(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍細胞検出のための診断手段の提供。【解決手段】抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体、エピトープ結合領域を含む抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のフラグメント、抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含む遺伝子組み換え抗体、抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含むヒト化抗体またはその組み合わせ、のうち一つを含む、免疫撮像技術を用いた腫瘍細胞の検出のための免疫造影剤であって、該抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系ＩＣＬＣ  ＰＤ０５００６によって作られることを特徴とする、免疫造影剤およびそれに対応する組成物およびキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体、
エピトープ結合領域を含む抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のフラグメント、
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含む遺伝子組み換え抗体、
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含むヒト化抗体またはその組み合わせ、
のうち一つを含む、免疫撮像技術を用いた腫瘍細胞の検出のための免疫造影剤であって、
該抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系ＩＣＬＣ  ＰＤ０５００６によって作られる免疫造影剤。
【請求項２】
免疫撮像技術がガンマ線カメラ撮像技術、ＰＥＴ技術およびＭＲＩ技術の中から選択される、請求項１に記載の免疫造影剤。
【請求項３】
検出可能なシグナル伝達部分に直接または間接結合されている、請求項１に記載の免疫造影剤であって、該検出可能なシグナル伝達部分が活性化されているまたは活性化可能である免疫造影剤。
【請求項４】
続いて検出可能なシグナル伝達物質に結合するのに適した分子に結合されている、請求項１に記載の免疫造影剤であって、該検出可能なシグナル伝達物質が活性されているかまたは活性化可能である免疫造影剤。
【請求項５】
検出可能なシグナル伝達部分が、ガンマ線カメラ造影可能試薬、ＰＥＴ造影可能試薬、ＭＲＩ造影可能試薬の中から選択される、請求項３または４に記載の免疫造影剤。
【請求項６】
ガンマ線カメラ造影可能試薬が３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９９ｍＴＣ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、および２０１Ｔｌ、１８６Ｒｅ、１７７Ｌｕから選択される、請求項５に記載の免疫造影剤。
【請求項７】
ＰＥＴ造影可能試薬が８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、７６Ｂｒ、８６Ｙ、１８Ｆ、６８Ｇａ、４５Ｔｉから選択される、請求項５に記載の免疫造影剤。
【請求項８】
ＭＲＩ造影可能試薬がＧａ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、ＡｕおよびＥｕから選択される、請求項５に記載の免疫造影剤。
【請求項９】
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体が配列番号１および２を含むヌクレオチド配列または少なくとも一つの保存的置換が存在する配列番号１および２を含むヌクレオチド配列を有する、請求項１から８のいずれか１つに記載の免疫造影剤。
【請求項１０】
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖから選択される、請求項１から８のいずれか１つに記載の免疫造影剤。
【請求項１１】
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含む遺伝子組み換え抗体が、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号９（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１０（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ３）を含むヌクレオチド配列を有する、請求項１から８のいずれか１つに記載の免疫造影剤。
【請求項１２】
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含むヒト化抗体がマウス／ヒトキメラ抗体である、請求項１から８のいずれか１つに記載の免疫造影剤。
【請求項１３】
免疫撮像技術における使用に適した診断用組成物であって、
（ｉ）少なくとも、
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体、
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント、
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含む遺伝子組み換え抗体、
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含むヒト化抗体またはその組み合わせ、
のうち１つを含む免疫造影剤、および
（ｉｉ）抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系ＩＣＬＣ  ＰＤ０５００６によって作られることを特徴とする、診断上許容し得る担体および／または賦形剤、
を含み、
該免疫造影剤が、ａ）検出可能なシグナル伝達部分に直接または関節結合されている、またはｂ）続いて、活性されているかまたは活性化可能である、検出可能なシグナル伝達部分に結合するのに適した分子に結合されている、診断用組成物。
【請求項１４】
免疫撮像技術が、ガンマ線カメラ撮像技術、ＰＥＴ技術およびＭＲＩ技術から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
検出可能なシグナル伝達部分がガンマ線カメラ造影可能試薬、ＰＥＴ造影可能試薬、ＭＲＩ造影可能試薬から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ガンマ線カメラ造影可能試薬が３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９９ｍＴＣ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１８６Ｒｅ、および１７７Ｌｕから選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＰＥＴ造影可能試薬が８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、７６Ｂｒ、８６Ｙ、１８Ｆ、６８Ｇａ、および４５Ｔｉから選択される、請求項１５に記載の免疫造影剤。
【請求項１８】
ＭＲＩ造影可能試薬がＧａ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、ＡｕおよびＥｕから選択される、請求項１５に記載の免疫造影剤。
