(57)【要約】      （修正有）【課題】これまで知られていなかった、ＶＩＩＩ因子阻害剤がＶＩＩＩ因子の凝血促進作用を妨害するメカニズムを明らかにし、前記阻害剤を含む医薬組成物を提供し、前記阻害剤を含む医薬組成物の治療への適用を提供する。【解決手段】哺乳動物において、ＶＩＩＩ因子を分解することができる触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の存在を測定する方法及び上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体による上記ＶＩＩＩ因子分子の切断の部位を特定する方法。また、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤；上記測定方法から生じる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を含む医薬組成物；及び、更に上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を含む医薬組成物であり、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を含む医薬組成物の治療への適用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏのアミノ酸配列。
【請求項２】
Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒのアミノ酸配列。
【請求項３】
Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕのアミノ酸配列。
【請求項４】
抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により分解されやすいＶＩＩＩ因子分子中の全ての部位を阻害することができることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミノ酸配列のペプチド又は非ペプチドアナログ。
【請求項５】
抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤。
【請求項６】
塩酸４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライドのようなプロテアーゼインヒビターを含むことを特徴とする請求項５記載の阻害剤。
【請求項７】
前記阻害剤は：ＶＩＩＩ因子分子のＡ１ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３、Ａ３ドメインのＮ末端にあるＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１、及び、Ａ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４−Ａｓｐ１７９５の切断しやすい結合の切断を阻害することを特徴とする請求項５又は６記載の阻害剤。
【請求項８】
アミノ酸配列：Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏのペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項９】
アミノ酸配列：Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒのペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１０】
アミノ酸配列：Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕのペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を医薬上有効量含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
血液中のＶＩＩＩ因子が生理的水準以下であることによる疾患を患う哺乳動物を治療する医薬組成物を調製するための、ＶＩＩＩ因子分解の阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、哺乳動物において、ＶＩＩＩ因子を分解することができる触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の存在を測定する方法及び上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体による上記ＶＩＩＩ因子分子の切断の部位を特定する方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤に関する。
【０００３】
更に、本発明は、上記測定方法から生じる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を含む医薬組成物、及び、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【０００４】
最後に、本発明は、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤、上記測定方法から生じる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を含む医薬組成物、及び、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を含む医薬組成物の治療への適用に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
血友病Ａは、Ｘ染色体に関する劣性異常で、その結果、ＶＩＩＩ因子の欠陥又は欠失となり、その重度の形態では生命を脅かす有害な出血性の疾患である。
【０００６】
重度の血友病Ａの患者に相同のＶＩＩＩ因子を注入すると、２５％のケースでは、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が出現する（Ｅｈｒｅｎｆｏｒｔｈ，Ｓ．，Ｋｒｅｕｚ，Ｗ．，Ｓｃｈａｒｒｅｒ，Ｉ．，Ｌｉｎｄｅ，Ｒ．，Ｆｕｎｋ，Ｍ．，Ｇｕｎｇｏｒ，Ｔ．，Ｋｒａｃｋｈａｒｄｔ．Ｂ．及びＫｏｒｎｈｕｂｅｒ，Ｂ．，＜＜Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａｃｓ＞＞，Ｌａｎｃｅｔ，１９９２，３３９：５９４−５９８）結果となるが、これは、ＶＩＩＩ因子と安定化分子  （Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｒａｊａｌａｋｓｈｍｉ，Ｋ．Ｊ．及びＳｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．，＜＜Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃ２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ＞＞，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９：１１６０１−１１６０５；並びに  Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｅ．