(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカチオン荷電性ポリマーを核酸のキャリヤーとして含んでなる標的細胞または組織への核酸デリバリー用組成物であって、
ポリカチオン荷電性ポリマーが、下記の一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマーまたはその塩であることを特徴とする核酸デリバリー用組成物。
【化１】
0005061349.tif 000010
上式中、Ｒ10は水酸基、オキシベンジル基または−ＮＨ−Ｒ11基を表し、ここでＲ11は未置換の直鎖もしくは分枝のＣ1-20アルキル基であるか、またはアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基及びシリルアミノ基からなる群より選ばれる置換基で置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-20アルキル基であり、
Ｒ2a及びＲ2bはそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ3は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ5a及びＲ5bはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、または−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であるが、Ｒ5aとＲ5bの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが少なくとも２つ以上存在し、Ｒ6aはそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
ｎは２〜５，０００の整数であり、
ｙは０〜５，０００の整数であり、
ｚは０〜５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとし、また、
上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
【請求項２】
Ｒ5aとＲ5bの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが５０％以上存在する請求項１記載の核酸デリバリー用組成物。
【請求項３】
Ｒ5aとＲ5bの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが８５％以上存在する請求項１または２記載の核酸デリバリー用組成物。
【請求項４】
Ｒ5a及びＲ5bのすべてまたは一部が−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基であり、ここでａが２または３であり、且つｅが１〜３の整数である請求項１〜３のいずれかに記載の核酸デリバリー用組成物。
【請求項５】
ｅが１である請求項４記載の核酸デリバリー用組成物。
【請求項６】
Ｒ2a及びＲ2bがメチレン基である請求項１〜５のいずれかに記載の核酸デリバリー用組成物。
【請求項７】
Ｘが下記の式で表される基からなる群から選ばれるいずれかの基である請求項１〜６のいずれかに記載の核酸デリバリー用組成物。
【化２】
0005061349.tif 000011
上記の各式中、
Ｘ2は水素原子またはＣ1-6アルキル基もしくはアミノＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ7a、Ｒ7b及びＲ7cはそれぞれ独立して水素原子またはメチル基を表し、
ｄ１、ｄ２及びｄ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、
ｅ１、ｅ２及びｅ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、
ｆは０〜１５の整数を表し、
Ｒ8a及びＲ8bはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基が通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
ｇは０〜１５の整数を表す。
【請求項８】
ｚが０（ゼロ）である請求項１〜７のいずれかに記載の核酸デリバリー用組成物。
【請求項９】
Ｒ3がアセチル基、アクリロイル基及びメタクリロイル基からなる群より選ばれる請求項１〜８のいずれかに記載の核酸デリバリー用組成物。
【請求項１０】
ポリカチオン荷電性ポリマーを核酸のキャリヤーとして含んでなる標的細胞または組織への核酸デリバリー用組成物であって、
ポリカチオン荷電性ポリマーが、下記の一般式（Ｉ）もしくはその塩または一般式（ＩＩ）で表されるブロックコポリマーもしくはその塩であり、かつ、標的細胞または組織が初代培養細胞株若しくは分化能を有する細胞であるか、または該細胞を含有する組織であることを特徴とする核酸デリバリー用組成物。
【化３】
0005061349.tif 000012
上式中、
Ｒ1a及びＲ1bはそれぞれ独立して水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基を表し、
Ｌ1およびＬ2は連結基を表し、
Ｒ2a、Ｒ2b、Ｒ2c及びＲ2dはそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ3は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、
Ｒ4は水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基または開始剤残基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘは一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、
Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c及びＲ5dはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であるが、Ｒ5aとＲ5bの総数及びＲ5cとＲ5dの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが少なくとも２つ以上存在し、
Ｒ6a及びＲ6bはそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
ｍは５〜２０，０００の整数であり、
ｎは２〜５，０００の整数であり、
ｙは０〜５，０００の整数であり、
ｚは０〜５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとし、また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
【請求項１１】
Ｘが下記の式で表される基からなる群から選ばれるいずれかの基である請求項１０記載の核酸デリバリー用組成物。
【化４】
0005061349.tif 000013
上記の各式中、
Ｘ2は水素原子またはＣ1-6アルキル基もしくはアミノＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ7a、Ｒ7b及びＲ7cはそれぞれ独立して水素原子またはメチル基を表し、
