(57)【要約】【課題】  本発明は、腎線維化抑制剤、および該薬剤を有効成分とする腎疾患の治療剤、並びに、腎線維化抑制剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。【解決手段】  本発明者は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を抑制することにより、腎線維化を効率的に抑制することが可能であることを初めて見出した。すなわち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素であるコンドロイチナーゼABCの投与、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸転移酵素であるC4ST-1、C6ST-1、C6ST-2の発現のsiRNAによる抑制により、腎組織における線維化を抑えることができた。このようなsiRNAに用いる核酸などの化合物は腎線維化抑制のための薬剤として利用できる。またこのことから、腎線維化抑制剤はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を抑制する化合物をスクリーニングすることにより見出すことが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、腎線維化抑制剤。
【請求項２】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
腎においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
腎線維化疾患の治療用または予防用の、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
前記腎線維化疾患が、腎線維化を伴う腎不全である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記腎線維化疾患が、腎硬化症、IgA腎症、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、膜増殖性糸球体腎炎、急性進行性糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、腎アミロイドーシス、多発性嚢胞腎、後腹膜線維症、膠原病に伴う腎病変、水腎症、または糖尿病性腎症である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項１０】
被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、腎線維化抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
【請求項１２】
前記腎線維化抑制剤が、腎線維化疾患の治療用または予防用である、請求項１０または１１に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎線維化による疾患の治療または予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎線維化は腎疾患が進行し末期腎不全に至る過程で伴う病態である。腎臓の線維化を伴う腎疾患には腎硬化症、IgA腎症、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、膜増殖性糸球体腎炎、急性進行性糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、腎アミロイドーシス、多発性嚢胞腎、後腹膜線維症、全身性エリテマトーデス（SLE）によるループス腎炎など膠原病に伴う腎病変、水腎症などがある。腎硬化症は腎血管系の異常による血行障害により、糸球体、尿細管の萎縮と間質の線維化変成が増大し、腎が硬化した状態をいう。腎硬化症は障害される血管病変の部位により全身の動脈硬化の一部として認められる動脈性（老人性）腎硬化症、慢性高血圧と関連があり、血管、糸球体、尿細管間質性病変によって特徴づけられる細動脈性（良性）腎硬化症、重症の高血圧と急激な進行性腎不全に関連した腎細動脈壊死、増殖性内膜炎、糸球体線維素性壊死を伴う悪性腎硬化症の三つに分類される。細動脈性腎硬化症は輸入細動脈の重い病変があり、ヒアリン化、内部の弾性膜と基底膜の変性、全体の脈管の線維素様壊死が見られ、糸球体は巣状広汎硬化と巣状分節硬化を示す。悪性腎硬化症においては糸球体に及ぶ拡張した流入細動脈の線維素性壊死が特徴的とされ、高血圧性脳症に関連する激しい頭痛や視力障害、蛋白尿、血尿、円柱などがみられる。治療されない患者の約50％が6カ月以内に死亡し，残りのほとんどの患者が1年以内に死亡するなど予後は不良である。いずれの疾患も病態が進行すると腎機能が低下し、慢性腎不全に陥ると最終的には人工透析さらには腎移植を受けなければならない。
【０００３】
我が国における人工透析患者数は日本透析学会2004年末の慢性透析患者に関する基礎集計によると約25万人に上り、導入患者数も前年より3.2％増加の35,000人と年々増加している。透析に導入された原因疾患としては糖尿病性腎症が導入患者の41.3％（13,920人）と最も多く、慢性糸球体腎炎（28.1％）、腎硬化症（8.8%）、多発性嚢胞腎（2.7％）、急性進行性糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、SLE腎炎、悪性高血圧、アミロイド腎等がある。厚生労働省によると透析にかかる医療費は1兆円を超え、国民総医療費の3％以上を占めるようになった。
【０００４】
糖尿病の合併症としての糖尿病性腎症による透析導入患者数の増加には、糖尿病患者の急増が背景にある。糖尿病は血糖降下作用をもつホルモンであるインスリンの相対的不足によって引き起こされる病気で症状は人によって様々であるが、大きくインスリン依存性である1型(IDDM)とインスリン非依存性である2型(NIDDM)に分けることができる。1型糖尿病（IDDM）は自己免疫などにより、先天的にインスリンを産生する膵β細胞が破壊されている状態をいう。これに対して2型糖尿病(NIDDM)は、遺伝因子に肥満や運動不足などの環境因子が加わることによって発症し、近年急増している生活習慣病として良く知られている。平成14年度に行なわれた厚生労働省の糖尿病実態調査によると、糖尿病が強く疑われる人は740万人、可能性を否定できない人を含めると1,620万人と推計され、その合併症としての糖尿病性腎症は15.6％の患者に発症しており年々増加している。糖尿病性腎症はその成因については不明な点も多いが、糖尿病による高血糖、高血圧により、糖尿病性糸球体硬化症に加え、動脈、細動脈硬化症や腎盂腎炎等の非特異的な病変を伴った状態をいい、結節性病変（Kimmelstiel-Wilson lesion）、瀰漫性病変、侵出性病変が特徴的に見られる。
【０００５】
腎線維化を伴う疾患の患者数は年々増加するにも関わらず根本的な治療法が見いだされていない。腎硬化症をはじめ腎線維化の進行と血圧の間には密接な関連があり、現在は初期にはアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬（ARB）などにより全身の血圧を下げ、糸球体高血圧を是正する保存治療が行われている。また血管収縮因子を減少させると同時に血管拡張因子を増加させるバソペプチダーゼ阻害薬の使用も知られている（特許文献１、非特許文献１）。近年TGF-βが線維化病変特に腎疾患、中でも糸球体硬化進展において細胞外基質の増生等の重要な役割を果たすと考えられており、TGF-βの発現を腎臓において阻害する新たな治療法が考えられているが臨床応用にはまだまだほど遠い状態である（特許文献２、非特許文献２)。腎機能が低下し腎不全に陥ると人工透析や腎移植が最終的な治療形態とされている。人工透析は技術の向上により延命期間は延長しているが、時間的な制約、経済的負担、人工透析による様々な合併症などQOLは著しく低下する。腎移植が現在の根治療法とされているが一般的な治療とはなっていない。
【０００６】
程度の差はあるものの腎線維化による機能低下は高齢者に必ず観察できる病態であり、高齢化社会の到来は透析に至る慢性腎不全患者の絶対的な増加をもたらすと考えられている。腎不全は完全な原因治療薬はなく症状の改善、QOLの改善といった治療効果の向上のために更なる薬剤が望まれている。
【０００７】
プロテオグリカンは様々な組織の細胞外マトリックスに存在している。プロテオグリカンはグリコサミノグリカン（GAG）鎖とコア蛋白質との結合で構成されており、細胞表面レセプターや他の細胞外マトリックスとの相互作用を調節する（非特許文献3）。またプロテオグリカンはヘパラン硫酸（HS）、コンドロイチン硫酸（CS）、ヘパリン、デルマタン硫酸（DC）、ケタラン硫酸（KS）、ヒアルロン酸と６種の形態が知られている（非特許文献4）。
【０００８】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）については損傷を受けた神経細胞より産生されるCSPGが軸索再生を阻止し（非特許文献5）、CSを分解する活性を持つ酵素として知られるコンドロイチナーゼを用いることで軸索再生を促進しうることが既に知られている（特許文献3、4）。
【０００９】
コンドロイチナーゼはコンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）を分解する細菌性の酵素として知られている。コンドロイチナーゼを用いた治療法としては、癌の転移と血管新生を抑制する方法（特許文献5）、網膜から後方硝子様体の分離を誘導する方法（特許文献6）、コンドロイチナーゼABCを用いる椎間板ヘルニアの治療薬（特許文献7）、コンドロイチナーゼACまたはコンドロイチナーゼB創傷治癒促進薬（特許文献8）、コンドロイチナーゼACまたはコンドロイチナーゼBを用いた強皮症、乾癬、ケロイド及び肺線維症の治療薬（特許文献9）等が知られている。
【００１０】
近年コンドロイチン硫酸合成に関係する硫酸転移酵素がクローニングされ、その分子的性質が明らかになってきた。その一つであるコンドロイチン６硫酸転移酵素（C6ST）はコンドロイチン6硫酸の合成の最終段階に触媒作用を及ぼし、コンドロイチンのGalNAc残基のC6位に硫酸基を転移する。（非特許文献6）。現在コンドロイチン６硫酸転移酵素としてC6ST-1、2がクローニングされ（非特許文献7）広く知られている（特許文献10、11）。
【００１１】
これまでに、2型糖尿病モデルにおいてコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)、デルマタン硫酸プロテオグリカン(DSPG)、Basic fibroblast growth factor(bFGF)、decorin、biglycan、lumican、fibromodulinなどの発現、蓄積が報告されている。(非特許文献8〜14)
【００１２】
しかし、それら疾患におけるCSPG増加の意義は全く明らかになっておらず、近年では、CSPGを遺伝的に欠損させたマウスが胎生致死や器官形成不全に陥ることが判明したことから、CSPGは生体に必須の分子であるとの認識が強まっている。
【００１３】
これらのプロテオグリカン蓄積を制御し病態変化を観察した実際の臨床治療報告は勿論存在しないが、今回、その一例としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質から伸長したらせん状側鎖を切断する酵素の1つであるChondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1 (C4ST-1)に着目しその実施例を示す。ヒト、ラットに限らずマウス2型糖尿病（NIDDM）モデルを用いたC4ST-1 siRNA投与での応用例、有効性検討実験はこれまで実施されていない。
【００１４】
【特許文献１】米国特許第6,930,103号
【特許文献２】米国特許第6,492,325号
【特許文献３】国際公開2003/074080号
【特許文献４】国際公開2003/015612号
【特許文献５】米国特許第6,979,563号
【特許文献６】米国特許第6,585,972号
【特許文献７】米国特許第6,001,630号
【特許文献８】米国特許第5,997,863号
【特許文献９】国際公開第2001/039795号
【特許文献１０】米国特許第5,827,713号
【特許文献１１】特許公開2002-125681号
【非特許文献１】Med Klin (Munich) 2005 15;100(12) :826-31
【非特許文献２】Hou CC, Am J Pathl. (2005) 166;3 761-771
【非特許文献３】Corvetti L, J Neurosci (2005) 25(31):7150-7158
【非特許文献４】Lozzo RV, FASEB J. (1996) 10:598-614
【非特許文献５】Smith-Thomas, J Cell Sci. (1994) 107;1687-1695
【非特許文献６】Uchimura K, JBC (2002) 277;2 11 1443-1450
【非特許文献７】Kitagawa H, JBC (2000) 275;28 21075-21080
【非特許文献８】Schaefer L et al. FASEB J.(2001)Mar;15(3):559-561
【非特許文献９】McCarthy K.J et al.  J Histochem Cytochem. (1994)Apr; 42(4): 473-484
【非特許文献１０】Hanneken A et al.  Arch Ophthalmol. (1991)Jul; 109(7): 1005-1011
【非特許文献１１】Fushimi H et al.  J Intern Med.(1989)Dec;226(6):409-416
【非特許文献１２】Klein D.J et al  Diabetes.(1989)Jan;38(1):130-139
【非特許文献１３】Klein D.J et al. Diabetes.(1986)Oct;35(10):1130-1142
【非特許文献１４】Rohrbach DH et al.  J Biol Chem.(1983)Oct 10; 258(19): 11672-11677
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、腎線維化抑制剤、および該薬剤を有効成分とする腎疾患の治療剤、並びに、腎線維化抑制剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、そのような薬剤を開発するため鋭意研究を重ねるうち、これまで腎線維化疾患の病因とはされていなかったコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の過剰な蓄積が、腎線維化を促進しうるのではないかと考えた。
【００１７】
