(57)【要約】【課題】セルロース系原料以外で、作物原料に代わる入手容易なバイオエタノール原料、及びそれを用いた低コストでのエタノール製造方法を提供する。【解決手段】本発明は、クズ属（Pueraria）植物の根茎を原料としてエタノールを製造する方法であって、（ａ）クズ属植物に耐熱性液化酵素を添加し、６０〜８０℃にて０．５〜３時間インキュベートすることを含む、液化ステップ、（ｂ）ステップ（ａ）の生成物に耐熱性糖化酵素を添加し、４０〜６０℃にて０．５〜３時間インキュベートすることを含む、糖化ステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物をアルコール発酵することを含む、発酵ステップを含む方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クズ属（Pueraria）植物の根茎を原料としてエタノールを製造する方法であって、
（ａ）クズ属植物の根茎に耐熱性液化酵素を添加し、６０〜８０℃にて０．５〜３時間インキュベートすることを含む、液化ステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物に耐熱性糖化酵素を添加し、４０〜６０℃にて０．５〜３時間インキュベートすることを含む、糖化ステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物をアルコール発酵することを含む、発酵ステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記耐熱性液化酵素が耐熱性α−アミラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記耐熱性糖化酵素が耐熱性グルコアミラーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
液化ステップを７０℃にて１時間のインキュベーションにより行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
糖化ステップを５０℃にて１時間のインキュベーションにより行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
糖化ステップの後に、必要に応じて、生成物にセルラーゼを作用させるステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記クズ植物の根茎が、乾燥根茎粉末である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、入手容易な原料からの低コストのエタノール製造方法に関する。具体的には、本発明は、クズ属植物を原料とするエタノールの製造方法に関する。特に、本発明は、クズ属植物の根茎を原料とする、燃料用エタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石炭、原油等の化石燃料に代えて、エタノール、メタノール等のアルコールを燃料として用いることにより、有限な資源である化石燃料の使用量を低下させようとする試みが多くなされている。中でも、植物原料から生成したエタノール（バイオエタノール）を自動車の燃料として用いる試みは実用段階に至り、非常に注目されている。
【０００３】
燃料用のバイオエタノールは、現在のところ、コムギ、イネ、サツマイモ、サトウキビ、ビートをはじめとする、デンプン及び糖を多く含む作物を原料として製造されている。しかし、これらの作物の生産に適した農地が限られ、ヒト及び動物の食料用作物との競争が激しいため、新たな原料からの燃料用エタノール製造方法の開発が急務とされている。
【０００４】
この問題に対して、セルロース系原料からのエタノール製造を工業規模で行う試みが提案されている。セルロース系原料とは、例えば、農業廃棄物、雑草、森林廃材、糖処理残渣等の、デンプン及び糖の含有量が比較的少なく、セルロースを多く含む植物材料を意味する。セルロースは分解に極めて抵抗性であり、アルコール発酵に用いることができる材料を得るためには、極端な条件での処理が必要である。例えば、前処理として、蒸煮又は爆砕処理等の物理化学的処理、あるいは酸又はアルカリによる処理などの化学的処理を行い、さらに酵素的処理によりセルロースを糖に変換することが必要である。これらの処理は、装置及び処理のためのエネルギー供給の観点から、コストが高く、実用化のためには解決すべき課題が多い。一方で、セルロース系原料からエタノール製造に用いることができる材料を得るのに必要なコストを削減するための試みも、種々なされている（例えば、特許文献１〜３）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１５９９５４号公報
【特許文献２】特開２００５−５８０５５号公報
