(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
立枯病抵抗性のタバコを選抜する方法であって、タバコゲノムDNA中に存在する配列番号3および4のDNA配列の多型を指標とし、その部位38塩基がアデニンであるDNAをもった個体を立枯病抵抗性のタバコとして選抜することを特徴とする方法。
【請求項２】
立枯病抵抗性のタバコを選抜する方法であって、
（1） タバコから抽出したDNAをテンプレートとして、配列番号3または4の部位38を含む配列を増幅する工程と、
（2） 得られた増幅産物をBfaＩで切断する工程とを含み、
前記増幅産物がBfaＩで切断された場合に、前記DNAの供給源である個体を立枯病抵抗性のタバコとして選抜することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項2に記載の方法であって、配列番号3または4の部位38を含む配列を増幅するためのプライマーとして、プライマー123-57.61 STSF3（CGAACCATGCGTCAGCATTGGATCT）および123-57.61 STSF5（GTTGAGGAAATTGGTTATTGTCACC）を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はタバコの育種方法に関し、特に、立枯病抵抗性のタバコを選抜するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ralstonia Solanacearumはトマト、ナス、ピーマン、タバコ等のナス科植物に土壌感染する病原菌で、本菌による病害はタバコでは立枯病と呼ばれている。本病害は、病勢の進展が早く症状も激しいことから、一度感染するとその被害は甚大である。タバコにおいても立枯病抵抗性品種の育成が進められているが、現在までに知られている抵抗性遺伝子は多遺伝子支配のものがほとんどであり、幼苗の段階での個体選抜が不可能なため、圃場検定に頼らざるをえないのが現状である。そのため、抵抗性検定において多大な労力、検定圃地面積、時間を必要とし、検定に供試できる系統数もごく少数に制限されている。これらが育種効率が向上しない一因とされており、効率的な抵抗性個体の選抜方法の開発が望まれている。
【０００３】
近年、目的の形質に連鎖したDNAマーカーを育種の選抜の際に利用した、いわゆるマーカー育種技術が開発されてきた。DNAマーカーとしては、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA,Williams 1990,Nucleic Acids Res 18:6531-35) 、マイクロサテライトマーカー(Tautz 1989, Nucleic Acids Res 17:6463-71)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism,Vos et al.1995,Nucleic Acids Res 23:4407-14)などが知られている。これらのDNAマーカーは、特に従来の育種方法で困難であった病害抵抗性、収量といった複数の遺伝子に支配される量的形質遺伝子座（QTL）に着目した品種の選抜に対して極めて有効である。タバコの立枯病抵抗性もQTLであることから、DNAマーカーの適用により育種効率の大幅な改善が期待できる。
【０００４】
このようなDNAマーカーの利用は、病害抵抗性品種の育成に極めて有効な手段であるが、タバコはゲノムサイズが大きく種間の変異が少ないため、DNAマーカーによる連鎖地図の整備もなされていない。また、現在のところRalstonia Solanacearum抵抗性と連鎖するQTLを同定した例はトマト（Philippe Thoquet et al.1996, Mol Plant-Microbe Interac 9:826-836, Philippe Thoquet et al.1996, Mol Plant-Microbe Interac 9:837-842,Mangin et al. 1999,Genetics Mar;151(3):1165-72., Wang et al.2000,Mol Plant Microbe Interact Jan;13(1):6-13）の他には報告されておらず、タバコについてはそのような例は全く知られていない。
【０００５】
上述のように、タバコの立枯病抵抗性を幼苗での個体選抜段階で判別する手段はいまだ確立されておらず、このことがタバコの育種の効率を低下させている一因にもなっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような問題を解決するために、本発明は、タバコの立枯病抵抗性を簡便に判別する手段を提供すると共に、立枯病抵抗性のタバコを選抜育種する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記方法を使用して育種された立枯病抵抗性のタバコを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、タバコの立枯病抵抗性と連鎖するDNAマーカーを同定することに成功し、本マーカーを利用した立枯病抵抗性個体の選抜方法を確立した。
