(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の表裏の一方に対向して非接触で配置された第１のプローブと、
前記試料の表裏の他方に対向して非接触で配置された第２のプローブであって、該プローブの先端部が前記第１のプローブの先端部の近傍に配置された第２のプローブと、
前記第１のプローブの先端部から入力され前記試料により変調された後に前記第２のプローブの先端部により検出された信号の振幅変化情報または周波数変化情報の少なくとも一方の情報に基づいてマッピング像を形成する信号処理部と、を備えていることを特徴とする非接触型走査プローブ顕微鏡。
【請求項２】
前記第２のプローブはカンチレバーであり、前記第２のプローブの先端部により検出される信号が該カンチレバーの振幅変化または共振周波数の変化であることを特徴とする請求項１に記載の非接触型走査プローブ顕微鏡。
【請求項３】
前記第１のプローブの先端部から前記カンチレバーの機械的共振周波数と同じ周波数の交流信号が入力されることを特徴とする請求項２に記載の非接触型走査プローブ顕微鏡。
【請求項４】
前記第２のプローブの先端部により検出される信号は下式により与えられるクーロン力であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の非接触型走査プローブ顕微鏡。
【数１】
0004863405.tif 000004
ここで、Ｑ1：第１のプローブの先端部の電荷、Ｑ2：第２のプローブの先端部の電荷、ｄ：第１および第２のプローブ先端間の距離、ε(x,y)：試料の測定位置（ｘ、ｙ）における比誘電率、ε0：測定環境の誘電率である。
【請求項５】
前記第１のプローブはタングステンプローブであり、前記第２のプローブは自己検知型のカンチレバーであって、該第１および第２のプローブの先端部は何れも１０ｎｍ以下の曲率半径となるように先鋭化されていることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の非接触型走査プローブ顕微鏡。
【請求項６】
前記信号処理部は、
前記第１のプローブの先端部のＸＹ平面内での位置（ｘ1，ｙ1）と前記第２のプローブの先端部のＸＹ平面内での位置（ｘ2，ｙ2）を独立に制御可能なプローブ位置制御手段と、
前記第１及び第２のプローブの先端部間の複数の相対位置関係の下で得られた複数のマッピング像に基づいて前記試料の三次元構造を画像化するための画像処理手段を備えている、
請求項１乃至５の何れかに記載の非接触型走査プローブ顕微鏡。
【請求項７】
前記信号処理部は、前記第１及び第２のプローブの先端部間の複数の相対位置関係を、予め指定された範囲内で自動的に変化させる手段を備えている請求項６に記載の非接触型走査プローブ顕微鏡。
【請求項８】
前記画像処理手段は、前記複数のマッピング像内に基準点を定め、該基準点からマッピング像相互間の位置ずれを補正して三次元構造を画像化する請求項６又は７に記載の非接触型走査プローブ顕微鏡。
【請求項９】
前記第１および第２のプローブは、該プローブの先端部と試料との位置関係を視認可能な装置内に設けられていることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の非接触型走査プローブ顕微鏡。
【請求項１０】
前記装置は、走査型電子顕微鏡である請求項９に記載の非接触型走査プローブ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非接触型の走査プローブ顕微鏡に関し、より詳細には、生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料に対してもダメージを与えることなく、その形態や構造を高分解能且つ迅速に観察・計測し得る走査プローブ顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な試料の形態観察や構造解析を行なう手段として、光学顕微鏡や電子顕微鏡、或いは、ＡＦＭやＳＰＭ等のプローブ顕微鏡といった顕微鏡が開発されてきた。光学顕微鏡は、溶液中の細胞を観察することが可能であり、様々な蛍光色素との併用により、多様な機能解析に用いられている。電子顕微鏡は、電子線を試料に照射した際の反射電子や透過電子を計測するために分解能は数Åと極めて高く、被観察試料中の原子位置まで特定することが可能である。また、プローブ顕微鏡は、様々な試料の表面構造の観察を可能とし、その分解能も１０Å以下と極めて高い。
