(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原、ウィルス、細胞、糖鎖、糖タンパク質、細胞表面の受容体、酵素基質アナログ、酵素阻害剤、核酸、ホルモン受容体等の生体成分、生理活性物質や医薬品、組み換えタンパク質から選択される分離目的の物質に対して特異的親和性を有するリガンドである物質Ａ、及び該物質Ａに対して特異的親和性を有する分子量１０００以下の化合物である低分子物質Ｂの両者を結合させた、直鎖状または架橋させた下限臨界温度または上限臨界温度を有する刺激応答性高分子を材料表面に担持させた分離材料であって、該刺激応答性高分子が下限臨界温度を有する場合には下限臨界温度以下の温度で、また該刺激応答性高分子が上限臨界温度を有する場合には上限臨界温度以上の温度で、上記分離目的の物質を吸着させた後にカラム温度を臨界温度を超えるまで変化させる事により該刺激応答性高分子の分子構造を変化させて分離目的の物質と低分子物質Ｂとの競争反応によって目的物質を溶出させ、分離精製することを特徴とする、前記分離材料。
【請求項２】
抗原、ウィルス、細胞、糖鎖、糖タンパク質、細胞表面の受容体、酵素基質アナログ、酵素阻害剤、核酸、ホルモン受容体等の生体成分、生理活性物質や医薬品、組み換えタンパク質から選択される分離目的の物質に対して特異的親和性を有するリガンドである物質Ａのみを結合した直鎖状または架橋させた下限臨界温度または上限臨界温度を有する刺激応答性高分子、及び該物質Ａに対して特異的親和性を有する低分子物質Ｂのみを結合した直鎖状または架橋させた下限臨界温度または上限臨界温度を有する刺激応答性高分子の両高分子を材料表面に担持させた分離材料であって、該刺激応答性高分子が下限臨界温度を有する場合には下限臨界温度以下の温度で、また該刺激応答性高分子が上限臨界温度を有する場合には上限臨界温度以上の温度で、上記分離目的の物質を吸着させた後にカラム温度を臨界温度を超えるまで変化させる事により該刺激応答性高分子の分子構造を変化させて分離目的の物質と低分子物質Ｂとの競争反応によって目的物質を溶出させ、分離精製することを特徴とする、前記分離材料。
【請求項３】
抗原、ウィルス、細胞、糖鎖、糖タンパク質、細胞表面の受容体、酵素基質アナログ、酵素阻害剤、核酸、ホルモン受容体等の生体成分、生理活性物質や医薬品、組み換えタンパク質から選択される分離目的の物質に対して特異的親和性を有するリガンドである物質Ａもしくは該物質Ａに対して特異的親和性を有する物質Ｂを材料表面に直接担持させ、かつ物質Ｂもしくは物質Ａを結合させた下限臨界温度または上限臨界温度を有する刺激応答性高分子を材料表面に担持させた分離材料であって、該刺激応答性高分子が下限臨界温度を有する場合には下限臨界温度以下の温度で、また該刺激応答性高分子が上限臨界温度を有する場合には上限臨界温度以上の温度で、上記分離目的の物質を吸着させた後にカラム温度を臨界温度を超えるまで変化させる事により該刺激応答性高分子の分子構造を変化させて分離目的の物質と低分子物質Ｂとの競争反応によって目的物質を溶出させ、分離精製することを特徴とする、前記分離材料。
【請求項４】
分離目的の物質が糖鎖、糖タンパク質、細胞のいずれかであり、目的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａが糖鎖の特異的な構造に対して親和性を有するレクチン等の糖親和性物質であるとともに該物質Ａに対して特異的親和性を有する低分子物質Ｂがハプテン糖であり、刺激応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である事を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の分離材料。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の分離材料においてポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）に対してアミノ基を有する化合物をポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）のスクシンイミド基の５０〜９７ｍｏｌ％を導入する事によって水溶性にした後に物質Ａを低分子物質Ｂ共存下で該水溶性高分子鎖に導入した後に分離材料上に固定化するか、もしくは該水溶性高分子に物質Ａおよび低分子物質Ｂ共存下で分離材料上に固定化する事によって作成した分離材料。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の分離材料を含むアフィニティクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の刺激応答性高分子を担持させた分離材料に分離目的物質を吸着させた後に溶離液の塩濃度やｐＨなどの液組成を変化させず、若しくは変化させるとともに刺激応答性高分子の分子構造を変化させて分離目的物質と低分子物質Ｂとの競争反応を生じさせる事によって分離目的の物質を溶出させる事を特徴とする物質の分離精製方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項記載の刺激応答性高分子が刺激応答性高分子であるとともに該応答性高分子が下限臨界温度（ＬＣＳＴ）を有する場合にはＬＣＳＴ以下の温度で、また該刺激応答性高分子が上限臨界温度（ＵＣＳＴ）を有する場合にはＵＣＳＴ以上の温度で、分離目的物質を吸着させた後に溶離液の塩濃度やｐＨなどの液組成を変化させず、若しくは変化させるとともにカラム温度を臨界温度を超えるまで変化させる事により該刺激応答性高分子の分子構造を変化させて分離目的の物質と低分子物質Ｂとの競争反応によって分離目的の物質を溶出させる事を特徴とする物質の分離精製方法。
【請求項９】
クロマトグラフィーを用いる請求項７または８記載の分離精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、目的物質に対して特異的親和性を有する物質と該物質に対して特異的親和性を有する低分子物質を直接的に若しくは刺激応答性高分子を介して分離材料表面に担持した分離材料および当該分離材料を用いる物質の分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体成分、医薬品の分離および精製には、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等が使用されている。この中でアフィニティクロマトグラフィーは、ほとんどすべての生体分子をその生物学的機能もしくは個々の化学構造を基礎にして精製する唯一の方法であり、非常にユニークな分離技術である。
