(57)【要約】【課題】本発明は、多孔質ポリマービーズ集合物を用いてオリゴヌクレオチドを合成した場合の、オリゴヌクレオチド収量、すなわちオリゴヌクレオチド合成能が高い多孔質ポリマービーズ集合物を得ることを課題とする。【解決手段】本発明は、スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体を含む多孔質ポリマービーズ集合物であって、該集合物の粒子径のメジアン値が８０〜１４０μｍであることを特徴する集合物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体を含む多孔質ポリマービーズ集合物であって、該集合物の粒子径のメジアン値が８０〜１４０μｍであることを特徴する、集合物。
【請求項２】
該集合物の粒子径のＣＶ値が１２〜２８％である、請求項１記載の多孔質ポリマービーズ集合物。
【請求項３】
乾燥重量あたり２００〜８００μｍｏｌ／ｇの水酸基を有する、請求項１または２に記載の多孔質ポリマービーズ集合物。
【請求項４】
水銀圧入法により測定した際の、細孔直径のメジアン値が１０〜３００ｎｍである、請求項１〜３いずれかに記載の多孔質ビーズ集合物。
【請求項５】
スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体を含む多孔質ポリマービーズ集合物であって、該集合物の粒子径のメジアン値が８０〜１４０μｍである集合物を用意し、該多孔質ポリマービーズにヌクレオシドを結合させ、該結合されたヌクレオシドにヌクレオチドを順次結合させ、オリゴヌクレオチドを得る工程を含む、オリゴヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質ポリマービーズ集合物およびそれを用いたオリゴヌクレオチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、種々の多孔質ポリマービーズ集合物は、イオン交換樹脂、吸着剤、タンパク質合成用の担体、液体クロマトグラフィーなどへ適用されていた。近年では、医薬品として使用されるアンチセンスオリゴＤＮＡおよびｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド合成用担体としても使用されるようになり、より低コストな多孔質ポリマービーズ集合物が求められている。
【０００３】
このような多孔質ポリマービーズ集合物は、カラムに充填して使用することができる。充填された多孔質ポリマービーズ集合物層を液体が通過するので、多孔質ポリマービーズ集合物は液の通過抵抗を最小にするため、その粒子径が均一であるのが良いと考えられている。したがって、粒度分布の幅の狭い、たとえば粒子径のＣＶ値が１２％未満の単分散ビーズが一般的に求められている。また、平均粒径約３０μｍの単分散ポリマービーズ集合物がオリゴヌクレオチド合成用途で市販されている。
【０００４】
単分散ビーズを製造する方法としては、マイクロノズルや多孔膜から単量体溶液を押し出して、均一な径を持った液滴を生成し重合する方法、乳化重合やソープフリー重合によって、単量体のミセルに液滴から単量体を供給し、これを重合させ、単量体のミセルを成長させる方法、これにさらに単量体および有機溶媒を吸収させて膨潤してその粒子径を大きくして重合する方法などがある。これらの方法は、製造工程が複雑となり製造に時間を要することから高コストになるといった問題がある。
【０００５】
また、重合方法として比較的操作が簡単な懸濁重合では、容易に任意の集合物の粒子径の算術平均値をもつ粒子が得られる半面、比較的広い粒度分布をもつ傾向にあり、単分散粒子を得るには、重合後に幾度もの分級操作の繰り返しが必要となり（例えば特許文献１の実施例１参照）、製造工程に多大な手間と時間を要しコストが高くなる場合がある。
【特許文献１】特開２００６−３４２２４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、多孔質ポリマービーズ集合物を用いてオリゴヌクレオチドを合成した場合の、オリゴヌクレオチド収量、すなわちオリゴヌクレオチド合成能が高い多孔質ポリマービーズ集合物を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かくして、本発明は：
（１）
スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体を含む多孔質ポリマービーズ集合物であって、該集合物の粒子径のメジアン値が８０〜１４０μｍであることを特徴する、集合物；
（２）
該集合物の粒子径のＣＶ値が１２〜２８％である、（１）記載の多孔質ポリマービーズ集合物；
（３）
乾燥重量あたり２００〜８００μｍｏｌ／ｇの水酸基を有する、（１）または（２）に記載の多孔質ポリマービーズ集合物；
（４）
水銀圧入法により測定した際の、細孔直径のメジアン値が１０〜３００ｎｍである、（１）〜（３）いずれかに記載の多孔質ビーズ集合物；および
（５）
スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体を含む多孔質ポリマービーズ集合物であって、該集合物の粒子径のメジアン値が８０〜１４０μｍである集合物を用意し、該多孔質ポリマービーズにヌクレオシドを結合させ、該結合されたヌクレオシドにヌクレオチドを順次結合させ、オリゴヌクレオチドを得る工程を含む、オリゴヌクレオチドの製造方法；
を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値を８０〜１４０μｍとすることで、これを用いてオリゴヌクレオチドを合成した場合の、オリゴヌクレオチド収量、すなわちオリゴヌクレオチド合成能が高い多孔質ポリマービーズ集合物を得ることができる。
【０００９】
好ましい実施態様において、さらに、多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のＣＶ値を１２〜２８％とすることで、収率よく低コストで、オリゴヌクレオチド合成能が高い多孔質ポリマービーズ集合物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物は、スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体を含む多孔質ポリマービーズの集合物である。本明細書にいう「多孔質ポリマービーズ集合物」は、２個以上の多孔質ポリマービーズが集められた集団を意味するが、文脈によって適切な場合、１個の多孔質ポリマー樹脂ビーズそれ自体を意味することができる。
【００１１】
スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体の典型例としては、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の構造単位を含有する共重合体が挙げられる。
【００１２】
【化１】
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上記（Ａ）〜（Ｃ）の構造単位は、本発明の好ましい態様においてスチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体が含有する構造単位である。これらの構造単位は、以下に示すように置換されていてもよい。
【００１３】
上記（Ａ）の構造単位における、１つ以上の水素原子（ベンゼン環の水素原子を含む）は、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、メトキシ基、ニトロ基等で置換されていてもよい。
【００１４】
上記（Ｂ）の構造単位における、１つ以上の水素原子（ベンゼン環の水素原子を含むが、水酸基の水素原子を除く）は、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、メトキシ基、ニトロ基等で置換されていてもよい。また、得られる多孔質ポリマービーズ集合物を、オリゴヌクレオチド合成用担体として用いる際に、隣接する水酸基間での合成反応の阻害の起こり易さを考慮すると、ベンゼン環への水酸基の結合は、上記（Ｂ）のごとく主鎖に対してパラ位が特に好ましいが、オルト位、メタ位であってもよい。
【００１５】
上記（Ｃ）の構造単位における、１つ以上の水素原子（ベンゼン環の水素原子を含む）は、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、メトキシ基、ニトロ基等で置換されていてもよい。
【００１６】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物を構成するスチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体は、上記構造単位（Ａ）〜（Ｃ）およびそれらの置換体以外の構造単位を含んでいてもよい。スチレン系単量体とは、スチレンまたはその置換体であり、好ましくは無置換のスチレンを主とし、微粒子の利用特性に応じた官能基を付与するためにスチレンの置換体を適宜混合して用いる。
【００１７】
スチレンの置換体には、スチレンの１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、ニトロ基、アシルオキシ基等で置換された化合物が挙げられる。
【００１８】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物における「ビーズ」とは、厳密な球状を呈することを意味するのではなく、一定形状（例えば、楕円球状などの略球状、多面体形状、円柱形状、金平糖形状などの異型形状など）を有していればよいことを意味するものである。
【００１９】
当該多孔質ポリマービーズ集合物は、オリゴヌクレオチド合成用担体に用いる場合に合成反応容器への充填効率を高くすることができ、また、該反応容器が破損し難いという点から、好ましくは略球状である。多孔質ポリマービーズを２粒以上集め、すなわち多孔質ポリマービーズ集合物として、オリゴヌクレオチド等の合成担体として用いることができる。
【００２０】
