(57)【要約】      （修正有）【課題】ゴーヤ由来のレクチンをコードする遺伝子及び当該遺伝子を利用したレクチンの生産方法を提供する。【解決手段】以下の(a)〜(c)のいずれか1記載のタンパク質をコードするDNA。(a)ゴーヤ由来のアミノ酸配列に含まれる特定のアミノ酸配列から成るレクチンタンパク質  (b)上記のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成るレクチンタンパク質  (c)上記のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成り、且つ赤血球凝集活性を有するレクチンタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(c)のいずれか1記載のタンパク質をコードするDNA。
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成るタンパク質
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成り、且つ赤血球凝集活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のDNAを有する発現ベクター。
【請求項３】
請求項２記載の発現ベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項４】
請求項３記載の形質転換体を培養することを特徴とする、レクチンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、レクチンの組換え生産に使用できる、レクチンをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチンは、細胞膜複合糖質(例えば、糖タンパク質、糖脂質)の糖鎖に結合することによって、細胞凝集、糖複合体の沈降、分裂誘発、機能活性化、細胞傷害等の作用を有するタンパク質である。様々な動植物がレクチンを有する。
【０００３】
また、植物由来のレクチンの中には、病害微生物を凝集する作用を有するものが存在する(非特許文献１及び２)。従って、当該植物由来のレクチンは病害抵抗性に関する役割を担っている可能性が示唆されている。
【０００４】
一方、ウリ科に属するゴーヤ(「ツルレイシ」とも呼ばれる：Momordica charantia)は、主に九州及び沖縄地方で食用として栽培されている。
【０００５】
これまでの研究において、ゴーヤの種子には赤血球凝集活性を有するレクチンが含まれていることが明らかにされている(特許文献１)。特許文献１には、当該ゴーヤ由来のレクチンが赤血球膜表面上のH抗原に対して特異的な凝集素であることが開示されている。なお、H抗原は、血液型O型のヒトの赤血球膜表面上に存在する。従って、ゴーヤ由来のレクチンは、O型の血液型判定に利用することができる。
【０００６】
しかしながら、ゴーヤ由来のレクチンの全アミノ酸配列及び当該レクチンをコードする遺伝子の塩基配列は、これまでのところ明らかとなっていない。
【０００７】
【特許文献１】特許第3849945号明細書
【非特許文献１】Vania M.M. Meloら, 「Plant Science」, 2005年, 第169巻, p.629-639
【非特許文献２】Ana Paula de A. Boletiら, 「Journal of Agricultural and Food Chemistry」, 2007年, 第55巻, p.2653-2658
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、ゴーヤ由来のレクチンの全アミノ酸配列及び当該レクチンをコードする遺伝子の塩基配列は、これまでのところ明らかとなっていない。
【０００９】
一方、ゴーヤ由来のレクチンは、ハリエニシダ(Ulex europaeus)由来のレクチンと比べ、赤血球凝集の点で高力価であり、優れた血液型判定試薬である(特許文献１)。しかしながら、今まで、ゴーヤ由来のレクチンは天然物であるゴーヤから取得されていた。従って、天候や生産量の変動により、ゴーヤ由来のレクチンを長期にわたり安定的に供給することは難しかった。
【００１０】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、ゴーヤ由来のレクチンをコードする遺伝子を単離するとともに、当該遺伝子を利用したレクチンの生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ゴーヤからレクチンをコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、ゴーヤ由来のレクチンをコードする遺伝子に関する。本発明において、ゴーヤ由来のレクチンをコードする遺伝子としては、配列番号２記載のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA、配列番号２記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA、及び配列番号２記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成り、且つ赤血球凝集活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
【００１３】
