(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式によって表される化合物からなるタンパク質キナーゼ阻害剤。
【式１】
0004876239.tif 000013
ここで、Ｒは１’−ナフチル；２’−ナフチル；ｍ−フェノキシフェニル；ｍ−ベンゾイルオキシフェニル；ｍ−（２’，６’−ジクロロ）ベンジルオキシフェニル；３−ピペロニル；ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル；１’−ナフチルメチル；１’−ナフトキシメチル；または２’−ナフチルメチルである。
【請求項２】
Ｒが１’−ナフチルである、請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項３】
Ｒが２’−ナフチルである、請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項４】
Ｒが１’−ナフチルメチルである、請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項５】
Ｒが２’−ナフチルメチルである、請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤を含む製薬組成物。
【請求項７】
細胞を請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤に接触することを含む、Ｓｒｃファミリーの突然変異体タンパク質キナーゼを発現する細胞における形質転換をインビトロで阻害する方法。
【請求項８】
突然変異体タンパク質キナーゼがＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
突然変異体タンパク質キナーゼがＴ３３９Ｇ  Ｆｙｎである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞を請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤を含む組成物に接触することを含む、Ｓｒｃファミリーの突然変異体タンパク質キナーゼを発現する細胞における形質転換をインビトロで阻害する方法。
【請求項１１】
突然変異体タンパク質キナーゼがＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
突然変異体タンパク質キナーゼがＴ３３９Ｇ  Ｆｙｎである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のタンパク質キナーゼ阻害剤を、前記タンパク質キナーゼおよびその基質を含む混合物によってインキュベートすることを含む、突然変異体タンパク質キナーゼの基質のリン酸化をインビトロで阻害する方法。
【請求項１４】
突然変異体タンパク質キナーゼがＳｒｃファミリーの突然変異体タンパク質キナーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
突然変異体ｖ−Ｓｒｃが突然変異体ｖ−Ｓｒｃである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
突然変異体タンパク質キナーゼがＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体Ｆｙｎである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
突然変異体ＦｙｎがＴ３３９Ｇ  Ｆｙｎである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ｃ−Ａｂｌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
突然変異体ｃ−ＡｂｌがＴ３１５Ａ  Ａｂｌである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ＣＡＭＫ  ＩＩαである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
突然変異体ＣＡＭＫ  ＩＩαがＦ８９Ｇ  ＣＡＭＫ  ＩＩαである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ＣＤＫ２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
突然変異体ＣＤＫ２がＦ８０Ｇ  ＣＤＫ２である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体Ｃｄｃ２８である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
突然変異体Ｃｄｃ２８がＣｄｃ２８−ａｓ１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体Ｆｕｓ３である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
突然変異体Ｆｕｓ３がＦｕｓ−ａｓ１である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
突然変異体タンパク質キナーゼを請求項１に記載の阻害剤によってインキュベートすることを含む、突然変異体タンパク質キナーゼの触媒作用活性をインビトロで阻害する方法。
【請求項３０】
突然変異体タンパク質キナーゼがＳｒｃファミリーの突然変異タンパク質キナーゼである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ｖ−Ｓｒｃである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
突然変異体ｖ−ＳｒｃがＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体Ｆｙｎである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
突然変異体ＦｙｎがＴ３３９Ｇ  Ｆｙｎである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ｃ−Ａｂｌである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
突然変異体ｃ−ＡｂｌがＴ３１５Ａ  Ａｂｌである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ＣＡＭＫ  ＩＩαである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
突然変異体ＣＡＭＫ  ＩＩαがＦ８９Ｇ  ＣＡＭＫ  ＩＩαである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ＣＤＫ２である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
突然変異体ＣＤＫ２がＦ８０Ｇ  ＣＤＫ２である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体Ｃｄｃ２８である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
突然変異体Ｃｄｃ２８がＣｄｃ２８−ａｓ１である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体Ｆｕｓ３である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
突然変異体Ｆｕｓ３がＦｕｓ−ａｓ１である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体メチルトランスフェラーゼである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１のタンパク質キナーゼ阻害剤によって細胞をインキュベートすることを含む、突然変異体タンパク質キナーゼを発現する細胞の成長をインビトロで阻害する方法。
【請求項４７】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ｖ−Ｓｒｃである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
突然変異体ｖ−ＳｒｃがＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ｃ−Ａｂｌである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
突然変異体ｃ−ＡｂｌがＴ３１５Ａ  Ａｂｌである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体ＣＤＫ２である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
突然変異体ＣＤＫ２がＦ８０Ｇ  ＣＤＫ２である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
突然変異体タンパク質キナーゼが突然変異体Ｃｄｃ２８である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
突然変異体Ｃｄｃ２８がｃｄｃ２８−ａｓ１である、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、１９９９年１月１１日に提出された米国仮特許出願第６０／１１５，３４０号および１９９９年６月２３日に提出された米国仮特許出願第６０／１４５，４２２号に対する優先権を請求する。どちらの出願も引用することによってその全体が本明細書に含まれている。
【０００２】
連邦政府助成研究
本発明につながる研究は、国立衛生研究所による助成金ＮＩＨ（ＩＲＯＩＩＣＡ７０３３１−０１）およびＮＩＨ（ＩＲＯＩＡＩ／ＣＡ４４００９−０１）によって一部支援されている。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、酵素のどのようなクラスの突然変異阻害剤でも同様に、そのように同定された特異的阻害剤を発見する一般的な方法を提供する。さらに詳細には、本発明は、多基質酵素の特異的阻害剤を発見する一般的方法を提供する。そのような多基質酵素の例としては、これに限定されるわけではないが、キナーゼおよびトランスフェラーゼが挙げられる。本発明の方法によって同定された突然変異阻害剤は、発癌遺伝子形質転換などの非常に選択的に細胞機能を阻害させるために使用できる。ある１つの実施形態において、本発明はＳｒｃタンパク質キナーゼ阻害剤、その製薬組成物、および、細胞をタンパク質キナーゼ阻害剤に接触させることを含む、標的ｖ−ｓｃｒを発現する細胞における形質転換を混乱させる方法を提供する。
【０００４】
【発明の背景】
本明細書におけるすべての出版物および特許出願は、それぞれの出版物または特許出願が詳細および個々に引用することによって本明細書の一部となっていると記載されているのと同程度に、引用することによって本明細書の一部となっている。米国特許出願第０８／７９７，５２２および６０／０４６，７２７号およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０２５２２は、本出願に関連付けられており、これらの各出願は引用することによりその全体が詳細および個々に本明細書の一部となっている。
【０００５】
現在、新たに発見される遺伝子の数が爆発的に急増していることにより、遺伝子の機能を説明および制御するのに使用可能な小型分子リガンドの必要性が明らかになっている。タンパク質／小型分子のインタフェースの収束技術は近年、高い特異性を備えた新規リガンド／受容体対を生成するための強力な方法として出現した。化学多様性を標的タンパク質はもちろん小型分子にも導入することによって、ユニークな結合相互作用を、従来の医薬品化学によってよりもさらに効率よく設計および開発することができる。このような手法を用いて、多数の生体系の化学的調査が行われている。ＦＫ５０６結合タンパク質は、Ｃｌａｃｋｓｏｎおよび共同研究者と同様に、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒおよび共同研究者によって、非天然型ＦＫ５０６結合タンパク質類似体に優先的に結合するように設計されている。この系は、細胞において受容体を選択的に二量体化し、遺伝子発現を制御するために広範に使用されてきた。核ホルモン受容体も、化学的遺伝子設計にあわせて修飾可能なことが示されている。Ｃｏｒｅｙおよび共同研究者は、レチノイドＸ受容体における２つのアミノ酸残基における突然変異は、新規リガンド特異性を持つ新たな２クラスの受容体を作成するのに十分であることを証明した。さらに医薬的に応用可能な系において、Ｓｍｉｔｈおよび共同研究者は、野生種プロテアーゼによる加水分解に耐性であるメトトレキサートのプロドラッグを加水分解するために、プロテアーゼであるカルボキシペプチダーゼＡ１を設計した。
【０００６】
セリン、トレオニンまたはチロシンのヒドロキシ部分のタンパク質キナーゼ触媒リン酸化反応は、真核信号形質導入における中心的な翻訳後制御要素である。所与のタンパク質のリン酸化反応状態は、その酵素活性、タンパク質−タンパク質結合相互作用および細胞分布を制御できる。そのため、リン酸化反応および脱リン酸化反応は、高度に調節された方法で遺伝子発現を最終的に制御するために、細胞がプラズマ膜から核まで信号を伝達できるようにする「化学スイッチ」である。各キナーゼの高度に選択的な細胞透過性阻害剤によって、キナーゼの細胞機能をリアルタイムで系統的に調査することができるため、信号伝達カスケードにおけるリン酸化反応依存プロセスの逆重畳積分用の非常に貴重なツールを供給する。
【０００７】
Ｓｒｃ科は、リンパ球活性化から細胞成長および増殖にわたる細胞信号経路の配列内の重要な構成要素である、高度に相同的な１０個の細胞質ゾルキナーゼで構成されている。これらの酵素を構成的に活性化すると、癌細胞形質転換が生じ、それらを癌療法の推定上の薬剤標的とすることができる。この基本的細胞プロセスの調節は重要であるため、多くの研究がＳｒｃ科キナーゼの阻害剤の開発に重点を置いている。しかし、発見された強力な阻害剤は、個々の標的キナーゼの細胞阻害を探索するのに要求される高い選択性が欠如している。従来の阻害剤スクリーンは、各種のＳｒｃ科キナーゼの活性部位を弁別可能な分子を、生成するとしてもわずかに生成している。
【０００８】
あいにく、信号伝達でキナーゼを非常に有用にし、キナーゼをほとんどすべての細胞機能の中心に進化させた、まさにその機能も、研究および理解することが不可能でないにしてもきわめて困難になっている。その重複タンパク質特異性、構造的および触媒的類似度、その数の多さ、高い速度によって、現在の遺伝子および生化学手法を用いてインビボタンパク質基質を特異的に同定することは、不可能でないにしても非常に困難になる。このことは今日、タンパク質キナーゼ仲介信号伝達に関与する信号カスケードを解読するための最大の障害となっている（４、６−８）。
【０００９】
信号伝達カスケードにおける特異的タンパク質キナーゼの関与を精細に調べる努力は、インビトロおよびインビボのタンパク質基質特性が見かけ上欠如しているために、無効になってきた（４、８）。タンパク質キナーゼの触媒領域は、領域交換実験によって証明されたように（１８−２３）、固有のタンパク質基質特異性をほとんどまたは全く持っていない。１個のタンパク質キナーゼによる触媒領域は、異なるタンパク質キナーゼのタンパク質基質特異性をわずかに変化させるだけで、そのタンパク質キナーゼと置換することができる（２２）。
【００１０】
キナーゼのインビトロ特異性が乏しいことも、所与のキナーゼにおけるインビボ機能の推定を不可能でないにしても困難にしている。興味のある単離タンパク質キナーゼは、多くの試験基質を等しい効率でリン酸化することが多い（２９）。この見かけ上乏しい基質特異性は、インビボでも見られる；たとえば、遺伝子ノックアウト実験などの多数の遺伝子的手法では、他の細胞タンパク質キナーゼの補償によって、解釈可能な表現型が与えられない（３０、３１）。
【００１１】
別の複雑な点は、多くのタンパク質キナーゼが、それ自体はタンパク質キナーゼである下流および上流のタンパク質をリン酸化すると計画されていたことである；このことは複雑で明確なフィードバックループを可能にしているように思われるが、カスケードの分析もさらに困難にする（１）。酵素のインビトロおよびインビボ両方の役割を解読し、機能を理解するための重要な手段は、特異的な酵素阻害剤を使用することである。タンパク質キナーゼ標的を独自に阻害する１個以上の化合物が発見できる場合、阻害剤を用いて酵素の活性を調節し、その減少効果を確認することができる。ゲノム手法全体は多くの標的を提供しているが、その機能は未知である。所与の新規キナーゼが好ましい標的であるかどうかを判断するための方法が多数開発されている。これらの方法は共通して、酵素を阻害する小型分子を欠いているため、混乱を引き起こすことがある。
【００１２】
たとえば、最も一般的に用いられている最新の手法は、キナーゼをノックアウトして、新しい表現型を見つけることである。通常、マウスゲノム（最も普通のモデル生体）の１個のキナーゼが欠落していると、教育的変化は起きない。これには２つの理由がある：１）胚発生時に遺伝子（キナーゼ）が不可欠であるため、出生前に致命性が引き起こされるため、または２）遺伝子が欠落して（ノックアウトされて）おり、その機能が、まだ存在している密接に関連するキナーゼによって置換可能であるため、のいずれかである。当業者に認識された手法と本明細書の発明との重要な相違点は、本明細書では興味のあるキナーゼの機能を阻害するために小型有機分子を使用していることである。なぜなら、キナーゼはいまだにインビボに存在しているが不活性であるため、生体に著しい変化を引き起こすことが可能なためである。最も重要なのは、その変化が野生種酵素の阻害剤が作成された場合に起きるものと全く同一であることである。
【００１３】
さらに、このような阻害剤は、最も重要な既知の製薬化合物に含まれる。たとえばアスピリン（アセチルサリチル酸）はこのような阻害剤である。アスピリンは、痛みの生成に関与するプロスタグランジンの合成の第一段階を触媒する酵素を阻害する（７２）。従来の薬剤発見は、疾病を引き起こすタンパク質に特異的に結合し、それを不活性化するよう設計された化合物の設計および修飾として特徴付けられる；そのような努力が比較的成功するかどうかは、標的タンパク質用の薬剤選択と、同様の酵素活性を持つ、疾病に関連していない酵素の阻害欠如によって変わる。ヒトの癌の多くは正常タンパク質の調節不能によって発生するため（たとえば、プロト癌遺伝子は遺伝子転座によって癌遺伝子に変換される）、このような手法は、癌の治療法を開発するための有望な方法であるように思われる。そしてキナーゼは主要な制御因子であるため、キナーゼがきわめて一般的なプロト癌遺伝子であることが判明し、このように理想的な薬剤設計標的であることがわかった。
【００１４】
選択的阻害剤設計のプロセスは、標的インビボにいくつかの同様の酵素が存在する場合、たとえば細菌に独自のタンパク質の阻害剤が標的にできる場合には比較的簡単である。しかしあいにく、キナーゼとその多数の類似性によって、特異的阻害剤の発見および設計はほぼ完全に無効となり、プロト癌遺伝子レベルを対象とした特異的な製薬治療を開発する望みもほぼ阻止された。候補阻害剤の大多数は、特定の精製されたキナーゼを阻害することが最初に確認された場合でも、複数のキナーゼを阻害することが予想される。
【００１５】
上述したこのような問題は、科学者らの単なる失敗をはるかに超える暗示を含んでいる；科学者らはキナーゼカスケードおよびこれらのカスケードならびに他の細胞機構における個々のキナーゼの機能を解読しようとする努力が無効となった。このようなキナーゼ活性および機能の理解は、ヒトの特定の疾病を効果的に治療、予防および矯正する前に不可欠である。たとえば、癌遺伝子ｂｃｒ−ａｂｌは、慢性骨髄性白血病の原因であるタンパク質キナーゼであることは３０年以上前から知られている；しかしｂｃｒ−ａｂｌが作用して発癌する生理基質は薬剤設計標的であるが、まだ明確に同定されていない（１１）。救われるのは、阻害剤ＣＧＰ  ５７１４８はこの欠点にもかかわらず、インビボのリン酸化を阻止する基質がわかっていないが、骨髄性白血病の治療に使用するための現在臨床試験が行われているそうである。
【００１６】
これらの問題における医学上の重要性は、発癌におけるキナーゼの役割を研究するための重要なモデル系となっている、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）によってさらに明らかにされる。繊維芽細胞のＲＳＶ形質転換は、ひとつのウイルス性遺伝子産物であるタンパク質キナーゼｖ−ｓｒｃによって制御される（３２）。これは迅速な時間経過であり、ＲＳＶをすべての細胞における発癌遺伝子活性研究の実例とした、ＲＳＶ繊維芽細胞形質転換中の劇的な形態学的変化である。ｖ−Ｓｒｃの起源（３３）、調節（３、８、３４、３５）および構造（２５、２７、３６）は広範に研究され、よく理解されている（８、３７、３８）。しかし集中的に研究されたキナーゼに関して中核をなす問題はまだ答えられていない：その直接細胞基質とは何か？その触媒活性の阻害は、形質転換を効果的に阻害あるいは反転さえするか？そのような阻害はＲＳＶ形質転換に対する有効な治療法または予防法となるか？残念ながら上述したように、これらの質問に対する回答は、主に細胞キナーゼの数が莫大である（哺乳類ゲノムの２％がタンパク質キナーゼをコード化すると見積もられている（４））という理由で、またタンパク質キナーゼが重複基質特異性（８、３９）を示し、触媒領域を共有することによって、特異的阻害剤の設計が非常に困難になっているため、すぐに得られるものではない。
【００１７】
これらの問題は困難であるが、合理的な薬剤設計および組合せ有機合成の新たな方法によって、キナーゼ特異的阻害剤の設計および発見が十分な資源を与えられ、実行可能となっている。しかしキナーゼネットワークは未知の方法で高度に変性し、相互接続されているため、キナーゼが阻害のために標的とされる多くの疾病に関して、かなりの不確実性がある。さらに、所与のキナーゼの特異的阻害剤が、インビトロまたはインビボのいずれかで疾病に対して何らかの効果があることは、まったく明らかになっていない。キナーゼは高度に乱交雑であるため、ひとつのキナーゼを阻害すると、容易に別のキナーゼが強制的に「それにとって代わる」可能性が大である。
【００１８】
本発明は、たとえばキナーゼやメチルトランスフェラーゼなどの、インビトロまたはすべての細胞におけるある設計酵素用の選択的小型分子阻害剤を迅速に生成できるようにするために、化学的および遺伝子的手法を組合わせる戦略（すなわち方法論）を提供する。本明細書で開示された本発明は、特異的点突然変異を使用して、ゲノム内の他の酵素では発生しない、興味のある酵素の基質結合ポケットまたは部位内に独特のポケットを作成する。次に設計酵素の特異的阻害剤は、新規活性部位ポケットに適合するよう設計されたかさ高い基を用いて酵素阻害剤を誘導体化することによって合成される。遺伝子操作を用いて独特の構造差を保存された酵素活性部位に導入することによって、本明細書で説明するような推定上の阻害剤の非常に小規模なパネル（１０個の化合物）より、高度に選択的な阻害剤を識別することができる。本発明の阻害剤は、生化学経路における酵素機能の研究はもちろんのこと、治療目的にも有用である。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、野生種酵素の触媒活性を阻害しないが、対応する突然変異酵素の同一の酵素活を、野生種酵素および突然変異酵素が機能的に同一である場合に阻害する、阻害剤を提供する。さらに詳細には、本発明の阻害剤は、ＩＣ50が約２００ｎＭ未満である突然変異酵素の触媒活性を阻害する。本発明はさらに、突然変異触媒を本発明の阻害剤と接触させることによって、突然変異酵素の触媒活性を阻害する方法を提供する。
【００２０】
本発明は、野生種酵素および野生種酵素の突然変異形が機能的に同一である場合に、野生種酵素を発現する細胞の成長を阻害せずに、野生種酵素の突然変異形を発現する細胞の成長を阻害する阻害剤を提供する。本発明によって提供される阻害剤の例は、これに限定されるわけではないが、タンパク質キナーゼ阻害剤、脂質キナーゼ阻害剤、アミノグリコシドキナーゼ阻害剤、メチルトランスフェラーゼ阻害剤などのトランスフェラーゼ阻害剤が挙げられる。本発明は、細胞を本発明の阻害剤に接触させることによって、突然変異酵素を発現する細胞の成長を阻害する方法も提供する。
【００２１】
本発明はさらに、以下の式Ｉで表されるタンパク質キナーゼ阻害剤を提供する：
【００２２】
【式２】
0004876239.tif 000002
【００２３】
ここで、Ｒは１’−ナフチル、２’−ナフチル；ｍ−フェノキシフェニル；ｍ−ベンジルオキシフェニル；ｍ−２’，６’−ジクロロ、ベンジルオキシフェニル；３’−ピペロニルピラゾロ；ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル；１’−ナフチルメチル；１’−ナフトキシメチル；または２’−ナフチルメチルである。さらに詳細には、本発明は、Ｒは１’−ナフチル、２’−ナフチルまたは１’−ナフチルメチル；２’−ナフチルメチルであるようなタンパク質キナーゼ阻害剤を提供する。本発明は、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を含む組成物も提供する。
【００２４】
本発明は、細胞を本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤に接触させることによって、Ｓｒｃ科の突然変異タンパク質キナーゼを発現する細胞における形質転換を中断させる方法を提供する。さらに詳細には、本発明は、細胞を本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤に接触させることによって、１３３８Ｇ  ｖ−ＳｒｃまたはＴ３３９Ｇ  Ｆｙｎを発現する細胞における形質転換を中断させる方法を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、細胞を本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を含む組成物に接触させることによって、Ｓｒｃ科の突然変異タンパク質キナーゼを発現する細胞における形質転換を中断させる方法を提供する。さらに詳細には、本発明は、細胞を本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を含む組成物に接触させることによって、１３３８Ｇ  ｖ−ＳｒｃまたはＴ３３９Ｇ  Ｆｙｎを発現する細胞における形質転換を中断させる方法を提供する。
【００２６】
本発明はまた、突然変異キナーゼおよびその基質を含む混合物を用いて本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を培養することによって、突然変異タンパク質キナーゼの基質のリン酸化を阻害する方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、本発明の阻害剤を用いて突然変異酵素を培養することによって、突然変異酵素の酵素活性を阻害する方法を提供する。
【００２８】
本発明はまた、本発明の阻害剤を用いて細胞を培養することによって、細胞の成長を阻害する方法を提供する。
【００２９】
本発明の方法で使用される突然変異タンパク質キナーゼとしては、以下にに限定されるわけではないが：i)突然変異ｖ−Ｓｒｃなどの、Ｓｒｃ科の突然変異タンパク質キナーゼ；ii)突然変異Ｆｙｎ；iii)突然変異ｃ−Ａｂｌ；iv)突然変異ＣＡＭＫ  ＩＩα；v)突然変異ＣＤＫ２；vi)突然変異Ｃｄｃ２８およびｖii)突然変異Ｆｕｓ３が挙げられる。本発明の方法で使用される突然変異タンパク質キナーゼの具体例としては、以下にに限定されるわけではないが:i)Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｃｉ；ii)Ｔ３３９Ｇ  Ｆｙｎ；iii)Ｔ３１５Ａ  Ａｂｌ；iv)Ｆ８９Ｇ  ＣＡＭＫ  ＩＩα；v)Ｆ８０Ｇ  ＣＤＫ２；vi)Ｃｄｃ２８−ａｓ１およびｖii)Ｆｕｓ−ａｓ１が挙げられる。
【００３０】
本発明はさらに、いかなる野生種のタンパク質キナーゼも阻害しない細胞透過性分子に対してタンパク質キナーゼを感作させる一般的な手法を提供する。この手法を用いると、推定上の阻害剤の２種類の構造階級による強力で特異的な阻害剤が、５種類の別個の亜科による７種類のタンパク質キナーゼに対して識別される。この手法は、タンパク質キナーゼの条件的対立遺伝子を系統的に生成するためにインビボで使用できる。
【００３１】
本発明は、細胞透過性阻害剤４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフチルメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（１−ＮＭ−ＰＰ１）に対して唯一感受性である、突然変異キナーゼのＣｄｃ２８−ａｓ１（類似体−特異的１）も提供する。ｃｄｃ２８−ａｓ１細胞において、有糸分裂の開始は低濃度の１−ＮＭ−ＰＰ１によって阻害されるが、温度感受性ｃｄｃ２８突然変異体で一般に見られるＧ１阻止を誘発するにはさらに高濃度の阻害剤が必要である。ゲノム規模の転写分析によって、ｃｄｃ２８−ａｓ１細胞の１−ＮＭ−ＰＰ１処置は、Ｇ２／Ｍ特異的遺伝子発現の阻害につながるが、野生種細胞の処置は著しい影響を及ぼさない。このように、類似体−特異的ｃｄｃ２８−ａｓ１突然変異体の生成は、細胞内のＣｄｃ２８活性を阻害する高度に特異的な方法を提供し、この方法が一般にタンパク質キナーゼの分析に利用できることを証明する。
【００３２】
【発明の実施の形態】
Ｉ．定義
バイオテクノロジーでは一般的であるが、本明細書における本発明の記述は、多数の当業用語を使用する必要がある。あまり徹底的に行うのは実際的でないが、これら用語の一部の定義を、参照しやすいようにここに示す。他の用語の定義も本明細書の別の箇所に現れるが、それらはここでは反復しない。ここまたは本明細書の別の箇所で定義した用語に、本分野で使用する場合にそれらの用語が持っていると当業者によって理解される以外の意味を与えるつもりでないこと注意することが重要である。したがって、これらの用語および本明細書の別の箇所で定義された用語の意味を解釈する場合に別の資料も調べることを推奨する。しかし、ここおよび本明細書の別の箇所で与える定義は常に、定義された用語の範囲および意味を決定する場合に考慮する必要がある。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「酵素」という用語は、多かれ少なかれ特異的に、１つ以上の（生）化学反応を触媒する、天然型または合成の全体または大部分がタンパク質で構成される巨大分子物質を意味する。酵素が作用する物質は、酵素が特異的結合すなわち「活性部位」を持つ「基質」として知られる。酵素は、筋繊維などの巨大分子構造および細胞内小胞などの多くの「積荷」にも作用できる。このようなタンパク質はモータータンパク質と呼ばれ、そのうちの２種類がミオシンとキネシンである。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「酵素の触媒活性」という用語は、酵素がアッセイシステムで生成する特定化学反応の変換速度の上昇によって評価される特性として定義される。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「キナーゼ」という用語は、リン酸基を伝達するホスホトランスフェラーゼ酵素を意味する。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「タンパク質キナーゼ」という用語は、タンパク質中の１個以上のヒドロキシルまたはフェノール基をリン酸化するすべての酵素を意味し、ＡＴＰはホルホリル基供与体である。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「ホスホリラーゼ」という用語は、グルカンから非還元末端グルコース残基の加リン酸分解除去を触媒するすべての酵素を意味する。
【００３８】
本明細書で使用されるように、「ホスホリラーゼキナーゼ」という用語は、「タンパク質ホスホリラーゼキナーゼ」という用語と同義語であり、ホスホリラーゼａをホスホリラーゼｂに変換するすべてのホスホリラーゼ酵素を意味する。
【００３９】
本明細書で使用されるように、「ホスホリラーゼホスフェターゼ」という用語は、ホスホリラーゼａをホスホリラーゼｂに変換するすべてのホスホリラーゼ酵素を意味する「タンパク質ホスホリラーゼホスフェターゼ」という用語と同義語である。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「チロシンキナーゼ」という用語は、「タンパク質チロシンキナーゼ」という用語と同義語であり、ＡＴＰの末端リン酸をその標的タンパク質の特異性チロシン残基に変換する酵素を意味する。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「トランスフェラーゼ」という用語は、基−たとえばメチル基、グリコシル基、アクチル基、リン酸含有、またはその他の基の伝達を触媒するすべての酵素を意味する。
【００４２】
本明細書で使用されるように、「メチルトランスフェラーゼ」という用語は、「トランスメチラーゼ」という用語と同義語であり、メチル基の伝達を触媒するすべての酵素を意味する。
【００４３】
「低親和性阻害剤」という用語は、標的酵素の結合定数（ＩＣ50）が約２００ｎＭより大きいため、細胞ベースまたは動物全体ベースのアッセイにおいて高濃度（５０μＭを超える濃度）で使用する必要のある小型分子を指す。このような高濃度は、阻害剤の望ましい標的の特異的役割をマスクできる非特異的薬剤効果を引き起こすことがある。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「突然変異特異的阻害剤」という用語は、特定の種類の突然変異酵素を阻害する阻害剤として定義される。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「単一特異的阻害剤」という用語は、単一の特定酵素のみと反応できる阻害剤を意味する。
【００４６】
「高親和性阻害剤」という用語は、標的酵素の結合定数（ＩＣ50）が約２００ｎＭ未満であるため、細胞ベースまたは動物全体ベースのアッセイにおいて低濃度（５０μＭ未満の濃度）で使用する必要のある小型分子を指す。低濃度において、小型分子の非特異的効果は低下するため、標的キナーゼの阻害に対するさらに正確な反応が評価できるようになる。
【００４７】
本明細書で使用される「直交の」という用語は、所与の酵素の天然基質まは前記酵素の野生種型の阻害剤に構造的および／または幾何級数的に類似している化合物であって、前記化合物が天然基質よりも酵素の野生種型に結合しにくくなる化学結合の相違がある化合物を意味する。「天然基質」とは、その酵素の野生種型によって使用される基質を意味する。本発明の直交阻害剤は、本明細書では異なる方法で呼ばれることがある；たとえば場合によっては「修飾基質」、「修飾阻害剤」、「類似体」、「誘導体」、単に「基質」または「阻害剤」などと、そしておそらく他の用語によっても同様に呼ばれる。しかし、各例において同じ意味を表している。もちろん「直交」およびその同義語の意味は、以下に与える本発明の記述でさらに説明する。
【００４８】
本明細書で述べる本発明の実施形態における推定上の直交基質および阻害剤は、既知のキナーゼ阻害剤における天然基質の原子にかさ高い置換基をそれぞれ加えることによって作成された。しかし、本発明はそれほど限定されていない。たとえば、天然基質に存在する１個以上の原子または置換基が欠失した類似体を調製することによって、既知の阻害剤または天然基質よりも小さい直交基質を作成することができる。そのような推定上の直交基質または阻害剤によって、野生種アミノ酸配列に見られるよりもかさ高い側鎖を持つ１個以上のアミノ酸を含むように酵素を突然変異させることができるため、直交基質または阻害剤が結合する場合、これらのさらにかさ高いアミノ酸側鎖は、欠失する原子または置換基によって作成された余分の空間を充填または部分的に充填する。このようにして、突然変異体が直交基質または阻害剤に結合したり、直交基質または阻害剤によって阻害されるが、通常の基質を実質的に利用しないことが予想される。なぜなら、付加したかさ高いアミノ酸はその結合に対して立体障害を示すためである。このような手法によって、生じる突然変異に対する高度な選択的制御が可能となる。
【００４９】
本明細書における実施形態の基質および阻害剤が非競合型であっても、これを本発明の範囲を制限するものとして見なすべきでないことに留意することが重要である。多くの異なる種類の酵素基質および阻害剤、たとえば競合性、非競合性、「自殺」阻害剤などが知られている。競合性阻害剤は、基質とその結合部位に関して競合するが、阻害剤は酵素が実施する酵素反応に関与できないため、触媒作用を減速する。非競合性阻害剤は活性部位に結合するが、次に酵素のタンパク質構造に除去されないように、共有的にまたはイオン的に結合する。このように反応から酵素の分子を完全に除去して、触媒作用を阻害する。これらおよび他の競合機構の詳細な説明は、各種資料に記載されている（たとえば７２）。このような機構に関する当業界の知識を、本発明の阻害剤の設計に応用することによって、このようなあらゆる種類の阻害剤を作成できる。
【００５０】
たとえば、結合は可能であるが、反応は不可能である類似体は競合的阻害を行い、結合時に酵素に共有結合する類似体は、非競合性阻害剤すなわち毒物である。このようなすべての種類の阻害剤は、本発明の範囲内である。
