(57)【要約】      （修正有）【課題】ブロモドメインを有する新規な転写調節因子およびその遺伝子、並びにこれらを利用した医薬品候補化合物などのスクリーニング方法を提供する。【解決手段】転写調節因子のブロモドメイン配列を用いて検索したESTの配列を基にプライマーを作製し、該プライマーを利用することにより、ヒト精巣cDNAライブラリーからブロモドメインを有する新規な転写調節因子をコードする複数の遺伝子を単離することに成功した。さらに、これら遺伝子が構造的に互いに類似していることを見いだした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、１３、２１、２７若しくは２９に記載のアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有し、ブロモドメインを有する転写調節因子。
【請求項２】
配列番号：２、１４、２２、２８または３０に記載の塩基配列を有するDNAとハイブリダイズするDNAがコードし、ブロモドメインを有する転写調節因子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の転写調節因子をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３に記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載の転写調節因子の製造方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載の転写調節因子に結合する抗体。
【請求項８】
請求項１または２に記載の転写調節因子と被験サンプルとを接触させ、請求項１または２に記載の転写調節因子に結合する活性を有する化合物を選択する工程を含む、請求項１または２に記載の転写調節因子に結合する活性を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により単離しうる、請求項１または２に記載の転写調節因子に結合する活性を有する化合物。
【請求項１０】
天然由来である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
配列番号：２、１４、２２、２８または３０に記載の塩基配列からなるDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブロモドメインを有する新規な転写調節因子およびその遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブロモドメインは、転写調節因子に見られる特徴的なアミノ酸のモチーフであり、他の転写調節因子などとの相互作用に関与すると考えられている。ブロモドメインを有するタンパク質は、通常、1個または2個（Tamkun JW et al.(1992). Nuc. Acids. Res., 20, 2603(非特許文献１)）、あるいは5個（Nicolas RH and Goodwin GH. (1996). Gene, 175 (12), 233-240(非特許文献２)）のブロモドメインモチーフを含んでいる。このモチーフの見られる動物は広範囲にわたっており、例えば、酵母（Winston F et al.(1987). Genetics, 115, 649-656(非特許文献３)、Laurent BC et al.(1991). Proc. Nat. Acad. Sci., USA 88,  2687-2691(非特許文献４)）、キイロショウジョウバエ（drosophila）ホメオ遺伝子（Digan ME et al.(1986). Dev. Biol., 114, 161-169(非特許文献５)、Tamkun JW et al.(1992). Cell, 68, 561-572(非特許文献６)）や哺乳動物（Denis GV, and Green MR.(1996). Genes and Devel., 10, 261-271(非特許文献７)、Yang X  J et al.(1996). Nature, 382, 319-324(非特許文献８)）の転写調節遺伝子などで同定されている。
【０００３】
ブロモドメインを有する転写調節因子を比較すると、これらのすべては活発に増殖している細胞でシグナル依存性の転写を調節している（Tamkun JW et al.(1992). Cell, 68, 561-572(非特許文献６)、Haynes SR et al. (1992).  Nuc. Acids. Res., 20, 2603(非特許文献９)）。この特徴は、ブロモドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の正常な制御が行われない場合に発癌する可能性があることを示唆している。現に、実験によって、ブロモドメインを有するヒトの転写調節因子、「RING3」、「p300／CBP」、及び「PCAF」が癌に影響していることが示されている。
【０００４】
このうち「RING3」は、Drosophila発生調節タンパク質fshと高い相同性を有する転写調節因子であり（Haynes SR et al.(1989). Dev. Biol., 134, 246-257(非特許文献１０)）、自己ホスホリル化活性を備えた核のセリン／スレオニンキナーゼである。「RING3」の活性は、慢性ないし急性のリンパ性白血病における増殖状態に関連している。即ち、Denis及びGreenは、10人の白血病患者から末梢血液のリンパ球を採取したところ、10人すべての患者に「RING3」が関与するキナーゼを認めたが、10人の正常のコントロールではそれは認められなかった（Denis GV, and Green MR. (1996). Genes and Devel., 10, 261-271(非特許文献７)）。また、この活性は化学療法を行って緩解した患者から得た血液細胞では検出されなかった。
【０００５】
一方、「p300」及び「CBP(CREB binding protein)」は非常に似たタンパク質をコードしており、これらはしばしばまとめて「p300／CBP」と呼ばれている。「p300／CBP」は、転写調節因子「CREB(cAMP responsive element binding protein)」に対するコアクチベーターであって（Kwok RPS et al.(1994). Nature, 370, 223-226(非特許文献１１)）、増殖調節のカギとなるタンパク質であると考えられている。「p300／CBP」の突然変異は、家族性の癌あるいは散発性の癌で見つかっている。 即ち「CBP」の突然変異は、時に患者に種々の悪性腫瘍を発生させる「Rubinstein-Taybi症候群」を引き起こす（Petrij F et al.(1995). Nature,376, 348-51(非特許文献１２)）。一方、「p300」の突然変異は、散発性の結腸直腸癌や胃癌で見い出されている（Muraoka M et al.(1996) Oncogene, 12, 1565-1569(非特許文献１３)）。さらに「CBP」は、ある種の急性骨髄性白血病において見出されている「t（8；16）（p11；p13）トランスロケーション」で「MOZ」（Monocytic leukemia Zinc finger protein） と融合されている。この融合タンパク質には、両方の遺伝子のヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインが存在する（Bannister AJ and Kouzarides T. (1996). Nature, 384, 641-643(非特許文献１４)、Orgyzco VV et al.(1996). Cell, 87, 953-959(非特許文献１５)、Brownwell JE and Allis CD. (1996). Curr. Opin. Genet. Devel., 6, 176-184(非特許文献１６)）。アセチル化されたヒストンは転写活性クロマチンの特性を有している ことが知られているいるため、この融合遺伝子は、異常なアセチルトランスフェラーゼの活性化を経る白血病誘発に関与している可能性がある（Brownwell JE and Allis CD. (1996). Curr. Opin. Genet. Devel., 6, 176-184(非特許文献１６)）。
【０００６】
また「p300／CBP」は、既知の癌遺伝子産物と相互作用するため、癌に関連していると考えられている。例えば、「p300／CBP」は、「c−Myb」（Dai P et al. (1996). Genes Dev., 10, 528-540(非特許文献１７)）及び「c−Fos」転写因子（Bannister AJ and Kouzarides T.(1996) Nature,384,641-643(非特許文献１４)）に対するコアクチベーターであり、アデノウイルス初期遺伝子の一つである「E1A」タンパク質（Arany Z et al.(1995) Nature 374:81-84(非特許文献１８)）に結合する。
【０００７】
また、ブロモドメインタンパク質「PCAF」は、「p300／CBP」への結合に「E1A」と競合することにより、「E1A」と「p300／CBP」との相互作用を阻害していると考えられている（Yang X  J et al.(1996). Nature, 382, 319-324(非特許文献８)）。また、「PCAF」は「p300／CBP」と共に存在すると、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する。
【０００８】
このようにプロモドメインを有する転写調節因子は、細胞増殖に関与しており、その調節異常が種々の疾患、特に癌と密接に関与していると考えられる。このためブロモドメインを有する転写調節因子は、特に癌治療のための新しい標的として近年注目されている。
【非特許文献１】Tamkun JW et al.(1992). Nuc. Acids. Res., 20, 2603
【非特許文献２】Nicolas RH and Goodwin GH. (1996). Gene, 175 (12), 233-240
【非特許文献３】Winston F et al.(1987). Genetics, 115, 649-656
【非特許文献４】Laurent BC et al.(1991). Proc. Nat. Acad. Sci., USA 88,  2687-2691
【非特許文献５】Digan ME et al.(1986). Dev. Biol., 114, 161-169
【非特許文献６】Tamkun JW et al.(1992). Cell, 68, 561-572
【非特許文献７】Denis GV, and Green MR.(1996). Genes and Devel., 10, 261-271
【非特許文献８】Yang X  J et al.(1996). Nature, 382, 319-324
【非特許文献９】Haynes SR et al. (1992).  Nuc. Acids. Res., 20, 2603
