(57)【要約】【課題】相転移温度を有する生体関連物質固定化用ゲルをより安定化するための方法を提供する。【解決手段】界面活性剤を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化剤。および、以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化方法。  １）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、前記安定化剤を添加する工程  ２）安定化剤を添加した溶液をゲル化させる工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化剤。
【請求項２】
界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項１に記載の安定化剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の安定化剤と、相転移温度を有するゲルを形成するモノマーとを含む、生体関連物質固定化用ゲルの形成溶液。
【請求項４】
モノマーが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項３に記載の溶液。
【請求項５】
請求項３または４に記載の溶液から形成されたゲルに生体関連物質が固定された、生体関連物質固定化ゲル。
【請求項６】
請求項５に記載のゲルが中空管状体の中空部に充填されている、ゲル充填中空管状体。
【請求項７】
請求項５に記載のゲルが基盤にアレイ状に配列された、生体関連物質固定化用ゲルマイクロアレイ。
【請求項８】
請求項３または４に記載の溶液をゲル化させる工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化方法。
【請求項９】
請求項３または４に記載の溶液をゲル化させる工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの形成方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化方法。
１）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、請求項１または２に記載の安定化剤を添加する工程
２）安定化剤を添加した溶液をゲル化させる工程
【請求項１１】
モノマーが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの形成方法。
１）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、請求項１または２に記載の安定化剤を添加する工程
２）安定化剤を添加した溶液をゲル化させる工程
【請求項１３】
モノマーが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルマイクロアレイの製造方法。
１）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、請求項１または２に記載の安定化剤を添加する工程
２）安定化剤を添加した溶液を用いて、ゲルをアレイ状に配列させた基盤を製造する工程
【請求項１５】
ゲルをアレイ状に配列させた基盤を製造する工程が、次の工程を含むものである、請求項１４に記載の方法。
２−１）中空管状体を複数本集束する工程
２−２）得られた集束物の各管状体の中空部に工程１）で得られた溶液を充填する工程
２−３）充填した溶液からゲルを形成する工程
２−４）集束物を管状体の長手方向と交差する方向で切断する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相転移温度を有するゲルの安定化方法、および相転移温度を有するゲルをマイクロアレイに利用する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
1990年代後半にトランスクリプトーム解析を推し進める技術として登場したマイクロアレイは、その作製原理によりスタンフォード方式（非特許文献１）とAffymetrix社方式（非特許文献２）の２つに大別される。しかし、これらに代表されるマイクロアレイの製造方法は、いずれの方式も固体基盤上に核酸を検出するための生体関連物質（以下プローブと称する場合がある）を結合させることを基本思想としている。
【０００３】
このプローブを結合させる基盤として、ゲルを形成したものを用い、形成したゲルを担体として利用する技術が近年提案され、既に実用化されている。例えば、スライドガラス基板上にゲルをコーティングし、プローブをガラス基板上のゲルに固定化させる方法が開示されている（特許文献１）。
【０００４】
更に、プローブ固定化ゲルを貫通孔で区画化した貫通孔型のゲル利用マイクロアレイの技術も開示されている。当該技術のうちの一つである貫通孔に中空繊維を利用する技術として、特許文献２に記載の技術がある。この技術では、先ず中空繊維を３次元に配列させ、樹脂で固化させて集束物を得る。そして、この集束物の各中空繊維の中空部に、プローブを固定化したゲルを導入し、これを繊維軸に直交する方向に薄片化する。これにより、マイクロアレイを得る。薄片化されたマイクロアレイの各アレイスポットは、中空繊維で区画化されている。また、アレイ状に配列された各中空繊維の中空部にはゲルが充填されている。
