(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分類学上、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに分類される橈脚類由来の蛍光性タンパク質であって、
該蛍光性タンパク質の完全長アミノ酸配列は、
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SHCMGYGFYH   60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP  120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE  180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM  219
（配列番号：１に記載のアミノ酸配列）であり、
該蛍光性タンパク質は、哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系、ならびに、大腸菌において、翻訳後、形成される蛍光団に起因する蛍光性を示す蛍光性タンパク質として組換え発現可能である
ことを特徴とする蛍光性タンパク質。
【請求項２】
Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに分類される橈脚類由来の蛍光性タンパク質をコードする遺伝子であって、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでなる遺伝子。
【請求項３】
前記配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は、
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG   48
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC   96
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC  144
CTG CTG TCC CAC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC  192
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT  240
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG  288
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC  336
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC  384
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC  432
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC  480
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT  528
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA  576
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC  624
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG                  660
（配列番号：２に記載の塩基配列）である
ことを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコードする、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに分類される橈脚類由来の蛍光性タンパク質のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡであり、
該ｃＤＮＡの塩基配列は、
AGAACACTCA GTGTATCCAG TTTTCCGTCC TACTACAAAC                       40
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG   88
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC  136
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC  184
CTG CTG TCC CAC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC  232
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT  280
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG  328
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC  376
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC  424
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC  472
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC  520
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT  568
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA  616
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC  664
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG                  700
AATGTGGAAC GAAACCTTTT TTTCTGATTA CTTTCTCTGT TGACTCCACA           750
TTCGGAACTT GTATAAATAA GTTCAGTTTA AA                              782
（配列番号：３に記載の塩基配列）である
ことを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコードする、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに分類される橈脚類由来の蛍光性タンパク質のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを挿入してなるプラスミド・ベクターであって、
該ｃＤＮＡの塩基配列は、
AGAACACTCA GTGTATCCAG TTTTCCGTCC TACTACAAAC                       40
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG   88
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC  136
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC  184
CTG CTG TCC CAC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC  232
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT  280
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG  328
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC  376
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC  424
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC  472
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC  520
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT  568
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA  616
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC  664
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG                  700
AATGTGGAAC GAAACCTTTT TTTCTGATTA CTTTCTCTGT TGACTCCACA           750
TTCGGAACTT GTATAAATAA GTTCAGTTTA AA                              782
（配列番号：３に記載の塩基配列）である
ことを特徴とするプラスミド・ベクター  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ−ＮＦＰ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６８１）。
【請求項６】
哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を完全長アミノ酸配列とする、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに分類される橈脚類由来の蛍光性タンパク質を前記哺乳動物細胞中で組換え発現させ、翻訳後、形成される蛍光団に起因する蛍光性を示す、組換え発現型蛍光性タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用することを目的とする、該配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードする塩基配列としての、配列番号：２に記載の塩基配列を有するＤＮＡの使用。
【請求項７】
前記哺乳動物細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養可能なヒト由来細胞系である
ことを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡの使用。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞は、ヒト由来のＨｅＬａ細胞である
ことを特徴とする、請求項６または７に記載のＤＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛍光性タンパク質とそれをコードする遺伝子に関する。具体的には、本発明は、新規に発見された発光能を示す海洋プランクトンに由来する、新規な蛍光性タンパク質と、かかる蛍光性タンパク質の組換え発現に利用可能なコード遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラゲのアエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｒｏｅｓｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、あるいは、その改変体タンパク質は、異種細胞内、特には、各種の哺乳動物細胞内において、組換え発現可能であり、また、得られる組換えタンパク質は、宿主細胞内において、蛍光特性を示す。この特徴を利用して、生化学、細胞生理学、医学分野において、動物細胞内で発現可能な、ｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰならびにその相同体は、種々の対象、用途へ利用が図られている（文献１：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｊ．  Ｇ．Ｈ．  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．３００，  ８７−９１  （２００３）；  文献２：Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．Ｙ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ｖｏｌ．６７，  ５０９−５４４  （１９９８）を参照）。【０００３】
加えて、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ以外にも、刺胞動物門（Ｃｎｄａｒｉａ）のヒドロ虫類（ｃｌａｓｓ  Ｈｙｄｒｏｚｏａ）からＧＦＰ様タンパク質のクローニングされており、更には、刺胞動物門（Ｃｎｄａｒｉａ）の花虫類（ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ）からも、ＧＦＰ様タンパク質のクローニングされている。これら刺胞動物門（Ｃｎｄａｒｉａ）の花虫類（ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ）で発見されているＧＦＰ様タンパク質に関して、生物進化的には、共通する起源を有する、蛍光性タンパク質ファミリーを構成するであろうことが報告されている（文献３：Ｙ．Ａ．  Ｌａｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ｖｏｌ．９９，  ４２５６−４２６１  （２００２）を参照）。【０００４】
Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰに関しては、その蛍光特性の発揮に必要な機構の研究が進んでいる。まず、翻訳されたＧＦＰポリペプチドは、天然の立体構造へとフォールディングされる際、その蛍光団を形成する内部トリペプチド部位の環化と、その後の酸化を経て、蛍光特性を有する成熟型ＧＦＰとなることが解明された。更には、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の野生型ＧＦＰの推定アミノ酸配列（ｄｅｄｕｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中、６５番〜６７番目のＳＹＧが、蛍光団を形成する内部トリペプチド部位であることも確認されている。例えば、６６番目のＴｙｒをＨｉｓへと変異を施した、Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰでは、その蛍光は、野生型ＧＦＰの緑色蛍光に対して、ブルー・シフトを起こし、極大波長４４８ｎｍの青色蛍光を示すことが報告されている。さらに、６５番目のＳｅｒをＴｈｒへと変異を施した、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰでは、その蛍光の極大波長は５１０ｎｍとなり、野生型ＧＦＰの緑色蛍光に対して若干レッド・シフトを示す。また、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰでは、内部トリペプチド：ＴＹＧ部位の環化と、その後の酸化による蛍光団の形成は、野生型ＧＦＰのＳＹＧよりも有意に速やかに進行することも報告されている。【０００５】
前記６５番〜６７番目のＳＹＧ部位への変異導入以外に、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の野生型ＧＦＰ中、２０３番目のＴｈｒを、Ｈｉｓ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒへと置換する、Ｔ２０３Ｈ，Ｔ２０３Ｆ，Ｔ２０３Ｙの変異導入を施すと、蛍光の極大波長は５３０ｎｍ程度と顕著なレッド・シフトを生じ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ：Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｒｏｅｓｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）となることも報告されている。また、６５番〜６７番目のＳＹＧ部位に隣接する６４番目のＰｈｅをＬｅｕへと置換する、Ｆ６４Ｌの変異導入が施されたＥＧＦＰ（“ｅｎｈａｎｃｅｄ”  ＧＦＰ）では、野生型ＧＦＰと比較し、蛍光団の形成を伴う成熟化過程が格段に向上されることが報告されている（文献４：Ｂ．Ｐ．  Ｃｏｒｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ｖｏｌ．１７３，  ３３−３８  （１９９６）を参照）。【０００６】
このように、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰを始めとし、刺胞動物門（Ｃｎｄａｒｉａ）に属する各種海洋動物由来のＧＦＰ様タンパク質に関しては、動物細胞内で発現可能な、ｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用する試みが多数行われている。一方、海洋生物、特に、動物性プランクトン類には、バイオルミネッセンスを示すものが多数存在することが知られている。従って、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰの属する蛍光性タンパク質ファミリーとは、生物進化的には、異なる起源を有する、別種のタンパク質ファミリーを構成する、新規な蛍光性タンパク質の存在も期待される。すなわち、宿主動物細胞内で発現可能な、ｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用可能な、新規な蛍光性タンパク質ファミリーの探索が待望されている。
【発明の開示】
【０００７】
蛍光性タンパク質を、宿主細胞内で発現可能な、ｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用する際、その蛍光を観測するためには、宿主細胞外より光励起を行う。この光励起に利用される波長は、該蛍光性タンパク質の示す蛍光波長より、短波長側（高エネルギー側）に位置する光吸収帯に選択される。蛍光性タンパク質から得られる蛍光強度は、励起波長における、モル吸収係数ε（ｃｍ−１・Ｍ−１）と蛍光量子収率ηとの積に依存している。実際には、蛍光性タンパク質から得られる蛍光強度をモニターしつつ、励起スペクトルを測定し、その極大ピーク波長を決定する。例えば、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰの励起スペクトルでは、３９６ｎｍの主ピーク、４７５ｎｍに副ピークを示す。一方、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰを改変したＹＦＰの励起スペクトルでは、極大ピークが５２０ｎｍ程度に示される。
【０００８】
宿主細胞内において、二種のｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質を利用する際には、このように蛍光波長ならびに励起波長が相違する、二種の蛍光性タンパク質が必要である。その観点から、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰなどの緑色蛍光を発する蛍光性タンパク質と併用する際、弁別可能な蛍光を発する、新規な蛍光性タンパク質の提供が望まれている。具体的には、蛍光の極大波長が、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰなどが示す緑色蛍光の極大波長よりも長波長側に見出され、かつ、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰの属する、蛍光性ＧＦＰ様タンパク質ファミリーとは、生物進化的に異なる起源を有する、新規な蛍光性タンパク質の提供が望まれている。
【０００９】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、刺胞動物門（Ｃｎｄａｒｉａ）と異なる門（ｐｈｙｌｕｍ）に属する動物性プランクトンに由来し、少なくとも、蛍光の極大波長が５１０ｎｍより長波長側に存在し、黄色蛍光または黄緑色蛍光を示す、異種細胞内で組換え発現可能な、新規な蛍光性タンパク質、ならびに、それをコードする遺伝子を提供することにある。
