(57)【要約】【課題】  ヒト結核菌と非結核性抗酸菌のヌクレオチド増幅産物を検出するテストストリップと方法を提供する。【解決手段】  ヒト結核菌と非結核性抗酸菌のヌクレオチド増幅産物を検出するテストストリップは、(a) アビジンー金開放領域と、 (b) テストバンドと、からなる。更に、ヒト結核菌TBと非結核性抗酸菌のヌクレオチドNTMを検出する方法は、(a) 標識プライマーを有するサンプルDNAを増幅する工程と (b) 増幅したDNA産物とランニングバッファを混合する工程と、;(c) テストストリップを混合物に浸し塗りする工程と (d)混合物がストリップの反応領域に移動できるようにする工程と、からなる。【選択図】   図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト結核菌ＴＢと非結核性抗酸菌ＮＴＭのヌクレオチド増幅産物を検出するストリップであって、 (a) アビジンー金開放領域と、 (b) テストバンドと、からなり、前記テストバンドは、ＴＢテストバンド、或いは、ＮＴＭテストバンドを含むことを特徴とするストリップ。
【請求項２】
更に、制御バンドを有することを特徴とする請求項１に記載のストリップ。
【請求項３】
前記ヌクレオチド増幅産物は、標識プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅したＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載のストリップ。
【請求項４】
前記標識プライマーは、一ストランドでビオチンと、別のストランドで免疫原生分子と標識されることを特徴とする請求項３に記載のストリップ。
【請求項５】
前記免疫原生分子は、ジゴキシゲニンＤＩＧ、或いは、フルオレセインＦＩＴＣであることを特徴とする請求項４に記載のストリップ。
【請求項６】
前記ＴＢテストバンドは、標識ＴＢ  ＤＮＡに結合される抗体に被覆されることを特徴とする請求項１に記載のストリップ。
【請求項７】
前記ＴＢテストバンドは、抗ＤＩＧ抗体に被覆されることを特徴とする請求項６に記載のストリップ。
【請求項８】
前記ＮＴＭテストバンドは、標識ＮＴＭ  ＤＮＡに結合される抗体に被覆されることを特徴とする請求項１に記載のストリップ。
【請求項９】
前記ＮＴＭテストバンドは、抗ＦＩＴＣ抗体に被覆されることを特徴とする請求項８に記載のストリップ。
【請求項１０】
前記制御バンドは、ＢＳＡ−共役ビオチンに被覆されることを特徴とする請求項２に記載のストリップ。
【請求項１１】
ヒト結核菌ＴＢと非結核性抗酸菌のヌクレオチドＮＴＭを検出する方法であって、
(a) 標識プライマーを有するサンプルＤＮＡを増幅する工程と、 
(b) 増幅したＤＮＡ産物とランニングバッファを混合する工程と、
(c) テストストリップを混合物に浸し塗りする工程と、
(d) 混合物がストリップの反応領域に移動できるようにする工程と、
からなることを特徴とするストリップ。
【請求項１２】
前記標識プライマーは、一ストランドでビオチンと、別のストランドで免疫原生分子と標識されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫原生分子は、ジゴキシゲニンＤＩＧ、或いは、フルオレセインＦＩＴＣであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記テストストリップは、前記請求項１で記述されるストリップであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）と非結核性抗酸菌（ｎｏｎ−ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増幅DNA産物の存在を快速に同定するストリップと方法に関するものである。
【０００２】
ヒト結核菌は、多くの結核（ＴＢ）の症例を引き起こすバクテリアであり、誰でもよく知っている死に至る危険な伝染病である。バクテリアは、呼吸器系を攻撃するが、身体の別の部分にも作用する。人が、咳、くしゃみや会話でＴＢを運び、空気を通じて拡散する。２００４年、死亡と疾病率の統計値は、１４６０万の慢性活動性ＴＢ患者、８９０万の新患者、１６０万の死者があり、多くは発展途上国で発生する。しかし、免疫システムが、免疫抑制薬、薬物乱用、或いは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに屈し、先進国世界でも、結核にかかる人が増加の一途をたどる。
【０００３】
