(57)【要約】      （修正有）【課題】虫体の細胞接着による感染過程を阻害することにより、あるいは補体や抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を介した作用、その他の免疫機構によって虫体を傷害することにより、赤痢アメーバに対するワクチン効果があるタンパク質断片の提供。【解決手段】赤痢アメーバに特異的、かつ多型すべての株に共通に存在するエピトープを含んで、赤痢アメーバに対する免疫原性を有し、特定のアミノ酸配列を持つタンパク質断片。およびそれをコードするＤＮＡを含むベクター、さらに該タンパク質断片の製造方法。該断片は、低分子であることから、大腸菌で効率よく生産、大量安定供給できる、赤痢アメーバワクチンとなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の６０３−１０８８のアミノ酸配列をもつタンパク質断片、または該配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をもつタンパク質断片から選ばれる、赤痢アメーバに対する免疫原性タンパク質断片。
【請求項２】
配列番号２の１４−１０８８のアミノ酸配列をもつタンパク質断片、または該配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をもつタンパク質断片から選ばれる、赤痢アメーバに対する免疫原性タンパク質断片。
【請求項３】
前記配列番号２のアミノ酸配列が、赤痢アメーバEntamoeba histolyticaのＨＭ-１：ＩＭＳＳ株（寄託番号ＡＴＣＣ３０４５９）の全ゲノムにおける遺伝子座５３.ｍ００１７１の１５９５７−１９２６２の３３０６残基の塩基配列である配列番号１の１−３３０３の塩基配列に対応する請求項１または２に記載のタンパク質断片。
【請求項４】
前記配列番号１が、赤痢アメーバEntamoeba histolyticaの表面接着因子の中サブユニットのエピトープ領域を含む断片をコードする請求項３に記載のタンパク質断片。
【請求項５】
前記タンパク質断片が原核生物で生産される組換え断片である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質断片。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかのタンパク質断片をコードするＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを、原核生物に導入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換した後培養し、産生されたタンパク質断片を回収する、請求項５に記載のタンパク質断片の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質断片を免疫原性成分として含む赤痢アメーバワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤痢アメーバの表面接着因子の中サブユニットのエピトープ領域を含むタンパク質断片、および該タンパク質断片を免疫原として含む赤痢アメーバ感染に対する予防・治療のためのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界人口のうち、約５億人が従来赤痢アメーバとされた原虫（Entamoeba histolytica/E.dispar）に感染し、その約１割が、病原種である赤痢アメーバ（E.histolytica）によって赤痢、大腸炎、肝膿瘍を発症し、毎年４万〜１１万人が死亡している。寄生虫症の死亡者数としては、マラリア、住血吸虫症に次いで多い。感染は熱帯・亜熱帯地域を中心として世界分布し、輸入症例よりも国内感染例の多い我が国でも、現在、５類感染症として扱われる赤痢アメーバ症の報告数は年々増加している。欧米と異なり、男性同性愛者に赤痢アメーバ症の発生が増加しており、ＨＩＶとの混合感染も多いのが我が国の特徴である。厚生労働省／国立感染症研究所のＩＤＷＲによる２００６年の報告数は７３８例である。この数は全数把握の感染症の中では、腸管出血性大腸菌感染症、後天性免疫不全症候群についで３番目に多い。
【０００３】
赤痢アメーバ症は、副腎皮質ステロイド剤投与時あるいは妊娠によって症状が増悪することはよく知られる。赤痢アメーバ症に対する治療薬としてメトロニダゾールが用いられるが、該薬剤は妊婦禁忌である。また、赤痢アメーバ症の中心地域が熱帯・亜熱帯地域であることからも、ワクチンの開発が望まれる。
【０００４】
