(57)【要約】【課題】ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１に対する新規のモノクローナル抗体と、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。【解決手段】ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１の細胞外ドメインの立体構造を認識することを特徴とする抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体。前記細胞外ドメイン内の細胞外ループの立体構造を認識するものである構成、前記細胞外ループが細胞外第２ループである構成、及び、ヒスタミン受容体タイプ１に結合することにより、前記ヒスタミン受容体タイプ１が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を促進することができる構成が推奨される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１の細胞外ドメインの立体構造を認識することを特徴とする抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記細胞外ドメイン内の細胞外ループの立体構造を認識するものである請求項１に記載の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体。
【請求項３】
前記細胞外ループは、細胞外第２ループである請求項２に記載の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体。
【請求項４】
ヒスタミン受容体タイプ１に結合することにより、前記ヒスタミン受容体タイプ１が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を促進することができる請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体。
【請求項５】
H１-99 1.5x106 cells 080328（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５６２）により産生される請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
H１-99 1.5x106 cells 080328（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５６２）である請求項６に記載のハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体、並びに、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。本発明の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体は、医薬品開発等に有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面上の膜受容体タンパク質は、細胞外の情報を細胞内へ伝達する極めて重要な働きをしている。そのため、膜受容体タンパク質に結合する物質はアゴニスト型医薬品やアンタゴニスト型医薬として候補物質となる。膜受容体タンパク質の中でも特にＧタンパク質共役型受容体（G protein-coupled receptor；ＧＰＣＲ）は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。また、ＧＰＣＲの約半数が、生体内で機能しているナチュラルリガンドが同定されていないオーファンＧＰＣＲであり、ナチュラルリガンドやその類縁化合物が新規医薬品の候補物質として期待されていることから、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングが熾烈を極めている。
【０００３】
ＧＰＣＲは、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。すなわち、ＧＰＣＲの細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループ、細胞外第２ループ、および細胞外第３ループから構成されている。同様に、ＧＰＣＲの細胞内ドメインは、細胞内第１ループ、細胞内第２ループ、細胞内第３ループ、およびＣ末端ドメインから構成されている。
【０００４】
ヒスタミン受容体はＧＰＣＲの一種であり、４種類のサブタイプ（タイプ１〜４）が見出されている。ヒスタミン受容体タイプ１は、Ｇｑ／ホスホリパーゼＣと共役し、イノシトールリン酸の蓄積、Ｃａ2+の動員を引き起こす受容体であり、種々の平滑筋、副腎髄質、血管内皮および脳に分布する（非特許文献１）。ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１（以下、「ｈＨ１Ｒ」と略記することがある。）は４８７個のアミノ酸からなり、そのＮ末端ドメイン、各細胞外ドメイン、各細胞内ドメイン、およびＣ末端ドメインに相当する部位が特定されている。
【０００５】
受容体に結合する抗体がアゴニストやアンタゴニスト、さらにアロステリックモジュレータとして機能する場合があり、医薬品候補として注目されている。ｈＨ１Ｒに対する抗体については、細胞内第３ループ又はＣ末端ドメインを認識するモノクローナル抗体がすでに取得され、市販されている。しかし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のいずれにおいても、ｈＨ１Ｒの細胞外ドメインの立体構造を特異的に認識するものは取得されていない。したがって、ｈＨ１Ｒに結合することによってｈＨ１Ｒが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を促進することができる機能を備えた抗体も取得されていない。なお、受容体等の膜タンパク質の立体構造を認識する抗体を発現するハイブリドーマを効率的に製造する方法について、特許文献１に開示がある。
【特許文献１】特開２００６−００６２５０号公報
