(57)【要約】【課題】酵素阻害法を利用して一つの酵素により複数種のピレスロイドを検出することができるピレスロイド系農薬の検査方法を提供する。【解決手段】試料中に含まれるピレスロイド系農薬がアピラーゼに対しての酵素阻害剤として働くように酵素接触させる工程１０と、酵素接触させた混合物に、ルシフェリン、アデノシン三リン酸及びルシフェラーゼを加えて発光を生じさせる発光反応工程１１と、発光を測定する発光測定工程１２と、アピラーゼ無添加時のルシフェラーゼの発光量と、ピレスロイド系農薬非存在下でアピラーゼ添加時のルシフェラーゼ発光量と、試料サンプルで生じた発光量から、ピレスロイド系農薬非存在下と試料中でのアピラーゼの活性の程度を算出し、ピレスロイド系農薬の濃度を決定する濃度算出工程と、を備えた。【選択図】図１
2009039054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料サンプル中のピレスロイド系農薬の濃度を検査するための方法であって、該方法は、
ａ）試料サンプルとアピラーゼとをインキュベートして、前記試料中に含まれるピレスロイド系農薬がアピラーゼに対しての酵素阻害剤として働くように酵素接触させる工程と、
ｂ）該酵素接触させた混合物に、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びアデノシン三リン酸を加えて、発光を生じさせる発光反応工程と、
ｃ）該発光反応工程にて生じる一定時間の発光を測定する発光測定工程と、
ｄ）アピラーゼ無添加時のルシフェラーゼの発光量と、ピレスロイド系農薬非存在下でアピラーゼ添加時のルシフェラーゼ発光量と、試料サンプルで生じた発光量から、ピレスロイド系農薬非存在下と試料中でのアピラーゼの活性の程度を算出し、その相対活性値ＲＡの逆数ＲＡ−１が、試料中のピレスロイド系農薬濃度に対して応答することを利用してピレスロイド系農薬の濃度を決定する濃度算出工程と、
を備えたことを特徴とするピレスロイド系農薬の検査方法。
【請求項２】
前記アピラーゼが、昆虫、ロブスター又はジャガイモからなる群から選択される請求項１記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
【請求項３】
前記ピレスロイド系農薬が、下記一般式で表される構造を有する請求項１記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
【化１】
2009039054.tif 000003
【請求項４】
前記ピレスロイド系農薬が、下記一般式で表される構造を有する請求項１記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
【化２】
2009039054.tif 000004
【請求項５】
前記ピレスロイド系農薬が、下記一般式で表される構造を有する請求項１記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
【化３】
2009039054.tif 000005
【請求項６】
前記ピレスロイド系農薬が、エトフェンプロックス又はシラフルオフェンからなる群から選択される請求項３記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
【請求項７】
前記ピレスロイド系農薬が、フェンバレレート、フルバリネート又はフルシトリネートからなる群から選択される請求項4記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
【請求項８】
前記ピレスロイド系農薬が、トラロメトリン、シハロトリン、フェンプロパトリン又はシペルメトリンからなる群から選択される請求項5記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素阻害法によるピレスロイド系農薬の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピレスロイド系農薬は、古くから存在する除虫菊（シロバナムシヨケグサ）の殺虫有効成分から派生した農薬であり、例えば、アレスリン、フタルスリン、レスメトリンなど多数が殺虫剤として開発されている。また、菊酸には多数の光学異性体が存在し、従来、これら光学異性体の検査は、検査・分析機関や研究機関等に設置してある高価なガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーを用いなければ分析することができなかった（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