本発明のポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値は、８０〜１４０μｍである。多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値が８０μｍを下回ると、ビーズが飛散する傾向にあり、集合物の取り扱い性が悪い。一方、多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値が１４０μｍを上回ると、多孔質ポリマービーズ集合物をオリゴヌクレオチド合成に用いる際に、十分なオリゴヌクレオチド収率が得られない。
【００２１】
本明細書にいう用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の置換されることもあるヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結された鎖状の物質を意味する。通常、用語「オリゴヌクレオチド」は、数十個のヌクレオチドが連結された鎖状の物質を意味するが、本明細書においては、特に上限ヌクレオチド数なくオリゴヌクレオチドというものとする。オリゴヌクレオチドはオリゴＤＮＡおよびオリゴＲＮＡを含み、オリゴヌクレオチドの製造効率の観点から、好ましくはオリゴＤＮＡである。
【００２２】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のＣＶ値は、好ましくは１２〜２８％、より好ましくは１６〜２８％である。本明細書にいう多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のＣＶ値は、多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径の変動係数を意味し、下記式にて算出されるものである。
式：
多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のＣＶ（変動係数）[％]＝集合物の粒子径の標準偏差[μｍ]÷集合物の粒子径の算術平均値[μｍ]×１００
多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のＣＶ値が１２％を下回ると、そのような多孔質ポリマービーズ集合物を容易に大量に重合により合成することは困難であり、重合後に分級操作の繰り返しが必要となる可能性がある。結果的に、製造される多孔質ポリマービーズ集合物の収率が低下し、多孔質ポリマービーズ集合物は高コストとなる傾向にある。一方、これが２８％を上回ると、多孔質ポリマービーズ集合物を製造する際に多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値も増大する傾向にある。結果的に、多孔質ポリマービーズ集合物をオリゴヌクレオチド合成に用いる際に、十分なオリゴヌクレオチド収量が得られない傾向にある。
【００２３】
なお、本明細書にいう、多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径の算術平均値、標準偏差、およびメジアン値は、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置（堀場製作所社製、ＬＡ−９２０）によって、エタノールと水の１：１（体積：体積）混合液を分散媒として用いるほかは製造者の指示に従って測定された値を意味する。
【００２４】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物は、乾燥重量あたり２００〜８００μｍｏｌ／ｇの水酸基を有することが好ましい。上記水酸基量は、共重合体に占めるヒドロキシスチレン系構造単位（例えば、上述の構造単位（Ｂ）またはその置換体）の量に主に依存する。
【００２５】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物の水酸基量は、ＪＩＳ  Ｋ００７０に準じて、以下に示す滴定により測定することができる。即ち、測定対象の多孔質ポリマービーズ集合物の水酸基を既知量の下記アセチル化試薬によってアセチル化し、アセチル化に消費されなかったアセチル化試薬中の無水酢酸の量を水酸化カリウムによる滴定で求めることによって、測定対象物の水酸基量を算出するのである。
【００２６】
この測定の具体的な手順は以下の通りである。
無水酢酸２５ｇに全量が１００ｍｌになるまでピリジンを加えてアセチル化試薬を得る。
測定試料（乾燥した多孔質ポリマービーズ集合物）０．５〜２ｇをフラスコに量り取り、上記アセチル化試薬０．５ｍｌとピリジン４．５ｍｌとを正確に加える。
フラスコ中の混合物を９５〜１００℃で２時間維持した後、室温まで冷却してから蒸留水１ｍｌを加える。
アセチル化に消費されなかった無水酢酸を１０分間加熱することによって分解する。
フラスコの中身を全てビーカーに移し、蒸留水で全量１５０ｍｌになるまで希釈して冷却した後、０．５ｍｏｌ／ｌの水酸化カリウム水溶液で滴定する。
【００２７】
これとは別に、測定試料を入れずに上記と同様の操作により、ブランク測定を行う。測定試料の水酸基量は以下の式（３）により算出される。
【００２８】