【００５１】
「相同的な」という用語は、１つの酵素を修飾する方法に関する情報を、他の関連酵素の３次元構造に関する情報から推論する方法について述べるために使用されてきた。周知の分野におけるそれらと同様に、第二の酵素の部分のある部分に関連する第一の酵素のある部分は、第二の酵素のタンパク質配列に関連するタンパク質配列を備えている。この関係は、相互に関連する同一の位置における多数のアミノ酸を持っているということである。たとえば、架空配列Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）と架空配列Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）は、同一の関連する位置に４個のアミノ酸を持ち、３個のアミノ酸は異なっており、相同的配列を持つと言われる。鎖間で異なる３個のアミノ酸は「保存的」相違であり、第一配列に対応する第二配列の置換は、側鎖に同一機能を備えているアミノ酸によるものであることに注意すること。たとえば、ＧｌｕおよびＡｒｇはどちらも荷電基を持ち、ＰｈｅおよびＩｌｅはどちらも疎水性である。このことは相同的タンパク質配列ではよくあることであるが、かならずしもそうでなくてもよく、このような２種類の架空配列は、相違が保存的でない場合でも相同的であると見なされる。参考文献７１は、当業者に「相同的である」と見なされる既知の領域に関して優れた概要を与えている。さらに、当業界は一般に同意しないかもしれないが、ここでは相互に同一である配列も、相互に「相同的」であると見なされるということを意図する。
【００５２】
「領域」という用語も当業者に周知の用語であり、特定の機能を備えていることが認識されているタンパク質内の領域を指す。たとえば、タンパク質キナーゼの３個の領域は本明細書の別の箇所で述べられており、その機能的役割について議論されている。キナーゼではよくあることだが、同一系統群の異なる酵素は、それぞれ同一の機能を及ぼす同数の領域を備え、タンパク質配列に沿って同じ順番で配列されることが多い（しかし、おそらく必ずというわけではない）。興味深いことに、キナーゼではよくあることだが、１個の酵素は、別の酵素とは、領域間のタンパク質配列の長さが異なっている。しかし、２個の関連する酵素は一般に（しかしおそらく必ずというわけではないが）相互に相同性であり、このことは一般に該当する領域の同定を阻害しない。
【００５３】
本発明のさらに幅広い態様の記述において、「多基質」または「多基質酵素」という用語が使用される。これらの用語は同義語であり、２個以上の基質に結合する酵素を意味する。本明細書で最も興味のあるこれらの多基質酵素は、少なくとも１個の基質の部分を少なくとも１個の他の基質に触媒作用的に結合させる酵素である。キナーゼおよびトランスフェラーゼは、このような多基質酵素の２つの系統群以外であるが、当業者は、他のこのような酵素および酵素系統群があることをただちに認識するであろう。
【００５４】
「認識する」という用語は本明細書において場合によっては、基質が酵素の活性部位に特異的に結合する能力を記述するために用いる。これは単に、酵素の基質（時には、基質誘導体あるいは基質を模倣する完全に異なる化合物でさえ）基質の活性部位に接触および結合するが、他の化合物は結合しないという事実を指す。この概念は当業者に周知である。酵素学者はしばしば、酵素は基質に対して親和性を持つ、あるいは基質は酵素に親和性を持つ、と言う。酵素学者はまた、酵素は「基質特異性」を持つと言い、これらは実際にすべて同一の現象のことを指している。
【００５５】
関連用語は「結合する」という用語である。阻害剤は一般に、１個以上の疎水性、親水性、水素および／またはイオン結合によって、あるいは非競合性阻害剤の場合は共有結合によって、活性部位に結合または付着する。阻害剤結合および阻害の理由に関する、当業界における複合知識は興味深いが、このような知識は本発明の知識に不可欠というわけではない。
【００５６】
阻害剤による結合は触媒作用反応を阻害することに注目するだけで十分である。
【００５７】
「突然変異体」および「設計型」という用語は本発明の酵素の記述に用いる場合、野生種酵素の配列と比較した場合に、１個以上の位置のアミノ酸が異なる配列を持つ酵素を意味する。このような突然変異体を記述する場合、数によって分離された２個の文字は生じたアミノ酸突然変異を示す。この文字は１文字アミノ酸コードであり、数は無傷の野生種酵素内のアミノ酸残基位置である。たとえばＧＳＴ−ＸＤ４は、野生種ｖ−Ｓｒｃの特異的部分をとしての同一配列を持つフラグメントＸＤ４を含む融合タンパク質である。ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）の表示において、競合的野生種ｖ−Ｓｒｃ配列における位置３２３を表すｖ−ＳｒｃフラグメントＸＤ４の配列におけるバリンはアラニンによって置換されており、完全野生種ｖ−Ｓｒｃ配列の位置３３８を示すＸＤ４フラグメントにおけるイソロイシンもアラニンによって置換されている。したがって、「突然変異体」および「設計型」という用語は、突然変異アミノ酸およびアミノ酸を含む野生種酵素の部分を含む。
【００５８】
「Ａ*ＴＰ」という用語は、追加原子または原子のグループがＡＴＰ構造の１個以上の位置に付加される、ある形式のＡＴＰを指す。さらに、１個以上の原子が除去され、ＡＴＰ自体より小さい分子を形成するＡ*ＴＰはＡＴＰの類似体を意味する。Ａ*ＴＰは必ずしもＡＴＰの非天然型類似体を意味しない。たとえば、ＧＴＰはこの定義では、ＡＴＰの類似体として見なすことができる。
【００５９】
「機能的沈黙活性部位突然変異」という用語は、突然変異がタンパク質の正常な細胞機能を中断しないことを意味する。言い換えれば、「機能的沈黙」突然変異体は完全に、または少なくとも著しく、野生種タンパク質の生物的役割に置き換わることが可能でなければならない。たとえば、タンパク質の野生種型がなく、酵素の「機能的沈黙」型が追加される細胞または生体が作成される場合、この「突然変異体を含む」細胞または生態は、細胞または生態の元の未修飾型に（なんらかの適切なアッセイによる）挙動が同一でないにしても非常に類似している必要がある。
【００６０】
ＩＩ．概要
本発明は、特異的タンパク質キナーゼ阻害剤を提供する。選択的タンパク質キナーゼ阻害剤は、細胞信号形質導入カスケードの研究用ツールとして非常に求められているが、キナーゼ触媒作用領域の高度な保存層によって、ほとんど発見されていない。小型分子合成およびタンパク質突然変異誘発の組合せによって、合理的に設計されたｖ−Ｓｒｃタンパク質キナーゼ（Ｉｌｅ３３８Ｇｌｙ  ｖ−Ｓｒｃ）の高い作用強度（ＩＣ50＝１．５ｎＭおよび独自の特異的阻害剤（４−アミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフチル）ピラゾロ６［３，４−ｄ］ピリミジン）が同定されている。この化合物の作用強度および特異性の両者が、既知のＳｒｃ科タンパク質キナーゼの作用強度および特異性を上回っている。前記分子は全細胞の設計ｖ−Ｓｒｃを強力に阻害するが、野生種タンパク質キナーゼのみを発現する細胞におけるチロシンリン酸化を阻害しない。さらに前記阻害剤は、標的ｖ−Ｓｒｃを発現する細胞における形質転換を選択的に阻害する。キナーゼ活性部位の構造退化によって、同一の相補的阻害剤／タンパク質設計戦略がこの酵素上科全体に適用可能となる。したがって、本発明は突然変異チロシンおよびｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼを提供する。
【００６１】
本発明は、開示された細胞透過阻害剤に対して感受性の突然変異タンパク質キナーゼを提供する。突然編タンパク質は、以下の亜科に属している：Ｓｒｃ科（ｖ−Ｓｒｃ）、Ａｂｌ系統群（ｃ−Ａｂｌ）、Ｃａ+2／カルモジュリン依存系統群（ＣＡＭＫＩＩα）、サイクリン依存系統群（ＣＤＫ２およびＣｄｃ２８）。
【００６２】
ＩＩＩ．タンパク質キナーゼ阻害剤
本発明は、以下の式Ｉによって表されるタンパク質キナーゼ阻害剤を提供する：
【００６３】
【式３】
0004876239.tif 000003
【００６４】
ここで、Ｒは１’−ナフチル、２’−ナフチル；ｍ−フェノキシフェニル；ｍ−ベンゾイルオキシフェニル；ｍ−２’，６’−ジクロロベンゾイルフェニル；３−ピペロニルピラゾロ；ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル；１’−ナフチルメチル；１’−ナフトキシメチル；または２’−ナフチルメチルである。
【００６５】
１つの実施形態において、ナフチルはナフチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ａによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ｂによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、ｍ−フェノキシフェニルは、ｍ−フェノキシフェニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｃによって表される。別の実施形態において、ｍ−ベンゾイルオキシフェニルは、ｍ−ベンゾイルオキシフェニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｄによって表される。別の実施形態において、ｍ−ジクロロベンゾイルオキシフェニルは、ｍ−ジクロロベンゾイルオキシフェニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｅによって表される。別の実施形態において、３−ピペロニルは３−ピペロニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｆによって表される。別の実施形態において、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルピラゾロピペリジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｇによって表される。別の実施形態において、ナフチルメチルはナフチルメチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｈによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図２４に示す式６ｊによって表される。別の実施形態において、ナフトキシエチルはナフトキシメチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図２４に示す式６ｉによって表される。
【００６６】
本発明はｓｒｃ系統群キナーゼ阻害剤を提供し、ここで阻害剤は以下のとおりである；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ａ）;
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（２’−ナフチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｂ）;
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｍ−フェノキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｃ）;
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｍ−ベンジロキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｄ）;
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｍ−（２’，６’−ジクロロ）ベンジロキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｅ）;
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−ピペロニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｆ）;
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｇ）;
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフチルメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｈ）;
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフトキシメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｉ）;
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（２’−ナフチルメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｊ）。
【００６７】
本明細書で示すように、すべての開始物質および合成試薬は別途記載しない限り、商業供給者より購入した。すぐに商業的に入手できなかった酸塩化物（３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｈ、３ｉ）は、該当するカルボン酸を過剰の塩化オキザリルおよび触媒ＤＭＦのジエチルエーテル溶液を用いた処理によって合成した。すべてのＰＰ１類似体は、Ｈｅｎｅｆｅｌｄらに従って合成した。修飾阻害剤のグループは、細菌中で発現され、グルタチオニン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として精製した標的キナーゼ、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの触媒作用領域に対してスクリーニングした。すべてのＣ3誘導体化類似体は、Ｎ4誘導体化化合物の第一世代パネル（図１５を参照）から同定された最も強力な分子（化合物３ｇ、ＩＣ50＝４３０ｎＭ、図１５）よりも、さらに強力なＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの阻害剤である。４個の分子（６ａ、６ｂ、６ｄ、６ｈ）は、最大作用強度（ＩＣ50＝１．５ｎＭ）を示す２個のナフチル異性体（６ａ、６ｂ）を用いて、標的キナーゼを低いｎＭ濃度で阻害する。
【００６８】
我々のアッセイの条件化では、親分子ＰＰ１は最適標的ＦｙｎをわずかＩＣ50＝３０ｎＭで阻害した。このデータは、酵素工学と定方向小型分子合成を組合わせる阻害剤設計戦略は、大型ライブラリのスクリーニングによって同定された分子の作用強度に適合するだけでなく、野生種キナーゼの以前最適化された阻害剤を越える親和性の著しい向上（６ａ、６ｂの場合は２０倍）につながる。式６ａおよび６ｂを持つ化合物は、今日までに報告されているＳｒｃ科タンパク質キナーゼの最も強力な阻害剤である。化合物６ｈおよび６ｊは、野生種キナーゼに対してさらに直交であり、中程度の作用強度である。これらは６ａおよび６ｂほど強力ではないが、野生種キナーゼにごくわずかしか結合しないため、突然変異キナーゼの阻害に結局のところたいへん有用である。
【００６９】
本発明は、以下の式Ｉで表現されるタンパク質キナーゼ阻害剤を含む製薬化合物を提供する：
【００７０】
【式４】
0004876239.tif 000004
【００７１】
ここで、Ｒは１’−ナフチル、２’−ナフチル；ｍ−フェノキシフェニル；ｍ−ベンゾイルオキシフェニル；ｍ−２’，６’−ジクロロベンゾイルフェニル；３−ピペロニルピラゾロ；ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル；１’−ナフチルメチル；１’−ナフトキシメチル；または２’−ナフチルメチルおよび適切な希釈剤または担体である。
【００７２】
１つの実施形態において、ナフチルはナフチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ａによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ｂによって表される。タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｃによって表される。別の実施形態において、ｍ−ベンゾイルオキシフェニルは、ｍ−ベンゾイルオキシフェニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ｄによって表される。別の実施形態において、ｍ−ジクロロベンゾイルオキシフェニルは、ｍ−ジクロロベンゾイルオキシフェニルピラゾロピリミジンである。図１８に示す式６ｅによって表される。別の実施形態において、３−ピペロニルは３−ピペロニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｆによって表される。別の実施形態において、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルピラゾロピペリジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は図１８に示す式６ｇによって表される。別の実施形態において、ナフチルメチルはナフチルメチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｈによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図２４に示す式６ｊによって表される。別の実施形態において、ナフトキシエチルはナフトキシメチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図２０に示す式６ｉによって表される。
【００７３】
本発明は、ｓｒｃ系統群キナーゼ阻害剤を含む製薬組成物を提供し、ここで阻害剤は以下のとおりである；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ａ）；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（２’−ナフチル）ピラゾロ［３，４−  ｄ］ピリミジン  （６ｂ）；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｍ−フェノキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｃ）；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｍ−ベンジロキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｄ；）
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｍ−（２’，６’−ジクロロ）ベンジロキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｅ）；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−ピペロニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｆ）；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｇ）；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフチルメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｈ）；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフトキシメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｉ）；
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（２’−ナフチルメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  （６ｊ）；および適切な担体または希釈剤。
【００７４】
本発明は、細胞を以下の式Ｉで表現されるタンパク質キナーゼ阻害剤に接触させることを含む、標的突然変異体ｖ−Ｓｒｃを発現する細胞における形質転換を阻害する方法を提供する：
【００７５】
【式５】
0004876239.tif 000005
【００７６】
ここで、Ｒは１’−ナフチル、２’−ナフチル；ｍ−フェノキシフェニル；ｍ−ベンゾイルオキシフェニル；ｍ−２’，６’−ジクロロベンゾイルフェニル；３−ピペロニルピラゾロ；ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル；１’−ナフチルメチル；１’−ナフトキシメチル；または２’−ナフチルメチルである。
【００７７】
１つの実施形態において、ナフチルはナフチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ａによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ｂによって表される。別の実施形態において、ｍ−フェノキシフェニルは、ｍ−フェノキシフェニルピラゾロピリミジンである。タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｃによって表される。別の実施形態において、ｍ−ベンジルオキシフェニルは、ｍ−ベンジルオキシフェニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｄによって表される。別の実施形態において、ｍ−ジクロロベンジルオキシフェニルは、ｍ−ジクロロベンジルオキシフェニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、３−ピペロニルは３−ピペロニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｆによって表される。別の実施形態において、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルピラゾロピペリジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｇによって表される。別の実施形態において、ナフチルメチルはナフチルメチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｈによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図２４に示す式６ｊによって表される。別の実施形態において、ナフトキシエチルはナフトキシメチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｉによって表される。
【００７８】
本発明は、細胞を以下の式Ｉによって表されるタンパク質キナーゼ阻害剤を含む製薬組成物に接触させることを含む、標的突然変異ｖ−Ｓｒｃを発現する細胞における形質転換を阻害する方法を提供する：
【００７９】
【式６】
0004876239.tif 000006
【００８０】
ここで、Ｒは１’−ナフチル、２’−ナフチル；ｍ−フェノキシフェニル；ｍ−ベンゾイルオキシフェニル；ｍ−２’，６’−ジクロロベンゾイルフェニル；３−ピペロニルピラゾロ；ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル；１’−ナフチルメチル；１’−ナフトキシメチル；または２’−ナフチルメチルおよび適切な希釈剤または担体である。
【００８１】
１つの実施形態において、ナフチルはナフチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ａによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ｂによって表される。別の実施形態において、ｍ−フェノキシフェニルは、ｍ−フェノキシフェニルピラゾロピリミジンである。タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｃによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示した式６ｄによって表される。別の実施形態において、ｍ−ジクロロベンゾイルオキシフェニルは、ｍ−ジクロロベンゾイルオキシフェニルピラゾロピリミジンである。図１８に示す式６ｅによって表される。別の実施形態において、３−ピペロニルは３−ピペロニルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｆによって表される。別の実施形態において、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルピラゾロピペリジンである。図１８に示す式６ｇによって表される。別の実施形態において、ナフチルメチルはナフチルメチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｈによって表される。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図２４に示す式６ｊによって表される。別の実施形態において、ナフトキシエチルはナフトキシメチルピラゾロピリミジンである。別の実施形態において、タンパク質キナーゼ阻害剤は、図１８に示す式６ｉによって表される。
【００８２】
本明細書で示すように、６ａによって処理される野生種ｖ−Ｓｒｃ発現細胞は、未処理野生種細胞と見分けがつかないように思われ、６ａはこの非突然変異細胞系に何の影響も及ぼさないことを示唆している。しかし、標的キナーゼを発現する細胞は、透明アクチン繊維を持ち、２５０ｎＭ  ６ａで１６時間培養した場合には、正常なＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞と見分けられないように思われる。このデータより、ｖ−Ｓｒｃの触媒作用活性の小型分子阻害は、発癌におけるその役割を阻止するのに十分である。
【００８３】
式Ｉによって表される化合物の低級アルキル基は、１−６個の炭素原子を含む、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルおよびその該当する分岐鎖異性体が含まれる。これらの基は随意に１個以上のハロヒドロキシ、アミノ、または低級アミノ基によって置換される。フェニルまたはアリル環と置換される可能性がある場合は、置換基の位置は、フェニルまたはアリル環がヒドラジン基の窒素に結合点に対してオルト、メタ、パラとなる場合がある。置換基は結合点に対してパラかメタであることが好ましく、同一の環に１個以上の置換基が存在する場合は、パラおよびメタ位であることが好ましい。上の式中のハロ原子は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードである。低級アルキル基は１−６個、好ましくは１−３個の炭素原子を含み、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシなどによって例示される。さらに本明細書で検討されるように、ｔ−ブチル基は上記のどれかによって置換または修飾できる。
【００８４】
本発明の化合物としては、青、赤、緑、黄色の範囲の、特に青と緑色の蛍光染料などの、標識またはマーカーが挙げられる。蛍光色は、吸収色とは異なることがある。蛍光色素は高い発光を示し、たとえば高度の耐光性および低い移動傾向などの有利な応用特性を持つ。蛍光特性を備えていることによってさらに、本発明の化合物を多様な医療、製薬および診断用途に使用することができる。本発明の化合物を利用して、各種治療用薬剤に標識付けし、体内に配置することもできる。そのような場合、このように標識付けした治療用薬剤による治療は、標的器官および組織について綿密に監視することができる。このことは、化学治療薬剤の局在化が極めて重要であり、副作用の可能性による用量を綿密に監視しなければならない、各種の癌、特に固形腫瘍型の癌の治療にとりわけ有用である。
【００８５】
本発明の阻害剤は、ピラゾロピリミジンの系統群に属する。ピラゾロピリミジンは喘息に代表される呼吸器系統の疾病の治療および予防に有用である（米国特許第５，９４２，５１５号）。さらにアミノ−ピラゾロピリミジン誘導体は、タンパク質キナーゼ阻害剤として細胞増殖の阻害に使用されており、そのため腫瘍および過増殖性疾病の治療に有用である（ＷＯ  ９６３１５１０）。阻害剤の系統群も、心血管および泌尿生殖器疾病の治療（ＤＥ  １９７０９１２６Ａ）および虚血、関節炎および痛み（ＷＯ  ９６４０７０７）の治療に有用であることが示されている。したがって、本発明の阻害剤は治療用途があることも予想される。
【００８６】
さらに本発明は、別のタンパク質キナーゼを同時に阻害せずに、ひとつのタンパク質キナーゼを特異的に阻害するための物質および方法を提供することによって、上述の問題の解決策を提供する。
【００８７】
ＩＶ．設計キナーゼおよび設計多基質酵素
第一の態様において、本発明は、酵素がその野生種型によってただちに使用できない修飾基質を利用できる、キナーゼおよび他の多基質酵素の設計を含む。本発明はさらに、このような化学修飾ヌクレオチド三リン酸基質、その作成方法、その使用方法を提供する。本発明の方法は、キナーゼが作用するタンパク質基質を確認し、そのような作用の程度を測定し、試験化合物がそのような作用を調節できるかどうかを判定するために、修飾基質を設計キナーゼとともに使用する方法を含む。
【００８８】
別の態様において、本発明は、設計タンパク質キナーゼであって、それらの酵素の野生種によってただちに結合されないような阻害剤を結合可能な設計タンパク質キナーゼを提供する。このような設計キナーゼすべての作成および使用方法も提供する。本発明はさらに、このような阻害剤、その作成方法およびその使用方法を提供する。本発明の方法は、キナーゼが作用するタンパク質基質を確認し、そのような作用の程度を測定し、そのような阻害の生化学および細胞効果を決定するために、修飾基質を設計キナーゼとともに使用する方法を含む。これらは、疾病に関与するキナーゼを明らかにするために、そのような阻害剤および設計キナーゼを使用することにも関する；次に、これらのキナーゼは、その野生種型のさらに伝統的な特異的阻害剤を設計および発見する努力へのテーマとなり、このことはキナーゼ関連疾病または障害の治療に有用であることが明らかになるであろう。
【００８９】
さらに、好ましくは該当する野生種キナーゼの代わりに、設計キナーゼを細胞または動物全体に挿入し、次に疾病−キナーゼ関係の研究のためのツールとして、そして最終的に疾病を治療する薬剤として採用された阻害剤を使用する方法を提供する。
【００９０】
本発明は、さらに一般的には、少なくとも１つの（供与体）基質の一部または全体を他の（受容体）基質に共有結合させる多基質酵素の設計型にも関する。これらの設計型は、これらの酵素の野生型によってただちに結合されない修飾基質および阻害剤を受容する。
【００９１】
本発明は、そのような設計酵素はもちろんのこと修飾供与体基質の作成および使用方法にも関する。本発明の方法は、キナーゼが作用するタンパク質基質を確認し、そのような作用の動態を測定し、受容体基質が結合する供与体基質の一部または全部を確認し、そのような作用の程度を測定し、試験化合物によってその調整程度を確認および測定するために、修飾基質および阻害剤を設計酵素とともに使用する方法を含む。
【００９２】
阻害剤の例では、前記方法はこのような阻害の生化学および細胞効果を決定しようと努める。前記方法は、このような阻害剤および設計酵素を、疾病に関与する酵素を明らかにするためにも使用する；次にこれらの酵素は、その野生種型の特異的阻害剤を設計および発見する努力へのテーマとなり、このことは酵素関連疾病または障害の治療に有用であることが明らかになるであろう。さらに、好ましくは該当する野生種酵素の代わりに、設計酵素を細胞または動物全体に挿入し、次に疾病−酵素関係の研究のためのツールとして、そして最終的に疾病を治療する薬剤として採用された阻害剤を使用する方法を提供する。
【００９３】
本発明に従い、酵素工学を通じて、興味のあるタンパク質キナーゼのヌクレオチド結合部位と他のキナーゼのヌクレオチド結合部位の構造を区別することができる。この区別によって、設計キナーゼが、そのキナーゼの野生種型または他のキナーゼによってただちに結合されないヌクレオチド三リン酸または阻害剤を使用できるようにする。阻害剤に関する好ましい実施形態において、使用する阻害剤は、そのキナーゼの「天然」ヌクレオチド三リン酸基質に対して「直交」であるか、特異性の低い阻害剤（たとえば、そのキナーゼの野生種型によってただちに結合される阻害剤）に対して直交である阻害剤である。「直交の」という用語は、上述したように、基質または阻害剤は、構造が類似しているが（下記のように、幾何学的に類似しているが、化学的に類似していない基質または阻害剤）、野生種型に結合する能力を制限する方法が異なることを意味する。
【００９４】
Ｖ．直交ヌクレオチド三リン酸
本発明によって作成された設計キナーゼは、細胞内に存在する他の、非設計キナーゼがただちに使用できない直交ヌクレオチド三リン酸基質を使用することができる。他のキナーゼが実質的に使用しない直交ヌクレオチド三リン酸を使用できることが好ましく；そして、他のキナーゼによって全く使用できないヌクレオチド三リン酸を使用できることが全く好ましい。たとえば、放射性リン（Ｐ32）によって、直交基質にリン酸を標識付けし、次にその標識化基質を透過化処理細胞または細胞抽出物に結合させることによって、設計キナーゼのタンパク質基質は標識されるようになり、一方、他のキナーゼのタンパク質基質は少なくとも、さらに少ない程度に標識される；他のキナーゼのタンパク質基質は実質的に標識されないことが好ましく、それらが全く標識されないことが最も好ましい。
【００９５】
以下で述べる詳細な説明および実施例は、原型タンパク質キナーゼ、ｖ−Ｓｒｃの直接基質を独自にタグ付けする、この戦略の使用について述べている。タンパク質工学によって、修飾ｖ−Ｓｒｃヌクレオチド結合部位および他のすべてのキナーゼのヌクレオチド結合部位の間の構造区別を与える、アミノ酸配列における化学的相違が作成されている。ｖ−Ｓｒｃキナーゼは、野生種キナーゼにヌクレオチド基質に対して直交である、ＡＴＰ類似体（Ａ*ＴＰ）、Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰを識別するよう設計された。直交Ａ*ＴＰ基質に対して特異性を持つｖ−Ｓｒｃ突然変異体の精製によって、ｖ−Ｓｒｃの直接基質が、［ｙ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰを用いて一意に放射線標識できるようになる。なぜなら、設計ｖ−Ｓｒｃキナーゼに対する基質として作用することが可能であるが、他の細胞キナーゼの基質として作用することが実質的に不可能だからである。
【００９６】
以下で述べる詳細な説明および実施例は、原型タンパク質キナーゼ、ｖ−Ｓｒｃの直接基質を独自に識別するこの戦略の使用について説明する。タンパク質工学によって、修飾ｖ−Ｓｒｃヌクレオチド結合部位および他のすべてのキナーゼのヌクレオチド結合部位の間の新しい構造区別を与える、アミノ酸配列における化学的相違が作成されている。本明細書で作成および提示された設計ｖ−Ｓｒｃキナーゼは、さらに一般的なキナーゼ阻害剤ＰＰ３の直交類似体：化合物Ｎ−４シクロペンチルＰＰ３（図１１Ａ）に結合する。このような阻害剤に対する特異性を持つｖ−Ｓｒｃ突然変異体の世代によって、突然変異体は阻害されるが、同じ試験系の他のキナーゼは、その同一キナーゼの野生種型でも、実質的に阻害されない。
【００９７】
ＶＩ．突然変異体タンパク質キナーゼ
前記から明らかなように、本発明の１つの目的は、リン酸供与体基質として直交ヌクレオチド三リン酸類似体を受容する突然変異体タンパク質キナーゼを提供することである。本発明の別の目的は、そのような突然変異体タンパク質キナーゼをコード化するヌクレオチド配列を提供することである；そして、また別の目的は、そのような核酸配列を生成する方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、そのような突然変異体タンパク質キナーゼを、たとえばそのような核酸配列を発現することによって、生成する方法を提供することである。Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰ、Ｎ6（シクロペンチロキシ）ＡＴＰ、Ｎ6−（シクロヘキシル）ＡＴＰ、Ｎ6−（シクロヘキシロキシ）ＡＴＰ、Ｎ6−（ベンジル）ＡＴＰ、Ｎ6−（ベンジロキシ）ＡＴＰ、Ｎ6−（ピロリジノ）ＡＴＰ、Ｎ6−（ピペリジノ）ＡＴＰ、そのような直交ヌクレオチド三リン酸塩およびその合成方法を提供することである（２７）。
【００９８】
本発明のまた別の目的は、試験化合物が１個以上のタンパク質基質に関してタンパク質キナーゼの活性をポジティブまたはネガティブに調整するかどうかを決定する方法を提供する。さらに詳細には、本発明のさらなる態様に従って、主な目的は、突然変異体を提供することであり、阻害剤によって阻害され、阻害剤は該当する野生種キナーゼへの即時の結合、または野生種キナーゼへの阻害は低下する。
【００９９】
