(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の波長の励起光を多重染色蛍光標本に照射して当該標本の多重染色観察を行なう走査型光学顕微鏡において、
前記励起光の複数の波長のうち前記多重染色蛍光標本に照射する励起波長を選択する励起波長選択手段と、
前記選択された励起波長に対応して前記多重染色蛍光標本から発せられた蛍光を受光してその蛍光強度を検出する光検出器であって、その数が前記励起波長選択手段で選択される前記励起波長の総数よりも少ない光検出器と、
前記光検出器の少なくとも一つの前に配置され、前記励起波長選択手段により選択される励起波長の全てを遮断し、かつ前記多重染色蛍光標本から発せられる前記蛍光の波長を透過するバリアフィルタと、
前記励起波長選択手段により前記光検出器の数と同じ数の前記励起波長を選択して第１の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した標本画像を取得し、次に、前記励起波長選択手段により異なる励起波長を選択して第２の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した標本画像を取得し、取得された前記励起波長ごとの前記各標本画像を合成して前記多重染色蛍光標本の画像を取得する画像形成手段と、
を具備したことを特徴とする走査型光学顕微鏡。
【請求項２】
前記選択される励起波長の総数が３以上でかつ前記光検出器の数が２つであり、
前記複数の励起波長に対応して発せられる蛍光を、夫々の励起波長に対応した蛍光に分岐して前記各光検出器に導く分光手段を更に備え、
前記画像形成手段は、前記励起波長選択手段により２つの前記励起波長を選択して前記第１の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した前記標本画像を前記各光検出器を介して取得し、次に、前回と異なる励起波長を選択して前記第２の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した前記標本画像を取得する、
ことを特徴とする請求項１の走査型光学顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の波長の励起光を多重染色蛍光標本に照射して当該標本を露光し、この多重染色蛍光標本から発せられた蛍光を検出して多重染色観察を行なう走査型光学顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば共焦点レーザ走査型光学顕微鏡を用いて多重染色蛍光標本を観察する場合には、標本を多重染色した複数の試薬に対応する複数波長の蛍光が発せられるので、これら波長の蛍光をそれぞれ検出するために複数の光検出器が備えられている。
【０００３】
ところが、励起光の波長に対する蛍光の発光波長帯域が広い試薬に対しては、各蛍光波長毎に別れている複数の光検出器によって同時にその試薬により発せられる蛍光が検出されてしまい、多重染色してその標本を観察する意味をなさなくなってしまう。
【０００４】
このようなことを回避するために、波長帯域が隣接する各光検出器により上記蛍光の発光波長帯域が広い試薬の蛍光を検出しないように、一画面の標本に対する画像取得毎に励起波長を切り換え、当該励起波長に応じた波長の蛍光を発せさせ、画像を取得するシーケンシャルスキャン方法が行われている。この方法において、各光検出器は、その蛍光波長に応じた特性のチャンネルに割当てられており、励起波長の種類と同じ数の光検出器が用いられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記レーザ走査型光学顕微鏡のようにそれぞれ異なる励起波長の励起光を順次スキャンし、それぞれの蛍光波長に応じたチャンネルに用意された各光検出器によって蛍光を検出して多重染色蛍光標本の画像を取得する方法では、励起波長の種類に応じた数だけ光検出器が必要であり、そのうえに各チャンネルごとに最適な共焦点開口、分光フィルタ、励起光カットフィルタなどが必要となり、顕微鏡が大型化すると共に高価になっていた。
【０００６】
通常、生物標本の蛍光観察においては、励起光による標本に対する光毒性の影響を少なくするために励起光の露光を最小限にすることが要求されている。ところが、一画面の画像を取得するのに励起露光を励起波長の種類だけ複数回行なうため、これら励起露光を行なうだけでも時間がかかっている。
【０００７】
そこで本発明は、励起波長の種類よりも少ない数の光検出器を用いて小型化、低価格化を図り、かつ短時間での画像取得ができる走査型光学顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載による本発明は、複数の波長の励起光を多重染色蛍光標本に照射して当該標本の多重染色観察を行なう走査型光学顕微鏡において、前記励起光の複数の波長のうち前記多重染色蛍光標本に照射する励起波長を選択する励起波長選択手段と、前記選択された励起波長に対応して前記多重染色蛍光標本から発せられた蛍光を受光してその蛍光強度を検出する光検出器であって、その数が前記励起波長選択手段で選択される前記励起波長の総数よりも少ない光検出器と、前記光検出器の少なくとも一つの前に配置され、前記励起波長選択手段により選択される励起波長の全てを遮断し、かつ前記多重染色蛍光標本から発せられる前記蛍光の波長を透過するバリアフィルタと、前記励起波長選択手段により前記光検出器の数と同じ数の前記励起波長を選択して第１の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した標本画像を取得し、次に、前記励起波長選択手段により異なる励起波長を選択して第２の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した標本画像を取得し、取得された前記励起波長ごとの前記各標本画像を合成して前記多重染色蛍光標本の画像を取得する画像形成手段とを具備したことを特徴とする走査型光学顕微鏡である。