非結核性抗酸菌（Ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ 、ＮＴＭ)は、結核と呼ばれる疾病を引き起こさない。これらの有機体の感染は伝染性ではなく、公衆衛生と密接な関わりがなく、これらによる疾病は、Ｍ．結核とは違い、届出義務がない。しかし、ミコバクテリウムに感染する組織は、乾酪壊死に至る特徴を伴う肉芽腫形成のＭ．結核に感染するのと同一のものである可能性が高い。直接塗抹の状態で、全ミコバクテリウム染色は、抗酸性、抗アルコールのチールニールゼンであり、お互い区別できない。培養液だけが、種特異特徴を同定できる。その結果、ＮＴＭに肺感染した患者は、まず、結核の可能性があると診断される。培養物が約６週間有効である時、診断が修正され、患者と医師に混乱が生じる。
【０００４】
感染者の臨床治療と危険にさらされる暴露群の同定にとって、臨床サンプル中のＭ.結核の早期で正確な検出は重大性が増大している。ミコバクテリウム種の特定のDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等の分子技術は、快速で、特定の高感度診断の有望で、目新しいやり方の一つである。
【０００５】
カナダ特許第02223705号、Jia Bei Zhu等により、免疫原生分子、或いは、親和性リガンドコンパウンドによるDNA増幅に用いるプローブを標識したヌクレオチド増幅産物の最終生産物を検出し、抗体、及び／又は、リガンドの二種を予固定化したテストストリップを有する最終生産物を検出する方法が開示された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒト結核菌と非結核性抗酸菌のヌクレオチド増幅産物を検出するテストストリップと方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒト結核菌ＴＢと非結核性抗酸菌のヌクレオチドＮＴＭの増幅産物を検出するテストストリップを提供し、(a) アビジンー金開放領域と、 (b) テストバンドと、からなる。本発明は、更に、ヒト結核菌ＴＢと非結核性抗酸菌のヌクレオチドＮＴＭを検出する方法を提供し、(a) 標識プライマーを有するサンプルDNAを増幅する工程と、 (b) 増幅したDNA産物とランニングバッファを混合する工程と、(c) テストストリップを混合物に浸し塗りする工程と (d)混合物がストリップの反応領域に移動できるようにする工程と、からなる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、公知の診断法のように、多大な時間を必要とせず、臨床治療を容易にし、感染のリスクを減少させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
結核は、ヒト結核菌により発症し、感染病中で、死亡率と疾病率が一番高い。しかし、ヒト結核菌と非結核性抗酸菌により発生する同様の臨床症状により、公知の診断法は、多大な時間を必要とするだけでなく、わずらわしい。ミコバクテリア種の迅速診断法と正確な同定は、臨床治療を容易にし、感染のリスクを減少させることができる。本発明のストリップと方法は、患者から作られたサンプルからミコバクテリアを同定する快速で簡単な手段を提供し、一ストリップで、ＴＢとＮＴＭなどの二ミコバクテリアをテストすることができる。
【００１０】
ストリップは、吸水性のある紙で、左から右に、アビジンー金開放領域と、テストバンドを有するテスト領域と、からなる。テストバンドの後に制御バンドを含んでもよい。アビジンー金開放領域は、アビジンと連結するコロイド金粒子により被覆される。更に、免疫原生の標識プライマーに対する二種の抗体は、二つのテストバンドでそれぞれ予固体化され、制御バンドで、BSA共役ビオチンがプレフィックスされる。
【００１１】
本方法は、四工程からなる。第一工程は、特別に設計されたプライマーは、一ストランドでビオチンを含み、別のストランド中、DIG、或いは、FITC等の免疫原生分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、患者から作られたサンプルDNAを増幅するために用いられる。プライマーは、rpoB 遺伝子などの遺伝子に狙いを定め、全ミコバクテリア種中で検出され、各種と見分けられる高い保存領域を含む。増幅後、DNA産物は、ランニングバッファに混合される。次に、テストストリップの左側が混合物に浸漬され、混合物が、毛管現象により、ストリップの左側から右側に移動する。
【００１２】