【非特許文献１】生化学辞典（第４版），東京化学同人，２００７年１２月１０日，ｐ．１０６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、新たな医薬品開発等に有用なヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１に対する新規のモノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に記載の発明は、ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１の細胞外ドメインの立体構造を認識することを特徴とする抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体である。
【０００８】
本発明の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体は、ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１の細胞外ドメインの立体構造を認識することを特徴とするものである。本発明のモノクローナル抗体は、ヒスタミン受容体タイプ１の細胞外ドメインに関係する疾病、例えば、糖尿病における創傷治癒、精神疾患等の治療薬の開発に有用である。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、前記疾病の診断や、ヒスタミン受容体タイプ１の免疫測定法の構築にも有用である。なお、立体構造を保持した細胞外ドメインは、天然（native）のヒスタミン受容体タイプ１（すなわち、活性型のヒスタミン受容体タイプ１）が該当し、例えば、生きた細胞の表面に存在する。
【０００９】
前記細胞外ドメイン内の細胞外ループの立体構造を認識するものである構成が推奨される（請求項２）。
【００１０】
前記細胞外ループが細胞外第２ループである構成も推奨される（請求項３）。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、ヒスタミン受容体タイプ１に結合することにより、前記ヒスタミン受容体タイプ１が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を促進することができる請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体である。
【００１２】
かかる構成により、ヒスタミン受容体タイプ１のアロステリックモジュレータとなり得るモノクローナル抗体が提供される。
【００１３】
H１-99 1.5x106 cells 080328（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５６２）により産生される構成が推奨される（請求項５）。
【００１４】
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００１５】
本発明はハイブリドーマに係るものであり、上記した本発明の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体を産生することを特徴とする。本発明のハイブリドーマは、細胞外ドメインの立体構造を認識する抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体の製造に有用である。
【００１６】
H１-99 1.5x106 cells 080328（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５６２）である構成が推奨される（請求項７）。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体は、ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１の細胞外ドメイン、特に細胞外ループに関係する疾病の治療薬開発に有用である。また、ヒスタミン受容体タイプ１の細胞外ループに関係する疾病の診断や、ヒスタミン受容体タイプ１の免疫測定法の構築にも有用である。
【００１８】
本発明のハイブリドーマは、本発明の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体の製造に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００２０】
まず、ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１（ｈＨ１Ｒ）の構造について説明する。
前述したように、ｈＨ１ＲはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ｈＨ１Ｒをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ｈＨ１Ｒのアミノ酸配列も知られている。配列番号３にｈＨ１Ｒ遺伝子の塩基配列と該塩基配列に対応するアミノ酸配列を、配列番号４にアミノ酸配列のみを示す。
【００２１】
ｈＨ１Ｒの疎水性モデルにより一般的に考えられている構造によれば、ｈＨ１Ｒの各ドメインは、配列番号４に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当する。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。
【００２２】
１〜  ２６：Ｎ末端ドメイン
５０〜  ６４：細胞内第１ループ
８８〜１０１：細胞外第１ループ
１２５〜１４５：細胞内第２ループ
１６９〜１８９：細胞外第２ループ
２１３〜４２４：細胞内第３ループ
４４８〜４５０：細胞外第３ループ
４７４〜４８７：Ｃ末端ドメイン
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１の細胞外ドメインの立体構造を認識するものである。本発明のモノクローナル抗体を製造する方法としては、公知の方法をそのまま採用することができ、例えばケーラーとミルシュタインの細胞融合法を基礎として製造することができる。概説すれば、ｈＨ１Ｒに対する免疫応答が誘導されたマウス等の動物の脾臓細胞とミエローマとを融合してハイブリドーマの集団を作製し、該ハイブリドーマの集団から所望のモノクローナル抗体を産生するものを選抜する。そして、選抜したハイブリドーマを培養し、その培養物から所望のモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【００２４】
