(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のナノ粒子を含有するシリカ粒子であって、該複数のナノ粒子の粒子間距離が３ｎｍ以上７ｎｍ以下であることを特徴とするナノ粒子内包シリカ。
【請求項２】
前記シリカ粒子内に５個以上のナノ粒子を内包することを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子内包シリカ。
【請求項３】
前記ナノ粒子が、コア及びシェルで構成されるコアシェル構造を有するナノ粒子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のナノ粒子内包シリカ。
【請求項４】
前記ナノ粒子のコアがＳｉであり、前記シェルがＳｉＯ2であることを特徴とする請求項３に記載のナノ粒子内包シリカ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子内包シリカの表面を化学修飾することにより表層修飾した修飾基を介し、
生体物質が特異的に結合していることを特徴とする生体物質の標識物質。
【請求項６】
生体物質の標識方法であって、請求項５に記載の生体物質の標識物質を用い、
ナノ粒子を前記生体物質と特異的に結合する部位を有する修飾基を介して生体物質を
結合させることを特徴とする生体物質の標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質を対象とした標識剤および生体物質の標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオインフォマティクス、プロテオミクスの観点から、ｍＲＮＡやタンパク質の生体内での作用、動態を解析するために、ゲノムの機能、遺伝子の発現調節または個々の生体分子の振る舞いを分子レベルで把握する、いわゆる「１分子イメージング」なる方法概念が提起されている。これに基づき病気の原因や医薬の作用を解明しようとする１分子イメージング技術の研究開発が進められている。このような１分子イメージング技術においては、標的とする生体物質（タンパク質、例えば抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなど）の１分子に対して蛍光標識物質１分子を結合させ、これに所定の励起光を照射し、蛍光標識物質の発光を検出することにより、生体物質の動態などに関する情報を得ることが試みられる。蛍光標識物質の発光寿命が短く退色が早い場合や、発光強度が不足している場合には、１分子イメージングとして充分な観察が行えないことは明らかである。
【０００３】
これまで生体物質を対象とした分析に一般的に用いられている有機蛍光色素、例えば蛍光タンパク質であるルシフェリンとルシフェラーゼとの反応を利用した生物発光、発光分子などを利用した有機蛍光色素は、上記のような発光寿命や発光強度の点で充分ではなかった。そこで１分子イメージング技術分野においては、これらの有機蛍光色素に替わるものとして、ナノ粒子内包シリカを利用した蛍光標識物質が開発の途にある。ナノ粒子内包シリカは、発光スペクトルがシャープな形状である（半値幅が狭い）こと、発光強度が強いこと、励起波長と発光波長が離れているため検出精度が高いこと、粒子サイズに応じて励起波長を制御できること、ならびに蛍光寿命が長いことなど、有機蛍光色素と比較して有利な点をもっている。
【０００４】
このような、１分子イメージング技術分野におけるナノ粒子内包シリカを利用した蛍光標識剤については、上記のような事項だけでなく、標的とする生体物質との結合性、すなわち特異性、結合力も重要視される。ところが、従来のナノ粒子内包シリカを利用した蛍光標識剤（例えは特許文献１参照）においては、結合性に大きく関与する立体障害などの面から修飾基に関する結合性を改善することについて、何ら検討されてこなかった。また、ナノ粒子内包シリカを利用した蛍光標識物質については、検出精度を改善するため、発光強度の向上が追求されている。従来は、個々のナノ粒子内包シリカの粒径や材質、またはコアシェル構造などの粒子の構造の面から、発光強度を向上させようとすることが試みられてきた（例えば特許文献１参照）が、さらなる改善の余地が残されていた。
【特許文献１】特開２００５−１７２４２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ナノ粒子内包シリカを用い、生体物質への結合性を高め、より好適な標識を実現しうる標識物質および生体物質の標識方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的は、下記構成により達成される。