【請求項１９】
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体が配列番号１および配列番号２を含むヌクレオチド配列または少なくとも１つの保存的置換が存在する配列番号１および配列番号２を含むヌクレオチド配列を有する、請求項１３から１８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２０】
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖから選択される、請求項１３から１８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２１】
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含む遺伝子組み換え抗体が、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号９（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１０（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ３）を含むヌクレオチド配列を有する、請求項１３から１８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２２】
抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域を含むヒト化抗体がマウス／ヒトキメラ抗体である、請求項１２、１３から１８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２３】
癌または腫瘍細胞がＭｅｔを発現している対象における癌の状態または腫瘍の診断のための、請求項１から１２のいずれか１つに記載の免疫造影剤を含む第一薬瓶または請求項１３から２２のいずれか１つに記載の診断用組成物、および免疫造影剤または診断用組成物の使用説明書を含む診断用キット。
【請求項２４】
第一薬瓶が検出可能なシグナル伝達部分に結合するのに適した分子に結合している免疫造影剤を含むものであり、免疫造影剤に結合するのに適した検出可能なシグナル伝達部分を含む第二薬瓶を含む、請求項２３に記載の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍細胞の検出のための診断手段として、モノクローナル抗体、そのフラグメントおよび／または誘導体の使用に関する。特に、本発明は発癌性細胞の検出のための診断手段としての幹細胞増殖因子受容体の細胞外ドメインに対する抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体、そのフラグメントおよび／または誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞増殖因子（ＨＧＦ）のチロシンキナーゼ受容体をコードするＭＥＴ癌遺伝子は、細胞増殖、浸潤および細胞死からの防御に関する遺伝的プログラムを制御している。ＨＧＦＲの無秩序な活性化は、発癌性が獲得されるだけでなく、浸潤表現型が達成されるため危機的である。ヒトの腫瘍中のＭＥＴの役割がいくつかの実験的方法から明らかとなり、癌の遺伝型におけるＭＥＴ活性化突然変異の発見によって、明白に証明された。さらに、ＭＥＴの構成的活性化は、散在性癌であることも多く、研究によりＭＥＴ癌遺伝子は特定の組織型の腫瘍において過剰発現されるか、または自己分泌メカニズムを通して活性化されることが示された。加えて、異常なＭＥＴ発現の広がりは、原発腫瘍部よりも転移部で特に高くなり、不良な臨床予後と関連している。例として、ＭＥＴ遺伝子は結腸直腸癌の血行性転移で増幅される。
【０００３】
さらに、Ｅｎｇｅｌｍａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１６：１０３９−４３）は最近、肺腫瘍はＭＥＴ癌遺伝子を増幅させる結果として上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する耐性となり得ることを示した一方で、Ｍｅｔシグナル伝達の阻害剤がＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性を回復させることを示した。これにより、例えばＥＧＦＲから類推して、遺伝子変化がない場合であっても、Ｍｅｔは腫瘍検出、癌予後診断および抗癌治療のための標的として使われる。
【０００４】
モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）は、この目的に関して特に魅力があります。特に、無傷ＭＡｂｓ（１５０ＫＤａ）は価値がある。なぜならば、長い滞留時間により成長因子または成長因子受容体を長時間かけて、中和／妨害し得るからである。中和抗ＨＧＦ  ＭＡｂｓが使用されるが、その適用はＨＧＦ依存性Ｍｅｔの活性化を伴う腫瘍に限定される。最近、ＨＧＦ／Ｍｅｔで誘導された侵襲プログラムを阻止するための、おそらく最良と思われる方法が、Ｍｅｔ受容体それ自体と拮抗していることが明らかとなった。
【０００５】
最近、Ｈａｙ  ＲＶら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；１１：７０６４ｓ−９ｓおよびＷＯ−Ａ−２００３／０５７１５５に記載されているように、Ｖａｎｄｅ  Ｗｏｕｄｅのグループは、Ｍｅｔを発現している腫瘍の可視化のためにガンマ線カメラを開発した。この目的のために、Ｍｅｔ３およびＭｅｔ５を指定した抗−Ｍｅｔ  ＭＡｂｓ（ＭｅｔＳｅｅｋ（登録商標））が使用された。ガンマ線カメラの撮像を可能にするために、抗体を１２５Ｉで標識した。マウスの右大腿部（すなわち、１２５Ｉの摂取率が高い腹部のはるか外側）に局在する比較的大きな腫瘍を用いたところ、Ｍｅｔ５はＭｅｔ３よりも良好な腫瘍の可視化および停留を示した。それにもかかわらず、著者は、診断結果を改善するために、Ｍｅｔの異なるエピトープを認識するＭＡｂｓの混合物を採用することを提案する。さらに、ＷＯ−Ａ−２００３／０５７１５５に記載された抗体は、ＭＥＴが低レベルに発現する腫瘍細胞および発生の初期段階の腫瘍（すなわち、小さな腫瘤を有する）または、特に腹部に局在する場合における新たな転移を、よく検出しない。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、幹細胞増殖因子のチロシンキナーゼ受容体で、ＭＥＴを発現する発癌性細胞を、なるべく早急に信頼をもって検出できる改良解が必要である。
【０００７】
この開示の対象はそのような改良解を提供することである。
【０００８】
本発明によれば、前記対象は、この公開の全体を形成していると解される特許請求の範囲に明確に記載された対象によって達成される。
【０００９】
本発明は、腫瘍細胞を検出する診断試薬としての、幹細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体、そのフラグメントおよび／または誘導体の使用を提供するものであって、ＭＥＴが細胞表面で非常に低レベルに発現した場合でも、該モノクローナル抗体がそのような腫瘍細胞を検出できる。
【００１０】
本発明の実施態様は、インビボ免疫撮像技術を用いた腫瘍細胞の検出のための免疫造影剤を提供するものであり、該免疫造影剤は少なくとも：
−抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体、