ｄ１、ｄ２及びｄ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、
ｅ１、ｅ２及びｅ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、
ｆは０〜１５の整数を表し、
Ｒ8a及びＲ8bはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基が通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
ｇは０〜１５の整数を表す。
【請求項１２】
ポリカチオン荷電性ポリマーが細胞に導入された遺伝子を数日以上に渡り発現可能な状態に保持できることを特徴とする請求項１０または１１記載の核酸デリバリー用組成物。
【請求項１３】
標的細胞または組織が核酸の導入を必要とする個体の体内のものであり、標的細胞または組織との接触に先立って、核酸とポリカチオン荷電性ポリマーのコンジュゲートが個体に投与されるものであることを特徴とする請求項１２記載の核酸デリバリー用組成物。
【請求項１４】
下記の一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマーまたはその塩。
【化５】
0005061349.tif 000014
上式中、Ｒ10は水酸基、オキシベンジル基または−ＮＨ−Ｒ11基を表し、ここでＲ11は未置換の直鎖もしくは分枝のＣ1-20アルキル基であるか、またはアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基及びシリルアミノ基からなる群より選ばれる置換基で置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-20アルキル基であり、
Ｒ2a及びＲ2bはそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ3は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、
Ｒ5a及びＲ5bはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、または−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であるが、Ｒ5aとＲ5bの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが少なくとも２つ以上存在し、
Ｒ6aはそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
ｎは２〜５，０００の整数であり、
ｙは０〜５，０００の整数であり、
ｚは０〜５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとし、また、
上記の一般式のおける各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
【請求項１５】
Ｒ5aとＲ5bの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが５０％以上存在する請求項１４記載のポリマーまたはその塩。
【請求項１６】
Ｒ5aとＲ5bの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが８５％以上存在する請求項１４または１５記載のポリマーまたはその塩。
【請求項１７】
Ｒ5a及びＲ5bのすべてまたは一部が−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基であり、ここでａが２または３であり、且つｅが１〜３の整数である請求項１４〜１６のいずれかに記載のポリマーまたはその塩。
【請求項１８】
ｅが１である請求項１７記載のポリマーまたはその塩。
【請求項１９】
Ｘが下記の式で表される基からなる群から選ばれるいずれかの基である請求項１４〜１８のいずれかに記載のポリマーまたはその塩。
【化６】
0005061349.tif 000015
上記の各式中、
Ｘ2は水素原子またはＣ1-6アルキル基もしくはアミノＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ7a、Ｒ7b及びＲ7cはそれぞれ独立して水素原子またはメチル基を表し、
ｄ１、ｄ２及びｄ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、
ｅ１、ｅ２及びｅ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、
ｆは０〜１５の整数を表し、
Ｒ8a及びＲ8bはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基が通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
ｇは０〜１５の整数を表す。
【請求項２０】
ｚが０（ゼロ）である請求項１４記載のポリマーまたはその塩。
【請求項２１】
Ｒ3がアセチル基、アクリロイル基及びメタクリロイル基からなる群より選ばれる請求項１４〜２０のいずれかに記載のポリマーまたはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞または組織への核酸のデリバリーに関する技術分野に属し、より具体的には、ポリカチオン荷電性ポリマーの核酸デリバリー用キャリヤーとしての使用及び新規なポリカチオン荷電性ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸または核酸アナログを標的細胞または組織に運搬するための手段として、所謂、遺伝子キャリヤーもしくはベクターとして、ウイルスベクターと合成ベクター（または非ウイルスベクター）のそれぞれについて多種多様な提案がされている。合成ベクターの使用は、従来の医療で検討されてきたドラッグデリバリーシステムで問題にされてきたのと同様にベクターの毒性等に関するリスクは存在するものの、ウィルスベクターに比べれば深刻な毒性がないと考えられること、担持させるべき核酸のサイズに制限がなく、ベクターの精密な分子設計が可能であることから精力的な開発研究が続けられている。代表的なものとして、負電荷のＤＮＡとイオンコンプレックスを形成するカチオニックリピッド（例えば、リポフェクチン）、及びカチオニックポリマーがあげられる。前者では、脂質の分子構造を変化させて細胞に対する毒性を低下させ、さらに導入された細胞内での遺伝子の発現効率を高めることが検討され、ある程度の成果が得られている（例えば、非特許文献１参照。文献名は下記に示す。以下、同様。）。しかし、必ずしもｉｎ  ｖｉｖｏでは、所期の効果が得られていない。
他方、後者としては、古くから、ポリ（Ｌ−リシン）やＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン（例えば、非特許文献２）、キトサン（例えば、非特許文献３）等が検討されている．しかし、細胞に対する毒性と遺伝子の導入効率ないし発現効率において、未だ満足できるものでない。
