(57)【要約】  【課題】本発明は、新規な真皮色素沈着抑制剤を開発することである。【解決手段】マクロファージ遊走阻止因子由来のポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むプラスミドを有効成分とする真皮色素沈着抑制剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージ遊走阻止因子由来のポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むプラスミドを有効成分とする真皮色素沈着抑制剤。
【請求項２】
配列番号１又は３のアミノ酸配列であるマクロファージ遊走阻止因子由来のポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むプラスミドを有効成分とする真皮色素沈着抑制剤。
【請求項３】
マクロファージ遊走阻止因子由来のポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むプラスミドが配列番号１３又は１８のアミノ酸配列のポリペプチドを発現するプラスミドである請求項１に記載の真皮色素沈着抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真皮色素沈着抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の黒化は表皮のメラノサイトが産生するメラニン色素により生じ、表皮のターンオーバーによりメラニン色素が排泄されることが一般的である。その他の皮膚の黒化機構として、真皮へのメラニン色素の滴落が挙げられる。真皮に滴落したメラニン色素は代謝され難いため、皮膚の黒化を防ぐためにはメラニン色素の滴落を防ぐことが必要である。
真皮へのメラニン色素の滴落は、色素沈着型接触皮膚炎、リール黒皮症、女子顔面黒皮症、摩擦黒皮症によって生じる。その他にもアトピー性皮膚炎患者の頚部にしばしば認められる特異な色素沈着（ダーティーネック）においても、真皮へのメラニン色素の滴落が生じている。また、過剰な紫外線被爆によっても真皮へのメラニン色素の滴落が生じる。
ビタミンＣ誘導体や植物抽出エキスにより表皮のメラニン産生を抑制する技術が知られているが、真皮色素沈着を抑制する技術は知られていない。
【０００３】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の一部または全部をコードする遺伝子ユニットを含むベクターが知られている（特許文献１：特開２００６−８９４４２号公報）。このベクターをマウスに適用することにより、関節炎が抑制されることが確認されている。このベクターは炎症性疾患の予防または治療に用いられるとされている。しかしながら、このベクターについて、色素沈着抑制、真皮へのメラニン色素の滴落を防ぐ効果は記載されていない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−８９４４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規な真皮色素沈着抑制剤を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）マクロファージ遊走阻止因子由来のポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むプラスミドを有効成分とする真皮色素沈着抑制剤。
（２）配列番号１又は３のアミノ酸配列であるマクロファージ遊走阻止因子由来のポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むプラスミドを有効成分とする真皮色素沈着抑制剤。
（３）マクロファージ遊走阻止因子由来のポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むプラスミドが配列番号１３又は１８のアミノ酸配列のポリペプチドを発現するプラスミドである（１）に記載の真皮色素沈着抑制剤。
【発明の効果】
【０００７】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の一部または全部をコードする遺伝子ユニットを含むベクターを用いた色素沈着抑制、真皮へのメラニン色素の滴落を防ぐことができる新規な真皮色素沈着抑制剤を提供することができた。
本発明は、ローション剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤等にプラスミドを配合した皮膚外用剤として用いることができる。
真皮色素沈着抑制のため、本発明のプラスミドを投与する量は１〜２，０００μｇが適当である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の「マクロファージ遊走阻止因子（以下ＭＩＦと呼ぶ）由来のポリペプチドの一部または全部をコードする少なくとも一つの遺伝子ユニットを含むプラスミド」はＭＩＦ由来のポリペプチドのアミノ酸配列を基に調製される。
MIFのアミノ酸配列は、ヒト（BC013976；配列番号：１）、マウス（BC024895；配列番号：3）、ラット（NM_031051；配列番号：2）などで公知である。本発明では特にヒトのMIFが好ましく用いられる。
