(57)【要約】【課題】  本発明は、砒素等を含む有害化合物を効率的に、系統的に無害化するのに有益な方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の有害化合物の無害化方法は、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害化可能な植物プランクトンに取り込ませて、前記植物プランクトン内で前記有害化合物をアルキル化することにより無害化し、前記無害化物質を前記植物プランクトンの生体外へ排出させることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害化可能な植物プランクトンに取り込ませて、前記植物プランクトン内で前記有害化合物をアルキル化することにより無害化し、前記無害化物質を前記植物プランクトンの生体外へ排出させることを特徴とする有害化合物の無害化方法。
【請求項２】
前記植物プランクトンの培養を、リン酸の存在下で行う請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記リン酸の濃度が、培養液中において、０．１〜５．０mg/Lである請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記植物プランクトンの培養を、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の金属を還元する還元剤の存在下で行う請求項１〜3項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記還元剤が、SH基を有する物質である請求項４記載の方法。
【請求項６】
SH基を有する物質が、還元型グルタチオン（GSH）、システイン、S−アデノシルシステイン、スルフォラファン、チオグリコール酸からなる群から選択される少なくとも１種である請求項５記載の方法。  
【請求項７】
前記植物プランクトンの培養を、炭素源の存在下で行う請求項１〜６項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記炭素源が、糖類又は有機酸である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトースからなる群から選択される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記有機酸が、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、ピルビン酸からなる群から選択される請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記植物プランクトンが、クロレラである請求項１〜７項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記有害化合物が、亜ヒ酸、五酸化砒素、三塩化砒素、五塩化砒素、硫化砒素化合物、シアノ砒素化合物、クロロ砒素化合物、及びその他の砒素無機塩類からなる群から選択される請求項１〜１１項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルキル化が、メチル化である請求項１〜１２項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記メチル化によって、有害化合物をジメチル化合物又はトリメチル化合物とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ジメチル化合物が、ジメチルアルソニルエタノール（DMAE）、ジメチルアルソニルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシン酸、又はアルセノシュガーである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記トリメチル化合物が、アルセノコリン、アルセノベタイン、トリメチルアルセノシュガー又はトリメチルアルシンオキシドである請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害化合物の無害化方法に関し、特に植物プランクトンを利用した有害化合物の無害化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
砒素、アンチモン、セレン等の重金属は、半導体等の工業材料として広く用いられている物質であるが、生物に有毒な物質であることから、環境中に流出することにより生物に与えられる影響が懸念されている。
【０００３】
従来、これらの重金属を除去する方法として、有毒な亜砒酸等の無機砒素を含む廃水にポリ塩化アルミニウム（PAC）等の凝集剤を添加し、該凝集剤と原水中の鉄分に砒素を凝集、吸着し、沈殿させた後、濾過により除去する方法や、活性アルミナ、セリウム系吸着剤により砒素化合物等を吸着させる方法等が一般に知られている。
【０００４】
一方、自然界において、海藻等の海洋生物では、無機砒素が蓄積され、該無機砒素の一部が生理反応により、ジメチル化砒素などの有機砒素化合物へ転換されることが明らかとなっている（非特許文献１）。このように無機ヒ素を取り込み、蓄積する藻類としてクロレラ(Chlorella)等の幾つかの種の微細藻類が知られている（非特許文献２、３）。そして、これらの有機砒素化合物は、一般に、哺乳動物に対して無機砒素よりも低い毒性を示すことが知られている。Dunaliella salinaは、培地に添加するヒ素の種類で藻体への蓄積量が変わり、As(V)＞As(III)＞DMAの順にヒ素の蓄積量が多いことが知られている（非特許文献４）。
【０００５】