ｈＨ１Ｒに対する免疫応答を誘導する方法としては、動物にｈＨ１Ｒタンパク質を接種する一般的なタンパク免疫の手法によってもよいし、動物にｈＨ１Ｒ遺伝子を投与する遺伝子免疫の手法によってもよい。遺伝子免疫によれば、ｈＨ１Ｒの全長をコードする遺伝子を用いることにより、全長のｈＨ１Ｒを免疫原に用いたのと同様の状況を作り出すことができる。さらに、発現したｈＨ１Ｒが動物体内で天然（native）の状態（活性型の状態）で存在できるので、ｈＨ１Ｒの立体構造に特異的な免疫応答が誘導されやすい。また遺伝子免疫の手法によれば、ｈＨ１Ｒ遺伝子さえ入手できれば行うことができ、精製されたｈＨ１Ｒを準備する必要がない。
【００２５】
遺伝子免疫の場合には、動物に接種する遺伝子として、シャペロニンをコードする遺伝子とｈＨ１Ｒをコードする遺伝子との融合遺伝子を用いてもよい。当該融合遺伝子を用いた遺伝子免疫の方法については、国際公開第２００６／０４１１５７号パンフレットにその詳細が記載されている。
【００２６】
融合遺伝子を動物に投与する際には、融合遺伝子が発現ベクターに組み込まれ、プロモーターの制御下にある状態で投与することが好ましい。発現ベクターの例としては、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐＡｄＶａｎｔａｇｅ、ｐＴｒｉＥＸ、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳが挙げられる。また、発現ベクター上のプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＡＭＬプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。さらに、発現ベクターには、プロモーター活性を増強するエンハンサーを含めてもよい。またさらに、発現ベクターには、ＣｐＧモチーフを含めてもよい。
【００２７】
融合遺伝子を動物に投与する方法としては、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射等が挙げられる。またパーティクルガンによる投与も適用可能である。また投与量としては、用いる発現ベクターやプロモーターの種類等に応じて適宜決定すればよいが、１回当たりおおむね１〜３ｍｇ／ｋｇ体重で、これはマウスの場合は２５〜１００μｇ／回になる。また投与の回数は、１回でもよいが、一定間隔をおいて複数回行う方がより高い免疫応答を誘導することができる。
【００２８】
タンパク免疫によって動物に免疫応答を誘導する場合には、一般的に行われている方法をそのまま採用することができる。例えば、精製したｈＨ１Ｒを用意し、アジュバントとの混合液を調製する。この混合液をマウス等に皮下注射し、ｈＨ１Ｒに対する免疫応答を誘導する。必要に応じて、間隔をあけて複数回投与し、追加免疫してもよい。またシャペロニン融合タンパクを免疫してもよい。
【００２９】
免疫される動物としては特に限定はないが、好ましくは、マウスが用いられる。これにより、マウス由来のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３０】
ハイブリドーマの作製は、ケーラーとミルシュタインの方法によって行うことができる。すなわち、上記した手順で遺伝子免疫あるいはタンパク免疫され、ｈＨ１Ｒに対する免疫応答が誘導された動物から脾臓を摘出し、脾臓細胞を採取する。そして、脾臓細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマの集団を作製する。ハイブリドーマの選抜は、例えば、ＨＡＴ選択培地を用いて行うことができる。また、ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法により行うことができる。このようにして、ｈＨ１Ｒの細胞外ドメインの立体構造を認識する抗ｈＨ１Ｒモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜ならびにクローニングすればよい。なお、本発明の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５６２として独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託されている。
【００３１】
そして、選抜ならびにクローニングされたハイブリドーマを培養することにより、前記の性質を有する抗ｈＨ１Ｒモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマの培養は、動物の腹腔内で行ってもよく、ディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。インビトロで培養する場合には、その培養液からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【００３２】
モノクローナル抗体の精製については、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて行うことができる。モノクローナル抗体のサブクラスがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
【００３３】
本発明の抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体は、種々の用途に使用できる。例えば、ｈＨ１Ｒに対するアゴニストとして、医薬品開発に応用することができる。すなわち、ｈＨ１Ｒが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を促進することにより、糖尿病の創傷治療に応用することができる。また、本発明のモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の構造を特定し、キメラ化あるいはヒト化すれば、より安全性が高い医薬品とすることができる。また本発明のモノクローナル抗体は、低分子医薬のスクリーニング用試薬、組織切片・細胞等を用いたヒスタミン受容体タイプ１局在検証用研究試薬、組換えヒスタミン受容体タイプ１発現細胞調製用検査試薬、ヒスタミン受容体タイプ１の結晶構造解析用研究試薬、等の用途にも使用できる。
【００３４】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
（１）ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１遺伝子の単離
