(57)【要約】      （修正有）【課題】分子生物学的プロトコルを利用して、ＤＮＡ構造体を作製し、このＤＮＡ構造体の基板上での精確な位置決めを行う方法を提供する。【解決手段】（ａ）原子間力顕微鏡を用いた陽極酸化により該基板上に陽極酸化膜のアンカーポイントを等間隔に形成する；（ｂ）該アンカーポイントをシランカップリング剤によりコーティングする；（ｃ）該コーティングされたアンカーポイントにストレプトアビジンを固定する；（ｄ）ビオチン標識されたＤＮＡ構造体を該ストレプトアビジンと結合させる；そして（ｅ）該ナノ粒子の懸濁液を滴下し、静置し、及び乾燥させることにより、該ナノ粒子と該ＤＮＡ構造体を固定させて、ナノ粒子／ＤＮＡ構造体の複合体を形成させることを含み、該ＤＮＡ構造体のサイズは、該ナノ粒子のサイズに適合する、ナノ粒子をシリコン基板上に等間隔に配列させたナノ粒子配列基板の製造方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子をシリコン基板上に等間隔に配列させたナノ粒子配列基板の製造方法であって、下記のステップ：
（ａ）原子間力顕微鏡を用いた陽極酸化により該基板上に陽極酸化膜のアンカーポイントを等間隔に形成する；
（ｂ）該アンカーポイントをシランカップリング剤によりコーティングする；
（ｃ）該コーティングされたアンカーポイントにストレプトアビジンを固定する；
（ｄ）ビオチン標識されたＤＮＡ構造体を該ストレプトアビジンと結合させる；そして
（ｅ）該ナノ粒子の懸濁液を滴下し、静置し、及び乾燥させることにより、該ナノ粒子と該ＤＮＡ構造体を固定させて、ナノ粒子／ＤＮＡ構造体の複合体を形成させる；
を含み、ここで、該ＤＮＡ構造体のサイズは、該ナノ粒子のサイズに適合する前記方法。
【請求項２】
隣接するアンカーポイントが、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの等間隔で形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アンカーポイントが、正方格子で整列する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各アンカーポイントが、直径１０ｎｍ〜１００ｎｍの円形である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
シランカップリング剤が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、及びβ−アミノエチルアミノプロピルトリメトキシシランからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）において、各アンカーポイントに１〜５個のストレプトアビジンが固定される、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ構造体が、直径５ｎｍ〜１００ｎｍの環状ＤＮＡを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により製造されたナノ粒子配列基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、量子ドットなどのナノ粒子を基板上に位置決めして単一粒子として配列させるナノ粒子配列基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノテクノロジーを応用した加工手法として、原子や分子を積み上げてデバイスを構築させるボトムアップ的手法が着目されている。その手法の１つに、生体高分子であるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が有する自己組織化能に着目し、ＤＮＡを足場としてナノ構造体を作製することで微細加工技術を構築しようとする研究が近年盛んに進められている。
【０００３】
ＤＮＡを利用して構造体を作製する分野の研究は、ＤＮＡコンピュータの開発を目的として、Ｓｅｅｍａｎら（非特許文献１）によって先駆的な研究が進められ、現在まで、ＤＮＡの塩基配列をプログラミングによって設計し、正方形及びスマイルマーク形状、タイル形状、チューブ形状、星型、カゴ形状の構造体を作製することが可能になっている（非特許文献２及び３）。また、近年、Ｙａｎ及びＭａｏらによって、ＤＮＡ構造体を利用したタンパク質などの識別素子などが報告されている（非特許文献４）。
【０００４】
一方、ＤＮＡとタンパク質を組み合わせた構造体の作製についても報告されている。Ｎｉｅｍｅｙｅｒらは、末端をビオチン標識したＤＮＡとストレプトアビジンとの結合によって環状ＤＮＡを作製する手法を報告している（非特許文献５）。この手法については、環状ＤＮＡ同士が結合しない構造になっているため、大型かつ広範囲にＤＮＡ構造体が作製できないという問題点が挙げられる。また、ＤＮＡ構造体の変形に関しては、ＹａｎおよびＮｉｅｍｅｙｅｒらによって報告はされているが、基礎研究として取り組むべき点が多い研究分野である。
【０００５】
以上のように、複雑な形状のＤＮＡ構造体の作製手法が、近年盛んに報告されており、ＤＮＡ構造体の特定の部位にタンパク質やナノ粒子を標識すること、ＤＮＡ構造体に変形機能を付加することにより、更に複雑なナノ構造体を作製することが可能になると期待されている。
【０００６】
しかしながら、従来の手法は、分子の熱エネルギーや分子構造の歪みエネルギーなどの計算を用いて、塩基配列の設定を行うプログラミング作業が必須であり、高度な演算処理技術が要求される。そのため、バイオインフォマティクスなどの情報処理に携わらない研究者には扱いが困難であるという問題点が挙げられる。さらに、従来の配列手法は、基板上の化学物質と表面修飾したナノ粒子との反応により粒子を固定化しているが、粒子群としての取り扱いのため、複数の粒子が同一位置に結合する等、粒子密度のバラツキが生じていた。
【０００７】
また、複雑な形状のＤＮＡ構造体の作製技術は報告されているが、ＤＮＡを足場としてナノ構造体を作製することを実現させるためには、ＤＮＡ構造体を精確に位置決めする技術が更に必要となる。しかしながら、従来のＤＮＡ構造体はマイカ基板や高配向熱分解黒鉛（Ｈｉｇｈｌｙ  Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｐｙｒｏｌｙｔｉｃ  Ｇｒａｐｈｉｔｅ：ＨＯＰＧ）の上にランダムに配置して観察しており、精確な位置決めは行われていない。
【０００８】
【非特許文献１】Ｎ．Ｃ．Ｓｅｅｍａｎ，日経サイエンス，９月号，ｐｐ．２１−３０，２００４
【非特許文献２】Ｅ．Ｗｉｎｆｒｅｅ，Ｎ．Ｃ．Ｓｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９４，ｐｐ．５３９−５４４，１９９８
【非特許文献３】Ｐ．Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ，Ｎａｔｕｒｅ，４４０，ｐｐ．２９７−３０２，２００６
【非特許文献４】Ｈ．Ｙａｎ，Ｓ．Ｈ．Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１，ｐｐ．１８８２-１８８４，２００３