【０００８】
すなわち、本発明は、立枯病抵抗性のタバコを選抜する方法であって、タバコゲノムDNA中に存在する配列番号3および4のDNA配列の多型を指標とし、その部位38塩基がアデニンであるDNAをもった個体を立枯病抵抗性のタバコとして選抜することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、立枯病抵抗性のタバコを選抜する方法であって、
（1）タバコから抽出したDNAをテンプレートとして、配列番号3または4の部位38を含む配列を増幅する工程と、
（2）得られた増幅産物をBfaＩで切断する工程とを含み、
前記増幅産物がBfaＩで切断された場合に、前記DNAの供給源である個体を立枯病抵抗性のタバコとして選抜することを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は上記方法であって、配列番号3または4の部位38を含む配列を増幅するためのプライマーとして、プライマー123-57.61 STSF3（CGAACCATGCGTCAGCATTGGATCT）および123-57.61 STSF5（GTTGAGGAAATTGGTTATTGTCACC）を使用する方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
立枯病抵抗性DNAマーカーの同定は、AFLP法を使用して、図1に示すような手順で行った。
【００１４】
AFLP法は、Vos et al.(1995)の方法に従って行った。なお、AFLP法はDNAフィンガープリント法の一つであり、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism：制限酵素断片長多型）法とRAPD（Randam Amplified Polymorphic DNA）法を組み合わせた方法である。フィンガープリント法について概説すれば次の通りである。
【００１５】
DNAは、4種類の塩基（アデニン：A，チミン：T，グアニン：G，シトシン：C）から構成され、AとT、GとCがそれぞれ対をなし、ゲノムDNAの塩基対は数億〜数十億と膨大である。一口に「DNAの違いを調べる」と言っても，膨大な量の塩基配列を調べるのは非現実的である。そこで、制限酵素（例えばEcoRI）を用いてDNAを特定の塩基配列部位で切断し、電気泳動にかけ、DNA断片をサイズに従って分離することが考えられた。すなわち、比較するDNA間で塩基配列の差異（塩基置換，欠失等に基づく多型）があれば、制限酵素で切断されたDNA断片の長さの違い（RFLP）として検出される。その後、分子生物学の急速な進歩に伴い、PCRによって増殖したDNAの長さの違いによってDNA多型を迅速・簡便に検出するRAPD法が開発された。これら二つのフィンガープリント法を組合わせたAFLP法では、制限酵素で切断されたDNA断片の長さの違いを、PCRにより選択的に増幅させて検出する。AFLP法の優れた利点は、RFLP法やRAPD法の問題であった1反応あたりの多型情報の低さや再現性の低さが大幅に改善されたことにある。
【００１６】
今回、後述の実施例に示したように、AFLP法を用いることにより、タバコの立枯病抵抗性に連鎖するDNAマーカーが同定された。この立枯病抵抗性に連鎖したDNAマーカー付近のゲノムDNA配列は、W6およびみちのく1号において、一塩基を除き全く同一の塩基配列を示した。すなわち配列番号3に示したみちのく1号のDNA配列の部位38に位置するシトシン（C）が、W6では配列番号4に示したようにアデニン（A）に置換されている。また、W6由来の配列を有する品種は立枯病に抵抗性を示すが、みちのく1号由来配列を有する品種では罹病生であった。従って、このC/Aの一塩基の違いを検出することによって、立枯病抵抗性を判別することが可能となる。
【００１７】
本発明に使用するDNAマーカー配列において、C/Aの一塩基置換が生じている部位は、制限酵素BfaIの認識配列と一致している。従って、この部位を含む領域（配列番号3または4の部位38C/Aを含む配列）を増幅可能なPCRプライマー（たとえば表6に記載のプライマー）を使用してPCR増幅を行い、さらにそのPCR産物をBfaIによって消化し、切断の有無を確認することにより、マーカーDNAのタイプを判別することができる。前記PCR産物が切断された場合、立枯病抵抗性であると判断され、切断されない場合は抵抗性を持たないと判断される。前記PCR増幅は、たとえば抽出したDNAをテンプレートとしてPCRを行えばよい。DNAの抽出は、通常のフェノールクロロホルム法などに従って行えばよい。前記PCR増幅は、たとえばPCR9600を用い、表6に記載の配列のプライマー、123-57.61 STSF3（CGAACCATGCGTCAGCATTGGATCT）および123-57.61 STSF5（GTTGAGGAAATTGGTTATTGTCACC）を使用してPCR増幅することができ、95℃（20秒）−57℃（30秒）−72℃（30秒）を35サイクル行って増幅することができる。得られた増幅産物をBfaＩで2時間消化処理した後、2.0％アガロース・ゲルで電気泳動を行う。アガロース・ゲルを、エチジウム・ブロマイドで染色した後、紫外線ランプで発光させて、BfaＩの消化の有無を断片の泳動度の違いで判別することができる。
