(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞への遺伝子導入に必要なベクターを、少量の大腸菌の培養で効率良く作製することが可能な動物細胞用ベクターを提供する。【解決手段】ＳＶ４０プロモーター、蛋白質発現をする遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト及びｐｏｌｙＡシグナルの順に並んでいる特定の遺伝子配列と、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を発現するためのプロモーター配列、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子及びｐｏｌｙＡシグナルの順に並んでいる特定の遺伝子配列と、大腸菌を宿主とするｐＵＣ系の複製開始点から構成される特定の遺伝子配列と、を有する動物細胞用発現ベクター。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＶ４０プロモーター、蛋白質発現をする遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト及びｐｏｌｙＡシグナルの順に並んでいる遺伝子配列１と、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を発現するためのプロモーター配列、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子及びｐｏｌｙＡシグナルの順に並んでいる遺伝子配列２と、大腸菌を宿主とするｐＵＣ系の複製開始点から構成される遺伝子配列３と、を有する動物細胞用発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞を宿主として組換え蛋白質を生産するための動物細胞発現用ベクターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
種々の有用な蛋白質を生産する技術は、大腸菌、酵母、動物細胞などを宿主として開発されており、生産された組換え蛋白質は、医薬品、診断用試薬等、多様な分野で使用されている。
【０００３】
例えば、インスリンは大腸菌あるいは酵母を発現宿主としてインスリン遺伝子を導入し、それら遺伝子を導入した大腸菌あるいは酵母を培養することにより生産している（例えば特許文献１、特許文献２参照）。エリスロポエチンは、ｃＤＮＡ遺伝子を哺乳動物の細胞に導入し、導入した動物細胞を培養することにより生産している（例えば特許文献３、特許文献４、非特許文献１参照）。Ｇ−ＣＳＦは、同じく哺乳動物の細胞を発現宿主として遺伝子を導入し、導入した動物細胞を培養することにより生産している（例えば特許文献５参照）。また、組織性プラスミノーゲンアクチベータ（例えば特許文献６参照）、ＩＦＮ−γ（例えば非特許文献２参照）、ＩＦＮ−β（例えば非特許文献３参照）等も哺乳動物の細胞を発現宿主として生産している。これらの組換え蛋白質を生産するためには、ベクターに組換え蛋白質の遺伝子を挿入し、該ベクターを宿主である細胞に導入する方法がとられている。
【０００４】
また、発現した蛋白質が、正しい立体構造をとることや糖鎖が付加されることで、活性を保持した状態で発現されることから、動物細胞を宿主として組換え蛋白質の生産を行う例が増えてきている。
【０００５】
動物細胞を宿主として組換え蛋白質を生産するためには、動物細胞用発現ベクターを用いて、組換え蛋白質の遺伝子を宿主への導入する方法が行われているが、これらの動物細胞用発現ベクターに組換え蛋白質の遺伝子を挿入するための遺伝子組換え操作は、主として大腸菌を宿主として行われている。大腸菌を宿主としてこれらの動物細胞用発現ベクターを作製する調製する場合、宿主に該ベクターを導入後、培養した大腸菌からベクターを抽出することにより行われる。
【０００６】
【特許文献１】特許２６９４８４０号公報
【特許文献２】特許２５１１２５１号公報
【特許文献３】特公平４−３５１５９号公報
【特許文献４】特公平１−４４３１７号公報
【特許文献５】特公平１−４４２００号公報
【特許文献６】特開昭５９−１８３６９３号公報
【非特許文献１】Ｐｏｗｅｌｌ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ，“Ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｇｅｎｅ：  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，６４６５，１９８６年発行
【非特許文献２】Ｓｃａｈｉｌｌ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｃＤＮＡ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，４６５４，１９８３年発行
【非特許文献３】Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１  ｃｅｌｌｓ  ａｄａｐｔｅｄ  ｔｏ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｂｙ  ａ  ｄｈｆｒ  ｇｅｎｅ  ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．”，Ｃｙｔｒｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３，１９９０年発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
