(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原とアジュバントを含む経皮的免疫のための製剤であって、該製剤は、無傷の皮膚へ穿孔無しで、直接乾燥型で適用され、それにより抗原に特異的な免疫応答を誘導し、
該アジュバントは、細菌性ＡＤＰリボシル化外毒素又はそのガングリオシドＧＭ１−結合性サブユニットを含み、
該抗原が、炭疽菌；キャンピロバクター；コレラ菌；クロストリディウム（クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）を含む）；ジフテリア、腸管出血性大腸菌；毒素原性大腸菌；ジアルジア（giardia）；淋菌；ヘリコバクターピロリまたはヘリコバクターピロリが産生するウレアーゼ；インフルエンザ菌Ｂ；型別不能インフルエンザ菌；レジオネラ菌；髄膜炎菌；マイコバクテリウム（結核に関与する生物を含む）；百日咳菌；肺炎双球菌；サルモネラ菌；赤痢菌；ブドウ球菌およびその腸毒素；Ａ群ベータ溶血性連鎖球菌；連鎖球菌Ｂ；破傷風菌；ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）；エルシニア；アデノウイルス；デングウイルス血清型１〜４；エボラ；腸内ウイルス：ハンタウイルス；肝炎血清型Ａ〜Ｅ；単純ヘルペスウイルス１または２；ヒト免疫不全症ウイルス；ヒトパピローマウイルス；インフルエンザ；麻疹；ノーウォーク；ウマ日本脳炎；パピローマウイルス；パルボウイルスＢ１９；ポリオ；狂犬病；ＲＳウイルス；ロタウイルス；風疹；麻疹；セントルイス脳炎（St. Louis encephalitis）；ワクシニア；マラリア抗原、水痘、および黄熱から選択される他の抗原をコードする遺伝子を含むウイルス発現ベクター；からなる群から選択される、上記製剤。
【請求項２】
前記抗原が５００ダルトンより大きい分子量を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
単一の分子が、製剤のアジュバントかつ抗原である、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
製剤は、浸透増強剤、ウイルス粒子、リポソーム、または荷電脂質を含まない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
製剤は、化学的又は物理的浸透増強剤が欠如した製剤の使用に比較して、免疫の効力を上昇させる化学的又は物理的浸透増強剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
製剤はさらに、少なくとも１つの賦形剤、安定剤、乾燥剤、または保存剤を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
包帯をさらに含み、それによりパッチ型の製剤を提供する、請求項１〜６のいずれかに記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導するための経皮的免疫に有用な乾燥製剤に関する。特にこの乾燥製剤の物理形態には、必要な被験体の皮膚に乾燥製剤を適用するのに使用されるパッチや他の固体基質（例えば、包帯）のような製造物品がある。この製剤は、保存や輸送のために安定化され、かつ驚くべきことにこの誘導された免疫応答は、従来の液体製剤によるものより強固である。
【０００２】
２．関連技術の説明
ヒトの最も大きな臓器である皮膚は、感染性物質の侵入および有害物質との接触に対する体の防御の重要な部分である（ボス（Bos）ら、１９９７を参照）。しかし皮膚はまた、慢性感染症の標的であり、そこでは生物は免疫系を避けて住み着く。
【０００３】
皮膚は、３つの層（表皮、真皮、皮下）からなる。表皮は、基底層、有棘層、顆粒層、および角化層からなる；角質層は、角化層と脂質を含む（モシェラ（Moschella）とハーレイ（Hurley）、１９９２）。皮膚の主要な抗原提示細胞であるランゲルハンス細胞は、ヒトの表皮の中〜上有棘層にあると報告されている。真皮は、主に結合組織を含有する。血管とリンパ系は、真皮と皮下脂肪に限定される。
【０００４】
角質層（死んだ皮膚細胞と脂質の層）は伝統的に、好ましくない世界に対するバリアであると考えられ、角質層下の生存細胞から生物や有害物質を排除する（ボス（Bos）、１９９７）。ランゲルハンス細胞のような皮膚の抗原提示細胞が提供する２次防御は、最近わかってきたばかりである（セルッチ（Celluzzi）とファロ（Falo）、１９９７）。さらに皮膚−活性アジュバントの重要な概念を使用して皮膚を介して免疫する能力が、つい最近記載された（グレン（Glenn）ら、１９９８）。ワクチン化におけるこの重要な進歩の科学的認識は早かった。「これは、驚くべき結果であり、これはすばらしい。」と、ニューヨークのハワードヒューズ医学研究所（Howard Hughes Medical Institute)とアルバートアインシュタイン医科大学（Albert Einstein College of Medicine)のワクチン専門家であるバリー・ブルーム（Barry Bloom）は語り、この方策は「非常に容易、非常に安全、かつ非常に安価である」ようである（ＣＮＮニュース、１９９８年２月２６日）。
【０００５】
別の驚くべき結果は、免疫宿主への有害作用無しで、経皮的免疫のための有効な皮膚活性アジュバントとして毒素を使用できることである。
【０００６】
例えば、コレラ菌（Vibrio cholerae）はコレラ毒素（ＣＴ）を分泌し、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、熱不安定性腸毒素（ＬＴ）を分泌する、これらのタンパク質は、小腸液分泌と重傷の下痢（スパングラー（Spangler）、１９９２）を引き起こし、危険な毒素と考えられている。
【０００７】
コレラ菌（Vibrio cholerae）とコレラ毒素（ＣＴ）は、皮膚が防御作用を示すと予測された、それぞれ感染性因子と有害な細菌生成物の例である。クレイグ（Craig）（１９６５）は、ウサギまたはモルモットの皮内に注入したコレラ患者の便ろ液は、特徴的な遅延発症性の持続性浮腫性硬化（腫脹）を引き起こし、これは、皮膚内の毒素の存在により誘導されることを報告した。腫脹と血管漏出は非常に劇的であり、未知の透過性因子が原因であるとされたが、これは後にＣＴ自身であることが証明された。すなわち妥当に予測されたように、ＣＴは皮膚上にのせるかまたは角質層を介して挿入すると極めて反応性が高く、同様の発赤と腫脹を引き起こすであろう。クレイグ（Craig）試験は、便ろ液または培養培地中のＣＴの存在と量の標準的測定法となった。データは、この皮膚の反応性がコレラ毒素によることを確認した（フィンケルスタイン（Finkelstein）とロスパルット（LoSpallutto）、１９６９を参照）。
【０００８】
クレイグ（Craig）（１９６５）は、「臨床的コレラに皮膚病変が無いことは、腸管傷害に関与する病毒が、充分な濃度で皮膚に適用されたなら、皮膚に対しても有害な作用を示すことを、必ずしも否定しない。」と注意した。皮膚におけるコレラ毒素の極端な反応性は、その毒性の検査として使用され、先行技術は、コレラ毒素は皮膚に適用された時反応性であり、好ましくない反応を引き起こすという予測を証明した。
【０００９】
これに対して、我々は、コレラ毒素は免疫原性であり、皮膚にのせた時、抗原としてもアジュバントとしても作用することを証明した。これは、局所的または全身的な副作用を生じることなく免疫することができる。経皮的免疫のために皮膚上にコレラ毒素をのせた時の反応性の欠如は、驚くべきであり、先行技術から導かれる結論とは矛盾した。皮膚上にのせたＣＴの液体製剤は、クレイグ（Craig）の予想とは反対に、非毒性、非反応性アジュバントとして作用し、皮膚にＣＴを注入すると、腫脹と発赤が生じる。すなわちコレラ毒素または他のＡＤＰ−リボシル化外毒素が経皮的免疫に有用であることは、我々の発明以前には明らかではなかった。ＷＯ９８／２０７３４と米国特許第５，９１０，３０６号および第５，９８０，８９８号を参照されたい。
【００１０】
皮膚上にのせた時、コレラ毒素または他のアジュバントが非常に反応性が高いであろうという予測は、基本型アジュバントであるフロイントアジュバントを使用する知見によりさらに指示された。クレイナウ（Kleinau）ら（１９９４）は、ラットの皮膚に不完全フロイントアジュバントを局所的投与すると、臨床的におよび関節ライニングの増殖、炎症性浸潤物、および骨と軟骨破壊により証明されるように、関節炎を誘導した。彼らはさらに、「この研究は、免疫学的アジュバントの原型であるミネラル油の関節炎発症性役割に焦点を当てている。しかし、アジュバント性を有する多くの他の化合物もまた、経皮的に適用した時同じ作用を有する可能性もある（原文のまま）。」と記載した。この指摘に対して我々は、皮膚活性アジュバント（ＬＴ）の油中水エマルジョンを使用し、これは、全身的な影響無しで免疫応答を安全に誘導することを見いだした。ＷＯ９８／２０７３４と米国特許第５，９１０，３０６号および５，９８０，８９８号を参照されたい。すなわち、アジュバント（特にエマルジョン中のアジュバント）の経皮的投与が、この動物モデルで関節炎を引き起こすことは予測できたであろう。しかし我々の知見は予想外にも、そのような製剤は反応性が無いことを示した。
【００１１】
経皮的免疫には、皮膚の外部バリアを抗原が通過すること（皮膚は、そのような通過に対して非透過性である）と、抗原に対する免疫応答の両方が必要である。フィッシャー（Fisher）の「接触皮膚炎（Contact Dermatitis）」は、５００ダルトンより大きい分子は、通常皮膚を通過できない。さらにハーレイ（Hurley）によると、「皮膚は、その耐久性を真皮に負うが、その化学的不透過性は表皮にあり、ほとんどはその死んだ外層である角質層にある。」
【００１２】
アレルギーまたはアトピー性皮膚炎のような皮膚反応は公知であるが、抗原特異的免疫エフェクターを誘導し、皮膚への免疫原の単純な適用による治療的利点を提供する全身性免疫応答の誘導は、我々の発明以前には教示も示唆もされていないようである。
【００１３】
一般に皮膚の抗原提示細胞（ＡＰＣ）と特にランゲルハンス細胞は、感作物質の標的であり、これは接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、および乾癬を含む病態を引き起こす。接触皮膚炎は、抗原を食菌し、リンパ節に移動し、抗原を提示し、罹患した皮膚部位で起きる強い破壊性細胞応答のためにＴ細胞を感作するランゲルハンス細胞により指令され得る（クリプケ（Kripke）ら、１９８７）。アトピー性皮膚炎の例は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）による皮膚のコロニー形成に関連する慢性の再発性炎症性皮膚疾患であり、これは、ランゲルハンス細胞を介する慢性Ｔ細胞性皮膚炎症を引き起こす黄色ブドウ球菌（S. aureus）由来のスーパー抗原により引き起こされると考えられる（ヘルツ（Herz）ら、１９９８；レウング（Leung）、１９９５；サロガ（Saloga）ら、１９９６ａ）。アトピー性皮膚炎は、接触皮膚炎と同様にランゲルハンス細胞を利用し、一般に高レベルのＩｇＥ抗体に関連している（ワング（Wang）ら、１９９６）。
【００１４】
これに対して、コレラ毒素または関連ＡＤＰ−リボシル化外毒素による経皮的免疫は、免疫後の皮膚所見の欠如、高レベルの抗原特異的ＩｇＧ抗体、すべてのＩｇＧサブクラス抗体の存在を有する、新規免疫応答を生じた。ＷＯ９８／２０７３４と米国特許第５，９１０，３０６号および５，９８０，８９８号、および米国特許出願第０９／２５７，１８８号を参照されたい。
【００１５】
ポール（Paul）ら（１９９５）によるトランスフェロソーム（transferosome）を使用する抗原感作リポソームの補体介在性溶解の誘導の報告がある。トランスフェロソームは、抗原のビヒクルとして使用され、抗原感作リポソームの補体介在性溶解が測定された。抗原による皮膚の通過の限界は、７５０ダルトンであるとされた。さらにポール（Paul）とシベック（Cvec）（１９９５）は、単純なペプチドまたはタンパク質溶液を用いて表皮的に免疫することは不可能」であると記載した。すなわち本明細書に記載の経皮的免疫が、この群に従って起きることは予測しにくいであろう。
【００１６】
低分子量物質の皮膚の通過を限定する物理的制限以外に、ポリペプチドの通過は、化学的制限により制限されると考えられた。カーソン（Carson）ら（米国特許第５，６７９，６４７号）は、「経皮的または粘膜伝搬後のペプチドのバイオベイラビリティは、これらの組織中の比較的高いプロテアーゼ濃度により限定されると考えられる。しかし不幸なことに、これらをコードする遺伝子の経皮的または粘膜伝搬による・・・ペプチドの信頼できる送達手段は、無い。」と記載している。
【００１７】
経皮的免疫に対して、経皮吸収的薬剤療法は、真皮中に存在する血管を標的とすると理解されている。例えば、モシェラ（Moschella）（１９９６）は、「従来の経口投与に対して経皮吸収的療法の利点には以下がある：１．「ピークと谷」の血漿プロフィールを避ける、２．腸管と肝臓でのファーストパス代謝を避ける」（強調は加えた）と記載している。すなわち薬剤療法の分野で、経皮吸収的の意味は、表皮を通過して、真皮または下部層に入って、血管への吸着を達成するという意味である。
【００１８】
多くの場合、防御につながる有効な免疫は、同時投与された抗原またはプラスミドのアジュバントの形の助けの必要とし、従って有用な免疫応答は、アジュバントを使用して免疫応答を増強することを必要とする（ストウテ（Stoute）ら、１９９７；ササキ（Sasaki）ら、１９９８）。ＷＯ９８／２０７３４および以後の論文（シャルトン−ケルステン（Sharton-Kersten）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、印刷中）において、我々は、同時投与抗原に対する高レベルの全身性および粘膜抗体を誘導することが必要であることを証明した。例えばＣＴ＋ＤＴで免疫したマウスは、高レベル全身性および粘膜抗ＤＴ抗体を誘導した。抗体は、ジフテリアに対する防御と相関することが知られている。すなわち、経皮的免疫のための皮膚アジュバントは、同時投与抗原に対して免疫応答の「助け」となることが予測され、有用な免疫応答の誘導に決定的に重要な役割を果たすことが予測される。
【００１９】
このような文献は、コレラ毒素（これは８５，０００ダルトンである）のような大きな分子は、皮膚を通過することは予測されず、従って強くて特異的な免疫応答を誘導することは予測されなかったため、免疫におけるコレラ毒素のような分子の使用の我々の成功が、なぜ当該分野で感激と驚きをもって迎えられたかを説明している。
【００２０】
我々は、ＷＯ９８／２０７３４と米国特許第５，９１０，３０６号および第５，９８０，８９８号、および米国特許出願第０９／２５７，１８８号において、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌からの熱不安定性外毒素（ＬＴ）、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素Ａ（ＥＴＡ）および百日咳毒素（ＰＴ）のようなＡＤＰ−リボシル化外毒素を使用すると、非常に再現性の高い強い免疫応答を誘発できることを証明した。さらにそのようなＡＤＰ−リボシル化外毒素をアジュバントとして使用して、食塩水中の別の抗原（例えば、ウシ血清アルブミンまたはジフテリアトキソイド）とともに皮膚に適用すると、全身性および粘膜性の抗原特異的免疫応答が誘発された。
【００２１】
この成功に基づき我々は、保存または輸送中に厳しい条件に曝されたワクチンの潅流液を維持する問題、およびこの分野で製造されたワクチン製剤の無菌性を維持する問題について記載する。低温保存することなく保存と輸送ができ、野外で溶液を混合する必要を排除することにより汚染の危険性を最小にする製剤が必要であった。
【００２２】
