(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個の一本鎖のヌクレオチド多量体と複数のアルキルアミンとの複合体の単分子膜が固定化された導電性基板の製造方法であって、
（１）一本鎖ヌクレオチド多量体の水溶液の水滴を導電性基板上で静置する工程；
（２）前記水滴を完全に覆うように、水と非相溶の第１の有機溶媒中のアルキルアミンの溶液を滴下してアルキルアミンの溶液の液膜を形成する工程；
（３）一本鎖ヌクレオチド多量体の水溶液とアルキルアミンの溶液との液体界面にて、一本鎖ヌクレオチド多量体の複数のリン酸基部位に前記複数のアルキルアミンが結合して、１個の一本鎖のヌクレオチド多量体と複数のアルキルアミンとの複合体の単分子膜が形成するのに十分な時間静置する工程；および
（４）前記導電性基板を加熱しつつ、一本鎖ヌクレオチド多量体の水溶液の水滴およびアルキルアミンの溶液の液膜を、水と非相溶の第２の有機溶媒で洗い流すことによって、１個の一本鎖のヌクレオチド多量体と複数のアルキルアミンとの複合体の単分子膜を導電性基板上に固定する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
１個の一本鎖のヌクレオチド多量体と複数のアルキルアミンとの複合体であって、前記１個の一本鎖のヌクレオチド多量体の複数のリン酸基部位に前記複数のアルキルアミンが結合した、一本鎖のヌクレオチド多量体とアルキルアミンとの複合体。
【請求項３】
前記一本鎖のヌクレオチド多量体が、５個以上の塩基を有する、請求項２記載の複合体。
【請求項４】
前記アルキルアミンが、５から２０個の炭素数を有する１個のアルキル基で置換された１級アミンである、請求項２記載の複合体。
【請求項５】
請求項２〜４いずれかに記載の一本鎖のヌクレオチド多量体とアルキルアミンとの複合体の単分子膜が固定化された導電性基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）などのヌクレオチド多量体を安定に導電性基板に固定化する方法に関する。より詳しくは、本発明は、一本鎖ヌクレオチド多量体を伸張した状態でグラファイト等の導電性基板に単分子膜として安定に固定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は生物の遺伝情報を担う分子であり、その塩基配列には生命体に必要な情報が符号化されている。したがって、ＤＮＡシークエンシング［非特許文献１］は遺伝情報を解析するための基本手段となっている。ＤＮＡシークエンシングにおいては、サンガー法［非特許文献２］などＤＮＡ断片長を調べる方法が主流である。
しかしながら、上記方法は、ＤＮＡ鎖の複製を伴い、さらに断片化するため、ＤＮＡの塩基配列をそのままの状態で観察解析することができない。特に、複製のたびに、ＤＮＡ末端に存在するテロメアが５０から２００塩基ずつ短くなり、テロメアの塩基配列を正確に観察することができないことなどの問題があった。
【０００３】
これに対して、一本鎖ＤＮＡを伸張した状態で基板に固定し、塩基配列を観察できれば、オリジナルのＤＮＡ配列を観察することが可能となる。
走査プローブ顕微鏡法で一分子ＤＮＡをそのままの状態で観察解析を行うことは、単に一分子シークエンシングが可能になるだけでなく、ＤＮＡ内の分子のマニピュレーションへの応用へと期待できる。
【０００４】
走査プローブ顕微鏡法において現在最も汎用な手法は原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）であり、このＡＦＭでＤＮＡらせんを識別する分解能は達成されているが［非特許文献３および４］、その先の塩基識別は困難である。
【０００５】
これに対して走査トンネル顕微鏡法（ＳＴＭ）は、ＤＮＡ観察においてＡＦＭよりも高い空間分解能を得ることが可能であり［非特許文献５］、真空噴霧法で作製したＤＮＡ試料を超高真空下で液体窒素温度において観察することにより、塩基が識別できる高い空間分解能が達成できる［非特許文献６］。
