(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理食塩水、水中油エマルションもしくは水不混和固相、および所望により水相と、アジュバントとしての、下記一般式で表される１以上の二糖誘導体：
【化１】
0005025869.tif 000056
〔式中、
(i)少なくとも３個かつＮ−１個以下のＲ基は脂肪酸エステル基であり、ここで、脂肪酸エステル基の各々は−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３（式中、ｘは６〜１４である）の一般式で表され、かつ、
(ii)少なくとも１個かつＮ−１個以下のＲ基は陰イオン基−ＳＯ２−ＯＲ１（ここで、Ｒ１は一価の陽イオンである）であり、
Ｎは二糖誘導体中のＲ基の数であり、
脂肪酸エステル基と陰イオン基の合計数はＮを超えることはなく、残りのＲ基はＨである〕
とを含んでなる、アジュバント製剤。
【請求項２】
前記二糖誘導体が、Ｎ−２個以下、またはＮ−３個以下の陰イオン基−ＳＯ２−ＯＲ１を有する、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項３】
前記二糖誘導体が、少なくとも４個かつＮ−１個以下の脂肪酸エステル基と、Ｎ−３個以下、またはＮ−４個以下の陰イオン基−ＳＯ２−ＯＲ１を有する、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項４】
前記二糖誘導体が、２、３または４個の陰イオン基−ＳＯ２−ＯＲ１と、少なくとも３個の脂肪酸エステル基を有し、陰イオン基−ＳＯ２−ＯＲ１と脂肪酸エステル基の合計数が６または７個である、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項５】
前記二糖誘導体が、少なくとも１個の陰イオン基、または１もしくは４個の陰イオン基と、少なくとも３個の脂肪酸エステル基を有し、陰イオン基と脂肪酸エステル基の合計数が６〜９個の範囲、または７または８個である、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項６】
一価の陽イオンが、独立して、Ｈ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋およびＮＨ４＋からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項７】
水中油エマルションを含んでなり、該水中油エマルションが、スクアラン、鉱油、植物油、ヘキサデカン、フルオロカーボンまたはシリコーン油である水不混和液相を含む、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項８】
乳化剤または安定剤をさらに含んでなる、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項９】
乳化剤または安定剤が、親水性親油性バランス値が１０を超える非イオン界面活性剤、糖脂肪酸エステル、または親水性親油性バランス値が１０を超える陰イオン界面活性剤である、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項１０】
乳化剤または安定剤が二糖誘導体である、請求項８に記載のアジュバント製剤。
【請求項１１】
水不混和固相が不溶性の塩である、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項１２】
不溶性の塩が、アルミニウム塩またはカルシウム塩、好ましくは水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、シリカまたはその混合物である、請求項１１に記載のアジュバント製剤。
【請求項１３】
請求項１に記載のアジュバント製剤を含んでなり、抗原性成分をさらに含んでなる、ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、単糖誘導体および二糖誘導体、ならびにその製造方法に関する。本発明はさらに、とりわけ医療、医薬、化粧品および食品用途におけるこれらの誘導体の使用に関する。
【０００２】
糖脂肪酸エステルはそれらの乳化力についてよく知られている。それらは水中油型および油中水型のいずれかで、大きな分散相を小さな連続相で乳化させることができる。さらに、糖脂肪酸エステルについては、それらのＨＬＢ値（親水性親油性バランス、スクロースエステルのＨＬＢ値は＜１から１６まで様々である）が広範囲であることもよく知られている。糖脂肪酸エステルのＨＬＢ値は、糖一分子当たりの脂肪酸エステルの数および脂肪酸エステルの炭素鎖の長さによって異なる。
【０００３】
糖脂肪酸エステルはさらに、油脂の結晶化を促進または阻害する能力、抗菌作用、湿潤および分散作用、タンパク質の熱および凍結変性防止剤としての使用の可能性、ならびに非特異的宿主防御の増強作用など、その他いくつかの用途について知られている。
【０００４】
Nigam et al. (Br. J. Cancer, 46, pp. 782-793, 1982)には、アラビノース、ガラクトース、グルコース、マンノース、セロビオース、ラクトース、マルトース、およびスクロースの種々の脂肪酸エステルのin vitroおよびin vivo免疫刺激作用が開示されている。抗体応答の増強倍数は１から＜１０まで様々であった。
【０００５】
Nigam et al. (Cancer Res. 38, pp. 3315-3312, 1978)には、二糖脂肪酸エステル、特に四パルミチン酸マルトースの免疫増強活性が開示されている。
【０００６】
Nishikawa et al. (Chem Pharm. Bull. 29, pp. 505-513, 1981)には、スクロース脂肪酸エステルの抗腫瘍活性が開示されている。
【０００７】
Azuma（欧州特許第ＥＰ１，５７２，３６８号公報）には、ワクチン効力に対する糖脂肪酸エステルの増強作用（これを本明細書では「アジュバント活性」または「アジュバント性」という）が開示されている。
【０００８】
水中油エマルションと組み合わせた二糖脂肪酸エステルのワクチン効力に対する刺激作用はよく知られている。
【０００９】
Nigam et al. (Br. J. Cancer, 46, pp. 782-793, 1982)にはまた、スクロース脂肪酸エステルとスクアラン水中油エマルションの組合せ、ならびにアジュバントとしてのそれらの使用が開示されている。しかしながら、スクロース八オレイン酸エステルでは、たとえあるにしてもワクチン効力に対する刺激作用はわずかなものであるに過ぎないことが示されている（本明細書の下記実施例も参照）。スクロース八オレイン酸エステルとスクアラン水中油エマルション組合せでさえ、ワクチン効力に対する増強作用は弱く、ワクチンアジュバントとして用いるには不十分であることが示されている（本明細書の下記実施例も参照）。
【００１０】
スクロース硫酸エステルもよく知られている。米国特許第３，４３２，４８９号明細書には、種々の二糖ポリスルフェートおよびそれからのアルミニウム錯体の合成方法が、それらの適当な治療用途ともに開示されている。さらに詳しくは、この特許明細書には、ピリジンをはじめとする種々の溶媒中で、スクロースをクロロスルホン酸またはＳＯ３−ピリジンをはじめとする多くの硫酸化剤と反応させることが記載されている。さらに、米国特許第３，４３２，４８９号明細書には、スクロース硫酸エステル、特にスクラルファートとしても知られる、スクロース八硫酸エステルとアルミニウム塩との錯体の医薬および医療用途が開示されている。胃腸障害の治療におけるスクラルファートの適用はよく知られている。
【００１１】
ＷＯ９０／０２１３３号公報には、医療用のスクロース硫酸エステルおよびそのアルミニウム錯体、ならびにその製剤の製造方法が開示されている。
【００１２】
Bazin et al. (Carbohydrate Res. 309, pp. 189-205, 1998)には、アシルスクロースのスルホン化によるスクロースベース界面活性剤の位置選択的合成が開示されている。開示された誘導体は、スクロース一分子当たり１個のアシル基と、スクロース一分子当たり１個の硫酸基を含む。開示された方法は、スクロース分子の特定の水酸基を誘導体化する位置選択的方法である。この方法では、特定の水酸基をブロッキングするのにジブチルスタンニレン錯体が用いられる。この製造方法の欠点はその煩雑性である。
【００１３】
Hilgers et al. (Immunology 60, pp. 141-146, 1986)には、スルホリポ多糖としても知られる、脂肪酸エステルと硫酸エステルの双方を含有する多糖類、およびワクチンのアジュバントとしてのそれらの使用が開示されている。さらに、Hilgers et al. (Immunology 60, pp. 141-146, 1986; WO96/20222)には、この多糖を塩化アコイルと接触させ、次いでスルホン化剤と接触させることによるスルホリポ多糖の製造方法が開示されている。
【００１４】
Mashihi and Hilgers（ＥＰ−Ａ−０−２９５，７４９号公報）には、スルホリポ多糖と水中油エマルションの組合せ、特に親水性スルホリポ多糖と水中スクアランエマルションの組合せが開示されている。Mashihi and Hilgers（ＥＰ−Ａ−０−２９５，７４９号公報）にはさらに、非特異的宿主防御機構に対するスルホリポ多糖、特に親水性スルホリポ多糖と水中油エマルション、特に水中スクアランエマルションの組合せの増強作用が開示されている。
【００１５】
Hilgers et al. (Vaccine 12, pp. 653-660, 1994; Vaccine 12, pp. 661-665, 1994; WO96/20008; Vaccine 17, pp. 219-228, 1999)には、スルホリポ多糖、特に疎水性スルホリポ多糖と水中油エマルション、特に水中スクアランエマルション、水中鉱油エマルション、水中大豆油エマルションおよび水中ヘキサデカンの組合せが開示されている。スルホリポ多糖、特に疎水性スルホリポ多糖と水中油エマルション、特に水中スクアランエマルション、水中鉱油エマルション、水中大豆油エマルションおよび水中ヘキサデカンエマルションの組合せの安定な製剤の製造方法も開示されている。
【００１６】
ＷＯ９６／２０００８号公報に開示されているスルホリポ多糖の製造方法は、（１）まず、多糖を塩化アコイルと接触させ、次いで（２）その脂質多糖誘導体をスルホン化剤と接触させるという二工程を含む。両工程ともランダムな化学付加反応であると考えられ、エステル化されている多糖分子の各水酸基の確率は等しく、この工程中変化しないことを意味する。このスルホリポ多糖の製造方法によって、多糖一分子当たりに存在する硫酸エステルの数、多糖一分子当たりの水酸基の数、ならびに多糖一分子における脂肪酸エステル、硫酸エステルおよび水酸基の分布が異なる種々のスルホリポ多糖誘導体が形成される。得られた製剤中の化学的に異なるスルホリポ多糖誘導体の数は、出発材料中の種々の多糖分子の数により、また多糖一分子当たりの水酸基の数により決まる。
【００１７】
スルホリポ多糖製剤中に存在する化学的に異なる多数のスルホリポ多糖誘導体について上記の点を説明するため、Hilgers et al. （ＷＯ９６／２０００８号公報）によって開示されているように、以下の例が含まれる。
【００１８】
当技術分野で公知の最も良く化学的に定義されているスルホリポ多糖誘導体製剤は、β−シクロデキストリンから得られるスルホリポ多糖製剤（スルホリポ−シクロデキストリンとしても知られる）である。このスルホリポ−シクロデキストリン製剤は多糖一分子当たり７個のグルコース分子を有する多糖から得られる。このスルホリポ−シクロデキストリン製剤は、開示された最も小さい分子量の多糖から誘導され、最も少ない水酸基を有する。β−シクロデキストリンの分子量は１１５３Ｄａであり、一分子当たりの水酸基は２１個である。これらの水酸基は脂肪酸エステルまたは硫酸エステルにより化学的に付加され得るか、あるいは不変である。スルホリポ−シクロデキストリン製剤に存在する誘導体はβ−シクロデキストリン一分子当たりの脂肪酸エステルの数、β−シクロデキストリン一分子当たりの硫酸エステルの数、β−シクロデキストリン一分子当たりの水酸基の数、β−シクロデキストリン一分子におけるこれらの脂肪酸エステル、硫酸エステルおよび水酸基の分布が異なる。当技術分野で公知の方法(Vaccine 17, pp. 219-228, 1999; ＷＯ９６／２０２２２号公報)によって製造されたスルホリポ−シクロデキストリン製剤における化学的に異なる誘導体の数は極めて多い。β−シクロデキストリン一分子における脂肪酸エステル、硫酸エステルおよび水酸基の分布を考慮しない場合、スルホリポ−シクロデキストリン製剤中の化学的に異なる誘導体の数は数百であり得る（例えば２１０）。また、β−シクロデキストリン一分子における脂肪酸エステル、硫酸エステルおよび水酸基の分布を考慮する場合には、スルホリポ−シクロデキストリン製剤における化学的に異なる誘導体の数は、
３３＋｛（３３）７−３３｝／７＝１，４９４，３３６，１９５
である。
【００１９】
スルホリポ−シクロデキストリン製剤における化学的に異なる誘導体の濃度は、出発材料、すなわちHilgers et al.（ＷＯ９６／２０２２２号公報）により開示されたようにβ−シクロデキストリン、塩化アコイルおよびスルホン化剤のモル比または重量比を変えることで調整することができる。スルホリポ−シクロデキストリン製剤に存在する化学的に異なる誘導体の濃度は数学的に見積もることができる。スルホリポ多糖誘導体の製造に含まれる両化学反応が完全にランダムであれば、スルホリポ−シクロデキストリン製剤に存在する特定の誘導体の最大濃度は大抵５％未満となる。β−シクロデキストリンより分子当たりの水酸基の数がずっと多い多糖から得られたスルホリポ多糖製剤は、含まれる化学的に異なる誘導体の数がずっと多く、従って、含まれる誘導体それぞれの濃度は低くなる。
【００２０】
このように、Hilgers et al.（ＷＯ９６／２０２２２号公報；ＷＯ９６／２０００８号公報）の開示に従って得られるスルホリポ多糖製剤は化学的に異なる多数の誘導体を含み、それはある状況では不利となり得るものと結論づけることができる。また、特定の誘導体が極めて少量でしか存在しないということも不利となり得る。
【００２１】
スルホリポ多糖の欠点は様々な物理的、化学的および物理化学的特性（溶解度、張力活性など）を有することであり、それらの意図される使用（例えば、洗剤または乳化剤として）には適当なものではあるが、他の分子とともに使用するには、かつ／または他の使用には適当でない。このため、「適当な」スルホリポ多糖誘導体から「不適当な」スルホリポ多糖誘導体を分離することが望まれる。このような分離は当技術分野で周知の従来の分離技術によって行うことができる。しかし、記載したように、スルホリポ多糖誘製剤中の「適当な」誘導体の濃度は比較的低い。また、「不適当な」スルホリポ多糖誘導体と「適当な」スルホリポ多糖誘導体の化学特性および物理特性は酷似している可能性がある。従って、分離方法は煩雑で、コストも時間もかかる。
