(57)【要約】      （修正有）【課題】リガンド分子固定粒子を用いて、高感度な標的物質の検出方法および分離効率の良い標的物質の分離方法を提供する。【解決手段】下記一般式（１）で示される構造を有することを特徴とするリガンド分子固定ポリマーからなる。2009292804.tif 000007（式中、Ｒ1はリガンド分子１を含む基、Ｒ2は疎水性基２、Ｒ3はスペーサ部位、Ｒ4は親水性基３、Ｒ5は電荷を有する基４を示す。ａ〜ｄの値は組成比を規定するものであり、それぞれの値は１以上の整数である。nおよびmの値は、鎖長を規定するものであり、それぞれの値は、１≦ｎ(ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ)≦１００００、1≦m≦３５０を満たす整数である）【選択図】図１
2009292804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で示される構造を有することを特徴とするリガンド分子固定ポリマー。
【化１】
2009292804.tif 000006
（式中、Ｒ1はリガンド分子を含む基、Ｒ2は疎水性基、Ｒ3はスペーサ部位、Ｒ4は親水性基、Ｒ5は電荷を有する基を示す。ａ〜ｄの値は組成比を規定するものであり、それぞれの値は１以上の整数である。nおよびmの値は、鎖長を規定するものであり、それぞれの値は、１≦ｎ（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）≦１００００、１≦ｍ≦３５０を満たす整数である）
【請求項２】
前記疎水性基が、芳香族炭化水素からなる基であることを特徴とする請求項１に記載のリガンド分子固定ポリマー。
【請求項３】
前記電荷を有する基が、酸性基もしくは塩基性基であることを特徴とする請求項１または２に記載のリガンド分子固定ポリマー。
【請求項４】
表面が疎水性および電荷を有するコア粒子と、
該コア粒子の表面に固定されているリガンド分子固定ポリマーと、
からなるリガンド分子固定粒子であって、
前記リガンド分子固定ポリマーが請求項１乃至３のいずれかに記載のリガンド分子固定ポリマーであり、
検体液中での、前記リガンド分子固定ポリマーが有する電荷を有する基の電荷Ｑ1と、前記コア粒子が表面に有する電荷Ｑ2との関係が、
Ｑ1×Ｑ2＜０
を満たすことを特徴とするリガンド分子固定粒子。
【請求項５】
標的物質を分離する方法であって、
（１）請求項４に記載のリガンド分子固定粒子が有するリガンド分子に標的物質を捕捉させて前記リガンド分子固定粒子と前記標的物質からなる複合体Ａを形成する工程と、
（２）前記複合体Ａを分離する工程と、
を有することを特徴とする標的物質の分離方法。
【請求項６】
前記複合体Ａを分離する工程を遠心分離により行うことを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分離方法。
【請求項７】
前記複合体Ａを分離する工程を磁力によって行うことを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分離方法。
【請求項８】
標的物質の検出方法であって、
請求項５乃至７のいずれかに記載の分離方法により前記標的物質を分離した後、前記標的物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項９】
標的物質の検出方法であって、
（１）支持体に固定された第一のリガンド分子と標的物質とからなる複合体Ｂを形成する工程と、
（２）前記複合体Ｂが有する標的物質を請求項４に記載のリガンド分子固定粒子が有する第二のリガンド分子が更に捕捉した複合体Ｃを形成する工程と、
（３）前記複合体Ｃが有する標的物質を検出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項１０】
前記（２）の工程が、
前記複合体Ｂが有する標的物質を、前記コア粒子に固定されていない前記リガンド分子固定ポリマーが有する第二のリガンド分子に捕捉させた後に、該リガンド分子固定ポリマーに前記コア粒子を固定させる工程であることを特徴とする請求項９に記載の標的物質の検出方法。
【請求項１１】
前記支持体が基体もしくは標識材であることを特徴とする請求項９または１０に記載の標的物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンド分子固定ポリマー、リガンド分子固定粒子、標的物質の検出方法および標的物質の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アフィニティー精製試薬や検体検査試薬として、リガンド分子などの生体分子を固定した粒子が広く用いられている。ここで用いられる粒子には、分散性に優れ、且つ、標的物質に対して親和性の高い粒子が求められており、これらの性質を有する粒子の作成方法が必要とされている。つまり、リガンド分子を固定した粒子の作製において、粒子にリガンド分子を固定化する時に、粒子の凝集が起こらず、且つ、多量のリガンド分子を効率良く固定化できる粒子の作製方法が求められる。
【０００３】
この課題を克服するために、例えば、特許文献１では、疎水性粒子の表面に、官能基を有する親水性ポリマーを被覆し、該親水性ポリマーの官能基にリガンド分子を固定する方法が開示されている。この方法では、リガンド分子は官能基を介して共有結合により粒子に強固に固定され、さらに粒子表面が親水基で覆われているため、リガンド分子固定時の粒子同士の凝集は緩和され、歩留まりの良い作製が可能となる。
【０００４】
また、特許文献２では、疎水性粒子の表面にグリシジルメタクリレート重合体を被覆し、その表面に存在する官能基に対して化学結合を介して生理活性物質を固定化する方法が開示されている。この方法では、表面が親水性ポリマーで覆われているため、分散性に優れ、且つ生理活性に優れた粒子作成が可能である。
【特許文献１】特開昭５９−１３５８８７号公報
【特許文献２】特登録０３０８６４２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１および特許文献２に記載の方法では、粒子表面へ形成できる官能基の数が制限されるため、粒子表面に多量のリガンド分子を固定できない。この結果、標的物質に対する粒子の親和性は低下してしまう。また、固定する反応が不均一系の化学反応であるため、リガンド分子の固定化効率が悪く、反応させるリガンド分子が多量必要となる。
【０００６】
そこで、本発明は、粒子同士の凝集が生じにくく、多量のリガンド分子が表面に固定したリガンド分子固定粒子および該リガンド分子固定粒子などに用いることができるリガンド分子固定ポリマーを提供する。
【０００７】
また、前記リガンド分子固定粒子を用いることで、高感度かつ高精度な標的物質の検出および標的物質の分離を実現する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
下記一般式（１）で示される構造を有することを特徴とするリガンド分子固定ポリマーである。
【０００９】
【化１】
2009292804.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｒ1はリガンド分子を含む基、Ｒ2は疎水性基、Ｒ3はスペーサ部位、Ｒ4は親水性基、Ｒ5は電荷を有する基を示す。ａ〜ｄの値は組成比を規定するものであり、それぞれの値は１以上の整数である。ｎおよびｍの値は、鎖長を規定するものであり、それぞれの値は、１≦ｎ（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）≦１００００、１≦ｍ≦３５０を満たす整数である）
また、別の本発明は、
表面が疎水性および電荷を有するコア粒子と、
該コア粒子の表面に固定されているリガンド分子固定ポリマーと、
からなるリガンド分子固定粒子であって、
