(57)【要約】【課題】公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供すること。【解決手段】改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素残基から半径３０オングストローム以内の距離にあるアミノ酸であり、かつ、αへリックスを構成するアミノ酸及びまたはαへリックスの両端より２アミノ酸以内のアミノ酸において、１もしくは数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して、改変前と比較して熱安定性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素原子から半径３０オングストローム以内の距離にあるアミノ酸であり、かつ、αへリックスを構成するアミノ酸、αへリックスを構成するアミノ酸の両端より２アミノ酸以内のアミノ酸、βシートを構成するアミノ酸の両端より４アミノ酸以内のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して熱安定性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項２】
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が、改変前と比較して、他のアミノ酸に置換していることを特徴とする請求項１記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項３】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する、請求項１、２のいずれかに記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項４】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する、請求項１，２のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項５】
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１、２のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項６】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６０位、１６２位、１６３位、１６７位、１７１位、５５１位またはそれらと同等の位置からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項７】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６０位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＧ１６０Ｐに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項８】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６２位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＳ１６２Ｐに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項９】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６３位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＧ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒのいずれかに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項１０】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６７位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＳ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖのいずれかに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項１１】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１７１位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＳ１７１Ｐに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項１２】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の５５１位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＶ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ及びＶ５５１Ｙからなる群のうちいずれか１つのアミノ酸置換を有する請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換体を培養し、該培養物からフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の製造法。
【請求項１７】
請求項１〜１２項のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコース測定用試薬。
【請求項１８】
請求項１〜１２項のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコースセンサ。
【請求項１９】
請求項１〜１２項のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を用いるグルコース測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の製造法及び該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体のグルコース測定試薬への種々の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（本書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７）が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９６７  ；１３９  （２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９６７  ；１３９  （２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９６７  ；１４６  （２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９６７  ；１４６  （２）：３２８−３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、酵素の安定供給という観点から、該酵素を遺伝子組み換えにより生産することを視野に先行技術を再検討した。
その結果、意外にも、大腸菌で発現させて取得したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組換え体は、熱安定性が野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて大きく劣ることが判明した。例えば、発明者らが後述の方法によりアスペルギルス・オリゼから取得したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、５０℃・１５分処理において約７７％の活性を維持していたが、大腸菌で発現させて取得したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組換え体の熱安定性は、５０℃・１５分処理において約１３％しか維持できない程度であった。
【０００６】
これは、遺伝子組み換えにより生産された酵素は、表面に多糖が付加されておらず、熱安定性が低下したからであると考えられた。
血糖センサ用チップの作製工程においては、加熱乾燥処理を施す場合があり、組換え体を利用する場合には、大幅な熱失活をおこす危険性があり、熱安定性を向上させる必要があった。
【０００７】
加熱乾燥可能なレベルとは、５０℃、１５分処理後の残存活性が２０％以上存在する状態であり、好ましくは４０％以上の残存活性が存在する状態であり、更に好ましくは、６０％以上の残存活性が存在する状態である。
【０００８】
そこで我々は、遺伝子組み換えにより生産しても十分な熱安定性を有し、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的にさらに検討を重ねた。
その結果、我々は、アスペルギルス・オリゼ株由来のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのＸ線結晶構造解析データを基にして活性中心のアミノ酸を標的として適宜改変することにより、上述のような公知の血糖センサ用酵素の熱安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することができた。
【０００９】
すなわち、本発明は、改変前のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼよりも熱安定性が向上したでフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体あって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素原子から半径３０オングストローム以内の距離にあるアミノ酸であり、かつ、αへリックスを構成するアミノ酸、αへリックスを構成するアミノ酸の両端より２アミノ酸以内のアミノ酸、βシートを構成するアミノ酸の両端より４アミノ酸以内のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して熱安定性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項２］
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が、改変前と比較して、他のアミノ酸に置換していることを特徴とする請求項１記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項３］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する、請求項１、２のいずれかに記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項４］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する、請求項１，２のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項５］
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１、２のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項６］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６０位、１６２位、１６３位、１６７位、１７１位、５５１位またはそれらと同等の位置からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項７］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６０位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＧ１６０Ｐに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項８］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６２位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＳ１６２Ｐに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項９］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６３位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＧ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒのいずれかに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項１０］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６７位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＳ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖのいずれかに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項１１］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１７１位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＳ１７１Ｐに置換されていることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項１２］
