(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質からなるジベレリン結合剤。
（ａ）配列番号：２、５、７、または９に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号：２、５、７、または９に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および/または挿入されたアミノ酸配列を含み、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号：１、４、６、または、配列番号：９のアミノ酸配列をコードするアラビドプシスゲノムイニシアチブジーン（AGI）コードAt5g27320で特定される遺伝子の塩基配列および/またはその相補配列からなる核酸と、5×SSC、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト液を含む溶液中、60℃でハイブリダイゼーションを行い、その後65℃で0.1×SSC中、振蘯しながら2時間洗浄する条件下でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および/または挿入されたアミノ酸配列を含み、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列および/またはその相補配列からなる核酸と、5×SSC、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト液を含む溶液中、60℃でハイブリダイゼーションを行い、その後65℃で0.1×SSC中、振蘯しながら2時間洗浄する条件下でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号：２、５、７、または９に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質からなる、請求項１に記載のジベレリン結合剤。
【請求項４】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の蛋白質。
【請求項５】
単子葉植物の蛋白質である、請求項２に記載の蛋白質。
【請求項６】
請求項１（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質をコードする核酸の、請求項１に記載のジベレリン結合剤の製造における使用。
【請求項７】
請求項２または４に記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸が導入された形質転換細胞。
【請求項１０】
ジベレリン感受性が上昇した植物細胞である、請求項９に記載の形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項７に記載の核酸が導入された形質転換植物体であって、ジベレリン感受性が上昇した植物体。
【請求項１２】
単子葉植物である、請求項１１に記載の形質転換植物体。
【請求項１３】
請求項１１に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１４】
請求項２に記載の蛋白質に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチド。
【請求項１５】
請求項２に記載の蛋白質の発現を抑制する核酸を発現するベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項１７】
ジベレリン感受性が低下した植物細胞である、請求項１６に記載の形質転換細胞。
【請求項１８】
請求項１５に記載のベクターが導入された形質転換植物体であって、ジベレリン感受性が低下した植物体。
【請求項１９】
単子葉植物である、請求項１８に記載の形質転換植物体。
【請求項２０】
請求項１８に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項２１】
ジベレリン感受性を上昇または低下させる方法であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を、それぞれ上昇または低下させる工程を含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、７、または９に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号：２、５、７、または９に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および/または挿入されたアミノ酸配列を含み、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号：１、４、６、または、アラビドプシスゲノムイニシアチブジーン（AGI）コードAt5g27320で特定される配列番号：９のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列および/またはその相補配列からなる核酸と、5×SSC、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト液を含む溶液中、60℃でハイブリダイゼーションを行い、その後65℃で0.1×SSC中、振蘯しながら2時間洗浄する条件下でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質。
【請求項２２】
ジベレリン高または低感受性植物体の製造方法であって、請求項２１の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を、それぞれ上昇または低下させた植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項２３】
ジベレリン応答性のアッセイ方法であって、請求項２１の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を上昇または低下させた植物細胞または植物体にジベレリンを接触させる工程、および該細胞または該植物体のジベレリン応答を検出する工程、を含む方法。
【請求項２４】
ジベレリン応答性のアッセイ方法であって、請求項２１の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を上昇または低下させた植物細胞または植物体に被験化合物を接触させる工程、および該細胞または該植物体のジベレリン応答を検出する工程、を含む方法。
【請求項２５】
ジベレリンを接触させる工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ジベレリン応答を制御する化合物の選択方法であって、
（ａ）請求項２１の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質の発現を上昇または低下させた植物細胞または植物体に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞または植物体のジベレリン応答を検出する工程、
（ｃ）ジベレリン応答を上昇または低下させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項２７】
工程（ａ）をジベレリン存在下で行う、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２１の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質およびジベレリンを接触させる工程を含む、該蛋白質およびジベレリンを結合させる方法。
【請求項２９】
ジベレリンの結合を検出する方法であって、請求項２１の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質にジベレリンを接触させる工程、および該蛋白質とジベレリンとの結合を検出する工程、を含む方法。
【請求項３０】
ジベレリンと請求項２１の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質との相互作用を制御する化合物のアッセイ方法であって、
（ａ）被験化合物、ジベレリン、および該蛋白質を接触させる工程、および
（ｂ）ジベレリンと該蛋白質との結合を検出する工程、を含む方法。
【請求項３１】
ジベレリンと請求項２１の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質との相互作用を阻害する化合物の選択方法であって、
（ａ）被験化合物、ジベレリン、および該蛋白質を接触させる工程、
（ｂ）ジベレリンと該蛋白質との結合を検出する工程、および
（ｃ）該結合を阻害する化合物を選択する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の分化・生長を制御する遺伝子、および該遺伝子を利用して植物の分化・生長を制御する方法に関する。植物の分化・生長の制御は、植物の品種改良などの分野において有用である。
【背景技術】
【０００２】
ジベレリン（GA）は、四環性ジテルペノイド系の植物ホルモンファミリーであり、植物の幅広い生長や開花・結実など様々な発生過程に必須の化合物である（非特許文献１）。GAの作用を制御することができれば、様々な植物の生長・分化を制御することが可能となる。例えば作物の草型は収量に大きく影響することから、GAシグナル伝達の制御により草型を改良すれば作物の収量増加が期待できる。しかし現在まで、植物がどのようにGAを知覚し、どのようにGAシグナルが伝達され、GAにより調節される植物生長を引き起こすのかは、ほとんど知られていない。最近、本発明者らはイネのGAシグナル伝達変異体を２種類単離した。１つは恒常的GA応答変異体、slender rice1 (slr1)（非特許文献２、非特許文献３）で、もう１つはGA非感受性矮性変異体、GA-insensitive dwarf2 (gid2)（非特許文献４）である。SLR1遺伝子はアラビドプシスのGAI（非特許文献５）およびRGA（非特許文献６）、コムギのRht、トウモロコシ d8、およびオオムギ SLN1（非特許文献７）とオーソロガスな転写調節因子と予想される蛋白質をコードしており、アラビドプシス GAI以下のこれらの蛋白質は全てGRASファミリーの中のDELLAサブファミリーに分類されている（非特許文献８）。GID2遺伝子は、アラビドプシス SLY（非特許文献９）とオーソロガスな、SCF E3ユビキチンライゲースのF-boxサブユニットと予想される蛋白質をコードしている。これらの変異体の解析から、GAシグナル伝達のリプレッサーであるイネSLR1蛋白質は、GAの下流の作用を誘導するSCFGID2-プロテオソーム経路を介して分解されると予想されている（非特許文献８）。しかしながら、GA知覚（GA perception）のステップに関する知見は、DELLA蛋白質により調節されるステップの知見に比べればはるかに少ない。これまでに、生化学的アプローチによりGA結合蛋白質に関するいくつかの報告がなされている（非特許文献１０、非特許文献１１）が、現在に至るまでGA知覚に直接的に関与する蛋白質は同定されていない。
【非特許文献１】Davies, P. J., Plant Hormones (Kluwer Academic, Dordrecht, Netherlands, 1995)
【非特許文献２】Ikeda, A. et al., Plant Cell. 13, 999-1010 (2001)
【非特許文献３】Itoh, H. et al., Plant Cell 14, 57-70 (2002)
【非特許文献４】Sasaki, A. et al., Science 299, 1896-1898 (2003)
【非特許文献５】Peng, J. et al., Genes Dev. 11, 3194-3205 (1997)
【非特許文献６】Silverstone, A. L. et al., Plant Cell 2, 155-169 (1998)
【非特許文献７】Gubler, F. et al., Plant Physiol. 129, 191-200 (2002)
【非特許文献８】Itoh, H. et al., Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003)
【非特許文献９】McGinnis, K. M. et al., Plant Cell. 15, 1120-1130 (2003)
【非特許文献１０】Lovegrove, A. et al., Plant J. 15, 311-320 (1998)
【非特許文献１１】Nakajima, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 782-786 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明はGAシグナル伝達に関与するジベレリン結合蛋白質およびその遺伝子を提供する。また本発明は、該遺伝子を利用して植物の分化・生長を制御する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
疎水性で弱酸であるというGAの生化学的特性から、GAは植物組織の細胞内および細胞間部分では酸性塩の形態として可溶化した状態にあり、また遊離酸の形態として受動拡散により生体膜を通過することもできる（Hooley, R. et al., Biochem. Soc. Trans. 85-89 (1992)）。これまで、GAの受容体には、膜結合型と細胞質型の２つのタイプがあるとの仮説が出されているが（Hooley, R. et al., Biochem. Soc. Trans. 85-89 (1992)）、これまでいずれのGA受容体も同定されていない。ところで本発明者らは、イネのGA非感受性矮性変異体（GA insensitive dwarf mutant）を複数単離することに成功した。これらの変異体の原因遺伝子を同定するため、ポジショナルクローニングにより変異部位を特定した結果、GA非感受性矮性変異の原因となる遺伝子（GA insensitive dwarf mutant-1; GID1）を同定することに成功した。この遺伝子について解析を行ったところ、GID1遺伝子は、hormone sensitive lipase (HSL) ファミリーと類似する未知の蛋白質をコードしており、組み換えGID1蛋白質は、GA4、GA1、およびGA3などの生物学的に活性のあるGAに高親和性を示すが、GA9、GA51、および3-epi-GA4などの生物学的に不活性なGAには示さないことが明らかになった。また、３種の各gid1アレルそれぞれに対応する変異を有する変異GID1蛋白質はいずれもGAに親和性を示さなかった。さらに、GA4に対するGID1のKd値は10-7Mオーダーの範囲内で、シュートの伸長を説明するに十分であった。また、GA4のGID1に対する結合／解離速度は非常に速いことが判明した。さらに、GID1の過剰産生体はGA高感受性（hypersensitive）の表現型を示した。これらの観察から、GID1蛋白質は、GAシグナル伝達を媒介する細胞質受容体であると判断される。本発明により提供されるジベレリン結合蛋白質遺伝子は、ジベレリン感受性を上昇させ、植物の生長を促進するために極めて有用である。また、該蛋白質の発現を抑制することにより植物を矮性化させれば、穀類等の草丈の高い作物の倒伏を軽減し、収穫性を向上させることができる。さらに本発明の蛋白質は、生物活性を持つジベレリンとの結合を評価するために用いることが可能である。これを基に、植物に対するジベレリンの作用を制御する化合物を検査およびスクリーニングすることができる。【０００５】
すなわち本発明は、ジベレリン結合蛋白質およびその遺伝子、並びにそれらの利用に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の１つまたは複数の組み合わせからなる発明は、それらに引用される請求項に記載の発明に既に意図されている。すなわち本発明は、
〔１〕以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質、
（ａ）配列番号：２、５、７、または９に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）配列番号：２、５、７、または９に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および/または挿入されたアミノ酸配列を含み、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質、
（ｃ）配列番号：１、４、６、または８に記載の塩基配列および/またはその相補配列からなる核酸から調製したプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質、
〔２〕以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の蛋白質である、〔１〕に記載の蛋白質、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および/または挿入されたアミノ酸配列を含み、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列および/またはその相補配列からなる核酸から調製したプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、ジベレリンと結合する活性を有する蛋白質、
〔３〕配列番号：２、５、７、または９に記載のアミノ酸配列を含む、〔１〕または〔２〕に記載の蛋白質、
〔４〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む、〔２〕に記載の蛋白質、
〔５〕単子葉植物の蛋白質である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の蛋白質、
〔６〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質をコードする核酸、
〔７〕〔６〕に記載の核酸を含むベクター、
〔８〕〔６〕に記載の核酸が導入された形質転換細胞、
〔９〕ジベレリン感受性が上昇した植物細胞である、〔８〕に記載の形質転換細胞、
〔１０〕〔６〕に記載の核酸が導入された形質転換植物体であって、ジベレリン感受性が上昇した植物体、
〔１１〕単子葉植物である、〔１０〕に記載の形質転換植物体、
〔１２〕〔１０〕または〔１１〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔１３〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチド、
〔１４〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質の発現を抑制する核酸を発現するベクター、
〔１５〕〔１４〕に記載のベクターが導入された形質転換細胞、
〔１６〕ジベレリン感受性が低下した植物細胞である、〔１５〕に記載の形質転換細胞、
〔１７〕〔１４〕に記載のベクターが導入された形質転換植物体であって、ジベレリン感受性が低下した植物体、
〔１８〕単子葉植物である、〔１７〕に記載の形質転換植物体、
〔１９〕〔１７〕または〔１８〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔２０〕ジベレリン感受性を上昇または低下させる方法であって、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質の発現を、それぞれ上昇または低下させる工程を含む方法、
〔２１〕ジベレリン高または低感受性植物体の製造方法であって、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質の発現を、それぞれ上昇または低下させた植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
