(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シークワサー（Citrus depressa hay.）を抽出原料とし、抽出溶媒として圧力が２５〜３５ＭＰａ、温度が６０〜８０℃の超臨界状態の二酸化炭素を用い、これにモディファイヤーとして水およびエタノールを３：７〜１：９の質量比で加え、前記モディファイヤーの量をモディファイヤーと超臨界状態の二酸化炭素の総量の１〜４質量％として超臨界流体抽出することを特徴とするノビレチンおよびタンゲレチンの抽出方法。
【請求項２】
抽出原料として、シークワサー（Citrus depressa hay.）の果実、果皮または葉を用いる請求項１記載のノビレチンおよびタンゲレチンの抽出方法。
【請求項３】
抽出原料として、シークワサー（Citrus depressa hay.）の葉を用いる請求項１記載のノビレチンおよびタンゲレチンの抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はミカン科植物からポリメトキシフラボノイドを抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミカン科植物には、シネフリン、β−クリプトキサンチン、ポリメトキシフラボノイド、ビタミン等の有用成分が含まれていることが知られている。
【０００３】
これら成分のうち、例えば、シネフリンとポリメトキシフラボノイドの１種であるノビレチンはミカン科植物の果皮からエタノールまたは含水エタノールで抽出できることが知られている（特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、この方法では抽出効率が悪く、また、抽出したものについても水溶性のヘスペリジン等が多く含まれてしまい、更には、この抽出液には溶媒であるエタノールも多く含まれており、食品用途に使用するためにはその留去に時間がかかるため、実用的なものではなかった。
【特許文献１】特開２００６−３２７９９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明はミカン科植物からこれらに含まれる、有用成分であるポリメトキシフラボノイドを効率的に抽出する方法を提供することをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、超臨界流体を利用することによりミカン科植物からこれに含まれる有用成分の一つであるポリメトキシフラボノイドを効率的に抽出できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明はミカン科植物を超臨界流体で抽出することを特徴とするポリメトキシフラボノイドの抽出方法である。
【０００８】
また、本発明はミカン科植物の葉を超臨界流体で抽出することを特徴とするポリメトキシフラボノイドの抽出方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の抽出方法によれば、ミカン科植物から効率よくポリメトキシフラボノイドを抽出することができる。特にミカン科植物の葉をポリメトキシフラボノイドの抽出原料とすれば、果実等と異なり収穫時期に影響されないので、ポリメトキシフラボノイドを安定に供給できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のポリメトキシフラボノイド（以下、「ＰＭＦ」という）の抽出方法（以下、「本発明抽出方法」という）は、ミカン科植物を抽出原料とし、それを超臨界流体を抽出溶媒とする超臨界流体抽出で行われるものである。
【００１１】
本発明抽出方法において、抽出原料として用いられるミカン科植物としては特に限定されないが、例えば、シークワサー（学名:Citrus depressa hay.）、ポンカン（学名：Citrus reticulata Blanco.）等のミカン属のものが挙げられる。本発明抽出方法においては、これらミカン科植物の中でも特にシークワサーを用いることが好ましい。これらミカン科植物の抽出部位としては、特に限定されないが、例えば、果実、果皮、葉等が挙げられ、果皮または葉が好ましく、特に収穫時期に影響されないことから葉が好ましい。
【００１２】
また、本発明抽出方法において、抽出溶媒として用いられる超臨界流体としては、例えば、その圧力が７.３８〜５０ＭＰａ、好ましくは２０〜４０ＭＰａ、特に好ましくは２５〜３５ＭＰａ、その温度が２５〜８０℃、好ましくは４０〜８０℃、特に好ましくは６０〜８０℃の超臨界状態の二酸化炭素が挙げられる。
【００１３】
上記したミカン科植物と超臨界流体を用いたＰＭＦの超臨界流体抽出は、超臨界流体を発生させるためのポンプと、超臨界流体とミカン科植物を接触させ、抽出を行うための容器、抽出液を貯留するための容器および系全体を暖めるためのオーブン等を備える超臨界流体抽出装置で行われる。このような超臨界流体抽出装置としては各社から市販されている一般的なものを用いることができる。
【００１４】
超臨界流体抽出における超臨界流体の流量や抽出時間等の抽出条件は、容器の大きさ等により変化するので一概には言えないが、例えば、内容積１０ｍｌの容器であれば、流量は後記するモディファイヤーと併せて１.４〜２ｍｌ／分、抽出時間は５〜４０分、好ましくは１０〜３０分、特に好ましくは２０〜３０分である。
