(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＲＰＶ１による疼痛や胃粘膜の防御作用を制御するために、ＴＲＰＶ１の結合タンパク質を提供し、ＴＲＰＶ１の作動を制御を可能にする方法を提供する。【解決手段】マウスＥＨＤ４タンパク質の６６位、１８４位、及び２２５位に相当部分のアミノ酸の少なくとも１カ所が、正常なＥＨＤ４タンパク質のアミノ酸と変異してなる変異ＥＨＤ４タンパク質、及びこれらの変異タンパク質をコードする遺伝子を提供する。また、該変異タンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性調節剤、並びにＥＨＤ４若しくはＥＨＤ４の活性を亢進する物質、又はＥＨＤ４の活性を阻害する物質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスＥＨＤ４タンパク質の６６位、１８４位、及び２２５位に相当部分のアミノ酸の少なくとも１カ所が、正常なＥＨＤ４タンパク質のアミノ酸と変異してなる変異ＥＨＤ４タンパク質。
【請求項２】
少なくとも１８４位に相当する部分のアミノ酸が変異したものである請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
変異ＥＨＤ４タンパク質が、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するものである請求項１又は２に記載の変異タンパク質。
【請求項４】
変異タンパク質がヒト由来のタンパク質である請求項１又は２に記載の変異タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
【請求項８】
医薬組成物が鎮痛用である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
正常なＥＨＤ４の活性を阻害する物質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
【請求項１０】
医薬組成物が鎮痛用である請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
正常なＥＨＤ４の活性を阻害する物質が、ＥＨＤ４に対する抗体である請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
正常なＥＨＤ４の活性を阻害する物質が、ＥＨＤ４の発現を阻害する物質である請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＥＨＤ４の発現を阻害する物質が、アンチセンス又はＲＮＡｉによる阻害物質である請求項１２に記載の医薬組成物
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性調節剤。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１６】
ＥＨＤ４タンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＨＤ４タンパク質の新規な機能を見出したものであり、ＥＨＤ４タンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性調節剤に関する。また、本発明は、ＥＨＤ４タンパク質の新規な変異タンパク質、それをコードする遺伝子、その抗体、それを用いた医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カプサイシン受容体としてクローニングされた非選択性陽イオンチャネルＴＲＰＶ１(transient receptor potential vamlloid 1)は熱、酸などの刺激をも受容し、生体の侵害受容体として機能している（特許文献１及び２、並びに非特許文献１参照）。当該受容体は、当初はバニロイド受容体、バニロイド様受容体として「ＶＲ」、「ＶＬＲ」、又はバニロイド受容体関連ぺプチドとして「ＶＲＲＰ」として命名されていたが、受容体活性化Ｃａ２＋流入を担っている透過型カチオンチャネルである「ＴＲＰ」の１種として命名されている。ＴＲＰ(transient receptor potential)は、１９８９年に光受容に異常を起こすショウジョウバエの変異の原因遺伝子として発見された。以来、多数のＴＲＰホモログが発見されＴＲＰスーパーファミリーを形成している。ＴＲＰスーパーファミリーは、６個〜８個の膜貫通領域を有し、２５個のアミノ酸からなるＴＲＰドメインを有するという構造的な特徴を有するＣａ２＋透過型カチオンチャネルである。
ＴＲＰスーパーファミリーには、ショウジョウバエのＴＲＰと相同性が高いＴＲＰＣ（TRP-canonical）、悪性黒色腫（メラノーマ）細胞から見出されたＴＲＰＭ（TRP-melastatin）、アンキリンリピートを有するＴＲＰＡ、バニロイド受容体であるＴＲＰＶ（TRP-vanilloid）などが知られている。アンキリンリピートを有するＴＲＰＡ１は、１５℃以下の低温や、ワサビやマスタードの辛み（アリルイソチオシアネート）に反応する。
ＴＲＰＶには、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、及びＴＲＰＶ６のサブタイプが知られており、ＴＲＰＶ１はトウガラシの辛みの成分であるカプサイシンの受容体として見出された。ＴＲＰＶ１は辛みだけでなく、４３℃以上の熱や、ｐＨ５．９以下のｐＨにも反応することから、痛覚刺激の伝達に深く関与しているものとされている。ＴＲＰＶ２はＴＲＰＶ１よりも高温の５２℃以上で反応し、ＴＲＰＶ３は３０℃以上で反応するが、カプサイシンやｐＨでは反応しない。ＴＲＰＶ４は細胞外液の浸透圧の減少により活性化される。また、ＴＲＰＶ６は腸におけるＣａ２＋の取り込みに関与しているとされている。
【０００３】
ＴＲＰＶ１は、舌では味蕾が豊富に存在する有郭乳頭、葉状乳頭、茸状乳頭を取り巻くように集中して局在化している。これらのＴＲＰＶ１陽性神経線維は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）やサブスタンスＰを含み、これらの物質がＴＲＰＶ１の作用に深く関連していると考えられている。また、ＴＲＰＶ１は胃粘膜にも発現しており、胃酸によるｐＨの変化に反応して、胃粘膜の血流増加、重炭酸イオン分泌の増加、粘膜分泌の促進、胃収縮性の抑制、胃酸分泌抑制などに関与している。さらに、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬であるラニチジンは、ＴＲＰＶ１関連知覚神経を活性化し、胃粘膜防御因子を増加させることも報告されている。
ＴＲＰＶ１は、カプサイシン、熱、及びｐＨで刺激され、これらの刺激はいずれも実際に生体においても痛みとして知覚されるものである。ＴＲＰＶ１が多刺激痛覚受容体として機能していることは、電気生理学的な機能解析により明らかにされてきたが、生体内においてもＴＲＰＶ１が多刺激痛覚受容体として機能していることは、ＴＲＰＶ１欠損マウスによる解析からも明らかにされてきた。ＴＲＰＶ１欠損マウスはカプサイシンに反応せず、熱刺激感受性も低下し、炎症による熱性痛覚過敏もみられない。
また、大韓民国コジュリ（kojuri）の野生ハツカネズミに由来する近交系マウスであるＫＪＲマウス（ｓｔｒａｉｎ；ＫＪＲ／Ｍｓ）は、通常のＣ５７ＢＬ／６Ｊと比較してカプサイシン感受性、温度感覚が鈍く、このＴＲＰＶ１を介した刺激受容に異常があると考えられていた（非特許文献２及び３参照）。
【０００４】
このように、ＴＲＰＶ１は単に辛みの受容体として機能しているだけでなく、多刺激痛覚受容体として機能し、さらに胃粘膜の防御因子のひとつとしても機能しており、ＴＲＰＶ１に関連する物質の探索とその作用機序の解明が求められていた。
本発明者らは、ＴＲＰＶ１と同じファミリーに属するＴＲＰＶ４の研究から、酵母ツーハイブリッド（two-hybrid）法を用い、ＥＨ１と呼ばれるタンパク質がＴＲＰＶ４の結合タンパク質であることを見出してきた（特許文献３参照）。ＴＲＰＶ１とＴＲＰＶ４は同じファミリーに属し、同様な結合タンパク質の存在が期待されていた。
【０００５】
【特許文献１】特表２００１−５１４８７９号
【特許文献２】特表２００２−５０３４５１号
【特許文献３】ＷＯ  ０１／６２９１５号
【非特許文献１】Caterina et a1.，1997；Tominaga et a1.，1998；Jordt et a1.，2000
【非特許文献２】Koide T，et al., Mammalian Genome, 11, 664-670, 2000.
