(57)【要約】【課題】  生細胞内のウイルス増殖を、その生細胞を破壊することなく、リアルタイムに検出し得るウイルス検出方法を提供する。【解決手段】  ウイルスゲノム中に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドを蛍光検出することにより、生細胞内のウイルスを検出する方法であって、前記蛍光標識ヌクレオチドは、少なくとも、光吸収により得た励起エネルギーを他の蛍光色素に与える励起対象蛍光色素と、他の蛍光色素から励起エネルギーを受け取って発光する検出対象蛍光色素と、を有する複数の蛍光色素群によって標識されていることを特徴とするウイルス検出方法。【選択図】図４
2009039065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノム中に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドを蛍光検出することにより、生細胞内のウイルスを検出する方法であって、
前記蛍光標識ヌクレオチドは、少なくとも、光吸収により得た励起エネルギーを他の蛍光色素に与える励起対象蛍光色素と、他の蛍光色素から励起エネルギーを受け取って発光する検出対象蛍光色素と、を有する複数の蛍光色素群によって標識されていることを特徴とするウイルス検出方法。
【請求項２】
前記蛍光色素群において、励起対象蛍光色素と、検出対象蛍光色素と、が異なることを特徴とする請求項１記載のウイルス検出方法。
【請求項３】
（１）前記蛍光標識ヌクレオチドを前記生細胞内へ導入する工程と、
（２）該生細胞にウイルスを感染させる工程と、
（３）該生細胞内において複製されるウイルスゲノム中に前記蛍光色素を取り込ませる工程と、
を含み、
前記（１）の工程において、前記検出対象蛍光色素から検出される蛍光強度（Ａ）と、
前記（３）の工程において、前記検出対象蛍光色素から検出される蛍光強度（Ｂ）と、
の差分（（Ｂ）−（Ａ））に基づいて、前記生細胞内におけるウイルス複製量を測定することを特徴とする請求項２記載のウイルス検出方法。
【請求項４】
前記励起対象蛍光色素としてＣｙ５を、前記検出対象蛍光色素としてＣｙ５．５を用いることを特徴とする請求項２記載のウイルス検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルスの検出方法に関する。より詳しくは、ウイルスゲノム中に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドを蛍光検出することにより、生細胞内のウイルスを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、ヒトや動植物などの病気の原因となるものであり、ウイルスを検出する技術は、さまざまな分野の研究開発などにおいて重要な一端を担っている。例えば、特定の疾患の診断、創薬、食品などの衛生面の管理、環境汚染の浄化・修復などあらゆる分野において、検出技術の開発が進んでいる。
【０００３】
その中で、生細胞内におけるウイルス増殖性を評価する方法として、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓｅｙ）法や、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などが一般的に用いられている。
【０００４】
ＥＬＩＳＡ法は、細胞中のウイルス抗原を、酵素などで標識した抗体（標識抗体）を用い、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法である。具体的には、まず、測定対象となるウイルス抗原に対する抗体を予め結合させた固相にウイルス感染させた細胞を溶解したものを添加し、細胞内のウイルス抗原を固相に結合させる。ここに標識抗体を添加すると、固相に結合したウイルス抗原に前記標識抗体が結合し、「固相化抗体／目的物質／標識抗体」のサンドイッチ構造が構築される。この状態において前記標識抗体を定量することにより、測定対象であるウイルス抗原量が求められる（サンドイッチ法）。また、前記標識抗体の代わりに、酵素や蛍光色素などで標識した抗原をサンプル中のウイルス抗原と競争的に固相に結合させ、これを定量する方法（競合法）なども用いられている。