【非特許文献５】Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ａｄｌｅｒ，ｅｌ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，ｐｐ．４５５３−６１，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、分子生物学的プロトコルを利用して、ＤＮＡ構造体を作製し、このＤＮＡ構造体の基板上での精確な位置決めを行う方法を提供することである。
また、ＤＮＡ構造体に変形機能を付加させることで、アクチュエーターなどの部品への応用が期待されるため、本明細書では、ＤＮＡ構造体に変形機能を付加させることにも着目した。
【００１０】
本発明は、量子ドットなどのナノ粒子を基板上に位置決めして単一粒子として配列させるナノ粒子配列基板の製造方法を提供することを目的とする。
より具体的には、本発明者らは、（１）ナノリソグラフィー手法により、基板上に固定点（アンカーポイント）を作製し、（２）ナノ粒子の直径に近い環状ＤＮＡを作製し、化学結合によりアンカーポイントに固定し、（３）目的のナノ粒子を化学結合により環状ＤＮＡ内に１粒子ずつ固定する、という方法により量子ドット等のナノ粒子１つ１つを基板上に個別に配置する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、ナノ粒子をシリコン基板上に等間隔に配列させたナノ粒子配列基板の製造方法であって、下記のステップ：
（ａ）原子間力顕微鏡を用いた陽極酸化により該基板上に陽極酸化膜のアンカーポイントを等間隔に形成する；
（ｂ）該アンカーポイントをシランカップリング剤によりコーティングする；
（ｃ）該コーティングされたアンカーポイントにストレプトアビジンを固定する；
（ｄ）ビオチン標識されたＤＮＡ構造体を該ストレプトアビジンと結合させる；そして
（ｅ）該ナノ粒子の懸濁液を滴下し、静置し、及び乾燥させることにより、該ナノ粒子と該ＤＮＡ構造体を固定させて、ナノ粒子／ＤＮＡ構造体の複合体を形成させる；
を含み、ここで、該ＤＮＡ構造体のサイズは、該ナノ粒子のサイズに適合する前記方法が提供される。
【００１２】
本発明の一態様では、本発明のナノ粒子配列基板の製造方法において、隣接するアンカーポイントは、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの等間隔で形成されることが好ましい。さらに好ましくは、アンカーポイントが、正方格子で整列する。
【００１３】
本発明の一態様では、本発明のナノ粒子配列基板の製造方法において、各アンカーポイントは、直径１０ｎｍ〜１００ｎｍの円形であることが好ましい。
【００１４】
本発明の一態様では、本発明のナノ粒子配列基板の製造方法に使用されるシランカップリング剤は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（「γ−ＡＰＴＥＳ」と省略される場合がある）、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、及びβ−アミノエチルアミノプロピルトリメトキシシランからなる群から選択されることが好ましい。
【００１５】
本発明の一態様では、本発明のナノ粒子配列基板の製造方法の工程（ｃ）において、各アンカーポイントに１〜５個のストレプトアビジンが固定されることが好ましい。
【００１６】
本発明によれば、本発明のナノ粒子配列基板の製造方法において使用されるＤＮＡ構造体は、直径５ｎｍ〜１００ｎｍの環状ＤＮＡを含むことが好ましい。
【００１７】
本発明によれば、前記ナノ粒子配列基板の製造方法により製造されたナノ粒子配列基板も提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法により製造されたナノ粒子配列基板は、ナノ粒子の粒径、位置を制御できることから、例えば、量子ドットを用いたセンシングの色制御（粒径、粒子間距離による励起光、発光の波長制御）及びナノ粒子のフィルタリング（粒径による分別）、フィルタリング機構のマイクロＴＡＳ（Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）などの生化学分析装置への応用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、ナノ粒子をシリコン基板上に等間隔に配列させたナノ粒子配列基板の製造方法であって、下記のステップ：
（ａ）原子間力顕微鏡を用いた陽極酸化により該基板上に陽極酸化膜のアンカーポイントを等間隔に形成する；
（ｂ）該アンカーポイントをシランカップリング剤によりコーティングする；
（ｃ）該コーティングされたアンカーポイントにストレプトアビジンを固定する；
（ｄ）ビオチン標識されたＤＮＡ構造体を該ストレプトアビジンと結合させる；そして
（ｅ）該ナノ粒子の懸濁液を滴下し、静置し、及び乾燥させることにより、該ナノ粒子と該ＤＮＡ構造体を固定させて、ナノ粒子／ＤＮＡ構造体の複合体を形成させる；
を含み、ここで、該ＤＮＡ構造体のサイズは、該ナノ粒子のサイズに適合する前記方法、並びに該製造方法により製造されるナノ粒子配列基板に関する。
【００２０】
１．定義
用語「原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＡＦＭ）」は、本明細書中で使用するとき、探針と試料間に働く原子間力を検出することにより、試料の表面形状を測定する装置をいう。原子間力顕微鏡は、１９８６年にＩＢＭのＢｉｎｎｉｎｇによって開発された技術であり、試料表面を非常に鋭い針（カンチレバー）によって表面を走査し、表面形状を測定することを特徴とする。
【００２１】
原子間力顕微鏡には、一般的に、（１）測定用カンチレバー、（２）カンチレバーに照射する半導体レーザー、及び（３）測定試料の走査用スキャナの構成部品が含まれる。試料の表面形状を測定する上で特に重要である測定用カンチレバーは、先端に鋭い深針を有する片持ちはりの形状をしており、原子間力の検出感度や空間分解能を直接決める重要な構成要素である。測定の際には、測定対象に合った先端の鋭い深針の形状、バネ定数、共振周波数の選定が重要になる。
【００２２】
原子間力顕微鏡の測定方式は、（１）コンタクトモード、及び（２）タッピングモードの２種類があり、測定する試料の状態に合わせた測定が可能である。
（１）コンタクトモード
コンタクトモードは、カンチレバーを固定した状態で、測定試料を接近させた際に生じる原子間力が一定になるように走査用スキャナを制御する測定方式である。このコンタクトモードは、測定が容易であるという利点を有するが、接触時に働く強い力や摩擦のために軟性試料を損傷してしまうリスクも有している。そのため、損傷の恐れが少ない半導体材料の表面測定など、剛性材料の測定に適しているといえる。
【００２３】
（２）タッピングモード
タッピングモードは、カンチレバーを振動させた状態で、測定試料を接近させる測定方式である。この測定方式では、接近前にカンチレバーの振動振幅や振動周波数を測定しておく。次に、測定試料とカンチレバーを接近させると、原子間力によって振動振幅や振動周波数が変化する。この変化量が一定になるように走査用スキャナを制御することにより測定を行う。このタッピングモードは、生体試料や破壊されやすい試料に対しても使用可能であり、分解能も高いため、軟性材料の精密測定に適している。
【００２４】