１．複数のナノ粒子を含有するシリカ粒子であって、該複数のナノ粒子の粒子間距離が３ｎｍ以上７ｎｍ以下であることを特徴とするナノ粒子内包シリカ。
２．前記シリカ粒子内に５個以上のナノ粒子を内包することを特徴とする１に記載のナノ粒子内包シリカ。
３．前記ナノ粒子が、コア及びシェルで構成されるコアシェル構造を有するナノ粒子であることを特徴とする１又は２に記載のナノ粒子内包シリカ。
４.前記ナノ粒子のコアがＳｉであり、前記シェルがＳｉＯ２であることを特徴とする３に記載のナノ粒子内包シリカ。
５．ナノ粒子内包シリカの表面を化学修飾することにより表層修飾した修飾基を介し、
生体物質が特異的に結合していることを特徴とする生体物質の標識物質。
６．生体物質の標識方法であって、５に記載の生体物質の標識物質を用い、
ナノ粒子を前記生体物質と特異的に結合する部位を有する修飾基を介して生体物質を
結合させることを特徴とする生体物質の標識方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、生体物質を対象とした分析、ＥＬＩＳＡ法での抗原の検出を行う分析などにおいて、標識剤の結合性が改善され、１分子イメージング技術により、ナノ粒子の輝度向上により、より高感度およびより高精度の分析を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明者らは、低毒性かつ高輝度の観点からナノ粒子を用いた細胞染色実験を鋭意検討した結果、生体内物質の高感度一分子イメージングを行う場合には、さらなる高輝度化が必要であることが判明した。生体内シグナルの高感度検出には高輝度蛍光プローブの使用が必須であり、ナノ粒子の輝度向上手段が重要な課題であることを認識した。
【０００９】
生体毒性の低いナノ粒子としてＳｉ／ＳｉＯ２、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳｅ等のコア・シェル型ナノ粒子がある。本研究者らはシリカ内にコア・シェル型ナノ粒子を分散させたナノ粒子を調整することによりナノ粒子間距離を制御し、粒子凝集による輝度低下の問題を解決できることを見出した。本発明により調製されたコア・シェル型ナノ粒子内包シリカではナノ粒子同士の凝集による濃度消光は回避され、高輝度・高感度な一分子イメージングが可能になる。本研究者らの検討の結果、シリカ内の粒子間距離が３ｎｍ以下である場合、濃度消光が著しく起きることがわかった。また、粒子間距離が８ｎｍ以上の場合、内包されているナノ粒子はシリカ表面から出ている状態になり、欠陥発生による量子効率低下が起きることがわかった。なお、シリカ内粒子が５個以上の場合、より高輝度かつ高感度な分子イメージングが可能になるという結果を得ている。以上の結果をもち、高輝度・高感度化の実現には、シリカ内のナノ粒子間距離が３ｎｍから７ｎｍであり、内包ナノ粒子数が５個以上であるナノ粒子内包シリカが好ましいということがわかった。また、発光色の違うナノ粒子をシリカ内に内包させることにより、バーコード機能が付加した蛍光プローブとすることも可能となる。
【００１０】
コア・シェル型ナノ粒子としてＳｉ／ＳｉＯ２を用いる場合、細胞毒性を大きく低下させることが可能である。本発明で言うナノ粒子内包シリカは、ロッド状のものから円盤状、球状等様々な形状を含むが、均一分散や標識対象物質本来の挙動をイメージングするという点で、球状のナノ粒子内包シリカが好ましい。すなわち、本発明は下記に掲げる態様を含むものである。
【００１１】
本発明のナノ粒子内包シリカのナノ粒子はコア・シェル型ナノ粒子であり、Ｓｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子を用いる場合、コア・シェル型ナノ粒子はＳｉおよびＳｉＯ２のスパッタ処理した後、アニール処理、フッ酸処理次いで自然酸化処理を行うことで得ることができる。
【００１２】
本発明のナノ粒子内包シリカの製造方法はＳｔｏｂｅｒの方法に従い、４：１のエタノール溶液中で上述のＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子およびテトラエトキシシランのアンモニアによる加水分解と縮重合により製造することができる。反応は室温・大気下で行われ、このとき、成熟の回数を変えることによってナノ粒子内包シリカの球サイズを直径数ｎｍから数百ｎｍ、さらにはμｍオーダーへと自在に調整できる。また、Ｓｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子とシリカ化合物であるテトラエトキシシランの濃度比を変えることによってシリカ球内のＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子数を調整することができる。
