(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記微生物が、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株である請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであって、配列表の配列番号２で示される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４または５に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項７】
下記の工程：
0004880859.tif 000013
により得られるプラスミドｐＴＳＢＨである請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素である請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
下記の工程：
0004880859.tif 000014
により得られるプラスミドｐＴＳＢＧ１である請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１２】
請求項６または７に記載の発現ベクター、および、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの両方を含む形質転換体。
【請求項１３】
前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドが、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素である請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
宿主が大腸菌である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１５】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１８）である請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９）である請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１７】
プラスミドｐＧＤＡ２をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで二重消化して得られるＤＮＡ断片を、プラスミドｐＳＴＶ２８のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入して得られるプラスミドｐＳＴＶＧで、請求項１５に記載のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１８）を形質転換して得られるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ，ｐＳＴＶＧ）である、請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１８】
請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の形質転換体および／またはそれらの処理物を、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンと反応させる工程、並びに、生成した（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを採取する工程からなることを特徴とする、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法。
【請求項１９】
前記反応させる工程が、補酵素再生系の存在下で行われる請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドを発現するための発現ベクター、該発現ベクターを用いて宿主を形質転換して得られた形質転換体、および該形質転換体を用いた、医薬等の合成原料として有用な化合物の製造方法に関する。
より詳細には、本発明は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を持つ微生物より単離された、該酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。本発明はまた、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法に関する。
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールはβ−ラクタム系抗生物質やジヒドロピリジン系化合物等の医薬品の合成中間体として有用な化合物である。
背景技術
光学活性（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法としては、光学活性な化合物から合成する方法や、プロキラルな化合物から出発して不斉合成または光学分割する方法が知られている。このような方法として、特開平６−１４１８７６号公報には、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元する活性を有する酵素の存在下、このＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造する方法が開示されている。また、特開平１０−１５０９９７号公報には、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を作用させて光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造する方法が開示されている。しかしながら、これらの方法はその基質仕込み濃度および基質から生成物への転換率が低く、実用に耐えるものではなかった。
発明の要約
本発明者らは、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元し、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する微生物由来のポリペプチドを見出し、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを効率良く製造することが可能であることを見出して本発明を完成するに至った。
本発明は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成し得るポリペプチドを提供することを課題とする。さらに、本発明は、遺伝子組換え技術を利用して該ポリペプチドを効率よく生産することを課題とする。また、本発明は、該ポリペプチドとグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドを同時に高生産する形質転換体を提供し、さらに、該形質転換体を用いた実用的な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法を提供することを課題とする。
すなわち本発明は、以下の（１）から（５）の理化学的性質を有するポリペプチドである：
（１）作用：ＮＡＤＰＨを補酵素として、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する、
（２）作用至適ｐＨ：４．５から５．５、
（３）作用至適温度：４０℃から４５℃、
（４）分子量：ゲル濾過分析において約２９０００、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析において約３５０００、
（５）阻害剤：二価銅イオンにより阻害される。
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである：
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するポリペプチド。
さらに本発明は、これらポリペプチドをコードするＤＮＡである。または、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであって、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであるか、または、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであって、配列表の配列番号２で示される塩基配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するＤＮＡでもある。