このような状況下で、本発明者等は、カチオニックポリマー（例えば、ポリリシン）に水溶性でかつ低毒性のポリエイエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合した形態にあるブロックコポリマーを用いるとＤＮＡを内包して自律的に会合したポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）でもある、高分子ミセルを形成し、かかる高分子ミセルは毒性が低下し、また、現在、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの遺伝子導入に最も広く使用されているリポフェクチンよりも高い発現効率を示すことを確認した。本発明者等は、さらに改良された遺伝子のキャリヤーたりうるブロックコポリマーとして、カチオン荷電性基として、特定のアミン基を側鎖に有するセグメント鎖とＰＥＧ鎖のブロックコポリマーを提供した（特許文献１：特開２００４−３５２９７２号公報）。
文献の一覧
【特許文献１】特開２００４−３５２９７２号公報
【非特許文献１】Ｃ．Ｆ．Ｂｅｎｅｔｔ，ｅｔ，ａｌ．，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，５，１４９（１９９７）
【非特許文献２】Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ，ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２，７２９７（１９９５）
【非特許文献３】Ｓ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ｅｔ，ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１７８，（１９９９）２３１
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、核酸をデリバリーするためのさらなる多様な手段を入手する必要性は、依然として存在する。本発明者等は、特許文献１に記載されているようなカチオン荷電性基として、特定のアミン基を側鎖に有するセグメント鎖とＰＥＧ鎖のブロックコポリマーが、動物細胞（特に、哺乳類細胞）に対して極めて低毒性であり、細胞内に導入した遺伝子を長期にわたり発現可能な状態に保持できることを見出した。そのため、例えば、分化能を有する細胞に悪影響を及ぼすことなく、導入遺伝子の発現を長期にわたり持続するためのキャリヤーまたはベクターとして使用できることを見出した。また、かかる、特定のアミン基を側鎖に有するセグメント鎖を有するポリマーは、ＰＥＧ鎖を有さず、ＤＮＡとのＰＩＣとしての高分子ミセルを形成しなくとも、ポリ（Ｌ−リシン）、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、及びキトサン等のポリカチオン荷電性ポリマーとは対照的に、動物細胞（特に、哺乳類細胞）に対して極めて低毒性であり、細胞内に導入した遺伝子を長期にわたり発現可能な状態に保持できることを見出した。
したがって、本発明は、ポリカチオン荷電性ポリマーを核酸のキャリヤーとして含んでなる標的細胞または組織への核酸デリバリー用組成物を提供する。また、本発明は、標的細胞または組織への核酸デリバリー用組成物を調製するためのポリカチオン荷電性ポリマーの使用を提供する。さらに、本発明は、標的細胞または組織への核酸デリバリー方法であって、該核酸とポリカチオン荷電性ポリマーのコンジュゲートを該標的細胞または組織と接触させることを含んでなる，上記方法も提供する。
上記で使用する、ポリカチオン荷電性ポリマーは、ポリ（アミノ酸）、多糖、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタンまたはビニルポリマーをベースとする主鎖を有し、かつ、側鎖として、当該主鎖に直接結合または連結基を介して結合した式−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅはそれぞれ独立して１〜５の整数である）を含む荷電性ポリマー、並びに該荷電性ポリマー由来のセグメント鎖と非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖とブロックコポリマーからなる群より選ばれるが、但し、ポリカチオン荷電性ポリマーがブロックコポリマーである場合は、標的細胞または組織は分化能を有する細胞であるかまたは該細胞を含む組織であることができる。好ましい態様では、前記の非イオン性親水性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）及びポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）からなる群より選ばれる。
より具体的な態様の発明では、ポリカチオン荷電性ポリマーが、下記の一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマーまたはその塩である。
0005061349.tif 000002
上式中、Ｒ１０は水酸基、オキシベンジル基または−ＮＨ−Ｒ１１基を表し、ここでＲ１１は未置換または置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−２０アルキル基を表し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ５ａ及びＲ５ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、または−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であるが、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが少なくとも２つ以上存在し、Ｒ６ａはそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、ｚは０〜５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとし、また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
より具体的な別の態様の発明では、ポリカチオン荷電性ポリマーが、下記の一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表されるブロックコポリマーまたはその塩である。
0005061349.tif 000003
0005061349.tif 000004
上式中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１およびＬ２は連結基を表し、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄはそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４は水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基または開始剤残基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘは一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であるが、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数及びＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが少なくとも２つ以上存在し、Ｒ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、ｚは０〜５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとし、また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
