(57)【要約】【課題】リポ多糖を簡便かつ正確に測定する。【解決手段】リポ多糖含有試料をリポ多糖結合ペプチドを結合させた担体と混合し、該担体に結合したリポ多糖を検出するリポ多糖の測定方法において、  該リポ多糖結合ペプチドとして配列番号１〜４のいずれかを含むペプチドまたはその誘導体を用い、  リポ多糖含有試料をリポ多糖結合ペプチドを結合させた担体と混合するステップおよびＬＰＳを検出するステップを、装置本体と、この装置本体上に配列された複数の流体取扱部とからなり、これらの流体取扱部の各々が、流体を注入するための注入部と、この注入部から導入された流体を連続的に下方に流動させる流動部と、この流動部内の流体が導入される流体収容室と、この流体収容室と前記注入部および前記流動部との間に設けられた壁部と、この壁部に形成されて前記流体収容室内に流体を導入する開口部とを備え、前記開口部が少なくとも前記流動部の下端付近から前記流動部の上端より高い位置まで延びて前記注入部および前記流動部を前記流体収容室に連通させることを特徴とする流体取扱装置を用いて行うことを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ多糖含有試料をリポ多糖結合ペプチドを結合させた担体と混合し、該担体に結合したリポ多糖を検出するリポ多糖の測定方法において、
該リポ多糖結合ペプチドとして配列番号１〜４のいずれかを含むペプチドまたはその誘導体を用い、
リポ多糖含有試料をリポ多糖結合ペプチドを結合させた担体と混合するステップおよびリポ多糖を検出するステップを下記の装置を用いて行うことを特徴とする方法：
装置本体と、この装置本体上に配列された複数の流体取扱部とからなり、これらの流体取扱部の各々が、流体を注入するための注入部と、この注入部から導入された流体を連続的に下方に流動させる流動部と、この流動部内の流体が導入される流体収容室と、この流体収容室と前記注入部および前記流動部との間に設けられた壁部と、この壁部に形成されて前記流体収容室内に流体を導入する開口部とを備え、前記開口部が少なくとも前記流動部の下端付近から前記流動部の上端より高い位置まで延びて前記注入部および前記流動部を前記流体収容室に連通させることを特徴とする流体取扱装置。
【請求項２】
装置本体と、この装置本体上に配列された複数の流体取扱部とからなり、これらの流体取扱部の各々が、流体を注入するための注入部と、この注入部から導入された流体を連続的に下方に流動させる流動部と、この流動部内の流体が導入される流体収容室と、この流体収容室と前記注入部および前記流動部との間に設けられた壁部と、この壁部に形成されて前記流体収容室内に流体を導入する開口部とを備え、前記開口部が少なくとも前記流動部の下端付近から前記流動部の上端より高い位置まで延びて前記注入部および前記流動部を前記流体収容室に連通させることを特徴とする流体取扱装置、および配列番号１〜４のいずれかを含むペプチドを含む、リポ多糖測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリポ多糖（Lipopolysaccharide；ＬＰＳ）測定方法およびＬＰＳ測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＰＳは、グラム陰性菌の外膜に存在し、グラム陰性菌感染時では、体内に溶出されたＬＰＳによって敗血症が誘発されることが知られている。これは、ＬＰＳがＬＢＰ（LPS binding protein）などの血漿中のＬＰＳ結合タンパクによって細胞膜上のＴＬＲ４（Toll Like Receptor 4）にリクルートされ、ＮＦｋＢ（nuclear factor κB）経路を中心とした炎症反応を誘発することが主な発症メカニズムである。これらは各所での炎症又は発熱を引き起こす他、毛細血管での血液凝固（disseminated intravascular coagulation；ＤＩＣ）を誘発し、多臓器不全等、不可逆的反応によって患者を死に至らしめる。
【０００３】
ＬＰＳは、医薬品の製造プロセス中に存在する細菌が破壊（死滅・溶菌）することによって遊離し、医薬品に混入する可能性がある。例えば、輸液や注射製剤等のような非経口医薬品は、主に発酵技術や遺伝子組換え技術により製造されており、製造工程において宿主細胞壁成分からの混入が懸念される。したがって、これら医薬品の安全性を確保する上でＬＰＳ含有量を、簡便かつ高感度に測定することは必須となっている。
【０００４】
ＬＰＳの濃度測定方法としては、リムルス試験が主流となっている。このリムルス試験は、カブトガニの血球抽出液がＬＰＳにより凝固する現象を利用したものである。リムルス試薬の凝固反応は、哺乳類の血液擬固系に類似したカスケード反応で起こる。したがって、少量のＬＰＳのシグナルを増幅して擬固が引き起こされるもので、非常に高感度な測定系である。
しかしながら、リムルス試験では試料の種類によっては加熱処理が必要であり、また、血液などの試料中に含まれる共雑物の影響によって測定結果が安定しないなどの問題があった。
【０００５】
