(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療又は診断での使用のための免疫反応性タンパク質を含む調製物において、式：免疫反応性(IR)〔％〕=１００％−[１００％×(上清中のＭＡｋ濃度／ＭＡｋ出発濃度)]で測定される、免疫反応性及び非免疫反応性のタンパク質化学的に異ならない分子からなる分子の全体数に対する免疫反応性分子のパーセント割合が＞９０％であり、その際、免疫反応性タンパク質がＣＤ６６上のエピトープに結合する、ＢＷ４３１／２６及びＢＷ２５０／１８３から選択されるモノクローナル抗体であることを特徴とする調製物。
【請求項２】
免疫反応性タンパク質が標識を有する、請求項１記載の調製物。
【請求項３】
前記標識が、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ及びアスタチンから選択される放射性標識である、請求項２記載の調製物。
【請求項４】
免疫反応性タンパク質を細胞培養での製造によって作製した、請求項１から３のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項５】
免疫反応性タンパク質を組み換え真核性宿主細胞での発現によって作製した、請求項４に記載の調製物。
【請求項６】
ＣＤ６６が、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｅである、請求項１から５までのいずれか１項記載の調製物。
【請求項７】
ＣＤ６６がＣＤ６６ｅである、請求項６に記載の調製物。
【請求項８】
治療又は診断での使用のための免疫反応性タンパク質の調製物の製造方法において、免疫反応性タンパク質を発現する宿主細胞を適当な培養培地中で流動床反応器−発酵を行い、かつ宿主細胞及び／又は培養培地から該タンパク質を回収し、その際、式：免疫反応性(IR)〔％〕=１００％−[１００％×(上清中のＭＡｋ濃度／ＭＡｋ出発濃度)]で測定される、免疫反応性及び非免疫反応性のタンパク質化学的に異ならない分子からなる分子の全体数に対する免疫反応性分子のパーセント割合が＞８１％であり、その際、免疫反応性タンパク質がＣＤ６６上の、ＣＤ４５上の、Ｎ−ＣＡＭ上の、ＦＶＩＩＩＲＡＧ上の及び／又はＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−レセプター複合体上のエピトープに結合し、かつＶＥＧＦにもＶＥＧＦ−レセプターにも結合しない、ＢＷ４３１／２６、ＢＷ２５０／１８３及びＢＷ２７８／１０５から選択されるモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。
【請求項９】
真核性宿主細胞を使用する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
免疫反応性タンパク質を宿主細胞及び／又は培養培地から少カラム精製法によって回収し、その際、カラムクロマトグラフィー工程として１回だけアフィニティークロマトグラフィーを実施する、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
免疫反応性タンパク質を宿主細胞及び／又は培養培地から慣用の精製法によって回収し、その際、カラムクロマトグラフィー工程として
アフィニティークロマトグラフィー、
ゲルクロマトグラフィー及び
アニオン交換クロマトグラフィー
を実施する、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１２】
式：免疫反応性(IR)〔％〕=１００％−[１００％×（上清中のＭＡｋ濃度／ＭＡｋ出発濃度)]で測定される、免疫反応性及び非免疫反応性のタンパク質化学的に異ならない分子からなる分子の全体数に対する免疫反応性分子のパーセント割合が＞９０％であり、その際、免疫反応性タンパク質がＣＤ６６上の、ＣＤ４５上の、Ｎ−ＣＡＭ上の、ＦＶＩＩＩＲＡＧ上の及び／又はＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−レセプター複合体上のエピトープに結合し、かつＶＥＧＦにもＶＥＧＦ−レセプターにも結合しない、ＢＷ４３１／２６、ＢＷ２５０／１８３及びＢＷ２７８／１０５から選択されるモノクローナル抗体である、請求項８から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
該調製物を、以下の工程
−  細胞培養培地を回収し、かつ細胞分離を行い、
−  濃縮し、
−  溶解し、界面活性剤処理によってウイルス不活性化をし、滅菌濾過し、
−  アフィニティークロマトグラフィーを行い、
−  濃縮し、
−  溶解し、ゲルクロマトグラフィーにより再緩衝し、
−  アニオン交換クロマトグラフィーを行い、
−  濃縮し、
−  溶解し、ゲルクロマトグラフィーにより再緩衝し、
−  所望のバルクの最終濃度に調整し、
−  滅菌濾過する
を含む製造方法Ｉに相応して製造する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該調製物を、以下の工程
−  細胞培養培地を回収し、細胞分離を行い、滅菌濾過し、かつ貯蔵し、
−  融解し、回収し、引き続きマイクロ濾過及び限外濾過を行い、
−  希釈し、
−  界面活性剤で処理し、
−  アフィニティークロマトグラフィーを行い、
−  希釈し、かつ滅菌濾過し、
−  アニオン交換−膜吸着を行い、
−  限外濾過によりウイルス濾過を行い、
−  限外濾過及び透析濾過を行い、
−  濾過及び希釈を行い、
−  滅菌濾過を行う
を含む製造方法ＩＩに相応して製造する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
炎症性過程及び／または骨髄転移過程の診断のための薬剤を製造するための、γ−線の担体としての請求項１から７までのいずれか１項記載のタンパク質調製物の使用。
【請求項１６】
炎症性過程及び／または骨髄転移過程の診断が、前立腺癌、乳癌及び／またはリンパ腫からの転移の診断である、請求項１５に記載のタンパク質調製物の使用。
【請求項１７】
γ−線がＴｃ−９９ｍの担体である、請求項１５または１６に記載のタンパク質調製物の使用。
【請求項１８】
造血系の疾患の治療のための薬剤の製造のためのα−線及び／またはβ−線の担体としての請求項１から７までのいずれか１項記載のタンパク質調製物の使用。
【請求項１９】
造血系の疾患が白血病である、請求項１８に記載のタンパク質調製物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は分子の全体数に対して高い割合の免疫反応性分子を有する、有利には精製された形の免疫反応性のタンパク質の調製物に関する。これらのタンパク質は免疫反応性のタンパク質を発現する宿主細胞の流動床反応器中での発酵及び宿主細胞もしくは培養のために使用される培地からの該タンパク質の回収によって得られる。本発明によるタンパク質調製物は診断用及び治療用の組成物の製造のために充分適当である。
【０００２】
診断用タンパク質及び治療用タンパク質は原核細胞系（例えばＥ．ｃｏｌｉ（Houston et al., 米国特許第５，１３２，４０５号明細書））及び真核細胞系（例えばピチア パストリス、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−）細胞、ハイブリドーマ、遺伝子導入動物及び植物（Maeda et al., 米国特許第４，８７３，３１６号明細書））のいずれにおいても発現させることができ、かつタンパク質化学的な方法によって精製することができる。
