(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ４光合成回路に深く関与する葉緑体ピルビン酸輸送体タンパク質（ＴＰ１）およびそれをコードする遺伝子を提供する。【解決手段】ＴＰ１として、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、およびこれらのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。また、上記ＴＰ１をコードする領域を含む遺伝子として、特定の塩基配列からなるＤＮＡ、およびこれらの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（I）〜（V）のいずれかに該当する葉緑体ピルビン酸輸送タンパク質。
（I）   配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（II）  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（III） 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（IV）  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（V）  上記（I）〜（IV）のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する範囲で、アミノ酸の欠失、置換もしくは付加のいずれか１種以上により修飾されたアミノ酸配列からなり、葉緑体ピルビン酸輸送能を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
下記（i）〜（v）のいずれかに該当する、請求項１に記載のタンパク質をコードする領域を含む遺伝子。
（i）   配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ii）  配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（iii） 配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（iv）  配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（v）  上記（i）〜（iv）のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、葉緑体ピルビン酸輸送能を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質および候補物質の存在下に、葉緑体のピルビン酸輸送活性を測定する工程を含む、請求項１に記載のタンパク質の活性阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記活性阻害物質が除草剤の有効成分として使用しうるものである、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として得られた抗ペプチド抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉緑体へのピルビン酸の輸送に関わるタンパク質およびそれをコードする遺伝子、ならびにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
トウモロコシ、コウリャン、サトウキビ、キビ、ヒエなどの主要穀物や雑穀の一部は、「Ｃ４光合成回路」とよばれる代謝回路を有しており、これらの作物以外にも、田畑の主要強雑草にはＣ４光合成回路を有するものが多い（世界の１０大雑草のうち８種が有している）。そして、植物の基本的な代謝産物であるピルビン酸はＣ４光合成回路に深く関与しており、葉緑体における脂肪酸合成、イソプレノイド（IPP）合成、分岐鎖アミノ酸合
成などの初発物質としても重要である。
【０００３】
Ｃ４光合成回路は、葉肉細胞と維管束鞘細胞との分業で成立しており、この二つの細胞の間での代謝によって、二酸化炭素を高濃度に濃縮できる機構を達成し、Ｃ３植物の約２倍の光合成活性を示す（図１参照）。葉肉細胞において、取り込まれた二酸化炭素はホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）と反応してオキサロ酢酸となりさらにリンゴ酸あるいはアスパラギン酸に変換され、維管束鞘細胞へと運搬される。Ｃ4植物は、維管束鞘細胞に
おける主たる脱炭酸酵素がＮＡＤＰ＋−マリックエンザイム（ＮＡＤＰ＋−ＭＥ）か、ＮＡＤ＋−マリックエンザイム（ＮＡＤ＋−ＭＥ）あるいはＰＥＰカルボキシナーゼ（ＰＣＫ）であるかにより３群に分類されるが、これらすべてのＣ４回路について、維管束鞘細胞での脱炭酸反応後に生じるピルビン酸は、ふたたび葉肉細胞の葉緑体内に移動し、炭素回路として完結することが知られている。しかし、このようなピルビン酸の輸送機構に関与する「ピルビン酸輸送体」は、その存在こそ示唆されていたものの、分子的実体は不明であった。
【０００４】
なお、植物の葉肉細胞における葉緑体へのピルビン酸の取り込みは、ナトリウムイオンまたは水素イオンの存在により促進されることが知られており、この違いにより、関与しているピルビン酸輸送体も異なるものと考えられる。たとえば、トウモロコシ（Zea mays
L.）やソルガム（Sorghum bicolor (L.) Moench）など、ＮＡＤＰ＋−ＭＥ型Ｃ４植物の一部は水素イオン依存型であるが、ＮＡＤＰ＋−ＭＥ型Ｃ４植物でもタイヌビエ（Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.）はナトリウムイオン依存型であり、ＮＡＤ＋−ＭＥ型Ｃ４植物のキビ（Panicum miliaceum L.）など、その他の多くのＣ４植物もナトリウムイオン依存型である（非特許文献１）。また、Ｃ３植物のピルビン酸輸送能はＣ４植物と比較すると極めて低く、エンドウの葉においてはきわめて低い値が測定され、アブラナ(Brassica napa)の発達中の種子においても輸送活性の測定はなされているものの、詳細な生化
学的解析はなされていない。
【非特許文献１】Naohiro Aoki, Jun-ichi Ohnishi and Ryuzo Kanai (1992): Two Different Mechanisms for Transport of Pyruvate into Mesophyll Chloroplasts of C4 Plants - a Comparative Study. Plant Cell Physiol. 33(6), 805-809.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｃ４光合成回路に深く関与する葉緑体ピルビン酸輸送体タンパク質およびそれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、フラベリア属の植物のＣ３種（Flaveria pringlei等）およびＣ４種（F. 