そこで、非特許文献１には、ＬＰＳを抽出した後にリムルス試験に供することを目的としたパイロセップ法が開示されている。この方法では、ＬＰＳ結合物質を充填したキャピラリーカラムを使用してＬＰＳを吸着させて試料から抽出した後、リムルス反応を測定するという方法である。しかしながら、この方法では、ＬＰＳの抽出とリムルス反応の測定を別の系で行う必要があり、手間がかかるという問題や塩濃度の調整が必要であるという問題があった。
【０００６】
また、特許文献１には、ＬＰＳ結合活性を示すペプチドが開示されており、このペプチドをビーズ担体に結合させたものを用いて、ＬＰＳを含む可能性のある被検試料と接触させ、吸着させるＬＰＳ除去方法が開示されている。そのアッセイ法としてはカラム法やバッチ法で開示されている。また、これらの技術を応用し、前記ペプチド固定化ビーズとＬＰＳを含む可能性のある被検試料を接触させ、ＬＰＳを被検試料から抽出した後、そのペプチド固定化ビーズ担体に結合したＬＰＳの定量をリムルス試験にて試みた（非特許文献１と同様な測定方法を行なった）が、より効率よく測定するために改善の余地があった。
【０００７】
また特許文献２には、装置本体と、この装置本体上に配列された複数の流体取扱部とからなり、これらの流体取扱部の各々が、流体を注入するための注入部と、この注入部から導入された流体を連続的に下方に流動させる流動部と、この流動部内の流体が導入される流体収容室と、この流体収容室と前記注入部および前記流動部との間に設けられた壁部と
、この壁部に形成されて前記流体収容室内に流体を導入する開口部とを備え、前記流動部内に導入された流体が前記流動部内で接触する表面の面積を増大させる表面積増大部材が前記流動部内に配置され、前記開口部が少なくとも前記流動部の下端付近から前記流動部の上端より高い位置まで延びて前記注入部および前記流動部を前記流体収容室に連通させることを特徴とする流体取扱装置が開示されている。そして、この装置がＥＬＩＳＡなどの生化学アッセイに使用できる旨が記載されているが、この装置をＬＰＳの測定に使用することは開示されていなかった。
【特許文献１】国際公開第2007/060769号パンフレット
【特許文献２】特開2007-279018号公報
【非特許文献１】和光純薬ホームページ「パイロセップ法」http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/life/talk_lal/tlal-20.pdf
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、簡便かつ、正確にＬＰＳを測定する方法およびそれに使用するキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、配列番号１〜４のいずれかを含むペプチドまたはその誘導体を結合させた担体とリポ多糖含有試料とを混合するステップおよびＬＰＳを検出するステップを「装置本体と、この装置本体上に配列された複数の流体取扱部とからなり、これらの流体取扱部の各々が、流体を注入するための注入部と、この注入部から導入された流体を連続的に下方に流動させる流動部と、この流動部内の流体が導入される流体収容室と、この流体収容室と前記注入部および前記流動部との間に設けられた壁部と、この壁部に形成されて前記流体収容室内に流体を導入する開口部とを備え、前記開口部が少なくとも前記流動部の下端付近から前記流動部の上端より高い位置まで延びて前記注入部および前記流動部を前記流体収容室に連通させることを特徴とする流体取扱装置」を用いて行うことで簡便かつ正確にＬＰＳを定量できることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、リポ多糖含有試料をリポ多糖結合ペプチドを結合させた担体と混合し、該担体に結合したリポ多糖を検出するリポ多糖の測定方法において、
該リポ多糖結合ペプチドとして配列番号１〜４のいずれかを含むペプチドまたはその誘導体を用い、
リポ多糖含有試料をリポ多糖結合ペプチドを結合させた担体と混合するステップおよびリポ多糖を検出するステップを、装置本体と、この装置本体上に配列された複数の流体取扱部とからなり、これらの流体取扱部の各々が、流体を注入するための注入部と、この注入部から導入された流体を連続的に下方に流動させる流動部と、この流動部内の流体が導入される流体収容室と、この流体収容室と前記注入部および前記流動部との間に設けられた壁部と、この壁部に形成されて前記流体収容室内に流体を導入する開口部とを備え、前記開口部が少なくとも前記流動部の下端付近から前記流動部の上端より高い位置まで延びて前記注入部および前記流動部を前記流体収容室に連通させることを特徴とする流体取扱装置を用いて行うことを特徴とする方法を提供する。
この流体取扱装置においては、開口部が壁部を貫通するスリットであるのが好ましく、このスリットの上部の幅を下部の幅よりも広くしてもよい。また、開口部の下端が流体収容室の底面と略等しい高さであるのが好ましい。また、装置本体が、枠体と、この枠体上に互いに略平行に配置された複数の支持体とからなり、これらの支持体の各々に複数の凹部が所定の間隔で一列に配置して形成され、これらの凹部内に複数の流体取扱部がそれぞれ取り付けられているのが好ましい。
また、上記の流体取扱装置においては、流動部が流体収容室を取り囲むように配置され
