(57)【要約】      （修正有）【課題】リガンド依存的転写に使用するための融合タンパク質を提供する。【解決手段】細胞内受容体由来の改変されたリガンド結合ドメインと作動可能に連結したヌクレオチド結合ドメインを含む融合タンパク質、さらに転写制御ドメインも含む融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、およびトランスフェクションされた細胞。該ヌクレオチド結合ドメインは、約３ないし約１８ヌクレオチドの隣接する標的ヌクレオチド配列に結合する亜鉛フィンガーペプチドである。該融合タンパク質は、遺伝子治療に用いられる。【選択図】図１０
2009273463.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内受容体由来の改変されたリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と作動可能に連結したヌクレオチド結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む融合タンパク質であって、
融合タンパク質が、リガンド活性化転写レギュレーターであり；
ヌクレオチド結合ドメインが、亜鉛フィンガーモジュラー部分を含む多指（polydactyl）亜鉛フィンガーであり；
ヌクレオチド結合ドメインの各モジュラー部分が、少なくとも３つのヌクレオチドの隣接するヌクレオチド配列と相互作用し；
ＬＢＤのリガンド特異性が、ＬＢＤが誘導された天然細胞内受容体のリガンド結合ドメインのリガンド特異性と比較してそのリガンド特異性が変化するように改変され、それによって融合タンパク質を活性化するリガンドがＬＢＤが誘導されたレセプターを活性化するリガンドではなく、そして、
融合タンパク質が少なくとも６つの亜鉛フィンガーモジュラー部分を含む、
融合タンパク質。
【請求項２】
モノマーである、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】
第１のモノマーおよび第２のモノマーを有するダイマーである、請求項１または請求項２の融合タンパク質。
【請求項４】
ヘテロダイマーである、請求項３の融合タンパク質。
【請求項５】
ホモダイマーである、請求項３の融合タンパク質。
【請求項６】
作動可能に連結した転写制御ドメインをさらに含む、請求項１−５のいずれかの融合タンパク質。
【請求項７】
細胞内受容体が核ホルモン受容体である、請求項１−６のいずれかの融合タンパク質。
【請求項８】
亜鉛フィンガーが、式（ＧＮＮ)ｎ（ただし、Ｇはグアニジン、Ｎは任意のヌクレオチド、そしてｎは３ないし６の整数である。）のヌクレオチド配列に結合する、請求項１−７のいずれかの融合タンパク質。
【請求項９】
ＤＢＤがＣ２Ｈ２亜鉛フィンガー由来の亜鉛フィンガーモジュラー部分を含む、請求項１−８のいずれかの融合タンパク質。
【請求項１０】
細胞内受容体が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド−α受容体、グルココルチコイド−β受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体、ＣＯＵＰ−ＴＦ受容体、エクジソン受容体、Ｎｕｒｒ−Ｉ受容体およびオーファン受容体からなる群から選択される核ホルモン受容体である、請求項１−９のいずれかの融合タンパク質。
【請求項１１】
細胞内受容体がステロイド受容体である、請求項１−９のいずれかの融合タンパク質。
【請求項１２】
ホルモン受容体が、プロゲステロン受容体変異体またはエストロゲン受容体変異体である、請求項１０の融合タンパク質。
【請求項１３】
転写制御ドメインが転写活性化ドメインを含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１４】
転写制御ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＴＡ２、ＳＴＡＴ−６、ｐ６５ならびにそれらの転写活性化活性を有する誘導体類、多量体および組合せからなる群から選択される、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１５】
転写制御ドメインが、核ホルモン受容体転写活性化ドメインまたはその転写活性化活性を有する変異体を含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１６】
転写制御ドメインが、ステロイドホルモン受容体転写活性化ドメインまたはその転写活性化活性を維持している変異体を含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１７】
転写制御ドメインが、ウイルス転写活性化ドメインまたはその転写活性化活性を維持している変異体を含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１８】
転写制御ドメインが、ＶＰ１６転写活性化ドメインまたはその変異体を含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項１９】
転写制御ドメインが、転写抑制ドメインを含む、請求項６の融合タンパク質。
【請求項２０】
転写抑制ドメインが、ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、デアセチラーゼ、ならびにそれらの誘導体類、多量体および組合せ、例えばＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、（ＫＲＡＢ）２、（ＫＲＡＢ）３、ＫＲＡＢ−Ａ、（ＫＲＡＢ−Ａ）２、（ＳＩＤ）２、（ＫＲＡＢ−Ａ）−ＳＩＤおよびＳＩＤ−（ＫＲＡＢ−Ａ）からなる群から選択される、請求項１９の融合タンパク質。
【請求項２１】
転写抑制ドメインが、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、（ＫＲＡＢ）２、（ＫＲＡＢ）３、ＫＲＡＢ−Ａ、（ＫＲＡＢ−Ａ）２、（ＳＩＤ）２、（ＫＲＡＢ−Ａ）−ＳＩＤおよびＳＩＤ−（ＫＲＡＢ−Ａ）からなる群から選択されるドメインの組合せである、請求項１９の融合タンパク質。
【請求項２２】
配列番号１ないし配列番号１８のいずれかに示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２３】
核酸結合ドメインが、標的核酸分子と約１．０ナノモルより小さい解離定数で結合する、請求項１−２２のいずれかの融合タンパク質。
【請求項２４】
２つのリガンド結合ドメインを含む、請求項１−２３のいずれかの融合タンパク質。
【請求項２５】
リガンド結合ドメインが同じである、請求項２４の融合タンパク質。
【請求項２６】
リガンド結合ドメインが異なっている、請求項２４の融合タンパク質。
【請求項２７】
請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２８】
請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２９】
融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む請求項２８のベクターであって、
融合タンパク質が細胞内受容体由来のリガンド結合ドメインと作動可能に連結したヌクレオチド結合ドメインを含み、ヌクレオチド結合ドメインが少なくとも１８個のヌクレオチドの隣接するヌクレオチド配列と相互作用する多指Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガーペプチドまたはそのモジュラー部分であり、
融合タンパク質がリガンド活性化転写レギュレーターである、
ベクター。
【請求項３０】
ウイルスベクターである、請求項２８または請求項２９のベクター。
【請求項３１】
ウイルスベクターがＤＮＡウイルスまたはレトロウイルスに由来する、請求項３０のベクター。
【請求項３２】
アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３０のベクター。
【請求項３３】
請求項２８−３２のいずれかのベクターを含む単離細胞。
【請求項３４】
真核生物細胞である、請求項３３の細胞。
【請求項３５】
有効量の請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および医薬的に許容し得る賦形剤を含む、遺伝子発現を制御するための医薬組成物。
【請求項３６】
単回投与用に製剤された、請求項３５の医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子；および融合タンパク質または核酸分子の非ウイルス送達を達成するための試剤を含む、非ウイルス送達システム。
【請求項３８】
発現カセットを含む核酸分子をさらに含み、該発現カセットは、融合タンパク質の核酸結合ドメインが相互作用するヌクレオチド配列を含有するものである、請求項３７の非ウイルス送達システム。
【請求項３９】
非ウイルス送達を達成するための試剤が、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡ直接注入用試剤、ＣａＰＯ４沈殿用試剤、遺伝子銃法用試剤、エレクトロポレーション用試剤、リポソームおよびリポフェクション用試剤からなる群から選択される、請求項３７または請求項３８の非ウイルス送達システム。
【請求項４０】
融合タンパク質のヌクレオチド結合ドメインが結合する核酸配列を含む遺伝子の転写を調節するための薬剤の製造における、請求項１−２６のいずれかの融合タンパク質または請求項２７の核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載された研究は、National Institutes of Health NIH Contract No. GM53910により支援された。米国政府は本主題発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本願は、１９９９年１０月２５日に出願された、Carlos F. Barbas III, Michael Kadan、およびRoger R. Beerliの、"Recombinant Ligand Activated Transcriptional Regulator Polypeptides."なる発明の名称の、米国特許出願番号09/433,042の一部継続出願である。米国特許出願番号09/433,042を引用することにより本明細書に完全に含める。
【０００３】
発明の分野
本発明の分野は遺伝子発現の制御である。特に、リガンド活性化融合タンパク質(本明細書ではキメラレギュレーターとも呼ばれる)および遺伝子発現の制御のためのその使用を提供する。融合ポリペプチドは細胞内受容体に由来する１または複数の亜鉛フィンガーポリペプチドドメインおよびリガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)を含むＤＮＡ結合ドメインを含む。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
細胞内受容体は、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモンおよびビタミンＡおよびＤを含むさまざまなホルモンおよびエフェクター分子の核への作用を介在する関連タンパク質のスーパーファミリーである。細胞内受容体の本ファミリーのメンバーは、基本型のリガンド活性化転写因子である。これらの受容体は、２つの基本的な機能のドメイン：約６６アミノ酸を含むＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)および約３００アミノ酸を有する受容体のＣ末端側の半分に位置するリガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)を含む。受容体は、熱ショックタンパク質のような不活性化因子と関連しているため、ホルモン(リガンド)の不存在下では不活性である。リガンドが結合すると、受容体は不活性複合体から解離してダイマー化し、このことによりそれらはＤＮＡと結合できるようになり、転写を調節できる。
【０００５】
例えば、ステロイド受容体に関していえば、ステロイドホルモンがその受容体に結合すると受容体タンパク質のホモダイマー化が起こり、次いで核ＤＮＡ中の「ステロイド応答エレメント」(ＳＲＥ)ＤＮＡ配列に結合する。リガンドの結合に伴って受容体のコンホメーションが変化すると、コアクチベーターと呼ばれる、転写を制御する他の転写制御因子がＳＲＥ結合部位に隣接するプロモーターから補充される。
【０００６】
修飾されたステロイドホルモン受容体は、ＬＢＤのリガンド特異性を修飾することにより導入遺伝子(例えば、米国特許第5,874,534号および米国仮出願第60/029,964号に基づいた公開国際ＰＣＴ出願第WO98/18925号を参照)の調節された発現に関する使用のために開発された。さらに、受容体のＤＮＡ結合ドメインが酵母ＧＡＬ４ ＤＢＤ、ウイルス性ＤＢＤおよび昆虫性ＤＢＤ結合ドメインから選択される非哺乳動物のＤＮＡ結合ドメインと置換されると、非哺乳動物のＤＢＤにより認識される領域を含む一緒に投与された遺伝子(co-administered gene)の制御された発現を提供する。しかしながら、これらの構成物はいくつかの欠点を有する。非哺乳動物のＤＢＤは強力な免疫原性があり、これらのＤＢＤにより認識される配列のアレイは限られており、それによって遺伝子の標的を厳密に限定している。
【０００７】
したがって、より用途の広い遺伝子レギュレーターが必要とされている。遺伝子発現の用途の広いレギュレーターとして機能するポリペプチドを提供することが本明細書の目的である。
【発明の概要】
【０００８】
発明の要約
リガンド活性化転写レギュレーターとして機能するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。ポリペプチドは、任意の所望の内在性または外因性遺伝子を標的とし得るリガンド活性化転写レギュレーターの融合タンパク質である。融合タンパク質の変異体は、内在性または外因性のリガンドに関して異なる選択性および感受性を有するように設計され得る。
【０００９】
融合タンパク質をコードしている核酸分子、該核酸を含む発現ベクターおよび該発現ベクターを含む細胞を提供する。融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸、特にベクターは細胞中に導入され得、細胞内で発現した場合、リガンドに依存した方法で遺伝子発現を制御する。
【００１０】
融合タンパク質
本明細書で提供される融合タンパク質は、細胞内受容体由来のリガンド結合ドメイン(本明細書においてＬＤＢと表される)、好ましくは、ＬＢＤが生じた自然の細胞内受容体と比較して修飾されたリガンド特異性を有するＬＢＤ、および任意の所望の特異性に調整され得る核酸結合ドメイン(本明細書においてＤＢＤと表される)を含む。融合タンパク質は、また、転写制御ドメイン(本明細書においてＴＲＤと表される)、特にレプレッサーまたはアクチベータードメインを含み得る。ドメインを実施可能なように（operativebly）連結すると、得られる融合タンパク質はリガンド制御標的転写因子として機能する。
【００１１】
細胞の核に送達された場合、実施可能なように連結されたドメインは、ともに標的遺伝子の発現を調節するように作用し、該標的遺伝子は細胞中の自然の遺伝子であってもよいし、細胞内に送達された遺伝子であってもよい。ゆえに、標的遺伝子は内在性の細胞遺伝子または細胞外から供給された組換えポリヌクレオチド構成物であり得る。融合タンパク質は、また、標的遺伝子の転写を活性化、促進または抑制することから選択される転写制御ドメインを含み得る。
【００１２】
１つの実施態様において、融合タンパク質はヒトのタンパク質と非常に相同性が高いコンポーネント、好ましくは、アミノ酸配列における対応するヒトのドメインとの相同性が約８０％、さらに好ましくは約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０％であるコンポーネントから構成される。別の実施態様において、融合タンパク質は自然に発生する遺伝子と結合し、リガンドに依存した方法で自然に発生する遺伝子の転写を調節する。別の実施態様において、融合タンパク質は、細胞外から供給された組換え構成物に結合し、リガンドに依存した方法で細胞外から供給された組換え構成物の転写を調節する。
【００１３】
好ましい実施態様において、単離された組換え融合タンパク質はポリヌクレオチドと結合した場合にダイマーを形成する。ダイマーはホモダイマーまたはヘテロダイマーであり得る。１つの実施態様において、ダイマーは少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つ、好ましくは２つのリガンド結合ドメインおよび少なくとも１つの転写調節ドメインを含む。ヘテロダイマーにおいて、ダイマーは２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン、２つの異なるリガンド結合ドメインまたは２つの異なる転写調節ドメインを含み得る。１つの例示的なヘテロダイマーは少なくとも３つの亜鉛フィンガーモジュラーユニット、２つの異なるリガンド結合部位および１つの転写調節ドメインを含む。
【００１４】
エストロゲンに応答せず、臨床的処置のためにルーチンで使用される合成非ステロイド性薬物により誘導される、亜鉛フィンガーおよびＬＢＤを含む例示的な融合タンパク質を記載する；これらのレギュレーターはリガンド依存性の遺伝子の活性化を提供する。例示的な融合タンパク質は、配列番号１〜１８のそれぞれに示されたオープンリーディングフレームによりコードされたアミノ酸配列を含む。
融合タンパク質は植物種ならびに動物において使用され得る。特定の細菌性またはウイルス性病原体に耐性のトランスジェニック植物を作成し得る。
【００１５】
リガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)
ＬＢＤは細胞内受容体、特にステロイドホルモン受容体由来のものである。ＬＢＤの由来となる受容体は、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体、ＣＯＵＰ−ＴＦ受容体、エクジソン受容体、Ｎｕｒｒ−Ｉ受容体、オーファン受容体およびその変異体を含むが、これらに限定されない。これらの種類の受容体は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド−α受容体、グルココルチコイド−β受容体、アンドロゲン受容体および甲状腺ホルモン受容体を含むが、これらに限定されない。ＬＢＤは、好ましくは、内在性のリガンドと比較して外因性のリガンド、例えば薬物と優先的に結合するようにリガンド選択性を改変するように修飾される。
【００１６】
ヒトの遺伝子治療を意図する場合、リガンド結合ドメインは、好ましくは実質的な免疫応答を回避するために、十分な同一性、典型的にヒトリガンド結合ドメインと少なくとも約９０％の配列同一性を保持する。ＬＢＤにおける１アミノ酸の変異がタンパク質の性能を劇的に改変し得る。
【００１７】
ＬＢＤは、好ましくは、ＬＢＤの由来となる受容体の内在性のリガンドには結合しないが、標的遺伝子の微調節された制御を可能にする選択的リガンドには結合するように修飾される。ゆえに、ある実施態様において、リガンド結合ドメインは、自然の受容体における選択性と比較してリガンド選択性を変えるために修飾された。好ましくは、修飾されたリガンド結合ドメインは、内在性のリガンドによって実質的に活性化されない。リガンド選択性を改変し、系統的な配列変更を含み、特異性を試験することに関する任意の方法、および選別のプロトコール(例えば、米国特許第5,874,534号およびWang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:8180-8184)を使用し得る。
【００１８】
核酸結合ドメイン(ＤＢＤ)
標的化されたおよび特異的な転写制御を達成するため、ＤＢＤは少なくとも１つの亜鉛フィンガーモジュラーユニットを含み、そして標的遺伝子に結合するよう設計される。亜鉛フィンガーの核酸結合ドメインは、ヌクレオチドの選択された配列に結合する少なくとも２つの亜鉛フィンガーモジュールを含む。任意の亜鉛フィンガーまたはモジュラー部分を使用し得る。ＤＢＤによって、リガンド結合ドメインの由来となる受容体中の天然の亜鉛フィンガードメインが置換されるか、または補われる。
【００１９】
核酸結合ドメイン(ＤＢＤ)は、少なくとも１、好ましくは少なくとも２亜鉛フィンガー核酸結合ポリペプチドのモジュラーユニットを含み、各モジュラーユニットは３塩基のヌクレオチド配列を特異的に認識する。得られるＤＢＤは、３〜約１８ヌクレオチドの隣接するヌクレオチド配列に結合する。
【００２０】
既に述べたように、ＤＢＤはモジュラー亜鉛フィンガーユニットを含み、ここで、各ユニットはトリヌクレオチドに特異的である。モジュラー亜鉛タンパク質は、得られるドメインが任意の標的配列、一般的にはＤＮＡに特異的に結合するように組み合わせられ得、その結果、融合タンパク質が標的配列に結合すると標的遺伝子の転写が調節される。
融合タンパク質の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合部分は、トランケーションまたは伸張による野生型亜鉛フィンガータンパク質由来のものであるか、またはそれから作成されたものであるか、あるいはサイト・ダイレクト突然変異誘発法による、またはさまざまなモジュラーユニットの組み合わせによる、または手順の組み合わせによる野生型由来のポリペプチドの変異体として誘導されまたは作成され得る。
【００２１】
Cys2His2(C2H2)型亜鉛フィンガータンパク質は、細胞内受容体における天然のＤＮＡ結合ドメイン、例えばステロイド受容体におけるＣ４−Ｃ４型ドメインと置換され得る亜鉛フィンガーの典型であり、機能的リガンド応答性転写因子融合タンパク質を形成する。亜鉛フィンガーによって、得られる融合タンパク質は未修飾の細胞内受容体と比べて改変されたＤＮＡ結合特異性を示す。
【００２２】
使用する受容体のリガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)の最適部分、亜鉛フィンガーアレイおよびその範囲ならびにＤＮＡ結合の化学量論および配向性は、ステロイド受容体に関して本明細書において例示されているように経験的に決定され得る。
【００２３】
好ましい実施態様において、融合タンパク質の亜鉛フィンガー部分は、式(ＧＮＮ)ｎのヌクレオチド配列に結合し、ここでＧはグアニジンであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１〜６の整数であり、典型的にはｎは３〜６である。好ましくは、該亜鉛フィンガーモジュラーユニットはＣ２Ｈ２亜鉛フィンガーペプチド由来のものである。さらに好ましくは、該亜鉛フィンガーペプチドはヒト亜鉛フィンガーペプチドと少なくとも９０％配列同一性を有するＣ２Ｈ２亜鉛フィンガーペプチドである。
【００２４】
転写制御ドメイン(ＴＲＤ)
融合タンパク質は、また、転写制御ドメインを含み得る。好ましい実施態様において、転写制御ドメインは転写活性化ドメインを含む。好ましくは、該転写制御ドメインは、望ましくない免疫応答の誘発を避けるため、ヒトを含む哺乳動物の転写制御ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００２５】
転写制御ドメインは、真核生物の転写レギュレーターとして知られ、またはそれを制御するために作成された任意のドメインであり得る。このようなＴＲＤは既知であり、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＴＡ２、ＳＴＡＴ−６、ｐ６５、およびその誘導体、転写制御特性を示すそのマルチマーおよび組合せを含むが、これらに限定されない。転写制御ドメインは、細胞内受容体、例えば核ホルモン受容体転写活性(または抑制)ドメインに由来し得、そして、好ましくは、ステロイドホルモン受容体転写活性ドメインまたは転写制御特性を示すその変異体である。転写ドメインはＴＡＦ−１、ＴＡＦ−２、ＴＡＵ−１、ＴＡＵ−２、およびその変異体を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
転写制御ドメインは、ウイルス性転写活性化ドメインまたはその変異体であり得る。好ましくは、ウイルス性転写制御ドメインはＶＰ１６転写活性化ドメインまたはその誘導体を含む。
【００２７】
転写制御ドメインは転写抑制ドメインを含み得る。このようなドメインは既知であり、ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、デアセチラーゼ、およびその誘導体、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、(ＫＲＡＢ)２、(ＫＲＡＢ)３、ＫＲＡＢ−Ａ、(ＫＲＡＢ−Ａ)２、(ＳＩＤ)２(ＫＲＡＢ−Ａ)−ＳＩＤおよびＳＩＤ−(ＫＲＡＢ−Ａ)のようなマルチマーおよびその組合せの中から選択される転写抑制ドメインを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
核酸構成物
得られる融合タンパク質をコードする核酸分子もまた提供される。該核酸は、タンパク質の発現に適したベクターおよび／または遺伝子治療に適したベクター中に含まれ得る。ベクターを含む細胞もまた提供される。典型的に、該細胞は真核細胞である。他の実施態様において、該細胞は原核細胞である。
【００２９】
転写制御領域または応答エレメントと実施可能なように連結され、本明細書において提供される融合タンパク質と結合し、特に融合ポリペプチドのＬＢＤがリガンドと結合すると転写を制御する核酸の配列を含む目的の遺伝子、特に血管形成阻害剤のような治療産物をコードする遺伝子を含む発現カセットも提供される。このような発現カセットは、遺伝子治療のためのベクター中に含まれ得、融合タンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸の投与と同時に、前にまたは後に投与することが意図される。外因性の送達のための目的の遺伝子は、典型的に治療用タンパク質、例えば増殖因子、増殖因子阻害剤または拮抗剤、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)阻害剤、抗腫瘍剤、血管形成剤、抗血管形成剤、凝固因子、アポトーシスおよび他の自殺遺伝子をコードする。
【００３０】
組成物、組合せおよびキット
融合タンパク質または融合タンパク質をコードするベクターを含む組成物も提供される。融合タンパク質または該タンパク質をコードしている核酸および融合タンパク質による活性化のために選択された制御領域を有する標的遺伝子をコードする核酸の組合せも提供される。
【００３１】
組成物、特に薬学的に許容される担体中に融合ポリペプチドを含む医薬組成物も提供される。
【００３２】
発現カセットおよび融合ポリペプチドまたは核酸分子、特に融合ポリペプチドをコードする発現ベクターの組み合わせが提供される。組み合わせは個別の組成物または両方のエレメントを含む単一の組成物を含み得る。該組み合わせおよび所望によりその投与のための指示書および該組み合わせの調製および投与に使用される他の試薬を含むキットも提供される。
【００３３】
ゆえに、典型的には遺伝子治療に適したベクター中に、融合タンパク質をコードしている核酸を含む、遺伝子治療に適した組成物が提供される。好ましいベクターはウイルス性ベクター、好ましくはアデノウイルス性ベクター、およびレンチウイルス性ベクターを含む。他の実施態様において、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、リン酸カルシウム法、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、リポソーム法およびリポフェクションが提供される。
【００３４】
遺伝子発現を制御するのに適した組成物は、有効量の融合タンパク質またはリガンド活性化転写制御融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む。このような組成物は、さらに、遺伝子をコードしている制御可能な発現カセットおよび融合ポリペプチドのヌクレオチド結合ドメインにより認識される遺伝子に関する少なくとも１つの応答エレメントを含み得る。
【００３５】
制御可能な発現カセットは、リガンド活性化転写制御融合タンパク質の核酸結合ドメインが相互作用する核酸の配列を含むように設計される。それは、また、好ましくは、融合タンパク質のＴＲＤにより制御可能な、実施可能なように連結された転写制御配列を含む。典型的に、制御可能な発現カセットは、３〜６の応答エレメントを含む。
【００３６】
方法
内在性および外因性遺伝子の発現を制御する方法が提供される。該方法は、有効量または有効濃度の融合タンパク質または核酸分子、例えば融合タンパク質をコードするベクターを含む組成物を細胞に投与することにより実施される。融合タンパク質の核酸結合ドメイン(ＤＢＤ)は、細胞のゲノム内のまたは細胞外から投与された核酸分子内の標的核酸配列に結合するように選択され、転写制御ドメイン(ＴＲＤ)は、標的核酸結合ドメインに実施可能なように連結した選択されたプロモーターから転写を制御するように選択される。細胞外から投与された核酸分子は、目的の遺伝子をコードし、プロモーターおよび応答エレメントのようなエレメントを含む制御領域に実施可能なように連結された発現カセットを含む。
【００３７】
既に述べたように、標的制御領域および目的の遺伝子は、細胞中に内在的に存在し得、または目的の遺伝子をコードしている発現カセットの一部として別々に投与され得る。別々に投与される場合、それは遺伝子および融合タンパク質のヌクレオチド結合ドメインにより認識される遺伝子に関する少なくとも１つの応答エレメントを含む制御可能な発現カセットの一部として投与される。
【００３８】
それと同時にまたはその後に、融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドを含む組成物も投与される。該リガンドは、融合タンパク質(またはそれをコードしている核酸分子)と同じ組成物で、または別個の組成物で投与される。リガンドおよび融合タンパク質は、連続的に、同時にまたは断続的に投与され得る。
【００３９】
ゆえに、遺伝子治療は融合タンパク質のＬＢＤと結合するリガンドを投与することにより実施される。好ましくは、該リガンドは非天然リガンドであり、ＬＤＢは天然の細胞内受容体に存在する天然型から、非天然リガンドと優先的かつ選択的に相互作用するように修飾される。投与後、リガンドは融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、モノマーまたはダイマーとして融合タンパク質のＤＢＤは標的遺伝子と相互作用し、標的遺伝子の転写を抑制または活性化する。既に述べたように、標的遺伝子は内在性の遺伝子または細胞外から投与された遺伝子であり得る。
【００４０】
他の実施態様において、細胞内における遺伝子発現を制御する方法は、リガンド活性化転写制御融合タンパク質をコードする有効量の核酸分子、ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのヌクレオチド結合ドメインにより認識される遺伝子に関して少なくとも１つの応答エレメントに実施可能なように連結した遺伝子を含む制御可能な発現カセット、および薬学的に許容される賦形剤を細胞に投与すること；およびコードされたポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合するリガンドを細胞に投与することにより実施され、ここで、コードされたポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合するリガンドは、応答エレメントに結合し、遺伝子の転写を活性化または抑制する。
【００４１】
融合タンパク質をコードしている組換え発現ベクターのex vivo導入による細胞性増殖障害の処置方法が提供される。細胞性増殖疾患は、低下または上昇したレベルでの遺伝子の転写に関連した疾患を含む。
【００４２】
該組成物(複数を含む)の投与は、in vitro、in vivoまたはex vivoで実施され得る。１つのこのような方法は、疾患、例えば細胞増殖疾患を有する対象から組織サンプルを切除し、組織サンプルから造血細胞または他の細胞を単離し、単離した細胞を、融合タンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸分子、および、所望により、標的特異的遺伝子と接触させることを含む。所望により、細胞を、例えばインターロイキン−２のような増殖因子で処置して、対象に細胞を再導入する前に細胞増殖を刺激し得る。再導入された場合、該細胞は初めに単離された細胞集団を特異的に標的とする。本方法において、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの交差抑制活性(trans-repressing activity)は、対象における望ましくない細胞増殖を阻害または抑制するために使用され得る。好ましくは、対象はヒトである。
【００４３】
本明細書において例示された結果により、標的遺伝子のリガンド活性化転写が説明され、そして哺乳動物のＣ２Ｈ２ＤＮＡ結合ドメインのような亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、エストロゲン受容体のような細胞内受容体由来のリガンド結合ドメイン、および、所望により哺乳動物細胞に導入された導入遺伝子の発現をリガンド依存的に制御するための異種性の転写制御ドメインを含む融合タンパク質の利用が説明される。ゆえに、本明細書において、異種性の亜鉛フィンガードメインが標的遺伝子のリガンド依存的な遺伝子発現を達成するために細胞内受容体と組み合わせられ得ることが示される。
図面の説明
本明細書の一部を構成する図面において：
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、天然の９ｂｐ標的部位(最上部)を認識する３フィンガータンパク質Zif268が所望の１８ｂｐ標的配列(最下部)を認識する６フィンガータンパク質へとin vitroで変わることに関する選択ストラテジーのための概略図である。
【図２】図２は、ヒトエストロゲン受容体の機能性ドメイン(Ａ〜Ｆ)の概略図である。
【図３】図３は、組換え分子構成物の作成のためのクローニングストラテジーの概略図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＣ７ＬＢＤＡＳのための発現ベクターの概略マップである。
【図５】図５は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＣ７ＬＢＤＢＳのための発現ベクターの概略マップである。
【００４５】
【図６】図６は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＣ７ＬＢＤＣＳのための発現ベクターの概略マップである。
【図７】図７は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＣ７ＬＢＤＡＬのための発現ベクターの概略マップである。
【図８】図８は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＣ７ＬＢＤＢＬのための発現ベクターの概略マップである。
【図９】図９は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＣ７ＬＢＤＣＬのための発現ベクターの概略マップである。
【図１０】図１０は、組換え分子構成物のいくつかの実施態様の構造および亜鉛フィンガードメインＣ７、Ｅ２Ｃおよび２Ｃ７のＤＮＡ結合領域のヌクレオチド配列の概略的要約である。
【００４６】
【図１１】図１１は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＥ２ＣＬＢＤＡＳのための発現ベクターの概略マップである。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＥ２ＣＬＢＤＢＳのための発現ベクターの概略マップである。
【図１３】図１３は、構成物Ｃ７ＬＢＤＡＳＴＡ２、Ｃ７ＬＢＤＢＳＴＡ２、Ｃ７ＬＢＤＢＳ−ＳＴＡＴ６、Ｃ７ＬＢＤＢＳＶＰ１６(配列番号：１６)、およびＣ７ＬＢＤＢＳＮＬＳＶＰ１６の概略的ダイアグラムである。
【図１４】図１４は、ヘテロダイマーで使用されるＲＸＲおよびエクジソン(ＥｃＲ)リガンド結合ドメインを含む構成物の概略マップである。
【図１５】図１５は、２Ｃ７ＬＢＤ組換え分子構成物の作成のためのクローニングストラテジーの概略図である。
【００４７】
【図１６】図１６は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づく２Ｃ７ＬＢＤＡＳのための発現ベクターの概略マップである。
【図１７】図１７は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づく２Ｃ７ＬＢＤＢＳのための発現ベクターの概略マップである。
【図１８】図１８は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づく２Ｃ７ＬＢＤＣＳのための発現ベクターの概略マップである。
【図１９】図１９は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＬＢＤＡＳＮＬＳＶＰ１６(配列番号：１３)のための発現ベクターの概略マップである。
【図２０】図２０は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＣ７ＬＢＤＢＳＶＰ１６のための発現ベクターの概略マップである。
【００４８】
【図２１】図２１は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＣ７ＬＢＤＢＳＧ５２１Ｒ(配列番号：１５)のための発現ベクターの概略マップである。
【図２２】図２２は、プラスミドｐＣＤＮＡ３.１に基づくＣ７ＬＢＤＢＳＧ４００Ｖ(配列番号：１４)のための発現ベクターの概略マップである。