但し、Ａ（μｍｏｌ／ｇ）は測定試料の水酸基量であり、Ｂ（ｍｌ）はブランク測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、Ｃ（ｍｌ）は測定試料の測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量であり、ｆは水酸化カリウム水溶液のファクターであり、Ｍ（ｇ）は量り取った測定試料の重量である。
【００２９】
Ａ＝（Ｂ−Ｃ）×０．５（ｍｏｌ／ｌ）×ｆ×１０００÷Ｍ      （３）
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物は、スチレン−ヒドロキシスチレン高分子鎖が、ジビニルベンゼン系単量体に基づく構造単位（好ましい態様では、上記構造単位（Ｃ）またはその置換体）によって架橋された網目構造からなるものが好ましい。
【００３０】
従って、多孔質ポリマービーズ集合物の架橋の程度は、多孔質ポリマービーズ集合物を合成する際に添加するジビニルベンゼン系単量体に依存し、ジビニルベンゼン系単量体の添加量が多いほど架橋の程度は高く、網目構造は密になり、逆にジビニルベンゼン系単量体の添加量が少ないほど架橋の程度は低く、網目構造は粗になる。
【００３１】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物の表面・内部形状は特に限定されず、水銀圧入法により測定したその比表面積は、好ましくは２０〜４００ｍ2／ｇであり、より好ましくは５０〜２００ｍ2／ｇである。
【００３２】
比表面積が小さ過ぎる多孔質ポリマービーズ集合物をオリゴヌクレオチド合成用担体として用いた場合、オリゴヌクレオチド合成反応の反応場が小さくなって得られるオリゴヌクレオチド収量が少なくなるということが懸念される。
【００３３】
逆に、多孔質ポリマービーズ集合物の比表面積が大きいということは、微細な孔が多数生成している場合と、空隙率が大きくなっている場合とがあり得る。細孔が多過ぎる場合には、当該ビーズ集合物をオリゴヌクレオチド合成用担体として用いた際に合成反応が進行し難くなることが懸念される。空隙率が大き過ぎる場合には、多孔質ポリマービーズ集合物の物理的強度が低くなり、合成操作中にビーズが破損することが懸念される。
【００３４】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物の孔の大きさ、個数などは特に限定されない。孔の大きさは、細孔直径のメジアン値によって定量化することができる。本発明の多孔質ポリマービーズ集合物の細孔直径のメジアン値は、好ましくは１０〜３００ｎｍ、より好ましくは３０〜１５０ｎｍである。
【００３５】
多孔質ポリマービーズ集合物の細孔直径のメジアン値が小さ過ぎる場合、オリゴヌクレオチド合成用担体として用いた際にオリゴヌクレオチド合成反応によって得られるオリゴヌクレオチド物質の収量や純度が低下する場合がある。逆に、多孔質ポリマービーズ集合物の細孔直径のメジアン値が大き過ぎる場合、反応場であるビーズ表面の水酸基と反応に関わる物質との接触機会が少なくなり、オリゴヌクレオチド合成用担体として不利となる場合がある。
【００３６】
本明細書にいう多孔質ポリマービーズ集合物の細孔直径のメジアン値は、水銀圧入法により測定された値を意味する。具体的には、サンプルセル（直径１０ｍｍ、長さ３０ｍｍ、  セル容量０．５ｃｃ）に約０．３ｇの測定試料（多孔質ポリマービーズ集合物）を充填し、該サンプルセルを、水銀ポロシメータＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ  Ｃｏ．製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件における水銀注入圧から、測定試料の細孔直径のメジアン値を求める。
【００３７】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物の製造方法は、特に限定されない。以下、１例として、スチレン系単量体と、アシルオキシスチレン系単量体と、ジビニルベンゼン系単量体とを、水と有機溶媒の存在下で懸濁共重合して共重合体を得、アシルオキシ基を水酸基に変換する工程を含む方法について説明する。
【００３８】
本発明において、スチレン系単量体とは、スチレンまたはその置換体であり、好ましくは無置換のスチレンである。スチレンの置換体には、スチレンの１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、ニトロ基、アシルオキシ基等で置換された化合物が挙げられる。
【００３９】
上記方法において、アシルオキシスチレン系単量体は、アシルオキシスチレン（スチレンのフェニル基部分にアシルオキシ基が置換したもの）またはその置換体であり、好ましくは無置換のｐ−アセトキシスチレンである。アシルオキシスチレンの置換体には、アシルオキシ基以外の１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、メトキシ基、ニトロ基等で置換された化合物が挙げられる。アシルオキシ基とは、Ｘ−ＣＯ−Ｏ−（式中、Ｘはアルキル基）の一般式で表される基であり、Ｘで示されるアルキル基部分の炭素数が１〜５のアシルオキシ基が好ましく、アセトキシ基がより好ましい。アシルオキシ基はスチレンのビニル基に対してパラ位に配置することが好ましいが、オルト位またはメタ位にあってもよい。アシルオキシスチレン系単量体のアシルオキシ部分を、例えばアルカリ、酸等を用いて、常法により加水分解することによって、水酸基に変換することができる。
