(57)【要約】【課題】セルロースに重合度２５以上のα−１，４グルカンをグラフト化し、α−１，４グルカンの包接機能を付与したα−１，４グルカングラフト化セルロースを提供すること。【解決手段】α−１，４グルカン側鎖がセルロース主鎖に結合したグラフトポリマーであって、セルロース主鎖中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素にα−１，４グルカン側鎖の末端の１位炭素が、−ＮＨ−基を介して共有結合しており；該１位炭素に２つの水素基が結合しているか、または１つの酸素原子が結合しており；該セルロース主鎖の重合度が２５以上であり；該α−１，４グルカン側鎖の重合度が２５以上である、グラフトポリマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１，４グルカン側鎖がセルロース主鎖に結合したグラフトポリマーであって、
セルロース主鎖中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素にα−１，４グルカン側鎖の末端の１位炭素が、−ＮＨ−基を介して共有結合しており；
該１位炭素に２つの水素基が結合しているか、または１つの酸素原子が結合しており；
該セルロース主鎖の重合度が２５以上であり；
該α−１，４グルカン側鎖の重合度が２５以上である、
グラフトポリマー。
【請求項２】
前記α−１，４グルカン側鎖が完全に直鎖状である、請求項１に記載のグラフトポリマー。
【請求項３】
前記グラフトポリマーが、以下の構造（Ｉ）：
【化１】
2009293017.tif 000011
を有し、ここで、各Ｒは、−ＯＨ、−ＮＨ２および以下の構造（ＩＩ）もしくは（ＩＩＩ）：
【化２】
2009293017.tif 000012
からなる群より独立して選択され、該ｎが２５〜２０，０００の整数であり、該ｍが２４〜１０００の整数であり、セルロース主鎖中のグルコース残基どうしがβ−１，４結合により結合している、請求項１または２に記載のグラフトポリマー。
【請求項４】
前記α−１，４グルカン側鎖の重合度が４０以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグラフトポリマー。
【請求項５】
前記α−１，４グルカン側鎖の重合度が５０以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のグラフトポリマー。
【請求項６】
前記セルロース主鎖に結合しているα−１，４グルカン側鎖の数が、１〜１０，０００
個である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のグラフトポリマー。
【請求項７】
前記セルロース主鎖に結合しているα−１，４グルカン側鎖の数が、セルロース主鎖中のグルコース残基１００個あたり１〜５０個である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のグラフトポリマー。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のグラフトポリマーの製造方法であって、
セルロース中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素に結合しているＯＨ基をＮＨ２基に置換して、アミノ化セルロースを得る工程；
該アミノ化セルロースとプライマーとを反応させて、該アミノ化セルロース中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素と、該プライマーの末端の１位炭素とを、−ＮＨ−基を介して共有結合させて、プライマー結合セルロースを得る工程；
該プライマー結合セルロースと、基質と、α−１，４グルカン鎖伸長酵素とを接触させることによってプライマーを伸長させることにより、重合度２５以上のα−１，４グルカン側鎖を形成させて、請求項１〜７のいずれか１項に記載のグラフトポリマーを得る工程を包含し、
該プライマーは、重合度３〜２０のα−１，４グルカン、またはその還元末端酸化物もしくはラクトン化物であり、
該基質は、該酵素の作用により該プライマーにグルコース残基を提供する物質であり、
該α−１，４グルカン側鎖の重合度が２５以上であり、
α−１，４グルカン結合セルロースにおいては、該１位炭素に２つの水素基が結合しているか、または１つの酸素原子が結合している、方法。
【請求項９】
前記α−１，４グルカン側鎖の重合度が４０以上である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記α−１，４グルカン側鎖の重合度が５０以上である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記セルロースに結合しているα−１，４グルカンの数が、１〜１０，０００個である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記セルロース主鎖に結合しているα−１，４グルカン側鎖の数が、セルロース主鎖中のグルコース残基１００個あたり１〜５０個である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記グラフトポリマーを精製する工程をさらに包含する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アミノ化セルロースを得る工程が、
トリエチルアミン、塩化リチウムおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドの存在下でセルロースと塩化−ｐ−トルエンスルホニルとを反応させてトシル化セルロースを得ること；
テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージドおよびジメチルスルホキシドの存在下で該トシル化セルロースをアジ化ナトリウムと反応させて６−アジド−６−デオキシセルロースを得ること；ならびに
ジメチルスルホキシド中で該６−アジド−６−デオキシセルロースを水素化ホウ素ナトリウムと反応させてアミノ化セルロースを得ること
によって行われる、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記α−１，４グルカン鎖伸長酵素がα−グルカンホスホリラーゼであり、前記基質がグルコース−１−リン酸である、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記α−１，４グルカン鎖伸長酵素がα−グルカンホスホリラーゼおよびスクロースホスホリラーゼであり、前記基質がスクロースおよび無機リン酸またはグルコース−１−リン酸である、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記α−１，４グルカン鎖伸長酵素がアミロスクラーゼであり、前記基質がスクロースである、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−１，４グルカンを結合させたセルロースおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
構造および／または機能が異なる２種類のポリマーを結合させ、機能および／または物性の異なるポリマーを開発することが、高分子材料分野では行われている。例えば、デンプンにアクリル酸をグラフト化させたポリマーは高吸水性ポリマーとして日用品分野で利用されている。
【０００３】
また、枝分かれした複合多糖は、自然界において重要な役割を示すことが知られている。これらの材料は異なる糖ユニットから構成された分岐型構造を有しており、このような構造が材料の機能に影響していると考えられる。一方、でんぷん、アミロース、セルロース、キチンなどの天然多糖は自然界に豊富に存在し、生分解性を持つ循環型炭素資源であることから低環境負荷材料としての利用が期待される。
【０００４】
セルロースはグルコース残基がβ−１，４−結合で多数結合した多糖である。セルロースは水に不溶性であり、結晶性が高く、高い力学強度を有することが特徴であり、構造材、フィルム、繊維などに利用されている。
【０００５】
一方アミロースは、グルコースがα−１，４−結合で多数結合した多糖であり、水に溶解あるいは膨潤し、水溶液またはヒドロゲルになる。またアミロースはヘリックス構造をとり、その内部の空洞部分にゲスト物質を取り込んで包接化合物を形成するという、特徴的な機能を有する。アミロースの包接化合物形成能力は、アミロースの重合度によって大きく影響を受け、アミロースの重合度が高いほど強いことが報告されている（非特許文献１）。また、重合度１０〜２０程度の短いα−１，４グルカンが、α−１，６結合により多数結合した分岐状多糖のアミロペクチンやグリコーゲンには、包接機能はないことが知られている。このように、包接機能を充分発揮させるためには、アミロースは分岐構造を含まない、完全直鎖状のα−１，４グルカンであることが好ましく、かつその重合度が長いほど好ましい。一方、アミロースは環境内および生体内で容易に分解されることも大きな特徴である。
【０００６】
当該分野においては、例えば、特許文献１は、直鎖状アミノ多糖類（例えば、キトサン繊維）に環状オリゴ糖類が結合した高分子包接性化合物からなる繊維を開示している。さらに、化学−酵素法によるアミロースグラフト化キチンおよびアミロースグラフト化キトサンの合成が非特許文献２に報告されている。非特許文献２においては、キチンの構造中に存在するＮＨ２基に側鎖を結合してグラフトポリマーを製造することが開示されている。
【０００７】
しかし、セルロースにはＮＨ２基が存在しないので、グラフトポリマーを製造するためには水酸基を使わなければならない。しかし、セルロース中には非常に多数の水酸基が存在し、キチンのように選択的に反応させることはできない。セルロース中の全ての水酸基をグラフト化しようとすると構造障害が発生して、反応が進まない。また、重合度２５以上のような重合度の大きなアミロースは反応性が低く、化学合成によってグラフト化させることができない。このため、アミロース側鎖をセルロース主鎖にグラフト結合させたグラフトポリマーについては報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−３２７３３８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，  Ｊａｐａｎ  Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．１  １６２３（２００７）
【非特許文献２】Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏｌ．８，  ３９５９  （２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、セルロースに重合度２５以上のα−１，４グルカンをグラフト化し、α−１，４グルカンの包接機能を付与したグラフトポリマー（すなわち、α−１，４グルカングラフト化セルロース）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、プライマーをセルロースに共有結合し、その後、酵素的にプライマーを伸長させてα−１，４グルカンとすることにより、重合度２５以上のα−１，４グルカン側鎖をセルロース主鎖に共有結合することができることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００１２】