【図２３】図２３は、Ａ：３フィンガータンパク質Ｎ１のための結合部位に基づく誘導可能なプロモーターを示す。プロモーターは、３ｂｐのスペースを有するＮ１部位の５つのダイレクト・リピート配列を含む；５つの反復配列間のスペースは６ｂｐである。最下部：ルシフェラーゼアッセイ。HeLa細胞は示された融合タンパク質をコードしているプラスミドおよびＮ１レポーター構成物で共トランスフェクトされた。２４時間後、細胞を１０ｎＭ ＲＵ４８６(Ｂ)または１００ｎＭ タモキシフェン、Ｃでそれぞれ処理した。トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をアッセイする。
【図２４】図２４は、３フィンガータンパク質Ｂ３の結合部位に基づいて誘導可能なプロモーターを示す。Ａ：プロモーターは、３ｂｐのスペースを有するＢ３部位の５つのダイレクト・リピート配列を含む；５つの反復配列間のスペースは６ｂｐである。最下部：ルシフェラーゼアッセイ。HeLa細胞は示された融合タンパク質をコードしているプラスミドおよびＢ３レポーター構成物で共トランスフェクトされた。２４時間後、細胞を１０ｎＭ ＲＵ４８６(Ｂ)または１００ｎＭ タモキシフェン(Ｃ)、でそれぞれ処理した。トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をアッセイする。
【図２５】図２５は、ＲＵ４８６で誘導された機能性ＶＰ６４−Ｃ７−ＰＲ／ＶＰ６４−ＣＦ２−ＰＲヘテロダイマーの形成を示すルシフェラーゼアッセイの結果のグラフである。HeLa細胞は、対応するエフェクタープラスミドおよびＴＡＴＡレポータープラスミド(Ｃ７／ＣＦ２−ｄｒ０、５'のＣ７部位からＣＦ２部位、ダイレクト「リピート」でスペーサーなし；Ｃ７／Ｃ７−ｄｒ０、２Ｃ７部位、ダイレクト・リピートでスペーサーなし)で共トランスフェクトされた。２４時間後、細胞を１０ｎＭ ＲＵ４８６で処理した。トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をアッセイする。
【００４９】
【図２６】図２６は、ｐＡｖＣＶＩｘで示されるプラスミドの制限マップを示す。
【図２７】図２７は、ｐＳＱ３で示されるプラスミドの制限マップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
詳細な説明
１．定義
特記しない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明の属する分野における通常の知識を有する者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。すべての特許、出願、公開出願および他の刊行物およびＧｅｎＢａｎｋの配列、および本明細書の記載のいかなる部分を引用した他のデータベースを、引用することによりそれらの全体を本明細書に含める。
【００５１】
本明細書で使用されるように、本明細書において提供される融合タンパク質のリガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)は、選択されたリガンドとの結合に関与する融合タンパク質の部分を意味する。ＬＢＤは、所望によりおよび好ましくは、ダイマー化および不活性化機能を含む。本明細書におけるタンパク質中のＬＢＤは、細胞内受容体(特に、ステロイドホルモン核受容体スーパーファミリーのメンバーであるもの)のＣ末端側の半分の３００アミノ酸に由来するものである。それは、リガンドがその部位で相互作用し、カスケード事象を誘発し、結果的に標的遺伝子の制御エレメントと活性化された受容体が特異的に会合する受容体タンパク質の一部である。これらの受容体において、ＬＤＢはホルモン結合機能、例えば熱ショックタンパク質(ｈｓｐ)との相互作用を介する不活性化機能、およびダイマー化機能を含む。本明細書で使用するＬＢＤは、このようなＬＢＤおよび修飾されたその誘導体、特に改変されたリガンド特性を有する誘導体を含む。
【００５２】
本明細書に使用するように、転写調節ドメイン(ＴＲＤ)は遺伝子の転写を制御するように機能する、本明細書で提供される融合ポリペプチドの一部を意味する。例示的および好ましい転写抑制ドメインは、ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、デアセチラーゼ、およびその誘導体、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、(ＫＲＡＢ)２、(ＫＲＡＢ)３、ＫＲＡＢ−Ａ、(ＫＲＡＢ−Ａ)２、(ＳＩＤ)２(ＫＲＡＢ−Ａ)−ＳＩＤおよびＳＩＤ−(ＫＲＡＢ−Ａ)のようなマルチマーおよびその組み合わせである。
【００５３】
本明細書で使用するように、ＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)、または代わりに核酸(またはヌクレオチド)結合ドメインは、特異的な核酸結合能力を提供する、本明細書で提供される融合ポリペプチドの一部を意味する。略語ＤＢＤを使用することは、それをＤＮＡ結合ドメインに限定することを意味するのではなく、ＲＮＡに結合するポリペプチドを含むことも意図する。核酸結合ドメインは、遺伝子の転写機構と実施可能なように連結したヌクレオチド配列に関するＴＲＤ領域の相互作用の特異性によって、特定の遺伝子を該タンパク質の標的とするように機能する。ＤＢＤによって融合タンパク質は選択された標的遺伝子(複数を含む)を標的にし、該遺伝子(複数を含む)は内在性または外因的に加えられたものであってよい。
【００５４】
ここで使用されるように、実施可能なように連結され(operatively linked)は、例えば、融合ポリペプチドが、それぞれが意図されるように実行または機能するように連結されていることを意味する。例えば、リプレッサーは、その結合ドメインを介して標的ヌクレオチドに結合されるとき、当該リプレッサーが作用して転写を阻害または防止するような方法で、結合ドメインに付着している。エレメントの間の、またはエレメントの中の結合は、直接的または間接的であってもよく、例えば、リンカーを介していてもよい。そのエレメントは、必ずしも隣接していない。ゆえに、ＴＲＤのリプレッサードメインを、当業界で周知の任意の連結手法を使用してＤＮＡ結合ドメインに連結することができる。これらの２種のドメインの間にリンカー部分を含むことが必要であり得る。そのようなリンカー部分は、典型的にはドメイン間の間隔をもたらすアミノ酸残基の短い配列である。リンカーが、結合またはリプレッサードメインの何らの機能も干渉しない限り、任意の配列が使用されることができる。
【００５５】
ここで使用されるように、融合タンパク質は、実施可能なように結合または連結され、融合タンパク質を形成する、２種またはそれ以上の天然に存在するタンパク質の部分またはフラグメントを含むタンパク質であって、そのなかのそれぞれのフラグメントが天然に存在するタンパク質によって示される機能または修飾された機能を保持しているタンパク質である。天然に存在するタンパク質からのフラグメントを修飾して本来の特性を変化させ得る。
【００５６】
ここで使用されるように、修飾され、修飾、突然変異体または他のそのような用語は、その天然に存在する野生型形態からの所望のドメインの変化を意味し、そして本質的な配列変化を含む。
【００５７】
ここで使用されるように、“調節（モジュレーティング）”は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターが過剰に活性化されているとき、そこからの発現の阻害または抑制、またはそのようなプロモーターが低位に活性化されているとき、そこからの発現の増加または促進を意味する。
【００５８】
ここで使用されるように、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーは、ステロイド受容体である細胞内受容体のスーパーファミリーを意味する。そのような受容体の代表例は、エストロゲン、プロゲステロン、グルココルチコイドα、グルココルチコイドβ、ミネラルコルチコイド、アンドロゲン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、レチノイドＸ、ビタミンＤ、ＣＯＵＰ−ＴＦ、エクジソン、Ｎｕｒｒ−Ｉおよびオーファン（orphan）受容体を含むがこれらに限定されない。
【００５９】
ここで使用されるように、ここで出現する種々のアミノ酸配列に存在するアミノ酸は、それらの周知の、３文字または１文字省略形にしたがって同定される。種々のＤＮＡフラグメントに存在するヌクレオチドは、当業界でルーチンに使用される標準的単一文字命名法によって命名される。
【００６０】
ペプチドまたはタンパク質では、アミノ酸の適当な保存的な置換が当業者に既知であり、そして一般に、得られる分子の生物学的活性を変化させることなく産生され得る。当業者は、ポリペプチドの非本質的領域の単一アミノ酸置換が、一般に、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識する（例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Bejacmin/Cumming Pub. co., p.224参照）。
【００６１】
ここで使用されるように、送達プラスミドは、治療的遺伝子をコードし、または治療的産物またはその前駆体または制御遺伝子またはその他のファクターであって、インビボで細胞株に、またはその中に導入されたときに、治療的効果を生じるものをコードする遺伝子をコードしているヌクレオチド酸を運搬し、または送達するプラスミドベクターであり、例えば、治療的ウイルス性ベクターを増加させるパッケージング細胞株があるがこれらに限定されない。
【００６２】
ここで使用されるように、“組換え発現ベクター”または“発現ベクター”は、プラスミド、ウイルスまたはその他の媒体であって、異種性ＤＮＡ、例えば、ここでの融合タンパク質またはここで提供される発現カセットをコードしている核酸の挿入または組み込みによって操作されることが当業界で既知であるものを意味する。そのような発現ベクターは、細胞に挿入される核酸の効率的な転写のためのプロモーター配列を含む。その発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型による選択を可能とする特定の遺伝子を典型的には含む。
【００６３】
ここで使用されるように、ＤＮＡまたは核酸相同物は、予め選択された保存された核酸配列、例えば、治療的ポリペプチドをコードしている配列を含む核酸を意味する。用語“実質的に相同な”は、それと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相同性、または相同性または同一性のより小さいパーセンテージ、そして保存された生物学的活性または機能を有することを意味する。
【００６４】
ここで使用されるように、“宿主細胞”は、ベクターを増加させ、そしてそのＤＮＡを発現させることのできる細胞である。対象の宿主細胞の後代も含む。すべての後代が親細胞と同一であるとはいえず、なぜなら、複製中に発生する突然変異があり得るからである。用語“宿主細胞”が使用されるとき、そのような後代が含まれる。安定的導入の方法であって、ここで、外因性ＤＮＡが宿主に継続的に維持される方法は、当業界で既知である。
【００６５】
用語“相同性”および“同一性”は、しばしば相互交換的に使用される。この点では、パーセント相同性または同一性は、例えば、配列情報をＧＡＰコンピュータープログラムを使用して比較することによって決定され得る。このＧＡＰプログラムは、Needleman and Wunsch((1970) J. Mol. Biol. 48:443)のアラインメント法を使用し、Smith and Waterman((1981) Adv. Appl. Math. 2:482)に概説されている。簡単には、該ＧＡＰプログラムは、類似性を、類似である、アラインメントされるシンボルの数、すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸の数として定義し、２つの配列のより短いほうのシンボルの総数によって割られる。
【００６６】
当該ＧＡＰプログラムに好ましいデフォルトパラメーターは：（１）単一性比較マトリックス（同一について１の値および非同一について０の値を含む）およびSchwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)に記載されたようにGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の重量に基づく比較マトリックス（２）それぞれのギャップについて３．０のペナルティおよびそれぞれのギャップのそれぞれのシンボルについてさらなる０．１０ペナルティ；および（３）末端ギャップについてペナルティなし、を含み得る。
【００６７】
いずれの２種の核酸分子が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％“同一”であるヌクレオチド配列を有するかを、既知のコンピューターアルゴリズム、例えば、“ＦＡＳＴ  Ａ”プログラム（例えば、Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444におけるようなデフォルトパラメーターを使用する）を使用して決定することができる。あるいは、National Center for Biotechnology InformationデータベースのＢＬＡＳＴ機能を使用して同一性を決定し得る。
【００６８】
一般に、最高のオーダーのマッチが得られるように、配列はアラインメントされる。“同一性”それ自体が当業界に認識される意味を有し、そして公開された技術を使用して算出することができる。（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.,ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.,ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, PartI, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Deverux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991参照）。
【００６９】
２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、用語“同一性”は当業者に周知である（Carillo et al., (1988) SIAM J Applied Math 48:1073）。２種の配列間の同一性または類似性を決定するために一般に使用される方法は、Guide to Huge Computers, Martin j. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073に記載されたものを含むがこれらに限定されない。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュタープログラムにコード化される。２種の配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、GCGプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Reserch 12(I):387(1984), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S.F.,et al., J Molec Biol 215:403(1990)）を含むがこれらに限定されない。
【００７０】
したがって、ここで使用されるように、用語“同一性”は、テストおよびリファレンスポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の対比を意味する。例えば、テストポリペプチドはリファレンスポリペプチドと９０％またはそれ以上同一である任意のポリペプチドとして定義され得る。ここで使用されるように、用語、少なくとも“９０％同一である”は、リファレンスポリペプチドに対して９０ないし９９．９９パーセント同一性を意味する。９０％またはそれ以上のレベルの同一性は、例証目的のために、１００アミノ酸長のテストおよびリファレンスポリヌクレオチド長が比較されることを仮定すると、以下の事実を意味している。
【００７１】
テストポリペプチドの１０％（すなわち、１００のうちの１０）を超えないアミノ酸が、リファレンスポリペプチドのそれと異なる。同様の比較が、テストおよびリファレンスポリペプチドの間になされ得る。そのような相違は、アミノ酸配列の全長にわたりランダムに分布する点突然変異として表され得、またはそれらは、許容される最大の、例えば、１０／１００アミノ酸の相違（近似的に９０％同一性）までの変動する長さの１またはそれ以上の位置にクラスター化され得る。相違は、核酸またはアミノ酸置換、または欠失として定義される。
【００７２】
ここで使用されるように、プライマーは、２またはそれ以上の、好ましくは３より多いデオキシリボンヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味し、そこからのプライマー伸長産物の合成がイニシエートされることができる。ここでの目的のために、所望のプライマーは、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質鎖に実質的に相補的なものであり、選択された残基部位の増幅産物に突然変異を導入することもできる。合成の実行の実験的条件は、ヌクレオシドトリフォスフェートおよびポリマー化および伸長のための物質、例えばＤＮＡポリメラーゼ、および適当なバッファー、温度およびｐＨの存在を含む。
【００７３】
ここで使用されるように、遺伝子治療は、そのような治療が求められる障害または状態を有する、哺乳動物、特にヒトのある種の細胞、標的細胞への異種性ＤＮＡの導入に関係する。ＤＮＡは、異種性ＤＮＡを発現し、そしてそれによってコードされている治療的産物を生成するような方法で、選択された標的細胞に導入される。
【００７４】
あるいは、異種性ＤＮＡは、ある方法で、治療的産物をコードするＤＮＡの発現を介在し得、またはそれは、治療的産物の発現をある方法で直接的に、または間接的に介在する、産物、例えば、ペプチドまたはＲＮＡをコードし得る。遺伝子治療は、また欠損性遺伝子を置換し、または導入される哺乳動物または細胞によって生成される遺伝子産物を補足する遺伝子産物をコードしている核酸を送達するために使用され得る。
【００７５】
導入された核酸は、治療的化合物、例えば、その成長因子インヒビター、または腫瘍壊死因子またはその（thereor）インヒビター、例えば、その（therefor）受容体であって、通常は哺乳動物宿主で生成されず、または治療的に有用な時に治療的有効量で、または治療的有用時に生成されないものをコードし得る。治療的産物をコードしている異種性ＤＮＡは、その産物またはその発現を促進あるいは変化させるために、罹患性宿主の細胞への導入に先立ち、修飾され得る。遺伝子治療は、また遺伝子発現のインヒビターまたはリプレッサーまたはその他のモジュレーターの送達に関係し得る。
【００７６】
ここで使用されるように、異種性ＤＮＡは、通常はインビボで細胞によって生成されないＲＮＡおよびタンパク質であって、当該細胞はそれが発現されていないものをコードしている、または転写、翻訳、またはその他の制御可能な生物学的プロセスに影響を与えることによって内在性ＤＮＡの発現を変化させるメディエーターを介在し、またはコードしている、ＤＮＡである。異種性ＤＮＡは、また外因性ＤＮＡを意味し得る。当業者が、発現される細胞に異種性であり、または外因性であると認識し、または考える任意のＤＮＡが、ここで異種性ＤＮＡに含まれる。
【００７７】
異種性ＤＮＡの例は、追跡可能マーカータンパク質、例えば、薬物抵抗性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ、治療的に有効な物質、例えば、抗がん剤、酵素およびホルモンをコードするＤＮＡ、およびその他のタイプのタンパク質、例えば、抗体をコードするＤＮＡを含むがこれらに限定されない。異種性ＤＮＡによってコードされている抗体は、異種性ＤＮＡが導入されている細胞の表面上に分泌され、または発現され得る。
【００７８】
ゆえに、ここでの異種性ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡは、ゲノムに見出されるカウンターパートＤＮＡ分子のような、正確な配向で、および位置に存在しないＤＮＡを含む。それは、その他の生物または種（すなわち外因性）からのＤＮＡ分子もまた意味し得る。
【００７９】
ここで使用されるように、治療的有効産物は、宿主へ核酸を導入すると、産物が発現され、遺伝性または後天性疾患の症候、明示を緩和し、または排除し、または当該疾患を治療する、異種性核酸、典型的にはＤＮＡによってコードされている産物である。
【００８０】
典型的には、望まれる遺伝子産物をコードしているＤＮＡは、プラスミドベクターにクローンニングされ、そしてルーチンな方法、例えば、カルシウムフォスフェート介在ＤＮＡ取り込み（(1981)Somat. Cell. Mol. Genet. 7:603-616参照）によって、プロデューサー細胞、例えば、パッケージング細胞に導入される。プロデューサー細胞で増幅の後、異種性ＤＮＡを含むベクターは選択された標的細胞に導入される。
【００８１】
ここで使用されるように、発現または送達ベクターは、外因性または異種性ＤＮＡが適当な宿主細胞での発現のために挿入され得る、すなわち、当該ＤＮＡによってコードされているタンパク質またはポリペプチドが宿主細胞系で合成される、任意のプラスミドまたはウイルスを意味する。１またはそれ以上のタンパク質をコードしている、ＤＮＡセグメント（遺伝子）の発現を指示することのできるベクターは、ここで、“発現ベクター”と称される。逆転写酵素を使用して生成されるｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローニングをもたらすベクターもまた含まれる。
【００８２】
ここで使用されるように、遺伝子は、そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードしている核酸分子を意味する。遺伝子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでもよい。遺伝子はコード領域に先行し、そして後続する領域（リーダーおよびトレーラー）並びにそれぞれのコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含み得る。
【００８３】
ここで使用されるように、核酸分子またはポリペプチドまたはその他の生物物分子のリファレンスにより単離され、は、核酸またはポリペプチドが、ポリペプチドまたは核酸が取得された遺伝的環境から分離されることを意味する。それは、また天然状態からの変化を意味し得る。例えば、生存動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、“単離され”ではないが、共存在するその天然状態の材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ここで使用される用語としての“単離され”である。
【００８４】
したがって、組換え宿主細胞内に生成され、そして／または含まれるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、単離されていると考えられる。組換え宿主細胞から、または天然の源から部分的に、または実質的に精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドも、また“単離されたポリペプチド”または“単離されたポリヌクレオチド”として意図される。例えば、化合物の組換え的に生成されたバージョンは、Smith et al. (1988) Gene 67: 31-40に記載された、１ステップ法によって実質的に精製されることができる。用語、単離され、および、精製され、は、ときに相互交換的に使用される。
【００８５】
したがって、“単離され”ることによって、当該核酸は、天然に存在するゲノムにおいて、所望の核酸をコードしている遺伝子にすぐ隣接するこれらの遺伝子のコード配列から遊離である。単離されたＤＮＡは一本鎖または二本鎖であり得、そしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えハイブリッドＤＮＡ、または合成ＤＮＡであり得る。それは自然のＤＮＡ配列に同一であり得、または１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、付加、または置換によってそのような配列と異なり得る。
【００８６】
生物学的細胞または宿主から作成された調製物に言及するとき、単離され、または精製され、は、所望のＤＮＡまたは所望のタンパク質の粗抽出物を含む指摘されるＤＮＡまたはタンパク質を含む任意の細胞抽出物を意味する。例えば、タンパク質の場合、精製された調製物は個々の技術または一連の調製的または生物学的技術にしたがって取得されることができ、そして所望のＤＮＡまたは所望のタンパク質は、これらの調製物中で種々の程度の純度で存在することができる。これらの手法は、例えば、硫酸アンモニウム分別、ゲル濾過、イオン交換荷電クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心法および電気泳動を含むがこれらに限定されない。
【００８７】
“実質的に純粋な”、または“単離され”である、ＤＮＡまたはタンパク質の調製は、そのようなＤＮＡまたはタンパク質が通常天然に会合する、天然に存在する材料から遊離の調製物を意味するものと理解されるべきである。“本質的に純粋”は、所望のＤＮＡまたは所望のタンパク質の少なくとも９５％を含む“高度に”精製された調製物を意味すると理解されるべきである。
【００８８】
所望のＤＮＡまたは所望のタンパク質を含む細胞抽出物は、所望のタンパク質を発現し、または所望のＤＮＡを含む細胞から取得される、ホモジネート調製物または細胞フリーの調製物を意味すると理解されるべきである。用語“細胞抽出物”は、培養培地、特に細胞が除去された使用済み培養培地を含むことを意図している。
【００８９】
ここで使用されるように、“調節する”は、機能の抑制、促進または誘導を意味する。例えば、亜鉛フィンガー核酸結合ドメインおよびその変異体は、プロモーター内のモチーフへの結合によってプロモーター配列を調節し、それによってそのプロモーター細胞内ヌクレオチド配列に実施可能なように連結された遺伝子の転写を促進し、または抑制し得る。あるいは、調節は遺伝子の転写の阻害を含み得て、ここで、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド変異体は、構造遺伝子に結合し、そしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを遺伝子を経由する読みからブロックし、したがって、遺伝子の転写を阻害する。構造遺伝子は、例えば、通常の細胞内遺伝子または癌遺伝子（oncogene）であり得る。あるいは、調節は、転写物の翻訳の阻害を含み得る。
【００９０】
ここで使用されるように、“阻害する”は、プロモーターに実施可能なように連結された構造遺伝子の転写の活性化のレベルの抑制を意味する。例えば、ここでの方法について、当該遺伝子は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフを含む。
【００９１】
ここで使用されるように、転写制御領域は、標的細胞での遺伝子発現をドライブする領域を意味する。ここでの使用のために適当な転写制御領域は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー/プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー/プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＰＧＫおよびＣＮＶエンハンサーにカップリングされたαアクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【００９２】
ここで使用されるように、遺伝子のプロモーター領域は、構造遺伝子の典型的には５’側に位置する制御エレメントを含む。遺伝子が活性化されるべきならば、転写因子として知られるタンパク質が、その遺伝子のプロモーター領域に付着する。この集合体は、ＤＮＡからの第２遺伝学的セグメントをＲＮＡへ転写することを酵素に可能とすることによって“オンスイッチ”に似ている。殆どの場合に、得られるＲＮＡ分子は、特異的タンパク質の合成のための鋳型として働き；ときにＲＮＡそれ自体は最終産物である。プロモーター領域は、通常の細胞内プロモーターであり、または例えば癌プロモーター（onco-promorter）で有り得る。
【００９３】
癌プロモーターは、一般にウイルス誘導性プロモーターである。亜鉛フィンガー結合ポリペプチドが標的化され得るウイルス性プロモーターは、レトロウイルス性長末端反復（ＬＴＲｓ）、およびLentivirusプロモーター、例えば、ヒトＴ細胞リンパ親和性ウイルス（ＨＴＬＶ）１および２およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１または２を含むがこれらに限定されない。
【００９４】
ここで使用されるように、“有効量”は、予め活性化されたプロモーターの不活性化を生じる量、または亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターの不活性化を生じる量、または構造遺伝子の転写またはＲＮＡの翻訳をブロックする量を含む。要求される亜鉛フィンガー誘導性ヌクレオチド結合ポリペプチドの量は、存在するタンパク質／プロモーター複合体の自然の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質を置換するのに必要な量、またはプロモーターそれ自体と複合体を形成するために自然の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質と競合するのに必要な量である。
【００９５】
同様に、構造遺伝子またはＲＮＡをブロックするために要求される量は、それぞれＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして遺伝子を経由した読みからブロックする量、または翻訳を阻害する量である。好ましくは、この方法は、細胞内で実施され得る。機能的に不活性化しているプロモーターまたは構造遺伝子によって、転写または翻訳は抑制される。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質モチーフを含む細胞内ヌクレオチド配列への結合または“接触”のための阻害タンパク質の有効量の送達は、ここで記載されたメカニズムのいずれかによって、例えば、レトロウイルス性ベクターまたはリポソームによって、または当業界で周知のその他の方法によって達成されることができる。
【００９６】
ここで使用されるように“トランケートされ”は、自然の亜鉛フィンガー結合タンパク質に見出される亜鉛フィンガーを全数より少なく含み、または望まれない配列が欠失された亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体を意味する。例えば、９つの亜鉛フィンガーを天然に含む、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質ＴＦＩＩＩＡのトランケーションは、１ないし３つの亜鉛フィンガーのみを有するポリペプチドであってもよい。エクスパンジョンは、さらなる亜鉛フィンガーモジュールが付加された亜鉛フィンガーポリペプチドを意味する。
【００９７】
例えば、ＴＦＩＩＩＡは３つの亜鉛フィンガードメインを付加することによって１２個のフィンガーまで伸長し得る。さらに、トランケートされる亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、１より多い野生型ポリペプチドからの亜鉛フィンガーモジュールを含み、したがって“ハイブリッド”亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを生じ得る。
【００９８】
ここで使用されるように、“突然変異誘発され”は、タンパク質をコードしているＤＮＡのランダムまたは部位特異的突然変異誘発を達成するための任意の既知の方法を実施することによって取得された亜鉛フィンガー誘導性ヌクレオチド結合ポリペプチドを意味する。例えば、ＴＦＩＩＩＡでは、突然変異誘発が実施され、共通配列の１またはそれ以上の反復の非保存性残基を置換することができる。トランケートされた亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質は、また突然変異誘発されることができる。
【００９９】
ここで使用されるように、ポリペプチド“変異体”または“誘導体”は、ポリペプチドの突然変異された形態であるポリペプチドまたは組換えを経由して産生され、しかしなお望まれる活性、例えば、リガンドまたは核酸分子に結合し、または転写を調節する能力を保持しているものを意味する。
【０１００】
ここで使用されるように、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド“変異体”または“誘導体”は、亜鉛フィンガータンパク質の突然変異誘発された形態または組換えを経由して生成されたものである、ポリペプチドを意味する。変異体は、例えば、第２タンパク質の亜鉛フィンガードメイン（複数含む）に連結された１つのタンパク質からの、亜鉛フィンガードメイン（複数を含む）を含むハイブリッドであってもよい。当該ドメインは野生型または突然変異誘発性であってよい。
【０１０１】
“変異体”または“誘導体”は、野生型亜鉛フィンガータンパク質のトランケートされた形態を含み、それは野生型タンパク質のフィンガーの本来の数より少なく含む。誘導体または変異体が生成され得る、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの例は、ＴＦＩＩＩおよびｚｉｆ２６８を含む。類似用語は、“変異体”または“誘導体”核ホルモン受容体および“変異体”または“誘導体”転写エフェクタードメインを意味するために使用される。
【０１０２】
ここで使用されるように、“亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフ”は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合誘導体ポリペプチドが、特異性を有して結合する、ヌクレオチドセグメントの任意の２または３次元の特徴を意味する。この定義の中に、一般に５ヌクレオチドまたはそれより少ないヌクレオチド配列、ならびにＤＮＡ二本鎖ヘリックスの３次元態様、例えば、ヘリックスの大きいおよび小さい溝およびヘリックスの表面が含まれるがこれらに限定されない。典型的には、モチーフは、亜鉛フィンガーポリペプチドが結合できる適当な長さの任意の配列である。例えば、３フィンガーポリペプチドは、典型的には約９ないし約１４塩基対を有するモチーフに結合する。
【０１０３】
好ましくは、認識配列は、ゲノム内の特異性を確保するために、少なくとも約１６塩基対である。したがって、任意の特異性の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが提供される。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフは、経験的に設計され、または亜鉛フィンガータンパク質が結合する任意の配列であることができる。このモチーフは、制御配列、エキソン、イントロン、または任意の非コード配列を含む、任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に見出され得る。
【０１０４】
ここで使用されるように、用語“薬学的に許容される”、“生理学的に耐性である”およびその文法的変形は、組成物、担体、希釈剤および試薬に言及するときに相互交換的に使用され、そして望ましくない生理学的影響、例えば、吐き気、めまい、異常昂進等なく、当該材料をヒトにまたはヒトにおいて投与することができることを表す。
【０１０５】
ここで使用されるように、用語“ベクター”は、異なる遺伝学的環境の間に、実施可能なように連結された別の核酸を運搬することの可能な核酸分子を意味する。好ましいベクターは、ＤＮＡセグメントに存在する自律的複製および構造遺伝子産物の発現の可能なものであって、それらが実施可能なように連結されているものである。したがって、ベクターは、好ましくは前に記載されたレプリコンおよび選択可能マーカーを含む。
【０１０６】
ここで使用されるように、ＤＮＡフラグメントを含む、核酸分子に関して、語句“実施可能なように連結され（operatively linked）”は、一本鎖または二本鎖形態であれ、意図されたように実施可能なように連結された部分が機能する、好ましくは通常のホスホジエステル結合によって、ＤＮＡの１の鎖に共有結合的に結合された配列またはセグメントを意味する。ここで提供される転写単位またはカセットが実施可能なように連結されるベクターの選択は、当業界で周知のように、望まれる機能的特性、例えば、ベクター複製およびタンパク質発現、および形質転換されるべき宿主細胞（これらは組換えＤＮＡ分子を構成する当業界に固有の制限である）に直接的に依存する。
【０１０７】
ここで使用されるように、直接的ライゲーションに適合されたヌクレオチドの配列、すなわちポリリンカーは、ＤＮＡ発現ベクターの領域であって、（１）複製のために実施可能なように連結し、そして上流および下流の翻訳可能ＤＮＡ配列を輸送し、そして（２）ベクターへのＤＮＡ配列の直接的ライゲーションのための部位または手段を提供する、領域である。典型的には、直接的ポリリンカーは、２またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列、または制限部位を定義するヌクレオチドの配列である。制限切断すると、２つの部位が、翻訳可能ＤＮＡ配列がＤＮＡ発現ベクターにライゲートされることのできる粘着末端を得る。
【０１０８】
