(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有糸分裂および減数分裂における高次クロマチン依存性の染色体安定性を改変する化合物の同定方法であって、
ヒストンH3 K9メチルトランスフェラーゼの基質を、メチルドナーの存在下に、ヒトSUV39H1、ヒトSUV39H2、マウスSuv39h1およびマウスSuv39h2から選ばれるメチルトランスフェラーゼと一緒に試験化合物の存在下及び不存在下でインキュベートし、前記試験化合物がメチルトランスフェラーゼ活性を調節しているかどうかを測定することを特徴とし、
前記調節が、前記試験化合物が有糸分裂および減数分裂における高次クロマチン依存性の染色体安定性を改変することの指標である、前記方法。
【請求項２】
基質が、ヒストンH3またはリシン9におけるメチル化部位を含有するそのN-末端フラグメントである、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
ヒストンH3 N-末端フラグメントが配列番号7に記載されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
メチルドナーがメチオニンまたはS-アデノシル-L-メチオニンである請求の範囲第1項〜第３項のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
メチルドナーのメチル基が検出可能なラベルを担持する請求の範囲第1項〜第４項のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
メチルドナーが発色性ラベルを担持し、メチルトランスフェラーゼ活性を、メチル基の基質への移行時の色の変化を測定することによって測定する請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】
メチルドナーが放射活性ラベルを担持し、メチルトランスフェラーゼ活性を、メチル基移行時に基質へ移行した放射活性を測定することによって測定する請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項８】
メチルトランスフェラーゼ活性を、基質のメチル化部位に特異的な抗体の結合を定量することによって測定する請求の範囲第1項〜第４項のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
基質が検出可能なラベルを担持する請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１０】
ヒストンH3中のメチル化リシン9を特異的に認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、真核細胞内の染色体動力学に影響を与える化合物の同定方法に関する。詳細には、本発明は、有糸分裂および減数分裂中の高次クロマチン依存性の染色体安定性を調節することによるヒト症状の治療および予防方法に関する。
【０００２】
高次クロマチンは、後成的発現遺伝子の制御および染色体の機能的組織化において不可欠である。高次クロマチン体における差異は、転写の‘作動’または‘非作動’状態を調節し(Grunstein,1988；Turner, 1998；Strahl and Allis, 2000)、また染色体の縮合および分離に影響する(Karpen and Allshire, 1997；Wei et al., 1999)ヒストン尾部の別々の共有結合的修飾に関連している。
ヒストン類は高度に保護されたタンパク質群(H3、H4、H2A、H2B、H1)を構成し、これらは、真核細胞クロマチン構造体の主要成分である。ヒストン類は、ゲノムDNAを塩基繰返し構造単位、即ち、ヌクレオソームに圧縮する。DNAパッケージング機能に加え、ヒストン類は、遺伝子発現を調節する分子機構の必要不可欠な成分であることも証明されている。
ヒストン、とりわけH4およびH3のN-末端の翻訳後修飾は、よく報告されており、アセチル化における変化(Grunstein, 1998；Turner, 1998；Strahl and Allis, 2000)、リン酸化における変化(Wei et al., 1999)、ごく最近では、メチル化における変化(Chen et al., 1999；Strahl et al., 1999)として機能的に特性決定されている。多数の開示されたヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)類およびヒストンデアセチラーゼ(HDAC)類と対照的に、ヒストンN-末端のリン酸化(Sassone-Corsi et al., 1999；Hsu et al., 2000)またはメチル化(Chen et al., 1999)を調節する酵素活性コード化遺伝子は、同定が始まったばかりである。さらにまた、転写結果の一体化または高次クロマチン組織化における種々のヒストン尾部修飾の相互依存性は、現在のところ解明されていない。
【０００３】
全体的には、正常および異常細胞増殖が転写レベルで影響を受けるということのみならず、より高レベルの調節、即ち、ヒストン分子の修飾を介してのクロマチン構造体の組織化が関連しているという証拠が増大しつつある。ヒストン修飾に関連するタンパク質および分子メカニズムの決定は、細胞増殖プログラムを理解することに寄与し、それによって腫瘍の形成および進行中に起る異常増殖に関連するメカニズムに光明を照らすこととなろう(Jacobson and Pillus, 1999)。
Drosophila (Reuter and Spierer, 1992)およびS. pombe (Allshire et al., 1995)における位置効果多様性(position effect variegation = PEV)のサプレッサーに関する遺伝子スクリーニングにおいて、Su(var)群 (Wallrath, 1998)遺伝子と称されるおよそ30〜40の座の下位群が同定されている。興味あることに、数種のヒストンデアセチラーゼ類(De Rubertis et al., 1996)、プロティンホスファターゼタイプ1(Baksa et al., 1993)およびS-アデノシルメチオニンシンセターゼ(Larsson et al., 1996)は、Su(var)類として分類されている。対照的に、Su(var)2-5 (これはHP-1のアレルである) (Eissenberg et ai., 1992)、Su(var)3-7 (Cleard et al., 1997)およびSu(var)3-9 (Tschiersch et al., 1994；Schotta and Reuter, 2000)は、ヘテロクロマチン関連タンパク質をコードする。Su(var)遺伝子機能は、このように、ヌクレオソームレベルでの修飾によって明確な染色体サブドメインの形成が開始され、次いで、これらのサブドメインがヘテロクロマチンSU(VAR)タンパク質によって安定化され増殖されるというモデルを示唆している(Henikoff, 1997)。
【０００４】
Su(var)3-9は大部分のPEV修飾因子変異において支配的であり(Tschiersch et al., 1994)、相応するS. pombe clr4遺伝子における変異体(Ivanova et al., 1998)は、他の修飾因子のヘテロクロマチン会合を破壊し、染色体分離欠陥を生ずる(Ekwall et al., 1996)。最近、ヒト(SUV39H1)およびマウス(Suv39h1およびSuv39h2)のSu(var)3-9ホモログ類が分離されてきている(Aagaard et al., 1999)。これらのホモログ類は、哺乳動物HP-1と会合するヘテロクロマチンタンパク質をコードすることが証明されている(Aagaard et al., 1999)。SU(VAR)3-9タンパク質群は、‘クロマチンレギュレーター’の２つの最も進化的に保護されたドメイン、即ち、クロモ(Aasland and Stewart, 1995；Koonin et al., 1995)およびSET (Tschiersch et al., 1994；Jenuwein et al., 1998)ドメインを結合させる。６0アミノ酸のクロモドメインは真正クロマチンまたはヘテロクロマチンの局在化(Platero et al., 1995)を支配する旧来のヒストン様ホールディング (Ball et al., 1997)を表すのに対し、130アミノ酸SETドメインの分子役割は謎のままである。ヒトSUV39H1変異体による過剰発現研究において、高次クロマチン組織化との支配的干渉が示唆されており、この干渉は、驚くべきことに、SETドメインとリン酸化(セリン10における)ヒストンH3分布との間の機能的関係を示唆していた(Melcher et al., 2000)。
【０００５】
本発明の目的は、ヒストン修飾および高次クロマチン組織化をもたらす分子経路にさらなる洞察を加え、これらの知見を染色体誤分離による異常遺伝子発現およびゲノム不安定性を干渉するのに利用し、それによって新規な癌治療法を提供することであった。
とりわけ、本発明の目的は、SU(VAR)3-9タンパク質群の各メンバーの機能を、高次クロマチン依存染色体安定性に影響を与える新規な戦略を開発するという観点から研究することであった。そのような戦略は、染色体誤分離による異常遺伝子発現およびゲノム不安定性が偶発的に関連する症状の治療方法において、使用することができる。（“染色体安定性”なる用語は、安定な真核細胞の維持に導く成功裏の染色体分離を意味する）。
本発明の実施例1〜7は、哺乳動物SU(VAR)3-9関連タンパク質(ヒトSUV39H1、マウスSuv39h1およびマウスSuv39h2)が、H3 N-末端のリシン9("K9")を選択的にメチル化するSETドメイン依存性H3特異性ヒストンメチルトランスフェラーゼであることを示している。K9のメチル化は隣接セリン10のリン酸化を負に調節し、高次クロマチンの組織化に本質的に関連しているようである‘ヒストンコード’を明らかにしている。(以下、ヒストンメチルトランスフェラーゼは、“HMTアーゼ”、より一般的には、“MTアーゼ”と称する)。
【０００６】
Suv39h1およびSuv39h2が哺乳動物ヒストンH3リシン9特異性ヒストンメチルトランスフェラーゼ(Suv39h HMTアーゼ)として同定された後、これらのHMTアーゼは、有糸分裂中にセントロメア(動原体)において一時的に集積するヘテロクロマチン富化(enriched)酵素であることが示された(Aagaard et al., 1999；Aagaard et al., 2000)。さらにまた、リシン9でのヒストンH3のメチル化(H3-K9)がHP1タンパク質のための高親和性結合部位を発生させ(Lachner et al., 2001；Bannister et al., 2001)、それによってSUV39H1-HP1メチル化系をヘテロクロマチンの集合および増殖のための重要な調節メカニズムとして規定していることが示された(Jenuwein, 2001)。ヒトSUV39H1の過剰発現は、異所性へテロクロマチンを誘発させ、哺乳動物細胞系において染色体誤分離をもたらす(Melcher et al., 2000)。上述の本質的な有糸分裂機能以外に、ヘテロクロマチンは、減数分裂染色体の動的再組織化においても重要である。減数分裂は核ルーメンから核エンベロープへの染色体移動によって開始され、そこで、染色体は、その挾動原体(pericentric)サテライト配列を介してクラスター化する(Hawley et al., 1992；Scherthan et al., 1996)。減数分裂前期においては、染色体は凝縮し、次いで母性および父性染色体間での相同性対合と組換え(パキテン期での)と続く。減数分裂の開始に先立ち、不対合、さらなる染色体凝縮および挟動原体へテロクロマチンでのヒストンH3リン酸化が起こる(Cobb et al., 1999)。とりわけ雄生殖細胞においては、単相ゲノム含有物は、伸展する精子細胞内で１つのヘテロクロマチンブロックとして最終的に組織化される。Drosophilaにおいては、ヘテロクロマチンとその関連サテライト配列が、染色体を類似する高次構造体に配向させることによって初期減数分裂染色体移動および相同性対合を補助することが提唱されている(Hawley et al., 1992；Karpen et al., 1996；dernburg et al., 1996b)。哺乳動物の生殖細胞においては、パキテン期チェックポイント(de Vries et al., 1999)が誤配列し対合していない染色体をモニターし、減数分裂前期で細胞を停止させ、それによって異数体配偶子の産生を防止している。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、Suv39h1およびSuv39h2の胚発生および精子形成における役割を、これらのタンパク質を受精、とりわけ雄性受精に関連する症状における薬物ターゲットとして利用するという観点から分析することであった。
本発明の基礎となる問題を解決するために、第1段階においては、バイオ情報技術を応用した。SU(VAR)3-9タンパク質群のSETドメインを出発配列として使用したところ、6種の植物タンパク質メチルトランスフェラーゼに対する重要な配列および二次構造類似物(後述の方法の項を参照されたい)が検出された。
ヒトSUV39H1のSETドメインが酵素活性を有するかどうかを検証するために、ヒストン類をインビトロ(生体外)メチル化における潜在的基質として試験した。得られた結果は、SUV39H1が固有のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有することを示し、このHMTアーゼ活性がC-末端SETドメイン内に存在していることを示唆している。
組換えタンパク質を用いて、マウスGST-Suv39h1 (82-412)および対応するヒトSUV39H1融合タンパク質[GST-SUV39H1(82-412)]はいずれも触媒活性があることが示された。短い内部欠損をGST-SUV39H1(82-412)内のSETドメインコアの2つの保護領域に導入し、さらに、追加のC-末端尾部欠落(ΔC-尾部)またはSET関連システィンリッチ領域の欠落(Δcys)変異体を作製した。どの変異体タンパク質はHMTアーゼ活性を示すことができなかった。
これらの結果は上記システィンリッチ領域による有意の寄与を示唆しているものの、植物メチルトランスフェラーゼにおけるこれら領域の明らかな不存在は触媒活性を妨げていない。SETドメインの酵素機能をより詳細に試験するために、点変異を、最高度に保存されたモチーフ中に導入した。インビトロHMTアーゼアッセイは、すべての点変異が、１例を除いて、酵素活性を喪失させたことを示した。驚くべきことに、後者の変異は、およそ20倍増大した活性を有する高活性酵素を生じていた。得られたデータは、SETドメイン中の320ＨφφNHSC326モチーフが重要な触媒部位であることを明白にしている。
【０００８】
SETドメインはクロマチンレギュレーター内で最も保存されたタンパク質モチーフの1つであるので(Stassen et al., 1995；Jenuwein et al., 1998)、次に、このドメインをSU(VAR)3-9群メンバーまたは他のSETドメインタンパク質がHMTアーゼ活性を含有するかどうかについて分析した。GST-SUV39H1(82-412)に相応するであろうS.pombe CLR4 (Ivanova et al., 1998)、ヒトEZH2 (Laible et al., 1997)およびヒトHRX (Tkachuk et al., 1992)の延長SETドメインのGST融合生成物を作製した。興味あることに、GST-CLR4(127-490)は、組換えSUV39H1産生物に比較して3倍〜5倍の増大レベルで明確なHMTアーゼ活性を示し、高活性位置においてアルギニンを担持するCLR4と一致していた。この分析から得られた結果は、SUV39H1の変異分析と一致して、遊離ヒストンに対するHMTアーゼ活性がSETドメインと隣接システィンリッチ領域との組み合わせを必要とするようであることを示しており、これは、限られた数のSETドメイン含有タンパク質においてしか見出せない性質である。
【０００９】
