(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘミアセタール水酸基を有する基質であるオリゴ糖に、グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体を接触させ、該ヘミアセタール水酸基を酸化し、該基質であるオリゴ糖に対応するアルドン酸を生成することを特徴とするアルドン酸の製造方法。
【請求項２】
グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体が、誘導化剤として、基質であるオリゴ糖と同一のオリゴ糖を、添加した培地により培養して得られた菌体である請求項１記載のアルドン酸の製造方法。
【請求項３】
グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属が、誘導化剤として、基質であるオリゴ糖と同一のオリゴ糖を、用いずに培養されたものであることを特徴とする請求項１記載のアルドン酸の製造方法。
【請求項４】
グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物を、ヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖を含有した培地で培養することにより、培養液中に、該オリゴ糖に対応するアルドン酸を蓄積させ、該培養液から蓄積されたアルドン酸を分離することを特徴とするアルドン酸の製造方法。
【請求項５】
ヘミアセタール水酸基を有する基質であるオリゴ糖が、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース及びラクトースからなる群から選択された少なくとも一つの糖である請求項１〜４のいずれか１項に記載のアルドン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸菌に属する微生物を用いたアルドン酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、カルシウム、鉄、亜鉛などのミネラル補給剤が注目を集めている。中でも、アルドン酸はカルシウムや鉄等の金属との塩形態である場合に、他の金属塩に比べて高い水溶性を示すことから、ミネラル補強効果が高いと考えられており、特に注目されている。また、オリゴ糖を酸化して得られるアルドン酸は、オリゴ糖のヘミアセタール水酸基が酸化されていることから、シュクラーゼやβ−ガラクトシダーゼなどの生体内加水分解酵素等による分解を受け難い。このため、人が摂取した際、分解されることなく腸内に到達でき、ビフィズス菌増殖を誘発する因子として利用することが可能である。このような特性を有するため、各種糖からアルドン酸を製造する方法が探索されてきた。
【０００３】
アルドン酸を得るための具体的な方法としては、ヘミアセタール水酸基を有する糖を臭素ナトリウムとともに電気を印加することによって酸化する方法が知られている。また、微生物変換・発酵法により得る方法としては、アシネトバクター属やブルクホルデリア属などの微生物を、ヘミアセタール水酸基を有する糖に作用し酸化することによって得る方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
アルドン酸の中でも、乳糖のヘミアセタール水酸基を酸化することにより得られるラクトビオン酸（Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｄ−グルコン酸）は米国では既にＦＤＡの認可を受け、凝固剤としてプリンのプレミックスに添加されたり、保湿剤として化粧品に利用されている。機能面では、ラクトビオン酸はビフィズス菌選択増殖活性を持ち（例えば、特許文献２参照）、ミネラル吸収促進効果があること（例えば、特許文献３参照）が知られている。また、本発明者らはラクトビオン酸に卵殻強化効果があることを見出し既に特許出願を行った（特願２００４−０３０８９８号）。このような特性を有するため、ラクトビオン酸を容易にかつ安全性の担保された方法で製造することが特に望まれていた。
【０００５】
一方、酢酸菌として知られているアセトバクター属はエタノールを酸化して酢酸にし、酢酸の醸造に使われてきた（例えば、非特許文献１参照）。またグルコノバクター属はグルコースを酸化してグルコン酸や２および５−ケトグルコン酸（例えば、非特許文献２参照）にする。また、グルコノバクター属に属するグルコン酸菌はＤ−ソルビトールからL-ソルボースの製造に用いられている（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、グルコース以外のヘミアセタール水酸基を有する糖からアルドン酸を生成することについては知られていなかった。
【特許文献１】特開２００１−２４５６５７号公報
【特許文献２】特許第３５５９０６３号公報
【特許文献３】特許第３５０１２３７号公報
【非特許文献１】栃倉辰六郎ら監修、発酵ハンドブック  共立出版、p.189-192（2001）
【非特許文献２】栃倉辰六郎ら監修、発酵ハンドブック  共立出版、p.163-164（2001）
【非特許文献３】栃倉辰六郎ら監修、発酵ハンドブック  共立出版、p.257-258（2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のようにラクトビオン酸を容易にかつ安全性の担保された方法で製造することが特に望まれていたが、アルドン酸の化学合成品は国内の法規制上、食品や飼料用途に使用することができない。また、アシネトバクター属やブルクホルデリア属などの微生物は安全性が十分に担保された菌株とはいえず、これらの微生物を用いて生産したアルドン酸を食品や飼料用途に用いることには問題があった。
【０００７】