【０００３】
このような手段以外にも、生体サンプル、特にタンパク質の構造計測技術としては、タンパク質の結晶サンプルを作製し、Ｘ線照射によるディフラクションを測定することで、３次元構造を導き出すＸ線結晶構造解析法やＮＭＲ法などがある。
【０００４】
しかし、これらの従来の計測技術には、幾つかの難点が存在する。具体的に例示すると、光学顕微鏡では、プローブとして光を用いるために、その分解能は約２００ｎｍと低く、細胞中のタンパク質やウィルス等を直接観察することは不可能である。
【０００５】
電子顕微鏡では、電子線の照射によりタンパク質やウィルス等がダメージを受けて破壊される虞があることから、照射電子線量を低くして観察する必要がある。このため、得られる撮影画像は、極めてノイズが高くコントラストが低いものとなり易く、かかる電顕画像から正確な試料構造を解析するためには、様々な画像処理技術を駆使しなければならない。
【０００６】
Ｘ線結晶構造解析法は、分解能が数Åと極めて高いものの、結晶化試料の作製が必須であるため、結晶化が困難な試料の解析を行なうことができない。さらに、ＮＭＲによる解析では、試料を結晶化させる必要はないものの、比較的大きなサイズの試料の解析は困難である。これらの難点に加え、Ｘ線結晶構造解析法にせよＮＭＲによる解析にせよ、得られる情報は、試料内に存在する多数の粒子の平均的な構造でしかなく、個々の粒子の構造や特性を解析することは不可能である。
【０００７】
走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）は、先端が鋭敏なプローブを走査させることにより試料表面の形態や形状を高分解能で観察することが可能な手法であり、現在では、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）や走査近接場光顕微鏡（ＳＮＯＭ）などの様々な方法として開発されてきており（非特許文献１）、その分解能は１０Å以下と極めて高く、金属や有機材料あるいは生物といった多様な試料の表面計測に利用されてきている。しかし、ＡＦＭやＳＰＭ等のプローブ顕微鏡は、試料表面の形状についての情報しか得ることができず、内部構造に関する情報を得ることができない。
【特許文献１】特開平１１−１６０３３３号公報
【特許文献２】特開２００５−１７２５７１号公報
【非特許文献１】日本表面科学会編「表面分析技術選書  ナノテクノロジーのための走査プローブ顕微鏡」丸善株式会社出版（２００２年）
【非特許文献２】H. Takahashi et al.,"Self-sensing piezoresistive cantilever and its magnetic force microscopy applications" Ultramicroscopy 91 (2002) 63-72.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述したような従来の計測技術が抱える難点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、生体物質や有機物質など極めて脆弱な試料の内部構造を、ダメージなく、高分解能で、しかも極めて迅速に計測し、さらに、個々タンパク質を明確に解析できるレベルのコントラストとＳＮ比が得られる非接触型走査プローブ顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するために、本発明に係る非接触型走査プローブ顕微鏡は、試料の表裏の一方に対向して非接触で配置された第１のプローブと、前記試料の表裏の他方に対向して非接触で配置された第２のプローブであって、該プローブの先端部が前記第１のプローブの先端部の近傍に配置された第２のプローブと、前記第１のプローブの先端部から入力され前記試料により変調された後に前記第２のプローブの先端部により検出された信号の振幅変化情報または周波数変化情報の少なくとも一方の情報に基いてマッピング像を形成する信号処理部と、を備えていることを特徴とする。
