(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスチック物質製支持体のガスプラズマ親水性化表面の、マイクロデバイスの液体輸送システムにおける液体接触表面としての使用であって、該液体輸送システムが、該表面に設けられた≦１０００μmの深さの溝およびチャンバーから形成され、そしてトップによりカバーされており、該ガスプラズマ親水性化表面は
ａ)≦３０°の水接触角を有し、これは７０％エタノールでの洗浄により±２０％以上または±５°以上変化せず、そして
ｂ)次の工程：
ｉ)表面が≧３０°の水接触角を有する該支持体の親水性化されていない形態を提供する工程；および
ii)工程(ｉ)で提供された支持体の表面を非重合可能ガスのガスプラズマで、≧５Ｗ／cm３／分であるプラズマ強度で処理する工程
を含む方法により得られるものである、使用。
【請求項２】
該ガスプラズマ親水性化方法が、工程(ii)に続いて、(iii)工程(ii)で得られた表面を水、水混和性溶媒およびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄する工程を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ガスプラズマ親水性化表面が水接触角≦２０°を有する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
工程(ii)を１００mTorrより低い圧力で行う、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
非重合可能ガスが酸素、窒素、希ガス、二酸化炭素、一酸化炭素または水蒸気を含んでいる、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ガスプラズマ親水化法後の表面がアニオン交換基、カチオン交換基、両性基、ヒドロキシ基、バイオアフィニティー基および／またはキレート化基を示すために誘導体化される、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
プラスチック物質が不飽和を含むモノマーの重合化により得られたおよび／または縮合ポリマーであるポリマー物質から選択される、請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
液体接触表面が水性液体を自己吸引により導入するのに十分な親水性を有する、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
プラスチック物質製支持体の表面に設けられた深さ≦１０００μmの溝およびチャンバーから形成され、そしてトップによりカバーされる液体輸送システムを含むマイクロデバイスであって、該表面の少なくとも一部が該液体輸送システムにおける液体接触表面であり、ここで、該液体接触表面が≦３０°の水接触角を有し、これは７０％エタノールでの洗浄により±２０％以上または±５°以上変化せず、プラズマ中のガスが非重合可能であるガスプラズマ親水性化方法により得られることを特徴とする、マイクロデバイス。
【請求項１０】
ガスプラズマ親水性化表面が水接触角≦２０°を有することを特徴とする、請求項９に記載のマイクロデバイス。
【請求項１１】
該ガスプラズマ親水性化法が：
ｉ)表面が≧３０°の水接触角を有する該支持体の親水性化されていない形態を提供し；そして
ii)工程(ｉ)で提供された支持体の表面を非重合可能ガスのガスプラズマで、≧５Ｗ／cm３／分であるプラズマ強度で処理する
工程を含む方法により得られることを特徴とする、請求項９または１０に記載のマイクロデバイス。
【請求項１２】
該ガスプラズマ親水性化方法が、工程(ii)に続いて、(iii)工程(ii)で得られた表面を水、水混和性溶媒およびそれらの混合物から選択される溶媒で洗浄する工程を含む、請求項１１に記載のマイクロデバイス。
【請求項１３】
ガスプラズマ親水性化法において使用されるガスプラズマ反応器の圧力が１００mTorrより低いことを特徴とする、請求項９から１２のいずれかに記載のマイクロデバイス。
【請求項１４】
ガスプラズマ親水性化法において使用される非重合可能ガスが酸素、窒素、希ガス、二酸化炭素、一酸化炭素または水蒸気を含んでいることを特徴とする、請求項９から１３のいずれかに記載のマイクロデバイス。
【請求項１５】
ガスプラズマ親水化法後の液体接触表面がアニオン交換基、カチオン交換基、両性基、ヒドロキシ基、バイオアフィニティー基および／またはキレート化基を示すために誘導体化されることを特徴する、請求項９から１４のいずれかに記載のマイクロデバイス。
【請求項１６】
プラスチック物質が不飽和を含むモノマーの重合化により得られたおよび／または縮合ポリマーであるポリマー物質から選択されることを特徴とする、請求項９から１５のいずれかに記載のマイクロデバイス。
【請求項１７】
液体接触表面が水性液体を自己吸引により導入するのに十分な親水性を有することを特徴とする、請求項９から１６のいずれかに記載のマイクロデバイス。
【請求項１８】
プラスチック物質が脂肪族モノマーのポリマーを含むことを特徴とする、請求項９から１７のいずれかに記載のマイクロデバイス。
【請求項１９】
プラスチック物質がノルボルネンまたは置換ノルボルネンのポリマーを含むことを特徴とする、請求項９から１８のいずれかに記載のマイクロデバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、プラズマで処理することによる、ポリマー表面の親水性の促進法に関する。
【０００２】