−そのエピトープ結合領域を含む抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のフラグメント、
−抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含む遺伝子組み換え抗体、
−抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含むヒト化抗体、またはその組み合わせ
のうち一つを含み、
該抗−Ｍｅｔモノクローナル抗体（ＤＮ３０と命名された）は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＣ）、Ｉｎｔｅｒｌａｂ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＩＣＬＣ）、Ｓ．Ｓ．  Ｂａｎｃａ  Ｃｅｌｌｕｌｅ  ｅ  Ｃｏｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ＧＭＰ，  Ｌａｒｇｏ  Ｒｏｓａｎｎａ  Ｂｅｎｚｉ  １０，  Ｇｅｎｏｖａ，  Ｉｔａｌｙに受入番号ＩＣＬＣ  ＰＤ０５００６として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって作られる。
【００１１】
本発明による実施態様は、ガンマ線カメラの撮像技術、ＭＲＩ技術またはＰＥＴ技術での使用に適した、検出可能なシグナル伝達部分と結合するＤＮ３０エピトープ結合領域またはＣＤＲｓを含む、ＤＮ３０モノクローナル抗体、そのフラグメントあるいは遺伝子組み換えまたはヒト化抗体を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、免疫造影剤としてＤＮ３０エピトープ結合領域またはＣＤＲｓを含むＤＮ３０モノクローナル抗体、そのフラグメントあるいは遺伝子組み換えまたはヒト化抗体を含む診断用組成物に関し、該免疫造影剤の検出がガンマ線カメラ撮像技術／ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ技術またはＰＥＴ技術などのインビボでの免疫撮像技術を用いて行われる。
【００１３】
さらなる実施態様において、本発明は、免疫造影剤としてＤＮ３０エピトープ結合領域またはＣＤＲｓを含むＤＮ３０モノクローナル抗体、そのフラグメントあるいは遺伝子組み換えまたはヒト化抗体を含む診断用組成物を含む第一薬瓶、および免疫造影剤に結合される検出可能なシグナル伝達部分を含む任意の第二薬瓶を含む診断用キットを提供する。
【００１４】
１の実施態様において、免疫造影剤は直接的（たとえば、１２４Ｉが使用されたとき、抗体のチロシン残基を介して）または間接的（たとえば、金属キレート剤として−リンカーを介して）に検出可能なシグナル伝達部分に結合されている。他の実施態様において、免疫造影剤は使用される時間と場所において検出可能なシグナル伝達部分に結合され得る分子に結合されている（インビトロまたはインビボのいずれかにおいて）。
【００１５】
検出可能なシグナル伝達部分は、すでに活性化されていても、または活性化可能であってもよく、この場合該検出可能なシグナル伝達部分とは、とりわけ、たとえば金属などの活性因子、放射性核種、または検出に適した陽電子放射体の置換によって活性化可能である。
【００１６】
検出可能なシグナル伝達部分は、診断に用いられる免疫撮像技術の機能として選択される、すなわち、ガンマ線カメラ撮像技術／ＳＰＥＣＴ、金属または陽電子放射体の場合、ＭＲＩまたはＰＥＴ撮像技術の場合のそれぞれにおいて、ガンマ線放射性核種（またはガンマ放射体）が選択される。
【００１７】
本発明は、診断、予後診断および／または治療後の監視の目的のために、組織、器官または生体サンプルの細胞自身の表面における、すなわち、インビトロまたはインビボのいずれにおける、ＭＥＴ発現の検出を可能とする。
【００１８】
免疫造影剤としてのＤＮ３０の使用により、たとえ、細胞表面上でのＭｅｔ発現が非常に低い場合であっても、Ｍｅｔに対するＤＮ３０の高親和性のため、表面上でＭｅｔが発現している腫瘍細胞の早期検出が可能となる。免疫造影剤としてＤＮ３０を用いることのさらなる利点は、長時間腫瘍細胞表面に付着するという予期しなかった特性にある。さらに、ＤＮ３０が腫瘍細胞内に取り込まれ得ることより、予期しなかった有効な腫瘍対非腫瘍率と、その結果、発癌性細胞の検出に関して驚異的な感受性と選択性を獲得することがきる。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、これに限定されない例として図を参照することで、望ましい実施態様に関して詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（ａ）ＧＴＬ−１６および（ｂ）ＦａＤｕ細胞のサイトスピン上、ならびに（ｃ）ＧＴＬ−１６および（ｄ）ＦａＤｕ異種移植片の凍結切片上におけるビオチニル化ＤＮ３０のＭｅｔ発現の免疫組織化学的染色を示す。
【図２】８９Ｚｒ−ＤＮ３０（２．６ＭＢｑ，１００μｇ  ＭＡｂ）を静脈注射した後１、２、３および４日目のヌードマウスに関する２つの異なるＧＴＬ−１６異種移植片の逐次ＨＲＲＴ  ＰＥＴ画像（冠状切片）を示す。左右両方の腫瘍が認められる画面を選んだ。異種移植片を矢印で示す。
【図３】８９Ｚｒ−ＤＮ３０（１．８ＭＢｑ，１００μｇ  ＭＡｂ）を注射した後１、２、３および４日目のヌードマウスに関する２つの異なるＦａＤｕ異種移植片の逐次ＨＲＲＴ  ＰＥＴ画像（冠状切片）を示す。左右両方の腫瘍が認められる画面を選んだ。異種移植片を矢印で示す。
【図４ａ】ＤＮ３０重鎖の核酸（ａ）を示す。ＣＤＲ領域に下線を引いた。
【図４ｂ】アミノ酸配列（ｂ）を示す。ＣＤＲ領域に下線を引いた。
【図５ａ】ＤＮ３０軽鎖の核酸（ａ）を示す。ＣＤＲ領域に下線を引いた。
【図５ｂ】アミノ酸配列（ｂ）を示す。ＣＤＲ領域に下線を引いた。
【００２１】
分子撮像法における抗−Ｍｅｔ  ＭＡｂｓの最適な応用に関して、ＤＮ３０ＭＡｂの場合のように、抗−Ｍｅｔ  ＭＡｂｓは、腫瘍細胞に結合した後、腫瘍細胞の中に取り込まれて、Ｍｅｔに対して高い親和性を有することができる、すなわち、細胞表面上のＭｅｔの発現レベルがとても低い場合であってもＭｅｔに結合できる。それにもかかわらず、ＭＡｂｓが中に取り込まれない場合は、最適分子画像は適当な検出可能シグナル伝達部分、たとえば、ＰＥＴ画像の場合には１２４Ｉを選択することにより得ることができる。
【００２２】
従来の放射線撮像法に関して、ガンマ−カメラまたは単光子放射型コンピュータ断層撮像法（ＳＰＥＣＴ）を用いた二次元撮像法が用いられている。より最近では、陽電子放出断層撮像法（ＰＥＴ）がＭＡｂｓのインビボ撮影に魅力的な選択肢として登場した。ＰＥＴは、高い解像度および三次元の放射線の組織中濃度を測定するという独特の能力を併せ持った検出感度を提供する。
【００２３】
前記撮像法は、当該分野においてそれ自体従来のものであり、ここにさらなる詳述を必要としない。
【００２４】
前記免疫撮像技術を用いたＭＡｂｓの免疫撮像を可能とするために、適当な腫瘍対非腫瘍率の達成に必要な時間に相当する半減期を有する適当な検出可能なシグナル伝達部分が、免疫造影剤にしっかりと（直接または適当なキレート分子を介して）結合される必要がある。この方法は、免疫造影剤が使用する研究室または病院に届いて１、２日以内に、続いて行うことができる。これは、３−４日の半減期を有する長命な陽電子放射体の利点である。供給に約３０時間かかる場合、２日まで十分に保存可能な複合体の性質を持ち、３０％以上の放射能を有する、標識された免疫造影剤を配達する必要がある。
