(57)【要約】【課題】  効果的に神経細胞の神経突起を形成することができる低分子量の神経分化誘導剤を提供する【解決手段】  ヒアルロナン又は薬理学的に許容されるその塩を有効成分として含有する神経細胞分化誘導剤、及び、神経幹細胞又は神経前駆細胞をヒアルロナン又は薬理学的に許容されるその塩の存在下で培養することを含む、神経幹細胞又は神経前駆細胞をインビトロで分化させる方法が提供される。神経細胞誘導に使用するヒアルロナンは、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、これを１個〜１０個含む２糖〜２０糖の低分子量ヒアルロナンを用いることができ、特に、  低分子量ヒアルロナンが、１単位を２個含む４糖のヒアルロナン（ＨＡ４）を用いることができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナン又は薬理学的に許容されるその塩を有効成分として含有する神経細胞分化誘導剤。
【請求項２】
ヒアルロナンが−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、これを１個〜１０個含む２糖〜２０糖の低分子量ヒアルロナンであることを特徴とする請求項１に記載の神経細胞分化誘導剤。
【請求項３】
低分子量ヒアルロナンが、１単位を２個含む４糖であることを特徴とする請求項２に記載の神経細胞分化誘導剤。
【請求項４】
神経幹細胞又は神経前駆細胞の神経細胞への分化を促進することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の神経細胞分化誘導剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の神経細胞分化誘導剤を含む神経疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の神経細胞分化誘導剤を含有することを特徴とする食品。
【請求項７】
神経幹細胞又は神経前駆細胞をヒアルロナン又は薬理学的に許容されるその塩の存在下で培養することを含む、神経幹細胞又は神経前駆細胞をインビトロで分化させる方法。
【請求項８】
ヒアルロナンが−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、これを１個〜１０個含む２糖〜２０糖の低分子量ヒアルロナンであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
低分子量ヒアルロナンが、１単位を２個含む４糖であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞又は神経前駆細胞の神経突起伸長を含む神経細胞分化を誘導する神経細胞分化誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロナン４糖（ＨＡ４）は、ストレス存在下においてＨＳＰ７２の発現を増強し、細胞死を抑制することが知られている（非特許文献１）。また、ヒアルロナン４糖には他にもin vitroにおいてサイトカインおよびケモカイン遺伝子の発現抑制効果（特許文献１）、シナプス伝達促進（特許文献２）、多発性硬化症の改善効果（特許文献３）、変形性関節症への改善効果（特許文献４）、アトピー性皮膚炎への改善効果（特許文献５）、ヒアルロナン産生促進効果（特許文献６）等が知られており、多様な生理活性を持つ物質として注目されている。
【０００３】
これまでにヒアルロナンが結合するタンパク質として、ＣＤ４４（非特許文献３）などが知られている。ＣＤ４４のようなタンパク質に結合できるヒアルロナンの最小サイズは６糖または１０糖以上であり、ヒアルロナン４糖は結合できない。また、ヒアルロナン４糖による神経細胞への直接的な作用として、神経幹細胞の分化誘導、神経突起伸長についての効果は知られていない。
【０００４】
近年、バイオテクノロジーや再生医学の分野において、細胞の分化メカニズムの解明が注目されている。このメカニズムの研究には、実際に細胞を分化させることや分化した細胞が必要であり、効果的な細胞の分化方法を確立することが求められている。
【０００５】
分化した細胞を調製するための方法としては、従来、神経成長因子(nerve growth factor；ＮＧＦ）等の成長因子を培養液に添加する方法（非特許文献４参照）、インターロイキン−６ （ＩＬ−６）のようなサイトカインを培養液に添加する方法（非特許文献５参照）、細胞培養用の恒温装置内で酸素濃度をコントロールし、生体での酸素濃度を模倣した低酸素濃度培養により分化させる方法（特許文献７参照）、放射線を照射することで分化させる方法（非特許文献６参照）、培養液に電圧を印加することで分化させる方法（特許文献８参照）等が知られている。
【０００６】
