(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞を、細胞膜透過性のｐＨ感受性蛍光色素前駆体と、細胞膜非透過性のＤＮＡ染色色素とを用いて同時染色して、ｐＨ６以下の酸性条件下に保持し、得られた細胞に、２種類の波長の励起光を照射して蛍光を発生させ、３種類の波長の蛍光強度をフローサイトメーターを用いて測定することによって、微生物細胞の細胞内ｐＨ値に基づく細胞活性（バイタリティ）と、細胞の生死（バイアビリティ）判定とを同時に得ることを含んでなる、微生物細胞の生理状態評価方法であって、
２種類の励起光の波長がそれぞれ、４１０ｎｍ〜５１０ｎｍおよび５４０ｎｍ〜７００ｎｍから選択されるものであり、測定する３種類の蛍光波長が５１０ｎｍ〜６４０ｎｍから２種、かつ、６００ｎｍ〜８００ｎｍから１種選択され、かつ
６５０ｎｍ〜６８０ｎｍの蛍光強度を測定することによって微生物細胞の生死（バイアビリティ）を判定し、それに基づいて、全細胞群から死滅細胞を除いた生細胞群における、細胞活性（バイタリティ）を得ることを含む、方法。
【請求項２】
細胞膜非透過性のＤＮＡ染色色素が、４−［３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリジン）−１−プロペニル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］−キノリニウムジイオジド（ＴＯ−ＰＲＯ ３色素）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞膜透過性のｐＨ感受性蛍光色素前駆体が、５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテートである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光強度の測定によって得られた細胞内ｐＨ値が、所定値より高いかまたは微生物本来の細胞内ｐＨ値との差が小さい細胞を細胞活性が高いものと判定することを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
微生物が食品用の酵母または細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、フローサイトメーターを用いた、微生物細胞のバイアビリティおよびバイタリティの両方を同時に測定して解析し得る、微生物細胞集団の生理状態の評価方法に関する。
【０００２】
背景技術
酵母のような微生物を用いて発酵、醸造や物質生産をする場合に、生産にこれから用いようとする微生物細胞の生理状態を予め把握しておくことは、発酵の成否を予見し、高品質で安定した製品を得る観点から、極めて重要である。
【０００３】
微生物細胞の生理状態は、２つの側面、すなわち細胞の生死を区別するバイアビリティと、細胞自体の活性を示すバイタリティと、から把握し、評価することができる。微生物細胞の生理状態を、バイアビリティとバイタリティの両側面から把握することで、単に微生物が「生きている」というものだけではなく、「生きている」中でもさらに「活き」がいい「元気なもの」であるか否かを知ることができる。
【０００４】
微生物細胞のバイアビリティを判定する技術としては、スライドカルチャー法、プレートカルチャー法、細胞染色をもとにしたメチレンブルー法、フルオレセオインジアセテート（ＦＤＡ）法、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸マグネシウム塩法、ＴＯ−ＰＲＯ３染色法（小林弘司ら，防菌防ばい，31,7,2003（非特許文献１））などが知られている。
【０００５】
この内、例えば、メチレンブルー法は、酵母に取り込まれたメチレンブルーが生細胞中の還元力によって無色化されることを利用するものである。またＦＤＡ法は、取り込まれたＦＤＡが生細胞に存在するエステラーゼによって分解され、生細胞内で蛍光を発することを利用するものである。これらの方法はともに簡便ではあるが、染色のされ方や測定者間で差が生じやすく、また、細胞の増殖力とは必ずしも一致しない。