本発明の別の目的は、このような突然変異体タンパク質キナーゼをコード化するヌクレオチド配列を提供することである；別の目的は、そのような核酸配列を生成する方法を提供することである。また別の目的は、たとえば、そのような核酸配列を発現することによって、そのような突然変異体タンパク質キナーゼを生成する方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、化合物Ｎ−４シクロペンチルＰＰ３などの阻害剤、およびその合成方法を提供することである。別の目的は、所与のタンパク質キナーゼの基質を判定する方法を提供することである。また本発明の別の目的は、特定のキナーゼの特異的阻害が、細胞を含まない抽出物、細胞培養物、または生存多細胞生体などの試験系において生化学または表現型効果を生成するかどうかを判定することである。本発明のまた別の目的は、特定のキナーゼの阻害が疾病の治療において治療的価値を持つかどうかを判定することである。さらにまた別の目的は、本発明の該当する突然変異体の阻害を研究することによる、キナーゼの活性、動態および触媒作用機構の研究方法を提供することである。別の目的は、本発明の阻害剤適合突然変異体キナーゼを疾病にかかった生体に導入することにより、好ましくは野生種酵素の生体を減少させることにより、さらに好ましくは、疾病の原因または症状を縮小または除去できるように、現在の疾病仲介突然変異体キナーゼの活性を調節するために、野生種酵素の生体を除去し、次に阻害剤を投与することにより、キナーゼ仲介疾病を予防および治療する方法を提供することである。
【０１００】
ＶＩＩ．多基質酵素
本発明の前の説明、および以下に示す詳細な説明に基づき、当業者は、本発明が、キナーゼと同様に、供与体基質またはその一部を受容体基質に共有結合的に伝達する多基質酵素と、２種類の基質を結合しない、または基を伝達しない酵素を研究するために、一般に使用できることを認識するであろう。本発明のこのような用途は、以下の詳細な説明にさらに記述する。したがって、本発明の別の目的は、阻害剤に結合する突然変異体多基質酵素を提供することであり、前記阻害剤は、野生種酵素または同様の活性を持つ他の酵素にただちに結合しにくい。
【０１０１】
本発明の別の目的は、このような突然変異体多基質酵素をコード化するヌクレオチド配列を提供することである；そしてまた別の目的は、このような核酸配列を生成する方法を提供することである。本発明の別の目的は、そのような突然変異体多基質酵素を、たとえばそのような核酸基質を発現することによって生成することである。本発明のまた別の目的は、そのような阻害剤およびその合成方法を提供することである。別の目的は、所与の多基質酵素の基質を判定する方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、特定の多基質酵素の特異的阻害が、細胞を含まない抽出物、細胞培養物または多細胞生体などの試験系において生化学または表現型効果を生成するかどうかを判定する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、特定の多基質酵素の阻害が疾病治療に治療的価値を持つかどうかを判定することである。
【０１０２】
本発明は、野生種がただちに結合しない阻害剤によって結合されるようになる、キナーゼおよび他の多基質酵素の設計を含む。それらに結合可能な修飾基質および突然変異体酵素は、伸展因子（４１）およびサイクロフィリンＡ（４２）の研究に使用されている。しかし、本発明の前に、供与体基質の一部または全体を受容体基質に結合させる多基質酵素を、阻害剤がない場合に受容体基質に対して少なくともある程度の触媒活性と少なくともある程度の特異性を維持しながら、阻害剤に結合するように設計する方法は、たとえあったとしても、知られていなかった。本発明は、以下で説明するようにこれが可能であるということである；そして本発明は初めて、個々のキナーゼの選択的阻害に便宜を与えた。これらのキナーゼは、キナーゼカスケードおよび複雑な触媒細胞機構を理解するための重要なツールであるだけでなく、これらの機構が効果を示す疾病における治療的介入に到達手段も提供する。
【０１０３】
また別の目的は、本発明の該当する突然変異体の阻害を研究することによって、活性、動態および触媒作用機構の研究方法を提供することである。さらに別の目的は、本発明の阻害剤適合多基質酵素を疾病にかかった生体に導入し、野生種酵素の生体を好ましくは減少させ、最も好ましくは除去することによって；そして、疾病の原因または症状を減少または除去できるように、現在の疾病仲介突然変異体酵素を調節するために阻害剤を投与することによって、多基質酵素仲介疾病を予防および治療する方法を提供することである。
【０１０４】
上述したように、本発明は突然変異体キナーゼ、直交阻害剤およびその合成ならびに使用に限定されない。本発明は、ここでは供与体と呼ばれる１つの基質の一部または全部を、ここでは受容体と呼ばれる別の基質に共有結合的に伝達する他の多基質酵素に対しても同様に働く；そしてやがて発見されるそのような酵素が確かに存在する。そのような場合、本明細書について研究した当業者は、本発明をそのような酵素に応用できることを認識するであろう。そのような例における手近な課題は、キナーゼに関して本明細書で述べた課題に非常に類似している。最初に、供与体基質がどのようなものであるかを確認し、および／またはそのキナーゼを阻害できる化合物を、たとえそのキナーゼに対して特異的でなくても、識別することが必要である。
【０１０５】
第二に、かさ高い置換基を、野生種キナーゼにただちに結合しないように、あるいは好ましくは野生種キナーゼに実質的に結合しないように、そして好ましくは全く結合しないように、阻害剤基質に結合させる場合を考慮する必要がある。もちろん、上述したようにキナーゼまたは他の多基質酵素の場合は、これらのどの類似体を作成するかという点に関して制限する必要は実際にない；理想的でないように思えるものも含めて、各種の類似体を作成可能であり、どれが最良であるかをスクリーニングによって決定することができる。これを行う方法に関する詳細な指針は、以下の実施形態より得られる。阻害アッセイ、図６に示したその結果は、そのようなスクリーニングに特に適したアッセイの非限定的な例である。
【０１０６】
第三段階は、類似体が結合した場合にかさ高い基があると予想される三次元位置にある１個以上のアミノ酸が、よりかさ高くない側鎖を持つアミノ酸と置換されたために、阻害剤のかさ高い部分に「空間を作る」ように、キナーゼを設計することである。第二段階および第三段階はもちろん、逆の順番で実施することができる。
【０１０７】
たとえば、トランスフェラーゼ酵素は、本発明を用いた研究の最も興味深い候補である。本明細書の教示に従って、直交阻害剤を受容する突然変異体トランスフェラーゼを調製することができ、これらは相同性トランスフェラーゼの大型系統群における１つの特定のトランスフェラーゼの直接基質を識別するために、キナーゼに関して上述した方法によって、ともに使用することができる。メチルトランスフェラーゼの系統群は、明らかに興味深く、本明細書で与えた方法を使用してかなり容易に研究できる。これらの酵素はすべて、同一ヌクレオチドベースの補助因子、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）をメチル（ＣＨ３）基供与体として使用する。系統群の各種構成要素は、ＡｄｏＭｅｔのメチル基を、タンパク質（この場合、メチル基がアルギニン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩の側鎖に結合する）、ＤＮＡ（この場合、メチル基がシトシンのＣ−５位置か、グアニンのＮ−７位置に結合する）などの幅広い細胞成分、リン脂質などの細胞膜成分の成分、またホルモンを含む多数の小型アミンにもに伝達することができる。このように多様な系統群の酵素に対して、新たな標的も多数識別されている。本発明は、これらの酵素が実行する、著しく複雑な細胞機構を解読する機会を与える。
【０１０８】
たとえば、かさ高い疎水性基をさらにＮ−６位置または他の環位置に含む一連のＡｄｏＭｅｔ類似体を合成できる。これによって直交類似体が作成され、このように野生種メチルトランスフェラーゼによって、天然基質のようにただちには受容されない；伝達されたメチル基の構造ｉｎｔ  ｅｈ領域は、メチル基が伝達に対してされに化学的耐性を持つように改変される；あるいは、たとえば、Ｓ−アデノシルシステインは、代わりに開始物質として使用されることがある。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａｌおよびカテコールメチルトランスフェラーゼのカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）の結晶構造を使用して、タンパク質キナーゼに対して本明細書で実施されたような、突然変異の候補であるアデニン結合ポケットのこれらのアミノ酸を同定することができる；当業者は、１個以上の直交基質のかさ高い疎水性基を調節するために、一連の残基をただちに同定できるであろう。
【０１０９】
たとえば、大型の疎水性基をより小さいアラニンまたはグリシン残基に突然変異させたり、水素結合アミノ酸を、ＡｄｏＭｅｔの直交プリン類似体に適合する他のアミノ酸と置換することがある。もちろん他の多数の考えられる突然変異も同様に鎖吉、すべて本発明の範囲内である。さらに、メチルトランスフェラーゼの配列アラインメントおよび結晶構造から、メチルトランスフェラーゼが触媒作用領域構造（７０）を共通して備えていることが知られている；そのためこの手法は、Ｍ．ＨｈａｌおよびＣＯＭＴに限定されないが、他のメチルトランスフェラーゼにも等しく適用可能なことが必要である。
【０１１０】
直交阻害剤を受容するメチルトランスフェラーゼ突然変異体が同定された後、ＡｄｏＭｅｔの硫黄原子に結合したＣ−１４標識メチル基を含む次に放射線標識されたＡｄｏＭｅｔが合成可能である。この放射線標識類似体を、１個のメチルトランスフェラーゼを発現する細胞に結合させると、サンプル中のすべてのメチルトランスフェラーゼの直接基質（たとえばタンパク質、ＤＮＡまたはポリアミン）は、Ｃ−１４メチル基によって特異的に放射線標識される。しかし、これが直交阻害剤の存在時に行われると、興味のあるメチルトランスフェラーゼの特異的基質は、阻害剤を含まないサンプルと比較して、あまり標識されない；実質的に標識されないことが好ましく、全く標識されないことが最も好ましい。このようにして、またはキナーゼ研究のために本明細書に記載された他の方法を使用することによって、癌、胚発生、多形態核白血球の走化性、または神経障害において重要な、メチルトランスフェラーゼの直接基質が同定できる。さらに、本発明の方法は次に、酵素活性を調節する化合物が同定可能かどうかを判定するために使用できる。本発明の他の複数の態様は、おそらく本明細書に述べられているが、メチルトランスフェラーゼにも適用可能であり、他の多基質酵素にも適用可能である。
【０１１１】
本発明のメチルトランスフェラーゼへの適用を以前述べたことは、本発明の範囲を限定するものではないが、本発明をタンパク質キナーゼ以外の多基質酵素への本発明の適用性を例示することである。当業者に認識されるように、本発明は同様の手法を用いて他の多基質酵素に同様に適用できる。
【０１１２】
以下の実施例に述べるように、ペプチドおよびタンパク質を含むチロシンに対する野生種特異性を維持しながら、合成阻害剤に対する高い特異性を示すｖ−Ｓｒｃの有用性が、本発明を用いて証明および実施されたため、当初の研究目標が満足された。キナーゼ上科のＡＴＰ結合部位の高度な保存特性と他のタンパク質キナーゼによる構造情報の可用性を利用することによって、ｖ−Ｓｒｃの新たな阻害特異性が、ｖ−Ｓｒｃ自体に関する詳細な構造情報なしで設計された。無関係のキナーゼを、ｖ−Ｓｒｃの直接細胞基質に結合する直交ＡＴＰ類似体を設計するための青写真として使用し、同様の起源から阻害剤を調製したことは、この手法が他のキナーゼにも同様に作用することを証明している。
【０１１３】
ＶＩＩＩ．修飾された阻害剤および基質
本発明によって検討する阻害剤は、このキナーゼおよび他のキナーゼの他の有用な突然変異体の開発を目指した研究において、および本明細書の他の箇所で述べられている複数の方法に対して有用である。しかし本発明の範囲は、これらの特定の阻害剤の使用に限定されず、当業者は、他の考えられる構造が本明細書で述べた構造と置換されるか、構造を補足することを認識するであろう。たとえば各種のより単純か、さらに複雑な脂肪族または芳香族基をＡＤＰのＮ6位置か、ＰＰ３のＮ4位置に結合させることができる。さらに、本発明の阻害剤は、Ｎ6位置のヌクレオチドの変更またはＮ4位置のＰＰ３の変更に限定されない。このような化合物の各種位置を変更する化学的手段が知られており、生じた誘導体はすべて本発明の範囲に含まれる；その環構造に変更や置換を行うことさえ可能である。本明細書に例示的な変異形を示しており、類似体およびその活性に関するデータの両方を示した図１２を特に参照すること。もちろん、このような阻害剤を使用すると、それらに結合する設計キナーゼを作成するために、キナーゼのタンパク質配列における各種位置の変更が必要になることがあるが、そのような各種変更も本説明の範囲に十分含まれる。
【０１１４】
さらに、本発明の阻害剤がＡＤＰおよびＰＰ３誘導体に限定されないことに注目することが重要である。たとえば、他の天然ヌクレオチドリン酸供与体基質の誘導体をそのような阻害剤として利用することも可能である必要がある。あるキナーゼを研究するために、実際には各種類似体基材が好ましい。たとえば、アルキナーゼはＧＴＰをリン酸供与体基質およびエネルギー源として利用する；阻害剤をそのようなキナーゼの設計形にするためには、グアノシンニリン酸が適している。さらに、関連化合物（たとえば他の基材）および天然基質にたいして化学的に無関係な化合物は場合によって、それでも活性部位に結合し、酵素による化学触媒作用を通じて他の基質に作用させられる、または作用することが可能である（しかし本発明の目的のためには、その必要はない）。天然基質と同様に触媒化反応に関与することもあり、別の方法で触媒か反応に作用することもある。このような化合物およびその誘導体は、それらに対して直交である阻害剤の設計の開始点として適しており、本発明の範囲内である。同様に、他の既知のキナーゼ阻害剤は、図９に構造を示しているような、本発明の阻害剤合成の開始点として使用できる。もちろん、現在未知である阻害剤の誘導体はいったん同定されれば、本明細書に例示され、その一部となっている、本発明の阻害剤設計に適した中心構造となるであろう。
【０１１５】
加えて、本発明の阻害剤は化学合成手段によって生成された阻害剤に限定されず、自然界に見られ、その役割を果たすことが可能である化合物も含み、そのうちのいくつかは上述されている。さらに、当業技術者は、本明細書に述べた以外の他の変異体があることと、それらがすべて本発明の範囲内であることを認識するであろう。
【０１１６】
本発明に従って使用するための候補である阻害剤は、野生種キナーゼによって受容される程度を判定するために、以下の実施例１３で述べるようなスクリーニング手順を用いて、あるいは本明細書の実施例１９で述べるタンパク質キナーゼ活性の高い細胞の使用を含むスクリーニング手順を用いて、都合よくスクリーニングできる。このようなアッセイにより、各阻害剤が設計キナーゼよりも野生種キナーゼに弱く結合されているかどうかを、または好ましくは、野生種キナーゼが実質的にその阻害剤に結合していないかどうかを、あるいは最も好ましくは阻害剤にまったく結合しないかどうかを判定することができる。ただちに結合しにくい基質の場合、たたちに結合するようにするために、興味のあるキナーゼの設計を試みることも価値がある。もちろん設計したキナーゼを最初に作成し、次に野生種酵素と並行してアッセイを行い、設計キナーゼが野生種キナーゼよりも所与の直交基質をよく使用するかどうかを判定することもできる；これは実施形態１３で使用された手法である。しかし、大半の状況では、上述した予備スクリーニングが好ましい。もちろん他のアッセイ手法も当業者には明白であり、そのようなアッセイの使用は本発明の範囲内である。
【０１１７】
ＩＸ．キナーゼの再設計
野生種チロシンおよびセリン／トレオニンキナーゼの存在下で標準基質に独自に結合させるために、キナーゼの再設計ではいくつかの基準を満足する必要がある。細胞レベルのＡＴＰ（１から２ｍＭ）の存在下で突然変異キナーゼが優先的にＡ*ＴＰをリン供与体として使用されるようにするために、設計されたキナーゼは（１）野生種キナーゼによってすぐには利用されないＡＴＰ類似体（Ａ*ＴＰ）を受容する；好ましくは野生種キナーゼによって実質的に利用されないＡ*ＴＰを受容する；最も好ましくは、野生種キナーゼに全く利用されないＡ*ＴＰを受容する；（２）好ましくは、高い触媒作用効率を持つＡ*ＴＰ類似体を使用する；（３）好ましくは、天然型ヌクレオチド基質（ＡＴＰ）の触媒作用効率を低下させる必要がある。このような設計キナーゼが、野生種キナーゼのタンパク質基質特性の研究に使用される場合、これらの基準は、キナーゼのタンパク質標的特異性を実質的に変更背渦に満足されなければならない。
【０１１８】
さらに、本発明の阻害剤によって阻害されるために、キナーゼの再設計で複数の基準を満足する必要がある。設計キナーゼは：（１）野生種キナーゼによってすぐには結合されない阻害剤に結合し；好ましくは前記阻害剤が野生種キナーゼに実質的に結合せずしない；最も好ましくは前記阻害剤が野生種キナーゼに全く結合しない；（２）好ましくは、設計キナーゼは高親和性（たとえば低いＩＣ50）を持つ阻害剤を結合する必要がある。設計キナーゼに該当するキナーゼの野生種型に、結合および生じた阻害が設計キナーゼの結合および阻害を増大させるように、阻害剤が結合するかどうかは、一般に特に重要ではない。しかし、そのキナーゼの野生種型は、他の野生種キナーゼ以上に阻害剤と結合しないように思われる。阻害可能な設計キナーゼを、野生種キナーゼのタンパク質基質特異性を研究するため、あるいは遺伝子治療または他の手段によってそのキナーゼの野生種型を置換するために使用する場合、さらなる懸念は、該当する野生種型と比較した場合に、設計キナーゼのタンパク質標的特性を実質的に変更せずに、上述の基準を好ましく満さねばならないことである。
【０１１９】
本発明が実施された際の最新の見通しから考えると、これらの基準すべてを同時に満足できるかどうかは予測できなかった；実際に、設計されるＡＴＰ結合部位が第二の基質結合部位、すなわちペプチド結合部位に非常に近いため、そのことは疑わしかった。しかし、以下の実施形態によって示されるように、好ましい基準を含め、これらの基準はすべて実際に、説明したｖ−Ｓｒｃ突然変異体が作成された場合に同時に満足され、ｖ−Ｓｒｃ突然変異体にＮ6（シクロペンチル）ＡＴＰを与え、Ｎ4−シクロペンチルＰＰ３を用いて阻害する。
【０１２０】
実施例１は、突然変異体ｖ−Ｓｒｃの研究で使用された１２個のＡＴＰ類似体について述べており、突然変異体ｖ−Ｓｒｃは以下に続く別の実施例で説明する。これらの直交ＡＴＰ類似体は、このキナーゼおよび他のキナーゼの有用な他の突然変異体の開発を目指した研究において、および本明細書の別の箇所で述べる複数の方法にとって有用である。しかし、本発明の範囲はこれらの特定のＡＴＰ類似体の使用に限定されず、当業者は、他の考えられる直交基質が本明細書で述べた直交基質と置換されたり、それらを補足することを認識するであろう。たとえば、異なるさらに複雑な脂肪族または芳香族基をＡＴＰのＮ6位置に加えることができる。さらに本発明の直交基質は、Ｎ6位置のヌクレオチドの変更のみに限定されない。アデノシンの各種位置を変更する化学的手段が既知であり、これらのどれも本発明の範囲内である；そしてヌクレオチドの環構造で変更または置換を行うことさえ可能である。もちろん、このような直交基質を使用することによって、それらに結合する設計キナーゼを作成するためにキナーゼのタンパク質配列の各種位置を変更することが必要となる場合があるが、そのような各種変更は、十分に本発明の範囲内である。
【０１２１】
さらに、本発明の直交基質がＡＴＰ誘導体に限定されていないことに注目することは重要である。各種キナーゼを研究する場合、実際には異なる類似体基材が好ましい。たとえば、あるキナーゼがＧＴＰをリン酸供与体基質およびエネルギー源として使用することが知られている；そのようなキナーゼを研究する場合、グアノシン三リン酸の類似体が好ましい。天然基質に化学的に無関係の化合物が場合によっては、それにもかかわらず活性部位に結合することあり、酵素による化学触媒作用を通じて他の基質に作用させられる、または作用することが可能である。天然基質と同様に触媒化反応に関与することもあり、別の方法で触媒か反応に作用することもある。このような化合物およびその誘導体も、本明細書で使用される「天然基質」および「直交基質」という用語の範囲内である。
【０１２２】
加えて、本発明の直交基質は化学合成手段によって生成された阻害剤に限定されず、自然界に見られ、その役割を果たすことが可能である化合物も含む。当業技術者は、本明細書に述べた以外の他の変異体があることと、それらがすべて本発明の範囲内であることを認識するであろう。
【０１２３】
本発明に従って使用するための候補である直交基質は、野生種キナーゼによって受容される程度を判定するために、以下の実施例２で述べるようなスクリーニング手順を用いて、都合よくスクリーニングできる。このようなアッセイにより、各直交基質が設計キナーゼよりも野生種キナーゼに弱く受容されているかどうかを、または好ましくは、野生種キナーゼが実質的にその基質をに受容していないかどうかを、あるいは最も好ましくは基質をまったく受容しないかどうかを判定することができる。ただちに受容されにくい基質の場合、たたちに受容されるようにするために、興味のあるキナーゼの設計を試みることも価値がある。もちろん設計したキナーゼを最初に作成し、次に野生種酵素と並行してアッセイを行い、設計キナーゼが野生種キナーゼよりも所与の直交基質をよく使用するかどうかを判定することもできる。しかし、大半の状況では、実施例２で述べたような予備スクリーニングが好ましい。もちろん他のアッセイ手法も当業者には明白であり、そのようなアッセイの使用は本発明の範囲内である。
【０１２４】
設計ｖ−Ｓｒｃの設計は、以下の実施例３で述べる。述べられているように、設計型は、すべてではないにしても大半のキナーゼで見られる領域に相同性の領域を持つ他のキナーゼの結晶構造を参照して設計された。示されるように、本明細書で述べた実施例の突然変異キナーゼは、配列全体を含むのではなく、タンパク質キナーゼのフラグメントして作成されている；しかし配列全体を使用した場合の性能には、実質的な相違はないことがわかっている。もちろん、概念および実用性は、フラグメントまたはキナーゼ全体のどちらを使用しても同じであり、どちらも本発明の範囲内である。したがって、「キナーゼ」という用語は、請求項を解釈する場合を含め、酵素全体または１つのフラグメントを含むものとして見なす必要がある。
【０１２５】
この手法を使用すれば、タンパク質キナーゼ、脂質キナーゼまたはアミノグリコシドキナーゼなどの、実質的に他のすべてのキナーゼの同様の突然変異体を設計することが可能である。これを行う方法は：（ａ）アミノ酸から、（そのキナーゼに対して非特異性であり、そのキナーゼを除くキナーゼには一般に特異性であり、あるいはそのキナーゼに対して特異性である）既知のキナーゼ阻害剤を持つキナーゼを含む、興味のあるキナーゼアラインメント、推定的な直交阻害剤のその位置に結合したかさ高い置換基の侵入を立体的に制限する、結合リン酸供与体基質または阻害剤の置換基に十分に近い１個以上のアミノ酸を同定するステップと；（ｂ）１個以上の同定されたアミノ酸をコード化するヌクレオチドトリプレットが、同定されたアミノ酸よりも立体的にかさ高くない側鎖を持つアミノ酸をコード化するヌクレオチドトリプレットにコード化されるように、野生種タンパク質キナーゼをコード化するヌクレオチド配列を突然変異させるステップとを含む。上述の方法は、変更するアミノ酸を決定し、変更する方法を決定するための基準として、侵入または除外の立体制限を使用する。しかし、本発明はそれほど限定されていない。疎水性、親水性、イオン結合、または相反、水素結合などの他の要因を検討し、直交基質上の酵素および求電子基間の共有結合を生成することなどによって、直交基質に結合する能力を変更するためにキナーゼを設計することも可能である。
【０１２６】
本発明を用いたタンパク質キナーゼの研究は、多くの各種キナーゼの領域構造に関する多大な知識と、一般に相同的な配列によって著しく促進されるであろう。タンパク質キナーゼファクツブック（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ（７１））は、実際に数百のタンパク質キナーゼの３つの機能領域のタンパク質配列データを提供し、このことは主要な文献で入手可能な配列情報とともに、キナーゼへの本発明の応用をさらに著しく促進するはずである。他の多基質酵素に関する同様の情報が入手可能であり、これは本発明によるそれらの研究および使用を促進するはずである。
【０１２７】
本発明の好ましい方法には基質類似体および突然変異タンパク質キナーゼの合理的な設計が含まれるが、どちらも代わりに組合わせ方法として知られる方法を使用して作成することができる。有機化合物を合成する組合わせ方法が数多くある。このような方法を使用して、逐次化学ステップを用いて樹脂ビーズ上にヌクレオチド類似体を合成し、次にレジンから類似体を放出してから、ヌクレオチド三リン酸を作成するためのリン酸化を行うことができる。このような方法を使用して、ｖ−Ｓｒｃキナーゼの突然変異体、他のタンパク質キナーゼまたは他の多基質酵素のための推定直交基質のコレクションまたはライブラリを作成した後、前記コレクションまたはライブラリは特に好ましい結合または触媒特性についてスクリーニングすることができる。これによって、このような推定直交基質の構造的、立体配座的および電子的特徴を完全に検索できるようになる。さらに、所与の基質のさらに多数の類似体を調査する場合、予想外に有効な基質または阻害剤が見つかるということがしばしばわかっている。その上、場合によって、よく理解されたパラメータを用いて最良の化合物を特別に設計しさえすれば、最も望ましい化合物が選択される。
【０１２８】
タンパク質突然変異体を作成するための組合わせ方法も、当業者に多数知られている。これらには「誤差の起こりやすい」ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、「性的な」ＰＣＲ、またはタンパク質配列内の固定位置としてランダムヌクレオチドを持つプライマーを用いるＰＣＲがある。他の配列ランダム化法は、ｃＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡの変異誘発物質、あるいは、発現するタンパク質内にランダムに変異を導入することが知られている、細菌のＭｕｔＤ型菌株を含む。ランダムに突然変異されたタンパク質キナーゼまたは他の多基質酵素を作成し、次に特定の直交基質を持つ、あるいは上の段落で述べたように、組合わせ合成を用いて作成した推定直交基質の一部または全部を持つ、特に活性の高いものをスクリーニングするために、このような方法を利用して本発明を実施することができる。以下の例で述べるアッセイ方法は、この目的に適しており、当業者はただちに代わりの手法を設計することができるであろう。
【０１２９】
タンパク質配列空間を調査するために、これらの方法および他の方法は開発され、小型有機分子の構造空間は、考えられる最良の非天然（すなわち直交）フィットを見つけるためにタンパク質および推定阻害剤の両者を変更をよび改変する、本明細書に記載の技術応用で特に有用である。これらのいずれか、あるいは本明細書に記載の他の方法のいずれかを使用することは、本発明の範囲内である。
【０１３０】
ある設計キナーゼの合成は実施例４で述べる。この努力は、ＡＴＰのＮ6の約４Å以内のアミノ酸側鎖に集中されている；しかし、その距離について不思議なことは何もない。約１Å、２Å、３Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å以内、またはそれ以下、それ以上、あるいは中間距離の側鎖を持つ残基も、変更の標的と考えるべきである。約３Åから約６Å以内の側鎖を持つアミノ酸は、好ましい標的となる。一般に、より近い側鎖を持つこれらのアミノ酸は、阻害剤の直交置換基との最大の立体または他の干渉を引き起こすことが予想されるため、さらに遠い距離の側鎖を持つアミノ酸よりも好ましい；そして最も近い側鎖を持つアミノ酸が最も好ましい。
【０１３１】
もちろん、今日では実施例で使用した方法以外に、部位定方向突然変異誘発などの、遺伝子配列を変更および発現する他の方法もたくさんある。これらのいずれか、またはすべてを使用することは、本発明の範囲内である。さらに、遺伝子工学は今日おそらく、このような突然変異体を調製する好ましい方法であるが、唯一の方法ではない。たとえば、設計キナーゼを設計し、次に化学ペプチド合成の既知の方法によってタンパク質を合成できる。あるいは、さらにただちに直交基質を利用できるようにするために、１個以上の側鎖の大きさ、疎水性または他の特性が変化するように、特異的な位置の所与の酵素を化学的に変更することが可能である。このような方法すべての使用は、発明の範囲内である。
【０１３２】
実施例７は、設計キナーゼがそのタンパク質基質特性を保持したかどうかを判定するために実施できる試験について述べている。目標が、キナーゼが作用する基質を研究するために設計キナーゼを使用することであるか、インビボで、たとえば遺伝子工学によって該当する野生種キナーゼを置換または補足するために設計キナーゼを使用する場合、野生種タンパク質基質の特異性は、実施例と同様に実質的に保持されることが好ましい。しかし、そのような目的のために、キナーゼはいまだに野生種と同じ基質を認識することが重要であるが、同じ動態でキナーゼがそうすることが重要である；すなわち、キナーゼがより遅くまたはより速く、あるいはより高い程度、または低い程度でそうする場合、設計キナーゼはまだ、そのような目的の実質的な値を備えている。設計キナーゼが野生種酵素と同一のタンパク質基質を認識しない場合、野生種酵素を研究する場合に低い値を持つが、タンパク質リン酸化およびキナーゼを研究する際にはまだ、実質的な値を持つことがあり、まだ本発明の範囲内になる。
【０１３３】
もちろん、実施例７で使用される特定のアッセイは、有用であるが、使用する必要ない。当業者はただちに、比較できる情報を提供可能な他のアッセイを開発または採用することができるだろう。
【０１３４】
所与の直交基質類似体を受容する、あるいは所与の阻害剤によって阻害される突然変異体キナーゼがいったん作成されると、実施例５および６に示したような、古典的な酵素動態分析を用いて特徴付けることが可能である。また、実施例８に示されているように、突然変異体が類似体を利用する程度、または類似体に阻害される程度、および類似体が野生種酵素に対して「死んでいる」（すなわち完全に無効である）阻害剤であるかどうかについて研究できる。もちろん、実施形態で使用される方法は、これらの研究を実施できる唯一の方法ではなく、当業者は代わりの手法を容易に設計できる。
【０１３５】
実施例１０に示すように、本発明の阻害剤によって阻害される突然変異体を与えるために、複数のアミノ酸置換を行う必要はない。突然変異体ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｉ３３８Ａ）およびＧＳＴ−ＸＤ４（Ｉ３３８Ｇ）と同様に、単一のアミノ酸の変更のみが必要になるかもしれない。
【０１３６】
Ｘ．キナーゼ基質を同定するアッセイ
本発明の１つの実施例は以下のとおりである。第一に直交阻害剤を、設計キナーゼの追加遺伝子を発現するか、興味のあるキナーゼの正常なコピーを発現する興味のある細胞の２種類のサンプルに添加する。阻害剤は、（それらに対して自然に透過性である、透過化処理細胞、細胞抽出物または細胞などの）信号カスケードの活性化の前、後、または間に添加される。次に、たとえば放射性リン酸［ｙ−32Ｐ］ＡＴＰを使用することによって、またはリン酸化アミノ酸に特異性のモノクローナル抗体を使用することによって、細胞または細胞画分中のすべてのリン酸化タンパクを検出可能にする方法を用いて、興味のあるキナーゼの特異的阻害の結果を明らかにする。興味のあるキナーゼの正常コピーを発現する細胞において、未変性キナーゼのタンパク質基質は、阻害剤が存在する場合でも標識されるが、設計キナーゼのタンパク質基質は少なくとも、それより低い程度に標識される；設計キナーゼのタンパク質基質は実質的に標識されないことが好ましく、全く標識されないことが最も好ましい。
【０１３７】
それは、突然変異体に該当する野生種キナーゼが、たとえばそのための細胞遺伝子の「ノックアウト」によって、細胞から除去される場合にも好ましい。そのようなアッセイの標識タンパク質を、野生種キナーゼを含むが突然変異体キナーゼを含まない対象サンプルによってタンデムで検査する場合、対照に対する突然変異体処理サンプルにおいて、あるバンドの強度が低下する。強度の差が大きくなることが好ましい；阻害剤によって処理した突然変異体含有サンプルで欠失しているバンドが生じる。このことは、そのキナーゼの野生種がこれらの差次的に標識されたタンパク質をリン酸化することを示している；キナーゼが阻害されると、これらのバンドは標識されない。
【０１３８】
実施例１０は、本発明の突然変異体キナーゼの細胞間タンパク質基質を検出するために、場合によってはその直交基質類似体または阻害剤とともに、そのキナーゼを用いた方法の一例を与える。そのような試験を開発することが、本発明につながる研究の主要な目標であった。
【０１３９】
一般に、実施例１０および図８で述べる方法は一般に適用可能なように見える；しかし、直交基質類似体または阻害剤を受容する突然変異体をいったん調製してしまえば、考えられる他の方法が多数ある。天然のリン酸供与体基質は最初に、たとえばリン酸塩を［ｙ−32Ｐ］と置換することによって、末端リン酸に標識された部分を含むように調製される。この基質は次に、類似体または阻害剤と共に、直交ヌクレオチド三リン酸基質類似体または阻害剤に対して自然に透過性であり、突然変異体キナーゼを発現する、溶解細胞、細胞抽出物、透過化処理細胞または細胞のサンプルに添加するか、あるいはそれに突然変異キナーゼが外因的に添加されている（たとえばマイクロインジェクションによる）。突然変異キナーゼが阻害されるようになる、および／またはそのタンパク質基質を阻害されない程度にリン酸化する条件化での培養後、標識化された生成物は次に抽出され、実質的で同じ方法で処理されているが、類似体または阻害剤がそれぞれ添加されていない対照サンプルによって生成された生成物と比較して分析される。標識化タンパク質の検出方法は周知であり、定量的および定性的方法を両方とも含む。さらに、タンパク質をキャラクタライズおよび同定するすべての方法を用いて、どのタンパク質基質であり、どのような機能を持つか、特異性を用いて決定することができる。最終的に、各種タンパク質キナーゼがそれぞれ作用するタンパク質基質に関する知識を得られ、細胞信号伝達の謎を多数明らかにすることが必要である。
【０１４０】
いったん１個以上の細胞タンパク質基質が同定されてしまえば、同様のアッセイを用いて、１個以上の基質に対する所与のタンパク質キナーゼの活性を調節可能な薬剤または他の化合物を同定することができる。たとえば、そのような各種化合物の溶液少量を、標識化直交基質類似多および／または阻害剤とともに、細胞を含まない抽出物、突然変異体キナーゼを含む試験サンプルに加えることができる。標識化タンパク質は次に、ゲル電気泳動、次いでオートラジオグラフィーによって同定され、同様に処理されたが、薬剤または化合物を添加していない全く同様の試験サンプルと比較できる。
【０１４１】
タンパク質が、添加化合物と基質類似体、および／または、類似体および／または阻害剤で処理されたサンプル中で標識される阻害剤を含むサンプル中で、標識されていない場合、このことは、添加化合物によってキナーゼが化合物が存在しない場合には作用しないタンパク質をリン酸化したこと、すなわち化合物がそのタンパク質に対するキナーゼの活性を上方へ調節したことを示す。あるいは、標識化タンパク質が、化合物または薬剤が添加された試験サンプル中に現れたが、化合物または薬剤が添加されていない試験サンプル中には現れない場合、このことは、添加化合物が、キナーゼによる、化合物の不在時に作用しないタンパク質のリン酸化を阻害したこと、すなわち、化合物がそのタンパク質基質に対するキナーゼの活性を下方に調節したことを示す。
【０１４２】
さらに、たとえばオートダイヤグラムのスキャンやデータの積分によって、標識化サンプルそれぞれに定量的測定を実施すると、キナーゼ活性に対するさらに微妙な影響が検出できる。たとえば、タンパク質が、所与の化合物の有無によって、より十分に、あるいはより不十分にリン酸化されること（すなわち、より劇的でない調節が行われたこと）がわかる場合がある。ある化合物が同時に、一部のタンパク質に対するキナーゼ活性を上方に調節し、他のタンパク質に対する活性を下方に調節することも予想できる。
【０１４３】
ＸＩ．薬剤設計標的キナーゼのスクリーニングにおける使用
上述したように、キナーゼは各種疾病において重要な役割を果たすため、、単一の野生種キナーゼまたは野生種キナーゼのグループを特異的に阻害できる阻害剤を開発することは大変な関心を集めている。これらの疾病関与キナーゼの活性を下方に調節することによって、疾病症状を緩和できる、あるいは疾病を治癒できることが必要である。しかし、上で簡単に説明したように、野生種キナーゼのそのような阻害剤の製造では多大な問題が生じているため、その手法の可能性が制限されている。主な問題は、特異的であり、意図した標的以外の他のキナーゼを阻害しない阻害剤を発見することが難しいことである。このような非特異性の理由は（ｉ）キナーゼのヌクレオチド三リン酸結合部位が発生時に高度に保存されている、（ｉｉ）多くのキナーゼは「変質している」、すなわちキナーゼが、遺伝子欠失または他の理由によって、細胞濃度中に存在しない、または減少した他のキナーゼと置換可能であり、十分に同様の活性および特異性を備えているためである。結合部位の類似性に関する問題は、たとえば注意深く合理的阻害剤を設計したり、特異性に基づいて組合わせライブラリから阻害剤を選択したりすることによって、多くの場合克服可能である。しかし、他のキナーゼによって正しく変質するキナーゼを用いてそのような努力をすることは、無益であるように思われる。共変質キナーゼすべてが最良の候補化合物によってさえ阻害されるか、あるいは標的が阻害されるかは、判断できない。なぜなら変質キナーゼが阻害キナーゼの活性を引き継ぐためである。