現在、承認されたワクチンは、水溶液または懸濁物で供給され、免疫中に筋肉内または経口経路で投与されている。ワクチン成分と水または緩衝液とを、安定性に問題のある条件下で混合することの欠点と溶液中の抗原がこわれる可能性は公知であり、これが、一部は、ワクチン成分の低温保存のニーズを生じた。水の存在下ではワクチン成分は化学的にあまり安定ではなく、細菌の増殖のための水性媒体を提供することにより汚染を受けやすい。ワクチンの輸送と保存中の低温保存ための厳しい要求性のために「コールドチェーン」が生まれ、ワクチンの製造後、ワクチンは絶えず正しい低温保存条件下に置かれることを意味する。これは、ワクチンを保存することの複雑性を増し、ワクチンを輸送する際の兵站学的問題を生み出し、ワクチン化の費用が大幅に増加する。ジョン（John）ら（１９９６）が報告した研究は、コールドチェイン維持の問題と費用を例示している：
【００２３】
「開発途上国全体で幼児の免疫カバー率８０〜８５％が維持できるようになった。開発途上国のワクチンマーケットは巨大である。１９９２年には、ワクチン用量の全消費量は、２２億７００万に達した。出産数はわずかに１．２７億であり、実際に幼児に投与する用量は１０億未満であったろう。これは莫大な無駄を意味し、これは、ワクチンが高温でより安定であり、汚染されることがなければ節約できたであろう。」
【００２４】
前記で開示した経皮的免疫についての我々の研究において、我々は、液体型の製剤（溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、またはリポソーム調製物として）で免疫した。乾燥型の製剤がうまく使用でき、かつ驚くべきことに免疫応答は液体製剤による免疫より強固であることを、我々は発見した。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の利点を以下に説明する。
【００２６】
（発明の説明）
本発明の目的は、動物またはヒトで免疫応答（例えば、体液性および／または細胞性エフェクター）を誘導する経皮的免疫のための改良されたシステムを提供することである。この送達系は、抗原とアジュバントまたはポリヌクレオチド（アジュバントまたは抗原をコードする）からなる製剤の、被験体の皮膚への簡便な適用を提供し、こうして抗原に対する特異的免疫応答を誘導する。最も重要なことは、製剤の少なくとも１つの成分（すなわち、抗原またはアジュバント）は、製剤の投与前に乾燥型で提供されることである。
【００２７】
例えば、抗原、アジュバント、または抗原提示細胞の活性化は、免疫細胞による抗原の提示を助ける。活性化は、製剤と免疫系の抗原提示細胞（例えば、上皮のランゲルハンス細胞、表皮の樹状細胞、濾胞性樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞）との接触を促進し、および／または抗原提示細胞が製剤を取り込むのを誘導する；次に抗原提示細胞は抗原をリンパ球に提示するであろう。特に抗原提示細胞は皮膚からリンパ節に移動し、次に抗原をリンパ球に提示し、こうして抗原特異的免疫応答を誘導する。さらに、製剤は、抗原を認識するリンパ球に直接接触し、こうして抗原特異的免疫応答を誘導する。
【００２８】
免疫応答を誘発して、抗原特異的Ｂ細胞および／またはＴ細胞集団（細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む）を活性化および／または拡張させる以外に、本発明の他の目的は、経皮的免疫系を使用して免疫系の成分を、陽性におよび／または陰性に制御して、抗原特異的ヘルパー（Ｔｈ１および／またはＴｈ２）または遅延型過敏症（ＤＴＨ）Ｔ細胞サブセットに影響を与えることである。これは、異なるＴヘルパー応答を生じるＣＴとＬＴの差別的挙動により例示される。所望の免疫応答は、好ましくは全身性または局所的（例えば、粘膜性）であるが、アレルギー反応、皮膚炎、湿疹、乾癬、または他のアトピー性反応ではない。これらの免疫応答は、破傷風の抗破傷風トキソイド抗体またはジフテリアの抗ジフテリア抗体のような防御性免疫応答につながる。
【００２９】
本発明は、皮膚の穿孔有りまたは無しで実施してもよい。例えば、化学的または物理的浸透増強剤を用いて実施してもよい。例えば、皮膚を水溶液（例えば、水、食塩水および緩衝化溶液）、アルコール（例えば、イソプロピルアルコール）、ポリエチレングリコール、およびグリセロールで拭くか、またはこれらを製剤中に取り込むことは、化学的浸透増強剤として作用し得る。同様に、研磨剤（例えば、爪やすり）で皮膚を研磨すること、はがす（例えば、接着テープをはがす）ことにより皮膚の表層を除去すること、および微小な針で小さく穿孔することは、物理的浸透増強剤として作用し得る。ウォルターズ（Walters）とハドグラフト（Hadgraft）（１９９３）およびＷＯ９９／４３３５０を参照されたい。あるいは、無傷の皮膚への製剤の適用は、角質層の下の皮膚の層を穿孔するために関与しない、物理的、電気的又は音のエネルギーを含まない。
【００３０】
本発明の他の目的は、免疫およびワクチン化に有用な製剤、ならびにその製造法を提供することである。乾燥製剤は保存と輸送が従来のワクチンより容易であり、これは、ワクチンの製造場所からワクチン化が行われる場所へのコールドチェーンの必要性を破壊する。特定の作用モードに限定されないが、乾燥製剤が液体製剤に対して改良である別の方法は、製剤の乾燥活性成分（例えば、抗原とアジュバント）の高濃度が、免疫部位で直接可溶化することにより短時間で達成されることである。皮膚および閉鎖性包帯の水分は、このプロセスを促進する。こうして活性成分の溶解度限界に近づく濃度をｉｎ ｓｉｔｕ で達成することができる。あるいは、製剤の乾燥した活性成分自身は、抗原提示細胞により取り込まれ処理される固形顆粒を提供することによる改良である。これらの可能な機序は、本発明またはその相当物の範囲を限定せずに、本発明の操作に対する理解を深め、免疫やワクチン化におけるこの製剤の使用を指導するために、説明される。
【００３１】
本発明の乾燥製剤は、種々の型で提供される。「パッチ」とは、固体基質（例えば、医用包帯）ならびに少なくとも１つの活性成分を含む実施態様を意味する。他の実施態様は、微小なまたは粒状化粉末、乾燥した均一なフィルム、ペレットおよび錠剤である。製剤は溶解され、次にアンプル中または平らな表面（例えば、皮膚）上で乾燥されるか、または平らな表面にふりるだけでもよい。これは、空気乾燥、高温で乾燥、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥、固体基質上に被覆もしくは噴霧してから乾燥、固体基質にふりかけ、急速凍結そして次に真空下でゆっくり乾燥するか、またはこれらの組合せにより乾燥してもよい。製剤の活性成分がいくつかあるなら、これらは溶液中で混合し、次に乾燥されるか、または乾燥型のみで混合される。パッチのコンパートメントまたはチャンバーは、抗原またはアジュバントの１つのみが、投与前に乾燥型で維持されるように、活性成分を分離するために使用され；こうして液体と固体を分離することは、少なくとも１つの乾燥活性成分の溶解の時間と速度に対する制御を可能にする。場合により製剤は、賦形剤、安定剤、乾燥剤、保存剤、接着剤、パッチ材料、またはこれらの組合せを含有してもよい。
【００３２】
製剤は、生物学的製剤やワクチンための適切な規制機関（例えば、食品医薬品局）に許容される方法で無菌条件下で製造される。
【００３３】
本発明の実施態様は、投与ための単回または単位服用量の製剤を提供することである。単位服用量中の抗原またはアジュバントの量は、約０．１μｇ〜約１０mgの広い範囲のいずれかである。約１μｇ〜約１mgの範囲が好ましく、約１０−μｇ〜約５００μｇの範囲がより好ましい。他の適当な範囲は、約１μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約２００μｇ、および約１mg〜約５mgである。抗原とアジュバントの比は、１：１（例えば、抗原とアジュバントの両方ならＣＴ）でもよいが、弱い抗原ではより高い比、またはより低い比のアジュバント対抗原が使用される。
【００３４】
本発明のさらなる実施態様を以下に説明する。
本発明の１つの実施態様において、抗原とアジュバントまたはポリヌクレオチドを含む製剤が、感染した被験体の皮膚に適用され、抗原が免疫細胞に提示され、抗原特異的免疫応答が誘導される。製剤の抗原性が充分でアジュバント活性を必要としないなら、この製剤は、抗原または抗原をコードするポリヌクレオチドのみを含有して追加のアジュバントが無くてもよい。製剤は、製剤の適用が複数の抗原に対する免疫応答を誘導するように、追加の抗原を含有してもよい。このような場合、抗原は、同じ供給源から得られても得られなくてもよいが、抗原は異なる抗原に対して特異的免疫応答を誘導するように、異なる化学構造を有するであろう。抗原特異的リンパ球が免疫応答に参加してもよく、Ｂリンパ球の参加の場合、抗原特異的抗体は、免疫応答の一部でもよい。上記製剤は、当該分野で公知の賦形剤、安定剤、乾燥剤、保存剤、接着剤、パッチ材料を含有してもよい。
【００３５】
本発明の別の実施態様において、本発明は被験体を治療するのに使用される。抗原が病原体由来なら、治療は、病原体による感染に対してまたは病原作用（例えば、毒素分泌により引き起こされるもの）に対して被験体をワクチン化する。腫瘍抗原を含有する製剤は、癌治療を提供し；自己抗原を含有する製剤は、被験体自身の免疫系により引き起こされる疾患（例えば、自己免疫疾患）の治療を提供する。本発明は、既存の疾患を治療するために治療的に、疾患を予防するために防御的に、疾患の重症度および／または持続を低減させるために、または疾患の症状を軽減するために、使用される。
【００３６】
本発明のさらなる実施態様において、上記方法で使用されるパッチが提供される。パッチは、包帯、有効量の抗原、およびアジュバントを含有してもよい。包帯は、閉鎖性または非閉鎖性でもよい。
【００３７】
抗原とアジュバントまたはポリヌクレオチドを含有するパッチは、製剤の個々の成分とともに、単一の貯蔵部分または複数の貯蔵部分を含有してもよい。パッチの適用が複数の抗原に対する免疫応答を誘導するように、追加の抗原を含有してもよい。このような場合、抗原は、同じ供給源するから得られても得られなくてもよいが、抗原は異なる抗原に対して特異的免疫応答を誘導するように、異なる化学構造を有するであろう。複数のパッチを同時に適用してもよいし、単一のパッチが複数の貯蔵部分を含有してもよい。有効な治療のために複数のパッチが、ある時間にわたって短い間隔でまたは継続的に適用される（パッチの詳細な説明については米国特許第５，０４９，３８７号と例を参照されたい）か、または同時に適用される。
【００３８】
液体型または固体型の製剤は、複数の抗原とアジュバントを使用して、同じかもしくは別の部位にまたは同時にもしくはしばしば繰り返して適用される。パッチは、制御された放出される貯蔵場所を含有してもよく、または抗原の段階的放出を可能にするマトリックスもしくは速度制御膜を使用してもよい。パッチは、抗原またはアジュバントを有する単一の貯蔵場所を含有するか、または別々の抗原とアジュバントを分離する複数の貯蔵場所を含有してもよい。
【００３９】
しかし少なくとも１つの抗原またはアジュバントは、投与前に乾燥型で維持しなければならない。貯蔵場所からの以後の液体の放出、または製剤の乾燥成分を含有する貯蔵場所への液体の侵入は、少なくとも部分的にはその成分を溶解される。
【００４０】
適用部位は、抗炎症性コルチコステロイド、例えばヒドロコーチゾン、トリアミシノロンおよびモメタゾンまたは非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）により保護されて、局所的皮膚反応の可能性を低下させるかまたは免疫応答の型を調節する。同様に抗炎症ステロイドまたはＮＳＡＩＤをパッチ材料、クリーム剤、軟膏剤などに含有してもよく、コルチコステロイドまたはＮＳＡＩＤは、免疫後に適用してもよい。ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、他の免疫調節物質を、抗炎症剤の代わりに使用してもよい。さらに本発明のさらに別の実施態様において製剤は、１回のまたは複数回の適用により、２つ以上の排膿性リンパ節領域の上にある無傷の皮膚に適用される。製剤は、無傷の皮膚への適用が複数の抗原に対する免疫応答を誘導するように、追加の抗原を含有してもよい。このような場合、抗原は同じ供給源から得られても得られなくてもよいが、異なる抗原に対する免疫応答を誘導するように、抗原は異なる化学構造を有するであろう。マルチチャンバーのパッチは、各チャンバーが個々のセットの抗原提示細胞をカバーするため、多価ワクチンの有効な送達を可能にするであろう。すなわち抗原提示細胞は、１つの抗原（＋アジュバント）に出会うのみで、従って抗原の競合を排除し、こうして多価ワクチン中の個々の抗原に対する応答を増強する。
【００４１】
この製剤は、物理的に浸透性のまたは他の経路の免疫とともに、免疫応答を増強またはプライムするために、皮膚に適用される。すなわち単回のまたは複数回の適用による経皮的免疫を用いるプライミング後に、同じかまたは改変した抗原を用いて、免疫を増強するための経口、鼻内、または非経口法を行う。製剤は、無傷の皮膚への適用が複数の抗原に対する免疫応答を誘導するように、追加の抗原を含有してもよい。
【００４２】
抗原とアジュバント以外に、製剤はビヒクルを含有してもよい。例えば製剤は、ＡＱＵＡＰＨＯＲ（ＷＯ９８／２０７３４に示すように、ペトロラツム、ミネラル油、ミネラル蝋、ウール蝋、パンテノール、ビサボールおよびグリセリンのエマルジョン）、エマルジョン（例えば、水性クリーム）、ミクロエマルジョン、ゲル、水中油エマルジョン（例えば、油性クリーム）、無水脂質および水中油エマルジョン、他の型のエマルジョン、脂肪、蝋、油、シリコーン、ゲル、および保湿剤（例えば、グリセロール）を含有してもよい。しかし少なくとも１つの抗原またはアジュバントは、投与前に乾燥型中で維持される。
【００４３】
抗原は、被験体に感染する病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、または寄生体）、または細胞（例えば、腫瘍細胞または正常細胞）から得られてもよい。抗原は、腫瘍抗原または自己抗原でもよい。抗原は、アレルゲン（例えば、花粉、動物のふけ、カビ、ほこりのダニ、ノミ抗原、唾液アレルゲン、草、食物（例えば、ピーナツと他のナッツ類）、Ｂｅｔｖ１（ウィーダーマン（Wiedermann）ら、１９９８）、または接触感作物質（例えば、ニッケルまたはＤＮＣＢ））でもよい。自己抗原は、アイレット抗原のような自己免疫疾患に関係していることがある（ラミヤ（Ramiya）ら、１９９６）。化学的には抗原は、炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リン脂質、ポリペプチド、または上記の化学的または組換え結合体でもよい。抗原の分子量は、５００より大きく、好ましくは８００ダルトンより大きく、より好ましくは１０００ダルトンより大きい。
【００４４】
抗原は、組換え法、化学合成、または天然の供給源から精製して得られる。抗原は、タンパク質性でも多糖との結合体でもよい。抗原は、生きたウイルス、弱毒化された生きたウイルス、または化学的または遺伝的方法により不活性化したウイルスでもよい。あるいは抗原は、無細胞型（例えば、膜画分、細胞全体の溶解物）で少なくとも部分的に精製される。
【００４５】
アジュバントを含有させることは、免疫応答の強化または調節を可能にする。さらに適切な抗原またはアジュバントの選択は、体液性または細胞性免疫応答、特異的抗体イソタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４）、および／または特異的Ｔ細胞サブセット（例えば、ＣＴＬ、Ｔｈ１、Ｔｈ２および／またはＴDTH）の優先的誘導を可能にする。好ましくはアジュバントは、活性化ＡＤＰ−リボシル化外毒素またはそのサブユニットである。抗原、アジュバント、またはその両方は、適宜抗原またはアジュバントをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）を用いて製剤で提供される。共有結合閉環状ＤＮＡ（例えば、プラスミド）はポリヌクレオチドの好適な型であるが、線形型もまた使用される。場合によりポリヌクレオチドは、複製開始点、セントロメア、テロメア、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、転写開始もしくは停止シグナル、スプライスアクセプターもしくはドナー部位、リボゾーム結合部位、翻訳開始もしくは停止シグナル、ポリアデニル化シグナル、細胞性局所的シグナル、プロテアーゼ切断部位、ポリリンカー部位、またはこれらの組合せのような領域を含有してもよい。この方法は、「遺伝的免疫」と呼ばれる。