【００４０】
上記方法において、ジビニルベンゼン系単量体とは、ジビニルベンゼンまたはその置換体であり、好ましくは無置換のジビニルベンゼンである。ジビニルベンゼンの置換体には、ジビニルベンゼンの１つ以上の水素原子が、炭素数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、シアノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、ニトロ基等で置換された化合物が挙げられる。２つのビニル基は、パラ位、メタ位、オルト位のいずれの配置であってもよい。
【００４１】
上記方法において、懸濁共重合に供する際、スチレン系単量体と、アシルオキシスチレン系単量体と、ジビニルベンゼン系単量体との合計量に占める、ジビニルベンゼン系共重合体の量は、好ましくは２重量％以上、より好ましくは５重量％以上であり、かつ、好ましくは３０重量％以下、より好ましくは２０重量％以下である。その量がこれよりも少ない場合や多い場合には、良好な多孔質構造が得られないことや、略真球状の多孔質ポリマービーズ集合物が形成されない場合がある。
【００４２】
懸濁共重合に供する際、スチレン系単量体と、アシルオキシスチレン系単量体と、ジビニルベンゼン系単量体との合計量に占める、アシルオキシスチレン系単量体の量は、好ましくは１〜３０重量％、より好ましくは３〜１０重量％である。
【００４３】
少なすぎる場合には、多孔質ポリマービーズ集合物の官能基の量が少なくなり、オリゴヌクレオチド合成用担体として使用した際のオリゴヌクレオチドの合成量が減少する傾向にある。一方、これが多すぎる場合には、目的とするオリゴヌクレオチドの合成比率が低下し、オリゴヌクレオチド収率が低下する傾向にある。よって、多孔質ポリマービーズ集合物に付加する水酸基量としては、２００〜８００μｍｏｌ／ｇが好ましい。
【００４４】
上記方法において、懸濁共重合系には、スチレン系単量体、アシルオキシスチレン系単量体、あるいはジビニルベンゼン系単量体のいずれにも該当しない単量体成分が含まれていてもよい。それらの単量体の総重量の５０重量％以上がスチレン系単量体、アシルオキシスチレン系単量体、およびジビニルベンゼン系単量体であれば、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、メタクリル酸メチル等の単量体を混合してもよい。
【００４５】
また、ジビニルベンゼン系単量体として無置換のジビニルベンゼンを使用する場合、エチルスチレン等との混合物を用いてもよい。この場合、混合物におけるエチルスチレンはスチレン系単量体に相当する。
【００４６】
上記方法において、懸濁共重合する際に有機溶媒を単量体に混合して用いることができる。有機溶媒としては、炭化水素およびアルコールが好ましく用いられる。炭化水素としては、脂肪族の飽和または不飽和炭化水素、あるいは芳香族炭化水素を用いることができ、その炭素数は、好ましくは５〜１２である。好ましい炭化水素としては、トルエン、ｎ−ヘキサン、ｎ−へプタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、ウンデカン、ドデカン等が挙げられる。
【００４７】
アルコールとしては、例えば脂肪族アルコールを挙げることができ、そのアルキル基の炭素数は、好ましくは５〜１２である。好ましいアルコールとしては、２−エチルヘキサノール、ｔ−アミルアルコール、ノニルアルコール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。有機溶媒として炭化水素とアルコールとの混液を用いるのも好ましい。その場合、炭化水素とアルコールとの重量比は、炭化水素およびアルコールの具体的な組み合わせによって異なり、この比を適宜調節することにより、得られる多孔質ポリマービーズ集合物の細孔径分布や比表面積などの多孔質構造を制御できる。
【００４８】
懸濁共重合する際の、有機溶媒の重量は、単量体の総重量に対して好ましくは０．５倍以上、より好ましくは０．８倍以上であり、かつ、好ましくは２．０倍以下、より好ましくは１．５倍以下である。その量がこれよりも少ない場合や多い場合には、良好な多孔質構造が得られないことや、略真球状の多孔質ポリマービーズ集合物が形成されないことがある。
【００４９】
懸濁重合する際に、単量体と有機溶媒の混合物と、水とを混合することができる。水の重量と単量体と有機溶媒の混合物の総重量との比率（水の重量：単量体と有機溶媒の混合物の総重量）は特に限定されないが、１：１〜１：４が好ましい。水の重量の比率がこれよりも小さいと重合反応中の重合物の分散が不十分となり、重合物の凝集が生じたり、重合物の比表面積や細孔径分布などが不均一になる恐れがあり、一方、水の重量の比率がこれよりも大きいと、重合生産スケールに対する単量体の量が少なくなることから、生産効率が低下する恐れがある。