前記リガンド分子固定ポリマーが本発明に係る上記リガンド分子固定ポリマーであり、
検体液中での、前記リガンド分子固定ポリマーが有する電荷を有する基の電荷Ｑ1と、前記コア粒子が表面に有する電荷Ｑ2との関係が、
Ｑ1×Ｑ2＜０
を満たすことを特徴とするリガンド分子固定粒子。
【００１１】
また、別の本発明は、
標的物質を分離する方法であって、
（１）前記リガンド分子固定粒子が有するリガンド分子に標的物質を捕捉させて前記リガンド分子固定粒子と前記標的物質からなる複合体Ａを形成する工程と、
（２）前記複合体Ａを分離する工程と、
を有することを特徴とする標的物質の分離方法である。
【００１２】
また、別の本発明は、
標的物質の検出方法であって、
（１）支持体に固定された第一のリガンド分子と標的物質とからなる複合体Ｂを形成する工程と、
（２）前記複合体Ｂが有する標的物質を前記リガンド分子固定粒子が有する第二のリガンド分子が更に捕捉した複合体Ｃを形成する工程と、
（３）前記複合体Ｃが有する標的物質を検出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、粒子同士の凝集が生じにくく、多量のリガンド分子が表面に固定したリガンド分子固定粒子および該リガンド分子固定粒子などに用いることができるリガンド分子固定ポリマーを提供することができる。
【００１４】
また、前記リガンド分子固定粒子を用いることで、高感度かつ高精度な標的物質の検出および標的物質の分離を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本発明は請求項によって特定されるものであって、以下の形態及び実施例に限定解釈されるものではない。例えば、以下の形態及び実施例の材料、組成条件、反応条件等は、当業者が理解可能な範囲で自由に変更して本発明を実現することができる。
【００１６】
本発明の第１は、下記一般式（１）で示される構造を有することを特徴とするリガンド分子固定ポリマーである。
【００１７】
【化２】
2009292804.tif 000004
【００１８】
（式中、Ｒ1はリガンド分子を含む基、Ｒ2は疎水性基、Ｒ3はスペーサ部位、Ｒ4は親水性基、Ｒ5は電荷を有する基を示す。ａ〜ｄの値は組成比を規定するものであり、それぞれの値は１以上の整数である。ｎおよびｍの値は、鎖長を規定するものであり、それぞれの値は、１≦ｎ（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）≦１００００、１≦ｍ≦３５０を満たす整数である）
リガンド分子固定ポリマーの主鎖骨格の炭素数の長さを示すｎ（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）は、１から１００００の範囲であり、前記リガンド分子固定ポリマーの分子量は１０００〜１０００００ｋＤａであることが好ましい。
【００１９】
リガンド分子固定ポリマーの構造は、リガンド分子を含む基（Ｒ1）、疎水性基（Ｒ2）、親水性部位（−［Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2］m−Ｒ4）（ただしＲ4は親水性基）および電荷を有する基（Ｒ5）の４つの構成要素を有し、上記の条件を満たすものであれば特に限定されない。したがって、リガンド分子固定ポリマーは、これらの構成要素を有する単体をモノマーユニットとして重合した重合体であっても良いし、２つ以上の異なるモノマーユニットを共重合して得られる共重合体であっても良い。また、共重合体である場合は、各モノマーユニットが１つの構成要素を含んでいてもよく、２つ以上の構成要素を含んでいても良い。また、これらの共重合体の構造としては、ランダム共重合体、交互共重合体、周期的共重合体、ブロック共重合体、のいずれであることが好ましい。なお、リガンド分子固定ポリマーは上記機能的な構成要素を含まないモノマーユニットを含んでいてもよい。
【００２０】
２つ以上のモノマーユニットを共重合して得られる重合体である場合、一般式（１）で表されるポリマーは、例えば、それぞれユニットがａとｂを一括りとするユニットと、ｃとｄを一括りとするユニットとのランダム共重合体である下記の一般式（２）を含むものであってもよい。
【００２１】
【化３】
2009292804.tif 000005
【００２２】
（式中、Ｒ1はリガンド分子、Ｒ2は疎水性基、Ｒ3はスペーサ部位、Ｒ4は親水性基、Ｒ5は電荷を有する基を示す。ａ＋ｂ、ｃ＋ｄの値は組成比を規定するものであり、それぞれの値は１以上の整数である。ｎおよびｍの値は、鎖長を規定するものであり、ｎは１≦ｎ（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）≦１００００、１≦ｍ≦３５０を満たす整数である）
また、構成要素を含んでおらず、かつ該構成要素を修飾付加できる基を有するモノマーユニットを用いて重合体を合成した後に構成要素を付加してリガンド分子固定ポリマーを得ることもできる。さらに、いずれかの構成要素を含むものの全ての構成要素は含んでおらず、かつ、構成要素を付加可能な基を有するモノマーユニットを用いて重合した後に、構成要素を付加させてリガンド分子固定ポリマーを得ることも可能である。このような製造方法の場合、未反応の基が残っていることもあるため、一般式（１）で表されるポリマーは構成要素を含まないユニットが含まれてもよいものとする。
【００２３】
以下、各部分について詳細に説明する。
【００２４】
＜リガンド分子を含む基＞
前記リガンド分子固定ポリマーにおいてＲ1は、リガンド分子を含む基であり、より具体的には、リガンド分子、または、スペーサを含むリガンド分子を示す。リガンド分子は、標的物質を特異的に認識して捕捉することが可能な物質である。標的物質とリガンド分子の組み合わせとしては、例えば、抗原−抗体、ペプチド−抗体、ウイルス−抗体、低分子化合物−抗体、細胞−抗体、抗原−アプタマー、抗原−酵素、ペプチド−タンパク質、ペプチド−ペプチド、ＤＮＡ−タンパク質、ＲＮＡ−タンパク質、糖−タンパク質、タンパク質−タンパク質、糖−糖などが挙げられる。なお、「標的物質とリガンド分子の組み合わせがＡ−Ｂである」と表記する場合は、標的物質がＡでありリガンド分子がＢである場合と、標的物質がＢでありリガンド分子がＡである場合の両方を含むものとする。標的物質に抗原を用い、リガンド分子に抗体を用いる場合、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られたモノクロ−ナル抗体や抗原で免疫させて得られた血清により精製させるポリクローナル抗体などを用いることができる。なお、抗原は、上記抗体を誘発させる物質であり、非生体分子と生体分子に分けることができる。非生体分子として産業上利用価値の大きいものは、環境汚染物質としての塩素置換数／位置の異なるＰＣＢ類、同じく塩素置換数／位置の異なるダイオキシン類、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質等が挙げられる。また、生体分子としては、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質およびそれらの複合体から選択される生体物質が含まれ、さらに詳しくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ糖脂質のいずれかから選択された物質を含むものであれば、如何なる物質にも本発明を適用することができる。
【００２５】
