(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）イオン源と、第１の質量フィルタまたは質量分析部と、前記第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスと、前記衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部とを備える質量分析計を準備する工程、
（ｉｉ）前記第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、前記第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを固定する、比較的分解能が低い負の親イオンスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比を有する目的の第１のフラグメントイオンをモニタリングする工程を含む、質量分析の方法であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、前記方法が、
（ｉｉｉ）前記第１の質量フィルタもしくは質量分析部または前記第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い負のＭＳスキャンを実行する工程、
その直後に、（ｉｖ）前記質量分析計を正イオンモードに速やかに切り替え、前記負のＭＳスキャンから特定された情報に基づいて、少なくとも、第１の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第１の正イオン多重反応モニタリング(Multiple Reaction Monitoring)チャンネルと、第２の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第２の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルとを前記質量分析計を用いて決定する工程と、
少なくとも前記第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定する工程と、
観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定する工程とを含む工程、および
（ｖ）前記第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、前記観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して前記第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、前記第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する工程、
をさらに含む、質量分析の方法。
【請求項２】
少なくとも前記第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングする前記工程は、前記第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを固定する工程または狭い質量電荷比範囲にわたって狭い質量スキャンを実行する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルは、質量電荷比の半値幅がｘＤａとなるように構成され、ｘは、（ｉ）＜０．１；（ｉｉ）０．１〜０．２；（ｉｉｉ）０．２〜０．３；（ｉｖ）０．３〜０．４；（ｖ）０．４〜０．５；（ｖｉ）０．５〜０．６；（ｖｉｉ）０．６〜０．７；（ｖｉｉｉ）０．７〜０．８；（ｉｘ）０．８〜０．９；および（ｘ）０．９〜１．０からなる群から選択される、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）エレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＩ」）イオン源；（ｉｉ）大気圧光イオン化（「ＡＰＰＩ」）イオン源；（ｉｉｉ）大気圧化学イオン化（「ＡＰＣＩ」）イオン源；（ｉｖ）マトリックス支援レーザ脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）イオン源；（ｖ）レーザ脱離イオン化（「ＬＤＩ」）イオン源；（ｖｉ）大気圧イオン化（「ＡＰＩ」）イオン源；（ｖｉｉ）シリコン上脱離イオン化（「ＤＩＯＳ」）イオン源；（ｖｉｉｉ）電子衝突（「ＥＩ」）イオン源；（ｉｘ）化学イオン化（「ＣＩ」）イオン源；（ｘ）電界イオン化（「ＦＩ」）イオン源；（ｘｉ）電界脱離（「ＦＤ」）イオン源；（ｘｉｉ）誘導結合プラズマ（「ＩＣＰ」）イオン源；（ｘｉｉｉ）高速原子衝撃（「ＦＡＢ」）イオン源；（ｘｉｖ）液体二次イオン質量分析（「ＬＳＩＭＳ」）イオン源；（ｘｖ）脱離エレクトロスプレーイオン化（「ＤＥＳＩ」）イオン源；（ｘｖｉ）ニッケル−６３放射性イオン源；（ｘｖｉｉ）大気圧マトリックス支援レーザ脱離イオン化イオン源；および（ｘｖｉｉｉ）熱スプレーイオン源からなる群から選択されるイオン源を用いてイオンをイオン化する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
イオン源を用いて目的の分析種イオンをイオン化する前に、液体クロマトグラフィー装置を用いて前記目的の分析種イオンを時間的に分離する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の質量分析の方法。
【請求項６】
前記衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスは、（ｉ）衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｉ）表面誘起解離（「ＳＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｉｉ）電子移動解離（「ＥＴＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｖ）電子捕獲解離（「ＥＣＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｖ）電子衝突または衝撃解離フラグメンテーションデバイス；（ｖｉ）光誘起解離（「ＰＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｖｉｉ）レーザ誘起解離フラグメンテーションデバイス；（ｖｉｉｉ）赤外放射誘起解離デバイス；（ｉｘ）紫外放射誘起解離デバイス；（ｘ）ノズル−スキマ間インターフェースフラグメンテーションデバイス；（ｘｉ）インソースフラグメンテーションデバイス；（ｘｉｉ）イオン源衝突誘起解離フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｉｉ）熱または温度源フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｖ）電界誘起フラグメンテーションデバイス；（ｘｖ）磁場誘起フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉ）酵素消化または酵素分解フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉｉ）イオン−イオン反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉｉｉ）イオン−分子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｘ）イオン−原子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘ）イオン−準安定イオン反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉ）イオン−準安定分子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉｉ）イオン−準安定原子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−イオン反応デバイス；（ｘｘｉｖ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−分子反応デバイス；（ｘｘｖ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−原子反応デバイス；（ｘｘｖｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定イオン反応デバイス；（ｘｘｖｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定分子反応デバイス；および（ｘｘｖｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定原子反応デバイスからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の質量分析の方法。
【請求項７】
イオン源、第１の質量フィルタまたは質量分析部、前記第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイス、および前記衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部、ならびに