【０００５】
ゲルをプローブ固定化担体として利用する最大の利点としては、ゲルの３次元網目構造をプローブ固定に利用できることである。プローブを従来の固体基盤のような２次元平面上ではなく、３次元空間に固定化できることは、ＤＮＡマイクロアレイにおけるプローブと核酸試料とのハイブリダイゼーション反応を効率的に行う上で、極めて有用である。
【０００６】
ただし、ゲルをプローブの固定化担体とし、且つゲルの機能を最大限に発揮させるためには、幾つかの技術的課題が存在する。まずは、ゲルの網目サイズの最適化である。ゲル中で核酸ハイブリダイゼーション等の反応を効率良く行うには、プローブと検体との衝突頻度を低下させることなく、且つ検体がゲルの網目構造中をある程度自由に移動できる程にゲルの網目に空間を持たせる必要がある。この課題に対して、最近、相転移温度を有するポリマーをゲル材に利用する方法、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下ＮＩＰＡＡｍと称する場合がある）を分子構造に持つゲル材の利用が提案されている（特許文献３）。ＮＩＰＡＡｍのポリマーは、３７℃付近で相転移温度を有し、この温度を境にポリマーの高次構造が劇的に変化する特性を有している。このポリマーの高次構造変化を検体の拡散性を向上させることに利用できれば、ハイブリダイゼーション反応の反応効率を劇的に高めることが可能となる。
【０００７】
【非特許文献１】Science 270,467-470 (1995)
【非特許文献２】Science 251,767-773 (1991)
【特許文献１】WO2000-31148
【特許文献２】特許第3654894号公報
【特許文献３】特開2005-290107号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ＮＩＰＡＡｍなどをゲル構造の骨格に用いると、ゲルの形状安定性が低下する場合があった。即ち、ＮＩＰＡＡｍなどから形成したゲルは、相転移温度で高次構造が変化する際、ゲルの形状が十分に保持できない場合があった。ゲルをマイクロアレイのプローブ担体として利用するためには、ゲル自体の強度安定性は極めて重要である。少なくともアレイのゲルスポットとして、アッセイ時の各操作に耐えるだけの形状保持安定性を備えているのが好ましい。例えば、核酸のハイブリダイゼーションを行う場合、まず、マイクロアレイをハイブリダイゼーション溶液中に封入し、通常３０℃〜９５℃の温度範囲から所定温度条件を選択し、一昼夜反応させる。その後マイクロアレイを該溶液から取り出し、特異的ハイブリダイゼーション反応以外の結合を取り除くために、マイクロアレイを塩溶液中に浸漬させる洗浄操作を数回行う。こうした一連のアッセイ操作中における温度変化、溶液の組成変化、濃度の変化の下でもゲルが崩れることなく安定に形状が維持されることが、ゲルをマイクロアレイのプローブ担体として利用するための好ましい条件となる。
【０００９】
このような状況の下、相転移温度を有する生体関連物質固定化用ゲルをより安定化するための方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
こうした状況の下、本発明者らは、鋭意検討した結果、ゲル形成溶液中に界面活性剤を添加することで、相転移温度を有する生体関連物質固定化用ゲルの形状安定性が向上することなどを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、次のものである。
【００１１】
（１）界面活性剤を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化剤。
（２）界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、上記（１）に記載の安定化剤。
（３）上記（１）または（２）に記載の安定化剤と、相転移温度を有するゲルを形成するモノマーとを含む、生体関連物質固定化用ゲルの形成溶液。
（４）モノマーが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、上記（３）に記載の溶液。
（５）上記（３）または（４）に記載の溶液から形成されたゲルに生体関連物質が固定された、生体関連物質固定化ゲル。
（６）上記（５）に記載のゲルが中空管状体の中空部に充填されている、ゲル充填中空管状体。
（７）上記（５）に記載のゲルが基盤にアレイ状に配列された、生体関連物質固定化用ゲルマイクロアレイ。
（８）上記（３）または（４）に記載の溶液をゲル化させる工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化方法。
（９）上記（３）または（４）に記載の溶液をゲル化させる工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの形成方法。
（１０）以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化方法。
１）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、上記（１）または（２）に記載の安定化剤を添加する工程
２）安定化剤を添加した溶液をゲル化させる工程