さらに、本発明等が知る限り、上記の一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマーは、文献未載のポリマーであり、該一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマーまたはその塩も本発明の一態様として提供される。
また．本発明によれば、上記一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマーと核酸とのコンジュゲートも提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例１における、ルシフェラーゼ遺伝子発現の結果を示すグラフである。（ａ）はＨｕＨ−７細胞に、そして（ｂ）は２９３Ｔ細胞に対するものである。ＬＰＥＩは、直鎖状ポリエチレンイミン（Ｅｘｇｅｎ５００）の結果である（以下の図において同じ。）。グラフ中、縦軸はルシフェラーゼ遺伝子の発現量を表し、横軸はＤＮＡ中のりん酸基に対するポリマー中のカチオンの比（Ｎ／Ｐ）を表す（図において同じ。）。
図２は、実施例２における、初代培養株細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入実験の結果を示すグラフである。（ａ）はマウス頭頂骨由来の骨芽細胞株に、そして（ｂ）はヒト由来の滑膜細胞に対する導入結果である。
図３は、実施例２における、初代培養株細胞へのＧＦＰ遺伝子導入実験の結果を示す図に代わる蛍光顕微鏡写真である。（ａ）はマウス頭頂骨由来の骨芽細胞株に、そして（ｂ）はヒト由来の滑膜細胞に対する導入結果である。
図４は、実施例３における、初代培養株細胞へのトランスフェクション後の生細胞数の推移を示すグラフである。（ａ）はマウス頭頂骨由来の骨芽細胞株を、そして（ｂ）はヒト由来の滑膜細胞をトランスフェクションした結果を示す。
図５は、実施例４における、骨芽細胞株（ＰＯＢ）へのＰＥＧ−ＤＥＴ（Ｎ／Ｐ＝２０または８０）による転写因子Ｒｕｎ×２の導入後の、骨芽細胞分化マーカーであるオステオカルシンの発現を示すグラフである。５日目、１０日目のオステオカルシンｍＲＮＡ発現をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて定量した結果を示す。
図６は、実施例５における、骨芽細胞株（ＰＯＢ）での持続的ルシフェラーゼ遺伝子発現の結果を示すグラフである。（ａ）はルシフェラーゼ遺伝子の発現をタンパク質の発現量として示したものであり、（ｂ）はルシフェラーゼｍＲＮＡの発現量の変化示す。横軸はトランスフェクション後のサンプリング日を示す。
図７は、実施例６における、１５０ｍＭ塩化ナトリウム存在下の、（ａ）ＰＥＧ−ＤＥＴのｐＨ−α曲線を示すグラフである。（ｂ）ＰＥＧ−ＤＰＴのｐＨ−α曲線を示すグラフである。
［発明の詳細な記述］
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明にいう核酸は、限定するものでないが、それが動物細胞デリバリーされたときに細胞に対して何らかの作用を及ぼしうる核酸または核酸関連物質を指す。化学構造により分類すると、所謂、オリゴまたはポリマーの範疇に入る、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸、核酸のリン酸部がたとえば、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスフェートトリエステル、ホスホロアミデート等、に改変されている核酸アナログ）が本発明にいう核酸に包含される。機能する形態によると、遺伝情報を担うものまたはアンチセンスの範疇に属するあらゆる分子が本発明にいう核酸に包含される。
ポリカチオン荷電性ポリマーに関して、ポリ（アミノ酸）をベースとする主鎖を有するとは、好ましくは、天然のもしくは合成のアミノ酸からのペプチド結合を介して形成されるポリアミノ酸の主鎖を意味し、多糖をベースとする主鎖を有するとは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、キトサンまたはポリガラクトサミン等の糖連鎖を指し、ビニルポリマーをベースとする主鎖を有するとは、不飽和エチレン性重合性モノマーの重合により形成される重合鎖を指す。側鎖は、当該主鎖に結合または連結基を介して結合した式  −ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅはそれぞれ独立して１〜５の整数である）を指す。このような側鎖は、主鎖がポリ（アミノ酸）をベースとする場合には、例えば、ベーターもしくはガンマー位に存在するカルボキシル基、ε−位のアミノ基等を介して結合しており、主鎖が多糖をベースとする場合には、糖部分のヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシル基を介して結合しており、主鎖がビニルポリマーをベースとする場合には、例えば、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、またはポリ（メタクリル酸）等のヒドロキシ基、アミド基カルボキシル基を介して結合している。これらの結合は，例えば、１〜１０個の酸素もしくは硫黄で中断されていてもよい炭素原子数２２個までのアルキレン鎖を含む連結基を介して結合することができる。このような側鎖は、通常、高分子反応により導入されるが、それに限定されるものでない。反応としてはハロゲンに対する置換反応、カルボキシル基またはアミノ基を利用した縮合反応、エステルに対するエステル交換反応またはアミノリシス等が用いられる。かかるポリマーの分子量は、本発明の目的を達成できるものであれば限定されないが、通常１０００〜２０００００である。
本発明で好ましく使用できる、ポリカチオン荷電性ポリマーは、上記の一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマーまたは一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表されるブロックコポリマー、またはそれらの塩をあげることができる。本発明にいう塩としては、限定されるものでないが、対イオンとしてＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（１／２ＳＯ４）−、ＮＯ３−、（１／２ＣＯ３）−、（１／３ＰＯ４）−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ３−、またはＣＦ３ＳＯ３−等との塩があげられる。