【非特許文献３】Furuse T, et al., Brain Research Bulletin, 57, 49-55, 2002.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＴＲＰＶ１による疼痛や胃粘膜の防御作用を制御するために、ＴＲＰＶ１の結合タンパク質を解析する第一の目的とし、さらにＴＲＰＶ１の作動を制御を可能にすることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、大韓民国コジュリ（kojuri）の野生ハツカネズミに由来する近交系マウスであるＫＪＲマウスでは温度感覚とカプサイシン感受性が低下していることを生体外に取り出して（ex vivo）確認した。さらに、ＫＪＲマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのカプサイシン感受性の違いに関わるタンパク質をコードしている遺伝子の遺伝子座をＱＴＬ（quantitative trait loci）解析で検討したところ、１１番染色体にあるＴＲＰＶ１の遺伝子座ではなく、２、７、８番染色体にある遺伝子座が関わっていることが明らかにされた（非特許文献３参照）。
一方、本発明者らが見出してきたＥＨ１（特許文献３参照）のファミリーであるＥＨ４がＱＴＬで明らかにされた２番染色体の遺伝子座に相当する位置にコードされていることがわかった。ＥＨ４はその中に小胞輸送（vesicle transport）などに関わるＥＨドメインを持つことから、当該ＥＨ４がＴＲＰＶ１の機能的な発現に深く関与することが予想され、本発明者らは、当該ＥＨ４の機能を解析した。
【０００８】
即ち、本発明は、ＥＨＤ４タンパク質の変異タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、マウスＥＨＤ４タンパク質の６６位、１８４位、及び２２５位に相当部分のアミノ酸の少なくとも１カ所が、正常なＥＨＤ４タンパク質のアミノ酸と変異してなる変異ＥＨＤ４タンパク質に関する。さらに詳細には、本発明は、マウスＥＨＤ４タンパク質の６６位、１８４位、及び２２５位に相当部分のアミノ酸の少なくとも１カ所が、それぞれＭ（メチオニン）又はＬ（ロイシン）に、Ｇ（グリシン）に、Ａ（アラニン）に変異してなる変異ＥＨＤ４タンパク質に関する。また、本発明は、これらの変異タンパク質をコードする遺伝子に関する。
本発明は、ＥＨＤ４タンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性調節剤に関する。
また、本発明は、前記した本発明の変異タンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性調節剤に関する。
さらに本発明は、前記した本発明の変異タンパク質に対する抗体に関する。
また、本発明は、前記した本発明の変異タンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、前記した本発明の変異タンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性阻害剤に関する。
さらに本発明は、ＥＨＤ４若しくはＥＨＤ４の活性を亢進する物質、又はＥＨＤ４の活性を阻害する物質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物に関する。
【０００９】
本発明の態様をより詳細に述べれば以下のとおりとなる。
（１）マウスＥＨＤ４タンパク質の６６位、１８４位、及び２２５位に相当部分のアミノ酸の少なくとも１カ所が、正常なＥＨＤ４タンパク質のアミノ酸と変異してなる変異ＥＨＤ４タンパク質。
（２）少なくとも１８４位に相当する部分のアミノ酸が変異したものである前記（１）に記載のタンパク質。
（３）６６位のアミノ酸が、Ｍ（メチオニン）又はＬ（ロイシン）である（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（４）１８４位のアミノ酸が、Ｇ（グリシン）である（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（５）２２５位のアミノ酸が、Ａ（アラニン）である（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（６）変異ＥＨＤ４タンパク質が、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するものである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の変異タンパク質。
（７）変異タンパク質がヒト由来のタンパク質である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の変異タンパク質。
（８）前記（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（９）前記（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性阻害剤。
（１０）前記（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
（１１）医薬組成物が鎮痛用である前記（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）正常なＥＨＤ４の活性を阻害する物質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
（１３）医薬組成物が鎮痛用である前記（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）正常なＥＨＤ４の活性を阻害する物質が、ＥＨＤ４に対する抗体である前記（１２）又は（１３）に記載の医薬組成物。
（１５）正常なＥＨＤ４の活性を阻害する物質が、ＥＨＤ４の発現を阻害する物質である前記（１２）又は（１３）に記載の医薬組成物。
（１６）ＥＨＤ４の発現を阻害する物質が、アンチセンス又はＲＮＡｉによる阻害物質である前記（１５）に記載の医薬組成物
（１７）前記（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性調節剤。
（１８）前記（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質に対する抗体。
（１９）ＥＨＤ４タンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性調節剤。
【００１０】
次に、本発明におけるＥＨＤ４の機能、及びＥＨＤ４タンパク質の変異タンパク質について説明する。
まず、本発明者らは、ＫＪＲマウスの性質を明らかにするために、マッピングに使用したＦ２世代において第２番染色体のＤ２Ｍｉｔ９の遺伝子座のみでＫＪＲ由来ホモ接合とＣ５７ＢＬ／６由来ホモ接合及びそのヘテロ接合の３種類に分けて、通常のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びそれらのＦ１雑種との間の相違を検討した。