（ｉ）前記第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、前記第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを固定する、比較的分解能が低い負の親イオンスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比を有する目的の第１のフラグメントイオンをモニタリングするように構成および適合された制御システムを備える、質量分析計であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、前記制御システムがさらに、
（ｉｉ）前記第１の質量フィルタもしくは質量分析部または前記第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い負のＭＳスキャンを実行し、
その直後に、（ｉｉｉ）前記制御システムが、前記質量分析計を正イオンモードに速やかに切り替え、前記負のＭＳスキャンから特定された情報に基づいて、少なくとも、第１の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第１の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第２の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定し、
少なくとも前記第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定し、かつ
観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定する工程、および
（ｉｖ）前記制御システムが、前記第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、前記観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して前記第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、前記第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する工程が続く、
質量分析計。
【請求項８】
前記制御システムは、前記第１の多重反応モニタリングチャンネルを固定するかあるいは狭い質量電荷比範囲にわたって狭い質量スキャンを実行することによって、少なくとも前記第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングする、請求項７に記載の質量分析計。
【請求項９】
前記イオン源は、（ｉ）エレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＩ」）イオン源；（ｉｉ）大気圧光イオン化（「ＡＰＰＩ」）イオン源；（ｉｉｉ）大気圧化学イオン化（「ＡＰＣＩ」）イオン源；（ｉｖ）マトリックス支援レーザ脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）イオン源；（ｖ）レーザ脱離イオン化（「ＬＤＩ」）イオン源；（ｖｉ）大気圧イオン化（「ＡＰＩ」）イオン源；（ｖｉｉ）シリコン上脱離イオン化（「ＤＩＯＳ」）イオン源；（ｖｉｉｉ）電子衝突（「ＥＩ」）イオン源；（ｉｘ）化学イオン化（「ＣＩ」）イオン源；（ｘ）電界イオン化（「ＦＩ」）イオン源；（ｘｉ）電界脱離（「ＦＤ」）イオン源；（ｘｉｉ）誘導結合プラズマ（「ＩＣＰ」）イオン源；（ｘｉｉｉ）高速原子衝撃（「ＦＡＢ」）イオン源；（ｘｉｖ）液体二次イオン質量分析（「ＬＳＩＭＳ」）イオン源；（ｘｖ）脱離エレクトロスプレーイオン化（「ＤＥＳＩ」）イオン源；（ｘｖｉ）ニッケル−６３放射性イオン源；（ｘｖｉｉ）大気圧マトリックス支援レーザ脱離イオン化イオン源；および（ｘｖｉｉｉ）熱スプレーイオン源からなる群から選択される、請求項７または８に記載の質量分析計。
【請求項１０】
イオン源を用いて目的の分析種イオンをイオン化する前に、前記目的の分析種イオンを時間的に分離するように構成および適合された液体クロマトグラフィー装置をさらに含む、請求項７〜９のいずれかに記載の質量分析計。
【請求項１１】
１つ以上のイオンガイドならびに／または
１つ以上のイオン移動度分離デバイスおよび／もしくは１つ以上のフィールド非対称イオン移動度分光計デバイスならびに／または
１つ以上のイオントラップもしくは１つ以上のイオントラップ領域をさらに備える、請求項７〜１０のいずれかに記載の質量分析計。
【請求項１２】
前記衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスは、（ｉ）衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｉ）表面誘起解離（「ＳＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｉｉ）電子移動解離（「ＥＴＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｖ）電子捕獲解離（「ＥＣＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｖ）電子衝突または衝撃解離フラグメンテーションデバイス；（ｖｉ）光誘起解離（「ＰＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｖｉｉ）レーザ誘起解離フラグメンテーションデバイス；（ｖｉｉｉ）赤外放射誘起解離デバイス；（ｉｘ）紫外放射誘起解離デバイス；（ｘ）ノズル−スキマ間インターフェースフラグメンテーションデバイス；（ｘｉ）インソースフラグメンテーションデバイス；（ｘｉｉ）イオン源衝突誘起解離フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｉｉ）熱または温度源フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｖ）電界誘起フラグメンテーションデバイス；（ｘｖ）磁場誘起フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉ）酵素消化または酵素分解フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉｉ）イオン−イオン反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉｉｉ）イオン−分子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｘ）イオン−原子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘ）イオン−準安定イオン反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉ）イオン−準安定分子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉｉ）イオン−準安定原子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−イオン反応デバイス；（ｘｘｉｖ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−分子反応デバイス；（ｘｘｖ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−原子反応デバイス；（ｘｘｖｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定イオン反応デバイス；（ｘｘｖｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定分子反応デバイス；および（ｘｘｖｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定原子反応デバイスからなる群から選択される、請求項７〜１１のいずれかに記載の質量分析計。
【請求項１３】
（ｉ）イオン源と、第１の質量フィルタまたは質量分析部と、前記第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスと、前記衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部とを備える質量分析計を準備する工程、
（ｉｉ）イオンが前記第１の質量フィルタまたは質量分析部によって選択される質量電荷比をスキャンしながら、イオンが前記第２の質量フィルタまたは質量分析部によって選択される質量電荷比を固定する、比較的分解能が低い負の親イオンスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比を有する目的の第１のフラグメントイオンをモニタリングする工程を含む、質量分析の方法であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、前記方法が、