【非特許文献１０】Haynes SR et al.(1989). Dev. Biol., 134, 246-257
【非特許文献１１】Kwok RPS et al.(1994). Nature, 370, 223-226
【非特許文献１２】Petrij F et al.(1995). Nature,376, 348-51
【非特許文献１３】Muraoka M et al.(1996) Oncogene, 12, 1565-1569
【非特許文献１４】Bannister AJ and Kouzarides T. (1996). Nature, 384, 641-643
【非特許文献１５】Orgyzco VV et al.(1996). Cell, 87, 953-959
【非特許文献１６】Brownwell JE and Allis CD. (1996). Curr. Opin. Genet. Devel., 6, 176-184
【非特許文献１７】Dai P et al. (1996). Genes Dev., 10, 528-540
【非特許文献１８】Arany Z et al.(1995) Nature 374:81-84
【発明の開示】
【０００９】
本発明はブロモドメインを有する新規な転写調節因子およびその遺伝子、並びにこれらを利用した医薬品候補化合物などのスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、転写調節因子のブロモドメイン配列を用いて検索したESTの配列を基に作製したプライマーを利用することにより、ヒト精巣cDNAライブラリーからブロモドメインを有する新規な転写調節因子をコードする遺伝子を複数単離することに成功した。さらに、本発明者らは単離したこれら遺伝子の構造が互いに類似しており、１つのファミリーを形成していることを見いだした。本発明者らは、単離したこれらの遺伝子およびそのタンパク質を利用することにより、これらと相互作用する他の因子やこれらタンパク質の活性を制御する医薬品候補化合物のスクリーニングを行うことが可能であることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明は、ブロモドメインを有する新規な転写調節因子およびその遺伝子、並びにこれらを利用した医薬品候補化合物などのスクリーニング方法に関し、より具体的には、
（１）  配列番号：１、１３、２１、２７若しくは２９に記載のアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有し、ブロモドメインを有する転写調節因子、
（２）  配列番号：２、１４、２２、２８または３０に記載の塩基配列を有するDNAとハイブリダイズするDNAがコードし、ブロモドメインを有する転写調節因子、
（３）  （１）または（２）に記載の転写調節因子をコードするDNA、
（４）  （３）に記載のDNAを含むベクター、
（５）  （３）に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体、
（６）  （５）に記載の形質転換体を培養する工程を含む、（１）または（２）に記載の転写調節因子の製造方法、
（７）  （１）または（２）に記載の転写調節因子に結合する抗体、
（８）  （１）または（２）に記載の転写調節因子と被験サンプルとを接触させ
、（１）または（２）に記載の転写調節因子に結合する活性を有する化合物を選択する工程を含む、（１）または（２）に記載の転写調節因子に結合する活性を有する化合物のスクリーニング方法、
（９）  （８）に記載の方法により単離しうる、（１）または（２）に記載の転写調節因子に結合する活性を有する化合物、
（１０）  天然由来である、（９）に記載の化合物、
（１１）  配列番号：２、１４、２２、２８または３０に記載の塩基配列からなるDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNA、に関する。
【００１２】
なお、本発明において「転写調節因子」とは、遺伝子の発現を調節しているタンパク質を指す。また、「ブロモドメイン」とは、シグナル依存的な転写に関連している転写調節因子中で保存されているタンパク質-タンパク質相互作用に関与するアミノ酸のモチーフを指す。
【００１３】
本発明は、ブロモドメインを有する新規な転写調節因子（BAZファミリー）に 関する。本発明らが単離したBAZファミリーに属するcDNAの塩基配列を配列番号：2（BAZ(BAZ1α)）、配列番号：14（BAZ2α）、配列番号：22（BAZ2β）、配列番号：28および30（BAZ1β）に示す。また、これらcDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：1（BAZ(BAZ1α)）、配列番号：13（BAZ2α）、配列番号：21（BAZ2β）、配列番号：27および29（BAZ1β）に示す。
【００１４】
ブロモドメインはシグナル依存的な転写に関連している転写調節因子群で保存されている特徴的な構造領域であり（Tamkun JW et al., (1992). Cell, 68, 561-572.、Haynes SR et al., (1992). Nuc. Acids. Res., 20, 2603.）、これまでにブロモドメインを有する転写調節因子をコードする６つの哺乳動物遺伝子、RING3、p300/CBP、PCAF、BRG1、HRX/ALL-1およびTIF1の活性と癌との関連が報告されている。ブロモドメインを有する転写調節因子が共通して癌に関与していることは、本発明者らが単離したこれら遺伝子が癌に関連していることを示唆するものである。本発明者らが単離した遺伝子によりコードされるタンパク質は、ブロモドメイン以外の特徴的なモチーフとして、共通して、(1)酵母からヒトに至る広範囲の生物に発現するタンパク質に見出されており、タンパク質−タンパク質相互作用または非特異的なDNA結合に関与していると考えられている「C4HC3ジンクフィンガー」、(2)多くの転写調節因子に存在しており、この配列の存在によりタンパク質は自己または他のタンパク質と二量体を形成することができることが知られている「ロイシンジッパー」（Busch SJ and Sassone-CorsiP. (1990) Trends in Genetics 6,36-40.）、(3)多くの転写コアクチベーターに共通に見出されるモチーフで、核レセプターにより誘導される転写を仲介するために必要であることが示されている「LXXLLモチーフ」（Torchia J et al.,(1997). Nature 387,677-684.、Heery DM et al.,(1997) Nature 387,733-736.）、(4)細胞質で合成されたタンパク質に核への移行活性を付与する「核移行シグナル」を有している。
【００１５】
このうちブロモドメインとC4HC3ジンクフィンガーとの組み合わせの存在は、いくかの白血病のブレークポイント遺伝子（breakpoint gene）に関連していることが知られている(Tkachuk D.C.et al(1992). Cell, 71, 691-700.、Gu Y et al.,(1992) Cell, 71, 701-708.、Miki T et al.,(1991) Proc. Nat. Acad. Sci., 88,5167-5171.、Le Douarin B et al.,(1995) EMBO J. 14, 2020-2033.、Borrow J et al.,(1996). Nature Genet., 14,33-41.)。従って、本発明者等が単離したこれら遺伝子は癌におけるブレークポイント遺伝子の重要な候補である。
【００１６】
本発明の転写調節因子は、当業者に公知の方法により、遺伝子組み換え技術を用いて調製される組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、例えば、本発明の転写調節因子をコードするDNA（例えば、配列番号：2、14、22、28、30に記載の塩基配列を有するDNA）を適当な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して得た形質転換体から精製するなどの方法により調製することが可能である。また、天然のタンパク質であれば、例えば、調製した組み換えタンパク質を小動物に免疫することにより得た抗体を用いたカラムを調製し、本発明の転写調節因子の発現の高い組織、細胞（例えば、精巣や癌細胞など）の抽出物に対し該カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うなどの方法により調製することが可能である。
【００１７】
また、本発明は、配列番号：1、13、21、27または29に記載のアミノ酸配列を有する本発明の転写調節因子と機能的に同等な転写調節因子に関する。特定のタンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離する方法としては、タンパク質中のアミノ酸に変異を導入する方法が当業者によく知られている。即ち、当業者であれば、配列番号：1、13、21、27または29に記載のアミノ酸配列を有する本発明の転写調節因子において、その機能に影響を与えないアミノ酸を適宜置換などして、本発明の転写調節因子と同等の機能を有する転写調節因子を単離することは通常行いうることである。また、タンパク質中のアミノ酸の変異は自然界においても起こりうる。本発明の転写調節因子には、配列番号：1、13、21、27または29に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、ブロモドメインを有する転写調節因子も含まれる。タンパク質中にアミノ酸の変異を導入する当業者に公知の方法としては、例えば、PCRによる部位特異的変異誘発システム（GIBCO-BRL社,Gaithersburg,Maryland）、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Kramer,W.and Fritz,HJ (1987) Methods in Enzymol.,154:350-367）などが挙げられる。変異するアミノ酸の個数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは、10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内である。
【００１８】