カプサイシン溶液を０μＭ、１μＭ、４μＭ、７μＭ、１０μＭの順番で日ごとに濃度を上昇させマウスに与えた。飲水は昼間１２時間は水を与え、夜間１２時間はカプサイシン溶液に変更し夜間の飲水量を測定した。０μＭの飲水量のみは３日間連続で測定しその平均値を１００％とした。各カプサイシン水溶液の飲水量は０μＭの飲水量に対する割合（％）で示した。結果を図１にグラフで示す。図１の横軸はカプサイシン水溶液の濃度（μＭ）を示し、縦軸は飲水量の水に対する割合（％）を示す。グラフの丸印（●）はＫＪＲ由来ホモ接合マウスの場合を、四角印（■）はＣ５７ＢＬ／６由来ホモ接合マウスの場合を、菱形印（◆）はこれらのＦ１雑種であるヘテロ接合マウス（ＢＫＦ１）の場合をそれぞれ示す。この結果、１０μＭのカプサイシンにおいてＫＪＲマウス及びＦ１雑種は水の７０−８０％の飲水をするのに対して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは２０％以下になり、ＫＪＲマウスがカプサイシンに対して抵抗性を有している事が分かった。
【００１１】
次に、熱に対する抵抗性を調べた。５２℃の中温のホットプレート上にマウスを置き、痛みに反応して後肢をなめるまでの時間を調べた。結果を図２Ａ（左側）にグラフで示す。図２Ａの縦軸は後肢をなめるまでの時間（秒）を示し、横軸はマウスの種類を示す。ＫＪＲはＫＪＲ由来ホモ接合マウスを示し、Ｃ５７ＢＬ／６はＣ５７ＢＬ／６由来ホモ接合マウスを示し、ＢＫＦ１はこれらのＦ１雑種であるヘテロ接合マウスを示す。図２Ａ中のａとｂの間ではｐ＜０．００１で有意差があった事を示す。この結果、ＫＪＲマウスは後肢をなめるまでに約７０秒かかったのに対し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＦ１雑種マウスでは約２０秒前後で反応し、ＫＪＲマウスが熱に対して抵抗性を有している事が分かった。
更に、マウスの尾部に高温の熱刺激を与え脊髄反射により尾を振る反応をするまでの時間を調べた。結果を図２Ｂ（右側）にグラフで示す。図２Ｂの縦軸は尾を振るまでの時間（秒）を示し、横軸はマウスの種類を示す。ＫＪＲはＫＪＲ由来ホモ接合マウスを示し、Ｃ５７ＢＬ／６はＣ５７ＢＬ／６由来ホモ接合マウスを示し、ＢＫＦ１はこれらのＦ１雑種であるヘテロ接合マウスを示す。図２Ｂ中のａとｂの間ではｐ＜０．００１で有意差があった事を示す。この結果、ＫＪＲマウスは尾を振るまでに約１２秒かかったのに対し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＦ１雑種マウスでは約４秒前後で反応し、ＫＪＲマウスが高い熱に対しても抵抗性を有している事が分かった。
また、４７．５℃、４２．５℃、３７．５℃、及び３４．０℃にそれぞれ加熱した床を用意し、それぞれのマウスがどの温度の床に分布するかを１群６匹で観察した。結果を図３に示す。図３の左側はＫＪＲマウスの場合を示し、右側は通常のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの場合を示す。それぞれのマウスが分布した割合（％）をそれぞれの横軸に示している。図３中の＊＊印は、ｐ＜０．０５で有意差があったことを示す。この結果、通常のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの場合には、約８０％以上のマウスが３４．０℃の床に止まったのに対して、ＫＪＲマウスでは４７．５℃の床に止まったものが最も多く、温度依存性が見られなかった。
【００１２】
次に、カプサイシン抵抗性に寄与している分子を明らかにするために連鎖分析を行った。Ｆ２の連鎖分析及び戻し交雑数（backcross population）は、複雑な表現型に影響を与えているＱＴＬ（quantitative trait loci）のマッピングのための重要な手法となる。ＫＪＲマウスのＱＴＬ分析はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの遺伝子座に基づいて既に行われており、３カ所の遺伝子座が候補として同定されている。しかし、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＶ２がコードされている第１１番染色体は候補にされなくて、第２番染色体（Ｃａｐｓｑ１，Ｄ２Ｍｉｔ１２０−１２６）がロッドスコアーが４．８７以上となり、ＫＪＲマウスにおけるカプサイシン抵抗性における最も可能性の高いものであることが判明した。しかし、第２番染色体にはＴＲＰＶ１及びＴＲＰＶ２もコードされておらず、本発明者らが見出してきたＴＲＰＶ１に結合するＥＨＤ１をコードする遺伝子も第２番染色体には存在しない。第２番染色体にコードされているタンパク質は、ＥＨＤ１のファミリーであるＥＨＤ４であり、第２番染色体のＣａｐｓｑ１の遺伝子座に位置している。このＥＨＤ４タンパク質の機能については十分な解明が為されていない。
【００１３】
ＫＪＲマウスのカプサイシン抵抗性をさらに検討するために、さらに詳細な実験を行った。まず、大腿の神経の神経活性を直接測定することにした。２５℃と５０℃における放電周波数を測定した。その結果を図４に示す。図４の縦軸は放線の周波数（Ｈｚ）を示し、横軸は温度（℃）を示す。黒丸印（●）はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの場合を示し、白丸印（○）はＫＪＲマウスの場合を示す。図４の＊印はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。この結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの場合は、０．８８±０．６０から７．２４±１０．０（ｎ＝２１８）であったのに対して、ＫＪＲマウスでは０．９７±０．５６から４．３０±６．０（ｎ＝６３）であり、明らかな相違が見られた（ｐ＜０．０１で有意差有り。）。しかし、熱感受性神経の発現頻度（熱による放電の周波数が１Ｈｚ以上のニューロンとして定義した。）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの場合は７８％であり、ＫＪＲマウスでは８２％であり、両者に変化は見られなかった。末梢神経の直接加熱（４０℃）においても同様な結果が得られた。このことは、熱に対する最初の反応は皮膚ではなく、ニューロンであることを示唆している。
【００１４】
次に、カプサイシン（１０μＭ）の刺激又は熱刺激（２５℃〜４５℃）を与えた場合における、細胞内の遊離カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を、ＤＲＧ（後根神経節）からすぐに分離した細胞を用いて測定した。結果を、カプサイシンによる場合を図５に示し、熱による場合を図６にそれぞれ示す。図５の縦軸は刺激前の細胞内の遊離カルシウム濃度を１としたときの相対値を示し、横軸は時間（秒）を示す。図６の左側の縦軸は刺激前の細胞内の遊離カルシウム濃度を１としたときの相対値を示し、右側の縦軸は温度（℃）を示し、横軸は時間（秒）を示す。図５及び図６における黒丸印（●）はＫＪＲマウスの場合を示し、白丸印（○）はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの場合を示す。カプサイシン及び熱刺激に応答するＣａ２＋の細胞内への流入は、ＫＪＲマウスのＤＲＧ細胞では顕著に減少していた。しかし、Ｍｎ２＋／Ｃａ２＋の流入の相違は３２℃で開始された。これは、ＴＲＰＶ１の活性化温度よりも低い温度である。さらに、Ｍｎ２＋／Ｃａ２＋の流入は、最初の２０秒間では、統計的な相違は見られなかった。カプサイシンの適用により一度活性化された流入は、ＫＪＲマウスのＤＲＧにおいては２０秒遅れて回復される。カプサイシンに対する応答は、ＫＪＲマウスにおいては一過性である。ＫＪＲマウスのＤＲＧニューロンにおけるマウスＴＲＰＶ１の局在化は、既に明らかにされており、これらのことから、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＤＲＧニューロンに比べて、ＫＪＲマウスのＤＲＧニューロンにおけるマウスＴＲＰＶ１の分布は希薄であり、ＴＲＰＶ１のクラスター化は薄いことが示唆された（図７及び図８参照）。しかし、ＴＲＰＶ１タンパク質の発現量に変化はなかった。
