(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の化合物に結合した、ヒトＰｅｒｉｏｄタンパク質の核局在化配列ペプチドに由来するか又はそれと重複する膜透過性ペプチドからなる、所定の化合物を細胞内に送達するための融合タンパク質であって、
該膜透過性ペプチドは、以下のペプチド：
SRRHHCRSKAKRSRHH；
SARHHCRSKAKRSRHH；
SRAHHCRSKAKRSRHH；
SRRAHCRSKAKRSRHH；
SRRHACRSKAKRSRHH；
SRRHHARSKAKRSRHH；
SRRHHCRAKAKRSRHH；
SRRHHCRSAAKRSRHH；
SRRHHCRSKAARSRHH；
SRRHHCRSKAKASRHH；
SRRHHCRSKAKRARHH；
SRRHHCRSKAKRSAHH；
RRHHCRSKAKRSR；
RKGKHKRKKLP；
からなる群より選択され、
該所定の化合物は、該膜透過性ペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に結合している、上記融合タンパク質。
【請求項２】
所定の化合物はペプチド、タンパク質、化学物質、核酸またはそれらの任意の修飾された形態である請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１記載の融合タンパク質を細胞と接触させることからなる、所定の化合物を細胞内に送達するインビトロの方法。
【請求項４】
請求項１記載の融合タンパク質を培養細胞と接触させることからなる、所定の化合物をインビトロで細胞内に送達する方法。
【請求項５】
所定の化合物は、膜透過性ペプチドに直接化学的にまたはリンカーにより結合させたものである請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項６】
リンカーはアミノ酸リンカーまたはポリペプチドリンカーである請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項７】
膜透過性タンパク質は組換え技術、化学合成または前駆体タンパク質の分解により産生されたものである請求項１記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願】
本出願は2000年８月25日の出願に係る米国特許仮出願60/227,647号および2001年２月７日の出願に係る英国特許出願0103110.3号の利益を享受する。
【０００２】
【技術分野】
本発明は、所定の化合物をインビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて細胞に細胞内送達するためのインビトロ、エキソビボおよびインビボ送達デバイスとして有用な膜透過性ペプチド、それらからなる組成物およびそれらを使用する方法に関する。本発明はまたさらに、所定の化合物をインビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて細胞に細胞内送達するための送達デバイスとして有用な膜透過性ペプチドの同定に関する。
【０００３】
【背景技術】
生物学的な膜を通過しての小分子、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質の送達は、治療および確認規範のチャレンジが直面する大きな課題である。最近ではアンテナペディア、TAT−HIVおよびVP22に由来する形質導入ペプチドが生物学的膜を透過し、カーゴビークルとして働いて、特異的な細胞下コンパートメント（subcellular compartment）に標的化されることが確立されている。本発明者らは形質導入ペプチドとして機能するヒトPeriod １（hPER１）概日周期タンパク質の核局在配列（NLS）の同定をここに示す。さらに重要な点は、データベースの探索を用いて、本発明者らは他のタンパク質のNLS内に包埋されている知られていない付加的な形質導入ペプチドを明らかにし、遺伝子によりコードされた形質導入ペプチドの数を３から１４に拡大したことである。本発明者らのデータによれば、形質導入ペプチドはNLS内に見出され、普遍的かつ多様性であり、ゲノムを通じて広く分布することが示唆されている。ある種の細胞外および細胞内タンパク質は細胞内の特異的なオルガネラに標的化され、膜を内外に横切り、または細胞から分泌されることは十分に確立されている。細胞内タンパク質の標的化を生じる生物学的機構はその特徴を持続し続けるが、局在の一つの機構は所定のタンパク質内に含まれる特異的リーダー配列またはタンパク質内配列によって生じることが十分認識される。細胞内の選ばれたオルガネラ内におけるタンパク質の局在は特異的な標的化配列によって補助される。多数の核局在配列（NLS）が、タンパク質の輸送、または他の場合には、細胞質から核膜内部への通過を可能にするものとしてタンパク質内に同定されている。
