(57)【要約】【課題】バラ亜目に属する植物に対し、安定した土壌病害防除効果を生起することのできる土壌病害の予防方法、及び、同予防方法により微生物を感染させた果樹、並びに、土壌病害を防除するための資材を提供する。【解決手段】本発明に係る土壌病害の予防方法では、ミクロスフェロプシス属に属する微生物（受託番号：NITE P-513）の菌体、胞子、産生物の少なくともいずれか１つを含有する微生物資材を、バラ亜目の果樹の根に内生または含浸させることとした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロスフェロプシス属に属する微生物（受託番号：NITE P-513）の菌体、胞子、産生物の少なくともいずれか１つを含有する微生物資材を、バラ亜目の果樹の根に内生または含浸させる土壌病害の予防方法。
【請求項２】
前記果樹は、バラ科(Rosaceae)、カキノキ科(Ebenaceae)、ミカン科(Rutaceae)、ブドウ科(Vitaceae)のいずれかに属する果樹であることを特徴とする請求項１に記載の土壌病害の予防方法。
【請求項３】
前記果樹は、台木と穂木とを接ぎ木したものであって、前記台木はバラ科(Rosaceae)、カキノキ科(Ebenaceae)、ミカン科(Rutaceae)、ブドウ科(Vitaceae)のいずれかに属することを特徴とする請求項１に記載の土壌病害の予防方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の土壌病害の予防方法により、前記微生物を感染させた果樹。
【請求項５】
ミクロスフェロプシス属に属する微生物（受託番号：NITE P-513）の菌体、胞子、産生物の少なくともいずれか１つを含有する土壌病害を防除するための資材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌病害の予防方法及び同予防方法により微生物を感染させた果樹並びに土壌病害を防除するための資材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、植物の病原菌の一つとして、根部に感染して生育を阻害したり、枯死させる土壌病原菌の存在が知られている。
【０００３】
この土壌病原菌は、感染した植物が枯死した後でも、土壌中に存在して土壌汚染を引き起こすため、特に作物にあっては、一度感染すると多大な被害をもたらすとともに、後年の作付けにも影響を及ぼすこととなる。
【０００４】
そこで、キャベツ・ハクサイ・カブ等のアブラナ科の野菜の根部に予め感染させておくことにより、根こぶ病を防除することのできるヘテロコニウム属に属する根部エンドファイトが提案されている。
【０００５】
このヘテロコニウム属に属する根部エンドファイトによれば、アブラナ科の植物が根こぶ病に感染するのを防止することができ、また、根こぶ病の防除に要する農薬の量を減らすことができるとしている。
【特許文献１】ＷＯ９８／４２８２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来のヘテロコニウム属に属する根部エンドファイトでは、アブラナ科の植物の根部に感染することはできるものの、ナシやリンゴ、モモ、カキ、ビワ、ミカン、ブドウ等の果樹の根部には定着することができず、果樹の土壌病害を防止することができなかった。
【０００７】
すなわち、ヘテロコニウム属に属する根部エンドファイトは、その宿主特異性のため、多くの果樹が属するバラ亜目の根部に感染することができず、果樹に発症する土壌病原菌由来の病害を防止することができなかった。
【０００８】
本発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、バラ亜目に属する植物に対し、安定した土壌病害防除効果を生起することのできる土壌病害の予防方法、及び、同予防方法により微生物を感染させた果樹、並びに、土壌病害を防除するための資材を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明に係る土壌病害の予防方法では、ミクロスフェロプシス（microsphaeropsis）属に属する微生物（受託番号：NITE P-513）の菌体、胞子、産生物の少なくともいずれか１つを含有する微生物資材を、バラ亜目の果樹の根に内生または含浸させることとした。
【００１０】
また、次の点にも特徴を有する。
（１）前記果樹は、バラ科(Rosaceae)、カキノキ科(Ebenaceae)、ミカン科(Rutaceae)、ブドウ科(Vitaceae)のいずれかに属する果樹であること。
（２）前記果樹は、台木と穂木とを接ぎ木したものであって、前記台木はバラ科(Rosaceae)、カキノキ科(Ebenaceae)、ミカン科(Rutaceae)、ブドウ科(Vitaceae)のいずれかに属すること。
【００１１】
また、本発明に係る果樹では、請求項１〜３いずれか１項に記載の土壌病害の予防方法により、前記微生物を感染させることとした。