これらの実験は、哺乳動物SU(VAR)3-9関連タンパク質のHMTアーゼ活性が選択されたアッセイ条件下においてヒストンH3に対して選択的であることを示していた。この知見をさらに詳細に試験するために、インビトロメチル化反応を個々のヒストンにおいて実施した。H3はGST-Suv39h1(82-412)によって特異的にメチル化されていることを示すことができたが、H2A、H2BまたはH4においては、シグナルは検出されていない。H3のメチル化は、広範囲の生物においてはリシン4において、また、HeLa細胞においてはリシン9において主として生じていることが示されたが、それに関与するHMTアーゼ類はこれから明らかにされなければならないところである(Strahl et al., 1999)。Suv39h1の部位利用プロフィールを検証するために、野生型H3 N-末端を含む未修飾ペプチドおよび変異体K9Lペプチドを基質として試験した。さらに、インシュリン並びにCENP-A (Sullivan et al., 1994)、macroH2A (Pehrson and Fried, 1992)のN-末端を含むペプチドを含ませた。これらのインビトロアッセイにおいて、野生型H3ペプチドの選択性メチル化が確認された。また、得られたデータは、H3 N-末端がSuv39h1依存性HMTアーゼ活性に対して好ましい残基であることも示していた。
この部位優先性をもっと明確に試験するために、野生型H3 N-末端ペプチドを、S-アデノシル-[メチル-3H]-L-メチオニンを使用し、GST-Suv39h1(82-412)によってインビトロメチル化した。その後、逆相HPLCによって精製したラベル化ペプチドを直接ミクロシークエンシングし、各個々のアミノ酸と関連した3H取り込みを分析した。結果は、メチルラベルのリシン9への移行を明確にし、Suv39h1がインビトロにおいてH3 N-末端に対して高度に部位特異性のHMTアーゼであることを示唆していた。
【００１０】
マウスSuv39h遺伝子は、Suv39h1およびSuv39h2という2つの座によってコードされている。Suv39h機能およびSuv39h依存性K9 H3メチル化のインビボ(生体内)の意義を検証するために、Suv39h1およびSuv39h2の双方を欠損するマウス株を作製した。Suv39h1欠損株とSuv39h2欠損株を交差させてSuv39h二重欠損マウスを作製した。二重変異体マウスは、メンデル比以下で生まれた。幾つかの二重ヌル胚は、重度の生育遅延と脳ヘルニア(exencephaly)を示した。さらに、生存している二重変異体も生育が遅れ、細胞増殖におけるSuv39hの役割を示唆していた。
Suv39hヌルマウスにおける胚表現型が有糸分裂欠陥に起因し得るかどうかを検証するために、Suv39h二重マウス由来のPMEF (初代マウス胚繊維芽細胞)を分析した。Suv39h二重ヌルPMEFは、有糸分裂中の分裂欠陥を暗示するG1インデックスの低下と異常核形態を有する細胞割合の増加を示していた。さらにまた、二重ヌル細胞は、ゲノム不安定性をも示し容易に異数体となった。これらの異数体の重篤度は、継代数が多くなるにつれ増大する。Suv39h二重ヌル細胞が安定な核型を維持する能力がないことが、Suv39h胚表現型の根底にあるのかも知れない。
【００１１】
H3のN-末端尾部内のセリン10でのリン酸化(phosH3)は、染色体の縮合およびその後の分離において必要であることが証明されている(Wei et al., 1999)。細胞周期において、phosH3は、G2後期において挟動原体へテロクロマチン内部で開始し、次いで、有糸分裂中に染色体全体に沿って進行する(Hendzel et al., 1997)。野生型PMEFにおいて、その細胞のおよそ7％が、特徴的なヘテロクロマチン関連phosH3部位に関して陽性に染色されることが見出された。対照的に、この数は、Suv39h二重ヌルPMEFにおいては、約3倍に増大する。この結果は、phosH3の全体的レベルがSuv39h二重ヌルPMEFにおいて増強されているかもしれないことを示唆していた。このことは、生化学的に確認された。以上から、得られたデータは、H3中のリシン9のSuv39h介在メチル化がセリン10のリン酸化を負に調節するモデルと非常によく一致している。
上記と共に、これらのデータは、細胞分裂におけるSuv39hの重要な役割を明白に示唆している。Suv39h機能の喪失は、K9ヒストンH3メチル化を損ない、欠陥細胞分裂を誘発してゲノム不安定性をもたらす。分離欠陥/ゲノム不安定性は、多くのヒト癌の病因の根底にあり(Lengauer et al., 1997)、多くの場合、腫瘍進行における前提条件である。これらの観察は、Suv39hを腫瘍療法における新規な治療方法の優れた候補とするものである。
【００１２】
さらに、本発明の1連の実験は、Suv39h HMTアーゼ活性の不存在が、変異体マウスの発育と生存力を損ない、挟動原体へテロクロマチンでのH3-K9メチル化の殆ど完全な欠損と直接相関しているというインビボ根拠も提供している。注目に値するに、Suv39h欠損マウスは体細胞および減数分裂細胞の双方において染色体不安定性を示し、これらの不安定性は、B細胞リンパ腫発症リスクの増大および雄減数分裂中の染色体相互作用の混乱によってさらに証明される。これらのインビボデータは、挟動原体へテロクロマチンでのH3-K9メチル化における基本的役割を示しており、Suv39h HMTアーゼが ‘ヘテロクロマチン受容能’を調節し、有糸分裂および減数分裂中に染色体安定性を保護することを示唆している。
Suv39h1またはSuv39h2のいずれかの単遺伝子破壊は、正常マウス発育を許容し、変異体マウスの生存力および生殖に影響を与えていないようである。遺伝子機能におけるこの明らかな重複性は、マウス胚形成中の上記2つのSuv39h遺伝子の重複発現プロフィール(O'Carroll et al., 2000)と一致しているようである。対照的に、Suv39h二重ヌル(dn)マウスにおける両遺伝子の双方破壊は、分娩期生存率の重度の低下(≒33％；表1)、生長遅延および雄における性機能不全をもたらしている。双方のSuv39h dn雄とも、生殖力なしである。Suv39h dn胎仔は、E12.5日までは正常に発育しているようであるが、体サイズは小さく、多くの場合、妊娠後期中に分解吸収されている。これらのインビボ分析は、哺乳動物発育中および全体的生存率においてSuv39h遺伝子の重要な役割を示している。Suv39h HMTアーゼ活性の不存在はゲノム安定性を誘発するので、Suv39h dn胎仔の高致死率は、主として、発育中の胚の増殖および分化プログラムを有意に損傷するであろう混乱した染色体分離の結果であろう。
【００１３】
Suv39h酵素は体細胞(図12参照)および初期減数分裂細胞(図13Ｂ参照)中の挟動原体へテロクロマチンでのH3-K9メチル化における主要HMTアーゼであるけれども、マウスゲノム中には、進化的に高度に保存されたSETドメインを含有し且つ推定されるHMTアーゼ活性を有するさらなる酵素もコードされているようである、≦15の固有の遺伝子配列が存在する(Jenuwein, 2001)。これらSETドメイン含有タンパク質の少なくとも1つは、実際に、H3をリシンにおいてもメチル化し得る(Tachibana et al., 2001)。このように、Suv39h dnマウスの≒33％生存率は、Suv39h dnマウスを分析した場合において、混在する遺伝的背景において種々の度合で発現するかもしれない他のHMTアーゼの補償的活性に依存し得る。
Suv39h HMTアーゼ活性の不存在は、マウス胚繊維芽細胞(PMEF) (図10参照)、精原細胞中の胎仔肝細胞および骨髄細胞(図14C参照)のような各種の細胞タイプにおいてゲノム不安定性を触発する。これらの細胞系において観察された異数体と一致して、Suv39h欠陥マウスは、腫瘍形成のリスク増大を示し、Suv39h dnマウスの≒33％において後期発症B細胞リンパ腫を生じている(図11参照)。また、B細胞リンパ腫は、Suv39h1の遺伝子破壊を含有する複合変異体マウスにおいてSuv39h遺伝子含有量低下にともなっても発症している(表2参照)。興味あることに、Suv39h誘発異数体は、主として、殆ど完全な群の染色体の分離欠陥を特徴とし、低-4倍体或いは低-8倍体細胞さえも生じている(図10参照)。これらのデータは、Suv39h dn細胞中のすべての末端原動体セントロメア辺りでのH3-K9メチル化の欠損と一致した染色体分離の一般的損傷を示唆している(図12参照)。
【００１４】
アセチル化(Ekwall et al., 1997)およびリン酸化(Wei et al., 1997)のようなヒストンN-末端の明確な修飾は、S.pombeおよびTetrahymeneにおける正確な染色体分離において必要であることが示されており、おそらくこれは機能性セントロメアの確立を容易にする特化したクロマチン構造を挟動原体へテロクロマチンにおいて誘導することによるものであろう。H3-K9メチル化は、Ipl1/オーロラキナーゼによって介在されたH3リン酸化を制限し(Hsu et al., 2000)、またヒストンアセチル化と相互依存性(Rea et al., 2000)でもあるので、Suv39h HMTアーゼ活性の不存在は、この別のヒストン修飾パターンを混乱させるようである。第2に、ヌクレオソーム配列を改変させる以外に、ヒストン修飾は、クロマチン関連タンパク質に対する特異的相互作用親和性を発生させ得る(Rice and Allis, 2001)。CENPエピトープの局在化は改変されないようであるが、HP1タンパク質のヘテロクロマチンの富化はSuv39h dn体細胞において大いに喪失する(Lachner et al., 2001)。注目に値するに、HP1は、aurora-B (Adams et al., 2000；Kaitna et al., 2000)とコンプレックスを形成するINCENP (Ainsztein et al., 1998)とインビトロで相互作用する。INCENPの変異は、巨大核および核内ブリッジのような重度の有糸分裂異常を誘発し、殆ど完全な染色体の誤分離および細胞質分裂欠陥をもたらす(Cutts et al., 1999；Adams et al., 2000；Kainta et al., 2000)。これらの興味ある対比は、Suv39h介在H3-K9メチル化とオーロラB依存性リン酸化間での潜在的インビボ関連を示唆しており、Suv39h遺伝子を新規な腫瘍サプレッサー遺伝子として分類することができた。
【００１５】
Suv39h介在染色体不安定性は、細胞集団の一部に影響するのみで、明確なアポトーシス(細胞死)を触発しないようであり(図10b参照)、S.pombe中のclr4変異体の同様な分析(Ekwall et al., 1996；Ivanova et al., 1998)と一致する。これらのデータは、体細胞におけるSuv39h誘発欠陥が既知のチェックポイントコントロールの厳格な支配下にないようであり(Cortez and Elledge, 2000；但し、Bernard et al., 1998を参照されたい)、むしろ、有糸分裂中の後期分離問題によって生じ得ることを示唆している。事実、Suv39h dn細胞の１つの画分は、アナフェイズ(後期)で止まっている染色体を含有している。Suv39h dn PMEFは低-4倍体および低-8倍体核型に特徴を有し(図10d参照)、腫瘍細胞は‘バタフライ’型染色体を含有している(図11c参照)ので、H3-K9メチル化の不存在が整列した中期染色体間でより強力でより持続性のある挟動原体会合を許容するモデルが提案されている(図16、上方パネル参照)。セントロメア結合におけるSuv39h HMTアーゼの役割は決定されるべき状況にあるが、既知のチェックポイントコントロールを活性化しない、可能な細胞質分裂欠損および全体的染色体組の誤分離を説明する魅力的なメカニズムを提供している。
【００１６】
体細胞と対照的に、雄減数分裂におけるSuv39h介在欠陥は、中期から後期パキテン期への移行中に第V〜VI段階精母細胞の明確なアポトーシスを誘導する(図13a参照)。この段階でのプログラム細胞死の活性化は、DNA損傷コントロール(Xu et al., 1996)、減数分裂組換え(Yoshida et al., 1998；de Vries et al.,1999；Baudat et al., 2000)およびシナプトネマルコンプレックス（合糸期複合体）形成(Yuan et al., 2000)において損傷されたマウス変異体においても観察されている。Suv39h dn精母細胞においては、挟動原体H3-K9メチル化は、前レプトテン期において特異的に低下するが、驚くべきことに、後期減数分裂段階中に野生型染色として出現する(図13b、下方パネル参照)。即ち、上述の増大したセントロメア会合からの類推において、減数分裂開始時でのH3-K9メチル化を損傷することにより、中期パキテン期中のさらなるH3-K9 HMTアーゼの仮想活性によってはもはや‘救済’され得ない異常セントロメア集塊化を誘発することが提案される。このモデル(図16、下方パネル参照)では、Suv39h依存性H3-K9メチル化を、減数分裂の成功を保証し、非正規ヘテロクロマチン相互作用を防止する最早期条件の1つとして特徴付けている。非相同性相互作用は、対合遅延或いは完全な対合欠陥させも生じるので(図14a参照)、パキテン期チェックポイントを活性化させることによりアポトーシスを触発させ(de Vries et al., 1999)、それによって雄生殖系を異数体の蓄積から保護する。
【００１７】
Suv39h dnマウスにおいては、精子形成欠陥は、非正統的な染色体相互作用、対合遅延、未対合の性染色体および減数分裂Iでの2価誤分離によって増強されている(図14〜15参照)。注目に値するに、これらの‘禁止’相互作用の主要部分は、性染色体と常染色体間の物理的接触を含み、これらの接触は、セントロメア領域によって大いに介在される(図14Dおよび14L参照)。これらのデータは、H3-K9メチル化の損傷により、挟動原体へテロクロマチンがより緩和した形状(ランダム会合で系合するようになる傾向を有する)を形成することを可能にすることを示唆している。Drosophilaにおける細胞学および遺伝子研究において、へテロクロマチンの染色体間および染色体内相互作用を制限する固有のポテンシャルが示唆されている(Dernbrug et al., 1996a；Csink and Henikoff, 1996)。さらにまた、挟動原体へテロクロマチンは、アキアスメイト(achiasmate)染色体の配列および対合を開始させ減数分裂Iまで維持することも証明されており(Karpen et al., 1996；Dernburg et al., 1996b)、相同性染色体のパートナー認識を確実にするであろう‘自己相補性’高次染色体構造を構成することにおけるへテロクロマチンの役割(Karpen et al., 1996)を示唆している。Suv39h HMTアーゼの機能についてのインビボデータは、これらの提案されたへテロクロマチンの役割と一致しており、減数分裂へテロクロマチンの損傷が哺乳動物生物体における染色体同一性に影響し得るという最初の証拠を明らかにしている。
【００１８】
最後に、Suv39h欠損は、一価性染色体をパキテン期および移動期において誘発させる(図15参照)。興味あることに、HP1β(Motzkus et al., 1999；Turner et al., 2000)およびSuv39h HMTアーゼ(O'Carroll et al., 2000)は、XY体中の性染色体の特化したクロマチン構造体に局在化する。XY体形成はSuv39h dn精母細胞の早期/中期パキテン期においては正常であるけれども、Suv39h欠損は、H3-K9メチル化を長期化し(図13Bの矢印参照)、Y染色体の低凝縮を誘発させる(図15E参照)。これらの結果は、Y染色体のへテロクロマチン同一性の定義におけるSuv39h HMTアーゼ活性に関連し、Suv39h介在H3-K9メチル化が異形性染色体のホモログ対合を間接的に促進または安定化させ得ることを示唆している。
へテロクロマチンは、70年以上も前に最初に記載された(Heitz, 1928)。細胞核内でのその安定な発現故に、細胞タイプ同一性の遺伝および染色体分離の忠誠度における重要な機能を奏することが提唱されてきた。最初のHMTアーゼ類(Rea et al., 2000；O'Carroll et al., 2000)およびそのH3-K9メチル化によるへテロクロマチン親和性を発生させるメカニズム上の関連の発見、並びにHP1タンパク質の補充(Lachner et al., 2001；Bannister et al., 2001；Nakayama et al., 2001)は、今や、へテロクロマチンの基本的役割の幾つかを明らかにする開始点を構成している。
