(57)【要約】【課題】各生体試料から各発光色の正確な定量的結果を得ることができ、その結果、同一の生体試料について多項目の検査を行うことができる発光測定方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、発光色が互いに異なるように発光標識された複数の所定の遺伝子を含む生体試料を作製し、作製した生体試料に当該生体試料外から所定の刺激を与え、所定の刺激が与えられた後の生体試料の発光画像を、発光色および発光強度の両方の関係を各々の発光色ごとに関連付けて撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各々の発光色の発光強度を定量的に測定する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料からの発光を測定する発光測定方法であって、
発光色が互いに異なるように発光標識された複数の所定の遺伝子を含む前記生体試料を作製する作製工程と、
前記作製工程で作製した前記生体試料に当該生体試料外から所定の刺激を与える刺激工程と、
前記刺激工程で前記所定の刺激が与えられた後の前記生体試料の発光画像を、前記発光色および発光強度の両方の関係を各々の前記発光色ごとに関連付けて撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、各々の前記発光色の前記発光強度を定量的に測定する測定工程と、
を含むことを特徴とする発光測定方法。
【請求項２】
前記撮像工程は、前記発光画像の撮像に用いたカメラのダイナミックレンジと前記発光標識するために用いた発光タンパク質の種類とに応じて当該カメラの露出時間を調節して、前記生体試料の前記発光画像を撮像すること
を特徴とする請求項１に記載の発光測定方法。
【請求項３】
前記撮像工程は、前記生体試料の前記発光画像を繰り返し撮像し、
前記測定工程は、前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像に基づいて、各々の前記発光色の前記発光強度の経時変化を定量的に測定すること
を特徴とする請求項１または２に記載の発光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料（例えば細胞を含む試料）を観察する発光イメージングに関し、特に、同一の生体試料について多項目の検査を行う方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体機能解析に用いられる発光酵素であるルシフェラーゼは、その種類に応じて多様な発光色を持つことが知られている。そして、現状では、すり潰された大量の細胞から、異なる各発光色のシグナルをルミノメーターを用いて同一の測定時間で検出している。しかし、各発光色の正確な定量的結果を得ることが難しい。そこで、大量の細胞を１つの溶解溶液にまとめ、複数色の発光酵素を含む細胞中の各発光酵素による相対光量を同時に測定する特許文献１を用いれば、各発光色の正確な定量的結果を得ることが可能となる。
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−２１８７７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来技術では、大量の細胞を１つの溶解溶液にまとめるので、各細胞から各発光色の正確な定量的結果を得ることができず、ゆえに、同一の細胞について多項目の検査を行うことができないという問題点があった。
【０００５】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、各生体試料から各発光色の正確な定量的結果を得ることができ、その結果、同一の生体試料について多項目の検査を行うことができる発光測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者による鋭意検討の結果、一細胞毎の発光色により発光強度の差が大きいことが判明した。しかも、その差は、各発光色に対応する分光フィルタで分光する際のフィルタ毎の透過率の違いを上回るものであり、定量測定やイメージング性能に影響するほどの大きなものであった。そこで、本発明者は、発光色に起因する発光強度の違いを鑑み、発光色および発光強度の両方の関係を発光色毎に関連付けてイメージングまたは解析するようにして、本発明を完成するに至った。具体的には、例えば、ルシフェラーゼの種類とＣＣＤカメラのダイナミックレンジに応じて、イメージングの際にＣＣＤカメラの露出時間を適切な範囲に調節することによって、上述した課題を解決した。
【０００７】
すなわち、上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる発光測定方法は、生体試料からの発光を測定する発光測定方法であって、発光色が互いに異なるように発光標識された複数の所定の遺伝子を含む前記生体試料を作製する作製工程と、前記作製工程で作製した前記生体試料に当該生体試料外から所定の刺激を与える刺激工程と、前記刺激工程で前記所定の刺激が与えられた後の前記生体試料の発光画像を、前記発光色および発光強度の両方の関係を各々の前記発光色ごとに関連付けて撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、各々の前記発光色の前記発光強度を定量的に測定する測定工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】
また、本発明にかかる発光測定方法は、前記に記載の発光測定方法において、前記撮像工程は、その撮像に用いたカメラのダイナミックレンジと前記発光標識するために用いた発光タンパク質の種類とに応じて当該カメラの露出時間を調節して、前記生体試料の前記発光画像を撮像することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明にかかる発光測定方法は、前記に記載の発光測定方法において、前記撮像工程は、前記生体試料の前記発光画像を繰り返し撮像し、前記測定工程は、前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像に基づいて、各々の前記発光色の前記発光強度の経時変化を定量的に測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、発光色が互いに異なるように発光標識された複数の所定の遺伝子を含む生体試料を作製し、作製した生体試料に当該生体試料外から所定の刺激を与え、所定の刺激が与えられた後の生体試料の発光画像を、発光色および発光強度の両方の関係を各々の発光色ごとに関連付けて撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各々の発光色の発光強度を定量的に測定する。これにより、各生体試料から各発光色の正確な定量的結果を得ることができ、その結果、同一の生体試料について多項目の検査を行うことができるという効果を奏する。
【００１１】
本発明によれば、その撮像に用いたカメラのダイナミックレンジと発光標識するために用いた発光タンパク質の種類とに応じて当該カメラの露出時間を調節して、生体試料の発光画像を撮像する。これにより、各生体試料から各発光色の正確な定量的結果を得ることができ、その結果、同一の生体試料について多項目の検査を行うことができるという効果を奏する。