ヒト肺ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号３に示す塩基配列を有するヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１（ｈＨ１Ｒ）遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ａ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ａには、プライマーに由来して、５’末端にＮｈｅＩサイト、３’末端にＳａｌＩサイトが導入された。また、同様にして配列番号１及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号３に示す塩基配列を有するｈＨ１Ｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｂ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｂには、プライマーに由来して、５’末端にＮｈｅＩサイト、３’末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＳａｌＩサイトが導入された。
【００３６】
（２）ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子の単離
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（ノバジェン社）からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。次に、精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号８に示す塩基配列を有するＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｃ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｃには、プライマーに由来して、５’末端にＳａｌＩサイト、３’末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。
【００３７】
（３）ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１とＧｒｏＥＬサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vector（プロメガ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ａを挿入した。さらに、この発現ベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｃを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＨ１Ｒ・ＧｒｏＥＬを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＨ１Ｒ・ＧｒｏＥＬは、ｈＨ１Ｒをコードする遺伝子とＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子との融合遺伝子を有している。一方、同様にして、哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vectorを制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＨ１Ｒを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＨ１ＲはｈＨ１Ｒ遺伝子のみを有している。
【００３８】
（４）ヒト由来ヒスタミン受容体タイプ１安定発現細胞の作製
（３）で構築したｐＣＩ−ｈＨ１Ｒ・ＧｒｏＥＬを鋳型とし、配列番号１及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＨ１Ｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＮｈｅＩ−ＸｈｏＩサイトに導入し、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＨ１Ｒを構築した。
【００３９】
Lipofectamin溶液３７．５μＬと、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬと、２０μｇのｐＣＩｎｅｏ−ｈＨ１Ｒを含むＯＰＴＩ―ＭＥＭＩ培地６２５μＬとを混和した。この混和液を用いて、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＨ１Ｒを２×１０5個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。対照として、ｐＣＩｎｅｏのみをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。遺伝子が導入された各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ’ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地（ＩＣＮ社）にて３０時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、１００ｍｍディッシュに５×１０5個を播き、抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＨａｍ’ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地で２週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、抗生物質耐性細胞をクローニングした。クローニングした各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、さらに、２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、１×１０-6〜１×１０-12Ｍの濃度範囲内のヒスタミン（和光純薬）によって各細胞を刺激したところ、細胞内のＣａ2+濃度が一過的に上昇した。Ｃａ2+濃度は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ2+染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて測定した。このことから、活性型ｈＨ１ＲがＣＨＯ−Ｋ１細胞膜上に正常に安定発現していることがわかった。
