(57)【要約】      （修正有）【課題】ウシなど哺乳類動物血清を培地に添加することによるヒトへの病原体混入の恐れがなく、かつ良好な培養成績を実現せしめる、細胞培養用培地の提供。【解決手段】哺乳類動物血清の代わりに魚類血清を含む、動物細胞用培地。魚類動物の血清を５％Ｖ／Ｖ濃度未満の低濃度で含有する、動物細胞用培地。哺乳類血清濃度が０．５％未満である、動物細胞用培地。４０℃から７０℃の範囲内の温度で加熱処理した魚類動物の血清を含有する、動物細胞用培地。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類動物の血清を５％Ｖ／Ｖ濃度未満の低濃度で含有することを特徴とする哺乳動物細胞培養用培地。
【請求項２】
魚類動物の血清を２％Ｖ／Ｖ濃度以下の低濃度で含有することを特徴とする哺乳動物細胞培養用培地。
【請求項３】
魚類動物の血清を５％Ｖ／Ｖ濃度未満の低濃度で含有することを特徴とする昆虫細胞培養用培地。
【請求項４】
魚類動物の血清を２％Ｖ／Ｖ濃度以下の低濃度で含有することを特徴とする昆虫細胞培養用培地。
【請求項５】
魚類動物の血清を５％Ｖ／Ｖ濃度未満の低濃度で含有することを特徴とするヒト細胞培養用培地。
【請求項６】
魚類動物の血清を２％Ｖ／Ｖ濃度以下の低濃度で含有することを特徴とするヒト細胞培養用培地。
【請求項７】
哺乳類血清濃度が０．５％未満である請求項１ないし６のいずれかの細胞培養用培地。
【請求項８】
哺乳類血清濃度が実質的に０％である請求項１ないし６のいずれかの細胞培養用培地。
【請求項９】
加熱処理した魚類動物の血清を含有することを特徴とする哺乳動物細胞培養用培地。
【請求項１０】
加熱処理温度が４０℃から７０℃の範囲内であることを特徴とする請求項９の細胞培養用培地。
【請求項１１】
４０℃から７０℃の範囲内の温度で加熱処理した魚類動物の血清を含有することを特徴とする請求項１ないし８のいずれかの細胞培養用培地。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、魚類動物血清を用いた細胞培養用培地に係わる。
【従来の技術とその課題】
細胞工学技術の進歩に伴い、これまでに様々な動物の細胞が単離されている。そして、これらの細胞は、さらなる研究や応用のために培養、増殖されている。しかし、一般に細胞培養、特に細胞増殖を行う際には、アミノ酸、ビタミン、糖、無機塩類からなる基礎培地に細胞増殖因子として１０〜２０％のウシ、ウマなどの哺乳類動物血清を添加した培地が用いられる。これら哺乳類動物血清は大量生産ができず非常に高価である上に、その組成は個体差（ロット差）が大きい。１ロットの量が限られているため、ロット変更のたび毎にロットチェック、培養条件の調整や管理等の煩雑な操作が必要となる。その上に、細胞培養によって医薬品や再生組織などヒトの医療に供する生産物を生産する場合は、異種動物由来タンパク質の生産物への混入や異種動物由来病原体の混入など、特に大きな問題が生ずる。厳重な品質管理が必要とされる医療用生産物の製造においては、これらは非常に重大な問題である。なかでも最近特にウシ由来のプリオンなどの未知の病原因子やトリインフルエンザウイルスが、ウシ、ブタなど哺乳類動物やニワトリなど鳥類動物の臓器、組織、卵や血清を介して混入する可能性が問題となっている。これらの理由により医薬品生産や治療用再生組織生産などの医療用途の細胞培養には、ウシをはじめとする異種動物、特にヒトに関して異種の哺乳類動物血清を含有しない培地の開発が望まれている。しかしながら、無血清条件下における培養では血清添加時と同程度の細胞の増殖を得ることは困難である。また、血清の増殖促進作用を部分的に代替しうる添加物は種々開発されているが、上記のような品質管理の観点から、血清の作用を代替する添加する成分はなるべく少なくした方がよいにもかかわらず、少なくとも数種類から１０種類に及ぶ血清代替添加物の混合添加が必要であるのが現状である。また、医薬品や再生組織が適用される患者と同種であり、上記の品質上の問題が極めて少ないヒト血清に関しては、倫理的および社会的観点から、このような目的に使用することは極めて困難であるのが現状である。
また、魚由来のウイルスとして多数のＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスが報告されているが、ヒトに病原性を有するウイルスが分離された例は無く、魚血清にはＦＣＳよりも高い安全性が考えられた。（吉水守、笠井久会：魚類ウィルス病の最前線その現状と防除対策、化学と生物、４３（１）、４６−５８（２００５））さらに、培養用の血清を生産するための魚の養殖、捕獲及び採血、血清保存、品質管理などのシステムを構築することによって、将来、魚血清の量的な確保も可能と考えられる。したがって、魚血清はＦＣＳに代わる血清として有望であると考えられた。