【００１３】
ナノ粒子内包シリカ球は、上記工程で使用するシリカ化合物の種類を適宜選択して用いることにより、所望の分子と結合可能なアクセプター基を表面に有する形態で調整することができる。反応に使用するシリカ化合物と、それによって得られるナノ粒子内包シリカの球表面に形成されたアクセプター基との関係を表１に示す。
【００１４】
【表１】
0004985541.tif 000002
【００１５】
また、ナノ粒子内包シリカのアクセプター基を、当初のアクセプター基とは異なる所望のアクセプター基に修飾することが可能で、表２に示すカップリング剤を有するシリカ化合物での処理を行うことができる。
【００１６】
【表２】
0004985541.tif 000003
【００１７】
本発明のナノ粒子内包シリカは、化学的に安定でありながら表面修飾が容易である。すなわち、表面修飾による生体適合性の付与や特定のタンパク質と結合するためのアクセプター分子を表面に固定することが可能である。
【００１８】
例えば、シリカ球表面をＰＥＧ系修飾剤で修飾することにより、非特異吸着が起こらない生体適合性を有するナノ粒子内包シリカとなり、細胞の染色、特に細胞の経時変化を観察する際に有効な蛍光プローブとなる。また、シリカ球表面に抗体を導入したナノ粒子内包シリカを感度が課題となっているイムノクロマトグラフィーに利用することで、高感度イムノクロマトグラフィーが可能となる。また、抗体を導入したナノ粒子内包シリカはウエスタンブロット等の各種分子生物学アッセイで有効な高輝度蛍光プローブとして使用することができる。また、表面にビオチンを導入したナノ粒子内包シリカはアビジン化タンパク質の選択的標識を可能とし、特定のタンパク質のイメージングに有効な高輝度蛍光プローブとして利用できる。
【００１９】
本発明のＳｉナノ粒子内包シリカは、化学的に安定でありながら表面修飾が容易である。すなわち、表面修飾による生体適合性の付与や特定のタンパク質と結合するためのアクセプター分子を表面に固定することが可能である。
【００２０】
（修飾基の導入）
本発明の修飾基は、ナノ粒子内包シリカの表面に結合しうる化合物を用いて前記表面結合部位を形成し、この化合物に前記生体物質結合部位を形成する物質を結合させることにより、導入することが可能である。また、表面結合部位を形成する化合物に、スペーサーを形成する化合物を結合させた後、前記生体物質結合部位を形成する物質を結合させてもよい。
【００２１】
表面結合部位を形成する化合物としては、例えば、無機物と有機物とを結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を与えるエトキシ基またはメトキシ基を有し、他端にチオール基（メルカプト基）、アミノ基、エポキシ基（グリシジル基）、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物に結合する。従来用いられているシランカップリング剤としては、例えば、メルカプトプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。
【００２２】
シランカップリング剤は、公知の手法を用いて反応させることにより、酸素原子を介して蛍光ナノ粒子と結合させることが可能である。例えば、以下に示すような手順の通りである。まず、Ｓｉをコア／ＳｉＯ２をシェルとするナノ粒子内包シリカを調整し、これを過酸化水素水中に分散させ、シェルの表面を水酸化させる。続いて、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランを添加して２時間程度かけて反応させることにより、シェルの表面にメルカプトプロピルトリエトキシシランが導入される。
【００２３】