アフィニティクロマトグラフィーは吸着クロマトグラフィーの一種であり、精製される物質は不溶性の支持体（マトリックス）に固定された結合物質（リガンド）に特異的可逆的に吸着される。多くの分離が一段階で達成され選択性の低い多段的方法に比べて大幅な時間の節約ができるため生体物質の分離精製に汎用されている。
【０００３】
しかしながら、通常のアフィニティクロマトグラフィーの手法では標的物質となる生体成分、医薬品、組み換えタンパク質等の溶出に際して、溶離液の塩濃度、有機溶媒濃度、ｐＨ等を変化させるか、もしくはリガンドと拮抗的に結合する物質のグラジェントを使用している。これらの手法は、例えば、塩濃度、有機溶媒濃度などは標的物質に対して過酷な条件となる場合もあり回収率が低下する事が知られている。さらに、標的物質を溶出する際に使用した塩、有機溶媒、リガンドと拮抗的に結合する物質を最終的には脱塩、乾燥等の操作により取り除く必要があるが、リガンドと拮抗的に結合する物質と標的物質の分子サイズが近い場合には、標的物質と溶出に使用した物質の分離が非常に困難であるか不可能な場合もある。また、脱塩、乾燥の操作により最終的な物質の活性および回収率はしばしば低いものとなってしまう。
【０００４】
標的物質溶出において、塩、有機溶媒、ｐＨ、リガンドと拮抗的に結合する物質濃度など溶離液組成の変化による溶出は、溶離液中に塩、有機溶媒、酸や塩基、リガンドと拮抗的に結合する物質などのような化学物質を使うことにより、上記のような失活、回収率の低下などの問題が起こる。しかし、このような化学的手法による溶出ではなく熱、光、磁石などの物理的変化が標的物質の溶離に対して影響を与えられるような環境をつくることができれば、物理的手法による標的物質の溶出が可能となり、失活、回収率の低下などの問題の解決になることが期待できる。
【０００５】
最近、イオン交換基に共有結合した刺激応答性高分子を含む分離材料に関する記載が見られる（例えば、特願平１０−１４０７２２号および対応するＷＯ９９−６１９０４公報を参照）。
Ｇａｌａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ６８４（１９９４）３７−４３は、チバクロンブルーを共有結合させるとともに温度応答性高分子（ポリビニルカプロラクタム）を物理的に吸着させた基材を用いたクロマトグラフィー系において乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の温度による溶出を記述している。しかし、使用しているポリビニルカプロラクタムの曇点は３８℃であり吸着させる際に４０℃以上まで温度をあげる必要があり目的タンパク質によっては変性を招く虞れがある。通常疎水性基の導入によって曇点は低下させる事は可能だが、この場合には疎水性基への非特異的な吸着の増加による回収率の低下も予想される。
Ｈｏｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、国際出願公開ＷＯ８７／０６１５２号公報にリガンドが温度応答性高分子に結合した分離方法を記載している。さらに、国際出願公開ＷＯ９７／０９０６８号公報には、刺激応答性高分子を目的物質に対して特異的親和性を有する物質に導入した分子結合体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）による分離方法を提案している。
また、特開平７−１３５９５７号公報および国際出願公開ＷＯ９７／０９０６８号公報にも目的物質と特異的親和性を有する物質と刺激応答性高分子によって構成された分離材料に関する記載がある。
しかしこれらいずれの特許においても目的物質と特異的な親和性を有する物質とともにリガンドと拮抗的な結合をする低分子物質を刺激応答性高分子に固定化する事によって温度溶出の効率をあげる手法については示唆されていない。
刺激応答性高分子を含むが、温度応答性高分子に共有結合したリガンドを有していない分離材料に基づくクロマトグラフィーを記述した多くの刊行物もある。Ｇａｗｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １９３（１９９２）２４９−２５６）は、刺激応答性高分子で被覆した多孔質シリカビーズ上のゲルクロマトグラフィーを記述している。Ｈｏｓｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７（１９９５）１９０７−１９１１）；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．１１４ｔｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｔｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，  Ｔｏｋｙｏ（１９９４）１６０（１９９９４年に東京で開催された第１１４回日本薬学会総会講演要旨集１６０）；Ｋａｎａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（薬学雑誌、１１７（１０−１１）（１９９７）８１７−８２４）；金澤ら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８（１）（１９９６）１００−１０５）；金澤ら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９（５）（１９９７）８２３−８３０）；金澤ら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１５（１９９７）１５４５−１５５０）；薬師寺ら（Ｌａｎｇｍｕｉｒ１４（１６）（１９９８）４６５７−４６６２６８）；金澤ら（Ｔｒｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７（７）（１９９８）４３５−４４０）；薬師寺ら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１（６）（１９９９）１１２５−１１３０）；Ｇｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ（ＥＰ  ５３４０１６）；岡野（特開平６−１０８６４３）はいずれも、生体高分子の分離を目的とした熱応答性高分子により被覆されたマトリックス上で逆相クロマトグラフィーを記述している。当該マトリックスは多孔質であってもよい。利用された疎水性基は高分子自体に備わっているものである。これらの先行技術文献には、重合の後で当該高分子に共有結合されたリガンドについての記載はない。