【０００９】
請求項２記載による本発明は、請求項１記載の走査型光学顕微鏡において、前記選択される励起波長の総数が３以上でかつ前記光検出器の数が２つであり、前記複数の励起波長に対応して発せられる蛍光を、夫々の励起波長に対応した蛍光に分岐して前記各光検出器に導く分光手段を更に備え、前記画像形成手段は、前記励起波長選択手段により２つの前記励起波長を選択して前記第１の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した前記標本画像を前記各光検出器を介して取得し、次に、前回と異なる励起波長を選択して前記第２の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した前記標本画像を取得することを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（１）以下、本発明の第１の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００１４】
図１は共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の構成図である。複数の試薬により染色された多重染色蛍光標本１の励起に必要なそれぞれ異なる複数の波長のレーザ光（励起光）を出力する各レーザ光源２、３、４が備えられている。これらレーザ光源２、３、４は、３重染色した多重染色蛍光標本１を観察するためのものである。これらレーザ光源２、３、４は、それぞれ励起波長λ１、λ２、λ３の各レーザ光を出力するもので、これら励起波長λ１、λ２、λ３の長さはλ１＜λ２＜λ３の関係となっており、これら励起波長λ１、λ２、λ３の中心波長は具体的にλ１は４８８ｎｍ、λ２は５４３ｎｍ、λ３は６３３ｎｍとなっている。
【００１５】
これらレーザ光源２、３、４の出力光路上には、それぞれ各シャッタ５、６、７を介して各ダイクロイックミラー８、９とミラー１０が配置されている。このうち各シャッタ５、６、７は、シャッタ制御装置１１により１画面取得毎に順次開閉制御されて各励起波長λ１、λ２、λ３のレーザ光を順次切り替えて顕微鏡本体１２に導入させるものとなっている。
【００１６】
各ダイクロイックミラー８、９とミラー１０は、上記の如く各レーザ光源２、３、４の出力光路上に配置され、かつミラー１０の反射光路上に各ダイクロイックミラー８、９が配置されている。
【００１７】
このうちミラー１０は励起波長λ３のレーザ光を反射する特性を有し、ダイクロイックミラー９は励起波長λ３のレーザ光を透過しかつ励起波長λ２のレーザ光を励起波長λ３のレーザ光の透過方向と同一方向に反射する特性を有し、ダイクロイックミラー８は励起波長λ３及びλ２のレーザ光を反射しかつ励起波長λ１のレーザ光を励起波長λ３及びλ２のレーザ光の反射方向と同一方向に透過する特性を有している。
【００１８】
顕微鏡本体１２内には、当該顕微鏡本体１２内に導入されるレーザ光の光路上にダイクロイックミラー１３が配置されている。このダイクロイックミラー１３は、当該顕微鏡本体１２内に導入される励起波長λ１、λ２、λ３のレーザ光を反射し、かつ多重染色蛍光標本１から発した蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の蛍光を透過する特性を有している。
【００１９】
このダイクロイックミラー１３の反射光路上には、互いに直交する２つの偏向素子１４、１５が配置されている。これら偏向素子１４、１５は、例えばガルバノミラーが用いられ、励起波長λ１、λ２、λ３のレーザ光をそれぞれ多重染色蛍光標本１の全面に対して走査（スキャン）照射して当該標本１を励起するものである。
【００２０】
多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過するものとなる。
【００２１】
このダイクロイックミラー１３の透過光路上には、共焦点開口部１６を介してバリアフィルタ１７が配置されている。このバリアフィルタ１７は、励起波長λ１、λ２、λ３のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の蛍光を透過する波長特性を有している。図２はかかるバリアフィルタ１７の波長特性図である。この波長特性図は、縦軸に分光透過率Ｔ、横軸に波長λを示している。蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の中心波長は、それぞれ具体的に５２０ｎｍ、５９０ｎｍ、６６０ｎｍである。このバリアフィルタ１７の波長特性は、各励起波長λ１、λ２、λ３のレーザ光に対して透過率を０．０１％以下に設定し、検出すべき蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の蛍光に対しては透過率８０％以上の製造できうる最大限の透過率に設定されている。このバリアフィルタ１７は、１枚の基板上に形成してもよいし、又は複数の基板に形成した波長特性の異なる基板を組み（重ね）合わせて形成してもよい。
【００２２】
光検出器１８は、バリアフィルタ１７を透過した蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の蛍光をそれぞれ受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力するもので、例えば１つのフォトマルが用いられている。