本発明のナノ粒子配列基板の製造方法においては、上述した原子間力顕微鏡を用いて、シリコンなどの基板上に陽極酸化膜のアンカーポイントを形成させることが好ましい。しかしながら、該アンカーポイントを形成させることができる装置あれば、原子間力顕微鏡の使用に限定されない。なお、後述するように、実施例２では、ＤＮＡ構造体はタッピングモードを使用して観察した。また、実施例４では、ＤＮＡ構造体の精確な位置決めにおいてコンタクトモードとタッピングモードを併用した。
【００２５】
用語「ナノ粒子」は、本明細書中で使用するとき、微粒子の中でも粒子の直径が１〜数百ナノメートル（ｎｍ）程度の超微粒子をいう。ナノ粒子には、限定されないが、量子ドット、金コロイド、磁性微粒子、フラーレン、カーボンナノチューブが含まれる。好ましくは、量子ドットである。ここで、用語「量子ドット」とは、原子が数百個〜数千個集まった直径１０数〜数１０ｎｍの凝集体をいう。本発明のナノ粒子配列基板の製造方法において使用される量子ドットには、センシングの色制御（粒径、粒子間距離による励起光、発光の波長制御）等の生化学分析装置に応用するための発光性の量子ドット、例えば、カドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）が挙げられる。また、本発明の製造方法には、タンパク質（例えば、抗体）などと共役された蛍光染色用色素として、水中で使用し易いようにポリマーコーティングされた量子ドットも使用することができる。
【００２６】
用語「ＤＮＡ構造体」とは、本明細書中で使用するとき、制限酵素等により適切な長さに調節されたＤＮＡ（デオキシリボ核酸）をいう。供給されるＤＮＡには、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組合せが含まれる。本発明のナノ粒子配列基板の製造方法に使用されるＤＮＡ構造体は、好ましくは、環状ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、より好ましくは環状ＤＮＡであって、さらに、限定されないが、例えば、タンパク質、チオール基、アミノ基、蛍光色素によって標識されたものをいう。なお、ＤＮＡのタンパク質等による標識は、限定されないが、タンパク質等の標識試薬が、ＤＮＡのらせん構造に挿入され、塩基と共有結合され、またはそれらの組合せであってもよい。例えば、使用されるＤＮＡが、環状ＤＮＡである場合、１個の環状ＤＮＡを標識するために導入される試薬の数は、特に限定されず、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００２７】
本発明のナノ粒子配列基板の製造方法に使用されるＤＮＡ構造体は、上記ＤＮＡが、１個〜数個凝集した複合体であってもよい。このような複合体の例としては、環状ＤＮＡ同士による凝集に限定されず、環状ＤＮＡと直鎖状ＤＮＡとの複合体であってもよい。好ましくは、数個の環状ＤＮＡによる複合体である。例えば、ＤＮＡがビオチンによって標識される場合には、１分子のストレプトアビジンが４個のビオチンと結合できる性質に因り、１分子のビオチンで標識された環状ＤＮＡは最大４個の環状ＤＮＡが結合した複合体を形成することができる。また、１個の環状ＤＮＡを数個のビオチンで標識した場合、ストレプトアビジンを介して、環状ＤＮＡを連鎖的に結合させた複合体を形成させることができる。このようにビオチン標識されたＤＮＡ構造体を構成する環状ＤＮＡの数は、２個以上、好ましくは２〜１０個、より好ましくは、２〜６個、さらにより好ましくは２〜３個である。
後述するように、実施例１では、１個の環状ＤＮＡを１分子のビオチンで標識したＤＮＡ構造体を作製し、実施例３では、さらに変形機能を付加させたＤＮＡ構造体を作製した。
【００２８】
本発明のＤＮＡ構造体の作製に使用することができる「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡの３〜８ヌクレオチドからなる特異的配列（認識配列）を識別し、二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼの総称であり、当業者に容易に使用できるものである限り、特に限定されない。
【００２９】
２．ナノ粒子配列基板の製造方法
Ａ．ＤＮＡ構造体の作製
本発明のナノ粒子配列基板の製造方法に使用されるＤＮＡ構造体は、本質的には、（ａ）制限酵素や連結酵素を利用したＤＮＡの切断及び連結、（ｂ）特異的に結合するタンパク質を用いた標識法（アビジン−ビオチン結合）、並びに（ｃ）環状ＤＮＡから切り出された直鎖状ＤＮＡが再度ＤＮＡリングに成り易い、といった上記３つの手法及び特長を利用することにより作製される。
【００３０】
（１）制限酵素を利用したＤＮＡの切断
本発明によれば、上述したように、制限酵素によって切断されたＤＮＡを用いることができる。ここで、本発明のＤＮＡ構造体を製造する際に使用される制限酵素は、（ｉ）切断後のＤＮＡ末端は５’突出末端になること、及び（ｉｉ）１回の処理でＤＮＡが切断できるように緩衝液（ＤＮＡなどに用いる保存溶液）を選択すること、に基づいて選択されることが好ましい。
【００３１】
通常、制限酵素により切断されたＤＮＡは、「５’突出末端」、「平滑末端」、及び「３’突出末端」の３種類に分類することができる。また、切断されたＤＮＡの５’末端はリン酸基が露出し、３’末端は水酸化基が露出した状態になっている。ここで、本発明において使用される下記のライゲーション反応を行う際には、５’突出末端の方が平滑末端及び３’突出末端よりも反応効率が良い。したがって、本発明では、５’突出末端にＤＮＡを切断可能な制限酵素の使用が好ましい。
【００３２】
また、制限酵素を使用する際には、ＤＮＡを専用の緩衝液と混合する必要がある。このバッファーは使用する制限酵素によって種類が異なり、制限酵素の活性（ＤＮＡを切断する能力）が高くなるようにバッファーを選択することが好ましい。しかしながら、２種類以上の制限酵素を使用してＤＮＡを切断する場合、バッファーの交換処理（エタノール沈殿など）を実施すると、ＤＮＡの収量が低下してしまうという問題がある。その際は、バッファーを統一して１回の処理でＤＮＡを切断することにより、ＤＮＡの収量低下を防ぐことができる。本発明では、限定されないが、同一のバッファーで使用できる制限酵素を選択することが好ましい。
【００３３】
（２）ライゲーションによるＤＮＡの結合
本発明によれば、ＤＮＡ同士をつなぎ合わせる酵素としては、二本鎖ＤＮＡの５’−リン酸基末端と３’−水酸基末端をつなぎ合わせ、ホスホジエステル結合の形成を触媒するリガーゼを用いることができる。このようなライゲーションを行う手法は、当業者に周知であり、また、ライゲーションを効率良く行うために、キット（例えば、タカラバイオ社から市販されているＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１）を用いることができる。
【００３４】
（３）アビジン−ビオチン結合
アビジン−ビオチン結合は、蛍光物質や抗体を細胞やタンパク質へ結合させるための媒介として、生物学実験で広く利用されている。例えば、蛍光物質の１つである量子ドットの周囲にストレプトアビジンをコーティングし、標的とする細胞の表面にビオチンを標識することにより、標的細胞の表面に量子ドットを付着させることが可能となり、細胞の変化などを蛍光観察することができる。そこで、本発明では、アビジン−ビオチン結合の高い親和力に着目し、アビジン−ビオチン結合を利用することにより、ＤＮＡ構造体及びナノ粒子配列基板を製造した。
【００３５】