〔２２〕ジベレリン応答性のアッセイ方法であって、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質の発現を上昇または低下させた植物細胞または植物体にジベレリンを接触させる工程、および該細胞または該植物体のジベレリン応答を検出する工程、を含む方法、
〔２３〕ジベレリン応答性のアッセイ方法であって、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質の発現を上昇または低下させた植物細胞または植物体に被験化合物を接触させる工程、および該細胞または該植物体のジベレリン応答を検出する工程、を含む方法、
〔２４〕ジベレリンを接触させる工程をさらに含む、〔２３〕に記載の方法、
〔２５〕ジベレリン応答を制御する化合物の選択方法であって、
（ａ）〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質の発現を上昇または低下させた植物細胞または植物体に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞または植物体のジベレリン応答を検出する工程、
（ｃ）ジベレリン応答を上昇または低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔２６〕工程（ａ）をジベレリン存在下で行う、〔２５〕に記載の方法、
〔２７〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質およびジベレリンを接触させる工程を含む、該蛋白質およびジベレリンを結合させる方法、
〔２８〕ジベレリンの結合を検出する方法であって、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質にジベレリンを接触させる工程、および該蛋白質とジベレリンとの結合を検出する工程、を含む方法、
〔２９〕ジベレリンと〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質との相互作用を制御する化合物のアッセイ方法であって、
（ａ）被験化合物、ジベレリン、および該蛋白質を接触させる工程、および
（ｂ）ジベレリンと該蛋白質との結合を検出する工程、を含む方法、
〔３０〕ジベレリンと〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質との相互作用を阻害する化合物の選択方法であって、
（ａ）被験化合物、ジベレリン、および該蛋白質を接触させる工程、
（ｂ）ジベレリンと該蛋白質との結合を検出する工程、および
（ｃ）該結合を阻害する化合物を選択する工程、を含む方法、
〔３１〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質およびDELLA蛋白質を接触させる工程を含む、これらの蛋白質を結合させる方法、
〔３２〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質およびジベレリンを含む複合体、
〔３３〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質およびDELLA蛋白質を含む複合体、
〔３４〕DELLA蛋白質をさらに含む、〔３２〕に記載の複合体、に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】gid1のGA非感受性の表現型を示す図である。ａ，播種３ヶ月後の野生型植物（左）およびgid1-1（右）植物の全体の形態 (bar = 10 cm)。挿入図は播種4週間後のgid1-1 の拡大写真である (bar = 1 cm)。ｂ，野生型（黒い丸）およびgid1-1 （黒い三角）のGA3処理応答における第二葉鞘の伸長。バーは標準偏差を表す (n = 10)。ｃ，野生型（黒い丸）およびgid1-1 （黒い三角）の無胚半切種子のGA3処理応答におけるαアミラーゼ活性の誘導。3回繰り返した実験のうち、代表的な１つのデータを示した。ｄ，SD1/OsGA20oxのRNAゲルブロット解析。10-6 MのGA生合成阻害剤 uniconazol (uni) の存在下 (3, 4, 7, 8) または非存在下 (1, 2, 5, 6) で2週間生育させ、10-5 M GA3存在下 (2, 4, 6, 8) または非存在下 (1, 3, 5, 7) で処理した野生型およびgid1の植苗から全RNAを抽出した。Loading controlとして、ゲルをethidium bromideで染色した (EtBr)。ｅ，gid1-1 および野生型におけるイネGA代謝経路およびGAレベル (ng/g fresh weight)。3回繰り返した実験のうち、代表的な１つのデータを示した。ｆ，gid1-1 におけるGAを介したSLR1分解の欠如。上パネル；SLR1 蛋白質の蛋白質ゲルブロット解析。播種後2週のgid1-1 および野生型植苗を10-6 M uniconazol 存在下で生長させ、10-4 M GA3 で図示した時間処理した。各レーンには10μgの全蛋白質をロードした。中央パネル；ローディングコントロールのためのCoomassie brilliant blue (CBB) 染色。下パネル；SLR1 プロモーター - SLR1 - GFP を持つトランスジェニック野生型およびgid1-1 植物の若葉切片のGFP蛍光の共焦点顕微鏡像。植物を10-6 M uniconazol 存在下で生長させ、10-4 M GA3 存在下 (+) または非存在下 (-) で12時間処理した。ｇ，gid1 変異および slr1 変異間のepistatic 解析。各遺伝子の配列から遺伝型を同定したslr1-1 単独変異体、slr1/gid1二重変異体、gid1-1 単独変異体、および野生型植物の全体の形態 (bar = 10 cm)。slr1-1/gid1-1 二重変異体はslr1-1 の表現型を示した。これは、F2植物 (total = 844) の分離比率（segregation ration）からも確認された [各表現型の分離は、200 (slr1-1), 493 (WT), 151 (gid1-1) で、4 : 9 : 3に相当 (χ2 = 0.124, p = 0.940)]。
【図２】GID1遺伝子のゲノム構造を示す図である。ａ，gid1はイネ第5染色体約80 cM、分子マーカーc56-10とc57の間の約38 kbに座乗する。ｂ，4つのgid1変異体の変異体の突然変異箇所およびその変異を示す。
【図３】GID1の構造を示す図である。ａ，GID1のアミノ酸配列。gid1-1、gid1-2、およびgid1-3の変異部位が示されている。ｂ，GID1と、NCBI Conserved Domain Search のデータベースに由来するHSLグループのコンセンサス配列（配列番号：３）とのアミノ酸配列の比較。黒い丸はHSLファミリーで保存された領域を表す。数値は各配列の第一メチオニンからの位置を示す。ｃ，Act1 プロモーター - GID1 - GFP を持つトランスジェニックイネ植物の若葉切片のGFP蛍光の共焦点顕微鏡像。10-6 M uniconazol (+uni) または10-5 M GA3 (+GA3) で1週間植物を処理した。左パネルは、中央パネルのDAPI染色を表す。
【図４】GID1のGA結合特性およびGID1過剰生産体の表現型。ａ，GID1のGA結合の可飽和性。組み換えGID1を、トリチウム化GA4 誘導体 3H4-16,17-dihydroGA4、および濃度を順次増加させた非標識の16,17-dihydroGA4と共にインキュベートした。バーは標準偏差を表す (n = 3)。ｂ，ａの結合データのスキャッチャードプロット。3つの独立した実験結果からKd値を算出した（相関係数 R2 = 0.96）。ｃ，GID1の3H-GAの結合/解離速度（association/dissociation rate）。3H4-16,17-dihydroGA4 のtotal bindingは数分以内に最大値の半分に達した（黒い丸）。アッセイ混合液に非標識のGA4 (0.125 mM) を添加（矢印）すると、3H-GA 結合は数分以内に10%未満に減少した（黒い三角）。バーは標準偏差を表す (n = 3)。ｄ，変異GID1蛋白質はGA結合活性を失っている。(上パネル): 3つのgid1アレルに対応する3つの変異GID1組み換え蛋白質 (GID1-1, -2, および -3) は、GA4と相互作用しなかった。ベクター由来のタグ蛋白質 (Vec) も相互作用しなかった。バーは標準偏差を表す (n = 3)。(下パネル): この実験で用いた組み換え蛋白質のCoomassie brilliant blue染色。ドットはSDS-PAGEプロフィール上のGID蛋白質またはタグ蛋白質を示す。実験では各蛋白質はほぼ同量用いた (80 pmol)。ｅ，播種後3ヶ月のGID1過剰発現体植物 (Actin1 プロモーター - GID1, 右) および野生型植物 (コントロール, 左) の全体の形態。Bar = 50 cm。ｆ，GID1過剰発現体 (黒い三角) および野生型 (黒い丸) の第二葉鞘伸長における用量依存的GA応答。バーは標準偏差を表す (n = 5)。
【図５】アラビドプシスGID1 (AtGID1) およびイネGID1 (OsGID1) のアミノ酸配列。3つのAtGID1および関連蛋白質の配列のアライメント。AtGID1a (配列番号：５), AtGID1b (配列番号：７)、およびAtGID1c（配列番号：９）の配列をOsGID1 (配列番号：２) と比較した。アライメントにはClustalWプログラム（Thompson JD et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-80; Chenna R et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:3497-500; DNA Data Bank of Japan (DDBJ) のClustalWのウェブページ；http://www.ddbjp/search/clustalw-e.html）を利用した。BLAST検索で4番目から10番目にランクされた、OsGID1とオーソロガスな7クローンは、順に「D」から「J」と命名し、AGIグループアノテーション（AGI code）のORF名と結合した文字列としてリストに掲載した。ドッドで示した2つのアミノ酸はOsGID1のGA結合活性の維持に必須のアミノ酸 Gly-196、Arg-251に対応し、イネのgid1-1またはgid1-2 変異体では、それぞれ他のアミノ酸残基に置換されている。矢印は、ホルモン感受性リパーゼの3つの触媒中心（Ser (S), Asp (D), および His (H)）を表す。
【図６】GA結合活性を持たないAtGID1類似蛋白質。A：AtGID1に対する4つの類似蛋白質 (D, At5g23530; E, At5g06570; F, At5g62180; および G, At3g48700；各AGIコード (The Arabidopsis Genome Initiative gene code)) の各組み換え蛋白質をE. coli 発現系を用いて調製した。ポジティブコントロールのAtGID1c組み換え体 (C) の量と比較して10倍量の各粗精製蛋白質を、続くGA結合アッセイに用いた。アスタリスクはSDS-PAGE上の組み換え蛋白質を表す。B：AtGID1類似蛋白質 (D-G) のGA結合活性を標準的なプロトコールにより評価した。特異的GA結合活性 (B-UB) は、非特異的結合活性 (UB：過剰量の非標識GAで可換でない活性) を全結合活性 (B) から差し引いて計算した。3つの独立した測定からSDを決定した。C：AtGID1c組み換え蛋白質の粗画分 (Cr) およびNi-カラムクロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーによる精製画分 (GE) のSDS-PAGEプロフィール。アスタリスクは精製したAtGID1c組み換え蛋白質を表す。D：AtGID1c組み換え蛋白質の粗画分 (Cr) および精製画分 (GE) のGA結合活性。3つの独立した測定からSDを決定した。
【図７】ClustalWプログラムで整列させたOsGID1および10のアラビドプシス蛋白質の系統解析。
【図８】アラビドプシス種子における16,17-dihydro-GA4 の生理学的活性。Yamaguchi et al. (Plant Cell, 10, 2115-2126, 1988) の方法に概して従い、16,17-dihydro-GA4 を含む培地におけるGA欠損ga1-3種子の発芽を調べた。各ディッシュで約70から80の種子を用い、3つの独立した測定を行い標準偏差 (SD) を決定した。4℃で3日間のcold処理後、23℃、4日目で種子の発芽を判断した。GA4をレファレンスに使用した。
【図９】AtGID1のGA結合特性。A-C：AtGID1のGA結合のスキャッチャードプロット解析。AtGID1a (A), AtGID1b (B), および AtGID1c (C) の結果を示す。様々な濃度のGAをアッセイ混合液に添加して、16,17-dihydro-GA4のKd 値を求めた。3つの独立した測定から標準偏差（SD）を決定した。挿入図はAtGID1のGA結合および過剰量の非標識GA4（0.125 mM）による置換（矢印）の時間経過特性を示す。D-F：異なるpH条件におけるAtGID1のGA結合活性。AtGID1a (D), AtGID1b (E), および AtGID1c (F) の結果を示す。特異的結合活性（B-UB）は、全結合活性（B）から、アッセイ溶液への0.125 mM GA4の添加により求めた非特異的結合活性（UB）を差し引いて決定した。
【図１０】in vivoおよびin vitroにおけるAtGID1-AtDELLAの相互作用。A：2つの酵母Twoハイブリッド (Y2H) アッセイにおけるGA存在下でのAtGID1-AtDELLA相互作用。各AtGID1をbaitとして用い、AtDELLAをpreyとした。GA4 (10-5 M) を培地に加えた。バーは、o-nitrophenol-β-D-galactopyranosideを基質として用いたβ-ガラクトシダーゼ活性を示す（アッセイB）。各バーグラフの下に、限定培地での各形質転換体の2日間の増殖を示した（アッセイA）。実験は4回行った。図中のSD値は3回の測定から決定した。B：Y2HのアッセイBにおけるAtGID1-RGA相互作用のdose response。GA4 (10-5 から 10-9 M) を培地に添加した。実験は２回行った。図中のSD値は3回の測定から決定した。C：In vitroにおけるAtDELLAによるAtGID1のGA結合能の評価。左パネル：AtGID1cを混合して15分後 (C)、トリチウム化GAおよび過剰量の非標識GA (+) または非標識GAなし (-)。GAI (G) または RGA (R) を添加し、その後各反応液においてGA結合活性を標準的な方法により測定した。ベクターに由来する組み換え蛋白質 (v) をネガティブコントロールとして用いた。実験は２回行った。SD値は3回の測定から決定した。右パネル：Hisタグに対する抗体を用いた組み換えAtDELLAのウェスタンブロットプロフィール。G, GAI; R, RGA; v, ベクター; M, 分子量マーカー。
【図１１】AtGID1b-AtDELLAのGA非依存的相互作用。A：両方のアッセイで、GAなしでAtGID1b-RGL1のポジティブシグナルが検出された。下パネル：アッセイAにおける各形質転換体の増殖。AtGID1b-GAIの形質転換体も、4日間インキュベーションを延長するとコロニーを形成した。上パネル：アッセイBにおける各形質転換体のβ-ガラクトシダーゼ活性。o-nitrophenol-β-D-galactopyranosideを使った場合はシグナルは検出されず、高感受性基質であるchlorophenol red-β-D-galactopyranosideを用いた場合のみポジティブシグナルが検出された。B：chlorophenol red-β-D-galactopyranosideをより高い感受性を持つ基質として用い、それからo-nitrophenol-β-D-galactopyranosideを用いた時のアッセイBプロフィール。各ウェルの吸収を570 nmで測定した。
【図１２】イネgid1-1形質転換体におけるAtGID1の発現およびアラビドプシスにおける器官特異性。A：pAct1-AtGID1a (a1 および a2)、pAct1-AtGID1b (b1 および b2)、およびpAct1-AtGID1c (c1 および c2) を発現する形質転換体の全体の形態。イネActin1プロモーター制御下でAtGID1遺伝子 (pAct1-AtGID1) を過剰発現するgid1-1植物が、親の変異体（gid1-1）および野生型植物（T65）と共に示されている。バーは5 cmを表す。B：RT-PCRによる形質転換体のAtGID1 mRNA の検出。各形質転換体の葉身約200mgから全RNAを得た。PCRのサイクル数は25 (AtGID1) および 22 (OsActin) とした。C. アラビドプシスにおけるAtGID1発現の器官分布。F, 花 (flower); Si, 長角果 (silique); St, 茎 (stem); L, 葉 (leaf); R, 根 (root); および S, 浸種した種子 (imbibed seed)。PCRのサイクル数は31 (AtGID1) および 22 (AtActin) とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、ジベレリン結合蛋白質および該蛋白質をコードする核酸を提供する。核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、またその形態にも特に制限はない。すなわち核酸は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、mRNAなどであってよく、その形態は一本鎖でも二本鎖でもよい。また環状でも直鎖状でもよい。また本発明において蛋白質という時は、その鎖長が限定されるものではなく、オリゴペプチドと呼ばれる短いペプチド鎖からなるものを含む。また蛋白質はポリペプチドと呼ばれるものを含む。また本発明の蛋白質および核酸には、単離されたもの、および組み換え体が含まれる。単離された蛋白質および核酸とは、自然の状態から離された蛋白質および核酸を言い、精製されたもの、および人工的に製造されたものが含まれる。組み換え体とは、遺伝子組み換えまたは合成により製造または複製されたものを指し、核酸であればその両端または片端が自然の状態とは同じように繋がっていない核酸を言い、プラスミドや他のベクター中にクローニングされたものや合成核酸が含まれる。組み換え核酸は、天然の核酸をヌクレアーゼや超音波などで切断し、リガーゼなどで再結合することにより製造することができる。また、合成された核酸、およびプラスミドやファージあるいはPCR等で増幅された核酸も、本発明において組み換え核酸と言う。また蛋白質であれば、組み換え核酸から発現された蛋白質や合成された蛋白質を組み換え蛋白質と言う。【０００８】
ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって周知の手段を利用して行うことが可能である。例えば、ゲノムDNAであれば、所望の植物から調製したゲノムDNAから作製したゲノミックライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。また、同様に、所望の植物から調製したmRNAを逆転写して得たcDNAを元にcDNAライブラリーを作製し、これをスクリーニングすることにより、cDNAを得ることができる。スクリーニングのためのプローブは適宜調製すればよく、例えば配列番号：１、４、６または８に記載の塩基配列を元に標識プローブを作製して用いればよい。あるいはcDNAやゲノムDNAを鋳型として用いてPCRにより目的のDNAを増幅することができる。また、市販のDNA合成機を用いれば、目的のDNAを合成により調製することも可能である。
【０００９】