さらには、これらＤＮＡを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターを含む形質転換体でもある。
また本発明は、これら形質転換体および／またはそれらの処理物を、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンと反応させる工程、並びに、生成した（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを採取する工程からなる、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法でもある。
発明の詳細な開示
以下に本発明を詳述する。
まず、本発明のポリペプチドについて説明する。
本発明のポリペプチドは、以下の式（Ｉ）で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して、以下の式（ＩＩ）で表される（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するものである。
0004880859.tif 000002
このようなポリペプチドとして、以下の（１）から（５）の理化学的性質を有する酵素を挙げることができる。
（１）作用：ＮＡＤＰＨを補酵素として、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する、
（２）作用至適ｐＨ：４．５から５．５、
（３）作用至適温度：４０℃から４５℃、
（４）分子量：ゲル濾過分析において約２９０００、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析において約３５０００、
（５）阻害剤：二価銅イオンにより阻害される。
本発明において、ポリペプチドの酵素活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．１６７ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより実施する。
該ペプチドの作用至適ｐＨ、作用至適温度は、例えば、上述の還元活性測定系の反応ｐＨ、反応温度を変えて還元活性を測定することによって決定する。
該ペプチドのゲル濾過分析による分子量は、ゲル濾過において標準タンパク質の相対溶出時間から算出することにより決定する。また、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析による分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動において標準タンパク質の相対移動度から算出することにより決定する。
阻害剤は、例えば、上述の還元活性測定系に種々の化合物を添加して還元活性を測定することによって決定する。
本発明のポリペプチドは、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する微生物から取得することができる。従って、ポリペプチドの起源として用いられる微生物は特に限定されないが、例えばミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物が挙げられ、特に好ましいものとしてはミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株を挙げることができる。本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物も用いられ得る。遺伝子操作された本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらの酵素を単離および／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいて該酵素をコードする塩基配列を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいて該酵素をコードする塩基配列を得る工程、および、この塩基配列を他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程からなる方法により得られ得る。
本発明のポリペプチドを生産する微生物のための培養培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。
本明細書で用いられる用語「微生物の培養物」は、微生物の菌体または菌体を含む培養液を意味し、そして「その処理物」は、微生物の菌体または菌体を含む培養液から抽出または精製などの処理を行って得られた抽出物または精製物を意味する。
本発明のポリペプチドを生産する微生物からの該ポリペプチドの精製は、常法により行い得る。例えば、該微生物の菌体を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離により菌体を集める。得られた菌体を例えば、超音波破砕機などで破砕し、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液に、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、ポリペプチドが精製され得る。
本発明のポリペプチドは、上述のように微生物から取得する天然酵素であってもよいし、組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
また、本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。
このようなポリペプチドは、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができる。
ここで、「Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有する」とは、上述のような還元活性測定条件下でＮ−ベンジル−３−ピロリジノンと反応させた場合に、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上の収率で（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成することをいう。
次に、本発明のＤＮＡについて説明する。
本発明のＤＮＡとしては、上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡであってもよいし、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードし、かつ、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
「配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
また、本発明のＤＮＡは、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードし、かつ、配列表の配列番号２で示される塩基配列と、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＤＮＡであってもよい。
用語「配列同一性」は、対比される２つの塩基配列が同一であることを意味し、対比される２つの塩基配列間の配列同一性の割合（％）は、対比される２つの塩基配列を最適に整列させた後、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で生じて適合した位置の数を得て適合位置数とし、適合した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じて計算される。配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＵｎｉｘベースのＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ、Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０  １ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