また、ヒ素を回収し無毒化する方法としては、緑藻クラミドモナス・ラインハルディのヒ素耐性に関与するＰＴＢ１遺伝子を破壊する事で藻類のヒ素耐性を高め、環境中、排水中のヒ素を藻体内に蓄積させ、ジメチルヒ素として無毒化することが知られている（特許文献１）。この文献には、ヒ素の取込はリン酸の取込と同じ経路を通り、競合的に取込まれるため、リン酸濃度が低いほど、ヒ素の取込が増加し、逆にヒ素濃度が高いほど、リン酸の取込が減少することも記載されている。
【０００６】
一方、微生物を用いて化学兵器や農薬などに含まれる有害な有機ヒ素を無機ヒ素に分解する方法が知られており（特許文献２）、そのほか、ヒ素等の重金属イオンを含む酸性水溶液中において、緑藻類酸性藻を培養することにより、酸性藻の生体内に重金属イオンをとりこませ、重金属イオンを除去する方法も知られている（特許文献３）。
【０００７】
クロレラへのヒ素の取込と培地中のヒ素の残存量を調べた結果、クロレラに蓄積したヒ素は殆どが無機ヒ素でMMA、DMA、TMAが僅かに検出され、培地中には痕跡程度のDMAとTMAが検出されていることも知られている（非特許文献５及び６）。
【０００８】
【非特許文献１】Kaiseet al.、 1998、 Organomet. Chem.、 12 137-143
【非特許文献２】Maeda et al., 1990, Appl. Organomet. Chem., 4, 251-254
【非特許文献３】Gossleret al., 1997, Appl. Organomet. Chem., 11, 57-66
【非特許文献４】Yamaokaet al., 1999, Appl. Organomet. Chem., 13, 89-94
【非特許文献５】Maedaet al., 1992, Appl. Organomet. Chem., 6, 399-405
【非特許文献６】Maedaet al., 1992, Appl. Organomet. Chem., 6, 407-413
【特許文献１】特開２００３−２６５１８６号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９９４５号公報
【特許文献３】特開平８−２０６６８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、濾過、吸着等を利用した上述の重金属を除去する方法では、依然として有害なままである無機砒素等の有害化合物を含んだ汚泥、及び当該有害化合物が吸着されている吸着剤を、当該有害化合物が外部に漏れないようにコンクリート等で密封するなどした上で保管するか又は埋め立てる必要があり、保管場所、埋め立て地用の広いスペースを要することから、大量処理が困難であるという問題があった。
【００１０】
また、上記の海洋生物に無機砒素を取り込ませても、取り込まれた無機砒素の一部しか有機砒素化合物とならず、有害な無機砒素が依然として海洋生物体内に蓄積されているという問題がある。
【００１１】
また、上記特許文献１には、砒素の取り込みについて詳細に記載されているものの、培養液など微生物の生体外へ無毒化されたヒ素を排出させる点について考慮されていない。上記特許文献２には、ジメチルアルシン酸などは無機ヒ素より毒性が低く、メチル化された有機ヒ素を無機ヒ素にすることは逆に毒性を高めるという問題がある。
【００１２】
また、上記特許文献３及び非特許文献４には、無害化された物質を微生物の生体外へ排出させる点について記載がない。
【００１３】
さらに、上記非特許文献５及び６においては、培地中のメチル化されたヒ素が極微量で検出されているが、工業的に無害化処理を達成し得るほどの量とは認められず、少しも無害化できていないケースもあり、無機砒素の無害化について有効なデータを示すものではない。
【００１４】
そこで、本発明は、上記問題点を解決すべく、砒素等を含む有害化合物を効率的に、系統的に無害化するのに有益な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するために、本発明者らは、クロレラの培養と有害化合物の無害化との関係について鋭意検討した結果、本発明を見出すに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の有害化合物の無害化方法は、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害化可能な植物プランクトンに取り込ませて、前記植物プランクトン内で前記有害化合物をアルキル化することにより無害化し、前記無害化物質を前記植物プランクトンの生体外へ排出させることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記植物プランクトンの培養を、リン酸の存在下で行うことを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記リン酸の濃度が、培養液中において、０．１〜５．０mg/Lであることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記植物プランクトンの培養を、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の金属を還元する還元剤の存在下で行うことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記還元剤が、SH基を有する物質であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、SH基を有する物質が、還元型グルタチオン（GSH）、システイン、S−アデノシルシステイン、スルフォラファン、チオグリコール酸からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。  
【００２２】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記植物プランクトンの培養を、炭素源の存在下で行うことを特徴とする。