【０１４４】
このため、どの野生種キナーゼが変質し、そのため変質せず、特異的阻害におそらく適していない候補がどれであるか、このように特異的阻害のために好ましい候補がどれであるか判定するために、キナーゼをスクリーニングする方法が必要である。本発明はそのような方法を提供する。本発明は、選択した候補阻害剤によって阻害されるように特に設計されたキナーゼの突然変化体を作成し、次にその阻害の効果を研究することによって、興味のあるすべてのキナーゼに対する特異性の、独特のキナーゼ阻害剤を生成する手段を提供する。
【０１４５】
そのようなスクリーニングの別の好ましい方法は、興味のある疾病の動物モデルを作成し、次いで野生種細胞を「ノックアウト」し、さらに遺伝子工学によってゲノム内に、本発明の突然変異体キナーゼをこーどかする遺伝子を挿入「ノックイン」することである。次に、インビトロで突然変異体への阻害を示した阻害剤が好ましいが、本発明の阻害剤を使用して、突然変異体キナーゼをダウンレギュレートする。ダウンレギュレーションが、モデル動物における疾病の症状または罹患率の低下につながれば、キナーゼは、野生種型の特異的阻害剤の開発のための好ましい候補である。
【０１４６】
ＸＩＩ．遺伝子治療の用途
本発明の突然変異体キナーゼおよび阻害剤は、ヒトおよび動物の疾病の治療に直接使用することもできる。動物モデル系についてちょうど上述したように、それらのキナーゼによって仲介される疾病を持つ患者に、遺伝子置換を使用することができる。１個以上のそのような野生種キナーゼの野生種を、たとえば当業者に既知の「ノックダウン」法によって除去して、次にそのような１個以上のキナーゼの特異的に阻害可能な突然変異体を、たとえば「ノックイン」すなわち当業者に既知の遺伝子治療方法によって動物のゲノムに加える。次いで、阻害剤を薬剤として用いて、疾病が少なくともある程度は好転するが、正常な細胞機能に必要なことがわかっているこれらのキナーゼの活性の程度は維持するように、これらの１個以上の突然変異体キナーゼをダウンレギュレートする。もちろんキナーゼは、治療的に有効であることが証明されれば、強力な阻害によって実質的に「停止させる」こともできる。その上、ダウンレギュレーションあるいは停止の期間によって疾病が著しく改善または治癒したことが判明した場合、阻害剤の投与を中止することが可能であり、疾病は再発または一層悪化することはないであろう。そうでない場合は、次に阻害を長期にわたって、あるいは永久に中止して、突然変異体を残して、その患者の残りの寿命の間、野生種キナーゼの代わりに機能させることが可能である。本発明の特異的阻害剤は環境中に存在しないため、突然変異体キナーゼは、（設計によって変更された程度の活性および動態を除いて）野生種と同様に挙動する必要がある。疾病がｉｎｔ  ｅｈ将来、再発または再度突発した場合、遺伝子交換を反復する必要なしで、患者を阻害剤で再度治療することができる。
【０１４７】
ＸＩＩＩ．タンパク質キナーゼの阻害剤感受性対立遺伝子の分子スイッチの開発
本発明は、野生種タンパク質キナーゼを阻害しない透過性分子に対してタンパク質キナーゼを感作するための一般的手法を提供する。独特のタンパク質／小型分子インタフェースを設計するために化学スイッチを使用して、細胞透過性阻害剤に対して独特の感受性を備えたタンパク質キナーゼを設計した。５種類の別個の系統族による７種類のタンパク質キナーゼを、半無作為的な方法で選択した。各キナーゼに対して阻害剤を同定した。この手法は、選択された「リード」阻害剤によって強力に阻害されないタンパク質キナーゼに対してさえ、うまく作用することが証明された。同一の標的に対して特異的である非常に異なる類似体を生成するためには、非常に異なる足場を使用可能なことが示されている。さらに、インビトロスクリーニングを実施する必要のない、標的キナーゼの特異的インビボ阻害が示されている。データは、タンパク質キナーゼの大多数がこの特異的阻害戦略に対して感受性があることを示唆している。ただちに相同組換が行われる生物（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ、ＤＴ４０ニワトリＢ細胞、胚幹細胞など）の場合、この手法によって、可視ヌル表現型をもたないゲノムでも、ゲノム中の各タンパク質キナーゼの条件対立遺伝子系統を迅速に生成する可能性が開かれる。このような系統のライブラリは、細胞中の各遺伝子生成物に関する小型分子リガンドを同定する薬理遺伝的構想の実現のための大きな一歩を表す。
【０１４８】
ＸＩＶ．細胞透過性化学阻害剤に対して感受性のＣｄｃ２８突然変異体キナーゼ
サイクリン依存性タンパク質キナーゼ（Ｃｄｋｓ）は真核生物細胞分裂サイクルのイベントを駆動および調整する（１１２）。発育期の酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、細胞サイクルの調節はＣｄｃ２８（Ｃｄｋｌ）（（１１３）で概説）が行い、その機能は主に、温度感受性（ｔｓ）突然変異体対立遺伝子の分析によって研究されてきた（１１４）。３７℃ではこれらの突然変異体の大半はＧ１で停止し、ＳＴＡＲＴによる進行がＣｄｃ２８活性の抑制に対して独自に感受性であることを示唆している。興味深いことに、他の真核生物では有糸分裂開始にＣｄｋ１が必要であるという証拠は多数あるが、Ｃｄｃ２８がＧ２／Ｍ転移で役割を果たしているという明らかな証拠は、突然変異体の分析によって与えられていない（１１５−１１７）。
【０１４９】
温度感受性突然変異体は、遺伝子機能の分析では強力なツールであるが、表現型の分析は熱ショックの影響によって複雑になる場合がある。さらに、タンパク質不活性化の機構は細胞の詳細において理解されることはまれである。たとえばＣｄｃ２８のキナーゼ活性は、あるｃｄｃ２８突然変異体において高温で低下する（１１８）が、細胞サイクル停止は、酵素の触媒作用機能に対する影響によるか、あるいはタンパク質の折りたたみ、安定性または他のタンパク質との相互作用における欠陥によるかは明らかでない。
【０１５０】
化学的遺伝子学によって、遺伝子機能における条件的欠陥の生成に対する代わりの手法が与えられる（１１９−１２１）。この手法では、以前同定された遺伝子生成物の機能は、合理的な設計または化学ライブラリのスクリーニングによって同定された、高度に特異的な化学阻害剤を使用して決定される。あいにく、この手法は、タンパク質キナーゼの研究では、その高度の保存された活性部位によって、突然変異体の特異的阻害剤（１２１、１２２）を同定するのが困難になるため、限られた成功しか収めていない。
【０１５１】
細胞透過性化学阻害剤に対して独自の感受性を持つ突然変異標的キナーゼの設計を含む、高度に特異的な化学的遺伝子手法が開発された（１２３−１２５）。キナーゼのＳｒｃ科の該当する残基の突然変異に基づいて、Ｃｄｃ２８のフェニルアラニンはグリシンと置換され、結果として、ＡＴＰ結合部位に新たなポケットが生成した。この突然変異体キナーゼ、Ｃｄｃ２８−ａｓ１（類似体−特異的１）は、ＡＴＰ結合部位内の設計ポケットを占有する一時変異を持つキナーゼ阻害剤ＰＰ１の類似体である、４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフチルメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（１−ＮＭ−ＰＰ１）に対して感受性であると予想された。
【０１５２】
本発明は、対立遺伝子特異性化学阻害剤をインビボでのＣｄｃ２８活性の研究に使用できることを証明する。低濃度の１−ＮＭ−ＰＰ１では、ｃｄｃ２８−ａｓｌ系統は過分極芽によってＧＭ／２内で遅延または停止する。この表現型は、有糸分裂サイクリンＣｌｂｌ−４を欠失した細胞で見られる表現型に似ている（１３９）。ｃｄｃ２８−ａｓｌ細胞のおける表現型は、有糸分裂開始、および頂芽から等方性芽成長へのスイッチに必要な閾値以下に、Ｃｄｃ２８活性が低下したことによる。明らかに、これらの細胞におけるＧ１／Ｓサイクリン−Ｃｄｋ錯体の活性は、出芽およびＤＮＡ複製を誘発するにはまだ十分である。これらの錯体の活性は阻害剤の高濃度においてのみ、ＳＴＡＲＴによるパスに必要な閾値以下に低下する。これらのデータは一般に、異なる細胞サイクルイベントがＣＤＫ活性の特異的な閾値レベルによって誘発され、後のほうのイベントがより高い活性を必要とするという概念と一致する（１４０）。しかし、異なるサイクリンの基質特異性の相違も、細胞サイクルイベントの順序に寄与する（１４１−１４３）。
【０１５３】
Ｇ２／Ｍ進行がＣｄｃ２８阻害に最も感受性があるという証拠は、温度感受性ｃｄｃ２８突然変異体の大半が、Ｇ１において未発芽細胞として停止するという以前の結果に、矛盾するように思われる。高温におけるＧ１阻止はおそらく、異なる形のＣｄｃ２８の温度感受性の相違によって説明される。たとえば、ＳフェーズまたはＧ２／ＭにおけるＣｄｃ２８−Ｃ１ｂ錯体が、Ｇ１にて優勢であるモノマーＣｄｃ２８よりも耐熱性が高い場合に、Ｇ１阻止が生じることがある。対立遺伝子特異性化学阻害剤は、温度感受性突然変異体に関するこのような問題および他の問題を回避する、代わりの強力な方法を提供する。
【０１５４】
ＡＴＰ結合部位の構造はタンパク質キナーゼ間で高度に保存されるため、我々の手法は、あらゆるタンパク質キナーゼの分析に適用可能なはずである（これまで我々は、設計Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｃｄｋ２、ＣａＭＫＩＩα、ｃ−Ａｂｌ、Ｆｕｓ３、Ｌｃｋ、ｐ３８、Ｐｈｏ３８の特異性阻害剤の同定に成功している（１２３−１２５、１４４））。この方法は、従来の温度感受性対立遺伝子の単離方法よりもさらに迅速である、条件的対立遺伝子の生成への手法も提供する。加えて、条件的対立遺伝子の新たなクラスの可用性によって、遺伝子生成物を線形情報伝達経路に配列するための簡単な上位性分析が可能になる：類似体特異性対立遺伝子および興味のある他の温度感受性または冷感受性遺伝子生成物間の相反転位実験を現在実施している。結果も、突然変異体対立遺伝子の強度は、阻害剤濃度を変化することによって制御できることを示唆している：したがってｃｄｃ２８−ａｓｌは、中程度の阻害剤濃度では弱い対立遺伝子として挙動し、高濃度では仮想ヌル仮想遺伝子として挙動する。このように、この方法を他のタンパク質キナーゼに適用すると、触媒作用活性について異なる要件を持つ遺伝子機能の同定が可能になる。同様に、タンパク質キナーゼがキナーゼ依存性機能とキナーゼ独立性機能を持つと考えられる場合（１４５）、類似体特異性対立遺伝子を使用すると、キナーゼ活性を必要とするそれらの機能のみが阻害される。最後に、類似体特異性対立遺伝子を生成する同一のキナーゼ突然変異によっても、キナーゼは、変更された放射線標識ＡＴＰ類似体を使用して、設計ＡＴＰ結合部位を補完することができる（１２６、１４６）。これらのＡＴＰ類似体および突然変異キナーゼを細胞溶解物に加えると、直接キナーゼ標的の標識化および同定が行われる。この手法は、特異性Ｃｄｃ２８基質の同定にも使用できる。
【０１５５】
ＸＶ．細胞系
本明細書の別の箇所で説明したように、突然変異酵素をコード化する核酸を含む設計発現ベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換することができる。多数の哺乳類細胞系は、当業者に既知であり、これに限定されるわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、マディン−ダービーウシ肝臓（“ＭＤＢＫ“）細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ  １５７３）、ＣＯＳ−７、２９３、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＴＭ４、ＣＶ１、ＶＥＲＯ−７６、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ  ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＭＭＴ  ０６０５６２、ＴＲＩ細胞、その他などの、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系も含まれる。トリ細胞系の周知の例は、ニワトリＢ細胞系“ＤＴ−４０“である。そのような細胞系を形質転換するのに有用なベクターの例としては、これに限定されるわけではないが、レトロウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、家禽ジフテリアウィルスベクター、細菌発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３などのプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）、またはバキュロウィルス転移ベクターが挙げられる。
【０１５６】
バキュロウィルス発現ベクターと使用する昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【０１５７】
別の実施形態において本発明の遺伝子は、ｐＰＤ６９．７８  ｈｓｐ  １６．２またはｐＰＤ６９．３  ｈｓｐ  １６−４１などの発現ベクターにおける熱ショックプロモータ要素などの、Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ構成プロモータまたは誘導プロモータのクローン化下流である。前記発現ベクターは、興味のある遺伝子が誘導熱ヒートプロモータ要素の制御下にあるＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子導入系を作成するためのパブリック領域ベクターである。そして遺伝子導入Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓは、卵母細胞のマイクロインジェクションによって得られる。
【０１５８】
別の実施形態において、ショウジョウバエ細胞は一般に入手可能なベクターによって形質移入できる（１５６、１５７）。
【０１５９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．および他の下位真核生物細胞は、本発明の発現作成物に使用される。本発明で有用な酵母宿主は、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。
【０１６０】
以下の実施例は、本発明を説明および例示するために与える。したがって、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。当業者は、上の分および請求項で述べるように、他の多くの実施態様が本実験の範囲内に含まれることを認識するであろう。
【０１６１】
実験詳細部
実施例１
ＡＴＰ類似体の合成：１２種類の異なる直交ＡＴＰ類似体を合成した。図２はその構造の概略図である。図２は、６位置に“Ｘ”が結合したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を示す；下の囲みには、実施例に記載されたそれぞれの直交ＡＴＰ類似体において“Ｘ”に代わる（常に、太字体で示す数字１から１２によって呼ばれる）１２個の側鎖の概略図が与えられている。これらの類似体は以下のとおりである：
１−Ｎ6（メトキシ）ＡＴＰ
２−Ｎ6（エトキシ）ＡＴＰ
３−Ｎ6（アセチル）ＡＴＰ
４−Ｎ6（ｉ−プロポキシ）ＡＴＰ
５−Ｎ6−（ベンジル）ＡＴＰ
６−Ｎ6−（ベンジロキシ）ＡＴＰ
７−Ｎ6（ピロリジノ）ＡＴＰ
８−Ｎ6（シクロペンチル）ＡＴＰ
９−Ｎ6（シクロペンチロキシ）ＡＴＰ
１０−Ｎ6（ピペリジノ）ＡＴＰ
１１−Ｎ6（シクロヘキシル）ＡＴＰ
１２−Ｎ6（シクロヘキシロキシ）ＡＴＰ
類似体１、２、４、６、９および１２は、フジイ他の手順によって（４３）、アデニンから始まる４ステップにおいて、該当するＮ1アルコキシアデニン誘導体のＤｉｍｒｏｔｈ再配列によって合成された。類似体５は、Ｎ1ベンジルアデノシンのＤｉｍｒｏｔｈ再配列によって同様に合成された（４４）。類似体３は、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ他による、トリメチルシリルエステルとしてのアデノシンヒドロキシル基のインシトゥ保護と、その後の塩化アセチルによる処理によて調製した（４５）。類似体７、８、１０および１１は、６−クロロプリンリボサイド（Ａｌｄｒｉｃｈ）をピロリジン、シクロメンチルアミン、ピペリジンならびにシクロヘキシルアミンとそれぞれ処理して合成した（４６）。
【０１６２】
三リン酸合成は、ピロリン酸の調製を除き、Ｌｕｄｗｉの方法（４７）に従って実施した。したがって、ピロリン酸１当量とトリブチルアミン１当量の（１：１）水：エタノール混合物溶液を、均一溶液が得られるまで混合して、ビス−トリ−Ｎ−ブチル−アンモニウムピロリン酸を調製した。真空下で乾燥するまで溶媒を除去し、ピロリン酸を五酸化二リン酸上で一晩貯蔵した。すべての非放射性ヌクレオチドは、1Ｈ−ＮＭＲ、質量分析および強アニオン交換（ＳＡＸ）ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ＃８３−ＥＯ３−ＥＴＩ）によってキャラクタリゼーションした。
【０１６３】
［ｙ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰは、ＨｅｃｈｔおよびＫｏｚａｒｉｃｈの方法（４８）に従って合成した。放射線標識された類似体は、ＤＥＡＥ（Ａ−２５）Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムクロマトグラフィーによって精製し、三リン酸は、放射線標識物質とＮ6−（シクロペンチル）ＡＴＰの標準サンプルを、ＳＡＸ−アニオン交換ＨＰＬＣカラム（Ｒａｉｎｉｎ）（１０分間で５−７５０ｍＭ  リン酸アンモニウム  ｐＨ３．９の直線濃度勾配、０．５ｍｌ／分）。反応の化学収率は７０から８０％で変化した。
【０１６４】
実施例２
ヌクレオチド類似体のスクリーニング：既存の細胞キナーゼによって基質として受容されない化合物を同定するために（５３）、合成Ａ*ＴＰ類似体のパネルを、タンパク質チロシンキナーゼを豊富に含むネズミリンパ球溶解物（ＣＦ）中でスクリーニングした（１３）。アッセイは、単離され、５％子牛血清（ＢＣＳ）、１％ヘルペスおよびＤＮＡｓｅｌ（１ｕｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液で洗浄した脾臓細胞（プリンストン大学動物学部による８から３０週齢オスおよびメスＣ５７／Ｂ６マウス）を用いて実施した。赤血球は、ｐＨ７．２の１７ｍＭ  ｔｒｉｓ塩化アンモニウムを用いた処理により４℃で溶解させた。フカザワ他の方法による（５１）ｐＨ７．４の１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  塩化マグネシウム、ロイペプチン（１０ｕｇ／ｍｌ）、アプロチニン（１０ｕｇ／ｍｌ）および１００ｕｇ  ＰＭＳＦ中で、細胞は低張にて氷上で１０分間溶解させた。ボルテックスおよび５００ｘｇでの遠心分離の後、上澄を回収した。細胞は４℃で２０分間補完した。基底タンパク質リン酸化レベルを減衰させるために、その後、緩衝液をｐＨ７．４の２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  フッ化ナトリウムに調製した。次にバナジウム酸ナトリウム（１００ｕＭ）を加え、ホスホチロシンホスフェートの活性を抑制した。
【０１６５】
各ヌクレオチド三リン酸を加え、５ｘ１０6細胞に対する最終濃度１００ｕＭとし、３７℃で５分間培養した。その後、４倍Ｌａｅｍｍｉｌｉゲル添加液を細胞溶解物に加え、反応を抑制した。タンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｐｒｏｔｒａｎ  Ｂ８５（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ−Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。ブロットは抗ホスホチロシンモノクローナル抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてプローブし、製造者の指示に従って、ＨＲＰ−結合ヤギ−抗−マウス抗体（ＶＷＲ  ｃａｔ．  ７１０１３３２）による処置の後、向上したケミルミネセンス（ｃａｔ．３４０８０，  Ｐｉｅｒｃｅ）によって、結合した抗体を検出した。
【０１６６】
結果は、１００ｕＭのＡＴＰまたはＡ*ＴＰ類似体（１−１２）を用いたネズミリンパ球細胞溶解物による処理後のタンパク質チロシンリン酸化の濃度を示す抗ホスホチロシン免疫ブロットである図３に示す。使用した細胞溶解物としては、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、Ｙｅｓ、Ｆｇｒ、Ｈｃｋ、Ｚａｐ、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、Ｂｌｋ、およびＢならびにＴリンパ球、マクロファージおよび濾胞樹状細胞に存在する他のタンパク質チロシンキナーゼが含まれる（１３）。分子サイズ標準（キロダルトン）で示されている。最小のＮ6置換基、１（メトキシ）、２（エトキシ）、３（アセチル）を含むＡ*ＴＰは、細胞タンパク質チロシンキナーゼ基質として作用する一部の能力を示した（図３、レーン３−５）。立体的に要求の多いＮ6置換基、４（Ｉ−プロポキシ）、５（ベンジル）、６（ベンジロキシ）を持つＡ*ＴＰおよび環状脂肪族置換基を含むすべての類似体（７−１２）は、タンパク質リン酸化をほとんど、または全く示さなかった（図３、レーン６−８、１１−１６）。
【０１６７】
Ａ*ＤＰおよびＡＴＰを与える、細胞ＡＤＰによる直交Ａ*ＴＰ（７−１２）の考えられる複分解を試験するために、１ｍＭのＡＤＰを図３に示したのと同一の細胞溶解物キナーゼ反応に加えた；リンタンパク質のパターンは同じであり、完全な細胞溶解物系ではＡ*ＴＰの著しい複分解が発生しないことを示した。
【０１６８】
これらの結果に基づくと、類似体（７−１２）は野生種タンパク質チロシンキナーゼの「無効基質」である。すなわち野生種基質はリン酸供与体基質としてこれらを実質的に、または全く受容しない。したがって、これらの類似体は、ｖ−Ｓｒｃのヌクレオチド結合部位の再設計のための最も好ましい標的として選択された。
【０１６９】
実施例３
突然変異体ｖ−Ｓｒｃの設計：複数の構造の不活性キナーゼは溶解しているにもかかわらず、活性配座にある結晶構造のタンパク質チロシンキナーゼは今日まで溶解していない（５４、５５）。しかし、２種類の結晶構造の触媒作用的に活性のキナーゼは溶解している（５６、５７）。両方のキナーゼ系統群（ｃＡＭＰ依存性キナーゼのＫ７２（ＰＫＡ）、ｖ−ＳｒｃのＫ２９５）の同一の触媒作用活性を示すリジン残基の親和性標識化によって示されているように、ｓｅｒ／ｔｈｒとタンパク質チロシンキナーゼ触媒作用領域の間には高度の機能相同性がある（５８、５８）ＰＫＡ（５６）およびサイクリン依存性キナーゼ−２（ＣＤＫ２）−サイクリンＡ（５７）結晶構造の調査によって、結合ＡＴＰのＮ6アミノ基の４Ａ球内の２種類のアミノ酸側鎖が明らかになった。Ｖ１０４／Ｍ１２０（ＰＫＡ）およびＶ６４／Ｆ８０（ＣＤＫ２）（６０）である。
【０１７０】
図４は、ＡＴＰに結合されている、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）のＡＴＰ結合部位の拡大図である。ＡＴＰのＮ6アミノ基の４Ａ球内の３個の残基（Ｖａｌ１０４、Ｍｅｔ１２０、Ｇｌｕ１２１）および触媒作用的に不可欠なリジン残基（Ｌｙｓ７２）は球と棒で表現されている。残りのタンパク質はリボンで表現されている。この図はＭｏｌｓｃｒｉｐｔの出力をＲａｓｔｅｒ３Ｄレンダリングプログラムに入力して作成した（６８、６９）。このモデルで、Ｇｌｕ１２１の側鎖がアデニン環結合領域を指していないため、Ｇｌｕ１２１は変更の候補ではなかった。
【０１７１】
ＰＫＡ（ＳＥＱ．ＩＤ．  Ｎｏ．１）、ＣＤＫ２（ＳＥＱ．  ＩＤ＞ＮＯ．２）およびｖ−Ｓｒｃ（ＳＥＱ．  ＩＤ．ＮＯ．３）のＡＴＰ結合領域の配列アラインメントを以下に示す。太字で示した残基は、キナーゼ結合ＡＴＰのＮ6アミノ基の５Å球内に側鎖を持つアミノ酸に相当する。
サブ領域
【０１７２】
【式７】
0004876239.tif 000007
【０１７３】
上述のキナーゼの間の機能的類似性に基づいて、ＰＫＡのＶ１０４／Ｍ１２０およびＣＤＫ２のＶ６４／Ｆ８０に該当する、ｖ−Ｓｒｃ触媒作用領域における位置Ｖ３２３およびＩ３３８を突然変異させた。アラニンに対するこれらの残基を突然変異させると、好ましい直交Ａ*ＴＰ（４−１２）のひとつを結合できるようにするために、ｖ−Ｓｒｃのヌクレオチド結合部位内に追加「ポケット」が作成されることが期待された。
【０１７４】
実施例４
突然変異体合成、発現および精製：突然変異体（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）は以下で述べるように作成した。ｖ−Ｓｒｃ触媒作用領域（ＸＤ４フラグメント）の野生種および二重アラニン突然変異体はどちらも、グルタチオニンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質（ＧＳＴ−ＸＤ４）として作成された（６１、６２）。これらは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で作成された。Ｅ．ｃｏｌｉは以下の実施例で述べるように、いずれかの内因性タンパク質チロシンキナーゼを欠失しているために、優れた発現宿主である。ｖ−ＳｒｃのＸＤ４フラグメントは、無傷ＳＨ１触媒作用領域を含んでいるが、非触媒作用調節ＳＨ３およびＳＨ２領域を欠失しており、全長ｖ−Ｓｒｃよりも高い特異的活性を示すために使用された。
【０１７５】
重複延長ＰＣＲを使用して、ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）を作成した（４９）。Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、製造者のプロトコルに従ってＰＣＲ反応で使用した。６種類の合成オリゴヌクレオチドを使用した：
【０１７６】
【式８】
0004876239.tif 000008
【０１７７】
プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４はＢａｍＨ１部位を含み、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５はＥｃｏＲ１部位（イタリックで示す）を含む。プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７は、Ｖ３２３Ａ突然変異を導入するためのヌクレオチド配列変化を含む（ヌクレオチドコード化突然変異は太字で示す）。プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９はＩ３３８Ａミスマッチを含む。
【０１７８】
Ｙｅｐ５１−ＸＤ４プラスミドによるＸＤ４遺伝子（Ｔｕｆｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＢ．  Ｃｏｃｈｒａｎより供与）は、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５によって増幅した。ＰＣＲ生成物はＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１で消化し、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１で消化したｐＧＥＸ−ＫＴ内に結合し、次にＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａ内へ形質転換させる。ＢＯＳＣ２３（６）およびウィルス粒子は、説明されているように２日後に収集した（６）。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、説明されているように（７）これらのウィルス粒子によって感染させ、安定したトランスフェクタントは、説明されているように（５）、ピューロマイシンを含む培養液中で選択された。安定したトランスフェクタントは、ｖ−Ｓｒｃの発現が損失しないように、ピューロマイシンを含む培養液中で保持した。
【０１７９】
最終結果を図１に示す。図１は、Ｓｒｃ−相同３、２および１（ＳＨ３、ＳＨ２およびＳＨ１）領域を含むｖ−Ｓｒｃの領域構造を示し、領域境界は、囲まれた領域それぞれの上に示されたアミノ酸残基番号によって示す。残基７７−２２５の欠失（Δ７７−２２５）を含むＸＤ４の領域構造も示す。ＸＤ４（ｖ−Ｓｒｃからの番号付け）を持つグルタチオニンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合の領域構成および二重突然変異ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８ＡおよびＩ３３８Ｇの両方を示す）も図式的に示す。
【０１８０】
実施例５
突然変異体ｖ−Ｓｒｃの直交ＡＴＰ類似体に結合する能力の試験：Ｎ6置換ＡＴＰ類似体（図２の１−１２）が、［γ−32Ｐ］ＡＴＰを持つＲＲ−Ｓｒｃ野生種および突然変異体キナーゼリン酸化を差次的に阻害する能力を評価した。これは個々のＡＴＰ結合部位に結合する能力の尺度である。アッセイは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１．６ｍＭグルタチオニン、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＲＲ−Ｓｒｃペプチドと、ＧＳＴ−ＸＤ４（１００ｎＭ）またはＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）（１００ｎＭ）のいずれかと、１０μＭ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）［Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮ］を含み、ｐＨ８．０に緩衝された、最終体積３０μｌ中で、３７℃にて３通り実行した。冷ＡＴＰまたはＡＴＰ類似体（１００μＭ）（１−１２）を加え、次にキナーゼを加えた。３０分後、反応体積の２５μｌをｐ８１ホスホセルロース円板（Ｗｈａｔｔｍａｎ）にスポットして、反応物をクエンチし、これらを１０％酢酸２５０ｍｌに３０分間浸漬したのち洗浄し、標準方法（５２）によってシンチレーション計数を行った。
【０１８１】
結果を図６に示す。ＧＳＴ−ＸＤ４の相対抑制を塗りつぶした棒で示し、ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）は斜線の棒で示した。阻害パーセント（１−Ｖ1／ｖ0）は、ｖ１（表示した三リン酸１００μＭおよび［γ−32Ｐ］ＡＴＰ１０μＭの存在時のｃｐｍ（１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ））／ｖ0（［γ−32Ｐ］ＡＴＰ１０μＭの存在時のｃｐｍ）のみ−リン酸セルロース円板に結合した非特異性の１０μＭ［γ−32Ｐ］ＡＰＴによる背景ｃｐｍ（合計入力カウントの＜０．１％）の比として報告される。誤差棒は、３度反復した独立した実験４回のから決定した標準偏差を表す。
【０１８２】
野生種キナーゼＧＳＴ−ＸＤ４は、リンパ球キナーゼアッセイ（図３）から予想されるように、大半のＡＴＰ類似体に対して低い結合親和性を示す（図６、塗りつぶした棒）。これに対して、二重突然変異ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３、Ｉ３３８Ａ）は、さらに立体的に要求の多いＮ6置換ＡＴＰ類似体（図６、斜線棒）によって優れた阻害を示している。最も有意なのは、ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）突然変異体がＡＴＰ類似体５、８、９および１１によって阻害されることであり、野生種キナーゼＧＳＴ−ＸＤ４が天然基質によって阻害されるのとほぼ同様である。ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）および全長ＧＳＴ−ｖ−Ｓｒｃ（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）がＡＴＰ（１−１２）と同じ阻害パターンを示すことも確認された。
【０１８３】
野生種キナーゼ特異性のスクリーニング（図３）で同定された９個の「無効」基質のうち４個は、突然変異体キナーゼによく結合する。野生種キナーゼによって受容されない突然変異体キナーゼ用の新たな基質が、このように高い割合で同定されることは、ｖ−Ｓｒｃヌクレオチド結合部位の主要な特徴、すなわちＡＴＰのＮ6アミノ基周囲に密接に適合する残基が同定されたことを示唆する。ｖ−ＳｒｃにおけるＩ３３８に対応する位置（ＰＫＡにおける位置１２０）にアラニンを含む野生種タンパク質キナーゼが知られていないことは、何の価値もない。この位置にある立体的に要求の多いアミノ酸側鎖も、他のキナーゼの特性を決定するのに重要な役割を果たす場合、本明細書で述べたのと非常に似た方法を用いて、他のキナーゼが直交基質を受容するように設計することも十分可能なはずであり、そのように設計されたキナーゼは十分、本発明の範囲内である。
【０１８４】
実施例６
最も好ましい直交ＡＴＰ類似体による、突然変異体ｖ−Ｓｒｃの触媒作用効率の決定：Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰ、８が、野生種ＧＳＴ−ＸＤ４およびＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）突然変異体の両者の、触媒作用的に適した基質として作用する能力は、試験され（図３、レーン１２）、類似体８が野生種キナーゼによってわずかに低いレベルのリン酸化を示したためにＡＴＰ類似体５、９および１１に勝っている。
【０１８５】
ＧＳＴ−ＸＤ４およびＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）によるＡＴＰおよびＮ6−（シクロペンチル）ＡＰＴ依存性ＲＲ−Ｓｒｃリン酸化（１ｍＭ）は、低い基質転換（＜５％）にて、３通り実施した。速度定数は速度データのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットの分析によって決定した（６４）。アッセイは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１．６ｍＭグルタチオニン、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＲＲ−Ｓｒｃペプチドと、ＧＳＴ−ＸＤ４（１００ｎＭ）またはＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）（１００ｎＭ）のいずれかと、１０μＭ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）または［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰ（５０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を表示通り含み、ｐＨ８．０に緩衝された最終体積３０μｌ中で、３７℃にて３通り実行した。
【０１８６】
【表１】
0004876239.tif 000009
【０１８７】
上の表１に示したように、野生種キナーゼＧＳＴ−ＸＤ４は、［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰを含むＲＲ−Ｓｒｃペプチドを実質的にリン酸化せず、この類似体が野生種キナーゼにとって重要な基質でないという以前の結果が確認された。これに対して、ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）は、直交ＡＴＰ、［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰによってミカエリス−メンテン動態を示した。直交基質に対する突然変異体のＫMは、ＡＴＰに対するＧＳＴ−ＸＤ４のＫMと非常に近い。一方、突然変異体のＡＴＰに対するＫMの値は、ＧＳＴ−ＸＤ４のＡＴＰに対するＫMによりも１０倍以上大きかった。
【０１８８】
競合基質に対して触媒をランク付けするのに用いるパラメータは、ミカエリス−メンテン定数に対する変換率、Ｋcat／Ｋm（「特異性定数」）である（６４）。直交基質［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰを用いた設計突然変異体ＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）のＫcat／ＫMは、天然基質のＡＴＰを用いた野生種キナーゼのＫcat／ＫM値よりも５０倍も低い。直交ＡＴＰ基質によるこの触媒作用効率は、野生種と比較した場合、ＡＴＰを用いた突然変異キナーゼの低い触媒作用効率と結びついて、上述した２種類の設計基準を満足する。
【０１８９】