【０００４】
標的化配列、およびさもなければ他の場合には非標的化配列を含む融合タンパク質は、選択された標的化配列に依存して選択される細胞オルガネラ中に局在する。たとえば、Ferullo JM & Paget E：フランス特許279695には、酵素をサイトゾル以外の細胞内コンパートメントたとえば小胞対向性のシグナル配列に融合したヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（HPPD）の選択的コンパートメンタリゼーションが開示されている。同様に、WO 0147950（Wehrle-Haller, Bernhard M: Imhof, Beat A）には基底外側に対する標的化および細胞表面に繋留された成長因子の細胞表面に対する長期間暴露に関与する新しい決定基が同定されている。シグナルは、アミノ酸配列X1h2X3h4Lp5p6（式中、X1は極性アミノ酸残基またはアラニンを表し、h2は任意の疎水性アミノ酸残基を表し、X3は任意のアミノ酸残基を表し、h4はロイシンおよびイソロイシンを除く任意の疎水性アミノ酸残基を表し、Ｌはロイシン残基を表し、p5は任意の極性アミノ酸残基を表し、p6は任意の極性アミノ酸残基を表す）から構成されるモノロイシン依存性基底外側ソーティングシグナルである。Richardson, A.E.ら, Plant J. (2001), 25 (6), 641-649にはキャロット伸長遺伝子からのシグナルペプチドを含む酵素アスペルギルスフィターゼの操作が記載されている。得られた融合タンパク質は、隣接する土壌に細胞外酵素として分泌された場合にのみ有効であって、トランスジェニック系列における根の総フィターゼ活性は２０倍に上昇し、以後のリン栄養は、植物の成長およびリン含量が無機リンを供給された対照植物と同等に改善された。WO 0132894（Lok, S.）には、組換えタンパク質をトランスフェクト細胞の表面に繋留させる目的でのII型細胞表面タンパク質シグナル繋留ドメイン配列の使用が開示されている。II型細胞表面タンパク質の特徴的性質は、それらが単一の疎水性膜貫通ドメインによって細胞膜内に保持され、それらのＣ−末端は細胞の外側に向けられていることである。
【０００５】
さらに最近になって、能動的な輸送機構もしくは「ポア」を必要とせずに細胞膜を通過できる数種のタンパク質が同定された。アンテナペディア、TATおよびVP22に由来する膜透過性ペプチド（MPP, タンパク質形質導入ドメイン、「PTD」としても知られる）が生物学的膜を貫通し、特異的な細胞下コンパートメントを標的化できることが最近分かった。以前に開示されたこれらのタンパク質には哺乳動物タンパク質に由来するものはない。本発明の目的は哺乳動物または酵母タンパク質の核局在化配列（NLS）に由来するポリペプチドまたはNLSと重複するポリペプチドがMPPとして作用可能であることの発見、および大きなタンパク質たとえば生物学的に活性なタンパク質または他の有機化合物と結合していても、細胞膜を透過することができる特異的ポリペプチド配列の同定に向けられている。
【０００６】
核輸送は、遺伝子の発現および細胞分裂、ならびにウイルスの複製、腫瘍形成および腫瘍細胞の増殖を含む多くの生物学的過程に必須である。核輸送の機構は最近その特徴の詳細が明らかにされたばかりで、多数の別個の工程を含むことが示されている。核内への輸送が予定されるタンパク質は、それらのアミノ酸配列内に核局在化配列（「NLS」）と呼ばれる短いアミノ酸のストレッチを含有する。これらの配列はそのアミノ酸配列内の任意場所に存在して、通常４〜約８個のアミノ酸からなる。これらの配列は、一般に本質は塩基性（すなわち、陽性に荷電している）が、コンセンサス配列は同定されていない。すなわち、これらの広範囲の配列が特定のタンパク質に特異的であるように思われる。
【０００７】
