(57)【要約】【課題】抗体よりも簡便に調製可能で、且つ抗体と比べて同等以上の結合性を有する、ミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子を提供する。【解決手段】本発明の一態様は、ミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子であることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子。
【請求項２】
配列番号９に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子。
【請求項３】
配列番号１０に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子。
【請求項４】
配列番号１１に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子。
【請求項５】
配列番号１２に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡ等のオリゴヌクレオチドは、主としてタンパク質の合成に関与する分子種としての機能を主として有するものと考えられてきたが、リボザイムやＲＮＡｉといった、遺伝子などの高分子との相互作用により機能発現を行う分子種が多数発見され、治療分野等への応用に注目が集まっている。なかでも、アプタマーは、近年、タンパク質、酵素などの高分子に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏを問わず、特異的に結合する機能を有する核酸として、注目されており、医薬品等への応用を目的として、新規のアプタマーが多く取得されている。
【０００３】
一方、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＭＰＯ）は、オキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）の一種であり、多核白血球（ＰＭＮｓ）のアズール親和性顆粒に存在する酵素であり、ＰＭＮｓの存在を示す細胞マーカーとして用いられたり、骨髄細胞系の分化の指標として用いられている。また、ＰＭＮｓを活性化により、ミエロペルオキシダーゼが細胞外に放出されることを利用して、敗血症や成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などの疾患や、炎症をモニタリングするのにも用いられている。
【０００４】
上記のようにミエロペルオキシダーゼを検出の対象とする場合、主に、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）などの、ミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する抗体を用いて行われる方法が一般的である（非特許文献１）。しかしながら、抗体は、抗原と特異的な活性を有する点で、有用であるものの、抗体の調製には、種々の問題が指摘されている。例えば、抗体は、マウス、ラット、ウサギ等の被免疫動物に抗原を反復的に注入して免疫反応を惹起した後、血清等から、所望する、抗原との結合性を有する画分を調製する必要があり、作業の面でも、コストの面でも、非常に不利である。また、抗体は、この抗体が特異的に結合する抗原以外にも、種々のタンパク質や、ＰＰ、ＰＥといった容器等にも非特異的に結合する性質を有しており、ハンドリングの面でも不利である。さらに、抗体の調製には、上述の通り、被免疫動物を用いる必要があり、動物愛護の面からも、好ましいものではない。
【０００５】
また、抗体は、上述の診断薬などに二次抗体として用いる場合、抗原−抗体複合体への結合の程度を分光光度的に検出するため、ペルオキシダーゼ等の標識化合物とのコンジュゲート体として用いられる必要があるが、このようなコンジュゲート体の調製は、二次抗体の調製に加えて、さらに煩雑となる。
【０００６】
従って、抗体に代わって、抗原と特異的に結合し得る分子種が所望されていた。
【非特許文献１】Ｐｉ−Ｙｕｅｈ  Ｃｈａｎｇら著、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．、２００６年、３７３巻、ｐ．１５８−１６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであり、抗体よりも簡便に調製可能で、且つ抗体と比べて同等以上の結合性を有する、ミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、ミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、ミエロペルオキシダーゼに特異的に結合し得る物質として、有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
＜本発明による核酸分子＞
本発明において、核酸分子とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）など種々の核酸を有するヌクレオチドであれば、特に制約はなく、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど、鎖の本数や、核酸が修飾されているか否か等に制約はない。また、核酸分子は、ミエロペルオキシダーゼへの結合の程度に影響を与えない範囲で、フッ素、塩素、臭素及び要素などのハロゲンや、メチル、エチル、プロピルなどのアルキル基など、適当に置換された核酸分子の置換体も包含する。
【００１１】
本発明において、「ミエロペルオキシダーゼ」とは、白血球や骨髄などの血球系細胞のうち、好エオシン性細胞に含まれる、結晶状態で緑色を呈するペルオキシダーゼを総称する。
【００１２】
本発明による核酸分子において、ミエロペルオキシダーゼに対する結合定数（Ｋｄ）は、１．３７×１０−１１（Ｍ）以下であることが好ましい。
【００１３】
＜本発明による核酸分子の製造方法＞
本発明による核酸分子は、いわゆるＲＮＡプールなどの核酸分子と、標的物質としてミエロペルオキシダーゼとを用いて、核酸分子と標的物質とが特異的に結合して形成される核酸分子／標的物質複合体から、この複合体の形成に関与した核酸分子のみを選択する方法で製造することが可能である。このような方法としては、例えば、ＳＥＬＥＸ法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と称される方法や、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどの担体を用いて核酸分子／標的物質複合体を得た後にこの複合体の形成に関与した核酸分子のみを回収する方法などが挙げられる。