【００１５】
また、上記超臨界流体抽出の際には、超臨界流体に、更にモディファイヤーを加えることが好ましい。このようなモディファイヤーとしてはエタノールおよび／または水が挙げられ、好ましくはエタノールおよび水の混液であり、特に好ましくは水およびエタノールが質量比で９９：１〜１：９９、好ましくは１：１〜１：９９、特に好ましくは３：７〜１：９の混液である。このモディファイヤーを超臨界流体に加えることにより抽出効率の向上となり、ＰＭＦの収量が高くなる。モディファイヤーの量は上記超臨界流体とモディファイヤーを併せた総流量の１〜５０質量％（以下、単に「％」という）が好ましく、１〜３０％がより好ましく、１〜４％が特に好ましい。
【００１６】
上記の超臨界流体抽出によりミカン科植物からＰＭＦ、特にノビレチンおよびタンゲレチンが好適に抽出される。これらＰＭＦはさらに、常法に従い再結晶、クロマトグラフィー等により精製しても良い。なお、この超臨界流体抽出では目的とするＰＭＦ以外の、例えば、ヘスペリジン等は殆ど抽出されない。
【００１７】
上記したＰＭＦは、これを有効成分とする癌、アルツハイマー等の疾患の治療を目的とした医薬品やその原料の他、肌荒れ、老化等の防止・改善を目的とした化粧品、氷菓、清涼飲料、アルコール飲料、ジャム、ゼリー、クッキー、アメ、ガム等の飲食品に配合することができる。また、ＰＭＦは苦味を有するため苦味を付与するための食品添加物として用いることもできる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００１９】
実 施 例   １
シークワサー果皮の超臨界流体抽出（１）：
（１）試料
シークワサーの果皮を凍結乾燥し、冷凍保存したものをコーヒーミルで粉砕し、それを試料とした。
【００２０】
（２）超臨界流体抽出
試料約１ｇを内容積１０ｍｌの抽出容器に入れ、超臨界抽出システム（ＳＣＦ  series：日本分光（株）製）の所定の位置に設置後、カラムオーブンを設定温度（３０〜７５℃）になるまで昇温させた。カラムオーブンが設定温度になった後、３０ＭＰａで二酸化炭素を超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）とし、これを２ｍＬ／分の流量として５分間抽出を行い、抽出物を得た。
【００２１】
（３）測定
上記で得られた抽出物をロータリーエバポレーターで乾固程度まで濃縮した後、１ｍＬ程度のエタノールに再溶解させた。それについて以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。抽出物に含まれるノビレチンおよびタンゲレチン量を、これらについて予め作成しておいた検量線を元に定量した。測定結果を表１に示した。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム  ：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８ＨＧ（φ４.６×１５０ｍｍ）
溶出液Ａ：水
溶出液Ｂ：アセトニトリル
勾配条件：アセトニトリル：水＝５０：５０→０：１００（７分）および０：１００→
５０：５０（１０〜１３分）
流速    ：１.０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量  ：１０μＬ
検出波長：３３０ｎｍ
【００２２】
【表１】
0004921297.tif 000002
【００２３】
上記結果よりＰＭＦの抽出量は抽出温度が高いほど多くなることがわかった。特に抽出温度が７５℃でＰＭＦの抽出量が多かった。
【００２４】
実 施 例   ２
シークワサー果皮の超臨界流体抽出（２）：
実施例１の超臨界流体抽出をカラムオーブンの温度を４０℃に固定し、超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）の設定圧力を１０〜４５ＭＰａとする以外は、全て実施例１と同様にして試料の調製、超臨界流体抽出および測定を行った。測定結果を表２に示した。
【００２５】
【表２】
0004921297.tif 000003
【００２６】
上記結果よりＰＭＦの抽出量は圧力が３０ＭＰａで多かった。
【００２７】
実 施 例   ３
超臨界流体抽出におけるモディファイヤーの効果（１）：
（１）試料
実施例１と同様の試料を抽出に供した。
【００２８】
（２）超臨界流体抽出
試料約１ｇを内容積１０ｍｌの抽出容器に入れ、超臨界抽出システム（ＳＣＦ  series：日本分光（株）製）の所定の位置に設置後、カラムオーブンが４０℃になるまで昇温させた。カラムオーブンが４０℃になった後、３０ＭＰａで二酸化炭素を超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）とし、これとモディファイヤー（水またはエタノール）の総流量を２ｍＬ／分として５分間抽出を行い、抽出液を得た。なお、モディファイヤーの量は総流量の２〜３０％とした。
【００２９】
（３）測定
実施例１と同様にして測定を行った。測定結果を表３に示した。
【００３０】
【表３】
0004921297.tif 000004
【００３１】