細胞内においては、これらのNLSは補助的タンパク質によって、またはNLS含有タンパク質内のコンフォーメーション変化によってマスクされていても、マスクされていなくてもよい。NLSはタンパク質のコア中に埋没しており、タンパク質の表面に露出されないのでマスクされているであろう。NLSのマスクをはずすことおよび細胞質タンパク質の核トランスロケーションは、リン酸化、脱リン酸化、蛋白分解消化、阻害サブユニットのサブユニット会合もしくは解離等により誘発される。したがって、NLSのマスキングおよびアンマスキングは、これらの細胞質タンパク質の核への輸送を調節する機構を提供する。たとえば、転写因子NF−ATは、細胞内カルシウムの存在下にNF−ATの核へのトランスロケートを可能にする核局在化配列を含有するが、カルシウムの不存在下にはNF−ATポリペプチド内の他のドメインとの分子内会合の形成によりシールドされる。
【０００８】
Lee H.C. & Bernstein H.D.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001), 98 (6), 3471-3476）は分泌前タンパク質たとえばマルトース結合タンパク質（MBP）および、シグナル認識粒子（SRP）によるシャペロン分子SecBによって大腸菌内膜に標的化される、膜内在性タンパク質の標的化とは異なる外膜タンパク質Ａ（OmpA）の関与する機構を検討した。その著者らはMBPまたはOmpAシグナルペプチドをAcrBの最初の膜貫通セグメントで置換すると、輸送に対するSecBへの依存性は消失し、両タンパク質はSRP標的化経路に経路変更されることを見出した。
【０００９】
一部のタンパク質は細胞質局在化配列（CLS）または核エキスポート配列を含有し、これがタンパク質の細胞質中における優先的な残留を保証する。たとえば、Hamilton MHら, J. Biol. Chem. (2001), 276 (28), 26324-26331は、ユビキチン−タンパク質リガーゼ (E3), hRPF1／Nedd4, すなわち基質認識および基質特異性に関与するユビキタン−プロテアーゼ経路の成分は核に進入できるが、hRPF1／Nedd4における機能性Rev−様核エキスポート配列の存在下では優先的な細胞質局在化を確実にすることを示している。多くの膜タンパク質の細胞質ドメインは形質膜からのそれらのエンドサイトーシスを仲介するソーティングシグナルを含有する。
【００１０】
Heineman T.C. & Hall SV（Virology (2001), 285 (1), 42-49）はVZV gBの細胞質ドメイン内の３種のコンセンサス内在化モチーフを検討し、VZV gBの内在化およびそれに続くゴルジへの局在はその細胞質ドメイン内の２つのチロシンベース配列モチーフにより仲介されることを決定した。哺乳動物細胞および酵母細胞においては、膜貫通タンパク質の細胞質テールにおけるアミノ酸モチーフが、小胞体（ER）からの迅速なエキスポートによる局在を仲介することによって初期分泌経路におけるタンパク質の標的化に顕著な役割を果たしている（Hoppe HC & Joiner KA, Cell Microbiol. (2000), 2 (6), 569-578）。
【００１１】
哺乳動物のエンドペプチダーゼのフューリンは定常状態においてはトランス−ゴルジネットワーク（TGN）に著明に局在する。このコンパートメントに対するフューリンの局在はタンパク質がTGNと形質膜の間で環形成を受ける動的過程の結果であると思われる。TGNの局在と形質膜からの内在化の両者はフューリンの形質膜ドメイン内に含まれる標的化情報によって仲介される。Voorhees Pら, EMBO J. (1955), 14 (20), 4961-75には、フユーリンの定常状態における局在および交換に寄与する細胞質決定基に少なくとも２種があることが報告されている。第一の決定基は主として内在化シグナルとして機能する標準的なチロシンベースのモチーフ、YKGL（残基758−761）に相当する。第二の決定基は、酸性残基（ＥおよびＤ）の大きなクラスターを含み、チロシンベースまたはジロイシンベースのモチーフを欠く強力な疎水性配列（残基766−783）から構成される。この第二の決定基はTGNへの局在性の付与と同時に形質膜からの内在化を仲介することができる。
【００１２】
トランス−ゴルジネットワーク（TGN）はタンパク質のソーティング／ターゲッティングに中心的な役割を果たし、配列SXYQRLはそれ自体有意なTGN局在性を付与することができる。Wong, S.H. & Hong, W., J. Biol. Chem. (1993). 268 (30), 22853−62には、TGN38の３２−残基配列の詳細な突然変異誘発源としてTGNに封じ込まれた内在性膜タンパク質が報告され、TGNの局在にはそれぞれ位置23、25および28におけるSer、TyrおよびLeuが必須であることが決定された。TGN38の細胞質３２−残基配列がグリコフォリンＡ（表面タンパク質）の外部および膜貫通ドメインに融合している場合、生じるキメラタンパク質はＴＧＮに局在した。