一般式（ＩＩＩ）、一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）における、Ｒ１１、Ｒ１ａ及びＲ１ｂの直鎖もしくは分枝のＣ１−１２としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等をあげることができる。また置換された場合の置換基としてはアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基をあげることができる。ここで、アセタール化とは、ホルミルのカルボニルと、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールの２分子または炭素原子数２〜６個の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によりアセタール部の形成を意味し、当該カルボニル基の保護方法でもある。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ：またはアルデヒド基）に転化できる。かようなホルミル基、またはカルボキシル基もしくはアミノ基はこれらの基を介して、抗体もしくはその特異結合性を有する断片（Ｆ（ａｂ′）２、Ｆ（ａｂ）、等）およびその他の機能性もしくは標的指向性をキャリヤーに付与するのに利用できる。  一般式（ＩＩＩ）における、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが５０％以上存在するポリマーが好ましく、さらには、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが８５％以上存在するポリマーがより好ましい。
また、一般式（ＩＩＩ）における、Ｒ５ａ及びＲ５ｂのすべてまたは一部が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であり、ここでａが２であり、且つｅが１であるポリマーも好ましい。またさらに、一般式（ＩＩＩ）における、Ｒ２ａ及びＲ２ｂがメチレン基であるポリマーが好ましい。
一般式（ＩＩＩ）における、各基が具体的に上記に示し、そしてＸが下記の式で表される基：
0005061349.tif 000005
からなる群から選ばれ、ここで、上記の各式中、Ｘ２は水素原子またはＣ１−６アルキル基もしくはアミノＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ７ｃはそれぞれ独立して水素原子またはメチル基を表し、ｄ１、ｄ２及びｄ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｅ１、ｅ２及びｅ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｆは０〜１５の整数を表し、Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基が通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、ｇは０〜１５の整数を表す、ポリマーが特に好ましい。また、より特別には、当該式中のｚが０（ゼロ）であり、そして／またはＲ３がアセチル基、アクリロイル基及びメタクリロイル基からなる群より選ばれるポリマーが好ましい。
本発明においては、一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表されるブロックコポリマーである場合の、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数またはＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であり、且つＸが（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ここでｅは１〜５の整数であるものが５０％以上、さらには８５％以上存在するブロックコポリマーを使用するのが好ましく、また、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄのすべてまたは一部が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であり、ここでａが２であり、且つｅが１〜３の整数であり、特に、ｅが１であるコポリマーを使用するのが好ましい。一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）において、Ｌ１が−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−（ここでｂは１〜５の整数である）であり、Ｌ２が−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−（ここでｃは１〜５の整数である）である、上記のブロックコポリマーを好ましく使用できるより具体的なものとしてあげることができ、特に、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄがメチレン基であり、かつ、Ｘが上記の一般式（ＩＩＩ）について具体的にあげた式で表される基からなる群から選ばれる基であるものが好ましい。
また、一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）において、上記の各基が上記に定義したとおりであり、Ｒ３がアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基であり、さらには場合により、Ｒ４が−ＮＨ−Ｒ９であり、ここでＲ９は未置換または置換された直鎖または分枝のＣ１−２０アルキル基を表すブロックコポリマーが本発明でより好ましく使用できる。
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）におけるＲ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄは、上述したように、それぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表すが、Ｒ２ａ及びＲ２ｂのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当し、また、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、Ｒ２ａ及びＲ２ｂ（Ｒ２ｂ及びＲ２ａ）がメチレン基およびエチレン基の両者を表す場合、及びＲ２ｃ及びＲ２ｄ（Ｒ２ｄ及びＲ２ｃ）がメチレン基およびエチレン基の両者を表す場合、アスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。
以上に記載のブロックコポリマーは、例えば、上記の特許文献１に一部は記載されており、また、記載された方法にしたがって、またはそれらの改変方法によって製造することができる。
本発明の組成物では、核酸とポリカチオン荷電性ポリマーとの混合比は、ポリマー中のカチオンと核酸分子内のリン酸基との比率（Ｎ／Ｐ比）で表すことができる。Ｎ／Ｐ比とは、次式によって定義される量であり、以後断りの無い限り、Ｎ／Ｐ比とはこの量のことを指す。
Ｎ／Ｐ比＝〔溶液中のポリマー中のカチオンの総数〕／〔溶液中の核酸中のりん酸基の総数〕