新しい基質［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰが野生種ＧＳＴ−ＸＤ４によって実質的に利用されないことは、図５Ｃのレーン３に示すように、ＧＳＴ−ＸＤ４がこの類似体を自己リン酸化のリン酸供与体として全く使用できないことから明らかに証明されるように、なおさら重大なことである。図５Ｃはダイアグラムであり、レーン１にはＧＳＴ−ＸＤ４の、レーン２にはＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）の［γ−32Ｐ］ＡＴＰ依存性自己リン酸化を示し、レーン３にはＧＳＴ−ＸＤ４の、レーン３にはＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）の［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰ依存性リン酸化を示す。設計キナーゼはＧＳＴ−ＸＤ４に対し、［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰによって効率的に自己リン酸化されることに注意する（図５Ｃ、レーン４）。
【０１９０】
実施例７
タンパク質基質特異性の保持の確認：以下の表２に示すように、野生種ＧＳＴ−ＸＤ４キナーゼは、文献報告（６３）と一致する動態によって、適切にキャラクタリゼーションされているｖ−Ｓｒｃ、ＲＲ−Ｓｒｃのペプチド基質に対して自己リン酸化されたことがわかった。このことは、配列設計がタンパク質基質に関しては、酵素の触媒作用活性に実質的に影響しなかったことを示す。
【０１９１】
【表２】
0004876239.tif 000010
【０１９２】
Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰ
ＲＲ−ＳｒｃのＧＳＴ−ＸＤ４およびＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）リン酸化のアッセイは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１．６ｍＭグルタチオニン、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＲＲ−Ｓｒｃペプチドと、ＧＳＴ−ＸＤ４（１００ｎＭ）またはＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）（１００ｎＭ）のいずれかと、１０μＭ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）［Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮ］を含み、ｐＨ８．０に緩衝された、最終体積３０μｌ中で、３７℃にて３通り実行した。
【０１９３】
アラニン突然変異がタンパク基質特性に何らかの影響を与えたかどうかを判定するために、ＲＲ−Ｓｒｃペプチドの野生種および突然変異体融合タンパク質の両者のＫMを測定した。［γ−32Ｐ］ＡＴＰの飽和濃度において、野生種および突然変異体は、ＲＲ−Ｓｒｃに対してそれぞれ２．６±０．９ｍＭという実質的に同一のＫMを示した（６３）。さらに、飽和量の直交基質存在下でのタンパク質基質に対する突然変異体のＫも、実質的に同一の、２．１±０．９ｍＭであった。これらの結果は、隣接したリン酸受容体結合部位に近接したＡＴＰ結合ポケットにおけるアラニン突然変異が、タンパク質標的特異性に影響しないことを示唆している。
【０１９４】
このことを裏付けて、設計キナーゼは、野生種ＸＤ４によってリン酸化される同一の幅広いタンパク質を、それぞれＳｆ９昆虫細胞内で発現された場合にリン酸化する。これを図５（ａ）に示す。図５は、レーン２の６−Ｈｉｓ−ＸＤ４またはレーン３の６−Ｈｉｓ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）を発現するＳｆ昆虫細胞による細胞溶解物（１０8細胞当量／ランド）の抗ホスホチロシンタンパク質ブロットを示す。これらのブロットは、実施例２のブロットと同じ手順を用いて、１０6個の細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含むｐＨ８．０の緩衝液に溶解した後に実施した。
【０１９５】
Ｓｆ９昆虫細胞系は、これらの細胞が、哺乳類細胞に見られるキナーゼと活性がさらに似ているキナーゼを生じる、タンパク質に対する翻訳後変更を実施するのに必要な同一の機構の大半を含んでいるため、タンパク質チロシンキナーゼを少量発現させるのに優れた宿主である。さらに、感染してないＳｆ９細胞は、図５Ａレーン１に示したように、内因性タンパク質チロシンキナーゼ活性を欠失しているため、図５Ａのレーン２および３のタンパク質を含むホスホチロシンは、発現された６−Ｈｉｓ−ＸＤ４または突然変異体６−Ｈｉｓ−ＸＤ４キナーゼの基質である。特定のタンパク質のリン酸化濃度に小さな差があるのは、野生種キナーゼにくらべて、突然変異ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）の触媒作用活性が低いことが原因である。総合すれば、これらのデータは、設計キナーゼのペプチド特異性が、野生種ｖ−Ｓｒｃの特異性と実質的に同一であることを示している。
【０１９６】
実施例８
設計キナーゼが好ましい直交基質を受容するが、野生種キナーゼが実質的にそれを受容しないことの確認：本研究の最終的な目標は、合成基質類似体に特異性を持つ突然変異体キナーゼを用いて、細胞全体または細胞溶解物中の直接タンパク質基質を結合することである。このためには、（すべてのホスホアミノ酸のわずか０．０３％がチロシンであるため、細胞リン酸化の大半を実施する）ｓｅｒ／ｔｈｒ特異性キナーゼを含む（６５）、野生種キナーゼが実質的に合成基質を受容しないことが好ましい。［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰがすべての野生種細胞キナーゼに対して実質的に「無効基質」であるようにするためには、ネズミリンパ球溶解液によって、［γ−32Ｐ］ＡＴＰまたは［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰを用いたインビトロキナーゼ反応を行った。
【０１９７】
これらのアッセイは、放射線標識［γ−32Ｐ］ＡＴＰまたは［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を用いて、最終濃度が５ｘ１０6細胞当量を含み、１００μＭとなるように添加し、３７℃で１０分間培養し、その後、４ＸのＬａｅｍｍｌｉゲル添加液を細胞溶解液に加えて、反応をクエンチすることを除き、実施例２で述べた手順と同様の方法で実施した。タンパク質は１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルは、１０％酢酸、１０％イソプロパノールに浸漬した後、ゲルドライヤーで乾燥させ、Ｂｉｏｍａｘ  ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ＃１１１−１６８１）に１時間露出させた。
【０１９８】
結果を図５（ｂ）に示す。低張液で溶解させたネズミリンパ球におけるリン酸化濃度を示すダイアグラムを、［γ−32Ｐ］ＡＴＰの場合はレーン１に、［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰの場合はレーン２に示す。［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰの添加後には、細胞溶解物中に放射線標識リンタンパク質はなく、すべての野生種タンパク質キナーゼ関する、Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰの真の直交性質が確認された。［γ−32Ｐ］ＡＴＰまたは［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰを用いたインビトロキナーゼ反応の場合にも同じ結果が見られ、新たに単離されたネズミリンパ球の代わりにＮＩＨ  ３Ｔ３細胞溶解液を使用した。原則として、他のすべての細胞キナーゼの存在時に１つのタンパク質キナーゼの活性に従う能力によって、膜透過（６６）および［γ−32Ｐ］Ａ*ＴＰを細胞内に導入するためのＡ*ＴＰ細胞透過性形（６７）を使用することにより、ある細胞タイプの直接キナーゼ標的の同定が可能になる。
【０１９９】
実施例９
単一突然変異ｖ−Ｓｒｃ突然変異体の構造および分析：Ｎ6（シクロペンチル）ＡＴＰが基質として効率よく使用されるために、単一突然変異で十分かどうかを判定するために、実施例４に匹敵する方法を用いて、さらに３種類のｖ−Ｓｒｃ由来突然変異体を調製した。しかしこれらは位置３３８に単一突然変異を持っているだけであった。これらを再度、ＧＳＴ−ＸＤ融合タンパク質として発現させた。次に、これらの突然変異体ＧＩＳＴ−ＸＤ（Ｉ３３８Ａ）、ＧＳＴ−ＸＤ（Ｉ３３８Ｇ）を実施例８に述べたように試験した。
【０２００】
結果を図７に示す。図７の左上のゲルレーンは、３３８位置にアラニンを持つ突然変異体が天然基質のＡＴＰを、その位置にセリンを持つ突然変異体よりも迅速に利用できることを示す。図７の左下に示すゲルレーンは、３３８位置にアラニンを持つ突然変異体はまた、その位置にグリセリンを持つ突然変異体よりもＡＴＰを基質としてよりよく使用できることも示している。図７の右側のパネルは、さらに興味深い説明を示している。右上のパネルから、位置３３８にセリンを持つ突然変異体は、その位置にアラニンを持ち突然変異体とほぼ同様に、Ｎ6（シクロペンチル）ＡＴＰを使用できないことは明らかである。しかし、下のパネルは、位置３３８にグリセリンを持つ突然変異体が、その位置にアラニンを持つ突然変異体よりも、Ｎ6（シクロペンチル）ＡＴＰを基質としてよく使用できることを示している。
【０２０１】
これらの結果は最も見込みがある。単一突然変異はこの直交基質が使用されるために十分なように思われる。とりわけ、位置３３８にグリセリンを持つ突然変異体は、現在までに作成された最良の設計ｖ−Ｓｒｃ突然変異体であるように思われる。さらに、グリセリン置換がここで作用することは非常に以外である。一般には、グリセリン置換は、酵素の構造をあまりに多くの柔軟性をもたらし、望ましい結果に悪影響を与えるため、通常このような状況で作用しないと考えられる。
【０２０２】
実施例１１
ｖ−Ｓｒｃの基質の同定：図８に、ｖ−Ｓｒｃ基質を同定するための実験手法の概略図を示す。ＧＳＴ−ＸＤ（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）などの設計ｖ−Ｓｒｃは、［γ−32Ｐ］Ｎ6−（シクロペンチル）ＡＴＰの放射線標識直交基質とともに、細胞抽出物または透過処理化細胞に添加される。通常これは、３通り実施する。培養後、（まだ溶解していない場合）細胞を溶解させ、生じたサンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。ゲルより得られ、抗ホスホチロシンによって標識化されたウェスタンブロットは、サンプル中のすべてのリン酸化タンパク質を示す；そしてゲルのオートダイアグラムは、これらのうちどれがｖ−Ｓｒｃによってリン酸化されたかを明らかにする。
【０２０３】
実施例１２
阻害剤の合成：最初の６個の阻害剤のピラゾロピリミジン主鎖を図１０Ａに示す。“Ｒ”位置にフェニル基を持つ４−アミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、化合物１（図９に示したＰＰ１と同じ構造であるが、フェニル環のパラメチル着を持たない）の合成は、Ｈａｎｅｆｅｌｄらの方法（７６）に従って実施した。“Ｒ”位置にシクロブチル、シクロペントイル、シクロヘキソイル、ベンゾイルおよび２−フロイル置換基をそれぞれ持つ化合物２−６（図１０Ｂ）は、処置１により塩化シクロブトイル、シクロペントイル、塩化シクロヘキソイル、塩化ベンゾイルまたは塩化フロイルをそれぞれ用いて、無水ピリジン中で室温にて１時間合成した。各置換基の構造は、図１０Ｂに示す。シリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、１６から８４％の収率で生成物を与えた。化合物１−６（図１０Ｂ）は、1Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析法によってキャラクタリゼーションした。
【０２０４】
実施例１３
野生種キナーゼに対して直交である阻害剤のスクリーニング：既存の細胞キナーゼを阻害しない化合物を同定するために、合成ピラゾロピリミジン類似体（１−６）のパネル（図１０）を、Ｓｈａｈらが述べているように（７９）、［γ−32Ｐ］ＡＴＰをキナーゼ活性の放射線標識トレーサーとして用いたペプチドリン酸化アッセイによって、２種類の密接に関連した精製タンパク質チロシンキナーゼｖ−ＳｒｃおよびＦｙｎに対してスクリーニングした。結果は、化合物２−６のＩＣ50値はそれぞれＳｒｃの阻害に対しては４００μＭを超え、化合物３および５の野生種Ｆｙｎに対する阻害のＩＣ50値は４００μＭを超えていることを示し、これらの類似体（２および５）がこれらの代表的な野生種キナーゼに直交である（野生種キナーゼを阻害しない）ことを示した。
【０２０５】
実施例１４から１６
従来の遺伝子的および生化学的手法を用いたタンパク質キナーゼ情報伝達経路の逆畳込は、密接に関連するキナーゼの数が圧倒的に多いために困難である。個々のキナーゼの細胞透過性阻害剤が設計できるなら、各タンパク質キナーゼの役割を系統的に評価できる。
【０２０６】
化学と遺伝子学を組合わせる手法は、発癌タンパク質チロシンキナーゼであるｖ−Ｓｒｃの最初の独自の特異的細胞透過性阻害剤を得るために開発された。ｖ−Ｓｒｃを他のすべての細胞キナーゼから区別するために、機能的に沈黙である活性部位突然変異をｖ−Ｓｒｃ内で行った。野生種キナーゼを阻害しない、この突然変異体キナーゼの強束縛（ＩＣ50＝４３０ｎＭ）細胞透過性阻害剤が設計および合成された。インビトロおよび全細胞アッセイによって、突然変異体ｖ−Ｓｒｃ／阻害剤対独特の特異性が確認された。この阻害剤は、設計ｖ−Ｓｒｃの細胞発現の形質転換効果を逆転させるが、細胞形質転換に仲介される野生種ｖ−Ｓｒｃを阻害しない。これらの細胞系は、１個のタンパク質キナーゼ中の１個のアミノ酸のみが異なり、細胞情報伝達の劇的な変化が設計キナーゼの特異的阻害に起因するように設定する。本方法の普遍性は、別のタンパク質チロシンキナーゼを設計することによって試験された。本方法の普遍性は、該当する沈黙突然変異を含む別のタンパク質チロシンキナーゼＲｙｎを設計することによって試験された。
【０２０７】
同一の化合物は、この突然変異体キナーゼの強力な阻害剤（ＩＣ50＝８３０ｎＭ）であることもわかっており、複数のタンパク質チロシンキナーゼの対立遺伝子特異性阻害剤の作成に向けた戦略の普遍性を確かなものとしている。
【０２０８】
Ｓｒｃ科キナーゼそれぞれの対立遺伝子特異性細胞透過性阻害剤は、複合化学的、遺伝子的手法を使用して、迅速に開発することができる。独自に特異的なｖ−Ｓｒｃによる、突然変異体ｖ−Ｓｒｃ形質転換ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞の処理によって、形質転換の形態学的特徴が復帰する。阻害剤は、野生種ｖ−Ｓｒｃ対立遺伝子によって形質転換された細胞に影響を示さず、阻害剤処理によって誘起された表現型が、単一の阻害イベントの結果であることが強く示唆される。普遍的な方法でキナーゼ特異性阻害剤を迅速に生成する能力は、キナーゼ仲介細胞経路の逆畳込と、インビトロおよびインビボ両方での薬剤発見のための優れた標的としての新規キナーゼの確認のために有用である。
【０２０９】
以前に示したように、複合化学的、遺伝子的手法が開発されたことにより、合理的に設計された小型分子阻害剤によって独自に阻害される「化学的感受性」突然変異体キナーゼが生成できるようになる。前記手法は、機能的沈黙突然変異を用いて、興味のあるキナーゼの活性部位に独自のポケットを設計することを含む。次に、新規活性部位ポケットに適合するように設計された、かさ高い基を持つ既知のキナーゼ阻害剤を誘導体化することによって、設計キナーゼの特異性阻害剤が合成される。かさ高い基は、野生種キナーゼの阻害剤の効力を無効にする。したがって正常な相補的設計によって、設計キナーゼ／阻害剤錯体においてのみ可能な、好ましい結合相互作用が生まれる。設計キナーゼをコード化する遺伝子による細胞の形質移入によって、１種類のキナーゼのみが設計阻害剤によって阻害される細胞が生成される（図１３を参照）。
【０２１０】
重要なのは、突然変異体キナーゼが野生種キナーゼと同じ機能を果たすため、突然変異体の阻害剤が、非形質移入細胞における野生種キナーゼの選択的阻害剤と同じ方法で、細胞情報伝達に影響を及ぼす。タンパク質キナーゼの選択的阻害の後の、細胞の表現型を観察する能力によって、信号形質導入カスケードにおける個々の役割を判定するための迅速な方法が与えられる。
【０２１１】
ｓｒｃ系統群タンパク質チロシンキナーゼは、細胞機能の仲介において至るところで重要であるために、特異性阻害剤の設計の目標とされている。集中的な調査にもかかわらず、ｓｒｃ系統族メンバそれぞれの役割は、細胞の共局在化およびその高い配列同一性のために、評価するのが困難である。ｓｒｃ系統群キナーゼの強力な阻害剤も一部知られているが、これらの密接に関連した酵素を効率よく弁別できる分子（１個のｓｒｃ系統群メンバについて選択的に２０通り）は確認されていない。機能的に重要な２種類のｓｒｃキナーゼ、ｖ−ＳｒｃおよびＦｙｎは、突然変異体キナーゼ／阻害性対設計の主要な標的として選択された。Ｓｒｃキナーゼは乳癌、肺癌および結腸癌の発癌における暗示により、主な薬剤標的として出現した。ｖ−Ｓｒｃは発癌遺伝子タンパク質チロシンキナーゼのプロトタイプであるが、このキナーゼに対し高度に選択的な小型分子阻害剤は発見されていない。Ｆｙｎは、リンパ球活性化によって仲介されたＴ細胞受容体において重要な、ｓｒｃ系統群タンパク質チロシンキナーゼである。ＳｒｃおよびＦｙｎは同様の領域構造を共有し、その触媒作用領域において約８５％のアミノ酸同一性を有する。ｓｒｃ系統群メンバの密接な構造上の関係によって、相同性の高いキナーゼ間の酵素／阻害剤特異性を設計する能力を理想的に試験できる。細胞透過性阻害剤を用いて、これらの密接に関連するｓｒｃメンバを弁別できる場合、他のタンパク質キナーゼ系統群の特異性も同様の手法を用いて実現できる見通しである。
【０２１２】
物質および方法
化学合成：すべての開始物質および合成試薬は、別途記載しない限りＡｌｄｒｉｃｈより入手した。すべての化合物は1Ｈ  ＮＭＲおよび高解像度質量分析法によってキャラクタリゼーションした。４−アミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（２、図１４）はＨａｎｅｆｅｌｄらに従って合成した。
【０２１３】
化合物２のＮ−４アクリル化の基本手順（３ａ−３ｇ、図１４Ｂ）
２ｍｌのピリジンに溶解させた２の溶液（１００ｍｇ）に望ましい１０当量の塩化アクリルを０℃にて加えた。反応溶液は、温度を室温まで上昇させ、１２時間攪拌した。反応は２５ｍｌの水を加えてクエンチした。生じた混合物をジエチルエーテルによって抽出し、合わせたジエチルエーテル抽出物を１Ｎ塩酸および５％炭酸水素ナトリウムで洗浄した。ジエチルエーテル層は硫酸マグネシウムで乾燥させ、揮発させた。残留物を２５ｇのシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーでジエチルエーテル／ヘキサン＝１：１で溶出させて精製し、純粋な３ａ−３ｇを得た。
【０２１４】
４−シクロブチルアミド−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３ａ）：収量０．０１１６ｇ（１６％）、白色粉末；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ20Ｈ23Ｎ5Ｏについて計算した分子イオン  ３４９．１９０４９、検出値  ３４９．１８７６２；1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．８６（９Ｈ，ｓ）、１．８９−２．２７（６Ｈ，ｍ）、３．５８（1Ｈ，ｍ）、７．２６−７．６７（５Ｈ，ｍ）、８．６９（1Ｈ，ｓ）
４−シクロペンチルアミド−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３ｂ）：収量０．０４５６ｇ（６８％）、白色粉末；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ２1Ｈ２５Ｎ５Ｏについて計算した分子イオン  ３６３．２０６１５、検出値  ３６３．２０３９８；1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．４１−１．９１（８Ｈ，ｍ）、１．８７（９Ｈ，ｓ）、２．９７（1Ｈ，ｍ）、７．５１−７．６７（５Ｈ，ｍ）、８．７０（1Ｈ，ｓ）  ４−シクロヘキシルアミド−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３ｃ）：収量０．０５７５ｇ（８４％）、白色粉末；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ２２Ｈ２７Ｎ５Ｏについて計算した分子イオン  ；1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．２１−１．９３（１０Ｈ，ｍ）、１．８６（９Ｈ，ｓ）、２．４３（1Ｈ，ｍ）、７．５１−７．６７（５Ｈ，ｍ）、８．７０（1Ｈ，ｓ）
４−２’−フリルアミド−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３ｄ）：収量０．０３４２ｇ（６０％）、白色粉末；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ２０Ｈ１９Ｎ５Ｏ２について計算した分子イオン  ３６１．１５４０７、検出値  ３６１．１５２５４；1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．８７（９Ｈ，ｓ）、６．５２（1Ｈ，ｄ）、７．２３（1Ｈ，ｄ）、７．４３−７．５３（５Ｈ，ｍ）、７．９５（1Ｈ，ｓ）、８．５９（1Ｈ，ｓ）
４−ベンザミド−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３ｅ）：収量０．１３０９ｇ（５６％）、白色粉末；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ22Ｈ21Ｎ5Ｏについて計算した分子イオン  ３７１．１７９３３、検出値  ３７１．１７３２４；1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．４１−１．９１（８Ｈ，ｍ）、７．２２−８．１１（１０Ｈ，ｍ）、８．４８（1Ｈ，ｓ）
４−（ｐ−メチル）ベンザミド−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３ｆ）：収量０．０７５１ｇ（３３％）、白色粉末；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ23Ｈ23Ｎ5Ｏについて計算した分子イオン  ３８５．１９４９９、検出値  ３８５．１８７５１；1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．８８（９Ｈ，ｓ）、２．４２（３Ｈ，ｓ）、７．１９（２Ｈ，ｄ）、７．４１−８．１１（７Ｈ，ｍ）、８．４９（1Ｈ，ｓ）
４−（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチル）ベンザミド−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３ｇ）：収量０．１０５０ｇ（４２％）、白色粉末；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ26Ｈ29Ｎ5Ｏについて計算した分子イオン  ４２７．２３７４７、検出値  ４２７．２３４７４；1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．３５（９Ｈ，ｓ）、１．８８（９Ｈ，ｓ）、７．３８−７．９９（９Ｈ，ｍ）、８．５０（７Ｈ，ｓ）
Ｎ−４アクリル化合物のＮ−４メチレン化合物への還元の基本手順（４ｂ、４ｄ、４ｅ、図１４）
丸底フラスコに水素化アルミニウムリチウム３０ｍｇを加えた。フラスコは均圧滴下漏斗を備えており、無水アルゴンで洗浄した。水素化アルミニウムリチウムは、アイスバス超３ｍＬのＴＨＦで延長された。約１００ｍｇの該当するＮ−４アクリル２類似体をテトラヒドロフラン５ｍｌに溶解し、水素化アルミニウムリチウムの懸濁液中に滴下して加えた。反応混合物を氷浴上で３０分間攪拌し、次いで加熱して３０分間還流した。酢酸エチルエーテル１ｍｌ、水１ｍｌ、６Ｎ水酸化ナトリウム１ｍｌを連続的に滴下して加えて、反応をクエンチする。５分間攪拌した後、セライトパッドによって反応混合物を濾過し、水で希釈し、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル抽出物を合わせて、硫酸マグネシウム上で乾燥、揮発させた。残留物を１０ｇのシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーでヘキサン／酢酸エチルエーテル＝４：１で溶出させて精製した。
【０２１５】
４−シクロペンチルメチルアミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４ｂ）：収量  ０．０６４９ｇ（７５％）、透明油；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ２1Ｈ２７Ｎ５について計算した分子イオン  ；３４９．２２６９１、検出値３４９．２２４２０、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．１６−２．１４（９Ｈ，ｍ）、１．８４（９Ｈ，ｓ）、３．５４（２Ｈ，ｄ）、５．５１（1Ｈ，ｓ）、７．４６−７．６７（５Ｈ，ｍ）、８．４３（1Ｈ，ｓ）
４−２’−フリルメチルアミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４ｄ）：収量  ０．０６２０ｇ（６６％）、淡褐色粉末；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ20Ｈ21Ｎ5Ｏについて計算した分子イオン  ；３４７．１７４８３、検出値３７１．１７３３０、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．８３（９Ｈ，ｓ）、４．７５（２Ｈ，ｄ）、５．６４（1Ｈ，ｓ）、６．２５（２Ｈ，ｄ）、７．３４−７．６３（６Ｈ，ｍ）、８．４３（1Ｈ，ｓ）
４−ベンジルアミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４ｅ）：収量  ０．０５２０ｇ（５４％）、白色粉末；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ２２Ｈ２３Ｎ５について計算した分子イオン  ；３５７．１９５５９、検出値３５７．１９３０３、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）ｄ  １．８２（９Ｈ，ｓ）、４．７６（２Ｈ，ｄ）、５．６３（1Ｈ，ｓ）、７．２８−７．６３（１０Ｈ，ｍ）、８．４４（1Ｈ，ｓ）
タンパク質発現および精製：ＷＴ  ｖ−Ｓｒｃ  ＳＨ１領域、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ  ＳＨ１、ＷＴ  Ｆｙｎ、Ｔ３３９Ｇ  Ｆｙｎ、ＷＴ  Ａｂｌのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の遺伝子のｐＧＥＸ−ＫＴプラスミド内への部位指示突然変異誘発およびクローニングは、以前述べたように実施した。これらのキナーゼはＤＨ５ａ  Ｅ．  Ｃｏｌｉ内で発現させ、固定化グルタチオンビーズ（Ｓｉｇｍａ）で精製した。ＰＫＡは購入（Ｐｉｅｒｃｅ）し、さらに精製せずに使用した。ＰＫＣｄは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系（ｐＦａｓｔＢａｃ  Ｂベクター）を使用して、６−Ｈｉｓ作成物として発現された。ＰＫＣｄはＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムを用いて精製した。
【０２１６】
インビトロキナーゼ阻害アッセイ：推定キナーゼ阻害剤のＩＣ50は、ｓｒｃ系統群キナーゼ（ＩＹＧＥＦＫＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２））の最適化ペプチド基質に転写された32Ｐの分当たりカウント（ｃｐｍ）を測定して決定した。各種濃度の阻害剤は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１．６ｍＭグルタチオン、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１３３ｍＭ  ＩＹＧＥＦＫＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、３．５％ジメチルスルホキシド、０．０５ｍＭキナーゼ、１１ｎＭ（２ｍＣｉ）［ｇ−32Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，  ＮＥＮ）を用いて、最終体積３０ｍｌで３０分間培養した。反応混合物（２５ｍｌ）をホスホセルロース円板にスポットし、１０％酢酸に浸漬し、０．５％リン酸で洗浄した。32Ｐの転写は、標準シンチレーション計数によって測定した。ＩＣ50は、ｃｐｍが対照円板の５０％になる阻害剤の濃度に定義した。ＩＣ50が測定した２つの濃度の間まで低下した場合、２つのデータ点の間の阻害剤濃度とｃｐｍとの反比例関係の仮定に基づいて計算した。水溶液中の阻害剤類似体の溶解度限度は３００μＭであるため、２５０μＭに対するＩＣ50値は、阻害上限に対する全滴定とほぼ等しく試験できなかった。非ｓｒｃ系統群キナーゼのＩＣ50は、以下を例外として、等しく測定した。Ｋｅｍｐｔｉｄｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、１３３ｍｇ／ｍｌ）は、ＰＫＡの基質として使用した。最適化されたＡｂｌは、（ＥＡＩＹＡＡＰＦＡＫＫＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）１３３ｍｇ／ｍｌ）はＡｌｂアッセイのために使用された。ＰＫＣｄアッセイは１７ｎｇ／ｍｌジアシルグリセロール（Ｓｉｇｍａ）および１７ｎｇ／ｍｌホスファチジルセリン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、１７０ｎｇ／ｍｌヒストン（Ｓｉｇｍａ）をキナーゼ基質として実施した。
【０２１７】
ネズミＢ細胞アッセイ：脾臓リンパ球は６−２０週齢Ｂａｌｂ／ｃまたはＣ５７／Ｂ６マウスから単離した。細胞は脾臓から、１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ培養液に洗い出し、赤血球はｐＨ７．２の１７ｍＭ  ｔｒｉｓ−塩化アンモニウムに溶解させた。約４ｘ１０6の細胞を、３ｇまたは２の１００ｍＭ１．１％ジメチルスルホキシド溶液によって３７℃で３０分間培養した。Ｂ細胞刺激は、ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｃａｔ＃  １１５−００５−０７５）２ｍｇを追加し、次いで３７℃で５分間培養することによって開始した。細胞は遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、２分間）によって単離し、溶解させた（溶解緩衝液：１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭ  ＰＭＳＦ、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｍｇ／ｍｌアポプロチン）。次に細胞細片を１３，０００ｒｐｍで１５分間ペレット化した。細胞タンパク質は１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜に移した。タンパク質を含むホスホチロシンを、抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を用いた免疫ブロッティングによって描出した。
【０２１８】
ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞のレトロウィルス感染：ＷＴおよびＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃをコード化する遺伝子をパッケージング細胞系に形質移入し、述べられているように（Ｓｈａｈ，Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｓｈｏｋａｔ，Ｋ．Ｍ．，準備中）、ｐＢａｂｅレトロウィルスベクターおよびピューロマイシン（２．５ｍｇ／ｍｌ）選択可能マーカーを用いて、ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞にレトロウィルス感染させた。ＷＴおよびＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換細胞は、ＤＭＥＭ／２．５ｍｇ／ｍｌピューロマイシンを含む１０％ＢＣＳ中で培養した。
【０２１９】
ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞におけるｖ−Ｓｒｃの阻害：非形質転換ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、３７℃にて１．１％ＤＭＳＯまたは１００ｍＭ３の１．１％ＤＭＳＯ溶液によって培養した。１２時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し溶解させた（溶解緩衝液：１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭフッ化フェニルメチルスフホニル、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｍｇ／ｍｌアポプロチン）。溶解物は１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離にかけて清澄にした。溶解タンパク質濃度を規格化し、同じ体積の溶解物を電気泳動によって分解し、上述したようにホスホチロシン含有量について分析した。
【０２２０】
顕微鏡法：非形質転換、ＷＴ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換およびＩ３３８Ｇ形質転換のＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞を、組織培養処理スライド上でＤＭＥＭ／１０％ＢＣＳ中で培養した。細胞を発現するｖ−Ｓｒｃは１．１％ＤＭＳＯまたは１００ｍＭ３の１．１％ＤＭＳＯ溶液によって処理した。４８時間後、細胞をニコンＴＭＳ光学顕微鏡にて４００倍で撮影した。光学顕微鏡法の直後、細胞を３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で２０分間固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ中で６０秒間透過化処理した。透過化処理細胞は、２００ｎｇ／ｍｌファロイジン−ＦＩＴＣ／ＰＢＳで２０分間培養した。スライドはＰＢＳですすいで、重合アクチンは蛍光顕微鏡法により、ツァィス蛍光顕微鏡にて６００倍で描出した。
【０２２１】
結果
酵素設計：キナーゼのホスホ受容体特異性または生理作用を変化させずにグリシンに突然変異可能な、ｖ−Ｓｒｃ（Ｉｌｅ３３８）のＡＴＰ結合ポケット内の機能保存残基が開発された。空間作成突然変異によってＡＴＰのｋｃａｔが適度に減少し、Ｋmが適度に増加し、繊維芽細胞形質転換のレベルには定量的変化はなかった（Ｓｈａｋ  Ｋ，未発表の結果）。突然変異体ｖ−Ｓｒｃの生理基質は不変のままであり、Ｉ３３８Ｇｖ−Ｓｒｃは野生種ｖ−Ｓｒｃと同様の生理機能を行う。ＡＴＰ結合タンパク質キナーゼのすべての結晶構造によって、３３８（Ｓｒｃ番号付け）に該当する残基とＡＴＰの密接接触相互作用が明らかになった。タンパク質キナーゼ配列アラインメントの分析によって、既知の真核生物タンパク質キナーゼすべてにおいて、残基３３８がかさ高い側鎖（通常Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＰｈｅ）を含むことが確認された。したがって、３３８位置におけるグリシン突然変異は、野生種キナーゼには存在しない新しいポケットを作成するはずである。ＡＴＰ結合部位の拡張によって、グリシン突然変異体キナーゼは、野生種キナーゼを結合できなかったかさ高い阻害剤を受容する。標準方法を使用して、ＷＴおよびＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ触媒領域のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を、以前述べたように、クローニング、発現させ、精製した。ＷＴ  Ｆｙｎ、Ｔ３３９Ｇ  Ｆｙｎ（Ｓｒｃ番号付け）およびＷＴ  ＡｂｌもＧＳＴ融合タンパク質と同様に発現させ、精製した。
【０２２２】