また、近年の老人人口の増加に伴って老人性痴呆病などの脳疾患等の増加が懸念される他、外傷、代謝性の要因、脳虚血、パーキンソン病またはダウン症等によっても脳神経細胞障害が生じる。すなわち、加齢、内的要因、外的要因により神経が障害を受けると病的症状が発現する。例えば、中枢神経に障害が起こる場合として、アルツハイマー病や脳血管障害による痴呆、脳挫傷等による意識障害、パーキンソン病による振戦や筋硬直等が知られている。また末梢神経に障害が起こる場合として、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症や事故等に伴う神経損傷による運動機能障害、糖尿病、尿毒症、ビタミンＢ１欠乏、ビタミンＢ１２欠乏、慢性肝障害、サルコイドーシス、アミロイドーシス、甲状腺低下症、がん、血管炎、シェーグレン症候群、感染症に伴う免疫異常、遺伝性疾患、物理的圧迫、薬剤（制癌剤、抗結核剤、抗てんかん剤等）、または中毒（砒素、タリウム、二硫化炭素等）等によるニューロパチーが良く知られている。
【０００７】
これらの障害において神経が不可逆的損傷を受けた場合、再生・修復は困難であると考えられてきた。これらの神経疾患における有効な治療法の確立が急務であり、有効な治療薬の開発が強く望まれている。このような状況下、近年、神経幹細胞や胚性幹細胞から神経分化を誘導することが脳疾患の治療に有効であると提唱されている。
【０００８】
神経栄養因子は、ニューロンの分化誘導、生存維持に関与する一群のタンパク質性化合物であり、その代表的な物質としてＮＧＦやBrain Derived Nerve growth Factor （ＢＤＮＦ） が知られている。このような神経栄養因子は、中枢神経、末梢神経のいずれにおいても神経の分化、生存維持、修復に深く関与していることが明らかになってきている。神経細胞の増殖・分化因子は、神経発生に深く関与している他、筋萎縮性側索硬化症、抗癌剤等による薬剤障害性末梢神経障害、糖尿病性の末梢神経障害などの疾患にも関与していると考えられる。従って、神経細胞の増殖や分化を制御する因子は、これらの疾患の治療や予防に用いることが可能である。さらに該因子は、上記疾患に加え、アルツハイマー病、パーキンソン病等の中枢神経系の疾患に対する治療薬や予防薬となり得る。そこで、神経栄養因子の神経に対する作用を応用すれば、神経障害の治療が可能ではないかという仮説から、神経栄養因子の医薬品としての開発が検討され、実際、神経障害の治療薬として使用し得ることも示唆されている（非特許文献７参照）。
【０００９】
【非特許文献１】Xu H, Ito T, TawadaA, Maeda H, Yamanokuchi H, IsaharaK, Yoshida K, Uchiyama Y, Asari A. Related Articles, Links Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72.  J Biol Chem. 2002  277(19):17308-14.
【非特許文献２】Tawada A, Masa T, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronanoligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology. 2002 12(7):421-6.
【非特許文献３】Isacke CM, Yarwood H.   The hyaluronanreceptor, CD44.  Int J Biochem Cell Biol. 2002 Jul;34(7):718-21.
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA、73巻、2424-2428項 （1976）
【非特許文献５】Mol. Cell Biol.、8巻、3546-3549 項 (1988)
【非特許文献６】FEBS Lett.、364巻、298-300項 (1995)
【非特許文献７】Science、264巻、772-774項 (1994)
【非特許文献８】Glycobiology. 12巻、421-426項（2002）
【特許文献１】特開２００７−１０６６８８号公報
【特許文献２】特開２００７−１５３７６１号公報
【特許文献３】特開２００６−３２７９５８号公報
【特許文献４】特開２００６−３３５６９４号公報
【特許文献５】特願２００６−２８２７８７号公報
【特許文献６】特願２００７−１２６４５３号公報
【特許文献７】特表２００２−５３００６７号公報
【特許文献８】特願平２−２６３８２３号公報
【特許文献９】特表平８−５０６５０６号公報
【特許文献１０】国際公開WO２００４／０８４９１２号公報
【特許文献１１】国際公開ＷＯ２００３／０４２３８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の通り、神経の分化誘導因子としてＮＧＦとＢＤＮＦが知られている。ＮＧＦは、分子量約５万、ＢＤＮＦは分子量約２万７千のタンパク質であり、生体で容易に分解を受けやすい。特に、脳に薬剤を送達させたい場合には、これらのタンパク質は血液脳関門を通過しないため、末梢からの投与や経口投与では効果がない。また、神経障害の治療には長期間を有することから、投与法や製剤化の開発が困難なＮＧＦやＢＦＮＦでは適用に限界がある。さらに、ＮＧＦやＢＤＮＦなどの神経細胞分化誘導因子は、非常に高価であるため、長期投与を必要とする神経障害の治療には経済的ではない。また、放射線照射、低酸素条件下における培養、電圧の印加による分化誘導は、特殊あるいは高価な機器が必要であり、コストや手間が大きい。したがって、簡便、安価、かつ有効な神経細胞への分化誘導手段が依然として求められている。
