(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エグリンまたはα1−抗プロテアーゼから選択されるエラスターゼ阻害剤と混合されていることを特徴とする、フィブリノーゲンを含む組織接着剤。
【請求項２】
ヒトタンパク質のみから構成されていることを特徴とする、請求項１に記載の組織接着剤。
【請求項３】
ヒト血液タンパク質またはヒト血漿タンパク質のみから構成されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の組織接着剤。
【請求項４】
エラスターゼ阻害剤が、フィブリノーゲンｍｇを基準として１：１００から１：１５０，０００の重量比で含まれることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項５】
エラスターゼ阻害剤が、フィブリノーゲンｍｇを基準として１：５００から１：１１０，０００の重量比で含まれることを特徴とする、請求項４に記載の組織接着剤。
【請求項６】
フィブリノーゲン１ｇ当たり少なくとも１０-6Ｕのエラスターゼ阻害剤が含まれることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項７】
フィブリノーゲン１ｇ当たり１０-3から１０Ｕまでの範囲のエラスターゼ阻害剤が含まれることを特徴とする、請求項６に記載の組織接着剤。
【請求項８】
フィブリノーゲン１ｍｇ当たり少なくとも０．０００１ｍｇの量のプラスミノーゲンを含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項９】
フィブリノーゲン１ｍｇ当たり少なくとも０．００１ｍｇの量のプラスミノーゲンを含むことを特徴とする、請求項８に記載の組織接着剤。
【請求項１０】
フィブリノーゲン１ｍｇ当たり０．０１ｍｇ以上の量のプラスミノーゲンを含むことを特徴とする、請求項９に記載の組織接着剤。
【請求項１１】
プラスミノーゲンを全く含まないことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項１２】
プラスミン阻害剤またはプラスミンアクチベーター阻害剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項１３】
プラスミン阻害剤またはプラスミンアクチベーター阻害剤が、アプロチニン、α2−マクログロブリン、α1−抗トリプシン、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、およびその混合物の群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の組織接着剤。
【請求項１４】
抗生物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項１５】
抗生物質が、アミノグリコシド、ベータラクタム、ポリペプチド、ホスホマイシン、テトラサイクリン、およびその混合物の群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の組織接着剤。
【請求項１６】
因子ＸＩＩＩをさらに含むことを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項１７】
フィブリノーゲン１ｍｇ当たり少なくとも０．００１Ｕ量の因子ＸＩＩＩを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の組織接着剤。
【請求項１８】
フィブリノーゲン１ｍｇ当たり少なくとも０．１Ｕ量の因子ＸＩＩＩを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の組織接着剤。
【請求項１９】
キニノゲンタンパク質を含まないことを特徴とする、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項２０】