【００４６】
本発明で使用される「抗原」という用語は、被験体の免疫細胞に提示される時、特異的免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、Ｂ細胞受容体（すなわち、Ｂ細胞の膜上の抗体）またはＴ細胞受容体により認識される単一の免疫原性エピトープ、または複数の免疫原性エピトープを含有してもよい。分子は、抗原とアジュバント（例えば、コレラ毒素）の両方でもよく、従って製剤は１つのみの成分を含有してもよい。
【００４７】
本発明で使用される「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を誘導するのを助けるために製剤に加えられる物質を意味する。
【００４８】
本発明で使用される「有効量」という用語は、抗原特異的免疫応答を誘導する抗原の量を意味する。
【００４９】
免疫応答のこのような誘導は、例えば免疫防御、脱感作、免疫抑制、自己免疫疾患の調節、癌免疫監視の強化、または樹立された感染疾患に対する治療的ワクチン化のような治療を提供する。その存在または非存在が、免疫応答の強度および／または動力学の、統計的に有意なそれぞれ増加または減少；免疫系の誘導された成分（例えば、体液性対細胞性、Ｔｈ１対Ｔｈ２）の変化；被験体の健康および状態に対する作用；またはこれらの組合せを引き起こす時、生成物または方法は「誘導する」。
【００５０】
本発明で使用される「排膿性リンパ節領域」という用語は、採取されたリンパが、明確なリンパ節（例えば、頸部、腋窩、鼠蹊、肘窩上部、膝窩、腹部と胸部のもの）のセットを介してろ過される解剖的領域を意味する。
【００５１】
特定の理論には拘泥されないが、我々の観察結果を説明するために、経皮的免疫送達系は、抗原を免疫系の細胞に運び、そこで免疫応答が誘導されると仮定される。抗原は、皮膚の正常な防御性外層（すなわち、角質層）を通過し、免疫応答を直接誘導するか、または表皮中の抗原提示細胞集団（例えば、マクロファージ、組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、表皮の樹状細胞、Ｂ細胞、またはクプファー細胞）を通過し、これは処理された抗原をリンパ球に提示する。場合により抗原は、毛包または皮膚小器官（例えば、汗腺、脂線）を介して角質層を通過する。
【００５２】
例えば、例として細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素（ｂＡＲＥ）を用いる経皮的免疫は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の中で最も効率的であることが知られている表皮性ランゲルハンス細胞を標的とする。我々は、ｂＡＲＥは、無傷の皮膚の表皮下に適用すると、ランゲルハンス細胞を活性化することを見いだした。トリプシン切断ＬＴのようなアジュバントは、ランゲルハンス細胞活性化を増強する。ランゲルハンス細胞は、抗原の食作用およびリンパ節への移動により特異的免疫応答を指令し、ここでこれらはＡＰＣとして作用して、抗原をリンパ球に提示し、こうして強力な抗体応答を誘導する。皮膚は一般に侵入する生物に対するバリアと考えられているが、このバリアの不完全さは、皮膚を介して侵入する生物に対する免疫応答をまとめるように設計されている表皮全体に分散されている無数のランゲルハンス細胞により証明される。ウデイ（Udey）（１９９７）によると：
【００５３】
「ランゲルハンス細胞は、すべての哺乳動物の重層扁平上皮上に存在する骨髄由来の細胞である。これらは、非炎症性の表皮中に存在する付属細胞活性のすべてを構成し、現在の科学では、表皮に適用された抗原に対する免疫応答の開始と伝播に必須である。ランゲルハンス細胞は、表皮および固体臓器ならびにリンパ系組織中に広く分布しているがあまり現れていない強力付属細胞（「樹状細胞」）のファミリーのメンバーである。」
【００５４】
「現在、ランゲルハンス細胞（およびおそらく他の樹状細胞）は、少なくとも２つの明確な段階を有する生活史を有すると認識されている。表皮に存在するランゲルハンス細胞は、抗原捕捉性の「歩哨」細胞の正規のネットワークを構成する。表皮ランゲルハンス細胞は、粒状物（微生物を含む）を取り込むことができ、複雑な抗原の効率的な処理物質である。しかしこれらは、低レベルのＭＨＣクラスＩとII抗原および同時刺激性分子（ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−１、およびＢ７−２）を発現するのみであり、プライムされていないＴ細胞の弱い刺激物質である。抗原と接触後、一部のランゲルハンス細胞は活性化され、表皮を出て、局所的リンパ節のＴ細胞依存性領域に移動し、ここで成熟樹状細胞として局在化する。表皮を出てリンパ節に移動する過程で、抗原担持表皮ランゲルハンス細胞（今は「メッセンジャー」）は、形態、表面表現型および機能の劇的な変化を示す。表皮ランゲルハンス細胞に比較して、リンパ系樹状細胞は基本的に非食作用性であり、タンパク質抗原の処理が非効率的であるが、高レベルのＭＨＣクラスＩとクラスII抗原および種々の同時刺激性分子を発現し、同定されている天然のＴ細胞の最も強力な刺激物質である。」
【００５５】
我々は、表皮ランゲルハンス細胞の強力な抗原提示能力は、経皮的に送達されるワクチンに利用することができると考えている。皮膚免疫系を使用する経皮的免疫応答は、例えば、受動的拡散と、次にランゲルハンス細胞を活性化して抗原を取り込ませ、Ｂ細胞濾胞および／またはＴ細胞依存性領域に移動させ、抗原をＢ細胞および／またはＴ細胞に提示させることにより、角質層（すなわち、角質化細胞および脂質からなる皮膚の最外層）中のランゲルハンス細胞にのみ製剤を送達することにより達成される。ｂＡＲＥ以外の抗原（例えば、ＢＳＡ）がランゲルハンス細胞により食作用されるなら、これらの抗原はまた、Ｔ細胞に提示するためにリンパ節に運ばれ、次にその抗原（例えば、ＢＳＡ）に特異的な免疫応答を誘導する。すなわち経皮的免疫の特徴は、おそらくはｂＡＲＥ、またはトリプシン活性化ＬＴまたは他の活性化細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素、ＡＤＰ−リボシル化外毒素結合サブユニット（例えば、コレラ毒素Ｂサブユニット）、組換え融合タンパク質、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β）、ＩＬ１βの活性ペプチド断片、ＬＰＳ、ＬＰＳ誘導体および類似体、脂質Ａまたは他のランゲルハンス細胞活性化物質（接触感作物質またはアジュバントを含む）によるランゲルハンス細胞の活性化である。拭くことまたはアセトン処理によりランゲルハンス細胞の皮膚集団のサイズを大きくすることまたはその活性化状態を上昇させることもまた、免疫応答を増強すると考えられる。老化したまたはＬＣ枯渇皮膚（すなわち、ＵＶ傷害）では、トレチノインを使用して、ランゲルハンス細胞の集団を補充することが可能であろう（マーフィー（Murphy）ら、１９９８）。
【００５６】
ＬＰＳのようなアジュバントは、全身性に注入または投与されると非常に毒性が高いことが知られている（リーチェル（Rietschel）ら、１９９４；ボシカ（Vosika）ら、１９８４）が、無傷の皮膚の表面にのせると、全身性の毒性を誘導する可能性は低く、従って経皮的経路は、ＣＴでの我々の知見と同様に、全身的毒性の無いアジュバント作用の利点を可能にすることに注意されたい。皮膚が角質層下でのみ浸透されるなら、同様の毒性の欠如が予測される。すなわち皮膚を介して免疫系の活性化を誘導する能力は、全身的毒性の無い強力な免疫応答という予想外の利点を付与する。
【００５７】
さらに経皮的免疫および主にＩｇＧへのイソタイプスイッチングにより誘導される抗体応答の程度は、一般にＴ細胞ヘルプ（ジェーンウェイ（Janeway）とトラバース（Travers）、１９９６）で達成され、Ｔｈ１とＴｈ２経路の両方の活性化は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａの産生により示唆される（ポール（Paul）とセーダー（Seder）、１９９４；セーダー（Seder）とポール（Paul）、１９９４）。あるいは、大きな抗体応答は、Ｂ細胞を直接活性化する（ジェーンウェイ（Janeway）とトラバース（Travers）、１９９６）かまたはＭＨＣクラスII、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ２５、およびＩＣＡＭ−１のアップレギュレーションのようなＢ細胞に及ぼす同様の活性化作用を有する（ナシャー（Nashar）ら、１９９７）胸腺非依存性抗原型１（ＴＩ−１）により誘導される。
【００５８】
より一般的に知られている皮膚免疫応答のスペクトルは、接触皮膚炎とアトピーにより代表される。ＬＣ活性化の病原性発現である接触皮膚炎は、抗原を食作用し、リンパ節に移動し、抗原を提示し、Ｔ細胞（皮膚に移動し、罹患した皮膚部位で起きる強烈な破壊性細胞応答を引き起こす）を感作するランゲルハンス細胞により指令される（ダール（Dahl）、１９９６；レウング（Leung）、１９９７）。このような応答は、一般に抗原特異的ＩｇＧ抗体に関連することが知られている。アトピー性皮膚炎は同様にランゲルハンス細胞を利用するが、Ｔｈ２細胞と同一であり、一般に高レベルのＩｇＥ抗体と関連している（ダール（Dahl）、１９９６；レウング（Leung）、１９９７）。
【００５９】
コレラ毒素および一方関連するｂＡＲＥによる経皮的免疫は、誘導される高レベルのＩｇＧを投与されたアトピーまたは接触皮膚炎に典型的な所見の無い新規免疫応答である。例えば、コレラ毒素を無傷の皮膚の表皮に適用すると、免疫後２４、４８および１２０時間目に、リンパ球浸潤無しで免疫が行われる。これは、「非炎症性の表皮中に存在する付属細胞活性のすべてを構成し、現在の科学では、表皮に適用された抗原に対する免疫応答の開始と伝播に必須であるとして」、経皮的免疫により関与するランゲルハンス細胞を示す（ウデイ（Udey）、１９９７）。ここで経皮的免疫応答のユニークさはまた、高レベルの抗原特異的ＩｇＧ抗体、および産生される抗体のタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＡ）、および一般に抗原特異的ＩｇＥ抗体の欠如により示される。アトピーまたは接触皮膚炎と共存する経皮的応答でＡＰＣとＴ細胞の充分な活性化が起きるなら、経皮的免疫は、おそらく皮膚炎症と連携して起きるであろう。
【００６０】
ランゲルハンス細胞の経皮的ターゲティングはまた、抗原提示機能のすべてまたは一部を不活性化する物質、従って免疫を修飾するかまたは感作を防ぐ物質と連携して使用される。他の皮膚免疫細胞に対するランゲルハンス活性化を調節する方法には、例えば抗炎症性ステロイドまたは非ステロイド剤（ＮＳＡＩＤ）、シクロホスファミドまたは他の免疫抑制剤、インターロイキン−１０、インターロイキン−１に対するモノクローナル抗体、インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）インヒビター、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＲＡ）の使用、例えば、ブドウ球菌腸毒素−Ａ（ＳＥＡ）誘導性表皮ランゲルハンス細胞枯渇のようなスーパー抗原による枯渇を含む。同様の化合物を使用して、ランゲルハンス細胞の本質的応答を修飾し、異なるＴヘルパー応答（Ｔｈ１またはＴｈ２）を誘導するか、または皮膚炎症性応答を調節して、免疫の可能性のある副作用を低下させる。
【００６１】
同様に、免疫抑制剤を別に投与するかまたは免疫抑制剤と製剤を同時投与することにより、免疫の前、その最中または後にリンパ球が免疫抑制される。例えば、通常アレルギーまたは刺激性の接触過敏症を引き起こす物質お用いて、強力な全身性防御性免疫応答を誘導することが可能であるが、ＩＣＥのインヒビターを加えると、有害な皮膚反応を緩和し得る（ゼプター（Zepter）ら、１９９７）。
【００６２】
経皮的免疫は、ＣＴ、ＬＴ、またはＣＴＢのようなサブユニットのガングリオシドＧＭ１結合活性を介して誘導される。ガングリオシドＧＭ１は、すべての哺乳動物細胞中に見いだされる遍在する細胞膜糖脂質である。ペンタマーのＣＴＢサブユニットが細胞表面に結合すると、親水性の孔が形成され、これはＡサブユニットが脂質二重層を通過して挿入されることを可能にする（リビ（Ribi）ら、１９８８）。ＡＰＣ上の他の結合標的を用してもよい。ＬＴのＢサブユニットは、他のガングリオシド以外にガングリオシドＧＭ１に結合し、その結合活性は、ＬＴが皮膚上で免疫原性が高いという事実を説明し得る。
【００６３】
ＣＴまたはＣＴＢによる経皮的免疫は、ガングリオシドＧＭ１結合活性を必要とする。マウスをＣＴ、ＣＴＡ、およびＣＴＢで経皮的に免疫すると、ＣＴとＣＴＢのみが免疫応答を引き起こした。ＣＴＡはＡＤＰ−リボシル化外毒素活性を含有するが、結合活性を含有するＣＴとＣＴＢのみが、免疫応答を誘導することができ、これは、皮膚を介して免疫するのにＢサブユニットが必要かつ充分であることを示している。我々は、ランゲルハンス細胞または他のＡＰＣが、細胞表面へのＣＴＢ結合により活性化され、その結果経皮的免疫応答を引き起こすと結論する。
【００６４】
抗原
経皮的免疫系は、免疫応答を生み出す専門化した細胞（抗原提示細胞、リンパ球）に物質を送達する。これらの物質は、１つの群として抗原と呼ばれる。抗原は、化学物質（例えば炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リン脂質、ポリペプチド、これらの結合体、または免疫応答を誘導することが知られている任意の他の物質）からなる。抗原は、生物全体として、例えば細菌またはウイルス粒子として提供されるか、抗原は、例えば細胞全体または膜単独から抽出物または溶解物として得られるか、または抗原は、化学合成されるか組換え手段により産生されてよい。
【００６５】
本発明の抗原は、組換え手段により発現され、好ましくは親和性もしくはエピトープ標識との融合体として発現され（サマーズ（Summers）とスミス（Smith）、１９８７；ゲーデル（Goeddel）、１９９０；アウスベル（Ausubel）ら、１９９６）；遊離のまたは担体タンパク質に結合したオリゴペプチドの化学合成は、本発明の抗原を得るために使用される（ボダンスキー（Bodanszky）、１９９３；ウィズダム（Wisdom）、１９９４）。オリゴペプチドは、１つのタイプのポリペプチドと考えられる。６残基〜２０残基のオリゴペプチドの長さが好ましい。ポリペプチドはまた、例えば米国特許第５，２２９，４９０号および第５，３９０，１１１号に開示されたような分岐構造として合成される。抗原性ペプチドには、例えば合成もしくは組換えＢ細胞およびＴ細胞エピトープ、普遍的なＴ細胞エピトープ、および１つの生物または疾患からの混合Ｔ細胞エピトープ、および別のものからのＢ細胞エピトープを含む。組換え手段またはペプチド合成により得られる抗原ならびに天然の起源もしくは抽出物から得られる本発明の抗原は、抗原の物理的および化学的特徴により、好ましくは分画またはクロマトグラフィーにより精製される（ジャンソン（Janson）とライデン（Ryden）、１９９７；ドイチャー（Deutscher）、１９９０；スコープス（Scopes）、１９９３）。組み換え体は、ｂＡＲＥのＢサブユニットまたはキメラを含有してもよい（ルー（Lu）ら、１９９７）。多価抗原製剤は、同時に２つ以上の抗原に対する免疫応答を誘導するのに使用される。結合体は、複数の抗原に対する免疫応答を誘導し、免疫応答を増強し、または両方を行うのに使用される。さらに、毒素は、トキソイドの使用により増強され、またはトキソイドは毒素の使用により増強される。経皮的免疫は、免疫の他の経路、例えば経口、鼻内または非経口経路により最初に誘導される応答を増強するのに使用される。抗原には、例えば毒素、トキソイド、これらのサブユニット、またはこれらの組合せ（例えば、コレラ毒素、破傷風トキソイド）を含み、さらに毒素、トキソイド、これらのサブユニット、またはこれらの組合せは、抗原とアジュバントの両方として作用してもよい。このような経口／経皮的または経皮的／経口免疫は、粘膜免疫が防御と相関する疾患の粘膜免疫を増強するのに特に重要である。