本発明のＤＮＡは、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有する微生物より取得することができる。該微生物として、例えばミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物が挙げられ、特に好ましいものとしてはミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株を挙げることができる。
以下に、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有する微生物より、本発明のＤＮＡを取得する方法の例を記載する。
まず、精製した該ポリペプチド、および該ポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼで消化することにより得られるペプチド断片の部分アミノ酸配列を、エドマン法により決定する。そして、このアミノ酸配列情報をもとにＤＮＡプライマーを合成する。次に、該ＤＮＡの起源となる微生物より、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｍｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４３２１−４３２５（１９８０））により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチド遺伝子の一部を増幅する。さらに、ここで増幅された該ポリペプチド遺伝子の一部を通常用いられる方法、例えばランダムプライムラベリング法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２，６（１９８３））で標識し、ＤＮＡプローブを調製する。該微生物の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素により切断し、該制限酵素切断断片をベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入することにより、該微生物染色体のＤＮＡライブラリーを構築する。先述のＤＮＡプローブを用いて、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法等により、このＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、該ポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。このようにして得られた該ポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列は、ジデオキシ・シークエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネイション法などにより決定することができる。例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行われ得る。
次に、本発明の発現ベクター及び形質転換体について説明する。
本発明のＤＮＡをベクターに組込み、これを宿主内に導入してなる形質転換体内で酵素遺伝子を発現させることができる。このために用いられるベクターとしては、適当な宿主内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよい。このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。
本願明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ＤＮＡと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを導入する宿主としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などがあげられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡは常法により宿主に導入され得る。宿主として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のＤＮＡを導入することができる。
本発明のＤＮＡを用いてＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生産する場合、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ等の補酵素が必要となる。しかし、酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質とともに、つまり補酵素再生系を本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明のＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を用いた場合、補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加することなしに、該反応を効率良く実施し得る。このような形質転換体は、本発明のＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、同一のベクターに組込み、これを宿主に導入することにより得られるし、また、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主に導入することによっても得られる。すなわち、本発明のＤＮＡとグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとを含む発現ベクターを含む形質転換体や、本発明のＤＮＡを含む第一の発現ベクターと、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとの両方を含む形質転換体を使用できる。グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドとしては、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のものが好ましい。
形質転換体中のグルコース脱水素酵素活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭおよび酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより実施する。
次に、本発明の形質転換体を用いた（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの生産について説明する。
このような製造方法は、上記形質転換体および／またはそれらの処理物を、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンと反応させる工程、および、生成した（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを採取する工程からなる。
以下、具体的に説明する。まず最初に、適当な溶媒中に基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、および該形質転換体の培養物および／またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。この反応は１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応はバッチ方式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。また、本反応は、補酵素再生系の存在下で行うことが好ましい。例えば、本反応を行う際、形質転換体として本発明のポリペプチドとグルコース脱水素酵素の両者を生産するものを用いる場合、反応系にさらにグルコースを添加することにより、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。