【０００３】
原核細胞系は栄養要求のない培地に基づいて、かつ僅かに要求が多い発酵系における微生物の迅速な増殖に基づいてより少ない炭化水素不含のタンパク質の廉価な製造を可能にする。
【０００４】
複雑な炭化水素を有する（糖−）タンパク質の製造のためには、前記に挙げた真核細胞系が使用され、これらは高価な発酵系及び高価な細胞培養培地の使用を必要とする。精製されるべき（糖−）タンパク質調製物の状態はその場合、使用される細胞培養培地及び使用される発酵系によって決定的に影響される。とりわけ精製された（糖−）タンパク質調製物の原形質中の半値時間並びに規定の生物学的エフェクター機能に影響を有するタンパク質の糖付加における差異は先行文献（Stahl et al., PNAS, 73(1976),4045-4049）に記載されている。
【０００５】
炭化水素組成物に対する前記の影響の他に、精製された調製物中の機能的に活性な（糖−）タンパク質のパーセント割合は生成物の質を規定し、同様に細胞培養培地、発酵条件及び精製方法によって影響されうる重要なファクターである。
【０００６】
放射性標識された機能的に活性な分子（例えば生理学的にインタクトなＶ領域を有するＭＡｋ）の割合を規定するための選択方法としてはＬｉｎｄｍｏ他（Immunological Methods 72 (1984),77）によって初めて記載された抗原過剰での定量的結合アッセイが使用される。この方法は、免疫反応性の及び結合性の放射性標識されたＭＡｋの割合をタンパク質化学的な精製の後に定量的に測定することを可能にする。別の結合アッセイ、例えばＳｅｉｔｚ他（European Journal of Nuclear Medicine 26(1999), 1265）によって、１００％までの免疫反応性が記載されている免疫反応性試験は、放射性標識されたＭＡｋの免疫反応性の成分を未標識のスタンダードと比較して相対的に測定することを可能にし、従って絶対的な免疫反応性フラクションの測定のためには不適である。またＪａｇｏｄａ他（Journal of Immunological Methods 173(1994), 191-201）によって記載される免疫反応性の測定のためのアフィニティークロマトグラフィー法は、アフィニティーカラム（１０〜２０％）への比較的高い割合の非特異的結合の割合に基づいて免疫反応性成分の定量的測定のために条件付でのみ使用可能である。
【０００７】
しかしながらまた、殆どの著者によって使用されるＬｉｎｄｍｏ試験は、著者の方法の一般化可能性に対する要求にもかかわらず放射性標識されたＭＡｋの評価のためだけに適当であり、その結合は高い抗原量の使用下に明らかなプラトーをもたらす。低い結合力のＭＡｋに関して、又は細胞あたり高い抗原密度を発現する細胞が不足している場合には、しばしば明らかなプラトーは達成されない（Mattes, M. J., Int. J. Cancer: 61(1995),286-288）。定義されたプラトーを達成する調査においてさえも、飽和曲線からの値のプロットに応じてＬｉｎｄｍｏ他によって規定された方法に相応して、Ｙ軸との交差点が多様な免疫反応性に導きうる２つの交差線をもたらす（Mattes, M.J., Int. J. Cancer: 61(1995), 286-288, Seite 287, Figur1B und E）。そのため必然的にＬｉｎｄｍｏ法の使用において、最大の特異的に結合した放射活性割合及び無限の抗原過剰までに推定される値のいずれかを定めねばならない。これらの両方の値の間の差異が＞１０％である場合には、推定される免疫反応性値は信頼できるとはいえない（Mattes, M.J., Int. J.Cancer: 61(1995), 286-288, Seite 288）。
【０００８】
前記に示される方法的概念を考慮して、慣用の発酵法、例えば撹拌発酵槽及び中空繊維モジュールで製造され、かつプロテインＡカラムの他にイオン交換カラム及び多くの場合にはゲルクロマトグラフィーカラムを含む古典的なタンパク質化学的方法によって精製された調製物中の機能的に活性なＭＡｋ分子のパーセント割合は、Ｌｉｎｄｍｏ試験が使用される場合には４０〜８０％の範囲で変動する（Mattes, M.J., Int. J. Cancer: 61(1995), 286-288; Jagoda et al., Journal of Immunological Methods173(1994), 191-201; Morales-Morales et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 26(1999), 275-279; Boven et al., Blood, 67, No. 2(1986), 429-435）。この場合、使用される放射性標識法及び使用される放射線同位体は同様に重要な役割を担う。
【０００９】
これは、製造に応じて調製物のＭＡｋ分子の２０〜６０％が望ましくない診断又は治療の機能を促進しないことを意味する。
Ｂｒｕｙｎｃｋ他（Br. J. Cancer 67 (1993), 436-440）は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のために特異的なアーム及び放射性標識されたキレートＤＴＰＡ−９０Ｙに対するアームを有する腫瘍治療のための人化された二種特異性モノクローナル抗体の特徴付けを記載している。これらの抗体は二重免疫アフィニティークロマトグラフィー法によって精製された。放射線標識されていない二種特異的ＭＡｋについての免疫反応性が記載される。
ＷＯ８６／０５２０２号は流動床バイオリアクター及び細胞、とりわけモノクローナル抗体を得るためのハイブリドーマ細胞の培養のためのその使用を記載している。該方法によって高い免疫反応性を有する抗体を得ることができるという主張はみられない。
ＥＰ−Ａ−０７２７４８０号はインビトロ細胞培養系を用いる試験物質の医薬的動力学もしくは毒学的動力学の測定のための方法及びそのために適当な装置として流動床バイオリアクターを記載している。モノクローナル抗体を得るためにこの流動床反応器を使用するという主張は見られない。
【００１０】
文献から公知の例外はＳｃｈｕｂｉｇｅｒ他（Eur.J.Nucl.Med.15:(1989),605-608）によって記載されるＧｒａｎｕｌｏｓｚｉｎｔであり、その都度の標識法に依存して９３％もしくは４０％の免疫反応性が記載される。ただ、このＭＡｋは腹水（個人的な報告）の形で製造された。このインビボ法は経済的条件も最新の調節条件も満たさず、かつ本願では例外として考慮されねばならない。更に本願では、実際に特異的に結合するＭＡｋ分子の割合がＬｉｎｄｍｏ試験で測定された値よりも低いことが判明した。これは、１００００倍のモル過剰の非標識の特異的ＭＡｋを添加するにもかかわらず放射性標識されたＭＡｋの、例えば抗原過剰で使用される顆粒細胞への非特異的な結合によって左右される（Schubiger et al., Euro J. Nucl. Med., 15(1989), 605-608）。その結果として、免疫反応性値は非特異的結合の減算後に＜９０％である。
【００１１】
放射性標識された診断用モノクローナル抗体の場合に、低減されたＭＡｋの免疫反応性が特に不利である。それというのも特異的な標的構造に結合しない放射線標識された分子が血液中を循環し、非特異的な背景に寄与し、部分的に肝臓中で受容され、かつ核医学的判断による解釈を困難にするからである。放射性標識された治療用抗体の場合には標的組織に結合しないＭＡｋ分子の割合が非特異的かつ不所望な標的でない組織の照射のために寄与する。
【００１２】