【０００６】
一方、微生物細胞のバイタリティ（活性）を判定する方法としては、代謝活性を利用したアシディフィケーションパワー法、細胞内ｐＨ（ＩＣＰ）法などや、発酵試験法などがある。
【０００７】
この内、細胞内ｐＨ（ＩＣＰ）法は、細胞内に蛍光物質を取り込ませてｐＨ６以下の低ｐＨ環境下に置き、所定時間経過後に細胞内ｐＨを指標として、細胞の活性を測定する方法である（特開平５−７６３９３号公報（特許文献１））。この方法については、さらにフローサイトメーターを組み合わせて、微生物集団の活性分布を測定する方法も開発されている（特開２００２−１６８８７０号公報（特許文献２））。しかしながら、ＩＣＰ法は、細胞の生死（バイアビリティ）を判定することができないため、微生物細胞の集団の生理状態を把握する観点からは、必ずしも満足できるものではなかった。
【０００８】
例えば、特開２００６−２３８７７１号公報（特許文献３）やKaouther Ben Amorら, AEM,68,11,2002（非特許文献２）には、微生物細胞の「バイアビリティ」と「バイタリティ」の両方を同時に評価する方法が報告されている。これらにおける方法は、１レーザーのフローサイトメーターを用いたものであり、バイアビリティをプロピジウムイオダイドで、バイタリティをＦＤＡ染色後の蛍光強度を用いて測定するものである。しかしながら、個々の細胞によってフルオレセインおよびその誘導体の取り込み量が異なり、励起光照射によって発生する蛍光の強度は、取り込まれたフルオレセインの細胞内濃度によって左右されるので、測定された蛍光強度の絶対値では細胞個々の正確なバイタリティを測定するのが難しいといえた。
【０００９】
したがって、バイアビリティとバイタリティを同時かつ正確に測定する方法が依然として求められている。
【００１０】
【特許文献１】特開平５−７６３９３号公報
【特許文献２】特開２００２−１６８８７０号公報
【特許文献３】特開２００６−２３８７７１号公報
【非特許文献１】小林弘司ら，防菌防ばい，31,7,2003
【非特許文献２】Kaouther Ben Amorら, AEM,68,11,2002
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは今般、細胞内ｐＨを測定するＩＣＰ法で使用される色素に加えて、特定のＤＮＡ染色色素をさらに用いて同時に細胞を染色し、得られた細胞を、各色素に対応する個別の波長を有する２種類の励起光を照射して蛍光を発生させ、３種類の波長の蛍光強度をフローサイトメーターを用いて測定することによって、個々の細胞質内ｐＨを計測することができ、それによって個々の細胞の活性（バイタリティ）を迅速に測定すると同時に、さらに個々の細胞の生死（バイアビリティ）判定も同時にかつ正確に行うことに成功した。また色素の選択と、照射する励起光波長の選択の結果、同時染色に伴う相互干渉等もみられず、個々の細胞についてのバイタリティおよびバイアビリティを正確かつ効率的に判定可能であった。得られる結果は、個々の細胞のデータの積み重ねであることから、細胞集団について評価する従来の方法に比べて格段に正確性の高いものであった。本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１２】
よって、本発明は、微生物細胞のバイアビリティとバイタリティとを同時にかつ正確に測定することができる、細胞の生理状態評価方法の提供をその目的とする。
【００１３】
本発明による微生物細胞の生理状態評価方法は、微生物細胞を、細胞膜透過性のｐＨ感受性蛍光色素前駆体と、細胞膜非透過性のＤＮＡ染色色素とを用いて同時染色して、ｐＨ６以下の酸性条件下に保持し、得られた細胞に、２種類の波長の励起光を照射して蛍光を発生させ、３種類の波長の蛍光強度をフローサイトメーターを用いて測定することによって、微生物細胞の細胞内ｐＨ値に基づく細胞活性（バイタリティ）と、細胞の生死（バイアビリティ）判定とを同時に得ることを含んでなる。
【００１４】