本発明において、Ｎ／Ｐ比は、ポリイオンコンプレックスを形成できる限り限定されず、ポリマーに含まれる非荷電性セグメントまたは荷電性セグメントの性質によって異なる。本発明における適当なＮ／Ｐ比は、当業者であれば、適宜選択することができる。
さらに、組成物を調製するとき、水性媒体，好ましくは，脱イオン水をベースとする媒体中で核酸とポリマーを混合すればよいが、必要により、透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、ｐＨ制御、イオン強度制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜付加することができる。
また、本発明の組成物を標的組織または組織にデリバリーするには、組成物と標的組織または組織が接触し得る状態におかれればよい。かような接触は、組成物の存在下で細胞を培養するか、または細胞の培養物中に組成物を添加すればよい。他方、生体内の細胞または組織と組成物の接触は、遺伝療法等の当該技術分野で常用されている投与方法により、組成物を、当該核酸の導入を必要とする個体（または処置すべき個体）に投与すればよい。このような個体としては、限定されるものでないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、鳥類等を挙げることができる。また、投与方法としては、標的細胞または組織の近傍または組織内への直接導入または移植，静脈内注入、動脈内注入、筋肉内注入、経口投与、経肺投与等を挙げることができる。このような投与に際して、医薬製剤を調製する技術分野で常用されている希釈剤、賦形剤，その他の、生理活性成分を併用できる。このような投与により、前記個体の、例えば、遺伝子疾患、癌、エイズ等の難治疾患、感染症等の疾患を治療することができる。
以下、本発明を具体例を参照しながらより具体的に説明するが、本発明は、これらに限定して解釈されるものでない。
製造例１：ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）の合成
β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とジクロロメタンの混合溶媒に溶解し、ブチルアミンを開始剤として４０℃で２日間重合反応を行った。Ｎ末端を無水酢酸によりアセチル化した後、ジエチルエーテルで再沈を行い、乾燥してポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＢＬＡ）ポリマーを得た。ＰＢＬＡをＤＭＦに溶解し、ベンジルエステルに対し５０倍当量に相当するジエチレントリアミンを加え、４０℃で１日間反応させた。反応液を酢酸水溶液中に滴下し透析チューブに入れ、０．０１Ｎ塩酸を外液として透析を行った。エバポレートした後凍結乾燥を行い、ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）の白色粉末を得た。得られたポリマー（以下、ＤＥＴともいう）は下記の構造式で表すことのできるポリマーの塩酸塩であり、ｎ＝９８であった。
0005061349.tif 000006
製造例２：ポリエチレングリコール−ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）ブロックコポリマーの合成
片末端メトキシ、もう一方の片末端アミノプロピルで平均分子量が１２，０００のポリエチレングリコールをジクロロメタンに溶解し、ＢＬＡ−ＮＣＡをＤＭＦとジクロロメタンの混合溶媒に溶解して加え、４０℃で２日間反応させ、さらに無水酢酸によりＮ末端のアセチル化を行い、ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。ＮＭＲによる解析からＰＢＬＡ部分の重合度は６８であった。以下、ＰＥＧの分子量が１２，０００、ＰＢＬＡ部分の重合度６８のブロック共重合体をＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）のように表記することがある（かっこ内の数字１２が分子量１２，０００を表し、６８が重合度を表している）。こうして得られた、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下でＤＭＦに溶解させた。この溶液に、蒸留により乾燥し精製したジエチレントリアミンをベンジルエステルに対して５０倍当量添加し、アルゴン雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した。反応溶液を１０％酢酸に滴下し、分画分子量３５００の透析膜を用いて０．１Ｎ−ＨＣｌに対して透析を行い、透析膜内液を回収、凍結乾燥することで下記式（Ｖ）に示す構造式で表すことのできるＰＥＧ−ＤＥＴブロックコポリマーを塩酸塩の形で白色固体として得た。
0005061349.tif 000007
製造例３：ポリエチレングリコール−ポリ（Ｎ−（３−アミノプロピル）−アミノプロピルアスパルタミド）ブロックコポリマーの合成
製造例２で用いたのと同じＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下でＤＭＦに溶解させた。この溶液に、蒸留により乾燥し精製したジプロピレントリアミンをベンジルエステルに対して５０倍当量添加し、アルゴン雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した。反応溶液を１０％酢酸に滴下し、分画分子量３５００の透析膜を用いて０．１Ｎ−ＨＣｌに対して透析を行い、透析膜内液を回収、凍結乾燥することで下記式（ＶＩ）に示す構造式で表すことのできるＰＥＧ−ＤＰＴブロックコポリマーを塩酸塩の形で白色固体として得た。
0005061349.tif 000008
【実施例１】
【０００５】
ＤＥＴ、ＰＥＧ−ＤＥＴを用いた培養細胞（株化細胞）への遺伝子導入
この実施例では、ＤＥＴ及びＰＥＧ−ＤＥＴの細胞への遺伝子導入能を株化細胞に対するルシフェラーゼ遺伝子導入により評価する。
＜材料及び方法＞
ＰＥＧ−ＤＥＴとルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）（理研ジーンバンクより入手できる。）とのｃｏｍｐｌｅｘは、トランスフェクションの前日にＰＥＧ−ＤＥＴ溶液とｐＤＮＡ溶液を種々のＮ／Ｐ比で混合し、一晩静置することによって行った。ＤＥＴとｐＤＮＡとのｃｏｍｐｌｅｘは、トランスフェクションの３０分前にそれぞれの溶液を混合することによって行った。なお、ここで言うＮ／Ｐ比とは、次式によって定義される量であり、以後断りの無い限り、Ｎ／Ｐ比とはこの量の事を指す。
Ｎ／Ｐ比＝〔溶液中のポリマー中のカチオンの総数〕／〔溶液中の核酸中のりん酸基の総数〕
また対照として、市販のカチオン性ポリマー遺伝子導入試薬の中で最も高い遺伝子導入効率の得られるもののひとつである、Ｅｘｇｅｎ５００（直鎖状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩと略記する場合あり。）；ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、及び脂質ベースの遺伝子導入試薬であるＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。Ｅｘｇｅｎ５００の調製は最も高い遺伝子発現の得られる条件であるＮ／Ｐ＝１０にて行った。Ｆｕｇｅｎｅ６、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの調製はメーカープロトコールに従って行った。