赤痢アメーバが病原性を発揮するには、まず宿主細胞に接着することが必須の過程であることから、重要なワクチン候補タンパク質分子として、糖鎖特異的結合性タンパク質である表面レクチンが研究されている（非特許文献１など参照）。たとえば、寄生虫などの微生物に対するワクチンにＣ型レクチンの使用を提案する文献（特許文献１参照）には、寄生虫として赤痢アメーバも例示する。
【０００５】
赤痢アメーバに特化して従来最もよく研究されているレクチンは、ガラクトース（Ｇａｌ）およびＮ-アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に特異的な２６０ｋＤａの表面レクチンである。このＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ接着レクチンは、赤痢アメーバＨＭ−１：ＩＭＳＳ株から単離され、１７０ｋＤａの重サブユニット（heavy subunit：ＨＧＬ）と、３５／３１ｋＤａの軽サブユニット（light subunit：ＬＧＬ）とがＳ−Ｓ結合した分子であることが知られている。２つのサブユニットのうち、糖鎖の認識部位は、ＨＧＬにある（非特許文献２など参照）。
【０００６】
このＨＧＬのワクチンへの利用について、たとえば、原核細胞培養系で組換型として産生される、E.histolyticaのＨＧＬの糖付加されてないエピトープベアリング領域を含むワクチンの提案がある（特許文献２参照）。ここでは、上記ＨＧＬ部分の１７０ｋＤａタンパク質に含まれる病原型に特徴的なエピトープとして、該部分を構成するアミノ酸配列のうち、５９６−８１８，１０３３−１０８２，１０８２−１１３８の３つのアミノ酸領域を挙げている。
【０００７】
赤痢アメーバ症のワクチン候補となるいくつかのタンパク質について動物実験が行われているが、実用化に至っているワクチンはまだない（非特許文献３）。また、赤痢アメーバは多型の存在が知られており、どのような株にも有効なワクチンが望まれる。
【０００８】
【特許文献１】特表２０００−５０３６３０号公報
【特許文献２】特表平９−５０２１６５号公報
【非特許文献１】ペトリ（PETRI）, W. A., JR.，ハク（HAQUE）, R. およびマン（MANN）, B. J.，「寄生虫と宿主とのビタースィート界面：寄生虫Entamoeba histolyticaによるヒト侵襲におけるレクチン−糖質相互作用（The bittersweet interface of parasite and host:lectin-carbohydrate interactions during human invasion by the parasite Entamoeba histolytica）」，Annu Rev Microbiol，２００２年，５６，p.39-64
【非特許文献２】ペトリ（PETRI）, W. A., JR., チャップマン（CHAPMAN）, M. D., スノッドグラス（SNODGRASS）, T., マン（MANN）, B. J., ブローマン（BROMAN）, J.およびラヴディン（RAVDIN）, J. I.「E.histolyticaのガラクトースおよびＮ-アセチルガラクトサミン阻害性接着レクチン（Subunit structure of the galactose and N-acetyl-D-galactosamine-inhibitable adherence lectin of Entamoeba histolytica）」，J. Biol Chem,１９８９年，264，p.3007-3012.
【非特許文献３】チョードリー（CHAUDHRY）, O. A. およびペトリ（PETRI）, W. A., JR.「アメーバ症ワクチンの展望（Vaccine prospects for amebiasis）」，Expert Rev Vaccines，２００５年，４，p.657-668
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、赤痢アメーバに対し、どのような株にも有効なワクチンとして有用なタンパク質断片、とりわけエピトープ領域の低分子タンパク質断片、その組換え断片およびそれを含む大量安定供給可能な赤痢アメーバワクチンを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、赤痢アメーバを研究する過程で、E. histolyticaに特異性を示すモノクロナール抗体（以下、ＥＨ３０１５と称す）を選定することができ、この抗体ＥＨ３０１５がin vitro系での細胞接着阻止効果およびハムスターにおける赤痢アメーバの肝膿瘍形成に対する抑制効果を示すこと、さらに、抗体ＥＨ３０１５により同定されるタンパク質断片は、１５０ｋＤａの分子であり、従来検討されているＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ接着レクチンの重鎖ＨＧＬおよび軽鎖ＬＧＬとの関連性を示すが、これらとは明確に異なる分子であるという知見を得た。このタンパク質断片は、ＨＧＬおよびＬＧＬと関連のある表面接着因子の中サブユニット（intermediate subunit）であることからＩＧＬと称呼されており、本明細書でも、以下この称呼にしたがう。
