(57)【要約】【課題】生体への移植後に生体に悪影響を及ぼすことを十分に低減した移植材を短時間に製造する。【解決手段】採取した生体組織と消化酵素を含む消化液とを混合して攪拌し細胞を分離する分離工程Ｓ２と、該分離工程Ｓ２において分離された細胞を含む細胞懸濁液に消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤を添加する阻害剤添加工程Ｓ３とを備える移植材の製造方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取した生体組織と消化酵素を含む消化液とを混合して攪拌し細胞を分離する分離工程と、
該分離工程において分離された細胞を含む細胞懸濁液に消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤を添加する阻害剤添加工程とを備える移植材の製造方法。
【請求項２】
採取した生体組織を２つに分割する分割工程と、
分割された生体組織の一方と消化酵素を含む消化液とを混合して攪拌し細胞を分離する分離工程と、
該分離工程において分離された細胞を含む細胞懸濁液に消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤を添加する阻害剤添加工程と、
該阻害剤添加工程において阻害剤が添加された細胞懸濁液から細胞を回収する回収工程と、
該回収工程において回収された細胞と、前記分割工程において分割された他方の生体組織とを混合する混合工程とを備える移植材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植材の製造方法に関するものである。  
【背景技術】
【０００２】
従来、採取した生体組織、例えば、脂肪組織から細胞を集めるために、消化酵素液（コラゲナーゼ等）の試薬を添加して、生体組織から細胞を単離させることが行われている。
この場合に、単離された細胞を移植材として使用する必要から、移植後に消化酵素液が移植先の生体に対して悪影響を及ぼす可能性を低減するために、単離後に、生理食塩水等の洗浄液を加えて攪拌することにより、細胞に付着している消化酵素液を洗い流す作業が行われていた。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第０５／０１２４８０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、消化酵素液を完全に除去することはできないため、生体に影響を及ぼさない程度の濃度まで、消化酵素液の濃度を希釈するには、大量の洗浄液を必要とし、かつ、洗浄作業に多大な時間を要するという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体への移植後に生体に悪影響を及ぼすことを十分に低減した移植材を短時間に製造することができる移植材の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、採取した生体組織と消化酵素を含む消化液とを混合して攪拌し細胞を分離する分離工程と、該分離工程において分離された細胞を含む細胞懸濁液に消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤を添加する阻害剤添加工程とを備える移植材の製造方法を提供する。
【０００６】
上記発明においては、分離工程において、生体組織と消化液とが混合されて攪拌されることにより、生体組織から細胞が単離された細胞懸濁液が生成される。その後、阻害剤添加工程において、消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤を細胞懸濁液に添加することにより、消化酵素の機能が不活化される。すなわち、細胞懸濁液内に消化酵素が残存していても、消化阻害剤の作用によりその機能が停止されるので、そのまま、生体に移植しても、生体に及ぼす悪影響を低減した移植材を製造することができる。
【０００７】
また、本発明は、採取した生体組織を２つに分割する分割工程と、分割された生体組織の一方と消化酵素を含む消化液とを混合して攪拌し細胞を分離する分離工程と、該分離工程において分離された細胞を含む細胞懸濁液に消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤を添加する阻害剤添加工程と、該阻害剤添加工程において阻害剤が添加された細胞懸濁液から細胞を回収する回収工程と、該回収工程において回収された細胞と、前記分割工程において分割された他方の生体組織とを混合する混合工程とを備える移植材の製造方法を提供する。
【０００８】