【００１２】
また、本発明に係る土壌病害を防除するための資材では、ミクロスフェロプシス属に属する微生物（受託番号：NITE P-513）の菌体、胞子、産生物の少なくともいずれか１つを含有することとした。
【発明の効果】
【００１３】
請求項１に記載の土壌病害の予防方法では、ミクロスフェロプシス属に属する微生物（受託番号：NITE P-513）の菌体、胞子、産生物の少なくともいずれか１つを含有する微生物資材を、バラ亜目の果樹の根に内生または含浸させることとしたため、バラ亜目に属する果樹の土壌病害に由来する生育障害を防止することができる。
【００１４】
また、請求項２に記載の土壌病害の予防方法では、前記果樹は、バラ科(Rosaceae)、カキノキ科(Ebenaceae)、ミカン科(Rutaceae)、ブドウ科(Vitaceae)のいずれかに属する果樹であることとしたため、食用として生産される果実の多くが属するこれらの科の果樹を土壌病害から守ることができる。
【００１５】
また、請求項３に記載の土壌病害の予防方法では、前記果樹は、台木と穂木とを接ぎ木したものであって、前記台木はバラ科(Rosaceae)、カキノキ科(Ebenaceae)、ミカン科(Rutaceae)、ブドウ科(Vitaceae)のいずれかに属することとしたため、食用として生産される果実の多くが属するこれらの科の果樹を、接ぎ木の利点を生かしながら、土壌病害から守ることができる。
【００１６】
また、請求項４に記載の果樹では、請求項１〜３いずれか１項に記載の土壌病害の予防方法により、前記微生物を感染させることとしたため、土壌病害に強い果樹とすることができる。
【００１７】
また、請求項５に記載の土壌病害を防除するための資材では、ミクロスフェロプシス属に属する微生物（受託番号：NITE P-513）の菌体、胞子、産生物の少なくともいずれか１つを含有することとしたため、バラ亜目に属する果樹の土壌病害に由来する生育障害を防止できる資材を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、ミクロスフェロプシス属に属する微生物（受託番号：NITE P-513）の菌体、胞子、産生物の少なくともいずれか１つを含有する微生物資材を、バラ亜目の果樹の根に内生または含浸させる土壌病害の予防方法を提供するものである。
【００１９】
換言すると、バラ亜目に属する植物の根部に内生し、前記植物の土壌病害を抑制する根部エンドファイトを提供するものである。
【００２０】
すなわち、バラ亜目に属する植物の根部に、土壌病害菌の感染を防止したり、土壌病害菌の生育を阻害する根部エンドファイトを予め接種しておくことにより、前記植物に土壌病害の耐性能を付与するようにしている。
【００２１】
したがって、バラ亜目の植物が土壌病害を受けることを防いだり、バラ亜目の植物に感染した土壌病害菌の生育を阻害することができる。
【００２２】
ここで、本明細書において、「根部エンドファイト」とは、植物の根の内部をすみかとする微生物を指す。根部エンドファイトは、一般的には、植物と共生関係にあり、植物に病気を引き起こさない微生物である。
【００２３】
このような根部エンドファイトは、後述する本発明に係る根部エンドファイトのスクリーニング方法によって得ることができ、たとえば、ミクロスフェロプシス（Microsphaeropsis）属に属する微生物とすることができる。
【００２４】
このミクロスフェロプシス属に属する根部エンドファイトは、バラ亜目の根部に内生可能であって、同バラ亜目の植物に病害を発現することがない種や菌株であれば、特に限定されるものではなく、例えば、本発明者らが独自に分離し、「JPR-05-3-2-21株」と命名して独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託した寄託番号:NITE P-513等を用いることができる。
【００２５】
根部エンドファイトとして使用する菌株は、JPR-05-3-2-21株の突然変異株や遺伝子操作を行った株であっても、バラ亜目の根部に内生可能であって、同バラ亜目の植物に病害を発現することがなければ適用可能であることは勿論である。
【００２６】
根部エンドファイトは、バラ亜目に属する多年生の果樹の根部に予め内生させるようにしても良い。
【００２７】
すなわち、一般に食される果実は、バラ亜目に属するものが多く、本発明に係る土壌病害の予防方法をバラ亜目の多年生果樹に適用することにより、JPR-05-3-2-21株を果樹の根部に内生させ、同果樹を土壌病害から守ることができ、多くの果実に対して、病害による収穫減少を防止することができる。
【００２８】
また、多年生の果樹に接種することにより、一年以上の期間に亘って、果樹の根部に根部エンドファイトを内生させることができる。
【００２９】