【００２３】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記炭素源が、糖類又は有機酸であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトースからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記有機酸が、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、ピルビン酸からなる群から選択されることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記植物プランクトンが、クロレラであることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記有害化合物が、亜ヒ酸、五酸化砒素、三塩化砒素、五塩化砒素、硫化砒素化合物、シアノ砒素化合物、クロロ砒素化合物、及びその他の砒素無機塩類からなる群から選択されることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記アルキル化が、メチル化であることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記メチル化によって、有害化合物をジメチル化合物又はトリメチル化合物とする。
【００３０】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記ジメチル化合物が、ジメチルアルソニルエタノール（DMAE）、ジメチルアルソニルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシン酸、又はアルセノシュガーであることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記トリメチル化合物が、アルセノコリン、アルセノベタイン、トリメチルアルセノシュガー又はトリメチルアルシンオキシドであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の有害化合物の無害化方法は、有害化合物、特に、砒素、アンチモン、セレンなどを含有する有害化合物を、容易かつ簡便にアルキル化することにより、無害化を達成できるという有利な効果を奏する。また本発明の方法によれば、有害化合物を限りなく無害化することができるので、保管場所等の広いスペースを必要としないという有利な効果を奏する。また、本発明の方法によれば、植物プランクトンの細胞内に無機砒素等の有害化合物を蓄積させるのではなく、培養液中にアルキル化砒素等を排出し、環境中の有害化合物をより毒性の低い物質へ、より簡便に変換させることが可能であるという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の有害化合物の無害化方法は、有害化合物を無害化可能な植物プランクトンに取り込ませて、前記植物プランクトン内で前記有害化合物をアルキル化することにより無害化し、前記無害化物質を前記植物プランクトンの生体外へ排出させる。これは、植物プランクトンの培養を続けることにより、前記植物プランクトンの体内へ取り込まれた有害化合物が、アルキル化、より好ましくは、メチル化されることによって、より毒性が低い無害化物質へ変換され、最終的に、当該無害化物質は、生体外へ排出させることができるので、無害化システムの工業的利用が可能である。生体からの煩雑な抽出操作も必要がなく、より簡便な方法である。
【００３４】
ジメチル化されたヒ素を得る効率としては、クロレラ中に蓄積させる方法もあるが、メチル化を促進させると培地への排出効率が高まり、クロレラ藻体への蓄積量より、培地排出される量が多いため、培地に排出させて無機ヒ素を無毒化する本発明の方法によるものが効率的であると考えられる。  
【００３５】
ここで有害化合物としては、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有するものを挙げることができる。また、本明細書において、有害化合物とは、環境中に流出し、生物に暴露された際に、何らかの悪影響を生物に与える虞がある化合物を意味する。
【００３６】
前記有害化合物のうち砒素を含有する有害化合物としては、亜ヒ酸、五酸化砒素、三塩化砒素、五塩化砒素、硫化砒素化合物、シアノ砒素化合物、クロロ砒素化合物、及びその他の砒素無機塩類等が挙げられる。これらの砒素は、例えばLD50(mg/kg)（マウスにおける50％致死量）が20以下であり、一般に生物に対して有毒な値である。
【００３７】
また、アンチモンを含有する有害化合物としては、三酸化アンチモン、五酸化アンチモン、三塩化アンチモン、五塩化アンチモン等が挙げられる。
【００３８】
さらに、セレンを含有する有害化合物としては、二酸化セレン、三酸化セレン等が挙げられる。
【００３９】
また、本発明において、植物プランクトンとは、上記有害化合物を無害化することができれば特に限定されるものではなく、当該植物プランクトンとしては、クロレラなどの淡水性微細藻類、ナノクロロプシス、スピルリナ、ドナリエラ等の海洋性微細藻類、海草類および海苔などを挙げることができる。無機砒素を回収してメチル化するという効果を達成できる限り、他の植物プランクトンを使用することも可能である。下記の実施例において使用しているクロレラは一般に市販されており工業化に適しているので、本発明においてクロレラを使用することは特に好適な態様である。すなわち、クロレラは機能性食品や栽培漁業の稚魚の飼料として使用されており、大量培養技術が確立しており、工業的に無機ヒ素を無毒化することに適している。しかし、本発明で使用する植物性プランクトンは、溶液中に含まれる無機砒素を短時間で溶液から吸収する効果を有するものであれば、クロレラ以外のものであってもよい。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様において、植物プランクトンの培養を、リン酸の存在下で行う。これは、植物プランクトンの安定した生育において必須だからである。すなわち、リン酸は核酸、ATP、細胞膜などに必須であり、これを供給しつつ培養することにより、より砒素等の有害化合物の取り込み、及びアルキル化砒素などの無害物質の排出が効率的に行われるからである。