【００５０】
懸濁共重合の際には種々の分散安定剤を必要により用いることができる。分散安定剤は特に限定されず、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ゼラチン、デンプン、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン等の水溶性高分子が好適に用いられ、これらを混合して用いても良い。分散安定剤の添加量は特に限定されないが、好ましくは懸濁共重合系の水の重量に対して０．１〜５重量％、より好ましくは０．５〜３重量％である。
【００５１】
懸濁共重合の際には必要により重合開始剤を用いることができる。重合開始剤は特に限定されず、ジベンゾイルパーオキサイド、ジラウロイルパーオキサイド、ジステアロイルパーオキサイド、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）−２−メチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−へキシルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−へキシルペルオキシ）シクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ジ−ｔ−へキシルパーオキサイド、ｔ−ブチルクミルパーオキサイド、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、１，１，３，３−テトラメチルブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−へキシルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシイソプロピルモノカルボネート等の過酸化物、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチルブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物等、自体公知のものが用いられる。
【００５２】
多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値は、単量体、重合開始剤および有機溶媒の混合物を、水へ混合し液滴を生成させる際の撹拌回転数を変化することによって制御できる。撹拌が強ければ多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値は小さくなり、撹拌が弱ければ多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値は大きくなる。
【００５３】
温度や反応時間等の懸濁共重合の際の反応条件は、適宜設定すればよいが、例えば、窒素気流下、６０〜９０℃、２〜４８時間の撹拌が反応条件の例として挙げられうる。本発明において、上記のようにして得られた共重合体と溶媒とを含む混合物を、遠心ろ過、減圧吸引ろ過、加圧ろ過等によってろ過することができる。
【００５４】
ろ過に使用されるろ材は特に限定されるものではなく、ろ紙、ステンレス焼結フィルター、ガラス繊維ろ紙、ガラス焼結フィルター、ポリプロピレンやポリエチレン製のろ布、ナイロンメッシュ等を用いてもよい。使用するろ材の目開きは特に限定されるものではないが、目開きの大きさによって多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のＣＶ値は変化する。目開きは、歩留まりを大きく低下させない程度に大きいほど好ましく、後述の洗浄・ろ過工程において、微粒子が取り除かれてＣＶ値が低くなる。上記共重合体と溶媒とを含む混合物がろ過されて得られた多孔質ポリマービーズ集合物のケーキは、分散安定剤や多孔質ポリマービーズ集合物の内部に残存する溶媒などの不純物を除去するために、繰り返し洗浄・ろ過を行うことができる。
【００５５】
洗浄液としては、懸濁重合系に添加される水溶性の分散安定剤を除去するために、最初にイオン交換水、精製水、蒸留水、超純水などの水が用いられ、次いで、懸濁重合系の有機溶媒を除去するためにそれと相溶性が良好な種々の洗浄用の有機溶剤を用いることができる。
【００５６】
洗浄用の有機溶媒としては、懸濁重合系の溶媒を除去できるものあれば、特に限定されるものではないが、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール等の比較的低沸点のアルコール類、ヘキサン、トルエン、アセトン等の比較的低沸点の石油系溶剤等が挙げられ、これら２種類以上を混合して用いても良い。洗浄後に多孔質ポリマービーズ集合物ケーキの集合物を乾燥する必要がある場合には、メタノール、アセトン、ヘキサンが、溶剤のコストや乾燥時の動力コスト的に有利であり、好適に用いられる。洗浄され、不純物が除去された多孔質ポリマービーズ集合物を、熱風流動乾燥や加熱真空乾燥によって、乾燥させることができる。このようにして得られたポリマービーズ集合物は、必要により分級してもよい。
【００５７】