本発明によれば、分割工程において分割された一方の生体組織と消化液とが混合されて攪拌されることにより、生体組織から細胞が単離された細胞懸濁液が生成される。その後、阻害剤添加工程において、消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤を細胞懸濁液に添加することにより、消化酵素の機能が不活化される。そして、回収工程において、阻害剤が添加された細胞懸濁液から細胞が回収され、回収された消化酵素の機能が不活化された細胞と他方の生体組織とを混合工程において混合することにより、自己の生体組織のみからなり、該生体組織内における細胞の濃度を向上した移植材を製造することができる。この場合に、細胞を洗浄する洗浄工程を不要としたので、洗浄液が不要となり、また、多大な時間を要していた洗浄工程が不要となるので、短時間に移植材を製造することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生体への移植後に生体に悪影響を及ぼすことを十分に低減した移植材を短時間に製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の第１の実施形態に係る移植材の製造方法について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る移植材Ｆの製造方法は、図１に示されるように、哺乳動物、例えば、ヒトから採取した脂肪組織（生体組織）Ａを生理食塩水等の洗浄水Ｂにより洗浄する洗浄工程Ｓ１と、洗浄された脂肪組織Ａ′と消化酵素（例えば、コラゲナーゼ等）を含む消化液Ｃとを混合して攪拌し、脂肪組織Ａ′から脂肪由来細胞を分離する分離工程Ｓ２と、該分離工程Ｓ２において分離された脂肪由来細胞を含む細胞懸濁液Ｄに消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤Ｅ（例えば、ＥＤＴＡ）を添加する阻害剤添加工程Ｓ３とを備えている。洗浄工程Ｓ１は、脂肪組織Ａと生理食塩水のような洗浄液Ｂとを混合して攪拌することにより赤血球等の付着物を洗い落として清浄な脂肪組織Ａ′を得るようになっている。
【００１１】
本実施形態に係る移植材Ｆの製造方法は、図２に示される製造装置１により実施される。
この製造装置１は、脂肪組織Ａから赤血球等の付着物を洗い落とす洗浄工程Ｓ１を行う洗浄手段２と、洗浄された脂肪組織Ａ′から脂肪由来細胞を分離する分離工程Ｓ２を行う分離手段３と、該分離手段３において分離された脂肪由来細胞を含む細胞懸濁液Ｄに消化阻害剤Ｅを添加する阻害剤添加工程Ｓ３を行う阻害剤添加手段４とを備えている。
【００１２】
このような本実施形態に係る移植材Ｆの製造方法によれば、分離工程Ｓ２において、脂肪組織Ａと消化液Ｂとが混合されて攪拌されることにより、脂肪組織Ａから脂肪由来細胞が単離された細胞懸濁液Ｄが生成される。その後、阻害剤添加工程Ｓ３において、消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤Ｅを細胞懸濁液Ｄに添加することにより、消化酵素の機能が不活化される。
【００１３】
すなわち、細胞懸濁液Ｄ内に消化酵素が残存していても、消化阻害剤Ｅの作用によりその機能が停止される。したがって、そのまま、生体に移植しても、生体に及ぼす悪影響を低減した移植材Ｆを製造することができる。
【００１４】
この場合において、本実施形態に係る移植材Ｆの製造方法によれば、移植しても生体に悪影響を及ぼさない移植材Ｆを、洗浄液によって洗浄することなく簡易に得ることができる。その結果、従来、分離工程Ｓ２後の洗浄工程に要していた多量の洗浄液を不要として、資源を無駄にすることなく低コストに移植材Ｆを製造することができるとともに、消化酵素の濃度を低減するために多大な時間を要していた洗浄工程をなくして、短時間に移植材Ｆを製造することができるという利点がある。
【００１５】
次に、本発明の第２の実施形態に係る移植材Ｈの製造方法について、図３を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る移植材Ｆの製造方法および製造装置１と共通する箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００１６】
本実施形態に係る移植材Ｈの製造方法は、図３に示されるように、ヒトから採取した脂肪組織（生体組織）Ａを生理食塩水等の洗浄水Ｂにより洗浄する洗浄工程Ｓ１と、洗浄された脂肪組織Ａ′を２つの脂肪組織片Ａ１，Ａ２に分割する分割工程Ｓ１１と、分割された一方の脂肪組織片Ａ１と消化酵素を含む消化液Ｃとを混合して攪拌し脂肪由来細胞を分離する分離工程Ｓ２と、該分離工程Ｓ２において分離された脂肪由来細胞を含む細胞懸濁液Ｄに消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤Ｅを添加する阻害剤添加工程Ｓ３と、該阻害剤添加工程Ｓ３において阻害剤が添加された細胞懸濁液Ｆから脂肪由来細胞Ｇを回収する回収工程Ｓ１２と、該回収工程Ｓ１２において回収された脂肪由来細胞Ｇと前記分割工程Ｓ１１において分割された他方の脂肪組織片Ａ２とを混合する混合工程Ｓ１３とを備えている。