酵素触媒重合を用いてアミロース側鎖を有するセルロースを得るには、セルロースにマルトオリゴ糖または短鎖アミロースを導入する必要がある。本発明の１つの実施形態では、還元的アミノ化反応によってマルトオリゴ糖または短鎖アミロースを導入する。すなわち、セルロース主鎖中のグルコース残基中の６位のヒドロキシ基の一部をアミノ基に変換し、このアミノ基に対して還元的アミノ化反応を行うことによりマルトオリゴ糖または短鎖アミロースを導入する。その後、このマルトオリゴ糖部位または短鎖アミロース部位からのアミロース生成重合を行いアミロースグラフト化セルロースを合成する。他の実施形態については、本明細書の「発明を実施するための形態」中で詳細に説明する。
【００１３】
本発明によるグラフトポリマーの製造方法の一例を図１に示す。この例では、プライマーとしてマルトヘプタオースを使用し、酵素としてα−グルカンホスホリラーゼを使用する。図１に示すように、本発明においては、まず、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）に化学反応によってアミノ基（ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ）を導入してアミノ基含有セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈａｖｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ｇｏｕｐ）を得る。次いで、化学反応によってこのアミノ基含有セルロースにマルトヘプタオース（ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）を導入して、マルトヘプタオースグラフト化セルロース（ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ−ｇｒａｆｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を得る。マルトヘプタオースグラフト化セルロースにおいては、セルロースに導入されたアミノ基を介してマルトヘプタオース鎖（ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ−ｃｈａｉｎ）が結合している。このマルトヘプタオースグラフト化セルロースを用いて、α−グルカンホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）を用いた酵素反応によってマルトヘプタオース鎖を伸長してアミロース鎖（ａｍｙｌｏｓｅ−ｃｈａｉｎ）とすることにより、アミロースグラフト化セルロース（ａｍｙｌｏｓｅ−ｇｒａｆｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）が得られる。
【００１４】
本発明により、例えば、以下が提供される：
（項目１）
α−１，４グルカン側鎖がセルロース主鎖に結合したグラフトポリマーであって、
セルロース主鎖中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素にα−１，４グルカン側鎖の末端の１位炭素が、−ＮＨ−基を介して共有結合しており；
該１位炭素に２つの水素基が結合しているか、または１つの酸素原子が結合しており；
該セルロース主鎖の重合度が２５以上であり；
該α−１，４グルカン側鎖の重合度が２５以上である、
グラフトポリマー。
【００１５】
（項目２）
前記α−１，４グルカン側鎖が完全に直鎖状である、項目１に記載のグラフトポリマー。
【００１６】
（項目３）
前記グラフトポリマーが、以下の構造（Ｉ）：
【００１７】
【化３】
2009293017.tif 000002
を有し、ここで、各Ｒは、−ＯＨ、−ＮＨ２および以下の構造（ＩＩ）もしくは（ＩＩＩ）：
【００１８】
【化４】
2009293017.tif 000003
からなる群より独立して選択され、該ｎが２５〜２０，０００の整数であり、該ｍが２４〜１０００の整数であり、セルロース主鎖中のグルコース残基どうしがβ−１，４結合により結合している、項目１または２に記載のグラフトポリマー。
【００１９】
（項目４）
前記α−１，４グルカン側鎖の重合度が４０以上である、項目１〜３のいずれか１項に記載のグラフトポリマー。
【００２０】
（項目５）
前記α−１，４グルカン側鎖の重合度が５０以上である、項目１〜４のいずれか１項に記載のグラフトポリマー。
【００２１】
（項目６）
前記セルロース主鎖に結合しているα−１，４グルカン側鎖の数が、１〜１０，０００個である、項目１〜５のいずれか１項に記載のグラフトポリマー。
【００２２】
（項目７）
前記セルロース主鎖に結合しているα−１，４グルカン側鎖の数が、セルロース主鎖中のグルコース残基１００個あたり１〜５０個である、項目１〜６のいずれか１項に記載のグラフトポリマー。
【００２３】
（項目８）
項目１〜７のいずれか１項に記載のグラフトポリマーの製造方法であって、
セルロース中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素に結合しているＯＨ基をＮＨ２基に置換して、アミノ化セルロースを得る工程；
該アミノ化セルロースとプライマーとを反応させて、該アミノ化セルロース中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素と、該プライマーの末端の１位炭素とを、−ＮＨ−基を介して共有結合させて、プライマー結合セルロースを得る工程；
該プライマー結合セルロースと、基質と、α−１，４グルカン鎖伸長酵素とを接触させることによってプライマーを伸長させることにより、重合度２５以上のα−１，４グルカン側鎖を形成させて、項目１〜７のいずれか１項に記載のグラフトポリマーを得る工程
を包含し、
該プライマーは、重合度３〜２０のα−１，４グルカン、またはその還元末端酸化物もしくはラクトン化物であり、
該基質は、該酵素の作用により該プライマーにグルコース残基を提供する物質であり、
該α−１，４グルカン側鎖の重合度が２５以上であり、
α−１，４グルカン結合セルロースにおいては、該１位炭素に２つの水素基が結合しているか、または１つの酸素原子が結合している、方法。
【００２４】
（項目９）
前記α−１，４グルカン側鎖の重合度が４０以上である、項目８に記載の方法。
【００２５】
（項目１０）
前記α−１，４グルカン側鎖の重合度が５０以上である、項目８または９に記載の方法。
【００２６】
（項目１１）
前記セルロースに結合しているα−１，４グルカンの数が、１〜１０，０００個である、項目８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【００２７】
（項目１２）
前記セルロース主鎖に結合しているα−１，４グルカン側鎖の数が、セルロース主鎖中のグルコース残基１００個あたり１〜５０個である、項目８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【００２８】
（項目１３）
前記グラフトポリマーを精製する工程をさらに包含する、項目８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００２９】
（項目１４）
前記アミノ化セルロースを得る工程が、
トリエチルアミン、塩化リチウムおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドの存在下でセルロースと塩化−ｐ−トルエンスルホニルとを反応させてトシル化セルロースを得ること；
テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージドおよびジメチルスルホキシドの存在下で該トシル化セルロースをアジ化ナトリウムと反応させて６−アジド−６−デオキシセルロースを得ること；ならびに
ジメチルスルホキシド中で該６−アジド−６−デオキシセルロースを水素化ホウ素ナトリウムと反応させてアミノ化セルロースを得ること
によって行われる、項目８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【００３０】
（項目１５）
前記α−１，４グルカン鎖伸長酵素がα−グルカンホスホリラーゼであり、前記基質がグルコース−１−リン酸である、項目８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【００３１】
（項目１６）
前記α−１，４グルカン鎖伸長酵素がα−グルカンホスホリラーゼおよびスクロースホスホリラーゼであり、前記基質がスクロースおよび無機リン酸またはグルコース−１−リン酸である、項目８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【００３２】
（項目１７）
前記α−１，４グルカン鎖伸長酵素がアミロスクラーゼであり、前記基質がスクロースである、項目８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により、α−１，４グルカングラフト化セルロース（アミロースグラフト化セルロースともいう）が得られる。本発明により、アミロースの機能が付与された、セルロースまたはセルロース製品を得ることができる。本発明のアミロースグラフト化セルロースは、セルロースの性能（例えば、力学的強度などの物性）とアミロースの性能（例えば、包接機能）とを併せ持つ素材であり、種々の用途に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、本発明によるグラフトポリマーの製造方法の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３６】
（１．セルロース）
本明細書中では、用語「セルロース」とは、多数（例えば、２５個以上）のＤ−グルコピラノースがβ１→４グルコシド結合によって連結された分子をいう。セルロース中の各結合単位をグルコース残基ともいう。セルロースは、（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎによって表され得る。セルロースは、植物細胞壁の骨組を形成する、植物体のおもな多糖類であり、植物が光合成する物質であり、植物体の約３分の１を占める。セルロースは、地球上で最も多い炭水化物である。セルロースは通常、白色で無臭の固体で吸湿性が強い。セルロースは、極性の高い溶媒に強親和性であり、硫酸、銅アンモニウム液、塩化亜鉛溶液、および塩酸に可溶である。セルロースは、水、アルコール、エーテル、メタノールに不溶である。セルロースは、４０〜５０本の分子が平行に並んでミクロフィブリルを形成し、それらが非結晶分子の散在する中を走って全体としてふさ状のミセルをつくっている。酸およびセルラーゼによって加水分解されてグルコースになるが、その中間体生成物としてセロビオース、セロトリオース、セロトテラオースなどができる。