また、リガンド分子を含む基をポリマーに結合させる場合、化学結合もしくはアフィニティー結合を利用して行うことができる。ここで、「化学結合」とは、原子間やイオン間で電子の授受を伴って形成された結合であり、例えば、共有結合、配位結合、金属結合などが挙げられる。化学結合を利用する方法としては、例えば、アミド結合で固定する方法、グルタルアルデヒドを介して固定する方法、スペーサを介してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによりアミド結合で固定する方法、スペーサを介してマレイミドによりチオール結合で固定するなどの方法が挙げられる。また、アフィニティー結合を利用する方法としては、ビオチン−アビジン結合で固定する方法、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡとＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇにより固定する方法、抗原−抗体反応で肯定する方法、これらを組み合わせたサンドイッチ結合を利用して固定する方法、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリダイズにより固定する方法などを用いることができる。
【００２６】
なお、リガンド分子を含む基を結合させる際は、リガンド分子が標的物質の検出や分離の用途において求められる活性を損なわないように変性が起こらない程度の緩和な温度および化学的条件下で行われることが望ましい。例えば、ポリマーの主鎖骨格を合成した後に、リガンド分子を付加する方法などを好適に用いることができる。このような方法として、例えば、活性の高い酸無水物部位を有するスチレン−無水マレイン酸コポリマーにリガンド分子及びポリエチレングリコールを導入する方法が挙げられる。
【００２７】
＜疎水性基＞
前記リガンド分子固定ポリマーにおけるＲ2は疎水性基である。ここで、本発明および本明細書において、「疎水性」とは、水との親和性が低く、極性の低い性質のことである。前記リガンド分子固定ポリマーにおける疎水性基は、該リガンド分子固定ポリマーをコア粒子表面に疎水性相互作用により固定する作用を有する。そのような疎水性基としては、例えば、置換もしくは非置換の鎖式飽和炭化水素、鎖式不飽和炭化水素、脂環式飽和炭化水素、脂環式不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、複素芳香族炭化水素などが挙げられる。これらの中でも、疎水性基は、芳香族炭化水素の構造を有することが好ましい。疎水性基のより具体的な構造としては、ベンゼン誘導体、ナフタレン誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体などが挙げられる。なお、ここで、「置換されたＡ」とは、Ａの主鎖の炭素が他の原子に置換されているものおよびＡの側鎖の水素が他の原子に置換されているもののいずれも含むものとする。したがって、置換された芳香族炭化水素は、芳香族環が有する水素が他の官能基に置換されたものも含まれ、例えば、これらのベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環の水素原子が、第１から４級のアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、スルホニル基、炭素数１〜１０のアルキル基、イソプロピル基、アシル基、ハロゲン元素などで置換されていても良い。なお、このような官能基としては、粒子に化学結合するもしくは相互作用するものであることが好ましい。化学結合を利用して粒子に結合する基として、例えば、チオール基を用いた場合、表面に金を有する粒子に、前記ポリマーは金−チオール結合によって結合できる。また、基としてアジ基を用いた場合、前記ポリマーは、表面がアミノ化された粒子の表面に光架橋反応により結合できる。さらに、相互作用を利用して粒子に結合する官能基としては、例えば、酸性基（酸性官能基）や塩基性基（塩基性官能基）が挙げられる。酸性基や塩基性基を用いた場合、前記リガンド分子固定ポリマーは、コア粒子が表面に有する電荷と静電相互作用を起こし、コア粒子に固定される。なお、ここで示す酸性基とは、液中で負電荷を帯びやすい基が好ましく、例えば、カルボキシル基、スルホニル基、ニトロ基、リン酸基、ヒドロキシル基などが挙げられる。一方で、ここで示す塩基性基とは、液中で正電荷を帯びやすい基が好ましく、例えば、第１〜４級アミンなどが挙げられる。よって、芳香族炭化水素がベンゼン誘導体、ナフタレン誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体である場合は、これらの芳香族環が有する水素が上記に挙げた基に置換されたものを含むことができ、さらに、炭素数１〜６の低級アルキル基及びアルコキシ基に置換されたものを含んでもよい。
【００２８】
＜親水性部位＞
前記リガンド分子固定ポリマーにおける−［Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2］m−Ｒ4は親水性部位である。ここで、本発明において「親水性部位」とは、水との親和性が高く、極性の高い性質を有する部位のことである。また、Ｒ4は、−［Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2］mに結合する末端基（末端官能基）であって、親水性基である。Ｒ4を含む親水性部位は、粒子間の凝集の防止剤や粒子表面への夾雑物の非特異的吸着の防止剤として働く。このような親水性基としては、例えば、水素、カルボキシル基、スルホ基、リン酸基、第１〜４級アミノ基、ヒドロキシル基、ホスホリルコリン誘導体などを用いることができる。なお、−［Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2］m−Ｒ4は、モノエチレングリコール、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコールのいずれかを示しており、ｍは１以上３５０以下を示す。特に、ｍは１０以上３５０以下のオリゴエチレングリコール、及びポリエチレングリコールを用いることが好ましい。
【００２９】
前記リガンド分子固定ポリマーにおけるＲ3は、前記リガンド分子固定ポリマー内の親水性部位である−［Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2］m−Ｒ4とリガンド分子固定ポリマー主鎖とを連結するスペーサ部位である。このようなスペーサー部位としては、例えば、置換または非置換の炭化水素基、アミド基、イミン基、ウレア基、チオウレア基、スルホンアミド基、アジリジン基、  トリアゾール基、エステル基、エーテル基、チオエーテル基などからなる部位とすることができる。これらの中でも、スペーサ部位は、置換または非置換の炭化水素基からなることが好ましく、より好ましくは、炭素数が２０以下の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基からなる炭化水素基が好ましく、最も好ましくは炭素数が１２以下の炭化水素基である。
【００３０】
＜電荷を有する基＞
電荷を有する基は、液体中で電荷を有するものであり、少なくとも検体液中で電荷を有するものであり、リガンド分子固定ポリマーをコア粒子表面上に静電相互作用により固定する作用を有する。このような電荷を有する基としては、カチオン性またはアニオン性を有する基であり、より具体的には、酸性基もしくは塩基性基などが挙げられる。ここでの酸性基とは、液中で負電荷を帯びやすい基が好ましく、例えば、カルボキシル基、スルホニル基、ニトロ基、リン酸基、ヒドロキシル基などが挙げられる。一方で、ここでの塩基性基とは、液体中で正電荷を帯びやすい基が好ましく、例えば、第１〜４級アミンなどが挙げられる。なお、ここでの検体液とは標的物質を含む測定対象溶液を示し、例えば標的物質を含む血液、リンパ液、組織液、髄液、尿、体腔液、透析液、水溶液などが挙げられる。
【００３１】
次に、本発明の第２について説明する。
【００３２】
本発明の第２は、リガンド分子固定粒子であって、コア粒子と、該コア粒子の表面に固定されている上記記載のリガンド分子固定ポリマーと、からなることを特徴とするリガンド分子固定粒子である。
