(57)【要約】【課題】ＮｍのＤＮＡおよびそれらを取得する手段をそれらＮｍ特異性ＤＮＡからもっぱらなるバンク（ライブラリ−）を構築することによって、提供する。【解決手段】本発明のＤＮＡは、髄膜炎菌に存在するが淋菌にもナイセリア・ラクタミカにも存在しないところの、読み取り相をもつ遺伝子（ただし、多糖性莢膜、ｆｒｐＡ、ｆｒｐＣ、ｏｐｃ、ｐｏｒＡ、ロ−タマ−ゼ、配列ＩＳ１１０６、ＩｇＡプロテア−ゼ、ピリン、ＰｉｌＣ、トランスフェリンに結合する蛋白質、および混濁蛋白質の生合成に関わる遺伝子を除く）の全部または一部である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄膜炎菌（以下Ｎｍと表示）に存在するが淋菌（以下Ｎｇと表示）にもナイセリア・ラクタミカ（以下Ｎｌと表示）にも存在しないところの、読み取り相をもつ遺伝子（ただし、多糖性莢膜、ｆｒｐＡ、ｆｒｐＣ、ｏｐｃ、ｐｏｒＡ、ロ−タマ−ゼ、配列ＩＳ１１０６、ＩｇＡプロテア−ゼ、ピリン、ＰｉｌＣ、トランスフェリンに結合する蛋白質、および混濁蛋白質の生合成に関わる遺伝子を除く）の全部または一部であることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
Ｎｍには存在するが、Ｎｇには存在しないことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体上のｔｕｆＡとｐｉｌＴとの間、すなわち該染色体の領域１に存在する１つ以上の配列および／または該配列とハイブリダイズしうる１つ以上のヌクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
ＮｇはＭＳ１１株であり、ＮｌはＮｌ８０６４株である、請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項５】
Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体上のｐｉｌＱとλ７４０との間、すなわち該染色体の領域２に存在する１つ以上の配列および／または該配列とハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項６】
Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体上のａｒｇＦとｏｐａＢとの間、すなわち該染色体の領域３に存在する１つ以上の配列および／または該配列とハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項７】
それの配列の全部または一部が、配列番号９、１３、２２または３０に相当し、および／または、配列全体として、あるＮｍ株の染色体上のこの配列番号の前後２０ｋｂ以内に位置し、および／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項８】
それの配列の全部または一部が、配列番号１、２、４、６、７、１０、１５、３１または３４に相当し、および／または、配列全体として、あるＮｍ株の染色体上のこれら配列番号の前後２０ｋｂ以内に位置し、および／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうることを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号３６のＤＮＡ配列の全部または一部あるいは配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５の読み取り枠（オ−プンリ−ディングフレ−ム）に相当する、および／または配列全体として、あるＮｍ株の染色体上のこれら配列番号の前後２０ｋｂ以内に位置する、および／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうる配列の全部または一部であることを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
それの配列の全部または一部が、配列番号８、２１、２３、２５、２６、２８、２９、３２または３５に相当し、および／または、配列全体として、あるＮｍ株の染色体上のこれら配列番号の前後２０ｋｂ以内に位置し、および／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうることを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
それの配列の全部または一部が、配列番号３、５、１１、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２４、２７または３３に相当し、および／または、配列全体として、あるＮｍ株の染色体上のこの配列番号の前後２０ｋｂ以内に位置し、および／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
Ｎｇのそれらとは共通であるが、Ｎｌには存在しないことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体上のａｒｇＪとｒｅｇＦとの間、すなわち該染色体の領域４に存在する１つ以上の配列および／または該配列とハイブリダイズしうるフクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項１２記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体上のラムダ３７５とｐｅｎＡとの間、すなわち該染色体の領域５に存在する１つ以上の配列および／または該配列とハイブリダイズしうるフクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項１２記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
細胞膜を越えて運び出される蛋白質をコ−ドしていることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１つに記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
それの配列の全部または一部がＮｍ種中に保存されている領域に相当することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
コスミド、プラスミド、バクテリオファ−ジなどの伝達ベクタ−または発現ベクタ−中に挿入されていることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか記載の少なくとも１つのＤＮＡの挿入によって形質転換されている宿主細胞、とくに細菌細胞またはＮｍ細胞。
【請求項１９】
染色体から請求項１〜１６のいずれか記載の少なくとも１つのＤＮＡ、とくに病原性の原因であるＤＮＡが欠失しているところのＮｍに特異的な遺伝子またはそれらの断片を含む細胞、とくに細菌細胞またはＮｍ細胞。
【請求項２０】
それの配列の全部または一部が請求項１〜１６のいずれか記載の少なくとも１つのＤＮＡ配列またはその断片の転写物に相当することを特徴とするＲＮＡ。
【請求項２１】
それの配列が、請求項１〜１６または２０のいずれか記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列またはかかる配列の断片のアンチセンスに相当し、それらが場合によりメチル基および／またはグリコシル基などの少なくとも１つの化学的置換基を有することを特徴とするアンチセンス核酸。
【請求項２２】
請求項１〜１６または２０のいずれかに定義した核酸によりコ−ドされているかまたはそれら核酸の配列から演繹しうる配列の全部または一部に相当するアミノ酸鎖を示し、場合により、天然ポリペプチドで認められる生化学的性質を変えない限りにおいて、コ−ドされているまたは演繹される配列に比して修飾されていてもよいポリペプチド。
【請求項２３】
細胞膜を越えて運び出されるペプチド、とくに請求項１５記載のＤＮＡによりコ−ドされているものに全部または一部が相当するペプチドであることを特徴とする請求項２２記載のペプチド。
【請求項２４】
請求項２１または２２記載のペプチドの少なくとも１つのエピト−プに対するポリクロ−ナルまたはモノクロ−ナル抗体もしくはこれらの抗体の断片、とくにＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２断片、あるいは抗原−抗体型反応に従って該抗体またはそれらの断片を認識しうる抗抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項２５】
−  ２つのＤＮＡ集団の混合、
−  差引き（サブトラクティヴ）ハイブリダイゼ−ション−増幅の少なくとも１回の反復および
−  所望のＤＮＡ（単数または複数）の回収およびそれに続く場合によってのそれらの精製および余分な配列の除去
を包含する髄膜炎菌に特異的なＤＮＡバンク（ライブラリ−）の取得方法。
【請求項２６】
Ｎｇに比してＮｍに特異的なバンクを得るために、
−  それのために特異的バンクを構築すべき１つの髄膜炎菌株、すなわち基準株および１つの淋菌株、すなわち差引き株にそれぞれ由来する２つのＤＮＡ集団を混合すること、それらの株のＤＮＡ配列は、
・該差引き株の染色体ＤＮＡの、とりわけ注射器を反復通過させることによる、ランダム切断および
・基準株の染色体ＤＮＡの、好ましくは約１ｋｂ未満の大きさの断片を生じる制限酵素による、切断により得られたものであること、およびＮｍとＮｇとには共通であるが、Ｎｌに比しては特異的なＤＮＡバンクを得るために、３つの異なるバンクを、２つはＮｍの染色体ＤＮＡのＭｂｏＩおよびＴｓｐ５０９１による消化によって、第三のものはＮｍの染色体ＤＮＡのＭｓｐＩによる消化によって、構築し、２系列の差引きを実施し、求める特異性を示すＤＮＡを回収すること
を特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５または２６記載の方法を実施して得られたＤＮＡクロ−ンバンク。
【請求項２８】
遺伝的に近い他の種または他の変異体が存在し、異なる病原性を発現するときに、所与の細胞または同種細胞の所与の変異体の特異的なＤＮＡバンク、とくにクリプトコックス、ヘモフィルス、肺炎双球菌または大腸菌に特異的なＤＮＡバンクを取得するために、請求項２５記載の方法を適用すること。
【請求項２９】
生体試料中の髄膜炎菌の存在を証明することによって髄膜炎菌感染、とくに髄膜炎菌性髄膜炎を診断する方法であって、
−  請求項１〜１６または２０に定義した少なくとも１種の核酸から出発して作成した、場合によりヌクレオチドプローブまたはプライマーの形の、試薬、もしくは変形として、請求項２４に定義した抗体または抗体断片から出発して作成した試薬に、分析すべき生体試料を、それぞれハイブリダイゼーションまたは抗原−抗体型反応を可能ならしめる条件下で、接触させる段階および
−  場合により形成された反応生成物を確認する段階
を包含することを特徴とする該診断方法。
【請求項３０】
−  分析すべき生体試料を、場合により標識されていてもよい請求項２２または２３のいずれか記載の少なくとも１つのポリペプチドまたは請求項２４記載の抗体もしくはこれらの断片と、抗原−抗体型反応を可能ならしめる条件下で接触させる段階および
−  場合により形成された反応生成物を確認する段階
を包含することを特徴とする髄膜炎菌感染に特異的な免疫反応を診断する方法。
【請求項３１】
−  請求項２９または３０に定義した、すなわち核酸、抗体またはペプチドタイプの少なくとも１種の試薬、
−  目的とするヌクレオチドのハイブリダイゼーションまたは免疫反応の実施を可能ならしめる製品、とりわけマーカーまたは緩衝液ならびに使用説明書
を包含することを特徴とする請求項２９または３０のいずれか記載の方法を実施するためのキット。
【請求項３２】
生理学的に許容しうる担体（単数または複数）と組合せて、有効量の
−  請求項２２または２３記載のペプチドまたは
−  請求項２４記載の抗体、または抗抗体断片