【００１９】
本発明の実験は、挟動原体へテロクロマチンでのH3-K9メチル化が、実際に、哺乳動物発生を保証し、且つ体細胞および雄生殖細胞の双方における染色体安定性を保護するための重要な要件であるというインビボ証拠を提供している。Suv39h欠陥は有糸分裂および減数分裂における染色体機能を損傷するので、それらの実験データは、、H3-K9メチル化の基本的役割を全体的染色体動力学における‘へテロクロマチン受容能’に帰属させるものであり、へテロクロマチンと称される不可解な実在物の直接的な生物学的機能の幾つかを明らかにするものである。
第1の局面において、本発明の実験において得られたデータは、SU(VAR)3-9タンパク質群の各メンバーがHMTアーゼ活性を有し、この活性により、これらのメンバーを、増殖障害とりわけ癌治療用の新規なターゲットとして同定することを示している。
さらにまた、本発明の実験は、Suv39h HMTアーゼが胚発生および精子形成において重要であることも示唆している。
Suv39h HMTアーゼ遺伝子双方の破壊は、挟動原体へテロクロマチンでのH3-K9メチル化を消滅させ、腫瘍形成のリスク増大を伴う染色体不安定性を誘発する。
【００２０】
さらに、Suv39h二重ヌル雄マウスは、非相同性染色体会合および対合遅延によって主として生ずる完全な精子形成欠損を示し、減数分裂前期細胞のアポトーシスを生ずる。これらの結果は、ヒストンH3-K9メチル化を挟動原体へテロクロマチンにおける重要な決定子として確立し、有糸分裂および減数分裂中の染色体安定性を保護する‘へテロクロマチン受容能’を維持することにおけるSuv39h HMTアーゼの直接の役割を提供する。
ヒトSUV39H1、マウスSuv39h1およびマウスSuv39h2によって例示されるSU(VAR)3-9タンパク質群の各メンバーのK9特異性ヒストンH3 HMTアーゼとしての同定は、高次クロマチン依存染色体安定性を改変、とりわけ干渉する化合物の発見(この発見が癌治療における新規な試みの基本である)を可能にするアッセイ方法の設計において前提条件である。（以下、特に説明しない限り、用語“Suv39h”は、マウスおよびヒトタンパク質の双方を称する）。
精子形成におけるSuv39h1またはSuv39h2の役割に基づき、これらタンパク質のMTアーゼ活性を調節する、即ち、精子形成を調節する化合物は、雄性不妊治療(Suv39h MTアーゼ活性を高める化合物を使用して)において、また可逆的雄性避妊(male contraception)(Suv39h MTアーゼ活性を抑制する化合物を使用して)においても使用し得る。
【００２１】
本発明は、有糸分裂および減数分裂中の高次クロマチン依存性の染色体安定性を改変する化合物の同定方法に関し、その方法は、メチルトランスフェラーゼの基質を、メチルドナーの存在下に、Suv39h様MTアーゼ活性を有するMTアーゼと一緒に試験化合物の存在または不存在下にインキュベートし、試験化合物がMTアーゼ活性を調節しているかどうかを測定することを特徴とする。
Suv39h様MTアーゼ活性(以下においても、“Suv39h様MTアーゼ活性と称する)を有するMTアーゼ群は、ヒストンH3-K9 MTアーゼ活性またはこれから同定しなければならない他の基質に対するメチルトランスフェラーゼ活性を示す酵素類も包含する。
用語“ヒストンH3-K9”は、ヒトSUV39H1またはマウスSuv39h基質(即ち、リシン9におけるヒストンH3のメチル化部位)に限定されるものではなく、そのメチル化が下記で定義する後生的発現シグナルを生じさせる、ヒストンいかなる基質、またはヒストン変異体型タンパク質のいかなる基質を包含することを意味する。
MTアーゼ群のさらなるメンバーは、バイオインフォマティクス技術/生化学的技術によって同定し、生化学的に試験することができる。例えば、第1段階においては、実施例1において記載するような類似性についてのデータベースを調査することによる。次に、同定した候補物は、各実施例において記載したのと同様な或いは同一の生化学アッセイ法においてSuv39h様MTアーゼ活性を有するMTアーゼとして確認することができる。
【００２２】
この群のSuv39h様MTアーゼは、本発明において観察されたSuv39h K9ヒストンH3 HMTアーゼ活性同様に、高次クロマチン依存性の染色体安定性において必要とする、K9以外の他のヒストンH3残基に対するまたはヒストンH3以外の基質に対する特異性を有するMTアーゼも包含する。この後成的発現シグナルは、H3のリシン9でのヒストンメチル化単独での結果であり得る；しかしながら、未定義の基質類に対するMTアーゼ活性または基質メチル化と他のヒストン残基でのリン酸化またはアセチル化のような他の共有的修飾との組合せが関連していることも否定することはできない。
本発明の実験においては、SETドメインにおける点変異を有するSuv39h変異体が上記タンパク質に対する高活性のHMTアーゼ活性を有することが証明され、これらのSuv39h変異体も本発明の方法において有利に使用できる。
好ましい実施態様においては、MTアーゼはマウスSuv39h1またはSuv39h2であり、最も好ましくは、MTアーゼはヒトSUV39H1またはSUV39H2である。
本発明においては、組換えSuv39hがHMTアーゼ活性を有することが証明されているので、最も好ましくは、組換えMTアーゼを使用する。Suv39hまたはSuv39h変異体は、適切な宿主、例えば、細菌、酵母、昆虫または真核細胞内での発現による標準方法に従って組換えにより産生させ、例えば、GSTをタグ付けした場合のグルタチオン-アガロースカラム上で精製できる。
【００２３】
Suv39h1およびSUV39H1のcDNA配列は文献公知であり(Aagaard et al., 1999)、Suv39h2のcDNA配列は配列番号1に示されており；ヒトSUV39H2のcDNAは、配列番号3-6に示されているようにESTによって定義されている。
Suv39h活性に対する効果について化合物を試験する場合、そのアッセイは、その本質的な特徴として、ヒストンH3タンパク質またはK9を含むヒストンH3 N-末端フラグメント、メチルドナー、例えば、メチオニンまたはS-アデノシル-L-メチオニンをSuv39h MTアーゼ活性を含有する調製物と一緒にインキュベートし、試験物質の存在または不存在下にMTアーゼ活性を測定することを含む。
本発明の方法において有用なMTアーゼ基質は、天然産基質に等価の基質または天然産基質を模倣する基質、例えば、生化学的に精製したヒストンH3、組換えにより産生させたヒストンH3、K9メチル化部位を含有するヒストンH3ペプチド、またはSuv39h MTアーゼに対する基質として作用する他のこれから同定されるべきタンパク質であってよい。新規なSuv39h基質をバイオインフォマティクスおよび生化学的方法によって同定することができ、本発明の各実施例において記載する生化学アッセイ法を使用して試験することができる。例えば、新規なSuv39h基質を共免疫沈降法によって同定することができる。Suv39hタンパク質またはSuv39hタンパク質のタグ付加物は、特異的抗血清および相互作用するタンパク質と共に免疫沈降させることができ、相互作用性タンパク質を質量分光分析によって同定することができる。Suv39hタンパク質またはSuv39hタンパク質の1部を釣り餌(bait)として使用する酵母2ハイブリッドスクリーニングも、各種のcDNAライブラリーからの新規な相互作用性タンパク質を同定するのに使用できる。
【００２４】
好ましい実施態様においては、ヒストンH3フラグメント：ARTKQTARKSTGGKAPRKQL (配列番号:7)を使用する。また、MTアーゼが増大した親和性/活性を有するような修飾ペプチドも使用できる。そのようなペプチドは、アミノ酸を交換しおよび/または付加しおよび/または欠落させ、基質をMTアーゼ親和性/活性についての1連の試験において試験することによって設計することができる。
メチルドナーのメチル基は、好ましくは、検出可能なラベル、例えば、放射活性または発色性ラベルを担持し、これを基質への移行時に定量できる。
好ましくは、メチルドナーは、放射活性ラベル化メチオニンまたはS-アデノシル-L-メチオニンである。
ラベル化メチルドナーを使用する別法として、基質を、上記酵素によるメチル化時に、特異性抗体によって認識し得るエピトープとして使用し、それによって、標準のイムノアッセイ法、例えば、ELISA法によって定量できる。このタイプのアッセイにおいて有用な抗体は、メチル化基質、好ましくは小ペプチド、例えば、配列番号:7に示されている配列を有するペプチドを抗原として使用し、標準方法に従ってポリクローナルまたはモノクローナル抗体を得ることによって得ることができる。ヒストンH3リシン9位置に対するメチル特異性抗体の産生および精製は、下記の材料および方法の項において説明する。適切なH3-K9メチル抗体は、Nakayama et al., 2001によっても開示されている。
小スケール用途においては、上記スクリーニング方法は、実施例2、3または4に記載しているようなアッセイに基づき得る。
【００２５】
別の実施態様においては、本発明のスクリーニング方法は、リシン9でのヒストンH3のメチル化(H3-K9)がHP1タンパク質に対する高親和性結合部位を形成させるという事実を利用する。この実施態様においては、基質を、メチル化時に、HP1に結合させ、次いで、ラベル化抗HP1抗体と一緒にインキュベートする。試験化合物の不存在または存在下での反応間のラベル強度の差異が、MTアーゼ活性に対するその化合物の調節効果について指標となり得る。
HP1は、好ましくは、組換え形態で使用する。HP1 cDNAの配列情報(Jones et al., 2000；アセッションNo.BC006821)に基づき、HP1を標準技術に従って組換えにより産生させる。この組換えタンパク質またはそのフラグメントを使用してこのアッセイフォーマットにおいて使用するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生させる。
好ましい実施態様においては、本発明の方法は、高処理量スケールにおいて実施する。この実施態様においては、主要アッセイ成分、とりわけSuv39hは、組換え形で使用する。
高処理量フォーマットにおいては、MTアーゼインヒビターを同定する本発明のスクリーニング方法は、標準のアッセイ手順に従って実施する。そのようなアッセイは、Suv39hまたはSuv39h変異体によって介在されたドナーから基質、例えば、ヒストンH3ペプチドへのメチル基の触媒性移行に基づく。これを達成するためには、基質、例えば、ヒストンH3またはその変異体もしくはフラグメントを、担体、通常はマイクロタイタープレート上に固定させ、組換えSuv39hまたはSuv39h変異体およびメチルドナーと一緒にインキュベートする。
【００２６】
メチルドナーのメチル基は、ラベル、好ましくは発色性または放射活性ラベルを担持する。
高処理量スケールで上記酵素反応を実施するための蛍光または放射活性ラベルおよび他の試薬類は、商業的に入手可能であり、供給業者の指示書(例えば、Molecular Probes、Wallac社)に従って使用することができる。適切な蛍光ラベルの例は、クマリン誘導体、例えば、7-アミノ-4-メチルクマリンまたは7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンである。放射活性ラベルは、14Cまたは3H原子であり得る。Suv39hによるメチル基の基質への移行時に、発色性試薬の場合、メチルドナーは色を変え、これを定量することができる。放射活性メチルドナーを使用する場合には、メチル基を基質に移行させ、直接定量することができる。
特定のアッセイ設計は、種々のパラメーター、例えば、使用する基質のサイズに依存する。短ペプチドを使用する場合、蛍光消光法または蛍光共鳴エネルギー移行法は、下記で説明するように、適切なアッセイ技術の例である。
基質を、例えば、ビオチンでタグ付けし、次いで、反応を溶液中で実施し、その後、ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートに、例えば、放射活性メチル基の場合には、“フラッシュ”プレート(その材料がシンチラントを含有する)またはシンチラントをコーティングしたプレートに移す。このようにして、基質のメチル化量を、適切なシンチレーション装置/リーダー内で定量することができる。また、アッセイは、既にプレートに結合させたビオチン化基質を含むストレプトアビジンコーティング“フラッシュ”プレート内でも実施できる。このタイプのアッセイは、いわゆる“均質アッセイ”の形(中間の移行および洗浄工程を必要としないアッセイタイプ)で、例えば、シンチラントおよびストレプトアビジンをコーティングしビオチン化基質を結合させたマイクロビーズを使用することによっても実施できる。
【００２７】
ビオチンと同様に、タグ特異性抗体をコーティングしたプレートに基質を固定するのに適し得る他の普通に使用するタグ、例えば、Flag、Myc、HA、GSTも上述のアッセイにおいて使用できる。
変形としては、このアッセイは、ELISAタイプフォーマットのアッセイにおいて実施する；この場合、メチル特異性抗体を使用してプレートに結合したメチル化基質の量を検出する。
あるいは、上記のプレートにメチル化基質に対する抗体をコーティングしてメチル化基質を捕捉する；また、基質をタグ付けまたは発色性ラベル化し、結合したメチル化タグ付け/ラベル化基質をタグ特異性抗体によるかまたは発色性ラベル量を測定するかのいずれかによって定量することができる。例えば、基質は、発色性ラベル、例えば、ユウロピウムでラベル化し、Suv39h様MTアーゼによるメチル化時に、担体(例えば、マイクロタイタープレート)上に固定させたLys9-メチル特異性抗体に対するエピトープ(下記の材料および方法の項参照)となる線状または枝分れペプチド、例えば、[TARKST]4-K2-K-cysである。捕捉されていない基質を洗い流し、その後、ユウロピウムラベルを開裂し、その蛍光を増強させ、蛍光量を時間分解蛍光によって算出する。蛍光量は、メチル化基質の量に直接関連する(図17)。
【００２８】
別の実施態様は、上記ペプチドのメチル化がプロテアーゼによる開裂に対するその感応性を改変させ得るという原理に基づく。この原理を使用して、蛍光消光(Resonance Energy Transfer、"RET")アッセイを使用してペプチド基質のメチル化量を測定することができる。第1段階において、Suv39hペプチド基質はメチル化部位と特定したプロテアーゼ、例えば、トリプシンまたはLysC、に対する認識/切断部位を含有し、認識/切断部位の修飾(特定の例として、リシンのメチル化)に対して感受性である。このペプチドは、一方の末端近くに蛍光ドナーを、他の末端近くにアクセプターを担持する。未切断基質においては、ドナーとアクセプター間の分子内RETを持続させることによって基質の蛍光は消光されている。特定プロテアーゼによって (未メチル化)基質が切断されると、切断生成物がRET消光から解放され蛍光シグナルが発生する。基質のメチル化は、プロテアーゼの基質切断能力を消失させる。即ち、プロテアーゼ活性の消失(メチル化に比例する)は、シグナル抑制、完全なプロテアーゼ抑制の場合は基本レベルまでの抑制として反映される。
このタイプのアッセイは、次のようにして実施できる：アッセイ緩衝液中のラベル化基質(例えば、1端を4-[[4'-(ジメチルアミノ)フェニル]アゾ]安息香酸(DABCYL)で、他端を5-[(2'-アミノエチル)アミノ]ナフタレンスルホン酸(EDANS)でラベル化した、或いは1端をベンジロキシカルボニルで、他端を4-アミノメチルクマリンでラベル化したペプチド)の溶液を黒色96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル中に移す。特定濃度の試験物質を添加した後、MTアーゼとメチルドナーを各ウェルに添加する。反応条件下にメチル化反応に十分な時間で、例えば、室温で40分間インキュベーション後、プロテアーゼ、例えば、トリプシンを添加し、適切な条件下で反応させ、最後に、蛍光をフルオロメーター内で、励起波長、例えば、340 nmおよび発出波長、例えば、485 nmで測定する。