本発明者らは、この考えに基づいて研究を進めた結果、コンドロイチン硫酸分解酵素であるコンドロイチナーゼ（コンドロイチネース）ABC、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)硫酸転移酵素の1つであるC4ST-1、C6ST-1、C6ST-2の遺伝子をsiRNAにより処置することで腎のCSPG発現を抑制、線維芽細胞、炎症性細胞の浸潤を減少させ腎線維化を顕著に抑制出来ることを見出した。即ち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積あるいは生合成を阻害することによって、腎線維化を抑制させることができることを実証し、本発明を完成させた。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質は、腎線維化抑制剤として有用である。また、該薬剤は、腎疾患の治療もしくは予防のための薬剤となる。
【００１８】
本発明は、腎線維化抑制剤、および該薬剤を有効成分とする腎疾患の治療剤、並びに、腎線維化抑制剤のスクリーニング方法等に関し、より具体的には、
〔１〕  コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、腎線維化抑制剤、
〔２〕  前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔３〕  前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔４〕  前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔５〕  前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔６〕  腎においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬剤、
〔７〕  腎線維化疾患の治療用または予防用の、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の薬剤、
〔８〕  前記腎線維化疾患が、腎線維化を伴う腎不全である、〔７〕に記載の薬剤、
〔９〕  前記腎線維化疾患が、腎硬化症、IgA腎症、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、膜増殖性糸球体腎炎、急性進行性糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、腎アミロイドーシス、多発性嚢胞腎、後腹膜線維症、膠原病に伴う腎病変、水腎症、または糖尿病性腎症である、〔７〕に記載の薬剤、
〔１０〕  被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、腎線維化抑制剤のスクリーニング方法、
〔１１〕  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、〔１０〕に記載のスクリーニング方法、
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
〔１２〕  前記腎線維化抑制剤が、腎線維化疾患の治療用または予防用である、〔１０〕または〔１１〕に記載のスクリーニング方法、
を提供するものである。
さらに本発明は、以下に関する。
〔１３〕  〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤の、腎線維化抑制剤の製造における使用、
〔１４〕  〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤を、個体（患者等）へ投与する工程を含む、腎疾患の治療方法、
〔１５〕  〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤および薬学的に許容された担体を含んでなる組成物。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、腎線維化の発症にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積が関係していることが明らかになった。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積を阻害することにより腎線維化が抑制されることが示された。これまでにない新しいコンセプトの腎線維化疾患の治療薬が提供できることになる。特に腎線維化は現代社会で患者数が増大している、腎線維化を伴う腎不全、腎硬化症、IgA腎症、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、膜増殖性糸球体腎炎、急性進行性糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、腎アミロイドーシス、多発性嚢胞腎、後腹膜線維症、膠原病に伴う腎病変、水腎症、糖尿病性腎症などと密接に関連しており、新しいコンセプトの治療薬剤は医療上また産業上も重要な意義を持つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、腎組織における腎線維化状態の改善を糖尿病性腎症の有効な方法の一つとするため、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの機能に着目した。そして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積を抑制する状態を糖尿病性腎症モデルマウスにおいて作出し、詳細に解析したところ、野生型の腎組織に比してコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積が改善している細胞が多数観察されるとともに、線維芽細胞、炎症性細胞の浸潤の減少など腎線維化の病態が改善された。即ち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害すると、糖尿病性腎症に深く関与している腎組織におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの異常蓄積状態の改善が促進され、腎線維化の改善につながることを見出した。
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、腎線維化抑制剤に関する。
【００２１】
本発明の「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、プロテオグリカンの一つであり、代表的な硫酸化ムコ多糖であるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸とタンパク質（コアタンパク質）との共有結合化合物の総称である。本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質（ホモログ・オルソログ等）も本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」に含まれる。例えば、ヒトコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに相当するタンパク質を有し、かつ、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは可能である。また本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンには、炎症などで一時的にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合しプロテオグリカンになるもの、いわゆるパートタイムプロテオグリカンも含まれる。
【００２２】
以下の記載において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして、aggrican、versican、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbを例示する。本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンはこれらに限られず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を持つ物質であればよい。ここでコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの活性とは、例えば細胞接着能、または細胞増殖促進などがあげられる。当業者は次のような方法でコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を評価することができる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのアミノ酸配列の一部の領域を含むタンパク質、または一部の領域と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有するタンパク質の存在下で腫瘍細胞（例えばCaco-2、HT-29細胞など）の分裂増殖を測定する。分裂増殖を促進する効果を持つタンパク質をコンドロイチン硫酸プロテオグリカン活性を有するタンパク質として判定できる（Int J Exp Pathol. 2005 Aug;86(4):219-29およびHistochem Cell Biol. 2005 Aug;124(2):139-49）。ここで高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。
【００２３】
本発明における「腎線維化」とは、通常、腎組織における線維化状態を指す。例えば、細胞外マトリックスの腎組織への過剰な沈着、間質への線維芽細胞や炎症性細胞（マクロファージ）などの侵入によるものがあげられるが、これらには限られない。
【００２４】
本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する」とは、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」、「合成阻害」、「脱硫酸化」、「硫酸化阻害」などがあげられるが、これには限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量、機能または活性が比較対象よりも低下または消失させることをいう。本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する物質」とは、特に制限されないが、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進作用を有する物質」、「合成阻害作用を有する物質」、「脱硫酸化作用を有する物質」、または「硫酸化阻害作用を有する物質」である。
【００２５】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」とは、たとえばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現の阻害・存在の減少が上げられる。ここで「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質があげられる。また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばβglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質があげられる。これらはいずれも例示であり、これらに限らず広くコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質であればよい。
【００２６】
「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、またはこれらの転写・翻訳によりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質が生成されることを意味する。また、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の機能」とは、例えば、該タンパク質がコンドロイチン硫酸と結合する機能や、その他の細胞中の構成要素との結合等を挙げることができる。上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価（測定）することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。
【００２７】
さらにまた、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素の発現の上昇であってもよい。これらの酵素の例としては、メタロプロテイナーゼ（例えばADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5など）やコンドロイチナーゼ、Calpain Iなどがあげられるが、これらには限られない。また「分解促進」は、これらの酵素または酵素の一部の投与により生ずる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量の減少であってもよい。
【００２８】
また「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現の抑制を促す物質の投与により生じるものであってもよい。これらの物質には例えばn-butylate、Diethylcarbamazepine、Tunicamycin、non-steroidal estrogen、Cyclofenil deiphenolなどがあげられるが、これらには限られない。
【００２９】
「分解促進作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３０】
また「分解促進作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する低分子化合物
【００３１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「合成阻害」とは、たとえばグリコサミノグリカンの生合成の阻害、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成に関わる酵素の阻害などがあげられるが、必ずしもこれらに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程のいずれかを阻害することを指す。
【００３２】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を阻害する物質として、グリコサミノグリカンの生合成を阻害する物質としては、たとえば、β-D-xyloside、2-deoxy-D-glucose (2-DG)、ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate (ETDP)、5-hexyl-2-deoxyuridine (HUdR)などがあげられる。これらをはじめとした物質によりグリコサミノグリカンの生合成が阻害され、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