プラスチックの表面修飾のための一般法は、それらを種々の形のプラズマ処理に付すことである(Chen et al., Surface Science Reports 24 (1996) 1-54; and Garbassi et al, Polymer Surfaces - From Physics to Technology, John Wiley (1998) 238-241)。これは、低圧のガスを含む真空容器であるプラズマリアクター中で行われる(典型的に１０から１０００mTorr)。高周波数電場をリアクターに適用したとき、イオン、遊離ラジカルおよび真空ＵＶのような反応性種を含む、プラズマ(またグロー放電とも呼ばれる)が形成される。これらの種はプラスチック表面と反応し、ガスの性質およびプラズマパラメーターに依存した特性で化学修飾をもたらす。酸素およびアルゴンのようなガスは典型的に、非極性プラスチックの親水性化および接着改善に使用され、一方重合化モノマーの蒸気は多くの様々な目的のためにプラスチックに薄コーティングを適用するのに使用できる(Yasuda, Plasma polymerization, Academic Press 1985)。
【０００３】
酸素およびアルゴンプラズマでポリカーボネート表面を処理することに関する多くの刊行物がある。安定性試験(Morra et al, Angew. Makromol. Chem. 189 (3184) (1991) 125-136)は、処置された表面の親水性の殆どが水を抜き取るかまたは３日間の乾燥貯蔵の後に損失することを示した。水抜き取り後の親水性損失は、プラズマ処理中の低分子量水溶性表面種の形成によるものであった。貯蔵不安定性は、表面におけるポリマー鎖の再配置に帰するものであった。ＥＳＣＡ試験(Greenwood et al, Macromolecules 30 (1997) 1091-1098)は、酸素プラズマ処理によりポリカーボネート表面に包含された酸素の７９％が１：１シクロヘキサン／イソプロパノール混合物での洗浄後に除去されたことを示した。これは、プラズマ処理中のポリマー鎖の分解に帰する。
【０００４】
ポリスチレンに関しても同様の効果が観察された。プラズマ処理組織培養ポリスチレン表面のＥＳＣＡ試験は、洗浄後の表面酸素の約３５％の損失を示した(Onyiriuka et al., J. Coll. Interf. Sci. 144(1) (1991) 98)。二つの他のＥＳＣＡ試験において、酸素プラズマ処理ポリスチレンは、洗浄後に２５％表面酸素損失をした(Callen et al., J. Vac. Sci. Technol. A 13(4) (1991) 2023-2029), (Morra et al., Angew. Macromo. Chem. 189 (3184) (1991) 125-136)。酸素プラズマで処理したポリスチレン表面は、最初７°の水接触角であったが、メタノール洗浄後、接触角は６４°まで増加した(Murakami et al., J. Coll. Interf. Sci. 202 (1998) 37-44)。
【０００５】
WO9618498は、プラスチック製の永久的親水性化表面の製造の試みを記載している。方法は、表面に電荷を導入するための無機ガスプラズマ中の第１段階、および逆の電荷を有する多イオンポリマーが表面に吸着される第２段階を含む。
【０００６】
EP-A-106,046は、主成分が重合化窒素含有有機化合物であるガスプラズ中での処理による、フッ素化ポリマー表面の親水性化を記載する。
【０００７】
GB2,061,969は、無機ガスプラズマ中での処理による、親水性および静電気防止性塩化ビニルポリマーの製造を記載する。プラスチックに永久的親水性を与える問題は記載されていない。
DE3712491は、様々な合成ポリマー製の多孔性膜ガスプラズマ親水性化を記載する。プラスチック物質は記載されていない。親水性膜の貯蔵安定性は示されているが、水性媒体での洗浄条件中の安定性に関する記載はない。液体接触角は測定されているが、多孔性表面は典型的に無孔平滑表面と比較して著しく低下した値を有するため、これらの値は本明細書に記載の値と単純に比較はできない。
EP106662は、ウェルにおける蛍光測定を改善するための暗色プラスチック物質製のマイクロタイタープレートを記載する。マイクロタイタープレートは、通常微小形態の液体輸送システムがない。
【０００８】
適用される電気励起場は、典型的に電磁波またはマイクロ波、即ち、各々kHz-MHzまたはGHzにおける周波数を有する。プラズマによりもたらされるポリマー表面の修飾(親水性化)は、主に：プラズマに存在する種のタイプ、空間的分散、エネルギー分散および方向的分散のような多くの内部プラズマパラメーターに依存する。次ぎに、これらのパラメーターは、複合的な方法で外部プラズマパラメーター：リアクター幾何学、励起のタイプ、適用される力、処理ガスのタイプ、ガス圧およびガス流速に依存する。
【０００９】
極性液体と表面の間の接触が関与する多くの出願において、導入された親水性が洗浄に対して安定であるか否かは大きな問題ではなかった。特定の問題は、水性液体を自己吸引により導入するか、または求心力により導入することが必要な場合、高程度の親水性が必要である、ポリマー表面がキャピラリー寸法の溝の一部である場合に遭遇する。これは、反復接触を行う場合特に当て嵌まり、この場合、不安定表面修飾が最初の液体接触の間に洗い流される。溝の寸法が小さいほど、この問題はより深刻になる。
【００１０】
本発明の内容において、“プラズマ処理表面”なる用語は、特記しない限り、恐らく表面にしっかり結合した別の反応種を含むように誘導体化されている、非被覆の剥き出しのプラズマ処理表面を意味する。
【００１１】
マイクロデバイス(microfabricated device)における細胞培養は、以前に、例えば、１９９８年４月２７日の優先日でWO9955827に記載されている。