本発明の好ましい態様によれば、細胞膜非透過性のＤＮＡ染色色素は、４−［３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリジン）−１−プロペニル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］−キノリニウムジイオジド（ＴＯ−ＰＲＯ ３色素）である。
【００１５】
本発明の一つの好ましい態様によれば、細胞膜透過性のｐＨ感受性蛍光色素前駆体が、５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテートである。
【００１６】
本発明の一つの好ましい態様によれば、２種類の励起光の波長がそれぞれ、４１０ｎｍ〜５１０ｎｍおよび５４０ｎｍ〜７００ｎｍから選択されるものであり、測定する３種類の蛍光波長が５１０ｎｍ〜６４０ｎｍから２種、かつ、６００ｎｍ〜８００ｎｍから１種選択される。
【００１７】
本発明の別の好ましい態様によれば、６５０ｎｍ〜６８０ｎｍの蛍光強度を測定することによって微生物細胞の生死（バイアビリティ）を判定し、それに基づいて、全細胞群から死滅細胞を除いた生細胞群における、細胞活性（バイタリティ）を得ることを含む。
【００１８】
本発明の別の一つの好ましい態様によれば、蛍光強度の測定によって得られた細胞内ｐＨ値が、所定値より高いかまたは微生物本来の細胞内ｐＨ値との差が小さい細胞を細胞活性が高いものと判定することを含んでなる。
【００１９】
本発明の好ましい態様によれば、微生物が食品用の酵母または細菌である。
【００２０】
本発明の微生物細胞の生理状態評価方法によれば、微生物細胞のバイアビリティとバイタリティを同時にかつ正確に計測することが可能となる。これにより、細胞の活性情報に加えて、細胞の生死判別の結果も得られるため、両者の結果から、生細胞の割合と、その生細胞の活性を知ることができるため、評価対象の細胞またはその集団のより厳密な生理状態を迅速に評価することができる。また、本発明の方法は、細胞活性を絶対値として得ることができるため、例えば三段階の評価基準で分類して評価していた従来の方法よりも、より正確に細胞の生理状態の評価をすることができる。また本発明によれば、同一細胞の細胞内ｐＨと細胞の死滅率が同時に解析可能であるため、目的とする細胞もしくは細胞集団の糖消費経過を正確に予測することができる。本発明による方法は、適切な酵母ハンドリングや醸造における仕込発酵条件の設定に威力を発揮し得るものであり、ビール醸造などをはじめとする各種醸造過程において工程管理指標としての利用が期待される。
【発明の具体的説明】
【００２１】
微生物細胞の生理状態評価方法
本発明による微生物細胞の生理状態評価方法は、前記したように、微生物細胞を、細胞膜透過性のｐＨ感受性蛍光色素前駆体と、細胞膜非透過性のＤＮＡ染色色素とを用いて同時染色して、ｐＨ６以下の酸性条件下に保持し、得られた細胞に、２種類の波長の励起光を照射して蛍光を発生させ、３種類の波長の蛍光強度をフローサイトメーターを用いて測定することによって、微生物細胞の細胞内ｐＨ値に基づく細胞活性（バイタリティ）と、細胞の生死（バイアビリティ）判定とを同時に得ることを含んでなる。ここで、微生物細胞の生理状態評価とは、微生物の細胞活性の良否と、細胞の生死の状態に基づく、評価のことを言う。
【００２２】
本発明において、測定対象となる「微生物」としては、例えば、酵母、細菌（乳酸菌、ビフィズス菌等）など食品等の分野に有用な微生物が挙げられる。ここで酵母としては、分類学上酵母の範疇に入るものであればいずれもであっても良い。酵母の例としては、ビール酵母、パン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母等であって、微生物学的にはサッカロマイセス（Saccaaromyces）に属するものが挙げられる。また酵母には、例えば醸造業者が使用目的に応じて育種したものも包含され、そのような「変異種」（変異株）も本発明における微生物に包含される。
【００２３】