【００４１】
リン酸の濃度については、植物プランクトンの種類、培養条件、有害化合物の種類等により特に限定されるものではないが、リン酸の濃度としては、クロレラへの無機砒素の取込効率を高めるという観点から、培養液中において、０．１〜５．０mg/Lとすることが好ましい。
【００４２】
このようにリン酸の存在下としたのは、砒素等はリン酸と似た性質をもち、クロレラのリン酸取り込みと同じ経路で砒素の取り込みを行うため、培地中のリン酸濃度が砒素等の濃度と比較して低いと、砒素の取り込みが促進され、ひいては、有害化合物の無害化を効率的に行うことができる反面、リン酸が無添加では、クロレラの必須成分が供給されないため生育できないことも考えられるからである。
【００４３】
一般に、クロレラ等の植物プランクトンは、取り込んだ砒素をメチル化するメチル化能を有するが、低リン酸濃度で無機砒素の取り込みを促進させると、無機砒素の毒性で生育が悪くなったり、死滅することが考えられる。しかし、植物プランクトンに応じた適当なリン酸の存在下で、培養を行うことにより、取り込まれた砒素をアルキル化し、植物プランクトンの生体外、例えば培地等へ排出することができ、植物プランクトン中の有害化合物の蓄積量も減少し、毒性も発現することがない。したがって、このような条件下では、有害化合物を取り込んだ植物プランクトンの安定した培養が可能であり、ひいては、有害化合物の無害化を工業的に達成することが可能となる。
【００４４】
本発明においては、前記植物プランクトンの培養を、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の金属を還元する還元剤の存在下で行うことも可能である。このような還元剤の存在により、アルキル化をさらに促進することができる。さらにまた、本発明者らの鋭意研究により、還元剤の存在下では、植物プランクトン内でアルキル化されて無害化された物質が、当該植物プランクトンの生体外への排出を促進することが見出されたことによるものである。無害化された物質が、植物プランクトン外へ排出されれば、植物プランクトンを抽出して無害化物質を得るよりも、作業が簡便であり、また、植物プランクトンの生育管理を行うことさえすれば、有害化合物の無害化の工業的なシステムを提供することができる。  
【００４５】
本発明において、前記還元剤としては、メチル化砒素などへの変換を促進できるという観点から、SH基を有する物質であることが好ましい。SH基を有する物質として、還元型グルタチオン（GSH）、システイン、S−アデノシルシステイン、スルフォラファン、チオグリコール酸からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
しかしながら、SH基を持たない酸化型グルタチオン（GSSG）であっても植物プランクトン中又は当該植物プランクトンを培養している培地中などで、還元型グルタチオンになるケースもあり、このようなことを考慮すると、SH基を持たない酸化型グルタチオンの存在下であっても、十分にメチル化砒素などへの変換を促進し得る。
したがって、本発明において、「還元剤の存在下」とは、還元剤そのものを培養液等へ添加する場合の他、植物プランクトン内や培養液内等で変化し還元剤として作用する物質を培養液へ添加する場合をも含む概念を意図する。  
【００４６】
さらに、本発明において、前記植物プランクトンの培養を、炭素源の存在下で行うことが好ましい。クロレラなどの植物プランクトンは取込んだ無機ヒ素をメチル化する能力を持っているが、メチル基のソースとして大気中の二酸化炭素を光合成により取込み、メチル化に利用している。しかし、光合成による二酸化炭素の利用のみではメチル化の効率が低く、藻体内に無機ヒ素が多く残留してしまう。そこで、メチル化に不足する炭素源を培養液に添加して培養することで効率よく炭素源を取込み、メチル化に利用できるようになることを本発明者らは見出したものである。さらに炭素源を添加して培養することで高密度に培養でき、単位培地あたりから得られる藻類の総量が増え、ヒ素の取込総量、メチル化量も大きく向上するという付随的な効果も相乗的に作用し、本発明の効率的無害化を達成している。
【００４７】
すなわち、メチル化の促進には炭素源を培養液に添加して培養することでメチル化に必要な炭素源として効率よくメチル化に利用できるようになる。さらに炭素源を添加して培養することで高密度に培養でき、培地へのジメチル化ヒ素の排出量も増える。
これは、グルコース添加により植物プランクトン量が増える事により培地への無害化物質の排出量が増える要因の1つであると考えられるが、培地への排出（植物プランクトンの生体外）は、アルセノシュガーの1種であるUN8（以下の実施例を参照）が主であり、植物プランクトン内でUN８までメチル化させるのにグルコースが、メチル基の炭素の供給源として機能していると推測される。
以上のことから、植物プランクトンの生体外へアルキル化無害化物質が排出には、植物プランクトンの培養を継続させつづけることのほか、リン酸、GSHなども重要である。
しかしながら、アルセノシュガーの例をとると、アルセノシュガーの1種であるUN８は植物プランクトン内には少なく、大部分が植物プランクトン外（培地中）に存在することから、UN８を作る要因が培地への排出の要因になっていると推測される。
【００４８】
本発明においては、炭素源の供給下での条件は、特に限定されることはなく、例えば、光合成は必ずしも必要ではなく、暗所でも明所でも実施することが可能である。暗所の培養では、事前に明所で培養し、対数期後期程度まで培養した後、炭素源とヒ素を添加し、暗所で培養しヒ素のメチル化を行うことも可能である。
【００４９】