【００２５】
免疫造影剤の供給が３０時間以上かかる場合、他の標識方法を用いなければならない。例として、免疫造影剤は適当な二官能性キレート分子（第一複合体）の複合体として第一薬瓶に供給されてもよく、また検出可能なシグナル伝達部分は第二薬瓶に別々に供給されてもよい。該検出可能なシグナル部分は、二官能性キレート分子を介して免疫造影剤に容易に結合される。このような場合、標識は使用する研究室／病院において容易に行うことができる。第一複合体は必要なときに検出可能なシグナル部分を用いて室温にて標識される。
【００２６】
続いて、本発明の典型的な実施態様としてＰＥＴ撮像法に着目する。
【００２７】
本開示では、Ｍｅｔが発現しているヒト腫瘍異種移植片の定量的ＰＥＴ撮影に関するＭＡｂ  ＤＮ３０の可能性について開示している。
【００２８】
ＰＥＴを用いたＭＡｂ生体内分布の視覚化および定量化は適当な陽電子放出核種を必要とする。８９Ｚｒ（ｔ１／２＝７８．４ｈ）および１２４Ｉ（ｔ１／２＝１００．３ｈ）の２つの陽電子放射体が無傷ＭＡｂｓの撮影に適していると思われる。なぜならば、これらの放射性各種の物理的半減期が、ＭＡｂｓにとって最適な腫瘍対非腫瘍非を達成するために必要な時間と合致するからである。銅−６４（ｔ１／２＝１２．７ｈ）、イットリウム−８６（ｔ１／２＝１４．７ｈ）および臭素−７６（ｔ１／２＝１６．２ｈ）もまたこの目的に使用されるが、しかし後の時点ではあまり最適でない。
【００２９】
本発明者らは、多量の陽電子放射体を製造および精製する方法およびインビボにおける後者の生体内分布特性を維持しながらＭＡｂｓに安定してカップリングさせる方法を先行研究に記載した（Ｖｅｒｅｌ  Ｉ，ら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００４；３１：１６４５−５２およびＶｅｒｅｌ  Ｉ，ら，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００３；４４：１２７１−８１参照）。８９Ｚｒはキレートを介してＭＡｂのリジン残基に結合される一方、１２４Ｉは直接チロシン残基を介して結合され得る。また、本発明者らは８９ＺｒがＭＡｂｓを取り組むＰＥＴ撮影に対して、および１２４ＩがＭＡｂｓを取り組まないＰＥＴ撮影に対して特に適していることを実証した。直接標識された１２４Ｉとは対照的に、８９ＺｒはＭＡｂが取り込まれた後に細胞に捕捉される（残留化）。残留化は肝臓、腎臓および脾臓などのＭＡｂ異化作用器官である程度起こる。最近では、腫瘍検出のための８９Ｚｒ−免疫−ＰＥＴおよびＰＥＴ−ＣＴの臨床的可能性が頭部および輕部癌患者においても実証されている（Ｂｏｒｊｅｓｓｏｎら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２：３１３３−４０）。
【００３０】
本発明者らは、長期間放射標識されておらず、適当に修飾された免疫−造影剤を保存することができる、検出可能なシグナル分子を用いた免疫−造影剤を標識化する代替手法についても記載した。標識化は使用前に即座に遂行されてもよい。このような場合、免疫造影剤は、続く陽電子放射体、たとえば、８９Ｚｒまたは６８Ｇａにカップリングすることができるｐ−イソチオシアナチベンジル−デスフェリオキサミンに予めカップリングされる。該予め修飾された免疫−造影剤は使用される日まで−２０℃で保存され得る。
【００３１】
この開示において、Ｍｅｔの発現レベルが相違する２つの異なる異種移植片系、すなわち、高い発現を示すヒト胃癌細胞系ＧＴＬ−１６と低い発現を示すＨＮＳＣＣ細胞系ＦａＤｕ、を用いたヌードマウスにおける生体内分布およびＰＥＴ撮影研究が記載されている。ＦａＤｕ細胞系もまた放射標識されたＤＮ３０の撮影の質の試験モデルとして選択された。
【００３２】
残留性放射性核種８９Ｚｒおよび非残留性放射性核種１２４Ｉの両長寿命陽電子放射体は、ＤＮ３０とともにＰＥＴ撮影のための候補として考えられていた。もし、ＭＡｂが腫瘍細胞に結合した後取り込まれるならば、撮影にとって残留性放射性核種の使用は、高い腫瘍対非腫瘍比のため、有利である。担ＧＴＬ−１６異種移植片マウスにおける同時注入された８９Ｚｒ−ＤＮ３０および１３１Ｉ−ＤＮ３０（同時計測を促進するため１２４Ｉの代わりに１３１Ｉを用いる）の生体内分布により、腫瘍の摂取の主な相違が明らかになった。腫瘍の摂取は、１３１Ｉより８９Ｚｒの方がすべての時点において実質的に高く、最終時点（５日目）において４倍高かった。結果として、腫瘍対非腫瘍比は８９Ｚｒ−ＤＮ３０で優位に良かった。８９Ｚｒに対して、腫瘍における１３１Ｉは血中の１３１Ｉのレベルを決して超えなかった。
【００３３】
これらの結果に基づいて、発明者らは、残留性放射性核種８９ＺｒがＤＮ３０を用いたＰＥＴ撮影のためには非残留化ヨウ素（１２４Ｉ）よりも適していると考えた。しかしながら、間接放射性ヨード化の方法は、標識化されたＭＡｂｓが取り込まれた後、腫瘍細胞の放射能を高く保持することに応用できる。
【００３４】
８９Ｚｒ−ＤＮ３０を用いたＰＥＴにより、１１ｍｇほどの小さいＧＴＬ−１６腫瘍が１日目以後はっきりと可視化され得る。ＦａＤｕ異種移植片のように、Ｍｅｔ発現が低い腫瘍でも、８９Ｚｒ−ＤＮ３０免疫−ＰＥＴではっきりと輪郭が浮かび上がった。また、ＤＮ３０生体内分布の非観血式数量化に関する８９Ｚｒ−免疫−ＰＥＴの可能性はＰＥＴ評価された腫瘍吸収データと生体外腫瘍吸収データ（Ｒ２＝０．９８）との相関関係により明らかにされた。臨床試験において、定量ＰＥＴ撮影は、特に、腫瘍は異質であることが多く（典型的でない生検体を生じる、解析が難しいという理由から、繰り返される腫瘍生体検査よりも望ましい。
【００３５】
小さい腫瘍の明確な可視化の場合でも、８９Ｚｒ−ＤＮ３０は、特に比較的低いタンパク質投与量で投与されたとき、肝臓および脾臓で比較的高い吸収を示した（表２）。発明者らによって、同じ動物モデルにおいて８９Ｚｒ−セツキシマブ（エルビタックス）および８９Ｚｒ−イブリツモマブ  チウキセタン（ゼバリン）を用いた先行研究で明らかにされたように、肝臓および脾臓の吸収部分は、それらの器官で複合体が異化された後、８９Ｚｒの残留化に起因する。そうではあるが、肝臓および脾臓の放射能の増進された吸収がヒトでは起こりえず、ヌードマウスモデルに関する部分的な不自然な結果かもしれないと仮定した。この点に関して、臨床的研究でのより良い撮影が期待され得る。
【００３６】
ＤＮ３０はＩｇＧ２ａアイソトープのマウス抗体である。Ｓｈａｒｋｅｙら．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９１；５１：３１０２−７）およびＶａｎ  Ｇｏｇら．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９９７；４４：１０３−１１）は、非近交系ｎｕ／ｎｕマウスの様々な系統において、肝臓および脾臓での高い蓄積に伴う、マウス抗体の急速な血中クリアランスの現象を記載した。急速な血中クリアランスおよび増大した肝臓および脾臓の吸収は、マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂアイソトープＭＡｂｓ、若い動物、あるいは低ＭＡｂ投与量が使用されたときに特に生じた。該現象は動物において、内生ＩｇＧの低い力価で最も高くなった。内性の抗体力価が低い場合、たとえば、肝臓および脾臓におけるＦｃ−結合受容体によって、血液からのＭＡｂの迅速な除去が調整されていると著者は仮定した。ＤＮ３０のＭＡｂ投与量が変化したときに、とても似た現象が観察された：低いＭＡｂ投与量は、強化された可変の血液クリアランス並びに肝臓および特に脾臓における同時に増加する摂取と関係があった（表２）。