不織物としての固形表面とともに存在することを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項２１】
固形表面がコラーゲン、ゼラチンまたはポリサッカライド表面であることを特徴とする、請求項２０に記載の組織接着剤。
【請求項２２】
手術および泌尿器科学の環境において、少なくとも１０時間の間、溶解に対して抵抗性であることを特徴とする、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項２３】
手術および泌尿器科学の環境において、少なくとも１５時間の間、溶解に対して抵抗性であることを特徴とする、請求項２２に記載の組織接着剤。
【請求項２４】
凍結乾燥されていることを特徴とする、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項２５】
溶液中に存在することを特徴とする、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項２６】
溶液が急速冷凍されていることを特徴とする、請求項２５に記載の組織接着剤。
【請求項２７】
ウイルス不活化形態で存在することを特徴とする、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項２８】
エラスターゼ阻害剤が組換え起源であることを特徴とする、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組織接着剤。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の組織接着剤を、その一成分として含むことを特徴とする組織接着製品。
【請求項３０】
トロンビンをさらに含むことを特徴とする、請求項２９に記載の組織接着製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はフィブリノーゲンに基づく組織接着剤に関する。
【０００２】
フィブリン接着剤と称することもできる、フィブリノーゲンに基づく組織接着剤は、その接着作用において、血液凝固の最終段階を模倣する。この例では、そのほとんどが接着手順中にフィブリノーゲン溶液に加えられるトロンビンの作用により、フィブリノーゲンがフィブリン単量体に切断されるが、これはすべての傷害で起こることである。フィブリン単量体は自然に凝集して、フィブリンと称される規則的な繊維型構造になる。次いでこのフィブリン単量体の凝集物は、因子ＸＩＩＩａの作用下、共有結合性の架橋によりさらに安定化される。この時点で、アミド基転移反応（transamidizing reaction）において、フィブリン単量体の特定のグルタミンとリジン側鎖の間にペプチド結合が形成される。不活性な因子ＸＩＩＩからトロンビンによって同様に切断された因子ＸＩＩＩａは活性トランスアミダーゼであり、その作用のため、「フィブリン安定化因子」とも称される。
【０００３】
組織接着剤を適用する場合、原理的には、「天然の」血液凝固と同じ過程が生じるが、組織接着剤では、関与する成分および因子が血液中より数倍濃縮されている。これにより、血液の凝固もずっと速く生じ、達成された組織接着またはクロットはずっと安全であり、またより安定でもある。
【０００４】
７０年代末の時点でフィブリン接着剤の成功に前もって必要な条件は、血液凝固因子の分画化および精製の進歩であった。その後、有効な組織接着に必要なほど純度および濃度の天然の凝固因子を製造することが可能になった。最初の市販の組織接着剤は７０年代末に市場に登場し、それから多数の適用可能分野、主に、神経を接着する場合あるいは内臓、例えば肝臓および脾臓を接着する場合、慣用の外科手術の手法を使用すると、深刻な問題、例えば深刻な出血が繰り返し生じていた分野において適当であることが証明された。
【０００５】
