(57)【要約】【課題】大腸菌の尿路細胞壁への付着を低減させるスノキ属抽出物及びその抽出物の製造法の開発。【解決手段】抽出物の乾燥残分に対してプロシアニジンＣ１当量として表わして、少なくともプロアントシアニジン１５重量％を含む、スノキ属の植物から得られる抽出物で、スノキ属の植物がオオミツルコケモモ又はアメリカンクランベリーである。当該抽出物の調製法として、オオミツルコケモモ又はアメリカンクランベリーを水溶液に入れ、固液分離を行い、有機溶媒を加え、そののち生成物を乾燥する方法を開発した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出物の乾燥残分に対してプロシアニジンＣ１当量として少なくともプロアントシアニジン１５重量％を含む、スノキ属の植物から得られる抽出物。
【請求項２】
スノキ属の植物がオオミツルコケモモ又はアメリカンクランベリーである、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
アメリカンクランベリーのベリーを使用する、請求項１及び２のいずれかに記載の抽出物。
【請求項４】
当該プロアントシアニジンの平均重合度が５より大きい、請求項１から３のいずれかに記載の抽出物。
【請求項５】
当該プロアントシアニジンの平均重合度が６より大きい、請求項４に記載の抽出物。
【請求項６】
当該プロアントシアニジンの平均重合度が８より大きい、請求項５に記載の抽出物。
【請求項７】
当該アメリカンクランベリーを水溶液に入れ、固液分離を行い、有機溶媒を加え、そののち当該抽出物を得るために生成物を乾燥する、請求項１から６のいずれかに記載の抽出物の調製方法。
【請求項８】
二回目の乾燥を行う、請求項７に記載の抽出物を調製する方法。
【請求項９】
当該有機溶媒がアルコールである、請求項７及び８のいずれかに記載の抽出物の調製方法。
【請求項１０】
当該アルコールがエタノールである、請求項９に記載の抽出物の調製方法。
【請求項１１】
当該有機溶媒がアルデヒドである、請求項７及び８のいずれかに記載の抽出物の調製方法。
【請求項１２】
当該アルデヒドがアセトアルデヒドである、請求項１１に記載の抽出物の調製方法。
【請求項１３】
当該有機溶媒がエステルである、請求項７及び８のいずれかに記載の抽出物の調製方法。
【請求項１４】
当該エステルが酢酸エチルである、請求項１３に記載の抽出物の調製方法。
【請求項１５】
当該溶媒が水溶液のクランベリー量に対して容量で０から１５の比率である、請求項７から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項７から１４に記載の方法で得られるべき、請求項１から６のいずれかに記載の抽出物。
【請求項１７】
請求項１から６及び１６のいずれかに記載の抽出物を含有する、規定食又は栄養補助食品。
【請求項１８】
尿路の壁へある種の大腸菌の付着の低減に寄与するための、請求項１から６及び１６のいずれかに記載の抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スノキ属から採れる抽出物及びこの抽出物を得る方法に関する。このプロアントシアニジンに富む抽出物は規定食又は健康補助食品の調製品として使用できる。
【背景技術】
【０００２】
オオミツルコケモモ（アメリカンクランベリー）は小さくて、おおよそ３０ｃｍを超えない匍匐性低木で、カロライナからカナダの北アメリカ東部のみに自然に生えている。これは痩せてそして湿地土壌上において、泥炭性湿原、原野又は針葉樹林の間に繁茂する。果実は直径１０から２０ｍｍ程度の小さなベリーである。熟すと、その色は鮮赤色で、その味は少し酸味があり、収れん性がある。
【０００３】