【００３７】
本発明で使用されるセルロース１分子中のグルコース残基の数は、好ましくは約２５以上であり、より好ましくは約３０以上であり、さらに好ましくは約３５以上であり、特に好ましくは約４０以上であり、最も好ましくは約５０以上である。本発明で使用されるセルロース１分子中のグルコース残基の数は、例えば、約１００以上、約２００以上、約３００以上、約４００以上、約５００以上、約６００以上、約７００以上、約８００以上、約９００以上、約１，０００以上、約２，０００以上、約２，５００以上、約３，０００以上、約４，０００以上、約５，０００以上などであってもよい。本発明で使用されるセルロース１分子中のグルコース残基の数は、好ましくは約３０，０００以下であり、より好ましくは約２５，０００以下であり、さらに好ましくは約２０，０００以下であり、特に好ましくは約１５，０００以下であり、最も好ましくは約１０，０００以下である。本発明で使用されるセルロース１分子中のグルコース残基の数は、例えば、約９，０００以下、約８，０００以下、約７，０００以下、約６，０００以下、約５，０００以下、約４，０００以下、約３，０００以下、約２，０００以下、約１，０００以下、約９００以下、約８００以下、約７００以下、約６００以下、約５００以下、約４００以下などであってもよい。
【００３８】
一般に市販されるセルロースは天然物であり、種々の分子量を有するセルロースの混合物である。
【００３９】
本発明では、市販のセルロースを使用し得る。
【００４０】
（２．アミノ化セルロース）
本発明のグラフトポリマーの製造方法は、セルロース中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素に結合しているＯＨ基をＮＨ２基に置換して、アミノ化セルロースを得る工程；該アミノ化セルロースとプライマーとを反応させて、該アミノ化セルロース中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素と、該プライマーの末端の１位炭素とを、−ＮＨ−基を介して共有結合させて、プライマー結合セルロースを得る工程；該プライマー結合セルロースと、基質と、α−１，４グルカン鎖伸長酵素とを接触させることによってプライマーを伸長させることにより、重合度２５以上のα−１，４グルカン側鎖を形成させて、本発明のグラフトポリマーを得る工程を包含する。ここではまず、アミノ化セルロースの作製方法について以下に説明する。
【００４１】
なお、アミノ化セルロースの製造方法については種々の経路を経るものが当該分野で公知であり、本明細書中に記載した経路以外の経路で製造することもできる。例えば、６−トシル化セルロース誘導体を経て製造する以外に、６−酸化セルロース誘導体を経て製造する方法が公知である。アミノ化セルロースは、当該分野で公知の方法によって製造され得る。例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４０（２００５）１４０３−１４０６およびＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０８（１９９０）８３−１９１を参照のこと。
【００４２】
（３．  スキーム１  セルロースからのアミノ基含有セルロースの合成）
アミノ化セルロース（すなわち、アミノ基含有セルロース）を製造する方法の１つの実施態様のスキームを以下に示す。
【００４３】
【化５】
2009293017.tif 000004
本発明の１つの実施形態ではまず、上記スキーム１にしたがってアミノ基含有セルロース（スキーム１中の化学式３）の合成を行う。概略を述べると、塩化トシル（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｐｈｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いてセルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）をトシラート化してｐ−トルエンスルホニル基含有セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈａｖｉｎｇ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｐｈｏｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）１を得る。
【００４４】
なお、本明細書中では、ｐ−トルエンスルホニル基含有セルロース１についてスキーム１中に示したように、化学式の（）ｎ内に／で区切られた２つの構造を示す場合がある。これは、ポリマーの構造単位が、／で区切られた２つの構造のいずれかであることを示す。この２つの構造の並び方、存在頻度などは、反応条件、反応物などによって変化するため、確定した化学式として示すことができない。
【００４５】
各工程についてより詳細に説明する。
【００４６】
（３．１  トシラート化）
詳細には、まず、セルロースをトシラート化して、ｐ−トルエンスルホニル基含有セルロース（スキーム１中の化学式１）を得る。トシラート化の代表的な条件は、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）および塩化リチウム（ＬｉＣｌ）を含有するＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中で、塩化トシルとともに１０℃にて２４時間である。この条件で反応を行うと、６位の水酸基が選択的にトシラート化され、他の水酸基はトシラート化されない。セルロースと、塩化トシルと、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドと、トリエチルアミンと、塩化リチウムとは、一度に混合してもよいが、予めセルロース溶液を作製した後に塩化トシルを添加することが好ましい。トシラート化の前にセルロースをＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中に充分に溶解させ、その後塩化リチウムを添加して溶解し、トリエチルアミンを添加してよく混合した後に塩化トシルを添加することが好ましい。
【００４７】
セルロースに対して導入されるｐ−トルエンスルホニル基の数または割合を増やすためには、塩化トシルの量を増やすか、反応温度を上げるか、または反応時間を長くすればよい。セルロースに対して導入されるｐ−トルエンスルホニル基の数または割合を減らすためには、塩化トシルの量を減らすか、反応温度を下げるか、または反応時間を短くすればよい。セルロースに対して導入されるｐ−トルエンスルホニル基の数または割合の調節は、当業者によって容易に行われ得る。
【００４８】
（３．２  アジド化）
次いで、上記で得られたｐ−トルエンスルホニル基含有セルロース（スキーム１中の化学式１）をアジド化することにより、アジド基含有セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈａｖｉｎｇ  ａｚｉｄｅ  ｇｒｏｕｐｓ）（スキーム１中の化学式２）を得る。ｐ−トルエンスルホニル基含有セルロース１のアジド化の代表的な条件は、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージド（（ｎ−Ｂｕ）４ＮＩ）およびアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）を含有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、７０℃にて７２時間である。ｐ−トルエンスルホニル基含有セルロースと、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージドと、アジ化ナトリウムと、ジメチルスルホキシドとは、一度に混合してよい。
【００４９】
（３．３  アジド基の還元）
次いで、アジド基含有セルロース（スキーム１中の化学式２）を還元することによりアミノ基含有セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈａｖｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ）（スキーム１中の化学式３）を合成する。アジド基含有セルロース（スキーム１中の化学式２）の還元の代表的な条件は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を含有するＤＭＳＯ中、６０℃にて７２時間である。アジド基含有セルロース（スキーム１中の化学式２）と、水素化ホウ素ナトリウムと、ＤＭＳＯとは、一度に混合してよい。
【００５０】
（４．プライマー）
本発明において使用されるプライマーは、α−１，４グルカン鎖の合成において出発物質として作用する分子をいう。本発明の方法では、プライマーに対して糖単位がα−１，４−グルコシド結合で順次結合されて、約２５残基以上の長さのα−１，４グルカン鎖が合成される。プライマーの例としては、α−グルカンホスホリラーゼによって糖単位が付加され得る任意の糖が挙げられる。
【００５１】
プライマーは、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４グルカンであっても、α−１，６−グルコシド結合を部分的に有してもよい。当業者は、所望のグルカンに応じて、適切なプライマーを容易に選択し得る。本発明では、直鎖状のアミロースをグラフト化させたセルロースを合成することが好ましいので、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４グルカン、またはその還元末端酸化物もしくはラクトン化物をプライマーとして用いることが好ましい。本明細書中では、α−１，４グルカンであるプライマーをα−１，４グルカンプライマーということがあり、α−１，４グルカンの還元末端酸化物であるプライマーを酸化プライマーということがあり、α−１，４グルカンの還元末端のグルコース残基のラクトン化物であるプライマーをラクトン化プライマーということがある。
【００５２】
（４．１  α−１，４グルカンプライマー）
α−１，４グルカンプライマーの例としては、マルトオリゴ糖および短鎖アミロースが挙げられる。α−１，４グルカンの還元末端は、酸化もラクトン化もされておらず、水溶液中では、アルデヒドの状態と環状構造になった状態との平衡状態を保っている。α−１，４グルカンプライマーは、アルデヒドの状態で還元的アミノ化に寄与する。
【００５３】