この高い分解能を、室温で大気中または固液界面など汎用性の高い環境で得るためには、ＤＮＡを伸張した状態で安定に基板表面に固定することが必要である。
【０００６】
山本らはグラファイト表面に伸張したＤＮＡを展開する方法を開発した［非特許文献８］。しかしこの手法で作製した試料をＳＴＭ観察すると、らせん構造までは確認できたが、ＤＮＡが基板に安定に固定されていないため、それ以上の分解能を得ることは困難であった。
【０００７】
ＤＮＡおよびＲＮＡはリン酸基を有する鎖状高分子である。このリン酸基に、グラファイトなどの基板に対して格子整合性のある長鎖アルキル分子、例えば、オクチルアミンを結合させることにより、長鎖アルキル分子を介して鎖状高分子を基板上に配列する手法が開発されている［非特許文献７］。
しかしながら、この手法を単に一本鎖ＤＮＡに応用すると多層膜は得られるが、一本鎖ＤＮＡを単分子膜として基板に配列させることができなかった。
【０００８】
１３塩基のＤＮＡの片末端にチオール基を導入し、金基板上にＤＮＡの自己組織化膜を配列し、ＳＴＭで観察する手法が報告されている［非特許文献９］。この手法によれば、らせん構造を見ることができるが、伸張した状態でＤＮＡを観察することはできなかった。
【０００９】
特開２００５−０４９１７６号公報［特許文献１］には、ＤＮＡなどの鎖状高分子を基板に伸張固定する方法が開示されているが、大気中または固液界面でＤＮＡ内の塩基識別が可能な分解能にてＳＴＭ観察するためには、ＤＮＡと基板との相互作用が小さく、固定を安定に行うことができなかった。
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−０４９１７６号公報
【非特許文献１】L. T. C. Franca, E. Carrilho, and T. B. L. Kist, Quart. Rev. Biophys. 35, 169 (2002).
【非特許文献２】F. Sanger, S. Nicklen, and A. R. Coulson, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977).
【非特許文献３】H. G. Hansma et al., Science 256, 1180 (1992).
【非特許文献４】H. G. Hansma et al., Nucl. Acids Res. 20, 3585 (1992).
【非特許文献５】R. Guckenberger et al., Science 266, 1538 (1994).
【非特許文献６】H. Tanaka and T. Kawai, Surf. Sci. 539, L531 (2003).
【非特許文献７】I. Yamamoto, T. Kanno, H. Tanaka and T. Kawai, Jpn. J. Appl. Phys. 42, L559 (2003).
【非特許文献８】K. Ijiro and Y. Okahata, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1339 (1992).
【非特許文献９】M. Gubb et al., J. Am. Chem. Soc., 7734 (2006).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ（一本鎖ヌクレオチド多量体）を伸張した状態で、基板、特に、グラファイトなどの導電性基板に単分子膜として簡便かつ安定に固定化する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、長鎖アルキル分子を介して鎖状高分子を基板上に伸張固定する上記の手法［非特許文献８］を応用して、一本鎖ヌクレオチド多量体のリン酸部位にアルキルアミンを結合させる反応を、水と有機溶媒の界面で行って単分子膜を作製して、この単分子膜を基板に固定する方法を開発した。この方法により作製したヌクレオチド多量体-アルキルアミン複合体の単分子膜を１テラオーム以上の高インピーダンスSTMで観察することにより、作製した単分子膜を破壊することなく塩基識別可能な空間分解能観察を達成した。