【００１５】
図７及び図８は、ＫＪＲマウス及びＣ５７ＢＬ／６の雄マウスのＤＲＧ（後根神経節）（図７）と舌（図８）を、フルオル４８８（緑色）で染色して共焦点顕微鏡により免疫蛍光分析した結果を示す図面に代わるカラー写真であり、これによりＴＲＰＶ１の分布を示す。図７及び図８の左側はＣ５７ＢＬ／６マウスの場合を示し（Ｂ６）、右側はＫＪＲマウスの場合（ＫＪＲ）の場合を示す。
この結果、ＫＪＲマウスの舌では、味蕾の三叉神経の神経末端におけるＴＲＰＶ１は検出できなかった。このようなＴＲＰＶ１の異常な分布がＫＪＲマウスの熱抵抗性の第一の原因であると考えられた。熱感受性組織の広範囲にわたる欠如は、このような熱抵抗性に対する候補分子はＴＲＰＶ１だけでなく、ＴＲＰＶ４である可能性を示唆していた。
【００１６】
ＴＲＰＶ４についてさらに検討するために、成長したマウスの腎臓のｃＤＮＡライブラリーにおける酵母ツーハイブリッドスクリーニングを、バイト（bait）としてＴＲＰＶ４のＣ末端細胞内ドメインを用いて行った。その結果、Ｃ末端でβ−ガラクトシダーゼ活性を示すいくつかのクローンを単離することができた。配列の分析を行った結果、ＥＨドメインを有するＥＨＤ１がＴＲＰＶ４結合タンパク質であることが判明した。さらに、ＥＨＤ１とＴＲＰＶ４の免疫共沈を検討するために、ＥＨＤ１とＴＲＰＶ４を発現させたＣＨＯ細胞から抗ＴＲＰＶ４を用いて、２５℃、３０℃、３５℃、及び４０℃のそれぞれの温度で免疫沈降させた。その結果を図９に示す。この結果、いずれの温度においてもＥＨＤ１が免疫共沈して検出されることがわかった。
【００１７】
ＥＨＤ４は、主として心臓に発現するタンパク質として知られている。ＥＨＤ４はＴＲＰＶファミリーの結合タンパク質であることを確認するために、本発明者らは、ＥＨＤ４がＴＲＰＶ４だけでなくＴＲＰＶ１にも結合することを確認するためにプルダウンアッセイを行った。プルダウンアッセイによる、ＴＲＰＶ４とＥＨＤ４を発現させたＣＨＯ細胞から抗ＴＲＰＶ４を用い免疫沈降させた。結果を図１０に示す。図１０の左側のＫｄは分子量を示し、左側のレーンの「Ｐｒｅ」はコントロールを示す。ＴＲＰＶ４及びＥＨＤ４の欄の「−」は発現させていないことを示し、「＋」は発現させていることを示す。この結果、ＴＲＰＶ４及びＥＨＤ４の両者が発現している場合だけ、ＥＨＤ４が免疫沈降することがわかった。また、同様にして、ＥＨＤ４、及びヒスチジン（６）でラベルしたＴＲＰＶ１を発現させたＣＨＯ細胞から抗ヒスチジン（６）を用い免疫沈降させた。結果を図１１に示す。図１１の左側のＫｄは分子量を示し、左側のレーンの「Ｐｒｅ」はコントロールを示す。ＴＲＰＶ１及びＥＨＤ４の欄の「−」は発現させていないことを示し、「＋」は発現させていることを示す。ＴＲＰＶ１の欄の「ｆｕｌｌ」は全長のＴＲＰＶ１を発現させた場合を示し、「７０６」、「７３９」、及び「７６１」の数字は、その部位以降のＣ末端側のアミノ酸を欠損させて発現させたことを示す。この結果、全長のＴＲＰＶ１及び７６１番目以降が欠損している場合だけＥＨＤ４の免疫沈降が確認されたことから、ＴＲＰＶ１の７３９番目以降にＥＨＤ４との結合部位があることがわかり、ＥＨＤ４はＴＲＰＶ１のＣ末端を認識して結合していることが示された。
また、ＥＨＤ４は、これらの２のＴＲＰＶだけでなく、弱いながらもＴＲＰＶ２にも結合することも判明した。
【００１８】
そこで、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＫＪＲマウスのＤＲＧからそれぞれのＥＨＤ４のｃＤＮＡをクローニングした。ハウスマウス（家ネズミ）のＥＨＤ４の塩基配列は既に知られている（ＢＣ００７４８０）。また、ＴＲＰＶ１のｃＤＮＡは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及び家ネズミ（配列ＩＤ：ＮＭ００１００１４４５）から既に単離されている。
その結果、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＥＨＤ４（ＥＨＤ４−Ｂ６と略す。）と、及びＫＪＲマウスのＥＨＤ４（ＥＨＤ４−ＫＪＲと略す。）とでは、アミノ酸配列において３カ所の変異が有った。３カ所の変異は、６６位のＭ（メチオニン）がＫＪＲマウスではＬ（ロイシン）へ（６６Ｍ／Ｌ）、１８４位のＲ（アルギニン）がＫＪＲマウスではＧ（グリシン）へ（１８４Ｒ／Ｇ）、２２５位のＤ（アスパラギン酸）がＫＪＲマウスではＡ（アラニン）へ（２２５Ｄ／Ａ）の変異であった。なお、ハウスマウス（家ネズミ）のＥＨＤ４の塩基配列（ＢＣ００７４８０）によれば、６６位のアミノ酸はＬ（ロイシン）であるが、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスではＭ（メチオニン）に変異している。
ハウスマウス（家ネズミ）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＫＪＲマウスのそれぞれのＥＨＤ４タンパク質における６６位、１８４位、及び２２５位におけるアミノ酸の変異をまとめて次の表１に示す。
【００１９】
【表１】
2009017784.tif 000002
【００２０】
ＫＪＲマウスのＥＨＤ４タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
図１２に、ＥＨＤファミリーの構造を模式的に示す。左側がＮ末端側であり、Ｎ末端よりｌｏｏｐドメイン、ＣＣ（Coiled coil）ドメイン、及びＥＨ（Esp 15 homology）ドメインとなっている。図１２における「ＮＢＣ」は、核酸結合のモチーフであることを示している。下段の番号は、本発明により見出された変異がある部位を示している。
また、２２５位のアミノ酸は、ＮＣＢＩのデータベースによれば、ＧＴＰアーゼ（GTPase）活性を有する重要な位置であるとされている。
【００２１】
次に、ＥＨＤ４−Ｂ６及びＥＨＤ４−ＫＪＲのそれぞれと、ヒスチジン（６）でラベルしたＴＲＰＶ１を発現させたＣＨＯ細胞を、２７℃、３７℃、及び４７℃のそれぞれ異なる温度で培養した後、抗ヒスチジン（６）を用い免疫沈降させた。結果を図１３に示す。図１３の左側のＫｄは分子量を示し、左側の３つのレーンの「−」はＥＨＤ４を発現させなかった場合を示す。ＴＲＰＶ１の欄の「＋」は発現させていることを示す。ＥＨＤ４の欄のＢ６はＥＨＤ４−Ｂ６を発現させた場合を示し、ＫＪＲはＥＨＤ４−ＫＪＲを発現させた場合を示す。この結果、ＥＨＤ４−Ｂ６は共沈されたが、ＫＪＲ型のＥＨＤ４であるＥＨＤ４−ＫＪＲではＴＲＰＶ１と共沈されないことが示された。
