(57)【要約】【課題】ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物を容易にスクリーニングするための一連の技術を提供する。【解決手段】ｓＫＣａ受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質が提供される。分子シャペロン活性を有するタンパク質の例として、シャペロニン、ＰＰＩａｓｅが挙げられる。当該融合タンパク質を用いるｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法、並びに、当該スクリーニング方法に用いられるスクリーニング用組成物も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓＫＣａ受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、リガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
ｓＫＣａ受容体は、ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼは、トリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものであることを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してｓＫＣａ受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質からｓＫＣａ受容体を切り出してｓＫＣａ受容体を取得することを特徴とするｓＫＣａ受容体の製造方法。
【請求項１０】
融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってｓＫＣａ受容体を切り出すことを特徴とする請求項９に記載のｓＫＣａ受容体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のｓＫＣａ受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
下記工程：
（１）請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、ｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したｓＫＣａ受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でｓＫＣａ受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のｓＫＣａ受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断することを特徴とする請求項１２に記載の化合物のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物。
【請求項１５】
ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、ｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合タンパク質、ｓＫＣａ受容体の製造方法、化合物のスクリーニング方法、及びスクリーニング用組成物に関する。本発明は、ｓＫＣａ受容体を標的とする新規医薬の開発等に有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
ｓＫＣａ受容体はＣａ2+依存性小コンダクタンスＫ+チャネル（small-conductance calcium-activated potassium channel）として知られているチャネルファミリーに属する。ｓＫＣａ受容体は３つのメンバー、ＳＫ１、ＳＫ２、ＳＫ３に分類され、カルシウム依存性過分極に関与している。これらのメンバーは、いずれも孔形成領域およびＮ、Ｃ両末端が細胞内に位置する６回膜貫通構造を有している。ｓＫＣａ受容体は主に脳組織中に分布し、ＳＫ２，ＳＫ２は大脳新皮質や海馬に、ＳＫ３は視床、基底核、小脳や脳幹などに多く発現している。またｓＫＣａ受容体は統合失調症、アルツハイマー病などの神経疾患に関連していることが多数報告されている。そのため、選択的ｓＫＣａ受容体アゴニストが新しい治療薬として注目されている（非特許文献１）。すなわち、ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物はアンタゴニスト又はアゴニストとして薬理活性が期待できる。
【０００３】
アパミン（Ａｐａｍｉｎ）は神経毒素ポリペプチドの一種であり、Ｃａ2+依存性小コンダクタンスＫ+チャネルを選択的に抑制することが知られている。すなわち、アパミンはｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する。
【０００４】
ｓＫＣａ受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法としては、ｓＫＣａ受容体を発現しているラットなどの動物組織をホモジネートし、そのシナプトソームを材料とし、ラジオアイソトープでラベルした既知の化合物をトレーサーとして結合実験を行うのが常法である（非特許文献２）。しかしながら、この方法は非ヒト動物のｓＫＣａ受容体を用いた評価結果を指標とするものであり、ヒトへの薬理効果を正しく反映しているとは限らない。むしろ近年、非ヒト動物由来の材料を用いたアッセイ法が、必ずしもヒトへの薬理効果を正しく外挿しないことが明らかになりつつある。このため、ヒト由来のｓＫＣａ受容体を用いたスクリーニングのニーズが高まっている。ところが、ヒト組織を用いて同様の実験を行うことには倫理上の問題があり、実施は事実上困難である。
【０００５】
一方、ｓＫＣａ受容体を遺伝子工学的に取得する試みもある。非特許文献３には、ヒト由来のＳＫ３受容体を動物細胞ＣＨＯ−Ｋ１による安定発現細胞株を樹立することで、リガンド結合活性を有するｓＫＣａ受容体を回収した旨が開示されている。この方法では動物細胞膜にｓＫＣａ受容体を発現することで機能的な受容体を取得することに成功しているが、高発現の安定形質転換体を取得、選択するには多くの日数を要し、なおかつ大量に供給するには困難である。なお、ｓＫＣａ受容体全長を強制発現させた例は動物組織、動物細胞を用いた例のみであり、昆虫細胞、酵母などに強制発現させた例はこれまで報告されていない。
【０００６】
膜タンパク質等の難溶性のタンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で発現させる技術として、「タンパク質折り畳み因子」と呼ばれるタンパク質の作用を利用する方法が提案されている。タンパク質折り畳み因子は、他のタンパク質の折り畳み反応（フォールディング）を促進する作用を有するタンパク質の総称であり、酵素的に働く「フォールダーゼ」と非酵素的に働く「分子シャペロン」とに分類することができる。例えば、難溶性の目的タンパク質をタンパク質折り畳み因子との融合タンパク質として発現させ、目的タンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で取得する方法が提案されている（特許文献１）。しかし、この方法の有効性は目的タンパク質の種類によって異なり、ｓＫＣａ受容体のような６回膜貫通型受容体に対して有効であるか否かは定かでない。