本発明の蛋白質としては、配列番号：２、５、７または９に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質およびそれと機能的に同等な蛋白質が含まれる。機能的に同等とは、ジベレリンに対する結合活性を有することを言う。すなわち本発明の蛋白質は、少なくとも１つの生物活性のあるジベレリンに対して結合する活性を有する。生物活性のあるジベレリンとしては、GA4、16,17-dihydroGA4、GA1、GA3、GA35、およびGA37などが含まれる。好ましくは、本発明の蛋白質は、GA4、16,17-dihydroGA4、GA1、およびGA3から選択されるジベレリンの１つ以上（例えばGA4に）、より好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、より好ましくは４つ全てに対して結合活性を有する。さらに好ましくは、本発明の蛋白質は生物活性のあるジベレリンに特異的に結合する。すなわち本発明の蛋白質は、好ましくは不活性のジベレリン (GA4 methyl ester、3-epi-GA4、GA9、およびGA51) に対する親和性が、生物活性のあるジベレリン（例えばGA4、16,17-dihydroGA4、GA1、およびGA3）の少なくとも１つに対する親和性よりも有意に低い。結合親和性は、例えばKd値の測定により決定する。なお本明細書においてジベレリンという時は、特に断らない限りは生物活性のあるジベレリンを言う。【００１０】
ジベレリンとの結合を試験するには、例えば蛋白質を結合バッファー [20 mM Tris-HCl (pH7.6), 5 mM 2-mercaptoethanol, および0.1 M NaCl] に溶解し、標識したジベレリンとインキュベートする。その後、カラムにより結合したジベレリンを定量することにより、両者の結合を測定することができる（Nakajima, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 782-786 (1997)）。具体的には、実施例に記載した方法によりジベレリンとの結合を評価することができる。【００１１】
本発明の蛋白質および核酸の由来には特に制限はない。例えば、本発明の蛋白質および核酸が由来する植物種は、単子葉植物または双子葉植物であってよく、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくはオオムギ、コムギ、イネなどを含むイネ科植物であり、最も好ましくはイネである。また、双子葉植物であればアラビドプシスが挙げられる。ここで由来するとは、蛋白質または核酸が、(i) その植物から得られたものと同じ構造を有するもの、(ii) それらを改変したもの、(iii) (i)の構造（配列）情報を変更し、変更された情報を元に製造されたものが含まれる。例えば、天然の遺伝子を改変し制限酵素認識配列を挿入したり、あるいはタグペプチドを付加して融合蛋白質を作製することにより、活性を維持したまま、天然の遺伝子や蛋白質に由来する核酸や蛋白質を作製することは、通常行われている（Sambrook, J. and DW Russell, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。そのような改変体（および誘導体、派生体）などは、本発明の蛋白質および核酸に含まれる。すなわち本発明は、配列番号：２、５、７または９に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質以外の蛋白質であって、配列番号：２、５、７または９と高いホモロジーを有する配列を含み、ジベレリン結合活性を持つ蛋白質にも関する。【００１２】
また、本発明の蛋白質には、実施例に記載したイネまたはアラビドプシスジベレリン結合蛋白質（GID1）の多型およびバリアント、さらにイネまたはアラビドプシスGID1蛋白質の他の植物におけるホモログ（カウンターパート）などが含まれる。同種植物や他の植物から相同蛋白質をコードする核酸を単離するには、ハイブリダイゼーション技術（Southern EM: J. Mol. Biol. 98: 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki RK, et al: Science 230: 1350, 1985、Saiki RK, et al: Science 239: 487, 1988）が利用できる。例えば配列番号：１、４、６または８に記載の塩基配列またはその相補配列からなる核酸、あるいはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションにより本発明の蛋白質をコードする核酸を単離することができる。具体的には、配列番号：１、４、６または８に記載の塩基配列またはその相補配列、あるいはその一部からプローブを調製し、これとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸をイネや他の植物から単離したり、あるいは配列番号：１、４、６または８に記載の塩基配列またはその相補配列を基にプライマーを調製し、PCRによりイネや他の植物から目的の蛋白質をコードする核酸を増幅することができる。このような蛋白質の例として、例えば、AGI code（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）At3g05120（AtGID1a；配列番号：４、５）、At3g63010（AtGID1b；配列番号：６、７）、At5g27320（AtGID1c；配列番号：８、９）で同定される蛋白質が挙げられる。これらの蛋白質および遺伝子の構造は、MIPS（Munich information center for Protein Sequences）の公開データベース MATDB にても知ることができる他、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のウェブページにおける検索により同定することも可能である。【００１３】
核酸同士がハイブリダイズするかどうかは、例えば、配列番号：１、４、６または８に記載の塩基配列またはその相補配列を含む核酸、あるいはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。プローブの標識は、例えばランダムプライマー法（Sambrook, J. and DW Russell, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2.0 (Takara, Otsu, Japan)）により行えばよい。ストリンジェントな条件は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば 5×SSC (1×SSC は 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrateを含む)、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、48℃、好ましくは52℃、より好ましくは60℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度、より好ましくは60℃、さらにこの好ましくは65℃で、2×SSC中、振蘯しながら2時間洗浄する条件である。より好ましくは、洗浄は1×SSC中、さらに好ましくは0.5×SSC中、さらに好ましくは0.1×SSC中で行う（Sambrook, J. and DW Russell, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。【００１４】
本発明の蛋白質およびそれをコードする核酸は、それぞれ配列番号：２、５、７または９のアミノ酸配列、または配列番号：１、４、６、または８のCDSの塩基配列と高いホモロジーを有する配列を含んでいる。高いホモロジーとは、60％以上、好ましくは65％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有する配列である。配列の同一性は、例えばBLASTプログラムにより決定することができる (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)。具体的には、塩基配列の同一性を決定するにはblastnプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するにはblastpプログラムを用い、例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて「Low complexity」などのフィルターの設定は全てOFFにして、デフォルトのパラメータを用いて計算を行う（Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656）。パラメータの設定は、例えばopen gapのコストはヌクレオチドは5で蛋白質は11、extend gapのコストはヌクレオチドは2で蛋白質は1、nucleotide mismatchのペナルティーは-3、nucleotide matchの報酬は1、expect valueは10、wordsizeはヌクレオチドは11で蛋白質は2、Dropoff (X) for blast extensions in bitsはblastnでは20で他のプログラムでは7、X dropoff value for gapped alignment (in bits)はblastn以外では15、final X dropoff value for gapped alignment (in bits)はblastnでは50で他のプログラムでは25 にする。アミノ酸配列の比較においては、スコアのためのマトリックスとしてBLOSUM62を用いることができる（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）。２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、コーディング配列 (CDS) の外側のギャップは無視して、配列番号：1、4、6または8のCDS、または配列番号：2、5、7または9に対する同一性の値を計算する。【００１５】
また本発明の蛋白質には、配列番号：２、５、７または９に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質が含まれる。アミノ酸配列が改変された蛋白質をコードする核酸を調製するための当業者によく知られた方法としては、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel, TA(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などが挙げられる。また、塩基配列の変異により、コードされる蛋白質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のジベレリン結合蛋白質をコードするアミノ酸配列（例えば配列番号：２、５、７または９）において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質であって、ジベレリン結合活性を有する蛋白質は、本発明に含まれる。少数のアミノ酸を改変しても、蛋白質の活性に影響する可能性は低い（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413、Bowie et al., Science (1990) 247, 1306-1310）。改変されるアミノ酸の数は、一般的には、50アミノ酸以内、好ましくは30アミノ酸以内、より好ましくは25アミノ酸以内、20アミノ酸以内、15アミノ酸以内、または10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。【００１６】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが望ましい。このようなアミノ酸置換を保存的置換と言う。保存的置換のアミノ酸グループとしては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）などのグループ内のアミノ酸置換を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。改変前後の各アミノ酸についてのhydropathic index（Kyte and Doolitte, 1982, J Mol Biol. 157(1):105-32）やHydrophilicity value（US 4554101）の数値は、±2以内が好ましく、さらに好ましくは±１以内であり、最も好ましくは±0.5以内である。【００１７】
例えば、配列番号：２、５、７または９に記載のアミノ酸配列を改変する場合は、hormone sensitive lipase (HSL) ファミリーのコンセンサス配列であるHGGモチーフ（配列番号：２の120から122番目）とGXSXGモチーフ（配列番号：２の196から200番目）を保持するようにする（Osterlund, T. et al., Biochem. J. 319, 411-420 (1996); Manco, G. et al., Arch. Biochem. Biophys. 373, 182-192 (2000)）。また好ましくは、配列番号：２の70から119番目または配列番号：５、７または９においてこれに対応する領域 (図５参照) のアミノ酸配列を有することが好ましい。さらに好ましくは、配列番号：２の148から160番目および258から331番目、または配列番号：５、７または９においてこれらに対応する領域のアミノ酸配列を有することが好ましい。好ましい蛋白質の一例として、配列番号：２の70から350番目、または配列番号：５、７または９においてこれらに対応する領域のアミノ酸配列を含む蛋白質を例示することができる。配列番号：２、５、７または９以外の蛋白質を改変する場合には、これらの配列共にアミノ酸配列のアライメントを作成し、上記に相当する領域を保持するように改変することが好ましい。アライメントの作成は、例えば BLAST 2 SEQUENCES（Tatiana A. et al., 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）やClustalWプログラム（Thompson JD et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-80; Chenna R et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:3497-500）などを利用すればよい。【００１８】
植物のcDNAライブラリーから本発明の蛋白質をコードする核酸をスクリーニングするには、例えば周知の発現ライブラリーのスクリーニングを行うことができる。アラビドプシスおよびイネGID1のN末端の約70アミノ酸の配列は、非常に保存性が高く、かつジベレリン結合蛋白質に特異的であるので、この領域のいずれかの位置に結合する抗体を用いて、この抗体が結合する蛋白質をコードする遺伝子をスクリーニングすることにより、本発明の蛋白質を単離することができる。抗体は、アラビドプシスまたはイネGID1（配列番号：２、５、７または９）の1〜70番目のアミノ酸、好ましくは1〜60番目のアミノ酸、より好ましくは１〜50番目のアミノ酸、より好ましくは1〜40番目のアミノ酸の領域のいずれかの位置に結合する抗体がよい。また、イネGID1の250〜289番目のアミノ酸も保存性が高く、かつ特異的であるので、この領域のいずれかの位置に結合する抗体を用いることも好ましい。例えば、イネGID1（配列番号：２）の250〜289番目のアミノ酸、好ましくは250〜280番目、より好ましくは280〜270番目、より好ましくは280〜265番目、より好ましくは280〜260番目、またはアラビドプシスGID1の該当する領域 (図５参照) のアミノ酸の領域のいずれかの位置に結合する抗体を用いてスクリーニングを行うことができる。本発明においては、これらのいずれかの抗体が結合する蛋白質であって、ジベレリンに結合する蛋白質が含まれる。【００１９】
また蛋白質は、適宜他の蛋白質と融合させて融合蛋白質とすることができる。融合蛋白質を作製するには、目的の蛋白質をコードするDNA同士をフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。融合に付される他の蛋白質としては、特に限定されないが、例えばマーカー蛋白質やタグペプチドが挙げられる。本発明において配列番号：２、５、７または９に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質には、配列番号：２、５、７または９に記載のアミノ酸配列の片端または両端に、タグや他の蛋白質など所望の蛋白質を構成するアミノ酸配列が付加された配列からなる蛋白質が含まれる。【００２０】
本発明の蛋白質との融合に付される他の蛋白質としては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein Cの断片等の公知のタグペプチドが挙げられる。付加するポリペプチドの長さは、例えば50アミノ酸以内、好ましくは30アミノ酸以内、25アミノ酸以内、20アミノ酸以内、15アミノ酸以内、または10アミノ酸以内である。また、融合に付される他の蛋白質としては、例えば、GST（グルタチオン S-トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合蛋白質）等が挙げられる。GSTやMBPとの融合蛋白質は、インビトロで発現させた蛋白質を回収するためによく用いられている（Guan, C. et al. (1987) Gene, 67, 21-30; Maina, C.V. et al. (1988) Gene, 74, 365-373; Riggs, P.D. (1990) In Expression and Purification of Maltose-Binding Protein Fusions. F.M. Ausebel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith and K. Struhl (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, pp. 16.6.1-16.6.10; Bar-Peled and Raikhel (1996) Anal. Biochem. 241:140-142; Brew K, et al. (1975) JBC 250(4):1434-44; H. Youssoufian, (1998) BioTechniques 24(2):198-202）。融合蛋白質の境界部にペプチダーゼ切断配列を設計しておくことにより、蛋白質を精製後にGSTやMBP部分を切り離し、目的の蛋白質だけを回収することができる。【００２１】
また本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質をコードする核酸が挿入されたベクターに関する。ベクターには特に制限はないが、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、コスミド、YAC（yeast artificial chromosome)、BAC（bacterial artificial chromosome)、PAC（P1-derived artificial chromosome)、TAC（transformation-competent artificial chromosome）等が利用できる。ベクターは、上記蛋白質のコード配列および/またはその相補配列を含む。例えば、プラスミドベクターなどの２本鎖DNAベクターであれば、該蛋白質のコード配列およびその相補配列を含む。1本鎖ゲノムを含むウイルスベクターなどであれば、例えばプラス鎖ゲノムを持つウイルスであれば該蛋白質のコード配列を、マイナス鎖ゲノムを持つウイルスであれば相補配列を含む。本発明のベクターは、好ましくは、該蛋白質を発現する発現ベクターである。発現ベクターは、組み換え蛋白質の製造および形質転換に有用である。【００２２】