【００３３】
一方、コンドロイチン合成に関わる酵素としては、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどがあげられる。これらをはじめとした酵素を阻害、発現の抑制等を行うことにより、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
【００３４】
「合成阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３５】
また「合成阻害作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する低分子化合物
【００３６】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「脱硫酸化」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン中の硫酸基が除かれることを指し、例えば内在性あるいは外部から投与される脱硫酸化酵素による脱硫酸化、または硫酸化を抑制する化合物による硫酸化の抑制などがあげられるが、これらに限られず、硫酸基が除去される過程を指す。
【００３７】
脱硫酸化酵素としては、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseがあげられる。また、硫酸化を抑制する化合物としては、たとえばChlorate、EGF receptor antagonistなどがあげられる。
【００３８】
「脱硫酸化作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３９】
また「脱硫酸化作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質に対して、ドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化抑制タンパク質変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する低分子化合物
【００４０】
ここで「脱硫酸化抑制化合物」は、タンパク質には限られず、例えば補酵素など非タンパク質化合物を含む。
【００４１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「硫酸化阻害作用」とは、例えば、硫酸基転移酵素の阻害があげられるが、これに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程に生じる硫酸化が阻害されることを指す。
【００４２】
硫酸基転移酵素としては、例えば、C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)、C4ST-2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)、C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などがあげられる。
【００４３】
「硫酸化阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００４４】
また「硫酸化阻害作用を有する物質」としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する低分子化合物
【００４５】
上記例示した酵素は、一遺伝子に対応する一酵素を示すのみならず、ある特徴を共有する酵素群をも含む。例えばコンドロイチナーゼは、ムコ多糖分解酵素という特徴は共有するが基質特異性などの異なるABC、AC、Bなどの酵素の総称である。例えば、コンドロイチナーゼAC Iは、コンドロイチン硫酸類 (A、CまたはE)、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸-デルマタン硫酸ハイブリッド型およびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-グルクロン酸残基を持つオリゴ糖を生成する。本酵素はデルマタン硫酸 (コンドロイチン硫酸B，ヘキスロン酸としてL-イズロン酸を持つもの)、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンには作用しない。また、コンドロイチナーゼAC II は、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸CのN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、Δ4-不飽和二糖(ΔDi-0S、ΔDi-4SおよびΔDi-6S)を生成する。本酵素はヒアルロン酸にもよく作用する。デルマタン硫酸(コンドロイチン硫酸B)には作用せず、本酵素の競合的阻害剤となる。コンドロイチナーゼB(デルマタナーゼ)は、デルマタン硫酸のL-イズロン酸に結合したN-アセチルガラクトサミニド結合を脱離反応的に切断し、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つオリゴ糖(2糖および4糖)を生成する。本酵素はL-イズロン酸を含まないコンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸Cには作用しない。デルマタン硫酸の硫酸基を除去した誘導体であるデルマタンは、この酵素の基質とはならない。デルマタン硫酸のL-イズロン酸単位の第2位が硫酸化されている箇所はこの酵素によってよりよく切断される。コンドロイチナーゼABCは、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、コンドロイチンおよびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つ二糖を主に生成する。本酵素はケラタン硫酸、ヘパリンおよびヘパラン硫酸には作用しない。コンドロイチナーゼはこのような、異なる性質を持っていながらもムコ多糖分解酵素という共通の性質を持つ酵素の総称であり、必ずしもここで例示したChondroitinase ACI、Chondroitinase AC II、Chondrotinase B、Chondroitinase ABCには限られない。
【００４６】
また、このような特徴を共有する酵素群は、必ずしもゲノムDNA上の一遺伝子に対応するものではない。例えば、chondroitin-4-sulfatase、chondroitin-6-sulfataseは、ともにゲノムデータベース上の複数のアクセッション番号で参照される配列（例えばGenbankアクセッション番号NT_039500（その一部はアクセッション番号CAAA01098429（配列番号：８５）としてあらわされる）、NT_078575、NT_039353、NW_001030904、NW_001030811、NW_001030796、NW_000349）として公共遺伝子データベースGenbank上で検索される。
【００４７】
上記に例示したもののうち個別の遺伝子に対応しているものは下記のように示される。すなわち、上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして例示した、aggrican、versican、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lb、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素として例示した、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Calpain I、コンドロイチン合成に関わる酵素として例示した、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylT、硫酸基転移酵素として例示した、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3、D4ST、C6ST-1、C6ST-2をそれぞれヒトにおいてコードする遺伝子の公共遺伝子データベースGenbankにおけるアクセッション番号、塩基配列、アミノ酸配列は、次の通りである。
aggrican（アクセッション番号NM_007424、塩基配列の配列番号：１、アミノ酸配列の配列番号：２）
versican（アクセッション番号BC096495、塩基配列の配列番号：３、アミノ酸配列の配列番号：４）
neurocan（アクセッション番号NM_010875、塩基配列の配列番号：５、アミノ酸配列の配列番号：６）
brevican（アクセッション番号NM_007529、塩基配列の配列番号：７、アミノ酸配列の配列番号：８）
βglycan（アクセッション番号AF039601、塩基配列の配列番号：９、アミノ酸配列の配列番号：１０）
Decorin（アクセッション番号NM_007833、塩基配列の配列番号：１１、アミノ酸配列の配列番号：１２）
Biglycan（アクセッション番号BC057185、塩基配列の配列番号：１３、アミノ酸配列の配列番号：１４）
Fibromodulin（アクセッション番号NM_021355、塩基配列の配列番号：１５、アミノ酸配列の配列番号：１６）
PG-Lb（アクセッション番号NM_007884、塩基配列の配列番号：１７、アミノ酸配列の配列番号：１８）
ADAMTS-1（アクセッション番号NM_009621、塩基配列の配列番号：１９、アミノ酸配列の配列番号：２０）
ADAMTS-4（アクセッション番号NM_172845、塩基配列の配列番号：２１、アミノ酸配列の配列番号：２２）
ADAMTS-5（アクセッション番号AF140673、塩基配列の配列番号：２３、アミノ酸配列の配列番号：２４）
Calpain I（アクセッション番号NM_007600、塩基配列の配列番号：２５、アミノ酸配列の配列番号：２６）
GalNAc4ST-1（アクセッション番号NM_175140、塩基配列の配列番号：２７、アミノ酸配列の配列番号：２８）
GalNAc4ST-2（アクセッション番号NM_199055、塩基配列の配列番号：２９、アミノ酸配列の配列番号：３０）
GALNAC4S-6ST（アクセッション番号NM_029935、塩基配列の配列番号：３１、アミノ酸配列の配列番号：３２）
UA2OST（アクセッション番号NM_177387、塩基配列の配列番号：３３、アミノ酸配列の配列番号：３４）
GalT-I（アクセッション番号NM_016769、塩基配列の配列番号：３５、アミノ酸配列の配列番号：３６）
GalT-II（アクセッション番号BC064767、塩基配列の配列番号：３７、アミノ酸配列の配列番号：３８）
GlcAT-I（アクセッション番号BC058082、塩基配列の配列番号：３９、アミノ酸配列の配列番号：４０、またはアクセッション番号NM_024256、塩基配列の配列番号：４１、アミノ酸配列の配列番号：４２）
XylosylT（アクセッション番号NM_145828、塩基配列の配列番号：４３、アミノ酸配列の配列番号：４４）
C4ST-1（アクセッション番号NM_021439、塩基配列の配列番号：４５、アミノ酸配列の配列番号：４６）
C4ST-2（アクセッション番号NM_021528、塩基配列の配列番号：４７、アミノ酸配列の配列番号：４８）
C4ST-3（アクセッション番号XM_355798、塩基配列の配列番号：４９、アミノ酸配列の配列番号：５０）
D4ST（アクセッション番号NM_028117、塩基配列の配列番号：５１、アミノ酸配列の配列番号：５２）
C6ST-1（アクセッション番号NM_016803、塩基配列の配列番号：５３、アミノ酸配列の配列番号：５４）
C6ST-2（アクセッション番号AB046929、塩基配列の配列番号：５５、アミノ酸配列の配列番号：５６）
【００４８】
上記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつ、上記タンパク質が有する機能（例えば細胞内の構成成分と結合する機能等）を持つタンパク質は、本発明の上記タンパク質に含まれる。上記タンパク質とは、例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。
【００４９】
本発明における上記遺伝子には、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトの上記遺伝子のホモログ等）が含まれる。
【００５０】
また、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。
【００５１】
当業者は、上記の高い相同性を持つタンパク質から、上記のタンパク質に機能的に同等なタンパク質を、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用、合成阻害作用、脱硫酸化作用または硫酸化阻害作用の活性測定方法を用いることにより適宜取得することができる。具体的な活性測定方法は、後出の本発明におけるスクリーニング方法の項にて記載される。また当業者においては、他の生物における上記遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、上記遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物における上記タンパク質および遺伝子に相当する上記タンパク質および遺伝子、あるいは、上述のタンパク質および遺伝子と機能的に同等な上記タンパク質および遺伝子も、単に上記の名称で記載する場合がある。
【００５２】
本発明の上記タンパク質は、天然のタンパク質としてのほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質としては、例えば上記タンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、上記タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、例えば、上記タンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより、調製することが可能である。本発明の上記タンパク質は、例えば、後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。
【００５３】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA (peptide nucleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。
【００５４】
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。
【００５５】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素のいずれかをコードする遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有する内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば100塩基以上、または500塩基以上であってもよい。