さらに、これらのマウスの細胞を２７℃、３７℃、及び４７℃のそれぞれ異なる温度で培養し、ＥＨＤ４−Ｂ６とＥＨＤ４−ＫＪＲとを１；１に混合して、同様にして免疫沈降させた。結果を図１４に示す。図１４の左側のＫｄは分子量を示し、ＴＲＰＶ１の欄の「＋」は発現させていることを示す。ＥＨＤ４の欄のＢ６はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの細胞の場合を示し、ＫＪＲはＫＪＲマウスの細胞の場合を示し、Ｂ６／ＫＪＲはＣ５７ＢＬ／６ＪとＫＪＲを掛け合わせたヘテロマウスの細胞の場合を示す。この結果、ＥＨＤ４−Ｂ６が存在していても、ＥＨＤ４−ＫＪＲの存在により、ＴＲＰＶ１との結合が阻害され、ＨＤ４−ＫＪＲはＥＨＤ４−Ｂ６による正常の結合を阻害することがわかった。
これらのＥＨＤ４−Ｂ６によるＴＲＰＶ１のプルダウンアッセイによれば、ＥＨＤ４−Ｂ６とＥＨＤ４−ＫＪＲの結合キャパシティーは変化することが示された。ＥＨＤ４−Ｂ６は如何なる温度においてもＴＲＰＶ１と強く結合するが、ＥＨＤ４−ＫＪＲとＴＲＰＶ１との結合はそれに比べて遙かに弱くなっている。また、ＥＨＤ４−Ｂ６とＥＨＤ４−ＫＪＲを共存させた場合には、ＥＨＤ４−ＫＪＲはＥＨＤ４−Ｂ６とＴＲＰＶ１との結合を阻害する作用を示した。
これらの結合には、２７℃でのインキュベーションが最適であり、結合の温度依存性はＥＨＤ４−Ｂ６もＥＨＤ４−ＫＪＲも同じであった。
【００２２】
さらに、本発明者らは、ＥＨＤ４タンパク質の各変異体を人工的に作成し、ＴＲＰＶ１との結合を検討した。即ち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの６６位のＭ（メチオニン）をＬ（ロイシン）に変異させたタンパク質（６６Ｍ／Ｌ）、１８４位のＲ（アルギニン）をＧ（グリシン）へ変異させたタンパク質（１８４Ｒ／Ｇ）、及び２２５位のＤ（アスパラギン酸）をＡ（アラニン）へ変異させたタンパク質（２２５Ｄ／Ａ）をそれぞれ製造した。これらの変異させたＥＨＤ４を用いて、同様にプルダウンアッセイによる免疫沈降を行った。結果を図１５に示す。図１５の左側のＫｄは分子量を示し、ＴＲＰＶ１の欄の「＋」は発現させていることを示す。ＥＨＤ４の欄は前記したそれぞれの変異タンパク質を示し、右側のＫＪＲはＥＨＤ４−ＫＪＲを示す。この結果、１８４Ｒ／Ｇで結合が低下しているの示された。この解析結果から、ＥＨＤ４−１８６Ｒ／Ｇ変異体のＴＲＰＶ１への結合は顕著によわくなることが示され、１８４位は重要であると考えられた。しかし、ＥＨＤ４−１８６Ｒ／Ｇ変異体のＴＲＰＶ１への結合は、ＥＨＤ４−ＫＪＲに比べればより強いものであったことも示された。
【００２３】
次に、ＤＲＧ（後根神経節）細胞やヒト腎皮質（ＨＥＫ）細胞におけるＴＲＰＶ１−ＥＨＤ４複合体の分布を検討した。
まず、ＤＲＧ（後根神経節）細胞を用いて、ＥＨＤ４−Ｂ６又はＥＨＤ４−ＫＪＲをそれぞれ発現させてＴＲＰＶ１の存在を観察した。結果を図１６に示す。図１６の左側のＢ６はＥＨＤ４−Ｂ６を発現させた場合を示し、右側のＫＪＲはＥＨＤ４−ＫＪＲを発現させた場合を示す。この結果、いずれの細胞においても染色される量には差が見られないが、染色されたＴＲＰＶ１の細胞内の分布には差が見られた。ＥＨＤ４−ＫＪＲでは（図１６の右側）、分布が偏っているが、ＥＨＤ４−Ｂ６の場合には、細胞全体に均一な分布が観察された。通常は、ＥＨＤ４が結合した後、ＴＲＰＶ１は細管上を形質膜方向に移動する。ＴＲＰＶ１はＥＨＤ４−Ｂ６と一緒に細管に局在する。これに対して、ＥＨＤ４−ＫＪＲでは、エンドソームのコンパートメントの中心周囲に局在化していた。
次に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの６６位のＭ（メチオニン）をＬ（ロイシン）に変異させたタンパク質（６６Ｍ／Ｌ）、１８４位のＲ（アルギニン）をＧ（グリシン）へ変異させたタンパク質（１８４Ｒ／Ｇ）、及び２２５位のＤ（アスパラギン酸）をＡ（アラニン）へ変異させたタンパク質（２２５Ｄ／Ａ）をそれぞれ用いて、ＨＥＫ細胞でＴＲＰＶ１と共発現させた。これをファロイジンを用いたアクチン部分の染色（赤色）と、ＴＲＰＶ１部分の染色（緑色）の２重染色を行った。結果を図１７に示す。図１７の左側は６６Ｍ／Ｌを用いた場合を示し、中側は１８４Ｒ／Ｇを用いた場合を示し、右側は２２５Ｄ／Ａを用いた場合を示す。通常は、微細管であるアクチンのレールの上にＴＲＰＶ１が存在しており、赤色と緑色の２つの染色は重なって黄色く見えるのに対し、１８４Ｒ／Ｇにおいて、は緑の部分が明らかに認められた。このことはＴＲＰＶ１が微細管から外れていることを示している。このように、ＥＨＤ４−１８６Ｒ／Ｇ変異体とＴＲＰＶ１の共発現をファロイジン（アクチンの染色）及びＴＲＰＶ１（ＦＬＡＧ配列をマーカーとした）の２重染色での解析結果から、ＴＲＰＶ１の微細管上からの脱線が観察できた。つまり、ＥＨＤ４−１８６Ｒ／Ｇと共発現した場合に限り、微細管とー致しないために縁の染色が認められているのに対し、他の２つの変異休では一致して重なって染色されるので、黄色く染色されている。
図１７に示されるように、細管上に結合していないＴＲＰＶ１（緑色の小胞）は、明らかにこの変異体が発現したときだけに観察された。それゆえ、ＥＨＤ４−ＫＪＲはＴＲＰＶ１を細管輸送における適当な非細胞コンパートメントへ輸送することができず、その結果、リサイクリング及び形質膜におけるＴＲＰＶ１の機能的な発現を異常にしていることが明らかにされた。
【００２４】
以上のことから、以下に示す（１）〜（４）のことが明らかにされた。
（１）ＥＨＤ−ＫＪＲと、ＥＨＤ４−Ｂ６の間には３箇所のアミノ酸残基に違いが確認された。
（２）図１３及び図１４に示される実験結果から、ＥＨＤ４はＴＲＰＶ１と共に共沈できる。ＥＨＤ４−ＫＪＲはＥＨＤ４−Ｂ６に比較してｍＴＲＰＶ１との相互作用が減少していた。
（３）図１５に示される実験結果から、３箇所のうち２番目のアミノ酸残基をＫＪＲ型に置換したものは、ＥＨＤ４−ＫＪＲと同様にｍＴＲＰＶ１との相互作用が減少した。
（４）図１６及び図１７に示される実験結果から、ＥＨＤ４−ＫＪＲとＴＲＰＶ１、並びにＥＨＤ４−Ｂ６とＴＲＰＶ１を、それぞれＨＥＫ細胞に発現させると分布が異なっていた。
【００２５】
以上の結果からＥＨ４タンパク質はカプサイシン受容体の細胞におけるリサイクリングを調節する骨格タンパク質（scaffold protein）であることが判明した。このタンパク質とＴＲＰＶ１の相互作用を調節するかまたはＥＨ４タンパク質の機能を標的とした阻害剤は、ＴＲＰＶ１の多刺激痛覚受容体として機能を阻害することができることから、鎮痛剤として有用となる。
【００２６】
以上のように、本発明で示されたＥＨＤ４変異タンパク質はＴＲＰＶ１の機能を阻害し、しかも正常なＥＨＤ４の共存下においても競合的にＴＲＰＶ１の多刺激痛覚受容体として機能を阻害することができる。
したがって、本発明は、前記した新規なＥＨＤ４変異タンパク質を提供するものである。本発明のＥＨＤ４変異タンパク質は、６６位、１８４位、及び２２５位の少なくとも１つのアミノ酸がタンパク質のアミノ酸に変異したものである。これらのアミノ酸の位置は、マウスのタンパク質によるものであり、ヒトのタンパク質においては、マウスのタンパク質の６６位、１８４位、又は２２５位に相当する位置のアミノ酸の変異を意図することになる。
また、本発明は、前記した本発明のＥＨＤ４変異タンパク質を含有してなるＴＲＰＶ１の活性阻害剤を提供するものである。また本発明は、ＥＨＤ４の新たな機能を見出したものであり、ＥＨＤ４を含有してなるＴＲＰＶ１の活性調節剤を提供するものである。さらに本発明は、ＥＨＤ４の活性を調製することによりＴＲＰＶ１の活性を制御することができることから、ＥＨＤ４の活性阻害剤を含有してなるＴＲＰＶ１の活性阻害剤を提供するものである。
