(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭＺの預け番号がＤＳＭ２１７４７であり、キチナーゼ、キトサナーゼ、および、ナットウキナーゼを生産する菌株である、シュードモナス属菌株ＴＫＵ０１５。
【請求項２】
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）菌株ＴＫＵ０１５は、蝦殻粉を唯一の炭素／窒素源の液体培地とし、土壌から篩い分けて培養してなることを特徴とする請求項１に記載のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）菌株ＴＫＵ０１５。
【請求項３】
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）菌株ＴＫＵ０１５は、採集された土壌を無菌水により適当な濃度に希釈した後に、０．２〜１．５％の蝦殻粉（ＳＳＰ）、０．０５〜０．２％のＫ２ＨＰＯ４、０．０２〜０．１％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏと０．５〜３％のアガー（ａｇａｒ）を含む固体培地に塗布し、しばらくの時間を培養して得ることを特徴とする請求項２に記載のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）菌株ＴＫＵ０１５。
【請求項４】
請求項１に記載のシュードモナス属菌株ＴＫＵ０１５を培養して得られる培養物の上澄み液であって、キチナーゼ、キトサナーゼとナットウキナーゼを同時に具する、培養物の上澄み液。
【請求項５】
シュードモナス属菌株ＴＫＵ０１５を、液体培地（０．２〜１．５％の蝦殻粉（ＳＳＰ）、０．０５〜０．２％のＫ２ＨＰＯ４、０．０２〜０．１％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）により培養し、遠心して取得される上澄み液であることを特徴とする、請求項４に記載の上澄み液。
【請求項６】
シュードモナス属菌株ＴＫＵ０１５を、０．５％の蝦殻粉、０．１％のＫ２ＨＰＯ４および０．０５％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有するｐＨ８の液体培地によって３０℃で３日間振とう培養し、得た発酵の上澄み液を、硫酸アンモニウム沈殿およびクロマトグラフィー工程によって分離、純化して得られるキチナーゼおよびキトサナーゼを生産する方法。
【請求項７】
請求項１に記載のシュードモナス属菌株ＴＫＵ０１５を利用して、キチン含有水産加工廃棄物を発酵し、請求項４に記載の上澄み液を生産、製成し、該上澄み液からナットウキナーゼを分離純化する工程を含むことを特徴とする、ナットウキナーゼの製造方法。
【請求項８】
該キチン含有の水産加工廃棄物は、蝦蟹殻、イカ軟骨、菌茸類と粗製キチンを含むことを特徴とする請求項７に記載のナットウキナーゼの製造方法。
【請求項９】
該キチン含有の水産加工廃棄物の蝦殻粉の濃度範囲は、０．１〜３％の間にあり、より好ましい範囲が０．２〜１．５％の間にあることを特徴とする請求項７に記載のナットウキナーゼの製造方法。
【請求項１０】
シュードモナス属菌株ＴＫＵ０１５を利用してキチン含有の水産加工廃棄物を発酵する工程を、該菌株を、０．２〜１．５％の蝦殻粉、０．０５〜２％のＫ２ＨＰＯ４と０．０２〜０．１％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有する液体培地により培養することによって行うことを特徴とする、請求項７に記載のナットウキナーゼの製造方法。
【請求項１１】
シュードモナス属菌株ＴＫＵ０１５を利用してキチン含有の水産加工廃棄物を発酵する工程を、該菌株を、１％の蝦殻粉、０．１％のＫ２ＨＰＯ４と０．０５％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有するｐＨ７の液体培地１００ｍｌにより、３０℃で２日間培養することによって行うことを特徴とする、請求項７に記載のナットウキナーゼの製造方法。