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、海洋に棲息する動物性プランクトンより、黄色または緑黄色域の発光・蛍光を示す、発光プランクトンを探索した。具体的には、日本海、富山湾沖で採取された海洋深層水中に存在する、動物性プランクトンの分類を進める過程で、数多くの発光プランクトンが見出された。更に、これら発光プランクトンのうち、分類学的に刺胞動物門（Ｃｎｄａｒｉａ）と異なる門（ｐｈｙｌｕｍ）に属する動物性プランクトンであって、体内に黄色蛍光または黄緑色蛍光を示すタンパク質を発現しているものを選別した。その選別過程において、甲殻類のプランクトンのうち、白色光照射下において、目視観察すると赤色に見える、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ（赤色の橈脚類）の一種が、紫外光照射下において、高い輝度の黄緑色蛍光を発していることを見出した。
【００１０】
本発明者らは、この選別過程で見出された、黄緑色蛍光性タンパク質を発現しているＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ（赤色の橈脚類）の分類を試み、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ  ｐｈｙｌｕｍ）、大顎類（Ｍａｎｄｉｂｕｌａｔａ  ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ）、甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ  ｃｌａｓｓ）、橈脚類（カイアシ類：Ｃｏｐｒｐｏｄａ  ｓｕｂｃｌａｓｓ）に属し、Ａｅｔｉｄｅｉｄａｅ科、Ｂｒａｄｙｉｄｉｕｓ属の形態的特徴と合致することが判明した。なお、既に報告されている種か否かは、現段階では、確定できていない。その後、さらに詳細な比較に基づく分類学上の同定を進めた結果、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに属するとの結論に達した。
【００１１】
引き続き、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の黄緑色蛍光性タンパク質について、それをコードする遺伝子の塩基配列の特定と、推定アミノ酸配列の決定を試みた。先ず、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａから、全ＲＮＡを抽出し、含まれるｍＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用い、定法に従って、対応するｃＤＮＡを合成した。
【００１２】
本発明者らは、従来、報告されているＡ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰの属する蛍光性ＧＦＰ様タンパク質ファミリーでは、多くの場合、採取されたｃＤＮＡから大腸菌でペプチド鎖への翻訳、さらに、翻訳されたペプチド鎖の畳み込みと発光団の形成がなされ、成熟型の蛍光性タンパク質として発現されていることを考慮し、合成したｃＤＮＡを汎用のクローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ中に挿入して、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、大腸菌において、ｃＤＮＡからのタンパク質発現の有無を検討した。その際、目的とする黄緑色蛍光性タンパク質の発現がなされる際には、近紫外光（波長範囲３３０ｎｍ〜４００ｎｍ）や、紫・藍色〜青緑色（波長範囲４００ｎｍ〜５００ｎｍ）の光照射下において、黄緑色蛍光が観察されるはずであり、黄緑色蛍光の有無を選別基準としてスクリーニングを行った。その結果、明確に黄緑色蛍光が観察されるコロニーが、一コロニー選別され、引き続き、選別されたコロニーについて、二次スクリーングを行い、クローンの単離を行った。単離されたクローンのベクター中に挿入さている、ｃＤＮＡ断片の塩基配列解析を行い、目的とするＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の黄緑色蛍光性タンパク質の完全長アミノ酸配列、それをコードする遺伝子の塩基配列を解明した。さらに、本発明者らは、このＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の黄緑色蛍光性タンパク質の完全長アミノ酸配列と、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰの完全長アミノ酸配列との対比を行い、配列の類似性は低く、蛍光性ＧＦＰ様タンパク質ファミリーとは、生物進化的に異なる起源を有する、新規な蛍光性タンパク質であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明にかかる橈脚類由来の蛍光性タンパク質は、
分類学上、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに分類される橈脚類由来の蛍光性タンパク質であって、
該蛍光性タンパク質の完全長アミノ酸配列は、
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG
RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SHCMGYGFYH   60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE
DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP  120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS
SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE  180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ
VFNSAPRDM  219
（配列番号：１に記載のアミノ酸配列）であることを特徴とする蛍光性タンパク質である。
【００１４】
また、本発明にかかる橈脚類由来の蛍光性タンパク質をコードする遺伝子は、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでなる遺伝子である。例えば、前記配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は、
ATG ACA ACC
TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG   48
GAG AAG TTC
GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC   96
GAG ATT GAG
ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC  144
CTG CTG TCC
CAC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC  192
CCA AAG GGG
ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT  240
TAC ACC AAC
ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG  288
GTC AAC TTC
CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC  336
GAG TGC ATT
GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC  384
ACG ATC GTG
AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC  432
GGG AAC ATC
ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC  480
GGC TCT TTC
TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT  528
CCA ATC CAC
GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA  576
CGT GTC GAG
GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC  624
CAG CAG GTT TTC
AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG  660
（配列番号：２に記載の塩基配列）であることを特徴とする遺伝子であってもよい。
【００１５】
また、本発明にかかる橈脚類由来の蛍光性タンパク質をコードする遺伝子は、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列のコード領域に含む、該橈脚類由来の蛍光性タンパク質のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡであり、該ｃＤＮＡの塩基配列は、
AGAACACTCA GTGTATCCAG TTTTCCGTCC
TACTACAAAC  40
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG
ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG   88
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA
GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC  136
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA
CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC  184
CTG CTG TCC CAC TGC ATG GGT TAC GGG
TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC  232
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT
CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT  280
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT
GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG  328
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC
AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC  376
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT
CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC  424
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG
GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC  472
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT
AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC  520
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG
AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT  568
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG
GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA  616
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG
AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC  664
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA
GAC ATG TAG  700
AATGTGGAAC GAAACCTTTT TTTCTGATTA
CTTTCTCTGT TGACTCCACA  750
TTCGGAACTT GTATAAATAA GTTCAGTTTA
AA  782
（配列番号：３に記載の塩基配列）であることを特徴とする遺伝子であってもよい。
【００１６】
加えて、本発明は、前記該橈脚類由来のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを保持するプラスミド・ベクターの発明をも提供し、
すなわち、本発明にかかるプラスミド・ベクターは、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列のコード領域に含む、該橈脚類由来の蛍光性タンパク質のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを挿入してなるプラスミド・ベクターであって、
該ｃＤＮＡの塩基配列は、
AGAACACTCA GTGTATCCAG TTTTCCGTCC
TACTACAAAC  40
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG
ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG   88
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA
GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC  136
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA
CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC  184
CTG CTG TCC CAC TGC ATG GGT TAC GGG
TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC  232
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT
CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT  280
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT
GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG  328
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC
AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC  376
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT
CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC  424
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG
GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC  472
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT
AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC  520
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG
AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT  568
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG
GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA  616
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG
AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC  664
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA
GAC ATG TAG  700
AATGTGGAAC GAAACCTTTT TTTCTGATTA
CTTTCTCTGT TGACTCCACA  750
TTCGGAACTT GTATAAATAA GTTCAGTTTA
AA  782
（配列番号：３に記載の塩基配列）であるプラスミド・ベクター  ｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ−ＮＦＰ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６８１）である。
【００１７】
さらに、本発明は、本発明にかかる橈脚類由来の蛍光性タンパク質をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、該橈脚類由来の蛍光性タンパク質の組換え発現に利用する用途の発明をも提供し、
すなわち、本発明にかかる配列番号：２に記載の塩基配列を有するＤＮＡの使用は、
哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を完全長アミノ酸配列とする橈脚類由来の蛍光性タンパク質を前記哺乳動物細胞中で組換え発現させ、ｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用することを目的とする、該配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードする塩基配列としての、配列番号：２に記載の塩基配列を有するＤＮＡの使用である。例えば、前記哺乳動物細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養可能なヒト由来細胞系であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１（ａ）は、本発明の蛍光性タンパク質の起源である、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ（赤色の橈脚類）の、白色光照射下において顕微鏡観察される、外形を示し、図１（ｂ）は、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）の照射下に、蛍光顕微鏡観察される、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａの体内器官中の、黄緑色蛍光を発する領域を示す。
【図２】図２は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質をコードする遺伝子（６７３ｂｐ）を、市販のプラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）中に挿入してなる、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰの構成を説明する図である。
【図３】図３は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質をコードする遺伝子（６８８ｂｐ）を、市販のＧＳＴタグ付き融合型タンパク質発現用プラスミド・ベクター：ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）中に挿入し、エンドペプチターゼＦａｃｔｏｒ  Ｘａによる切断部位を具えたリンカー配列を介して、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質を融合パートナーのグルタチオン・Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末に連結したＧＳＴ−ｔａｇｇｅｄ  蛍光性タンパク質の発現用ベクター：ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＮＦＰの構成を示す。