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の５５１位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＶ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ及びＶ５５１Ｙからなる群のうちいずれか１つのアミノ酸置換を有する請求項３〜５のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
［項１３］
請求項１〜１２のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子。
［項１４］
請求項１〜１２のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子を含むベクター。
［項１５］
請求項１４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
［項１６］
請求項１５に記載の形質転換体を培養し、該培養物からフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の製造法。
［項１７］
請求項１〜１２項のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコース測定用試薬。
［項１８］
請求項１〜１２項のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコースセンサ。
［項１９］
請求項１〜１２項のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を用いるグルコース測定方法
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの熱安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の詳細を説明する。
【００１３】
本発明の一実施形態は、改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素原子から半径３０オングストローム以内の距離にあるアミノ酸であり、かつ、αへリックスを構成するアミノ酸、αへリックスを構成するアミノ酸の両端より２アミノ酸以内のアミノ酸、βシートを構成するアミノ酸の両端より４アミノ酸以内のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して熱安定性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体である。（以下、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）
【００１４】
本発明において、改変前のＦＡＤＧＤＨは、特に限定されるものではないが、自然界に存在する種々の公知のＦＡＤＧＤＨが挙げられる。具体的には、アスペルギルス属、ペニシリウム属由来のものなどが挙げられ、好ましくはアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ、さらに好ましくは配列番号２で示したアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨが挙げられる。配列番号２のＦＡＤＧＤＨは特許文献１の方法により取得することが可能である。
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８
【００１５】
本発明において、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素から３０オングストローム以内の距離にあるアミノ酸とは、改変前のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性デヒドロゲナーゼの活性中心近傍に位置するアミノ酸のことを指す。
活性中心とはｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ  ２．０（ＤＳ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いて、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼが結合した状態の立体構造により定義される部位である。フラビンアデニンジヌクレオチドからの距離も同ソフトを用いることで定義できる。
配列番号２のアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨの立体構造を例示する。これによれば、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素は活性中心に位置しており、基質の出入り口を構成するアミノ酸の中心に位置する。フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素から３０オングストローム以内の距離にあるアミノ酸は、基質の出入り口を構成するアミノ酸と定義することができる。基質の出入り口はフレキシビリティーが高く、立体構造上不安定であると推測されることから、この部位を標的として新たな相互作用が生じるように置換を行うことで、安定性が向上すると考えられる。
このことから、活性中心近傍に位置し、基質の出入り口と考えられる部位を構成するアミノ酸の中でもαへリックスを構成するアミノ酸、αへリックスを構成するアミノ酸の両端より２アミノ酸以内のアミノ酸、及び／または、βシートを構成するアミノ酸の両端より４アミノ酸以内のアミノ酸を標的として欠失、置換もしくは付加することが熱安定性を向上させるのに効果的であると考えられる。
αへリックスを構成するアミノ酸とは具体的には１７１位のアミノ酸を示す。また、αへリックスを構成するアミノ酸の両端より２アミノ酸以内のアミノ酸とは１６７位のアミノ酸を示す。  また、βシートを構成するアミノ酸の両端より４アミノ酸以内のアミノ酸とは１６０位、１６２位、１６３位のアミノ酸を示す。
【００１６】
本発明において、熱安定性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体とは、５０℃・１５分間の熱処理後の残存活性が改変前のＦＡＤＧＤＨより高いことを意味する。
好ましくは、改変前より相対的に２倍以上高い残存活性を有する状態である。
あるいは、好ましくは、５０℃・１５分間の熱処理後の残存活性が６０％以上である。
【００１７】
本発明の一実施形態は、改変前のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素原子から半径３０オングストローム以内の距離にあるアミノ酸であり、かつ、αへリックスを構成するアミノ酸、αへリックスを構成するアミノ酸の両端より２アミノ酸以内のアミノ酸、βシートを構成するアミノ酸の両端より４アミノ酸以内のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して熱安定性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体であって、改変前のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が、改変前と比較して、他のアミノ酸に置換していることを特徴とするＦＡＤＧＤＨ改変体である。
【００１８】
上記で示される本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するものであっても良い。配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものが、さらに好ましい。
また、改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するものであっても良い。
【００１９】
本発明のＦＡＤＧＤＨは、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有するＦＡＤＧＤＨ改変体であり、例えば、配列番号２において、１６０位、１６２位、１６３位、１６７位、１７１位及び５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、それらと同等の位置、すなわち他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する熱安定性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体である。上記のうち、１６３位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有するＦＡＤＧＤＨ改変体がさらに好ましいものとして例示できる。
【００２０】
より詳細には、１６０位、１６２位、１６３位、１６７位、１７１位及びまたはそれらと同等の位置からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸は、改変前のアミノ酸と比較して等電点が高いアミノ酸に置換することで、周辺のアミノ酸と電気的な相互作用が生じることより熱安定性を向上することが可能である。
具体的には１６０位のグリシンがアルギニンに置換したことで正に帯電した側鎖が、２０２位の負に帯電したセリンの側鎖とイオン結合を新たに形成することにより熱安定性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体。
具体的には１６２位のセリンがプロリンに置換したことで正に帯電した側鎖が、１６４位の負に帯電したセリンの側鎖とイオン結合を新たに形成することにより熱安定性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体。
具体的には１６３位のグリシンがリジン、ロイシン、アルギニンに置換したことで正に帯電した側鎖が、１６１位の負に帯電したトリプトファンの側鎖とイオン結合を新たに形成することにより熱安定性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体。
具体的には１６７位のセリンがプロリンに置換したことで正に帯電した側鎖が、１６９位の負に帯電したアスパラギンの側鎖とイオン結合を新たに形成することにより熱安定性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体。
具体的には１７１位のセリンがプロリンに置換したことで正に帯電した側鎖が、１６９位の負に帯電したアスパラギンの側鎖とイオン結合を新たに形成することにより熱安定性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体。
具体的には５５１位のバリンがアラニン、システイン、スレオニン、グルタミン、セリン及びチロシンに置換したことで側鎖の親水性が増大したことで、新たに水分子との水和が形成されたことにより熱安定性を向上したＦＡＤＧＤＨ改変体。
【００２１】
本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列における上記で示されるいずれかの位置においてアミノ酸置換を行うことにより得られる。
本発明において「配列番号２のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号２のアミノ酸配列と、配列番号２と高い相同性（好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上）のアミノ酸配列を有する他のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼとを、相同性分析においてアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
【００２２】
あるいは、本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６０位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＧ１６０Ｐに置換されているＦＡＤＧＤＨ改変体が例示できる。
あるいは、本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６２位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＳ１６２Ｐに置換されているＦＡＤＧＤＨ改変体が例示できる。
あるいは、本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６３位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＧ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒのいずれかに置換されているＦＡＤＧＤＨ改変体が例示できる。
あるいは、本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１６７位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＳ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖのいずれかに置換されているＦＡＤＧＤＨ改変体が例示できる。
あるいは、本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１７１位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＳ１７１Ｐに置換されているＦＡＤＧＤＨ改変体が例示できる。
あるいは、本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の５５１位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＶ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ及びＶ５５１Ｙからなる群のうちいずれか１つのアミノ酸置換を有するＦＡＤＧＤＨ改変体が例示できる。
