(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに電気的に絶縁している複数本の２次元目電気泳動用支持体と前記複数本の２次元目電気泳動用支持体に交差して一体化・連通する１次元目電気泳動用支持体とからなるゲルで構成された２次元電気泳動用支持体の作製方法であって、
ゲル作製用原料液をインクとし、前記の２次元電気泳動用支持体の平面形状に見合うパターンを孔版印刷法により基板上に印刷した後、これをゲル化させることにより作製することを特徴とする２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【請求項２】
前記２次元電気泳動用支持体たるゲルとして、ポリアクリルアミドに代表される合成高分子ゲルを用いることを特徴とする請求項１に記載した２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【請求項３】
前記２次元電気泳動用支持体たるゲルとして、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、寒天ゲル、デンプンゲル、マンナンゲル、若しくはカラギーナンゲルの何れかを用いることを特徴とする請求項１に記載した２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【請求項４】
前記２次元電気泳動用支持体たるゲルに緩衝液が含まれる場合であって、前記緩衝液として両性電解質を使用する広領域緩衝液を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たんぱく質の分離分析を行う電気泳動用支持体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアクリルアミドゲルを電気泳動用支持体として用いるゲル電気泳動法は生命科学、医療、環境、食品の分野でたんぱく質、ペプチド、神経伝達物質、ホルモン、核酸などの分離分析手段として広く用いられている。特に、たんぱく質を等電点と分子量という二つの異なる分離モードで分離するポリアクリルアミドゲル２次元電気泳動法は、分離能の優れた分析法として知られている。
【０００３】
上記の従来方法の一例を説明すれば、チューブゲルを用いた１次元目の電気泳動分離と、スラブ（平板）ゲルを用いた２次元目の電気泳動分離を組み合わせた２次元電気泳動においては、１次元目の分離が終了したのちにゲルをチューブから取り出して、これを２次元目分離用のスラブゲルの上に密着させてから、２次元目の電気泳動を行う必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１５５５６０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】O’Farrell,J.Biol. Chem., 250, 4007-4021, 1975
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ポリアクリルアミドゲルに代表されるゲルを支持体に用いる２次元電気泳動法は、分離能に優れた分析方法であるが、上述のゲルを用いる２次元電気泳動方法には下記のような課題がある。
（１）１次元目の分離が終了したのちのゲルをチューブから取り出して、これを２次元目分離用のスラブゲルの上に移し替えるという、複雑で熟練を要する操作が必要である。
（２）上記の理由により、装置の自動化が容易ではない。
【０００７】
これを解決するために、図２に示すような１次元目電気泳動の分離用ゲルと２次元目電気泳動の分離用ゲルとが一体化した構造を持つ「２次元電気泳動用支持体」が考えられている。上記構造を持つゲル２次元電気泳動用支持体を実用に供するには、これを大量に効率よく製造できることが重要であり、これに見合う適切な製造技術が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は上記の課題を解決するために、上記の２次元電気泳動用支持体を大量に効率良く作製する方法を提供するものである。図２は、本発明による作製方法を用いて作製する２次元電気泳動用支持体の模式構造を示す斜視図である。１次元目分離用のストライプゲルを２次元目分離用のスラブゲルに単純に接続・一体化しただけでは、１次元目電気泳動時、電圧印加による泳動電流は２次元目分離用のスラブゲルの領域にも流れてしまい、１次元目の分離精度が損なわれる。
【０００９】
図２に示す２次元電気泳動用支持体２００の構造においては、２次元目電気泳動用スラブゲルの領域に泳動方向に沿ってスリット２３０を設けることにより、上記不都合を解消している。本発明により作製した２次元電気泳動用支持体２００は、ストライプ状の１次元目電気泳動用支持体２１１に、複数本のストライプ状の２次元目電気泳動用支持体２１２および２２２が交差して一体化している。すなわち、２次元目展開用のスラブゲルに２次元目の電気泳動方向に沿ってスリット２３０が入っている。