【００２３】
画像形成装置１９は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して各励起波長λ１、λ２、λ３ごとの２次元画像を形成し、これら２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得する機能を有している。
【００２４】
この画像形成装置１９は、取得した多重染色蛍光標本１の画像を表示装置２０に表示したり、図示しない印刷装置等により印字出力させたりするものとなっている。
【００２５】
なお、この画像形成装置１９は、コンピュータを備え、画像処理等を実行するプログラムやシャッタ制御装置１１に指令を発するためのプログラム、各偏向素子１４、１５を駆動するためのプログラムを記憶し、これらプログラムを実行して多重染色蛍光標本１の画像を取得する一連の動作制御を行なう機能を有している。
【００２６】
次に、上記の如く構成された顕微鏡の作用について説明する。
【００２７】
画像形成装置１９は、シャッタ制御装置１１に対して一画面の画像が作成されるごとに各シャッタ５、６、７を順次切り替えて開閉する指令を発し、かつ各偏向素子１４、１５に対してレーザ光を多重染色蛍光標本１に対して走査照射させる指令を発する。
【００２８】
先ず、シャッタ５が開放され、他の各シャッタ６、７が遮蔽されている。レーザ光源２から出力された励起波長λ１のレーザ光は、シャッタ５からダイクロイックミラー８を透過して顕微鏡本体１２内に導入され、さらに当該顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射し、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１の全面に対して走査照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起される。
【００２９】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ１’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過し、さらに共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ１７に入射する。
【００３０】
このバリアフィルタ１７は、上記図２に示す波長特性図に示すように励起波長λ１のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ１’の蛍光を透過する波長特性を有しているので、多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ１’の蛍光は、バリアフィルタ１７を透過し、光検出器１８に入射する。
【００３１】
この光検出器１８は、バリアフィルタ１７を透過した蛍光波長λ１’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００３２】
画像形成装置１９は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ１の２次元画像を形成する。
【００３３】
次に、シャッタ６が開放され、他の各シャッタ５、７が遮蔽される。レーザ光源３から出力された励起波長λ２のレーザ光は、シャッタ６を通過してダイクロイックミラー９で反射され、ダイクロイックミラー８で反射されて顕微鏡本体１２内に導入され、さらに当該顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射し、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１の全面に対して走査（スキャン）照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起される。
【００３４】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ２’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過し、さらに共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ１７に入射する。
【００３５】
このバリアフィルタ１７は、上記図２に示す波長特性図に示すように励起波長λ２のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ２’の蛍光を透過する波長特性を有しているので、多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ２’の蛍光は、バリアフィルタ１７を透過し、光検出器１８に入射する。
【００３６】
この光検出器１８は、バリアフィルタ１７を透過した蛍光波長λ２’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００３７】
画像形成装置１９は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ２の２次元画像を形成する。
【００３８】
次に、シャッタ７が開放され、他の各シャッタ５、６が遮蔽される。レーザ光源３から出力された励起波長λ３のレーザ光は、シャッタ７を通過してミラー１０で反射された後、ダイクロイックミラー９を通過してダイクロイックミラー８で反射され、顕微鏡本体１２内に導入され、ダイクロイックミラー１３で反射し、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１に対して走査（スキャン）照射され、多重染色蛍光標本１を励起する。