また、機能的に同等なタンパク質を単離するための他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab.press,1989）を利用する方法が当業者によく知られている。即ち、当業者にとっては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab.press,1989）を用いて、配列番号：2、14、22、28または30に記載の、本発明の転写調節因子をコードするDNA配列もしくはその一部を基に、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAからこれら転写調節因子と機能的に同等な転写調節因子を得ることも通常行いうることである。本発明の転写調節因子には、配列番号：2、14、22、28または30に記載のDNA配列からなるDNAとハイブリダイズするDNAがコードし、ブロモドメインを有する転写調節因子も含まれる。機能的に同等な転写調節因子をコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、通常、「42℃、2xSSC、0.1% SDS」程度であり、好ましくは「50℃、2xSSC、0.1% SDS」程度であり、さらに好ましくは「65℃、2xSSC、0.1% SDS」程度である。なお、当業者であれば、温度条件、SDS濃度などの諸条件を適宜選択することにより、上記と同様のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを実現することが可能である。ハイブリダイズ技術により得られた転写調節因子は、配列番号：1、13、21、27または29に記載のアミノ酸配列を有する転写調節因子とアミノ酸配列において40％以上の相同性を有することが好ましく、60％以上の相同性を有することがさらに好ましく、80％以上の相同性を有することがさらに好ましく、95％以上の相同性を有することがさらに好ましい。特に、ブロモドメインの配列において高い相同性を有することが癌に関連した機能の上で重要であると考えられる。単離される機能的に同等な転写調節因子は、ブロモドメイン以外にも、他のタンパク質との相互作用に関与する配列（例えば、ロイシンジッパー、LXXLLモチーフ）、DNAとの結合などに関与する配列（例えば、ジンクフィンガー）、核移行シグナルなどを有しうる。なお、タンパク質中のブロモドメインの存在は、DNASIS（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）上のブロモドメインモチーフPROSITEデーターベースを検索することにより決定することが可能である。
【００１９】
また、本発明は、本発明の転写調節因子をコードするDNAに関する。本発明のDNAとしては、本発明の転写調節因子をコードしうるものであれば特に制限はなく、cDNA、ゲノムDNA、化学合成DNAなどが含まれる。cDNAは、例えば、配列番号：2、14、22、28または30に記載の塩基配列を基にプライマーを調製し、プラークPCRを行うことにより調製することが可能である（例えば、文献「Affara NA et al (1994) Genomics,22,205-210」参照）。また、ゲノムDNAであれば、例えば、 「Qiagen genomic DNA kits」（Qiagen社製,Hilden,Germany）を用いた常法により調製することが可能である。得られたDNAの塩基配列は、市販の「dye terminator sequencing kit」（Applied Biosystems社製）などを用いて常法により決定することが可能である。本発明のDNAは、後述するように組み換えタンパク質の製造に用いられる他、遺伝子治療などへの応用も可能である。
【００２０】
また、本発明は、本発明のDNAが挿入されたベクターに関する。本発明のDNAが挿入されるベクターとしては特に制限はなく、本発明の転写調節因子を生体内で発現させるためのベクター、組み換えタンパク質を調製するためのベクターなど目的に応じて種々のベクターが用いられる。本発明の転写調節因子を生体内で発現させるため（特に遺伝子治療のため）に用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター「pAdexLcw」やレトロウイルスベクター「pZIPneo」などが挙げられる。また、哺乳動物細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞などを用いる場合には、例えば、「LacSwitch II expression system」（Stratagene社製,La Jolla,California）などが好適である。本発明の転写調節因子を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては特に制限はないが、例えば、大腸菌（E.coli）を用いる場合には「pREP4」（Qiagen社製,Hilden,Germany）などが、酵母を用いる場合には「SP-Q01」（Stratagene社製,La Jolla,California）などが、昆虫細胞を用いる場合には「BAC-to-BAC baculovirus expression system」（GIBCO-BRL社製,Gaithersburg,Maryland）などが好ましい。なお、ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により行うことができる。
【００２１】
また、本発明は、本発明のDNAを発現可能に保持する形質転換体に関する。本発明の形質転換体には、本発明のDNAが挿入された上記ベクターを保持するもの、本発明のDNAが宿主ゲノム内に組み込まれているものなどが含まれるが、本発明のDNAを発現可能に保持している限り、その存在形態は問わない。本発明のベクターが導入される細胞としては特に制限はない。生体内で本発明の転写調節因子を発現させるために用いる場合には、所望の細胞を標的細胞にすることが可能である。また、本発明の転写調節因子を製造する目的の場合には、例えば、大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。細胞へのベクターの導入は、例えば、電気的穿孔法、熱ショックなどの方法で行うことが可能である。なお、組み換えタンパク質を製造するために作製した形質転換体からの該組み換えタンパク質の分離、精製は、常法により行うことが可能である。
【００２２】
また、本発明は、本発明の転写調節因子に結合する抗体に関する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどに本発明の転写調節因子を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらに遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、ヒト抗体も含まれる。本発明の抗体は、以下の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、本発明の転写調節因子をウサギなどの小動物に免疫し血清を得て、これを本発明の転写調節因子をカップリングさせたアフィニティーカラムにより、本発明の転写調節因子のみを認識する画分を得て、さらにこの画分から免疫グロブリンGある いはMを、プロテインA、あるいはプロテインGカラムにより精製することにより 調製することができる。また、モノクローナル抗体であれば、本発明の転写調節因子をマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明の転写調節因子に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明の転写調節因子をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明の転写調節因子の精製や検出に用いられる他、抗体治療に応用することも可能である。
【００２３】
また、本発明は、本発明の転写調節因子に結合する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング法は、本発明の転写調節因子と被験サンプルとを接触させ、本発明の転写調節因子に結合する活性を有する化合物を選択する工程を含む。スクリーニングに用いる被検サンプルとしては特に制限はなく、例えば、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリーなどが挙げられる。
【００２４】
本発明の転写調節因子を用いてこれに結合する化合物を単離する方法としては、例えば、以下の方法が当業者によく知られている。本発明の転写調節因子と結合するタンパク質のスクリーニングは、例えば、本発明の転写調節因子と結合するタンパク質を発現してることが予想される細胞（例えば、精巣組織細胞や癌細胞系「HL-60」、「HeLa S3」、「Raji」または「SW480」など）よりファージベクター（λgt11, ZAPなど）を用いたcDNAライブラリーを作製し、これをLB-アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、本発明の転写調節因子をビオチンラベル、あるいはGSTタンパク質との融合タンパク質として精製し、これを上記フィルターと反応させ、結合するタンパク質を発現しているプラークを、ストレプトアビジン、あるいは抗GST抗体により検出する「ウエストウエスタンブロッテイング法」（Skolnik EY, Margolis B, Mohammadi M, Lowenstein E, Fischer R, Drepps A, Ullrich A, and Schlessinger J (1991)Cloning of PI3 kinase-associated p85 utilizing a novel method for expression/cloning of target proteins for receptor tyrosine kinases. Cell 65, 83-90）により実施することが可能である。また、本発明の転写調節因子をSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明の転写調節因子と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、VP16またはGAL4転写活性化領域と融合する形で発現するようなcDNAライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来cDNAを単離して大腸菌に導入して発現させる（酵母細胞内で本発明の転写調節因子と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）「twoハイブリッドシステム」（「MATCHMARKER Two-Hybrid System」,「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」,「MATCHMAKER One-Hybrid System」(いずれもclontech社製)、「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(stratagene社製)、文献「Dalton S, and Treisman R  (1992)Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. Cell 68, 597-612」）に従い実施することも可能である。さらに、本発明の転写調節因子を固定したアフィニティーカラムに本発明の転写調節因子と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞の培養上清もしくは細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより実施することも可能である。