ここで、炭素源としては、特に限定されるものではないが、例えば、糖類又は有機酸などを挙げることできる。糖類の例としては、特に限定されるものではないが、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトース等を挙げることができる。有機酸の例としては、特に限定されるものではないが、例えば、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、ピルビン酸等を挙げることができる。炭素源の量としても、特に限定されないが、より効率的に、有害化合物の無毒化を達成するという観点から、グルコースの場合、１〜１００ｇ／Ｌの濃度範囲、酢酸ナトリウムの場合、１〜１００ｇ／Ｌの濃度範囲が好ましい。
【００５０】
また、本発明においては、アルキル化、好ましくは、メチル化によって、有害化合物をジメチル化合物又はトリメチル化合物とする。ジメチル化合物としては、ジメチルアルソニルエタノール（DMAE）、ジメチルアルソニルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシン酸、又はアルセノシュガーなどを挙げることができる。また、トリメチル化合物としては、アルセノコリン、アルセノベタイン、トリメチルアルセノシュガー又はトリメチルアルシンオキシドなどを挙げることができる。これは、無機砒素に比較して、極めて毒性が低く、しかも自然界において比較的安定である。
【００５１】
また、工業的な手法の一つとしてアルギン酸ビーズ等の中に固定化した植物プランクトンを用いて無機ヒ素を無毒化することができる。固定化する方法としては、担体結合法、架橋法、包括法などを挙げることができる。培地などへ物理的化学的吸着により吸着させて固定化した簡易な固定化方法を用いてもよい。
【００５２】
固定化微生物を用いることで以下の利点がある。
１）微生物固定化ビーズと溶液の分離が容易になる、
２）微生物固定化ビーズは再利用が可能である、
３）処理するヒ素等の有害化化合物の量にあわせて、微生物固定化ビーズの投入量が自由に調整できる、などが考えられる。
【００５３】
固定化剤としてはアルギン酸の他、ゼラチン、ポリアクリルアミド、寒天、アガロース、スターチ、デキストリン、カラギーナン、キトサン、ペクチン及びポリビニルアルコールなどが利用可能である。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明の実施例を説明するが、下記の実施例は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１
グルタチオン（ＧＳＨ）の有無とリン酸濃度の影響
（１）クロレラの培養
Bold's Basal (BB) Mediumで対数増殖期まで前培養したクロレラ（Chlorella vulgaris  IAM C-629株）を改変した150mlのBold's Basal (BB) Mediumに１×１０5cells/mlとなるように植菌し、蛍光灯照射下（４０００Ｌｕｘ、２４ｈｒ照射）、温度２５℃、１６８時間静置培養した。改変したBold's Basal (BB) Mediumは硝酸ナトリウムを２倍、グルコースを１０ｍＭ、ヒ酸を１ｐｐｍとなるように添加し、リン酸水素二カリウムおよびリン酸二水素カリウムを４倍、１倍、１／４、１／１６の濃度とすることで調整し、ＧＳＨ（シグマ社製）１ｍＭとＧＳＨ無添加で比較した。
【００５５】
（２）ヒ素取込試験
培地に金属ヒ素として１ｐｐｍとなるように３価の無機ヒ素として亜ヒ酸、５価の無機ヒ素としてヒ酸を添加し、蛍光灯照射下（４０００Ｌｕｘ、２４ｈｒ照射）、温度２５℃、静置培養することで、クロレラへのヒ素の取込試験を実施した。
【００５６】
（３）培地中のリン酸、硝酸、グルコース濃度測定
培地中のリン酸、硝酸およびグルコースの濃度は遠心分離により培地上清を調整し、MERCK  RQフレックスと比色試験紙リフレクトクアントにより定量した。各成分の測定下限はリン酸５ｍｇ／Ｌ  ＰＯ４３−（表中の表記はＰＯ４）、硝酸５ｍｇ／Ｌ  NO3−（表中の表記はNO3）、グルコース１ｍｇ／Ｌである。
【００５７】
（４）ヒ素含有量測定
クロレラおよび培地中の無機ヒ素および有機ヒ素は、ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ（高速液体クロマトグラフ装置Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００を直接オンラインで接続した誘導結合プラズマイオン質量分析装置Ａｇｉｌｅｎｔ  ７５００ｃｅ）で、標準サンプルと、反応性生物の保持時間を比較することにより、定性、定量分析を行った。
【００５８】
（５）ヒ素分析条件
有機ヒ素化合物の標準サンプルとして、ＭＭＡ、ＤＭＡ、ＴＭＡＯ、ＡＢ、ＡＣは、トリケミカル研究所の試薬を、無機ヒ素の標準サンプルとしては、Ａｓ（ＩＩＩ）、Ａｓ（Ｖ）の和光純薬特級試薬のナトリウム塩を用いた。各ヒ素化合物の１００ｍｇ／１００ｍＬの標準溶液は、超純水（ミリポア社）で希釈して調整した。
〔略号〕
Ａｓ（III）：無機三価ヒ素
Ａｓ（Ｖ）：無機五価ヒ素
ＭＭＡ：モノメチルアルソン酸
ＤＭＡ：ジメチアルシン酸
ＴＭＡＯ：トリメチルアルシンオキシド
ＡＢ：アルセノベタイン（トリメチルアルソニウム酢酸）
【００５９】
ＩＣＰ−ＭＳ装置条件としては以下のようであった。
ＲＦ  forward
power： １．６ｋＷ
ＲＦ  reflect
power：  ＜１Ｗ
Carrier gas flow：   Ar 0.75L/min
Sampling 8.5mm 
Monitoring mass：   m/z=75 and 35 internal
standard m/Z=71
Dwell time：    0.5 sec 
0.01sec 0.1sec
Times of scan：   1 time
【００６０】
ＨＰＬＣ条件
溶離液：５ｍＭ硝酸／６ｍＭ硝酸アンモニウム／1.5ｍＭピリジンジカルボン酸
溶離液流速：０．４ｍＬ／分
注入量：２０μＬ
カラム：陽イオン交換カラム  Shodex RSpak NN-614(150mm×4.6mm i.d.)