を含有し、場合により、その免疫原性増強のために、ポリオウイルス蛋白質、テタヌストキシン、ピリンの超可変領域由来の蛋白質などの担体分子と組合せられていてもよいことを特徴とする、そのスペクトル中に、とくに小児用の少なくとも１種のワクチンとの組合せにおいて、抗髄膜炎菌目的の予防を含み、あらゆる形の髄膜炎菌感染を防止するためのワクチン組成物。
【請求項３３】
生理学的に許容しうる担体（単数または複数）と組合せて、有効量の
−  請求項１〜１６または２０記載の核酸または
−  請求項１８または１９記載の細胞
を含有することを特徴とする、そのスペクトル中に、とくに小児用の少なくとも１種のワクチンとの組合せにおいて、抗髄膜炎菌目的の予防を含み、あらゆる形の髄膜炎菌感染を防止するためのワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（以下Ｎｍと略す）種の細菌に特異的なＤＮＡおよび蛋白質またはペプチド、それらの取得法およびそれらの生物学的応用、とくに髄膜炎菌感染および髄膜炎の予防および検出のための応用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｍが髄膜炎の主たる病因であることは既知である。
【０００３】
合衆国で進められた研究は、人口の５〜１０％が種々のＮｍ株の無症状保菌者であることを示している。Ｎｍの伝達因子はあまり知られていない。感染者の一部では、Ｎｍが血流中に入り込み、そこで髄膜炎菌血を惹起する可能性および／または髄液流中へ進み、髄膜炎を惹起する可能性がある。迅速な抗生物質療法がなければ、その感染症は速やかに進展して、致命的となる可能性がある。
【０００４】
他の病原体と比較して、Ｎｍは、血液脳関門を通過することができて、髄膜にすみつくという特性を示す。それゆえ、Ｎｍの病原性の研究は、髄膜炎という範囲内においてのみならず、脳に関するすべての疾患という範囲においても、重要である。
【０００５】
それゆえ、この細菌種に特異的なツ−ルを上記意図の用途に利用することに興味がもたれる。
【０００６】
Ｎｍは、遺伝学上、淋菌（Neisseria gonorrhoeae ）（以下Ｎｇと略す）種およびナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica ）（以下Ｎｌと略す）種にきわめて近い。しかし、それらの病原性はきわめて異なっている。  Ｎｍは、鼻咽腔にすみつき、つぎに咽頭上皮を通り抜けて粘膜下隙に侵入し、そこで敗血症および髄膜炎の原因となる。
【０００７】
Ｎｇは、とりわけ泌尿生殖器の局所感染の原因となる。それは、性器粘膜にすみつき、つぎに上皮を通る抜け、その後に上皮下に侵入し、そこで増殖し、強度の炎症反応の原因となる。播種性淋菌感染が起こりうるが、稀であり、若干の株の場合であるにすぎない。Ｎｌに関しては、それは非病原性であり、限局性侵襲の原因にも全身性侵襲の原因にもならないと言われている。
【０００８】
このように、まず考えられるのは、ＮｍおよびＮｇが、きわめて近似した細菌であるのに、異なる病原性を示すことを考慮に入れることである。
【０００９】
これらの細菌のゲノムは強度に相同性であるから、ＮｍとＮｇのゲノムの限られた部分のみが、それらの病原性の原因となる特異的毒力因子をコ−ドしているにちがいない。
【００１０】
Ｎｍが、（Ｎｇと比較して）それに特異的で、その特異的病原性の発現レベルに影響するにちがいないＤＮＡ配列を示すことは明らかである。
【００１１】
Ｎｍ種は、莢膜（きょうまく）多糖類の特徴に基づく血清グル−プによって副分類される。
【００１２】
少なくとも１３の血清グル−プが明らかにされており、それらのうちでも、血清グル−プＡ、ＢおよびＣが髄膜炎症例の約９０％の原因である。グル−プＡおよびＣは流行性の形態の疾患で観察される。グル−プＢは、欧州および合衆国でもっとも普通に単離される血清グル−プである。
【００１３】
Ｎｍでは存在し、Ｎｇでは存在しない莢膜が、髄膜炎菌由来抗髄膜炎ワクチン作成のための基礎となった。
【００１４】
Ｎｍの莢膜多糖類が、血清グル−プＡ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの髄膜炎菌により惹起される成人での髄膜炎を予防するのに有効なことが示されたワクチンの作成に利用された。
【００１５】
しかし、グル−プＢのＮｍの多糖類はヒトで非免疫原性であり、ヒト神経細胞中に存在する接着糖蛋白質とエピト−プを共にするが、グル−プＣのＮｍの多糖類は、１０歳未満の小児において軽度に免疫原性であることが明らかにされている。
【００１６】
それゆえ、全血清グル−プの髄膜炎菌により惹起される感染を予防でき、一般の細菌性病原体、とくにＮｍに固有の抗原性の可変性に対応できる万能ワクチンは存在しない。
【００１７】
Ｎｍのグル−プＢ多糖類のヒト抗原との交差反応性、血清グル−プの多様性およびＮｍの抗原としての多様性のために、今日までに提案された戦略は、すべての場面で有効なワクチンに導くことができていない。
【００１８】
それゆえ、研究は、髄膜炎菌病原の特異性の原因をなす特徴的要素の検討に集中された。
【００１９】
両細菌ＮｍおよびＮｇのいずれかで検討された遺伝子の多くは、もう一方の細菌中にそれらの相同配列をもっている。
【００２０】
同様に、現在までにＮｍ中で同定された病毒因子の多くが、Ｎｇ中に対応物、すわわちピリン、ＰｉｌＣ蛋白質、混濁蛋白質ならびにラクトフェリンおよびトランスフェリンの受容体をもっている。
【００２１】
先行技術において特性描写されている髄膜炎菌の特異的属性は、莢膜、ＲＴＸ毒素に類似の蛋白質Ｆｒｐ、外部構成因子蛋白質Ｏｐｃ、グルタチオンペルオキシダ−ゼ、ポ−リンＰｏｒＡおよびロ−タマ−ゼ遺伝子である。
【００２２】
これらのうち、莢膜は、常に、Ｎｍの病毒株中に存在する。一方、多くの細胞外病原体が莢膜をもつが、血液脳関門を通過するわけではない。
【００２３】
それゆえ、いまだ同定されていない属性が、髄膜炎菌病原の特異性の原因となっているにちがいない。これらの属性は、おそらく、髄膜炎菌の間では存在するが、淋菌では存在しないＤＮＡによってコ−ドされているであろう。
【００２４】
本発明者らは、Ｎｍに特異的な遺伝子の差引き（サブトラクション）単離に基づく新しいアプロ−チ法を開発した。これらの遺伝子はＮｍ特異性病原に、より詳しくは血液脳関門の通過に、関連しているにちがいない。
【００２５】
先行技術で開発された差引き法は、Ｎｍのいくつかの単離株について疫学的マーカーの産生に成功している。これらのマーカーは有用性が限られている：それらはＮｍ種の血清グループの全体をカバーしない。
【００２６】
これらの研究に対して、本発明者らの研究は、Ｎｍをランダム（無作為的）に切断したＮｇの染色体の全体と比較・照合することによりＮｍには存在するがＮｇには存在しないＤＮＡの全体をクロ−ンする手段の開発に導き、かくして、Ｎｍに対して高度の特異性をもつツ−ルを提供し、かくしてこの菌種の遺伝的可変性に初めて対応することを可能にした。
【００２７】
本明細書および特許請求の範囲においてある株のＤＮＡまたはそれらの発現産物に関連して使用した「存在する」および「存在しない」なる語は、同じプロ−ブ、同じプロ−ブ標識強度、同じ染色体ＤＮＡ量および同じ比較要素（相同株の染色体ＤＮＡ）を用いることによる同一のハイブリデ−ション条件（０．５Ｍ  ＮａＰＯ４ 、ｐＨ７．２；０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ−Ｎａ、１％、１％ウシ血清アルブミンおよび７％ドデシル硫酸ナトリウムを用い、６５℃で１６時間）に関連して把握されるものである。たとえば、プロ−ブによって得られたシグナルが参考株を用いて得られたものと実質的に同じであれば、当該ＤＮＡが存在すると考える。
【００２８】
一方、そのシグナルがきわめて弱いときには、当該ＤＮＡは存在しないと考える。
【００２９】
ＮｍおよびＮｇの病原性に関して第二に考えられるのは、それらが粘膜にすみつき、これを透過し、つぎにそれの上皮下隙を占拠することのできる能力を考慮に入れることである。このプロセスが両病原体に共通の病毒因子に関わっていることはきわめてありうることである。これに関して、ＮｍおよびＮｇにおいて、ｐｉｌｉ、ＰｉｌＣ蛋白質、混濁蛋白質、ＩｇＡプロテア−ゼ、トランスフェリンおよびラクトフェリンに結合する蛋白質、およびリポオリゴ糖などのいくつかの病毒因子がすでに同定されていることは既知である。
【００３０】
それゆえ、本発明者らのアプロ−チは、ＮｍおよびＮｇに特異性であるが非病原性菌種Ｎｌには存在しないＮｍの領域の探索、ならびに、本発明に従って開発された手段による与えられた菌種に特異的な染色体ＤＮＡ領域およびそれらの発現産物の一般的研究方法の探索へと拡がった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
従って、本発明は、その病原性により特異的なＮｍのＤＮＡおよびそれらを取得する手段を、とりわけそれらＮｍ特異性ＤＮＡからもっぱらなるバンク（ライブラリ−）を構築することによって、提供することを目的とする。
【００３２】
本発明はまた、これらのＤＮＡ配列により導かれた産物をも対象とする。
【００３３】
本発明はまた、とりわけ診断、治療および予防に利用できるツ−ルを作り上げるためにこれらバンクの特異的で網羅的な特徴を利用することを対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明のＤＮＡは、髄膜炎菌に存在するが淋菌にもナイセリア・ラクタミカにも存在しないところの、読み取り相をもつ遺伝子（ただし、多糖性莢膜、ｆｒｐＡ、ｆｒｐＣ、ｏｐｃ、ｐｏｒＡ、ロ−タマ−ゼ、配列ＩＳ１１０６、ＩｇＡプロテア−ゼ、ピリン、ＰｉｌＣ、トランスフェリンに結合する蛋白質、および混濁蛋白質の生合成に関わる遺伝子を除く）の全部または一部であることを特徴とする。
【００３５】
先に明確に説明した通り、「存在する」および「存在しない」なる語は、実施例中で記載したサザンブロットにおいて用いた、および先にも触れたハイブリデ−ション条件に関連して把握されるものである。
【００３６】
これらのＤＮＡが、菌種Ｎｍに固有の機能、より詳しくは、もっぱらＮｍで見出される表現型またはもっぱらＮｇと共通の表現型を示す限りの変異体を包含することを了解されたい。
【００３７】
主要な一面に従えば、これらのＤＮＡは髄膜炎菌の病原性のゆえに特異的であり、しかもこの菌種の遺伝的可変性に拘らずそうである。
【００３８】
本発明の一実施態様に従えば、該ＤＮＡはＮｇよりもＮｍに特異的である。
【００３９】
より詳しくは、Ｎｍに特異的なＤＮＡはナイセリア・ラクタミカおよびナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea ）には存在しない。
【００４０】
驚くべきことに、髄膜炎菌株とこれら淋菌株との間の遺伝的相違の大部分は、大腸菌およびペスト菌について以前に述べられているように病原性区画に対応したはっきり異なる領域に結集されているように思われる。
【００４１】
かくして、本発明の好ましい一態様においては、これらのＤＮＡは、髄膜炎菌Ｚ２４９１の染色体のｔｕｆＡとｐｉｌＴとの間、すなわち該染色体の領域１に存在している１つまたは複数の配列および／または髄膜炎菌特異性であるという条件付きで、上記配列とハイブリダイズしうる１つまたは複数の配列を包含することによっても特徴付けられる。
【００４２】
本明細書および特許請求の範囲において、「特異的」とは、実施例で示し、かつ前記したハイブリデ−ション条件下でＮｍのそれらとしかハイブリダイズしないヌクレオチド配列を意味する。
【００４３】
その点に関して、一般的に、明細書および特許請求の範囲において配列の「全部または一部」というとき、この表現は上で定義した特異性に関連して把握されるべきものである。
【００４４】
同様に、ペプチド、ペプチド断片および抗体の全部または一部とは、天然のペプチドまたはこのペプチドに対して生成される抗体のそれぞれの生物学的性質を呈する産物を意味する。
【００４５】
領域１には、髄膜炎菌の莢膜の遺伝子が結集されている。
【００４６】
このタイプのＤＮＡは、配列番号９、１３、２２または３０および／またはあるＮｍ株の染色体上のこれら配列番号から前後２０ｋｂ以内に位置するあらゆる配列に全部または一部が相応する配列を示し、および／またはこれらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうる配列を示す。