WO972190は、遠心力を使用して液体を駆動させる、微小流体デバイスに関する。ミクロ培養および病原体の同定が該デバイス内でできることが示唆されている一つの文章はあるが、適切な表面特性の選択に関するヒントは何らない。
【００１２】
細胞凝集物は、以前に、３０°より小さい水接触角の容器中で培養されている(日本特許出願１９９３０１１９５７９；Derwentアブストラクトアクセッション番号1995-047885)。
【００１３】
水接触角２０−４５°でのガスプラズマ処理ポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ)表面への細胞の接着は、試験されている(Dekker et al., Clinical Materials 11 (1992) 157-162)。接着は、最も一般的に使用される１０％またはそれ以下と比較して、接着を促進するために異常に高い濃度の物質(２０％ヒト血清含有培養培地)を必要とするように見える。
【００１４】
ＣＨＯ細胞の、ガスプラズマ親水性化された表面へのＨ２Ｏ蒸気中での接着は、プラスチック表面の最適細胞培養特性を探すために試験されている(Lee et al., Biomaterials 12 (5) (1991) 443-448)。殆どの親水性表面における欠しい細胞接着が観察されている。
【００１５】
液体輸送システムが親水性／疎水性バリアにより限定されている微小流体デバイスは、以前、例えば、１９９８年５月８日の優先日でＷＯ９９５８２４５に記載されている。
【００１６】
本発明に一部対応する実験的結果が、Second International Symposium on Polymer Surface Modification, New Ark June 1999 (Anders Larsson: Plasma Treated Polycarbonate as Substrate for Culture of Adherent Mammalian Cells)で発表されている。
【００１７】
本発明の目的
・第１の目的は、導入された親水性の安定性を促進する、ポリマー表面の親水性化のためのガスプラズマ法の提供である。
・第２の目的は、処理後に親水性であり、反復湿潤／乾燥の上でもそのままである、即ち、親水性液体、例えば、エタノール／水混合物との接触により最初の親水性が明白には変わらない、プラズマ処理処表面の提供である。
【００１８】
・第３の目的は、内部表面が第２の目的で定義された通りであり、再現性のある方法での水性液体の反復導入が可能である、例えば、キャピラリー／溝／チャンバーを有するマイクロ加工形のキャピラリー／溝／チャンバーシステムの提供である。
・第４の目的は、内部表面の少なくとも一部が第２の目的に従っている、液体輸送システムの提供である。
・第５の目的は、細胞培養、アッセイ反応等に使用できるプラズマ処理表面の提供である。
【００１９】
これらの目的は、主に、プラズマ処理前に相対的に高い即時水接触角、例えば、＞２０°、例えば＞３０°、または＞５０°でさえ有する表面に適合される。“即時水接触角”なる用語は、接触角を、適用した液体が明らかに蒸発する前に乾燥表面で測定することを意味する。実験部分参照。
【００２０】
本発明
我々は、本発明により、上記の目的が、ポリマー表面(プラスチック表面)が高密度(エネルギーインプット／ガス分子)のガスプラズマとの接触によりもたらされることを発見した。我々の発見は、挿入される二つのタイプの極性基：(１)ポリマー表面に堅く保持される基および(２)緩く保たれたフラグメントに配置された基の観点から説明できる。第１の選択肢は、安定な親水性をもたらす。第２の選択肢は、水性溶液のような極性液体との接触により容易に除去される、親水性をもたらす。
【００２１】
したがって、本発明の第１の態様は、堅く結合した極性基を表面上に導入するように、表面をガスプラズマと接触させることによる、永久的により親水性なポリマー表面(プラスチック表面)を付与する方法である。これらの極性基が、表面を構成するポリマー骨格上に直接導入され、恐らく表面相の架橋が関与することが最もありそうである。
【００２２】
ヒドロキシおよびまたはアミノ基、カルボキシ基、エーテル基等および、炭素原子が酸素、硫黄および窒素から選択されるヘテロ原子に結合している他の基が、挿入し得る極性基の例である。このタイプの基が存在する表面の変換は、ＥＳＣＡ(ＸＰＳ)により試験し得る。
【００２３】
“永久的により親水性”および“安定な親水性”なる表現は、即時水接触角が、エタノール(７０％ｗ／ｗ、洗浄法は実験部に記載の通り)での洗浄において本質的に未変化のまま残ることを意図する。これは、洗浄工程が、±２０％以上および／または±５°以上の即時水接触角の変化をもたらすことを可能にすべきではないことを意味する。
【００２４】
親水性化表面の貯蔵安定性(乾燥形)は、１０°より大きくない、好ましくは５°より大きくない、即時水接触角の許容される増加で少なくとも１ヶ月であるべきである。乾燥形の貯蔵安定性が許容されない場合、しばしば、十分な貯蔵安定性が水性雰囲気または水性液体中で達成できる。
【００２５】
本発明の方法は、ガスプラズマ処理段階に続く所望の洗浄段階を含み得る。この洗浄工程は、ガスプラズマ処理表面を、水性溶液、またはある他の極性液体を接触させ、緩く保たれた親水性化合物を除去することを意味する。洗浄溶液は好ましくは水、水混和性液体またはこれらの混合物である。水混和性液体の例は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｔ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフオキシド、アセトンおよび、水に同様の溶解性を有する他の液体化合物である。
