(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリーカラム内に先端開口までモノリス構造体を一体形成させ、該キャピラリーカラム一端を、その外壁、内壁及びその内部に固定したモノリス構造体共にテーパー状に引伸ばし先細に形成させたことを特徴とするＥＳＩ用スプレーニードル。
【請求項２】
キャピラリーカラム内に構成させるモノリス構造体は、シリカモノリス構造体であることを特徴とする請求項１記載のＥＳＩ用スプレーニードル。
【請求項３】
キャピラリーカラムは先端を外径１５０μｍ以下に構成したことを特徴とする請求項１乃至請求項２の何れか１項に記載のＥＳＩ用スプレーニードル。
【請求項４】
キャピラリーカラム内のモノリス構造体に設けられた先端まで貫通する連続孔に対し、所望の表面修飾を行い、分離濃縮カラム機能を持たせたことを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載のＥＳＩ用スプレーニードル。
【請求項５】
キャピラリーカラム内にモノリス構造体を形成すると共に、キャピラリーカラムを一端又は両端から牽引することにより、キャピラリーカラム内に形成されたモノリス構造体を共に牽き、牽引加工部位を順次細く形成し、切断することを特徴とするＥＳＩ用スプレーニードルの製造方法。
【請求項６】
前記モノリスカラム構造体はシリカモノリスであり、前記牽引の際、加工部位を加熱することを特徴とする請求項５記載のＥＳＩ用スプレーニードルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量物質、就中、生体物質の分析に使用される質量分析用のＥＳＩ用スプレーニードル及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーは、流体の成分の分離により、分析・同定が優れている分析方法である。
その利用法の一つとして、特にペプチド、タンパク質同定の基本装置として、ＥＳＩ−ＭＳ（electrospray ionization mass spectrometry）所謂エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法がある。
【０００３】
この方法は、キャピラリーに高電圧を印加することにより、キャピラリーに導入された試料溶液への高電圧印加の結果、キャピラリー先端に電荷を帯びた液滴を発生させ、該帯電液滴はキャピラリー先端に形成したノズルより引出され、液体コーンとなり、次いで蒸発によりイオンを放出する、このイオンを取り出し、質量分析計で分析するものである。これらは、特開２００３−３３１７７６号公報、特表２００２−５３８４６１号公報及びＵＳＰ第５５７２０２３号明細書に開示されている。
【０００４】
この手法は、多くの電荷を同時に持つ多価イオンを生成することが出来、蛋白質のような高分子分析には有効な場合がある。
【０００５】
この方法に於いては、従来キャピラリーカラムを用い、直径３μｍ〜１０μｍの粒子を、直径１２〜１００μｍのキャピラリーカラムに充填してカラムを形成する例が多くあり、このカラム先端から試料を吐出させてスプレーする先端部が形成されるものである。
【０００６】
この場合、キャピラリーに充填する粒子を保持するために先端に粒子の排出を阻止するフリットを入れたり、粒子自体をフリットとしたりする事が行われている。これらは、Naturo Bio Technology 19(2001)242,247又はJOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A979(2002)233-239に開示されている。
【０００７】
然し、このフリットは作製や配置が難しく、その上ピーク拡張原因ともなっている。
例えば、テーパーカラムに於いては、充填剤の粒径が大きく、クロマトの分離効率が悪いことと、カラムの先端開口部の内口径が大きいため、試料の吐出量が多くなり、スプレーによって形成される帯電流滴の粒径も大きく、この結果、溶媒が乾燥蒸発される過程で、そこに荷電していた電子の試料分子への移行効率、即ちイオン化効率が悪かったとされている。その対応として、開発した石英ガラスに微小口径の開口部を形成したカラムや、キャピラリーカラム先端を先細に形成したカラムが使用されている。又、カラムをフリットレスに構成し、カラムの先端開口部内口径を０．５μｍ以下とし、カラムの充填剤の粒径を０．５μｍより大きく５μｍ以下としたスプレーカラムが提案されている。これは特開２００３−１５１４８６号公報に開示されている。
【０００８】
しかし、粒子と内口径やテーパーとの関係は非常に難しく、又先端開口のμｍの微小径は目詰まりを起こすことが多い。これらは特表２００２−５３８４６１号公報、特開２００３−１５１４８６号公報及びAnalytical Chemistry Vol.74.No.18,September15 2002.4725に開示されている。
【０００９】
ＬＣ分析に於いて、スループットを高めるには、ＬＣカラム寸法を短く且つ内径を小さく形成し、充填する粒径を小さくしなければならないことは常識である。
【００１０】
然し、小さな粒径を使用する場合、例えば「１μｍの粒子が詰め込まれた５ｃｍのカラムは、５μｍの粒子が詰め込まれた２５ｃｍのカラムの５倍高い背圧を生成する。大部分の市販のＬＣポンプは、動作圧が４００バール未満に制御されており、したがって、このような小さな粒子を有するＬＣカラムの使用は実現不能である。」とＵＳＰ第５５７２０２３号明細書に記載されるように、粒径の微小化には問題がある。
【００１１】
近年、急速に発展しているプロテオミクス分野に於いて、迅速分離、分析が求められ、これに対応してカラムの圧密化、小型化が始まっている。
【００１２】