【００４７】
本発明の他の好ましい一態様においては、これらのＤＮＡは、髄膜炎菌Ｚ２４９１の染色体のｐｉｌＱとλ７４０との間、すなわち該染色体の領域２に存在している１つまたは複数の配列および／または髄膜炎菌特異性であるという条件付きで、上記配列とハイブリダイズしうる１つまたは複数の配列を包含することによっても特徴付けられる。
【００４８】
この態様に従ったＤＮＡは、配列番号１、２、４、６、７、１０、１５、３１または３４および／またはあるＮｍ株の染色体上のこれら配列番号から前後２０ｋｂ以内に位置するあらゆる配列に全部または一部が相応する配列を示し、および／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうる配列を示す。
【００４９】
本発明は、とくに、配列番号３６の１５６２０ｂｐのＤＮＡならびに配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５の読み取り枠（オ−プンリ−ディングフレ−ム）に相応する配列を対象とする。
【００５０】
本発明のさらに別の一態様においては、これらのＤＮＡは、髄膜炎菌Ｚ２４９１の染色体のａｒｇＦとｏｐａＢとの間、すなわち該染色体の領域３に存在している１つまたは複数の配列および／または髄膜炎菌特異性であるという条件付きで、上記配列とハイブリダイズしうる１つまたは複数の配列を包含することによっても特徴付けられる。
【００５１】
この態様に従ったＤＮＡは、配列番号８、２１、２３、２５、２６、２８、２９、３２または３５および／またはあるＮｍ株の染色体上のこれら配列番号から前後２０ｋｂ以内に位置するあらゆる配列に全部または一部が相応する配列を示し、および／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうる配列を示す。
【００５２】
上記の領域１、２、３は、髄膜炎菌特異配列の大きい割合を示し、やはり本発明の枠内に含まれる。
【００５３】
髄膜炎菌に対する特異性を代表する他のＤＮＡは、髄膜炎菌Ｚ２４９１の染色体上に存在する１つまたは複数の配列を示すが、上に定義した領域１、２、３の一部を構成しない。
【００５４】
かかるＤＮＡは、配列番号３、５、１１、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２４、２７または３３および／またはあるＮｍ株の染色体上のこれら配列番号から前後２０ｋｂ以内に位置するあらゆる配列に全部または一部が相応する配列を包含し、および／または、かかる配列とハイブリダイズしうる配列を示す。
【００５５】
とくに対象とする用途を考慮するとき、本発明は、より特別には、当該細菌の病原に関わる上記ＤＮＡに関するものである。
【００５６】
本発明は、とくに、上に示した特性の少なくとも１つに対応し、細胞膜を越えて運び出される蛋白質をコ−ドするＤＮＡおよび／またはその配列の全部または一部が該ＤＮＡの保存された領域に相応するＤＮＡを対象とする。
【００５７】
かくして、本発明の別の一実施態様に従えば、それらＤＮＡは、Ｎｇのそれらと共通であるが、Ｎｌには存在しない。
【００５８】
より特別には、それらは、Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体上の領域４（ａｒｇＪからｒｅｇＦまで）または領域５（ラムダ３７５マ−カ−からｐｅｎＡまで）に存在するＤＮＡおよび／またはＮｌよりもＮｍおよびＮｇに特異的であるという条件付きで、該存在するＤＮＡとハイブリダイズしうるＤＮＡである。
【００５９】
「ＮｌよりもＮｍおよびＮｇに特異的」とは、実施例（とくに実施例４参照）のハイブリダイゼ−ション条件下でＮｍおよびＮｇのＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを意味する。
【００６０】
領域４および５のＤＮＡならびにこれらのＤＮＡとハイブリダイズしうるＤＮＡは、Ｎｍに固有の機能を発現するという条件付きであるが、すみつきおよび初期侵入の段階および敗血症の拡散に関与することによって、主としてＮｍの病毒性に干渉するという長所を示す。
【００６１】
他の態様に従えば、本発明は、少なくとも１つの上に定義した通りのＤＮＡを含むプラスミド、コスミド、ファ−ジなどの伝達ベクタ−および発現ベクタ−を対象とする。
【００６２】
本発明はまた、少なくとも一つの上に定義した通りのＤＮＡにより形質転換された宿主細胞を対象とする。
【００６３】
本発明の他の宿主細胞は、Ｎｍに特異的な遺伝子または遺伝子断片を含み、それらの染色体が本発明の少なくとも１つのＤＮＡ、とくに病原性の原因となっているＤＮＡを欠失していることにより特徴付けられる。とくに、細菌細胞、とりわけＮｍの細胞が重要である。
【００６４】
本発明は、その配列の全部または一部が上に定義した通りのＤＮＡ配列またはその配列の断片の転写産物に相応するＲＮＡをも対象とする。
【００６５】
上に定義した通りのＤＮＡまたはこれらのＤＮＡの断片のアンチセンス核酸配列も、本発明の一部をなす。
【００６６】
これらのアンチセンス核酸は、場合により、メチル基またはグリコシル基などの少なくとも１つの置換基を有する。
【００６７】
本発明の範囲に含まれる他の産物は、ポリペプチドによって構成される。  これらのポリペプチドは、先に定義した核酸によりコ−ドされているかまたはそれら核酸の配列から推定される配列の全部または一部に相応するアミノ酸連鎖を示すことによって特徴付けられる。
【００６８】
それらは、細胞膜を越えて運び出されるポリペプチドの全部または一部に相応するポリペプチド、より特別には保存された領域によりコ−ドされているものに相応するポリペプチドであるのが有利である。
【００６９】
変形として、本発明のポリペプチドは、核酸配列に相応するものに比して、しかも所与の用途、とくにワクチンとしての適用にとくに適するように、修飾されていてもよい。
【００７０】
修飾とは、対応する天然ポリペプチド、とくにペリプラズムおよび外膜を通して運び出される機能性蛋白質の生化学的性質に影響しない限りのあらゆる変化、欠失、化学的置換を意味する。
【００７１】
本発明に従った他の生成物は、上記ポリペプチドに対する抗体からなる。  すなわち、本発明は、上に言及したポリペプチドの少なくとも１つのエピト−プを認識することを特徴とするポリクロ−ナル抗体ならびにモノクロ−ナル抗体を対象とする。
【００７２】
本発明は、これら抗体の断片、より詳細にはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２断片をも対象とする。
【００７３】
上に定義した抗体またはそれらの断片を抗原−抗体型反応に従って認識しうる抗抗体も本発明の一部をなす。
【００７４】
本発明に従えば、上で考慮した種々の製品は、合成および／または生物学的方法により、オ−ソドックスな技法に従って操作することによって得られる。
【００７５】
核酸は、差引き手法に従って構築されたＮｍ特異性ＤＮＡからなるバンクから出発して得ることもできる。この手法は、
−  ２つのＤＮＡ集団の混合、
−  差引きハイブリダイゼ−ション−増幅の反復の少なくとも一回の実施および
−  所望のＤＮＡ（単数または複数）の回収、場合によってのそれに続く余分な配列の除去を含めての精製
を包含する。
【００７６】
本発明に従えば、該２つのＤＮＡ集団はそれぞれ、それのために特定のバンクを構成すべき１つの髄膜炎菌株（いわゆる基準株）ならびに該髄膜炎菌株と約７０％を越える相同性を示すいわゆる差引き（サブトラクション）株である１つのナイセリア株に由来し、差引き株および基準株のＤＮＡ配列は、それぞれ、ランダム切断およびサイズが約１ｋｂ未満の断片を生じうる制限酵素による切断によって得られる。
【００７７】
本発明は、とくに：
−  いわゆる差引き株である１つの淋菌株の染色体ＤＮＡの、とりわけ注射器の反復通過によるランダム切断、
−  いわゆる基準株である髄膜炎菌の染色体ＤＮＡの、好ましくは約１ｋｂ未満のサイズの断片を生じうる制限酵素による切断、
−  制限酵素で切断した基準株のＤＮＡ断片と適当なオリゴヌクレオチドプライマ−との連結、
−  ・  相同性配列のハイブリダイゼ−ションための適当な条件下での２つのＤＮＡ集団の混合、
・  その後の、自己再アニ−リングした(auto-reanneles)断片の増幅およびこれら断片の回収、
・  これら断片の制限酵素による消化および該オリゴヌクレオチドへの再連結による差引きハイブリダイゼ−ション−増幅の反復の１回実施、続いての
−  連結ＤＮＡの精製および場合によっての引き続いての上に示したごとく切断した髄膜炎菌ＤＮＡ断片と先の反復で生じた髄膜炎菌ＤＮＡ断片との混合からなる差引きハイブリダイゼ−ションの新たな反復、所望による続いてのバンクＤＮＡのクロ−ニング
の各工程を包含する髄膜炎菌特異性ＤＮＡバンクの取得方法を対象とする。
【００７８】
使用するプライマ−は、クロ−ニング部位、たとえばプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位、への挿入を可能ならしめる使用制限酵素に適合したオリゴデオキシヌクレオチドプライマ−である。かかるプライマ−は、配列表の配列番号３６〜４５のもとに表されているオリゴデオキシヌクレオチドのうちから選ぶのが有利である。
【００７９】
こうして得られたバンクは、髄膜炎菌に特異的で、淋菌には存在しないＤＮＡから構成されている。
【００８０】
それらＤＮＡの特異性は、実施例で示したように、各反復ごとに、差引き株と基準株とに共通の遺伝子またはＣｌａＩなどの制限酵素により消化した各々の株の全ＤＮＡを用いて、サザンブロットにより確認されている。
【００８１】
各反復ごとに、ＤＮＡバンクの網羅性も、基準株に特異的であることが既知のプロ−ブ、すなわち髄膜炎菌の場合は、とりわけｆｒｐ、ｏｐｃ、ロ−タマ−ゼの各遺伝子を用いて、確認されている。
【００８２】
実施した実験の結果、本発明の方法に従って得られたバンクは、髄膜炎菌以外のナイセリア種と有意の相同性を示す遺伝子、たとえばｐｐｋまたはｐｉｌＣ１遺伝子を欠いている。それも、通常は２〜３回の反復操作でそうなる。
【００８３】
必要ならば、互いに排他的ではない２つの方法を利用することができる。
【００８４】
基準株のＤＮＡ集団として反復回数ｎのＤＮＡを用いて（ｎ＋１）回目の反復を実施することができる。
【００８５】
変形としては、第一のバンクで用いたものと特異性の異なる制限酵素、たとえばＭｂｏＩを用いて、第一のバンクから独立した第二のバンクを製出する。
【００８６】
いずれの場合にも、実施した反復の各々から生じた産物の各々を保存しておくことが好ましい。
【００８７】
本発明は、ＮｇとＮｍとに共通の、しかしＮｌと比較すれば特異的なＤＮＡバンクを取得するための上記差引き手法をも対象とする。
【００８８】
３つの異なるバンクを、２つはＮｍ染色体ＤＮＡのＭｂｏＩおよびＴｓｐ５０９１での消化により、一つはＮｍ染色体ＤＮＡのＭｓｐＩでの消化により、構築することが有利である。２系列の差引きにより、実施例で記載したように、求める特異性を示すＤＮＡを回収することが可能になる。
【００８９】
これらバンクの取得方法およびそれらのバンク自体も、本発明の一部をなす。
【００９０】
一般に、本発明の方法は、遺伝的に近く、異なる病原性を示す他の種または他の変異体が存在するときに、所与の細胞種または同じ種の所与の変異細胞種に特異的なＤＮＡバンクを得るのに適用できることが指摘される。
【００９１】
本発明の方法を適用することにより、クリプトコックス、ヘモフィルス、肺炎双球菌、さらには大腸菌の所与の種に、より一般的には、同じ種に属し、異なる病原性(pathovars) を有するすべての細菌性病原体に特異的なＤＮＡバンクが有利に構築される。
【００９２】
同様に、本発明は、これらのバンクから出発して、所与のある種または変異体に特異的な病毒因子を自由に処分する手段を提供する。
【００９３】
それゆえ、かかるバンクは、ある病原体の特異性の原因となっている属性を自由に処分する上で興味深いツ−ルを構成し、この応用は、とくに、本発明に従って、髄膜炎菌の病原の特異性の原因である属性を含むバンクを取得することによって例証される。
【００９４】