本発明は安全性の担保された微生物を用いて効率よくアルドン酸を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を達成するために、安全性の担保された菌について網羅的に検討した結果、グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物が、ヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖の前記水酸基を酸化することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明の第１は、ヘミアセタール水酸基を有する基質であるオリゴ糖に、グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体を接触させ、該ヘミアセタール水酸基を酸化し、該基質であるオリゴ糖に対応するアルドン酸を生成することを特徴とするアルドン酸の製造方法を要旨とするものであり、好ましくは、グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体が、誘導化剤として、基質であるオリゴ糖と同一のオリゴ糖を、添加した培地により培養して得られた菌体である方法であり、また好ましくは、オリゴ糖が、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース及びラクトースからなる群から選択された少なくとも一つの糖である方法である。
【００１０】
本発明の第２は、グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物を、ヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖を含有した培地で培養することにより、培養液中に、該オリゴ糖に対応するアルドン酸を蓄積させ、該培養液から該アルドン酸を分離することを特徴とするアルドン酸の製造方法を要旨とするものであり、好ましくは、オリゴ糖が、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース及びラクトースからなる群から選択された少なくとも一つの糖である方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、古くから食品製造に使用され安全性の担保された微生物により、基質であるオリゴ糖に対応するアルドン酸を効率よく製造することができ、しかもヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖の種類に制限されずに対応するアルドン酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明において用いられるヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖とは、その還元末端がアルデヒドである糖をいう。そのようなものの具体例としては、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース、ラクトース等があげられる。この中でも好ましくは、ラクトースである。
【００１４】
本発明においてアルドン酸とは、ヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖のヘミアセタール水酸基が酸化されたものであり、さらにこれらの塩の形態も含むものをいう。
【００１５】
したがって、本発明は、上記したヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖を対応するアルドン酸に変換する方法である。具体的には、セロビオースをセロビオン酸に、マルトースをマルトビオン酸に、マルトトリオースをマルトトリオン酸に、マルトテトラオースをマルトテトラオン酸に、マルトペンタオースをマルトペンタオン酸に、メリビオースをメリビオン酸に、ラクトースをラクトビオン酸に変換する方法である。
【００１６】
本発明に用いる微生物は、アセトバクター属、グルコノバクター属、またはグルコノアセトバクター属に属する微生物を言う。上述のような酢酸菌は古くから食品の発酵などに用いられているため、微生物の安全性が担保されている。
【００１７】
本発明の方法で用いるグルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物は、自然界から分離したものを用いることもできるが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の様に、いずれの人の要求に対しても分譲できるような公的な寄託機関によって保存されているものを使用することもできる。それらには、例えば、アセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)NBRC3281、アセトバクター・シジギ(Acetobacter syzygii)NBRC16604、アセトバクター・シビノジェシス(Acetobacter cibinongensis)NBRC16605、アセトバクター・インドネシエンシス(Acetobacter indonesienscis)NBRC 16471、グルコノアセトバクター・キシナス(Gluconacetobacterxylinus)NBRC16670、グルコノアセトバクター・リフンファシエンス(Gluconacetobacter liquefaciens)NBRC12388、グルコノアセトバクター(Gluconacetobacte rsp.)NBRC3261、グルコノバクター・セリナス(Gluconobactercer inus)NBRC3267、グルコノバクター・フラトゥリ(Gluconobacter fraturii)NBRC3260、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)NBRC3285などが挙げられる。ただし、これらの菌株に限るものではない。
【００１８】