また、上記シランカップリング剤の代わりに、ジメルカプトコハク酸や１１−メルカプトウンデカン酸などを用いて表面結合部位を形成することもできる。例えば、後述するような逆ミセル法により半導体ナノ粒子を製造した場合、その表面はＴＯＰＯ（ｔｒｉ−ｎ−ｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ）などで被覆されているが、これとジメルカプトコハク酸または１１−メルカプトウンデカン酸とを置換反応させることが可能である。これにより、ジメルカプトコハク酸または１１−メルカプトウンデカン酸は硫黄原子を介してナノ粒子内包シリカの表面に結合するが、他端にはカルボキシル基を有するため、後述するような生体物質結合部位を形成するための化合物を結合させることができる。
【００２４】
さらに、本発明において、ナノ粒子内包シリカに直接結合する化合物と、生体物質結合修飾基および／またはリンク形成修飾基を形成するための化合物、上記シランカップリング剤などの表面結合部位を形成する化合物が、中間部位（「スペーサー」ともいう。）を介して結合するような態様であっても構わない。すなわち、該スペーサーは、ナノ粒子内包シリカに直接結合する化合物と結合しうる部位と、生体物質結合修飾基および／またはリンク形成修飾基を形成するための化合物と結合しうる部位とを有する化合物であり、このような化合物としては、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｌｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｕｌｆｏｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）などのビファンクショナルクロスリンカーと呼ばれる有機分子を用いることが可能である。
【００２５】
例えば、上記ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、アミノ基またはチオール基に対する指向性を有する反応部位を２つ有するので、その片方を例えばシランカップリング剤に結合させ、他方を生体物質結合部位を形成するための化合物との結合に用いることができる。また、ビファンクショナルクロスリンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのオキシアルキレンの両端に、表面結合部位を形成する物質に結合しうる機能性官能基と、生体物質結合部位を形成する物質とに結合しうる機能性官能基とが導入された構造のものを用いることもできる。
【００２６】
一方、生体物質結合部位は、標的とする生体物質に結合しうる、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを構成する塩基やポリヌクレオチド、インターカレーターなどの一部に、表面結合部位またはスペーサーを形成する化合物が有する官能基と結合しうる官能基をあらかじめ公知の方法に従って導入することにより、それらの化合物に結合させることが可能である。例えば、チオール基を有するシランカップリング剤と、同じくチオール基を導入したヌクレオチドとを反応させた場合、ジスルフィド結合により、修飾基にヌクレオチドが導入される。
【００２７】
また、リンク形成修飾基については、例えば、チオール基、アミノ基、カルボキシル基などの反応性官能基を２つ以上有する化合物を用いることにより導入することができる。これらの官能基のうち、１つは、前述したような水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデルワールス力などにより相互に連結するために用いられ、もう１つは、表面結合部位またはスペーサーを形成する化合物が有する官能基と結合するために用いられる。このようなリンク形成修飾基を形成するための化合物としては、例えば、ジカルボン酸類や、アミノ基およびカルボキシル基を少なくとも有する化合物であるアミノ酸などが挙げられる。
【００２８】
本発明において、上記生体物質結合修飾基およびリンク形成修飾基がそれぞれ異なる分子としてナノ粒子内包シリカの表面に導入される場合、例えば、２種類のシランカップリング剤を混合して用いるなどの手法により、それぞれの分子の表面被覆率を調整することが可能である。例えば、この手法においては、ナノ粒子内包シリカおよび生体物質結合修飾基を形成する化合物とのみ結合しうるシランカップリング剤と、ナノ粒子内包シリカおよびリンク形成修飾基を形成する化合物とのみ結合しうるシランカップリング剤を、目的とする表面被覆率の割合と同じ割合で混合し、これら２種類のシランカップリング剤を含む混合溶液とナノ粒子内包シリカとを反応させ、その後に生体物質結合修飾基およびリンク形成修飾基を含む溶液と反応させるようにすればよい。無機蛍光粒子へ結合する、結合力の順位に従って官能基の結合部位を選択することにより平衡状態での表面修飾の割合をコントロールできる。