特に、前記果樹は、バラ科(Rosaceae)、カキノキ科(Ebenaceae)、ミカン科(Rutaceae)、ブドウ科(Vitaceae)のいずれかに属する果樹とすることにより、ナシやリンゴ、モモ、カキ、ビワ、ミカン、ブドウ等の多くの果実を、果樹の土壌病害から守ることができる。
【００３０】
ところで、作物として育成される果樹は、一般に病害等への耐性を獲得するために、根部を有する台木と、台木上に接がれる穂木とで接ぎ木を行う場合がある。
【００３１】
このような場合であっても、台木がバラ科、カキノキ科、ミカン科、ブドウ科のいずれかに属するものであれば、接ぎ木によって作られた新たな果実に対しても根部エンドファイトの土壌病害防除効果を生起させることができ、同果実が土壌病害により減収するのを防止することができる。
【００３２】
すなわち、根部エンドファイトは、接ぎ木を行っていない正木の自根に内生させても良く、また、接ぎ木した果樹の根部に内生させても良い。
【００３３】
上述してきたように、根部エンドファイトは、根部に内生することによりバラ亜目に属する植物の土壌病害を防除することが可能であるが、特に、土壌病害の中でも、白紋羽病に対して優れた防除効果を示す。
【００３４】
すなわち、本発明に係る土壌病害の予防方法によれば、白紋羽病菌（Rosellinia necatrix）によって発病する白紋羽病に対して防除効果を生起することができる。
【００３５】
また、本発明に係る土壌病害の予防方法で使用するミクロスフェロプシス属に属する微生物は、多年生木本植物の根部に内生し、前記多年生木本植物の土壌病害を抑制する根部エンドファイトのスクリーニング方法であって、洗浄した前記根部を７０％エタノールに浸漬する第１殺菌工程と、同第１殺菌工程を経た根部をTween 20と、次亜塩素酸ナトリウムとを含有する水溶液に浸漬する第２殺菌工程とを有し、前記第２殺菌工程を経た根部を培地に接触させて内生菌を培養し、同内生菌より前記根部エンドファイトを選抜することにより得ることができる。
【００３６】
すなわち、採取した多年生木本植物の根部の表層部近傍のみを殺菌するために、まず、第１殺菌工程で７０％エタノールに浸漬し、次いで、第２殺菌工程でTween 20と、次亜塩素酸ナトリウムとを含有する水溶液に浸漬するようにしている。
【００３７】
したがって、第１殺菌工程で、エタノールが根部表面の気泡などを除いて表面に浸透し表層部近傍に存在する標的外の微生物を殺菌することができ、しかも、第２殺菌工程で、Tween 20が界面活性剤として根部表面の気泡などを取り除くとともに次亜塩素酸ナトリウムを根部表面に浸透させ、次亜塩素酸ナトリウムにより根部の表層部近傍に存在する標的外の微生物を良好に殺菌することができる。
【００３８】
次に、本発明に係る土壌病害の予防方法、及び、同予防方法により微生物を感染させた果樹、並びに、前記土壌病害を予防するための資材について、より詳細に説明する。まずは、次の実施例１で、根部エンドファイトの分離手順について説明する。
【実施例１】
【００３９】
〔１．土壌病原菌の育成培地の検討〕
本実施形態に係る土壌病原菌として、白紋羽病菌（Rosellinia necatrix ES-9601菌株）を使用した。
【００４０】
この白紋羽病菌は、まず、１cmに切ったナシ枝と水道水をバイオポットに入れてオートクレーブ処理して調製した枝培地で培養し、25℃で保存した。
【００４１】
次いで、この白紋羽病菌の培養に適した培地を検討すべく、ジャガイモ煎汁寒天培地（PDA培地）、V8培地、素寒天培地の３種について検討を行った。
【００４２】
まず、直径9 cmの無菌シャーレに、滅菌処理したPDA培地[ジャガイモ200 g、グルコース20 g、寒天15 g／蒸留水（DW）1 l ]、または、V8培地 [ V8ジュース 200 ml、CaCO3 3 g、寒天15 g、DW 800 ml (pH 7.2) ]、または、素寒天培地を流し込み、固化させてPDA平板培地、V8平板培地、素寒天平板培地を調製した。
【００４３】
そして、それぞれの平板培地に、枝培地の白紋羽病菌を接種し、1週間ごとの白紋羽病菌の生育をコロニー直径の計測によって調べ、白紋羽病菌の生育に適する培地の検討を行った。
【００４４】
その結果、表１に示すように、PDA平板培地、V8平板培地、素寒天平板培地のいずれでも、培地による生育の差は見られず、白紋羽病菌の生育が確認された。そこで、以下、白紋羽病菌の培地として、内生糸状菌の分離と培養に用いたPDA培地を用いることとした。
【００４５】
【表１】
2009249317.tif 000002
〔２．内生糸状菌の分離〕
次に、バラ亜目に属する植物の根部より、土壌病害菌（白紋羽病菌）に対す防除能を生起する菌株を探索すべく、内生糸状菌の分離を行った。
【００４６】
本実施形態では、バラ亜目に属する植物として、鳥取大学の3ヶ所で育成中のニホンナシ（Pyrus pyrifolia var. culta 品種：二十世紀）の各台木（マンシュウマメナシ：P. betulaefolia, ニホンヤマナシ：P. pyrifolia, マメナシ：P. calleryana）を選択し、内生糸状菌の分離を試みた。