【００３７】
放射化学に関して言えば、８９Ｚｒで標識したヒト化または完全にヒトの抗−Ｍｅｔ  ＭＡｂｓを用いて、免疫−ＰＥＴの臨床評価を進めることは比較的容易である。同様の放射化学的手法を用いて、最近発明者は、２０人の頭頸部癌患者におけるリンパ節転移癌の発見のために８９Ｚｒで標識した抗−ＣＤ４４ｖ６  ＭＡｂ  Ｕ３６（７５ＭＢｑ）を用いた免疫−ＰＥＴ研究、および非ホジキンリンパ腫患者におけるＰＥＴを用いた９０Ｙ−イブリツモマブ  チウキセタン生体内分布予測のために８９Ｚｒイブリツモマブ  チウキセタンを用いた免疫−ＰＥＴ研究について報告した。両８９Ｚｒ複合体を用いることにより、優れたＰＥＴ画像が得られた。
【００３８】
本発明に係るＤＮ３０は動物を用いた従来法によって、または好ましくは遺伝子工学技術によって生成され得る。
【００３９】
本発明によるモノクローナル抗体ＤＮ３０の使用は遺伝子工学の産物であるヒト化抗体の使用もまた含むことを意図する。遺伝子工学の産物であるヒト化抗体およびそれらの製造方法は当該分野で公知である。Ｃｌａｒｋ  Ｍ．Ｉｍｍ．Ｔｏｄａｙ，２０００；２１：３９７−４０２参照。
【００４０】
ＤＮ３０の使用もまた、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなどのエピトープ結合領域または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含むフラグメントの使用を含む。従来のフラグメントは、典型的に、タンパク分解的切断によって生成されたが、液または固相合成ならびに組み換えＤＮＡ技術など化学的合成によっても生成され得る。「エピトープ結合領域」とは、抗原を認識する抗体部分、すなわち、抗原結合部位を意味する。「相補性決定領域」とは、抗原と相補的であり、抗体の可変ドメイン中に見られ、したがって、特定の抗原に対して特異性を有する抗体を提供する、短いアミノ酸配列を意味する。
【００４１】
材料および方法
ＤＮ３０ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１および図４ａに対応するＤＮ３０重鎖ヌクレオチド配列の翻訳は図４ｂおよびＳＥＱ  ＩＤＮｏ．６に示される。
【００４２】
ヌクレオチドおよびＣＤＲ領域に対応するアミノ酸配列は図４ａおよび４ｂに下線で示され；それらのアミノ酸配列は；ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）；ＣＤＲ−Ｈ２：ＩＮＰＳＳＧＲＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）；ＣＤＲ−Ｈ３：ＡＳＲＧＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）である。
【００４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２および図５ａに対応するＤＮ３０軽鎖ヌクレオチド配列の翻訳は図５ｂおよびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７である。
【００４４】
ＣＤＲ領域に対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図５ａおよび５ｂに下線で示され；それらのアミノ酸配列は：ＣＤＲ−Ｌ１：ＱＳＶＤＹＤＧＧＳＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）；ＣＤＲ−Ｌ２：ＡＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）；ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＳＹＥＤＰＬＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）である。
【００４５】
モノクローナル抗体、細胞系、および放射線
Ｍｅｔの細胞外ドメインに対するネズミ科のＩｇＧ２ａ  ＭＡｂ  ＤＮ３０（７．０ｍｇ／ｍＬ）は、イタリア、Ｔｕｒｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＴｒｅａｔｍｅｎｔ（ＩＲＣＣ）から得た。ハイブリドーマ細胞系は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＡＢＣ），Ｉｎｔｅｒｌａｂ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＩＣＬＣ）Ｉｔａｌｙに、受入番号ＩＣＬＣ  ＰＤ  ０５００６にて寄託した。ＤＮ３０の選択、構築および生成はＰｒａｔ  Ｍら．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １９９８；１１１：２３７−４７に記載されている。
【００４６】
ＭＥＴ原癌遺伝子が増幅され、過剰発現された（Ｐｏｎｚｅｔｔｏ  Ｃら．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９１；６：５５３−９）ヒト胃癌細胞系ＧＴＬ−１６は、ＩＲＣＣから得て、２００８年４月１６日に、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＡＢＣ），  Ｉｎｔｅｒｌａｂ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＩＣＬＣ）Ｉｔａｌｙに受入番号ＩＣＬＣ  ＰＤ  ０８００３にて寄託した。頭頸部扁平上脾細胞癌（ＨＮＳＣＣ）細胞系ＦａＤｕは、Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ｈｅｉｄｅｒ  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ）  （Ｒａｎｇａｎ  ＳＲＳ，  Ｃａｎｃｅｒ  １９７２；  ２９：１１７−２１）から得られた。
【００４７】
８９Ｚｒ（１Ｍシュウ酸中２．７ＧＢｑ／ｍＬ）は、ＢＶサイクロトロン（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で、天然イットリウム−８９（８９Ｙ）上での（ｐ，ｎ）反応によって生成され、ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅカラム（Ｖｅｒｅｌ  Ｉら．，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００３；４４：１２７１−８１）を用いて単離した。１３１Ｉ（０．０１Ｍ水酸化ナトリウム中７．４ＧＢｑ／ｍＬ）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）から仕入れた。
【００４８】
細胞系および異種移植片の免疫組織化学的染色
細胞系ＧＴＬ−１６およびＦａＤｕは、ビオチン化ＤＮ３０を用いた免疫細胞化学によってＭｅｔ発現のために特徴付けられた。要するに、細胞をトリプシン処理し、スライドガラス上で回転させて濃度５×１０４個／スピンとし、そしてスライドガラスを一晩空気乾燥させた。細胞を新しく用意した２％パラホルムアルデヒドで、１０分間固定した後、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むトリス緩衝液でスライドをインキュベートし、続いて、ビオチニル化ＤＮ３０を用いて室温で１時間インキュベートした。トリス緩衝液でよく洗浄した後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＣｈｅｍＭａｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｄａｋｏ，  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、室温で１時間インキュベートした。キットから新しく準備された基質を用いて発色を行い、続いて脱塩水を用いて洗浄した。