【図４】図４は、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ−ＮＦＰにより形質転換した大腸菌における、可溶性画分（細胞質成分）ならびに不溶性画分（膜成分）にそれぞれ含まれるタンパク質に関する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示し、形質転換大腸菌の可溶性画分（細胞質成分）中に見出される、分子量２５ｋＤａの新たなバンドを示す。
【図５】図５は、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを保持する形質転換大腸菌を大量培養し、可溶性画分（細胞質成分）から、アニオン交換カラム：ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）と、ゲル濾過：ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）により精製、回収した蛍光性タンパク質組換え体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す。
【図６】図６は、図５に示す精製純度を有する、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質溶液サンプルの、白色光照射下の目視結果と、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）照射下において、黄緑色蛍光を示す観察結果を示す。
【図７】図７は、図５に示す精製純度を有する、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質溶液サンプルについて、波長５００ｎｍで蛍光強度をモニターしつつ測定した、励起スペクトルと、波長５０８ｎｍで励起しつつ測定した、蛍光スペクトルの測定結果を示す。
【図８】図８は、ＧＳＴタグ付き蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＮＦＰにより形質転換した大腸菌（中央）、陰性対照の宿主大腸菌（左上）、ならびに、クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ中にＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入されている単離クローン（陽性対照；右上）を、それぞれ培地上で培養し、各コロニーをＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）照射下、観察した結果を示す。
【図９】図９は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質と、ＥＶＲΩＧＥＮ社から公表されている、Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質のアミノ酸配列との対比を示す。
【図１０】図１０は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体の精製過程を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図１１】図１１は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体を、各種温度において、インキュベーション処理を施した後、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性（波長  ５１７ｎｍで測定した蛍光強度）の、処理温度に対する安定性を示す。
【図１２】図１２は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体を、各種試薬（薬剤）の存在下において、インキュベーション処理を施した後、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性（波長  ５１７ｎｍで測定した蛍光強度）の、各種薬剤の作用に対する安定性を示す。
【図１３】図１３は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体を、各種緩衝液中のｐＨにおいて、インキュベーション処理を施した後、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性（波長  ５１７ｎｍで測定した蛍光強度）の、処理中のｐＨに対する安定性を示す。
【図１４】図１４は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体を、各種緩衝液中のｐＨにおいて、インキュベーション処理を施した後、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性（励起波長  ５０７ｎｍでの励起下に測定した蛍光スペクトル）の、処理中のｐＨに対する安定性を示す。
【図１５】図１５は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体のＨｅＬａ細胞内での組換え発現に利用した、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質のコード遺伝子（６６０ｂｐ）を、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）のクローニング・サイト中に挿入してなる、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の発現ベクターの構成を説明する図である。
【図１６】図１６は、前記図１５に示す該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の発現ベクターをＨｅＬａ細胞内に注入することで作製された、遺伝子組換えＨｅＬａ細胞において、１８時間培養後、ＣＭＶ由来のプロモータの支配化に発現される蛍光性タンパク質組換え発現体による、ＨｅＬａ細胞内での蛍光を蛍光顕微鏡下において観測した結果を示す、蛍光イメージ・プリント・アウトである。
【図１７】図１７は、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体に、種々の照射時間、波長３０２ｎｍの紫外光を照射する処理を施した後、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性（波長  ５１７ｎｍで測定した蛍光強度）の、紫外光照射に対する安定性を示す。
【図１８】図１８は、蛍光性タンパク質ＮＦＰとの融合タンパク質発現用ベクターを導入したＨｅＬａ細胞において発現される、ＮＦＰ−Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  β−Ａｃｔｉｎ（１１２８ｂｐ、３７５ａａ）融合タンパク質に起因する、細胞内における、蛍光強度の分布の局在を、蛍光顕微鏡下において観測した結果を示す、蛍光イメージ・プリント・アウトである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の橈脚類由来の蛍光性タンパク質は、異種の宿主細胞内において、その天然の蛍光特性を有する成熟型たんぱく質として組換え発現可能である。また、該組換え発現された、橈脚類由来の蛍光性タンパク質の蛍光は、極大波長５１８ｎｍを有し、黄色領域（５７０ｎｍ〜５９０ｎｍ）をカバーしている黄緑色蛍光であり、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰなどの緑色蛍光と弁別可能である。従って、両者を、宿主細胞内において、明瞭に区別可能な異なる蛍光を示す、二種のｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用することが可能である。
以下に、本発明の橈脚類由来の蛍光性タンパク質に関して、より詳しく説明する。【００２０】
まず、本発明の蛍光性タンパク質の起源である動物性プランクトンは、日本海、富山湾沖、水深３２１ｍから採取された海洋深層水中に見出された、甲殻類プランクトンである。その形態は、図１（ａ）に示すように、白色光照射下において、顕微鏡観察すると赤色に見える、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ（赤色の橈脚類）の一種である。このＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａは、分類学上、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ  ｐｈｙｌｕｍ）、大顎類（Ｍａｎｄｉｂｕｌａｔａ  ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ）、甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ  ｃｌａｓｓ）、橈脚類（カイアシ類：Ｃｏｐｒｐｏｄａ  ｓｕｂｃｌａｓｓ）に属し、Ａｅｔｉｄｅｉｄａｅ科、Ｂｒａｄｙｉｄｉｕｓ属の橈脚類の一種であると推断され、その後、さらに詳細な比較に基づく分類学上の同定を進めた結果、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに属すると結論されている。また、紫外光、例えば、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）の照射下に、蛍光顕微鏡観察すると、図１（ｂ）に示すように、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａの体内器官中に、黄緑色蛍光を発する領域が観察される。【００２１】
本発明者らは、この該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａの体内に観測される、黄緑色蛍光を発する領域を更に詳細に調べた結果、蛍光性タンパク質を産生するバクテリアの寄生、付着に起因するものではなく、このＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ自体に由来する蛍光性タンパク質に因ると結論した。実際に、該プランクトンを集め、蛍光性タンパク質の単離を進めることを検討したが、入手されるプランクトン量が十分でなく、そのアミノ酸配列解析に十分なタンパク質量を回収することは困難であると判断された。従って、アミノ酸配列解析の結果に基づき、そのアミノ酸配列の一部をコードする、縮重プローブを作製し、ゲノムＤＮＡから、当該蛍光性タンパク質の遺伝子をプローブ・ハイブリダイズ法により、クローニングする手法の適用は困難であると判断した。【００２２】
そのため、本発明者らは、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ体内でのタンパク質の発現に伴い、残留している多種のｍＲＮＡのうち、当該蛍光性タンパク質へと翻訳可能なものを選別することを試みた。具体的には、ｍＲＮＡよりｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリーを利用して、蛍光性タンパク質の発現が可能なものを選別することを目的として、発現クローニング法を適用した。【００２３】
先ず、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａより、市販のＲＮＡ抽出試薬；ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、次いで、市販の精製キット；Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ＜ＳＵＰＥＲ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いて種々のタンパク質の翻訳に利用された、ｐｏｌｙ（Ａ）＋  ｍＲＮＡの精製を行った。更に、精製済みのｍＲＮＡから、市販のｃＤＮＡ調製キット：ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を利用して、対応するｃＤＮＡの合成と、増幅をおこなった。調製されたｃＤＮＡは、クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ中に挿入し、ｃＤＮＡ  ライブラリーを作製した。【００２４】
作製されたｃＤＮＡ中、両末端のＰＣＲ増幅用プラーマー塩基配列に由来する領域を利用し、ｃＤＮＡの５’末端側は、Ｂｌｕｎｔ  端とし、３’末端側は、Ｘｈｏ  Ｉ  制限酵素の消化端とする。一方、クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫのマルチ・クローニング・サイト中、Ｘｈｏ  Ｉ  制限酵素サイトを酵素消化し、他の切断端をＢｌｕｎｔ端とした上で、前記のｃＤＮＡ断片と、Ｌｉｇａｔｉｏｎして、前記部位中にｃＤＮＡ断片を挿入した。【００２５】
従来、報告されているＡ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰなどでは、ｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡから大腸菌内で発現がなされ、翻訳されたペプチド鎖から成熟型のＧＦＰとなることが判明している。同様に、調製された該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来のｃＤＮＡ  ライブラリーを構成するベクターを大腸菌に導入し、挿入されているｃＤＮＡを発現させ、コードされるタンパク質中に蛍光性を有するものの有無を確認した。約３０万コロニーが生成する条件下において、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）照射下に、蛍光を発するコロニーが一つ見出された。この一次スクリーニングで選別された一つのコロニーについて、同様の条件で二次スクリーニングを行い、クローンの単離を行った。【００２６】
単離されたクローンから、導入されているベクターを回収し、挿入されているｃＤＮＡの塩基配列を決定した。利用したクローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫの既知塩基配列を基に、そのＢｌｕｎｔ−Ｘｈｏ  Ｉ  部位間に挿入されているｃＤＮＡへのシークエシングを進めた。その結果、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の大腸菌内発現に利用される、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ塩基配列として、全長：７８２ｂｐ、ＯＲＦ（翻訳枠）：６６０ｂｐが特定された。その全塩基配列と、ＯＲＦから推定されるアミノ酸配列：２１９アミノ酸長を以下に示す。
AGAACACTCA GTGTATCCAG TTTTCCGTCC
TACTACAAAC  40
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG
ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG   88
M   T   T   F   K   I   E   S   R   I   H   G   N   L   N   G
1              5                  10                  15
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA
GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC  136
E   K   F   E   L   V   G   G   G   V   G   E   E   G   R   L
20                  25                  30
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA
CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC  184
E   I   E   M   K   T   K   D   K   P   L   A   F   S   P   F
35                  40                  45
CTG CTG TCC CAC TGC ATG GGT TAC GGG
TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC  232
L   L   S   H   C   M   G   Y   G   F   Y   H   F   A   S   F
50                  55                  60
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT
CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT  280
P   K   G   T   K   N   I   Y   L   H   A   A   T   N   G   G
65                  70                  75                  80
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT
GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG  328
Y   T   N   T   R   K   E   I   Y   E   D   G   G   I   L   E
85                  90                  95
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC
AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC  386
V   N   F   R   Y   T   Y   E   F   N   K   I   I   G   D   V
100                105                  110
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT
CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC  424
E   C   I   G   H   G   F   P   S   Q   S   P   I   F   K   D
115                120                  125
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG
GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC  472
T   I   V   K   S   C   P   T   V   D   L   M   L   P   M   S  
130                135                  140
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT
AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC  520
G   N   I   I   A   S   S   Y   A   R   A   F   Q   L   K   D  
145                  150                  155                160 
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG
AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT  568
G   S   F   Y   T   A   E   V   K   N   N   I   D   F   K   N  
165                 170                175
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG
GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA  616
P   I   H   E   S   F   S   K   S   G   P   M   F   T   H   R  