【００３３】
図１に、本発明の第２にかかるリガンド分子固定粒子の一例を示す。
【００３４】
リガンド分子固定粒子６は、コア粒子５と、該粒子の表面に固定された本発明の第1のリガンド分子固定ポリマー１６とからなる。リガンド分子固定ポリマー１６は、コア粒子５に疎水性相互作用および静電相互作用を介して多点で固定されている。
【００３５】
コア粒子５は、表面が疎水性および電荷を有する。上記性質を有していれば、コア粒子５は、粒子全体が一つの疎水性および電荷を有する材料で構成されていても良いし、粒子が複数の層からなり、最表面の層が、疎水性および電荷を有する材料で構成されていても良い。後者である場合は、最表面の層以外の層が疎水性および電荷を有する材料以外の材料からなっていても良い。また、コア粒子の表面が、電荷を有する材料からなる領域と疎水性を有する材料からなる領域とを有していても良い。なお、本発明において、疎水性とは水に難溶で油に可溶な性質を表すものである。
【００３６】
なお、コア粒子５の表面が電荷を有するとは、少なくともコア粒子５の表面が検体液中で電荷を有することである。また、検体液中でのリガンド分子固定ポリマー１６が有する電荷を有する基の電荷をＱ1、検体液中でのコア粒子が表面に有する電荷をＱ2とすると、電荷Ｑ1と電荷Ｑ2の関係は、
Ｑ1×Ｑ2＜０
となる。
【００３７】
したがって、リガンド分子固定ポリマー１６のうち、疎水性基２および電荷を有する基４が主鎖を基準として粒子側に位置し、親水性基３およびリガンド分子１は、主鎖を基準として、粒子とは反対側に位置する。
【００３８】
これにより、リガンド分子固定ポリマー１６とコア粒子５との間には、リガンド分子固定ポリマーが有する疎水性基Ｒ2とコア粒子の表面との間に疎水性相互作用が生じ、リガンド分子固定ポリマーが有する電荷を有する基Ｒ5とコア粒子の表面との間に静電相互作用が生じ、リガンド分子固定ポリマーがコア粒子に強固に固定される。
【００３９】
コア粒子が疎水性および電荷を有する材料で構成される場合の材料の例としては、カルボキシル基、スルホニル基、第１〜４級アミノ基などの電荷を有する疎水性ポリマーなどが挙げられる。より具体的には、ポリ（４‐スチレンカルボン酸）、ポリ（４‐アミノスチレン）、ポリ（４‐スチレンスルホン酸）、ポリアクリル酸誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、ポリアミン、ポリイミド、ポリアミド酸、などが挙げられる。また、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびラウリン酸など、アルキル基の炭素数が１１以上１９以下の脂肪酸、およびこれに類する誘導体、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、リン脂質など親水基と親油基を有する両親媒性分子、などを有する材料とすることもできる。また、リガンド分子固定ポリマーの疎水性基として官能基を有する芳香族炭化水素を用いる場合、電荷および疎水性を有する材料としては、前記芳香族炭化水素と結合あるいは相互作用する官能基や材料を用いることができる。
【００４０】
コア粒子５の大きさは、粒子直径が１０ｎｍから１０μｍの大きさであることが好ましい。粒子が複数の層で構成される場合の最表面の層以外の層は、粒子を構成することができればいずれの材料を用いても良いが、例えば、磁性物質、蛍光物質、電気化学的活性物質、重金属物質、もしくは金属半導体物質などを用いることができる。磁性物質としては、例えば、酸化鉄、酸化クロム、コバルト、および、フェライトなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオロセイン、シアニン系色素、および、希土類金属錯体などが挙げられる。電気化学的活性物質としては、鉄錯体、コバルト錯体、および、ニッケル錯体などの重金属錯体物質が挙げられる。重金属物質としては、金、銀、および、白金などナノ金属粒子が挙げられる。金属半導体物質は、ＣｄＳｅ微粒子などの量子ドット材料が挙げられる。
【００４１】
本発明の第２にかかるリガンド分子固定粒子は、リガンド分子を固定したポリマーをコア粒子に結合させたものである。よって、本発明は、リガンド分子固定粒子の製造方法であって、上記のリガンド分子固定ポリマーを作製する工程と、溶液中で、コア粒子に前記リガンド分子固定ポリマーを加えて混合する工程と、を有し、前記コア粒子が、該リガンド分子固定ポリマーの電荷を有する基の電荷と異なる電荷を表面に有することを特徴とするリガンド分子固定粒子の製造方法を包含する。
【００４２】
本発明の第３は、
検体中の標的物質を分離する方法であり、次の（１）及び（２）の工程を有する。
（１）本発明の第２にかかるリガンド分子固定粒子が有するリガンド分子に前記標的物質を捕捉させて前記リガンド分子固定粒子と前記標的物質からなる複合体Ａを形成する工程。
（２）前記複合体Ａを分離する工程。
【００４３】
更に、標的物質自体が、蛍光などの検出可能なシグナルを発信し得る物質であるか、またはそのような物質を有するものであれば、上記（１）及び（２）の工程により標的物質を分離した後に、分離した標的物質を検出する工程を有することで標的物質を検出することができる。この場合の検出工程は、標的物質が発信し得る検出可能なシグナルを検出することが好ましい。
【００４４】
図２および図５は、本発明の第３の例を示す模式図である。
【００４５】
まずは、図２に関して説明する。
（ｉ）に示すように標的物質９および夾雑物１０を含む検体８が入った容器７に、リガンド分子固定粒子６を添加して、（ｉｉ）に示す標的物質９とリガンド分子固定粒子６との複合体Ａ２５を形成する。次に、（ｉｉｉ）に示すように、形成した複合体Ａ２５を磁石１１で特定部分に集めた状態で、ピペット１２などにより検体８を吸い取る。これにより、（ｉｖ）のように検体中に存在する夾雑物１０と複合体Ａ２５とを分離することができる。なお、（ｉｉｉ）において、夾雑物１０と複合体Ａ２５を分離する方法は、外的な作用により夾雑物１０と複合体Ａ２５とを分離できれば良く、磁石による磁気的分離法以外にも、例えば、遠心分離法なども用いることができる。
【００４６】
本発明の第４は、検体中の標的物質を検出する方法であり、次の（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の工程を有する。
（Ｉ）支持体に固定された第一のリガンド分子に標的物質を捕捉させる工程（言い換えれば、第一のリガンド分子と標的物質からなる複合体Ｂを形成する工程）。
（ＩＩ）リガンド分子固定粒子が有する第二のリガンド分子に、前記第一のリガンド分子が捕捉した前記標的物質を更に捕捉させる工程（言い換えれば、前記複合体Ｂが有する標的物質を前記リガンド分子固定粒子が有する第二のリガンド分子が更に捕捉した複合体Ｃを形成する工程）。
（ＩＩＩ）前記第一および第二のリガンド分子に捕捉された標的物質を検出する工程（言い換えれば、複合体Ｃが有する標的物質を検出する工程）。
【００４７】
図３〜図５を参照しながら説明する。
【００４８】
なお、図３および図５では前記リガンド分子固定ポリマーが省略されて記載されているが、第二のリガンド分子１５と粒子６との間には前記リガンド分子固定ポリマーが存在する。
（Ｉ）の工程では、図３（Ａ）および図４（ａ）に示すような支持体である基体１３の表面に固定された第一のリガンド分子１４に標的物質９および夾雑物１０を含む検体を接触させる。それにより、図３（Ｂ）および図４（ｂ）に示すように、標的物質９が第一のリガンド分子１４に特異的に認識されて捕捉されて複合体Ｂが形成される。