好ましくは、当該２つの制限部位は、制限切断すると、非相補的である粘着末端を提供し、それによって、翻訳可能ＤＮＡ配列のカセットへの直接的挿入を可能とする。ある実施態様では、直接的ライゲーションは、翻訳可能ＤＮＡ配列の上流に、翻訳可能ＤＮＡ配列の下流に、またはその両者に存在するヌクレオチドによって提供される。別の実施態様では、直接的ライゲーションに適合されたヌクレオチドの配列は、複数の直接的クローニング手段を定義するヌクレオチドの配列を含む。直接的ライゲーションに適合されたヌクレオチドの配列が多数の制限部位を定義する場合、それは複数のクローニング部位と称される。
【０１０９】
ここで使用されるように、分泌シグナルは、グラム陰性細菌のペリプラズム膜に当該タンパク質を標的させる、タンパク質のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルは、ｐｅｌＢ分泌シグナルである。Erwinia carotovaからの２種のｐｅｌＢ遺伝子産物変異体からの分泌シグナルドメインの推定されるアミノ酸残基配列は、Lei, et al. (Nature, 331: 543-546, 1988)に記載されている。ｐｅｌＢタンパク質のリーダー配列は、以前に融合タンパク質の分泌シグナルとして使用された（Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Sastry et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-5732; and Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8095-8099）。E. coliからのその他の分泌シグナルポリペプチドドメインのためのアミノ酸残基配列が既知である（例えば、Oliver, In Neidhard, F. C. (ed.), Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washinton, D. C., 1:56-69(1987)参照）。
【０１１０】
ここで使用されるように、リガンドは、受容体のリガンド結合ドメインと相互作用し、その活性を調節する任意の化合物を意味する；リガンドは典型的に受容体を活性化する。リガンドは、結合なく受容体を活性化する化合物も含むことができる。天然のリガンドは、その受容体と通常は相互作用する化合物である。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、抗ホルモンは、天然に存在する受容体のアンタゴニストである、化合物である。抗ホルモンは、ホルモンとは正反対の活性を有する。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、非天然リガンド(non-natural ligand)またはネイティブでないリガンド(non-native ligand)は、通常の化合物であって、ヒトのような哺乳類で発見された、受容体のリガンド結合ドメインに結合または相互作用する化合物をいう。ここで、“ネイティブでないリガンド”は、遺伝子治療が意図される特定生物種(ヒトまたは動物)において天然では発見されていないリガンドをいう。例えば、エクジソンのような特定の昆虫ホルモンはヒトでは発見されていない。そのためエクジソンはヒトのような動物にとってはネイティブでないホルモンである。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、“細胞増殖疾患”は、細胞群が形態学的に周りの組織とは相違してくる、悪性および非悪性の疾患を意味する。当該細胞増殖疾患は、遺伝子発現レベルの増加または減少を生ずる転写疾患であり得る。当該疾患の原因は、細胞由来またはウイルス由来であり得る。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを用いる遺伝子治療を用い、例えばヒトおよび植物のウイルス誘導性細胞増殖疾患を処置することができる。処置は、例えばウイルスに耐性のある植物細胞を作成するため予防となり得、またはウイルス産物の生成を防止することにより細胞における確立された感染を改善するため治療となり得る。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、“細胞性ヌクレオチド配列”は、細胞中に存在するヌクレオチド配列をいう。当該配列が天然に存在する細胞の配列である必要はない。例えば、宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれたレトロウイルスゲノムは、“細胞性ヌクレオチド配列”といえる。当該細胞性ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロンおよびエキソン、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。当該細胞および／または細胞性ヌクレオチド配列は、原核性または真核性であり得、酵母、ウイルスまたは植物ヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、治療組成物の投与は、任意の手段により効果をもたらし、それには、以下に限らないが、皮下、静脈、筋肉内、胸骨内、融合技術、腹膜内投与および非経口的投与が含まれる。
【０１１６】
ＩＩ．融合タンパク質
Ａ．一般
融合タンパク質は、リガンド結合ドメインおよび核酸結合ドメインを含むように構成され、当該核酸結合ドメインは、リガンド結合ドメインと同じ受容体からは誘導されない。これら２つのドメインの封入(inclusion)は、内在性または外因性の核酸分子に存在する標的核酸配列に配列特異的に結合し得る。その配列特異的結合のリガンド依存制御もまた提供される。その融合タンパク質にはまた、内在性または外因性の遺伝子の発現を促進、抑制または活性化する役割をする転写調節ドメインが含まれ得る。その転写制御はまた、リガンド依存である。
【０１１７】
核酸結合ドメイン(ＤＢＤ)は、１以上の亜鉛フィンガーペプチドモジューラーユニットを含み、そして典型的には、多数のその単位が結びつき、標的遺伝子の調節領域に結合するようにデザインされたペプチドを提供する。亜鉛フィンガーは、望ましい特異性のＤＢＤをデザインする手段を提供する。
【０１１８】
融合タンパク質はまた、細胞内受容体、好ましくはホルモン受容体、より好ましくはステロイド受容体から誘導されるＬＢＤを含む。ＬＢＤは修飾されてリガンド特異性が変化し得、それによって、内在性または天然リガンドは、それとは相互作用しないが、非天然リガンドは相互作用する。当該融合タンパク質はまた、標的遺伝子の転写を調節する転写調節ドメイン(ＴＲＤ)を含み得る。ある実施態様では、ＴＲＤは、内在性遺伝子の転写を抑制し得、他の実施態様では、内在性または外因性の遺伝子の発現を活性化し得る。
【０１１９】
ここで、融合タンパク質は、標的遺伝子に結合するように選択された、細胞内受容体から１以上の亜鉛フィンガードメインへ、ＬＢＤドメインを実施可能なように連結することにより作成する。転写調節ドメインはまた、実施可能なように連結し得る。これは、当業者に既知の任意の方法により行われる。一般的に融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする核酸を発現することにより産生される。
【０１２０】
１．リガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)
リガンド結合ドメインは、細胞内受容体から誘導され、好ましくは核ホルモン受容体から誘導される。細胞内受容体のＬＢＤには、カルボキシ末端から約３００アミノ酸が含まれ、修飾されるかまたは修飾されずに使用され得る。
【０１２１】
少数の残基の変異により、リガンド特異性は変化し得る。リガンド結合ドメインは修飾され得、例えば、トランケーションまたはポイントミューテーションによって、非天然またはネイティブでないリガンドにより遺伝子調節し得るリガンド特異性は変化する。
【０１２２】
典型的なホルモン受容体はステロイド受容体であり、それは、当業者に既知である。典型的であり好ましいステロイド受容体には、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体ならびにその変異体が含まれる。特に、リガンド特異性に変化が見られるリガンド結合ドメインが目的であり、そのため、ＬＢＤは、天然ホルモンに応答しないがＲＵ４８６のような薬物、または他の誘導物質には応答する。そのため、リガンド結合ドメインの特異性を修飾および試験する手段、ならびにリガンドを同定する手段は既知である(米国特許番号５，８７４，５３４；米国特許番号５，９３５，９３４；および米国仮特許出願番号６０／０２９，９６４に基づく国際特許出願番号９８／１８９２５；米国出願番号０８／４７９，９１３に基づく国際特許出願番号９６／４０９１１)。
【０１２３】
ＬＢＤは、ＬＢＤが誘導される受容体のカルボキシル末端において約１から約１５０までの、典型的には１２０アミノ酸の欠損により修飾され得る。アミノ酸の全体的欠損、そしてその後の、リガンド特異性および得られたＬＢＤの試験が用いられ得、非天然リガンドとの優先的な相互作用のような望ましい性質を有するＬＢＤ修飾を導く変異を経験的に同定し得る。典型的な変異を本明細書の実施例に記載しており、また、当業者に既知であり(例えば、米国特許番号５，８７４，５３４；米国特許番号５，９３５，９３４；米国特許番号５，３６４，７９１；および米国仮特許出願番号６０／０２９，９６４に基づく国際特許出願９８／１８９２５；米国出願番号０８／４７９，９１３に基づく国際特許出願番号９６／４０９１１)、これらの参考文献を本明細書に引用する。ここで、既知方法により作成されるＬＢＤまたはその修飾型が得られ、実施可能なようにＤＢＤに連結する；ＴＲＤはまた必要なとき連結される。
【０１２４】
２．核酸結合ドメイン(ＤＢＤ)
亜鉛フィンガーはモジューラー核酸結合ペプチドである。亜鉛フィンガー、またはそのモジュール、またはその変異体を用い、標的配列と特異的に相互作用する融合タンパク質を構成し得る。亜鉛フィンガーは偏在タンパク質であり、多くが十分に特性解析されている。例えば、特有の特異性を有する亜鉛フィンガーのＣ２Ｈ２クラスに基づく亜鉛フィンガーの作成および選択の方法および規則が知られている(例えば、国際特許出願ＷＯ９８／５４３１１および国際特許出願９５／１９４３１参照；また、米国特許番号５，７８９，５３８；Beerli et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2758-2763; Beerli et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 14628-14633；また１９９８年１０月１６出願、国際特許出願番号ＷＯ ００／２３４６４で発行される米国特許出願番号０９／１７３，９４１)。典型的な標的配列を本明細書で提供する。
【０１２５】
さらに、他の亜鉛フィンガーは同様に同定され得、Ｃ２Ｈ２に知られる当該規則を適用し、その亜鉛フィンガーの特異性を修飾し得るか、各クラスに特有の他の規則を同様の方法で導き得る。
【０１２６】
本明細書で提供されるリガンド依存転写調節融合タンパク質のターゲッティングのために亜鉛フィンガーを用いる利点は、特有の特異性を有する亜鉛フィンガーを構成する能力である。これにより、ターゲッティングおよび特異的内在性遺伝子の発現のリガンド依存制御、ならびにまた治療産物をコードする遺伝子のような外因性投与遺伝子のリガンド依存制御が行われる。
【０１２７】
亜鉛フィンガーおよびそのモジューラーユニットが、当業者に既知の方法により得られるかまたは作成され得る。本明細書で考察するように、任意の望ましい核酸の標的配列に結合する結果物ペプチドを産生するためにモジューラードメインを合わせる手段であるため、種々の配列特異性を有する合成亜鉛フィンガーを含む、亜鉛フィンガー過剰が知られる。望ましい特異性の亜鉛フィンガーを作成する規則が知られており、当業者により使用される方法によって推定され得る(例えば参照(例えば、米国特許出願番号０８／８６３，８１３に基づく国際特許出願番号ＷＯ９８／５４３１１；米国特許出願番号０８／１８３，１１９および０８／３１２，６０４に基づく国際出願番号９５／１９４３１参照)。
【０１２８】
例えば、亜鉛フィンガー変異体は、亜鉛フィンガーまたはそのモジューラーユニットを同定すること、ファージディスプレイライブラリーのような発現ライブラリーを作成すること(例えば、国際特許出願番号ＷＯ９８／５４３１１、Barbas et al. (1991) Methods 2: 119；Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457)、亜鉛フィンガーのまたはそのモジューラーユニットのポリペプチド変異体をコードすること、宿主中でライブラリーを発現させること、および望ましい特異性を有する変異体ペプチドをスクリーニングすることにより作成され得る。亜鉛フィンガーはまた、結合特異性の既知規則に従いアミノ酸を合わせること(または核酸をコードすること)、および必要ならばペプチドが望ましい特異性を有することを確実とする結果物ペプチドを試験することまたはスクリーニングすることにより構成され得る。亜鉛フィンガーのモジューラー性(この場合、各モジュールが作成され３つのヌクレオチド配列に結合し得る)のため、任意の特異性のペプチドがモジュールから作成され得る。使用されるモジュール数は、望ましいジーンターゲッティングの特異性に依存する。モジューラーユニットは合わされる；モジューラードメインのスペーシングおよび立体配座的特徴の維持に必要なスペーサー(すなわち、ＴＧＥＫＰ、ＴＧＱＫＰ)はペプチド内に含まれる(例えばＷＯ９８／５４３１１参照)。
【０１２９】
ａ．ＤＢＤおよび亜鉛フィンガーモジューラーユニットとしての亜鉛フィンガー
融合タンパク質中の核酸結合ドメインは、亜鉛フィンガーモジューラードメインを含み、そしてデザインされて、融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸を組み合わせて投与する内在性遺伝子または外因性遺伝子中に存在する標的核酸配列に結合する。
【０１３０】
亜鉛フィンガーは最も通常のおよび偏在する核酸結合タンパク質の１つである。任意の亜鉛フィンガーポリペプチドまたはそのモジューラーユニットが意図される；好ましくは当該ドメインは、融合タンパク質を目的とする宿主において非免疫原性となる。ヒトの治療の場合、亜鉛フィンガーＤＢＤは、好ましくは、ヒト亜鉛タンパク質モジューラーユニットまたはその変異体から選択される。
【０１３１】
本明細書の目的の場合、一般的に使用される亜鉛フィンガーは、リガンド結合ドメインを誘導する細胞内受容体に存在する他の天然存在亜鉛フィンガーである。典型的には、融合タンパク質は、標的核酸調節領域と相互作用するように設計した選択的亜鉛フィンガーと受容体中に存在する自然亜鉛フィンガーを置換えることにより作成する。更に、亜鉛フィンガーは、標的遺伝子に特異性を有する適当なモジューラーユニットの選択により設計され、それにより、標的遺伝子の発現を調節する正確な手段を提供する。
【０１３２】
天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質は、一般的に、複数リピートの亜鉛フィンガーモチーフを含む。このモジューラーの性質は、ＤＮＡ結合タンパク質の種々のクラスに特有である。野生型亜鉛フィンガータンパク質は、２から３７までの多くのモジューラータンデムリピートから成ると共に、各リピートは、一対の保存システインおよび一対の保存ヒスチジンの手段により四面体配位において亜鉛原子をホールディングする“フィンガー”を形成する。一般的に、各フィンガーはまた、モジュールの形状維持を助ける疎水性コアを形成するように相互作用する保存疎水性アミノ酸を含む。３７ぐらい多くの亜鉛フィンガードメインの多指アレイにより、この認識ドメインは伸張した非対称性配列を認識する。任意のこの亜鉛フィンガーまたはそのモジューラーユニットの組み合わせを本発明における使用の目的とする。
【０１３３】
亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ペプチドドメインは、ポリペプチドのα−ヘリックドメイン内の特有ヘプタマー(７アミノ酸残基の連続配列)を含み、そのヘプタマー配列が標的ヌクレオチドに対する結合特異性を決定する。ヘプタマー配列はα−ヘリックスドメイン内の何処にでも位置し得るが、残基が当分野における通常の番号付けをされたときに、ヘプタマーは１位から６位に位置していることが望ましい。ペプチドヌクレオチド結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質の一部として機能する当分野に既知の任意のβ−シートおよびフレームワーク配列を含み得る。
【０１３４】
天然亜鉛フィンガータンパク質の研究により、３つの亜鉛フィンガードメインが９ｂｐの連続ＤＮＡ配列に結合し得ることが示された(Pavletich et al. (1991) Science 252: 809-817; Swirnoff et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 2275-2287)。９ｂｐ配列の認識が、複雑なゲノム中の特有部位に特異的となるには不充分である場合、６つの亜鉛フィンガードメインを含むタンパク質が１８ｂｐ認識に特異的となり得る(Liu et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5525-5530)。モジューラーユニットを作成する１８ｂｐアドレスは、すべての既知ゲノム内の単一部位に特異的となるに充分な複雑性を有する(発行された国際特許出願番号ＷＯ９８／５４３１１参照)。特定ＤＮＡ配列に結合する亜鉛フィンガーアレイを構成する規則が知られている(例えば、米国特許出願番号０８／８６３，８１３に基づく国際特許出願番号ＷＯ９８／５４３１１；米国特許出願番号０８／１８３，１１９および０８／３１２，６０４に基づく国際特許出願番号９５／１９４３１)。
【０１３５】
亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド変異体は既知モチーフから構成され得る。当該変異体は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方のような細胞性ヌクレオチド配列に結合および特異的に結合し、細胞性ヌクレオチド配列の機能を調節する、少なくとも２つおよび好ましくは少なくとも約４つの亜鉛フィンガーモジュールを含む。
【０１３６】
本明細書の目的に関し、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合変異体ポリペプチドを得るために亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフが知られる必要はない。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフは、非真核性ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて、特に、細菌およびウイルスの自然プロモーターにおいて修飾核酸結合ペプチドに結合することにより同定され得る。修飾核酸結合ペプチドは、亜鉛フィンガーの既知構造特性を保存するが、アミノ酸配列および３次元構造により自然に見られる亜鉛フィンガータンパク質とは異なる。
【０１３７】
種々の亜鉛フィンガータンパク質が知られている。これらにおいて、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２(また、“Ｃ２Ｈ２”という)亜鉛フィンガーは融合タンパク質における使用に好ましい。標的遺伝子以外の遺伝子との非特異的相互作用を抑制するよう調節された亜鉛フィンガー含有融合タンパク質にＤＮＡ結合特異性を与えるＤＮＡに結合するＣ２Ｈ２亜鉛フィンガーの熟知された規則がある。これらのタンパク質は多様な配列に結合するように選択され得るかまたは設計され得る。更に、これらのタンパク質の配列特異性は修飾され、天然に存在する標的とは相違する。ポリペプチドを産生する亜鉛フィンガータンパク質の例には、ＴＦＩＩＩＡおよびＺｉｆ２６８が含まれる。
【０１３８】
マウスＣｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８は、ファージディスプレイライブラリーの構成に使用された(Wu et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 344-348)。Ｚｉｆ２６８は構造的に最も特性解析された亜鉛フィンガータンパク質である(Pavletich, et al. (1991) Science 252: 809-817; Elrod-Erickson et al. (1996) Structure 4: 1171-1180; Swirnoff et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 2275-2287)。このタンパク質の３つの亜鉛フィンガードメインのそれぞれにおけるＤＮＡ認識は、ＤＮＡの一本鎖における３つのヌクレオチドに最初に接触するα−ヘリックスのＮ末端の残基により仲介される。この３フィンガータンパク質のためのオペレーター結合部位は、5'-GCGTGGGCG-'3(フィンガー−２サブサイトをアンダーラインしている)である。Ｚｉｆ２６８および他の関連亜鉛フィンガーＤＮＡ複合体の構造研究により、α−ヘリックスにおける最初の３つの位置−１、３、および６の残基が、特異的塩基接触に含まれることが示された。典型的に、α−ヘリックスの−１位の残基は、当該フィンガーサブサイトの３'塩基と接触し、その一方、３位および６位が中間塩基および５'塩基に、それぞれ接触する。
【０１３９】
ｂ．亜鉛フィンガーＤＢＤペプチドの構成物および単離
ＤＮＡに結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド、および特にＤＮＡに結合する亜鉛フィンガードメインは、２つの亜鉛フィンガードメイン間の“リンカー”領域の試験により同定され得る。リンカーアミノ酸配列ＴＧＥＫ(Ｐ)(配列番号１９)は、典型的には、ＤＮＡに結合する亜鉛フィンガードメインを示す。そのため、特定の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが、リンカーアミノ酸の試験によりＤＮＡまたはＲＮＡに好ましくは結合するかどうか決定することができる。
【０１４０】
ｃ．合成亜鉛フィンガー
合成亜鉛フィンガーは、既知配列特異性に基づき集合し得る。多数の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが作成され、GNNトリプレットを含む標的ヌクレオチドに対する結合特異性に関し試験された。当該データより、３つすべての初期ＤＮＡ接触位置(−１、３、および６)の顕著な保存が、所定標的のウイルス性クローンのすべてについて観察されることが示される(実施例１参照、また１９９８年１０月１６日出願の、国際出願番号ＷＯ００／２３４６４として発行されている米国特許出願番号０９／１７３，９４１)。
【０１４１】
5'-GNN-3'サブセットの配列を認識する亜鉛フィンガードメインのファミリーを選択するため、２つの高多様性亜鉛フィンガーライブラリーは、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈに構成された(Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982; Rader et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 503-508)。両ライブラリーには、Ｃ７、Ｚｉｆ２６８の変異体のフィンガー２のα−ヘリックス内の残基の無作為化が含まれた(Wu et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 344-348)。ライブラリー１はＮＮＫドーピングストラテジーを用い−１、１、２、３、５、６位の無作為化により構成され、その一方、ライブラリー２はＶＮＳドーピングストラテジーを用い−２、−１、１、２、３、５、６位の無作為化を有するように構成された。ＮＮＫドーピングストラテジーは、３２コドン内でアミノ酸組み合せを可能とし、その一方、ＶＮＳは２４コドンのセットにおいてＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓおよびすべてのストップコドンを排除する。当該ライブラリーは、それぞれ４．４×１０９および３．５×１０９メンバーを含み、それぞれ、5'-GCGNNNGCG-3'型の配列を認識することができる。ＮＮＫライブラリーの大きさにより、９９％信頼度で調査可能となる一方、ＶＮＳライブラリーは幾分不充分なものを除き高い多様性となることが確実となる。しかし、これらのライブラリーは従前に報告された亜鉛フィンガーライブラリーよりも有意に大きい(国際特許出願番号ＷＯ０９／５４３１１；Choo et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 11163-7; Greisman et al. (1997) Science  275: 657-661; Rebar et al. (1994) Science 263: 671-673; Jamieson et al. (1994) Biochemistry 33: 5689-5695; Jamieson et al. 1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 12834-12839; Isalan et al. (1998) Biochemistry 37: 12026-12033; および米国特許番号５，７８９，５３８)。７ラウンドの選択を、１６ 5'-GCGGNNGCG-3'ビオチニル化ヘパリンＤＮＡ標的をそれぞれ有する亜鉛フィンガーディスプレイング−ファージにおいて、溶液結合プロトコールを用い行った。緊縮性は、競合ＤＮＡの添加により各ラウンドで増加させた。シーアリングしたニシン精子ＤＮＡを、ＤＮＡに非特異的に結合するファージに対する選択を提供した。配列特異性に関する緊縮選択的圧力は、特定競争物として5'-GCGNNNGCG-3'型のＤＮＡを提供することにより得られた。ビオチニル化標的と比較するため、5'-GCGGNNGCG-3'型の過剰ＤＮＡを添加し、一または二塩基変化を有するＤＮＡへの結合に対しより緊縮性の選択を提供した。単一ビオチニル化ＤＮＡ標的配列に対するファージ結合は、ストレプトアビジン被覆ビーズを用い回収した。幾つかの場合に、選択プロセスを繰り返した。当該データにより、これらのドメインは機能的にモジューラーであり、お互いに組み込まれナノモーラー未満(subnanomolar)の親和性を有する１８ｂｐ配列に結合可能なタンパク質を作成し得る。本明細書に記載の亜鉛ファミリードメインの得られたファミリーは、ＤＮＡ配列の5'-(GNN)6-3'ファミリーに結合する１７００万のタンパク質の構成に有意である。
【０１４２】
また印象的なアミノ酸保存は、種々の標的において同じヌクレオチドの認識が観察された。例えば、３位のＡｓｎ(Ａｓｎ３)は、実質的に常に選択され、ＧＡＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴまたはＧＡＣの配列（context）のいずれであっても中間位置のアデニンを認識する。Ｇｌｎ−１およびＡｒｇ−１が通常選択されて、配列に拘わりなく３'位でそれぞれアデニンまたはグアニンを認識する。ＧｌｎまたはＡｓｎによるアデニンの認識に基づくアミド側鎖は、３'または５'グアニンと接触するグアニンに対するＡｒｇグアニジン側鎖であるとして構造研究において多く報告されている(例えば、Elrod-Erickson et al. (1998) Structure 6: 451-464)。
【０１４３】
しかし、よりしばしば、２または３アミノ酸がヌクレオチド認識に選択される。Ｈｉｓ３またはＬｙｓ３(より低い程度ではＧｌｙ３)が、中間グアニンの認識のため選択される。Ｓｅｒ３およびＡｌａ３が選択されて中間チミンを認識する。Ｔｈｒ３、Ａｓｐ３、およびＧｌｕ３が選択されて中間シトシンを認識する。ＡｓｐおよびＧｌｕが−１位において選択され３'シトシンを認識し、その一方、Ｔｈｒ−１およびＳｅｒ−１が選択されて３'チミンを認識する。
【０１４４】
多くのヌクレオチドの特定認識は、単一アミノ酸以外に、モチーフを用い最も達成され得る。例えば、３'グアニンの最もより列挙は、Ａｒｇ−１、Ｓｅｒ１、およびＡｓｐ２の組合せを用い達成する(ＲＳＤモチーフ)。５'グアニンに特異的であるＶａｌ５およびＡｒｇ６を用いることにより、サブサイトＧＧＧ、ＧＡＧ、ＧＴＧ、およびＧＣＧの認識は、３位残基(ＧＧＧの場合Ｌｙｓ３、ＧＡＧの場合Ａｓｎ３、ＧＴＧの場合Ｇｌｕ３、およびＧＣＧの場合Ａｓｐ３)のみが異なる通常のヘリックス構造(ＳＲＳＤ−Ｘ−ＬＶＲ)を用い達成し得る。同様に、３'チミンを、Ｔｈｒ−１、Ｓｅｒ１、およびＧｌｙ２(ＴＳＧモチーフ)を用い最終的なクローンにおいて特定する。更に、３'シトシンは、サブサイトがＧＣＣであるときを除き、Ａｓｐ−１、Ｐｒｏ１、およびＧｌｙ２(ＤＰＧモチーフ)を用い特定され得る；Ｐｒｏ１はこのサブサイトにより耐性とはならない。３'アデニンの列挙は、２つのクローンにおいてＧｌｎ−１、Ｓｅｒ１、Ｓｅｒ２である(ＱＳＳモチーフ)。
【０１４５】
当該データ(実施例の表１参照)により、すべて可能なＧＮＮトリプレット配列が亜鉛フィンガードメインの鋭敏な特異性により認識し得ることが示される。最適化された亜鉛フィンガードメインは、親和性において１００倍を超える喪失により、単一塩基の相違を識別し得る。鍵となる接触位置−１、３、および６における最適化タンパク質中で発見された多くのアミノ酸は、簡単な認識コードと一致するものである一方、所望により特定認識が、これらの残基が存在する配列に感受的であることが発見された。１、２、および５位の残基は、特異的認識として臨界にあることが発見された。
【０１４６】
更なるデータにより、１位の残基と単に同一以外の−１、１、および２位の配列モチーフが、３'塩基の高特異的認識に必要であることが証明される。これら残基により、他の塩基を除外しながら特定塩基を認識する点で、ヘリックスの相互作用に適当な立体構造配列が提供されるようであり、差し引きされた結果は高い特異的相互作用である。次いで、開示ドメインの容易な組み込みにより、発生におけるファージディスプレイライブラリーを開発する必要のない特異性が明らかとなったタンパク質、典型的には多指タンパク質の作成が可能となる。その亜鉛フィンガードメインのファミリーは、ＤＮＡ配列の5'-(GNN)6-3'ファミリーに結合する１６００または１７００万のタンパク質の構成に有用である。
【０１４７】
ｄ．亜鉛フィンガーペプチドの修飾
亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ペプチドドメインは、トランケーションまたは伸張により野生型亜鉛フィンガータンパク質から、または部位特異的変異誘発の方法よるか当該手順の組合せにより野生型誘導性ポリペプチドの変異体として誘導または作成され得る(例えば、亜鉛フィンガーペプチドの設計および構成のための方法を記載した米国特許出願番号５，７８９，５３８)。変異誘発を行い、共通配列の１以上のリピート中の非保存残基を置換え得る。トランケートした亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質はまた変異誘発し得る。
【０１４８】
自然、トランケートされた、および伸張したポリペプチドを含む、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質をコードするＤＮＡが幾つかの方法により得ることができる。例えば、ＤＮＡは、当分野に既知のハイブリダイゼーション手順を用い単離され得る。これらには、以下に限定されないが、(１)占めるヌクレオチド配列を検出するためのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーに対するプローブのハイブリダイゼーション；(２)占める構造的特徴を検出するための発現ライブラリーをスクリーニングする抗体；および(３)ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)による合成が含まれる。ＲＮＡは当分野に既知の方法(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience参照)により得ることが出来る。
【０１４９】
亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質をコードするＤＮＡはまた、(１)ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離；(２)目的のポリペプチドに必要なコドンを提供するＤＮＡ配列の化学的製造；および(３)真核ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のインビトロ合成により、得ることができる。後者の場合、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補は、一般的にｃＤＮＡとして呼ばれるように結果的に形成される。ゲノムＤＮＡのこれら３つの単離方法はあまり一般的ではない。これは、特に、イントロンの存在に起因して哺乳類ポリペプチドの細菌性発現を得ることが望ましいときに真となる。
【０１５０】
亜鉛フィンガー誘導性ＤＮＡ結合ポリペプチドの場合、ＤＮＡ配列の合成は、望ましいポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知のとき、しばしば選択の方法となる。望ましいポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が既知でないとき、ＤＮＡ配列の直接合成は可能でなく、当該選択の方法はｃＤＮＡ配列の形成である。目的のｃＤＮＡ配列の単離のための標準的方法には、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞中に豊富なｍＲＮＡの逆転写から誘導されるプラスミド保持ｃＤＮＡライブラリーの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いるとき、非常に希な発現産物がクローニングされ得る。ポリペプチドのアミノ酸配列の重要部分が既知である場合、標的ｃＤＮＡに存在すると推定される配列を複製する標識一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の産物は、一本鎖型に変性したｃＤＮＡのクローニングコピーにおいて行われるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション手順に用いられ得る(Jay, et al., Nucleic Acid Research, 11: 2325, 1983)。
【０１５１】
ハイブリダイゼーション手順は、標識混合合成オリゴヌクレオチドプローブを用いることによる組換え体クローンのスクリーニングに有用であり、この場合、各プローブは、変性二本鎖ＤＮＡの異種性混合物を含むハイブリダイゼーションサンプル中の特異的ＤＮＡ配列と完全に相補的となる可能性を有する。そのスクリーニングでは、ハイブリダイゼーションは、好ましくは一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡの何れかにおいて行われる。ハイブリダイゼーションは、ソースから誘導されるｃＤＮＡクローンの検出に特に有用であり、この場合、目的のポリペプチドに関連する極度に少量のｍＲＮＡ配列が存在する。非特異的結合を避けることを目的とした緊縮ハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、標的ＤＮＡによる混合物中の完全相補的一本鎖プローブへのハイブリダイゼーションによって、特異的ｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフィーによる視覚化を可能とする(Wallace, et al., Nucleic Acid Research, 9: 879, 1981; Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)。
【０１５２】
核酸ハイブリダイゼーションに依存するスクリーニング手順は、任意生物種からの任意遺伝子配列の単離が可能となり、適当なプローブが利用可能となる。問題となるタンパク質をコードする配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成され得る。このことから、アミノ酸配列の、短い、オリゴペプチドストレッチ(oligopeptide stretch)が判明しなければならないことが必要となる。タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、遺伝的コードから推定され得るが、当該コードの縮重性を考慮しなければならない。当該配列が縮重するとき、混合付加反応が行い得る。これには、変性二本鎖ＤＮＡの異種性混合物が含まれる。そのスクリーニングの場合、ハイブリダイゼーションは、好ましくは一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡの何れかにおいて行われる。
【０１５３】
λｇｔ１１のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーは、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質に特異的な抗体を用い、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質に対し、または少なくとも１つのエピトープを有する亜鉛フィンガー誘導ポリペプチドに対し、間接的にスクリーニングされ得る。その抗体は、ポリクローナル的かモノクローナル的か何れかで誘導され得、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質ｃＤＮＡの存在を示す産物の発現の検出に用いられる。他に、誘導ポリペプチドによるＤＮＡ標的への結合は、放射標識ＤＮＡを標的部位に組み込み、非結合標的部位と比較して電気泳動移動度の遅延を試験することにより、アッセイし得る。
【０１５４】
