(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス  アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）, バチルス  コアグランス（Bacillus coagulans）, アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）, リゾプス  ストロニフェラ（Rizopus stolonifer）, サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）, サッカロマイセス  ロキシイ（Saccharomyces rouxii）, カンジダ  ユーティリス（Candida utilis）およびカンジダ  アンタルクティカ（Candida antarctica）からなる群から選択される一種または二種以上の微生物由来のグルタミナーゼをグルタミンとエチルアミン誘導体に作用させることを特徴とするテアニンの製造法において、
(i)前記微生物の培養上清のグルタミナーゼ比活性が１０ｍＵ／ｍｇ以上、
(ii)前記グルタミナーゼは、主産物であるテアニンと副産物であるグルタミン酸との比（テアニン／グルタミン酸）が５よりも大、
(iii)テアニン酵素合成時のｐＨが９〜１２、
(vi)Ｌ-グルタミンからテアニンへのモル転換率が７０％以上、および
(v)Ｌ-グルタミンからグルタミン酸へのモル転換率が６％以下である、という(i)〜(v)の条件を全て満足することを特徴とするテアニンの製造法。
【請求項２】
上記(vi)において、Ｌ-グルタミンからテアニンへのモル転換率が７０％〜７８％であることを特徴とする請求項１に記載のテアニンの製造法。
【請求項３】
前記グルタミナーゼが、担体に固定化されていることを特徴とする請求項１または２に記載のテアニンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テアニンの新規な製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テアニンは、緑茶の旨味の主要成分として知られ、茶をはじめとする食品の香味成分として重要な物質である。テアニンを含むγ−グルタミル誘導体は、動物及び植物体における生理活性物質として作用することが指摘されている。例えば、Ｃｈｅｍ．Ｐａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９（７）１３０１−１３０７（１９７１）には、テアニンやＬ−グルタミンがカフェインによって誘発される痙攣に拮抗することが報告されている。このことからこれらの化合物が中枢神経系に作用することが考えられ、生理活性物質としての有用性が期待されている。【０００３】
従来より、テアニンの製造方法としては、テアニンを含有する玉露の生産用茶園において得られる茶葉乾燥物より抽出する方法が一般的である。しかし、この方法を用いた場合、次の二つの短所がある。すなわち、（１）テアニンは茶葉乾燥物あたり、わずか１.５％前後程度しか蓄積されない、及び（２）一般の煎茶用茶園では光合成が活発であるため、合成されたテアニンが速やかに分解され、蓄積量が少ない。従って、茶葉乾燥物からの抽出法では、工業的に十分な量のテアニンを生産することが難しく、実用的ではないことが指摘されている。【０００４】
このようなことから、工業的生産方法の開発が期待されており、その一つとして、テアニンを化学的に有機合成する方法が報告されている（前述：Ｃｈｅｍ．Ｐａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９（７）１３０１−１３０７（１９７１））。しかし、この有機合成反応は収率が低く、合成物の分離精製等において煩雑な操作を必要とするという問題点が指摘されている。
また、別の工業的生産方法として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のグルタミナーゼのγ−グルタミル基転移反応を利用して、Ｌ−グルタミンとエチルアミンからテアニンを合成する酵素法が報告されている（特開平１１-２２５７８９）。加えて、この酵素を担体に固定化した酵素法が開発されている（特開平５−３２８９８６）。しかし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のグルタミナーゼを用いた場合には、テアニンを合成する反応と共に、加水分解反応によってＬ−グルタミン酸が副反応物として合成されてしまう。このため、副産物としてのＬ−グルタミン酸が、テアニン精製を煩雑にするという問題点がある。【０００５】
【特許文献１】特開平１１−２２５７８９号公報