また、本発明は、上述したゴーヤ由来のレクチンをコードする遺伝子を有する発現ベクター、当該発現ベクターによって形質転換された形質転換体、及び当該形質転換体を培養することを特徴とするレクチンの生産方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、優れた生産性で、ゴーヤ由来のレクチンを組換え生産できる。また、本発明によれば、天然産物であるゴーヤからの抽出による生産の場合と比較して、ゴーヤ由来のレクチンの生産性が向上するので、当該レクチンの生産の低コスト化を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るDNAは、ゴーヤ由来のレクチンをコードするDNA(以下、「レクチン遺伝子」という。)である。ゴーヤ由来のレクチンは、A抗原、B抗原及びH抗原から成る赤血球膜表面上の凝集原のうち、H抗原に対して特異的に結合し、赤血球を凝集させる。すなわち、本発明に係るレクチン遺伝子によりコードされるレクチンは、H抗原に特異的な抗Hレクチンである。
【００１６】
本発明に係るレクチン遺伝子としては、配列番号２記載のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNAが挙げられる。当該配列番号２記載のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成るタンパク質は、ゴーヤ由来のレクチンである。ゴーヤ由来レクチンは2つのヘテロ又はホモ2量体より形成される4量体であり、2種類のサブユニットを含んでいる。配列番号２記載のアミノ酸配列は、この2種類のサブユニットのアミノ酸配列を含んでおり、一方のサブユニットは配列番号２のアミノ酸番号24から始まるアミノ酸配列を有し、他方のサブユニットは配列番号２のアミノ酸番号287から始まるアミノ酸配列を有する。本発明に係るレクチン遺伝子の一例としては、配列番号１記載の塩基配列から成るDNAが挙げられる。配列番号１記載の塩基配列から成るDNAは、ゴーヤ由来のレクチンの2種類のサブユニットをコードしており、該DNAを発現させることにより、ゴーヤ由来レクチンを得ることができる。
【００１７】
また、本発明に係るレクチン遺伝子としては、配列番号２記載のアミノ酸配列において、1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA、及び配列番号２記載のアミノ酸配列において、1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成り、且つ赤血球凝集活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
【００１８】
さらに、本発明に係るレクチン遺伝子としては、配列番号２記載のアミノ酸配列に対して、80％以上の同一性、好ましくは90％以上の同一性、最も好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列から成り、且つ赤血球凝集活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
【００１９】
また、本発明に係るレクチン遺伝子には、上述したレクチン遺伝子(例えば、配列番号１記載の塩基配列から成るDNA)と相補的な塩基配列から成るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ赤血球凝集活性を有するタンパク質をコードするDNAも含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば5 X SSC(0.75M NaCl、0.75Mクエン酸ナトリウム)、5 X デンハルト試薬(0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清アルブミン)及び0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)から成るハイブリダイゼーション溶液中で、温度が45℃〜65℃、好ましくは55℃〜65℃である。また洗浄ステップにおいては、2 X SSC及び0.1％SDSから成る洗浄溶液中で温度が45℃〜55℃、より好ましくは0.1 X SSC及び0.1％SDSから成る洗浄溶液中で温度が45℃〜55℃である。
【００２０】
本発明に係るレクチン遺伝子によりコードされるレクチンの赤血球凝集活性の確認においては、当該レクチンを血液型O型のヒトの赤血球と反応させる。次いで、陰性対照(例えば、レクチンを反応させていない赤血球)と比較して、赤血球が有意に凝集された場合には、本発明に係るレクチン遺伝子によりコードされるレクチンが赤血球凝集活性を有すると判断することができる。
【００２１】
本発明に係るレクチン遺伝子は、例えば、ゴーヤのゲノムDNAやcDNAを鋳型とし、当該レクチン遺伝子に特異的なプライマーセットを用いたPCRによって増幅し、調製することができる。
【００２２】
以上に説明した本発明に係るレクチン遺伝子によれば、優れた生産性で、ゴーヤ由来のレクチンを組換え生産できる。
【００２３】
ゴーヤ由来のレクチンの組換え生産においては、先ず本発明に係るレクチン遺伝子が形質転換された形質転換体を準備する。当該形質転換のために、本発明に係るレクチン遺伝子を適当なベクターに導入し、発現ベクターを用意する。あるいは、本発明に係るレクチン遺伝子を含むDNA断片(例えば、発現カセットの形態)を形質転換に使用してもよい。
【００２４】
ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミド等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13等のYEp系、YCp50等のYCp系)等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルスベクターやバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターも、ベクターとして用いることができる。
【００２５】