トランケートした、および／または変異誘発した、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの同定に用いる好ましいベクターは、アミノからカルボキシ末端の方向へ、(１)原核性分泌シグナルドメイン、(２)異種性ポリペプチド、および(３)繊維状ファージ膜アンカードメインを含む融合ポリペプチドをコードし発現し得るヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子である。当該ベクターには、融合ポリペプチドの発現のためのＤＮＡ発現制御配列、好ましくは原核性制御配列を含む。
【０１５５】
本明細書で提供するＤＮＡ配列は、本質的に、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質のすべてまたは一部をコードするため、このＤＮＡ配列または相当するＤＮＡ配列由来のＤＮＡのトランケートポリペプチドフラグメントを調製し、サブクローニングし、発現させることはルーチンとなる。他に、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを定義する、本発明開示のＤＮＡフラグメントを用いることにより、既知技術と組み合わせて、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン全体をコードするＤＮＡ配列を決定することが可能である。その技術は、米国特許番号４，３９４，４４３および米国特許番号４，４４６，２３５に記載されており、それらは引用により本発明に組み込まれる。
【０１５６】
亜鉛フィンガーを作成するアミノ酸中の修飾に加えて、亜鉛フィンガー誘導ポリペプチドには、誘導される野生型タンパク質中に含まれる多量のフィンガーを多かれ少なかれ含み得る。最初のアミノ酸配列の少数(minor)変異は、本明細書に記載の亜鉛フィンガー誘導結合タンパク質と比較して実質的に同等の活性を有するタンパク質を生じ得る。その修飾は、部位特異的変異誘発として意図され得るか、または自然発生的となり得る。これら修飾により産生する全タンパク質は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質活性が存在する限り、本明細書に含まれる。
【０１５７】
ｅ．変異体亜鉛フィンガーおよび他のＤＢＤペプチドのスクリーニング
亜鉛フィンガーから誘導される機能性モジューラードメインの同定のための当分野に既知の任意の方法およびその組合せが用いられ得る。亜鉛フィンガー結合モチーフに結合する亜鉛フィンガーの変異体または他のポリペプチドを同定する典型的な方法が提供される。当該方法に使用されるコンポーネントには、第一の誘導性プロモーターに実施可能なように連結した推定または修飾亜鉛フィンガーペプチドをコードする核酸分子および第二の誘導性プロモーターに実施可能なように連結したレポーター遺伝子および亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフが含まれ、この場合、インキュベーションは、コンポーネントが相互作用し得るのに充分な条件の下、行われ、レポーター遺伝子の発現において推定ＤＢＤペプチドの影響の測定が提供される。
【０１５８】
例えば、アラビノースプロモーターのような第一の誘導性プロモーターは、推定ＤＢＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に実施可能なように連結される。ラクトースプロモーターのような第二の誘導性プロモーターは、βガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子が後に続く亜鉛フィンガー誘導ＤＮＡ結合モチーフに実施可能なように連結される。当該コンポーネントのインキュベーションはインビトロまたはインビボであり得る。インビボインキュベーションには、それぞれE. coliまたはＣＯＳ細胞のような原核性または真核性システムが含まれ得る。アッセイを行い得る条件には、第一および第二の誘導性プロモーターをそれぞれ活性化し、それにより推定トランスモジュレーティング(trans-modulating)タンパク質ヌクレオチド配列を発現し得る、アラビノースおよびラクトースのような基質の存在下のインキュベーションが含まれる。第二の誘導性プロモーターに実施可能なように連結し活性に影響する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフに推定調節タンパク質が結合するかどうかの決定は、レポーター遺伝子の発現により測定する。例えば、レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼならば、青色または白色プラークの存在は、推定調節タンパク質がプロモーター由来の遺伝子発現をそれぞれ促進または抑制するかどうかを示す。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)を含む、プロモーター由来機能の評価に通常用いられる他のアッセイは、当業者に既知である。原核性および真核性システムが用いられ得る。
【０１５９】
上記考察のように、実施例１は、上記のようなＺｉｆ２６８の修飾を説明する。そのため、他の実施態様では、ＨＩＶ配列に結合しＨＩＶ配列の機能を調節する少なくとも２つの亜鉛フィンガーモジュールを含むリガンド活性化転写レギュレーターポリペプチド変異体、例えばＨＩＶプロモーター配列を提供する。
【０１６０】
他の態様では、亜鉛フィンガータンパク質は操作して、伸張した標的配列を認識および結合し得る。例えば、約２から２０亜鉛フィンガーＺｉｆ(２)からＺｉｆ(２０)、および好ましくは約２から１２亜鉛フィンガーを含む亜鉛フィンガータンパク質は、Ｊｕｎ／Ｆｏｓタンパク質、ｂＺＩＰファミリーのタンパク質の原型メンバー、のロイシンジッパードメインに融合され得る(O'Shea et al. (1991) Science 254: 539)。他に、亜鉛フィンガータンパク質は、ヘテロダイマーを形成し得、そしてダイマー化ドメインを含む他のタンパク質に融合され得る。そのタンパク質は当業者に既知である。
【０１６１】
Ｊｕｎ／Ｆｏｓロイシンジッパーは、例証目的として記載しており、好ましくはヘテロダイマーを形成し、１２から７２塩基対を認識し得る。以下、Ｊｕｎ／Ｆｏｓは、これらタンパク質のロイシンジッパードメインを示す。亜鉛フィンガータンパク質は、当分野においてタンパク質連結に通常用いられる方法によりＪｕｎと融合し、独立してＦｏｓに融合する。精製後、Ｚｉｆ−ＪｕｎおよびＺｉｆ−Ｆｏｓ構成、当該タンパク質を混合し、自然発生的にＺｉｆ−Ｊｕｎ／Ｚｉｆ−Ｆｏｓヘテロダイマーを形成する。他に、これらタンパク質をコードする遺伝子の共発現は、インビボでＺｉｆ−Ｊｕｎ／Ｚｉｆ−Ｆｏｓヘテロダイマーの形成を生ずる。Ｎ末端核所在シグナル(N-terminal nuclear localization signal)とへテロダイマーとの融合により、核に対する発現のターゲッティングが可能となる(Calderon, et al, Cell, 41:499, 1982)。活性ドメインはまた、１つまたは各ロイシンジッパー融合構成に組み込まれ、転写のアクチベーターを作成する(Sadowski et al. (1992) Gene 118: 137)。次いで、これらのダイマー構成は特異的に活性化するかまたは転写を抑制し得る。これらへテロダイマーＺｉｆ構成は、パリンドローム配列(ＪｕｎおよびＦｏｓにおけるフィンガーが同じＤＮＡ／ＲＮＡ配列を認識するならば)または伸張対称配列(ＪｕｎおよびＦｏｓにおけるフィンガーが異なるＤＮＡ／ＲＮＡ配列を認識するならば)を認識し得るのため、有利となる。例えば、パリンドローム配列
【表１】
2009273463.tif 000003
は、Ｚｉｆ２６８−Ｆｏｓ／Ｚｉｆ２６８Ｊｕｎダイマーにより認識される(ｘは任意の数である)。サブサイト間のスペーシングは、ＪｕｎまたはＦｏｓジッパードメインとＺｉｆの融合の部位およびＺｉｆとジッパードメインとの間のリンカーの長さにより決定される。サブサイトスペーシングは、当業者に既知であるため結合部位選択方法により決定される(Thiesen et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 3203, 1990)。伸張対称配列の認識の例は、Ｚｉｆ(Ｃ７)６−Ｊｕｎ／Ｚｉｆ−２６８−Ｆｏｓダイマーにより示される。このタンパク質には、Ｊｕｎに連結するＣ７型(実施例11)の６つのフィンガーおよびＦｏｓに連結するＺｉｆ２６８の３つのフィンガーが含まれ、伸張配列
【表２】
2009273463.tif 000004
を認識する。
【０１６２】
他の実施態様では、Ｚｉｆタンパク質へのキレート化基の結合は、タンパク質の最初のメチオニン(Ｍｅｔ)と最初のチロシン(Ｔｙｒ)の間にシステイン(Ｃｙｓ)を挿入することにより好ましくは促進される。次いで、Ｃｙｓを、当業者に既知のキレート剤、例えば、述べられているようなＥＤＴＡ誘導体(Sigman (1990) Biochemistry, 29: 9097)でアルキル化する。他に、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓは、残基からなるアミノ末端がＣｕ＋２をキレートすると述べられているため(Mack et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 110: 7572)、殆どのアミノ末端残基として作成されることができる。好ましい金属イオンには、Ｃｕ＋２、Ｃｅ＋３(Takasaki and Chin (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 1121, 1994)、Ｚｎ＋２、Ｃｄ＋２、Ｐｂ＋２、Ｆｅ＋２(Schnaith et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 569, 1994)、Ｆｅ＋３、Ｎｉ＋２、Ｎｉ＋３、Ｌａ＋３、Ｅｕ＋３(Hall et al. (1994) Chemistry and Biology 1: 185)、Ｇｄ＋３、Ｔｂ＋３、Ｌｕ＋３、Ｍｎ＋２、Ｍｇ＋２が含まれる。キレート化物質による切断は、Ｏ２、過酸化水素水Ｈ２Ｏ２のような酸化剤およびチオールおよびアスコルベートのような還元剤の存在下、通常行われる。切断の部位および鎖(＋または−部位)は経験的に決定され(Mack et al. (1998) J. Am. Chem. Soc 110: 7572, 1988)、最初のフィンガー前のＭｅｔとＴｙｒとの間のＣｙｓの位置に依存する。タンパク質Ｍｅｔ(ＡＡ)Ｔｙｒ−(Ｚｉｆ)１−１２において、キレートは、Ｍｅｔ−(ＡＡ)ｘ１Ｃｙｓ−キレート−(ＡＡ)ｘ２−Ｔｙｒ−(Ｚｉｆ)１−１２となり、この場合、ＡＡ＝アミノ酸およびｘ＝アミノ酸数である。Ｚｉｆ−Ｊｕｎ／Ｚｉｆ−Ｆｏｓ型のダイマーｚｉｆ構成は、標的オリゴヌクレオチド内の２つの部位における、または一本鎖長標的部位における、切断が好ましい。二本鎖切断が好ましい場合は、タンパク質を含むＪｕｎおよびＦｏｓはキレート剤で標識され、切断は当業者に既知の方法により行われる。この場合、制限酵素により作成されるものに類似するスタッガー二本鎖切断を生ずる。
【０１６３】
変異誘発、およびフィンガー１特異性または親和性が修飾されるＺｉｆ２６８タンパク質の変異体の選択の後、複数コピーのフィンガーを保持するタンパク質を、当分野に既知の方法によるＴＧＥＫＰリンカー配列を用い構成し得る。例えば、Ｃ７フィンガーは、スキームにより構成され得る：
【表３】
2009273463.tif 000005
この場合、最後のリンカーの配列は、それが末端にあり、２つのフィンガーの同時の連結を含まないため、変化させる。このタンパク質は、ＧＣＧ−ＴＧＧ−ＧＣＧ配列をコードするオリゴヌクレオチドの３００ｎＭの親和性と比較すると、オリゴヌクレオチドヘアピンＣＣＴ−ＣＧＣ−ＣＧＣ−ＣＧＣ−ＧＧＧ−ＴＴＴ−ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＧＣＣ−ＣＣＣ ＧＡＧ Ｇ(配列番号２４)における設計標的配列ＧＣＧ−ＧＣＧ−ＧＣＧに９ｎＭの親和性で結合する(表面プラズモン共鳴試験により測定した)。使用したフィンガーは同定される必要はなく、混合され、マッチして、望ましい標的配列を認識するタンパク質を産生する。これらはまた、ロイシンジッパー(例えば、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ)または他のヘテロダイマーと共に用いられ、伸張配列認識を有するタンパク質が産生される。
【０１６４】
フィンガー１のポリマーの産生に加えて、３つすべてのフィンガーＺｉｆ２６８およびその修飾型は、共通リンカーＴＧＥＫＰを用い融合され得、伸張認識部位を有するタンパク質を産生し得る。例えば、タンパク質Ｚｉｆ２６８−Ｚｉｆ２６８が産生されるが、その天然タンパク質はＴＧＥＫＰリンカーを用い自身に融合される。このタンパク質は、配列ＧＣＧ−ＴＧＧ−ＧＣＧ−ＧＣＧ−ＴＧＧ−ＧＣＧに結合する。そのため、Ｚｉｆ２６８の３つのフィンガーまたは当分野に既知の他の亜鉛フィンガータンパク質内の修飾を、同時に融合し、伸張配列を認識するタンパク質を形成し得る。これら新規亜鉛タンパク質はまた、望ましいならばロイシンジッパーと組み合わせて使用され得る。
【０１６５】
３．転写調節ドメイン(ＴＲＤ)
当業者に既知の任意のＴＲＤが選択されるが、それらは細胞内受容体中に存在する。ＴＲＤは、ＤＢＤが標的とする遺伝子の転写を調節し、その発現の調節に効果を為すように選択される。ＴＲＤは、細胞中または外因的に加えられた構成中の内在性遺伝子の発現を調節するように選択され得る。外因的に加えられた遺伝子の場合、遺伝子の調節領域は、望ましいＴＲＤと相互作用するように選択され得る。ＤＢＤと組み合わせたＴＲＤの同定、作成および試験は、本明細書ではＥＲＢ−２およびインテグリンβ３について例示する。
【０１６６】
ａ．ＴＲＤの選択
転写調節ドメインは当分野に既知である。典型的で好ましい転写リプレッサードメインは、ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、デアセチラーゼ、および誘導体、マルチマーおよびその組合せであり、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、(ＫＲＡＢ)２、(ＫＲＡＢ)３、ＫＲＡＢ−Ａ、(ＫＲＡＢ−Ａ)２、(ＳＩＤ)２(ＫＲＡＢ−Ａ)−ＳＩＤおよびＳＩＤ−(ＫＲＡＢ−Ａ)といったものである。
【０１６７】
ｂ．リプレッサー
転写リプレッサーは当業者に既知であり、任意のそのリプレッサーを本明細書で使用し得る。当該リプレッサーは、上記開示のような核酸結合ドメインに実施可能なように連結されるポリペプチドである。当該レプレッサーは結合ドメインの実施可能に結合しており、結合ドメインを介して標的ヌクレオチドに結合するとき、転写を阻害または防止するように作用するような態様で結合ドメインに接している。当該リプレッサードメインは、当分野に既知の任意の連結手順を用い結合ドメインに連結され得る。２つのドメイン間のリンカー部分を含む必要があり得る。そのリンカー部分は、典型的にはドメイン間にスペーシングを提供するアミノ酸残基の短い配列である。リンカーが結合またはリプレッサードメインの任意の機能を妨げない限り、任意の配列を用い得る。
【０１６８】
転写リプレッサーは、３つのヒト誘導リプレッサードメインのうちの何れかによる亜鉛フィンガータンパク質への結合により生じた。第一のリプレッサータンパク質は、ｅｔｓ２リプレッサーファクター(ＥＲＦ)のアミノ酸４７３から５３０により定義される、ＥＲＦリプレッサードメイン(ＥＲＤ)を用い作成した(Sgouras et al. (1995) EMBO J. 14: 4781-4793)。このドメインは、ｅｔｓファミリーの転写ファクターの活性においてＥＲＦのアンタゴニスト効果を仲介する。合成リプレッサーは、このドメインによる亜鉛フィンガータンパク質のＣ末端への融合により構成された。
【０１６９】
第二のリプレッサータンパク質は、Krueppel-associated box(KRAB)ドメインを用い産生された(Margolin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513)。このリプレッサードメインは、亜鉛フィンガータンパク質のＮ末端で通常発見され、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１(Friedman et al. (1996) Genes & Dev. 10: 2067-2078)との相互作用により、距離および方向独立性方法(Pengue et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1015-1020)でＴＡＴＡ依存転写の抑制活性があると推定される。亜鉛フィンガータンパク質ＫＯＸ１のアミノ酸１から９７の間に見られるＫＲＡＢドメイン(Margolin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513)を用いた。この場合、６フィンガータンパク質とのＮ末端融合が構成された。
【０１７０】
抑制手段としてのヒストンデアセチル化を用い得る。例えば、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン(ＳＩＤ)の１から３６のアミノ酸は、亜鉛フィンガータンパク質のＮ末端に融合した(Ayer et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16: 5772-5781)。この小さなドメインは、転写ファクターＭａｄのＮ末端に存在し、ｍＳＩＮ３と相互作用し、次いで共リプレッサーＮ−ＣｏＲと相互作用し、ヒストンデアセチラーゼｍＲＰＤ１と相互作用するすることにより、その転写抑制の仲介に関与する(Heinzel et al. (1997) Nature 387: 43-46)。
【０１７１】
ｃ．アクチベーター
典型的で好ましい転写活性ドメインは、転写を調節する任意のタンパク質またはファクターを含む。典型的な転写調節ドメインは、以下に限らないが、ＶＰ１６、ＴＡ２、ＶＰ６４、ＳＴＡＴ６およびｒｅｌＡを含む。
【０１７２】
４．ヒトインテグリンβ３およびｅｒｂＢ−２標的配列に基づく典型的な構成
ＤＮＡ結合特異性および治療可能性を有するペプチドを産生する１以上のドメインを含む亜鉛フィンガーモジューラードメインおよびペプチドの産生を例示するため、標的配列は、ヒトインテグリンβ３およびｅｒｂＢ−２(Ishii et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 4374-4378)ゲノム配列に基づき同定された。
【０１７３】
癌遺伝子治療のための標的としてのインテグリンβ３
インテグリンαｖβ３はインテグリンファミリーの最も混交したメンバーであり、血管由来管組織のマーカーとして同定された。例えば、インテグリンαｖβ３は、通常の皮膚ではなくヒト創傷肉芽組織の血管において発現の促進が見られる。血管形成の誘導後、血管は、このプロセスを通らない血管と比較したαｖβ３発現において４倍の増加が見られる。インテグリンαｖβ３の環状ペプチドまたはモノクローナル抗体アンタゴニストは、ヒヨコ漿尿膜におけるサイトカインまたは腫瘍誘導性血管形成を阻止すると報告されている。そのため、インテグリンαｖβ３発現の阻害は、腫瘍誘導性血管形成を阻止するアプローチを提供する。
【０１７４】
癌遺伝子治療の標的としてのＥｒｂＢ２受容体チロシンキナーゼ
ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーはヒト悪性腫瘍の増加に重要な役割をする。特に、ＥｒｂＢ−２は、乳、卵巣、肺、胃および唾液腺を含む多数部分で生ずる高い割合のヒト腺癌における遺伝子複製および／または転写調節解除の結果として過剰発現する。ＥｒｂＢ−２の発現増加は、本質的に、内在性チロシンキナーゼの構造的活性を導く。多くの臨床的研究により、ＥｒｂＢ−２発現の増加が見られる腫瘍患者は予後がより悪い(poorer)ことが示される。そのため、ヒトの癌の異所発現の高い発生、および過剰発現腫瘍の攻撃的な振舞い(aggressive behavior)により、ＥｒｂＢ−２が治療で注目すべき(attractive)標的となる。
【０１７５】
亜鉛フィンガー、およびｅｒｂＢ−２およびインテグリンβ３を標的とする融合タンパク質の産生および構成を実施例に記載する。
【０１７６】
Ｂ．調節可能カセット
標的遺伝子が外因性遺伝子であり、特に治療産物をコードする遺伝子である実施態様では、当該遺伝子は、融合タンパク質が特異的相互作用するプロモーターおよび調節領域に実施可能なように連結する発現カセットとして提供される。当該カセットは、内在性遺伝子の転写を目的とする融合タンパク質および適当なプロモーター中に存在する相当する亜鉛フィンガードメインにより認識される少なくとも１つのポリヌクレオチドドメインを含む。典型的に、調節可能発現カセットには、３から６の応答エレメントを含み、リガンド活性化転写調節融合タンパク質の核酸結合ドメインと相互作用する。
【０１７７】
典型的に、外因性遺伝子は、内在性発現遺伝子によりコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を補い、それにより治療効果をあげることができる、増殖ファクターのような治療産物をコードする。幾つかの実施態様では、遺伝子は、適当な直接的または間接的手段により検出することができる適当なレポーター分子をコードする。当該カセットを、細胞中への導入に適当な送達媒体に挿入し得る。その媒体には、以下に限らないが、ヒトアデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、マウスまたはレンチウイルス誘導性レトロウイルスベクター、ならびにリポソーム、ポリマーおよび他のＤＮＡ結合体を含む種々の非ウイルス性組成物を含む。
【０１７８】
Ｃ．遺伝子調節のための融合タンパク質の使用
１．核酸の送達
標的細胞中への核酸分子の導入に適当な複合ウイルス性および非ウイルス性方法が当業者に利用可能である。細胞の遺伝的修飾は、遺伝子治療の分野で既知の１以上の技術を用い行われ得る(Human Gene Therapy, April 1994, Vol. 5, p. 543-563; Mulligan, R.C. 1993)。
【０１７９】
本明細書の実施例に定義されるような導入遺伝子発現能は、遺伝子治療の多種の適用に適用され得る。外因的に導入された導入遺伝子の発現の調節能は、殆どまたはすべての考え得る細胞および遺伝子治療の安全性および有効性に重要である。導入遺伝子の発現の調節を用い、治療タンパク質レベルの調節、望ましい細胞群の除去、細胞または他のもの何れかに含まれるベクター、または形質導入細胞内のベクター機能の調節を生ずるリコンビナーゼまたは他の機能の活性化が行われ得る。更に、その調節は、必要ならば遺伝子治療処置を終了し得る。
【０１８０】
遺伝子治療に有用な多数のベクターシステムが、本出願以前において記載されている。遺伝子治療のベクターには、当業者に既知の任意のものが含まれ、動物ウイルスおよび人工的クロモソームから誘導される任意のベクターが含まれる。当該ベクターは、縮主細胞クロモソーム中に組み込まれるようにデザインされるか、またはクロモソーム外エレメントとして維持され得る。そのベクターには、以下に限らないが、ヒトアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、マウスレトロウイルスベクターおよびレンチウイルス誘導レトロウイルスベクターのようなレトロウイルスベクターが含まれ得る。また本明細書で意図されるものは、以下に限らないがリポソーム、ポリマーおよび他のＤＮＡ含有組成物、および抗体および増殖ファクターに連結する核酸のような標的結合体を含む遺伝物質のターゲッティングおよび／または送達のための任意の種々の非ウイルス性組成物である。任意の送達システムは、融合ポリペプチドをコードする核酸構成の送達の使用を目的とし、また外因性遺伝子を標的とする。そのベクターシステムを用い、ベクターシステムに依存して、インビトロまたはインビボの何れかにおいてＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質および誘導性導入遺伝子カセットを送達することができる。例えばアデノウイルスを用いると、ベクターは、静脈注射的に投与され、肝臓および他の器官に形質導入され、肺に直接導入され、またはライゲーションまたは他の方法により一時的に局在する血管コンパートメントに直接導入される。そのベクターを構成する方法、その方法および使用は、遺伝子治療の分野の当業者に既知である。
【０１８１】
ある実施態様では、１のベクターは、融合タンパク質レギュレーターをコードし、第二のベクターは誘導性導入遺伝子カセットをコードする。ベクターを混合するか、または連続的に送達し細胞中に適当な量でレギュレーターおよび導入遺伝子を組み込み得る。その後の、標準的経路によるリガンドの投与および有効量は、導入遺伝子を活性化する。
【０１８２】
他の実施態様では、融合タンパク質および誘導性導入遺伝子をコードする核酸が同じベクター構成物中に含まれ得る。この場合、融合タンパク質をコードする核酸は、ベクター内に位置し、基底の発現および導入遺伝子カセットの誘導性を妨げない方法でプロモーターから発現する。更に、融合タンパク質を発現する細胞または組織特異的プロモーターの使用により、当該システムにおける更なるレベルの特異性が供与される。遺伝子治療のための二重コンポーネントベクターおよび使用が知られている(例えば、ウイルス性バックボーン遺伝子を完全に欠損したアデノウイルスベクターについて記載するBurcin et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:335-360参照)。
【０１８３】
他の実施態様では、遺伝子治療は、上記ベクターの組合せを用いて行われ得る。例えば、レトロウイルスベクターは、送達され、安定に組み込まれ、インビトロ(exo vivo)またはインビボの何れかで細胞群に導入遺伝子カセットを導入し得る。その後、組込み導入遺伝子は、この同じ細胞群に、融合タンパク質を発現できるアデノウイルスベクターのような第二のベクターを導入し、その後特異的リガンド誘導剤を投与することにより活性化される。これは、例えば、細胞性自殺機構のような導入遺伝子の“一斉”(one time)の活性化が望ましい場合に特に有用となる。この出願の例は、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(ＨＳＶ Ｔｋ)を含む誘導性導入遺伝子カセットの安定組込みである。この遺伝子のその後の活性化により、ガンシクロビルに対する感受性が供与され、この修飾細胞を除去する。
【０１８４】
ａ．ウイルス性送達システム
核酸構成物を細胞に送達するためのウイルス性形質導入法を本明細書では意図している。本明細書で用いる適当なＤＮＡウイルスベクターには、以下に限らないが、アデノウイルス(Ａｄ)、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはポリオウイルスが含まれる。本明細書で用いる適当なＲＮＡウイルスには、以下に限らないが、レトロウイルスまたはSindbisウイルスが含まれる。幾つかのそのＤＮＡおよびＲＮＡウイルスは、本明細書の使用に適するように存在することが当業者に理解し得る。アデノウイルスベクターは、真核細胞中への遺伝子導入に特に有用であることが証明され、広く当業者に利用されており、本明細書での使用に適当である。
【０１８５】
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)は、遺伝子治療における可能性ある適用を伴う遺伝子導入システムとして近年導入された。野生型ＡＡＶは、高レベルの感染性、広い宿主範囲および宿主細胞ゲノム中への組込みの特異性が証明される。ヘルペス単純ウイルス型−１(ＨＳＶ−１)ベクターは利用可能であり、神経向性のため神経系に特に有用となる。ポックスウイルスファミリーのワクシニアウイルスはまた、発現ベクターとして開発された。各上記ベクターは、広く利用可能であり、本明細書の使用に適する。
【０１８６】
レトロウイルスベクターは、高頻度で標的細胞に感染し、細胞ゲノム中に組込むことができる。好ましいレトロウイルスには、以下に限らないが、ＨＩＶ、ＢＩＶおよびＳＩＶのようなレンチウイルスが含まれる。
【０１８７】
本明細書で述べるような遺伝子治療に使用可能な種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)、または好ましくはレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの誘導体であるか、またはレンチウイルスベクターである。好ましいレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。単一の外因性遺伝子が導入され得るレトロウイルスベクターの例には、以下に限らないが、モロニーマウス白血病ウイルス(ＭｏＭｕＬＶ)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(ＨａＭｕＳＶ)、マウス乳癌ウイルス(ＭｕＭＴＶ)、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶおよびラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)が含まれる。多くの更なるレトロウイルスベクターが複数遺伝子に組み込まれ得る。これらすべてのベクターは選択性マーカーの遺伝子を導入するか、組み込まれ得、それにより、形質導入細胞が同定され、作成され得る。目的の亜鉛フィンガー誘導性ＤＮＡ結合ポリペプチド配列をウイルス性ベクターに、特定標的細胞、例えばベクターに受容体のためのリガンドをコードする他の遺伝子と共に、導入することにより、標的特異性が生じる。レトロウイルスベクターは、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより標的特異性を生じ得る。好ましいターゲッティングは、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用い行う。当業者は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを標的特異的送達し得るレトロウイルスゲノム中に挿入し得る特異的ポリヌクレオチド配列に精通しており、過度の実験を行うことなく容易に確認することができる。
【０１８８】
組換え体レトロウイルスは欠損しているため、感染ベクター粒子を産生するための補助が必要である。この補助は、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御の下、レトロウイルスの構造遺伝子すべてをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を用いることにより、提供され得る。これらプラスミドは、キャプシド形成のためのＲＮＡ転写産物を認識するパッケージング機構を可能とするヌクレオチド配列を喪失している。パッケージングシグナルを欠損しているヘルパー細胞系には、以下に限らないが、例えば、Ψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２が含まれる。これらの細胞系は、ゲノムがパッケージされていないため、細胞系はビリオンの枯渇を生じる。レトロウイルスベクターが、パッケージングシグナルがそのままである細胞中に導入されるが、構造遺伝子が目的の他の遺伝子に置換わっているならば、当該ベクターはパッケージされ、ベクタービリオンを生じ得る。次いで、この方法により産生するベクタービリオンを用い、ＮＩＨ３Ｔ３のような組織細胞系を感染させ、多量のキメラレトロウイルスビリオンを産生する。
【０１８９】
ｂ．非ウイルス性送達システム
遺伝子治療のための“非ウイルス性”送達技術には、ＤＮＡリガンド複合体、アデノウイルスリガンドＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接導入、ＣａＰＯ４沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、リポソーム法およびリポフェクションが含まれる。任意のこれらの方法は、当業者に利用可能であり、本明細書の使用に適当である。他に適当な方法が当業者に利用可能であり、本明細書では任意の利用可能なトランスフェクション方法を用い得ることが理解できる。
【０１９０】
他の標的送達システムは、コロイド状分散システムである。コロイド状分散システムには、高分子複合体、ナノカプセル(nanocapsule)、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに好ましい水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースシステムが含まれる。リポソームは人工膜小胞であり、それは、インビトロおよびインビボで送達媒体物として有用である。０．２−４．０μｍの大きさの範囲である大きな単層小胞(ＬＵＶ)は、大きい高分子を含む水性緩衝液を実質的比率でカプセル化することができる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび未処理ビリオンは、水性内部にカプセル化され、生物学的に活性な形態で細胞中に送達され得る(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981)。
【０１９１】
リポフェクションは、リポソーム粒子中に単離核酸分子をカプセル化し、リポソーム粒子を標的細胞の細胞膜に接触されることにより、行い得る。リポソームは、自己集合するコロイド状粒子であり、それは、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルクロリンのような両親媒性分子を構成する脂質二重層が、周囲媒体の一部をカプセル化し、それにより、脂質二重層は親水性内部を包む。単層または多層リポソームが構成され得、それにより、内部には、望ましい化学物質、薬物または、本明細書で提供するような単離核酸分子が含まれ得る。
【０１９２】
リポソームは、植物、酵母、細菌性細胞ならびに哺乳類細胞中におけるポリヌクレオチドの送達に有用である。リポソームが効果的な遺伝子導入媒体であるためには、以下の特徴が存在しなければならない：(１)生物学的活性を損なうことはないが、高い効率の目的遺伝子のカプセル化；(２)非標的細胞との比較して、標的細胞に対する好ましいおよび実質的な結合；(３)高い効率での標的細胞の細胞質への、小胞の水性内容物の送達；および(４)遺伝的情報の正確および効率的な発現(Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988)。
【０１９３】
リポソームの組成物は、通常、リン脂質、特に高相転移温度リン脂質の組合せ、通常ステロイド、特にコレステロールの組合せである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用し得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
【０１９４】
リポソーム産物に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルクロリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドのような化合物が含まれる。特に有用なものはジアシルホスファチジルグリセロールであり、この場合、脂質部分には、１４−１８炭素原子、特に１６−１８原子を含み、飽和している。実例となるリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルクロリンおよびジステロイルホスファチジルコリンが含まれる。
【０１９５】
リポソームのターゲッティングは、解剖学的因子および機構的因子に基づき、クラス分けされている。解剖学的クラス分けは、選択性のレベル、例えば、器官特異的、細胞特異的およびオルガネラ特異的に基づく。機構的ターゲッティングには、受動的かまたは積極的か何れかに基づいて分類され得る。受動的ターゲッティングは、シヌソイドキャピラリーを含む器官における網状内皮細胞系(ＲＥＳ)の細胞に分布するというリポソームの天然の傾向が用いられる。一方、積極的なターゲッティングには、モノクローナル抗体、糖、グリコ脂質、またはタンパク質のような特定リガンドにリポソームを結合されることによるか、または天然存在局所部位以外の器官および細胞型のターゲッティングを行うためのリポソームの組成物または大きさを変化させることによる他のリポソームが含まれる。
【０１９６】
標的送達システムの表面は、種々の方法で修飾され得る。リポソーム標的送達システムの場合、リポソーム二重相に安定に関連する標的リガンドを維持するため、脂質基をリポソームの脂質二重相中に組込むことができる。種々の連結基が、脂質鎖による標的リガンドへの結合に使用し得る。
【０１９７】
一般に、標的送達システムの表面に結合する化合物は、所望の細胞を発見し、その細胞上に“結合”（home-in）することを標的送達システム可能とするリガンドおよび受容体である。リガンドは、受容体のような他の化合物と相互作用する目的の任意の化合物であり得る。
【０１９８】
一般に、特定エフェクター分子に結合する表面膜タンパク質は、受容体と称する。抗体が好ましい受容体である。抗体を用いて、細胞表面リガンドに特異的なリポソームを標的とし得る。例えば、腫瘍付随抗原(ＴＡＡ)と称する、腫瘍細胞において特異的に発現する特定抗原は、タンパク質含有リポソームを悪性腫瘍に直接結合する抗体亜鉛フィンガーヌクレオチドをターゲッティングする目的のため活用された。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質遺伝子産物が細胞型に関しその作用おいて区別がなくなり得るため、標的送達システムは、無作為注入非特異的リポソームに有意な改善を提供する。多くの手順を用い、リポソーム二重層に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の何れかに共有結合的に接着し得る。標的細胞上の抗原性エピトープに有効に結合する限り、抗体標的リポソームには、モノクローナルまたはポリクローナル抗体またはＦａｂもしくはＦ(ａｂ')２のようなそのフラグメントが含まれる。リポソームはまた、ホルモンまたは他の血清因子のための細胞発現受容体を標的とし得る。
【０１９９】
２．投与
ａ．細胞に対する構成物の送達