【特許文献１】国際公開第０２／０５２０２９号パンフレット
【非特許文献１】ブランク・ティ（Blank T）ら，カレント・ドラッグ・ターゲッツ・シーエヌエス・アンド・ニューロロジカル・ディスオーダーズ（Current drug targets. CNS and neurological disorders），２００４年，第３巻，第３号，ｐ．１６１−１６７
【非特許文献２】高柳一成，「薬物受容体  細胞膜にあるレセプターの基礎知識」，１９９０年，南山堂，ｐ．３３
【非特許文献３】ジー・シー・タースタッペン（G.C. Terstappen）ら，ニューロファーマコロジー（Neuropharmacology），２００１年，第４０巻，ｐ．７７２−７８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物を容易にスクリーニングするための一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、ｓＫＣａ受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質である。
【０００９】
また請求項２に記載の発明は、ｓＫＣａ受容体はヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質である。
【００１０】
本発明の融合タンパク質は、ｓＫＣａ受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなるものである。そして、本発明の融合タンパク質は、受容体としての本質的な活性である「リガンド結合活性」を保持している。本発明の融合タンパク質はリガンド結合活性を有するので、単独分子としてのｓＫＣａ受容体の代替物質として利用できる。例えば、ｓＫＣａ受容体としてヒト由来のものを採用した融合タンパク質（請求項２）を使用すれば、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来ｓＫＣａ受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質は遺伝子工学的に大量取得が可能であるので、ｓＫＣａ受容体の部分を切り出すことによりｓＫＣａ受容体を高収率かつ容易に製造することができる。
【００１１】
ここで「リガンド結合活性」とは、天然（native）のｓＫＣａ受容体が本質的に有する活性を表現したものであり、具体的には「アパミンに特異的な結合活性」、「ｓＫＣａ受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性」、及び「ｓＫＣａ受容体に対するアンタゴニストに特異的な結合活性」等が例示される。
【００１２】
ここで「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指すものとする。「分子シャペロン活性を有するタンパク質」の代表例はシャペロニン、スモールヒートショックプロテイン、Ｈｓｐ９０等の「分子シャペロン」に属する一群のタンパク質である。ただし、分子シャペロン以外のタンパク質であっても、上記した「分子シャペロン活性」を有するタンパク質であれば、本発明における「分子シャペロン活性を有するタンパク質」に含まれる。
【００１３】
本発明においてｓＫＣａ受容体に連結されるタンパク質は、「分子シャペロン活性を有するタンパク質」と「そのサブユニット」のいずれかである。前者は分子シャペロン活性を有するタンパク質が単量体である場合、後者は複数のサブユニットからなる複合タンパク質の場合に該当する。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００１５】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質ある。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャペロニンはその内部に他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンを採用したものである。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質である。
【００１７】
２個以上のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結された人工タンパク質（以下、「シャペロニンサブユニット連結体」と称する。）が知られており、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている（古谷ら，Protein Science, 2005, 14, 341）。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンサブユニット連結体を採用したものである。なお、Ｎ個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンサブユニット連結体を、以下、「シャペロニンサブユニットＮ回連結体」と呼ぶこととする。
【００１８】
請求項５に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００１９】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼ（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と略記する。）はフォールダーゼの一種であり、細胞内で折り畳み途上のタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する酵素である。一部のＰＰＩａｓｅはＰＰＩａｓｅ活性に加えて「分子シャペロン活性」を有することが知られており、本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質として当該ＰＰＩａｓｅを採用したものである。
【００２０】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼがトリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものである構成が推奨される（請求項６）。
【００２１】
請求項７に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してｓＫＣａ受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質である。
【００２２】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットとｓＫＣａ受容体とがペプチドリンカーを介して間接的に連結されている。本発明によれば、ペプチドリンカー部分を利用して融合タンパク質に所望の機能を容易に付与することができる。