組み換え蛋白質は、上記発現ベクターを細胞に導入し、発現した蛋白質を回収することにより製造することができる。宿主細胞としては、組み換え蛋白質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、大腸菌等のバクテリア、酵母、種々の動植物細胞（昆虫細胞を含む）などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウム法およびエレクトロポレーション法（Mandel, M. & Higa, A., Journal of Molecular Biology, 1970, 53, 158-162、Hanahan, D., Journal of Molecular Biology, 1983, 166, 557-580）、酵母であれば酢酸リチウム法（BD Yeastmaker Yeast Transformation System 2, BD Bioscience/Clontech）、高等真核細胞であれば各種トランスフェクション試薬（TransIT (R) Transfection Reagents, Mirus Bio Corporation）などを用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換え蛋白質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することができる。上記のように、組み換え蛋白質は他の蛋白質との融合蛋白質として発現させてもよい。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合蛋白質との融合蛋白質（pMALシリーズ, New England BioLabs）、グルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質（pGEXシリーズ, Amersham Pharmacia Biotech）、ヒスチジンタグを付加した蛋白質（pETシリーズ, Novagen）として、蛋白質を製造することが可能である。組み換え蛋白質をマルトース結合蛋白質などとの融合蛋白質として発現させた場合には、アミロースカラムなどを用いて容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。GSTとの融合蛋白質として発現した場合は、グルタチオンカラムを、Hisタグを付加した蛋白質は、ニッケルカラムを利用して、蛋白質を精製・回収することができる。【００２３】
また本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質に結合する抗体に関する。本発明の蛋白質またはその部分ペプチドを抗原として用いることにより、これに特異的に結合する抗体を調製することが可能である。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明の蛋白質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去した血清より調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記蛋白質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, ed., Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY, 1988)）。これにより得られた抗体は、本発明の蛋白質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびこれら抗体の抗原結合部を含むポリペプチド（Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、およびsingle chain Fv (scFv) などを含む）が含まれる。また本発明は、抗血清などの、上記抗体を含む組成物にも関する。【００２４】
アラビドプシスおよびイネGID1のN末端の約70アミノ酸の配列は、非常に保存性が高く、かつジベレリン結合蛋白質に特異的であるので、この領域のいずれかの位置に結合する抗体は特に優れた性質を有する。また、イネGID1の250〜289番目のアミノ酸も保存性が高く、かつ特異的であるので、イネまたはアラビドプシスの対応する領域のいずれかの位置に結合する抗体も、同様に優れた性質を有する。すなわち本発明の抗体としては、例えばアラビドプシスまたはイネGID1（配列番号：２、５、７または９）の1〜70番目のアミノ酸、好ましくは1〜60番目のアミノ酸、より好ましくは１〜50番目のアミノ酸、より好ましくは1〜40番目のアミノ酸の領域のいずれかの位置に結合する抗体、さらに、イネGID1（配列番号：２）の250〜289番目のアミノ酸、好ましくは250〜280番目、より好ましくは280〜270番目、より好ましくは280〜265番目、より好ましくは280〜260番目、またはアラビドプシスGID1の該当する領域 (図５参照) のアミノ酸の領域のいずれかの位置に結合する抗体が特に好ましい。【００２５】
また本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質をコードする核酸が導入された形質転換植物細胞および形質転換植物体に関する。形質転換植物体は、本発明のジベレリン結合蛋白質をコードする核酸を含むベクターを植物細胞に導入し、得られた形質転換植物細胞から植物体を再生させることにより製造することができる。形質転換植物体には、形質転換した植物細胞から再生させた第一世代の植物体、およびその子孫およびクローンであって、導入された核酸を含む植物体が含まれる。子孫には、有性生殖および無性生殖（例えば栄養繁殖など）により生じたものが含まれる。また子孫は、自家交配により得られたもの、および多家交配により得られたものを含む。例えば、他の植物と交配させたF1やF2、およびそれ以降の子孫であって、導入された核酸を含む植物体も、本発明において形質転換植物体に含まれる。【００２６】
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば所望のプロモーターの下流に目的の蛋白質のコード配列を連結したベクターを用いることができる。コード配列の下流にはターミネーターを連結することが好ましい。プロモーターとしては、例えば、恒常的プロモーターとしては、Opineプロモーター（US 5955646）、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; US 5352605、US 5530196、US 5858742、US 6255560、EP 131623B2）、アクチンプロモーター（McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171; US 5684239、EP 1042491、AU 18809/99、US 5859331、EP 651812B1、EP 1179081A1、US 5641876）、ユビキチンプロモーター（Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632; Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689; US 5510474、US 5614399、US 6020190、US 6054574）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（CA 1338858、EP 278658B1、US 5001060、EP 459643B1、US 5 290 924）、その他、US 5608149; US 5608144; US5604121; US5569597; US5466785; US5399680; US5268463; および US5608142 に記載のプロモーターなどが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属イオン、または他の化合物や環境刺激により調節されるプロモーター系が知られている。例えば、ヒートショックプロモーター (Ainley WM, Key JL (1990) Plant Mol Biol 14:949-967; Holtorf S, et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-646)、pathogen応答性プロモーター (PR1-a; Williams S, et al. (1992) Biotechnology 10:540-543; Gatz C (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108)、herbicide safener応答性プロモーター (In2-2, GST-27; De Veylder L, et al. (1997) Plant Cell Physiol 38:568-577)、光応答性プロモーター (Kuhlemeier C, et al. (1989) Plant Cell 1:471-478)、wounding誘導性プロモーター (Firek S, et al. (1993) Plant Mol Biol 22:129-142)、アルコール応答性プロモーター (Salter MG, et al. (1998) Plant J 16:127-132)、phytohormone応答性プロモーター (Li Y, et al. (1991) Plant Cell 3:1167-1175)、ステロイド応答性プロモーター (Aoyama T, et al. (1997) Plant J 11: 605-612)、テトラサイクリン応答性プロモーター (Gatz C, et al. (1992) Plant J 2:397-404; Weinmann P, et al. (1994) Plant J 5:559-569; Sommer S, et al. (1998) Plant Cell Rep 17:891-896)、その他、EP 637339B1、US 5851796、US 5464758、US 5589362、US 5654168、US 5789156、US 5512483、US 6379945、EP 828829A1、EP 1112360A1、WO 01/62780、US 4940661、US 4579821、US 4601978、US 5654414、US 5689044、US 5789214、AU 708850B2、US 6429362、US 5447858、EP 159 884 B1、CA 1338010A1、EP 922110A2、US 6084089、EP 812917A1、US 6184443、US 5847102、US 5750385、US 5639952、US 5656496に記載のプロモーターなどを例示できる。【００２７】
組織特異的プロモーターとしては、Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 12(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J 4(3):495-505 などに記載のものを用いることができる。【００２８】
ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはoctopine合成酵素遺伝子やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、これらに限定されない（Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639）。遺伝子発現を増強するため、例えば使用するコドンを最適化することができる。そのためには、例えば以下の文献を参照することができる（US 5,380,831, US 5,436,391; Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498）。【００２９】
植物細胞へのベクターの導入は、当業者に周知の方法を用いることができる。遺伝子導入に用いる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、種子中の胚盤等の植物細胞、リーフディスク、カルスなどが挙げられる。具体的に例示すれば、アグロバクテリウムを介したTiプラスミドベクターを用いた遺伝子導入（EP 270355, EP 0116718, Nucl. Acids Res. 12(22):8711-8721 (1984), Townsend et al., US 5,563,055）、パーティクルガン（US 5,100,792, EP 444882 B1, EP 434616 B1; Sanford et al., US 4945050; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926）、マイクロインジェクション（WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press; Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334）、エレクトロポーレーション（EP 290395, WO 8706614, Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606; D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505）、その他のDNA直接取り込み（DE 4005152, WO 9012096, US 4,684,611, Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722）、リポソーム法（Freeman et al. (1984) Plant Cell Physiol. 29:1353）、ボルテックス法（Kindle (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87:1228）、ポリエチレングリコール法などが挙げられる。植物細胞への遺伝子導入については、以下の文献も参照することができる（Oard (1991) Biotech. Adv. 9:1-11; Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674; McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926; Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182; Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324; Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740; Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563; Tomes, US 5,240,855; Buising et al., US 5322783, US 5324646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839; Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349; De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, N.Y.), pp. 197-209; Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566; Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255; Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413; Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750）。【００３０】
植物細胞への形質転換については、以下の文献も参照のこと（Toriyarna et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7:379-384; Zhang et al. (1988) Theor. Appl. Genet. 76:835-840; Shimamoto et al. (1989) Nature 338:274-276; Datta et al. (1990) Bio/Technology 8: 736-740; Christou et al. (1991) Bio/Technology 9:957-962; Peng et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines, pp. 563-574; Cao et al. (1992) Plant Cell Rep. 11:585-591; Li et al. (1993) Plant Cell Rep. 12:250-255; Rathore et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21:871-884; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833-839; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505; Walters et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:189-200; Koziel et al. (1993) Biotechnology 11: 194-200; Vasil, I.K. (1994) Plant Mol. Biol. 25:925-937; Weeks et al. (1993) Plant Physiol. 102:1077-1084; Somers et al. (1992) Bio/Technology 10: 1589-1594; WO 92/14828; Hiei, et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282); Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:158-162; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10:667-674; Vain, et al. (1995) Biotechnology Advances 13(4):653-671; Vasil, et al.(1996) Nature Biotechnology 14:702)。【００３１】
上記の遺伝子導入法を２つ以上組み合わせて用いると、導入効率をより向上させ得る。例えば、アグロバクテリアをコートしたマイクロパーティクルを打ち込んだり、パーティクルガンで植物組織を傷つけた後でアグロバクテリアと共培養する方法などが知られている（EP 486234; EP 486233)。【００３２】
イネの形質転換植物体の作製についてより具体的に例示すれば、ポリエチレングリコール法（Datta, S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp 66-74）、エレクトロポレーション（Toki et al (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）、カルスを用いたアグロバクテリウム法（Hiei, Y. et al., Plant J. 6, 270-282 (1994）、および種子を用いたアグロバクテリウム法 (JP 2001-029075) などの方法が知られている。本発明において、これらの方法を好適に用いることができる。【００３３】
