(57)【要約】【課題】抗生物質を用いず、培地組成に制約されずに組換えＤＮＡクローニングベクターを宿主細胞中に維持し得る新たな手段とこの手段を利用した外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する方法を提供する。【解決手段】外来遺伝子を発現させて前記外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する方法。任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、組換えベクターの任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位に、所望の外来遺伝子を挿入した組換えベクターを用意する工程、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞等を用意する工程、変異宿主細胞を組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程、形質転換体を培養して、前記外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつ
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主において用いられる前記組換えベクター。
【請求項２】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
組換えベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、またはレトロトランスポゾンの形態を有する請求項１または２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主細胞であって、
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつ
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターで形質転換して用いられる前記変異宿主細胞。
【請求項５】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、請求項４に記載の変異宿主細胞。
【請求項６】
変異を入れる宿主細胞は、細菌、酵母、動物細胞、または植物細胞である請求項４または５に記載の変異宿主細胞。
【請求項７】
変異を入れる宿主細胞は、細菌または酵母である請求項４または５に記載の変異宿主細胞。
【請求項８】
細菌がバチルス属細菌である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の外来遺伝子を発現させて前記外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する方法であって、
任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、前記組換えベクターの任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位に、所望の外来遺伝子を挿入した組換えベクターを用意する工程、
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主細胞を用意する工程、
前記変異宿主細胞を前記組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程、
前記形質転換体を培養して、前記外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する工程、
を含む前記方法。
【請求項１０】
目的とする組換えベクターを宿主細胞内に安定的に維持させる方法であって、
前記宿主細胞に含まれる、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させるか、または宿主細胞が成育できない程度に低下させて、前記宿主細胞を変異宿主細胞とし、
前記目的とする組換えベクターに、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有させ、
前記変異宿主細胞を、前記のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有させた目的とする組換えベクターで形質転換することを含む、
前記方法。
【請求項１１】
前記組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
変異を入れる宿主細胞は、細菌、酵母、動物細胞、または植物細胞である請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
変異を入れる宿主細胞は、細菌または酵母である請求項９〜１２のいずれかに記載の変異宿主細胞。
【請求項１５】
細菌がバチルス属細菌である請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
外来遺伝子がコードするタンパク質が、酸化還元酵素 、転移酵素、加水分解酵素、加リン酸分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、合成酵素または修飾酵素からなる群から選ばれる１種の酵素である請求項９〜１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来遺伝子を細胞に安定に保持する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、この方法に使用する、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクター、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現させるために用いられる変異宿主細胞、およびアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の外来遺伝子を発現させて前記外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡの技術を実際に適用して、得られた形質転換細胞による目的分子の生産を試みると、一般に形質転換細胞内の染色体外遺伝子（すなわち、これに含有される目的外来遺伝子）の存在が大変不安定であり、目的分子の生産が非常に困難であるという問題が生じる。
【０００３】
実験室で通常用いられるクローニング及び発現ベクターは、通常マルチコピー組換えベクターであり、それらの後代への安定した伝達は１つの細胞ゲノムあたりの多数の組換えベクターにより確保される。しかし、外来遺伝子のこれらの組換えベクターへの導入は、細胞の増殖サイクルの期間に種々の程度の不安定性をもたらす。工業的生産工程では、１０００Ｌの培養物が必要な場合があり、５０世代以上の世代交代後の１０16個以上の細胞が必要となる。従って、細胞中の組換えベクターの存在、ひいては外来遺伝子の発現を確実にするために、醗酵槽内での培養が終了するまで細胞中の組換えベクターを安定化させることが望まれる。
【０００４】
外来遺伝子を有する組換えベクターを細胞中で安定化させる方法は、幾つか知られている。
【０００５】
その１つは、抗生物質耐性遺伝子を組換えベクターに包含させておき、適当な抗生物質を培養培地中に加えることから成る方法である。抗生物質耐性遺伝子含有組換えベクターを保持する細胞は選択され、該組換えベクターを保持しない細胞は選択されず、従って排除される。
【０００６】
抗生物質耐性遺伝子を組み込むことにより組換えベクターを安定化させることは、実験室で通常行なわれているが、下記の如き理由で、工業的スケールの生産では望ましくない。
（ｉ) 抗生物質耐性菌株の使用は、環境に対して危険を呈する可能性がある。
（ｉｉ) 培養中に必要な抗生物質の量は生産コストを有意に増加させる。
（ｉｉｉ）抗生物質の使用は、ヒト及び動物向けに用いられる物質の生産においては回避すべきである。
【０００７】
染色体の栄養要求突然変異を補う方法も、既知の組換えベクター安定化法の一つである（非特許文献１および２）。この方法では発酵培地の組成を厳しく制限して宿主細菌が必要とする栄養を培地に加えずに発酵を行う必要がある。しかも、栄養共生によって、組換えベクターの消失後もなお細胞が増殖し得る可能性がある。
【非特許文献１】Genetics. 1989 May;122(1):19-27. “A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae”
【非特許文献２】Curr Genet. 1989 Sep;16(3):159-63. “A gene transfer system based on the homologous pyrG gene and efficient expression of bacterial genes in Aspergillus oryzae”
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、上記２つの選択方法は培地の特殊な処理に依存している。そのような制約は、発酵工程の費用の増大、および生産性向上のためにとり得る選択自由度の制限を招く。
【０００９】
従って、抗生物質を用いることなく、かつ培地組成に制約されずに組換えＤＮＡクローニングベクターを維持し得る、他の選択方法が強く望まれている。
【００１０】
そこで本発明は、抗生物質を用いることなく、かつ培地組成に制約されずに組換えＤＮＡクローニングベクターを維持し得る新たな手段とこの手段を利用した外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために種々検討を行い、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する染色体外遺伝子と該アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性に欠損を生じさせた染色体変異宿主細胞との相補性に基づくことで、抗生物質を用いることなく、かつ培地組成に制約されずに組換えＤＮＡクローニングベクターを維持し得ることを見いだして、本発明を完成させた。本発明は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する染色体外遺伝子を含有した細胞のみが生存を確保されることに基づく。
【００１２】
本発明は以下のとおりである。
(１)アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつ
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主において用いられる前記組換えベクター。