上記結果より超臨界流体抽出に、超臨界流体と共にモディファイヤーを用いることによりＰＭＦの抽出量が多くなることがわかった。また、モディファイヤーとして水を用いた場合には総流量の５％、エタノールを用いた場合には総流量の２〜３０％でＰＭＦの抽出量が多かった。
【００３２】
実 施 例   ４
超臨界流体抽出におけるモディファイヤーの効果（２）：
実施例３の超臨界流体抽出を、モディファイヤーの流量を総流量の５％に固定し、モディファイヤーとして水およびエタノールの混液を用い、その比率（質量比）を変化させる以外は全て実施例３と同様にして試料の調製、超臨界流体抽出および測定を行った。測定結果を表４に示した。
【００３３】
【表４】
0004921297.tif 000005
【００３４】
上記結果よりモディファイヤーとして水またはエタノールを単独で用いるよりも水とエタノールを１：９で混合したものを用いることによりＰＭＦの抽出量が多くなることがわかった。
【００３５】
実 施 例   ５
超臨界流体抽出におけるモディファイヤーの効果（３）：
実施例３の超臨界流体抽出を、カラムオーブンの温度を７５℃、モディファイヤーの流量を総流量の２％に固定し、モディファイヤーとして水およびエタノールの混液を用い、その比率（質量比）を変化させる以外は全て実施例３と同様にして試料の調製、超臨界流体抽出および測定を行った。測定結果を表５に示した。
【００３６】
【表５】
0004921297.tif 000006
【００３７】
上記結果より抽出温度を上げることにより抽出されるＰＭＦの抽出量は全般的に多くなることかわかった。この場合も水またはエタノールを単独で用いるよりも水とエタノールを３：７〜１：９で混合したものを用いることによりＰＭＦの抽出量が多かった。
【００３８】
実 施 例   ６
シークワサー果皮または葉の超臨界流体抽出：
（１）試料
シークワサーの果皮もしくは葉を冷凍保存したもの（冷凍品）またはこれらを凍結乾燥させたもの（凍結乾燥品）をコーヒーミルで粉砕し、それを試料とした。
【００３９】
（２）超臨界流体抽出
試料約１ｇを内容積１０ｍｌの抽出容器に入れ、超臨界抽出システム（ＳＣＦ  series：日本分光（株）製）の所定の位置に設置後、カラムオーブンが７５℃になるまで昇温させた。カラムオーブンが７５℃になった後、３０ＭＰａで二酸化炭素を超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）とし、これとモディファイヤーの総流量を２ｍＬ／分として２０分間抽出を行い、抽出液を得た。なお、モディファイヤーとしては水およびエタノールの比率（質量比）が１：９の混液を用い、その量は総流量の２％とした。
【００４０】
（３）測定
実施例１と同様にして測定を行った。測定結果を表６に示した。
【００４１】
【表６】
0004921297.tif 000007
【００４２】
上記結果よりＰＭＦは果皮だけでなく葉にも十分に含まれていることが示された。また、冷凍品と凍結乾燥品で抽出されるＰＭＦ量に違いがあったが、この違いは試料中に含まれる水分量に起因するものと考えられる。
【００４３】
比 較 例  １
シークワサー果皮の従来法による抽出：
シークワサーの果皮を凍結乾燥し、冷凍保存したものをコーヒーミルで粉砕し、それを試料とした。試料約５ｇを内容積２００ｍｌの容器に入れ、これに水およびエタノールの混液（質量比５：５または１：９）を１００ｍｌ入れ、室温で抽出を行った。抽出開始３日目から溶媒中のＰＭＦ量を測定したところ、７日目で抽出量が横ばいになったため抽出を終了した。抽出開始から７日目の抽出液から溶媒を留去し、抽出物を得た。
【００４４】
また、比較として、上記と同様の試料を用いて超臨界流体抽出を行った。まず、試料５ｇを内容積１０ｍｌの抽出容器に入れ、超臨界抽出システム（ＳＣＦ  series：日本分光（株）製）の所定の位置に設置後、カラムオーブンが７５℃になるまで昇温させた。カラムオーブンが７５℃になった後、３０ＭＰａで二酸化炭素を超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）とし、これとモディファイヤーの総流量を４ｍＬ／分として２５分間抽出を行い、抽出液を得た。なお、モディファイヤーとしては水およびエタノールの比率（質量比）が１：９の混液を用い、その量は総流量の２％とした。更に、前記抽出液から溶媒を留去し、抽出物を得た。
【００４５】
上記で得られた各抽出物１ｇあたりのＰＭＦ量（ノビレチンおよびタンゲレチン量）およびヘスペリジン量を測定した。また、前記抽出物１ｇあたりのＰＭＦの収率を算出した。それらの結果を表７に示した。
【００４６】
【表７】
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【００４７】
上記結果より、従来法では抽出に７日間もかかる上、ＰＭＦの収率も低いものであり、しかも、抽出物にはヘスペリジンも多く含まれていた。一方、本発明方法によれば、２５分という短時間の抽出にもかかわらず、従来法の約９倍程度のＰＭＦが得られ、しかも、抽出物にはヘスペリジンが殆ど含まれていないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のポリメトキシフラボノイドの抽出方法によれば、ミカン科植物から効率よくＰＭＦを抽出することができる。
【００４９】
このように抽出されたＰＭＦは、医薬品、化粧品、飲食品等に好適に用いることができる。
以    上