【００２５】
また、固定した本発明の転写調節因子に、合成化合物、または天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング（Wrighton  NC;  Farrell  FX;  Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS;Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64、Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p11-13、Hogan JC Jr.,Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p17-9）により本発明の転写調節因子に結合する、低分子化合物、タンパク質（またはその遺伝子）、ペプチドなどをスクリーニングする方法も当業者に周知の技術である。これにより単離される本発明の転写調節因子に結合する化合物は、癌および他の増殖性疾患の治療などへの利用が考えられる。本発明のスクリーニング方法により単離される化合物を薬剤として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることが可能である。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）とともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行うことが可能である。
【００２６】
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNAに関する。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを指す。このようなDNAは、本発明のタンパク質をコードするDNAを検出、単離するためのプローブとして、また増幅するためのプライマーとして利用可能である。
【００２７】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２８】
[実施例１]  BAZ遺伝子の単離および解析
（１）  新規なブロモドメイン含有遺伝子の同定
RING3遺伝子（Beck S et al.(1992). DNA Sequence, 2, 203-210）の5'ブロモドメインモチーフをコードするDNA配列（配列番号：３）を用いて、ESTデータベースをBLASTサーチした。この結果、プローブの配列に同一性を示す多くのESTが検索された。これらのESTの一つである「H70181」につき、以下の実験を行っ た。なお、「H70181」は、酵母（Georgakopoulos T and Thireos G. (1992). EMBO J., 11 (11), 4145-4152）あるいはヒト（Candau R.et al.(1996). Mol.Cell.Biol.,16(2),593-602）のGCN5転写活性化因子と最も高い同一性を示す。
【００２９】
（２）  完全長の配列の単離
EST「H70181」に対する完全長の遺伝子についてクローニングを開始するために、PCRプライマーU「配列番号:4／AGAAAAAGACAATCTCCAGAGCA」及びプライマーL「配列番号:5／GCTGTCATCATGTCGTACCAATTC」を設計した。該プライマーを用いてRT-PCRを行うことにより、精巣のcDNAから得られる129bpの特定の産物を増幅した。増幅生成物は「QIAクイック」（Qiagen社製）精製カラムを用いて直接的に精製した。このPCR生成物を、精巣のcDNAライブラリー（Clontech社製 HL3023a）をスクリーニングするプローブとして用いた。プローブは、ランダムプライミングによって［α-３２P］dCTPを用いてラベルし、「Chromaspin10カラム」（Clontech社製）を利用して精製した。さらに、得られたcDNAクローンを用いて、このライブラリーを再スクリーニングした。この工程は一連のオーバーラップしたクローンが得られるまで繰り返して行い、完全長の配列を単離した。単離した配列は全長で5934bpであった。なお、単離した遺伝子を「BAZ」（Bromodomain,Atypical Zinc finger）と銘々した。「BAZ」には、塩基125〜塩基5147までの1674アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）が存在した（配列番号：１）。ORFの後には787bpからなる3’非翻訳領域が続き、ポリAテイルで終了した。ポリアデニル化シグナル（AATAAA）は、ポリAテイルの上流の21bpに存在する。推定アミノ酸配列を併記したヌクレオチド配列を配列番号：２に示した。
なお、ライブラリーフィルタースクリーニングは、「ExpressHybハイブリダイゼーション溶液」（Clontech社製）中で65℃で1時間かけて行った。次に、フィルターを、65℃で1×SSC、0．1％SDSの最終的なストリンジェンシーになるまで 洗浄した。また、全ての塩基配列決定は、ABI色素末端化学法を利用する自動シーケンシング装置「ABI 377」（Perkin Elmer社製,Norwalk,Connecticut）を用 いて行った。
【００３０】
（３）  相同性と転写因子の特徴を持つモチーフの確認
タンパク質データベースを、BAZのアミノ酸配列を用いて検索した結果、C．Elegans染色体III（Wilson R et al.(1994). Nature, 368, 32-38.）の2.2Mb連続 セグメントからなる遺伝子によってコードされるタンパク質に最も広範に渡る類似性（46％の類似性、23％の同一性）を持つことが分かった。また、類似性を示す領域は、TFIID 250KDサブユニット（Ruppert S, Wang E. and Tjian R. (1993). Nature, 362, 175-179.）および「p300／CBP」（Eckner R et al.(1994). Genes Dev., 8 (8), 869  884、Chrivia JC et al.(1993).Nature, 365, 855-859.）などの種々の転写因子にも認められた。DNASIS（Hitachi Software engineering Co.）上のデーターベース「PROSITE」を用いるアミノ酸配列のモチーフサー チを行った結果、一個のブロモドメインが確認された（配列番号：１のアミノ酸の1569-1627番目）。他の転写調節因子のブロモドメインを併記したブロモドメインの配列を図1Aに示した。また、「U13646」、レチノブラストーマ結合性タンパク質「RBB2」（Fattaey AR et al.(1993). Oncogene, 8, 3149-3156.）、「MOZ」（Borrow J et al.(1996). Nature Genet., 14,33-41.）及び「p300／CBP」 （Koken MH et al.(1995). CR Acad. Sci. III,  318, 733-739）などの非常に多くのタンパク質に保存される「C4HC3 Znフィンガー」（C4C3ZF）を用いてBLASTサーチを行った結果、1個の45アミノ酸モチーフ（配列番号：１のアミノ酸1269−1313番目に相当する）を確認した。これらの遺伝子に存在する「C4HC3ZF」を図1Bに示した。BAZがいくつかの転写調節因子に対して共通した類似性を持つこと、特に「C4HC3ZF」及び「p300／CBP」とともに保存されているブロモドメインモチーフの存在は、「BAZ」が転写の調節因子として機能することを示している。「BAZ」の「p300／CBP」との類似性はC4HC3ジンクフィンガーやブロモドメインに限定されるものではなく、ブロモドメインの近傍にもよく保存された領域が存在する。一方、「BAZ」とヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインとの間、また「BAZ」と「p300／CBP」の存在する他のドメインとの間には相同性は認められなかったが、元来ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインはタンパク質間であまり保存されてはおらず、「BAZ」はHAT活性を持つ可能性がある。
核に存在するタンパク質の特徴を持つ数個の配列からなるモチーフは、11箇所で種々の核局在保存配列（Robbins J et al.(1991). Cell, 64, 615-23.）を用いて検索する「PSORTプログラム」（http://psort.nibb.ac.jp）を用いたところ、11箇所において核に存在するタンパク質の特徴を持つ数種の配列モチーフが確認された。
【００３１】
（４）  BAZの地図形成
プライマーB「配列番号：6／AACACAAGTGAAGCAAAAGCTGGA」及びプライマーM「 配列番号：7／GTGGTGTGCTAACTTGGTCCACAT」（遺伝子の3’末端から得られる）を、Coriell Cell Respositories，New Jerseyから入手した24モノクロモソームのヒト／ネズミの体細胞系（Dubois BL and Naylor S. (1993). Genomics, 16, 315-319）のそれぞれから得られるDNAを増幅するために用いた。予期された111bp 産物は、ヒト第14番染色体に対するモノクロモソームである細胞系「GM10479」 からのみ増幅された（図2A参照）。上記プライマーB（配列番号:6）及びプライマーM（配列番号:7）を続いて、「GeneBridge4放射ハイブリッドパネル」（Research Genetics社製,Huntsville,Alabama）に対するPCRを行う際に用いた。増幅 に対して正あるいは負としてそれぞれのハイブリッドを評価することによって生成する二進符号を、「http://www-genome.wi.mit.edu/cgobin/contig/rhmapper.pl」にあるサーバーを用いて、フレームワーク地図を形成するマーカーについての類似のコードと比較した。この工程をプライマーW「配列番号：8／CCCATCGTGAGTCAAGAGTGTCTGT」及びプライマーX「配列番号：9／CTCGCTTCTACCTTTTTATTGGCT」（遺伝子の5’末端から）を用いて繰り返し行った。このパネルにおいて増幅 が確認されたパターンから、二つのマーカー「D14S730」と「D14S75」の間の14qにBAZが存在することが判明した（図2B参照）。
【００３２】
（５）  正常組織におけるBAZ発現の分析