【００５６】
本発明のアンチセンス核酸は特に制限されないが、例えばVersican遺伝子の塩基配列（GenBankのアクセッション番号BC096495、配列番号：３）、C4ST-1（GenBankのアクセッション番号NM_021439、配列番号：４５）、C4ST-2（GenBankのアクセッション番号NM_021528、配列番号：４７）、C4ST-3（GenBankのアクセッション番号XM_355798、配列番号：４９）等をもとに作成することができる。
【００５７】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。
【００５８】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。
【００５９】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y.& Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００６０】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。
【００６１】
近年のゲノムプロジェクトの完了によってヒトの全塩基配列が解読され数多くの疾患関連遺伝子が盛んに同定されている現在、特定の遺伝子を標的とした治療法、創薬開発が盛んに実施されている。中でも特異的転写後抑制効果を発揮するsmall interfering RNA(siRNA)の遺伝子治療への応用が注目されている。RNAiは、2本鎖RNA(dsRNA)が直接細胞内に取り込まれると、このdsRNAと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖dsRNA(siRNA)を用いることにより、RNAiを誘導する事が可能で、RNAiは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。
【００６２】
RNA干渉（RNAi）は二本鎖RNAと相補的な塩基配列を持ったmRNAが分解される現象である。RNAiは、この現象を利用して人工的に21〜23merの二本鎖RNA（siRNA）を導入することにより任意の遺伝子の発現を抑制する方法である。1998年にFireらがC.eleganceを用いて二本鎖RNAが配列特異的に遺伝子のサイレンシングを引き起こすことを発見して以来（Fire A, Nature (1998) 391,806-811）、21〜23merにプロセッシングされた二本鎖RNAがmRNAを切断する機構（Zamore PO, Cell (2000) 101,25-33）や、RISC（RNA-induced silencing complex）の存在（Hammond SM, Nature (2000) 404,293-296）、Dicerのクローニングを経て（Bernstein E, Nature (2001) 409,363-366）、2001年にElbadhirらにより哺乳類細胞でもsiRNAによる配列特異的な表現抑制が可能であることが証明され（Elbadhir SM, Nature (2001) 411,494-498）、遺伝子治療応用への期待が高まっている。
【００６３】
RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、dsRNAを細胞内に導入すると、そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。
【００６４】
siRNAの設計にあたっては、ターゲットとしては上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば、Versican遺伝子の塩基配列（配列番号：３）、C4ST-1遺伝子の塩基配列（配列番号：４５）、C4ST-2遺伝子の塩基配列（配列番号：４７）、C4ST-3遺伝子の塩基配列（配列番号：４９）等をもとに作成することができる。より具体的には、その配列の一部の領域をターゲット候補とすることが可能であり、例えば、Versican遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５７）、C4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５８）、C4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５９）、C4ST-3遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６０）、C6ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６１）、C6ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６２）、GalNAc4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６３）、GalNAc4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６４）、GALNAC4S-6STの塩基配列の一部領域（配列番号：６５）等をもとに作成することができる。さらに具体的には、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：７３〜７９および８２〜８４）を標的とするsiRNAが例示できる。
【００６５】
siRNAを細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。
【００６６】
また上記２本のRNA分子は、ここで一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)であってもよい。shRNAとは、ショートヘアピンRNA(short hairpin RNA)と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子もまた本発明のsiRNAに含まれる。
【００６７】
また本発明の好ましい態様としては、Versican、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）であって、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：７３〜７９および８２〜８４）を標的とするsiRNAにおいて、例えば、１もしくは少数のRNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖RNAであっても、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明のsiRNAに含まれる。
【００６８】
RNAi(siRNA)のために使用されるRNAは、上記タンパク質をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一（相同）である必要はないが、完全な同一（相同）性を有することが好ましい。
【００６９】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。
【００７０】
例えば、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明の上述の遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
【００７１】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：７３に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：７３に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００７２】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖RNAである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の２本鎖RNAの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのsiRNAは、当業者においては市販の核酸合成機およびDICER酵素を用いて適宜作成することが可能であり、また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のsiRNAには、所謂「カクテルsiRNA」が含まれる。
【００７３】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド(RNA)でなくともよい。即ち、本発明において、siRNAを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。
【００７４】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００７５】
また、本発明の発現阻害物質には、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現調節領域（例えば、プロモーター領域。具体的な例としては、PG-Lbのプロモーター領域である配列番号：６６で表される塩基配列があげられる。）と結合することにより、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また当業者においては、所望の化合物について、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するか否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。
【００７６】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００７７】
本発明の上記ベクターの好ましい態様としては、Versican、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）を発現するベクターを挙げることができる。
【００７８】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然の上述のタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素やその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素のタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００７９】
本発明の抗体は、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合するものであれば特に制限はなく、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかにヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物であってもよい。
【００８０】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質はその由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて適宜取得することができる。
【００８１】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味する。
【００８２】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００８３】
本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に対する抗体は、該タンパク質と結合することにより、該タンパク質の発現もしくは機能を阻害する効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型化抗体が好ましい。
【００８４】
さらに本発明は、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素の機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。該低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。
【００８５】
さらに本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する変異体（ドミナントネガティブタンパク質）を挙げることができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する該タンパク質変異体」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。このようなドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、コンドロイチン硫酸との結合を野生型Versicanコアタンパク質と競合阻害するようなVersicanコアタンパク質変異体を挙げることができる。
【００８６】
また本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する臓器、組織または細胞は特に限定はされないが、好ましくは腎であり、より好ましくは腎組織であり、さらに好ましくは腎細動脈、腎間質または糸球体である。
【００８７】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する化合物は、腎線維化疾患の治療または予防のための薬剤となることが期待される。ここで「治療または予防」は、腎線維化を呈する組織、または細胞に対して、必ずしも完全な治療効果または予防効果を有する必要はなく、部分的な効果を有する場合であってよい。
【００８８】
本発明において腎線維化疾患は、腎線維化を伴う疾患であれば特に限定はされないが、好ましくは腎線維化を伴う腎不全であり、さらに好ましくは、腎硬化症、IgA腎症、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、膜増殖性糸球体腎炎、急性進行性糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、腎アミロイドーシス、多発性嚢胞腎、後腹膜線維症、膠原病に伴う腎病変、水腎症、または糖尿病性腎症を挙げることができる。
【００８９】
本発明の腎線維化抑制剤は、腎線維化の原因であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害することにより腎線維化を抑制する作用を有する。従って、本発明の好ましい態様としては、例えば、本発明の腎線維化抑制剤を有効成分とする、腎線維化を伴う腎不全治療剤、腎硬化症治療剤、IgA腎症治療剤、巣状糸球体硬化症治療剤、膜性腎症治療剤、膜増殖性糸球体腎炎治療剤、急性進行性糸球体腎炎治療剤、慢性腎盂腎炎治療剤、腎アミロイドーシス治療剤、多発性嚢胞腎治療剤、後腹膜線維症治療剤、膠原病に伴う腎病変治療剤、水腎症治療剤、または糖尿病性腎症治療剤を提供する。