，及びＳｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．，＜＜Ｓｌｏｗｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｃｌｅａｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｆｒｏｍ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ＞＞，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２７４２４−２７４３１）、又は、その活性に必須の分子  （Ａｒａｉ，Ｍ．，Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．，及びＨｏｙｅｒ，Ｌ．Ｗ．，＜＜Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ＞＞，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８９，８３：１９７８−１９８４；並びに  Ｚｈｏｎｇ，Ｄ．，Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｆｅｌｃｈ，Ｍ．及びＳｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．，＜＜Ｓｏｍｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ  ｗｉｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ＞＞，Ｂｌｏｏｄ，１９９８，９２：１３６−１４２）、又は、活性化分子（Ｌｕｂａｈｎ，Ｂ．Ｃ．，Ｗａｒｅ，Ｊ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｄ．Ｗ．，及びＲｅｉｓｅｒ，Ｈ．Ｍ．，＜＜Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＦＶＩＩＩ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ＞＞，Ｂｌｏｏｄ，１９８９，７３：４９７−４９９；並びにＮｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ，Ｐ．Ｆ．，及びＪｅｓｔｙ，Ｊ．，  ＜＜Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｃａｙ  ｒａｔｅ＞＞，Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９２，２９６：４２６−４３４）のいずれかとの相互作用を立体的に妨害することにより、ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、これまで知られていなかった、ＶＩＩＩ因子阻害剤がＶＩＩＩ因子の凝血促進作用を妨害するメカニズムを明らかにし、前記阻害剤を含む医薬組成物を提供し、前記阻害剤を含む医薬組成物の治療への適用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏのアミノ酸配列に関する。
【０００９】
本発明は、また、Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒのアミノ酸配列に関する。
【００１０】
本発明は、また、Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕのアミノ酸配列に関する。
【００１１】
本発明は、また、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により分解されやすいＶＩＩＩ因子分子中の全ての部位を阻害することができることを特徴とする前記のアミノ酸配列のペプチド又は非ペプチドアナログに関する。
【００１２】
本発明は、また、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤に関する。
【００１３】
前記阻害剤において、塩酸４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライドのようなプロテアーゼインヒビターを含むことが好ましい。
【００１４】
前記阻害剤において、ＶＩＩＩ因子分子のＡ１ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３、Ａ３ドメインのＮ末端にあるＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１、及び、Ａ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４−Ａｓｐ１７９５の切断しやすい結合の切断を阻害することが好ましい。
【００１５】
本発明は、また、アミノ酸配列：Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏのペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする前記の阻害剤に関する。
【００１６】
本発明は、また、アミノ酸配列：Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒのペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする前記の阻害剤に関する。
【００１７】
本発明は、また、アミノ酸配列：Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕのペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする前記の阻害剤に関する。
【００１８】
本発明は、また、前記のＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を医薬上有効量含むことを特徴とする医薬組成物に関する。
【００１９】
本発明は、また、血液中のＶＩＩＩ因子が生理的水準以下であることによる疾患を患う哺乳動物を特に治療する医薬組成物を調製するための、ＶＩＩＩ因子分解の阻害剤の使用に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本願発明により、血友病性疾患、具体的にはＶＩＩＩ因子が不十分なことによる凝血欠陥を伴う疾患の治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ抗体による［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解。
【図２】抗ＶＩＩＩ因子抗体の触媒活性のサイズ排除クロマトグラフィー。