【００１１】
分化誘導因子を生体に用いるためには、安全であることが必須であり、かつ医薬品としての利用法を考慮すると簡便、安価、かつ高い効率が求められる。
【００１２】
現段階においては、確実な分化誘導を促すため、体内から細胞を生体外に取り出し、しかるべき条件下において分化誘導後、分化した細胞を体内に移植することが試みられている。生体外に取り出して再度移植をする技術はすでに確立されているが、脳虚血や外傷による神経障害においては速やかな処置が必要であることと、移植手術においては必要な人がすべて治療を受けることができないという現状を鑑みると、薬剤を経口又は非経口投与することにより神経障害が治療及び予防できることも望まれている。
【００１３】
近年、成人の脳内において未分化の細胞が存在することが知られている。分化誘導物質を脳内の未分化細胞に届け、適切な分化誘導を起こすことができれば、急性期の神経障害に対する早急な治療手段を開発できる。また同様に、分化誘導作用を有し、かつ経口投与が可能な薬剤が開発されれば、在宅での治療が可能となり、急性神経障害に限らず慢性神経障害に対しての有効な治療方法が開発できる。
そこで、本発明は、安全性が高く、かつ容易に入手でき、効果的に神経細胞の神経突起を形成することができる低分子量の神経分化誘導剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、鋭意検討の結果、ヒアルロナン、特に低分子量ヒアルロナンを生体内に投与することでＮＧＦやＢＤＮＦなどの神経細胞分化誘導因子の非存在下においても、幹細胞から神経細胞を効率よく分化誘導をすることを明らかにした。
【００１５】
即ち、本発明は、ヒアルロナン又は薬理学的に許容されるその塩を有効成分として含有する神経細胞分化誘導剤を提供する。ヒアルロナンは、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、これを１個〜１０個含む２糖〜２０糖の低分子量ヒアルロナンを用いるのが好ましく、１単位を２個含む４糖のヒアルロナン（ＨＡ４）を用いるのがより好ましい。
本発明の神経細胞分化誘導剤は、神経幹細胞又は神経前駆細胞の分化を促進することができる。したがって、本発明は、神経細胞分化誘導剤を含有する、神経疾患を治療するための医薬組成物を提供する。また、本発明は、神経細胞分化誘導剤を含有する食品を提供する。
【００１６】
また、本発明は、神経幹細胞又は神経前駆細胞をヒアルロナン又は薬理学的に許容されるその塩の存在下で培養することを含む、神経幹細胞又は神経前駆細胞をインビトロで分化させる方法を提供する。本発明の方法で使用されるヒアルロナンは、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、これを１個〜１０個含む２糖〜２０糖の低分子量ヒアルロナンを用いるのが好ましく、１単位を２個含む４糖のヒアルロナン（ＨＡ４）を用いるのがより好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の神経細胞分化誘導剤及び分化方法によって、神経幹細胞又は神経前駆細胞をインビトロ又はインビボで神経細胞への分化を誘導できる。したがって、本発明により、神経細胞の分化についての基礎研究、神経疾患のための治療剤及びその開発ツール、再生医療への応用が可能となる。
さらに、ヒアルロナン自体が天然物質であることから、副作用がなく（又は極めて少ない）、安全性の高い、急性、慢性の神経障害の症状を緩和又は進行を防止できる医薬を提供できる。本発明の神経細胞分化誘導剤を生体から取り出した細胞または培養細胞に添加することも可能である。また、本発明の神経細胞分化誘導剤を生体内に投与することで急性、慢性に依らず神経障害を治療することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明において、神経細胞分化とは、神経幹細胞又は神経前駆細胞を、神経細胞に分化させることである。分化した神経細胞とは、例えば、神経細胞の神経突起の伸長を起こし、神経網の形成を起こした状態の細胞をいい、顕微鏡による観察やマーカータンパク質の発現などにより確認することができる。マーカータンパク質としては、例えば、チューブリン（特にβチューブリン）、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼを例示することができる。また、神経幹細胞とは、胚、胎児または成人から取り出すことのでき、一定の条件下で長期間にわたって自らを再生できる能力を備えると同時に、ニューロンおよびグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト）のどちらをも生じることができる多分化能細胞である。神経前駆細胞は、胚、胎児細胞や成人の組織中で作り出され、特定の分化細胞系譜に入った部分的に分化した細胞で、さらに分化を続けて限られた回数の分裂後に最終的に特定の神経細胞に分化する細胞をいう。
【００１９】