180                185                  190
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG
AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC  664
R   V   E   E   T   H   T   K   E   N   L   A   M   V   E   Y  
195                200                  205
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA
GAC ATG TAG  700
Q   Q   V   F   N   S   A   P   R   D   M   *  
210                215
AATGTGGAAC GAAACCTTTT TTTCTGATTA
CTTTCTCTGT TGACTCCACA  750
TTCGGAACTT GTATAAATAA GTTCAGTTTA AA  782
加えて、上記の塩基配列に基づき、ＰＣＲ用プライマーを作製し、改めて、３１個体のＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａからｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行って、対応する塩基配列と分子量を示す増幅産物が得られることを確認し、実際に、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰ（Namerikawa Fluorescent Protein）をコードするものであることを検証した。また、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰ（Namerikawa Fluorescent Protein）は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉ由来の黄緑蛍光性タンパク質であり、学術的には、Ｃｐ  ＹＧＦＰ（Chiridius poppei Yellowish Green Fluoresent Protein）の略称を付与した。【００２７】
また、上記塩基配列に基づき、ＰＣＲ用ファワード・プライマーとリバース・プライマーとして、
ファワード・プライマー：ｐＥＴ−ＵＰ１（２８ｍｅｒ）
5-CACCATGACAACCTTCAAAATCGAGTCC
リバース・プライマー：ＳａｌＩ−ＬＰ１（３５ｍｅｒ）；３’末端に制限酵素ＳａｌＩの切断サイトを導入するため、対応する塩基配列が付加されている
5-CTCGTCGACCTACATGTCTCTTGGGGCGCTGTTGA
を作製し、単離クローンより回収したベクターを鋳型として、ＰＣＲ増幅産物を得た。図２に示すように、このＯＲＦ（翻訳枠）を含むＰＣＲ増幅産物６７３ｂｐを、市販のプラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）中に挿入し、該蛍光性タンパク質ＮＦＰの発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを作製した。【００２８】
一方、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質が、融合パートナーのグルタチオン・Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末に、エンドペプチターゼ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａによる切断部位を具えたリンカー配列を介して連結されている、ＧＳＴ−ｔａｇｇｅｄ  蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＮＦＰを作製した。すなわち、ＰＣＲ用ファワード・プライマーとリバース・プライマーとして、
ファワード・プライマー：ＧＳＴ−ＵＰ１（４３ｍｅｒ）；前記ｐＥＴ−ＵＰ１（２８ｍｅｒ）に対して、プロテーアーゼ：Ｆａｃｔｅｒ  Ｘａの切断アミノ酸配列をコードするATCGAAGGCCGCの部分配列と、５’末端に制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩの切断サイトを導入するため、対応する塩基配列GAATTCが付加されている
5-CGAATTCATCGAAGGCCGCATGACAACCTTCAAAATCGAGTCC
5-CACCATGACAACCTTCAAAATCGAGTCC
リバース・プライマー：ＳａｌＩ−ＬＰ１（３５ｍｅｒ）；３’末端に制限酵素ＳａｌＩの切断サイトを導入するため、対応する塩基配列が付加されている
5-CTCGTCGACCTACATGTCTCTTGGGGCGCTGTTGA
を利用して、単離クローンより回収したベクターを鋳型として、ＰＣＲ増幅産物を得た。一旦、ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）中に組み込み、選択マーカーにより、クローン選別を行った。各選別クローンについて、培養後、含まれるプラスミド：ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＮＦＰを精製し、その分子量サイズ、挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列の確認を行った。ついで、図３に示すように、ＯＲＦ（翻訳枠）を含む、６８８ｂｐの挿入ＤＮＡのＥｃｏ  ＲＩ／ＳａｌＩ断片を、市販のＧＳＴタグ付き融合型タンパク質発現用プラスミド・ベクター：ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）中に挿入し、ＧＳＴタグ付き蛍光性タンパク質ＮＦＰの発現ベクター：ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＮＦＰを作製した。【００２９】
図２に示す、該蛍光性タンパク質ＮＦＰの発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを用いて、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換大腸菌に関して、選択マーカーのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ耐性遺伝子を用いて、クローン選別を行った。また、ベクター由来のプロモーターから、ＩＰＴＧを用いて、挿入された遺伝子の発現を誘導し、誘導後２時間、４時間経過後、蛍光性タンパク質の発現の有無を確認した。ＩＰＴＧ発現誘導後、蛍光性タンパク質発現の確認済みの形質転換株の培養菌体を破砕後、遠心（１５，０００ｒｐｍ；１８，８００×ｇ）により分離した、可溶性画分（細胞質成分）ならびに不溶性画分（膜成分）にそれぞれ含まれるタンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。その結果、形質転換大腸菌の可溶性画分（細胞質成分）中に、分子量２５ｋＤａの新たなバンドが見出された。すなわち、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の分子量は、上記の推定アミノ酸配列から２４．７ｋＤａと推定され、図４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果に示される、分子量２５ｋＤａの新たなバンドは相当している。【００３０】
該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを保持する形質転換大腸菌を大量培養し、蛍光性タンパク質組換え体の分離精製を試みた。予め、推定アミノ酸配列に基づき、該蛍光性タンパク質組換え体の等電点（ｐＩ）を推測（算定）した結果、ｐＩ＝６．５０と算定された。その結果を参照して、可溶性画分（細胞質成分）を、アニオン交換カラム：ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、溶出条件：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ  １Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  Ａ  ｂｕｆｆｅｒ、  直線勾配  ０−２０％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ（０−２００ｍＭ  ＮａＣｌ濃度）において、４．８−８．８％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒの画分に該蛍光性タンパク質組換え体を回収した。次いで、該回収画分を、予め、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０  ＭＷ１０，０００ｃｕｔの条件で、濃縮した。この濃縮サンプルを、ゲル濾過：ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、溶出条件：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６において、分子量１００ｋＤａ以下の、蛍光画分として、該蛍光性タンパク質組換え体を精製、回収した。この段階で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったところ、図５に示すように、目的とする該蛍光性タンパク質組換え体がほぼ精製された状態となっている。この段階の精製タンパク質溶液サンプルは、図６に示すように、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）照射下では、黄緑色蛍光を発していることが確認される。なお、宿主大腸菌の可溶性画分（細胞質成分）を同一の精製処理を施した対照サンプルでは、勿論、蛍光は観測されていない。実際に、この段階の精製タンパク質溶液サンプルを用いて、蛍光スペクトルと、励起スペクトルの測定を行った。図７に示すように、波長５００ｎｍで蛍光強度をモニターしつつ測定した、励起スペクトルでは、波長５０７ｎｍに極大ピークが見出された。一方、波長５０８ｎｍで励起しつつ測定した、蛍光スペクトルでは、波長５１８ｎｍの極大ピークを持ち、黄色域（波長域５７０ｎｍ〜５９０ｎｍ）をカバーする蛍光が確認されている。【００３１】
また、図３に示す、ＧＳＴタグ付き蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＮＦＰを用いて、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換大腸菌、宿主大腸菌（陰性対照）、ならびに、クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ中に該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入されている単離クローン（陽性対照）を、それぞれ培地上で培養した。図８に示すように、各コロニーをＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）照射下、観察したところ、得られた形質転換大腸菌のコロニーは、蛍光を発しており、ＧＳＴタグ付き蛍光性タンパク質の発現がなされていることが確認された。また、他のタンパク質と適正なリンカー配列を介して連結された融合型タンパク質として、組換え発現した際にも、翻訳されたペプチド鎖から、蛍光団を形成する内部トリペプチド部位の環化と、その後の酸化を経て、蛍光特性を有する成熟型蛍光性タンパク質となることが確認される。
一方、本発明者らは、本発明のＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質以外に、Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質に関する報告などの有無を検索したところ、Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質遺伝子をヒト化したコード領域を含む緑色蛍光性タンパク質発現ベクターが、極く最近、ＥＶＲΩＧＥＮ社からＣｏｐ−ＧｒｅｅｎＴＭ  の商品名で市販されていることを知った。同市販品の緑色蛍光性タンパク質発現ベクターから発現される、Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の組換え発現体ＣｏｐＧＦＰは、波長５０２ｎｍに極大ピークを示す、緑色蛍光を示すこと、また、励起スペクトルは、波長４８２ｎｍに極大ピークを有することが、その商品カタログに掲載されている。【００３２】
また、ＥＶＲΩＧＥＮ社から公表されている、Ｃｏｐ−ＧｒｅｅｎＴＭ中にコードされるＣｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質のアミノ酸配列、ならびに、ＯＲＦのコドンを対応するヒト化コドンに変換した塩基配列を以下に示す。
Sequence
of the humanized version of the CopGFP's open reading frame
ATG CCC GCC
ATG AAG ATC GAG TGC CGC ATC ACC GGC ACC CTG AAC
GGC      48
M   P   A   M   K   I   E   C   R   I   T   G   T   L   N   G       16
GTG GAG TTC
GAG CTG GTG GGC GGC GGA GAG GGC ACC CCC GAG CAG
GGC      96
V   E   F   E   L   V   G   G   G   E   G   T   P   E   Q   G       32
CGC ATG ACC
AAC AAG ATG AAG AGC ACC AAG GGC GCC CTG ACC TTC AGC     144
R   M   T   N   K   M   K   S   T   K   G   A   L   T   F   S       48
CCC TAC CTG
CTG AGC CAC GTG ATG GGC TAC GGC TTC TAC CAC TTC GGC     192
P   Y   L   L   S   H   V   M   G   Y   G   F   Y   H   F   G       64
ACC TAC CCC
AGC GGC TAC GAG AAC CCC TTC CTG CAC GCC ATC AAC AAC     240
T   Y   P   S   G   Y   E   N   P   F   L   H   A   I   N   N       80
GGC GGC TAC
ACC AAC ACC CGC ATC GAG AAG TAC GAG GAC GGC GGC GTG     288
G   G   Y   T   N   T   R   I   E   K   Y   E   D   G   G   V       96
CTG CAC GTG
AGC TTC AGC TAC CGC TAC GAG GCC GGC CGC GTG ATC GGC     336
L   H   V   S   F   S   Y   R   Y   E   A   G   R   V   I   G      112
GAC TTC AAG
GTG GTG GGC ACC GGC TTC CCC GAG GAC AGC GTG ATC TTC     384
D   F   K   V   V   G   T   G   F   P   E   D   S   V   I   F      128
ACC GAC AAG
ATC ATC CGC AGC AAC GCC ACC GTG GAG CAC CTG CAC CCC     432
T   D   K   I   I   R   S   N   A   T   V   E   H   L   H   P      144
ATG GGC GAT
AAC GTG CTG GTG GGC AGC TTC GCC CGC ACC TTC AGC CTG     480
M   G   D   N   V   L   V   G   S   F   A   R   T   F   S   L      160
CGC GAC GGC
GGC TAC TAC AGC TTC GTG GTG GAC AGC CAC ATG CAC TTC     528
R   D   G   G   Y   Y   S   F   V   V   D   S   H   M   H   F      176
AAG AGC GCC
ATC CAC CCC AGC ATC CTG CAG AAC GGG GGC CCC ATG TTC     576
K   S   A   I   H   P   S   I   L   Q   N   G   G   P   M   F      192
GCC TTC CGC
CGC GTG GAG GAG CTG CAC AGC AAC ACC GAG CTG GGC ATC     624
A   F   R   R   V   E   E   L   H   S   N   T   E   L   G   I      208
GTG GAG TAC
CAG CAC GCC TTC AAG ACC CCG ATC GCA TTC GCC
TGA         669
V   E   Y   Q   H   A   F   K   T   P   I   A   F   A   *          223
本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質と、該ＥＶＲΩＧＥＮ社から公表されている、Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質のアミノ酸配列を対比すると、図９に示される通り、同一性を示すアミノ酸１１２残基、相同的なアミノ酸残基をふくめると、相当に高い相同性が見出されている。但し、両者の示す蛍光スペクトルには、明確な相違が存在している。【００３３】
これら甲殻類由来の蛍光性タンパク質は、相当の相同性を示し、新規な蛍光性タンパク質のファミリーを構成すると推定できる。また、その蛍光団の形成に関与するトリペプチド部位は、ＧＹＧの部位と推測される。さらに、この二種の甲殻類由来の蛍光性タンパク質において、蛍光団の環化、酸化を受けた、成熟型タンパク質は、類似する立体構造を示すと推定される。該ＥＶＲΩＧＥＮ社から市販される発現ベクターから発現される、Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の組換え発現体ＣｏｐＧＦＰは、モノマーとして蛍光を示すことが示されている。相同性を考慮すると、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質も、哺乳動物細胞内において、組換え発現した際、同様にモノマーの形態とでき、ｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用可能であると予測される。【００３４】
なお、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を、クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫのマルチ・クローニング・サイト中に挿入したベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ−ＮＦＰは、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６８１として、国際寄託（平成１６年３月３１日付け）がなされている。【００３５】
本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として、哺乳動物細胞内で組換え発現する際には、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰや、その人為的な改変体の発現系を利用し、そのコード領域を置換する手法が利用可能である。また、哺乳動物細胞以外に、従来のＧＦＰの組換え発現が可能な、バクテリア、酵母、真菌、昆虫細胞などの宿主において、同様にＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質を組換え発現することが可能である。これら組換え発現に利用する際、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質をコードする遺伝子は、必要に応じて、宿主において使用頻度の高いコドンへと変換した上で発現ベクターに挿入することが好ましい。勿論、コドン変換に伴い、その遺伝子によりコードされるアミノ酸配列自体には、変異が導入されない。発現ベクターへの挿入に際し、予めコドン変換された、コード遺伝子は、両端の非コード領域において制限酵素消化し、断片化する。この制限酵素消化を行う際、適当な制限酵素サイトが存在しない場合には、部位特異的変異導入法によって、非コード領域の塩基配列に変異導入して、所望の制限酵素サイトを導入することもできる。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。ここに示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら具体例に限定されるものではない。