【００３９】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ３’の蛍光は、各偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過し、共焦点開口部１６を通過してバリアフィルタ１７に入射する。
【００４０】
このバリアフィルタ１７は、上記図２に示す波長特性図に示すように励起波長λ３のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発した蛍光波長λ３’の蛍光を透過する波長特性を有しているので、多重染色蛍光標本１で発した蛍光波長λ３’の蛍光は、バリアフィルタ１７を透過し、光検出器１８に入射する。
【００４１】
この光検出器１８は、バリアフィルタ１７を透過した蛍光波長λ３’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００４２】
画像形成装置１９は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ３の２次元画像を形成する。
【００４３】
そして、画像形成装置１９は、各励起波長λ１、λ２、λ３の３枚の２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得し、同画像を表示装置２０に表示したり、図示しない印刷装置等により印字出力させたりする。
【００４４】
このように上記第１の実施の形態においては、励起波長λ１、λ２、λ３のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の蛍光を透過する特性を有する１つのバリアフィルタ１７を用い、このバリアフィルタ１７を透過した蛍光を１つの光検出器１８により検出し、この光検出器１８から出力される蛍光強度信号に基づいて励起波長λ１、λ２、λ３ごとの画像を形成し、これら画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得するようにしたので、３つの励起波長λ１、λ２、λ３の種類よりも少ない１つの光検出器１８を用いて多重染色蛍光標本１の画像を取得して３重染色観察をすることができ、そのうえ顕微鏡の小型化、低価格化を図ることができる。
【００４５】
又、励起波長λ１、λ２、λ３のレーザ光を順次多重染色蛍光標本１に照射して励起し、このとき発せられた各蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の蛍光を順次検出してその画像を形成し、これら画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得するので、短時間での多重染色蛍光標本１の画像を取得できる。
【００４６】
なお、当該共焦点レーザ走査型光学顕微鏡では、多重染色蛍光標本１をこの標本１の厚さ方向に一定間隔で送りながら画像を取得して、多重染色蛍光標本１の３次元画像を構築したり、３画面像取得を連続又は間欠取得して時間経過と共に観察、解析を行なうこともできる。
【００４７】
（２）次に、本発明の第２の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００４８】
図３は共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の構成図である。この共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の上記第１の実施の形態と相違するところは、光検出器３０を設けて２つの光検出器１８、３０を用いている点である。
【００４９】
顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３の透過光路上には、分光ダイクロイックミラー３１が配置されている。この分光ダイクロイックミラー３１は、多重染色蛍光標本１から発せられた各蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の蛍光を所定の波長λｓ、例えばλ１’＜λｓ＜λ３’でかつλｓ＜λ２’の関係である波長λｓ、例えば波長λｓ＝５６０ｎｍを境として分光する光分光手段としての波長特性を有するもので、図４及び図５に示すように波長λｓよりも短い波長の光を反射し、かつ波長λｓよりも長い波長の光を透過するものとなっている。
【００５０】
この分光ダイクロイックミラー３１の透過光路上には、共焦点開口部１６を介してバリアフィルタ３２が配置されている。このバリアフィルタ３２は、上記境の波長λｓよりも長い波長帯域の蛍光波長を透過する特性を有するもので、図４に示すように少なくとも不要な励起波長λ１、λ２、λ３を遮断し、かつ蛍光波長λ２’、λ３’の蛍光を透過するものとなっている。すなわち、バリアフィルタ３２は、各励起波長λ１、λ２、λ３の近傍において透過率０．０１％以下に設定され、かつ励起波長λ１−λ２の間では特に規定せず、さらに蛍光波長λ２’、λ３’の帯域の透過率をできるだけ高く設定されている。
【００５１】
一方、分光ダイクロイックミラー３１の反射光路上には、共焦点開口３３を介してバリアフィルタ３４が配置されている。このバリアフィルタ３４は、上記境の波長λｓよりも短い波長帯域の蛍光波長を透過する特性を有するもので、図５に示すように少なくとも不要な励起波長λ１、λ３を遮断し、かつ蛍光波長λ１’の蛍光を透過するものとなっている。すなわち、バリアフィルタ３４は、各励起波長λ１、λ３の近傍において透過率０．０１％以下に設定され、かつ励起波長λ１以下は特に規定せず、さらに蛍光波長λ１’の帯域の透過率をできるだけ高く設定されている。