本発明に係る誘導剤に含まれるヒアルロナンとしては、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとから基本的に構成されるものであれば、２糖単位が１個または複数個結合したものにそれらの要素が結合した糖であってもよく、またこれらの誘導体、例えば、アシル基等の加水分解性保護基を有したもの等も使用し得る。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。本発明で使用するヒアルロナンとしては、具体的には動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどいずれも使用することができる。例えば鶏冠、さい帯、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法と精製法によって得ることができる。またストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によっても製造できる。
【００２０】
本発明においては、ヒアルロナンオリゴ糖もヒアルロナンに包含され、上記２糖単位１個からなる２糖およびその誘導体のような低分子量のヒアルロナンから、重量平均分子量４００万程度の高分子量のヒアルロナンまで使用することができる。好ましくは組織、特に脳における浸透性などの点で優れる重量平均分子量３８０程度〜９００，０００程度のヒアルロナンが挙げられ、より好ましくは２〜２０糖程度のヒアルロナンを挙げることができる。特に好ましくは、１単位を２個含む４糖のヒアルロナン（ＨＡ４）である。
【００２１】
ヒアルロナンのうち分子量の低いものは、具体的には、酵素分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、超音波処理法(Biochem., 33(1994)p6503-6507)等の公知の方法によってヒアルロナンを低分子化する方法、化学的もしくは酵素的に合成する方法(Glycoconjugate J., (1993)p435-439、WO93/20827) などで製造することが好ましい。例えば酵素分解法としては、ヒアルロナン分解酵素（ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Streptomyces由来）、ヒアルロニダーゼＳＤなど）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII 、コンドロイチナーゼＡＢＣなどのヒアルロナンを分解する酵素をヒアルロナンに作用させてヒアルロナンオリゴ糖を生成する方法（新生化学実験講座「糖質II−プロテオグリカンとグリコサミノグリカン−」p244-248、1991年発行、東京化学同人 参照）などが挙げられる。
【００２２】
また、アルカリ分解法としては、例えばヒアルロナンの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して、低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量のヒアルロナンを得る方法などが挙げられる。本発明で用いるヒアルロナンは、塩の形態を包含し、製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を用いることができる。例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ（ｎ−ブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などであることができる。
【００２３】
本発明の分化誘導剤は、ある分子量のヒアルロナン単独又は種々の分子量のヒアルロナンを組み合わせたものなど特に限定することなく使用できる。本発明の分化誘導剤は、ヒアルロナンを有効成分とするものであり、その有効量を、培養細胞の培地中に添加することによって、又はヒトを含む哺乳動物に投与することによって、神経幹細胞又は神経前駆細胞の神経細胞への分化を誘導することができる。
【００２４】
例えば、神経幹細胞又は神経前駆細胞にインビトロで本発明の分化誘導剤を添加して、神経細胞への分化を誘導したり、ヒアルロナンを経口又は非経口で投与して、生体内において神経幹細胞又は神経前駆細胞から神経細胞への分化を誘導することに使用することができる。また、例えば、ヒトを含む哺乳動物から神経幹細胞又は神経前駆細胞を生体外に取り出し、本発明の分化誘導剤を使用して神経細胞への分化を誘導して、その後、その神経細胞を生体内に再び戻すことも可能である。また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のような各種の幹細胞に対して神経細胞への分化を誘導することも可能である。
【００２５】
本発明の分化誘導剤をインビトロで使用する場合には、ＨＡ４の濃度が１〜１０００ ｎｇ／ｍｌになるように培養培地に添加すればよく、より好ましくは、３〜５０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、５〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば１０ｎｇ／ｍｌである。本発明の分化誘導剤にＢＤＮＦやＮＧＦのような他の神経分化誘導物質と併用することもできるが、これらの神経分化誘導物質の非存在下でも神経への分化誘導が可能である。すなわち、ヒアルロナン単独でも神経細胞への分化が誘導される。