【００２２】
Hilgers et al.（ＷＯ９６／２０２２２号公報；ＷＯ９６／２０００８号公報）により開示されているスルホリポ多糖製剤のさらなる欠点としては、比較的大量の有機溶媒が用いられ、最終のスルホリポ多糖製剤からこれを除去する必要があるということである。これは困難であることが多く、かつ／または特に工業規模では難しく、コストがかかり、また危険でさえある方法の使用を含む。
【００２３】
従って、種々の目的のための幅広い用途を可能とする物理化学的および／または生物学的および／またはバイオ医薬的特性を有する糖誘導体が依然として必要とされていることは明らかである。さらに、かかる糖誘導体の工業規模での容易、安全かつ安価な製造方法も必要とされている。
【００２４】
本発明の目的は、多様な水不混和分子と安定な製剤を形成し得る糖誘導体を提供することにある。目的の糖誘導体は極めて有利な物理的および／または物理化学的および／または生物学的および／または医薬的特性を有するものであり、医療用途、例えば、ワクチンおよび／またはワクチンアジュバントの製造における用途など、種々の用途に好適なものとなる。本発明の目的は、さらに、かかる糖誘導体の簡便、容易かつ安価な製造方法を提供することにある。
【００２５】
本発明によれば、極めて有利な化学的、物理的および物理化学的特性を有する糖誘導体が提供される。これらの誘導体は、単糖および二糖分子に対する種々の化学的（および／または酵素的）修飾によるものである。
【００２６】
本発明は、単糖分子（単糖分子には開放された水酸基が３、４または５個ある）または二糖類（二糖分子には開放された水酸基が好ましくは８個ある）の開放された水酸基の少なくとも１つが修飾されている糖誘導体に関する。これらの修飾は、水酸基の水素原子または水酸基それ自体全体のいずれかの、多様な置換基の１つによる置換である。このようにして、行われた置換の数およびタイプに応じて、所望の特性を有する単糖または二糖誘導体が得られる。
【００２７】
特に、本発明は、１個〜Ｎ−１個の脂肪酸エステル基（Ｎはその誘導体が誘導される単糖または二糖の水酸基の数である）を有する新規な単糖または二糖誘導体に関する。好ましい実施態様によれば、単糖または二糖誘導体は、１個〜Ｎ−１個の陰イオン基をさらに含んでなり、この場合には、脂肪酸エステル基と陰イオン基の合計数はＮを超えない。陰イオン基と脂肪酸エステル基の合計数は１〜Ｎである。好ましくは、単糖または二糖誘導体は２個以下の開放された水酸基を有し、水酸基、脂肪酸エステルおよび陰イオン基の合計数はＮを超えない。
【００２８】
好ましい実施態様によれば、二糖誘導体は少なくとも２個、さらに好ましくは少なくとも３個、さらに好ましくは少なくとも４または５個、最も好ましくは少なくとも６個、かつＮ−１個以下の脂肪酸エステル基と、少なくとも１個、かつＮ−２個以下、さらに好ましくはＮ−３個以下、さらに好ましくはＮ−４またはＮ−５個以下、最も好ましくはＮ−６個以下の陰イオン基を有し、脂肪酸エステルと陰イオン基の合計数はＮを超えない（Ｎはその誘導体が誘導される二糖の水酸基の数である）。
【００２９】
本発明による単糖誘導体は、好ましくは、少なくとも２個、さらに好ましくは少なくとも３または４個、かつＮ−１個以下の脂肪酸エステルと、少なくとも１個、かつＮ−２個以下、さらに好ましくはＮ−３個以下の陰イオン基を有し、脂肪酸エステルと陰イオン基の合計数はＮを超えない（Ｎはその誘導体が誘導される二糖の水酸基の数である）。
【００３０】
従って、本発明による特に好ましい誘導体化単糖は、少なくとも１個の陰イオン基と少なくとも２個の脂肪酸エステルを有し、陰イオン基と脂肪酸エステルの合計数は３〜５の範囲であり、特に好ましい誘導体化二糖は、少なくとも１個の陰イオン基、好ましくは１または４個の陰イオン基と、少なくとも１個の脂肪酸エステルを有し、陰イオン基と脂肪酸エステルの合計数は６〜８個の範囲、好ましくは７または８個である。
【００３１】
本明細書において「脂肪酸エステル基」または「脂肪酸基」とは、少なくとも８個の炭素原子の直鎖炭化水素鎖を含んでなる脂肪酸エステル基をいう。本明細書において「陰イオン基」とは、負電荷を持つ（すなわち、中性ｐＨまたはその誘導体が適用される環境のｐＨで負電荷を有する）部分である。かかる陰イオン基としては、例えば、硫酸基、スルホン酸基またはリン酸基が挙げられる。好ましい陰イオン基としては、「硫酸エステル基」、すなわち一般式ＳＯ２−ＯＲを有する基、「リン酸エステル基」、すなわち一般式ＰＯ２−（ＯＲ）２（ここで、Ｒは一価の陽イオンを形成する原子および／または分子の群から選択される）が挙げられる。「水酸基」とは、式−ＯＨを有する基をいう。
【００３２】
本明細書において「糖誘導体」とは、単糖および二糖誘導体をいう。
【００３３】
本発明による糖誘導体は、有利には水不混和分子の乳化剤として用いられる。水不混和分子の本発明による糖誘導体との複合体形成により、その水不混和分子製剤のバイオアベラビリティー、生体活性および安定性に関する著しい利点がもたらされる。糖誘導体と標的分子の間の会合の向上は、同時に水不混和分子製剤のバイオアベラビリティー、生体活性および／または医薬活性、ならびに物理特性（例えば安定性）に改良をもたらす。本発明の単糖または二糖誘導体の物理化学的特性は、存在する陰イオン基の数と脂肪酸エステル基の数（および脂肪酸エステル基に対する陰イオン基の割合）（また、小さな程度ではあるが水酸基の数）、ならびに陰イオン基の対イオンの性質および脂肪酸エステル基のタイプおよび性質によって異なる。本発明による単糖誘導体は、好ましくは少なくとも１個かつ３または４個以下の陰イオン基を有し、二糖誘導体は、好ましくは少なくとも１個かつ７個以下の陰イオン基を有する。
【００３４】
本発明による糖誘導体はさらに、ワクチンのアジュバントとしての使用に極めて適している。抗原性成分と本発明の糖誘導体との複合体を形成することで、その抗原性成分製剤のバイオアベラビリティー、生体活性および安定性が向上するとい点で著しい利点がもたらされる。糖誘導体と抗原性成分との会合における向上は、ワクチンの効力および／または安定性が同時に改良され、免疫反応が増強するか、または免疫系が活性化され得る。本明細書において「抗原性成分」とは、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生虫または腫瘍細胞などの抗原自体、微生物サブユニット、タンパク質、多糖、ペプチド、糖タンパク質、多糖−タンパク質コンジュゲート、ペプチド−タンパク質コンジュゲートなどのアレルゲンなど、またはそれに対して免疫応答が生じると考えられる他のいずれかの物質であるいずれかの成分または材料をいう。この抗原性成分は、例えば１以上の活性生物、不活化した生物、またはいわゆるサブユニット（後者は例えば、合成により、または組換えＤＮＡ技術により製造されたもの、あるいは生物から単離されたもの）からなるか、あるいはそれらを含有し得る。抗原性成分はさらに、抗原、例えば免疫化された被験体（そこで抗原性成分の形成を誘導することができる）の宿主細胞（のＤＮＡ）に組み込むことができるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を誘導することができるいずれの成分をもいう。かかるヌクレオチド配列を含んでなるワクチンはまた、ＤＮＡワクチンまたはＲＮＡワクチンとも呼ばれる。
【００３５】
本発明による単糖誘導体は一般式Ｃ５Ｈ１０Ｏ５を有するペントースまたは一般式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有するヘキソースから誘導されるのが好ましい。好適なペントースは、アラビノース、リボース、キシロースからなる群から選択され得る。好適なヘキソースは、アロロース、アルトリオース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グロース、イノシトール、マンノースおよびソルボースからなる群から選択され得る。好ましくは、新規な単糖誘導体はフルクトース、ガラクトースまたはグルコースから誘導される。
【００３６】
本発明による二糖誘導体は、好ましくは一般式Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１の二糖から誘導され、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクトース、ラクツロース、マルトース、メリビオース、スクロースおよびツラノースからなる群から好適に選択され得る。好ましくは、新規な二糖誘導体はラクトース、マルトースまたはスクロースから誘導される。最も好ましくは、本発明による糖誘導体はスクロースから誘導される。
【００３７】
脂肪酸エステル基は、好ましくは−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３（式中、ｘは４〜２４、好ましくは４〜２２、さらに好ましくは６〜１８、最も好ましくは６〜１４である）の一般化学構造を有する直鎖炭素鎖エステル基、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ３（式中、ｘ＋ｙは４〜２４、好ましくは４〜２２、さらに好ましくは６〜１４である）の一般構造を有するエステル基、または−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｚ−ＣＨ３（式中、ｘ＋ｙ＋ｚは２〜２０、好ましくは４〜１８、さらに好ましくは６〜１４である）の一般構造を有する基である。これらの脂肪酸エステル基の組合せもまた存在し得る。
【００３８】
−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３の一般構造を有する特に好ましい脂肪酸エステル基は、ｘが４（ヘキサノン酸）、６（オクタノン酸）、８（デカン酸）、１０（ドデカン酸；本明細書ではラウリン酸とも呼ばれる）、１２（ミリスチン酸としても知られるテトラデカン酸）、１４（パルミチン酸としても知られるヘキサデカン酸）、および１６（ステアリン酸としても知られるオクタデカン酸）であるものである。−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ３の一般構造を有する好ましい脂肪酸エステル基は、ｘ＋ｙが１４（例えばオレイン酸）であるものである。−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｚ−ＣＨ３の一般構造を有する好ましい脂肪酸エステル基は、ｘ＋ｙ＋ｚが１２（例えばリノール酸）であるものである。
【００３９】
陰イオン基は、好ましくは一般構造−Ｏ−ＳＯ２−ＯＲまたは−ＰＯ２−（ＯＲ）２（ここで、Ｒは一価の陽イオンを形成する原子および／または分子からなる群から選択される）を有する。Ｒの例としては、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋またはＮＨ４＋が挙げられる。特定の具体例としては、硫酸エステル基−Ｏ−ＳＯ２−ＯＨ、−Ｏ−ＳＯ２−ＯＮａ、または−Ｏ−ＳＯ２−ＯＮＨ４を有する糖誘導体が挙げられる。これらの硫酸エステル基の組合せも存在し得る。
【００４０】
本発明はさらに、上記単糖および二糖誘導体の容易、安全かつ安価な製造方法に関する。本方法は、単糖または二糖を塩化アコイルおよびスルホン化剤と反応させることを含んでなる。単糖または二糖は、該塩化アコイルおよびスルホン化剤と順次に反応させてもよいし、同時に反応させてもよい。
【００４１】
以下に詳細に論じるように、（１）用いる単糖または二糖の性質を変えること、（２）用いる種々の出発材料の量（割合）を変えること、（３）用いる塩化アコイルの性質を変えること、および／または（４）精製に用いる水溶液において用いられる陽イオンを変えることのいずれかにより、種々の単糖または二糖誘導体製剤が得られ、それらは特異な物理化学的特性を有することが分かっている。このようにして調節できる単糖または二糖誘導体の特性としては、水性溶媒（水）および非水性（非極性）溶媒中での溶解度、他の分子とミセルおよび混合ミセルを形成する能力、疎水面への吸着力、親水面への吸着力、生体材料への吸着力、および界面活性／張力活性がある。
【００４２】
好ましい塩化アコイルとしては、塩化ヘキサノイル、塩化オクタノイル、塩化デカノイル、塩化ドデカノイル（塩化ラウロイル）、塩化テトラデカノイル（塩化ミリストイル）、塩化ヘキサデカノイル（塩化パルミトイル）、塩化オクタデカノイル（塩化ステアロイルおよび塩化オレオイル）、およびこれらの混合物がある。
【００４３】
本明細書では特定の具体例として、水に対する溶解度が高く、有機溶媒中の溶解度が低く、疎水分子との結合力が小さく、かつ、疎水面との結合力が小さい単糖または二糖誘導体が開示される。この点で塩化アコイルは塩化オクタノイル、塩化デカノイル、塩化ドデカノイル、塩化テトラデカノイル、およびその混合物の群から選択するのが好ましい。この点でさらに好ましくは、塩化アコイルは塩化オクタノイル、塩化デカノイル、および／または塩化ドデカノイルの群から選択される。この点で最も好ましくは、塩化アコイルは塩化デカノイルおよび／または塩化ドデカノイルである。
【００４４】
本明細書では他の具体例として、水に対する溶解度が低く、有機溶媒中の溶解度が高く、疎水分子との結合力が大きく、かつ、疎水面との結合力が大きい単糖または二糖誘導体が開示される。この点で塩化アコイルは塩化ドデカノイル、塩化テトラデカノイル、塩化ヘキサデカノイル、塩化オクタデカノイル、およびその混合物の群から選択するのが好ましい。この点でさらに好ましくは、塩化アコイルは塩化テトラデカノイル、塩化ヘキサデカノイル、および／または塩化オクタデカノイルである。この点で最も好ましくは、塩化アコイルは塩化ヘキサデカノイルおよび／または塩化オクタデカノイルである。
【００４５】
好ましいスルホン化剤としては、ＳＯ３ガス、ＨＣｌＳＯ３（クロロスルホン酸）、ＳＯ３−ピリジン、ＳＯ３−２−メチルピリジン、ＳＯ３−２，６−ジメチルピリジン、ＳＯ３−ジメチルホルムアミド、ＳＯ３−トリメチルアミン、ＳＯ３−トリエチルアミン、ＳＯ３−ジメチルアラニン、ＳＯ３−Ｎ−エチルモルホリン、ＳＯ３−ジエチルアラニン、ＳＯ３−ジオキサンまたはこれらの混合物がある。スルホン化剤は、好ましくはＳＯ３−ピリジンまたはＳＯ３ガスである。
【００４６】
単糖または二糖は、１：１〜１：Ｎ−１のモル比の塩化アコイル、および１：１〜１：Ｎ−１のモル比のスルホン化剤と反応させるのが好ましく、ここでは塩化アコイルエステルの量とスルホン化剤の量の合計がＮを超えず、Ｎはその誘導体が誘導される単糖または二糖の水酸基の数である。当業者ならば試薬間のモル比を適宜選択することで、所望の数の脂肪酸エステル基および硫酸エステル基を有する単糖または二糖誘導体を便宜に製造することができる。
【００４７】
単糖または二糖は、無水の非プロトン性媒質中で塩化アコイルおよびスルホン化剤と反応させるのが好ましい。本方法は、好ましくは、可能な限り少量の有機溶媒中で行う。好ましくは、これらの有機溶媒は、それらが例えば沈殿、濾過、結晶化または蒸発により反応混合物から容易に除去できるように選択する。好ましい有機溶媒はピリジンおよびＮ−メチルピロリジノンである。極めて好ましいのは無水ジメチルホルムアミドと無水ピリジンの混合物、および無水Ｎ−眼IT類似体ピロリジノンと無水ピリジンの混合物である。