（ＩＩ）の工程では、図３（Ｃ）、図４（ｄ）のように、前記基体１３の表面に固定された第一のリガンド分子１４に捕捉された標的物質９をリガンド分子固定粒子６が有する第二のリガンド分子１５に更に捕捉させる。なお、図５（イ）のように第一のリガンド分子は基体に固定されておらず、かつ標識部位１７を有していても良い。また、第一のリガンド分子１４と第二のリガンド分子１５は、標的物質９のうちの異なる部分を認識して捕捉することが好ましく、このような点から、第二のリガンド分子として二次抗体を好適に用いることができる。また、上記のように、工程（Ｉ）及び、（ＩＩ）は、第一のリガンド分子１４と標的物質９とリガンド分子固定粒子６によってサンドイッチされた複合体Ｃ２６が形成される限りにおいては、作業工程の順序は特に限定されない。なお、（ＩＩ）の工程では、図４の（ｂ）〜（ｃ）に示されているように、基体１３の表面に固定された第一のリガンド分子１４に捕捉された標的物質９に前記リガンド分子固定ポリマー１６が有する第二のリガンド分子を接触させた後に、リガンド分子固定ポリマー１６をコア粒子５を接触させることで、複合体Ｃを形成することができる。言い換えれば、複合体Ｂが有する標的物質を前記リガンド分子固定ポリマーが有する第二のリガンド分子に捕捉させた後に、前記リガンド分子固定ポリマーにコア粒子を固定させることもできる。
【００４９】
上記工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）は同時に行うこともできる。例えば、図５では、標識材１７に固定された第一のリガンド分子１４と、リガンド分子固定粒子６を同時に容器７に入った検体８に添加している。同時に添加する場合、反応時間の短縮が期待できるため好ましい。また、第二のリガンド分子を有する前記リガンド分子固定粒子６と標的物質９をあらかじめ反応させておき、リガンド分子固定粒子６と標的物質９の複合体である第一の複合体を第一のリガンド分子１４に反応させることもできる。
【００５０】
なお、（Ｉ）、（ＩＩ）の工程間、および、（ＩＩ）の工程後には図５（ウ）に示すように、形成した複合体Ｃ２６を磁石１１で特定部分に集めた状態で洗浄するなどの洗浄工程を入れることもできる。洗浄工程を入れることにより、未反応の標的物質や前記リガンド分子固定粒子を除去することによりシグナル‐ノイズ比を向上させることが期待できる。
【００５１】
また、（ＩＩＩ）の工程では、図３（Ｃ）および図４（ｄ）に示す前記第一のリガンド分子１４および第二のリガンド分子１５に捕捉された標的物質９を検出する。標的物質９の検出方法としては、図３（Ｃ）および図４（ｄ）に示すように、基体１３が検出部を有することにより、基体１３の表面に固定された第一のリガンド分子１４とリガンド分子固定粒子が有する第二のリガンド分子１５とに捕捉された標的物質９の有無もしくは数を直接的もしくは間接的に検出部によって検出しても良い。また、図５（エ）のように、溶液中に存在する状態で、第二のリガンドに結合した標識材１７を使って検出しても良い。さらに、溶液中に存在する複合体Ｃ２６を溶液中から取り出して（カ）のように検出基体１８の表面に固定させてから検出しても良い。ここで、「直接的に検出する」とは、基体上に固定されたコア粒子５、リガンド分子固定粒子６、および、標識材１７の少なくともいずれかを検出するものであれば良い。また、「間接的に検出する」とは、コア粒子５、リガンド分子固定粒子６、および、標識材１７の少なくともいずれかを基体上から離れた位置で検出するものであれば良い。
【００５２】
なお、検出基体１８の表面上に複合体Ｃ２６を固定する方法としては、前記検出基体に特異的に粒子を固定できれば、如何なる方法でも良い。例えば、粒子に磁性体を用いた場合、磁力を用いて検出基体表面に固定できる。また、前記リガンド分子固定粒子は電荷を有しているので、検出基体に電圧を印加し分極させることで、静電的相互作用により前記複合体Ｃを検出基板表面に固定できる。最後に、検出基体表面に固定された前記複合体Ｃを直接的もしくは間接的に検出することで、標的物質を検出する。
【００５３】
固定された複合体Ｃの有無あるいは数を検出する方法は、試料中の標的物質の有無あるいは濃度を検出する方法であれば、如何なる方法でもよい。例えば、粒子に磁性体を用いた場合、磁界効果を利用する方式として、基体に磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、磁気インピーダンス素子、超電導量子干渉計素子を用いることができる。また、粒子に蛍光物質を用いた場合、光検出を利用する方式として、プレートリーダを用いた発光、蛍光、燐光測定法を用いることができる。また、粒子に電気化学的活性物質を用いた場合、電気化学的検出を利用する方式として、基体に電極を用いたサイクリックボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー、アンペロメトリー、クーロメトリーなどの測定方法を用いることができる。また、直接的に粒子を測定する方式として、ＳＥＭ測定やＴＥＭ測定による粒子数をカウントする方法や、ＭＳ測定により分子量を測定する方法を用いることができる。
【００５４】
なお、上記材料、粒子、基体などを用いて標的物質検出キットとすることもできる。
【００５５】
例えば、
１−１）第一のリガンド分子が固定された検出基体
１−２）第二のリガンド分子を有する前記リガンド分子固定粒子
または、
２−１）第一のリガンド分子が固定された検出基体
２−２）前記リガンド分子固定ポリマー
２−３）コア粒子
または、
３−１）第一のリガンド分子を有するリガンド分子固定粒子
３−２）第二のリガンド分子を有する標識材
３−３）検出基体
を備えていることを特徴とするキットである。
【００５６】
前記検査キットでは、標的物質を含む試料を、前記１−１）、２−１）、３−１）で示すリガンド分子が固定された検出基体表面、およびリガンド分子固定粒子に滴下することで、前記１−２）、２−３）、３−２）に示すリガンド分子固定粒子、コア粒子、および、標識材が、検出基体上に固定化され、リガンド分子固定粒子、コア粒子、および、標識材の有無や数を検知することにより、試料中の標的物質の有無や濃度を検出することが可能である。
【００５７】
前記検査キットは、リガンド分子固定粒子、コア粒子、および、標識材を、直接的もしくは間接的に検出することで、試料中の標的物質の有無、および、濃度を検出することが可能である。
【００５８】
なお、リガンド分子を「第一」および「第二」とする表記は、サンドイッチ法などの二つのリガンド分子を用いる場合に、リガンド分子固定粒子、リガンド分子固定ポリマー、標識材および検出基体などの材料のうちのいずれが有するものかを区別するために用いる。そして、サンドイッチ法に用いる場合は、通常、第一のリガンド分子と第二のリガンド分子には標的物質の互いに異なる領域を捕捉するものを用いることが好ましい。例えば、「第一のリガンド分子が固定化された検出基体」と、「第二のリガンド分子を有する本発明に係るリガンド分子固定粒子」とを有する検査キットでは、第一のリガンド分子は、検出基体が備えるリガンド分子であることを示し、第二のリガンド分子は、リガンド分子固定粒子が備えるリガンド分子であることを示す。
【実施例】
【００５９】
（実施例１）
本実施例は、リガンド分子に抗体を用いた場合のリガンド分子固定ポリマーの作製例、および、リガンド分子固定粒子の作製例である。
【００６０】
＜１−１．リガンド分子固定ポリマーの作製＞
リガンド分子として抗体を用い、図７に示すスキームによりリガンド分子固定ポリマー（以下、抗体固定ポリマー１と呼ぶ）を作製した。
【００６１】
（化合物２の合成）
ジメチルスルホキシド  ５００μＬ（キシダ化学  社製）中に、スチレン−ａｌｔ−無水マレイン酸コポリマー（分子量〜３６００００、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０ｍｇとアミノ化メトキシポリエチレングリコール（ＭＥＰＡ）（平均分子量２０００）（日本油脂  社製）を０．２  ｍｇ加え、室温で一昼夜反応させた。反応後、この溶液をマイクロコンＹＭ−１００（ミリポア社製）にアプライし、１２０×１００ｒｐｍ、１０分で遠心させ、未反応ＭＥＰＡを除去した。フィルター上部に得られた溶液を回収し、この溶液を一昼夜透析させ、透析後、この溶液を凍結乾燥させることで化合物２を得た。化合物２の同定は、ＦＴ  ＩＲ測定、1Ｈ  ＮＭＲ測定で行った。