カラム温度：４０度
【００６１】
（６）ヒ素取込みを行ったクロレラ試料の調整
クロレラを含む培養液を遠心分離し、湿重量約１００ｍｇとなるように調整したクロレラにメタノール：純水＝１：１溶液５００μLを添加し、ペレット状のクロレラを超音波分散した後、室温で１２時間以上抽出処理を行った。ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳの測定には抽出液を超純水で希釈し、０．４５μｍのメンブランフィルターで粒子を除去し測定試料とした。
【００６２】
（７）ヒ素を添加した培地試料の調整
クロレラを含む培養液を遠心分離し、培養液上清を分離した。ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳの測定には培地上清を超純水で希釈し、０．４５μｍのメンブランフィルターで粒子を除去し測定試料とした。
【００６３】
（８）クロレラの生育結果
表１および図１にリン酸添加量とGSH添加有、無によるクロレラの生育結果を示す。
【表１】
2009154029.tif 000002
無機ヒ素１ｐｐｍ存在下では培地へのリン酸添加濃度が低いと生育が阻害され、生育量が低くなった。これに対し、ＧＳＨを添加することで、リン酸の初期添加量１／４までは生育が阻害されなかった。
【００６４】
（９）クロレラ中の化学種別ヒ素量の測定結果
表２および図２にGSHを添加して培養したクロレラ中の化学種別ヒ素量の測定結果を示す。
【表２】
2009154029.tif 000003
リン酸の添加濃度が１／４以下では培養終了時に培地中のリン酸が枯渇したことでクロレラのヒ素取り込み量が増加し、ＵＮ１、Ａｓ(V)、ＭＭＡ、ＵＮ２、Ａｓ(III)、ＵＮ４、ＤＭＡ、ＵＮ１３、ＵＮ８、ＵＮ１４の増加が顕著であった。一方、培地にリン酸が残存している条件ではヒ素の取り込み量は同等であった。
【００６５】
表３および図３にＧＳＨを無添加で培養したクロレラの測定結果を示す。
【表３】
2009154029.tif 000004
ヒ素の毒性により生育が阻害された結果、リン酸初期添加濃度１／４では培養後のリン酸が残存した。クロレラ中の化学種別ヒ素量はＧＳＨ添加条件と同様の傾向が得られ、リン酸の添加濃度を１／４以下ではクロレラのヒ素取り込み量が増加し、ＵＮ１、Ａｓ(V)、ＭＭＡ、ＵＮ２、Ａｓ(III)、ＵＮ４、ＤＭＡ、ＵＮ１３、ＵＮ８の増加が顕著であった。一方、培地にリン酸が残存している条件ではヒ素の取り込み量は同等であった。
【００６６】
（１０）培地中の化学種別ヒ素量の測定結果
表４および図４にＧＳＨを添加して培養した培養後の培地成分の測定結果を示す。
【表４】
2009154029.tif 000005
リン酸の添加濃度が低いほど、ＵＮ８の排出量が顕著に増加し、これに対応して培地中の無機ヒ素量が減少した。これはリン酸が培地中で枯渇する事で、クロレラへのヒ素の取込が増え、取込んだヒ素をＵＮ８に変換し、培地中に排出したと考えられる。
【００６７】
表５および図５にＧＳＨを無添加で培養した培養後の培地成分の測定結果を示す。
【表５】
2009154029.tif 000006
培地中のリン酸が培地中で枯渇した試料ではＵＮ８の排出量が顕著に増加し、培地中の無機ヒ素量が減少した。しかし、ＧＳＨを添加した場合に比べ、ＵＮ８の培地への排出量は１／３程度であり、ＧＳＨがＵＮ８への変換と排出を促進する結果となった。
【００６８】
（１１）培地中の未同定成分の確認
培養後の培地（実施例１の試料４）と等量の４Ｎ−ＮａＯＨを添加し、１００℃で３時間加熱分解処理することで藻類が合成する糖鎖が結合したジメチル化ヒ素の糖鎖の切断を行った。糖鎖が切断されたジメチル化されたヒ素はＤＭＡとして検出が可能となる。アルカリ加熱処理の結果、培地中に最も多く排出されるＵＮ８が減少し、ＤＭＡが増加した。このことよりＵＮ８は糖鎖が結合したジメチル化されたアルセノシュガーと推定された。
【００６９】
（１２）クロレラ中の未同定成分の確認
クロレラ（実施例３の試料２３）約１００ｍｇに４Ｎ−ＮａＯＨを添加し、１００℃で３時間加熱分解処理することで藻類が合成する糖鎖が結合したジメチル化ヒ素の糖鎖の切断を行い、メタノール抽出した成分と比較した。アルカリ処理によりＵＮ１、ＵＮ２、ＵＮ８が減少し、ＭＭＡ、ＤＭＡが増加しており、クロレラ中のヒ素はメチル化またはジメチル化された形態が多いと推定された。