（ｉｉｉ）イオンが前記第１の質量フィルタもしくは質量分析部または前記第２の質量フィルタもしくは質量分析部によって選択される質量電荷比をスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い負のＭＳスキャンを実行する工程、
その直後に、（ｉｖ）前記質量分析計を正イオンモードに速やかに切り替え、前記負のＭＳスキャンから特定された情報に基づいて、少なくとも、第１の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第１の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第２の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルとを前記質量分析計を用いて決定する工程と、
少なくとも前記第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定する工程と、
観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定する工程とを含む工程、および
（ｖ）イオンが前記第１の質量フィルタまたは質量分析部によって選択される質量電荷比を、前記観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して前記第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比に対応するように設定し、イオンが前記第２の質量フィルタまたは質量分析部によって選択される質量電荷比をスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する工程、
をさらに含む、質量分析の方法。
【請求項１４】
イオン源、第１の質量フィルタまたは質量分析部、前記第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイス、および前記衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部、ならびに
（ｉ）イオンが前記第１の質量フィルタまたは質量分析部によって選択される質量電荷比をスキャンしながら、イオンが前記第２の質量フィルタまたは質量分析部によってが選択される質量電荷比を固定する、比較的分解能が低い負の親イオンスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比を有する目的の第１のフラグメントイオンをモニタリングするように構成および適合された制御システムを備える、質量分析計であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、前記制御システムがさらに、
（ｉｉ）イオンが前記第１の質量フィルタもしくは質量分析部または前記第２の質量フィルタもしくは質量分析部によって選択される質量電荷比をスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い負のＭＳスキャンを実行し、
その直後に、（ｉｉｉ）前記制御システムが、前記質量分析計を正イオンモードに速やかに切り替え、前記負のＭＳスキャンから特定された情報に基づいて、少なくとも、第１の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第１の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第２の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定し、
少なくとも前記第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定し、かつ
観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定する工程、および
（ｉｖ）前記制御システムが、イオンが前記第１の質量フィルタまたは質量分析部によって選択される質量電荷比を、前記観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して前記第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比に対応するように設定し、イオンが前記第２の質量フィルタまたは質量分析部によって選択される質量電荷比をスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する工程が続く、
質量分析計。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年５月２９日に出願された米国仮出願第６１／１８２,１２３号および２００９年５月２９日に出願された英国特許出願第０９０９２８５．９号の優先権および恩典を主張するものである。これら出願の全ての内容は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、質量分析の分野に関し、特に、翻訳後修飾ペプチドの質量分析計を用いた検出および同定に関する。
【０００３】
ペプチドは、ｍＲＮＡメッセージをタンパク質配列へと翻訳する処理の際にアミド結合を介して互いに結合した一般に存在する２０のアミノ酸で構成される。これらのポリペプチドの翻訳後修飾は広範に生じ、これらの修飾から生物学的機能が推測される場合が多いことが今では広く理解され認められている。相当数の修飾が生じ、一般的な修飾としては、リン酸化、グリコシル化、ミリスチル化、アセチル化、メチル化およびユビキチン化（ubiquinylation）がある。
【０００４】
様々な産業でタンデム四重極質量分析計が広く使用されている。公知のタンデム四重極質量分析計は、第１の分解四重極質量フィルタ（ＭＳ１）および、その後に続く、当該第１の四重極質量フィルタの下流に配置されたガス充填衝突セルを備える。第２の分解四重極（ＭＳ２）が衝突セルの下流に配置される。従来、衝突セルは非分解四重極ロッドセットを備える場合が多いことから、これらの機器は「三連四重極」として知られている。
【０００５】
タンデム四重極質量分析計の一般的な動作モードは多重反応モニタリング(Multiple Reaction Monitoring)（「ＭＲＭ」）として知られており、このモードにおいて、第１の四重極質量フィルタＭＳ１は、所定のプリカーサーイオンあるいは親イオンのみを移送するように設定され、当該イオンは、次に、衝突セルにおいてフラグメンテーションされる。得られたフラグメントイオンは、次に、質量フィルタとして動作し、１つの所定のフラグメントイオンのみをイオン検出器へと前方移送するように設定された第２の四重極質量分析部（ＭＳ２）へ移送される。したがって、得られた検出信号は、特異性が高く、また感度が高いものとなる。
【０００６】
上記公知のタンデム四重極機器の別の一般的な動作モードは「プリカーサーイオンあるいは親イオンスキャン」として知られており、このモードにおいて、第１の四重極質量フィルタＭＳ１は、選択された質量範囲全体にわたってスキャンされ、移送されるイオンは、衝突セルにおいてフラグメンテーションされる。第２の四重極質量フィルタＭＳ２は、一定のフラグメント質量を移送するように設定される。得られた質量スペクトルは、フラグメンテーションされることで選択されたフラグメントイオンを生じたプリカーサーイオンあるいは親イオンのみを含んでいる。これもまた、特異性および感度が高い動作モードである。
【０００７】
「娘イオンあるいはプロダクトイオンスキャン」またはＭＳ／ＭＳとしてさらなる動作モードが知られており、このモードにおいて、第１の四重極ＭＳ１は、選択されたプリカーサーイオンあるいは親イオンのみを移送するように設定され、当該イオンは、その後衝突セルにおいてフラグメンテーションされる。次に、娘イオンあるいはプロダクトイオンの質量スペクトルを得ることを可能にするために、第２の四重極質量フィルタＭＳ２を選択された質量範囲全体にわたってスキャンする。
【０００８】
ＭＳスキャンとは、ＭＳ１が分解を行うように設定されてスキャンされ、ＭＳ２は分解を行わないか、あるいはその逆であるスキャンである。ＭＳスキャンにより、全ての親イオンあるいはプリカーサーイオンのスペクトルが生成される。
【０００９】
ＰＴＭペプチドの検出および配列決定を行うためのＭＳに基づくいくつかの手法が知られている。これらは、インフュージョンと液体クロマトグラフィーとの両方に基づく分離方法をタンデム四重極システムやハイブリッド四重極−飛行時間質量分析部システムといった様々なＭＳ機器構成と組み合わせて使用している。例えば、タンデム四重極に基づくシステム上で共通の構造モチーフを探索するプリカーサーイオンスキャンを用いることが知られている。しかしながら、これら公知の手法にはいくつかの問題がある。これらの手法は、狭ピーク幅（４〜１０秒の間）のナノスケールの液体クロマトグラフィー分離に対応しなければならなくなってきている。このことにより、クロマトグラフピーク全体にわたって適当な点を得ることを確実にするためには、１つの完全な分析試験サイクルに１秒以上を要しないことが求められている。これは、ほとんどの公知の手法には当てはまらない。第２に、全てのペプチドの試験および配列決定を行い、非修飾ペプチドから修飾ペプチドを選別するために総当たり的な手法が用いられてきた。これには非常に時間がかかり、相当量の冗長なＭＳ／ＭＳ情報の取得を要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