【００２３】
あるいは、本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の５５１位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換が（Ｇ１６０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｑ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｌ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６３Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｔ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｙ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｌ１６５Ｖ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ａ１６６Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（  Ａ１６６Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）  、（Ａ１６６Ｍ＋Ｓ１６７Ｐ）、  （Ａ１６６Ｐ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｆ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ａ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｅ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｓ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｔ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ３２９Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｄ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｌ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｖ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）
及び（Ｋ１２０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ＋Ｋ３６９Ｒ）からなる群のうちいずれか１つのアミノ酸置換を有するＦＡＤＧＤＨ改変体が例示できる。
【００２４】
本願発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、種々の公知の手段で作製することが出来る。
以下に、配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変したＦＡＤＧＤＨ改変体の製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，  ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００２５】
作製されたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５・、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００２６】
なお、これらの過程で得られた、ＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体も、本発明の実施形態として含まれる。
配列番号１で示される塩基配列は、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列を示す。また、
配列番号１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も適用できる。
【００２７】
配列番号４１で示される塩基配列は、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列にゲノム情報よりシグナルペプチドと推測される塩基配列を付加した配列を示す。また、
配列番号４１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も適用できる。
【００２８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列とは、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列を示す。また、
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も本発明に適用できる。
【００２９】
配列番号４２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列とは、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列にゲノム情報よりシグナルペプチドと推測される塩基配列を付加した配列を示す。また、
配列番号４２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も本発明に適用できる。
【００３０】
本発明の塩基配列は本グルコースデヒドロゲナーゼの発現を向上させるように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変えたものを含まれる。
【００３１】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する範囲で適日変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し買い変体朴質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００３２】
培養物中のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変タンパク質が培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３３】
このようにして得られたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や東電点処理も有効な生成手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製されたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を得ることができる。
【００３４】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコースアッセイキット（本発明で「グルコース測定用試薬」と「グルコースアッセイキット」は同義である。）、を特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００３５】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００３６】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００３７】
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ  ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００３８】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００３９】
実施例１：グルコース測定系を用いたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体熱安定性の検討
検討は、先述の試験例のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法に準じて行った。
まず、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。コントロールには、夫々のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体（各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
【００４０】
実施例２：フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の調整  
野生型フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン（５０ｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。
【００４１】
実施例３：フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含む粗酵素液の調整
実施例２で調整したプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン（１０μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調整した。
【００４２】
実施例４：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例３の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、３種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら３種の改変体をコードするプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４と命名した。
【００４３】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１で配列番号２記載の１６２番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２では１６７番目のセリンがプロリンに４７１番目のリジンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３では１８０番目のアラニンがグリシンに５５１番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４では１２０番目のリジンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリンに３６９番目のリジンがアルギニンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2009273381.tif 000002
【００４５】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２のプラスミドを鋳型として、１６０番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６５番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６７番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６８番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６９番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７１番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７２番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２９番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３１番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１８の合成オリゴヌクレオチド、５５１番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、  グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
【００４６】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調整した。
【００４７】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、１６種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら１６種の改変体をコードするプラスミドを、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９と命名した。
