(57)【要約】【課題】低温適合性の新規なセルロース分解酵素の提供。【解決手段】シマミミズ（Eisenia fetida）に由来し、下記の性質：（１）分子量：ゲル濾過により測定した分子量が約70kDaであり、そしてSDS-PAGEにより測定した分子量が約70kDaと約25kDaである；（２）温度特性：CMCを基質とし、pHを５とした場合、40℃における相対活性を100％として、30℃で約71％、20℃で約54％、15℃で約44％の相対活性を有する；及び（３）最適pH：CMCを基質とし、37℃で測定した場合、最適pHは５である；を有する低温適応性セルロース分解酵素。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シマミミズ（Eisenia fetida）に由来し、下記の性質：
（１）分子量：ゲル濾過により測定した分子量が約70kDaであり、そしてSDS-PAGEにより測定した分子量が約70kDaと約25kDaである；
（２）温度特性：CMCを基質とし、pHを５とした場合、40℃における相対活性を100％として、30℃で約71％、20℃で約54％、15℃で約44％の相対活性を有する；及び
（３）最適pH：CMCを基質とし、37℃で測定した場合、最適pHは５である；
を有する低温適応性セルロース分解酵素。
【請求項２】
請求項１に記載のセルロース分解酵素をセルロースに作用させることを特徴とする、セルロースの加水分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温適応性の新規なセルロース分解酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進諸国における化石燃料の大量消費により大量のCO2ガスが大気中に放出されたために、地球温暖化が深刻な問題となっている。地球の生態系は温暖化に伴い、多大な影響を受けていることから、化石燃料に代わるエネルギー(代替エネルギー)を推進することが急務となっているが、どのエネルギー資源も様々な限界を持っている。今後、再生可能な資源である植物由来のバイオマスからバイオエタノールやバイオディーゼルを生産する研究は重要な課題である。植物由来のバイオマスも燃焼させると、CO2ガスを発生するが、植物は生育する際に光合成を行い、CO2ガスを固定化するので、CO2ガスの出入りはプラスマイナスゼロ（カーボンニュートラル）となる。
【０００３】
植物バイオマスを糖化する際、高温条件でなく低温条件で糖化する方が加えるエネルギーを節約でき、CO2ガスの発生量も少なくて済むことから、低温条件下での糖化が望まれている。しかしながら、カビの酵素等を用いて高温条件下で糖化が行われているのが現状である。これは、現在使われている酵素が低温環境下では十分，その能力を発揮できないことに起因すると考えられる。そこで、低温環境下でも高い活性を保持している酵素（低温適応酵素）が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、低温環境下でも高い活性を保持している（低温適応性）セルロース分解酵素を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、落ち葉や小枝の消化能力に優れたシマミミズに低温適応酵素が存在することを見出した。シマミミズは食品系廃棄物の処理に利用されており、その糞は団粒構造をとることやミネラルに富むことからコンポストとして農業用の肥料等に広く利用されている。このように、シマミミズは有機物を分解する能力が高いので、多糖類を分解する酵素のスクリーニングを行った。その結果、低温環境下で生デンプンならびに結晶性セルロースに対して高い分解活性を有する酵素が存在することを見出した。
【０００６】
従って、本発明は、シマミミズ（Eisenia fetida）に由来し、下記の性質：
（１）分子量：ゲル濾過により測定した分子量が約70kDaであり、そしてSDS-PAGEにより測定した分子量が約70kDaと約25kDaである；
（２）温度特性：CMCを基質とし、pHを５とした場合、40℃における相対活性を100％として、30℃で約71％、20℃で約54％、15℃で約44％の相対活性を有する；及び
（３）最適pH：CMCを基質とし、37℃で測定した場合、最適pHは５である；
を有する低温適応性セルロース分解酵素を提供する。
【０００７】
本発明はまた、上記のセルロース分解酵素をセルロースに作用させることを特徴とする、セルロースの加水分解方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のセtルロース分解酵素の原料となりるシマミミズは大量に培養され、販売されており、容易に入手することが出来る。
シマミミズから本発明の酵素を得るには、例えば次の方法を用いることが出来る。シマミミズを凍結して粉砕する。次の、この粉砕物を水性緩衝液で抽出する。その後、水溶液中の酵素は、酵素の精製のために使用される常法に従って精製することが出来る。具体的な方法は、下記の実施例に示す。
【実施例】
【０００９】
酵素活性測定法
Sample、Blank共に0.4%各基質を100 μl、緩衝液 100 μlずつ入れ37℃で５分間プレインキュベートし、その後Sampleにのみ酵素液を20 μl加え、15 分間反応させた。反応後、Sample、Blank共にソモギー試薬を200 μlずつ、Blankにのみに更に酵素液を20 μl加えた後、100℃で10 分間煮沸し反応を停止させた。Sample、Blank共に10 分間水冷後、ネルソン試薬を200 μlずつ加え、20 分間放置し発色させた。20 分後、蒸留水2.0 mlを加えてよく混和し、655 nmの波長で吸光度を測定した。酵素活性はソモギーネルソンの検量線から得られた式を用いて求めた。なお、1 Unitは1分間に1 μmolのグルコースに相当する還元糖を遊離する酵素量とした。
【００１０】
実施例１．酵素の単離