翻訳後修飾ペプチドの検出および特性決定のための特異的で迅速な高感度の技術が所望される。
【００１１】
したがって、改良された質量分析計および質量分析の方法を提供することが所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明の一態様によると、
イオン源と、質量フィルタまたは質量分析部と、第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスと、衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部とを備える質量分析計を準備する工程、
第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンし、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを固定する、比較的分解能が低い負の親イオンスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比を有する目的の第１のフラグメントイオンをモニタリングする工程を含む、質量分析の方法であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、上記方法が、
（ｉ）第１の質量フィルタもしくは質量分析部または第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンし、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い負のＭＳスキャンを実行する工程、
（ｉｉ）少なくとも、第１の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第１の正イオン多重反応モニタリング(Multiple Reaction Monitoring)チャンネルと、第２の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第２の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定する工程、
（ｉｉｉ）少なくとも第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定する工程、
（ｉｖ）観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定する工程、および
（ｖ）第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する工程、
をさらに含む、質量分析の方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、翻訳後修飾ペプチドの同定および特性決定を行う従来の方法を示す。
【図２】図２は、翻訳後修飾ペプチドの同定および特性決定を行う本発明の一実施形態に係る方法を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、翻訳後修飾ペプチドの同定および特性決定を行う本発明の一実施形態に係る包括的な方法を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、翻訳後修飾ペプチドの同定および特性決定を行う本発明の一実施形態に係る包括的な方法を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、翻訳後修飾ペプチドの同定および特性決定を行う本発明の一実施形態に係る包括的な方法を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、４つのリンペプチド（すなわち、リン酸化ペプチド）を含む混合物に対して３０ｅＶおよび７０ｅＶにおいて実行した２回の負イオンプリカーサースキャンに対応する２つのマスクロマトグラムを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、４つのリンペプチドに対する４回の負イオン高分解能ＭＳスキャンを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、４つのリンペプチドに対する６つのＭＲＭトランジション（MRM transitions）についての得られたＭＲＭ強度を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、正イオンのフルスキャンＭＳ／ＭＳ質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の別の態様によると、
イオン源と、質量フィルタまたは質量分析部と、第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスと、衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部とを備える質量分析計を準備する工程、
第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを第１の質量フィルタまたは質量分析部と同期してスキャンする、比較的分解能が低い負イオンのニュートラルロススキャンまたはニュートラルゲインスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比差を有する目的の第１のフラグメントイオンのモニタリングを行う工程を含む、質量分析の方法であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、上記方法が、
（ｉ）第１の質量フィルタもしくは質量分析部または第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い負のＭＳスキャンを実行する工程、
（ｉｉ）少なくとも、第１の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第１の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第２の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定する工程、
（ｉｉｉ）少なくとも第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定する工程、
（ｉｖ）観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定する工程、および
（ｖ）第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する工程、
をさらに含む、質量分析の方法が提供される。
【００１５】
本発明の好ましさが劣る別の態様によると、
イオン源と、質量フィルタまたは質量分析部と、第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスと、衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部とを備える質量分析計を準備する工程、
第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを固定する、比較的分解能が低い正の親イオンスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比を有する目的の第１のフラグメントイオンをモニタリングする工程を含む、質量分析の方法であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、上記方法が、
（ｉ）第１の質量フィルタもしくは質量分析部または第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い正のＭＳスキャンを実行する工程、
（ｉｉ）少なくとも、第１の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第１の負イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第２の負イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第３の負イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定する工程、
（ｉｉｉ）少なくとも第１、第２および第３の負イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定する工程、
（ｉｖ）観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定する工程、および
（ｖ）第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する工程、
をさらに含む、質量分析の方法が提供される。
【００１６】
本発明の好ましさが劣る別の態様によると、
イオン源と、質量フィルタまたは質量分析部と、第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスと、衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部とを備える質量分析計を準備する工程、