マルトオリゴ糖は、本明細書中では、２〜１０個のグルコースが脱水縮合して生じた物質であって、α−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖は、好ましくは４個以上の糖単位、より好ましくは５個以上の糖単位、さらに好ましくは７個以上の糖単位を有する。なお、この糖単位の数を、重合度ともいう。マルトオリゴ糖は、好ましくは１０個以下の糖単位を有する。マルトオリゴ糖の糖単位数は、例えば、９個以下、８個以下、７個以下などであってもよい。マルトオリゴ糖の糖単位数が小さいほど、調整が容易であり、コストも安く、その後の取り扱いも容易である。マルトオリゴ糖が短すぎると、酵素が効率的に作用できず、よって糖鎖を伸長させることができない。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。マルトオリゴ糖は、好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースである。本発明で使用するマルトオリゴ糖は、純粋な単一の化合物であってもよいし、複数のマルトオリゴ糖の混合物であってもよい。マルトオリゴ糖は、直鎖状のオリゴ糖であってもよいし、分枝状のオリゴ糖であってもよい。マルトオリゴ糖は、その分子内に、環状部分を有し得る。本発明では、直鎖状のマルトオリゴ糖が好ましい。
【００５４】
本明細書中では、短鎖アミロースとは、重合度が１１以上２０以下である、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖状分子である。短鎖アミロースは、天然の澱粉中に含まれるアミロペクチンを枝きり酵素（例えばイソアミラーゼ）により完全分解することによって得られる。本発明においてプライマーとして用いる場合、短鎖アミロースの糖単位数は、例えば、約１１以上、約１２以上、約１３以上などであり得る。本発明においてプライマーとして用いる場合、短鎖アミロースの糖単位数は、例えば、約２０以下、約１９以下、約１８以下、約１７以下、約１６以下、約１５以下、約１４以下、約１３以下、約１２以下などであり得る。
【００５５】
（４．２  酸化プライマー）
本明細書中では、「酸化プライマー」とは、プライマーの還元末端にあるアルデヒド基が酸化されてカルボキシル基になっているものをいう。酸化プライマーにおいては、アルデヒド基以外の部分は酸化されていないことが好ましい。
【００５６】
上記４．１に記載されるマルトオリゴ糖および短鎖アミロースの還元末端にあるアルデヒド基を酸化することにより、酸化プライマーを製造することができる。マルトオリゴ糖（または短鎖アミロース）の還元末端のアルデヒド基の酸化は、例えば酵素的または化学的に行うことができる。酵素的酸化には、例えばオリゴ糖酸化酵素を用いることができる。また、化学的酸化には、例えば臭素水やヨウ素を用いることができる。
【００５７】
オリゴ糖酸化酵素の例としては、特開平５−８４０７４号公報に記載されているアクレモニウム属起源のオリゴ糖酸化酵素を挙げることができる。オリゴ糖酸化酵素を作用させた場合、原料のマルトオリゴ糖（または短鎖アミロース）の還元末端グルコース残基が酸化されグルコン酸型になる。例えば、基質となるマルトオリゴ糖の濃度を１〜２０％（ｗ／ｖ）とし、ｐＨを６〜８とし、温度３０〜５０℃でこの酸化酵素を０．１〜０．５単位加えて５〜１０時間反応を行なうことにより、マルトオリゴ糖がマルトオリゴ糖酸に変換され得る。
【００５８】
臭素水またはヨウ素による原料のマルトオリゴ糖（または短鎖アミロース）の還元末端のアルデヒド基の化学的酸化は、例えば、以下のとおりに行われ得る。ヨウ素を用いる場合、１〜１０重量％マルトオリゴ糖水溶液と例えば５重量％ヨウ素−メタノール溶液とを等量混合し、３０〜５０℃で４％水酸化カリウムを全液量の１／５〜１／３滴下することにより、原料のマルトオリゴ糖をマルトオリゴ糖酸に変換し得る。
【００５９】
（４．３  ラクトン化プライマー）
本明細書中では、「ラクトン化プライマー」とは、プライマーの還元末端にあるグルコース残基がラクトン化されたものをいう。ラクトン化プライマーにおいては、還元末端のグルコース残基以外の部分はラクトン化されていないことが好ましい。
【００６０】
上記４．２に記載される酸化プライマーを含む溶液からイオン交換樹脂を用いてカウンターイオンを除去した後、酸化プライマーを含む画分を集めて乾燥することによりラクトン化プライマーを得ることができる。
【００６１】
（５．プライマーグラフト化アミノ化セルロースの作製方法）
アミノ化セルロースにプライマーを結合させ、プライマーグラフトセルロースを作る方法としては、以下のいずれかの方法を選択しうる。
（１）還元的アミノ化法：セルロースに結合したアミノ基とプライマーの還元性末端とからシッフ塩基を形成させ、その後還元剤を用いてこのシッフ塩基を還元的にアミノ化する方法。この方法を用いた場合、プライマーは以下の構造式（ＩＩＩ）の構造でセルロースに共有結合（グラフト）される。
（２）カルボジイミドカップリング法：プライマーの還元性末端を酸化した酸化プライマーのカルボキシル基と、セルロースに結合したアミノ基との間に、カルボジイミドを用いてアミド結合を形成させる方法。この方法を用いた場合、プライマーは以下の構造式（ＩＩ）の構造でセルロースに共有結合（グラフト）される。
（３）ラクトン化プライマー法：プライマーの還元性末端を酸化した酸化プライマーを脱水することにより得られたラクトン化プライマーおよびアミノ化セルロースを無水環境下で加熱して、ラクトン化プライマーの−ＣＯ−Ｏ−部分とセルロースに結合したアミノ基との間にアミド結合を形成させる方法。この場合、プライマーは以下の構造式（ＩＩ）の構造でセルロースに共有結合（グラフト）される。
【００６２】
【化６】
2009293017.tif 000005
（５．１  スキーム２  プライマーグラフト化セルロースの合成）
プライマーグラフト化セルロースを合成する方法の１つの実施態様を以下のスキームに示す。
【００６３】
【化７】
2009293017.tif 000006
上記スキーム２では、プライマーの例としてマルトヘプタオースを示し、プライマーグラフト化セルロースの例として、マルトヘプタオースグラフト化セルロース（スキーム２中の化学式５）を示す。概略を述べると、アミノ基含有セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈａｖｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ）（スキーム２中の化学式３）へのプライマー（例えば、マルトヘプタオース（ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）（スキーム２中の化学式４））の導入反応を、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を用いる還元的アミノ化反応により行う。得られた生成物を１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより分析すると、マルトヘプタオース（スキーム２中の化学式４）の良溶媒であるＤＭＳＯで十分洗浄したとしても、主鎖であるセルロースのアノマー位由来のピークとマルトヘプタオース（スキーム２中の化学式４）のアノマー位由来のピークが観察される。それゆえ、生成物の構造がマルトヘプタオースグラフト化セルロース（ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ−ｇｒａｆｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（スキーム２中の化学式５）であることが確認される。
【００６４】
（５．２  還元的アミノ化）
還元的アミノ化の代表的な条件は、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウムおよびプライマーを含有する酢酸メタノール混合溶液（１：１混合溶液）中で室温（ｒ．ｔ．）にて３日間である。アミノ基含有セルロースと、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウムと、トリエチルアミンと、プライマーと、酢酸と、メタノールとは、一度に混合してもよく、予め酢酸エタノール混合溶液を作製した後に他のものを添加してもよい。他の任意の混合順序であってもよい。
【００６５】
（５．３  カルボジイミドカップリング）
カルボジイミドカップリングの代表的な条件は、アミノ基含有セルロース、酸化プライマー、カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩化物）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを含有する水溶液中で室温にて１日間である。アミノ基含有セルロースと、酸化プライマーと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドとは、一度に混合してもよく、予め酸化プライマー溶液を作製した後に他のものを添加してもよい。他の任意の混合順序であってもよい。
【００６６】
（５．４  ラクトン化プライマー法）
ラクトン化プライマー法の代表的な条件は、アミノ基含有セルロースおよびラクトン化プライマーを含むエチレングリコールの７０℃で６時間の加熱である。アミノ基含有セルロースと、ラクトン化プライマーと、エチレングリコールとは、一度に混合してもよく、または他の任意の混合順序であってもよい。
【００６７】
（６．基質およびα−１，４グルカン鎖伸長酵素）
本明細書中では、用語「基質」とは、酵素によって触媒作用を受けて変化する物質をいう。本明細書では場合によって、基質の概念にプライマーを含まない場合がある。好ましくは、基質は、酵素によって触媒作用を受けて、プライマーに対してα−１，４グルカン鎖を伸長させる化合物である。
【００６８】
当該分野では、水溶液中で行われる、種々のα−１，４グルカン鎖伸長反応が公知である。本発明においては、α−１，４グルカン鎖が伸長される限り、当該分野で公知の任意の基質が使用され得る。基質は、使用されるα−１，４グルカン鎖伸長酵素に適切であるように選択される。
【００６９】
本明細書中では、用語「α−１，４グルカン鎖伸長酵素」とは、プライマーに対してα−１，４グルカン鎖を伸長させる酵素およびそれに関与する酵素をいう。
【００７０】
本発明で使用され得るα−１，４グルカン鎖伸長系の例としては、以下が挙げられる：
（１）α−グルカンホスホリラーゼ（Ｇｌｕｃａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ：ＧＰ）（例えば、馬鈴薯由来）により、α−グルコース−１−リン酸（ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のグルコシル基をプライマーであるマルトヘプタオースなどに転移することによりα−１，４−グルカン鎖を合成する方法；
（２）プライマー、スクロースおよび無機リン酸またはグルコース−１−リン酸を基質として、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼを同時に作用させてα−１，４−グルカン鎖を合成する方法（以下、ＳＰ−ＧＰ法という）（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｈ．ら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５７（１９８６）ｃ４−ｃ７；ＷＯ２００２／０９７１０７）。この方法は、他の方法よりも安価に直鎖状グルカンを合成し得るという利点を有する；