【００６６】
抗原は、緩衝液または水または有機溶媒（例えば、アルコールまたはＤＭＳＯ）に溶解されるか、またはゲル、エマルジョン、ミクロエマルジョン、およびクリーム剤中に取り込まれる。適当な緩衝液には、特に限定されないが、リン酸緩衝化生理食塩水Ｃａ++／Ｍｇ++不含（ＰＢＳ）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、正常な食塩水（１５０mMのＮａＣｌ水溶液）、およびトリス緩衝液がある。中性緩衝液に溶解しない抗原は、１０mM酢酸で可溶化され、次にＰＢＳのような中性緩衝液で所望の容量に希釈される。酸性ｐＨでのみ溶解する抗原の場合は、希酢酸で可溶化後に酸性ｐＨの酢酸−ＰＢＳが希釈剤として使用される。グリセロールは、本発明での使用に適した非水性緩衝液である。
【００６７】
疎水性抗原（例えば膜にまたがるドメインを含むポリペプチド）は、界面活性剤中で可溶化される。さらにリポソームを含有する製剤用に、界面活性剤溶液中の抗原（例えば、細胞膜抽出物）は脂質と混合され、次に希釈、透析、またはカラムクロマトグラフィーにより、界面活性剤を除去してリポソームを形成してもよい（グレゴリアディス（Gregoriadis）、１９９５を参照）。ある種の抗原（例えば、ウイルス（例えば、肝炎Ａ）由来のものは、それ自身可溶性である必要は無いが、ウイルス粒子単独の懸濁物中に、または微小球もしくは熱不活性化細菌（これは、抗原提示細胞を活性化（例えば、オプソニン作用）することにより取り込まれる）の懸濁物中で、脂質膜中に直接取り込まれることができる。抗原はまた、ＷＯ９９／４３３５０に記載したように浸透増強剤と混合してもよい。
【００６８】
プロトキン（Plotkin）とモルチマー（Mortimer）（１９９４）は、動物またはヒトをワクチン化して特定の病原体に特異的な免疫応答を誘導することができる抗原、ならびに抗原の調製法、抗原の適当な用量の決定法、免疫応答の誘導の測定法、および病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、または寄生体）による感染の治療法を提供する。
【００６９】
細菌には、例えば：炭疽菌、キャンピロバクター、コレラ、クロストリディウム（クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）を含む）、ジフテリア、腸管出血性大腸菌、毒素原性大腸菌、ジアルジア（giardia）、淋菌、ヘリコバクターピロリまたはヘリコバクターピロリが産生するウレアーゼ（リー（Lee）とチェン（Chen）、１９９４）、インフルエンザ菌Ｂ、型別不能インフルエンザ菌、レジオネラ菌、髄膜炎菌、マイコバクテリウム（結核に関与する生物を含む）、百日咳菌、肺炎双球菌、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌およびその腸毒素、Ａ群ベータ溶血性連鎖球菌、連鎖球菌Ｂ、破傷風菌、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ボレリア・ブルグドルフィ（Borrelia burgdorfi）、およびエルシニア；およびこれらの生成物がある。
【００７０】
ウイルスには、例えば：アデノウイルス、デングウイルス血清型１〜４（デレンダ（Delenda）ら、１９９４；フォンセカ（Fonseca）ら、１９９４；スムクニ（Smucny）ら、１９９５）、エボラ（ハーリング（Jahrling）ら、１９９６）、腸内ウイルス、ハンタウイルス、肝炎血清型Ａ〜Ｅ（ブルム（Blum）、１９９５；カトコフ（Katkov）、１９９６；リーバーマン（ieberman）とグリーンバーグ（Greenberg）、１９９６；マスト（Mast）、１９９６；シャファラ（Shafara）ら、１９９５；スメジラ（Smedila）ら、１９９４；米国特許第５，３１４，８０８号および第５，４３６，１２６号）、単純ヘルペスウイルス１または２、ヒト免疫不全症ウイルス（デプレツ（Deprez）ら、１９９６）、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザ、麻疹、ノーウォーク、ウマ日本脳炎、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオ、狂犬病、ＲＳウイルス、ロタウイルス、風疹、麻疹、セントルイス脳炎（St. Louis encephalitis）、ワクシニア、他の抗原（例えば、マラリア抗原、水痘、および黄熱）をコードする遺伝子を含むウイルス発現ベクター；およびこれらの生成物がある。
【００７１】
寄生体には、例えば：赤痢アメーバ（ザング（Zhang）ら、１９９５）；プラスモジウム（Plasmodium）（バサースト（Bathurst）ら、１９９３；チャング（Chang）ら、１９８９、１９９２、１９９４；フリース（Fries）ら，１９９２ａ、１９９２ｂ；ヘリングトン（Herrington）ら、１９９１；クスミス（Khusmith）ら、１９９１；マリク（Malik）ら、１９９１；ミグリオリニ（Migliorini）ら、１９９３；ペッシ（Pessi）ら、１９９１；タム（Tam）、１９８８；ブレデン（Vreden）ら、１９９１；ホワイト（White）ら、１９９３；ワイズミューラー（Wiesmueller）ら、１９９１）、レイシュマニア（Leishmania）（フランケンバーグ（Frankenburg）ら、１９９６）、および蠕虫；住血吸虫；およびこれらの生成物がある。
【００７２】
躯幹白癬、爪白癬、スポロトリクム症、アスペルギルス症、カンジダ症を引き起こす起こす真菌、および他の病原性真菌がある。
【００７３】
アジュバント
製剤はまたアジュバントを含有するが、単一の分子がアジュバントと抗原性の両方を有してもよい（例えば、コレラ毒素）（エルソン（Elson）とダーツボー（Dertzbaugh）、１９９４）。アジュバントとは、抗原特異的免疫応答を特異的または非特異的に増強するのに使用される物質である。通常アジュバントと製剤は、抗原提示の前に混合されるが、あるいは、これらは短時間に別々に提示されてもよい。
【００７４】
アジュバントには、例えば油エマルジョン（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）、ケモカイン（例えば、デフェンシンズ（defensins）１または２、ＲＥＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８、またはサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β、−２、−６、−１０、または−１２；インターフェロンガンマ；腫瘍壊死因子−α；または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）（ノーリア（Nohria）とルービン（Rubin）、１９９４の総説）、ムラミルジペプチド誘導体（例えば、ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰまたはムラミルトリペプチド）、熱ショックタンパク質もしくは誘導体、リーシュマニアメージャー（Leishmania major）ＬｅＩＦの誘導体（スケイキイ（Skeiky）ら、１９９５）、コレラ毒素またはコレラ毒素Ｂ、細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素およびそのサブユニット、または細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素もしくはそのサブユニットを使用する組み換え体、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導体（例えば、脂質Ａまたはモノホスホリル脂質Ａまたは脂質Ａ類似体）、スーパー抗原（サロガ（Saloga）ら、１９９６ｂ）、トリプシン切断部位の突然変異体（ディケンソン（Dickenson）とクレメンツ（Clements）、１９９５）を含むＡＤＰ−リボシル化（ドウチェ（Douce）ら、１９９７）に影響を与える突然変異細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素、ＱＳ２１、キル（Ｑｕｉｌｌ）Ａ、またはみょうばんがある。また、免疫に有用な他のアジュバントについてはリチャード（Richards）ら（１９９５）を参照されたい。
【００７５】
アジュバントは、抗体または細胞性エフェクター、特異的抗体イソタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４）、または特異的Ｔ細胞サブセット（例えば、ＣＴＬ、Ｔｈ１、Ｔｈ２、および／またはＴDTH）を優先的に誘導するように選択される（例えば、ムノツ（Munoz）ら、１９９０；グレン（Glenn）ら、１９９５を参照）。
【００７６】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドまたはモチーフは、Ｂ細胞およびマクロファージを活性化することが知られている（クレイグ（Kreig）ら、１９９５；スタセイ（Stacey）ら、１９９６）。他の型の細菌性ＤＮＡは、アジュバントとして使用することができる。細菌性ＤＮＡは、免疫系がその病原性起源を認識して本質的免疫応答を刺激し適合性免疫応答を引き起こすことを可能にするパターンを有する構造体の１つのクラスである（メドジトブ（Medzhitov）とジェーンウェイ（Janeway）、１９９７）。これらの構造体は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれ、リポ多糖、テイコ酸、非メチル化ＣｇＧモチーフ、２本鎖ＲＮＡ、およびマニンズ（mannins）がある。ＰＡＭＰは内因性シグナルを誘導し、これは炎症性応答を仲介し、Ｔ細胞機能の同時刺激物質として作用し、かつエフェクター機能を制御することができる。これらの応答を誘導するＰＡＭＰの能力は、そのアジュバントとしての可能性において重要な役割を果たし、その標的は、マクロファージや樹状細胞のようなＡＰＣである。皮膚の抗原提示細胞は同様に、皮膚を介して伝搬されるＰＡＭＰにより刺激される。例えば、樹状細胞の１つのタイプであるランゲルハンス細胞は、経皮的に免疫原性が弱い分子を用いて皮膚上の溶液中のＰＡＭＰにより活性化され、この免疫原性が弱い分子を移動させ、リンパ節中のＴ細胞に提示するように誘導され、免疫原性の弱い分子に対する抗体応答を誘導する。ＰＡＭＰはまた、他の皮膚アジュバント（例えば、コレラ毒素）と一緒に使用されて、異なる同時刺激分子を誘導し、異なるエフェクター機能を制御して免疫応答（例えば、Ｔｈ２からＴｈ１応答へ）を導くことができるであろう。
【００７７】
コレラ毒素は、ＡＤＰ−リボシル化外毒素のファミリーの細菌性外毒素（ｂＡＲＥと呼ぶ）である。多くのｂＡＲＥは、結合性ＢサブユニットとＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼを含有するＡサブユニットのＡ：Ｂダイマーとして構成される。このような毒素には、ジフテリア、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素Ａ、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌熱不安定性腸毒素（ＬＴ）、百日咳毒素、シー・ボツリヌム（C. botulinum）毒素Ｃ２、シー・ボツリヌム（C. botulinum）毒素Ｃ３、シー・リモスム（C. limosum）外酵素、ビー・セレウス（B. cereus）外酵素、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素Ｓ、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＥＤＩＮ、ビー・スフェリクス（B. sphaericus）毒素がある。
【００７８】
コレラ毒素は、ＡサブユニットとＢサブユニットで構成されるｂＡＲＥの一例である。Ｂサブユニットは、結合性サブユニットであり、Ａサブユニットに非共有結合している。Ｂサブユニットペンタマーは、対称のドーナツ型の構造で、標的細胞上のＧＭ１−ガングリオシドに結合している。Ａサブユニットは、Ｇｓタンパク質を含むヘテロトリマーＧＴＰタンパク質（Ｇタンパク質）のサブセットのアルファサブユニットをＡＤＰ−リボシル化し、その結果、サイクリックＡＭＰの細胞内レベルが上昇する。これは、コレラの場合は小腸細胞からのイオンと液体の流出を刺激する。しかしコレラ毒素（ＣＴ）とそのＢサブユニット（ＣＴＢ）は、筋肉内または経口投与免疫原として使用される時アジュバント性を有する（エルソン（Elson）とダーツボー（Dertzbaugh）、１９９４；トラッチ（Trach）ら、１９９７）。大腸菌の熱不安定性腸毒素（ＬＴ）は、アミノ酸レベルでＣＴと７５〜７７％相同的であり、同様の結合性を有する；これはまた、腸管のＧＭ１ガングリオシド受容体に結合するようであり、同様のＡＤＰ−リボシル化外毒素活性を有する。シュードモナス（Pseudomonas）外毒素Ａ（ＥＴＡ）は、α２−マクログロブリン受容体−低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質に結合する（コウナス（Kounnas）ら、１９９２）。ｂＡＲＥは、クルーガー（Krueger）とバービエリ（Barbieri）（１９９５）が総説を書いている。ＣＴ、ＣＴＢ、ＬＴ、ＥＴＡおよびＰＴは、異なる細胞結合部位を有しているが、経皮的免疫の強力なアジュバントであり、ＩｇＧを誘導しＩｇＥは誘導しない。ＣＴの無いＣＴＢはまた、ＩｇＧ抗体を誘導することができる。すなわちｂＡＲＥとその誘導体の両方とも、単純な溶液中で皮膚の表皮に適用すると、有効に免疫する。
【００７９】
ＣＴのようなアジュバントをＢＳＡ（皮膚に適用した時、通常は免疫原性の無いタンパク質）と混合すると、抗ＢＳＡ抗体が誘導される。ジフテリアトキソイドに対する免疫応答は、百日咳毒素をアジュバントとして使用すると誘導されたが、ジフテリアトキソイド単独では誘導されなかった。しかしアジュバントかつ抗原としての未変性のＬＴは、未変性のＣＴほど強力ではない。しかし、活性化ｂＡＲＥは、経皮的免疫系で非免疫原性タンパク質のアジュバントとして作用し得る。すなわちＨＩＶ、ＨＰＶまたはレイシュマニア（Leishmania）のような生物の抗原を用いる治療的免疫は、感染ＡＰＣの免疫刺激と別にまたは一緒に使用して、治療的免疫を誘導することができる。
【００８０】
生死に関わる感染性ジフテリア、百日咳、および破傷風（ＤＰＴ）に対する防御は、高レベルの循環抗毒素抗体を誘導することにより達成される。百日咳は、侵入する生物の他のタンパク質に対する抗体が防御に必要であるため、例外であると一部の研究者は考えているが、これは議論の余地があり（シュネーソン（Schneerson）ら、１９９６）、多くの新世代の無細胞百日咳ワクチンは、その成分としてＰＴまたは遺伝的に無毒化されたＰＴを有する（クルーガー（Krueger）とバービエリ（Barbieri）、１９９５）。ＤＰＴにより引き起こされる疾患の病理は、その毒素の作用と直接関連しており、おそらく抗毒素抗体が防御における役割を果たしている（シュネーソン（Schneerson）ら、１９９６）。
【００８１】
一般に、毒素は化学的に不活性化させて、毒性がより低いが免疫原性を維持しているトキソイドを生成することができる。我々は、毒素ベースの免疫原とアジュバントを用いる経皮的免疫系は、これらの疾患に対する防御に充分な抗毒素レベルを達成することができると考えている。抗毒素抗体は、毒素、または遺伝的に無毒化したトキソイド自身、または毒素とアジュバント（例えばＣＴ）を用いる免疫により誘導される。改変されたＡＤＰ−リボシル化外毒素活性またはトリプシン切断部位を有する（しかし、結合活性は無い）遺伝的にトキソイド化した毒素は、経皮的免疫で使用される抗原提示細胞の非毒素アクチベーターとして特に有用であると考えられ、毒素の使用に対する懸念を減少させる。