【０００５】
ＰＣＲ法では、細胞中のウイルスゲノムを増幅させ、これを定量することにより細胞中のウイルス増殖性を評価する。具体的には、ウイルス感染させた細胞からウイルスゲノムを単離し、これをＰＣＲ法と呼ばれるＤＮＡの増幅技術によりウイルスゲノムを増幅させ、アガロースゲル電気泳動法などの核酸検出手段によって定量する。
【０００６】
特許文献１には、抗体を蛍光物質で標識し、抗原であるウイルスと蛍光で標識された抗体とを抗原抗体反応させて検出液とし、該被検出液を連続的にフローセルに通過させつつ、該検出液中に単一波長をもつ励起光を照射すると共に、該照射により蛍光物質を発光させ、該蛍光物質の発光を受光素子で検出することにより該蛍光の発光数とその強度とを計測し、これらの計測結果より、被検出液に含まれるウイルスを識別することを特徴とする血液中ウイルスの検出方法が開示されている。
【０００７】
特許文献２には、ウイルスを含有する可能性がある試料を水不溶性担体と接触させる工程と、前記水不溶性担体をアルカリ性水溶液と接触させる工程と、前記アルカリ性水溶液を中和する工程と、核酸を増幅する工程と、を含み、前記水不溶性担体は、疎水化処理が施された磁性体を含有する、ウイルス検出方法が開示されている。
【０００８】
また、特許文献３には、ＰＣＲにおいて、増幅効率が最善になるべく調整された時間、パルボウイルスＤＮＡの熱変性処理を行うことによりＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡをＥＬＩＳＡ法により検出することからなるパルボウイルスＤＮＡの検出方法が開示されている。
【０００９】
【特許文献１】特開平１０−８２７８５号公報。
【特許文献２】特開２００４−１４１１１６号公報。
【特許文献３】特開平１１−２２１０９９号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記のウイルス増殖性評価方法では、評価の際にウイルス感染させた細胞を溶解し、細胞内のウイルスゲノムを抽出しなければならないため、一の細胞内におけるウイルス増殖をリアルタイムに検出することはできなかった。
【００１１】
そこで、本発明は、生細胞内のウイルス増殖を、その生細胞を破壊することなく、リアルタイムに検出し得るウイルス検出方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記技術的課題を解決するために、まず、ウイルスゲノム中に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドを蛍光検出することにより、生細胞内のウイルスを検出する方法であって、前記蛍光標識ヌクレオチドは、少なくとも、光吸収により得た励起エネルギーを他の蛍光色素に与える励起対象蛍光色素と、他の蛍光色素から励起エネルギーを受け取って発光する検出対象蛍光色素と、を有する複数の蛍光色素群によって標識されていることを特徴とするウイルス検出方法を提供する。この方法によれば、ヌクレオチドに標識された蛍光色素群の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用することにより、生細胞内におけるウイルスの複製をリアルタイムに検出することができる。
この際、前記蛍光色素群は、励起光の励起対象蛍光色素と、蛍光の検出対象蛍光色素とを異なるものとするのが好適である。
また、本発明に係るウイルス検出方法は、（１）前記蛍光標識ヌクレオチドを前記生細胞内へ導入する工程と、（２）該生細胞にウイルスを感染させる工程と、（３）該生細胞内において複製されるウイルスゲノム中に前記蛍光色素を取り込ませる工程と、を含み、前記（１）の工程において、前記検出対象蛍光色素から検出される蛍光強度（Ａ）と、前記（３）の工程において、前記検出対象蛍光色素から検出される蛍光強度（Ｂ）との差分（（Ｂ）−（Ａ））に基づいて、前記生細胞内におけるウイルス複製量を測定することを特徴とする。