本発明の「MIF由来のポリペプチド」とは、ヒトMIF（配列番号：１）のＭＩＦに対して、80%以上（好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上）の相同性を有するペプチドであり、（１）アミノ酸配列中の1または２個以上（好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個（例えば1〜6））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個（例えば1〜6））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）アミノ酸配列中の１または2個以上（好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個（例えば1〜6））のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドなども包含するものである。
【０００９】
本発明に用いるプラスミドはＭＩＦの一部または全部をコードする塩基配列を生体内で発現できるような状態で保持している。本発明のプラスミドには、ＭＩＦをコードする塩基配列に加えて、ＭＩＦと異なる塩基配列を有していても良い。
【００１０】
本発明に用いるプラスミドは薬学的に許容される担体に配合して注射剤、経口剤、皮膚外用剤として投与することができる。担体の具体例としては、カチオン性リポソーム、フルオロカーボンエマルジョン、蝸牛状剤（cochleate）、筒状剤（tubule）、金粒子、生体分解性ミクロスフェア、あるいはカチオン性ポリマーなどが挙げられる。
本発明で好適に用いられるリポソームとしては、カチオン性脂質あるいはカチオン性ポリマーのいずれかを含むリポソームなどが挙げられる。本発明の好ましい態様としては、リポソームは、シ゛オレオイルホスファチジルエタノールアミンあるいはコレステロールなどの中性脂質とカチオン性脂質との混合物を含むリポソームが用いられる。また、エステル結合を有さないカチオン性ポリマーは生体内で高い安定性を有する。カチオン性ポリマー（デンドリマー）の構造は、鎖状でも環状でもよく、ダイマー、オリゴマーあるいはポリマーの何れでもよい。
【００１１】
ホスファチジルセリン、コレステロール、およびカルシウムからなる安定なリン脂質カルシウム沈殿剤である蝸牛状剤は、消化系で存続することができる非毒性および非炎症性試薬として知られている。また、ポリエステルであるポリ（ラクチド−コ−グリコライド）などのポリマーからなる生体分解性ミクロスフェアを、プラスミドをマイクロカプセル化するために用いることができる。筒状剤はらせん状に巻かれた二層の脂質からなり、その縁が合わされてパックされている脂質ベースの微小筒として知られている。筒状剤を用いる場合、プラスミドは動物体内に送達および制御放出を行うための中空中心部に配置することができる。
【００１２】
本発明のプラスミドを皮膚外用剤として適用する場合には、ローション剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤等にプラスミドを配合して用いることができる。
真皮色素沈着抑制のため、本発明のプラスミドを投与する量は１〜２，０００μｇが適当である。
【実施例１】
【００１３】
マウスＭＩＦ ｃＤＮＡの作成
マウスＭＩＦ ｃＤＮＡは、ＲＡＷ２６４．７細胞より調製した全ＲＮＡを材料として配列番号：６で表されるプライマーＢ−１Ｕおよび配列番号：９で表されるプライマーＸ−３４８Ｌを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅した。ｃＤＮＡの合成反応系は５０ｍＭ  トリス塩酸塩（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．５ｍＭ  スペルミジン、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、４０Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤、０．２μＭ  ランダムオリゴヌクレオチド（９残基）、３０Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素、２μｇ  ＲＮＡからなり、全量で２５μｌとした。反応は４２℃、６０分間行った。ＰＣＲは以下の条件：１０ｍＭ  トリス塩酸塩（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、０．２μＭ  プライマーＢ−１Ｕ（配列番号：６）およびＸ−３４８Ｌ（配列番号：９）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０Ｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼからなる全量２５μｌの反応系で、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行い、マウスＭＩＦ  ｃＤＮＡ断片を得た。
【００１４】
マウス変異ＭＩＦプラスミドの作製（ＤＶ２）（１）
マウス変異ＭＩＦプラスミドとして、ここでは破傷風毒素Ｔｈエピトープ（配列番号：４）を持ったマウス変異ＭＩＦ発現プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦ／Ｔｔｘ（ＤＶ２））を作製した。その手順を図１に示す。