そこで、手間と時間並びに設備費等を抑えて、より簡便でかつ迅速に測定することが可能な、抗原抗体法を利用した免疫学的検出法もある（特許文献２参照）。
【０００４】
特許文献２記載の抗原抗体法を利用した免疫学的検出法によれば、ピレスロイドに対して特異的に反応するより優れた抗体を開発する上で鋭意研究したものであるが、特定ピレスロイド農薬に対しての分析には効果があると思われるが、残留農薬のように多種の成分が混合したものを分析する際は、それぞれの農薬に対して特異性のある多数の抗体を用意して分析する必要があり、抗体の開発に多大な手間と時間並びに費用がかかると思われる。
【０００５】
【特許文献１】特開昭５９−１１６５４４号公報
【特許文献２】特開平９−３７７８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記問題点にかんがみ、抗原抗体法を利用した免疫学的検出法よりも、より簡易的に残留農薬をスクリーニングする方法を提供するものであり、詳しくは酵素阻害法を利用して一つの酵素により複数種のピレスロイドを検出することができるピレスロイド系農薬の検査方法を提供することを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため請求項１記載の発明は、試料サンプル中のピレスロイド系農薬の濃度を検査するための方法であって、該方法は、ａ）試料サンプルとアピラーゼとをインキュベートして、前記試料中に含まれるピレスロイド系農薬がアピラーゼに対しての酵素阻害剤として働くように酵素接触させる工程と、ｂ）該工程で酵素接触させた混合物に、ルシフェリン、アデノシン三リン酸及びルシフェラーゼを加えて、発光を生じさせる発光反応工程と、ｃ）該発光反応工程にて生じる一定時間の発光を測定する発光測定工程と、ｄ）アピラーゼ無添加時のルシフェラーゼの発光量と、ピレスロイド系農薬非存在下でアピラーゼ添加時のルシフェラーゼ発光量と、試料サンプルで生じた発光量から、ピレスロイド系農薬非存在下と試料中でのアピラーゼの活性の程度を算出し、その相対活性値ＲＡの逆数ＲＡ−１が、試料中のピレスロイド系農薬濃度に対して応答することを利用してピレスロイド系農薬の濃度を決定する濃度算出工程と、を備えたことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００８】
請求項１記載の発明によれば、酵素接触の工程においては、アピラーゼをＡＴＰ分解酵素として働かせるのではなく、ピレスロイド系農薬がアピラーゼに対しての酵素阻害剤として働くように酵素と接触させ、次いで、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びアデノシン三リン酸を加えて発光反応工程を行うことでアピラーゼとルシフェラーゼの基質を奪い合う反応が発光量として測定できる。そして、アピラーゼ無添加時のルシフェラーゼの発光量と、ピレスロイド系農薬非存在下でアピラーゼ添加時のルシフェラーゼ発光量と、試料サンプルで生じた発光量から、ピレスロイド系農薬非存在下と試料中でのアピラーゼの活性の程度を算出し、その相対活性値ＲＡの逆数ＲＡ−１が、試料中のピレスロイド系農薬濃度に対して応答することを利用して農薬濃度を決定する濃度算出工程を備えているので、複数種のピレスロイド系農薬が共存する試料であっても、各農薬ごと酵素阻害した量の和をもって総括的な農薬による酵素阻害量を知ることができ、その酵素阻害量の測定結果（相対活性値）から、その中に含まれる複数の未知濃度の農薬すべてについての最大残存濃度を知ることができる。
【０００９】
なお、アピラーゼと同様にピレスロイド系農薬に酵素活性を阻害されるＡＴＰａｓｅにあっては、検出感度が低いために農薬検出のような超微量検出が必要な測定には適さない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明を実施するための最良の形態を説明する。ルシフェリンとルシフェラーゼを用いた生物化学発光法により細胞内ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を測定し、食品などの雑菌による汚染を測定することはよく知られている。また、本発明者らはＡＴＰをＡＭＰ（アデノシン一リン酸）まで分解する酵素であるアピラーゼが、ピレスロイド系の農薬成分に高感度で阻害されることを見出した。ルシフェラーゼ及びアピラーゼ両酵素は共にATPを基質とし、これら2酵素の反応を利用することでピレスロイド系農薬成分含有量を推定することができる方法を開発したのである。