分子量４４０のビオチンと分子量６８，０００の卵白由来のアビジンの親和力（結合力）は非常に高く（Ｋd＝１０-15Ｍ）、特異性が高いと言われている抗原−抗体間の親和力（Ｋd＝１０-9Ｍ）のほぼ１０6倍に匹敵する。アビジンは４個のサブユニットから構成され、各サブユニットが１分子のビオチンと結合する。すなわち、アビジン１分子は、４分子のビオチンと特異的に結合することができる。近年、アビジンの代わりにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ由来のストレプトアビジンが、ビオチンと高い親和性を有するのみならず、細胞への非特異的結合が少ないという特性を有するといった理由から使用されている。したがって、本発明で使用されるアビジンは、好ましくはストレプトアビジンである。
【００３６】
（４）ＤＮＡの環状化
本発明のナノ粒子配列基板の製造方法に使用されるＤＮＡ構造体は、上述した通り、二本鎖の環状ＤＮＡが好ましい。環状構造のＤＮＡとしては、プラスミドＤＮＡが挙げられる。ここで、「プラスミドＤＮＡ」とは、主として細菌細胞内で宿主染色体とは別個に独立して自律的に複製され、安定に保持・伝達される遺伝因子の総称である。使用される環状ＤＮＡとしては、（ｉ）ＤＮＡの複製機能を有していること、（ｉｉ）別のＤＮＡを付け加える（導入する）ことができること、及び（ｉｉｉ）繰り返して安定にＤＮＡ複製が可能であること、といった特徴を有するプラスミドＤＮＡを用いることが好ましい。
【００３７】
プラスミドＤＮＡは、制限酵素によって切断して容易にＤＮＡ断片を切り出すことができる。切り出したＤＮＡ断片の末端が、（ｉ）５’突出末端であること、（ｉｉ）両末端の塩基が相補的に結合する配列になっていること、及び（ｉｉｉ）末端にリン酸基を有すること、の条件を満たす限り、ＤＮＡ末端をライゲーションにより、再度、環状構造を作製することができる。本発明者らは、制限酵素を用いてプラスミドＤＮＡからＤＮＡ断片を切り出し、ビオチン標識したＤＮＡ断片をライゲーションして、ビオチン標識のＤＮＡ構造体を作製することに成功した。さらに、ストレプトアビジンを結合剤として利用することで、１個のストレプトアビジンに対して、最大４個のビオチン標識したＤＮＡ構造体を結合させることができ、この複合体もまた、本発明のＤＮＡ構造体に含まれる。
【００３８】
（５）ＤＮＡ構造体及びその製造方法
上述した通り、本発明のＤＮＡ構造体は、ストレプトアビジンを結合剤として用いることにより、ビオチン標識した環状ＤＮＡを１〜４個結合させた複合体を製造することができる。
【００３９】
１箇所にビオチンを標識した環状ＤＮＡの作製は、まず、プラスミドＤＮＡを制限酵素で切断し、ＤＮＡ断片を切り出す。次に、切り出したＤＮＡ断片（以下、「ベクターＤＮＡ」という）に、予め合成したビオチン標識したＤＮＡ断片（以下、「インサートＤＮＡ」という）をライゲーションする。このように作製されたビオチン（１個）標識した環状ＤＮＡを用いることによって、例えば、下記の３種類のＤＮＡ構造体を作製することができる。なお、本発明で使用することができるプラスミドには、限定されないが、ｐＢＲ３２２、ｐＫＦ３、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐＫＦ１８ｋ−２が挙げられる。好ましくは、ｐＢＲ３２２、ｐＫＦ３である。
【００４０】
また、ベクターＤＮＡの長さに依存して、その後のビオチン標識した環状ＤＮＡの直径を変化させることができる。このようなビオチン標識した環状ＤＮＡの直径は、基板に配列させるナノ粒子のサイズに適合可能であれば、特に限定されないが、好ましくは、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、さらにより好ましくは、約５ｎｍ〜約３０ｎｍである。
【００４１】
（ｉ）ＤＮＡグラス（ＤＮＡ  ｇｌａｓｓｅｓ）
このＤＮＡ構造体は、１箇所にビオチンを標識した環状ＤＮＡを結合させたメガネ形状のＤＮＡ構造体であり、２個のビオチン標識した環状ＤＮＡをストレプトアビジンで連結させることによって作製することができる。ストレプトアビジンは、金ナノ粒子の表面にストレプトアビジンをコーティングしたものを使用することができる。後述するように、実施例２では、ＤＮＡグラスを作製した。
【００４２】
（ｉｉ）ＤＮＡ直列リング（ＤＮＡ  ｓｅｒｉａｌ  ｒｉｎｇｓ）
このＤＮＡ構造体は、１箇所にビオチンを標識した環状ＤＮＡとビオチンを等間隔に配置した直線状ＤＮＡを結合させたＤＮＡ構造体である。ビオチンを等間隔に配置した直線状ＤＮＡは、ビオチン標識したＤＮＡ断片とスペーサーのＤＮＡ断片を交互に組み合わせてライゲーションすることによって作製することができる。ストレプトアビジンを介して、このビオチンを等間隔に配置した直線状ＤＮＡとビオチン標識した環状ＤＮＡを結合させることによって、目的とするＤＮＡ直列リングを作製することができる。
【００４３】
（ｉｉｉ）ＤＮＡチェーン（ＤＮＡ  ｃｈａｉｎｓ）
このＤＮＡ構造体は、２箇所にビオチンを標識した環状ＤＮＡ同士を結合させたＤＮＡ構造体である。２箇所にビオチンを標識した環状ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡから切り出した２種類のベクターＤＮＡとビオチンを標識したインサートＤＮＡをライゲーションすることによって作製することができる。次に、ストレプトアビジンを介して、この２箇所にビオチンを標識した環状ＤＮＡを連鎖的に結合させることによって、目的とするＤＮＡチェーンを作製することができる。
上述したＤＮＡ構造体は、特に限定されないが、前述の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、電気泳動法などにより、容易に評価することができる。
【００４４】
Ｂ．変形機能を有するＤＮＡ構造体の作製
本発明者らは、ナノサイズのアクチュエーターなどに応用するために、ＤＮＡの「スーパーコイル形状」に着目して、前述したＤＮＡ構造体に変形機能を付加させる試みを行った。具体的には、生体内では、通常、ＤＮＡの「畳み込み操作」及び「元の形状に戻す操作」を繰り返すことによって、タンパク質の合成を行っているが、ジャイレース及びトポイソメラーゼという酵素がその役割を担っており、これら酵素を用いて変形機能を有するＤＮＡ構造体を作製した。ここで、トポイソメラーゼは、スーパーコイル形状のＤＮＡの一部に切り欠き（ニック）を入れることで、スーパーコイル形状のＤＮＡを環状ＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡへ変形させることができる。ジャイレースは、環状ＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡを更に捩じって、スーパーコイル形状へ変形させることができる。なお、後述する実施例３において、変形機能を有するＤＮＡ構造体を作製した。
【００４５】
Ｃ．ナノ粒子配列基板の製造方法
本発明のナノ粒子配列基板の製造方法は、（ｉ）原子間力顕微鏡を用いた陽極酸化によりシリコン基板上に陽極酸化膜のアンカーポイントを等間隔に形成させ、（ｉｉ）該アンカーポイントをシランカップリング剤によりコーティングし、（ｉｉｉ）該コーティングされたアンカーポイントにストレプトアビジンを固定し、（ｉｖ）ビオチン標識されたＤＮＡ構造体を該ストレプトアビジンと結合させ、及び（ｖ）該ナノ粒子の懸濁液を滴下し、静置し、及び乾燥させることにより、該ナノ粒子と該ＤＮＡ構造体を固定させて、ナノ粒子／ＤＮＡ構造体の複合体を形成させることを含み、ここで、該ＤＮＡ構造体のサイズは、該ナノ粒子のサイズに適合している。本発明の方法の原理を図１に概説する。