【００１４】
（ＳＥＬＥＸ法に準じた本発明による核酸分子の製造方法）
本発明による核酸分子は、ＳＥＬＥＸ法に従って、またこの方法に準じた方法で、ＲＮＡプールと、標的物質とを反応させて得られるＲＮＡプール−標的物質複合体を回収した後、この複合体から、この複合体の形成に関与したＲＮＡプールのみを回収して、製造することが可能である。
【００１５】
ＲＮＡプールとは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵからなる群から選択された塩基、及びこの塩基の置換体を２０〜１２０個程度連結した領域（この領域を、以下、「ランダム領域」と称する。）を有する遺伝子配列を総称する遺伝子の混合物をいう。従って、ＲＮＡプールは、４２０〜４１２０（１０１２〜１０７２）種類の複数の遺伝子が含まれ、４３０〜４６０（１０１８〜１０３６）種類の遺伝子が含まれることが好ましい。塩基の置換体としては、フッ素、塩素、臭素及び要素などのハロゲンや、メチル、エチル、プロピルなどのアルキル基など、適当に置換された塩基が挙げられる。
【００１６】
ＲＮＡプールは、ランダム領域を有する限り、その他の構造に制約はないが、本発明による核酸分子をＳＥＬＥＸ法に準じて製造する場合、ランダム領域の５’末端及び／又は３’末端には、後述のＰＣＲ等で利用するプライマー領域や、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域を有することが好ましい。例えば、ＲＮＡプールは、５’末端側からＴ７プロモーターなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域（以下、この領域を「ＲＮＡポリメラーゼ認識領域」と称する。）と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を「５’末端側プライマー領域」と称する。）とを連結し、この５’末端側プライマー領域の３’末端にランダム領域を連結し、さらにこのランダム領域の３’末端側にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を、「３’末端側プライマー領域」と称する。）を連結した構造を有してもよい。また、ＲＮＡプールは、これらの領域の他に、標的物質への結合を補助する公知の領域を有してもよい。さらに、ＲＮＡプールは、ランダム領域の一部が各ＲＮＡプールにおいて同じ配列を有するものであってもよい。
【００１７】
ＲＮＡプールは、ＲＮＡプールのランダム領域のＵをＴに置き換えた初期プールを鋳型として、ＰＣＲ法に基づいて、遺伝子増幅した後、得た遺伝子産物と、Ｔ７ポリメラーゼ等のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとを反応させて、調製されてもよい。また、初期プールに相補的な遺伝子を合成し、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と、５’末端側プライマー領域に相補的な配列とからなるプライマーを、初期プールにおいてこのプライマーと相補的な遺伝子にアニーリングさせて、ＰＣＲ法に基づいて、調製されてもよい。
【００１８】
次に、このようにして合成したＲＮＡプールと、標的物質であるミエロペルオキシダーゼとを水素結合などの分子間力を介して結合させる。この結合方法としては、ＲＮＡプールと標的物質とを、標的物質の結合などの機能が保たれる緩衝液中で一定時間インキュベートする方法が挙げられる。このようにして、緩衝液中でＲＮＡプール−標的物質複合体が形成される。
【００１９】
次に、このように形成されたＲＮＡプール−標的物質複合体を回収する。緩衝液中には、この複合体の他、複合体の形成に関与しなかったＲＮＡプールや標的物質が含まれるが、この複合体の回収方法としては、標的物質に結合性を有する核酸分子を回収することを目的として、緩衝液中に存在する複合体の形成に関与しなかったＲＮＡプールを除去する方法により行えばよい。この方法としては、標的物質及びＲＮＡプールの吸着性の違いや、複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用する方法が挙げられる。
【００２０】
標的物質とＲＮＡプールとの吸着性の違いを利用した方法としては、例えば、ニトロセルロース等の標的物質に吸着性を有する膜を用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を有する緩衝液を濾過し、この膜上にＲＮＡプール−標的物質複合体を吸着させ、その後、この膜上に残存したＲＮＡプール−標的物質複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを、例えばこの複合体におけるＲＮＡプールと標的物質との結合を解除した後にＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。
【００２１】
また、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用した方法としては、アガロースゲルなど、ＲＮＡプールを通過させ得るがＲＮＡプール−標的物質複合体を通過させ得ない程度のポアを有する担体を利用して、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとを電気的に分離し、この複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。
【００２２】
次に、このようにして得たＲＮＡプール−標的物質複合体から回収した複合体の形成に関与したＲＮＡプールを用いて、遺伝子増幅を行う。この遺伝子増幅の方法としては、ＲＮＡプールに含まれる５’末端側プライマー領域、３’末端側プライマー領域、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用する方法が挙げられる。例えば、複合体の形成に関与したＲＮＡプールの３’末端側プライマー領域に相補的な遺伝子断片をプライマーとして用いて、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）などのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応に従ってｃＤＮＡを調製した後、このｃＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー領域及び３’末端側プライマー領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応を行い、得た遺伝子産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行って、ＲＮＡプールの遺伝子増幅を行ってもよい。