反応で生じた（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールは常法により採取され得る。例えば、必要に応じ遠心分離、濾過などの処理を施して菌体等の懸濁物を除去した後、水酸化ナトリウム等を添加し反応液を塩基性にし、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出した後、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに蒸留またはクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製され得る。
本反応において、基質となるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンは、例えば、特開昭５４−１６４６６号公報に記載の方法で調製され得る。
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＵｎｉｐｏｒｔＢ  １０％ＰＥＧ−２０Ｍ（３．０ｍｍＩＤ×１．０ｍ）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：窒素、検出；ＦＩＤ）で行い得る。また、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの光学純度の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ（ダイセル化学工業社製）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／ジエチルアミン＝９５０／５０／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ）で行い得る。
以上のように、本発明に従えば、本発明に含まれるポリペプチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの優れた製造法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）
（実施例１：酵素の精製）
以下の方法に従って、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株よりＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する酵素を単一に精製した。
（ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株の培養）
２Ｌ容坂口フラスコに下記の組成からなる液体培地４００ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。
培地組成：
トリプトン                            １．６％（ｗ／ｖ）
イーストエキス                        １．０％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌ                              ０．５％（ｗ／ｖ）
水道水
ｐＨ７．０
この培地に、予め同培地にて前培養しておいたミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株の培養液を１ｍｌずつ接種し、３０℃で５０時間振とう培養した。
（無細胞抽出液の調製）
上記の培養液２Ｌから遠心分離により菌体を集め、生理食塩水にて菌体を洗浄した。このようにして，該菌株の湿菌体４２ｇを得た。この湿菌体を１７０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、２−メルカプトエタノールおよびフッ化フェニルメチルスルホニルをそれぞれ終濃度５ｍＭおよび０．１ｍＭとなるよう添加し、菌体をＳＯＮＩＦＩＲＥ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。この菌体破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液１８０ｍｌを得た。
（硫酸アンモニウム分画）
上記で得た無細胞抽出液に４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除去した（この際無細胞抽出液のｐＨをアンモニア水でｐＨ７．０に維持しながら行った）。先と同様ｐＨ７．０を維持しながら、この遠心上清に６５％飽和となるようさらに硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同一緩衝液で１夜透析した。
（Ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液に終濃度１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し（この際粗酵素液のｐＨをアンモニア水でｐＨ７．０に維持しながら行った）、５ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび１Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１３０ｍｌ）に供し、酵素を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
（ＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（２０ｍｌ）に供し、酵素を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌ（０Ｍから１．０Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
（Ｂｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＢｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１０ｍｌ）に供し、酵素を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌ（０Ｍから０．５Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
（ゲル濾過）
上記で得られた粗酵素液を、５ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび１００ｍＭの硫酸ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラム（東ソー株式会社製）に供し、同一緩衝液で活性画分を溶出させた。活性画分を集め、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行い、電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。以後、この酵素をＢＲＤと呼ぶことにする。
（実施例２：酵素の性質の測定）
得られた酵素の酵素学的性質について検討した。酵素活性の測定は、基本的には、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．１６７ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で１分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。
（１）作用：
ＮＡＤＰＨを補酵素として、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用し、９９％ｅｅ以上の光学純度で（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成した。
（２）作用至適ｐＨ：
緩衝液としてリン酸緩衝液および酢酸緩衝液を用いて、ｐＨ４．０〜７．０の範囲で、上記方法で酵素活性を測定した。その結果、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用する至適ｐＨは４．５〜５．５であった。
（３）作用至適温度：
２０℃〜６０℃の温度で、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを基質とした場合の本酵素の活性を、１分間の反応で測定した。その結果、至適温度は４０℃〜４５℃であった。
（４）分子量：