ているのが好ましい。また、複数の凹部の各々が、上側凹部と、この上側凹部の底面に形成された下側凹部とからなり、流動部が、複数の凹部の各々に挿入された仕切り壁部材と上側凹部との間に形成され、流体収容室が、仕切り壁部材に囲まれていてもよい。この場合、流体の注入を容易にするように上側凹部を略水平方向に拡張する拡張凹部が複数の凹部の各々に形成されているのが好ましい。また、注入部に注入された液体が毛管現象により流動部内および開口部内を流動するのが好ましい。
なお、本明細書中、「開口部」とは、一部が壁部を貫通していればよく、壁部を貫通するスリットのような細長い貫通孔の他、細長い溝部（凹部）の一部に貫通孔が形成されている場合も含む。
【００１１】
本発明はまた、前記配列番号１〜４のいずれかを含むペプチドまたはその誘導体および前記流体取扱装置を含むＬＰＳ検出キットを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法およびキットによれば、ＬＰＳを特異的に結合させて測定するので、試料中のＬＰＳを正確に定量できる。また、ＬＰＳの結合反応と検出反応を同一の反応装置で行うことができるので簡便にＬＰＳの測定を行うことができる。また、多検体処理も可能で、注入、吸引、撹拌、検出の操作を自動化した自動化測定も可能である。また、本発明の方法およびキットによれば、高塩濃度試料や、リムルス試験阻害物質含有試料を用いたときも、ＬＰＳを正確に定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法に使用されるＬＰＳ結合ペプチドは、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００１４】
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡ（配列番号１）
ここで、ＸはＫ、ＲまたはＨを示す。
配列番号１で表されるアミノ酸配列として具体的には、
ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号５）
ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号６）
ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号７）
ＲＮＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号８）
ＲＮＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号９）
ＲＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号１０）
ＨＮＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号１１）
ＨＮＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号１２）
ＨＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号１３）
が挙げられる。
【００１５】
ＸＮＹＳＳＳ（配列番号２）
ここで、Ｘはアミノ酸残基なし、Ｋ、ＲまたはＨを示す。
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１〜６番目のアミノ酸からなる配列である。配列番号２で表されるアミノ酸配列には、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘが、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨである配列、すなわち、
ＫＮＹＳＳＳ（配列番号１４）
ＲＮＹＳＳＳ（配列番号１５）
ＨＮＹＳＳＳ（配列番号１６）
が含まれる。
【００１６】
また、「配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つＬＰＳ結合活性を示すペプチド」であってもよく、このような配列としては、
ＸＮＹＳＳＳＩ（配列番号１７）
ＸＮＹＳＳＳＩＳ（配列番号１８）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳ（配列番号１９）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号２０）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸ（配列番号２１）
を挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＫ）であり、配列番号２１の１１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。
【００１７】
また、以下のような配列を含むペプチドもＬＰＳ結合ペプチドとして例示できる。
ＮＹＳＳＳ（配列番号２２）
ＮＹＳＳＳＩ（配列番号２３）
ＮＹＳＳＳＩＳ（配列番号２４）