【００８２】
ＣＴはまた、アジュバントとして作用して、経皮的免疫を介して抗原特異的ＣＴＬを誘導する。ｂＡＲＥアジュバントは、他の抗原（例えば、炭水化物、ポリペプチド、糖脂質、および糖タンパク質抗原を含む）に化学的に結合される。これらの抗原との毒素、そのサブユニット、またはトキソイドの化学的結合は、表皮に適用した時、これらの抗原に対する免疫応答を増強すると予想される。毒素の毒性の問題（例えば、ジフテリア毒素は、１分子が１つの細胞を死滅させるほど毒素が強い）を克服するために、かつ破傷風のような強力な毒素で作業をすることの困難さを克服するために、何人かの研究者は、組換えアプローチを用いて遺伝的に産生されるトキソイドを作成している。これは、遺伝的欠失により、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼの触媒活性を不活性化することに基づく。これらの毒素は、天然の毒素の結合能を保持するが毒性は無い。このアプローチは、ブルネッテ（Burnette）ら（１９９４）、ラップオリ（Rappuoli）ら（１９９５）、およびラップオリ（Rappuoli）ら（１９９６）により記載されている。このような遺伝的にトキソイド化した外毒素は、経皮的免疫応答を誘導し、アジュバントとして作用すると予測される（ドウチェ（Douce）ら、１９９７）。トキソイドは毒素ではないと考えられるためこれらは安全性の問題を引き起こさないという点で、経皮的免疫系における利点を提供し得る。しかしトリプシン切断のような方法による活性化は、固有のトリプシン酵素が欠如した皮膚を介するＬＴのアジュバント性を増強すると予測されるであろう。さらに、同じ問題を解決することができる化学的にトキソイド化した毒素に対するいくつかの方法が存在する（シュネーソン（Schneerson）ら、１９９６）。これらの方法は、いくつかの応用、特に取り込まれた毒素（例えば、ジフテリア毒素）が有害反応を引き起こすかも知れない小児への応用にとって、重要かも知れない。
【００８３】
場合によりランゲルハンス細胞のアクチベーターをアジュバントとして使用してもよい。このようなアクチベーターの例には：熱ショックタンパク質のインデューサー；接触感作物質（例えば、トリニトロクロロベンゼン、ジニトロフルオロベンゼン、ナイトロジェンマスタード、ペンタデシルカテコール）；毒素（例えば、シガ毒素、ブドウ球菌腸毒素Ｂ）；リポ多糖、脂質Ａ、またはこれらの誘導体；細菌性ＤＮＡ（スターシイ（Stacey）ら、１９９６）；サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子−α、インターロイキン−１β、−１０、−１２）；ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー、溶液中のカルシウムイオン、カルシウムイオノフォア、およびケモカイン（例えば、デフェンシンズ（defensins）１または２、ＲＥＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８）がある。
【００８４】
さらに、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＣＴＢおよびＬＰＳの少なくとも１つとともに少量のコレラ毒素を含有する製剤が考えられる。製剤の２つの部分のモル比は、約０．００１〜約０．２０である。
【００８５】
免疫抗原が充分なランゲルハンス細胞活性化能を有するなら、抗原かつアジュバントの両方であるＣＴの場合のように、別のアジュバントは必要ではないかも知れない。あるいはこのような抗原は、充分免疫原性であるため、免疫応答を誘導するのにアジュバントを必要としないこともある。細胞全体の調製物、生きたウイルス、弱毒化ウイルス、ＤＮＡプラスミド、および細菌性ＤＮＡは、経皮的に免疫するのに充分であると考えられる。低濃度の接触感作物質またはランゲルハンス細胞の他のアクチベーターを使用して、皮膚病変を誘導することなく免疫応答を誘導することも可能かも知れない。
【００８６】
製剤
製剤の製造法は公知である。製剤の成分は、薬剤学的に許容される担体またはビヒクル、ならびに随時任意の添加物（例えば、希釈剤、結合剤、賦形剤、安定剤、乾燥剤、保存剤、着色剤）と一緒にされる。固体担体の使用、および乾燥成分の可溶化を助ける賦形剤の添加、または抗原活性もしくはアジュバント活性の安定剤のの使用は、好ましい実施態様である。一般的には、Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 第６版（電子版、１９９８）；Remington's Pharmaceutical Sciences、第２２版（ゲンナロ（Gennaro）、１９９０、マックパブリシング（Mack Publishing））；Pharmaceutical Dosage Forms、第２版（複数の編者、１９８９〜１９９８、マーセルデッカー（Marcel Dekker））；および、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems（アンセル（Ansel）ら、１９９４，ウィリアムズアンドウィルキンス（Williams & Wilkins））を参照されたい。
【００８７】
医薬品製造管理基準（Good manufacturing practices）は、医薬品業界で公知であり、政府機関（例えば、食品医薬品局）により規制されている。無菌の液体製剤は、製剤の目的の成分を、充分量の適切な溶媒に溶解し、次にろ過し滅菌して混入微生物を除去することにより調製される。一般には、製剤の種々の滅菌成分を、基本的な分散媒体を含有する無菌ビヒクル中に取り込むことにより、分散物が調製される。無菌であることが必要な固体型の産生のために、真空乾燥または凍結乾燥を使用することができる。
【００８８】
一般に固体剤形（例えば、粉末、顆粒、ペレット、錠剤）は、製剤の少なくとも１つの成分から作成される。
【００８９】
適当な錠剤製造法およびパッチ製造法は公知である。製剤はまた、少なくとも１つの活性成分の固体型を封入するか、またはこれらを液体とは別にコンパートメントまたはチャンバーに保持して調製してもよい。ある実施態様においてパッチは、ビヒクル（例えば、食塩水溶液）を含有するパウチを含有してもよく、これは押しつぶし、次にパッチの乾燥製剤を可溶化する。各投与サイズと被験体への投与間隔は、錠剤、カプセル、コンパートメント、またはチャンバーの適当なサイズと形を決定するために使用される。
【００９０】
製剤は有効量の活性成分（例えば、抗原とアジュバント）を、担体または適当量のビヒクルとともに含有し、ヒトまたは動物への投与に適した薬剤学的に許容される組成物を提供する。ビヒクルを含有する製剤は、クリーム剤、エマルジョン、ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、ペースト剤、溶液剤、懸濁剤、または当該分野で公知の他の液体型でもよく、特に皮膚の吸水を増強するものである。しかし本発明において、製剤の少なくとも１つの活性成分は固体型であることが好ましい。
【００９１】
１回の投与および投与スケジュール内の活性成分の相対量は、被験体（例えば、動物またはヒト）への有効な投与について適宜調整される。この調整はまた、被験体の具体的な疾患もしくは症状、および治療であるかまたは予防であるかに依存する。被験体への製剤の投与を単純化するために、各単位服用量は、１ラウンドの免疫のためのあらかじめ決められた量の活性成分を含有する。
【００９２】
ポリペプチドの不安定性または分解（加水分解および変性を含む）には多くの理由がある。変性の場合、タンパク質のコンフォメーションまたは３次元構造が乱され、タンパク質はその通常の球状構造から開いていく。天然のコンフォメーションに再度折り畳まれるよりも、疎水性相互作用が、分子の集合（すなわち、凝集）または非天然のコンフォメーションへの再折り畳みを引き起こす。これらの結果のいずれも、抗原またはアジュバント活性を低下もしくは喪失させる。このような問題を低減または予防するために、安定剤を加えてもよい。
【００９３】
製剤またはその製造中の中間体は、防御性物質（すなわち、凍結防止剤および乾燥安定剤）で前処理され、次に氷の結晶生成を最小にする冷却速度と温度に付す。凍結防止剤を適切に選択しあらかじめ選択した乾燥パラメータを使用することにより、ほとんどすべての製剤を、適当な所望の最終用途用に低温調製することができる。
【００９４】
随時の添加剤（賦形剤、安定剤、乾燥剤、および保存剤）の以後の考察は、その機能により記載されることを理解されたい。すなわち特定の化学物質は、賦形剤、安定剤、乾燥剤、および／または保存剤のある組合せとして作用する。そのような化学物質は、免疫応答を直接誘導しないため、免疫学的に不活性であるが、抗原またはアジュバントの免疫活性を増強（例えば抗原またはアジュバントの修飾を、または乾燥および溶解サイクル中の変性を低下させる）することによりその応答を増強する。
【００９５】
安定剤には、シクロデキストリンとその誘導体がある（米国特許第５，７３０，９６９号を参照）。適当な保存剤（例えば、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキストラン、およびグリセリン）を、最終製剤を安定化するために加えてもよい（ハウウェル（Howell）とミラー（Miller）、１９８３）。非イオン性界面活性剤、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸の塩、トレハロース、デキストラン、ヒドロエチルデンプン、およびこれらの混合物から選択される安定剤を、製剤に加えてもよい。アルカリ金属塩または塩化マグネシウムの添加は、ポリペプチドを安定化し、随時血清アルブミンと、安定性をさらに増強するための凍結乾燥工程を含む。ポリペプチドはまた、これを、デキストラン、コンドロイチン硫酸、デンプン、グリコーゲン、インスリン、デキストリン、およびアルギン酸塩から選択される糖と接触させることにより安定化してもよい。添加される他の糖には、単糖、二糖、糖アルコール、およびこれらの混合物（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、果糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖、マンニトール、キシリトール）がある。ポリオールは、ポリペプチドを安定化し、水と混合性または水溶性である。適当なポリオールは、ポリヒドロキシアルコール、単糖および二糖（マンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、果糖、アラビノース、マンノース、麦芽糖、ショ糖を含む）、およびこれらのポリマーがある。例えばハンソン（Hanson）とロウン（Roun）（１９９２）を参照されたい。種々の賦形剤（血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸、およびリン脂質、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニルピロリドン、加水分解ゼラチン、および硫酸アンモニウムを含む）も、ポリペプチドを安定化させる。
【００９６】
単回投与破傷風ワクチンは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）とポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）微小球中で、賦形剤または安定剤を適当に選択することにより安定化することができる（サンチェス（Sanchez）ら、１９９９）。トレハロースは非還元糖であるため、添加剤として有利に使用され、従ってタンパク質のようなアミノ基を有する物質とアミノカルボニル反応を引き起こさない。
【００９７】
乾燥非液体型で被験体に投与することができる製剤は、コールドチェーンを必要としない条件下で保存することができると考えられる。ある実施態様において、溶液中の抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）は、溶液中でＣＴのようなアジュバントと混合され、閉鎖性裏面（例えば、プラスチックラップ（サラン（Saran））のあるガーゼパッド上に置かれ、乾燥される。次にこのパッチは、皮膚と直接接触しているガーゼ部分とともにある時間皮膚上に置かれ、単純な閉鎖物（例えば、プラスチックラップ（例えば、サランラップ（Saran Wrap）および接着テープ）で覆われて保持することができる。このようなパッチは、多くの組成物を有してもよい。抗原を保持するマトリックスは、綿ガーゼ、レーヨン−ナイロンの組合せ、または他の合成材料でもよく、閉鎖性固体裏面（塩化ポリビニル、レーヨン、他のプラスチック、ゲル剤、クリーム剤、エマルジョン、蝋、油、パラフィン、ゴム（合成または天然）、布、または膜を含む）を有してよい。パッチは皮膚上に保持され、パッチの成分は、周知の種々の接着剤を使用して互いに保持される。
【００９８】
液体または半液体製剤は、直接皮膚に適用され、空気乾燥されるか、皮膚または頭皮に擦り込むか、耳、鼠蹊、もしくは間擦性領域（特に動物）の上にのせるか、肛門／直腸組織にのせるか、包帯、パッチ、もしくは吸収性材料とともに保持するか、浸漬するか、あるいはストッキング、スリッパ、手袋、もしくはシャツのようなものにより保持するか、または皮膚に噴霧して皮膚との接触を最大にする。しかし本発明では、固体型の少なくとも１つの活性成分を有する製剤が好ましい。製剤は、吸収性包帯またはガーゼ中で適用される。製剤は、例えばＡＱＵＡＰＨＯＲ（ベイエルスドルフインク（Beiersdorf, Inc.）のペトロラツム、ミネラル油、ミネラル蝋、ウール蝋、パンテノール、ビサボールおよびグリセリンのエマルジョン）、プラスチックフィルム、ＣＯＭＦＥＥＬ（コロプラスト（Coloplast））またはワセリンのような閉鎖性包帯；または、ＴＥＧＡＤＥＲＭ（スリーエム（3M））、ＤＵＯＤＥＲＭ（スリーエム（3M））またはＯＰＳＩＴＥ（スミトアンドナフュー（Smith & Napheu））のような非閉鎖性包帯で覆われる。閉鎖性包帯は、水の通過を排除する。製剤は完全に浸漬することにより、１つの部位もしくは複数の部位、１つもしくは複数の四肢、または皮膚の大きな表面積に適用される。製剤は、皮膚に直接適用してもよい。使用される他の基質は、感圧性接着剤（例えば、アクリル、ポリイソブチレン、およびシリコーン）である。製剤は、このような基質中に、おそらく多孔性パッド（例えば、ガーゼ）または胆汁性ストリップ（例えば、ろ紙）の代わりに、接着剤自身を用いて基礎製剤に直接加えられる。
【００９９】
乾燥アジュバントを有する製剤は、普遍的なアジュバントとなるように製造される。すなわち乾燥アジュバントとともに基礎製剤に任意のワクチンを加えることができる。このような普遍的アジュバントは、パッチ中に取り込まれる。添加されたワクチンは水性でもよく、以後免疫の前に乾燥されるか、または水性環境で添加されてワクチンに適用される。
【０１００】
パッチが使用されるかどうかに無関係に、製剤に加えられるポリマーは、活性成分の賦形剤、安定剤、および／または保存剤として、ならびに活性成分の乾燥型を溶解するのに使用される溶液を飽和させる活性成分濃度の低下剤として作用する。このような低下は、ポリマーが「空の」スペースを埋めることにより溶液の有効量が低下するために起きる。すなわち抗原／アジュバントの量は、飽和溶液の量を低下させることなく保存することができる。重要な熱力学的考察は、飽和溶液中の活性成分は、低濃度の領域に「運ばれる」（例えば、皮膚を介して）ということである。溶液中では、ポリマーはまた、製剤の可溶化成分の抗原／アジュバント活性を安定化および／または保持することができる。そのようなポリマーには、エチレングリコールもしくはプロピレングリコール、ビニルピロリドン、およびβ−シクロデキストリンポリマーおよびコポリマーがある。
【０１０１】
抗原の経皮的送達