（３）プライマーおよびスクロースを基質として使用して、アミロスクラーゼを作用させることによりα−１，４−グルカン鎖を合成する方法。
【００７１】
従って、（１）の反応系を使用する場合、α−１，４グルカン鎖伸長酵素はα−グルカンホスホリラーゼであり、基質はプライマーおよびグルコース−１−リン酸である。
【００７２】
（２）の反応系を使用する場合、α−１，４グルカン鎖伸長酵素はα−グルカンホスホリラーゼおよびスクロースホスホリラーゼであり、基質はプライマー、スクロースおよび無機リン酸またはグルコース−１−リン酸である。
【００７３】
（３）の反応系を使用する場合、α−１，４グルカン鎖伸長酵素はアミロスクラーゼであり、基質はプライマーおよびスクロースである。
【００７４】
（６．１  無機リン酸）
本明細書中において、無機リン酸とは、ＳＰの反応においてリン酸基質を供与し得る物質をいう。ここでリン酸基質とは、グルコース−１−リン酸のリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ）の原料となる物質をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒されるスクロース加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。本発明において、無機リン酸は好ましくは、リン酸の任意の金属塩であり、より好ましくはリン酸のアルカリ金属塩である。無機リン酸の好ましい具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどが挙げられる。
【００７５】
無機リン酸は、１種類のみ使用してもよく、複数種類使用してもよい。
【００７６】
無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。
【００７７】
本明細書において、グルコース−１−リン酸とは、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。
【００７８】
グルコース−１−リン酸は反応開始時のＳＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ使用してもよく、複数種類使用してもよい。
【００７９】
本発明の系（好ましくは、水を主成分とする水系溶媒相）に含まれる無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計は、代表的には約１ｍＭ以上であり、好ましくは約１０ｍＭ以上であり、より好ましくは約２０ｍＭ以上である。本発明の系（好ましくは、水を主成分とする水系溶媒相）に含まれる無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計は、好ましくは約１０００ｍＭ以下であり、好ましくは約５００ｍＭ以下であり、より好ましくは約２５０ｍＭ以下である。無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の量が多すぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの合成に時間がかかる場合がある。
【００８０】
（６．２  スクロース）
スクロースは、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１で示される、分子量約３４２の二糖である。スクロースは、光合成能を有するあらゆる植物中に存在する。スクロースは、植物から単離されてもよいし、化学的に合成されてもよい。コストの面からみて、スクロースを植物から単離することが好ましい。スクロースを多量に含む植物の例としては、サトウキビ、サトウダイコンなどが挙げられる。サトウキビは、汁液中に約２０％のスクロースを含む。サトウダイコンは、汁液中に約１０〜１５％のスクロースを含む。スクロースは、スクロースを含む植物の汁液から精製糖に至るいずれの精製段階のものとして提供されてもよい。
【００８１】
本発明の方法で使用されるスクロースは、純粋なものであることが好ましい。しかし、α−１，４グルカン鎖伸長を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。
【００８２】
（６．３  α−グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ.２．４．１．１）：
α−グルカンホスホリラーゼとは、α−１，４−グルカンの加リン酸分解を触媒する酵素の総称であり、グルカンホスホリラーゼ、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。α−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、α−グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。本発明の方法においてＳＰ−ＧＰ法を用いる場合、無機リン酸は、スクロースの加リン酸分解に使われ、反応溶液中に含まれる無機リン酸の量が少ないので、α−１，４−グルカンの合成の方向に反応が進む。他の系を用いる場合も、α−１，４−グルカンの合成の方向に反応が進むように基質の量が調整される。
【００８３】
α−グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。本発明においてα−グルカンホスホリラーゼを用いる場合、このα−グルカンホスホリラーゼは、植物、動物または微生物由来であってもよく、またはこれらに由来するものを遺伝子工学によって生産したものであってもよい。
【００８４】
α−グルカンホスホリラーゼは、藻類、ジャガイモ（馬鈴薯ともいう）、サツマイモ（甘藷ともいう）、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などからなる群より選択される選択される植物由来であり得る。
【００８５】
α−グルカンホスホリラーゼは、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類などからなる群より選択される動物由来であり得る。
【００８６】
α−グルカンホスホリラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．などからなる群より選択される微生物由来であり得る。グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【００８７】
α−グルカンホスホリラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、ジャガイモに由来することがより好ましい。α−グルカンホスホリラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いα−グルカンホスホリラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。α−グルカンホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。
【００８８】
（６．４  スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．１．７））
本明細書中では、「スクロースホスホリラーゼ」とは、スクロースのα−グリコシル基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【００８９】
【化８】
2009293017.tif 000007
スクロースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｍｏｎｉｌｉａ  ｓｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｅａ  ｅｓｃｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．からなる群より選択される細菌に由来し得る。スクロースホスホリラーゼが由来する生物は、これらに限定されない。
【００９０】
スクロースホスホリラーゼは、スクロースホスホリラーゼを産生する任意の生物由来であり得る。スクロースホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、単独で存在する場合の耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、スクロースホスホリラーゼを４％のスクロース存在下で５５℃にて３０分間加熱した場合に加熱前のスクロースホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌由来であり、さらに好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ由来である。スクロースホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。
【００９１】
（６．５  α−１，４グルカン鎖伸長酵素についての一般的説明）
上記のような本発明のα−１，４グルカン鎖伸長酵素は、任意の生物に由来し得る。本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
【００９２】
本発明で用いられるα−１，４グルカン鎖伸長酵素は、上記のような自然界に存在する、α−１，４グルカン鎖伸長酵素を産生する動物、植物、および微生物から直接単離され得る。
【００９３】
本発明で用いられるα−１，４グルカン鎖伸長酵素は、これらの動物、植物または微生物から単離したα−１，４グルカン鎖伸長酵素をコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。α−１，４グルカン鎖伸長酵素は、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。スクロースホスホリラーゼおよびα−グルカンホスホリラーゼの生産方法は、例えば、ＷＯ２００２／０９７１０７に開示されている。他のα−１，４グルカン鎖伸長酵素についても、この記載に従って同様に行われ得る。
【００９４】
（７．プライマーグラフト化セルロースからのα−１，４グルカングラフト化セルロースの作製方法）
以下では、プライマーグラフト化セルロース（プライマー結合セルロースともいう）と、基質と、α−１，４グルカン鎖伸長酵素とを接触させることによってプライマーを伸長させることにより、重合度２５以上のα−１，４グルカン側鎖を形成させて、本発明のアミロースグラフト化セルロース（グラフトポリマーともいう）を得る工程について説明する。
【００９５】
（７．１  スキーム３  アミロースグラフト化セルロースの合成）
【００９６】
【化９】
