(57)【要約】【課題】ノロウイルスＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して高感度に検出すること。【解決手段】ノロウイルスＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して、ハイブリダイゼーション効率の高い二種以上の切断用オリゴヌクレオチド、５’末端にプロモーター配列を有する第一のプライマー、第二のプライマー、および逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において増幅されたＲＮＡ産物量をインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブにて測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する方法であって
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定核酸配列を鋳型とし、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複し、該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程、
（２）５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマー、第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（４）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（５）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなり、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１から３に対してそれぞれ十分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなり、前記第一のプライマーが配列番号４に対して十分に相同的な配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号５に対して十分に相補的な配列からなることを特徴とするノロウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（５）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブ存在下で該シグナル変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが配列番号６に対して十分に相補的な配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便、迅速にノロウイルスを測定する方法に関する。本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査、食中毒検査の分野に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスはヒトカリシウイルス科に属するウイルスで、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムにもつ。ノロウイルスは、小型球形ウイルス（Ｓｍａｌｌ  Ｒｏｕｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｖｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）とも呼ばれている。
【０００３】
我が国で届け出されている食中毒の約２０％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイルス性食中毒例の約８０％以上からノロウイルスが検出される。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題となっている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎からもノロウイルスが検出され、ヒトからヒトへの感染例も報告されている。以上から、ノロウイルスの検査は、公衆衛生上および食品の品質管理上大きな課題となっており、遺伝子増幅法を用いた、高感度かつ迅速でしかもあらゆる遺伝子型の検出が可能もしくは検出率の高い検査法の開発が望まれている。従来、ノロウイルスの検出は、電子顕微鏡による観察が基本であった。この方法では、あらゆる遺伝子型の検出か可能であるが、検出するには１０６個／ｍＬ以上のウイルス量が必要と感度が低いため、検体は患者糞便に限られている。また、ウイルスを観察できても同定することはできなかった。
【０００４】
また、ヒトカリシウイルスのウイルス様中空粒子を用いた特異抗体検出ＥＬＩＳＡの試薬も開発されている（特許文献１）。しかし、検出感度は電子顕微鏡と同程度で決して高感度とはいえない。
【０００５】
ノロウイルスを高感度に測定する手段としてノロウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅する方法があげられる（特許文献２）が、該方法の場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要である。このことは、操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、二次汚染の危険性をも増加させることにもなる。また、前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。
【０００６】
標的ＲＮＡの定量法としては、ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程をインターカレーター性蛍光色素存在下で実施して蛍光増加を測定するＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法が汎用されている（非特許文献１）が、該方法ではプライマーダイマーなどの非特異増幅産物も検出してしまうという問題もあった。さらに、ＰＣＲは急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
【０００７】
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４）、およびＴＭＡ法（特許文献５）などが報告されている。該ＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行なうものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
【０００８】
以上のように前記ＲＮＡ増幅方法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法などによる検出は煩雑な操作を必要とし、再現性良く定量できないという課題がある。
【０００９】
簡便にＲＮＡを増幅および測定する方法としては、Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（特許文献６および非特許文献２）の方法があげられる。該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、簡便、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を同時に実施することが可能である。
【００１０】
前記の各核酸増幅方法は、いずれもセンスプライマー（第一のプライマー）およびアンチセンスプライマー（第二のプライマー）からなるプライマーセットにより標的ＲＮＡを増幅する方法であり、該プライマーセットを構成するプライマー配列の組み合わせが前記核酸増幅の効率および特異性に重要な意義を持つことは周知である。しかし、ノロウイルスはきわめて多様な遺伝子型を有するため、全ての遺伝子型を一様かつ高効率に増幅するプライマーセットの構築はきわめて困難であった。
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２０００／０７９２８０号公報
【特許文献２】特許３７５２１０２号公報
【特許文献３】特許２６５０１５９号公報
【特許文献４】特許３１５２９２７号公報
【特許文献５】特許３２４１７１７号公報