(２)アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、(１)に記載の組換えベクター。
(３)組換えベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、またはレトロトランスポゾンの形態を有する(１)または(２)に記載の組換えベクター。
(４)アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主細胞であって、
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつ
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターで形質転換して用いられる前記変異宿主細胞。
(５)アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、(４)に記載の変異宿主細胞。
(６)変異を入れる宿主細胞は、細菌、酵母、動物細胞、または植物細胞である(4)または(５)に記載の変異宿主細胞。
(７)変異を入れる宿主細胞は、細菌または酵母である(４)または(５)に記載の変異宿主細胞。
(８)細菌がバチルス属細菌である(７)に記載の方法。
(９)アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の外来遺伝子を発現させて前記外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する方法であって、
任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、前記組換えベクターの任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位に、所望の外来遺伝子を挿入した組換えベクターを用意する工程、
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主細胞を用意する工程、
前記変異宿主細胞を前記組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程、
前記形質転換体を培養して、前記外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する工程、
を含む前記方法。
(１０)目的とする組換えベクターを宿主細胞内に安定的に維持させる方法であって、
前記宿主細胞に含まれる、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させるか、または宿主細胞が成育できない程度に低下させて、前記宿主細胞を変異宿主細胞とし、
前記目的とする組換えベクターに、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有させ、
前記変異宿主細胞を、前記のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有させた目的とする組換えベクターで形質転換することを含む、
前記方法。
(１１)前記組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有する、(１０)に記載の方法。
(１２)アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、(９)〜(１１)のいずれかに記載の方法。
(１３)変異を入れる宿主細胞は、細菌、酵母、動物細胞、または植物細胞である(９)〜(１２)のいずれかに記載の方法。
(１４)変異を入れる宿主細胞は、細菌または酵母である(９)〜(１２)のいずれかに記載の変異宿主細胞。
(１５)細菌がバチルス属細菌である(１５)に記載の方法。
(１６)外来遺伝子がコードするタンパク質が、酸化還元酵素 、転移酵素、加水分解酵素、加リン酸分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、合成酵素または修飾酵素からなる群から選ばれる１種の酵素である（９）〜（１５）のいずれかに記載の方法。。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、抗生物質を用いることなく、かつ培地組成に制約されずに組換えＤＮＡクローニングベクターを維持することができ、その結果、工業的な生産においても、醗酵槽内での培養が終了するまで細胞中の組換えベクターを安定化させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［組換えベクター］
本発明は、（１）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、（２）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつ（３）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主において用いられる、前記組換えベクターに関する。
【００１５】
（１）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクター。
【００１６】
本発明の組換えベクターは、アミノアシルtRNA合成酵素遺伝子をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有する。当該組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子をコードする遺伝子を、所望の宿主細胞内で発現可能な状態で含んでおり、当該宿主細胞を形質転換するために使用される。ゆえに、本発明の組換えベクターは、かかる宿主細胞の形質転換が達成できる形態を有するものであればよく、例えばプラスミド、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンの形態を有するものであってもよい。
【００１７】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、２０種類のアミノ酸に対応するよう、２０数種類（一部は数種類ある）存在し、例えばアラニンに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素はアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅまたはａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）と呼ばれている。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、具体的には、例えば、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である。
【００１８】
トリプトファンに対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素と呼び、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素が欠失している細胞株は、トリプトファンを含むタンパクの合成を行うことができないため増殖することができないことになる。
【００１９】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子は原核生物から真核生物に至るあらゆる生物に含まれる。例えば、大腸菌にはａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１）、ａｒｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２）、ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号３）、ａｓｐａｒｔｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号４）、ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号５）、ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号６）、ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号７）、ｇｌｙｃｉｎｅ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号８）、ｇｌｙｃｉｎｅ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号９）、ｈｉｓｔｉｄｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１０）、ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１１）、ｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１２）、ｌｙｓｉｎｅ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ（配列番号１３）、ｌｙｓｉｎｅ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ（配列番号１４）、ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１５）、ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号１６）、ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号１７）、ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１８）、ｐｒｏｌｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１９）、ｓｅｒｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ａｌｓｏ ｃｈａｒｇｅｓ ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｗｉｔｈ ｓｅｒｉｎｅ（配列番号２０）、ｔｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２１）、ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２２）、ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２３）、ｖａｌｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２４）が含まれている。