【００１１】
ＩＧＬについては、さらにE. histolyticaの標準株とされるＨＭ-１：ＩＭＳＳにおける遺伝子のクローニングにより、１１０１アミノ酸（以下、ＩＧＬ１と表記）および１１０５アミノ酸（以下、ＩＧＬ２と表記）それぞれをコードする２つの遺伝子の存在が確認されている。本発明者らは、これら２つのアイソタイプＩＧＬ１とＩＧＬ２の遺伝子発現量を調べたところ、赤痢アメーバと非病原性であるE. disparのいずれの株においても、ＩＧＬ１の発現量はＩＧＬ２の発現量よりも有意に高く、またＩＧＬ２の発現量が種間で差がないのに対し、ＩＧＬ１の発現量は赤痢アメーバの方がE. disparよりも高いという知見を得た。このことから、ＩＧＬ１はＩＧＬ２よりも病原性と強い関連性があることが示唆された。
【００１２】
また、ＩＧＬ１の大腸菌で作製した組換えタンパク質を取得し、これを用いてハムスターにおける免疫試験をしたところ、赤痢アメーバによる肝膿瘍形成に対する防御免疫を付与できるという知見を得、組換えタンパク質のワクチンとしての有効性が確認できた。さらに、ＩＧＬ１の組換え断片を用いる試験から、ＩＧＬ１の抗原エピトープはＣ末端側断片（Ｃ-ＩＧＬ）に含まれているという知見も得た。ＩＧＬの２つのアイソタイプＩＧＬ１とＩＧＬ２との間で、Ｃ末端側の一次構造の差は少なく、また、ＩＧＬの一次構造には多型が存在するが、Ｃ末端側は株間でほとんど差がないことも確かめられた。
これら知見から、ＨＭ-１：ＩＭＳＳ株由来のＩＧＬ１のエピトープ領域を含む断片による免疫効果は、特定の株に対してのみではなく、世界中に分布する赤痢アメーバ株に対して有効である可能性が示唆され、また、これを免疫原とするワクチンは大量安定供給可能であると考えられることから、以下のような本発明を提供する。
【００１３】
本発明は、赤痢アメーバに対する免疫原性断片として、配列番号２の６０３−１０８８のアミノ酸配列をもつタンパク質断片、または該領域を含む配列番号２の１４−１０８８のアミノ酸配列をもつタンパク質断片を提供する。また、これらタンパク質断片と同等の免疫原性を示す範囲であれば、上記各アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。
【００１４】
上記配列番号２で示されるアミノ酸配列は、赤痢アメーバEntamoeba histolytica（以下、E. histolyticaを赤痢アメーバと称することもある）ＨＭ-１：ＩＭＳＳ株（寄託番号ＡＴＣＣ３０４５９）由来のＩＧＬ１全長のアミノ酸配列であり、ＨＭ-１：ＩＭＳＳ株の全ゲノムにおける遺伝子座５３.ｍ００１７１の１５９５７−１９２６２の３３０６残基の塩基配列である配列番号１の１−３３０３の塩基配列に対応する。
配列番号１は、ＩＧＬ１に対応する遺伝子の塩基配列であり、すなわち赤痢アメーバの表面接着因子の中サブユニットのエピトープ領域を含む断片をコードする。
【００１５】
配列番号２のアミノ酸配列の６０３−１０８８のアミノ酸配列からなるタンパク質断片は、ＩＧＬ１のエピトープ領域を含む４８６個のアミノ酸残基からなるＣ末端側断片（以下、Ｃ−ＩＧＬと表記することもある）であり、１４−１０８８番目のアミノ酸配列からなるタンパク質断片は、ＩＧＬ１のＮ末端とＣ末端のシグナル配列を除く全長の１０７５個のアミノ酸残基からなる断片（以下、Ｆ−ＩＧＬと表記することもある）である。
【００１６】
上記タンパク質断片は、糖鎖をもたない。好ましくは原核生物、通常大腸菌で生産される組換え断片である。エピトープ領域を含むタンパク質断片のうちでも、生産効率のよい６０３−１０８８の短いアミノ酸配列からなるタンパク質断片Ｃ−ＩＧＬの組換え断片が好ましい。組換え断片の製造は、タンパク質断片をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、宿主細胞を該ベクターで形質転換した後、培地で培養し、産生されたタンパク質断片を回収する、一般的な遺伝子工学的手法を用いて行なうことができる。本発明では、このようなタンパク質断片の製造方法、ならびに上記タンパク質断片をコードするＤＮＡを含むベクターをも提供する。
【００１７】