【００１０】
例えば、前記第２のプローブはカンチレバーであり、前記第２のプローブの先端部により検出される信号は該カンチレバーの振幅変化または共振周波数の変化である。
【００１１】
好ましくは、前記第１のプローブの先端部から前記カンチレバーの機械的共振周波数と同じ周波数の交流信号が入力される。
【００１２】
前記第２のプローブの先端部により検出される信号は、例えば、下式により与えられるクーロン力である。なお、Ｑ1は第１のプローブの先端部の電荷、Ｑ2は第２のプローブの先端部の電荷、ｄは第１および第２のプローブ先端間の距離、ε(x,y)は試料の測定位置（ｘ、ｙ）における比誘電率、ε0は測定環境の誘電率である。
【００１３】
【数２】
0004863405.tif 000002
【００１４】
例えば、前記第１のプローブはタングステンプローブであり、前記第２のプローブは自己検知型のカンチレバーであって、該第１および第２のプローブの先端部は何れも１０ｎｍ以下の曲率半径となるように先鋭化されている。
【００１５】
好ましくは、前記信号処理部は、前記第１のプローブの先端部のＸＹ平面内での位置（ｘ1，ｙ1）と前記第２のプローブの先端部のＸＹ平面内での位置（ｘ2，ｙ2）を独立に制御可能なプローブ位置制御手段と、前記第１及び第２のプローブの先端部間の複数の相対位置関係の下で得られた複数のマッピング像に基づいて前記試料の三次元構造を画像化するための画像処理手段を備えている。
【００１６】
また、好ましくは、前記信号処理部は、前記第１及び第２のプローブの先端部間の複数の相対位置関係を、予め指定された範囲内で自動的に変化させる手段を備えている。
【００１７】
更に好ましくは、前記画像処理手段は、前記複数のマッピング像内に基準点を定め、該基準点からマッピング像相互間の位置ずれを補正して三次元構造を画像化する。
【００１８】
また、前記第１および第２のプローブは、該プローブの先端部と試料との位置関係を視認可能な装置内に設けられていることが好ましい。
【００１９】
前記装置は、例えば、走査型電子顕微鏡である。
【発明の効果】
【００２０】
従来の走査プローブ顕微鏡は何れも、試料の表面側にのみプローブを配置する構成のものであった（例えば、特開平１１−１６０３３３号公報（特許文献１）や特開２００５−１７２５７１号公報（特許文献２）など参照）のに対し、本発明では、試料の表裏の双方に２つのプローブの先端部を対向させて配置して試料により変調された信号に基いてマッピング像を形成することとしたので、試料内部の物理的な特性情報を得ることが可能となる。
【００２１】
また、本発明の顕微鏡では、プローブ間の微弱な物理量を計測するために印加する信号も数Ｖ程度と弱く、かつ、非接触であるために、試料に対するダメージもない。このため、ウィルスやタンパク質等の生物サンプルをダメージ無しに高分解能で計測することが可能となる。
【００２２】
さらに、本発明の顕微鏡では、第１及び第２のプローブの先端部のＸＹ平面内での位置（（ｘ1，ｙ1）及び（ｘ2，ｙ2））を独立に制御可能な構成としたので、試料を斜め方向から観察した場合のものに相当する画像情報（マッピング像）を得ることが可能となり、試料の三次元構造を画像化することができる。
【００２３】
このように、本発明によれば、生体物質や有機物質など極めて脆弱な試料の内部構造を、ダメージなく、高分解能で、しかも極めて迅速に計測し、さらに、個々タンパク質を明確に解析できるレベルのコントラストとＳＮ比が得られる非接触型走査プローブ顕微鏡を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に、図面を参照して、本発明の非接触型走査プローブ顕微鏡について説明する。