【００２０】
枯草菌には、ａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２５）、ａｒｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２６）、ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２７）、ａｓｐａｒｔｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２８）、ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２９）、ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号３０）、ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, ｓｕｂｕｎｉｔ ａ（配列番号３１）、ｇｌｙｃｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号３２）、ｇｌｙｃｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号３３）、ｈｉｓｔｉｄｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｈｉｓＳ（配列番号３４）、ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号３５）、ｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号３６）、ｌｙｓｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ（配列番号３７）、ｈｉｓｔｉｄｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｈｉｓＺ（配列番号３８）、ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号３９）、ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号４０）、ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号４１）、ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｙｔｐＲ （配列番号４２）、ｐｒｏｌｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号４３）、ｓｅｒｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ａｌｓｏ ｃｈａｒｇｅｓ ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｗｉｔｈ ｓｅｒｉｎｅ（配列番号４４）、ｔｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｍａｊｏｒ（配列番号４５）、ｔｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｍｉｎｏｒ（配列番号４６）、ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号４７）、ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｍａｊｏｒ（配列番号４８）、ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｍｉｎｏｒ （配列番号４９）、ｖａｌｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号５０）、ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, ｓｕｂｕｎｉｔ ｂ（配列番号５１）、ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ｓｕｂｕｎｉｔ ｃ（配列番号５２）などが含まれることが知られている。
【００２１】
本発明の組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有するものである。従って、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子以外に、この遺伝子を発現可能な状態とするために、宿主として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌を使用する場合は一般に、例えば、プロモーター、オペレーター領域（プロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合領域（ＳＤ領域）を含む）、開始コドン、生産目的タンパク質をコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域、及びプラスミド複製可能単位などを有する。また、酵母等の真菌細胞または動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、一般に、プロモーター、開始コドン、シグナルペプチド及び生産目的タンパク質をコードするＤＮＡ、及び終止コドンなどを有する。また、本発明の組換えベクターは、必要に応じて、エンハンサーなどのシスエレメント、生産目的タンパク質をコードするＤＮＡの５´側または３´側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、複製可能単位、相同領域、選択マーカーを含むことができる。これらのエレメントは、生産目的タンパク質をコードする遺伝子の発現に用いられる宿主に対応したものであれば、特に制限されず、技術常識に基づいて選択することができる。
【００２２】
なお、選択マーカーとしては、特に制限されず、例えば遺伝子発現に使用される宿主が細菌の場合は、薬剤抵抗性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子、テトラマイシン耐性遺伝子など）、宿主が細菌以外の例えば酵母などの場合は、栄養要求性遺伝子（例えば、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４など）などを始めとする公知の各種選択マーカーを利用することもできる。
【００２３】
（２）本発明の組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有しる。この部位は、後述するように、本発明の宿主細胞を用いて、生産したいタンパク質をコードする外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位である。
【００２４】
「遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る」とは、一般にタンパク質をコードする遺伝子の発現は、その遺伝子の情報がｍＲＮＡに転写されるためのＲＮＡポリメラーゼ認識部位およびｍＲＮＡの情報がペプチドに翻訳されるためのリボゾーム結合領域が該タンパク質をコードする遺伝子の開始コドンの上流に存在する必要がある。要するに、「遺伝子を発現可能な状態で有する」ということは、その遺伝子の開始コドンから終止コドンまでをｍＲＮＡに転写されるために必要な配列が開始コドンより上流に存在し、さらにそのｍＲＮＡの情報がペプチドに翻訳されるための配列が開始コドンより上流に存在するということになる。ここでいう開始コドンとは本来染色体上における該遺伝子の開始コドン配列に限らず、開始コドンとして機能するコドンであれば何れでも良い。またここで言うリボゾーム結合領域とは、例えば原核生物の５´−ａａａｇｇａｇｇ−３´からなるコンセンサス配列を有する配列に集約されることなく、リボゾームが認識できる配列であれば良く、本来染色体上で該遺伝子のリボゾーム結合領域としての配列に限らず、リボゾームが認識できる配列であれば用いることができる。
【００２５】
本発明の組換えベクターの構築は、ＤＮＡ組換えの一般的な方法、例えばMolecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Lab.)に記載される方法に従って行うことができる。
【００２６】
ベクターとしては、プラスミドベクターとして、例えばｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター；ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター；大腸菌由来のプラスミド（たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６またはｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド；ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１Ａ系プラスミド；ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８またはｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミドなど）；枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）；ｐＨＹ３００ＰＬＫなどの大腸菌−枯草菌シャトルベクターを挙げることができる。またファージベクターとして、λファージ（たとえば、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、ψＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしてはＴｙ因子などを挙げることができる。また、融合タンパク質として発現する発現ベクター、例えばｐＧＥＸシリーズ（ファルマシア製）、ｐＭＡＬシリーズ（Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用することもできる。
【００２７】
（３）本発明の組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主において用いられる。この変異宿主については後述する。
【００２８】
［宿主細胞（変異宿主）］