上記タンパク質断片は、赤痢アメーバ感染の治療、予防に有用である。したがって本発明では、上記のようなタンパク質断片を免疫原性成分として含む赤痢アメーバワクチンを提供することができる。ワクチンは、タンパク質断片ともにアジュバントなどを含む組成物であってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るタンパク質断片は、赤痢アメーバに特異的で且つ多型すべての株に共通に存在するエピトープを含み、赤痢アメーバに対する免疫原性である。虫体の細胞接着による感染過程を阻害することにより、あるいは補体やＡＤＣＣを介した作用、その他の免疫機構によって虫体を傷害することにより、赤痢アメーバに対するワクチン効果がある。低分子であることから大腸菌で生産効率よく、大量安定供給できる赤痢アメーバワクチンを実現しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明では、本発明者らの見出した免疫原性タンパク質断片を提供する。この断片は、E. histolyticaのＨＭ-１：ＩＭＳＳ株由来の表面接着因子の中サブユニットのエピトープ領域を含む断片である。より具体的には、前述したとおり、マウスモノクロナール抗体ＥＨ３０１５により同定されるタンパク質断片ＩＧＬについて、ＨＭ-１：ＩＭＳＳ株における遺伝子のクローニングにより存在が確認された２つのタンパク質断片ＩＧＬ１（１１０１アミノ酸）およびＩＧＬ２（１１０５アミノ酸）のうちのＩＧＬ１に基づく。
本発明で利用するＨＭ-１：ＩＭＳＳ株のＩＧＬ１をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に、該塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２０】
E. histolyticaのＨＭ-１：ＩＭＳＳ株は、ＡＴＣＣ３０４５９で寄託されている。ＨＭ-１：ＩＭＳＳ株は、ゲノムが解析されており（http://www.tigr.org/tdb/e2k1/eha1/）、また、上記２つのタンパク質断片ＩＧＬ１およびＩＧＬ２をコードする遺伝子は、本発明者らの論文（“Intermediate subunit of the Gal/GalNAc lectin of Entamoeba histolytica is a member of a gene family containing multiple CXXC sequence motifs”Infect Immun（2001），69, 5892-5898.）に記載されている。ＩＧＬ１とＩＧＬ２との間で、Ｃ末端側に一次構造の差は少ないことは、該文献にも説明されており、その説明記載を引用して本明細書にも記載されているものとする。
【００２１】
なお、ＩＧＬ１の一次構造は、従来研究されているＨＧＬまたはＬＧＬとは明らかに別異である。具体的に、ＩＧＬ１のアミノ酸配列（配列番号２）をＨＧＬのアミノ酸配列とを、Blast２配列プログラムで比較したところ、有意な類似性は見つからない。また、ＩＧＬ１の赤痢アメーバ（ＨＭ-１：ＩＭＳＳ株の全ゲノム）における遺伝子座５３.ｍ００１７１の１５９５７−１９２６２は、ＨＧＬの遺伝子座１６．ｍ００３００の３３７１０−３７５７０および２９．ｍ００２０６の３２８５９−３６７３３とも異なる。
【００２２】
上記ＩＧＬの２つのアイソタイプについて、後述するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試験による遺伝子発現量の比較では、E. histolytica（ＨＭ-１：ＩＭＳＳ）におけるＩＧＬ１遺伝子の発現量は、ＩＧＬ２遺伝子の発現量の６.４倍（相対比）であるという知見を得た。また、E. histolyticaと病原性のないE. disparとの比較では、ＩＧＬ２遺伝子の発現量は差がなく、ＩＧＬ１遺伝子の発現量は、E. histolyticaの方がE. disparよりも高いという知見を得た。このことから、ＩＧＬ１遺伝子の方が病原性との関連性が高い可能性が考えられる。
【００２３】
また、様々な地域から単離された赤痢アメーバ株についてＩＧＬの一次構造を調べた結果、多型が存在する知見を得ている。
多型の株間におけるＩＧＬ１全長のアミノ酸配列の同一性は、たとえば、ＨＭ-１：ＩＭＳＳ、ＤＫＢ、ＨＫ-９、ＨＢ-３０１：ＮＩＨ、ＮＯＴ-１２、ＹＳ、ＹＩについて、ＩＡＳＲ，２００７年４月号，第２８巻，p１１０〜１１１の報告を参照することができ、この記載を引用して本明細書に記載されているものとする。ここにも報告されるとおり、株間のＩＧＬ１全長アミノ酸配列の同一性について、標準株ＨＭ-１：ＩＭＳＳと、ＤＫＢ株（イングランド由来）とは９９.９％の高い相同性を示す。
ＨＫ-９株（韓国由来）およびＨＢ-３０１:ＮＩＨ株（ミャンマー由来）のアジア分離株群間では、完全一致し、これらと標準株ＨＭ-１：ＩＭＳＳとの同一性は８６％である。ＮＯＴ-１２、ＹＳおよびＹＩ株の国内分離株群間では、完全一致し、これらと標準株ＨＭ-１：ＩＭＳＳとの同一性は８８％である。