【図３】阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体による［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解の時間及び量依存性。
【図４】量が増加している冷ＶＩＩＩ因子存在下での抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧによる［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解。
【図５】患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧの触媒活性阻害。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の要約
本出願人らは、重度の血友病Ａ高応答患者２人のアロ抗体によりＶＩＩＩ因子が分解されることを全く驚くべき方法で発見し、これまで知られていなかった、ＶＩＩＩ因子阻害剤がＶＩＩＩ因子の凝血促進作用を妨害するメカニズムを明らかにした。
【００２３】
本出願人による触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の発見は、患者をＶＩＩＩ因子で治療する際に誘導された触媒活性抗体の出現に関して、その知見の限り最初の報告である。触媒的加水分解（＜＜タンパク質分解＞＞）によりＶＩＩＩ因子分子を実際には不活性にする抗体がＶＩＩＩ因子の存在下で生成することは、今までとても驚くべき、非常識又は信じられないとさえ考えられていた。しかし、現在まで報告されている触媒活性抗体は、全て疾患の進行の過程又は生理的条件下で発見されている自己抗体である。つまり、誘導された抗体はアロ抗体と呼ばれ、その由来は、全ての自己免疫疾患での自己抗体の由来とは明らかに異なる。
【００２４】
患者のうちの１人の抗ＶＩＩＩ因子抗体の反応での平均Ｋｍ及び見かけのＶｍａｘはそれぞれ、９．４６±５．６２μＭ、及び、８５±６０ｆｍｏｌ．ｍｉｎ−１と計算された。ＶＩＩＩ因子加水分解の動力学的パラメーターは、生体内でのＶＩＩＩ因子の不活性化における触媒による免疫応答への機能的役割を示唆している。
【００２５】
つまり、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を部位特異的プロテアーゼと特定することは、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を持つ患者の疾患の治療に新しいアプローチを提供する。
【００２６】
つまり、第一の側面によると本発明は：ｉ）哺乳動物から採取した血液サンプルから血漿を単離し、ｉｉ）上記血漿から抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を単離し；
ｉｉｉ）上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によりＶＩＩＩ因子の分解が全て起こるのに充分な期間、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を上記ＶＩＩＩ因子と接触させ；
ｉｖ）上記期間の後、上記ＶＩＩＩ因子が上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により効率的に分解されたかどうかを測定することを特徴とする、上記哺乳動物において、ＶＩＩＩ因子を分解することができる触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の存在を測定する方法を提供する。
【００２７】
本発明の方法の工程ｉｉ）の形態によると、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体は、好ましくはマトリックスと結合した上記ＶＩＩＩ因子と上記血漿を混合することにより血漿から単離される。工程ｉｉ）において、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体は、アフィニティークロマトグラフィーにより有利に単離される。工程ｉｉ）において、上記アフィニティークロマトグラフィーは、好ましくはセファロース（登録商標）マトリックスを使用し、臭化シアンにより活性化されていることが好ましい。
【００２８】
本発明の方法の工程ｉｉｉ）の形態によると、上記ＶＩＩＩ因子は、特にＩ１２５のような、好ましくは放射性ラベリング剤といったラベリング剤によりラベルされている。工程ｉｉｉ）において、約０．５〜約３０時間の間、好ましくは約１０時間、約１５〜約４０℃の温度、好ましくは３８℃で上記ＶＩＩＩ因子を抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体と好適に接触させる。
【００２９】
本発明の方法の工程ｉｖ）の形態によると、上記ＶＩＩＩ因子が上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により効率的に分解されたかどうかの測定は、特にＳＤＳＰＡＧＥのようなゲル電気泳動、又は、特にファストプロテインリキッドクロマトグラフィーゲル濾過のようなゲル濾過といった分離技術、及び、特にオートラジオグラフィーのような視覚化技術を含む測定により行われる。
【００３０】
本発明の方法のさらなる形態によると、上記方法は更に：ｖ）上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により切断された上記ＶＩＩＩ因子分子の部位を特定することを含むことを特徴とする。
【００３１】
本発明の方法の工程ｖ）の形態によると、上記特定は、上記ＶＩＩＩ因子を、ＶＩＩＩ因子を分解することができる上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体と接触させ、分離した後、そこから得られたＶＩＩＩ因子のフラグメントをシークエンスすることにより行われる。上記分離は、特にＳＤＳＰＡＧＥのようなゲル電気泳動、又は、ゲル濾過といった技術を用いて好適に行われる。上記シークエンシングは、特に自動プロテインマイクロシークエンサーを用いるようなＮ末端シークエンシングといった技術を用いて好適に行われる。上記シークエンシングを用いることにより、以下の切断しやすい結合の位置を示す：ＶＩＩＩ因子分子のＡ１及びＡ２ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３、Ａ３ドメインのＮ末端にあるＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１、及び、Ａ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４−Ａｓｐ１７９５。
【００３２】
よって、第二の側面によると本発明は、アミノ酸配列：Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ；
アミノ酸配列：Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ；
及びアミノ酸配列：Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕを提供する。
【００３３】