本発明において、「細胞膜透過性のｐＨ感受性蛍光色素前駆体」とは、細胞膜透過性を有する色素の誘導体であって、それ自体は蛍光性を有しないが、ひとたび細胞内に入ると、細胞内のエステラーゼによって加水分解されて、蛍光性を示すｐＨ感受性の色素化合物に変換されうるものを言う。すなわち、このような色素前駆体としては、例えば、ｐＨ感受性蛍光色素が、フェノール性水酸基またはカルボキシル基を少なくとも有するものであり、この官能基が低級カルボン酸（例えば炭素数１〜４）または低級アルコール（例えば炭素数１〜４）によりエステル化されたものが挙げられる。すなわちこの場合、前記色素前駆体とは、細胞膜透過性のｐＨ感受性蛍光色素のエステル誘導体である。エステル誘導体とすることで、細胞膜透過性とすることができる一方で、細胞内に入るとエステラーゼの作用により、エステルが加水分解され、蛍光性を有するｐＨ感受性色素となる。ここでｐＨ感受性の蛍光色素とは、外部のｐＨに依存して蛍光性を変化させうる色素のことをいう。
【００２４】
本発明においては、ｐＨ感受性蛍光色素としては、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、クエン１およびその誘導体、１，４−ジヒドロキシ−フタロニトリルおよびその誘導体、ウンベリフェロンおよびその誘導体、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホネート（ダンシル）発色基、カルボキシセミナフトロダフルオル（carboxy-seminaphthorhodafluor）（カルボキシＳＮＡＲＦ）、カルボキシ−セミナフトフルオレセイン（カルボキシＳＮＡＦＬ）等が挙げられる。このような色素を、前記したように予めエステル化することによって、本発明の細胞膜透過性のｐＨ感受性蛍光色素前駆体とすることができる。
【００２５】
細胞膜透過性のｐＨ感受性蛍光色素前駆体の具体例としては、５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテート、５−カルボキシフルオレセインジアセテート、６−カルボキシフルオレセインジアセテートや２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセイン・テトラアセトオキシメチルエステル等が挙げられる。本発明においては、この内、５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテートがより好ましい。５（６）−カルボキシフルオレセインは、細胞質に入った後、他の膜系に再移行し難い性質を持っている。
【００２６】
本発明において、「細胞膜非透過性のＤＮＡ染色色素」とは、細胞膜透過性を有しない色素であって、細胞膜が破壊された細胞内に入り込んで、細胞の染色体（ＤＮＡ）を染色して蛍光を発し得る色素化合物を言う。本発明ではさらに、該ＤＮＡ染色色素は、前記したｐＨ感受性蛍光色素とは異なる励起波長で蛍光を発しうるものである。すなわち、「細胞膜非透過性のＤＮＡ染色色素」としては、このような性質を具備する限りいずれの色素であっても使用することができる。本発明においては、「細胞膜非透過性のＤＮＡ染色色素」は、好ましくは、ＴＯ−ＰＲＯ  ３（invitrogen社より入手可能、ＴＯ−ＰＲＯ−３ iodide）（４−［３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリジン）−１−プロペニル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］−キノリニウムジイオジド（4-[3-(3-methyl-2(3H)- benzothiazolylidene)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-Quinolinium diiodide））である。
【００２７】
微生物細胞を、ｐＨ感受性蛍光色素で染色するには、もしくはその細胞膜透過性の色素前駆体を微生物細胞内に取り込ませるには、通常、酵母細胞などの微生物細胞をその水性縣濁液中で例えば０℃〜常温で色素前駆体と所定持間、例えば数秒〜６０分間程度、好ましくは低温（０〜１０℃）で５〜３０分間接触させればよい。また微生物細胞をＤＮＡ染色色素で染色するには、微生物細胞内をｐＨ感受性蛍光色素を染色するタイミング、またはその細胞膜透過性の色素前駆体を微生物細胞内に取り込ませるタイミングとは関係なく、いずれのタイミングにおいて染色を行っても良い。通常、酵母細胞などの微生物細胞をその水性懸濁液中で例えば０℃〜常温でＤＮＡ染色色素と所定時間、例えば数秒以上接触させればよい。