【００２５】
図１は、本発明に係る非接触型走査プローブ顕微鏡の構成例を説明するためのブロック図で、この図では、当該非接触型走査プローブ顕微鏡のプローブが、該プローブの先端部と試料との位置関係を視認可能な装置である走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）内に設けられ、試料をＳＥＭ観察しながら測定することが可能な態様とした例が図示されている。
【００２６】
なお、以降の説明では、便宜上、第１のプローブ１４及び第２のプローブ１５の先端部間の相互作用の程度をカンチレバーの共振周波数の変化から求めるいわゆる「ＦＭ検出法」による信号検出手法に基づく顕微鏡として本発明を説明するが、ＦＭ検出法の採用そのものは、本発明にとって必須条件ではない。
【００２７】
ＸＹ平面内での試料移動を可能とする試料ステージ（ＸＹステージ）１１の上に、支持膜１２で支持された試料１３が載置されている。この試料の表面と裏面の一方の面（ここでは表面）に対向させて非接触で第１のプローブ１４（ここではタングステンプローブ）が配置され、試料の裏面に対向させて非接触で第２のプローブ１５（ここでは自己検知型カンチレバー）が配置されている。これらのプローブは何れも、その先端部の位置移動がＸＹ平面内はもとよりＺ方向（垂直方向）への移動も可能であり、マニピレータ１６、１７によりそれらの先端部の精密な位置決めが可能とされ、両プローブの先端部が試料１２を介して、サブミクロンオーダの隙間をもって直近対向している。
【００２８】
なお、これらのプローブ先端部は、第１のプローブの先端部から入力され試料により変調された信号が第２のプローブの先端部により十分な感度で検出される限度で近傍配置されていればよく、両先端部がＸＹ平面内で同じ位置（ｘ，ｙ）に配置されることは、必ずしも必要ではない。
【００２９】
これらのプローブの先端部は何れも先鋭化（例えば、先端の曲率半径が１０ｎｍ以下）されており、第１のプローブ１４であるタングステンプローブには、ＦＭ検出モジュール１８から、第２のプローブ１５であるカンチレバーの機械的な共振周波数と同じ周波数の交流信号が数Ｖの振幅で印加されている。一方、第２のプローブ１５であるカンチレバーには、ＤＣ電圧源１９により６Ｖの電圧が印加され、リファレンス側は例えばグランドに接続されている。
【００３０】
このような条件下では、第２のプローブの先端部では、第１のプローブ１４の先端部から入力され試料１３により変調された後の信号が感知（検出）され、第２のプローブ１５であるカンチレバーは当該信号により共振することとなる。なお、プローブの先端部は、先鋭度が高いほど、また、アスペクト比（プローブ先端の長さと径の比）が高いほど、高感度の顕微鏡が得られる。
【００３１】
ここで、上記第２のプローブ１５の先端部により感知（検出）される信号は、例えば、試料１３を介してプローブ先端部間に作用する微小なクーロン力（下式）である。ここで、Ｑ1は第１のプローブ１４の先端部の電荷、Ｑ2は第２のプローブ１５の先端部の電荷、ｄは第１および第２のプローブ先端間の距離、ε(x,y)は試料１３の測定位置（ｘ、ｙ）における比誘電率、そして、ε0は測定環境（ここでは真空）の誘電率である。
【００３２】
【数３】
0004863405.tif 000003
【００３３】
このような相互作用に基づく共振振動は、カンチレバー１５により電気信号として検出され、第１のプローブ１４からの入力信号と第２のプローブからの検出信号は、何れもＦＭ検出モジュール１８により制御される。そして、検出信号の振幅変化と周波数変化は、ＦＭ検出モジュール１８からコントロールＰＣ２０へと送られる。
【００３４】
試料の測定位置制御（試料ステージ１１の移動）もコントロールＰＣ２０により行なわれ、当該コントロールＰＣ２０からの制御信号を高電圧アンプモジュール２１が増幅して試料ステージ１１へと送られる。
【００３５】
このようにして収集された測定位置（ｘ、ｙ）に対応付けられた検出信号はコントロールＰＣ２０により処理されて、振幅変化情報および周波数変化情報に基いて画像情報（マッピング像）が形成される。
