(57)【要約】【課題】本発明は、セルロースを完全にグルコースに分解することを目的とする。【解決手段】本発明は、高温下にセルロースを超好熱性古細菌由来のβ−1,4エンド型グルカネースと超好熱性古細菌由来のβグルコシダーゼを逐次的にあるいは同時に反応させることを特徴とする、セルロースからグルコースを製造する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高温下にセルロースを超好熱性古細菌由来のβ−1,4エンド型グルカネースと超好熱性古
細菌由来のβグルコシダーゼを逐次的にあるいは同時に反応させることを特徴とする、セルロースからグルコースを製造する方法。
【請求項２】
反応温度が70℃〜100℃である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
可溶性セロオリゴ糖およびセロビオースが検出限界以下である、請求項1または２に記載
の方法。
【請求項４】
β−1,4エンド型グルカネースがパイロコッカスホリコシ由来である、請求項１〜３のい
ずれかに記載の方法。
【請求項５】
βグルコシダーゼがパイロコッカスフリオサス由来である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
得られたグルコースを限外濾過膜等により原料のセルロース及び酵素から分離する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースをグルコースに酵素分解する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化対策におけるガソリン代替として、バイオエタノールの生産が注目されており、澱粉やショ糖のエネルギー変換技術の開発が急速に進められている。ブラジルではサトウキビのショ糖からエタノールが生産され、米国ではトウモロコシ澱粉由来のグルコースを用いて酵母によりエタノールが製造されている。しかしながら、澱粉あるいは糖類からのバイオエタノールの製造によるこれら原料の高騰が問題となっている。
【０００３】
植物繊維系バイオマスは、主にセルロースから構成され、セルロースは豊富に存在しかつ安価であるので、セルロースからその構成単位であるグルコースが効率よく得られれば、非常に望ましい。
【０００４】
セルロースを原料としてグルコースを取り出す方法として硫酸法が知られているが、この方法は大量の硫酸を使用するため、グルコースの過分解や環境汚染などの問題がある。セルロースを原料として利用する酵素糖化方法として、アルカリ・過酸化水素処理したセルロースを使用する方法が知られている（非特許文献１参照）。この方法は、前処理にアルカリ、過酸化水素などの化学薬品を使用するため、環境汚染などの問題がある。
【０００５】
現在、自然界の中で最強のセルロース加水分解酵素はトリコデルマ由来のセルラーゼ群であると考えられている。トリコデルマ由来のセルラーゼ群はβ−1,4エンド型グルカネ
ースとβグルコシダーゼを含む種々のセルラーゼ酵素を含んでいるが、このセルラーゼ群においても、微生物が資化できないセロビオースやセロオリゴ糖が残り完全に単糖（グルコース）にすることは不可能である。そこで、これらのオリゴ糖を加水分解できる種々の酵素を新たに加えることで完全糖化する方法が期待されている。
【０００６】
セルロースをβ−1,4エンド型グルカネースにより分解する方法は公知である。この方
法によると、セルロースから主にセロビオースが生成する。セロビオースはβグルコシダーゼによりグルコースにまで分解されるため、β−1,4エンド型グルカネースとβグルコ
シダーゼを組み合わせると理論上セルロースからグルコースが生産できる。
【０００７】
一方、β−1,4エンド型グルカネースによる生成物セロビオースは、β−1,4エンド型グルカネースの阻害物質であるため、本酵素のみでセルロースが全てセロビオースに変換されることはない。また、βグルコシダーゼは、生成物グルコースが高濃度になると転移縮合反応を触媒するために種々のセロオリゴ糖を生成することが知られている。すなわち、β−1,4エンド型グルカネースとβグルコシダーゼを組み合わせても反応後期になると、
グルコースとともにセロビオースないしセロオリゴ糖が混在することになるために、グルコースの利用が制限されていた。この現象は、自然界の中で最強のセルロース加水分解酵素群を生産するといわれるトリコデルマにおいても観察される。
【非特許文献１】Biotechnol. Prog., 22, pp. 449-453 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、高温下において、セルロースから効率よくグルコースを生産する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、セルロースの酵素分解について検討を重ねた結果、超好熱性古細菌由来のβ−1,4エンド型グルカネースと超好熱性古細菌由来のβグルコシダーゼを併用すること
により、非常に効率的にグルコースが得られることを見出した。
【００１０】
本発明は、以下のセルロースからグルコースを製造する方法に関する。
項１．  高温下にセルロースを超好熱性古細菌由来のβ−1,4エンド型グルカネースと超
好熱性古細菌由来のβグルコシダーゼを逐次的にあるいは同時に反応させることを特徴とする、セルロースからグルコースを製造する方法。
項２．  反応温度が70℃〜100℃である、項1に記載の方法。
項３．  可溶性セロオリゴ糖およびセロビオースが検出限界以下である、項1または２に