【００２９】
FRETアッセイを使用する場合、次のような商業的に入手可能なラベル化用対が本発明の方法においては適している：ユウロピウム(Eu)とアロフィコシアニン(APC)、EuとCy5、EuとPE (フィンランド、ターク(Turku)のWallac社)。試験基質がMTアーゼ活性のモジュレーターである場合、検出系によって、また試験物質が抑制作用または活性化作用を有するかどうかによって、試験物質の存在しない対照サンプルに比較して検出可能シグナルの低下または増大が存在する。高処理量フォーマットにおいては、調節作用のSuv39h MTアーゼ活性を有する化合物を、化合物ライブラリーからの試験物質を公知のアッセイ原理に従って、例えば、マイクロタイタープレート上の自動化システム内でスクリーニングすることによって同定できる。
Suv39h様MTアーゼを直接調節、とりわけ抑制することによりその効果を発揮する化合物を同定する方法を提供することによって、本発明は、急速分裂中の動物細胞、とりわけ腫瘍細胞の増殖を抑制する基礎を提供する。
上述の方法で同定した化合物類は、これも本発明の主題であり、Suv39hのMTアーゼ活性を調節することにより、染色体安定性および高忠誠度の染色体分離性に干渉する能力を有する。
好ましい実施態様においては、本発明の化合物は、Suv39h HMTアーゼ活性のインヒビターである。
好ましくは、本発明の化合物は、Suv39h、とりわけSuv39h1またはSuv39h2の特異性モジュレーターである。
【００３０】
また、本発明は、ヒトの治療、とりわけ癌治療において使用するためのSuv39h様MTアーゼ活性のモジュレーター、とりわけSuv39hのモジュレーターとして作用する化合物にも関する。
Suv39h HMTアーゼ活性を抑制する化合物は、ゲノム安定性の低下をもたらし、分裂性細胞、とりわけ高増殖性腫瘍細胞をターゲットとする治療において使用できる。これらの化合物は、好ましくは、他のゲノム安定性低下剤、例えば、チューブリン結合剤(タキサン類、例えば、タキソル；パクリタキセル(Paclitaxel)；またはエピテロン(epithelone)類)のような有糸分裂抑制剤と併用して投与する。SUV39Hインヒビターは、通常の癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、とりわけ腫瘍細胞を事前感応化するためのDNA劣化剤を施すのと同時に、またはその前でも使用できる。腫瘍細胞ゲノムを安定性低下させることにより、SUV39Hインヒビターは、腫瘍細胞を併行/事後治療に対してより感受性にする。
SUV39Hインヒビターは、好ましくは、併用療法において使用し、継続的および一時的な治療において投与する。Suv39h二重ヌルマウスにおけるB細胞リンパ腫の発症は後期(即ち、9ヶ月齢後)のみに起るので、SUV39Hインヒビターによる一時的な治療は、腫瘍リスクの直の増大を誘発するのではなく、むしろ高増殖性細胞の全体的ゲノム安定性を弱めるであろう。
【００３１】
同様に、Suv39h HMTアーゼ活性を増強する薬剤を使用して本来的に不安定な細胞のゲノムを安定化させ、それらの細胞が増殖促進変異を獲得する傾向を低くすることも可能である。Suv39h機能およびSuv39h酵素の抑制または増強の効果についてのモデルを図8に示す。
Suv39hモジュレーターとして同定した化合物の有効性は、陽性対照として作用するSuv39h二重ヌル細胞を含む哺乳動物細胞におけるインビボ有効性について試験できる。癌療法において有効な化合物は、染色体安定性および分裂に干渉すべきであり、これは、核型分析(karyotyping)することにより、例えば、そのDNA含量をFACSまたは標準の細胞学手法によって分析することにより測定できる。治療用途におけるポテンシャルがそのような二次スクリーニングにおいて確認されてた物質は、腫瘍細胞に対する効果についてさらに試験することができる。腫瘍細胞の抑制を試験するためには、初代ヒト腫瘍細胞を二次スクリーニングにおいて同定した化合物と一緒にインキュベートし、腫瘍細胞増殖の抑制を、通常の方法、例えば、ブロモ-デソキシ-ウリジンまたは3Ｈチミジン取り込みにより試験する。これらのアッセイにおいて抗増殖作用を示す化合物は、腫瘍動物モデルにおいてさらに試験し、腫瘍治療において使用できる。
【００３２】
男性妊性応用を意図する化合物は、Vigil等によって1985年に開示された動物モデル、Weinbauer等によって2001年に開示されたようなヒト精子形成の実験研究用に開発された動物モデル、またはLambおよびNiederberger (1994)によって開示されたようなヒト男性生殖欠陥を擬似した動物モデルにおいて試験できる。動物データのヒト生殖障害評価への有効な応用のためのガイダンスは、Workingにより1988年に提供されている。
本発明の方法により薬物候補として同定した化合物の毒性および治療上の有効性は、標準の製薬手順によって決定でき、その手順は、細胞培養と動物実験を実施してIC50、LD50、ED50を決定することを含む。得られたデータを使用してヒト投与量範囲を決定する。投与量は、剤形(タブレット、カプセル、エアゾールスプレー、アンプル等)および投与経路(経口、口内、経鼻、パテレンタル(paterental)、直腸、または、一時的な男性避妊用途の場合には、局所持続型放出形投与、例えば、生殖腺中またはその近くに埋め込む遅延放出性マイクロペレット)にも依存する。活性成分として上記化合物を含有する製薬組成物は、1種以上の生理学上活性な担体または賦形剤を使用して通常の方法において調製できる。そのような製剤の製造方法は、マニュアル類、例えば、“Remington Pharmaceutical Sciences”において見出すことができる。
【００３３】
Suv39hは、安定な核型を維持するのに必要とするので、腫瘍サプレッサー遺伝子と考えることができる。Suv39h変異体も、B細胞リンパ腫発症におけるSuv39h二重ヌルマウスの分析によって強く示唆されているようなヒトにおける細胞形質転換事象の根底にある因子であることが証明された場合には、遺伝子治療による野生型のSuv39h遺伝子の再導入により、癌進行を遅延または抑制するゲノム安定性の増大がもたらされることが予期され得る。
遺伝子治療においては、Suv39h DNA分子を、好ましくは組換え形のプラスミド上に含有させて、直接または組換えウィルスまたは細菌の1部として投与できる。一般的には、任意の遺伝子治療方法を、Suv39h組換えDNAを体内および体外の両方で投与するのに使用できる。
体内投与の例は、筋肉内経路によるか或いは遺伝子銃を使用しての“裸の”DNAの直接注入である。組換え生物の例は、ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスである。さらにまた、カチオン性脂質、微小球、マイクロペレットまたはリポソームのような核酸用の合成担体も、Suv39hポリペプチドをコードする核酸分子の体内投与用に使用できる。
Suv39hが主としてその固有のHMTアーゼ活性を介して高次哺乳動物クロマチン内の動的移動を介在することが本発明において証明されたので、ヒストンH3-K9メチル化(H3-K9 Me)は細胞分裂中の染色体動力学において重要な後成的発現インプリントを表すものである。従って、H3-K9 Meに特異的な抗体を使用して、細胞/患者をへテロクロマチン系ゲノム不安定性についてスクリーニングすることができる。本質的に、H3-K9メチル化特異性抗体を、染色体誤分離による異常遺伝子発現およびゲノム不安定性或いはへテロクロマチンの異常形成または組織化に関連するヒト疾患の診断手段として使用することができる。
【００３４】
材料および方法
a) 配列アラインメントおよび二次構造予測
ヒトSUV39H1(Aagaard et al., 1999)、Drosophila SU(VAR)3-9(Tschiersch et al., 1994)およびS.pombe CLR4 (Ivanova et al., 1998)の各SETドメインを、Profile (Birney et al., 1996)、Markov (Eddy, 1998)および位置特異的繰返しBLAST(Altschul et al., 1997)の各方法を使用するデータベース類似性調査における出発マルチプルアラインメントとして使用した(代表的なリストは、SMART WWWサーバーのSETドメイン頁から入手できる(Schultz et al., 2000))。これらの調査により、推定的リシンN-メチルトランスフェラーゼとして記載された6種の植物タンパク質(アセッション番号Q43088、O65218、P94026、O80013、AAC29137およびAC007576-12に対する有意な類似性が明らかになった。例えば、問い合わせとしてS.pombe仮想的タンパク質SPAC3c7.09を用いたPSI-BLAST調査においては、0.001のE値包含閾値(E-value inclusion threshold)を使用して、10回以内でこれらの植物配列と周知のSETドメイン配列を同定した。同じ調査において、YHR109w(シトクロムcMTアーゼをコード化することが知られている(Martzen et al., 1999))におけるSETドメインの存在も3回以内で明らかになった。コンセンサス二次構造を、記載されているアルゴリズム(Frishman and Argos, 1997)により予測した。
【００３５】
b) HeLa細胞におけるエピトープ-タグ付けされたSUV39H1タンパク質
全長(myc)3-SUV39H1 (aa3-412)または(myc)3-Nクロモ (aa3-118)を過剰発現するHeLa細胞株が開示されている(Aagaard et al., 1999；Melcher et al., 2000)。核抽出物を抗-myc抗体ビーズ(Aagaard et al., 1999)により免疫沈降させ、約1〜3μgのマトリックス結合(myc)3タグ付けされたSuv39hタンパク質をインビトロHMTアーゼアッセイにおいて使用した。
【００３６】
c) GST融合タンパク質の作製および精製
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質としてのpGEX-2Tベクター(Pharmacia社)から発現させたGST-Suv1(82-412)が記載されている(Aagaard et al., 1999)。BamHI-EcoRI PCRアンプリコンをpGEX-2Tに導入して、Suv39h1(7-221)、SUV39H1(82-412)、SUV39H1(82-378)ΔC-尾部、SUV39H1(255-412)Δcys、Suv39h2(157-477) (O'Carroll et al., 2000)、CLR4(127-490) (Ivanova et al., 1998)、EZH2(382-747) (Laible et al., 1997)およびHRX(3643-3969) (Tkachuk et al., 1992)についてフレーム内融合物をコードする追加のGST構築物を作製した。短い内部欠失体(ΔNHSCDPN323-329およびΔGEELTFDY358-365)または-320HφφNHSC326-モチーフ内での点変異は、GTS- SUV39H1(82-412)プラスミドにおける二重PCR変異誘発によって直接操作した。全ての構築物はシークエンシングにより確認した。
各組換えタンパク質は、E.coli BL21株の1リットル培養物中で発現させ、フルセットのプロテアーゼインヒビター類(Boehringer Mannheim社)およびリゾチーム(5 mg/ml；Sigma社)を含有する10 mlのRIPA緩衝液(20 mM Tris pH 7.5、500 mM NaCl、5 mM EDTA、1% NP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム)中で、液体N2中で凍結解凍し次いで超音波処理することによって可溶化させた。各可溶性タンパク質を遠心処理により透明化し、800μlのグルタチオンセファローズビーズ(Pharmacia社)で精製し、RIPA緩衝液で2回洗浄した。タンパク質濃度は、SDS-PAGEゲルのクーマシー染色により測定した。マトリックス結合融合タンパク質を直ぐにインビトロHMTアーゼアッセイにおいて使用するか、或いは4℃で保存した。
【００３７】
d) インビトロ ヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMTアーゼ)アッセイ
インビトロHMTアーゼ反応を、開示されたプロトコール(Strahl et al., 1999)に基づいて修正し、基質として10μgの遊離ヒストン(H1、H3、H2B、H2AおよびＨ４の混合物；Boehringer Mannheim社)をまたメチルドナーとして300 nCiのS-アデノシル-[メチル-14C]-L-メチオニン(25μCi/ml) (Amersham社)を含有する50μl容量のメチラーゼ活性緩衝液(MAB：50 mM Tris ph 8.5、20 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM β-ME、250 mMアガロース)中で実施した。通常、10μgのマトリックス結合GST融合タンパク質を一般的に使用してHMTアーゼ活性についてアッセイした。37℃で60分のインキュベーション後、反応をSDSローディング緩衝液中で煮沸することによって停止させ、各タンパク質を15％または18％SDS-PAGEにより分離し、クーマシー染色およびフルオログラフィにより可視化した。
個々のヒストン(Boehringer Mannheim社)、インシュリン(Sigma社)およびN-末端ペプチドによるHMTアーゼアッセイは、5μgの基質により実施した。次の各ペプチドを使用した：ヒトヒストンH3の野生型N-末端(ARTKQTARKSTGGKAPRKQL) (配列番号7)およびリシン9(ボルド)をロイシンに変えた変異体ペプチド；ヒトCENP-AのN-末端(MGPRRRSRKPEAPRRRSPSP) (配列番号8) (Sullivan et al., 1994)；ラットmacro-H2AのN-末端(MSSRGGKKKSTKTSRSAKAG) (配列番号9) (Penhrson and Fried, 1992)。
インビトロメチル化野生型H3 N-末端ペプチドのペプチドマイクロシークエンシングおよびシンチレーション計数による個々のアミノ酸の3H取り込み量の測定は、記載されたとおりに行った(Strahl et al., 1999)。
【００３８】
e) 胚幹細胞内でのSuv39h1およびSuv39h2遺伝子座のターゲッティング
Suv39h1遺伝子座(Xクロモソーム)およびSuv39h2遺伝子座(２番染色体) (O'Carroll et al., 2000)の各部分ゲノムクローンを使用し、Suv39h1の最初の40個アミノ酸またはSuv39h2の最初の113個アミノ酸のフレーム内融合タンパク質を核局在化シグナル(nls)で修飾したβ-ガラクトシターゼ(LacZ)によって産生させる戦略で、短および長相同腕を作製した。ターゲッティングのために、1.2 kb Pfu PCRアンプリコンと5.4 kb Sacl DNAフラグメントをゲノムサブクローンgSuv39h1#18から誘導し、1.3 kb Pfu PCRアンプリコンと5.0 kb MluI/Apal DNAフラグメントをゲノムサブクローンgSuv39h2#28から調製した(図9A参照)。pGNA誘導ターゲッティングカセットは、正の選抜のためのRSV-ネオマイシン(neo)遺伝子と2つのポリアデニル化部位を含有していた。ランダム取込みに対して選抜をかけるためにMCIプロモーターの制御下のジフテリアトキシンA(DTA)遺伝子を使用し、相同長腕の3'に挿入した。NotIによる直線化後、Suv39h1およびSuv39h2ターゲッティング構築物をエレクトロポーレーション処理し、フィーダー依存性R1およびE14.1 (129/Sv)胚性幹(ES)細胞とした。
【００３９】