trinervia等）を対象として、遺伝子発現量に差のある遺伝子を抽出する一手法である「
ディファレンシャル＋／−法」を用いて、トランスクリプトーム解析を行った。その結果、Ｃ４種で多く発現していた複数の遺伝子の中から、葉緑体ピルビン酸輸送体タンパク質をコードしていると想定される遺伝子を見出し、ピルビン酸輸送活性に関する検証を通じてそのタンパク質の機能を推定できたことにより、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
ＢＬＡＳＴサーチによる相同性検索の結果、上記FtTP１遺伝子に類似する配列の遺伝子は、Ｃ３植物のシロイヌナズナ、トマト（Lycopersicon esculentum）およびイネ（Oryza
sativa）にも存在していた。これらの遺伝子（シロイヌナズナ：At2g26900）がコードするタンパク質の具体的な機能はこれまで不明であったが、本発明の実験により葉緑体ピルビン酸輸送機能を有するタンパク質であることが明らかとなった。さらに驚くべきことに、シロイヌナズナでは、これらの遺伝子は生育の初期段階においてのみ発現することも明らかとなった。また、Ｃ４植物であっても、トウモロコシ等の水素イオン依存型ピルビン酸輸送能を有する植物には、上記遺伝子は存在しないことも明らかになった。
【０００８】
本発明は、下記（I）〜（V）のいずれかに該当する葉緑体ピルビン酸輸送タンパク質を提供する。
（I）   配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（III） 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（IV）  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（V）  上記（I）〜（IV）のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する範囲で、アミノ酸の欠失、置換もしくは付加のいずれか１種以上により修飾されたアミノ酸配列からなり、葉緑体ピルビン酸輸送能を有するタンパク質。
【０００９】
あわせて、本発明は、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（上記葉緑体ピルビン酸輸送タンパク質の一部）を抗原として得られた抗ペプチド抗体を提供する。
また、本発明は、たとえば下記（i）〜（v）のいずれかに該当するような、上記葉緑体ピルビン酸輸送タンパク質をコードする領域を含む遺伝子を提供する。
【００１０】
（i）   配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ii）  配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（iii） 配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（iv）  配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（v）  上記（i）〜（iv）のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、葉緑体ピルビン酸輸送能を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ。
【００１１】
さらに、本発明は、上記葉緑体ピルビン酸輸送タンパク質および候補物質の存在下に、葉緑体のピルビン酸輸送活性を測定する工程を含む、当該タンパク質の活性阻害物質のスクリーニング方法を提供する。このような方法は、特に、除草剤の有効成分として使用しうる活性阻害物質をスクリーニングするために好適である。
【００１２】
なお、本明細書において、葉緑体ピルビン酸輸送タンパク質を「ＴＰ１」と総称し、特にF. trinerviaのＴＰ１を「ＦｔＴＰ１」、シロイヌナズナのＴＰ１を「ＡｔＴＰ１」、イネのＴＰ１を「ＯｓＴＰ１」、トマトのＴＰ１を「ＬｅＴＰ１」、また、これらのタンパク質をコードする遺伝子を「ＴＰ１遺伝子」等と記載する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により提供される、ＴＰ１タンパク質およびそれに関する遺伝子、ＤＮＡ、抗体
等は、葉緑体ピルビン酸輸送タンパク質に関する研究開発に極めて大きく貢献するものと考えられる。
【００１４】
特に、本発明のＴＰ１遺伝子は、発芽直後のＣ３植物および所定のＣ４植物のみで発現し、成長したＣ３植物では発現せず、またトウモロコシ等のＣ４植物は当該遺伝子を有さないという特徴を有する。したがって、ＴＰ１活性阻害剤をスクリーニングすることにより、栽培作物の成長に悪影響を及ぼすことなく強雑草のみを枯死させ、また葉緑体をもたないヒトや動物等への危害のおそれのない、極めて有用性の高い除草剤の開発に途が開かれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
葉緑体ピルビン酸輸送体タンパク質およびその遺伝子
配列番号５、６、７および８で表されるＤＮＡは、それぞれ、フラベリア属のＣ４種（F. trinervia）、シロイヌナズナ（A. tahliana）、イネ（O. sativa）、トマト（L. esculentum）に由来するものであり、それぞれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＦｔＴＰ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＡｔＴＰ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＯｓＴＰ１、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＬｅＴＰ１をコードする領域を含む遺伝子である。