本発明は、（４）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主細胞であって、（５）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつ（６）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターで形質転換して用いられる変異宿主細胞に関する。
【００２９】
（４）本発明の変異宿主細胞は、変異前の宿主細胞として、例えば、大腸菌や枯草菌などの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ｓｆ９やｓｆ２１などの昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細胞、タバコなどの植物細胞を挙げることができる。好ましくは、大腸菌や枯草菌などの細菌、及び酵母である。
【００３０】
一般に、細胞は、自己の増殖のためにアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を有している。それに対して、本発明では、細胞が本来有している、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させるか、あるいはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させる。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損または該遺伝子発現の低下は、以下の方法で行うことができる。
【００３１】
[遺伝子欠損（不活性化）]
不活性化の語は染色体遺伝子のうち１以上の機能発現を妨げる方法を含んでいる。不活性化は核酸遺伝子配列における欠失、置換（例えば変異）、阻害、及び／または挿入などによって行われる。いくつかの実施態様において、変異微生物は好ましくは安定かつ不可逆的な不活性化を生じる１以上の遺伝子の不活性化を含む。
【００３２】
（挿入による不活性化）
ここで用いる“挿入配列”の語は微生物染色体内に導入されたＤＮＡ配列を言う。いくつかの実施態様において、挿入配列は形質転換される細胞のゲノム中に既に存在する、または存在しない配列であってもよい（すなわち、相同または異種配列である）。さらに別の実施態様において、挿入配列は選択マーカーを含むことがある。さらなる実施態様において、挿入配列は２つの相同ボックスを含むことがある。
【００３３】
ここで用いる“相同ボックス”とは微生物染色体の配列と相同な核酸配列をいう。より具体的には、相同ボックスは、本発明に従って不活性化される遺伝子に隣接するコード領域または遺伝子の一部と約８０〜１００％配列同一性、約９０〜１００％配列同一性または約９５％〜１００％配列同一性を有する上流または下流領域をいう。これらの配列は微生物染色体の一部が置換されることを目的とする。本発明を限定するものではないが、相同ボックスは約１塩基対（ｂｐ）〜２００キロ塩基（ｋｂ）を含む。好ましくは、相同ボックスは約１ｂｐ〜１０．０ｋｂ；１ｂｐ〜５．０ｋｂ；１ｂｐ〜２．５ｋｂ；１ｂｐ〜１．０ｋｂ及び０．２５ｋｂ〜２．５ｋｂを含む。また、相同ボックスは約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂを含む。いくつかの実施態様において、選択マーカーの５´及び３´末端は相同ボックスに隣接し、ここで相同ボックスは当該遺伝子のコード領域にすぐ隣接した核酸配列を含む。
【００３４】
ここで用いる“選択マーカー”の語は宿主細胞において発現できるヌクレオチド配列をいい、選択マーカーの発現により対応する選択因子の存在下、または必須栄養素の不存在下で発現遺伝子を含む細胞は成長できるようになる。ここで用いる“選択可能マーカー”及び“選択マーカー”の語は宿主細胞中で発現できる核酸（例えば遺伝子）を言い、ベクターを含むこれら宿主の選択が簡単にできるようにする。当該選択マーカーの例としては、限定されないが、抗微生物剤などがある。従って、“選択マーカー”とは、宿主細胞が目的の挿入ＤＮＡを取り込んだ、またはその他の反応が起こった印を与える遺伝子をいう。通常、選択マーカーは、形質転換時に外来配列を受け取らなかった細胞と外来ＤＮＡを含む細胞との区別を可能にするために宿主細胞に抗菌耐性または代謝利点を与える遺伝子をいう。選択マーカー抗微生物耐性マーカーなどが挙げられる（例えば、ａｍｐＲ；ｐｈｌｅｏＲ；ｓｐｅｃＲ；ｋａｎＲ；ｅｒｙＲ；ｔｅｔＲ；ｃｍｐＲ；及びｎｅｏＲ；例えばＧｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙ，Ｇｅｎｅ，１６７：３３５−３３７［１９９５］；Ｐａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ ２４７：２５５−２６４［２０００］；及びＴｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、２３：３３１−３４１［１９８３］を参照）。いくつかの特に好ましい実施態様において、本発明はクロラムフェニコール耐性遺伝子を提供する（例えば、ｐＣ１９４上に存在する遺伝子、及びバチルス・リケニフォルミスゲノム中に存在する耐性遺伝子）。この耐性遺伝子は本発明及び染色体上統合されたカセット及び統合プラスミドの染色体増幅に関する実施態様において特に有用である。
【００３５】
例えば、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子（ｔｒｐＳ）が不活性化される遺伝子である場合、ＤＮＡ構築体は選択マーカーを挿入配列として含みその活性を阻害されるtrpS遺伝子を有する。選択マーカーはｔｒｐＳコード配列部分の内側に挿入する。ＤＮＡ構築体は宿主染色体中のｔｒｐＳ遺伝子に本質的に同一配列を有し、二重交差の場合、ｔｒｐＳ遺伝子は選択マーカーの挿入により不活性化される。
【００３６】
（欠失による不活性化）
いくつかの好ましい実施態様において、不活性化は欠失により達成される。いくつかの好ましい実施態様において、遺伝子は相同組換えにより欠失する。例えば、いくつかの実施態様において、欠失する遺伝子がｔｒｐＳの場合、相同ボックスの両側に隣接する選択マーカーを有する挿入配列を含むＤＮＡ構築体を用いる。相同ボックスは染色体ｔｒｐＳ遺伝子の核酸フランキング領域に相同なヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ構築体は微生物宿主染色体の相同配列と一致し、二重交差の場合、ｔｒｐＳ遺伝子は宿主染色体から切除される。
【００３７】
ここで用いる遺伝子の“欠失”の語は、コード配列全体の欠失、コード配列の一部の欠失、またはフランキング領域を含むコード配列の欠失をいう。欠失は染色体に残った配列が欠失前の生物活性を発揮しないのであれば部分的であってもよい。コード配列のフランキング領域は約１ｂｐ〜約５００ｂｐを５´及び３´末端に含むことができる。フランキング領域は５００ｂｐよりも大きくてもよいが、好ましくは本発明に従って不活性化または欠失され得るその他の遺伝子を当該領域に含まない。最終的には、欠失遺伝子は事実上、非機能的である。簡単に言えば、“欠失”の語は１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基がそれぞれ除去された（すなわち、存在しない）、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化として定義される。
【００３８】
ここで用いる“フランキング配列”とは対象の配列の上流または下流にある配列をいう（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃは、遺伝子ＢはＡ及びＣ遺伝子配列にフランキング（側面に位置）している）。好ましい実施態様において、挿入配列は相同ボックスの両側の側面に位置する。いくつかの実施態様において、フランキング配列は一方の側（３´または５´）にのみ存在するが、好ましい実施態様において、配列の両側の側面に位置する。各相同ボックスの配列は微生物染色体中の配列に相同である。これらの配列は微生物染色体に新しい構築体が統合されること、及び微生物染色体の一部が挿入配列により置換されることを目的とする。好ましい実施態様において、選択マーカーの５´及び３´末端は不活性化染色体断片の一部を含むポリヌクレオチド配列の側面に位置する。
【００３９】
（変異による不活性化）
別の実施態様において、不活性化は遺伝子の変異により生じる。遺伝子を変異する方法はさまざまな方法があり、限定されないが、部位特異的変異、ランダム変異発生、及びｇａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｅｘ法が挙げられる（例えばＭｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：６４６［１９８４］；及びＫｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：９４４１［１９８４］を参照）。
【００４０】
好ましい実施態様において、変異は少なくとも染色体上の１つのコドンにおいて突然変異誘発を用いて生じる。さらなる実施態様において、変異ＤＮＡ配列は野生型配列と４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の相同性を有する。別の実施態様において、変異ＤＮＡは公知の変異誘発手順、例えば、UV照射、ニトロソグアニジン等の化学変異剤を用いてｉｎ ｖｉｖｏで生じる。
【００４１】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性に欠損を生じさせる染色体変異の内でも、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子自体の欠損を用いることが望ましい。しかしアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素生合成を調節する他の遺伝子も、対応する遺伝子を保有する染色体外遺伝子を用いる限り使用できる。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の欠損株の場合、染色体外遺伝子に挿入されるべき遺伝子は該当するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子が相応しい。
【００４２】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を有する染色体外遺伝子と染色体の変異されたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子との間の相同性組換えの可能性を回避するためには、目的のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を染色体から実質的に欠失させることが望ましい。
【００４３】
（５）および（６）の組換えベクターは、上述の（１）および（２）の組換えベクターと同様のものである。