【００４６】
（１）ＤＮＡ構造体の精確な位置決め
ＤＮＡ構造体の精確な位置決めは、ＤＮＡ構造体を土台として分子デバイスやアクチュエーターを作製するために重要な技術である。本発明によれば、ＤＮＡ構造体の精確な位置決めに使用される装置は、本発明の目的を達成することができる限り、いずれの装置であってもよい。典型的には、原子間力顕微鏡を利用することが好ましい。また、本発明のナノ粒子配列基板に使用される基板は、ＤＮＡ構造体を固定するためのアンカーポイントの作製の基礎とする基板表面が原子間力顕微鏡による陽極酸化に適したものであれば、特に限定されない。本発明によれば、リソグラフィー技術を適用することが可能であり、実験プロトコルが確立しており、取り扱いが容易であるという理由からシリコン基板を利用することができる。
【００４７】
また、シリコン基板の表面は凹凸があるため、原子間力顕微鏡による陽極酸化膜を形成させる前に、バッファード・フッ酸（ＢＨＦ）を用いて、適宜、酸化膜を除去してもよい。その後、陽極酸化の位置を確認するためのマーカーを作製し、原子間力顕微鏡の電圧印加機能を用いて、シリコン基板に直流電圧を印加して酸化膜を形成させることができる。
【００４８】
原子間力顕微鏡を用いた陽極酸化には、例えば、セイコーインスツル社ＳＰＡ４００の電圧印加機能を使用することができる。この機能により、大気中の水分子を利用して、シリコン基板の局部に酸化膜が形成される。より具体的には、原子間力顕微鏡のカンチレバー（上記参照）をシリコン基板表面に接近させると、大気中の水分子がカンチレバーおよび基板表面に吸着し、水の表面張力によってカンチレバーと基板の間に極微小な水のカラムが形成される。この状態で、カンチレバーと基板の間に数ボルトの直流電圧を印加すると、シリコン基板表面では、下記の反応式：
Ｓｉ  ＋  ２Ｈ2Ｏ  →  ＳｉＯ2  ＋  ２Ｈ2
に基づいて、水分子を利用した酸化反応が起こり、酸化シリコンと水素が生成される。この現象により、シリコン基板の上に酸化膜が局部的に形成される。なお、酸化反応の関係上、カンチレバー側の電位は負に、シリコン基板側の電位は正になるように電圧を印加する必要がある。
【００４９】
さらに、本発明では、酸化膜を作製した後に、ＤＮＡ構造体を基板表面に吸着させるため、原子間顕微鏡から基板を取り出してもよい。次に、酸化膜が形成された位置を確認するために、リソグラフィーなどの慣用的な技術を用いてマーカーを作製してもよい。例えば、酸化膜を除去したシリコン基板の上に、レジスト膜を塗布し、ベイクを実施して固める。次に、マスクアライナーを用いて、マスクのパターンを露光する。なお、使用したマスクは、従来から報告されているものを使用することができ、マスクには、所定の直径（例えば、３５μｍ）を有する円が所定の間隔（例えば、８０μｍ）でパターン化されてもよい。最後に、現像し、純水を用いてリンスを行ってもよい。マーカーを作製する方法は、上記の方法に限定されず、必要に応じてシリコン基板上に酸化膜の位置確認用マーカーを作製することができる。
【００５０】
本発明の方法は、原子間力顕微鏡を用いた陽極酸化により基板上に陽極酸化膜のアンカーポイントを等間隔に形成させることによって特徴付けられる。本発明によれば、本発明の方法によって、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの等間隔でアンカーポイントを形成させることができる。基板上のアンカーポイントは、好ましくは、正方格子、三角格子、六角格子、より好ましくは正方格子である。
【００５１】
本発明の一態様では、アンカーポイントの形状は、限定されないが、円形であることが好ましい。また、アンカーポイントが円形である場合には、円の直径は、典型的には、１０ｎｍ〜１００ｎｍである。
【００５２】
各アンカーポイントにアビジン（例えば、ストレプトアビジン）を固定するために、予めアンカーポイントをシランカップリング剤によってコーティングすることができる。本発明の製造方法に使用可能なシランカップリング剤は、限定されないが、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、及び  β−アミノエチルアミノプロピルトリメトキシシランが含まれる。好ましくは、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、γ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、より好ましくは３−アミノプロピルトリエトキシシランである。このようなシランカップリング剤によってコーティングされたアンカーポイントに固定させるストレプトアビジンの数は、好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個、最も好ましくは１個である。このようにアンカーポイントに固定されたストレプトアビジンを介して、ビオチン標識した上述のＤＮＡ構造体を結合させることができる。ストレプトアビジンとビオチンとの反応条件は、当業者に周知である。
【００５３】
（２）ナノ粒子／ＤＮＡ構造体の複合体の形成
本発明によれば、ナノ粒子を基板上の環状ＤＮＡ内部に静電気力又は化学結合に固定させることができるが、これに限定されない。より具体的には、ナノ粒子の懸濁液を基板に滴下し、静置し、その後、乾燥させることにより、基板上でナノ粒子／ＤＮＡ構造体の複合体を形成させることができる。このような複合体を形成させるための上記懸濁液の濃度、滴下条件、静置時間、乾燥条件などは、当業者であれば適宜調節することができる。
なお、下記の実施例は、本発明のナノ粒子配列基板の製造方法をより具体的に説明するために例示したものであり、本発明はこれら実施例に限定されない。
【実施例】
【００５４】
実施例１．ＤＮＡ構造体の作製
（１）試料及び試薬
ベクターＤＮＡの作製には、プラスミドＤＮＡとしてｐＢＲ３２２、ｐＫＦ３（タカラバイオ）、制限酵素としてＨｉｎＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ（タカラバイオ）を用いた。制限酵素によるプラスミドＤＮＡの切断処理には、超純水（Ｍｉｌｉ−Ｑ水、１８．３ＭΩｃｍ）、緩衝液を用いた。なお、緩衝液はＭバッファー（タカラバイオ、組成：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）、Ｋバッファー（タカラバイオ、組成：２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、１，０００ｍＭ  ＫＣｌ）を用いた。また、インサートＤＮＡの作製には、一本鎖の合成ＤＮＡ（タカラバイオに合成依頼）を用いた。ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡのライゲーションには、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１（タカラバイオ）を用いた。
【００５５】