針と糸を用いて適用される縫合とは反対に、フィブリン接着剤のさらなる利点は、処置される組織または器官が縫合手順によってさらなる損傷を受けないことにあり、したがってフィブリノーゲンに基づく組織接着剤を用いる場合、慣用の外科的縫合を用いた場合よりずっと簡単であり、傷跡も目立たない。接着の高い耐荷重量および高い内部強度ならびに傷口または組織表面に対する接着剤の良好な接着能を含む最適な接着作用以外に、組織接着剤の最適化には、接着直後の過程がまた不可欠である（ＡＴ−Ｂ−３５９ ６５２および３５９ ６５３）。これらには、体内における接着の耐久性の制御ならびに吸収されやすさおよび接着剤の高い傷害治癒性などが含まれる。
【０００６】
したがって、組織接着剤に関し、速く確実な接着剤の効果のみならず、形成された接着またはクロットのそれぞれが一定期間内に体内で再溶解し、形成されたクロットが完全に吸収された結果として傷口が完全に再生することが非常に重要である。
【０００７】
この点に関して、組織接着剤の最適化によって、形成されたクロットの（内因性）溶解過程、すなわち繊維素溶解を制御することがまた必要である。
【０００８】
繊維素溶解では、形成されたクロット中に存在するフィブリンを分解し、除去し、これによりクロットを溶解する。まず最初に、内因性または外因性のプラスミノーゲンアクチベーター、例えば血液凝固因子ＸＩおよびＸＩＩ、プレカリクレイン、ウロキナーゼまたはｔ−ＰＡの影響下、不活性プラスミンから繊維素溶解的にプラスミンが形成され、該プラスミンは、フィブリンに加え、フィブリノーゲンおよび血液凝固因子ＶおよびＶＩＩをも分解する。
【０００９】
内因性の繊維素溶解過程はたいてい、クロットが形成された後すぐに開始されるので、形成された組織接着が十分接着しないか、または形成されたクロットが余りに早く不安定化する危険性があるため、プラスミン阻害剤またはプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を添加して、プラスミンの作用を直接または間接に阻害し、主としてその初期段階における早すぎる繊維素溶解から接着を保護することが組織接着の常法になっている。阻害剤の濃度により、形成されたクロットまたは接着それぞれの溶解時間を標的化して制御することが可能である。阻害剤を大量に用いるほど、クロットが繊維素溶解に対してますます安定になり、すなわち、このクロットがより長期間安定に維持され、接着剤がより長期間かけて完全に吸収される。
【００１０】
したがって、繊維素溶解阻害剤を用いる場合、最適な妥協点は、早すぎる繊維素溶解の阻害とできるだけ早い傷害治癒の間に見出されなければならない。
【００１１】
市販の組織接着剤では、ウシ塩基性膵臓トリプシン阻害剤（bovine basic pancreatic trypsin inhibitor）とも称される、アプロチニンをプラスミン阻害剤として用いる。アプロチニンは多価のプロテイナーゼ（カリクレイン）阻害剤であり、凝固因子ＸＩＩａ、ＸＩａ、ＶＩＩＩａおよび主としてプラスミンおよびプラスミンアクチベーターを阻害し、またトリプシン、キモトリプシンおよびカリクレインをも阻害する。
【００１２】
従来、アプロチニンは主としてウシから製造されていた。しかし、ヒトの治療に用いる薬剤にウシ物質を使用することに関係する問題のせいで、組換え的に製造されたアプロチニンが用いられることがますます多くなっている。
【００１３】
組織接着では通常、２０〜３０００カリクレイン不活性化ユニット（ＫＩＵ）／組織接着剤ｍＬの量のアプロチニンを用い、その最適な濃度は各組織の繊維素溶解活性に依存する。しかし、主として繊維素溶解活性が高い組織では、高濃度のアプロチニンの使用にもかかわらず、アプロチニンの繊維素溶解阻害作用が非常に限られた程度にしか制御できず、望ましくない早期の溶解過程が生じ得る。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、先行技術の不利益を克服し、主に高いプラスミン活性を示す傷害の組織接着において、成熟前の繊維素溶解に対する十分かつ信頼できる保護を保証し、しかも接着の質が負の影響を決して受けないような組織接着剤を提供することである。
【００１５】