2009293017.tif 000008
次に、アミロースグラフト化セルロース（スキーム３中の化学式６）の合成をスキーム３に示す。このスキーム３では、酵素反応系として（１）の反応系を使用する場合を示す。概略を述べると、マルトヘプタオースグラフト化セルロース（スキーム３中の化学式５）のマルトヘプタオースユニットに対して１００当量のグルコース−１−リン酸塩（Ｇ−１−Ｐ）存在下、酢酸緩衝液中でα−１，４グルカン鎖伸長酵素（例えば、α−グルカンホスホリラーゼ）による酵素触媒重合を行い、アミロースグラフト化セルロース（スキーム３中の化学式６）の合成を行う。生成物は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に可溶であり、１Ｈ  ＮＭＲスペクトル、ＸＲＤ測定、ＴＧ測定により得られた生成物の構造がアミロースグラフト化セルロース（スキーム３中の化学式６）であることが確認される。
【００９７】
上述のように、酵素反応系としては、（１）に限定されず、（１）〜（３）の任意のものが使用され得、そしてその酵素反応系に合わせて酵素および基質が適切に選択され得る。
【００９８】
（７．２  α−１，４グルカン鎖の伸長）
酵素反応系として（１）を用いる場合、α−１，４グルカン鎖の伸長の代表的な条件は、プライマーグラフト化セルロース（例えば、マルトヘプタオースグラフト化セルロース（スキーム３中の化学式５））のプライマーユニット（例えば、マルトヘプタオースユニット）に対して１００当量のグルコース−１−リン酸塩（Ｇ−１−Ｐ）存在下、酢酸緩衝液中でα−１，４グルカン鎖伸長酵素（例えば、α−グルカンホスホリラーゼ）によって約４２℃にて約７時間である。プライマーグラフト化セルロースと、グルコース−１−リン酸塩と、α−１，４グルカン鎖伸長酵素と、酢酸緩衝液とは、一度に混合してもよく、予め酢酸エタノール混合溶液を作製した後に他のものを添加してもよい。他の任意の混合順序であってもよい。
【００９９】
酵素反応系として（１）〜（３）のいずれの反応系を用いる場合も、α−１，４グルカン鎖の伸長反応開始時の溶液中でのプライマーグラフト化セルロースの量は、好ましくは約０．１重量％以上であり、より好ましくは約０．２重量％以上であり、さらに好ましくは約０．３重量％以上であり、特に好ましくは約０．４重量％以上であり、最も好ましくは約０．５重量％以上である。α−１，４グルカン鎖の伸長反応開始時の溶液中でのプライマーグラフト化セルロースの量は、好ましくは約１０重量％以下であり、より好ましくは約５重量％以下であり、さらに好ましくは約４重量％以下であり、特に好ましくは約３重量％以下であり、最も好ましくは約２重量％以下である。
【０１００】
酵素反応系として（１）の反応系を用いる場合、α−１，４グルカン鎖の伸長反応開始時の系中でのグルコース−１−リン酸塩の濃度は、好ましくはプライマーグラフト化セルロース中のプライマーモル濃度の約４０倍以上であり、より好ましくは約５０倍以上であり、さらに好ましくは約６０倍以上であり、特に好ましくは約７０倍以上であり、最も好ましくは約８０倍以上である。α−１，４グルカン鎖の伸長反応開始時の溶液中での無機リン酸またはグルコース−１−リン酸塩の濃度は、好ましくはプライマーグラフト化セルロース中のプライマーモル濃度の約１０００倍以下であり、より好ましくは約８００倍以下であり、さらに好ましくは約６００倍以下であり、特に好ましくは約４００倍以下であり、最も好ましくは約３００倍以下である。
【０１０１】
酵素反応系として（１）の反応系を用いる場合、反応開始時の系中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコース−１−リン酸に対して、好ましくは約０．０５Ｕ／ｇグルコース−１−リン酸以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｇグルコース−１−リン酸以上であり、さらに好ましくは約０．５Ｕ／ｇグルコース−１−リン酸以上である。反応開始時の系中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコース−１−リン酸に対して、好ましくは約１，０００Ｕ／ｇグルコース−１−リン酸以下であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇグルコース−１−リン酸以下であり、さらに好ましくは約１００Ｕ／ｇグルコース−１−リン酸以下である。α−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１０２】
酵素反応系として（２）の反応系を使用する場合、反応開始時の系中に含まれるスクロースのモル濃度は、好ましくはプライマーグラフト化セルロース中のプライマーモル濃度の約４０倍以上であり、より好ましくは約５０倍以上であり、さらに好ましくは約６０倍以上である。スクロースの濃度は、例えば、約６ｗ／ｖ％以上、約７ｗ／ｖ％以上、約８ｗ／ｖ％以上、約９ｗ／ｖ％以上、約１０ｗ／ｖ％以上、約１５ｗ／ｖ％以上などであってもよい。本発明の系中に含まれるスクロースの濃度は、プライマーグラフト化セルロース中のプライマーモル濃度の約１０００倍以下であり、より好ましくは約８００倍以下であり、さらに好ましくは約６００倍以下である。スクロースの濃度は、例えば、約５０ｗ／ｖ％以下、約４０ｗ／ｖ％以下、約３０ｗ／ｖ％以下、約２０ｗ／ｖ％以下、約１５ｗ／ｖ％以下、約１０ｗ／ｖ％以下などであってもよい。
【０１０３】
上述のスクロースの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（スクロースの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。スクロースの重量が多すぎると、反応中に未反応のスクロースが析出する場合がある。スクロースの使用量が少なすぎると、高温での反応において収率が低下する場合がある。
【０１０４】
酵素反応系として（２）の反応系を用いる場合、α−１，４グルカン鎖の伸長反応開始時の系中での無機リン酸またはグルコース−１−リン酸塩の量は、合計として、好ましくはスクロースのモル濃度の約１／４０以上であり、より好ましくは約１／３０以上であり、さらに好ましくは約１／２５以上であり、特に好ましくは約１／２０以上であり、最も好ましくは約１／１５重量％以上である。α−１，４グルカン鎖の伸長反応開始時の溶液中での無機リン酸またはグルコース−１−リン酸塩の量は、合計として、好ましくはスクロースのモル濃度の約１／２以下であり、より好ましくは約１／３重量％以下であり、さらに好ましくは約１／４重量％以下であり、特に好ましくは約１／５重量％以下であり、最も好ましくは約１／６重量％以下である。
【０１０５】
酵素反応系として（２）の反応系を使用する場合、反応開始時の系中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約０．０５Ｕ／ｇスクロース以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｇスクロース以上であり、さらに好ましくは約０．５Ｕ／ｇスクロース以上である。反応開始時の系中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約１，０００Ｕ／ｇスクロース以下であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇスクロース以下であり、さらに好ましくは約１００Ｕ／ｇスクロース以下である。α−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１０６】
酵素反応系として（２）の反応系を使用する場合、反応開始時の系中に含まれるスクロースホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約０．０５Ｕ／ｇスクロース以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｇスクロース以上であり、さらに好ましくは約０．５Ｕ／ｇスクロース以上である。反応開始時の系中に含まれるスクロースホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約１，０００Ｕ／ｇスクロース以下であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇスクロース以下であり、さらに好ましくは約１００Ｕ／ｇスクロース以下である。スクロースホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１０７】
酵素反応系として（３）の反応系を使用する場合、反応開始時の系中に含まれるスクロースの量は、好ましくは約１ｗ／ｖ％以上であり、より好ましくは約３ｗ／ｖ％以上であり、さらに好ましくは約５ｗ／ｖ％以上である。スクロースの濃度は、例えば、約６ｗ／ｖ％以上、約７ｗ／ｖ％以上、約８ｗ／ｖ％以上、約９ｗ／ｖ％以上、約１０ｗ／ｖ％以上、約１５ｗ／ｖ％以上などであってもよい。本発明の系中に含まれるスクロースの濃度は、好ましくは約８０ｗ／ｖ％以下であり、より好ましくは約７０ｗ／ｖ％以下であり、さらに好ましくは約６０ｗ／ｖ％以下である。スクロースの濃度は、例えば、約５０ｗ／ｖ％以下、約４０ｗ／ｖ％以下、約３０ｗ／ｖ％以下、約２０ｗ／ｖ％以下、約１５ｗ／ｖ％以下、約１０ｗ／ｖ％以下などであってもよい。
【０１０８】
酵素反応系として（３）の反応系を使用する場合、反応開始時の系中に含まれるアミロスクラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約０．０５Ｕ／ｇスクロース以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｇスクロース以上であり、さらに好ましくは約０．５Ｕ／ｇスクロース以上である。反応開始時の系中に含まれるアミロスクラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約１，０００Ｕ／ｇスクロース以下であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇスクロース以下であり、さらに好ましくは約１００Ｕ／ｇスクロース以下である。スクロースホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１０９】