本発明において、多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のＣＶ値を１２〜２８％とすることは、前記共重合体と溶媒とを含む混合物を上述のようにろ材でろ過して多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを得、得られた多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを必要によりメッシュ等を用いてふるい分けすること等により分級することで実現することができる。この目的のためには、ろ材の目開きは１０〜８０μｍが好ましく、３０〜６０μｍがより好ましい。
【００５８】
本発明では、多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のＣＶ値は、前記範囲が好ましいことから、多孔質ポリマービーズ集合物の製造において、必ずしも分級を行う必要性は無い。分級を行わないまたは簡単に済ませることで、オリゴヌクレオチド合成能が高い多孔質ポリマービーズ集合物を一層、収率よく低コストで得ることができる。したがって、本発明の製造方法では、収率よく低コストで、オリゴヌクレオチド合成能が高い多孔質ポリマービーズ集合物を得ることができる。
【００５９】
本発明の多孔質ポリマービーズ集合物を固相として用いてオリゴヌクレオチドを合成することができる。合成するには、ホスホロアミダイト法のような自体公知の方法を使用することができる。したがって、本発明はまた、スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体を含む多孔質ポリマービーズ集合物であって、該集合物の粒子径のメジアン値が８０〜１４０μｍである集合物を用意し、該多孔質ポリマービーズにヌクレオシドを結合させ、該結合されたヌクレオシドにヌクレオチドを順次結合させ、オリゴヌクレオチドを得る工程を含む、オリゴヌクレオチドの製造方法にも関する。
【００６０】
より具体的には、本発明の多孔質ポリマービーズ集合物におけるビーズの水酸基に、スクシニルリンカー等のリンカーを結合させ、該リンカーに必要により５‘末端を保護基、例えばジメトキシトリチル基で保護されたヌクレオシドを結合させ、次式のような構造を得ることができる。
【００６１】
【化２】
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[式中、○は本発明の多孔質ポリマービーズであり、Ｂ1は塩基であり、ＤＭＴＯは、５‘末端保護基である。]
次に、ヌクレオシドに、所定の塩基配列となるように、ホスホロアミダイトを順次結合させることができる。この合成反応は自動合成装置を用いて行うことができる。最終的には、リンカーを加水分解するなどして切断して目的のオリゴヌクレオチドを得ることができる。本方法は、オリゴヌクレオチド合成能が高い多孔質ポリマービーズ集合物を使用するので、オリゴヌクレオチドを容易に高収率で製造することができる。
【実施例】
【００６２】
以下に本発明を具体例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されないものとする。
［実施例１］
（懸濁共重合）
冷却管、撹拌機、窒素導入管を備え付けた、５００ｍＬのセパラブルフラスコを恒温水相に設置し、精製水（大和薬品製）２４０ｇおよびポリビニルアルコール（クラレ製、平均重合度約２０００、けん化度７９モル％）２．４ｇを入れて、恒温水相の温度を２８℃にして撹拌しながらポリビニルアルコールを溶解した。
【００６３】
これとは別に、スチレン（和光純薬製）４４ｇ、ｐ−アセトキシスチレン（東ソー有機化学製）３ｇ、ジビニルベンゼン（和光純薬製）７ｇを混合し、これに、ジベンゾイルパーオキサイド（日本油脂製、２５％含水）１ｇを加えて溶解し、さらに２−エチルヘキサノール（関東化学製）５０ｇ、イソオクタン（和光純薬製）２０ｇを加えて混合し、この溶液を上記のセパラブルフラスコに入れた。窒素気流下、毎分４８０回転で４０分間撹拌した後、撹拌回転数を毎分３００回転にして、恒温水相を２８℃から８０℃まで昇温して９時間、懸濁共重合反応を行った。
【００６４】
共重合反応後、恒温水相を降温して重合液が２８℃になるまで冷却した。
（ろ過）
重合液は、ろ材（ＮＲＫ製、ナイロンメッシュ、目開き４５μｍ）用いて吸引ろ過を行い、多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを得た。
（洗浄）
多孔質ポリマービーズ集合物のケーキに精製水２００ｍＬを入れ、撹拌してケーキをよく分散した。これを再びろ過して多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを得た。この操作を４回行った。
【００６５】
さらに、多孔質ポリマービーズ集合物のケーキにアセトン（和光純薬製）２００ｍＬを入れ、同様に洗浄、ろ過を行った。この操作を３回行った。
（水酸基の付与）