従ってとりわけ放射性標識されたモノクローナル抗体の製造のために、経済的及び調節的にインビトロで許容される、できるだけ高い免疫反応性の成分を有するＭＡｋ調製物の製造を可能にする方法を開発する非常に大きな意味合いがある。
【００１３】
目下のところ、高価なかつ以下の医薬品製造のために不適な免疫親和性クロマトグラフィー法の使用によってのみ非常に高い免疫反応性成分を獲得することが可能である。この場合、タンパク質化学的に活性な分子とは異ならない機能的に不活性な分子の機能的な活性な分子は抗原カラムへの結合によって機能的に不活性の分子から分離され、かつそれによって濃縮される。免疫親和性クロマトグラフィーのために必要な試薬の製造における高い費用並びに精製時の高い損失にもかかわらず、機能的に活性なＭＡｋの割合は調査目的のために使用される調製物中で＜８１％である。
【００１４】
標識されていないＭＡｋの免疫反応性割合も放射性標識されたＭＡｋの免疫反応性割合も非特異的結合によって影響なく正確に測定できるために、“変更されたＬｉｎｄｍｏ試験（modifizierter Lindmo-Test）”が開発され、これは例３に詳細に記載されている。この変更されたＬｉｎｄｍｏ試験において非特異的に結合するＭＡｋ分子（例えば１００００倍の弱いＭＡｋの過剰の存在時の放射性標識の後に見いだされる、Schubiger et al., Euro J. Nucl. Med., 15 (1989), 605-608）の割合は見積もられた免疫反応性値に影響しない。
【００１５】
モノクローナル抗体ＢＷ２５０／１８３（Eur. J. Nucl. Med. 14(1988),523-528及びJ. Cancer 36(1985), 75-84）のための製造方法の製造の最適化のための作業範囲において、変更されたＬｉｎｄｍｏ試験で免疫反応性が一般に＞９５％であるＭＡｋを含有する細胞培養上清を生成する発酵法を構成することに成功したことは意想外であった。
【００１６】
この細胞培養上清から、慣用の精製方法の使用下にＭＡｋ調製物を製造することが可能であり（またＧＭＰに適した）、これらは８０〜９０％の免疫反応性を有する。本願で観察されるべき精製の経過における約１０％の免疫反応性の損失は多数のカラムクロマトグラフィー工程によって左右される。
【００１７】
更に、変更されたＬｉｎｄｍｏ試験で細胞培養上清中の精製されていないＭＡｋ分子と大きく異ならない（約１〜２％の損失）免疫反応性を有するＭＡｋ調製物の製造を可能にする（またＧＭＰに適した）“少カラム”精製法（“saeulenarmes” Reinigungsverfahren）を開発することに成功した。
【００１８】
この方法は異なる特異性の多数のＭＡｋ及びタンパク質化学的組成物並びに別の免疫反応性タンパク質に使用でき、かつまたこの場合には匹敵する意想外な結果をもたらす。
【００１９】
従って本発明は免疫反応性タンパク質の調製物に関し、その際、変更されたＬｉｎｄｍｏ試験で測定された免疫反応性分子の分子の全体数に対するパーセント割合が＞８１％、有利には９０％、特に有利には＞９５％である。免疫反応性タンパク質は細胞培養、特に真核性宿主細胞中での製造によって得られる。免疫反応性タンパク質を活性損失なく標識、特に放射性標識とカップリングさせることができる。
【００２０】
本発明の範囲における免疫反応性タンパク質は、少なくとも１つの抗体結合ドメインを有するタンパク質である。かかるタンパク質の例は抗体、特にモノクローナル抗体、キメラ化された抗体、人化された抗体、組み換え抗体、例えば単鎖抗体又はそのフラグメント、例えばタンパク質分解断片、例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ′フラグメント又はＦ（ａｂ）２フラグメント又は組み換え抗体フラグメント、例えば単鎖Ｆｖフラグメントである。
【００２１】
抗体及び抗体フラグメントの他に、また少なくとも１つの抗体結合ドメイン及び１つの他のドメイン、例えばエフェクタードメイン、例えば酵素又はサイトカインを有する融合タンパク質を使用してよい。このための例はｓｃＦｖ−サイトカイン、例えばｓｃＦｖ−ＩＬ１、ｓｃＦｖ−ＩＬ２、ｓｃＦｖ−ＩＬ６、ｓｃＦｖ−ＩＬ１０、ｓｃＦｖ−ＩＬ１１、ｓｃＦｖ−ＩＬ１２、ｓｃＦｖ−ＴＮＦ、ｓｃＦｖ−ＩＦＮγ、ｓｃＦｖ−ＩＦＮβ、ｓｃＦｖ−ＩＦα又はｓｃＦｖ−凝集剤、例えばｓｃＦｖ−ｔＴＦ、ｓｃＦｖ−（デオキシ）リボヌクレアーゼ又は酵素との融合物、例えばBritish J. Cancer 654(1992),234-238に記載されるβ−グルクロニダーゼにヒンジリンカーを介して融合された人化されたＭＡｋ ＢＷ４３１／２６のＶＨ−ＣＨ１ 重鎖並び人化されたＭＡｋの人化されたＶＬ−ＣＬ 軽鎖からなる融合タンパク質である。
【００２２】
本発明によるタンパク質調製物は流動床反応器中での発酵によって得られる。かかる流動床反応器中で培養された宿主細胞、例えばハイブリドーマ細胞又は別の真核細胞を非常に高い密度でガラス球上で増殖させ、かつ最適に酸素及び栄養物質を供給してよい。死んだ細胞はガラス球から剥離し、かつ連続的に回収された培地で発酵装置から除去する。この場合、プロテアーゼ及び細胞残骸の量を発酵装置中で低く保ち、かつ生成したタンパク質の完全性が保証される。適当な流動床発酵反応器のための例はバイオリアクターＰｉｌｏｔ Ｂ ５００（Papaspyrou Biotechnologie GmbH）。
【００２３】
本発明のタンパク質調製物の免疫反応性の測定は例３に記載される変更されたＬｉｎｄｍｏ試験によって行われる。この試験の実施において、抗原を含有する材料を過剰に使用して免疫反応性タンパク質、例えばＭＡｋを定量的に結合させることが重要である。更に、抗原含有材料が十分な量のエピトープを有し、それによって非特異的な大表面によって引き起こされる吸着効果を無視できることが重要である。従って固定化された細胞あたり＞１０４のエピトープ密度が有利である。この場合、免疫反応性のための検針点はコントロールのＭＡｋ（試験ＭＡｋと同じアイソタイプであるが、重要でない結合領域）が重大な非特異的吸着を示さない点である。
【００２４】
以下に本発明による発酵法及び本発明による“少カラム”精製法の他に、得られる本発明によるタンパク質調製物並びに診断薬及び治療薬としてのその有利な使用が記載される。
【００２５】
両者の本発明による製造方法Ｉ及びＩＩは複数の個々の工程に分割できる２つの部分からなる：
【００２６】
【表１】
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【００２７】
製造方法Ｉ（特定の）：
真核細胞の培養及び流動床反応器中でのその発酵
１．  細胞バンクからの細胞を融解し、かつ例えばＴフラスコ中で培養する
２．  例えばスピナー培養において細胞を増大させる
３．  流動床反応器中で発酵させる
慣用の精製法によるタンパク質化学的な精製
１．  細胞培養培地を回収し、例えばマイクロ濾過によって細胞分離をし、滅菌濾過及び、例えば−２０℃での貯蔵
２．  例えば硫酸アンモニウム沈殿及び引き続いての遠心分離によって濃縮する
３．  溶解し、界面活性剤処理によってウイルス失活させ、滅菌する
４．  プロテインＡ又は匹敵するアフィニティーシステムでアフィニティークロマトグラフィーをする
５．  例えば硫酸アンモニウム沈殿及び引き続いての遠心分離によって濃縮する
６．  溶解し、ゲルクロマトグラフィーによって再緩衝させる
７．  アニオン交換クロマトグラフィーを行う
８．  例えば硫酸アンモニウム沈殿及び引き続いての遠心分離によって濃縮する
９．  溶解し、ゲルクロマトグラフィーによって再緩衝させる
１０．  バルクの所望の最終濃度を調整する
１１．  滅菌濾過する。
【００２８】
製造方法ＩＩ（特定の）
真核細胞の培養及び流動床反応器中でのその発酵