【００４９】
加えて、ＧＴＬ−１６の凍結切片およびＦａＤｕ異種移植片の免疫組織化学を行った。クリオスタット切片（５μｍ）を空気乾燥し、２％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。上記のとおりＭｅｔ染色を行った。
【００５０】
放射性標識
（ａ）８９Ｚｒを用いたＤＮ３０の放射性標識に関して、以前にＶｅｒｅｌらがＪ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００３；４４：１２７１−８１に記載したように、二官能性金属キレート部分はＭＡｂに結合した。つまり、キレートデスフェラール（Ｄｆ；  Ｎｏｖａｒｔｉｓ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｓｅｒｌａｎｄ）はコハク酸化され（）、一時的に、安定した鉄［鉄（ＩＩＩ）］で満たされ、そしてテトラフルオロフェノール−Ｎ−ｓｕｃＤＦエステルによって、ＤＮ３０のリジン残基に結合した。ＥＤＴＡによるトランスキレート化によって鉄（ＩＩＩ）を除去した後、予め修飾したＭＡｂをＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。およそ１Ｎ−ｓｕｃＤｆ部分は５９Ｆｅ（Ｐｅｒｋ  ＬＲら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００６；３３：１３３７−４５）を用いて評価されるＤＮ３０分子ごとに結合した。続いて、ｐＨ７．０の０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中で、Ｎ−ｓｕｃＤｆ−ＤＮ３０（０．５ｍｇ）を８９Ｚｒ（最大３７ＭＢｑ）で標識した。最後に、８９Ｚｒ−Ｎ−ｓｕｃＤｆ−ＤＮ３０をＰＤ１０カラム（溶離剤：０．９％塩化ナトリウム／ゲンチシン酸５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０）で精製した。以後、８９Ｚｒ−Ｎ−ｓｕｃＤｆ−ＤＮ３０を８９Ｚｒ−ＤＮ３０と省略する。
【００５１】
１３１Ｉを用いたＤＮ３０の放射性ヨウ素化は、基本的に、Ｖｉｓｓｅｒ  ＧＷら，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００１；４２：５０９−１９に記載されたとおりに行われた。１３１Ｉは、生体内分布研究（後述参照）において８９Ｚｒとともに集計する二つの同位体を促進するために、１２４Ｉの代わりに用いられた。すなわち、７５μｇのＩＯＤＯ−ＧＥＮ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）で被覆された２０ｍＬ  β−シンチレーションガラス製薬瓶に、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）０．０５ｍＬ、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）０．４５ｍＬ中  ＤＮ３０５０−２００μｇ、および１３１Ｉ  ９−１８．５ＭＢｑを続けて加えた。室温で４分間、穏やかに撹拌させた後、２５ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸（ｐＨ５．０）０．１ｍＬを加えて反応をとめた。最後に、ＰＤ１０カラム（溶離剤：０．９％塩化ナトリウム／アスコルビン酸５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０）で精製することによって、１３１Ｉ−ＤＮ３０を未反応の１３１Ｉから分離した。
【００５２】
（ｂ）８９Ｚｒを用いたＤＮ３０の放射性標識は、使用日まで標識されないで、適当に修飾されたＤＮ３０の保存を可能とする第二のプロトコルに従って行うことができる。
【００５３】
ｐＨ＝８．９−９．１、濃度２ｍｇ  ｍｌ−１以上のＤＮ３０溶液に、ＤＭＳＯ中ｐ−イソチオシアナチベンジル−デスフェリオキサミンを溶解して濃度２から５ｍＭ（１．５−３．８ｍｇ  ｍｌ−１）とし、すぐに混合して、結合反応混合物中ＤＭＳＯ濃度を５％以下に保った。ｐ−イソチオシアナチベンジル−デスフェリオキサミンはＤＮ３０モル濃度の３倍のモル濃度になった。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＰＤ−１０カラムを用いて、下記のプロトコルに従って、Ｄｆ−ＤＮ３０複合体を精製した：ｉ）ＰＤ１０カラムを２０ｍｌ  ０．９％ＮａＣｌ／ゲンチシン酸５ｍｇ  ｍｌ−１（ｐＨ＝４．９−５．３）を用いて洗い流した；ｉｉ）結合反応混合物をピペットで取りカラムに滴下し、素通し画分を廃棄した；ｉｉｉ）１．５ｍｌ  ０．９％ＮａＣｌ／ゲンチシン酸５ｍｇ  ｍｌ−１（ｐＨ＝４．９−５．３）をピペットで取ってカラムに滴下し、素通し画分を廃棄した；ｖｉ）２ｍｌ  ０．９％ＮａＣｌ／ゲンチシン酸５ｍｇ  ｍｌ−１（ｐＨ＝４．９−５．３）をピペットで取ってＰＤ−１０カラムに滴下し、Ｄｆ−ＤＮ３０複合体を収集した。
【００５４】
その後、Ｄｆ−ＤＮ３０複合体を使用日まで−２０℃で保存することができる。Ｄｆ−ＤＮ３０複合体は少なくとも数週間保存しても安定である。
【００５５】
その後、Ｄｆ−ＤＮ３０複合体は８９Ｚｒを用いて以下に従って標識され得る：ｉ）８９Ｚｒシュウ酸溶液（３７および１８５ＭＢｑの間）の２５−２００μｌ（Ａ）をピペットに取り、ガラス製の「反応薬瓶」に滴下した；ｉｉ）穏やかに撹拌している間、１Ｍシュウ酸２００−Ａμｌを反応薬瓶に加えた。続いて、２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３  ９０μｌをピペットで取り反応薬瓶に滴下し、室温で３分間インキュベートした；ｉｉｉ）穏やかに撹拌している間、引き続いて、０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．２）０．３０ｍｌ、Ｄｆ−ＤＮ３０  ０．７１ｍｌ（一般に１−３ｍｇ）、および０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．２）０．７０ｍｌをピペットで取り反応薬瓶に滴下し、標識反応物のｐＨを６．８−７．２の範囲に保った；ｉｖ）その後反応混合物を穏やかに撹拌して、室温で１時間インキュベートした；ｖ）一方、ＰＤ１０カラムを２０ｍｌ  ０．９％ＮａＣｌ／ゲンチシン酸５ｍｇ  ｍｌ−１（ｐＨ＝４．９−５．３）で洗い流した；ｖｉ）一時間インキュベートした後、反応混合物をピペットで取り出し、カラムの上から滴下し、素通し画分を除去した；ｖｉｉ）１．５ｍｌ  ０．９％ＮａＣｌ／ゲンチシン酸５ｍｇ  ｍｌ−１（ｐＨ＝４．９−５．３）をピペットで取り出し、カラムに滴下して、素通し画分を除去した；ｖｉｉｉ）２ｍｌ  ０．９％ＮａＣｌ／ゲンチシン酸  ５ｍｇ  ｍｌ−１（ｐＨ＝４．９−５．３）をピペットで取り出しＰＤ−１０カラムに滴下し、精製した放射性標識されたＤＮ３０を収集した；ｉｘ）精製した放射性標識されたＤＮ３０をＩＴＬＣおよびＨＰＬＣで分析した。放射化学的純度は９５％より高く、該溶液を４℃で保存するか、またはインビトロまたはインビボにおける研究のために、０．９％ＮａＣｌ／ゲンチシン酸５ｍｇ  ｍｌ−１（ｐＨ＝４．９−５．３）で希釈する準備をした。放射性標識されたタンパク質は少なくとも数日間、安定して保存される。