【特許文献２】特開平５−３２８９８６号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｐａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９（７）１３０１−１３０７（１９７１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、その目的はテアニンの効率的な製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは前記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、カビ、または酵母のうちの一種または二種以上の微生物由来のグルタミナーゼを用い、テアニンを高収率で合成でき、かつ副産物が極めて少量であることを見い出し、基本的には本発明を完成させるに至った。即ち、本発明の要旨はグルタミンとエチルアミン誘導体の混合物にＢａｃｉｌｌｕｓ属、カビ、または酵母のうちの一種または二種以上の微生物由来のグルタミナーゼを作用させることを特徴とするテアニンの製造法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、テアニンの効率的な新規製造法を提供し、簡易かつ工業的有利な生産を可能とすることができる。すなわち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、カビ、または酵母のうちの一種または二種以上の微生物由来のグルタミナーゼを用いることにより、従来よりも高いテアニンへの転換率が認められ、工業的な生産が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
次に、本発明の実施形態について、詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。【００１０】
本発明に用いられるテアニンとは、茶の葉に含まれているグルタミン酸誘導体で、茶の旨味の主成分であって、呈味を用途とする食品添加物として使用されている。具体的には、γ−グルタミルエチルアミド、Ｌ−グルタミン酸−γ−エチルアミドなどと称する化合物である。
本発明に用いられるエチルアミン誘導体とは、エチルアミン、エチルアミン塩酸塩、エチルアミン塩化金酸塩、エチルアミン脂肪酸塩、エチルアミンピクラート、エチルアミンのＮ−ベンゼンスルホニル化合物、エチルアミンのＮ−ｐ−トルエンスルホニル化合物等が挙げられるが、これらに限定されない。また、特にこれらのうち、エチルアミン、エチルアミン塩酸塩を用いることが好ましい。【００１１】
本発明におけるグルタミナーゼとは、Ｌ−グルタミンを加水分解してＬ−グルタミン酸を生成するグルタミナーゼ活性を有し、味噌・醤油等の醗酵食品のうま味向上・呈味性向上に用いられているものである。グルタミナーゼは、アルカリ条件下において、γ-グルタミル転移活性が加水分解活性よりも高くなることが知られており、テアニンをはじめとしたアルキルアミドの合成にも利用できる。【００１２】
本発明におけるグルタミナーゼ活性は、Ｌ−グルタミンを基質として酵素を作用させ、生成するＬ−グルタミン酸を定量することにより測定される。生成したＬ−グルタミン酸量は、市販のキット、例えばＦキットＬ−グルタミン酸（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用い測定することができる。本酵素の単位としては、１分間当たり１μｍｏｌのグルタミン酸を生成する酵素量を「ｍＵ」と定義した。また、この定義を使用し、溶液中の蛋白質１ｍｇ当りの酵素量をグルタミナーゼ比活性「ｍＵ／ｍｇ」と定義した。【００１３】
本発明におけるＢａｃｉｌｌｕｓ属とは、細胞形態学的に、グラム陽性の好気性菌、桿菌、芽胞形成能、運動性を有するなどの諸性質を有する微生物である。
本発明におけるＢａｃｉｌｌｕｓ属由来のグルタミナーゼの起源は特に限定されるものではないが、好ましくは、Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus polymixa, Bacillus stearothermophilus, Bacillus thermoproteolyticus由来の酵素である。グルタミナーゼ比活性が特に高い菌が好ましいという観点から見ると、最も好ましくはBacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens由来のグルタミナーゼである。
また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のグルタミナーゼは、バイオテクノロジーを応用して、遺伝子組替え等の改変菌によって製造したものも用いることができる。【００１４】
本発明におけるカビとは、真菌類のうち、菌糸がからみ合った不定形の集合体をなすものの総称であり、藻菌類、子嚢菌類の多く、および担子菌類の一部に見られる。
本発明におけるカビ由来のグルタミナーゼの起源は、特に限定されるものではないが、好ましくは、Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Penicillium notatum, Rizopus stolonifer, Mucor sponosus由来の酵素である。グルタミナーゼ比活性が特に高い菌が好ましいという観点より、最も好ましくはAspergillus oryzae, Aspergillus niger由来のグルタミナーゼである。
また、カビ由来のグルタミナーゼは、バイオテクノロジーを応用して、遺伝子組替え等の改変菌によって製造したものも用いることができる。【００１５】
本発明における酵母とは、子嚢菌類に属する菌類である。葉緑素を含まず、出芽によって繁殖するが、分裂によることもある。酒類、醤油、パンなどの製造に利用される。
本発明における酵母由来のグルタミナーゼの起源は特に限定されるものではないが、好ましくは、Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces rouxii, Candida utilis, Candida antarctica, Hansenulla anomala, Schizosaccaromyces octosporus由来の酵素である。グルタミナーゼ比活性が特に高い菌が好ましいという観点から見ると、最も好ましくはSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces rouxii, Candida utilis, Candida antarctica由来のグルタミナーゼである。
