(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン、インターフェロンａ、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、及び、花粉中のアレルゲン蛋白質からなる群より選ばれる蛋白質を、エピガロカテキンガレートからなる蛋白質複合体形成剤で処理することを含む、徐放性医薬製剤としての蛋白質複合体の形成方法。
【請求項２】
エピガロカテキンガレートに対する前記蛋白質の重量比が５０〜１０００の範囲内である請求項１に記載の徐放性医薬製剤としての蛋白質複合体の形成方法。
【請求項３】
前記蛋白質の溶液にエピガロカテキンガレートを添加するステップと、
前記溶液を５〜８時間攪拌するステップと、
前記溶液を凍結乾燥により乾燥させるステップとを含む請求項１に記載の徐放性医薬製剤としての蛋白質複合体の形成方法。
【請求項４】
インスリン、インターフェロンａ、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、及び、花粉中のアレルゲン蛋白質からなる群より選ばれる蛋白質と、エピガロカテキンガレートとからなる、徐放性医薬製剤としての蛋白質複合体。
【請求項５】
請求項４に記載の蛋白質複合体とともに、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤、アルブミン及び賦形剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの添加剤をさらに含む徐放性医薬製剤。
【請求項６】
エピガロカテキンガレートに対する前記蛋白質の重量比が５０〜１０００の範囲内である請求項４に記載の徐放性医薬製剤としての蛋白質複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は蛋白質分子間の架橋、人または動物の細胞に対する細胞接着抑制剤および免疫寛容剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に蛋白質は水溶性であるので、不溶化するために化学架橋剤処理や光、熱架橋処理が行われている。ここで化学的架橋剤としてはグルタルアルデヒド等の二官能性の架橋剤がよく用いられている。また、トランスグルタミナーゼ、カルボジイミド、無水コハク酸、ヘキサメチレンジイソシアナート（特公平６−６５２８０）、ペルオキシダーゼ（特開平１１−７５８８７）やマルチ銅オキシダーゼ（特開平１１−２７６１６２）等の酵素を用いる蛋白質の架橋法が知られている。
【０００３】
しかし、これら蛋白質の化学的架橋剤は蛋白質を分子間の共有結合で架橋するため架橋構造が安定であり、生理活性を有する元の蛋白質には戻らなくなる。
【０００４】
一方、アレルギー反応、免疫反応、癌転移、動脈硬化あるいは各種の炎症反応等の疾患には、例えば白血球と血管内皮細胞、あるいは癌細胞と血管内皮細胞等の細胞間接着が共通して関与していることが分かってきた。
【０００５】
ウイルス感染や細菌感染等の刺激が生体に対して与えられると、様々な炎症反応が惹起されることにより、好中球、マクロファージ、あるいはＴ細胞等の白血球が炎症部位へ浸潤する。また、生体に異物が侵入すると生体自らの防御手段である免疫反応が生じ、そこに白血球が浸潤する。この際、白血球と血管内皮細胞は細胞表面に存在する特異な細胞接着分子を介して接着されると言われている。
【０００６】
これらの様々な接着分子は免疫応答の制御において重要な役割を果しているために、このような接着分子を介する細胞間接着、細胞間相互作用を制御し、炎症反応や免疫反応をコントロールする細胞接着抑制剤が知られている（特開平８−２８３１５１、特開平１０−１５８１８４）。しかしながら、それらの効果は未だ満足できるものではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明が解決しようとする課題は種々の蛋白質の生体に対して安全で、また可逆的な架橋剤として蛋白質系のサイトカイン類の徐放剤として、あるいは遺伝子導入のためのＤＮＡ複合体形成に安全で優れた効果をもつ蛋白質の架橋剤を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、ポリフェノールが有効成分であり、遺伝子複合体、細胞接着抑制剤または免疫寛容剤として有効な蛋白質複合体形成剤が提供される。