【００４０】
（５）遺伝子免疫
生理食塩水にベクターｐＣＩ−ｈＨ１Ｒ・ＧｒｏＥＬを２５０μｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢のマウスＢＡＬＢ／ｃ（雌）の両足大腿筋に各０．１２ｍＬずつ注射を行い、免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ−ｈＨ１Ｒ・ＧｒｏＥＬを両足に各３０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり６０μｇ投与した。その後、７日目、２１日目、及び２８日目にも同様して繰り返し免疫した。そして、０、７、１４、２１、２８、３５、４２日目に採血を行い、血清を調製した。対照として、ｈＨ１Ｒを単独で発現するベクターｐＣＩ−ｈＨ１Ｒを用いてマウスを免疫した。
【００４１】
（６）フローサイトメトリーによる活性型ｈＨ１Ｒに対する血清中抗体結合性評価
ｐＣＩｎｅｏ−ｈＨ１Ｒが導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞」と称する。）、及びｐＣＩｎｅｏが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（対照の細胞）をＰＢＳで洗浄した。免疫後３５日目の血清を５００倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞と血清中の抗ｈＨ１Ｒ抗体との相互作用を解析した。
【００４２】
その結果、ｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫前の血清ではフィコエリスリンがほとんど検出されなかったが、遺伝子免疫後の血清では検出された。これは、免疫後の血清中の抗ｈＨ１Ｒ抗体がｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞に結合することを示していた。なお、対照の細胞を用いた場合も、遺伝子免疫後の血清でもフィコエリスリンが検出されなかった。これは、免疫後の血清中の抗ｈＨ１Ｒ抗体が対照の細胞に結合しないことを示していた。
以上のことから、ベクターｐＣＩ−ｈＨ１Ｒ・ＧｒｏＥＬによる遺伝子免疫によって、マウス血清中に活性型ｈＨ１Ｒの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の産生を誘導することができた。
【００４３】
（７）抗ヒスタミン受容体タイプ１モノクローナル抗体の作製
上記（５）と同様の手順で遺伝子免疫したマウス４匹に対して追加免疫を行った。追加免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＰＥＧ法により、１×１０8個の脾細胞と、１×１０7個のＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のＨＡＴ選択性のミエローマＳＰ２／０細胞とを融合した（細胞融合）。融合した細胞（ハイブリドーマ）の集団をＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロプレート３４枚の各穴に播種した。この段階で、約２３８０種のハイブリドーマが得られた。
【００４４】
細胞融合の翌日から２週間、３日に１度の頻度で、上記マイクロプレート内の培地をＨＡＴ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）（Ｓｉｇｍａ社、品番：Ｈ０２６２）を添加したＲＰＭＩ培地に置き換えた。
【００４５】
上記（６）と同様のフローサイトメトリーによって抗体結合評価を行い、ｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞と各穴のハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性を調べた。その結果、１４７穴において抗体との結合性が確認された。
【００４６】
抗体との結合性が確認された１４７種のハイブリドーマの中から、限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、１３８種のハイブリドーマについて９６穴マイクロプレートに細胞１個以下／穴になるように播種し、培養した。２週間後、同様のフローサイトメトリーを行い、クローニングされた培養上清中の抗体（抗ｈＨ１Ｒモノクローナル抗体）の結合性を確認した。その結果、抗ｈＨ１Ｒモノクローナル抗体を産生する５１種のハイブリドーマがクローニングされた。そのうち１種をH１-99 1.5x106 cells 080328と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５６２）。
【００４７】
H１-99 1.5x106 cells 080328（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５６２）について、ＲＰＭＩ培地１００ｍＬ内でフラスコ培養を２週間行った。培養上清を、プロテインＧカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に供して精製・濃縮し、約２ｍｇの精製された抗ｈＨ１Ｒモノクローナル抗体Ｈ１−９９（以下、「Ｈ１−９９」と略記する。）を得た。
【００４８】
（８）フローサイトメトリーによるｈＨ１Ｒに対する結合性評価
１０μｇ／ｍＬ濃度のＨ１−９９のＰＢＳ溶液を調製した。一方、ｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞、および陰性対照としてＣＨＯ−Ｋ１細胞をそれぞれＰＢＳで洗浄した。洗浄した各細胞をＨ１−９９溶液と共にインキュベートした。インキュベート終了後、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを用いて、各細胞とＨ１−９９との相互作用を解析した。結果を図１に示す。図１（ａ）はｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞とＨ１−９９との相互作用を表すヒストグラム、図１（ｂ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とＨ１−９９との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図１（ａ），図１（ｂ）において、縦軸は細胞数、横軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度を表す。また、「Ｈ１−９９添加」はＨ１−９９溶液とインキュベートした場合、「Ｈ１−９９未添加」はＨ１−９９溶液とインキュベートしなかった場合を示す。すなわち、細胞表面にｈＨ１Ｒを発現していないＣＨＯ−Ｋ１細胞では、Ｈ１−９９とインキュベートしても蛍光強度のピークがシフトせず（図１（ｂ））、Ｈ１−９９との結合が確認されなかったのに対し、ｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞ではＨ１−９９とインキュベートすると蛍光強度のピークがシフトし（図１（ａ））、Ｈ１−９９との結合が確認された。