【００２６】
プラズマの必要な強度は、上記の種々の変数に依存する。十分なガスプラズマが、適用された電気励起力が≧２５０Ｗ、好ましくは≧３００Ｗ、および典型的に５００±１００Ｗで、≦５０cm３／分、好ましくは≦２５cm３／分のインターバルで選択されたガス流の場合に見られ得る。プラズマ強度に関して、インターバルは通常≧５Ｗ／cm３／分、例えば≧１０Ｗ／cm３／分または≧２０Ｗ／cm３／分または≧３５Ｗ／cm３／分でさえある。電極領域ｍ２あたりの標準化値は、典型的に≧３０Ｗ／ｍ２／cm３／分、例えば、≧６０Ｗ／ｍ２／cm３／分、または≧１２０Ｗ／ｍ２／cm３／分、または≧２１５Ｗ／ｍ２／cm３／分でさえある。圧力は典型的に１００mTorrより低く、好ましくは≦５０mTorrである圧力である。これらの範囲は、２５℃の温度、大気圧および酸素で適用される。他のガスに関して、値はＭ０２／ＭＸ(ここで、Ｍ０２およびＭＸは各々酸素および他のガスの分子量である)倍しなければならない。
【００２７】
使用するガスは、意図するプラズマのタイプにおいて非重合可能でなければならない。典型的に、このようなガスは無機である。これは、適当なガスが酸素、窒素、希ガス(ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンのような)およびこれらの混合物、例えば、空気および酸素と窒素の他の割合を含む混合物の中で見られることを意味する。他の有用な可能性のあるガスは、二酸化炭素、一酸化炭素、水蒸気等であり、これらは単独でまたは組合わせて使用し得る。ガスの組成を変えることにより、表面に挿入される基は、種類および密度に関して変えることができるようである。
【００２８】
重合可能ガスの説明的例は、低級炭化水素およびアリル−またはアクリルモノマー、芳香族などの蒸気のような揮発性低有機分子である。無機非重合可能ガスは、ガス形で重合可能有機化合物と共に存在し得る。
【００２９】
適当なガス流速度と合わさった充分に高いパワーのアウトプットを可能にするプラズマリアクター容器は、商品として入手可能である。上記のように、リアクター容器は、例えば、マイクロ波または電磁波の範囲の、電気的励起力インプットを可能にしなければならない。適当なプラズマリアクターは、０−５００Ｗの無線周波数(ＲＦ)力および０−１００または０−１０００スタンダードcm３／分のガス流を可能にするPS0500(BOC Coating Technology, USA)である。
【００３０】
処理の結果は、使用したリアクター容器の設計に依存し得、ある程度への最適区間が１つのリアクター設計から別のものへ変わることを意味する。結果はまたリアクター中のどこに表面を処置中に置くかにも依存し得る。
【００３１】
ガスプラズマ処理する表面をカバーするポリマー物質(プラスチック)の即時水接触角は、典型的に＞２０°である。本発明の大きな利点は、＞３０°、例えば＞５０°のような大きい即時水接触角を提供するポリマー物質で得られる。これらの数字は、水溶性化合物および低分子量化合物(典型的に＜１kD)に関して綺麗にされてるプラスチック表面に関する。水接触角がポリマーでどのように変わり得るかの例は表１に示す。
【００３２】
本発明法は、典型的に永久的親水性の増加をもたらし、これは最初のプラスチック表面の即時水接触角の２０％以上、例えば、５０％以上(水溶性化合物、低分子量化合物等の除去後)の低下に対応する。親水性の大きな増加は、親水性プラスチックよりも疎水性のものでより重要である。
【００３３】
表１
プラスチック                            水接触角
ＰＴＦＥ(Teflon)                        １０８°
シリコンラバー
(Sylgard 184)                           １０６°
ポリプロピレン                            ９５°
ポリエチレン                              ９４°
ポリスチレン                              ９０°
ポリカーボネート                          ７８°
ＰＥＴ(ポリエステル)                      ７６°
スチレン−アクリロニトリル                ７３°
ＰＭＭＡ(Plexiglas)                       ５９°
【００３４】
典型的に、表面上のポリマーは、不飽和部分、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合を含むモノマーの重合化により得られている。ポリマーはホモポリマーまたはコポリマーであり得る。
【００３５】
モノマーは、例えば、モノ−、ジ−およびポリ／オリゴ−不飽和化合物、例えばビニル化合物および、不飽和部分を含む他の化合物から選択され得る。モノマーは、フルオロおよび／またはクロロのようなハロゲン置換基を含んでも含んでいなくてもよい。説明的モノマーは：
(ｉ)アルケン／アルカジエン(例えば、エチレン、ブタジエン、プロピレン、およびビニルエーテルのような置換形を含む)、シクロアルケン、モノフルオロビニルおよびジおよびポリフルオロビニル炭化水素(例えば、テトラフルオロエチレン)、アルケン含有酸、エステル、アミド、ニトリル等、例えばメタクリル／アクリル化合物；および
(ii)所望により例えば低級アルキル基(Ｃ１−６)等で置換されていてもよいビニルアリール化合物(例えば、モノ−、ジ−およびトリビニルベンゼン)である。
【００３６】