【００４８】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６  、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５で配列番号２記載の１６０番目のグリシンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６では１６３番目のグリシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７では１６３番目のグリシンがロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８では１６３番目のグリシンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９では１６７番目のセリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０では１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１では１６７番目のセリンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２では１６７番目のセリンがバリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３では１７１番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４では５５１番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５では５５１番目のバリンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６では５５１番目のバリンがスレオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７では５５１番目のバリンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８では５５１番目のバリンがセリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９では５５１番目のバリンがチロシンに置換されていることが確認された。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2009273381.tif 000003
【００５０】
実施例５；多重変異体の作製と熱安定性
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０のプラスミドを鋳型として、１６０番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６５番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６８番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６９番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７１番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７２番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２９番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３１番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３４の合成オリゴヌクレオチド、５５１番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、  グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
【００５１】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５のプラスミドを鋳型として、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、  グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
【００５２】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調整した。
【００５３】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、５７種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら５７種の改変体をコードするプラスミドを、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９  ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６と命名した。
【００５４】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９  ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ；  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０で配列番号２記載の１６０番目のグリシンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１では１６０番目のグリシンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２では１６０番目のグリシンがセリングルタミンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３では１６０番目のグリシンがグルタミンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４では１６２番目のセリンがアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５では１６２番目のセリンがシステインに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６では１６２番目のセリンがアスパラギン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７では１６２番目のセリンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８では１６２番目のセリンがフェニルアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９では１６２番目のセリンがヒスチジンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０では１６２番目のセリンがロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１では１６３番目のグリシンがアスパラギン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２では１６４番目のセリンがフェニルアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３では１６４番目のセリンがスレオニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４では１６４番目のセリンがチロシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５では１６５番目のロイシンがアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６では１６５番目のロイシンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７では１６５番目のロイシンがアスパラギンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８では１６５番目のロイシンがプロリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９では１６５番目のロイシンがバリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０では１６６番目のアラニンがシステインに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１では１６６番目のアラニンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２では１６６番目のアラニンがリジンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３では１６６番目のアラニンがロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４では１６６番目のアラニンがメチオニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５では１６６番目のアラニンがプロリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６では１６６番目のアラニンがセリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがチロシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがトリプトファン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１では１６７番目のセリンがプロリンに１７０番目のロイシンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２では１６７番目のセリンがプロリンに１７０番目のロイシンがフェニルアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがイソロイシンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがバリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがシステインに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがグルタミン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがイソロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがグルタミン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがトリプトファン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがにチロシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７では１６７番目のセリンがプロリンに３２９番目のバリンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがアスパラギン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがイソロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがリジンｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがロイシン、ＡＯＧＤＨ−Ｍ７３では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
2009273381.tif 000004
【００５６】
実施例５：改変体の取得
フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体生産菌として、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＴＢ培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去しフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体サンプルとした。表４に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００５７】
【表４】
2009273381.tif 000005
【００５８】
実施例６：ｐＨ安定性
実施例５で得た精製標品についてｐＨ安定性を知るために、ｐＨ３．５〜８．５の範囲の緩衝液（ｐＨ３．５〜６．３：０．１Ｍ  酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．５：０．１Ｍ  トリス塩酸バッファー、ｐＨ６．０〜７．７：０．１Ｍ  リン酸バッファー）を調製し、これらを用いて各ＧＤＨを酵素濃度１Ｕ／ｍｌとなるよう希釈した。希釈液を２５℃で１６時間インキュベートしてインキュベート前後の活性を比較した。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性残存率を示したグラフを図１に示す。図１に示すようにｐＨ安定域の幅が広がっていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの熱安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】野生型、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体精製標品のｐＨ安定性を示す。ｐＨ３．５〜６．３：酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．８：トリス塩酸バッファー、ｐＨ６．０〜７．７：リン酸バッファーをそれぞれ用いた。
【図１】
2009273381.tif 000006
【配列表】
2009273381000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月21日(2009.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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