抗原の経皮的送達はランゲルハンス細胞を標的とするため、本発明により効率的な免疫が達成される。これらの細胞は皮膚に豊富に存在し、Ｔ細胞記憶と強力な免疫応答につながる効率的な抗原提示細胞である。皮膚中に多数のランゲルハンス細胞が存在するため、経皮的送達の効率は、抗原とアジュバントに暴露される表面積に関連する。実際、経皮的免疫が非常に効率的な理由は、これが、筋肉内免疫よりより多くの数のこれらの効率的な抗原提示細胞を標的とするためである。
【０１０２】
我々は、本発明は免疫へのアクセスを増強し、一方強力な免疫応答を誘導すると考えている。経皮的免疫は、皮下注射針による注射（すなわち、真皮を介する貫通）およびその合併症や困難さが無いため、熟練者、無菌技術、および無菌装置の必要性が低減される。さらに、複数の部位での免疫もしくは複数の免疫に対してバリアが低減される。製剤の単回投与による免疫もまた考えられる。
【０１０３】
免疫は、固体型の抗原とアジュバントの単純な製剤を表皮に適用することにより行われ、随時閉鎖性包帯によりもしくは他のパッチ技術により覆われる。免疫は、非熟練者が行うことができ、自己適用が可能である。容易に免疫ができるなら、大規模な野外の免疫も可能である、単純な免疫法が、小児患者や老人、および第３世界の国民が免疫を受けやすくする。
【０１０４】
本発明の目的は、皮膚を穿孔することなく無傷の皮膚を介する免疫のための新規手段を提供することである。本発明の経皮的免疫は、液体ベースの送達系を必要とせずに、抗原とアジュバントを免疫系、特に皮膚の下にある特殊化した抗原提示細胞（例えば、ランゲルハンス細胞）に、送達することができる方法を提供する。
【０１０５】
従来のワクチンでは、製剤は針を用いて皮膚から注入された。針を使用するワクチンの注入は、無菌の針とシリンジ、ワクチンを投与する熟練した医療従事者、注射による不快感、針による疾患、および再使用される可能性のある針を用いる皮膚の穿刺による合併症の可能性を含む、いくつかの欠点を有する。皮下注射針を使用せずに皮膚を介して免疫することは、皮下注射針を避けることによりワクチン送達にとって進歩である。
【０１０６】
さらに経皮的免疫は、皮膚の大きな表面積を標的とするいくつかの部位を使用することにより、より多くの免疫細胞が標的とされるため、皮下注射針を使用する免疫より優れている。免疫応答を誘導するのに充分な治療上有効量の抗原は、単一の皮膚位置で経皮的に、または排膿性リンパ節領域（頸部、腋窩、鼠蹊、肘窩上部、膝窩、腹部と胸部のもの）を覆う皮膚の領域上に送達される。体全体の位置の無数の異なるリンパ節に近いそのような位置は、皮内、皮下または筋肉内注射により１つの位置に少量の抗原を注入する時より、免疫系により広範な刺激を提供するであろう。
【０１０７】
皮膚を通過するかまたは皮膚に入る抗原は、抗原提示細胞に出会い、これは免疫応答を誘導するように抗原を処理する。複数の免疫部位は、より多数の抗原提示細胞を動員し、動員されたより多数の抗原提示細胞は、免疫応答のより大きな誘導を招く。皮膚の使用は、抗原を皮膚の食作用細胞（例えば、皮膚樹状細胞、マクロファージ）および他の皮膚の抗原提示細胞に送達し、抗原はまた、血流またはリンパ系を介して抗原提示細胞として機能することが知られている肝臓、脾臓、および骨髄の食作用細胞に送達されると考えられる。
【０１０８】
ランゲルハンス細胞、樹状細胞、およびマクロファージは、α２−マクログロブリン結合抗原、またはアジュバント、抗原またはその両方とのタンパク質融合体として結合してまたは組換え法で産生されたＡＰＣを標的とすることが知られている他の物質を使用して、特異的に標的化される。ランゲルハンス細胞、樹状細胞、およびマクロファージは、アジュバントに結合したかまたはアジュバントとのタンパク質融合体として組換え法で産生されたＩｇＥ（ビーバー（Bieber）、１９９７）のＦc受容体または高親和性受容体を使用して、特異的に標的化される。またアジュバントは、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ（米国特許第５，１０２，６６３号、第５，１４１，７４２号および第５，２６２，１７７号）、前立腺癌（米国特許第５，５３８，８６６号）、およびリンパ腫（米国特許第４，８１６，２４９号、第５，０６８，１７７号、および第５，２２７，１５９号）と結合したか、またはこれとタンパク質融合体として組換え法で産生される。Ｔ細胞受容体オリゴペプチドを用いるワクチン化は、自己免疫疾患の進行を止める免疫応答を誘導し得る（米国特許第５，６１２，０３５号、および第５，６１４，１９２号；アンテル（Antel）ら、１９９６；バンデンバーク（Vandenbark）ら、１９９６）。米国特許第５，５５２，３００号はまた、自己免疫疾患の治療に適した抗原を記載する。
【０１０９】
遺伝的免疫の製剤の実施態様は、固体基質（例えば、金粒子または他のコロイド性金属）に結合、浸漬、および／または被覆されたポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）である。こうして生成した発射物は、ガス圧または電磁力（例えば、バイオリスティクス（biolistics））により、被験体の皮膚に導入される。そのような製剤は、皮膚の抗原提示細胞または他の樹状細胞により取り込まれるなら、コードされる抗原の提示が促進されるかまたは増強される。
【０１１０】
本出願で言及されるすべての刊行物、本、特許出願、および特許は、参照することにより本明細書に組み込まれ、技術の現状を示す。
【０１１１】
以下は、本発明を例示するが、本発明の実施は、決してこれらの例に限定されない。
【０１１２】
例
免疫法
６〜８週齢のマウスの背中の毛を＃４０バリカンで剃った。この毛剃りは、皮膚への傷害の兆候無しで行われた。この毛剃りは、胸郭中央から首のうなじのすぐ下まで行った。次にマウスを４８時間休息させた。この操作の前に、識別のためにマウスの耳に標識を付け、免疫前の血清試料を得るためにあらかじめ採血した。また、５０μlの免疫溶液を各耳に適用することにより、毛を剃ることなくマウスを経皮的に免疫した。
【０１１３】
次に、マウスを以下の方法で免疫した。マウスを０．０３〜０．０６mlの２０mg/mlキシラジン溶液と０．５mlの１００mg/mlケタミンで麻酔した。この用量の麻酔によりマウスを約１時間固定した。より長期間の固定が必要な時は、より多量のまたは繰り返し投与を使用する。マウスを、暖めてある毛布の上に腹部を下にしてのせた。
【０１１４】
次に免疫溶液を、以下の方法でマウスの背中の皮膚の毛を剃った上にのせた：ポリスチレンで作成した１．２cm×１．６cmのステンシルを静かに皮膚の上にのせ、Ｂ細胞の表面免疫グロブリンを標的とした。結果は、現在の免疫法では達成されたとしてもまれである程度に、抗原が抗原提示細胞に広く分散されるであろう。
【０１１５】
遺伝的免疫は、米国特許第５，５８９，４６６号、第５，５９３，９７２号、および第５，７０３，０５５号に記載されている。製剤に含有される核酸は、抗原、アジュバントまたはその両方をコードする。核酸は、複製が可能であるか可能ではなく、非組み込み性および非感染性でもよい。例えば核酸は、免疫応答をクラスＩ制限応答に向けるために、抗原とユビキチンドメインを含む融合ポリペプチドをコードする。核酸はさらに、抗原またはアジュバントをコードする配列に機能的に連結した制御領域を含有してもよい。核酸はアジュバントとともに添加されてよい。核酸は、トランスフェクションを促進する物質（例えば、陽イオン性脂質、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン−ＤＭＳＯ、またはこれらの組合せ）と複合体を形成してもよい。また免疫細胞は、Ｆc受容体もしくはタンパク質Ａ／ＧへのＤＮＡの結合、α２−マクログロブリンもしくはタンパク質Ａ／Ｇもしくは同様のＡＰＣターゲティング物質に結合させる物質へのＤＮＡの結合により標的化することができる。核酸はまた、ウイルスゲノム由来の領域を含有してもよい。そのような物質および技術は、クリーグラー（Kriegler）（１９９０）とムレイ（Murray）（１９９１）に記載されている。
【０１１６】
免疫応答は、体液性（すなわち、抗原特異的抗体）および／または細胞性（すなわち、抗原特異的リンパ球、例えばＢ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＴＬ、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、および／またはＴDTH細胞）のエフェクターアームを含有してもよい。さらに免疫応答は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を仲介するＮＫ細胞を含有してもよい。
【０１１７】
本発明の製剤により誘導される免疫応答は、抗原特異的抗体および／または細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ、アルビング（Alveng）とワッセフ（Wassef）、１９９４）の誘発を含んでよい。抗体は、免疫測定法により検出することができ、種々のイソタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）の検出が予測される。免疫応答はまた、中和測定法により検出することができる。抗体は、Ｂリンパ球により産生される防御性タンパク質である。これらは、特異性が高く、一般に抗原の１つのエピトープを標的とする。抗体はしばしば、疾患を引き起こす病原体から得られる抗原と特異的に反応することにより、疾患に対する防御において役割を果たす。免疫は、免疫抗原（例えば、コレラ毒素）に特異的な抗体を誘導する。
【０１１８】
ＣＴＬは、病原体による感染に対して防御するために産生される防御性免疫細胞である。これはまた、非常に特異性が高い。免疫は、抗原に特異的なＣＴＬ（例えば、マラリアタンパク質に基づく合成オリゴペプチド）を自己主要組織適合性抗原とともに誘導する。経皮的送達系を用いる免疫により誘導されるＣＴＬは、病原体に感染された細胞を死滅させる。免疫はまた、抗体とＣＴＬの応答を強化することにより示される記憶応答、抗原で刺激したリンパ球の培養により示されるリンパ球増殖、および抗原単独の皮内皮膚抗原刺激に対する遅延型過敏応答も生成する。
【０１１９】
ウイルス中和測定法では、血清の連続希釈物を宿主細胞に加え、次にこれを、感染性ウイルスによる抗原刺激後の感染について観察する。あるいは、血清の連続希釈物を、感染性力価のウイルスとともにインキュベートしてから、動物に接種し、次に接種した動物を、感染の兆候について観察する。
【０１２０】
本発明の経皮的免疫系は、動物またはヒトの抗原刺激モデルを使用して評価され、これは、抗原を用いる免疫が疾患から被験体を防御する能力を評価する。そのような防御は、抗原特異的免疫応答を証明するであろう。抗原刺激感染の代わりに、５IU/mlまたはそれ以上の抗ジフテリア抗体力価を達成することは、一般に最適な防御を意味すると考えられ、防御の代理マーカーとして機能する（プロトキン（Plotkin）とモルチマー（Mortimer）、１９９４）。
【０１２１】
さらにプラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）抗原刺激モデルは、ヒトで抗原特異的免疫応答を誘導するために使用される。ヒトの志願者を、マラリア寄生虫由来のオリゴペプチドまたはタンパク質（ポリペプチド）を含有する経皮的免疫系を使用して免疫し、次に実験的にまたは自然の環境でマラリアに接触させる。プラスモジウム・ヨエリイ（Plasmodium yoelii）マウスマラリア抗原刺激モデルを使用して、マラリアに対するマウスの防御性を評価してもよい（ワング（Wang）ら、１９９５）。
【０１２２】
コレラ毒素特異的またはＬＴ特異的ＩｇＧもしくはＩｇＡ抗体は、コレラ毒素抗原刺激（ピアス（Pierce）、１９７８；ピアス（Pierce）とレイノルズ（Reynolds）、１９７４）に対する防御を提供し、ＬＴ特異的ＩｇＧまたはＩｇＡは、ＥＴＥＣ関連赤痢疾患に対して防御することが知られている。
【０１２３】
ワクチン化はまた、癌、アレルギー、および自己免疫疾患の治療として使用されている。例えば、腫瘍抗原(例えば、前立腺特異的抗原）によるワクチン化は、抗体、ＣＴＬおよびリンパ球増殖（これは、体の免疫系が腫瘍細胞を認識しかつ死滅させることを可能にする）の形で免疫応答を誘導する。ワクチン化に有用な腫瘍抗原は、黒色腫の背中について記載されており、食塩水を湿らせた無菌ガーゼを使用して、皮膚を部分的に湿らせ（これは、免疫溶液の適用さえ可能にする）、次に免疫溶液を、ステンシルで周囲を囲った領域にピペットで適用して、免疫溶液の２cm2のパッチを得る。あるいは、免疫溶液を、耳に均等に適用する。ピペットの先で皮膚を引っ掻いたりこすったりしないように注意した。免疫溶液を領域の周りに広げ、ピペットの先の平滑な面で被服した。
【０１２４】
約１００μlの免疫溶液を、１時間マウスの背中にのせた。次にマウスを、大量（約１リットル）のぬるい水道水の流れの下で、首のうなじと尾でゆるく固定し、洗浄した。次にマウスを、無菌ガーゼ片で軽くたたいて乾燥し、２回目の洗浄を行った。次に２回目としてマウスをたたいて乾燥を行い、ケージの中に放置した。毛剃り、麻酔、免疫、または洗浄操作からの悪影響は観察されなかった。抗原への暴露後７２時間まで、免疫部位での紅斑や硬化は見られなかった。耳を使用する免疫は前記したように行ったが、免疫前に毛は剃らなかった。
【０１２５】
本発明の乾燥製剤とパッチの製造、ならびにその適用を以下に記載する。
【０１２６】
抗原
以下の抗原を、免疫またはＥＬＩＳＡに使用する：コレラ毒素すなわちＣＴ（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州、カタログ＃１０１Ｂ）、ＣＴＢサブユニット（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州、カタログ＃ＢＴ０１）、ＣＴＡサブユニット（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州、カタログ＃１０２Ａ）、ＣＴＡサブユニット（カルビオケム（Calbiochem）、カタログ＃６０８５６２）、百日咳毒素（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州）、破傷風断片ＣすなわちｔｅｔＣ（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州）、破傷風トキソイド（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州）、破傷風毒素（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州）、シュードモナス外毒素Ａ（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州）、ジフテリアトキソイド（リストバイオロジカルズ（List Biologicals））、大腸菌熱不安定性腸毒素（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州、ロット＃９６４０６２５）、ウシ血清アルブミンすなわちＢＳＡ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州、カタログ＃３Ａ−４５０３）、およびヘモフィルス・インフルエンザ（Hemophilus influenza）Ｂ結合体（コノート（Connaught）、ロット＃６Ｊ８１４０１）。抗原を乾燥型で提供しない場合は、これらを無菌ＰＢＳまたは正常な食塩水と混合して溶解（すなわち、液体型）した。
【０１２７】
ＥＬＩＳＡ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
記載された抗原に特異的な抗体を、グレン（Glenn）ら（１９９５）と同様の方法でＥＬＩＳＡを使用して測定した。すべての抗原を、無菌食塩水に２μg/mlの濃度で溶解した。ウェル当たり５０μlのこの溶液（０．１μｇ）をイムロン−２（IMMULON-2）ポリスチレンプレート（ダイナテック（Dynatech）、チャンチリ（Chantilly）、バージニア州）に入れ、室温で一晩インキュベートした。次にプレートを、０．５％カゼイン／０．０５％ツイーン２０ブロッキング緩衝液で１時間ブロックした。血清を０．５％カゼイン／０．０５％ツイーン２０希釈液で希釈し、希釈系列は、プレート上の列中で行った。インキュベーションは、室温で２時間であった。