【００１０】
本発明では、孔版印刷法を応用してパターン化したゲルを基板２１０上に形成して、２次元電気泳動用支持体を作製する。
【００１１】
上記のゲルの材質には、ポリアクリルアミドに代表される合成高分子ゲルが主として用いられるが、その他にアガロース、寒天ゲル、デンプン、マンナン、カラギーナンなども使用可能である。さらに、上記のゲルの中に両性電解質を使用する広領域緩衝液を予め混合・添加しておくことも可能である。これにより、１次元目の電気泳動を等電点電気泳動法で行うことができる。
【００１２】
本発明による作製方法を用いて製作されたゲル２次元電気泳動用支持体を応用した電気泳動法においては、１次元目の電気泳動終了後、直ちに２次元目の電気泳動を開始することが出来る。従来の方式で必要とされた１次元目電気泳動終了後に、試料を含む泳動用支持体を２次元目電気泳動用支持体上に移す煩雑な操作が不要になり、電気泳動時間が短縮されると同時に工程が簡素化されるため、装置の自動化が容易になる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、種々の利点を有する「ゲル２次元電気泳動用支持体」を、大量に効率よく製造することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）実施例における孔版印刷用型板を示す平面図（Ｂ）実施例における印刷途中の電気泳動用支持体などの部分断面図
【図２】本発明の製法により作製する２次元電気泳動用支持体の斜視図
【図３】（Ａ）１次元目電気泳動用電極システムを示す斜視図（Ｂ）２次元目電気泳動用電極システムを示す斜視図
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、実施例に基づき本発明の実施の形態を説明する。
【００１６】
本発明の実施例を図１及び図２を用いて以下に説明する。図１は、厚膜孔版印刷法を応用したゲルパターンの作製方法を示す模式図、図２は、厚膜孔版印刷法を用いて基板上に作製した２次元電気泳動用支持体（パターン化されたゲル）２００の模式構造を示す斜視図である。図２に示すように、基板２１０上に作製したゲルパターンは、１本の１次元目電気泳動用支持体２１１と、これと交差する複数本の２次元目電気泳動用支持体２１２・２２２とで構成されている。ストライプ状の２次元目電気泳動用支持体２１２・２２２の本数は、例えば１００本であり、図面では間引いて描画している。また、１次元目電気泳動用支持体２１１の両端には１次元目電気泳動用電極受け部２１３が設けられている。
【００１７】
次に、孔版印刷法を応用したゲルパターンの作製方法を図１を用いて説明する。図１（Ａ）は孔版印刷用の型板１００を示す平面図である。型基板１４０の板厚は約１００μｍであり、１次元目電気泳動用支持体２１１に対応するパターン孔１３１、上記ゲルの両端に設ける電極受け部に対応するパターン孔１３３、複数本の２次元目電気泳動用支持体２１２に対応する複数個のパターン孔１３２が設けられている。基板１１０上に上記の型板１００をセットし、適度の粘度に調整したゲル作製用原料液をスキージにより刷り込む。この状態を図１（Ｂ）に示す。この図は、基板１１０上にセットされた型板（ステンシル）１００にあるパターン孔１３２の中に刷り込まれたゲル作製用原料液１２２を示す模式断面図であり、図２のＡ−Ａ部分に相当する箇所の部分断面を示す。１３０は型基板１４０に形成されている仕切り壁を示す。流動性がなくなる程度にまで溶液１２２が固ったら、型板（ステンシル）をとりはずし、溶液１２２を完全にゲル化させれば、図２に示すゲルパータン（２次元電気泳動用支持体）が完成する。
【００１８】
ゲル作製用原料液の主成分は、例えば、アクリルアミドモノマー４％、架橋剤として用いるBis（N,N’−ビスアクリルアミド）０.２％、ゲル重合反応を促進する薬品としてTEMED（N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン）、過硫酸アンモニウム、そして緩衝液などであり、光照射で重合させる場合は、リボフラビンなどの光重合触媒などを混合しておく。
また、１次元目を等電点電気泳動とする場合には、上記の緩衝液として両性電解質を使用する広領域緩衝液を用いる。ゲル作製用原料液を基板上に塗布（印刷）した後、加温（例えば３５℃位）するか、あるいは紫外線照射などによりゲル化（重合）させる。このため、作製プロセスの温度制御、光の管理などが要求されると同時に、重合反応を阻害する酸素の脱気、雰囲気制御、使用する基板材質の選択などにも注意を払う必要がある。
【００１９】
ゲルパターンの寸法の一例を挙げれば、ゲル層の厚さ：約１００μｍ、ストライプ状の１次元目電気泳動用支持体２１１の幅：約１５０μｍ、ストライプ状の２次元目電気泳動用支持体２１２・２２２の幅：約１２０μｍ、ストライプ状の２次元目電気泳動用支持体の各々の間隔（スリット２３０の幅）：約５０μｍ、２次元目電気泳動用支持体の全長：約２５ｍｍである。上記２次元目電気泳動用支持体のストライプ本数は、１００本である（図面では、描画の都合上、本数を間引いて示している）。