１．  細胞バンクからの細胞の融解及び、例えばＴフラスコ中で培養する
２．  例えばスピナー培養中で細胞を増大させる
３．  流動床反応器中で発酵させる
“少カラム”精製法でのタンパク質化学的な精製
１．  細胞培養培地を回収し、例えばマイクロ濾過によって細胞分離をし、滅菌濾過及び、例えば−２０℃での貯蔵
２．  滅菌及び細胞不含の培養を融解させ、マイクロ濾過及び限外濾過によって実施して回収する
３．  希釈する
４．  界面活性剤で処理する
５．  プロテインＡ又は匹敵するアフィニティーシステムでアフィニティークロマトグラフィーを行う
６．  希釈及び滅菌濾過を行う
７．  アニオン交換−膜吸着を行う
８．  限外濾過によりウイルス濾過を行う
９．  限外濾過及び透析濾過を行う
１０．  濾過及び希釈を行う
１１．  滅菌濾過を行う。
【００２９】
前記に示される個々の製造工程はそれぞれの個々の工程として当業者（細胞生物学／タンパク質化学者）に方法上公知であり、かつより詳細な記載は必要ない。それにもかかわらず該方法を例２に詳細に記載する。
【００３０】
製造方法Ｉでの新規事項は、慣用の精製方法と組み合わせた流動床反応器中での発酵である。
【００３１】
意想外にも精製されていない細胞培養上清（Ｔフラスコ、流動床反応器）中のＭＡｋの免疫反応性は変更されたＬｉｎｄｍｏ試験において＞９０％である。慣用の精製の後には＞８０％の免疫反応性が達成される。
【００３２】
製造方法ＩＩの新規事項は、１つだけのカラムクロマトグラフィー（プロテインＡ上でのアフィニティークロマトグラフィー）を使用する“少カラム”精製法と組み合わせての流動床反応器を用いた発酵である。他の全ての工程は膜による穏やかな濾過工程又は簡単な希釈工程を表す。それにもかかわらず、該方法では許可局に規定されたタンパク質化学的純度及びウイルス削減／ウイルス失活に関する要求を満たしている。
【００３３】
意想外にも、例えばＭＡｋの製造されるべき（糖−）タンパク質の免疫反応性は全ての試験された段階（Ｔフラスコ、流動床反応器、精製されたタンパク質）においてＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３に関して例１に示されるようにＬｉｎｄｍｏ試験で＞９０％、それどころか主に９５％を示す。匹敵する高い免疫反応性値は、先行技術で記載されないインビトロ製造法での我々の知るところである。
【００３４】
類似の高い免疫反応性値は本発明による方法で別のＭＡｋ、例えばＭＡｋ ＢＷ４３／２６（ＣＤ６６ｅに関して選択的）（Eur. J. Nucl. Med. 14 (1988),523-528及びInt. J. Cancer 36 (1985),75-84）、ＭＡｋ ＢＷ２７８／１０５（ＦＶＩＩＩ ＲＡＧのサブポピュレーションに関して選択的）（J. Histochem. Cytochem. 34(1986), 209-214）、ＭＡｋ ＢＷ５７５／９３１（Ｎ−ＣＡＭに関して選択的）（Pediatr. Hematol. Oncol. 6(1989), 73-83）及びＭＡｋ ＹＴＨ２４．５（ＣＤ４５に関して選択的）（J. Immunol. 134(1985), 3056-3061及びLeucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens (Hrsg. Mc Michael et al.), Oxford University Press, Oxford, pp 788-803）並びにドイツ国特許出願１９７４４５３１．４号に記載される幾つかのＭＡｋ（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−レセプター複合体に関して選択的であるが、ＶＥＧＦにもＶＥＧＦ−レセプターにも単独には結合しない）に関して判明した。この所見は、本発明による製造法が近似的に１００％免疫反応性である（糖−）タンパク質を発酵可能であり、かつ製造方法ＩＩの場合において、検出可能な免疫反応性の損失さえもなく廉価に穏やかかつ迅速に精製できることを裏付ける。
【００３５】
更に本発明による製造方法はＦｃ部を有さない多数の（糖−）タンパク質のＧＭＰに適した製造のために使用でき、とりわけＢｏｓｓｌｅｔ他によって記載される融合タンパク質（British Journal of Cancer, 645(1992), 234-238）のために使用でき、その際、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの代わりに代替のアフィニティークロマトグラフィー法が使用される（抗イディオタイプ、レクチンカラム、プロテインＬ、ニッケル酸など）。
【００３６】
免疫反応性の他に、それぞれの製造段階で複数の品質コントロール（最終生成物における滅菌性、ＤＮＡ含量、タンパク質含量、特異性、ｐＨ値、タンパク質組成、等電点、発熱原、プロテインＡ含量）が行われ、これは製造されるべき（糖−）タンパク質（ＭＡｋ）の微生物学的、免疫学的かつタンパク質化学的な特性を試験することを可能にする。本発明ではその試験を先行技術なので検討しなかった。
【００３７】
更に本発明は以下の実施例によって図面と組み合わせて説明されるべきである。
【００３８】
図１は流動床発酵反応器を示してる。
【００３９】
該反応器（２）は担体球（４）、例えば有利には０．４〜０．７ｍｍの直径を有する開孔性の焼結ガラスからなる、酸処理（例えば２．５ＮのＨＣｌ及び５％の硝酸）が施され、中和後に熱処理（例えば２２０℃で６時間）によって滅菌した球で部分的に充填されている。該反応器は更に反応器中の担体球の流動化のためにガス混合物（８）を送り込み、かつ再び導出するベンチレーションモジュール（６）を有する。更に該反応器はｐＨ電極、酸素電極、温度センサなどを備えている。培地は例えば４５０〜５００ｍｌ／分の流速で循環（１０）中を再循環する。該循環は新たな培地の入口（１２）、ポンプ（１４）及び試料採取バルブ（１６）を有してよい。導管を通って、培地はそこに含まれるタンパク質の回収のために採取される。
【００４０】
図２は変更されたＬｉｎｄｍｏ試験における抗体調製物についての結果曲線を示す。
【００４１】
図３及び図４は従来の技術の調製物からのＴＣ−９９ｍ標識されたモノクローナル抗体によるシンチレーション図を示す。
【００４２】
図５〜図７は本発明による調製物からのＴＣ−９９ｍ標識されたモノクローナル抗体によるシンチレーション図を示す。
【００４３】
以下に、ＭＡｋ、実施例においてはＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３に関する典型的な免疫反応性測定の結果を示す。
【００４４】
例１
ＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３（Eur. J. Nucl. Med. 14(1988), 523-528）の免疫反応性を、変更されたＬｉｎｄｍｏ試験（実施は例３参照）によって、慣用の発酵及び精製の際に本願に記載される発酵法及び精製法（製造方法Ｉ及び製造法ＩＩ）に対して精製の開始前（細胞培養上清）及び精製の完了後（精製されたＭＡｋ最終生成物）に測定して比較する。
【００４５】
細胞培養上清もしくは精製されたＭＡｋ最終生成物のＭＡｋ含有試料を、例３に正確に記載されるように処理し、かつ変更されたＬｉｎｄｍｏ試験を指示通りに実施した。ネガティブコントロールとして、同じアイソタイプ（ＩｇＧ１）、同じ軽鎖（κ）、匹敵する等電点及び無関係の特異性のＭＡｋを使用した。ポジティブコントロールは抗原カラムを通して分析規模で精製された９１〜９４％の免疫反応性を有するＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３のバッチである。