本発明はまた、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により分解されやすいＶＩＩＩ因子分子中の全ての部位を阻害することができる、ＶＩＩＩ因子の種々の配列の変形若しくはアナログにも及ぶ。本発明のコンテクストの中で、そのような変形は、例えば抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により分解されやすいＶＩＩＩ因子分子中の全ての部位を阻害する上述したアミノ酸配列のペプチド又は非ペプチドアナログである。そのような変形は、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により分解されやすいＶＩＩＩ因子分子中の全ての部位を阻害する変形であれば、例えばＮ末端、Ｃ末端又は両端において数アミノ酸短い、若しくは、数アミノ酸長い（このような変形は、化学合成又は自然に存在する分子を酵素により分解することにより得ることができる）配列の変形のいずれかでありうる。
【００３４】
よって、第三の側面によると本発明は、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を提供する。この阻害剤は、プロテアーゼインヒビターを含むことを有利な特徴とする。本発明のコンテクストの中で、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤として使用しうるプロテアーゼインヒビターの例は、これらに限定されないが、例えばＤＦＰのようなフルオロホスフェート型阻害剤、若しくは、例えばＰＭＳＦ又はＡＥＢＳＦ（塩酸４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（特にＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＧｅｒｍａｎｙによりＰｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）の登録商標で販売））のようなスルホニルフルオライド型阻害剤である。具体的には、この阻害剤は、上記阻害剤が：ＶＩＩＩ因子分子のＡ１ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３、Ａ３ドメインのＮ末端にあるＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１、及び、Ａ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４−Ａｓｐ１７９５の切断しやすい結合の切断を阻害することを特徴とする。さらに好ましくは、この阻害剤はアミノ酸配列：Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ；のペプチド又は非ペプチドアナログ、アミノ酸配列：Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ；のペプチド又は非ペプチドアナログ、若しくは、アミノ酸配列：Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕのペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする。
【００３５】
上記で定義したようなＶＩＩＩ因子分解の阻害剤は、それらの付加塩、特にそれらの医薬上許容される付加塩と同様に、それらが抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体に対して中和活性を持つという非常に価値のある薬学的な側面を持つ。
【００３６】
これらの性質はそれらを治療に適用することを正当化し、本発明は更に薬剤の手段によって、それらの付加塩、特にそれらの医薬上許容される付加塩と同様に、上記ＶＩＩＩ因子分解の阻害剤に関する。
【００３７】
よって、それらはとりわけ血友病性疾患、具体的にはＶＩＩＩ因子が不十分なことによる凝血欠陥を伴う疾患の治療に特に示される。
【００３８】
それらの使用の例としては、一方では、例えば軽度又は重度の血友病Ａのような疾患の高応答患者（これらの患者に触媒活性抗体が見られる場合）、及び／又は、他方では、例えば自己免疫疾患を患う患者の治療が挙げられる。
【００３９】
よって、第四の主要な側面によると本発明は、上述したように、特に上述した方法から得られる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる少なくとも一つの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体、若しくは、医薬上許容される賦形剤、基材又は担体に配合されたその医薬上許容される付加塩の一つを医薬上有効量含むことを特徴とする医薬組成物をもって、長年感じられてきた必要性への解決を提供する。
【００４０】
更に、第五の主要な側面によると本発明は、上述したように、ＶＩＩＩ因子を分解することができる少なくとも一つの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体、若しくは、医薬上許容される賦形剤、基材又は担体に配合されたその医薬上許容される付加塩の一つを医薬上有効量含むことを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００４１】
これらの組成物は、例えば頬、直腸、非経口、経皮、目、鼻又は耳の経路から投与されうる。
【００４２】
これらの組成物は固体又は液体であり、例えば純粋な又は被覆された錠剤、ゼラチンカプセル、粉末、坐剤、注射できる製剤、経皮系、点眼剤、エアゾール及びスプレー、並びに、点耳剤のような通常ヒトの薬に使用される医薬上の形状で存在しうる。これらは通常の方法で調製される。少なくとも一つの上述したようなＶＩＩＩ因子分解の阻害剤、又は、その医薬上許容される付加塩の一つの医薬上有効量を構成する有効成分は、タルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビドン、セルロース派生物、カカオバター、半合成グリセリド、水性又は非水性基材、動物又は植物由来の脂肪、グリコール、各種の湿潤剤、分散剤又は乳化剤、シリコーンゲル、特定の重合体又は共重合体、防腐剤、風味及び色のような通常医薬組成物に使用される賦形剤と共にその中に混合されうる。好ましい医薬上の形状は、注射できる形状である。
【００４３】
本発明は、中和活性を持つ医薬組成物も包含し、これは抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を生産する血友病Ａのような疾患；特に抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を持つ自己免疫疾患（これらの患者に触媒活性抗体が見られる場合）の有利な治療に特に使用でき、上記の組成物は、少なくとも一つの上記ＶＩＩＩ因子分解の阻害剤、若しくは、医薬上許容される賦形剤、基材又は担体に配合されたその医薬上許容される付加塩の一つを医薬上有効量含むことを特徴とする。
【００４４】
本発明はまた、少なくとも一つの上述したＶＩＩＩ因子分解の阻害剤、又は、その医薬上許容される付加塩の一つを医薬上有効量哺乳動物に投与することを特徴とする、その血液中のＶＩＩＩ因子水準による疾患を患う上記哺乳動物の治療方法を包含する。