【００１１】
そして、本発明では、迅速に、一般的には、３０分から６０分で検出でき、しかも、１００ｐｐｂレベル以下と感度もよく、水、土壌、食物（穀物、果物及び野菜など）やその他の物質に含まれる複数のピレスロイド系農薬を生物化学発光法により検出することができるものである。
【００１２】
図１は本発明の検査方法の検出手順を示す概略図である。図１に示す符号１は、被測定試料の前処理工程であり、被測定試料の粉砕工程２、粉砕試料の秤量工程３、農薬の抽出を行うための振とう工程４及び有機溶剤により抽出した農薬を水溶液中に溶解させ有機溶剤を除去する減圧濃縮工程５を備えている。この前処理工程１で抽出した農薬の水溶液を抽出液６とする。
【００１３】
そして、容量２ｍＬの供試用のバイアル瓶７ａ及び対照用のバイアル瓶７ｂ，７ｃの計３個のバイアル瓶を準備し、7aには抽出液６を０．５ｍＬ投入し7b，7cには抽出成分が入っていない緩衝液を投入し、次に各バイアルにアピラーゼ測定用緩衝液を投入し（符号８）、さらに、バイアル瓶７ａ，７ｂにはピレスロイド系農薬を投入し、バイアル瓶７ｃにはメタノール（ＭｅＯＨ）を投入する（符号９）。なお、符号９に示すピレスロイド系農薬及びメタノールのバイアル瓶７ａ，７ｂ，７ｃの投入工程は、本来、被測定試料中にピレスロイド系農薬が含まれていれば不要である。本実施形態では、アピラーゼがピレスロイド系農薬成分を実際に阻害するか否かをテストするために、作為的に符号９の工程を設けている。
【００１４】
そして、バイアル瓶７ａ，７ｃには、アピラーゼ溶液を０．１ｍＬずつ投入するとともに、バイアル瓶７ｃには、緩衝液を０．１ｍＬ投入して、約１時間放置して酵素接触させた（符号１０）。
【００１５】
上記のように酵素接触させた後、バイアル瓶７ａ，７ｂ，７ｃのそれぞれに発光試薬（ルシフェリン、ルシフェラーゼ）０．１ｍＬ及び測定ノイズとなる抽出液中のATPを無視できる程高濃度のＡＴＰ０．１ｍＬを添加して蛍光発光反応を開始させ（符号１１）、各バイアル瓶７ａ，７ｂ，７ｃの発光量をルミノメータ（光電子倍増管、アドバンテック社製、型式ＡＴＰ−３０１０）により測定した（符号１２）。
【００１６】
図２は蛍光発光反応の発光量の累積経時変化を示したもので、黒丸印でプロットしたもの（バイアル瓶７ｂ）はルシフェラーゼの活性度合いを表す。白抜き丸印でプロットしたもの（バイアル瓶７ｃ）は農薬非存在下でルシフェラーゼとアピラーゼが共存しているときのルシフェラーゼの活性度合いを表す。三角印でプロットしたもの（バイアル瓶７ｃ）は農薬存在下でルシフェラーゼとアピラーゼが共存しているときのルシフェラーゼの活性度合いを表す。白抜き丸印でプロットしたもの（バイアル瓶７ｃ）はアピラーゼの活性度合い分、黒丸印でプロットしたもの（バイアル瓶７ｂ）に比べ累積発光量が低下する。一方、同様にアピラーゼとルシフェラーゼが共存していても、さらに農薬が加わることでアピラーゼのATP分解作用が阻害されるため、農薬濃度が高まる程、黒丸印でプロットしたもの（バイアル瓶７ｂ）に近づくように発光量が回復する。
【００１７】
図３はアピラーゼの代替手段として、ＡＴＰ分解酵素ＡＴＰａｓｅを使用したときのシラフルオフェンの酵素阻害信号と農薬濃度との関係を示したものである。この図３は、例えば、本発明者らが発明した特許第３４７３０２２号に開示される、試料中に農薬が存在するときの酵素活性の程度と農薬が非存在下での酵素活性の程度との比から求めた相対活性値ＲＡの逆数ＲＡ−１が、農薬濃度に対して応答することを利用して作図することができる。これにより、複数種のピレスロイド系農薬が共存する試料であっても、各農薬ごと酵素阻害した量の和をもって総括的な農薬による酵素阻害量を知ることができ、その酵素阻害量の測定結果（相対活性値）から、その中に含まれる複数の未知濃度の農薬すべてについての最大残存濃度を知ることができる。
【００１８】
そして、この図３を参照すれば、ＡＴＰａｓｅはＡＴＰをＡＤＰ（アデノシン二リン酸）に分解する酵素であり、アピラーゼと同様にピレスロイド系農薬に酵素活性を阻害されるものではあるが、感度が低いために残留農薬検出のような超微量検出が必要な測定には適さないことが分かった。