【００２３】
このように遺伝子増幅された複合体の形成に関与したＲＮＡプールと、標的物質とを用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を形成する方法以下の各方法を繰り返し行い、最終的に、標的物質としてのミエロペルオキシダーゼに特異的に結合する核酸分子を得ることができる。
【００２４】
（その他の方法に準じた本発明による核酸分子の製造方法）
従来公知の種々の方法で合成することが可能である。本発明による核酸分子は、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて、ｄＮＴＰを材料として、末端塩基から化学合成されたものであってもよい。
【実施例】
【００２５】
（実施例１）
標的物質として、５０ｐＭのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ；配列番号１）を用いて、下記の［ゲル法］を１世代行った。
【００２６】
この１世代目の放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を用いて、下記の［ＰＡＧＥ法］を３世代分（先の世代と合わせて、２、３及び４世代）行った。２世代、３世代及び４世代で得たポリアクリルアミドゲルのラジオアイソトープ図をそれぞれ、図１、図２及び図３に示す。
【００２７】
図１中、レーンＰは、ＲＮＡプールのみを、レーン１及び２は、マウスＩｇＧとそれに対応するＲＮＡアプタマーとを、レーン３は、ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ−ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣｐＹＧＦＰ；配列番号２）のみを、レーン４は、ＭＰＯのみを、レーン５は、ＭＰＯ、ＣｐＹＧＦＰ及びＭＢＰを混合したものを、それぞれ用いて得た放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物に対応する。また、図２中、レーンＰは、ＲＮＡプールのみを、レーン１は、マウスＩｇＧとそれに対応するＲＮＡアプタマーとを、レーン２は、ＣｐＹＧＦＰのみを、レーン３は、ＭＰＯのみを、レーン４は、ＭＰＯ、ＣｐＹＧＦＰ及びＭＢＰを混合したものを、それぞれ用いて得た放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物に対応する。図３中、レーンＩは、上記マウスＩｇＧに対するＲＮＡアプタマーを、レーンＩＩは、マウスＩｇＧとそれに対応するＲＮＡアプタマーとを、レーンＩＩＩは、ＣｐＹＧＦＰのみを、レーンＩＶは、ＣｐＹＧＦＰから得た放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物とＭＰＯとを、レーンＶは、ＭＰＯから放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物とＭＰＯとを、それぞれ用いて得た図を示す。また、図１乃至図３において、点線で囲んだ領域は、採取したゲルを示す。
【００２８】
［ＲＮＡプールの調製］
配列番号３に示すＤＮＡを、ＤＮＡ合成装置（３３４ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製））で合成した。このプール（約１０μＭ）と、５’端Ｔ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列を有するプライマーの塩基配列（配列番号４）とを、ＤＮＡポリメラーゼ存在下で反応させ、Ｔ７プロモーターが附加するようにした。その後、得られた二本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行い、ＲＮＡプール（配列番号５）を得た。
【００２９】
［ゲル法］
５００ｐＭのＲＮＡプールを、結合バッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２０％のグリセロール）に加え、さらに、標的物質を添加し、室温で３０分間放置した。
【００３０】
この混合物を、予めウェルの周辺に切り込みを入れた１％アガロースゲルのウェルに導入し、ＴＢＥ緩衝液中、１００Ｖで７分間、電気泳動を行った。
【００３１】
電気泳動後のウェル中の溶液を回収するとともに、切り込みを入れたアガロースゲル片から、ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（商品名：Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ（ミリポア社製））を用いて、オリゴヌクレオチド溶液を回収した。ウェル中の溶液と、アガロースゲル片から回収したオリゴヌクレオチド溶液とを合わせて、エタノール沈殿を行い、オリゴヌクレオチドを得た。
【００３２】
なお、これまでの工程、並びにこのオリゴヌクレオチドを用いて行う下記の［ＲＴ］、［ＰＣＲ］、及び［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写］又は［放射標識］までの工程を１世代とする。また、次の世代からは、ＲＮＡプールに代えて、直前の世代で得たｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物又は放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を用いて、当該次の世代の各工程を行った。
【００３３】
［ＰＡＧＥ法］
