(57)【要約】【課題】本発明は、エルゴチオネイン生産能を有するキノコを材料として、エルゴチオネインを抽出、精製する工程を含む、エルゴチオネインの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明者らは、上記の課題を解決するために、種々のキノコのエルゴチオネイン生産能をスクリーニングし、これまでにエルゴチオネイン生産能を有することが知られていないエノキタケ属（Flammulina）、サンゴハリタケ属（Hericiaceae）、シメジ属（Lyophyllum）、ブナハリタケ属（Mycoleptodonoides）、キコブタケ属（Phellinus）、ショウゲンジ属（Rozites）に属するキノコが著量のエルゴチオネインを生産することを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エノキタケ属（Flammulina）、サンゴハリタケ属（Hericiaceae）、シメジ属（Lyophyllum）、ブナハリタケ属（Mycoleptodonoides）、キコブタケ属（Phellinus）、ショウゲンジ属（Rozites）に属するキノコよりエルゴチオネインを抽出することを特徴とする、エルゴチオネインの製造方法。
【請求項２】
キノコが、エノキタケ（Flammulina velutipes）、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）、ブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）、メシマコブ（Phellinus linteus）、ショウゲンジ（Rozites caperata）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エルゴチオネイン生産能を有するキノコを材料として、エルゴチオネインを抽出、精製する工程を含む、エルゴチオネインの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記式（１）で表されるエルゴチオネイン
【０００３】
【化１】
2009249356.tif 000002
は、アミノ酸の1種であり、ライ麦角菌 (Claviceps purpurea) よりはじめて単離された（非特許文献１）。その後、ヒトを含めた動物の赤血球、肝臓などに広く分布することが明らかにされ、ヒドロキシルラジカルの捕捉作用、Fe, Cuに依存した過酸化水素からのヒドロキシラジカルの生成抑制作用、銅依存オキシヘモグロビンの酸化抑制作用、ミオグロビン及び過酸化水素によるアラキドン酸酸化抑制作用などの抗酸化活性が報告され、エルゴチオネインが生体内で抗酸化物質として機能している可能性が示唆された（非特許文献２）。これらのエルゴチオネインの抗酸化活性を活用し、機能性食品、動物飼料、化粧品などとしての利用が期待されている。
【０００４】
エルゴチオネインの製造方法としては、動物の血液や臓器から抽出する方法、オートムギなど植物から抽出する方法（非特許文献３）、キノコを含む微生物から抽出する方法と化学的に合成する方法がある。微生物を用いた方法としては、酵母、一部の例外 (Mycobacteria)を除くバクテリアはエルゴチオネインを生産せず、カビ類が主に生産すること（非特許文献４）、特にアカパンカビ (Neurospora crassa) をシスチン添加培地で培養することにより生産性が高められることが報告されている（特許文献１）。また、キノコでは、ツキヨタケ(Lampteromyces japonicus) （非特許文献５）やアガリクス、マイタケ、シイタケ、エリンギ、ヒラタケ（非特許文献６）がエルゴチオネインを生産することが報告されている。また、化学的な合成方法がビオキシテックから報告されている（特許文献２）。一方で、本発明者らの調査によれば、ヒメマツタケ（Agaricus blazei Murrill）、キッタリア（Cyttaria espinosae）、カバノアナタケ（Fuscoproria obliqua）等のキノコは、エルゴチオネインを産生しないことが明らかとなっている。
【０００５】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【特許文献１】特公昭43-20716
【特許文献２】特表平 8-501575
【非特許文献１】Acad. Sci., 149, 222-224(1909)
【非特許文献２】Arch. Biochem. Biophys., 288, 10-16 (1991)
【非特許文献３】J. Biol. Chem., 218, 647-651 (1956)