【００３６】
なお、ここでは、非接触型走査プローブ顕微鏡のプローブ（およびマニピュレータと試料ステージ）がＳＥＭ内に設けられ、試料をＳＥＭ観察しながらマニピュレータを操作して、プローブとカンチレバーを試料内の目的の位置へと移動可能な態様を説明したが、ＳＥＭの代わりに光学顕微鏡を用いることも可能である。また、プローブ間の距離や試料とプローブ間の距離をセンサにより計測するようにして、自動的に位置決定するような態様とすることもできる。
【００３７】
図２は、プローブと試料の近傍領域を拡大して示した図である。試料ステージ（不図示）上の試料１３は支持膜１２の上に支持され、試料ステージの移動に伴って、試料表面に非接触で配置された第１のプローブ１４と試料裏面に非接触で配置された第２のプローブ１５の試料上でのプローブ先端位置（ｘ，ｙ）が変わる。
【００３８】
そして、第１のプローブ１４の先端部から入力された信号（カンチレバーの機械的共振周波数と同じ周波数の交流信号）は試料１３により変調された後に第２のプローブ１５の先端部によりクーロン力として検出されてカンチレバーの共振周波数変化として検出信号が生成される。そして、このような検出信号の振幅変化情報および周波数変化情報に基いて抽出された情報が、測定位置（Ｘ，Ｙ）に対応付けされてマッピングされることとなる。
【００３９】
なお、試料１３は支持膜１２の上に支持されているから、第２のプローブ１５により検出される信号は、試料１３のみならず支持膜１２の存在の影響をも受けている。この支持膜１２の影響を除去するためには、試料１３の存在しない領域を測定して得られた信号をブランクとして取り扱えばよい。
【００４０】
図３は、後述する実施例で用いたＦＭ検出モジュールからプローブまでの詳細な回路構成を説明するためのブロック図である。ＦＭ検出モジュール１８からの信号は、ＯＰアンプ２２により約５０倍に増幅された後にタングステンプローブ１４へと入力される。この入力信号は、自己検知型カンチレバー１５の機械的な共振周波数と同じに設定する。
【００４１】
一方、この入力信号を受ける自己検知型カンチレバー１５は、そのレバー先端側に直流６Ｖが印加され、リファレンス側がグランドに接続されている。なお、自己検知型カンチレバーに関する技術文献としてはH. Takahashi et al., "Self-sensing piezoresistive cantilever and its magnetic force microscopy applications" Ultramicroscopy 91 (2002) 63-72（非特許文献２）などがある。
【００４２】
カンチレバー１５は、タングステンプローブ１４からのクーロン力のみを受けて振動することとなり、この振動により、カンチレバー接続部の抵抗が変化して電位変化が生じる。このようにして生成する検出信号は、ハイパスフィルターを通した後にＯＰアンプ２３で６倍に増幅され、ＦＭ検出モジュール１８へと入力される。ＦＭ検出モジュール１８では、入力信号と検出信号とを比較し、周波数の変化や振幅の変化が計測される。
【００４３】
なお、試料１３を載置する試料ステージ１１は、１０ＭΩの抵抗を介してグランドへと接続されている。これにより、帯電やプローブからの放電を防ぐことができる。
【実施例１】
【００４４】
本実施例の測定試料は、カーボン薄膜のメッシュである。カーボン薄膜には数マイクロ程の穴が点在しており、このようなカーボン薄膜が銅製のフレームに固定されているものを用いた。
【００４５】
図４（Ａ）〜（Ｄ）はその観察結果を説明するための図で、図４（Ａ）は、カーボンメッシュの上方にタングステンプローブの先端が対向し、下方に自己検知型カンチレバーの先端が対抗している様子を示すＳＥＭ写真である。本発明の非接触型走査プローブ顕微鏡によるカーボンメッシュの測定領域は、図４（Ｂ）のＳＥＭ写真中に四角で示した領域である。
【００４６】