【００４６】
以下に細胞培養上清並びに精製されたＭＡｋ最終生成物の個々の免疫反応性測定の結果を示す。
【００４７】
１．  慣用の発酵法及び慣用の精製法（先行技術）
ａ）慣用の発酵（ＫＦ）後の精製されていない細胞培養上清（ＺＫＵＥ）
第１表：
【００４８】
【表２】
0004880854.tif 000003
【００４９】
結果曲線を図２Ａに示す。
【００５０】
ｂ）慣用の発酵（ＫＦ）及び慣用の精製（ＫＲ）後の精製されたＭＡｋ最終生成物（ＭＡｋ）
第２表：
【００５１】
【表３】
0004880854.tif 000004
【００５２】
結果曲線を図２Ｂに示す。
【００５３】
２．  流動床反応器中での発酵及び慣用の精製方法又は“少カラム”精製方法（本発明）
ａ）流動床発酵（ＷＦ）後の細胞培養上清（ＺＫＵＥ）
第３表：
【００５４】
【表４】
0004880854.tif 000005
【００５５】
結果曲線を図２Ｃに示す。
【００５６】
ｂ）流動床発酵（ＷＦ）及び慣用の精製（ＫＲ）後の精製されたＭＡｋ最終生成物（ＭＡｋ）
第４表：
【００５７】
【表５】
0004880854.tif 000006
【００５８】
結果曲線を図２Ｄに示す。
【００５９】
ｃ）流動床発酵（ＷＦ）及び“少カラム”精製（ＳＲ）の後の精製された生成物（ＭＡｋ）
第５表：
【００６０】
【表６】
0004880854.tif 000007
【００６１】
結果曲線を図２Ｅに示す。
【００６２】
例１の結果を以下の第６表にまとめる：
ＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３の免疫反応性
【００６３】
【表７】
0004880854.tif 000008
【００６４】
ＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３の免疫反応性は明らかに発酵条件及び精製条件に依存する。慣用の発酵において、いずれにせよ細胞上清中では既に８０％以下に達するが、流動床反応器による新規の発酵法においては、しかしながら９７％を有する免疫反応性は明らかに高い。
【００６５】
また精製法はＭＡｋの免疫反応性に影響を及ぼす。新規の“少カラム”精製法は明らかに慣用の精製法よりも穏やかである（慣用の方法での免疫反応性の低下は新規の“少カラム”精製法での１％だけの低下に対して８％である）。
【００６６】
匹敵する結果は同様に別のＭＡｋ、例えばＭＡｋ ＢＷ４３１／２６（Eur. J. Nucl. Med. 14(1988),523-528及びInt. J. Cancer 36(1985), 75-84）、ＭＡｋ ＢＷ５７５／９３１（Pediatr. Hematol. Oncol. 6(1989), 73-83）、ＭＡｋ ＹＴＨ２４．５（J. Immunol. 134(1985), 3056-3061及びLeucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens (Hrsg. Mc Michael et al.), Oxford University Press, Oxford, pp 788-803）、ＭＡｋ ＢＷ２７８／１０５（J. Histochem. Cytochem. 34(1986), 209-214）、特許出願１９７４４５３１．４号に記載されるＭＡｋ並びにBritish J. Cancer 645, 234-238, 1992に記載される融合タンパク質で達成できる。
【００６７】
第７表：
発酵法及び精製法に依存する免疫反応性
【００６８】
【表８】
0004880854.tif 000009
【００６９】
ＺＫＵＥ：細胞培養上清
ＧＭＥ：精製されたＭＡｋ生成物
全ての試験されたＭＡｋ及び非常に複雑な（糖−）タンパク質との比較可能な調査結果は融合タンパク質（天然条件下のテトラマーの分子量５００ｋＤａ）に到達するので、匹敵する値が原核性及び真核性の系において発酵可能な全てのＭＡｋ及び（糖−）タンパク質によって得られ、かつ有利な調査結果を一般化できることから出発することが必要である。
【００７０】
慣用の製造法によるか、製造方法Ｉ及びＩＩにより精製されたＭＡｋ−バッチのいずれもＳｃｈｗａｒｚ及びＳｔｅｉｎｓｔｒａｅｓｓｅｒにより記載された方法（J. Nucl. Med., 25(1987), 721）に相応する放射性標識の後に、精製されたＭＡｋタンパク質の免疫反応性と、変更されたＬｉｎｄｍｏ試験の精度の範囲で同一な免疫反応性を示す。該データは以下の第８表にまとめる：
【００７１】
【表９】
0004880854.tif 000010
【００７２】
期待されない臨床的調査結果
慣用の製造方法（慣用のタンパク質化学的精製により行われる撹拌発酵槽中でのバッチ式発酵；免疫反応性７２％）又は新規の製造方法ＩＩ（流動床反応器二引き続いて“少カラム”精製法；免疫反応性９６％）のいずれかによりＧＭＰに適宜に製造されたＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３の調製物のアリコートをＳｃｈｗａｒｚ及びＳｔｒｅｉｎｓｔｒａｅｓｓｅｒによって記載された方法に相応してＴｃ−９９ｍで標識した。ＭＡｋに結合されたアイソトープの割合は両方の調製物中で９９．９％であった。この放射生化学的に同一のＭＡｋ調製物によって炎症性疾患もしくは骨髄転移の疑いがある患者に１０〜２０ｍＣｉの用量を静脈内に与えた。γ−カメラを用いて、全身シンチレーション図を放射性標識されたＭＡｋの静脈内添加の後に２〜２５時間の時間にわたり前側及び背側から撮影した。
【００７３】
意想外にも免疫反応性＞９０％を有するＭＡｋバッチ（製造法ＩＩ）での注入の後のシンチレーション図では、有利には優先的に骨髄がシャープな輪郭で、かつ脾臓が多かれ少なかれ示された（例３参照：図面ＧＲＡＮ９１、ＧＲＡＮ８１及びＧＲＡＮ７１）。慣用の発酵法及び精製法により製造されたＭＡｋバッチ（免疫反応性７０〜８０％）の場合には骨髄が示される他は、非常に明瞭に肝臓及び脾臓が確認された（例３参照：ＧＲＡＮ１１及びＧＲＡＮ２１）。更にこれらの写真では、軽く霞みかつある程度不鮮明なシンチレーション図が認められるより高いバックグラウンドを示す。
【００７４】
結果としては、免疫反応性＞９０％を有するＭＡｋバッチを受容した患者のエピトープ陰性の正常組織は免疫反応性＜８０％を有するＭＡｋバッチで処理された患者よりも実質的に少なく負荷された。患者の観察は核医学において像付与（シンチレーション図）のための顆粒細胞に対する特異的なＭＡｋの免疫反応性の高さの意味を裏付ける。しかしながらイメージ付与だけでなく、α−線及びβ−線での治療のためにも、免疫反応性＞９０％を有するＭＡｋバッチは明らかな利点を示す。このように、例えば免疫反応性≧９０％を有するＭＡｋバッチの標識の後に文献から公知の方法を用いてＲｅ１８８／１８６、Ｙ９０又はアスタチンをカップリングさせ、優先的な骨髄照射を行うことができる（Visser et al., J. Nucl. Med. 34(1993), 1953-1963; Griffith et al., Cancer Res. 51(1991), 4594-4602; Denora et al., Anticancer Res. 17(1997), 1735-1744）。
【００７５】
こうして治療調査の範囲で急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病を有する１９人の患者の集団を治療した。このために、ＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３（免疫反応性＞９０％）のバッチをＲｅ１８８で標識し（比活性；５〜７．５ＧＢｑ／ｍｇ）、かつ６．５〜１２．４ＧＢｑを静脈内に適用した。