そこで、魚類血清を用いた動物細胞の培養が試みられたが、魚類血清の動物細胞増殖促進活性はウシ胎児血清と比べて明らかに劣っていた。たとえば、ウシ胎児血清の添加濃度を変えて動物細胞を培養すると添加濃度５−２０％が最適でありそれ以下の濃度では最適な細胞増殖が得られないとの従来の一般的知見（新生化学実験講座１８「細胞培養技術」東京化学同人１９９０年、Ｐ．３８および「Ａｌｏｗ−ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＢＳＡ  ａｎｄ  ｆｅｒｒｏｕｓ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏ  ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｓ．」Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７，３９４−３９９（１９９４）．）を参考にして、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）産生性の組換えＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ４Ｎ株をＦＳ（マダイ：Ｐａｇｒｕｓ  ｍａｊｏｒ）を５、１０、２０、３０％の各濃度含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ培地２．０ｍｌを用いて１２ウェル  タイプＩコラーゲンコートディッシュ（３．８ｃｍ２）上で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間接着培養した結果、細胞の増殖は認められるものの、平均世代時間は３２時間と、ウシ胎児血清を用いた場合の平均世代時間の１９時間に比べて明らかに劣っていた。（日本生物工学会２００６年年会要旨集、Ｐ．２０６、演題番号３Ｋ１１−４、魚血清を利用したＣＨＯ細胞の接着培養法の検討）
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、魚類動物血清を、ウシなど哺乳類動物血清の代わりに培地に添加する方法を工夫することにより、ヒトに対する病原体混入の恐れがなく、かつ良好な培養成績を実現せしめる細胞培養用培地を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
上述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は少なくとも、魚類動物血清を低濃度で含むことを特徴とする動物細胞用培地に関する。
本発明の培地に添加される魚類動物血清の由来する魚類動物としては、タイ、ブリのほか、サメ、エイなどの軟骨魚類、チョウザメなどの硬骨魚類、メクラウナギなどの無顎類、カツオ、サバ、タチウオ、イワシ、サケなどの赤身魚、カレイなどの白身魚などを例として挙げることができるがこれらに限られることはない。
本発明の培地に添加される魚類血清の濃度は５％未満が良いが、できれば２％以下が望ましい。従来使用されている哺乳動物血清含有培地は、典型的には、哺乳動物血清を５％よりも多く、４０％以下含むものであることから、この出願の発明の細胞培養用培地において使用される魚類血清濃度は極めて低濃度であるといえる。
本発明における魚類血清の加熱処理温度としては、４０℃から７０℃の範囲が良いが、５０℃から６０℃の範囲内が望ましい。本発明における魚類血清の加熱処理時間としては、１分から１２０分の範囲が良いが、１５分から６０分の範囲内が望ましい。
この出願の発明の細胞培養用培地において用いられる標準培地は、培養する細胞種によって異なり、どのようなものであってもよい。例えば、通常動物細胞の培養に用いられるイスコフ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地などの血清を含まない培地を用いることができる。また、標準培地は、細胞の増殖および維持に有効であることが知られている血清以外の公知または新規の物質、例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、脂質、脂質酸源、コレステロール、ピルビン酸、グルココルチコイド、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成用ヌクレオシド、増殖因子（例えば、表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、およびインシュリン）、並びに細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン）等を添加したものであってもよい。
この出願の発明において使用される哺乳類動物血清無血清培地は、実質的に全ての哺乳類動物血清が培地から除去されているものをいう。実際には、哺乳類動物血清濃度が培地の０．５％未満のものが哺乳類動物血清無血清培地として考慮される。
この出願の発明の細胞培養用培地を用いて培養される細胞は、昆虫および動物由来の細胞であればよく、とくに限定されない。動物としては、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、哺乳類などが例示される。哺乳類動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネズミなどが挙げられるが、とくに限定されない。また、この出願の発明の細胞培養用培地で培養されるこれらの細胞は、動物から採取してから一般的に５０回程度までの限られた回数のみ分裂、増殖できる初代細胞であっても、動物細胞から採取された後、一般に５０回以上の多数回分裂、増殖できる細胞株であってもよい。
初代細胞の例としては、ラットの初代肝細胞、マウス初代骨髄細胞、ブタ初代肝細胞、ヒト初代臍帯血細胞などが挙げられる。一方、細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ細胞、ヒト子宮癌細胞株ＨｅＬａ、アフリカミドリザル腎細胞株Ｖｅｒｏ細胞、ヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７細胞などが例示される。