細胞は、インビボ、ex vivoまたはインビトロでトランスフェクトされ得る。当該細胞は、患者から単離された最初の細胞または最初の細胞から誘導された細胞系としてトランスフェクトされ、細胞が最終的に投与される患者にとっては必然的に自己由来ではない。ex vivoまたはインビトロトランスフェクション後、当該細胞を宿主に移植し得る。当該細胞の遺伝学的修飾は、遺伝子治療の分野で知られる１以上の技術を用い行い得る(例えば、(1994) Human Gene Therapy 5: 543-563)。
【０２００】
本明細書で提供される核酸分子による、標的細胞への投与は、任意の種々の当業者に既知の技術を用い行われ得る。本明細書のベクターは、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、直腸的にまたは局所的に、通常の薬学的に許容される担体、添加物または媒体を含む用量単位製剤で投与され得る。薬物の直腸投与のための坐薬は、通常温度で市販されているが直腸温度で液体となりそれゆえ直腸で溶解し薬物を放出する、ココアバターおよびポリエチレングリコールのような適当な非刺激性賦形剤と薬物を混合することにより製剤化され得る。
【０２０１】
提供されたベクターおよび／または組成物による異常または疾患を処置する投薬摂取は、疾患の型、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重篤度、投与経路および用いる特定化合物を含む種々の因子に基づく。そのため、投薬摂取は、広く変わり得るが、標準的方法を用い経験的に決定し得る。
【０２０２】
医薬的に活性化合物(すなわち、ベクター)は、薬学の通常の方法に従い処理され、ヒトまたは他の哺乳類を含む患者への投与のための製剤を製造する。経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、懸濁液または液体の形態となり得る。医薬組成物は、好ましくは所定量のＤＮＡまたはウイルスベクター粒子(集合的には“ベクター”と称する)を含む用量単位の形態で製造され得る。例えば、これらには、約１０３−１０５ウイルス性ベクター粒子、好ましくは約１０６−１０１２ウイルス性粒子のベクター量が含み得る。ヒトまたは他の哺乳類の適当な一日用量は、患者の病状および他の因子に依存して広く変化し得るが、再度、ルーチンの方法を用い測定し得る。当該ベクターはまた、生理食塩水、デキストロースまたは水を含む適当な担体を伴う組成物としての注入により、投与され得る。
【０２０３】
本明細書の核酸および／またはベクターは、単独の活性医薬製剤として投与され得るが、それらはまた、１以上のベクターまたは他の製剤と組合せて使用され得る。組合せとして投与されるとき、治療製剤は、同時または別々に供与される別組成物として製剤化されるか、または治療製剤は単一組成物として供され得る。
【０２０４】
ｂ．送達リガンド
リガンドは、同様に、経口、非経口、静脈、筋肉内および他の既知経路を含む任意の適当な型の投与により送達され得る。任意の既知医薬製剤を意図する。
【０２０５】
３．リガンド
示されているように、リガンドは、天然に存在するリガンドであるが、好ましくは、ＬＢＤが修飾され特異的に相互作用する非天然リガンドである。ＬＢＤを修飾する方法は、そのリガンドをスクリーニングする方法として既知である。
【０２０６】
リガンドには、非天然リガンド、ホルモン、抗ホルモン、合成ホルモンおよび他のそのような化合物が含まれる。非天然リガンド、抗ホルモンおよびネイティブでないリガンドには、以下に限らないが、１１β−４−ジメチルアミノフェニル)−１７α−ヒドロキシ−１７α−プロピニル−４，９−エストラジエン−３−オン(RU38486またはMifepestone)；１１β−(４−ジメチルアミノフェニル)−１７α−ヒドロキシ−１７β−(３−ヒドロキシプロピル)−１３α−メチル−４，９−ゴナジエン−３−オン(ZK98299またはOnapristone)；１１β−(４−アセチルフェニル)−１７β−ヒドロキシ−１７α−(１−プロピニル)−４，９−エステラジエン−３−オン(ZK112993)；１１β−(４−ジメチルアミノフェニル)−１７β−ヒドロキシ−１７α−(３−ヒドロキシ−１(Ｚ)−プロペニル−エストラ−４，９−ジエン−３−オン(ZK98734)；(７β１１β，１７β)−１１−(４−ジメチルアミノフェニル)−７−メチル−４’，５’−ジヒドロスピロｙ’エステル−４，９−ジエン−１７，２’(３’Ｈ)−フラン！−３−オン(Org31806)；(１１β，１４β，１７α）−４’，５’−ジヒドロ−１１−（４−ジメチルアミノ−フェニル)ｙ’スピロエストラ−４，９−ジエン−１７，２’(３’Ｈ)−フラン！−３−オン(Org31376)；５−アルファ−プレグナン−３，２−ジオンが含まれる。更なる非天然リガンドには、一般的に、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(ＳＥＲＭＳ)として広く定義される、合成非ステロイドエストロゲンまたは抗エストロゲン化合物が含まれる。
【０２０７】
４．医薬組成物および組合せ
医薬的に許容される担体において、治療的に有効量の融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子が含まれる医薬組成物もまた提供される。別の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインを有する１以上の融合タンパク質を含む医薬組成物を意図する。発現カセットを含む医薬組成物および当該リガンドを含む組成物もまた提供する。多数の組成物を含む組合せもまた提供する。
【０２０８】
組成物の製剤
ここで、溶解するかまたは分散する活性成分を含む薬理学組成物の製剤が知られる。典型的なその組成物は、液体溶液または懸濁液、水性または非水性の何れかのように滅菌注入し得るように製剤化されるが、使用前の液体における溶液または懸濁液に適当な固体型もまた製剤化される。当該製剤はまた、エマルジョンとなり得る。錠剤および他の固体型も意図する。
【０２０９】
活性成分は、医薬的に許容され当該活性成分と適合する賦形剤と、本明細書で述べた治療方法の使用に適当量で混合し得る。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびその組合せである。更に望ましいならば、当該組成物には、活性成分の有効性を促進する湿潤剤または乳化剤、ならびにｐＨ緩衝剤などのような少量の補助物質が含まれる。
【０２１０】
治療医薬組成物には、本明細書の成分の医薬的に許容される塩が含まれる。医薬的に許容される塩には、例えば塩酸またはリン酸のような無機酸または酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成される酸付加塩(ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される)が含まれる。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインおよび他のもののような有機塩基から誘導され得る。
【０２１１】
生理学的に耐性の担体は当分野に既知である。液体担体の典型は、活性成分および水の他には物質は何も含まないか、またはリン酸緩衝性生理食塩水のような生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理食塩水またはその両方のような緩衝剤を含む。また更に、水性担体には、１を超える緩衝塩および塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質のような塩を含み得る。
【０２１２】
液体組成物はまた、水を加えた液相および水を除いた液相を含み得る。その更なる液相の典型例は、グリセリン、綿実オイルのような植物油、オレイン酸エチルのような有機エステル、および水−オイルエマルジョンである。
【０２１３】
Ｄ．遺伝子制御の方法
内在性および外因性遺伝子の発現の制御の方法を提供する。特に、リガンド依存方法を提供する。当該方法の実施において、有効な結合量リガンドの存在下、有効量の融合タンパク質にさらされる融合タンパク質の核酸結合ドメインと相互作用する配列を含む標的核酸分子であって、それは、融合タンパク質と同時に加え得るか、または融合タンパク質の後に加え得る。融合タンパク質の核酸結合ドメインは、標的核酸分子の一部に結合し、当該リガンドは融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合する。暴露は、インビトロ、インシトゥまたはインビボで生じ得る。
【０２１４】
必要な亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの量は、存在するタンパク質／プロモーター複合体中の自然亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質を置換えるために必要な量か、または自然亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質と競争し自身のプロモーターと複合を形成するために必要な量である。同様に、構造遺伝子またはＲＮＡの阻止に必要な量は、遺伝子における読み取り(reading through)からのＲＮＡポリメラーゼと結合しそれを阻止する量であるか、またはそれぞれの翻訳を阻害する量である。好ましくは、当該方法は細胞内で行える。プロモーターまたは構造遺伝子を機能的に不活性化することにより、転写または翻訳を抑制する。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質モチーフを含む細胞性ヌクレオチド配列に結合するか“接触”するための阻害タンパク質の有効量の送達は、レトロウイルスベクターまたはリポソーム、または当分野に既知の他の方法のような、本明細書に記載のうちの１つにより、行い得る。
【０２１５】
ある態様は、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフを含む細胞性遺伝子または制御配列の機能を阻害するか抑制する方法である。これは、亜鉛フィンガー結合モチーフを、モチーフに結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体を含む有効量の融合タンパク質と接触させることにより、効果を為す。細胞性ヌクレオチド配列がプロモーターである場合、当該方法は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含むプロモーターの転写トランス活性化の阻害が含まれる。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体は、構造遺伝子内またはＲＮＡ配列内のモチーフに結合し得る。
【０２１６】
処置
遺伝子治療の方法を提供する。融合タンパク質を、タンパク質としてまたは当該タンパク質をコードする核酸として何れかとして投与し、ヒトのような哺乳類中の細胞または組織に送達する。当該融合タンパク質は、ゲノム内の特定配列(内在性遺伝子)、または発現カセットの一部として投与される外因的付加された遺伝子の何れかを標的とする。融合タンパク質の投与前、投与と同時または投与後、融合タンパク質中のＬＢＤと特異的に相互作用するリガンドを投与する。標的遺伝子が外因性である実施態様では、ベクター中に存在し得る発現カセットを、融合タンパク質と同時または融合タンパク質の投与後に投与する。これらの方法は、任意の遺伝的疾患の処置、後天性疾患および任意の他の病状の処置を目的とする。疾患には、癌のような細胞増殖異常が含まれる。その治療は、融合またはタンパク質の何れかとしての、または細胞中で発現する核酸分子によりコードされる亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを含む融合タンパク質による異常を有する動物の細胞中への導入により治療効果を為す。融合タンパク質または核酸分子の送達は、本明細書に記載の方法を含む当業者に既知の任意の方法により行い得る。例えば、キメラウイルスまたはコロイド状分散システムのような組換え発現ベクターを用い行い得る。
【０２１７】
本明細書で提供された融合タンパク質は、種々の異常の処置に有用となり得る。例えば、当該タンパク質は、以下に限らないが、肺、乳、リンパ、胃腸、および尿生殖路腺癌を含む種々器官系の悪性腫瘍、ならびに大腸癌(most colon cancer)、腎細胞癌、前立腺癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌および食道の癌のような他の悪性腫瘍の処置に有用となり得る。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、乾癬、天疱瘡（pemphigus vulgaris）、ベーチェット症候群および脂質組織球増殖症のような非悪性腫瘍細胞増殖疾患の処置に有用である。本質的に、プロモーター、構造遺伝子またはＲＮＡを含む亜鉛フィンガーヌクレオチド結合モチーフの活性化に病因論的に関連する任意の異常は、誘導体または変異体亜鉛フィンガー誘導性ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによる処置の可能性が考えられる。
【０２１８】
以下の実施例は、解説目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定する目的ではない。
【０２１９】
実施例１．
設計特異的亜鉛フィンガードメインの構成および試験
変異体亜鉛フィンガータンパク質をデザインし、特異的ＤＮＡ配列(表１)に選択的に結合するように構成した。以下の表１は、配列(配列番号７７−９２)を要約したものであり、ＧＮＮトリプルレットの１６実施態様の最も高い選択性を示している。
【表４】
2009273463.tif 000006
亜鉛フィンガーライブラリーパンニングのためのオリゴヌクレオチド
【０２２０】
フィンガー２(“Ｆ２”)ライブラリーのパンニングのためのビオチニル化、ヘアピン構造標的部位オリゴは以下の配列を有する：
Ｆ２ＸＸＸ：
5'-ビオチン-GGACGCN'N'N'CGCGGGTTTTCCCGCGNNNGCGTCC-3'(配列番号２５)
ここで、ＮＮＮ＝１６トリプルレットのＧＮＮセットまたはＴＧＡの何れかであり、Ｎ’Ｎ’Ｎ’＝その相補鎖である。
【０２２１】
非ビオチニル化、ヘアピン構造化特異的競争物オリゴは、以下の配列を有する：
Ｆ２ＮＮＮ：
5'-GGACGCN'N'N'CGCGGGTTTTCCCGCGNNNGCGTCC-3'(配列番号２５)
ここで、ＮＮＮ＝６４存在するトリプルレットのすべての混合物であり、Ｎ’Ｎ’Ｎ’＝その相補鎖である。
【０２２２】
亜鉛フィンガーライブラリーのパンニング
亜鉛フィンガーファージディスプレイライブラリーのパンニングは、ビオチニル化標的部位ヘアピンオリゴを用いる溶液中で行った。７ラウンドのパンニングを以下の通り行った：一夜培養物から調製したファージを、種々の量の非ビオチニル化特異的競争物ヘアピンオリゴに事前に結合させ、その後、標的部位オリゴを添加した。事前の結合は、１％Ｂｌｏｔｔｏ、５ｍＭ ＤＴＴ、４μｇシーアリングしたニシン精子ＤＮＡおよび１００μｌファージ調製物を含むＺｉｎｃ緩衝液Ａ４００μｌ中で行った。典型的に、標的オリゴよりも１０倍少ない特異的競争物を、最初のラウンドのパンニングに用いた。その後のパンニングラウンドについて、特異的競争物の量は、最後パンニングラウンドの最高１２μｇまで逐次的に増加させた。室温で３０分後、０．４μｇビオチニル化標的ヘアピンオリゴを含むＺｉｎｃ緩衝液Ａ１００μｌを加えた。ＲＴで２．５時間から３．５時間後、標的オリゴに結合したファージは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０懸濁液(Ｄｙｎａｌ)５０μｌを加え、ＲＴで１時間インキュベーションすることにより回収した。当該ビーズを磁石で回収し、２％Ｔｗｅｅｎ−２０および５ｍＭ ＤＴＴを含むＺｉｎｃ緩衝液Ａ(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／９０ｍＭ ＫＣｌ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／９０μＭ ＺｎＣｌ２)で１０回洗浄し、５ｍＭ ＤＴＴを含むＺｉｎｃ緩衝液Ａで１回洗浄した。ファージは、ＲＴ、３０分間で、１０ｍｇ／ｍｌトリプシンを含むＴＢＳ２５μｌで溶出させた。Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ７５μｌの添加の後、溶出ファージを、３７℃シェーカー中で３０分間のE. coliER2537培養物５ｍｌに感染させた。当該体積を１０ｍｌに増やし、カルベニシリンを加え濃度２０μｇ／ｍｌとした。この段階で、多くの出力ファージ(output phage)の数を、カルベニシリン含有ＬＢ寒天プレートに感染細菌のアリコートをプレーティングすることにより、決定した。３７℃の１時間の振盪後、カルベニシリン濃度を５０μｇ／ｍｌに増加させた。３７℃の１時間を越える振盪の後、１０１３ｐｆｕヘルパーファージを加え、当該培養物をＲＴで数分間インキュベーションした。次いで、カルベニシリン(５０μｇ／ｍｌ)およびＺｎＣｌ２(９０μＭ)を含むＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ９０ｍｌを加え、当該培養物を３７℃で２時間インキュベーションした。最終濃度７０μｇ／ｍｌのカナマイシンとなる添加において、当該培養物を３７℃シェーカーで一夜インキュベーションした。ファージを、ＰＥＧ沈殿により培養物上清から精製し、更なるラウンドのパンニングのため１％ＢＳＡおよび５ｍＭ ＤＴＴを含むＺｉｎｃ緩衝液Ａ２ｍｌ中に再懸濁した。ファージの数を、E. coliER2537の感染のためファージプレップの種々の希釈を用い、その後、カルベニシリン含有ＬＢ寒天プレートにプレーティングすることにより、測定した。７ラウンドのパンニング後、亜鉛フィンガーｃＤＮＡを、マルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)融合物として亜鉛フィンガータンパク質を発現し得る、ｐＭａｌ−Ｃ２(New England Biolabs)の誘導物である細菌性発現ベクターｐＭａｌ−ＣＳＳ中にサブクローニングした。
【０２２３】
望ましいＤＮＡ結合特異性を有するタンパク質の産生
３フィンガータンパク質をコードするＤＮＡを作成するため、Ｆ２コーディング領域を、選択または設計したＦ２変異体からＰＣＲ増幅し、ＰＣＲオーバーラップ伸張によりアセンブルした。他に、Ｚｉｆ２６８またはＳｐ１Ｃフレームワークを有するＤＮＡをコードする３フィンガータンパク質は、それぞれ、８または６オーバーラッピングオリゴヌクレオチドから合成した。Ｓｐ１Ｃフレームワーク構成物は、以下のように作成した。
【０２２４】
Ｅ２Ｃ−ＨＳ１(Ｓｐ１)の場合、オリゴヌクレオチドＳＰＥ２−３(5'-GCGAGCAAGGTCGCGGCAGTCACTAAAAGATTTGCCGCACTCTGGGCATTTATACGGTTTTTCACC-3')(配列番号２６)およびＳＰＥ２−４(5'GTGACTGCCGCGACCTTGCTCGCCATCAACGCACTCATACTGGCGAGAAGCCATACAAATGTCCAGAATGTGGC-3')(配列番号２７)、それぞれ０．４ピコモルを、オリゴヌクレオチドＳＰＥ２−２(5'-GGTAAGTCCTTCTCTCAGAGCTCTCACCTGGTGCGCCACCAGCGTACCCACACGGGTGAAAAACCGTATAAATGCCCAGAG-3')(配列番号２８)およびＳＰＥ２−５(5'-ACGCACCAGCTTGTCAGAGCGGCTGAAAGACTTGCCACATTCTGGACATTTGTATGGC-3')(配列番号２９)、それぞれ４０ピコモルと、標準的ＰＣＲ混合物中で混合し、２５サイクル(９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間)した。次いで、プレアセンブリ反応のアリコートを、プライマーＳＰＥ２−１(5'-GAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCTCGAGCCCGGGGAGAAGCCCTATGCTTGTCCGGAATGTGGTAAGTCCTTCTCTCAGAGC-3')(配列番号３０)およびＳＰＥ２−６(5'-GAGGAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTTTTTTTACCGGTGTGAGTACGTTGGTGACGCACCAGCTTGTCAGAGCG-3')(配列番号３１)、それぞれ４０ピコモルで、同じサイクリング条件を用い、増幅させた。
【０２２５】
Ｅ２Ｃ−ＨＳ２(Ｓｐ１)、Ｂ３Ｂ−ＨＳ１(Ｓｐ１)、Ｂ３Ｂ−ＨＳ２(Ｓｐ１)、Ｂ３Ｃ２−ＨＳ１(Ｓｐ１)、およびＢ３Ｃ２−ＨＳ２(Ｓｐ１)ＤＮＡは、同じ方法で、認識ヘリックスコーディング領域のみが異なる類似性のセットのオリゴヌクレオチドを用い、作成した。すべてのアセンブルした３つのフィンガーコーディング領域は、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉ１で消化し、ＭＢＰ融合物として亜鉛フィンガータンパク質を発現する、細菌性発現ベクターｐＭａｌ−Ｃ２(New England Biolabs)の誘導体であるｐＭａｌ−ＣＳＳ中にクローニングした。各異なるフレームワークを有する６フィンガータンパク質をコードするＤＮＡを、３つのフィンガーコーディング領域に隣接する配列に含まれるＸｍａ１およびＢｓｒＦ１制限部位を用いｐＭａｌ−ＣＳＳ中にアセンブルした(Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 14628-14633)。
【０２２６】
ＥＬＩＳＡアッセイのためのＭＢＰ亜鉛フィンガー融合タンパク質の産生
亜鉛フィンガーコーディング配列を含むプラスミドｐＭａｌ構成物を、エレクトロポレーションにより、E. coli株ＸＬ−１Ｂｌｕｅ中に形質転換した。Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ３ｍｌをインキュベーションし、３７℃で一夜増殖させた。次の日、当該培養物を５０ｍｌコニカルチューブ中で１：２０希釈し、３７℃でＯＤ６００＝０．５となるまで増殖させた。ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭとなるよう添加し、インキュベーションを２時間続けた。当該培養物を２０分間遠心分離し、次いで、ペレットを、５ｍＭ fresh ＤＴＴを含むＺｉｎｃ緩衝液Ａ４００μｌ中に再懸濁した。次いで、当該サンプルを６回、乾燥氷／エタノール中で凍結させ、３７℃水で融解し、最終的に３０秒間遠心分離し、３０分間氷上に放置し、その後、上清を使用した。
【０２２７】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＰＢＳ中の濃度０．２μｇ／２５μｌのストレプトアビジンを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーションした。当該プレートを水で２回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中０．１μｇ／２５μｌのビオチニル化オリゴヌクレオチドまたは全くのＰＢＳを適当なウェルに加え、１時間３７℃でインキュベーションした。当該プレートを２回水で洗浄し、次いで、各ウェルをＰＢＳ中３％ＢＳＡで満たし、１時間３７℃でインキュベーションした。ＢＳＡを洗浄せずに取り除き、５ｍＭ ＤＴＴを含むＺｉｎｃ緩衝液Ａ中に希釈した適当な抽出物２５μｌを適当なウェルに加えた。当該結合反応は、１時間室温で行うことができた。当該プレートを８回水で洗浄し、次いで、Ｚｉｎｃ緩衝液Ａ中のα−ＭＢＰｍＡｂおよび１％ＢＳＡをウェルに添加し、室温で３０分間インキュベーションした。当該プレートを８回水で洗浄し、次いで、Ｚｉｎｃ緩衝液Ａ中、アルカリホスファターゼに結合した抗マウスｍＡｂを添加し、当該プレートを３０分間室温でインキュベーションした。最後に８回水で洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質２５μｌおよび展開剤(developer)を各ウェルに添加した。インキュベーションは、室温で行い、各ウェルのＯＤ４０５を３０分および１時間の時点で測定した。
【０２２８】
亜鉛フィンガー転写制御ドメイン融合タンパク質の構成物
ｅｔｓリプレッサー因子(ＥＲＦ)リプレッサードメイン(ＥＲＤ)(Sgouras et al. (1995) EMBO J. 14: 4781-4793)のアミノ酸４７３から５３０をコードするｃＤＮＡを、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用い４つのオーバーラッピングオリゴヌクレオチドから作成した；ＫＯＸ１(Margolin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513)のＫＲＡＢドメインのアミノ酸１から９７をコードするｃＤＮＡを、６つのオーバーラッピングオリゴヌクレオチドからアセンブルした；Ｍａｄ ｓｉｎ３相互作用ドメイン(ＳＩＤ)(Ayer et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16: 5772-5781)のアミノ酸１から３６をコードするｃＤＮＡは、３つのオーバーラッピングオリゴヌクレオチドからアセンブルされた。ＶＰ１６転写活性ドメイン(Sadowski et al., (1988) Nature 335: 563-564)のアミノ酸４１３から４８９のコーディング領域は、ｐｃＤＮＡ３／Ｃ７−Ｃ７−ＶＰ１６(Liu et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 5525-5530)からＰＣＲ増幅された。テトラマー性リピートのＶＰ１６'ｓ最小活性化ドメインをコードし、アミノ酸４３７から４４７を含むＶＰ６４ＤＮＡ(Seipel et al. (1992) EMBO 13: 4961)は、２対の相補性オリゴヌクレオチドから作成した。すべての生じたエフェクタードメインコード化フラグメントは、標準的クローニング手順により、亜鉛フィンガーコーディング領域に融合され、それによって、それぞれ得られた構成物は、内部ＳＶ４０核局所シグナルおよびＣ末端ＨＡデカペプチドタグを含んでいた。融合構成物は、哺乳類細胞中で発現するためｐｃＤＮＡ３中にクローニングした。
【０２２９】
インテグリンβ３およびｅｒｂＢ−２ルシフェラーゼレポータープラスミドの構成物
ヌクレオチド−５８４から−１(ＡＴＧコドンについて)を包含するインテグリンβ３プロモーターフラグメントは、ヒトゲノムＤＮＡから、プライマーｂ３ｐ(Ｎｈｅ1)−ｆ(5'-GAGGAGGAGGCTAGCGGGATGTGGTCTTGCCCTCAACAGGTAGG-3')(配列番号３２)およびｂ３ｐ(Ｈｉｎｄ３)−ｂ(5'-GAGGAGGAGAAGCTTCTCGTCCGCCTCCCGCGGCGCTCCGC-3')(配列番号３３)、ならびにTaq Expand DNA Polymerase mix(Boehringer)を用い、ＰＣＲ増幅した。サイクリング条件は、９４℃で３０分間；４０×(９４℃で１分間、６２℃で３０分間、７２℃で２．５分間)；７２℃で１０分間であった。１０％ＤＭＳＯは反応混合物中に存在した。
【０２３０】
ヌクレオチド−７５１から−１を含むｅｒｂＢ−２プロモーターフラグメント(Ishii et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 4374-4378)は、同じ条件下、プライマーｅ２ｐ(Ｎｈｅ１)−ｆ(5'-GAGGAGGAGGCTAGCCGATGTGACTGTCTCCTCCCAAATTTGTAGACC-3')(配列番号３４)およびｅ２ｐ(Ｈｉｎｄ３)−ｂ(5'-GAGGAGGAGAAGCTTGGTGCTCACTGCGGCTCCGGCCCCATG-3')(配列番号３５)を用い、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、Qiagen PCR prepキットを用い精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅ１およびＨｉｎｄ３で消化し、ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ(Promega)中にクローニングした。
【０２３１】
ヌクレオチド−１５７１から−２４を含むｅｒｂＢ−２プロモーターを、Ｈｉｎｄ３消化によりｐＳＶＯＡＬΔ５'／ｅｒｂＢ−２(Ｎ−Ｎ)から切除し、ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ中にサブクローニングした。ｐＳＶＯＡＬΔ５'／ｅｒｂＢ−２(Ｎ−Ｎ)はGordon Gillから入手した。
【０２３２】
ルシフェラーゼアッセイ
すべてのトランスフェクションのため、ＨｅＬａ細胞を２４ウェルディッシュにプレートし、４０−６０％の集密で使用した。典型的に、レポータープラスミド２００ｎｇ(ｐＧＬ３−プロモーター構成物または陰性対照としてｐＧＬｂａｓｉｃ)およびエフェクタープラスミド(ｐｃＤＮＡ３中の亜鉛フィンガー構成物または陰性対照として空(empty)のｐｃＤＮＡ３)を、リポフェクタミン剤(Gibco BRL)を用いトランスフェクトした。細胞抽出物は、トランスフェクト後約４８時間で調製した。ルシフェラーゼ活性は、Progemaルシフェラーゼアッセイ試薬を用い、MicroLumat LB96P照度計(EG&G Berthold)中で測定した。
【０２３３】
ＤＮＡ結合特異性を用いた６フィンガータンパク質の産生の選択ストラテジー
亜鉛フィンガードメインのモジューラー性および各亜鉛フィンガーが３ｂｐのＤＮＡ配列を認識するという事実に基づき、幾つかのストラテジーを用い、好ましくは１から３のフィンガーを伴い、望ましいＤＮＡ結合特異性ａｎを有する亜鉛フィンガータンパク質を作成する。例えば、１８ｂｐ標的配列に結合する６フィンガータンパク質のインビトロの開発は、図１の概略のストラテジーに従った。標的配列は、６つの３ｂｐサブサイトに分けられる(Ａ−Ｆ)。最初の段階では、中央のフィンガー２が無作為化されたＺｉｆ２６８に基づく亜鉛フィンガーファージディスプレイライブラリーは、２野生型フィンガーの配列中の全６サブサイトに対し選択される。所定の標的を必要とするすべてのフィンガー２変異体の上手くいった産生の後、ハーフ・サイト１(ＡＢＣ)またはハーフ・サイト２(ＤＥＦ)の何れかを認識する３フィンガータンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＰＣＲオーバーラッピング伸張を介し構成される。最終的に、標準クローニング手順を用い、１８ｂｐ標的部位全体を認識する６フィンガータンパク質をコードする遺伝子を構成する。
【０２３４】
他の連続的結合のＦ２ドメイン変異体として、３および６のフィンガータンパク質は“ヘリックス移植”により産生され得る。亜鉛フィンガードメインのフレームワーク残基であって、認識ヘリックスの存在を支持する当該残基はタンパク質間で変化する。フレームワーク残基は、親和性および特異性の役割をする。そのため、ＤＮＡ認識ヘリックスのアミノ酸位−２から６は、Ｚｉｆ２６８(Pavletich et al. (1991) Science 252: 809-817)またはＳｐ１Ｃフレームワーク(Desjarlais et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 2256-2260)の何れかに融合する。
【０２３５】
ヒトインテグリンβ３およびｅｒｂＢ−２標的配列の選択
亜鉛フィンガーがＧまたはＴを用い５’位でＧ含有トリプレットと結合することを示す従前に行われたパンニング実験は、他のトリプレットに結合する亜鉛フィンガーよりも容易に得られる。亜鉛フィンガー標的配列は、１８ｂｐ配列の各トリプレット中に１以上のＧ’が含まれ、そして各トリプレットはＧまたはＴで開始するように選択された(表２)。これらの要求に適合させるためにｅｒｂＢ−２標的Ｂ２を、２塩基により分けられる２つの半分に分割した。適当な亜鉛フィンガー間のより長いリンカーペプチドはまた、分割部位の認識用となり得る。Ｂｌａｓｔ配列類似性探索は、各標的配列で行われ得、各１８ｂｐ配列がヒトゲノム中の特有の部位に特異的であることを確認した(最大の類似性が許容される：１６／１８ｂｐ同一性)。
【０２３６】
転写因子ＡＰ−２は、ＥｒｂＢ−２過剰発現腫瘍細胞系の有意な画分における非制御下発現の中に含まれるため、ｅｒｂＢ−２標的部位Ｂ２は、活性化転写抑制の結果としてばかりでなく、また重要転写因子との競争としてＥｒｂＢ−２の発現を阻害する意図により、ＡＰ−２結合部位ＧＣＴＧＣＡＧＧＣとオーバーラップするように設計した。対照的に、他のｅｒｂＢ−２標的部位に結合する亜鉛フィンガータンパク質(すなわち、ｅｒｂＢ−２標的部位ＣおよびＤ)は、エフェクタードメインの結果として転写に影響する。
【０２３７】
インテグリンβ３標的配列ＢおよびＣ２は、転写制御の効率を比較するため、転写開始部位から種々の距離で選択された。選択亜鉛フィンガータンパク質が転写エフェクタードメインに融合するため(Sadowski et al., (1988) Nature 335: 563-564; Margolin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513; Sgouras et al. (1995) EMBO 14: 4781-4793; Ayer et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16: 5772-5781)、亜鉛フィンガータンパク質の結合自体が、転写レベルに影響を与える。
【０２３８】
亜鉛フィンガータンパク質の選択のための選択した標的配列のリストを以下の表２に挙げる。亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ二重ヘリックスの一本鎖に優先的に塩基接触を形成するため、関連鎖の標的配列を挙げ、コーディング鎖に関して＋／−でデザインした。標的配列の位置および主要転写開始部位に関連する位置を提供する。
【表５】
2009273463.tif 000007
【０２３９】
フィンガー２ライブラリーの構成およびパンニング
Ｚｉｆ２６８−Ｃ７(“Ｃ７”)のフィンガー２でＤＮＡと接触に影響を与えるアミノ酸残基(Wu et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 344-348)は、ＰＣＲオーバーラップ伸張突然変異誘発ストラテジーを用い広範囲で無作為化した。２種の無作為化ストラテジーを用い、２つのサブライブラリーを、ｐＣｏｍｂ３ファージディスプレイベクター(Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 7978-7982)を用い構成した。サブライブラリーは、それぞれ約４×１０９の独立したクローンを保有する。
【０２４０】
ヘリックス位置−３から７を示すＺｉｆ２６８−Ｃ７のフィンガー２の無作為化のための突然変異誘発を以下の表３に要約した。一番上の行は、フィンガー２の野生型配列を示す。下２つの行は、使用した２つの突然変異誘発ストラテジーを示す。この場合、Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｋ＝Ｇ、Ｔ；Ｖ＝Ｇ、Ａ、Ｃ；Ｓ＝Ｇ、Ｃである。ＮＮＫ無作為化コドンは、３２コドンにおいて２０アミノ酸すべてを提供する。ＶＮＳ無作為化コドンは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓおよびすべてのストップを除き、２４コドンにおいて１６アミノ酸を提供する。一番下の行に示すストラテジーでは、より少ない複合コドンの使用により、更なるコドンの突然変異誘発が可能となることに注意すべきである。
【表６】
2009273463.tif 000008
【０２４１】
ＧＸＸセットの１６トリプレットのそれぞれを認識するフィンガー２変異体(Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2758-2763; および表１)およびＴＧＡを認識する１つの変異体が上手く選択された。従前の観察の拡大において、亜鉛フィンガー配列の比較は、ＤＮＡの亜鉛フィンガー認識のコードを示した。そのため、５’−および３’−Ｇは、ヘリックス位置６および−１でそれぞれアルギニンを選択する一方、中央のＧは、認識ヘリックスの３位でヒスチジンまたはリシンを選択した。対照的に、相当するヘリックス位置において、中央のＡはアスパラギンを選択し、３’−Ａはグルタミンを選択し、中央のＴはセリンまたはアラニンを選択し、３’−Ｔはスレオニンまたはセリンを選択し、中央のＣは、アスパラギン酸またはスレオニンを選択し、そして、３’−Ｃはアスパラギン酸またはグルタミン酸を選択した。選択亜鉛フィンガー変異体の特異性および親和性の広範な特性解析が行われ、多くの亜鉛フィンガーペプチドが高い特異的特質でその標的を認識することを示す(Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2758-2763および表１)。
【０２４２】
部位特異的変異誘発によるフィンガー２特異性の改良
試みが行われ、部位特異的変異誘発を用い、認識ヘリックスを修飾することにより幾つかの亜鉛フィンガードメインの結合特異性を改善した。ファージディスプレイ選択のデータおよび構造上の情報により、突然変異体の設計が導かれる。ヘリックスの１および５位は、認識において直接役割を担うとは予想されないけれども、特異性の最善の改良は、常に、これらの位置に修飾が含まれることである(Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2758-2763および表１)。これらの残基は、非配列特異的特質の親和性に寄与する、リン酸バックボーン接触の形成が観察される。そのため、非特異的接触の除去は、複合体の全体的安定性に対する特異的接触の重要性を増大させ得、それにより、特異性を促進させ得る。
【０２４３】
３フィンガータンパク質結合ｅｒｂＢ−２およびインテグリンβ３標的配列の作成