上記の［ゲル法］において、５００ｐＭのＲＮＡプールを、直前の世代で得た放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物に代え、１％アガロースゲルを、ポリアクリルアミドゲル（８％、４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．４５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に代え、ＴＢＥ緩衝液を、Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．４５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に代えて、１６０Ｖ（ＣＶ）、４℃で２時間電気泳動を行った。
【００３４】
電気泳動後のゲルの放射標識を検出するように、Ｘ線フィルムで感光させて観察しながら、ゲルシフトが観察された相当部分のバンドを切り出し緩衝液中に浸透して自由拡散によりＲＮＡ分子を緩衝液中に抽出し、アルコール沈殿法などを用いて効率的にオリゴヌクレオチドを得た。
【００３５】
［ＲＴ］
回収した全オリゴヌクレオチドと、プライマー１（配列番号６）と、Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｉＴ  ＲＴａｓｅ  Ｂｌｅｎｄ（ＡＢｇｅｎｅ社製）とを用いて、逆転写反応を４２℃、１時間行った。
【００３６】
［ＰＣＲ］
逆転写反応の反応産物の全量と、６０ｐｇのプライマー２（配列番号７）、及びプライマー３（配列番号８）とを用いて、ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社製）により、９５℃×３０秒、５５℃×３０秒及び７２℃×３０秒の順で行うサイクルを１サイクルとして、１８サイクルでＰＣＲ反応を行い、二本鎖ＤＮＡ産物を得た。
【００３７】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写］
ＰＣＲ反応で得た二本鎖ＤＮＡ産物（０．５μｇ）と、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（商品名：Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）、使用量１μＬ）とを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。
【００３８】
［放射標識］
上記の二本鎖ＤＮＡ産物を用いて、α−３２Ｐ−ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）存在下で、上記の［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写］を行い、放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。
【００３９】
（実施例２）
実施例１で得た第４世代のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物について、ＴＡクローニングを行い、クローニングした５０コロニーの塩基配列を分析したところ、配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドを得た。
【００４０】
これらのオリゴヌクレオチドに対応する放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物について、上記の［結合実験］を行った。この結合実験からそれぞれのオリゴヌクレオチドのＫｄ値、及びＢｍａｘを出したところ、表１の通りであった。
【００４１】
【表１】
2009017793.tif 000002
【００４２】
（実施例３）
放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物として、配列番号９、及びＲＮＡプールに対応するものを用い、標的タンパク質として、０、５０、及び１００ｎＭのＭＰＯ、及び１００ｎＭのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用い、下記の［結合実験］を行った。その結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2009017793.tif 000003
【００４４】
なお、表２中、それぞれの値は、ｎ＝３で行って得たものであり、＊印は、ＲＮＡプールで得た値に対して危険率５％以下の有意差を有することを示す。
【００４５】
（実施例４）
実施例２において、配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドに代えて、これらのオリゴヌクレオチドを構成する塩基の２’位の水素をフッ素としたもの（それぞれ、配列番号１１及び１２）を用いた以外は、実施例２と同様に、結合実験を行った。その結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2009017793.tif 000004
【００４７】
［結合実験］
放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物と、標的タンパク質とを、結合バッファ２（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＣａＣｌ２）中、室温で１０分間インキュベーションを行った。
【００４８】
得た混合物を、サッカーを用いて吸引したフィルター（商品名：ＭＦ−メンブレンフィルター（ミリポア社製））上に導入し、その後、混合物の２０倍量の結合バッファで、このフィルターを洗浄した。このようにして得たフィルターの放射強度を、ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製バイオ・イメージングアナライザー（ＢＡＳ−２５００（イメージングプレートとして、ＢＡＳ−ＭＳ２０４０を使用））を用いて、測定した。なお、放射強度は、ＩｍａｇｅＲｅａｄｅｒ（同前）で可視化し、得たデータをＩｍａｇｅＧａｕｇｅ  ｖｅｒ．  ４．０（同前）を用いて数値化した。
【００４９】
これらのことは、本発明による核酸分子は、ミエロペルオキシダーゼに特異的に結合し得ることを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実施例１で得た第２世代のラジオアイソトープ図である。
【図２】実施例１で得た第３世代のラジオアイソトープ図である。
【図３】実施例１で得た第４世代のラジオアイソトープ図である。
【図１】
2009017793.tif 000005
【図２】
2009017793.tif 000006
【図３】
2009017793.tif 000007
【配列表】
2009017793000001.app