【特許文献６】特開２０００−１４４００号公報
【特許文献７】特開２００５−２４５４３４号公報
【特許文献８】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献９】特開２００１−１３１４７号公報
【非特許文献１】Ｋａｇｅｙａｍａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４１，１５４８−１５５７（２００３）
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【非特許文献３】感染症発生動向調査週報、６（１１）、１４−１９（２００４）
【非特許文献４】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４９９２−４９９７（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ノロウイルスは遺伝子配列の違いによりジェノグループＩ（ＧＩ）とジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）の２種の遺伝子群に大別される。さらに各遺伝子群についても、現時点でＧＩは１４の遺伝子型に、ＧＩＩは１７の遺伝子型に区別される（非特許文献３参照）。ＧＩに属する遺伝子型間、およびＧＩＩに属する遺伝子型間の塩基配列の相同性は約７０％である。また、ＧＩとＧＩＩの塩基配列の相同性は４０〜５０％である。
【００１３】
前記遺伝子増幅法を用いたノロウイルス検出試薬で高い検出率をあげるためには、プライマー結合領域として、各種遺伝子型間で塩基配列が高度に保存された２０塩基以上の領域が、少なくとも２箇所は必要である。しかしながら、ＧｅｎＢａｎｋ上のノロウイルスの配列として、以下の６配列（Ｃｈｉｂａ（Ｎｏ．ＡＢ０４２８０８）、Ｎｏｒｗａｌｋ（Ｎｏ．Ｍ８７６６１）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（Ｎｏ．Ｌ０７４１８）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ（Ｎｏ．ＡＦ１４５８９６）、Ｈａｗａｉｉ（Ｎｏ．Ｕ０７６１１）、ＨｕＣＶ（Ｎｏ．ＡＹ０３２６０５））の相同性を調べただけでも、遺伝子型間で塩基配列が同じである２０塩基以上の領域は存在しない。
【００１４】
このような背景のもと、本発明者らは、既に、ＧＩ、あるいはＧＩＩの幅広い遺伝子型で高い検出率を有する検出方法を提供している（特開２００５−２４５４３４号公報、特許文献７）。しかし、該方法をもってしてもノロウイルスの全ての遺伝子型に対する高感度かつ一様な検出が達成されたとはいえず、より広範囲の遺伝子型をより高感度に検出するノロウイルスＲＮＡの検出方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、ノロウイルスＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して高感度に簡便、迅速な測定をすることが可能となった。
【００１６】
請求項１に記載の発明は試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する方法であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定核酸配列を鋳型とし、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複し、該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程、
（２）５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマー、第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（４）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（５）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなり、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１から３に対してそれぞれ十分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなり、前記第一のプライマーが配列番号４に対して十分に相同的な配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号５に対して十分に相補的な配列からなることを特徴とする。
【００１７】
請求項２に記載の発明は請求項１に係り、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（５）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブ存在下で該シグナル変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが配列番号６に対して十分に相補的な配列からなることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明中の特定塩基配列とは、ノロウイルスＲＮＡ上で、第一のプライマーと相同領域の５’末端から第二のプライマーと相補領域の３’末端までの塩基配列に相同なＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。すなわち、本発明では前記特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。本発明中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、該部位は切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。本発明中のプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位で種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が既知であり、本発明の使用において特に限定するものではないが、分子生物学的実験等で汎用されているＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどが好適である。
【００２０】
本発明中の十分に相補的な配列とは、最適化された核酸増幅反応条件（塩濃度、オリゴヌクレオチド濃度、反応温度等）において特定塩基配列に対して特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能な配列をいう。また、本発明中の十分に相同的な配列とは、最適化された核酸増幅反応条件（塩濃度、オリゴヌクレオチド濃度、反応温度等）において特定塩基配列の完全相補配列に対して特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能な配列をいう。したがって、本発明でいう十分に相補的あるいは十分に相同な配列は、ハイブリダイゼーションの特異性および効率に影響を与えない範囲内であれば長さなどを任意に設定することが可能である。
【００２１】
本発明において、ノロウイルスＲＮＡはｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定核酸配列の前記５’末端部位で切断される。特定核酸配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。このような切断方法として、ノロウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内で５’末端を含む部分配列）に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以降、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素等により切断する方法があげられる。該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが好ましい。高効率に前記５’末端部位を切断するためには切断用オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率を上げる必要がある。しかし、ノロウイルスＲＮＡには多様な遺伝子型が存在するため、１種類の切断用オリゴヌクレオチドで種々の遺伝子型に対して高効率にハイブリダイゼーションさせることは困難である。そこで本発明では、切断用オリゴヌクレオチドとして、配列番号１から３に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列からなる切断用オリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドを使用することにより、ノロウイルスＲＮＡのより広範囲な遺伝子型に対して、切断用オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率を向上させ、結果として、使用する第一のプライマーおよび第二のプライマーはそれぞれ一種類でありながら、より広範囲な遺伝子型に対する高感度化が可能となった。