（１１）モノマーが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、上記（１０）に記載の方  法。
（１２）以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの形成方法。
１）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、上記（１）または（２）に記載の安定化剤を添加する工程
２）安定化剤を添加した溶液をゲル化させる工程
（１３）モノマーが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、上記（１２）に記載の方  法。
（１４）以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルマイクロアレイの製造方法。
１）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、上記（１）または（２）に記載の安定化剤を添加する工程
２）安定化剤を添加した溶液を用いて、ゲルをアレイ状に配列させた基盤を製造する工程
（１５）ゲルをアレイ状に配列させた基盤を製造する工程が、次の工程を含むものである、上記（１４）に記載の方法。
２−１）中空管状体を複数本集束する工程
２−２）得られた集束物の各管状体の中空部に工程１）で得られた溶液を充填する工程  ２−３）充填した溶液からゲルを形成する工程
２−４）集束物を管状体の長手方向と交差する方向で切断する工程
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、相転移温度を有する生体関連物質固定化用ゲルの安定化方法が提供される。本発明の好ましい態様によれば、ゲル化させる前に、相転移温度を有するゲルを形成するゲル形成溶液に界面活性剤を含有させる。これにより、相転移による高次構造変化にも耐えうる、より形状安定性が向上したゲルを形成させることが出来る。また、本発明の好ましい態様によれば、ゲルを利用するマイクロアレイの製造方法なども提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００１４】
１．生体関連物質固定化用ゲルの安定化剤および生体関連物質固定化用ゲルの安定化方法
前述のように、従来、相転移温度を有する生体関連物質固定化用ゲルをより安定化する方法が求められていた。本発明者らは、鋭意検討した結果、ゲル形成溶液中に界面活性剤を含有させることで、相転移温度を有する生体関連物質固定化用ゲルの形状安定性が向上することなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、界面活性剤を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化剤を提供する。
【００１６】
また、本発明は、以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化方法を提供する。
１）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、上記本発明の安定化剤を添加する工程
２）安定化剤を添加した溶液をゲル化させる工程
さらに、本発明は、後述のゲルの形成溶液をゲル化させる工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの安定化方法を提供する。
【００１７】
このように、本発明の好ましい態様によれば、ゲル化させる前に、相転移温度を有するゲルを形成するゲル形成溶液に界面活性剤を含有させる。これにより、相転移による高次構造変化にも耐えうる、より形状安定性が向上したゲルを形成させることが出来る。
ここで、「含有させる」とは、界面活性剤をゲル形成溶液に添加して溶液中に界面活性剤を含有させること、および界面活性剤とゲル形成溶液とを混合して溶液中に界面活性剤を含有させることのいずれも意味する。
【００１８】
また、「生体関連物質」とは、プローブとして使用しうる生物学的材料を意味し、例えばデオキシリボ核酸（DNA）や、リボ核酸（RNA）、蛋白質、脂質等が挙げられる。これら生体関連物質は、市販品又は生細胞等から得ることができる。例えば、生細胞からのDNAの抽出は、Blinらの方法〔Nucleic.Acids.Res.3.2303(1976)〕等により、また、RNAの抽出は、Favaloroらの方法〔Methods.Enzymol.65.718(1980)〕等により実施することができる。また、DNAとしては、鎖状若しくは環状のプラスミドDNA又は染色体DNAが用いられる。さらには、制限酵素若しくは化学的に切断したDNA断片、試験管内で酵素等により合成されたDNA又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
上記の方法等により調製された生体関連物質は、ゲルに固定される。ここで「固定」とは、ゲル中に生体関連物質を保持させることを意味する。ゲルに生体関連物質を固定する方法としては、重合反応の際、末端にビニル基を導入した生体関連物質を加え、ゲルの構成成分と共重合させる方法（WO02/62817号公報参照）、ヒドラジン処理したゲルを準備し、アミノ基を有する生体関連物質を反応させる方法（特表平6-507486号公報参照）等が例示できる。