また、酵母由来のグルタミナーゼは、バイオテクノロジーを応用して、遺伝子組替え等の改変菌によって製造したものも用いることができる。【００１６】
上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、カビ、酵母等の微生物由来のグルタミナーゼとしては、（１）微生物そのもの、または（２）微生物から抽出される粗酵素を用いることもできる。しかしながら、テアニン転換率の観点から見ると、微生物からグルタミナーゼを精製して用いることが好ましい。グルタミナーゼの精製方法は、公知のいかなる酵素精製法を用いても良い。例えば、カラムクロマトグラフィー、溶媒を用いた分配、透析、限外濾過、電気泳動、中性塩による分別塩析、アルコール、アセトンを用いる分別沈殿法、ＨＰＬＣなどを例示することができる。このうち溶媒分配および各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣを組み合わせて、グルタミナーゼを精製することが好ましい。更に、ＣＭ−セルロースカラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ１５０カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、ブチルトヨパールカラムクロマトグラフィーを組み合わせても良い。【００１７】
こうして、本発明に係るテアニンの製造法おいては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｒｉｚｏｐｕｓ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌｌａ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属のうちの一種または二種以上の微生物由来のグルタミナーゼをグルタミンとエチルアミン誘導体に作用させることが好ましい。この場合に、（１）これら微生物の培養上清のグルタミナーゼ比活性が１０ｍＵ／ｍｇ以上となる条件で培養したものである場合が好ましく、また（２）グルタミナーゼについては、本発明における主産物であるテアニンと副産物であるグルタミン酸との比（テアニン／グルタミン酸）が５よりも大であるものを用いることが副産物を軽減させる点から好ましい。【００１８】
本発明におけるテアニン酵素合成時の液性は特に限定するものではないが、ｐＨは約９〜１２が好ましく、約１０〜１１がより好ましい。また、反応温度は特に限定するものではないが約０℃〜４５℃が好ましく、約４℃〜３０℃がより好ましい。基質として使用するＬ−グルタミン、エチルアミン誘導体濃度は特に限定するものではないが、Ｌ−グルタミン約０.１モル以上、エチルアミン誘導体約１モル以上が好ましい。本発明におけるＬ−グルタミンとは、純粋なＬ−グルタミンを含むほか、Ｌ−グルタミンナトリウム塩など、適当な無機塩あるいは有機塩を含む。【００１９】
本発明の方法によって合成されたテアニンを反応液から単離精製するには、公知のいかなるアミノ酸精製法を用いても良く、例えばカラムクロマトグラフィー、溶媒を用いた分配、透析、晶析、限外濾過、電気泳動、中性塩による分別塩析、アルコール、アセトンを用いる分別沈殿法、ＨＰＬＣなどを例示することができる。このうち溶媒分配および各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣを組み合わせることが好ましい。さらにＣＭ−セルロースカラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ１５０カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、ブチルトヨパールカラムクロマトグラフィーを組み合わせても良い。【００２０】
本発明における担体とは、グルタミナーゼを固定化するものであり、例えばセライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例および試験例により本発明を更に詳細に説明する。これらは、本発明の実施例の一部であり、本発明は当該実施例および試験例によって限定されるものではない。【００２２】
実施例１
Bacillus subtilis をグルコース０.３％、ポリペプトン３.０％、酵母エキス１.０％、塩化ナトリウム０.５％を含むｐＨ７.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し、透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に、塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、６７ｍＵ／ｍｇであった。【００２３】
実施例２
Bacillus amyloliquefaciens をグルコース０.３％、ポリペプトン３.０％、酵母エキス１.０％、塩化ナトリウム０.５％を含むｐＨ７.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、５３ｍＵ／ｍｇであった。【００２４】
実施例３