酵素反応系として（１）〜（３）のいずれの反応系を用いる場合も、α−１，４グルカン鎖の伸長の際の温度条件は、使用する酵素の反応至適温度、耐熱性などを考慮して適切に設定される。反応至適温度が約３７℃付近にある通常の酵素の場合、反応温度は、好ましくは約１０℃以上であり、より好ましくは約２０℃以上であり、さらに好ましくは約２５℃以上であり、特に好ましくは約３０℃以上である。α−１，４グルカン鎖の伸長の際の温度条件は、好ましくは約４５℃以下であり、より好ましくは約４２℃以下であり、さらに好ましくは約４０℃以下であり、特に好ましくは約３８℃以下である。例えば、反応至適温度が約５０℃の耐熱性酵素の場合、反応温度は、好ましくは約３０℃以上であり、より好ましくは約３５℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上であり、特に好ましくは約４５℃以上である。α−１，４グルカン鎖の伸長の際の温度条件は、好ましくは約６５℃以下であり、より好ましくは約６０℃以下であり、さらに好ましくは約５５℃以下であり、特に好ましくは約５３℃以下である。反応温度は、使用される酵素の反応至適温度の±１０℃以内であることが好ましく、±５℃以内であることがより好ましい。この工程での反応温度が高すぎると、酵素が失活しα−１，４グルカン鎖の伸長が行われない場合がある。この工程での反応温度が低すぎると、酵素反応が進まずα−１，４グルカン鎖の伸長が行われない場合がある。
【０１１０】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、反応系全体に均質に熱が伝わるように、例えば有機系溶媒相中で攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０１１１】
反応時間は、好ましくは約０．５時間以上であり、より好ましくは約１時間以上であり、さらに好ましくは約３時間以上であり、特に好ましくは約５時間以上であり、最も好ましくは約８時間以上である。反応時間は、好ましくは約７２時間以下であり、より好ましくは約４８時間以下であり、さらに好ましくは約３６時間以下であり、特に好ましくは約２４時間以下であり、最も好ましくは約２０時間以下である。この工程での反応時間が長すぎると、微生物汚染などのリスクが高くなる。この工程での反応時間が短すぎると、必要酵素量が多くなり、コストアップになる。
【０１１２】
反応終了後、反応系は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応系中の酵素が失活され得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。反応系は、そのまま保存されてもよいし、生産されたグラフトポリマーを単離するために処理されてもよい。
【０１１３】
各α−１，４グルカン側鎖は、好ましくは、重合度が約２５以上になるまで伸長される。各α−１，４グルカン側鎖の重合度は、反応系に含まれる基質の量、セルロース中に導入されたプライマーの量、反応時間の長さなどによって調節される。一般的には、基質の量が多いほど重合度は高くなり、基質の量が少ないほど重合度は低くなる。セルロース中に導入されたプライマーの量が多いほど重合度は低くなり、プライマーの量が少ないほど重合度は高くなる。反応時間が長いほど重合度は低くなり、反応時間が短いほど重合度は高くなる。
【０１１４】
本発明の方法によって得られる生成物は、当業者に公知の方法によって精製され得る。精製方法の例としては、限外ろ過膜を用いた膜分画、クロマトグラフィー、濾過、遠心分離が挙げられる。
【０１１５】
本発明の方法によって得られる生成物は、当業者に周知の従来の方法（例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、融点、質量分析（ＭＳ）、元素分析など）により、純度について分析および／または検査され得る。反応生成物の構造は、反応生成物を精製した後、ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）およびＭＳを行うことにより、詳細に確認され得る。
【０１１６】
（８．本発明のグラフトポリマー）
本発明のグラフトポリマーは、α−１，４グルカン側鎖がセルロース主鎖に結合したグラフトポリマーであって、セルロース主鎖中の少なくとも１つのグルコース残基の６位炭素にα−１，４グルカン側鎖の末端の１位炭素が、−ＮＨ−基を介して共有結合しており；該１位炭素に２つの水素基が結合しているか、または１つの酸素原子が結合しており；該セルロース主鎖の重合度が２５以上であり；該α−１，４グルカン側鎖の重合度が２５以上である。
【０１１７】
ここで、α−１，４グルカン側鎖中のグルコース残基とグルコース残基との間の結合は、主にα−１，４結合である。グルコース残基とグルコース残基との間の結合のうち、９０％以上がα−１，４結合であることが好ましく、９５％以上がα−１，４結合であることがより好ましく、９８％以上がα−１，４結合であることがさらに好ましく、９９％以上がα−１，４結合であることが特に好ましく、９９．５％以上がα−１，４結合であることが最も好ましい。
【０１１８】
該α−１，４グルカン側鎖は完全に直鎖状であることが好ましい。ここで、「完全に直鎖状」とは、α−１，４グルカン側鎖中のグルコース残基とグルコース残基との間の結合が、すべてα−１，４結合であり、α−１，６結合を含まないことをいう。
【０１１９】
本発明のグラフトポリマーはまた、α−１，４グルカングラフト化セルロース、アミロースグラフト化セルロースなどとも呼ばれる。
【０１２０】
本発明のグラフトポリマーは、好ましくは以下の構造（Ｉ）を有する：
【０１２１】
【化１０】
2009293017.tif 000009
ここで、各Ｒは、−ＯＨ、−ＮＨ２および以下の構造（ＩＩ）もしくは（ＩＩＩ）からなる群より独立して選択され、該ｎが２５〜２０，０００の任意の整数であり、該ｍが２４〜１０００の整数であり、セルロース主鎖中のグルコース残基どうしがβ−１，４結合により結合している：
【０１２２】
【化１１】
2009293017.tif 000010
。
【０１２３】
本発明の製造方法においてプライマーとしてα−１，４グルカンプライマー（すなわち、還元末端が酸化もラクトン化もされていないプライマー）を用いると、セルロースの６位炭素と−ＮＨ−基を介して結合しているα−１，４グルカンの末端の１位炭素に２つの水素基が結合したグラフトポリマーが得られる。すなわち、上記ＩＩＩの構造を有するα−１，４グルカン側鎖がセルロース骨格に結合しているグラフトポリマーが得られる。
【０１２４】
本発明の製造方法においてプライマーとして酸化プライマーまたはラクトン化プライマーを用いると、セルロースの６位炭素と−ＮＨ−基を介して結合しているα−１，４グルカンの末端の１位炭素に１つの酸素原子が結合したグラフトポリマーが得られる。すなわち、上記ＩＩの構造を有するα−１，４グルカン側鎖がセルロース骨格に結合しているグラフトポリマーが得られる。
【０１２５】
本発明のグラフトポリマー中のセルロース主鎖１分子中のグルコース残基の数（すなわち、ｎ）は、好ましくは約２５以上であり、より好ましくは約３０以上であり、さらに好ましくは約３５以上であり、特に好ましくは約４０以上であり、最も好ましくは約５０以上である。例えば、約１００以上、約２００以上、約３００以上、約４００以上、約５００以上、約６００以上、約７００以上、約８００以上、約９００以上、約１，０００以上、約２，０００以上、約２，５００以上、約３，０００以上、約４，０００以上、約５，０００以上などであってもよい。本発明で使用されるセルロース主鎖１分子中のグルコース残基の数は、好ましくは約３０，０００以下であり、より好ましくは約２５，０００以下であり、さらに好ましくは約２０，０００以下であり、特に好ましくは約１５，０００以下であり、最も好ましくは約１０，０００以下である。例えば、約９，０００以下、約８，０００以下、約７，０００以下、約６，０００以下、約５，０００以下、約４，０００以下、約３，０００以下、約２，０００以下、約１，０００以下、約９００以下、約８００以下、約７００以下、約６００以下、約５００以下、約４００以下などであってもよい。
【０１２６】
本発明のグラフトポリマーにおいては、少なくとも１個のα−１，４グルカン鎖の重合度は、好ましくは約２５以上であり、より好ましくは約３０以上であり、さらに好ましくは約４０以上である。例えば、約５０以上、約６０以上、約７０以上、約８０以上、約９０以上、約１００以上などであってもよい。本発明のグラフトポリマーにおいては、少なくとも１個のα−１，４グルカン鎖の重合度は、好ましくは約１，０００以下であり、より好ましくは約８００以下であり、さらに好ましくは約５００以下である。例えば、約４００以下、約３００以下、約２００以下、約１００以下、約９０以下、約８０以下、約７０以下、約６０以下、約５０以下などであってもよい。α−１，４グルカン側鎖の重合度が大きすぎると、立体障害が生じて包接機能を充分に発揮できない場合がある。α−１，４グルカン側鎖の重合度が小さすぎると、所望の包接機能を得られない場合がある。
【０１２７】
本発明のグラフトポリマーにおいては、セルロース主鎖に結合したα−１，４グルカン側鎖の数平均重合度が上記の好適な範囲内にあることが特に好ましい。また、本発明のグラフトポリマーにおいては、セルロース主鎖に結合したα−１，４グルカン側鎖のうち、上記の好適な範囲を満たすα−１，４グルカン側鎖の割合は、好ましくは約５０％以上であり、より好ましくは約６０％以上であり、さらに好ましくは約７０％以上であり、特に好ましくは約８０％以上であり、最も好ましくは約９０％以上である。
【０１２８】
本発明のグラフトポリマーにおいては、セルロース１分子に結合しているα−１，４グルカン側鎖の数は、セルロース主鎖中のグルコース残基の数１００個あたり、好ましくは約１個以上であり、より好ましくは約２個以上であり、さらに好ましくは約３個以上であり、特に好ましくは約４個以上であり、最も好ましくは約５個以上である。本発明のグラフトポリマーにおいては、セルロース１分子に結合しているα−１，４グルカン側鎖の数は、セルロース主鎖中のグルコース残基の数１００個あたり、好ましくは約５０個以下であり、より好ましくは約４５個以下であり、さらに好ましくは約４０個以下であり、特に好ましくは約３５個以下であり、最も好ましくは約３０個以下である。
【０１２９】
（９．本発明のグラフトポリマーの用途）
従来からセルロースは、さまざまな用途に利用されており、その利用方法は公知である。その様々な用途において、本発明のグラフトポリマーを使用することが可能である。すなわち、従来からセルロースが使用される材料において、そのセルロースの一部またはすべてを本発明のグラフトポリマーに置き換えて使用することができる。
【０１３０】
より具体的には、例えば、本発明のグラフトポリマーは、環境浄化機能を有するフィルター、カラム充填材、香料含有繊維などの、複合機能性素材およびデバイスなどに利用され得る。
【０１３１】
例えば、本発明のグラフトポリマーを繊維の形態に加工して、得られた繊維を所望の形態に加工して最終的な製品とすることができる。
【０１３２】
また、例えば、セルロース繊維を製造する際に、原料のセルロース中に本発明のグラフトポリマーを混入させて、グラフトポリマー含有繊維を製造し、その繊維を所望の形態に加工して目的の製品を得ることもできる。
【０１３３】
また、例えば、本発明のグラフトポリマーから得られた繊維をセルロース繊維と混合して、得られた混合繊維を所望の形態に加工して最終的な製品とすることができる。このような混合繊維はアミロースの包接機能を付与された繊維であり、環境ホルモンや界面活性剤の除去機能を有する水処理用フィルターなどに利用できる。
【０１３４】