【００７６】
線量測定による調査は以下の表にまとめられるデータを提供した。
【００７７】
第９表：
Ｒｅ−１８８標識されたＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３での放射線免疫治療後の線量測定的調査
【００７８】
【表１０】
0004880854.tif 000011
【００７９】
該データは、Ｒｅ−１８８標識されたＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３（免疫反応性＞９０％）での放射線免疫治療を用いて白血病を有する患者の骨髄及び脾臓に高い照射線量を局在させることができることを示している。
【００８０】
患者の集団は２年以内に４０〜５０％の再発リスクを有する患者からなった。意想外にも放射性免疫治療は重大な副作用を誘導しなかった。それに応じて、１２グレイの全身照射及びシクロホスファミド投与からなる標準的治療を行った。全ての１９人の患者は完全な緩解がもたらされ、これは標準的治療と組み合わせる白血病の治療におけるＭＡｋ２５０／１８３での放射線免疫治療の将来的な役割のための示唆をもたらす。この場合、放射線免疫治療は副作用の多い全身照射に換わることが可能であると思われる。
【００８１】
免疫反応性＞９０％を有するＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３の使用の更なる利点は、適用あたり１ｍｇから適用あたり０．５ｍｇに投与されるＭＡｋ量を低減できることにある。この低減は２％未満のＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）頻度に導き、かつそれによって健常者のバックグラウンド−ＨＡＭＡ値と大きく異ならない。
【００８２】
更に意想外にもＲＥＳ（細網内皮系）における骨髄の早期の転移は免疫反応性≧９０％を有するＭＡｋ調製物で見いだされ、約８０％の免疫反応性を有する調製物の場合には過剰照射に基づいて肺及び肝臓の活性増大によって明確に検出できなかった。
【００８３】
まとめると、本願ではＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３の高い免疫反応性バッチを使用することによってα−線、β−線又はγ−線と組み合わせて生じるイメージの質、診断効率、線量測定及び治療効率に関する意想外な利点は定性的にも定量的にも見込まれず、かつより効率的な炎症プロセスの診断及び転移の診断並びに白血病及び他の造血系の疾患の治療のための道を開くことが期待されると思われる。
【００８４】
例２
製造方法Ｉ
真核細胞の培養及び流動床反応器中でのその発酵
液体窒素中に貯蔵されている作業細胞バンクからのアンプルを融解し、かつそこに存在する細胞を標準的細胞培養条件（合成されたタンパク質不含の細胞培養培地）下にＴフラスコ中で培養した。全細胞数が６〜１０×１０７細胞に達した後に、４〜６個のＴフラスコの内容物を５００ｍｌのスピナー容器中で標準的細胞培養条件下で再び培養した。細胞数が１．５〜２×１０８細胞に達した後に、これらの細胞をそれぞれ１０００ｍｌ容量を有する２つのスピナー容器中に移し、かつ再び培養した。細胞数が１．２〜１．５×１０９細胞に達した後に、これらの細胞を９００ｍｌの細胞培養培地及び２００ｍｌのＳｉｒａｎ（Ｒ）担体を含む流動床反応器（Bioreaktor Pilot B 500, Papaspyrou Biotechnologie GmbH, Technologiezentrum Juelich, D-52428 Juelich）中に接種し、かつPapaspyrou Biotechnologie社の取扱指示に相応して３６．５℃で６０日間培養した。酸素含量、ｐＨ値、グルコース濃度並びにＭＡｋ含量を１〜４日間隔で調節した。発酵の間に、細胞培養上清を連続的に回収し、かつ４℃で貯蔵した。
【００８５】
慣用の方法によるタンパク質化学的精製
再処理されるべき培養超濃縮物の容量を共に確認し、かつ撹拌下に１．５倍量の飽和硫酸アンモニウム溶液を緩慢に添加した。該懸濁液を４℃で３日まで、澄明な上清が生じるようになるまで放置する。これをデカンテーションし、該調製物を上清の残量で懸濁し、＞５０００ｇで３０分間にわたって室温で遠心分離する。沈殿物を遠心分離カップ中で一緒にし（→ＭＡｋ−硫酸アンモニウムペースト）、かつ引き続き開始バッファー（１部の沈殿物に対して１〜４部のバッファー）で溶解させる。
【００８６】
プロテインＡ作業のために算出された量の溶解された沈殿物を撹拌下にトライトンＸ−１００水溶液と１００ｇ／ｌで混合し、トライトンＸ−１００の最終濃度は０．５％であった（１０００ｍｌの溶解された沈殿物に対して５０ｍｌのトライトンＸ−１００溶液）。該バッチをスプレーフィルタ（Spritzenfilter）を介して（０．２μｍ）滅菌濾過する。該バッチを４℃で２〜１８時間放置する（→ウイルス不活性ＭＡｋ溶液）。
【００８７】
引き続き直ちにプロテインＡ画分を実施する。試料の導入はできるだけ無菌条件下にかつポンプを用いて行われ、その際、流速は１時間あたり１倍乃至２倍のカラム容量に相当しうるので、ＭＡｋとプロテインＡとの接触は少なくとも３０分間保証される。完全な溶液の導入後に、プロテインＡ上に結合していないタンパク質及びトライトンを開始バッファーによってカラムから洗浄し、かつ流出物の吸光度／透過率が開始バッファーの開始値に再び到達するまですすぐ（期間：０．５〜３時間）。ＭＡｋの溶出は溶出バッファー、ｐＨ３．０によって行われる。溶出液を砕氷で冷却された、約１／１０のカラム容量の２Ｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０が装入された容器（秤量されたガラスビン）中に収容する。溶出はレコーダの出発値にほぼ到達するまで行われる（→精製されたＭＡｋ溶液）。
【００８８】
容量の測定の後に、撹拌しながら１．５倍量の飽和硫酸アンモニウム溶液を緩慢に添加し、６０分間撹拌する。引き続き該懸濁液を４℃で、澄明な上清が生じるまで３日以下放置する。該バッチを振盪し、かつ＞５０００ｇで３０分間にわたり室温で遠心分離する。該上清をデカンテーションで除去し、かつ沈殿物を遠心分離ビーカ中にまとめ（→ＭＡｋ−硫酸アンモニウムペースト）、かつトリス／ＨＣｌ−ＮａＣｌバッファーでできるだけ濃縮して溶解する（１部の沈殿物に対して１〜３部のバッファー）。
【００８９】
澄明になったタンパク質溶液を直ちに、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を含有するトリス／ＨＣｌ−ＮａＣｌバッファー、ｐＨ７．５で平衡化された再生されたカラムに施与する。塩析する（umsalzen）タンパク質溶液の容量は高くてカラム容量の１５％であるべきである。カラムから排出される溶液を流量測光器に、かつ引き続きｐＨ／イオンモニタに導く。ＭＡｋ溶液が完全に施与されたら、該カラムをトリス／ＨＣｌ−ＮａＣｌバッファー、ｐＨ７．５で１ｃｍ２及び１時間あたり約２０ｍｌのカラム中の流速で後すすぎする。カラムの排出容量を流れるＭＡｋを、ラインレコーダで近似的に吸光度／透過率の出発地（約９５％）が再び確認されるまでＵＶ−ラインレコーダ−プロフィールに相応して滅菌受容器中に回収する。ｐＨ／イオンモニタは更なる導電率の変化を示さない（→再緩衝されたＭＡｋ溶液）。
【００９０】
溶液の導電率を調節し、場合により塩化ナトリウム溶液、１０ｇ／ｌ又は水の添加によって注入を目的としてバッファーの導電性に調整する。
【００９１】