さらに、本発明に係るウイルス検出方法では、前記励起対象蛍光色素及び前記検出対象蛍光色素の種類は特に限定されないが、一例として、前記励起対象蛍光色素としてＣｙ５を、前記検出対象蛍光色素としてＣｙ５．５を用いることができる。
【００１３】
ここで、本発明に関する技術用語の説明をする。
【００１４】
「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）」とは、ドナーとなる蛍光物質とアクセプターとなる蛍光物質との間の距離が１ｎｍ〜１０ｎｍ程度の近傍にある場合に、ドナーを励起するとエネルギーがアクセプターに移動し、アクセプターが励起される現象をいう。
【００１５】
本発明における「ウイルス」とは、広義に解するものとし、動植物に感染するもののみならず、細菌に感染するいわゆるバクテリオファージなども含むものとする。また、ウイルスゲノムの種類は問わず、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスのいずれも含むものとする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係るウイルス検出方法によれば、生細胞内におけるウイルス増殖性を、その生細胞を破壊することなく、リアルタイムに検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照としながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１８】
図１乃至図５は、本発明に係るウイルス検出方法の好適な実施形態を示す図である。Ｎはヌクレオチドであり、それぞれ励起対象蛍光色素Ｘ１及び検出対象蛍光色素Ｘ２で標識された蛍光標識ヌクレオチドＮ１、Ｎ２を含むものである。１はウイルスの宿主となる生細胞、２は増殖させるウイルス、２１はウイルスゲノムをそれぞれ表す。
【００１９】
本発明に係るウイルス検出方法は、以下の工程からなる。
【００２０】
まず、励起対象蛍光色素Ｘ１及び検出対象蛍光色素Ｘ２がそれぞれ標識された蛍光標識ヌクレオチドＮ１及びＮ２を含むヌクレオチドＮを、ウイルス感染させる生細胞１内に導入する（工程（１）、図１（１）参照）。
【００２１】
なお、励起対象蛍光色素Ｘ１は、光吸収により得た励起エネルギーを検出対象蛍光色素Ｘ２に与え、前記検出対象蛍光色素Ｘ２は、前記励起対象蛍光色素Ｘ１から蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴによって励起エネルギーを受け取って発光する。
【００２２】
この状態で、前記生細胞１に前記励起対象蛍光色素Ｘ１の励起波長λＥｘＸ１の励起光Ｐを照射し、前記検出対象蛍光色素Ｘ２の発光波長域中の蛍光検出波長λＥｍＸ２における蛍光Ｆ０を検出する（図１（２）参照）。
【００２３】
前記励起対象蛍光色素Ｘ１の発光波長域は、前記検出対象蛍光色素Ｘ２の蛍光検出波長λＥｍＸ２と異なっているため、λＥｍＸ２における前記励起対象蛍光色素Ｘ１由来の蛍光強度は充分に小さい。また、前記検出対象蛍光色素Ｘ２の励起波長域は励起対象色素Ｘ１の励起波長λＥｘＸ１と異なっているため、λＥｘＸ１の光Ｐを照射してもＸ２はほとんど励起されず、前記検出対象蛍光色素Ｘ２が直接励起されることによる蛍光強度も充分に小さい。従って、バックグラウンドシグナルはほとんど検出されない。
【００２４】
さらに、前記ヌクレオチドＮは前記生細胞１の細胞質内にランダムに存在しているため、前記励起対象蛍光色素Ｘ１と前記検出対象蛍光色素Ｘ２の間で蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴの起こる確率は充分に低い。
【００２５】
従って、蛍光Ｆ０はほとんど観測されず、これは本発明に係るウイルス検出方法におけるバックグラウンドとなる。
【００２６】
次に、前記ヌクレオチドＮを導入した前記生細胞１に、増殖させる前記ウイルス２を感染させる（工程（２）、図２参照）。
【００２７】
前記生細胞１に前記ウイルス２を感染させると、前記生細胞１内に導入された前記ウイルス２が脱殻し、ウイルスゲノム２１が複製される。このとき、工程（１）で前記生細胞１内に導入した前記ヌクレオチドＮは、前記ウイルスゲノム２１の複製に用いられるとともに、前記生細胞１中の細胞質内でランダムに存在していた状態から複製されるウイルスゲノム２１中に配列した状態へと変化する（工程（３）、図３参照）。