動物細胞を宿主とした組換え蛋白質の生産を行う場合、動物細胞発現用ベクターを大量に調製する必要がある。例えばＣＯＳ細胞を宿主として組換え蛋白質を発現させる場合、１回の遺伝子導入に使用するベクターの量は数十マイクログラム必要であり、大量の細胞に遺伝子を導入しようとるすと、数百マイクログラムのベクターが必要である。また、動物細胞で多様な蛋白質を発現させるための遺伝子ライブラリーを作製するためには、蛋白質の遺伝子を組み込んだ発現ベクターを大量に調製する必要がある。
【０００８】
これらの蛋白質の遺伝子を組み込んだ発現ベクターの調製は、通常大腸菌を宿主としてとして行われる。大腸菌に発現ベクターを導入し、この発現ベクターが導入された大腸菌を培養し、培養された大腸菌から目的プラスミドを抽出する。その場合、ベクターの保有する複製開始点が低コピー数の大腸菌プラスミドである場合は、これらの遺伝子導入のためのプラスミドを調製するために、該プラスミドを保持した大腸菌を大量に培養する必要があり、費用と多大な労力がかかるという問題点があった。
【０００９】
例えば、ｐＳＶ２ｎｅｏは哺乳動物細胞を宿主とした発現細胞用のベクターであるが、複製開始点が低コピー数のプラスミドであるため、大腸菌で組換え体を調製する場合に、大腸菌を大量に培養しなくてはならない。
【００１０】
本発明の目的は、細胞への遺伝子導入に必要なベクターを、少量の大腸菌の培養で効率良く作製することが可能な動物細胞用ベクターを提供することにある。これにより、少量の大腸菌の培養で効率よく必要なベクターを作製し、目的蛋白質を生産する動物細胞を作製することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、少量の大腸菌の培養で効率良く作製することが可能な動物細胞用ベクターを構築した。
【００１２】
本発明は、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＰＪ，  Ｂｅｒｇ  Ｐ．“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７，１９８２年発行  を参照）、蛋白質発現をするための遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト及びｐｏｌｙＡシグナル（ポリアデニレーションシグナル）の順に並んでいる遺伝子配列１と、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を発現するためのプロモーター配列、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子及びｐｏｌｙＡシグナルの順に並んでいる遺伝子配列２と、大腸菌を宿主とするｐＵＣ系の複製開始点から構成される遺伝子配列３と、を有する動物細胞用発現ベクターに関するものである。以下、本発明を詳細に説明する。
＜遺伝子配列１＞
本発明に係る動物細胞用発現ベクターは遺伝子配列１を有しており、ＳＶ４０プロモーター、蛋白質発現をする遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト及びｐｏｌｙＡシグナルの順に並んでいる。
【００１３】
ここで、本発現ベクターにおけるＳＶ４０プロモーターとは、ＳＶ４０の初期および後期プロモーターである。
蛋白質発現をするための遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトは、目的蛋白質の遺伝子を組み込むための部位であり、ひとつあるいは複数の制限酵素部位から構成される。目的蛋白質の遺伝子を組み込むための制限酵素サイトが一つ以上望ましくは複数入っていれば、どのような配列を使用してもかまわない。構成する制限酵素部位は、本発現ベクター内の他の部位に存在しないものでなくてはならない。
【００１４】
ｐｏｌｙＡシグナルは、ターミネーションシグナルを含んでいれば特に制限はなく、例えばＳＶ４０ウイルスゲノム由来のｐｏｌｙＡシグナルやウシ成長ホルモン由来のｐｏｌｙＡシグナルが挙げられる。
＜遺伝子配列２＞
本発明に係る動物細胞用発現ベクターは遺伝子配列２を有しており、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を発現するためのプロモーター配列、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子及びｐｏｌｙＡシグナルの順に並んでいる。
【００１５】
ここで、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子は、動物細胞を宿主とした形質転換体を作製する場合に抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を宿主に与える遺伝子であり、その上流には該ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を発現誘導するためのプロモーター配列を有する。又該ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子は、大腸菌を宿主とした形質転換体を作製する場合にカナマイシン耐性を与えることができる遺伝子であり、その上流に該カナマイシン耐性遺伝子を発現するためのプロモーターを有する。