【００９０】
また本発明の「腎線維化抑制剤」は、「腎線維化治療剤」、または「腎線維化改善剤」等と表現することも可能である。また、本発明において「抑制剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
【００９１】
なお、本発明における「治療」には、腎線維化の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、腎線維化発現細胞（組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
【００９２】
本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【００９３】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
【００９４】
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
【００９５】
また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【００９６】
また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
【００９７】
本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【００９８】
また、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。siRNAやshRNAを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。腎線維化組織等に局所的に投与することもできる。siRNAはin vitroにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、in vivoにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例として、siRNAのキャリアとして用いられるアテロコラーゲンとはコラーゲン分子をペプシンで消化することによって得られる抗原性のない分子である。生体親和性に富み、生体に投与した場合でも炎症を惹起する心配がなく、また生体内で生分解性があり、さらに核酸と相互作用が強いため生体への遺伝子ベクターのキャリアとして有用であると注目されている（Ochiya T, Nature Med. (1999) 5(6): 707-10）が、本発明の薬剤の導入の方法はこれには限られない。
【００９９】
本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり106〜1013個程度であり、1週〜8週間隔で投与される。
【０１００】
また、siRNAまたはshRNAを目的の組織または器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
【０１０１】
本発明の薬剤を使用する場合は、腎線維化を発現する疾患であれば適用部位もしくは疾患の種類は特に限定されず、例えば腎線維化を伴う腎不全、腎硬化症、IgA腎症、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、膜増殖性糸球体腎炎、急性進行性糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、腎アミロイドーシス、多発性嚢胞腎、後腹膜線維症、膠原病に伴う腎病変、水腎症、または糖尿病性腎症を対象として適用される。上記疾患は、他の疾患と併発したものであってもよい。
【０１０２】
また本発明は、被検試料からコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする腎線維化抑制剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法によって、腎線維化抑制剤もしくは腎線維化抑制剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。
【０１０３】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、腎線維化抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
【０１０４】
これらに共通したスクリーニングの基本的な原理として、代表的な例として、下記の工程を含むものがあげられる。
（１） コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)そのもの／もしくはグリコサミノグリカン(GAG)鎖／もしくはCSPGやGAG鎖を合成（生成）する細胞
（２） 被検化合物（例えば、製薬企業の有する莫大な化合物ライブラリー）
（３） コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の切断断面／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)量／遊離グリコサミノグリカン(GAG)量を検出する方法
上記3種のツールを用いる。（１）と（２）を試験管内、もしくは培養皿上で混合させ、その効果を（３）により簡便に検出するという手順が望ましい。
【０１０５】
以下、本発明のスクリーニング方法の態様を例示する。なお、以下に記載の態様においては、用いられるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、脱硫酸化酵素の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来するものが挙げられるが、これらに由来するものに特に制限されない。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一部とは、グリコサミノグリカン鎖、コアタンパク質などの構成要素またはその一部であり、特に限定されない。
【０１０６】
また以下に記載の態様に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
【０１０７】
また以下に記載の態様における被検化合物への「接触」は、通常、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、その一部、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素を被検化合物と混合することによって行うが、この方法に限定されない。例えば、これらのタンパク質またはその一部を発現する細胞を被検化合物と接触させることにより、上記「接触」を行うことができる。
【０１０８】
また以下に記載の態様における「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、それぞれの態様において用いられるタンパク質を発現するように形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。例えば、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを発現する細胞」としては、内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子を発現している細胞、または外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が発現した細胞は、通常コンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【０１０９】
また以下の記載において、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質、また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばDecorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質である。また「合成酵素」は、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどである。また「硫酸基転移酵素」は、例えば、C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)、C4ST-2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)、C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などである。また、「分解促進酵素」とは、例えば、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Chondroitinase ABC (ChABC)、Chondroitinase AC、Chondroitinase B、Calpain Iなどである。また「脱硫酸化酵素」は、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseなどである。
【０１１０】
本発明のスクリーニング方法の態様として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用を有する化合物を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、存在量を低下させる物質を選択する工程
【０１１１】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１１２】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に結合する標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１１３】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は腎線維化治療のための薬剤となる。
【０１１４】
被検化合物が上記(a)分解促進作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１１５】
上記(a) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用に関するスクリーニング方法態様：
CS-GAGとして、コンドロイチン硫酸A（CS-A）、CS-B、CS-C（生化学工業社、ICN社、Sigma社など）、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１１６】
検出方法としては、例えばWFAレクチン（ノダフジレクチン）結合法が簡便な手法として挙げられる。WFAレクチンはCS-GAG鎖のGalNAc残基に結合するため、CS-GAGを簡便に検出できる。被検化合物の陽性コントロールとしてはコンドロイチナーゼABCを使用する。コンドロイチナーゼABC添加により、CS-GAG鎖が分解されるとWFAレクチンが結合できなくなるため、その原理を利用する。より具体的には、FITC標識WFAレクチン（EY社など）を、被検化合物混合前後でCSコーティング・ウェルに添加し、CS-GAGが分解される事により、ウェル中のFITC蛍光強度の変化を蛍光プレートリーダーあるいは蛍光顕微鏡などの検出機器により極めて簡便に定量・数値化できる。混合前後で最も蛍光数値を減少させた化合物が、本コンセプトを満たす新規の治療候補化合物として判定できる。
【０１１７】
また、他の検出方法として、CS-GAGそのものを直接的に標識する抗CS抗体（クローン：CS56、生化学工業社製）を使用する事ができる。WFAレクチンと同様に、FITC標識抗CS抗体をCSコーティング・ウェルに添加する事で、蛍光数値の変化を見れば、極めて短時間かつ簡便に大量スクリーニングができる。
【０１１８】
より詳細な検出方法として、被検化合物混合前後のプレートをそのまま使用し、sGAG Assay Kit(WIESLAB社製)、Sulphanated Glycosaminoglycans, ELISA Kit（FUNAKOSHI社製）などを適用するにより、GAG含有量を正確に定量・数値化する方法がある。
【０１１９】
さらに詳細には、被検化合物混合前後のプレートに2-AB（2-aminobenzamide）や2-AP（2-aminopyridine；いずれもLUD社製など）を添加することにより、遊離GAG鎖の還元末端を簡便に蛍光標識し、糖鎖の各タイプや、各タイプの含有率までを、HPLC、MALDI-MS、LC-MSなどで解析する事により、より詳細な解析が可能である。候補化合物の特性を詳細に調べるという、スクリーニングの次の段階の方法である。
【０１２０】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群における、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記合成量を低下させる化合物を選択する工程
【０１２１】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる。
【０１２２】
次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する。測定は当業者においては公知の手法、例えば、標識した抗体による方法、質量分析法、クロマトグラフィー法等によって適宜実施することができる。
【０１２３】
さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、合成量を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は腎線維化治療のための薬剤となる。
【０１２４】
被検化合物が上記(b)合成阻害作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１２５】
上記(b) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸を合成する細胞、細胞株は当該研究者には既知である。ヒトでは例えば、健常人の末梢血を採取後、単核球を分離・培養するという標準的な方法により、16時間の細胞培養でコンドロイチン硫酸を産生してくる（Uhlin-Hansen L et al., Blood 82:2880, 1993.など）。また、より簡便には、既知の細胞株、例えば、線維芽細胞株NIH3T3（Phillip HA, et al. J. Biol. Chem. 279:48640, 2004など）、腎尿細管由来癌細胞株ACHN（Kawashima H et al., J. Biol. Chem. 277:12921, 2002）、腎遠位尿細管由来細胞株MDCK（Borges FT et al., Kidney Int. 68:1630, 2005.など）、血管内皮細胞株HUVEC（Schick BP et al., Blood 97:449, 2001など）など、多数挙げられる。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後のCS-GAG量の変化を上記（a）の方法で簡便に数値化できる。細胞培養後のCS-GAG量の増加（すなわち、CS-GAG合成量を反映する）を抑制する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１２６】