第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを第１の質量フィルタまたは質量分析部と同期してスキャンする、比較的分解能が低い正イオンのニュートラルロススキャンまたはニュートラルゲインスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比差を有する目的の第１のフラグメントイオンのモニタリングを行う工程を含む、質量分析の方法であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、上記方法が、
（ｉ）第１の質量フィルタもしくは質量分析部または第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い正のＭＳスキャンを実行する工程、
（ｉｉ）少なくとも、第１の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第１の負イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第２の負イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第３の負イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定する工程、
（ｉｉｉ）少なくとも第１、第２および第３の負イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定する工程、
（ｉｖ）観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定する工程、および
（ｖ）第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する工程、
をさらに含む、質量分析の方法が提供される。
【００１７】
多重反応モニタリングチャンネルは、好ましくは、質量電荷比の半値幅がｘＤａとなるように構成され、ｘは、（ｉ）＜０．１；（ｉｉ）０．１〜０．２；（ｉｉｉ）０．２〜０．３；（ｉｖ）０．３〜０．４；（ｖ）０．４〜０．５；（ｖｉ）０．５〜０．６；（ｖｉｉ）０．６〜０．７；（ｖｉｉｉ）０．７〜０．８；（ｉｘ）０．８〜０．９；および（ｘ）０．９〜１．０からなる群から選択される。
【００１８】
上記方法は、（ｉ）エレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＩ」）イオン源；（ｉｉ）大気圧光イオン化（「ＡＰＰＩ」）イオン源；（ｉｉｉ）大気圧化学イオン化（「ＡＰＣＩ」）イオン源；（ｉｖ）マトリックス支援レーザ脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）イオン源；（ｖ）レーザ脱離イオン化（「ＬＤＩ」）イオン源；（ｖｉ）大気圧イオン化（「ＡＰＩ」）イオン源；（ｖｉｉ）シリコン上脱離イオン化（「ＤＩＯＳ」）イオン源；（ｖｉｉｉ）電子衝突（「ＥＩ」）イオン源；（ｉｘ）化学イオン化（「ＣＩ」）イオン源；（ｘ）電界イオン化（「ＦＩ」）イオン源；（ｘｉ）電界脱離（「ＦＤ」）イオン源；（ｘｉｉ）誘導結合プラズマ（「ＩＣＰ」）イオン源；（ｘｉｉｉ）高速原子衝撃（「ＦＡＢ」）イオン源；（ｘｉｖ）液体二次イオン質量分析（「ＬＳＩＭＳ」）イオン源；（ｘｖ）脱離エレクトロスプレーイオン化（「ＤＥＳＩ」）イオン源；（ｘｖｉ）ニッケル−６３放射性イオン源；（ｘｖｉｉ）大気圧マトリックス支援レーザ脱離イオン化イオン源；および（ｘｖｉｉｉ）熱スプレーイオン源からなる群から選択されるイオン源を用いてイオンをイオン化する工程を好ましくはさらに含む。
【００１９】
一実施形態によると、上記方法は、イオン源を用いて分析種イオンをイオン化する前に、液体クロマトグラフィー装置を用いて目的の分析種イオンを時間的に分離する工程をさらに含む。
【００２０】
衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスは、好ましくは、（ｉ）衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｉ）表面誘起解離（「ＳＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｉｉ）電子移動解離（「ＥＴＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｖ）電子捕獲解離（「ＥＣＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｖ）電子衝突または衝撃解離フラグメンテーションデバイス；（ｖｉ）光誘起解離（「ＰＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｖｉｉ）レーザ誘起解離フラグメンテーションデバイス；（ｖｉｉｉ）赤外放射誘起解離デバイス；（ｉｘ）紫外放射誘起解離デバイス；（ｘ）ノズル−スキマ間インターフェースフラグメンテーションデバイス；（ｘｉ）インソースフラグメンテーションデバイス；（ｘｉｉ）イオン源衝突誘起解離フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｉｉ）熱または温度源フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｖ）電界誘起フラグメンテーションデバイス；（ｘｖ）磁場誘起フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉ）酵素消化または酵素分解フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉｉ）イオン−イオン反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉｉｉ）イオン−分子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｘ）イオン−原子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘ）イオン−準安定イオン反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉ）イオン−準安定分子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉｉ）イオン−準安定原子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−イオン反応デバイス；（ｘｘｉｖ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−分子反応デバイス；（ｘｘｖ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−原子反応デバイス；（ｘｘｖｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定イオン反応デバイス；（ｘｘｖｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定分子反応デバイス；および（ｘｘｖｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定原子反応デバイスからなる群から選択される。
【００２１】
本発明の別の態様によると、
イオン源、質量フィルタまたは質量分析部、第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイス、および衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部、ならびに
第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンし、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを固定する、比較的分解能が低い負の親イオンスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比を有する目的の第１のフラグメントイオンをモニタリングするように構成および適合された制御システムを備える、質量分析計であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、制御システムがさらに、
（ｉ）第１の質量フィルタもしくは質量分析部または第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い負のＭＳスキャンを実行し、
（ｉｉ）少なくとも、第１の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第１の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第２の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定し、
（ｉｉｉ）少なくとも第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定し、
（ｉｖ）観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定し、かつ