Bacillus coagulans をグルコース０.３％、ポリペプトン３.０％、酵母エキス１.０％、塩化ナトリウム０.５％を含むｐＨ７.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、４３ｍＵ／ｍｇであった。【００２５】
実施例４
Bacillus licheniformisをグルコース０.３％、ポリペプトン３.０％、酵母エキス１.０％、塩化ナトリウム０.５％を含むｐＨ７.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、４０ｍＵ／ｍｇであった。【００２６】
実施例５
Bacillus cereusをグルコース０.３％、ポリペプトン３.０％、酵母エキス１.０％、塩化ナトリウム０.５％を含むｐＨ７.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、５ｍＵ／ｍｇであった。【００２７】
比較例１  Pseudomonas nitroreducens 由来の精製グルタミナーゼの調製
Pseudomonas nitroreducens をグルタミン酸ナトリウム０.６％、酵母エキス０.１％、グルコース１.０％、ＫＨ２ＰＯ４ ０.０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０.０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.０７％、ＥＤＴＡ−Ｆｅ ０.０１％を含む培養液（ｐＨ７）を用いて、３０Ｌ容のジャーファメンター（３０Ｌ、通気１ｖｖｍ＝２５Ｌ／分、回転数２，０００ｒｐｍ）中、Pseudomonas nitroreducens を約２０時間培養した。得られた培養液１７５Ｌ分の菌体を洗浄後、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）７.５Ｌに懸濁し、５〜２０℃で超音波破砕し、菌体破砕物を得た。【００２８】
７％アンモニア水でｐＨを７に調整しながら菌体破砕物を硫酸アンモニウム分画を行い、４５〜９０％飽和画分を得た。これを０.０１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶かし、同緩衝液に対して透析した。ＤＥＡＥ−セルロースカラム（１５×６０cm）に吸着させ、グルタミナーゼを０.１Ｍの食塩を含む緩衝液で溶出し、グルタミナーゼ液を得た。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、１５ｍＵ／ｍｇであった。【００２９】
実施例６  精製グルタミナーゼによるテアニンの酵素合成
精製グルタミナーゼ(０.１ｍＬ)を用いて、基質溶液１０ｍＬ（０.５Ｍ Ｌ−グルタミン、及び種々の濃度のエチルアミン）をｐＨ１０.０、温度３０℃の条件にて、テアニンの酵素合成を行った。【００３０】
実施例７  ＨＰＬＣによるテアニン量及びグルタミン酸量の定量
テアニンの酵素合成を行った酵素反応液中のテアニン量及びグルタミン酸量は、反応液を適宜希釈した後、ＨＰＬＣにかけることにより定量した。得られたテアニン量（ｍｏｌ／Ｌ）及びグルタミン酸量（ｍｏｌ／Ｌ）を用いて、基質のグルタミン量（ｍｏｌ／Ｌ）からのモル転換率（％）を計算した。
ＨＰＬＣの定量条件は、下表の通りであった。【００３１】
【表１】
0004874105.tif 000002
【００３２】
試験例１  Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のグルタミナーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のグルタミナーゼによるテアニン酵素合成
実施例１〜実施例５、及び比較例１で調整した各微生物由来のグルタミナーゼを用いて、実施例６の条件でテアニン酵素合成試験を行った。試験後のテアニン量、及びグルタミン酸量は、実施例７の条件で測定した。試験の結果を図１に示した。【００３３】
実施例１〜実施例５、及び比較例１のいずれのグルタミナーゼを用いた場合にも、Ｌ−グルタミンからテアニンへのモル転換率は、５０％以上であった。特に、実施例１〜実施例４のグルタミナーゼのモル転換率は、それぞれ７８％、７６％、７２％及び７０％という高値であった。一方、Ｌ−グルタミンからＬ−グルタミン酸へのモル転換率（副産物の生産）は、実施例１〜実施例４のグルタミナーゼでは６％以下の低値であったが、実施例５及び比較例１のグルタミナーゼでは１５％以上の高値を示した。グルタミナーゼを用いてテアニンを合成する場合には、テアニンへのモル転換率が高いことに加えて、副産物であるＬ−グルタミン酸へのモル転換率が低いことが好ましい。そうすれば、テアニンの精製工程を簡易とすることができる。本試験例において、このような条件を満足させるためには、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のグルタミナーゼであって、その培養上清のグルタミナーゼ比活性が１０ｍＵ／ｍｇ以上のものを用いることが好ましい。【００３４】
実施例８
Aspergilus oryzae をモルツエキス（Malt extract）２.０％、グルコース２.０％、ペプトン０.１％、酵母エキス（Yeast extract）０.１％を含むｐＨ５.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、４２ｍＵ／ｍｇであった。【００３５】
実施例９