【００４８】
ピリジンを用いる場合、その量は好ましくは用いる塩化アコイルの量の二倍未満である。用いるピリジンの量は塩化アコイルの量と同等であるのがさらに好ましい。
【００４９】
例えば、単糖または二糖を塩化アコイルと反応させて二糖脂肪酸エステルを形成した後、それをスルホン化剤と反応させることが可能である。
【００５０】
好ましくは、単糖または二糖を塩化アコイルと約６０〜７０℃で４〜８時間、好ましくは約６時間反応させる。この後、反応混合物を周囲温度で１８時間まで静置することが望ましい。スルホン化剤との反応は周囲温度〜７０℃の間で少なくとも６時間行うことが好ましい。好ましい実施態様によれば、単糖または二糖を塩化アコイルおよびスルホン化剤と同時に約６０〜７０℃で少なくとも６時間反応させる。この後、反応混合物を周囲温度で１８時間まで静置することが望ましい。
【００５１】
別の好ましい実施態様によれば、単糖または二糖を、まず周囲温度で塩化アコイルおよびスルホン化剤と反応させ、その後温度を約５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、さらに好ましくは約６０℃にする。
【００５２】
この点で、周囲温度で処理を行うということは、その処理に対して温度が重要なものではないということである。かかる特徴から、広範囲な温度で、同時に省力的な広範囲な条件下で処理が行われる。約１０℃といった低い周囲温度であってもよいと考えられる。好ましい周囲温度は約１５℃以上、さらに好ましくは約１８℃以上である。さらに、好ましい周囲温度は約５０℃以下、さらに好ましくは約４０℃以下、最も好ましくは約２５℃以下である。
【００５３】
本発明の単糖または二糖誘導体は、単糖または二糖と塩化アコイルおよびスルホン化剤との二段階反応によって得られる。好ましい実施態様によれば、この反応は単糖または二糖を塩化アコイルおよびスルホン化剤と同時に反応させ、一段階で行われる。もちろん、単糖脂肪酸エステルまたは二糖脂肪酸エステル、例えばスクロースラウリン酸エステルＬ−１９５(Mitsubishi, Japan)、スクロースラウリン酸エステルＬ−５９５(Mitsubishi, Japan)、またはスクロースステアリン酸エステルＳ−１９５(Mitsubishi, Japan)、から出発して、この出発材料を１以上のスルホン化剤と反応させて所望の単糖または二糖誘導体を形成することもできる。
【００５４】
上述のように、使用する有機溶媒は可能な限り少量であることが好ましい。この点で、単糖または二糖を有機溶媒に加熱溶解して透明な均質溶液を得ることが好ましい。特に、この均質溶液の調製方法は有機溶媒に比較的わずかしか溶けない、または有機溶媒に対して難溶性の糖、例えばスクロースおよびラクトースに好適である。これらの糖を最少量の有機溶媒へ溶解するため、温度を＞８０℃まで上昇させる。好ましくは、有機溶媒の温度を＞９０℃まで上昇させる。
【００５５】
好ましい実施態様によれば、反応完了後、有機溶媒中の単糖または二糖誘導体をＮａＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、ＫＯＨ溶液で中和し、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋のうちの１つの陽イオンを含む硫酸エステル基を有する単糖または二糖誘導体を得る。
【００５６】
目的の単糖または二糖誘導体を冷却して回収すると、結果として２または３以上の異なる相が形成され、その１つの相に単糖または二糖誘導体が多く含まれている。これを濾過、デカンテーションなどをはじめとする当技術分野で周知の方法により回収する。残留する有機溶媒は、例えば高温および減圧で蒸発させるか、または水相で洗浄することによりこの相から除去する。冷却後、有機溶媒および反応で形成された副生成物はいずれも、単糖または二糖誘導体が全くまたはほとんど含まれない１つまたは２つの相に存在すると考えられる。この相またはこれらの相は濾過、デカンテーションなどをはじめとする当技術分野で周知の方法により除去できる。誘導体化した糖類は当技術分野で公知のその他の技術によりさらに精製してもよい。
【００５７】
単糖または二糖誘導体を、単糖または二糖誘導体の製造に用いた有機溶媒と不混和性の液体を用いて反応混合物から抽出することができる。これによって、単糖または二糖誘導体を副生成物およびその製造に用いた有機溶媒から分離するまたは単離する。この点で、上記の液体が揮発性有機溶媒であるか、または糖誘導体の最終の製剤の構成要素であることが好ましい。上記の液体が油状物質であり、最終の製剤がエマルションであることがさらに好ましい。最も好ましくは、上記の液体はスクアランである。
【００５８】
本発明による単糖誘導体および二糖誘導体の合成に関与する２つの化学反応はランダム反応であると考えられるため、単糖または二糖一分子当たりの硫酸エステル基の数が異なり、かつ／または単糖または二糖一分子当たりの脂肪酸エステル基の数が異なり、その結果、それらが有する構造および物理化学的特性が異なる様々な単糖または二糖誘導体の集合物が得られる。
【００５９】
しかしながら、単糖または二糖誘導体の製造における化学的に異なる誘導体の数は、従前に記載されたHilgers et al.により開示されたスルホリポ多糖の製造（ＷＯ９６／２０２２２号公報；ＷＯ９６／２０００８号公報）によるものよりもかなり少ないことは特筆すべきである。二糖分子における脂肪酸エステル基、硫酸エステル基および水酸基の分布を考慮しない場合、本発明に従って８個の水酸基を有する二糖から製造される製剤中の異なる誘導体の数は２８である。二糖分子における脂肪酸エステル基、硫酸エステル基および水酸基の分布を考慮する場合には、本発明に従って８個の水酸基を有する二糖から得られる異なる誘導体の数は３８＝６，５６１である。これらの数がスルホリポ−シクロデキストリンのものに比べて低いこと（それぞれ２１０と１，４９４，３３６，１９５であった）がそれらの使用および製造においてかなり有利である。
【００６０】
従って、単糖または二糖誘導体を製造する本方法によってかかる誘導体の混合物が得られる。これらの誘導体は、結晶化、沈殿、濾過、蒸発、透析または限外濾過などの技術を用いて分離することができる。用いた有機溶媒および形成された副生成物の除去については、得られた様々な単糖または二糖の分離と同時に行うことが好ましい。好ましくは、これを相分離、クロマトグラフィー、沈殿、溶解、抽出、またはこれらの技術の組合せによって行う。さらに好ましくは、単糖または二糖誘導体を凍結乾燥により乾燥単糖または二糖誘導体製剤として有機溶媒から分離する。好ましくは、かかる凍結乾燥は、室温、１０ミリバール未満の内部圧力および−２５℃未満の低温トラップで行う。
【００６１】
特に、本明細書では、約１モルの二糖を、それによって製造される二糖一分子当たりの各脂肪酸エステル基に対し約７モルの塩化アコイルと、それによって製造される二糖一分子当たりの各硫酸エステル基に対し約１モルのスルホン化剤または各リン酸エステルに対し約１モルのホスホン化剤と接触させる（ただし、塩化アコイルおよびスルホン化剤の全モル数はＮ以下である（ここで、Ｎは接触した二糖の水酸基総数である））工程による、特定の数および種類の脂肪酸エステル基および陰イオン基を有する二糖誘導体を多く含有する製剤の製造方法を開示する。
【００６２】
本発明による単糖または二糖誘導体製剤の水溶性は、（１）本発明による方法で使用するスルホン化剤またはホスホン化剤の量を増やすこと、かつ／または本発明による方法で使用する塩化アコイルの量を減らすことにより高められ、従って、存在する脂肪酸エステル基の数に応じた数の陰イオン基を有する単糖または二糖誘導体が得られる。また、高い水溶性は（２）短い炭素鎖の塩化アコイルを使用することによっても達成され、比較的短い炭素鎖の脂肪酸エステル基を有する単糖または二糖誘導体が得られる。これについては、特に塩化アコイル試薬として、塩化オクタノイル、塩化デカノイル、塩化ドデカノイル（塩化ラウロイル）および／または塩化テトラデカノイルによって達成してもよい。
【００６３】
逆の作用を利用して水溶性を低下させてもよいし、または非極性溶媒への溶解性を高めてもよい。これについては、特に塩化アコイル試薬として、塩化ドデカノイル（塩化ラウロイル）、塩化テトラデカノイルおよび／または塩化オクタノイルによって達成してもよい。同じ方法で単糖または二糖誘導体の疎水面への結合力が高められる。
【００６４】
本発明による単糖または二糖誘導体のミセル形成力は、本発明による方法で使用するスルホン化剤またはホスホン化剤の量を増やすこと、かつ塩化アコイルの量を増やすことにより提供される。同じ方法で表面活性／張力活性が高められる。
【００６５】
この点で、本発明による単糖および二糖誘導体がその他の化合物と大きな混合ミセルを形成することは、特筆すべきである。例えば、単糖一分子当たり１硫酸エステル基および３脂肪酸エステル基の硫酸エステル／脂肪酸エステル比の単糖誘導体、または二糖一分子当たり１硫酸エステル基および７脂肪酸エステル基の硫酸エステル／脂肪酸エステル比の二糖誘導体がポリソルベート８０と混合ミセルを形成することが認められている。これらのミセルは高分子量を排除する限外濾過膜を通らない。その他の化合物との混合ミセルの大きさは、親水基（すなわち硫酸エステル）と疎水基（すなわち脂肪酸エステル）の比率、およびそれと結合する分子の物理的特徴によって決まる。
【００６６】
特定の数および種類の陰イオン基、例えば硫酸エステル基および脂肪酸エステル基を有する単糖または二糖誘導体を多く含有する製剤が、特定分子の安定性、反応性、移動性および／またはバイオアベイラビリティーを改変し得る特定の水不混和分子、例えば食品成分、色素、香味剤、オイル、薬剤分子および抗原と複合体を形成し得ることが分かっている。
【００６７】
本発明による単糖および二糖誘導体は種々の医療用途および製薬用途に使用してもよい。
【００６８】
本発明による単糖および二糖誘導体によれば、分子（薬剤分子または抗原化合物など）と複合体を形成した場合、固体、半固体および／または液体製剤の分子のバイオアベイラビリティーに改良がもたらされる。また、本発明による単糖および二糖誘導体によれば、安定性が向上し、貯蔵寿命が向上する。さらに、本発明による単糖および二糖誘導体は、これと複合体を形成する分子の副作用（毒性）を弱める。最後に、本発明による単糖および二糖誘導体によれば、均質な取り扱いやすい注射溶液（難溶性薬剤）の提供が可能となる。
【００６９】
本発明の単糖および二糖誘導体（およびその製剤）の使用によって優れた利点がもたらされる医療適用例はワクチンアジュバントである。好適なアジュバントとしては、水中油エマルション（水中スクアラン、水中鉱油、水中ヘキサデカン、水中大豆油、水中スクロース脂肪酸エステルなどを含む）、油中水エマルション（鉱油中水、スクアラン中水、スクロース脂肪酸エステル中水などを含む）または水中油中水エマルション（水中鉱油中水、水中スクアラン中水、水中スクロース脂肪酸エステル中水などを含む）と一般的に呼ばれるものが挙げられる。
【００７０】
ワクチン接種は、ヒトおよび動物の双方の健康のために感染症を予防し、抑制する最も原価効率のよい手段の１つである。ワクチン接種または免疫化では、関連した抗原性成分および／またはエピトープに対する好適な免疫応答様式が十分なレベルおよび／または期間で起こる。免疫応答は、例えば血清中の抗体力価、リンパ球の増殖応答、人為または自然感染に対する防御、防御期間、非応答動物の数などによって確認できる。
【００７１】
多数の標的動物種、例えばブタ、畜牛、飼鳥類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒトなどでは、ウイルス、細菌、寄生虫または他のいずれかの感染体、例えばインフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、パルボウイルス、狂犬病ウイルス、連鎖球菌、髄膜炎菌、クロストリジウム属、大腸菌、サルモネラ菌、カンピロバクター、アクチノバチルス、リステリア菌、マラリア、トリパノソーマ属、肺線虫、原生動物、マイコプラズマ、クラミジアなどに引き起こされる疾患を、ワクチン接種によって予防または抑制することができる。
【００７２】
多くの場合、不活化抗原に対する免疫応答およびいくつかの場合でも活性抗原に対する免疫応答が低すぎて十分なレベルの防御または十分な期間の防御が確立することができない。そのため、これらの抗原に免疫応答を刺激するアジュバントを添加する。
【００７３】
理想的なアジュバントは防御に関連する抗原および／またはエピトープに対する関連免疫応答様式（体液性および細胞性）を重大な副作用なく増強する。ある免疫様式を刺激するアジュバントはある用途には好適であるが他の用途には不適当である。さらに、ある抗原に対する免疫を刺激するアジュバントはある用途には好適であるが他の用途には不適当である。強力なアジュバントは、例えば多くの異なる抗原に対する抗体媒介性および細胞媒介性免疫を増強する。アジュバントが異なる抗原へ異なる影響を及ぼすことは、特にいくつかの異なる抗原を含有する組合せワクチンに対しては明らかに不利となる。抗原の種類、動物種、免疫応答様式に関して強い活性を示すアジュバントには重要な利点がある。
【００７４】
アジュバントをin vivoにおいて抗原を誘導し得るＤＮＡまたはＲＮＡにおいて使用する場合、アジュバントが宿主のＤＮＡにＤＮＡまたはＲＮＡ配列をうまく組み込む（トランスフェクション）手助けをすることが好ましい。
【００７５】
多くの異なる種類のアジュバントが知られているが、ごくわずかなものだけが商業的なヒトまたは家畜ワクチンに使用されているに過ぎない。ワクチンに選ばれるアジュバントの種類は、標的動物種、アジュバントの効力、アジュバントの毒性、アジュバントの質、アジュバントの原価などをはじめとするいくつかの要因によって決められる。アジュバントの効力および毒性については、効力が高ければ毒性も高く、毒性が低ければ効力も低いといった関係があることは十分に知られている。高い毒性は局所反応、例えば炎症、はれ、膿瘍形成、肉芽腫、壊死など、および／または全身反応、例えば痛み、熱、高血圧、過敏症、食欲不振、体重の減少などとして現れる。アジュバントの毒性はその用途をかなり限定するものであり、ある動物種では許容されるものであっても、別の動物種では許容されない。
【００７６】
実験動物での標準アジュバントは強力なアジュバントであるフロイントの完全アジュバントである。その毒性、特に局所作用によって、それはヒトまたは食用動物もしくは伴侶動物には使用できない。畜牛、ヒツジおよびブタなどの食用動物では、多くの場合、鉱油のエマルションが選ばれるアジュバントである。例としては、水中鉱油エマルション（Ｏ／Ｗ）、鉱油中水エマルション（Ｗ／Ｏ）および水中鉱油中水エマルション（Ｗ／Ｏ／Ｗ）が挙げられる。これらのアジュバントは高い免疫応答をもたらす（しかし、フロイントの完全アジュバントよりは低い）。局所および全身副作用をはじめとする毒性によって伴侶動物およびヒトにおける使用を避ける。ネコ、イヌおよびウマなどの伴侶動物では比較的安全なアジュバント、例えばＩＳＣＯＭ、Ａｌ（ＯＨ）３およびポリアクリレートを使用する。一般に、これらのアジュバントは鉱油エマルションよりも誘導する応答が低いが、不利益な副作用は少ない。ヒトでは、アルミニウム塩が認可された唯一のアジュバントである。それらは家畜ワクチンに使用される多くのアジュバントよりも低い免疫応答しか起こさないが、比較的安全であると考えられる。