【００４５】
この方法は、特にその血液中のＶＩＩＩ因子が欠失することによる疾患のような血友病性疾患の有利な治療を特に提供する。
【００４６】
本発明はまた、抗トロンビン活性を持つ医薬組成物を包含し、これは特に血栓症のような疾患の有利な治療に特に使用しうる。上記組成物は、特に上述した方法で得られる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる少なくとも一つの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体、若しくは、医薬上許容される賦形剤、基材又は担体に配合されたその医薬上許容される付加塩の一つを医薬上有効量含むことを特徴とする。
【００４７】
本発明はまた、少なくとも一つの上述したような抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体、又は、その医薬上許容される付加塩の一つを治療上有効量哺乳動物に投与する事を特徴とする上記哺乳動物の治療方法を包含する。
【００４８】
この方法は、特にその血液中にＶＩＩＩ因子が過剰に存在することによる上記疾患のような血栓性疾患の有利な治療を特に提供する。
【００４９】
ヒト及び動物の治療には、上述した抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体又はＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を単独、又は、生理学上許容される賦形剤と共に、特にゼラチンカプセル又は錠剤の形状のような経口、又は、注射できる溶液の形状の非経口のどのような形状でも投与しうる。坐剤、軟膏、クリーム、ゲル又はエアゾール製剤のような他の投与の形状を考えてもよい。
【００５０】
本発明のコンテクストの中で、以下の用語を使用する：
＜＜触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体＞＞は、ＶＩＩＩ因子の治療上の製剤を注入する際に血友病Ａ患者で誘導される、触媒活性を賦与されたＶＩＩＩ因子に対する抗体を意味するものと解する；
＜＜ＶＩＩＩ因子＞＞は、血液凝固プロセス中で、Ｘ因子の酵素的切断におけるＩＸ因子の補酵素を意味するものと解する；
＜＜ＶＩＩＩ因子の分解＞＞は、自発的な加水分解、又は、生理的な切断酵素、すなわちトロンビン、活性化ＩＸ因子、活性化Ｘ因子及び活性化プロテインＣによる加水分解によって出現しないＶＩＩＩ因子からのフラグメントの生成を意味するものと解する；
＜＜抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤＞＞は、抗ＶＩＩＩ因子触媒活性抗体の加水分解活性を特異的に中和することができる、ＶＩＩＩ因子配列に属する又は属さないペプチド、若しくは、プロテアーゼインヒビターの全てを意味するものと解する；
【００５１】
本発明の好ましい形態の説明ヒトリコンビナントＶＩＩＩ因子を１２５Ｉで放射性ラベルした。抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体は、阻害剤を持つ３人の血友病患者の血漿から、免疫精製したヒトＶＩＩＩ因子を結合したセファロース（登録商標）マトリックスを用いてアフィニティー精製した。患者Ｂｏｒ、Ｃｈｅ及びＷａｌのアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体は、ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性をそれぞれ５７．０、６４．０及び４３．０ＢＵ／ｍｇ−ＩｇＧまで阻害した。
【００５２】
ラベルしたＶＩＩＩ因子を抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体と共にインキュベーションした結果、３人の患者のうち２人の場合、分子のタンパク質分解が起きた。ＩｇＧアイソタイプの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の部位に結合する抗体での加水分解の特異性が示された。アプロチニン（０．１５μＭ）、Ｅ−６４（２８μＭ）、ＥＤＴＡ（１．３μＭ）、ロイペプチン（１０μＭ）及びペプスタチン（１０μＭ）のプロテアーゼインヒビターの存在下で、［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子を患者Ｂｏｒ及びＷａｌのアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧと共にインキュベーションした結果、タンパク質分解活性は阻害されなかった。
【００５３】
本出願人らは、ＶＩＩＩ因子分子中の触媒活性ＩｇＧによる主要な切断部位を以下のように特定した：Ａ１及びＡ２ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３、Ａ３ドメインのＮ末端にあるＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１、及び、Ａ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４−Ａｓｐ１７９５。
【００５４】
抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によるＶＩＩＩ因子の加水分解の時間及び量依存性が示された。特に、患者の血漿中に存在すると考えられるモル比より８０〜９５００倍低いモル比で、抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧをＶＩＩＩ因子と共にインキュベーションする条件下で加水分解が観察され、加水分解は、生体内での患者のアロ抗体によるＶＩＩＩ因子不活性化のメカニズムであることが示唆された。
【００５５】
本出願人らは更に、一定濃度の［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の存在下で、ラベルしていないＶＩＩＩ因子の濃度を増加させながら、患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧを共にインキュベーションすることにより、抗体が仲介するＶＩＩＩ因子の加水分解の動力学を研究した。速度の逆数を基質濃度の逆数と相関してプロットしたカーブは直線（ｒ＝０．９９）であった事から、すでにポリクローナル触媒活性自己抗体で観察されているように、反応は単純なＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ動力学と一致する事が示唆された。見かけの触媒効率、Ｖｍａｘ及び抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の加水分解速度を、患者Ｗａｌの場合について計算した。加水分解の動力学的パラメーターを生体外で計算し、タンパク質分解は、生体内での患者のアロ抗体によるＶＩＩＩ因子不活性化のメカニズムであると考えられる事が示唆された。
【００５６】