プライマーＢ−１Ｕ（配列番号：６）とＥ−９３Ｌ（配列番号：７）、あるいはＥ−１１２Ｕ（配列番号：８）とＸ−３４８Ｌ（配列番号：９）の組合せで、マウスＭＩＦ  ｃＤＮＡを鋳型として、それぞれＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は１ｎｇの上記ｃＤＮＡ，１０ｍＭ  トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ  塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１．５ｍＭ  塩化マグネシウム，０．２μＭの上記のプライマー，１ｍＭ  ｄＮＴＰ，  １０Ｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。その結果、ＭＩＦ  ｃＤＮＡの断片Ｂ−１／Ｅ−９３およびＥ−１１２／Ｘ−３４８を得た。これらの断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、さらに得られた断片を鋳型に、Ｂ−１ＵとＸ−３４８ＬをプライマーとしてＰＣＲを行った。この反応における反応液の組成は、上記で得られた断片のＤＮＡを１ｎｇ使用し、１０ｍＭ  トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ  塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１．５ｍＭ  塩化マグネシウム，０．２μＭの上記のプライマー，１ｍＭ  ｄＮＴＰ，  １０Ｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。その結果、２番目のループを欠損し、かつここをＥｃｏＲＩ部位に置き換えたマウス変異ＭＩＦ  ｃＤＮＡを得た。これをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで処理し、ｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。その結果得られたマウス変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦｄ２（ＤＶ０と称する）と命名した。また、このベクターにより発現されるポリペプチドを配列表に配列番号：１２で示す。
【００１５】
一方、破傷風毒素のＴｈエピトープ（配列番号：４）を、ＤＮＡ伸長反応により作製した。すなわち、Ｅ−ＴｘＵ（配列番号：１０）およびＥ−ＴｘＬ（配列番号：１１）をプライマー／鋳型とし、Ｋｌｅｎｏｗ断片を酵素として使用し、１０ｍＭ  トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ  塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１．５ｍＭ  塩化マグネシウム，１μＭの上記のプライマー，１ｍＭ  ｄＮＴＰ，  最終液量を２５μｌとして３７℃・３０分の伸長反応を行った。この産物（配列番号：５）をＥｃｏＲＩで処理した後、上記のように調製したＭＩＦ発現ベクターＤＶ０のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、破傷風毒素のＴｈエピトープを持ったマウス変異ＭＩＦ発現プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＦ／Ｔｔｘ（ＤＶ２と称する））を得た。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：１３で示す。
【００１６】
ＤＶ２の投与
Ｃ５７Ｂ／６マウス（日本クレシア製）（5週齢）にＤＶ２（２５μｇ／２５μｇ生理食塩水）を注射した。また、ｐｃＤＮＡ３．１（controlプラスミド）も同様に投与した（control群）。
【００１７】
ＵＶＢ照射誘導性色素沈着抑制試験
マウスの背部皮膚の毛を剃り、以下の群でＵＶＢ（FL20SE30ランプ、Clinical  Supply製）300mJ/cm2を週に３回12週間照射した。照射後、背中の皮膚を採取し、フォンタナマッソン染色病理皮膚組織切片の真皮中の1mm2あたりのメラニン粒数を測定した。同様に、真皮の面積に対する真皮中のメラニンの面積の比率（真皮中のメラニン面積率（％））を測定した。結果を表１ならびに図１，２に示す。
【００１８】
【表１】
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【実施例２】
【００１９】
ヒトＭＩＦｃＤＮＡの作成
ヒトＭＩＦ ｃＤＮＡは、ＨＬ６０細胞より調製した全ＲＮＡを材料として配列番号：１４で表されるプライマーｈＢ−１Ｕおよび配列番号：１５で表されるプライマーｈＸ−３４８Ｌを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅した。ｃＤＮＡの合成反応系は５０ｍＭ  トリス塩酸塩（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．５ｍＭ  スペルミジン、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、４０Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤、０．２μＭ  ランダムオリゴヌクレオチド（９残基）、３０Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素、２μｇ  ＲＮＡからなり、全量で２５μｌとした。反応は４２℃、６０分間行った。ＰＣＲは以下の条件：１０ｍＭ  トリス塩酸塩（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、０．２μＭ  プライマーｈＢ−１Ｕ（配列番号：１４）およびｈＸ−３４８Ｌ（配列番号：１５）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０Ｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼからなる全量２５μｌの反応系で、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行い、ヒトＭＩＦｃＤＮＡ断片を得た。
【００２０】
ヒト変異ＭＩＦプラスミド（ＤＶ１２）の作製（２）