【００２３】
請求項８に記載の発明は、ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質である。
【００２４】
かかる構成により、融合タンパク質からｓＫＣａ受容体を容易に切り出すことができる。
【００２５】
請求項９に記載の発明は、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質からｓＫＣａ受容体を切り出してｓＫＣａ受容体を取得することを特徴とするｓＫＣａ受容体の製造方法である。
【００２６】
本発明はｓＫＣａ受容体の製造方法にかかるものであり、上記した本発明の融合タンパク質からｓＫＣａ受容体を切り出すことを特徴とする。本発明のｓＫＣａ受容体の製造方法では、遺伝子工学的に大量取得が可能な融合タンパク質を用いるので、ｓＫＣａ受容体を高収率で取得することができる。さらに、融合タンパク質からｓＫＣａ受容体を切り出す構成を採用したので、製造が容易に行える。
【００２７】
請求項１０に記載の発明は、融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってｓＫＣａ受容体を切り出すことを特徴とする請求項９に記載のｓＫＣａ受容体の製造方法である。
【００２８】
かかる構成により、融合タンパク質からｓＫＣａ受容体をきわめて容易に切り出すことができる。
【００２９】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のｓＫＣａ受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３０】
本発明は、ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法にかかるものである。本発明のスクリーニング方法では、単独分子のｓＫＣａ受容体ではなく、本発明の融合タンパク質を用いる。上記したように、本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのｓＫＣａ受容体の代替物質として利用できるものである。本発明のスクリーニング方法では、融合タンパク質としてヒト由来ｓＫＣａ受容体を含むものを使用することができるので、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来ｓＫＣａ受容体に対するスクリーニングを行うことができる。その結果、ｓＫＣａ受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３１】
請求項１２に記載の発明は、下記工程：
（１）請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、ｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したｓＫＣａ受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でｓＫＣａ受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のｓＫＣａ受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法では、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でｓＫＣａ受容体と被検化合物とを接触させる。そして、分子シャペロン活性を有するタンパク質とｓＫＣａ受容体として、本発明の融合タンパク質を切断して遊離させたものを使用する。ここで、被検化合物と接触する遊離のｓＫＣａ受容体は、溶液中において分子シャペロン活性を有するタンパク質の作用によって正しく折り畳まれた可溶性の状態で存在できる。したがって本発明のスクリーニング方法によれば、ｓＫＣａ受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３３】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する構成が推奨される（請求項１３）。
【００３４】
請求項１４に記載の発明は、ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物である。
【００３５】
本発明はｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング用組成物に係るものであり、本発明の融合タンパク質を含有することを特徴とする。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【００３６】
請求項１５に記載の発明は、ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、ｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物である。
【００３７】
本発明のスクリーニング用組成物は、本発明の融合タンパク質を溶液中で切断し、ｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものであり、分子シャペロン活性を有するタンパク質とｓＫＣａ受容体とを含有する。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、ｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのｓＫＣａ受容体の代替物質として利用でき、例えば、ｓＫＣａ受容体としてヒト由来のものを採用することで、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来ｓＫＣａ受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質からｓＫＣａ受容体の部分を切り出すことにより、ｓＫＣａ受容体を高収率かつ容易に製造することができる。
【００３９】
本発明のｓＫＣａ受容体の製造方法によれば、ｓＫＣａ受容体を高収率かつ容易に取得することができる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法によれば、ｓＫＣａ受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００４１】
本発明のスクリーニング用組成物によれば、ｓＫＣａ受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニングを容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明の融合タンパク質は、ｓＫＣａ受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有する。好ましくは、ｓＫＣａ受容体がヒト由来のものである。
【００４３】
分子シャペロン活性を有するタンパク質の例としては、シャペロニン（Ｈｓｐ６０）、スモールヒートショックプロテイン、プレフォルディン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ９０、等の分子シャペロンに属するタンパク質が挙げられる。好ましくは、シャペロニンが採用される。