【請求項１２】
該分離純化処理は、下記の工程を含み、
ａ．粗酵素液の製成：前記上澄み液を遠心分離し、得られた上精液を硫酸アンモニウムによって沈殿させ、生じた沈殿物を遠心分離によって回収し、沈殿物を少量のリン酸緩衝液に懸濁し、得られた液をリン酸緩衝液に対して一晩透析して粗酵素液を得る工程、
ｂ．陰イオンの交換クロマトグラフィー：粗酵素液をカラムへ注入してカラムクロマトグラフィーを行い、リン酸緩衝液で未吸着のタンパク質を溶出し、続いて塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液により吸着されたタンパク質を溶出し、ナットウキナーゼを未吸着画分から回収する工程、
ｃ．疎水性クロマトグラフィー：ナットウキナーゼ溶液をカラムへ注入し、硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液により溶出し、且つカラム内の疎水度合を変更し、異なる疎水度合に基づいて分離の目的を達成する工程、
ナットウキナーゼを純化することを特徴とする請求項７に記載のナットウキナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）新種菌株、および該新種菌株を使用してキチナーゼ（chitinase）、キトサナーゼ(chitosanase)とナットウキナーゼ(Nattokinase)を生産する製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
大豆の自身がプラスミン(plasmin)を含有しておらず、蒸煮された大豆には納豆菌（Bacillus natto）又は枯草菌(Bacillus
subtilis)の接種を経由して納豆の発酵生産を行う必要があり、このようなキナーゼは、主として納豆表面の粘性物質中に分布され、且つナットウキナーゼ(nattokinase)と命名される。ナットウキナーゼが血栓の溶解酵素で、脳卒中、心筋梗塞などの心臓血管疾病の防止または改善に対し有効だけではなく、脳内の微細な血管の塞ぎにより引き起こされた老人の痴呆症に対し、効果もを具する。
【０００３】
人体内にフィブリンを直接に溶解できる酵素が、プラスミン(plasmin)のみである。通常血液中には、プラスミノゲン（plasminogen）と称するプラスミン前駆体(plasmin
precursor)が含有される。いわゆる線維素溶解系（fibrinolytic system）酵素は、プラスミンをプラスミンのプラスミノゲン賦活剤（plasminogen
activator）の一種に賦活することを言う。然しながら、ナットウキナーゼの性質がプラスミンに類似し、血清中のフィブリンを溶解でき、ウロキナーゼ前駆体の賦活剤（pro-urokinase
activator）をプロウロキナーゼ（prourokinase）に間接的に作用し、ウロキナーゼ（urokinase）を生成し、再びウロキナーゼをプラスミノゲン（plasminogen）に作用し、プラスミンを形成し、ひいてはプラスミンにより血栓を溶解し、血栓減成物を形成し、プラスミンの増加を介して血栓の形成を減少する。
【０００４】
ナットウキナーゼは、納豆の発酵により取得される以外に、細菌、放線菌、真菌と藻類の中からも、この種類の酵素が存在することを見出す。但し、目前に未だシュードモナス属（Pseudomonas
sp.）又はバチルス種（Bacillus sp.）以外の細菌によりナットウキナーゼを生産する従来の技術がない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蝦蟹殻廃棄物がタンパク質とキチンを多く含み、微生物を利用してこれを発酵し、高付加価値を具する生理活性物質を生産できれば、このような水産加工廃棄物の環境保護問題を解決、処理できるだけではなく、更にナットウキナーゼの生産により、その利用価値を向上できる。