【００５２】
なお、各バリアフィルタ３２、３４は、それぞれ１枚の基板上に形成してもよいし、又は複数の基板に形成した波長特性の異なる基板を組み（重ね）合わせて形成してもよい。
【００５３】
光検出器３０は、バリアフィルタ３４を透過した蛍光波長λ１’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力するもので、例えば１つのフォトマルが用いられている。
【００５４】
画像形成装置３５は、２つの光検出器１８、３０から出力された各蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、これら蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して各励起波長λ１、λ２、λ３ごとの２次元画像を形成し、これら２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得する機能を有している。
【００５５】
この画像形成装置３５は、シャッタ制御装置１１に対して、先ずは２つのシャッタ５と７とを開放して各励起波長λ１、λ３により多重染色蛍光標本１を励起（１回目励起露光）し、次にシャッタ６を開放して励起波長λ２により多重染色蛍光標本１を励起（２回目励起露光）させる機能を有している。
【００５６】
次に、上記の如く構成された顕微鏡の作用について説明する。
【００５７】
画像形成装置１９は、シャッタ制御装置１１に対して一画面の画像が作成されるごとに各シャッタ５、６、７を開放する組み合わせを選択的に順次切り替える指令を発し、かつ各偏向素子１４、１５に対してレーザ光を多重染色蛍光標本１に対して走査（スキャン）照射させる指令を発する。
【００５８】
先ず、シャッタ５と７とが開放され、シャッタ６が遮蔽されている。レーザ光源２から出力された励起波長λ１のレーザ光は、シャッタ５からダイクロイックミラー８を透過して顕微鏡本体１２内に導入され、これと共にレーザ光源４から出力された励起波長λ３のレーザ光は、シャッタ７を通過してミラー１０で反射された後、ダイクロイックミラー９を透過してダイクロイックミラー８で反射され、顕微鏡本体１２内に導入される。
【００５９】
これら励起波長λ１、λ３の各レーザ光は、顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射され、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１の全面に対して走査（スキャン）照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起波長λ１、λ３の各レーザ光により励起される。
【００６０】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ１’、λ３’の各蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過して分光ダイクロイックミラー３１に入射する。
【００６１】
この分光ダイクロイックミラー３１は、蛍光波長λ１’、λ３’の各蛍光が入射すると、λ１’＜λｓ＜λ３’の関係から上記図４及び図５に示すように境とする波長λｓよりも長い波長すなわち蛍光波長λ３’の蛍光を透過し、かつ波長λｓよりも短い波長すなわち蛍光波長λ１’の蛍光を反射する。
【００６２】
この分光ダイクロイックミラー３１を透過した蛍光波長λ３’の蛍光は、共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ３２を透過して光検出器１８に入射する。この光検出器１８は、バリアフィルタ３２を透過した蛍光波長λ３’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００６３】
一方、分光ダイクロイックミラー３１で反射された蛍光波長λ１’の蛍光は、共焦点開口部３３に集光されてこの共焦点開口部３３を通過し、バリアフィルタ３４を透過して光検出器３０に入射する。この光検出器３０は、バリアフィルタ３４を透過した蛍光波長λ１’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００６４】
画像形成装置３５は、２つの光検出器１８、３０から出力された各蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、これら蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して各励起波長λ１、λ３ごとの２次元画像を形成する。
【００６５】
次に、シャッタ６が開放され、他の各シャッタ５、７が遮蔽されている。レーザ光源３から出力された励起波長λ２のレーザ光は、シャッタ６を通過してダイクロイックミラー９で反射された後、ダイクロイックミラー８で反射されて顕微鏡本体１２内に導入され、さらに顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射し、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１の全面に対して走査（スキャン）照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起波長λ２のレーザ光により励起される。