【００１９】
また、「安定化」とは、安定化剤を添加した相転移温度を有するゲルの形状が、安定化剤を添加していないものと比較して、相転移温度以上の温度でより保たれることをいう。安定化の程度は、例えば、安定化剤を添加したゲルと安定化剤を添加していないゲルを用いたゲルマイクロアレイを作製した後、ゲル脱落スポットの発生率を両者で比較することで、判断することができる。ゲル脱落スポットの発生率が低い方が、より安定化の程度が高いと判断することができる。
【００２０】
さらに、「相転移温度を有する」とは、相転移温度により、ポリマー分子の高次構造が変化する温度を有することを意味する。
【００２１】
本発明で用いる界面活性剤は、親水性と親油性の両官能基を有する両親媒性の物質であれば良く、限定されない。親水性基は、ノニオン性のもの、イオン性のもののいずれでもよい。また親油性基は、脂肪族のもの、芳香族のものの他、親油性があるものであればいずれでもよく、特に限定されない。ノニオン系の界面活性剤としては、ノニルフェニルアルコール、アルキルグルコシドなどの低分子系のもの、またはポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどのような高分子系のものの他、一般に用いられているものを使用することができる。ノニオン系の界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系の界面活性剤が挙げられる。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系の界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０（ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０（ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノステアレート）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレート）等がある。また、イオン性のものとしては、アニオン性のものとカチオン性のものに大別されるが、特に制限するものではない。アニオン性のものとしては、例えば、アルキル硫酸塩系のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどに代表される硫酸基やスルホン酸基を有するものの他、カルボン酸、リン酸などが挙げられる。カチオン性のものとしては、アルキルアンモニウム塩が挙げられる。中でも界面活性剤としては、ＳＤＳおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）系の界面活性剤を用いるのが好ましく、特に、ＳＤＳを用いるのが好ましい。
２）溶液をゲル化させる工程については後述する。
【００２２】
２．生体関連物質固定化用ゲルの形成溶液および生体関連物質固定化用ゲル
また、本発明の好ましい態様によれば、前記本発明の安定化剤と、相転移温度を有するゲルを形成するモノマーとを含む、生体関連物質固定化用ゲルの形成溶液が提供される。
さらに、本発明の好ましい態様によれば、上記ゲル形成溶液から形成されたゲルに生体関連物質が固定された、生体関連物質固定化ゲルが提供される。
【００２３】
ここでいうゲルは、相転移温度を有するゲルである。このようなゲルは、例えば、界面活性剤の存在下、下記の相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを、それぞれ単独で重合させて形成するようにしても良いし、また他のモノマーと共重合させて形成させるようにしてもよい。また、例えば、界面活性剤の存在下、相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを架橋剤と共に重合させることで製造することも可能である。
【００２４】
相転移温度を有するゲルを形成するモノマーとしては、ゲル化したときに、相転移温度を有するゲルを形成することができる既存のすべてのモノマーを用いることができ、限定されない。そのようなモノマーとしては、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−アクロイルピロリドン、Ｎ−アクロイルピペリジンなどを挙げることができる。中でも、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを選択することが特に望ましい。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーは、３７℃付近に相転移温度を有し、この温度を境にポリマーの構造に大きな変化が起こる。
【００２５】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーは、３７℃以上にすると、ポリマー鎖の凝集が起こり、高次構造が大きく変化する。その結果、光学的透過性が著しく低下する。また３７℃未満に温度を下げると、ポリマーは元の構造に戻り、光学的透明性は再び元の透明度に回復するという感温特性を有している。このような特性と同質の特性を示すポリマーであれば如何なるポリマーでも本発明の好ましい態様におけるゲルに適用させることが出来る。しかしながら、このような温度によって高次構造が大きく変化するポリマーを用いる場合、高次構造変化の前後でゲルの形状を保持させることに課題を残す。つまり、高次構造変化によって、ゲルの形状が保たれず、ゲルの一部が脱落するなどの現象が懸念される。このような高次構造変化を起こすゲルであっても、例えば、界面活性剤をゲル中に介在させて、ゲルを形成させることで、ゲルの形状をより安定化させることができる。