ＮＹＳＳＳＩＳＳ（配列番号２５）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号２６）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸ（配列番号２７）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡ（配列番号２８）
なお、配列番号２７，２８における１０番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。
【００１８】
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡ（配列番号３）
ここで、ＸはＫ、ＲまたはＨを示す。
配列番号３で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において２番目のＮが欠失した配列である。配列番号３で表されるアミノ酸配列には、配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番目及び１０番目の各アミノ酸Ｘが、それぞれ独立して、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨである配列、すなわち、
ＫＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号２９）
ＫＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号３０）
ＫＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号３１）
ＲＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号３２）
ＲＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号３３）
ＲＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号３４）
ＨＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号３５）
ＨＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号３６）
ＨＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号３７）
が含まれる。
【００１９】
ＸＹＳＳＳ（配列番号４）
ここで、Ｘはアミノ酸残基なし、Ｋ、ＲまたはＨを示す。
配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列における１〜５番目のアミノ酸からなる配列である。配列番号４で表されるアミノ酸配列には、配列番号４で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘが、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨである配列、すなわち、
ＫＹＳＳＳ（配列番号３８）
ＲＹＳＳＳ（配列番号３９）
ＨＹＳＳＳ（配列番号４０）
が含まれる。
【００２０】
「配列番号５で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」であってもよく、そのようなペプチドとしては、例えば、
ＸＹＳＳＳＩ（配列番号４１）
ＸＹＳＳＳＩＳ（配列番号４２）
ＸＹＳＳＳＩＳＳ（配列番号４３）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号４４）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸ（配列番号４５）
を挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＫ）であり、配列番号４５における１０番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。
【００２１】
また、以下のような配列を含むペプチドもＬＰＳ結合ペプチドとして例示できる。
ＹＳＳＳ（配列番号４６）
ＹＳＳＳＩ（配列番号４７）
ＹＳＳＳＩＳ（配列番号４８）
ＹＳＳＳＩＳＳ（配列番号４９）
ＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号５０）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＸ（配列番号５１）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡ（配列番号５２）
なお、配列番号５１，５２における９番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。
【００２２】