Aspergilus niger をモルツエキス２.０％、グルコース２.０％、ペプトン０.１％、酵母エキス０.１％を含むｐＨ５.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、３９ｍＵ／ｍｇであった。【００３６】
実施例１０
Rizopus stolonifer をモルツエキス２.０％、グルコース２.０％、ペプトン０.１％、酵母エキス０.１％を含むｐＨ５.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、１５ｍＵ／ｍｇであった。【００３７】
実施例１１
Mucor sponosus をモルツエキス２.０％、グルコース２.０％、ペプトン０.１％、酵母エキス０.１％を含むｐＨ５.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、５ｍＵ／ｍｇであった。【００３８】
試験例２  カビ由来のグルタミナーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のグルタミナーゼによるテアニン酵素合成
実施例８〜実施例１１、及び比較例１で調整した各微生物由来のグルタミナーゼを用いて、実施例６の条件でテアニン酵素合成試験を行った。試験後のテアニン量、及びグルタミン酸量は、実施例７の条件で測定した。試験の結果を図２に示した。【００３９】
実施例８〜実施例１１、及び比較例１のいずれのグルタミナーゼを用いた場合にも、Ｌ−グルタミンからテアニンへのモル転換率は、５０％以上であった。特に、実施例８及び実施例９のグルタミナーゼのモル転換率は、それぞれ７２％及び７３％という高値であった。一方、Ｌ−グルタミンからＬ−グルタミン酸へのモル転換率（副産物の生産）は、実施例８及び実施例９のグルタミナーゼでは５％以下の低値であったが、比較例１のグルタミナーゼでは１０％という高値であった。グルタミナーゼを用いてテアニンを合成する場合には、テアニンへのモル転換率が高いことに加えて、副産物であるＬ−グルタミン酸へのモル転換率が低いことが好ましい。そうすれば、テアニンの精製工程を簡易とすることができる。本試験例において、このような条件を満足させるためには、カビ由来（特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｒｉｚｏｐｕｓ属、Ｍｕｃｏｒ属）のグルタミナーゼであって、（１）その培養上清のグルタミナーゼ比活性が１０ｍＵ／ｍｇ以上のもの、または（２）Ｌ−グルタミンからのモル転換率において、本実施例における主産物であるテアニンと副産物であるグルタミン酸との比（テアニン／グルタミン酸の比＝Ｘ）が、Ｘ＞５であるものを用いることが好ましい。【００４０】
実施例１２
Saccharomyces cerevisiae をモルツエキス０.３％、酵母エキス０.３％、ペプトン０.５％、グルコース１.０％を含むｐＨ５.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、４５ｍＵ／ｍｇであった。【００４１】
実施例１３
Saccharomyces rouxii をモルツエキス０.３％、酵母エキス０.３％、ペプトン０.５％、グルコース１.０％を含むｐＨ５.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、４０ｍＵ／ｍｇであった。【００４２】
実施例１４
Candida utilis をモルツエキス０.３％、酵母エキス０.３％、ペプトン０.５％、グルコース１.０％を含むｐＨ５.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、３０ｍＵ／ｍｇであった。【００４３】
実施例１５
Candida antarctica をモルツエキス０.３％、酵母エキス０.３％、ペプトン０.５％、グルコース１.０％を含むｐＨ５.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、２５ｍＵ／ｍｇであった。【００４４】
実施例１６
Hansenulla anomala をモルツエキス０.３％、酵母エキス０.３％、ペプトン０.５％、グルコース１.０％を含むｐＨ５.０の培地にて３０℃の温度で培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た。この培養上清に冷エタノールを添加し、得られた沈殿を遠心分離、回収した。得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７.０）に溶解し透析を行った。透析液は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて吸着した後に塩溶液による溶離により蛋白質の純度を高めた。得られたグルタミナーゼ溶液をＵＦ膜（ＵＦＰ-５-Ｃ-３ＭＡ）（アマシャムバイオサイエンス（株））を用いて、濃縮及び脱塩を行い、精製グルタミナーゼを得た。培養上清のグルタミナーゼ比活性は、１５ｍＵ／ｍｇであった。【００４５】
試験例３  酵母由来のグルタミナーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のグルタミナーゼによるテアニン酵素合成
実施例１２〜実施例１６、及び比較例１で調整した各属由来のグルタミナーゼを用いて、実施例６の条件でテアニン酵素合成試験を行った。試験後のテアニン量、及びグルタミン酸量は、実施例７の条件で測定した。試験の結果を図３に示した。【００４６】