アガロースゲル電気泳動に使用するゲルには、アガロース２１（ニッポンジーン）とＴＡＥバッファー（和光純薬、組成：０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ−酢酸、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）を使用した。ゲル内部のＤＮＡの染色溶液には、エチジウムブロマイド溶液（ＥｔＢｒ）（和光純薬）を使用した。電気泳動のゲル片から環状ＤＮＡを抽出するためのキットは、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｔｅｍｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動に使用するゲルには、３０％アクリルアミド溶液（和光純薬、アクリルアミド−ＨＧ）、５×ＴＢＥバッファー（４４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン：ＴＥＭＥＤ（和光純薬）、ペルオキソ二硫酸アンモニウム：ＡＰＳ（和光純薬）を使用した。
【００５６】
アビジン−ビオチン結合の確認用のタンパク質は、ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１．０ｍｇ）を用いた。また、原子間力顕微鏡におけるＤＮＡ構造体の作製用のタンパク質は、ストレプトアビジン標識の金コロイド溶液（ＢＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製、ストレプトアビジン：５ｎｍ金）を用いた。
【００５７】
（２）ベクターＤＮＡの作製
ベクターＤＮＡは、プラスミドＤＮＡを制限酵素によって切断することによって作製した。１箇所にビオチンを標識した環状ＤＮＡ作製用のベクターＤＮＡには、プラスミドＤＮＡであるｐＢ３２２を使用した。ｐＢＰ３２２  ２０μｌにＭバッファー１０μｌ、超純水を６０μｌで混合した後、制限酵素ＮｈｅＩ（１０ユニット／μｌ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（１０ユニット／μｌ）を各５μｌずつ混合して、３７℃、１時間で静置し、長さ２００ｂｐ（理論値：６４ｍｍ）のＤＮＡ断片を得た。また、２箇所にビオチンを標識した環状ＤＮＡ作製用のベクターＤＮＡには、プラスミドＤＮＡであるｐＫＦ３を２個使用した。１つ目のベクターについては、ｐＫＦ３  ２０μｌにＫバッファー１０μｌ、超純水６０μｌを混合した後、制限酵素ＸｈｏＩ（１０ユニット／μｌ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（１０ユニット／μｌ）を各５μｌずつ混合して、３７℃、１時間で静置し、長さ８１ｂｐ（理論値：２８ｎｍ）のＤＮＡ断片を得た。２つ目のベクターについては、先のベクターと同様の混合比で、ｐＫＦ３にＫバッファー、超純水を混合した後、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０ユニット／μｌ）、ＮｈｅＩ（１０ユニット／μｌ）によって３７℃、１時間で静置し、長さ１０６ｂｐ（理論値：３６ｎｍ）のＤＮＡ断片を得た。さらに、エタノール沈殿によりＤＮＡを精製した。
【００５８】
（３）インサートＤＮＡの作製
インサートＤＮＡの作製には、ビオチン標識の一本鎖ＤＮＡおよび相補的に結合する一本鎖ＤＮＡの塩基配列を設計し、ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した（タカラバイオに合成依頼）。また、ビオチン標識は、一本鎖ＤＮＡを合成する際に、ビオチン標識ヌクレオチドを用いることによって行った。ビオチンを１箇所に標識した環状ＤＮＡ用のインサートＤＮＡの塩基配列は、インサートＤＮＡａ：５’−ＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＴＡＣＧＴ−３’（配列番号１）（下線のＧは、ビオチン標識されている）及びインサートＤＮＡｂ：５’−ＣＴＡＧＡＣＧＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号２）である。ビオチンを２箇所に標識した環状ＤＮＡ用のインサートＤＮＡの塩基配列は、（Ｉ）インサートＤＮＡ１ａ：５’−ＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＴＡＣＧＴ−３’（配列番号３）（下線のＧは、ビオチン標識されている）及びインサートＤＮＡ１ｂ：５’−ＣＴＡＧＡＣＧＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号４）、並びに（ＩＩ）インサートＤＮＡ２ａ：５’−ＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＴＡＣＧＴ−３’（配列番号５）及びインサートＤＮＡ２ｂ：５’−ＧＡＴＣＡＣＧＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号６）である。次に、合成した一本鎖ＤＮＡを用いて、二本鎖ＤＮＡの作製を行った。
【００５９】
（４）ベクターＤＮＡ及びインサートＤＮＡの結合による環状ＤＮＡの作製
ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡをライゲーションして、ビオチン標識した環状ＤＮＡを作製した。まず、ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡの濃度（ｗ／ｖ）を分光器（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ，ＤＵ８００）で測定し、それぞれのモル濃度を算出した。次に、ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡのモル濃度比が１：１０になるように混合した。このモル濃度比は、インサートＤＮＡの量を多くすることで、環状ＤＮＡが形成され易くなることを配慮した。電気泳動により、上記モル濃度比が妥当であることを確認した。混合したＤＮＡ溶液は、ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（タカラ、Ｍｏｄｅｌ  ＴＰ６００）を使用して、５０℃で５分加熱した後、−２℃／分の間隔で除冷し、２０℃まで冷却した。この処理により、ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡの末端同士を結合させて、環状ＤＮＡを作製した。また、塩基同士の結合のみでは結合強度が不足していると考えられたため、連結酵素（ｌｉｇａｓｅ）によるライゲーションを実施した。ライゲーションは、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１をＤＮＡ溶液と等量混合し、１６℃で３０分静置させて行った。この処理により、ＤＮＡの糖鎖部分においてホスホジエステル結合が行われ、ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡの結合を強固なものとした。以上の手順により、直径２５ｎｍの１箇所にビオチン標識した環状ＤＮＡ、及び直径２８ｎｍの２箇所にビオチン標識した環状ＤＮＡを作製した。
【００６０】