【００４７】
まず、各台木より根部を複数本切り出し、土を洗い流すべく水で洗浄し、得られた根部の長さを１cmに切断し、根部の殺菌を行った。
【００４８】
根部の殺菌は、第１殺菌工程と第２殺菌工程とよりなり、第１殺菌工程では、70%エタノールに１分間浸漬を行った。
【００４９】
次に、第２殺菌工程として、0.1％Tween 20を加えた0.5％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に20〜25分間浸し、表面を十分に殺菌した。
【００５０】
そして、第１及び第２殺菌工程を経た根を、クリーンベンチ内で滅菌水により十分に水洗し、滅菌ろ紙で水分をふき取り、PDA平板培地上に載置した。
【００５１】
同PDA平板培地を、インキュベーター内で25℃、３〜７日培養後、根内部から培地上に発生した糸状菌の一部を別のPDA平板培地上に移植し、３〜４回植え継ぐことによって内生糸状菌の分離を行った。
【００５２】
なお、ここで内生糸状菌の分離に際し、PDA平板培地上に細菌の混在が多く確認される場合は、内生糸状菌の分離を効率化すべく、PDA平板培地中に、硫酸ストレプトマイシン（明治製菓社製）を100〜200 ppm添加しても良い。
【００５３】
このようにして、台木の根より内生糸状菌の分離操作を行った結果、合計297株の内生糸状菌が分離された。
〔３．白紋羽病菌に対する抗菌性を示す内生糸状菌株の選抜〕
次に、分離した内生糸状菌297菌株のうち、白紋羽病菌の生育を抑制可能な内生糸状菌株の選抜を行った。
【００５４】
すなわち、分離した内生糸状菌と白紋羽病菌とを、それぞれPDA平板培地上で対峙培養し、白紋羽病菌の生育を抑制する菌株について調べた。
【００５５】
本実施形態における対峙培養は、分離した内生糸状菌株と白紋羽病菌とを、シャーレ(直径９cm)内のPDA平板培地上に６cm離してそれぞれ接種し、25℃で培養することで行った。
【００５６】
また、白紋羽病菌に対する抗菌性の判別は、分離した内生糸状菌株と白紋羽病菌との間に形成される阻止帯や阻止縁を、１ヶ月間に亘って観察することにより行った。
【００５７】
なお、本明細書中において阻止帯とは、分離した内生糸状菌株が白紋羽病菌と接することなく成長を抑制することで形成されるものをいい、阻止縁とは、分離した内生糸状菌株と白紋羽病菌とが接しながら成長を抑制しているものをいう。
【００５８】
その結果、分離した内生糸状菌株のほぼ半数に当たる菌株に、活性に差があるものの白紋羽病菌の菌糸伸長を阻害する効果が見られた。
【００５９】
また、１ヵ月以上に亘って阻止縁または阻止帯を維持する内生糸状菌株として、表２に示すＡ〜Ｋの11菌株を分離し、それぞれ、Ａ株をJPR-05-3-2-9、Ｂ株をJPR-05-3-2-11、Ｃ株をJPR-05-3-2-17、Ｄ株をJPR-05-3-2-20、Ｅ株をJPR-05-3-2-21、Ｆ株をJPR-05-3-3-7、Ｇ株をJPR-05-5-1-6、Ｈ株をJPR-05-5-1-21、Ｉ株をJPR-05-5-3-14、Ｊ株をJPR-05-5-3-20、Ｋ株をJPR-05-7-1-16と命名し、これらの菌株を土壌病害菌を防除可能な根部エンドファイト（以下、単に根部エンドファイトという）とした。
【００６０】
【表２】
2009249317.tif 000003
〔４．根部エンドファイトの形態学的同定〕
次に、分離した根部エンドファイトを、PDA平板培地に接種して培養し、菌糸や形成された胞子などの形態を光学顕微鏡で観察し、文献と比較することで根部エンドファイトの形態学的同定を行った。
【００６１】
なお、得られたＡ〜Ｋの11菌株の根部エンドファイトのうち、Ｂ〜Ｋの10菌株については形態学的同定を行ったが、Ａ株については培養時において、形態観察に重要な胞子を形成しなかったため、形態学的同定は行わなかった。
【００６２】
その結果を、表３に示す。
【００６３】
【表３】
2009249317.tif 000004
Ｂ菌株は培地上ではベージュ色の菌叢で、胞子は新月形で透明、数個の横隔壁が存在する大型分生胞子および数個が連鎖した厚膜胞子も観察された。大型分生胞子サイズは20〜35 × 5〜6 μmであり、胞子の両端以外の細胞は肥大した形態であった。これは文献（樋浦 1979 、宇田川 1986、久能2002）に記載されているFusarium sp.の形態と一致した。
【００６４】
Ｃ菌株は培地上で赤紫色または紫色の菌叢で、胞子はＢ菌株と同じく新月形で無色の大型分生胞子および無色で単胞の楕円形の小型分生胞子が観察された。厚膜胞子は単生で、他のFusarium sp. に比べてわずかしか観察できなかった。また、胞子を形成している分生子形成細胞、菌糸細胞内部に紫色の色素含有物も観察された。胞子サイズは大型分生胞子が50〜88 × 3〜5 μmとＢ菌株の胞子よりも大きく細長く、胞子の形状は滑らかな新月状であった。小型分生胞子は10〜15 × 4〜5 μmであった。これは文献（樋浦1979 、宇田川 1986、久能 2002）に記載されているFusarium sp.の形態と一致した。