【００４４】
シャペロニンは、グループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング構造を形成し、さらに２つのリングが２層構造を形成する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。１型シャペロニンの例としては、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬが挙げられる。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８〜９個のシャペロニンサブユニットからなるリングが２層に連なった１６〜１８量体のホモ、またはヘテロオリゴマーを形成している。本発明の融合タンパク質に含まれるシャペロニンは、グループ１型及びグループ２型のいずれでもよい。
【００４５】
好ましい実施形態では、シャペロニンサブユニットの少なくとも２個がペプチド結合を介して連結されている。換言すれば、ｓＫＣａ受容体のＮ末端側又はＣ末端側に「シャペロニンサブユニット連結体」が連結されている。上記したように、シャペロニンサブユニット連結体においても、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている。また、シャペロニンサブユニットＮ回連結体の連結数（Ｎ）は、そのシャペロニンの由来によって決定される最適数であることが特に好ましく、グループ１型シャペロニンの場合には７個、グループ２型シャペロニンの場合には８又は９個が好ましい。Ｎがこれらの最適数であれば、シャペロニンサブユニット連結体のみでリング状構造体を形成することができ、単独分子のシャペロニンサブユニットを補充する必要がない。
【００４６】
本発明の融合タンパク質においては、リング構造への自己集合能が維持されている限り、天然型のシャペロニンと同様にアミノ酸変異体等の変異型のシャペロニンも採用することができる。
【００４７】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロンには分類されない「分子シャペロン活性を有するタンパク質」を採用することもできる。好ましくは、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを採用する。すなわち、一部のＰＰＩａｓｅは、本来のＰＰＩａｓｅ活性に加えて分子シャペロン活性を有する。分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの例としては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ；トリガーファクター（ＴＦ）タイプＰＰＩａｓｅ（Huang, Protein Sci., 9, 1254-, 2000年）；ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Arie, Mol. Microbiol. 39, 199-, 2000年）；ＳｌｙＤタイプＰＰＩａｓｅ（Scholz, Biochemistry, 45, 20-, 2006年）；ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Bose, Science, 274, 1715-, 1996年）；ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（Pirkl, J. Mol. Biol., 308, 795-, 2001年）；ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Behrens, EMBO J. 20, 285-, 2001年）、が挙げられる。
【００４８】
このうち、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより２種類に大別できる。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明の融合タンパク質においては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでも採用できるが、一般的に、ショートタイプの方がより強い分子シャペロン活性を有する傾向にあること、タンパク質の分子量が大きくなるにつれて、その組み換えタンパク質の発現量が低下する傾向があること、の２点を考慮すると、ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを採用することがより好ましい。
【００４９】
さらに、これらのＰＰＩａｓｅの一部のアミノ酸残基を改変したポリペプチドや、これらのＰＰＩａｓｅの一部分を含むポリペプチド等であって、ＰＰＩａｓｅ活性と分子シャペロン活性とを有するポリペプチドも、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして採用できる。
【００５０】
上記したように、本発明において「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指す。分子シャペロン活性の評価方法としては、例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田，バイオサイエンスとインダストリー,５６,５９３−,１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率をもって、検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Horowitz, Methods Mol. Biol., 40, 361-, 1995年）が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Taguchi, J. Biol. Chem., 269, 8529-, 1994年）等が挙げられる。
【００５１】
好ましい実施形態では、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してｓＫＣａ受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されている。特に、ペプチドリンカーがプロテアーゼ認識切断部位を有する実施形態によれば、融合タンパク質に当該のプロテアーゼを作用させることにより、ｓＫＣａ受容体を容易に切り出すことができる。当該プロテアーゼの例としては、トロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００５２】