上記プライマーU（配列番号:4）及びプライマーL（配列番号:5）を用いて精巣のcDNAをPCR増幅することによって合成された実施例１（２）と同様のプローブを、16個の正常組織のパネルをノーザン分析する際に用いた。プローブは、遺伝子の配列から同定されるORFの大きさと一致する約7.0kbの単一のmRNA種とハイブリダイズした。この転写産物は非常に低いレベルでほとんどの組織で発現したが、精巣では比較的高いレベルで発現した（図3参照）。脳、肺、肝臓、腎臓、及び結腸で転写産物は検出されなかった（非検出レベルで発現している可能性はある）。さらに、約6.5kbのわずかに小さい転写産物が、精巣のみにおいて低いレベルで検出された。テストを行った組織のうち精巣は最大に活発な細胞分裂を行っているため、その発現パターンは組織の増殖と成長における「BAZ」に対する役割と一致していると考えられる。なお、ノーザン分析のためのハイブリダイゼーションは、「ExpressHybハイブリダイゼーション溶液」（Clontech社製）中で65℃で1時間かけて行った。次に、フィルターを、65℃で1×SSC、0.1％SDSの最 終的なストリンジェンシーになるまで洗浄した。イメージングは「Fuji BASイメージ分析器」（富士写真フィルム社製）を用いて行った。
【００３３】
（６）  癌におけるBAZ発現の分析
精巣で「BAZ」高い発現を示すことは、活発に増殖している癌においても高い 発現を示す可能性を示唆している。そこで、8個の癌細胞系のパネルについて、実施例１（５）と同じプローブを用いるノーザン分析を行った。この結果、正常組織を用いた場合と同様、唯一7.0kbの転写物のみがこのプローブとハイブリダイゼーションした。しかしながら、ほとんどの正常組織と比較して、転写レベルはほとんどの癌細胞系において顕著に高くなっていた（図4A参照）。具体的には、癌細胞系「HL-60」、「HeLa S3」、「Raji」及び「SW480」において高かった。一方、「K−562」、「MOLT−4」、「A549」及び「G361」での発現レベルは、ほとんどの正常組織と同程度であった。
RT-PCRを、表1に示した原発性肺癌における「BAZ」の発現を検査するために用いた。
【００３４】
【表１】
2009028043.tif 000003
【００３５】
10個のサンプルそれぞれにつき、ハウスキーピング遺伝子「G3PDH」の442bpを増幅するためのに対するプライマーであるプライマーG3U「配列番号：10／TCATCATCTCTGCCCCCTCTGTCTG」およびプライマーG3L「配列番号：11／GACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG」、並びにBAZに対するプライマーであるプライマーU「配列番号：4」およびプライマーN「配列番号：12／TCATGTGGTCAATCAATTGTTTGT」を用いて増幅を行った（図4B参照）。「G3PDH」は、それぞれのサンプルについての鋳型の量を支配できるように増幅した。「BAZ」に対してはcDNAからは特異的に増幅できるがゲノムのDNAを増幅することはできないプライマーを選択した。増幅生成物 は精巣と二つの肺癌サンプルでは明確に検出されたが、他の8個の肺癌サンプルやこれと同様に正常の肺では検出されなかった。
【００３６】
なお、RT-PCRは、標準的な方法により行った。即ち、全RNAをAGPC法（Chomczynski P and Sacchi N.(1987) Analytical Biochem.,162,156-159）により抽出し、oligo(dT15)プライマーとMMLV逆転写酵素により、一本鎖DNAを合成した後、その一部をRT-PCRに用いた。RT-PCRは「AmpliTaq gold」（ABI社製）を用い、「G3PDH」を増幅する場合には、アニーリング温度60℃で27サイクル行い、「BAZ」を増幅する場合には、アニーリング温度55℃で33サイクル行った。また、ハイブリダイゼーションの条件およびイメージングは実施例１（５）と同様にした。
【００３７】
[実施例２]  BAZ2α遺伝子の単離および解析
（１）新規なブロモドメイン含有遺伝子の同定および全長配列の単離
BAZのブロモドメインをコードするDNAは、GCN5のブロモドメインと極めて同一性が高い。ヒトGCN5遺伝子のブロモドメインモチーフをコードするDNA配列（Candau R et al.,(1996).Mol. Cell. Biol., 16 Q),593-602.）を、ESTデータベースの検索に用いた。データベース検索はBLASTを用いて行った。モチーフ検索はPROSITEを用いて行った。タンパク質の比較はGCG中でBetfitを利用して行った。核移行シグナルの同定はPSORTを用いて行った。その結果、このプローブ配列に 同一性を示す多数のESTが見出された。胎児肝臓／脾臓cDNAライブラリーより得られた、これらのESTの一つ（登録番号N76552）は、新規な遺伝子であることが明らかとなった。
EST N76552の全長遺伝子についてクローニングを開始するために、PCRプライマーNB16U（配列番号：15／TGACTCTGAAGTAGGCAAGGCTGG）およびNB16L（配列番号：16／CTTGCCTCACAGATTGGCCTGT）を設計して、精巣cDNA由来の91bpの特定の産物を増幅するために使用した。このPCR産物を、精巣cDNAライブラリー（Clontech 社製 HL3023a）をスクリーニングするプローブとして用いた。なお、増幅産物はQIAquick（Qiagen社製）精製カラムを用いて直接的に精製した。ESTと整列した配列を持つcDNAクローンを、このライブラリーを続いて再スクリーニングするために用いた。この工程を、遺伝子の完全コード領域の全長配列を与える、一連のオーバーラップしたクローンが得られるまで繰り返した。全ての配列決定は、ABIダイ・ターミネーター・ケミストリーを利用する自動配列決定装置ABI 377で行った。その結果、全体で、9408bpの連続配列が生成した。この配列を理論的に翻訳すると、塩基740にメチオニンコドンが存在し、そこから1878アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）が開始し、塩基6373で終結することが明らかとなった。ORFの後には少なくとも3kbからなる3'UTRが続いている。なお、得られたcDNAの塩基配列を配列番号:14に、該cDNAから推定されるアミノ酸配列を配列番号:13に示した。なお、単離したクローンをBAZ2αと銘々した。
【００３８】
（２）相同性および転写因子に特徴的なモチーフの同定
BAZと同様に、BAZ2αのアミノ酸配列でタンパク質データベースを検索することにより、C．elegansブロモドメイン遺伝子U13646、即ちC．Elegans染色体III （Wilson R et al.,(1994). Nature,368,32-38.）の2.2Mb連続セグメントの一部を形成する遺伝子によってコードされるタンパク質に最も高い相同性を有することが同定された。さらに、類似性を示す領域を、TFIID 250KDサブユニット（Ruppert S et al.,(1993). Nature,362,175-179.）およびp300／CBP（Eckner R et al.,(1994). Genes Dev., 8 (8), 869-884.、Chrivia JC et al.,(1993).Nature, 365,855-859.）などの種々の転写因子を用いて同定した。ブロモドメインは、アミノ酸1788〜1846の間に存在する。BAZ2αとBAZおよびU13646とのアライン メントを図5に示す。BAZ2ブロモドメイン配列と他のブロモドメインとのアラインメントを図6Aに示す。さらに、BLAST検索を行うことにより、BAZ、U13646、網膜芽腫結合タンパク質RBB2（Fattaey AR et al.,(1993). Oncogene, 8,3149-3156.）、MOZ（Borrow J et al.,(1996). Nature Genet., 14,33-41.）およびp300 ／CBP（Koken MH et al.,(1995). CR,4cad. Sci. III, 318,733-739.）などの多数のタンパク質に保存されるC4HC3ジンクフィンガー（C4C3ZF）（アミノ酸1652 〜1696）をコードする一個の45アミノ酸モチーフが同定された。これらの遺伝子のC4HC3ZFのアラインメントを図6Bに示す。BAZ2αはBAZと類似しており、そのことは、これら2つのタンパク質が密接に関連しており、類似の機能を有するタンパク質ファミリーの一部を形成している可能性をしている。BAZと同様に、BAZ2αがいくつかの転写因子と全体的に類似しており、特に、p300/CBPおよびTIF1に保存されているC4HC3ZFおよびブロモドメインモチーフが存在することは、BAZが転写の調節因子として機能する可能性が高いことを示している。
核レセプターにより誘導される転写を仲介するために必要であると考えられているLXXLLモチーフ（Torchia J et al.,(1997). Nature 387,677-684.、Herry DM et al.,(1997) Nature 387,733-736.）が、残基872に存在する。PROSITEモチーフ検索により、このモチーフは、ロイシンジッパー（残基852〜873）の3'末端に位置することが明らかとなった。BAZ2αにおけるLXXLL、C4HC3およびブロモドメインモチーフの相対的な位置関係は、U13646およびBAZと極めて類似している（図5）。さらに、いずれの場合においても、LXXLLモチーフは、規則的な間隔で存在する保存されたリジン残基により特徴づけられるへリックス構造の後に存在する。
【００３９】
（３）BAZ2αのマッピング
BAZ2αの染色体上の位置を同定する目的で、132bpの断片を増幅するPCRプライマーD（配列番号：17／TTGCCGTATTTGGCTGGTATC）およびE（配列番号：18／CATAGAGAAGAGGGCAGGGTTGA）を、Coriell Cell Respositories（New Jersey）から入手した24のモノクロモソームのヒト／ネズミ体細胞系（Dubois BL and Naylor S. (1993). Genomics, 16,315-319.）のそれぞれからDNAを増幅するために用いた。BAZ2αの局在領域は、91の放射ハイブリッドのGeneBridge4パネルを用いて同定した（Walter MA et al.,(1994). NatureGenetics, 7,22-28.）。このパネルは、再びプライマーDおよびEを用いてPCRによってスクリーニングした。各ハイブリッドが増幅に対して陽性か陰性かを評価することによって作製したバイナリーコードを、「http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl」にあるサーバーを用いてフレームワーク地図を形成するマーカーについての同様のコードと比較した。このようにして、BAZ2αが、D12S367から12q24.3-terの距離に位置することが明らかとなった（図7B参照）。
【００４０】
（４）BAZ2α発現の分析