ライゲーション直後のＤＮＡ溶液には、環状ＤＮＡの他にプラスミドＤＮＡの残りがあるため、アガロースゲル電気泳動を用いて環状ＤＮＡの分離及び抽出を行った。また電気泳動では、ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡのモル濃度比を１：１０で混合した場合には、環状ＤＮＡを検出することができたが、該モル濃度比を１：０．１、１：１とすることによって環状ＤＮＡは検出されなくなった（データ示さず）。この結果から、ビオチン標識の環状ＤＮＡの作製には、ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡのモル濃度比を１：１０で混合することが妥当であることが示唆された。
【００６１】
実施例２．原子間力顕微鏡によるＤＮＡ構造体の確認
ゲル片より抽出した環状ＤＮＡに対して、ストレプトアビジン標識の金コロイド溶液（ＢＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製、ストレプトアビジン：５ｎｍ金）を混合して、ＤＮＡ構造体を作製した。「ＤＮＡグラス」は、ビオチンが１箇所付加された環状ＤＮＡとストレプトアビジン溶液を１０，０００倍希釈したものを混合し、１６℃、１２時間静置後、超純水を加えて作製した。「ＤＮＡ直列リング」は、ビオチン１箇所付加された環状ＤＮＡ、ビオチンを等間隔に配置した鎖状ＤＮＡ（ビオチン間隔２７ｎｍ、長さ３４０ｎｍ）及びストレプトアビジン溶液を１０，０００倍希釈したものを混合し、１６℃、１２時間静置後、超純水を加えて作製した。「ＤＮＡチェーン」は、ビオチンが２箇所付加された環状ＤＮＡとストレプトアビジン溶液を８０，０００倍希釈したものを混合し、１６℃、１２時間静置後、超純水を加えて作製した。次に、作製したＤＮＡ構造体を確認するため、原子間力顕微鏡（ＳＩＩ、ＳＰＡ４００）を用いて観察した。観察条件は、タッピングモード（ＤＦＭ  ｍｏｄｅ）で、カンチレバーはＳＩ−ＤＦ２０（ＳＩＩ、バネ定数１３Ｎ／ｍ）を用いた。観察用の基板は劈開マイカ板を用い、０．０２％（ｖ／ｖ）３−アミノプロピルトリエトキシシラン（γ−ＡＰＴＥＳ）を介してＤＮＡ溶液を基板上に固定した。
【００６２】
原子間力顕微鏡で観察を行った結果、２個の環状ＤＮＡが結合したメガネ形状のＤＮＡ構造体を確認し、本発明で提案した原理によるＤＮＡとタンパク質の複合型ナノ構造体が作製できることが示唆された（図２（ａ）及び（ｂ））。次に、ＤＮＡグラスの原子間力顕微鏡観察結果を用いて、原子間力顕微鏡のソフトウェアの機能である断面プロファイル解析機能を利用して得られた断面図を図２（ｃ）に示す。断面図の測定結果により、環状になっている物体の直径は２１〜２４ｎｍとなり、設計した環状ＤＮＡの直径の理論値（２５ｎｍ）に近似し、構造体の中央部にある物体の直径は１７ｎｍとなり、ストレプトアビジン単体を原子間力顕微鏡で測定した場合の直径（２０ｎｍ）に近似することを確認した。以上の結果より、原子間力顕微鏡で観察したメガネ形状の構造体は、ストレプトアビジンと環状ＤＮＡが結合したＤＮＡグラスであると考えられる。
【００６３】
また、本発明で提案したビオチン標識の環状ＤＮＡは、使用する制限酵素とインサートＤＮＡの塩基配列を変更することにより、環状ＤＮＡの直径を変更するできる。そこで、直径４１ｎｍ、７１ｎｍの環状ＤＮＡを作製し、本発明で提案する原理が有効であることを確認した。直径４１ｎｍの環状ＤＮＡは、ｐＢＲ３２２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（１０ユニット／μｌ）とＮａｍＨＩ（１０ユニット／μｌ）を用いてベクターＤＮＡを作製し、このベクターＤＮＡ及び前述したインサートＤＮＡａ（配列番号１）とインサートＤＮＡ２ｂ（配列番号６）をライゲーションさせて作製した。また、直径７１ｎｍの環状ＤＮＡは、ｐＢＲ３２２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（１０ユニット／μｌ）とＳａｌＩ（１０ユニット／μｌ）を用いてベクターＤＮＡを作製し、このベクターＤＮＡ及びインサートＤＮＡａ（配列番号１）とインサートＤＮＡ３ｂ：５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号７）をライゲーションさせて作製した。作製した環状ＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動で生成を確認後、抽出した。さらに、原子間力顕微鏡を用いて環状であることを確認した（図３）。
【００６４】
各環状ＤＮＡの生成率について検討すると、直径２５ｎｍ及び４１ｎｍの環状ＤＮＡは、生成率が約７０％であった。一方、直径７１ｎｍの環状ＤＮＡは、生成率が１８％であった。これは、ベクターＤＮＡが長くなることにより、インサートＤＮＡの両末端と結合することが困難になるからであると考えられる。
【００６５】
実施例３．変形機能を有するＤＮＡ構造体の作製
（１）試料及び試薬
本試験では、１箇所にビオチンを標識した環状ＤＮＡとして、実施例２で作製した直径７１ｎｍのものを使用した。ニック部分のリン酸化処理には、リン酸化処理キットであるＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）を使用した。リン酸化処理キットは、１×Ｔ４ＰＮＫバッファー（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＤＴＴ）、１０ｍＭ  ＡＴＰ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μｌ）で構成されている。アガロースゲル電気泳動に使用するゲルには、アガロース２１（ニッポンジーン）とＴＡＥバッファー（上述）を使用した。ゲル内部のＤＮＡの染色溶液には、エチジウムブロマイド溶液を使用した。リン酸化した環状ＤＮＡが含まれているゲル片から環状ＤＮＡを抽出するキットは、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。ニックを解消するためのライゲーションには、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１（タカラバイオ）を使用した。
【００６６】
（２）スーパーコイル形状のＤＮＡ構造体の作製方法
前述のＤＮＡグラスには、ニックと呼ばれる切り欠き部分が存在している。ニックがある環状ＤＮＡはスーパーコイル化しないことが知られているため、予めニックを解消する処理を施した。まず、直径７１ｎｍの環状ＤＮＡを使用し、ニック部分をリン酸化させる酵素を用いてリン酸化処理を施した。その後、酵素を失活させるために、６５℃で１０分間インキュベートした。次に、アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、リン酸化した環状ＤＮＡが含まれているゲル片を切り出し、抽出した。その後、連結酵素を用いてライゲーションを行い、ニック部分の結合を行った。ライゲーションは、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１をＤＮＡ溶液と等量混合し，１６℃で３０分間静置させることで行った。この処理により、環状ＤＮＡのニック部分の糖鎖部分においてホスホジエステル結合が行われ、環状ＤＮＡのニックを解消した。
【００６７】
（３）原子間力顕微鏡による観察