（ｖ）第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する、
質量分析計が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様によると、
イオン源、質量フィルタまたは質量分析部、第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイス、および衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部、ならびに
第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを第１の質量フィルタまたは質量分析部と同期してスキャンする、比較的分解能が低い負イオンのニュートラルロススキャンまたはニュートラルゲインスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比差を有する目的の第１のフラグメントイオンのモニタリングを行うように構成および適合された制御システムを備える、質量分析計であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、制御システムがさらに、
（ｉ）第１の質量フィルタもしくは質量分析部または第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンし、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い負のＭＳスキャンを実行し、
（ｉｉ）少なくとも、第１の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第１の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第２の正イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の正の電荷状態を有する正イオンに対応する第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定し、
（ｉｉｉ）少なくとも第１、第２および第３の正イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定し、
（ｉｖ）観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定し、かつ
（ｖ）第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する、質量分析計が提供される。
【００２３】
本発明の好ましさが劣る別の態様によると、
イオン源、質量フィルタまたは質量分析部、第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイス、および衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部、ならびに
第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンし、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを固定する、比較的分解能が低い正の親イオンスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比を有する目的の第１のフラグメントイオンをモニタリングするように構成および適合された制御システムを備える、質量分析計であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、制御システムがさらに、
（ｉ）第１の質量フィルタもしくは質量分析部または第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い正のＭＳスキャンを実行し、
（ｉｉ）少なくとも、第１の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第１の負イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第２の負イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第３の負イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定し、
（ｉｉｉ）少なくとも第１、第２および第３の負イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定し、
（ｉｖ）観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定し、かつ
（ｖ）第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する、質量分析計が提供される。
【００２４】
本発明の好ましさが劣る別の態様によると、
イオン源、質量フィルタまたは質量分析部、第１の質量フィルタまたは質量分析部の下流に配置された衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイス、および衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスの下流に配置された第２の質量フィルタまたは質量分析部、ならびに、
第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを第１の質量フィルタまたは質量分析部と同期してスキャンする、比較的分解能が低い正イオンのニュートラルロススキャンまたはニュートラルゲインスキャンを実行するとともに、第１の質量電荷比差を有する目的の第１のフラグメントイオンのモニタリングを行うように構成および適合された制御システムを備える、質量分析計であって、
目的の第１のフラグメントイオンが検出された場合、制御システムがさらに、
（ｉ）第１の質量フィルタもしくは質量分析部または第２の質量フィルタもしくは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンしながら、他方の質量フィルタまたは質量分析部を非分解動作モードで動作させる、比較的分解能が高い正のＭＳスキャンを実行し、
（ｉｉ）少なくとも、第１の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第１の負イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第２の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第２の負イオン多重反応モニタリングチャンネルと、第３の負の電荷状態を有する負イオンに対応する第３の負イオン多重反応モニタリングチャンネルとを決定し、
（ｉｉｉ）少なくとも第１、第２および第３の負イオン多重反応モニタリングチャンネルを設定およびモニタリングするとともに、観察されたイオンの強度が最も高いのはどの多重反応モニタリングチャンネルであるかを特定し、
（ｉｖ）観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対応する親イオンの質量電荷比および／または電荷状態を測定し、かつ
（ｖ）第１の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウを、観察されたイオンの強度が最も高い多重反応モニタリングチャンネルに対して第１の質量フィルタまたは質量分析部が設定された質量電荷比移送ウィンドウに対応するように設定し、第２の質量フィルタまたは質量分析部の質量電荷比移送ウィンドウをスキャンする、ＭＳ／ＭＳスキャンを実行する、質量分析計が提供される。
【００２５】
上記質量分析計は、（ｉ）エレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＩ」）イオン源；（ｉｉ）大気圧光イオン化（「ＡＰＰＩ」）イオン源；（ｉｉｉ）大気圧化学イオン化（「ＡＰＣＩ」）イオン源；（ｉｖ）マトリックス支援レーザ脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）イオン源；（ｖ）レーザ脱離イオン化（「ＬＤＩ」）イオン源；（ｖｉ）大気圧イオン化（「ＡＰＩ」）イオン源；（ｖｉｉ）シリコン上脱離イオン化（「ＤＩＯＳ」）イオン源；（ｖｉｉｉ）電子衝突（「ＥＩ」）イオン源；（ｉｘ）化学イオン化（「ＣＩ」）イオン源；（ｘ）電界イオン化（「ＦＩ」）イオン源；（ｘｉ）電界脱離（「ＦＤ」）イオン源；（ｘｉｉ）誘導結合プラズマ（「ＩＣＰ」）イオン源；（ｘｉｉｉ）高速原子衝撃（「ＦＡＢ」）イオン源；（ｘｉｖ）液体二次イオン質量分析（「ＬＳＩＭＳ」）イオン源；（ｘｖ）脱離エレクトロスプレーイオン化（「ＤＥＳＩ」）イオン源；（ｘｖｉ）ニッケル−６３放射性イオン源；（ｘｖｉｉ）大気圧マトリックス支援レーザ脱離イオン化イオン源；および（ｘｖｉｉｉ）熱スプレーイオン源からなる群から選択されるイオン源を好ましくはさらに備える。
【００２６】
一実施形態によると、上記質量分析計は、
１つ以上のイオンガイドならびに／または
１つ以上のイオン移動度分離デバイスおよび／もしくは１つ以上のフィールド非対称イオン移動度分光計デバイスならびに／または