別のタイプのポリマーは、モノマーがアミノ、ヒドロキシ、カルボキシ等からなる群から選択される２個以上の基を示す化合物から選択される(いわゆる多官能性化合物)。特記されるモノマーは、ポリアミノモノマー、ポリカルボキシモノマー(対応する反応性ハライド、エステルおよび無水物を含む)、ポリヒドロキシモノマー、アミノ−カルボキシモノマーであり、ここでポリは２、３またはそれ以上の官能基を意味する。多官能性化合物は、二回反応性の、例えば、炭酸またはホルムアルデヒドである官能基を有する化合物を含む。意図されるポリマーは、典型的にポリカーボネート、ポリアミド、ポリアミン、ポリエーテル等である。ポリエーテルは、シリコンラバーのような対応する対応するシリコンアナログを含む。
【００３７】
ポリマーは架橋形であり得る。
【００３８】
表面上のポリマーは、２個以上の異なるポリマー／コポリマーの混合物であり得る。この場合、上記の水接触角およびそれらの変化がこれらの混合物、即ち実際の表面に適用される。
【００３９】
特に興味深いポリマーは、２００−８００nmの区間の励起波長および４００−９００nmの区間の放出波長に関して無視できる蛍光を有するものである。無視できる蛍光なる用語は、上記放出波長区間における蛍光強度が、対照プラスチック(＝蛍光付加なしのビスフェノールＡのポリカーボネート)の蛍光強度の５０％より小さくなければならないことを意味する。実際、プラスチックの蛍光強度が、対照プラスチックの蛍光強度の＜３０％または＜１５％より低い、例えば＜５％または＜１％である場合、害にならない。許容できる蛍光を有する典型的プラスチックは、重合可能炭素−炭素二重結合を含む脂肪族モノマーのポリマー、例えば、シクロアルケン(例えば、ノルボルネンおよび置換ノルボルネン)、エチレン、プロピレンなどのポリマー、ならびに高純度の他の非芳香族ポリマー、例えば、一定グレードのポリメチルメタクリレートである。
【００４０】
低蛍光の必要条件は、プラスチックを、１個以上の蛍光置換基を検出／測定するサンプルの担持に使用する場合、特に重要である。殆どの場合、これは、物質の放出波長におけるプラスチックの蛍光波長が、物質の蛍光波長の５０％より小さくなければならないことを意味する。実際、プラスチックの蛍光強度が、対照物質の蛍光強度の＜３０％または＜１５％、またはそれより低い、例えば＜５％または＜１％である場合、害にならない。異なる波長で光を放出する数個の物質の蛍光を測定する場合、プラスチックの蛍光がその時は広い波長バンド、または数個のバンドに関して無視できるべきであるため、プラスチックにより過酷な要求がされる。
【００４１】
プラズマ処理の後、所望により緩く保たれた親水性化合物を除去するための洗浄工程の後、表面は、１個以上の反応性基、即ち、あるタイプの親和性を介して、または共有結合的結合を介して他の化合物に結合できる基を示すために更に誘導体化され得る。誘導体化は、好ましくは洗浄工程後に行われ、例えば、誘導体化に使用できる付加的親水性基を担持するコーティングを表面に提供する、コーティング段階より前であり得る。
【００４２】
加水分解の前に表面のある部分をマスキングし、他の部分をマスキングしないままにすることにより、疎水性表面上の親水性パターンを得ることができる。あるいは、疎水性パターンを、親水性化の後に表面にプリントし得る。これらの技術は、マイクロ液体輸送システムの製造において価値があり得る。下記参照。
【００４３】
ヒドロキシ、アミノまたはカルボキシ基等の親水性基を示すポリマー上に反応性基を導入するための種々の方法は、当分野の標準的技術者には既知である。既知の親和性基は荷電基、および他のタイプの相互作用を介して、恐らく荷電−荷電相互作用と組み合わさって、親和性を作用する基である。荷電基の説明的例は、イオン交換基、例えば、アニオンおよびカチオン交換基であり、典型的例はアンモニウムイオン(１級、２級、３級および４級アンモニウムイオン)、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、ホスホネート等である。他の親和性基の説明的例は、抗体−抗原／ハプテン、相補的核酸、Ｉｇ結合タンパク質−Ｉｇ(例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ−ＩｇＧ)、レクチン−炭水化物構造、細胞−細胞接合分子(フィブロネクチン、コラーゲン、ＲＧＤ−ペプチド等)のようなリガンド−レセプターペアの個々のメンバーを含む、いわゆるバイオアフィニティー基である。バイオアフィニティー基に含まれるのはまた、天然バイオアフィニティーを多かれ少なかれ完全に模倣する半−および全−合成リガンドである。
【００４４】
親水性化表面はまた異なる物理的形のアレンジメントの一部であり得る。親水性化表面は、マイクロタイターウェルおよび他のタイプの容器の底／壁であり得、また多孔性および無孔性粒子状物質の外表面であり得る。親水性化表面は、親水性が小さいより大きな表面(例えば、疎水性表面)の一部であり得る。
【００４５】
親水性化表面は、水性液体の輸送を意図したシステムにおける液体接触表面の大部分を提供し得る。これらのシステムは、キャピラリー寸法、例えば、二つの逆の壁の間が≦１０００μm、例えば≦１００μm、または≦１０μm、例えば≦１μmの距離でさえある、溝を有し得る。これらのシステムはまた溝に接続する１個以上のチャンバーを含み得、≦５００μl、例えば≦１００μl、およびまた≦１０μl、例えば≦１μlでさえある容量を有し得る。チャンバーの深さは典型的に≦１０００μmの区間、例えば≦１００μm、例えば≦１０μm、または≦１μｍでさえあり得る。下限はまた使用する試薬の最大より常に有意に大きい。下限は典型的に乾燥形で送達するデバイスに関しては、０.１−０.０１μmの範囲である。このタイプの１個以上の液体輸送システムは一般的なプレート、例えば、回転可能な、例えば、ＣＤタイプのディスク上に置き得る。回転可能形の場合、液体はディスクの回転(求心力)により、輸送システムの１個以上のセグメントを通るよう強いられ得る。この後者の場合、液体輸送システムは放射状に置く。他のタイプの圧力発生システムをまた上記の液体輸送システムにおける液体の輸送に使用し得る。