本発明の融合タンパク質は、例えば、分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とｓＫＣａ受容体をコードする遺伝子とを連結させた融合遺伝子を発現させることにより製造することができる。例えば、該融合遺伝子を発現ベクターに組み込み、該組換えベクターを適宜の宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体内で融合遺伝子を発現させればよい。このときに用いる宿主としては特に限定はないが、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点からバクテリア等の微生物が好ましく、特に、大腸菌が取り扱いの容易さの面でより好ましい。
【００５３】
また、宿主細胞のペリプラズム領域や細胞外に前記融合タンパク質を分泌発現させてもよい。この場合には、融合タンパク質を酸化的環境に発現・分泌させることになるので、融合タンパク質が適切なジスルフィド結合を形成しやすくなり、融合タンパク質に含まれるｓＫＣａ受容体の立体構造を安定化させることができる。また、発現させたｓＫＣａ受容体が宿主細胞の細胞膜に組み込まれることにより、受容体の比活性が向上することが期待できる。大腸菌を宿主として用いる場合に採用できるシグナル配列としては、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＴ、Ｍ１３ファージのｇ３タンパクのシグナル配列、などが挙げられる。
【００５４】
本発明のｓＫＣａ受容体の製造方法は、本発明の融合タンパク質からｓＫＣａ受容体を切り出して取得するものである。好ましくは、プロテアーゼ認識切断部位を有するペプチドリンカーを介して分子シャペロン活性を有するタンパク質とｓＫＣａ受容体とが連結されている融合タンパク質を用い、この融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて、ｓＫＣａ受容体を切り出す。例えば、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーを採用した場合には、融合タンパク質にトロンビンを作用させてトロンビン認識切断部位を切断し、ｓＫＣａ受容体を切り出すことができる。
【００５５】
本発明の化合物のスクリーニング方法の１つの様相では、本発明の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のｓＫＣａ受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。例えば、非ヒト動物の組織ホモジネートを使用する従来のスクリーニング方法において、組織ホモジネートの代わりに本発明の融合タンパク質を使用することにより、本様相のスクリーニング方法を実施することができる。特に、ヒト由来ｓＫＣａ受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来ｓＫＣａ受容体に対するスクリーニングを行うことができ、好適である。なお、本様相のスクリーニング方法においては複数種の融合タンパク質を併用してもよく、例えば、「ｓＫＣａ受容体とシャペロニンとの融合タンパク質」と「ｓＫＣａ受容体とＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質」の２種を併用することができる。
【００５６】
本発明のスクリーニング用組成物の１つの様相では、本発明の融合タンパク質を含有する。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、融合タンパク質と被検化合物との結合性を容易に調べることができる。本様相のスクリーニング用組成物は本発明の融合タンパク質を含有しておればよく、その他の成分については特に限定はない。例えば、適宜の緩衝成分や安定化剤を含有していてもよい。組成物の形状についても特に限定はなく、溶液状でもよいし、凍結乾燥品でもよい。
【００５７】
本発明の化合物のスクリーニング方法の他の様相は、２つの工程（１）及び（２）を包含する。工程（１）では、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、ｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させる。これにより、ｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物が得られる。この段階で、遊離したｓＫＣａ受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる。具体的手順としては、例えば、融合タンパク質の切断処理が終了した溶液に被検化合物を添加することが挙げられる。すなわち、ｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物に被検化合物を添加する。他の例としては、工程（１）開始時の溶液に予め被検化合物を含有させておき、その後、融合タンパク質の切断処理を行うことが挙げられる。すなわち、融合タンパク質と被検化合物とを混合した状態で当該融合タンパク質を切断し、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でｓＫＣａ受容体と被検化合物とを接触させる。
【００５８】
そして工程（２）において、工程（１）でｓＫＣａ受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のｓＫＣａ受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。本様相の化合物のスクリーニング方法においても、ヒト由来ｓＫＣａ受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来ｓＫＣａ受容体に対するスクリーニングを行うことができる。なお、本様相のスクリーニング方法においても複数種の融合タンパク質を併用することができる。
【００５９】
好ましい実施形態では、融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する。当該プロテアーゼの例としては、上記したトロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００６０】
本発明のスクリーニング用組成物の他の様相は、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、ｓＫＣａ受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものである。連結部の切断は、例えば、連結部にプロテアーゼ認識切断部位を設けておき、融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させることにより行うことができる。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下における被検化合物のｓＫＣａ受容体に対する結合性を容易に調べることができる。なお本様相のスクリーニング用組成物は、適宜の緩衝成分や安定化剤をさらに含有していてもよいし、組成物の形状は溶液状でも凍結乾燥品でもよい。
【００６１】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６２】