【特許文献３】特表２００８−５０６３７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、多大な努力にもかかわらず、セルロース系原料からのエタノール製造は未だ実用化に至っていない。したがって、セルロース系原料以外で、作物原料に代わる入手容易なバイオエタノール原料、及びそれを用いた低コストでのエタノール製造方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、燃料供給に関わる上記の問題に鑑み、入手容易な原料からの低コストのエタノール製造方法を開発し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明者らは、以下に詳細に記載するクズ属植物の特徴から、クズ属植物からのエタノール製造が、セルロース系原料からのエタノール製造よりも非常に低コストに行うことができる可能性に着目し、クズ属植物からのエタノール製造方法を開発した。
【０００９】
驚くべきことに、クズ属植物からのエタノール製造は、従来行われている作物植物からのエタノール製造と比較しても、簡便且つ低コストな処理により行うことができることが明らかとなった。
【００１０】
より具体的には、本発明は以下の特徴を有する。
（１）クズ属（Pueraria）植物の根茎を原料としてエタノールを製造する方法であって、
（ａ）クズ属植物の根茎に耐熱性液化酵素を添加し、６０〜８０℃にて０．５〜３時間インキュベートすることを含む、液化ステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物に耐熱性糖化酵素を添加し、４０〜６０℃にて０．５〜３時間インキュベートすることを含む、糖化ステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物をアルコール発酵することを含む、発酵ステップ
を含む、上記方法。
【００１１】
（２）前記耐熱性液化酵素が耐熱性α−アミラーゼである、上記（１）に記載の方法。
（３）前記耐熱性糖化酵素が耐熱性グルコアミラーゼである、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）液化ステップを７０℃にて１時間のインキュベーションにより行う、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
【００１２】
（５）糖化ステップを５０℃にて１時間のインキュベーションにより行う、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）糖化ステップの後に、必要に応じて、生成物にセルラーゼを作用させるステップをさらに含む、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）前記クズ植物の根茎が、乾燥根茎粉末である、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、容易に入手可能な材料からの低コストでのエタノール製造が可能になり、これにより化石燃料の代替として用いることができる燃料エタノールが安価に供給される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明においては、マメ科クズ属植物を原料とするエタノール製造方法が提案される。
クズ属植物は、その根にデンプンを多く含むこと、及び繁殖力が強いことを特徴とする。クズ属植物は日本全域をはじめとする亜熱帯〜熱帯地域に天然に広く分布しているほか、北米大陸に外来種として持ち込まれ、ここでも一般的に見られる。すなわち、クズ属植物は、非常に安価且つ大量に入手可能な材料である。その上、上記のとおり、クズ属植物はその根にデンプンを多く含むため、通常のセルロース系原料とは異なり、これを原料とするエタノール製造においては、困難なステップであるセルロースの分解を必要としない。
【００１５】
本発明において、「クズ属植物」とは、クズ属（Pueraria）に属する植物であれば特に制限されない。好ましいクズ属植物は、ニホンクズ（Pueraria lobata）又はネッタイクズ（Pueraria phaseoloides）である。
【００１６】
本発明においてエタノール製造の原料として用いるクズ属植物部分は根茎であり、好ましくは乾燥根茎粉末である。
【００１７】
本発明のクズ属（Pueraria）植物の根茎を原料としてエタノールを製造する方法は、
（ａ）クズ属植物の根茎に液化酵素を添加し、インキュベートすることを含む、液化ステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物に糖化酵素を添加し、インキュベートすることを含む、糖化ステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物をアルコール発酵することを含む、発酵ステップ
を含む。
【００１８】