また、形質転換細胞を効率的に選択するために、ベクターに適当な選抜マーカー遺伝子を搭載させたり、あるいは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞に導入することができる。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えばハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。【００３４】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（R. Abdullah et al., Bio/Tecnology, 4: 1087-1090 (1986); K. Toriyama et al., Theor. Appl. Genet., 73: 16-19 (1986); Y. Yamada et al., Plant Cell Reports, 5: 85-88 (1986)）。植物体の再生に関しては、以下の文献も参照のこと（Vasil et al. (1984) in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vols. I, II, III, Laboratory Procedures and Their Applications (Academic Press); Weissbach et al. (1989) Methods For Plant Mol. Biol.）。形質転換植物体は、同じ形質転換系統または他の系統を用いて、自家受粉や他家受粉により子孫を得ることができる。他家受粉により、所望の形質を導入したハイブリッドを作製することもできる。【００３５】
形質転換植物体は、有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。繁殖材料とは、植物体への生長能を持つ植物組織または器官を言い、種子、切穂、および栄養繁殖器官および栄養繁殖組織が含まれる。栄養繁殖器官としては、具体的には、株、切穂（cuttings）、根茎（rhizome）、塊茎（tuber）、鱗茎（bulb）、球茎（corm）などの地下茎（subterraneanstem）、根茎と同様に土中を広がる横走根（creeping-root）、地表を横走するほふく茎（stolon）、さらに地上部に形成される珠芽（むかご，bulbil）などが含まれる。【００３６】
本発明は所望の植物に適用してもよく、例えばイネ科植物、マメ科植物、ナス科植物、アブラナ科植物、ウリ科植物、アカザ科植物、セリ科植物、キク科植物、バラ科植物、ユリ科植物から選択される植物などが例示できる。具体的には、例えばトウモロコシ (Zea mays)、カノーラ (Brassica napus, Brassica rapa ssp.)、アルファルファ (Medicago sativa)、イネ (Oryza sativa)、ライムギ (Secale cereale)、モロコシ (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare)、ヒマワリ (Helianthus annuus)、オオムギ (Hordeum vulgare)、コムギ (Triticum aestivum)、ダイズ (Glycine max)、タバコ (Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana)、ジャガイモ (Solanum tuberosum)、ピーナッツ (Arachis hypogaea)、綿花 (Gossypium hirsutum)、サツマイモ (Ipomoea batatus)、コーヒーノキ (Coffea spp.)、ココヤシ (Cocos nucifera)、パイナップル (Ananas comosus)、シトリス (Citrus spp.)、カカオノキ (Theobroma cacao)、チャノキ (Camellia sinensis)、バナナ (Musa spp.)、アボカド (Persea americana)、グアヴァ (Psidium guajava)、マンゴー (Mangifera indica)、オリーブ (Olea europaea)、パパイア (Carica papaya)、カシューナットノキ (Anacardium occidentale)、マカデミア (Macadamia integrifolia)、アーモンド (Prunus amygdalus)、サトウダイコン (Beta vulgaris)、カラス麦（エンバク）、Arabidopsis spp.、その他の作物、野菜、および観賞植物などが挙げられる。好ましくは、本発明は単子葉植物、および穀類植物に適用され、具体的には、イネ科、マメ科、タデ科などの植物が含まれる。より好ましくは、本発明が適用される植物はイネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、キビ、ヒエ、アワ、サトウキビ、ソルガム、ハトムギ、トウモロコシ、シバ、エンバクなどを含むイネ科植物であり、最も好ましくはイネ（Oryza属）である。【００３７】
得られた植物体は、好ましくはジベレリンに対する感受性が上昇している。ジベレリン感受性が上昇するとは、ジベレリンの作用の少なくとも１つが、本発明の核酸の導入前の親株に比べて上昇することを言う。ジベレリン感受性は、例えば、草丈、葉身長、分蘗数、枯死率、葉鞘の伸長速度、種子のαアミラーゼ誘導などにより測定することができる。好ましい態様において、本発明の形質転換体は、本発明の核酸の導入前の親株に比べ、ジベレリンの作用の2以上、より好ましくは3以上、または4以上が上昇している。ジベレリン作用としては、例えば高い草丈、長い葉身、葉鞘の伸長速度の増大、分蘗の減少、枯死率の減少、発芽促進、開花促進、落葉抑制などに加え、細胞分裂促進、アリューロン細胞のアミラーゼ誘導、加水分解酵素の合成誘導、およびGA応答遺伝子の発現誘導を含む細胞内シグナル伝達の活性化などが挙げられる。これらのうち1つ以上、好ましくは2以上、3以上、または4つの特徴を有する植物は、ジベレリン感受性が上昇していると判断される。作用のジベレリン特異性は、形質転換体と非形質転換体との間で効果に差が見られるかを検証したり、ジベレリンの用量依存性が見られるかで確認することができる。GAの細胞内シグナル伝達の検出については、以下の文献も参照のこと（Yazaki J, et al., DNA Res., 2003, 10(6):249-61; Yazaki J, et al., Physiol Genomics., 2004, 17(2):87-100; Margis-Pinheiro M, et al., Plant Cell Rep., 2005, 23(12):819-33; Thomas SG, Sun TP., Plant Physiol., 2004, 135(2):668-76; Ogawa M, et al., Plant Cell., 2003, 15(7):1591-604; Gomez-Maldonado J, et al., Planta., 2004, 218(6):1036-45; Skadsen RW., Plant Physiol., 1993, 102(1):195-203; Dill A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2001, 98(24):14162-7; Bouquin T, et al., Plant Physiol., 2001, 127(2):450-8; Washio K., Biochim Biophys Acta., 2001, 1520(1):54-62; Ogawa M, et al., Plant Mol Biol., 1999, 40(4):645-57; Chono M, et al., Plant Cell Physiol., 1998, 39(9):958-67; Vishnevetsky M, et al., J Biol Chem., 1997, 272(40):24747-50; Toyomasu T, et al., Biosci Biotechnol Biochem., 1995, 59(10):1846-9; Cejudo FJ, et al., Plant Mol Biol., 1992, 20(5):849-56; Gubler F, Jacobsen JV., Plant Cell., 1992, 4(11):1435-41; Baulcombe DC, et al., J Biol Chem., 1987, 262(28):13726-35; Gale MD, Spencer D., Biochem Genet., 1977, 15(1-2):47-57; Gopalakrishnan B et al., Plant Mol Biol., 1991, 16(3):463-7; Cho, H. T.,and H. Kende., 1997, Plant Cell 9: 1661-1671）。
【００３８】
ジベレリン感受性は、好ましくは、第二葉鞘の伸長および/または無胚半切種子（embryoless half seeds）のαアミラーゼの誘導を測定することにより決定する（Ueguchi-Tanaka, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 11638-11643 (2000); Yamaguchi, J. (1998) Breeding Sci. 48, 365-370; Chrispeels, M.J. and Varner, J.E. (1967) Plant Physiol. 42:398-406; Kashem MA et al. (1998) Planta, 205(3):319-26）。より具体的には、実施例を参照のこと。本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現を上昇させる工程を含む、ジベレリン感受性を上昇させる方法に関する。該方法には、ジベレリン感受性の上昇による表現型の変化、すなわち生長の促進、草丈の伸長などを引き起こすための方法も含む。例えば生長速度の増大などのジベレリン高感受性の表現型の少なくとも１つを獲得させるために、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現レベルを上昇させることができる。また本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質をコードする核酸を植物細胞に導入する工程を含む、ジベレリン感受性を上昇させる方法、および、ジベレリン感受性を上昇させるための該核酸の使用に関する。これらには、ジベレリン感受性の上昇による表現型の変化、すなわち生長の促進、草丈の伸長などを引き起こすための方法および使用も含む。また本発明は、ジベレリン結合蛋白質をコードする核酸が導入された植物体を製造する工程を含む、ジベレリン感受性が上昇した植物体の製造方法、および、ジベレリン感受性が上昇した植物体の製造における該核酸の使用にも関する。これらの方法および使用も同様に、ジベレリン感受性の上昇による表現型の変化、すなわち生長の促進、草丈の伸長などが引き起こされた植物体の製造方法および使用を含む。また本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質をコードする核酸であって、ジベレリン感受性上昇用核酸に関する。ジベレリン感受性上昇用核酸とは、もっぱらジベレリン感受性を上昇させる用途のみに用いる核酸である。また本発明は、ジベレリン感受性の上昇による表現型の変化、すなわち生長の促進、草丈の伸長などを引き起こす用途のみに用いる、ジベレリン感受性上昇用核酸にも関する。ジベレリン感受性が上昇した植物は生長が促進されることが期待できるため、例えば食用植物などの作物に適用すれば収量の増大が期待できる。また、植物の草丈を自由に制御することができる。【００３９】
また本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現が抑制された植物体に関する。このような植物は、該植物体が内因的に保持する該蛋白質の発現量が低下している。ここで蛋白質の発現の抑制とは、対象とする蛋白質またはそれをコードするmRNAの発現量が低下または消失することを言い、転写抑制、翻訳抑制、および/またはmRNAや蛋白質の安定性の低下等に起因してよい。発現の抑制は、植物細胞における該蛋白質のmRNAレベルの低下、該蛋白質レベルの低下、または蛋白質の活性低下による表現型の変化などにより確認することができる。【００４０】
本発明のジベレリン結合蛋白質の発現を抑制するためには、該蛋白質を発現を抑制する核酸を植物で発現させればよい。このような核酸は、その発現により該蛋白質をコードする遺伝子の転写および/または翻訳を抑制する核酸を言い、具体的にはアンチセンス効果やRNAiを利用することができる。植物細胞におけるアンチセンス効果は、Eckerらが一時的遺伝子発現法を用いてアンチセンス効果を発揮することで実証した（J.R.EckerおよびR.W.Davis,(1986)Proc.Narl.Acad.USA.83:5372）。その後、タバコやペチュニアなど多くの植物において、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており（A.R.van der Krolら（1988）Nature 333:866）、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。【００４１】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（A）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸と蛋白質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制、RNA silencingを介したmRNAの分解などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害あるいはmRNAの分解して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座2  核酸IV  遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人，p.319-347，1993, Serio ら (2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6506-6510）。【００４２】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的である。あるいは、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用しうる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物の相補配列に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば、96％, 97％, 98％, 99％以上）の同一性を有する配列を、少なくとも18塩基以上、好ましくは20塩基以上、より好ましくは22、25、30、35、40、50、100、200、または500塩基以上含む。通常、用いられるアンチセンス核酸の長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。【００４３】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子である。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, (1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191)。【００４４】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている (M. Koizumiら (1988) FEBS Lett.228:225)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である (M. Koizumiら (1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄子 (1990) 蛋白質核酸酵素, 35:2191、M. Koizumiら (1989) Nucleic Acids Res. 17:7059)。例えば、配列番号：１、4、6または8のコーディング配列中には、標的となり得る部位が多数存在する。【００４５】
また、ヘアピン型リボザイムも、遺伝子発現を抑制するために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Y.Kikuchi およびN.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、菊池洋, (1992) 化学と生物 30:112)。【００４６】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Tairaら, (1990) Protein Eng. 3:733、A.M.DzianottおよびJ.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.GrosshansおよびR.T.Cech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Tairaら (1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyamaら Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。このようなリボザイムを用いて標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。【００４７】
また、内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成することができる。「共抑制」には転写抑制型（transcriptional gene silencing, TGS）と転写後抑制型（post-transcriptional gene silencing, PTGS）の2種類が知られているが、いずれも植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、標的内在性遺伝子の発現が抑制される現象のことを指し、植物においてはしばしば観察される (Curr.Biol.7:R793,1997, Curr.Biol.6:810,1996)。同様の現象は相同的遺伝子抑制（homologous gene silencing, HGS）としても知られている。例えば、本発明の核酸の発現が共抑制された植物体を得るためには、本発明のDNAもしくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して標的遺伝子の発現が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子（例えば配列番号：１、4、6または8）と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％, 96％, 97％, 98％, 99％以上）の配列の同一性を有することが好ましい。転写させる核酸は、ジベレリン結合活性を持つ蛋白質をコードしないものを用いることが好ましい。例えば蛋白質コード配列中に塩基の欠失、挿入、または置換を含み、機能的蛋白質を発現しないようにした核酸が好適に用いられる。【００４８】