すなわち、本発明は、一本鎖ヌクレオチド多量体を伸張した状態で基板に安定に接合するために、液体界面での化学反応を用いて、アルキルアミンを一本鎖ヌクレオチド多量体のリン酸部位に結合して一本鎖ヌクレオチド多量体−アルキルアミン複合体を生成する。一本鎖ヌクレオチド多量体−アルキルアミン複合体は液体界面に沿って生成されるため、一本鎖ヌクレオチド多量体−アルキルアミン複合体の単分子膜が形成される。次に、アルキルアミンと基板との相互作用を利用して、一本鎖ヌクレオチド多量体を単分子膜として機械的および電気的に安定に基板に固定化する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、一本鎖ヌクレオチド多量体を単分子膜として固体表面に安定して固定化することができるので、超高真空を用いる従来の方法と異なり、大気圧下で１分子のヌクレオチド多量体（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のシークエンシングが可能となる。
さらに、本発明により、従来は困難であったＤＮＡや分子ワイヤーの分子内構造の計測の安定性および再現性が向上し、単分子デバイスの実現において鍵となる技術のひとつになると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、１個の一本鎖のヌクレオチド多量体と複数のアルキルアミンとの複合体の単分子膜が固定化された導電性基板の製造方法であって、
（１）一本鎖ヌクレオチド多量体の水溶液の水滴を導電性基板上で静置する工程；
（２）前記水滴を完全に覆うように、水と非相溶の第１の有機溶媒中のアルキルアミンの溶液を滴下してアルキルアミンの溶液の液膜を形成する工程；
（３）一本鎖ヌクレオチド多量体の水溶液とアルキルアミンの溶液との液体界面にて、一本鎖ヌクレオチド多量体の複数のリン酸基部位に前記複数のアルキルアミンが結合して、１個の一本鎖のヌクレオチド多量体と複数のアルキルアミンとの複合体の単分子膜が形成するのに十分な時間静置する工程；および
（４）前記導電性基板を加熱しつつ、一本鎖ヌクレオチド多量体の水溶液の水滴およびアルキルアミンの溶液の液膜を、水と非相溶の第２の有機溶媒で洗い流すことによって、１個の一本鎖のヌクレオチド多量体と複数のアルキルアミンとの複合体の単分子膜を導電性基板上に固定する工程を含むことを特徴とする製造方法を提供する。
【００１５】
ヌクレオチドとは、塩基と糖が結合したヌクレオシドにさらにリン酸基が結合した物質である。糖成分がリボースのヌクレオチドをリボヌクレオチドといい、リボヌクレオチドの多量体がリボ核酸（ＲＮＡ）である。糖成分がデオキシリボースのヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドといい、デオキシリボヌクレオチドの多量体がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
本発明において、ヌクレオチドの多量体とは、ヌクレオチドが５’−３’ホスホジエステル結合によって結び付けられた鎖状高分子であり、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む概念である。
【００１６】
ＤＮＡは、通常、相補的な二本鎖が塩基対間の水素結合により二重らせん構造を形成している。一方、ＲＮＡは、一般に、一本鎖として存在するが、例外もある。
本発明は、核酸の塩基配列をＳＴＭ等の手法により、そのままの状態で観察解析を行うことに鑑み、二重らせん構造により塩基が内部に埋め込まれた二本鎖ではなく、一本鎖のヌクレオチド多量体を対象とする。
【００１７】
本発明の対象である一本鎖ヌクレオチド多量体の１例を図１（ａ）に示す。このヌクレオチド多量体は、六量体ＤＮＡ（ＡＡＡＴＴＴ；Ａ＝アデニン、Ｔ＝チミン）である。