９ｂｐのＤＮＡ配列を認識する３フィンガータンパク質を産生するための２種のストラテジーを用いた。各ストラテジーは、亜鉛フィンガードメインのモジューラー性に基づき、表１に定義の５’−ＧＮＮ−３’型のトリプレットを認識する亜鉛フィンガードメインのファミリーの利点を生ずる。５’−(ＧＮＮ)６−３’ｅｒｂＢ−２標的部位ｅ２ｃのハーフ・サイト(ＨＳ)１および２を認識する、２つの３フィンガータンパク質は、第一のストラテジーにおいて、ＰＣＲアセンブリストラテジーを用い、事前に定義したフィンガー２(Ｆ２)ドメイン変異体を互いに融合することにより、産生した。
【０２４４】
このアプローチの普遍性を調べるため、５’−(ＧＮＮ)３−３’型の３つの更なる３フィンガータンパク質認識配列を、同じアプローチを用い調製した。亜鉛フィンガータンパク質を、マルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)との融合として調製した。ＥＬＩＳＡ分析は、一連の連結Ｆ２タンパク質が、望ましい９ｂｐＤＮＡ標的配列を特異的に認識することに関し作用し得ることを示した(Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 14628-14633)。示された５つの各タンパク質は、標的と非標的５’−(ＧＮＮ)３−３’配列との間で識別できた。標的に対する各タンパク質の親和性は、電気泳動移動シフトアッセイにより測定された。これらの研究により、亜鉛フィンガーペプチドは、Ｚｉｆ２６８に匹敵する親和性を有し、３から７０ｎＭの範囲のＫｄを有する他の天然転写因子を有する(表４、以下)。
【０２４５】
他の連続的結合のＦ２ドメイン変異体として、第二のストラテジーにおいて、ｅｒｂＢ−２標的部位ｅ２ｃ(表４、以下)の２つのハーフ・サイトに特異的な３フィンガータンパク質は、“ヘリックス移植”により産生した。フレームワーク残基は、親和性および特異性の役割をする。ヘリックス移植の場合、ＤＮＡ認識ヘリックスのアミノ酸−２から６位は、Ｚｉｆ２６８(Pavletich et al. (1991) Science 252: 809-817)またはＳｐ１Ｃフレームワーク(Desjarlais et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 2256-2260)の何れかに融合した。Ｓｐ１Ｃタンパク質は、キレート剤に対し安定性の促進が見られるように設計された共通タンパク質である。当該タンパク質は、急速ＰＣＲベース遺伝子アセンブリストラテジー(rapid PCR-based gene assembly strategy)により調製されたＤＮＡ鋳型から発現した。それぞれの場合、ＭＢＰ融合タンパク質のＥＬＩＳＡ分析より、Ｆ２フレームワーク構成と共に観察されるＤＮＡ結合特異性および親和性(表４、以下)が保持されることが示された。インテグリンβ３標的部位ｂ３ｂおよびｂ３ｃ２のＨＳ１およびＨＳ２を認識する３フィンガータンパク質はまた、Ｓｐ１Ｃバックボーンを用い産生した。予備的なＥＬＩＳＡデータにより、これらのタンパク質は、良好な特異性で各標的に結合することが示された。ゲルシフトアッセイ分析による親和性の測定のような、タンパク質の更なる特性解析を行い得る。以下、表４参照。
【０２４６】
ｅｒｂＢ−２およびインテグリンβ３プロモーター領域の特異的ターゲッティングのための６フィンガータンパク質の産生
９ｂｐのＤＮＡ配列の認識は、複合ゲノム内の特有部位への特異性には重要ではない。対照的に、１８ｂｐの連続ＤＮＡ配列を認識する６フィンガータンパク質は、ヒトゲノム中の単一部位を決定し、そのため、遺伝子特異的転写スイッチの産生に重要な先行条件を満たす。ｅｒｂＢ−２標的配列ｅ２ｃに結合する６フィンガータンパク質は、単一の制限酵素消化により３フィンガー構成物から産生され、Ｆ２、Ｚｉｆ２６８およびＳｐ１Ｃフレームワーク鋳型ＤＮＡ(これらのタンパク質の配列の場合、Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 14628-14633参照)でクローニングされた。インテグリンβ３標的配列ｂ３ｂおよびｂ３ｃ２に結合する６フィンガータンパク質は、Ｓｐ１Ｃバックボーンを用い産生されるのみであった。精製ＭＢＰ融合タンパク質のＥＬＩＳＡ分析により、各６フィンガータンパク質は、非標的５’−(ＧＮＮ)６−３’部位またはタンデムリピートのＺｉｆ２６８標的部位に対する交差反応を僅かに伴って、特異的標的配列を認識できることが示された。
【０２４７】
以下の表４では、ゲルシフトアッセイにより測定されるような種々の標的配列に対する３つおよび６つフィンガータンパク質の親和性を要約している。タンパク質を大文字で表記しており、ＤＮＡ標的配列を小文字で表記している。使用する略語は、Ｆ２＝フィンガー２フレームワーク；Ｚｉｆ＝Ｚｉｆ２６８フレームワーク；Ｓｐ１＝Ｓｐ１Ｃフレームワーク；ｍｕｔ＝突然変異体；ＨＳ＝ハーフ・サイトである。標的部位オーバーラップ現象(target site overlap phenomenon)に関し、各標的配列後の塩基を小文字で示す(Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 14628-14633参照)。Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ相互作用の親和性が測定され、１０ｎＭであった(Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2758-2763)。Ｋｄ値は、５０％未満の標準偏差を有する、２つの独立した実験から得た平均である。
【０２４８】
３および６フィンガータンパク質の親和性
【表７】
2009273463.tif 000009
下記表５において、ファージ提示選択性(系)によって生じ、サイト・ダイレクト変異体誘発によって精製した該フィンガー２変異体について要約した。タンパク質の提示は、パニングから誘導されたクローンについて、ｐＸＸＸの形態であり；ｐｍＸＸＸは、突然変異誘発によって精製されたクローンを示す。ヘリックス位置−１、３および６は、太字で示し、変異したヌクレオチドを下線にした。その値は少なくとも２つの独立した実験の結果を示す。標準誤差は±５０％またはそれ以下であった。
【０２４９】
【表８】
2009273463.tif 000010
e２cＤＮＡ標的部位に対する各Ｅ２Ｃタンパク質の親和性をゲル位相分析によって測定した。２５ｎＭの中程度のＫｄ値を、Ｆ２の骨組みから構築したＥ２Ｃ（Ｆ２）６フィンガータンパク質で観察した。その値はその構成要素である３フィンガータンパク質よりも２〜３倍高いだけである。６フィンガータンパク質に関する以前の研究において、３フィンガータンパク質構成要素と比較してそれらのＤＮＡリガンドに対して６フィンガータンパク質の親和性が約７０倍程度強いことが観察された[Liu et al.(1997）Proc. Natil. Acad. Sci. U.S.A. 94:5525-5530]。
【０２５０】
Ｅ２Ｃ（Ｆ２）ペプチドの親和性における実質的な増加がない場合は、Ｆ２ドメインの連続的結合が適当でないことが考えられる。６フィンガータンパク質のＦ２ドメインの周期性が、この伸長された配列上のＤＮＡの周期性と一致していないこと、およびこのタンパク質結合エネルギーのかなりの部分が巻戻しＤＮＡに費やされる可能性がある。Ｆ２ドメインタンパク質と対照的に、Ｅ２Ｃ（Ｚif）およびＥ２Ｃ（Ｓp１）６フィンガータンパク質は、それらオリジナルの３フィンガータンパク質構成要素と比較すると４０−７０倍の高い親和性を示し、Ｋｂ値が各々１.６ｎＭおよび０.５ｎＭであった。いずれかハーフ・サイトの変異により、親和性が約１００倍低下するため、これらタンパク質の３フィンガータンパク質成分の両方は結合に関与する（表４参照：Beerli et al.(198)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14628-14633）。数多くの既知転写因子はそのナノモルの親和性で特異的ＤＮＡリガンドを結合し、このことは遺伝子発現の制御が、ごく普通の生存時間のタンパク質／ＤＮＡ複合体によって決定されていることが考えられる。即ち、高い親和性の亜鉛フィンガータンパク質は必要とはされず、特に非特異的なＤＮＡの結合も増加する場合には不利益となり得る。それらの各標的に対するＢ３Ｂ（Ｓp１）とＢ３Ｃ２（Ｓp１）の６フィンガータンパク質の親和性は、本明細書中に記載の方法だけでなく当業者には既知の方法を用いて測定することができる。
【０２５１】
実施例２
亜鉛フィンガードメインおよび転写リプレッサーおよびアクチベーターを含有する融合タンパク質の構築
遺伝子特異的転写のレギュレーターとして亜鉛フィンガータンパク質の使用を示すために、Ｅ２Ｃ（Ｓp１）、Ｂ３Ｂ（Ｓp１）、Ｂ３Ｃ２（Ｓp１）の６フィンガータンパク質を多数のエフェクタードメインと融合した（Beerli et al.(198)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14628-14633）。転写リプレッサーは、３つのヒト誘導リプレッサードメインどれかを亜鉛フィンガータンパク質に付着させることによって生じた。最初のリプレッサータンパク質を、ets２repressor factor（ＥＲＦ）の４７３〜５３０個のアミノ酸によって定義されるＥＲＦ repressor domein(ＥＲＤ)を用いて調製した（Sgouras et al.(1995)EMBO J. 14:4781-4793）。このドメインは、etsファミリーの転写因子の活性へのＥＲＦのアンタゴニスト的効果を媒介する。合成リプレッサーを亜鉛フィンガータンパク質のＣ末端との融合によって構築した。
【０２５２】
第２のリプレッサータンパク質を、Krueppel-associated box（ＫＲＡＢ）ドメインを用いて調製した（Margolin et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91:4509-4513）。このリプレッサードメインは、亜鉛フィンガータンパク質Ｎ末端に広く見出され、おそらく、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１との相互作用によって距離および配向性と独立した方法でＴＡＴＡ依存性転写へのその抑制活性を働かせる。
【０２５３】
亜鉛フィンガータンパク質ＫＯＸ１のアミノ酸１番目および９７番目の間に見出されたＫＲＡＢドメインを用いた。この場合、６フィンガータンパク質とのＮ末端融合体を構築した。最後に、抑制についてヒストン脱アセチル化の有用性を示すために、Mad mSIN３ interaction domain（ＳＩＤ）のアミノ酸１から３６を亜鉛フィンガータンパク質のＮ末端と融合した（Ayer et al.,(1996)Mol. Cell. Biol. 16:5772-5781）。この小さなドメインは、転写因子ＭａｄのＮ末端で見いだされ、mＳＩＮ３との相互作用によりその転写抑制を媒介するのに寄与し、これが順番にコリプレッサーＮ−ＣｏＲとヒストン脱アセチル化酵素ｍＲＰＤ１と相互作用する。
【０２５４】
遺伝子特異的活性化を試験するために、転写アクチベーター、亜鉛フィンガータンパク質と、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４１３から４８９（Sadowski e al.(1988)Nature 335:563-564）、またはＶＰ６４と呼ばれるＶＰ１６の最小活性化ドメインであるＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ（配列番号：３６）(Seipel et al.(1992)EMBO 13:4961）の人工的な四量体化繰り返しとに融合させて生成した。
【０２５５】
erbＢ-２プロモーター活性の特異的制御
ルシフェラーゼリポーター遺伝子と連結したerbＢ-２プロモーターフラグメントを含有するレポーター構成物を生成し、erbＢ-２特異的合成転写レギュレーターの特異的活性を試験した。該標的レポータープラスミドはＡＴＧ開始コドンに関してヌクレオチド−７５８から−１を含み、一方、コントロールレポータープラスミドはヌクレオチド−１５７１から−２４を含有し、そのため、−２４位から−７位に含まれるＥ２Ｃ結合部位の１つのヌクレオチド以外の全ては欠損している。両プロモーターフラグメントは、ＨｅＬａ細胞に一時的にトランスフェクションした場合に、以前の知見と一致して、同様の活性を示した。亜鉛フィンガーリプレッサードメイン融合構成物のerbＢ-２プロモーター活性への影響を試験するために、Ｈela細胞を、各亜鉛フィンガー発現ベクターとルシフェラーゼリポーター構成物とを用いて一時的にコトランフフェクションを行った（Beerli et al.,(1998)Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.95:14628-14633）。顕著な抑制を、各構成物で観察した。該ＥＲＤおよびＳＩＤ融合タンパク質は、約５０および８０％の抑制を各々生成した。最も高いリプレッサーは、ＫＲＡＢ融合タンパク質であった。このタンパク質は、erbＢ-２プロモーター活性を完全に抑制した。この観察された残存活性は、プロモーターを含まないｐＧＬ３リポーターのバックグラウンドレベルであった。対照的に、該タンパク質のどれもがＥ２Ｃ標的部位を欠損する該コントロールerbＢ-２プロモーター構成物の顕著な抑制を導かないため、抑制は確かにＥ２Ｃ（Ｓp１）タンパク質とその標的部位との特異的結合によって事実媒介されることを示している。どれかのエフェクタードメインを欠損する亜鉛フィンガータンパク質の発現は、約３０％の弱い抑制を生じ、ＳＩＤおよびＫＲＡＢ構成物で見られる殆どの抑制は、それらのエフェクタードメイン、むしろＤＮＡ結合単独で生じることを示している。この所見は、抑制機構が伸長よりむしろ転写開始の積極的な阻害であることを強く示唆するものであった。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写開始が一旦始まると、亜鉛フィンガータンパク質はポリメラーゼの作用によってＤＮＡから容易に置換されるようにみえる。
【０２５６】
転写の活性化を媒介するためにerbＢ-２特異的亜鉛フィンガータンパク質の使用を、同じ２つのレポーター構成物を用いて提示した。該ＶＰ１６融合タンパク質は、転写を約５倍刺激し、一方ＶＰ６４タンパク質は２７倍の活性を示すことがわかった。１つのＶＰ１６を基本とした転写アクチベーターによって生じるプロモーター活性の劇的な刺激は、亜鉛フィンガータンパク質が遺伝子の転写領域で結合するという事実をみると例外的である。これは、亜鉛フィンガータンパク質の単なる結合、ナノモル以下の親和性を示すものとの結合であっても、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの進路において、かならずしも、遺伝子発現に関する負の影響をうけるわけではないことも示す。
【０２５７】
erbＢ-２プロモーターによって駆動されるレポーター構成物の有効かつ特異的な調節に基づいて、一時的にトランスフェクトした亜鉛フィンガー発現プラスミドの内在的erbＢ-２プロモーターの活性への効果を分析した。erbＢ-２プロモーター活性の読み出しとして、ＥrbＢ-２タンパク質レベルをウエスタンブロッティングによって分析した。驚くべきことに、Ｅ２Ｃ（Ｓp１）−ＶＰ６４はＥrbＢ-２タンパク質レベルの上流調節をみちびき、一方でＥ２Ｃ（Ｓp１）−ＳＫＤはその下流調節を導いた。ＥＧＦＲの発現に対する影響はまったく観察されなかったのでこの調節は特異的である。
【０２５８】
重要なことは、これらの実験で得た知見は、ＨｅＬａ細胞のトランスフェクション効率が５０％以下であったので、亜鉛フィンガーペプチドの有効性をひどく過小評価したものであることを示すことである。１００％の細胞が亜鉛フィンガータンパク質を発現することを確認するために、安定な細胞系を作ることが必要である。テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で亜鉛フィンガー構成物を発現する安定な細胞系の生成することは既知である（Gossen et al. (1992) Poc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:5547-5551）。安定な細胞系で亜鉛フィンガータンパク質の誘導し得る発現はそのようなタンパク質の特異性の程度に関する詳細な分析に供した。
【０２５９】
インテグリンβ３プロモーター活性の特異的調節
インテグリンβ３プロモーターに対する転写レギュレーター特異性の活性を試験するために、インテグリンβ３プロモーターのコントロール下に、ルシフェラーゼオープンリーディングフレームを含有するリポータープラスミドを構築した。上記記載の２つのerbＢ-２プロモーターフラグメントと比較すると、該インテグリンβ３プロモーターフラグメントは非常に低い活性を示す。実際、いくつかの実験では、バックグラウンド以上のルシフェラーゼ活性の活性化は全く検出されず、ＫＲＡＢ融合タンパク質の効果に関する分析を防げた。しかし、ＶＰ６４融合タンパク質を試験すると、インテグリンβ３プロモーターの効率的活性が観察された。Ｂ３Ｂ(Ｓp１)−ＶＰ６４およびＢ３Ｃ２(Ｓp１)−ＶＡ６４は、各々１２および２２倍転写を刺激した。erbＢ-２の活性に対する効果は全く検出されなかったので転写活性は特異的であった。
【０２６０】
実施例３
プロゲステロン受容体変異体を含む融合タンパク質構成物
ステロイド受容体ファミリー群をアミノ酸配列比較すると、それらは一般に多くの規定されたドメインを含み、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメインともう少しＣ末端に位置したリガンド結合ドメインを包含することが示された。重要なことは、これらドメインはモジュラーであって、プロゲステロン受容体(ＰＲ)のＤＮＡ結合ドメインはＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと上手く交換する。この構成物のＮまたはＣ末端にＶＰ１６活性化またはＫＲＡＢリプレッサードメインを添加することにより、リガンド依存性方法でＧａｌ４応答性リポーターを制御し得るタンパク質を得た。これらの研究において使用したリガンド結合ドメインの重要な性質は、少しのＣ末端欠失を有する突然変異株ＰＲから誘導されることである。この変異体は、プロゲステロンに応答できず、ＲＵ４８６などのプロゲステロンアンタゴニストにのみ応答性であり、この系をイン・ビボ用途に適切なものとしている。
【０２６１】
オリジナルのＰＲＤＮＡ結合ドメインは遺伝子操作した亜鉛フィンガータンパク質によって置換され得る。例えば、３亜鉛フィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８（Ｃ７）を、ＰＲリガンド結合ドメイン(ＰＢＤ)（ａａ６４０〜９１４）のＮ末端に、そのＣ末端へＶＰ１６活性化ドメインを融合させた。この融合タンパク質はＲＵ４８６依存性方法で、１０個の上流のＺｉｆ２６８（Ｃ７）結合部位を有するＳＶ４０プロモータールシフェラーゼ構成物を制御することが可能であることがわかった。
【０２６２】
ＲＵ４８６用量作用曲線により、至適誘導が約１ｎＭから約１０ｎＭのＲＵ４８６で起こることが示わかった。経時変化の研究は、１０ｎＭのＲＵ４８６で行い、Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６活性の至適誘導は約２４時間でおこることを示した。
【０２６３】
通常存在するステロイド受容体結合は二量体としてＤＮＡに結合するので、このアプローチを適用するために重要な前提条件は、注目するプロモーターにおける適切な標的配列の存在である。さいわいにも、ステロイド受容体二量体によって標的となる２つのハーフ・サイトのスペーシングおよび配向性は柔軟である。通常、ステロイド応答配列は、インバート・リピート、即ちパリンドロームを包含するが、可変性スペーシングにおいてハーフ・サイトについてダイレクト・リピートまたはインバート・リピートであっても寛容である（Aumais et al.(1996)J. Biol. Chem. 272:12229-12235）。erbＢ-２およびインテグリンβ３プロモーターの探索によって、５’−(ＧＮＮ)３−３’のダイレクトおよびインバート・リピート配列が非常に頻繁におきることがわかった。ヘテロ二量体のＲＵ４８６調節し得る亜鉛フィンガータンパク質による標的化に適切な配列モチーフの例は、
【表９】
2009273463.tif 000011
であり、当該配列は、erbＢ-２プロモーターで見出され、ＴＡＴＡボックス（上記下線）と重複する。幾つかの例では、プロモーターの標的化は、ホモ二量体を使用すると可能であり、例えばerbＢ-２プロモーターに見出され、標的配列e２c（下線）とオーバーラップする配列
【表１０】
2009273463.tif 000012
を標的とすることにより可能である。
【０２６４】
実施例４
ヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメインを含有する組替えリガンド活性化転写性調節融合タンパク質
ヒトエストロゲン受容体は、ステロイド受容体タンパク質の例として図２に示される。方形の下のこの数字は、各ドメインのボーダーを定義するアミノ酸残基の位置を示す。Ａ／Ｂは、アミノ末端活性化機能１（ＡＦ−１）のドメインであり、ＣはＤＮＡ結合ドメインであり、Ｄはhinge領域と呼ばれ、Ｅはリガンド結合ドメインであり、またこれは活性化機能２(ＡＦ−２）も包含し、Ｆはカルボキシ末端に最も近い部分で、そのドメインの機能が完全には確立されない。ホモ二量体化複合体に関与し安定化するタンパク質の領域は、Ｃ、ＤおよびＥドメインに分散している。ステロイド受容体リガンド結合ドメインの領域（図２中の領域Ｅ）に加えて、天然ＤＢＤ中の領域およびhinge領域(各々領域ＣおよびＤ)が、該受容体のホモ二量体化に分担する。Ｃ２Ｈ２含有受容体の機能に関するこれらの領域の重要性を示すために、３つの異なる鎖長ＬＢＤフラグメントを含有するタンパク質が構築された。これらの異なる鎖長のＬＢＤ構成物により、Ａ、ＢおよびＣ（図３）を設計した。ＬＢＤフラグメントＡは、「最小の」ＬＢＤフラグメントとして一般的に引用されるものを示す。いくつかの研究は、hinge領域が、ステロイド受容体ＬＢＤ−キメラタンパク質において重要な役割を担うこと；フラグメントＢはＬＢＤとhingeを示すことを示唆している。エストロゲン受容体の、天然ＣまたはＤＮＡ結合領域は、Ｃ４−Ｃ４クラスの２つの亜鉛フィンガーを含有する。該５'またはアミノ末端フィンガーはＤＮＡ特異的接触に寄与する；該３'フィンガーはＤＮＡ結合ドメイン二量体複合体を安定化するために寄与する。３'天然亜鉛フィンガーの寄与を利用するように、３'天然亜鉛フィンガーが保持され、Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガー配列に直接融合したＬＢＤフラグメントＣが包含される。
【０２６５】
遺伝子発現を制御するために融合タンパク質の能力を至適化するために、さらに受容体にヘテロなトランスアクチベーションドメインを加える必要があるかもしれない。これらの研究を促進するために、融合タンパク質を、エストロゲン受容体残基５９５を伸長する完全長ＬＢＤと、またはＦ領域を除去するためにアミノ酸(aa)５５４で切り取ったＬＢＤフラグメントと共に構築した。完全長構成物は、ロング（Ｌ）として引用され、切り取ったバージョンはショート（Ｓ）として引用される。全ての構成物は、ＶＰ１６最小ドメインを含むヘテロなトランスアクチベーションドメイン（ＴＡ）を含み、特記しなければリガンド結合ドメインのカルボキシ末端に融合する。ＶＰ１６最小ドメイン三量体は、アミノ酸残基配列を３×（ＰＡＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ）(配列番号：３６)を持ち、テトラサイクリン制御化トランスアクチベーター(tＴＡ)ＴＡ２である（Baron et al.(1997)Nucleic Acids Research 25:2723-2729）。
【０２６６】
これら構成物を図３に要約し、クローニングストラテジーの図式要約とＣ２Ｈ２ＤＮＡ結合ドメイン−ＥＲリガンド結合ドメイン融合タンパク質に関連した命名法の概略を提供する。下部でのプラスミド構成物に示したように、最後の構成物は、３つの成分：アミノ末端ではＣ２Ｈ２亜鉛フィンガードメイン(ＺＦＰ)、中間部ではステロイド受容体リガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)フラグメント、そしてカルボキシ末端では付随するヘテロなトランスアクチベーションドメイン(ＴＡ) を包含する。ＬＢＤフラグメントＡ、ＢまたはＣは、ＬＢＤのアミノ末端ボーダーの位置によって定義される；Ａ（２８３）、Ｂ（２５８）およびＣ（２１２）についてのアミノ酸の数は野生型ＥＲにおける残基数に対応する。ＬＢＤフラグメントは、そのカルボキシ末端の接合点によって、ロング(Ｌ)またはショート(Ｓ)としてさらに定義される。長い構成物は、ヘテロなＴＡをｗｔＥＲアミノ残基５９５に融合し、ショート構成物は、ＴＡをＥＲアミノ酸５５４で切り取ったＬＢＤフラグメントに融合した。即ち、全部で６つの融合タンパク質、ＺＦＰ−ＬＢＤ−ＴＡ  Ａ、ＢおよびＣと各々長い形態または短い形態で構築した。発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１中で構築した特定の例に関する地図は、図４（Ｃ７ＬＢＤＡＳ）(配列番号：６）、図５（Ｃ７ＬＢＤＢＳ）(配列番号：８)、図６（Ｃ７ＬＢＤＣＳ）(配列番号：１０）、図７（Ｃ７ＬＢＤＡＬ）(配列番号：７）、図８（Ｃ７ＬＢＤＢＬ）(配列番号：１）および図９（Ｃ７ＬＢＤＣＬ）(配列番号：９）に示した。
【０２６７】
上記詳細に記載したように、Ｃ２Ｈ２クラスの亜鉛フィンガータンパク質各々は、ＤＮＡ配列接触の約３塩基に寄与する。Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガーレイは、それらを結合するために６、９、１２、１５、１８塩基またはそれ以上の特定配列を持つＤＮＡ結合ドメインを集めるために「ステッチ（stitch together）」し得る。これらＣ２Ｈ２Ｚｎフィンガー(ＺＦＰ)−ステロイド受容体融合タンパク質に用い得る亜鉛フィンガーのアレイのサイズを評価するために、３つのフィンガーおよび６つのフィンガーのアレイを含有するタンパク質を構築した。集められた様々なタンパク質の組成、およびそれらのＤＮＡ結合部位特異性を図１６に列挙する。
【０２６８】
一般的なクローニングストラテジーは以下のとおりである。Ｆ領域を有する、もしくは有さないヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の３つのフラグメント（図３で参照したＡ、ＢおよびＣ）は、一連のＰＣＲ増幅およびクローニング過程からpcＤＮＡ３.１（Invitrogen）ベクターのバックボーン中に構築した。最初に、Ｆ領域を持たない(即ち、短い形態；ＬＢＤＡＳ) ＬＢＤフラグメントＡとＦ領域を持つ（即ち、長い形態；ＬＢＤＡＬ）ＬＢＤフラグメントＡを、各々ＮＲ１／ＮＲ２およびＮＲ１／ＮＲ３のプライマーの一組（表１）を持つヒト野生型エストロゲン受容体のプラスミドクローン、pＨＥＧＯ(Tora et al. EMBO J.8:1981-1986)からＰＣＲ増幅した。都合の良い制限部位は、必要に応じてプライマー（表１）に組込んだ。ＰＣＲ増幅ＬＢＤＡＳおよびＬＢＤＡＬフラグメントを、pＣＲ-ＳcriptＡmpＳＫ（＋）ベクター(Strategene)のＳrf Ｉ部位に最初にクローンし、構成物pＬＢＤＳおよびpＬＢＤＡＬを生成した。該ＶＰ１６最小ドメイン三量体(ＴＡ２；Baron et a.(1997)Nucleic Acids Research 25;2723-2729)を、プライマーの組ＮＲ４およびＮＲ９を用いてプラスミドpＴＴＡ２（Clontech）からＰＣＲ増幅し、pＬＢＤＳおよびpＬＢＤＡＬのＳpIIおよびＮotl部位中でクローンし、pＬＢＤＡＳＴＡ２およびpＬＢＤＡＬＴＡ２を生成した。Ｆ領域（ＬＢＤＢＳ）を含まないＬＢＤフラグメントＢと、Ｆ領域（ＬＢＤＣＳ）を含まないＬＢＤフラグメントＣを生成し、各キメラＢおよびキメラＣ中のＬＢＤフラグメント領域の５'の境界を示すＰＣＲプライマーＮＲ７およびＮＲ８を構築した。これらのプライマーは、３'末端プライマーＮＲ６と組み合わせて、固有のＢlpI部位をＥＲに導入した。次いで、プライマーの組ＮＲ６／ＮＲ７を持つpＨＥＧＯからのＰＣＲフラグメントおよびプライマーの組ＮＲ６／ＮＲ８を持つＰＣＲフラグメントを、pＬＢＤＣ７ＡＳＴＡ２バックボーンのＳpelおよびＢIpl中にクローンした。これにより、pＬＢＤＢＳＴＡ２とpＬＢＤＣＳＴＡ２を得た。
【０２６９】
【表１１】
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【０２７０】
ＴＡ２領域に融合した３つのＬＢＤフラグメントのクローニングを完成した後、次いで、Ｃ２Ｈ２ＤＮＡ結合タンパク質Ｃ７を、ＢgIIIおよびＳpeＩ切断によってpcＤＮＡＣ７ＶＰ１６から切り出し、各３つの構成物（pＬＢＤＡＳＴＡ２、pＬＢＤＢＳＴＡ２およびpＬＢＤＣＳＴＡ２）のＢamＨＩおよびＳpeＩ部位中に連結し、pＣ７ＬＢＤＡＳＴＡ２、pＣ７ＬＢＤＢＳＴＡ２およびpＣ７ＬＢＤＣＳＴＡ２中を生じた。次いで、Ｃ７ＬＢＤＡＳＴＡ２、Ｃ７ＬＢＤＢＳＴＡ２およびＣ７ＬＢＤＣＳＴＡ２のカセットを、ＥcoＲＩ−ＮotＩ構成物によってpＣＲ-Ｓcriptベクターから除去し、発現カセットベクターpcＤＮＡ３.１(+)の同じ部位にクローンし、構成物pＣＤＮＡＣ７ＡＳＴＡ２、pＣＤＮＡＣ７ＢＳＴＡ２およびＣＤＮＡＣ７ＣＳＴＡ２で生じた。ＴＡ２に融合したエストロゲン受容体Ｆ領域を包含するＬＢＤフラグメントを持つこれら３つのＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質を再構築するために、ＢlplからＮotIフラグメントをpＬＢＤＡＬＴＡ２構成物から切り出し、pＣＤＮＡＣ７ＬＢＤＡＳＴＡ２、pＣＤＮＡＣ７ＬＢＤＢＳＴＡ２およびpＣＤＮＡＣ７ＬＢＤＣＳＴＡ２中にＢlpＩ−ＮotＩフラグメントを置換し、pＣＤＮＡＣ７ＬＢＤＡＬＴＡ２、pＣＤＮＡＣ７ＬＢＤＢＬＴＡ２およびpＣＤＮＡＣ７ＬＢＤＣＬＴＡ２を生成した。
【０２７１】
ＤＮＡ結合ドメインＣ７をＥ２Ｃで置換するためのクローニング
最初に、pcＤＮＡＣ７ＶＰ１６中、Ｃ７を含有するＳfiIフラグメントをＳfiＩ切断後のpＭaＩ／Ｅ２Ｃ(hs１)から単離したＥ２Ｃ（hs１）フラグメントで置換することによって、介在性構成物pcＤＮＡＥ２ＣＶＰ１６を構築した。次に、pcＤＮＡＥ２ＣＶＰ１６をＳpeＩで切断し、１ｋｂのフラグメントを単離した。このＳpeIフラグメントを、pcＤＮＡ−Ｅ２ＣＬＢＤＡＳＴＡ２を作ったpcＤＮＡＣ７ＬＢＤＡＳＴＡ２の大きなＳpeＩフラグメントに連結した。同様の過程を行い、pcＤＮＡＥ２ＣＬＢＤＢＳＴＡ２を構築した。
【０２７２】
ＤＮＡに結合する組替え体構築タンパク質の分析
該融合タンパク質が配列の特異的手法でＤＮＡに結合することを示すため、またタンパク質の化学量論：ＤＮＡ結合を評価するために、標準的な電気泳動シフトまたはゲルリターデーションアッセイを行った。
【０２７３】
最初に、融合タンパク質は、商品説明書に従ってＴＮＴCoupled Reticlocyte Lysate System(Promega, Cat#L4610)を用いてイン・ビトロ転写および翻訳によって作成した。簡単にいうと、各発現反応は全体積５０μlで設定し、これはＴＮＴウサギ網状赤血球分解物（２５μl）、ＴＮＴ反応緩衝液(２μl)、ＲＮasinリボヌクレアーゼ阻害剤(２０Ｕ／μl)、ロイシンを含まないアミノ酸混合物(１μl)、メチオニンを含まないアミノ酸混合物(１μl)およびＴＮＴ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ(１μl)、発現プラスミド (１μg／μl) (２μl)および水を含有する。該反応混合物を３０℃で９０分間インキュベートした。
【０２７４】
発現タンパク質の２本鎖オリゴヌクレオチドへの結合は、ゲル電気泳動シフトアッセイ系（Promega, Cat#E3050)を用いて次のように行った:イン・ビトロ翻訳産物（５μl）を、５Xゲルシフト結合緩衝液(４μl)および水(７μl)と共に室温で２０分間インキュベーションし、Ｅ２(２μl)(１０nＭ終濃度)と３２Ｐ標識プローブ(２μl)を該混合物に添加した。キットに記載のような標準的なプロトコールを用いて、該プローブを標識した。室温で２０分間インキュベーションした後、該混合物を６％のＤＮＡリターデーションゲル上に充填し、約３０−６０分間１５０−２００ボルトで０.５×ＴＢＥ緩衝液に流した。次いで、ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに感光させた。
【０２７５】
各々ハーフ・サイトが３塩基対毎に分離されているもので、それをＣ７として知られるＣ２Ｈ２ドメインに対する２つのインバート結合部位を含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ結合の最初のアセスメントに使用した。このパリンドロームの配置は、ＥＲＥの天然の６塩基対のハーフ・サイトがＣ７によって特定される９塩基対のハーフ・サイトによって置換されることを除いて、天然エストロゲン受容体応答配列(ＥＲＥ)の組成を擬態する。全て短い形態のＣ７−ＬＢＤ融合タンパク質Ａ、ＢおよびＣの結合を試験し、対照タンパク質Ｃ７ＶＰ１６および２Ｃ７ＶＰ１６と比較した（参照、Liu, et al.(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 5525-5530、対照のタンパク質を記載）。各タンパク質に対して、競合物として非標識オリゴヌクレオチド(１.７５μＭ)の非存在もしくは１００倍過剰の存在下で試験した。非標識オリゴヌクレオチドによるゲルシフト生成物の競合は、そのバンドが特定タンパク質：ＤＮＡ相互作用であることを示す。この結果によって、Ｃ７ＶＰ１６がオリゴヌクレオチドに１または２回結合し、２つの特定のゲルシフトのバンドを示すことがわかった。２Ｃ７ＶＰ１６は、２つの逆転したＣ７部位を含有するオリゴヌクレオチドにただ１回結合する。特に、Ｃ７ＬＢＤＡおよびＣ７ＬＢＬＢは強固に結合し、他の対照のバンドのどれよりも速く進む１つの主要な種類を得た。真の分子量はこのタイプの移動度アッセイから測定することはできないが、該複合体の相対的サイズは、Ｃ７ＬＢＤに結合するタンパク質はＣ７ＶＰまたは２Ｃ７ＶＰよりも大きいことを示す。バンドのサイズとただ１つの主要な種類の存在は、融合タンパク質ＺＦＰ−ＬＢＤがダイマーとしてオリゴヌクレオチドと結合していることを示す。顕著なゲルシフト生成物はＣ７ＬＢＤキメラＣに関して全く検出せず、それはエストロゲン受容体から追加の天然亜鉛フィンガータンパク質を添加により、そのＣ２Ｈ２特異的なＤＮＡ結合部位に対する融合タンパク質の親和性を低下し得ることを示唆した。最終的に、非標識オリゴヌクレオチドの添加による各ゲルシフト生成物に関する結合の低下は、これらの融合タンパク質が配列の特異的方法においてＤＮＡに結合することを示す。
【０２７６】
該キメラＺＦＰ−ＬＢＤがダイマーとしてＤＮＡに結合することをさらに示すために、Ｃ７ＬＢＤ Ａ、ＢおよびＣが１または２つの結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合することを試験した。３つの融合タンパク質(Ｃ７ＬＢＤＡＳ、Ｃ７ＬＢＤＢＳおよびＣ７ＬＢＤＣＳ）を、３つの異なる標的オリゴヌクレオチド配列に対して試験したが、後者にはパリンドローム性またはダイレクト・リピート配向性のいずれかで１つのＣ７ハーフ・サイトまたは２つのＣ７ハーフ・サイトを含有する。
【表１２】
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ゲルシフトアッセイ条件は、上記の標準的なプロトコールと同じである。結果によれば、Ｃ７ＬＢＤＡＳおよびＣ７ＬＢＤＢＳが２つのＣ７ハーフ・サイトを含有する両方のオリゴヌクレオチドに結合し得るが、１つのハーフ・サイトだけを含有する該オリゴには結合しないことを示す。Ｃ７ＬＢＤＣＳは、３つの標的に弱く結合するか、全く結合しなかった。
【０２７７】
融合タンパク質Ｃ７ＬＢＤＡおよびＣ７ＬＢＤＢは１つの形態としてパリンドローム(２つの逆のハーフ・サイト)を含有する該プローブに、Ｃ７ＶＰ対照と等量で結合するが、一方Ｃ７ＬＢＤＣは検出可能な結合を示さなかった。対照的に、融合タンパク質Ｃ７ＬＢＤＡおよびＣ７ＬＢＤＢはただ１つのＣ７部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合せず、一方、予想したように、Ｃ７ＶＰは一回結合するだけであった。Ｃ７ＬＢＤＡおよびＣ７ＬＢＤＢは、３つの介在スペースを有するインバート・リピートまたは９つの介在スペースを有するダイレクト・リピートとして２つの部位を含有するオリゴ１およびオリゴ３に等しく結合した。この実験データは、該ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質が２量体化し、２つのＣ７ハーフ・サイトを含有するＤＮＡに優先的に結合するが、ハーフ・サイトの正確な配向性およびスペーシングは重大ではないことを示す。ＤＮＡ結合部位配向性におけるこの柔軟性は、Ｃ２Ｈ２ドメインにおける二量体化機能の欠如を反映している可能性があるが、野生型エストロゲン受容体がインバートおよびダイレクト・リピートを包含するコンセンサスＥＲＥとは異なる多様な応答配列に結合することは注目に値する。
【０２７８】
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質のホモダイマー結合の化学量論をさらに確認するため、かつそれらのＤＮＡ配列特異性を示すために、以下の実験を行った。第２のＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質を、Ｃ７結合部位から９つの塩基対のうち６つの塩基対で異なる認識配列５'−ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ｇ  ３’に結合するＣ２Ｈ２亜鉛フィンガードメインＥ２Ｃ（ＨＳ１）を用いて構築した（注：非常に低い方のｇは該タンパク質に小さな影響を与える１０番目の塩基を示す：ＤＮＡ接触親和性）。発現ベクターpcＤＮＡ３.１に構築した特定態様の地図は、図１１（Ｅ２ＣＬＢＤＡＳ）（配列番号：１１）および図１２（Ｅ２ＣＬＢＤＢＳ）（配列番号：１２）に示した。
【０２７９】