【００２８】
その結果、前記蛍光標識ヌクレオチドＮ１及びＮ２は同一のウイルスゲノム内に存在することとなり、前記蛍光標識ヌクレオチドＮ１及びＮ２にそれぞれ標識された前記励起対象蛍光色素Ｘ１と前記検出対象蛍光色素Ｘ２は、蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが充分に起こりうる距離に近接する。
【００２９】
この状態において、前記生細胞１にλＥｘＸ１の光Ｐを照射すると、複製された前記ウイルスゲノム２１中に取り込まれた前記励起対象蛍光色素Ｘ１と前記検出対象蛍光色素Ｘ２の間で蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが起こり、前記励起対象蛍光色素Ｘ１の励起エネルギーが前記検出対象蛍光色素Ｘ２に移動する（工程（４）、図４参照）。
【００３０】
蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴが起こると、励起された前記励起対象蛍光色素Ｘ１は失活し、前記検出対象蛍光色素Ｘ２が発光する。従って、工程（１）において観測される蛍光Ｆ０と比較して、λＥｍＸ２における蛍光Ｆ１の強度は増大する。
【００３１】
蛍光共鳴エネルギー移動ＥＴは、互いに近傍に位置する前記励起対象蛍光色素Ｘ１と前記検出対象蛍光色素Ｘ２の対が多いほど、すなわち、複製された前記ウイルスゲノムの数が多いほど、生じる確率が増え、その結果蛍光Ｆ１の強度が増大する。
【００３２】
従って、蛍光Ｆ１の強度と、蛍光Ｆ０の強度の差分から、生細胞１中におけるウイルスゲノムの増殖を検出することができる。
【００３３】
また、あらかじめ蛍光Ｆ１の強度と複製されたウイルスゲノムの量との相関を調べておけば、蛍光Ｆ１の強度から生細胞１中におけるウイルスゲノムの増殖をリアルタイムかつ定量的に求めることができる。
【００３４】
さらに、蛍光Ｆ１を経時的に観測することにより、生細胞１中におけるウイルスゲノム２１の増殖速度を求めることもできる。
【００３５】
次に、本発明の構成について詳細に説明する。
【００３６】
本発明に係るウイルス検出方法に用いられる生細胞１の種類は特に限定されず、動物、植物、細菌の細胞のうち、増殖させるウイルスに感染しうる生細胞を適宜選択することができる。
【００３７】
生細胞１に感染させるウイルス２の種類などは特に限定されず、例えば、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、バクテリオファージなどとすることができる。
また、前記生細胞１内に導入するヌクレオチドＮは前記ウイルス２の種類に応じて選択することができ、例えば、ＤＮＡウイルスを感染させる場合にはデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡウイルスを感染させる場合にはリボヌクレオチドとすることができる。
【００３８】
蛍光標識ヌクレオチドＮ１及びＮ２に標識される励起対象蛍光色素Ｘ１及び検出対象蛍光色素Ｘ２は、前記励起対象蛍光色素Ｘ１の発光波長域が、前記検出対象蛍光色素Ｘ２の励起波長域に重複するものであれば、その種類及び組み合わせは特に限定されないが、前記励起対象蛍光色素Ｘ１は、前記検出対象蛍光色素Ｘ２と異なる蛍光色素とするのが好ましい。具体的には、例えば、表１に示す組み合わせとすることができる。
【００３９】
【表１】
2009039065.tif 000003
【００４０】
好適には、前記励起対象蛍光色素Ｘ１にＣｙ５を、前記検出対象蛍光色素Ｘ２にＣｙ５．５を用いることができる。Ｃｙ５およびＣｙ５．５はいずれも耐光性に優れ、かつＣｙ５の発光波長とＣｙ５．５の励起波長との重なりが大きい。このため、Ｃｙ５とＣｙ５．５を組み合わせて用いることにより、高感度かつ長時間安定してウイルスゲノムを検出することができる。
【００４１】
また、本発明に係る蛍光標識ヌクレオチドについて、標識する蛍光色素の種類の数は特に限定されない。本実施形態では、励起対象蛍光色素Ｘ１及び検出対象蛍光色素Ｘ２の２種類の蛍光色素が標識された蛍光標識ヌクレオチドＮ１、Ｎ２を用いているが、３種類以上の蛍光色素を標識してもよい。