このカラムの小型化に対応するものとして、試料流量を小さくし、イオン形成率を高めるためにキャピラリー先端をマイクロチップ化したスプレーチップが開発され、又一方ではキャピラリー内にポリマー、例えばＰＳ−ＤＶＢのモノリス構造を形成させる方法がある。このスプレー先端部は、試料溶液の流量が低いほど、イオン生成効率が高くなるが、又、１μｌ／ｍｉｎ以下ではイオン生成効率は低下してしまう。そこで、先端を数μ〜１０μｍの小型化した石英製のスプレーチップが開発され、溶媒の蒸発効果低減のため、１μｌ／ｍｉｎから１ｎｌ／ｍｉｎの低容量で安定したイオン生成が出来るようにしている。
【００１３】
又一方モノリス構造は従来ＰＳ−ＤＶＢ粒子が逆相モードにおける蛋白質分析に効果があったところから、これを連続層とする構成に至ったものである。これはＵＳＰ第５５７２０２３号明細書に開示されている。
【００１４】
又、キャピラリーカラム内に０．５〜５μｍサイズの細孔（スルーポア）と２〜５０ｎｍサイズの細孔（メソポア）を有する骨格が絡み合った構造を持つ二重細孔構造のシリカゲルを形成したキャピラリーカラムが提案されている。これは、特表２００３−５３４９０５号公報に記載されている。
【００１５】
然しこれらは何れもキャピラリーカラムの構成であって、然も分離カラムとしての作用、即ち溶質を液相の該カラム内の移動中の相互作用の繰り返しによる分離効率を追求されるものである。
【００１６】
これらのキャピラリーカラムはカラムからダイレクトに質量分析器インレットにスプレーする構成は全くなく、所謂スプレーニードルとして使用することはできない。
【００１７】
一方スプレーニードルとしてカラム先端をテーパー状に形成した構成のものが提案され、使用されている。例えば広く使用されている素管内部中空のエミッターＰｉｃｏＴｉｐ（登録商標）がある。これを使用した実験では、トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）のピーク巾が広がり、マススペクトルのＳ／Ｎが低く、これはイオン化が不十分であることが判明している。
【００１８】
【特許文献１】特開２００３−３３１７７６号公報
【特許文献２】特表２００２−５３８４６１号公報
【特許文献３】特開２００３−１５１４８６号公報
【特許文献４】ＵＳＰ第５５７２０２３号明細書
【特許文献５】特表２００３−５３４９０５号公報
【非特許文献１】Naturo Bio Technology 19(2001)242,247
【非特許文献２】JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A979(2002)233-239
【非特許文献３】Analytical Chemistry Vol.74.No.18,September15 2002.4725
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
このように所謂スプレーニードルとしてキャピラリーカラムを加工したものは、先端内径を数μｍ以下にしている場合があり、この場合目詰まりを起こしやすく、しばしば使用できなくなる欠点がある。
【００２０】
又、充填物、粒子を充填していないスプレーチップではキャピラリー内部での溶質の拡散が大きく、ピークがブロード化することになる。
【００２１】
一方粒子状の充填物を充填するスプレーニードルでは、先ず粒子の充填に困難性があり、再現性のよい、ニードルの調製が出来ない。
【００２２】
又、充填した状態が構造変化を起こしやすく、性能変化及び劣化を来たすことが多い。
更にカラム先端をテーパー状に形成した素管ではピーク巾が広がり、イオン化が充分に行われない。
【００２３】
そこで本発明に於いては、キャピラリースプレーニードルのテーパーと粒子の間の困難な形状を調整する必要もなく、粒子の充填の必要もなく、従って粒子の充填構造の変化も起こることなく、更に構造変化による性能低下もなく、又使用耐久性も向上し、性能的にもピークのシャープ化ができる他、エミッターとしての用途と共に、分離濃縮カラムとしても機能するスプレーニードル及びその製造方法を提案するものである。
【００２４】
本発明の目的は、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）又別に補助的に噴霧ガスを使用するエレクトロスプレーイオン法（ＥＳＩ）に於いて、試料溶液が流速１μｌ／ｍｉｎ以下の低容量で安定したイオン生成が可能となるように、或は高速検出が可能であるように高流速にも対応できるようにしようとするものである。又、イオン生成効率を高めるためにスプレーチップを低流量に形成すれば定められた流速を使用するしかなく、その使用範囲は限られていたのに対し、キャピラリー中に一体構造のゲルを調製し、ＥＳＩスプレーニードルとしてそのまま使用できるように構成し、然も試料溶液の広い流量領域に対応して使用でき、イオン生成効率を高めることが可能であり、更に先端加工なしにスプレー機能を発揮できるニードルを提供することである。
【００２５】
又、キャピラリー中に出入口に貫通する連続孔を有するモノリス構造体を充填し、キャピラリーの先端をニードル状に加工してスプレーニードルとして構成したニードルを提供する。
【００２６】
特にこの際、フューズドシリカキャピラリーを用い、その内にゲルのモノリス構造体を構成し、先端を一体的に牽引加工してスプレーニードルを形成し、ナノＥＳＩエミッターとして使用することも目的の一つである。
【００２７】
更に別の目的は、キャピラリー中に一体構造のゲルを調製し、ゲルのモノリス構造体通孔表面に化学処理を施し、分離カラム、濃縮カラムとして機能させることである。
【００２８】
又、これに加えて先端をそのまま或は加工してスプレーニードルとして分離カラム兼エミッターとして使用することもできる。
勿論、これらエミッターは分離カラムに接続して使用することが可能である。
【００２９】