本発明で用いるヌクレオチド多量体は水溶性であるが、水と非相溶の有機溶媒には実質的に溶解しない。本発明において、対象とするヌクレオチド多量体の塩基数は５個以上が好ましく、より好ましくは、５〜５０００個である。塩基数が５０００個を超えると、別の研究から、伸張した状態でヌクレオチド多量体の単分子膜を得ることは困難であった［非特許文献７］。
【００１８】
本発明において用いることができるアルキルアミンは、１個のアルキル基で置換された１級アミンであることが好ましく、より好ましくは、５〜２０個の炭素数を有する１個のアルキル基で置換された１級アミンである
１級アミンであれば、ポリヌクレオチド多量体を基板に直接接した状態で安定に固定化することができるが、より高級アミンの場合、ポリヌクレオチド多量体が基板から離れた状態で固定されるため、ポリヌクレオチド多量体を安定に固定させることができなかった。ここで、「ポリヌクレオチド多量体を安定に固定させる」とは、ＳＴＭ解析において探針の走査によって、ポリヌクレオチド多量体が移動して、その配列状態が乱されないように固定することを意味する。
【００１９】
本発明で用いるアルキルアミンは、水には実質的に溶解しないが、水と非相溶の有機溶媒に溶解する。
本発明において用いることができるアルキルアミンの一例を図１（ｂ）に示す。このアルキルアミンは、炭素数８のアルキル基が置換した一級アミン（オクチルアミン；ＣＨ３（ＣＨ２）７ＮＨ２）である。
【００２０】
本発明によれば、一分子のヌクレオチド多量体に含まれる複数のリン酸基の各々にアルキルアミンが配位したヌクレオチド多量体とアルキルアミンの複合体が形成される。本発明によるヌクレオチド多量体とアルキルアミンの複合体の一例を図２に示す。
【００２１】
本発明は、この複合体を伸張した状態で単分子膜として導電性基板上に固定化することを特徴とする。
これにより、ＳＴＭを用いた高い空間分解能観察を可能とし、ヌクレオチド多量体の塩基配列を決定するための試料を調製することができる。
本発明で用いる導電性基板は、ＳＴＭ観察に用いることができる基板であればよく、例えば、グラファイト基板、Ａｕなどの金属製基板などが挙げられる。
特に、高配向焼結グラファイト（Highly Oriented Pyrolytic Graphite; HOPG）が好ましい。アルキル鎖の炭化水素繰り返し単位の間隔と、ＨＯＰＧの格子定数がほぼ一致するため、アルキル鎖がＨＯＰＧ基板上で配列され、その結果、ポリヌクレオチド多量体を伸張した状態で基板に固定化することができる。
【００２２】
次に、図３および４を参照して、本発明の製造方法を説明する。
本発明の製造方法の工程（１）において、一本鎖ヌクレオチド多量体の水溶液を導電性基板上に滴下して、得られた水滴を導電性基板上で静置する。
この工程の目的は２つある。１番目の目的は、溶液中で会合したポリヌクレオチド多量体を単一分子に分離させることにある。２番目の目的は、凝集し、絡み合ったポリヌクレオチド多量体を沈殿させることにある。この目的のため、好ましい静置時間は１〜６０分間である。
本発明の製造方法において、ヌクレオチド多量体の水溶液濃度は、好ましくは、１０ｐＭ／μｌ〜１０ｎＭ／μｌである。水溶液濃度が、１０ｐＭ／μｌ未満であると、ヌクレオチド多量体が離散的に基板上に固定化され、ＳＴＭ観察による解析が不十分となり、１０ｎＭ／μｌを超えると、ヌクレオチド多量体が凝集した状態で基板に固定化されるおそれがあるからである。
本発明の製造方法において、ヌクレオチド多量体の水溶液の滴下量は、好ましくは、０．１〜１μｌである。水溶液の滴下量が、０．１μｌ未満であると、ヌクレオチドの絶対量が不足して、ＳＴＭ観察による解析が不十分となるからである。また、水溶液の滴下量の上限は、ＳＴＭ観察に用いる基板の面積に依存し、基板からあふれ出さない量であればよく、通常のＳＴＭ観察には、１０ｍｍ角の基板を用いることから、滴下量は１μｌを超えないことが好ましい。
すなわち、本発明の方法によれば、極少量のヌクレオチド多量体が存在すれば、そのままの状態で塩基配列を観察解析することができる。