（新規な蛍光性タンパク質を産生する甲殻類プランクトンの採取）
本発明者らは、Ａ．  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰを代表とする、刺胞動物門（Ｃｎｄａｒｉａ）のヒドロ虫類（ｃｌａｓｓ  Ｈｙｄｒｏｚｏａ）や、花虫類（ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ）に由来するＧＦＰ様タンパク質ファミリーとは、生物進化的には、共通する起源をもたない、あらたな蛍光性タンパク質ファミリーを発見することを目的として、新たに、日本海、富山湾沖、水深３２１ｍから海洋深層水を採取し、蛍光性タンパク質を生産している動物性プランクトンを探索した。【００３７】
その探索過程で、数多くの発光プランクトンが、サンプリングされた海洋深層水に存在することが確認されている。なかでも、甲殻類プランクトンの内で、蛍光性タンパク質に起因する蛍光が体内器官に見出され、さらに、その蛍光が、黄色蛍光または黄緑色蛍光を呈するものを選別した。【００３８】
その選別過程において、その形態は、図１（ａ）に示すように、白色光照射下において、顕微鏡観察すると赤色に見える、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ（赤色の橈脚類）の一種が、紫外光、例えば、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）の照射下に、蛍光顕微鏡観察すると、図１（ｂ）に示すように、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａの体内器官中に、黄緑色蛍光を発する領域を示すことを見出した。このＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａは、分類学上、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ  ｐｈｙｌｕｍ）、大顎類（Ｍａｎｄｉｂｕｌａｔａ  ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ）、甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ  ｃｌａｓｓ）、橈脚類（カイアシ類：Ｃｏｐｒｐｏｄａ  ｓｕｂｃｌａｓｓ）に属し、Ａｅｔｉｄｅｉｄａｅ科、Ｂｒａｄｙｉｄｉｕｓ属の橈脚類の一種であると推断された。さらに詳細な分類学上の同定を進めた結果、北海道大学大学院  水産科学研究科  多様性生物学講座  に所属の、助手  山口  篤  氏による同定に基づき、このＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａは、Ｍｅｔａｚｏａ（動物界）、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ（節足動物門）、Ｃｒｕｓｔａｃｅａ（甲殻亜門）、Ｍａｘｉｌｌｏｐｏｄａ（アゴアシ綱）、Ｃｏｐｅｐｏｄａ（カイアシ亜綱）、Ｎｅｏｃｏｐｅｐｏｄａ（カイアシ下網）、Ｇｙｍｎｏｐｌｅａ（前脚類）、Ｃａｌａｎｏｉｄａ（カラヌス目）、Ａｅｔｉｄｅｉｄａｅ（アエティデウス科）、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ（キリディウス属）に分類される、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ  ｐｏｐｐｅｉに属すると結論された。
（Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰをコードする遺伝子クローニング）
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの採取
サンプリングされた海洋深層水より、回収されたＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａの３００個体について、水きりした後、合計３ｍＬのＴＲＩＺＯＬ試薬中に懸濁し、−８０℃で凍結、保存した。【００３９】
凍結保存したＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ個体を室温で解凍し、更に、３ｍＬのＴＲＩＺＯＬ試薬を添加した。この懸濁液を、１５ｍＬ容テフロン製ホモジナイザー用容器に移し、１０度破砕機にかけ、外殻ならびに体内細胞の破砕を行った。得られた細胞破砕物を１５ｍＬ容ファルコン・チューブに移し、２〜８℃において、１０分間、遠心（１１，０００ｒｐｍ）した。上清（第一抽出成分）を、別の１５ｍＬ容ファルコン・チューブに回収した。【００４０】
残った沈澱物ペレットに、１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ試薬を添加して、再懸濁した。この再懸濁液を、ガラス製ホモジナイザー用容器に移し、再度ホモジナイズ処理を施した。別の１５ｍＬ容ファルコン・チューブに、再処理済み液を移し、４ｍＬのＴＲＩＺＯＬ試薬を加えた後、２〜８℃において、１０分間、遠心（１１，０００ｒｐｍ）した。得られた上清（第二抽出成分）を回収し、前段の上清（第一抽出成分）と併せて、合計１０ｍＬの抽出成分とし、１５ｍＬ容ファルコン・チューブ中に各５ｍＬ分注した。【００４１】
分注したチューブ中、ＴＲＩＺＯＬ試薬１ｍＬ当たり、０．２ｍＬのクロロフォルム（１チューブ当たり、１ｍＬ）を添加した上で、よく振って、両液相の分散を図った。室温で２〜３分間静置した後、２〜８℃において、１０分間、遠心（１１，０００ｒｐｍ）した。分離された水相（約３ｍＬ）を、別のチューブに分取した。【００４２】
分取した水相（約３ｍＬ）に、当初のＴＲＩＺＯＬ試薬１ｍＬ当たり、０．５ｍＬのイソプロパノール（１チューブ当たり、２．４ｍＬ）を加え、よく混合した。室温で５分間静置した後、２〜８℃において、１０分間、遠心（１１，０００ｒｐｍ）した。上清を除いた後、アルコール沈澱画分に、１チューブ当たり、５ｍＬの無水エタノールを添加して、−２０℃で保存した。【００４３】
チューブ中のエタノール沈澱ペレットに、当初のＴＲＩＺＯＬ試薬１ｍＬ当たり、１ｍＬの７５％エタノール（１チューブ当たり、５ｍＬ）を加え、ヴォルテックスにかけ、分散・混合した。分散・混合液を、２〜８℃において、１０分間、遠心（１１，０００ｒｐｍ）した。上清を除いた後、ＲＮＡ沈澱ペレットを、室温、１０分間放置して、残留する溶媒を蒸散させ、乾燥した。二つの分注から精製された、乾燥済みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料二つの一方は、乾燥状態のまま、−８０℃で保存した。【００４４】
残る一方の乾燥済みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料は、ＲＮａｓｅの混入のない水４００μＬを加えて、１０〜２０分間静置して、再溶解した。一部溶解液を採取して、波長２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、３２０ｎｍの吸光度ＯＤ２６０、ＯＤ２８０、ＯＤ３２０（バックグラウンド吸収）を測定した。その結果に基づき、定法に従って、吸光度ＯＤ２６０からＲＮＡ含有濃度を算定した。併せて、非変性条件において、ゲル電気泳動を行い、夾雑物の有無を分析することで、含有されるＲＮＡの純度確認を行った。表１に、得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料に関する、ＲＮＡ含有濃度の評価結果を示す。
【００４５】
【表１】
0004863280.tif 000002
ｐｏｌｙ（Ａ）＋  ｍＲＮＡの精製
上で調製した、精製済みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液（ＲＮＡ含有濃度１．１４μｇ／μＬ）２００μＬから、含まれているｐｏｌｙ（Ａ）＋  ｍＲＮＡを市販の精製キット；Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ＜ＳＵＰＥＲ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いて分離、精製した。【００４６】
前記ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液２００μＬに、同キットに添付のバイブリダイゼーション・バッファー：２×Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬを加え、合計４００μＬの液を均一化した。このＲＮＡ溶液に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０の分散液２０μＬを添加し、よく混合した。チューブ中の液を７０℃に加熱し、３分間保持し、引き続き、室温で１０分間放冷して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋  ｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）末端と、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０のＯｌｉｇｏ−ｄＴプローブ部とのバイブリダイゼーションを行った。５分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０を沈澱画分として分離した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０とバイブリダイゼーションしていないＲＮＡ成分を含む、上清を除去した。【００４７】
沈澱画分を、同キットに添付の洗浄用バッファー３５０μＬ中に分散し、遠心カラム用チューブに移した。３０秒間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、上清を除去した。さらに、同量の洗浄用バッファーを用いて、同じ洗浄操作を行った。【００４８】
二度の洗浄を終えた、沈澱画分に、予め７０℃に加熱した、同キットに添付のＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ（水溶液）  ５０μＬを加えて、この混合物を別の遠心カラム用チューブに移した。３０秒間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０のプローブ上から遊離されたｐｏｌｙ（Ａ）＋  ｍＲＮＡを含む上清を回収した。沈澱画分に、再度、予め７０℃に加熱した、ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ（水溶液）  ５０μＬを加えて、プローブ上からの遊離操作を行い、上清を回収した。回収された上清を合わせ、合計１００μＬの精製済みｍＲＮＡを含む溶液とした。【００４９】
この精製済みｍＲＮＡを含む溶液に、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  １０μＬと、１００％イソプロパノール  １００μＬを添加し、よく混合した。その後、−２０℃、１０分間放置し、含有されるｍＲＮＡをアルコール沈澱させた。３０分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）して、析出したｍＲＮＡを沈澱画分に集め、上清を除去した。更に、析出したｍＲＮＡの沈澱画分に、７５％エタノール１ｍＬを加え、よく混合した。５分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）して、析出したｍＲＮＡの沈澱画分を分離し、上清を除去した。【００５０】
得られた精製済みのｍＲＮＡ析出物は、ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ（水溶液）  １１μＬ中に再溶解した。一部評価用サンプルを取り、残り（１０．５μＬ）の精製済みのｍＲＮＡ試料溶液は、−８０℃で凍結、保存した。なお、評価用サンプルを用いて、ＲＮＡ含有濃度を評価した。また、精製各段階において、除去された上清、ならびに、精製済みのｍＲＮＡ析出物について、非変性条件において、ゲル電気泳動を行い、精製過程の確認を行った。表２に、得られた精製済みｍＲＮＡ試料に関する、ＲＮＡ含有濃度の評価結果を示す。【００５１】
【表２】
0004863280.tif 000003
ｍRNAを鋳型としたｃDNAの合成
市販のｃＤＮＡ合成キット：ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、精製済みｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成した。
先ず、一本鎖ｃＤＮＡ（第一鎖）の合成を、以下の手順で行った。
同キット添付の逆転写用バッファー：１０×１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、ｍｅｔｈｙｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ３μＬ、ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｉｍｅｒ  混合液  ２μＬ、ＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  溶液  １μＬ、水（ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ）  ３０．０６μＬの混合液に対して、
精製済みｍＲＮＡ溶液７．４４μＬ（ｍＲＮＡ量５μｇ）を一旦、７０℃で３分間加熱処理し、高次構造の解消を行い、氷冷により急冷した後、添加して緩やかに混合した。室温で、１０分間保持して、ｍＲＮＡの３’末端にプラーマーを結合させた。添付されている逆転写酵素：ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ  Ｒｉｖｅｒｅｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  液  １．５μＬを添加し、緩やかに混合して、４２℃、１時間酵素反応を行った。
次いで、合成された一本鎖のｃＤＮＡ（第一鎖）を鋳型として、その相補鎖（第二鎖）の合成を、以下の手順で行った。【００５２】
得られた酵素反応液５０μＬに対して、氷冷下、
同キット添付のＤＮＡ合成用バッファー：１０×２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０μＬ、２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ６μＬ、蒸留水（ＤＤＷ）１１１μＬを順次加え、更に、ＲＮＡ分解酵素として、ＲＮａｓｅＨ  溶液  ２μＬ（酵素濃度１．５Ｕ／μＬ）、ＤＮＡ合成酵素として、ＤＮＡ  ｐｏｌ．  Ｉ  溶液  １１μＬ（酵素濃度９．０Ｕ／μＬ）を加えて、緩やかに混合した。残留しているｍＲＮＡをＲＮａｓｅＨで分解し、一方、調製された一本鎖のｃＤＮＡ（第一鎖）を鋳型として、上流側のプラーマーより、ＤＮＡ  ｐｏｌ．  Ｉにより、その相補鎖（第二鎖）の合成を進める。酵素反応液を、１６℃、２．５時間保持し、相補鎖（第二鎖）の伸長を行い、二本鎖ｃＤＮＡとした後、氷冷し、酵素反応を停止した。
二本鎖ｃＤＮＡ末端の平滑化
前記二本鎖ｃＤＮＡの両末端を、以下の手順で平滑化処理した。【００５３】
前記二本鎖ｃＤＮＡを含む反応液に対して、ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ２３μＬ、ｃＰｆｕ  酵素液  ２μＬ（酵素濃度２．５Ｕ／μＬ）を添加した。反応液をヴォルテックスにかけ、均一に混和した後、３０分間、７２℃に保持し、酵素処理した。【００５４】
３０分間経過後、反応溶液に、フェノール  ２００μＬを添加し、ヴォルテックスにかけ、混合した。２分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、液相を分離し、上層の水層を分取した。その分取した水層に、クロロフォルム  ２００μＬを添加し、ヴォルテックスにかけ、混和した。２分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、液相を分離し、上層の水層を分取した。【００５５】
分取した水層に、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  ２０μＬと、無水エタノール  ４００μＬを添加し、ヴォルテックスにかけて、よく混合し、含まれるｃＤＮＡをエタノール沈澱させた。エタノール沈澱させた、ｃＤＮＡ析出物は、６０分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、沈澱画分に分離した。上清を除去し、残ったｃＤＮＡ析出物の沈澱画分に、７０％エタノール５００μＬを加え、よく混合した。２分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、再び、ｃＤＮＡ析出物を沈澱画分に分離し、上清を除去した。回収されたｃＤＮＡ析出物のペレットを乾燥した。
ｃＤＮＡ析出物の乾燥ペレットを、Ｅｃｏ  ＲＩ  ａｄａｐｔｅｒ  溶液  ９μＬ中に、４℃、１時間保持して、再分散した。この液に、市販のＬｉｇａｔｉｏｎ反応液：Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ４．５μＬを添加し、１６℃、夜間（１６時間）保持して、ｃＤＮＡ末端に、Ｅｃｏ  ＲＩ  ａｄａｐｔｅｒを連結した。反応液に、蒸留水  １８６．５μＬを加え、総量２００μＬに希釈した。更に、フェノール  ２００μＬを加え、ヴォルテックスにかけ、よく混和した。５分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、液相を分離し、上層の水層を分取した。その分取した水層に、クロロフォルム  ２００μＬを添加し、ヴォルテックスにかけ、混和した。５分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、液相を分離し、上層の水層を分取した。
分取した水層に、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  １０μＬと、１００％イソプロパノール  ２００μＬを添加し、ヴォルテックスにかけて、よく混合し、含まれるｃＤＮＡをアルコール沈澱させた。アルコール沈澱させた、ｃＤＮＡ析出物は、６０分間、４℃、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、沈澱画分に分離した。上清を除去し、残ったｃＤＮＡ析出物の沈澱画分に、７０％エタノール５００μＬを加え、よく混合した。２分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、再び、ｃＤＮＡ析出物を沈澱画分に分離し、上清を除去した。回収されたｃＤＮＡ析出物のペレットを乾燥した。
回収されたｃＤＮＡ析出物のペレットを、蒸留水  ２０μＬ、Ｔ４  ＰＮＫ  ｂｕｆｆｅｒ  ３μＬ、５０％  グリセロール  ３μＬ、７５ｍＭ  ＡＴＰ  溶液  ３μＬの混合液中に、よく再分散させた。このＴ４  ＰＮＫ酵素用反応液を−２０℃に冷却した。解凍した後、市販の酵素液セット（ＴＡＫＡＲＡ製）のＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ  酵素液  １μＬを添加し、３７℃、１時間保持し、酵素反応を行わせた。二本鎖ｃＤＮＡの５’末端へのリン酸化を終えた後、７０℃、３０分間加熱保持して、熱変性処理を施し、反応を終了した。
二本鎖ｃＤＮＡのＸｈｏ  Ｉ消化処理
上記の末端平滑化処理を施した二本鎖ｃＤＮＡを、以下の手順でＸｈｏ  Ｉ消化処理した。【００５６】
末端平滑化処理を施した二本鎖ｃＤＮＡ  溶液  ３０μＬ、市販の制限酵素反応用ｂｕｆｆｅｒ液（ＴＡＫＡＲＡ製）：１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  １１．５μＬ、水（ＤＤＷ）  ７０．５μＬ、市販の制限酵素液キット（ＴＡＫＡＲＡ製）のＸｈｏ  Ｉ制限酵素液  ３μＬ（酵素濃度１０Ｕ／μＬ）を混合し、合計１１５μＬの反応液に調製する。３７℃、２時間、酵素消化を行った後、フェノール  ２００μＬを加え、ヴォルテックスにかけ、よく混和した。５分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、液相を分離し、上層の水層を分取した。その分取した水層に、クロロフォルム  １１５μＬを添加し、ヴォルテックスにかけ、混和した。５分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、液相を分離し、上層の水層を分取した。【００５７】