【００２０】
以下に、上記の図２に示す２次元電気泳動用支持体２００を用いた電気泳動の一例を示す。例えば、図３（Ａ）、図３（Ｂ）に示すような電極システムを用いて電気泳動を行う。今、２次元電気泳動用支持体２００には予め両性電解質を使用する広領域電解質などの泳動液が含浸されているとすれば、まず、1次元目等電点電気泳動用支持体２１１上の目的に適った位置に試料を供給した後、一対の１次元目電気泳動用電極システム３１０を１次元目電気泳動用電極受け部２１３に接触させ、電圧を印加する。電極システム３１０のキャピラリー３１３の中には電極液３１１として０.０１Ｍリン酸（陽極用）および０.０４Ｍ水酸化ナトリウム（陰極用）が充填されており、毛細管作用により一定量が保持されている。電極液中には電極線３１２が設けられている。以上の１次元目電気泳動分離は１次元目電気泳動用支持体２１１の領域で進行し、これと交差・一体化している複数本の２次元目電気泳動用支持体２１２・２２２の影響をほとんど受けることなしに、１次元目の電気泳動が行われる。
【００２１】
上述した１次元目の電気泳動終了後、直ちに２次元目の分子量分離電気泳動に移行できる。これには、図３（Ｂ）に示す２次元目電気泳動用電極システム３２０を一対用いる。２次元目電気泳動用の電極システム３２０の構成も１次元目用と類似しており、電極液容器３２３の中に電極液３２１が充填されており、毛細管作用により一定量が保持されている。電極液には陽極、陰極共、例えば０.０５Ｍトリス（Tris(hydroxyl)aminomethane）−０.３８Ｍグリシン緩衝液を用いる。電極液中には電極線３２２が設けられている。上記の電極システムを２次元目電気泳動用支持体２１２・２２２の両端の電極受け領域２１４に接触させてから電圧を印加して、２次元目の電気泳動を行う。
【００２２】
上述のように、１次元目の電気泳動終了後、直ちに２次元目の電気泳動を開始することが出来る。従来の方式で必要とされた１次元目電気泳動終了後に、試料を含む泳動用支持体を２次元目電気泳動用支持体上に移す煩雑な操作が不要になり、電気泳動時間が短縮されると同時に工程が簡素化されるため、電気泳動装置の自動化が容易になる。
【００２３】
本実施例では、孔版印刷用の型板としてメッシュスクリーンを持たない型板（ステンシル）を用いてゲルパターンを作製する例を示した。一方、基板上に刷り込んだ直後に型板を取り外したときに、ゲル作製用原料液がもはやそれ以上の濡れ広がりを起こすことがなく、ゲル化するまでの間、所定のパターン形状を保持できるような条件下であれば、スクリーン印刷手法、すなわち、メッシュスクリーンに乳化剤による所定パターンを設けた印刷用マスク（印刷原版）を用いる印刷手法によりゲルパターンを作製することも可能である。
【００２４】
また、ゲルパターンの下地となる基板２１０は、例えば、ガラス基板、プラスチック基板、プラスチックシートなどである。これらの基板には、必要に応じて、アクリルアミドモノマーと基板の結合剤となるシランカップリング剤などで前処理を施す。好ましくは、上記基板材質が電気泳動像の観察のための照明光や蛍光標識体を発光させるための励起光に対して透明であることが望ましい。また、パターン化されたゲルで構成される支持体を１個づつ印刷するのではなく、複数個を同時に印刷できる原版を用いた、複数個同時印刷手法を採用することも可能である。
【００２５】
なお、以上の実施例においては、ゲルの材質としてポリアクリルアミドを例にして説明したが、これに限定されるものではなく、広く合成高分子ゲルや、アガロース、デンプン、寒天ゲル、マンナン、カラギーナン等も使用可能である。
【００２６】
また、紫外線照射によるゲル化促進も可能である。更には、必要に応じ、カバープレート（例えば、ガラス薄板など）で支持体の必要箇所を覆う構造とすることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明の活用例としては、医療、食品、環境分析、又はその品質管理など広い分野に適用可能である。
【符号の説明】
【００２８】
１００―――孔版印刷用型板
１２２、２１２、２２２―――２次元目電気泳動用支持体
２００―――２次元電気泳動用支持体
２１０―――基板
２１１―――１次元目電気泳動用支持体
２１３―――１次元目電気泳動用電極受け部
２１４―――２次元目電気泳動用電極受け領域
２３０―――スリット
３１０―――１次元目電気泳動用電極システム
３１１、３２１―――電極液
３１２、３２２―――電極線
３２０――２次元目電気泳動用電極システム
【図１】
0005061261.tif 000002
【図２】
0005061261.tif 000003
【図３】
0005061261.tif 000004