【００１３】
ある種のタンパク質が特異的なオルガネラ内でのみ活性であるか、またはそれらの局在に応じて別異に機能できることは十分に認識されている。たとえば適当な細胞下局在はNF−κB機能の調節にきわめて重要である。Huang, T.T.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), 97(3), 1014-1019には、潜在的NF−κB複合体がプレインダクション状態において核を出入させることができることを示し、不活性複合体の細胞質局在に要求されるＩκBαの残基45−54中の、以前には特性が明らかにされていなかった核エキスポート配列が決定されている。NF−κB／ＩκBα複合体は、核局在シグナル依存性インポートおよびCRM１−依存性核エキスポートによって細胞質と核の間を折り返し輸送され、核インポートを越える支配的な核エキスポートが不活性複合体の細胞質局在に大きく寄与し、細胞外シグナルによる効果的なNF−κB活性化が達成されるものと思われる。
【００１４】
古典的核局在化配列含有タンパク質の核インポートには、核膜孔複合体（NPC）の細胞質表面におけるインポート複合体のアッセンブリーが関与し、ついでこの複合体のNPCの貫通移動および核内部へのインポート基質の放出が起こる。Ranとの組み合わせで、他の２つの溶解因子が核への古典的または基本的なＮＬＳを含有するタンパク質の核へのインポートを仲介するために絶対的に要求される。第一のものはカリオフェリン／インポーティンα（Kap α）であり、これは古典的ＮＬＳとを結合し、ついでカリオフェリン／インポーティンβ１（Kap β１）と複合体を形成する（Adam, S.A. & Gerace, L., (1991) Cell 66, 837-847; Goerlich, D.ら (1994) Cell 79, 767-778; Moroianu, J.ら (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2008-2011; Radu, A.ら (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA  92, 1769-1773; Goerlich, D.ら (1995) Curr. Biol. 5, 383-392; Chi, N.C.ら, J. Cell Biol. 130, 265-274）。Kap β１は核膜孔複合体（NPC）タンパク質と相互作用し、これらの相互作用を介してNPCを通過するインポート複合体の移動が仲介されるものと思われる（Rexach, M. & Blobel, G. (1955) Cell 83, 683-692; Radu, A., Blobel, G. & Moore, M.S. (1955) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1769-1773; Iovine, M.K., Watkins, J.L. & Wente, S.R. (1995) J. Cell Biol. 131, 1699-1713; Radu, A., Moore, M.S. & Blobel, G. (1955) Cell 81, 215-222）。他のタンパク質、p10／NTF2も核インポートに関連しているが、その機能はRanを核内に取り込むのみで、入ったインポート複合体をついで分解する必要がある（Moore, M.S. & Blobel, G., (1994) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10212-10216; Paschal, B.M. & Gerace, L., (1995) J. Cell Biol. 129, 925-937; Ribbeck, K., Lipowsky, G., Kent, H.M., Stewart, M. & Goerlich, D., (1998) EMBO J. 17, 6587-6598; Smith, A., Brownawell, A. & Macara, I.G., (1998) Curr. Biol. 8, 1403-1406）。
【００１５】