本発明の第１の製造方法は、ヘミアセタール水酸基を有する基質であるオリゴ糖に、グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体を接触させ、菌体中の酵素によってヘミアセタール水酸基を酸化し、該基質であるオリゴ糖に対応するアルドン酸を生成する方法である。本発明で用いられるグルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体は、グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属の生菌体そのまま、あるいは菌体処理物又はそれらを担体に固定化したものをいう。
【００１９】
先ずグルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体を得るには、培養を行なう必要がある。培地としては、通常の微生物と同様に培養することができる。微生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適宜配合したものが用いられる。炭素源としては、グルコース、果糖などの単糖類、ショ糖、麦芽糖などのオリゴ糖類、デンプン等の多糖類、糖アルコール、グリセロールなどが挙げられ、一般的な炭水化物としては、トウモロコシ澱粉、モルトなどがあり、さらには、オリーブ油、コーン油、などの植物油も炭素源にふくめられる。また、CSL（コーンスティーブリカー）や、大豆フレークを用いてもよい。その他、アルコール、有機酸、アルカンの様な炭素化合物でもよい。
【００２０】
窒素源としては、無機、有機どちらの窒素も利用できるが、無機態の窒素はアンモニアガス、アンモニア塩、硝酸体などを用いる。有機窒素はアミノ酸、たんぱく質または尿素の形で与えられる。天然の有機窒素複合体としては、CSL、大豆や、大豆フレーク、ピーナッツミール、綿花ミール、Distillers’ solubles、カゼイン水解物、屠殺場廃棄物、魚粉、酵母エキスなどを使用する。
【００２１】
ビタミンとしては、天然の炭素源、窒素源を用いることで微生物の生育にとって必要なビタミン類は十分に補給できるが、パントテン酸カルシウムや、ビオチン、ビタミンB1などを必要に応じて添加する。
【００２２】
ミネラルとしては、マグネシウム、リン酸、カリウム、硫酸、カルシウム、塩素が必要であるが、さらに、コバルト、銅、鉄、マンガン、モリブデン、亜鉛なども微量ながら必要である。
【００２３】
その他の成分としては、ｐHのコントロールのために、培養液中に炭酸カルシウムを添加したり、緩衝作用を持たせるために、リン酸塩などを加えてもよい。また、培養系のｐHを制御するために、アンモニアや、苛性ソーダ、塩酸、硫酸などを添加してよい。
【００２４】
培養は、使用する菌株の最適培養条件で行うことが好ましいが、概略温度としては、２０〜３０℃が好適であり、ｐＨとしては、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液や炭酸カルシウムなどによりｐＨ５〜８に維持することが好ましい。
【００２５】
培養方法としては静置培養、振とう培養、深部通気撹拌培養があげられる。大量培養の場合、回分法、逐次添加培養法、連続培養法を用いた深部通気撹拌培養が好ましい。このような条件で培養を行うと、培養から１５〜７２時間で十分な量の微生物が得られる。
【００２６】
本発明においては、上記の培養の際に、培地中に、酵素の誘導化剤として、基質であるオリゴ糖と同一のオリゴ糖を添加することが、アルドン酸への変換効率を上昇させることができるという点で好ましい。ここで用いられるヘミアセタール水酸基を有する糖としては、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース、ラクトース等のオリゴ糖があげられる。
【００２７】
誘導化剤の添加量としては、０．１〜１００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１０ｇ／Ｌである。
【００２８】
この場合、グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体が前記糖のみで生育できないときには、資化することができる炭素源を添加して培養することが必要である。グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体が通常資化できる炭素源としては、グルコース、果糖などの単糖類、ショ糖、麦芽糖などのオリゴ糖類、デンプン等の多糖類、糖アルコール、グリセロールなどが挙げられる。炭素源の添加量としては、一般的に１０〜２００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは、１０〜５０ｇ／Ｌである。他の培地成分として、培養条件を最適化するために、前述の窒素源や、ミネラル、ビタミン、緩衝剤などを加えてもよい。
【００２９】
上記のようにして得られたグルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体の生菌体をそのまま用いる場合は、回収した菌体をそのまま用いることができる。
【００３０】
グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体処理物として用いる場合は、アセトン、第四アンモニウム化合物、硫酸ラウリルソーダ、Tweenまたは、微生物の細胞壁の特異的な結合を分解する酵素などで薬剤処理した菌体、凍結した菌体を減圧下で水分を昇華することで得られる凍結乾燥菌体、ホモジナイザーやガラスビーズを用い、物理的に破砕した菌体破砕物、さらには菌体破砕物の上清である無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素液などを用いることができる。
【００３１】
グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体あるいは処理物を担体に固定化するには、セルロース担体、セラミック担体、ガラスビーズ担体のような物質に吸着させる方法や、格子構造を持つゲル状物質、たとえば寒天、アルギン酸カルシウム、カラギーナンや、公知のポリマーに包括する方法などが挙げられる。この方法は微生物を繰り返し使用することを可能にする。
【００３２】