本発明では、混合されたエラスターゼ阻害剤を含むことを特徴とする、フィブリノーゲンに基づく組織接着剤によってこの目的を達成する。驚くべきことに、プラスミンを阻害するか、あるいはプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を阻害することによってだけでなく、エラスターゼの阻害剤、またはその繊維素溶解阻害作用が主に非プラスミン性繊維素溶解機構に基づいている阻害剤によっても繊維素溶解過程を妨げることができることが示された。簡易化のため、このような非プラスミノーゲン性繊維素溶解阻害剤は、本発明の目的のための用語「エラスターゼ阻害剤」に含まれる。プラスミン媒介性の繊維素溶解以外に、プラスミンに基づかず（例えば、リソソーム過程（a lysosomal process）；Simon et al., BLOOD 82 (8) (1993), pp.2414-2422 を参照のこと）、アプロチニンによっては実質的に阻害することができないさらなる繊維素溶解過程が存在し得ることが推測され、さらに、この非プラスミン性繊維素溶解経路が特異的エラスターゼ阻害ペプチド、例えばＮ−メトキシ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−バラニルクロロメチルケトン（ＡＡＰＶＣＫ）によっても阻害不能であることが示された（Simon et al. を参照のこと）。さらに驚くべきことに、（実質的な）プラスミン阻害活性またはプラスミノーゲンアクチベーター阻害活性を全く有さない阻害剤、すなわち本発明のエラスターゼ阻害剤は、インビトロおよびインビボ両方において形成されたクロットの非常によく制御可能な溶解過程を保証できることが本発明において見出された。これは特に、高い繊維素溶解活性を有する組織において適当であり、適度な濃度でさえ、早期の溶解を妨げることができることがわかった。
【００１６】
また成熟前の溶解は、接着の（部分的）分離を生じさせ、再出血を生じさせ得るため、この成熟前の溶解は主として接着形成後、最初のうちに、高い繊維素溶解活性を有する組織において役割を担っている。
【００１７】
さらに、本発明で用いる、組織接着剤中のエラスターゼ阻害剤は、プラスミンに対して作用する慣用の阻害剤と組み合わせてその繊維素溶解活性を示すだけでなく、エラスターゼ阻害剤単独でも繊維素溶解を完全に阻害できることが示された。本発明の具体的態様の１つは、組織接着剤がフィブリノーゲン、エラスターゼ阻害剤および場合により因子ＸＩＩＩ以外の別の活性成分を全く含まないことに存する。
【００１８】
本発明の接着剤中、フィブリノーゲン濃度は既知の組織接着剤のものに対応し、通常、フィブリノーゲンが少なくとも５０ｍｇ以上／ｍＬ、特に７０−８０ｍｇ以上／ｍＬ、すなわち、血液中のフィブリノーゲン濃度（２−４ｍｇ／ｍＬ）の少なくとも約２０倍にすべきである。フィブリノーゲンは、クリオ沈降物と比べてさらに精製された形態で存在するのが好ましい。
【００１９】
本発明の範囲内の好ましいエラスターゼ阻害剤は、エグリン（eglin）、エラスターゼ−α1−プロテイナーゼ阻害剤、α1−抗プロテアーゼ、エラフィン（elafin）、白血球プロテアーゼ阻害剤、特に白血球画分、好ましくは顆粒性白血球から誘導された画分、またはヒト分泌性白血プロテアーゼ阻害剤（human secretory leukoprotease inhibitor）、またはその混合物の群から選択される。白血球画分として、例えば細胞溶解物、特にヒト細胞から誘導されたものを用いることができる。当業者であれば、他のエラスターゼ阻害剤またはプラスミンに対して作用しない他の繊維素溶解阻害剤を、本発明の組織接着剤でのその有用性について、実施例に開示するアッセイ系によって、あるいは先行技術から既知のエラスターゼ阻害アッセイを適用することによって簡単にアッセイすることができる。また好ましいエラスターゼ阻害剤には、本発明のエラスターゼ阻害剤の種々の誘導体、例えば化学的に、あるいは（組換え）タンパク質設計によって修飾されたこれらの阻害剤の断片または形態が含まれるが、もちろんこれらの誘導体は常に、性質上、基本的（basic）阻害剤のエラスターゼ阻害剤特性を有している必要がある。