ＬＰＳ結合ペプチドとして使用できる「配列番号１〜４のペプチドの誘導体」としては、例えば、ペプチドの安定性を向上させる各種修飾を施したペプチド誘導体を挙げることができる。前記修飾としては、例えば、Ｌ体アミノ酸のＤ体化（例えば、Ｎ末端アミノ酸のＤ体化、Ｃ末端アミノ酸のＤ体化、Ｎ末端及びＣ末端以外のアミノ酸のＤ体化）、Ｎ末アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然型アミノ酸の（性質の類似した）非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せを挙げることができる。Ｎ末端アミノ酸（Ｌ体）をＤ体アミノ酸に置換した誘導体としては、Ｄ体の塩基性アミノ酸に置換した誘導体が好ましく、Ｄ体リジン又はＤ体アルギニンに置換した誘導体がより好ましい。誘導体としては、以下の配列が例示される。
Lys（d） Tyr Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ile Arg Ala Cys（d）
この配列は、配列番号３０の１番目のＫがＤ体であり、末端にＤ体のＣが結合したものである。
【００２３】
本発明の方法では、上記ＬＰＳ結合ペプチドを担体に結合させたものを用いる。
ここで、担体としては、例えば、シリカビーズ、ガラスビーズやアガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、架橋デキストランビーズ、キチンビーズ、架橋キチンビーズ、キトサンビーズ、架橋キトサンビーズなどの多糖系ビーズ、磁気ビーズ、ラテックスビーズ又はガラスファイバー等を用いることができる。
上記ＬＰＳ結合ペプチドは担体に直接結合させてもよいが、リンカー配列を介して結合させてもよい。リンカー配列としては、例えば、ペプチドを担体に担持させるための配列、例えば、チオール基を有するアミノ酸（例えば、システイン又はホモシステイン）又はアミノ基と反応しない官能基（例えば、マレイミド基）を側鎖に有するアミノ酸１個からなるリンカー配列、あるいは、末端にチオール基を有するアミノ酸又はアミノ基と反応し
ない官能基を有するアミノ酸を含むリンカー配列を挙げることができる。
担体は、適切な方法でカップリングのための活性基を導入し活性化されて、上記LPS結合ペプチドを固定化させる。活性化方法しては、CNBr活性化法、活性化エステル法、カルボニルジイミダゾール法、アルデヒド（ホルミル）基導入、FMP（２-フルオロ-１−メエチルピリジニニュウム  トルエン-４−スルフォネート）活性化法、有機スルホニルクロライド活性化法、ジビニルスルホン活性化法、アゾラクトン基導入、塩化シアヌル活性化法、ヒドラジン基導入、エポキシ活性化法、ジアゾニウム基導入などが知られている。これらは、アミノ基、水酸基、カルボニル基、活性化水素との反応も起こり、チオール基特異的ではない。チオール基に特異的な方法としては、ヨード酢酸やブロモ酢酸などハロゲン化アセチル基の導入や、マレイイミド基の導入、S-S結合を持つピリジルジスルフィット基の導入などがある。特にハロゲン化アセチルの導入はチオール基特異的で安定な結合がペプチドを形成されるので好ましい。ハロゲン化アセチル基の導入は、たとえば、アミノ基導入セルロース粒子にヨード酢酸をアミド結合で導入することで容易にヨード酢酸アミド化セルロース粒子に活性化した粒子を得ることができる。
【００２４】
担体にＬＰＳ結合ペプチドを結合させる態様はＬＰＳ結合ペプチドがＬＰＳ結合能を失わない限り特に制限されないが、下記に示されるようなＬＰＳ結合ペプチドのＣ末端にシステイン残基を結合させたものを用意し、これをヨード酢酸アミド化セルロース粒子に反応させて結合させる態様が例示される。
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号５３）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号５４）
ＸＮＹＳＳＳＣ（配列番号５５）
ＸＮＹＳＳＳＩＣ（配列番号５６）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＣ（配列番号５７）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＣ（配列番号５８）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＣ（配列番号５９）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＣ（配列番号６０）
ＮＹＳＳＳＣ（配列番号６１）
ＮＹＳＳＳＩＣ（配列番号６２）
ＮＹＳＳＳＩＳＣ（配列番号６３）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＣ（配列番号６４）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＣ（配列番号６５）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＣ（配列番号６６）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号６７）
ＸＹＳＳＳＣ（配列番号６８）
ＸＹＳＳＳＩＣ（配列番号６９）