本発明の第１の製造方法においては、基質となるヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖を反応溶媒に溶解し、上記したように調製したグルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物の菌体の培養液、菌体、または菌体処理物を加えて必要により反応温度、反応液のｐＨを制御しながら反応させる。反応溶媒としては、イオン交換水、緩衝液などの水性溶媒が使用できる。反応液の基質濃度は特に制限はないが、基質となる前記糖の溶解度、生産性などを考慮すると１０〜５０質量％で実施するのが好ましい。
【００３３】
反応時間に特に制限はないが、通常６〜２４時間、好ましくは６〜１２時間で反応が終了する条件を選択することが好ましい。反応ｐＨは、用いる微生物の酵素の至適ｐＨに依存するが、一般的にはｐＨ４〜８の範囲で、特に５〜７が好ましい。また、反応温度は微生物酵素が失活しない条件であればよく、２０〜６０℃が好ましいが、３０〜４５℃がより好ましい。
【００３４】
反応方法としては静置、振とう、深部通気撹拌があげられる。このような条件で培養を行うと、１５〜７２時間で十分な量の生産物が得られる。
【００３５】
以上のようにして得られた反応液から、目的とするアルドン酸を単離精製するには、抽出、カラム分離などの一般的な分離方法を用いることができる。例えば、エタノールを反応液に添加して、目的産物を沈殿し回収する方法、活性炭や、多孔性有機樹脂粒子を用いた吸着クロマトグラフィーや、ゲルろ過、イオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて単離することができる。
【００３６】
本発明の第２の製造方法は、グルコノバクター属、グルコノアセトバクター属、またはアセトバクター属に属する微生物を、ヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖を含有した培地で培養することにより、培養液中に、基質であるオリゴ糖に対応するアルドン酸を蓄積させ、培養液から該アルドン酸を分離するものである。培養に用いられる培地成分としては、培地中に、基質であるオリゴ糖と同一のオリゴ糖を含有させる以外は、本発明の第１の製造方法で用いる上記の培地成分が同様に用いられる。基質であるオリゴ糖と同一のオリゴ糖としては、上記したものと同様のものが利用できる。これらの含有量としては、１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは、１０〜１００ｇ／Ｌである。
【００３７】
また、培養条件としては、培養期間が通常１〜１０日間であることを除いて、前記した培養条件と同様に行うことができる。
【００３８】
培養液中に蓄積したアルドン酸は、前述した方法と同様に分離、精製することができる。
【００３９】
本発明により製造されたアルドン酸は、整腸作用、脂質代謝改善作用、ミネラル吸収促進作用、卵殻強化作用を示し、医薬品、食品や、飼料として有用である。上記アルドン酸を医薬品として用いる場合は、当該分野で常套的に用いられている賦形剤、潤沢剤、希釈剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、甘味剤、芳香剤、乳化散剤などを用いて錠剤、粉剤、水和剤、乳剤として経口的にまたは非経口的に投与することができる。また、上記アルドン酸を食品や、飼料として用いる場合、そのままで、または他の食品や飼料に添加もしくは混合して使用することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。なお、実施例中、％は、質量％を表す。
【００４１】
実施例において、反応液中あるいは培養液中のアルドン酸の定量は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用い以下の条件により行なった。
HPLC分析条件
カラムAsahipak NH２P−５０（Shodex社製）
溶離液  アセトニトリル：４０mMクエン酸−NaH2PO4緩衝液（ｐH5.0）＝60：40（体積比）
条件  温度：４０℃
流速：0.8ｍL/mL
検出器：示差屈折計
実施例１
〔菌体の調製〕（誘導化剤としてラクトースを添加）
試験管（18 mm×200 mm）に、ラクトース0.5％、グルコース0.5％、酵母エキス0.5％、ポリペプトン0.5％、硫酸マグネシウム0.1％（pH7.0)を含む培地3mLを分注し、121℃で20分間殺菌した。その試験管に表１に示した各種グルコノバクター（独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手）の一白金耳を植菌し、30℃で3日間振とう培養（220rpm）した。その後、培養液を遠心し菌体を回収した。
〔ラクトビオン酸の生産〕
上記の方法で得られた菌体を２％ラクトース1mLに再懸濁し、40度で6時間インキュベーションし、反応液中のラクトビオン酸を測定した。結果を表1に示す。
【００４２】
【表１】
0005100987.tif 000002
【００４３】
【表２】
0005100987.tif 000003
【００４４】
実施例３〔各種アルドン酸の生産〕
実施例１と同様にして、グルコノバクター・オキシダンス  NBRC  3285の菌体を調製し、ヘミアセタール水酸基を有するオリゴ糖７種（セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース、ラクトース）の２％水溶液１ｍＬに再懸濁し、４０度で６時間インキュベーションした。反応液中に含まれる各種アルドン酸の定量結果を表３に示した。
【００４５】
【表３】
0005100987.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】グルコノバクター・セリナス NBRC 3267によるラクトビオン酸の生成を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図１】
0005100987.tif 000005