共抑制におけるPTGSやHGSの一部は、RNAi（RNA interference）や、miRNA (micro RNA)を介する発現抑制機構が関与していると理解されている（van der Krol AR, et al., Plant Cell, 1990, 2(4):291-9; Jorgensen RA, et al., Plant Mol Biol, 1996, 31(5):957-73； Vance and Vaucheret (2001) Science 292:2277-2280; Kerschen, A. et al., 2004, FEBS Letters 566:223-228; Jorgensen, R.A., 2003, Sense cosuppression in plants: past, present and future. In: RNAi: a Guide to Gene Silencing (ed. G. J. Hannon), Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 5-21）。RNAiは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNA（以下dsRNA）を細胞内に導入すると、標的内遺伝子の発現が抑制される現象である。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、RNaseIII様のヌクレアーゼであるDicerがdsRNAを3'末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA, small interfering RNA）を生じる。このsiRNAに特異的な蛋白質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC：RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子のmRNAを切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びDicerの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する。【００４９】
RNAiは真核細胞で広く観察され、現在では標的遺伝子の発現を効果的に抑制する手段として幅広く用いられている（Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001)、Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)）。特に植物では、上述のように古くから共抑制として知られており、RNAiを利用した遺伝子発現の抑制は、所望の遺伝子に対するノックダウン植物体を作出する方法として頻繁に利用されている（Chuang CF & Meyerowitz EM: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4985, 2000; Tomita, R. et al., FEBS Lett. 573: 117-120）。本発明においても、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現が抑制された植物を製造するために、この蛋白質をコードする遺伝子に対するRNAiを誘導するRNA（RNAi-RNAと称す）を転写するベクターを好適に利用することができる。【００５０】
RNAi-RNAとして、例えば標的遺伝子のコード配列の一部を含むセンス鎖およびその相補鎖を含む2本鎖RNA(dsRNA）を用いることができる。例えば、短い2本鎖領域を含むsiRNAを発現させることが好ましい。siRNAは21〜23塩基対程度のものが好ましいが、細胞に対して毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。siRNAは、適宜発現ベクターから転写させて生成させることができる。プロモーターとしては、例えばRNA polymerase IIIプロモーターを用いることができる（McManus et al. (2002) RNA 8:842-850）。siRNAを発現するベクターは、例えば標的蛋白質のコード配列とその相補配列を含むRNAを別々のRNA分子として転写させてもよいし、両者をスペーサーで連結したRNA分子を転写させてもよい。一本鎖として転写されたRNAはヘアピン構造を持つ二本鎖RNA (self-complementary hairpin RNA (hpRNA)) を形成し、RNAiにより標的遺伝子の発現が抑制される（Smith, N.A. et al. Nature, 407:319, 2000、Wesley, S.V. et al. Plant J. 27:581, 2001、Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001）。【００５１】
RNAi-RNAの二本鎖領域は、標的遺伝子と完全に同一な配列である必要はないが、好ましくは90％以上（例えば、95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上）の配列の同一性を有する。dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。ミスマッチおよびバルジの数は、通常は1から6であり、好ましくは１から3である。【００５２】
またmiRNA (micro RNA) も上記と同様に標的遺伝子の発現を阻害するために利用することができる。miRNAは前駆体RNAの一部として発現させることができる（Reinhart et al. (2002) Genes & Development 16:1616-1626; Llave et al. (2002) Plant Cell 14:1605-1619）。miRNAのサイズは、通常は15から30塩基程度であり、標的mRNAと相補的な配列を含む。miRNA前駆体の構築や、miRNAを用いた標的遺伝子の発現抑制については、既報を参照することができる（McManus et al. (2002) RNA 8:842-850; Reinhart et al. 前記; Llave et al. (2002) 前記)。発現ベクターから転写させる場合には、例えばRNA polymerase IIIプロモーターを用いることができる（McManus et al. (2002) RNA 8:842-850）。【００５３】
上記のようなアンチセンス、リボザイム、共抑制核酸、siRNA、またはmiRNAなどの、本発明の蛋白質の発現を抑制する核酸を発現するベクターを植物細胞に導入し、この細胞から植物体を再生することにより、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現が抑制された植物体を製造することができる。本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現を抑制する核酸を含むベクター、具体的には本発明のジベレリン結合蛋白質をコードするRNAのアンチセンスRNA、該蛋白質をコードするRNAを切断するリボザイム、共抑制により該蛋白質の発現を抑制する共抑制誘導RNA、または該蛋白質の発現を抑制するsiRNAまたはmiRNAをコードする核酸、および該核酸を含むベクターを提供する。また本発明は、該核酸が導入された植物細胞、および該細胞を含む植物体に関する。ベクターの導入、および植物体の再生は、既に上記に記載した方法を用いればよい。本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現を抑制する工程を含む、ジベレリン感受性を低下させる方法に関する。ここで本発明の蛋白質の発現の抑制には、該蛋白質に変異を導入し、活性を低下または消失させることを含む。すなわち、本発明の蛋白質をコードする遺伝子に変異を導入したり、欠失や挿入により破壊して、機能的蛋白質が発現しないようにすることで、本発明の蛋白質の発現を抑制することができる。該方法には、ジベレリン感受性の低下による表現型の変化、すなわち生長の抑制、草丈の短縮、矮性化などを引き起こすための方法も含む。例えば矮性化などのジベレリン低感受性の表現型の少なくとも１つを獲得させるためには、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現レベルを低下させればよい。また本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現を抑制する核酸を植物細胞に導入する工程を含む、ジベレリン感受性を低下させる方法、および、ジベレリン感受性を低下させるための該核酸の使用に関する。これらには、ジベレリン感受性の低下による表現型の変化、すなわち生長の抑制、草丈の短縮、矮性化などを引き起こすための方法および使用も含む。また本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現を抑制する核酸であって、ジベレリン感受性低下用核酸に関する。ジベレリン感受性低下用核酸とは、もっぱらジベレリン感受性を低下させる用途のみに用いる核酸である。また本発明は、ジベレリン感受性の低下による表現型の変化、すなわち生長の抑制、草丈の短縮、矮性化などを引き起こす用途のみに用いる、ジベレリン感受性低下用核酸にも関する。また本発明は、ジベレリン結合蛋白質の発現を抑制する核酸が導入された植物体を製造する工程を含む、ジベレリン感受性が低下した植物体の製造方法、および、ジベレリン感受性が低下した植物体の製造における該核酸の使用にも関する。これらの方法および使用も同様に、ジベレリン感受性の低下による表現型の変化、すなわち生長の抑制、草丈の短縮、矮性化などが引き起こされた植物体の製造方法および使用を含む。植物が本発明の蛋白質をコードする遺伝子を複数（2つ、3つ、またはそれ以上）有する場合は、2つ以上、好ましくは3つ以上、より好ましくはすべての遺伝子の発現を抑制させることで、より効果的にジベレリンの感受性を低下させることができる。ジベレリン結合蛋白質の発現を抑制する核酸が導入された形質転換植物体には、形質転換した植物細胞から再生させた第一世代の植物体、およびその子孫またはクローンであって、該核酸を含む植物体が含まれる。形質転換植物体からは、有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株等）を得ることが可能である。有性生殖により子孫を得る場合は、自家受粉のみならず、他の植物体と交配させてもよい。【００５４】
このようにして作出された植物体は、親株または野生型と比較してジベレリン感受性が低下している。ジベレリン感受性の低下は、例えば草丈の短縮、葉身の短縮、分蘗の増加、枯死率の上昇、葉鞘の伸長速度の低下、種子のアミラーゼ誘導の低下などのジベレリンの作用のうち１つ以上、好ましくは2以上、3以上、または4以上の特徴を有することにより確認することができる。例えば本発明の蛋白質の発現が抑制された植物体は、SD1 mRNA（Sasaki, A. et al., Nature 416, 701-702 (2002)）レベルが対照植物（抑制される前の親株）に比べて上昇（例えば1.5倍以上、好ましくは2倍以上、3倍以上、または5倍以上に）していてよい。また本発明の蛋白質の発現が抑制された植物体は、GA1レベルが対照植物に比べて上昇（例えば2倍以上、好ましくは5倍以上、10倍以上、20倍以上、50倍以上、または100倍以上に）していてよい。また本発明の蛋白質の発現が抑制された植物体は、ジベレリンによるSLR1蛋白質の分解が、対照植物に比べて有意に阻害されていてよい。より詳細なジベレリン作用については本明細書に既に記載した通りである。好ましくは、ジベレリン感受性は、第二葉鞘の伸長および/または無胚半切種子のαアミラーゼの誘導を測定することにより決定する（Ueguchi-Tanaka, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 97, 11638-11643 (2000)）。すなわち、ジベレリン感受性が低下した植物体は、親株または野生型に比べ第二葉鞘の伸長が減少、および/またはαアミラーゼの誘導が低下している。本発明に従い、上記のように植物のジベレリン感受性を低下させることで、植物を矮性化することができる。特に、草丈の高い植物を矮性化して短稈化すれば、耐倒伏性を高めることができる。短稈化した穀類植物は収量の増加が期待できる。実際、ジベレリン生合成酵素の1つであるGA20酸化酵素をコードする遺伝子の変異により短稈化した高収量イネ品種（IR8）が開発されている（Sasaki, A. et al., Nature, 2002, 416, 701-702）。農業上重要な作物の収穫性を向上させることは世界的に重要な課題であり、特に、米、小麦、大麦、カラス麦、ライ麦、トウモロコシ、栗などの穀類植物における高収量性品種の開発の必要性は高い。本発明に従い穀類植物を短稈化することにより、より高収量を望める作物を作り出すことが期待できる。また、作物以外の植物に関しても、例えば鑑賞用植物を矮性化することで、新たな美的価値を付加することも可能である。例えば本発明は、本発明のジベレリン結合蛋白質の発現が抑制され矮性化した観賞用盆栽イネを提供する。【００５５】
また本発明は、本発明の蛋白質およびジベレリンを接触させる工程を含む、該蛋白質およびジベレリンを結合させる方法に関する。ジベレリンは任意の生物活性ジベレリンであってよい。さらに本発明は、本発明の蛋白質およびDELLA蛋白質を接触させる工程を含む、本発明の蛋白質およびDELLA蛋白質を結合させる方法に関する。さらに本発明は、本発明の蛋白質、ジベレリン、およびDELLA蛋白質を共存させる工程を含む、これら３者を結合させる方法に関する。これらの方法は、後述のように、これらの結合を調節する化合物をアッセイしたり、あるいはこれらの結合を調節する化合物をスクリーニングするために有用である。スクリーニングにより得られた化合物は、ジベレリンシグナル伝達を調節するために有用である。結合反応は、適宜生理的溶液中で行うことができ、例えば結合バッファー [20 mM Tris-HCl (pH7.6), 5 mM 2-mercaptoethanol, および0.1 M NaCl] などを例示できるがこれに限定されない。また本発明は、本発明の蛋白質およびジベレリンを含む単離された複合体、および本発明の蛋白質およびDELLA蛋白質を含む単離された複合体に関する。さらに本発明は、本発明の蛋白質、ジベレリンおよびDELLA蛋白質を含む単離された複合体にも関する。【００５６】
DELLA蛋白質とは、植物GRASファミリーの中のDELLAサブファミリーに分類され、GAシグナル伝達を調節する蛋白質を言う（Peng J et al. (1999) Nature 400: 256-261; Itoh, H. et al., Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003)）。DELLA蛋白質は、ジベレリンシグナル伝達を抑制する機能を有することが知られている。DELLA蛋白質としては、例えばアラビドプシスのRGA、GAI、RGL1、RGL2、および RGL3、イネSLR1、オオムギSLN1、トウモロコシ D8、コムギRHTなど、多数が知られている（Fleet, C.M., and Sun, T.-P. (2005) Curr. Opin. Plant Biol., 8, 77-85；Dill, A., and Sun, T. (2001) Genetics, 159, 777-785; Ueguchi-Tanaka, M. et al. (2005) Nature, 437, 693-698; Chandler PM et al.(2002) Plant Physiol 129: 181-190; Gubler F et al. (2002) Plant Physiol 129: 191-200; Peng J et al. (1999) Nature 400: 256-261）。より具体的には、RGA（Location: At2g01570, Accession number; NM_126218, CDS: 207..1967, Protein ID: NP_178266）、GAI（Location: At1g14920, Accession number; NM_101361, CDS: 189..1787, Protein ID: NP_172945）、RGL1（Location: At1g66350, Accession number; NM_105306, CDS: 133..1665, Protein ID: NP_176809）、RGL2（Location: At3g03450, Accession number; NM_111216, CDS: 128..1768, Protein ID: NP_186995）、RGL3（Location: At5g17490, Accession number; AK117226, CDS: 191..1759, Protein ID: BAC41902）、イネSLR1（Accession number; AB030956, CDS: 216..2090, Protein ID: BAA90749）、オオムギSLN1（Accession number; AF460219, CDS: 1765..3618, Protein ID: AAL66734, Q8W127）、トウモロコシ D8（Accession number; AJ242530, CDS: 1..1890, Protein ID: CAB51557）、コムギRHT（Accession number; AJ242531, CDS: 1..1869, Protein ID: CAB51555, Q9ST59）を例示できる。【００５７】
他の植物のDELLA蛋白質は、例えば上記のDELLA遺伝子のコード配列（CDS）またはその相補配列から調製したプローブを用いたハイブリダイゼーションなどにより単離することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば 5×SSC (1×SSC は 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrateを含む)、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、48℃、好ましくは52℃、より好ましくは60℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度、より好ましくは60℃、さらにこの好ましくは65℃で、2×SSC中、振蘯しながら2時間洗浄する条件である。より好ましくは、洗浄は1×SSC中、さらに好ましくは0.5×SSC中、さらに好ましくは0.1×SSC中で行う（Sambrook, J. and DW Russell, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。【００５８】
DELLA蛋白質のアミノ酸配列またはそのコード配列（CDS）は、上記のアラビドプシスまたはイネDELLAのいずれかと高いホモロジーを有する配列を含むことが好ましい。高いホモロジーとは、60％以上、好ましくは65％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有する配列である。配列の同一性は、本明細書に記載した方法により決定する。【００５９】
本発明は、ジベレリン応答性をアッセイ（評価）する方法であって、本発明の蛋白質の発現を上昇または低下させた植物細胞または植物体にジベレリンを接触させる工程、および該細胞または該植物体のジベレリン応答を検出する工程、を含む方法を提供する。ここでジベレリン応答性のアッセイとは、ジベレリン応答を定性的および/または定量的に測定することをいい、ジベレリン応答の有無の検出、ジベレリン応答の程度の決定などであってよい。またジベレリン応答には、ジベレリンによる表現型の変化、すなわち草丈や生長速度などの変化も含む。また、本発明の蛋白質の発現を上昇または低下させた植物細胞または植物体とは、該蛋白質量またはそのmRNA量が上昇または低下（消失を含む）していることが知られた所望の植物細胞または植物体が含まれ、例えば該蛋白質量またはそのmRNA量の上昇または低下が既に記載されているか、または知られていることであってよい。例えば本発明のジベレリン結合蛋白質をコードするベクター、または該蛋白質の発現を抑制する核酸（アンチセンス、siRNAなど）をコードするベクターが導入された植物細胞または植物体を用いて、このアッセイを行うことができる。例えば、本発明の蛋白質をコードする核酸が導入された植物細胞または植物体に生物活性型ジベレリンを接触させ、ジベレリン応答を検出する。これにより、本発明の蛋白質をコードする核酸の導入によるジベレリン応答性の上昇やその程度を知ることができる。また、アンチセンスやsiRNAなど、本発明の蛋白質をコードする核酸の発現を抑制する核酸が導入された植物細胞または植物体にジベレリンを接触させ、ジベレリン応答を検出することにより、ジベレリン応答性の低下やその程度を測定することができる。ジベレリン応答の検出は、公知の方法を用いればよい。【００６０】