【００４４】
[機能]
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主細胞は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子が発現できないため、そのままでは、もはや増殖できない。
【００４５】
それに対して、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターを含むことで、増殖を維持できる。即ち、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の欠失は、染色体外遺伝子上に該アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を導入することにより相補することができる。しかし、もしも細胞が該染色体外遺伝子を失うと、該細胞はもはや増殖できなくなる。
【００４６】
従って、本発明の変異宿主細胞は、上記関係の下に、培地に抗生物質を含めることなく、または特定の栄養要求性を満たす栄養分を排除または制限することなく外来遺伝子を挿入した組換えベクターを安定して宿主細胞に維持することができる。そのため、本発明の変異宿主細胞は、工業的スケールの生産に使用される任意の培地に適用できるという利点を有する。
【００４７】
さらに、本発明の変異宿主細胞は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現させるために用いられる。本発明の宿主細胞は、上記変異宿主に前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターを含むものであり、さらに、この組換えベクターは、外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、この部位に所望の外来遺伝子を挿入することで、所望の外来遺伝子を挿入した組換えベクターを安定して宿主細胞に維持することができる。そして、外来遺伝子を発現させて、外来遺伝子でコードされる所望のタンパク質の生産に用いることができる。
【００４８】
［タンパク質またはペプチドを調製する方法］
本発明は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の外来遺伝子を発現させて前記外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する方法に関する。この方法は、以下の工程を含む。
（１０）任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、前記組換えベクターの任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位に、所望の外来遺伝子を挿入した組換えベクターを用意する工程、
（１１）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主細胞を用意する工程、
（１２）前記変異宿主細胞を前記組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程、
（１３）前記形質転換体を培養して、前記外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する工程。
【００４９】
（１０）組換えベクターを用意する工程
この工程では、任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有し、かつアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、前記組換えベクターの任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位に、所望の外来遺伝子を挿入した組換えベクターを用意する。前記組換えベクターは、先に説明した本願発明の組換えベクターである。本発明の製造方法では、この組換えベクターの任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位に、所望の外来遺伝子を挿入した組換えベクターを用意する。具体的には、適当なベクターにアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子、および所望の外来遺伝子を挿入する。遺伝子の挿入は常法によって行うことができる。いずれの遺伝子も、発現可能な状態で挿入する。
【００５０】
「２つの遺伝子の挿入についての一般的な説明」
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子および任意の外来遺伝子の組換えベクターへの挿入は、ＤＮＡ組換えの一般的な方法、例えばMolecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Lab.)に記載される方法に従って行うことができる。各々の遺伝子の組換えベクターへの挿入位置は組換えベクターの複製に関与していない場所であれば基本的にはどこでも良く、使用するベクターによって挿入位置は異なる。例えば使用できる組換えベクターベクターは大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６またはｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド；ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１Ａ系プラスミド；ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８またはｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミドなど）；枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）；ｐＨＹ３００ＰＬＫなどの大腸菌−枯草菌シャトルベクターを挙げることができる。
【００５１】
例えば大腸菌-枯草菌のシャトルベクターであるｐＨＹ３００ＰＬＫプラスミドを例に取れば、マルチクローニング部位であるＥｃｏＲＩ 部位にアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を、同じくマルチクローニング部位ＢａｍＨＩ部位に任意の外来遺伝子を挿入することなどが可能である。以下に少し詳しく本例を説明する。
【００５２】
任意の外来遺伝子を有する生物の染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅を用いてプロモーター部位から終止コドンまでを含む該任意の外来遺伝子を増幅し、これをｐＨＹ３００ＰＬＫを制限酵素ＢａｍＨＩで消化することによって得られたＤＮＡ 断片とライゲーション反応を行い、得られたライゲーション反応混合物を用いて大腸菌を形質転換してｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ部位に目的の通りプロモーター部位から終止コドンまでを含む任意の外来遺伝子が挿入されているプラスミドを含む形質転換体を選択し、この形質転換体からプラスミドを調製する。続いて上記の通り調製できたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、本プラスミドを切断する。枯草菌１６８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８）株の染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅を用いてプロモーター部位から終止コドンまでを含むアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を増幅し、ＥｃｏＲＩで切断された構築済みプラスミド由来ＤＮＡ断片とライゲーション反応を行い、得られたライゲーション反応混合物を用いて大腸菌を形質転換して構築済みプラスミドのＥｃｏＲＩ部位に目的の通りアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子が挿入されているプラスミドを含む形質転換体を選択し、この形質転換体から目的プラスミドを調製することができる。
【００５３】
（１１）変異宿主細胞を用意する工程
この工程では、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主細胞を用意する。この変異宿主細胞は、前記で説明した本発明の変異宿主細胞である。その調製方法は、以下のとおりである。
【００５４】
変異宿主細胞の調製の手順としては、宿主染色体上に存在する標的遺伝子を計画的に削除又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の削除又は不活性化変異を与え、その後適当な方法により遺伝子解析またはタンパク質生産性の評価を行う方法が挙げられる。
【００５５】
標的とする遺伝子を削除又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドまたは直鎖上のＤＮＡ 断片を宿主細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等による不活性化変異を導入した標的遺伝子、又は標的遺伝子の外側領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側２ヶ所、又は標的遺伝子外側の２ヶ所の領域で２ 回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を削除或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。
【００５６】
（１２）形質転換体を得る工程
工程（１０）で調製した組換えベクターを用いて、工程（１１）で調製した変異宿主細胞を形質転換する。組換えベクターによる宿主細胞の形質転換も常法により実施できる。
【００５７】
組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）方法は、特に制限されず、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、コンピテント細胞法、エレクトロポレーションなど、導入する宿主細胞の種類や組換えベクターの形態に応じて、適宜選択することができる。
【００５８】
ここで用いる、“宿主細胞” とは新しく導入するＤＮＡ配列のための宿主または発現媒体として作用する能力を有する細胞をいう。
【００５９】
なお、組換えベクターの宿主細胞内での存在様式は、特に制限されず、染色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込まれてもよいし、またプラスミド状態で存在していてもよい。