【００２９】
（クラスター）
本発明のナノ粒子内包シリカにおいて、上述したようなリンク形成修飾基を介してナノ粒子内包シリカ同士は互いに連結し、クラスターを形成する。このクラスターを構成するナノ粒子内包シリカの数は、温度またはｐＨにより調整することが可能であることが望ましい。リンク形成修飾基同志の結合力は、例えば温度、またはｐＨなどの環境を変更したり、リンク形成修飾基の結合を妨げる修飾基を導入しその数をコントロールすることによって調整することができる。また、リンク形成修飾基として例えばオリゴヌクレオチドを利用する場合、相補的な塩基配列と相補的でない塩基配列とを混在させることにより、リンク形成修飾基の結合力を調整することも可能である。
【００３０】
また、上記クラスターを構成するナノ粒子内包シリカの数は適宜調整することができるが発光強度を充分に高めると共に、生体内の移動を妨げないようにするなどの点から、その数は２〜２０であることが好ましい。なお、クラスター中のナノ粒子内包シリカの数は、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）での観察により確認することが可能である。
【００３１】
標的とする生体物質に結合したナノ粒子内包シリカに、生体物質には直接的に結合していないナノ粒子内包シリカが連結するような態様のクラスターが形成されることにより、１分子の生体物質を従来より多数のナノ粒子内包シリカで標識することが可能である。
【００３２】
上述した本発明の蛍光標識物質は、従来の蛍光標識物質を用いて行われていた各種分析において好適に利用することが可能である。このような分析としては、例えば、固定細胞を用いた免疫染色、レセプター・リガンドのリアルタイムトラッキング、１分子イメージングなどが挙げられる。これらの分析において、本発明の蛍光標識物質により形成されたクラスターは、蛍光標識物質が単独である場合と比較して、より強力な蛍光を発するため、生体物質の検出精度を向上させることが可能となる。
【００３３】
（蛍光標識物質を用いた分析方法）
本発明の蛍光標識剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝子情報を持つ、生体物質を対象とした各種分析に用いることができるが、とりわけ下記のような分析に好適に用いることができる。
【００３４】
例えば、生体物質結合部位にアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはそれぞれの塩基を有するヌクレオチドを導入した、異なる波長の蛍光を発する４種類の蛍光標識剤は、それぞれの対応する塩基を有するｓｓＤＮＡまたはヌクレオチドに結合する。したがって、それらの４種類の結合標識剤を用いて、未知の塩基配列のｓｓＤＮＡの個々の塩基に蛍光標識剤を結合させた場合、これに励起光を照射し、蛍光の配列を読みとることにより、ｓｓＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる。また、未知の塩基配列のｓｓＤＮＡを、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性または５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でヌクレオチドを１分子ずつ切断し、次々と切り離されるヌクレオチドのそれぞれに上記４種類の蛍光標識剤のいずれかを結合させるようにした場合、結合した蛍光標識剤が発する蛍光を高感度の蛍光検出器を用いて経時的に検出することにより、ｓｓＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる。
【００３５】
Ｓｉナノ粒子内包シリカの表面修飾に用いられる物質としては、表２に挙げた各種シランカップリング剤とそれらの各種クロスリンキング剤との共役体、各種タンパク質、各種ＰＥＧ修飾剤が挙げられる。このようなシリカ球表面の修飾により、多種多様な機能を付与することができ、各種応用技術への適用が可能となる。
【００３６】