【００１８】
本発明で使用するプライマーは、DNA自動合成機等を利用して、本発明で開示する塩基配列に従って合成することができる。また上記プライマーの塩基長は、当該DNA特異的なプライマーとして機能する塩基長であれば特に制限されない。通常１５〜３０程度、好ましくは２０〜３０程度、より好ましくは２０〜２５程度の塩基長であることができる。
【００１９】
本発明における多型の検出は、上記方法だけでなく、その他の一塩基多型を検出することが可能な方法で行うことができる。
【００２０】
上記のタバコ立枯病抵抗性を示すDNAマーカー配列の多型は、たとえばシーケンシングによって検出してもよい。このシーケンシングでは、配列番号3または4の部位38に位置するCまたはAを含む配列の周辺をシーケンスすればよく、通常の方法を使用して行うことができる。たとえば表6に記載のプライマーを使用したサンガー法などによってシーケンスすることができる。
【００２１】
本発明の多型を検出する方法の例としては、当該変異部位を含む塩基配列を解析する各種の方法、例えばサザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリダイゼーション法（J. Mol. Biol.,98: 503-517, 1975等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、またはＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（RFLP: Restriction fragment length polymorphism）、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86: 2766-2770, 1989等参照）、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（SSO: Specific sequence oligonucleotide），ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Nature, 324: 163-166,1986等参照）］等を例示することができる。
【００２２】
上記一塩基多型を含む配列を使用したDNAチップ等を使用して検出することもできるであろう。
【００２３】
本発明において、配列番号3または4の部位38を含むタバコ由来配列のDNA断片は、PCR法等のDNA増幅法またはDNA伸長法を含むDNA合成法を用いて、DNAを調製するためのテンプレートとしても有用であり、更に本発明に係る上記多型を検出するためのプローブとしても有用である。前記配列の例として、たとえば配列番号1、2、3または4の配列があげられるが、その塩基長に制限はない。
【００２４】
上記方法に使用されるプローブは、塩基置換を検出するためのプローブとしての機能的有効長を有するものであれば、特にその塩基長について制限はなく、通常約１０〜１００の、好ましくは１０〜５０、より好ましくは１０〜３０程度の塩基長からなることができる。
【００２５】
本発明の他の態様においては、上記方法を使用して選抜された、立枯病抵抗性タバコが提供される。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の方法を使用することにより、タバコ立枯病抵抗性を簡便に判別することが可能となる。その結果、幼苗における個体選抜段階において、容易に立枯病抵抗性個体を選別する手段が提供され、タバコ育種を効率的に行うことが可能となる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２８】
[実施例1]
タバコ立枯病抵抗性に連鎖するDNAマーカーの同定
1)倍化半数体系統（F1DH）の作成
立枯病に対して抵抗性を示すバーレー品種「W6」と、罹病性を示す「みちのく1号」を交配して、立枯病に対する抵抗性程度が罹病性から抵抗性に連続的に分離した固定系統（WMH系統）を作成した。「W6」と「みちのく1号」を交配し作成したF1から葯を採取し、葯培養を行った。再生した植物体にコルヒチン処理を施し染色体を倍化させ、遺伝的に固定した倍化半数体系統 (F1 doubled haploid;F1DH)を125系統作成した。
【００２９】
2)圃場検定
1998年、1999年の2ヵ年にわたり、立枯病が均一に発生する汚染圃場（静岡県磐田郡豊田町）において、125系統のF1DH（WMH系統）を1系統あたり15本、4反復栽培した。立枯病抵抗性の判定は、病徴の進展にあわせて複数回行った。罹病度については、0:健全株、1:下位葉が萎凋、２:中上位葉が萎凋、３:枯死の4段階とし、各系統の平均を求め、最低0（全て健全株）から100（全て枯死株）までの指数に換算し算出した（図2）。
【００３０】
3)マーカー解析
「W6」あるいは「みちのく１号」に特異的に存在するDNAマーカーを特定し、連鎖地図を作成するために、W6及びみちのく１号それぞれから抽出したDNAをAFLP法により解析した。播種後30日〜60日の各個体からフェノールクロロホルム法によりDNAを抽出した。
【００３１】