アメリカンクランベリーは北アメリカでは数百年に亘って、食物として普通に食されてきた。これは毒性で知られたような成分を疑わせる量は含有せず、その摂取による事故は報じられていない。通常の量にては好ましからざる影響は殆どない。臨床研究において語られる有害効果の主な理由を消化器系障害が占めている。ジュースの摂取が極端に過剰（１日当たり３〜４リットル）な場合に起こり、そして特に下痢及び胃腸痛が起こる（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  Ｍ．等、Ｔｈｅ  ＡＢＣ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｈｅｒｂｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｔａｎｉｃａｌ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，２００３，ｐｐ．７３〜８３）。
【０００４】
アメリカンクランベリーはフラボノイド及び特に食用植物ではあまり見られない化合物の種類であるＡ型プロアントシアニジンオリゴマーに富んでいるのが特徴である。
【０００５】
縮合型タンニン又はプロアントシアニジンは、カテキン、エピカテキン及びその誘導体のようなフラバノール単位の重合フェノール化合物である。
【０００６】
当該ベリーの治療上の使用に関する報告の最初は１７世紀まで遡ると考えられる。アメリカインディアンは傷の上に湿布の形で適用したとみられる。そののち、航海者及び開拓者たちは壊血病の予防及び循環器系と肝疾患、胃痛、発熱など種々の症状の治療に使用した（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ等、２００３）。アメリカンクランベリーの尿路感染治療での使用は百年より前に米国で見られる文献にて言及されている。
【０００７】
１９８４年には、１４日間マウスにアメリカンクランベリーを経口投与すると、尿が大腸菌の尿路感染株の尿道上皮細胞への付着を強く阻止できるようになることが発見された（Ｓｏｂｏｔａ  Ａ．Ｅ．，クランベリージュースによる細菌付着の阻止：尿路感染の治療への使用可能性，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１９８４，１３１，５，１０１３〜６）。
【０００８】
スノキ属の他の種、殊にビルベリー（ブルーベリー）において高濃度のプロアントシアニジンを有する画分は同じような活性を持つと考えられる（Ｈｏｗｅｌｌ  Ａ．Ｂ．等、クランベリーからのプロアントシアニジン抽出物によるＰ繊毛大腸菌の尿道上皮細胞表面への付着の阻止、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９８，３３９，１５，１０８５；クランベリー及びブルーベリージュースの抗大腸菌付着活性、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１、３２４，２２，１５９９）。
【０００９】
プロアントシアニジンに富んだオオミツルコケモモベリー抽出物の尿路疾患性大腸菌の尿道上皮細胞への付着を阻止する能力はインビトロで１０から５０μｇ／ｍｌの間の濃度で見られる（Ｈｏｗｅｌｌ等、１９９８）。
【００１０】
カナダで実施された研究では、ジュースの味を幾らかの患者は好まないので、アメリカンクランベリーの乾燥ジュースを含有する錠剤形状が、治療で良い結果をもたらすにはクランベリージュースより好ましいと考えられた（Ｓｔｏｔｈｅｒｓ  Ｌ．，女性における尿道感染に対する予防として自然療法クランベリー製品の効果と費用対効果を評価する無作為試験、Ｃａｎ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．，２００２，９，３，１５５８〜６２）。
【００１１】
しかしながら、これら錠剤が低プロアントシアニジン用量であると１日当たりの数個の錠剤を取らねばならず、この治療が長びくことになる。
【００１２】