次いで、酵素消化されたｃＤＮＡ断片を含む、分取した水層  １１５μＬを、１×ＳＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ３倍容を加えて平衡させた、Ｓ−３００  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにかけた。２分間、遠心（１，５００ｒｐｍ；４００×ｇ）して、分離する水層  １０５μＬを回収した。この回収した水層に、無水エタノール  ２００μＬを加え、−２０℃、１時間静置して、ｃＤＮＡ断片を析出させた。ｃＤＮＡ断片の析出物は、６０分間、４℃、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、沈澱画分に分離した。ｃＤＮＡ析出物の沈澱画分に、７０％エタノール９００μＬを加え、洗浄する操作を２度繰り返した後、回収されたｃＤＮＡ断片析出物のペレットを乾燥した。【００５８】
回収されたｃＤＮＡ断片析出物のペレットを、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ６．０μＬ中に再分散し、溶液とした。その一部（１．０μＬ）を採取し、含有されるｃＤＮＡ濃度を評価した。ｃＤＮＡ濃度は、４０４．１ｎｇ／μＬであり、５’末端はＢｌｕｎｔ  ｅｎｄ、３’末端部はＸｈｏ  Ｉ消化処理済みの、二本鎖ｃＤＮＡ断片の溶液、計５．０μＬが得られた。
クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫのマルチ・クローニング・サイト中に、Ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ／Ｘｈｏ  Ｉ切断の挿入部位の形成
市販のベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を、予め増殖し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）の溶液（濃度５００ｎｇ／μＬ）に調製した。このベクター溶液  ６μＬ（ベクター量３μｇ）、１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３μＬ、Ｘｈｏ  Ｉ制限酵素液  １μＬ（酵素濃度１０Ｕ／μＬ）、水（ＤＤＷ）  ２０μＬの、合計３０μＬの反応液を、３７℃、３時間保持し、ベクターをＸｈｏ  Ｉサイトで酵素消化する。酵素消化されたベクターの主断片を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ法で分離精製し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中の２６μＬの溶出液として回収した。【００５９】
この２６μＬの溶出液に、ＣＩＡＰ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｏｎｅ−ｐｈｏｒ−Ａｌｌ  ｂｕｆｆｅｒ）  ３μＬ、ＣＩＡＰ  酵素溶液  １μＬを加え、合計３０μＬの反応液を、３７℃、３０分間保持し、Ｘｈｏ  ＩサイトのみにＣＩＡＰ処理を施した。処理済みベクター主断片を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ法で分離精製し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中の２６μＬの溶出液として回収した。【００６０】
回収された２６μＬの溶出液に、１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３μＬ、Ｅｃｏ  ＲＶ制限酵素液  １μＬ（酵素濃度１５Ｕ／μＬ）を添加し、３７℃、夜間（１４時間）保持し、ベクターのＸｈｏ  Ｉ切断端の一方にＥｃｏ  ＲＶによる処理を加えた。結果的に、ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）は、Ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ／Ｘｈｏ  Ｉ切断サイトの挿入部位を有するように切断されたものとなる。【００６１】
前記Ｅｃｏ  ＲＶ処理後の反応液を、０．７％  アガロース・ゲルにかけ、電気泳動して、目的のサイズを有するＤＮＡ断片バンドを切り出した。切り出したゲルを、Ｕｌｔｒａ  ｆｒｅｅ  ＤＡにより処理し、１０分間、遠心（７，０００ｒｐｍ）して、ベクターＤＮＡ断片を含む液層を回収した。次いで、この液から、ベクターＤＮＡ断片を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ法で分離精製し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中の２０μＬの溶出液として分離した。このベクターＤＮＡ断片溶液中のＤＮＡ断片を一旦、エタノール沈澱させ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ中に再分散させ、ＤＮＡ濃度  ９４．５ｎｇ／μＬのベクターＤＮＡ断片溶液に調製した。
ｃＤＮＡライブラリーの構築
前記のＢｌｕｎｔ−ｅｎｄ／Ｘｈｏ  Ｉ切断サイトの挿入部位を形成したベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）断片と、５’末端はＢｌｕｎｔ  ｅｎｄ、３’末端部はＸｈｏ  Ｉ消化処理済みの二本鎖ｃＤＮＡ断片とを連結して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。【００６２】
ベクターＤＮＡ断片溶液  ０．５３μＬ（ＤＮＡ量５０ｎｇ）、末端処理済み二本鎖ｃＤＮＡ断片の溶液  １μＬ（ＤＮＡ量２００ｎｇ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ０．７６５μＬを混合し、１６℃、一夜（１４時間）保持して、両ＤＮＡ断片の連結を行った。得られたプラスミド・ベクターは、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａから回収されたｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡが挿入されており、ｃＤＮＡライブラリーが構築されている。
プラスミド・ベクターの宿主大腸菌への導入
構築されたｃＤＮＡライブラリーを、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ法により宿主大腸菌へ導入し、形質転換株を選択した。プラスミド・ベクターのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ法による宿主大腸菌へ導入は、以下の手順で実施した。
作製されたｃＤＮＡライブラリーを含むＬｉｇａｔｉｏｎ液  ２．２９５μＬに、Ｓｔｒａｔａ  Ｃｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎ  液  ５μＬを添加し、１５秒間ヴォルテックスにかけて、よく混合した。遠心して、Ｒｅｓｉｎを沈降させ、上清を別のチューブに回収した。再度、上清にＲｅｓｉｎ  液  ５μＬを添加し、１５秒間ヴォルテックスにかけて、よく混合した。また、遠心して、Ｒｅｓｉｎを沈降させ、上清を別のチューブに回収した。【００６３】
二つのチューブ内に残余しているＲｅｓｉｎ沈降物に、水（ＤＤＷ）２．５μＬをそれぞれ加え、洗浄した。遠心して、Ｒｅｓｉｎを沈降させ、洗浄により回収されたプラスミド・ベクターを含む液層を分離した。【００６４】
先の上清と、回収された液層とを合わせて、計１０μＬのプラスミド・ベクターを含む液とした。今一度、この混合液を遠心し、僅かに混入しているＲｅｓｉｎを沈降させ、上清を別のチューブに回収した。回収された上清は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応に利用した酵素が除去され、プラスミドＤＮＡ溶液となる。
宿主大腸菌に利用する、ＴＯＰ１０株、ならびに、ＴｅｎＢｌｕｅ株は、凍結保存されているＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌを、氷温で解凍する。Ｒｅｓｉｎ吸着処理を施した、プラスミドＤＮＡ溶液  ５μＬを、解凍された宿主大腸菌のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ懸濁液  ４０μＬに加えた。市販のＥｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ装置：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ  （Ｂｉｏ−ｒａｄ製）を用いて、パルス電圧；１．７ｋＶ、０．１ｍｍ  ｇａｐ  ｃｕｖｅｔｔｅ内において、宿主へのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ注入を行った。なお、使用パルスの時定数は、ｃＤＮＡライブラリー／ＴＯＰ１０株の系では、４．１  μｓ、ｃＤＮＡライブラリー／ＴｅｎＢｌｕｅ株の系では、４．０  μｓに設定した。ベクター注入処理後、宿主大腸菌を懸濁した液  ４５μＬに、３７℃に予熱した培地成分ＳＯＣ  ９５５μＬを加えて、３７℃、１．５時間振盪培養した。【００６５】
その後、得られた培養液  １０００μＬから、５μＬを採取し、培地成分ＳＯＣ  １００μＬを加えて、９ｃｍφシャーレ上に撒種し、室温（２０℃）で二日間培養を行った。残る培養液  ９９５μＬに、５０％グリセロール  ４２８．５７μＬを加え、混合液（最終濃度１５％グリセロール含有）を−８０℃で、凍結保存した。【００６６】
シャーレ培養において、ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ耐性を示すコロニー生成数を数えたところ、ｃＤＮＡライブラリー／ＴＯＰ１０株の系では、１４２５コロニー、ｃＤＮＡライブラリー／ＴｅｎＢｌｕｅ株の系では、７００コロニーであった。従って、前記培養液中に含まれる形質転換株密度は、ｃＤＮＡライブラリー／ＴＯＰ１０株の系では、２．８×１０５ｃｆｕ／ｍＬ（１．１×１０７ｃｆｕ／μｇ  ｖｅｃｔｏｒ）、ｃＤＮＡライブラリー／ＴｅｎＢｌｕｅ株の系では、１．４×１０５ｃｆｕ／ｍＬ（５．６×１０６ｃｆｕ／μｇ  ｖｅｃｔｏｒ）に相当している。
一方、コロニーＰＣＲ法を利用して、形質転換株中、ｃＤＮＡ断片が挿入されたベクターを有するものの比率（ｃＤＡＮライブラリー効率）を評価した。ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）のマルチ・クローニング・サイトの上流に位置するＴ７プロモータ部位と、マルチ・クローニング・サイトの下流に位置するＴ３プロモータ部位の間への、ｃＤＮＡ断片挿入の有無を以下の手順で確認した。
ｃｏｌｏｎｙ  ＲＣＲは、
フォワード・プライマーとして、Ｔ７プロモータ部位の塩基配列に相当する、
Ｔ７プライマー：ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
リバース・プライマーとして、Ｔ３プロモータ部位の塩基配列に対して、相補的な
ＴＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣ
Ｔ３プライマー：ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ
を利用して、市販のＤＮＡ合成酵素：ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、クローン中に含まれるベクターＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅を行った。表３に、用いたＰＣＲ反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。
【００６７】
【表３】
0004863280.tif 000004
シャーレ上のコロニーから、無作為に１０コロニーを選択し、各コロニーの菌体を７０μＬの水（ＤＤＷ）に懸濁した。この菌体懸濁液を９５℃、５分間処理した。この菌体から回収されたベクターを含む液を、反応液において、コロニー溶液として利用した。【００６８】
ＰＣＲ反応の終了後、増幅産物を含む反応液１０μＬから、３μＬを採取して、０．７％ゲル上で泳動して、ｃＤＮＡ断片に相当するＰＣＲ増幅産物の有無、そのサイズ範囲を調べた。上で作製したｃＤＮＡライブラリーに対して、無作為に選択した１０コロニー中、５コロニーにおいて、ｃＤＮＡ断片に相当するＰＣＲ増幅産物が見出された。従って、実際に、形質転換株中、ｃＤＮＡ断片が挿入されたベクターを有するものの比率は、５０％程度と判断した。
Ｅｘｐｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ法による、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質をコードするｃＤＮＡを有するクローン選別
調製されたｃＤＮＡライブラリー中に含まれる、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来のタンパク質をコードする遺伝子種類が、３×１０４と仮定する。一方、全コロニー数３×１０５ｃｆｕを生成した場合、その内、ｃＤＮＡ断片が挿入されたベクターを有するコロニーは、前記比率５０％とすると、１．５×１０５ｃｆｕが見込まれる。ｃＤＮＡライブラリー中に含まれる、コード遺伝子種類が３×１０４であり、同程度の存在頻度で含まれると仮定すると、各コード遺伝子当たり、５コロニー程度の存在が期待される。存在頻度のバラツキは、主に、元々のｍＲＮＡの存在比率を反映するが、目的の蛍光性タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入されている形質転換株のコロニーは、少なくとも、２〜３コロニーは見出されると推定された。【００６９】
加えて、従来から知られているＧＦＰの多くは、宿主大腸菌内で発現させた際、蛍光性を有する成熟型のＧＦＰとして、産生されることが報告されている。Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質も、宿主大腸菌内で発現させた際、蛍光性を有する成熟型の蛍光性タンパク質として産生される可能性がある。
以上の考察に基づき、少なくとも、コロニー総数１．５×１０５以上を生成する条件で、ｃＤＮＡライブラリーを保持する形質転換株を、培地  ＬＢ／Ｃａｒを用いた、複数枚のシャーレ上で培養して、コロニー形成を行った。【００７０】
−８０℃で凍結保存している、グリセロール添加培養液を解凍し、培地成分ＳＯＣを加えて、総量２０００μＬの培養液とした。その内、１μＬの培養液を採取し、培地成分ＳＯＣ  １００μＬに加えて、９ｃｍφシャーレ上に撒種し、３７℃、一夜（１４時間）培養を行った。残る培養液の全量を、合計１１枚の１５ｃｍφシャーレに作製した培地  ＬＢ／Ｃａｒ上に撒種して、３７℃、一夜（１４時間）培養を行った。【００７１】
９ｃｍφシャーレ上では、１μＬの培養液から、１５３コロニーが生成されていた。一方、合計１１枚の１５ｃｍφシャーレでは、少なくとも、コロニー数の総和は、１．５×１０５以上に達していた。従って、生成されたコロニー総数は、１５３×２０００、凡そ、３．０×１０５〜１．５×１０５の範囲と判断される。【００７２】
合計１１枚の１５ｃｍφシャーレについて、蛍光を発するコロニーの有無を調べた結果、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒの紫外線照射下、蛍光を発するコロニーが一つ見出された。この蛍光を発するコロニーを取り出し、５ｍＬの培地  ＬＢ／Ｃａｒ中に懸濁した液を、同培地を用いた１／１０希釈した。この菌体希釈液  １００μＬを、１５ｃｍφシャーレに作製した培地  ＬＢ／Ｃａｒ上に撒種して、蛍光を発するコロニーの二次スクリーニングを行った。３７℃、一夜（１４時間）培養を行った後、１５ｃｍφシャーレ上に生成されたコロニーをＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒの紫外線照射下、観察すると、８０〜９０％のコロニーが蛍光を示していた。【００７３】
この二次スクリーニングにおいて、特に、明確な蛍光を示す（蛍光ｐｏｓｉｔｉｖｅ）コロニー複数のうち、無作為に４つの蛍光ｐｏｓｉｔｉｖｅコロニーを採取した。この蛍光ｐｏｓｉｔｉｖｅコロニーは、それぞれ、５ｍＬの培地  ＬＢ／Ｃａｒ中に懸濁し、３７℃、９時間培養を行った。得られた蛍光ｐｏｓｉｔｉｖｅコロニー４つの各培養液を、クローン培養液（１５％グリセロール含有）として、凍結保存した。
選別クローン中に導入されているプラスミド・ベクターの複製、精製
選別された４つのクローンから、以下の手順で、導入されているプラスミド・ベクターの複製、精製を行った。【００７４】
宿主大腸菌  ＴＯＰ１０を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを導入した系において、蛍光を発するコロニーとして、二段階スクリーニングで選別された４つのコロニー（クローン）を、それぞれ５ｍＬの培地  ＬＢ／Ｃａｒ中に懸濁し、３７℃、８時間培養を行った。培養液を、遠心（５０００×ｇ）して、細胞を分取した。【００７５】
分取した細胞から、市販のプラスミド精製キット：ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を利用して、プラスミドを分離、精製した。分取した細胞に、同精製キットに添付のＰ１液  ０．３７５ｍＬを添加し、ヴォルテックスにかけて、よく分散させた。この細胞分散液に、添付のＰ２液  ０．３７５ｍＬを添加し、混和した。室温（２０℃）に、５分間静置した。次いで、添付のＮ３液  ０．５２５ｍＬを添加し、混和した。破菌処理後、１５分間、４℃で遠心（１１，０００ｒｐｍ）し、プラスミドＤＮＡを可溶性画分（上清）を分離、回収した。【００７６】
プラスミドＤＮＡを含む可溶性画分（上清）を、同精製キットのＱＩＡｐｒｅｐ  ４  カラムにかけた。４℃で遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、液層を除去した。ＰＢ  ０．５ｍＬを加えて、洗浄し、引き続き、ＰＥ  ０．７５ｍＬを加えて、洗浄した。最終的に、１分間、４℃で遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、洗浄液を除去した。精製キットのＱＩＡｐｒｅｐに吸着されている、プラスミドを、Ｅｌｕｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＥＢ）  ３０μＬにより、溶出させ、回収した。この精製済みプラスミドを含む液  ３０μＬのうち、２μＬをとり、蒸留水  ９８μＬを加えて、５０倍希釈液とした。【００７７】
表４に、各クローンについて、精製済みプラスミドを含む液中に含まれるＤＮＡ濃度を評価した結果を示す。【００７８】
【表４】
0004863280.tif 000005
選別クローン中のｃＤＮＡ断片の塩基配列解析
前記4種のクローンは、ｃｏｌｏｎｙ  ＲＣＲの結果から、保持しているプラスミド・ベクター中には同一の塩基長のｃＤＮＡ断片を有することが判明している。先ず、以下の手順で、このプラスミド・ベクター中に挿入されている、ｃＤＮＡ部分をＰＣＲ増幅した。【００７９】
選別クローンから回収、精製したプラスミド・ベクターを含む液について、そのＤＮＡ濃度を５００ｎｇ／μＬとなるように、濃度調整を行った。次いで、市販のシークエンス用ＤＮＡ試料調製キット：ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより、この精製済みプラスミド・ベクターを鋳型として、塩基配列解析用の試料を、
フォワード側プライマーとして、Ｔ７プロモータ部位の塩基配列に相当する、
Ｔ７プライマー：ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
リバース側プライマーとして、Ｔ３プロモータ部位の塩基配列に対して、相補的な
ＴＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣ
Ｔ３プライマー：ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ
をシークエンス・プライマーとして利用し、プラスミド・ベクター中に挿入されているｃＤＮＡを含む領域から調製した。表５に、用いたＤＮＡ鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【００８０】
【表５】
0004863280.tif 000006
調製された塩基配列解析用の試料の精製は、以下の手順で行った。【００８１】