本発明に於いては、キャピラリーはフューズドシリカキャピラリー（溶融シリカゲル）を使用し、そのキャピラリー中にモノリス構造体を構成し、先端部加工によりＥＳＩ用のナノスプレーとして利用できるキャピラリーを提案するものである。
【００３０】
又、他の一つは、モノリス構造体の通孔の表面処理を行うことにより、キャピラリーを分離、濃縮カラムの作用を有し、且つエミッターとして利用可能なキャピラリーカラムを提案する。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、これらの目的を達成するため、第１にキャピラリーカラムの一端を外壁、内壁共にテーパー状に先細に形成させると共に、該キャピラリーカラム内に先端開口までモノリス構造体を形成させたことを特徴とし、第２にキャピラリーカラム内に構成させるモノリス構造体は、シリカモノリス構造体であることを特徴とし、第３にキャピラリーカラムは先端を外径１５０μｍ以下に構成したことを特徴とし、第４にキャピラリーカラム内のモノリス構造体に設けられた先端まで貫通する連続孔に対し、所望の表面修飾を行ない、分離濃縮カラム機能を持たせたことを特徴とし、第５にキャピラリーカラム内にモノリス構造体を形成すると共に、キャピラリーカラムを一端又は両端から牽引することにより、キャピラリーカラム内に形成されたモノリス構造体を共に牽き、牽引加工部位を順次細く形成し、切断することを特徴とし、第６に前記モノリスカラム構造体はシリカモノリスであり、前記牽引の際、加工部位を加熱することを特徴とする。
【００３２】
本発明の最も特徴的な点は、キャピラリー中にシリカ等の無機質或は無機質を中心とするモノリス構造体を形成する工程を経て、このキャピラリーをその内部に固定形成したモノリス構造体と共に加工する部位を加熱し、両端部を牽引し、加工する部位にて切断することにより、二つのキャピラリーがその内部にモノリス構造体を形成したまま、その先端がテーパー状に牽引、形成され、極めて狭い開口部が出来、液体の流量が低下し、イオン生成効率が高く、然も内部のモノリス構造体によって溶出ピークがシャープになるスプレーニードルとなる処である。
【００３３】
又、本発明に於いて、前述のキャピラリー中に構成したモノリス構造体に対して、その通孔表面処理を行うことにより、スプレーニードルとしての機能の他に、同時に分離・濃縮機能を有するカラムとして使用できるスプレーニードルを提供できる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、キャピラリーカラムの内径にモノリス構造体を形成させたこと、テーパー状の先端開口までモノリス構造体を形成したこと、又、キャピラリーカラム内にモノリス構造体を形成し、キャピラリーカラムを牽くことにより、キャピラリーカラム先端をその内部にモノリス構造体が形成されたテーパー状と為したので、試料溶液が流速１μｌ／ｍｉｎ以下の低容量でも安定したイオン生成が可能であり、又高速検出が可能であるように、高流速にも対応できるＥＳＩ用のスプレーニードルを提供することが出来る。
【００３５】
従って、低容量から高流速の広い範囲に亘って対応できるスプレーニードルを調製形成して提供することが出来る。
然もその製法は容易であり、困難な工程を必要とすることなく、キャピラリー中にゲルを形成して先端機能を形成させる工程にてスプレーニードルを得ることが出来る。
【００３６】
然も得られたスプレーニードルは粒体を充填する場合と異なり、使用による形態変化や先端部の目詰まりがなく、常に安定したイオン生成が達成できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明一実施例縦断側面図である。
【図２】本発明他実施例縦断側面図である。
【図３】本発明製作工程一実施例作動態様図である。
【図４】本発明製作工程一実施例作動態様図である。
【図５】本発明一使用例部分説明図である。
【図６】本発明一使用例部分断面側面図である。
【図７】本発明一使用例概略説明図である。
【図８】本発明一実施例顕微鏡写真拡大側面図である。
【図９】本発明一実施例顕微鏡写真拡大正面図である。
【図１０】本発明一実施例顕微鏡写真拡大正面図である。
【図１１】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図１２】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図１３】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図１４】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図１５】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図１６】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図１７】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図１８】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図１９】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図２０】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図２１】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図２２】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図２３】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図２４】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図２５】本発明使用実施例クロマトグラムである。