選抜後、G418耐性ES細胞コロニーを、Suv39h1 (PCR1：5'-ATGGGGGCAGGGTTTTCGGGTAGAC、配列番号10；PCR2：5'-AAATGGTATTTGCAGGCCAC-TTCTTG、配列番号11)またはSuv39h2 (PCR1：5'-GAAAAGGTTGTTCTCCAGCTC、配列番号12；PCR2：5'-GGATGGGATGGTGG-AATGGTTTTTAT、配列番号13)の各短腕についての外側のプライマー、およびlacZ遺伝子(lacZ-PCR1：5'-AACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAAC、配列番号14；lacZ-PCR2：5'-CTCAGGAA-GATCGCACTCCAGCC、配列番号15)内部のプライマーを使用し、ネステッド(nested)PCRによって相同性組換えについてスクリーニングした。
ターゲッティングの成功は、プライマーg24r (5'-GACTGC-CTAGTCTGGCACTGAACT、配列番号16)およびg13 (5'-GATCACTGCGTACATATAC-ACTGAT、配列番号17)によって作製した約500 bpの外部Suv39h1イントロンプローブでPvuII消化したES細胞DNAのサザンブロット分析、またはプライマーP1F (5'-TAGACTT-CTACTACATTAACG、SEQ ID NO18)およびP1r (5'-GATGTCAGTGGCTATGAATG、配列番号19)によって作製した約500 bpの外部Suv39h2エクソン/イントロンプローブによるHindIII消化ES細胞DNAのサザンブロット分析により確認した。これらのDNAプローブは、野生型Suv39h1対立遺伝子からの4.5 kbフラグメントとターゲティングされた対立遺伝子の4.0 kbフラグメント、またはSuv39h2野生型とターゲッティングされた対立遺伝子からの11kbと6.1 kbの各フラグメントを検出する(図9B参照)。
【００４０】
f) Suv39h1-およびSuv39h2-欠損マウスの作製および遺伝子型決定
幾つかの個々にターゲッティングされたES細胞クローンは、生殖系を通して変異を伝達したキメラマウスを生じさせた。Suv39h1-/-およびSuv39h2-/-マウスを交配させて複合Suv39h変異体マウス(例えば、Suv39h1-/-、Suv39h2+/-；null1/het2)を作製し、次いで、これらを交雑してSuv39h二重ヌル(dn)マウスを作製した。この試験における全てのマウスは129/SvおよびC57BI/6J起原の混合遺伝的背景に維持した。
変異体マウスの遺伝子型決定は、上述したようなサザンブロット分析によって行った。マウス精巣からの核抽出物のα-Suv39h1およびα-Suv39h2抗体によるタンパク質ブロット分析は、従来記載されているようにして行った(O'Carroll et al., 2000)。
【００４１】
g) Suv39h二重ヌル初代マウス胚性繊維芽細胞(PMEF)の作製と分析
PMEFを、Suv39h1-/-/Suv39h2+/-複合変異体マウスを交配させた後のE12.5日のSuv39h二重ヌル胚から得た。対照として、PMEFを同じ遺伝的背景の野生型胚からも調製した。細胞周期プロフィールおよび増殖曲線分析において、継代第2代のPMEFを、記載されているようにして分析した(Xu et al., 1999)。α-phosH3 (Hendzel et al., 1997)抗体によるPMEF間期クロマチンの染色を、記載されているようにして(Melcher et al., 2000)、非浸透性細胞において行った。生化学分析においては、全核抽出物をポンソー染色により予備較正し、α-H3抗体(Upstate Biotechnology社)およびα-phosH3 (Hendzel et al., 1997)抗体でイムノブロットし、増感化学発光（Enhanced ChemiLuminescence (ECL)）(Amersham社)を使用してペルオキシダーゼ染色によって可視化した。
【００４２】
h) PMEFの増殖曲線およびFACS分析
野生型細胞および変異体細胞の増殖能を分析するために、各PMEFを10 cm2皿上に播いた。次の30継代に亘って、3×105個の細胞を3日毎に新しい10 cm2皿に連続して再播種し(3T3プロトコール)、それらの倍化速度を測定した。継代第3代および継代第８代のPMEF培養物のDNAプロフィールを、内部標準としてニワトリ胚赤血球核(Becton Dickison社)を使用し、エタノール固定してヨウ化プロピジウム染色した細胞のFACSによって得た。
【００４３】
i)骨髄培養およびB細胞リンパ腫のFACS分析
wtおよびSuv39h dnマウス由来の各骨髄細胞を、IL-3 (10 ng/ml)、IL-6 (5 ng/ml)、SCF (100 ng/ml)、FLT3リガンド(20 ng/ml)、GM-CSF (1 ng/ml) (以上いずれも、R&D Systems社)、10μMのデキサメタソン(Sigma社)およびIGF-1 (40 ng/ml) (Sigma社)を補充したStemPro-34 SFM培地(Life Technologies社)中で2週間培養した。培養物は、約3×106細胞/mlの密度で増殖させ、分化した細胞および死滅した細胞からFicoll-Paque勾配遠心(Pharmacia社)によって精製した。
初代リンパ腫細胞は、70μmのNylon Cell Strainer (Becton Dickinson社)を使用して脾臓およびリンパ節から採取し、5％の加熱不活化ウシ胎仔血清、2 mMのグルタミンおよび1％のペニシリン-ストレプトマイシン(いずれも、Gibco-BRL社)を加えたイスコヴ(Iscove's)改変ダルベッコ(Dulbecco's)培地(IMDM)中で培養した。単細胞懸濁液を、50μMのβ-メルカプトエタノールおよび5％のrIL-7産生性J558L細胞由来の条件づけ上清を含有する培地中でさらにO/N増殖させた。
腫瘍細胞のアイデンティティは、特異的細胞表面マーカーを検出する抗体(すべて、Pharmingen社から入手)を使用するFACS分析によって決定した。すべての腫瘍細胞は、B細胞マーカーB220-low(RA3-6B2)およびCD19(1D3)に対して二重陽性であったが、T細胞マーカーCD3(145-2C11)、CD4(RM4-5)、CD8(53-6,7)または顆粒球/マクロファージマーカーGr-1(RB6-sC5)、Mac-1(M1/70)に対して、さらに、赤血球系細胞マーカー、Ter-119に対しては陰性であった。大多数のB細胞リンパ腫細胞は、CD43(S7)およびIgM(R6-60.2)に対して二重陽性であり、一方、幾つかのクローン性培養物は、CD5(53-7.3)に対して反応性を示した。これらのFACSプロフィールは、Suv39h介在腫瘍がヒトにおける慢性リンパ系白血病と類似していると特徴付けるものである(Foon and Gale, 1995)。
【００４４】
j) 染色体スプレッディングおよび核型分析
PMEFおよび腫瘍細胞の核型をコルヒチン停止、ギムザ染色中期染色体展開物（スプレッディング）について分析した。
精原細胞および精母細胞の各中期スプレッディングを、1％クエン酸ナトリウムによりRTで10分間低張膨潤させ、カルノア(Carnoy's)溶液(75％メタノール、25％酢酸)により4℃でO/N固定させた単離精細管フラグメントから調製した。精細管フラグメントを60％酢酸中で2分間インキュベートした後、単細胞懸濁液を繰返しピペット処理することにより作製し、予熱(60℃)したガラススライド上に移し、細胞をガラスホッケー型スティックによる機械的剪断により分散させた。
【００４５】
k) α-methH3-K9抗体の作製および精製
ヒストンH3リシン9位置に対するメチル特異的抗体を作製するために、ジメチル化リシン(Bachem社)および末端システィンを含有するヘキサマーペプチド、-TARK(Me)2ST-cysを作製した。抗原性および免疫原性を増大させるために、リシン残基を介してC-末端に結合している4本の-TARK(Me)2ST-‘フィンガー’からなる‘枝分れ’ペプチドも合成した。この‘枝分れ’ペプチドの配列は、[TARK(Me)2ST]4-K2-K-cysである。各ペプチドをKLHに結合させ、ウサギポリクローナル抗血清を産生させたところ、‘枝分れ’ペプチドが線状ペプチドよりもはるかに免疫原性であることを示していた。
2羽の陽性ウサギ(#2233および#2236)からの粗抗血清を‘枝分れ’しているが未修飾の対照ペプチドに対してバッチ吸収させ、次いで、PorosTMカラム(Lachner et al., 2001)に架橋させたジメチル化‘枝分れ’抗原に対するアフィニティ精製を行った。結合抗体を100 mMグリシンpH2.5で溶出させ、2M Hepes pH7.9の1/10容量で中和させた。各抗体のメチル特異性を、未修飾またはK9-ジメチル化ヒストンH3ペプチドを示すスロットブロットで、またwtまたはSuv39h dn の各PMEFからの核抽出を含有するタンパク質ブロットで確認した。アフィニティ精製α-methH3-K9抗体(濃度≒0.6 mg/ml)は、タンパク質ブロット分析において1：1,000の希釈で、或いは間接免疫蛍光法において1：1,000〜1：5,000の希釈で使用できる。
【００４６】
l) 間期クロマチンおよび中期染色体の免疫蛍光
継代第６代のPMEFを氷上で2％p-FAにより10分間固定し、洗浄し、ブロッキング溶液(PBS、2.5% BSA、10％ヤギ血清および0.1% Tweeen 20)と一緒にRTで30分間インキュベーションし、α-methH3-K9抗体により4℃でO/N染色した。0.2％のBSAと0.1％のTween 20を含有するPBSで数回洗浄した後、一次抗体をAlexa Fluor488-結合ヤギα-ウサギ抗体(Molecular Probes社)により検出した。DNAを4',6'-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI)で対向染色し、サンプルをベクタシールド(Vectashield) (Vector Laboratories社)に埋め込んだ。
中期染色体の調製においては、骨髄細胞または初代腫瘍細胞を、2.5時間のコルヒチン処理(0.5 mg/ml) (Sigma社) によって停止させ、続いて0.6％KClまたはRBS緩衝液(10 mM Tris HCl ph 7.4；10 mM NaCl；5 mM MgCl2)中で15分間、37℃にて低張膨潤、およびCytospin (Shandon社)中で2000 rpm、8分間の遠心処理をした。スプレッディングさせた細胞を、直ちにPBS中の氷冷2％p-FAで15分間固定し、2回洗浄し、α-methH3-K9抗体で上述のようにして染色した。
【００４７】
m) 精巣組織学
精巣は、成体マウスから切取り、ブアン(Bouins)液(75％飽和ピクリン酸、5％氷酢酸、9.3％ホルムアルデヒド)中で固定し、ヘマトキシリン/エオシンで染色した。精細管のステージ決定はOakberg(1956)およびRussell等(1990)に従って行った。マウス主要サテライトDNAプローブによるFISH分析を最近記載されたようにして行い(Scherthan et al., 1996)、チュネル(Tunel)アッセイをDeadEndアポトーシス検出システム(Promega社)を使用して行った。さらに、精巣凍結切片(O'Carroll et al., 2000)も、α-Scp、α-Hp1β、α-phosH3およびα-meth H3-K9の各抗体による免疫組織化学法により分析した。
【００４８】
n) 生殖細胞および減数分裂染色体展開物の免疫蛍光
精子形成細胞の染色体展開物を、若干の修正を行ったPeters等(1997a)に従って調製した。分離した精細管の機械的破壊によりDMEM培地中で単個生殖細胞懸濁液を得た。数回の洗浄および低張緩衝液(30 mM TrisHCl pH8.2、50 mMサクロース、17 mMクエン酸ナトリウム)中でのRTにて10分間の低張膨潤後に、細胞を100 mMスクロース、15 mM TrisHCl pH8.2中で再懸濁させ、予め清浄化したスライド上に展開させ、5 mMホウ酸塩pH9.2および0.15% Triton X-100を含有する1％p-FA薄膜で被覆した。各スライドを湿潤チャンバー内で約2時間ゆっくり乾燥させ、−80℃で保存した。記載されているように(Perters et al., 1997b)してオートソームおよび性染色体の形態の変化によって減数分裂のサブステージの分類を行った。
【００４９】
これら生殖細胞調製物の二重ラベル化免疫蛍光を、ウサギポリクローナルα-methH3-K9抗体およびヤギα-ウサギAlexa568-コンジュゲート二次抗体による順次インキュベーションによって行った。1%p-FA中で短時間固定化した後、各サンプルを、ウサギポリクローナルα-Scp3抗体(Lammers et al., 1995)と一緒にインキュベートし、ヤギα-ウサギAlexa488-結合二次抗体によって可視化した。さらに、α-Scp3とα-Spc1 (Offenberg et al., 1991) (図14A〜C参照)、α-Scp3とα-HP1β(Wreggett et al., 1994)、およびα-Scp3とα-phosH3 (Hendzei et al., 1997)の各抗体での同時染色も行った。
【００５０】
o) EM分析
スプレッディングした生殖細胞(上記参照)からのSC複合体の調製および銀染色をPeters等(1997a)に従って行い、各サンプルをJeol 1200 EKII透過型電子顕微鏡で分析した。
【００５１】
実施例1
植物メチルトランスフェラーゼとSETドメインとの配列類似性
SU(VAR)3-9タンパク質群のSETドメインを出発アラインメントとして使用し、6種の植物タンパク質メチルトランスフェラーゼに対する有意な配列類似性および二次構造類似性(前述の方法の項参照)を検出した。これら植物配列の幾つかは潜在的ヒストンリシンN-メチルトランスフェラーゼとして分類されているももの、1つのみは、機能的に特性決定されて、HMTアーゼ活性を欠損していることが見出されていた(Klein and Houtz 1995；Zheng et al., 1998)。
ヒトSUV39H1(Aagaard et al., 1999) (AFO19968)、マウスSuv39h1(Aagaard et al., 1999) (AFO19969)、マウスSuv39h2 (O'Carroll et al., 2000) (AF149205)、Drosophila SU(VAR)3-9 (Tschiersch et al., 1994) (P45975)、C.elegans SU(VAR)3-9様ORF C15H11.5 (CAB02737)、S.pombe CLR4 (Ivanova et al., 1988) (O74565)、ヒトEZH2 (Laible et al., 1992) (Q15910)、ヒト トリソラックス(trithorax)ホモログHRX (Tkachuk et al., 1992) (Q03164)、並びにP.sativum (rubisco Is-MT; Q43088) (Klein and Houtz, 1995；Zheng et al., 1998)およびA.thaliana (O65218)由来のMTアーゼ類からのSETドメイン配列のC-末端半分のアミノ酸および二次構造[β-シート(ｂ)またはα-ヘリックス(h)]類似性が検出された。植物MTアーゼ配列は、SETドメインの中央部においておよそ100個のアミノ酸の挿入物を含有している。
【００５２】
実施例2
トランスフェクションされた、組換えSUV39H1およびSuv39h1タンパク質のHMTアーゼ活性