【００１６】
発現誘導を促すプロモーターは、動物細胞を宿主として遺伝子導入する場合は、動物細胞内で発現誘導を起こすプロモーターであればよく、例えばＳＶ４０プロモーターなどが挙げられる。大腸菌を宿主として遺伝子導入する場合は、大腸菌内で発現誘導を起こすプロモーターであればよく、例えばｂｌａプロモーターなどが挙げられる。
【００１７】
ｐｏｌｙＡシグナルは、ターミネーションシグナルを含んでいれば特に制限はなく、例えばＳＶ４０ウイルスゲノム由来のｐｏｌｙＡシグナルやウシ成長ホルモン由来のｐｏｌｙＡシグナルが挙げられる。
＜遺伝子配列３＞
本発明に係る動物細胞用発現ベクターは遺伝子配列３を有しており、大腸菌を宿主とするｐＵＣ系の複製開始点から構成されるものである。
【００１８】
ここで、大腸菌を宿主とするｐＵＣ系の複製開始点（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍ１３  ｐｈａｇｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ：  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍ１３ｍｐ１８  ａｎｄ  ｐＵＣ１９  ｖｅｃｔｏｒｓ．”，Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５年発行  を参照）は、ＣｏｌＥ１系複製開始点であり、大腸菌内でのコピー数が高くプラスミドＤＮＡの収量が多いという特徴を持つ。
【００１９】
本発明におけるベクターの遺伝子長は、可能な限り短いほうが良く、この好ましくは遺伝子の長さにして４５００塩基以下であることが望ましい。又さらに好ましくは４０００塩基以下であることが望ましい。これにより、大腸菌での形質転換効率を上げることが可能となり、多様な蛋白質の遺伝子を組み込んだ発現ベクターライブラリーを調製するのが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、大腸菌内において高コピーで複製されうる動物細胞用発現ベクターを提供する。そのため、動物細胞に蛋白質を発現させるために該蛋白質の遺伝子を宿主である動物細胞に導入することを目的として、該蛋白質遺伝子を組み込んだ動物細胞用発現ベクターを調製する場合に、少量の培養液を用いた培養で数十マイクログラムの該発現ベクターを得ることができる。これにより、少ない費用と労力で動物細胞用発現ベクターを作製することが可能となる。
【００２１】
また、動物細胞で多様な蛋白質を発現させるための遺伝子ライブラリーを作製するためには、蛋白質の遺伝子を組み込んだ発現ベクターを大量に調製する必要があるが、本発明により提供されるベクターを用いて遺伝子ライブラリーを作製することにより、多様な蛋白質の遺伝子を組み込んだ遺伝子ライブラリーを、少ない費用と労力で大量に調製することが可能となる。
【００２２】
本発明により作製されたベクターは、哺乳動物の細胞を発現宿主として、有用な蛋白質を生産することに用いることが可能である。有用蛋白質の例としては、インスリン、エリスロポエチン、ＩＬ６、ＩＬ３などの各種サイトカイン及びそのレセプター、ＳＣＦなどの細胞刺激因子、抗体、Ｆｃレセプター等が挙げられる。
【００２３】
発現宿主として用いられる哺乳動物細胞は、ＳＶ４０プロモーターが機能する細胞であればよく、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。
【実施例】
【００２４】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１．ＳＶ４０プロモーター、蛋白質発現をするための遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト、ｐｏｌｙＡシグナル、ｐＵＣ系プラスミドの複製開始点を有するプラスミド（ｐＤＳＰ）の作製
作製のスキームを図１に示す。プラスミドｐＥＣＥ（Ｅｌｌｉｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ，“Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  １１６２  ａｎｄ  １１６３  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ．”，Ｃｅｌｌ，４５，７２１，１９８６年発行  を参照）のＳＶ４０初期プロモーター及び後期プロモーターからｐｏｌｙシグナルにかけた部分を、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅した（プライマー１及び２。配列表参照。）。これをＰＣＲ産物とした（図１−Ａ）。
【００２６】
ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍ１３  ｐｈａｇｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ：  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍ１３ｍｐ１８  ａｎｄ  ｐＵＣ１９  ｖｅｃｔｏｒｓ．”，Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５年発行  を参照）を制限酵素ＳｓｐＩ（タカラバイオ株式会社製）及びＳａｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製）で切断した遺伝子の末端をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて平滑化し、続いてアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）（タカラバイオ株式会社製）を用いて脱リン酸化した。これをｐＵＣ  Ｏｒｉとした（図１−Ｂ）。
【００２７】
上記のＳＶ４０初期プロモーター及び後期プロモーターからｐｏｌｙシグナルにかけた部分のＰＣＲ産物（ＰＣＲ産物）と、ｐＵＣ１９をＳｓｐＩ及びＳａｐＩで切断後、平滑化及び脱リン酸化した遺伝子（ｐＵＣ  Ｏｒｉ）を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結した。作製したプラスミドをｐＤＳＰとした（図１−Ｃ）。
【００２８】
実施例２．ＳＶ４０プロモーター、蛋白質発現をするための遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト、ｐｏｌｙＡシグナル、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子及びそれを発現誘導するためのプロモーター、ｐＵＣ系プラスミドの複製開始点を有するプラスミド（ｐＤＳＢ）の作製
プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＰＪ，  Ｂｅｒｇ  Ｐ．，“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７，１９８２年発行  を参照）を制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ株式会社製）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ株式会社製）で切断することにより、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子及びそれを発現誘導するためのプロモーターを有する遺伝子を調製した。これをネオマイシン遺伝子とした（図１−Ｄ）。
【００２９】
調製した遺伝子（ネオマイシン遺伝子）を、実施例１で作製したｐＤＳＰを制限酵素ＳｃａＩ（タカラバイオ株式会社製）及びＢｓａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製）で切断した遺伝子（図１−Ｅ）に、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ株式会社製）を用いて挿入した。作製したプラスミドをｐＤＳＢとした（図１−Ｆ）。
【００３０】
実施例３．プラスミドｐＤＳＢの調製
実施例２で調製したベクターｐＤＳＢのうち３ナノグラム（ｎｇ）を用いて、大腸菌のコンピテントセルＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）１００マイクロリットル（μｌ）を形質転換した。形質転換はコンピテントセルに添付の資料に従って行った。
【００３１】
得られた形質転換体を、２ｍｌの２ｘＹＴ培地（バクトトリプトン（ベクトンアンドデッキンソン社製）１６ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト（ベクトンアンドデッキンソン社製）１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム（関東化学製）５ｇ／Ｌ）にて３７℃で１８時間培養し、該培養液からＱＩＡ  ｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出した。対照として、ｐＢＲ３２２由来の複製開始点を持つ動物細胞発現ベクターｐＳＶ２ｎｅｏ及びｐＥＣＥを、同様にコンピテントセルＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより調製した。
【００３２】
結果を図２に示した。その結果、プラスミドｐＤＳＢは培養液２．５ｍｌから１１．５マイクログラム調製できた。一方、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは培養液２．５ｍｌから１．２マイクログラム調製された。また、プラスミドｐＥＣＥは培養液２．５ｍｌから１．３マイクログラム調製された。このことは、本発明で提供するベクターは、少量の培養液を用いた培養で数十マイクログラムの該発現ベクターを得ることが可能である動物細胞発現用ベクターであることを示している。これにより、少ない費用と労力で動物細胞用発現ベクターを作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】プラスミドｐＤＳＢの作製スキームを示す。
【図２】図２は、培養液２．５ｍｌから抽出されたプラスミドの量を示したものであり、単位はマイクログラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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