【００２６】
また、架橋剤としては、少なくとも２つのエチレン性不飽和結合を持つ多官能単量体、例えばメチレンビスアクリルアミドおよびポリエチレングリコールジアクリレートを例示することができる。
【００２７】
また、ゲル形成溶液には、相転移温度を有するゲルを形成するモノマー、架橋剤および界面活性剤、後述の開始剤の他、エチレン性不飽和結合を有する生体関連物質を含有させることができる。
【００２８】
相転移温度を有するゲルを形成させるために使用されるモノマーの、ゲル形成溶液中での含有量は、２重量％〜１０重量％であることが好ましく、特に、３重量％〜５重量％がより好ましい。
また、架橋剤の、ゲル形成溶液中での含有量は、全モノマー量に対する架橋剤の添加比率が、５重量％〜１５重量％であることが好ましく、特に、８重量％〜１０重量％がより好ましい。
さらに、界面活性剤の、ゲル形成溶液への添加量は、０．５重量％〜１．０重量％であることが好ましく、特に、０．１重量％〜０．２重量％がより好ましい。
【００２９】
形成するゲルとしては、より具体的には、例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリメタクリルアミドゲル、ポリイソプロピルアクリルアミドゲル、ポリイソプロピルメタクリルアミドゲル、ポリジメチルメタクリルアミドゲル、およびジメチルアクリルアミドゲルなどのアクリルアミド系ゲル、またはポリビニルピロリドンゲル、メタクリル酸2-(ジメチルアミノ)エチルゲル、2-ジメチルアミノエチルメタクリレートゲル、ビスアクリルアミドメチルエーテルゲル、ポリ-(2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸)ゲル、ポリアクリル酸ゲル、ポリ-(N,N-アクリル酸ジメチルアミノエチルエステル)ゲル、ポリ-(N-アクリロイルアミノエトキシエタノール)ゲル、ポリ-（N-アクリロイルアミノプロパノール）ゲル、ポリアクリロキシプロパンスルホン酸ゲル、ポリイソブチレン・マレイン酸共重合体ゲル、ポリエチレンイミンゲル、ポリエチレンオキシド・プロピレンオキシド共重合体ゲル、ポリエチレンオキシド・ポリエチレングリコールゲル、ポリエチレン−酢酸ビニルコポリマーゲル、ポリジオキソランゲル、ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドゲル、ポリ-(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)・ポリメタクリル酸2-ヒドロキシエチルゲル、ポリビニルピリジンゲル、ポリビニルメチルエーテルゲル、ポリプロピレンオキシドゲル、およびポリ-(N-メチロールアクリルアミド)ゲルなどを挙げることができる。
【００３０】
３．  生体関連物質固定化用ゲルの形成方法
また、本発明は、前述の本発明のゲルの形成溶液をゲル化させる工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの形成方法を提供する。
さらに、本発明は、以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルの形成方法を提供する。
１）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、前記本発明の安定化剤を添加する工程
２）安定化剤を添加した溶液をゲル化させる工程
【００３１】
先ず、１）溶液に、安定化剤を添加する工程について説明する。
ゲルの形状を安定化させるためには、ゲル形成溶液がゲル化する時に界面活性剤が該溶液中に存在していることが重要である。従って、界面活性剤を含む安定化剤のゲル中への添加は、例えばゲル形成溶液を調製する段階で行い、その後モノマー溶液を重合させることが好ましい。
【００３２】
次に、２）溶液をゲル化させる工程について説明する。
溶液に安定化剤を添加した後、該溶液を種々の方法でゲル化させる。ゲル化の方法は、公知の方法を用いることができ、特に限定されない。ゲル化の方法としては、例えば、モノマーをラジカル重合により架橋する方法といった一般的方法が利用できる。形成されるゲルが、前述の界面活性剤の存在下、相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを架橋剤と共に重合させることで製造するゲルである場合にも、重合の手法は一般的な手法が利用でき、特に制限されるものではない。基盤として、中空管状体を使った貫通孔型基盤を用いる場合には、例えば、実施例に記載した手法でゲル化させることができる。
【００３３】
また、重合には、開始剤を用いても良い。重合に用いる開始剤は、特に制限はなく、一般的に知られているアゾ化合物系のもの、過硫酸塩のもの、過酸化物などの開始剤が利用できる。そのような開始剤としては、例えば、2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]ジハイドロクロライドおよびＫＰＳ等を挙げることができる。