【００６６】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ２’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過して分光ダイクロイックミラー３１に入射する。
【００６７】
この分光ダイクロイックミラー３１は、蛍光波長λ２’の蛍光が入射すると、λｓ＜λ２’の関係から上記図４及び図５に示すように境とする波長λｓよりも長い波長すなわち蛍光波長λ２’の蛍光を透過する。
【００６８】
この分光ダイクロイックミラー３１を透過した蛍光波長λ２’の蛍光は、共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ３２を透過して光検出器１８に入射する。この光検出器１８は、バリアフィルタ３２を透過した蛍光波長λ２’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００６９】
画像形成装置３５は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ２の２次元画像を形成する。
【００７０】
そして、画像形成装置３５は、各励起波長λ１、λ３の２次元画像と励起波長λ２の２次元画像とを合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得し、同画像を表示装置２０に表示したり、図示しない印刷装置等により印字出力させたりする。
【００７１】
このように上記第２の実施の形態においては、多重染色蛍光標本１から発せられた各蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の蛍光を所定の波長λｓ、例えばλ１’＜λｓ＜λ３’でかつλｓ＜λ２’の関係である波長λｓを境として分光する分光ダイクロイックミラー３１を設け、先ずは多重染色蛍光標本１を各励起波長λ１、λ３のレーザ光により励起してその２次元画像を形成し、次に多重染色蛍光標本１を励起波長λ２のレーザ光により励起してその２次元画像を形成し、これら２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得するようにしたので、上記第１の実施の形態と同様に、３つの励起波長λ１、λ２、λ３の種類よりも少ない１つの光検出器１８、３０を用いて多重染色蛍光標本１の画像を取得して３重染色観察ができるうえに顕微鏡の小型化、低価格化を図ることができ、さらに短時間での多重染色蛍光標本１の画像を取得できる。
【００７２】
又、３つの励起波長λ１、λ２、λ３による３重染色観察を１回目励起露光と２回目励起露光とで取得された各画像を合成して３重染色蛍光標本１の画像を取得するので、クロストークの無い、３波長励起分の蛍光画像を得ることができる。
【００７３】
（３）次に、本発明の第３の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図３と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００７４】
図６は共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の構成図である。この共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の上記第２の実施の形態と相違するところは、励起波長（中心波長）λ４＝３５１ｎｍのレーザ光を出力するレーザ光源４０を加えて４波長とした点である。
【００７５】
このレーザ光源４０から出力されたレーザ光の光路上には、シャッタ４１が配置されている。このシャッタ４１は、上記シャッタ制御装置１１により開閉制御されるもので、他のシャッタ５、６、７との組み合わせて選択的に開閉、例えば各シャッタ５と７、各シャッタ３と４１が同時に開放されるようになっている。
【００７６】
レーザ光源４０から出力されたレーザ光は、ミラー４２で反射し、ダイクロイックミラー４３で反射して、上記励起波長λ１、λ２、λ３のレーザ光と同一の光軸、傾きとなるように導入されるようになっている。
【００７７】
上記分光ダイクロイックミラー３１は、多重染色蛍光標本１から発せられた各蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’、λ４’の蛍光を所定の波長λｓ、例えばλ４’＜λ１’＜λｓ＜λ２’＜λ３’の関係である波長λｓを境として分光する波長特性を有するもので、図７及び図８に示すように波長λｓよりも短い波長の光を反射し、かつ波長λｓよりも長い波長の光を透過するものとなっている。
【００７８】
この分光ダイクロイックミラー３１の透過光路上には、共焦点開口部１６を介してバリアフィルタ４４が配置されている。このバリアフィルタ４４は、上記境の波長λｓよりも長い波長帯域の蛍光波長を透過する特性を有するもので、図７に示すように不要な励起波長λ４、λ１、λ２、λ３の近傍では透過率を０．０１％以下にし、かつ励起波長λ２以下は透過率５％以下とし、蛍光波長λ２’、λ３’帯域の蛍光の透過率をできるだけ高く設定したものである。
【００７９】
一方、分光ダイクロイックミラー３１の反射光路上には、共焦点開口３３を介してバリアフィルタ４５が配置されている。このバリアフィルタ４５は、上記境の波長λｓよりも短い波長帯域の蛍光波長を透過する特性を有するもので、図８に示すように不要な励起波長λ４、λ１、λ２の近傍及び励起波長λ３以上では透過率を０．０１％以下にし、かつ励起波長λ４以下は特に規定せず、蛍光波長λ４’、λ１’帯域の透過率ができるだけ高くなるように設定されている。
【００８０】
なお、これらバリアフィルタ４４、４５は、それぞれ１枚の基板上に形成してもよいし、又は複数の基板に形成した波長特性の異なる基板を重ね合わせて形成してもよい。