【０００９】
本発明のポリフェノールは芳香族または脂環族にフェノール性水酸基が付加されているものなら特に限定はないが、特に好ましいものは種々の茶（緑茶、紅茶、ウーロン茶等）の主成分であるカテキン類、および種々の果実（葡萄、林檎、柿等）の主成分であるタンニンやプロアントシアニジン類である。
【００１０】
これらは日常愛飲している緑茶や紅茶、さらに赤ワインに多く含有されている。例えば、緑茶から緑茶ポリフェノールを抽出するには、乾燥した緑茶の葉から水、エタノールまたは酢酸エチルなどの有機溶剤で抽出、生成するが、その主成分はエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）を主体とするカテキン類である。
【００１１】
ポリフェノールは通常、純度６０％以上の製品が入手可能である。本発明の蛋白質複合体形成剤には純度６０％以上であれば仕様可能であるが、純度８０％以上に精製されていれば好ましい。ここで、高純度であればあるほど効果が著しく、特に医薬品として適用する場合には、ＥＧＣｇ、カテキン、エピガロカテキン等の純品を使用することが特に好ましい。
【００１２】
この発明の遺伝子複合体は、動物や人の細胞に遺伝子類を導入するための複合体であって、ポリフェノールのカテキン類で遺伝子類を複合化することによって得られる。
【００１３】
この発明の細胞接着抑制剤の細胞が、人または動物から単離された胚性幹細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、卵細胞、神経細胞、リンパ球、赤血球、血小板、骨髄細胞、軟骨細胞からなる群より選ばれた細胞である。また、これを使用する場合は、人や動物の種々の細胞や組織あるいは臓器に適用されている通常の細胞培養液や臓器保存液に、ポリフェノールを加えることによって、該細胞や細胞外マトリックスの表面に、簡単にポリフェノールを吸着させることができる。
【００１４】
この発明の免疫寛容剤が対象とする移植用の組織および臓器は、人および動物の組織および臓器である。
また、ＩｇＥ抗体の関与する花粉症や喘息の患者に行うアレルギーの免疫法に用いる花粉症治療薬に応用できる。このアレルギーの免疫療法とは、微量のアレルゲンからはじめて、その量を漸増させて皮下注射することにより患者の症状を軽減させるもので、減感作療法と呼ばれている。さらに、肝炎やＨＩＶワクチンにも応用できる。
【００１５】
蛋白質複合体形成剤の蛋白質は、アミノ酸がペプチド結合したポリペプチド鎖からなる動物性蛋白質、植物性蛋白質、核蛋白質、糖蛋白質、リポ蛋白質および金属蛋白質からなる群より選ばれた蛋白質である。好ましい態様として、蛋白質複合体形成剤を使用する場合、種々の蛋白質水溶液に攪拌下でポリフェノール水溶液を添加することにより、簡単に複合体が調整できる。
【００１６】
本発明の蛋白質複合体形成剤からなる徐放性医薬製剤には、ポリフェノール粉末に加えて、既存の抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤等を適宜、添加、組合せることができ、さらにアルブミンとか通常の賦形剤や添加剤などを加えることができる。
【００１７】
本発明の蛋白質複合体形成剤からなる徐放性医薬製剤の形状は、目的に応じて粉剤、錠剤、注射剤、ペースト、軟膏、坐薬等の形状をとることができ、さらに、他の抗酸化剤であるＳＯＤ、ビタミンＥ、Ｃおよびグルタチオン等も併用できる。
【００１８】