さらに、より選択的には、例えばGalNAc4ST-1やXylosylTなどのCS-GAG合成酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的にCS-GAGを合成する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１２７】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、硫酸化を受けていた量を低下させる物質を選択する工程
【０１２８】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１２９】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に残存する脱硫酸化の構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１３０】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は腎線維化治療のための薬剤となる。
【０１３１】
被検化合物が上記(c)脱硫酸化作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１３２】
上記(c) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用に関するスクリーニング方法態様：
基本的に上記（a）の方法と同様、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１３３】
検出方法は、脱硫酸化する事により、プロテオグリカンのコア蛋白側に残存した脱硫酸化断片の２糖構造を、抗プロテオグリカンΔdi４S抗体（クローン；2-B-6、4位に硫酸化を受けていた部分を認識する） あるいは抗プロテオグリカンΔdi6S(クローン；3-B-3、6位に硫酸化を受けていた部分を認識する。ともに生化学工業社製)と反応させることで、脱硫酸化を受けた部分の検出が容易にできる。したがって、混合培養前後のプレートにおいて、FITC標識した2-B-6や3-B-3抗体を反応させ、その蛍光数値の変化を簡便に検出できる。反応前後の蛍光強度を増加させた化合物が、より脱硫酸化を促進する物質であると判定でき、本コンセプトを満たす新規治療候補化合物として簡便に同定できる。
【０１３４】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は、例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞もしくは細胞抽出液あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化過程を構成する酵素、基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
【０１３５】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検物質を接触させる。
【０１３６】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１３７】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は腎線維化治療のための薬剤となる。
【０１３８】
被検化合物が上記(d)硫酸化阻害の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１３９】
上記(d) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸の硫酸化を促進する細胞、細胞株は上記（c）に記載の細胞、細胞株と一致する。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後の硫酸化の程度を、例えば、4位硫酸化を検出する抗体（クローン；LY111）や6位硫酸化を検出する抗体（クローン；MC21C、いずれも生化学工業社製）で簡便に確認できる。蛍光標識抗体を用いて、培養前後の蛍光数値を比較しても良いし、上記（c）同様に、培養前後で2-B-6や3-B-3抗体を使用した検出法を行っても良い。細胞培養後の硫酸化の増加（LY111やMC21Cの蛍光数値増加）を抑制する化合物、もしくは細胞培養後の脱硫酸化の進行（2-B-6や3-B-3の蛍光数値増加）を促進する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１４０】
さらに、より選択的には、例えばC4ST-1やC6ST-1などの硫酸基転移酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的に硫酸基を付加する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１４１】
本発明の他の好ましい態様は、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む腎線維化抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞における遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）該発現量を被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下している化合物、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１４２】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。
【０１４３】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
【０１４４】
例えば、上記いずれかのタンパク質を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、RT- PCR法、DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、上記いずれかのタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、上記いずれかのタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、上記いずれかのタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
【０１４５】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と該遺伝子の発現量を比較する。
【０１４６】
本方法においては、次いで、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、腎線維化抑制のための薬剤もしくは腎線維化治療のための候補化合物となる。
【０１４７】
また、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、腎線維化抑制のための薬剤もしくは腎線維化治療のための候補化合物となる。
【０１４８】
また、本発明のスクリーニング方法の一態様としては、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。本発明の上記方法は例えば以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下している化合物、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素に機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１４９】
本方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。
【０１５０】
ここで「機能的に結合した」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
【０１５１】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
【０１５２】
「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。
【０１５３】
ここで「接触」は、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
【０１５４】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
【０１５５】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する。
【０１５６】
本方法においては、次いで、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、腎線維化抑制のための薬剤もしくは腎線維化治療のための候補化合物となる。
【０１５７】
また、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素にと機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、腎線維化抑制のための薬剤もしくは腎線維化治療のための候補化合物となる。
【０１５８】
本発明のスクリーニング方法において見出される腎線維化抑制剤は、好ましくは、腎線維化疾患の治療用または予防用のものである。
【０１５９】
また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。
【０１６０】
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。
【０１６１】
本発明の好ましい態様においては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されているかどうかを検出する工程を含む、腎線維化抑制剤のスクリーニング方法である。従って、該スクリーニング方法において、例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの検出の際に利用可能な、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識する抗体（抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体）も、本発明の腎線維化抑制剤スクリーニング用キットの構成要素に含めることができる。
【０１６２】
上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のVersicanコアタンパク質遺伝子のDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら, Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のVersicanコアタンパク質遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【０１６３】
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1 ×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、 42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。
【０１６４】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、例えば配列番号：６９または７０に記載のものであるが、上記本発明中の遺伝子のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【０１６５】
また本発明は、本発明の薬剤を個体（例えば、患者等）へ投与する工程を含む、腎線維化疾患の治療もしくは予防方法を提供する。
【０１６６】
本発明の予防もしくは治療方法の対象となる個体は、腎線維化疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【０１６７】
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【０１６８】
さらに本発明は、本発明の薬剤の、腎線維化抑制剤の製造における使用に関する。
【０１６９】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１７０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１７１】
実験１：片側尿管結紮術（UUO）による腎線維化モデルマウスによるC6ST siRNA、コンドロイチナーゼ処置による遺伝子発現、組織レベルの評価、検討
実施例1  ：  マウス腎線維化モデルの作成
C57BL/6JcLマウス（♀、8週齢、日本クレア社製）に片側尿管結紮術（UUO）を行い、腎線維化モデルを作成した。この腎線維症モデルマウスは再現性に優れており、マウスの腎線維症の実験系で広く用いられている（American journal of pathology 2003 163;4 1261-1273）。マウスをケタラール/キシラジン麻酔下で開腹し、尿管を露出させ、右尿管を4-0号手術用糸で2カ所結紮し、1-0号手術用糸にて腹膜、皮膚を縫合した。
【０１７２】
実施例2  ：  マウス腎線維化モデルにおけるC6ST(Chondroitin 6-sulfotransferase-1) siRNAによるC6ST発現の抑制