【００２０】
本発明の組織接着剤はヒトタンパク質のみからなるのが好ましく、ここでは組換え生産されたヒトタンパク質もまた「ヒトタンパク質」と理解すべきである。したがって、組織接着剤中で用いるタンパク質は、血液、血漿、クリオ沈降物または組換え細胞培養物から調製するのが好ましい。
【００２１】
特に好ましい組織接着剤はヒト血液または血漿タンパク質のみから構成されていることを特徴とする。
【００２２】
フィブリノーゲンに対するエラスターゼ阻害剤量の比は重量比（ｍｇ）で、１：１００〜１：１５０，０００であるのが好ましく、さらに好ましくは１：５００〜１：１１０，０００であるのが好ましい。フィブリノーゲンのｇに対する阻害剤の単位量（ユニット）で表すと、少なくとも１０-6Ｕ／フィブリノーゲンｇを組織接着剤に混合するのが好ましい。１０-3から１０Ｕ／フィブリノーゲンｇの範囲が特に好ましい。本発明の組織接着剤中で混合する、血液または血漿中に天然に存在し得る阻害剤の量は、血液または血漿中のその生理的濃度より少なくとも２０倍、特には少なくとも５０倍であるのが好ましい。本発明の組織接着剤は例えば以下のものから構成することができる：７５−１１５ｍｇ／ｍＬ凝固可能タンパク質、５０−１１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは７０−１１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン；場合により、因子ＸＩＩＩ １−５０、好ましくは１０−５０ ＩＵ／ｍＬ。阻害剤として、例えば１−１００μｇ／ｍＬ量のエグリンまたは０．０１−１Ｕ／ｍＬのα1−抗プロテアーゼを混合してもよい。通常、既知の組織接着剤中のアプロチニンの繊維素溶解阻害活性に相当する量のエラスターゼ阻害剤を混合すれば十分であるだろう。
【００２３】
接着剤の目的に応じて、本発明の接着剤にプラスミノーゲンを含ませるか、あるいはプラスミノーゲンを含ませなくてもよい。プラスミノーゲンを含ませる場合、フィブリノーゲンｍｇあたり、少なくとも０．０００１ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ以上、特には０．０１ｍｇ以上の量含ませるべきである。組織接着剤中にプラスミノーゲンが存在する場合、そのプラスミンに対する活性に基づき、組織接着剤の繊維素溶解性をさらにより明確にすることもできる。
【００２４】
一方、さらに好ましい態様では、組織接着剤はプラスミノーゲンを全く含まないか、あるいはそれを少量しか含まない。
【００２５】
すでに述べたが、驚くべきことに、組織接着剤中、エラスターゼ阻害剤が単一の繊維素溶解阻害剤として存在すれば、本発明の接着剤の機能性に十分である。しかし、エラスターゼ阻害剤に加え、溶解、吸収および傷害治癒のより良好な制御に貢献するプラスミン阻害剤またはプラスミンアクチベーター阻害剤を用いるのもまた好ましい。好ましいプラスミン阻害剤またはプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤は、主にアプロチニン、またはα2−マクログロブリン、α1−抗トリプシン、ε−アミノ−カプロン酸、トラネキサム酸（tranexaminic acid）、またはこれらの物質の混合物である。α1−抗トリプシンにエラスターゼに対するある種の作用を帰属する著者もいるが、この作用はこれらの物質が示す主要な活性であることから、これらの物質は当該技術分野においてプラスミンまたはプラスミンアクチベーターとみなされている。もちろんこれは本発明の目的に適用される。さらに、抗接着剤である添加剤、例えばヒアルロン酸を加えることもできる。
【００２６】
本発明の組織接着剤のさらに好ましい態様は、ＡＴ−Ｂ−３６９，９９０ですでに提示されているように、接着剤中に抗生物質を含ませることである。特に好ましい抗生物質は、アミノグリコシド、ベータラクタム（betalactams）、ポリペプチド、ホスホマイシン（phosphomycin）、テトラサイクリンまたはその混合物の群から選択される。さらに好ましい態様では、抗生物質はほとんど不溶性の誘導体形態で存在する。