多孔質ポリマービーズ集合物のケーキにエタノール２００ｍＬを入れ、撹拌してケーキをよく分散した。これを再びろ過して多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを得た。これにエタノール１６０ｍＬおよび１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液４０ｍＬを入れ、撹拌してケーキをよく分散し、７６℃まで加温し３時間加水分解反応を行った。反応後、室温まで冷却し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液で中和した後、ろ過し、上記（洗浄）と同様に操作を行った。
（乾燥）
洗浄後の多孔質ポリマービーズ集合物のケーキを７０℃の真空乾燥機中で４８時間乾燥し、実施例１の多孔質ポリマービーズ集合物を得た。
［実施例２］
実施例１で得た多孔質ポリマービーズ集合物を、目開き７０μｍおよび１２０μｍのメッシュを用いてふるい分け分級し、実施例２の多孔質ポリマービーズ集合物を得た。
［実施例３］
実施例１で得た多孔質ポリマービーズ集合物を、目開き８５μｍおよび１００μｍのメッシュを用いてふるい分け分級し、実施例３の多孔質ポリマービーズ集合物を得た。
［比較例１］
実施例１で得た多孔質ポリマービーズ集合物を、目開き３０μｍおよび８０μｍのメッシュを用いてふるい分け分級し、比較例１の多孔質ポリマービーズ集合物を得た。
［比較例２］
実施例１で得た多孔質ポリマービーズ集合物を、目開き５０μｍおよび９０μｍのメッシュを用いてふるい分け分級し、比較例２の多孔質ポリマービーズ集合物を得た。
［実施例４］
実施例１で得た多孔質ポリマービーズ集合物を、目開き９０μｍおよび１６０μｍのメッシュを用いてふるい分け分級し、実施例４の多孔質ポリマービーズ集合物を得た。
［比較例３］
実施例１の（懸濁重合）の「毎分４８０回転で４０分間撹拌した後」を「毎分３００回で４０分間撹拌した後」に変更した以外は、実施例１と同様に行った。
（多孔質ポリマービーズ集合物の分析）
多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値（μｍ）、多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のＣＶ値（％）、多孔質ポリマービーズ集合物の水酸基量（μｍｏｌ／ｇ）、およびメジアン細孔直径（ｎｍ）は、本明細書に前記した方法で測定した。
（多孔質ポリマービーズ集合物によるオリゴヌクレオチドの合成）
実施例１〜４、および比較例１〜３で作製した多孔質ポリマービーズ集合物のそれぞれのヒドロキシル基にＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ(ヌクレオシドリンカー)
を０．２ｍｍｏｌ／ｇの量になるように調整して結合した後、ヌクレオシドリンカーが結合しなかったヒドロキシル基をアセチル基でキャップした。これらのヌクレオシドリンカーを結合した多孔質ポリマービーズ集合物を用いて、１μｍｏｌのスケールでオリゴヌクレオチド合成装置を用いて２０塩基数のオリゴＤＮＡを合成し、粗オリゴＤＮＡ合成量（ｍｇ／μｍｏｌ）を重量測定により測定した。
【００６６】
得られた粗オリゴＤＮＡをＨＰＬＣにより、合成オリゴＤＮＡ純度（重量％）を求めた。粗オリゴＤＮＡ合成量に合成オリゴＤＮＡ純度／１００を乗じて、２０塩基数からなるオリゴＤＮＡの収量（ｍｇ／μｍｏｌ）を求めた。結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
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実施例の多孔質ポリマービーズ集合物は、その粒子径のメジアン値が８０〜１４０μｍであったため、オリゴＤＮＡ収量が、比較例と比較して高かった（表１および図１）。実施例１〜３の比較から、粒子のＣＶ値が高く、単分散でなくても粗オリゴＤＮＡ合成量、合成オリゴＤＮＡ純度およびオリゴＤＮＡ収率は同等は同等であることがわかった。したがって、これらによればオリゴヌクレオチドが安価に製造可能であることがわかった。
【００６８】
また、実施例１〜３の多孔質ポリマービーズ集合物の収率は、実施例１では約７０％、実施例２では約４０重量％、実施例３では約２０重量％であった。なお、ここにいう多孔質ポリマービーズ集合物の収率（重量％）は、ポリマービーズ集合物の重量［ｇ］／単量体の混合物の総重量［ｇ］に１００を乗じて算出される値である。
【００６９】
したがって、本発明によれば、複雑な製造工程や多大な手間をかけずに、指向した目的を達成しうることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径のメジアン値（μｍ）とオリゴＤＮＡ収量（ｍｇ／μｍｏｌ）との関係を表すグラフである。
【図２】実施例１の多孔質ポリマービーズ集合物の写真である（倍率６５倍）。
【図３】実施例３の多孔質ポリマービーズ集合物の写真である（倍率６５倍）。
【図４】実施例および比較例の多孔質ポリマービーズ集合物の粒子径による分布を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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