【０１２８】
次にプレートをＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０洗浄溶液で４回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合（バイオラッド（Bio-Rad）、リッチモンド、カリホルニア州、カタログ＃１７０−６５１６）２次抗体を、カゼイン希釈液中で１／５００で希釈し、プレート上に室温で１時間のせた。次にプレートを、ＰＢＳ−ツイーン洗浄溶液で４回洗浄した。各ウェルに１００μlの２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾロン）スルホン酸基質（ＡＢＴＳ、カークガードアンドペリー（Kirkegaard and Perry）、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を加え、約３０分間の発色後プレートを４０５nmで読んだ。結果は、ＥＬＩＳＡ単位（吸光度が１．０に等しい血清希釈倍率の逆数）の個々の血清の幾何平均と平均の標準誤差として、またはＥＬＩＳＡ単位の個々の抗体応答として報告する。すべての場合に、ＥＬＩＳＡ測定法を行って、同時投与抗原の間の交差反応の寄与を差し引く。
【０１２９】
ＥＬＩＳＡ−ＩｇＧ（γ）、ＩｇＭ（μ）、およびＩｇＡ（α）
ＩｇＧ（γ）、ＩｇＭ（μ）、およびＩｇＡ（α）抗ＣＴ抗体レベルを、グレン（Glenn）ら（１９９５）と同様の方法を用いてＥＬＩＳＡを使用して測定する。ＣＴを無菌食塩水に２μg/mlの濃度で溶解する。ウェル当たり５０μlのこの溶液（０．１μｇ）をイムロン−２（IMMULON-2）ポリスチレンプレート（ダイナテック（Dynatech）、チャンチリ（Chantilly）、バージニア州）に入れ、室温で一晩インキュベートする。次にプレートを、０．５％カゼイン−ツイーン２０ブロッキング緩衝液で１時間ブロックする。血清をカゼイン希釈液で希釈し、プレート上で連続希釈を行う。これを室温で２時間インキュベートする。
【０１３０】
次にプレートをＰＢＳ−ツイーン洗浄溶液で４回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）ＨＲＰ結合（バイオラッド（Bio-Rad）、リッチモンド、カリホルニア州、カタログ＃１７２−１０３８）、ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ）ＨＲＰ結合（バイオラッド（Bio-Rad）、リッチモンド、カリホルニア州、カタログ＃１７２−１０３０）、またはヤギ抗マウスＩｇＡ（ザイメッド（Zymed）、サウスサンフランシスコ、カリホルニア州）２次抗体を、カゼイン希釈液中で１／１０００で希釈し、プレート上に室温で１時間のせる。次にプレートを、ＰＢＳ−ツイーン洗浄溶液で４回洗浄する。各ウェルに１００μlの２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾロン）スルホン酸基質（ＡＢＴＳ、カークガードアンドペリー（Kirkegaard and Perry）、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を加え、プレートを４０５nmで読む。結果は、ＥＬＩＳＡ単位（吸光度が１．０に等しい血清希釈倍率の逆数）の個々の血清の幾何平均と平均の標準誤差として報告する。
【０１３１】
ＥＬＩＳＡ−ＩｇＧサブクラス
ＣＴ、ＬＴ、ＥＴＡ、およびＢＳＡに対する抗原特異的なＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３）サブクラス抗体を、グレン（Glenn）ら（１９９５）が記載したように行う。固層ＥＬＩＳＡをイムロン−２（IMMULON-2）ポリスチレンプレート（ダイナテック（Dynatech）、チャンチリ（Chantilly）、バージニア州）で行う。ウェルを、食塩水中０．１μｇ／５０μlの各抗原で一晩インキュベートし、次に０．５％カゼイン−ツイーン２０でブロックする。０．５％カゼイン中で希釈した個々のマウス血清を連続希釈し、室温で４時間インキュベートする。２次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスイソタイプ特異的抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ザバインディングサイト（The Binding Site）、サンジエゴ、カリホルニア州）からなる。各サブクラスの標準曲線を、マウス骨髄腫ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３（ザバインディングサイト（The Binding Site）、サンジエゴ、カリホルニア州）を使用して決定する。標準ウェルを、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バイオラッド（Bio-Rad）、リッチモンド、カリホルニア州、カタログ＃１７２−１０５４）を用いて被覆して、骨髄腫ＩｇＧサブクラス標準物質を捕捉し、これは連続希釈物で加える。骨髄腫ＩｇＧサブクラスはまた、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスサブクラス特異的抗体を使用して検出する。試験血清と骨髄腫標準物質の両方を、基質として２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾロン）スルホン酸（ＡＢＴＳ、カークガードアンドペリー（Kirkegaard and Perry）、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を使用して検出する。４０５nmで吸光度を読む。個々の抗原特異的サブクラスを、骨髄腫標準曲線に対して計算した線形力価測定曲線からの値を使用して定量し、次にμg/mlとして報告する。
【０１３２】
ＥＬＩＳＡ−ＩｇＥ
研究製品カタログ、１９９６−１９９７（ファーミンゲン（Pharmingen）、サンジエゴ、カリホルニア州）のファーミンゲンテクニカルプロトコール（Pharmingen Technical Protocols）、第５４１頁のプロトコールを使用して、抗原特異的ＩｇＥ抗体定量を行う。０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．２）中の５０μlの２μg/ml精製抗マウスＩｇＥ捕捉モノクローナル抗体（ファーミンゲン（Pharmingen）、カタログ＃０２１１１Ｄ）を、イムノ（ＩＭＭＵＮＯ）プレート（ヌンク（Nunc）、カタログ＃１２−５６５−１３６）に加える。プレートを室温で一晩インキュベートし、ＰＢＳ−ツイーン２０で３回洗浄し、ＰＢＳ中３％ＢＳＡで２時間ブロックし、ＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄する。血清をＰＢＳ中１％ＢＳＡで希釈し、１／１００の希釈率で加え、列に沿って連続希釈する（例えば、１／１００、１／２００など）。精製マウスＩｇＥ標準物質（ファーミンゲン（Pharmingen）、カタログ＃０３１２Ｄ）を出発希釈０．２５μg/mlで加え、列に沿って連続希釈する。プレートを２時間インキュベートし、ＰＢＳ−ツイーンで５回洗浄する。
【０１３３】
ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中の２μg/mlのビオチン化抗マウスＩｇＥモノクローナル抗体（ファーミンゲン（Pharmingen）、カタログ＃０２１２２Ｄ）を４５分間インキュベートし、ＰＢＳ−ツイーンで５回洗浄する。アビジン−ペルオキシダーゼ（シグマ（Sigma）Ａ３１５１、１：４００の１mg/ml溶液）を３０分間加え、プレートをＰＢＳ−ツイーンで６回洗浄する。試験血清とＩｇＥ標準物質を、基質として２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾロン）スルホン酸（ＡＢＴＳ、カークガードアンドペリー（Kirkegaard and Perry）、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を使用して検出する。４０５nmで吸光度を読む。個々の抗原特異的サブクラスを、ＩｇＥ標準曲線に対して計算した線形力価測定曲線からの値を使用して定量し、次にμg/mlとして報告する。
【０１３４】
肺洗浄液と便採取
抗原刺激の日にマウスを屠殺後、肺洗浄液を得る。気管を切開し、２２ゲージのポリプロピレンチューブを挿入し、ＰＢＳを注入して静かに肺を膨らます。洗浄液を取り出し、次に再注入し、計３サイクル行い、次に−２０℃で保存する。抗原刺激の前日、自然排便後便ペレットを採取する。ペレットの重量を測定し、１００μｇの便物質について１mlのＰＢＳでホモジナイズし、遠心分離し、上清を集め、次に測定するまで−２０℃で保存する。
【０１３５】
毒素抗原刺激
マウスをキシラジン：ケタミンで麻酔し、１０mMトリス（ｐＨ７．５）中１mg/mlの２０μlのＣＴ（カルビオケム（Calbiochem）、ラホヤ、カリホルニア州）を鼻内抗原刺激する。各鼻孔について等分した緩衝液中の２０μｇを鼻内投与して、麻酔下でマウスを抗原刺激する。抗原刺激後、マウスを毎日観察し、罹患率と死亡率の両方を記録する。
【０１３６】
統計解析
特に明記しない場合は、データは、幾何平均とＳＥＭとして表す。群中の抗体力価測定の間の比較は、対応があるかまたは対応の無い片側ｔ検定を使用して行い、ｐ値＜０．０５を有意であると見なす。抗原刺激試験では、群をフィッシャーの正確度検定（スグマスタット（SigmaStat）、ＳＰＳＳ、シカゴ、イリノイ州）により比較する。
【０１３７】
パッチの製造
はく離ライナー（ＣＯ５５、アールアンドディーマテリアル（R & D material））を、アクリル接着ラミネート（Ｋ００２１Ｆ、アールアンドディーマテリアル＃Ｓ９６Ｉ００６）から取り除き、接着ラミネートを裏面（１０１２、アールアンドディーマテリアル（R & D material））に適用し、巻き、担体ペーパーストリップを除去して、アクリル接着ラミネートを露出させる。４インチ×４インチの正方形の４枚ガーゼ（ジョンソンアンドジョンソン（Johnson & Johnson））を、上記裏面に巻き、アクリル接着ラミネートで固定する。１cm2の丸単位を、製剤の単回投与を用いる使用に適した裏面（２）上のガーゼ（１）からパンチする。
【０１３８】
追加のアクリル接着ラミネートからはく離ライナーを取り出し、アクリル接着ラミネートをＣｏＴｒａｎ９７０１（２ミル、P.U.T.、アールアンドディーマテリアル（R & D material）、ＳＬＰ＃Ｐ２６１４５０１４３）のＴＥＧＡＤＥＲＭ閉鎖性包帯に適用し、巻き、担体ペーパーストリップを除去して、アクリル接着ラミネートを露出させる。裏面（２）上のガーゼ（１）の単位を、ピンセットで前記閉鎖性包帯（３）の上にガーゼ側を上にし包帯側を下にして、アクリル接着ラミネートで固定してのせた。ガーゼ側を、先に除去したはく離ライナーでカバーし、巻き、中心に単位がある２cm×２．５cmの長方形で切断した。
【０１３９】
前記したように作成したパッチを、断面で模式的に図１に示す。これは、無菌条件下で調製することができ、室温で保存される。パッチを、ガーゼ側ではく離ライナー（４）で、包帯側で担体ペーパー（５）でカバーすることにより、無菌に維持することができる。
【０１４０】
例１．凍結乾燥抗原（１６０μｇのコレラ毒素）の皮膚への表皮適用後のマウスの免疫
Ｃ５７ＢＬ６マウスを、以下の方法でコレラ毒素（ＣＴ）を使用して免疫した：２μｇの凍結乾燥ＣＴ（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州）を、元々のバイアルから注意深く取り出し、紙片の上で計量（１．２８ｇ回収）し、各１６０μｇずつのほぼ等しい８つの部分に分けた。粉剤で免疫したマウスは、１６０μｇのＣＴをペーパーからブラシで注意深く皮膚の上に移した。マウスを麻酔し、毛を剃ってから免疫し、免疫粉剤を皮膚の上に１時間のせ、その後マウスを完全に洗浄した。皮膚の水による前処理には、基本的に５分間の皮膚の湿潤、ブロットして皮膚を乾燥、および免疫粉剤または溶液を皮膚上にのせることを含んだ。液剤で免疫したマウスは、食塩水中１００μlの１mg/mlＣＴで免疫した。抗体は、初期の免疫の２週間後に、前記したようにＥＬＩＳＡで検出した。１回の免疫のみが必要であった。引いた力価（１４日の力価−前血液）から幾何平均（geo mean）を計算した。結果については表１を参照されたい。
【０１４１】
ＣＴの食塩水溶液で免疫したマウスは、経皮的免疫を使用して前記したように典型的な免疫応答を示した。粉剤を皮膚上にのせると、マウスは明らかに高レベルの抗体を発現した。皮膚を吸水させてから免疫すると、水性型で送達した抗原と粉剤型で送達した抗原とも、非常に高レベルの抗体を誘導することができた。しかし乾燥粉剤で免疫したマウスは、一貫して高レベルの抗体を達成した。
【０１４２】
【表１】
0004932086.tif 000002
【０１４３】
例２．凍結乾燥抗原（５０μｇのコレラ毒素）の皮膚への表皮適用後のマウスの免疫
【０１４４】
【表２】
0004932086.tif 000003
【０１４５】
Ｃ５７ＢＬ６マウスを、以下の方法でコレラ毒素（ＣＴ）を使用して免疫した：１mgの凍結乾燥ＣＴ（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州）を、元々のバイアルから注意深く紙片の上に取り出し、５０μｇずつのほぼ等しい２０の部分に分けた。粉剤で免疫したマウスは、５０μｇのＣＴをペーパーからブラシで注意深く皮膚の上に移した。マウスを麻酔し、毛を剃ってから免疫し、免疫粉剤を皮膚の上に１時間置き、その後マウスを完全に洗浄した。水による皮膚の前処理には、基本的に５分間の皮膚の湿潤、ブロットしてガーゼで皮膚を乾燥、および免疫粉剤または溶液を皮膚上にのせることを含んだ。アルコール（ａｌｃ）でふいてから免疫したマウスは、イソプロピルアルコール（７０％）スワブを皮膚に静かに２０回こすった。液剤で免疫したマウスは、食塩水中５０μlの１mg/ml  ＣＴで免疫した。抗体は、初期の免疫の２週間後、前記したようにＥＬＩＳＡで検出した。１回の免疫のみが必要であった。引いた力価（１４日の力価−前血液）から幾何平均（geo mean）を計算した。結果については表２を参照されたい。
【０１４６】
ＣＴの食塩水溶液で免疫したマウスは、経皮的免疫を使用して前記したように典型的な免疫応答を示した。再度、粉剤を皮膚上にのせると、マウスは明らかに高レベルの抗体を発現した。皮膚を吸水させてから免疫すると、水性型で送達した抗原と粉剤型で送達した抗原とも、非常に高レベルの抗体を誘導することができた。乾燥粉剤で免疫したマウスは、非常に高レベルの抗体を達成し一貫して高い応答を示した。アルコールによるスワブは、粉剤免疫で誘導した免疫応答を妨害しなかった。この２回目の実験は、皮膚の前処理があってもなくても、乾燥製剤が免疫に使用できることを証明している。
【０１４７】
例３．中間的応答動物マウス株中の凍結乾燥抗原（２５μｇのコレラ毒素）の皮膚への表皮適用後のマウスの免疫
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、以下の方法でコレラ毒素（ＣＴ）を使用して免疫した：５mgの凍結乾燥ＣＴ（リストバイオロジカルズ（List Biologicals）、キャンベル（Campbell）、カリホルニア州）を、１mlの無菌水に溶解して、５mg/mlの溶液を作成した。粉剤免疫のために、５μlのこの溶液を、室温でガラススライド上で空気乾燥した。残存粉剤を、免疫すべきマウスの皮膚の背中の上にはがしてのせた。すなわち粉剤で免疫したマウスは、２５μｇのＣＴをスライドからブラシで注意深く皮膚の上に移した。乾燥パッチで免疫したマウスは、４cm×４cmの四角のプラスチックラップ（サラン（Saran））上で１cm×１cm部分のキムワイプ（KIMWIPE）ティシューペーパー上に５μlの５mg/ml  ＣＴをのせ、室温で空気乾燥させた。次にティシューペーパーとプラスチックラップを、免疫するマウスの皮膚とティシューペーパーとを直接接触させてのせ、プラスチックラップでカバーした。「湿った」パッチは、同様の方法で作成したティシューペーパーとプラスチックラップ「パッチ」を使用したが、３０μlの無菌水を乾燥パッチ上にピペットでのせ、これを次に皮膚の上にのせ、プラスチックラップを湿ったパッチの上にのせた。