【００４６】
＜１０００μm、例えば＜１００μmまたは１０μmより小さくさえある、例えば＜１μmの深さの溝およびチャンバーを含む１個以上の液体輸送システムを有するデバイスは、更にマイクロデバイスと呼ばれる。チャンバーおよび溝はマイクロフォーマットと言われる。マイクロデバイスは、典型的に、プレートの表面、例えば、ディスク上のような、一つの面に溝およびチャンバーを有する。プレートは円形、卵形、方形または任意の他の２Ｄ幾何学的形であり得る。
【００４７】
溝および／またはチャンバーは、液流を導くべき液体バリアーにより限定される。液体バリアーは物理的な壁、底および天井の形であり得る。水性液体を導くための疎水性バリアーの形である、そして非極性液体を導くための親水性バリアーの形である壁が示されている(１９９８年４月２７日の優先日のWO9955827)。伝達ラインおよび点のパターンを残して表面(Ｉ)をマスクでカバーし、例えば、本発明にしたがって親水性化することにより、表面(Ｉ)は親水性パターンを示す。疎水性表面(II)(カバーまたはトップ)を親水性パターンに対して配置し、キャピラリー溝穴を表面の間に残すことにより、液体輸送システムが得られる。表面(II)はまた表面(Ｉ)の親水性パターンに適合した親水性パターンを有し得る。上記のように、親水性パターンはまた全表面を親水性化し、次いで所望の疎水性パターンをその上にプリントすることにより得られ得る。トップ／カバーは液体の蒸発を防止する。液体の添加／除去を意図した通し穴の形の小さい部分／点を有し得る。
【００４８】
疎水性表面にトップ／カバーを付ける有利な方法は、２０００年１月３０日に出願のＳＥ出願００００３００−４(本明細書に引用して包含させる)に記載のようなサーモグルーイングによる。トップ／カバーはまた培養チャンバーと環境雰囲気の間のガス交換を可能にする。
【００４９】
上記のタイプの液体輸送システムはまたバルブ、ポンプ、フィルター等を含み得る。
【００５０】
表面は無機および／または有機／生化学的性質の化学反応の実施に使用し得る。表面はクロマトグラフィーにおける、細胞培養のための、オリゴ／ポリペプチド、オリゴ／ポリヌクレオチド、他の有機ポリマーおよび他の有機化合物の固相化学合成のための、担体マトリックスとして使用し得る。本発明の表面で行う反応の説明的例は、慣用の化学反応、または幾何学的適合性を介した認識および水素結合、ファンデルヴァールス結合、双極子−双極子相互作用、電荷−双極子相互作用、電荷−電荷相互作用等に基づいた相互作用が関与する親和性に基づく反応である。細胞培養に関して、更なる詳細を下に記載する。
【００５１】
本発明により得られた表面の更なる有利な開発は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９９／１０３４７に記載されている(本明細書に引用して包含させる)。これらの開発において、本発明のプラズマ親水性化は、液体輸送システムの一部、または全体に適用されている。親水性化後、モノメトキシポリエチレングリコール鎖が結合するポリエチレンイミンが処理表面に吸着される。液体輸送システムの好ましい設計も記載されている。
【００５２】
本発明の第２の態様は、上で定義され、単独でまたは組み合わさって、上記の他の性質と適合する、永久的に親水性化された剥き出しのプラズマ処理ポリマー表面(プラスチック表面)である。
【００５３】
本発明の第３の態様は、本発明に従って得たおよび／または本明細書に記載され、本発明の親水性化法を通して達成できる任意の性質を有する表面の、上記または下記の種々の使用である。
【００５４】
マイクロデバイスを含むキット
第４の態様は、
(ａ)合成ポリマー(プラスチック)を含む、少なくとも一つのチャンバーおよび／または少なくとも一つの溝がある、液体輸送システムを含む、マイクロデバイス、および
(ｂ)デバイスで検出する蛍光物質
を含むキットである。
【００５５】
キットは、合成ポリマー物質が、本明細書で先に記載のものと同じ観点で、無視できる蛍光を有する。マイクロデバイスの溝およびチャンバーの表面は、例えば、好ましくは、本明細書に記載の方法に従った、ガスプラズマ処理により、全部または一部ガスプラズマ処理され得る。壁(表面)のプラスチックの化学組成およびその物理的パラメーターに関して、上記と同じ優先傾向を有する同じ物質を使用し得る。
【００５６】
別の親水性化プロトコールは、物質の液体接触表面上の、酸化酸およびＵＶ酸化での処理、コロナ放電処理、増加した数の極性基等を提供するポリマーでのグラフティングおよび慣用のコーティングである。言及される極性基は、例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、アミド、ポリエチレンオキサイド等である。
【００５７】
蛍光物質の説明的例は、有機または無機起源のフルオロフォアである。前者の場合、しばしば低分子量(典型的に＜１kD)である。重要なフルオロフォアは、４００−７５０nmの区画、好ましくは４８０−６７０nmの区画に明瞭な放出波長を明瞭な最大と共に有する。フルオレッセイン、天然または化学的修飾されていてもよいフィコシアニン、ローダミン、Texas Red、蛍光希土類キレート(特にユーロピウムおよびテルビウム)、セレン化カドミウムナノ粒子等が、典型的な例である。使用に際し、フルオロフォアは、共役形であり得、即ち、使用する試薬に共有結合し得る。この形において、蛍光物質は典型的に分子量１kDを有する。キット、特に蛍光物質と組み合わさったチャンバーおよび溝は、化学反応、アッセイ、分離、細胞培養、本明細書の他の場所に記載のような他のものの実施に使用し得る。