【０００６】
さらに、次のような刺激応答性高分子を用いた種々の分離材料が提案されている。
特開平７−１３６５０５号公報には、標的物質に対して特異的な親和性を有する物質を、互いに結合能のある２種の化合物（例えばアビジン−ビオチン）の結合体からなるスペーサーを介して刺激応答性高分子に結合させたアフィニティー分離材料を用いて、刺激（例えば温度）により２種の化合物間の解離を起こさせて標的物質を回収する旨の記載がある。しかしながら刺激による高分子の構造変化によって十分な解離の促進は得られておらず回収率は細胞の場合で５０％程度と低いものになっている。
特開平８−１０３６５３号公報及び特開平９−４９８３０号公報には、刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物質に対して親和性を有する領域とを基材表面に有する刺激応答型分離材料において標的物質を該分離材料に吸着させた後、該刺激応答性高分子の高次構造を変化させる事により、標的物質を該分離材料より脱離させることを特徴とする分離精製方法に関する記載がある。しかしながらこの場合にも刺激による高分子の構造変化によって十分な解離の促進は得られておらず回収率は細胞の場合でも６３％と低いものになっている。
国際出願公開ＷＯ９４−１５９５１号公報には、第１の標的物質よりも結合能の弱い標的物質に結合したリガンドを含む複合リガンドを用いたアフィニティー分離材料を用いて物質を分離する方法が記載されている。この公報においても刺激応答性高分子を用いることが記載されているが、同時に低分子物質を用いることについては示唆されていない。
しかしながら、これらの公報に記載されている方法では、溶離液組成を変化させずに目的物質を高い回収率で精製することが困難である。とくにレクチンアフィニテイクロマトグラフィーにおいて精製目的分子が糖鎖等の低分子化合物である場合には、これまで溶出にハプテン糖を使用すると糖鎖とハプテン糖の分離が困難であるためにレクチンアフィニテイクロマトグラフィーの使用が制限される場合があった。また、検出感度の向上や担体の再生の点でも問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは、上記の問題に対して解決すべく、物理的手法による標的物質の溶出について種々の検討および開発を行った。その結果、目的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａと該物質Ａに対して特異的親利性を有する低分子物質Ｂの両者を結合した直鎖状または架橋させた刺激応答性高分子を分離材料表面に担持させた事を特徴とする分離材料において、物質Ａに目的物質を吸着させた後に該刺激応答性高分子の転移点を超えるまで刺激を与える事によって該刺激応答性高分子鎖に構造変化を起こす事によって高分子鎖内または高分子間の低分子物質Ｂと目的物質との競争反応が起こりやすい状態にする事により目的物質を溶出させることができる事を見いだした。本発明はかかる知見に基づき完成したものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記（１）〜（７）に記載の分離材料または分離方法を提供する。
（１）目的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａと該物質Ａに対して特異的親和性を有する低分子物質Ｂの両者を結合した直鎖状または架橋させた刺激応答性高分子を分離材料表面に担持させた事を特徴とする分離材料。
（２）目的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａのみを結合した直鎖状または架橋させた刺激応答性高分子と該物質Ａに対して特異的親和性を有する低分子物質Ｂのみを結合した直鎖状または架橋させた刺激応答性高分子の両高分子を分離材料表面に担持させた事を特徴とする分離材料。
（３）目的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａもしくは該物質Ａに対して特異的親和性を有する物質Ｂを担体に直接担持するとともに、物質Ｂもしくは物質Ａを結合した刺激応答性高分子を分離材料表面に担持させた事を特徴とする分離材料。
（４）目的物質が糖鎖もしくは糖タンパク質であり、目的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａが糖鎖の特異的な構造に対して親和性を有するレクチン等の糖親和性物質であるとともに該物質Ａに対して特異的親和性を有する低分子物質Ｂがハプテン糖であり、刺激応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である事を特徴とする上記（１）、（２）、および（３）に記載の分離材料。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの分離材料においてポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）に対してアミノ基を有する化合物をポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）のスクシンイミド基の５０〜９７ｍｏｌ％を導入する事によって水溶性にした後に物質Ａを低分子物質Ｂ共存下で該水溶性高分子鎖に導入した後に分離材料上に固定化するか、もしくは該水溶性高分子に物質Ａおよび低分子物質Ｂ共存下で分離材料上に固定化する事によって作成した分離材料。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の分離材料を含むクロマトグラフィー用充填剤。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の刺激応答性高分子を担持させた分離材料に目的物質を吸着させた後に溶離液の塩濃度やｐＨなどの液組成を変化させないか若しくは変化させるとともに刺激応答性高分子の分子構造を変化させて目的物質と低分子物質Ｂとの競争反応を生じさせる事によって目的物質を溶出させる事を特徴とする物質の分離精製方法。