【００７７】
よって、強いアジュバントの欠点は毒性が比較的高いことである。安全なアジュバントの欠点は効力が比較的低いことである。
【００７８】
効力と毒性に加え、アジュバントおよびアジュバントを含有するワクチンの品質が極めて重要である。品質の基準としては、粘性、化学的安定性、物理的安定性、物理化学的安定性などが挙げられる。粘性が高いと製品の取り扱い、例えば製品のシリンジへの吸引または製品の動物への投与が難しくなる。粘性が低いと製品の取り扱いが容易である。化学的、物理的または物理化学的安定性が低いとワクチンの貯蔵寿命が短くなり、製品の貯蔵および輸送には厳しい条件が必要となる。化学的、物理的および物理化学的安定性が高いと貯蔵寿命が長く、製品のロジスティックスが容易となる。食用動物に使用される鉱油エマルションを含有するワクチンは高い粘性を有しており、不安定になりやすいことは十分に知られている。
【００７９】
上記のことから、高い効力と低い毒性を有し、広範囲の抗原に対して有効でありかつ取り扱いが容易であるアジュバントの必要になお迫られていることが明らかである。
【００８０】
本発明によれば、このようなアジュバントが提供される。上記の単糖または二糖誘導体が種々のワクチンのアジュバントとして非常に好適であることが分かった。よって、本発明は本発明の単糖または二糖誘導体形のアジュバントおよび１以上の上記の単糖または二糖誘導体を含んでなるワクチンを製造するためのアジュバント製剤に関する。アジュバント製剤はさらに医薬上許容される担体を含んでなってもよい。好適な担体の例としては、生理食塩水および水中油エマルション、好ましくは水中スクアランエマルションが挙げられる。
【００８１】
本発明による特に好ましいアジュバント製剤は、本発明による単糖または二糖誘導体（Ｉ）、水不混和性液相または水不混和性固相（II）、乳化剤または安定剤（III）および所望により水相（IV）を含んでなる。
【００８２】
本発明による糖誘導体はいずれもアジュバントとして使用できる。この誘導体は、例えば１〜３個、好ましくは１または２個の脂肪酸基と０〜３個、好ましくは１または２個の陰イオン基を有するペントース（ただし、陰イオン基と脂肪酸基の合計は４個を超えない）とすることができる。
【００８３】
１〜４個、好ましくは１〜３個の脂肪酸基と０〜４個、好ましくは１〜３個の陰イオン基を有するヘキソース（ただし、陰イオン基と脂肪酸基の合計は５を超えない）もまた、本発明によるアジュバントとしての使用に好適である。
【００８４】
アジュバントとして好ましい二糖誘導体は、１〜７個、さらに好ましくは３〜７個、最も好ましくは４〜７個の脂肪酸基と０〜７個、さらに好ましくは０〜６個、最も好ましくは１〜５個の陰イオン基（ただし、陰イオン基と脂肪酸基の合計は８個を超えない）を含んでなるものとすることができる。
【００８５】
１個の陰イオン基、好ましくは硫酸エステル基と５〜７個の脂肪酸エステル基を有する二糖誘導体で特に優れた結果が得られた。また、４個の陰イオン基、好ましくは硫酸エステル基と４個の脂肪酸エステル基を有する二糖誘導体がアジュバントとして極めて安定した性能を示した。
【００８６】
本発明によるアジュバント製剤には、通常、アジュバントとして本発明による１以上の糖誘導体が０．１〜１０００ｇ／ｌ、好ましくは０．５〜５００ｇ／ｌ、さらに好ましくは１〜３２０ｇ／ｌの濃度で存在する。
【００８７】
水不混和性液相は油状物質が好ましい。好適な油状物質としては、例えば大豆油、落花生油、カノーラ油、オリーブ油、ベニバナ油、トウモロコシ油、マゾーラ油、肝油、扁桃油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、桃仁油、ゴマ油、オレイン酸ミリスチル、オレイン酸セチルおよびパルミチン酸ミリスチルが挙げられる。その他の好適な油状物質としては、飽和、不飽和および／または部分的水素化脂肪酸からなる生体適合性のある油、シリコーン含有油、例えばオレイン酸のグリセロールトリグリセリドエステルのような、飽和および不飽和鎖のＣ１２〜Ｃ２４脂肪酸で構成されたトリグリセリドのような合成油、テルペン、リノレン、スクアレン、スクアラン、スクアラミンならびに ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７２、ＦＣ−７７、ＦＣ−７０、ＦＣ−７５、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロオクチルブロミド（ペルフルオロブロンとしても知られる）、ペルフルオロオクチルヨージドとして知られるペルフルオロ化合物をはじめとするフッ素化油、もしくはこれらの混合物が挙げられる。
【００８８】
水不混和性相（II）がスクアラン、スクアレン、鉱油、植物油、ヘキサデカン、過フッ化炭化水素またはシリコーン油であるアジュバント製剤で極めて優れた結果が得られた。
【００８９】
典型的には、水不混和性相（II）はアジュバント製剤において０〜６４０ｇ／ｌ、好ましくは０〜４８０ｇ／ｌ、さらに好ましくは１０〜３２０ｇ／ｌの様々な濃度で存在する。
【００９０】
アジュバント製剤が水不混和性固相を含んでなる場合、かかる固相が水に不溶性の塩であることが好ましい。特に好適なものは不溶性アルミニウムまたはカルシウム塩もしくはこれらの混合物である。好ましい塩としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウムシリカおよびこれらの混合物が挙げられる。
【００９１】
乳化剤または安定剤（III）は洗剤であってもよい。好適な乳化剤および／または安定剤としては、例えばコレステロール、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノおよびジグリセリド、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、例えばポロキサマー１８８、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８１、非イオンブロック重合体（例えばBASFのＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、二酢酸プロピレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トリトンＸ−１００、サポニン、精製サポニン（例えばＱＳ２１）、高分子（例えばポリアクリレート）が挙げられる。
【００９２】
乳化剤または安定剤（III）が、親水性親油性バランス値が１０を超える非イオン洗剤、糖脂肪酸エステル、または親水性親油性バランス値が１０を超える陰イオン洗剤であるアジュバント製剤で特に優れた結果が得られた。
【００９３】
好ましい乳化剤または安定剤（III）としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５、トリトンＸ−１００、サポニン、レシチン、非イオンブロック共重合体、スクロース脂肪酸エステル、糖ラウリル酸エステル、例えばMitsubishi-Kagaku Food corporationのＲｙｏｔｏ糖エステルＬ１６９５が挙げられる。ポリソルベート８０およびスクロース脂肪酸エステルが特に好ましい。
【００９４】
また、本発明の単糖または二糖をアジュバント製剤で乳化剤または安定剤（III）として使用することも有利である。少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、かつＮ−１個以下の陰イオン基と、少なくとも１個、かつＮ−３個以下、好ましくはＮ−４個以下の脂肪酸エステル基を有する単糖または二糖誘導体（ただし、Ｎは誘導体を誘導する単糖または二糖の水酸基の数であり、脂肪酸と陰イオン基の合計数はＮを超えない）で特に優れた結果が得られた。
【００９５】
典型的には、１以上の乳化剤または安定剤は、本発明によるアジュバント製剤において全濃度０〜６４０ｇ／ｌ、好ましくは１〜４８０ｇ／ｌ、さらに好ましくは１〜３２０ｇ／ｌで存在する。
【００９６】
好適な水相（IV）としては、例えば生理食塩水、リン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、等張イオン溶液、等張非イオン溶液などが挙げられる。水相量の範囲は広く、通常、０〜９９９．９ｇ／ｌ、好ましくは１０〜９９０ｇ／ｌ、さらに好ましくは６４０〜９９０ｇ／ｌである。
【００９７】
さらに、本発明は、抗原化合物および本発明による単糖または二糖誘導体を、所望により本発明によるアジュバント製剤中に含んでなるワクチンに関する。かかるワクチンは、アジュバントとして単糖または二糖誘導体またはかかる誘導体の混合物を０．０５〜２５０ｇ／ｌ、好ましくは０．２５〜１２５ｇ／ｌ、さらに好ましくは１〜８０ｇ／ｌで含んでなってもよい。これはさらに、１以上の乳化剤または安定剤を全濃度０〜６４０ｇ／ｌ、好ましくは１〜４８０ｇ／ｌ、さらに好ましくは１〜３２０ｇ／ｌで含んでなってもよく、さらに水不混和性液相、好ましくは油状物質を０〜６４０ｇ／ｌ、好ましくは１〜４８０ｇ／ｌ、さらに好ましくは１〜３２０ｇ／ｌの様々な濃度で含んでなってもよい。
【００９８】
ワクチンは上記のいずれかの抗原性成分を含有していてもよい。ワクチンの製造については、使用するかなり前または直前のいずれかに抗原性成分を混合する。
【００９９】
本発明によるワクチンは、例えばヒトおよび動物（後者としては、例えば哺乳類、鳥類および齧歯類（例えばブタ、畜牛、ヒツジ、ウマ、イヌ、飼鳥類）が挙げられる）の免疫化に使用することができる。
【０１００】
ワクチン、アジュバントまたはアジュバント製剤は、非経口または経口経路、例えば筋肉内、皮内、経皮、皮下、腹膜内、皮内、鼻腔内、経鼻、経口、膣内、排泄腔内などにおいて適用される。
【０１０１】
本発明が公知のアジュバントと本発明による単糖または二糖誘導体形のアジュバントの組合せの使用をも意図していることに留意すべきである。
【０１０２】
食用動物に関し、本発明によるアジュバントには、すでに適用されているアジュバントより優れたいくつかの利点がある。例えば、局所および全身副作用が少ないこと、動物への予防接種の不快さが少ないこと、体重増加への不利な作用が弱まり、経済的損失が少ないこと、ワクチン残留物を含有する食肉がなくなり、経済的損失が少ないこと、ワクチン適用者に対する自己注入の危険性が少なくなること、ワクチンの取り扱いの容易性の向上、製品の安定性の向上などが挙げられる。
【０１０３】
伴侶動物に関し、本発明によるアジュバントには、すでに適用されている公知のアジュバントより優れたいくつかの利点がある。例えば、免疫応答レベルが高いこと、免疫応答期間が拡大すること、応答動物数が増加すること、アジュバントと組み合わせることができる抗原が多いことなどが挙げられる。
【０１０４】
以下、限定されるものではないが、実施例を挙げて本発明を説明する。
実施例
以下の実施例に記載される実験のいくつかは同時に実施した。比較を容易にするために、選択された群の結果を例ごとに示す。結論として対照群の結果はいくつかの実施例に示されている。
【０１０５】
実施例１
いわゆるスルホリポ多糖に関して従前に記載されているように(Hilgers et al., 1986)スクロース誘導体を合成した。便宜には、微粉状スクロース(Merck)を＜５０ミリバールにて９０℃で約６時間加熱することによって乾燥させ、無水Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ;Merck）および無水ピリジン(Merck)を加えた。この混合物を透明な溶液が得られるまで約８０℃で攪拌した。塩化ドデカノイル(Merck)を加えて反応混合物を６０℃で約６時間維持した。ＳＯ３−ピリジン(Merck)を加えて反応混合物を室温で約１８時間インキュベートした。ｐＨを４ＭのＮａＯＨを用いて７．０（±０．３）に調整した。Ｎ−メチルピロリジノンおよびピリジンを、残渣の重量減が３０分間で０．１ｇ未満となるまで高温（＜８０℃）、減圧（＜１０ミリバール）で十分にな蒸発させ（＞６時間）、４℃で凝縮させることで除去した。種々の誘導体に用いた出発材料の量は表１．１に示されている。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
得られた生成物は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて分析した。誘導体の０．５ｇサンプルを４．５ｍｌのＮＭＰに溶解し、得られた２μｌの各溶液をシリカゲルＴＬＣプレート（ＨＰＬＣ−ＴＬＣ、順相；Analtech、Newark; Delaware, USA）に適用し、２３３ｍｌのジエチルエーテル＋１００ｍｌのｎ−ヘキサン＋８．３ｍｌの酢酸の混合物で溶出した。スポットはプレートにメタノール中の５０ｖ／ｖ％硫酸の溶液を噴霧し、プレートを１２０℃で１０〜３０分間加熱することによって可視化した。結果は図１に示されている。
【０１０８】
表１．１の種々のスクロース誘導体の製剤は１０ｇのスクロース誘導体を１０ｇのポリソルベート８０(ICI)および４０ｇのスクアラン(Merck)および１９０ｇの０．０１ｗ／ｖ％チメロサール(Sigma)リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−チメロサール；ｐＨ７．０）の溶液と混合することによって製造した。得られた各混合物は少なくとも４００バールの内部圧力および周囲温度にてマイクロフリューダイザーモデルＹ１１０(Microfluidics Corp., Newton, USA)に３回通すことによって乳化した。各エマルションは顕微鏡下で観察した。１０００倍率の顕微鏡下で、調べた１０視野につき直径が１μｍより大きい油滴が１０個より多く認められた場合には乳化手順を繰り返した。得られたエマルションは使用まで４℃で保存した。
【０１０９】
これらの製剤のアジュバント活性はブタで調べた。ワクチンは１容量のいずれかの製剤をHulst et al(1994)によって記載されるように昆虫細胞において産生された３２μｇ／ｍｌの古典的ブタコレラウイルス糖タンパク質Ｅ２（ＣＳＦＶ−Ｅ２；ID-DLO,Lelystad,The Netherlands）を含有する１容量の抗原製剤と混合することによって製造した。
【０１１０】
５個体のブタからなる群（１０週齢）を動物当たり２ｍｌのワクチンで筋肉内感作した。３週間後、同一ワクチンで感作を反復した。２回目の感作を行ってから３週間後、ＣＳＦＶ−Ｅ２に対する血清中の抗体力価をTerpstra et al.(Vet. Microbiol. 9, pp 113-120, 1984)によって記載されるウイルス中和アッセイによって測定した。幾何平均力価（ＧＭＴ）、各群の標準偏差および真数（２指数ＧＭＴ）を算出した。結果は表１．２に示されている。