該生成物を準備されたＱ−セファロースカラムにおいてできる限り無菌条件で１時間あたり１５０ｍｌの適用速度で施す（１ｍｌのＱ−セファロースあたり２〜５ｍｇのタンパク質）。溶出はトリス／ＨＣｌ−ＮａＣｌ−バッファー、ｐＨ７．５で１ｃｍ２及び１時間あたり約２５ｍｌの流速において実施する。カラムから排出される溶液を流量測光器を介して、引き続きｐＨ／イオンモニタを介して導く。カラムの流動中を移動するＭＡｋを滅菌装置中でＵＶラインレコーダ−プロフィールに相応して、ラインレコーダにおいて吸光度／透過率のほぼ出発値（約９５％）が再び記録されるまで回収する（→発熱物質が排除されたＭＡｋ溶液）。
【００９２】
ＭＡｋを含有する溶出液のアニオン交換クロマトグラフィー後のｐＨ値を１ＮのＨＣｌ又は１Ｎの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．９に調整する。
【００９３】
容量の測定後に、撹拌しながら再び１．５倍量の飽和硫酸アンモニウム溶液を緩慢に添加し、かつ６０分間撹拌する。引き続き該懸濁液を一晩４℃で、澄明な上清が生じるまで放置する。該バッチを振盪し、かつ８５２５ｇで６０分間室温で遠心分離する。上清をデカンテーションにより分離し、沈殿物を遠心分離ビーカ中にまとめ（→ＭＡｋ−硫酸アンモニウムペースト）、かつリン酸ナトリウム−ＮａＣｌ−ソルビトール−バッファー、ｐＨ７．２でできるだけ濃縮して溶解させる（１部の沈殿物に対して１〜３部のバッファー）。
【００９４】
澄明になったタンパク質溶液を直ちに、リン酸ナトリウム−ＮａＣｌ−ソルビトール−バッファー、ｐＨ７．２で平衡化されたセファデックスＧ−２５を含有する再生されたカラムにおいてできる限り滅菌条件下に施す（多くてカラム容量の１５％）。カラムから排出される溶液を流量測光器を介し、かつ引き続きｐＨ／イオンモニタを介して導く。これらのカラムをリン酸ナトリウム−ＮａＣｌ−ソルビトールバッファー、ｐＨ７．２（流速１ｃｍ２及び１時間あたり約２０ｍｌ）で後すすぎする。カラムの流出容量中を移動するＭＡｋを滅菌受容器中にＵＶ−ラインレコーダ−プロフィールに相当して、ラインレコーダにおいて吸光度／透過率のほぼ出発値（約９５％）が再び記録されるまで回収する。ｐＨ／イオンモニタは更なる導電性の変化を示さない（→ＭＡｋ−バルク溶液、濃縮）。
【００９５】
溶液のｐＨ値を調節し、かつ１ＮのＨＣｌ又は１Ｎの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．２に調整する。
【００９６】
マウス−ＩｇＧ濃度に関する調査された値及び容量をもとに、“最終バルク”をリン酸ナトリウム−ＮａＣｌ−ソルビトールバッファー、ｐＨ７．２を用いて所望の最終濃度に希釈する。
【００９７】
該生成物を０．２μｍの１回のフィルタを介して滅菌濾過し、等分し、かつ“最終バルク”を−２０℃で貯蔵する。
【００９８】
製造方法ＩＩ
真核細胞の培養及び流動床反応器中でのその発酵
液体窒素中に貯蔵されている作業細胞バンクからのアンプルを融解し、かつそこに存在する細胞を標準的な細胞培養条件（合成されたタンパク質不含の細胞培養培地）下でＴフラスコ中で培養する。全細胞数が６〜１０×１０７細胞に達したら、４〜６つのＴフラスコの内容物を５００ｍｌのスピナー容器中で標準的な細胞培養条件下に再び培養する。細胞数が１．５〜２×１０８細胞に達したら、これらの細胞をそれぞれ１０００ｍｌの容量を有する２つのスピナー容器に移し、かつ更に培養する。細胞数が１．２〜１．５×１０９細胞に達したら、細胞を９００ｍｌの細胞培養培地及び２５０ｍｌのＳｉｒａｎ（Ｒ）担体を含有する流動床反応器（Bioreaktor Pilot B 500, Papaspyrou Biotechnologie GmbH, Technologiezentrum Juelich, D-52428 Juelich）中に接種し、かつＰａｐａｓｐｙｒｏｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社の取扱手順に相応して３６．５℃で６０日間培養する。酸素含量、ｐＨ値、グルコース濃度並びにＭＡｋ含量を１〜４日間隔で調節する。発酵の間に、細胞培養上清を連続的に回収し、かつ４℃で貯蔵する。
【００９９】
“少カラム”方法によるタンパク質化学的精製
１８ｌの細胞培養培地が回収されたら、“タンジェンシャルフロー”マイクロ濾過を用いて、引き続き０．２μｍフィルタによる滅菌濾過によって実施する。細胞不含及び滅菌の細胞培養回収物を、更なる精製のために十分な細胞培養回収物が存在するまで−２０℃で貯蔵する（約２５０ｌの細胞培養培地からの細胞培養回収物）。予定されるバッチサイズが達成されたら、滅菌の細胞培養回収物を融解し、ミクロ濾過によって澄明化し、かつ超遠心分離によって１００〜１５０倍に濃縮する。次いで超遠心分離物を２倍に濃縮された同容量の開始バッファー（ｐＨ８．６）と混合し、滅菌濾過する。滅菌条件下に滅菌されたトライトンＸ−１００溶液（１００ｇのトライトン／ｌ）を０．５％のトライトンの最終濃度になるまで撹拌下に添加する。エンベロープを有するウイルスの失活のために、該溶液を４〜１８時間４℃で放置する。
【０１００】
次いでトライトンで処理された超濃縮物を、予め５カラム容量の開始バッファーで平衡化されているプロテインＡ−セファロース−４−ファストフロー（Fast-Flow）カラムにポンプ導入する。結合していないタンパク質及びトライトンＸ−１００を５カラム容量の開始バッファーでカラムから洗浄する。引き続きプロテインＡに結合するＭＡｋを溶出バッファー（ｐＨ３．０）でカラムから溶出させ、かつ１３０ｍｌの中和バッファー（ｐＨ８）中に収容する。次いで中和バッファー中に収容されたＭＡｋのｐＨを必要に応じてＮａＯＨを用いてｐＨ７〜７．５に調整し、同容量の２×膜吸着バッファー（ｐＨ７．５）で希釈し、滅菌濾過する。引き続き、ＭＡｋ溶液を滅菌条件下に、予めＷＦＩ及び吸着バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化された膜吸着器（Membranadsorber）にポンプ導入する。ＭＡｋを含有する、事実上含有する発熱物質及びＤＮＡ不含の流量を滅菌容器に回収し、バッファー（ｐＨ７．５）を用いて５００μｇのＭＡｋ／ｍｌに調整する。次いで希釈されたＭＡｋ溶液を超遠心分離によってＶｉｒａｇａｒｄ中空繊維モジュールを用いて潜在的に有するウイルスを排除する。ウイルス不含のＭＡｋを含有する透過物を超遠心分離によって４〜５ｍｇのＭＡｋ／ｍｌの濃度に濃縮し、かつエンドバッファー（ｐＨ７．２）に対して透析濾過する。滅菌濾過、エンドバッファー中での希釈及び再度の滅菌濾過の後にＭＡｋをバルク品として充填する。
【０１０１】
例３
Ｌｉｎｄｍｏによる変更された定量的な免疫反応性試験
導入
ハイブリドーマ上清中の免疫反応性のモノクローナル抗体の含量を測定するために、抗原過剰で高感度（１〜２ｎｇのマウスＩｇ／ｍｌ）ＥＬＩＳＡシステムと組み合わせて結合されないモノクローナル抗体の割合の測定のために使用した。この試験は実質的にＬｉｎｄｍｏによって開発された免疫反応性試験に対して２つの利点を有する。
【０１０２】
ａ）該試験は精製されていなくても精製されていても非放射線標識及び放射線標識のＭＡｋの免疫反応性の測定を可能にする。
【０１０３】
ｂ）該試験は非特異的な結合の不在下に免疫反応性の測定を可能にする。
【０１０４】
材料
0004880854.tif 000012
必要な溶液の製造
リリーによる４％のホルムアルデヒド溶液
−  １００ｍｌの３７％ホルムアルデヒド溶液に
−  ９００ｍｌの二回蒸留水を添加する。この溶液中に
−  ４ｇのリン酸二水素ナトリウム及び
−  ６．５ｇのリン酸水素二ナトリウムを撹拌下に溶解させる。