また、例えば、本発明のグラフトポリマーを成型して所望の形状の製品を得ることができる。例えば、本発明のグラフトポリマーをフィルム状に成型してフィルム状の製品を得ることができる。
【０１３５】
さらに、例えば、本発明のグラフトポリマーを添加剤として所望の製品に添加することもできる。
【０１３６】
（実施例）
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
【実施例１】
【０１３７】
（アミノ基含有セルロースの合成）
（１）トシル化セルロースの合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド５０ｍｌ、セルロース（試薬等級；微結晶セルロース；数平均重合度約３００）０．５ｇをナス型フラスコに加え、１３０℃で１時間撹拌し、さらに、塩化リチウム４．２ｇを加え、１００℃で３０分間撹拌後、室温になるまで放置し溶解させた。これにトリエチルアミン０．５ｍｌを加え、１０℃に冷却後、塩化−ｐ−トルエンスルホニル０．０４１２ｇ（グルコースユニットに対して０．４当量）を加え、１０℃で２４時間反応させた。反応液を水中に再沈殿し、吸引ろ過後、減圧下で乾燥してトシル化セルロース０．５６ｇを得た。
【０１３８】
（２）アジド化セルロースの合成
ジメチルスルホキシド２５ｍｌ、トシル化セルロース０．５ｇ、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨージド０．０２７ｇ、アジ化ナトリウム０．４６８ｇをナス型フラスコに加え、７０℃で７２時間反応させた。反応液を水中に再沈澱し、吸引ろ過後、減圧下で乾燥し、６−アジド−６−デオキシセルロース０．４６３ｇを得た。
【０１３９】
（３）アミノ化セルロースの合成
ジメチルスルホキシド４５ｍｌ、６−アジド−６−デオキシセルロース０．４５０ｇ、水素化ホウ素ナトリウム０．６０３ｇをナス型フラスコに加え、６０℃で７２時間反応させた。反応液を０℃に冷却し、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去するため、１Ｎ塩酸をガスが発生しなくなるまでゆっくり滴下した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。これを吸引ろ過によって単離し、凍結乾燥して６−アミノ−６−デオキシセルロース０．４４４ｇを得た。
【実施例２】
【０１４０】
（還元アミノ化法によるマルトヘプタオースグラフト化セルロースの合成）
実施例１で得られた６−アミノ−６−デオキシセルロース０．４４４ｇ、酢酸−メタノール混合溶液２０ｍｌ、マルトヘプタオース０．７８４ｇ、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム０．２３７ｇをサンプル管に加え、室温で３日間反応させた。これをメタノール中に投入し、吸引ろ過を行ない、未反応のマルトヘプタオースを除去するため、ジメチルスルホキシドで洗浄後単離した。減圧下で乾燥し、マルトヘプタオースグラフト化セルロースを０．４７８ｇ得た。
【０１４１】
得られた生成物を１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより分析すると、主鎖であるセルロースのアノマー位由来のピークとマルトヘプタオースのアノマー位由来のピークが観察された。生成物の構造がマルトヘプタオースグラフト化セルロースであることが確認された。
【実施例３】
【０１４２】
（カルボジイミドカップリング法によるマルトヘプタオースグラフト化セルロースの合成）
（酸化マルトヘプタオースの合成）
マルトヘプタオース１ｇを水２０ｍｌに溶解し、５％（ｗ/ｖ）ヨウ素−メタノール溶液２５ｍｌを添加し、４０℃で撹拌しながら４％（ｗ/ｖ）水酸化カリウム−メタノール溶液１０ｍｌを1滴ずつ滴下した。１時間撹拌後、ヨウ素の色が消えるまで４％（ｗ／ｖ）水酸化カリウム−メタノール溶液をさらに滴下し、３０分撹拌後反応を終了した。反応液を冷却し、沈殿物をろ過後、４５ｍｌの脱イオン水に溶解し、アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ＋型）に通液した。溶出液がｐＨ７．０になるまで脱イオン水を流して目的物を回収し、ロータリーエバポレーターにより数回減圧乾固した。４５ｍｌの脱イオン水に溶解し、酸化マルトヘプタオースの水溶液（１９ｍｇ／ｍｌ）を得た。
【０１４３】
（マルトヘプタオースグラフト化セルロースの合成）
実施例１で得られた６−アミノ−６−デオキシセルロース０．４２ｇ、酸化マルトヘプタオース(１９ｍｇ／ｍｌ）の水溶液４０ｍｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩化物０．１３ｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．０８ｇをサンプル管に加え、室温で１日間反応させた。これをゲルろ過カラムに通液し、未反応の酸化マルトヘプタオース、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩化物およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを除去した。減圧下で乾燥し、マルトヘプタオースグラフト化セルロースを０．４１ｇ得た。
【実施例４】
【０１４４】
（ラクトン化プライマー法によるマルトヘプタオースグラフト化セルロースの合成）
（ラクトン化マルトヘプタオースの合成）
マルトヘプタオース２.０ｇを水３.０ｍｌに溶解し、そこへヨウ素１．３３ｇをメタノール１０ｍｌ中に溶解した液を加え、４０℃、２時間撹拌した。続いて、水酸化カリウム１.２１ｇをメタノール３５ｍｌ中に溶解し、1滴ずつ滴下後、1時間撹拌した。反応後、
冷却し、得られた沈殿物をデカンテーションにより単離した。未反応のヨウ素、生成したヨウ化カリウムを除去するため水１０ｍｌを加え溶解液とし、メタノール１００ｍｌを加え沈殿物を得た。再度、デカンテーションし、水で溶解し、メタノールで沈殿を形成させた。デカンテーション後、この沈澱を９ｍｌの水で溶解し、イオン交換カラムに通液し、生成物の回収を行った。減圧下で乾燥し、ラクトン化マルトヘプタオースを１．２ｇ得た。生成物の１Ｈ  ＮＭＲにおいて、ラクトン環の２位（４．４７ｐｐｍ）および３位（４．２５ｐｐｍ）のピークが観察されたことから、生成物がラクトン化マルトヘプタオースであることを確認した。
【０１４５】
（マルトヘプタオースグラフト化セルロースの合成）
実施例１で得られた６−アミノ−６−デオキシセルロース０．７ｇ、ラクトン化マルトヘプタオース１．２ｇおよびエチレングリコール１０ｍｌをサンプル管に加え、７０℃で６時間反応させた。反応終了後、室温まで冷却し、窒素雰囲気下でアセトンを加えた。沈殿物をろ過し、アセトンおよびヘキサンで洗浄しながら吸引ろ過し、エチレングリコールおよび未反応のラクトン化マルトヘプタオースを除去した。減圧下で乾燥し、マルトヘプタオースグラフト化セルロース１．２５ｇを得た。
【実施例５】
【０１４６】
（アミロースグラフト化セルロースの合成）
実施例２で得られたマルトヘプタオースグラフト化セルロース０．１４ｇ、酢酸緩衝液１２．５ｍｌ、グルコース−１−リン酸ナトリウム０．３８ｇ（マルトヘプタオース基に対して１００当量）、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ４２単位をサンプル管に加え、ｐＨ６．２、４２℃で７時間反応させた。不純物を除去するために１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で透析後、メタノール中に投入し、吸引ろ過によって単離した。減圧下で乾燥し、アミロースグラフト化セルロース０．１９ｇを得た。
【０１４７】
生成物の１Ｈ  ＮＭＲからセルロースのアノマー位由来のピークとアミロースのアノマー位由来のピークが観察されたことから、この生成物は、セルロースに重合度４９のアミロースがグラフト化したものであることが確認された。また、元素分析により、セルロース主鎖中のグルコース残基２８個あたり１個の割合でアミロースがセルロースに結合していることが確認された。また生成物はセルロースとは異なり、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に可溶であった。これらの結果から、生成物の構造がアミロースグラフト化セルロースであることが確認された。それゆえ、この生成物は、セルロース主鎖中のグルコース残基の６位炭素にα−１，４グルカン側鎖の末端の１位炭素が−ＮＨ−基を介して共有結合しており、この１位炭素に２つの水素基が結合しており、セルロース主鎖の数平均重合度が約３００であって、セルロース主鎖のグルコース残基２８個あたり１個の割合で重合度４９のアミロースがグラフト化された構造を有するグラフトポリマーである。
【実施例６】
【０１４８】
（α−１，４グルカングラフト化セルロースからのフィルムの製造）
実施例５の反応液をガラス容器に入れ静置したところ不透明で膨潤したゲルが得られた。未反応物等を除去するために水で洗浄した。セルロースは同じ条件でこのようなゲルを形成することはできなかった。次にこのゲルを自然乾燥させたところ、不透明な固形物が得られた。さらに、この乾燥した固形物に水を加えると、不透明で浸潤したゲルに戻った。また、このゲルを自然乾燥させると、再度、不透明な固形物が得られた。
【０１４９】
また実施例５の反応液をガラスプレートに薄く広げ静置したところ不透明で膨潤したフィルムを得た。未反応物等を除去するために水で洗浄した。このフィルムを自然乾燥したところ不透明である程度柔軟なフィルムが得られた。さらに乾燥したフィルムに水を加えると不透明で膨潤したフィルムに戻った。このフィルムを自然乾燥すると再度不透明である程度柔軟なフィルムが得られた。乾燥したフィルムに１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を加えたところ、このフィルムは溶解した。このようにα−１，４グルカングラフト化セルロースは、セルロースと異なり、アミロースの溶解性や柔軟性を併せ持つ独特の物性を示した。
【０１５０】
さらに得られたゲルおよびフィルムをそれぞれ５ｍＭのヨウ素溶液（ＫＩ・Ｉ２：０．０２４Ｍ／０.０１０Ｍ）１０ｍｌに添加したところ、いずれも青色に染色された。従って、α−１，４グルカングラフト化セルロースには、アミロースの物性だけでなく、アミロースの包接機能が付与されていることを確認した。
【０１５１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
セルロースは、繊維、紙、不織布、織物、フィルターなど、幅広い産業分野で利用されている。本発明を利用することにより、セルロースまたはセルロース製品にアミロースの機能を付与することができる。たとえばアミロースは様々な化学物質と包接錯体を形成することができるが、これを利用して環境浄化機能を有するフィルター、香料含有繊維などの、複合機能性素材およびデバイスを設計することが可能となる。
【図１】
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