【００２６】
本発明の薬剤は、ヒアルロナン又はその塩を、そのまままたは必要に応じて担体、賦形剤、その他の添加物と共に、経口的あるいは非経口的に投与（静脈内投与、髄腔内投与など）するための医薬品として、任意の剤形に製剤化することが可能である。特に、本発明に係る薬剤は、髄腔内投与とすることが好ましい。投与量は、対象とする疾患、患者の年令、健康状態、体重等に応じ適宜決定するが、一般には０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇを１日１回あるはそれ以上に分けて投与する。本発明の分化誘導剤は、神経系の疾患、例えば、老人性痴呆症；外傷、脳虚血、パーキンソン病またはダウン症等による脳神経細胞障害；
アルツハイマー病や脳血管障害による痴呆、脳挫傷等による意識障害、パーキンソン病；多発性硬化症；筋萎縮性側索硬化症；脊髄性筋萎縮症や事故等に伴う神経損傷又は脊髄損傷による運動機能障害；糖尿病、尿毒症、ビタミンＢ１欠乏、ビタミンＢ１２欠乏、慢性肝障害、サルコイドーシス、アミロイドーシス、甲状腺低下症、がん、血管炎、シェーグレン症候群、感染症に伴う免疫異常、遺伝性疾患、物理的圧迫、薬剤（制癌剤、抗結核剤、抗てんかん剤等）、または中毒（砒素、タリウム、二硫化炭素等）等によるニューロパチーの治療及び予防に使用可能である。
【００２７】
ＨＡ４のような低分子量ヒアルロナンはマウスに対して過剰量投与することによる急性毒性試験を行った結果、投与限界量まで与えても毒性所見を示さなかった。よって、この低分子量ヒアルロナンは有効であり、かつ非常に安全であることから神経分化を誘導することによる神経障害の治療に有効である。
【００２８】
また、本発明の分化誘導剤を食品中に含有させて、上記疾患及び障害の治療及び予防のために使用することもできる。特に、痴呆症等の予防や、神経損傷の治療など、長期にわたり投与が必要になる場合に、本発明の分化誘導剤を含有させた食品として摂取することができる。特に痴呆症など、医薬の持続的投与が困難である場合には、食品として本発明の分化誘導剤を日常的に摂取させることができるという利点がある。
【００２９】
食品は、固形、半固形の食料品のみならず、液体又は流動性の高い、いわゆる飲料も含む。例えば、動物性食品、植物性食品、加工食品、調味用材料、調理用材料、嗜好食品、加工食品など、任意の食料品に本発明の食品を含有させることができる。また、例えば、水、清涼飲料水、アルコール飲料、茶、コーヒー、流動食などの任意の飲料に含有させることができる。食料品及び飲料の具体的な例として、例えば栄養補助食品やサプリメントを挙げることができる。また、健康食品として、又は厚生労働省の認可を受けることにより、効果を標榜することのできる特定保健用食品として販売することも可能である。食品としてヒアルロナンは生体物質であるため、多量に摂取しても副作用がない又は極めて低いと考えられる。上記の通り任意の食料品及び飲料に、本発明の食品を含有させることができる。痴呆や神経損傷の症状の緩和を図るためには、継続的に本発明のヒアルロナンを摂取するのが望ましいため、日常的に摂取する食品及び飲料に本発明の食品を含有させるのが望ましい。
【実施例】
【００３０】
＜材料と方法＞
＜培地調製＞
２００ｍｌのＮＰＢＭ （Camblex）に、NP supplement singlequots (Camblex) を全量入れて、ＮＰＤＭとした。そのうち５０ｍｌをファルコンチューブにとり、growth singlequotsの内容物それぞれ０．１ｍｌを添加して、ＮＰＭＭとした。
【００３１】
＜ラミニンコート＞
４１４０μｌの冷ＮＰＤＭ培地に、１ｍｇ／ｍｌのマウスラミニンＩ(R&D) を３６０μｌ加えて、ラミニン溶液とした。氷上に設置した９６ウェルプレートに、２０μｌ／ウェル（１．６μｇ／ウェル）の量でラミニン溶液を添加して、ウェルをコートした（５μｇ／ｃｍ２）。３７℃で１時間以上インキュベートし、残ったラミニン液を除き、２００μｌの培地で洗浄した。
【００３２】
＜ＢＤＮＦ調製＞
組換え型ヒトＢＤＮＦの５μｇ入りバイアル (R&D) に、フィルター濾過した０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを５０μｌ入れ、１００μｇ／ｍｌとし、ストック溶液とした。
【００３３】
＜細胞の調製＞
Ｔ１７５フラスコにＮＰＭＭ培地を４０ｍｌ入れ、３７℃、５％ＣＯ２で３０分プレインキュベートした。３７℃の温浴で正常ヒト神経細胞前駆細胞（ＮＨＮＰ）(Lonza)を溶かし、２ｍｌピペットを用いて懸濁し、プレインキュベートしたフラスコに移し、２４時間インキュベートした。２４時間培養後、細胞を８０ｇで５分間遠心し、上清を除いた。２０ｍｌのＮＰＤＭを添加し、１×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁した。
【００３４】
＜被検物質の調製＞