【００７０】
（１３）クロレラおよび培地中のヒ素総量
表６及び図６にリン酸添加量とGSH添加有無によるクロレラおよび培地中のヒ素総量を無機ヒ素と無機ヒ素以外をメチル化ヒ素の総量として示す。
【表６】
2009154029.tif 000007
クロレラ中のメチル化ヒ素は培地中のリン酸が枯渇した条件で増加した。また、表７は、クロレラ中成分のアルカリ処理による確認を示す。
【表７】
2009154029.tif 000008
さらに、表８にリン酸添加量とGSH添加有無によるクロレラ及び培地中の砒素総量の結果を示す。
【表８】
2009154029.tif 000009
表７及び図７から明らかなように、NaOH処理で糖鎖切断した結果、MMA、DMAが増加していることから、UN８は、何らかのメチル化砒素であり、UN８が生成していることによって、有害化合物が無害化されていることが確認できる。
培地中のメチル化ヒ素も培地中のリン酸が枯渇した条件で増加した。その際、メチル化ヒ素量はクロレラへ蓄積される量より、培地中へ排出される量の方が多く、その大部分がUN８であった。さらにGSHを添加することで培地へのメチル化ヒ素の排出が多くなった。メチル化ヒ素（UN8）を得るにはクロレラへの蓄積より、培地に排出させる方が効率が高いことが示された。
【００７１】
実施例２
培地排出量の経時変化
（１）クロレラの培養
Bold's Basal (BB) Mediumで対数増殖期まで前培養したクロレラ（Chlorella vulgaris  IAM C-629株）を改変した150mlのBold's Basal (BB) Mediumに１×１０5cells/mlとなるように植菌し、蛍光灯照射下（４０００Ｌｕｘ、２４ｈｒ照射）、温度２５℃、で静置培養し、経時的にサンプリングを行った。改変したBold's Basal (BB) Mediumは硝酸ナトリウムを２倍、グルコースを１０ｍＭ、ヒ酸を１ｐｐｍとなるように添加し、リン酸水素二カリウムおよびリン酸二水素カリウムを１／１０の濃度とし、ＧＳＨ１ｍＭとＧＳＨ無添加で比較した。分析試料の調整および分析は前記と同様の方法で実施した。
【００７２】
（２）クロレラの生育結果
表９および図８に初期リン酸添加濃度１／１０の条件下でGSH添加有、無で培養したクロレラの生育の経時変化を示す。
【表９】
2009154029.tif 000010
ＧＳＨ１ｍＭを添加した培養は無添加に比べ生育が良く、無機ヒ素の毒性の影響が少ない結果となった
【００７３】
（３）培地中の化学種別ヒ素量の測定結果
表１０および図９にＧＳＨを添加して培養した培地成分の経時変化を示す。
【表１０】
2009154029.tif 000011
培養開始後１２０時間で培地中のリン酸が枯渇し、その後、経時的にＵＮ８の培地への排出量が増加し、培養１６８時間では培地中の無機ヒ素の４８％がＵＮ８に変換され、２４０時間では５５％がＵＮ８に変換された。これに対応して培地中の無機ヒ素量が減少した。
【００７４】
表１１および図１０にＧＳＨを無添加で培養した培地成分の経時変化を示す。
【表１１】
2009154029.tif 000012
培養開始後１２０時間で培地中のリン酸が枯渇したが、ＵＮ８の培地への排出量は培養１４４時間以降で確認された。培養１６８時間では培地中の無機ヒ素の１３％がＵＮ８に変換された。これに対応して培地中の無機ヒ素量が減少した。ＧＳＨ添加に比べ１／４ではあるがＵＮ８を排出した。
【００７５】
実施例３
グルタチオン濃度の影響
（１）クロレラの培養
Bold's Basal (BB) Mediumで対数増殖期まで前培養したクロレラ（Chlorella vulgaris  IAM C-629株）を改変した150mlのBold's Basal (BB) Mediumに１×１０5cells/mlとなるように植菌し、蛍光灯照射下（４０００Ｌｕｘ、２４ｈｒ照射）、温度２５℃、１６８時間静置培養した。改変したBold's Basal (BB) Mediumはリン酸水素二カリウムおよびリン酸二水素カリウムを１／１０、硝酸ナトリウムを２倍、グルコースを１０ｍＭ、ヒ酸を１ｐｐｍとなるように添加し、ＧＳＨを０、０．０１、０．１、１mＭの濃度とすることで調整した。分析試料の調整および分析は前記と同様の方法で実施した。