さらに、本発明は、ＥＨＤ４タンパク質を発現している細胞、又はこのような細胞を有する生物に、試験物質を添加して、当該試験物質によるＥＨＤ４の発現量の変化又はＥＨＤ４の活性を測定することからなる、ＴＲＰＶ１の機能を制御できる物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００２７】
本発明におけるＥＨＤ４の活性阻害剤としては、ＥＨＤ４に対する抗体、ＥＨＤ４のｍＲＮＡの転写抑制剤、当該ｍＲＮＡのアンチセンス、ＲＮＡｉによりｍＲＮＡを失活させる遺伝子などが挙げられる。本発明における遺伝子としては、ＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられる。
本発明におけるＴＲＰＶ１阻害剤は、多刺激痛覚受容体として機能を有するＴＲＰＶ１の活性を阻害するものであり、特に炎症性の疼痛の緩解のための鎮痛剤として有用であるがこのような疼痛に限定されるものではなく、ＴＲＰＶ１が関与するあらゆる疼痛に対する鎮痛剤として有用となる。近年においては、特にＱＯＬが重要となってきており、各種の疼痛を緩解させるための本発明の鎮痛剤は極めて有用である。
したがって、本発明におけるＥＨＤ４の活性阻害剤や、ＥＨＤ４変異タンパク質は、疼痛を緩解させるための有効成分としての医薬組成物の成分として有用となる。
本発明の医薬組成物は、前記した本発明のＥＨＤ４の活性阻害剤、又は本発明のＥＨＤ４変異タンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなるものである。本発明の医薬組成物における有効成分としてのタンパク質は、タンパク質自体であってもよいが、必要により当該タンパク質に対する抗体、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該タンパク質の発現を抑制するためのアンチセンスなどであってもよい。
【００２８】
本発明の医薬組成物における「製薬上許容される担体」としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。本発明の医薬組成物は、必要により、前記した製薬上許容される担体の一種以上を用いることにより、錠剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤等の形態に製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、経口又は非経口、好ましくは非経口投与される。非経口投与のための剤型としては、注射剤や粘膜投与剤などが挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される有効成分（前記したタンパクや、その抗体など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、有効成分の量として一回につき１μｇから１００ｍｇの範囲で投与される。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法としては、次の（１）から（３）、
（１）ＥＨＤ４タンパク質が発現している細胞、又はこれらの細胞を有する生物、好ましくは動物に、
（２）試験物質を添加して、
（３）当該試験物質による、ＥＨＤ４タンパク質の発現量の変化、又はその活性を測定する、
ことからなるものである。
この方法における細胞としては、ヒトの細胞、サルの細胞、マウスの細胞、ラットの細胞などの動物細胞、大腸菌、酵母などの微生物細胞などを使用することができる。また、これらの細胞に目的タンパク質を発現させる方法としては、発現細胞を採取してきてもよいが、１又は２以上のコピー数を有する遺伝子を用いてこれらの細胞を形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法としては当業者によく知られている通常の手法を採用することができる。また、抗体を用いて目的のタンパク質の機能を障害させたり、遺伝子を欠損させて目的のタンパク質の発現を抑制することもできる。欠損させる方法としては、突然変異法やターゲッティング法などを採用することができる。さらに、細胞種によっては、培養系に目的のタンパク質を添加することにより、目的のタンパク質の発現系と同種の状況を形成してもよい。
ＥＨＤ４の発現量を測定する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、目的のタンパク質の抗体による免疫染色法、タグタンパク質による方法、ＧＦＰなどの蛍光法などの各種の方法を採用することができる。
本発明のスクリーニングする方法により、ＥＨＤ４の活性を制御できると判定された物質は、ＥＨＤ４の活性や機能を制御し、その結果ＴＲＰＶ１の機能を制御することができ、ＴＲＰＶ１の機能に基づく鎮痛剤の有効成分として有用な物質となる。これらの有効性が確認された物質は、医薬の有効成分として、また化粧品や機能性食品における成分として有用である。
【００３０】
本発明の前記した各タンパク質に対する抗体を製造することもできる。したがって、本発明は、前記した本発明のＥＨＤ４変異タンパク質に対する抗体、好ましくは特異的抗体を提供するものである。
本発明のこれらの抗体は、公知の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、本発明のタンパク質又はその一部のアミノ酸配列からなるタンパク質を免疫原（抗原）として、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギに免疫することにより製造できる。ポリクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た抗体産生細胞（脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓のＢ細胞）と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを免疫学的測定法（ＥＬＩＳＡなど）により選択することによって製造することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、多刺激痛覚受容体として機能しているＴＲＰＶ１の活性を制御する手法を提供するものであり、知覚神経におけるＴＲＰＶ１の機能を制御できるために、極めて有効な鎮痛成分となる。また、ＴＲＰＶ１は、胃粘膜などに発現しているために胃粘膜におけるＴＲＰＶ１の機能も制御可能となり、各種の消化器官における疾患の治療や予防剤としても有用となる。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
カプサイシンに対する抵抗性
ＫＪＲ由来ホモ接合マウス（ＫＪＲ）、Ｃ５７ＢＬ／６由来ホモ接合マウス（ＣＢＬ／６）、及びこれらのＦ１雑種であるヘテロ接合マウス（ＢＫＦ１）のそれぞれのマウスに、カプサイシン溶液を０μＭ、１μＭ、４μＭ、７μＭ、１０μＭの順番で日ごとに濃度を上昇させマウスに与えた。飲水は昼間１２時間は水を与え、夜間１２時間はカプサイシン溶液に変更し夜間の飲水量を測定した。０μＭの飲水量のみは３日間連続で測定しその平均値を１００％とした。各カプサイシン水溶液の飲水量は０μＭの飲水量に対する割合（％）で示した。
結果を図１に示す。
【実施例２】
【００３４】
熱に対する抵抗性