【０１４８】
【表３】
0004932086.tif 000004
【０１４９】
マウスを麻酔し、毛を剃ってから免疫し、免疫粉剤を皮膚の上に１時間置き、その後マウスを完全に洗浄した。水による皮膚の前処理には、基本的に５分間の皮膚の湿潤、ブロットしてガーゼで皮膚を乾燥、そして免疫粉剤または液剤を皮膚上にのせることを含んだ。液剤で免疫したマウスは、食塩水中２５μlの１mg/ml  ＣＴで免疫した。抗体は、初期の免疫の２週間後、前記したようにＥＬＩＳＡで検出した。１回の免疫のみが必要であった。引いた力価（１４日の力価−前血液）から幾何平均（geo mean）を計算した。結果については表３を参照されたい。
【０１５０】
前処理した皮膚にＣＴの食塩水溶液で免疫したマウスは、Ｂａｌｂ／ｃマウス（中程度の応答マウス）を用いる経皮的免疫を使用して前記で証明したような、典型的な免疫応答を示した。再度、粉剤を皮膚上にのせると、皮膚を吸水させてから免疫すると、マウスは明らかに高レベルの抗体を発現した。吸水させた皮膚上にのせたパッチと免疫の時に吸水させたパッチとも、高レベルの抗体を達成し一貫して高い応答を示した。この３回目の実験は、乾燥粉剤が、皮膚上の免疫のためにパッチ型で使用できることを証明している。
【０１５１】
例４．液体または乾燥抗原製剤を用いる経皮的免疫に応答した血清抗インフルエンザウイルスＡ  ＩｇＡ−およびＩｇＧ−力価。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群５匹）を、液剤または固体製剤の、５０μｇのインフルエンザウイルス株Ａ／Ｓｙｄ／５／９７（ＦｌｕＡ）と６０μｇの精製したコレラ毒素Ｂサブユニット（ｐＣＴＢ）で免疫した。
【０１５２】
簡単に説明すると、免疫の４８時間前に、肩甲骨の末端面から尾の付け根の０．５cm上まで、マウスの背中の毛を剃った。免疫の日に、マウスに３０μlの麻酔薬混合物（約８３mg/kgケタミンと８．３mg/kgキシラジンの最終用量を与える）を注射して、マウスを固定化した。各マウスの背中を、水を飽和させたガーゼパッドで１０回拭いて吸水させた。背中に水たまりを約５分間残した。乾燥したガーゼパッドで過剰の水を吸い取ってから、抗原を適用した。
【０１５３】
乾燥パッチについて、免疫の前日に抗原溶液を混合し、エランコーポレーション（Elan Corporation）から提供されたプラセボパッチから、１．２５×２．５cmの透明の接着パッチを切り取った。食塩水中の２００μlの抗原／アジュバントを接着表面に適用し、１００μlの抗原をのせ数時間空気乾燥し、次にさらに１００μｌをのせ、一晩空気乾燥した。
【０１５４】
液剤パッチ群について、（ＦｌｕＡ／ｐＣＴＢ）を含有する食塩水２００μｌまたはｐＣＴＢを含有する食塩水１００μｌを、背中に適用した。０、３および６週目に、上記したように動物を免疫した。抗原／アジュバントに暴露する前（すなわち、前採血）と３回目の免疫の３週間後に、血清を採取した。抗原特異的抗体を、固層ＥＬＩＳＡで、被覆タンパク質としてインフルエンザＡ抗原を使用して評価した。試料は、１：１００で希釈剤で希釈した。
【０１５５】
血清ＩｇＡ力価についての結果は表４を参照されたい。固体製剤群と液体製剤群の両方の動物が、前採血試料またはアジュバント（ｐＣＴＢ）単独で免疫したマウスで観察された力価と比較して、高い抗インフルエンザＡ  ＩｇＡ力価を示した。乾燥パッチ群からの３匹の動物は、前採血群に対して２倍またはそれ以上の上昇を示し、いっぽう液剤抗原群の１匹の動物のみが、２倍の上昇を示した。
【０１５６】
【表４】
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【０１５７】
血清ＩｇＧ力価についての結果は表５を参照されたい。免疫後、固体製剤群と液体製剤群の両方の動物が、前採血試料またはアジュバント（ｐＣＴＢ）単独で免疫したマウスで観察された力価と比較して、高い抗インフルエンザＡ  ＩｇＧ力価を示した。結果はＥＬＩＳＡ単位（ＯＤ４０５nmが１．０になる希釈率の逆数）で報告される。抗原単独群（最大力価は４７であった）と比較して、乾燥抗原群の５匹のマウスのうちの２匹と液剤抗原群の５匹のマウスのうちの４匹は、抗原特異的ＩｇＧ力価の上昇を示した。
【０１５８】
【表５】
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【０１５９】
例５．液剤または乾燥抗原製剤を用いる経皮的免疫後の血清ＩｇＧ抗原特異的応答。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群５匹）を、乾燥製剤または液体製剤中の２５μｇの熱不安定性腸毒素（ＬＴ）と１００μｇのジフテリアトキソイド（ＤＴ）で皮膚に免疫した。
【０１６０】
簡単に説明すると、免疫の４８時間前に、肩甲骨の末端面から尾の付け根の０．５cm上まで、マウスの背中の毛を剃った。免疫の日に、マウスに３０μlの麻酔薬混合物（約８３mg/kgケタミンと８．３mg/kgキシラジンの最終用量を与える）を注射して、マウスを固定化した。各マウスの背中を、水を飽和させたガーゼパッドで１０回拭いて吸水させた。背中に水たまりを約５分間残した。乾燥したガーゼパッドで過剰の水を吸い取ってから、抗原を適用した。
【０１６１】
パッチ群について、免疫の４８〜７２時間前に抗原溶液を混合した。パッチは以下のように作成した。１〜５群について、エランコーポレーション（Elan Corporation）から提供されたプラセボパッチから、１．２５cm×２．５cmの透明の接着パッチを切り取った。第１群では、０．６cm×１．５cmのキムワイプ（KIMWIPE）ティシューペーパー片を切り、接着パッチの上にのせた。抗原溶液２５μｌをティシューペーパーの表面に適用し、一晩空気乾燥させた。第２群では、０．６cm×１．５cmのティシューペーパー片を切り、接着パッチの上にのせた。抗原溶液２５μｌをティシューペーパーの表面に適用し、一晩凍結乾燥させた。第３群では、抗原溶液２５μｌを接着表面に適用し、一晩空気乾燥させた。第４群では、抗原溶液２５μｌを接着表面に適用し、一晩凍結乾燥させた。第５群では、ＤＴのバイアルの１／５をＬＴのバイアルの１／４０と混合し、直接接着表面の上にのせた。第７群では、ＤＴのバイアルの１／５を熱不安定性腸毒素のバイアルの１／４０と混合し、直接マウスの背中の上にのせた。第９群では、抗原を含有する食塩水２５μｌを、動物の背中に適用した。
【０１６２】
０、３および５週目に、上記したようにマウスを免疫した。抗原／アジュバントに暴露する前（すなわち、前採血）と３回目の免疫の４週間後に、血清を採取した。抗原特異的抗体の力価を、固層ＥＬＩＳＡで、被覆タンパク質としてＬＴまたはＤＴ抗原を使用して評価した。試料は、１：１００希釈で出発して希釈剤で連続希釈した。
【０１６３】
表６と７の結果はＥＬＩＳＡ単位（ＯＤ４０５nmが１．０になる希釈率の逆数）で報告される。免疫後、固体製剤群と液体製剤群の両方の動物とも、前採血試料の平均力価（＜１０単位）と比較して、高い抗ＬＴ（表６）および抗ＤＴ（表７）ＩｇＧ力価を示した。これらの結果をまとめると、乾燥および凍結乾燥抗原／アジュバント製剤の両方とも、皮膚を介して抗原を送達するのに使用することができ、かつ抗原は、乾燥した粉剤型で、直接または単純な接着裏面上に適用することができることを示している。
【０１６４】
【表６】
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【０１６５】
【表７】
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【０１６６】
例６．異なる用量の熱不安定性腸毒素（ＬＴ）と一定量のジフテリアトキソイド（ＤＴ）を用いる経皮的免疫後の血清ＩｇＧ抗原特異的応答。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群５匹）を、６μｇ〜２００μｇのＬＴと１００μｇのＤＴを含有する乾燥製剤または液体製剤で皮膚に免疫した。
【０１６７】
簡単に説明すると、免疫の４８時間前に、肩甲骨の末端面から尾の付け根の０．５cm上まで、マウスの背中の毛を剃った。免疫の日に、マウスに３０μlの麻酔薬混合物（約８３mg/kgケタミンと８．３mg/kgキシラジンの最終用量を与える）を注射して、マウスを固定化した。各マウスの背中を、水を飽和させたガーゼパッドで１０回拭いて吸水させた。背中に水たまりを約５分間残した。乾燥したガーゼパッドで過剰の水を吸い取ってから、抗原を適用した。
【０１６８】
１〜６群について、免疫の４８〜７２時間前に抗原溶液を混合した。第１０群では、抗原は免疫の日に調製した。パッチを投与した群では、市販の材料から１．２５cm×２．５cmのセロファン片を切り取った。１cm2のキムワイプ（KIMWIPE）ティシューペーパー片を切り取り、セロファン片の上にのせた。１００μｇのＤＴとＬＴ（２００μｇ、第１群；１００μｇ、第２群；５０μｇ、第３群；２５μｇ、第４群；１２．５μｇ、第５群；６．２μｇ、第６群）を含有する食塩水の２５μｌを、ティシューペーパー／セロファンパッチのティシューペーパー表面にのせた。抗原溶液を、室温で一晩乾燥させた。第１０群では、抗原溶液２５μｌをマウスの皮膚上に直接のせた。すべての群で、製剤を３０分間適用し、次に大量の水で免疫部位の表面を洗浄して、残りの製剤を除去した。抗原／アジュバントに暴露する前（すなわち、前採血）と３回目の免疫の４週間後に、血清を採取した。抗原特異的抗体を、固層ＥＬＩＳＡで、被覆タンパク質としてＬＴまたはＤＴ抗原を使用して評価した。試料は、１：１００希釈で出発して希釈剤で連続希釈した。
【０１６９】
免疫後、固体製剤群と液体製剤群の両方の動物とも、前採血試料で観察された力価と比較して、高い抗ＬＴ（表８）および抗ＤＴ（表９）ＩｇＧ力価を示した。結果はＥＬＩＳＡ単位（ＯＤ４０５nmが１．０になる希釈率の逆数）で報告される。これらの結果をまとめると、乾燥抗原／アジュバント製剤が、表皮免疫で皮膚を介して抗原を送達するのに使用することができ、かつ少量のアジュバント（ＬＴ）は、抗体力価の上昇を誘導することができることを示している。
【０１７０】
【表８】
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【０１７１】
【表９】
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【０１７２】
例７．サイズの減少するパッチに対して一定量の熱不安定性腸毒素（ＬＴ）とジフテリアトキソイド（ＤＴ）を用いる経皮的免疫後の血清ＩｇＧ抗原特異的応答。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群５匹）を、２５μｇのＬＴと１００μｇのＤＴで乾燥製剤または液体製剤で皮膚に免疫した。
【０１７３】
簡単に説明すると、免疫の４８時間前に、肩甲骨の末端面から尾の付け根の０．５cm上まで、マウスの背中の毛を剃った。免疫の日に、マウスに３０μlの麻酔薬混合物（約８３mg/kgケタミンと８．３mg/kgキシラジンの最終用量を与える）を注射して、マウスを固定化した。各マウスの背中を、水を飽和させたガーゼパッドで１０回拭いて吸水させた。背中に水たまりを約５分間残した。乾燥したガーゼパッドで過剰の水を吸い取ってから、抗原を適用した。１〜５群について、免疫の４８〜７２時間前に抗原溶液を混合した。第６群では、抗原は免疫の日に調製した。
【０１７４】
パッチを投与した群では、市販の材料から１．２５cm×２．５cmのセロファン片を切り取った。製剤のより濃縮した送達を可能にするため、表面積が連続的に小さくなるように、キムワイプ（KIMWIPE）ティシューペーパー片を切り取った。このティシューペーパー片の大きさは以下の通りである：１．００cm2（第１群）、０．５cm2（第２群）、０．２５cm2（第３群）、０．１２cm2（第４群）、０．０６cm2（第５群）。次に切り取ったティシューペーパー片を、セロファンの裏面上にのせた。すべての群に、一定量の活性成分、２５μｇのＬＴおよび１００μｇのＤＴを適用し、これを、増加する濃度でティシューペーパー／セロファンパッチのティシューペーパー表面にのせて、パッチ表面積が減少するようにした。マウス１匹当たりパッチ当たりの容量は以下の通りである：５０μｌ（第１群）、２５μｌ（第２群）、１２．５μｌ（第３群）、６．３μｌ（第４群）、３．１μｌ（第５群）。抗原溶液を、室温で一晩乾燥させた。第６群では、５０μｌの溶液をマウスの皮膚上に直接のせた。すべての群で、製剤を３０分間適用し、次に大量の水で免疫部位の表面を洗浄して、残りの製剤を除去した。
【０１７５】
抗原／アジュバントに暴露する前（すなわち、前採血）と３回目の免疫の４週間後に、血清を採取した。抗原特異的抗体の力価を、固層ＥＬＩＳＡで、被覆タンパク質としてＬＴまたはＤＴ抗原を使用して評価した。試料は、１：１００希釈で出発して希釈剤で連続希釈した。
【０１７６】
免疫後、固体製剤群と液体製剤群の両方の動物とも、前採血試料で観察された力価と比較して、高い抗ＬＴ（表１０）および抗ＤＴ（表１１）ＩｇＧ力価を示した。結果はＥＬＩＳＡ単位（ＯＤ４０５nmが１．０になる希釈率の逆数）で報告される。これらの結果をまとめると、乾燥および凍結乾燥抗原／アジュバント製剤の両方とも、表皮免疫で皮膚を介して抗原を送達するのに使用することができ、そして乾燥抗原は、せまい表面積に適用できかつ有意な免疫応答を与えることを示している。
【０１７７】
【表１０】
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【０１７８】
【表１１】
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【０１７９】
以上の例は、経皮的免疫において乾燥製剤とその種々の物理的形態を使用する利点を証明している。しかし、我々の刊行物（グレン（Glenn）ら、１９９８ａｂ；１９９９）；米国特許第５，９１０，３０６号、および５，９８０，８９８号；ＷＯ９８／２０７３４およびＷＯ９９／４３３５０；および米国特許出願第０９／２５７，１８８号；０９／３０９，８８１号；０９／３１１，７２０号；０９／３１６，０６９号；および０９／３３７，７４６号に示した経皮的免疫を達成するのに関与する方法は、本発明に適合させられることに注意されたい。
【０１８０】
本発明を、現実的かつ好適と考えられる実施態様に関連して説明したが、本発明は、決して開示した実施態様に限定されるものではなく、請求の範囲の精神と範囲内に含まれる種々の変更態様および同等の組合せを包含するものと理解されたい。特に、上記で開示された要素の一般化ならびにこれらの要素の組合せは、本発明の範囲内である。
【０１８１】
すなわち、発明の新規な面から逸脱することなく、説明した発明の変更が可能であることは当業者には明らかであり、そのような変更は本請求の範囲内であることを理解されたい。
【０１８２】
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【図面の簡単な説明】
本発明のパッチの例を、図１に示す。本発明の製剤は、１cm2の直径の円形ユニットとして裏面（２）に接着したガーゼ（１）に適用される。円形ユニットは、長方形の包帯（３）に接着されてパッチを形成し、これは皮膚と接触するガーゼ側で被験体の皮膚に適用することができ、露出した接着剤によりそこに接着され、包帯側によりカバーされる。パッチは無菌的に包装され、ガーゼ側でリリースライナー（４）に、包帯側でキャリアーペーパー（５）で包まれ、室温で保存することができる。成分は、パッチの包装以外は、接着剤ラミネートにより密接に付着される。パッチの厚さと他の大きさは、一定の比例に応じて描かれていない。
【図１】
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