２００４年４月６日の２００３−ＳＡ−０３５２の見解では、Ａｇｅｎｃｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅ  Ｓｅｃｕｒｉｔｅ  Ｓａｎｉｔａｉｒｅ  ｄｅｓ  Ａｌｉｍｅｎｔｓ（ＡＦＳＳＡ）（食品安全に関するフランスの政府機関）は以下の要求を認めた：“Ｌｅ  ｊｕｓ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｅ  ｏｕ  ｌａ  ｐｏｕｄｒｅ  ｄｅ  ｊｕｓ  ｄｅ  ｆｒｕｉｔｓ  ｄｅ  Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｅ  ａ  ｄｉｍｉｎｉｕｅｒ  ｌａ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｄｅ  ｃｅｒｔａｉｎｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｅｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｕｒ  ｌｅｓ  ｐａｒｏｉｓ  ｄｅｓ  ｖｏｉｅｓ  ｕｒｉｎａｒｉｒｅｓ”（オオミツルコケモモの果実の濃縮ジュース又はジュース粉末はある種の大腸菌の尿路壁への付着を阻止するのに寄与する）。そこで、ＡＦＳＳＡは請求の範囲“ｃｏｎｔｒｉｂｕｅ  ａ  ｄｉｍｉｎｕｅｒ  ｌａ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｄｅ  ｃｅｒｔａｉｎｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｅｓ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｓｕｒ  ｌｅｓ  ｐａｒｏｉｓ  ｄｅｓ  ｖｏｉｅｓ  ｕｒｉｎａｉｒｅｓ”（ある種の大腸菌の尿路壁への付着を減少させることに寄与する）は、新鮮／冷凍クランベリー及びクランベリーのピューレにつき、少なくとも３６ｍｇのプロアントシアニジンを供与する製品量を毎日消費すれば受け入れできると見なしている（ＡＦＳＳＡ、２００７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、クランベリーに基づく組成物に関して残されている要求は、当該患者にとって摂取する製品の味又は摂取する錠剤数に関し重すぎるなどの観点からの治療での制限なしにヒトが１日用量で摂取するのが容易で、前記の毎日の治療を続けるのを容易にするほどプロアントシアニジンに富むことである。
【００１４】
当該出願人は本発明の主題を構成する新規スノキ属抽出物を開発した。
【００１５】
本発明の主題は同様にこの画分を得る方法である。
【００１６】
他の主題は、規定食又は栄養価を高めた栄養補助食品としての、この抽出物の応用にある。
【００１７】
他の主題は、当該説明及び以下の実施例を読むことで明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明による抽出物はスノキ属の植物から得られ、当該抽出物の乾燥重量に対してプロシアニジンＣ１当量として表わして、少なくともプロアントシアニジン重量１５％を含んでいる。
【００１９】
好ましくは、当該スノキ属がオオミツルコケモモ又はアメリカンクランベリーである。当該抽出物は好ましくはこの植物のベリーから得られる。
【００２０】
好ましくは、この抽出物は、当該抽出物の乾燥重量に対して当該果実より得た蔗糖を５％より多く含有する。
【００２１】
好ましくは、この抽出物は５より大きいプロアントシアニジンの平均重合度を有する（これはタンニン鎖の平均長さを称する）。より好ましくは、この重合度は６より大きい。更により好ましくは、本発明の抽出物中のプロアントシアニジンの平均重合度は８より大である。
【００２２】
好ましくは、このクランベリー抽出物はクランベリージュースのものと同一のアントシアニン量を保つ。
【００２３】
本発明によるプロアントシアニジンに富む抽出物を製造する方法は、当該クランベリーのアントシアニンの比率を変化させないので、当該クランベリー抽出物の特徴はそれゆえ処置前のジュースに近似したままである。
【００２４】