【００４２】
具体的には、励起対象蛍光色素Ｘ１、検出対象蛍光色素Ｘ２に加え、例えば、前記励起対象蛍光色素Ｘ１から励起エネルギーを受け取り（ＥＴ１）、受け取った励起エネルギーをさらに前記検出対象蛍光色素Ｘ２に与える（ＥＴ２）蛍光色素などを含むことができる。このような蛍光色素を含むことにより、励起対象蛍光色素Ｘ１と検出対象蛍光色素Ｘ２のみを用いる場合と比較して（図５上図参照）、励起光波長と蛍光検出波長との波長の差を広げることができ、バックグラウンドシグナルを減少させることができる（図５下図参照）。
【００４３】
生細胞１内に導入するヌクレオチドＮに含まれる蛍光標識ヌクレオチドＮ１及びＮ２の割合は特に限定されないが、導入する前記ヌクレオチドＮの一部を前記蛍光標識ヌクレオチドＮ１、Ｎ２とするのが好ましい。導入する前記ヌクレオチドＮのすべてを前記蛍光標識ヌクレオチドＮ１、Ｎ２とすると、前記蛍光標識ヌクレオチドＮ１、Ｎ２に標識された前記励起対象蛍光色素Ｘ１及び前記検出対象蛍光色素Ｘ２がウイルスゲノム２１の複製の際に障害となり、ウイルスゲノム２１の複製が起こりにくくなる、又は起こらなくなる可能性があるため好ましくない。また、蛍光標識ヌクレオチドＮ１とＮ２の割合も特に限定されない。
【００４４】
前記励起対象蛍光色素とＸ１と前記検出対象蛍光色素Ｘ２を標識する前記ヌクレオチドＮ１、Ｎ２の種類などは特に限定されず、例えば、前記励起対象蛍光色素Ｘ１及び前記検出対象蛍光色素Ｘ２を特定の１種類のヌクレオチドにのみ標識することができる。また、前記励起対象蛍光色素Ｘ１と前記検出対象蛍光色素Ｘ２をそれぞれ異なる特定の種類のヌクレオチドに標識することもできる。さらに、ヌクレオチドの種類を問わず、前記生細胞１内に導入する複数種のヌクレオチドＮのうち、一定の割合を前記蛍光標識ヌクレオチドＮ１、Ｎ２とすることもできる。
【００４５】
前記ヌクレオチドＮの前記生細胞１への導入は、トランスフェクションに通常用いられる方法で行うことができる。例えば、カルシウム法、リポソームトランスフェクション法、マイクロインジェクション法などから適宜選択することができる。
【００４６】
蛍光Ｆ０及びＦ１の観察手段は特に限定されず、通常の落射型の蛍光顕微鏡のほか、共焦点顕微鏡、多光子励起顕微鏡、エバネッセント顕微鏡など、光源がレーザーの顕微鏡を用いることができる。また、蛍光光度計などを用いることもできる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明に係るウイルス検出方法は、動植物や細菌に感染するウイルスの生細胞内での増殖性を観測するのに用いることができる。特に、宿主となる生細胞を破壊することなく、リアルタイムにウイルスの増殖を検出するのに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の好適な実施形態の工程（１）に係る概念図である。
【図２】本発明の好適な実施形態の工程（２）に係る概念図である。
【図３】本発明の好適な実施形態の工程（３）に係る概念図である。
【図４】本発明の好適な実施形態の工程（４）に係る概念図である。
【図５】本発明の好適な実施形態に係る蛍光色素群の蛍光スペクトルの模式図である。
【符号の説明】
【００４９】
Ｎ                   ヌクレオチド
Ｎ１，Ｎ２           蛍光標識ヌクレオチド
Ｘ１                 励起対象蛍光色素
Ｘ２                 検出対象蛍光色素
１                   生細胞
２                   ウイルス
２１                 ウイルスゲノム
Ｐ                   励起光
Ｆ０，Ｆ１           蛍光
【図１】
2009039065.tif 000004
【図２】
2009039065.tif 000005
【図３】
2009039065.tif 000006
【図４】
2009039065.tif 000007
【図５】
2009039065.tif 000008