阻害剤の設計および合成：基本設計戦略である、以前合成したＮ−６置換アデノシン分子のパネルに対する、ＷＴおよびＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ  ＳＨ１領域のＷＲ  ｖ−Ｓｒｃに対するＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの選択的阻害について試験する。アデノシンは唯一の中程度の阻害剤またはｓｒｃ系統群のタンパク質チロシンキナーゼであるため、設計キナーゼの強力な阻害剤を発見することは予想していなかった。予想通りに、Ｎ−６アデノシン類似体すべてが、ＷＴ  ｖ−ＳｒｃよりもＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃを阻害した。本スクリーニングで発見された最も強力な阻害剤は、Ｎ−６シクロペンチロキシアデノシン（１、図１４Ａ）であって、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃに対して１ｍＭの５０％阻害濃度（ＩＣ50）を有していた。選択性を試験する次の試験は、Ｎ−６シクロペンチロキシアデノシンは、４００ｍＭまでの濃度ではＷＴ  ｖ−ＳｒｃまたはＦｙｎのインビトロ阻害は検出されなかったことを示した。設計によって我々は、従来の阻害剤発見における主な問題である選択性障壁をただちに克服できたため、この最初のスクリーニングに促されて、我々はＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの新規阻害剤の開発戦略を追求した。
【０２２３】
アデノシン類似体は、アデノシンに結合した多数の細胞タンパク質と同様に、アデノシンによって多くの細胞機能が行われるため、阻害剤として理想的ではない。Ｎ−６アデノシン類似体は、アデノシン受容体作用物質および拮抗物質として作用することが証明されており、Ｎ−６アデノシン類似体がヌクレオチドキナーゼの基質として作用することが想像できる。これらの理由により、生物学的に既知の分子の直接類似体ではない、既知のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤のクラスを使用した。本設計戦略は、複数の野生種キナーゼに対して強力な阻害性を示す核構造を必要とし、容易に合成できる。また、酵素活性部位内の分子の結合方向も既知であるか、ただちに予測できなければならない。さらに前記分子は、Ｉｌｅ３３８の方を示している部位を容易に変更できるように結合する必要がある。核阻害剤構造として、４−アミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（２，図１４Ｂ）を使用した。本分子は、Ｈａｎｋｅおよび共同研究者が強力なｓｒｃ系統群キナーゼ阻害剤として報告した、４−アミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（ｐ−メチルフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ＰＰ１）の誘導体である。一般的なキナーゼ阻害剤ケルセチン（５、図１５Ａ）に結合したｓｒｃ系統群キナーゼ、Ｈｃｋの共結晶構造に基づいて、２がｓｒｃ系統群キナーゼに、ＡＴＰと似た配座で結合することが仮定された。Ｈｃｋにおける２の予想結合配向は、ＡＭＰ  ＰＮＰ（６）およびケルセチン（図１５Ｂ）の既知のＨｃｋ共結晶構造へのオーバーレイに示されている。この配座において、容易に誘導体化できる２のＮ−４位置は、ＡＴＰのＮ−６（残基３３８に密接に接触、図１５Ｃ）に相当する。そしてｔｅｒｔ−ブチル部分は、ＡＴＰのリボース環にほぼ相当する。この配向において、２のＣ−３フェニル環は、Ｈｃｋ／ケルセチン共結晶構造で見られるように、ＡＴＰのＮ−７を取り囲むポケット内で結合することが仮定されている。この分析によって、我々は２のＮ−４誘導体化類似体の小規模なパネルを合成することになる（図１４）。
【０２２４】
独自の選択性を持つ阻害剤の同定：ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンのパネルは、ＷＴおよびＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃキナーゼに対してスクリーニングした。すべての類似体は野生種と比較して、設計ｖ−Ｓｒｃのより優れた阻害剤であり、キナーゼ活性部位における２の結合配向の予想が確認される。２のＮ−４位置での誘導体化によって、ＷＴ  ｖ−Ｓｒｃに対する阻害活性が無効になる（溶解度限度３００ｍＭにおいて阻害は検出できない）。１０個の類似体すべてが、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの測定可能な阻害を示し、複数の化合物のＩＣ50値は低いｍＭ範囲にある。Ｎ−４−（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチル）ベンザミド−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル類似体（図１５の３ｇ）は、パネル中でＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの最も強力な阻害剤である（ＩＣ50＝４３０ｎｍ）。本分子は、３００ｍＭにおいてＷＴ  ｖ−Ｓｒｃの阻害を示さず、３ｇが野生種と比較すると、少なくとも１０００倍強力な突然変異体ｖ−Ｓｒｃの阻害剤であることが示唆される。Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ活性部位のマイクロモル未満の活性を実現するのに必要な誘導体化の大きさは、かなり予想外であった。４個の炭素分子のみがＡＴＰ結合部位から除去され、１１個の炭素原子を持つ親分子を誘導体化する。この不一致は結合予測での不完全のせいであり得る。ＩｌｅからＧｌｙへの突然変異も酵素活性部位により大きな柔軟性を与え、突然変異体キナーゼが予想以上に大きい阻害剤類似体を受容できるようになる。３ｇがＩ３３８ＧをＡＴＰ結合部位で阻害することを確認するために、各種ＡＴＰ濃度における阻害動態が調査された。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ分析によって、約４００ｎＭの阻害定数（Ｋｉ）を持つＡＴＰに関して、３ｇがＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃを競合的に阻害しないことが確認された。
【０２２５】
次に、阻害剤類似体のパネルがこのキナーゼと交差反応する可能性を調査するために、ＷＴ  Ｆｙｎに対してスクリーニングした。公表された親分子ＰＰ１および２（図１４）が非常に強力な（低いｎＭの）Ｆｙｎ阻害剤であるため、ＷＴ  Ｆｙｎは野生種キナーゼの「最悪の」対照として選択された。１０種類の合成類似体の多くは、標的キナーゼに対して高い選択性を示さなかった。飽和環系を持つＮ−アクリル類似体（３ａ−３ｃ、図１４）は野生種Ｆｙｎを効率よく阻害する。Ｎ−メチレン化合物（４ｂ、４ｄ、４ｅ、図１４）はＷＴ  Ｆｙｎに対して十分に直交であるが、設計ｖ−Ｓｒｃに対しては低から中程度の阻害性しか示さない。重要なのは、突然変異体ｖ−Ｓｒｃの最も強力な阻害剤である３ｇ（図１４）が、ＷＴ  Ｆｙｎをきわめて弱くしか阻害しなかったことである（ＩＣ50＝３００ｍＭ）。そのため、３ｇは設計ｖ−Ｓｒｃを、前記分子に最も結合しやすい野生種細胞キナーゼと考えられるＷＴ  Ｆｙｎの７００倍も効率よく阻害する。試験を行った他の非−ｓｒｃ系統群キナーゼは、インビトロで３ｇに偶発的に阻害された。セリン／トレオニンキナーゼ、ＰＫＣｄおよびＰＫＡは、３００ｍＭの濃度までは検出可能なほど阻害されなかった。同様に、３ｇはＡｂｌタンパク質チロシンキナーゼに対して非常に弱い阻害性（ＩＣ50＞３００）しか示さなかった。したがって３ｇは、ある設計キナーゼの強力な選択性阻害に関する初期設計のすべての要件を満足した。
【０２２６】
細胞全体における選択性：３ｇ（図１４）が野生種タンパク質チロシンキナーゼを阻害しないことをさらに証明するために、リン酸化カスケードに仲介された３ｇ処理の細胞受容体（ＢＣＲ）に対する影響を調査した。Ｓｒｃ科（Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ）および非Ｓｒｃ科タンパク質チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ、Ｓｙｋ）は、ＢＣＲ架橋によって活性化することが知られている。ＢＣＲ仲介カスケードの増幅特性により、これらのキナーゼの阻害は、活性化後の細胞ホスホチロシンの分布および強度を劇的に変化させる。３ｇは野生種キナーゼの活性部位と立体的に適合しないように設計されていたため、野生種Ｂ細胞に依存するチロシンリン酸化を阻害することはない。抗原受容体架橋ネズミＢ細胞による１００ｍＭ  ３ｇの処理は、Ｂ細胞刺激のリン酸チロシンパターンに何の影響も与えない。すべての主要なバンドの信号伝達強度は不変であり、一部の少数のバンドがいくらか減少していることが検出され、ＢＣＲ架橋によって活性化されるタンパク質チロシンキナーゼのパネルを感知できるほど阻害しないことが確認される。しかし、Ｂ細胞を１００ｍＭ２によって処理すると、チロシンリン酸化が著しく低下し（図４、レーン４）、このことは野生種ｓｒｃ系統群キナーゼの強力な阻害性と矛盾しない。
【０２２７】
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におけるＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの選択性阻害：選択性阻害剤を使用してＳｒｃ仲介経路を研究するために、ＷＴおよびＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの両者をレトロウィルス的にＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞に導入した。これらの細胞は、ｖ−Ｓｒｃ発現から独立した形質転換表現型を獲得する。３ｇ（図１４）は、ＷＴ変換細胞には影響を与えずに、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換細胞のＳｒｃ依存性信号伝達形質導入経路を選択的に阻害できることが示された。ＷＴ  ｖ−Ｓｒｃ感染細胞の処理（１００ｍＭ  ３ｇ）によって、対照のＤＭＳＯ処理レーン（図１６）に比較するとチロシンリン酸化の損失は生じず、設計阻害剤がＷＴ  ｖ−Ｓｒｃ、またはｖ−Ｓｒｃ仲介細胞形質転換によって活性化されたタンパク質チロシンキナーゼのいずれも阻害しないことが証明される。Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換細胞を同様に処理すると、推定ｖ−Ｓｒｃ基質ｐ３６のチロシンリン酸化の劇的な低下が生じると同時に、ホスホチロシンの細胞レベルでは中程度の全体的な低下が生じる。以前に、ｖ−Ｓｒｃ形質転換細胞を一般的なタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤によって処理留守と、３６ｋＤタンパク質のチロシンリン酸化が生じることが示された。ｐ３６は特異的なホスホチロシンホスフェターゼと結合しており、おそらく阻害剤処理細胞における迅速な脱リン酸化を明らかにすると考えられる。
【０２２８】
Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ発現細胞（５０ｍＭ）におけるｐ３６ホスホチロシン信号の３ｇのＩＣ50は、インビトロの値のほぼ１００倍である。これはおそらく阻害剤が、細胞実験におけるキナーゼ活性部位のミリモル濃度のＡＴＰと競合しなければならないことによるものである。
【０２２９】
形質転換細胞の形態を逆転させるＩ３３８Ｇ突然変異ｖ−Ｓｒｃの選択性阻害：ｖ−Ｓｒｃ活性は、哺乳類細胞のラウス肉腫ウイルス形質転換に必要である。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を発現するＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃを１００ｍＭ  ３ｇ（図１４）で処理すると、形質変換の逆転と一致して、細胞の形態が劇的に変化した（図１７）。阻害剤３ｇで処理した突然変異細胞は、平坦に見え、形質転換細胞の成長の特徴（すなわち、相互の上部に成長する能力）を示さなかった。ＷＴ  ｖ−Ｓｒｃ感染細胞は同一条件下で、形質転換細胞のプロトタイプの丸型形態および重複清澄パターンを示した。
【０２３０】
細胞形態の選択的逆転をさらに証明するために、蛍光顕微鏡法を使用して、細胞重合アクチンをファロイジン−ＦＩＴＣで染色してから３ｇ処理細胞を観察した（図１７）。非形質転換ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、細胞上に渡って形成される長いアクチン紡錘体を示している。ｖ−Ｓｒｃ形質転換細胞（ＷＴとＩ３３８Ｇの両方）は、アクチン形成の識別可能なパターンを持たず、丸型に見える。光学顕微鏡データによると、阻害剤で処理したＷＴ  ｖ−Ｓｒｃ発現細胞は、未処理ＷＴ細胞と区別がつかないように見える。しかし、３ｇで処理したＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ発現細胞は、重合アクチンストリングの範囲を限定し、非形質転換ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞のアクチン形成に非常によく似ている。これらの阻害剤処理細胞は、異常に平坦な形態をとり、非形質転換ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞には存在しない周囲のアクチン染色を示した。このデータは、興味のあるキナーゼにおいて１つのアミノ酸変化を含むように設計された細胞内で、３ｇが独自に形態変化を誘起することを示している。このことは、タンパク質チロシンキナーゼ発癌生成物に対して選択的な小型分子阻害剤が、細胞形質転換に関係する形態変化を復元できることを初めて証明する。ハービマイシンＡ（および他のベンゾキノンアンサマイシン）による形質転換の形態復帰の以前の例は、発癌タンパク質チロシンキナーゼのプロテアソームに対する熱ショックタンパク質（ｈｓｐ９０）仲介ターゲティングより成る、キナーゼ阻害とは関係のない機構によって作用することが最近証明された。
【０２３１】
他のキナーゼへの一般化：興味のある酵素と他の酵素すべての独特の分子の差異を与えるために突然変異誘発を使用すること利点は、保存キナーゼ集団により、キナーゼ上科に対して手法が拡張可能であることである。ほぼすべての既知タンパク質キナーゼは、ｖ−Ｓｒｃの残基３３８に該当する位置にかさ高い側鎖を持っている。そのためこの位置に突然変異を作成する空間は、複数のキナーゼを選択性阻害に対して感受性にする。このことを試験するために、Ｔ３３９Ｇに対する類似体の阻害を測定した。Ｉ３３８  ｖ−ＳｒｃおよびＴ３３９Ｇ  Ｆｙｎの類似体の構造活性関係には、驚くべき類似性がある。Ｉ３３８  ｖ−Ｓｒｃのデータによると、３ｇはＴ３３９Ｇ  Ｆｙｎに対する最も強力な阻害剤類似体であり、ＩＣ50は８３０ｎＭを示す。このデータは、推定阻害剤の大型のライブラリをスクリーニングせずに、複数のタンパク質を、優先的にある阻害剤類似体を受容するように、系統的に設計できることを暗示している。
【０２３２】
上記では、化学的感受性のキナーゼおよび合理的に設計された阻害剤の相補的設計による選択性タンパク質キナーゼ阻害への新たな手法について述べている。標的キナーゼに対する高い選択性は、細胞全体で実現可能であり、発癌タンパク質チロシンキナーゼの活性部位阻害が形質転換細胞の形態を十分阻害できることが証明された。前記手法は容易に一般化できるため、信号伝達経路の逆畳込はもちろんのこと、焼く税設計の標的としてのキナーゼの評価にも広範囲に応用できるはずである。効率のよい薬剤発見のペースは、重要な薬剤標的の同定および評価によって制限される。これは２０００種類の相同タンパク質がある環境ではささいな問題ではない。タンパク質キナーゼの化学的感受性突然変異体を使用することは、薬理的キナーゼ阻害の細胞および生理的効果を調べる能力を拡張する。形質移入細胞系および「ノックイン」マウスでさえ現在では迅速に作成できるため、前記手法は、所与のキナーゼの細胞全体または動物モデルにおける選択性阻害の効果を試験するプロセスを著しく促進させるはずである。さらに多くの阻害剤結合タンパク質キナーゼ結晶構造が利用できるようになると、この戦略によって、信号伝達カスケード全体の範囲での、所与のキナーゼの時間および用量依存性阻害の効果に関する系統的調査が可能となる。
【０２３３】
実施例１７
化学的遺伝子手法による突然変異体ナノモルタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の生成
本明細書の実験に基づいて、キナーゼ／阻害剤対の指示された構造ベースの設計により、従来の阻害剤スクリーニング法によって達成されていない作用強度を持つ、設計Ｓｒｃ科キナーゼの突然変異体特異性の、細胞透過性阻害剤が得られた。ｖ−Ｓｒｃの活性部位を突然変異させることにより、他のすべてのキナーゼのうち１つのタンパク質キナーゼを分化するだけでなく、同時に、さらに強力な阻害剤の設計に用いる、新たにアクセス可能な結合部位を作成した。このように、従来の阻害剤設計戦略に比べて、作用強度および選択性の両方を向上させることができる。設計は、ｖ−ＳｒｃのＩｌｅ３３８に該当する部位におけるキナーゼの保存によって、高度に一般化が可能である。実際に最近の研究によって、有糸分裂誘発因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のピリジニルイミダゾール阻害剤に対する感受性は大部分が、Ｓｒｃの３３８に該当する残基１０６の側鎖によって制御されることが示された。タンパク質キナーゼ機能を研究するための選択性キナーゼ阻害剤設計への手法の主要な利点は、小型分子による独自の阻害のために、興味のあるキナーゼを遺伝子的に「プログラムする」能力である。これによって、特異性キナーゼの活性を誘起表現型に明確に割り当てることができる。遺伝子操作と酵素活性の小型分子制御の組合わせは、細胞はもちろん生体全体における生育性薬剤標的としてのタンパク質キナーゼの薬理評価において、幅広く応用できるはずである。
【０２３４】
物質および方法
タンパク質発現および精製：野生種ｖ−Ｓｒｃ触媒活性領域Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ  ＳＨ１およびＷＴ  Ｆｙｎのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の遺伝子の、ｐＧＥＸ−ＫＴプラスミドへの部位指定突然変異誘起およびクローニングは、以前述べたように実施した。これらのキナーゼはＤＨ５ａ  Ｅ．Ｃｏｌｉで発現され、固定グルタチオンビーズ（Ｓｉｇｍａ）で精製した。
【０２３５】
インビトロキナーゼ阻害アッセイ：推定キナーゼ阻害剤のＩＣ50は、ｓｒｃ系統群キナーゼ（ＩＹＧＥＦＫＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２））の最適化ペプチド基質に転写された32Ｐの分当たりカウント（ｃｐｍ）を測定して決定した。各種濃度の阻害剤は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１．６ｍＭグルタチオン、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＩＹＧＥＦＫＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、３．３％ジメチルスルホキシド、適切なキナーゼ、１１ｎＭ（２ｍＣｉ）［ｇ−32Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＮＥＮ）を用いて、最終体積３０ｍｌで３０分間培養した。反応混合物（２５ｍｌ）をホスホセルロース円板にスポットし、１０％酢酸に浸漬し、０．５％リン酸で洗浄した。32Ｐの転写は、標準シンチレーション計数によって測定した。ＩＣ50は、ｃｐｍが対照円板の５０％になる阻害剤の濃度に定義した。ＩＣ50が測定した２つの濃度の間まで低下した場合、２つのデータ点の間の阻害剤濃度とｃｐｍとの反比例関係の仮定に基づいて計算した。
【０２３６】
化学合成：すべての開始物質および合成試薬は、別途記載しない限り民間供給者より入手した。ただちに商業的に入手できなかった酸塩化物（３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｈ、３ｉ）は、該当するカルボン酸を過剰の塩化オキザリルおよび触媒作用ＤＭＦのジエチルエーテル溶液で処理した。すべてのＰＰ１類似体はＨａｎｅｆｅｌｄらに従って合成した。
【０２３７】
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１−ナフチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ａ、図１８）
白色粉末、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3）ｄ  １．９２（ｓ，  ９Ｈ）、５．０４（ｍ，  ２Ｈ）、７．４３−７．７３（ｍ，  ４Ｈ）、７．９２−８．０２（ｍ，  ３Ｈ）、８．３４（ｓ，  1Ｈ）；Ｃ19Ｈ19Ｎ5について計算したＨＲＭＳ（ＥＩ）分子イオン  ３１７．１６４２７、検出値３１７．１６２４７
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（２’−ナフチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ｂ、図１８）
白色粉末、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3）ｄ  １．８８（ｓ，  ９Ｈ）、５．５５（ｍ，  ２Ｈ）、７．５６−８．００（ｍ，  ６Ｈ）、８．３９（ｓ，  1Ｈ）；Ｃ19Ｈ19Ｎ5について計算したＨＲＭＳ（ＥＩ）分子イオン  ３１７．１６４２７、検出値３１７．１６３５９
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｍ−フェノキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ｃ、図１８）
白色粉末、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3）ｄ  １．８３（ｓ，  ９Ｈ）、５．６１（ｍ，  ２Ｈ）、７．０８−７．４９（ｍ，  ２Ｈ）、７．０８−７．４９（ｍ，  ９Ｈ）、８．３５（ｓ，  1Ｈ）；Ｃ21Ｈ21Ｎ5について計算したＨＲＭＳ（ＥＩ）分子イオン  ３５９．１７４８３、検出値３５９．１７３２５
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｍ−ベンジロキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ｄ、図１８）
白色粉末、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3）ｄ  １．８５（ｓ，  ９Ｈ）、５．１７（ｓ，  ２Ｈ）、５．５５（ｍ，  ２Ｈ）、５．７４（ｓ，  ２Ｈ）、７．１０（ｄ，  Ｊ＝８Ｈｚ，  1Ｈ）、７．２７−７．４８（ｍ，  ８Ｈ）、８．３４（ｓ，  1Ｈ）；Ｃ22Ｈ23Ｎ5Ｏについて計算したＨＲＭＳ（ＥＩ）分子イオン  ３７３．１９０４９、検出値３７３．１８８３３
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｍ−（２’，６’−ジクロロ）ベンジロキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ｅ、図１８）白色粉末、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3）ｄ  １．８５（ｓ，  ９Ｈ）、５．３６（ｍ，  ２Ｈ）、５．７４（ｓ，  ２Ｈ）、７．１１−７．５１（ｍ，  ７Ｈ）、８．３６（ｓ，  1Ｈ）；Ｃ22Ｈ21Ｎ5Ｏについて計算したＨＲＭＳ（ＥＩ）分子イオン  ４４１．１１２６３、検出値４４１．１１０５０
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−ピペロニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ｆ、図１８）
白色粉末、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3）ｄ  １．８３（ｓ，  ９Ｈ）、５．７０（ｍ，  ２Ｈ）、６．０５（ｓ，  ２Ｈ）、６．９６（ｄ，  Ｊ＝８Ｈｚ，  1Ｈ）、７．１３−７．２７（ｍ，  ２Ｈ）、８．３４（ｓ，  1Ｈ）；Ｃ16Ｈ17Ｎ5Ｏ2について計算したＨＲＭＳ（ＥＩ）分子イオン  ３１１．１３８４１、検出値３１１．１３７７７
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ｇ、図１８）
白色粉末、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3）ｄ  １．３８（ｓ，  ９Ｈ）、１．８４（ｍ，  ９Ｈ）、５．８３（ｓ，  ２Ｈ）、７．５８（ｄｄ，  Ｊ＝８Ｈｚ，  １２Ｈｚ，  ２Ｈ）、８．３３（ｓ，  1Ｈ）；Ｃ19Ｈ25Ｎ5について計算したＨＲＭＳ（ＥＩ）分子イオン  ３２３．２１１２５、検出値３２３．２１０２４
４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフチルメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ｈ、図１８）
白色粉末、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3）ｄ  １．８５（ｓ，  ９Ｈ）、４．７６（ｓ，  ９Ｈ）、５．０４（ｓ，  ２Ｈ）、７．１９（ｄ，  Ｊ＝６Ｈｚ，  1Ｈ）、７．３９（ｔ，  Ｊ＝８Ｈｚ，  1Ｈ）、７．５５（ｔ，  Ｊ＝４Ｈｚ，  ２Ｈ）、７．７９−７．９２（ｍ，  ２Ｈ）、８．２０（ｄ，  Ｊ＝８Ｈｚ，  1Ｈ）、８．２４（ｓ，  1Ｈ）；Ｃ20Ｈ21Ｎ5について計算したＨＲＭＳ（ＥＩ）分子イオン  ３３１．１７９９３、検出値３３１．１７９５１  ４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（１’−ナフトキシメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ｉ、図１８）
淡褐色粉末、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨＺ  ＣＤＣｌ3）ｄ  １．８３（ｓ，  ９Ｈ）、５．５７（ｍ，  ２Ｈ）、６．１２（ｓ，  ２Ｈ）、７．０７（ｄ，  Ｊ＝６Ｈｚ，  1Ｈ）、７．３９−７．５４（ｍ，  ４Ｈ）、７．８４（ｄ，  Ｊ＝８Ｈｚ，  1Ｈ）、８．２５（ｄ，  Ｊ＝８Ｈｚ，  1Ｈ）、８．３５（ｓ，  1Ｈ）；Ｃ20Ｈ21Ｎ5Ｏについて計算したＨＲＭＳ（ＥＩ）分子イオン  ３４７．１７４８３、検出値３４７．１７４０８
結果
阻害剤の設計およびモデル化：最初に、Ｓｒｃ系統族キナーゼ阻害剤４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンのＮ4環外アミンを、かさ高い基に束縛される化学かぎとして利用して、野生種キナーゼに対する分子の親和性を破壊した（１は、Ｈａｎｋｅらが報告した、ＰＰ１のｄｅｓ−メチル修飾類似体）。この手法によって、設計ｖ−Ｓｒｃキナーゼ（Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ）の非常に選択性の高い阻害剤（２、図１９）が得られたが、野生種Ｓｒｃ科キナーゼに対する親分子の開始親和性から結合エネルギーが１桁以上も失われたため、完全に満足できるものではなかった（図１９を参照）。
【０２３８】
阻害剤の作用強度を向上させるために、１の結合をＳｒｃ科キナーゼＨｃｋの活性部位においてモデル化した。分子グラフィックスプログラムＧＲＡＳＰを使用して、設計タンパク質キナーゼＴ３３８Ｇ  Ｈｃｋの拡張ポケットの該当する予想マップを備えた、タンパク質をＨｃｋのＡＴＰ結合ポケットの表面マップと比較した。このモデルから、Ｎ4の誘導体化が、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの独自の結合ポケットとの相補的ファンデルワールス相互作用を生成する唯一の手段でないことが推論された。表面マップより、かさ高い基を持つ１のＣ3フェニル環（たとえばナフチル環系と置換されたフェニル環、化合物６ａ）の誘導体化は、誘導体化阻害剤およびＴｈｒ３３８によって作成された分子表面の間の立体的衝突につながることがわかる。残基３３８がグリセリンに突然変異すると、１のナフチル類似体を受容するのに十分な大きさであることが予想される、独自の結合ポケットが生成する。疎水性置換基を持つこのフェニル基の誘導体化によって、Ｎ4における潜在的な水素結合相互作用を阻害せずに、該当するＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ活性部位を補完する化合物が与えられる。さらにＣ3部分のおけるこの追加バルクによって、これらの分子は、野生種タンパク質チロシンキナーゼの活性部位と立体的に不適合となり、適切な設計ｖ−Ｓｒｃに高い特異性を与える。
【０２３９】
阻害剤合成およびスクリーニング：Ｃ3誘導体化ＰＰ１類似体（６ａ−６ｉ）の小規模なパネルを図１８に示すように互生した。修飾阻害剤のグループは、細菌中に発現させ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として精製した、標的キナーゼＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの触媒作用領域に対してスクリーニングした。Ｃ3誘導体化類似体はすべて、Ｎ4誘導体化タンパク質の第一世代より同定された最も強力な分子（２、ＩＣ50＝４３０ｎＭ）（表３を参照）よりも、狭量なＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの阻害剤である。４種類の分子（６ａ、６ｂ、６ｄ、６ｈ）は、最大の作用強度（ＩＣ50＝１．５ｎＭ）２つのナフチル異性体（６ａ、６ｂ）によって、低ｎＭ濃度にて標的キナーゼを阻害する。前記アッセイの条件下で、親分子ＰＰ１はその最適標的であるＦｙｎをわずかＩＣ50＝３０ｎＭにて阻害した。このデータは、酵素設計と指示小型分子設計と組合わせた阻害剤設計戦略が、大規模なライブラリのスクリーニングによって同定された分子の作用強度に適合するだけではなく、野生種キナーゼの以前最適化された阻害剤を超える、大幅な親和性の向上（６ａ、６ｂの場合、２０倍）につながることを示している。式６ａおよび６ｂを持つ化合物は、これまでに報告されているＳｒｃ科タンパク質チロシンキナーゼの最も強力な阻害剤である。
【０２４０】
【表３】
0004876239.tif 000011
【０２４１】
重要なのは、９種類の分子すべてが、野生種酵素に関しては、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃに対して著しい選択性を示していることである。インビトロ選択性は、ピペロニル化合物（６ｆ）の１２０から、ナフトキシメチル誘導体（６ｉ）の＞６５００という高い値にまで及んでいる。この範囲は、Ｎ4誘導体化によって生成された選択性に似ており、親阻害剤の結合配向はもちろんのこと、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの拡張結合部位のモデル化という予測をどちらも根拠のあるものにしている。これらの選択性は、タンパク質設計を小型分子認識と組合わせる他の戦略はもちろん、突然変異体の大規模なプールから堅く結合したタンパク質を同定する選択技術を利用する戦略による選択性に都合よく比較される。
【０２４２】
標的キナーゼに対する選択性をさらに確認するために、パネルを野生種Ｆｙｎに対してスクリーニングした（表３）。ＦｙｎはＰＰ１によってさらに強力に阻害されるため、これはむしろ、おそらく、野生種キナーゼｖ−Ｓｒｃの緊縮調節阻害である。４種類の最も強力な阻害剤のうちの３種類（６ａ、６ｄ、６ｈ、図１８）は、野生種Ｆｙｎに関しては、標的キナーゼに対して十分な選択性（１００倍）を示した。Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの最も強力な阻害剤６ａは、野生種Ｆｙｎを６００ｎＭで結合し、設計標的に対して４００倍の選択性を示した。
【０２４３】
標的キナーゼの細胞阻害：２つの細胞培養系を用いて、細胞全体における化合物６ａの特異性キナーゼ阻害剤としての利用について調査した。最初に、野生種またはＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃのどちらかを発現するＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞は、レトロウィルス感染によって生成させた。ｖ−Ｓｒｃは高度に活性化された発癌タンパク質チロシンキナーゼであるため、これらの細胞におけるチロシンリン酸化の大半は、ｖ−Ｓｒｃ発現の結果である。設計ｖ−Ｓｒｃの選択的阻害を調べるために、細胞を発現する野生種およびＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃの両方を、６ａの各種濃度で培養した。これらの細胞に由来する溶解物の抗ホスホチロシンブロットは、６ａが濃度依存的な方法で、チロシンリン酸化を数分以内に著しく減少させることを証明した（図２０、レーン３−８）。インビトロ強度にしたがって、６ａによるリン酸チロシン信号の除去は、同じ細胞系の最も強力なＮ4誘導体化類似体によって行われる除去よりも、はるかに迅速で完全である。５００ｎＭ  ６ａの存在下で細胞を発現する野生種ｖ−Ｓｒｃは、ホスホチロシン信号の消失を示さず（レーン１および２）、数日間は化合物の存在下で成長することができ、チロシンリン酸化または見かけの細胞毒性の消失を示さない。
【０２４４】
６ａの選択性をさらに確認するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（設計キナーゼを含まないヒト由来Ｔ細胞系）を、ホスホチロシンホスフェターゼの活性部位において触媒作用的に必須のシステインと共有結合する、一般的なタンパク質チロシンホスフェターゼ阻害剤である過バナジン酸塩で処理した。過バナジン酸が存在すると、ホスホチロシンの細胞平衡が効率よく移動され、チロシンリン酸化が大幅に上昇する（図２０を参照、レーン１０をレーン９と比較）。これらの細胞を５００ｎＭ  ６ａで処理すると（レーン１１）、リン酸化は検知できるほど低下せず、Ｊｕｒｋａｔ細胞中の野生種タンパク質チロシンキナーゼはいずれも、設計阻害剤によって感知できるほどは阻害されないことが示される。ＰＰ１は、野生種キナーゼの阻害に対する性の制御として１０μＭで使用した（レーン１２）。１０μＭの濃度では以前、チロシンリン酸化に仲介されたＴ細胞受容体を強力に抑制することが証明されている。
【０２４５】
細胞形質転換の選択性阻害：選択性の高い阻害剤が迅速に生成されることは、薬剤標的としてのタンパク質キナーゼの薬理評価において、幅広く応用できるはずである。この考えを試験するために、化合物６ａ（図１８）が、標的キナーゼを発現する細胞内における発癌形質転換を選択的に阻害できるかどうかを調べた。正常なＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞は、細胞にわたって重合アクチンの長い繊維があり、ローダミンに結合したファロイジンによって細胞を染色して描出ことができる（図２１Ａ）。発癌性タンパク質を発現する細胞（野生種またはＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃのどちらか）は円形であるため、アクチンの拡散パターンがある（図２１Ｂ）。６ａによって処理した野生種ｖ−Ｓｒｃ発現細胞は、未処理野生種細胞とは区別できないように見え、６ａがこの非突然変異体細胞系に対して何の影響も及ぼさないことが示唆される。しかし、標的キナーゼを発現する細胞は、２５０ｎＭ  ６ａで１６時間培養した場合に、透明なアクチン繊維を持ち、正常なＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞と区別できないように見える。このデータより、ｖ−Ｓｒｃの触媒作用活性による小型分子阻害は、発癌におけるその役割を阻止するのに十分であることが明らかである。
【０２４６】
実施例１８
特異的阻害のための、選択タンパク質キナーゼを標的とする汎用化学スイッチの開発
上記の例で、Ｓｒｃ科タンパク質チロシンキナーゼは、野生種タンパク質キナーゼには存在しない独自の結合ポケットを含むように設計された。これらの突然変異体は、突然変異体の活性部位拡大を補完するように変更されたＳｒｃ科選択的阻害剤ＰＰ１の誘導体（１０、図２８）（８５−８７）に対して、独自の感受性を持つ。これまでに同定されているタンパク質キナーゼはすべて、この手法によって用いられる保存活性部位の特徴を備えている（８８）。しかしＰＰ１の骨組みはＳｒｃ科キナーゼには選択的であり、幅広く一般化できる、上科のキナーゼを阻害するための戦略はおそらく適用されないだろう（非常に異なるキナーゼ系統群にわたる幅広い応用のための、理想的な親化合物ではない）（８５）。したがって、特異的阻害のための、選択されたタンパク質キナーゼを迅速に標的とするために使用できる、さらに無差別のキナーゼ阻害剤に基づいて、一般的な化学スイッチを開発することが望ましい。