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の０．５ｍL容チューブに移した。試料溶液  ５μＬ当たり、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  ０．５μＬ、９５％エタノール  １２．５μＬの比率で混合した液を、別途、１．５ｍL容チューブに予め用意した。この１．５ｍL容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入した。均一に混合した上で、氷冷下に、１０分間静置し、含まれるＤＮＡ断片をエタノール沈澱（析出）させた。２０分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出したＤＮＡ断片を沈積させ、上清を除去した。次いで、１２５μＬの７０％エタノールを加え、析出ＤＮＡ断片をリンスした。再び、５分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出ＤＮＡ断片を沈積させ、上清を吸引除去した。残った析出ＤＮＡ断片のペレットを乾燥した。
精製した解析用試料ＤＡＮ断片を、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）中に再分散した。ヴォルテックスにかけて、混合した後、遠心して液を集めた。９５℃、２分間加熱し、一本鎖ＤＮＡに分離し、氷冷した。一旦、ヴォルテックスにかけた後、遠心して、鋳型のプラスミドを沈積させた。この鋳型のプラスミドの分離処理後、−２０℃に保存した。その後、解析用試料ＤＡＮ断片は、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、塩基配列解析を行った。【００８２】
５’末端側からの配列解析結果と、３’末端側からの配列解析結果とを総合し、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質をコードするｍＲＮＡから調製された、ｃＤＮＡ断片の塩基配列が決定された。
（Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の組換え発現）
プラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ中へのＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質遺伝子の挿入
先ず、上記塩基配列に基づき、ＰＣＲ用ファワード・プライマーとリバース・プライマーとして、
ファワード・プライマー：ｐＥＴ−ＵＰ１（２８ｍｅｒ）
5-CACCATGACAACCTTCAAAATCGAGTCC
リバース・プライマー：ＳａｌＩ−ＬＰ１（３５ｍｅｒ）；３’末端に制限酵素ＳａｌＩの切断サイトを導入するため、対応する塩基配列が付加されている
5-CTCGTCGACCTACATGTCTCTTGGGGCGCTGTTGA
を作製し、単離クローンより回収したベクターを鋳型として、以下の条件でＰＣＲ増幅産物を得た。表６に、用いたＰＣＲ反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【００８３】
【表６】
0004863280.tif 000007
調製されたＰＣＲ増幅産物の精製は、以下の手順で行った。【００８４】
各２５μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、合計３回の反応液を合わせ、２μＬの反応液を採取し、１％アガロース・ゲル上で泳動し、目的分子量６７３ｂｐのＰＣＲ増幅産物を確認した。【００８５】
次いで、反応液から、産物ＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ法で濃縮した。反応液１容（７３μＬ）当たり、ＰＢ  ｂｕｆｆｅｒ  ５容を加え、ヴォルテックスにかけた後、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移した。３０秒間遠心し、析出するＤＮＡを沈積させ、上清を除去した。析出したＤＮＡを、ＰＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．７ｍＬで洗浄し、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）した。さらに、ＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬを加えて、室温で、１分間静置する。その後、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、上清を回収した。【００８６】
回収されたＤＮＡ溶液に、１０×ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ  液  ２μＬを添加した後、１．０％  ＴＡＥ  アガロース・ゲル上、各レーン  ＤＮＡ溶液  １２μＬを泳動した。目的の６８８ｂｐのバンドをゲルから切り出した。１．５ｍL容ｅｐｐｅｎチューブ中に、ゲル切片を入れ、ＤＮＡを回収した。【００８７】
図２に示すように、精製済み二本鎖ＤＮＡを、市販のプラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）中に挿入し、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを作製した。
加えて、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質が、融合パートナーのグルタチオン・Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末に、エンドペプチターゼ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａによる切断部位を具えたリンカー配列を介して連結されている、ＧＳＴ−ｔａｇｇｅｄ  蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＮＦＰをも作製した。すなわち、ＰＣＲ用ファワード・プライマーとリバース・プライマーとして、
ファワード・プライマー：ＧＳＴ−ＵＰ１（４３ｍｅｒ）；前記ｐＥＴ−ＵＰ１（２８ｍｅｒ）に対して、プロテーアーゼ：Ｆａｃｔｅｒ  Ｘａの切断アミノ酸配列をコードするATCGAAGGCCGCの部分配列と、５’末端に制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩの切断サイトを導入するため、対応する塩基配列GAATTCが付加されている
5-CGAATTCATCGAAGGCCGCATGACAACCTTCAAAATCGAGTCC
5-CACCATGACAACCTTCAAAATCGAGTCC
リバース・プライマー：ＳａｌＩ−ＬＰ１（３５ｍｅｒ）；３’末端に制限酵素ＳａｌＩの切断サイトを導入するため、対応する塩基配列が付加されている
5-CTCGTCGACCTACATGTCTCTTGGGGCGCTGTTGA
を利用して、単離クローンより回収したベクターを鋳型として、ＰＣＲ増幅産物を得た。表７に、用いたＰＣＲ反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【００８８】
【表７】
0004863280.tif 000008
調製されたＰＣＲ増幅産物の精製は、前記の手順に準じて行った。【００８９】
先ず、各２５μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、合計３回の反応液を合わせ、２μＬの反応液を採取し、１％アガロース・ゲル上で泳動し、目的分子量６８８ｂｐ（１９＋６６０＋９）のＰＣＲ増幅産物を確認した。その後の分離、精製手順、条件は同じであった。【００９０】
精製済み二本鎖ＤＮＡは、一旦、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）中に組み込み、選択マーカーにより、クローン選別を行った。各選別クローンを培養して、該クローン・プラスミドｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＮＦＰを増やした。培養後、含まれるプラスミドを精製し、その分子量サイズ、挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列の確認を行った。ついで、図３に示すように、上記Ｆａｃｔｅｒ  Ｘａの切断配列をコードする部位に続きＯＲＦ（翻訳枠）を含む、６８８ｂｐの挿入ＤＮＡのＥｃｏ  ＲＩ／ＳａｌＩ断片を、市販のＧＳＴタグ付き融合型タンパク質発現用プラスミド・ベクター：ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）中に挿入し、ＧＳＴタグ付き蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＮＦＰを作製した。
（Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質ＮＦＰの組換え発現体の蛍光特性）
先ず、図２に示す、該蛍光性タンパク質ＮＦＰの発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを用いて、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換大腸菌に関して、選択マーカーのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ耐性遺伝子を用いて、クローン選別を行った。【００９１】
選別されたクローンについて、ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ由来のプロモーターから、ＩＰＴＧを用いて、挿入された遺伝子の発現を誘導し、誘導後２時間、４時間経過後、蛍光性タンパク質の組換え発現の有無を確認した。また、ＩＰＴＧ発現誘導後、組換え発現されている蛍光性タンパク質が成熟型タンパク質となっていることは、形質転換株のコロニーを紫外線照射下、蛍光を示すことによって確認される。【００９２】
培養形質転換株について、ＩＰＴＧ発現誘導後、４時間経過した時点で培養菌体を回収した。菌体破砕後、遠心（１５，０００ｒｐｍ；１８，８００×ｇ）により分離した、可溶性画分（細胞質成分）ならびに不溶性画分（膜成分）にそれぞれ含まれるタンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。その結果、形質転換大腸菌の可溶性画分（細胞質成分）中に、分子量２５ｋＤａの新たなバンドが見出された。すなわち、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の分子量は、上記の推定アミノ酸配列から２４．７ｋＤａと推定され、図４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果に示される、分子量２５ｋＤａの新たなバンドは相当している。【００９３】
該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰの発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを保持する形質転換大腸菌を大量培養し、ＩＰＴＧ発現誘導によって産生された蛍光性タンパク質組換え体の分離精製を試みた。【００９４】
予め、推定アミノ酸配列に基づき、該蛍光性タンパク質組換え体の等電点（ｐＩ）を推測（算定）した結果、ｐＩ＝６．５０と算定された。その結果を参照して、可溶性画分（細胞質成分）を、アニオン交換カラム：ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、溶出条件：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ  １Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  Ａ  ｂｕｆｆｅｒ、  直線勾配  ０−２０％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ（０−２００ｍＭ  ＮａＣｌ濃度）において、４．８−８．８％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒの画分に該蛍光性タンパク質組換え体を回収した。【００９５】
次いで、該回収画分を、予め、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０  ＭＷ１０，０００ｃｕｔの条件で、濃縮した。この濃縮サンプルを、ゲル濾過：ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、溶出条件：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６において、分子量１００ｋＤａ以下の、蛍光画分として、該蛍光性タンパク質組換え体を精製、回収した。この段階で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったところ、図５に示すように、目的とする該蛍光性タンパク質組換え体がほぼ精製された状態となっている。【００９６】
この段階の精製タンパク質溶液サンプルは、図６に示すように、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）照射下では、黄緑色蛍光を発していることが確認される。なお、宿主大腸菌の可溶性画分（細胞質成分）を同一の精製処理を施した対照サンプルでは、勿論、蛍光は観測されていない。実際に、この段階の精製タンパク質溶液サンプルを用いて、蛍光スペクトルと、励起スペクトルの測定を行った。図７に示すように、波長５００ｎｍで蛍光強度をモニターしつつ測定した、励起スペクトルでは、波長５０７ｎｍに極大ピークが見出された。一方、波長５０８ｎｍで励起しつつ測定した、蛍光スペクトルでは、波長５１８ｎｍの極大ピークを持ち、黄色域（波長域５７０ｎｍ〜５９０ｎｍ）をカバーする蛍光が確認されている。【００９７】
さらに、ゲル濾過済みのタンパク質溶液サンプルを、ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、溶出条件：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ  １Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  Ａ  ｂｕｆｆｅｒ、  直線勾配  １０−２０％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ（１００−２００ｍＭ  ＮａＣｌ濃度）において、１２．０−１４．０％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒの画分に、精製済みの該蛍光性タンパク質組換え体を回収した。図１０に、上述するＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体の精製過程における各タンパク質溶液サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
また、図３に示す、ＧＳＴタグ付き蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＮＦＰを用いて、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換大腸菌、宿主大腸菌（陰性対照）、ならびに、クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ中に該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入されている単離クローン（陽性対照）を、それぞれ培地上で培養した。図８に示すように、各コロニーをＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ光（波長範囲４２０ｎｍ〜５００ｎｍ）照射下、観察したところ、得られた形質転換大腸菌のコロニーは、蛍光を発しており、ＧＳＴタグ付き蛍光性タンパク質の発現がなされていることが確認された。また、他のタンパク質と適正なリンカー配列を介して連結された融合型タンパク質として、組換え発現した際にも、翻訳されたペプチド鎖から、蛍光団を形成する内部トリペプチド部位の環化と、その後の酸化を経て、蛍光特性を有する成熟型蛍光性タンパク質となることが確認される。
（Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質ＮＦＰの組換え発現体の蛍光特性の温度依存性）
上記の手法で調製される、精製済みの該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体について、下記の評価法に従って、種々の温度におけるインキュベーション処理を施し、蛍光特性の処理温度に対する依存性を評価する。【００９８】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５  ｂｕｆｆｅｒ中に、タンパク質濃度０．５７７ｍｇ／ｍＬで精製済みの該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体を含む溶液各１０μＬを、温度：４，２０，３０，３７，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０℃において、１０分間、インキュベーション処理を行う。処理後、ＮＦＰ組換え体を含む溶液は氷冷（０℃）する。氷冷（０℃）された各溶液１０μＬに、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５  ｂｕｆｆｅｒ  １９２．５μＬを加え、希釈し、最終タンパク質濃度２０μｇ／ｍＬの希釈溶液とする。この希釈溶液を用いて、日立製分光蛍光光度計を使用して、波長５０７ｎｍで励起しつつ、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体の蛍光スペクトルを測定する。【００９９】
なお、インキュベーション処理を施していない、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体を含む希釈溶液において測定される蛍光スペクトルでは、波長５１８ｎｍの極大ピークをします。このインキュベーション処理を施していない際に測定される、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体の蛍光スペクトルを基準として、前記各種温度におけるインキュベーション処理を施した、ＮＦＰ組換え体を含む希釈溶液において測定される蛍光スペクトルを測定する。測定される蛍光スペクトル中、波長５１７ｎｍにおける蛍光強度を、横軸の前記インキュベーション処理時の処理温度に対して、プロットして、図１１に示すプロットを得た。【０１００】
図１１に示すプロットでは、処理温度７０℃以下の範囲では、インキュベーション処理後、氷冷（０℃）すると、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体の蛍光特性の劣化は見出されていない。一方、処理温度が７５℃以上となると、インキュベーション処理後、氷冷（０℃）しても、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体の蛍光特性の低下が観測されている。従って、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体は、処理温度７０℃以下の範囲では、インキュベーション処理後、氷冷（０℃）すると、熱変性に起因する構造変化に伴う、蛍光特性の劣化は無く、前記の温度範囲においては、高い温度安定性を示すと評価される。
（Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質ＮＦＰの組換え発現体の蛍光特性の薬剤耐性）
上記の手法で調製される、精製済みの該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体について、下記の評価法に従って、各種試薬（薬剤）の存在下においてインキュベーション処理を施し、蛍光特性の各種薬剤の作用に対する安定性を評価する。【０１０１】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５  ｂｕｆｆｅｒ中に、タンパク質濃度０．５７７ｍｇ／ｍＬで精製済みの該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体を含む溶液各１０μＬに、下に列記する、各種の試薬（薬剤）液１９２．５μＬを加え、最終タンパク質濃度２０μｇ／ｍＬの薬剤含有溶液とする。この薬剤含有溶液に、氷冷（０℃）下、１０分間、インキュベーション処理を施す。処理後、該薬剤含有溶液を用いて、日立製分光蛍光光度計を使用して、波長５０７ｎｍで励起しつつ、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体の蛍光スペクトルを測定する。【０１０２】