（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の刺激応答性高分子が刺激応答性高分子であるとともに該応答性高分子が下限臨界温度（ＬＣＳＴ）を有する場合にはＬＣＳＴ以下の温度で、また該刺激応答性高分子が上限臨界温度（ＵＣＳＴ）を有する場合にはＵＣＳＴ以上の温度で、目的物質を吸着させた後に溶離液の塩濃度やｐＨなどの液組成を変化させないか若しくは変化させるとともにカラム温度を臨界温度を超えるまで変化させる事により該刺激応答性高分子の分子構造を変化させて目的物質と低分子物質Ｂとの競争反応によって目的物質を溶出させる事を特徴とする物質の分離精製方法。
（９）クロマトグラフィーを用いる上記（７）または（８）記載の分離精製方法。
【０００９】
国際出願公開ＷＯ９４−１５９５１号公報に記載されている発明は、本発明で低分子物質Ｂに相当する部分が刺激応答性高分子から成っており、本発明の分離材料とは異なる構成になっている。また、国際出願公開ＷＯ９７−０９０６８号公報に記載されている発明は、刺激応答性高分子自体を本発明における物質Ａに導入しており、本特許とは異なる構成になっている。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、目的物質とは、抗原、ウィルス、細胞、糖鎖、糖タンパク質、細胞表面の受容体、酵素基質アナログ、酵素阻害剤、核酸、ホルモン受容体等の生体成分、生理活性物質や医薬品、組み換えタンパク質等を意味する。アフィニティクロマトグラフィーは、これらの目的物質を複雑な生体成分混合物から分離精製する事、変性した試料から目的とする未変性のものを分離する事、大量の夾雑物から少量の目的物質を取り出す目的で利用されている。
本発明において、目的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａとは、目的物質に対して特異的結合能を有するリガンドを意味し、例えば、酵素、抗体、レクチン、核酸、ホルモン、ビタミン、細胞などが挙げられる。
本発明において、低分子物質Ｂとは、分子量１０００以下の化合物を意味し、例えば、ＮＡＤやＮＡＤＰ等の補欠分子族やハプテン糖などが代表例として挙げられる。
本発明において、直鎖状または架橋させた物質Ａとは親和性を有しない刺激応答性高分子とは、物理的刺激を受けることによって構造変化を起こす高分子を意味し、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピペリジン）、ポリ（Ｎ−プロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリジン）、ポリ（Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）をはじめとするポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）からのアルキルアミン置換体が挙げられる。また、架橋構造を導入する場合にはアルキルジアミン類等の多官能性の架橋剤を置換反応時に添加する事によって得られる。
【００１１】
上記物理的刺激とは、例えば温度である。温度変化により、標的物質と相互作用する分子の分子認識能を変化させることは、例えば熱応答性高分子との複合化により達成される。例えば、複合体末端にアミノ基、カルボキシル基、水酸基等を有するポリアルキルアミドあるいはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー充填材が挙げられる。化学修飾した担体とは例えば、シリカ担体などが挙げられる。
使用される具体的な刺激応答性高分子に応じて、他の刺激、例えば、光、磁場、電場、振動等を適用してもよい。刺激応答性高分子はしばしば「機能性高分子（ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」とよばれる。
刺激応答性高分子は、正しい強度若しくはレベルの正しい刺激（臨界刺激強度若しくは臨界刺激レベル）にさらされると、その物理化学的特性が構造的かつ可逆的に変化することによって特徴付けられる。その変化は顕著な疎水性から顕著な親水性への転換またはその逆の転換であることもある。必要とされる刺激の正確なレベル／強度および種類は高分子の構造に依存し、しばしば他の条件（溶媒、例えば塩類などの溶質、等）にも依存する特性がある。最もよく知られており、かつ最も利用されているこの種の高分子は熱に応答する（熱応答性高分子または刺激応答性高分子）。刺激応答性高分子は、顕著な親水性から顕著な疎水性に転換するかまたはその逆に転換する鋭い相転移温度あるいは温度限界（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｌｉｍｉｔ）を有することによって認識される。溶液中における刺激応答性高分子に関して、コンフォメーション／物理化学的特性の変化はいわゆる臨界溶液温度（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＣＳＴ）において起こる。
水溶液系における刺激応答性高分子に関しては、下限臨界温度（ＬＣＳＴ）または上限臨界温度（ＵＣＳＴ）がある。ＬＣＳＴを有する高分子に関しては、温度がＬＣＳＴより低い温度からＬＣＳＴを通過しているときに、親水性のコンフォメーションから疎水性のコンフォメーションに変化する。ＵＳＣＴを有する高分子に関しては、温度がＵＣＳＴより低い温度からＵＣＳＴを通過しているときに、その変化は正反対になる。ＬＣＳＴおよびＵＣＳＴの正確な値は当該高分子および適用される他の条件（溶媒、溶質、等）に依存する。
上述のように、刺激応答性高分子が用いられる場合の本発明の特徴の１つは、リガンドへの結合およびリガンドからの放出は適用される臨界溶液温度の反対側で行われるということである。
刺激応答性高分子は、標的物質および共有結合しているリガンドとの間の親和力に比較して、標的物質に対する親和力が小さいことが好ましい。リガンドおよび熱応答性高分子との間には大きな親和力がないことが好ましい。