【００６２】
（化合物３の合成）
得られた化合物２  ３５ｍｇを５０％ＤＭＳＯを含む０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）５００μＬに溶かした後、この溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（東京化成  社製）を５ｍｇ加え完全に溶解させた。この溶液にＷＳＣＩ（Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（アルドリッチ社製）を５ｍｇ徐々に加え、室温で３時間攪拌させた。３時間後、この反応溶液をＮＡＰ１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、ＭｉｌｌｉＱ水を用いて目的由来成分を精製した。分取した溶液を凍結乾燥させることで、化合物３を得た。化合物３の同定は、ＦＴ  ＩＲ測定、1Ｈ  ＮＭＲ測定で行った。
【００６３】
（化合物１、抗体固定ポリマー１の合成）
得られた化合物３  １０ｍｇを０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）５００μＬに溶かした後、この溶液に抗体１ｍｇを加え、室温で３時間反応させた。反応後、この反応溶液をマイクロコンＹＭ−１００にアプライし、１２０×１００ｒｐｍ、１０分で遠心させ、フィルター上部に得られた溶液を回収した。得られた溶液からゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＡＫＴＡ，ＧＥヘルスケア社製）を用いて目的物由来の成分を分取した。得られた溶液を再度、マイクロコンＹＭ−１００で濃縮し、目的物である化合物１を得た。化合物１の同定は、ＦＴ  ＩＲ測定、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ測定、ＵＶ  ｖｉｓスペクトル測定を用いて行った。得られたＵＶ  ｖｉｓスペクトル結果を図８に示す。ＵＶ  ｖｉｓスペクトル測定の結果からは、スチレン由来の吸収（λ＝２６０ｎｍ）と抗体由来の吸収（λ＝２８０ｎｍ）が得られ、目的物であると判断した。また、それぞれの吸光度から１ポリマー内に導入された抗体量を算出したところ、およそ１ポリマー内に１抗体導入されることがわかった。
【００６４】
＜１−２．リガンド分子固定粒子の作製＞
得られた抗体固定ポリマー１を用いてリガンド分子固定粒子（以下、抗体固定粒子と呼ぶ）を作製した。コア粒子としては、直径２００ｎｍ、表面アミノ化のフルオロセイン内包蛍光粒子（インビトロジェン社製）、および、直径２００ｎｍ、表面アミノ化のフェライト内包磁性粒子（ａｄｅｍｔｅｃｈ社製）を使用した。まず、粒子を予め使用するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。洗浄後、１ｍｇ／ｍＬの粒子に抗体固定ポリマーを０．００１，０．０１，０．０５，０．１，０．５，１ｍｇ（それぞれ１粒子に対して、×１０，×１００，×５００，×１０００，×５０００，×１００００の個数比で抗体固定化ポリマーを加えた）を加え、リン酸緩衝液中で室温で１時間反応させた。反応後、溶液に３０秒程度超音波をかけ、遠心分離機により所定回転数、所定時間で遠心した。遠心後、上清溶液を除去し、これにリン酸緩衝溶液を５００μＬ加えた。この操作を４回程度繰り返し、未反応の抗体固定ポリマーを除去した。精製後、１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、１％ＢＳＡ溶液、０．０５％ＴＷＥＥＮを含む溶液中で保存した。上記操作により、目的物である抗体固定粒子を得た。
【００６５】
＜１−３．作製した抗体固定粒子の分散性評価＞
作製した抗体固定粒子の特性として、粒子の分散性を評価した。抗体固定粒子の分散性は、動的光散乱測定法を用いて評価した。１−２で作製した６種類の抗体固定粒子（それぞれ１粒子に対して、×１０，×１００，×５００，×１０００，×５０００，×１００００の個数比で抗体固定化ポリマーを加えた６種類の粒子）１μｇ／ｍＬ溶液を用意し、この溶液をダイナミック光散乱光度計（大塚電子  社製）で測定し、抗体固定粒子の平均粒子径、および、粒径分布を解析し、粒子の分散性を評価した。比較として、従来法である物理固定法で作製された抗体固定化粒子  １μｇ／ｍＬ溶液を用意し、この溶液をダイナミック光散乱光度計で測定して、抗体固定粒子の平均粒子径を求めた。
【００６６】
図９は、それぞれの粒子に対して得られた平均粒子径をプロットしたものである。図９に示す本手法とは１粒子に対して抗体固定ポリマーを個数比で×１０，×１００，×５００，×１０００，×５０００加えて作製した粒子を示し、物理固定とは１粒子に対して抗体のみを個数比で×１０，×１００，×５００，×１０００，×５０００加えて、抗体を疎水性相互作用や静電相互作用などで粒子表面に固定化し作製された粒子を示す。図９の結果から、本手法で作製された粒子は、物理固定によって作製された粒子に比べ平均粒子径が小さく、分散性に優れていることがわかった。これは、本抗体固定ポリマーを粒子に固定化した際、ポリマー内の親水部（ＰＥＧ）が粒子表面の外側に位置し、粒子の凝集を防止するためである。一方、物理固定の場合、抗体を固定化した際に表面の電荷が中和されるため、粒子の凝集が促進されてしまい、平均粒子径が大きくなる。
【００６７】
＜１−４．作製した抗体固定化粒子表面上の固定抗体数の算出＞
抗体固定化粒子表面上の固定抗体数の算出は、上記１−２の操作において遠心分離精製で得られた未反応の抗体固定ポリマー量を定量した。回収した未反応の抗体固定ポリマーを６μＬマイクロウェルプレート（パーキンエルマー社製）上に加え、これにＢｒａｄｆｏｒｄ指示薬（コスモバイオ社製）２００μＬを加えた。５分後、このプレートを蛍光プレートリーダ（パーキンエルマー社製）にセットし、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度から、未反応の抗体固定ポリマー量を定量した。得られた未反応の抗体固定ポリマー量から、粒子表面に固定化された抗体数を求めた。比較として、従来法である物理固定、および、化学固定で作製した抗体固定化粒子を用いて、上記と同様の操作で粒子表面に固定化された固定化抗体数を求めた。
【００６８】
図１０は、それぞれの粒子に対して求めた１粒子当たりの固定化抗体数をプロットしたものである。図１０に示す本手法、及び物理固定とは、上記１−３に示した作製方法と同様の方法を示し、化学固定法とは、１粒子に対して抗体のみを個数比で×１０，×１００，×５００，×１０００，×５０００加え、アミド結合を介して粒子上に抗体を固定化し作製されたものである。図１０の結果から、１粒子に対して抗体固定ポリマーを個数比で×５００，×１０００，×５０００，加えて作製した粒子は、物理固定、および、化学固定された粒子に比べ、抗体固定化効率が高く、多数の抗体を固定化できることがわかった。
【００６９】
＜１−５．作製した抗体固定化粒子の親和性評価＞