【０１１１】
動物実験には、水中スルホリポ−シクロデキストリン／スクアランエマルション（ＳＬ−ＣＤ／スクアラン／ポリソルベート８０；Hilgers et al., Vaccine 17, pp.219-228, 1999）を含めた。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
実施例２
８４．２ｇ（０．１モル）の無水スクロース(Merck)、１４９ｇ（１．５モル）の無水Ｎ−メチル−ピロリジノンおよび７９ｇ（１モル）の無水ピリジンを丸底フラスコに入れ、次いでこれをＲｏｔａｖａｐｏｒ（商標）(Buchi, Switzerland)に接続し、回転させることによって混合した。混合物を透明な溶液が得られるまで、９０℃まで加熱した。温度を６０℃に調節し、スクロース溶液に１５３．３ｇ（０．７モル）のドデカノイルクロリドを入れた。フラスコ中の反応混合物を６０℃で６時間維持した。フラスコ中の反応混合物に１５．９ｇ（０．１モル）のＳＯ３−ピリジンを入れ、反応混合物を６０℃で６時間、次いで、周囲温度で１２時間維持した。この反応混合物を４℃で２４時間維持したところ結晶性沈殿および２種の液相が形成した。上相を回収し、溶媒を、残渣の重量減が３０分当たり０．１ｇ未満となるまでＲｏｔａｖｏｐｏｒ（商標）で高温（＜６０℃）、減圧（＜１０ミリバール）で蒸発させ、４℃で凝縮させることによって除去した（画分Ｉ）。画分Ｉのサンプルに、ｎ−ヘキサンおよびＮ−メチルピロリジノンを加えた。この混合物を１０００ｇで１０分間遠心分離して透明な黄色の上相（画分II）、白乳白色の中間相（画分III）および透明な下相を得た。画分IIおよび画分IIIの溶媒を、残渣の重量減が３０分当たり０．１ｇ未満となるまでＲｏｔａｖａｐｏｒ（商標）で高温（＜６０℃）、減圧（＜１０ミリバール）で蒸発させ、４℃で凝縮させることによって除去した。
【０１１４】
得られた生成物は実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
【０１１５】
いくつかの製剤を製造し、ＣＳＦＶ−Ｅ２に対する抗体応答に対するその作用を上記実施例１に記載のように調べた。結果は表２．２に示されている。
【０１１６】
１０ｇのポリソルベート８０(ICI)、４０ｇのスクアラン(Merck)および１９０ｇのＰＢＳ−チメロサールを含む、１０ｇのスクロース誘導体の各画分（画分Ｉ、画分IIおよび画分III）の製剤は上記実施例１に記載のように製造した。これらの製剤はそれぞれ第３群、第６群および第８群として試験した。
【０１１７】
１０ｇのポリソルベート８０、４０ｇのスクアランおよび１９０ｇのＰＢＳ−チメロサールを含む、１０ｇの実施例１の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロースの製剤は実施例１に記載のように製造した。この製剤は群２および５で調べた。
【０１１８】
１０ｇのポリソルベート８０、１０ｇのスクアランおよび２２０ｇのＰＢＳ−チメロサールを含む、１０ｇの表１．１の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロースの製剤は実施例１に記載のように製造した。この製剤は第４群として試験した。
【０１１９】
１０ｇのポリソルベート８０および２３０ｇのＰＢＳ−チメロサールを含み、スクアランを含まない、１０ｇの表１．１のスクロース誘導体（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロースの製剤は実施例１に記載のように製造した。この製剤は第７群として試験した。
【０１２０】
１０ｇのポリソルベート８０、４０ｇのスクアラン(Merck)および２００ｇのＰＢＳ−チメロサールの製剤は上記実施例１に記載のように製造した。この製剤は第９群として試験した。
【０１２１】
実験には正の対照として水中鉱油中水系ＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチン(ID-Lelystad, Lelystad, The Netherlands)を含めた。この製剤は第１０群として試験した。
【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
抗体応答の他に、これらのアジュバントの細胞媒介性免疫応答に対するいくつかの作用を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いるリンパ球増殖アッセイによって調べた。２回目の感作を行ってから６日後、第１群、第２群および第１０群の各ブタから約５ｍｌのヘパリン血を採取した。血液サンプルを３容量のＰＢＳで希釈し、５０ｍｌのポリプロピレンチューブ(Falcon)中の１２ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ(Pharmacia, Uppsala, Sweeden)上に積層した。１０００ｇで２０分間遠心分離した後、ＰＢＭＣを含む界面を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、懸濁液を１０〜１５分間遠心分離した。１００倍にてトリパンブルー排除法によって生細胞数を調べ、懸濁液を培地［１００ＩＥ／ペニシリンｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、４μｌ／Ｌ  β−メルカプトエタノールおよび１０％の正常ブタ血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｆｌｏｗ１０−６０１−２２）］１ｍｌ当たり５×１０６個細胞に調節した。各懸濁液のうち１００μｌのサンプルを平底９６ウェルプレートのウェルに６反復で入れた。３反復には５０μｌのＲＰＭＩ培地を添加し（負の対照）、３反復には培地１ｍｌ当たり７．１μｇのＣＳＦＶ−Ｅ２の５０μｌの溶液を加えた。細胞をＣＯ２インキュベーターにおいて５％のＣＯ２中で３７℃で４日間インキュベートした。インキュベーション後、培地１ｍｌ当たり５０μＣｉのメチル３Ｈ−チミジン(Amersham  TRA 120；１ｍＣｉ／ｍｌ)を含有する２５μｌの培地を各ウェルに加えた。４時間インキュベートした後、セルハーベスター(Tomtec Harvester 96 match IIIM)を用いて細胞のＤＮＡをフィルター(Wallac)上に回収した。フィルターを７０℃で乾燥させてフィルターバッグ(Wallac)に入れた。５ｍｌのシンチレーション液(Wallac betaplate scint；Wallac, Turku, Finland)を加えてバッグを密閉し、各サンプルの放射活性をβカウンター(Wallac beta-counter Model 1450 Microbeta PLUS,Wallac)で測定した。個々の動物のリンパ球懸濁液の刺激指数は抗原で刺激した２または３反復の１分当たりの平均カウント数（ｃｐｍ）から培地単独とともにインキュベートした２または３反復の１分当たりの平均カウント数を差し引くことによって算出した。各群の動物の算術的平均刺激指数（ＡＭＴ）および標準偏差（ＳＴＤＥＶ）を算出した。結果は表２．３に示されている。
【０１２４】
【表４】
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【０１２５】
実施例３
種々のスクロース誘導体は実施例１に記載のように合成した。微粉状スクロース(Merck)を＜５０ミリバールにて９０℃で６時間加熱することによって乾燥させ、無水Ｎ−メチルピロリジノン(Merck)および無水ピリジン(Merck)を加えた。混合物を透明な溶液が得られるまで８０℃で攪拌した。塩化ドデカノイル(Merck)、塩化テトラデカノイル(Merck)、塩化ヘキサデカノイル(Merck)または塩化オクタデカノイル(Merck)を加え、反応混合物を６０℃で６時間インキュベートした。ＳＯ３−ピリジン(Merck)を加えて反応混合物を室温で１８時間インキュベートした。反応混合物を４℃で２４時間維持し、２または３相を形成させた。上相を回収し、Ｎ−メチルピロリジノンおよびピリジンを、残渣の重量減が３０分当たり０．１ｇ未満となるまで高温（＜６０℃）、減圧（＜１０ミリバール）での蒸発させ、４℃で凝縮させることで除去した。
【０１２６】
用いた出発材料の量は表３．１に示されている。
【０１２７】
【表５】
0005025869.tif 000006
【０１２８】
得られたいくつかの生成物は上記実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
１０ｇのポリソルベート８０(ICI)、４０ｇのスクアラン(Merck)および１９０ｇのＰＢＳ−チメロサールを含む、１０ｇの表３．１のスクロース誘導体の製剤を上記実施例１に記載のように製造した。
【０１２９】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤のいくつかの作用を上記実施例１に記載のように調べた。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価は上記実施例１に記載のようにウイルス中和アッセイによって測定した。結果は表３．２に示されている。
【０１３０】
さらに、ＣＳＦＶに対する抗体力価は酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)によって測定した。このために、各ウェルに５０μｌの２．５μｇ／ｍｌの免疫アフィニティークロマトグラフィー精製したＣＳＦＶ−Ｅ２を含有する炭酸バッファー（ｐＨ９．６）を分注し、次いで４℃で１８時間または３７℃で２時間インキュベートすることによってＥＬＩＳＡプレートを被覆した。プレートを０．０２％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、ウェル当たり２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２；０．０５Ｍ）中の２％（ｗ／ｖ）スキムミルク(Difco)でブロッキングして３７℃で１時間インキュベートした。血清サンプルは２％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／ＳＭ）に１０または１００倍に予め希釈し、５０μｌのこれらの予備希釈液をＥＬＩＳＡプレート中のＰＢＳ／ＳＭに２倍に連続希釈した。次いで、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。０．０２％のＴｗｅｅｎ２０での５回洗浄した後、供給業者の使用説明書に従って希釈したペルオキシダーゼ(Dako)と結合させたウサギ抗ブタＩｇ抗血清を含有するＰＢＳ／ＳＭ５０μｌをウェルに加え、このプレートを再び３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．０２％のＴｗｅｅｎ２０で１０回洗浄し、１００μｌの２，２’−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）］およびＨ２Ｏ２(Kirkegaard & Perry Labs, Inc., Gaithersburg, MA)を含有する基質溶液をウェルに加えた。プレートを２０℃で１時間インキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度をTitertek Multiscan(ICN/ Flow, Oxfordshire, United Kingdom)によって測定した。抗体力価は血清濃度対吸光度値のプロットの直線部分の回帰係数（直線性は０．０〜１．４の吸光度値間で著しい）として表し、これはＥＬＩＳＡにおけるバックグラウンドを超える１吸光度単位という光学密度を示す血清サンプルの希釈係数に相当する。追加免疫の３および１２週後の抗体力価がそれぞれ表３．３および３．４に示されている。
【０１３１】
これらの製剤のＣＳＦＶ−Ｅ２に対する細胞媒介性免疫応答に対する作用は上記実施例２に記載のように調べた。結果は表３．５に示されている。
【０１３２】
【表６】
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0005025869.tif 000008
【０１３３】
ブタにおける不活化インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株Ａ／ブタおよびＨ３Ｎ２株ＭＲＣ−１１（以下、それぞれＡ／ブタおよびＭＲＣ−１１と示す）ならびに不活化偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）に対する血清中の抗体応答におけるこれらの製剤のいくつかの作用を調べた。０週目および３週目に動物にFort Dodge Animal Health Holland, Weesp, The Netherlandsの４．４μｇのＡ／ブタ、４μｇのＭＲＣ−１１および１０８３ＴＣＩＤ５０（ＴＣＩＤ５０はin vitroにおいて組織培養物の５０％感染を引き起こす用量である）不活化ＰＲＶ(Hilgers et al. Vaccine 1994)をアジュバントとともに、あるいはアジュバントをともなわずに注射した。最初の感作から３週間後（第３週）および２回目の感作から３週間後（第６週）に、Ａ／ブタおよびＭＲＣ−１１に対する抗体応答をＥＬＩＳＡによって測定した。このために、ＥＬＩＳＡプレートを各ウェルに５μｇ／ｍｌＨＡを含有する炭酸バッファー（ｐＨ９．６）５０μｌを分注し、次いで、４℃で１８時間または３７℃で２時間インキュベートすることによってスクロース勾配精製インフルエンザウイルスで被覆した。プレートは０．０２％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、ウェル当たり２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２；０．０５Ｍ）中の２％（ｗ／ｖ）スキムミルク(Difco)でブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートした。血清サンプルは２％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／ＳＭ）に１０または１００倍に予め希釈し、５０μｌのこれらの予備希釈液をＥＬＩＡプレート中のＰＢＳ／ＳＭに２倍に連続希釈した。次いで、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。０．０２％のＴｗｅｅｎ２０での５回の洗浄の後、ＰＢＳ／ＳＭに１／２０００希釈したペルオキシダーゼと結合させたマウス抗ブタ総ＩｇＧモノクローナル抗体(ID-Lelystad)を含有するＰＢＳ／ＳＭ５０μｌをウェルに加え、プレートを再度３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．０２％のＴｗｅｅｎ２０で１０回洗浄し、１００μｌの２，２’−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）］およびＨ２Ｏ２(Kirkegaard ＆ Perry Labs, Inc., Gaithersburg, MA)を含有する基質溶液をウェルに加えた。プレートを２０℃で６０分インキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度をTitertek Multiscan(ICN/Flow, Oxfordshire, United Kingdom)によって測定した。抗体力価は血清濃度対吸光度値のプロットの直線部分の回帰係数（直線性は０．０〜１．４の吸光度値の間で著しかった）として表し、これはＥＬＩＳＡにおけるバックグラウンドを超える１吸光度単位という光学密度を示す血清サンプルの希釈係数に相当する。最初の（初回抗原刺激）および２回目の（追加）感作から３週間後の抗体力価がそれぞれ表３．６および３．７に示されている。