【図２６】本発明と素管使用による性能比較図である。
【図２７】本発明と素管使用による性能比較図である。
【図２８】本発明と素管使用による性能比較図である。
【図２９】本発明と素管使用による性能比較図である。
【図３０】本発明一実施例クロマトグラムである。
【図３１】本発明一実施例クロマトグラムである。
【図３２】本発明他実施例クロマトグラムである。
【図３３】本発明他実施例クロマトグラムである。
【図３４】本発明他実施例クロマトグラムである。
【図３５】本発明他実施例クロマトグラムである。
【図３６】本発明他実施例クロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
先ず、キャピラリーとしては、フューズドシリカキャピラリーを使用する。フューズドシリカキャピラリーは通常外径１５０μｍ〜３７５μｍが使用され、又内径は５０μｍ〜２００μｍが使用に便である。
【００３９】
外径と内径の組合せについては、外径３７５μｍで内径が５０μｍ、外径３７５μｍで内径が１００μｍ、外径３７５μｍで内径が２００μｍと云うように夫々適性に応じて選択できる。
【００４０】
このフューズドシリカキャピラリー中にモノリス構造体を形成させる。モノリス構造体の構成は、溶媒に溶ける高分子、例えばポリエチレンオキシドのような水溶性高分子に熱分解性の化合物、例えば尿素等を酸性水溶液を加えて溶解させ、この溶解液にテトラメトキシシランのような調整物を加え撹拌する。この撹拌下加水分解反応を行い、得られた溶液をフューズドシリカキャピラリーに注入する。これを恒温槽下材質に応じ所望時間、温度に保持した処ゲル化する。
【００４１】
この固化したゲルを所望時間熟成させる。その後ゲルを洗浄乾燥させ、更に３００℃以上加熱し、シリカモノリスキャピラリーを得る。このモノリス構造体の調製物としては、４官能性アルコキシシラン（Ｓｉ（ＯＲ）４）、３官能性アルコキシシラン（Ｓｉ（ＯＲ）３）、（ＲはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５）が挙げられる。又、４官能性アルコキシシランと３官能性アルコキシシランの混合アルコキシシランから調製される。
【００４２】
フューズドシリカキャピラリー中でＨＰＬＣ等に使用されるカラムの調製を行うためには、キャピラリー壁と一体となったモノリスゲルが理想とされる。然し、反応が縮合重合反応により進行を行うためゲル自体が収縮し、壁と一体となったゲルの調製は非常に困難である。そのためフューズドシリカキャピラリー壁のシラノール基の活性化を行って化学的にキャピラリー壁とゲルを結合させることで一体となったシリカモノリスキャピラリーカラムの調製を行うのがよい。
【００４３】
又このモノリス構造体通孔には、分離試料に適したコーティング剤及び／又は化学的修飾剤を適用して通孔の表面を修飾・改質し得る。例えば、コーティング剤としては、ポリエチレングリコール、シリコンオイルなどが挙げられる。
【００４４】
化学的修飾剤としては、トリメチルクロロシラン（ＴＭＳ）、ジメチル−ｎ-クチルクロロシラン、ジメチル−ｎ−オクタデシルクロロシラン（ＯＤＳ）などのアルキルクロロシラン、又はトリメチルメトキシシラン、ジメチル−ｎ−オクチルメトキシシラン、ジメチル−ｎ−オクタデシルメトキシシラン（ＯＤＳ）などのアルキルアルコキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミノアルコキシシラン、フェニルトリメトキシシランなどのフェニルアルコキシシラン、エポキ含有シラン（グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン）、ビニル基含有シラン（アリルトリメトキシシラン）、チタンイソプロポキシド、チタンプトキシドなど各種シラン処理剤が挙げられる。
【００４５】
コーティング剤としては、尿素樹脂、ポリアミン、フェニルシリコンオイル、メチルシリコンオイル、ビニルシリコンオイル、ポリエチレングリコール、ブタジエンポリマー、ポリスチレン、ポリジビニルベンゼン、ポリメタクリレートなどのポリマーをコーティングしたり、コポリマーなどをコーティング後、熱重合や光重合などで高分子化し、ポリマー相を得る事ができる。また、ブタジエン、スチレン、ジビニルベンゼン、メタクリレート、メチルメタクリレート、ヒドロキシメタクリレート、グリシジルメタクリレート、エチレングリコールジメタクリレートなどのモノマーに開始剤や重合触媒などを添加された溶液をコーティング後に、熱や光などでポリマー相を作成できる。
【００４６】
また、化学的修飾剤を結合後に上記のコーティングを行い、ビニル基などの開環重合やアミノ基などの縮重合やエステル化などにより、強固なポリマー相を形成させることができる。
【００４７】
〔具体例１〕
ジメチル−ｎ−オクタデシルクロロシランのトルエン溶液（１０％ｖ／ｖ）をモノリスキャピラリーカラムに送液する。（このときの温度８０℃以上、送液はシリンジポンプ、ガス圧などで行う。）数時間モノリスキャピラリーカラムに送液を行う。その後にトルエン、テトラヒドロフランで洗浄を行う。以上の操作を行い、モノリスキャピラリーカラムのオクタデシル化を行う。
【００４８】
〔具体例２〕
３−アミノプロピルトリエトキシシランのトルエン溶液（１０％ｖ／ｖ）をモノリスキャピラリーカラムに送液する。（このときの温度８０℃以上、送液はシリンジポンプ、ガス圧などで行う。）数時間モノリスキャピラリーカラムに送液を行う。その後にトルエン、テトラヒドロフランで洗浄を行う。以上の操作を行い、モノリスキャピラリーカラムのアミノ化を行う。
【００４９】
〔具体例３〕