本発明に係るレクチン遺伝子を含む発現ベクターは、宿主において機能的な制御領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等)を適宜含むことができる。発現ベクターにおいて、本発明に係るレクチン遺伝子は、制御領域の制御下に配置される。また、本発明に係るレクチン遺伝子によりコードされるレクチンを他のタンパク質との融合タンパク質として発現させるべく、発現ベクターにおいて、本発明に係るレクチン遺伝子を当該他のタンパク質をコードする遺伝子と機能的に連結させてもよい。さらに、本発明に係るレクチン遺伝子の全長を発現させるか、又は当該遺伝子の一部を発現させるように、発現ベクターに本発明に係るレクチン遺伝子を配置してもよい。
【００２６】
ベクターに、本発明に係るレクチン遺伝子を挿入するには、先ず精製された本発明に係るレクチン遺伝子を含むDNA断片を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに作動可能に連結する方法等が採用される。また、ベクターと本発明に係るレクチン遺伝子のそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、PCR等を用いたin vitro法又は酵母等を用いたin vivo法によって両者を連結する方法であってもよい。
【００２７】
次いで、上述の発現ベクターを宿主中に導入することにより、形質転換体を得ることができる。ここで、宿主としては、例えば、酵母(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))、細菌(例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌)、動物細胞(例えば、COS細胞、Vero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウスL細胞)、昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)、及び植物(例えば、アブラナ科に属する植物)が挙げられる。
【００２８】
酵母への発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００２９】
細菌への発現ベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３０】
動物細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３１】
昆虫細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３２】
植物を宿主とする場合は、植物体全体、植物器官(例えば、葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織(例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞等が用いられる。植物への発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等が挙げられる。
【００３３】
なお、上述の発現ベクターの作製及び形質転換方法に準じて、発現カセット等の本発明に係るレクチン遺伝子を含むDNA断片を用意し、当該DNA断片を用いて形質転換を行うこともできる。
【００３４】
本発明に係るレクチン遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体から調製されたDNAを鋳型とし、本発明に係るレクチン遺伝子に特異的なプライマーを用いて、PCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法を採用してもよい。
【００３５】
次いで、得られた形質転換体を、形質転換に使用した宿主に応じた培地に播種し、定法により培養する。培養終了後、培養物から一般的な方法によって、ゴーヤ由来のレクチンの分取、精製、濃縮等を行う。特に、ガラクトースを結合させたアフィニティー樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いることにより、効率的にゴーヤ由来のレクチンを精製することができる。
【００３６】
以上に説明したように、本発明に係るレクチン遺伝子を用いることで、ゴーヤ由来のレクチンを高収量で生産することができる。また、天然産物のゴーヤからの抽出による生産と比較して、本発明に係るレクチン遺伝子を用いた組換え生産によれば、ゴーヤ由来のレクチンを安定的に、且つ効率的に得ることができる。
【００３７】
得られたゴーヤ由来のレクチンは、ヒトO型赤血球を判定するための抗Hレクチンとして利用することができる。すなわち、得られたゴーヤ由来のレクチンを血液型判定試薬として利用できる。
【００３８】
一方、レクチンは、従来、赤血球凝集活性以外に、免疫賦活活性や腫瘍増強抑制活性を有する(Lavelle et al. Immunology 2000;99:30-7及びKaur et al. Phytochemistry 2005;66:1933-40)。本発明に係るレクチン遺伝子によりコードされるゴーヤ由来のレクチンも、同様の活性を有する可能性がある。従って、当該ゴーヤ由来のレクチンを、免疫賦活剤や腫瘍増強抑制剤等の医薬に使用できる可能性がある。
【００３９】
また、植物由来のレクチンの中には、病害微生物を凝集する効果を有するものが存在する(非特許文献１及び２)。本発明に係るレクチン遺伝子によりコードされるゴーヤ由来のレクチンも、同様の効果を有する可能性がある。従って、当該ゴーヤ由来のレクチンを、植物病害抑制剤に使用できる可能性がある。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ゴーヤ由来のレクチン遺伝子の単離