ヒトSUV39H1のSETドメインが酵素活性を有するかどうかを試験するために、ヒストンをインビトロメチル化の潜在的基質として試験した。トリプルmycタグ付け全長SUV39H1 (aa3-412)を‘安定’に発現するHeLA細胞株を使用して、異所性タンパク質を、核抽出物から抗-mycビーズによる免疫沈降により富化させ(図1/1A、矢印上方パネル参照)、記載された条件(Strahl et al., 1999)に従って、S-アデノシル-[メチル-14C]-L-メチオニンからラベル化メチル基を遊離ヒストンに移行させる活性について調べた。反応生成物をSDS-PAGEにより分離し、フルオログラフィにより可視化し、メチルラベルのH3への選択的移行を表示した(図1/1、下方パネル)。対照的に、SUV39H1のN-末端1/3 (aa 3-118)のみを発現するHeLa細胞株からの抽出物またはHeLa対照細胞からの抽出物においては、シグナルは検出されなかった。HMTアーゼ活性がSUV39H1の固有の特性でありSUV39H1関連因子によっては介在されないことを確認するために、インビトロHMTアーゼ反応を、E.coliからのGST融合タンパク質として精製した組換え産生物を用いて繰り返した(図1/2B、矢印上方パネル参照)。この分析において、ヒトSUV39H1(Aagaard et al., 1999)と95％同一であるマウスSuv39hを使用した。aa 82-412を含む精製GST生成物はHMTアーゼ活性を維持して(但し、移入SUV39H1に比較し低レベルで)いたが、aa 7-221を含む精製GST生成物は高タンパク質濃度においてさえも陰性を示していた(図1/2B、下方パネル)。これらの結果は、HMTアーゼ活性がC-末端SETドメイン中に存在することを示唆している。
図1Aにおいては、トリプルmycタグ付け全長ヒトSUV39H1 (aa 3-412)またはC-末端端切取りSUV39H1タンパク質 (aa 3-118)を、‘安定’的にトランスフェクションしたHeLa細胞から抗-myc抗体ビーズにより免疫沈降させ、基質としての遊離ヒストンおよびメチルドナーとしてのS-アデノシル-[メチル-14C]-L-メチオニンとのインビトロHMTアーゼ反応において使用した。クーマシー染色(上方パネル)は、精製タンパク質(矢印)と遊離ヒストン(ドット)を示している。フルオログラフィ(下方パネル、図1A)は、(myc)3-SUV1 (3-412)のHMTアーゼ活性を示している。
図1Bに示す実験においては、マウスSuv39hの種々のドメインをコードする組換えGST融合タンパク質を、上述のようにインビトロHMTアーゼ反応におけるタンパク質濃度を増大させるのに使用した。
【００５３】
実施例3
a) ヒトSUV39H1のSETドメイン中の触媒性モチーフの定義
組換えマウスGST-Suv39h1(82-412)産生物と同様に、相応するヒトSUV39H1融合タンパク質[GST-SUV39H1(82-412)]は、触媒的に活性である(図2参照)。短い内部欠失(ΔNHSCDPN323-329；ΔNHSCおよびΔGEELTFDY358-365；ΔGEEL)をGST-SUV39H11(82-412)中のSETドメインコアの2つの保存領域中に導入し、さらに、C-末端尾部欠失(ΔC-尾部)およびSET関連システィンリッチ領域欠失(Δcys)変異体も作製した。すべての変異体タンパク質は、HMTアーゼ活性を示すことができなかった(図2/1A参照)。SETドメインの酵素機能をさらに詳細に試験するために、点変異を最も高度に保存されたモチーフ中に導入した。インビトロHMTアーゼアッセイは、すべての点変異が、1例を除いて、酵素活性を消失していることを示した。驚くべきことに、後者の変異(H320R)は、およそ20倍の増大活性を有する高活性酵素を生じていた。得られたデータは、重要な触媒部位としてSET中に320HφφNHSC326モチーフを明らかにしている。
【００５４】
b) 哺乳動物SU(VAR)3-9関連タンパク質のSETドメインの特異的HMTアーゼ活性
SETドメインはクロマチンレギュレーター中の最も保存されたタンパク質モチーフの1つであるので(Stassen et al., 1995；Jenuwein et al., 1998)、次に、SU(VAR)3-9群メンバーまたは他のSETドメインタンパク質がHMTアーゼ活性を含有するかどうかを分析した。GST-SUV39H1(82-412)に相応する、S.pombe CLR4 (Ivanova et al., 1998)、ヒトEZH2 (Laible et al., 1997)およびヒトHRX (Tkachuk et al., 1992)の延長SETドメインのGST融合生成物を作製した(図2/2B参照)。興味あることに、GST-CLR4 (127-490)は、組換えSUV39H1生成物と比較して3倍〜5倍の増大レベル(図2/2C参照)で明白なHMTアーゼ活性を示し、高活性位置にアルギニンを担持するCLR4と一致していた。対照的に、GST-EZH2382-747)およびGST-HRX(3643-3966)の双方は、遊離ヒストンに対する検出し得るHMTアーゼ活性を有してなく(図2/2C)、また、最近単離されたマウスSuv39h2遺伝子(O'Carroll et al., 2000)から作製した匹敵するGST生成物、即ち、GST-Suv39h2(157-477)は、GST-SUV39H1(82-412)同様に活性であった。EZH2はC-末端システィンを欠いており、HRXはSET関連システィンリッチ領域を含有していない(図2B参照)。これらのシスティンドメインは、両方とも、CLR4、Suv39h2およびSUV39H1中に存在する。SUV39H1の変異分析と一致して、遊離ヒストンに対するHMTアーゼ活性はSETドメインと隣接のシスティンリッチ領域との組合せを必要とし、限られた数のSETドメイン含有タンパク質においてしか見出せない性質であるようである。
【００５５】
図2Aにおいては、およそ10μgのGST-SUV1(82-412)をコード化する融合タンパク質(＝ヒトSUV39H1)および７種のSETドメイン変異体を使用して、図1において概略するような遊離ヒストンとのインビトロHMTアーゼ反応において使用した。高活性H320R変異体においては、相応する融合産生物の僅か1μg(10％)を使用した。図2は、CLR4、Suv39h2、SUV39H1、EZH2およびHRXタンパク質のドメイン構造体を示すダイアグラムであり、矢印によりN-末端融合とGSTを区別している。システィンリッチ領域は、灰色点描により示している。
図2Cにおいては、S.pombe CLR4[GST-CLR4(127-490)]、マウスSuv39h2[GST-Suv2(157-477)]、ヒトEZH2[GST-EZH2(382-747)]、ヒトHRX [GST-HRX(3643-3969)]およびヒトSUV39H1[GST-SUV1(82-402)]をコードする各融合タンパク質のおよそ10μgを、図1において概略するような遊離ヒストンとのインビトロHMTアーゼ反応において使用した。
【００５６】
実施例4
H3 N-末端のリシン9は、組換えSuv39h1によるインビトロメチル化における主要部位である
上記の各実施例において、哺乳動物SU(VAR)3-9関連タンパク質のHMTアーゼ活性が選択されたアッセイ条件においてH3に対して選択性であることを示した。この知見をさらに詳細に試験するために、インビトロメチル化反応を、個々のヒストン類に対して、酵素としてGST-Suv39h1(82-412)を使用して実施した。図3/1Aに示すように、H3はGST-Suv39h1(82-412)により特異的にメチル化されており、一方、H2A、H2BまたはH4においては、シグナルは検出されなかった。H1を単独基質として使用した場合には、弱いシグナルが存在する；H1メチル化の意義は決定されていない。H3メチル化が広範囲の生物体においてはリシン4で、またHeLa細胞においてはリシン9において主として起ることは示されているが、関与するHMTアーゼ類はこれから定義されるべきものである(Strahl et al., 1999)。Suv39h1の部位利用プロフィールを検証するために、野生型H3 N-末端(aa 1-20)およびリシン9をロイシンに変えている変異体K9Lペプチドを含む各未修飾ペプチドを基質として試験した。さらに、インシュリン、およびCENP-A (Sullivan et al., 1994)およびmacroH2A (Pehrson and Fried, 1992)のN-末端を含む各ペプチドも含ませた。各ペプチドをGST-Suv39h1(82-412)でインビトロメチル化し、反応生成物を高濃度SDS-PAGEで分離し、フルオログラフィにより可視化した。これらのインビトロアッセイにより、野生型H3ペプチドの選択的メチル化が明らかになったが、CENP-AもしくはmacroH2Aペプチド、またはインシュリンにおいては、シグナルは検出されなかった(図3/2B参照)。重要なことは、変異H3(K9L)ペプチドは基質ではなく、H3 N-末端のリシン9がSuv39h1依存性HMTアーゼ活性における好ましい残基であるということである。
【００５７】
この部位選択性をより明確に決定するために、野生型H3 N-末端ペプチドを、S-アデノシル-[メチル-3H]-L-メチオニンを使用して、GST-Suv39h1(82-412)によりインビトロメチル化した。逆相HPLCにより精製したこのラベル化ペプチドを、その後、直接マイクロシークエンシングし、各個々のアミノ酸と関連した3H取込みをシンチレーション計数によって分析した。その結果、メチルラベルのリシン9への選択的移行を確認し(図3/2C参照)、Suv39h1がインビトロH3 N-末端における高度に部位特異的なHMTアーゼであることが示唆された。
図3Aにおいては、およそ10μgのマウスGST-Suv39h1(82-412)を、図1において概略しているようにして、個々のヒストン類とのインビトロHMTアーゼ反応において使用した。
図3Bは、酵素としてGST-Suv39h1(82-412)を、基質として野生型H3、変異H3(K9L)、CENP-A、macroH2Aの上記各N-末端ペプチド、またはインシュリンを使用したインビトロメチル化アッセイの結果を示している。
図3Cは、組換えGST-Suv39h1(82-412)によりインビトロメチル化されている野生型H3 N-末端ペプチド(aa 1-20)の自動化シークエンシングの結果を示す。連続する各回のマイクロシークエンシングにおいて、同定した個々のアミノ酸の3H取込みが示されている。
【００５８】
実施例5
マウス生殖系におけるSuv39h1およびSuv39h2遺伝子座のターゲッティング
マウスSuv39h遺伝子は2つの遺伝子座、Suv39h1およびSuv39h2によってコードされている(O'Carroll et al.,2000)。Suv39h機能およびSuv39h依存性H3-K9メチル化のインビボにおける意義を検証するために、Suv39h1およびSuv39h2の双方を欠損するマウス系統を標準方法に従って産生させた。ターゲッティング戦略、および、Suv39h1およびSuv39h2の双方に対するヌル対立遺伝子の作製を図4に示す。どちらの遺伝子変異も、両方の遺伝子座間の機能的重複性の結果として生命力のある多産性マウスを生じた。従って、Suv39h1欠損系統とSuv39h2欠損系統とを交配させてSuv39h二重ヌルマウスを作製した。Suv39h二重ヌルマウスは、メンデル比以下で生まれ(後の実施例8B参照)、予期していたSuv39h二重変異体のおよそ30％のみしか観察しなかった。図4は、X-連鎖Suv39h1座を不活化するのに使用した通常のターゲッティング戦略を示す、図4Bは、野生型およびSuv39h1ヌルマウスからの脾臓(Sp)、肝臓(Li)、腎臓(kidney)および脳(Br)由来のSuv39h1のノーザンブロット分析を示す。図4Cは、常染色体Suv39h2座を不活化するのに使用した通常のターゲッティング戦略を示す。下方パネルは、野生型およびSuv39h2ヌル精巣由来のタンパク質抽出物についてのα-Suv39h2抗体によるウェスタンブロット分析である。
【００５９】
実施例6
Suv39h二重ヌル初代マウス繊維芽細胞(PMEF)における異常有糸分裂
Suv39h二重ヌルマウスにおける胚表現型が有糸分裂欠陥によるものであるかどうかを決定するために、Suv39h二重マウス由来のPMEFを分析した。野性タイプおよびSuv39h二重ヌルの各PMEFの細胞周期プロフィールはS-およびG2/M-期においてむしろ類似の細胞数割合を示したが(図5A参照)、Suv39h二重ヌルPMEFは、G1係数の低下と異常核形態を有する細胞割合の増大を示し、有糸分裂中の分裂欠陥を暗示していた。例えば、Suv39h二重ヌルPMEFは、およそ2倍上昇した数の微小核および多核を有する細胞数を含み、更に、過大核を含む部分集団および僅かな異常に凝集したいくつかの部位のみに現れる弱いへテロクロマチン像によって特徴づけられる(図5B参照)。さらにまた、Suv39h二重ヌル細胞は、ゲノム不安定性も示し容易に異数性になる(後の実施例9も参照されたい)。これら異数性の重度は、継代数が多いほど増大する(図6参照)。Suv39h二重ヌル細胞が安定な核型を維持する能力がないことが、Suv39h胚表現型の根底にあるのかも知れない。
図5Aは、野生型およびSuv39h二重ヌルPMEFの種々の細胞周期段階における細胞数パーセンテージを示す。
図5Bは、α-チューブリン(図示せず)およびDAPI染色によって検出したSuv39h二重ヌルPMEFにおける異常有糸分裂の代表的な像(左および中央)を示す。また、Suv39h二重ヌルPMEFの部分集団におけるへテロクロマチンの異常な像を例示した核も示す(右側像)。像は、すべて630×の倍率で撮影した。
図6Aは、継代第3代での野生型およびSuv39h二重ヌルPMEFのDNA含量プロフィールを示す。図6Bは、継代第8代での野生型およびSuv39h二重ヌルPMEFのDNA含量プロフィールを示す。
【００６０】
実施例7
Suv39h二重ヌルPMEFにおけるphosＨ３リン酸化の増大
H3のN-末端尾部中のセリン10におけるリン酸化(phosH3)は、染色体の凝縮およびその後の分離において必要であることが示されている(Wei et al., 1999)。細胞周期中に、phosH3はG2後期の挟動原体へテロクロマチン内で始まり、次いで、有糸分裂中の染色体全体に沿って進行する(Hendzel et al., 1997)。野生型のPMEFにおいては、α-phosH3抗体による間接免疫蛍光によって検出した場合、およそ7％の細胞が特徴的なへテロクロマチン関連phosH3像について陽性である(図7A、右側パネル参照)。対照的に、この数は、Suv39h二重ヌルPMEFにおいては約3倍に増大し、およそ22％の細胞数がphosH3陽性像を有するが(図7A、左側パネル)、その像はDAPI-高密度物質と必ずしも重ならない多くの小斑点において現れる。この結果は、phosH3の全体的レベルがSuv39h二重ヌルPMEFにおいて増強され得ることを示唆していた。従って、予備較正した核抽出物中の相対的なphosH3の多さを、α- phosH3特異的抗体を用いて決定した。この定量は、野生型対照と比較したとき、Suv39h二重ヌル細胞において有意に高レベルのphosH3を示していた(図7B参照)。同時に、得られたデータは、H3中のリシン9のSuv39h介在メチル化がセリン10のリン酸化を負に調節するモデルと最も良く一致している。
図7Aは、αphosH3抗体およびCY3-結合二次抗体による間期クロマチン染色を示す。DNAは、DAPIで対向染色した。少なくとも1,000個の細胞を計数し、αphosH3陽性細胞の割合(図示している)を評価した。図7Bは、α-H3抗体およびα-phosH3抗体でイムノブロットした15μgおよび30μgの総核タンパク質による定量的ウェスタンブロット分析を示している。
【００６１】
実施例8
a) Suv39h二重欠損マウスの作製
マウスSuv39h HMTアーゼは、X染色体(Suv39h1)または第２染色体(Suv39h2) (O'Carroll et al., 2000)中のセントロメア近接位置にマッピングされる2つの遺伝子座によってコードされる。両遺伝子座を、進化的に保存されたクロモドメインの1部をバクテリアLacZ遺伝子およびRSV-ネオマイシン選抜カセットで置換える通常のターゲッティング方法を使用して胚性幹(ES)細胞において相同性組換えによって独立に破壊した(図9a)。これらのターゲッティング戦略により、Suv39h1の最初の40個アミノ酸またはSuv39h2の最初の113個アミノ酸のlacZとの、β-ガラクトシダーゼ活性を維持したフレーム内融合タンパク質を作製した。ターゲッティングに成功したES細胞クローンを使用して、生殖系を介して変異Suv39h1またはSuv39h2対立遺伝子を伝達するキメラマウスを産生させた(図9b)。α-Suv39h1およびα-Suv39h2特異的抗体(Aagaard et al., 1999；O'Carroll et al., 2000)による野生型、Suv39h1-またはSuv39h2-欠損マウスからの精巣核抽出物のタンパク質ブロット分析は、上記それぞれのタンパク質の不存在を示しており、両遺伝子について機能喪失対立遺伝子が生成されたことを示唆していた(図9c)。