３−グリシドオキシプロピルトリエトキシシランのトルエン溶液（１０％ｖ／ｖ）をモノリスキャピラリーカラムに送液する。（このときの温度８０℃以上、送液はシリンジポンプ、ガス圧などで行う。）数時間モノリスキャピラリーカラムに送液を行う。その後にトルエン、テトラヒドロフランで洗浄を行う。以上の操作を行い、モノリスキャピラリーカラムへのエポキシ基の修飾を行う。
【００５０】
〔具体例４〕
アゾビスイソブチロニトリル（０．０１ｗｔ％）を添加したブタジエンコポリマーのヘキサン溶液（２％ｖ／ｖ）をモノリスキャピラリーカラムに送液する。ガスを流して溶液を除去する。次に、８０℃以上で数時間熱重合する。その後にトルエン、テトラヒドロフランで洗浄を行う。以上の操作を行い、モノリスキャピラリーカラムへポリマー相を形成させる。
【００５１】
その他試薬を変更することにより、化学修飾は同一操作で行え、表面官能基が変わってくることになる。
【００５２】
また、これらの表面官能基を結合後に、更にモノマーやコポリマーやポリマーなどをコーティングや重合させることで、ポリマー相を形成できる。
【００５３】
〔具体例５〕
３−アリルトリエトキシシランのトルエン溶液（１０％ｖ／ｖ）をモノリスキャピラリーカラムに送液する。（このときの温度６０℃以下、送液はシリンジポンプ、ガス圧などで行う。）数時間モノリスキャピラリーカラムに送液を行う。次に、過酸化ベンゾイル（０．０１ｗｔ％）を添加したジビニルベンゼンのベンゼン溶液（２％ｖ／ｖ）でキャピラリー内を満たす。８０℃以上で熱重合を行い、その後にトルエン、テトラヒドロフランで洗浄を行う。以上の操作を行い、モノリスキャピラリーカラム内にポリマー相を形成させる。
【００５４】
使用できる原料についてさらに詳述する。
４官能性シリカで作製する場合の原料（アルコキシシラン）は基本的には
Ｓｉ（ＯＣｎＨ２ｎ＋１）４  ｎ＝１〜１０
の式で得られるものが１種類のみで使用可能である。
【００５５】
その一例として
Ｓｉ（ＯＣＨ３）４：テトラメトキシシラン
Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）４：テトラエトキシシラン
Ｓｉ（ＯＣ３Ｈ７）４：テトラプロポキシシラン
Ｓｉ（ＯＣ４Ｈ９）４：テトラブトキシシラン
等がある。そのいずれか１種類のみで合成可能である。
【００５６】
３官能性シリカで作製する場合の原料（アルコキシシラン）は基本的には
ＲＳｉ（ＯＣｎＨ２ｎ＋１）４  ｎ＝１〜１０
の式で得られるものが使用可能である。
【００５７】
その一例として
ＲＳｉ（ＯＣＨ３）３：トリメトキシシラン
ＲＳｉ（ＯＣ２Ｈ５）３：トリエトキシシラン
ＲＳｉ（ＯＣ３Ｈ７）３：トリプロポキシシラン
ＲＳｉ（ＯＣ４Ｈ９）３：トリブトキシシラン
等はいずれか１種類のみで合成可能である。
【００５８】
Ｒで示した部分に入るものとして
・アルキル基＝ＣｎＨ２ｎ＋１で表されるもの（ｎ＝１〜１０）
例えば
ＣＨ３Ｓｉ（ＯＣＨ３）３（メチルトリメトキシシラン）
ＣＨ３Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３（メチルトリエトキシシラン）
Ｃ２Ｈ５Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３（エチルトリエトキシシラン）
などの組合せによって種々得られる。
【００５９】
・エポキシ基＝〜〜ＣＨＯＣＨ２を含むもの
例えば
ＣＨ２ＯＣＨＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３Ｓｉ（ＯＣＨ３）３（グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン）
【００６０】
・アリル基＝〜〜ＣＨ２ＣＨＣＨ２
例えば
ＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３（アリルトリメトキシシラン）
その他にもアミノ基、チオール基、カルボキシル基を含むものなど多数あり、上記のものに限定されない。
【００６１】
ハイブリッド系シリカゲルに使用されるアルコキシシラン
４官能性アルコキシシラン（一般的にはＳｉ（ＯＣＨ３）４：テトラメトキシシラン、Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）４：テトラエトキシシランのどちらか）と、３官能性アルコキシシランのどれか１つを混合したアルコキシシランを原料とする。
【００６２】
混合アルコキシシランのアルコキサイドは同一種を使用する。
例えば
Ｓｉ（ＯＣＨ３）３＋Ｓｉ（ＯＨＣ３）３ＣＨ３（実施例１に示す。）
Ｓｉ（ＯＣＨ３）４＋ＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３（アリルトリメトキシシラン（アリル基））
Ｓｉ（ＯＣＨ３）４＋ＣＨ２ＯＣＨＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３Ｓｉ（ＯＣＨ３）３（グリシドオキシブロピルトリメトキシシラン（エポキシ基））
混合比は４：１、３：１、２：１、１：１で調製可能である。
【００６３】
上記の方法で或は他のゾルゲル法により上面から下面まで貫通している通孔を有する連続構造体或はその内部に開放構造を持ち、ミクロ細孔を持つ多孔質体を形成する。このスプレーニードル１０のモノリスは、シングルポア、ダブルポア共に使用可能である。
【００６４】
使用できる範囲としては、スルーポアー３０μｍ〜０．１μｍ、メソポアサイズ５０ｎｍ、骨格サイズ（スケルトンサイズ）５〜０．１μｍが適当である。
【実施例１】
【００６５】
先ず、スプレーニードルの製造例について説明する。
フューズドシリカキャピラリー（外径０．３７５ｍｍ、内径０．１ｍｍ、長さ１０ｃｍ）に１Ｎ−ＮａＯＨを満たし、４０℃で数時間放置しする。次に１Ｎ−ＨＣｌに置換を行い、室温で数時間放置する。その後、水で洗浄し、乾燥を行う。