記載の方法。
項４．  β−1,4エンド型グルカネースがパイロコッカスホリコシ由来である、項１〜３
のいずれかに記載の方法。
項５．  βグルコシダーゼがパイロコッカスフリオサス由来である、項１〜３のいずれかに記載の方法。
項６．  得られたグルコースを限外濾過膜等により原料のセルロース及び酵素から分離する、項１〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、驚くべきことに、セルロースがほぼ完全にグルコースまで分解され、中間体であるセロビオースおよびその他のセロオリゴ糖は検出限界以下まで分解することができる。
【００１２】
原料となるセルロースは、リン酸や熱処理によりアモルファスのセルロースに変換されるため、特に熱処理されたアモルファスセルロースの場合は、これを高温のまま本発明の方法に供することで、グルコースを効率的に得ることができる。
【００１３】
さらに、本発明の酵素処理は高温でも行うことができるため、生成物濃度の向上が可能である。すなわち、高濃度の生成物グルコース溶液を得ることができ、これを用いてバイオエタノールを得た場合、高濃度のバイオエタノール溶液を得ることができるため、エタノールを分離するときのエネルギー効率にも優れている。さらに、本酵素は超耐熱性で安定性が高いことから、膜等を用いてグルコースを反応系外に取り出すことができれば、長期間の反復使用にも耐えることが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、超好熱性古細菌としては、例えばパイロコッカス属、アエロパイラム属、Sufolobus属、Thermococcus 属、Thermoplasma属、Thermoproteus属、Mastigocladus属、Bacillus属、Synechococcus属、Thermus属に属する細菌が挙げられる。特に、Pyrococcus属により生産されたものが好ましい。
【００１５】
エンド型グルカネースは、超好熱性古細菌から得られる超耐熱性のβ−1,4エンド型グ
ルカネースであれば特に限定されず、例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のβ−1,4
エンド型グルカネースが好ましく例示され、特にパイロコッカスホリコシ由来のβ−1,4
エンド型グルカネースが好ましい。また、超耐熱性エキソ型グルカネースも同様な効果があると考えられる。
【００１６】
βグルコシダーゼは、超好熱性古細菌から得られる超耐熱性のβグルコシダーゼであれば特に限定されず、例えばPyrococcus属細菌由来のβグルコシダーゼが好ましく例示され、特にパイロコッカスフリオサス由来のβグルコシダーゼが好ましい。
【００１７】
本発明の酵素反応は、いずれも高温下で行われる。セルロースとβ−1,4エンド型グル
カネースとの反応は、例えば７０〜１００℃程度、好ましくは８０〜９５℃程度で行われる。温度が低すぎると本発明の効果が損なわれ、温度が高すぎると酵素が失活する可能性がある。β−1,4エンド型グルカネースとの反応生成物とβグルコシダーゼとの反応は、
例えば７０〜１００℃程度、好ましくは８０〜９５℃程度で行われる。温度が低すぎると本発明の効果が損なわれ、温度が高すぎると酵素が失活する可能性がある。
【００１８】
反応時間は、セルロースとβ−1,4エンド型グルカネースとの反応時間は、１〜４８時
間程度で有利に進行する。セルロースとβ−1,4エンド型グルカネースとの反応生成物と
βグルコシダーゼとの反応時間は、１〜２４時間程度で有利に進行する。
【００１９】
セルロースは、植物、微生物などの生物由来のセルロースを広く包含し、アモルファス状態のセルロースが好ましく使用される。アモルファス状態のセルロースは、化学薬品により処理しても良いが、常圧ないし加圧下に熱処理をしてアモルファスセルロースとしたものを好ましく使用することができる。アモルファスセルロースを得るための熱処理温度は、通常２００〜３００℃程度、好ましくは２４０〜２８０℃程度、圧力は１５〜１００ＭＰａ程度、好ましくは２０〜５０ＭＰａ程度である。セルロースは、完全にアモルファスのセルロースが最も分解されやすいが、一部結晶構造を有しているセルロースであっても本発明の方法によりグルコースまで完全分解される。この場合、結晶セルロースは分解されず残存することになるが、アモルファス部分のセルロースはセロビオースが検出限界以下であるグルコース溶液として得ることができる。結晶セルロースは濾過あるいは透析などの分離手段により、容易に分離できる。
【００２０】
β−1,4エンド型グルカネースは、セルロース１ｇあたり0.1〜10 mg程度、好ましくは0.5〜5 mg程度使用される。
【００２１】
βグルコシダーゼは、セルロース１ｇあたり0.05〜1 mg程度、好ましくは0.1〜0.5 mg
程度使用される。
【００２２】
β−1,4エンド型グルカネースは、単独でセルロースと酵素反応させてセロビオースに
まで分解し、次にβグルコシダーゼを反応させてセロビオースをグルコースに酵素分解する２段階反応で行ってもよく、セルロースに対してβ−1,4エンド型グルカネースとβグ
ルコシダーゼを同時に反応させて、ワンポットでグルコースにまで分解してもよい。
【００２３】
これらの酵素反応は、溶液中においてセルロースとβ−1,4エンド型グルカネースとβ
グルコシダーゼを連続的／同時に反応させてもよく、透析膜の中でセルロースとβ−1,4