【００２４】
本発明者らのさらなる研究において、多型は特にＮ末端側で大きく、Ｃ末端側には株間でほとんど差がないことが確認された。したがって、上記に例示する後者２群は、Ｆ−ＩＧＬについては、ＤＫＢ株に比べてＨＭ-１：ＩＭＳＳとの相同性が低いが、Ｃ−ＩＧＬについては高い相同性が示された。
具体的に、ＩＧＬ１のＮ末端側、Ｃ末端側および中央部の３つの領域をコードする遺伝子をＰＣＲ増幅し、これらの遺伝子断片を発現ベクターに組み込んで、後述する実施例の表２に示すアミノ酸配列を有する３つの断片を得た。
Ｃ−ＩＧＬアミノ酸配列についてのＨＭ-１：ＩＭＳＳ株に対するＨＫ-９株の同一性は９４％、ＮＯＴ-１２株は９７％であった。このことからも、以下の実施例で明らかになったＨＭ-１：ＩＭＳＳ株ＩＧＬ１由来のエピトープ領域断片による免疫効果は、特定の株に対してのみ有効なのではなく、世界中に分布する赤痢アメーバ株に対してワクチン効果を発揮できる可能性が高い。
【００２５】
アミノ酸残基４８６個のＣ−ＩＧＬは、全長Ｆ−ＩＧＬよりもサイズが小さいため大腸菌でよく発現され、より多くの産物を得ることができる。封入体として回収でき、３〜４回の洗浄操作だけで純度の高い組換えＣ−ＩＧＬを取得することができる。
【００２６】
なお、ＨＧＬには３種のアイソタイプが存在する。アイソタイプが２種類のみであるＩＧＬは、ＨＧＬよりも１種類の組換えタンパク質によるワクチン効果がより大きいことが予想される。また、ＩＧＬはＨＧＬに比べ、よりシステインリッチであり、強固な立体構造を有すると考えられる。この立体構造から構成されるエピトープも存在すると予想される。
【００２７】
ＩＧＬには糖鎖認識部位はないが、表面接着因子であることは後述する実施例において確かめられている。ＩＧＬの細胞接着性の作用機序は明確に解析されている訳ではないが、ＩＧＬの挙動がＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ特異的レクチンＨＧＬおよびＬＧＬと密接に関連することから、ＩＧＬの表面接着性は、糖鎖認識部位をもつＨＧＬ-ＬＧＬダイマーと非共有結合で結合し、複合体を形成することで発揮されることが予想される。最近、ＩＧＬに関して、小腸絨毛に結合性があるという報告（Cellular Microbiology，２００５，７,５６９-５７９）やＩＧＬ２がフィブロネクチンに結合性があるという報告（Parasitology，２００７，１３４,１６９-１７７）がある。
【００２８】
上記ＩＧＬの同定に用いられた抗体ＥＨ３０１５は、マウスモノクロナール抗体を用いて、形態的にE. histolytica/E. disparと同定されるもののうちから赤痢アメーバ（E. histolytica）と、病原性のないE. disparの虫種識別法を確立する過程で、E. histolytica 特異性が認められたマウスモノクロナール抗体である。本発明者らは、このＥＨ３０１５については、すでに該抗体で赤痢アメーバ虫体を前処理することにより、赤血球やChinese hamster ovary（ＣＨＯ）細胞への接着、赤血球貪食能、ＣＨＯ細胞傷害作用などをin vitro系で阻止できたこと（“Amonoclonal antibody against the 150ｋＤａ surface antigen of Entamoeba histolytica inhibits adherence and cytotoxicity to mammalian cells” Med Sci Res（1997），25, 159-161）、さらに、ＥＨ３０１５をハムスターの腹腔内に投与し、２４時間後に肝臓内に直接赤痢アメーバ虫体を接種したところ、肝膿瘍形成が有意に抑制できたことを報告している（“Protection of hamsters from amebic liver abscess formation by a monoclonal antibody to a 150ｋＤａ surface lectin of Entamoeba histolytica” Parasitol Res（1999）, 85, 78-80）。
【００２９】
さらに、ＥＨ３０１５のアフィニティカラムで虫体から精製したタンパク質でハムスターを免疫したところ、同様に肝膿瘍形成が抑制できたことも報告している（“Protection of hamsters from amebic liver abscess formation by immunization with the 150- and 170ｋＤａ surface antigens of Entamoeba histolytica” Parasitol Res（2001）, 87, 126-130）。