【００１６】
ＴＰ１遺伝子がコードするタンパク質は、ナトリウム依存的な葉緑体ピルビン酸輸送機能を担う。このことは、後述の実施例に示すように、若芽期（子葉と第一、第二本葉）のシロイヌナズナの野生株が有するナトリウムイオン依存型の葉緑体へのピルビン酸輸送活性がＴＰ１遺伝子破壊株において消失すること、ＴＰ１遺伝子を過剰発現させたタバコの当該輸送活性が野生型よりも増大すること、ならびに、実際にＣ４植物の昼の葉でＴＰ１遺伝子が高く発現すること、ＴＰ１タンパク質が葉肉細胞の葉緑体に局在するようになることなどから、強く推定することができる。なお、本発明の葉緑体ピルビン酸輸送タンパク質は、葉緑体の内膜の膜タンパク質であると強く予測される。
【００１７】
このようなＴＰ１遺伝子は、Ｃ４植物の葉において発現量が多く、一方Ｃ３植物の完全展開した葉ではほとんど発現しないことから、後述の実施例に示すような、同属のＣ３種およびＣ４種の植物を対象としたディファレンシャルスクリーニングにより得ることができる。
【００１８】
上記ディファレンシャルスクリーニングや、それに伴うｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの作製その他の操作は、公知の手法に従って行うことができ、特に制限されるものではない。その一態様は、後述の実施例で説明するようなものである。
【００１９】
また、上記のようにして得られたＦｔＴＰ１遺伝子等をもとにしてＤＮＡプローブを合成し、これを用いて他の植物等ｃＤＮＡライブラリまたはゲノムライブラリのスクリーニングを行うことにより、それらのＴＰ１遺伝子を取得することができる。
【００２０】
本発明のＴＰ１遺伝子を含むＤＮＡは天然に由来するものに限られず、化学的合成によるＤＮＡ、あるいはＴＰ１遺伝子を利用したＰＣＲ産物なども含まれ、そのＤＮＡは、センス鎖単独の１本鎖ＤＮＡとして存在しても、センス鎖およびアンチセンス鎖からなる２本鎖ＤＮＡとして存在してもよい。また、ＴＰ１タンパク質をコードする塩基配列（ＴＰ１遺伝子）の他、転写制御のための領域（エンハンサー、プロモーター等）や非翻訳領域を含んでいてもよい。
【００２１】
図２は、ＦｔＴＰ１、ＡｔＴＰ１およびＯｓＴＰ１のアミノ酸配列を比較した図である。これら３種およびＬｅＴＰ1（図に示さず。）のタンパク質のアミノ酸配列は全体として７０％前後の相同性を有しているが、特にＦｔＴＰ１のＮ末端側から約１００番目以降に相当する部分について高度に保存されており、この部分が当該タンパク質の活性に重要である可能性がある。したがって、上記４種のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、さらに好ましくは１個または数個のみ異なるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、特に上記４種のアミノ酸配列の相同性が保持されている部分は同一であるものは、葉緑体にピルビン酸を輸送する機能を有すると考えられる。
【００２２】
また、配列番号５〜８で表される塩基配列からなるＤＮＡの他、これらのいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、ＴＰ１遺伝子をコードしうるＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され非特異的なものは形成されない条件をいい、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、かつ、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃の条件をいう。
【００２３】
スクリーニング方法
本発明により提供されるＴＰ１を用いることにより、その機能に影響を与える物質のスクリーニングが可能となる。
【００２４】
たとえば、ＴＰ１および候補物質の存在下に、葉緑体のピルビン酸取込速度を測定し、通常の葉緑体のピルビン酸取込速度と比較してその影響を評価することにより、ＴＰ１の活性阻害物質をスクリーニングすることができる。
【００２５】
また、このようなスクリーニングにより得られたＴＰ１活性阻害作用の強い物質は、除草剤の有効成分として有用である。たとえば、葉緑体内のピルビン酸を初発とする一連の代謝のうち、分岐鎖アミノ酸合成に関わるアセト乳酸合成酵素阻害剤が除草剤としてすでに使用されている。しかし、ピルビン酸輸送はこれよりも代謝的上位に位置し、また、ピルビン酸を初発とする他の代謝にも影響すると考えられるので、アセト乳酸合成酵素阻害剤以上の薬効が期待できる。
【００２６】
なお、上記スクリーニング方法に関連するステップとして、ＴＰ１のアミノ酸配列の情報に基づき、タンパク質の二次構造（ドメイン、モチーフ）、高次構造、その他の構造上の特徴をコンピュータ等を用いて解析することにより、ＴＰ１の活性阻害物質となりうる化合物の絞り込みを行うこともできる。
【００２７】
抗ペプチド抗体
本発明は、一つの側面として、ＴＰ１に特異的に結合する抗体を提供する。かかる抗体は、ＴＰ１を抗原として、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製するための公知の方法により得られる。たとえば、配列番号９で表されるアミノ酸配列（ＦｔＴＰ１のＣ末端側１〜１２番目のアミノ酸配列）からなるペプチドを抗原として得られる抗体は、ＴＰ１との特異的な結合性に優れ、各種の分析に使用することができるものである。
【実施例】
【００２８】
ＦｔＴＰ１遺伝子のクローニング
ディファレンシャルスクリーニングには、cDNAライブラリーとしてF. trinervia全葉cDNAライブラリーを用いた。プローブには、F. pringlei全葉RNA由来のプローブおよびF. trinervia全葉RNA由来のプローブの異なる二種類のプローブを用いた。プローブの作製法