【００２８】
本発明においては、微生物細胞を、ｐＨ感受性蛍光色素およびＤＮＡ染色色素で同時染色する。このため、同時染色する場合、通常、微生物細胞をその水性縣濁液中で、ｐＨ感受性蛍光色素前駆体およびＤＮＡ染色色素と、例えば０℃〜常温で所定持間、例えば数秒〜６０分間程度、好ましくは低温（０〜１０℃）で５〜３０分間接触させればよい。
【００２９】
本発明においては、微生物細胞内にｐＨ感受性蛍光色素を取り込ませた後、微生物細胞をｐＨ６以下の酸性条件下、好ましくは５以下の条件下に所定時間保持する。ｐＨの下限は２．０付近にあり、好ましくはｐＨ２．６〜３．５程度である。このような低ｐＨ条件を調整するには、例えば微生物の水性懸濁液に無機酸（塩酸、硫酸など）または有機酸（燐酸、酢酸、クエン酸など）を添加すればよい。また所定のｐＨを維持するためには、通常酸性緩衝剤（燐酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液など）を用いてｐＨ調整すればよい。微生物細胞を上記のような低ｐＨの条件下に保持する時間は、微生物細胞内ｐＨが実質的に変化しなくなるまでの時間が好ましく、通常１分〜４００分程度まで、好ましくは５分〜１００分、特に好ましくは３０分〜１００分程度である。
【００３０】
また、低ｐＨの条件下における温度は、通常微生物細胞が活性を有する、もしくは代謝活動を行い得る温度であり、例えば酵母（ビール酵母、パン酵母など）では、好ましくは０℃から３０℃程度であり、細菌（例えば乳酸菌、ビフィズス菌など）では０℃から３７℃程度である。
【００３１】
このように色素を細胞に取り込ませた後に、細胞を低ｐＨ条件下に置くと、活性の高い細胞は、細胞外ｐＨが低くても細胞内ｐＨの低下は小さいが、細胞が弱って活性が低下すると、細胞内ｐＨも低下する傾向にある。これは微生物のプロトン排出能に基づく傾向であると言える。このような理論に制限されるものではないが、本発明は、かかる現象を利用するものである。
【００３２】
微生物の染色方法および活性測定用サンプルの調製の条件は、例えば、酵母の測定に関する特開平５−７６３９３号公報、および特開２００２−１６８８７０号公報に記載された方法に準拠することができ、後述する実施例にも具体的に記載されている。
【００３３】
本発明の方法において、ｐＨ感受性蛍光色素とＤＮＡ染色色素を取り込ませた微生物細胞に、２種の励起光を照射して蛍光を発生させ、３種の波長の蛍光強度をフローサイトメーターを用いて測定する。これにより、微生物細胞内ｐＨを測定すると同時に、細胞の生死判別（細胞の死滅率）を測定する。
【００３４】
照射する励起光としては、使用するｐＨ感受性蛍光色素とＤＮＡ染色色素のそれぞれを励起して蛍光を発せさせることができる色素に対応する２種類の波長の励起光であって、互いの励起光での蛍光に影響のない波長の励起光であることが望ましい。例えば、ｐＨ感受性蛍光色素として５（６）−カルボキシフルオレセインを使用し、ＤＮＡ染色色素としてＴＯ−ＰＲＯ  ３を使用した場合には、４１０〜５１０ｎｍと５４０〜７００ｎｍのそれぞれの範囲内の波長を有する２種類の励起光を使用する。前者の波長範囲ものが５（６）−カルボキシフルオレセインで使用できものであり、後者の波長範囲がＴＯ−ＰＲＯ  ３で使用できるものである。通常、これら励起光波長はそれぞれ、約４８８ｎｍと約６３３ｎｍが使用される。
【００３５】
また、測定される３種類の蛍光波長としては、使用するｐＨ感受性蛍光色素とＤＮＡ染色色素のそれぞれに対して使用した励起波長に対応して適宜決定することができ、例えば、ｐＨ感受性蛍光色素として５（６）−カルボキシフルオレセインを使用し、ＤＮＡ染色色素としてＴＯ−ＰＲＯ  ３を使用した場合には、５（６）−カルボキシフルオレセインについて５１０〜６４０ｎｍの蛍光波長範囲から２種類選択され、ＴＯ−ＰＲＯ  ３について６００〜８００ｎｍの蛍光波長範囲から選択される。前者の波長範囲においては、２種類の蛍光波長は、例えば、約５２５ｎｍと約５５０ｎｍ、約５２５ｎｍと約５７５ｎｍ、約５２５ｎｍと約５９０ｎｍ、約５２５ｎｍと約６１０ｎｍ、および、約５２５ｎｍと約６３５ｎｍなどの組み合わせから好ましく選択することができ、より好ましくは、約５２５ｎｍと約５７５ｎｍの組合せ、または約５２５ｎｍと約５５０ｎｍの組合せから選択できる。後者の波長範囲においては、好ましくは、約６６０ｎｍが使用される。