【００２３】
本発明の製造方法の工程（２）において、前記水滴を完全に覆うように、水と非相溶の第１の有機溶媒中のアルキルアミンの溶液を滴下してアルキルアミンの溶液の液膜を形成する。
水と非相溶の第１の有機溶媒中のアルキルアミンの溶液濃度は、好ましくは、１ｎＭ〜１０ｍＭである。
図４に示すように、この工程において、導電性基板上には、ヌクレオチド多量体の水溶液およびアルキルアミンの溶液の二層構造が形成され、２つの溶液の間に液体界面が存在する。
【００２４】
本発明の製造方法の工程（３）において、アルキルアミンは、そのアミン末端側を液体界面に向けて配列していると考えられる。したがって、ヌクレオチド多量体のリン酸基とアルキルアミンのアミン末端とは、二次元的に限定された液体界面でのみ反応して複合体を形成するため、複合体の単分子膜が液体界面に沿って形成される。複合体の単分子膜を形成するのに好ましい静置時間は、３０〜１８０分である。
【００２５】
本発明の製造方法の工程（４）において、前記導電性基板を加熱しつつ、一本鎖ヌクレオチド多量体の水溶液の水滴およびアルキルアミンの溶液の液膜を、水と非相溶の第２の有機溶媒で洗い流すことによって、液体界面に沿って形成された複合体の単分子膜を導電性基板上に固定する。
この工程を室温（約２５℃）で行った場合、基板上に単分子膜は形成されず、複合体は三次元的に堆積した。工程温度を上昇させたところ、３５℃以上であれば、基板上に単分子膜を形成することができた。ヌクレオチド多量体に与える影響を考慮して、この工程は８０℃以下で行うことが好ましい。
【００２６】
工程（２）で用いる第１の有機溶媒および工程（４）で用いる第２の有機溶媒は、水と非相溶であり、本発明の対象であるヌクレオチド多量体を溶解することができ、さらに、揮発性が低いものが望ましい。より具体的には、上記の有機溶媒は、同一または異なって、フェニルオクタン、トルエン、ヘキサン、オクタン、クロロホルム等から選択される。
【００２７】
本発明は、さらに、１個の一本鎖のヌクレオチド多量体と複数のアルキルアミンとの複合体であって、前記１個の一本鎖のヌクレオチド多量体の複数のリン酸基部位に前記複数のアルキルアミンが結合した、一本鎖のヌクレオチド多量体とアルキルアミンとの複合体およびそのような複合体が固定化された導電性基板も提供する。
【実施例】
【００２８】
実施例１
劈開したグラファイト基板１の表面に、１００ｐＭ／μｌの六量体DNA(AAATTT, A=アデニン, T=チミン)の水溶液２を０．１μｌ滴下して１０分間静置した。１級アミンであるオクチルアミン［ＣＨ３（ＣＨ２）７ＮＨ２］のフェニルオクタン溶液３をこの水溶液上に静かに滴下して、両液体界面４での反応によりDNA―アルキルアミン複合体の単分子膜を生成した。そして基板を６０℃に加熱しながら基板にフェニルオクタンを滴下してリンスすることにより、生成した単分子膜をグラファイト基板１に固定した。
【００２９】
作製した基板のＳＴＭ観察は、RHK Technology社のBesocke型STMヘッド(ATM300)を専用コントローラ(SPM1000)で制御して行った。探針には汎用の白金イリジウム線の他に、電解研磨で作製した白金イリジウム探針や、タングステン探針を白金またはチタンで被覆した探針や、さらにこれらの探針表面をフッ素樹脂被覆した探針なども用いた。
【００３０】
作製した基板をSTMで観察して得られた像を図５に示す。ＳＴＭ観察の際、バイアス電圧を−１．０Ｖとし、トンネル電流を０．２ｐＡとした。
グラファイト基板は双晶であり、<18 1 0>と<18 -1 0>の２つの結晶方位を有し、前記２つの方位の交差角は５．４゜である。
ＳＴＭ像を解析すると、DNA―オクチルアミン複合体が配列して複数の方向に向かってストライプを形成し、これらのストライプの配列方向およびストライプの交差角から、DNA―オクチルアミン複合体がグラファイト基板表面の<18 1 0>と<18 -1 0>の方位にエピタキシャル配向していることが確認された。