【００２２】
本発明中の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的な配列となる。そのため、たとえば本発明の一態様として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは配列番号６に対して十分に相補的な配列を有する核酸プローブが利用できる。
【００２３】
本発明の一態様として、切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１から３に対してそれぞれ十分に相補的な配列を有し、かつノロウイルスＲＮＡに対し十分に相補的である。そして、第一のプライマーは、その５’末端にプロモーター配列を有しており、配列番号４に対して十分に相同な配列を有し、かつノロウイルスＲＮＡの完全相補配列に対して、十分に相補的なオリゴヌクレオチドである。また、第二のプライマーは、配列番号５に対して十分に相補的な配列を有し、かつノロウイルスＲＮＡに対して十分に相補的である。さらに、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、配列番号６に対して十分に相補的な配列を有し、かつ標的核酸に対して十分に相補的であることが好ましい。
【００２４】
より好ましくは、本発明の前記切断用オリゴヌクレオチドとして、配列番号７から９に記載のオリゴヌクレオチド配列、前記第一のプライマーは配列番号４に記載のオリゴヌクレオチド配列、前記第二のプライマーは配列番号１０に記載のオリゴヌクレオチド配列、前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは配列番号１１に記載のオリゴヌクレオチド配列を有することが好ましい。
【００２５】
本発明中のノロウイルスＲＮＡの測定方法において、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素）が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、たとえば、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素をさらに添加して補足すること等も可能である。前記逆転写酵素は、分子生物学的実験等で汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、あるいはこれらの誘導体などが好適であり、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験等で汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、およびこれらの誘導体が使用可能である。
【００２６】
試料中のノロウイルスＲＮＡに前記切断用オリゴヌクレオチドを添加し、前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として前記第一のプライマーおよび第二のプライマーの存在下で前記逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがノロウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、前記逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行なわれる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは前記逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。引き続いて、前記逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００２７】
このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加することも可能である。
【００２８】
たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から４４℃の範囲で設定することが特に好ましい。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。
【００２９】
増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。このような測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法などが利用できる。しかし、これらは操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを用いることが好ましい。さらに好適な方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特許文献６および非特許文献２参照）。
【００３０】
前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、およびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、前記ＲＮＡ転写産物に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基が適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献８および非特許文献４参照）。
【００３１】
オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献９および非特許文献４参照）。また、前記官能基の導入方法としては、汎用されているＬａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（クロンテック製）等を用いることも可能である。
【００３２】
本発明の一態様として、試料に少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号４に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号１３）を付加した配列）、第二のプライマー（配列番号１０に示す配列）、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号１１に示す配列）、切断用オリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号７から９に示す配列）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から４４℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。前記態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例１時間以内で終了することが可能である。
【００３３】
また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にノロウイルスＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【００３４】