は後述する。具体的なスクリーニング方法は以下の通りである。このライブラリーはλgt10ファージに組み込まれた状態にあり、大腸菌(NM514)に感染させ、9cm×12cmのプレート1枚につき約1,000クローンとなるようにプラークを成育させ、総計9,000クローンとなるよう調製したプレートを用意した。これらのプレートからファージをナイロンメンブレンに移し取り、2組の同一メンブレンを作製した。メンブレンにはAmersham Pharmacia社のHybondN+を用い、メンブレンの調製およびハイブリダイゼーションの手順はHybondN+メンブレンのプロトコールに従った。方法は以下の通りである。まず、ファージを生育させた寒天培地にHybondN+メンブレンを置き、30秒間 (2枚目は1分間) 接着させた後にメンブレンをはがし、プラーク側を上にして変性溶液 (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH)に浸したろ紙上に7分間置いた。次に、中和溶液 (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl (pH7.2), 1 mM EDTA) に浸したろ紙上に3分間置いて、2×SSPE (0.36 M NaCl, 20 mM リン酸ナトリウム(pH7.7), 2 mM EDTA)で洗浄した。その後、0.4M NaOHに浸したろ紙上に20分間置いてファージDNAをメンブレンに固定し、2×SSPEで洗浄した。ハイブリバック(コスモ・バイオ)に、そのメンブレンとハイブリダイゼーション溶液 (5×SSPE, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 20 mg/mlサケ精子DNA) を加えて60℃で1時間以上のプレハイブリダイゼーションを行った。さらに、poly (A)+RNAを鋳型として合成した標識一本鎖cDNAのプローブを加えて、65℃で2日間、ゆっくり振とうしながらハイブリダイゼーションを行った。
【００２９】
プローブとして用いた標識一本鎖cDNAは、poly (A)+RNA(後述) 1.5 μgを鋳型とし、Amersham Pharmacia 社の[α-32P] dCTPを用い、BIO-RAD社のM-MuLV Reverse Transcriptaseにより合成した。逆転写反応後、Sephadex-G50 spun columnに通し未反応の[α-32P] dCTPを取り除き、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿を行って精製し、200 μlの滅菌水に溶解した。合成したプローブの比放射活性は、F. trinervia mRNAより調製したプローブが4.2×108cpm/μg、F. pringlei mRNA より調製したプローブが2.4×108 cpm/μgであった。これらのプローブは、およそ106cpm/mlの濃度で使用した。
【００３０】
メンブレンの洗浄は、400 mlの洗浄液I (2×SSPE、0.1% SDS) で60℃、15分間の処理を一回、洗浄液II (0.2×SSPE、0.1% SDS) で60℃、15分間の処理を一回、振とうしながら
行った。洗浄終了後、Fuji Film社のイメージングプレートに16時間メンブレンを密着さ
せ、バイオイメージングアナライザーBAS2000を用いて画像化することで放射活性を解析
した。F. trinervia mRNAプローブにより強いシグナルを同定後、それらに対応するファ
ージプラークをプレートから回収した。この後、ディファレンシャルスクリーニングに用いたメンブレンを脱プローブし、C4型酵素の代表的なものである、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PpcA)、ピルビン酸ジキナーゼ(PPDK)およびNADP-マリックエンザ
イム(NADP-ME)の部分配列をPolymerase Chain Reaction (PCR)法により増幅し、得られたDNA断片を鋳型として作成した標識プローブにて、先と同様の条件でハイブリダイゼーシ
ョンを行った。PCRはTaKaRaのEx taqを用いた。イメージングプレートによって読み取っ
たC4型酵素のシグナルを、ディファレンシャルスクリーニングで得られたC4高発現シグナルと比較し、高発現シグナルとして単離できていたことを確認した。以降、C4型酵素のシグナルは解析からはずしておいた。
【００３１】
一連の手順によりＣ４種の方において特異的なシグナルを呈した１２６のクローンを単離し、さらにこれらを互いの相同性に基づいて26グループに分類した。塩基配列決定は、PE Applied Biosystem社のABI PRISMTM 310自動シークエンス解析装置を用いて行った。
これは蛍光色素でラベルしたDNA断片の移動度によって塩基配列を決定する方法である。
塩基配列決定のための試料調製反応にはABI社 PRIMTM Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kitを使用した。まず、4種類の蛍光標識したジデオキシヌクレオチドやTaq polymeraseを含む反応混液(Terminator Ready Reaction Mix 4 μl、template 0.2 
μg、primer 1.6 pmol, 滅菌蒸留水 2.4 μl) 10 μlに20 μlのミネラルオイルを重層し、PCR反応を行った。PCRにはTaKaRa社 PCR Thermal Cycler を用い、96℃ 30秒、50℃ 15秒、60℃4分間のサイクルを25回繰り返した。反応後のサンプルはEthanol Precipitation
Protocol 2に従い精製し、ABI PRISMTM 310による自動解析を行った。DNA塩基配列の解
析にはSDCソフトウエア開発株式会社製GENETYX Macを用いた。
【００３２】