【００１２】
刺激応答性高分子の基本構成単位としては、例えば、（メタ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、（メタ）Ｎ−アクリロイルピペリジン、（メタ）Ｎ−プロピルアクリルアミド、（メタ）Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、（メタ）Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、（メタ）Ｎ−アクリロイルピロリジン、（メタ）Ｎ、Ｎーエチルメチルアクリルアミド、（メタ）Ｎ−エチルアクリルアミドをはじめとする（メタ）Ｎ−アルキルアクリルアミドのホモポリマーとこれらの共重合体、また標的物質と相互作用する分子と化学的に複合化させるためにカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシスクシンイミド基、チオール基、イミノ基、エポキシ基等の官能基を含むモノマーとの共重合体が挙げられる。
本発明の方法において使用するポリアルキルアクリルアミドとしては、例えばポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−レクチン複合体が挙げられる。
標的物質および標的物質と相互作用する分子とは、アミノ酸、糖、核酸などからなる生体成分や分子量が１０００以下の有機化合物などが挙げられる。刺激応答性高分子と化学的に複合化させるリガンドの量は任意に制御を行うことができるが、複合体中の構成中の０．１％〜５０％が望ましい。また、標的物質と相互作用する分子の複合化する量により、刺激応答性高分子の物理的、化学的性質を変化させることができる。例えばポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の場合、ホモポリマーでは３２℃付近に下限臨界温度を有するが、標的物質と相互作用する分子の複合化量によりこれを制御できる。
【００１３】
分離材料（例えば、クロマトグラフィー用充填材）
本発明において使用されるべき分離材料は有機および／または無機材料に基づくものでよい基材（ｂａｓｅ  ｍａｔｒｉｘ）（担体（ｃａｒｒｉｅｒ））を含む。使用される液体が水性である場合、基材は親水性であることが好ましい。これは特に、上述の種類の生体高分子である標的物質に適用される。
基材は高分子であるのが好ましく、この高分子は水に不溶性でありかつ多かれ少なかれ膨張性を示すものであることが好ましい。親水性になるように修飾された疎水性高分子はこの定義に含まれる。好適な高分子は、ポリヒドロキシ高分子（例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、でん粉、プルラン等のような多糖類に基づくポリヒドロキシ高分子）および合成高分子（例えば、ポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエーテル）、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）およびポリメタクリレート（例えば、ポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコール並びにスチレンおよびジビニルベンゼンに基づく高分子）、および前記の高分子に対応する２種若しくは３種以上のモノマーが含まれている共重合体である。水に溶解する高分子を、例えば、架橋により、および吸着若しくは共有結合により不溶性物質に結合させることにより、不溶性に修飾してもよい。親水性基は、ＯＨに転換しうる基を有するモノマーの重合化により、または最終高分子の親水性化（例えば、親水性高分子のような適当な化合物の吸着）により疎水性高分子上に（例えば、モノビニルおよびジビニルベンゼンの共重合体上に）導入することができる。
基材において使用されるべき適当な無機材料は、シリカ、酸化ジルコニウム、グラファイト、酸化タンタル等である。
好ましい基材は、シラン基、エステル基、アミド基およびシリカの中にそういうものとして存在する基などのような加水分解に対して不安定な基を欠いたものである。
基材は多孔質であっても非多孔質であってもよい。このことは、基材が十分に若しくは部分的に透過性（多孔質）であっても除去されるべき化合物に対して完全に非透過性（非多孔質）であってもよいことを意味する。
細孔（ｐｏｒｅ）は０．１μｍ以上（例えば、０．５μｍ以上）の大きさを有していてもよく、このことは直径が０．１μｍ以上の球体（例えば、直径が０．５μｍ以上の球体）が通過することができることを意味する。適用される液体はこの種の細孔系（貫通性）を貫流することができるものであってもよい。支持基材（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｍａｔｒｉｘ）が分離材料に充填されたビーズの形である場合、貫通性細孔系の細孔径と粒子の直径の間の比率は典型的には０．０１−０．３、好ましくは０．０５−０．２である。大きさが０．１μｍ以上（例えば、０．５μｍ以上）の細孔はしばしばマクロポア（ｍａｃｒｏｐｏｒｅ）と呼ばれる。
基材は０．５μｍ以下（例えば、０．１μｍ以下）の大きさを有する細孔を有していてもよく、このことは０．５μｍ以下（例えば、０．１μｍ以下）の直径を有する球体だけが通過することができることを意味する。大きさが０．５μｍ以下（例えば、０．１μｍ以下）の細孔はしばしばミクロポア（ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ）と呼ばれる。
本発明の特に興味ある実施態様において、基材は大きさが１−１０００μｍの範囲の不ぞろいの粒子若しくは球状粒子の形態であり、高性能な利用を目的とするには５−５０μｍ、予備的な（準備段階の）目的には５０−３００μｍの大きさが好ましい。
また、基材は上で定義した通りの少なくともマクロポアを有するモノリスの形態であってもよい。代わりの幾何学的形態は管の内壁等である。
上で定義した通りの刺激応答性高分子は、基材にその外表面上でおよび／またはその内表面上で結合することが可能である（マクロポア表面および／またはミクロポア表面）。当該刺激応答性高分子はまた、基材それ自体を構成する高分子の一部であってもよい。刺激応答性高分子は物理的吸着および／または共有結合によって基材に結合していてもよく、後者が好ましい。