例えば、シリカ球表面をＰＥＧ系修飾剤で修飾することにより、非特異吸着が起こらない生体適合性を有するナノ粒子内包シリカとなり、細胞の染色、特に細胞の経時変化を観察する際に有効な蛍光プローブとなる。また、シリカ球表面に抗体を導入したナノ粒子内包シリカを感度が課題となっているイムノクロマトグラフィーに利用することで、高感度イムノクロマトグラフィーが可能となる。また、抗体を導入したナノ粒子内包シリカはウエスタンブロット等の各種分子生物学アッセイで有効な高輝度蛍光プローブとして使用することができる。また、表面にビオチンを導入したナノ粒子内包シリカはアビジン化タンパク質の選択的標識を可能とし、特定のタンパク質のイメージングに有効な高輝度蛍光プローブとして利用できる。
【００３７】
本発明のＳｉナノ粒子内包シリカは、化学的に安定でありながら表面修飾が容易である。すなわち、表面修飾による生体適合性の付与や特定のタンパク質と結合するためのアクセプター分子を表面に固定することが可能である。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
＜Ｓｉナノ粒子内包シリカ球の製造＞
以下にＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子および該ナノ粒子を内包するシリカ球のより詳細な製造方法を説明する。
【００４０】
高周波スパッタリング装置にアルゴンガスを導入し、イオン化されたアルゴンイオンをターゲット材料であるシリコンチップと石英ガラスへ衝突させ、ターゲット材料から放出された原子や分子が半導体基板上に堆積し、シリコン原子と酸素原子が混ざり合ったアモルファスＳｉＯｘ膜を形成する。前記アモルファスＳｉＯｘ膜が形成された半導体基盤をアルゴンガス等の不活性ガス雰囲気下９００℃で１時間熱処理を行った。
【００４１】
次に、前記半導体基板をフッ酸蒸気にさらすことで表面処理する。膜表層に露出させたナノシリコンを３日ほど自然酸化させると、レーザー照射した際に発光するＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子となった。
【００４２】
前記半導体基板をエタノール中で超音波処理することにより、エタノール中にＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子を分散させる。エタノールを濃縮することによりＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子粉末が得られた。
【００４３】
上述の方法により得られた粒径約２．５ｎｍのＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子３ｍｇを１ｍｌのエタノール溶液に再度分散させた。このＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子分散液から５０μＬを採取し、エタノール３．９５ｍｌ中に加えた。これに、シリカ化合物としてテトラエトキシシラン（Ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）５０μＬ、蒸留水１ｍｌ、２７質量％のアンモニア水溶液を１００μＬ加えて２４時間撹拌した。なお、反応液中のエタノールと蒸留水の容積比は４：１となっている。反応終了後、反応液を遠心式濃縮メンブレン（アミコンウルトラ−４、１００Ｋ、ミリポア社）を使用し、蒸留水を用いたろ過洗浄を数回繰り返して３ｍｌの分散液を得た。
【００４４】
＜Ｓｉナノ粒子内包シリカ球合成反応前後の蛍光特性＞
反応前の混合液と反応後の反応終了液について、それぞれ蛍光スペクトルを測定した。なお、測定では励起スリット幅は５ｎｍ、蛍光スリット幅は５ｎｍとしたときの５６０ｎｍの蛍光強度を読み取った。励起波長を３５０ｎｍとして測定したところ、反応前後の蛍光強度はそれぞれ１０３．４５（反応前）と２３７．９４（反応後）であり、反応によって約２．３倍蛍光強度が増加したことがわかった。
【００４５】
＜１粒子あたりのナノ粒子数＞
得られた分散液中のＳｉナノ粒子内包シリカを透過型電子顕微鏡で観察したところ、直径約２０ｎｍの粒子像が観察された。さらに、直径約２０ｎｍの粒子内にはＳｉナノ粒子と考えられる直径１．５ｎｍから２．５ｎｍの格子像が２から３個観察された。直径約２０ｎｍの粒子の顕微鏡観察を１００粒子分行い、シリカ球内部に含まれるナノ粒子数の平均を見積もった結果、シリカ球１粒子あたり６個から７個のナノ粒子が内包されていることがわかった。また、シリカ球内でナノ粒子は互いに３ｎｍから７ｎｍ離れていることがわかった。
【００４６】
＜濃度消光の有無＞