プライマーgt10F（配列番号：19／CTTTTGAGCAAGTTCAGCCT）およびNB16N（配列番号：20／GTCGGCTTCTTCATTTCCTCCA）を用いて精巣cDNAライブラリー（Clontech社製）より実施例2(1)で得た1クローンのDNAを増幅することによって調製されたプローブ（BAZ2α遺伝子の481bp断片）を、16の正常組織のパネル（Clontech社 製）をノーザン分析するために用いた。プローブは、ランダムプライミングによって［α-３２P］dCTPでラベルし、Chromaspin10カラム（Clontech社製）を利用して精製した。ノーザン分析およびライブラリー・フィルター・スクリーニングのためのハイブリダイゼーションは、ExpressHybハイブリダイゼーション溶液（Clontech社製）中で65℃で1時間行った。フィルターは、65℃で0.5×SSC、0.1％SDSという最終ストリンジェンシーまで洗浄した。イメージングはFujiBASイメージ分析機を用いて行った。その結果、ほとんどの組織で、プローブは、約10.5kbの一個のmRNA種とハイブリダイズした。この大きさは、遺伝子の配列から同定されるORFの大きさと一致する（図8）。この転写産物はほとんどの組織で低レベルで発現していた。精巣で主に発現する9.0kbのもう一つの転写産物も検出された。このバンドは、高ストリンジェンシーで洗浄した後でも消失しなかった。この第2の転写産物は、BAZ2αのオルタナティブ・スプライシングを受けた型であるか、またはBAZ2αと密接に関連する異なる遺伝子であると考えられる。
【００４１】
[実施例３]  BAZ2β遺伝子の単離および解析
（１）新規ブロモドメインを有する遺伝子の同定および全長塩基配列の単離
既知のブロモドメインモチーフをコードする種々の塩基配列を用い、ESTデーターベースに対してBLAST検索を行った。SMAP遺伝子(Nielsen MS et al., (1996)  Biochim. Biophys. Acta)の塩基配列を用いた検索結果から、ブロモドメイン遺伝子をコードする可能性のある幾つかのESTを同定した。その内の一つ、網膜cDNAライブラリー由来のEST(Gnbank accession# AA015589)はその予測されるタンパク質がBAZ2αと最も相同性が高い新規遺伝子であることが判明した。
そこで、全長塩基配列の単離を行った。ESTAA015589に対する全長遺伝子のクローニングは、先ずPCRプライマーNB7U（配列番号：23／CTGACTGAAATGGAAACTCATGAGG）およびプライマーNB7L(配列番号：24／CTAGAGCAAAGGTTTCAAGGTTTGG)をデザインし、精巣のcDNA から特異的な165 bpの産物を得た。増幅した産物は直接  QIAquick (Qiagen社製) の精製カラムを使い精製した。このPCR産物を精巣cDNAライブラリーのスクリーニングのプローブとして用い、さらにこのESTの配列をもつcDNAクローンを用いて、ライブラリーのスクリーニングを再度行った。同様な操作を、得られたクローンを連結させ、本遺伝子の全コード領域をカバーする塩基配列が得られるまで繰り返し行った。その結果、全体で7585 bpの塩基配列 が得られた。この全塩基配列中には、367番目のATGをスタートコドンとする1972アミノ酸（6282塩基）からなるオープンリーディングフレーム(ORF)があり、それに続いて1303 bpの3' UTRが存在した。なお、得られたcDNAの塩基配列を配列番号:22に、該cDNAから推定されるアミノ酸配列を配列番号:21に示した。なお、全ての塩基配列は ABI 色素ターミネーター化学を用いてABI 377自動配列決定機で決定した。また、ライブラリーフィルタースクリーニンングのハイブリダイゼーションはExpressHybハイブリダイゼーション溶液(Clontech)を用い、65℃で１時間かけて行った。フィルターを65℃で0.5x SSC、0.1% SDSの最終的ストレンジェンシーになるまで洗浄した。続いてそのフィルターをシグナル強度増大のために-70℃で1乃至3日間のオートラジオグラフィーを行った。
【００４２】
（２）相同性および転写因子のモチーフ特性
得られた遺伝子がコードするタンパク質のモチーフはPROSITEにより検索した。タンパク質の比較はGCGにおけるBestfitを用いて行った。核移行シグナルの同定はPSORT(http://psort.nibb.ac.jp/form.html)で行った。
登録された遺伝子から予測されるアミノ酸配列を基にしたデーターベースに対する検索結果では、BAZおよびBAZ2αと同様に、本遺伝子も線虫（C. elegans ) ブロモドメイン遺伝子U13646によってコードされているタンパク質に対して、最も広範な類似性が見られた。この線虫ブロモドメイン遺伝子は線虫（C. Elegans ）第３染色体から予測連結されて得られた2.2 Mbの一部に相当する(Wilson R et al., (1994). Nature, 368, 32-38.)。しかしながら、BAZとBAZ2αに対してはさらに広い領域で相同性が見られた。実際、本遺伝子がコードするタンパク質がBAZ、BAZ2αと類似していることはこれら３つのタンパク質が密接に関連してい ること、さらにはこれらは類似した機能を持つより広いタンパク質ファミリーの一部である可能性をも示している。本遺伝子はBAZ2αと最も関連が深いことから、「BAZ2β」(for bromodomain, atypical zinc finger)と銘々した。また、BAZは「BAZ1α」と改名した。BAZ2βのアミノ酸配列をBAZ1α、BAZ2α、U13646、および後述するBAZ1βSと共に図9に示した。少なくとも５つの領域もしくはドメインを確認することができる。最初のドメイン (I) はBAZ1αには存在しないが他の３つのタンパク中には存在する。次のドメインを解析すると、ロイシンリッチなヘリックス構造 (helical structure＝LH)の存在が予測される。u13646にはないが、全てのBAZのこのドメインの中央部にはLXXLLモチーフが存在している。 このモチーフは核受容体との相互作用を与えている可能性があるものと考えられる (Torchia J et al, (1997). Nature 387, 677-684.、Heery DM et al, (1997) Nature 387, 733-736.)。ドメインIIとドメインIIIは共に高度に保存されており、機能的に重大であることを示唆している。それぞれのタンパクは、高度に保存されたC4HC3 ジンクフィンガー (Aasland R et al., (1995). Trends Biochem. Sci., 20, 56-59.、Koken MH et al, (1995). CR Acad. Sci. III,  318, 733-739.、Saha V et al., (1995). Proc. Nat. Acad. Sci.,92, 9737-9741.)とブロモドメインを一つずつ持っている。ジンクフィンガーモチーフの上流には保存された領域がさらに存在しており、この部分も機能的に重要な意味をもつ可能性がある。これと同様にブロモドメインモチーフの上流にも保存されている配列がある。これらの保存されたドメインを整列した結果を図10に示す。BAZ1αとBAZ2αのと同様に、BAZ2βもいくつかの転写因子に対して広範な類似性を示しており、転写調節因子として機能していることが予想される。この機能と矛盾することなく、PSORTプログラムを用いて細胞内蛋白質局在を予測すると、全部で19箇所に核局在コンセンサス配列(Robbins J et al., (1991). Cell, 64, 615-23.) が存在した。
【００４３】
（３）BAZ2βの染色体地図作製
BAZ2βの染色体地図作製のため、プライマーnb7n（配列番号：25／TGTTGCTGCATCACTTGTGTAGTT）とプライマーnb7ee(配列番号：26／GGCATGACAATAATGTCTGCAAA)を作製し、24のモノクロモソームのヒト／ネズミ体細胞系（Dubois BL and Naylor S. (1993). Genomics, 16,315-319.）のそれぞれから得られるDNAを増幅した。期待された147bpのPCR産物の増幅は、本遺伝子がヒトモノクロモソーム染色体第2番に存在する可能性を示唆するものであった(図11)。一方、BAZ2βの領域座はGeneBridge4放射パネル91ハイブリッド(Walter et al.,(1994). Nature Genetics 7: 22-28.) を用いて決定した。再度プライマーnb7nとプライマーnb7eeを使い、そのハイブリッドパネルでPCRを行うことによってスクリーニングした。増幅に対して正あるいは負としてそれぞれのハイブリッドを評価することによって、生成する２進符号をアドレス (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl）にあるサーバを用いてフレムワーク地図を形成するマーカーについての類似コードと比較し、本遺伝子の染色体上の位置を同定した。その結果BAZ2βは確かに染色体第2番q23-24にマップされ、さらにマーカーD2S1986とG09369との間にに存在することが確認された(図11)。
【００４４】
（４）BAZ2βの発現解析 
約1700-4000番目のヌクレオチドを含むcDNAプローブを用い、16の正常組識、8つの癌細胞系と4つの胎児組識をパネルとしてノーザン解析を行った（図12）。プローブはランダムプライミングにより [α-３２P] dCTPで標識し、クロマスピン10カラム (Clontech社製)で精製した。ノーザン分析のハイブリダイゼーションはExpressHybハイブリダイゼーション溶液(Clontech社製)を用い、65 ℃で１時間かけて行った。フィルターを65℃で0.5x SSC、0.1% SDSの最終的ストレンジェンシーになるまで洗浄した。続いてそのフィルターをシグナル強度増大のために-70℃で1乃至3日間のオートラジオグラフィーを行った。このプローブではほとんどの組識で、約9.5 kbのmRNAが検出され、この転写産物の大きさは、塩基配列から同定されたORFの大きさと一致する。この他に、精巣では約6.5 kb の転写産物が優位に発現していたが、このバンドは高ストリンジェンシー(0.1xSSC,65℃)で洗浄した後でも変わらないため、特異的な発現であるものと考えられる。この２つ目の転写産物はBAZ2βからのオルタネイティブスプライスによるものかもしれないが、このことを示唆するようなクローンは見つからなかった。その他にBAZ2βと密接に関連のある別の遺伝子の発現を検出している可能性もある。これらの転写物のほかに、いくつかのmRNAがほとんどの組織で検出されたが、おそらくはこれらは類似した配列をもつ他の遺伝子に由来するものと考えられる。ブロモドメインを含んだ別のプローブを用いた解析では精巣にのみ6.5kbの転写産物と、広範な組織で8.5kbの転写産物の発現がみられた。
【００４５】
[実施例４]  BAZ1β（BAZ1βSおよびBAZ1βL）遺伝子の単離および解析
（１）新規ブロモドメインを有する遺伝子の同定および全長塩基配列の単離 