ターゲットDNAがサンプル中に存在し、増幅した場合、DNA産物は一面でビオチンを、もう一面で、免疫原生分子を含む。DNA産物中のビオチンは、ビオチン化により、アビジンー金開放領域で、アビジンに結合し、よって、コロイド金粒子と結びつく。テスト領域に達する時、テストバンド上の抗免疫原生分子抗体が、DNA産物中の免疫原生分子と結合する。コロイド金粒子は、ビオチンがサンプル中に存在する間は、制御バンドに結合し、アビジンー金開放領域で、アビジンー金と有効に働き、アビジンー金が、ストリップの右側に移動するようにする。コロイド金の赤色性質により、テストバンドと制御バンドは、赤色バンドとして出現する。テストバンド上に出現する赤色バンドは、陽性結果を意味する。テストターゲットが混合物に存在しない場合、即ち、DNAが増幅しない時、標識DNAは存在しない。ストリップ上で、テストバンド中に反応が生じず、赤色バンドは、サンプル中のターゲットDNAの存在にかかわらず、制御バンド上にだけ出現する。
【００１３】
もう一つの具体例において、左から右のストリップ上の領域とバンドの順序は、アビジンー金開放領域、ＴＢテストバンド、ＮＴＭテストバンド、及び、制御バンドである。ＴＢテストバンドは、予固定化した抗DIG抗体により被覆され、ＮＴＭテストバンドは予固定化抗FITC抗体により被覆される。制御バンドはBSA−ビオチンにより被覆される。
【００１４】
ＴＢ  DNAに狙いを定めたプライマーペアは、一ストランドでビオチンで、別のストランドのDIGで標識される。ＮＴＭ  DNAに狙いを定めたプライマーペアは、一ストランドでビオチンで、別のストランドでFITCで標識される。ＴＢがサンプルに存在する場合、ＴＢ DNAは増幅し、よって、ＴＢテストバンドと制御バンドは赤を呈する。ＮＴＭがサンプルに存在する場合、ＮＴＭ  DNAは増幅し、よって、ＮＴＭテストバンドと制御バンドは赤を呈する。ＴＢとＮＴＭがサンプルに存在する場合、ＴＢ  DNAとＮＴＭ  DNAは増幅し、よって、ＴＢテストバンド、ＮＴＭテストバンド、及び、制御バンドは赤を呈する。ＴＢとＮＴＭがサンプル中にない場合、増幅するDNAはなく、よって、赤を呈するテストバンドがなく、制御バンドだけ赤を呈する。
【００１５】
本実施例は、本発明に限定されるものではなく、単に、様々な側面と本発明の特徴を代表するものである。
図１は、設計例のコンセプトを示す図である。
【００１６】
例１
ターゲットDNAの増幅
図２は、プライマーの相対位置を示す図である。
ＴＢ／ＮＴＭのrpoB遺伝子は、まず、RpoBプライマーを用いて、PCRにより増幅される。センスプライマーRpoBF3の配列は、SEQ ID NO: 1.で示されるように、
5’-ACCGACGACATCGACCACTT-3’ である。アンチセンスプライマーRpoBR2の配列は、SEQ ID NO: 2. で示されるように、5’-AGCCGATCAGACCGATGTT-3’である。第一PCR状態は：
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【００１７】
第一PCR産物は、その後、第二PCRのためのテンプレートとして用いられる。第二PCRに用いられるプライマーは、ＴＢプライマーとＮＴＭプライマーである。ＴＢセンスプライマー  ＴＢc1の配列は、SEQ ID NO: 3で示されるように、5-CGTACGGTCGGCGAGCTGATCCAA-3’ である。ＴＢ アンチプライマーＴＢcR の配列は、SEQ ID NO: 4で示されるように、5’-GACCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT-3’ である。ＮＴＭ センスプライマーＮＴＭＭ5の配列は、SEQ ID NO: 5で示されるように、 5’-GGAGCGGATGACCACCCAGGACGTC-3’ である。 ＮＴＭ アンチセンスプライマー ＮＴＭRＭ3の配列は、SEQ ID NO: 6で示されるように、5’-CAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAAC-3’ である。 ＴＢプライマーとＮＴＭプライマーの比率は、その後、テストされ、その結果は、最適比率が、０．３μｌのＴＢのプライマーに、１μｌのＮＴＭプライマーを加えたものである（表１）（図３）。
【００１８】
表１
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テスト結果によると、第二PCR状態は以下のようである: 
【００１９】
例２
ランニングバッファ