上記でえられたシリカ球についてエタノール中、励起波長３５０ｎｍで定常光ではなく、ナノ秒オーダーのパルス光を照射し、一回のパルス光で励起され発光した蛍光ピーク強度を測定した。この結果は、同様にして測定したＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子のエタノール分散液の結果とほぼ同じであったことから（蛍光寿命：１３．５ｎｓｅｃ）、Ｓｉナノ粒子内包シリカ内のナノ粒子は濃度消光を起こしていないことがわかった。
【００４７】
＜表面にＮＨ２基を有すＳｉナノ粒子内包シリカの作製と修飾＞
ナノ粒子内包シリカの水分散液０．５ｍｌを、４．５ｍｌの４ｍＭ  ３−（アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＳ）とともに室温下で１２時間反応させた。これにより、シリカ球にＡＰＳを付着させて表面にアクセプター基としてＮＨ２基を有するシリカ球を作製した。
【００４８】
＜Ｓｉナノ粒子内包シリカを用いたタンパク質標識＞
上記の表面にＮＨ２基を有する発光波長７５０ｎｍのシリカ球１ｍｇをＰＢＳ２ｍｌ中に分散させ、ＮＨＳ化したビオチン（ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ、テクノケミカル）１ｍｇを添加し３時間撹拌した。反応終了後、反応液を遠心式濃縮メンブレン（アミコンウルトラ−４、１００Ｋ、ミリポア社）を使用し、ＰＢＳを用いたろ過洗浄を数回繰り返して３ｍｌの分散液を得た。このようにして調整したビオチン／シリカ球分散液５００μＬを、Ｃ末端をアビジン化したＧＣＮ５  Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎタンパク質ＰＢＳ溶液（５μＭ）３ｍｌ中に添加し、タンパク質とナノ粒子内包シリカを結合させた。
【００４９】
＜Ｓｉナノ粒子内包シリカを用いたタンパク質一分子イメージング＞
発光波長７５０ｎｍ、Ｓｉナノ粒子間距離３ｎｍから７ｎｍのＳｉナノ粒子内包シリカで標識したＧＣＮ５  Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎタンパク質ＰＢＳ溶液（５μＭ）３ｍｌに、別途調整した発光波長５５０ｎｍのナノ粒子内包シリカをＣ末端側に結合させた２０残基のヒストンＨ４テール・ペプチド−を添加した。すると、ＧＣＮ５  Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎタンパク質分子と一部のヒストンＨ４テール・ペプチドが結合する様子を共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ１０００−Ｄ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）上で確認することができた。ここへ、発光波長６５０ｎｍのナノ粒子内包シリカをＣ末端側に結合させ、１６位のＬｙｓ残基をアセチル化した２０残基のヒストンテール・ペプチドを添加した。このとき、ＧＣＮ５  Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎタンパク質結合サイト上でＬｙｓ１６アセチル化ヒストンテール・ペプチドが非アセチル化ペプチドと入れ替わる様子を確認できるか各標識剤を用いてテストした結果を表３に示す。
【００５０】
Ｓｉ粒子間距離３ｎｍから７ｎｍかつシリカ球内Ｓｉ粒子数が５個以上であるナノ粒子内包シリカを標識剤に用いた場合、ペプチドが入れ替わる様子を容易に確認することができた。
【００５１】
一方、Ｓｉ粒子間距離３ｎｍから７ｎｍかつシリカ球内Ｓｉ粒子数が４個以下であるナノ粒子内包シリカを用いた場合、ペプチドの入れ替わりを確認できたが、一部低輝度粒子も見られた。粒子間距離１０ｎｍ以上かつシリカ球内Ｓｉ粒子数が５個以上であるのＳｉナノ粒子内包シリカを用いた場合、低輝度であったがかろうじてタンパク質分子の入れ替わりを判断することができた。粒子間距離２ｎｍから０ｎｍかつシリカ球内Ｓｉ粒子数が５個以上のＳｉナノ粒子内包シリカを用いて同様の実験を行った場合、濃度消光による低輝度化のためタンパク質分子の入れ替わりを判断することはできなかった。従来のＳｉ／ＳｉＯ２コア・シェルナノ粒子標識剤に用いて同様の実験をした場合、ペプチドの入れ替わりを確認できたが、一部低輝度粒子も見られた。
【００５２】
【表３】
0004985541.tif 000004
【００５３】
＜表面ＮＨ２基修飾Ｓｉナノ粒子内包シリカへのＰＥＧ鎖導入＞