human GCN5遺伝子(Candau et al.,(1996). Mol.Cell.Biol.,16:593-602.)のブロモドメインモチーフの塩基配列を用い、ESTデーターベースに対してBLAST検索を行った。多数のブロモドメイン遺伝子をコードする可能性のある幾つかのESTを同定した。その内の一つ、網膜cDNAライブラリー由来のEST(Gnbank accession# AA01307)は新規遺伝子であることが判明した。
そこで全長遺伝子の単離を行った。EST AA01307に対する全長遺伝子のクローニングは、先ずPCRプライマーnb3U (配列番号：31／TGGATGATGCTGAGGTGGATGA)およびnb3L (配列番号：32／GGGGTGCGTGATGACATCATAG)をデザインし、精巣のcDNAから特異的な184 bpの産物を得た。増幅した産物は直接QIAquick(Qiagen社製)の精製カラムを使い精製した。このPCR産物を精巣cDNAライブラリー(Clontech HL3024a)のスクリーニングのプローブとして用い、さらにこのESTの配列をもつcDNAクローンを用いて、ライブラリーのスクリーニングを再度行った。同様な操作を、得られたクローンを連結させ、繰り返し行った。その結果、2つの型の塩基配列が得られた。これら2つの配列を合わせてBAZ1βと名付け、さらに短い配列をBAZ1βS、長い配列をBAZ1βLと名付けた。短い配列は5561塩基からなり、1527アミノ酸のタンパク質をコードしていた。一方、長い配列にはフレーム内に配列「TACAGACCCTCC」の1つの縦の繰り返しが存在し、5573塩基からなり、1531アミノ酸のタンパク質をコードしていた。この繰り返しは、658位に4アミノ酸 「LLQT」の挿入を生じていた。興味深いことに、その結果、さらなるLXXLLモチーフが生じた。BAZ1βSは655、658、1000、1436位から始まる4つのLXXLLモチーフを有し、BAZ1βLは655、658、663、1004、1440位から始まる5つのLXXLLモチーフを有していた。図13にBAZ1βSおよびBAZ1βLの多重LXXLLモチーフを含む部位の整列を示す。
LXXLLモチーフの多様性がスプライシングの変化によるものか多型性によるも のかを決定するために、可変領域の両側に対応するNB3KK（配列番号：33／GAGTGCAGATAAGGGTGGCTTTTT）およびNB3LL（配列番号：34／CCAATTCACCATAGTCTTCGGCTA）からなるプライマー対を調製し、ゲノムDNAおよびcDNAに対して用いた。その結果、プライマーは両鋳型から同じサイズの生産物を増幅した。このことは完全な配列が1つのイントロン内で生じることを示唆する。従って、配列の変化は多 型性によるものと考えられる。このことは核内受容体との相互作用に影響しているかもしれない。なお、得られたBAZ1βS cDNAの塩基配列を配列番号:28に、該cDNAがコードするタンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号:27に示す。またBAZ1βL cDNAの塩基配列を配列番号:30に、該cDNAがコードするタンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号:29に示す。全ての塩基配列は ABI 色素ターミネーター化学を用いてABI 377 自動配列決定機で決定した。また、ライブラリーフィルタースクリーニンングのハイブリダイゼーションはExpressHyb ハイブリダイゼーション溶液(Clontech社製)を用い、65 ℃で１時間かけて行った。フィルターを65℃で0.5x SSC、0.1% SDSの最終的ストレンジェンシーになるまで洗浄した。続いてそのフィルターをシグナル強度増大のために-70 ℃で4日間のオートラジオグラフィー、または富士BAS sysytemによる4時間のオートラジオグラフィーを行った。
【００４６】
（２）相同性および転写因子のモチーフ特性
BAZ1βS遺伝子およびBAZ1βL遺伝子がコードするタンパク質のモチーフはPROSITEにより検索した。タンパク質の比較はBCM search launcher (http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/multi-align.html) のMAP programを用いてdefault settingの条件で行い、出力結果はboxshade program (http://ulrec3.unil.ch/software/BOX_form.htmlat)で編集した。核移行シグナルの同定はPSORT(http://psort.nibb.ac.jp/form.html)で行った。
BAZ1βSおよびBAZ1βLには転写因子に特徴的ないくつかのモチーフがみられた。即ち、ブロモドメイン、C4HC3 ジンクフィンガー(C4HC3ZF)およびLXXLLモチーフである。LLXXLLモチーフは他のBAZファミリーメンバー遺伝子とU13646との間 に保存されているロイシンリッチなドメインの中に存在していた（図9）。このドメインの重要性は明らかではないが、タンパク質の2量体形成に関連するロイシンジッパーを形成しうるかもしれない。このようなモチーフは真核生物の転写調節因子に共通してみられること (Busch and Sassone-Corsi, 1990)、またLXXLLモチーフも核内レセプターと相互作用していることが報告されている(Torchia et al, (1997). Nature 387: 677-684.、Heery et al, (1997) Nature 387: 733-736.)。予測されるアミノ酸配列が数種の転写因子に対して広範な類似性を持つと言うことはこれら遺伝子が転写調節因子として機能しうる可能性を示しているものである。さらにこのことを裏付ける事実として、PSORTプログラムを用いて細胞内蛋白質局在を予測すると、全部で13箇所に核局在コンセンサス配列(Robbins et al.,(1991).Cell, 64: 615-23.)が存在した。予測されるアミノ酸配列は、BAZ1αにも最も高い類似性を示していた。またさらにBAZ2αやBAZ2βおよび線虫（C. elegans)ブロモドメイン遺伝子U13646によってコードされているタンパク質に対して類似性が見られた。6個のドメインの内最初のドメインは、BAZ2α やBAZ2βおよびU13646には存在するが、BAZ1αの場合と同様にBAZ1βSおよびBAZ1βLには存在しなかった。また、これら遺伝子産物の全体構造は例えばドメインIIとドメインIIIの間はBAZ1αに最も類似している(図14から18)。これら遺伝子産物も他のBAZファミリーのメンバー同様、ゲノム遺伝子配列の解析により同定された線虫（C. elegans)ブロモドメイン遺伝子U13646 (Wilson et al.,(1994).Nature,368: 32-38.) がコードすると推定されるタンパク質中に存在するモチーフを持っている。BAZ1βSと他のBAZファミリーのメンバーおよびU13646をアラインすると、中央部とC末の間の配列が最もよく保存されている領域であることがわかる(図14から18)。U13646についてはこの領域について図中には示しておらず、N末についてのみBAZ1βSとBAZ1αをアラインした。
【００４７】
（３）BAZ1βの染色体地図作製
BAZ1βの染色体地図作製のため、プライマーnb3S (配列番号：35／GAAACGGGAGGAGCTGAAAAAG) および nb3T (配列番号：36／CCTTCAGGGGTATCCACCAATC)を作製し、24のモノクロモソームのヒト／ネズミ体細胞系（Dubois BL and Naylor S. (1993). Genomics, 16,315-319.）のそれぞれから得られるDNAを増幅した。期待された156bpのPCR産物が２つ別々のcell lineのGM10791から増幅され、BAZ1β遺伝子はヒトモノクロモソーム染色体第7番とに存在する可能性を示唆するものであった(図19Ａ)。BAZ1βの領域座は GeneBridge 4 放射パネル91 ハイブリッド（Walter et al.,(1994). Nature Genetics 7: 22-28.）を用いて決定した。再度プライマーnb3S とプライマーnb3Tを使い、そのハイブリッドパネルで PCRを行うことによってスクリーニングした。増幅に対して正あるいは負としてそれぞれのハイブリッドを評価することによって、生成する2進符号をアドレス (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl）にあるサーバを用いてフレムワーク地図を形成するマーカーについての類似コードと比較し、染色体上の位置を同定した。その結果BAZ1βは確かに染色体第7番q11-22にマップされ、さらにマーカーD7S489とD7S669との間にに存在することが確認された(図19Ｂ)。
【００４８】
（４）BAZ1βの発現解析 
精巣cDNAをプライマーnb3Sとプライマーnb3Tを用いたPCRにより調製した156bpcDNAプローブを用い、16の正常組識のパネルとしてノーザン解析を行った(図20)。プローブはランダムプライミングにより [α-３２P] dCTP で標識し、クロマスピン10カラム (Clontech社製)で精製した。ノーザン分析のハイブリダイゼーションはExpressHybハイブリダイゼーション溶液(Clontech社製)を用い、65℃で１時間かけて行った。フィルターを65℃で0.5x SSC 、0.1% SDSの最終的ストレンジェンシーになるまで洗浄した。続いてそのフィルターをシグナル強度増大のために-70℃で4日間のオートラジオグラフィー、または富士BAS sysytemによる4時間のオートラジオグラフィーを行った。このプローブではほとんどの組識で、約7.5kbのmRNAが検出された。これはBAZ1αの転写物の7.0kbと類似していた。
【００４９】
[実施例５]  BAZ2β融合タンパク質の発現および精製
細菌における融合タンパク質の発現のために用いられるpGEXベクター（Pharmacia社製）を用いて、BAZ2βにつき3つの構築物を調製した。3つの構築物は、それぞれBAZ2βのアミノ酸1-190位, 1241-1584位, および1500-1970位を含有する（図21）。タンパク質の発現は、クローニング部位の上流に位置するIPTG誘導性のプロモーターを介して行った。発現タンパク質は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST) タンパク質と融合しているため、グルタチオンセファロースビーズを含むアフィニティーマトリックスを用いて精製した。具体的には、GST融合タンパク質の発現および精製は、GST purification  modules (Pharmacia社製)に添付の説明書に従って行った。但し、培養体積を400mlとし、タンパク質の誘導は、0.1mM IPTGを用い30℃で一晩行った。ウェスタンブロッティングは、アルカリフォスファターゼ結合基質キット（alkaline phosphotase conjugate substrate kit）に含まれるBioRad試薬を用いて、添付のマニュアルに従って行った。