これらの細胞株の中でも、とくにチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ細胞）が医薬品生産などの目的で工業的に多用されており好ましい。このようなＣＨＯ細胞としては、ＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ１−１５５００株（ＡＴＣＣＣＲＬ−９６０６）、ＣＨＯ  ＤＧ４４株などが例示される。
本発明におけるヒト細胞は、造血系細胞や間葉系細胞を含む中胚葉組織細胞、内胚葉組織細胞、外胚葉組織細胞あるいは受精卵からこれらの細胞へ分化する過程に含まれるあらゆる細胞、および胚性幹細胞などの幹細胞のいずれでもよい。本発明における造血系細胞とは、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、赤血球細胞、リンパ球細胞、顆粒球細胞、血小板細胞などを指す。
本発明における間葉系細胞とは、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、腱細胞、脂肪細胞、毛乳頭細胞、歯髄細胞などの組織学的にいうところの結合組織の細胞およびこれらの細胞に分化する能力を有する細胞を指す。細胞形態としては、繊維芽細胞、脂肪細胞などがある。間葉系細胞の存在する組織としては、骨、軟骨、筋肉、腱、脂肪組織、毛乳頭、歯髄などを例として挙げることができる。またこれら以外の、血管、肝臓、膵臓などの実質臓器の内部や周囲にも存在し、さらに骨髄や臍帯の中にも存在する。骨髄中には、多くの結合組織細胞への多分化能を有した細胞（間葉系幹細胞）の存在が報告されているが、これも本発明における間葉系細胞のひとつである。また骨髄液や臍帯血など由来の間葉系細胞を増殖せしめる場合、骨髄液や臍帯血などの細胞懸濁液から定法に従ってフィコール溶液などを用いた密度勾配遠心分離法により分離した間葉系細胞を播種して増殖させてもよいし、このような分離ステップを経ずに骨髄液や臍帯血を直接培養器に播種しその中に含まれる間葉系細胞を増殖せしめてもよい。
本発明における内胚葉組織細胞とは、たとえば膵臓細胞や膵臓幹細胞、肝細胞や肝肝細胞、胆管細胞などの組織学的に言う内胚葉組織に含まれる細胞及びそれらの幹細胞を含む。
本発明における外胚葉組織細胞とは、たとえばニューロン細胞、アストロサイト細胞やオリゴデンドロサイト細胞など神経細胞などの組織学的に言う外胚葉組織に含まれる細胞及びそれらの幹細胞たとえば神経幹細胞を含む。
この出願の発明の細胞培養用培地は、以上に例示される細胞に限らず、これらの細胞に対して、プラスミドの導入やウィルス感染などの手段により遺伝子操作を施して得られた細胞の培養にも用いることができるものである。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例】＜実施例１＞
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ４Ｎ株）３．６×１０４個を含む１０％ＦＣＳ含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地１ｍｌを、２４穴マルチウェルに接種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養し、細胞を接着させた。その後、種々の濃度のＦＣＳ含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地あるいは種々の濃度のブリ血清含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地１ｍｌに培地を交換し、さらに４日間培養し、接着細胞密度を脱核染色法により測定した。なお、ＦＣＳ、ブリ血清のいずれについても、加熱処理（５６℃、３０分間）をしたものとしないものの両方をそれぞれ使用した。
結果を図１に示した。
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図１より、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を用いた培地では、添加濃度５〜２０％で細胞密度がほとんど変わらないが、添加濃度を５％以下に下げると細胞密度が低下した。それに対して、ブリ血清を用いた培地では、添加濃度を２０％から０．３１３％に下げるに従って細胞密度が増大する傾向を示した。このように、細胞密度が血清添加濃度に依存する傾向は、ＦＣＳとブリ血清とでは全く逆だった。
さらに、ＦＣＳ添加培地ではＦＣＳ加熱処理の有無にかかわらず細胞密度はほぼ同じであった。一方、ブリ血清添加培地では、加熱処理したブリ血清培地を用いた方が加熱処理していないブリ血清を用いた場合に比べて明らかに細胞密度が高かった。
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、細胞培養において、哺乳類動物血清を添加することなく動物細胞を培養できる哺乳類動物血清無血清または哺乳類動物血清低血清の細胞培養用培地が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この発明の実施例において、ＣＨＯ細胞をこの出願の発明の培養用培地で培養した際の細胞密度成績を示した図である。
【図１】
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