本発明の産物、核酸、ポリペプチドおよび抗体の研究により、髄膜炎菌株またはその変異体のいずれであれ、髄膜炎菌に関する絶対的特異性がはっきりとなった。
【００９５】
それゆえ、これらの産物は、成人におけるものであれ、小児におけるものであれ、また問題の株の血清グル−プにかかわりなく、髄膜炎菌により惹起される感染および髄膜炎の診断および予防にとくに適している。
【００９６】
分析すべき試料中の髄膜炎菌の存在を証明することによる髄膜炎菌感染、とくに髄膜炎菌性髄膜炎の本発明に従った診断方法は、
−  分析すべき試料、すなわち生体試料または細胞培養を、少なくとも１種の上に定義した通りの核酸から、場合によりヌクレオチドプロ−ブまたはプライマ−の形で、作成した試薬、または、変形として、上に定義した通りの少なくとも１種の抗体または抗体断片から作成した試薬と、それぞれにハイブリダイゼ−ションまたは抗原−抗体型反応を可能ならしめる条件下で接触させ、
−  場合によって形成された反応生成物を確認する
工程により特徴付けられる。
【００９７】
該試薬を核酸から作成するとき、それはヌクレオチドプロ−ブの形であってもよく、その形態において該核酸またはその断片をその確認を可能ならしめるために標識する。適当な標識としては、放射性、蛍光性、酵素性または発光性の標識が挙げられる。
【００９８】
変形としては、該核酸が試薬として使用される宿主細胞中に包含される。
【００９９】
これらの様々な形態のもとに、該核酸は、そのまままたは不活性担体との組成物の形で使用される。
【０１００】
該試薬を抗体または抗体断片から作成するときには、確認のためにそれを標識することができる。もっとも普通には、蛍光性、酵素性、放射性または発光性の標識を利用する。
【０１０１】
使用する抗体または抗体断片は、場合により標識されていてもよいが、それをそのまままたは不活性担体との組成物の形で使用できる。
【０１０２】
接触段階で使用する試料は、脳脊髄液、尿、血液、唾液などの哺乳動物由来の生体試料である。
【０１０３】
確認段階は、それが生成された場合の反応生成物を明らかにしうる条件下で実施する。オ−ソドックスな手段では、蛍光反応、発光反応、呈色反応、放射能、さらにはオ−トラジオグラフィ−手法を利用する。生成物を定量することも可能である。
【０１０４】
それら標識産物、核酸および抗体も、新規産物として本発明の一部をなす。
【０１０５】
上に定義した方法は、髄膜炎菌感染に特異的な免疫反応による診断にも適用できる。
【０１０６】
その時には、試薬として、天然産物に相応して前記の核酸配列によりコ−ドされている本発明のポリペプチドまたは対応する天然ポリペプチドの生物学的活性および免疫活性を有する修飾ポリペプチドを利用する。
【０１０７】
それは、細胞膜を通して運び出される髄膜炎菌のポリペプチド、とくに保存ＤＮＡ領域に対応するかかるポリペプチドの部分であるのが有利である。
【０１０８】
本発明はまた、上に定義した方法を実施するためのキットをも対象とする。これらのキットは、
−  少なくとも１種の上に定義した試薬、すなわち核酸、抗体またはポリペプチドタイプの試薬、
−  対象とするヌクレオチドハイブリダイゼーション反応または免疫反応の実施を可能ならしめる製品、とりわけマーカーまたは緩衝液ならびに使用説明書
を包含することを特徴とする。
【０１０９】
本発明の産物の特異性と、病原性区画であると解釈しうる領域に結集されていても、染色体上で隔離されていても、それらが髄膜炎菌Ｚ２４９１染色体上に局在していることとが、普遍的対象に対する、すなわち菌株およびそれが示す可変性を問わない、ワクチン組成物の実現のための特別な重要性をそれらに与える。これらの組成物は、それらのスペクトル中にとりわけ予防を包含でき、たとえば小児用ワクチンに組み込むことができる。
【０１１０】
それゆえ、本発明は、抗髄膜炎菌を目的とした予防をそのスペクトル中に包含し、髄膜炎菌により惹起される可能性のあるあらゆる感染を予防するのに当てられるワクチン組成物を対象とし、これらの組成物は、上に定義したポリペプチドまたは抗抗体またはそれらの断片の有効量を生理学的に許容しうる一種または複数の担体と組み合わせて含有することを特徴とする。なお、これらの産物は、それらの免疫原性を増強するために、組み合わせてもよい。
【０１１１】
利用可能な免疫原分子としては、ポリオウイルス蛋白質、破傷風毒素（テタヌストキシン）、さらにはピリンの超可変部に由来する蛋白質が挙げられる。
【０１１２】
変形として、本発明のワクチン組成物は、有効量の
−  上に定義した通りの核酸、
−  上で定義した通りの形質転換宿主または
−  細菌の病原性に関与する少なくとも１つの本発明のＤＮＡ配列が染色体から欠失しているＮｍ細胞
を、生理学的に許容しうる１種または複数の担体とともに包含することを特徴とする。使用するヌクレオチド材料は、生体内でのそれの発現および対応する蛋白質の合成を助長するプロモ−タ−の調節下に置くことが有利である。免疫原性を増強するために、この核酸材料を、ポリオウイルス蛋白質、破傷風毒素、ピリンの超可変部に由来する蛋白質などの担体蛋白質をコ−ドするＤＮＡまたはＲＮＡと組み合わせることもできる。
【０１１３】
本発明のワクチン組成物は、非経口経路で、または皮下に、筋肉内に、さらにはスプレ−の形態で、投与する。
【０１１４】
本発明の他の特徴および利点は、本発明を例証する下記実施例に示すが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１５】
これらの実施例においては、図１〜１１を参照する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１６】
以下の実施例において、以下の材料および方法を用いた：
細菌株  −  差引きバンク構築のためには、ＮｍのＺ２４９１株（Ａｃｈｔｍａｎら、１９９１年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６４，３７５−３８２）、ＭＳ１１株（Ｓｗａｎｓｏｎら、１９７４年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１０，６３３−６４４）およびＮｌの８０６４株および９７６４株を用いたが、検討した種の他のいかなる株も使用可能なことはもちろんである。
【０１１７】
これらバンクの特異性を確認するために、６株のＮｍ、４株のＮｇ、１株のＮｌ（ナイセリア・ラクタミカ）および１株のＮｃ（ナイセリア・シネレア）を用いた。
【０１１８】
６株のＮｍは次のものである：、血清グル−プＡのＮｍ  Ｚ２４９１、血清グル−プＣのＮｍ  ８０１３（ＸＮコレクション）、血清グル−プに分類できないＮｍ  １１２１（ＸＮコレクション）、血清グル−プＡのＮｍ  １９１２（ＸＮコレクション）、血清グル−プＡのＮｍ  ７９７２（ＸＮコレクション）および血清グル−プＢのＮｍ  ８２１６（ＸＮコレクション）。
【０１１９】
４株のＮｇは次のものである：Ｎｇ  ＭＳ１１（パスツ−ル研究所、パリ）、Ｎｇ４０３（パスツ−ル研究所、パリ）、Ｎｇ  ６９３４（パスツ−ル研究所、パリ）、Ｎｇ  ＷＩ（播種性淋菌感染例から単離）、Ｎｇ  ４Ｃ１、Ｎｇ  ６４９３およびＮｇ  ＦＡ１０９０。
【０１２０】
Ｎｌ株はＮｌ  ８０６４およびＮｌ  ９７６４（ＸＮコレクション）であり、Ｎｃ株はＮｃ  ３２１６５（ＸＮコレクション）である。
【０１２１】
分子遺伝学的手法
とくに断らない限り、使用した手法および試薬は、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル。コ−ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）により推奨されているものに相応する。この検討において使用したオリゴデオキシヌクレオチドは次のものである：
【０１２２】
【化１】
2009022296.tif 000002
【０１２３】
膜への転移（サザンブロット）
膜への転移は、正荷電ナイロン膜（ベーリンガー・マンハイム）へのキャピラリー転移により実施した。ハイブリダイゼ−ションは、０．５Ｍ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．２／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／７％ＳＤＳ／１％ＢＳＡを含有する溶液中、６５℃で実施した。膜の洗浄は、４０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．２／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％ＳＤＳを含有する溶液中で実施した。最終洗浄は、６５℃で５分間実施した。
【０１２４】
ｆｒｐＡの配列に基づいたオリゴヌクレオチドを用いて得られたプローブｆｒｐは、Ｚ２４９１株遺伝子５’末端の２．４ｋｂに相応するものである。完全遺伝子に相応するプロ−ブｏｐｃおよびロータマーゼは、発表されている配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドを用いてＺ２４９１株から作成した。プローブｐｉｌＣ１およびｐｐｋ（ポリ燐酸キナーゼ）は、それぞれプラスミドｐＪＬ１およびｐＢｌｕｅＰＰＫ６００１の挿入片に相応したものである。
【０１２５】
（実施例１：Ｎｍに存在するがＮｇには存在しないＤＮＡバンクの構築）
ａ．「ＭｂｏＩ」バンク
構築  −  Ｎｍ  Ｚ２４９１のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＭｂｏＩにより切断し、以下ＣＤＡ（包括的差分析、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）と呼ぶ方法に付し、これを２回反復した。この方法は、Ｎｇ  ＭＳ１１のＤＮＡを切断したものの過剰の存在下での差引きハイブリダイゼ−ションならびにＮｇ  ＭＳ１１のＤＮＡとは有意の相同性を欠いているかまたはそれを示さないために再アニーリング(re-anneler)しうる髄膜炎菌配列をもつもののＰＣＲによる増幅を包含する。
【０１２６】
Ｎｇ  ＭＳ１１株の染色体ＤＮＡを、皮下注射器を反復通過させてランダムに切断し、サイズが３〜１０ｋｂの範囲内になるようにする。これらのＤＮＡ断片をフェノ−ル抽出により精製する。
【０１２７】
Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体ＤＮＡは、制限酵素ＭｂｏＩにより切断する。これらのＤＮＡ断片（２０μｇ）を、１０ナノモルのアニーリングさせたオリゴヌクレオチドＲＢａｍ１２およびＲＢａｍ２４に連結する。過剰のプライマーを２％低融点アガロ−スゲル電気泳動により除去する。サイズが２００ｂｐを越える増幅断片を含有するゲル部分を切り出し、β−アガラーゼで消化する。これらの断片をフェノ−ル抽出により精製する。
【０１２８】
差引きハイブリダイゼーション（第一回）の実施のために、オリゴヌクレオチドＲＢａｍに連結したＮｍ  ＤＮＡの０．２μｇを、全量８ｍｌのＥＥ３Ｘ緩衝液（ＥＥ１Ｘ緩衝液は、１０ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（プロパン−３−スルホン酸）および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる。そのｐＨは８．０である。）中で４０μｇのＮｇ  ＤＮＡと混合する。この溶液を鉱油で覆い、１００℃で２分間加熱してＤＮＡを変性させる。２μｌの５Ｍ  ＮａＣｌを加え、混合物を５５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。反応混合物を、ＮａＣｌおよびＥＥ緩衝液からなる前もって加温した溶液で１／１０に希釈し、直ちに氷上に置く。
【０１２９】
この希釈液の１０μｌを、ＰＣＲ用反応混合物（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ９．０；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ ；０．１％トライトンＸ１００；各々０．２５ｍＭの４種のデオキシヌクレオチド三燐酸；５０単位／ｍｌのＴａｑポリメラ−ゼ）４００μｌに加える。混合物を７０℃で３分間インキュベートして、髄膜炎菌ＤＮＡの再アニーリングした断片の末端を補って完全化する。