【００６２】
b) Suv39h二重ヌルマウスの生存力損傷
Suv39h1またはSuv39h2のいずれかを欠損するマウスは、正常な生存力と生殖性を示し、明白な表現型を示さず、両遺伝子がマウス発育中に機能的に重複性であり得ることを示唆している(O'Carroll et al., 2000)。従って、Suv39h1-/-およびSuv39h2-/-マウスを交配させて複合Suv39h変異体を作製し、次いでこれを使用してSuv39h二重ヌル(dn)マウスを得た。異なる何回かの交配(表1)から得られたSuv39h dnマウスメンデル比以下でしか生まれず、成長遅延があり(図9d)、雄における生殖腺機能低下に特徴を有する。例えば、総計197匹のマウスから、46匹が二重ヌルであることを予想したが(表1)、15匹のSuv39h dnマウス(約33％)しか生まれなかった。マウス胚形成の分析によって、E12.5日まではSuv39h dn胎仔の正常な発育が示されたが、後期段階においては、Suv39h dn胎仔は、小さくて、吸収および胎仔期致死率の増大を示している。これらの結果は、Suv39h遺伝子は正常な生存力において必要であり、また出生前および出生後の発育において必要であることを示唆している。
【００６３】
図9は、次のようなSuv39h1-およびSuv39h2-欠損マウスのターゲッティングおよび遺伝子型決定を示している：(A)Suv39h1およびSuv39h2のゲノム座、組換えベクターおよびターゲットされた対立遺伝子の図式的表示。エクソンは黒ボックスで示し、数はそれぞれのエクソンの出発アミノ酸位置を示す(O'Carroll et al., 2000)。また、サザンブロット分析において使用した診断制限部位および外部プローブも表示している。pAは、ポリアデニル化シグナルを示す。(B)は、Suv39h1+/-またはSuv39h2+/-異型接合交配の子孫から単離したDNAのPvuIIまたはHindIII消化物のサザンブロット分析。(C)野生型(wt)、Suv39h1-/- (Suv1-/-)およびSuv39h2-/-(Suv2-/-)マウスからの精巣核抽出物のα-Suv39h1抗体およびα-Suv39h2抗体によるタンパク質ブロット分析。(D)Suv39h二重ヌル(dn)マウスは、出生時および成長中に成長遅延が起こる。
【００６４】
実施例9
Suv39h dn胚性繊維芽細胞内での染色体誤分離
Suv39h依存性欠陥をより詳細に試験するために、初代マウス胚性繊維芽細胞(PMEF)をE12.5日の胎仔から得た。最初の20継代に亘っての3T3プロトコールにおける野生型(wt)とSuv39h dnとの各PMEFの比較増殖曲線は、Suv39h dn PMEFの方が継代12までは速い倍化速度を有すること示した(図10a)。その後の継代では、Suv39h dn PMEFは、特徴的ハイフリック(Hayflick)急変期を生き延びる不死化wt PMEFよりも僅かに低下した増殖能を有しているようである。最近(実施例6参照)、Suv39h dn PMEFが、有糸分裂の損傷および染色体誤分離を暗示する巨大核または多核のような異常核形態を有する有意の細胞画分を含有することが示された(Rea et al., 2000)。従って、継代第3代および継代第8代のwtおよびSuv39h dnの各PMEFのDNA含量をFACSによって分析した。wt PMEFが継代第3代でゲノム的に安定であるようであるのに対し、Suv39h dn PMEFは、FACSプロフィールにおける異数体ショルダーによって示されているように、4Nよりも大きいDNA含量の細胞を既に含んでいる(図10B、上方パネル)。継代第8第においては、wt PMEFは大きく老化している。対照的に、Suv39h dn PMEFは増殖し続けているが、多くの細胞は8倍体DNA含量を示している(図10B、下方パネル)。
【００６５】
これらのゲノム不安定性をさらに特性決定するために、継代第8代のPMEFの核型分析を行った(図10C)。とりわけ、2つの独立なwt PMEFおよび２つのSuv39h dn PMEF培養物の各々において45種の核型を調べた。図10Dにおいて示すように、wt核型の主要画分は非2倍体であり、染色体数は25〜82の範囲にある。異数体は、Suv39h dn核型において有意に増大し、38〜162の染色体数を含んでいた。注目に値するに、wt PMEFがランダム整列の異数体核型を含有しているのに対し、Suv39h dn PMEFは、主として低-(hypo)4倍体または低-8倍体である。Suv39h dn PMEF中の染色体は正常な形態を有しているようであり、ロバートソン融合は観察されなかった。Suv39h機能が存在しないことはゲノム不安定性を誘導するが、これは主として完全な染色体セットの分離を損傷させることによるものであると結論づけた。
図10は、次のようなSuv39h dn PMEFにおける染色体不安定性を示している：(A)最初の20継代に亘っての3T3プロトコールにおいて測定したwtおよびSuv39h dnの各PMEFの相対的倍化速度。(B)継代3および継代8でのwtおよびSuv39h dnの各PMEF大量培養物のDNA含量。(C)wtにおける染色体の2倍体数(n=40)およびSuv39h dn PMEFにおける染色体の高(hyper)-4倍体数(n=82)を示す中期染色体展開物。(D)継代第8代における2種のwtおよび2種のSuv39h dnの各PMEF培養物による統計的核型分析。各培養物において、45の中期染色体を評価した。
【００６６】
実施例10
Suv39h変異体マウスにおけるB細胞リンパ腫の発症
次に、Suv39h変異体マウスを腫瘍形成の発生率について分析した。大多数のSuv39h dnマウスは生存できないので、Suv39h1またはSuv39h2のいずれかにおけるその遺伝子含量の異なる別々のSuv39h遺伝子型を試験した。例えば、X連鎖Suv39h1遺伝子のランダムX不活化は、殆どの成熟組織において有意に下方調節されるSuv39h2(O'Carroll et al., 2000)の機能的コピーの存在下においてさえも、Suv39h1+/-マウスにおいては腫瘍リスクを増大させ得ることが予期された。事実、Suv39h1遺伝子座に対して異型接合性(het)またはヌルのいずれかである98匹のマウスの検査において、9〜15ヶ月齢での発症による約28％の腫瘍形成浸透度が示された(表2)。これらの腫瘍は、FACSプロファイリングによれば(材料および方法の項参照)、主としてヒトの遅進行性非ホジキンリンパ腫(Foon and Gale, 1995)に類似したB細胞リンパ腫(図11A)である。後期発症B細胞リンパ腫における腫瘍発症率は、少ない生存性Suv39h dnマウス(n=6)において約33％であった。対照的に、Suv39h2+/-またはSuv39h2-/-マウスは、僅かに5％以下の浸透率(n=21)でしかB細胞リンパ腫を発症せず、対照野生型マウスにおいては腫瘍形成は観察されなかった。
【００６７】
初代培養物をSuv39h dnおよびSuv39h1-/-、Suv39h2+/-(null1/het2)腫瘍マウスのリンパ節から得て、B細胞リンパ腫の核型を分析した。Suv39h dn PMEF大量培養物における上述の異数体と一致してこれらの腫瘍細胞は、主として高-2倍体であるが、若干の高-4倍体核型も含んでいた(図11B)。驚くべきことに、幾つかの独立なB細胞リンパ腫において検査したSuv39h dn腫瘍核型の一部は、その末端動原体領域を介して結合したままの非分離染色体に特徴を有している(図11C)。これらの‘バタフライ’型染色体は、Suv39h HMTアーゼ活性の不存在が、中期染色体間のより持続性の相互作用を増大させることによって挟動原体へテロクロマチンの品質と機能を損傷したかもしれないという興味深い可能性を生じている。事実、新たに開発された抗体(後の実施例11参照)によるH3-K9メチル化の分析において、Suv39h null1/het2 B細胞リンパ腫細胞由来の腫瘍染色体の挟動原体へテロクロマチンでのmethH3-K9染色の不存在が示されている。
図11は、次のようなSuv39h変異体マウスにおけるB細胞リンパ腫の発症を示している：(A)11ヶ月齢Suv39h dnマウスと野生型対照マウスの脾臓およびリンパ節。(B)腫瘍担持Suv39h dn (null1/null2)およびSuv39h1-/-、Suv39h+/- (null1/het2)の各マウスのリンパ節由来の4つの個々の初代培養物の核型分析。(C)末端動原体領域を介して会合したままの‘バタフライ’型染色体を示す初代Suv39h dn B細胞リンパ腫細胞由来の中期染色体展開物。
【００６８】
実施例11
Suv39h dnへテロクロマチンでのH3-K9メチル化の不存在
上述のPMEFおよび腫瘍細胞についての核型分析は、染色体組全体の分離が挾動原体クロマチン組織化におけるSuv39h依存性欠陥によって損傷されるかもしれないという一般的メカニズムを示唆していた。ヒストンメチル化およびへテロクロマチン形成におけるSuv39h HMTアーゼ類の役割を直接評価するために、リシン9においてジメチル化したときのヒストンH3(α-methH3-K9)を特異的に認識するウサギポリクローナル抗血清を産生させた。図12Aにおいて示すように、この抗血清は、DAPIリッチへテロクロマチンと有意に重なるwt PMEFにおける焦点状染色物を検出する。単一Suv39h1-またはSuv39h2-欠損マウス由来のPMEFにおいては、約75％の細胞がこれらのαmethH3-K9抗体によってへテロクロマチン部に対して陽性に染色される。重要なことに、methH3-K9に対するへテロクロマチン染色は、Suv39h dn PMEFにおいては消失した(図12A、右側列)。
【００６９】
骨髄細胞からの減数分裂染色体展開物も上記α-methH3-K9抗血清によって分析した。wt展開物においては、挟動原体へテロクロマチンは選択的に可視化され(図12Bの挿入図参照)、一方、Suv39h dn展開物においては残留染色のみが検出された。即ち、活性セントロメアでのSUV39H1の局在化(Aagaard et al., 2000)に一致して、これらのデータは、両Suv39h酵素が体細胞の挟動原体へテロクロマチンにおけるH3-K9をメチル化する主要HMTアーゼであることを示唆している。さらにまた、これらの結果は、α-methH3-K9抗体をへテロクロマチンに対する新規な細胞学的マーカーとして特徴づけしており、また、MATおよびCEN領域でのH3-K9メチル化の富化が機能的CIr4酵素に依存性であることを示している最近のS.pombe研究(Nakayama et al., 2001)を確証するものである。
図12は、次のような挟動原体へテロクロマチンにおけるSuv39h依存性H3-K9メチル化を示している：(A)野生型(wt)、Suv39h1-/-、Suv39h2-/-およびSuv39h dnの各PMEFの間期クロマチンのDAPIおよびmethH3-K9染色。パーセントは、へテロクロマチン座でのH3-K9メチル化を示す間期核を示す。(B)インビトロ培養したwtおよびSuv39h dnの各骨髄細胞から調製した有糸分裂期染色体のDAPIおよびmethH3-K9染色。
【００７０】
実施例12
a) Suv39h dnマウスにおける生殖腺機能低下および完全精子形成欠陥
Suv39h遺伝子の発現パターンは、精子形成中の重要な役割を示唆している(O'Carroll et al., 2000)。事実、Suv39h dn雄(n=7)は不稔であって、成熟精子を含有せず、その精巣重量はwt雄の精巣重量と比較して3〜10倍低下している(図13A)。その精子形成欠陥をさらに詳細に試験するために、組織学的切開を実施し、有糸分裂増殖性精原細胞(Sg)から減数分裂精母細胞(Sc)および減数分裂後半数性精子細胞(St)への特徴的分化を示すwt精巣においては、正常に発育した精細管が明らかにされた(図13A)。対照的に、Suv39h dnマウスにおいては、精子形成は重度に損なわれ、早期から後期精母細胞への移行期における明白な分化停止を伴い、高度に液胞化した精細管を生じていた(図13A)。
マウス主要サテライトDNAプローブによるFISH分析およびTUNELアッセイを使用してSuv39h依存性精子形成欠陥をさらに解析した。精原細胞の有糸分裂増殖は正常のようであったが、前レプトテン期精母細胞割合の3〜10倍の増大が観察された。これらの前レプトテン期精母細胞は、多くの場合、肥大していた。これらの結果は、減数分裂前期への進行がSuv39h機能の不存在においては遅れていることを示唆している。この遅れにもかかわらず、減数分裂前期を経て中期パキテン期までの進行は正常のようであった。しかしながら、中期〜後期パキテン期においては、殆どの精母細胞がアポトーシスを受けており、後期パキテン期精母細胞を大きく欠如し且つ半数性精子細胞を含有しないステージV-VI細管を生じていた(図13A参照)。Suv39h遺伝子機能の不存在は、減数分裂前期への進行遅延を誘導し、中期〜後期パキテン段階中に精母細胞の明白なアポトーシスを触発すると結論付けた。
【００７１】
b) 減数分裂へテロクロマチンにおけるH3-K9メチル化
Suv39h依存性精子形成欠陥が減数分裂へテロクロマチンの明確な損傷と相関し得たかどうかを試験するために、精巣展開調製物および凍結切片をα-methH3-K9抗体によって分析した。wt調製物においては、α-methH3-K9抗体は、精原細胞(B-Sg)中および前レプトテン期精母細胞(preL-Sc)中のへテロクロマチン像を装飾する(図13B、左側像、上方パネル)。減数分裂前期の初期(Zyg-Sc)および初期パキテン期においては、α-methH3-K9抗体染色は、へテロクロマチンについて排他的ではなく、真正クロマチンにも及んでいた。中期パキテン期からディプロテン期までおよび移動期においては、α-methH3-K9抗体染色は、1つのへテロクロマチンブロックに凝縮して精子細胞を細長くするへテロクロマチンクラスターに限られていた(図13B、上方パネル)。細長精子細胞および成熟精子(ヒストン類がプロタミン類に置換わっている)におけるmethH3-K9シグナルは検出されなかった。この染色パターンの信頼性は、対合複合体(Offenberg et al., 1991；Lammers et al., 1995)、HP1β(Motzkus et al., 1999)およびphosH3(Cobb et al., 1999)を認識する各抗体による共局在化分析において確認されている。このように、PMEFにおける上記で示した体染色から類推して、これらの結果は、分化中の雄性生殖細胞おける減数分裂へテロクロマチンに関する特異性マーカーでもあることを示している。
【００７２】
c) Suv39h dn精原細胞における損傷されたH3-K9メチル化および異数体
Suv39h dn精巣展開物からの調製物において、H3-K9メチル化は、精原細胞および前レプトテン期精母細胞においては存在しなかった(図13B、左側像、下方パネル)。さらに、減数分裂前期開始時の初期精母細胞(Zyg-Sc)を特徴づける明白な真正ロマチン染色は観察されなかった。H3-K9メチル化の損傷は、Suv39h dn精原細胞の約60％におけるphosＨ３の散在的な分布を伴っていた。対照的に、HP1βは、wtおよびSuv39h dn精原細胞の双方において広範囲に検出されなかった。
驚くべきことに、中期パキテン期から先において、挟動原体へテロクロマチンにおけるmethH3-K9に対する野生型染色が観察された(図13B、下方パネル)。常染色体でのHP1β局在化およびphosH3シグナルがSuv39h dn後期精母細胞において正常に起きていた。即ち、これらの結果は、Suv39h HMTアーゼが精原細胞中および減数分裂前期の極めて初期の段階においてH3-K9メチル化を選択的に調節することを示唆している。PMEFによる分析(前述参照)と同様に、4倍体精母細胞の出現をもたらすSuv39h dn精原細胞中での染色体対誤分離が約5倍増大することが観察された(図14C参照)。要するに、これらのデータは、Suv39h HMTアーゼの早期およびステージ特異性減数分裂役割を明らかにしえおり、さらに、減数分裂前期、移動期中および精子細胞においてへテロクロマチンをメチル化し得る新規なH3-K9 HMTアーゼ類が存在することを示唆している。
【００７３】
