(57)【要約】【課題】従来、芽胞検出法には長時間の培養が必要であり、生乳などの製品は品質を保持することが難しく、滅菌処理後の原料には多くの死滅した細菌が存在しているため、培養を行わずに顕微鏡を用いて検出することは不可能であった。これら芽胞形成菌の迅速な検出方法が求められてきた。【解決手段】本発明者は、芽胞形成菌を迅速かつ容易に検出するため、芽胞形成菌に特異的に結合可能なＲＮＡアプタマーを利用することを検討した。【選択図】図１
2009039033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芽胞形成菌もしくは芽胞断片と結合可能な核酸分子。
【請求項２】
下記、一般式１に示される配列を有する請求項１に記載の塩基配列を含むＲＮＡ分子、および修飾糖部を含むその誘導体。
（一般式１）
５’−ＮＮＮＮＮＡＡＵＵＣＧＡＧＣＵＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＵＧＣＡＧＧＣＡＵＧＣＡＮＮＮＮ−３’
（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである。）
【請求項３】
請求項１〜２のいずれかに記載の該ＲＮＡ分子に対応するＤＮＡ分子からなる群から選択される核酸分子のプールと混合し、該芽胞形成菌もしくは芽胞断片と結合することのできる核酸分子を選択および分離し、所望により該分離された核酸分子を増幅した後、分離された核酸分子の、該芽胞形成菌もしくは芽胞断片に対する結合特異性を決定する工程を含む方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ分子が、下記の塩基配列
５’−ＮＮＮＮＮＡＡＵＵＣＧＡＧＣＵＣＧＧＡＧＧＧＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＡＡＵＧＣＧＧＡＵＡＵＡＡＣＣＵＵＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＵＡＵＵＡＣＵＧＣＡＧＧＣＡＵＧＣＡＮＮＮＮ−３’
（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである。）
を含む分子である、請求項３の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡ分子が、下記の塩基配列
５’−ＧＧＧＣＧＡＡＵＵＣＧＡＧＣＵＣＧＧＡＧＧＧＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＡＡＵＧＣＧＧＡＵＡＵＡＡＣＣＵＵＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＵＡＵＵＡＣＵＧＣＡＧＧＣＡＵＧＣＡＡＧＣＵ−３’
（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである。）
を含む分子である、請求項３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芽胞形成菌の細胞に特異的に結合する核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、進化分子工学の発達により、ランダムなオリゴヌクレオチドライブラリーから蛋白質等の標的分子に対して高いアフィニティーを有する核酸分子、すなわちアプタマーをスクリーニングする技術（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；ＳＥＬＥＸあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）が開発された。この方法を用いた、抗体よりも迅速且つ容易な高アフィニティーリガンドの調製が数多く報告されている。
【０００３】
現在、芽胞形成菌の食品への混入が問題となっている。この芽胞は非常に耐熱性に優れており、通常の食品における滅菌処理では死滅させることができないため、製品に混入した場合、出荷後に増殖し、腐敗、異臭の問題を起こす原因となる。しかし、食品の品質低下をまねくような芽胞形成菌を死滅させる条件での滅菌処理を行うことができない。
これら芽胞の検出には、芽胞は通常の滅菌処理では死滅しないという特徴を活かし、滅菌処理を行った後の原料を、数日間培養を行い、芽胞から増殖した細菌を顕微鏡によって観察することによって、混入を確認するという方法が取られている。
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ９２／１４８４３号公報
【特許文献２】特開平８−２５２１００号公報
【特許文献３】特開平９−２１６８９５号公報等
【非特許文献１】Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ、Ｌｏｕｉｓ  Ｃ．Ｂｏｃｋ，Ｌｉｎｄａ  Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｌａｔｈａｍ，  Ｅｒｉｃ  Ｈ．Ｖｅｒｍａａｓ  ＆  Ｊｏｈｎ  Ｊ．Ｔｏｏｌｅ；Ｎａｔｕｒｅ３５５，５６４−５６６（０６  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前述した通り、従来の芽胞検出法は、非常に時間がかかるものであるため、生乳などの製品は品質を保持することが難しいという問題がある。しかし、滅菌処理後の原料には多くの死滅した細菌が存在しているため、培養を行わずに顕微鏡を用いて検出することは不可能である。
【０００５】
したがって、これら芽胞形成菌の迅速な検出方法が求められている。そこで、本発明者は、芽胞形成菌を迅速かつ容易に検出するためＲＮＡアプタマーを利用することを検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下のものを包含する。
本発明は、第１の態様において、芽胞形成菌もしくは芽胞断片と結合可能な核酸分子の製造、同定及び分離のための方法であって、
５’−ＮＮＮＮＮＡＡＵＵＣＧＡＧＣＵＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＵＧＣＡＧＧＣＡＵＧＣＡＮＮＮＮ−３’
（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである。）