【０１３０】
９４℃で５分間の変性および１００μｌ当たり０．１ナノモルの割合でのオリゴヌクレオチドＲＢａｍ２４の添加ののち、ハイブリダイゼーション産物をＰＣＲ（９４℃で１分間、７０℃で１分間および７２℃で３分間を３０サイクル、続いて９４℃で１分間および７２℃で１０分間；パーキン・エルマーＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００）により増幅する。
【０１３１】
増幅された髄膜炎菌断片を、プライマ−および高分子量淋菌ＤＮＡのゲルで分離する。それらをＭｂｏＩにより消化し、再度オリゴヌクレオチドＪＢａｍ１２およびＪＢａｍ２４に連結する。これらの連結されたＤＮＡを再度ゲルおよびフェノ−ル抽出により精製する。
【０１３２】
ランダムに切断したＮｇ  ＤＮＡ  ４０μｇおよび第一回の差引きハイブリダイゼーションから得られたＪＢａｍオリゴヌクレオチド連結ＤＮＡ  ２５ｎｇについて二回目の差引きハイブリダイゼーションを実施する。この第二回反復の時には、自己アニーリングしたＮｍ  ＤＮＡの増幅を、オリゴヌクレオチドＪｂａｍ２４を用いて実施する。
【０１３３】
特異性  −  それらのＮｍ特異性を確認するために、第二回ＣＤＡ法反復後の増幅された配列を標識し、６株の髄膜炎菌、４株の淋菌、１株のナイセリア・ラクタミカおよび１株のナイセリア・シネレアからなるパネルに由来するＣｌａＩ消化ＤＮＡに対するプローブとして用いる。
【０１３４】
実施したサザンブロットにより、第二回ＣＤＡ法反復後の増幅された配列が髄膜炎菌に相応する多くのバンドと強い反応性を示すが、Ｎｇ、Ｎｌ、Ｎｃの諸株に相応するバンドとの反応性は示さないことが証明される。
【０１３５】
それゆえ、「ＭｂｏＩ」バンクはＮｍ特異的であると思われる。
【０１３６】
網羅性  −  バンクの網羅性を検定するために、第一回および第二回のＣＤＡ法の反復で生じた生成物の全体ならびにＮｍ  Ｚ２４８１およびＮｇ  ＭＳ１１の初期染色体材料をアガロースゲル電気泳動に付し、膜に移し、髄膜炎菌特異的であることが既知の遺伝子、すなわちｆｒｐ、ｏｐｃ、ロータマーゼを含むプローブと接触させる（サザンブロット）。
【０１３７】
これらのハイブリダイゼーションから、Ｎｍ特異的遺伝子ｆｒｐがＭｂｏＩバンクにおいて６００ｂｐの断片により表されるが、ロータマーゼおよびｏｐｃ遺伝子についてはいかなる活性も認められないという結果が得られる。それゆえ、ＭｂｏＩバンクは、Ｎｍ特異的であるにも拘らず、網羅的であると考えることはできない。
【０１３８】
しかしながら、高い特異性が得られたので、ＭｂｏＩバンクのためのＣＤＡ法の第二回反復で生じた断片を、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ部位にクロ−ニングすることができる。
【０１３９】
Ｎｍ特異的遺伝子のいずれかに対応する配列は、それが適当なサイズの制限断片により担持されている場合にのみ、当該差引きバンク中に含まれうる。この条件は、２つの因子によって左右される。第一に、より大きい断片が完全にＮｍ特異的である確率は低い。第二に、そのような断片が存在していたとしても、断片のサイズの増大とともに増幅効率が低下するというＰＣＲ手法の限界のために、それら断片がバンク中に不十分にしか出現しない。約６００ｂｐを越えるサイズの断片はバンク中に含まれない。Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体中に適当なサイズのＭｂｏ断片が存在しないために、ロータマーゼおよびｏｐｃ遺伝子はバンク中に含まれえない。いかなる酵素も、それ単独では、何らかのＮｍ特異的遺伝子に対応する小さい断片を製出することができない。それゆえ、特異性の異なる別の制限酵素Ｔｓｐ５０９を用いて、第二のバンクを構築した。
【０１４０】
ｂ．「Ｔｓｐ５０９Ｉ」バンク
構築  −  酵素Ｔｓｐ５０９１には、酵素ＭｂｏＩよりも小さいサイズ（約１ｋｂ未満）の断片を製出することができるという利点がある。
【０１４１】
Ｔｓｐ５０９Ｉは配列ＡＡＴＴを認識し、ＥｃｏＲＩに適合する４塩基配列を５’突出端に残す。使用するオリゴヌクレオチドはＲｅｃｏ、ＪｅｃｏおよびＮＥｃｏである。
【０１４２】
従った方法は、上記「ＭｂｏＩ」バンクの構築のために従った方法と一致している。ただし、Ｔｓｐ５０９Ｉにより製出されたより低分子量断片の数がより多いのを相殺するために、差引きハイブリダイゼーションの第一反復のために、より多量の髄膜炎菌ＤＮＡを用いた。第一反復のためには、４００ｎｇのＮｍ  ＤＮＡ断片を、第二反復のためには、２５ｎｇのＮｍ断片を、４０μｇのランダム切断Ｎｇ  ＤＮＡ断片とともに、差引きハイブリダイゼ−ションに付す。
【０１４３】
この「Ｔｓｐ５０９Ｉ」バンクの構築のため、切断Ｎｇ  ＤＮＡ  ４０μｇおよびＴｓｐ５０９Ｉ消化と第二反復から得られた断片のアダプターＮＥｃｏへの再連結とによって得られたＮｍ断片０．２ｎｇを用いて、対照として、差引きハイブリダイゼーションの第三反復を実施する。
【０１４４】
特異性  −  先のバンクについて記載した通りにして、ＣＤＡ法の第二反復で生じた生成物を標識し、ナイセリア諸株からなるパネルに対するプロ−ブとして利用する。
【０１４５】
図１Ａは、ＣＤＡ法の第二反復の生成物の、つぎのもののＣｌａＩ消化ＤＮＡとのサザンブロットハイブリダイゼ−ションを示している：Ｎｍ（レ−ンａ）、Ｎｇ  ＭＳ１１（レ−ンｂ）、Ｎｍ  ８０１３（レ−ンｃ）、Ｎｇ  ４０３（レ−ンｄ）、Ｎｍ  １１２１（レ−ンｅ）、Ｎｇ  ６９３４（レ−ンｆ）、Ｎｍ  １９１２（レ−ンｇ）、Ｎｇ  ＷＩ（ＤＧＩ株）（レ−ンｈ）、Ｎｍ  ７９７２（レ−ンｉ）、Ｎｌ  ８０６４（レ−ンｊ）、Ｎｃ  ３２１６５（レ−ンｋ）、Ｎｍ  ８２１６（レ−ンｌ）。
【０１４６】
すべてのＮｍ株について観察された強い反応性とは反対に、Ｎｇ、ＮｌおよびＮｃの諸株については弱い反応性が認められるかまたはいかなる反応性も認められない。
【０１４７】
該バンクの特異性を、まず、ＣＤＡ法の３回の反復の各々から生じた生成物の膜への転移（サザンブロット）をｐｉｌＣ１およびｐｐｋに相応するプロ−ブと反応させて調べた。これら２つの遺伝子はＮｍとＮｇとに共通している。
【０１４８】
図１Ｂは、Ｔｓｐ５０９で消化したＮｍ  Ｚ２４９１およびＮｇ  ＭＳ１１の染色体ならびにＣＤＡ法の反復の各々から生じた生成物の電気泳動後のアガロ−スゲルを示している。
【０１４９】
レーンａには、Ｎｍの染色体１μｇを、レーンｂにはＮｇの染色体１μｇを、レーンｃにはＣＤＡの第一反復で生じた生成物０．１５μｇを、レーンｄには第二反復で生じた生成物０．１μｇを、レーンｅには第三反復で生じた生成物０．０５μｇを、それぞれ置いた。ＭＷは分子サイズマーカーを表している。
【０１５０】
図１Ｃおよび１Ｄは、膜への転移（サザンブロット）およびｐｉｌＣ１（図１Ｃ）およびｐｐｋ（図１Ｄ）とのハイブリダイゼ−ションののちの図１Ｂについて記載したのと同様にして得られたゲルを表している。
【０１５１】
ＣＤＡ法の第二反復ののち、遺伝子ｐｉｌＣ１およびｐｐｋに相応する配列はバンクから完全に排除されている。
【０１５２】
網羅性−  該バンクの網羅性を、差引きハイブリダイゼーションで生じた生成物をＮｍ特異性の３遺伝子（ｆｒｐ、ロータマーゼおよびｏｐｃ）に相応するプロ−ブと反応させることにより調べた。
【０１５３】
これらのＮｍ特異性プロ−ブは、差引きハイブリダイゼ−ションの第一および第二反復で生じた増幅産物と反応する。
【０１５４】
図１Ｅ、１Ｆおよび１Ｇは、膜への転移（サザンブロット）およびｆｒｐＡ（図１Ｅ）、ロータマーゼ（図１Ｆ）およびｏｐｃ（図１Ｇ）とのハイブリダイゼーションののちの図１Ｂについて記載したのと同様にして得られたゲルを表している。
【０１５５】
しかし、差引きハイブリダイゼーションの第三反復は、Ｎｍ特異性配列の喪失をもたらす。なぜなら、ロータマーゼ遺伝子およびｏｐｃ遺伝子と反応する断片がこの第三反復には欠けるからである。
【０１５６】
これらのデータの全体を考慮するとき、ＣＤＡ法の第二反復で生じた産物はＮｍ特異性であり、Ｎｍ特異性配列の網羅的バンクを構成してもいるということになる。
【０１５７】
この第二反復で生じた産物を、改めて、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。
【０１５８】
Ｔｓｐ５０９Ｉにより製出されたバンクは、酵素によるより小さい制限断片の産生に基づく理論的考察から推測されるように、ＭｂｏＩにより産生されたバンクよりも網羅的である。
【０１５９】
この見地からは、Ｔｓｐ５０９ＩバンクはＭｂｏＩバンクよりも冗長さがより少ないこと、すなわちそれが包含するクロ−ンの重複がより少ないことにも注目すべきである。Ｔｓｐ５０９Ｉバンクの８６％が異なる配列に相応するが、ＭｂｏＩバンクではクロ−ンの４３％が異なる配列に対応するだけである（データは示さない）。
【０１６０】
それゆえ、Ｔｓｐ５０９Ｉにより製出されたバンクは、Ｎｍ特異的クロ−ンの源を構成する。
【０１６１】
（実施例２：差引きバンクのクローンの分析）
Ｎｍ特異的ＤＮＡのクローニングおよび配列決定
差引きバンクのＤＮＡを、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ（ＭｂｏＩバンク）またはＥｃｏＲＩ（Ｔｓｐ５０９Ｉバンク）のレベルでクローニングしたのち、大腸菌ＤＨ５αを形質転換する。挿入片を、プライマーＭ１３−５０およびＭ１３−４０を用いて形質転換コロニーについてＰＣＲを実施して増幅する。後者のプライマーはその５’末端がビオチニル化されている。
【０１６２】
配列決定は、各ＰＣＲ産物につき、ビオチニル化された鎖とビオチニル化されていない鎖を分離後、ストレプトアビジンを用いるダイナビーズＭ−２８０システム（ダイナール社、オスロ）を用いて実施した。それらの配列を、コンピュータープログラムＢｌａｓｔｎおよびＢｌａｓｔｘ（ＮＣＢＩ、ＵＳＡおよびファスタ）を用い、先に発表されている配列とのそれらの相同性に従って選別する。
【０１６３】
上記の通りプライマーＭ１３−４０およびＭ１３−５０を使用した後の形質転換細菌コロニーからのＰＣＲ産物を、ランダムプライミングによるα−３２Ｐ−ｄＣＴＰの組み込みにより標識し、上記の通りに、Ｎｍ  Ｚ２４９１およびＮｇ  ＭＳ１１株のＣｌａＩにより消化した染色体ＤＮＡの膜への転移のためのプローブとして使用して、それらの特異性を確認しようとした。
【０１６４】
Ｎｍ  Ｚ２４９１株染色体上のクローンの地図の作成
「ＭｂｏＩ」バンク（文字Ｂで表わす）の１７クローンおよび「Ｔｓｐ５０９１」バンク（文字Ｅで表わす）の１６クローンを用いて実施した検討の結果を報告する。これらのクローンの各々は、非反復配列を有しており、Ｎｇには対応するものがない。
【０１６５】
Ｎｍ特異性クローン産物に対応するＤＮＡの配列の位置を、パルスフィールド電気泳動（ＰＦＧＥ）に付したアガロースゲルの膜への転移（サザンブロット）を用い、発表されているＮｍ  Ｚ２４９１の染色体地図（Ｄｅｍｐｓｅｙら、１９９５年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，６３９０−６４００）と比較し、決定した。
【０１６６】
それらＮｍ特異的クロ−ンを、稀な切断部位を示す酵素、すなわちＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＳｇｆＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩおよびＳｇｆＩで消化したＮｍ  Ｚ２４９１のＤＮＡの膜上でのハイブリダイゼーション（サザンブロット）のためのプロ−ブとして利用する。
【０１６７】
ゲル（２０×２０ｃｍ）は、ＴＢＥ  ０．５Ｘ緩衝液中の１％アガロースゲルで、５秒と３５秒との間で直線状に変動するパルスタイムに従い、６Ｖ／ｃｍで３６時間電気泳動に付した。
【０１６８】
膜上でのハイブリダイゼーション（サザンブロット）は、先に記載した通りに実施した。
【０１６９】