ＶＩＩＩ因子がｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）と結合すると、ＶＩＩＩ因子に対するトロンビンの触媒速度が増加するが、それは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）による加水分解からＶＩＩＩ因子を保護する。ｖＷＦをＶＩＩＩ因子に添加した結果、正常な血漿中に存在するのと同様の重量／重量比を用いて、すなわち３０μｇ／ｍｌのｖＷＦに対して３００ｎｇ／ｍｌのＶＩＩＩ因子で、精製したｖＷＦ及びＶＩＩＩ因子を混合した場合、抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧによるＶＩＩＩ因子の加水分解が、部分的、すなわち３６．９％阻害された。
【００５７】
抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を触媒活性抗体として同定する事は、喘息患者における血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）に対する加水分解抗体、ＳＬＥ患者におけるＤＮＡ加水分解抗体及び自己免疫性甲状腺炎患者におけるチログロブリン特異的触媒活性抗体についての以前の報告に加えて、触媒活性免疫応答の範囲を拡張する。また、本出願人の知見の限りでは、これは、タンパク質抗原の細胞外投与に応答した、ヒトにおける触媒抗体の誘導についての最初の報告である。抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧが示す触媒活性の性質によるＶＩＩＩ因子の加水分解の動力学的パラメーター、及び、血漿中でのこれらの抗体の推定量は、生体内でのＶＩＩＩ因子の不活性化における触媒活性免疫応答の機能的役割を示唆する。その機能的性質が異なる抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体のポリクローナル混合物中では、触媒活性抗体は、非触媒活性抗ＶＩＩＩ因子抗体よりも早い速度でＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を阻害すると考えられる。よって、タンパク質分解活性抗ＶＩＩＩ因子抗体のターゲットであるペプチドエピトープを同定することは、我々がＶＩＩＩ因子阻害剤応答の病態生理学を理解する上で不可欠である。更に、ＶＩＩＩ因子阻害剤を部位特異的プロテアーゼとして特定する事は、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を持つ患者の治療に新たなアプローチを提供する。
【００５８】
図の簡単な説明
添付した図を用いた以下の説明のための記述により、本発明はさらによく理解され、発明の他の目的、特徴及び利点はさらに明確に明らかになるが、これらは抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によるＶＩＩＩ因子の切断の特異性を示す限定されない実施例としてのみ示される。
【００５９】
図１：阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ抗体による［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解
図１Ａ：［１２５Ｉ］−ラベルしたＶＩＩＩ因子は、患者Ｂｏｒ（レーンＢｏｒ）、Ｃｈｅ（レーンＣｈｅ）及びＷａｌ（レーンＷａｌ）のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ、又は、緩衝液のみ（レーン１）と共に、３８℃で１０時間インキュベーションし、その後ＳＤＳＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーを行った。ＶＩＩＩ因子を、アフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧと共にインキュベーションした結果、３人の患者のうち２人（Ｂｏｒ及びＷａｌ）で、ＶＩＩＩ因子分子が加水分解された。それに対して、［１２５Ｉ］−ラベルしたＶＩＩＩ因子を、患者Ｃｈｅ（レーンＣｈｅ）の血漿から精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧと共にインキュベーションした場合、ＶＩＩＩ因子の移動の概略（ｐｒｏｆｉｌｅ）は変わらなかった。ＶＩＩＩ因子に対して阻害活性を示さないヒトモノクローナルＭ０６１抗ジゴキシンＩｇＧ（ｍＡｂ）、又は、通常の分画していないポリクローナルヒトＩｇＧ（サンドグロブリン（登録商標）、ＩＶＩｇ）と共にインキュベーションした際にも、ＶＩＩＩ因子の移動の概略（ｐｒｏｆｉｌｅ）は変わらなかった。
【００６０】
図１Ｂ：アフィニティーカラムのフロースルーには、ＥＬＩＳＡの測定によると抗ＶＩＩＩ因子抗体が存在せず、［１２５Ｉ］−ラベルしたＶＩＩＩ因子を加水分解しなかった。
【００６１】
図１Ｃ：プロテインＧのクロマトグラフィーにより、患者Ｗａｌ及びＢｏｒのアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体を含む酸性溶出物からＩｇＧを除去した結果、ＶＩＩＩ因子に対するその加水分解活性が消失した。
【００６２】
図２：抗ＶＩＩＩ因子抗体の触媒活性のサイズ排除クロマトグラフィー
図２Ａ：抗体のタンパク質分解活性がプロテアーゼのコンタミネーションによるという可能性をさらに排除するために、患者Ｗａｌのアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体を８Ｍ尿素と共に処理し、サイズ排除クロマトグラフィーに供した。フラクション２５に主要なピークが単離され、ＥＬＩＳＡによりそれはＩｇＧに一致する事が示された。加水分解活性はＩｇＧフラクションと共に溶出し、ＩｇＧが存在しないフラクション（例えばフラクション３５）では活性が検出されなかった。
【００６３】
図２Ｂ：フラクション２５に単離された主要なピークはＩｇＧと一致する事が、フラクションの内容物を放射性ラベルしたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示された。
【００６４】
図３：阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体による［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解の時間及び量依存性
患者Ｂｏｒ及びＷａｌの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によるＶＩＩＩ因子の加水分解の動力学。患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧによる［１２５Ｉ］−ラベルしたＶＩＩＩ因子の加水分解速度は、患者Ｂｏｒの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧにより示されたものより速かったが、このことは、患者の触媒活性抗体は異なる動力学的性質を示す事、又は、抗ＶＩＩＩ因子抗体のうち触媒活性抗体の割合は患者の間で異なる事のどちらかを示唆した。
【００６５】