本発明における「酵素」は、目的の酵素を有する限りいずれの生物由来のものであってもよく、あるいはその酵素をコードする核酸を用いて適切な宿主細胞で組み換え的に発現させて得られる組換え酵素でもよい。酵素は、粗精製形態、精製形態、固定化形態などの任意の形態を採ることが可能である。粗精製形態には、例えば細胞培養からの処理物（例えば、抽出物、凍結乾燥物など）が含まれる。
【００１９】
本発明において「液化」とは、高分子のデンプンをそれよりも小さな分子に加水分解することにより、粘性を有する糊化デンプン含有材料の粘度を下げることを意味する。
【００２０】
本発明における「耐熱性液化酵素」は、高温（例えば７０〜９０℃）において安定で、且つ液化活性を発揮し得る酵素であれば限定されないが、好ましくは耐熱性α−アミラーゼである。耐熱性α−アミラーゼは、例えば、洛東化成工業から、ラクターゼ２０００又はラクターゼＴＨＲ−１００などとして市販されている。
【００２１】
本発明において用いる液化酵素は、インキュベーション中の雑菌繁殖の防止などの観点から、高温で反応を行うことができる耐熱性酵素であることが望ましいが、上記の課題を解決する方法があれば、耐熱性でない液化酵素を用いることも可能である。
【００２２】
本発明の液化ステップは、９０℃より低い温度、好ましくは６０〜８０℃、より好ましくは７０℃にて、０．５〜３時間、好ましくは１時間、クズ属植物に耐熱性液化酵素を作用させることにより行う。反応ｐＨは、好ましくは中性〜弱酸性域（例えば、ｐＨ４〜ｐＨ７）とする。
【００２３】
液化ステップは、サツマイモなど通常用いられる作物原料では、９０℃で２時間程度行うことが必要であるが（アルコールハンドブック、アルコール協会／バイオインダストリー協会（編）、技報堂出版、第９版、１９９７年）、クズ属植物を原料とする場合は７０℃程度の温度で１時間行えば十分である。また、添加する酵素の量は、サツマイモでは０．５％（約１０，０００Ｕ／原料ｇに相当；ここで、「Ｕ」（活性単位）は、例えば、ヨウ素呈色により検出した場合に０．１ｇのデンプンを４０℃にて３０分間に完全に消失させる酵素量を１０Ｕとして糊精化力測定にて測定される活性を意味する）必要であるのに対して、クズ属植物では０．０５〜０．１％（約１，０００〜２，０００Ｕ／原料ｇ）で十分である。このことは、クズ属植物では反応の際の加熱に必要なエネルギーを顕著に低減することができること、したがって反応に必要なエネルギー面でのコストを削減できることを意味する。また、酵素は一般に高価であるため、酵素量を少なくすることができることにより、それによっても液化ステップを行うためのコストを大幅に削減することができる。
【００２４】
本発明の液化ステップは、酸等による処理で代用することも可能である。酸によるデンプンの液化は、例えば特開２００３−２５９８９２号公報に記載されている。
【００２５】
本発明において「糖化」とは、液化ステップで低分子化されたデンプン由来物質をさらに加水分解して、オリゴ糖又は単糖を生成させることを意味する。
【００２６】
本発明における「耐熱性糖化酵素」は、高温（例えば４０〜９０℃）において安定で、且つ糖化活性を発揮し得る酵素であれば限定されないが、好ましくは耐熱性グルコアミラーゼである。耐熱性グルコアミラーゼは、例えば、新日本化学工業から、スミチームとして市販されている。
【００２７】
本発明において用いる糖化酵素は、インキュベーション中の雑菌繁殖の防止などの観点から、高温で反応を行うことができる耐熱性酵素であることが望ましいが、上記の課題を解決する方法があれば、耐熱性でない糖化酵素を用いることも可能である。
【００２８】
本発明の糖化ステップは、９０℃より低い温度、好ましくは４０〜６０℃、より好ましくは５０℃にて、０．５〜３時間、好ましくは１時間、液化生成物に耐熱性糖化酵素を作用させることにより行う。反応ｐＨは、好ましくは中性〜弱酸性域（例えば、ｐＨ４〜ｐＨ７）とする。
【００２９】
糖化ステップは、サツマイモなど通常用いられる作物原料では、６０℃で２時間程度行うことが必要であるが（アルコールハンドブック、上掲）、クズ属植物を原料とする場合は５０℃程度の温度で１時間行えば十分である。また、添加する酵素の量は、サツマイモでは０．５％（９．３７Ｕ／原料ｇに相当；ここで、「Ｕ」（活性単位）は、５０℃にて６０時間で１ｇのデンプンを９７％以上分解する活性を１．５Ｕとする）必要であるのに対して、クズ属植物では０．０５〜０．２％（０．９４〜３．７５Ｕ／原料ｇ）で十分である。このことは、液化ステップと同様、クズ属植物では反応の際の加熱に必要なエネルギーを顕著に低減することができること、したがって反応に必要なエネルギー面でのコストを削減できることを意味する。また、これも液化ステップと同様に、酵素は一般に高価であるため、酵素量を少なくすることができることにより、それによっても糖化ステップを行うためのコストを大幅に削減することができる。
【００３０】