を含むＲＮＡ分子、および修飾糖部を含むその誘導体、および該ＲＮＡ分子に対応するＤＮＡ分子からなる群から選択される核酸分子のプールと混合し、該芽胞形成菌もしくは芽胞断片と結合することのできる核酸分子を選択および分離し、所望により該分離された核酸分子を増幅した後、分離された核酸分子の、該芽胞形成菌もしくは芽胞断片に対する結合特異性を決定する工程を含む方法を提供する。
【０００７】
その第１の実施形態において、前記ＲＮＡ分子が、下記の塩基配列
５’−ＧＧＧＣＧＡＡＵＵＣＧＡＧＣＵＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＵＧＣＡＧＧＣＡＵＧＣＡＡＧＣＵ−３’
（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである。）
の４７塩基長のランダム領域をもつＲＮＡ分子または修飾糖部を含むその誘導体から、上記の本発明の方法を使用して得られる、芽胞形成菌もしくは芽胞断片と結合可能なＲＮＡアプタマーを提供する。
【０００８】
別の実施形態において、前記ＲＮＡ分子が、下記の塩基配列
５’−ＮＮＮＮＮＡＡＵＵＣＧＡＧＣＵＣＧＧＡＧＧＧＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＡＡＵＧＣＧＧＡＵＡＵＡＡＣＣＵＵＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＵＡＵＵＡＣＵＧＣＡＧＧＣＡＵＧＣＡＮＮＮＮ−３’
（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである。）、
またはその塩基配列において１もしくは複数の修飾糖部を含む塩基配列、を含む。
【０００９】
別の実施形態において、前記ＲＮＡ分子が、下記の塩基配列
５’−ＧＧＧＣＧＡＡＵＵＣＧＡＧＣＵＣＧＧＡＧＧＧＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＡＡＵＧＣＧＧＡＵＡＵＡＡＣＣＵＵＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＵＡＵＵＡＣＵＧＣＡＧＧＣＡＵＧＣＡＡＧＣＵ−３’
（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである。）、
またはその塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列、またはそれらの塩基配列において１もしくは複数の修飾糖部を含む塩基配列、を含む。
【００１０】
本発明は、第２の様態において、上記定義の本発明のＲＮＡアプタマーを含む、組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、第３の様態において、上記定義の本発明のＲＮＡアプタマーを含む、芽胞形成菌検出用組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、第４の様態において、芽胞形成菌の食品などへの混入を検出するためのＲＮＡアプタマーを検出ツールとして用いる方法を提供する。
【００１３】
本発明は、第５の様態において、上記定義の本発明ＲＮＡアプタマーを、芽胞を形成した芽胞形成菌のみを特異的に認識するため、蛍光標識などを施したＲＮＡアプタマーなどを用いることによって、食品などへ混入した芽胞形成菌を認識し、顕微鏡などを用いて検出する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のアプタマーは芽胞形成菌を特異的に認識するため、蛍光標識したアプタマーなどを用いることによって食品などに混入した芽胞形成菌を数十分で検出することが可能になる。また、医療や化粧品などの広範な分野での応用が可能であり、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
蛍光標識したＲＮＡアプタマーを２ｍＭ−ＭｇＣｌ２と１００ｍＭ−ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（以下、ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとする）中に溶解した後、高次構造の再構築（７５℃／５分、３７℃／３０分）を行い、検査を行う原料と混合し結合反応させる（４℃／３０分）。
【００１６】
ここで得られた反応液を、フィルターを用いて濾過することにより、フィルター上には標的と標的に結合したＲＮＡアプタマーのみが保持されるため、ＲＮＡアプタマーに予め蛍光標識などを施しておくことにより、蛍光顕微鏡などを用いて芽胞形成菌を検出することができる。以下に、実施例を用いて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
ＳＥＬＥＸ
ランダムな４７塩基を含む一本鎖ＤＮＡとＰＣＲによる増幅を可能にするため、その両端に５’−ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧ−３’及び、５’−ＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＧＡ−３’の配列を持つプライマーによって認識される配列を有する。また、前者の配列の中には転写を可能にするためのＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのプロモーター配列も含まれている。このＤＮＡをＰＣＲによって増幅し二本鎖ＤＮＡとし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行い、ＲＮＡライブラリを作成した。作成したＲＮＡライブラリを、ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ中で、７５℃、５分間加熱後、３７℃、３０分間静置し、高次構造の再構築を行った。次いで、芽胞を形成している芽胞形成菌Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（以下これを標的とする）と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。このとき、使用したＲＮＡの種類は６×１０１３個とした。