２つのＣ７部位、２つのＥ２Ｃ部位のインバート・リピート、または１つのＣ７および１つのＥ２Ｃハーフ・サイトの混合ヘテロ二量体部位を含有するオリゴヌクレオチドを調製した。異なるＤＮＡ結合ドメイン（Ｃ７またはＥ２Ｃ）を持つ２つの融合タンパク質は、Ｃ７、Ｅ２Ｃまたは２つの組み合わせ物に対して特異的なパリンドローム結合部位を含有する３つのオリゴヌクレオチドに対するそのＤＮＡ結合特異性について試験した。
【０２８０】
【表１３】
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ゲルシフトアッセイを、上記標準プロトコールに従って行った。
【０２８１】
この結果によれば、Ｃ７ＬＢＤ融合タンパク質は、２つのＣ７部位を含有するオリゴヌクレオチドにのみ強固に結合するが、２×Ｅ２ＣプローブまたはＣ７／Ｅ２Ｃプローブのいずれにも結合しなかった。同様に、該Ｅ２Ｃ−ＬＢＤキメラタンパク質は２×Ｅ２Ｃプローブに強固に結合する。最後に、ＺＦＰ−ＬＢＤ構成物はヘテロ二量体部位を有するオリゴヌクレオチドにも結合しない。２つのタンパク質を等量で混合した場合、Ｃ７ＬＢＤとＥ２ＣＬＢＤヘテロ二量体は形成した。ヘテロ二量体はヘテロ二量体化プローブに結合した。これらの結果から、ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質が二量体としてＤＮＡに優先的に結合することを確認した。さらに、これらのデータは、異なるＣ２Ｈ２結合部位選択性をもつ融合タンパク質間に良好なＤＮＡ結合特異性を示す。
【０２８２】
実施例５
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質による形質転換遺伝子発現のリガンド依存性調節
形質転換遺伝子発現を調節するための融合タンパク質Ｃ７ＬＢＤ Ａ、ＢおよびＣの能力を評価するために、標準的なコトランスフェクションリポーターアッセイを行った。ＳＶ４０プロモーターフラグメントの上流とホタルルシフェラーゼ（pＧＬ３Ｐro；Ｐromega）をコードするリポータータンパク質を挿入したダイレクト・リピートＣ７結合部位（６×２Ｃ７）の６つのコピーを含有する６×２Ｃ７pＧＬ３Ｌucとして知られるリポーター構成物を、構築された融合タンパク質と共に形質移入し、以下に記載したようにアッセイした。
【０２８３】
培養細胞（ＨeＬa、Ｃos、Ｈep３Ｂまたはその他）をＤＭＥＭフェノール不含培地でのトランスフェクションの日の前に２４ウェルプレート中でウェルあたり５×１０４細胞で幡種し、Ｌ−グルタミンおよび胎児ウシ血清(sＦＢＳ)を除いた５％(ｖ／ｖ)チャコールデキストランを添加した。細胞を、Qiagen Superfect Transfection法を用いて形質転換した。各ウェルに、ルシフェラーゼリポータープラスミド(６×２Ｃ７pＧＬ３proluc)（５μg）、キメラアクチベーターＤＮＡ(０.１μg）（例えば、Ｃ７ＬＢＤＡ、Ｃ７ＬＢＤＢまたはＣ７ＬＢＤＣ）、特記しなければ、不活性キャリアープラスミドＤＮＡ（０.４μg）（p３Ｋpn）を含有する全量のＤＮＡ(１μg)を、ＤＭＥＭフェノール不含／血清不含培地（６０μl）およびＳuperfect試薬（５μl）と混合した。一般的に、約１０ng〜約０.５μgのキメラアクチベーターＤＮＡを、各ウェルごとに使用した。
【０２８４】
該混合物を、１０秒間ボルテックスに供し、室温で１０分間インキュベートし、次いでＤＭＥＭフェノール不含５％sＦＢＳ培地(３５０μl)を添加した。細胞を、Ｄulbeccoリン酸緩衝液の生理食塩水（ＤＰＢＳ）で１回洗浄し、トランスフェクション混合物を細胞に加えた。細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄に続いて２.５時間３７℃でインキュベーションし、ＤＭＥＭフェノール不含５％sＦＢＳ培地を再び与えた。
【０２８５】
約２４時間のトランスフェクション後、細胞を、ＤＭＥＭフェノール不含５％sＦＢＳ中１００nＭ終濃度で誘導化剤、または記載したような１７βエストラジオールまたは４ＯＨ-Ｔamoxifenで処理した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、１×リポーター分解緩衝液(Ｐromega)(２００μl)を添加して２４時間後に回収し。プレートを−８０℃で凍結させ、１００ＲＰＭで軌道攪拌機で室温で１.５時間浸漬した。細胞片を静置した後、分解物を１×リポーター分解用緩衝液で１：１０に希釈し、１０μlを９６ウェルの不透明なプレートに移す。プレートを、ホタルルシフェラーゼ基質(Ｐromega）を用いてＴropix ＴＲ７１７マイクロプレート照度計で分析した。
【０２８６】
エストロゲン依存方法でリポーター遺伝子発現を調節するためのＣ７ＬＢＤの短い形態のキメラタンパク質Ａ、ＢおよびＣの能力を、ＣosおよびＨeＬa細胞で調べた。構成的アクチベーターＣ７ＶＰ１６および２Ｃ７ＶＰ１６を陽性対照として使用した。該結果から、３つのＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質がＣosおよびＨeＬa細胞において同様のプロファイルを示すことがわかった。３つのＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質の全てが、ルシフェラーゼリポーター遺伝子に対するエストロゲン依存性効果を持つことを示した。特徴的なパターンは、ＡはＢ以上に全活性が高いことを示し、ＢはＣ以上に全活性が高いことを示した。同様に、これらタンパク質のリポーター遺伝子に対する基底またはリガンド依存性の効果は、同様のパターンに従う；Ａ＞Ｂ＞Ｃ。遺伝子発現に対するエストロゲン依存性効果は、これらの実験で２倍〜９倍の範囲であった。
【０２８７】
Ｃ７ＬＢＤ長い形態と短い形態の融合タンパク質によるルシフェラーゼリポーター遺伝子の調節をＣos細胞で比較した。該結果は、エストロゲン受容体Ｆ領域を含有する長い形態の融合タンパク質が、短い形態のものよりリポーター遺伝子に対する高い基底状態およびリガンド依存性の効果を示す。結果として、長い融合タンパク質は、比較的低い結合誘導を示す。この結果はヘテロなＶＰ最小ドメイン三量体と共同的に機能するＦ領域における高められているがリガンド依存性のトランスアクチベーション活性によるものであろう。あるいは、この結果は、組替えタンパク質のＶＰ活性化ドメインとエストロゲン受容体リガンド結合ドメインとの間の介在性Ｆ領域の結果として、スペーシングの差異による可能性もある。
【０２８８】
Ｃ７ＬＢＤ融合タンパク質の活性に対してヘテロなトランスアクチベーションドメインの組成の役割を評価するために、ＶＰ最小ドメイン三量体を、ヒトＳＴＡＴ−６（アミノ酸６６０−８４７）または約７７個のアミノ酸（残基４１３−４９０）（図１３）の完全長ＶＰ１６アクチベーションドメインのいずれかで置換した。完全長ＶＰ１６との構成体において、トランスアクチベーションドメインを、そのまま、または、ＶＰ１６のアミノ末端でＳＶ４０核酸局在性ペプチド配列との連結で添加した。異なるトランスアクチベーションドメイン （ＴＡ２、ＳＴＡＴ６Ｃ、ＶＰ１６およびＮＬＳＶ１６）を含有するＣ７ＬＢＤ融合タンパク質ＡまたはＢを構築し、遺伝子アクチベーションとリガンド誘導に対するそれらの効果について評価した。構成物は、図解的に、上に略記して示したように、該構成物は以下を包含する：
１．Ｃ７ＡＳＴＡ２、Ｃ７ＢＳＴＡ２：ＶＰ１６最小ドメイン三量体で形成するＣ７ＬＢＤＡまたはＢショート
２．Ｃ７ＢＳ−ＳＴＡＴ：ＳＴＡＴ６カルボキシ活性化ドメインで形成するＣ７ＬＢＤＢショート
３．Ｃ７ＢＳ ＶＰ１６：完全長のＶＰ１６アクチベージョンドメインで形成するＣ７ＬＢＤＢショート
４．Ｃ７ＡＳ nlsＶＰ１６：nlsによって先行した完全長のＶＰ１６を有するＣ７ＬＤＡショート
【０２８９】
アッセイを、６×２Ｃ７pＧＬ３Ｌucリポーター(０.５μg)とレギュレーター（０.１μg）でトランスフェクションしたＨela 細胞で行い、Ｌuc活性を以前記載したように測定した。ヒトＳＴＡＴ６トランスアクチベーションドメインを使用して、ＴＡ２ＶＰ最小ドメイン三量体を置換した場合、ＴＡ２ドメインの場合より２倍以下であるが、形質転換遺伝子の同じ低い基底活性と９倍のリガンド依存性誘導が得られた。
【０２９０】
完全長ＶＰ１６（図２４、Ｃ７ＡＳnlsＶＰ１６）のＮＬＳ上流の組込みが、ＴＡ２またはＮＬＳのないＶＰ１６と比較してホールディング誘導を大きく増加するが、全活性は顕著に低下した。完全長ＶＰ１６ドメインを用いた場合、約２倍の高い全体の活性を示すが基底活性が高いと、弱いリガンド依存性誘導を生じる（３倍）。
【０２９１】
実施例６
レポーター構成物に依存するＣ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６構成物のリガンド独立活性
初期の試験では、Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６構成物は高い基底活性（即ち、リガンド依存性）を示した。従って、Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６を、本来のもの、即ちＧal４を基にした構成物ＧＬ９１４ＶＰc'と比較したが、それは報告によると非常に低い基底活性を示した。ＧＬ９１４ＶＰc'タンパク質は６×Ｇal４−ＳＶ４０プロモータールシフェラーゼリポーターについて試験した場合、それは、Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６以上に高い基底活性を示した。エフェクター／リポーターの割合が変動しても、両方の系で基底活性に対して効果を示さなかった。しかし、至適な誘導のための割合は、ＧＬ９１４ＶＰc’およびＣ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６について異なり、各々１／３０および１／１０であることがわかった。
【０２９２】
リガンド独立性活性のその他の起こり得る起源を試験した。市販入手可能な胎児ウシ血清(ＦＣＳ)群は、エストロゲンまたはエストロゲン様活性を含有することが知られている。血清中のプロゲスチンアゴニスト活性の存在が、高い基底活性に関する原因である可能性があるので、該ＦＣＳを、デキストリン被覆したチャコールを用いて、ステロイドを「除去」した。しかし、除去したまたは除去しない血清を平行して比較すると、スイッチ構成物の基底活性における差異を検出できない。脂質を基にしたトランスフェクション試薬、例えばLipofectamineＴＭはステロイド受容体に対する顕著なアゴニスト活性をもち得る。従って、Qiagenからの非脂質トランスフェクション試薬SuperfectＴＭが代替物として使用し、LipofectamineＴＭと比較した。
【０２９３】
基底活性に関する減少は全く観察されなかった。上記アッセイ全てについて、ＨeＬa細胞を使用した。しかし、ＧＬ９１４ＶＰc’によるオリジナルの研究で使用されたＨepＧ２細胞の使用は全く改善をもたらさなかった。
【０２９４】
Ｇal４に対する元々の研究で使用したレポーターp１７×４ＴＡＴＡ-lucは、ＴＡＴＡボックスの４つのＧal４ダイマー結合部位上流を含有する。ＧＬ９１４ＶＰc'は、このリポーターに対する非常に低い基底活性を示し、ＲＵ４８６によって誘導できる。そのため、等価のリポーターであるpＧＬ３ＴＡＴＡ／１０×Ｃ７を構築し、Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６を試験した。ＴＡＴＡリポーターを持つリポーター構成物を用いると基底活性がＧal４システムにおいてよりもなお高いが、基底活性はＳＶ４０プロモーター含有pＧＬ３prm／１０×Ｃ７を用いる場合よりも明らかに低い。また、最小のＣＭＶプロモーターを有する２つの追加のリポーター、pＧＬ３minＣＭＶ/６×Ｇal４およびpＧＬ３minＣＭＶ/１０×Ｃ７を構築した。対応するスイッチタンパク質の基底活性は、リポーターを含有するＳＶ４０プロモーターに対して、これらのリポーターに対するものと同等に高かった。
【０２９５】
これらの結果が示すのは、ＧＬ９１４ＶＰc'およびＣ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６は構成的に核内に位置し、単量体かまたは二量体としてのどちらかでそれらの標的部位に結合し得る。しかし、リガンドに結合すしなければ、融合タンパク質はＴＡＴＡボックス、即ちＳＶ４０プロモーターまたは最小ＣＭＶプロモーターを超える範囲で転写を活性化し得るのみである。ＴＡＴＡボックスのみが存在する場合、構造変化におそらく関連したリガンド結合は、転写の十分な活性を必要とする。
【０２９６】
リガンド独立性活性も細胞型特異性であることがわかった。Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６は、ＨeＬa細胞中で示した活性よりも、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞中のＴＡＴＡリポーターに対して非常に低い基底活性を示した。
【０２９７】
Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６は、核に構成的に移動することがわかったので、ＰＢＤとＶＰ１６ドメインとの間のＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）を、リガンド依存性以上の核移動をなすということを期待して除去した。得られる構成物、Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６noＮＬＳを、次いでpＧＬ３prom／１０×Ｃ７で試験した。しかし、転写活性は変化しない基底活性によって示したようにＣ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６の場合ほどにはＲＵ４８６に依存しなかった。ＰＢＤ（aa６４０−６４４）のＮ末端で天然ＳＶ４０様ＮＬＳの最小の残存部分を除去した構成物Ｃ７−ＰＢＤΔＮＬＳ−ＶＰ１６noＮＬＳを作成した。
【０２９８】
実施例７
ＤＮＡ結合ドメインのハーフ・サイトのスペーシングおよび配向性の至適化
天然に存在するステロイドホルモン受容体は、通常インバート・リピート、即ちパリンドロームＳＲＥに結合する。しかし、幾つかの場合では、結合においていくらかの柔軟性が存在する場合に示された。ダイレクト・リピートおよびインバート・リピートもまた応答性配列として役に立つ。ステロイド受容体を基にしたスィッチ構成物の結合のために全部で１８のＣ７ダイマーＴＡＴＡルシフェラーゼリポーター構成物の２つのハーフ・サイトの至適スペーシングおよび配向性を測定するために調製した。０〜５個の介在塩基のスペーサーによって直接的に各６つのＣ７ダイマーを逆転させ、リピート配向性を裏返した。これらの各リポーター構成物に対するＲＵ４８６応答性Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ６４タンパク質の試験により、ＲＵ４８６誘導性活性がリポーターの各々で観察されたことから、実際完全にいくつかの柔軟性が存在することが明らかになったことがわかった（表７-９以下；記載の値は２つの定量値の平均と標準偏差である）。各リポーターの応答性の程度において明らかに相違があった。
【０２９９】
全てスペーシングのない２つのＣ７部位のダイレクト・リピートは、最も好ましい特性を示した。これは、特に重要なことであり、ホモ二量体およびヘテロ二量体の組替体リガンド応答性転写因子を用いて、(ＧＮＮ)６部位を標的とする能力を示す。
【０３００】
ＲＵ４８６応答性ＶＰ６４−Ｃ７−ＰＲタンパク質およびタモキシフェン応答性ＶＰ６４−Ｃ７−ＥＲタンパク質に対する、これらリポーター構成物に対する更なる試験によって、いくつかの柔軟性を明らかにし、リガンド誘導性活性化が各リポーターに対する各タンパク質で観察された。しかし、最も好ましい特性は、３つの塩基対のスペーシングを有する繰り返しＶＰ６４−Ｃ７−ＥＲタンパク質で観察された。しかし、最も好ましい特性は、３塩基対のスペーシングを有するダイレクトおよびインバート・リピートに対してＶＰ６４−Ｃ７−ＥＲタンパク質で観察された。５塩基対のスペーシングを有するダイレクト・リピートも、３フィンガー構成物（以下参照）を有するerb-２プロモータの標的化を可能にする。
【０３０１】
更なる研究から、Ｃ７／Ｃf２−ＰＢＤ−ＶＰ６４ヘテロ二量体が、Ｃ７およびスペーシングを含まないＣf２の各々に１つの結合部位を有するＣ７−Ｃf２ＴＡＴＡリポーターに結合することが、転写の際に２倍のリガンド依存性の変化を提供する。
【表１４】
2009273463.tif 000016
【表１５】
2009273463.tif 000017
【表１６】
2009273463.tif 000018
【０３０２】
実施例８
Ｃ７−ＰＢＤ−リプレッサードメイン融合タンパク質構成物
制御し得る転写リプレッサーとしてＰＢＤ融合タンパク質の使用を評価するために、Ｃ７−ＰＢＤを多数のリプレッサードメイン(表１０、以下)と融合した。
ルシフェラーゼリポーターアッセイで試験した場合、多くのリプレッサー構成物は有意な活性はなかった。Ｃ７−ＰＢＤ−ＫＫ（２つのＫＲＡＢ−Ａボックスの二量体を含有する）は、２５−５０％の抑制を再現的に導いたが、殆どがＲＵ４８６依存性であった。しかし、ＲＵ４８６非依存性のより強固な抑制は、Ｃ７−ＰＢＤ−ＳＫＤ構成物で観察された。
【０３０３】
実施例９
３フィンガー−ＰＢＤ−ＶＰ６４ホモ／ヘテロ二量体によるerbＢ−２プロモーター活性の制御
Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６スイッチタンパク質が、５塩基対のスペーシングＣ７部位の１０個のダイレクト・リピートを含有する１０×Ｃ７リポーター構成物を制御するこができたが、このことはスイッチダイマーがこの特異的なスペーシングを有するダイレクト・リピートに結合し得ることを示す。erbＢ−２プロモーター活性のリガンド依存性制御に関するホモおよびヘテロ二量体の３フィンガーＰＢＤ融合タンパク質の潜在的な使用を評価するために、該プロモーター領域を（ＧＮＮ）３Ｎ５（ＧＮＮ）３モチーフの存在についてスクリーンした。４つの二量体標的部位(Ｅ２Ｅ、Ｅ２Ｆ、Ｅ２ＧおよびＥ２Ｈ)を同定した。Ｅ２Ｅは１８塩基対Ｅ２Ｃ標的配列とオーバーラップし、ホモ二量体に関する結合部位として機能し得る。別の３つの部位はヘテロ二量体結合部位として機能するための潜在力を持つ。３フィンガータンパク質を獲得したその７つは、Ｆ２ステッチによって生成されＥＬＩＳＡ(表１１、以下)によって結合するために分析した。次いで、erbＢ−２特異的なスイッチ構成物を、各３フィンガータンパク質のＰＢＤ−ＶＰ６４への融合によって生じ、erbＢ−２プロモーター活性を制御するそれらの能力を試験した。該値は、２回の測定の平均および標準偏差である。ヘテロ二量体Ｅ２Ｆ−ＰＢＤ−ＶＰ６４スイッチのみが、erbＢ−２プロモーターの検出可能な制御を導いた。この制御は、ＲＵ４８６に依存性ではなくＣ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６およびＣ７−ＰＢＤ−ＶＰ６４タンパク質の高い基底活性に一致する。
【０３０４】
【表１７】
2009273463.tif 000019
【表１８】
2009273463.tif 000020
【０３０５】
実施例１０
Ｎ末端エフェクタードメインを有するエストロゲンおよびプロゲステロン受容体融合タンパク質
エストロゲン受容体(ＥＲ)リガンド結合ドメイン(ＥＢＤ)を用いて、組替え体リガンド応答性ポリペプチドを構築した。Ｍyc−ＥＲ融合構成物を、Ｅliane Ｍuller から得、ＥＢＤコード領域の起源として使用した。ヒト野生型アミノ酸配列を含有するというよりはむしろ、Ｍyc−ＥＲは、もはやエストロゲンを結合しないがエストロゲンアンタゴニスト４−ＯＨタモキシフェンを結合することを示すポイントミューテーション（aa２８２−５９９、Ｇ５２５Ｒ）マウスＥＢＤを含有し、そして逆説的にそれによって逆に活性となった。血清がエストロゲンを含有するためでなく、全ての組織培養培地で存在するフェノールレッドがエストロゲンアゴニストとして作用するために、これはイン・ビボの適用への、そして組織培養実験への利点を示す。
【０３０６】
該ＶＰ１６−Ｃ７−ＥＲ、ＶＰ１６−ＮＬＳ−Ｃ７−ＥＲおよびＶＰ１６−Ｃ７−ＮＬＳ−ＥＲ融合構成物を上記のように調製した。並行してプロゲステロン受容体(ＰＲ)変異体のアナログの組を調製した（ＶＰ１６−Ｃ７−ＰＲ、ＶＰ１６−ＮＬＳ−Ｃ７−ＰＲおよびＶＰ１６−Ｃ７−ＮＬＳ−ＰＲ）。これら構成物中のＰＢＤはaa６４０−９１４を包含し、そのため一部天然ＮＬＳ(aa６４０−６４４)を欠く。
【０３０７】
これらの各構成物を、ルシフェラーゼアッセイで試験し、pＧＬ３prom／１０×Ｃ７をレポーターとして用いて、Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６と比較した。これらＰＲ構成物の全てが、Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ１６よりもＲＵ４８６の存在下で高い活性を示すだけではなく、完全にＮＬＳを含まないＶＰ１６−Ｃ７−ＰＲも非常に低い基底活性を示した。これにより、リガンド依存性誘導を劇的に改良し、この特定の実験において２６倍vs６倍になった。ＥＲ構成物のタモキシフェン誘導活性は、ＰＲ変異体のＲＵ４８６誘導活性よりも約４倍高かった。リガンド依存性の誘導はよりよくなった；ＶＰ１６−Ｃ７−ＥＲに対して４３倍となった。
【０３０８】
ＶＰ１６−Ｃ７−ＰＲおよびＶＰ１６−Ｃ７−ＥＲにおけるＶＰドメインは、以下のエフェクタードメインによって置換した：該アクチベーターＶＰ６４、リプレッサーＫＫ（ＫＲＡＢ−Ａボックス二量体）、ＭＭ（Ｍad sin３相互作用ドメインの二量体）およびＳＫＤ。該ＶＰ６４変異体は有用であり、例えば、上記Ｃ７二量体−ＴＡＴＡルシフェラーゼリポーターを用いて、２つハーフ・サイトの至適スペーシングおよび配向性を決定するための研究では有用である。
【０３０９】
実施例１１
核ホルモンＬＢＤに融合した３フィンガータンパク質を用いる標的化自然プロモーター
３フィンガースイッチホモおよびヘテロ二量体についての以下の標的配列を、ヒトerbＢ−２(Ｅ２)およびインテグリンβ３（Ｂ３）プロモーターにおいて同定した。
【表１９】
2009273463.tif 000021
【表２０】
2009273463.tif 000022
【０３１０】
実施例１２
核標的リガンド結合ドメインに融合した６フィンガータンパク質を用いる標的化自然プロモーター
「６フィンガーヘテロ二量体」
記載したいずれかのフォーマットを用いて単一の１８塩基部位への結合に対する６フィンガータンパク質の制御は失敗した。同様に、Ｃ７−ＰＢＤ−ＶＰ６４タンパク質は単一のＣ７部位のみを含有するＴＡＴＡリポーター活性化しなかった。別法として、ヘテロ二量体構成物を調製したが、この中にはただ１つの二量体化パートナーがＤＮＡ結合ドメインを含有し、一方他方はエフェクタードメインを含有する。
該形式は以下のものであった：
（１）Ｅ２Ｃ−ＰＲ//ＰＲ−ＶＰ６４
（２）Ｅ２Ｃ−ＥＲ//ＥＲ−ＶＰ６４
【０３１１】
４つの融合構成物の全てを完全に配列決定し、リガンド依存性方法においてerbＢ−２プロモーターを制御する能力についてルシフェラーゼアッセイで試験し。ＰＲ６フィンガーヘテロ二量体は不活性化であることがわかった；同様の観察結果がＣ７−ＲｘＲ//ＥcＲ−ＶＰ１６ヘテロ二量体についてもなされた。対照的に、該Ｅ２Ｃ−ＥＲ//ＥＲ−ＶＰ６４ヘテロ二量体はある活性を示し、タモキシフェンの添加によりプロモーター活性の約３倍の上流制御を導く。２つのヘテロ二量体化パートナーの割合における変化は、全体で５.３倍まで誘導性の増加をもたらした。
【０３１２】
ＲＸＲ(哺乳類)およびＥcＲ(Drosophila)についてのコード領域を、以下に列挙した該プライマーおよびＡmpliＴaqＤＮＡポリメラーゼ(Hoffmann-LaRoche)を用いてpＶgＲＸＲ(Invitrogen)からＰＣＲ増幅した。前方および後方プライマーを構成物を構築されるように選択した。該サイクル条件は、２'／９４℃；２５×（３０''／９４℃−３０''／６０℃−２''／７２℃）；１０'／７２℃であった。該ＰＣＲ生成物を、Quiagen PCRキットで精製し、記載の制限エンドヌクレアーゼで切断し、修飾真核生物発現ベクターpcＤＮＡ３に連結した(Invitrogen; 参照、Beerli et al., (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.95:14628-14633)図１４にある構成物を得た。
【表２１】
2009273463.tif 000023
【０３１３】
亜鉛フィンガーおよびエフェクタードメインの交換
制限エンドヌクレアーゼＳfilで分解後、Ｃ７ ３フィンガータンパク質を、標準的なクローニング法によって、６フィンガータンパク質Ｅ２Ｃ、Ｂ３Ｂ、Ｂ３Ｃ２および２Ｃ７で置換した。制限エンドヌクレアーゼＡsclおよびＰaclで分解後、活性化ドメインＶＰ１６を、活性化ドメインＶＰ６４と抑制ドメインＫＫおよびＳＫＤで置換した。
【０３１４】
ルシフェラーゼアッセイ
全てのトランスフェクションに関して、ＨeＬa細胞を２４ウェルディッシュ上で培養し、４０−６０％の密生で用いた。通常、１７５ngリポータープラスミド （pＧＬ３プロモーター構成物、または負対照としてpＧＬbasic）および２５ngエフェクタープラミド(pcＤＮＡ３中の亜鉛フィンガータンパク質、または負対照として含まないpcＤＮＡ３.１)を、リポフェクタミン試薬(Ｇibco BLR)を用いてトランスフェクトした。細胞抽出物をトランスフェクション後の４８時間で調製した。ルシフェラーゼ活性を、MicroLumat ＬＢ９６Ｐ照度計（EG & GBerthold）でPromegaルシフェラーゼアッセイ試薬を用いて測定した。
【０３１５】
Bombyx mori EcR
Bombyx mori EcRに対するコード領域を含有するプラスミド (ＬＮＣＶＢＥ)をF.Gageから得た。Bombyｘ mori EcRを下記に挙げたプライマーおよびＡmpliＴaqＤＮＡポリメラーゼ(Hoffmann-LaRoche)を用いて、このプラスミドからＰＣＲ増幅した。前方および後方プライマーを選択し、Drosohila EcRをBombyｘ mori EcRで置換する以外は図１４に対応する該構成物を構築した。
【表２２】
2009273463.tif 000024
【０３１６】
Ｃ７−Ｒ−ＶＰ１６//Ｃ７−Ｅ−ＶＰ１６
このヘテロ二量体を、２つのレポーター、１０Ｃ７部位を含有するものと６２Ｃ７部位を含有するものについて、２つの細胞系、ＨeＬaおよびＮＩＨで試験した。全ての場合で、Ｃ７−Ｒ−ＶＰ１６構成物のみが、ポナステロンＡの存在に依存せずに高い転写活性(８４０倍)を示した。しかしｓ、該Ｃ７−Ｅ−ＶＰ１６構成物をそれ自身に対して転写活性が非常に低いことを示した。Ｃ７−Ｒ−ＶＰ１６//Ｃ７−Ｅ−ＶＰ１６共に、Ｃ７−Ｒ−ＶＰ１６単独と同じ挙動を示した。
【０３１７】
Ｃ７−Ｒ//Ｅ−ＶＰ１６
このヘテロ二量体において、ＲＸＲ上の活性化ドメインを除いて、上記観察された基底活性を排除した。ＥcＲは、ＤＮＡ結合ＲＸＲの存在に依存して活性を与えるＤＡＮ結合ドメインを持たない。このヘテロ二量体を、１つのＥ２Ｐ結合部位を含有する、１０Ｃ７レポーター上の３フィンガータンパク質Ｃ７を用いて、またＥ２Ｐレポーター上の６フィンガータンパク質Ｅ２Ｃを用いて試験した。両方の場合において、有意な活性は観察されなかった。
【０３１８】
Ｃ７−Ｒ//Ｃ７−Ｅ−ＶＰ１６
Ｃ７−Ｒ//Ｃ７−Ｅ−ＶＰ１６の低い基底活性と、Ｃ７−ＲＶＰ１６//Ｃ７−Ｅ−ＶＰ１６で見られるような高い活性を組み合わせるためにＲＸＲ上の活性ドメインを除くが、ＥcＲ上の亜鉛フィンガータンパク質を保持させた。６×２Ｃ７レポーターに対してこの配置において、非常に低い基底活性を有する５倍の活性化が観察された。より強力なＶＰ６４活性ドメインを用いて同様の構成物も作製した。
【０３１９】
Ｅ２Ｃ−ＥＲ//ＥＲ−ＶＰ６４
このヘテロ二量体構成物は、erbＢ−２プロモーターの各比６.７／６０および２.２／６０で５.３倍のタモキシフェン依存性活性を示した。
【０３２０】
Ｅ２Ｃ−ＥＲ//ＥＲ−ＫＲＡＢ
このヘテロ二量体構成物は、１／１０の比で２.９倍のerbＢ−２プロモーターのタモキシフェン依存性抑制を示した。
【０３２１】
Ｂ３Ｂ／Ｂ３Ｃ２−ＥＲ//ＥＲ−ＶＰ６４
この６フィンガーヘテロ二量体構成物は、β３プロモーターの４.５−７.８倍のタモキシフェン依存性活性を示した。
【０３２２】
実施例１３
Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢのアデノウイルス介在送達を用いる内在性ＥrbＢ−２遺伝子発現の制御
アデノウイルスベクターを非常に高い力価で生成することができた。これは遺伝子治療用途で有用である。動物モデルにおけるＥ２Ｃ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質の使用を説明するために、アデノウイルスをコードするＥ２Ｃ−ＫＲＡＢ（および、コントロールとして２Ｃ７−ＫＲＡＢ）を生成した。アデノウイルス生成のための方法は、詳細に記載する、例えば、He et al.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.95:2509-2514。
【０３２３】
要約すると、亜鉛フィンガーコード領域を、ＢamＨ１−Ｎot１分解によってpＭＸ／Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢおよびpＭＸ／２Ｃ７−ＫＲＡＢバイシストロンレトロプラスミドから切除した。次いで、得られたフラグメントを、pＡdＴrack−ＣＭＶのＢamＨ１−Ｎot１部位でサブクローニングした。Ｐme１を用いて線形化した後、pＡdＴrackプラスミドＢＪ５１８３細胞中に環状pＡdＥasy-１と共電気穿孔を行った。この細菌株は、recＡではないので、２つのプラスミド間の相同的組替えとなる。次いで、電気穿孔をした細胞をＫanプレート上で培養した。組替えたプラスミドのみが、カナマイシン耐性を共に提供する。そのため、このマーカーはpＡdＴrack上でのみ存在した。バックグラウンド（pＡdＴrackプラスミドの不完全な線形化による）から異なる組替え体をスクリーニングした後、該線形アデノウイルスベクターゲノムを、組替え体pＡdＥasy/Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢおよびpＡdＥasy/２Ｃ７−ＫＲＡＢプラスミドから、Ｐac１分解によって解離した。
【０３２４】
次いで、線状化ベクターを２９３細胞にトランスフェクトした。この細胞系は、該ベクターから欠失し、複製に必要なＡdenoＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を生成した。
【０３２５】
実施例１４
リガンド依存性誘導とリガンド選択性を改良するエストロゲン受容体リガンド結合ドメインへの修飾
エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン中の１つのアミノ酸変異は、遺伝子活性の、基底およびリガンド依存性レベルに対する有意な効果を持ち得る。例えば、エストロゲン受容体残基４００位でグリシンをバリンに置換することは脱安定化または温度感受性変異として述べられる（White(1997)Adv. Pharmacol. 40:339-367;Ａumais et al.,(1996)J.Biol.Chem.272:12229-12235）。融合タンパク質の特性について、この変異の効果を試験した。アミノ酸を変えた融合タンパク質を構築するための一般方法を以下に記載する。
【０３２６】
融合タンパク質Ｃ７ＬＢＤaおよびＣ７ＬＢＤbの突然変異誘発を、オリゴヌクレオチド介在性直接変異誘発 (Stratagene; Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit) を用いて、 アミノ酸５２１（Ｇ５２１Ｒ−ヒトエストロゲン受容体の命名法）でアルギニンをグリシンに置換するか、アミノ酸４００位（Ｇ４００Ｖ）でバリン残基をグリシンに置換を行った。Ｇ５２１Ｒ突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドの配列は、非コード鎖については、
【表２３】
2009273463.tif 000025
、コード鎖については、
【表２４】
2009273463.tif 000026
であり、上記太線は野生型からの配列における変化を示す。
【０３２７】
Ｇ４００Ｖ突然変異誘発に使用されたオリゴヌクレオチド配列は、コード鎖については、
【表２５】
2009273463.tif 000027
であり、非コード鎖については、
【表２６】
2009273463.tif 000028
であり、上記太線ヌクレオチドは野生型からの配列における変化を示す。
【０３２８】
鋳型を反応あたり１０ng〜５０ngで、１０mＭ ＫＣl、１０mＭ（ＮＨ４)ＳＯ４、２０mＭＴris-ＨＣl(pＨ８.８)、２mＭ ＭgＳＯ４、０.１％ Ｔriton Ｘ−１００、０.１mg／mlＢＳＡ、dＮＴＰ混合物および２.５ＵＰfuＴurboＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ中で各プライマー(１２５ng)と共に添加した。該反応を、Perikin Elmer GeneAmp PCR System 9600サーマル・サイクル上で、はじめに９４℃で３０秒で鋳型を変性させ、次いで９５℃で３０秒間１２サイクル、５５℃で１分間、６８℃で４分間、７２℃で２.５分間で１ラウンドの伸長を行った。ＰＣＲ試料を、１０Ｕ Ｄpnl、１時間３７℃で処置し、変異をおこしていない親の鋳型を分解した。
【０３２９】
ＤＨα５ supercompetent Epicurean Coli(登録商標)XL-１細胞を、Ｄpnl処置したＰＣＲ試料(１μl)と冷Ｆalcon２０５９チューブ中の該細胞(５０μl)とを組み合わせて、氷上で３０分間インキュベーションし、４２℃で４５秒間で熱ショックを与え、２分間氷上で冷却して形質転換した。４２℃に予め加熱したＳＯＣ培地の５００μlのアリコートを、形質転換反応に添加し、振とうしながら１時間３７℃でインキュベートした。該形質転換細胞を、１００μg／mlアンピシリンを含有するＬＢプレート上で培養し、少なくとも１６時間インキュベートした。
【０３３０】
突然変異効率は、β−ガラクトシダーゼ発現プラスミド中のナンセンスコドンをグルタミンに変化させ、ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレートにより明示されるように、β−ガラクトシダーゼの発現を測定することによって測定される。各突然変異につき約３クローンを制限酵素切断用に選び出して鋳型の完全性を調べ、続いて所望の変異を確認するためにコーディングフレーム全体のジデオキシヌクレオチド配列解読法を行った。
【０３３１】
Ｃ７ＬＢＤ（ｓｈｏｒｔ）キメラレギュレーターＡ、ＢおよびＣの、エストロゲン受容体ＬＢＤにＧ４００Ｖ突然変異を含むものおよび含まないものを、６ｘ２Ｃ７ｐＧＬ３Ｌｕｃの発現を誘導する能力について比較した。以前に観察されたように、３つの融合タンパク質の総活性には、Ａ＞Ｂ＞Ｃの関係があった；この関係は、Ｇ４００Ｖ突然変異の有無によらず維持された。基底発現のパターンは、Ｇ４００Ｖ突然変異によって劇的に変化した。Ｇ４００Ｖ突然変異を有する３つのＣ７ＬＢＤレギュレーターの、基底またはリガンド非依存的効果は、ほぼレポータープラスミドのみのレベルまで減少した。結果として、リガンド依存性誘導の倍率は、例えばＣ７ＬＢＤＡに関して１０倍ないし４２０倍というように、劇的に増加した。
【０３３２】
エストロゲン受容体リガンド結合ドメインを含む融合タンパク質で、天然のアゴニストのエストロゲン（Ｅ２）だけでなく、４−ＯＨタモキシフェンなどの合成アンチ−エストロゲンの使用によっても活性が誘導され得ることが以前から観察されてきた（Littlewood et. al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:1686-1690; Danielian et al. (1993) Mol. Endocrinol. 7:234-240）。Ｃ７ＬＢＤ融合物が４−ＯＨタモキシフェンに誘導される能力を明らかにした。
【０３３３】
実験の結果は、３つの組換え分子構成物Ｃ７ＬＢＤＡＳ、Ｃ７ＬＢＤＢＳ、Ｃ７ＬＢＤＣＳのＧ４００Ｖ突然変異を含むものおよび含まないものを用いて、エストロゲン（Ｅ２）および４−ＯＨヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）に応答する、Ｈｅｌａ細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子構成物のリガンド依存性制御を示した。特に、その結果は、Ｃ７ＬＢＤのＢおよびＣが、１００ｎＭのタモキシフェンまたはエストロゲンによって同等にかなり誘導されることを示した。Ｃ７ＬＢＤＡについては、タモキシフェンはエストロゲンそのものよりも約２倍高く活性であると判明した。
【０３３４】
エストロゲン受容体ＬＢＤ中の他の興味深い突然変異は、ヒトエストロゲン受容体のアミノ酸５２１におけるグリシンからアルギニンへの置換である。この突然変異は、マウスエストロゲン受容体ホモログでも、等価の部位である残基５２５で記述されてきた。この突然変異は、突然変異したＬＢＤのエストロゲン応答を無くすが、アンチ−エストロゲンであるタモキシフェンの結合は維持する（Littlewood et. al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:1686-1690; Danielian et al. (1993) Mol. Endocrinol. 7:234-240）。Ｃ７ＬＢＤレギュレーターの活性に与えるＧ５２１Ｒ突然変異の影響を調べた。Ｃ７ＬＢＤＢをＣ７ＬＢＤＢ（Ｇ４００Ｖ）およびＣ７ＬＢＤＢ（Ｇ５２１Ｒ）と比較した。
【０３３５】
実験の結果は、３つの組換え分子構成物：Ｃ７ＬＢＤＢＳ、Ｇ５２１Ｒ突然変異を有するＣ７ＬＢＤＢＳおよびＧ４００Ｖ突然変異を有するＣ７ＬＢＤＢＳを用いて、エストロゲン（Ｅ２）および４−ＯＨヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）に応答する、Ｈｅｌａ細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子構成物のリガンド依存性制御を示した。Ｇ４００Ｖ突然変異で観察された影響と同様に、Ｇ５２１Ｒは、融合タンパク質レギュレーターの基底活性を有意に減少させた。しかし、最も重要なことは、今回はＣ７ＬＢＤＢ（Ｇ５２１Ｒ）レギュレーターは１００ｎＭのタモキシフェンによって完全に活性化されたが、エストロゲンに応答して完全に不活性であったことである。Ｇ４００Ｖ突然変異体は、エストロゲンとタモキシフェンによって依然として完全に活性化されたことに留意されたい。