続いて、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）による相同性検索を行っ
たところ、上記クローンの内の一つに、ピルビン酸輸送体と想定されうる“bile acid sodium symporter family protein”類縁タンパク質（これをＦｔＴＰ１と名付けた）をコードする遺伝子を発見した。また、この遺伝子に類似する配列の遺伝子は、シロイヌナズナおよびイネにも存在することもわかった。これら３種のＴＰ１を図２に示す。
【００３３】
上述のディファレンシャルスクリーニングが機能していることを、マーカー遺伝子PpcA（上記クローンの一つで、すでにＣ４植物について公知の遺伝子）やその他のクローンと共に確認した。
【００３４】
グループ化を経て遺伝子配列解析を済ませたクローンについて、ノーザンハイブリダイゼーションを行い、ディファレンシャルスクリーニングの精度を確認した。C4種、C3種 
とともに中間種F. ramosissimaにおける発現も調査した。プローブに用いたDNA断片は、cDNAライブラリーより単離したそれぞれのクローンの挿入cDNA全域を、主として使用した
。各RNA10 μgを1% ホルムアルデヒドゲル電気泳動にかけた。同時にRNA ladder marker (0.24-9.5 kb)(GIBCO BRL社)を泳動し、泳動後、エチジウムブロマイドで染色することでmRNAのサイズを決定するのに使用した。メンブレンはスクリーニングと同様にHybond N+
メンブレンを使用した。ゲルからメンブレンへのRNAの転写及び、ハイブリダイゼーショ
ンの手順についてはそのプロトコールに従い、20×SSPEで12時間転写後、0.05N NaOHをしみこませたワットマン3MM濾紙上に メンブレンを5分間おくことでメンブレンにRNAを固定した。アルカリ処理の後は10〜60秒間、2×SSPE内で振盪し、中和した。
【００３５】
ハイブリダイゼーション溶液(5×SSPE、5×Denhardt溶液、0.5% SDS)を1 ml/20 cm2メ
ンブレンになるように用意し、それに最終濃度20 mg/ml となるように熱変性したサケ精
子 DNAを加え、ハイブリバックにその溶液とメンブレンを浸し、60℃で1時間以上放置し
た。その間にAmersham社の[α-32P] dCTP とMegaprime DNA labelling systemを用いて、12.5 ngの鋳型DNA断片よりプローブを調製した。このプローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、ゆっくり振盪しながらハイブリダイゼーション(60℃で一晩以上)を行った。ハイブリダイゼーション後は、上記と同様の条件で洗浄を行った。処理後のメンブレンに結合している放射能をイメージアナライザーにより測定し、相対値として解析した。また一度使用したメンブレンは100℃の0.5% (w/v) SDS 溶液に浸し、室温になるまで放置することで脱プローブし再使用した。
【００３６】
ＦｔＴＰ１遺伝子の発現の様子
ＦｔＴＰ１遺伝子の植物における発現を確認するため、下記の実験を行った。
・ＲＮＡゲルブロッティング
ＦｔＴＰ１の発現を調査するために、明期および暗期の葉とともに、根あるいは茎から調製したRNAを用いた。解析の手順・条件は先に示したとおりである。
【００３７】
結果は図３に示すとおりである。上記実験により、ＦｔＴＰ１はＣ４種（F. trienervia）の昼の葉で発現量の多いことが分かった。
・In situ hybridization
より詳細な組織特異的発現を調査するために、in situ hybridizationを行った。まず
発現組織観察のための葉のサンプル調整から説明する。葉組織を解剖ばさみで5 mm×5 mm程度に切り取り、直ちに 20 ml のガラスバイアルに入れた15 ml のホルムアルデヒド固
定液に浸潤させた。固定液を 0.05 M Na-P bufferに置換して30分間緩やかに振盪し、洗
浄を行った。この洗浄を２回行った後、エタノールシリーズで、室温で緩やかに振盪しながら脱水し100% t-ブタノールに置換した。この後、60℃の温度条件化で液状化したパラ
フィン (Paraplast, OXFORD) を重層し、t-ブタノールを蒸発させパラフィン固定サンプ
ルとした。
【００３８】
パラフィン包埋ブロックに対してミクロトームを用いて10 μmの厚さで連続切片を切り出し、パラフィンリボンを製作した。
ハイブリダイゼーションに用いるスライドグラスを、連続する切片を貼り付けた 2 枚
を 1 組として光学顕微鏡下で選び出し、60℃のホットプレート上に並べてパラフィンを
溶解させ、100% キシレンに 10 分間 2 回浸し、パラフィンを溶解させた。次にキシレンをエタノールに置き換え（50% キシレン/エタノール 5 分、100% エタノール 5 分 2 回
）、1 時間減圧乾燥させた後、エタノール下降系列（100、90、70、50、30% エタノール
各 2 分）と滅菌水 5 分 2 回の処理でエタノールを水に置換した。次に、プローブの組
織浸透性を高めるために Proteinase K 処理を行った。処理液 (100 mM Tris-HCl, 50 mM
EDTA-2Na, 5 mg/ml Proteinase K, pH 7.5) をまず37℃のウォーターバス (YAMATO SCIENTIFIC) で20分自己消化させ、その中にスライドグラスを浸して 30 分間処理した。処理後、室温、滅菌水で 5 分ずつ 3 回洗浄し、続いて再固定液 (4% PFA, 10 mM Na-P buffer) で 10 分間再固定を行い、滅菌水で 5 分ずつ 3 回洗浄した。さらにプローブの非特異的吸着を減少させるため、アセチル化液 (0.1 M triethanolamine, 0.25% acetic anhydride) で10分間、組織片のアセチル化処理を行い、2×SSPE (20 mM NaH2PO4, 0.3 M NaCl, 2 mM EDTA-2Na, pH7.4) で5分間ずつ2回洗浄後、エタノール上昇系列 (30、50、70、90% エタノール各2分)、100% エタノール5分間 2回の処理で脱水し、1時間減圧乾燥させた。