これを遠心分離し、標的を沈殿させ、上澄みを除去することにより遊離ＲＮＡを分離した。さらに、口径０．２２μｍのフィルター（Ｄｕｒａｐｏｒｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（ＧＶＷＰ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて吸引濾過を行い、遊離ＲＮＡの分離を徹底化させた。このフィルターに保持された標的−ＲＮＡ複合体より、ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （８Ｍ−Ｕｒｅａ／１０ｍＭ−ＥＤＴＡ）によってＲＮＡを回収し、エタノール沈殿によってＲＮＡを濃縮した。回収したＲＮＡを逆転写することによりＤＮＡとし、次いでＰＣＲによって増幅した。このＤＮＡを転写し、８Ｍ−尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）によって精製を行い、次のサイクルに使用した。この一連の操作を１ラウンドとし、１６ラウンド行った後に得られたＤＮＡをプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ−Ｋｎ（ｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチプルクローニングサイトのＢａｍＨＩサイト、ＳａｌＩサイト間にカナマイシン耐性遺伝子を組み込んだもの）にクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。各クローンが組み込まれているプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄIIIによって処理を行った。次にＴｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＲｕｎ−ｏｆｆ転写することによって［α−３２Ｐ］ＵＴＰを取り込ませ、目的鎖長のＲＮＡを放射能標識した。そして１０％−ＰＡＧＥ／８Ｍ−Ｕｒｅａによって精製し、エタノール沈殿によって濃縮した後、標的に対する結合能評価を行った。この結果結合能を示すクローンの塩基配列をＤＮＡシーケンシング（ＬＩ−ＣＯＲ）によって決定した。ＳＥＬＥＸによって選択されたＲＮＡの結合能評価の結果、図１に示すアプタマーを取得した。
【実施例２】
【００１８】
［３２Ｐ］を用いて内部放射能標識したＲＮＡアプタマーを調製した。これをｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ中で、７５℃、５分間加熱後、３７℃、３０分間静置し、高次構造の再構築を行った。このアプタマーと標的を結合反応（４℃／３０分、ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｓｃａｌｅ  １００μｌ）させた。結合反応後、フィルター（Ｄｕｒａｐｏｒｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（ＧＶＷＰ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に結合反応溶液を投入し、吸引濾過を行った。このフィルターを乾燥させた後、フィルター上に保持された標的に結合しているアプタマーの放射能強度を液体シンチレーションカウンター（ＡＬＯＫＡ）により測定した。そして、フィルターに捕捉されたＲＮＡと投入ＲＮＡの放射能強度を比較することにより、ＲＮＡ集団の標的への結合率を百分率で示した。また、同様の方法を用い芽胞形成菌であり、芽胞を形成している状態のＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに対しても同様に結合率を評価した。その結果、それぞれの標的に対して高い結合率を示した（図２）。さらに、ＳＥＬＥＸを行っていないランダムなヌクレオチドで構成されるＲＮＡを用いた場合、これらには全く結合を示さなかった。
【実施例３】
【００１９】
顕微鏡による芽胞形成菌の検出
（１）蛍光標識
Ｇ．ｓｔ−１の蛍光標識を、５´−ＥｎｄＴａｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）と、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を用いて行った。方法は、まず蛍光標識したＧ．ｓｔ−１  １０ｎＭと標的との結合反応（４℃／３０分）を行った。ＲＮＡと反応しなかった蛍光物質を除き、残存している可能性がある蛍光色素を除くため、口径０．２２μｍのフィルター（Ｉｓｏｐｏｒｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（ＧＴＢＰ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて吸引ろ過を行った後に顕微鏡観察を行った。
（２）結果
【００２０】
結果を図３に示す。顕微鏡によって、蛍光標識したアプタマーが検出された。また、同様の方法を用い芽胞形成菌であり、芽胞を形成している状態のＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを用いた場合でも同様の蛍光が検出された。一方、ＳＥＬＥＸを行っていないランダムなヌクレオチドで構成されるＲＮＡを用いた場合蛍光は検出されなかった。したがって、本発明のアプタマーを用いることによって芽胞形成菌を顕微鏡を用いて検出することができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明のアプタマーは、芽胞を形成した芽胞形成菌を特異的に認識するものであり、食品などへ混入した芽胞形成菌を迅速かつ容易な検出の可能性を示しており、今後の食品検査などに貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明のＲＮＡアプタマーの配列を示すものである。
【図２】本発明により得られたアプタマーの結合能評価の結果を示す。
【図３】本発明により得られた蛍光ラベルアプタマーの標的への結合の顕微鏡写真の結果を示す。
【図１】
2009039033.tif 000003
【図２】
2009039033.tif 000004
【図３】
2009039033.tif 000005