【００６５】
Ｄ菌株は培地上では紫色の菌叢で、胞子はＢおよびＣ菌株とよく似た無色で横隔壁のある新月形の大型分生胞子、無色で単胞の楕円形の小型分生胞子および単生の厚膜胞子が観察された。また、胞子を形成した分生子形成細胞、菌糸細胞内部に紫色の色素含有物も観察された。胞子サイズは大型分生胞子が45〜70 × 3〜5 μmで、Ｃ菌株に酷似した細長く滑らかな新月状であった。小型分生胞子は10〜15 × 3〜4 μmであった。これは文献（樋浦1979 、宇田川 1986、久能 2002）に記載されているFusarium sp.の形態と一致した。
【００６６】
Ｅ菌株は培地上ではベージュの菌叢上に小さな黒い粒を形成した。柄子殻が形成され、その内壁に円錐状の突起を形成し、その先端に柄胞子を形成した。柄胞子は楕円で茶色く、胞子内に丸い中壁があった。胞子サイズは4〜6 × 3〜4 μmであった。これは文献（Sutton 1980）に記載されているConiothyrium sp., Microsphaeropsis sp. または Cytoplea sp. の形態と一致した。そこで、さらに検討したところ、Ｅ菌株は分生子が平滑であり、いぼ状突起を有する分生子によって特徴付けられるConiothyrium属およびCytoplea属とは異なる特徴を有していることから、平滑な分生子を有する種が所属するMicrosphaeropsis属に属するものと考えられた。
【００６７】
Ｆ菌株の菌叢は培地上では赤色の菌叢で、胞子は無色で横隔壁のある新月形の大型分生胞子および数個が連鎖した厚膜胞子が観察された。小型分生胞子は観察されなかった。大型分生胞子の形態はＢ、ＣおよびＤ菌株とは若干異なり、隔壁が明瞭で湾曲が大きく、胞子サイズは大型分生胞子が20〜30 × 3〜4 μmと小さかった。これは文献（樋浦1979 、宇田川 1986、久能 2002）に記載されているFusarium sp.の形態と一致した。
【００６８】
Ｇ菌株は培地上では黒色の綿毛状で、こげ茶で球形の分生胞子を形成した。分生胞子が形成される分生子形成細胞も観察された。分生胞子サイズは直径8〜10.5 μmで、脆く厚い壁に覆われ、表面は滑らかであった。これは文献（Domsch et al. 1980）に記載されているHumicola sp. の形態と一致した。
【００６９】
Ｈ菌株は培地上ではベージュ色の菌叢上に小さな黒褐色の粒を形成し、球形で透明の胞子を形成した。胞子サイズは2〜3 μmであった。しかし、有性世代が観察できず、本菌の属の同定には至らなかった。なお、この菌株は文献（Domsch et al. 1980）に記載されている分生子果菌綱（Coelomycetes）の形態と一致した。
【００７０】
Ｉ菌株は培地上では白色の粒状でまれに橙色および黄色の粒も形成した。菌糸は無色、脆く厚い子のうおよび楕円形で表面に微細な突起を持つ子のう胞子を形成した。子のう胞子サイズは4〜4.5 × 2.5〜3 μmであった。これは文献（Domsch et al. 1980）に記載されているTalaromyces sp. (Plectomycetes) の形態と一致した。
【００７１】
Ｊ菌株は培地上では白色で、胞子は無色の球形であった。胞子サイズは3〜5 μmであった。これは文献（Domsch et al. 1980）に記載されているAcremonium sp.の形態と一致した。
【００７２】
Ｋ菌株は培地上では白い羊毛状の菌糸上に黒い粉が撒かれたような状態で生育した。分生胞子は暗褐色〜黒色の偏円状で、赤道面にスリットを形成した。分生胞子サイズは直径5.5〜8.0 μmで厚さは約3 μmであった。これは文献（Domsch et al. 1986）に記載されているArthrinium sp. の形態と一致した。
〔５．根部エンドファイトの遺伝学的同定〕
次に、分離した根部エンドファイトＡ〜Ｋ菌株について、遺伝学的同定（分子系統分類）を試みた。
【００７３】
本実施形態における遺伝学的同定は、rRNA遺伝子の18Sサブユニットをコードする領域と、25Sサブユニットをコードする領域との間に存在するITS(internal transcribed spacer)領域の塩基配列と、既知微生物のITS領域塩基配列との相同性を調べることにより行った。
【００７４】
具体的には、分離した根部エンドファイトのＡ〜Ｋ株のそれぞれから、ゲノムDNAを抽出し、精製した後に同ゲノムＤＮＡ中のITS領域を、ＰＣＲ法により増幅し標的ＤＮＡを得た。
【００７５】
そして、ＰＣＲ法によって得られた標的ＤＮＡについて、ダイターミネーター法によるシークエンス解析を行い、塩基配列の決定を行った。
【００７６】
また、決定したDNAの塩基配列をBLAST searchに供し、ホモロジー検索（相同性検索）を行った。その結果を表４に示す。
【００７７】
【表４】
2009249317.tif 000005