【００１２】
本発明によれば、生体試料の発光画像を繰り返し撮像し、撮像した複数の発光画像に基づいて、各々の発光色の発光強度の経時変化を定量的に測定する。これにより、所定の刺激による各々の所定の遺伝子の発現状態の経時変化を解析することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明にかかる発光測定方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００１４】
まず、本発明にかかる発光測定方法（具体的には撮像工程および解析工程）で用いる発光観察システム１００の構成について、図１、図２および図３を参照して説明する。図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。
【００１５】
図１に示すように、発光観察システム１００は、生体試料１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、発光画像撮像ユニット１０６と、画像解析装置１１０と、で構成されている。微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６をステージ１０４の下側に配置してもよい。これにより、カバー開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断できて発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。発光画像撮像ユニット１０６は、レーザー走査式の光学系であってもよい。
【００１６】
生体試料１０２は、例えば、発光色が互いに異なるように発光関連遺伝子で発光標識された複数の所定の遺伝子を含む生きた細胞である。生体試料１０２には、当該生体試料の撮像直前に、当該生体試料外から所定の刺激（例えば薬物刺激など）が与えられる。
【００１７】
発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、生体試料１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には、（開口数／倍率）２の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６ｂは、生体試料１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された生体試料１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、画像解析装置１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、生体試料１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、当該撮像範囲中に含まれる複数の生体試料１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的には生体試料１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。
【００１８】
ここで、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された生体試料１０２の発光画像（スプリットイメージ）および明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、サンプル１０２から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００１９】
また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された生体試料１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、生体試料１０２から発せられた発光をフィルタ交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００２０】
図１に戻り、画像解析装置１１０は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入出力インターフェース部１２０と、入力装置１２２と、出力装置１２４と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。
【００２１】
記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部１１８は、画像解析装置１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部１２０は、入力装置１２２や出力装置１２４に接続する。ここで、出力装置１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力装置１２４をモニターとして記載する場合がある。）。また、入力装置１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。
【００２２】
制御部１１２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１２は、大別して、発光画像撮像指示部１１２ａと、発光画像取得部１１２ｂと、画像解析部１１２ｃと、解析結果出力部１１２ｄと、で構成されている。
【００２３】
発光画像撮像指示部１１２ａは、通信インターフェース部１１８を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１８を介して取得する。制御部１１２は、発光画像撮像指示部１１２ａを制御して、生体試料１０２の発光画像および明視野画像を繰り返し撮像する。
【００２４】
ここで、ＣＣＤカメラ１０６ｃで生体試料１０２の発光画像を撮像するにあたって、発光色および発光強度の両方の関係を各々の発光色ごとに関連付けておく。換言すると、発光色および発光強度の両方の関係を各々の発光色ごとに関連付けて、生体試料１０２の発光画像を撮像する。
【００２５】
具体的には、ＣＣＤカメラ１０６ｃで生体試料１０２の発光画像を撮像するにあたって、発光画像の撮像に用いたＣＣＤカメラ１０６ｃのダイナミックレンジと発光標識するために用いた発光タンパク質の種類とに応じて当該ＣＣＤカメラの露出時間を調節する。換言すると、発光画像の撮像に用いたＣＣＤカメラ１０６ｃのダイナミックレンジと発光標識するために用いた発光タンパク質の種類とに応じて当該ＣＣＤカメラの露出時間を調節して、生体試料１０２の発光画像を撮像する。
【００２６】