細胞の準備として、ＨｕＨ−７細胞及び２９３Ｔ細胞をそれぞれ２４ｗｅｌｌディッシュに２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ捲き、１０％血清入りＤＭＥＭ中で２４時間インキュベーションした後、実験に用いた。培地を再度１０％血清入りＤＭＥＭに交換し（２５０μｌ／ｗｅｌｌ）、調製した各ｃｏｍｐｌｅｘを培地中に滴下することによって、トランスフェクションを行った。ｐＤＮＡ量として０．７５μｇ／ｗｅｌｌ投与した。そのまま４８時間インキュベーションした後、ルシフェラーゼ遺伝子発現を定量した。
＜結果＞
図１に示すように、いずれの細胞においても、ＤＥＴ／ｐＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘでは、特に、Ｎ／Ｐ比１０以上で高いルシフェラーゼ遺伝子発現が確認された。
ＰＥＧ−ＤＥＴ／ｐＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘでは、Ｎ／Ｐ比２０以上で高い遺伝子発現が観察された。ＨｕＨ−７細胞では、いずれもＦｕｇｅｎｅ６には届かないものの、Ｅｘｇｅｎ５００を上回る遺伝子発現となった。一方、２９３Ｔ細胞では、傾向は同様であったが、Ｅｘｇｅｎ５００を若干下回った。また、ＤＥＴ、ＰＥＧ−ＤＥＴともＮ／Ｐ比が８０を超える条件では発現が低下した。
【実施例２】
【０００６】
ＤＥＴ，ＰＥＧ−ＤＥＴを用いた初代培養株細胞への遺伝子導入
さらにＤＥＴ及びＰＥＧ−ＤＥＴを用いて、初代培養株細胞への遺伝子導入を行った。一般的に初代培養株細胞は外来の遺伝子導入は困難であることが多く、特に試薬による細胞毒性の影響を受けやすいことがその原因のひとつであった。ポリエチレンイミンは良好な遺伝子導入能を持つものの、非常に細胞毒性の強いことも知られており、初代培養株細胞への遺伝子導入は困難であることが多かった。
＜材料及び方法＞
細胞は１日齢マウス頭頂骨から採取された骨芽細胞株（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ；ＰＯＢ）、及びヒト由来滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を用いた。ルシフェラーゼ遺伝子による評価では、実施例１と同様に２４ｗｅｌｌディッシュに細胞を２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ捲き、１０％血清入りＤＭＥＭ中で２４時間インキュベーションした後、トランスフェクションを行った。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は４８時間後及び１２０時間後（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔのみ）に定量した。
またＰＥＧ−ＤＥＴ、Ｅｘｇｅｎ５００に関しては、ＧＦＰ遺伝子による評価も行った６ｗｅｌｌディッシュに細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ捲き、２４時間培養後にトランスフェクションを行った。４８時間インキュベーションした後、蛍光顕微鏡にてＧＦＰ遺伝子発現を観察した。
＜結果＞
ＰＯＢでは、ルシフェラーゼ遺伝子（図２）、ＧＦＰ遺伝子（図３）とも、ＰＥＧ−ＤＥＴ及びＤＥＴで良好な発現が観察された。ルシフェラーゼ遺伝子の定量では、Ｆｕｇｅｎｅ６には及ばないものの、Ｅｘｇｅｎ５００をわずかに上回る遺伝子発現が得られた。さらに特徴的な点として、図３の明視野画像に示すように、Ｅｘｇｅｎ５００とくらべ、ＰＥＧ−ＤＥＴでは細胞数の減少無く、細胞の形態もほとんど変化しておらず、細胞毒性が非常に少ないことが示唆された。
ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔにても同様の傾向が確認された。トランスフェクション後１２０時間では、Ｅｘｇｅｎ５００では４８時間と比し大きく発現が減少するのに対し、ＰＥＧ−ＤＥＴではその変化はわずかであり、細胞毒性の違いが大きく影響しているものと考えられた。
【実施例３】
【０００７】
ＤＥＴ，ＰＥＧ−ＤＥＴの細胞毒性の評価
トランスフェクションの実験で示唆されたＤＥＴ，ＰＥＧ−ＤＥＴの細胞毒性の低さを確認するため、初代培養株細胞へのトランスフェクション後の生細胞数をＭＴＴアッセイにて定量評価した。
＜材料及び方法＞
実施例２と同じく、ＰＯＢ及びｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＰＥＧ−ＤＥＴのみ）を用いた。９６ｗｅｌｌディッシュに８×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞を捲き、２４時間培養後、実施例２と全く同様にトランスフェクションを行い（遺伝子はルシフェラーゼ）、４８時間後の生細胞数をＭＴＴアッセイ（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ：Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて定量した（ｎ＝８）。トランスフェクションを行わないコントロールの細胞数により標準化して表示した。
＜結果＞
図４に示すように、いずれの細胞においても、ＰＥＧ−ＤＥＴではＮ／Ｐ＝１０〜８０までほとんど細胞毒性は見られず、増殖には影響を及ぼさないことが確認された。Ｅｘｇｅｎ５００（Ｎ／Ｐ＝１０）はコントロールと比べ大きく細胞数は減少しており、良好な遺伝子発現は得られるものの、非常に細胞毒性も強いことが分かる。ＤＥＴはＮ／Ｐ＝１０ではほとんど毒性は見られないものの、これ以上のＮ／Ｐでは徐々に細胞数は減少する。ＤＥＴは先述のようにＮ／Ｐ＝１０で既に非常に高い遺伝子発現が得られ、ＤＥＴ、ＰＥＧ−ＤＥＴとも非常に毒性の低い条件下で良好な遺伝子導入可能なポリマーであるといえる。
【実施例４】
【０００８】
骨芽細胞の分化誘導に対する応用
非常に低毒性で遺伝子導入可能なＤＥＴ、ＰＥＧ−ＤＥＴの機能を生かして、骨芽細胞への転写因子遺伝子導入による分化誘導を評価した。
＜材料及び方法＞
ＰＯＢに対して、骨芽細胞分化に働く転写因子であるＲｕｎｘ２をＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴ、及びＦｕｇｅｎｅ６により導入し、骨芽細胞分化マーカーであるオステオカルシンの発現を５日目、１０日目に定量した。細胞はこれまでと同様にＰＯＢを２４ｗｅｌｌディッシュに用意し、２４時間後にＲｕｎｘ２遺伝子をコードしたｐＤＮＡを、ＰＥＧ−ＤＥＴ及びＤＥＴを用いてトランスフェクションした。Ｃｏｍｐｌｅｘの調製はＰＥＧ−ＤＥＴはＮ／Ｐ＝８０，  ＤＥＴはＮ／Ｐ＝１０で行った。陰性対照としてトランスフェクションを行わず培養を続けたもの、及びＧＦＰ遺伝子をコードしたｐＤＮＡをトランスフェクションしたものを置いた。
＜結果＞