【０２４７】
インドロカルバゾール天然生成物（＋）Ｋ２５２ａおよび突然変異体キナーゼ：キナーゼ／阻害剤の界面を再設計するために、インドロカルバゾール天然生成物（＋）Ｋ２５２ａ（１、図２２Ａ）を選択した。前記生成物は次の３つの重要な設計基準を満足する：１）１はタンパク質キナーゼの多くの異なる系統群を阻害する；２）１の結合配向はただちに予想できる；３）１の合理的に誘導体化された類似体は合成によって得やすい。Ｋ２５２ａは非常に一般的なタンパク質キナーゼ阻害剤であり、密接に関連する化合物スタウロスポリン（２、図２２Ａ）と同一の配向でキナーゼ活性部位と結合することが予想された。Ｋ２５２ａは、タンパク質キナーゼＣ、タンパク質キナーゼＡ、ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、ミオシン軽鎖キナーゼ、Ｔｒｋ系統群チロシンキナーゼの強力な（ＩＣ50≦３０ｎＭ）阻害剤であることが報告されている（８９、９０）。本実施例は、同一の分子がＳｒｃ科キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、カルモジュリン依存性キナーゼを効率よく阻害することを示している（図２７）。タンパク質キナーゼＡ（９１）、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）（９２）およびＬｃｋ（９３）に結合した２（図２２Ａ）の構造が最近解明され、構造ベースの設計によって、インドロカルバゾールクラスのキナーゼ阻害剤（図２２Ｂ）に対する独自の感受性を設計できる。
【０２４８】
上記の実施例で示したように、Ｉ３３８のグリセリンへの突然変異は、ＰＰ１誘導体に独自の阻害性感受性を与えるのに十分であった。ＣＤＫ２における該当する残基はＦ８０であり、スタウロスポリンに結合したＣＤＫ２の結晶構造において（図２２Ｂ）（９２）、２（図２２Ａ）のＣ（７）（Ｋ２５２ａ番号付け）に近い（３．７Å）。したがって、我々の感作化キナーゼに対するインドロカルバゾールベースの独自の阻害剤を開発するには、１または２（図２２Ａ）のどちらかでＣ（７）を選択的に操作する必要があることが予想された。この仮説を調査するために、総合的な分析および最近開発された手法によって、１（図２２Ａ）はもちろんのこと、Ｃ（７）で立体特異的に修飾した１の誘導体のモジュラー組立が可能となる（９４、９５）。
【０２４９】
Ｃ（７）置換Ｋ２５２ａ誘導体の小規模なパネルを合成した。ＣＤＫのＦ８０がインドロカルバゾール環と共平面にないと（図２２Ｂ）、Ｓ−（Ｌ）−アミノ酸を利用した合成によって、Ｆ８０のグリシンまたはアラニンへの空間作成突然変異を補完するＫ２５２ａ誘導体が得られることが予想された。Ｓ−Ｃ（７）類似体に加え、該当するＳジアステレオマー（図２７）ほど、設計タンパク質キナーゼを強力に阻害しないと推定されるＲ−Ｃ（７）−ベンジル（＋）−Ｋ２５２ａ（６、図２７）を、結合方式の予想に基づいて調製した。
【０２５０】
すぐ上で述べたＫ２５２ａ類似体、チロシンおよびセリン／チロシンキナーゼの両方より成るタンパク質キナーゼのパネルに対する阻害についてスクリーニングした。４種類の異なる生理的に重要な亜科（図２６Ａ；Ｓｒｃ科（ｖ−Ｓｒｃ，  Ｆｙｎ）（９６，  ９７）、Ａｂｌ系統群（ｃ−Ａｂｌｅ）（９８）、Ｃａ2+／カルモジュリン依存性系統群（ＣＡＭＫ  ＩＩα）（９９）およびサイクリン依存性系統群（ＣＤＫ２）（１００））からの少なくとも１種類のタンパク質キナーゼのインビトロ阻害。ｖ−Ｓｒｃの３３８に該当するアミノ酸は、上記のタンパク質キナーゼ（図２４Ｂ、ｃ−Ａｂｌの場合は、Ｔ３１５Ｇは不安定であった（１０１））のすべてについて小型残基（グリシンまたはアラニン）に突然変異させて、次の阻害剤感受性キナーゼを生成した；Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ、Ｔ３３９Ｇ  Ｆｙｎ、Ｔ３１５Ａ  Ａｂｌ、Ｆ８９Ｇ  ＣＡＭＫ  ＩＩα  Ｆ８０Ｇ  ＣＤＫ。Ｋ２５２ａに感受性のキナーゼと感受性でないキナーゼ（ｃ−Ａｂｌ）を選択して、両方のクラスの標的キナーゼを示した（図２７）。
【０２５１】
Ｋ２５２ａ類似体は、外因性基質のリン酸化のインビトロ阻害に関し、野生種および設計タンパク質キナーゼに対してスクリーニングした。予想したとおり、すべてのＣ（７）置換Ｋ２５２ａ誘導体は、野生種タンパク質キナーゼのパネル（図２７）の阻害については、１（図２２Ａ）よりもはるかに効率が低かった。５種類の野生種キナーゼのうち、ＣＡＭＫ  ＩＩαはＫ２５２ａ誘導体による阻害を最も受けやすい。ＣＡＭＫ  ＩＩαはＫ２５２ａ自体にも最も感受性であるため、このことは驚くべきことではない。各キナーゼについて、突然変異の存在時には、Ｋ２５２ａ類似体のＩＣ50値は低下し、１の結合配向に関する我々の予想が確認された。結合が野生種キナーゼ／１対の親和性に接近あるいは超越するような、突然変異体キナーゼそれぞれの誘導体化パートナーが見つかった。注目すべきなのは、２−メチル−プロピル類似体（４、図２７）が設計Ｓｒｃ科キナーゼ（ｖ−Ｓｒｃおよびｃ−Ｆｙｎ）に、ナノモル以下のＩＣ値（それぞれ２３０ｐＭおよび５５０ｐＭ）で結合したことである。この値は、同じ野生種キナーゼに対する１の値よりも、ほぼ２桁以上低い値である。これらの値は、現在までに報告されているＳｒｃ科キナーゼの最も強力な阻害を表す。強度（ＩＣ50＜５０ｎＭ）および選択性（パネル中のすべての野生種キナーゼと比較して１５倍以下）の適切な組合わせは、ｃ−Ａｂｌを除くすべての突然変異体キナーゼについて発見された。Ａｂｌはパネル内で唯一、Ｋ２５２ａによって効果的に阻害されない野生種タンパク質キナーゼであり、１に対する感受性が、（図２６にない）他のキナーゼがＫ２５２ａ類似体による阻害に適しているかどうかについての予測的な決定因子であることを示唆する。
【０２５２】
当初、Ｔ３１５Ａ  ｃ−Ａｂｌの弱い阻害が、アラニン側鎖のβ−メチル基によるものか、１（図２２Ａ）による阻害に対するｃ−Ａｂｌ固有の非感受性によるものなのかが不明瞭であった。β−メチル基の影響をさらに直接的に調べるために、Ａｌａ置換によって別のキナーゼをチェックした。最も強力なＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ阻害剤である４および７（図２７）のＩ３３８Ａ  ｖ−Ｓｒｃに対する阻害を測定した。ｖ−Ｓｒｃのアラニン突然変異体のこれらの化合物に対するＩＣ値はそれぞれ、０．０２４および０．４３μＭであり、Ｉ３３８Ｇに対する値のほぼ１００倍であった。しかし、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−ＳｒｃおよびＴ３１５Ａ  ｃ−Ａｂｌの阻害値は１０，０００倍以上も異なるため、ｃ−Ａｂｌは本質的に１の類似体によって阻害されにくいことが示唆される。
【０２５３】
適切に突然変異されたあらゆるキナーゼを阻害可能な汎用阻害剤：適切に突然変異されたあらゆるキナーゼを阻害可能な、さらに一般化できる阻害剤をするために、野生種および突然変異体キナーゼのパネルを、Ｃ（３）−フェニル修飾ＰＰ１類似体のグループに対して試験した。ＰＰ１はＳｒｃ科選択性であるが、小型アミノ酸に対する３３８位置の突然変異（ｖ−Ｓｒｃ）によって、他のキナーゼに対する独自のＰＰ１類似体感受性が与えられるという結論に至った。なぜならこのアミノ酸が、ＰＰ１事態の選択性に大きく寄与していることがわかったためである。阻害剤のこのパネルの中で、Ｃ（３）−１’−ナフチルＰＰ１（９、図２８）またはＣ（３）−１’−ナフチルメチルＰＰ１（１１、図２８）が、試験した各設計キナーゼの最も強力な阻害剤であった。図２８のＰＰ１類似体阻害データの分析によって、ある注目すべき傾向が明らかになる。ＰＰ１によって、設計キナーゼ／阻害剤対に幅広い用途を持つ類似体が得られた。５種類の標的キナーゼはそれぞれ、ＰＰ１類似体に低いナノモル濃度で阻害され、標的特異性は８５から４００倍の範囲であった（最も阻害可能な野生種キナーゼに対して測定）。野生種ＰＰ１のＩＣ50と同一（設計）キナーゼのＰＰ１類似体感受性の間には、ほとんどまたは全く相関関係はない。このことは、Ｓｅｒ／ＴｈｒキナーゼのＣＤＫ２およびＣＭＫ  ＩＩαにおいて最も明らかである。これらの野生種酵素はどちらも、１５μＭを超える弱いＰＰ１  ＩＣ50を持つ。しかしこれらのキナーゼの設計版は、ＰＰ１類似体によって非常に強力に阻害される（１１；それぞれ５．０ｎＭおよび８．０ｎＭ）。この相違はおそらく、所与のタンパク質キナーゼのＰＰ１感受性を決定する際の残基３３８の重要性（８６）と、拡張キナーゼ活性部位のナフチル環の親和性の組合わせによるものと考えられる。すべてのグリセリン突然変異体に対する１１のＩＣ50は、たとえその野生種ＰＰ１感受性が４００倍以上も変化しても、相互の３倍の範囲内（すべて＜１０ｎＭ）であった。重要なのは、試験を行った野生種キナーゼはいずれも、１μＭ  １１未満の濃度では阻害されなかったことであり、このことはこの化合物の標的選択性が高いことを示している。
【０２５４】
ＰＰ１類似体１０および１１（図２８）は、その大きさと柔軟性に基づいて、異なる空間作成突然変異に対して選択性を持つ。最も強固なＣ（３）−１’ナフチルＰＰ１（１０）は、各種のキナーゼグリシン突然変異体（図２８）に対して広範囲の作用強度を示す。しかし、Ｔ３１５Ａ  ｃ−Ａｂｌ（７．０ｎＭ）を高い特異性で強力に阻害するため、このタンパク質チロシンキナーゼの最初の突然変異体阻害剤が生じる（１０２）。位置３３８にてアラニンに突然変異させたタンパク質キナーゼの阻害に、１０が使用可能かどうか判定するために、Ｉ３３８Ａ  ｖ−Ｓｒｃに対するその作用強度を試験した。１０は、該当するグリシン突然変異体を阻害するよりよりもはるかに強く、アラニン突然変異ｖ−Ｓｒｃを阻害する（ＩＣ１０＝１．０ｎＭ）し、グリシン突然変異によって活性または安定性が著しく損なわれるタンパク質キナーゼの突然変異体阻害剤を開発するための一般的な方式が、この分子によって提供されることが示唆されている（１０１）。
【０２５５】
実施例１９
ＰＰ１類似体感受性キナーゼ対立遺伝子
続いて、上の戦略が、インビボ有用性を備えた「ＰＰ１類似体感受性」（ａｓ）キナーゼ対立遺伝子の作成に使用可能かどうかを判定するために調査を行った。我々がこの用語を選択したのは、同一の突然変異体キナーゼを用い、「ａｓ」を補完するように設計された直交ＡＴＰ類似体を使用して、突然変異を各キナーゼの直接細胞基質を同定できるためである（１５４、１５５）。
【０２５６】
Ｃ（３）誘導体化ＰＰ１類似体が、ネズミ繊維芽細胞においてレトロウィルス発現されたｖ−Ｓｒｃの標的特異性阻害に使用できることが明らかになっている。しかし、従来の遺伝子検査に幅広く利用される、生物中の内因性キナーゼ遺伝子生成物の突然変異体阻害を実証することはさらに興味深い。発芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、遺伝子操作に対する感受性と迅速な成長によって、単細胞モデル生物として遺伝子研究で広範に使用されている（１０３）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムは、多くの哺乳類キナーゼ系統群によるタンパク質の相同体を含むほぼ１２０種類のタンパク質キナーゼをコード化する（１０４）。酵母サイクリン依存性キナーゼＣｄｃ２８は、インビボ阻害の初期標的として選択された。この酵素は、発芽酵素において主要なＣＤＫであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞サイクルにおけるＳＴＡＲＴおよび有糸分裂での細胞生存度に不可欠である（１０５）。Ｃｄｃ２８はヒトＣＤＫ２と６２％同一であり、設計Ｆ８８Ｇ  Ｃｄｃ２８、Ｃｄｃ２８−ａｓ１がＣ（３）誘導体化ＰＰ１類似体による阻害に対して感受性であることが示唆される。野生種Ｃｄｃ２８およびＣｄｃ２８−ａｓ１が発現され、この２つのキナーゼのインビトロでのＰＰ１誘導体に対する感受性が調査された。ＣＤＫ２と同様に、１１（図２８）は設計Ｃｄｃ２８の非常に強力な阻害剤であるが（ＩＣ50＝３．９ｎＭ）、野生種タンパク質は阻害しない（ＩＣ50＝＞５０μＭ）。Ｃｄｃ２８−ａｓ１を発現する酵母の成長は、野生種系統の成長に影響をもたない１１の濃度にて完全に除去される。これらの細胞系が１つのタンパク質中の１つのアミノ酸側鎖によって異なることにより、この選択的な細胞サイクル阻害は明らかに標的特異性である。さらに、１１が酵母細胞壁と容易に交差する能力は珍しく、アッセイ中に極端に高い濃度の阻害剤を加える必要がなくなる。
【０２５７】
この戦略が各酵素をインビトロでそれぞれ精製およびアッセイせずに、タンパク質キナーゼの他の系統族の類似体感受性対立遺伝子の同定に拡張できるかどうかを判定するために、交配時のフェロモン誘発性遺伝子の誘発、細胞サイクル阻止、細胞融合に必要な、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＡＰキナーゼＦｕｓ３が選択された（１０６）。交配因子フェロモンの存在下で、Ｆｕｓ３はＦａｒ１およびＳｔｅ１２をリン酸化する。これらのリン酸化イベントは、交配に必要なＧ１細胞サイクル阻止および遺伝子の転写に必要である（１０７、１０８）。Ｆｕｓ３の温度感受性（ｔｓ）対立遺伝子は、おそらく交配プロセスの温度感受性によって単離されていない（１０９）。
【０２５８】
ｆｕｓ３の類似体感受性対立遺伝子を生成するためにグルタミン９３（ｖ−ＳｒｃのＩ３３８に該当）をグリシン（Ｄ９３Ｇ  Ｆｕｓ３、Ｆｕｓ−ａｓ１）に突然変異させ、この酵素を野生種Ｆｕｓ３を欠失した発芽酵母中で発現させた。ｆｕｓ３−ａｓ１突然変異体は、同数の半数体野生種またはｆｕｓ３−ａｓ１細胞（ＵＲＡ３  ｈｉｓ３）とｆｕｓ１Δｆｕｓ２Δｕｒａ３  ＨＩＳ３系統との交配と、それに続く媒質欠乏ウラシルおよびヒスチジンの対する二倍体子孫の選択（図２３）によって示されるように、遺伝子欠失を完全に補完した。Ｆｕｓ３およびＦｕｓ３−ａｓ１発現系統はどちらも、約７．５ｘ１０4コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌを産出したが、ｆｕｓ３Δ系統の交配では同じ選択条件下でわずか０−１００ｃｆｕ／ｍｌが与えられた。ｆｕｓ３−ａｓ１系統の交配を５０μＭ  １０（図２８）の存在下で実施した場合、生成した二倍体の量はｆｕｓ３Δ系統と区別できなかった（図２３Ｂ−２３Ｃ）。５００ｎＭ  １０においてでさえ、同等の対照細胞から４４倍も減少して、ｆｕｓ３−ａｓ１系統はわずか１．７ｘ１０3ｃｆｕ／ｍｌしか与えなかった（図２３Ｃ）。酵母細胞中のＡＴＰのミリモル量との競合によって、５００ｎＭ  １０におけるこの強力な阻害は、低いナノモル範囲におけるＦｕｓ３−ａｓ１のインビトロＩＣ50を暗示している。１１（図２８）もＦｕｓ３−ａｓ１仲介交配を阻害するが、作用強度は低い（５０μＭにおいて８５倍の減少）。これに対して、野生種Ｆｕｓ３発現細胞を１０または１１で処理した場合、交配効率の低下は見られなかった（５０μＭまでのすべての濃度で０．６−１．１ｘ１０5ｃｆｕ／ｍｌ、図２３Ｃ）。したがって、ｆｕｓ３−ａｓ１はＭＡＰＫの最初の条件的対立遺伝子ｆｕｓ３を表現する。１０のインビボ添加によって、ｆｕｓ３遺伝子生成物の活性は、選択的に、迅速にそして用量依存的な方法で制御できる。
【０２５９】
本明細書で述べた類似体感受性対立遺伝子は、従来のｔｓ対立遺伝子に勝る多数の利点を備えている。これらは化学量論的および一時的制御を受ける。独自の特異性阻害剤を添加すると、酵素標的またなタンパク質−タンパク質相互作用の安定性が阻害されるべきではない。阻害剤感作系統は、本来温度感受性である細胞プロセス（アクチン細胞骨格再配列、交配など）で機能する遺伝子に対して生成できる（１０９、１１０）。さらに、タンパク質活性は、熱ショックによって誘起される非特異的転写効果を引き起こさずに、特異的に制御される（１１１）。
【０２６０】
実施例２０
Ｃｄｃ２８突然変異キナーゼ感受性細胞透過阻害剤
方法
Ｃｄｃ２８−Ｈｉｓ6、Ｃｄｃ２８−ａｓ１−Ｈｉｓ6、ＭＢＰ−Ｃｌｂ２の精製：溶解物は、Ｃｄｃ２８−Ｈｉｓ6またはＣｄｃ２８−ａｓ１−Ｈｉｓ6およびＣａｋ１−ＨＡ3をコード化するバキュロウィルスに共感染した昆虫細胞から調製した（１５１）。Ｃｄｃ２８−Ｈｉｓ6またはＣｄｃ２８−ａｓ１−Ｈｉｓ6は説明されているように（１５２）、金属親和性クロマトグラフィーによって精製し、次いでアニオン交換（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）およびカチオン交換（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）を行った。ＭＢＰ−Ｃｌｂ２は、アミロースカラム（ＮＥＢＬ）でＭＢＰ−Ｃｌｂ２（Ｒ．Ｄｅｓｈａｉｅｓより寄贈）を発現する細菌の溶解物より精製し、次いでアニオン交換（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）を行った。
【０２６１】
精製したＣｄｃ２８−Ｈｉｓ6（最終濃度１ｎＭ）およびＭＢＰ−Ｃｌｂ２（最終濃度３ｎＭ）は、ヒストン５μｇ、γ32Ｐ−ＡＴＰのＣｉ１μ（１μＣｉ／１０ｎＭおよび１μＣｉ／１ｍＭ）および各種濃度の１−ＮＭ−ＰＰ１をキナーゼ緩衝液に含む２５μｌ反応混合物中で２３℃にて１０分間培養した（４１）。反応生成物は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その後、オートラジオグラフィーを行った。リン酸塩取込みは、各阻害剤濃度でシンチレーション計数によって決定した。リン酸塩取込みに対して阻害剤濃度をプロットし、阻害剤に制御されない、リン酸塩取込みが５０％の１−ＮＭ−ＰＰ１濃度がＩＣ50として報告された。
【０２６２】
酵母プラスミドおよび系統の構成：培養液および遺伝子的ならびに微生物的技法は、説明された方法と実質的に同じであった（１４８、１５３）。すべての系統はＷ３０−３の誘導体であった（ｕｒａ３−ａ、ｌｅｕ２−３、１１２、ｔｒｐｌ−１、ｈｉｓ３−１１，１５、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００、ＧＡＬ＋）。すべての系統は別途記載しない限り、２３℃で培養した。ｃｄｃ２８−ａｓ１を作成するために、ＣＤＣ２８コード化配列および４００ｂｐの５’−フランキングＤＮＡおよび３８６ｂｐの３’−フランキングＤＮＡをゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＰＳ３０６内に結合して、ｐＪＡＵ１を作成した。Ｆ８８Ｇ突然変異は、ｐＪＡＵ１のオリゴヌクレオチド定方向突然変異によって設計された。プラスミドを野生種ＣＤＣ遺伝子座に組込んだ後、説明されているように（１４８、１５３）ポップインポップアウト戦略によるＡｆｌＩＩ消化を行った。
【０２６３】
Ｃｄｃ２８およびＣｄｃ２８−ａｓ１  ＡＴＰ動態：精製したＣｄｃ２８−Ｈｉｓ6（最終濃度１ｎＭ）およびＭＢＰ−Ｃｌｂ２（最終濃度３ｎＭ）は、ヒストンＨ１  ５μｇと複数の濃度のγ−32Ｐ−ＡＴＰをキナーゼ緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−水酸化ナトリウム、ｐＨ７．４、１０ｍＭ水酸化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中に含む２５μｌの混合溶液中で、２３℃にて１０分間培養した。反応生成物は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その後、オートラジオグラフィーを行った。リン酸塩取込みは、各阻害剤濃度でシンチレーション計数によって決定した。次にＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプロットを用いて、Ｋmおよびｋｃａｔを計算した。
【０２６４】
１−ＮＭ−ＰＰ１  ＩＣ50値：精製したＣｄｃ２８−Ｈｉｓ6（最終濃度１ｎＭ）およびＭＢＰ−Ｃｌｂ２（最終濃度３ｎＭ）は、ヒストン５μｇ、γ32Ｐ−ＡＴＰのＣｉ１μ（１μＣｉ／１０ｎＭおよび１μＣｉ／１ｍＭ）および各種濃度の１−ＮＭ−ＰＰ１をキナーゼ緩衝液に含む２５μｌ反応混合物中で２３℃にて１０分間培養した。
【０２６５】
精製したＣｄｃ２８−Ｈｉｓ6（最終濃度１ｎＭ）およびＭＢＰ−Ｃｌｂ２（最終濃度３ｎＭ）は、ヒストンＨ１  ５μｇと複数の濃度のγ−32Ｐ−ＡＴＰをキナーゼ緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−水酸化ナトリウム、ｐＨ７．４、１０ｍＭ水酸化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中に含む２５μｌの混合溶液中で、２３℃にて１０分間培養した。
【０２６６】
反応生成物は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その後、オートラジオグラフィーを行った。リン酸塩取込みは、各阻害剤濃度でシンチレーション計数によって決定した。次にＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプロットを用いて、Ｋmおよびｋｃａｔを計算した。
【０２６７】
反応生成物は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その後、オートラジオグラフィーを行った。リン酸塩取込みは、各阻害剤濃度でシンチレーション計数によって決定した。リン酸塩取込みに対して阻害剤濃度をプロットし、阻害剤に制御されない、リン酸塩取込みが５０％の１−ＮＭ−ＰＰ１濃度がＩＣ50として報告された。
【０２６８】
ＤＮＡフローサイトメトリー：各サンプルの約１  ｘ  １０  ７個の細胞を７０％エタノールで固定し、ｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸で再懸濁し、短時間超音波処理して、２ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅによって３７℃にて２時間消化し、０．２ｍｌのプロテアーゼ溶液（５ｍｇ／ｍｌペプシン、０．５％濃塩酸）中で再懸濁し、３７℃にて４５分間消化した。ＤＮＡは１μＭのＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含むｐＨ７．５の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸によって染色し、各サンプルの細胞２０，０００個をＦＡＣＳｃａｎのＦＡＣＳ装置（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によってスキャンした。
【０２６９】
結果
Ｃｄｃ２８−Ｈｉｓ6およびＣｄｃ２８−ａｓ１−Ｈｉｓ6は、Ｓｆ９昆虫細胞から発現させ、精製した。これらは細菌由来の精製ＭＢＰ−Ｃｌｂ２と活性錯体を形成した。溶解物は、Ｃｄｃ２８−Ｈｉｓ6またはＣｄｃ２８−ａｓ１−Ｈｉｓ6およびＣａｋ１−ＨＡ3をコード化するバキュロウィルスで共感染した昆虫細胞から調製した（４８）。Ｃｄｃ２８−Ｈｉｓ6およびＣｄｃ２８−ａｓ１−Ｈｉｓ6は説明されているように（４９）、金属親和性クロマトグラフィーによって精製し、次いでアニオン交換（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）およびカチオン交換（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）を行った。ＭＢＰ−Ｃｌｂ２は、アミロースカラム（ＮＥＢＬ）でＭＢＰ−Ｃｌｂ２（Ｒ．Ｄｅｓｈａｉｅｓより寄贈）を発現する細菌の溶解物より精製し、次いでアニオン交換（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）を行った。
【０２７０】
Ｃｄｃ２８−ａｓ１は野生種Ｃｄｃ２８に比べ、中程度の活性低下を示し、ＡＴＰの結合親和性は１０倍低下し、最大ＡＴＰ転換率は６倍低下した（表４）。さらに重要なのは、Ｃｄｃ２８−ａｓ１は阻害剤１−ＮＭ−ＰＰ１に対してきわめて感受性であることである。細胞間ＡＴＰ濃度とほぼ同様の、１ｍＭ  ＡＴＰの存在下において、Ｃｄｃ２８−ａｓ１は１−ＮＭ−ＰＰ１に対して、野生種Ｃｄｃ２８より１５，０００も感受性が高かった（ＩＣ50≒Ｃｄｃ２８−ａｓ１の場合は３ｎＭ、Ｃｄｃ２８の場合は４４，０００ｎＭ）。したがって、フェニルアラニンのグリシンとの１回の置換によって、１−ＮＭ−ＰＰ１に対して高い親和性と特異性の両方を示すＣｄｃ突然変異体が生じる。
【０２７１】
インビボでのＣｄｃ２８の機能を調べるために、ＣＤＣ２８の野生種コピーをｃｄｃ２８−ａｓ１に置換した酵母系統を作成した。培養液および遺伝子的ならびに微生物的技法は、説明された方法と実質的に同じであった（１４８、１５３）。すべての系統はＷ３０−３の誘導体であった（ｕｒａ３−ａ、ｌｅｕ２−３、１１２、ｔｒｐｌ−１、ｈｉｓ３−１１，１５、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００、ＧＡＬ＋）。すべての系統は別途記載しない限り、２３℃で培養した。ｃｄｃ２８−ａｓ１を作成するために、ＣＤＣ２８コード化配列および４００ｂｐの５’−フランキングＤＮＡおよび３８６ｂｐの３’−フランキングＤＮＡをゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＰＳ３０６内に結合して、ｐＪＡＵ１を作成した。Ｆ８８Ｇ突然変異は、ｐＪＡＵ１のオリゴヌクレオチド定方向突然変異によって設計された。プラスミドを野生種ＣＤＣ遺伝子座に組込んだ後、説明されているように（１４８、１５３）ポップインポップアウト戦略によるＡｆｌＩＩ消化を行った。
【０２７２】
１−ＮＭ−ＰＰ１がないと、Ｃｄｃ２８−ａｓ１は過分極し、アイソジェニックＣＤＣ２８系統よりも大きく、液体培地中では倍加時間が２０％長くなるが、プレート上で正常な生存度および成長を示した。非同期分裂細胞のフローサイトメトリー分析によって、ｃｄｃ２８−ａｓ１およびＣＤＣ２８系統が同様のＤＮＡ含有量プロフィールを示すことが明らかになった。最後に、合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ配列を使用して、非同期の野生種およびｃｄｃ２８−ａｓ１細胞間のゲノム規模の転写差を測定した（１２７）。
【０２７３】
以下の比較において、変化は、２倍以上の場合か、転写によって（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアによって示されたように）有／無状態が変化した場合に、有意と見なされた：非特異的薬剤効果の場合：ＣＤＣ２８＋１−ＮＭ−ＰＰ１対ＣＤＣ２８；ｃｄｃ２８−ａｓ１効果の場合：ｃｄｃ２８−ａｓ１対ＣＤＣ２８。特異的Ｃｄｃ２８阻害効果では、ｃｄｃ２８−ａｓ１  １−ＮＭ−ＰＰ１対ｃｄｃ２８−ａｓ１の場合は２．５倍以上であるか、ｃｄｃ２８−ａｓ１  １−ＮＭ−ＰＰ１対ＣＤＣ２８＋１−ＮＭ−ＰＰ１の場合は２倍以上ならば、有意と見なされた。
【０２７４】
２つの別個の実験において、１１の転写（ゲノムの０．２％）においてのみ２倍以上の変化が見られた。野生種およびｃｄｃ２８−ａｓ１を比較した場合、以下の遺伝子の発現で２倍以上の差が見られた:実験１：ＬＥＵ２，  ＹＤＬ２４１Ｗ，  ＹＦＬ０５７Ｃ，  ＹＨＲ０７１Ｗ，  ＣＢＰ１  ＹＪＲ１３０Ｃ，  ＣＷＰ１，  ＹＬＬ０６０ｃ；  ＡＴＲ１  ＹＭＬ１２８Ｃ，  ＹＭＲ０９５Ｃ，  ＹＭＲ０９６Ｗ，  ＹＮＬ２７５Ｗ，  ＹＮＲ０６５Ｃ，  ＡＲＧ１，  ＹＯＬ１０１Ｃ，  ＳＰＳ４，  ＳＳＵ１，  ＳＶＳ１，  ＯＹＥ３，  ＲＬＥ２およびＹＰＲ２０３Ｗ，  ＴＷＴ１，  ＹＨＲ２０９Ｗ，  ＹＩＬ０１１Ｗ，  ＹＩＬ０２３Ｃ，  ＤＡＬ４，  ＹＫＬ２１８Ｃ，  ＹＬＬ０６０Ｃ，  ＹＬＯ１０８Ｃ，  ＹＬＲ２３７Ｗ，  ＹＬＲ４２７Ｃ，  ＹＭＬ０７１Ｃ，  ＡＴＲ１，  ＹＭＲ０９５Ｃ，  ＹＭＲ０９６Ｗ，  ＹＮＲ０６５Ｃ，  ＡＲＧ１，  ＹＯＲ３０２Ｗ，  ＳＰＳ４，  ＹＰＬ０８８Ｗ，  ＳＶＳ１，  ＹＰＲ０１３Ｃ，  ＣＴＲ１。
【０２７５】
ｃｄｃ２８−ａｓ１細胞における微量の増殖欠陥は、突然変異体酵素のｋｃａｔが６倍も低いことによると思われる。これによりインビボの高いＡＴＰ濃度では、活性は６倍低くなる（突然変異体のＡＴＰ結合親和性が低いことは、ＡＴＰ濃度がＫmよりはるかに高いインビボでは無関係である）。したがって、ｃｄｃ２８−ａｓ１は、ＣＤＣ２８のやや弱められた対立遺伝子であり、それでも細胞サイクルの進行を支持できる。
【０２７６】
次に阻害剤１−ＮＭ−ＰＰ１の細胞の成長および形態に対する影響を分析した。野生種細胞の増殖は、非常に高い濃度（５０，０００ｎＭ）を除いて阻害剤によって影響を受けず、倍加時間は約２倍に増加した。ＤＮＡマイクロアレー分析によって、野生種細胞を５００ｎＭ  １−ＮＭ−ＰＰ１によって３０分間処理した後に、わずか６個の遺伝子（０．１％）が２倍以上に変化したことが明らかになった。
【０２７７】
阻害剤による処理の３０分後に、野生種細胞にて変化した６個の転写のうち、３個は既知の機能を備えておらず（ＹＧＲ０３５Ｃ、ＹＬＲ３４６Ｃ、ＹＰＬ２２２Ｗ）、他の転写は、熱ショック（ＳＳＡ４）、浸透圧ストレス反応（ＧＲＥ２）および薬剤耐性（ＹＯＲ１）における役割を備えている。これらの遺伝子のうちの１個のみ（ＹＧＲ０３５Ｃ）の転写は細胞サイクルに調節される（１５０）。野生種細胞を阻害剤によって１２０分間処理すると、３個の遺伝子のみに変化が生じた（ＹＧＲ０３５Ｃおよびリボゾームタンパク質をコード化する２個の遺伝子：ＲＰＳ２６ＡおよびＲＰＬ６２Ｂ）。
【０２７８】
細胞を１２０分間処理すると、転写反応はさらに少なかった：２倍以上の変化が見られたのは、３個の転写だけであった。興味深いことに、ストレス反応性転写産物の著しい活性化が見られず、このことは、多くの薬剤検出機構が薬剤の存在ではなく、その機能に反応するという提案に一致している（１２２）。したがって、５００ｎＭ  １−ＮＭ−ＰＰ１処理が野生種細胞の生理機能に著しい影響を与えないという結論に達し、酵母内の野生種キナーゼまたは他の酵素のいずれも阻害または刺激しないことが示唆された。
【０２７９】
Ｃｄｃ２８−ａｓ１キナーゼにおける１個のアミノ酸変化によって、インビボにて阻害剤１−ＮＭ−ＰＰ１に対する感受性が非常に高くなる。ｃｄｃ２８−ａｓ１系統の成長は、５０から１００ｎＭ阻害剤にて５０％阻害された。インビボのＩＣ50とキナーゼアッセイで測定したＩＣ50がよく一致していることによって、他の小型分子ＣＤＫ阻害剤によって示されない特徴である、１−ＮＭ−ＰＰ１が酵母細胞に浸透する有効性が示される（１２２）。
【０２８０】
【表４】
0004876239.tif 000012
【０２８１】
Ｃｄｃ２８−ａｓ１は、インビボで１−ＮＭ−ＰＰ１に対する感受性が高く、やや弱められたキナーゼである。活性サイクリンＣｄｋ錯体は、精製されたＣｄｃ２８−Ｈｉｓ6またはＣｄｃ２８−ａｓ１−Ｈｉｓ6に過剰のＭＰＢ−Ｃｌｂ２を加えることによって形成され、異なるＡＴＰ濃度におけるリン酸化ヒストンに対する能力を測定して、Ｋmおよびｋｃａｔ値を算出した。キナーゼが５０％阻害される阻害剤濃度であるＩＣ50を決定するために、異なる濃度の１−ＮＭ−ＰＰ１の存在下で、２種類のＡＴＰ濃度において、Ｃｄｃ２８−ＭＰＢ−Ｃｌｂ２またはＣｄｃ２８−ａｓ１−ＭＰＢ−Ｃｌｂ２のキナーゼ活性を測定した。
【０２８２】
１／精製したＣｄｃ２８−Ｈｉｓ6（最終濃度１ｎＭ）およびＭＢＰ−Ｃｌｂ２（最終濃度３ｎＭ）は、ヒストンＨ１  ５μｇと複数の濃度のγ−32Ｐ−ＡＴＰをキナーゼ緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−水酸化ナトリウム、ｐＨ７．４、１０ｍＭ水酸化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中に含む２５μｌの混合溶液中で、２３℃にて１０分間培養した。反応生成物は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その後、オートラジオグラフィーを行った。リン酸塩取込みは、各阻害剤濃度でシンチレーション計数によって決定した。次にＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプロットを用いて、Ｋmおよびｋｃａｔを計算した。
【０２８３】
２／精製したＣｄｃ２８−Ｈｉｓ6（最終濃度１ｎＭ）およびＭＢＰ−Ｃｌｂ２（最終濃度３ｎＭ）は、ヒストンＨ１  ５μｇと複数の濃度のγ−32Ｐ−ＡＴＰをキナーゼ緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−水酸化ナトリウム、ｐＨ７．４、１０ｍＭ水酸化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中に含む２５μｌの混合溶液中で、２３℃にて１０分間培養した（１４７）。反応生成物は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その後、オートラジオグラフィーを行った。リン酸塩取込みは、各阻害剤濃度でシンチレーション計数によって決定した。リン酸塩取込みに対して阻害剤濃度をプロットし、阻害剤に制御されない、リン酸塩取込みが５０％の１−ＮＭ−ＰＰ１濃度がＩＣ50として報告された。
【０２８４】
ｃｄｃ２８−ａｓ１細胞のＤＮＡ含有量および形態の詳細な分析は、低濃度の１−ＮＭ−ＰＰ１が、Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡ含有量および大規模な過分極芽による遅延（５０ｎＭ）または阻止（５００ｎＭ）を引き起こすことを明らかにした。さらに高い阻害濃度（５，０００ｎＭ）は、未発芽Ｇ１細胞はもちろんのこと大きな発芽Ｇ２／Ｍ細胞を含む不均一な阻止を引き起こした；芽の過分極はもはや明らかではなかった。したがって、インビボでのＣｄｃ２８−ａｓ１活性のレベルを滴定できるように思われ、Ｃｄｃ２８の触媒作用活性の低下に対する感受性が異なる細胞サイクルのイベントが可能になる。
【０２８５】
ｃｄｃ２８−ａｓ１細胞はＧ１内で酵母交配フェロモンのα因子と同期化され、５００ｎＭ  １−ＮＭ−ＰＰ１を含む新しい培養液中に放出される。発芽およびＤＮＡ合成の開始は約３０から６０分遅延し、一方、有糸分裂サイクリンＣｌｂ２は６０から９０分遅延する。非同期細胞で見られる阻止と同様に、細胞は、中程度のＣｌｂレベル、高度に過分極した発芽およびＧ２／Ｍ  ＤＮＡ含有量によって阻止を開始する。微小管おおびＤＮＡの微視的分析によって、これらの細胞が紡錘体を欠失しており、芽のくびれに正しく配置された１個のＤＮＡ塊によって阻止されることが明らかになった。そのため、低濃度の阻害剤で処理した細胞は、細胞サイクルの初期段階における進行の間、やや遅延するが、紡錘体の集合の失敗によって結局阻止し、有糸分裂を始める。
【０２８６】
ＧＩ合成ｃｄｃ−ａｓ１細胞を、５，０００ｎＭ  １−ＮＭ−ＰＰ１を含む培養液中に放出すると、ＩＣ  ＤＮＡ含有量によって阻止され、最初は発芽できなかった。このことはＳＴＡＲＴにおける阻止を示唆する。これらの細胞は最終的に１８０から２４０分後に発芽し、１Ｃ  ＤＮＡ含有量、大きな過分極化芽、母細胞中の１個のＤＮＡ塊および静止期星状体微小管微小管配列によって阻止される。
【０２８７】
Ｃｄｃ２８に密接に関連しているＣｄｋである、Ｐｈｏ８５は、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発芽の開始に関係している（１２８、１２９）。したがって残りのＣｄｃ２８−ａｓ１活性によって、またはＰｈｏ８５活性によって５，０００ｎＭ  １−ＮＭ−ＰＰ１に放出されたｃｄｃ２８−ａｓ１細胞に見られる発芽が調査された。Ｐｈｏ８５のサイクリンを活性化する２つのＧ１をコード化するＰＣＬ１およびＰＣＬ２を欠失した、ｃｄｃ２８−ａｓ１系統が作成された。これらの細胞をＧ１内で同期化し、ｋ５，０００ｎＭ  １−ＮＭ−ＰＰ１に放出した場合、１Ｃ  ＤＮＡ含有量によって阻止され、６時間後でも発芽することはなかった。残りのＣｄｃ２８活性ではなく、Ｐｃ１１−およびＰＣ１２−関連Ｐｈｏ８５活性は、高濃度の阻害剤によって処理されたｃｄｃ２８−ａｓ１で見られる、大幅に遅延した発芽の原因であるという結論に達した。
【０２８８】
阻害剤処理によって引き起こされた細胞サイクル阻止をさらに特徴付けるために、非同期ｃｄｃ２８−ａｓ１細胞を５００ｎＭ  １−ＮＭ−ＰＰ１によって処理した後、ゲノム規模の転写を分析した（図２５Ａ−Ｄ）。２時間の処理によって、１０４の遺伝子の転写で２．５倍以上の変化が生じた（６６で低下、３８で上昇）（図２５ＢおよびＣ）。ダウンレギュレートされた転写のうち、６０は細胞サイクルによって調整され、３２はＧ２／Ｍにおいてピーク発現する。このダウンレギュレートされたＧ２／Ｍサブセットは、ＣＬＢ２、ＳＷ１５、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ５などの、広範囲の確立された有糸分裂制御因子を含む。ＣＬＢ２転写産物の濃度低下は、ＧＩ阻止による放出後のＣｌｂ２の蓄積遅延と一致している。ダウンレギュレートされたＧ２／Ｍサブセットは、未知の機能を持つ１１の転写産物を含み、これらの転写産物は、Ｃｄｃ２８の転写制御によって、Ｇ２／Ｍ制御因子をコード化する。Ｉ−ＮＭ−ＰＰ１による３０分間の処理によって、同様の転写ブロックが生成した（４２のダウンレギュレートされた遺伝子のうち３７が調整された細胞サイクルであり、これらのピークの５７％がＧ２／Ｍにある）（１３０）。
【０２８９】
２時間の薬剤曝露によっても、３８の転写産物の発現が２．５倍以上に上昇した（１０の調整された細胞サイクル）（図２５Ａ−Ｄ）。これらの細胞サイクル調整転写産物の１つを除くすべてが、Ｇ１のピークレベルにて発現される。このグループは、ＧＩサイクリンをコード化する遺伝子を含む（Ｃｌｎ２およびＰｃＩ  Ｉ）。この結果は、Ｃｌｎ−Ｃｄｃ２８阻害剤Ｆａｒ１が２０倍ダウンレギュレートされたという結果と組合わさって、延長されたＣｄｃ２８の阻害およびＧ２／Ｍ阻止が、ＧＩサイクリン−Ｃｄｋ錯体の活性を上昇させる転写プログラムをもたらすことを示唆している。