ゲル濾過による本酵素の分子量の測定は、ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラム（東ソー株式会社製）を、溶離液としては５ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび１００ｍＭの硫酸ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。酵素のサブユニットの分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準タンパク質の相対移動度から算出した。その結果、本酵素の分子量はゲル濾過分析において約２９０００、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析において約３５０００であった。
（５）阻害剤：
表１に示す各種金属イオン，阻害剤を添加して反応を行い，無添加の場合の活性を１００％として、それらを添加した際の相対活性を調べた。表１に示す様に本酵素は二価銅イオンによって阻害を受けた。
0004880859.tif 000003
（実施例３：ＢＲＤ遺伝子のクローニング）
（合成オリゴヌクレオチドプローブの作成）
実施例１で得られた精製ＢＲＤを牛膵臓由来のトリプシン（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列をもとに、配列表の配列番号３および配列番号４に示す２種のＤＮＡプライマーを常法に従って合成した。
（ＰＣＲによるＢＲＤ遺伝子の増幅）
ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株の培養菌体からＭｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４３２１−４３２５（１９８０））に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマーを用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、ＢＲＤ遺伝子の一部と考えられる約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
（染色体ＤＮＡライブラリーの作成）
ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動により分離した。次に、上記で得られた約２５０ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして用い、サザン法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３（１９７５））により該染色体ＤＮＡ消化物の解析を行った（ＤＮＡプローブの標識およびその検出はＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓラベリング・検出システム（アマシャム株式会社製）を用いて行った）。その結果、約４．５ｋｂのＤＮＡ断片が該ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることが判った。
そこで、該消化物をアガロースゲル電気泳動により分離した後、４．３ｋｂから６．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これらのＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入した後、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造株式会社製）に導入し、同菌株の染色体ＤＮＡライブラリーを作成した。
（染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
上記で得られたＤＮＡ断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法により上記で作成した染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った（ＤＮＡプローブの標識およびその検出はＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓラベリング・検出システム（アマシャム株式会社製）を用い、実験手順も同システムの取り扱い説明書に従った）。その結果、１個の陽性コロニーが得られた。そこで、この陽性コロニーから得られた約４．５ｋｂのＤＮＡが挿入された組換えプラスミドｐＵＣ−ＢＢをＢＲＤ遺伝子を含む染色体ＤＮＡクローンとして選択した。
（塩基配列の決定）
上記で得られた組換えプラスミドｐＵＣ−ＢＢについて、種々の制限酵素を作用させた際に生じる消化断片の解析を行い、制限酵素切断地図を作成した。次に、この解析の際に得られた各種ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに挿入した組換えプラスミドを構築した。これらの組換えプラスミドを用いて、各々の挿入断片の塩基配列分析をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行い、目的遺伝子が含まれると予想される約１．４ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その塩基配列を図１に示した。また、この塩基配列中の構造遺伝子部分については、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列を図１中で塩基配列の下段に示した。このアミノ酸配列と、精製ＢＲＤのトリプシン消化断片の部分アミノ酸配列を比較した結果、精製ＢＲＤの部分アミノ酸配列は全て、塩基配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、その部分で完全に一致した（図１中のアミノ酸配列の下線部分）。このことから、本遺伝子がＢＲＤ遺伝子であると判断した。
（実施例４：ＢＲＤ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製）
ＢＲＤの構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、さらに３’末端の直後に終止コドン（ＴＡＡ）とＥｃｏＲＩ切断点を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。実施例３で決定された塩基配列を基に、ＢＲＤ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したＮ末端ＤＮＡプライマー、および同遺伝子の３’末端の直後に終止コドン（ＴＡＡ）とＥｃｏＲＩ部位を付加したＣ末端ＤＮＡプライマーを合成した。これら２つのプライマーの塩基配列を配列表の配列番号５および配列番号６に示した。これら２つの合成ＤＮＡプライマーを用い、実施例３で得たプラスミドｐＵＣ−ＢＢを鋳型としてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを増幅した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＢＲを得た。
（実施例５：ＢＲＤ遺伝子上流へのＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の付加）
ＢＲＤ遺伝子を大腸菌内で高発現させるため、実施例４で調製したプラスミドｐＮＴＢＲ中の同遺伝子の開始コドンの上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を新たに付加したプラスミドを以下のように取得した。まず、ＰＣＲ法により実施例４で使用した大腸菌発現ベクターｐＵＣＮＴのＮｄｅＩ部位中のＧをＴに変換し、プラスミドｐＵＣＴを構築した。次に、配列表の配列番号２に示したＢＲＤ遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ部位を付加したＮ末端ＤＮＡプライマーと、同遺伝子の３’末端の直後にＳａｃＩ部位を付加したＣ末端ＤＮＡプライマーを常法に従って合成した。これら２つのプライマーの塩基配列を配列表の配列番号７および配列番号８に示した。これら２つのＤＮＡプライマーを用い、実施例４で構築したプラスミドｐＮＴＢＲを鋳型としたＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで消化し、プラスミドｐＵＣＴのＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ部位（ｌａｃプロモーター下流）に挿入した組換えプラスミドｐＴＢＨを得た。