AFLP法は、Vos et al.(1995)の方法に従って行った。以下概要を大まかに示す。ゲノムDNAの切断に用いた制限酵素の組み合わせとして、PstＩ及びMseＩを選択した。抽出したDNAは、PstＩとMseＩで切断後、それぞれの酵素に対応した合成アダプターを連結した。アダプターの配列を表１に示す。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
アダプターを連結したゲノムDNAに対して、表２に示すAFLP選択プライマーを使用して、AFLP反応を行った。このプライマー中のNは、プライマーにおけるNの部分が可変であることを示している。PstＩプライマーとしては、5’側の一番最初のNがA,C,Gである48種類を使用し、MseＩプライマーとしては、5’側の一番最初のNがCである64種類のプライマーを使用した。これによりPstＩプライマーとMseＩプライマーの組み合わせの合計は48×64=3072となる。合計3072のプライマー組み合わせを使用して、AFLP反応を行った。PstＩプライマーは、バンドの有無を視覚的に判別できるように、蛍光色素FAM、HEX、TAMRAで標識して使用した（J Bios社に委託）。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
AFLP反応では、Gene Amp9600（Applied Biosystems社）を用い、94℃（1秒）−65℃（30秒）−72℃（２分）から１サイクルごとにアニーリング温度が１度づつ下がる反応を９サイクル、94℃（1秒）−56℃（30秒）−72℃（２分）を23サイクル行った。AFLP反応産物は核酸塩基配列解析機Prism377（Applied Biosystems社）で泳動を行い、バンドの有無を確認した。さらに、125系統のF1DH（WMH系統）それぞれについてもバンドの有無を検定し、「W6」、「みちのく１号」それぞれに特異的に存在し、かつ分離世代であるF1DH（WMH系統）でバンドの有無の分離が認めらるマーカーの選別を行った。その結果、84個のマーカーが得られた（表3）。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
4)データー解析
125系統のF1DH（WMH系統）を解析対象として、表３に示す84個のマーカーの有無を判定した。この結果をもとに、遺伝解析ソフトMap Mker Ver3.0を使用して遺伝連鎖解析を行い、遺伝連鎖地図を作成した。解析の設定はMinimam LOD;3.0、組換え価;0.4で行った。また、1999年度の圃場検定で得られた125系統の罹病指数と、前述の遺伝連鎖地図をもとに、QTL（量的形質遺伝子座）解析ソフトQ Geneを使用してQTL解析を行った。その結果、１つの遺伝連鎖群（G-5）において立枯病抵抗性に対して強い寄与度を示すQTL（LOD＞3.0）が認められ、この連鎖群にはマーカーが12個（M16,M35,M30,M84,M82,M83,M93,M94,M74,M108,M91,M107）座乗していた（図3）。みちのく1号に特異的に認められるM82マーカー（0.13kb）及びW6に特異的に認められるM84マーカー（0.13kb）が最も強い寄与度（LOD値；11.3）を示していた（図4）。
【００３８】
5) M82及びM84マーカーのクローニング
得られたM82及びM84の各フラグメントをシーケンスゲルから回収した。泳動したシーケンスゲルを蛍光イメージアナライザー(FM-Bio;日立社)で読み取った後、目的とするマーカーの位置を確認しながらマーカー断片をゲル片ごと回収した。回収したフラグメントは、新たに作成した非蛍光プライマーで再度PCR増幅を行い、精製後、ベクター（pBluescriptSK(+)）、東洋紡）に繋ぎ、大腸菌（JM109、東洋紡）に導入してクローニングを行った。
【００３９】
6) M82及びM84の塩基配列決定
M82及びM84の全領域について、Prism377を用いて塩基配列を決定した。M82及びM84は全く同じ長さでほぼ同一の塩基配列を示していたが、3’末端近傍のMseＩプライマーの選択塩基相当部位(108塩基目)で1塩基が異なっていた。M82の全塩基配列を配列番号1に、M84の全塩基配列を配列番号2にそれぞれ示す。
【００４０】
7) 「W6」及び「みちのく1号」における、M82及びM84が座乗するゲノムの塩基配列
M82とM84は１塩基を除き全く同一の塩基配列を示すマーカーであるが、M82は「みちのく1号」特異的に増幅し、M84は「W6」特異的に増幅を示す。この原因としては、6)で示した3’末端近傍の1塩基の違いに由来するものと予想される。そこで、Invereted PCR法を用いて、それぞれのマーカーが座乗するゲノムの塩基配列を確認した。配列番号1及び2により示された塩基配列に基づき、M82、M84に共通な配列部分から外側向きに増幅するように、表4に示すPCRプライマーを合成した（サワデー・テクノロジー社に委託）。
【００４１】
【表４】
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【００４２】