【表８】
0004863280.tif 000009
図１２には、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体を、各種試薬（薬剤）の存在下において、インキュベーション処理を施した後、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性（波長  ５１７ｎｍで測定した蛍光強度）を、希釈用バッファ液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５  ｂｕｆｆｅｒ）を添加した際の蛍光特性を基準として、相対値表示する。【０１０３】
有機溶剤を添加し、蛍光性タンパク質組換え発現体を覆っている溶媒和水分子が除去されると、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性は顕著に低下している。一方、タンパク質の変性剤の機能を示す、塩酸グアニジン、尿素を作用させると、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性は、相当の低下を受けている。但し、１％程度のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の作用では、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性には、何らの影響をも及ぼしていない。【０１０４】
タンパク質中のＣｙｓ−Ｃｙｓ結合を還元する作用を示す、２−メルカプトエタノール、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を作用させても、蛍光特性は、
若干の低下を受けるのみである。
（Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質ＮＦＰの組換え発現体の蛍光特性のｐＨ依存性）
上記の手法で調製される、精製済みの該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体について、下記の評価法に従って、種々のｐＨバッファ液を添加した液中におけるインキュベーション処理を施し、蛍光特性のｐＨに対する依存性を評価する。【０１０５】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５  ｂｕｆｆｅｒ中に、タンパク質濃度０．５７７ｍｇ／ｍＬで精製済みの該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体を含む溶液各１０μＬに、下に列記する、各種のバッファ液１９２．５μＬを加え、該バッファ液によるｐＨ調整された、最終タンパク質濃度２０μｇ／ｍＬの溶液とする。この種々のｐＨを示す溶液に、氷冷（０℃）下、１０分間、インキュベーション処理を施す。処理後、該種々のｐＨを示す溶液を用いて、日立製分光蛍光光度計を使用して、波長５０７ｎｍで励起しつつ、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体の蛍光スペクトルを測定する。
ｐＨ調整用バッファ液：
pH3.0   Glycine-HCl
pH3.5   Glycine-HCl
pH4.0   Acetate
pH4.5   Acetate
pH5.0   Acetate
pH5.5   Acetate
pH6.0   Phosphate
pH7.0   HEPES
pH8.0   Tris-HCl
pH8.5   Tris-HCl
pH8.9   Tris-HCl
pH10.0  Carbonate
pH10.5  Carbonate
pH11.0  Carbonate
pH11.5  Phosphate-NaOH
pH12.0  Phosphate-NaOH
pH12.5  Phosphate-NaOH
pH13.0  Phosphate-NaOH
pH13.6  NaOH
図１３には、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体を、各種バッファ液により調整されるｐＨにおいて、インキュベーション処理を施した後、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性（波長  ５１７ｎｍで測定した蛍光強度）を、各種バッファ液により調整されるｐＨ値に対して、プロットした結果を示す。少なくとも、ｐＨ  ６．０〜１１．０の範囲においては、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性は、高い安定性を示すことが確認される。【０１０６】
図１４には、前記の評価において、各種ｐＨの溶液中で測定された、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体の蛍光スペクトルについて、ｐＨ３．０〜ｐＨ１１．０における測定結果を併せて示す。少なくとも、ｐＨ３．５〜ｐＨ１１．０の範囲においては、波長  ５１７ｎｍで測定した極大ピークの蛍光強度は変化するものの、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体の蛍光スペクトルの相対的な形状は、概ね保持されていることが確認される。
（Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来蛍光性タンパク質ＮＦＰの組換え発現体の蛍光特性の紫外光照射に対する耐性）
上記の手法で調製される、精製済みの該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体について、下記の評価法に従って、波長３０２ｎｍの紫外光を長時間照射する処理を施し、蛍光特性の前記紫外光の長時間照射に対する安定性を評価する。【０１０７】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５  ｂｕｆｆｅｒ中に、タンパク質濃度０．５７７ｍｇ／ｍＬで精製済みの該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体を含む溶液に、照射光量  ７３００μＷ／ｃｍ２で、波長３０２ｎｍの紫外光を６０分間連続照射する処理を施す。その間、照射開始前（照射時間０分）と、照射開始後、０，１，５，１０，１５，３０，４５分間経過した時点、ならびに、照射終了時（照射時間６０分）において、各１０μＬのサンプルを採取する。採取された各サンプル溶液１０μＬに、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５  ｂｕｆｆｅｒ  １９２．５μＬを加え、希釈し、最終タンパク質濃度２０μｇ／ｍＬの希釈溶液とする。この希釈溶液を用いて、日立製分光蛍光光度計を使用して、波長５０７ｎｍで励起しつつ、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体の蛍光スペクトルを測定する。【０１０８】
図１７には、本発明にかかるＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質組換え発現体に、波長３０２ｎｍの紫外光を連続照射する処理を施した後、該蛍光性タンパク質組換え発現体が示す蛍光特性（波長  ５１７ｎｍで測定した蛍光強度）を、照射前における蛍光特性を基準として、相対値表示する。図１７に示す結果より、該蛍光性タンパク質ＮＦＰ組換え体は、少なくとも、波長３０２ｎｍの紫外光による連続照射時間が、６０分間以内の範囲では、実質的に蛍光特性の劣化を受けないことが確認される。
（Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質のヒト細胞内における組換え発現）
プラスミドｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯ中へのＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質遺伝子の挿入
上述するＲｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質の発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰの作製手順に準じて、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰのコード遺伝子に基づき、ＰＣＲ法で調整される、精製済み二本鎖ＤＮＡを、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）のクローニング・サイト中に挿入し、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質のヒト細胞内発現用発現ベクターを作製した。図１５に作製された該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰのヒト細胞内発現用発現ベクターの構成を示す。なお、かかる発現ベクター中に挿入されている二本鎖ＤＮＡ断片は、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰのコード遺伝子と同じ塩基配列を有し、ヒトにおけるコドン選択に適合するようなコドン変換は施されていない。すなわち、上記発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰ中に挿入される二本鎖ＤＮＡ断片と同じものである。【０１０９】
作製されたプラスミドの回収、精製は、市販のプラスミド精製キット；ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ  製）を用いて行った。
Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質のヒト細胞内発現用発現ベクターのＨｅＬａ細胞への導入
精製済みの、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰのヒト細胞内発現用発現ベクターを、ＨｅＬａ細胞中に、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法を適用して導入する。宿主のＨｅＬａ細胞は、血清添加培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１００μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を用いて、１００ｍｍ  Ｄｉｓｈ上で、７０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態まで培養されたものを利用する。その際、発現ベクター・プラスミド溶液（ＤＮＡ含有量：５ｎｇ／ｍＬ）６．０μＬを、市販のＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ用試薬液；ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ  製）５０．０μＬに加え、この混合液を１０分間攪拌する。ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ処理後、ＨｅＬａ細胞は、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃に保持し、２４〜４８時間インキュベーション処理を施し、処置に伴う細胞損傷の回復と、培養を行う。【０１１０】
この発現ベクターを導入されたＨｅＬａ細胞内における、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰの組換え発現を誘導したところ、図１６に一例を示すように、培養細胞中の一部において、その細胞全体に蛍光性タンパク質ＮＦＰの組換え体に由来する蛍光が観測された。すなわち、ヒト由来のＨｅＬａ細胞内においても、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰのコード遺伝子に基づき、蛍光性タンパク質ＮＦＰの組換え体へと翻訳がなされ、また、成熟型の蛍光性タンパク質ＮＦＰへと細胞内における翻訳後のプロセッシングが進行したことを明確に示している。【０１１１】
従って、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰのコード遺伝子は、ヒト細胞におけるコドン選択に適合させるコドン変換を施さなくとも、十分に、各種のヒト由来の細胞系を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、該宿主細胞内で発現可能なｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質のコード遺伝子として利用することが可能であることが検証される。
さらに、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰが、実際に、宿主細胞内で発現可能なｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用可能であることを、下記のように検証した。【０１１２】
汎用されている蛍光性マーカー・タンパク質ＥＧＦＰと同様に、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰを対象タンパク質のＮ末に連結してなる融合タンパク質は、宿主細胞内で発現可能であり、また、発現される融合タンパク質は、Ｎ末部分の蛍光性タンパク質ＮＦＰに由来する蛍光特性、ならびに、Ｃ末部分の対象タンパク質の機能を保持することを検証する。【０１１３】
汎用されている蛍光性マーカー・タンパク質ＥＧＦＰとヒト・細胞質β−アクチンとの融合タンパク質発現用の市販プラスミド・ベクター；ｐＧＦＰ−Ａｃｔｉｎ（５８２０ｂｐ：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ＥＧＦＰとヒト・α−チューブリンとの融合タンパク質発現用の市販プラスミド・ベクター；ｐＧＦＰ−Ｔｕｂ（６０４５ｂｐ：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を利用し、その蛍光性マーカー・タンパク質ＥＧＦＰのコード配列部分を、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰのコード配列により置き換え、ＮＦＰ−Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  β−Ａｃｔｉｎ（１１２８ｂｐ、３７５ａａ）融合タンパク質、ならびに、ＮＦＰ−Ｈｕｍａｎ  α−ｔｕｂｕｌｉｎ（ｉｎ  ｆｒａｍｅ  ｗｉｔｈ  ＲｅｄＧＦＰ  １３５６ｂｐ、４５１ａａ）融合タンパク質の組換え発現用ベクターを、下記の手順で構築する。【０１１４】
Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰのコード遺伝子に対して、開始コドンの直前に、ｋｏｚａｋ配列（GCCACC）を付加し、上流の非翻訳領域に制限酵素ＮｈｅＩ認識配列（GCTAGC）を設け、一方、終止コドンを除き、リンカー配列のコード塩基配列の一部を構成する塩基配列（T CCG GAC TCA GAT）を付加し、その下流に制限酵素ＳａｌＩの認識配列（GTCGAC）を設けるため、下記するファワード・プライマー：NFP NheI/Kozak-UP1とリーバース・プライマー：NFP SalI-LP1を用いて、ＰＣＲ増幅を行う。【０１１５】
NFP NheI/Kozak-UP1  48mer
5'-CCA GCT AGC GCT ACG GTC GCC
ACC ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC-3'
NFP SalI-LP1  45mer
5'-AAA GTC GAC ATC TGA
GTC CGG ACA TGT CTC TTG GGG CGC TGT TGA-3'
市販プラスミド・ベクターのｐＧＦＰ−ＡｃｔｉｎならびにｐＧＦＰ−Ｔｕｂ中、蛍光性マーカー・タンパク質ＥＧＦＰのコード配列部分を、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩの消化処理を施し、切除する。一方、得られたＰＣＲ産物（７０３ｂｐ）は、新たに導入した制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩ部位で消化する。得られるＤＮＡ断片と、それぞれ、制限酵素消化したプラスミド・ベクターのベクター断片と連結して、融合タンパク質の組換え発現用ベクターを構築する。なお、調製されたプラスミドの精製は、市販の精製キット；ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社）を使用しておこなった。【０１１６】
作製された、二種の発現ベクターは、その塩基配列解析を行い、挿入されたＰＣＲ産物由来のＤＮＡ断片と、連結部の塩基配列を確認し、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰとＣ末側の対象タンパク質とのコード配列が、リンカー部を介して、フレーム・シフト無く連結されていることを確認した。特に、該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰとＣ末側の対象タンパク質との間に設けるリンカー部のアミノ配列は、前記リーバース・プライマー：NFP SalI-LP1中に含まれる、塩基配列（T CCG GAC TCA GAT）と、その下流の制限酵素ＳａｌＩの認識配列（GTCGAC）における切断部を、前記ベクター断片と連結することで、下記の塩基配列： 
TCC GGA CTC AGA TGT CGA GCT 
AGG CCT GAG TCT ACA GCT CGA
によりコードされる、部分アミノ酸配列：  SGLRCRA  7a.a.  であることを確認した。【０１１７】
上記のトランスフェクション手順に準じて、各融合タンパク質のヒト細胞内発現用ベクターを、それぞれＨｅＬａ細胞中に、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法を適用して導入する。遺伝子組換え後、１６時間培養した時点で、培養されるＨｅＬａ細胞のうち、蛍光を発するものが見出された。蛍光顕微鏡観察を行ったとところ、上述する蛍光性タンパク質ＮＦＰのみの発現用ベクターを導入したＨｅＬａ細胞では、細胞全体から均一な蛍光が観測されるが、前記蛍光性タンパク質ＮＦＰとの融合タンパク質発現用ベクターを導入したＨｅＬａ細胞では、細胞内における、蛍光強度の分布は、局在を示していた。【０１１８】
すなわち、ヒト細胞内において、融合タンパク質として組換え発現でき、翻訳後、そのＮ末部分の該Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰは、適正なホールディングを経て、蛍光特性を発揮しており、一方、Ｃ末部分のβ−Ａｃｔｉｎ、あるいは、α−ｔｕｂｕｌｉｎの細胞内での局在に伴い、局在した蛍光強度分布として、観測されている。図１８に、蛍光性タンパク質ＮＦＰとの融合タンパク質発現用ベクターを導入したＨｅＬａ細胞において発現される、ＮＦＰ−Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  β−Ａｃｔｉｎ（１１２８ｂｐ、３７５ａａ）融合タンパク質に起因する、細胞内における、蛍光強度の分布の局在を、蛍光顕微鏡によって観測した結果を示す。この結果は、Ｒｅｄ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ由来の蛍光性タンパク質ＮＦＰのコード遺伝子は、実際に、各種のヒト由来の細胞系を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、該宿主細胞内で発現可能なｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質のコード遺伝子として利用することが可能であることの査証となっている。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の蛍光性タンパク質は、哺乳動物細胞を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、該宿主細胞内で発現可能なｉｎ  ｖｉｖｏ  蛍光性マーカー・タンパク質として利用することが可能である。
【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１６】
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【配列表】
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