本発明におけるポリフェノールによる蛋白質やＤＮＡとの架橋反応機構は今のところ定かでないが、次のように推定している。ポリフェノールは抗酸化剤の一つとして良く知られているが、他の抗酸化剤には有しない特徴として、水にも油にも良く溶ける両親媒性を持っている点である。さらにもう一つの大きな特徴は蛋白質とのアフィニティーが極めて高い点にある。
【００１９】
この蛋白質に対する高いアフィニティーはポリフェノールのフェノール性水酸基が蛋白質のアミノ基とのイオン結合および疎水性結合等によってバインディングするためであると考えられる。
【００２０】
【作用】
ポリフェノールの免疫抑制作用機構は、細胞、組織および臓器をポリフェノールで処理することにより、それら細胞のレセプターおよび細胞外マトリックスにポリフェノールが容易にバインディングされ、生体の白血球と移植片の血管内皮細胞などとの細胞接着を抑制することにより、生体が移植片を異物として認識されず、結果的に免疫拒絶反応が生じなくなるものと考えられる。
【００２１】
本発明によれば、蛋白質やＤＮＡにポリフェノールを添加することにより複合体が容易に調整でき、細胞接着反応の抑制、アレルギー反応および細胞接着の抑制ができる。詳しくは生体に安全なポリフェノールを用い、サイトカイン類や遺伝子、あるいは酵素類を可逆的に架橋することにより徐放性製剤として有用な蛋白質架橋剤を提供する。
【００２２】
また、人や動物の細胞、組織ならびに臓器をポリフェノールで処理することにより、免疫抑制剤、癌転移抑制剤、抗アレルギー剤、抗炎症剤、慢性関節炎予防、治療剤および動脈硬化症予防、治療剤として有用な細胞抑制剤を提供する。
さらに、微生物類にポリフェノールを添加することにより、微生物の長期間保存にも応用できる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例および比較例で詳述するが、本例示によって本発明は拘束されない。
【００２４】
実施例１
ブタインスリン（Ｓｉｇｍａ製原末）１００ｍｇを０．１ＮＨＣｌ  １０ｍｌに溶解した溶液に、室温でのマク゛ネティックスターラーによる攪拌下で、予め生理食塩水に溶解したエピガロカテキンガレート（１ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ添加した。約５時間後、不溶解物が出現し、その溶液を凍結乾燥することによりインスリン複合体を回収した。インスリン複合体からインスリン溶出量をグルコースオキシダーゼ法（酵素法）により測定した。インスリンは１日後に１８％、３日後に４２％、そして１週間後には９３％が溶出した。
【００２５】
比較例１
ブタインスリン（Ｓｉｇｍａ製原末）１００ｍｇを０．１ＮＨＣｌ  １０ｍｌに溶解した溶液に、室温でのマク゛ネティックスターラーによる攪拌下で、グルタルアルデヒド水溶液を添加し、約５時間後凍結乾燥によりインスリン架橋物を回収した。インスリン架橋物からのインスリン溶出量測定を実施例１と同じ方法で測定したところ、１週間後でもインスリンの溶出が全く認められなかった。
【００２６】
実施例２
市販のインターフェロンα１×１０８ｕｎｉｔを生理食塩水１０ｍｌに溶解し、室温でマグネティックスターラーによる攪拌下、予め生理食塩水に溶解したエピガロカテキンガレート（１ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ添加した。約８時間後、凍結乾燥することによりインターフェロン複合体を回収した。インターフェロン複合体からのインターフェロン溶出量をダイナボット社製キットを使用しＲＩＡ法にて測定した。インターフェロンは１日後６％、３日後に３２％、そして１週間後に８７％溶出した。
【００２７】
比較例２
市販のインターフェロンα１×１０８ｕｎｉｔを生理食塩水１０ｍｌに溶解し、室温でマグネティックスターラーによる攪拌下、予め牛理食塩水に溶解したグルタルアルデヒド水溶液を１００μｌ添加した。約８時間後、凍結乾燥することによりインターフェロン架橋物を回収した。インターフェロン架橋物からのインターフェロン溶出量を実施例２と同じ方法で測定したところ１週間後でもインターフェロン溶出は全く認められなかった。