【００３９】
スライドグラス1枚あたり200 μl のハイブリダイゼーション溶液 (50% formamide, 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA-2Na, 1×Denhardt solution、60 mM DTT、1 mg/ml yeast tRNA、500 μg/ml poly (A)、10% dextran sulfate, pH 7.5) を調製し、ここに80℃で5分間加熱した後、氷上で急冷して変性させたプローブ6 μlを加えた。50% formamide、2×SSC (0.3 M NaCl, 30 mM Citrate-3Na）を湿潤液とした湿潤箱にスライドグラスを並べ、スライドグラス 1 枚あたり約180 μlのハイブリダイゼーション溶液を切片上にのせた。2枚1組のスライドグラスに対し、片方にはセンス、もう片方にはアンチセンスのプローブをのせた。その後、液がスライドグラス全体にいきわたるようにカバーグラスをかけた。湿潤箱を密閉して、50℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
【００４０】
その後、スライドグラスを染色用ラックにセットし、染色壺に入れた溶液で洗浄した。まず、50℃のウォーターバスで15 分間、4×SSCで洗浄し、ずれてきたカバーガラスを、
サンプルがはがれないように丁寧に取り除いた。その後、50℃で5 分間ずつ 3 回、4×SSCによる洗浄を繰り返した。次に、一本鎖の RNA を分解するために RNase 処理を行った。RNase Buffer (16.2 mM Tris-HCl、5 mM EDTA-2Na、500 mM NaCl, pH7.5）にRNase A を20 μg/mlの濃度となるよう添加し、37℃のウォーターバスで30 分間インキュベートした。その後、RNase bufferで37℃、15 分間ずつ 3 回洗浄し、さらに0.5×SSCを用いて50℃、20分間ずつ2回、Buffer1 (100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl, pH 7.5) を用いて、スターラーで穏やかに撹拌しながら室温で5分間ずつ2回洗浄した。
【００４１】
Buffer1 から取り出したスライドグラスを、蒸留水を湿潤液とした湿室に並べ、ブロッキング液 (50% Normal rabbit serum, 50 mM Tris-HCl, 75 mM NaCl, 0.5% Tween 20, pH
7.5）を1枚あたり約200 μlのせ、室温で30分間インキュベートしブロッキングを行った。スライドグラスを傾けてブロッキング液を軽く拭き取り、一枚あたり500 μlのAnti-DIG Alkaline Phosphatase (AP) 溶液 (0.1% BSA, 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.375 U Anti-DIG-AP (Roche Diagnostics), pH 7.5) をのせ、室温で2時間抗体反応を行った。反応終了後、洗ビンを利用してスライドグラスを 1 枚ずつBuffer1で洗浄し、続いて染色壺内にBuffer1 を入れスターラーで撹拌しながら 10 分間ずつ 3 回、さらに Buffer3 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9.5) で5分間洗浄した。
【００４２】
洗浄終了後、滅菌水で湿らせた新しい湿室にスライドグラスを並べ、発色反応液（Buffer3 10 mlに対し、NBT/BCIP stock solution (DIG nucleic acid detection kit, Boehringer Mannheim) を200 μl加えたもの）をスライドグラス1枚あたり約500 μlのせてふたをし、遮光して発色させた。発色の状態は顕微鏡で観察した。発色が観察されたらセンスプローブとアンチセンスプローブによって標識した1 組のスライドグラスを同時に、TEで、その後滅菌水でそれぞれ 5 分間洗浄して発色反応を止めた。その後、エタノール上昇系列で脱水し、エタノールからキシレンに置き換えて（100% エタノール 5 分ずつ 2 回、キシレン 5 分ずつ 2 回）、カバーグラスをマウントした。封入剤はENTELLAN neu (MERCK) を用い、通気性の良い場所で一晩乾燥させ、光学顕微鏡下で観察を行った。
【００４３】
結果は図４に示すとおりである。上記実験により、ＦｔＴＰ１はＣ４種（F. trienervia）の葉肉細胞で発現していることが分かった。
・ＧＦＰによる蛍光標識
FtNBAT-:GFPコンストラクトの作成：  遺伝子導入用のプラスミドは、pUC18マルチクローニングサイトにカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(CaMV35S)、synthetic green fluorescent protein(sGFP：S65T)遺伝子、noparine syntase (nos) 3ターミネーターを挿入したものを使用した。導入遺伝子はFtTP1 coding regionを用い、PCRによりFtTP1内のNco Iサイトに部位変異を導入し、両端にNco Iサイトを付加した。ただし今回はFtTP1のストップコドンを変換し翻訳がそこで終結しないように、さらにsGFPとの読み枠がずれないようにプライマーを設計した。
【００４４】