しかし、この方法では大量にＩＧＬを得ることが困難であるし、微量に混在する可能性のある他のタンパク質の影響も否定できない。
【００３０】
一方、ＥＨ３０１５で同定されるタンパク質ＩＧＬ、特にＨＭ-１：ＩＭＳＳ株由来のＩＧＬ１の大腸菌で生産される糖鎖を含まない組換え断片にも、前記虫体から精製したタンパク質と同様に免疫効果があるか否かは不明であり、ＩＧＬを大量安定供給できるワクチンとして使用できる可能性を検討するため、大腸菌で作製した組換え型ＩＧＬ１による免疫で、ハムスターにおけるアメーバ性肝膿瘍形成が抑制できるかどうかを検討し、後述の実施例に示すとおり良好な結果を得た。
【００３１】
特に、先にも報告（“Evaluation of recombinant fragments of Entamoeba histolytica Gal/GalNAc lectin intermediate subunit for serodiagnosis of amebiasis”J Clin Microbiol（2004），42, 1069-1074）のとおり、ＩＧＬ１について、大腸菌で作製した全長または断片の組換えタンパク質の血清診断用抗原としての評価から、特に特異性に優れていたＣ末端側抗原のワクチン効果について良好な結果を得ることができた。
【００３２】
赤痢アメーバは、感染すると嚢子が小腸で栄養型になり、まず腸粘膜に接着した後、組織内に侵入して潰瘍を形成し、大腸炎を起こす。虫体が腸管組織から血行性に肝臓に転移すると肝膿瘍を形成し、治療しないと致命的になる。本発明のタンパク質断片を免疫原性成分とするワクチンは、その接種により、赤痢アメーバに対する免疫反応に基づき、感染に対する治療、予防に有効である可能性が高い。
本発明に係るワクチンは、ワクチン組成物を構築する際に一般的にアジュバントとして使用されるものを含ませることができる。
【実施例】
【００３３】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
以下の実験で用いたＨＭ-１：ＩＭＳＳ株（E. histolytica）、ＣＹＮＯ９株（E. dispar）、ＳＡＷ１７３４株（E. dispar）は、慶応大学医学部熱帯医学・寄生虫学教室から入手した。
【００３４】
（実施例１）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＩＧＬ遺伝子発現量の解析
赤痢アメーバのＩＧＬ１とＩＧＬ２遺伝子発現量のリアルタイムＲＴ（逆転写）−ＰＣＲによる比較を行なった。
赤痢アメーバとE. disparの栄養型培養虫体から、RNeasyミニキット（キアゲン：Qiagen）を用いて全ＲＮＡを単離し、GeneAmp ＲＮＡ ＰＣＲキット（アプライドバイオシステムズ：Applied Biosystems）を用いてｃＤＮＡを合成した。
定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析のための反応液は、ＳＹＢＲ Premix Ex Taq（宝酒造）、以下に示す特異的なプライマー、Ｒｏｘ染料、ｃＤＮＡを混ぜて調製した。
【００３５】
【表１】
2009022238.tif 000002
【００３６】
４０サイクル増幅し、各サイクルでの蛍光強度を、配列検出装置ABI PRISM 7700（アプライドバイオシステムズ，ソフトウェアバージョン１.７）で測定した。
９５℃で１０秒間の初期変性後、９５℃で５秒間の変性および６０℃で３０秒間のアニーリング伸長からなるシャトルＰＣＲプロトコルを行なった。
アクチン遺伝子を対照（内部標準）として用いる比較ＣT法により、ＩＧＬ１とＩＧＬ２遺伝子の相対的な発現量を解析した。実験は培養とＲＮＡの単離過程も含めて３回行い、平均値と標準偏差を算出した。アクチン遺伝子発現量に対する相対値としての各遺伝子発現量を図１に示す。図中、ＩＧＬ１は白抜き棒、ＩＧＬ２は塗潰し棒で示す。
【００３７】
図１に示されるとおり、赤痢アメーバにおけるＩＧＬ１の発現量はＩＧＬ２の発現量の約６．４倍であり、有意に高かった。E. disparにおいても、ＩＧＬ１の発現量はＩＧＬ２の発現量の３〜５倍であり、有意に高かった。ＩＧＬ２の発現量は、赤痢アメーバとE. disparとの間で差がなかったが、ＩＧＬ１の発現量は赤痢アメーバの方が高かった。これらから、ＩＧＬ１のＩＧＬ２よりも強い病原性への関連性が示唆される。
【００３８】
（実施例２）
組換えタンパク質の調製
組換えＩＧＬタンパク質の調製は、基本的に、タチバナら（TACHIBANA, H., CHENG, X. J., MASUDA, G., HORIKI, N. and TAKEUCHI, T.（2004），Evaluation of recombinant fragments of Entamoeba histolytica Gal/GalNAc lectin intermediate subunit for serodiagnosis of amebiasis. J Clin Microbiol, 42, 1069-1074.）の方法にしたがって行った。