図４：量が増加している冷ＶＩＩＩ因子存在下での抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧによる［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解
一定濃度の［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の存在下で、ラベルしていないＶＩＩＩ因子の濃度を増加させながら患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧを共にインキュベーションすることによる、抗体が仲介するＶＩＩＩ因子の加水分解の動力学。ラベルしていないＶＩＩＩ因子の量を増加させながら添加した結果、抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧによる［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解の量依存性阻害が起きた。使用したＶＩＩＩ因子の最大濃度（すなわち１．７μＭ）では、ＶＩＩＩ因子の加水分解の飽和は達成されなかった。速度の逆数を基質濃度の逆数と相関してプロットしたカーブは直線（ｒ＝０．９９）であった事から、すでにポリクローナル触媒活性自己抗体で観察されているように、反応は単純なＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ動力学と一致する事が示唆された。
【００６６】
図５：患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧの触媒活性阻害
Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙにより販売）の存在下、抗体をＶＩＩＩ因子と共にインキュベーションした場合、患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体による放射性ラベルしたＶＩＩＩ因子のタンパク質分解は約６２％まで阻害されたことから、ある触媒活性抗体の触媒活性を中和する特定のセリンプロテアーゼインヒビターの能力が示された。
【実施例】
【００６７】
実施例Ｉ：抗ＶＩＩＩ因子抗体のアフィニティー精製
抗体を血漿から硫酸アンモニウム沈殿により単離した。次に、ＶＩＩＩ因子に対して活性のある抗体を、免疫精製した市販のヒト血漿由来ＶＩＩＩ因子を結合した（２５０００Ｕ／３ｇ−ゲル）ＣＮＢｒ活性化セファロース（登録商標）４Ｂマトリックスでアフィニティー精製した。カラムのフロースルーを集めた。ＰＢＳ  ｐＨ７．４で充分洗浄した後、抗ＶＩＩＩ因子抗体を０．２Ｍグリシン  ｐＨ２．８を用いて溶出し、ＰＢＳで透析し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）で濃縮した。フロースルー及び溶出物は、使用するまで等分して−２０℃に保存した。抗ＶＩＩＩ因子抗体のＦ（ａｂ′）２フラグメントは、以前の記載のようにして調製した。
【００６８】
抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧの濃度は、患者Ｂｏｒ、Ｃｈｅ及びＷａｌの場合、カラムに使用したＩｇＧ１０ｍｇにつき、それぞれ１３０、２０及び２８０μｇ（すなわち、１４３±１３０μｇ／ｍＩ−分画していない血漿）であったが、これは以前の観察と一致していた。
【００６９】
実施例ＩＩ：ＶＩＩＩ因子中和活性
抗ＶＩＩＩ因子抗体のＶＩＩＩ因子中和活性は、Ｋａｓｐｅｒらの方法により測定され、Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット（ＢＵ）（ｒｅｆ）で表した。ＢＵは、ＶＩＩＩ因子凝血促進活性を５０％阻害するＩｇＧの濃度の逆数として定義された。残存ＶＩＩＩ因子活性は、ＶＩＩＩ因子を涸渇させたヒト血漿（Ｂｅｈｒｉｎｇ）を基質とし、ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（登録商標）（Ｂｅｈｒｉｎｇ）をアクチベーターとして用いた活性化部分トロンボプラスチン時間の測定による一段階アッセイにより測定した。試験される加熱した血漿又は免疫精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧは、プールしたクエン酸処理ヒト血漿と共に、３７℃で２時間インキュベーションした。リファレンス血漿プール（Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧ，Ｗｉｅｎ）の４つの段階希釈の凝固時間を、試験される各サンプルの３つの希釈の凝固時間と比較した。希釈は、Ｏｗｒｅｎ−Ｋｏｌｌｅｒバッファー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）の中で行った。アッセイ間の誤差は、１〜２．５％の間の範囲であった。
【００７０】
患者Ｂｏｒ、Ｃｈｅ及びＷａｌのアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体は、ＶＩＩＩ因子凝血促進活性をそれぞれ５７．０、６４．０及び４３．０ＢＵ／ｍｇ−ＩｇＧまで阻害した。
【００７１】
実施例ＩＩＩ：ＶＩＩＩ因子の加水分解アッセイ
市販のヒトリコンビナントＶＩＩＩ因子を、比活性１１．６ｎＣｉ／μｇまでヨードゲン法を用いて１２５Ｉでラベルした。［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子（１．５〜１５０ｎｇ）を、５０μｌの５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．７、１００ｍＭグリシン、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．０２％  ＮａＮ３中で、単独又は１７〜１６６７ｎＭの免疫精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧと共に、３８℃で５分〜１０時間インキュベーションした。ヒトモノクローナル抗ジゴキシンＩｇＧ  Ｍ０６１（ｍＡｂ）及び通常の分画していないヒトポリクローナルＩｇＧ（ＩＶＩｇ，Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標））を、ネガティブコントロールとして使用した。サンプルを、メルカプトエタノールを含まないＬａｅｍｍｌｉのバッファーと１：１で混合し、１レーンにつき２０μｌの各サンプルをロードした後、ボイルせずにＳＤＳ電気泳動に供した。１レーンにつき２０μｌの各サンプルをロードした後、サンプルを非変性条件下、並行して７．５％及び１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。移動は、２５ｍＡ／ゲルで、ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＩＩシステムを用いて、先頭のダイがゲルの底に来るまで室温で行った。その後、ゲルを乾燥させ、Ｘ−ＯＭＡＴＡＲを用いて、タンパク質のバンドを現した。オートラジオグラフィーの後、抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧにより一貫して加水分解されている明確な２００及び３００ｋＤａの分子量のＶＩＩＩ因子のバンドをスキャンし、ラベルしたＶＩＩＩ因子の加水分解速度を計算できるようにした。