表４に示すように、分離した根部エンドファイト中、Ａ菌株はThielavia intermediaとPodospora sp.に対してそれぞれ95％、94％の相同性を示した。
【００７８】
Ｂ菌株はFusarium sp.に、中でもFusarium equisetiに対して99％の高い相同性を示した。
【００７９】
Ｃ菌株およびＤ菌株はFusarium oxysporumに対して、それぞれ99%、100%という高い相同性を示した。
【００８０】
Ｅ菌株はConiothyrium sp. に99％、Coniothyrium sporulosum に97％、Microsphaeropisis sp. に98％の高い相同性を示した。本Ｅ菌株は、前述の形態学的特徴を踏まえて、Microsphaeropisis属に属する菌株であると同定した。
【００８１】
Ｆ菌株はGibberella acuminataとFusarium sporotrichioidesに対しそれぞれ99％、98％という高い相同性を示した。
【００８２】
Ｇ菌株はHumicola griseaとThielavia terricolaにそれぞれ95％の相同性を示した。
【００８３】
Ｈ菌株はApodus oryzaeとZopfiella latipesに96％、Cercophora appalachianensisに97％の相同性を示した。なお、これらはいずれもソルダリア目に属する。
【００８４】
Ｉ菌株はTalaromyces sp.とTalaromyces trachysperumsに99％という高い相同性を示した。
【００８５】
Ｋ菌株はArthrinium sp.とArthrinium sacchariに98％の高い相同性を示した。
【００８６】
なお、Ｊ菌株はPCR反応で標的ＤＮＡを増幅することができず、ITS領域の塩基配列の決定を行うことができなかったため、遺伝学的同定には至らなかった。
〔６．胞子発芽率の測定〕
次に、分離した根部エンドファイトの胞子発芽率について測定を行った。
【００８７】
まず、滅菌した蒸留水に各根部エンドファイトの胞子を懸濁し、この胞子懸濁液を１mlずつ遠沈管に分注し、800×gで５分間遠心分離することにより胞子の洗浄を行った。
【００８８】
次いで、滅菌蒸留水中に胞子を懸濁し、Thoma氏血球計（Erma社製）を用いて胞子濃度を１×10５個／mlに調整した後、プラスチックシャーレ上に50 μlずつ滴下し、25℃、暗下で培養した。
【００８９】
12時間及び24時間培養後、光学顕微鏡で胞子発芽を観察し、次式により胞子発芽率を求めた。なお、検定は３反復行った。
【００９０】
胞子発芽率＝ (発芽した胞子数/総胞子数) ×100
その結果、表５に示すように、24時間経過後にＢ〜Ｆ株で90％を越える良好な胞子発芽率が見られた。
【００９１】
【表５】
2009249317.tif 000006
〔７．ポット接種試験〕
次に、分離した根部エンドファイトＡ〜Ｋ株のうち、胞子発芽率の高いＢ〜Ｆ株について、ポット接種試験を行った。
【００９２】
本実施形態に係るポット接種試験では、バラ亜目に属する植物に、予め根部エンドファイトＢ〜Ｆ株をそれぞれ接種しておき、次いで、１週間後に白紋羽病菌を接種して、前記植物の生育状況を観察することにより、各菌株の土壌病害防除能の検証を行った。
【００９３】
また、ポット接種試験では、白紋羽病菌のみを接種したもの、及び、各根部エンドファイトＢ〜Ｆ株のみを接種したものをコントロールとして、前記植物の生育状況の比較を行った。
【００９４】
本実施形態において行ったポット接種試験について、以下、更に詳細に説明する。
１）供試植物
供試植物には、バラ亜目に属する植物として、ニホンナシ台木のマンシュウマメナシ（Pyrus betulifolia）を用いた。
【００９５】
このマンシュウマメナシは、次のようにして無菌的に育成されたものである。
【００９６】
まず、樹上で成熟させた果実を2005年11月に鳥取大学付属大塚農場で採集し、果実を潰し、果皮や果肉を洗い流し、種子を得た。
【００９７】
次に、バイオポットに保存した種子を取り出し、湿らせた滅菌砂を入れた上に間隔をあけて並べ、さらにその上を湿らせた滅菌砂で覆い、低温処理をするため、1ヶ月間、4℃で遮光保存した。
【００９８】
なお、種子は、播種前に砂を流水でよく水洗した後、70%エタノールに1分間、0.1% Tween 20を加えた0.5% 次亜塩素酸ナトリウムに5分間浸し表面殺菌を行い、滅菌水で洗浄後、滅菌土（種まき培土、タキイ）に播種した。
【００９９】
その後、グロースキャビネット内で23℃、12時間の光周期で無菌的に生育させた。播種後10ヶ月のマンシュウマメナシを実験に用いた。
２）根部エンドファイトの接種
根部エンドファイトＢ〜Ｆ株から得られた胞子を、それぞれ滅菌水に懸濁し、この胞子懸濁液を10４個／mlおよび10５個／mlに調整して後述する内生糸状菌資材を調製した。
【０１００】