１つ以上のイオントラップもしくは１つ以上のイオントラップ領域をさらに備える。
【００２７】
衝突、フラグメンテーションまたは反応デバイスは、好ましくは、（ｉ）衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｉ）表面誘起解離（「ＳＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｉｉ）電子移動解離（「ＥＴＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｉｖ）電子捕獲解離（「ＥＣＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｖ）電子衝突または衝撃解離フラグメンテーションデバイス；（ｖｉ）光誘起解離（「ＰＩＤ」）フラグメンテーションデバイス；（ｖｉｉ）レーザ誘起解離フラグメンテーションデバイス；（ｖｉｉｉ）赤外放射誘起解離デバイス；（ｉｘ）紫外放射誘起解離デバイス；（ｘ）ノズル−スキマ間インターフェースフラグメンテーションデバイス；（ｘｉ）インソースフラグメンテーションデバイス；（ｘｉｉ）イオン源衝突誘起解離フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｉｉ）熱または温度源フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｖ）電界誘起フラグメンテーションデバイス；（ｘｖ）磁場誘起フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉ）酵素消化または酵素分解フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉｉ）イオン−イオン反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｖｉｉｉ）イオン−分子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｉｘ）イオン−原子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘ）イオン−準安定イオン反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉ）イオン−準安定分子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉｉ）イオン−準安定原子反応フラグメンテーションデバイス；（ｘｘｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−イオン反応デバイス；（ｘｘｉｖ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−分子反応デバイス；（ｘｘｖ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−原子反応デバイス；（ｘｘｖｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定イオン反応デバイス；（ｘｘｖｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定分子反応デバイス；および（ｘｘｖｉｉｉ）イオンを反応させて付加イオンまたはプロダクトイオンを形成するイオン−準安定原子反応デバイスからなる群から選択される。
【００２８】
本発明の好適な実施形態は、質量分析を用いた方法であって、ペプチド上の翻訳後修飾部位を検出し、次に配列決定を行うために用いることが可能な方法に関する。（ｉ）いつＰＴＭペプチドが存在するかを判定し；（ｉｉ）修飾ぺプチドの質量電荷比および電荷状態を測定し；かつ（ｉｉｉ）その後、アミノ酸配列内の修飾位置を正確に示すように構造情報を特定するために、この方法には、好ましくは、異なるスキャンモードの組み合わせを用いた質量分析と併用した液体クロマトグラフィーによるタンパク質試料の分析が組み入れられる。
【００２９】
本発明の一実施形態によると、
負イオンモードにおいてプリカーサーイオンスキャンを実行して、フラグメンテーションされることで特定のフラグメントイオンを生じる負電荷のプリカーサーを同定し、
同定されたプリカーサーに対して質量分解能が高い負イオンスキャンを必要に応じて実行して、その質量および電荷状態を正確に測定し、
正イオンモードにおいてモニタリングを行うための多重ＭＲＭチャンネルを決定して、既に同定された負電荷のプリカーサーの最も強い正イオンおよび電荷状態を同定し、
同定されたプリカーサーに対してプロダクトイオンスキャンまたはＭＳ／ＭＳスキャンを実行する、方法が開示される。
【００３０】
好適な実施形態によると、正イオンの電荷状態が負イオンモードにおけるものと同じ電荷状態であると仮定するのではなく、正イオンの最も多い電荷状態が同定される。
【００３１】
＜図面の簡単な説明＞
ここで、添付の図面を参照しながら、あくまでも例示として、本発明の種々の実施形態を説明する。図面において、
図１は、翻訳後修飾ペプチドの同定および特性決定を行う従来の方法を示し、
図２は、翻訳後修飾ペプチドの同定および特性決定を行う本発明の一実施形態に係る方法を示し、
図３Ａ〜図３Ｃは、翻訳後修飾ペプチドの同定および特性決定を行う本発明の一実施形態に係る包括的な方法を示し、
図４Ａは、４つのリンペプチド（すなわち、リン酸化ペプチド）を含む混合物に対して３０ｅＶおよび７０ｅＶにおいて実行した２回の負イオンプリカーサースキャンに対応する２つのマスクロマトグラムを示し、図４Ｂは、４つのリンペプチドに対する４回の負イオン高分解能ＭＳスキャンを示し、図４Ｃは、４つのリンペプチドに対する６つのＭＲＭトランジション（MRM transitions）についての得られたＭＲＭ強度を示し、図４Ｄは、正イオンのフルスキャンＭＳ／ＭＳ質量スペクトルを示す。
【００３２】
＜発明の詳細な説明＞
翻訳後修飾ペプチドの同定および特性決定を行う従来の方法が図１に示され、同方法は、比較的分解能が低い負イオンプリカーサーイオンあるいは親イオンスキャンを実行して、目的の特定の質量電荷比を有する負電荷のフラグメントイオンを生じる親イオンを同定する工程を含む。次に、分解能が高い正イオンＭＳスキャン２を実行して、対応する目的の正電荷の親イオンの質量電荷比を正確に測定する。次に、目的の親イオンを同定するために正イオンＭＳ／ＭＳスキャン３を行う。
【００３３】
従来の技術によると、１価の負の親イオンが目的の親イオンであると判定された場合、対応する正電荷の親イオンの電荷もまた１価であると仮定とされる。しかしながら、この仮定は正しくない可能性がある。以下に詳述する好適な実施形態によると、好適な実施形態によればこのような仮定はなされない。
【００３４】
本発明の好適な実施形態は、翻訳語修飾タンパク質（一般に酵素消化または化学消化によって処理されて翻訳後修飾ペプチドを生成する）のタンデム質量分析計上での新規な取得方法と組み合わせた液体クロマトグラフィーによる分析に関する。その基本的な概念を図２に示し、これをリン酸化ペプチドの場合について以下に説明する。
【００３５】
本発明の一実施形態によると、ペプチドは、液体クロマトグラフィーによって分離され、次に、質量分析計（「ＭＳ」）のエレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＩ」）イオン源またはナノＥＳＩイオン源に入るように配置される。この質量分析計は、第１の四重極質量フィルタ（ＭＳ１）と、その後に続く、当該第１の四重極質量フィルタの下流に配置されたガス充填衝突セルを備える。第２の四重極質量フィルタ（ＭＳ２）が衝突セルの下流に配置されている。衝突セルは、好ましくは、衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）によってイオンをフラグメンテーションするように構成されている。
【００３６】
他の好ましさが劣る実施形態によると、第１および／または第２の四重極質量フィルタは、その他の形態の質量フィルタまたは１つ以上の質量分析部で置き換えてもよい。また、ＣＩＤ衝突セルは、電子移動解離（「ＥＴＤ」）フラグメンテーションデバイスを含む他の形態のフラグメンテーションデバイスで置き換えてもよい。
【００３７】
好ましさが劣る実施形態によると、第１の四重極質量フィルタＭＳ１と、四重極衝突セルと、第２の四重極質量フィルタまたは分析部ＭＳ２とを備える三連四重極構成を用いる代わりに、四重極質量フィルタ／分析部と、フラグメンテーションデバイスと、飛行時間質量分析部とを備えるハイブリッド四重極−飛行時間質量分析計を用いてもよい。
【００３８】
図２に示す本発明の好適な実施形態の第１のステップ１において、質量分析計は、好ましくは、負電荷のフラグメントイオンを検出するように構成され、親イオンスキャンモードあるいはプリカーサーイオンスキャンモードで動作し、このモードにおいて、第２の四重極ロッドセットＭＳ２は、分解モードで動作し、衝突セルまたはフラグメンテーションデバイスから現れ、共通の構造モチーフの質量電荷比を有するフラグメントイオンのみを移送するように設定される。第１の質量フィルタＭＳ１は、分解を行うように設定され、スキャンされる。
【００３９】