作製した抗体固定粒子の標的物質に対する親和性を評価した。評価法は、抗体固定化蛍光粒子を用いて、図６に示すマイクロウェルプレートを用いたサンドイッチイムノアッセイにより行い、得られた蛍光強度の値から評価した。以下に、サンドイッチイムノアッセイの実験手順に関して記述する。表面ポリスチレンの９６穴マイクロウェルプレート１９（パーキンエルマー社製）を用意し、ウェル２０内に第一のリガンド分子として１０μｇ／ｍＬの抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を１００μＬ加え、一昼夜４℃で静置させ、抗体をプレート上に固定化させた。固定化後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、１％  スキムミルク溶液を２００μＬウェルに加え、２時間、室温で静置させ、ブロッキング剤でブロックした。２時間後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、１μｇ／ｍＬの人絨毛性ゴナトトロピン（ロート製薬社製）を１００μＬウェルに加え、２時間、室温で静置させ、反応させた。２時間後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、２×１０10  粒子／ｍＬの作製した抗体固定蛍光粒子を１００μＬウェルに加え、１時間以上、室温で攪拌反応させた。１時間以上経過した後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄し、１００μＬのリン酸緩衝液をウェルに加えた。このプレートを検出装置２２である蛍光プレートリーダにセットし、蛍光エネルギー１００００、照射時間１秒で、各ウェルに波長４８５ｎｍの光を照射し、波長５３５ｎｍの蛍光強度を得た。得られた蛍光強度は、標的物質に対して反応している粒子量に対応するため、この値から粒子の親和性を評価することができる。
【００７０】
比較として、従来法である物理固定、および、化学固定で作製した抗体固定粒子を用いて、上記と同様の操作で蛍光強度を求めた。図１１は、１粒子に対して抗体固定ポリマーを個数比で×１０００加えて作製した粒子を用いて、抗原（標的物質）が１μｇ／ｍＬにおけるそれぞれ粒子の蛍光強度を示している。得られた蛍光強度を比較することで、本手法で作製した粒子は、他の粒子に比べ親和性の高いことがわかった。
【００７１】
次に、１−２で作製した５種類の抗体固定粒子（それぞれ１粒子に対して個数比で、×１０，×１００，×５００，×１０００，×５０００で抗体固定化ポリマーを加えて作製した５種類の粒子）を用いて、上記と同様の実験から得られた蛍光強度から粒子の親和性を比較した。図１２は、抗原（標的物質）が１μｇ／ｍＬにおけるそれぞれ粒子の蛍光強度を示している。得られた蛍光強度から、コア粒子１粒子に対して×１０００倍量の抗体固定化ポリマーを加えて作製した粒子が、５種類の粒子中で最も親和性が高いことがわかった。
【００７２】
（実施例２）
本実施例は、前記抗体固定粒子を分離担体として用いた場合のＢ／Ｆ分離例である。
【００７３】
＜２−１．遠心沈殿法による標的物質のＢ／Ｆ分離＞
標的物質として人絨毛性ゴナトトロピンを含む試料に、実施例１で作製した抗体固定粒子を１ｍｇ／ｍＬとなるように加える。この溶液を室温で１５分以上、インキュベーションさせる。インキュベーション後、この溶液を遠心分離機にかけ、抗体固定粒子を沈殿させる。上清を除去した後、沈殿した抗体固定粒子を攪拌により分散させる。この操作を３回以上繰り返す。上記の操作により、試料中に含まれる人絨毛性ゴナトトロピンのみ抗体固定粒子に結合させ、試料中の夾雑物は除去される。
【００７４】
得られた抗体固定粒子に人絨毛性ゴナトトロピンが結合しているかどうかの確認を行うため、実施例１に示したマイクロウェルプレートを用いたサンドイッチイムノアッセイにより評価する。操作は以下のとおりである。マイクロウェルプレートに第一のリガンド分子として１０μｇ／ｍＬの抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体を１００μＬ加え、一昼夜４℃で静置させ、抗体をプレート上に固定化させる。固定化後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、１％スキムミルク溶液を２００μＬウェルに加え、２時間、室温で静置させ、マスキングする。２時間後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、上記の操作で得られた抗体固定粒子を１００μＬウェルに加え、１時間以上、室温で攪拌させ、反応させる。反応後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、１００μＬのリン酸緩衝液をウェルに加える。このプレートを蛍光プレートリーダにセットし、蛍光エネルギー１００００、照射時間１秒で、各ウェルに波長４８５ｎｍの光を照射し、波長５３５ｎｍの蛍光強度を得る。得られた蛍光強度から、抗体固定粒子上に結合している人絨毛性ゴナトトロピン量を見積もり、抗体固定粒子のＢ／Ｆ分離能について比較評価する。ここで示す比較対照粒子は、従来法とされる化学固定法、および、物理固定法に基づいて作製された直径２００ｎｍの抗体固定粒子とする。
【００７５】
＜２−２．磁気ハンドリングによる標的物質のＢ／Ｆ分離＞
実施例１の１−１項で得られた抗体固定ポリマーを用いて、抗体固定磁性粒子を作製する。粒子は、直径２００ｎｍ、表面アミノ化、フェライト粒子内包磁性粒子（ａｄｅｍｔｅｃｈ社製）を使用する。まず、磁性粒子を予め使用する緩衝液で洗浄する。洗浄後、１ｍｇ／ｍＬの磁性粒子に抗体固定ポリマー溶液１ｍｇを加え、緩衝液中で２５℃、１時間以上反応させる。反応後、溶液に３０秒程度超音波をかけ、磁石により抗体固定磁性粒子と未反応の抗体固定ポリマーを分離し、未反応の抗体を除去する。この操作を４回程度繰り返す。精製後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１％ＢＳＡ溶液、０．０５％ＴＷＥＥＮを含む溶液中で保存する。
【００７６】
以下、図２に示す方法で磁気ハンドリングによるＢ／Ｆ分離を行う。上記の操作で作製したαサブユニット認識抗体固定粒子１ｍｇ／ｍＬと、標的物質として人絨毛性ゴナトトロピンを含む試料液を混合し、室温で１５分以上、インキュベーションさせる。インキュベーション後、この溶液に磁石を当て、混合溶液中から抗体固定粒子を分離させる。この状態で上清を除去した後、分離した抗体固定粒子を攪拌により分散させる。この操作を３回以上繰り返す。上記の操作により、試料中に含まれる人絨毛性ゴナトトロピンのみ抗体固定粒子に結合させ、試料中の夾雑物は除去される。
【００７７】
得られた抗体固定粒子に人絨毛性ゴナトトロピンが結合しているかどうかの確認を行うため、抗体固定粒子に蛍光色素を有する抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体をサンドイッチ反応させ、蛍光色素の蛍光強度を用いて評価する。操作は以下のとおりである。得られた抗体固定粒子に、フルオロセインを有する抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体を最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう加え、室温で１５分以上攪拌させる。反応後、この溶液に磁石を当て、混合溶液中から抗体固定粒子を分離させる。この状態で上清を除去した後、分離した抗体固定粒子を攪拌により分散させる。この操作を３回以上繰り返す。精製後、この溶液を蛍光光度計（日立製作所  社製）、または、蛍光プレートリーダにより、波長４８５ｎｍの光を照射し、波長５３５ｎｍの光を検出する。得られた蛍光強度から、抗体固定粒子上に結合している人絨毛性ゴナトトロピン量を見積もり、抗体固定粒子のＢ／Ｆ分離能について比較評価する。ここで示す比較対照粒子は、特開昭５９−１３５８８７号公報で示された製法に基づいて作製された直径２００ｎｍの抗体固定粒子とする。
【００７８】
（実施例３）
本実施例は、実施例１で作製した抗体固定粒子、および、抗体固定ポリマーをラベル剤として用いた場合のサンドイッチイムノアッセイによる標的物質の検出例である。本実施例では、サンドイッチイムノアッセイを行うため、基体にマイクロウェルプレート、標的物質に人絨毛性ゴナトトロピン、第一のリガンド分子に抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体を用い、蛍光プレートリーダによる標的物質の検出を行った。