【００２７】
また、因子ＸＩＩＩを本発明の組織接着剤に含ませ、クロットの内部強度および接着の強度および耐久性を向上させるのが好ましい。この目的には、１−５０ユニット／ｍＬ、好ましくは約１０Ｕ／ｍＬ量の因子ＸＩＩＩを用いるのが好ましい。フィブリノーゲンを基準にして、最小濃度０．００１Ｕ／フィブリノーゲンｍｇ、特に少なくとも０．１Ｕ／フィブリノーゲンｍｇの因子ＸＩＩＩを存在させるのが好ましい。しかし当業者であれば、接着のタイプまたは組織のタイプに応じて、最適な因子ＸＩＩＩ濃度を容易に活用することができる。組織接着剤中に抗生物質を存在させる場合、基本的に、やや多めの因子ＸＩＩＩを含ませるのが推奨される（ＡＴ−Ｂ−３６９，９９０を参照のこと）。
【００２８】
本発明の組織接着剤は、キニノゲンタンパク質（kininogenic proteins、例えば、カリクレインなど）を含まず、妨害副作用の開始を予防可能にするのが好ましい。
【００２９】
好ましい態様では、本発明の組織接着剤を、不織物（non-woven）としての固形表面と組み合わせて存在させ、これにより、主として大きな範囲の傷害に対し、最適な傷害閉塞および最適な被覆が達成される。このような不織物の例は、ＡＴ−Ｂ ３７４，３６７に列記されている。したがって、不織物の固形表面は、コラーゲン、ゼラチンまたはポリサッカライド表面であるのが好ましく、もちろん、場合により特定の使用目的のために含ませることもできる医薬的にさらに適当な表面を用いてもよい。
【００３０】
本発明では、エラスターゼ阻害剤を含む組織接着剤を用いることによって、高い繊維素溶解活性を有する環境においてさえ、少なくとも１０時間、好ましくは１５時間、溶解に対する耐性（抵抗性）を達成することができることが示された。本発明に記載の溶解に対する耐性とは、それぞれのフィブリンクロットが一定時間内に分解されず、すなわち存在したままであることを意味する。溶解に対する耐性の測定は、例えば時間に応じた光度測定によって行う。したがって、本発明の好ましい組織接着剤は、高い繊維素溶解活性の環境において、少なくとも１０時間、好ましくは１５時間溶解に対して耐性であるものである。「高い繊維素溶解活性」という語句は、例えばプラスミン活性が生理的プラスミンの潜在活性より高いことを意味する。繊維素溶解能は、例えば、プラスミノーゲン濃度によって表される（例えばHenriksson et al., Thrombosis Research 16: 301-312; 1979）。当業者であれば、この溶解に対する耐性を、実施例に記載のように簡単なアッセイによってチェックすることができる。
【００３１】
本発明の組織接着剤を適用する場合、溶液状態で存在させるのが好ましいが、保存目的のためには、この溶液の急速冷凍し、組織接着剤を急速凍結物形態で存在させるか、あるいはこの接着剤を凍結乾燥して、凍結乾燥形態で提供することが推奨できる。「凍結乾燥形態」という語句は、もちろん、凍結乾燥によって保存可能にされた、ただ１つの組織接着調製物が、その次なる再組成過程において、３７℃で数分の間にほとんど完全に（すなわち少なくとも８０％）再組成することができることを意味する。
【００３２】
本発明の組織接着剤はウイルス不活化形態として存在させるのが好都合である。
【００３３】
この不活化処理はテンシドおよび／または熱処理、例えば固形状態での熱処理、特にＥＰ−０ １５９ ３１１またはＥＰ−０ ５１９ ９０１またはＥＰ−０ ６７４ ５３１に記載の蒸気処理によって確実に行うのが好ましい。
【００３４】
ウイルスのさらなる不活化処理はまた、化学的方法または化学／物理的方法による処理、例えばＷＯ９４／１３３２９、ＤＥ ４４ ３４ ５３８またはＥＰ ０ １３１ ７４０（溶媒）に記載のカオトロピック物質または光不活性化による処理を含む。
【００３５】
ナノフィルトレーションもまた、本発明の範囲内の、ウイルスを涸渇する好ましい方法である。