【００６６】
メチルトリメトキシシラン、硝酸水溶液（１規定）、メタノールをモル比１：１．９：２の割合で混合し、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルを加え、数分間混合する。得られた反応溶液をキャピラリー中に導入し、４０℃にて数時間ゲル化を行う。その後ゲルを乾燥、洗浄し、シリカモノリスキャピラリーカラムを得た。
【００６７】
得られたモノリス構造体は中心径２μｍ程度の揃った貫通孔が３次元的に絡み合った構造で存在していることが電子顕微鏡により確認された。
【実施例２】
【００６８】
実施例１の如く処理したフューズドシリカキャピラリー（外径０．３７５ｍｍ、内径０．１ｍｍ、長さ１０ｃｍ）を用い、水溶性高分子であるポリエチレンオキシド０．８８ｇ、尿素０．９ｇを０．０１規定酢酸水溶液１０ｍｌに溶解した。この溶液にテトラメトキシシラン４ｍｌを撹拌下で加水分解反応を行った。数分間撹拌した後、得られた溶液を内面処理、即ちシラノール基の活性化を行ったフューズドシリカキャピラリーに注入し、４０℃の恒温槽中で保持したところ、固化した。固化したゲルを更に数時間熟成を行った。更に１００℃以上で数時間熟成を行った。その後、ゲルを洗浄、乾燥させ、３００℃以上に加熱し、シリカモノリスキャピラリーカラムを得た。
【００６９】
得られた多孔質体中には、中心孔径２．０μｍ程度の揃った貫通孔が３次元的に絡み合った構造で存在していることが電子顕微鏡により確認された。その貫通孔の内壁には直径１０ｎｍ程度の孔が存在している。
【００７０】
上記のように得られたモノリス構造多孔質体１を形成したキャピラリーカラム２をテーパー部３先端から適宜長さに切断してスプレーニードル１０を形成する。このスプレーニードル１０はＭＳ１１に連通するイオン取入口（図示せず）に液滴を噴射する構成をとってある。一方このスプレーニードル１０はＬＣポンプ１２に接続するキャピラリー１３に連結部１４を介して連通してある。この連結部１４は導電性で電圧印加装置１６に接続してあり、該連結部１４を介して溶出溶液に電圧を印加する構造である。
【００７１】
このスプレーニードル１０はＭＳ１１等にイオンを供給するための一つのスプレー構成であり、イオンの捕捉、検出には種々の構成が利用されること当然である。
【００７２】
上記のように形成したモノリスキャピラリーカラム２を所望長さに形成して、両端或は一端を牽引してニードル部を形成させる。この具体的方法としてキャピラリーカラム２両端を固定器具２１，２１により固定し、加工する部位、例えば中央部であれば、中央部２２を加熱する。この加熱は、ガスバーナー、レーザー等を使用し、キャピラリーカラム２のガラス転位温度以上に加熱する。この際、内部に形成されているモノリス構造多孔質体１も加熱される。次いで、キャピラリーカラム両端から外方への張力を加える。これにより、中央部がテーパー状に細くなり、最後に両端から軸力により切断され、夫々の先端がテーパー部３，３となる。
【００７３】
この結果、ニードル状の先端までモノリス構造多孔質体が形成されたスプレーニードル１０が形成される。
更に、必要に応じてニードル先端部のエッチング、切断乃至研磨等の作業を行う。
尚、この牽引加工操作は既存のプーラーによっても行われる。
【実施例３】
【００７４】
上記実施例１により得られたシリカモノリスキャピラリー１５ｃｍをレーザープーラー（Sutter Instrument Co.米国）にかけ、温度１２００℃、張力０．５ｋｇｆにて引張した。
【００７５】
その結果、内径０．０５ｍｍ、外径０．３７５ｍｍの先端テーパー部は外径９０μｍ、内径３０μｍ、テーパー状部１．５ｍｍのエミッターを得た。
【００７６】
図８〜１０はその先端径状のＳＥＭ写真である。
ＳＥＭ写真で先端の状態を見ると、モノリス骨格はキャピラリーに保持され、モノリス骨格自体は引伸ばされることにより、縮小されている構造となっている。メソポアの構造については測定方法なく判明しない。
【００７７】
このように形成されたスプレーニードル１０の顕微鏡写真図８、図９、図１０を示す。
写真は内径０．０５ｍｍ、外径０．３７ｍｍのキャピラリーで調製し、長さ５０ｍｍとしたモノリス構造のスプレーニードル１０で、図８は外側斜面図、図９は外径１７０μｍの正面図、図１０は内径約２５μｍの正面図であり、牽引加工を行ってもモノリス構造体とキャピラリーとの一体構造の維持が示されている。
【００７８】
上記先端の形成に於いて、先端径状は、内径２００μｍ、外径３７０μｍのキャピラリーカラムについては、内径１００μｍ、外径１５０μｍ以下である。内径７５μｍ、外径３７５μｍのキャピラリーカラムは、内径４０μｍ、外径１５０μｍ以下とする。内径１００μｍ、外径３７５μｍのキャピラリーカラムは、先端径内径５０μｍ、外径１５０μｍ以下とする。又、内径５０μｍ、外径３７５μｍのキャピラリーカラムは、先端径３０μｍ、外径１５０μｍ以下に加工を行うが、これに限定されるものではない。
【００７９】
一般にＥＳＩ用のスプレーニードルはイオン化が可能な、使用できる流速を定めている。例えば広く使用されているＰｉｃｏＴｉｐ（登録商標）は、素管のスプレーニードルであるが、チップ内径に対し、使用レンジを次のように推奨している。
【表１】
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【００８０】
このようにＰｉｃｏＴｉｐ（登録商標）では最大でも１μｌ／ｍｉｎまでにしか対応できない。例示例で云えば、先端内径３０μｍのものでは０．３０μｉ／ｍｉｎ〜１μｌ／ｍｉｎである。
【実施例４】
【００８１】
これに対し、上記により得られた本発明スプレーニードルを使用して実験したクロマトグラムを図１１〜図２５に示す。