【００３１】
さらにこの像を詳細に解析した結果、ストライプの間隔は４．６ｎｍであり、図６に示すように、グラファイトの結晶方位と重ね合わせて検討すると、DNA―オクチルアミン複合体はダイマーを形成した上でグラファイト表面において
0005100236.tif 000002
をとっていることがわかった。この周期構造解析結果から、DNAはオクチルアミンと結合することで伸張した状態になってグラファイト表面に配列していると考えられる。
【００３２】
実施例２
オクチルアミンを１級アミンであるドデシルアミン［ＣＨ３（ＣＨ２）１１ＮＨ２］に変更した以外は、実施例１と同様に単分子膜をグラファイト基板１に固定した。
図示しないが、ＳＴＭの観察により、ストライプの間隔は５．６ｎｍであり、炭素数８のオクチル基を炭素数１２のドデシル基に変更したときのアルキル鎖長を反映して増加していた。
オクチルアミンを用いた場合と同様に、ＤＮＡはドデシルアミンと結合することで伸張した状態になってグラファイト表面に配列していると考えられる。
【００３３】
比較例１
オクチルアミンを４級アミンであるジメチルジミリスチルアンモニウムブロミドに変更した以外は、実施例１と同様に単分子膜のグラファイト基板１への固定化を試みた。
しかしながら、伸張した状態でグラファイト表面に配列させることはできなかった。
アミンに複数のアルキル基が結合することにより、全てのアルキル基が基板上に結合せず、ＤＮＡが浮き上がった状態になっているものと考えられる。
実施例１、２および比較例１の結果から、本発明に用いることができるアルキルアミンは１級アミンであることが分かった。
【００３４】
比較例２
オクチルアミンのフェニルオクタン溶液３の滴下により、ＤＮＡ―アルキルアミン複合体を形成しない以外は、実施例１と同様に単分子膜のグラファイト１基板１への固定化を試みた。
ＳＴＭ観察により、図７に示すように、ＤＮＡは屈曲した状態で、ランダムに基板上に吸着していた。
実施例１、２および比較例２の結果から、ＤＮＡにアルキルアミンを結合させることが、ＤＮＡを基板上に安定に固定するために必要であることが確認された。
【００３５】
比較例３
特許文献１の方法に準じて、濃度１００ｐＭ／μｌの六量体ＤＮＡ（ＡＡＡＴＴＴ， Ａ＝アデニン, Ｔ＝チミン)の水溶液２を４０℃に加温し、劈開したグラファイト基板１の表面に滴下し、１時間放置した後、ＤＮＡ水溶液を空気で吹き飛ばすことにより、ＤＮＡを基板上に固定した。
ＡＦＭ観察により、ＤＮＡは基板上に伸張した状態で固定されていることが分かったが、ＳＴＭ観察を行ったところ、ＳＴＭの探針の走査により、基板上に固定されたＤＮＡが移動してしまい、良好なＳＴＭ像を得ることはできなかった。
実施例１、２および比較例３の結果から、ＤＮＡにアルキルアミンを結合させることが、ＤＮＡを基板上に安定に固定するために必要であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明に用いるヌクレオチド多量体の一具体例（ａ）およびアルキルアミンの一具体例（ｂ）。
【図２】本発明によるヌクレオチド多量体とアルキルアミンとの複合体の一具体例。
【図３】本発明によるヌクレオチド多量体とアルキルアミンとの複合体の単分子膜が固定化された導電性基板の製造方法を説明する概略図。
【図４】液体界面におけるヌクレオチド多量体とアルキルアミンとの反応。
【図５】本発明によるヌクレオチド多量体とアルキルアミンとの複合体の単分子膜が固定化された導電性基板のＳＴＭ像。
【図６】図５のＳＴＭ像の解析結果。
【図７】比較例のヌクレオチド多量体の導電性基板上での態様を示すＳＴＭ像。
【符号の説明】
【００３７】
１・・・導電性基板、
２・・・ヌクレオチド多量体の水溶液、
３・・・アルキルアミンの溶液、
４・・・液体界面。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【図７】
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