【００３４】
４．  ゲル充填中空管状体
また、本発明の好ましい態様によれば、前記本発明の生体関連物質固定化用ゲルが中空管状体の中空部に充填されている、ゲル充填中空管状体が提供される。
【００３５】
本発明の好ましい態様において、中空管状体は、ガラス管、ステンレス管、中空繊維等が例示できる。加工性、取り扱いの容易さを考慮すると中空繊維を使用することが好ましい。本発明において用いることができる繊維としては、合成繊維、半合成繊維、再生繊維、無機繊維のごとき化学繊維、及び天然繊維等が挙げられる（特開2000-270878号公報および特許3654894号公報等参照）。
合成繊維の代表例としては、ポリアミド系の各種繊維、ポリエステル系の各種繊維、アクリル系の各種繊維、ポリカーボネートを用いた繊維等が挙げられる。
【００３６】
半合成繊維の代表例としては、セルロース系誘導体系各種繊維などが挙げられる。
再生繊維の代表例としては、ビスコース法や銅−アンモニア法により得られるセルロース系の各種再生繊維などが挙げられる。
【００３７】
無機繊維の代表例としては、ガラス繊維、炭素繊維などが挙げられる。
天然繊維の代表例としては、植物繊維、動物繊維、鉱物繊維などが挙げられる。
【００３８】
天然繊維以外の中空繊維は、特殊なノズルを用いて公知の方法で製造することができる。ポリアミド、ポリエステル、ポリオレフィン等は溶融紡糸法が好ましく、ノズルとしては馬蹄型やC型ノズル、２重管ノズルなどを使用することができる。
溶融紡糸ができない合成高分子、半合成繊維又は再生繊維に用いられる高分子の紡糸は溶剤紡糸が好ましく用いられる。この場合も、溶融紡糸と同じく２重管ノズルを用いて、中空部に芯材として適切な液体を充填しながら紡糸することにより連続した中空部を有する中空繊維を得る。
また、中空管状体は、市販のものを用いても良い。
【００３９】
上記の通り調製された中空管状体または市販の中空管状体は、本発明の好ましい態様における生体関連物質固定化用ゲルを保持する基本単位とすることができる。
【００４０】
５．  生体関連物質固定化用ゲルマイクロアレイ
また、本発明は、前記本発明の生体関連物質固定化用ゲルが基盤にアレイ状に配列された、生体関連物質固定化用ゲルマイクロアレイを提供する。
このように、本発明の好ましい態様における生体関連物質固定化用ゲルは、マイクロアレイの構成部材としても使用できる。
【００４１】
ここで用いる基盤としては、例えば、固体基盤や、中空管状体を使った貫通孔型基盤などを挙げることができる。
固体基盤としては、ガラス基板、シリコンウェハー、合成樹脂等が利用でき、特に制限はない。また固体基盤の形状に関しても、平板、棒状、球状等の形状のものが利用でき、特に制限はない。また、固体基盤としては、例えば、複数の溝または貫通孔を有するものも使用することができる。
また、中空管状体を使った貫通孔型基盤としては、例えば、中空管状体を複数本集束し、集束物を管状体の長手方向と交差する方向で切断することで得られる基盤を挙げることができる（特許第3654894号公報等）。
【００４２】
ここで、「アレイ状に配列された」とは、所定の大きさおよび形状をしたゲル（以下ゲルスポットと称する場合がある）が規則的に配列されたことをいう。本発明の好ましい態様におけるマイクロアレイは、これらの基盤の複数の区画に生体関連物質固定化用ゲルが配置されたものであり、これにより、ゲルが、基盤にアレイ状に配列されている。区画は、例えば、基盤の溝や貫通孔などである。
各区画に保持される生体関連物質の種類は、区画毎に異なっていてもよい。また、同一種類の固定化ゲルを複数個、グループ化してマイクロアレイ上に配置しても良い。また、生体関連物質のかわりに、例えば色素が固定されたゲルを区画に保持することにより、区画の座標を決定することができる。
各区画の表面積は、例えば、10-6m2以下である。下限は生体関連物質の検出が可能能である限り特に制限されるものではない。
【００４３】
６．  生体関連物質固定化用ゲルマイクロアレイの製造方法
また、本発明は、以下の工程を含む、生体関連物質固定化用ゲルマイクロアレイの製造方法を提供する。
１）相転移温度を有するゲルを形成するモノマーを含む溶液に、前記本発明の安定化剤を添加する工程
２）安定化剤を添加した溶液を用いて、ゲルをアレイ状に配列させた基盤を製造する工程
【００４４】
上記１）安定化剤を添加する工程は、前述と同様である。
【００４５】
次に、上記２）ゲルをアレイ状に配列させた基盤を製造する工程について説明する。
基盤としては、例えば、前述の固体基盤や、中空管状体を使った貫通孔型基盤などを用いることができる。
【００４６】
固体基盤の場合、例えば、市販のアレイヤーを使って、本発明の好ましい態様における生体関連物質固定化用ゲル（以下、固定化ゲルと称する場合がある）を基盤に配置することにより、基盤の複数の区画に固定化ゲルがアレイ状に配置されたマイクロアレイを製造することができる（特表平6-507486号、USP 5,770,721号公報参照）。基盤としては、複数の溝又は貫通孔を有するものを使用することもできる。その場合、溝又は貫通孔によって形成された区画に、重合前又は重合開始直後の生体関連物質を含むモノマー溶液を添加し、区画内で重合反応を実施させ、架橋することにより、基盤に生体関連物質固定化用ゲルを配置させたマイクロアレイ（生体関連物質固定化用ゲルマイクロアレイ）を作製することできる（特開2000-60554号公報参照）。