また本発明は、ジベレリン応答性をアッセイする方法であって、本発明の蛋白質の発現を上昇または低下させた植物細胞または植物体に被験化合物を接触させる工程、および該細胞または該植物体のジベレリン応答を検出する工程、を含む方法を提供する。ここでジベレリン応答性のアッセイとは、ジベレリン応答を定性的および/または定量的に測定することをいい、ジベレリン応答の有無の検出、ジベレリン応答の程度の決定などであってよい。例えば、本発明の蛋白質の発現が上昇した植物はジベレリンに対する感受性が上昇しているので、ジベレリン応答に対する被験化合物の効果をより明確に検出することができる。また、野生型植物に被験化合物を適用した場合の結果を比較することで、効果の特異性を検証することもできる。また、本発明の蛋白質の発現が低下した植物を用いて被験化合物のアッセイを行えば、本発明の蛋白質に非依存的にジベレリン応答を誘導する効果を検出することができる。これにより、本発明の蛋白質を介さずにジベレリンシグナル伝達を制御する蛋白質や他の化合物を評価することができる。【００６１】
上記の被験化合物を用いるアッセイにおいては、ジベレリンを接触させる工程をさらに含むことができる。すなわち本発明は、ジベレリン応答性のアッセイ方法であって、（ａ）ジベレリン存在下で、本発明の蛋白質の発現を上昇させた植物細胞または植物体に被験化合物を接触させる工程、および（ｂ）被験化合物存在下または非存在下における該細胞または植物体のジベレリン応答を検出する工程、を含む方法を提供する。ジベレリンとしては、所望の生物活性ジベレリンを用いることができる。これにより、ジベレリン応答を制御する化合物のアッセイが可能となる。このアッセイは、被験化合物がジベレリン応答性を制御するか、あるいはその程度を評価するために有用である。【００６２】
さらにこれらのアッセイ方法の一態様として、ジベレリン応答を制御する化合物の選択方法が提供される。すなわち、被験化合物存在下で上記のアッセイ方法を実施し、ジベレリン応答を検出する。そして、ジベレリン応答を上昇または低下させる被験化合物を選択する。この方法により、新たなジベレリン誘導体をスクリーニングしたり、あるいはジベレリンの効果を阻害する化合物をスクリーニングすることが可能となる。比較のための対照として、被験化合物非存在下（または低用量存在下）や他の化合物の存在下でアッセイを行い、その場合のジベレリン応答に比べて該応答を上昇または低下させる被験化合物を選択することができる。【００６３】
また本発明は、ジベレリンの結合を検出する方法であって、本発明の蛋白質にジベレリンを接触させる工程、および該蛋白質とジベレリンとの結合を検出する工程、を含む方法を提供する。また本発明は、本発明の蛋白質であって、ジベレリン結合用蛋白質に関する。ジベレリン結合用蛋白質とは、もっぱらジベレリンとの結合の用途のみに用いる蛋白質である。ジベレリンとしては、所望の生物活性ジベレリンを用いることができる。またジベレリンとの結合の検出は、本明細書に記載した方法により実施することができる。さらに、この検出方法の一態様として、本発明の蛋白質とジベレリンとの相互作用を制御する化合物のアッセイ方法が提供される。すなわち、被験化合物、ジベレリン、および本発明の蛋白質を接触させ、ジベレリンと該蛋白質との結合を検出することにより、被験化合物が本発明の蛋白質とジベレリンとの結合を促進または阻害するかどうかを同定したり、さらにその程度を評価することができる。対照として、被験化合物非存在下（または低用量存在下）あるいは他の化合物の存在下で本発明の蛋白質とジベレリンとの結合を検出し、比較してもよい。さらにこのアッセイ方法の一態様として、本発明の蛋白質とジベレリンとの結合を促進または阻害する化合物の選択方法が提供される。すなわち、被験化合物、ジベレリン、および本発明の蛋白質を接触させ、ジベレリンと該蛋白質との結合を検出する。該結合を促進または阻害する化合物を選択することにより、本発明の蛋白質とジベレリンとの結合をそれぞれ促進または阻害する化合物を得ることができる。対照として被験化合物非存在下（または低用量存在下）あるいは他の化合物の存在下で本発明の蛋白質とジベレリンとの結合を検出し、比較してもよい。この方法により、ジベレリン応答を制御する新たな化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。【００６５】
植物材料および生育条件
以下の実施例で、イネ品種 Oryza sativa L. cv. Taichung 65, japonica (変異体が由来する元々の系統) および４つのgid1変異アレル（gid1-1 から gid1-4）およびslender rice1 (slr1-1)（Ikeda, A. et al., Plant Cell. 13, 999-1010 (2001)）を例示として用いた。gid1変異アレルは以下の変異原に起因する；N-methyl-N-nitrosourea (gid1-1)、細胞培養 (gid1-2 およびgid1-4)、およびγ線 (gid1-3)。全てのイネ植物は温室で30℃（昼）および24℃（夜）で生育させた。【００６６】
GA応答性試験
イネの第二葉鞘の伸長および無胚半切種子（embryoless half seeds）のαアミラーゼ誘導におけるGA応答性試験は、（Ueguchi-Tanaka, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 97, 11638-11643 (2000)）に記載された方法で実施した。【００６７】
プラスミド構築
組み換えイネGID1蛋白質の産生のため、野生型および変異型GID1の全長cDNAに対応するDNA配列をPCRにより増幅した。変異を持つものと持たないGID1 cDNA配列をpGEX-4T (Pharmacia) に挿入した。相補（complementation）試験では、BACクローンからのイネゲノムDNAをPstIで消化し、GID1配列の全長をカバーする6.7 kbのDNA断片を単離してpBluescript (R) ベクターにクローニングした。この断片を平滑末端化して、ハイグロマイシン耐性のバイナリーベクター pGI-Hm12 (Hm-2を改変；Sato, Y. et al., Plant Mol. Biol., 1998, 38:983-998) のSmaIサイトに挿入した。SLR1プロモーター - SLR1 - GFPの構築は、以前記載されている（Itoh, H. et al., Plant Cell 14, 57-70 (2002)）。これらの構築物は、（Hiei, Y. et al., Plant J. 6, 270-282 (1994)）に記載のように、Agrobacterium tumefaciensを介した形質転換によりイネ細胞に導入した。【００６８】
内在性GA測定およびその他の解析
イネの内在性GAの定量解析は、以前記載したように、ガスクロマトグラフィー選択イオンモニタリング（gas chromatography-selected ion monitoring）により行った（Kobayashi, M. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1969-1970 (1995)）。RNAゲルブロット解析およびウェスタンブロット解析は以前の記載のように行った（Itoh, H. et al., Plant Cell 14, 57-70 (2002)）。【００６９】
ジベレリン結合アッセイ
ジベレリン結合アッセイでは、[1,2,16,17-3H4]16,17-dihydro-GA4 を標識GA4として用いた。インビトロでのGA結合アッセイは以前の方法に改良を加えて行った（Nakajima, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 782-786 (1997)）。精製した組み換えGID1蛋白質 (400 pmol) を300μｌの結合バッファー [20 mM Tris-HCl (pH7.6), 5 mM 2-mercaptoethanol, および0.1 M NaCl] に溶解し、非標識GA4の非存在下 (全結合) または833倍過剰量の非標識GA4 の存在下(非特異的結合) で、100μlの3H4-16,17-dihydroGA4 (6 pmol) と、25℃で2時間インキュベートした。その後、0.1 mlの反応混合液をNAP-5 カラム (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) にかけた。結合バッファーによる溶出液 (0.6 ml) を捨てた後、続く溶出液 (0.2 ml) を回収し、その放射活性を測定した。全結合量から非特異的結合量を差し引いて、置換可能なGA結合部位数を反映する特異的結合活性を算出した。他のGAについても、上記と同様に実施することができる。
【００７０】
[実施例１]  ジベレリン非感受性矮性変異体の同定
ジベレリン知覚に関与する遺伝子を単離するため、イネのGA非感受性矮性変異体 (gid) をスクリーニングし、幾つかのgid変異を異なる遺伝子座で同定した。その中の１つの変異体であるgid1-1は、イネでこれまで知られているGA関連変異体（Sasaki, A. et al., Science 299, 1896-1898 (2003); Itoh, H et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8909-8914 (2001); Sakamoto, T. et al., Plant Physiol. 134, 1642-1653 (2004)）の典型的な表現型である重篤な矮性化と葉身の拡大および緑暗色化を示した（図１ａ）。この変異は劣性で遺伝し、稔性を持つ花は発生しなかったため、ヘテロ接合体植物として維持した。このgid1植物は、調べた限りどんなGA応答性も示さなかった。野生型植物（WT）では、第２葉鞘の伸長は10-8 M以上のGA3で促進されたが、gid1-1では全く促進されなかった（図１ｂ）。また、野生型の種子では10-9 M以上のGA3でαアミラーゼ活性の誘導が起きたが、gid1-1の種子では起きなかった（図１ｃ）。野生型では、GA3による、GA生合成遺伝子（Thornton, T. M. et al., Trends Plant Sci. 4, 424-428 (1999)）SD1/OsGA20ox2（Sasaki, A. et al., Nature 416, 701-702 (2002)）の発現のネガティブフィードバックが観察されたが、gid1-1では観察されず、高レベルのSD1 mRNAが蓄積した（図１ｄ）。また、内在性のGAsレベルを測定したところ、gid1-1は野生型に比べ約120倍のGA1 を蓄積していることが判明した（図１ｅ）。これらの結果は全て、gid1-1 がGA非感受性変異体であることを実証している。【００７１】
次に、gid1とslr1の上位性検定（epistatic analysis）を実施した。二重変異はslr1の表現型を示した（図１ｇ）ことから、GID1とSLR1はGAシグナル伝達の同一経路上で機能しており、SLR1がGID1に対して上位（epistatically）で機能することが示された。GA依存的なSLR1の分解はGA作用に必須であり、分解が阻害されると、植物はgidの表現型を示すことが知られている（Sasaki, A. et al., Science 299, 1896-1898 (2003)）。gid1-1においてSLR1の分解が阻害されているかを調べるため、SLR1のイムノブロット解析を行った。野生型では、GA3 処理の30分以内にSLR1の完全な分解が誘導されたが、gid1-1では、2時間経過しても、SLR1蛋白質はGA3処理と未処理で同様のレベルで維持された（図１ｆ、上パネル）。gid1 におけるGA3 に対するSLR1の安定性の増加は、SLR1プロモーター−SLR1−GFPが導入されたトランスジェニック植物でも確認され、gid1-1では、GA3 処理後も核においてGFPシグナルが観察されたが、野生型の核では観察されなかった（図１ｆ、下パネル）。これらの結果は、GID1はSLR1の分解に必須であることを実証している。【００７２】
[実施例２]  ジベレリン受容体遺伝子のクローニング
GID1の分子機能を解明するため、ポジショナルクローニングによりGID1遺伝子を単離し、4種の変異アレルにおける変異部位を決定した（図２）。予想されたGID遺伝子は１つのイントロンと２つのエクソンを含み、354アミノ酸残基のポリペプチドをコードしている（図２ｂおよび図３ａ）。この遺伝子の全長cDNAの配列の解析により、エクソン領域の予想は正確であり、この遺伝子は実際に転写されることが確認された。GID遺伝子の全領域をカバーする6.7 kbのPstI断片をgid1-1 に導入したところ、表現形は正常型に回復することが判明した。【００７３】
GID1蛋白質のアミノ酸配列を解析したところ、GID1はhormone sensitive lipase (HSL) ファミリーのコンセンサス配列を有することが判明した（図３ｂ）。実際、GID1は、HSLファミリーで最も保存されたモチーフであるGXSXGモチーフとHGGモチーフ（Osterlund, T. et al., Biochem. J. 319, 411-420 (1996); Manco, G. et al., Arch. Biochem. Biophys. 373, 182-192 (2000)）の両方をもつ（図３ｂのドット）。gid1-1 アレル中の GXSXGモチーフの最初のGがDに変わる一アミノ酸置換が、重篤な表現型を引き起こす（図３ａ）ことから、GXSXG モチーフはGID1の機能にとって重要であることが実証された。GID1とHSL蛋白質ファミリー間の構造的類似性から、GID1はイネにおいてHSL様の機能を持っていることが示唆される。本発明者らはまた、Act1プロモーター - GID1 - GFPを発現するトランスジェニック植物におけるGFPシグナルの観察により、GID1の細胞内局在を調べた。GID1-GFP蛋白質は主に核に局在し、細胞質中には弱いシグナルが検出された。この細胞局在は、GA3 処理の前後で変化しなかった（図３ｃ）。【００７４】
[実施例３]  ジベレリン受容体の分子解析
gid1においてGAによるSLR1分解が起きなくなることから（図１ｆ）、本発明者らは、GID1は、GID2のようにSLR1自体の分解に関与しているか、あるいはGAシグナル伝達においてSLR1よりも上流で機能している可能性があると考えた。gid1と他のGA関連変異体の間で表現型を正確に比較したところ、gid1の表現型は、gid2（Sasaki, A. et al., Science 299, 1896-1898 (2003)）およびΔDELLA型の優性GA-insensitive dwarf mutants（Itoh, H. et al., Plant Cell 14, 57-70 (2002)）などのGA非感受性変異体よりもむしろ、cps（Sakamoto, T. et al., Plant Physiol. 134, 1642-1653 (2004)）およびkao（Sakamoto, T. et al., Plant Physiol. 134, 1642-1653 (2004)）などのGA欠損変異体の重篤なアレルの方により類似していることが分かった。gid1のこの表現型の特性に基づき、本発明者らは、GID1はGA知覚に関与していると予想した。この可能性を確かめるため、本発明者らは、非平衡ゲルろ過法（Nakajima, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 782-786 (1997)）を用いてGID1 と放射性同位元素で標識したGAとの相互作用を直接的に調べた。期待した通り、GID1はトリチウム化GA4 誘導体（3H4-16, 17-dihydroGA4）に対する結合活性を示し、ほとんどの結合は過剰量の非標識 GA4 により置換可能であった。結合が置換可能であったことは、この結合はGA特異的であることを示している。一方、熱変性させたGID1や、組み換えGID2、イネGAシグナル伝達分子の他のメンバーは、いかなる特異的結合活性をも示さなかった。次に、GID1のリガンド特異性をトリチウム化GA4 誘導体および様々なGAの間の競合により試験した。表１に、GID1へのトリチウム化GA4 誘導体の結合の50％阻害に必要な各GAの濃度（IC50）を示す。GID1は、GA4、16,17-dihydroGA4、GA1、およびGA3などの生物活性のあるGAsに高親和性を示したが、生物活性のないGAsにはほとんどまたは全く親和性を示さなかった。これらの各GAのIC50 値は、それぞれの生理学的活性とよく一致している。【００７５】
表１  GID1蛋白質に対する3H-GA4誘導体の結合の各種GAによる競合
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[生物活性のあるGA (GA4、16,17-dihydroGA4、GA1、およびGA3)、弱い活性のあるGA （GA35およびGA37)、および不活性のGA (GA4 methyl ester、3-epi-GA4、GA9、およびGA51) を試験した。**：IC50は50％阻害に必要な濃度を表す。またRel%は相対値 (%) を表す]【００７６】
次に、GAへのGID1結合のカイネティクスを解析した。GAに対するGID1のKd値を計算するため、様々な濃度のGA4 誘導体でGAの結合の可飽和性を測定した（図４ａ）。スキャッチャードプロット解析により、16, 17-dihydroGA4 のKd値は1.4 x 10-6 Mで、GA4 のKd値は2.8 x10-7 M であることが、両GAの競合効率を基に判明した（図４ｂおよび表１）。これらのKd値は、投与された生物活性のあるGAに対するイネシュートの伸長の原因を合理的に説明することができる（図１ｃ）。また、結合の会合および解離速度を調べた。GID1とGA4 誘導体との間の結合/解離に必要なhalf-timeは数分以内であり（図４ｃ）、これらの反応は極めて速く起こることが示された。GA結合のこの速いカイネティクスは、細胞質受容体として機能するのに好都合だと思われる。本発明者らはまた、重篤な矮性化の表現型を示す３つのgid1アレル、gid1-1、-2、および-3由来の変異蛋白質のGA結合活性を調べた。変異GID1蛋白質は、GAへの結合活性を完全に失っていた（図４ｄ）。これは、GID1-1およびGID1-2の１アミノ酸置換が、GA結合活性の喪失をもたらし、ひいてはイネ植物において完全なGA非感受性を引き起こすことを実証している。これらの結果を合わせると、GID1はGA受容体に求められるこれまでの基準（Kende, H. & Gardner, Annu. Rev. Plant, Physiol. 27, 267-290 (1976)）、すなわち（i）可逆性、（ii）高いリガンド特異性、（iii）生物活性のあるリガンドに対する合理的な親和性、および（iv）GA結合特性の飽和性、を満たしていると結論される。【００７７】
[実施例４]  ジベレリン受容体遺伝子のトランスジェニック植物
GID1がGA受容体として働くならば、GID1過剰発現体はGA高感受性（hypersensitive）の表現型を示すことが予想される。そこで、イネアクチン遺伝子の強力なプロモーターの制御下でGID1を過剰発現するトランスジェニックイネ植物を作製した。GID1過剰発現体は、野生型に比べ、高い草丈、薄緑色で長い葉身、分蘗の減少、枯死率の減少を示し、これらは全てGA過剰投与時の表現型に一致する（図４ｅ）。過剰発現体の第二葉鞘の伸長におけるGA応答性は、野生型に比べほぼ100倍高かった（図４ｆ）。【００７８】
GA4に対するGID1のKd値は、イネのシュート伸長に対しては上記のように妥当であるが、αアミラーゼの誘導など、アリューロン細胞においてGAが媒介する応答のそれよりも約10倍高い（図１ｃ）。以前本発明者らは、アリューロン細胞における高感受性GA応答には三量体G蛋白質のαサブユニットが関与している可能性を提唱している（Ueguchi-Tanaka, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 97, 11638-11643 (2000)）。すなわち、GID1によるGA知覚は、三量体G蛋白質を介した膜受容体系の共同により促進されている可能性があり、これがアリューロン細胞におけるもう一つのGA受容体系の要素として機能している可能性がある（Hooley, R. et al., Planta 183, 274-280 (1991); Jones, H. D. et al., Plant Cell 10, 245-254 (1998)）。【００７９】