【００３６】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法においては、励起波長として、４１０〜５１０ｎｍと５４０〜７００ｎｍとの範囲からそれぞれ１波長で、２種類を使用し、４１０〜５１０ｎｍの励起光に対して５１０〜６４０ｎｍの中から２種類の蛍光波長を使用し、５４０〜７００ｎｍの励起光に対して６００〜８００ｎｍの中から１種類の蛍光波長を使用する。
【００３７】
微生物細胞内に取り込まれたｐＨ感受性蛍光色素は、上記のように励起光を照射すると所与の細胞内ｐＨに応じた蛍光を発する。所定の１励起波長によって発生する蛍光を所定の２波長において測定して得た２つの蛍光強度値と蛍光色素が置かれているｐＨ条件との関係を予め求めて検量線を作成しておき、さらに、励起光により微生物細胞が発生する蛍光の強度を測定することにより、細胞内ｐＨを知ることができる。この場合、例えば酸性緩衝液のｐＨ系列と得られる２つの蛍光測定値の比との関係を予め求めて検量線を作製すればよい。検量線の作成は、例えば、５（６）カルボキシフルオレセインを酸性緩衝液のｐＨ系列に溶解した液に無蛍光性の多孔性微粒子を添加し、フローサイトメーター測定を実施し２つの蛍光強度を計測して、その両測定値の比と上記ｐＨ系列との関係を求めればよい（例えば、特開２００２−１６８８７０号公報の実施例(4)および図６参照）。
【００３８】
本発明による方法は、上記のような本発明による微生物細胞内ｐＨ測定法を用いることを特徴の一つとするものである。本発明の一つの態様において、得られた細胞内ｐＨ値が所定値より高いかまたは微生物本来の細胞内ｐＨ値との差が小さい細胞を活性が高いものと判定する。本発明の他の一つの態様において、微生物細胞活性を、個々の細胞の活性または細胞集団の活性の分布状態として表わす。
【００３９】
具体的には、前記のようにして測定された微生物細胞内ｐＨは当該細胞の活性と相関があり、細胞内ｐＨ値が大きい細胞ほど活性が大きいので、対象とする微生物に対して、予め細胞内ｐＨ値と細胞活性についての情報を用意しておけば、細胞内ｐＨ値から当該細胞の活性を把握することができる。
例えば、酵母であれば、測定した酵母細胞内ｐＨ値を当該酵母本来のもしくは固有の細胞内ｐＨ値（活性の低下のない本来の高い活性を有する酵母を活性測定に用いた場合に得られる細胞内ｐＨ値）と比較し、その差が小さいものほど活性が高いと判定することができる。この値は、微生物の種類および使用する低ｐＨ値により異なり得るが、通常は例えば酵母で４．８〜６．５程度であり、乳酸菌、ビフィズ菌で６〜８程度である。また、得られた細胞内ｐＨ値を所定値と比較して、例えば所定値を酵母で６．０、乳酸菌、ビフィズス菌で６．５と設定してこの所定値と比較してこれより高いものを活性が高いと判定することができる。このような判定法を用いれば、例えば微生物（特に食品用の酵母、細菌）を産業上の目的で発酵等に利用する場合において、本発明による微生物活性評価を実施し、例えば所定値より低いｐＨ値が得られたとき、あるいは測定されたｐＨ値と微生物本来の細胞内ｐＨ値ととの差がある一定値以上になった時はその細胞を使用しないことにより、常に活性の高い細胞のみを利用することができる。
【００４０】
一方、細胞の生死は、上記のように励起光を照射すると細胞の生死に応じた蛍光を発するため、これに基づいて細胞の生死判別をすることができる。
具体的には、３種類の蛍光波長のうち６６０ｎｍの蛍光強度をＸ軸に取り、その頻度を表すグラフを作成する。ＤＮＡ染色色素の染色で陽性となる死細胞と表記したエリアに死滅細胞が示される。このグラフから、生死細胞分布がわかる。
【００４１】