赤痢アメーバＩＧＬ１遺伝子（配列番号１）から、Ｎ末端とＣ末端のシグナル配列を除く全長のアミノ酸［Ｆ-ＩＧＬ, アミノ酸番号（ａａ）１４−１０８８］をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。
ｐＥＴ１９ｂベクターのＸｈｏＩサイトに組み込み、大腸菌ＢＬ２１  ＳｔａｒTM（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入して発現させた。
遠心した菌体を界面活性剤溶液中で超音波破砕した後、遠心して沈渣を得た。この操作を３〜４回繰り返した。この洗浄操作はNovagenのProtein refolding kitに示された方法に従って行った。得られた封入体を前記Protein refolding kitに示された方法でリフォールディングしたのち、His結合レジンアフィニティークロマトグラフィーによって精製して全長の組換えタンパク質Ｆ-ＩＧＬを得た。
【００３９】
同様に、ＩＧＬ１のＮ末端側（Ｎ-ＩＧＬ, ａａ１４−３８２）、中央部（Ｍ-ＩＧＬ, ａａ２９４−７５３）、Ｃ末端側（Ｃ-ＩＧＬ，ａａ６０３−１０８８）をコードする各遺伝子断片をＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ１９ｂベクターのＸｈｏＩサイトに組み込み、大腸菌ＢＬ２１  ＳｔａｒTM（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入して発現させた。
前記の洗浄方法で封入体を得た。封入体をリフォールディングして、各断片の組換えタンパク質Ｎ-ＩＧＬ，Ｍ-ＩＧＬ，Ｃ-ＩＧＬを得た。組換えＩＧＬ断片は、アフィニティークロマトグラフィーによる精製なしに、電気泳動において単一のバンドとして確認できる純度を有していた。これら組換えＩＧＬを表２に示す。
【００４０】
【表２】
2009022238.tif 000003
【００４１】
上記で得られた各組換えＩＧＬの電気泳動を測定した。各レーン４μｇの上記リフォールディングしたタンパク質を、７．５％ゲル（ポリアクリルアミドゲル）を用いて還元条件下で泳動した後、タンパク質のバンドを、クーマシー・ブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した。電気泳動像を図２に示す。
図中、レーン１：Ｆ-ＩＧＬ、レーン２：Ｎ-ＩＧＬ、レーン３：Ｍ-ＩＧＬ、レーン４：Ｃ-ＩＧＬ、左側の数字はタンパク質マーカーの分子量（単位はｋＤａ）を示す。
【００４２】
（試験例１）全長組換えＩＧＬ１による免疫と感染実験
以下の動物実験には、赤痢アメーバ（E. histolytica）として、培養に慣れてハムスターに感染しにくくなっているＨＭ-１：ＩＭＳＳ株の代わりに比較的感染が容易なＳＡＷ７５５ＣＲ株（慶応大学を介して入手）を用いた。ＳＡＷ７５５ＣＲ株は、１９７９年、Sargeauntらによって、英国でエジプト人のアメーバ性大腸炎患者から分離された株であり、ＳＡＷ７５５ＣＲ株とＨＭ-１：ＩＭＳＳ株との一次構造は全長でほぼ同じであり、両株のＩＧＬ１の同一性は９９．９％である。
【００４３】
体重４０〜５０ｇの雄のシリアンハムスター２７個体を使用した。免疫開始前に少量の血液を眼静脈より採取した。
この試験では、Ｆ-ＩＧＬの５０μｇをアジュバントのタイターマックスゴールド（TiterMax Gold）とともに後肢筋肉内に接種した。初回免疫の３週間後と５週間後に、同量のＦ-ＩＧＬ をフロイント（Freund）の不完全アジュバントとともに追加免疫した。
最終免疫の１週間後に採血し、更に１週間後に、赤痢アメーバＳＡＷ７５５ＣＲ株の栄養型虫体５×１０5を肝臓内に接種した。そして１週間後に肝膿瘍の有無を調べ、肝臓の全重量と膿瘍の重量を測定した。
対照群ではリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とアジュバントのみで免疫し、同様の実験を行った。
【００４４】
ハムスターにおける赤痢アメーバの全長組換えＩＧＬ（Ｆ-ＩＧＬ）の筋肉内接種によるアメーバ性肝膿瘍形成の阻止効果を表３および図３に示す。
図３において、（Ａ）はＦ-ＩＧＬ免疫群（１〜１５）、（Ｂ）はＰＢＳ免疫対照群（１６〜２７）である。
Ｆ-ＩＧＬ免疫群では１１にのみ小さな膿瘍（矢印）が認められた。