図13は、次のようなSuv39h dnマウスの生殖細胞における精子形成欠陥およびH3-K9メチル化を示している：(A)約5ヶ月齢での野生型およびSuv39h dnの各精巣の全体的サイズおよび組織学。Suv39h dn精巣切片は、精母細胞(Sc)および精子細胞(St)を欠いた多くの精細管を明らかにしている。とりわけ、少数の精細管(1)が接合期精母細胞(Zyg-Sc)を含むものの、より進行した分化段階(2)は、パキテン期においてアポトーシス精母細胞(矢印)を示している。後期分化段階(3)においてさえも、パキテン期精母細胞は、殆ど完全に存在しない。いくつかの細管(4)はセルトリ(Sertoli)細胞(SeC)のみを含んでいる。
略号：中間体(In-Sc)およびBタイプ精原細胞(B-Sg)；前レプテン期(PreL-Sc)、接合期(Zyg-Sc)、中期パキテン期(mPach-Sc)、後期パキテン期（lPach-Sc）、ディプロテン期(Diplo-Sc)、および移動期/M-I(M-I-Sc)の精母細胞；丸型(rSt)、細長化中(elSt)および細長化(eSt)精子細胞；セルトリ細胞(SeC)。
【００７４】
(B) wt(上方パネル)およびSuv39h dn(下方パネル)の各生殖細胞のα-methH3-K9抗体(ピンク)およびα-Scp3抗体(グリーン)による二重標識化免疫蛍光。DNAは、DAPI(ブルー)により対向染色した。Suv39h dn生殖細胞においては、H3-K9メチル化は、増殖中の精原細胞(B-Sg)および前レプトテン期精母細胞(PreL-Sc)中では存在せず、サイゴテン期精母細胞(Zyg-Sc)中で高度に低下しており、僅かな残留シグナルが挟動原体へテロクロマチン(矢尻)において検出された。後期段階においては、H3-K9メチル化は野生型染色において出現しているが(上方パネルと下方パネルを比較されたい)、Suv39h dn性染色体(矢印)は、ディプロテン期および移動期においてより強力に標識化されたまま残っている。二重矢印は、擬似常染色体領域(PAR)を示す。
【００７５】
実施例13
a) Suv39h dn精母細胞における非相同性相互作用および対合遅延
精原細胞および初期精母細胞における挟動原体H3-K9メチル化が存在しないことは、初期整列および減数分裂染色体のクラスター化において必要であろう高次構造の形成におけるSuv39h HMTアーゼの役割に対して示唆的である。従って、染色体対合を、対合複合体(SC)の軸/側面および中心要素に対して特異性である抗体を用いてパキテン期展開物の免疫蛍光によって分析した(図14A、B)。興味あることに、約15％(n=90)のSuv39h dn精母細胞において、常染色体間の非相同性相互作用が観察された(図14J)。非相同性相互作用は、性染色体と常染色体間(X/Y-A)においてはずっと頻繁(約35％)であった。興味あることに、これらの非正規会合は、非相同染色体の末端動原体の末端間(cen-cen)で支配的に起こり、それより少ない度合でセントロメアとテロメア間(cen-tel)で起こり、テロメア間(tel-tel)では極めてまれにしか生じていなかった(図14J)。さらに、Suv39h dn精母細胞は、対合が遅延した未対合の性染色体(下記参照)および２価常染色体を含んでいた。常染色体の対合遅延(A-del)は、殆ど不変的に非相同会合における系合と相関しており（(図14A)、両プロセスが機能的に関連していることを示唆している。
上記の非正規会合を、透過型電子顕微鏡分析によってさらに確認した(図14D〜G)。これらの超微細構造分析によって、非相同染色体末端間の物理的連絡および染色体橋様構造の存在(図14Ｄ、C、Fにおける二重矢印)が明らかになった。パートナー交換(図14Ｇ)および非相同整列という事象も観察された。これらの異常染色体相互作用は、wt精母細胞からのEM調製物においては検出されなかった。
【００７６】
b) Suv39h dn精母細胞における減数分裂Iにおける二価染色体誤分離
有糸分裂前期の初期においてmethH3-K9が存在しないことが染色体動力学および減数分裂中の分離に影響し得るかどうかを試験するために、次に、精巣展開調製物を移動期/間期I (M-I)および間期II (M-II)細胞について分析した。移動期/M-Iにおいては、殆どのSuv39h dn精母細胞において、wt様形態を有する二価染色体が明らかとなり、染色体凝縮とキアズマ形成は撹乱されていないことが示された(但し、以下の図15B〜D参照)。しかしながら、M-IIにおいては、約14％の二次精母細胞は、4倍体であり、最初の減数分裂の際に全ての二価染色体が分離に失敗したことを示していた(図14Iおよび14K)。従って、挟動原体へテロクロマチンにおけるSuv39h誘発欠損は、最初の減数分裂全体に亘って持続し、中期〜後期減数分裂前期中に生ずるさらなるH3-K9メチル化によっては‘救済’されないようである(図13B参照)。
図14は、次のようなSuv39h dn減数分裂染色体の非正規会合と対合遅延を示す：(A〜C)対合複合体(SC)軸/側面要素に特異的な抗体αScp3(グリーン)および中心要素に特異的な抗体α-Scp1(レッド)を用いたSuv39h dnパキテン期精母細胞の二重標識免疫蛍光。この共標識化により、未対合染色体は緑色様染色として明らかにされ、対合染色体がオレンジ-赤色として明らかにされる。DNAは、より強烈なブルーコントラストで挟動原体へテロクロマチンを照らし出すDAPI(ブルー)によって対向染色した。(A)非相同常染色体(A)間および常染色体と性染色体(X、Y)間のマルチ非正規会合(矢尻)を示す2個の中期パキテン期精母細胞(mPach-Sc)。幾つかの常染色体も対合が遅れている(Adel)。(B)挟動原体領域(矢尻)を介した非相同相互作用において系合されている2個の常染色体を含む後期パキテン期精母細胞(IPach-Sc)。さらに性染色体が対合に失敗した。(C)Suv39h dn精原細胞の先行減数分裂における全染色体対誤分離から生ずる4倍体精母細胞。
【００７７】
(D〜G)非相同染色体会合が挟動原体へテロクロマチン(より粒子性の銀染色によって可視化されている。矢尻および二重矢印)を介して主として生ずることを確認する、Suv39h dnパキテン期染色体の透過型電子顕微鏡分析。パネルGにおいて示した染色体は、パートナー交換の複数系合を示している。
(H、I) wtおよびSuv39h dn二次精母細胞のギムザ染色中期II染色体。Suv39h dn細胞の先行減数分裂Iにおける完全誤分離を例示したものである。
(J) wt (n=80)およびSuv39h dn (n=90)の各パキテン期精母細胞における非相同染色体会合と対合遅延の頻度のヒストグラム。(K) wt (n=40)およびSuv39h dn (n=30)二次精母細胞における二価染色体の減数分裂I誤分離の頻度についてのヒストグラム。
【００７８】
実施例14
Suv39h欠損は性染色体分離に干渉する
オス哺乳動物における精子形成は、性ベシクルまたはXY体として知られている独特のクロマチン領域を形成する異形性染色体の存在によって特化される(Solari, 1974)。さらにまた、Y染色体は、マウスにおいて最もへテロクロマチン性の染色体である(Pardue and Gall, 1970)。性染色体間のホモログ対合および交差は、PARと称される小さな擬似常染色体領域の存在に依存している(Burgoyne, 1982)。Suv39h機能が存在しないことは、クロマチン組織化および性染色体の分離を幾つかの方式で阻害する。
第1に、XY体でのH3-K9シグナル(図13B内の矢印)はwtおよび変異体パキテン期の各精母細胞中で匹敵し得るレベルで検出されるけれども、Suv39h dn性染色体は、ジプロテン期および移動期においてはより重度にメチル化されたままである(図13B、下方パネル参照)。これに対応して、ジプロテン期中、XY体へのHP1βの長期の結合が観察された。第2に、移動期/M-Iにおいては、Y染色体の長腕の近位領域は、10％のSuv39h dn細胞においては低凝縮性であるようである(図15B、E)。さらにまた、変異Y染色体は、その腕の早期の分離或いは2つの姉妹染色分体の完全分離さえも示す(図15D、E)。第3に、H3-K9メチル化は、wtとSuv39h dn両方の性染色体においてPAR(図13B中の二重矢印)に存在しており、PARはHP1βによっても装飾されている。これらの同じような染色パターンにもかかわらず、性染色体は、約15％のSuv39h dnパキテン期精母細胞において対合できていなかった(図14A、B)。移動期/M-I(図15B、C)においては、XY 1価染色体の存在がwt細胞に比較して4倍増大していた(図15F)。これらのデータは、性染色体、とりわけ高度にへテロクロマチン性のY染色体の特殊なクロマチン構造を共調節することにおけるSuv39h HMTアーゼの役割を示唆している。
【００７９】
図15は、次のようなSuv39h dn精母細胞の減数分裂中のY染色体の異常機能を示している：wt (A)およびSuv39h dn (B〜D)の各一次精母細胞のギムザ染色移動期/中期-I染色体。Y染色体の1価性(B、C)、凝縮損傷(B、C)および早期シスタークロマチド分離(C、D)を示してある。(E)Y染色体(wt：n=190；Suv39h dn：n=170)の異常凝縮または早期姉妹染色分体分離を示す移動期/M-I細胞の頻度についてのヒストグラム。(F)パキテン期(wt：n=80；Suv39h dn：n=80)または移動期/M-I(wt：n=190；Suv39h dn：n=170)でのXY 1価性の頻度についてのヒストグラム。
【００８０】
実施例15
Suv39h1 HMTアーゼのモジュレーターのスクリーニング
工程全てを自動化し、種々の試験化合物のポジションを後の参考のためにコンピュータに登録する。調節活性について試験する化合物を384ウェルプレートに二重に小分けする。次に、MAB緩衝液中の20〜200 nモルの組換えGSTタグ付きSUV39H1を反応に加える。その後、ユウロピウムでラベル化した枝分れペプチド([TARKST]4-K2-K-cys) 20 nモルを加え、次いで、100 nモルのS-アデノシルメチオニンを加える。この反応を室温で40分間放置し、その後、α-methH3-K9抗体をコーティングしている第2プレート上に移す。次いで、この反応を室温で40分間放置し、抗体をメチル化基質に結合させる。メチル化基質の捕捉後、結合していない非メチル化基質を50 mM tris pH 8.5中で洗い流す。その後、ユウロピウムラベルを、50μlのpH4.5増強溶液中で25分間ペプチドから切り離す。キレート化ユウロピウム分子を、その後、360 nmで励起させ、620 nmでの発出蛍光量を、ポラスター(PolarStar)プレートリーダー内で時間分解蛍光を使用して算出する。その後、結果を自動的にグラフ化する。
【００８１】
蛍光量は、MTアーゼ活性量に直接関連する。MTアーゼ活性に対する種々の化合物の作用は、添加化合物を含まない或いは添加酵素を含まない対照反応と比較した時のグラフ上で明白に理解できる。
図17は、次のような上記スクリーニング方法の原理を図式化したものである：
a) Suv39h1様MTアーゼを、S-アデノシルメチオニン(SAM)および発色性ラベル化未修飾ペプチド基質(例えば、枝分れペプチドTARKST]4-K2-K-cys)と一緒にインキュベートする。この基質のメチル化後は、この基質は、マイクロタイタープレート上に固定させているLys9-メチル特異性抗体に対するエピトープとなる。その後、結合ペプチド量を、発色性ラベルからの蛍光量によって定量することができる。
b) モジュレーター(例えば、インヒビター、I)の存在下に、MTアーゼによるメチル基の移行は影響を受け(低下し)、これが固定された抗体により捕捉された基質量に影響し、その量を蛍光量によって定量する。抑制作用を有する化合物は蛍光シグナルの減少を生じ、一方、増強作用を有する化合物は蛍光シグナルの増大を生じるであろう。
【００８２】
表1
Suv39h二重ヌルマウスの生存力
0004896344.tif 000002
a即ち、N1H2 x H1H2：♂♂Suv39h1-/-、Suv39h2+/- x ♀♀Suv39h１+/-、Suv39h2+/-
b胎仔期生存力の低下を示さない他のSuv39h1およびSuv39h2対立組合せにより生まれるマウス数に基づく。
【００８３】
表2
減少したSuv39h遺伝子量を有するマウスのB細胞リンパ腫の発生率
0004896344.tif 000003
*即ち、N1H2：Suv39h1-/-、Suv39h2+/-
【００８４】
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【図面の簡単な説明】
【図１／１】  A:トランスフェクションされた組換えSUV39H1およびSuv39h1タンパク質のHMTアーゼ活性を示す。
【図１／２】  B:トランスフェクションされた組換えSUV39H1およびSuv39h1タンパク質のHMTアーゼ活性を示す。
【図２Ａ】  哺乳動物SU(VAR)3-9関連タンパク質のSETドメインの特異的HMTアーゼ活性を示す。
【図２Ｂ】    哺乳動物SU(VAR)3-9関連タンパク質のSETドメインの特異的HMTアーゼ活性を示す。
【図３Ａ】  ヒストンH3リシン9は組換えSuv39h1によるインビボメチル化における主要部位であることを示す。
【図３Ｂ】  ヒストンH3リシン9は組換えSuv39h1によるインビボメチル化における主要部位であることを示す。
【図４Ａ】  マウス生殖系列におけるSuv39h1およびSuv39h2のターゲッティングを示す。
【図４Ｂ】  マウス生殖系列におけるSuv39h1およびSuv39h2のターゲッティングを示す。
【図４Ｃ】  マウス生殖系列におけるSuv39h1およびSuv39h2のターゲッティングを示す。
【図５】  Suv39h二重ヌルPMEFの分析を示す。
【図６】  Suv39h二重ヌルPMEFにおける異常有糸分裂を示す。
【図７】  Suv39h二重ヌルPMEFにおけるphosH3リン酸化の増大を示す。
【図８】  Suv39h HMTアーゼ機能のモデルである。
【図９Ａ】  Suv39h1-およびSuv39h2欠損マウスの作製および遺伝子型を示す。
【図９Ｂ】  Suv39h1-およびSuv39h2欠損マウスの作製および遺伝子型を示す。
【図１０Ａ、Ｂ】  Suv39h dn PMEFにおける染色体不安定性を示す。
【図１０Ｃ、Ｄ】  Suv39h dn PMEFにおける染色体不安定性を示す。
【図１１Ａ、Ｂ】  Suv39h変異体マウスにおけるB細胞リンパ腫の発症を示す。
【図１２Ａ】  挟動原体へテロクロマチンでのSuv39h依存性H3-K9メチル化を示す。
【図１３Ａ】  Suv39h dnマウスの生殖細胞における精子形成欠損およびH3-K9メチル化を示す。
【図１３Ｂ】  Suv39h dnマウスの生殖細胞における精子形成欠損およびH3-K9メチル化を示す。
【図１４Ａ−Ｃ】  Suv39h dn減数分裂染色体の非正規会合および対合遅延を示す。
【図１４Ｊ、Ｋ】  Suv39h dn減数分裂染色体の非正規会合および対合遅延を示す。
【図１５Ｅ、Ｆ】  Suv39h dn精母細胞の減数分裂中のY染色体の異常機能を示す。
【図１６／１】  染色体安定性の保護における‘へテロクロマチン受容能’のモデルである。
【図１６／２】  染色体安定性の保護における‘へテロクロマチン受容能’のモデルである。
【図１７】  Suv39hモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法の模式図である。
【配列表】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ−Ｃ】
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【図１４Ｄ−Ｉ】
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【図１４Ｊ−Ｋ】
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【図１５Ａ−Ｄ】
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【図１５Ｅ−Ｆ】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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