当該領域を、上述した構成の非接触型走査プローブ顕微鏡で測定した際の検出信号に含まれる周波数変化情報（周波数信号）を抽出してマッピング像（周波数画像）としたものが図４（Ｃ）であり、カーボンメッシュの輪郭が極めて明瞭に観察されている。これに対して、同一領域のＳＥＭ像では、カーボンメッシュの輪郭はぼやけており、本発明の顕微鏡により得られる像の優位性が確認できる。
【実施例２】
【００４７】
本実施例の測定試料は、概ね３０ｎｍ径の金のコロイド溶液をカーボン薄膜に付着させたものである。
【００４８】
図５（Ａ）〜（Ｃ）はその観察結果を説明するための図で、図５（Ａ）はカーボン膜上の金コロイド付着部位をＳＥＭで観察した像であり、白い四角内の雲状のものが金コロイド付着部位である。
【００４９】
この金コロイド付着部位を、上述した構成の非接触型走査プローブ顕微鏡で測定した際の検出信号に含まれる振幅変化情報を抽出（振幅信号）してマッピング像（振幅画像）としたものが図５（Ｂ）であり、同一領域をＳＥＭ観察したものが図５（Ｃ）である。両画像から認識できる金粒子の形状は類似しているが、コントラストや分解能の点では、図５（Ｂ）の振幅画像が優れている。
【実施例３】
【００５０】
本実施例の測定試料は生物サンプルの一例であり、ウィルスの一種であるＴ４ファージをカーボン薄膜上に付着させたものである。なお、通常のＳＥＭ観察時に行なうオスミウム染色等の処理は一切施していない。
【００５１】
図６（Ａ）及び（Ｂ）は、上述した構成の非接触型走査プローブ顕微鏡による測定結果を説明するための図で、図６（Ａ）は、カーボン薄膜上のＴ４ファージを振幅変化情報を基に画像化した結果であり、マッチ棒状のＴ４ファージが点在しているのが確認できる。
【００５２】
図６（Ａ）中に示した黒い四角の中にＴ４ファージが存在しており、これらを拡大したものが図６（Ｂ）である。なお、図６（Ｂ）の右側には、各画像から確認できるＴ４ファージを模式的に示したもので、染色等の処理を何ら施さなくとも、ウィルス観察が可能であることが確認できる。
【実施例４】
【００５３】
本実施例の非接触型走査プローブ顕微鏡は、生物等の観察試料内部の３次元構造を観察可能な構成としたものである。
【００５４】
図７は、本実施例の非接触型走査プローブ顕微鏡の構成例を説明するためのブロック図で、この図に示した例においても、当該非接触型走査プローブ顕微鏡のプローブ（先端を鋭敏に研磨したタングステンプローブ）が、該プローブの先端部と試料との位置関係を視認可能な装置である走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）内に設けられ、試料をＳＥＭ観察しながら測定することが可能な態様とされている。
【００５５】
なお、便宜上、両プローブ（第１のプローブ１４と第２のプローブ１５）の先端部間の相互作用の程度をカンチレバーの共振周波数の変化から求めるいわゆる「ＦＭ検出法」による信号検出手法に基づく顕微鏡として本実施例を説明するが、ＦＭ検出法の採用そのものは、本発明にとって必須条件ではないことは上述したとおりである。
【００５６】
本実施例の非接触型走査プローブ顕微鏡の構成と図１に示した構成との相違は、第１のプローブ１４の先端部のＸＹ平面内での位置（ｘ1，ｙ1）と第２のプローブ１５の先端部のＸＹ平面内での位置（ｘ2，ｙ2）を独立に制御可能とするためのマニピュレータ制御装置２４と、観察試料の三次元構造を画像化するための三次元解析用ＰＣ２５を設けている点にある。
【００５７】
図７に示した構成では、第１及び第２のプローブ（１４，１５）の先端部のＸＹ平面内での位置（（ｘ1，ｙ1）及び（ｘ2，ｙ2））は独立に制御可能となるため、両プローブの先端部のＸＹ平面内での位置が異なる場合には、これらの先端部間の位置関係に、Ｚ軸に対して傾き（角度θ≠０）をもたせ得る。
【００５８】
図１に示した態様では、両プローブの先端部間を結ぶ直線はＺ軸方向（θ＝０）となり、コントロールＰＣ２０により処理される検出信号は測定位置（ｘ、ｙ）に対応付けられるものであった。これに対し、図７に示した構成では、両プローブの先端部間を結ぶ直線がＺ軸と成す角度をθ≠０とした状態での測定が可能となるため、計測角度θを情報として含む測定位置（ｘ、ｙ、θ）に対応付けられた検出信号がコントロールＰＣ２０により処理されることとなる。