【０００６】
本発明の目的は、即ちTKU015と命名されるシュードモナス属（Pseudomonas sp.）新種菌株（遺伝子ライブラリー番号EU103629、DSMZ
GmbHh（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）、預け番号DSM
21747）を提供するもので、それはキチナーゼ、キトサナーゼ及びナットウキナーゼの生産菌と見なすことが出来る。
【０００７】
本発明の他の目的は、ナットウキナーゼの生産方法を提供するもので、それが該新種菌株TKU015を利用し、キチン含有の水産加工廃棄物を発酵して生産することにより、このような水産加工廃棄物の環境保護問題を解決、処理できるだけではなく、更にナットウキナーゼの生産により、その利用価値を向上できる。
【０００８】
その中でも、TKU015と命名される新種菌株（以下、TKU015と略称）は、蝦殻粉を唯一の炭素／窒素源とし、台湾北部の土壌から篩い分けられた一株のキチナーゼ及びキトサナーゼの生産菌がシュードモナス属（Pseudomonas
sp.）と鑑定される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
該シュードモナス属（Pseudomonas sp.）新種菌株TKU015を利用してキチン含有の水産加工廃棄物を発酵することにより、ナットウキナーゼを生産、製成できる。該キチン含有の水産加工廃棄物は、蝦蟹殻、イカ軟骨、菌茸類と粗製キチンを含むが、該キチン含有の水産加工廃棄物の濃度範囲は、0.1〜3％の間にあり、より好ましい範囲が0.2〜1.5％の間にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
TKU015がキチナーゼ及びキトサナーゼを生産する培養条件は、より好ましくは0.5％の蝦殻粉、0.1％のK2HPO4と0.05％のMgSO4・7H2Oを含有する液体培地（pH8）には、30℃に瓶揺れして3日間培養するものである。取得された発酵の上澄み液が、硫酸アンモニウムの沈殿、陰イオンカラム(DEAE
Sepharose)、疎水吸着樹脂（Phenyl-Sepharose）及びゲル濾過カラム（Sephacryl S-100）などのクロマトグラフィー工程を経つことにより、キチナーゼ及びキトサナーゼを純化し、エスディーエスペイジ（SDS-PAGE）を経ってその分子量を測定し、夫々68kDa及び30kDaとなる。最適な反応pH値、最適な反応温度、pH値の安定性、熱安定性の方面について、キチナーゼがpH
5、50℃、pH 5〜7及び＜60℃で、キトサナーゼがpH 4、50℃、pH 3〜9及び＜50℃である。キチナーゼの活性がMn2+、Fe2+により抑制され、キトサナーゼの活性がMn2+、Cu2+、PMSFにより抑制される。
【００１１】
TKU015がナットウキナーゼを生産する生産条件は、より好ましくは1％の蝦殻粉、0.1％のK2HPO4と0.05％のMgSO4・7H2Oを含有する液体培地（pH
7）には、30℃に瓶揺れして2日間培養するものである。取得された発酵の上澄み液が、硫酸アンモニウムの沈殿、陰イオンカラム(DEAE-Sepharose)及び疎水吸着樹脂（Phenyl-Sepharose）などのクロマトグラフィー分離工程を経つことにより、ナットウキナーゼを純化する。エスディーエスペイジ（SDS-PAGE）を経ってその分子量を測定し、21kDaとなり、その最適な反応pH値、最適な反応温度、pH値の安定性、熱安定性が、夫々pH
7、50℃、pH 4〜11及び＜37℃となる。ナットウキナーゼの活性がPMSFにより完全に抑制され、Fe2+によりその活性を向上できる。
【実施例】
【００１２】
［TKU015新種菌株の篩い分け］
採集された土壌が、無菌水により適当な濃度に希釈した後に、1％の蝦殻粉（SSP）、0.1％のK2HPO4、0.05％のMgSO4・7H2Oと1.5％のアガー（agar）を含む固体培地に塗布し、30℃に2日間培養し、細菌群体