１．実験材料
シマミミズ（Eisenia fetida）は相模浄化サービス（有）等から購入した。
２．シマミミズからの酵素液の抽出
シマミミズ (Eisenia fetida)約３gを一晩絶食させ凍結乾燥後、乳鉢で破砕した。粉末状にしたミミズを 2.5 mM 2-メルカプトエタノールを含む50 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.0) に懸濁させ、遠心分離 (27,000 x g, 20分間，4℃)後、上清を回収した。この溶液を粗酵素液とした。
【００１１】
３．ストレプトマイシン処理
上記の粗酵素液に終濃度２％となるようにストレプトマイシン硫酸塩（核酸除去）を添加し、30分攪拌後、遠心分離 (27,000 x g, 15分間、4℃)し上清を回収した。
【００１２】
４．DEAE-Toyopearl 650Mイオン交換クロマトグラフィー
脱塩後の酵素液をあらかじめ 2-メルカプトエタノールを含む20 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.0)で平衡化したDEAE-Toyopearl 650Mに適用し、約400 mlの同上緩衝液 (pH 7.0)で洗浄した。20 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.0，2-メルカプトエタノールを含む)と0.5 MのNaCl を含む 20 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.0，2-メルカプトエタノールを含む)との間で食塩の直線濃度勾配をかけ、酵素の溶出を行った。この様子を図２に示す。
なお，ここまでの精製スキームを図１に示す。
【００１３】
５．Capto MMCマルチモーダル弱陽イオン交換担体
活性画分（Fra.35〜40）を集め、これの10倍量となるようにアセトンを加えて10分間攪拌した後、27,700×g, 20分間遠心し、沈殿（酵素）を回収した。沈殿を2-メルカプトエタノールを含む50mM 酢酸-NaOH緩衝液(ｐH4.5)で溶解した後にCapto MMCに適用した。同上の酢酸緩衝液で洗浄した後、この酢酸緩衝液と１M NaClを含む50mM リン酸-NaOH buffer（pH 7.5，2-メルカプトエタノールを含む）との間で直線濃度勾配をかけて酵素を溶出を行った。結果を図３に示す。
【００１４】
６．Superdex 75ゲルろ過クロマトグラフィー
活性のあった画分をVIVASPIN 20 (ザルトリウス社製)を用いた限外ろ過による濃縮の後に、Superdex 75に適用した。溶出は50mM Tris-HCl（pH 7.0）緩衝液を用いて行った。結果を図4に示す。ミミズ由来のセルロース分解酵素の精製過程を表１にまとめた。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
７．SDS-PAGE
ゲルろ過後のサンプルをSDS-PAGEに供した。電気泳動後，ゲルは銀染色法(ナカライテスク製）を用いて染色した。また，CMC含むゲルを作製し，電気泳動後コンゴーレッドで染色し，活性染色を行った。その結果を図５に示す。
【００１７】
実施例２．酵素の性質
１．分子量
Superdex 75ゲルろ過クロマトグラフィーの結果から本酵素は約70 kDaであると推定した。Superdex 75後の活性画分のサンプルをSDS-PAGEに供したところ、銀染色と活性染色の結果から約70 kDa付近と約25 kDa付近にセルラーゼ活性を有するバンドが見られた。活性のバンドは70 kDaより25 kDaの方が太いバンドとして見られた。
【００１８】
２．温度の影響
基質にCMCを用い、pH 5.0における酵素の温度依存性を調べた。その結果、本酵素は37℃での活性を100％とし、相対活性を調べたところ、30℃で71％、20℃で54％、15℃で44％と、低温下でも酵素活性を維持する低温適応酵素であった（図６）。さらに，高温側の70℃でも41％の活性を有していた。
【００１９】
３．pHの影響
基質にCMCを用い、37℃での最適 pHを調べた。その結果、pH 5.0付近で最高の活性を示した（図７）。
４．基質特異性
0.4%(w/v)の各種基質溶液と0.1M 酢酸-NaOH(pH 5.0)緩衝液にゲルろ過後の酵素液を加えたものを37℃で15分間インキュベートした。基質がCMCであるときの酵素活性を100%とした。アビセルおよびキシランに対してはこの条件では作用しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明のセルロース分解酵素の精製スキームの一例を示す。
【図２】図２は、DEAE-Toyopearl 650M イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図３】図３は、Capto MMCマルチモーダル弱陽イオン交換担体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４】図４は、Superdex 75によるゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図５】図５は、図４に示すSuperdex 75によるゲル濾過クロマトグラフィーにおいて得られた画分をSDS-PAGEにより分析した結果を示す図である。
【図６】図６は、本発明のセルロース分解酵素の、反応温度とCMC分解活性との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のセルロース分解酵素の、反応pHとCMC分解活性との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図５】
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