【００３６】
好ましい態様では、本発明にしたがって混合されるエラスターゼ阻害剤もまた、組換え起源のものであってよい。
【００３７】
さらに本発明は、その一成分としてエラスターゼ阻害剤を含む本発明の組織接着剤を含む組織接着系に関する。
【００３８】
通常、本発明の組織接着系は、液体形態かあるいは再組成可能な凍結乾燥物で存在するトロンビン成分をさらなる成分として含み、接着に用いる場合、適用分野に応じてトロンビン成分は様々な濃度を有し得る。
【００３９】
また、本発明の範囲内には、フィブリノーゲン成分、およびエラスターゼ阻害剤を含む別の成分を含むことを特徴とする組織接着系も含まれる。しかし通常は、フィブリノーゲン成分中に繊維素溶解阻害剤成分を含むのが適当である（ＡＴ−Ｂ−３５９，６５２および３５９，６５３を参照のこと）。しかし、適当な適用デバイスによって、フィブリノーゲン成分とは別に阻害剤成分を供給することもできる。エラスターゼ阻害剤を含む成分が、同時にまたトロンビンを含んでいることが好ましく、この成分も凍結乾燥物または（場合により急速冷凍されている）溶液として提供することが可能である。
【００４０】
本発明の組織接着系はさらに、系の成分用の適当な適用デバイスを含む。特に、ＥＰ ０ ０３７ ３９３、ＥＰ ０ ２１０ １６０またはＥＰ ０ ２９２ ４７２に記載の二重シリンジ系、あるいはＥＰ ０ ３１５ ３２２またはＥＰ ０ ６６９ １００に記載の適用デバイスは適当であることがわかっている。これらの特定の適用デバイスを用いると、阻害剤をトロンビン成分中で適用する態様で、確かな接着結果が得られる。
【００４１】
本接着剤はフィブリン接着剤を適用可能なすべての分野に適当である。しかし、特に適当なのは、高い繊維素溶解活性を有する分野において接着を提供する場合であることがわかっている。したがって、本発明の主題はまた、高い繊維素溶解活性を有する分野、特に泌尿器科学分野における、調製物または適用デバイスを製造するための、本発明の組織接着剤または本発明の組織接着系それぞれの使用である。本発明の主題はさらに、高い繊維素溶解活性を有する分野、特に泌尿器科学分野の手術における、本発明の組織接着剤の使用方法または本発明の組織接着系の使用方法である。
【００４２】
以下に実施例および図面を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、これらに限定されない。
【００４３】
実施例
１．本発明の組織接着剤の繊維素溶解阻害作用をアッセイするためのインビトロ試験（現時点で発明者らが本発明の最良の実施方法であると考えているもの）
この実施例では、エグリンまたはα1−抗プロテアーゼによって、組織接着クロットの溶解を防ぐことを示す。この例では、組織接着剤ＳＴＩＭ３（IMMUNO AG, Vienna, AT）（フィブリノーゲン７０ｍｇ／ｍＬを含む）を水に溶解させ、次いで０．９Ｍ ＮａＣｌ溶液で１：６希釈した。
【００４４】
４０ｍＭ ＣａＣｌ2に溶解させ、次いで４０ｍＭ ＣａＣｌ2／０．９Ｍ ＮａＣｌ（１：５）溶液で希釈して０．１Ｕ／ｍＬにしたトロンビン溶液とこの組織接着剤溶液を１：１混合し、１００μＬ／ウェルとなるようにマイクロプレート上に移した。
【００４５】
組織接着剤各５μＬ（エグリン１−１００μｇ／ｍＬ、α1−抗プロテアーゼ０．０１−１Ｕ／ｍＬ）に種々の濃度の阻害剤を加えた。
【００４６】
接着を硬化するために、ミクロタイタープレートを３７℃で約１．５時間インキュベートした。次いで対応する溶解試薬（ａ：白血球５００，０００／ｍＬの白血球ホモジネート（３× 凍結／解凍）由来の細胞を含まない上清；ｂ：正のコントロールとしてのｔ−ＰＡ ２ｍｇ／ｍＬ；負のコントロールとしてのＮａＣｌ ０．９％）をクロット上に移した（１００μＬ／ウェル）。次いでミクロタイターウェルを、プレート光度計、Photometer ＳＬＴ ３４０ ＡＴＴＣにおいて、動力学的に、波長４０５ｎｍ、３７℃で一晩６０×９００ｓ測定した。この結果を図１および図２に示す。消光の減少はクロットの溶解の増加に対応している。