(colony)成長状況を観察し、更に単一の細菌群体を夫々NA培地に接種し、30℃に1日間培養した後に、4℃に保管して予備する。篩い分けて取得された単一の菌株に対し、液体培地（1％の蝦殻粉（SSP）、0.1％のK2HPO4、0.05％のMgSO4・7H2O）にて瓶揺れして培養し、100mLの液体培地が250mLのテーパー瓶の中に30℃、瓶揺れして2日間培養し、その遠心の上澄み液を採取し、含まれたキチナーゼ及びキトサナーゼの活性をテストする。
【００１３】
［TKU015新種菌株の特性］
例えば図1に示す顕微鏡写真は、該TKU015がグラム陰性桿菌で、カタラーゼ、オキシダーゼと運動性を具し、好気性および嫌気性の環境下では、何れも成長し、胞子を生成することがない。
【００１４】
また、例えば図2に示す16S rDNA部分核酸配列の分析の通りで、TKU015がシュードモナス属（Pseudomonas sp.）に最接近し、相似度が97％以上に達する。
【００１５】
葡萄糖代謝タイプの結果に基づき、TKU015が酸化タイプでシュードモナス属（Pseudomonas sp.）の陳述に合致することを示す。
【００１６】
脂肪酸の組成成分の分析に基づき、TKU015の主要な脂肪酸がＣ１６：０とＨ１８：１ω７ｃで、且つ水酸化脂肪酸（hydroxylated
fatty acids）Ｃ１０:０ ３ＯＨ、Ｃ１２:０ ２ＯＨ、とＣ１２:０ ３ＯＨを含有し、Ｃ１６:０
２ＯＨ、とＣ１６:０ ３ＯＨが不足し、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）の陳述に合致する。
【００１７】
［キチンの製成］
ａ．3：40（w／v）の比にてイカ軟骨粉と2Nの水酸化ナトリウム溶液を混合し、100℃の水浴に30分間浸漬し、濾過を経って残り滓と濾過液を取得でき、60℃に残り滓を乾燥し且つ秤量する。乾燥して取得された残り滓が、1：8（w／v）の比にて2Nの塩酸溶液と混合し、室温下で2日間浸漬し、濾過を経って残り滓と濾過液を取得でき、60℃に残り滓を乾燥し且つ秤量する。
【００１８】
ｂ．前記のイカ軟骨粉末を5g取り、ゆっくり12Nの塩酸溶液を50mL注し入れ、均一に1時間攪拌した後に、これを蒸留水の中に注し入れ、沈殿した後に上澄み液を除去し、更に50mLのpH
7の燐酸緩衝溶液により洗浄し、上澄み液のpH値が7となるまでに工程を繰り返し、上澄み液を除去して取得された沈殿物が、即ち浮遊状態のキチンで、4℃に貯蔵して予備し、キチナーゼの活性測定のマトリックスと見なす。
【００１９】
TKU015がキチナーゼ及びキトサナーゼを生産する培養条件は、より好ましくは0.5％の蝦殻粉、0.1％のK2HPO4と0.05％のMgSO4・7H2Oを含有する液体培地（pH
8）には、30℃に瓶揺れして3日間培養するものである。取得された発酵の上澄み液が、硫酸アンモニウムの沈殿、陰イオンカラム(DEAE-Sepharose)、疎水吸着樹脂（Phenyl-Sepharose）及びゲル濾過カラム（Sephacryl
S-100）などのクロマトグラフィー工程を経つことにより、キチナーゼ及びキトサナーゼを純化し、エスディーエスペイジ（SDS-PAGE）を経ってその分子量を測定し、夫々68kDa及び30kDaとなる。最適な反応pH値、最適な反応温度、pH値の安定性、熱安定性の方面について、キチナーゼがpH
5、50℃、pH 5〜7及び＜60℃で、キトサナーゼがpH 4、50℃、pH 3〜9及び＜50℃である。キチナーゼの活性がMn2+、Fe2+により抑制され、キトサナーゼの活性がMn2+、Cu2+、PMSFにより抑制される。
【００２０】
［ナットウキナーゼの活性測定］
キチナーゼ生産のより好ましい培養条件（0.5％の蝦殻粉（SSP）、0.1％のK2HPO4、0.05％のMgSO4・7H2O、pH