【００５８】
マイクロデバイス
第５の本発明の態様は、上記のようなマイクロデバイスであり、液体輸送システムがポリマー物質(材料)中／上に形成され、プラスチックは本質的に上記の種類の１個以上の脂肪族モノマーの重合化により得られる１個以上のポリマーから成る。この態様において、デバイスは本明細書に記載の他の本発明の態様の１個以上の性質を有し得る。
【００５９】
細胞培養
第６の本発明の態様は、細胞培養法である。本明細書で使用する細胞の培養なる用語は、単層培養、懸濁培養等を含み、細胞凝集物、組織、生検材料等は除く。本明細書で意図される細胞培養は、本来の正常細胞培養プラクティス、例えば
(ａ)細胞の数は、培養期間中に少なくとも２倍または少なくとも３倍にならなければならない。
(ｂ)不均質表現型集団を意味する接着依存性(anchorage-dependant)細胞の培養は、使用する表面に接着する細胞に関し、低淘汰圧下で行わなければならないこれは、接着依存性細胞に関し、細胞表面が培養細胞の少なくとも３０％が支持体表面に接着するように選択すしなければならないことを意味する。より好ましくは、この接着割合は５０％以上、例えば少なくとも９０％でなければならない。
(ｃ)細胞と支持体表面の相互作用を促進するために、細胞接着因子は、典型的に培養培地に存在する。哺乳類接着細胞に関して、培養培地は典型的に、確立された方法に従って１５％(ｗ／ｗ)までの血清を含む。
を含む。
【００６０】
細胞、特に接着依存性細胞の培養は、プラスチックから成る支持体表面の存在下で成されている。即時水接触角は４０°−６０°である。マイクロデバイス中での細胞培養に関して、この相対的に低い親水性に関する液体流体工学の問題がある。
【００６１】
本発明により、様々な種類の細胞の培養が、４０°−６０°より有意に低い即時水接触角を有する、超親水性支持体との接触により行うことができることが判明した。マイクロ装置に適用したとき、この発見は、流体に関する状態を改善する。第６の態様は、従って、細胞培養が、即時水接触角＜３０°、例えば＜２０°を提供するプラスチックから成る表面の存在下で行われることを特徴とする。表面は主に培養容器の内壁上に提供されるが、例えば、容器中に懸濁した粒子によりまた提供され得る。
【００６２】
即時水接触角は、好ましくは、上記のように反復洗浄に対して安定である親水性を意味する。
【００６３】
本明細書に記載されているガスプラズマ処理により親水性化された表面が好ましい。
【００６４】
好ましいプラズマは、一つでまたは組合わせて下記の荷電／極性基の混合物に挿入できる１個以上のガスを含む。試験したガスの中で、酸素と窒素の混合物が好ましく、一つのガスはあまり好ましくなく、アルゴンがもっとも好ましくない。二酸化硫黄および五酸化二リン(diphosphorous pentoxide)のようなガスは、それらがもたらす取扱い問題を無視した場合、酸素および／または窒素と共に使用することが有利である。
【００６５】
接着依存性細胞の十分な培養および行動の最も重要な因子は、細胞が生育する表面である。このタイプの細胞をそれらが接着できないまたは殆ど接着しない表面で培養した場合、それらは生育しない。細胞機能は細胞とその基底との間の動的相互作用を必要とする。これらの相互作用は、経膜タンパク質(インテグリン；Hynes RO, Integrins: versatility, modulation and signalling in cell adhesion. Cell 69: 11-25, 1992)が細胞の内部が外部基底と結合する場所である、分化した接触部位で起こる。表面官能基およびそれらの荷電特性特性ならびに親水性／疎水性、および表面遊離エネルギーが細胞行動に重要である(Lee JH et al., Biomaterials 18:351-358. 1997)。適当な密度でのアミン(アンモニウム)、アミド、ヒドロキシル、カルボキシル(カルボキシレート)およびスルホニル(スルホネート)およびスルフェート基が細胞表面または接着タンパク質との静電気的相互作用の部位として、および細胞外マトリックス成分上の接着を模倣するとして考えられる(Maroudas, J. Theor. Biol. 49 (1975) 417-442; Lee et al., Biomaterials 15 (1994) 704-711; and Lee et al., Biomaterials 18 (1997) 351-358)。
【００６６】
非接着依存性細胞は、しばしばそのライフサイクルのある部分の間、支持体表面を必要とする。
【００６７】
典型的に、荷電基の密度は、Å２あたり１−２基以上でなければならない。経験則として、HeLa細胞(１０−２０μm)のようなより小さい細胞は、線維芽細胞(約３０×１００μm)のようなより大きい細胞よりも高い密度を必要とする。最適値は、細胞タイプで異なり、当分野で既知のように決定し得る。
【００６８】
本発明のこの態様に従った細胞培養は、広範囲の細胞に当て嵌まる。細胞は、接着、または非接着依存性であり得る。それらは、正常または腫瘍起源でり得、それらは培養に際し遺伝的に操作され得る。それらは哺乳類、細菌、真菌(酵母)、植物、魚、鳥、両生類、爬虫類等由来であり得る。哺乳類細胞に関して、それらは任意の組織、例えば、上皮、内皮、線維芽細胞、筋肉、神経、色素、造血細胞および胚細胞由来であり得る。
【００６９】
各々のそれぞれの細胞の種類に関して、条件およびプロトコールを選択する規則は、他の容器中または粒子上で培養するのと原則として同じである。
【００７０】