図１に示すゴーヤの未熟種子、中熟種子及び完熟種子について赤血球凝集活性を測定した。特許文献１記載の方法に準じて各種子より得られた抽出液を試料として用いた。赤血球凝集活性の測定は、2倍希釈法により求めた。すなわち、段階的にダルベッコリン酸緩衝液で2倍希釈した試料に、等量の3％ヒトO型赤血球懸濁液を混合し、室温で30分インキュベートした後、赤血球凝集を肉眼で観察した。また、凝集力価は、この赤血球凝集を起こし得る最終希釈倍率の値である。
【００４１】
その結果、赤血球凝集活性は、未熟種子(受粉後1〜2週)では検出されず、胚が形成される中熟種子(受粉後2〜3週)で凝集力価256〜1024倍、完熟種子(受粉後3週以降)で凝集力価512〜2048倍であった。このように、中熟期以降のゴーヤの種子において、赤血球凝集活性が著しく高まることが明らかとなった。そこで、ゴーヤ由来のレクチン遺伝子の単離に用いる材料として、当該レクチン遺伝子の発現が旺盛であると推定される受粉後2週間の種子を用いた。
【００４２】
一方、レクチンが豊富に含まれると思われるゴーヤの完熟種子から、特許文献１に記載の方法に準じて、粗レクチンをエタノール沈殿法により抽出した。次いで、得られた粗レクチンを、ガラクトース結合樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーに供することで、レクチンを精製した。精製したレクチンをSDS-PAGEに供した。その結果を図２に示す。図２において、レーン1はサイズマーカーであり、レーン2が精製レクチンである。さらに、縦軸に示す数字は、分子量(kDa)である。
【００４３】
図２に示すように、精製レクチンを還元条件下で電気泳動を行った結果、4本のバンドが確認されたことから、ゴーヤ由来のレクチンは4量体であることが判明した。そこで、4量体を構成する各単量体をN末端アミノ酸配列分析に供し、各単量体についてアミノ酸8〜20残基を同定した。この同定された部分アミノ酸配列は、それぞれ2つの単量体間で同一のアミノ酸配列であった（配列番号３及び配列番号４）。従って、4量体から成るゴーヤ由来のレクチンは、2つのヘテロ又はホモ2量体より形成されていると推察された。当該精製レクチンの性質は、ヒトO型赤血球に対して最も凝集力価が高かった点とガラクトースによって凝集が阻害された点で、特許文献１に記載のゴーヤの種子由来のレクチンの性質とほぼ同様であった。
【００４４】
これらの知見に基づき、以下のようにしてゴーヤ由来のレクチン遺伝子を単離した。
1. ゴーヤ種子からの全RNAの抽出とcDNAの合成
ゴーヤ由来のレクチン遺伝子に対応するcDNAの塩基配列を決定するために、受粉後2週間の種子より胚を取り出し、RNAqueous（アンビオン社）を用いて全RNAを抽出した。得られた全RNAとGeneRacerKit（インビトロジェン社）を用いて、cDNAの合成を行った。
2. RACE法によるゴーヤ由来の遺伝子の単離
精製レクチンより得られた部分アミノ酸配列（配列番号４）の中から、コドン縮重の少ない領域を選び出し、当該領域に対応するプライマー（配列番号５）を化学合成した。このプライマーと上記第1節で得られたゴーヤ種子由来のcDNAを用いた3'RACE法を、GeneRacerKitにより行った。その結果、約950bpの増幅断片が得られた。
【００４５】
得られた断片をベクターに導入した。次いで、ビッグダイ・ターミネーター・サイクルシークエンシング・キット（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、当該ベクター中の得られた増幅断片の塩基配列を3130 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ社）にて同定した。これにより該レクチン遺伝子の一部を含むcDNAの塩基配列が得られた。
【００４６】
さらに、この得られた塩基配列に基づいて、プライマー（配列番号６）を作製した。当該プライマーと上記第1節で得られたゴーヤ種子由来のcDNAを用いた5'RACE法を、GeneRacerKitにより行った。その結果、約1.3kbpの増幅断片が得られた。この断片に含まれる塩基配列を、先の方法と同様に同定した。
【００４７】
これらRACE法により得られた配列を統合した結果、配列番号１に示す塩基配列が得られた。また、この塩基配列をコドン表に基づきアミノ酸に変換し（配列番号２）、モチーフ検索を行ったところ、レクチンに保存された領域と、リボソーム不活性化タンパク質に保存された領域が存在した。
【００４８】
また、この変換したアミノ酸配列を、精製レクチンのN末端アミノ酸分析より得られた部分アミノ酸配列（配列番号３及び配列番号４）と比較したところ、配列番号３及び４の部分アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２のアミノ酸番号24から43までのアミノ酸配列、及びアミノ酸番号287から297までのアミノ酸配列と一致した。
【００４９】
以上の結果から、配列番号１に示す塩基配列及びそのコードされているアミノ酸配列は、上述の精製レクチンをコードする遺伝子及びその対応するアミノ酸配列であることが確認された。さらに、当該レクチンタンパク質は、リボソーム不活性化タンパク質としての機能も併せ持つタンパク質（タイプ2リボソーム不活性化タンパク質）であることが明らかとなった。
【００５０】
このように、ゴーヤ由来のレクチン遺伝子として、配列番号１記載の塩基配列から成るDNAが単離された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ゴーヤの未熟種子、中熟種子及び完熟種子の写真である。
【図２】精製レクチンについてのSDS-PAGEの写真である。
【図１】
2009039006.tif 000002
【図２】
2009039006.tif 000003
【配列表】
2009039006000001.app