得られた結果を図２に示す：発表されている地図上の対応するサイズの断片の位置と比較して、反応性が局在化されていた。Ｄｅｍｐｓｅｙら（先に引用）により地図に記入された遺伝標識形質（マーカー）の全体の位置は、線状染色体地図上に点によって表示してある。先行開示されているＮｍに特異的な遺伝子は星印によって示されている。「ｆｒｐ」と呼ばれる２つの座は、ｆｒｐＡおよびｆｒｐＣ遺伝子に相応する。「ｐｉｌＣ」座（複数）はｐｉｌＣ１およびｐｉｌＣ２遺伝子に相応し、これら遺伝子は相同性遺伝子対であるが、地図上では区別されていない。本発明のＮｍに特異的なクロ−ンの位置の正確さは、反応性制限断片の一部が重なり合うことによる。平均して、その位置は＋／−２０ｋｂである。
【０１７０】
この地図作成は、Ｎｍに特異的な配列のランダムではない分布を明らかにしている。Ｎｍに特異的な配列の大部分は、異なる３群に属している。これらの群の１つ（領域１）は、先に記述した莢膜に関係する遺伝子の位置に相応している。  下記が識別される：
−  Ｅ１０９、Ｅ１３８、Ｂ２３０およびＢ３２３を領域１であるとして、
−  Ｂ３２２、Ｂ２２０、Ｂ１０８、Ｂ１３２、Ｂ２３３、Ｂ３２８、Ｅ１３９、Ｅ１４５およびＢ１０１を領域２であるとして、そして、
−  Ｂ３０６、Ｅ１１４、Ｅ１１５、Ｅ１２４、Ｅ１４６、Ｅ１２０、Ｅ１０７、Ｅ１３７およびＥ１４２を領域３であるとして。
【０１７１】
髄膜炎菌に特異的であると確認された配列の６３％が、これら３つの異なる領域の内部に局在している。
【０１７２】
この結集は、先行開示されているＮｍに特異的な遺伝子（ｆｒｐＡ、ｆｒｐＣ、ｐｏｒＡ、ｏｐｃおよび莢膜に関係する領域）の分布と対照をなしている。
【０１７３】
この先行技術は、実際、Ｎｍに特異的な遺伝子が、機能的に莢膜に関係する遺伝子を除いて、染色体に沿って分散していることを示唆していた。
【０１７４】
染色体上のＮｍに特異的な配列の地図作成は、先行技術と比較して予想できない結果へと導いている。
【０１７５】
検討した髄膜炎菌株と淋菌株との間の遺伝的差の大部分は、異なる３つの群に結集されている。
【０１７６】
領域１は、髄膜炎菌の莢膜に関連する遺伝子を結集している。
【０１７７】
他の領域の遺伝子の機能は未知であるが、発表されている配列との相同性（表１）は、領域３のいくつかの遺伝子とバクテリオファージのトランスポザーゼ蛋白質および調節蛋白質との間の類似性を示唆している。いかなる髄膜炎菌ウイルスも確認されておらず、これらの配列がファージ起源のものであろうと想像するのは魅力的なことである。興味あることに、インフルエンザ菌のゲノムも、ファージＭｕの調節蛋白質Ｎｅｒの配列と相同性の配列を含んでいるが、機能的遺伝子であるかどうかは未知である。
【０１７８】
クローンＢ２０８は、ＴｏｎＢ依存性のフェリックシデロフォアに結合する蛋白質のクラス中に保存されている領域のクローン（ドメインＩＩＩ）と高い相同性（３３アミノ酸について４８％同一、９１％相同）を示す。
【０１７９】
このクロ−ンがＮｍに特異的な遺伝子ｐｏｒＡならびにｆｅｒ  ｆｒｐ（鉄）により調節される遺伝子に近接していること、およびとくにそれが外膜表面に露出したＮｍに特異的な受容体蛋白質である可能性は、それをさらに詳しく研究するためのよき候補ならしめる。
【０１８０】
クローンＢ３３９は、Ｎｍに特異的な挿入配列ＩＳ１１０６に相応する。
【０１８１】
クローンＢ１３４とアエロモナス(Aeromonas) の挿入配列との間のわずかな相同性ならびにＮｍの種々の株の間でのクローンＢ１３４の重複コピ−の存在は、それが新しいタイプのＮｍ特異性挿入配列を表わしている可能性を示唆する。
【０１８２】
Ｎｍに特異的なクローンを含む領域が大腸菌およびペスト菌について先に記述した通りの病原性区画に相応する可能性は、とくに興味あるものである。
【０１８３】
この発明において単離されたクローンは、より大きい染色体断片のクローニングおよび配列決定を可能ならしめることにより、そして直接的に、遺伝子座変異のためのそれらの利用により、Ｎｍ特異的領域の直接関連性をよりよく理解することを可能ならしめる。
【０１８４】
最後に、微生物の病原性に関与している可能性のある髄膜炎菌特異性遺伝子を検出することにより、抗髄膜炎菌ワクチンの利用できる適切な抗原に照準を当てることが可能になる。
【０１８５】
本発明方法の有効性および迅速性のため、似通った２つの病原体に固有の表現型の原因となっている遺伝的差を探究する多くの場面で該方法を使用することが可能となる。
【０１８６】
ナイセリア諸株からなるパネルに対する領域１、２および３のクローンの反応性の検討
クローンの各々の挿入断片に対応するＰＣＲ産物を集め、Ｎｍ、Ｎｇ、ＮｌおよびＮｃの諸株からなるパネルに対する膜上ハイブリダイゼーション（サザンブロット）のプローブとして使用した。
【０１８７】
領域１および２は、髄膜炎菌の各々について限られた数のバンドを生じさせる。このことは、これらの領域が、Ｎｍに特異的であると同時に、髄膜炎菌のすべてに共通していることを示唆している。
【０１８８】
図３は、ナイセリア諸株からなるパネルに対する領域１、２および３のクローンの反応性を示している。領域１（図３Ａ）、領域２（図３Ｂ）および領域３（図３Ｃ）のクローンを同時に、髄膜炎菌、淋菌からなるパネルならびにＮｌおよびＮｃの各１株に対するプローブとして用いた。
【０１８９】
レーンはつぎの通りである：レーンａがＮｍ  Ｚ２４９１の、レーンｂがＮｇＭＳ１１の、レーンｃがＮｍ  ８０１３の、レーンｄがＮｇ  ４０３の、レーンｅがＮｍ  １１２１の、レーンｆがＮｇ  ６９３４の、レーンｇがＮｍ  １９１２の、レーンｈがＮｇ  ＷＩ（ＤＧＩ株）の、レーンｉがＮｍ  ７９７２の、レーンｊがＮｌ  ８０６４の、レーンｋがＮｃ  ３２１６５の、レーンｌがＮｍ  ８２１６の各ＤＮＡ。
【０１９０】
見事なことに、領域３は血清グループＡの髄膜炎菌のみと反応性を示す。この領域３は、それゆえ、Ｎｍのサブグループに特異的である。
【０１９１】
クローン化された領域の可能性ある機能を評価するために、データバンクで既知の配列との比較を実施した。
【０１９２】
つぎの表１は、染色体地図上の特異的クロ−ンの位置および既知配列との相同性を示している。
【０１９３】
【表１Ａ】
2009022296.tif 000003
【０１９４】
【表１Ｂ】
2009022296.tif 000004
【０１９５】
【表１Ｃ】
2009022296.tif 000005
【０１９６】
括弧内は、プログラムＢｌａｓｔｘにより与えられたままの見出された相同性の有意性である。
【０１９７】
＊）指数「１」、「２」または「３」の付されたクローンはそれぞれ髄膜炎菌Ｚ２４９１の染色体の領域「１」、「２」または「３」のものである。
【０１９８】
＋）Ｅ１０９とＥ１３８とは隣接クロ−ンである。§）Ｂ３０６とＥ１１５とは一部が重なり合っている。＃）Ｂ２３６はａｒｇＦ領域で弱い反応性を示しもする。ｑ）クローンＥ１０３はＴｓｐ５０９Ｉ部位を含み、従って、２つの挿入断片を含みうるが、それは髄膜炎菌Ｚ２４９１の染色体のＣｌａＩ（Ｏｋｓ）断片としか反応せず、地図上で１つの位置しか占めないので、ここにはこのクローンが含められている。
【０１９９】
まず最初に、領域１のクローンがすべて莢膜の生合成に関与する遺伝子に相応していることがわかる。これらの遺伝子は、先に、血清グループＢのＮｍのあいだで研究されている（Ｆｒｏｓｃｈら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１６６９−１６７３およびＦｒｏｓｃｈら、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８，４８３−４９３）。
【０２００】
セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens ）の溶血素活性化物質との弱い相同性を除けば、領域２のクローンは、ＤＮＡレベルでも蛋白質レベルでも、発表されている配列とはいかなる有意の相同性も示さない。
【０２０１】
領域３のクローンの２つは、ＤＮＡに結合する蛋白質、とくにバクテリオファージの調節蛋白質およびトランスポザーゼ蛋白質との興味ある相同性を示す。
【０２０２】
クローンＢ２０８は、あるクラスの受容体（ＴｏｎＢ依存性フェリックシデロフォア）中に保存された領域の１つと強い相同性を示す。
【０２０３】
クローンＢ１３４およびＢ３３９は、染色体の多く（それぞれ少なくとも５つおよび少なくとも８つ）の領域とハイブリダイズする。
【０２０４】
配列に関するデータは、クローンＢ３３９がＮｍに特異的な挿入配列Ｓ１１０６に相応することを示している。
【０２０５】
クローンＢ１４３の翻訳産物は、アエロモナス(Aeromonas) の１つの挿入配列（ＳＡＳ２）のトランスポザ−ゼ（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎら、１９９４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３７，４５２−４６３）と限られた相同性を示す。我々は、膜への転移（サザンブロット）により、このクローンが、試験したパネルの各髄膜炎菌の染色体中の重複コピーとして存在するＮｍに特異的な存在であることを証明できた。
【０２０６】
他のクローンは、発表されているナイセリアの配列と有意の相同性を示さず、しかも、発表されているいかなる配列とも相同性を示さない。それゆえ、これらのクローンは、単離された他のクローンの大部分とともに、全く新規なＮｍ特異的遺伝子座のバンクを構成する。
【０２０７】
（実施例３：Ｎｍ染色体の領域２の研究）
領域２の配列決定および特性描写
血清グループＡ、サブグループＩＶ−１のＺ２４９１株の染色体ＤＮＡを用いてのＰＣＲによる増幅を、領域２のクローンの配列の各々から作成したオリゴヌクレオチドプローブを用い、多くの異なる組合せに従って、実施する。チェインターミネーター手法ならびに自動配列決定（ＡＢＩ３７３または３７７）を利用し、２本鎖から出発して、重なり合うＰＣＲ産物の配列を決定する。
【０２０８】
すぐに使用できるクローンの限界を越えて配列を延長するために、Ｚ２４９１株の１５ｋｂのＳａｕＩＩＩＡ部分断片をラムダＤＡＳＨ−ＩＩ（ストラタジーン）中にクローン化する。
【０２０９】
領域２に重なる挿入断片を含むファージを、この領域のクローンをプローブとしたハイブリダイゼーションにより確認する。挿入ＤＮＡを、挿入断片の両末端から配列決定し、これらの配列を、ファージＤＮＡを増幅しないで直接染色体ＤＮＡを増幅するのに役立つ新規なプライマーを作成するのに利用する。
【０２１０】
これら新規プライマーおよび以前から利用可能な配列のプライマーを用いることにより、染色体ＤＮＡの増幅が達成される。
【０２１１】
これらのＰＣＲ産物も、２本鎖から出発して配列を決定する。これにより、１５６２０ｂｐの完全配列に至る（配列番号３６）。この配列の、ＡＴＧまたはＧＴＧで始まり、高いコドン使用率により特徴付けられる読み取り枠を分析する。この分析により、１５６２０ｂｐの配列の大部分を満たす７つのＯＲＦ（open reading frame）が明らかになる。これらのＯＲＦはつぎのものである：
【０２１２】
【化２】
2009022296.tif 000006
【０２１３】
ＯＲＦ−４は、コドンＧＴＧで始まり、同じ読み枠（１０１２７−１２１１８、フレ−ム２）中のそれよりもわずかに小さくてコドンＡＴＧに始まるＯＲＦ（配列番号４１）に重なる。
【０２１４】
ＯＲＦ−４は、細菌毒素（ピオシン、コリシン）または細菌の真核細胞蛋白質への接着に関与する表面蛋白質であるピオシン（緑膿菌）、コリシンおよびインチミン（大腸菌）を包含するポリペプチドファミリーと構造上の相同性を示す蛋白質をコ−ドする。ＯＲＦ−７は、配列中に潜在的膜貫通領域を含み、細菌のペリプラズム蛋白質または外膜中にはさみ込まれる蛋白質と構造上の相同性を示す蛋白質をコードする。ＯＲＦ−４およびＯＲＦ−７の構造上の相同性は、プログラムＰｒｏｐＳｅａｒｃｈを用いて確認した。
【０２１５】
プログラムＢＬＡＳＴを用いてのＧｅｎＢａｎｋ中の他のＯＲＦと相同性の配列の検索により、ＯＲＦ−２のＮ末端領域と百日咳菌の繊維状ヘマグルチニンＢとの間の相同性（３５２アミノ酸について類似４３％、同一３６％）およびＯＲＦ−１と百日咳菌のｆｈａＣｄｅ蛋白質との間の相同性（４０１アミノ酸について類似３５％、同一２７％）が明らかにされた。ＯＲＦ−１とＯＲＦ−２とは、Ｚ２４９１株中での隣接遺伝子であり、百日咳菌の繊維状ヘマグルチニンＢとｆｈａＣとは百日咳菌中での隣接遺伝子であり、このことは、これらの相同性が機能上の相同性を反映している可能性を強めるものである。