【００５９】
そして、θ≠０の条件下でマッピング測定を実行すると、試料１３を斜め方向から観察した場合のものに相当する画像情報（マッピング像）が得られることとなり、複数のθ値（計測角度）についてマッピング像を収集することとすれば、三次元解析用ＰＣ２５により、試料１３の三次元構造を画像化することができる。なお、このような３次元構造を示す画像を得るための信号処理方法としては、ＣＴ等によく用いられているバックプロジェクション法等を利用することが可能である。
【００６０】
図８は、試料１３の三次元構造を画像化する手順を概念的に説明するための図で、タングステンプローブ１４の先端部のＸＹ平面内での位置（ｘ1，ｙ1）を固定し、カンチレバー１５の先端部のｘｙ平面内での位置（ｘ2，ｙ2）を変化させている。
【００６１】
図８の左図はカンチレバー１５の先端部位置をタングステンプローブ１４の先端部位置に一致させた状態（測定位置（ｘ、ｙ、θ＝±０））、図８の中央図はカンチレバー１５の先端部位置をタングステンプローブ１４の先端部位置に対して左側に位置させた状態（測定位置（ｘ、ｙ、θ＝−３０°））、そして、図８の右図はカンチレバー１５の先端部位置をタングステンプローブ１４の先端部位置に対して右側に位置させた状態（測定位置（ｘ、ｙ、θ＝＋３０°））を示している。
【００６２】
これらのプローブ間相対位置関係の下で測定を行い、当該測定を所定の観察領域内で実行（マッピング）すると、垂直画像、左傾斜画像、及び、右傾斜画像を得ることができる。そして、これらのマッピング像に基づいて、試料１３の三次元構造が画像として再構成される。なお、三次元解析用ＰＣ２５には、予め指定された範囲内で、第１及び第２のプローブの先端部間の複数の相対位置関係を自動的に変化させる機能をもたせることも可能である。
【００６３】
図９（Ａ）〜（Ｃ）は、プローブ（１４，１５）と試料１３の位置関係を横から示した図で、図９（Ａ）はカンチレバー１５の先端部位置をタングステンプローブ１４の先端部位置に一致させた状態（θ＝±０）、図９（Ｂ）はカンチレバー１５の先端部位置をタングステンプローブ１４の先端部位置に対して左側に位置させた状態（θ＝−３０°）、そして、図９（Ｃ）はカンチレバー１５の先端部位置をタングステンプローブ１４の先端部位置に対して右側に位置させた状態（θ＝＋３０°）を示しており、それぞれ、図８の左図、中央図、及び、右図におけるプローブ配置に対応している。
【００６４】
なお、図８では、タングステンプローブ１４の位置を固定し、カンチレバー１５を、タングステンプローブ１４に対して相対的に移動させた例を示したが、これとは逆に、カンチレバー１５の位置を固定し、タングステンプローブ１４を、カンチレバー１５に対して相対的に移動させることとしてもよい。また、観察領域（測定範囲）及び取得すべき画像数を予め指定することとして、タングステンプローブ１４やカンチレバー１５の移動を自動的に決定することも可能である。
【００６５】
図１０（Ａ）〜（Ｆ）は、観察試料であるバクテリアをカーボン薄膜上に付着させ、タングステンプローブの位置を変化させた場合の検出画像の変化を説明するための図である。
【００６６】
図１０（Ａ）は、バクテリア試料観察時の走査電顕画像（ＳＥＭ画像）で、このＳＥＭ画像中には、カーボン膜の上側に位置するタングステンプローブ（の先端部）が確認できる。なお、カンチレバーの先端部は、カーボン膜の下側において、タングステンプローブの先端部の直下（θ＝±０°）に位置している。
【００６７】
このプローブ位置関係で取得したマッピング像が図１０（Ｂ）であり、図１０（Ｃ）は図１０（Ｂ）のマッピング像を模式的に示したものである。図１０（Ｃ）から、２本の棒状のバクテリアがＶ字型に並んでいる様子が確認できる。
【００６８】
図１０（Ｄ）は、カンチレバーの位置を固定したまま、タングステンプローブを、カンチレバーに対して相対的に移動（３μｍ）させたプローブ配置とした状態でのＳＥＭ画像である。なお、図１０（Ｄ）中の白丸は、図１０（Ａ）のタングステンプローブ先端部の位置を示したものである。