4-20%勾配SDSポリアクリルアミドゲル上で発現タンパク質を解析した結果、誘導したタンパク質は、精製前の細菌細胞溶解物においては検出されなかった (図22、レーン1、4、5) 。このことはプロモーターの誘導が構築物のいずれにおいても強く行われなかったことを示唆する。しかしながら、予想された分子量に一致する明確なタンパク質(表2)がいずれの場合でも検出された(図23、レーン3、8、9)。精製したタンパク質が目的の融合タンパク質であることを証明するために、抗GST抗体を用いたウェスタンブロットを行った。その結果、どの場合でも、推定されたサイズに一致する精製タンパク質が検出された。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
産業上の利用可能性
本発明によりブロモドメインを有する新規な転写調節因子、該転写調節因子をコードするDNA、該DNAを含むベクター、該DNAを発現可能に保持する形質転換体、該転写調節因子に結合する抗体、該転写調節因子に結合する化合物のスクリーニング方法が提供された。本発明の転写調節因子およびDNAは、癌および増殖性疾患の診断や治療の指標として、また新規作用機序に基づく治療薬のスクリーニングなどへの利用が期待される。また、本発明の転写調節因子に結合する化合物は、上記疾患の治療薬としての利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、BAZ（BAZ1α）のドメインを他のタンパク質と比較した図である。ＡはBAZ（BAZ1α）のブロモドメインを、酵母TFIID、ヒトCCG1、p300、およびCBPと比較したものであり、ＢはBAZ（BAZ1α）のC4HC3 ZnフィンガーをU13646、レチノブラストーマ結 合タンパク質RBBP2、2つのMOZ、p300、およびCBPのZnフィンガーと比較したものである。保存されているアミノ酸であるシステインとヒスチジンを「*」で示した。なお、ＡおよびＢにおいて、同一のアミノ酸を反転文字で示し、類似のアミノ酸を強調文字（網掛けもしてある）で示した。
【図２】図２は、BAZ（BAZ1α）の染色体地図を示す。ＡはプライマーB（配列番号:6）およびプライマーM（配列番号:7）を用いたモノクロソームハイブリッド細胞パネルの解析による第14番染色体の割り当てを示す。なお、図中の「1」〜「Y」までの番号は染色体番号を示し、「TH」は全ヒト染色体(total human)を示す。111BPの産物はヒト染色体に対するモノクロモソームである細胞系GM10479において特異的に 増幅される。ＢはGenebridge4放射ハイブリッドパネル解析により決定された第14番染色体上のBAZ（BAZ1α）の存在位置を示す。
【図３】図３は、正常組織におけるBAZ（BAZ1α）の発現を示す。1は心臓、2は脳、3は胎盤、4は肺、5は肝臓、6は骨格筋、7は腎臓、8は膵臓、9は脾臓、10は胸腺、11は前立腺、12は精巣、13は卵巣、14は小腸、15は結腸（粘膜内層）、16は末梢血白血球を示す。なお、図下はアクチンプローブを用いた対照である。
【図４】図４は、癌におけるBAZ（BAZ1α）の発現を示す。Ａは癌細胞株でのノーザン解析を示し、1は前骨髄球性白血病HL-60、2はHeLaS3細胞、3は慢性骨髄性白血病K-562、4はリンパ芽球性白血病MOLT-4、5はバーキットリンパ腫Raji、6は大腸腺癌SW480、7は肺癌A549、8は黒色腫G361を示す。Ｂは10の初期肺癌のRT-PCR解析を示す。プライマーUおよびプライマーNを用いた554bpのBAZ（BAZ1α）遺伝子の増幅産物を上に示し、プライマーG3UおよびプライマーG3Lを用いた442bpのG3PDH遺伝子の増幅産物を下に示す。なお、図中の「L」は、正常人肺を示し、「T」は正常人精巣を示し、「G」は正常人ゲノムDNAを示す。
【図５】図５は、BAZ（BAZ1α）、BAZ2α、U13646における保存されたドメインの比較を示す。
【図６】図６は、BAZ2αのドメインと他のタンパク質のドメインとの整列を示す。ＡはBAZ2α（図中には「BAZ2」で示す）のブロモドメインをBAZ（BAZ1α）、ヒトCCG1、PCAF、およびCBPと整列させたものである。ＢはBAZ2αのC4HC3ジンクフィンガーをBAZ（BAZ1α）、U13646、網膜芽腫結合タンパク質RBBP2、2つのMOZのジンクフィンガー、p300と整列させたものである。保存されたシステインおよびヒスチジンを「*」で示した。
【図７】図７は、BAZ2αの染色体地図を示す。ＡはプライマーD（配列番号:16）およびプライマーE（配列番号:17）を用いたモノクロソームハイブリッド細胞パネルの解析による第12番染色体の割り当てを示す。なお、図中の「1」〜「Y」までの番号は染色体番号を示す。132BPの産物はヒト12番染色体に対するモノクロモソームであ る細胞系GM10868aにおいて特異的に増幅される。ＢはGenebridge4放射ハイブリッドパネル解析により決定された第12番染色体上のBAZ2（BAZ2α）の存在位置を示す。
【図８】図８は、正常組織におけるBAZ2αの発現の解析を示す。Ａ．1は心臓、2は脳、3は胎盤 、4は肺、5は肝臓、6は骨格筋、7は腎臓、8は膵臓、9は脾臓、10は胸腺、11は前立腺、12は精巣、13は子宮、14は小腸、15は結腸(粘膜内層）、16は末梢血白血球を示す。Ｂはアクチンプローブを用いた対照である。
【図９】図９は、BAZ2β、BAZ1α、BAZ2α、U13646、BAZ1βSの保存されたドメインの比較を示す。少なくとも５つのドメインが存在する。ドメインI はBAZ1αにはない。BAZ2β、BAZ1α、U13646、およにBAZ1βSの上に示す数字はBAZ2αとの相同性の割合を示す。LHドメイン内の数値はロイシン残基の相同性の割合を示す。LHドメイン内の黒いバンドは３つ全てのBAZ遺伝子の中でLXXLLモチーフが存在する場所を表わしている。LHはロイシンリッチなヘリックスドメイン、ZFはC4HC3 ジンクフィンガー、BDはブロモドメインを示す。
【図１０】図１０は、BAZ2βのLHドメインと他のタンパク質においてこれに相当するドメインとの アミノ酸配列の比較を示す。保存されているロイシン残基の場所は配列の上に矢印で示した。LXXLLモチーフは四角で囲んだ。
【図１１】図１１は、BAZ2βの染色体地図を示す。147 bpの産物がヒト第2番の染色体に対するモノ クロモソームである細胞系において増幅がみられた。ライマーnb7nとプライマーnb7eeを用いたPCRによりから増幅された。なお、図中の「1」〜「Y」までの番号は染色体番号を示す。第2番染色体上にあるBAZ2βの場所をGenebridge4 放射ハイブリッドパネルの解析によって決定した。
【図１２】図１２は、BAZ2βの正常組織、癌細胞株、および胎仔組織における発現の解析を示す。1 は心臓、2は脳、3は胎盤、4は肺、5は肝臓、6は骨格筋、7は腎臓、8は膵臓、9は脾臓、10は胸腺、11は前立腺、12は精巣、13は子宮、14は小腸、15は結腸(粘膜 内層)、16は末梢血白血球、17は胎児脳、18は胎児肺、19は胎児肝臓、20は胎児腎臓、21は急性白血病 HL-60、22はHela細胞S3、23は慢性骨髄性白血病 K-562、24はリンパ芽球性 白血病 MOLT-4、25はバーキットリンフォーマ Raji、26は大腸腺癌SW480、27は肺癌A549、28は黒色腫G361を示す。転写産物の大きさは図の右に示した。
【図１３】図１３は、BAZ1βSとBAZ1βLの可変部分の整列を示す。
【図１４】図１４は、BAZ1βSと他の３つのBAZファミリーとのN末端側のアミノ酸配列のアラインメントを示す。配列の相同性が50%以上のものを濃影のboxで、類似性が50%以上のものを薄影のboxで示した。保存されているLXXLL モチーフおよびC4HC3ジンクフィンガーはアラインメントの上に記載した。LXXLL モチーフの周辺領域に保存されているロイシン残基を特記した。ブロモドメインモチーフの位置はアラインメントの上に黒線で示した。
【図１５】図１５は、BAZ1βSと他の３つのBAZファミリーとのアミノ酸配列のアラインメントの図１４の続きを示す。
【図１６】図１６は、BAZ1βSと他の３つのBAZファミリーとのアミノ酸配列のアラインメントの図１５の続きを示す。
【図１７】図１７は、BAZ1βSと他の３つのBAZファミリーとのアミノ酸配列のアラインメントの図１６の続きを示す。
【図１８】図１８は、BAZ1βSと他の３つのBAZファミリーとのアミノ酸配列のアラインメントの図１７の続きを示す。
【図１９】図１９は、BAZ1βの染色体地図を示す。Ａはモノクロモソームハイブリッド細胞系パネル解析によるBAZ1bの第７染色体へのマッピングを示す。GM10791の細胞系においてプライマーnb3Sとプライマーnb3Tを用いたPCRにより156 bpの産物の増幅がみられた。なお、図中の「1」〜「Y」までの番号は染色体番号を示す。ＢはGeneBridge 4 放射ハイブリッドパネル解析による第７染色体上のBAZ1bの領域座決定を示す。BAZ1βの領域座は7q11-21のマーカーD7S489 と D7S669との間であることが 判明した。
【図２０】図２０は、BAZ1βの正常組織における発現の解析を示す。Ａ．BAZ1βプローブは広範な組織において２つの転写産物にハイブリダイズした。なお、1は心臓、2は脳、3は 胎盤、4は肺、5は肝臓、6は骨格筋、7は腎臓、8は膵臓、9は脾臓、10は胸腺、11は前立腺、12は精巣、13は子宮、14は小腸、15は結腸(粘膜内層)、16は末梢血白血球を示す。Ｂ．Ａと同一のブロットをアクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
【図２１】図２１は、発現クローンによってカバーされたBAZ2βの範囲を示す。保存ドメイン(影)およびLXXLLモチーフ(黒の線)を示した。ドメインの最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を図の上に示した。クローン１はアミノ酸1-190に渡り、クローン9はアミノ酸1241-1584に渡り、クローン11は、アミノ酸1500-1970に渡る。
【図２２】図２２は、GSTタンパク質のSDS-PAGE分析を示す電気泳動写真である。1は細胞溶解物(BAZ2β.1)、2は素通り(BAZ2β.1); 3は精製融合タンパク質(BAZ2β.1)、4は細胞溶解物(BAZ2β.11)、5は細胞溶解物(BAZ2β.9)、6は素通り(BAZ2β.11)、7は素通り(BAZ2β.9)、8は精製タンパク質(BAZ2β.11)、9は精製タンパク質(BAZ2β.9)を示す。サイズマーカーの位置(kDal)を右に示した。
【図２３】図２３は、精製したGST融合タンパク質のウェスタン解析を示す電気泳動写真である。レーン1はGST、レーン2はGST-BAZ2β.1、レーン3はGST-BAZ2β.9、レーン4はGST-BAZ2β.11を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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