本発明による抽出物を製造する方法は、当該アメリカンクランベリー果実を水溶液中に入れて置き、そこで固液分離を行い、その中に有機溶媒を添加し、そののち得られた生成物を脱水して本発明の抽出物を得るという特徴がある。
【００２５】
好ましくは、当該水溶液のｐＨは２と６の間であり、温度は９５℃未満であり、そして圧力は１と３気圧の間である。
【００２６】
場合により、水性抽出相中に亜硫酸塩又はメタ重亜硫酸塩を当該水溶液の容量の０．０１と１％の間、好ましくは０．３％の濃度で添加する。亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カルシウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム又はメタ重亜硫酸カリウムを使用してよい。
【００２７】
その抗酸化及び防腐作用により、当該亜硫酸塩又はメタ重亜硫酸塩は、当該製造工程において本発明による抽出物の活性を保つのに役立つ。
【００２８】
好ましくは、当該固液分離はｐＨ２から７、温度１５から７０℃の間及び１から１５気圧の間にて行われる。
【００２９】
好ましくは、当該有機溶媒は水溶液中のクランベリーの容量に対して、容量で０から１５の比率で添加される。
【００３０】
好ましくは、使用される有機溶媒はアルコール、アルデヒド又はエステルである。
【００３１】
より好ましくは、添加される有機溶媒はエタノール、アセトアルデヒド又は酢酸エチルである。
【００３２】
得られる生成物は好ましくは減圧下、即ち１気圧以下、６０℃未満の温度で脱水する。
【００３３】
場合により、最終的脱水工程は温度８０から１９０℃及び０．５から２気圧の間の圧力で行う。
【００３４】
本発明の抽出物は上記方法で得られる。
【００３５】
上記方法により得られるような、前述の特徴を有するこのアメリカンクランベリー抽出物は、規定食又は栄養価を高めた栄養補助食品として使用することができる。
【００３６】
本発明によるプロアントシアニジンに富む抽出物は細菌、より具体的には大腸菌の尿路壁表面への付着を防止するという特徴を有する。
【００３７】
本発明の主題は同じく、とりわけ上記プロアントシアニジンに富む抽出物を含んでいる組成物である。
【００３８】
本発明による組成物は摂取できる。投与の手法に従って、本発明による組成物は栄養補助分野の食品で通常使用される全ての形状にて提供される。
【００３９】
本発明による組成物は特にゼラチンカプセル、錠剤、粉末又は飲料の形で提供される。
【００４０】
本発明の栄養補助食品又は規定食組成物は、その目的に応じた応用に従って従来のやり方で処方される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、試験を行ったクランベリー抽出物及び使用した細菌（ＤＨ５α菌株＝標準菌株、菌株５と６＝尿路感染性菌株）の機能に従って吸光度として表わしたプレートへの付着細菌量を示す（０＝抽出物なし、バッチ９０３０＝Ｄｉａｎａ  Ｎａｔｕｒａｌｓ社からのＡＦＣＡＮＮ  ９０３０抽出物，バッチＡ４１２４Ａ＝市販で得られる抽出物）。
【００４２】
以下の実施例は、本発明を例示しているが、どのような形でも本発明を制限することはない。
【実施例１】
【００４３】
実施例１：本発明によるＡＦＣＡＮＮ９０３０抽出物を製造する方法
水５部当たりベリー１部の量である水相中の溶液にアメリカンクランベリーを入れて置く。擂り潰し、２５℃にて傾斜法で固液分離をしたのち、水相中にクランベリー１部当たり酢酸エステル５部の量の酢酸エチルを、温度２０℃、ｐＨ４．５，圧力１気圧にて添加し、そののち得られた二層を分離する。その後、０．１から０．５気圧の減圧、３０から４０℃の温度にて脱水し、その後二回目の脱水を圧力０．９から１．５気圧、温度１４５℃で実施した。
【００４４】
得られたＡＦＣＡＮＮ９０３０生成物は紫色粉末である。
【実施例２】
【００４５】
実施例２：得られたＡＦＣＡＮＮ９０３０抽出物中のプロアントシアニジンの分析