【００７２】
実施例ＩＶ：ファストリキッドプロテインクロマトグラフィーゲル濾過
１００μｌの等分の、８Ｍ尿素で処理した患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ（７４０μｇ）を、０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速でＰＢＳ−０．０１％アジドで平衡化したｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）−１２カラムのゲル濾過に供した。５００μｌのフラクションを集め、サンドイッチＥＬＩＳＡによりＩｇＧの存在を、また、１０倍希釈後のＶＩＩＩ因子タンパク質分解活性を分析した。フラクション２５のタンパク質を１２５Ｉで放射性ラベルし、通常のヒトポリクローナルＩｇＧと並行して非変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルをクマシーブルーで染色し、オートラジオグラフィーも行った；そして、両方の像を重ね合わせた。主要なピークはフラクション２５に単離され、ＥＬＩＳＡ及びフラクションの内容物を放射性ラベルしたＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ＩｇＧと一致する事が示された。加水分解活性はＩｇＧフラクションと共に溶出し、ＩｇＧが存在していないフラクション（例えばフラクション３５）では活性が検出されなかった。
【００７３】
実施例Ｖ：ＮＨ２末端シークエンス分析
ラベルしていないヒトリコンビナントＶＩＩＩ因子スクロース処方（ｒＤＮＡ−ＢＨＫ）（３００ｎｇ，ｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａ，Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を、１５００μｌの５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．７、１００ｍＭグリシン、０．０２５％  ｔｗｅｅｎ−２０及び０．０２％  ＮａＮ３中で、患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ（７４μｇ）と共に３８℃で２４時間処理した。得られたＶＩＩＩ因子フラグメントを非変性条件下、５０ｍＡで１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｐＨ１１．０の１０ｍＭ  ＣＡＰＳ、１０％エタノール中、１００ｍＡ、２時間でＨｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）にトランスファーした。クマシーブルーで染色した後、見られるバンドを切断して自動プロテインマイクロシークエンサー  Ｐｒｏｓｉｚｅ４９２ｃＬＣ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いたＮ末端シークエンシングに供した。シークエンスされたタンパク量は、フラグメントによって、０．５〜２ｐｍｏｌの範囲であった。
【００７４】
主要な切断しやすい結合は以下のようであった：ＶＩＩＩ因子のＡ１及びＡ２ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３（Ｒ３７２−Ｓ３７３）；Ａ３ドメインのＮ末端にあるＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１（Ｙ１６８０−Ｄ１６８１）；及びＡ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４−Ａｓｐ１７９５（Ｅ１７９４−Ｄ１７９５）。抗ＶＩＩＩ因子抗体によるＶＩＩＩ因子の複数部位での切断は、多種特異的触媒活性を持つ個々の抗体、又は、それぞれが独特の切断部位特異性を示す抗体のポリクローナル集団に由来すると考えられた。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
実施例ＶＩ：セリンプロテアーゼに属する阻害剤、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）を用いて阻害実験を行った
Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）存在下での、阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ抗体による［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解。［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子（１５０ｎｇ）は、単独、又は、患者Ｗａｌの免疫精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ  ５０μｇ／ｍｌと共に、又は、抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ及びセリンプロテアーゼインヒビターであるＰｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）４ｍＭの両方の存在下、３８℃で５時間インキュベーションした。その後、非変性条件下、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＶＩＩＩ因子を分析した。オートラジオグラフィーの後、抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧにより一貫して加水分解されている明確な２００及び３００ｋＤａの分子量のＶＩＩＩ因子のバンドをスキャンし、ラベルしたＶＩＩＩ因子の加水分解速度を計算できるようにした。
【００７７】
Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）の存在下、抗体をＶＩＩＩ因子と共にインキュベーションした場合、患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体による放射性ラベルしたＶＩＩＩ因子のタンパク質分解は約６２％まで阻害されたことから、ある触媒活性抗体の触媒活性を中和するあるセリンプロテアーゼインヒビターの能力が示された。
【００７８】
更なる観察：１２５Ｉ放射性ラベルしたＶＩＩＩ因子をターゲット分子として用いて、１０人の血友病Ａ高応答患者の精製ＩｇＧをスクリーニングした際に、６人の患者の場合でＶＩＩＩ因子の移動の概略（ｐｒｏｆｉｌｅ）に変化が観察された。これらの結果は、本出願人の以前の観察を実証するものであり、触媒活性抗ＶＩＩＩ因子抗体が約６０％の患者で見受けられる事を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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