【００６０】
尚、組換えベクターに含まれるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子は、変異宿主細胞において、欠損させられたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子、または宿主細胞が成育できない程度に発現を低下させられたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子と同種の遺伝子である。例えば、変異宿主細胞において、欠損させられたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子、または宿主細胞が成育できない程度に発現を低下させられたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子が、アラニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子である場合、組換えベクターに含まれるのもアラニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子である。
【００６１】
（１３）タンパク質またはペプチドを調製する工程
工程（１２）で得られる形質転換体を培養して、外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを調製する。形質転換体の培養は、宿主細胞の種類に応じて、適切な培地を用い、適切な培養条件の下で実施される。宿主細胞としては、外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドの生産が可能なものであればよく、野生型のものでも変異を施したものでものよい。具体的には、枯草菌などのバチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)属細菌や、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｈｉａ）属細菌、クロストリジウム(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質と菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌が好ましい。
【００６２】
本明細書でいう「バチルス属」とは、通常知られるバチルス属に含まれるすべての種類を含み限定されないが、たとえば、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ)、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ)、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ)、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ)、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ)、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ)、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ)、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ)、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ)などを意味する。なお、バチルス属は分類上再編成を受け続けており、当該属は再分類された種も含むものとする。たとえば、ジオバチルス(Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属、アルカリバチルス（Ａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属 、アミロバチルス（Ａｍｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属 、ゴリバチルス（Ｇｏｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラシバチルス（Ｃｅｒａｓｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ハロバチルス（Ｈａｌｏｌａｃｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ハロアルカリバチルス（Ｈａｌａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ジョーガリバチルス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オーシャノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、マリニバチルス（Ｍａｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、レンチバチルス（Ｌｅｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ウレーバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サリニバチルス（Ｓａｌｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ポンチバチルス（Ｐｏｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ピシバチルス（Ｐｉｓｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パラリオバチルス（Ｐａｒａｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ヴァージバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サルシューギニバチルス(Ｓａｌｓｕｇｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ)属、テニューイバチルス(Ｔｅｎｕｉｂａｃｉｌｌｕｓ)属、タラソバチルス(Ｔｈａｌａｓｓｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属、サームアルカリバチルス(Ｔｈｅｒｍａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ)属、チューメバチルス(Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ)属などがあり、これらもまた本明細書にいうバチルス属に含まれるものとする。
【００６３】
例えば、宿主細胞が枯草菌の場合、培養に用いる培地の種類としては、適当な窒素源、炭素源、ミネラルを含み、本発明の枯草菌宿主が生育し、目的タンパク質を生産することができるものであればよい。例えば、組換え枯草菌１６８株によって、外来遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドを生産する場合、炭素源として、ぶどう糖や果糖等の単糖類、しょ糖、麦芽糖等の二糖類又は可溶性澱粉等の多糖類等を配合した培地や、窒素源として、ペプトン類、大豆エキス、酵母エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、金属塩等を配合した培地等を用いることができる。
【００６４】
また、培地のｐＨは、用いる組換え生物体が生育し得る範囲のｐＨであれば良いが、例えば枯草菌の場合ｐＨ６．０〜８．０に調整するのが好適であり、培養条件は、１５〜４２℃、好ましくは２８〜３７℃で２〜７日間振盪または、通気撹拌培養すればよい。
【００６５】
上記培養後に目的タンパク質またはペプチドを回収する。目的タンパク質又はポリペプチドの回収方法は、常法により行うことができる。回収した目的タンパク質又はポリペプチドは、さらに必要により、常法によって精製することもできる。
【００６６】
本発明の製造方法によって生産される目的タンパク質又またはペプチドとしては、例えば食品用、医薬品用、化粧品用、洗浄剤用、繊維処理用、医療検査薬用等として有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられる。
【００６７】
目的タンパク質またはペプチド遺伝子は特に限定されず、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 ( O x i d o r e d u c t a s e ) 、転移酵素 ( T r a n s f e r a s e ) 、加水分解酵素 ( H y d r o l a s e ) 、加リン酸分解酵素（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、脱離酵素 ( L y a s e )、異性化酵素 ( I s o m e r a s e ) 、合成酵素 (L i g a s e / S y n t h e t a s e ) 、修飾酵素（Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）等が含まれる。さらに具体的にはセルラーゼ、寒天分解酵素、γ−サイクロデキストリン合成酵素等の糖質分解酵素の遺伝子などが挙げられる。
【００６８】
［組換えベクターを宿主細胞内に安定的に維持させる方法］
本発明は、目的とする組換えベクターを宿主細胞内に安定的に維持させる方法に関する。この方法は、以下の（２０）〜（２２）を含む
（２０）前記宿主細胞に含まれる、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させるか、または宿主細胞が成育できない程度に低下させて、前記宿主細胞を変異宿主細胞とし、
（２１）前記目的とする組換えベクターに、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有させ、
（２２）前記変異宿主細胞を、前記のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有させた目的とする組換えベクターで形質転換することを含む。
【００６９】
（２０）宿主細胞を変異宿主細胞とする方法は、前記変異宿主細胞の説明で記載したおりである。
【００７０】