（実施例６：ＢＲＤ遺伝子のＧＣ比の低減）
さらにＢＲＤ遺伝子を大腸菌内で高発現させるため、実施例５で構築したプラスミドｐＴＢＨ中の同遺伝子の１塩基目から１１８塩基目までを、そのコードするアミノ酸配列を変えることなくＧＣ比の小さいＤＮＡに置き換えたプラスミドｐＴＳＢＨを以下のように構築した。
常法に従い配列表の配列番号９に示した配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、これをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化した後、同制限酵素による消化でｐＴＢＨから切り出されるＢＲＤ遺伝子の５’末端部分を含むＤＮＡ断片と入れ替えたプラスミドｐＴＳＢＨを得た。
（実施例７：ＢＲＤ遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を含む組換えプラスミドの作製）
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶことにする）の遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、さらにその直前にＳａｃＩ切断点を、また、終止コドンの直後にＢａｍＨＩ切断点を付加した二本鎖ＤＮＡを、以下の方怯により取得した。ＧＤＨ遺伝子の塩基配列情報を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、さらにその直前にＳａｃＩ切断点を付加したＮ末端ＤＮＡプライマーと、ＧＤＨの構造遺伝子の終始コドンの直後にＢａｍＨＩ部位を付加したＣ末端ＤＮＡプライマーを常法に従って合成した。これら２つのプライマーの塩基配列を配列表の配列番号１０および配列番号１１に示した。これら２つのＤＮＡプライマーを用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，３８９（１９８９））を鋳型としてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、実施例５において構築したｐＴＳＢＨのＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ部位（ＢＲＤ遺伝子の下流に存在する）に挿入した組換えプラスミドｐＴＳＢＧ１を得た。ｐＴＳＢＧ１の作製法および構造を図２に示す。
（実施例８：組換え大腸菌の作製）
実施例５、６および７で得た組換えプラスミドｐＴＢＨ、ｐＳＴＢＨおよびｐＴＳＢＧ１を用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＢＨ）、ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ）およびＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）を得た。こうして得られた形質転換体のうち、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ）およびＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１８（寄託日２０００年４月１１日）およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１９（寄託日２０００年４月１１日）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
また、プラスミドｐＧＤＡ２（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９８９），２６４、６３８１）をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで二重消化して得られる、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＩＷＧ３由来のＧＤＨ遺伝子を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＳＴＶ２８（宝酒造株式会社製）のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入して、組換えプラスミドｐＳＴＶＧを構築した。このｐＳＴＶＧで、予め塩化カルシウム法でコンピテント化しておいた大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ）を高い導入率で形質転換し、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ，ｐＳＴＶＧ）を容易に得た。
（実施例９：組換え大腸菌におけるＢＲＤの発現）
実施例８で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＢＨ）およびＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で、２８℃において１５時間振とう培養した。この前培養液１ｍｌを、５００ｍｌ容坂口フラスコ中でオートクレーブ滅菌したグリセリン１．５％（ｗ／ｖ），バクト・トリプトン１．５％（ｗ／ｖ），バクト・イーストエキス０．４％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウム０．２％（ｗ／ｖ），リン酸二水素カリウム０．８％（ｗ／ｖ），硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ），アデカノールＬＧ１０９（旭電化製）０．０３３％（ｗ／ｖ）から成りｐＨ６．０に調整した培地１００ｍｌに接種し、３０℃で６０時間振とう培養した。これらの本培養液から遠心分離機を用いて集菌後、この菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。
この無細胞抽出液のＢＲＤ活性を以下のように測定した。ＢＲＤ活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．１６７ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。この様に測定した無細胞抽出液中のＢＲＤ活性を比活性として表し、ベクタープラスミドｐＵＣＮＴを保持する形質転換体と比較した。また、実施例１と同様の方法で調製したミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株の無細胞抽出液中のＢＲＤ活性についても同様に比較した。それらの結果を表２に示す。
0004880859.tif 000004
大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して明らかなＢＲＤ活性の増加が見られ、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７株と比較して約１０倍の活性が得られた。
（実施例１０：組換え大腸菌におけるＢＲＤおよびＧＤＨの同時発現）
実施例８で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）およびＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ，ｐＳＴＶＧ）を実施例９と同様に培養、処理して得られる無細胞抽出液のＧＤＨ活性を、以下のように測定した。ＧＤＨ活性の測定は１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ及び酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、ＢＲＤ活性についても実施例９と同様に測定した。このように測定した無細胞抽出液中のＢＲＤおよびＧＤＨ活性を比活性として表し、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ）およびベクターのみの形質転換体ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較した結果を表３に示す。
0004880859.tif 000005