【００１４】
リガンド
リガンドは、刺激応答性高分子が基材に結合若しくは基材に組み込まれた前若しくは後に当該高分子に結合される。刺激応答性高分子への結合は親和力結合（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｏｎｄｓ）若しくは共有結合により可能であり、好ましくは後者である。ある典型的な種類のリガンドは、程度の差はあれ、純然たるイオン性（静電性）の相互作用によって標的物質に結合する。あるいは、その結合は親和力結合（親和力吸着）のようなもっと複雑な相互作用を含む。イオン性の相互作用に関しては、リガンドは正に帯電した若しくは負に帯電した物質（イオン交換；固定化された物質は１級アミン、２級アミン、３級アミン、４級アンモニウム、スルホン酸塩、硫酸塩、ホスホン酸塩、リン酸塩、カルボキシ等の基の中から選択される）を含む。より複雑な相互作用は１対のものにおける親和力構成物質（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ）であるリガンドによって例証される。
（ａ）抗体および抗原／ハプテン。
（ｂ）レクチンおよび炭水化物構造。
（ｃ）ＩｇＧ結合タンパク質およびＩｇＧ。
（ｄ）高分子キレート化剤（ｐｏｌｉｍｅｒｉｃ  ｃｈｅｌａｔｏｒｓ）およびキレート。
（ｅ）相補的な核酸。
また、親和力構成物質は触媒反応（例えば、酵素、酵素基質、補酵素、補助基質（ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）等）に関与している物質を含む。細胞−細胞相互作用および細胞−細胞表面相互作用の構成物質並びに生体内で産生された親和力構成物質の合成物もまた含まれる。リガンドという用語はまた、親和力によって複雑な生体分子、例えば、オリゴペプチド構造若しくはポリペプチド構造（タンパク質を含む）、オリゴヌクレオチド構造およびポリヌクレオチド構造（核酸を含む）、オリゴ糖構造若しくは多糖構造等を有する複雑な生体分子、に結合する多かれ少なかれ複雑な有機分子（例えば、レクチン）をも含む。
【００１５】
本発明の高分子化合物は次のように製造される。高分子化合物の原料となる１種類もしくは２種類以上の単量体と重合開始剤を重合溶媒に溶解して、加熱などにより重合反応を開始する。この時、かかる高分子化合物を含むゲル構造体を得るために、２官能性の単量体を溶解してもよい。さらにこの時、かかる高分子化合物の分子量を調整するため、あるいはかかる高分子化合物の端末に反応性官能基を導入するために、連鎖移動剤を重合溶媒に溶解させてもよい。重合反応後はかかる高分子を溶解しない溶媒中で再沈殿させることで、目的の温度による刺激応答性高分子化合物を得ることができる。
本発明の高分子化合物は、例えばその端末に導入した反応性官能基を利用してシリカゲルあるいはポリマーゲルなどの担体表面に固定化することができる。またはシリカゲルあるいはポリマー等の固体表面に重合開始剤を固定化した後に、かかる高分子化合物の原料となる１種類もしくは２種類以上の単量体を重合溶媒に溶解して、重合開始剤を固定化したシリカゲルあるいはポリマーゲル等の担体存在下で加熱などにより重合反応を開始することで、かかる高分子化合物をシリカゲルあるいはポリマーゲル等の担体表面に固定化することができる。このとき、かかる高分子化合物のゲル構造体を得るために、２官能性の架橋剤を溶解しても良い。さらにこのとき、かかる高分子化合物の分子量を調整するために、あるいは反応性官能基を導入するために、連鎖移動剤を重合溶媒に溶解させても良い。かかる高分子化合物を含む材料は各種の液体クロマトグラフィー担体、吸着剤などの吸着・分離材料、バイオプロダクトなどの放出剤、生体機能材料に応用することができる。
【００１６】
目的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａ、該物質Ａに対して特異的親和性を有する低分子物質Ｂおよび刺激応答性高分子の固定化方法年手は、物質Ａ、Ｂを刺激応答性高分子に共重合もしくは刺激応答性高分子鎖上の官能基と反応させる事によって導入した後に分離材料に固定化する方法や、物質Ａを導入した刺激応答性高分子と物質Ｂを導入した物質を各々独立に分離材料表面に固定化する方法、物質Ａのみを分離材料表面に固定化した後に物質Ｂを導入した刺激応答性高分子を分離材料表面の残っている官能基を利用して導入する方法、もしくは、逆に物質Ｂのみを分離材料表面に固定化した後に物質Ａを導入した刺激応答性高分子を分離材料表面の残っている官能基を利用して導入する方法などが挙げられる。固定化反応時にはＡを有する化合物とＢを有する化合物を予め混合しておき、物質Ａと物質Ｂが近接可能な状態で分離材料表面に固定化する事が好ましい。固定化反応はｐＨ８−１０の範囲で最も効果的に進行する。レクチン等のタンパク質を結合させる場合には、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ８．５−９の炭酸水素ナトリウムバッファー（０．２−０．２５Ｍ）が好適である。
【００１７】
本発明の分離材料の好ましい実施態様の一例として、目的物質が糖鎖もしくは糖タンパク質であり、目的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａが糖鎖の特異的な構造に対して親和性を有するレクチン、例えば、ＲＣＡ１２０、コンカナバリンＡ、レンズマメレクチン、小麦胚芽レクチン、ピーナッツレクチン、ヒママメレクチン等の糖親和性物質が挙げられる。この場合、該物質Ａに対して特異的親和性を有する低分子物質Ｂとしてハプテン糖が、刺激応答性高分子としてポリ（Ｎ−イソフロピルアクリルアミド）が挙げられる。
【００１８】
刺激応答性高分子としてポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）のスクシンイミド基をアミン化合物で置換する事によって作製した温度応答性高分子を使用する場合、アミノ基を有する化合物をポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）のスクシンイミド基の５０〜９７ｍｏｌ％、好ましくは７０〜９５ｍｏｌ％、より好ましくは８０〜９０ｍｏｌ％を導入する事によって水溶性にした後に物質Ａを低分子物質Ｂ共存下で該水溶性高分子鎖に導入した後に分離材料上に固定化するか、もしくは該水溶性高分子に物質Ａおよび低分子物質Ｂ共存下で分離材料上に固定化する事によって分離材料を製造することができる。