【０３３６】
Ｇ５２１Ｒ突然変異の影響をさらに調べるために、一連の異なるエストロゲン化合物を、Ｃ７ＬＢＤレギュレーターを誘導する能力について評価した。４つの化合物、すなわち、エストロゲンアゴニストであるエストロゲン（Ｅ２）およびジエチル−スチルベストロール（ＤＥＳ）、非ステロイド系アンチ−エストロゲンまたはいわゆるＳＥＲＭＳ（選択的エストロゲン受容体モジュレーター）である４−ＯＨタモキシフェンおよびラロキシフェン（raloxifen、Ｒａｌ）、について、１００ｎＭの活性を比較した。
【０３３７】
実験では、Ｇ５２１Ｒ突然変異を有するＣ７ＬＢＤＢＳおよびＧ４００Ｖ突然変異を有するＣ７ＬＢＤＢＳの組換え分子構成物を用いて、エストロゲン（Ｅ２）ジエチル−スチルベストロール（ＤＥＳ）、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）およびラロキシフェン（Ｒａｌｏｘ）に応答する、ルシフェラーゼレポーター遺伝子構成物のリガンド依存性制御を、Ｈｅｐ３ＢＬ肝細胞で調べた。結果は、Ｇ５２１Ｒ突然変異は選択的にアゴニストへの応答を排除するが、非ステロイド系合成リガンドであるタモキシフェンおよびラロキシフェンはなお完全に活性であることを示した。
【０３３８】
実施例１５
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質による導入遺伝子の制御における、最小プロモーター構成の影響
レポーターアッセイに用いられる最小プロモーターの構成は、遺伝子発現のレベルに劇的な影響を与え得る。同様に、天然のステロイド受容体の活性は、異なる標的遺伝子において、それらのプロモーター構成に応じて変化する。本明細書でＴＡＴＡと呼ぶｃ−ｆｏｓ遺伝子由来の最小ＴＡＴＡボックスプロモーター断片の上流に６ｘ２Ｃ７結合部位を有するレポーター構成物を、制御のレベルに与える影響を示すために構築した。Ｇ４００ＶまたはＧ５２１Ｒ突然変異を含まないか、または含む、Ｃ７ＬＢＤのＡおよびＢの融合物を比較した。ｐＧＬ３ ＳＶ４０プロモーターで以前に観察されたように、Ｇ４００ＶおよびＧ５２１Ｒ突然変異によって、これらのキメラの基底活性は、これらの突然変異を有さないものと比較して有意に減少した。さらに、Ｇ５２１Ｒ突然変異は、タモキシフェンによって選択的に活性化された。この弱い最小プロモーターにおいて、エストロゲンはほんの弱い誘導因子でしかなく、一方４−ＯＨ−タモキシフェンは有意に優れていた。この影響は、Ｃ７ＬＢＤＡで、Ｂに比較してより明らかである；キメラＣ７ＬＤＢＡ（Ｇ４００Ｖ）において、タモキシフェンはエストロゲンよりも少なくとも１０倍は活性が高かった。
【０３３９】
もっと強いｐＧＬ３ ＳＶ４０プロモーターまたはもっと弱いｃ−ｆｏｓ ＴＡＴＡボックスプロモーターを含むレポーター構成物における、Ｃ７ＬＢＤキメラの相対的な活性を直接比較するために、ある実験を行った。
【０３４０】
実験の結果は、Ｇ４００Ｖ突然変異を有するＣ７ＬＢＤＡＳおよびＣ７ＬＢＤＢＳ並びにＧ５２１Ｒ突然変異を有するＣ７ＬＢＤＢＳの組換え分子構成物を用いて、エストロゲン（Ｅ２）および４‐ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）に応答する、最小ＴＡＴＡプロモーターから発現したルシフェラーゼレポーター遺伝子構成物のＨｅｐ３ＢＬ肝細胞におけるリガンド依存性制御を示す。３つの重要な観察がなされた：１）誘導される活性の絶対レベルは、ＴＡＴＡプロモーターよりもＳＶ４０で約１０倍高い。２）融合物の基底活性も、ＴＡＴＡプロモーターよりもＳＶ４０で約１０倍高い。３）両プロモーターがタモキシフェンによって高倍率の誘導（ＳＶ４０で４９２ｘ、ＴＡＴＡで１３２ｘ）を示す一方、エストロゲンはＳＶ４０で強い誘導因子であるがＴＡＴＡプロモーターではそうではない（１７７ｘ対１４ｘ）。これらの結果は、これらの融合タンパク質を使用している遺伝子の制御システムを、適切な最小プロモーターを選択することにより「変える」ことができることを示す。
【０３４１】
異なるＣ２Ｈ２ ＤＮＡ結合ドメインの標的選択性
ｐＧＬ３Ｌｕｃのプロモーター領域の上流に挿入したＣ７結合部位（ＧＣＧ ＴＧＧ ＧＣＧ）またはＥ２Ｃ結合部位（ＧＧＧ ＧＣＣ ＧＧＡ ｇ）の３コピーのダイレクト・リピートを有するレポーター構成物を、２つの異なるＺＦＰ−ＬＢＤＢｓ融合タンパク質レギュレーターの標的特異性を評価するために使用した。Ｃ７ＤＮＡ結合ドメインまたはＥ２Ｃ結合ドメインのどちらかを含むＺＦＰ−ＬＢＤＢｓｈｏｒｔの融合物を構築し、２つの異なるレポーター構成物で試験した。実験は、組換え分子構成物Ｃ７ＬＢＤＢＳおよびＥ２ＣＬＢＤＢＳを用いて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子構成物のプロモーターの上流に挿入したＣ７またはＥ２Ｃ結合部位の３回ダイレクト・リピートが、Ｈｅｌａ細胞におけるエストロゲン依存性遺伝子発現に与える影響を示すように計画された。エストロゲン依存性誘導は、キメラのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）がレポーターの結合部位に適合する場合にのみ起こった。Ｅ２ＣＬＢＤキメラは、３ｘ２Ｃ７Ｌｕｃレポーターでルシフェラーゼ活性の増加を示さず、３ｘＥ２ＣレポーターでのＣ７ＬＢＤで、逆もまた真であった。
【０３４２】
融合タンパク質レギュレーターは、ＤＮＡに結合するために「応答エレメント」中に片割れの部位が２個存在することに絶対的に依存することが、ＤＮＡ結合実験により以前に確定された。遺伝子活性化に最適な結合部位の方向とスペーシングを決定するために、一連の異なるレポーター構成物を集めた。導入遺伝子の誘導に最適な、標的ＤＮＡのＣ２Ｈ２結合部位のスペーシングと方向を決定するために、Ｃ７ＬＢＤＢＳをＨｅｌａ細胞にトランスフェクションし、一連のレポーター構成物で、基底の活性およびタモキシフェンに誘導される活性をアッセイした。
【０３４３】
一連の異なるレポーター構成物を、導入遺伝子の誘導に最適な標的ＤＮＡのＣ２Ｈ２結合部位のスペーシングおよび方向を決定するために集め、Ｃ７ＬＢＤＢＳをＨｅｌａ細胞にトランスフェクションし、上記の一連のレポーター構成物で、基底の活性およびタモキシフェンに誘導される活性をアッセイした。レポーター構成物は、様々な結合部位を含有する２本鎖オリゴヌクレオチドをｐＧＬ３Ｌｕｃレポーターのマルチクローニング部位にクローニングすることによって構築した。２つのＣ７結合部位のダイレクト、インバート（回文的）およびエバート・リピートからなる「応答エレメント」を比較した；スペーシングが５ｂｐであるコントロールの６ｘ２Ｃ７以外では、各応答エレメントを２ｂｐで隔てた。単一のＣ７部位をダイレクトに繰り返した数個の配列アレイを、様々なスペーシングで試験した。データは、ダイレクト・リピートおよびエバート・リピートが、回文的結合部位よりも好適であることを示す。さらに、それぞれ２ｂｐで隔てられた６つのＣ７部位は、個別のＣ７結合部位を半数しか含んでいないにもかかわらず、６ｘ２Ｃ７のコントロールのエレメントに匹敵した。
【０３４４】
実施例１６
６つのＣ２Ｈ２亜鉛フィンガーのアレイを含むＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質レギュレーターの構築と評価
１８ｂｐまでのＤＮＡに結合する亜鉛フィンガーのアレイからなるＤＮＡ結合ドメインが、正常なエストロゲン受容体ＤＢＤを置換し得るか否かを決定するために、実験を行った。９ｂｐに結合する３つのフィンガーのアレイを含む以前の構成物は、各受容体単量体につき６ｂｐを結合する野生型エストロゲン受容体リガンド結合ドメインの、かなり伝統的な置換物である。大きいＤＮＡ結合ドメインがＬＢＤ断片に融合されると、立体構造的妨害のために、これらの領域がＬＢＤ二量体化ドメインを介する二量体化を妨げる可能性が有る。しかし、６つのフィンガーのアレイは、既に高いＤＮＡ特異性と親和性をもたらしたので、これらの融合タンパク質のＤＮＡ結合と活性に、二量体化は不要であり得る。融合タンパク質レギュレーターを、２Ｃ７の６つのフィンガーのアレイを上記の３つのＬＢＤ断片Ａ、ＢおよびＣに融合させることによって調製した。図１５は、２Ｃ７ＬＢＤｓｈｏｒｔＡ、ＢおよびＣの集合に必要な、クローニングの段階の概要と説明である。
【０３４５】
ＤＮＡへのタンパク質結合を、ゲルシフトアッセイで分析した。電気泳動の実験では、２Ｃ７組換え分子構成物を使用し、６つの２Ｃ７結合部位を含むＤＮＡプローブへの結合について、ネイティブＰＡＧＥおよびＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を行った。この実験では、２Ｃ７ＶＰ１６をコントロールとして使用し、Ｐ３２標識のＤＮＡプローブは、６Ｘ２Ｃ７ｐＧＬ３Ｌｕｃから切り出した６ｘ２Ｃ７断片であった。十分な２Ｃ７ＶＰタンパク質を加えると、３つの異なるゲルシフトされた産物が得られた。２Ｃ７ＬＢＤ Ａ、ＢおよびＣについて、同様のレベルのタンパク質を加えると、ただ１つの弱いバンドが観察された。２Ｃ７ＶＰ１６コントロールの１および２コピーが結合したバンドと比較すると、２Ｃ７ＬＢＤバンドの位置は、それがモノマーとして結合していることを示唆している。さらに、結合レベルが２Ｃ７ＶＰ１６コントロールに比べて弱いことは、２Ｃ７ドメインのＤＮＡ結合親和性が、ＬＢＤ融合タンパク質に関しては有意に低下していることを示唆する。インビトロで発現したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結果は、等量のタンパク質が発現されたこと、およびＡ、ＢおよびＣ形態のＬＢＤに予想された相対的なサイズの増加を示した。
【０３４６】
２Ｃ７ＬＢＤのＡ、ＢおよびＣ融合タンパク質キメラレギュレーターが６ｘ２Ｃ７Ｌｕｃレポーター遺伝子の発現を活性化する能力を、Ｃ７ＬＢＤの実験で前記したように、本質的に評価した。実験の結果は、３つの組換え分子構成物、２Ｃ７ＬＢＤＡＳ（配列番号１）、２Ｃ７ＬＢＤＢＳ（配列番号２）、２Ｃ７ＬＢＤＣＳ（配列番号３）およびポジティブコントロール２Ｃ７−Ｖｐ１６を用いて、Ｃｏｓ細胞における２Ｃ７ ＳＶ４０ルシフェラーゼレポーター遺伝子構成物のリガンド依存性制御を示す。結果は、Ｃ７ＬＢＤをＣｏｓ細胞で評価したデータと同様であった。２Ｃ７ＬＢＤレギュレーターは、基底の約２倍のエストロゲン依存性誘導をもたらし、総活性化活性およびレポータープラスミドのみと比較して増加した基底活性の両方に関して、２Ｃ７ＬＢＤＡ＞Ｂ＞Ｃであった。さらなる構成物のマップを、図１６‐図２２に記載する。
【０３４７】
実施例１７
さらなるレポーター導入遺伝子構成物の構築と評価
誘導可能プロモーターを、３フィンガータンパク質Ｎ１の結合部位をベースとして構築した。該プロモーターは、３ｂｐで隔てられたＮ１部位の５つのダイレクト・リピートを含む；５反復間のスペーシングは６ｂｐである（図２３Ａ）。
【０３４８】
ルシフェラーゼアッセイ。Ｈｅｌａ細胞に、指定された融合タンパク質をコードするプラスミド、およびＮ１レポーター構成物を共にトランスフェクションした。２４時間後、該細胞を１０ｎＭ ＲＵ４８６（図２３Ｂ）または１００ｎＭタモキシフェン（図２３Ｃ）でそれぞれ処理した。トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出液のルシフェラーゼ活性をアッセイした。
【０３４９】
別の誘導可能プロモーターは、３フィンガータンパク質Ｂ３をベースとする。該プロモーターは、３ｂｐで隔てられたＢ３部位の５つのダイレクト・リピートを含む；５反復間のスペーシングは６ｂｐである（図２４Ａ）。
【０３５０】
ルシフェラーゼアッセイ。Ｈｅｌａ細胞に、指定された融合タンパク質をコードするプラスミド、およびＢ３レポーター構成物を共にトランスフェクションした。２４時間後、該細胞を１０ｎＭ ＲＵ４８６（図２４Ｂ）または１００ｎＭタモキシフェン（図２４Ｃ）でそれぞれ処理した。トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出液のルシフェラーゼ活性をアッセイした。
【０３５１】
実施例１８
リガンド存在下でのヘテロダイマー形成
図２５は、ＲＵ４８６に誘導される機能的ＶＰ６４−Ｃ７−ＰＲ／ＶＰ６４−ＣＦ２−ＰＲヘテロダイマーの形成を示すルシフェラーゼアッセイの結果を表わす。Ｈｅｌａ細胞に、対応するエフェクタープラスミドおよびＴＡＴＡレポータープラスミドを共にトランスフェクションした（Ｃ７／ＣＦ２−ｄｒ０、５'のＣ７部位からＣＦ２部位、ダイレクト「リピート」、スペーシングなし；Ｃ７／Ｃ７−ｄｒ０、ダイレクト・リピート、スペーシングなし）。２４時間後、該細胞を１０ｎＭ ＲＵ４８６で処理した。トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出液のルシフェラーゼ活性をアッセイした。
【０３５２】
実施例１９
アデノウイルスベクターでのＣｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガーＤＢＤ−ＥＲ ＬＢＤレギュレーターの構築と評価
エクスビボ（ex vivo）またはインビボのどちらでも、哺乳動物細胞に制御システムの２つの構成要素を効果的に送達するために、一連のアデノウイルスベクターを構築した。これらのベクターは、前初期ＣＭＶプロモーターに連結したＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質レギュレーターか、または前記のようにＣ７結合部位の６ｘ２Ｃ７配列アレイおよび、ＳＶ４０由来最小プロモーターもしくはｃ−ｆｏｓＴＡＴＡに連結された制御可能な導入遺伝子のどちらかを含有する。該融合タンパク質レギュレーターベクターおよび制御可能な導入遺伝子ベクターは、次いで様々な割合で混合され、標準的な方法で細胞または動物に送達される。
【０３５３】
アデノウイルスベクターの構築は日常的かつ一般的であり、その方法には３つの主な段階がある：第１に、ウイルスレフトＩＴＲ、ウイルスパッケージングシグナル、プロモーターエレメント、プロモーターエレメントに連結された目的の導入遺伝子、それに続くポリアデニル化配列、および組換えに必要なウイルス性または非ウイルス性の数個の付加的ＤＮＡ配列を含有するシャトルプラスミドを調製する。第２に、このレフトエンドシャトルプラスミドを、ウイルスゲノムの残りの部分（すなわち、ベクターのライトエンド）と共に宿主細胞にトランスフェクションし、ＤＮＡ組換えを介して結合させ、完全なベクターゲノムにする。この組換えの段階は、２つのベクターの片割れ間の配列相同性に起因してもよいし、Ｃｒｅおよびその対応するＬｏｘＰ組換え配列などの部位特異的リコンビナーゼを使って補助されてもよい。最後に、新しく形成されたウイルスが増幅され、そして一連の段階で精製される。これらのベクターの構築の詳細を、以下に略述する。
【０３５４】
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質レギュレーター用のレフトエンドシャトルプラスミド構築
レフトウイルスＩＴＲ、ＣＭＶ前初期プロモーターおよびＺＦＰ−ＬＢＤレギュレーターを含むシャトルプラスミドを、プラスミドｐＡｖＣＶＩｘ中で調製した（図２６）。このベクターはポリアデニル化配列のすぐ下流にｌｏｘＰ組換え部位を有することに留意されたい。キメラレギュレーターＣ７ＬＢＤ Ａｓ（Ｇ５２１Ｒ）、Ｃ７ＬＢＤ Ｂｓ（Ｇ５２１Ｒ）およびＣ７ＬＢＤ Ｂｓ（Ｇ４００Ｖ）の完全なリーディングフレームをコードするＤＮＡを、適切なｐＣＤＮＡ構成物から、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩでの切断によって切り出した（ＬＢＤ ＡｓおよびＬＢＤ Ｂｓ構成物には、それぞれ図４および５を参照のこと）。制限部位突出を埋めるためにＺＦＰ−ＬＢＤのＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗで修飾し、平滑末端をｐＡｖＣｖｌｘのｂｐ１３９３のＥｃｏＲＶ部位にライゲーションして、ｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ Ａｓ（Ｇ５２１Ｒ）、ｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ Ｂｓ（Ｇ５２１Ｒ）およびｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ Ｂｓ（Ｇ４００Ｖ）を生成させた。
【０３５５】
制御可能な導入遺伝子カセットを含むレフトエンドシャトルプラスミドの構築
２つの制御可能な導入遺伝子カセットを調製した。一方はｐＧＬ３ ６ｘ２Ｃ７−Ｌｕｃ（実施例５に記載）のように、ルシフェラーゼ導入遺伝子に連結された６ｘ２Ｃ７結合部位とＳＶ４０最小プロモーター断片を含有した。第２のベクターは、アミノ末端の分泌シグナルと融合したマウスのエンドスタチンをコードするｃＤＮＡと連結した６ｘ２Ｃ７結合部位およびｃ−ｆｏｓＴＡＴＡ最小プロモーターを含有した。この融合タンパク質の完全な配列は、配列番号７０および７１に列挙されている。
【０３５６】
これらのベクターを、２段階で構築した。第１に、ＣＭＶプロモーターと、ｐＡｖＣｖｌｘのトリパーティータ（tri-partite）リーダー配列（ＴＰＬ）（図２６）を含有する断片を、ｂｐ４７３および１３７５でそれぞれ切断するＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩで切断して切り出した。制限部位突出をＫｌｅｎｏｗで埋めた。前記のレポータープラスミドの６ｘ２Ｃ７−ＳＶ４０または６ｘ２Ｃ７−ＴＡＴＡのエンハンサー／プロモーター領域を含む、平滑末端にされたＤＮＡ断片を、このバックボーンにライゲーションし、ｐＡＶ−６ｘ２Ｃ７ＳＶ４０およびｐＡＶ−６ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡシャトルプラスミドを作り出した。次に、ルシフェラーゼまたはマウスエンドスタチン導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適切なシャトルプラスミドのＥｃｏＲＶ部位にライゲーションし、ｐＡＶ６ｘ２Ｃ７ＳＶ４０−Ｌｕｃ（ｌｏｘ）またはｐＡＶ６ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡ−ｍＥｎｄｏ（ｌｏｘ）を作り出した。
【０３５７】
ライトエンドベクタープラスミドの構築
ベクター構築を完了するためには、ウイルスベクターゲノムの残りの部分を含むプラスミドが必要である。図２７に示すｐＳＱ３と称するこのプラスミドは、ｐＢＲ３２２由来のバックボーン、アンピシリン耐性遺伝子およびアデノウイルス血清型５ゲノムを含む。以前に記述されたように、アデノウイルス血清型５ゲノムはＡｄ５のｂｐ３３２９から始まり、ライトＩＴＲを含み、Ｅ２ａおよびＥ３に欠失がある（Gorziglia et al. (1996) J. Virol. 70:4173-4178）。さらに、このプラスミドには２つの重要な特性がある。Ａｄ５配列のすぐ上流のＢａｍＨＩ部位（ｂｐ３１５６９）に挿入されたｌｏｘＰ部位と、ウイルスの５'ＩＴＲの末端にあるＣｌａＩ部位である。このＣｌａＩ部位は、ベクター構築中にプラスミドを線状にしてライトＩＴＲを露出させるために使用される。
【０３５８】
ベクターの組立てと増殖
融合タンパク質レギュレーターＡｖ３ＣＶ−Ｃ７ＬＢＤＡＳ（Ｇ５２１Ｒ）、Ａｖ３ＣＶ−Ｃ７ＬＢＤＢＳ（Ｇ５２１Ｒ）およびＡｖ３ＣＶ−Ｃ７ＬＢＤＢＳ（Ｇ４００Ｖ）をコードする３つのアデノウイルスベクターと、制御可能な導入遺伝子Ａｖ３ＳＶ−ＬＵＣおよびＡｖ３ＴＡＴＡ−Ｅｎｄｏを含む２つのベクターを構築した。各ベクターは、標準的な手法で生成した。概説すると、各ベクター構成物用に、３種のプラスミド、即ち、ｐＳＱ３（事前にＣｌａＩで切断）、適するレフトエンドシャトルプラスミド（例えば、ｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ Ａｓ（Ｇ５２１Ｒ）、またはｐＡｖ６Ｘ２Ｃ７ＳＶ４０−Ｌｕｃ（ｌｏｘ）、事前にＮｏｔＩおよびＡｆｌＩＩで切断）、およびＣｒｅリコンビナーゼ用の発現プラスミドであるｐＣＭＶ−ＣＲＥを、デキサメタゾンで誘導したＡＥ１‐２ａ細胞に、PromegaのProfection Kitを用いて、重量比３：１：１で共にトランスフェクションした（Gorziglia et al.）。トランスフェクションの約１週間後、細胞を回収し、４サイクルの凍結／融解によって溶解した。生じた細胞溶解物を、デキサメタゾンで誘導した新鮮なＡＥ１‐２ａ細胞に移し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されるまで約１週間培養を続けた。この過程を、塩化セシウム平衡密度遠心分離法でベクターを精製するのに十分な材料が得られるまで、数サイクル繰り返した。一度精製したら、１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中で、５６℃で１５分間ベクターを溶解し、冷やし、２６０ｎｍの波長での吸光度（ＯＤ２６０）を読んで、ベクターを定量した。ＯＤ２６０の示度を、１ＯＤ２６０ユニット＝１．１ｘ１０１２粒子／ｍｌを用いて、ウイルス粒子の濃度に変換した。
【０３５９】
結果
アデノウイルスベクターを用いるインビトロ制御
アデノウイルスベクターによって送達された導入遺伝子が発現を制御する能力を、以下の実験で証明した。Ｈｅｌａ細胞を２つのアデノウイルスベクターの混合物に感染させた。一方のベクターは融合タンパク質レギュレーターのどちらか（Ａｖ３−Ｃ７ＬＢＤ−Ａ（Ｇ５２１Ｒ）またはＡｖ３−Ｃ７ＬＢＤ−Ｂ（Ｇ５２Ｒ））を、他方は６ｘ２Ｃ７ＳＶ４０−ｌｕｃカセットを含む。エフェクターベクターに対する標的ベクターの最適な割合を決定するために、導入遺伝子または標的ベクターの２通りの異なる用量（細胞当り５０または２５０のウイルス粒子）を、３通りの異なる割合のエフェクターベクター（各標的の用量について、細胞当り５０、２５０、７５０粒子）で試験した。ベクター形質導入の２４時間後、細胞を１００ｎＭ４−ＯＨ−タキシフェンで適切に処理した。さらに２４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。Ａｖ３ＣＶ−Ｃ７ＬＢＤ−Ａ（Ｇ５２１Ｒ）ベクターについて、データは、４−ＯＨＴ非存在下でルシフェラーゼ活性が比較的低レベルであること、４−ＯＨＴ依存的誘導が強いこと、そして融合タンパク質レギュレーターベクターをより多く使用するのに伴って、ｌｕｃ活性が用量依存的に増加することを示した。試験したキメラレギュレーターベクターの最大用量（細胞当り７５０粒子）では、細胞当り２５０および５０粒子の標的ベクター用量のとき、基底の４６０ないし５６０倍のタモキシフェン特異的誘導が、それぞれ達成された。
【０３６０】
同じ実験を、キメラレギュレーターのＬＢＤ Ｂ版；Ａｖ３ＣＶ−Ｃ７ＬＢＤ Ｂ（Ｇ５２１Ｒ）を用いて実行した。このベクターでは、誘導倍率と絶対的なルシフェラーゼ活性は、Ａｓベースのレギュレーターで得られたものよりも約２倍低かった。これらの結果は、プラスミドを用いて行われた以前の一過性トランスフェクション実験のすべてと矛盾しない。留意すべきは、Ｃ７ＬＢＤ遺伝子の発現を引き起こすＲＳＶプロモーターを用いて構築されたＡｖ３−キメラレギュレーターベクターの第１世代では、Ａｖ３ＳＶ４０−Ｌｕｃベクターの導入遺伝子の十分なアップレギュレーションが見られなかったことである。明らかに、より弱いＲＳＶプロモーターからの発現レベルは、必要なレベルの融合タンパク質を作成するのに不適切である。
【０３６１】
アデノウイルスベクターを用いるインビボ制御
Ｃ７ＬＢＤレギュレーターがインビボで導入遺伝子の発現を制御する有効性を証明するために、３つの重要な変数を評価するように実験を計画した。変数は、１）Ｇ４００ＶまたはＧ５２１Ｒ突然変異のどちらかを含むレギュレーターの有効性、２）標的およびエフェクターベクターの比率、および３）４−ＯＨＴの用量、である。Ｇ４００ＶおよびＧ５２１Ｒ突然変異は、以下の点で重要である。Ｇ５２１Ｒ突然変異は４−ＯＨＴに選択的に応答し、内在性エストロゲンに影響されないが、最大の活性になるためにＧ４００Ｖ突然変異より約１０倍高い薬剤濃度を必要とする。Ｇ４００Ｖはより低い４−ＯＨＴ用量で活性だが、エストロゲンによる誘導を受けやすく、インビボでより高い基底活性を示し得る。
【０３６２】
動物実験の詳細は以下の通りである。実験１日目に、オスのＣ５７ＢＩ／６マウスに、２ｘ１０１１粒子の総アデノウイルスベクター用量を、尾の静脈注射で与えた。２日目に、血液試料を採取し、５％ＤＭＳＯおよび、タモキシフェン（Sigma ＃Ｔ５６４４８）なし、５０μｇまたは５００μｇのいずれかを含有するヒマワリ油２００μｌを該動物に腹膜内注射した。薬剤投与に続く３日間は毎日、並びに実験８日目および１０日目に血液試料を採取した。実験完了時に、マウスのエンドスタチンレベルをＥＬＩＳＡ（Accucyte Kit, Cytimmune Science, Maryland）で測定した。
実験グループには以下のものが含まれる：
ネガティブコントロール−２ｘ１０１１粒子のＡｖ３Ｎｕｌｌ（導入遺伝子を持たないＡｄベクター）
ポシティブコントロール−２ｘ１０１１粒子のＡｖ３ＲＳＶ−ｍＥｎｄｏ（ＲＳＶプロモーターから構成的にエンドスタチンを発現する）。
１：１Ａｓ５２１−１ｘ１０１１粒子のＡｖ３ＴＡＴＡ−ｍＥｎｄｏおよび１ｘ１０１１粒子のＡｖ３Ｃｖ−Ｃ７ＬＢＤＡｓ（Ｇ５２１Ｒ）を与えられた；無処理（基底）または＋５０μｇタモキシフェン。
１：１Ｂｓ４００−１ｘ１０１１粒子のＡｖ３ＴＡＴＡ−ｍＥｎｄｏおよび１ｘ１０１１粒子のＡｖ３Ｃｖ−Ｃ７ＬＢＤＢｓ（Ｇ４００Ｖ）を与えられた；無処理（基底）または＋５０μｇタモキシフェン。
さらに、グループ５および６は、グループ３および４と同様であったが、エフェクターに対する標的の割合を１：３にするために、０．５ｘ１０１１個のＡｖ３ＴＡＴＡ−ｍＥｎｄｏベクターおよび１．５ｘ１０１１個のＣ７ＬＢＤレギュレーターベクターを動物に与えた。グループ３−６は、薬剤無し、５０μｇおよび５００μｇタモキシフェン処理のサブグループをれぞれ含んだ。
【０３６３】
結果は、２日目の５０μｇタモキシフェン投与に続く、マウスエンドスタチンの劇的な誘導を示した。最高レベルの誘導は、薬剤投与直後の日である３日目に観察された。タモキシフェン無しのグループで３日目に観察された基底レベルと比較して、Ｃ７ＬＢＤＡｓ（Ｇ５２１Ｒ）およびＣ７ＬＢＤＢｓ（Ｇ４００Ｖ）レギュレーターグループでは、約１７倍の誘導倍率と、約１５００ｎｇ／ｍｌの絶対的な発現レベルが見られた。この実験では、無処理マウス群の内在性マウスエンドスタチンレベルは２０±７ｎｇ／ｍｌであった。薬剤に誘導されたエンドスタチン発現は、薬剤投与後３日目である実験５日目までに急速に減少した。このことはおそらく、タモキシフェンのクリアランスと、エンドスタチンタンパク質の生物学的半減期によるものである。対照的に、Ａｖ３ＲＳＶ−ｍＥｎｄｏ処理群での発現は、１５日目まで２００ｎｇ／ｍｌで持続した。エフェクターに対する標的の比が１：３のグループでは、タモキシフェンに誘導される発現は６００−９００ｎｇ／ｍｌに達し、これは比１：１の群の約１／２のレベルであった。この結果は、融合タンパク質をコードするベクターではなく、導入遺伝子を含むベクターが、インビボで絶対的なタンパク質発現を制限していることを示す。さらに、５００μｇタモキシフェンで処理した動物でのエンドスタチン発現は、ほんの５０μｇで処理した動物と同等であった。このことは、低いほうのタモキシフェン用量が、Ａｓ（Ｇ５２１Ｒ）およびＢｓ（Ｇ４００Ｖ）レギュレーターを完全に活性化するのに十分であることを示している。最後に、Ａｓ（Ｇ５２１Ｒ）およびＢｓ（Ｇ４００Ｖ）グループで観察されたエンドスタチンの基底レベルが同等に低いことによって、Ｃ５７ＢＩ／６マウスの内在性エストロゲンレベルが、エストロゲン応答性のＢｓ（Ｇ４００Ｖ）レギュレーターを誘導するのに十分ではないことが示唆される。３−５日目に観察された基底のエンドスタチンレベルの上昇は、アデノウイルスベクターの投与に起因する非特異的効果であると考えられる。なぜなら、Ａｖ３Ｎｕｌｌベクターにも、Ａｖ３ＴＡＴＡ−ｍＥｎｄｏ含有群と同様の効果があるからである。
【０３６４】
結論
この実施例で示されたインビトロおよびインビボの結果は、ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質が、アデノウイルスベクターによって効果的に送達され得ること、そして動物で導入遺伝子の高レベルな薬剤依存的制御を引き起こすのに十分な量で発現され得ることを証明している。さらに、融合タンパク質が同じ細胞内で発現されたときでさえ、アデノウイルスベクターで試験した６ｘ２Ｃ７最小プロモーター構成物からの発現の基底レベルが比較的低いことが、データに示された。従って、該システムは高度に薬剤依存的であり、ベクターによって送達された導入遺伝子の実質的な制御を可能にしている。合わせて考えると、これらのデータは、遺伝子治療の応用にこのシステムが有効であることを証明している。
【０３６５】
実施例２０
レンチウイルスベクターでのＣｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガーＤＢＤ‐ＥＲＬＢＤレギュレーターの構築と評価
組込みベクターシステムでの制御された遺伝子発現を証明するために、実施例１９に記載したアデノウイルスベクターを用いる制御システムを用いて、一連のレンチウイルスベクターを開発した。これらのベクターは、前初期ＣＭＶプロモーターに連結したＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質か、またはＣ７結合部位の６ｘ２Ｃ７配列アレイおよび、ＳＶ４０由来の最小プロモーターまたはＣ−ｆｏｓＴＡＴＡのどちらかに連結した制御可能な導入遺伝子（ｅＧＦＰまたはルシフェラーゼ）を含有した。融合タンパク質をコードするベクターと制御可能な導入遺伝子ベクターを、今度はレンチウイルスベクター上清を生成するのに使用できる。該上清を、安定に形質導入されたヒト細胞に単一または並行で使用できる。組込みベクターを含む安定な細胞株を、次いで適切な活性化する薬剤（例えば、４−ＯＨ−タモキシフェン）で誘導し、薬剤の存在下および非存在下での遺伝子発現を、誘導倍率として計測することができる。
【０３６６】
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質または制御可能な導入遺伝子をコードするレンチウイルスベクターの構築
レンチウイルスベクターとベクター上清の生成には、３つの主な段階がある：
第１に、転写、パッケージ、逆転写および組込み用のウイルスの全シス−エレメントを含むシャトルベクターのバックボーンプラスミドに、目的の遺伝子または領域を挿入する。第２に、レンチウイルスベクターのシャトルプラスミドを、パッケージの機能（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をもたらすプラスミドと共に、ヒト２９３細胞にトランスフェクションする。典型的には、１０μｇのベクタープラスミド、１０μｇのパッケージングプラスミドおよび１μｇのエンベローププラスミド（水疱性口内炎ウイルスＧエンベロープ）がトランスフェクションに含まれ、Profection Calcium Phosphateトランスフェクションキットを使用する。第３に、レンチウイルスベクターを含む培養物の上清を回収し（トランスフェクション後２４から４８時間の間に）、未処理のヒト標的細胞に形質導入するために用いる。
【０３６７】
ＨＩＶ−１ベースのベクターの構築
内部にＣＭＶプロモーターを有するＨＩＶ−１ベースのベクターシステムを、感染性のＨＩＶ−１ＩＩＩＢプロウイルスｃＤＮＡ（ｐＨＩＶ−ＩＩＩＢ）から構築した。慢性的にＨＩＶ−１ＩＩＩＢに感染したＨ−９細胞から単離したＤＮＡからのＰＣＲによって、感染性プロウイルスｃＤＮＡを生成させた。ｐＨＩＶ−ＩＩＩＢのｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ配列を、ＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片の切断と切り出しによって除去した。ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ配列と置き換えたものは、唯一のマルチクローニング部位を含むＰｓｔＩ／Ｋｐｎポリリンカーであり、中間ベクターｐ２ＸＬＴＲを形成させた。正しいベクターＲＮＡプロセッシングに必要なＨＩＶＩＩＩＢ由来のＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を、ｐ２ＸＴＲの切除されたｇａｇ配列の下流に挿入し、ｐＨＩＶｅｃ構成物を形成させた。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clonthch, Palo Alto, CA）由来のＡｓｅｌ−ＸｂａＩ ＣＭＶ−ｅＧＦＰレポーター断片を、ｐＨＩＶｅｃのＮｄｅＩ−Ｘｂａ部位にクローニングし、ｐＨＩＶＣＭＶＧＦＰを生成させた。ＫｐｎＩ切断および再ライゲーションによってｅＧＦＰを除去して、ｐＨＩＶＣＭＶ−Ｘを生成させた。
【０３６８】
ｐＨＩＶＣＭＶ−Ｃ７ＬＢＤ／Ａ（Ｇ５２１Ｒ）の構築
Ｃ７ＬＢＤＡＳをＮｏｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで埋め、ＥｃｏＲＩ部位で切断して、ＡＳ５２１Ｒ（Ｃ７ＬＢＤ／Ａ（Ｇ５２１Ｒ））をコードする断片を得、これをｐＨＩＶＣＭＶ−ＸのＣＭＶプロモーターの下流でＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ制限部位にクローニングした。誘導のコントロールとして、構成的トランスアクチベーターおよびＤＢＤのキメラを含むＨＩＶベクターであるｐＨＩＶＣＭＶ−Ｃ７ＶＰ１６を生成させた。Ｃ７ＶＰ１６をコードする断片を含むｐＣＤＮＡ３−Ｃ７ＶＰ１６由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ制限断片を、ｐＨＩＶｅｃＣＭＶ−ＸのＳｍａ部位でＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。
【０３６９】
ｐＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖおよびｐＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡルシフェラーゼベクターの構築
６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡルシフェラーゼ断片を含むＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ制限断片を、ｐＴＡＴＡ６Ｘ２ＣＬｕｃから単離し、ＳｐｅＩ‐ＸｂａＩ制限部位でＲＲＥの下流にクローニングした。ｐＧＬ３−６Ｘ２ＣＳｖＬｕｃから６Ｘ２Ｃ７Ｓｖルシフェラーゼ断片を含むＭｌｕＩ−ＢｓｔＢＩ制限断片を単離し、ＳｐｅＩ‐ＸｂａＩ制限部位でＲＲＥの下流にクローニングした。
【０３７０】
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質および制御可能なレンチウイルスベクターの評価
誘導可能レンチウイルスベクターによるＨｅｌａ細胞の形質導入
やや密集したＨｅｌａ細胞を、ＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｃまたはＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡＬｕｃベクターの上清で２４時間形質導入し、続いてＨＩＶＡＳ５２１Ｒレンチウイルスベクター上清で形質導入した。細胞を新鮮な培地で２４時間感染から回復させ、その後４−ＯＨ−タモキシフェン（１００または１０００ｎｍ）を培養に加えてさらに２４時間おいた。細胞を標準的なルシフェラーゼ溶解緩衝液で溶解し、凍結融解に処して、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を分析した。その結果、ＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｃまたはＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡＬｕｃのどちらかに感染し、続いてＨＩＶＣＭＶＡＳ５２１Ｒで形質導入した細胞は、４−ＯＨ−タモキシフェンを与えられると、ルシフェラーゼ活性がそれぞれ１３．１および１１．７倍刺激される結果となることが示された。
【０３７１】
レンチウイルスで組込まれた標的ベクター群へのレンチウイルス形質導入
以前にＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｃまたはＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡＬｕｃのどちらかで形質導入されたＨｅｌａ細胞を、ＺＦＰ−ＬＢＤ融合タンパク質にさらすことなく９回植継いで培養した。１０回目の植継ぎで、細胞をＨＩＶＣＭＶＡＳ５２１Ｒで２４時間形質導入し、続いて１００ｎｍタモキシフェンを加えてさらに２４時間おいた。結果は、組込まれたＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｃまたはＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡＬｕｃベクターを含有するＨｅｌａ細胞株は、ＡＳ５２１Ｒを含むＬＶの形質導入＋タモキシフェンによって、ルシフェラーゼ発現についてそれぞれ３１．４および２２．５倍誘導され得ることを示す。
【０３７２】
これらのデータは、Ｃ２Ｈ２−ＬＢＤレギュレーターが、宿主細胞の染色体に安定に組込まれた導入遺伝子の発現制御に有効であることを証明している。
【０３７３】
改変は当業者に明らかであるので、本発明は添付された請求の範囲によってのみ限定されると解釈される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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