【００５６】
ゲンチシン酸は放射線によるタンパク質全体の崩壊を防ぐために標識および保存の間導入された。典型的に、０．９−１．５Ｄｆ部分はＤＮ３０抗体ごとに結合された。８９Ｚｒを用いたＤｆ−複合ｍＡｂの放射性標識は全体的に８５％以上の標識収率を得た。生じた８９Ｚｒ−ｍＡｂ複合体は放射化学的純度（ＩＴＬＣおよび分析的ＨＰＬＣによる９５％以上）、免疫活性およびインビボでの安定性に関して最適であった。
【００５７】
分析
８９Ｚｒ−ＤＮ３０または１３１Ｉ−ＤＮ３０の各準備の後、放射標識効率および放射化学的純度のための瞬間薄層グロマトグラフィ（ＩＴＬＣ）によって、そして高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）およびドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、続いて全体のための蛍光体撮像装置分析、続いて免疫活性のための細胞−結合アッセイによって、複合体を分析した。ガラス線維シート（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，  ＮＹ）を浸透させたシリカゲル上で、放射性標識されたＤＮ３０のＩＴＬＣ分析を行った。移動相として０．０２Ｍクエン酸塩緩衝剤（ｐＨ５．０）を用いた。
【００５８】
ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ  ２００１０／３００  ＧＬ  ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＪａｓｃｏ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍにおいて最終生成物のＨＰＬＣのモニタリングを行った。溶離剤として、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ  ６．８）の混合物を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎにて使用した。非還元性条件下で７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてＰｈａｓｔｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて電気泳動を行った。
【００５９】
基本的にＬｉｎｄｍｏら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８４；７２：７７−８９によって記載されたように、２％パラホルムアルデヒドで固定したＧＴＬ−１６細胞の連続希釈法で、８９Ｚｒ−ＤＮ３０および１３１Ｉ−ＤＮ３０（１００００ｃｐｍ／ｍＬ）の結合を測定することによって免疫活性を決定した。データを、ラインウィーバー・バーク（二重逆数）プロットによるグラフを用いて分析し、そして免疫活性を無限の高原過剰を表す状況を推定することによって決定した。
【００６０】
生体内分布
皮下に注入されたヒト胃癌細胞系ＧＴＬ−１６またはＨＮＳＣＣ細胞系ＦａＤｕの異種移植片をもつヌードマウスを用いた。メスのマウス（ＨＳＤ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ，２１−３１ｇ，Ｈａｒｌａｎ  ＣＰＢ）は、実験の際、１０−１４週であった。すべての動物実験は、国立衛生研究所での実験動物の世話に関する理念およびオランダ国内法令（Ｗｅｔ  ｏｐ  ｄｅ  ｄｉｅｒｐｒｏｅｖｅｎ”，  Ｓｔｂ  １９８５，  ３３６）に従って行われた。
【００６１】
生体内分布調査を３セット行った。第一の実験は、８９Ｚｒ−ＤＮ３０（０．２８±０．００４ＭＢｑ）および１３１Ｉ−ＤＮ３０（０．３７±０．００４ＭＢｑ）を皮下に同時注入したときの生体内分布を、ＧＴＬ−１６を有するヌードマウスで評価した。それぞれの動物がＭＡｂを合計１００μｇ与えられるように、標識されていないＤＮ３０が注射混合物に加えられた。この最初の抗体用量は、ヌードマウスモデルに関して記載されているように、血液からＩｇＧ２ａイソタイプに関係のあるＭＡｂの迅速な除去を阻止するのに十分量であり、腫瘍において抗原の浸潤を阻止するのに十分に低用量として選択された。実験当初の平均腫瘍の大きさは、６４±３３ｍｍ３であった。注射後１、２、３および５
日目に、時点ごとの４匹のマウスに麻酔をして、出血させ、殺して解剖した。採血後、腫瘍および正常組織の重さを量り、ガンマ計数器を用いて、各サンプルの放射線量を測定した。組織の１グラム当たりの注射された用量のパーセンテージとして、放射線接種を算出した（％ＩＤ／ｇ）。
【００６２】
第二の実験では、ＧＴＬ−１６を有するヌードマウスにおいて、８９Ｚｒ−ＤＮ３０タンパク質用量と生体内分布との間の関係を調査した。４匹ずつ４つの群は、０．３９±０．０２ＭＢｑの８９Ｚｒ−ＤＮ３０を注射によって受けた。各群のマウスがＤＮ３０をそれぞれ合計して２５、５０、１００または２００μｇ与えられるように、標識していないＤＮ３０を注射混合物に加えた。実験当初の平均腫瘍の大きさは、５０±３４ｍｍ３であり、他の群間で同じであった。注射後３日目に、上記手順に従った、さらなる処理を行って、すべてのマウスに麻酔をし、出血させ、殺して解剖した。
【００６３】
第三の実験では、ＦａＤｕを有するヌードマウス（ｎ＝１６）において、８９Ｚｒ−ＤＮ３０（０．２８±０．０１ＭＢｑ；１００μｇ）の生体内分布を評価した。実験当初の平均腫瘍の大きさは、１４９±４７ｍｍ３であった。注射後１、２、３および４日目に、上記手順に従った、さらなる処理を行って、すべてのマウスに麻酔をし、出血させ、殺して解剖した。
【００６４】
ＰＥＴ撮影手順
８９Ｚｒ−ＤＮ３０による  撮影および定量化のための動物のＰＥＴ研究は、本質的にＶｅｒｅｌら，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００３；４４：１６６３−７０に記載されたように行われる。つまり、ＰＥＴ研究は、二重結晶層ＨＲＲＴ  ＰＥＴスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ／ＣＴＩ  Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ）、専用の小型動物およびヒトの脳のスキャナ（Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＨＷＡＭら，Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２００７；５２：１５０５−２６）を用いて行われた。ＧＴＬ−１６異種移植片を有する４匹のヌードマウスに８９Ｚｒ−ＤＮ３０（１００μｇ）  ２．６±０．０４ＭＢｑを皮下注射した。実験当初の平均腫瘍の大きさは４６±１９ｍｍ３であった。動物をイソフルレンを用いて鎮静状態にして、１０分で撮影し、注射後１、２、３および４日目に、３Ｄ放射スキャンを４００−６５０ＫｅＶ  ｗｉｎｄｏｗを用いて６０分間、６４−ビット  リストモードで得た。９のスパンを用いて、６４−ビットリストモードファイルを最初に単枠ヒストグラムに変換し、次いで、２反復および１６サブセットの３Ｄ  ＯＰ−ＯＳＥＭ再構築を用いて再現した。再現した後、バックグラウンド補正とともに最大ピクセル値の５０％で、３Ｄ  ｉｓｏｃｏｎｔｏｕｒを用いて、腫瘍周辺の関心領域（ＲＯＩ）を半自動式に描いた。最後のＰＥＴスキャンの後すぐに、動物を殺し、解剖して、上記のとおり処理した。