【０２１６】
Ｎｍに対する領域２の特異性の確認
領域２の諸クローンの配列から出発して作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて領域２のいろいろな部分のＰＣＲによる増幅によって得られたＤＮＡプローブを用いて、サザンブロットを実施した。
【０２１７】
図４に、これらオリゴヌクレオチドのおおよその位置を示した。
【０２１８】
ＯＲＦ−１の半分には、Ｒ２００１（配列番号４６）およびＲ２００２（配列番号４７）と呼ぶオリゴヌクレオチドが、ＯＲＦ−１の半分＋ＯＲＦ−２の大部分には、オリゴヌクレオチドＢ３３２ａ（配列番号４８）、ｅ１３９ａ（配列番号４９）、ｂ１３２ａ（配列番号５０）およびｂ２３３ｂ（配列番号５１）が、ＯＲＦ−４の１／３＋ＯＲＦ−５〜７には、オリゴヌクレオチドｅ１４５ａ（配列番号５２）およびｂ１０１ａ（配列番号５３）がある。
【０２１９】
つぎのハイブリダイゼ−ション条件のもとで３回のサザンブロットを実施する：
６５℃で１６時間、
ＮａＰＯ４    ０．５Ｍ、ｐＨ７．２
ＥＤＴＡ−Ｎａ  ０．００１Ｍ
ドデシル硫酸ナトリウム１％。
【０２２０】
洗浄のためには、６５℃で１０分間加熱し、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．２；０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ−Ｎａ、１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いる。
【０２２１】
図５、６および７は、それぞれ、上に述べたＯＲＦ部分の各々を用いて得られたサザンブロットを示している。
【０２２２】
サザンブロットの各々において、１４のレ−ンはそれぞれ下記に対応している：
１：ＭＳ１１（Ｎｇ）
２：４０３（Ｎｇ）
３：ＦＡ１０９０（Ｎｇ）
４：Ｗ１（Ｎｇ）
５：６４９３（Ｎｇ）
６：マーカー（ラムダＨｉｎｄＩＩＩ）
７：Ｚ２４９１（Ｎｍ，グループＡ）
８：７９７２（Ｎｍ  グループＡ）
９：８０１３（Ｎｍ，グループＣ）
１０：１１２１（グループ分けできないＮｍ）
１１：１９１２（Ｎｍ，グループＢ）
１３：３２１６５（Ｎｃ）
１４：８０６４（Ｎｌ）
これらの実験ではナイセリア諸株からなるパネルを用い、各々のウエルには類似した量の消化ＤＮＡを加えているから、これら３回のサザンブロットは、領域２に相応する配列が試験した髄膜炎菌のすべてにあること、および試験した諸株のＮｇのゲノム中には有意の相同性配列がないことをはっきりと示している。
【０２２３】
（実施例４：Ｎｍのゲノムの、Ｎｌにはなく、Ｎｇとは共通の領域の同定）
実施例１に記載した手法に従い、ただし１株のＮｍ（Ｚ２４９１）および２株のＮｌ（ＸＮコレクション）用い、同量のＤＮＡを混合して、操作する。
【０２２４】
ＲおよびＪのプライマー系列を用いて２回の差引きを実施する。このようにして、３つの異なるバンクを構築する。
【０２２５】
ＢａｍおよびＥｃｏと呼ぶ２つのバンクは、それぞれ、Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体ＤＮＡをＭｂｏＩおよびＴｓｐ５０９１により消化することによって得る；Ｎｍの染色体ＤＮＡのＭｓｐＩ消化に由来するＣｌａと呼ぶ第三のバンクは、プライマーＲＭｓｐ１０、ＲＭｓｐ２４、ＪＭｓｐ１０およびＪＭｓｐ２４のセットを用いて得る。使用プライマーの集合を、つぎの表２に示す。
【０２２６】
【表２】
2009022296.tif 000007
【０２２７】
２回の差引きののち、各増幅産物全体を標識し、プローブとして利用する。
【０２２８】
それらの差引きバンクのチェックを、１２株のナイセリア（ＣｌａＩ切断染色体ＤＮＡ）からなるパネルについてサザンブロットにより実施する。ハイブリダイゼーション条件は、実施例１で示したものと同一である。
【０２２９】
これらのサザンブロットを図８Ａ〜８Ｃに示す。それらの図はそれぞれ、ＭｂｏＩ／ＢａｍＨＩバンク、ＭｓｐＩ／ＣｌａＩバンクおよびＴｓｐ５０９１／ＥｃｏＲＩバンクに対応している。
【０２３０】
１２のレ−ンはそれぞれ下記に対応している：
【０２３１】
【化３】
2009022296.tif 000008
【０２３２】
サザンブロット試験は、各バンクに含まれている配列がＮｍに特異的であり、Ｎｌにはないことを示している。さらに、Ｎｇの諸株を用いて観察された反応性は、これら配列のいくつかがＮｇに存在することを示唆している。
【０２３３】
これらのバンクの各々をつぎに、Ｂａｍの場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ部位に、Ｅｃｏの場合にはＥｃｏＲＩ部位に、Ｃｌａの場合にはＣｌａＩ部位にクローン化した。それらクローンのＮｍゲノムに対する特異性を確認するために、個々のクローンの制限およびそれらの放射性標識を実施した。ＮｍおよびＮｇに対して同時に反応性を示すクローンを、のちの研究のために保存した。これらのクローンを図９、１０および１１に示す。それらの図は、Ｎｍ、ＮｌおよびＮｇに対するＢａｍバンクの５クローン（図９）、Ｅｃｏバンクの１６クローン（図１０）およびＣｌａバンクの１３クローン（図１１）のプロフィールを示している。
【０２３４】
普遍プライマーおよび逆方向プライマーを用いて、これらのクローンの配列を決定した。以下の通りである：
−  Ｂａｍクローン
１４０ｂｐの不完全Ｂ１１（配列番号６６）、４２５ｂｐと推定される不完全Ｂ１３（配列番号６７）、１８１ｂｐのＢ２６（配列番号６８）、３０７ｂｐのＢ３３（配列番号６９）、２４３ｂｐのＢ４０（配列番号７０）、
−  Ｃｌａクロ−ン
２８０ｂｐのＣ１６（配列番号７２）、３６５ｂｐと推定される不完全Ｃ２０（配列番号７３）、６４５ｂｐと推定される不完全Ｃ２４（配列番号７４）、２４５ｂｐと推定される不完全Ｃ２９（配列番号７５）、３８１ｂｐのＣ３４（配列番号７６）、２６９ｂｐのＣ４０（配列番号７７）、２０３ｂｐのＣ４２（配列番号７８）、２２９ｂｐのｐ  Ｃ４３（配列番号７９）、２０６ｂｐのＣ４５（配列番号８０）、２２４ｂｐのＣ４７（配列番号８１）、２１２ｂｐのＣ６２（配列番号８２）および９００ｂｐと推定されるＣ１３０（５’．．．）（配列番号８３）ならびに
−  Ｅｃｏクロ−ン
３０８ｂｐのＥ２（配列番号８４）、１７０ｂｐと推定される不完全Ｅ５（配列番号８５）、３００ｂｐと推定される不完全Ｅ２２（配列番号８６）、２７３ｂｐのＥ２３（配列番号８７）、２７１ｂｐのＥ２４（配列番号８８）、２６８ｂｐのＥ２９（配列番号８９）、２７５ｂｐと推定される不完全Ｅ３３（配列番号９０）、３６５ｂｐと推定される不完全Ｅ３４（配列番号９１）、２６０ｂｐのＥ４５（配列番号９２）、３８０ｂｐを越えると推定されるＥ５９（配列番号９３）、３０８ｂｐのＥ７８（配列番号９４）、２８６ｂｐのＥ８５（配列番号９５）、２３８ｂｐのＥ８７（配列番号９６）、３２０ｂｐを越える不完全Ｅ９４（配列番号９７）、３２０ｂｐを越える不完全Ｅ１０３（配列番号９８）および２１７ｂｐのＥ１１０（配列番号９９）。
【０２３５】
各々のクローンの地図作成を、Ｎｍ  Ｚ２４９１の染色体上で、実施例２で記載した通りにして実施した。得られた結果を、図２の右側部分に示す。これらのクローンが４および５と呼ぶ領域に対応することが確認される。それゆえ、これらの領域は、ＮｍおよびＮｇに同時に存在するがＮｌにはない配列から構成されている。従って、それらは、初期のすみつきと粘膜貫通の原因となる病毒因子をコ−ドする配列であると考えられる。領域４は、Ｎｍ  ２４９１の染色体上のａｒｇＦとｒｅｇＦとの間に、領域５はラムダマ−カ−３７５とｐｅｎＡとの間に位置している。この領域は、おそらく、変異体Ｏｐａおよびトランスフェリン結合蛋白質をコ−ドする配列を含んでいると思われる。
【０２３６】
データバンクの既知の配列との比較から、５０％の確率で、領域４中ではクローンＣ１３０のみが相同性を、すなわちＭｓｐＩメチラーゼと相同性を示す。領域５では、クローンＣ８、Ｅ２、Ｂ４０、Ｃ４５、Ｅ２３およびＥ１０３について、いかなる既知配列との相同性も見出されなかった。他のクロ−ンについての相同性はつぎの通りである：
Ｂ１１  アルギニンデカルボキシラ−ゼＳｐｅＡ；Ｃ２９  アルギニンデカルボキシラ−ゼＳｐｅＡ；Ｃ６２  オキソグルタル酸／リンゴ酸トランスポーター；反復ＤＮＡエレメント；Ｅ３４  ＤＮＡの反復エレメント；Ｅ９４  マウスエンドペプチダーゼＭｅｐＡ；Ｃ４７  クエン酸シンターゼＰｒｐＣ；Ｅ７８  クエン酸シンターゼＰｒｐＣ
（実施例５：生体試料中に１つ以上の髄膜炎菌株が存在することの証明）
脳脊髄液、尿、血液、唾液タイプの生体試料を採取する。
【０２３７】
濾過および抽出ののち、この試料中に存在するＤＮＡをゲル電気泳動に付し、サザンブロッティングにより膜へ移行させる。
【０２３８】
配列番号５の３２Ｐ標識により構成されたヌクレオチドプローブをこの転移膜とともにインキュベートする。
【０２３９】
オートラジオグラフィーののち、反応性バンド（単数または複数）の存在により、試料中の髄膜炎菌の存在を診断できる。
【０２４０】
（実施例６：抗髄膜炎菌を目的とした予防をそのスペクトル中に含み、あらゆる形態の髄膜炎菌感染を防止するためのワクチン組成物）
配列番号１０を含む配列によりコードされたペプチドは毒素に結合される。
【０２４１】
そこで、この結合ペプチドを、抗ヘモフィルスおよび抗肺炎双球菌ワクチンまたは他の任意の小児用ワクチンを含有する組成物に加える。
【０２４２】
生じた組成物は、滅菌後、非経口的に、皮下にまたは筋肉内に注射できる。
【０２４３】
この同じ組成物を、噴霧によって粘膜に適用することもできる。
【０２４４】
（配列表）
【０２４５】
【化４】
2009022296.tif 000009
【０２４６】
【化５】
2009022296.tif 000010
【０２４７】
【化６】
2009022296.tif 000011
【０２４８】
【化７】
2009022296.tif 000012
【０２４９】
【化８】
2009022296.tif 000013
【０２５０】
【化９】
2009022296.tif 000014
【０２５１】
【化１０】
2009022296.tif 000015
【０２５２】
【化１１】
2009022296.tif 000016
【０２５３】
【化１２】
2009022296.tif 000017
【０２５４】
【化１３】
2009022296.tif 000018
【０２５５】
【化１４】
2009022296.tif 000019
【０２５６】
【化１５】
2009022296.tif 000020
【０２５７】
【化１６】
2009022296.tif 000021
【０２５８】
【化１７】
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【０２５９】
【化１８】
2009022296.tif 000023
【０２６０】
【化１９】
2009022296.tif 000024
【０２６１】
【化２０】
2009022296.tif 000025
【０２６２】
【化２１】
2009022296.tif 000026
【０２６３】
【化２２】
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【０２６４】
【化２３】
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【０２６５】
【化２４】
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【０２６６】
【化２５】
2009022296.tif 000030
【０２６７】
【化２６】
2009022296.tif 000031
【０２６８】
【化２７】
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【０２６９】
【化２８】
2009022296.tif 000033
【０２７０】
【化２９】
2009022296.tif 000034
【０２７１】
【化３０】