三種のランニングバッファがテストされる。バッファAは、１０ｍＭのHEPES、１％のBSA、及び、０．１％のTween２０を含む。バッファBは、１０ｍＭの  Tris、１％のBSA、及び、０．１％のTween２０を含む。バッファCは、１×PBS、１％のBSA、及び、０．１％のTween２０を含む。その結果は、バッファBは、最適な状態である（図４）。
【００２０】
例３
プライマーとＴＢ／ＮＴＭストリップの特異度
プライマーの特異度をテストするため、気道によく存在する四種のバクテリアのゲノムが、テスト工程に取り込まれる。それらは、インフルエンザ菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、肺炎連鎖球菌である。その結果は、プライマーとストリップは、ＴＢとＮＴＭに特異的である（図５）。
【００２１】
例４
ＴＢ／ＮＴＭストリップの感度
ＴＢ／ＮＴＭストリップの感度をテストするため、ＴＢ/ＮＴＭ二本鎖 PCR と ＴＢ/ＮＴＭ ネスト化二本鎖 PCRがDNAを増幅するのに用いられる。その結果は、ＴＢ/ＮＴＭ二本鎖 PCR により、 ＴＢとＮＴＭを検出する制限は２００００以上である。ＴＢ/ＮＴＭ ネスト化二本鎖 PCRにより、ＴＢを検出する制限は１０で、ＮＴＭを検出する制限は２０である（図６）。ストリップの発色結果は、電気泳動法に適合する。ＴＢ/ＮＴＭ ネスト化二本鎖 PCRにより、ＴＢを検出する制限は１０で、ＮＴＭを検出する制限は２０である（図７）。
【００２２】
例５
臨床サンプルのＴＢ／ＮＴＭストリップの特異性と感度
テストストリップの実際の特異性と感度を確認するため、全部で２３９の臨床サンプルが収集されて、比較のために、ＴＢ／ＮＴＭテストストリップ、或いは、公知の培養試験によりテストされる。結果は以下のようである：
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【００２３】
ＴＢ／ＮＴＭテストストリップによりテストされた２３９臨床サンプルの一サンプル（サンプル１６９）だけは、培養によりテストされた結果に符合しない。よって、ＴＢ検出のＴＢ／ＮＴＭテストストリップの感度は９７％で、特異性は１００％であり、ＮＴＭ検出のＴＢ／ＮＴＭテストストリップの感度は１００％で、特異性は９７％である。
【００２４】
本発明では好ましい実施例を前述の通り開示したが、これらは決して本発明に限定するものではなく、当該技術を熟知する者なら誰でも、本発明の精神と領域を脱しない範囲内で各種の変動や潤色を加えることができ、従って本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】設計例のコンセプトを示す図である。
【図２】プライマーの相対位置を示す図である。
【図３Ａ】ＴＢとＮＴＭプライマーの比率差動の効果を示す図である。
【図３Ｂ】ＴＢとＮＴＭプライマーの比率差動の効果を示す図である。
【図４】異なるランニングバッファの効果を示す図で、C：制御バンド、T：ＴＢテストバンド、N:ＮＴＭテストバンド、ＴＢ（＋）：ＴＢポジティブ、ＮＴＭ(+)：ＮＴＭポジティブ、ＴＢ(-)：ＴＢネガティブ、及び、ＮＴＭ（−）：ＮＴＭネガティブである。
【図５Ａ】プライマーとストリップの特異度を示す図で、ＴＢ：ヒト結核菌、ＮＴＭ:非結核性抗酸菌、H：インフルエンザ菌、S：黄色ブドウ球菌、K：肺炎桿菌、及び、P：肺炎連鎖球菌である。
【図５Ｂ】プライマーとストリップの特異度を示す図で、ＴＢ：ヒト結核菌、ＮＴＭ:非結核性抗酸菌、H：インフルエンザ菌、S：黄色ブドウ球菌、K：肺炎桿菌、及び、P：肺炎連鎖球菌である。
【図５Ｃ】プライマーとストリップの特異度を示す図で、ＴＢ：ヒト結核菌、ＮＴＭ:非結核性抗酸菌、H：インフルエンザ菌、S：黄色ブドウ球菌、K：肺炎桿菌、及び、P：肺炎連鎖球菌である。
【図５Ｄ】プライマーとストリップの特異度を示す図で、ＴＢ：ヒト結核菌、ＮＴＭ:非結核性抗酸菌、H：インフルエンザ菌、S：黄色ブドウ球菌、K：肺炎桿菌、及び、P：肺炎連鎖球菌である。
【図６Ａ】ＴＢ/ＮＴＭ 二本鎖 PCR と ＴＢ/ＮＴＭ ネスト化二本鎖 PCRの制限検出を示す図である。
【図６Ｂ】ＴＢ/ＮＴＭ 二本鎖 PCR と ＴＢ/ＮＴＭ ネスト化二本鎖 PCRの制限検出を示す図である。
【図７Ａ】DNAがＴＢ/ＮＴＭ ネスト化二本鎖 PCRにより増幅する時のストリップの制限検出を示す図である。
【図７Ｂ】DNAがＴＢ/ＮＴＭ ネスト化二本鎖 PCRにより増幅する時のストリップの制限検出を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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