前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明によりノロウイルスＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して高特異性、高感度、迅速、簡便、一定温度かつ一段階の測定が可能となった。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１
本願実施例で使用したノロウイルスＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で調製した。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているノロウイルスｃＤＮＡ塩基配列のうち、表１に示す遺伝子型、及び塩基配列領域の２本鎖ＤＮＡを調製した（なお、当該ＤＮＡの５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写を実施し、引き続きＤＮａｓｅ  Ｉ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００３６】
【表１】
2009017824.tif 000002
なお、標準ＲＮＡの全長は５３３塩基（該ＲＮＡの５’末端にはＳＰ６プロモーターに由来する８塩基が付加されている）と、ノロウイルスＲＮＡの全長（約７０００塩基）の一部ではあるが、本発明の測定対象であるノロウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。また、今回標準ＲＮＡを調製した遺伝子型はノロウイルス  ＧＩＩ  ＲＮＡの遺伝子型全１７種のうちの７種と一部ではあるが、
（Ａ）ＧＩＩ／７、ＧＩＩ／８、ＧＩＩ／９、およびＧＩＩ／１３との間
（Ｂ）ＧＩＩ／１１、ＧＩＩ／１４、およびＧＩＩ／１６との間
（Ｃ）ＧＩＩ／１、ＧＩＩ／１２、およびＧＩＩ／１５との間
（Ｄ）ＧＩＩ／２、ＧＩＩ／５、およびＧＩＩ／１０との間
はそれぞれ相同性が高い（非特許文献３）ことから、今回調製した遺伝子型の標準ＲＮＡを全て検出できれば、特殊な遺伝子型であるＧＩＩ／１７以外の全ての遺伝子型に属するノロウイルス  ＧＩＩ  ＲＮＡを検出可能であることが予想される。
実施例２
インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを調製した。非特許文献４に記載の方法で、配列番号１１に記載の配列の５’末端から１２番目のＣと１３番目のＡの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１）。
実施例３
本願発明の方法において、表２に示す組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以降、ＩＮＡＦプローブと表記）、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。なお、表２の組み合わせのうち、組み合わせＡに記載の第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチドは特開２００５−２４５４３４（特許文献７）の実施例１に開示した配列と同一である。
【００３７】
【表２】
2009017824.tif 000003
（１）前記各標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用い１０２または１０３コピー／５μＬとなるように希釈した。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００３８】
反応液の組成：酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度または量
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７．２ｍＭ  塩化マグネシウム
１２０ｍＭ  塩化カリウム
１．０ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
０．７５μＭ  第一のプライマー：該プライマーは、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号１３）が付加されている
１．０μＭ  第二のプライマー
２５ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ：該プローブは実施例２において調製したもの
各０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチド：該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ基で修飾されている
６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１３％  ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００３９】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度または量
２．０％  ソルビトール
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
１４２Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
３．６μｇ  牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に６０分間測定した。
【００４０】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３（初期ＲＮＡ量１０３コピーでの結果）および表４（初期ＲＮＡ量１０２コピーでの結果）に示した。なお、表３および表４においてＮ．Ｄ．とは酵素を添加して６０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料を意味する。
【００４１】
【表３】
2009017824.tif 000004
【００４２】
【表４】
2009017824.tif 000005
以前、本発明者らが提供したノロウイルスの検出方法（特開２００５−２４５４３４号公報、特許文献７）では、実施例１において、本願表２の組み合わせＡに示す第一のプライマー、第二のプライマー、および切断用オリゴヌクレオチドを用いることでＧＩＩ／１（Ｈａｗａｉｉ）、ＧＩＩ／２（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ）、ＧＩＩ／３（Ｍｅｘｉｃｏ）、ＧＩＩ／４（Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ）に属するノロウイルス  ＧＩＩ  人工ＲＮＡ（本願実施例１で調製したものとは塩基長が異なる）１０６コピーを検出したことを開示しているが、今回、初期ＲＮＡ量が低い条件で増幅・検出反応を行なったところ、遺伝子型に対する検出率は初期ＲＮＡ量１０３コピーでは７種中２種、１０２コピーでは７種全て未検出と、低濃度のノロウイルスＲＮＡに対する検出率が低いことが判明した。そこで、切断用オリゴヌクレオチドを配列番号７に変更（組み合わせＢ）したところ、遺伝子型に対する検出率は初期ＲＮＡ量１０３コピーでは７種全て、１０２コピーでは７種中１種検出と、低濃度のノロウイルスＲＮＡに対する検出率が向上した。さらに切断用オリゴヌクレオチドを二種以上使用すること（組み合わせＣからＥ）で初期ＲＮＡ量１０２コピーでの遺伝子型に対する検出率はより向上し、最も好ましい組み合わせである組み合わせＥでの初期ＲＮＡ量１０２コピーにおける遺伝子型に対する検出率は７種中５種まで向上した。
【００４３】
以上のことから、ノロウイルスの広範囲な遺伝子型に対して高感度に検出するためには、切断用オリゴヌクレオチドの選定が重要であり、さらに切断用オリゴヌクレオチドを二種以上使用したほうが好ましいことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例２で調製したインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（非特許文献４）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブである。なお、３’末端の水酸基からの伸長反応を防止するために３’末端の水酸基はグリコール酸修飾がなされている。
【図１】
2009017824.tif 000006
【配列表】
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