【００４９】
（９）細胞内Ｃａ2+シグナル伝達活性評価
ｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞を、２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、各穴に１．０×１０-6〜１．０×１０-10Ｍの濃度範囲内のＨ１−９９を添加した。また陰性対照として、マウスＩｇＧ（ピアス社）又はペプチド性アンタゴニストｐｙｒｉｌａｍｉｎｅ（ＴＯＣＲＩＳ社）を同様に１０-6〜１０-10Ｍの濃度範囲内で添加したものも調製した。１時間後、１×１０-9Ｍのヒスタミンによって各細胞を刺激した際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇の抗体濃度依存的増減度を測定した。Ｃａ2+濃度の測定は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて行った。結果を図２に示す。図２は細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。図２に示すように、Ｈ１−９９を添加した場合にのみ細胞内Ｃａ2+濃度の増加がみられた。これは、ｈＨ１Ｒのヒスタミン結合部位と異なるエフェクター部位にＨ１−９９が結合した結果、細胞内へのシグナル伝達が増強されたことを示していた。Ｈ１−９９のアロステリックモジュレータ５０％活性濃度（ＥＣ５０）を算出すると、６．５５×１０-8Ｍとなった。
【００５０】
（１０）細胞内Ｃａ2+シグナル伝達活性評価（抗体用量反応）
上記（９）と同様の手順でｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞を培養し、各穴に５×１０-6〜１×１０-10Ｍの濃度範囲内のＨ１−９９を添加した。１時間後、１×１０-9Ｍ（１ｎＭ）と６．６×１０-11Ｍ（６．６ｐＭ）のヒスタミンによって各細胞を刺激した際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇の抗体濃度依存的増減度を測定した。結果を図３に示す。図３は細胞内Ｃａ2+濃度とＨ１−９９濃度との関係を表すグラフである。図３に示すように、いずれのヒスタミン濃度でも細胞内Ｃａ2+濃度の増加がみられた。すなわち、一定のリガンド濃度下における抗体用量依存的活性増強作用が確認された。
【００５１】
（１１）細胞内Ｃａ2+シグナル伝達活性評価（リガンド用量反応）
上記（９）と同様の手順でｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞を培養し、各穴に６．５×１０-8又は１×１０-6ＭのＨ１−９９を添加した。また対照として、Ｈ１−９９を添加しない系も設定した。１時間後、１．０×１０-12Ｍ〜１．０×１０-6Ｍのヒスタミンによって各細胞を刺激した際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇のリガンド濃度依存的増減度を測定した。結果を図４に示す。図４は細胞内Ｃａ2+濃度とヒスタミン濃度との関係を表すグラフである。すなわち、いずれの条件においてもリガンド用量に応じてシグナル値が増強された。また、各曲線からＥＣ５０値を算出すると、「添加なし」では３．９０１×１０-9Ｍ、「６．５×１０-8Ｍ添加」では１．４２５×１０-9Ｍ、「１．０×１０-6Ｍ添加」では６．５５１×１０-10Ｍであり、抗体濃度依存的にヒスタミンのＥＣ５０値が減少する方向へシフト（図４の矢印）することが確認された。これは、Ｈ１−９９を添加することで、より低リガンド濃度でシグナル活性増強が達成されることを示していた。
【００５２】
（１１）低リガンド濃度における細胞内Ｃａ2+シグナル伝達活性評価
上記（９）と同様の手順でｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞を培養し、各穴に５．０×１０-6ＭのＨ１−９９を添加した。また陰性対照として、Ｈ１−９９の代わりに５．０×１０-6ＭのマウスＩｇＧを添加する系も設定した。１時間後、６．６×１０-11Ｍのヒスタミンによって各細胞を刺激した際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇の増減度を測定した。結果を図５に示す。図５は抗体種ごとの細胞内Ｃａ2+濃度を表すグラフである。図５に示すように、Ｈ１−９９を添加した場合は、マウスＩｇＧを添加した場合に比べて低リガンド濃度でもシグナル値を増強できることがわかった。以上より、Ｈ１−９９がｈＨ１Ｒの有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達とは異なるエフェクター部位を刺激することで、そのシグナル値を増強できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】（ａ）はｈＨ１Ｒ遺伝子導入細胞とＨ１−９９との相互作用を表すヒストグラム、（ｂ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とＨ１−９９との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図２】細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。
【図３】細胞内Ｃａ2+濃度とＨ１−９９濃度との関係を表すグラフである。
【図４】細胞内Ｃａ2+濃度とヒスタミン濃度との関係を表すグラフである。
【図５】抗体種ごとの細胞内Ｃａ2+濃度を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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