表面ＮＨ２基修飾Ｓｉナノ粒子内包シリカ１ｍｇを１ｍｌのＰＢＳ中に分散させ、ＮＨＳ活性化エステル−ＰＥＧ［ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＯＯ−ＮＨＳ、ＭＷ５０００、日本油脂］１．５ｍｇを加えて２時間撹拌した。反応終了後、反応液を遠心式濃縮メンブレン（アミコンウルトラ−４、１００Ｋ、ミリポア社）を使用し、ＰＢＳを用いたろ過洗浄を数回繰り返すことによりＰＥＧ化Ｓｉナノ粒子内包シリカのＰＢＳ分散液を得た。
【００５４】
＜細胞染色実験＞
ＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３７℃で細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるまでインキュベートした。続いて、０．０５ｎＭから１．６ｎＭまでの濃度のＰＥＧ化Ｓｉナノ粒子内包シリカおよびＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子をそれぞれマイクロインジェクションによりＨｅＬａ細胞に導入した。なお、濃度とはＳｉナノ粒子の濃度であり、ＰＥＧ化Ｓｉナノ粒子内包シリカの濃度はシリカ球内に含まれるＳｉナノ粒子数を１０分子と仮定して計算したものである。続いて、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ１０００−Ｄ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて発光するＨｅＬａ細胞の相対蛍光強度を測定した。その結果、本発明のＰＥＧ化Ｓｉナノ粒子内包シリカで染色した場合は濃度の上昇とともに相対蛍光強度が高くなっていったのに対し、従来のＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子で染色した場合では濃度が１ｎＭ以上になると相対蛍光が低下しはじめた。その結果を図１に示す。このことから、本発明のＳｉナノ粒子内包シリカは細胞内で濃度消光を起こしていないことがわかった。
【００５５】
＜バーコード機能をもつナノ粒子内包シリカ球を用いたフローサイトメトリー法＞
発光波長の異なる量子ドットを内包するシリカ球表面をビオチン化し、アビジンを導入した抗インターロイキン抗体と結合させた。ここで、抗インターロイキン抗体は量子ドット内包シリカ球内の発光波長パターンの違いによりＩＬ１抗体、ＩＬ２抗体、ＩＬ３抗体と異なるものを結合させている。また、シリカ球内にある発光波長の異なる量子ドットの組み合わせは、バーコード機能を有することとなる。標識した量子ドット内包シリカ球と細胞より抽出したインターロイキン（ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３・・・）を含む懸濁液を混合し１時間インキュベートし、各インターロイキンと抗体との結合反応を進行させた。ここへ、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）を結合させたディテクション用インターロイキン抗体を添加した。この操作により、量子ドット内包シリカ上の抗体に捕捉されたインターロイキンにＰＥ標識したディテクション用抗体がサンドイッチ状に挟み込む反応が進行する。１時間インキュベートした後、リン酸バッファによる洗浄を行った。得られたサンプルをフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ  ＡＤＣ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）にかけ、多種類のインターロイキンの同時解析が可能か調べた。その結果を表４にまとめる。解析の結果、多種類のインターロイキン同時解析にはシリカ球内のＳｉ量子ドット間の距離が大きく影響していることがわかった。シリカ球内のＳｉ量子ドット間距離が３ｎｍから７ｎｍである場合、高発光強度による高感度検出が可能であった。一方で、Ｓｉ量子ドット間距離が１０ｎｍ以上である場合、または０ｎｍから２ｎｍである場合、発光強度の低下により検出困難または検出不可という結果であった。以上の結果より、多種類インターロイキンの同時検出にはＳｉ粒子間距離が３ｎｍから７ｎｍであることが重要であることがわかった。
【００５６】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】細胞染色実験での相対蛍光強度を本発明と従来法とで比較した図である。
【図１】
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