スーパーコイル形状のＤＮＡ構造体を電気泳動によって確認後、原子間力顕微鏡を用いて観察した。原子間力顕微鏡による観察条件は、実施例２と同様である。その結果、環状ＤＮＡの一部が捩れた構造体を観察した（図４）。原子間力顕微鏡の観察結果を用いて、原子間力顕微鏡のソフトウェアの機能である断面プロファイル解析機能を利用して得られた断面図を図４（下段）に示す。構造体の断面を解析した結果、捩れた部分の高さは約０．７８ｎｍであり、環状部分の高さは約０．４ｎｍであった。その結果、捩れた部分の高さと環状部分の高さには、約２倍程度の差があることが確認された。以上の観察結果より、作製された構造体は、環状ＤＮＡの一部が捩れてスーパーコイル化した可能性があると考えられる。
【００６８】
実施例４．ＤＮＡ構造体の精確な位置決め
（１）試料及び試薬
ＤＮＡ構造体の精確な位置決めのための基板には、シリコン基板（Ｐ型（１００）、抵抗値０．１−０．３Ωｃｍ）を使用した。シリコン基板の表面洗浄には、アセトン（和光純薬）を使用し、シリコン酸化膜の除去には、バッファード・フッ酸（ＢＨＦ、和光純薬）を使用した。酸化膜の位置確認用マーカーの作製には、レジスト膜はＯＦＰＲ−８００（東京応化工業、５４ｍＰａ．ｓ，０．９４６Ｌ）を使用し、現像液はＮＭＤ−３（東京応化工業）を使用した。酸化膜へ固定するタンパク質は、ストレプトアビジン標識の金コロイド溶液（ＢＢ  Ｉｎｔｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製、ストレプトアビジン：５ｎｍ金）を使用した。
【００６９】
（２）ＤＮＡ構造体の精確な位置決め基板の作製方法
最初に、シリコン基板をダイシングによって、１５×１５ｍｍ2に切断した。切断したシリコン基板は、超音波洗浄器を用いて、超純水で５分間、アセトンで５分間の洗浄を実施し、基板表面に吸着した不純物を除去した。その後、シリコン基板をバッファード・フッ酸（ＢＨＦ）に１０分間浸して酸化膜の除去を行った。次に、酸化膜の位置確認用マーカーを作製するため、ＯＦＰＲ−８００をシリコン基板に塗布し、スピンコーター（エイブル）を用いて、２０００ｒｐｍ（４０秒間）、３０００ｒｐｍ（４秒間）の回転を与えて成膜を実施した。成膜後は、ホットプレート（ＫＰＩ、ＨＰ−１９Ｕ３００）を用いて、１００℃で２分間加熱し、基板上のレジストを固めた。レジストが成膜したシリコン基板は、マスクアライナー（ＫａｒｌＳｕｓｓ、ＭＪＢ３）に設置して、マスクパターンを露光した。露光後、現像液ＮＭＤ−３によるマスクパターンの現像を約５分間実施し、超純水でリンスをした後、エアーを吹き付けて乾燥させた。
【００７０】
次に、原子間力顕微鏡（ＳＩＩ、ＳＰＡ４００）の測定台にマーカー付きのシリコン基板を乗せて、原子間力顕微鏡のコンタクトモード（ＡＦＭ  ｍｏｄｅ）の電圧印加機能を用いて、９．９Ｖで１秒間、直流電圧を印加して、５０００×５０００ｎｍ2の領域に、間隔１０００ｎｍの円形の酸化膜を作製した。なお、原子間力顕微鏡のカンチレバーはＯＭＣＬ−ＲＣ８００ＰＢ（オリンパス、バネ定数０．１１Ｎ／ｍ）を使用し、予め作製したマーカーを目印にして電圧を印加する位置を決定した。電圧印加後は、カンチレバーをＳＩ−ＤＦ２０（ＳＩＩ、バネ定数１３Ｎ／ｍ）に換えて、タッピングモード（ＤＦＭ  ｍｏｄｅ）にて、作製した酸化膜の直径および高さを測定した。
【００７１】
測定後、ＤＮＡ構造体を基板に固定するために、基板を取り外して、０．０１％（ｖ／ｖ）３−アミノプロピルトリエトキシシラン（γ−ＡＰＴＥＳ）を介してストレプトアビジン標識の金コロイド溶液又はＤＮＡ溶液を滴下した。まず、基板を０．０１％（ｖ／ｖ）γ−ＡＰＴＥＳ溶液中に浸し、室温で２０分間静置した後、超純水にて洗浄し、エアーを吹き付けて乾燥させた。次に、ドライオーブン（三洋電機、ＭＯＶ−１１２Ｓ）を用いて１２０℃で５分間焼成し、マイカ基板上にγ−ＡＰＴＥＳを修飾させた。最後に、濃度調整したＤＮＡ溶液又はストレプトアビジン標識の金コロイド溶液１０μｌを基板上に滴下し、２分間静置した後、超純水で基板洗浄を行い、エアーを吹き付けて乾燥させた。
【００７２】
（３）陽極酸化膜（アンカーポイント）の形成
原子間力顕微鏡の電圧印加機能を用いて作製した酸化膜の原子間力顕微鏡の観察像を図５に示す。その結果、円形状の構造体がシリコン基板の表面に、１０００×１０００ｎｍ2の間隔で形成していることを確認した（図５（ａ）及び（ｂ））。次に、酸化シリコン膜の原子間力顕微鏡による観察結果を用いて、原子間力顕微鏡のソフトウェアの機能である断面プロファイル解析機能を利用して得られた断面図を図５（ｃ）に示す。断面図の測定結果により、酸化シリコンの直径は１２２ｎｍ、高さは３．２ｎｍの大きさをしていることを確認した。酸化膜の大きさは、印加電圧の大きさとカンチレバーの直径に依存することが知られており、酸化膜はカンチレバーの直径より大きくなる。本実験で使用したカンチレバー（ＯＭＣＬ−ＲＣ８００ＰＢ）の直径は６０ｎｍであり、カンチレバーの直径の約２倍の直径の酸化膜が形成した。以上の結果より、原子間力顕微鏡の電圧印加機能を用いて、シリコン基板上に局部的に酸化膜を形成できることを確認した。
【００７３】
（４）ストレプトアビジン及びＤＮＡの固定処理
作製した酸化膜にγ−ＡＰＴＥＳをコーティングして、タンパク質又はＤＮＡを吸着させ、原子間力顕微鏡を用いて観察した結果を図６に示す。本実験では、ストレプトアビジン標識の金コロイド溶液を使用した。これは、ストレプトアビジンが球形をしていることから、酸化膜へ吸着した際に幾何学的に判断がし易いという理由から、酸化膜への吸着実験の最初の取り組みとして採用した。まず、酸化膜が形成した直後の観察を行ったところ、高さ３．８ｎｍ、幅１２３ｎｍの酸化膜が形成していることを確認した（図６（ａ））。次に、ストレプトアビジン標識の金コロイド溶液の吸着処理を施したものでは、高さは５．０ｎｍに変化し、直径５７ｎｍの粒子状の物体が酸化膜に吸着していることを確認した（図６（ｂ））。なお、酸化膜の観察は同じ位置で実施している。ストレプトアビジンの吸着処理の前後において、酸化膜に高低差が発生しており、表面形状を比較しても、図図６（ｂ）には粒子状の物体が多数付着していることが確認出来ることから、原子間力顕微鏡を用いて作製した酸化膜にストレプトアビジンが吸着していると考えられる。以上の結果より、原子間力顕微鏡の電圧印加機能を用いて作製した酸化膜に、ストレプトアビジンを固定できることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】基盤上へのＤＮＡ構造体を固定化する方法の概要を示す。
【図２】ＤＮＡグラスの原子間力顕微鏡による観察結果を示す。（ａ）走査範囲１０００×１０００ｎｍ2における測定結果、（ｂ）ＤＮＡグラスの拡大図、及び（ｃ）ＤＮＡグラスの断面解析図。
【図３】１箇所にビオチン標識した内径２５ｎｍ、４１ｎｍ、及び７１ｎｍの環状ＤＮＡを確認するための原子間力顕微鏡による観察結果を示す。
【図４】ニックを含まない状態の環状ＤＮＡの原子間力顕微鏡による観察結果を示す。（ａ）原子間力顕微鏡による観察像及び断面図、及び（ｂ）観察された環状ＤＮＡの模式図。
【図５】原子間力顕微鏡による陽極酸化膜（アンカーポイント）の観察結果を示す。（ａ）及び（ｂ）原子間力顕微鏡の電圧印加機能によって作製した酸化膜、及び（ｃ）酸化膜の断面解析図。
【図６】原子間力顕微鏡によるストレプトアビジン固定処理の観察結果を示す。（ａ）酸化膜のみの状態、及び（ｂ）酸化膜にストレプトアビジン標識の金コロイド溶液を固定した状態。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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