ＸＹＳＳＳＩＳＣ（配列番号７０）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＣ（配列番号７１）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＣ（配列番号７２）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸＣ（配列番号７３）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号７４）
ＹＳＳＳＣ（配列番号７５）
ＹＳＳＳＩＣ（配列番号７６）
ＹＳＳＳＩＳＣ（配列番号７７）
ＹＳＳＳＩＳＳＣ（配列番号７８）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＣ（配列番号７９）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＸＣ（配列番号８０）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号８１）
ここで、ＸはＫ、ＲまたはＨを示す。
【００２５】
本発明の方法では、上記のようにして調製されたＬＰＳ結合ペプチドを結合させた担体を以下の流体取扱装置に加えてＬＰＳの測定を行う。
本発明の方法で使用される流体取扱装置は、特開2007-279018号公報に開示されている流体取扱装置である。ただし、特開2007-279018号公報に開示されている流体取扱装置における仕切り板は必ずしも必要ない。
以下、図面を参照して当該装置について説明する。
図１に示すように、この流体取扱装置１０は、装置本体部１２と、この装置本体部１２に取り付けられた複数（本実施の形態では８×１２の配列の９６個）の流体取扱部１６とから構成されている。
図１および図２に示すように、装置本体部１２は、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）などの樹脂材料またはガラス材料により形成されており、中央に略矩形の貫通穴１１ａが形成されて厚さが数ｍｍ程度で一辺の長さが数ｃｍ〜十数ｃｍ程度の大きさの略矩形の枠体１１と、この枠体１１に載置された複数（本実施の形態では１２個）の流体取扱部支持体１３とから構成されている。なお、枠体１１の貫通穴１１ａは、底面を備えた凹部でもよい。また、枠体１１として、例えば、ＳＢＳ（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）規格のマイクロプレート用の枠体のような標準的な規格の枠体を使用してもよい。流体取扱部支持体１３は、透明材料により形成することが好ましい。
【００２６】
図２に示すように、流体取扱部支持体１３の各々は、枠体１１の貫通穴１１ａの幅と略等しい長さの略直方体の細長い支持体本体部１３ａと、この支持体本体部１３ａの上部の長手方向両端から突出して支持体本体部１３ａの上面に沿って延びる略矩形の一対の突出部１３ｂとから構成されている。図１に示すように、流体取扱部支持体１３の各々の支持体本体部１３ａが枠体１１の貫通穴１１ａに挿入されて、突出部１３ｂが枠体１１の長手方向に延びる一対の上面１１ｂに支持されるように、枠体１１上に流体取扱部支持体１３を互いに略平行に且つ隣接して載置することにより、装置本体部１２が組み立てられる。
【００２７】
図３および 図４に示すように、流体取扱部支持体１３の各々の支持体本体部１３ａの上面には、複数（本実施の形態では８個）の凹部１４（以下、「取付用凹部１４」という）が所定の間隔で一列に配置して形成されている。これらの取付用凹部１４内には、流体取扱部１６が取り付けられるようになっている。これらの取付用凹部１４の各々は、 図３および図４に示すように、支持体本体部１３ａの上面に形成された略円柱形の大径凹部１４ａと、この大径凹部１４ａに隣接して大径凹部１４ａの上側部分を略水平方向に拡張するように支持体本体部１３の上面に形成され、大径凹部１４ａの略半分の深さの拡張凹部１４ｃと、大径凹部１４ａの底面の略中央部に形成された略円柱形の小径凹部１４ｂとから構成されている。拡張凹部１４ｃの大径凹部１４ａから延びる対向する２つの面は、流体取扱部支持体１３の支持体本体１３ａの長手方向に延びる側面に沿って互いに略平行に延びている。また、拡張凹部１４ｃの底面は、大径凹部１４ａに向かって湾曲して下方に傾斜しており、大径凹部１４ａの底面は、小径凹部１４ｂに向かって下方に傾斜している（図６参照）。また、小径凹部１４ｂの底面には、後述する円筒部材２０の内径と略等しい直径で貫通孔１４ｅが形成されており、円筒部材２０を小径凹部１４ｂ内に嵌合させ、円筒部材２０内に収容される液体に発色の程度を測定するために光を照射した際、その光が複数の界面で損失してしまうことを防止するように工夫されている。
【００２８】
図５（Ｃ）のように、流体取扱部１６は、流体取扱部支持体１３の取付用凹部１４に、円筒部材２０を取り付けることによって形成される。
また、円筒部材２０は底面部２０ａを有し、図５（Ａ）に示すように、円筒部材２０の外周面には、流体を通過させることができ且つビーズ２２を通過させない幅の１つまたは複数（本実施の形態では１２個）のスリット２０ｂが底面部２０ａの上面から長手方向に沿って互いに平行に延びるように円筒部材２０を貫通して形成されている。これらのスリ