Inverted PCR法は、W6及びみちのく1号のDNAを制限酵素HaeIIIで切断後、ライゲーションキット（Takara Ligation Kit Ver1）でセルフライゲーションしたDNA断片に対して、表4のプライマーを表5のように組み合わせ、2段階のPCR増幅することで行った。得られた増幅産物は同様にクローニング、塩基配列決定を行った。
【００４３】
【表５】
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【００４４】
みちのく1号より得られたゲノムの塩基配列を配列番号3に示し、W6より得られたゲノムの塩基配列を配列番号4に示す。その結果、配列番号1及び2で認められた1塩基の違いが、配列番号3及び4でも確認され（38塩基目）、W6、みちのく1号のゲノム塩基配列で1塩基置換が生じていることが明らかになった。
【００４５】
8) AFLPマーカーのCAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)化
１塩基置換が生じている領域は、制限酵素BfaＩの認識配列内に存在していることから、この領域を増幅するPCRプライマーでPCR増幅を行い、さらにBfaＩによる増幅断片の消化の有無を確認することで、マーカータイプの判別が可能である。配列番号3及び4により示される塩基配列に基づき、表6に示すPCRプライマーを合成した。W6、みちのく1号、F1DH（WMH系統）のそれぞれから抽出したDNAを鋳型としてPCRを行った。DNAの抽出は3)と同様にフェノールクロロホルム法に従った。PCRにはPCR9600を用い、95℃（20秒）−57℃（30秒）−72℃（30秒）を35サイクル行った。得られた増幅産物をBfaＩで2時間消化処理した後、2.0％アガロース・ゲルで電気泳動を行った。アガロース・ゲルを、エチジウム・ブロマイドで染色した後、紫外線ランプで発光させて、BfaＩの消化の有無を断片の泳動度の違いで判別した。その結果、F1DH（WMH系統）の各系統から抽出したDNAより増幅されたフラグメントは、BfaＩによって消化される「W6タイプ（106bp）」と、消化されない「みちのくタイプ（133bp）」に選別され、マーカータイプの判別が可能であった（図5、図6）。「W6タイプ（106bp）」はM84マーカーと、「みちのくタイプ（133bp）」はM84マーカーと同一の分離パターンを示していた（表7）。以上から、AFLPマーカーをCAPS化し、さらに利便性の高いマーカーに改良することができた。このマーカーをMWC1マーカーと名付けた。
【００４６】
【表６】
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【００４７】
【表７】
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【００４８】
[実施例2]
MWC1マーカーが、W6、みちのく１号以外の組み合わせより育成された系統においても適用可能であるかを調べるために、他の立枯病抵抗性分離集団（M2BH系統；101系統）を用いて検証を行った。M2BH系統は、W6由来の立枯抵抗性を有するWWH２と、みちのく１号のF1より作成されたF1DHである。圃場試験は、過去に均一な立枯病の発生が認められた汚染圃場（栃木県小山市）において、101系統のM2BH系統を1系統あたり11本、1反復で栽培した。立枯病抵抗性の判定は、病徴の進展にあわせて複数回行った。罹病度については、[実施例1]と同様に、0:健全株、1:下位葉が萎凋、２:中上位葉が萎凋、３:枯死の4段階とし、各系統の平均を求め、最低0（全て健全株）から100（全て枯死株）までの指数に換算し算出した。また、全系統について、8)の方法に従いMWC1マーカーのマーカータイプの判別を行った。その結果、W6タイプのマーカーが認められた系統の平均罹病度が44.7であるのに対して、みちのくタイプのマーカーが認められた系統の平均罹病度は66.3と異なっていた（図7、図8）。また、便宜的に系統を罹病度順に並べ、罹病度の低い20系統を抵抗性系統群、高い20系統を罹病性系統群とすると、抵抗性系統群におけるW6マーカータイプの出現率は0.7（14/20）であるのに対して、罹病性系統群におけるそれは0.1（2/20）と明らかな違いが認められた。よって、MWC1マーカーのマーカータイプの判別によりM2BH系統の立枯病抵抗性の判別は可能であり、本マーカーの利用が他の抵抗性分離集団においても有効であることが確認された。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】立枯病抵抗性DNAマーカー同定の概略図。
【図２】立枯病汚染圃場におけるF1DHの罹病度分布を示した図。
【図３】タバコG-5群の遺伝子連鎖地図。
【図４】タバコ立枯病抵抗性に連鎖するQTLを示した図。
【図５】表6に示すPCRプライマーによるPCR増幅産物の電気泳動写真。
【図６】表6に示すPCRプライマーによるPCR増幅産物をBfaIで消化した電気泳動写真。
【図７】  M2BH系統の罹病度分布を示す図。
【図８】  101系統のM2BH系統を罹病度順に並べ、MWC1マーカーについてそのマーカータイプを示した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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