A    ：CTTCccatggCGTCTATTTCAAGTATTG  (ccatgg: Nco Iサイト)
C-f  ：GTTTAAGGAATCCgTGGACTGTAGGTGTAG  (mutation: A → g)
C-r  ：CTACACCTACAGTCCAcGGATTCCTTAAAC  (mutation: T → c)
F    ：GCccatggACTCCTTGAAATCATCTTTGTC  (ccatgg: Nco Iサイト)
遺伝子の植物葉への導入はBio-Rad Biolistic (登録商標) PDS-1000/He Particle Delivery System (Bio-Rad)を用い、そのプロトコールに従い行った。タングステン粒子を70% EtOHで洗浄し、滅菌水で3回以上すすいだ。最後に滅菌済み50%グリセロールで60 mg/mlになるよう懸濁した。処理したタングステン粒子1.5 mgに5 μg plasmid, 0.625 mM CaCl2, 10 mM spermidine (3shot分)をボルテクスにより激しく撹拌しながら加え、そのまま3分間攪拌した。軽く遠心し上清を除き、70%、100%エタノールにより順次すすぎ、100%エタノール30 μlに懸濁した。一回分10 μlをマクロキャリアーに滴下し、風乾させてから植物体に打ち込んだ。ラプチャーディスクは1350 PSIを用い、チャンバー内真空度28 inch Hg、ストッピングプレートとサンプルまでの距離は4 cmでタングステン粒子を発射した。遺伝子を導入する組織は、温室で約4週間生育させたタバコ葉を用いた。葉を3 cm四方に切り、MSプレート(1×Murashige-Skoog、1% (w/v) agar)に密着させて導入および、発現誘導を行った。遺伝子導入後、25℃、暗所で一晩培養し観察した。GFP蛍光は培養後に、蛍光顕微鏡(Nikon社 ECLIPSE E600)を用い、励起波長490 nm、観察蛍光波長520 nmまたは520-560 nmで観察した。
【００４５】
結果は図５に示すとおりである。上記実験により、タバコの葉でもＦｔＴＰ１は葉緑体に運ばれることが分かり、このタンパク質が葉緑体への物質輸送に関与することが示された。
【００４６】
抗ペプチド抗体を利用したＦｔＴＰ１の検出
Ｃ４植物種におけるＴＰ１の一般性を調べる目的で、ＴＰ１の一部を抗原とする抗ペプチド抗体を作製し、前述のF. trienerviaの他、フウチョウソウ（Cleome gynandra）、トウモロコシ（Zea mays）、キビ（Panicum miliaceum）等のＣ４植物、ならびに対照とし
て前述のF. pringleiの他、セイヨウフウチョウソウ（Cleome spinosa）、イネ（Oryza s
ativa）等のＣ３植物を対象に、この抗体の交差するタンパク質の有無を検証した。
【００４７】
抗原領域は、図２において蛍光標識した、種間の保存性が高いＣ末端側の荷電領域に定めた。抗ペプチド抗体は、ペプチド研究所に依頼し、ウサギに免疫する汎用性のある手法によって作成した。
【００４８】
結果は図６に示すとおりである。上記実験において、Ｃ４のうちナトリウムイオン依存的ピルビン酸輸送能を有するフウチョウソウおよびキビと高い交差性を示す一方、水素イオン依存的ピルビン酸輸送能を有するトウモロコシに交差性は現れなかった。このことから、ＴＰ１がナトリウムイオン依存的ピルビン酸輸送能を示す実体であることを推察させる。なお、上記交差性は、単子葉（monocot）、双子葉（dicot）にかかわらず示された。
【００４９】
続いて、同じく上記抗ペプチド抗体を用いて、この抗体に交差性を示すタンパク質の局在性を調査するための免疫組織化学的分析を行った。
手法はin situ hybridizationの項目に従い作成したパラフィン切片に対して抗原抗体
反応を施すことによった。抗体の存在は、ヤギ抗ウサギ抗体を2次抗体に用い、金コロイ
ド銀増感法によった。
【００５０】
結果は図７に示すとおりである。上記抗ペプチド抗体に交差性を示すタンパク質（すなわちＴＰ１）は葉肉細胞の葉緑体に局在することが示された。
シロイヌナズナにおけるＴＰ１遺伝子の発現
Ｃ３植物であるシロイヌナズナにおけるＴＰ１遺伝子の発現の様子を調査するため、下記の実験を行った。
【００５１】
シロイヌナズナ形質転換にはpBI101-GUS-nosTベクターを用い、β-glucuronidase (GUS) 遺伝子の上流にAtTP1 (At2g26900) の翻訳開始Metから数えて上流2kbを導入した。
まず、シロイヌナズナのゲノム情報からAtTP1上流領域の塩基配列情報を得た。そこで
、シロイヌナズナのゲノムDNAを鋳型とし、AtTP1の開始コドンの直前から上流約2 kbをPCRにより増幅した。プライマーは、5’末端側にHind IIIサイト、3’末端側にXba Iサイトを導入するように設計した。PCR反応にはテンプレート3 ng とExtaq polymeraseを用い、反応条件は変性が94℃/30秒間、アニーリングは55℃/2分間、伸長が72℃/1分間で35サイクル行った。使用したプライマーの配列を以下に記す。
【００５２】
M: 5’- CGaagcttGGCCTGTTTTGATCAAAATCA -3’  (aagctt:Hind IIIサイト)
N: 5’- CGtctagaGTTTTGATCAAAAGGGTTTTAG -3’  (tctaga:Xba Iサイト)
PCRで増幅した産物をHind III/ Xba Iで制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動にかけ分離した。完全に分離した後ゲルより切り出し、 MagExtractor (TOYOBO) を用い
て精製し、定法に従ってサブクローニング産物を得た。このサブクローニング産物をHind
III/ Xba I消化し上記の方法でアガロースゲルより回収した。これを、Hind III/ Xba I消化し同様に回収したpBI101ベクターのGUS遺伝子上流に導入した。