本発明において「アルコール発酵」とは、グルコース、フルクトース、スクロースなどの糖類が、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）などにより代謝され、主産物としてアルコールが生成されることを意味する。本発明でのアルコール発酵に用いる酵母は、特に糖化生成物をアルコール発酵し得るものであれば特に制限されないが、好ましくはサッカロミセス・セレビジエ、特に好ましくはサッカロミセス・セレビジエＭＫ０２１株（宮崎県食品開発センターから入手可能）である。
【００３１】
本発明の発酵ステップは、バッチ方式、段仕込み方式などのいずれの方式にを用いてもよい。例えば、発酵ステップは、糖化生成物に前培養した酵母を添加し、３０℃にて２４時間発酵させた後、さらに酵母を添加し、３０℃にて２４時間発酵させることにより行う。
【００３２】
好ましい実施形態では、糖化ステップの後に、必要に応じて、生成物にさらにセルラーゼを作用させるステップを含む。これにより、残余のセルロースを糖化し、原料に含まれる炭水化物をさらに有効に発酵に用いることができる。セルラーゼとしては、例えば、微生物由来セルラーゼを使用することができる。酵素反応は、例えば、セルロース１ｇに対してセルラーゼ５００ＣＭＣ  Ｕを添加し、４５℃で２４時間反応させることにより行うことができる（ここで、「ＣＭＣ  Ｕ」（活性単位）は、ｐＨ４．８、５０℃にて１分間に１μモルの還元糖を生成する活性を１ＣＭＣ  Ｕとする）。
【００３３】
本発明は、さらに、液化酵素、糖化酵素、酵母及び使用説明書を少なくとも含む、本発明のエタノール製造方法を行うためのエタノール製造キットにも関する。
【００３４】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：クズ属植物の液化及び糖化
（１）液化ステップ
ニホンクズの根茎の表皮を剥がし、サイコロ状に切断して７０℃にて３日間乾燥させた後、粉砕した。続いてクズ根茎を３００メッシュの篩にかけ、粉末を得た。得られた乾燥クズ根茎粉末１６０ｇを１Ｌ三角フラスコに入れ、０．１Ｍ酢酸及び０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．０に調整した蒸留水２００ｍＬを加えて、クズ粉末を懸濁した。懸濁物に液化酵素（ラクターゼ２０００（耐熱性α−アミラーゼ）、洛東化成工業製）を粉末クズに対して０．０５〜０．１％（１，０００〜２，０００Ｕ／原料ｇに相当；ここで、「Ｕ」（活性単位）は、例えば、ヨウ素呈色により検出した場合に０．１ｇのデンプンを４０℃にて３０分間に完全に消失させる酵素量を１０Ｕとして糊精化力測定にて測定される活性を意味する）添加し、７０℃にて１時間、撹拌しながら反応を行った。
【００３６】
（２）糖化ステップ
上記（１）の液化ステップから得られた生成物に対して、４０８ｍＬの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、さらに糖化酵素（スミチーム２０００（耐熱性グルコアミラーゼ）、新日本化学工業製）を粉末クズに対して０．０５〜０．２％（０．９４〜３．７５Ｕ／原料ｇに相当；ここで、「Ｕ」（活性単位）は、５０℃にて６０時間で１ｇのデンプンを９７％以上分解する活性を１．５Ｕとする）添加し、５０℃にて１時間、撹拌しながら反応を行った。
【００３７】
（３）セルロース分解ステップ
上記（２）の糖化ステップから得られた糖化液約７００ｍＬに、セルラーゼ（ゼネンコア社製）１０ｍＬ（２５，０００ＣＭＣ  Ｕに相当；ここで、「ＣＭＣ  Ｕ」（活性単位）は、ｐＨ４．８、５０℃にて１分間に１μモルの還元糖を生成する活性を１ＣＭＣ  Ｕとする）を添加し、３０℃にて２４時間インキュベートすることにより、糖化液に含まれるセルロースを分解した。
【００３８】
（４）分析結果
粉末クズの一般分析の結果を、以下の表１に示す。
【００３９】
表１  粉末クズの成分（％）
水分              ４．５
タンパク質        ６．９
脂質              ０．８
灰分              ３．９
炭水化物        ８３．９
還元糖          ７２．０
直糖            １０．０
デンプン        ６３．９
セルロース      １１．９
（炭水化物−還元糖）
水溶性還元糖    １０
【００４０】
一般分析は、デンプン含量については塩酸加水分解法を用いて測定し、還元糖はＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法を用いて測定し、その他は宮崎県公衆衛生センターにおいて行った。
【００４１】
塩酸加水分解法は、簡潔には、デンプン含有材料１ｇに２．５％塩酸２００ｍＬを加え、沸騰水中で２．５時間加熱後、５％水酸化ナトリウムで中和し、得られた溶液を濾過し、そこに含まれる還元糖をＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法で測定することにより行った。
【００４２】
Ｎｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法は、簡潔には、まず、糖含有溶液１ｍＬに銅試薬１ｍＬを加え、沸騰水中で１０分間加熱した後、急冷し、ネルソン試薬２ｍＬを加えて酸化銅を溶解させる。一定容量（例えば、１０ｍＬ容）に希釈した後、１５分後に５００ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線に基づき還元糖濃度を算出することにより行った。
【００４３】
液化前のクズデンプンの顕微鏡写真を図１に示す。液化後の試料の顕微鏡写真を、図２に示す。デンプンは完全に液化していることが見て取れる。
【００４４】
糖化液の水溶性還元糖含量は１７％であった。これは、サツマイモを９０℃にて２時間液化し、さらに６０℃にて２時間糖化することにより得た糖化液の水溶性還元糖含量（１５％、アルコールハンドブック、上掲）に匹敵するものである。本発明の方法での液化・糖化ステップは、前記のサツマイモの液化・糖化ステップよりも顕著に穏やかな条件で行うことができ、また必要とされる酵素量もより少ない（クズ：０．２％；サツマイモ：０．５％）。したがって、クズの液化・糖化ステップでは、サツマイモをはじめとする既存の作物材料に対して行われるものよりもコストを大幅に低減することができる。
【００４５】
実施例２：糖化液のアルコール発酵
（１）第１発酵
実施例１で得られた糖化液を０．１Ｍ酢酸を用いて無菌的にｐＨ５．０に調整し、蒸留水４０８ｍＬを加えた。ここに、前培養（４８時間）した酵母サッカロミセス・セレビジエＭＫ０２１株（宮崎県食品開発センターより入手）の培養物４０ｍＬを添加し、静置条件で３０℃にて２４時間発酵を行った。
【００４６】
（２）第２発酵
（１）で得られた発酵液を、静置条件で３０℃にてさらに２４時間発酵させた。発酵終了後の生成物を濾過し、そのうち１００ｍＬを蒸留し、酒精計によりアルコール濃度を測定した。
【００４７】
（３）分析結果
発酵後の試料の顕微鏡写真を、図３に示す。酵母菌体が多く含まれることが見て取れる。
【００４８】
発酵残渣の一般分析結果を、以下の表２に示す。粉末クズ１６０ｇの発酵から得られた残渣は、乾燥重量で４９．５ｇであった。
【００４９】
表２  発酵残渣（乾燥）の成分（％）
水分              ７．５
タンパク質      ２４．６
脂質              ２．１
灰分              ３．６
炭水化物        ６２．２  （１００−３７．８）
水分、タンパク質、脂質及び灰分の合計
【００５０】
薄層クロマトグラフィーを用いて糖類の分析を行った。乾燥発酵残渣４９．５ｇ中、非発酵性糖分（キシロース、マンノース等）は５．８３ｇであった。発酵残渣にはグルコースは含まれていなかった。
【００５１】
表１に示す粉末クズの分析結果と比較してタンパク質量が増大しているが、これは図３に示されるように、発酵残渣中に酵母菌体が多く含まれることによるものと思われる。
【００５２】
発酵後のアルコール濃度は９．７％であった。このことは、粉末クズ原料１００ｇから４５ｇのエタノールを製造し得ることを意味する。この値は、サツマイモを原料として従来の方法により得られるエタノールの量と同程度である（アルコールハンドブック、上掲）。
【００５３】
以下の式により計算される発酵歩合は８９．２％であった。
2009273393.tif 000002
【００５４】
ここで、上記式の分母に含まれる係数（０．６４３５）は、下記式
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６（１８０．１６）→２Ｃ２Ｈ５ＯＨ（９２．１４）＋２ＣＯ２（８８．０２）（カッコ内は分子量）
から、１ｋｇの糖から生成されるアルコールは０．５１１４ｋｇであり、これを容積に換算すると０．６４３５Ｌであることから得られた値である。
【００５５】
（４）考察
以上より、クズ属植物を原料とした場合、セルロース系原料で必要とされるような極端な条件での処理はまったく用いることなく、高効率にエタノールを製造し得ることが実証された。クズ属植物を原料とするエタノール製造は、通常用いられる作物原料であるイネと比較しても、穏やかな条件で行うことができることも示された。
【００５６】
上記のとおり、クズ属植物は広い地域で容易に入手可能である。したがって、クズ属植物は、バイオエタノール製造の原料として非常に有望である。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明によれば、化石燃料の代替として用いることができる燃料エタノールを低コストで供給することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】クズデンプンの顕微鏡写真を示す。
【図２】液化後の試料の顕微鏡写真を示す。
【図３】アルコール発酵後の試料の顕微鏡写真を示す。
【図１】
2009273393.tif 000003
【図２】
2009273393.tif 000004
【図３】
2009273393.tif 000005