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 223, 9-17 (1956)
【非特許文献５】Natural Medicines (Tokyo), 51, 558 (1997)
【非特許文献６】Int. J. Med. Mushrooms, 8, 215-222 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、エルゴチオネイン生産能を有するキノコを材料として、エルゴチオネインを抽出、精製する工程を含む、エルゴチオネインの製造方法を提供することにある。
【０００７】
化学的合成法は食品用途には不向きであり、また、高価な合成試薬を利用するために安価なエルゴチオネインの合成は困難である。また、一方、キノコなど食品素材を用いた製造方法は機能性食品素材としてのエルゴチオネインの製法として適しているが、生産量が低く、また、利用できるキノコの種類も限られていた。そこで、より生産能力の高いキノコなどからの、食品用途に適したエルゴチオネイン生産方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、種々のキノコのエルゴチオネイン生産能をスクリーニングし、これまでにエルゴチオネイン生産能を有することが知られていないエノキタケ（Flammulina velutipes）、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）、ブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）、メシマコブ（Phellinus linteus）、ショウゲンジ（Rozites caperata）が著量のエルゴチオネインを生産することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔２〕を提供するものである。
〔１〕  エノキタケ属（Flammulina）、サンゴハリタケ属（Hericiaceae）、シメジ属（Lyophyllum）、ブナハリタケ属（Mycoleptodonoides）、キコブタケ属（Phellinus）、ショウゲンジ属（Rozites）に属するキノコよりエルゴチオネインを抽出することを特徴とする、エルゴチオネインの製造方法。
〔２〕  キノコが、エノキタケ（Flammulina velutipes）、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）、ブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）、メシマコブ（Phellinus linteus）、ショウゲンジ（Rozites caperata）であることを特徴とする、〔１〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、エルゴチオネイン生産能力の高いキノコを用いて、効率的にエルゴチオネインを製造する方法が提供された。
本発明の方法により、化学合成法によらず、食品、医薬品、化粧品、飼料などに有用な、安全かつ安価なエルゴチオネインを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、エルゴチオネイン生産能を有するキノコを材料として、エルゴチオネインを抽出、精製し、エルゴチオネインを生産することを特徴とする。
【００１２】
本発明の製造方法に用いる、エルゴチオネインを生産するキノコとして、エノキタケ属（Flammulina）、サンゴハリタケ属（Hericiaceae）、シメジ属（Lyophyllum）、ブナハリタケ属（Mycoleptodonoides）、キコブタケ属（Phellinus）、ショウゲンジ属（Rozites）に属するキノコを挙げることが出来る。
【００１３】
エノキタケ属に属するキノコは以下のような特徴を有する。
子実体はモリノカレバタケ型で、傘は黄、褐、橙など、粘性または乾性、平滑、傘シスチジアがある。胞子紋は純白色、胞子は非アミロイドである。菌糸にはクランプがあり、材上などに発生する。
エノキタケ属に属するキノコの代表的な例としては、エノキタケ（Flammulina velutipes）が挙げられる。
【００１４】
サンゴハリタケ属に属するキノコは以下のような特徴を有する。
樹上生で、子実層托は針状、針は束となって基物から垂れ下がるか、半円形〜棚状の傘の下側または基物から横に伸びるサンゴ状の子実体の下面に垂れ下がる。肉質〜柔軟な革質〜膜質で、1菌糸型、クランプがある。子実層にはグロエオシスチジアがある。胞子は卵円形、無色、微細なとげをおびるかほとんど平滑、アミロイドで材の白腐れをおこす。