【実施例】
【００１９】
供試農薬として、ピレスロイド系殺虫剤を１１種類（エトフェンプロックス、シハロトリン、シペルメトリン、シラフルオフェン、トラロメトリン、ビフェントリン、フェンバレレート、フェンプロパトリン、フルシトリネート、フルバリネート及びペルメトリン）準備した。使用酵素としては、ジャガイモ由来のアピラーゼを使用した。測定溶液としては、理想溶液（０．１Ｍ HEPES（pH7.5）＋０．１M KCl＋０．１M CaCl２＋１０ｍＭ NaCl＋1ｍM EDTA）を用いた。測定方法としては、理想溶液に農薬、酵素を加えて２時間以上酵素接触した後、発光試薬とＡＴＰを添加してリシフェラーゼ反応を開始させ、反応後２０〜２１分の間の１分間の発光量をルミノメータ（光電子倍増管、アドバンテック社製、型式ＡＴＰ−３０1０）により測定した。
【００２０】
上記実施例の代表的な結果を図４及び図５に示す。図４はシラフルオフェン及びエトフェンプロックスを測定したときの酵素阻害信号と農薬濃度との関係を示したもので、図５はシラフルオフェン、シハロトリン及びトラロメトリンを測定したときの酵素阻害信号と農薬濃度との関係を示したものである。このデータによれば、ピレスロイド系殺虫剤としての需要の高いシラフルオフェンと同等かそれ以上の高感度でアピラーゼに対する阻害剤としての素質があることが分かる。
【００２１】
図６は、シラフルオフェンを基準として前記各農薬がアピラーゼに対して同等の感度の阻害であるか（白丸印）、又はアピラーゼに対してシラフルオフェンよりも高感度の阻害であるか（黒丸印）を集計した結果を示す表である。これにより、測定した１１種類のピレスロイド系殺虫剤の全てがシラフルオフェンと同等かそれよりも高感度にアピラーゼに対する阻害剤としての素質があることが分かる。
【００２２】
図７は、種々のピレスロイド系農薬を構造的に分類した図である。この図７からピレスロイド系農薬は分子構造の中に特徴となる構造が３つあること分かった。そして、図７に示す特徴１、特徴２及び特徴３の全ての構造を有するピレスロイド系農薬としては、トラロメトリン、シハロトリン、フェンプロパトリン、シペルメトリンが挙げられ、特徴１及び特徴２の構造を有するピレスロイド系農薬としては、フェンバレレート、フルバリネート、フルシトリネートが挙げられ、特徴１のみの構造を有するピレスロイド系農薬としては、エトフェンプロックス、シラフルオフェンが挙げられる。
【００２３】
図７のような分類によって、例外もあるが、特徴１、特徴２及び特徴３の全ての構造を有するピレスロイド系農薬はアピラーゼへの阻害性が、特徴１のみの構造を有するシラフルオフェンに比較して高い傾向にあることが分かった。
【００２４】
なお、本実施例で使用した使用酵素としては、ジャガイモ由来のアピラーゼを使用したが、これに限定されることはなく、昆虫由来のアピラーゼ、又はロブスターの筋や肝由来のアピラーゼを使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の検査方法の検出手順を示す概略図である。
【図２】蛍光発光反応の累積発光量の経時変化を示したものである。
【図３】ＡＴＰ分解酵素ＡＴＰａｓｅを使用したときのシラフルオフェンの酵素阻害信号と農薬濃度との関係を示した図である。
【図４】シラフルオフェン及びエトフェンプロックスを測定したときの酵素阻害信号と農薬濃度との関係を示した図である。
【図５】シラフルオフェン、シハロトリン及びトラロメトリンを測定したときの酵素阻害信号と農薬濃度との関係を示した図である。
【図６】シラフルオフェンを基準として、各農薬がアピラーゼに対する阻害の感度を示した図である。
【図７】種々のピレスロイド系農薬を構造的に分類した図である。
【符号の説明】
【００２６】
１  前処理工程
２  粉砕工程
３  秤量工程
４  振とう工程
５  減圧濃縮工程
６  抽出液
７  バイアル瓶
８  緩衝液投入工程
９  農薬投入工程
１０  酵素反応工程
１１  発光反応工程
１２  発光測定工程
【図１】
2009039054.tif 000006
【図２】
2009039054.tif 000007
【図３】
2009039054.tif 000008
【図４】
2009039054.tif 000009
【図５】
2009039054.tif 000010
【図６】
2009039054.tif 000011
【図７】
2009039054.tif 000012