8、100mL／250mL、30℃に3日間培養）により取得された上澄み液は、夫々カゼイン（casein）及び人工合成マトリックス（N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa）をマトリックスとし、そのプロテイナーゼの活性を測定する。カゼイン（casein）をマトリックスとする時に、まだ活性を測定できないが、但し、人工合成マトリックス（N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa）をマトリックスとする時に、活性を表現し、酵素がナットウキナーゼの活性（0.02
FU／mL）を含有することを、意味する。前記の結果を総合し、TKU015のSSPにより培養して取得された上澄み液は、同時にキチナーゼ、キトサナーゼ及びナットウキナーゼに存在する。
【００２１】
［炭素／窒素源の選択］
キチナーゼ生産のより好ましい生産条件により取得された上澄み液は、同時にキトサナーゼ及びナットウキナーゼの活性も存在するが、上澄み液の培養中では、より大きな効果と利益を得るように求めるために、ナットウキナーゼの炭素源がSSPを主として、更にその異なる条件を検討する。そしてナットウキナーゼ生産のより好ましい濃度が1％のSSP（3.8
FU／mL）である（図3を参照）。
【００２２】
［ナットウキナーゼのより適当な成長条件］
例えば前記のTKU015のナットウキナーゼ生産のより適当な炭素／窒素源が1％のSSPである。異なる温度（25℃、30℃、37℃）に個別に1〜4日間培養し、結果として図4に示すように、30℃に2日間培養すれば、より好ましいナットウキナーゼ（4
FU／mL）を取得でき、30℃もキチナーゼを培養する最適な温度である。
【００２３】
より適当な培養のpH値の方面について、1％のSSPを含んで異なるpH値（5〜10）の培地には、30℃に1〜4日間培養し、結果として図5に示すように、pH 7の培地にて、より高いナットウキナーゼの活性（5
FU／mL）を取得できる。
【００２４】
異なる培養液の体積の方面について、250mLの三角テーパー瓶により、異なる体積の培地（50mL、100mL、150mL、200mL）を分けて詰め、1％のSSPを含むpH
8の培地には、30℃に1〜4日間培養し、結果として図6に示すように、培養の体積が100mLである時に、より好ましいナットウキナーゼの活性（5.5 FU／mL）を取得できる。
【００２５】
前記の実験結果を総合し、ナットウキナーゼのより適当な生産条件は、1％のSSP、0.1％のK2HPO4と0.05％のMgSO4・7H2Oを100mL含有する液体培地（pH
7）には、30℃に瓶揺れして2日間培養し、より好ましいナットウキナーゼの活性を取得できるものである。
【００２６】
図7は、0.5％のSSP、0.1％のK2HPO4と0.05％のMgSO4・7H2Oを100mL含有する液体培地（pH
8）には、30℃に瓶揺れしてシュードモナス属（Pseudomonas sp.）のTKU015を培養して取得された成長曲線図であるが、図7から分かるように、ナットウキナーゼは、二日目である時に、より好ましい活性を取得でき、培養時間の増加に連れてその活性も著しく低減し、そしてキチナーゼ及びキトサナーゼが何れも三日目である時に、より好ましい活性を取得する。
【００２７】
［ナットウキナーゼの分離純化］
粗酵素液の製成：TKU015がより適当な培養条件にて発酵液を取得し、遠心および硫酸アンモニウムの沈殿を経って取得された遠心の沈殿物を、少量の50 mMの燐酸緩衝液（pH
7）により回溶して4℃に透析した後に、取得された透析内液が即ち粗酵素液（50 mL）である。
【００２８】
陰イオンの交換クロマトグラフィー (Chromatography)：粗酵素液を管柱へ注入して陰イオンカラム(DEAE-Sepharose)CL-6Bカラムクロマトグラフィーを行い、流速が4
mL／minで、6 mL毎に収集して一管となり、未吸着のタンパク質を収集し、その後に更に1MのNaClを含有する50 mMの燐酸緩衝液（pH 7）により、0.1Mの勾配から溶離（elution）し、吸着されたタンパク質を溶離し、ナットウキナーゼが未吸着区に現れることを見出し、これを収集してナットウキナーゼ溶液（100