サンゴハリタケ属に属するキノコの代表的な例としては、サンゴハリタケ（Hericium ramosum）、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）などが挙げられる。
【００１５】
シメジ属に属するキノコは以下のような特徴を有する。
子実体はキシメジ型、カヤタケ型、ヒラタケ型、モリノカレバタケ型、ヒダサカズキタケ型などで、内外皮膜を欠く。傘はつねに鈍い色合い（灰、灰褐、褐など）または白色を呈する。胞子紋は白またはクリーム白色。胞子は平滑まれに突起に覆われ、球形、楕円形、卵形、紡錘形、楕円状円柱形、角形など、非アミロイド形である。担子器は内部にアセトカーミンで染まりやすい顆粒をみたしているため、核の存在を認めにくい。菌糸にはクランプがあり、地上生も材上生もあり、一部は任意的に外生菌根を作る。
シメジ属に属するキノコの代表的な例としては、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）、シャカシメジ（Lyophyllum fumosum）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ブナシメジ（Lyophyllum ulmarium）、ヤケノシメジ（Lyophyllum anthracophilum）、イバリシメジ（Lyophyllum tylicolor）、タマニョウシメジ（Lyophyllum gibberosum）、カクミノシメジ（Lyophyllum sykosporum）、スミゾメシメジ（Lyophyllum semitale）などが挙げられる。
【００１６】
ブナハリタケ属に属するキノコは以下のような特徴を有する。
子実体はほとんど無柄で、多湿で柔軟な肉質だが乾くとやや強靱になる。傘は扇形〜へら形で基部が狭まり、多数重生し、大きさは3〜8 x 3〜10 cm程度である。表面は無毛平滑、白色老熟すると酢酸ブチルエステルの香りがあるが、乾燥標品は無味、無臭である。菌糸構成は幅4-10μmの厚膜菌糸と傘の表皮の直下や縁の部分に幅3.5-5μmで、ふくらみとねじれを持つ薄膜菌糸の2菌糸型である。下面の子実層托はハリタケ型、針は鋭く尖り、長さ3-10 mm、乾燥すると淡〜濃黄橙色になる。胞子は腸詰形、無色、平滑、大きさ2〜2.5 x 5〜6.5μm。主にブナまたはイタヤカエデなどの枯れ木の幹におびただしく群生し、材の白枯れを起こす。
ブナハリタケ属に属するキノコの代表的な例としては、ブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）などが挙げられる。
【００１７】
キコブタケ属に属するキノコは以下のような特徴を有する。
菌糸が褐色であり、クランプを欠く。褐色で厚膜の剛毛体を形成する。リグニン分解菌で腐朽材は白腐れである。傘の背面には特別の組織は発達しない。
キコブタケ属に属するキノコの代表的な例としては、キコブタケ（Phellinus igniarius）、メシマコブ（Phellinus linteus）、ネンドタケ（Phellinus gilvus）、コブサルノコシカケモドキ（Phellinus setulosus）、カシサルノコシカケ（Phellinus robustus）、モミサルノコシカケ（Phellinus hartigii）などが挙げられる。
【００１８】
ショウゲンジ属に属するキノコは以下のような特徴を有する。
傘は初め半球系から卵形で後には平らに開く。色は黄土色や帯紫褐色で放射状の浅いしわがある。ひだは柄に直生から離生まで変化に富み、初めは淡褐色であるが、後にはさび褐色となる。柄は傘とほぼ同色またはより淡色で根もとはいく分ふくらむ場合もありつばをもつ。このつばは落ちやすい。
ショウゲンジ属に属するキノコの代表的な例としては、ショウゲンジ（Rozites caperata）などが挙げられる。
【００１９】
本発明の製造方法に用いるキノコとして、より具体的には、エノキタケ属（Flammulina）に属するキノコとしてエノキタケ（Flammulina velutipes）、サンゴハリタケ属（Hericiaceae）に属するキノコとしてヤマブシタケ（Hericium erinaceum）、シメジ属（Lyophyllum）に属するキノコとしてホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）、ブナハリタケ属（Mycoleptodonoides）に属するキノコとしてブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）、キコブタケ属（Phellinus）に属するキノコとしてメシマコブ（Phellinus linteus）、ショウゲンジ属に属するキノコの代表的な例としては、ショウゲンジ（Rozites caperata）を挙げることができる。なおこれらのキノコは食用キノコとして購入または自生キノコを採取することにより入手できる。