【００１９】
上記段落番号０００８における（１）〜（４）の刺激応答性高分子を担持させた分離材料に目的物質を吸着させた後に溶離液の塩濃度やｐＨなどの液組成を変化させないか若しくは変化させるとともに刺激応答性高分子の分子構造を変化させて目的物質と低分子物質Ｂとの競争反応を生じさせる事によって目的物質を溶出させ、分離精製することができる。
【００２０】
上記段落番号０００８における（１）〜（５）の刺激応答性高分子が刺激応答性高分子であるとともに該応答性高分子が下限臨界温度（ＬＣＳＴ）を有する場合にはＬＣＳＴ以下の温度で、また該刺激応答性高分子が上限臨界温度（ＵＣＳＴ）を有する場合にはＵＣＳＴ以上の温度で、目的物質を吸着させた後に溶離液の塩濃度やｐＨなどの液組成を変化させないか若しくは変化させるとともにカラム温度を臨界温度を超えるまで変化させる事により該刺激応答性高分子の分子構造を変化させて目的物質と低分子物質Ｂとの競争反応によって目的物質を溶出させ、分離精製することができる。
【００２１】
【実施例】
以下の実験例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【００２２】
分離材料作製実施例
レクチンとしてヒママメレクチン（ＲＣＡ１２０）、ＲＣＡ１２０に対するハプテン糖としてラクトース、分離材料としてセファロースを使用した場合の分離材料作製例を以下に示した。
ラクトースは炭酸水素アンモニウム飽和水中４８ｈｒ反応させてβラクトシルアミンに変換した。
Ｎ−（アクリロイロキシ）スクシンイミド（６．３０ｇ、３７．２ｍｍｏｌ）とＡＩＢＮ（５０ｍｇ）をベンゼン（４５０ｍｌ）に溶解後、６０℃で２４時間重合反応を行った。重合終了後にテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）からの再沈殿法によりポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）を白色のポリマー（６．１２ｇ、９８％）として得た。
分離材料としてはEAH  Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech)を使用した。
また、プレパックドカラムとしてNHSactivated Hi-Trap Column(1ml) (Amersham Pharmacia Biotech)を使用した。
【００２３】
【作製実施例１】
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍｌにポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）（１．０ｇ）、イソフロピルアミン（３１４．８ｍｇ）とβラクトシルアミン（１０．１ｍｇ）を溶解し、室温で３６時間攪拌して反応させた。反応終了後にポリマーを再沈殿法により白色の水溶性ポリマー（０．８１ｇ）を得た。この水溶性ポリマーをラクトース（１０ｍｇ）存在下にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）中でＲＣＡ１２０（５ｍｇ）と４℃で１２時間反応させたのちに、ＥＡＨセファロース４Ｂをパッキングしたカラム（ｌｍｌ）に導入して固定化反応を４℃で６時間行った。固定化反応終了後にエチレンジアミン（０．０１ｍｇ）を含むＰＢＳハッファー溶液１ｍｌを導入してさらに４℃で１２時間放置したのちに戦っているスクシンイミド基をエタノールアミン溶液（蒸留水１００ｍｌに対してエタノールアミン（３．０５ｇ）、ＮａＣｌ（２．９２ｇ）を溶解。）にて不活性化処理してカラム（Ｃ−１）を作製した。
【００２４】
【作製実施例２】
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍｌにポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）（１．０ｇ）、イソプロピルアミン（３１４．８ｍｇ）とβラクトシルアミン（５０．５ｍｇ）を溶解し、室温で３６時間攪拌して反応させた。反応終了後にポリマーを再沈殿法により白色の水溶性ポリマー（０．８１ｇ）を得た。この水溶性ポリマーをラクトース（１０ｍｇ）存在下にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）中でＲＣＡ１２０（５ｍｇ）と４℃で１２時間反応させたのちに、ＥＡＨセファロース４Ｂをパッキングしたカラム（１ｍｌ）に導入して固定化反応を４℃で６時間行った。固定化反応終了後にエチレンジアミン（０．０１ｍｇ）を含むＰＢＳバッファー溶液１ｍｌを導入してさらに４℃で１２時間放置したのちに残っているスクシンイミド基をエタノールアミン溶液にて不活性化処理してカラム（Ｃ−２）を作製した。
【００２５】
【作製実施例３】
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍｌにポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）（１．０ｇ）、イソプロピルアミン（３１４．８ｍｇ）とβラクトシルアミン（１０．１ｍｇ）を溶解し、室温で３６時間攪拌して反応させた。反応終了後にポリマーを再沈殿法により白色の水溶性ポリマー（０．８１ｇ）を得た。この水溶性ポリマーをラクトース（１０ｍｇ）存在下にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）中でＲＣＡ１２０（５ｍｇ）と４℃で１２時間反応させたのちに、ＮＨＳ活性化セファロース担体をエチレンジアミン溶液で処理してアミノ基を導入したカラム（１ｍｌ）に導入して固定化反応を４℃で６時間行った。固定化反応終了後にエチレンジアミン（０．０１ｍｇ）を含むＰＢＳバッファー溶液１ｍｌを導入してさらに４℃で１２時間放置したのちに残っているスクシンイミド基をエタノールアミン溶液（蒸留水１００ｍｌに対してエタノールアミン（３．０５ｇ）、ＮａＣｌ（２．９２ｇ）を溶解。）にて不活性化処理してカラム（Ｃ−３）を作製した。
【００２６】
【作製比較例１】
（刺激応答性高分子にラクトースを導入しなかった場合の作製例）