プロアントシアニジン分析用のＰｏｒｔｅｒ改良のＢａｔｅ−Ｓｍｉｔｈ法を使用した（Ｂａｔｅ−Ｓｍｉｔｈ  Ｅ．Ｃ．Ｐｈｙｔｈｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７３，１２，ｐｐ９０７〜９１２及びＰｏｒｔｅｒ．Ｌ．Ｊ．等、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８６，２５，２２３〜２３０）。
【００４６】
当該分析の反応は２工程で行う。最初、フラバン−３−オール重合体をブタノール−塩酸培質中で加水分解する。当該加水分解を完了させ、カテキン及びエピカテキン型の単量体が放出される。二番目の分析段階はＦｅＩＩＩの作用のもとでこれらの単量体を酸化することにある。当該酸化生成物はシアニジンであり、分光光度計を用い５４１ｎｍで定量する。
【００４７】
Ｂａｔｅ−Ｓｍｉｔｈ試薬は濃度３５％のＨＣｌを５００ｍＬ、ｎ−ブタノールを５００ｍＬ及びＦｅ２（ＳＯ４）３を１５０ｍｇ混合して調製する。
【００４８】
アメリカンクランベリー抽出物１００ｍｇを脱塩水とエタノールの重量比１：１の混合物１００ｍＬに溶解する。この溶液２ｍＬを第一の管中でＢａｔｅ−Ｓｍｉｔｈ試薬６ｍＬと混合する。当該溶液の半分を第二の管に移す。第一の管は暗所に置くが、第二の管は１００℃の水浴上で３０分間加熱し、そののち暗所で１０分間放置する。２本の管の吸光度値（ＯＤ）の測定は脱イオン水をブランクとして５４１ｎｍで実施する。
【００４９】
結果は以下の式によりプロアントシアニジンＣ１当量として表わした。
【数１】
2009249384.tif 000002
【００５０】
ＡＦＣＡＮＮ９０３０抽出物のプロアントシアニジン濃度の測定はプロアントシアニジンＣ１当量として表わすと３０％±２である。
【００５１】
プロアントシアニジンの定量は、当初培質中に存在するアントシアニンを考慮し、これらのアントシアニンによる吸光度をＰｏｒｔｅｒ反応後の吸光度の読みから差し引くということに注意しなければならない。
【実施例３】
【００５２】
実施例３：実施例１（ＡＦＣＡＮＮ９０３０）の抽出物の特徴
【００５３】
【表１】
2009249384.tif 000003
【実施例４】
【００５４】
実施例４：実施例１（ＡＦＶＡＮＮ９０３０）で得られた抽出物の組成
チオアシドリシスは、プロアントシアニジン含量及びプロアントシアニジンの平均重合度を測定できるようにする他の方法である（Ｇｕｙｏｔ等、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，１９９８，１６９８〜１７０５）。
【００５５】
当該方法も酸培質（ＨＣｌ）中でのプロアントシアニジン重合体の加水分解に基づいている。反応培質中に存在するα−トルエンエチオールが加水分解で放出された単量体と反応し、生成した化合物を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量する。
【００５６】
【表２】
2009249384.tif 000004
【実施例５】
【００５７】
実施例５：本発明による抽出物の生体膜への付着試験
本試験では付着の陰性対照として繊毛を持たないＤＨ５α細菌株を使用した。細菌株５及び６は臨床的単離で得た尿路感染症大腸菌株である。
【００５８】
当該菌株は３７℃にてＣＦＡ培地中で培養した。この培養用培地の組成は次の通りである：カザミノ酸１０ｇ（Ｄｉｆｃｏ社）、酵母エキス１．５ｇ、ＭｇＳＯ４０．０５ｇ及びＭｎＣｌ２０．００５ｇを脱イオン水１リットルに加える。
【００５９】
各細菌株について、菌株のみ、又は３０％のプロアントシアニジン含有の本発明によるバッチＡＦＣＡＮＮ９０３０（Ｄｉａｎａ  Ｎａｔｕｒａｌｓ社）からのクランベリー、又は３％のプロアントシアニジン含有のバッチＡ４１２４Ａからのクランベリー（市販試料）のどちらか存在下で試験をする。当該クランベリー試料はプロアントシアニジン濃度５００μｇ／ｍＬが得られるように調製するが、これはバッチ９０３０の１６．７ｍｇ又はバッチＡ４１２４Ａの１６７ｍｇを水１０ｍＬに希釈する。これらの溶液はそののち、当該試験を行うために水で１０倍に希釈する。