画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した発光画像に基づいて、各々の発光色の発光強度を定量的に測定する。画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した複数の発光画像に基づいて、各々の発光色の発光強度の経時変化を定量的に測定する。解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃでの解析結果を出力装置１２４に出力する。具体的には、解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃで得られた、各々の発光色の発光強度に関する時系列データを、グラフ化して出力装置１２４に表示する。
【実施例】
【００２７】
［マルチカラーレポーターアッセイ（ＡＰ−１遺伝子群の転写応答）］
ＡＰ−１（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）はＦｏｓやＪｕｎ遺伝子群から構成される転写因子で、細胞外からの様々な刺激に対する応答を制御していることが知られている。細胞が刺激を受けると、ｃ−ｆｏｓやｃ−ｊｕｎが活性化し、ｃ−Ｆｏｓ，ｃ−Ｊｕｎタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、複合体を形成してＡＰ−１転写因子として機能し、標的遺伝子のプロモーター領域にあるＡＰ−１結合部位に結合して、下流の遺伝子の転写を誘導する。
【００２８】
本実施例では、ｃ−ｆｏｓとＡＰ−１の各プロモーター制御下においたルシフェラーゼの発現を、発光イメージングシステム“ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ”（オリンパス（株）製）を用いて多色でイメージングすることで、シグナル伝達に伴うＡＰ−１遺伝子群の応答の経時変化を追った。
【００２９】
本実施例における実験の流れ（手順）について、以下に説明する。
［手順１：本発明の作製工程に相当］ｃ−ｆｏｓの活性をモニターするレポーターとして、ＨｅＬａ細胞からクローニングしたｃ−ｆｏｓプロモーター領域をｐＧＬ４．７２（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＭＣＳに挿入し、ｃ−ｆｏｓプロモーター／ＲＬｕｃ発現ベクター（ｃ−ｆｏｓ／ｈＲＬ）を作製した。
［手順２：本発明の作製工程に相当］ＡＰ−１の応答を観察するために、ＴｒａｎｓＬｕｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製）のルシフェラーゼ遺伝子をイリオモテボタル由来のＳＬＧルシフェラーゼ（東洋紡績（株）製）に置換し、ＡＰ−１エンハンサー／ＳＬＧ発現ベクター（ＡＰ−１／ＳＬＧ）を作製した。
［手順３：本発明の作製工程に相当］f３５ｍｍ−ガラスボトムディッシュに播いたＨｅＬａ細胞に、手順１および手順２で作製した２種類のベクターをトランスフェクションして一晩培養し、その後に培地を無血清培地に置き換えてさらに一晩培養した。続いて、培地に、ＥｎｄｕＲｅｎ（最終濃度６０μＭ）およびルシフェリン（最終濃度５００μＭ）を加えて１時間静置した。
［手順４：本発明の刺激工程に相当］培地にＦＢＳ（最終濃度１０％）を加えて細胞へ刺激を行った。
［手順５：本発明の撮像工程に相当］ディッシュをＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷにセットした後、１５分間隔で２０時間に亘り発光画像および明視野画像のタイムラプス撮影を行った。分光フィルタは、ｃ−ｆｏｓ発現解析用としてＢＡ４７０−４９０フィルタを、ＡＰ−１発現解析用としてＢＡ５３０−５５０フィルタを用いた。発光観察条件として、対物レンズの倍率は２０倍、露出時間は１０分（ｃ−ｆｏｓ発現解析用）および５分（ＡＰ−１発現解析用）、ｂｉｎｎｉｎｇは１×１、ＣＣＤカメラはｉＸｏｎ（ＡＮＤＯＲ社製）、である。
［手順６：本発明の測定工程に相当］手順５で撮影した各々のｃ−ｆｏｓ／ｈＲＬ発光画像とそれに対応する明視野画像とを重ね合わせ、その重ね合わせた画像に対して複数のＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定した（図５参照）。また、手順５で撮影した各々のＡＰ−１／ＳＬＧ発光画像とそれに対応する明視野画像とを重ね合わせ、その重ね合わせた画像に対して複数のＲＯＩを指定した（図６参照）。そして、指定した各ＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、その発光強度の経時変化をグラフで表示した（図７および図８参照）。
【００３０】
以上の実験の結果、血清刺激後の各プロモーターの応答を、シングルセルレベルで検出することができた（図５および図６参照）。また、各遺伝子発現の発光強度の経時変化を示す図７および図８との間で最大発現時期を比較すると、ｃ−ｆｏｓの応答が先に始まってから、それに遅れてＡＰ−１の応答が始まることが示唆された（図７および図８参照）。これにより、ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷを用いてマルチカラーイメージングを行うことで、同一細胞におけるシグナル伝達の様子を捉えることができ、その結果、より正確な遺伝子発現の解析が可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
以上のように、本発明にかかる発光測定方法は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。
【図２】発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図３】発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図４】発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。
【図５】血清刺激７時間後に撮像した明視野画像とｃ−ｆｏｓ／ｈＲＬ発光画像との重ね合わせ画像を示す図である。
【図６】血清刺激７時間後に撮像した明視野画像とＡＰ−１／ＳＬＧ発光画像との重ね合わせ画像を示す図である。
【図７】ｃ−ｆｏｓ／ｈＲＬの発光強度の経時変化を表すグラフを示す図である。
【図８】ＡＰ−１／ＳＬＧの発光強度の経時変化を表すグラフを示す図である。
【符号の説明】
【００３３】
１００  発光観察システム
１０３  容器（シャーレ）
１０４  ステージ
１０６  発光画像撮像ユニット
１０６ａ  対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂ  ダイクロイックミラー
１０６ｃ  ＣＣＤカメラ
１０６ｄ  スプリットイメージユニット
１０６ｅ  フィルターホイール
１０６ｆ  結像レンズ
１１０  画像解析装置
１１２  制御部
１１２ａ  発光画像撮像指示部
１１２ｂ  発光画像取得部
１１２ｃ  画像解析部
１１２ｄ  解析結果出力部
１１４  クロック発生部
１１６  記憶部
１１８  通信インターフェース部
１２０  入出力インターフェース部
１２２  入力装置
１２４  出力装置
【図１】
2009133697.tif 000002
【図２】
2009133697.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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