大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）およびＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ、ｐＳＴＶＧ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して、明らかなＢＲＤおよびＧＤＨ活性の増加が見られた。
（実施例１１：ＢＲＤ遺伝子を導入した組換え大腸菌によるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンからの（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの合成）
実施例９で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ）の培溶液を、ＳＯＮＩＦＩＲＥ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。この菌体破砕液２５ｍｌにグルコース脱水素酵素（天野製薬株式会社製）１３５０Ｕ、グルコース３．０ｇ、ＮＡＤＰ３．０ｍｇ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン０．２５ｇを添加した。この反応液を３０℃で攪拌し、５Ｍの塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整しつつ、１時間毎にＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを０．２５ｇずつ添加し、合計２．０ｇのＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを添加した後、さらに２０時間攪拌を続けた。反応終了後、この反応液に５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２．５ｍｌを添加した後トルエンで抽出し、脱溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、収率７４％でＮ−ベンジル−３−ピロリジノールが得られた。この際、生成したＮ−ベンジル−３−ピロリジノールは光学純度９９％ｅｅ以上のＳ体であった。
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンおよびＮ−ベンジル−３−ピロリジノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＵｎｉｐｏｒｔＢ  １０％ＰＥＧ−２０Ｍ（３．０ｍｍＩＤ×１．０ｍ）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：窒素、検出；ＦＩＤ）により行った。また、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの光学純度の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ（ダイセル化学工業社製）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／ジエチルアミン＝９５０／５０／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ）により行った。
（実施例１２：ＢＲＤおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌によるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンからの（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの合成）
実施例９で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）の培養液２５ｍｌに、グルコース２．５ｇ、ＮＡＤＰ３．０ｍｇ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン０．２５ｇを添加した。この反応液を３０℃で攪拌し、５Ｍの塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整しつつ、２時間毎にＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを０．２５ｇずつ添加し、合計１．０ｇのＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを添加した後、さらに１７時間攪拌を続けた。反応終了後、この反応液に５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１．２ｍｌを添加した後トルエンで抽出し、脱溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、収率９２％でＮ−ベンジル−３−ピロリジノールが得られた。この際、生成したＮ−ベンジル−３−ピロリジノールは光学純度９９％ｅｅ以上のＳ体であった。
（実施例１３：ＢＲＤおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌によるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンからの（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの合成）
実施例９で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＨ、ｐＳＴＶＧ）の培養液２５ｍｌに、グルコース２．５ｇ、ＮＡＤＰ３．０ｍｇ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン０．２５ｇを添加した。この反応液を３０℃で攪拌し、５Ｍの塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整しつつ、１時間毎にＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを０．２５ｇずつ添加し、合計２．０ｇのＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを添加した後、さらに１６時間攪拌を続けた。反応終了後、この反応液に５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２．５ｍｌを添加した後トルエンで抽出し、脱溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、収率９３％でＮ−ベンジル−３−ピロリジノールが得られた。この際、生成したＮ−ベンジル−３−ピロリジノールは光学純度９９％ｅｅ以上のＳ体であった。
産業上の利用可能性
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを不斉的に還元して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する酵素活性を有するポリペプチド遺伝子のクローニング、および、その塩基配列の解析により、該ポリペプチド産生能の高い形質転換体を得ることが可能になった。また、該ポリペプチドおよびグルコース脱水素酵素を同時に高生産する能力を有する形質転換体をも得ることが可能になった。さらに、これらの形質転換体を用いることにより、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンからの（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの合成を効率良く行うことが可能となった。
【配列表】
0004880859.tif 000006
0004880859.tif 000007
0004880859.tif 000008
0004880859.tif 000009
0004880859.tif 000010
0004880859.tif 000011
0004880859.tif 000012
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例３で決定したＤＮＡの塩基配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
図２は、実施例７の組換えプラスミドｐＴＳＢＧ１の作製方法及びその構造を示す図である。
【図１】
0004880859.tif 000015
【図２】
0004880859.tif 000016