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍｌにポリ（Ｎ−アクリロイルスクシンイミド）（１．０ｇ）、イソプロピルアミン（３１４．８ｍｇ）を溶解し、室温で３６時間攪拌して反応させた。反応終了後にポリマーを再沈殿法により白色の水溶性ポリマー（０．８１ｇ）を得た。この水溶性ポリマーをラクトース（１０ｍｇ）存在下にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）中でＲＣＡ１２０（５ｍｇ）と４℃で１２時間反応させたのちに、ＮＨＳ活性化セファロース担体をエチレンジアミン溶液で処理してアミノ基を導入したカラム（１ｍｌ）に導入して固定化反応を４℃で６時間行った。固定化反応終了後にエチレンジアミン（０．０１ｍｇ）を含むＰＢＳバッファー溶液１ｍｌを導入してさらに４℃で１２時間放置したのちに残っているスクシンイミド基をエタノールアミン溶液（蒸留水１００ｍｌに対してエタノールアミン（３．０５ｇ）、ＮａＣｌ（２．９２ｇ）を溶解。）にて不活性化処理して力ラム（Ｃ−４）を作製した。
【００２７】
【作製比較例２】
（刺激応答性高分子を導入しなかった場合の作製例）
ラクトース（１０ｍｌ）存在下にＲＣＡ１２０（５ｍｇ）のＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）溶液をＮＨＳ活性化セファロース担体をパッキングしたカラム（１ｍｌ）に導入して、４℃で４時間反応させた。固定化反応終了後に残っているスクシンイミド基をエタノールアミン溶液（蒸留水１００ｍｌに対してエタノールアミン（３．０５ｇ）、ＮａＣｌ（２．９２ｇ）を溶解。）にて不活性化処理してカラム（Ｃ−５）を作製した。
【００２８】
分離精製実施例
分離精製の例として糖タンパク質（ヒトトランスフェリン）を用いてアシアロトランスフェリンの吸脱着の温度制御を行った。これによりアシアロトランスフェリンとシアル酸を有するトランスフェリンの分離を行った。作製実施例及び比較例で示した方法によって作製したカラムをＨＰＬＣ装置（Shimazu,LC-6A）に接続した。その他の条件は以下に示した。
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、  検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）、  浴雛液：０．０１Ｍ  ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）
ヒトトランスフェリン２５ｎｍｏｌ（Sigma Chemical Co.Ltd.）を、１ｍｌの５０ｍＭシュウ酸バッファー（ｐＨ５．０）中、シアリダーゼ０．１ｍＵ（from Arthrobacter ureafaciens,Sigma Chemical Co.Ltd.）で３７℃、６時間処理したものをサンプルとした。
【００２９】
【精製実施例１】
力ラム（Ｃ−１）をＨＰＬＣ装置に装着後、送液を開始して５℃にセットした恒温槽で平衡化した後にサンプル（５０μｌ）をインジェクトしてアシアロトランスフェリンを吸着させた。カラムに保持されないシアル酸付加体が溶出された後に（４〜５分）カラム温度を１５℃にして、吸着されたアシアロトランスフェリンを温度変化だけで溶出させた。温度変化によって溶出されてくるものがなくなった所（１５分）から０〜５０ｍＭラクトースＰＢＳバッファー裕液のリニアグラジェント（１０分間）をかけて温皮変化だけでは溶出されなかった残りのアシアロトランスフェリンを溶出させた。
カラム（Ｃ−１）および比較用カラム（Ｃ−５）によって精製実施例の手法に従ってヒトトランスフェリンの精製を行った場合のクロマトグラムを図１に示した。図１からわかる様にカラム（Ｃ−１）では温度変化のみによる溶出によって総吸着量の９０％程度が回収されたのに対して比較用カラムでは回収率は２０％以下であった。各力ラムの１５℃での温度溶出による回収率を表１にまとめて示した。
また、比較用カラム（Ｃ−５）で溶出温度を１５℃から２０℃、２５℃にした場合のクロマトグラムを図２に示した。Ｃ−５の場合には溶出温度を２５℃にしても回収率は５０％だった。（ヒトトランスフェリンのシアリダーゼ処理品と未処理品のＣ−５カラムでのクロマトグラムを参考として図３に示した。未処理のヒトトランスフェリンは糖鎖末端のシアル酸がＲＣＡ１２０との相互作用をそがいするために殆どがスルーしてくるのに対して、シアリダーゼ処理によって末端シアル酸を除いたサンプルでは、殆どがＲＣＡ１２０にトラップされ最後にラクトースのグラジェントをかけることによって溶出された。
【００３０】
【表１】
0005109003.tif 000002
【００３１】
【発明の効果】
本発明の分離材料は、脱塩や脱ハプテン糖の操作が不要であるため、次のような優れた効果を有する。
（１）低分子化合物のアフィニテイクロマトグラフイー
脱塩や脱ハブテン糖が不可能若しくは困難な糖鎖等の低分子化合物に対してレクチンアフィニテイクロマトグラフィーによる精製が可能になる。
（２）バイオアッセイ
低塩濃度もしくは生理的条件で行うバイオアッセイが容易になる。
（３）検出感度のアップ
ＭＡＤＬＩ  ＴＯＦ−ＭＳでは、サンプル中の塩がＳ／Ｎを悪化させる事が知られており、微量サンプルでは特に脱塩操作を測定前に行う必要があるが、本発明による温度溶出を使用すれば脱塩操作を行わずにＴＯＦ−ＭＳ測定を行う事が可能となる。また、２Ｄ−ＰＡＧＥのサンプル前処理にアフィニティクロマトグラフィーを行う場合にもそのままサンプルを使用することが可能であり、サンプルロスの低下および検出感度の向上が期待出来る。
また、本発明の分離材料は、担体の再生を温度のみの操作によって行う事が可能となり、通常使用されている強アルカリ条件での洗浄が必要でなくなるために生産性の向上が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】カラム（Ｃ−１）および比較用カラム（Ｃ−５）によって精製実施例の手法に従ってヒトトランスフェリンの精製を行った場合のクロマトグラムである。
【図２】比較用カラム（Ｃ−５）で溶出温度を１５℃から２０℃、２５℃にした場合のクロマトグラムである。
【図３】ヒトトランスフェリンのシアリダーゼ処理品と未処理品のＣ−５カラムでのクロマトグラムである。
【図１】
0005109003.tif 000003
【図２】
0005109003.tif 000004
【図３】
0005109003.tif 000005