【０２９０】
Ｃｄｃ２８阻害に対する転写反応における一般的な傾向を評価するために、主要な各細胞サイクル遺伝子クラスターによるすべての遺伝子における発現の平均変化が計算された（図２５Ｄ）。この分析により、ｃｄ２８−ａｓ１細胞の阻害剤処理が、通常は細胞サイクルのＧ２／ＭおよびＭ／Ｇ１段階で発現される、主として遺伝子の発現低下につながることが確認された。
【０２９１】
有糸分裂開始に必要であることに加えて、Ｃｄｋ  １は有糸分裂の終了を制御することも知られている（１３１、１３２）。Ｃｄｋ  １活性は後期からＧ１までの進行を阻害するため、有糸分裂終了のために（主としてタンパク質分解）サイクリンＣｄｋ１の不活性化が必要である。さらにＣｄｋ１は、サイクリンを破壊の標的とする後期促進錯体（ＡＰＣ）の成分をリン酸化および不活性化することによって、有糸分裂後期にそれ自体の不活性化を阻害する（１３３、１３４）。細胞が微小管毒物ノコダゾールによって有糸分裂中に阻止されると、サイクリンの破壊および有糸分裂終了は、Ｃｄｋ阻害タンパク質Ｓｉｃ  １の過剰発現によって誘起することができる（１３５）。これらの結果に合致して、５００ｎＭ  １−ＮＭ−ＰＰ１を用いた処理は、迅速な（＜６０分）サイクリン破壊および有糸分裂後期にｃｄｃ１５−２突然変異によって阻止されたｃｄｃＭ−ａｓｌ細胞の再発芽につながることがわかった（１３６）。
【０２９２】
Ｃｄｋは後期からＧ１までの進行を阻害するが、中期から後期への転移時におけるＡＰＣ活性および姉妹染色分体分離も促進するように思われる（１３１、１３２、１３７）。たとえば、遺伝子的な証拠は、ｃｄｃＭ−ａｓｌを含む、ＣＤＣ２８のある弱い対立遺伝子が後期進行時にわずかな欠陥を示すことを示唆している（１３７）；さらに、ＣＤＣ２８の１つのｔｓ突然変異体（ｃｄｃ２８−ＩＮ）は、制限的温度において中期阻止を示す（１３８）。阻害剤処理がｃｄｃ２８−ａｓｌ細胞内で中期阻止を引き起こす場合の実験条件は、おそらく阻害剤の低い濃度が有糸分裂開始を阻害するか、早期有糸分裂終了を誘起するために、決定されていない。さらに、ｃｄｃ２８−ＩＮ細胞における中期阻止は、キナーゼ活性の一般的な低下によるものではなく、代わりに中期−後期進行に関与する基質に対する活性の限定された欠陥によるものである場合がある。
【０２９３】
実施例２１
脂質キナーゼの突然変異体特異的阻害剤の精製−−ホスファチジルイノシトール−３リン酸キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）アルファ（α）
細胞内でイノシトール三リン酸塩をリン酸化するタンパク質キナーゼの系統群は、ホスファチジルイノシトール−３リン酸キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）と呼ばれる。これらのタンパク質は、ＡＴＰをリン酸供与体基質として利用する。これらは、癌で重要な細胞信号伝達の主要な制御因子である。
【０２９４】
前の例に基づいて、野生種キナーゼを阻害しない阻害剤分子を結合するように変更可能なタンパク質キナーゼの残基を同定した。以前説明した方法を使用して、タンパク質キナーゼおよびＰＩ−３Ｋの間のタンパク質配列アラインメントを作成する。このアラインメントは、ＰＩ−３Ｋγの結晶構造にも基づいている。ＰＩ−３ＫγならびにＰＩ−３Ｋαの構造類似性およびタンパク質キナーゼならびにＰＩ−３Ｋの間の配列アラインメントに基づいて、ＰＩ−３Ｋαの残基Ｉ８４８がｖ−Ｓｒｃの残基Ｉ３３８に該当することが提案される。したがってＩ８４８をＡｌａまたはＧｌｙに突然変異させると、本明細書で開示した阻害剤に感受性であることが予想される突然変異体Ｉ８４８Ａ  ＰＩ−３−ＫαまたはＩ８４８Ｇ  ＰＩ−３−Ｋαが生成する。
【０２９５】
実施例２２
アミノグリコシドキナーゼの突然変異体特異的阻害剤の生成
以前述べた方法によって設計できる酵素の別の系統群は、カナマイシンなどのアミノグリコシド抗生物質をリン酸化する細菌キナーゼである。アミノグリコシドキナーゼの例はＡＰＨ（ＩＩＩ−ａ’）である。
【０２９６】
以前述べた方法に従って、ＡＰＨ（ＩＩＩ−ａ’）およびｖ−Ｓｒｃの間の配列アラインメントを作成する。このアラインメントはＡＰＨ（ＩＩＩ−ａ’）の結晶構造にも基づいている。配列アラインメントに基づいて、ＡＰＨ（ＩＩＩ−ａ’）のメチニオニン残基９０はｖ−ＳｒｃのＩ３３８に該当することが提案される。ＡＰＨ（ＩＩＩ−ａ’）のＭ９０をアラニンまたはグリシンに突然変異させると、本発明の阻害剤に感受性であることが予想されるＭ９０Ａ  ＡＰＨ（ＩＩＩ−ａ’）またはＭ９０Ｇ  ＡＰＨ（ＩＩＩ−ａ’）が生成する。
【０２９７】
上述の詳細な説明は、明確に理解するためのみに与えているものであり、当業者にとって変更は明らかであるため、それによる制限は不要であることを理解されたい。
【０２９８】
本発明はその具体的な実施態様に関連して述べられているが、さらなる変更が可能であり、この応用が、一般に本発明の原理に従い、本発明が関係する当業界の既知または習慣的な常法の枠内に入り、上述した主要な特徴に適用され、添付の請求項の範囲に従うような本開示からの逸脱を含む、あらゆる本発明の変形、用途または改作を含むように意図されることが理解されるであろう。
【０２９９】
このように、本発明は、本発明の精神または主要な特徴から逸脱せずに、別の形式で具現、または別の方法で実行できる。したがって、本開示はあらゆる点において例示的であり、制限的でないとみなされるべきであり、本発明の範囲は添付の請求項によって表され、同等の意味および範囲内に入るすべての変更はその中に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｖ−Ｓｒｃ、（残基７７−２２５が欠失した）ＸＤ４、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＸＤ４融合タンパク質、ＧＳＴ−ＸＤ４融合タンパク質二重突然変異体（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）のタンパク質領域構造の概略図である。
【図２】  Ｎ6位置に“Ｘ”が結合したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）概略図である。下の箱には、実施例に記載されたそれぞれの直交ＡＴＰ類似体において“Ｘ“に代わる（太字体で示す数字１から１２によって常に呼ばれる）１２個の側鎖の概略図が与えられている。
これらの類似体は以下のとおりである：
１−Ｎ6（メトキシ）ＡＴＰ                       ７−Ｎ6（ピロリジノ）ＡＴＰ
２−Ｎ6（エトキシ）ＡＴＰ                       ８−Ｎ6（シクロペンチル）ＡＴＰ
３−Ｎ6（アセチル）ＡＴＰ                       ９−Ｎ6（シクロペンチロキシ）ＡＴＰ
４−Ｎ6（ｉ−プロポキシ）ＡＴＰ     １０−Ｎ6（ピペリジノ）ＡＴＰ
５−Ｎ6−（ベンジル）ＡＴＰ                     １１−Ｎ6（シクロヘキシル）ＡＴＰ
【図３】  ネズミリンパ球細胞溶解物のＡＴＰまたはＡＴＰ類似体（Ａ*ＴＰ）のひとつによる処置後の、タンパク質チロシンリン酸化の濃度を示す抗ホスホチロシン免疫ブロット法を示す。
【図４】  ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（１ＡＴＰ）のＡＴＰ結合領域を示すＸ線モデルの拡大図である。
【図５Ａ】  ＸＤ４およびＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）を発現する細胞溶解物の抗ホスホチロシンブロットを示す。
【図５Ｂ】  細胞溶解物が放射線標識されたＡＴＰのみ、または放射線標識されたＮ6（シクロフェニル）ＡＴＰのみによって与えられる場合の、ホスホリル化のレベルを示すオートラジオグラムである。
【図５Ｃ】  放射線標識ＡＴＰおよび放射線標識Ｎ6（シクロペンチル）ＡＴＰ（Ａ*ＴＰ（８））によるＧＳＴ−ＸＤ４およびＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）の自己リン酸化を表すオートラジオグラムを示す。
【図６】  ＡＴＰおよび１２種類のＡＴＰ類似体それぞれが、ＧＳＴ−ＸＤ４およびＧＳＴ−ＸＤ４（Ｖ３２３Ａ、Ｉ３３８Ａ）触媒ホスホリル化を阻害する相対度を放射線標識ＡＴＰによって示す棒グラフである。
【図７】  リン酸供与基質として放射線標識ＡＴＰおよび放射線標識Ｎ6（シクロペンチル）ＡＴＰのいずれかが与えられた場合の、複数のｖ−Ｓｒｃ位置３３８単一突然変異による自己リン酸化のレベルを示すオートダイアグラムである。
【図８】  本発明の、特定のキナーゼによってリン酸化された細胞内のリン酸化基質を判定する方法の概略図である。ここではｖ−ｓｒｃである。
【図９Ａ】  ３種類の既知のキナーゼ阻害剤、Ｄａｍｎａｃａｎｔｈａｌ（Ａ）、ＰＰＩ（Ｂ）およびＣＧＰ（Ｃ）の化学構造を、複数のキナーゼに対するそれらの阻害定数（ＩＣ50）の概要とともに示す。
【図９Ｂ】  ３種類の既知のキナーゼ阻害剤、Ｄａｍｎａｃａｎｔｈａｌ（Ａ）、ＰＰＩ（Ｂ）およびＣＧＰ（Ｃ）の化学構造を、複数のキナーゼに対するそれらの阻害定数（ＩＣ50）の概要とともに示す。
【図９Ｃ】  ３種類の既知のキナーゼ阻害剤、Ｄａｍｎａｃａｎｔｈａｌ（Ａ）、ＰＰＩ（Ｂ）およびＣＧＰ（Ｃ）の化学構造を、複数のキナーゼに対するそれらの阻害定数（ＩＣ50）の概要とともに示す。
【図１０Ａ】  本発明で設計されたキナーゼである突然変異キナーゼｖ−Ｓｒｃ（Ｔ１２０Ｇ）の阻害剤を生成するために、ＰＰ３のＮ−４、アデノシンジホスフェートのＮ6またはアデノシンモノホスフェートのＮ6、あるいはアデノシン（特にＮ6シクロペンチロキシアデノシン）のＮ6に加えた場合の、各種のかさ高い置換基の構造を示す。
【図１０Ｂ】  本発明で設計されたキナーゼである突然変異キナーゼｖ−Ｓｒｃ（Ｔ１２０Ｇ）の阻害剤を生成するために、ＰＰ３のＮ−４、アデノシンジホスフェートのＮ6またはアデノシンモノホスフェートのＮ6、あるいはアデノシン（特にＮ6シクロペンチロキシアデノシン）のＮ6に加えた場合の、各種のかさ高い置換基の構造を示す。
【図１０Ｃ】  図１０Ａ〜Ｂの阻害剤の合成および阻害定数（図１０Ｃ）を示し、実施例１２で述べる。
【図１１Ａ】  Ｎ−４シクロペントイルＰＰ３の化学構造および野生種ｖ−Ｓｒｃまたは突然変異体（Ｉ３３８Ｇ）の存在下のＮ−４シクロペントイルＰＰ３の存在下で放射線標識される電気泳動タンパク質のオートダイアグラムを示す。
【図１１Ｂ】  Ｎ−４シクロペントイルＰＰ３の化学構造および野生種ｖ−Ｓｒｃまたは突然変異体（Ｉ３３８Ｇ）の存在下のＮ−４シクロペントイルＰＰ３の存在下で放射線標識される電気泳動タンパク質のオートダイアグラムを示す。
【図１２Ａ】  本発明にしたがって調製および試験される追加の阻害類似体を示す表を開示する。
【図１２Ｂ】  本発明にしたがって調製および試験される追加の阻害類似体を示す表を開示する。
【図１２Ｃ】  本発明にしたがって調製および試験される追加の阻害類似体を示す表を開示する。
【図１２Ｄ】  本発明にしたがって調製および試験される追加の阻害類似体を示す表を開示する。
【図１２Ｅ】  本発明にしたがって調製および試験される追加の阻害類似体を示す表を開示する。
【図１２Ｆ】  本発明にしたがって調製および試験される追加の阻害類似体を示す表を開示する。
図１２Ａ−１２Ｆに該当する名称：
ａ．  １−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イルアミン
ｂ．  （１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−エチル−アミン
ｃ．  （１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−プロピル−アミン
ｄ．  （１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−イソブチル−アミン
ｅ．  （１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−シクロペンチルメチル−アミン
ｆ．  （１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−フラン−２−イルメチル−アミン
ｇ．  ベンジル−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｈ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アセトアミド
ｉ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−プロピルアミド
ｊ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−イソブチラミド
ｋ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−２−フェニル−アセトアミド
ｌ．  シクロブタンカルボン酸（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミド
ｍ．  シクロペンタンカルボン酸（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミド
ｎ．  シクロヘキサンカルボン酸（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミド
ｏ．  フラン−２−カルボン酸（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミド
ｐ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−ベンザミド
ｑ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−４−メチル−ベンザミド
ｒ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−４−エチル−ベンザミド
ｓ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−４−イソプロピル−ベンザミド
ｔ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−４−プロピル−ベンザミド
ｕ．  ４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−ベンザミド
ｖ．  ビフェニル−４−カルボン酸（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミド
ｗ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−４−クロロ−ベンザミド
ｘ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−３，４−ジクロロ−ベンザミド
ｙ．  １−ｔｅｒｔ−ブチル−３−ｐ−トリル−1Ｈ−インダゾール−４−イルアミン
ｚ．  （１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−ｐ−トリル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−シクロペンチルメチル−アミン
ａａ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−ｐ−トリル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アセトアミド
ｂｂ．  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド
ｃｃ．  １−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イルアミン
ｄｄ．  ｓｅｃ−ブチル−（１−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｅｅ．  （１−エチル−プロピル）−（１−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｆｆ．  （２−メチル−ブチル）−（１−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｇｇ．  （３−メチル−ブチル）−（１−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｈｈ．  シクロペンチル−（１−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｉｉ．  シクロヘキシル−−（１−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｊｊ．  （１−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−フェニル−アミン
ｋｋ．  （３−クロロ−フェニル）−（１−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｌｌ．  ベンジル−（１−メチル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｍｍ．  ４−クロロ−１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール
ｍｎ．  １，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イルアミン
ｏｏ．  （１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−プロピル−アミン
ｐｐ．  ｓｅｃ−ブチル−（１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｑｑ．  （１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−（１−エチル−プロピル）−アミン
ｒｒ．  （１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−（２−メチル−ブチル）−アミン
ｓｓ．  （１，３−ジメチル−ブチル）−（１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｔｔ．  （３，３−ジメチル−ブチル）−（１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｕｕ．  （１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−ジエチル−アミン
ｖｖ．  シクロペンチル−（１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｗｗ．  シクロヘキシル−（１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−アミン
ｘｘ．  （１，３−ジフェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−フェニル−アミン
ｙｙ．  １−ベンジル−４−クロロ−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール
ｚｚ．  １−ベンジル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イルアミン
ａａａ．  （１−ベンジル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−（１−エチル−プロピル）−アミン
ｂｂｂ．  （１−ベンジル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−ジエチル−アミン
ｃｃｃ．  （１−ベンジル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−ジエチル−アミン
ｄｄｄ．  （１−ベンジル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−シクロペンチル−アミン
ｅｅｅ．  （１−ベンジル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−シクロヘキシル−アミン
ｆｆｆ．  （１−ベンジル−３−フェニル−1Ｈ−インダゾール−４−イル）−フェニル−アミン
【図１３Ａ】  細胞信号を脱回旋する小型分子タンパク質キナーゼ阻害剤の使用に関連する特異性問題の略図を示す。キナーゼ触媒領域（赤い楕円）は高度に保存されている。このように、強力な阻害剤の大多数は、密接に関連したキナーゼの活性をブロックし、キナーゼ活性によって伝達される経路を広範に調節する。
【図１３Ｂ】  本明細書で述べる選択的タンパク質キナーゼ阻害に関する手法の略図を示す。空間作成突然変異は、選択したキナーゼ（Ｓｒｃ）のＡＴＰ結合部位に導入される。この突然変異は、推論的に設計された小型分子阻害剤によって一意に認識されるＳｒｃに、活性部位ポケット（ノッチ）を作成する。この阻害剤は、野生種タンパク質キナーゼにそれを直交させる、かさ高い化学基（バンプ）を含む。相補的キナーゼ／阻害剤対の設計によって、細胞全体という点で、標的キナーゼの高度に選択的な阻害が可能になる。
【図１４Ａ】  Ｎ−６シクロペンチルオキシアデノシン（１）の構造について示す。
【図１４Ｂ】  ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン阻害剤および類似体の合成について述べる。２はＨａｎｅｆｅｌｄ他によって合成し、（ｉ）ＲＣＯＣＩ（１０当量）、ピリジン（Ｃ、１ｈ；次に２２（ｃまで加温、１１ｈ；（ｉｉ）窒素雰囲気下にてＬｉＡｌＨ4（３．０当量）、無水ＴＨＦ、０（ｃ、３０分；次に加熱して３０分間還流。すべての化合物は1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）および高分解能質量分析法（ＥＩ）によってキャラクタリゼーションした。
【図１５Ａ】  ケルセチン（５）およびＡＭＰ  ＰＮＰ（６）の化学構造を示す。
【図１５Ｂ】  ｓｒｃ系統群キナーゼ活性部位における２の予想結合配向を示す。ＡＭＰ  ＰＮＰ（赤）に結合されたＨｃｋおよびケルセチン（青）に結合された結晶構造は、Ｈｃｋタンパク質主鎖（白）にしたがって上書きした。続いて、２のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン環系をＡＭＰ  ＰＮＰに上書きして、２（黄）の構造をキナーゼ活性部位内に結合させた。
【図１５Ｃ】  ２のＮ−４とｓｒｃ系統群キナーゼにおける残基３３８の側鎖との間に予想される密接な接近を示す。図３のように、分子２はｓｒｃ系統群キナーゼ、ＨｃｋのＡＴＰ結合部位内に結合されている。トレオニン３３８側鎖および２の原子は、元素組成によって彩色されており（緑＝炭素、青＝窒素、赤＝酸素、白＝水素）、Ｈｃｋ主鎖は紫で示されている。ここでトレオニン側鎖のメチル水素を示す。画像はプログラムＩｎｓｉｇｈｔＩＩを使用して作成した。
【図１６】  阻害剤３ｇ（図１４）が１３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃにおけるｐ３６リン酸化を阻害しているが、ＷＴ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞は阻害しないことを示す。非形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン１）、ＷＴ  Ｓｒｃ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン２−３）、Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン４−５）は１．１％ＤＭＳＯ（レーン１、２および４）によって、または１００ｍＭ  ３ｇの１．１％ＤＭＳＯ溶液（レーン３および５）で培養した。１２時間後、細胞を溶解させた。リン酸化レベルは図４のように決定した。
【図１７】  Ｉ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換繊維芽細胞が３ｇによる培養時（図１４）に、選択的に平坦な形態をとり、選択的にアクチン張力繊維を回復することを示す。非形質転換（ａ、ｂ）、ＷＴ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換（ｃ．，ｄ．，ｇ．，ｈ．）およびＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換（ｅ．，ｆ．，ｉ．，ｊ．）。ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞は、１．１％ＤＭＳＯ（ａ．，ｃ．，ｅ．，ｇ．，ｉ）または１００ｍＭ  類似体３ｇの１．１％ＤＭＳＯ溶液（ｄ．，ｆ．，ｈ．，ｊ．）のどちらかで処理した。４８時間後に細胞を撮影し（ａ．，ｃ．，ｆ）、ファロイジン−ＦＩＴＣによって染色し、蛍光顕微鏡法によって視覚化（ｂ．，  ｇ．，  ｊ．）した。
【図１８】  Ｃ3誘導体化ＰＰ１類似体の合成を示す。条件：（ｉ．）ＮａＨ２当量、マロニトリル１当量、ＴＨＦ、ＲＴ、０．５時間；（ｉｉ．）ＮａＨｃＯ３  ５当量、硫酸ジメチル５当量、ジオキサン／Ｈ2Ｏ（６／１）、８０℃、１時間；（ｉｉｉ．）トリエチルアミン１当量、ｔｅｒｔ−塩酸ブチルヒドラジン１当量、エタノール、還流、１時間；（iv)ホルムアミド、１８０℃、１２時間。
【図１９】  ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンの２種類の予想結合配向の概略図を示す。Ｎ4で誘導体化された類似体は、ＡＴＰ状の水素結合ネットワークの妨害によって効力を失っている場合がある。このネットワークはＣ3誘導体化阻害剤ではおそらく無傷である。
【図２０Ａ】  野生種ｖ−Ｓｒｃ（レーン１、２）またはＩ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ（レーン３−８）のどちらかを発現するＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞における、チロシンリン酸化に対する６ａ（図１８）の影響を示す。細胞は表示量の６ａ（図１８）の０．５％ＤＭＳＯ溶液中で３０分間処理し、ただちに溶解させた。細胞タンパク質はポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％）によって分離し、ニトロセルロースに移した。チロシンリン酸化タンパク質は、モノクローナル抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０）を用いた免疫ブロットによって描出した。
【図２０Ｂ】  野生種Ｊｕｒｋａｔ細胞における、チロシンリン酸化に対する６ａ（図１８）の影響を示す。１０6Ｊｕｒｋａｔ細胞は、０．５％ＤＭＳＯ（レーン９、１０）、５００ｎＭ  ６ａ（レーン１１）または１０μＭ  ＰＰＩ（レーン１２）の存在下で、３７℃にて３０分間培養した。レーン１０から１２の細胞は次に０．５ｍＭ過バナジン酸で１０分間処理した後に溶解させた。チロシンリン酸化タンパク質は図２０Ａのように描出した。
【図２１Ａ】  ３３８Ｇ  ｖ−Ｓｒｃ形質転換繊維芽細胞が６ａ（図１８）を用いた培養時に、選択的に平坦な形態をとり、選択的にアクチン張力を回復することを示す。図２１Ａは非形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞を示す。
【図２１Ｂ】  野生種ｖ−ＳｒｃまたはＩ３３８Ｇｖ−Ｓｒｃのどちらかによって形質転換された細胞が、０．５％ＤＭＳＯまたは２５０ｎＭ  ６ａの０．５％溶液によって１６時間処理されたことを示す。すべての細胞は固定化し、ファロイジン−ローダミンによって染色し、共焦点顕微鏡法によって描出した。
【図２２Ａ】    （＋）−Ｋ２５２ａ（１）および（＋）−スタウロスポリン（２）の化学構造を示す。
【図２２Ｂ】  ＣＤＫ２（２８）に結合した２の結晶構造を示す。図２２Ａ及び２２Ｂにおいて、ＣＤＫ２はマゼンダで示し、ペプチド主鎖はリボンとして、Ｆ８０側鎖は棒として示す。スタウロスポリンは次のＣＰＫ彩色で示す：炭素（緑）、窒素（青）、酸素（赤）。水素は示していない。
【図２３Ａ】  Ｆｕｓ３機能試験に使用する交配アッセイの概略図である。
【図２３Ｂ】  １０（図２８）および１１（図２８）によって、ｆｕｓ３−ａｓｌ酵母交配の選択的分裂を示す。
【図２３Ｃ】  １０（図２８）および１１（図２８）によって、ｆｕｓ３−ａｓｌ酵母交配の選択的分裂を示す。図２３Ａ〜２３Ｃにおいて、ＯＤ600＝０．５にて野生種Ｆｕｓ３、Ｆｕｓ３−ａｓ１または非Ｆｕｓ３のいずれかを発現する半数体ＵＲＡ３  ｈｉｓ３  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、同数のｕｒａ３  ＨＩＳ３  ｆｕｓ１Δｆｕｓ２Δ細胞と交配し、ニトロセルロース円板上にピペットで移した。表示量の阻害剤を含むＹＰＤプレート上に円板を３０℃で５分間置いた。細胞が円板から遊離し、生じた培養物の連続希釈液を、ウラシルおよびヒスチジンを含まない培地上に配置し、３０℃で２日間培養し、コロニーをカウントした。１０および１１（図２８）が非選択的細胞毒性であることを確認するために、すべての培養物もＹＰＤ上にプレーティングした。１０または１１（図２８）の存在下では３種類の菌株のいずれについても、ＹＰＤプレート上ではｃｆｕ／ｍｌの著しい低下は見られなかった。図２３Ｂは、次の菌株による交配培養物０．１ｍｌを用いて播種した、ヒスチジンおよびウラシルを含まないプレートの写真を示す（上から）：ｆｕｓ３Δ、ｆｕｓ３、ｆｕｓ３＋５μＭ  １０、ｆｕｓ３−ａｓｌ、ｆｕｓ３−ａｓｌ＋５μＭ１０。図２３Ｃは、Ｆｕｓ依存交配の分裂が選択的であり、用量依存性であることを示している。赤い棒は、阻害剤表示濃度で酵母を発現する野生種Ｆｕｓ３のｃｆｕ／ｍｌｘ１０-3を示す。緑の棒は、阻害剤表示濃度で酵母を発現する野生種Ｆｕｓ３−ａｓｌのｃｆｕ／ｍｌｘ１０-3を示す。実験条件は上で述べたとおりである。
【図２４】  ４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（２’−ナフチルメチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（６ｊ）の構造を示す。
【図２５Ａ】  ５００ｎＭ  １−ＮＭ−ＰＰ１の添加によって、Ｇ２／Ｍ転写の降下が発生することを示す。図２５Ａから２５Ｃは、ｃｄｃ２８−ａｓ１細胞の非同期性母集団を１−ＮＭ−ＰＰ１によって１２０分間処理したことを示す。阻害剤の有無によるゲノム規模の転写の相違を、細胞ｍＲＮＡ（１２７）のオリゴヌクレオチドミクロ配列分析によって測定した。比較のために、図２５Ａは、細胞サイクル（１５０）中に転写が調節されることが知られている遺伝子のパーセンテージを示す。
【図２５Ｂ】  阻害剤処理後に２．５倍も減少する転写産物を示す。
【図２５Ｃ】  阻害剤処理後に増加する転写産物を示す。転写産物は、既知の細胞サイクル調節（１５０）に従って、リストと円グラフにグループ分けされている。
【図２５Ｄ】  遺伝子発現におけるゲノム規模の変化を次のような４つの比較によって評価したことを示す：１．未処理ｃｄｃ２８−ａｓｌ細胞と比較したｃｄｃ２８−ａｓｌ細胞＋５００ｎｍ  １−ＮＭ−ＰＰ１（ａｓｌ＋５００／ａｓｌ）；２．薬剤処理野生種細胞と比較した薬剤処理ｃｄｃ２８−ａｓｌ細胞（ａｓｌ＋５００／ｗｔ＋５００）；３．薬剤処理野生種細胞と比較した未処理ｃｄｃ２８−ａｓｌ細胞（ａｓｌ／ｗｔ）；４．未処理野生種細胞と比較した薬剤処理野生種細胞（ｗｔ＋５００／ｗｔ）。各比較では、２つの条件下での遺伝子発現の比を自然対数に変換した。主要な細胞サイクルクラスタ（Ｇ１、Ｓ、Ｓ／Ｇ２、Ｇ２／Ｍ、Ｍ／Ｇ１）それぞれにおけるすべての遺伝子の発現の平均対数変化は、発現が細胞サイクルによって調整されない（Ｕｎｒｅｇ．）遺伝子の場合と同様に計算した。誤差棒は平均の標準誤差を表す。
【図２６Ａ】  （ａ．）本報告書で使用したタンパク質キナーゼの分類、基質特異性および細胞機能を示す。
【図２６Ｂ】  （ｂ．）（ａ）に示したタンパク質キナーゼの位置３３８（ｖ−Ｓｒｃナンバリング）周囲の残基の配列アラインメントを示す。
【図２７】  野生種および合理的に設計されたタンパク質キナーゼのパネルに対するＫ２５２ａおよびＣ（７）誘導体化Ｋ２５２ａ類似体の５０％阻害濃度（ＩＣ50、μＭ）。阻害剤の誘導体化部分は赤で強調してある。最良のＫ２５２ａ誘導体／設計キナーゼのペアの値は、青で示す。キナーゼ精製およびＩＣ50値の測定は、実質的に（８６）に記載されたとおりに実施した。
【図２８】  野生種および合理的に設計されたタンパク質キナーゼのパネルに対するＰＰＩおよびＣ（３）−フェニル誘導体化ＰＰＩ類似体の５０％阻害濃度（ＩＣ50、μＭ）。阻害剤の誘導体化部分は赤で強調してある。最良のＰＰＩ誘導体／設計キナーゼの対の値は、青で示す。キナーゼ精製およびＩＣ50値の測定は、実質的に（８６）に記載されたとおりに実施した。
【図１】
0004876239.tif 000014
【図２】
0004876239.tif 000015
【図３】
0004876239.tif 000016
【図４】
0004876239.tif 000017
【図５Ａ】
0004876239.tif 000018
【図５Ｂ】
0004876239.tif 000019
【図５Ｃ】
0004876239.tif 000020
【図６】
0004876239.tif 000021
【図７Ａ】
0004876239.tif 000022
【図７Ｂ】
0004876239.tif 000023
【図７Ｃ】
0004876239.tif 000024
【図７Ｄ】
0004876239.tif 000025
【図８】
0004876239.tif 000026
【図９Ａ】
0004876239.tif 000027
【図９Ｂ】
0004876239.tif 000028
【図９Ｃ】
0004876239.tif 000029
【図１０Ａ】
0004876239.tif 000030
【図１０Ｂ】
0004876239.tif 000031
【図１０Ｃ】
0004876239.tif 000032
【図１１Ａ】
0004876239.tif 000033
【図１１Ｂ】
0004876239.tif 000034
【図１２Ａ】
0004876239.tif 000035
【図１２Ｂ】
0004876239.tif 000036
【図１２Ｃ】
0004876239.tif 000037
【図１２Ｄ】
0004876239.tif 000038
【図１２Ｅ】
0004876239.tif 000039
【図１２Ｆ】
0004876239.tif 000040
【図１３Ａ】
0004876239.tif 000041
【図１３Ｂ】
0004876239.tif 000042
【図１４Ａ】
0004876239.tif 000043
【図１４Ｂ】
0004876239.tif 000044
【図１５Ａ】
0004876239.tif 000045
【図１５Ｂ】
0004876239.tif 000046
【図１５Ｃ】
0004876239.tif 000047
【図１６】
0004876239.tif 000048
【図１７Ａ】
0004876239.tif 000049
【図１７Ｂ】
0004876239.tif 000050
【図１７Ｃ】
0004876239.tif 000051
【図１７Ｄ】
0004876239.tif 000052
【図１７Ｅ】
0004876239.tif 000053
【図１７Ｆ】
0004876239.tif 000054
【図１７Ｇ】
0004876239.tif 000055
【図１７Ｈ】
0004876239.tif 000056
【図１７Ｉ】
0004876239.tif 000057
【図１７Ｊ】
0004876239.tif 000058
【図１８】
0004876239.tif 000059
【図１９】
0004876239.tif 000060
【図２０Ａ】
0004876239.tif 000061
【図２０Ｂ】
0004876239.tif 000062
【図２１Ａ】
0004876239.tif 000063
【図２１Ｂ】
0004876239.tif 000064
【図２２Ａ】
0004876239.tif 000065
【図２２Ｂ】
0004876239.tif 000066
【図２３Ａ】
0004876239.tif 000067
【図２３Ｂ】
0004876239.tif 000068
【図２３Ｃ】
0004876239.tif 000069
【図２４】
0004876239.tif 000070
【図２５Ａ】
0004876239.tif 000071
【図２５Ｂ】
0004876239.tif 000072
【図２５Ｃ】
0004876239.tif 000073
【図２５Ｄ】
0004876239.tif 000074
【図２６Ａ】
0004876239.tif 000075
【図２６Ｂ】
0004876239.tif 000076
【図２７】
0004876239.tif 000077
【図２８】
0004876239.tif 000078