被検物質はＨＡ４を使用した。具体的には、ＨＡ４は、Tawadaらの方法（非特許文献６）により調製したものを使用した。２．７ｍｌのＮＰＤＭ培地に１ｍｇ／ｍｌのＨＡ４を１０．８μｌ添加し、４０００ｎｇ／ｍｌとした。ＮＰＤＭを２．４３ｍｌずつ入れたチューブに４０００ｎｇ／ｍｌの濃度のＨＡ溶液を０．２７ｍｌ入れ、さらに１０倍ずつ希釈して、４００、４０、４ ｎｇ／ｍｌのＨＡ溶液を調製した。
【００３５】
＜神経細胞前駆細胞の培養＞
上記のように調製された正常ヒト神経細胞前駆細胞（ＮＨＮＰ）を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μｌ（１×１０４細胞／ウェル）播種した。０、４、４０、４００、４０００ｎｇ／ｍｌになるよう調製したＨＡ４溶液を、１ウェルあたり５０μｌ添加した（ＨＡ４の最終濃度０、１、１０、１００、１０００ ｎｇ／ｍｌ）。さらに、０、５０、１００ ｎｇ/ｍｌになるよう調製したＢＤＮＦ溶液を、１ウェルあたり５０μｌずつ添加した（最終濃度０、１２．５、２５ ｎｇ／ｍｌ）。（ウェル内の全液量２００μｌ）。
約９６時間おきに培地交換を行った。二度目の培地交換以降、培地量は１００μｌ／ウェルとした。
【００３６】
＜神経突起の伸長の確認＞
１６日間培養後、細胞の写真を撮影した。ウェル中でニューロスフィア（Neurosphare）の大きいものを含む視野を選んで撮影した。結果を図１〜１４に示す。
【００３７】
神経細胞のマーカーであるチューブリンの発現の有無を確認するために、抗チューブリンモノクローナル抗体により免疫蛍光染色を行った。
【００３８】
＜結果＞
＜神経突起の確認＞
ＢＤＮＦの濃度が０ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌいずれの群においても、ＨＡ４で神経突起伸長促進作用が認められた。また、ＨＡ４の濃度が１０ｎｇ／ｍｌのときが、神経突起伸長の促進作用が最も高かった。
【００３９】
＜神経細胞マーカーの発現＞
免疫蛍光染色により、ＨＡ４により処理した神経幹細胞は、全て神経細胞マーカーであるチューブリンを発現していることが確認された。ＢＤＮＦを２５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞におけるチューブリンを免疫蛍光染色した写真を図１５に示す。
ＨＡ処理によって、神経突起のみならず、分化マーカーを発現することが示された。したがって、ＨＡ４には神経細胞分化誘導機能があることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＢＤＮＦを０ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図２】ＢＤＮＦを０ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図３】ＢＤＮＦを０ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図４】ＢＤＮＦを０ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図５】ＢＤＮＦを１２．５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図６】ＢＤＮＦを１２．５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図７】ＢＤＮＦを１２．５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図８】ＢＤＮＦを１２．５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図９】ＢＤＮＦを１２．５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図１０】ＢＤＮＦを２５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図１１】ＢＤＮＦを２５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図１２】ＢＤＮＦを２５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図１３】ＢＤＮＦを２５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図１４】ＢＤＮＦを２５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図１５】ＢＤＮＦを２５ｎｇ／ｍｌ及びＨＡ４を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加して培養後、チューブリンにより免疫蛍光染色により染色したときの写真である。
【図１６】ＢＤＮＦを２５ｎｇ／ｍｌ又はＨＡ４を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加して培養したときの神経幹細胞の突起伸長の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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