【０１０５】
−  溶液のｐＨ値はｐＨ７．０であった。
【０１０６】
洗浄溶液：０．０５Ｍのトリス−クエン酸バッファー、ｐＨ７．４
−  ６．０６ｇのトリス、
−  １９．５ｇのクエン酸−１−水和物及び
−  ４．２５ｇの水酸化ナトリウム
−  を１ｌの二回蒸留水に溶解させる。
【０１０７】
ブロッキング溶液：ＰＢＳ中１％のカゼイン、ｐＨ７．２
−  １０ｇのカゼインを
−  １ｌの冷ＰＢＳ、ｐＨ７．２＋フェノールレッド中で
−  ３０分間撹拌させ、
−  引き続き３０００ｒｐｍで遠心分離し、かつ
−  上清を折り畳みフィルタを介して濾過する。
【０１０８】
−  溶液のｐＨ値をＮａＯＨで調整する。
【０１０９】
基質バッファー：０．５Ｍのトリス、０．０１％のＭｇＣｌ、ｐＨ９．６
−  ６０．５７ｇのトリス及び
−  ０．１ｇの塩化マグネシウムを
−  １ｌの二回蒸留水に溶解させる。
【０１１０】
４−メチル−ウンベリフェリル−ホスフェート（ＭＵＰ）溶液
−  ＭＵＰ溶液の濃度は１ｍｇの４−ＭＰＵ／４ｍｌの基質バッファーである。
【０１１１】
停止溶液：０．２Ｍのグリシン、０．２％のＳＤＳ、ｐＨ１１．７
−  １５ｇのグリシン及び
−  ２ｇのＳＤＳを
−  １ｌの二回蒸留水に溶解させる。
【０１１２】
−  該溶液のｐＨ値を５ＮのＮａＯＨで調整する。
【０１１３】
変更されたＬｉｎｄｍｏにおる定量的免疫反応性試験の実施
１．  抗原を含有する材料の製造（“抗原含有材料”；ＡＣＭ）
−  ＢＷ２５０／１８３のエピトープを発現するヒトの腫瘍異種移植片（ＭＺ−ＳＴＯ１，胃ガン）の組織（顆粒細胞の膜上に発現する“非特異的交差反応抗原”（ＮＣＡ−９５））をムーリネットを用いて２〜５ｍｍの切片に切断し、かつ
−  室温で４％のリリーによるホルムアルデヒド溶液中で少なくとも１６時間固定化する。
【０１１４】
−  洗浄の後に固定化された組織をステンレススチールネットに通過させる。
【０１１５】
−  固定化された細胞を、上清がある程度澄明になるまでＰＢＳ中で少なくとも１０回洗浄し、引き続き
−  ホルマリン中で１回洗浄する。
【０１１６】
−  この調製物をリリーによるホルマリン中で４℃で保管し（１部のＡＣＭ及び１部のリリーによるホルマリン）、かつこれを“ＡＣＭ”として呼称する。
【０１１７】
２．  抗原過剰での結合アッセイ
−  ＡＣＭをＰＢＳで少なくとも１０回洗浄し、かつ引き続き
−  ペレットを懸濁し、かつ１００ｍＭのグリシン（４倍のペレット容量）中で４℃において３０分間インキュベートする。
【０１１８】
−  次いで該細胞を更にＰＢＳで４回洗浄する。
【０１１９】
−  ＡＣＭの増加量（０．１〜５０ｍｇ）を１ｍｌのミニチューブ中に添加し、かつ２５ｎｇのＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３を含有する５００μｌのハイブリドーマ上清と一緒に室温で一晩インキュベートする（上向き回転）。
【０１２０】
−  ネガティブコントロールを同一のアイソタイプを示す（ＩｇＧ１）２５ｎｇの抗マイコプラズマＭＡｋ ＢＷ２２７／７と一緒にインキュベートする。
【０１２１】
−  ＡＣＭを遠心分離し、
−  上清を除去し、かつ
−  ＡＣＭペレットに結合しなかった残りのマウスＩｇＧ分子に関して分析する。
【０１２２】
３．  結合しないマウスＩｇＧ分子の割合のＥＬＩＳＡシステムにおける測定
マイクロタイタープレートの抗原による被覆
−  ９６ウェルのポリスチレン−マイクロタイタープレートを５０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清を用いて１ウェルあたり２．５μｌ／ｍｌで一晩インキュベートする。
【０１２３】
−  ウサギ抗マウスＩｇＧ抗血清を引き続き吸い取り、かつこれらのプレートを０．０５Ｍのトリス−クエン酸バッファー、ｐＨ７．４で４回洗浄する（洗浄プロセス＝１ウェルあたり２００μｌをピペッティングし、かつ吸い取る）。
【０１２４】
−  マイクロタイタープレートをセルロース上で逆さにして一晩乾燥させる。
【０１２５】
−  乾燥パトローネで密閉し、前処理されたマイクロタイタープレートの貯蔵時間は少なくとも６ヶ月である。
【０１２６】
遊離の結合部位のブロッキング
−  ２００μｌのブロッキング溶液を１ウェルあたりにピペッティングし、かつ該プレートを室温で６０分間インキュベートする。
【０１２７】
−  引き続きブロッキング溶液を吸い取る。
【０１２８】
試料適用
−  結合されていないマウス−ＩｇＧ分子の総数に関して分析されるべき５０μｌのＡＣＭ上清を１ウェルあたりに適用し、かつ室温で６０分間インキュベートする。
【０１２９】
−  次いでマイクロタイタープレートを前記のように洗浄溶液で３回洗浄する。
【０１３０】
増幅及び検出
−  ５０μｌの、アルカリ性ホスファターゼとカップリングされた１：２５０で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１ウェルあたりに適用し、かつ室温で３０分間インキュベートする。
【０１３１】
−  マイクロタイタープレートを前記のように洗浄溶液で３回洗浄する。
【０１３２】
−  ５０μｌのＭＵＰ溶液を１ウェルあたりに適用し、かつ室温で３０分間インキュベートする。
【０１３３】
−  基質反応を室温で３０分間インキュベートした後で１００μｌの停止溶液の添加によって停止させる。
【０１３４】
−  引き続き蛍光を測定する：励起波長は３５５ｎｍであり、かつ放出波長は４６０ｎｍである。
【０１３５】
この試験の感度は１〜２ｎｇのマウスＩｇＧ／ｍｌの範囲にある。
【０１３６】
免疫反応性の数学的測定
ＩＲ［%］＝100%−［100%×（上清中のＭＡｋ濃度／ＭＡｋ出発濃度）］
免疫反応性の計算は検針点で行われる。この点は非特異的コントロール（非特異的結合）のプラトー値のまさにさらなる低下が存在しないようなそのＡＣＭ容量（ＥＬＩＳＡ経過曲線のＸ軸）にある。
【０１３７】
例４
Ｔｃ−９９ｍ標識されたＭＡｋ ＢＷ２５０／１８３の注入により記録されるシンチレーショングラム
Ｔｃ−９９ｍでの標識のために使用されるＭＡｋバッチはその製造方法に基づいてそれらの免疫反応性において異なる。これらのデータを以下の第１０表にまとめる。
【０１３８】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は流動床発酵反応器を示してる。
【図２】  図２は変更されたＬｉｎｄｍｏ試験における抗体調製物についての結果曲線を示す。
【図３】  図３は従来の技術の調製物からのＴＣ−９９ｍ標識されたモノクローナル抗体によるシンチレーション図を示す。
【図４】  図４は従来の技術の調製物からのＴＣ−９９ｍ標識されたモノクローナル抗体によるシンチレーション図を示す。
【図５】  図５は本発明による調製物からのＴＣ−９９ｍ標識されたモノクローナル抗体によるシンチレーション図を示す。
【図６】  図６は本発明による調製物からのＴＣ−９９ｍ標識されたモノクローナル抗体によるシンチレーション図を示す。
【図７】  図７は本発明による調製物からのＴＣ−９９ｍ標識されたモノクローナル抗体によるシンチレーション図を示す。
【符号の説明】
２  反応器、  ４  担体球、  ６  ベンチレーションモジュール、  ８  ガス混合物、  １０  循環、  １２  新たな培地の入口、  １４  ポンプ、  １６  試料採取バルブ、  １８  導管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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