ット２０ｂは、円筒部材２０の長さの半分以上の長さを有している。なお、本実施の形態では、スリット２０ｂは、図５（Ｂ）に示すように、円筒部材２０の外周面に放射状に形成されている。
【００２９】
具体的な測定方法について説明する。
まず、上記で調製したＬＰＳ結合ペプチドを結合させた担体（ビーズ２２）を流体取扱装置１０の注入部２６から加えて流動部２８に充填する。なお、ビーズ２２が流体収容室３０に移動しないようにするために、ビーズ２２の粒径はスリット２０の幅よりも大きくする。
次に、流体取扱部１６に平衡化バッファーを加える。平衡化バッファーはスリット２０ｂを通って流体収容室３０から流動部２８に到達してビーズ２２を平衡化する。平衡化終了後、流体取扱部１６から平衡化バッファーを除去する。なお、ビーズがあらかじめ平衡化されている場合はこの操作は必要ない。
次に、注入部２６に試料を添加する。試料は、流動部２８に到達してビーズ２２に結合したＬＰＳ結合ペプチドと混合され、試料中のＬＰＳがビーズ２２に特異的に結合する。反応終了後、流体取扱部１６から試料を除去する。
次に、流体取扱部１６に洗浄液を添加して流体取扱部１６の内部を洗浄し、洗浄液を流体取扱部１６から除去する。この操作は２回以上繰り返すことが好ましい。また、洗浄液は界面活性剤を含んでもよい。
洗浄後、注入部２６にリムルス試薬（例えば、エンドスペシーES-50Mセット；生化学工業社）などのＬＰＳ測定試薬を添加する。ＬＰＳ測定試薬は、流動部２８でビーズ２２に結合したＬＰＳと反応する。
発色反応を一定時間行った後、流体収容室３０の底部および上部（開口部）のどちらか一方から所定波長の光を照射し、流体収容室３０内の反応液の発色の程度をプレートリーダーなどで定量する。
【００３０】
なお、溶液の添加、吸引は、溶液を押出したり吸引したりできるマルチピペットで行うと多検体処理ができ好ましい。
なお、結合反応、洗浄は流体取扱装置１０を振とうさせながら行うことが好ましい。
また、結合反応、発色反応は、結合または発色に適した温度に流体取扱装置１０を制御しながら行うこともより安定した測定結果が得られるので好ましい。
なお、リポ多糖の除去が必要となる処理対象としては、例えば、血漿、血清、血液、透析液、輸液、注射剤、又は各種バッファーを挙げることができる。
【００３１】
本発明のキットは、上記ＬＰＳ結合ペプチドと上記流体取扱装置を含むＬＰＳ測定用キットである。
本発明のキットは、さらにＬＰＳ標準溶液やＬＰＳ測定試薬などを含んでもよい。LPS測定試薬としては、カブトガニの血球抽出液を用いたLPS測定試薬などが挙げられる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
実施例１
１−１．ペプチドLi5 K1dK N2del H10R C12dC（Lys（d） Tyr Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ile Arg Ala Cys（d）；（d）はD体アミノ酸を示す。）のビーズ担体への固定化
ヨード酢酸アミド化セルロース粒子（チッソ株式会社製）（以下、ビーズ担体と称する）に溶媒を加えて反応させ、最終的にＣ末端のシステインのチオール基を利用してペプチドを固定化した。
【００３４】
具体的には、先ず、ペプチドを少量のDMSO (ジメチルホルムアミド)で溶解した後、カップリングバッファー（50mmol/L Tris, 5mmol/L EDTA・2Na, pH8.5）を加え、0.25ｍMのペプチド溶液を調製した。
【００３５】
蒸留水でよく洗浄したビーズ担体と上記で調製したペプチド溶液を混合し、25℃で穏やかに攪拌しながら6時間程度反応させた。ペプチド固定化後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を洗浄し、更にカップリングバッファーにて平衡化した。続いて、ブロッキングバッファー（２−メルカプトエタノールを100 mmol/Lとなるようにカップリングバッファーに溶解したもの）を、平衡化したビーズ担体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら２５℃で６時間程度反応させ、非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行なった。ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメルカプトエタノールを取り除いた。その後、20％エタノールで置換し、ビーズ担体をカラムから2mLのマイクロテストチューブに移し変え、使用するまで４℃で保存した。
【００３６】
ペプチド固定化量はSH基定量試薬（Ellman's Reagent;PIERCE社）を用いて、未結合のペプチド溶液中のSH基を測定することで定量した。
【００３７】
１−２．ＬＰＳの測定
試料の調製