【０１３４】
６週間後、ｉＰＲＶに対する抗体応答をHilgers et al. (Vaccine 12, pp.653-660, 1994)によって記載されるウイルス中和アッセイによって測定した。結果は表３．８に示されている。
【０１３５】
ブタにおけるインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株Ａ／ブタおよびＨ３Ｎ２株ＭＲＣ−１１対する細胞媒介性免疫応答に対するこれらの製剤の作用を、上記実施例２に記載のように調べた。ＰＢＭＣはＡ／ブタおよびＭＲＣ−１１で細胞培養培地１ｍｌ当たり０．５および１．５μｇＨＡという濃度で刺激した。結果はそれぞれ表３．９および３．１０に示されている。
【０１３６】
【表７】
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0005025869.tif 000010
【０１３７】
実施例４
種々のスクロース誘導体を実施例３に記載のように合成した。用いた出発材料の量は表４．１に示されている。
【０１３８】
【表８】
0005025869.tif 000011
【０１３９】
得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
【０１４０】
１０ｇポリソルベート８０(ICI)、４０ｇスクアラン(Merck)および１９０  ＰＢＳ−チメロサールを含む表４．１の種々のスクロース誘導体１０ｇの製剤を上記実施例１に記載のように製造した。
【０１４１】
実施例５
種々のスクロース誘導体を実施例３に記載のように合成した。なお、出発材料の量は表５．１に示されている。
【０１４２】
【表９】
0005025869.tif 000012
【０１４３】
得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
【０１４４】
１０ｇポリソルベート８０(ICI)、４０ｇスクアラン(Merck)および１９０ｇＰＢＳ−チメロサールを含む表５．１のスクロース誘導体１０ｇの製剤を上記実施例１に記載のように製造した。
【０１４５】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載のように調べた。ワクチンは１容量のアジュバント製剤と１容量の抗原製剤とを単に混合することで製造した。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例１に記載のようにウイルス中和アッセイによって測定した。結果は表５．２に示されている。
【０１４６】
２回目の感作（追加抗原投与）から３週間および１２週間後に、上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定した。結果は表５．３および５．４に示されている。
【０１４７】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表５．５に示されている。
【０１４８】
【表１０】
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0005025869.tif 000014
【０１４９】
ブタにおける不活化インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株Ａ／ＳｗｉｎおよびＨ３Ｎ２株ＭＲＣ−１１に対する血清中の抗体応答におけるこれらの種々の製剤の作用を上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより調べた。結果は表５．６および５．７に示されている。
【０１５０】
【表１１】
0005025869.tif 000015
【０１５１】
実施例６
種々の二糖誘導体を実施例４に記載のように合成した。なお、出発材料の量は表６．１に示されている。
【０１５２】
【表１２】
0005025869.tif 000016
【０１５３】
得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
【０１５４】
ポリソルベート８０(ICI)、スクアラン(Merck)およびＰＢＳ−チメロサールを含む表６．１の種々のスクロース誘導体の製剤を上記実施例１に記載のように製造した。
【０１５５】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載のように調べた。ワクチンは１容量のアジュバント製剤と１容量の抗原製剤とを単に混合することで製造した。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例１に記載のようにウイルス中和アッセイによって測定した。結果は表６．２に示されている。
【０１５６】
２回目の感作（追加抗原投与）から３週間および１２週間後に、上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定した。結果は表６．３および６．４に示されている。
【０１５７】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表６．５に示されている。
【０１５８】
【表１３】
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【０１５９】
ブタにおける不活化インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株Ａ／ＳｗｉｎおよびＨ３Ｎ２株ＭＲＣ−１１に対する血清中の抗体応答におけるこれらの種々の製剤の作用を上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより調べた。結果は表６．５および６．６に示されている。
【０１６０】
【表１４】
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【０１６１】
実施例７
種々の二糖誘導体を、スクロース脂肪酸エステルＬ１９５(Mitsunishi-kagaku Foods Corp., Tokyo, Japan)とＳＯ３−ピリジンを６０℃で約６時間接触させることで合成した。出発材料の量は表７．１に示されている。
【０１６２】
【表１５】
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【０１６３】
得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
１０ｇの表７．１のスクロース誘導体、１０ｇポリソルベート８０(ICI)、４０ｇスクアラン(Merck)および１９０ｇＰＢＳ−チメロサールの製剤を上記実施例１に記載のように製造した。
【０１６４】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載のように調べた。ワクチンは１容量のアジュバント製剤と１容量の抗原製剤とを単に混合することで製造した。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例１に記載のようにウイルス中和アッセイによって測定した。結果は表７．２に示されている。
【０１６５】
２回目の感作（追加抗原投与）から３週間および１２週間後に、上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定した。結果は表７．３および７．４に示されている。
【０１６６】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表７．５に示されている。
【０１６７】
【表１６】
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【０１６８】
ブタにおける不活化インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株Ａ／ＳｗｉｎおよびＨ３Ｎ２株ＭＲＣ−１１に対する血清中の抗体応答におけるこれらの種々の製剤の作用を上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより調べた。結果は表７．６および７．７に示されている。
【０１６９】
【表１７】
0005025869.tif 000023
【０１７０】
実施例８
４０ｇＬ１９５(Mitsunishi-kagaku Foods Corp., Tokyo, Japan)、１０ｇポリソルベート８０(ICI)および２００ｇＰＢＳ−チメロサールの製剤を上記実施例１に記載のように製造した。１０ｇポリソルベート８０(ICI)、４０ｇＬ１９５(Merck)および１９０ｇＰＢＳ−チメロサールを含む実施例５の１０ｇ（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロースの製剤を上記実施例１に記載のように製造した。
【０１７１】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載のように調べた。ワクチンは１容量のアジュバント製剤と１容量の抗原製剤とを単に混合することで製造した。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例１に記載のようにウイルス中和アッセイによって測定した。結果は表８．２に示されている。
【０１７２】
２回目の感作（追加抗原投与）から３週間および１２週間後に、上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定した。結果は表８．３および８．４に示されている。
【０１７３】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表８．５に示されている。
【０１７４】
【表１８】
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【０１７５】
実施例９
（オレイル）８−スクロースを、０．０２モルのスクロースと０．１５モルの塩化オレイル(Merck)を６０℃で約６時間接触させることで製造した。このスクロース誘導体をｎ−ヘキサンで抽出した。上記実施例２に記載のように高温・減圧下で蒸発させることでｎ−ヘキサンを除去した。得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
【０１７６】
スクロースオクタオレイン酸エステルの種々のエマルションを製造した。（オレオイル）８−スクロース、スクアラン、ポリソルベート８０およびＰＢＳ−チメロサールを表９．１に示された量で混合し、上記実施例１に記載のように乳化した。さらに、スクロースオクタオレイン酸エステルを含まないスクアラン／ポリソルベート８０のエマルションを、表９．１に示された量のスクアラン、ポリソルベート８０およびＰＢＳ−チメロサールを混合することにより製造した。
【０１７７】
【表１９】
0005025869.tif 000025
【０１７８】
ＣＳＦＶ−Ｅ２に対するウイルス中和抗体応答アッセイに対する表９．１のエマルションの作用を実施例１に記載のように調べた。ＳＬ−ＣＤ／水中スクアラン(Fort Dodge Animal Health Holland, The Netherkands)を対照として含めた。結果は表９．２に示されている。
【０１７９】
【表２０】
0005025869.tif 000026
【０１８０】
実施例１０
不活化インフルエンザウイルス株ＭＲＣ−１１およびＡ／ブタを用量当たり４．０および４．４μｇＨＡ、ならびに不活化偽狂犬病ウイルスを用量当たり１０８．３ＴＣＩＤ５０を含有する市販の偽狂犬病／インフルエンザウイルスワクチン(Suvaxyn O/W of Fort Dodge Animal Health Holland, Weesp, The Netherlands)を、実施例１のアジュバント製剤（スルフェート）−（ドデカノイル）７−スクロース／スクアラン／ポリソルベート８０と１００／０、３３／６６、２０／８０および１０／９０の容量比で混合した。ブタの群を２回免疫し、Hilgers et al. (Vaccine 12, pp 653-660, 1994)のようなウイルス中和抗体アッセイにより偽狂犬病ウイルスに対する抗体応答を測定した。結果は表１０．１に示されている。インフルエンザウイルス株Ａ／ブタおよびＭＲＣ−１１に対する抗体応答を実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより測定した。結果はそれぞれ表１０．２および１０．３に示されている。
【０１８１】
【表２１】
0005025869.tif 000027
【０１８２】
実施例１１
スクロース誘導体を実施例１に記載のように合成した。用いた出発材料の量は表１．１に示されている。
【０１８３】
【表２２】
0005025869.tif 000028
【０１８４】
得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
ポリソルベート８０(ICI)、スクアラン(Merck)およびＰＢＳ−チメロサールを含む表１０．１のスクロース誘導体の製剤を上記実施例１に記載のように製造した。
【０１８５】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載のように調べた。ワクチンは１容量のアジュバント製剤と１容量の抗原製剤とを単に混合することで製造した。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例１に記載のようにウイルス中和アッセイによって測定した。結果は表１１．２に示されている。
【０１８６】
抗体力価は上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより測定した。結果は表１１．３に示されている。
【０１８７】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表１１．４に示されている。
【０１８８】
【表２３】
0005025869.tif 000029
【０１８９】
実施例１２