GID1はこれまで知られていなかった蛋白質をコードしており、HSLファミリーの保存配列を共有している。哺乳動物において、HSLは、脂肪細胞の脂肪分解反応（lipolysis）のホルモン制御における主要な酵素であり（Yeaman, S. J., Biochem J. 379, 11-22 (2004)）、HSLがノルアドレナリンおよびインスリンなどのホルモンシグナルを受けてトリグリセロールを加水分解する。植物では、in vivoにおける受容体活性についての遺伝学的な証拠は存在しないものの、salicylic acid (SA)-binding protein 2 (SABP2) がリパーゼ活性を持つHSLファミリーのメンバーの１つであり、SAと相互作用できることがKumar & Klessigにより報告されている（Kumar, D. & Klessig, D. F., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100, 16101-16106 (2003)）。本発明において、GID1は植物のシグナル知覚系に関与するHSLファミリーのメンバーであり、GAの細胞質受容体として機能してGAシグナルを制御することが実証された。【００８０】
[実施例５]  アラビドプシスジベレリン受容体の同定
遺伝子配列データベースの検索により、上記で同定したイネGID1（OsGID1）蛋白質のアミノ酸配列と類似する蛋白質をコードする複数の遺伝子をアラビドプシスから見い出した。図５は、OsGID1、およびOsGID1と類似性が高い10のアラビドプシス遺伝子がコードする導出アミノ酸配列のアライメントを示している。2つのイネgid1変異体（図2bおよび図3a）から、Gly-196とArg-251の2つのアミノ酸残基がGAの相互作用に必須であると考えられるが、このうち、Gly残基は図５にリストされた全ての遺伝子に存在するが、Arg残基は上位3つの遺伝子にしか存在しない。このことから、これら3つの候補はOsGID1と同様GA結合活性を有しており、残りは有していないことが示唆された。【００８１】
OsGID1と類似性の高い上位7つの遺伝子からE. coliで組み換え蛋白質を製造し、トリチウム化GA4誘導体 16, 17-dihydro-GA4 を用いた非平衡ゲルろ過法により、これらのGA結合活性を調べた。具体的には、AtGID1遺伝子の全長cDNA配列に従って設計した、各末端に適当な制限酵素部位を持つ特異的プライマーを用いて、AtGID1遺伝子のコード領域をPCRにより増幅した。配列解析による確認後、各cDNA断片をpET32aベクター (Novagen/Merck Biosciences, Madison, WI, USA) または pGEX-4T-2 ベクター (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA; 現在はGE Healthcareの一部) にライゲーションした。組み換え蛋白質の産生はSDS-PAGEで確認し、ネガティブコントロールとしてはベクターカセットを用いた。GA結合アッセイは、DuPont/NEN (Boston, MA, USA) にカスタムオーダーした [1,2,16,17-3H4]-16,17-dihydro-GA4 (4.55 TBq/mmol) を用い、上記に記載したのと同様に実施した。非標識GA4 (1.25 mM) を非特異的結合を測定するために用いた。カイネティクス解析の飽和実験は、25から1,500 nM の範囲の10段階の濃度の16,17-dihydro-GA4 を用いて実施した。競合アッセイは 15 nM の [1,2,16,17-3H4]-16,17-dihydro-GA4 と、5つの濃度の非標識競合物を用いて実施した。RGAおよびGAIの組み換え蛋白質は、pET32aを用いて既に記載した方法に従って調製した。【００８２】
一次構造から予想した通り、上位3つの遺伝子の産物は可逆的なGA結合活性を示したが、他の4つは示さなかった（図６）。そこでこれら3つの遺伝子をAtGID1a (At3g05120), AtGID1b (At3g63010), および AtGID1c (At5g27320) と命名した。これら3つのAtGID1のアミノ酸配列から、これらの遺伝子は、それぞれ345アミノ酸（39 kDa, pI=6.6, AtGID1a）、358アミノ酸（40 kDa, pI=7.4, AtGID1b）、および344アミノ酸（38 kDa, pI=7.2, AtGID1c）のポリペプチドをコードしていることがわかる。AtGID1のアミノ酸配列は互いに67から85％の同一性を示し、OsGID1とは60から63％の同一性を示す。【００８３】
系統解析により、3つのAtGID1はOsGID1と同じグループに分類され、他とは独立したグループに分類されることが確認された（図７）。また系統樹からは、AtGID1bが独立したサブグループに位置する一方で、AtGID1aとAtGID1cは同一のサブグループに分類することができたことから、AtGID1bの他のAtGID1の生物学的機能は異なっていることが示唆された。【００８４】
[実施例６]  アラビドプシスGID1のGA結合特性
上記で同定した3つのAtGID1のGA結合のカイネティクス、リガンド選択性、およびpH依存性を、トリチウム化GA4誘導体 16,17-dihydro-GA4を用いて調べた。16,17-Dihydro-GA4には、C-16位の配置により化学的に2つのアイソフォームが存在するが、2つのアイソフォームともAtGID1に対して同等に結合できた。アラビドプシスのGA欠損変異体ga1-3の発芽において、16,17-dihydro-GA4はGA4の約1/10の生理学的効果を有していた（図8）。まず、過剰量の非標識GA4を添加後の、トリチウム化16,17-dihydro-GA4の各AtGID1との会合の経時特性を、インキュベーション時間および解離時間を様々に変えながら調べた。図９A〜Cの挿入図に示されているように、AtGID1a複合体からのGAの解離はAtGID1b複合体からの解離よりも遅い一方で、AtGID1bのGAとの会合はAtGID1aのそれよりも速く起こった。これに対して、AtGID1cのGAの会合はAtGID1bのそれよりも遅い一方で、AtGID1c複合体とAtGID1b複合体からのGAの解離には、明確な違いはなかった。さらに、様々な濃度のGAの平衡条件で、各AtGID1のGA結合のカイネティクスを解析したところ、AtGID1bの16,17-dihydro-GA4に対する親和性（Kd = 4.8x10-7 M）は、AtGID1a (Kd = 2.0x10-6 M) および AtGID1c (Kd = 1.9x10-6 M) のそれらよりも4倍高いことが判明した（図９A〜C）。【００８５】
各AtGID1 のリガンド選択性を、アッセイ混合液へのGAの添加によるトリチウム化16,17-dihydro-GA4の組み換え蛋白質との結合の競合阻害を観察することにより調べた（表２）。この実験で調べた各GAの構造は表１に示されている。リガンド選択性は、トレーサー（15 nM）の結合を50％阻害する添加GAの濃度（IC50 値）により評価した。いずれのAtGID1も、極めて類似したリガンド選択性を示した。調べたGAの中では、GA4が最も高い阻害効果を有しており、やはり活性型GAに分類されるGA3およびGA1は中間的な効果を有していた。一方、生理学的に不活性なGAは効果がなく、AtGID1とは相互作用しないことが示唆された。【００８６】
表２  AtGID1-GA結合に対するGAの競合能
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[各GAの作用の評価にIC50値 (M) を採用した。各値は少なくとも2つの測定の平均を表す。GA4 の値を100 (%) とした各GAの相対値を括弧中に示した。H2-GA4, 16,17-dihydro-GA4; GA4-Me, GA4のメチルエステル。]【００８７】
アミノ酸配列から予想されるAtGID1aのpI値は、他の2つの値よりも明らかに低いことから、各AtGID1のGA結合のpHの効果を調べた。全てのAtGID1は中性のpH環境で最も高いGA結合活性を示す一方、他のpH条件では、GA結合に関して互いに異なる挙動を示した。AtGID1b は最も強いpH依存性を示す一方、AtGID1aとAtGID1cの中性以外のpH条件はより寛容であった（AtGID1bのGA結合の最適pHレンジは6.4〜7.5、AtGID1aのそれは6.4〜9.0、AtGID1cのそれは5.7〜8.3であった；図９D〜F）。これらの生化学的実験から、3つすべてのAtGID1は妥当なGA結合活性を有しており、AtGID1bの特性は、GA結合親和性およびpH依存性の観点で、他の2つとは異なっていることが実証された。【００８８】
[実施例７]  In vivoおよびin vitroでのAtGID1-AtDELLA相互作用
アラビドプシスは5つのDELLA蛋白質（RGA, GAI, RGL1, RGL2, および RGL3。AtDELLAと総称; Fleet, C.M., and Sun, T.-P. (2005) Curr. Opin. Plant Biol., 8, 77-85；Dill, A., and Sun, T. (2001) Genetics, 159, 777-785）を持つことから、GID1/DELLA蛋白質の組み合わせは15通りが考えられる。そこで酵母Twoハイブリッド (Y2H) 系を用いて、AtGID1-AtDELLAのポジティブな相互作用を検証する2つの実験を行った。最初の実験（アッセイA）では、ポジティブクローンのみが生き残る限定培地を用いた生存コロニーのアッセイを行い、第二の実験（アッセイB）では、AtGID1-AtDELLAの相互作用に対するレポーター遺伝子の産物としてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。【００８９】
Y2H実験にはBD Matchmaker Two-hybrid System 3 (Clontech, Palo Alto, CA, USA; now part of Takara Bio) を用いた。シークエンシングによりAtGID1遺伝子のPCR産物を確認後、それらをpGBKT7 DNA-BDシャトルベクターにクローニングしてbaitプラスミドを生成した。同様に、各AtDELLA遺伝子の全コード領域（GAIはEcoRI部位とXhoI部位、RGAはBamHI部位とXhoI部位、RGL1はSmaI部位とSacI部位、RGL2はSmaI部位とClaI部位、RGL3はSmaI部位とXhoI部位を各端に含む）をpGADT7 ADベクターにクローニングした。DNA-BDおよびADのベクターカセットをネガティブコントロールとして適用し、S. cerevisiae AH109 (MATa) 株または Y187 (MATα) 株を用いた。酵母アッセイで用いた方法の詳細は、製造元の説明書の通りである (Yeast Protocols Handbook #PT3024-1; http://www.clontech.com/)。実験は独立に4回行い、各回で同様の結果を得た。【００９０】
GA結合アッセイ（表２）においてGA4はすべてのAtGID1と最も高い親和性を示したので、GA4（10-5 M）を培地に添加するために用いた。図10Aに示したように、アッセイAでは、すべてのAtGID1-AtDELLAペアにおいて、形質転換した酵母はGA存在下でコロニーを形成し、他のネガティブコントロールでは形成しなかった。アッセイBでも、すべての15ペアにおいてβ-ガラクトシダーゼ活性が検出された。このように、すべてのAtGID1-AtDELLA相互作用がGA依存的に検出されたが、AtGID1bと幾つかのAtDELLAとの相互作用が、弱いながらもGAなしで検出された（図11）。これらの観察は、AtGID1とAtDELLAの間の相互作用は、in plantaでGA依存的な様式で起こるが、AtGID1b-RGL1相互作用がGA非依存的に起こる可能性も示唆する。【００９１】
AtGID1-RGAのペアにおけるβ-ガラクトシダーゼの酵素活性は、図10Aに示すように、比較的中間的で比較に適していることから、AtGID1-RGA相互作用における様々な濃度のGA4のdose responseをアッセイBで調べた。AtGID1a-RGA および AtGID1c-RGAの相互作用は10-7 Mを超えるGA4の存在下でのみ検出されたが、AtGID1bは10-8 MのGA4の存在下でもRGAと相互作用できた（図10B）。【００９２】
上記の通り、Y2H系を用いて、全てのAtGID1が明確にAtDELLA蛋白質と相互作用することが確認された。次に、AtGID1のGA結合活性に対して、AtDELLAが何らかの影響を及ぼすのかをin vitroで調べた。標識した16,17-dihydro-GA4とAtGID1を混合した後で、溶液にAtDELLA を添加し、そのGA結合活性を測定した。図10Cは、AtGID1の結合活性がAtDELLAの添加後に上昇したことを明確に示している。AtDELLAのin vitroの効果はDELLAのタイプに依存しないようにみえ、RGAおよびGAIのどちらもAtGID1cのGA結合に類似した効果を示した（図10C）。また、DELLA蛋白質を反応液に添加した時のAtGID1c-GA相互作用の結合親和性を調べた。スキャッチャードプロットは、RGA存在下でのAtGID1cと16,17-dihydro-GA4の結合のKd値は1.2x10-8 M、GAI存在下での値は4.6x10-8 Mであり、AtDELLAがない場合の値 (Kd = 1.9x10-6 M, 図9Cに示されている) よりも約1/100に減少させたことを示している。すなわち、AtGID1-GA結合はAtDELLA存在下で増強される。【００９３】
[実施例８]  イネgid1-1の表現型に対するAtGID1の相補作用
AtGID1がin vivoにおいてイネGID1 (OsGID1) と同じ機能を有していることを証明するため、各AtGID1遺伝子をAct1の構成的プロモーターの制御下で過剰発現する形質転換体を、イネgid1-1のバックグランドで作製した。具体的には、両端に適当な制限酵素部位 (AtGID1a/cはSmaI部位、AtGID1bはXbaIおよびSmaI部位) を含むAtGID1の全長cDNAをPCRにより調製し、イネアクチンプロモーター (pAct1) およびNOSターミネーターを含むバイナリーベクター (Sentoku, N. et al. (2000) Develop. Biol., 220, 358-364) に挿入した。挿入を確認した後、アグロバクテリウムを介した形質転換によりpAct1-AtGID1断片をイネgid1-1 植物に導入した。【００９４】
AtGID1aでは8系統、AtGID1bでも8系統、AtGID1cでは14系統を得た。AtGID1クローンを持つ全てのトランスジェニック植物で、gid1-1の矮性の表現型がレスキューされた（図12A）。これは、AtGID1がイネにおいてGA受容体として機能したことを示している。AtGID1a植物の草丈は、他のトランスジェニック植物や野生型植物よりも僅かに低かった（図12A）。この傾向はほとんど全てのAtGID1a植物で見られ、これらのトランスジェニック植物のAtGID1a mRNAの発現レベルは他のAtGID1のそれと同等であった（図12B）。従って、AtGID1aのGA受容体機能は、少なくともイネ細胞においては、AtGID1b や AtGID1cのそれよりも弱いと考えられる。AtGID1を持つこれらの形質転換体のGA応答を、GA3で外来的に処理することによりさらに調べた。この実験では、各系統の分けつ植物を2つの幼植物に分離し、一方の幼植物には1日1回GA3を5日間与え、他方にはGA3を含まないmock溶液を与えた。これらの植物は、野生型植物の応答と同様に、添加されたGAに正常に応答することが確認された。2つの独立した実験で、非常に類似した結果を得た。【００９５】
[実施例９]  様々な器官におけるAtGID1の発現
半定量RT-PCRにより、アラビドプシスの様々な器官、具体的には約10 cmの草丈の植物（発芽から40-45日後）の茎 (stems)、花 (flowers)、長角果 (silique)、葉 (leaf)、根 (root)、および浸種した種子 (imbibed seed) におけるAtGID1遺伝子の発現を解析した。全RNAの調製およびRT-PCRは、表３に示した特異的プライマーを用いてKim et al. (Kim, Y.-C. et al. (2005) Plant Cell Physiol., 46, 1317-1325) に従って実施した。上記の発現ベクターに対するプライマーの特異性については確認されている。試行実験により、可視化された各産物の量が一定のダイナミックレンジ内になるように、2サイクルのインターバルで異なるPCRサイクル数を用いて、各遺伝子の適当なPCRサイクル数を決定した。実験は独立に少なくとも2回行い、各回において同様の結果を得た。【００９６】
表３  RT-PCRに用いたプライマー
────────────────────────────────
AtGID1a, Fwd; 5'-CAGATCAAGAGCAACCTCCTAG-3' (配列番号：17)
AtGID1a, Rev; 5'-CCACAGGCAATACATTCACCTGTGTG-3' (配列番号：18)
AtGID1b, Fwd; 5'-GAACCCTCGAGCTAACCAAACCTCTC-3' (配列番号：19)
AtGID1b, Rev; 5'-GGAGTAAGAAGCACAGGACTTGACTTGC-3' (配列番号：20)
AtGID1c, Fwd; 5'-CTGGCACTTCACCAAGTATTACTG-3' (配列番号：21)
AtGID1c, Rev; 5'-GCCAATAGTGGCTTGCTCCAAG-3' (配列番号：22)
OsActin, Fwd; 5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3' (配列番号：23)
OsActin, Rev; 5'-GTACCCTCATCAGGCATCTG-3' (配列番号：24)
AtActin, Fwd; 5'-CGTGTGTGACAATGGTACCGGTATGG-3' (配列番号：25)
AtActin, Rev; 5'-CTGTGAACGATTCCTGGACCTGCCTC-3' (配列番号：26)
────────────────────────────────
（Fwd, フォワードプライマー; Rev, リバースプライマー）【００９７】
図12Cに示したように、AtGID1遺伝子の発現は様々な器官で検出することができ、この結果は、NASCArrays (Craigon DJ et al., Nucleic Acids Res. 32:D575-7, 2004; http://affymetrix.arabidopsis.info/narrays/experimentbrowse.pl) および Gene Atlas (Zimmermann P et al., Plant Physiol. 136: 2621-2632, 2004; https://www.genevestigator.ethz.ch/at/index.php) などのオープンアクセスアレイデータベースによっても支持された。これは、3つのAtGID1はアラビドプシスの様々な器官で機能していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明により、ジベレリン応答シグナルを媒介するジベレリン結合蛋白質およびその遺伝子が提供された。本発明の蛋白質の発現を制御することにより、植物の分化・生長を制御することができる。例えば本発明の蛋白質の発現を上昇させることにより、生長速度を上昇させることができ、逆に本発明の蛋白質の発現を低下させることにより、植物の草丈を短くし、耐倒伏性を高めることができる。本発明は、農作物の収量増加や、新たな美的価値が付加された鑑賞用植物の作製において有用である。
【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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