【００７６】
（２）クロレラの生育結果
表１２および図１１にＧＳＨ添加濃度によるクロレラの生育結果を示す。
【表１２】
2009154029.tif 000013
リン酸初期添加濃度１／１０の条件下では培養１６８時間で培地中のリン酸は全ての条件で枯渇した。生育量はＧＳＨの添加量が高いほど増加し、無機ヒ素による生育阻害が抑制された。
【００７７】
（３）クロレラ中の化学種別ヒ素量の測定結果
表１３および図１２にＧＳＨ濃度を変えて培養したクロレラ中の化学種別ヒ素量の測定結果を示す。
【表１３】
2009154029.tif 000014
ＧＳＨの添加濃度が高いほど、ＭＭＡ、ＵＮ２、ＵＮ４、ＤＭＡ、ＵＮ１３、ＵＮ８、ＵＮ１４が増加し、総ヒ素量も高くなった。
【００７８】
（４）培地中の化学種別ヒ素量の測定結果
表１４および図１３にＧＳＨ濃度を変えて培養した培養後の培地成分の測定結果を示す。
【表１４】
2009154029.tif 000015
ＧＳＨの添加濃度が高いほど、ＵＮ８の排出量が顕著に増加し、培地中の無機ヒ素量が減少した。ＧＳＨ濃度１ｍＭでは培養１６８時間で培地中の無機ヒ素の５０％がＵＮ８に変換された。
【００７９】
（５）クロレラおよび培地中のヒ素総量
表１５にクロレラおよび培地中のヒ素総量を無機ヒ素と無機ヒ素以外をメチル化ヒ素の総量として示す。
【表１５】
2009154029.tif 000016
培養後のリン酸は全てのGSH濃度の条件で枯渇しており、クロレラ中へのメチル化ヒ素の蓄積と培地への排出が確認されたGSH無添加と０．０１mＭ添加条件ではメチル化ヒ素のクロレラ中蓄積と培地排出に大きな差は無いが、GSH０．１mＭ以上の添加ではクロレラ中蓄積および培地への排出はGSH濃度の増加ともに増大した。その際、メチル化ヒ素量はクロレラへ蓄積される量より、培地中へ排出される量の方が多く、その大部分がUN8であった。メチル化ヒ素（UN8）を得るにはクロレラへの蓄積より、培地に排出させる方が効率が高いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の方法は、砒素等を含む有害化合物の無毒化をより実用的に、工業的に提供することが可能である。砒素等を含む有害化合物は、アルキル化によって、より無害な化合物に変換され、当該無害化合物は、極めて安定でかつ安全であるので、広く産業廃棄物の処理等の分野、汚泥、土壌の環境保護の分野において極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、リン酸添加量とGSH添加有、無によるクロレラの生育結果を示す図である。
【図２】図２は、GSHを添加して培養したクロレラ中の化学種別ヒ素量の測定結果を示す図である。
【図３】図３は、ＧＳＨを無添加で培養したクロレラの測定結果を示す図である。
【図４】図４は、ＧＳＨを添加して培養した培養後の培地成分の測定結果を示す図である。
【図５】図５は、ＧＳＨを無添加で培養した培養後の培地成分の測定結果を示す図である。
【図６】図６は、リン酸添加量とGSH添加有無によるクロレラおよび培地中のヒ素総量を無機ヒ素と無機ヒ素以外をメチル化ヒ素の総量として示す図である。
【図７】図７は、クロレラ中成分のアルカリ処理による化学種別砒素量の結果を示す。
【図８】図８は、初期リン酸添加濃度１／１０の条件下でGSH添加有、無で培養したクロレラの生育の経時変化を示す図である。
【図９】図９は、ＧＳＨを添加して培養した培地成分の経時変化を示す図である。
【図１０】図１０は、ＧＳＨを無添加で培養した培地成分の経時変化を示す図である。
【図１１】図１１は、ＧＳＨ添加濃度によるクロレラの生育結果を示す図である。
【図１２】図１２は、ＧＳＨ濃度を変えて培養したクロレラ中の化学種別ヒ素量の測定結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＧＳＨ濃度を変えて培養した培養後の培地成分の測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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