mL）となる。
【００２９】
疎水性クロマトグラフィー (Chromatography)：80 mLのナットウキナーゼ溶液（1Mの硫酸アンモニウムを含有する酵素液）を、疎水吸着樹脂（Phenyl-Sepharose）6
Fast Flow（FF）管柱中へ注入し、流速が4 mL／minで、6 mL毎に収集して一管となり、先ず1Mの硫酸アンモニウムを含有する50 mMの燐酸緩衝液（pH
7）により溶離し、その後に1〜0 Mの硫酸アンモニウムを含有する50 mMの燐酸緩衝液（pH 7）により、勾配から溶離し、管柱内の疎水度合を変更し、異なる疎水度合に基づいて分離の目的を達成し、最後に再び50
mMの燐酸緩衝液（pH 7）により、疎水性のタンパク質を溶離する。ナットウキナーゼの活性を具する区間（70 mL）を、収集し、酵素の特性分析を行い、且つエスディーエスペイジ（SDS-PAGE）により、その分子量を分析する。
【００３０】
総合の結果：ナットウキナーゼの純化過程中では、ナットウキナーゼが陰イオンカラム(DEAE-Sepharose) 管柱中の未吸着区に存在し、後続の疎水吸着樹脂（Phenyl-Sepharose）疎水性クロマトグラフィー分離を経ってTKU015ナットウキナーゼ（45mg）を純化できる。陰イオンカラム(DEAE-Sepharose)によるpH
7の分離結果から示すように、キトサナーゼ及びナットウキナーゼが何れも未吸着区に現れ、その両者の等電点がアルカリ性のpH値に属すべきである。
【００３１】
疎水吸着樹脂（Phenyl-Sepharose）による分離結果から示すように、勾配が形成した後に、キトサナーゼが現れ、従ってそれが疎水性タンパク質であると推測するが、勾配が形成する前に、ナットウキナーゼが現れ、従ってそれが親水性タンパク質であると推測する。ナットウキナーゼの純化倍率が5.1である。
【００３２】
［ナットウキナーゼの分子量の測定］
エスディーエスペイジ（SDS-PAGE）：12.5％のSDS-PAGEにより分子量を分析し（図8に示すように）、Lane 1（レーン ワン）が粗酵素液で、Lane
4がTKU015ナットウキナーゼで、分子量が約21kDaである。
【００３３】
結果を総合し、TKU015ナットウキナーゼ(Nattokinase)の分子量が約21 kDaで、表1に示すように、微生物ソースのナットウキナーゼの分子量が大体20〜45
kDaの間にあり、現在シュードモナス属（Pseudomonas sp.）のナットウキナーゼに関連する研究をまだ見出さず、TKU015ナットウキナーゼの分子量（21
kDa）が、細菌属に由来するナットウキナーゼの分子量よりも小さくなり、そしてその分子量がより真菌属に由来するナットウキナーゼに類似し、、例えばナラタケ（Armillaria
mellea）AMMP（21 kDa）；Rhizopus chinensis.12（18 kDa）である。表1に示すように、ナットウキナーゼが大体細菌と真菌にあることを見出し、細菌に由来する分子量が通常30
kDaの間にあり、そしてこのシュードモナス属（Pseudomonas sp.）TKU015により生産されたナットウキナーゼ(Nattokinase)の分子量が、より真菌に類似する。
【００３４】
【表１】
0004863227.tif 000002
表1の中に記載する引用文献が以下のように明記する。
【００３５】
1.Wang et al.,1999：Wang J,Wang M,Wang Y(1999)Purification and characterization
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Bacillus sp.KDO-13 isolated from soybean paste.J.Microbiol.Biotechnol.11:845-852.