【００１７】
本実施形態に係る移植材Ｈの製造方法は、図４に示される製造装置１０により実施される。
この製造装置１０は、採取された脂肪組織Ａから赤血球等の付着物を洗い落とす洗浄手段２と、洗浄された脂肪組織Ａ′を２つの脂肪組織片Ａ１，Ａ２に分割する脂肪組織分割部１１と、分割された一方の脂肪組織片Ａ１を処理する分離手段３と、分割された他方の脂肪組織片Ａ２を一時的に保管する保管容器１２と、該分離手段３において分離された脂肪由来細胞を含む細胞懸濁液Ｄに消化阻害剤Ｅを添加する阻害剤添加工程Ｓ３を行う阻害剤添加手段４と、該阻害剤添加手段４により阻害剤Ｅを添加された細胞懸濁液Ｆから脂肪由来細胞Ｇを回収する細胞回収手段１３と、回収された脂肪由来細胞Ｇと、前記保管容器１２に保管されていた脂肪組織片Ａ２とを備えている。
細胞回収手段１３は、遠心分離機を備え、細胞懸濁液Ｆを比重により遠心分離して、脂肪由来細胞Ｇを得るようになっている。
【００１８】
このような本実施形態に係る移植材Ｈの製造方法によれば、阻害剤添加工程Ｓ３において消化酵素の機能を阻害する消化阻害剤Ｅを細胞懸濁液Ｄに添加した後に行われる回収工程Ｓ１２により、消化酵素の機能が不活化された脂肪由来細胞Ｇを回収することができる。そして、最初に取り置いておいた脂肪組織片Ａ２と回収された脂肪由来細胞Ｇとを混合することにより、自己の脂肪組織Ａおよび自己の脂肪由来細胞Ｇのみからなる移植材Ｈを簡易に製造することができる。この移植材Ｈにおいては、採取した脂肪組織Ａよりも脂肪由来細胞Ｇの濃度が増大させられるので、移植後の組織形成能力が高く、患部を早期に治癒させることができるという利点がある。
【００１９】
この実施形態に係る移植材の製造方法の一実施例について、以下に説明する。
ブタの鼠頸部から採取した脂肪組織を生理食塩水に浸した状態で２〜３ｃｍ角に切断した。
切断された脂肪組織片を直径９０ｍｍのシャーレに２０ｇ程度収容し、生理食塩水２０ｍＬを加えた後、ハサミで裁断した。裁断後に得られた脂肪組織片を生理食塩水により洗浄した。
【００２０】
洗浄した脂肪組織片の一部を円筒形容器に体積比率で、脂肪組織：生理食塩水＝１：４となるように収容した。円筒形容器の体積は、脂肪組織片と生理食塩水とを合わせた体積の２倍程度とした。脂肪組織片と生理食塩水とを収容した円筒形容器に、コラゲナーゼとサーモライシンの２つの酵素を添加し、各濃度を２．１Wunch Ｕ／ｍＬ、９００caseinase Ｕ／ｍＬとした。
【００２１】
酵素添加後、円筒形容器を振盪装置に設置し、水平軸に対し±３０°の角度範囲で２０回／ｍｉｎの速度で３０分間振盪した。振盪後、濃度０．２％となるようにＥＤＴＡを添加し、コラゲナーゼおよびサーモライシンによる消化反応を停止させた。その後、円筒形容器を静置して相分離させてから、下相の細胞懸濁液を回収した。回収された細胞懸濁液を遠心分離することで脂肪由来細胞を回収した。
回収された脂肪由来細胞と、シャーレに保管していた残りの脂肪組織と混合することで、生体組織再生用の移植材を得た。
【００２２】
なお、上記各実施形態においては、生体組織として脂肪組織Ａを採用したが、これに代えて、他の任意の生体組織を採用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る移植材の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法を実施する移植材の製造装置を示すブロック図である。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る移植材の製造方法を示すフローチャートである。
【図４】図３の製造方法を実施する移植材の製造装置を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００２４】
Ａ  脂肪組織（生体組織）
Ａ１，Ａ２  脂肪組織片（生体組織）
Ｃ  消化液
Ｄ  細胞懸濁液（細胞）
Ｅ  阻害剤（消化阻害剤）
Ｆ，Ｈ  移植材
Ｇ  脂肪由来細胞（細胞）
Ｓ２  分離工程
Ｓ３  阻害剤添加工程
Ｓ１１  分割工程
Ｓ１２  回収工程
Ｓ１３  混合工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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