【００５３】
アグロバクテリウムAgrobacterium tumefaciensの系統としてGV3101::pMP90を使用し形質転換アグロバクテリアを用意し、汎用されている減圧浸潤法によりシロイヌナズナへ形質転換した。最終的には導入遺伝子が1コピーで、それがホモになった系統を得た。GUS活性の解析には、whole-mount GUS staining を行った。個体全体を直ちにGUS staining buffer (0.3% Triton X-100, 1.9 mM 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β- D-glucronide, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5mM potassium ferrocyanide, 100 mM phosphate buffer, pH 7.0) に浸潤させた。デシケーターに入れ、400 mmHgで1時間減圧した。その後、ゆっくりと減圧を解除し、37℃で24時間インキュベートした。その後、GUS staining bufferを取り除き、75％エタノールで1回サンプルを洗浄することで反応を停止させた後、新たな75％エタノール中にサンプルを浸潤し、4℃、24時間インキュベートして、クロロフィルを溶出させ、脱色した。
【００５４】
結果は図８および９に示すとおりである。シロイヌナズナの第一・第二本葉は青く発色し、ＡｔＴＰ１遺伝子が発現していることが示されている。一方、第３本葉（図９枠線内）および根は青く発色しておらず、ＡｔＴＰ１遺伝子は第３本葉以降の成長段階では発現しないことが示唆されている。
【００５５】
つづいて、上述のような限定的な発現の時期にＴＰ１タンパク質が存在しているかを、前述の抗ペプチド抗体を用いて検討した。
ここで、シロイヌナズナＡｔＴＰ１遺伝子について、Ｔ−ＤＮＡの挿入による、独立した２種類の当該遺伝子破壊株が存在することが、前述のＢＬＡＳＴ検索により分かっている（SALK_098692およびSALK_101808）。これらの変異種および野生型を対象としてＡｔＴＰ１のｍＲＮＡおよびタンパク質の検出を行った。
【００５６】
第一第二本葉を展開させ始めた個体から、タンパク質あるいはＲＮＡを抽出し、ＴＰ１抗体によってあるいは放射標識したＡｔＴＰ１遺伝子断片を用いて、それぞれを検出した。
【００５７】
結果は図１０に示すとおりである。発芽期の野生型ではＡｔＴＰ１のｍＲＮＡ、タンパク質のいずれも検出されたが、２種の破壊株では、ＡｔＴＰ１のｍＲＮＡ、タンパク質のいずれも検出されず、ＡｔＴＰ１の遺伝子が破壊されていることが確認された。
【００５８】
ピルビン酸輸送活性の測定
ＴＰ１が葉緑体へのピルビン酸輸送機能を担うタンパク質であることを、以下に示す２つの実験により証明した。
【００５９】
上記生育段階にあるシロイヌナズナや野生株あるいは遺伝子破壊株から単離葉緑体を調製し、シリコン二重層法により放射標識したピルビン酸輸送活性を調査した。二重層のうち中間層にナトリウムを50mM含むあるいは含まない溶液を用意することで、ナトリウムイオンの要求性を検討することができる。手順は、先に示した非特許文献に記載のとおりである。
【００６０】
結果は図１１に示すとおりである。野生株ではナトリウムイオン依存的なピルビン酸輸送活性が見られたが、破壊株ではそれが消滅しており、ＡｔＴＰ１が葉緑体ピルビン酸輸送タンパク質であることが示された。
【００６１】
次に、前述のＧＦＰ遺伝子を融合させたFtTP1を導入したタバコの形質転換体（ＦｔＴ
Ｐ１が過剰発現している）を用いて、これと同時期（約7日齢）のタバコと、ピルビン酸
輸送活性を比較した。葉緑体の調製、およびピルビン酸の取込速度の測定は、上記シロイヌナズナについての実験と同様にして行った。
【００６２】
結果は図１２に示すとおりである。形質転換体（Ｇ２）では、ナトリウムイオン依存的にピルビン酸輸送活性が増大することが観察され、ＦｔＴＰ１の過剰発現が反映されているものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】Ｃ３およびＣ４光合成回路の模式図。
【図２】ＦｔＴＰ１、ＡｔＴＰ１およびＯｓＴＰ１のアミノ酸配列の比較。
【図３】ＦｔＴＰ１のＲＮＡブロッティング。Ｃ４種の昼の葉での発現量が多いことがわかる。
【図４】ＦｔＴＰ１のIn Situ hybridization。葉肉細胞で発現していることがわかる。
【図５】タバコの葉におけるＴＰ１::ＧＦＰ遺伝子の発現。葉緑体の局在しており、ＴＰ１が葉緑体内への物質輸送に寄与することを示している。
【図６】抗ペプチド抗体を用いた交差性試験。ナトリウムイオン依存的ピルビン酸輸送活性を示すＣ４種と高い交差性を示している。
【図７】ImmunohistochemistryによるＴＰ１の検出。葉肉細胞の葉緑体に局在している。
【図８】ＧＵＳ遺伝子を導入したシロイヌナズナの出芽期における、ＡｔＴＰ１遺伝子の発現の様子。
【図９】ＧＵＳ遺伝子を導入したシロイヌナズナにおける、ＡｔＴＰ１遺伝子の発現の様子。第一・第二本葉は青く発色しているが、第３本葉（枠線内）および根では発色していない。
【図１０】シロイヌナズナの野生株および破壊株についての、ＡｔＴＰ１のｍＲＮＡおよびタンパク質の検出実験。野生型のみ両方とも検出された。
【図１１】シロイヌナズナの葉緑体へのピルビン酸取込速度の測定。野生型ではナトリウムイオン依存的にピルビン酸輸送活性が増大しているが、破壊株ではそれが見られない。
【図１２】タバコの葉緑体へのピルビン酸取込速度の測定。ＦｔＴＰ１過剰発現植物ではピルビン酸輸送活性が高まっている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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