【００７９】
＜３−１．抗体固定粒子をラベル剤として用いたサンドイッチイムノアッセイ＞
表面ポリスチレンの９６穴マイクロウェルプレートを用意し、ウェル内に第一のリガンド分子として１０μｇ／ｍＬの抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体を１００μＬ加え、一昼夜４℃で静置させ、抗体をプレート上に固定化した。固定化後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、１％スキムミルク溶液を２００μＬウェルに加え、２時間、室温で静置させ、マスキングする。２時間後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬの人絨毛性ゴナトトロピンを１００μＬウェルに加え、２時間、室温で静置させ、反応させた。２時間後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、実施例１−２項で作製したαサブユニット認識抗体を有する抗体固定蛍光粒子２×１０10粒子／ｍＬを１００μＬウェルに加え、１時間以上、室温で攪拌反応させた。１時間以上経過した後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄し、１００μＬのリン酸緩衝液をウェルに加えた。このプレートを蛍光プレートリーダにセットし、蛍光エネルギー１００００、照射時間１秒で、各ウェルに波長４８５ｎｍの光を照射し、波長５３５  ｎｍの蛍光強度を得た。加えた人絨毛性ゴナトトロピン濃度に対して、得られた蛍光強度をプロットすることで、検量線が得られた。比較として、従来法である物理固定、および、化学固定で作製した抗体固定粒子を用いて、上記と同様の操作で蛍光強度を求めた。図１３は、得られた検量線を示している。得られた検量線を比較することで、本手法で作製した粒子は、他の粒子に比べ、検出感度が１桁以上高いことがわかった。
【００８０】
＜３−２．抗体固定ポリマーを用いたサンドイッチイムノアッセイ＞
表面ポリスチレンの９６穴マイクロウェルプレートを用意し、ウェル内に第一のリガンド分子として１０μｇ／ｍＬの抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体を１００μＬ加え、一昼夜４℃で静置させ、抗体をプレート上に固定する。固定後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、１％スキムミルク溶液を２００μＬウェルに加え、２時間、室温で静置させ、マスキングする。２時間後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬの人絨毛性ゴナトトロピンを１００μＬウェルに加え、２時間、室温で静置させ、反応させる。２時間後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄した後、実施例１−１項で作製したαサブユニット認識抗体を有する抗体固定ポリマー、１μＭを１００μＬウェルに加え、１時間以上、室温で攪拌反応させる。１時間以上経過した後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄し、これに直径２００ｎｍ、表面アミノ化蛍光粒子１×１０11粒子／ｍＬを１００μＬウェルに加え、１時間以上、室温で攪拌反応させる。１時間以上経過した後、プレートをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬで３回洗浄し、１００μＬのリン酸緩衝液をウェルに加える。このプレートを蛍光プレートリーダ（パーキンエルマー社製）にセットし、蛍光エネルギー１００００、照射時間１秒で、各ウェルに波長４８５ｎｍの光を照射し、波長５３５ｎｍの蛍光強度を得る。加えた人絨毛性ゴナトトロピン濃度に対して、得られた蛍光強度をプロットすることで、検量線が得られる。
【００８１】
（実施例４）
本実施例は、実施例１で作製した抗体固定粒子を担体として用いた場合のサンドイッチイムノアッセイによる標的物質の検出例である。本実施例では、検出基体にマイクロウェルプレート、標的物質に人絨毛性ゴナトトロピン、標識材にフルオロセインを有する抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体を用い、蛍光プレートリーダによる標的物質の検出を行う。
【００８２】
実施例１−２項で作製したαサブユニット認識抗体を有する抗体固定磁性粒子溶液に、標的物質として人絨毛性ゴナトトロピン溶液が最終濃度１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬになるように加え、さらにこの溶液にフルオロセインを有する抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体を最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう加え、室温で１５分以上攪拌させる。反応後、この溶液に磁石を当て、混合溶液中から抗体固定粒子を分離させる。この状態で上清を除去した後、分離した抗体固定粒子を攪拌により分散させる。この操作を３回以上繰り返す。精製後、この溶液を蛍光光度計（日立製作所  社製）、または、蛍光プレートリーダにより、波長４８５ｎｍの光を照射し、波長５３５ｎｍの光を検出する。加えた人絨毛性ゴナトトロピン濃度に対して、得られた蛍光強度をプロットすることで、検量線が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明におけるリガンド分子固定粒子の一例の模式図である。
【図２】リガンド分子固定粒子を分離担体として用いたＢ／Ｆ分離法を説明する模式図である。
【図３】リガンド分子固定粒子をラベル剤として用いた標的物質の検出法を説明する模式図である。
【図４】リガンド分子固定ポリマーと粒子を組み合わせた標的物質の検出法を説明する模式図である。
【図５】リガンド分子固定粒子を担体として用いた標的物質の検出法を説明する模式図である。
【図６】マイクロウェルプレートを用いたサンドイッチイムノアッセイを説明する模式図である。
【図７】リガンド分子固定ポリマーの合成スキームの図である。
【図８】リガンド分子固定ポリマーのＵＶ  ｖｉｓスペクトル測定の図である。
【図９】各粒子の平均粒子径を比較した図である。
【図１０】各粒子の固定抗体数を比較した図である。
【図１１】抗原（標的物質）が１μｇ／ｍＬにおける各粒子の蛍光強度を比較した図である。
【図１２】抗原（標的物質）が１μｇ／ｍＬにおける各粒子の蛍光強度を比較した図である。
【図１３】各粒子の検量線を示した図である。
【符号の説明】
【００８４】
１  リガンド分子
２  疎水性基
３  親水性部位
４  電荷を有する基
５  コア粒子
６  リガンド分子固定粒子
７  容器
８  試料
９  標的物質
１０  夾雑物
１１  磁石
１２  ピペット
１３  基体
１４  第一のリガンド分子
１５  第二のリガンド分子
１６  リガンド分子固定ポリマー
１７  標識部位
１８  検出基体
１９  ウェルプレート
２０  ウェル
２１  ブロッキング剤
２２  検出装置
２３  標的物質の検量線
２４  標的物質が存在しない場合の検量線
２５  複合体Ａ
２６  複合体Ｃ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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