【００８１】
画像形成装置４６は、２つの光検出器１８、３０から出力された各蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、これら蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ１とλ３、励起波長λ４、λ２ごとの各２次元画像を形成し、これら２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得する機能を有している。
【００８２】
この画像形成装置４６は、シャッタ制御装置１１に対して、先ずは２つのシャッタ５と７とを開放して各励起波長λ１、λ３により多重染色蛍光標本１を励起（１回目励起露光）し、次にシャッタ６と４１を開放して励起波長λ４、λ２により多重染色蛍光標本１を励起（２回目励起露光）させる機能を有している。
【００８３】
次に、上記の如く構成された顕微鏡の作用について説明する。
【００８４】
画像形成装置４６は、シャッタ制御装置１１に対して一画面の画像が作成されるごとに各シャッタ５、６、７、４１を開放する組み合わせを選択的に順次切り替える指令を発し、かつ各偏向素子１４、１５に対してレーザ光を多重染色蛍光標本１に対して走査（スキャン）照射させる指令を発する。
【００８５】
先ず、シャッタ５と７とが開放され、他の各シャッタ６、４１が遮蔽されている。レーザ光源２から出力された励起波長λ１のレーザ光は、シャッタ５を通過してダイクロイックミラー８を透過して顕微鏡本体１２内に導入され、これと共にレーザ光源４から出力された励起波長λ３のレーザ光は、シャッタ７を通過してミラー１０で反射された後、ダイクロイックミラー９を透過し、ダイクロイックミラー８で反射されて顕微鏡本体１２内に導入される。
【００８６】
これら励起波長λ１、λ３の各レーザ光は、顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射され、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１に対して走査照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起波長λ１、λ３の各レーザ光により励起される。
【００８７】
この多重染色蛍光標本１で発した蛍光波長λ１’、λ３’の各蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過して分光ダイクロイックミラー３１に入射する。
【００８８】
この分光ダイクロイックミラー３１は、蛍光波長λ１’、λ３’の各蛍光が入射すると、λ１’＜λｓ＜λ３’の関係から上記図７及び図８に示すように蛍光波長λ３’の蛍光を透過し、かつ蛍光波長λ１’の蛍光の光を反射する。
【００８９】
この分光ダイクロイックミラー３１を透過した蛍光波長λ３’の蛍光は、共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ４４を透過して光検出器１８に入射する。この光検出器１８は、バリアフィルタ４４を透過した蛍光波長λ３’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００９０】
一方、分光ダイクロイックミラー３１で反射された蛍光波長λ１’の蛍光は、共焦点開口部３３に集光されてこの共焦点開口部３３を通過し、バリアフィルタ４５を透過して光検出器３０に入射する。この光検出器３０は、バリアフィルタ４４を透過した蛍光波長λ１’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００９１】
画像形成装置４６は、２つの光検出器１８、３０から出力された各蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、これら蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して各励起波長λ１、λ３の２次元画像を形成する。
【００９２】
次に、シャッタ６と４１が開放され、他の各シャッタ５、７が遮蔽されている。レーザ光源３から出力された励起波長λ２のレーザ光は、シャッタ６を通過してダイクロイックミラー９で反射され、さらにダイクロイックミラー８で反射されて顕微鏡本体１２内に導入され、これと共にレーザ光源４０から出力された励起波長λ４のレーザ光は、シャッタ４１を通過してミラー４２、ダイクロイックミラー４３で反射されて顕微鏡本体１２内に導入される。
【００９３】
これら励起波長λ２、λ４の各レーザ光は、顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射され、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１に対して走査（スキャン）照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起波長λ２、λ４の各レーザ光により励起される。
【００９４】
この多重染色蛍光標本１で発した蛍光波長λ２’、λ４’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過して分光ダイクロイックミラー３１に入射する。
【００９５】
この分光ダイクロイックミラー３１は、蛍光波長λ２’、λ４’の各蛍光が入射すると、λ４’＜λｓ＜λ２’の関係から上記図７及び図８に示すように蛍光波長λ２’の蛍光を透過し、かつ蛍光波長λ４’の蛍光の光を反射する。
【００９６】