ヒト変異ＭＩＦプラスミドとして、ここでは破傷風毒素Ｔｈエピトープ（配列番号：４）を持ったヒト変異ＭＩＦ発現プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＭＩＦ／Ｔｔｘ（ＤＶ１２））を作製した。手順はマウスに準じた。
【００２１】
プライマーｈＢ−１Ｕ（配列番号：１４）とＥ−９３Ｌ（配列番号：７）、あるいはｈＥ−１１２Ｕ（配列番号：１６）とｈＸ−３４８Ｌ（配列番号：１５）の組合せで、ヒトＭＩＦ  ｃＤＮＡを鋳型として、それぞれＰＣＲを行った。該反応における反応液の組成は１ｎｇの上記ｃＤＮＡ，１０ｍＭ  トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ  塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１．５ｍＭ  塩化マグネシウム，０．２μＭの上記のプライマー，１ｍＭ  ｄＮＴＰ，  １０Ｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。その結果、ＭＩＦ  ｃＤＮＡの断片ｈＢ−１／Ｅ−９３およびｈＥ−１１２／ｈＸ−３４８を得た。これらの断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、さらに得られた断片を鋳型に、ｈＢ−１ＵとｈＸ−３４８ＬをプライマーとしてＰＣＲを行った。この反応における反応液の組成は、上記で得られた断片のＤＮＡを１ｎｇ使用し、１０ｍＭ  トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ  塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１．５ｍＭ  塩化マグネシウム，０．２μＭの上記のプライマー，１ｍＭ  ｄＮＴＰ，  １０Ｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、最終液量を２５μｌとした。ＰＣＲは、（i）９４℃・５分の後、（ii）９４℃・１０秒、５６℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。その結果、２番目のループを欠損し、かつここをＥｃｏＲＩ部位に置き換えた変異ＭＩＦ  ｃＤＮＡを得た。これをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで処理し、ｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。その結果得られた変異ＭＩＦ発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ３．１／ｈＭＩＦｄ２（ＤＶ１１と称する）と命名した。また、このベクターにより発現されるポリペプチドを配列表に配列番号：１７で示す。
【００２２】
一方、破傷風毒素のＴｈエピトープ（配列番号：４）を、ＤＮＡ伸長反応により作製した。すなわち、Ｅ−ＴｘＵ（配列番号：１０）およびＥ−ＴｘＬ（配列番号：１１）をプライマー／鋳型とし、Ｋｌｅｎｏｗ断片を酵素として使用し、１０ｍＭ  トリス塩酸塩，ｐＨ９．０，５０ｍＭ  塩化カリウム，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１．５ｍＭ  塩化マグネシウム，１μＭの上記のプライマー，１ｍＭ  ｄＮＴＰ，  最終液量を２５μｌとして３７℃・３０分の伸長反応を行った。この産物（配列番号：５）をＥｃｏＲＩで処理した後、上記のように調製したＭＩＦ発現ベクターＤＶ０のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、破傷風毒素のＴｈエピトープを持った変異ＭＩＦ発現プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＭＩＦ／Ｔｔｘ（ＤＶ１２と称する））を得た。この発現プラスミドベクターにより得られるペプチドを配列表に配列番号：１８で示す。
【００２３】
ＤＶ１２をＤＶ２と同様に投与し、UVB照射誘導性真皮色素沈着に対する影響を試験したが、同様の結果を得ることができた。
【００２４】
処方例  １  注射剤
成分                                濃度（質量％）
１．実施例２のＤＶ１２                    ５
２．グリセリン                            ２
３．卵黄レシチン                          １
４．生理食塩水                          ９２
【００２５】
処方例  ２  クリーム
成分                                濃度（質量％）
１．実施例２のＤＶ１２                    ５
２．グリセリン                            ３
３．１，３−ブチレングリコール          １０
４．スクワラン                          １０
５．ベヘニルアルコール                    １
６．ＰＯＥ（２０）ステアリルエーテル      １．５
７．ポリアクリル酸アミド                  １
８．精製水                              残余
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１における真皮のメラニン粒数を示すグラフ。
【図２】実施例１における真皮のメラニン面積を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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