ＰＢＳ免疫対照群では１７、１８に膿瘍がなく、２１、２５は小さな膿瘍（矢印）であったが、その他の８個体では大きな膿瘍が形成されている。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
表３に示すとおり、ＰＢＳを用いた対照群１２匹中１０匹（８３％）で膿瘍が認められたのに対し、Ｆ-ＩＧＬ免疫群では１５匹中１匹（７％）のみに膿瘍が認められた。その差はフィッシャー検定（直接確率計算法，Fisher's exact probability test）においてＰ＝０．０００００１２であり、有意な差であった。
膿瘍が認められたハムスターにおける膿瘍の平均サイズも、対照群では肝臓の３１％（重量比）を占めたのに対し、Ｆ-ＩＧＬ群で膿瘍が認められた１個体において、膿瘍は肝臓の３％の大きさであった。
【００４７】
（試験例２）赤痢アメーバのＣＨＯ細胞へのin vitro系での接着に対する阻止活性
上記Ｆ-ＩＧＬ免疫後ハムスターのプール血清を、様々な濃度で赤痢アメーバＨＭ-１：ＩＭＳＳ株栄養型虫体と氷上で１時間反応させ、ＰＢＳで洗った後にＣＨＯ細胞と氷上で２時間反応させた。３個以上のＣＨＯ細胞が接着した赤痢アメーバ虫体の比率を計測した。
対照として免疫前プール血清を使用した。
赤痢アメーバとＣＨＯ細胞の接着に対する免疫ハムスター血清の阻止効果を表４に示す。
表４に示すように、Ｆ-ＩＧＬ免疫血清は、虫体のＣＨＯ細胞への接着を、１０倍希釈で対照群の２７％まで、１００倍希釈で４０％まで抑制した。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
上記に示すとおり、大腸菌で作製したＩＧＬの全長組換えタンパク質（Ｆ-ＩＧＬ）によって、肝膿瘍形成に対する防御免疫を付与できることが初めて明らかになった。すなわち大腸菌で作製したＩＧＬが有効であったことから、糖鎖による修飾は必ずしも必要ないと考えられ、大腸菌系で安価に大量のＩＧＬを作製できる可能性が示された。
【００５０】
（試験例３）免疫と感染実験
次に、上記でワクチン効果の示された組換えＩＧＬについて、分子量の大きい全長ＩＧＬタンパク質よりも産生効率の良い断片を大腸菌系で効率的に生産するために、ワクチン効果が期待できる部分を同定する。
Ｆ-ＩＧＬに代えて、表２に示す３つの断片Ｎ-ＩＧＬ，Ｍ-ＩＧＬ，Ｃ-ＩＧＬを用いる以外は、試験例１と同様のハムスターにおける赤痢アメーバの組換えＩＧＬ断片の筋肉内接種によるアメーバ性肝膿瘍形成の阻止実験を行なった。ここでは、シリアンハムスター３２個体を使用した。結果を表５および図４に示す。
【００５１】
【表５】
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【００５２】
図４中、（Ａ）はＰＢＳ免疫対照群、（Ｂ）はＮ-ＩＧＬ免疫群、（Ｃ）はＭ-ＩＧＬ免疫群、（Ｄ）はＣ-ＩＧＬ免疫群である。図中、＊は膿瘍（矢印）が認められなかったものである。
ＰＢＳを用いた対照群８匹中全例で膿瘍が認められたのに対し、Ｃ-ＩＧＬ免疫群では８匹中膿瘍が認められた個体はなかった。その差はフィッシャー検定においてＰ＝０．００００７８であり、有意な差であった。Ｎ-ＩＧＬ免疫群では全く防御効果がなく、Ｍ-ＩＧＬ免疫群では８匹中２匹で膿瘍が認められなかったものの、対照群と比べて有意差はなかった。また、膿瘍の平均サイズにおいても、Ｎ-ＩＧＬやＭ-ＩＧＬ免疫群ではＰＢＳ対照群と差がなかった。
この結果から、実験動物における赤痢アメーバによる肝膿瘍形成に対し防御免疫を付与できるＩＧＬの抗原エピトープは、Ｃ-ＩＧＬ断片に含まれていることが明らかになった。Ｃ-ＩＧＬの分子量は約５万であり、そのアミノ酸残基数４８６は全長ＩＧＬのアミノ酸残基数１０７５の半分以下の長さであり、大腸菌系で効率よく産生することができる。
【００５３】
上記のとおり、組換えＣ-ＩＧＬによる免疫効果が確認され、アメーバ感染の治療・予防に有効性の可能性が示された。今回、大腸菌で作製したＣ-ＩＧＬが有効であったことから、糖鎖による修飾は必ずしも必要ないと考えられ、大腸菌系で安価に大量の赤痢アメーバワクチンを製造できる可能性が示された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＩＧＬ１およびＩＧＬ２の各遺伝子発現量を相対比で示す図である。
【図２】組換えＩＧＬ１のポリアクリルアミドゲル電気泳動像である。
【図３】組換え全長ＩＧＬで免疫し、赤痢アメーバの栄養型虫体接種７日後のハムスターの肝臓の撮像である。
【図４】組換えＩＧＬ断片で免疫し、赤痢アメーバの栄養型虫体接種７日後のハムスターの肝臓の撮像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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