腎線維化モデルマウスの典型例として片側尿管結紮術（UUO）による腎線維化モデルマウスを用いてC6ST siRNA投与によるC6ST発現の抑制効果をPCR法により確認した。C57BL/6JcLマウス（♀、8週齢、日本クレア社製）にUUOを施術し腎線維化モデルを作成した。また、UUOを施術する直前に、マウスにはコンドロイチナーゼABC（2 U/ml、シグマ社製）を50μl、C6ST-1 siRNA、C6ST-2 siRNA混合物（1μg/匹、ジーンワールド社製）、またはPBSをsiRNA媒体である0.1 % Atelocollagen（高研社製）に混合し200μlを腹腔内に注射した。この処置を行ったマウス群をコンドロイチナーゼ群、C6ST siRNA群、対照群と名付けた。実験8日目に解剖し、UUO施術腎を摘出し、免疫染色用サンプル、遺伝子発現解析用サンプルを得た。摘出した臓器（腎臓）50 mg当たりに対し、RNA-Bee (TEL-TEST社製) 1mLを加え、電動ホモジナイザー（DIGITAL HOMOGENIZER、ASONE社製）にて粉砕させた後、chloroform 200μL(Sigma Aldrich Japan社製) を加え穏やかに混合後、約5分氷冷し、12,000 rpm、4℃、15分間  遠心分離機（Centrifuge 5417R、eppendorf社製）を用い遠心分離を行った。遠心分離後の上澄み液500μLを別のエッペンドルフチューブに移し、上澄み液と同等量のisopropannol 500μL(Sigma Aldrich Japan社製)を加え混合後、1μLのglycogen(Invitrogen社製)を加え、15分間氷冷した。氷冷15分後、12,000 rpm、4℃、15分間遠心し、その後、75 % Ethanol 1000μL(Sigma Aldrich Japan社製)で3回洗浄して得られたRNA沈殿物を30分間〜1時間、自然乾燥させた後、大塚蒸留水50μL(大塚製薬社製)に溶解させ、さらに大塚蒸留水(大塚製薬社製)にて100倍希釈し、UVプレート（コーニングコースター製）上でプレートリーダー(POWER Wave XS、BIO-TEK社製)により抽出したサンプル中のRNA濃度を算出した。
【０１７３】
次に、RT reaction(cDNA合成)を行うため以下の手技を行った。
算出して得られたRNAサンプルを500 ng/20μLの濃度に調整し、68℃、3分間、BLOCK INCUBATOR(ASTEC製)にて加温し、10分間、氷冷した。氷冷後、予め調製していたRT Pre Mix 液（組成：25 mM MgCl218.64μL（Invitrogen社製）、5×Buffer 20μL（Invitrogen社製）、0.1 M DTT 6.6μL（Invitrogen社製）、10 mM dNTP mix 10μL（Invitrogen社製）、RNase Inhibitor 2μL（Invitrogen社製）、MMLV Reverse transcriptase 1.2μL（Invitrogen社製）、Random primer 2μL（Invitrogen社製）、滅菌蒸留水19.56μL（大塚蒸留水：大塚製薬社製）を80μL加えBLOCK INCUBATOR(ASTEC社製)にて42℃、1時間、加温反応させ、1時間後、BLOCK INCUBATOR(ASTEC社製)にて99℃、5分間、加熱した後、氷冷し求めるcDNA 100μLを作製し、合成して得られたcDNAを用いて、以下の組成でPCR反応を行った。
【０１７４】
PCR Buffer 2μL [組成：166 mM (NH4)2SO4 (Sigma Aldrich Japan社製)、
670 mM Tris pH8.8(Invitrogen社製)、67 mM MgCl2・6H2O(Sigma Aldrich Japan社製)、100 mM 2-mercaptoethanol)(WAKO社製)]、25 mM dNTP mix 0.8μL(Invitrogen社製)、DMSO 0.6μL(Sigma Aldrich Japan社製)、Primer Forward 0.2μL(GeneWorld社製)、Primer Reverse 0.2μL(GeneWorld社製)、大塚蒸留水 15.7μL(大塚製薬社製)、Taq polymerase 0.1μL(Perkin Elmer社製)、2.より得られたcDNA 1μL を混合させAuthorized Themal Cycler(eppendorf社製)により94℃ 45 second、56℃  45 sec、72℃  60 second  35cycle 反応させた。反応終了後、得られたPCR産物に2μL Loading Dye(Invitrogen社製)を加え、1.5% UltraPure Agarose(Invitrogen社製)ゲルを作製し、Mupid-2 plus(ADVANCE社製)により100V、20分間 電気泳動を行った。泳動後、1×LoTE[組成：3mM Tris-HCl(pH7.5) (Invitrogen社製)、 0.2mM EDTA(pH7.5) (Sigma Aldrich Japan社製)]にて10000倍希釈Ethydium Bromide（Invitrogen社製）染色液中で20分間〜30分間 振とうさせた後、I-Scope WD(ADVANCE社製)に設置したEXILIM(CASIO社製)にてゲル撮影し遺伝子発現の確認を行った。
【０１７５】
今回、用いたC6ST-1 siRNA、C6ST-2 Primer (Forward、Reverse) (GeneWorld社製)を以下に示す。
[Primer配列]
*GAPDH(GeneWorld社製)
Forward : 5’-CTGCCAAGTATGACATCA -3’ （配列番号：６７）
Reverse : 5’-TACTCCTTGGAGGCCATGTAG -3’  （配列番号：６８）
*C6ST1(Chondroitin 6-sulfotransferase-1)
Forward : 5’-tgtgtggacacacctcccta-3’ （配列番号：６９）
Reverse : 5’-cttcaaaggtccccttcctc-3’ （配列番号：７０）
*C6ST2(Chondroitin 6-sulfotransferase-2)
Forward : 5’-cagcttgagccatttcaaca-3’ （配列番号：７１）
Reverse : 5’-gggtgaggcctttaggaaac-3’ （配列番号：７２）
［C6ST-1カクテル配列］(Gene Bank accession number NM_016803)
（Gene world社製）
5’-gcgccccctctccccatggagaaag-3’ （配列番号：７３）
5’-gctttgcctcaggatttccgggacc-3’ （配列番号：７４）
5’-ggttcagccttggtctaccgtgatgtc-3’ （配列番号：７５）
5’-gcagttgttgctatgcgacctgtat-3’ （配列番号：７６）
［C6ST-2カクテル配列］(Gene Bank accession number NM_021715)
（Gene world社製）
5’-tggggagagtgaggattcggtgaa-3’ （配列番号：７７）
5’-cggacgtgggactcgtcgaggacaaag-3’ （配列番号：７８）
5’-cgaaagtacctgcccgcccgtttcgc-3’ （配列番号：７９）
【０１７６】
その結果、RT-PCRによりPositive controlであるGAPDHの発現が対照群、C6ST siRNA処置群ともに認められた。さらにC6STにおいて対照群と比較しC6ST siRNA治療群では発現減少が認められ、Atellocollagen媒体C６ST siRNA投与によりC６ST遺伝子のノックダウンが確認された（図1）。
【０１７７】
実施例3  ：  マウス腎線維化モデルにおけるコンドロイチナーゼ、C6ST (Chondroitin 6-sulfotransferase-1)siRNAのコンドロイチン硫酸過剰蓄積抑制効果；組織像
摘出した組織を凍結用包埋剤OCTコンパウンド（サクラ社製）にて包埋し、液体窒素で凍結ブロックを作成し、クリオスタット（マイクロエッジ社製）を用いて厚さ6μmの切片を作成した。
【０１７８】
得られた切片をアセトン（和光社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗コンドロイチン硫酸抗体（クローン CS-56、マウスモノクローナル抗体、生化学工業社製）を添加し、室温で１時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質（ニチレイバイオサイエンス社製）を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン（武藤化学社製）により核染色を行い、光学顕微鏡（ライカ社製）下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
【０１７９】
その結果、UUO施術腎において、コンドロイチナーゼ群、C6ST siRNA治療群では対照群に比べて腎皮質及び髄質におけるコンドロイチン硫酸（CS56）の発現が抑制されていた。このことからコンドロイチナーゼもしくはC6ST  siRNAを投与しコンドロイチン硫酸を分解もしくはC6STの発現を抑制する事により、コンドロイチン硫酸の蓄積を抑制しうる事が認められた(図2、原図はカラー）。
【０１８０】
実施例4  ：  マウス腎線維化モデルにおけるコンドロイチナーゼ、C6ST (Chondroitin 6-sulfotransferase-1)siRNAの治療効果；組織像
得られた切片をアセトン（和光社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗F4/80抗体（クローンA3-1、ラットモノクローナル抗体、2μg/ml：CALTAG LABORATORIES社製）、抗ER-TR7抗体（ラットモノクローナル抗体、1μg/ml、BMA社製）、 抗タイプIVコラーゲン抗体、抗ヒト平滑筋線維アクチン抗体（αSMA : マウスモノクローナル抗体、1:100、DACO社製 ）を添加し、室温で１時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG（1：200希釈；抗F4/80抗体、抗ER-TR7抗体に対して使用）ペルオキシダーゼ標識抗ラビットIgG（1：200希釈；タイプIVコラーゲン抗体に対して使用）、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイバイオサイエンス社製、抗ヒト平滑筋線維アクチン抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質（ニチレイバイオサイエンス社製）を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン（武藤化学社製）により核染色を行い、光学顕微鏡（ライカ社製）下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
【０１８１】
その結果、UUO施術腎において、コンドロイチナーゼ群、C6ST siRNA治療群では対照群に比べて腎皮質及び髄質におけるマクロファージ（F4/80陽性細胞）や細網線維/線維芽細胞（ER-TR7陽性細胞）、筋線維芽細胞（αSMA陽性細胞）の浸潤が少なかった。また対照群においては腎小体内へのマクロファージの浸潤が高頻度に見られたが、コンドロイチナーゼ群及びC6ST siRNA群では浸潤が抑制されていた。また、糸球体周囲のタイプIVコラーゲンの蓄積も抑制されているのが観察された（図3、原図はカラー）。
【０１８２】
さらに炎症性細胞の浸潤、線維化を定量化するため、UUO施術腎におけるF4/80、ER-TR7陽性細胞をカウントした。それぞれの標本を顕微鏡下で400倍にて10視野観察し、陽性細胞数をカウントし対照群とC6ST siRNA治療群とを比較した。その結果、UUO施術腎において対照群と比較し治療群ではF4/80、ER-TR7ともに陽性率が有意に低下した（p＜0.01〜0.001）。またタイプIVコラーゲンの蓄積を定量化するため、糸球体周囲に茶色のシグナルで可視化されたコラーゲンの厚みを測定した。それぞれの標本を糸球体15〜20個において糸球体周囲で最も肥厚している部分の厚みをモニター上でノギスを用いて計測した。その結果、コンドロイチナーゼ群、C6ST siRNA群では対照群に比べて、糸球体周囲のコラーゲンの沈着が有意に抑制されていた（p＜0.001）（図4）。
【０１８３】
このことからコンドロイチナーゼもしくはC6ST  siRNAを投与しコンドロイチン硫酸を分解もしくはC6STの発現を抑制しコンドロイチン硫酸の蓄積および過剰発現を抑制することにより、炎症性細胞の浸潤、線維化を抑制しうる事が認められた。
【０１８４】
実験2  ：  streptozotocin誘発性C57BL/6JcL 2型糖尿病(NIDDM)モデルマウスによるC4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1) siRNA 処置における体重、血糖値の変動、C4ST-1遺伝子発現、組織レベルの評価、検討
実施例5  ：  streptozotocin誘発性C57BL/6JcL 2型糖尿病(NIDDM)モデルの作成、臨床像
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させ、出生後2日齢C57BL/6JcLマウスにstreptozotocin（STZ：シグマ社製）を投与し、STZ誘発糖尿病モデルを作成した。マウスにSTZ (10 mg/ml) 20μlを皮下に注射し、これを2日間で計3回行い、合計60μl投与した。これを4週齢まで親マウスと共に通常餌で飼育し、満4週齢で離乳させた後よりhigh fat diet（日本クレア社製）を給餌し、２週間飼育させた。2週間目にC4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1) siRNA 1μg（GeneWorld社製）をsiRNA媒体である0.1 % Atelocollagen（高研社製）と混合させたものを1回/1週間 200 μL 腹腔内投与(1shot/1週間)の2回（2週間）処置を行った。実験14日目に解剖し、肝臓、膵臓、腎臓、精巣、卵巣、筋肉を摘出し、免疫染色用サンプル、遺伝子発現解析用サンプルを得た。体重変動に関しては、実施例期間中、14日間、経時的に測定を行ったところ、対照群と比較してC4ST-1 siRNA処置群において処置12日目以降、体重増加が抑えられる傾向を示した。解剖前日にInsulin-tolerance testとしてHuman crystalline insulin (0.75 U/kg;MP Biomedicals社製)を腹腔内投与処置し、０分後、15分後、60分後の血糖値をグルテストエース血糖値測定器（ボンビックス薬品社製）を用い測定し評価を実施した。対照群と比較してC4ST-1 siRNA処置群において投与後、0分後、15分後においては有意な血糖値の減少は認められなかったが、60分後においてC4ST-1 siRNA処置群で有意な血糖値の減少が認められた（p＜0.01）。
【０１８５】
実施例6  ：  streptozotocin誘発性C57BL/6JcL 2型糖尿病(NIDDM)モデルにおけるC4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1) siRNA処置におけるC4ST-4遺伝子発現レベルの評価、検討