【００６０】
試験をする細菌の一夜培養物を使用し、この培養物の０．２ｍＬを、試験をするクランベリー試料の添加有り無しの９６穴マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に入れ、更に水で５倍に希釈する。各試験は３回実施する。培養物についての陰性対照としては、試験するそれらのクランベリー試料のいずれも入っていないＣＦＡ培地を入れた。
【００６１】
当該マイクロプレートを３５℃で２４時間、培養器中に入れて置いた。
【００６２】
次の日、当該培養用培地を除き蒸留水で穴を洗浄したのち、２００μＬのメタノールを各穴に１５分間加えた。メタノールを取除いたのち、当該プレートを３０分間培養器中で乾燥する。次いで、クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ社）２００μＬを１０分間加える。当該染色剤を取除き、蒸留水で洗浄したのち、２００μＬの酢酸／エタノール（容量／容量）溶液を生成した生体膜を脱色するために加える。分光光度計にて波長５７０ｎｍの読み取りをする。光学濃度が高ければ高いほど、当該プレートに付着する細菌の量が多い。
【００６３】
図１の結果は、試験を行った本発明による抽出物は抽出物Ａ４１２４Ａより光学濃度が低いので、試験を行った細菌に関わらずバッチＡ４１２４Ａより細菌のプレート穴への付着が少ないことを示す。ところで、当該培養培地中のプロアントシアニジン濃度は本発明による抽出物とＡ４１２４Ａ抽出物での試験では同じである。当該培養培地に同じ濃度で存在するプロアントシアニジンによるマイクロプレートへの細菌の付着阻止効果は、それゆえ当該プロアントシアニジン濃度が同等であっても本発明による抽出物がＡ４１２４Ａより高い。そこで、本発明による抽出物中に存在するプロアントシアニジンは質量で同じ濃度のＡ４１２４Ａ抽出物より細菌の付着阻止において高い効果を有する。
【００６４】
この市販抽出物（バッチＡ４１２４Ａ）は、３又は４程度のプロアントシアニジンの平均重合度を有する（これは平均タンニン鎖長を意味する）。更に、本発明による抽出物は８．１のプロアントシアニジンの平均重合度を有する。
【００６５】
そこで、これらの結果から本発明によるクランベリー抽出物中にあるプロアントシアニジンの平均重合度が穴表面への尿路疾患性細菌の付着に関与していると推定することができる。そこで、本発明による抽出物は市販の製品Ａ４１２４Ａと比べて強化した抗付着効能を有している。
【実施例６】
【００６６】
実施例６：ゼラチンカプセル形成の実施例
全体で２５０ｍｇのゼラチンカプセル一つを製造するには、以下のものを混合する：
−当該抽出物の乾燥残分に対してプロシアニジンＣ１当量で表して１５％のプロアントシアニジンの力価を有する本発明による抽出物２４０ｍｇ、
−マイクロクリスタリンセルロース１０ｍｇ。
各ゼラチンカプセルはプロアントシアニジン３６ｍｇを含有する。
【実施例７】
【００６７】
実施例７：ゼラチンカプセル形成の実施例
全体で３００ｍｇのゼラチンカプセル一個を製造するには、以下のものを混合する：
−ＡＦＣＡＮＮ９０３０抽出物２００ｍｇ（当該抽出物の乾燥残分に対してプロシアニジンＣ１当量として表して３０．５％のプロアントシアニジンの力価を有する）、
−マイクロクリスタリンセルロース１００ｍｇ。
各ゼラチンカプセルはプロアントシアニジン６１ｍｇを含有する。
【実施例８】
【００６８】
実施例８：本発明による飲料の例
【００６９】
【表３】
2009249384.tif 000005
【００７０】
飲料を調製するには、この粉末化組成物２２ｇを水の最終量５００ｍＬに混合する。攪伴すれば、強いラズベリー味を有する飲料が直ちに飲めるようになる。
【００７１】
この飲料の一日割当量５００ｍＬは、プロアントシアニジン４５ミリグラムを提供する。
【図１】
2009249384.tif 000006
【外国語明細書】
2009249384000001.pdf