【００２８】
実施例３
天然型ヒト上皮細胞成長因子（ヒトＥＧＦ、凍結乾燥品、大塚製薬社製）７５０μｇを５ｍｌの０．１ＮＨＣｌに溶解した溶液を、室温でのマク゛ネティックスターラーによる攪拌下で、予め生理食塩水に溶解したエピガロカテキンガレート（１ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ添加した。約５時間攪拌後、凍結乾燥することによりＥＧＦ複合体を回収した。ＥＧＦ複合体からのＥＧＦ溶出量をＨＰＬＣにて測定した。ＥＧＦは１日後に２１％、３日後に４５％、そして１週間後には９７％が溶出した。
【００２９】
比較例３
天然型ヒト上皮細胞成長因子（ヒトＥＧＦ、凍結乾燥品、大塚製薬社製）７５０μｇを５ｍｌの０．１ＮＨＣｌに溶解した溶液を、室温でのマク゛ネティックスターラーによる攪拌下で、グルタルアルデヒド水溶液を５０μｌ添加し、約５時間攪拌後、凍結乾燥によりＥＧＦ架橋体を回収した。ＥＧＦ架橋体からのＥＧＦ溶出量を実施例３と同じ方法で測定したところ、１週間後でもＥＧＦの溶出は全く認められなかった。
【００３０】
実施例４
ラットの腹腔大動脈（直径約３ｍｍ）を約４ｃｍ切除し、ポリフェノールを１ｍｇ／ｍｌ添加したＤＭＥＭ培養液に２４時間３７℃に浸漬した。その血管を家兎頚動脈への血管吻合により異種移植した。この移植を受けた家兎は２ヶ月以上生存し、血管造影により血流が認められた。さらに、移植２ヶ月後の移植血管の組織標本も正常な組織反応を示した。
【００３１】
比較例４
ラットの腹腔大動脈（直径約３ｍｍ）を約４ｃｍ切除し、ＤＭＥＭ培養液に２４時間３７℃に浸漬した。その血管を家兎頚動脈への血管吻合により異種移植した。この移植を受けた家兎は２日後死亡した。摘出した移植血管内空は血栓が全面を覆っていた。
【００３２】
実施例５
βガラクトシダーゼをレポーター遺伝子として持つプラスミドＰＬＺＲＮのＤＮＡ３０μＭを燐酸緩衝液（ＰＢＳ（−））中に溶解したＤＮＡ溶液に、予めＰＢＳ（−）に溶解したエピガロカテキンガレート（１ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ添加した。約５時間攪拌後、凍結乾燥することによりＤＮＡ複合体を回収した。
ＤＮＡ複合体の細胞内でのＤＮＡ発現をラット線維芽細胞由来の接着細胞株２０８Ｆを用いて培養し、遺伝子導入量を発現したβガラクトシダーゼ活性として測定した。その結果、ＤＮＡ−エピガロカテキンガレート複合体によるβガラクトシダーゼ遺伝子の安定形質転換株は一過性発現に比べて非常に高い活性を示した。
【００３３】
実施例６
スギ花粉より抽出・精製したアレルゲン蛋白質５０ｍｇを１０ｍｌの生理食塩水に溶解した溶液にエピガロカテキンガレート（１ｍｇ／ｍｇ）を１００μｇ添加し、５時間攪拌した後、凍結乾燥によりアレルゲン蛋白質複合体を回収した。この複合体に対するラットのＰＫ反応によってアレルゲン性を比較したところ、ＩｇＥ抑制効果が認められた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、ポリフェノールのカテキン類を蛋白質の複合体形成剤として用いることにより、生理活性蛋白質であるサイトカイン類のドラッグデリバリー製剤として有用である。また、ＤＮＡの複合体形成剤として用いることにより、種々の遺伝子類と再現性よく不溶性のＤＮＡ複合体を容易に形成でき、このＤＮＡ複合体は標的細胞に効率よく導入発現させることができる。そのため、遺伝子治療や有用物質産出のための細胞育種などに応用できる。また、ポリフェノールのカテキン類は優れた細胞接着抑制作用を持っているので、免疫抑制剤、抗アレルギー剤、癌転移抑制剤、点眼液、眼科用灌流液、抗炎症剤、動脈硬化症予防治療剤等の予防や治療に広範囲で使用することができる。また、種々の微生物類の長期間保存剤としても応用できる。さらに、移植用の臍帯血、各種細胞、組織、および臓器にも広く応用することができる。