（２１）組換えベクターにアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有させることについても、本発明の組換えベクターの説明で記載したおりである。前記組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子以外の任意の外来遺伝子を発現可能な状態で挿入し得る部位を有するものであることも前述のとおりである。
【００７１】
（２２）変異宿主細胞の形質転換についても、上記タンパク質またはペプチドを調製する方法の説明で記載したとおりである。
【００７２】
本発明は、目的とする組換えベクターを宿主細胞内に安定的に維持させる方法を含み、この方法では、宿主細胞として上記本発明の変異宿主細胞を用いる。本発明のこの方法は、上述のような細胞に含まれる染色体外遺伝子を安定化させる方法であって、例えば、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に欠陥を生じさせる染色体変異が該アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の少なくとも一部の欠失であり、染色体外遺伝子が該アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子である。
【００７３】
本発明によれば、例えば抗生物質による選択圧あるいは特定のアミノ酸を含有しないよう制限を加えた培地を必要とせずに、染色体外遺伝子が完全培地中で安定である形質転換細胞株が得られる。更に、本発明に記載の方法によれば染色体外遺伝子を失ってしまった細胞は増殖することができない。従って、本発明は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子及び産業上有用な蛋白質の発現を確実にする要素を持つ染色体外遺伝子により形質転換された細胞に関するものでもある。又、本発明は、形質転換細胞を用いて産業上有用な蛋白質を製造する方法であって、本発明の染色体外遺伝子により形質転換された細胞を完全培地中で培養することを特徴とする方法にも関する。該染色体外遺伝子は、更に該蛋白質の遺伝子を保有し得る。
【００７４】
ここで用いる、“蛋白質遺伝子” の語はぺプチド鎖の生成に関するＤＮＡの染色体断片を意味し、タンパク質をコードする領域に先行または後に続く領域を含んでも含まなくてもよい。
【００７５】
下記実施例は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の内の一つである、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に欠陥を有する枯草菌中でのトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を有するプラスミドの安定性を、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に欠陥を有していない枯草菌中での同プラスミドの安定性と比較して示すものである。またさらに、前述のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の内の一つである、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に欠陥を有する枯草菌中でのトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を有するプラスミドの安定性を、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に欠陥を有していない枯草菌中で、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を有しない同種プラスミドの安定性と比較して示すものである。
【００７６】
更に、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有するこれら組換えベクターは、同ベクターに同乗したセルラーゼ、寒天分解酵素をコードする遺伝子などを発現するために用いることもできた例を示すものである。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００７８】
［実施例１］枯草菌株へのトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を有する染色体外遺伝子の導入
トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する染色体外遺伝子であるプラスミドｐＤＡＴＳ１４を以下の方法で構築した。まず、汎用枯草菌−大腸菌のシャトルプラスミドであるｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト社製）を鋳型として、プライマーＡとＢを用いてＰＣＲによる増幅を行った。得られた増幅断片を制限酵素ＸｈｏＩで消化した後、両末端を連結することにより環状プラスミドとした。本プラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製しｐＤＡ２とした。一方、枯草菌株ＩＳＷ１２１４株の染色体を鋳型とし、プライマーＣとＤを用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含むＤＮＡ断片を得た。本DNA断片を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＸｈｏＩで消化したｐＤＡ２と連結した。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＤＡＴＳ１４と命名した。次にｐＤＡＴＳ１４を用いて、２種のプロテアーゼ（アルカリプロテアーゼＥ、中性プロテアーゼＥ）に欠陥を有する枯草菌ＩＳＷ１２１４株由来変異株（参考文献  Appl.Microbiol. Biotechnol 65:583-592 (2004)Hatada,Y.ら）を、プロトプラスト形質転換法（参考文献Mol. Gen. Genet. 168:111-115 （1979） Chang, S.とCohen, S. N.）により形質転換し、染色体外にトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する枯草菌形質転換体を得た。
【００７９】
［実施例２］枯草菌株染色体上のトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を破壊するためのDNA断片の構築
枯草菌株ＩＳＷ１２１４株の染色体を鋳型とし、プライマーＥとＦを用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含む約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化した。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで予め消化した汎用性プラスミドｐＵＣ１８に連結し、プラスミドｐＴＳＡＦを得た。一方、汎用性プラスミドであるｐＣ１９４を鋳型として、プライマーＧとＨを用いてスタフィロコッカス由来クロラムフェニコール耐性遺伝子とその近傍領域を含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。さらに、ｐＴＳＡＦを鋳型としてプライマーＩとＪを用いてＰＣＲ反応を行いＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片とクロラムフェニコール耐性遺伝子とその近傍領域を含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化した後連結し、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製し、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドｐＩＮＴＴＳとした。ｐＩＮＴＴＳを鋳型としてプライマーＫとＬを用いてＰＣＲ反応を行い直鎖状のトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を得た。
【００８０】
［実施例３］枯草菌株染色体上のトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の破壊
上記トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を用いて、コンペテントセル法を用いて上記染色体外トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する形質転換体をさらに形質転換し、クロラムフェニコール耐性を獲得した形質転換体を得た。本形質転換体から染色体ＤＮＡを調製した。本染色体ＤＮＡに対して、プライマーＭとＮ、あるいはＯとＰを用いてＰＣＲ反応を行い、染色体のトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子がコードされていた領域がトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子破壊用ＤＮＡ断片由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されていることを確認し、本菌株をトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子欠損株であるＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳ１４）株とした。
【００８１】
［実施例４］ＤＴＳ１４５１株へのカナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドの導入
枯草菌株ＩＳＷ１２１４株の染色体を鋳型とし、プライマーＣとＤを用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含むＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＸｈｏＩで消化したｐＤＡ２と連結した。これを用いて、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＤＡＴＳ１３と命名した。汎用性プラスミドｐＵＢ１１０を鋳型とし、プライマーＱとＲを用いてカナマイシン耐性遺伝子とその近傍の領域を含むＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＤＡＴＳ１４を鋳型としてプライマーＳとＴを用いてＰＣＲで増幅して、さらにＥｃｏＲＩで消化することにより得られたＤＮＡ断片と連結した。これを用いて、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性を有する形質転換体からプラスミドを調製し、プラスミドをｐＤＡＴＳＫと命名した。ｐＤＡＴＳＫを用いてｐＤＡＴＳ１４を有するＤＴＳ１４５１株をプロトプラスト形質転換法を用いて形質転換し、カナマイシン  ３０μｇ／ｍＬを含む再生培地（組成：コハク酸ナトリウム  ８％、寒天  １％、カザミノ酸  ０．５％、酵母エキス  ０．５％、リン酸２水素カリウム  ０．１５％、リン酸水素２カリウム  ０．３５％、グルコース  ０．５％、硫酸マグネシウム  ０．４％、牛血清アルブミン  ０．０１％、メチオニン  ０．００１％  ロイシン  ０．００１％）による選抜を行った。得られた形質転換体をカナマイシン入りＬＢ寒天培地およびテトラサイクリン  ７．５μｇ／ｍＬを含む再生培地に植菌し、カナマイシン耐性かつテトラサイクリン感受性となった株をＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳＫ）と命名した。