【００４７】
一方、中空管状体を複数本集束し、集束物を管状体の長手方向と交差する方向で切断することで得られる基盤は、上記２）ゲルをアレイ状に配列させた基盤を製造する工程として、例えば、次の工程を行うことより製造することができる。
２−１）中空管状体を複数本集束する工程
２−２）得られた集束物の各管状体の中空部に上記工程１）で得られた溶液を充填する  工程
２−３）充填した溶液からゲルを形成する工程
２−４）集束物を管状体の長手方向と交差する方向で切断する工程
【００４８】
先ず、２−１）中空管状体を複数本集束する工程は、例えば、次のようにして行う。
この工程では、規則的に孔を形成する多孔板を２枚用意して、一方の多孔板の孔の位置と他方の多孔板の孔の位置とが対応するように両方の孔に中空管状体を通す。次に、当該多孔板同士の間隔を調整する。但し、中空管状体を孔に通す作業と多孔板同士の間隔を調整する作業の順序は逆でもよい。そして、中空管状体に張力を与え、張力を与えた状態で中空管状体間（管状体集束物の隙間）に樹脂等の接着剤を充填して集束した管状体を固定し、例えば縦横に中空管状体が規則的に配列し集束物を得る（特開2001-239594号公報等）。ここで、「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中に含まれる中空管状体の本数が一定となるように、集束物を順序よく配列させることをいう。
【００４９】
次に、２−２）上記工程１）で得られた溶液を充填する工程では、例えば、キャピラリーゲル電気泳動に使用されるキャピラリーカラムを作製する場合と同様の方法で安定化剤を添加した溶液を中空部に充填することができる。
尚、本発明においては、個々の中空管状体にゲルを充填させた後に集束するようにしても良い。
【００５０】
また、２−３）充填した溶液からゲルを形成する工程では、前述したのと同様の方法でゲルを形成することができる。
【００５１】
さらに、２−４）集束物を管状体の長手方向と交差する方向で切断する工程は、例えば、次のように行う。
この工程では、上述の集束物を長手方向（中空管状体の軸方向）と交差する方向、好ましくは長手方向に対して垂直方向に切断することにより、薄片を得る。切断方法として、例えばミクロトームを用いて集束物から薄片を切り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みは任意に調整することができるが、通常1〜5,000μm、好ましくは10〜2,000μmである。
【００５２】
尚、集束物の断面形状は特に限定されるものではなく、例えば、中空管状体を規則的に配列させることにより断面を正方形又は長方形に形成してもよく、中空管状体を同心円状に配列させて断面を円形に形成してもよい。
【００５３】
ここで、本発明の好ましい態様における生体関連物質固定化用ゲルの安定化剤によれば、特許第3654894号公報等に記載されているような貫通孔型のゲルマイクロアレイについて、特にその有用性を発揮させることができる。貫通孔型のゲルマイクロアレイは、貫通孔内にゲルが保持されているので、貫通孔内の３次元空間をハイブリダイゼーション反応場に提供することが出来る点で、有用性を持っている。しかしこのアレイは、貫通孔内でゲルの形状が保てず、ゲルの一部が脱落する場合があった。これに対し、本発明の好ましい態様におけるゲル用安定化剤を用いることで、少なくとも貫通孔内でより安定にゲルの形状を保持できる。
【００５４】
また、特開2002-088652号公報には、中空管状体の中空部の内壁に両親媒性のポリマーを付着させる方法が開示されている。しかし、当該方法は、中空部の内壁とゲルとの密着性を向上させるための方法であり、構成としては、両親媒性ポリマーが中空繊維中空部内壁面とゲルの間に介在した構成となっている。これに対して、本発明の好ましい態様では、ゲル中に界面活性剤が分散された構成、好ましくは均一に分散された構成となっている。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
[実施例１]  核酸マイクロアレイの製造
まず、使用するマイクロアレイとして中空繊維を利用した貫通孔型のマイクロアレイを選び、以下の１〜４の手順で製造した。その後、５の手順でゲルの安定性の確認を行った。
【００５６】
１．中空管状体の集束物の製造
図１に示す配列固定器具を利用して中空管状体の集束物を製造した。なお、図１中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は管状体の長手方向と一致する。
まず、直径０．３２ｍｍの孔５２が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１２列で合計１４４個設けられた厚さ０．１ｍｍの２枚の多孔板５０を準備した。これらの多孔板５０を重ね合わせて、そのすべての孔５２に、中空管状体５４として、ポリカーボネート中空繊維（三菱エンジニアリングプラスチック社製  カーボンブラック1質量%添加）を１本ずつ、通過させた。
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物５６で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板５０と板状物５６を取り除き、中空管状体の集束物（中空繊維束）を得た。