本発明スプレーニードルは内径０．１ｍｍ×長さ５０ｍｍを使用
溶液：ＭｅＯＨ
流速：１０μｌ〜０．５μｌ／ｍｉｎ
【００８２】
実験例に於いて示すように、本発明スプレーニードルでは０．５μｌ／ｍｉｎ〜１０μｌ／ｍｉｎと広い流領域に適応し、イオン化できることを示している。この実験例に於いて本発明のモノリス型スプレーニードルは内径０．１ｍｍ×長さ５０ｍｍを使用し、ＬＣに連通したキャピラリーに設けてイオン源から発生させた帯電粒子をイオンと共にインターフェースを経て送り、ＭＳにて分析するものである。
これにより、高流速の試料にも対応が可能であり、高速検出が出来、このことは分析時間の短縮を意味し、イオン化効率のよいことを示している。
【実施例５】
【００８３】
素管のスプレーニードル、ＰｉｃｏＴｉｐ（ＦＳ３６０−５０−３０−ＣＥ）と本発明スプレーニードルの使用例の比較を行った。（図２６，２７，２８，２９）
エミッターのサイズ
ＰｉｃｏＴｉｐ  内径５０μｍ、外径３６０μｍ  Ｔｉｐ内径  ３０μｍ
本発明スプレーニードル  内径５０μｍ、外径３６０μｍ  Ｔｉｐ内径  １５μｍ
ＬＣ条件
溶液  Ａ  Ｈ２Ｏ（０．１％ＨＣＯＯＨ）
Ｂ  ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＨＣＯＯＨ）
Ａ／Ｂ＝５０／５０
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：０．５μｌ／ｍｉｎ
試料：ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎII（１ｎｇ／μｌ）
Ｍｗ＝１０４６
Ｉｎｊｅｃｔ．Ｖｏｌ：１００ｎｌ
ＭＳ条件
ニードル電圧：２０００Ｖ
検出器電圧：２６００Ｖ
【００８４】
素管のエミッターでは（図２６、図２７図示）ＴＩＣのピーク巾が広がり（約２０秒）マススペクトルでのＳ／Ｎが低い（Ｓ／Ｎ＝１１６）。これではイオン化が不充分、本発明スプレーニードルの使用により（図２８、図２９図示）イオン化が促進され、ＴＩＣのピーク巾の減少（約１０秒）マススペクトルのＳ／Ｎの上昇が得られた。イオン化が促進されている。
【００８５】
ＴＩＣを比較すると、本発明スプレーニードル使用のものの方がピーク巾が小さくシャープであると共に、強度が強い。
マススペクトルに於いては、Ｍ／Ｚは一致しているが、強度、Ｓ／Ｎは本発明のものがよい。
【実施例６】
【００８６】
本発明スプレーニードルを使用した図７に示す装置使用による実験結果を示す。
該実験により得たクロマトグラムを図３０に示す。
ＬＣ条件
溶媒  Ａ  Ｈ２Ｏ（０．１％ＨＣＯＯＨ）
Ｂ  ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＨＣＯＯＨ）
Ａ／Ｂ＝８０／２０−１０ｍｉｎ−４０／６０
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：０．５μｌ／ｍｉｎ
Ｓａｍｐｌｅ：１  ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎIII
２  ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎII
３  ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩ
４  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｃｈａｉｎＢ（１ｎｇ／μｌ）
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｖｏｌ：１００ｎｌ
ＭＳ条件
ニードル電圧：２５００Ｖ
検出器電圧：２８００Ｖ
ピーク巾の小さいシャープなクロマトが得られた。
【実施例７】
【００８７】
本発明スプレーニードルのモノリス表面処理の有無による分析結果の比較を行った。モノリス表面処理を施していない本発明スプレーニードルのみを用い、質量分析により得られたＴＩＣ（トータルイオンクロマトグラム）を図３１に、モノリス表面をオクタデシル基にて処理した本発明スプレーニードルのみを使用し得られたＴＩＣを図３２に、分離カラムの下流に表面処理を施していない本発明スプレーニードルを接続して使用し得られたＴＩＣを図３３に示す。
ＬＣ条件
溶液  Ａ  Ｈ２Ｏ（０．１％ＨＣＯＯＨ）
Ｂ  ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＨＣＯＯＨ）
Ａ／Ｂ＝１００／０−（１５ｍｉｎ）−５０／５０
Ｆｌｏｗｒａｔｅ  ２μｌ／ｍｉｎ
試料  １．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎIII  ２．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎII
３．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩ  ４．Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｃｈａｉｎＢ
【００８８】
図３１に示すようにモノリス表面処理を施していない本発明スプレーニードルでは、イオン化は良好に行われているが、分離能が低く、試料１．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎIIIと２．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎIIは分離されていない。
【００８９】
図３２に示すようにモノリス表面をオクタデシル基処理した本発明スプレーニードルでは、イオン化能、分離能ともに良好であった。
【００９０】