本発明の方法をより具体的に説明すると、まず、３種類の蛍光波長のうち例えば６６０ｎｍの蛍光強度をＸ軸に取り、その頻度を表すグラフ（図１）を作成する。ＴＯ−ＰＲＯ３のようなＤＮＡ染色色素の染色で陽性となる図１の死細胞と表記したエリアに死滅細胞が示される。このグラフから、生死細胞分布がわかる。次いで、例えば５２５ｎｍ、および５７５ｎｍの比から、上記のように、標準粒子にて作成した検量線を用いて細胞内ｐＨを算出する。また、算出した細胞内ｐＨをグラフに示したのが図２である。
【００４２】
本発明において、蛍光強度の測定はフローサイトメーターにより測定する。フローサイトメーターは、流体中の粒子（細胞など）にレーザー光による励起光を照射し、個々の粒子から発生する蛍光を測定するフローサイトメトリーの原理を用いた測定器を意味するものてあり、本発明において、通常のフローサイトメーターの他に、細胞分取装置をさらに備えたセルソーター等も包含する。
【００４３】
本発明は、前記したように、微生物個々の細胞内ｐＨに基づく細胞活性の測定と、細胞の生死判別とを同時に行うことができ、従って、微生物試料について個々の細胞の活性とその生死を同時に解析できるばかりでなく、標品となりうるその微生物集団（ロット）の細胞の生死判別と生細胞の活性の詳細な分布を知ることができる。
【００４４】
なお本明細書において、「約」や「程度」を用いた値の表現は、その値を設定することによる目的を達成する上で、当業者であれば許容することができる値の変動を含む意味である。
【実施例】
【００４５】
本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４６】
実施例１：
ビール酵母（Saccharomyces cerevisiae）として、酵母１（新鮮酵母）と酵母２（劣化酵母）の２種類のサンプルを用意した。
メッシュ（サイズ：７０μｍ）を通して大きなデッケ分を取り除いた酵母を２ｍｌ分取し、ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．２、５０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ＮａＣｌ  １１０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ）で洗浄した。その後、以下の条件で酵母へ各試験区の試薬（色素）を添加した。
試験区Ａ：  終濃度１ｍＭ  ５（６）カルボキシフルオレセインジアセテート
試験区Ｂ：  終濃度１０μＭ    ＴＯ−ＰＲＯ  ３
試験区Ｃ：  前記試験区ＡおよびＢ同時
【００４７】
各試験区の溶液を、０℃にて３０分放置した後、ｐＨ３のクエン酸／リン酸バッファ（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で洗浄後、同バッファに懸濁させた。０℃で９０分放置後、従来の蛍光光度計での測定と、フローサイトメーターによる測定・同時解析とを行った。
この内、従来の蛍光光度計での測定は、具体的には、特公平３−２４４４２号公報および特願平５−７６３９３号公報に記載されている条件に従い、蛍光光度計（島津製作所性、分光蛍光光度計「ＲＦ−５００」）で２波長の励起光（４４１および４８８ｎｍ）に対する５１８ｎｍにおける蛍光強度を計測し、その蛍光強度の比をとり、予め作成した検量線より細胞内ｐＨを求めた。
【００４８】
フローサイトメーターによる測定は、特開２００２−１６８８７０号公報に基づいて、まず、励起光は４８８ｎｍと６３３ｎｍの２種類を使用し、４８８ｎｍの励起光に対する５２５ｎｍと５７５ｎｍの蛍光強度値の比から、標準粒子にてｐＨに対する平均値をプロットして検量線を作成した。この検量線を使用して、実際に測定したサンプルにおける細胞内ｐＨ値を求め、また、６３３ｎｍの励起光に対する６６０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００４９】
結果は図３〜１０に示されるとおりであった。
図３〜６は、酵母１（新鮮酵母）についての結果であり、図３および図４は、試験区Ａと試験区Ｃにおける細胞内ｐＨ値を示す。また図５および図６はそれぞれ、試験区Ｃおよび試験区Ｂの細胞生死判別（死滅率）の結果を示す。