この集束物の繊維端の内、一方を封止し、もう一方を開放の状態にしておいた。
【００５７】
２．プローブ核酸および界面活性剤を添加したゲル形成溶液の調製
次に前記工程で得た集束物の各管状体の中空部に充填させるゲル形成溶液の調製を行った。尚、本実施例では、添加する界面活性剤としてＳＤＳを用いて、ゲル形成溶液の調製を行った（NIPAAmゲル/SDS添加）。また比較例として、ＳＤＳを添加しない溶液も同時に準備した（NIPAAmゲル）。そして、これらの溶液を同一のマイクロアレイ（チップ）に搭載して、両者の比較を行った。ゲル形成溶液は、表１に記した条件に従って調製した。
【００５８】
【表１】
2009008551.tif 000002
【００５９】
具体的にはゲル形成溶液（「NIPAAmゲル/SDS」溶液）は、次のようにして調整した。
まず、核酸プローブ溶液を以下の方法で調製した。
プローブ核酸溶液の調製
核酸配列としては、配列番号１に記載した配列情報をもつ5'末端ビニル化核酸（６５mer）を用いた。これら核酸の以下の方法により合成した。
まず、配列番号１のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置により合成した。合成の際、最終段階で、アミノリンクTM（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5'-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。
次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、5'末端ビニル化オリゴヌクレオチドとし、２０ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調製した。
【００６０】
NIPAAmゲル/SDSの調製
次に、２０ｃｃのガラス容器に、ＮＩＰＡＡｍを０．４３２ｇ、次いでＭＢＡＡｍを０．０４８ｇ、次いでミリポア社製超純水製造装置で製造した超純水７．８７ｇを秤量して加え、更に先で調製した２０ｐｍｏｌ／μｌの核酸プローブ溶液を、３．５ｇ加えて、超音波洗浄槽にて、内容物を完全に溶解させた。次に予め調製しておいたＳＤＳの２０％水溶液を０．１２ｇ、次いで同じく予め調製しておいたＶＡ０４４の１０％水溶液を０．１２ｇ加えてよく掻き混ぜた溶液を、次の操作を行うまで０℃で冷蔵保管しておいた。
一方、「NIPAAmゲル」溶液は、20% SDS溶液を加えないことを除いて、上記と同様にして調製した。
【００６１】
３．ゲル充填中空管状体の集束物の製造
２．にて調製したゲル形成溶液を、３８４マイクロタイタープレートの所定のウェル、即ち、後のゲル形成溶液吸い上げ操作の際に中空管状体の中空部に吸い上げるために中空管状体の末端を差し入れる予定のウェルに、各条件毎マイクロピペットを用いて各８０μｌ分注した。
各条件のゲル形成溶液を分注するマクロタイタープレートのウェル位置を図２に、また、集束物に導入された後のアレイ上の各ゲル形成溶液条件毎のゲルスポットの位置を図３にそれぞれ示した。
次に１．で作製した中空管状体の開放してある繊維端を、1本ずつ、３８４マイクロタイタープレートの各ウェルに差し入れ、ゲル形成性溶液に漬した状態で、固定し、デシケーター内に設置した。次にデシケーター内を減圧状態にしたのち、デシケーター内に窒素ガスを封入し、系内を常圧に戻して、ゲル形成溶液を中空管状体の中空部へ導入した。
次いで、容器内を70℃とし、３時間重合反応を行った。
かくして核酸プローブがゲルに固定化されたゲル充填中空管状体の集束物を得た。
【００６２】
４．薄片化
３．で得られた中空管状体の集束物を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍの薄片２００枚を得た。
【００６３】
５．ゲル保持安定性の確認
上記で作製した厚さ０．５ｍｍの薄片について、顕微鏡を使って、中空管状体によって区画化されたゲルスポットの形状を観察し、チップ１枚当たりのゲル脱落スポットの発生率を算出した。その結果を表２に示した。
表２に示した通り、安定化剤としてＳＤＳをゲル中に添加した条件は、添加しない条件よりもゲル保持安定性が向上していることが確認できた。
【００６４】
【表２】
2009008551.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】中空管状体の集束物の製造治具の図である。
【図２】ゲル形成溶液を分注するマイクロタイタープレートのウェルの位置を示した図である。
【図３】マイクロアレイの各ゲル形成溶液条件毎のゲルスポットの配置図である。
【符号の説明】
【００６６】
５０…多孔板、  ５２…孔、  ５４…中空管状体、  ５６…板状物。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号１：合成DNA
【図１】
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【図２】
2009008551.tif 000005
【図３】
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【配列表】
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