図５に示すように、ＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴでＲｕｎｘ２を導入した細胞では、５日目で非トランスフェクション細胞と比べ明らかにオステオカルシン発現の亢進が見られ、１０日目で発現は著名に亢進する。一方、Ｆｕｇｅｎｅ６でＲｕｎｘ２を導入した細胞では、オステオカルシンの発現はわずかであった。いずれに導入法においても、ＧＦＰ導入した細胞では、非トランスフェクション細胞との差は見られなかった。
ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ等のレポーター遺伝子導入による評価では、ＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴ、Ｆｕｇｅｎｅ６のいずれも非常に良好な遺伝子発現が観察されるにもかかわらず、Ｒｕｎｘ２導入による骨芽細胞分化では、前二者では良好な分化誘導が観察される一方、Ｆｕｇｅｎｅ６ではこれが観察されないという、非常に興味深い結果となった。この理由として、Ｆｕｇｅｎｅ６ではＭＴＴアッセイ等では現れない細胞への影響（毒性）があり、分化が阻害されている可能性、またはＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴとＦｕｇｅｎｅ６とでの細胞内での遺伝子の発現状態の違いが原因となっている可能性が考えられた。この後者のメカニズムを追求する目的で、次の実験を行った。
【実施例５】
【０００９】
持続的遺伝子発現の評価
ＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴ、Ｆｕｇｅｎｅ６の三者によりそれぞれＰＯＢに対してルシフェラーゼ遺伝子を導入し、その遺伝子発現を通常のルシフェラーゼ遺伝子発現、即ちルシフェラーゼタンパクの発現量として評価すると同時に、細胞内でのルシフェラーゼｍＲＮＡの発現をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて定量評価した。
＜材料および方法＞
実施例２と同様にルシフェラーゼ遺伝子トランスフェクションを行い、１、３、５日後にそれぞれサンプル回収した。ルシフェラーゼ遺伝子発現の発光定量は実施例２と同様に行った。ｍＲＮＡ定量は、細胞サンプルよりＲＮＡを抽出、精製した後、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｉｓｍ７０００）を用いてルシフェラーゼ遺伝子ｍＲＮＡの定量を行った。
＜結果＞
図６に示すように、発光定量ではＦｕｇｅｎｅ６は１日目より非常に高い発現を示し、５日目にやや減少する。一方、ＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴでは発現量は相対的に低い値となるが、５日目まで比較的維持される。
この傾向はｍＲＮＡレベルでの評価で顕著に示される。Ｆｕｇｅｎｅ６は１日目に非常に高い発現が見られるが、３日目には急激に低下する。一方、ＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴでは１日目から３日目にかけてむしろ発現量は増加を示し、５日目ではわずかではあるが、Ｆｕｇｅｎｅ６を上回る発現となる。
即ち、ルシフェラーゼタンパクの発現として観察する場合、Ｆｕｇｅｎｅ６は１日目の時点で既に非常に高い発現が得られ、このタンパクが細胞内に蓄積される結果、発光定量では相対的に高い発現が長期観察される。一方、導入されたｐＤＮＡからの転写過程がＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴでは数日以上の長期に渡り持続する一方、Ｆｕｇｅｎｅ６ではごく早期から新たなｍＲＮＡ転写は起こらなくなることが考えられる。
この遺伝子発現のパターンの違いが、細胞分化誘導の結果の異なる原因となっている可能性が考えられる。即ち、一過性の転写因子発現のみでは十分に分化スイッチが入らず、数日以上に渡る転写因子発現の可能な系でのみ、有効な分化誘導が得られるということが、ＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴでのみ分化誘導が観察された原因である可能性が示唆された。
なお、以上の分化誘導は、ＰＥＧ−ＤＥＴによるＲｕｎｘ２遺伝子導入（Ｎ／Ｐ＝８０）により、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験でも再現され、骨欠損部への骨再生が促進されることが確認された。
【実施例６】
【００１０】
ＰＥＧ−ＤＥＴの滴定
製造例２で合成したＰＥＧ−ＤＥＴ３０ｍｇを５０ｍｌの０．０１Ｎ塩酸（＋１５０Ｍ塩化ナトリウム）水溶液に溶解し、自動滴定装置（平山  ＴＩＴＳＴＡＴＩＯＮ  ＴＳ−２００）を用いて、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム（＋１５０ｍＭ塩化ナトリウム）水溶液を滴下していくことにより滴定を行った。液滴は０．０６３ｍｌずつ滴下し、ｐＨが安定してから次の液滴を加えるようにした（最低でも３０秒経過後）。得られた結果からｐＨ−α曲線を作成した。図７−（ａ）にＰＥＧ−ＤＥＴのｐＨ−α曲線を示す。明確な二段階のプロトン化挙動が観察された。それぞれのｐＫａ値はおよそ６及び９．５であった。生理的条件であるｐＨ７．４においては、ポリマー側鎖のエチレンジアミンユニットはモノプロトン化状態であり、おそらく下図の中央に示すようなゴーシュ構造をとっているものと推定される。ｐＨが５．０程度に下がるとジプロトン化状態となり、下図の左に示すようなトランス構造をとると考えられる。この変化がプロトンスポンジ効果を誘起すると考えられる。
0005061349.tif 000009
製造例３で合成したＰＥＧ−ＤＰＴについても同様の実験を行い、ｐＨ−α曲線を作成した。図７−（ｂ）に示すようにＰＥＧ−ＤＰＴはｐＨ７．４においてすでにモノプロトン化状態よりもかなりプロトン化が進んでおり、プロトンスポンジ効果においてはＰＥＧ−ＤＥＴほど有効に機能しないと考えられる。
＜まとめ＞
ＰＥＧ−ＤＥＴ、ＤＥＴはｐＤＮＡとコンプレックス化することにより、細胞への非常に高い遺伝子導入能を示すポリマーであることが明らかとなった。この高い遺伝子導入能を示す条件で、細胞毒性は非常に低く、通常遺伝子導入の困難な初代培養株細胞に対しても、良好な遺伝子導入が可能であった。さらに、遺伝子発現を長期にわたり持続させることが可能であり、細胞の分化誘導を目的とした遺伝子導入として非常に有効に機能することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
以上より、本発明は低毒性かつ遺伝子発現の時間的レギュレーションを可能とする細胞内遺伝子導入法として、非常に実用性に優れたシステムであることが明らかとなった。遺伝子導入を用いた治療法の臨床応用に向けて、導入遺伝子の発現状態をコントロールすることは、治療効果を効率よく発揮させるのみならず、治療の安全性を担保する意味においても非常に重要な要素である。従って、本発明のポリマーは、遺伝子導入を用いた疾患治療に必要となる臨床応用可能な遺伝子デリバリーシステムとして非常に有用である。
したがって、医療業、製薬業、研究試験薬提供業、等で利用できる。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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