そして、この内生糸状菌資材をセルトレー（72穴）に無菌生育させたマンシュウマメナシ実生苗株元に10mlづつ滴下することで、接種を行った。
【０１０１】
その後、毎日１個体につき５mlずつ蒸留水を与えながら、１週間、グロースキャビネット内で23℃、12時間の光周期で生育させた。
３）白紋羽病菌の接種
白紋羽病菌に汚染した土を調整すべく、おがくず培地（おがくずと水道水をバイオポットに入れてオートクレーブ処理したもの）に生育させた白紋羽病菌を滅菌土（種まき培土、タキイ社製）に濃度50%（w／w）となるよう混合した。
【０１０２】
次いで、白紋羽病菌感染土をバイオポットに入れ、根部エンドファイト接種後一週間経過したマンシュウマメナシ実生を移植した。
【０１０３】
その後、毎日1個体につき15 mlずつ蒸留水を与え、霧吹きで加湿条件にして、グロースキャビネット内で25℃、12時間の光周期で生育させた。
【０１０４】
そして、白紋羽病菌接種から3週間に亘って、ナシ実生の変化を観察するとともに、実生の白紋羽病発病程度を外観から評価した。その結果を、表６及び表７に示す。
【０１０５】
なお、表６及び表７中、「白紋羽病菌の接種」の欄の、＋は白紋羽病菌を接種したことを、−は白紋羽病菌を接種していないことを示している。
【０１０６】
また、表６及び表７中、「発病度合」の欄の、＋＋は葉の黄化を伴う枝枯れや立ち枯れが見られたことを示し、＋は葉の黄化が見られたことを示し、−は病状が見られなかったことを示している。
【０１０７】
表６は、１×104個／mlの濃度に調製したＢ〜Ｆの各菌株の胞子を含有する内生糸状菌資材を、苗株元に10mlづつ滴下して接種したマンシュウマメナシの外観評価結果を示している。
【０１０８】
【表６】
2009249317.tif 000007
表６からも分かるように、根部エンドファイトを接種せずに白紋羽病菌に感染させたコントロールに比して、Ｂ〜Ｆの根部エンドファイトを接種したマンシュウマメナシは、全て病態の軽減が見られた。
【０１０９】
また、Ｂ〜Ｆの根部エンドファイトの中でも、特にＥ株及びＦ株で顕著な病態の軽減効果が見られた。
【０１１０】
このことから、分離された根部エンドファイトは、バラ亜目の植物に対し、土壌病害の軽減が可能であることが示された。
【０１１１】
次に、１×105個／mlの濃度に調製したＢ〜Ｆの各菌株の胞子を含有する内生糸状菌資材を、苗株元に10mlづつ滴下して接種したマンシュウマメナシの外観評価結果を表７に示す。
【０１１２】
【表７】
2009249317.tif 000008
表７からも分かるように、さらに胞子濃度の濃い内生糸状菌資材を接種することにより、Ｄ〜Ｆ株においてより顕著な病態の軽減効果が見られ、中でも、E株については、その効果が安定していた。
【０１１３】
一方、白紋羽病菌のみを接種した試験区（根部エンドファイト未接種）において、白紋羽病菌によるナシ実生葉の黄化が見られ、中には葉の一部に枯死またはしおれが見られるものもあった。
【０１１４】
上述の結果より、分離した根部エンドファイトには、土壌病害の防除効果を有することが示された。
【０１１５】
特に、Ｅ株（JPR-05-3-2-21）については、病態の軽減効果が安定しており、バラ亜目に属する植物に対し、安定した土壌病害防除効果を生起することのできる土壌病害の予防方法に最も適した微生物であると言える。
【０１１６】
また、このＥ株は、前述の予防方法により微生物を感染させた果樹や、土壌病害を防除するための資材とすることにより、バラ亜目に属する植物に対し、安定した土壌病害防除効果を生起させることができる。
【実施例２】
【０１１７】
次に、土壌病害を防除するための微生物資材について詳細に述べる。本明細書中において、微生物資材は、大別すると、菌体自体を含有する内生糸状菌資材と、菌体から分泌される分泌物を含有する内生糸状菌分泌物資材とがある。なお、内生糸状菌資材と内生糸状菌分泌物資材の混合物についても、微生物資材の概念に含まれるものであるのは勿論である。
【０１１８】
微生物資材は、実施例１で述べた根部エンドファイトである菌株Eを、バラ亜目に属する植物の根部に感染させるための資材としても使用できるものである。
【０１１９】
したがって、内生糸状菌資材は、根部エンドファイトとして機能する微生物であるミクロスフェロプシス属に属する微生物（受託番号：NITE P-513）が賦活可能な状態で含有されていれば良い。
【０１２０】
すなわち、内生糸状菌資材に含まれる微生物は、賦活可能な胞子や菌糸の状態とすることができる。
【０１２１】
また、これらの胞子や菌糸は、乾燥状態、湿潤状態、冷凍状態、冷蔵状態のいずれであっても良いが、好ましくは、各微生物の性状に応じて長期保存が可能な状態とするのが良い。
【０１２２】
このような状態を有する内生糸状菌資材の具体例を以下に述べる。
〔内生糸状菌資材例１〕
ＰＤＡ平板培地上で培養した根部エンドファイトを培地上から掻き取り、同根部エンドファイトの菌糸体をミキサーで細片化し滅菌水に懸濁して、液状の内生糸状菌資材とした。