（１）常温性古細菌Methanosarcina acetivorans由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭａＦＫＢＰ１８）と融合するための発現ベクター構築
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの１つであるＭａＦＫＢＰ１８の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Iida, Gene, 222, 249-, 1998年）を鋳型とし、ＭａＦｕ―Ｆ１（配列番号１）とＭａＦｕ―Ｒ２（配列番号２）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＭａＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号３）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。
【００６３】
さらに、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーをコードするＤＮＡ（ペプチドリンカーサイト）、並びに、外来遺伝子を挿入するための種々の制限酵素サイト（クローニングサイト）を含むオリゴＤＮＡを調製した。これらのＤＮＡとＭａＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片とをｐＥＴ２１ｄベクター（メルク社）の制限酵素サイトに導入した。この際、ＭａＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片が上流、ペプチドリンカーサイトとクローニングサイトが下流に位置するように導入した。得られたＭａＦＫＢＰ１８融合タンパク質発現用プラスミドをＭａＦＫｆｕｓｉｏｎ３とした（図１）。図１中、「Ｐ」はプロモーター、「Ｌａｃ」はラックオペレーター、「ＲＢＳ」はリボゾーム結合部位、「ＭａＦＫＢＰ１８」はＭａＦＫＢＰ１８遺伝子、「Ｔｈｒｂｉｎ」はトロンビン認識切断部位をコードする配列、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列、「Ｔ」はターミネーターを表す。そして、ＭａＦＫｆｕｓｉｏｎ３のクローニングサイトにｓＫＣａ受容体遺伝子を挿入することにより、ＭａＦＫＢＰ１８とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００６４】
（２）大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクター構築
ＮＣＢＩコード：NP_414970に登録されている塩基配列情報を元に、プライマーＴＦ−Ｆ１（配列番号４）とＴＦ−Ｒ１（配列番号５）を設計した。大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＴＦ−Ｆ１とＴＦ−Ｒ１をプライマー対としてＰＣＲを行い、終止コドンを除いたＴＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号６）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。
【００６５】
ＴＦ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片が挿入されたｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターをＮｃｏＩとＳｐｅＩで処理し、ＴＦ遺伝子を得た。上記（１）で調製したＭａＦＫｆｕｓｉｏｎ３をＮｃｏＩとＳｐｅＩで処理してＭａＦＫＢＰ１８遺伝子の部分を除いた後、得られたＴＦ遺伝子を挿入し、ＴＦ融合タンパク質発現用プラスミドＴＦｆ３を構築した。ＴＦｆ３は、（１）で構築したＭａＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＭａＦＫＢＰ１８遺伝子がＴＦ遺伝子に置き換わった構成を有する。すなわち、ＴＦｆ３のクローニングサイトにｓＫＣａ受容体遺伝子を挿入することにより、ＴＦとｓＫＣａ受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００６６】
（３）大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬの７回連結体と融合するための発現ベクター構築
大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＣＰＮ−Ｆ１（配列番号７）とＣＰＮ−Ｒ１（配列番号８）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号９）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＳｐｅＩサイトとＸｂａＩサイトが導入された。このＤＮＡ断片７個を直列に連結し、ＧｒｏＥＬ７回連結体遺伝子（（ＧｒｏＥ）７遺伝子）を作製した。ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに、（ＧｒｏＥ）７遺伝子と他の必要な配列を導入し、発現ベクターｐＴｒｃＨ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｆを構築した（図２）。図２中、「Ｐ」はｔｒｃプロモーター、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列（Ｈｉｓペプチドサイト）、「ｇｒｏＥＬ」はＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子、「（ＧｒｏＥ）７」は（ＧｒｏＥ）７遺伝子、「ＰＳ」はペプチドリンカーをコードする配列（ペプチドリンカーサイト）、「ＣＳ」はクローニングサイト、「Ｅｋ」はエンテロキナーゼ翻訳サイト、「ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧタグをコードする配列（ＦＬＡＧペプチドサイト）、「Ｔ」はターミネーターを示す。すなわち、ｐＴｒｃＨ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｆは、ｔｒｃプロモーターの下流にＨｉｓペプチドサイト、（ＧｒｏＥ）７遺伝子、ペプチドリンカーサイト（トロンビン切断認識部位をコードする配列を有する）、クローニングサイト、エンテロキナーゼ翻訳サイト、ＦＬＡＧペプチドサイト、終止コドン、及びターミネーターが配置された構成を有している。そして、ｐＴｒｃＨ（ＧＶ）７ＴＣ２ＦのクローニングサイトにｓＫＣａ受容体遺伝子を挿入することにより、ＧｒｏＥＬ７回連結体とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００６７】
（４）ヒトｓＫＣａ受容体遺伝子の調製
ヒトｃＤＮＡクローン（インビトロジェン社）を鋳型とし、ＫＣＮ−Ｆ１（配列番号１０）とＫＣＮ−Ｒ１（配列番号１１）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトｓＫＣａ受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１２）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。得られたベクターをｐＴ７−ｓＫＣａ＃５とした。