【００６５】
第二の撮影研究において、ＦａＤｕ異種移植片を有する４匹のヌードマウスの一群に８９Ｚｒ−ＤＮ３０  １．８±０．０１ＭＢｑを皮下注射した（１００μｇ）。実験当初の平均腫瘍の大きさは、２３１±６４ｍｍ３であった。撮影は上記のとおり行われた。
【００６６】
統計分析
注入された複合体間の組織内摂取の相違を、対データに関するＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔを用いたＳＰＳＳ  １１．０ソフトウェアとともに、各時点で統計的に分析した。Ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ優位性レベルを算出し、Ｐ＜０．０１が統計的に有意であると考えられた。他の群間の組織内摂取の相違の統計分析は、不対データのＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行われた。ＰＥＴ−定義された８９Ｚｒ腫瘍摂取に対するエクスビボで評価された８９Ｚｒ腫瘍摂取の回帰分析もまたＳＰＳＳ１１．０ソフトウェアを用いて行った。
【００６７】
結果
免疫組織化学
ＧＴＬ−１６およびＦａＤｕの両細胞系はＭｅｔを発現したが（図１ａおよび１ｂ）、Ｍｅｔ発現はＧＴＬ−１６において最も高かった（外側細胞表面において〜１０００００コピー）。Ｍｅｔコピー数はＦａＤｕに関して正確に決定され得なかった。Ｍｅｔ発現はＦａＤｕ異種移植片に比べて、ＧＴＬ−１６異種移植片で高いことが明らかとなった（図１ｃおよび１ｄ）。
【００６８】
放射性標識
１３１Ｉを用いたＤＮ３０または８９Ｚｒを用いたＮ−ｓｕｃＤｆ−ＤＮ３０の放射性標識は、全体の標識産物がそれぞれ８５％以上と７０％以上という結果になった。ＩＴＬＣによって決定されたように、放射化学的純度は、両者の生成物に関して常に９５％以上であった。最終産物の特定の放射線は、１３１Ｉ−ＤＮ３０に関して３０から８０ＭＢｑ／ｍｇ、および８９Ｚｒ−ＤＮ３０に関して５４−７０ＭＢｑ／ｍｇの範囲であった。ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＭＡｂが１３１Ｉまたは８９Ｚｒで標識されたものであるかに関わらず、ＤＮ３０の最適な統合性を明らかにした。両放射免疫複合体の免疫活性は、最も高い細胞濃度で７０％以上、そして無限の抗原過剰状態で９５％以上であった。
【００６９】
生体内分布
第一の研究において、発明者らは、８９Ｚｒ−ＤＮ３０および１３１Ｉ−ＤＮ３０（合計１００μｇ  ＤＮ３０）をともに注射したときの生体内分布を、ＧＴＬ−１６−腫瘍を有するヌードマウスにおいて、注射後５日目まで比較した。８９Ｚｒ−ＤＮ３０は、１３１Ｉで標識した方に比べて、十分に高い腫瘍集積、ならびに肝臓および脾臓の十分に高い摂取を示した（表１）。注射後１日から５日目の期間において、８９Ｚｒ−ＤＮ３０の腫瘍集積は、１２．２±４．３％ＩＤ／ｇから１９．６±３．３％ＩＤ／ｇの範囲であり、１３１Ｉ−ＤＮ３０の腫瘍集積は、７．８±３．１％ＩＤ／ｇから５．３±１．０％ＩＤ／ｇの範囲であった。両複合体の摂取のわずかな相違は、血液と他のすべての正常な組織で見つかった。それにもかかわらず、８９Ｚｒ−ＤＮ３０に関して、腫瘍−対−正常組織の比率は、肝臓および脾臓の最初の時点を除いて常に高かった。８９Ｚｒと比べて、腫瘍中の１３１Ｉは、血液中の１３１Ｉのレベルを決して超えなかった。これらの結果に基づいて、発明者らは、残りの生体内分布およびＰＥＴ撮影研究に８９Ｚｒ−ＤＮ３０を選択した。
【００７０】
【表１】
2009292815.tif 000002
＊任意のタンパク質投与量間での８９Ｚｒ−ＤＮ３０摂取における有意差（Ｐ＜０．０１）をアスタリスクで記す。
すべてのデータは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）として示される。
【００７１】
マウスにおいて効率よく腫瘍を標的にすることに関して、１００μｇがＭＡｂ  ＤＮ３０の適当な投与量かを調べるために、８９Ｚｒ−ＤＮ３０の生体内分布を、注射後３日目のＧＴＬ−１６異種移植片を有するマウスにおいて、２５−２００μｇの範囲の４つのタンパク質投与量にて評価した。表２に、血液、腫瘍組織における平均摂取量、および腫瘍−対−正常組織比を示す。腫瘍−対−正常組織比と組み合わされた腫瘍摂取量は、５０および１００μｇ群でもっとも有利であると考えられた。もっとも少ないタンパク質投与量において、ＤＮ３０の血液レベルは相対的に低く、マウス間で大きく変化したが、その一方で、たとえば、脾臓の摂取は高かった。このことは、ヌードマウスモデルにおけるＭＡｂのＩｇＧ２ａアイソタイプに関する急速な除去を示す。したがって、発明者らは次の生体内分布および画像解析にＭＡｂ投与量１００μｇを使用した。
【００７２】
【表２】
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＊任意のタンパク質投与量間での８９Ｚｒ−ＤＮ３０摂取における有意差（Ｐ＜０．０１）をアスタリスクで記す。
すべてのデータは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）として示される。
【００７３】
第三の実験において、８９Ｚｒ−ＤＮ３０の生体内分布は注射後４日目までのＦａＤｕ（Ｍｅｔ低発現）を有するヌードマウスで評価した（表３）。ＦａＤｕ腫瘍における８９Ｚｒ−ＤＮ３０の摂取はＧＴＬ−１６腫瘍よりもかなり低く、たとえば、注射後３日目で、ＦａＤｕ腫瘍摂取は、ＧＴＬ−１６腫瘍で１８．０±４．５％ＩＤ／ｇであったのに対して、７．８±１．２％ＩＤ／ｇであった。この低い摂取は、免疫組織化学によって決定されるこれらの腫瘍において、Ｍｅｔの異なる発現レベルと相互に関連する（図１）。
【００７４】
【表３】
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すべてのデータは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）として示される。
【００７５】
ＰＥＴ画像
８９Ｚｒ−ＤＮ３０を皮下注射後１日目から４日目までの間に、Ｍｅｔを発現しているヒトの癌の異種移植片を有するマウスの代表的なＰＥＴ画像を図２（ＧＴＬ−１６）および図３（ＦａＤｕ）に示す。撮影の最初の時点、注射ご１０分で、血液プールでの唯一の放射能は観察されなかった（スキャンは示さない）。早くも注射後１日目で、すべての腫瘍（矢印）を明確に視覚化することができ、良好な腫瘍の撮像は最終の撮影までの期間持続された。生体内分布データから予測されるように、腫瘍の摂取はＧＴＬ−１６異種移植片においてより言明された。腫瘍の局在性が、経時的に減少する血液プールおよび肝臓と脾臓の摂取とともに明らかにされた。注目すべき、１１ｍｇほどの小さいＧＴＬ−１６の腫瘍が明確に視覚化された。ＰＥＴで定義づけられた腫瘍摂取とエクスビボの腫瘍摂取測定値（Ｒ２＝０．９８）との間にはよい相関関係があることがわかった。
【００７６】
もちろん、本発明の原理は変わらないが、請求項に定義されているように本発明の範囲から逸脱することなく、実施例によって単に記載されたことおよび説明されたことに関して、構成の詳細および実施態様は幅広く変化し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【配列表】
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