また、図７〜１０は、酵母２（劣化酵母）についての結果であり、図７および８は、試験区Ａと試験区Ｃにおける細胞内ｐＨ値を示す。また図９および図１０はそれぞれ、試験区Ｃおよび試験区Ｂの細胞生死判別（死滅率）の結果を示す。
これらの結果から、試験区Ａと試験区Ｃ、試験区Ｂと試験区Ｃのデータに差がないことがわかった。従って、カルボキシフルオレセインジアセテート単独、ＴＯ−ＰＲＯ  ３単独の染色と、同時染色とでは、細胞内ｐＨ並びに生死細胞分布の計測値に差がなく、同時に解析が可能であることが確認された。
【００５０】
実施例２：
実施例１と同様に、ビール酵母を用意して、メッシュを通して大きなデッケを取り除いた。酵母を蒸留水で２回洗浄し、遠心して上清を捨て３ｍｌにした酵母に対し、ＳＤＳ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，５％ＳＤＳ，ｐＨ９．０）を７ｍｌ加えて、振盪攪拌機（ｖｏｒｔｅｘ）を用いて混合した。これを３７℃で１５分インキュベーションし、５％ＳＤＳ溶液（ｐＨ９．０）で６日間（１回／日）洗浄して死滅酵母とした。
その後、メチレンブルー（ＭＢ）法、およびＴＯ−ＰＲＯ３染色により酵母死滅率を確認し、別途用意した新鮮酵母と混合することによって、死滅酵母率０％、２５％、５０％、７５％、および９０％の各酵母サンプルを調製した。
調製済みの酵母をそれぞれ、実施例１の要領で蛍光光度計での測定とメチレンブルー法による死滅率測定、フローサイトメーターにより細胞内ｐＨと死滅率を同時測定・解析すると共に、発酵試験に供した。
発酵試験は、麦汁を用いて９℃で発酵させ、７日間サンプリングを行った。
【００５１】
結果は表１、および図１１〜１２に示されるとおりであった。
表１では混合した酵母細胞の死滅率を各測定法について比較した結果を示す。
図１１は、フローサイトメーターによる解析結果を示す。図１１の左の列は細胞内ｐＨ、右の列は６６０ｎｍの蛍光強度の分布であり、細胞生死判別の結果を示す。図の上から順に、上記の死滅酵母率を有するサンプルにそれぞれ対応する。
図１２は、発酵試験の糖消費の経過を示す。従来のように細胞内ｐＨのみの測定では、生細胞のみを対象としたため、細胞内ｐＨがほぼ同じような分布を示してしまうため、図１２のような糖消費経過の違いが予測できなかった。しかしながら、本発明によれば、同一細胞の細胞内ｐＨと死滅率が同時に解析可能となるため、図１２のように糖消費経過を予測できるようになった。
【００５２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】６６０ｎｍの蛍光強度をＸ軸に取り、Ｙ軸にその頻度を表した、細胞の死滅率を示すグラフの例である。
【図２】フローサイトメーターによる細胞内ｐＨ値を表すグラフの例である。
【図３】実施例１の結果であって、新鮮酵母についての試験区Ａの場合の細胞内ｐＨ値を示すグラフである。
【図４】実施例１の結果であって、新鮮酵母についての試験区Ｃの場合の細胞内ｐＨ値を示すグラフである。
【図５】実施例１の結果であって、新鮮酵母についての試験区Ａの場合の細胞の死滅率を示すグラフである。
【図６】実施例１の結果であって、新鮮酵母についての試験区Ｂの場合の細胞の死滅率を示すグラフである。
【図７】実施例１の結果であって、劣化酵母についての試験区Ａの場合の細胞内ｐＨ値を示すグラフである。
【図８】実施例１の結果であって、劣化酵母についての試験区Ｃの場合の細胞内ｐＨ値を示すグラフである。
【図９】実施例１の結果であって、劣化酵母についての試験区Ａの場合の細胞の死滅率を示すグラフである。
【図１０】実施例１の結果であって、劣化酵母についての試験区Ｂの場合の細胞の死滅率を示すグラフである。
【図１１】実施例２のフローサイトメーターによる解析結果を示す。図の左の列は細胞内ｐＨ、右の列は６６０ｎｍの蛍光強度の分布であり、細胞生死判別の結果を示す。
【図１２】実施例２の発酵試験の糖消費経過の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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