いくつかのスクロース誘導体を実施例１に記載のように合成した。スクロースを塩化ドデカノイル（塩化ドデカノイル；Merck）、塩化デカノイル(Merck)、塩化オクタノイル(Merck)または塩化ヘキサノイル(Merick)と、さらにＳＯ３−ピリジンと接触させた。出発材料の量は表１２．１に示されている。
【０１９０】
【表２４】
0005025869.tif 000030
【０１９１】
得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
ポリソルベート８０(ICI)、スクアラン(Merck)およびＰＢＳ−チメロサールを含む表１２．１のスクロース誘導体の製剤を上記実施例１に記載のように製造した。
【０１９２】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の作用を上記実施例１に記載にように調べた。結果は表１２．２に示されている。
【０１９３】
抗体力価は上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより測定した。結果は表１２．３に示されている。
【０１９４】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表１２．４に示されている。
【０１９５】
【表２５】
0005025869.tif 000031
0005025869.tif 000032
【０１９６】
実施例１３
スクロースエステルＬ１９５(Mitsunishi-kagaku Foods Corp., Tokyo, Japan)、ポリソルベート８０(Merck)、スクアラン(Merck)、実施例９の（オレイル）８−スクロース、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDA; Eastman Kodak Company, Rochester, NY)、カルボポール９３４ＰＨ(BFGoodrich, Cleveland HO)を上記の実施例に記載のように製造した。用いた出発材料の量は表１３．１に示されている。
【０１９７】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載のように調べた。結果は表１３．２に示されている。
【０１９８】
抗体力価は上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより測定した。結果は表１３．３に示されている。
【０１９９】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表１３．４に示されている。
【０２００】
【表２６】
0005025869.tif 000033
0005025869.tif 000034
【０２０１】
実施例１４
マンノース誘導体を実施例１に記載のように合成した。用いた出発材料の量は表４．１に示されている。
【０２０２】
【表２７】
0005025869.tif 000035
【０２０３】
得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
１０ｇポリソルベート８０(ICI)、４０ｇスクアラン(Merck)および１９０ｇＰＢＳ−チメロサールを含む表１４．１のマンノース誘導体１０ｇの製剤を上記実施例１に記載のように製造した。
【０２０４】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載にように調べた。結果は表１４．２に示されている。
【０２０５】
抗体力価は上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより測定した。結果は表１４．３に示されている。
【０２０６】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表１４．４に示されている。
【０２０７】
【表２８】
0005025869.tif 000036
【０２０８】
実施例１５
（スルフェート）１−（ドデカノイル）２−グリセロールを実施例１に記載のように合成した。４．６ｇ無水グリセロール(Merck)を、無水Ｎ−メチルピロリジノン(Merck)および無水ピリジン(Merck)に溶解した。２１．９ｇ塩化ドデカノイル(Merck)を加え、反応混合物を６０℃で６時間インキュベートした。８．０ｇＳＯ３−ピリジン(Merck)を加え、反応混合物を室温で１８時間インキュベートした。反応混合物を２４時間４℃で維持し、二層を形成させた。上層を回収し、高温（＜６０℃）減圧（＜１０ミリバール）で蒸発させ、残渣の重量減が３０分間で０．１ｇ未満となるまで４℃で凝縮させることによりＮ−メチルピロリジノンおよびピリジンを除去した。
【０２０９】
得られた（スルフェート）１−（ドデカノイル）２−グリセロールを実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
【０２１０】
１０ｇグリセロール誘導体、１０ｇポリソルベート８０(ICI)、４０ｇスクアラン(Merck)および１９０ｇＰＢＳ−チメロサールを上記実施例１に記載のように製造した。
【０２１１】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載にように調べた。結果は表１５．１に示されている。
【０２１２】
抗体力価は上記実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより測定した。結果は表１５．２に示されている。
【０２１３】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表１５．３に示されている。
【０２１４】
【表２９】
0005025869.tif 000037
【０２１５】
実施例１６
１．３ｇスクロースエステルＬ１９５(Mitsunishi-kagaku Foods Corp., Tokyo, Japan)、１．３ｇポリソルベート８０(Merck)、１０．８ｇスクアラン(Merck)、２３７．７ｇＰＢＳ−チメロサールの製剤を実施例１に記載のように製造した。１．３ｇの実施例１２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース、１．３ｇポリソルベート８０(Merck)、１０．８ｇスクアレン(Merck)および２３８．１ｇＰＢＳ−チメロサールの製剤を実施例１に記載のように製造した。
【０２１６】
不活化ヒトインフルエンザウイルス株Ａ／パナマ、Ａ／ニューカレドニアおよびＢ／山梨に対する血清中のＥＬＩＳＡ抗体応答におけるこれらの製剤のいくつかの作用をブタにおいて調べた。このため、市販のインフルエンザウイルスワクチンSolvay Pharmaceuticals (Weesp, The Netherlands)のＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）１用量（０．５ｍｌ）をいずれかのアジュバント製剤１ｍｌに混合し、ブタ５匹の群を感作した。最初の感作から３週間後に抗体応答を実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡにより測定した。免疫記憶の誘発は、アジュバントを用いずSolvay Pharmaceuticals のＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）で２回目の感作を行った後に抗体応答を測定することにより調べた。最初の感作の後のＡ／パナマ、Ａ／ニューカレドニアおよびＢ／山梨に対する抗体力価の結果はそれぞれ表１６．１、１６．２および１６．３に示されている。アジュバントを用いずに２回目の感作を行ってから１週間後のＡ／パナマ、Ａ／ニューカレドニアおよびＢ／山梨に対する抗体力価の結果はそれぞれ表１６．４、１６．５および１６．６に示されている。アジュバントを用いずに２回目の感作を行ってから３週間後のＡ／パナマ、Ａ／ニューカレドニアおよびＢ／山梨に対する抗体力価の結果はそれぞれ表１６．７、１６．８および１６．９に示されている。
【０２１７】
【表３０】
0005025869.tif 000038
0005025869.tif 000039
0005025869.tif 000040
【０２１８】
実施例１７
（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロースエステルは、実施例１に記載のように２０５．２ｇスクロースと９１８ｇ塩化ドデカノイルおよび９８ｇＳＯ３−ピリジンを接触させることで合成した。このスクロースエステルを上記実施例２に記載のようにｎ−ヘキサンで抽出した。
【０２１９】
（スルフェート）４−（ドデカノイル）４−スクロースエステルは、実施例１に記載のように２３．９ｇスクロースと６７．５ｇ塩化ドデカノイルおよび４５．６ｇＳＯ３−ピリジンを接触させることで合成した。
【０２２０】
得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
【０２２１】
（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロースのアジュバント製剤は、油としてのスクアラン(Merck)、スクアレン(Merck)、ヘキサデカン(Acros, Geel, Belgium)、トリオレイン(Sigma, St. Louis, MI) Markol 52 (Esso)、臭化ペルフルオロオクチル(Acros)またはシリコーン油(Acros)、乳化剤としてのポリソルベート８０(Merck)、ポリソルベート２０(Baler)、Ｌ１６９５(Mitsubishi-Kagaku)、トリトンＸ−１００(Sigma)、サポニン(Fluka, Zwijndrechr, The Netherkands)または（スルフェート）４−（ドデカノイル）４−スクロース、および水相としてのＰＢＳ−チメロサールまたはＷＦＩ（ID-Lelystadの注射用水, Lelyatad, The Netherlands）を下記表１７．１に示されている量で用いて製造した。
【０２２２】
これらの製剤を上記実施例１に記載のように乳化した。
【０２２３】
【表３１】
0005025869.tif 000041
【０２２４】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載のように調べた。第１群および第２群は各群５匹、第３群〜第１０群は各群４匹であった。ワクチンは１容量のアジュバント製剤と１容量の抗原製剤とを単に混合することで製造した。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例３に記載のようＥＬＩＳＡによって測定した。結果は表１７．２に示されている。
【０２２５】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表１７．３に示されている。
【０２２６】
【表３２】
0005025869.tif 000042
0005025869.tif 000043
【０２２７】
実施例１８
（スルフェート）１−（デカノイル）７−スクロースエステルは、実施例１に記載のように２３．９ｇスクロースと９４ｇ塩化デカノイルおよび１１．１ｇＳＯ３−ピリジンを接触させることで合成した。このスクロースエステルを上記実施例２に記載のようにｎ−ヘキサンで抽出した。
【０２２８】
（スルフェート）４−（デカノイル）４−スクロースエステルは、実施例１に記載のように２４ｇスクロースと５４．４ｇ塩化デカノイルおよび４５ｇＳＯ３−ピリジンを接触させることで合成した。得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析し、結果は図１８に示されている。
【０２２９】
これらのスクロースエステルのいくつかのアジュバント製剤を、油としてのスクアランまたはスクアレン、乳化剤かつ／または安定剤としてのポリソルベート８０、Ｌ１６９５(Mitsubishi-Kagaku)または（スルフェート）４−（デカノイル）４−スクロース、およびＰＢＳ−チメロサールを表１８．１に示されている量で用いて製造した。これらの製剤を上記実施例１に記載のように乳化した。
【０２３０】
【表３３】
0005025869.tif 000044
【０２３１】
ブタにおけるＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答におけるこれらの製剤の（いくつかの）作用を上記実施例１に記載のように調べた。第１群は各群５匹、第２群および第３群は各群４匹であった。ワクチンは１容量のアジュバント製剤と１容量の抗原製剤とを単に混合することで製造した。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例３に記載のようＥＬＩＳＡによって測定した。結果は表１８．２に示されている。
【０２３２】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表１８．３に示されている。
【０２３３】
【表３４】
0005025869.tif 000045
【０２３４】
実施例１９
Ｌ１９５(Mitsubishi)、スクアレン(Merck)、Ｌ１６９５(Mitsubishi)およびＰＢＳ−チメロサールまたはＷＦＩの製剤を表１９．１に示されている量で製造した。この製剤を上記実施例１に記載のように乳化した。
【０２３５】
【表３５】
0005025869.tif 000046
【０２３６】
ブタにおけるこれら製剤のうち２種の、ＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答における作用を上記実施例１に記載のように調べた。第１群は各群５匹、第２群および第３群は各群４匹であった。ワクチンは１容量のアジュバント製剤と１容量の抗原製剤とを単に混合することで製造した。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例３に記載のようＥＬＩＳＡによって測定した。結果は表１９．２に示されている。
【０２３７】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表１９．３に示されている。
【０２３８】
【表３６】
0005025869.tif 000047
【０２３９】
実施例２０
（デカノイル）７−スクロースエステルは実施例１に記載のように合成した。２３．９ｇ微粉スクロース(Merck)を９４ｇ塩化デカノイル(Merck)と接触させた。このスクロースエステルを上記実施例２に記載のようにｎ−ヘキサンで抽出した。
【０２４０】
得られた生成物は、実施例１に記載のようにＴＬＣにて分析した。
【０２４１】
（デカノイル）７−スクロースエステル、スクアレン、ポリソルベート８０およびＰＢＳ−チメロサールの製剤を表２０．１に示されている量で製造し、上記実施例１に記載のように乳化した。
【０２４２】
【表３７】
0005025869.tif 000048
【０２４３】
ブタにおけるこれら製剤のうち１種の、ＣＳＦＶ−Ｅ２に対する免疫応答における作用を上記実施例１に記載のように調べた。第１群は各群５匹、第２群は４匹であった。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例３に記載のようＥＬＩＳＡによって測定した。結果は表２０．２に示されている。