図３３に示すように、分離カラムの下流に未処理の本発明スプレーニードルを接続したものでは、分離カラムによる分離を低下させることなく、良好にイオン化されている。
【実施例８】
【００９１】
本発明の表面処理済スプレーニードルを使用した実験に於いて、モノリス構造体の表面加工の加工形態の差異によるクロマトグラムを示す。（図３４、図３５）
【００９２】
図３４は実施例２に示す如く、レーザープーラーにより牽引加工してスプレーニードル１０を形成した後に、表面処理加工を行って得たスプレーニードル１０によるものである。
【００９３】
図３５はモノリス構造体の表面処理加工を施した後、レーザープーラーにより牽引加工してスプレーニードル１０を得たものを使用したクロマトグラムである。
何れもスプレーニードル分離カラムとして使用できる結果を得た。
【００９４】
ＬＣ条件
溶液  Ａ  Ｈ２Ｏ（０．１％ＨＣＯＯＨ）
Ｂ  ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＨＣＯＯＨ）
Ａ／Ｂ＝１００／０−（１５ｍｉｎ）−５０／５０
Ｆｌｏｗｒａｔｅ  ２μｌ／ｍｉｎ
試料  １．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎIII  ２．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎII
３．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩ  ４．Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｃｈａｉｎＢ
【実施例９】
【００９５】
本発明スプレーニードルを使用し、試料としてウシ血清アルブミンをトリプシンにより消化して得られたペプチド断片の質量分析を行った。同一試料を用いて、流速を１０μｌ／ｍｉｎ、５μｌ／ｍｉｎ、１μｌ／ｍｉｎ、０．５μｌ／ｍｉｎのそれぞれに設定し、分析を行った。本実験では、分離カラムを使用せず、本発明スプレーニードルのみによる分離及びイオン化により質量分析を行った。質量分析によって得られたＴＩＣを図３６に示す。
【００９６】
使用した本発明スプレーニードル
内径０．１ｍｍ、外径０．３７５ｍｍ、Ｔｉｐ内径２０μｍ、長さ４５ｍｍモノリス表面にオクタデシル基を修飾したものを使用
ＬＣ条件
溶媒  Ａ  Ｈ２Ｏ（０．１％ＣＯＯＨ）
Ｂ  ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＨＣＯＯＨ）
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１０μｌ／ｍｉｎ、５μｌ／ｍｉｎ、１μｌ／ｍｉｎ、
０．５μｌ／ｍｉｎ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ毎に、以下の条件のグラジエント分析を行った。
１０μｌ／ｍｉｎ：Ａ／Ｂ＝９０／１０−１０ｍｉｎ−５０／５０
５μｌ／ｍｉｎ：Ａ／Ｂ＝９０／１０−１０ｍｉｎ−５０／５０
１μｌ／ｍｉｎ：Ａ／Ｂ＝９０／１０−３０ｍｉｎ−５０／５０
０．５μｌ／ｍｉｎ：Ａ／Ｂ＝９０／１０−４０ｍｉｎ−５０／５０
試料：ウシ血清アルブミン  トリプシン消化物（１５０ｆｍｏｌ）
ＭＳ条件
ニードル電圧  ３０００Ｖ
検出器電圧  ２８００Ｖ
【００９７】
０．５μｌ／ｍｉｎ〜１０μｌ／ｍｉｎの流速範囲において、分離されたピークが検出された。このことは、試料であるペプチド断片が本発明スプレーニードル内において分離され、その分離されたペプチド断片が随時イオン化されることにより、質量分析計によって検出されたことを示す。流速の上昇に伴い、分析時間の短縮が見られ、流速の低下に伴い、検出強度の上昇が見られた。
【００９８】
以上のことから、本発明スプレーニードルは、高速分離に対応した高流速から、高感度分析を目的とした低流側まで、広範囲の流速を同一のスプレーニードルで分離及びイオン化が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によれば、キャピラリーカラムの内径にモノリス構造体を形成させたこと、テーパー状の先端開口までモノリス構造体を形成したこと、又、キャピラリーカラム内にモノリス構造体を形成し、キャピラリーカラムを牽くことにより、キャピラリーカラム先端をその内部にモノリス構造体が形成されたテーパー状と為したので、試料溶液が流速１μｌ／ｍｉｎ以下の低容量でも安定したイオン生成が可能であり、又高速検出が可能であるように、高流速にも対応できるＥＳＩ用のスプレーニードルを提供することが出来る。
【０１００】
従って、低容量から高流速の広い範囲に亘って対応できるスプレーニードルを調製形成して提供することが出来る。
然もその製法は容易であり、困難な工程を必要とすることなく、キャピラリー中にゲルを形成して先端機能を形成させる工程にてスプレーニードルを得ることが出来る。
【０１０１】
然も得られたスプレーニードルは粒体を充填する場合と異なり、使用による形態変化や先端部の目詰まりがなく、常に安定したイオン生成が達成できる。
【符号の説明】
【０１０２】
１  モノリス構造多孔質体
２  キャピラリーカラム
３  テーパー部
１０  スプレーニードル
１１  ＭＳ
１２  ＬＣポンプ
１３  キャピラリーカラム
１４  ユニオン
１５  インジェクションバルブ
【図１】
0004863877.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0004863877.tif 000020
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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