エンド型グルカネースと反応させ、生成するセロビオースを透析膜の外に導いてβグルコシダーゼでグルコースに加水分解してもよく、あるいは、透析膜の中でセルロースにβ−1,4エンド型グルカネースとβグルコシダーゼを同時に反応させて、グルコースを透析膜
の外に放出するようにしてもよい。
【００２４】
セルロースと酵素との反応液は、水でもよいが、緩衝液が好ましく例示される。緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが挙げられ、緩衝液のｐＨとしては、４〜８程度、好ましくは５〜７程度である。
【００２５】
本発明の方法によれば、セロビオース、セロオリゴ糖などのオリゴマーが検出限界以下となる程度までグルコースに変換される。「セロビオース、セロオリゴ糖などのオリゴマーが検出限界以下」とは、以下の条件で、セロビオース／セロオリゴ糖が検出されないことを意味する。
セロビオース／セロオリゴ糖の検出条件
可溶性生成物を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で調べる。具体的には、HPLC装置にオリゴ糖分析用カラム（TSK-GEL G-Oligo-PW(7.8 x 300)（Tosoh））を用いて、溶媒として水（流速=1.0 mL/min）およびRI検出器を用いて生成物の分析を行う。検出器は、Shimadzu RID-6A を用いて生成物分析を行う。本発明の実施例では、可溶化糖の９９％以上
はグルコースであった。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例１
超好熱性古細菌（アーケア）であるパイロコッカスホリコシのβ−1,4エンド型グルカ
ネース（遺伝子番号PH1171：EGPh）およびパイロコッカスフリオサス由来のベータグルコシダーゼ（遺伝子番号 PF0073：BGLPf）をKashima, Y. et al., Extremophiles(2005) 9,
37-43 および Voorhorst, W.G.B. et al.,(1995) J. Bocteriology (1995) 177, 7105-7111の手法でクローニングおよび発現精製した。
【００２７】
セルロース基質（アモルファスセルロース）は、下記の方法で、アビセルを燐酸により膨潤したもの（燐酸膨潤アビセル）を用いた。
【００２８】
燐酸膨潤アビセルは以下の方法で調製した。アビセル８ｇに燐酸溶液（８５％）１００ｍｌを加え、アビセルが完全に溶けるまでスターラーで攪拌する。完全に溶解した後、５００ｍｌ蒸留水を加え溶解したアビセルを再結晶させる。遠心分離機で、沈殿アビセルを回収した後、pＨが中性になるまでアビセルを水洗いする。最終的に蒸留水で２００ｍｌ
にフィルアップすることで２％燐酸膨潤アビセル懸濁液（酵素の基質）とした。
【００２９】
酵素反応条件
2%の燐酸膨潤セルロースを50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ5.5)に懸濁させ基質溶液
とする（図１、左）。本基質溶液１ｍＬにEGPh溶液(29μM)20μL を加え８５℃で２４時
間以上加熱することで、セルロースは部分的に可溶化するが、完全可溶化はできなかった（図１、中）。
【００３０】
本基質溶液１ｍＬにEGPh溶液(29μM)20μLとBGLPf溶液(10μM)10μL を加え８５℃で２４時間以上加熱することで、セルロースが完全に可溶化する（沈殿物が消失し透明になる）（図１、右）。
【００３１】
さらに本溶液（図１、中、右）の可溶性生成物を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で調べた。HPLC装置にオリゴ糖分析用カラム（TSK-GEL G-Oligo-PW(7.8 x 300)（Tosoh））を用いて、溶媒として水（流速=1.0 mL/min）およびRI検出器を用いて生成物の分析を
行った。結果、本基質溶液１ｍＬにEGPh溶液(29μM)20μL を加え８５℃で２４時間以上
加熱することで（図１、中）、溶液中には8.3％（重量）のグルコースと91.6%（重量）のセロビオースが生成していた。しかし、不溶性基質（セルロース）が、大量に沈殿物として残った。
【００３２】
本基質溶液１ｍＬにEGPh溶液(29μM)20μLとBGLPf溶液(10μM)10μL を加え８５℃で２４時間以上加熱することで（図１、右）、溶液中には99％以上のグルコースのみが検出された（セロビオースは検出されなかった）。不溶性基質（セルロース）は、殆んど見られなかった。
【００３３】
１種類の酵素(EGPh)だけでは、アモルファス状態セルロースを完全に可溶化することはできない（図1、中）、これは、EGPhの主たる加水分解生成物である、セロビオースによ
る生成物阻害によるものであると考えられる。２種類の酵素を用いることで（BGLPfによ
りセロビオースをグルコースに加水分解する反応が同時進行し）80℃以上の温度でアモルファス状態のセルロースを略完全にグルコースに変換することが可能になった。この技術は、高温下でアモルファス状態のセルロースをグルコースに変換し、透析膜、限外ろ過膜等を用いることで、酵素−基質の系からグルコースだけを取り出すシステム（酵素のリサイクルシステム）が可能になることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】左より燐酸膨潤セルロース、燐酸膨潤セルロース＋EGPh、燐酸膨潤セルロース＋EGPh＋BGLPf。
【図１】
2009273379.tif 000002