ＫＪＲ由来ホモ接合マウス（ＫＪＲ）、Ｃ５７ＢＬ／６由来ホモ接合マウス（ＣＢＬ／６）、及びこれらのＦ１雑種であるヘテロ接合マウス（ＢＫＦ１）のそれぞれのマウスについて、５２℃の中温のホットプレート上にマウスを置き、痛みに反応して後肢をなめるまでの時間を調べた。結果を図２Ａに示す。
同様に、各マウスについて、マウスの尾部に高温の熱刺激を与え脊髄反射により尾を振る反応をするまでの時間を調べた。結果を図２Ｂに示す。
【実施例３】
【００３５】
神経活性の解析
ウレタン（１ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔したマウスの後ろ足に定温の水を流すことができるアルミニウム管を取り付けた。温度計で後ろ足の表面の温度を測定し、後ろ足の表面温度が２５℃又は５０℃になるようにそれぞれ調整した。それぞれにおける後ろ足から放電される電流の周波数を公知の方法で測定した。大腿の神経信号を１５秒間にわたって測定し、測定結果を電子計算機で解析した。ＳＮ比は３以上であった。放電の速度は、ｐＳＴＡＴ（Ａｘｏｎインスツメント（米国、ＭＡ））のブラスト分析プログラムを用いて決定した。この方法は同時に数種の神経活性を測定することができる。この測定では、最も活性化された３種の神経を測定した。データはスチューデントのｔテスト又はＡＮＯＶＡで分析した。ｐ＜０．０５で有意差とした。ＫＪＲマウス６３匹、通常のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス２１８匹を用いた結果を図４に示す。
【実施例４】
【００３６】
免疫組織化学
ＫＪＲマウス及びＣ５７ＢＬ／６の雄マウスからＤＲＧ（後根神経節）及び舌組織をそれぞれ除去し、４％パラホルムアルデヒドで固定化した。それぞれの細胞組織を４％パラホルムアルデヒドで固定化し、１５分間０．１％のトリトンＸ−１００中でインキュベートして透過性とした。ゼノンキット（モレキュラープローブ社製）を用いて免疫蛍光分析を行った。フルオル４８８（緑色）で染色して共焦点顕微鏡で観察した。
結果を図７（ＤＲＧ（後根神経節））及び図８（舌組織）にカラー写真で示す。
【実施例５】
【００３７】
ＥＨＤ４タンパク質をコードするｍＲＮＡの同定
ＫＪＲマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスのＤＲＧ（後根神経節）細胞から抽出したｍＲＮＡ０．３μｇをテンプレートとして、ＲＮＡ−ＰＣＲキット（タカラ社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーとして、ＭＡＰ７のｍＲＮＡのオープンリーディングフレームを検出できるように８０ｍａｒと５２０ｍａｒのヌクレオチドを用いて、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルで３０サイクル行った。
増幅されたｃＤＮＡを常法により解析して、その塩基配列を決定した。決定された塩基配列から、それぞれのアミノ酸配列を決定した。
ＫＪＲマウスのＥＨＤ４のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。これらのＥＨＤ４のアミノ酸配列における６６位、１８４位、及び２２５位におけるアミノ酸の変位を表１に示す。
【実施例６】
【００３８】
マウスＴＲＰＶ１及びＥＨＤ４の発現
マウスＴＲＰＶ１及びＥＨＤ４を、発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Intyle社製）、及びｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（Stratagene社製）に再クローニングした。これらは、Ｃ末端にペンタ−ヒスチジンを、Ｎ末端にＦＬＡＧを融合している。
得られた発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して発現させた。
【実施例７】
【００３９】
プルダウンアッセイ
サブコンフルエントのＨＥＫ２９３細胞（ヒト腎皮質細胞）を、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、０．０５％のツウイーン２０（ｐＨ８．０）、及びプロテアーゼ阻害剤を含有する溶液中で超音波処理して溶解した。Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズ（Qiagen社製）を、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び２０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）で洗浄し、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、及びツウイーン２０（ｐＨ８．０）の溶液中に溶出し、当該磁気ビーズをこれらの複合体を引くために使用した。沈殿物及び上澄みは、抗ＦＬＡＧ抗体（抗ＦＬＡＧ−Ｍ２；Stratagene社製）を用いて検出した。
培養細胞の膜タンパク質は、以下のようにして調製した。形質転換したＣＨＯ細胞を氷冷したＰＢＳ（ｐＨ８．０）で３回洗浄した後、５００ｇで１５分間の遠心分離で細胞を集め、集められた細胞の表面タンパク質を、室温で３０分間、１ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンのＰＢＳ（ｐＨ８．０）溶液中に入れてビオチン化した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を１％トリトンＸ−１００、５ｍＭのＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ（ｐＨ８．０）中で、４℃で１時間かけて溶解した。細胞抽出物を１００μｇのストレプトアビジン−アガロース（Pierce社製）で４℃で、一晩インキュベートした。沈殿してきたタンパク質を抗ＣＤ４抗体（Dako社製）又は抗Ｈ５抗体で免疫ブロッティングにより分析した。
各種のプルダウンアッセイの結果を図１０、図１１、図１３、図１４、及び図１５に示す。
【実施例８】
【００４０】
ＤＲＧ（後根神経節）細胞におけるＥＨＤ４−Ｂ６又はＥＨＤ４−ＫＪＲの発現
ＤＲＧ（後根神経節）細胞を用いて、ＥＨＤ４−Ｂ６又はＥＨＤ４−ＫＪＲをそれぞれ発現させ、抗ＴＲＰＶ１（サンタクルーズ社）にて染色した。
結果を図１６に示す。
【実施例９】
【００４１】
ＨＥＫ細胞におけるＥＨＤ４変異体の発現
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの６６位のＭ（メチオニン）をＬ（ロイシン）に変異させたタンパク質（６６Ｍ／Ｌ）、１８４位のＲ（アルギニン）をＧ（グリシン）へ変異させたタンパク質（１８４Ｒ／Ｇ）、及び２２５位のＤ（アスパラギン酸）をＡ（アラニン）へ変異させたタンパク質（２２５Ｄ／Ａ）をそれぞれコードする遺伝子を導入したＨＥＫ（ヒト腎皮質）細胞でＴＲＰＶ１と共発現させた。これをファロイジン（Rhodamin-phalloidin）を用いたアクチン部分の染色（赤色）と、抗ＴＲＰＶ１（サンタクルーズ社）を用いてＴＲＰＶ１部分の染色（緑色）の２重染色を行った。