【００２０】
本発明において、エルゴチオネインを抽出するキノコは、子実体、菌糸体どちらの状態であってもよいが、好ましくは子実体を挙げることができる。
【００２１】
本発明において、子実体とは、菌類が胞子形成のために、菌糸により形成する構造体であり、一般的にキノコの食用とされる構造体を指す。一方、菌糸体とは、胞子が発芽し、細胞分裂を繰り返して形成された菌糸の集合体を指す。
【００２２】
これらのキノコからのエルゴチオネインの抽出は、有機溶媒(メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなど)を含んでもよい水、温水、または熱水などの水溶液により行うことが出来る。抽出溶媒温度は室温から100℃、好ましくは、40-90℃で行うことができる。有機溶媒は複数種類含んでいてもよく、有機溶媒と水の比率はどのようなものでもよい。抽出したエルゴチオネインは、一般的な精製方法、例えば、溶媒抽出、溶解度差による分離、シリカゲル、アルミナなど吸着剤を用いたクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過、チオプロピル−セファロース6B、逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、結晶化、活性炭処理、膜処理などを組み合わせることにより行うことができる。例えば、Chem. Pharm. Bull., 26, 3772-3778 (1978) 記載に従い、キノコから抽出したエルゴチオネインを含む水溶液から酢酸エチルを用いて脂質を抽出し、水溶液を凍結乾燥後、Amberlite IR120B を用いたカチオン交換樹脂に吸着させ、ピリジン：水=1：10の溶離液によるエルゴチオネインの溶出、凍結乾燥後、更に、シリカゲルクロマトグラフィーに吸着させ、エタノール、エタノール：水=95：5により洗浄後、水により溶出・凍結乾燥後、セファデックスG-10によるゲル濾過、Develosil C30-UG-5 を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製することにより純粋なエルゴチオネインを得ることが出来る。
【００２３】
抽出に用いるキノコは、生体であっても、乾燥したものであってもよいが、乾燥したものにあっては好ましくは乾燥粉末の状態を挙げることができる。
【００２４】
エルゴチオネインの定量は、比色定量法（Biochem. J., 139, 221-235 (1974)）、逆相HPLC（Int. J. Med. Mushrooms, 8, 215-222 (2006)）などにより行うことができる。HPLC分離条件は当業者であれば、適宜選択することができる。
【００２５】
比色定量法は以下のように行った。測定サンプル９００μＬに、１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を１００μＬ、１ｍＭ 硫酸銅を１００μＬを添加し、室温で１時間振盪して夾雑ＳＨ化合物を酸化する。酸化したサンプル２００μＬに１Ｍ塩酸 ２４０μＬ、１．５ｍＭ ２，２’−ジチオピリジンを添加し、混合後、３４３ｎｍの吸光度を測定することにより行える。
【００２６】
また、ＨＰＬＣによる定量は例えば以下のような条件で行うことができる。
カラム： Econosphere C18 (4.6 * 250 mm) 2本をタンデムに接続
溶離液： 50 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3), 3% アセトニトリル、0.1% トリエチルアミン
流速： 1.0 mL/min 
検出： 254 nm における紫外線吸収
【００２７】
本発明の方法によれば、乾燥キノコにおいて0.1 mg/g以上、好ましくは0.2 mg/g以上、より好ましくは2 mg/g以上の濃度で蓄積するエルゴチオネインを高濃度で抽出することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
〔実施例１〕  キノコのエルゴチオネイン含量の測定
エノキタケ、ヤマブシタケ、ホンシメジ、ハタケシメジ、ブナハリタケ、メシマコブ、ショウゲンジの乾燥粉末22.5 mg に水 202.5μL、メタノール：アセトン(1：1)を675μL添加し、30秒2回、ガラスビーズにてホモゲナイズしてエルゴチオネインを抽出した。これを用いて比色定量法により、溶媒中のエルゴチオネイン濃度（mg/L）を測定し、キノコ乾燥重量当りの含有濃度に換算した。
その結果を表１に示した。
【００３０】
【表１】
2009249356.tif 000003