実施例１２〜実施例１６、及び比較例１のいずれのグルタミナーゼを用いた場合にも、Ｌ−グルタミンからテアニンへのモル転換率は、５０％以上であった。特に、実施例１２〜実施例１５のグルタミナーゼのモル転換率は、それぞれ７０％以上という高値であった。一方、Ｌ−グルタミンからＬ−グルタミン酸へのモル転換率（副産物の生産）は、実施例１２〜実施例１５のグルタミナーゼではいずれも低値であったが、比較例１のグルタミナーゼでは１０％という高値であった。グルタミナーゼを用いてテアニンを合成する場合には、テアニンへのモル転換率が高いことに加えて、副産物であるＬ−グルタミン酸へのモル転換率が低いことが好ましい。そうすれば、テアニンの精製工程を簡易とすることができる。本試験例において、このような条件を満足させるためには、酵母（特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属）由来のグルタミナーゼであって、その培養上清のグルタミナーゼ比活性が１０ｍＵ／ｍｇ以上のものを用いることが好ましい。【００４７】
実施例１７  キトパール４０１０を用いた固定化グルタミナーゼの調製
キトサンビーズである市販品のキトパール４０１０（富士紡績（株））を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)に２４時間浸漬した。この平衡化後キトパール４０１０の１０ｍＬを実施例３にて調製したグルタミナーゼ（１５ｍｇ／ｍＬ）２５ｍＬに浸漬し、約２時間振盪した。その後、付着液を除去したキトパール４０１０を２.５％グルタルアルデヒド溶液に加え、さらに２時間振盪した。グルタルアルデヒド処理後、３０倍量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)を用いて吸光度(２８０ｎｍ)が０.０１以下になるまで洗浄し、カラムに充填した。【００４８】
実施例１８  固定化グルタミナーゼによる酵素反応
実施例１７にて調整した固定化グルタミナーゼを使用し、基質溶液（４％グルタミン、２５％エチルアミン
ｐＨ１０.０）を３０℃、ＳＶ＝０.２の流速で通筒した場合、７０％の収率でテアニンを得ることができた。【００４９】
実施例１９  陰イオン交換樹脂を用いた固定化グルタミナーゼの調製
実施例３にて得られた精製グルタミナーゼ（１５ｍｇ／ｍＬ）２５ｍＬに対し、陰イオン交換樹脂であるダイヤイオンＨＰＡ２５（三菱化学（株））を１０ｍＬ添加後、約２時間振盪した。その後、付着液を除去したＨＰＡ２５を２.５％グルタルアルデヒド溶液に加え、さらに２時間振盪した。グルタルアルデヒド処理後、３０倍量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)を用いて吸光度（２８０ｎｍ）が０.０１以下になるまで洗浄し、カラムに充填した。【００５０】
実施例２０  固定化グルタミナーゼによる酵素反応
実施例１９にて調整した固定化グルタミナーゼを使用し、基質溶液（４％グルタミン、２５％エチルアミン
ｐＨ１０.０）を３０℃、ＳＶ＝０.２の流速で通筒した場合、７５％の収率でテアニンを得ることができた。【００５１】
実施例２１  テアニンの精製
テアニンの反応液からの単離精製は、反応液よりエチルアミンを減圧濃縮により除去した後に、ＲＯ膜による脱塩を行い、その後Ｄｏｗｅｘ５０×８、Ｄｏｗｅｘ１×２カラムクロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理することにより行った。
この単離物質をアミノ酸アナライザー、ペーパークロマトグラフィーにかけたところ、テアニン標準物質と同じ挙動を示した。また、単離物質を塩酸あるいはグルタミナーゼで加水分解処理を行ったところ、１：１の割合でＬ−グルタミン酸とエチルアミンを生じた。このように、単離物質がグルタミナーゼによって加水分解されたことから、エチルアミンがＬ−グルタミン酸のγ位に結合していたことが示された。また、加水分解で生じたＬ−グルタミン酸がＬ型であることは、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）により確認された。図４には、テアニン標品及び単離物質のＩＲスペクトルを示した。両物質は、共に同等のスペクトルを示した。これらのことから、単離物質がテアニンであることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のグルタミナーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のグルタミナーゼを用いて、Ｌ−グルタミンとエチルアミンからテアニンを酵素合成した際の合成テアニン量、グルタミン酸量を示した表である。
【図２】カビ由来のグルタミナーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のグルタミナーゼを用いて、Ｌ−グルタミンとエチルアミンからテアニンを酵素合成した際の合成テアニン量、グルタミン酸量を示した表である。
【図３】酵母由来のグルタミナーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のグルタミナーゼを用いて、Ｌ−グルタミンとエチルアミンからテアニンを酵素合成した際の合成テアニン量、グルタミン酸量を示した表である。
【図４】テアニン標品及び単離物質のＩＲスペクトルを示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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