【００８２】
［実施例５］ＤＴＳ１４５１株におけるセルラーゼの生産
セルラーゼ生産菌であるバシラス・アキバイ１１３９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｋｉｂａｉ１１３９）株（ＪＣＭ ９１５７Ｔ） （J. Gen. Microbiol. 1986, 132, 2329-2335. Fukumoriら、Int J Syst Evol Microbiol. （2005）55:2309-15. Nogi, Y.ら）の染色体を鋳型として、プライマーＵとＶを用いてＰＣＲ反応を行い、セルラーゼとその近傍領域を含むＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片およびｐＤＡＴＳ１３を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、両者を連結し、プラスミドｐＤＡＴＳＣ１を得た。本プラスミドを用いてＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳＫ）を形質転換し、テトラサイクリン入り再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体をカナマイシン入りＬＢ寒天培地およびテトラサイクリン  ７．５μｇ／ｍＬを含む再生培地に植菌し、セルラーゼ活性を示し、さらにカナマイシン感受性かつテトラサイクリン耐性となった株をＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳＣ１）と命名した。ＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳＣ１）をＰＰＳ培地（ポリペプトンＳ  ３％、魚肉エキス  ０．５％、酵母エキス  ０．０５％、リン酸２水素カリウム  ０．１％、マルトース  ４％、硫酸マグネシウム  ０．０２％、塩化カルシウム  ０．０５％）中（抗生物質を含有しない）で３０℃、７２時間、１３０ｒｐｍにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれるセルラーゼ活性を測定した。その結果、培養液１Ｌあたり約１ｇのセルラーゼの大量生産が確認できた。
【００８３】
［実施例６］ＤＴＳ１４５１株におけるプラスミドｐＤＡＴＳＣ１の保持
ｐＤＡＴＳＣ１を保有するＤＴＳ１４５１株をテトラサイクリン  ７．５μｇ／ｍＬ添加または無添加のＬＢ培地（ポリペプトン  １％、酵母エキス  ０．５％、塩化ナトリウム  １％）に植菌し、３０℃で２４時間１３０ｒｐｍにて撹拌培養した。その培養液  １０μLを採取し、別のＬＢ培地１００ｍＬに植え継いた。さらに２４時間培養を行い、その培養液１０μLを採取し、別のＬＢ培地１００ｍＬに植え継ぎ、同様に２４時間培養した。その後、培養細胞からプラスミドの回収操作を行った。その結果、ｐＤＡＴＳＣ１を保有するＤＴＳ１４５１株においては、テトラサイクリン添加または無添加に関わらず、培養液あたりのプラスミド含量に変化は見られなかった。一方、ｐＤＡＴＳＣ１を保有する、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子に欠損の無い枯草菌ＩＳＷ１２１４株変異株においては、テトラサイクリン添加の場合には、培養液あたりのプラスミド含量は維持されていたが、テトラサイクリン無添加の場合には、プラスミド含量の極度な低下が観察された。さらに、ｐＤＡＴＳＣ１が保有するセルラーゼ遺伝子をｐＤＡ２のＢａｍＨＩ 認識部位に挿入したプラスミドｐＤＡＣ１を作成し、同様の試験を行なったところ、ｐＤＡＣ１を保有する枯草菌ＩＳＷ１２１４株変異株においては、テトラサイクリン添加の場合には、培養液あたりのプラスミド含量は維持されていたが、無添加の場合には、プラスミド含量の極度の低下が観察された。図１にこれらの結果を判りやすくするために、抗生物質無添加の培地で培養した各細胞から回収操作したプラスミド溶液の電気泳動結果を示す。電気泳動操作後のアガロースゲルをエチジウムブロマイドに浸し、ＤＮＡを染色した。図１のレーン１はプラスミド上にアミノアシルtRNA合成酵素遺伝子含有、染色体上の該アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子欠損宿主の形質転換の組み合わせ、レーン２はプラスミド上にアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子含有、染色体上の該アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子非欠損宿主の形質転換の組み合わせ、レーン３はプラスミド上にアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子含有せず、染色体上の該アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子非欠損宿主の形質転換の組み合わせである。
【００８４】
［実施例７］ＤＴＳ１４５１株における寒天分解酵素の生産
寒天分解酵素生産菌であるＭｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４株(Biosci Biotechnol Biochem. (2004) 68:1073-81.Ohta, Y.ら)の染色体を鋳型として、プライマーＷ、Ｘを用いてＰＣＲ反応を行い、寒天分解酵素をコードするＤＮＡ断片を得た。一方、前述のｐＤＡＴＳＣ１を鋳型として、プライマーＹ、Ｚを用いてＰＣＲ反応を行ない、得られたＤＮＡ断片の５´末端をリン酸化した後、寒天分解酵素をコードするＤＮＡ断片と連結した。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、得られた形質転換体のうち、寒天分解活性を有する形質転換体から調製したプラスミドをｐＤＡＴＳＡ１と命名した。本プラスミドを用いてＤＴＳ１４５１(ｐＤＡＴＳＫ)を形質転換し、テトラサイクリン  ７．５μｇ／ｍＬ再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体をカナマイシン入りＬＢ寒天培地およびテトラサイクリン７．５μｇ／ｍＬを含む再生培地に植菌し、寒天分解酵素活性を示し、さらにカナマイシン感受性かつテトラサイクリン耐性を示した株をＤＴＳ１４５１(ｐＤＡＴＳＡ１)と命名した。ＤＴＳ１４５１(ｐＤＡＴＳＡ１)をＰＰＳ培地中(抗生物質を含有しない)で３０℃、７２時間、１３０ｒｐｍにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれる寒天分解酵素活性を測定した。その結果、培養液１Ｌあたり約０．１ｇの寒天分解酵素の生産が確認できた。次に、ｐＤＡＴＳＡ１を鋳型に用いてプライマーＡ１（配列番号７９）、プライマーＢ１（配列番号８０）を用いてＰＣＲ反応を行ない、得られたＤＮＡ断片をＸｈｏＩで消化した後、ライゲーション反応にて閉環状化した。この操作で一旦トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を排除したプラスミドになった。本プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておき、一方、ｐＤＡＴＳＣ１を鋳型とし、プライマーＣ１（配列番号８１）とＤ１（配列番号８２）、プライマーＥ１（配列番号８３）とＦ１（配列番号８４）、プライマーＧ１（配列番号８５）とＨ１（配列番号８６）の各々の組み合わせを用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。各々のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで消化しておいた上記プラスミドと連結した。これらを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、得られた形質転換体のうち、寒天分解活性を有する形質転換体から調製したプラスミドをｐＤＡＴＳＡ２、ｐＤＡＴＳＡ３、ｐＤＡＴＳＡ４と命名した。ｐＤＡＴＳＡ２、ｐＤＡＴＳＡ３、ｐＤＡＴＳＡ４の塩基配列確認を行った結果、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその周辺部分は各々配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９に示した配列であった。続いて、これらのプラスミドを用いてＤＴＳ１４５１(ｐＤＡＴＳＫ)を形質転換し、テトラサイクリン  ７．５μｇ／ｍＬ再生培地による選抜を行った。形質転換体をカナマイシン入りＬＢ寒天培地およびテトラサイクリン  ７．５μｇ／ｍＬを含む再生培地に植菌し、寒天分解酵素活性を示し、さらにカナマイシン感受性かつテトラサイクリン耐性を示した株を選択した。得られたＤＴＳ１４５１(ｐＤＡＴＳＡ２)、ＤＴＳ１４５１(ｐＤＡＴＳＡ３)、ＤＴＳ１４５１(ｐＤＡＴＳＡ４)をＰＰＳ培地中(抗生物質を含有しな���)で３０℃、７２時間、１３０ｒｐｍにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれる寒天分解酵素活性を測定した。その結果、三者とも培養液１Ｌあたり約０．１ｇの寒天分解酵素の生産が確認できた。
【００８５】
【表１】
2009017840.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明は、細菌等の宿主細胞を形質転換することで得られた形質転換体を培養して、種々のタンパク質やペプチドを製造する分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】プラスミド回収溶液電気泳動結果
【図１】
2009017840.tif 000003
【配列表】
2009017840000001.app