この分光ダイクロイックミラー３１を透過した蛍光波長λ２’の蛍光は、共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ４４を透過して光検出器１８に入射する。この光検出器１８は、バリアフィルタ４４を透過した蛍光波長λ２’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００９７】
一方、分光ダイクロイックミラー３１で反射した蛍光波長λ４’の蛍光は、共焦点開口部３３に集光されてこの共焦点開口部３３を通過し、バリアフィルタ４５を透過して光検出器３０に入射する。この光検出器３０は、バリアフィルタ４４を透過した蛍光波長λ４’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００９８】
画像形成装置４６は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ４、λ２の２次元画像を形成する。
【００９９】
そして、画像形成装置３５は、各励起波長λ１、λ３の２次元画像と励起波長λ４、λ２の２次元画像とを合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得し、同画像を表示装置２０に表示したり、図示しない印刷装置等により印字出力させたりする。
【０１００】
このように上記第３の実施の形態においては、先ずは励起波長λ１、λ３により多重染色蛍光標本１を励起し、次に励起波長λ４、λ２により多重染色蛍光標本１を励起し、これら励起波長λ１、λ３の２次元画像と励起波長λ４、λ２の２次元画像とを合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得するようにしたので、上記第２の実施の形態と同様に、４つの励起波長λ１、λ２、λ３、λ４の種類よりも少ない２つの光検出器１８、３０を用いて多重染色蛍光標本１の画像を取得して４重染色観察ができるうえに顕微鏡の小型化、低価格化を図ることができ、さらに短時間での多重染色蛍光標本１の画像を取得できる。
【０１０１】
又、４つの励起波長λ１、λ２、λ３、λ４による４重染色観察を１回目励起露光と２回目励起露光とで取得された各画像を合成して４重染色蛍光標本１の画像を取得するので、クロストークの無い、４波長励起分の蛍光画像を得ることができる。
【０１０２】
なお、本発明は、上記第１乃至第３の実施の形態に限定されるものでなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々に変形することが可能である。
【０１０３】
さらに、上記実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【０１０４】
【発明の効果】
以上詳記したように本発明によれば、励起波長の種類よりも少ない数の光検出器を用いて小型化、低価格化を図り、かつ短時間での画像取得ができる走査型光学顕微鏡を提供できる。
【０１０５】
又、本発明によれば、クロストークのノイズを防止して多重染色蛍光標本の蛍光画像を得ることができる走査型光学顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図。
【図２】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第１の実施の形態におけるバリアフィルタの波長特性図。
【図３】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図。
【図４】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第２の実施の形態における一方のバリアフィルタの波長特性図。
【図５】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第２の実施の形態における他方のバリアフィルタの波長特性図。
【図６】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第３の実施の形態を示す構成図。
【図７】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第３の実施の形態における一方のバリアフィルタの波長特性図。
【図８】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第３の実施の形態における他方のバリアフィルタの波長特性図。
【符号の説明】
１：多重染色蛍光標本
２，３，４：レーザ光源
５，６，７：シャッタ
８，９：ダイクロイックミラー
１０：ミラー
１１：シャッタ制御装置
１２：顕微鏡本体
１３：ダイクロイックミラー
１４，１５：偏向素子
１６：共焦点開口部
１７：バリアフィルタ
１８：光検出器
１９：画像形成装置
２０：表示装置
３０：光検出器
３１：分光ダイクロイックミラー
３２：バリアフィルタ
３３：共焦点開口部
３４：バリアフィルタ
３５：画像形成装置
４０：レーザ光源
４１：シャッタ
４２：ミラー
４３：ダイクロイックミラー
４４：バリアフィルタ
４５：バリアフィルタ
４６：画像形成装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004896301.tif 000006
【図６】
0004896301.tif 000007
【図７】
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【図８】
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