結果を図１７に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、ＥＨＤ４の新たな機能を解明しただけでなく、ＥＨＤ４の活性を阻害することによりＴＲＰＶ１の機能を阻害する、新しいタイプの鎮痛剤としての医薬組成物を提供するものであり、製薬分野だけでなく、ヘルスケア分野において参照上の利用可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ＫＪＲマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、これらのＦ１雑種マウスを用いて、カプサイシン溶液を０μＭ、１μＭ、４μＭ、７μＭ、１０μＭの順番で日ごとに濃度を上昇させマウスに与え、カプサイシン溶液の飲水量を調べた結果を示すグラフである。図１の横軸はカプサイシン水溶液の濃度（μＭ）を示し、縦軸は飲水量の水に対する割合（％）を示す。グラフの丸印（●）はＫＪＲマウスの場合を、四角印（■）はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの場合を、菱形印（◆）はＦ１雑種マウス（ＢＫＦ１）の場合をそれぞれ示す。
【図２】図２Ａは、５２℃の中温のホットプレート上にマウスを置き、痛みに反応して後肢をなめるまでの時間を調べた結果を示すグラフである。図２Ａの縦軸は後肢をなめるまでの時間（秒）を示し、横軸はマウスの種類を示す。図２Ｂは、マウスの尾部に高温の熱刺激を与え脊髄反射により尾を振る反応をするまでの時間を調べた結果を示すグラフである。図２Ｂの縦軸は尾を振るまでの時間（秒）を示し、横軸はマウスの種類を示す。
【図３】図３は、１群１５０匹のＫＪＲマウスと通常のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いて、４７．５℃、４２．５℃、３７．５℃、及び３４．０℃にそれぞれ加熱した床に、それぞれのマウスがどのように分布するかを観察した結果を示すグラフである。図３の左側はＫＪＲマウスの場合を示し、右側は通常のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの場合を示す。それぞれのマウスが分布した割合（％）をそれぞれの横軸に示している。
【図４】図４は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（黒丸印（●））とＫＪＲマウス（白丸印（○））における大腿の神経の神経活性を、２５℃と５０℃の温度で直接測定した結果を示すグラフである。図４の縦軸は放線の周波数（Ｈｚ）を示し、横軸は温度（℃）を示す。図４の＊印はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
【図５】図５は、カプサイシン（１０μＭ）による刺激を与えた後、ＤＲＧからすぐに分離した細胞を用いて細胞内の遊離カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を測定した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、熱刺激（２５℃〜４５℃）を与えた後、ＤＲＧからすぐに分離した細胞を用いて細胞内の遊離カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を測定した結果を示すグラフである。
【図７】図７は、ＫＪＲマウス及びＣ５７ＢＬ／６の雄マウスのＤＲＧ（後根神経節）を、フルオル４８８（緑色）で染色して共焦点顕微鏡により免疫蛍光分析した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図７の左側はＣ５７ＢＬ／６マウスの場合を示し（Ｂ６）、右側はＫＪＲマウスの場合（ＫＪＲ）を示す。
【図８】図８は、ＫＪＲマウス及びＣ５７ＢＬ／６の雄マウスの舌を、フルオル４８８（緑色）で染色して共焦点顕微鏡により免疫蛍光分析した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図７の左側はＣ５７ＢＬ／６マウスの場合を示し（Ｂ６）、右側はＫＪＲマウスの場合（ＫＪＲ）を示す。
【図９】図９は、ＥＨＤ１とＴＲＰＶ４を発現させたＣＨＯ細胞から抗ＴＲＰＶ４を用い免疫沈降させるとＥＨＤ１も検出された結果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】図１０は、プルダウン法による、ＴＲＰＶ４とＥＨＤ４を発現させたＣＨＯ細胞から抗ＴＲＰＶ４を用い免疫沈降させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】図１１は、プルダウン法による、ＥＨＤ４と、ヒスチジン（６）でラベルしたＲＰＶ１を発現させたＣＨＯ細胞から抗ヒスチジン（６）を用いて免疫沈降させた結果を示す図面に代わる写真である。ＴＲＰＶ１の欄のｆｕｌｌは全長を示し、数字は当該数字の部位以降のアミノ酸を欠損させたＴＲＰＶ１を用いたことを示す。
【図１２】図１２は、ＥＨＤファミリーの構造を模式的に示したものである。Ｎ末端よりｌｏｏｐドメイン、ＣＣ（Coiled coil）ドメイン、ＥＨ（Esp 15 homology）ドメインを示している。ＮＢＣは核酸結合のモチーフであることを示している。下段の番号は、本発明により見出された変異がある部位を示している。
【図１３】図１３は、プルダウン法による、ＥＨＤ４−Ｂ６又はＥＨＤ４−ＫＪＲと、ヒスチジン（６）でラベルしたＲＰＶ１を発現させたＣＨＯ細胞から抗ヒスチジン（６）を用いて免疫沈降させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図１４】図１４は、各マウスの細胞を用いて、ＥＨＤ４−ＫＪＲとＥＨＤ４−Ｂ６とを１；１に混合して、これらのプルダウン法による免疫沈降させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図１５】図１５は、ＥＨＤ４の６６位、１８４位、及び２２５位のそれぞれの変異体タンパク質を人工的に作成し、ＴＲＰＶ１との結合を検討した結果を示す図面に代わる写真である。
【図１６】図１６は、ＤＲＧ（後根神経節）細胞を用いて、ＥＨＤ４−Ｂ６又はＥＨＤ４−ＫＪＲをそれぞれ発現させてＴＲＰＶ１の存在を観察した結果を示す図面に代わる写真である。図１６の左側のＢ６はＥＨＤ４−Ｂ６を発現させた場合を示し、右側のＫＪＲはＥＨＤ４−ＫＪＲを発現させた場合を示す。
【図１７】図１７は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの６６位のＭ（メチオニン）をＬ（ロイシン）に変異させたタンパク質（６６Ｍ／Ｌ）、１８４位のＲ（アルギニン）をＧ（グリシン）へ変異させたタンパク質（１８４Ｒ／Ｇ）、及び２２５位のＤ（アスパラギン酸）をＡ（アラニン）へ変異させたタンパク質（２２５Ｄ／Ａ）をそれぞれ用いて、ＨＥＫ（ヒト腎皮質）細胞でＴＲＰＶ１と共発現させ、これをファロイジンを用いたアクチン部分の染色（赤色）と、ＴＲＰＶ１部分の染色（緑色）の２重染色を行った結果を示す図面に代わるカラー写真である。図１７の左側は６６Ｍ／Ｌを用いた場合を示し、中側は１８４Ｒ／Ｇを用いた場合を示し、右側は２２５Ｄ／Ａを用いた場合を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号１  ：  ＥＨＤ４−ＫＪＲのアミノ酸配列
配列番号２  ：  ＥＨＤ４−ＫＪＲをコードする塩基配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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