先ず、Control Standard Endotoxinx (CSE) from E.coli UKT-B株製（和光純薬工業社製）をエンドトキシンフリーの蒸留水（大塚製薬社製）で溶解し（2,000EU/ml）、更にＰＢＳで希釈することにより、濃度の異なるＬＰＳ溶液（最終濃度＝0.1EU/mL、0.05EU/mL、0.025EU/mL、0EU/ｍL）を調製した。EUはエンドトキシンユニットを示す。
【００３８】
測定用プレートとしては、図１の構造を有するエンプラス社製の機能性プレートを用いた。
まず、実施例１−１で調製したペプチド固定化ビーズ担体のスラリー50μL(gel量で15μL)をピペットで吸引し、注入部に添加し、流体取扱部から不要な液をピペットで吸引除去した。次に、上記で調製したＬＰＳ溶液２００μLをビーズ充填部（流動部）に添加してプレートシェーカーで振とう（９００ｒｐｍ）させながら室温で２０分間反応させた。次に、反応液を流体取扱部からピペットで吸引除去した後、流体取扱部に洗浄液（２０ｍM NaCl）２５０μLを加え、その後、流体取扱部からピペットで洗浄液を吸引除去した。この操作をさらに２回行った。
さらに、２５０μLの蒸留水で洗浄操作を１回行った後、ビーズ充填部（流動部）に蒸留水１００μLを添加し、さらに、リムルス試薬（エンドスペシーES-50Mセット；生化学工業社）を１００μL添加して３７℃で３０分間静置反応させた。その後、プレートリーダーにて吸光度Ａ４０５を測定し、予め準備された検量線を用いて、吸光度の値からＬＰＳ濃度を求めた。
ｎ＝５で行った結果を図７に示す。その結果、添加量とほぼ同量のＬＰＳを検出することができた。これにより、試料中のＬＰＳがビーズで回収され、感度よく検出できることが示された。
【００３９】
実施例２
各種ＬＰＳ溶解バッファーの影響の評価
エンドトキシンフリーの蒸留水で溶解された（2,000EU/ml）エンドトキシン標準品を、ＰＢＳに代えて、0.5M NaClリン酸緩衝液（pH7.4）、0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.0）、0.1Mグリシン-NaOH緩衝液（pH10.0）または99.5%エタノールで希釈して調製されたＬＰＳ溶液（最終濃度＝0.1EU/mL、0.05EU/mL、0.025EU/mL、または0EU/ｍL）を測定に使用した以外は、実施例１−２と同様にして測定を行った。ｎ＝３で行った結果を図８に示す。その結果、いずれの溶液でも添加量の８０％以上のＬＰＳが検出され、バッファーの種類や塩
濃度によらず感度よくＬＰＳの検出が行えることがわかった。
従来のＬＰＳ結合活性を示すペプチド（非特許文献１に記載のペプチド）では、高い塩濃度のバッファー中においてＬＰＳの高い吸着率を維持するのは困難であったが、本発明の方法では、上記のように、LPSを特異的に吸着するペプチドを結合させた担体を用いること、および洗浄効率の高い流体取扱装置を用いて高い塩濃度のバッファーを効率良く洗浄することによって、高い塩濃度でも感度良くＬＰＳを検出できる。
【００４０】
実施例３
各種タンパク質の影響の評価
３−１．ウシ血清アルブミン
ＰＢＳで調製されたＬＰＳ溶液に代えて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＬＰＳ溶液（1% BSA, ＬＰＳ濃度＝0.1EU/mL、0.05EU/mL、0.025EU/mL、または0EU/ｍL in PBS）を用いることと洗浄回数を10回で行なったこと以外は、実施例１−２と同様にして測定を行った。ｎ＝３で行った結果を図９に示す。その結果、添加量よりも0.01〜0.025EU/mL多い値が得られた。これは、もともとのＢＳＡ中に当該量のＬＰＳが混入していたことが原因と考えられた。このように、ＢＳＡ溶液中のＬＰＳも感度よく検出が行えることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】流体取扱装置を示す斜視図である。
【図２】図１の流体取扱装置の装置本体の枠体と流体取扱部支持体を示す斜視図である。
【図３】図２の流体取扱部支持体を拡大して示す平面図である。
【図４】図３のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
【図５】（Ａ）円筒部材の断面図（縦）、（Ｂ）断面図（横）および（Ｃ）流体取扱装置の流体取扱部のビーズを除いた分解斜視図である。
【図６】流体取扱装置の流体取扱部の断面図である。
【図７】ＰＢＳ中のＬＰＳ添加回収試験の結果を示すグラフ。
【図８】各種溶液中のＬＰＳ添加回収試験の結果を示すグラフ。
【図９】ＢＳＡ溶液中のＬＰＳ添加回収試験の結果を示すグラフ。
【符号の説明】
【００４２】
１０…流体取扱装置、１１…枠体、１１ａ…貫通穴、１１ｂ…上面、１２…装置本体部、１３…流体取扱部支持体、１３ａ…支持体本体部、１３ｂ…突出部、１４…取付用凹部、１４ａ…大径凹部、１４ｂ…小径凹部、１４ｃ…拡張凹部、１４ｄ…微小凹部、１４ｅ…貫通孔、１６…流体取扱部、２０…円筒部材、２０ａ…底面部、２０ｂ…スリット、２２…ビーズ、２６…注入部、２８…流動部（反応部）、３０…流体収容室（測定部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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