2009022296.tif 000035
【０２７２】
【化３１】
2009022296.tif 000036
【０２７３】
【化３２】
2009022296.tif 000037
【０２７４】
【化３３】
2009022296.tif 000038
【０２７５】
【化３４】
2009022296.tif 000039
【０２７６】
【化３５】
2009022296.tif 000040
【０２７７】
【化３６】
2009022296.tif 000041
【０２７８】
【化３７】
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【０２７９】
【化３８】
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【０２８０】
【化３９】
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【０２８１】
【化４０】
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【０２８２】
【化４１】
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【０２８３】
【化４２】
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【０２８４】
【化４３】
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【０２８５】
【化４４】
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【０２８６】
【化４５】
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【０２８７】
【化４６】
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【０２８８】
【化４７】
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【０２８９】
【化４８】
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【０２９０】
【化４９】
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【０２９１】
【化５０】
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【０２９２】
【化５１】
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【０２９３】
【化５２】
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【０２９４】
【化５３】
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【０２９５】
【化５４】
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【０２９６】
【化５５】
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【０２９７】
【化５６】
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【０２９８】
【化５７】
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【０２９９】
【化５８】
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【０３００】
【化５９】
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【０３０１】
【化６０】
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【０３０２】
【化６１】
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【０３０３】
【化６２】
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【０３０４】
【化６３】
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【０３０５】
【化６４】
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【０３０６】
【化６５】
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【０３０７】
【化６６】
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【０３０８】
【化６７】
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【０３０９】
【化６８】
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【０３１０】
【化６９】
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【０３１１】
【化７０】
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【０３１２】
【化７１】
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【０３１３】
【化７２】
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【０３１４】
【化７３】
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【０３１５】
【化７４】
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【０３１６】
【化７５】
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【０３１７】
【化７６】
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【０３１８】
【化７７】
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【０３１９】
【化７８】
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【０３２０】
【化７９】
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【０３２１】
【化８０】
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【０３２２】
【化８１】
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【０３２３】
【化８２】
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【０３２４】
【化８３】
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【０３２５】
【化８４】
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【０３２６】
【化８５】
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【０３２７】
【化８６】
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【０３２８】
【化８７】
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【０３２９】
【化８８】
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【０３３０】
【化８９】
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【０３３１】
【化９０】
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【０３３２】
【化９１】
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【０３３３】
【化９２】
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【０３３４】
【化９３】
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【０３３５】
【化９４】
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【０３３６】
【化９５】
2009022296.tif 000100
【０３３７】
【化９６】
2009022296.tif 000101
【０３３８】
【化９７】
2009022296.tif 000102
【０３３９】
【化９８】
2009022296.tif 000103
【０３４０】
【化９９】
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【０３４１】
【化１００】
2009022296.tif 000105
【図面の簡単な説明】
【０３４２】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆおよび１Ｇは、差引きバンクＴｓｐ５０９１の分析結果を示す。
【図２】図２は、Ｎｇと比較してのＺ２４９１株の染色体上のＮｍ特異的配列の分布（左部分）およびＮｌと比較してのＮｍ特異的配列の分布（右部分）を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、本発明に従った染色体の３領域のクロ−ンのナイセリア属株標本パネルに対する反応性を示す。
【図４】図４は、プロ−ブとして用いたオリゴヌクレオチドのＮｍの染色体の領域２における位置を示す。
【図５】Ｎｍの領域２の部分をプロ−ブとして用いたときの、ナイセリア属標本パネルのサザンブロットを示す。
【図６】Ｎｍの領域２の部分をプロ−ブとして用いたときの、ナイセリア属標本パネルのサザンブロットを示す。
【図７】Ｎｍの領域２の部分をプロ−ブとして用いたときの、ナイセリア属標本パネルのサザンブロットを示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、１２株からなるナイセリア標本パネルについての、３つの差引きバンクを用いたサザンブロットを示す。
【図９】Ｎｍ、ＮｌおよびＮｇに対する３つの差引きバンクのクロ−ンの反応性を示す。
【図１０】Ｎｍ、ＮｌおよびＮｇに対する３つの差引きバンクのクロ−ンの反応性を示す。
【図１１】Ｎｍ、ＮｌおよびＮｇに対する３つの差引きバンクのクロ−ンの反応性を示す。
【図１】
2009022296.tif 000106
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2009022296.tif 000110
【図６】
2009022296.tif 000111
【図７】
2009022296.tif 000112
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2009022296.tif 000114
【図８Ｃ】
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【図９】
2009022296.tif 000116
【図１０】
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【図１１】
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