ポリマー表面物質は、培養する細胞に毒性であってはならない。我々は、例えば、アクリロニトリルモノマーまたはアクリル酸モノマーから構築されたガスプラズマ処理ポリマーが、恐らく、ポリマーの分解のために毒性であり得ることを認識している。これは、これらの種類の材料を避けることにより、または使用する前の物質の適切な後処理により、回避し得る。
【００７１】
本発明は、以下に非限定的実施例により説明する。本発明は、明細書の一部である特許請求の範囲により更に定義される。
【００７２】
実験部分
材料
表面(ディスク)：ビスフェノールＡとポリメチルメタクリレートのポリカーボネートＣＤブランク、Toolex Alpha AB, Sundbyberg, Swedenで注入鋳造。非パターン化ＣＤブランク、Zeonex(日本ゼオン、日本からのシクロオレフィンコポリマー)またはLuran KR2536(BASF, Germanyからのスチレンアクリロニトリルコポリマー(SAN))を、Åmic AB, Uppsala, Swedenで注入鋳造。ディスクの平面(非パターン化)側を全ての実験で使用した。
【００７３】
ガス：酸素、アルゴンおよび合成空気は、l'Air Liquide, Franceからであった。
【００７４】
プラズマリアクター：Plasma Science, PS0500 (BOC Coating Technology)主調節可能パラメーター：無線周波数(ＲＦ)力０−５００Ｗおよびガス流０−１００または０−１０００sccm(標準cm３／分)。
通常、リアクターPS0500は３つの電極プレートを備えるが、再構築した後、一つのプレートのみ残る。
【００７５】
方法
洗浄：プラズマ処理前に、全てのディスクをpro analysiイソプロパノールに２分浸し、短く９９％エタノールでフラッシュし、家庭用(house)窒素で送風乾燥した。これは、プラズマ処理を妨害するかもしれない放出薬剤、静電気防止剤等の除去のために行った。
【００７６】
プラズマ処理：ディスクを二つの位置：チャンバー床から２０.５cmのプラスチック支持体上、または電極プレート上に置かれたガラス支持体(チャンバー床から４５cm)の一つでプラズマリアクター中に置いた。６０mTorrの基底圧に排気した後、ガスを入れ、ガス流を所望のレベルに調節した。次いでＲＦ力のスイッチを意図した時間入れ、リアクターチャンバーを最後に大気中に発散させた。
【００７７】
接触角測定：処理した直後、平衡水接触角を、Rame-Hartゴニオメーターベンチ上の静滴法で測定した。各サンプルに次いで、６個の測定を行った(各々３個の水滴の２面)。接触角測定をまた切片を２分、７０％エタノール／水中に浸し、家庭用窒素で送風乾燥させた後に行った。測定は、例えば、水滴の蒸発による接触角の変化を避けるために、液体が適用されてから２０秒以内に行った。
【００７８】
架橋の導入のチェック：ポリマー物質を、元のポリマーに関して適当であるが、プラズマ処理の間に架橋したポリマーに関して適当ではない溶媒に、ガスプラズマ処理前および後に溶解した。処理後の不溶性物質の存在を、架橋の導入の指標として取った。
【００７９】
極性酸素含有基の導入のチェック：ＥＳＣＡによる以前の試験は、表面におけるこれらの基のパターンがガスプラズマ処理により、表面結合酸素の増加を示唆する方法で変化することを示した。ＥＳＣＡは、細胞培養に重要であり得る種々の極性／荷電基の測定に使用できる。
【００８０】
貯蔵試験：プラズマ処理ディスクをポリスチレンペトリ皿に入れ、環境研究室条件に貯蔵した。一定間隔の小切片を切断し、即時水接触角を直接および７０％エタノール／水に浸した後の両方に測定した。
【００８１】
許容基準：親水性の観点から、予備的許容基準は、水接触角が、７０％エタノールで洗浄後２０°以下であることであった。
【００８２】
細胞培養：
表面を評価する方法：
細胞が基底層上に非常に高い要求を提示するので、細胞培養を、プラズマ処理表面の評価の方法として使用した。
【００８３】
プラズマ処理物質の切片を多ウェルプレートに入れ、細胞培地中の細胞の懸濁液を各ウェルに添加し、プレートを細胞培養雰囲気中、種々の時間インキュベートした。細胞接着、形態学および増殖を顕微鏡的に、および時々細胞接触マーカーおよび接着性接触に対する免疫細胞化学の使用により評価した。予備的結果は、プラズマ処理表面が細胞培養に使用でき、細胞が最適行動のための必要な特性を示すことを明らかにした。このような特徴は、正常細胞運動性および細胞分割の徴候である材料表面上の均質にパターン化された、適切な細胞拡散における殆ど全ての培養細胞の接着を含む。空胞、過剰な量のリソゾーム顆粒、気泡、または膜破壊を含む病理的徴候は、有意ではない。現在まで試験した細胞系は、MRC5(正常胚線維芽細胞)、HeLa(上皮様起源の頸部癌細胞)、Chang(肝癌、肝臓細胞)を含む。細胞は、表面上の広範囲の要求をカバーするように選択している。非接着依存性細胞は、それ自体、非常に小さな要求を表面上にした。このような細胞の例(Rajiリンパ腫)は、プラズマ処理表面の存在下で十分培養されている。
【００８４】
我々の結果は、我々の発明のプラズマ親水性化表面の十分な細胞培養特性を示す。十分な細胞接着および生育が、線維芽細胞に関して１０−４０°の区画の水接触角を有する表面上で、および上皮様細胞に関しては５−４０°の区画で達成される。
【００８５】
結果
平面ＣＤディスクプラズマ処理
一つの電極プレートを供えたPlasma Science PS0500リアクター
サンプルを、チャンバーの中心のリアクターチャンバー床から２０cmのポリプロピレン支持体上に置いた。
【表１】
0005025043.tif 000002
【表２】
0005025043.tif 000003
【表３】
0005025043.tif 000004