Streptozotocin誘発性C57BL/6JcLマウス、雌より摘出した臓器（腎臓）50 mg当たりに対し、RNA-Bee (TEL-TEST社製) 1mLを加え、電動ホモジナイザー（DIGITAL HOMOGENIZER、ASONE社製）にて粉砕させた後、chloroform 200μL(Sigma Aldrich Japan社製) を加え穏やかに混合後、約5分氷冷し、12,000rpm、4℃、15分間  遠心分離機（Centrifuge 5417R、eppendorf社製）を用い遠心分離を行った。遠心分離後の上澄み液500μLを別のエッペンドルフチューブに移し、上澄み液と同等量のisopropannol 500μL(Sigma Aldrich Japan社製)を加え混合後、1μLのglycogen(Invitrogen社製)を加え、15分間氷冷した。氷冷15分後、12,000 rpm、4℃、15分間遠心し、その後、75 % Ethanol 1000μL(Sigma Aldrich Japan社製)で3回洗浄して得られたRNA沈殿物を30分間〜1時間、自然乾燥させた後、大塚蒸留水50μL(大塚製薬社製)に溶解させ、さらに大塚蒸留水(大塚製薬社製)にて100倍希釈し、UVプレート（コーニングコースター製）上でプレートリーダー(POWER Wave XS、BIO-TEK社製)により抽出したサンプル中のRNA濃度を算出した。
【０１８６】
次に、RT reaction(cDNA合成)を行うため以下の手技を行った。算出して得られたRNAサンプルを500 ng/20μLの濃度に調整し、68℃、3分間、BLOCK INCUBATOR(ASTEC製)にて加温し、10分間、氷冷した。氷冷後、予め調製していたRT Pre Mix 液（組成：25 mM MgCl218.64μL（Invitrogen社製）、5×Buffer 20μL（Invitrogen社製）、0.1 M DTT 6.6μL（Invitrogen社製）、10 mM dNTP mix 10μL（Invitrogen社製）、RNase Inhibitor 2μL（Invitrogen社製）、MMLV Reverse transcriptase 1.2μL（Invitrogen社製）、Random primer 2μL（Invitrogen社製）、滅菌蒸留水19.56μL（大塚蒸留水：大塚製薬社製）を80μL加えBLOCK INCUBATOR(ASTEC社製)にて42℃、1時間、加温反応させ、1時間後、BLOCK INCUBATOR(ASTEC社製)にて99℃、5分間、加熱した後、氷冷し求めるcDNA 100μLを作製し、合成して得られたcDNAを用いて、以下の組成でPCR反応を行った。
【０１８７】
PCR Buffer 2μL [組成：166 mM (NH4)2SO4 (Sigma Aldrich Japan社製)、
670 mM Tris pH8.8(Invitrogen社製)、67 mM MgCl2・6H2O(Sigma Aldrich Japan社製)、100 mM 2-mercaptoethanol)(WAKO社製)]、25 mM dNTP mix 0.8μL(Invitrogen社製)、DMSO 0.6μL(Sigma Aldrich Japan社製)、Primer Forward 0.2μL(GeneWorld社製)、Primer Reverse 0.2μL(GeneWorld社製)、大塚蒸留水 15.7μL(大塚製薬社製)、Taq polymerase 0.1μL(Perkin Elmer社製)、2.より得られたcDNA 1μL を混合させAuthorized Themal Cycler(eppendorf社製)により94℃ 45 second、56℃  45 sec、 72℃  60 second  35cycle 反応させた。反応終了後、得られたPCR産物に2μL Loading Dye(Invitrogen社製)を加え、1.5 % UltraPure Agarose(Invitrogen社製)ゲルを作製し、Mupid-2 plus(ADVANCE社製)により100V、20分間 電気泳動を行った。泳動後、1×LoTE[組成：3mM Tris-HCl(pH7.5) (Invitrogen社製)、 0.2mM EDTA(pH7.5) (Sigma Aldrich Japan社製)]にて10000倍希釈Ethydium Bromide（Invitrogen社製）染色液中で20分間〜30分間 振とうさせた後、I-Scope WD(ADVANCE社製)に設置したEXILIM(CASIO社製)にてゲル撮影し遺伝子発現の確認を行った。
【０１８８】
今回、用いたC4ST-1 siRNA、Primer (Forward、Reverse) (GeneWorld社製)を以下に示す。
[Primer配列]
*GAPDH(GeneWorld社製)
Forward : 5’-CTGCCAAGTATGACATCA -3’ （配列番号：６７）
Reverse : 5’-TACTCCTTGGAGGCCATGTAG -3’ （配列番号：６８）
*C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)
Forward : 5’-gtggatgaggaccacgaact-3’ （配列番号：８０）
Reverse : 5’-cttttcaagcggtggttgat-3’ （配列番号：８１）
[C4ST-1 siRNAカクテル配列]
*C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)
(GenBank accession number NM_021439)
5’-ACAAAGCCATGAAGCCGGCGCTGCTGGAAGTGATGAGGATGAACAGAATT-3’ （配列番号：８２） 
5’-CAACCTGAAGACCCTTAACCAGTACA-3’ （配列番号：８３）
5’-GCATCCCAGAGATCAACCACCGCTTG-3’ （配列番号：８４）
【０１８９】
RT-PCRによりPositive controlであるGAPDHの発現が正常群、対照群、C4ST-1  siRNA治療群において各々認められ、対照群と比較しC4ST-1  siRNA治療群ではC4ST-1発現減少が認められ、Atellocollagen媒体C4ST-1 siRNA投与によりC4ST-1遺伝子のノックダウンが確認された（図5）。
【０１９０】
実施例  7  ：  Streptozotocin誘発性 C57BL/6JcL 2型糖尿病（NIDDM）モデルマウスによるC4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1) siRNA、処置における免疫染色(CS56)による腎臓組織レベルの評価、検討
得られた組織サンプル切片をCS56(コンドロイチン硫酸プロテオグリカン自体を染色する抗体)を用いて染色を行い、組織レベルの発現を評価、検討した。図６より、CS56(コンドロイチン硫酸プロテオグリカン自体を染色する抗体)で染色した結果、対照群ではコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CS56）の沈着が強く認められているのに対し、C4ST-1 siRNA処置群ではコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CS56）の沈着が抑えられていることが観察された（図6、原図はカラー）。
【０１９１】
実施例8  ：  streptozotocin誘発性C57BL/6JcL 2型糖尿病(NIDDM)モデルにおけるC4ST-1 (Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1) siRNAの治療効果；組織像
得られた組織サンプル切片をアセトン（和光社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗F4/80抗体（クローンA3-1、ラットモノクローナル抗体、2μg/ml：CALTAG LABORATORIES社製）、抗ER-TR7抗体（ラットモノクローナル抗体、1μg/ml、BMA社製）抗タイプIVコラーゲン抗体、抗ヒト平滑筋線維アクチン抗体（αSMA : マウスモノクローナル抗体、1:100、DACO社製 ）を添加し、室温で１時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG（1：200希釈；抗F4/80抗体、抗ER-TR7抗体に対して使用）ペルオキシダーゼ標識抗ラビットIgG（1：200希釈；抗タイプIVコラーゲン抗体に対して使用）、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイバイオサイエンス社製、抗ヒト平滑筋線維アクチン抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質（ニチレイバイオサイエンス社製）を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン（武藤化学社製）により核染色を行い、光学顕微鏡（ライカ社製）下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
【０１９２】
その結果、C4ST-1 siRNA治療群では対照群に比べて腎皮質及び髄質におけるマクロファージ（F4/80陽性細胞）や細網線維/線維芽細胞（ER-TR7陽性細胞）の浸潤が少なかった（図7、原図はカラー）。
【０１９３】
また炎症性細胞の浸潤、線維化を定量化するため、F4/80、ER-TR7陽性細胞をカウントした。それぞれの標本を顕微鏡下で400倍にて10視野観察し、陽性細胞数をカウントし対照群とC4ST-1 siRNA投与群とを比較した。その結果、対照群と比較しC4ST-1 siRNA治療群ではF4/80、ER-TR7ともに陽性率が有意に低下した（p＜0.001 ）。さらにタイプIVコラーゲンの蓄積を定量化するため、糸球体周囲に茶色のシグナルで可視化されたコラーゲンの厚みを測定した。それぞれの標本を糸球体15〜20個において糸球体周囲で最も肥厚している部分の厚みをモニター上でノギスを用いて計測した。その結果、コントロール群、C4ST-1 siRNA投与群共に、正常群と同程度の蓄積を示し、今回使用したモデルマウスにおいては、タイプIVコラーゲンの蓄積は病態に関与しないと考えられた（図8）。
【０１９４】
このことからC4ST-1 siRNAを投与しC4ST-1の発現を抑制しコンドロイチン硫酸の過剰発現を抑制することにより、炎症性細胞の浸潤、線維化を抑制しうる事が認められた。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】片腎尿管結紮術（UUO）による腎線維化モデルマウスにおける対照群、C6ST siRNA治療群におけるRT-PCRによるGAPDH(図1A)、C6ST(図1B)の発現を検討したもので、C6ST siRNA治療群でC6STの発現が抑制されていることを示す写真である。
【図２】片腎尿管結紮術（UUO）による腎線維化モデルマウスにおける対照群、C6ST siRNA治療群におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の検出結果で、コンドロイチナーゼ治療群、C6ST siRNA治療群での現象効果を示す写真である。倍率400倍。
【図３−１】片腎尿管結紮術（UUO）による腎線維化モデルマウスにおける対照群、C6ST siRNA治療群におけるER-TR7陽性細胞で表された線維芽細胞の浸潤を示す写真である。コンドロイチナーゼ治療群、C6ST siRNA治療群において線維芽細胞の浸潤が糸球体内、間質共に抑制されている。倍率400倍。
【図３−２】片腎尿管結紮術（UUO）による腎線維化モデルマウスにおける対照群、C6ST siRNA治療群におけるF4/80陽性細胞で表された炎症性細胞（マクロファージ）の浸潤を示す写真である。コンドロイチナーゼ治療群、C6ST siRNA治療群において炎症性細胞の浸潤が抑制されている。倍率400倍。
【図３−３】片腎尿管結紮術（UUO）による腎線維化モデルマウスにおける対照群、C6ST siRNA治療群におけるタイプIVコラーゲンの蓄積を示す写真である。コンドロイチナーゼ治療群、C6ST siRNA治療群において糸球体周囲、間質におけるタイプIVコラーゲンの蓄積が抑制されている。倍率400倍。
【図３−４】片腎尿管結紮術（UUO）による腎線維化モデルマウスにおける対照群、C6ST siRNA治療群におけるαSMA陽性細胞で表された筋線維芽細胞の浸潤を示す写真である。コンドロイチナーゼ治療群、C6ST siRNA治療群において筋線維芽細胞の浸潤が抑制されている。倍率400倍。
【図４】片腎尿管結紮術（UUO）による腎線維化モデルマウスにおける対照群、C6ST siRNA治療群におけるER-TR7陽性細胞（上段）、F4/80陽性細胞（中段）、タイプIVコラーゲンの蓄積（下段）を数値化したグラフである。**p＜0.01、***p＜0.001（t-検定）
【図５】Streptozotocinによって誘導された2型糖尿病（NIDDM）モデルマウスにおける対照群、C4ST-1 siRNA処置群におけるRT-PCRによるGAPDH（図5A）、C4ST-1（図5B）の発現を検討したもので、C4ST-1 siRNA治療群でC4STの発現が抑制されていることを示す写真である。
【図６】Streptozotocinによって誘導された2型糖尿病（NIDDM）モデルマウスにおける対照群、C4ST-1 siRNA処置群におけるコンドロイチン硫酸プロテイグリカン(CSPG)の検出結果で、C4ST-1 siRNA処置群でのコンドロイチン硫酸プロテイグリカン(CSPG)の減少効果を示す写真である。倍率400倍。
【図７−１】Streptozotocinによって誘導された2型糖尿病（NIDDM）モデルマウスにおける対照群、C4ST-1 siRNA処置群におけるER-TR7陽性細胞で表された線維芽細胞の浸潤を示す写真である。C4ST-1 siRNA治療群において線維芽細胞の浸潤が抑制されている。倍率400倍。
【図７−２】Streptozotocinによって誘導された2型糖尿病（NIDDM）モデルマウスにおける対照群、C4ST-1 siRNA処置群におけるF4/80陽性細胞で表された炎症性細胞（マクロファージ）の浸潤を示す写真である。C4ST-1 siRNA治療群において炎症性細胞の浸潤が抑制されている。倍率400倍。
【図７−３】Streptozotocinによって誘導された2型糖尿病（NIDDM）モデルマウスにおける対照群、C4ST-1 siRNA処置群におけるタイプIVコラーゲンの蓄積を示す写真である。C4ST-1 siRNA治療群において差異は認められない。倍率400倍。
【図７−４】Streptozotocinによって誘導された2型糖尿病（NIDDM）モデルマウスにおける対照群、C4ST-1 siRNA処置群におけるαSMA陽性細胞で表された筋線維芽細胞の浸潤を示す写真である。C4ST-1 siRNA治療群において筋線維芽細胞の浸潤が抑制されている。倍率400倍。
【図８】Streptozotocinによって誘導された2型糖尿病（NIDDM）モデルマウスにおける対照群、C4ST-1 siRNA処置群におけるER-TR7陽性細胞（上段）、F4/80陽性細胞（中段）、タイプIVコラーゲンの蓄積（下段）を数値化したグラフである。***p＜0.001（t-検定）
【図４】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【配列表】
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