〔内生糸状菌資材例２〕
ＰＤＢ（PDA培地から寒天を除いたもの）培地に、根部エンドファイトを接種し、静置またはエアレーションしながら培養を行い、所定時間経過後、菌糸体をミキサーで細片化し滅菌水に懸濁して、液状の内生糸状菌資材とした。
〔内生糸状菌資材例３〕
ＰＤＡ平板培地上で根部エンドファイトを培養し、胞子を形成させた後、同胞子を回収して滅菌水に懸濁して液状の内生糸状菌資材とした。
〔内生糸状菌資材例４〕
ＰＤＡ液体培地で培養した根部エンドファイトの菌糸体または胞子を、フリーズドライ法またはＬ−乾燥法にて粉末化し、粉体の内生糸状菌資材とした。
【０１２３】
上述した内生糸状菌資材例１〜４で調製した内生糸状菌資材を予め果樹に感染させ、次いで、果樹に白紋羽病菌を接種してその病態を確認したところ、Ｅ菌株（JPR-05-3-2-21）において、土壌病害防除効果を確認することができた。
【実施例３】
【０１２４】
次に、微生物資材としての内生糸状菌分泌物資材について詳細に述べる。
【０１２５】
本発明に係る資材は、実施例１で述べた根部エンドファイトが分泌した、土壌病害菌に抗菌性を示す分泌物（以下、抗菌性分泌物という）を含有させて、バラ亜目に属する植物の根部に散布して土壌病害を防除するための資材として用いるようにしても良い。
【０１２６】
すなわち、抗菌性分泌物を含有する本発明に係る資材は、根部エンドファイトが分泌した抵抗性分泌物が抗土壌病害菌活性を有する状態で含有されていれば良い。
【０１２７】
また、抗菌性分泌物を含有する内生糸状菌分泌物資材は、乾燥状態、湿潤状態、冷凍状態、冷蔵状態のいずれであっても良いが、好ましくは、抵抗性分泌物の性状に応じて、抵抗性分泌物が安定した状態で長期保存可能であることが望ましい。
【０１２８】
このような状態を有する内生糸状菌分泌物資材の具体例を以下に述べる。
〔内生糸状菌分泌物資材例１〕
ＰＤＡ平板培地上で培養した根部エンドファイトを培地上から掻き取り後、使用した培地を滅菌水に懸濁して、液状の内生糸状菌分泌物資材とした。
〔内生糸状菌分泌物資材例２〕
ＰＤB培地に、根部エンドファイトを接種し、静置またはエアレーションしながら培養を行い、所定時間経過後、同培養液を濾過滅菌し、得られた濾液を液状の内生糸状菌分泌物資材とした。
〔内生糸状菌分泌物資材例３〕
ＰＤB培地に、根部エンドファイトを接種し、静置またはエアレーションしながら培養を行い、所定時間経過後、同培養液を濾過滅菌し、得られた濾液をフリーズドライ法またはＬ−乾燥法にて粉末化し、粉体の内生糸状菌分泌物資材とした。
〔内生糸状菌分泌物資材例４〕
ＰＤB培地に、根部エンドファイトを接種し、静置またはエアレーションしながら培養を行い、所定時間経過後、同培養液を濾過滅菌し、得られた濾液を冷凍し、凍結した内生糸状菌分泌物資材とした。
【０１２９】
上述した内生糸状菌分泌物資材例１〜４で調製した内生糸状菌分泌物資材を予め果樹に含浸させ、次いで、果樹に白紋羽病菌を接種してその病態を確認したところ、Ｅ株（JPR-05-3-2-21）において、土壌病害防除効果を確認することができた。
【０１３０】
上述してきたように、本発明に係る土壌病害の予防方法によれば、バラ亜目に属する植物の根部に感染させることにより、土壌病害を効果的に防除することができる。
【０１３１】
しかも、根部エンドファイトをバラ亜目に属する果樹の根部に感染させることにより、多くの果樹を土壌病害から守り、果実の収穫効率を飛躍的に向上させることができる。
【０１３２】
また、内生糸状菌分泌物資材によれば、必ずしもバラ亜目に属する植物の根に根部エンドファイトを感染させなくとも、前記植物の根部を内生糸状菌分泌物資材に接触させたり、前記植物が生育する土壌中に内生糸状菌分泌物資材を散布することにより、土壌病害菌防除効果を生起することができる。
【０１３３】
最後に、上述した各実施の形態の説明は本発明の一例であり、本発明は上述の実施の形態に限定されることはない。このため、上述した各実施の形態以外であっても、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲であれば、設計等に応じて種々の変更が可能であることは勿論である。
【０１３４】
例えば、実施例１で示した土壌病害菌は、白紋羽病菌（Rosellinia necatrix ES-9601菌株）を使用しているが、これに限定されるものではなく、例えば紫紋羽病菌など、根部エンドファイトが防除可能な土壌病害菌全てを含むものである。
【０１３５】
また、例えば、実施例１のポット接種試験では、バラ亜目に属する植物としてマンシュウマメナシを用いているが、これに限定されるものではなく、バラ亜目に属する多年生植物・一年生植物・木本植物・草本植物等を含むものである。
【０１３６】
また、例えば、実施例２または実施例３において、根部エンドファイトの培地にＰＤＡ培地やＰＤＢ培地を使用しているが、これに限定されるものではなく、根部エンドファイトが生育可能な培地であれば使用可能であることは言うまでもない。