好適な実施形態によると、第２の四重極ロッドセットまたは第２の質量フィルタＭＳ２は、質量電荷比が７９（ＰＯ3−）であるフラグメントイオンあるいはプロダクトイオンを移送するように設定してもよい。質量電荷比が７９であるフラグメントイオンあるいはプロダクトイオンが検出されると（例えば、閾値を超えることにより）、上記方法は、次に、好ましくは、第２のステップ４に進み、ここで、上記機器は、好ましくは、１つ以上のプリカーサーイオンあるいは親イオンの質量電荷比および電荷状態を測定するために、負イオンモードにある間に狭いＭＳスキャンを実行するように構成される。ＭＳスキャン４は、ＭＳ１を分解するように設定するとともにＭＳ１をスキャンし、ＭＳ２を非分解とするか、あるいはその逆を行うことで実行される。
【００４０】
次に、ＭＳスキャンステップ４の直後に第３のステップ５が行われることが好ましく、ここで、質量分析計は、好ましくは、正イオンモードに速やかに切り替えられ、負イオンモードスキャンから特定された情報に基づいて、上記機器は、好ましくは、モニタリングすべきいくつかの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）チャンネルを決定する。モニタリングすべきＭＲＭチャンネルは、負イオン試験から得られたＭＳ情報（プリカーサーイオンあるいは親イオンの質量電荷比値）と、選択されたイオンのうち１つのイオンがリン酸化されており、したがって、Ｈ3ＰＯ4のニュートラルロスを示すかあるいはホスホチロシン残基（質量電荷比２１６）の低質量電荷比マーカーイオン（インモニウムイオン）を示すという仮定とに基づいて計算される。これにより、ＭＲＭチャンネルが選択され、モニタリングされる。ＭＲＭチャンネルは、好ましくは、約０．７Ｄａという狭い半値幅を有する。
【００４１】
次に、これらＭＲＭ測定の信号強度を結果として用いて、修飾されているイオンはどれか、そして、正イオンモードにおいて観察された質量電荷比および電荷状態のうち最も強いものはどれかが判定されるのが好ましい。あるいは、ＭＲＭチャンネルを設定しモニタリングする代わりに、小さい質量範囲にわたる質量スキャンを取得してもよい。しかしながら、請求の範囲においては、ＭＲＭチャンネルの設定およびモニタリングへの言及は、狭い質量電荷比範囲にわたる狭いスキャンが実行される実施形態を含むものとして理解される。
【００４２】
最後に、第４のステップ３において、好ましくは、プロダクトイオンまたはＭＳ／ＭＳのフルスペクトルをリン酸化ペプチドについて取得して、ペプチドの配列およびリン酸化の部位を決定する。この動作モードにおいて、ＭＳ１は、特定の質量電荷比を有する親イオンを移送するように設定され、次に、親イオンは、衝突セルにおいてフラグメンテーションされる。次に、得られたフラグメントイオンは、スキャンを実行するように設定されたＭＳ２によって質量分析される。
【００４３】
この基本的な方法は、多数の成分および多数のニュートラルロス（またはニュートラルゲイン）を同一の方法を用いてモニタリングすることができるように拡張してもよい。このような方法のフローチャートの一例を図３Ａ〜図３Ｃに示す。図３Ｃにおいて、Ｓｃａｎ／ＷａｖｅＤＳスキャンの実行について言及する。これは、ＭＳ／ＭＳスキャンあるいは娘イオンスキャンが実行されることを意味するものであると理解されるべきである。好適な一実施形態によると、ＭＳ／ＭＳスキャンは、Ｓｃａｎ／Ｗａｖｅ（登録商標）機器を用いて実行してもよく、ここで、イオンは、装置の出口に配置された単一の擬電位障壁を有するイオントラップから射出される。イオンは、好ましくは、イオンが装置の出口に向かって駆動されるように、イオントラップを形成する電極に１つ以上の過渡ＤＣ電圧を印加することによって擬電位障壁に向かって駆動される。電位障壁の高さは変更してもよい。
【００４４】
一実施形態によると、スキャンまたは測定のうち一部は、走査四重極を用いてではなく、リニアイオントラップ質量分析部または飛行時間質量分析部といった他の種類の質量分析部を用いて実行してもよい。
【００４５】
好適な実施形態によるＰＴＭ検出方法をＸＥＶＯ（登録商標）ＴＱタンデム四重極（ウォーターズコーポレーション（Waters Corporation）、マンチェスター）上でＷａｔｅｒｓ（登録商標）ＭＰＤＳリンペプチド混合物（１８６００３２８５）を用いて試験した。この混合物は、４つのリンペプチド、すなわち、リン酸化ペプチド：（ｉ）ＮＶＰＬ（ｐＹ）Ｋ；（ｉｉ）ＨＬＡＤＬ（ｐＳ）Ｋ；（ｉｉｉ）ＶＮＱＩＧ（ｐＴ）ＬＳＥＳＩＫ；および（ｉｖ）ＶＮＱＩＧＴＬ（ｐＳ）Ｅ（ｐＳ）ＩＫで構成されていた。試料は、１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭのリン酸アンモニウム中で調製し、ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ（登録商標）ＵＰＬＣをトラップモードで動作させて、クロマトグラフ分離を行った。各試料注入前に、５０ｍＭのＥＤＴＡ（無勾配）のフルループ注入（Full loop injections）を行い、使用した勾配は、３００ｎＬ／分にて、３０分間で５〜４０％Ｂであった。
【００４６】
試験の第１の段階において、３０ｅＶおよび７０ｅＶの異なる衝突エネルギーにおいて、２回の負イオンプリカーサースキャンを実行し、７９Ｄａのフラグメントイオンについてモニタリングを行った。質量分析計は、第１の四重極質量フィルタＱ１と、衝突セルと、第２の四重極質量フィルタ／分析部Ｑ２とを備えていた。衝突エネルギーは、第１の四重極Ｑ１と衝突セルとの間に適切な電圧差を設定することにより固定した。
【００４７】
図４Ａに２つの異なる衝突エネルギーについての得られたマスクロマトグラムを示す。４つのピークのうち少なくとも３つが容易に観察され、これらは、４つのリン酸化ペプチドのうち３つに対応している。
【００４８】
いずれかのスキャンの強度が規定された閾値を超えると、分解能が高い負イオンＭＳスキャンを実行して、負イオンモードにおける各プリカーサーイオンあるいは親イオンについての正確な質量を測定するとともにその電荷状態を測定した。
【００４９】
図４Ｂは、この混合物中の４つのリンペプチドについての得られたスペクトルを示す。同位体ピーク間隔から、図４Ｂに示す最初の２つのペプチドが１価であるのに対し、図４Ｃに示す３番目および４番目のペプチドは２価のペプチドであることは明らかである。
【００５０】
この情報を用いて、考えられる正の電荷状態毎にＭＲＭトランジションを設定し、ｐＹインモニウムイオン（ｍ／ｚ２１６．１）の特性に加えてｐＴリンペプチドおよびｐＳリンペプチドのニュートラルロス特性を探索した。例えば、６つのＭＲＭトランジションを設定し、図４Ｂに示すｍ／ｚ８６１．４のプリカーサーイオンについてモニタリングを行った。これら６つのＭＲＭトランジションは以下の通りである。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
次に、これら６つのＭＲＭトランジションをモニタリングして、正イオンモードにおけるリンペプチドの最も強い電荷状態を同定した。４つのリンペプチドの全てについての得られたＭＲＭ強度を図４Ｃに示す。負イオンモードでは４つのペプチドのうち２つが１価であったのに対し、正イオンモードでは、最も強いイオンはすべての場合において２価であったことに注目することが重要である。
【００５３】
最も強い正イオン電荷状態が特定されると、図４Ｄに示すようにペプチドの配列決定を行うことを可能にするためにＳｃａｎＷａｖｅ増感プロダクトイオンスキャンを取得した。上記に詳述したように、ＳｃａｎＷａｖｅプロダクトイオンスキャンは、実質的にＭＳ／ＭＳスキャンに相当し、配列情報の特定を可能にすることによって親イオンの同定を可能にする詳細なフラグメントイオンスペクトルを提供するものである。
【００５４】
ＭＲＭチャンネルの代わりに小さい質量範囲にわたる質量スキャンが取得され得る好ましさが劣る実施形態について上記に言及した。しかしながら、ＭＲＭチャンネルの設定およびモニタリングに対する請求の範囲における言及は、ＭＲＭチャンネルが正確には固定されず、むしろ、例えば、０．１Ｄａという狭い質量電荷比範囲にわたって狭い質量スキャンを実行する実施形態を包含するものであるとも理解される。このような実施形態は請求の範囲に含まれるものである。
【００５５】
請求の範囲において、質量フィルタの「質量電荷比移送ウィンドウ」という表現が用いられている。本発明のいくつかの好ましさが劣る実施形態によると、特定の質量電荷比を有するイオンを選択するために従来の四重極質量フィルタ以外の装置を用いることができることが考えられる。このような状況において、当該装置は、少なくとも四重極質量フィルタと同じ意味では、質量電荷比移送ウィンドウで動作しない場合がある。したがって、質量電荷比移送ウィンドウを有する質量フィルタの使用は、好ましいものであるが必須ではない。
【００５６】
好適な実施形態を参照しながら本発明を説明したが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく形態および内容ともに種々の変更を加え得ることが当業者には理解されよう。
【要約】  翻訳後修飾ペプチドの検出および配列決定を行う方法が開示され、同方法においては、負イオンプリカーサースキャン（１）を実行する。次に、負イオン高分解能ＭＳスキャン（４）を実行し、次に、正イオンモードにおけるＭＲＭチャンネルを決定し、モニタリングする（５）。次に、正イオンＭＳ／ＭＳスキャンを実行する。
【選択図】図２【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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