【０２４４】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表２０．３に示されている。
【０２４５】
【表３８】
0005025869.tif 000049
【０２４６】
実施例２１
免疫応答に対する１回目と２回目の時間間隔の作用を検討した。ブタの個体群をＣＳＦＶ−Ｅ２および実施例１７の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース／スクアレン／ポリソルベート８０［４０／１６０／４０］で３週間空けて（第０週と第３週）、また２週間開けて（第１週と第３週）２回感作した。ＣＳＦＶに対する血清中の抗体力価を上記実施例３に記載のＥＬＩＳＡにより測定した。結果は表２１．１に示されている。
【０２４７】
ＣＳＦＶに対する細胞媒介性応答を上記実施例２に記載のようにリンパ球増殖アッセイにより測定した。結果は表２１．２に示されている。
【０２４８】
【表３９】
0005025869.tif 000050
【０２４９】
実施例２２
実施例１３に記載のように製造したアジュバント製剤Ｌ１９５／スクアレン／ポリソルベート８０［４０／１６０／４０］を、３μｇ口蹄疫ウイルスＯ／台湾株／ｍｌを含有する同量の抗原溶液と混合した。ブタ３匹の群を２ｍｌワクチンで２回感作した。van Maanen and Terpstra (J. Immunol. Meth. 124, pp.111-119, 1989)により記載されたウイルス中和抗体試験によって種々の時間間隔で抗Ｏ／台湾ウイルス中和抗体応答を測定した。
【０２５０】
結果は表２２．１に示されている。
【０２５１】
【表４０】
0005025869.tif 000051
【０２５２】
実施例２３
１６０ｇＬ１９５、６４０ｇスクアラン、１６０ｇポリソルベート８０および４０ｇ注射用水（Ｌ１９５／スクアラン／ポリソルベート８０［１６０／６４０／１６０］）のアジュバント製剤を実施例１に記載のように乳化した。このアジュバント製剤１容量を３μｇ口蹄疫ウイルスＯ／台湾株／ｍｌを含有する抗原溶液１容量と混合した。ブタ５匹の群を２ｍｌワクチンで２回感作し、実施例２２に記載のように種々の時間間隔で抗体応答を測定した。結果は表２３．１に示されている。
【０２５３】
【表４１】
0005025869.tif 000052
【０２５４】
実施例２４
実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III／スクアラン／ポリソルベート８０［４０／１６０／４０］アジュバントを、Oonk et al. (Vaccine 16, pp 1074-1082, 1998)によって記載されたようにして製造した卵白アルブミンと共役したゴナドトロピン放出ホルモンペプチド（Ｇ６ｋ−ＧｎＲＨ−タンデム−ダイマーＯＶＡコンジュゲート）と混合した。ブタ１０匹（第１群）を１８７μｇＧ６ｋ−ＧｎＲＨ−タンデム−ダイマー−ＯＶＡコンジュゲートおよび（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III／スクアラン／ポリソルベート８０［４０／１６０／４０］で２回感作し、５匹（第２群；対照）を抗原を含まない（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III／スクアラン／ポリソルベート８０［４０／１６０／４０］で感作した。１０週目に１回目の感作を行った後、また１７週目に２回目の感作を行った後に種々の時間間隔で、１／２０００希釈した血漿サンプル中のＧｎＲＨに対する抗体力価を、Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, England)から購入したヨウ素化ＧｎＲＨを用いてMeloen et al. (Vaccine 12, pp 741-746, 1994)により記載されたようなＲＩＡにより測定した。結果は表２４．１に示されている。２４週目に精巣の重量を、Meloen et al. (Vaccine 12, pp 741-746, 1994)により記載されたように調べた。結果は表２４．２に示されている。
【０２５５】
【表４２】
0005025869.tif 000053
【０２５６】
実施例２５
実施例１７の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース、スクアラン、ポリソルベート８０およびＰＢＳ−チメロサールを表２５．１に示されている量で混合することでアジュバント製剤を製造した。これらの混合物を実施例１に記載のように乳化した。
【０２５７】
【表４３】
0005025869.tif 000054
【０２５８】
実施例２６
１０ｇの実施例１７の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース、１０ｇポリソルベート８０(Baker)および３ｗ／ｖ％水酸化アルミニウム懸濁液(Alhydrogel of Superfos Biosector a/s, Vedbaeck, Denmark)２３０ｍｌを混合することでアジュバント製剤を製造した。
参照文献
【表４４】
0005025869.tif 000055
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  実施例１に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例１の（ドデカノイル）７−スクロース；
レーン３：実施例１の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース；
レーン４：実施例１の（ドデカノイル）−スクロース；
レーン５：実施例１の（スルフェート）１−（ドデカノイル）５−スクロース；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図１ｂ】  実施例１に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例１の（ドデカノイル）３−スクロース；
レーン３：実施例１の（スルフェート）１−（ドデカノイル）３−スクロース；
レーン４：実施例１の（ドデカノイル）１−スクロース；
レーン５：実施例１の（スルフェート）１−（ドデカノイル）１−スクロース；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図２Ａ】  実施例３に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例３の（ドデカノイル）７−スクロース；
レーン３：実施例３の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース；
レーン４：実施例３の（テトラデカノイル）７−スクロース；
レーン５：実施例３の（スルフェート）１−（テトラデカノイル）７−スクロース；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図２Ｂ】  実施例３に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例３の（ヘキサデカノイル）７−スクロース；
レーン３：実施例３の（スルフェート）１−（ヘキサデカノイル）７−スクロース；
レーン４：実施例３の（オクタデカノイル）７−スクロース；
レーン５：実施例３の（スルフェート）１−（オクタデカノイル）７−スクロース；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図３Ａ】  実施例４に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例４の（ドデカノイル）８−スクロース；
レーン３：実施例４の（スルフェート）０．５−（ドデカノイル）７−スクロース；
レーン４：実施例４の（スルフェート）１．０−（ドデカノイル）６−スクロース；
レーン５：実施例４の（スルフェート）１．５−（ドデカノイル）５−スクロース；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図３Ｂ】  実施例４に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例４の（スルフェート）２．０−（ドデカノイル）４−スクロース；
レーン３：実施例４の（スルフェート）２．５−（ドデカノイル）３−スクロース；
レーン４：実施例４の（スルフェート）３．０−（ドデカノイル）２−スクロース；
レーン５：実施例４の（スルフェート）３．５−（ドデカノイル）１−スクロース；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図４Ａ】  実施例５に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例５の（ドデカノイル）８−スクロース；
レーン３：実施例５の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース；
レーン４：実施例５の（スルフェート）２−（ドデカノイル）６−スクロース；
レーン５：実施例５の（スルフェート）３−（ドデカノイル）５−スクロース；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図４Ｂ】  実施例５に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例５の（スルフェート）４−（ドデカノイル）４−スクロース；
レーン３：実施例５の（スルフェート）５−（ドデカノイル）３−スクロース；
レーン４：実施例５の（スルフェート）６−（ドデカノイル）２−スクロース；
レーン５：実施例５の（スルフェート）７−（ドデカノイル）１−スクロース；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図５】  実施例６に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例６の（ドデカノイル）７−マルトース；
レーン３：実施例６の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−マルトース；
レーン４：実施例６の（ドデカノイル）７−ラクトース；
レーン５：実施例６の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−ラクトース；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図６】  実施例７に記載のように製造した誘導体の薄層クロマトグラフィー。
レーン１（左）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III；
レーン２：実施例７のＬ１９５；
レーン３：実施例７の（スルフェート）１−Ｌ１９５；
レーン４：実施例７の（スルフェート）２−Ｌ１９５；
レーン５：実施例７の（スルフェート）２．３−Ｌ１９５；
レーン６（右）：実施例２の（スルフェート）１−（ドデカノイル）７−スクロース画分III。
【図７】  Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、およびＲ’４がＨまたは−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）（＝Ｏ）−ＯＲ（ここで、ＲはＨ、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４である）または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３（ここで、ｎは６〜２４である）である本発明のスクロース誘導体の化学構造。
【図８】  本発明のアジュバント、特に（スルフェート）１（ドデカノイル）７−スクロース／スクアラン／ポリソルベート８０エマルション（実施例２の第５群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。わずかに繊維形成と浮腫が見られる。
【図９】  本発明のアジュバント、特に（スルフェート）１（ドデカノイル）７−スクロース／スクアラン／ポリソルベート８０エマルション（実施例２の第５群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。わずかに繊維形成と浮腫が見られる。
【図１０】  本発明のアジュバント、特に（スルフェート）１（ドデカノイル）７−スクロース／スクアラン／ポリソルベート８０エマルション（実施例２の第５群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。わずかに繊維形成と浮腫が見られる。
【図１１】  本発明のアジュバント、特に（スルフェート）１（ドデカノイル）７−スクロース／スクアラン／ポリソルベート８０エマルション（実施例２の第５群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。わずかに繊維形成と浮腫が見られる。
【図１２】  本発明のアジュバント、特に（スルフェート）１（ドデカノイル）７−スクロース／スクアラン／ポリソルベート８０エマルション（実施例２の第５群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。わずかに繊維形成と浮腫が見られる。
【図１３】  水中−鉱油中−水アジュバント（実施例２の第１０群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。肉芽腫、膿瘍、および壊死が見られる。
【図１４】  水中−鉱油中−水アジュバント（実施例２の第１０群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。肉芽腫、膿瘍、および壊死が見られる。
【図１５】  水中−鉱油中−水アジュバント（実施例２の第１０群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。肉芽腫、膿瘍、および壊死が見られる。
【図１６】  水中−鉱油中−水アジュバント（実施例２の第１０群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。肉芽腫、膿瘍、および壊死が見られる。
【図１７】  水中−鉱油中−水アジュバント（実施例２の第１０群）を含有するＣＳＦＶ−Ｅ２ワクチンの筋肉内注射後３週間（ａ）および６週間（ｂ）の５匹の個々の動物における局所反応の顕微鏡観察。肉芽腫、膿瘍、および壊死が見られる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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