【００６９】
このプローブ位置関係で取得したマッピング像が図１０（Ｅ）であり、図１０（Ｆ）は図１０（Ｅ）のマッピング像を模式的に示したものである。
【００７０】
図１０（Ａ）に示したプローブ位置関係で得られた画像に比較すると、下側のバクテリアの像は少し短くなっており、上側のバクテリアの太さが増している様子を読み取ることができる。
【００７１】
このような違いは、プローブの相対的位置関係の変化に対応している。つまり、プローブの相対的位置関係を変化させることで計測角度が変わり、得られる画像も変化する。このように、様々なプローブの相対的位置関係の下で画像を取得することで、３次元構造を再構成することが可能となる。
【００７２】
なお、図７においても、非接触型走査プローブ顕微鏡のプローブ（およびマニピュレータと試料ステージ）がＳＥＭ内に設けられ、試料をＳＥＭ観察しながらマニピュレータを操作して、プローブとカンチレバーを試料内の目的の位置へと移動可能な態様を図示したが、ＳＥＭの代わりに光学顕微鏡を用いることも可能である。
【００７３】
また、プローブ間の距離や試料とプローブ間の距離をセンサにより計測するようにして、自動的に位置決定するような態様とすることもできる。
【００７４】
以上、本発明の顕微鏡を具体的に説明したが、本発明は上述した態様の顕微鏡に限定されるものではない。例えば、三次元解析用ＰＣには、得られる複数のマッピング像内に基準点を定め、該基準点からマッピング像相互間の位置ずれを補正して三次元構造を画像化する機能をもたせることもできる。また、プローブ間信号はクーロン力に起因するもの以外にも、磁気力に起因するものであってもよく、或は、プローブ間に流れるトンネル電流をプローブ間信号として利用することも可能である。さらに、プローブの先端にカーボンナノチューブ等を設けて電界放出電流をローブ間信号として利用する等の態様も在り得る。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、生体物質や有機物質など極めて脆弱な試料の内部構造を、ダメージなく、高分解能で計測し、さらに、個々タンパク質を明確に解析できるレベルのコントラストとＳＮ比が得られる非接触型走査プローブ顕微鏡を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の非接触型走査プローブ顕微鏡の構成例を説明するためのブロック図である。
【図２】プローブと試料の近傍領域を拡大して示した図である。
【図３】実施例で用いたＦＭ検出モジュールからプローブまでの詳細な回路構成を説明するためのブロック図である。
【図４】本発明の非接触型走査プローブ顕微鏡により、カーボン膜メッシュを測定した結果を示す図である。
【図５】本発明の非接触型走査プローブ顕微鏡により、金コロイドの付着部位を測定した結果を示す図である。
【図６】本発明の非接触型走査プローブ顕微鏡により、Ｔ４ファージをカーボン薄膜に付着させた試料を測定した結果を示す図である。
【図７】本発明の非接触型走査プローブ顕微鏡の他の構成例を説明するためのブロック図である。
【図８】試料の三次元構造を画像化する手順を概念的に説明するための図である。
【図９】プローブと試料の位置関係を横から示した図である。
【図１０】観察試料であるバクテリアをカーボン薄膜上に付着させ、タングステンプローブの位置を変化させた場合の検出画像の変化を説明するための図である。
【符号の説明】
【００７７】
１１  試料ステージ（ＸＹステージ）
１２  支持膜
１３  試料
１４  第１のプローブ
１５  第２のプローブ
１６、１７  マニピュレータ
１８  ＦＭ検出モジュール
１９  ＤＣ電圧源
２０  コントロールＰＣ
２１  高電圧アンプモジュール
２２、２３  ＯＰアンプ
２４  マニピュレータ制御装置
２５  三次元解析用ＰＣ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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