【００４７】
エグリン  ＞１μｇ／ｍＬおよびα1−抗プロテアーゼ＞０．０１Ｕ／ｍＬの両方とも、それらを用いて、１５時間以内のアッセイ中に生じるフィブリンクロットの溶解を妨げることができることが示されたが、一方でこれは、フィブリンクロットの分解に関して白血球プロテアーゼが担う中心的役割に対するヒントであり、また他方では、本発明のエラスターゼ阻害剤の、この溶解の阻害に関する優れた効果を示すものである。
【００４８】
２．本発明で用いるエラスターゼ阻害剤のインビボ活性
本発明の範囲内の、白血球プロテアーゼ、特にエラスターゼ阻害剤の重要さを測定するため、高繊維素溶解性および通常の繊維素溶解活性の両系における本発明の組織接着剤の効果を試験して、組織接着剤による止血を説明し、阻害剤を含まない接着剤およびプラスミン阻害剤としてアプロチニンのみを含む接着剤それぞれと比較した。
【００４９】
２．ａ）高い繊維素溶解
麻酔したウサキ（２−３ｋｇ）をヘパリン（４，０００Ｕ／ｋｇ）で凝血防止した。３０分間後、右の肝葉の一部をクランプし、クランプから遠位の部分を切除した。大きな血管からの出血を電気凝固法によって止血し、残りの散在する出血を、２００秒以内の組織接着剤（最大４ｍＬ）の適用によって密閉した。１０分後、ｔ−ＰＡの注入（７００Ｕ／ｋｇ／時間）を開始し、前もって重量を測っておいたパッドの重量増加を測定することによって再出血の程度を２時間測定した。
【００５０】
このようにして、３つの異なる組織接着剤を試験した：
ａ）負のコントロールとして、アプロチニン（３，０００Ｕ／ｍＬ）を含む組織接着剤（ＳＴＩＭ３）
ｂ）正のコントロールとして、アプロチニンを含まない組織接着剤（ＳＴＩＭ３）
ｃ）アプロチニンを含まず、エグリン（１０μｇ／ｍＬ）を含む組織接着剤（ＳＴＩＭ３）；本発明の接着剤。
これらの接着剤を盲試験し、Duploject（登録商標）シリンジ（IMMUNO, Vienna, AT）によって適用した。
得られた結果を図３に示す。
【００５１】
２．ｂ）正常な繊維素溶解活性
高繊維素溶解性モデルに加え、ｔ−ＰＡ注入を行わず、観察時間を４時間に延長して同じアッセイを行った。得られた結果を図４に示す。
【００５２】
高繊維素溶解性モデルおよび正常な繊維素溶解性モデル両方において、主として長い溶解時間の場合に、慣用の接着剤と比較して再出血の減少が達成され、アプロチニンと比べて改善された性質を有することが示された。
【００５３】
これらの結果は、フィブリン接着の早期の溶解を妨げ、高い繊維素溶解活性を有する分野においても再出血を妨げることができる、本発明の組織接着剤の優良な効果を証明する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  消光の減少がクロットの溶解の増加に対応することを示す図である。
ａ）アプロチニンを含まないフィブリン接着剤
ｂ）アプロチニン（１，０００Ｕ／ｍＬ）を含むフィブリン接着剤
ｃ）α−１ ＰＩ（０．０１Ｕ／ｍＬ）を含むフィブリン接着剤
ｄ）α−１ ＰＩ（０．００１Ｕ／ｍＬ）を含むフィブリン接着剤
ｅ）α−１ ＰＩ（０．０００１Ｕ／ｍＬ）を含むフィブリン接着剤。
【図２】  消光の減少がクロットの溶解の増加に対応することを示す図である。
ａ）アプロチニン（１，０００Ｕ／ｍＬ）を含むフィブリン接着剤
ｂ）エグリン（１μｇ／ｍＬ）を含むフィブリン接着剤
ｃ）アプロチニンを含まないフィブリン接着剤
【図３】  ｔ−ＰＡの注入によって誘導された、高い繊維素溶解性環境における、前もって重量を測っておいたパッドの重量の増加で表される再出血の程度を示す図である。
【図４】  正常な繊維素溶解活性を有する環境、すなわちｔ−ＰＡを注入しない環境における、前もって重量を測っておいたパッドの重量の増加で表される再出血の程度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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