【００６８】
（５）融合タンパク質発現ベクターの構築
上記（４）で構築したｐＴ７−ｓＫＣａ＃５をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理し、ヒトｓＫＣａ受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（１）で構築したＭａＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＭａＦＫＢＰ１８とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質を発現するベクターＭａＦＫＢＰ１８−ｓＫＣａ＃１を構築した。同様に、このＤＮＡ断片を（２）で構築したＴＦｆ３のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＴＦとｓＫＣａ受容体との融合タンパク質を発現するベクターＴＦｆ３−ｓＫＣａを構築した。
【００６９】
上記（４）で構築したｐＴ７−ｓＫＣａ＃５をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理し、ヒトｓＫＣａ受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（３）で構築したｐＴｒｃＨ（ＧＶ）７ＴＣ２ＦのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、（ＧｒｏＥＬ）７とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質を発現するベクターｐＴｒｃＨ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｆ−ｓＫＣａを構築した。
【００７０】
（６）融合タンパク質の製造
上記（５）で構築した４種のベクターを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＲＡＲＥ株に導入し、４種の形質転換体を得た。２リットル容の三角フラスコに７００ｍＬの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ 酵母エキス、２０ｇ／Ｌバクトトリプトン、６ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、ｐＨ７．５）を仕込み、各形質転換体を２〜３白金耳接種した。２５℃で４０時間、１１０ｒｐｍで回転培養した後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分）にて菌体を回収した。得られた菌体を１％プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社）及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。凍結した菌体懸濁液を融解して、超音波破砕後、超遠心分離に供し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。その結果、培養液１Ｌ当たり、ＭａＦＫＢＰ１８との融合タンパク質が１４．０ｍｇ（純度：約３２％）、シャペロニン７連結体との融合タンパク質が２０ｍｇ（純度：約３３％）得られた。
【００７１】
表１に本実施例で用いた各プライマーの塩基配列と制限酵素サイトを示した。
【表１】
2009249303.tif 000003
【実施例２】
【００７２】
ｓＫＣａ受容体の製造とスクリーニング用組成物の調製
実施例１の（６）で精製したＭａＦＫＢＰ１８とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質をトロンビンにて２２℃で一昼夜処理し、ＭａＦＫＢＰ１８とｓＫＣａ受容体との間のトロンビン認識切断部位を切断した。これにより、ＭａＦＫＢＰ１８とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質からｓＫＣａ受容体を切り出し、取得することができた。
【００７３】
さらに、トロンビンにて一昼夜処理した上記反応液を、そのままＭａＦＫＢＰ１８とｓＫＣａ受容体とを含有するスクリーニング用組成物とした。
【実施例３】
【００７４】
ｓＫＣａ受容体のリガンド結合特異性評価
実施例１の（６）で調製した、ＭａＦＫＢＰ１８とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質を含む上清画分、並びに、（ＧｒｏＥＬ）７とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質を含む上清画分を、それぞれ以下の手順によるｓＫＣａ受容体のリガンド結合特異性評価に供した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にｓＫＣａ受容体３２０μｇ相当分の各試料を添加し、125Ｉ−Ａｐａｍｉｎ（ｓＫＣａ受容体に対するアゴニスト）をホットトレーサー、Ａｐａｍｉｎ（ｓＫＣａ受容体に対するアゴニスト）をコールドの置換体とするリガンド結合特異性評価を行った。反応条件は２５℃、６０分間とした。反応終了後、セルハーベスターにより濾過し、濾紙を３ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。濾紙を測定用バイアルに移し、液体シンチレーター（Atomlight、登録商標）５ｍＬを添加し、液体シンチレーションカウンターにて測定（２分間）した。その結果、ＭａＦＫＢＰ１８と融合させたｓＫＣａ受容体では２５３１ｃｐｍ、（ＧｒｏＥＬ）７と融合させたｓＫＣａ受容体では５４９ｃｐｍの値を示した。
【００７５】
以上より、ＭａＦＫＢＰ１８とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質、並びに、（ＧｒｏＥＬ）７とｓＫＣａ受容体との融合タンパク質は、いずれもｓＫＣａ受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性（リガンド結合活性）を有していた。これにより、これらの融合タンパク質を用いてヒトｓＫＣａ受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングできることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＭａＦＫｆｕｓｉｏｎ３の主要部の構成を示す説明図である。
【図２】ｐＴｒｃＨ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｆの主要部の構成を示す説明図である。
【図１】
2009249303.tif 000004
【図２】
2009249303.tif 000005
【配列表】
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