【００３６】
TKU015ナットウキナーゼの最適温度および熱安定性は、夫々50℃及び＜37℃である。表1に示すように、ナットウキナーゼの最適温度および熱安定性の大部分が何れも37〜50℃及び＜50℃で、最適温度の方面について、その他の細菌属ナットウキナーゼがTKU015ナットウキナーゼに類似するのは、枯草菌（Bacillus
subtilis）KCK-7（50℃）、枯草菌株（Bacillus subtilis strain）A1（50℃）とバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）DC-4（48℃）がある。熱安定性の方面について、TKU015ナットウキナーゼが熱に対し、比較的に不安定になり、それに類似するのは、更に真菌に由来するRhizopus
chinensis.12（＜37℃）；Foｍitella fraxinea FFP2（＜40℃）,（Park et al.,2005）であるが、前述の比較結果に基づいて推測すると、シュードモナス属（Pseudomonas
sp.）TKU015のナットウキナーゼ(Nattokinase)の分子量および温度特性が、真菌に由来するナットウキナーゼに類似する。
【００３７】
TKU015のナットウキナーゼの最適なpH値及びpH安定性が、夫々pH 7及びpH 4〜11となる。表1に示すように、ナットウキナーゼの最適なpH値は、中性〜弱アルカリ性の範囲にある場合が多く、pH安定性の大部分が何れもpH
7〜10で、最適温度の方面について、その他の細菌属ナットウキナーゼがTKU015ナットウキナーゼに類似するのは、バチルス種（Bacillus sp.）KA38（pH
7）；バチルス種（Bacillus sp.）KDO-13（pH 7）；枯草菌株（Bacillus subtilis Strain）A1（pH 7）があり、pH安定性の方面について、TKU015ナットウキナーゼが弱酸ないし弱アルカリに何れも安定し、そしてpH
11には、まだ80％の活性が残留し、TKU015ナットウキナーゼに類似するのは、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）DC-4（pH 4〜11）；バチルス種スブチリシン（Bacillus sp.subtilisin）QK-2（pH 3〜12）がある。
【００３８】
表2から了解できるように、純化されたTKU015ナットウキナーゼは、PMSFにより完全に抑制され、セリン・タイプ・プロテアーゼ(Serine-type
protease）に属し、そしてFe2+によりその活性を向上できる。表1に示すように、その他の細菌属ナットウキナーゼがPMSFにより抑制されるのは、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）DC-4；バチルス種株（Bacillus sp.strain）DJ-4；バチルス菌（Bacillus subtilis）QK-2；枯草菌（Bacillus
subtilis）KCK-7；納豆菌（Bacillus natto）NK（Fujita et al.,1993）；枯草菌（Bacillus subtilis）DC33（Wang
et al.,2006）がある。Fe2+が5mMである時に、ナットウキナーゼの活性が元の活性の232％に向上し、ナットウキナーゼは、その活性がCa2+、Cu2+とMg2+の影響を受けて活性を向上し（Peng
et al.,2005）、そしてTKU015ナットウキナーゼがFe2+で、そしてCa2+、Cu2+とMg2+が酵素の活性を影響しない。
【００３９】
【表２】
0004863227.tif 000003
【００４０】
表3は、異なる界面活性剤と異なる濃度がTKU015ナットウキナーゼ(Nattokinase)に対する影響で、結果から示すように、酵素が0.5、1、2mM
SDS存在する下で、50％の活性がまだ残留し、Triton X-100が0.5、1、2％（v／v）の異なる濃度にて存在する下で、酵素は、その活性も相次いで元の活性の160％、206％、344％に向上する。SDS（0.1％）が存在する下で、同属のシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas
aeruginosa PseA）プロテアーゼについて、61％の活性がまだ残留し、Triton X-100（0.1％、0.5％）が存在する下で、PseAプロテアーゼの活性が影響を受けない（Khare
et al.,2005）。
【００４１】
【表３】
0004863227.tif 000004
【００４２】
表4は、異なる有機溶剤がTKU015ナットウキナーゼ(Nattokinase)に対する影響で、結果から示すように、アセトンが存在する下で、TKU015ナットウキナーゼが活性を150％に向上し、そしてメタノール、トルエンとキシレンが酵素の活性に影響を及ぼさず、その残りが70％の活性を維持し、エチルエテールが50％の活性に抑制し、同属のシュードモナス・プロテアーゼの方につき、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas
aeruginosa PseA）（Khare et al.,2005）は、トルエン、ジメチルホルムアミド(N,N−dimethylformamide；以下にDMFと略称)が存在する下で、活性を影響しないが、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas
aeruginosa PST-01）（Ogino et al.,1999）は、トルエン、DMF、アセトンが存在する下で、活性を影響しず、シュードモナス・エルギノーサsan-ai株（Pseudomonas
aeruginosa san-ai strain）（Lee et al.,2006）は、DMFが存在する下で、活性を影響しず、TKU015ナットウキナーゼ(Nattokinase)とPseA、PST-01及びsan-aiプロテアーゼは、同様にDMFが存在する下で、80％の活性がまだ残留し、他にTKU015ナットウキナーゼ及びPST-01プロテアーゼは、アセトンが存在する下で、活性を夫々150％と200％に向上する。安定性の方について、TKU015ナットウキナーゼと有機溶剤を混合した後に、夫々25℃と4℃に10日間放置される。結果が表5に示すように、25℃と4℃の条件下で、各種な有機溶剤が何れもナットウキナーゼの活性に影響を及ぼさず、このような現象も同様にシュードモナス（Pseudomonas）属のPseAとsan-aiプロテアーゼ（Khare
et al.,2005）、（Lee et al.,2006）に由来することを見出す。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
【表５】
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【００４５】
シュードモナス属（Pseudomonas sp.）TKU015を、蝦殻粉を炭素／窒素源とする液体培地（100mL／250mL）に培養し、30℃に夫々2、3日間培養してキチナーゼ（chitinase）、キトサナーゼ(chitosanase)とナットウキナーゼ(Nattokinase)の活性を取得でき、発酵した上澄み液が、硫酸アンモニウムの沈殿、陰イオンカラム(DEAE
Sepharose)、疎水吸着樹脂（Phenyl-Sepharose）、ゲル濾過カラム（Sephacryl S-100）などのクロマトグラフィー工程を経つことにより、純度のより高い3種類の酵素（キチナーゼ、キトサナーゼ及びナットウキナーゼ）を取得でき、エスディーエスペイジ（SDS-PAGE）を経ってその分子量を測定し、夫々68、30、21となる。酵素の最適な反応pH値、最適な反応温度、pH値の安定性、熱安定性の方面について、キチナーゼがpH
5、50℃、pH 5〜7及び＜60℃で、キトサナーゼがpH 4、50℃、pH 3〜9及び＜50℃で、ナットウキナーゼがpH 7、50℃、pH 4〜11及び＜37℃である。キチナーゼの活性がMn2+、Fe2+により抑制され、キトサナーゼの活性がMn2+、Cu2+、PMSFにより抑制され、ナットウキナーゼの活性がPMSFにより完全に抑制され、セリン・タイプ・プロテアーゼ(Serine-type
protease）に属し、Fe2+によりその活性を向上できる。有機溶剤の方面について、キチナーゼがアセトンにより影響され、キトサナーゼがアセトニトリルにより影響され、ナットウキナーゼがエチルエテールにより影響されるが、耐有機溶剤性の方面について、夫々25℃と4℃に10日間放置し、キチナーゼについて、25℃に影響を与えないのが、トルエン、キシレンとDMFであるが、その残りが何れも活性を低減し、4℃に酵素の活性を影響するのがエチルエテール、アセトニトリルとアセトンで、キトサナーゼについて、25℃に影響を与えないのが、トルエン、キシレンとDMFであるが、その残りが何れも活性を低減し、4℃に酵素の活性を影響するのがエチルエテールとアセトンで、ナットウキナーゼについて、25℃と4℃に何れも活性に対して影響しない。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
蝦蟹殻廃棄物がタンパク質とキチンを多く含み、微生物を利用してこれを発酵し、高付加価値を具する生理活性物質を生産できれば、このような水産加工廃棄物の環境保護問題を解決できるだけではなく、ナットウキナーゼの生産により、その利用価値を向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明により提供されたシュードモナス属（Pseudomonas sp.）新種菌株TKU015の顕微鏡写真である。
【図２】該新種菌株TKU015の165rDNA部分核酸配列の分析図である。
【図３】SSP濃度がTKU015ナットウキナーゼ(Nattokinase)の生産に対する影響の曲線図である。
【図４】培養温度がTKU015ナットウキナーゼ(Nattokinase)の活性化生産に対する影響の曲線図である。
【図５】pH値がTKU015ナットウキナーゼ(Nattokinase)の活性化生産に対する影響の曲線図である。
【図６】培養液体積がTKU015ナットウキナーゼ(Nattokinase)の活性化生産に対する影響の曲線図である。
【図７】該新種菌株TKU015がSSP培地に培養されて生産するキチナーゼ、キトサナーゼ及びナットウキナーゼの成長曲線図である。
【図８】該新種菌株TKU015を使用することにより生産された各種な酵素のSDS−PAGE電気泳動分析図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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