酵母（SPR１またはKap 60）には唯１個のKapαホモローグが存在するが、脊椎動物細胞は、古典的NLSを結合可能であり、配列ホモロジーを有する多くのタンパク質を含有する（Nachury, M.V., Ryder, U.W., Lamond, A.I, & Weis, K. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 582-587およびそこに引用された文献参照）。これらのタンパク質には様々な名称が与えられているが、３つの主要なファミリーに分類することができる。Kapα１ファミリーはヒトタンパク質NPI−１／インポーティンα１／カリオフェリンα１／Rch２／hSRP１およびマウスＳ２タンパク質に加えて第二の関連タンパク質、インポーティンα６を含有する（Moroianu, J.ら (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2008-2011; Cortes, P.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7633-7637; O'Neill, R.E.ら (1995) J. Biol. Chem. 270, 22701-22704; Kohler, M.ら (1997) FEBS Lett. 417, 104-108; Tsuji, L.ら (1997) FEBS Lett. 416, 30-34）。第二のファミリー、Kapα２には、ヒトRch１／hSRP１／インポーティンα２／カリオフェリンα２およびマウスタンパク質のペンジュリン／PTAC58が含有される（Goerlich, D., Prehn, S., Laskey, R.A. & Hartmann, E. (1994) Cell 79, 767-778; Cuomo, C.A., Kirch, S.A., Gyuris, J., Brent, R. & Oettinger, M.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6156-6160; Kussel, P. & Frasch, M. (1995) Mol. Gen. Genet. 248, 351-363; Imamoto, N., Shimamoto, T., Takao, T., Tachibana, T., Kose, S., Matsuubae, M., Sekimoto, T., Shimonishi, Y. & Yoneda, Y. (1995) EMBO J. 14, 3617-3626; K., Mattaj, I.W. & Lamond, A.I. (1995) Science 268, 1049-53）。第三のファミリー、Kapα３は、２種のヒトタンパク質、QIP1／インポーティンα３およびKPNA３／hSPR１γ／hSRP４、ならびにマウスタンパク質Ｑ１およびＱ２から構成される（Nachury, M.V.ら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 582-587; Kohler, M.ら（1997） FEBS Lett. 417, 104-108; Tsuji, L.ら (1997) FEBS Lett. 416, 30-34; Takeda, S.ら (1997) Cytogenet. Cell Genet. 76, 87-93; Seki Tら (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 48-53; Miyamoto, Y.ら (1997) J. Biol. Chem. 272, 26375-26381）。これらのクラスのそれぞれは互いにおよび酵素SRP１と約５０％のホモロジーを有し、これらの哺乳動物タンパク質のそれぞれは１またはそれ以上の古典的NLS−含有タンパク質のインポートを仲介できることが示されている（Nachury, M.V.ら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 582-587; Sekimoto, T. ら (1997) EMBO J. 16, 7067-7077; Nadler, S.G.ら (1997) J. Biol. Chem. 272, 4310-4315; Prieve, M.G.ら (1998) Mol. Cell Biol. 18, 4819-4832）。
【００１６】
Stat−１のインポートはKapα１／NPI−１によって仲介されるが、Kapα２／Rch１によっては仲介されない。しかしながら、活性化Stat−１はＮＬＳ結合Armadilloリピートから離れたKapα１のCOOH−末端領域に結合するものと思われる。RCC１に対し観察される、異なるKapαの結合の差は単にRCC１上のNLSによるものであり、したがって多分、Kapα３のＮＬＳ結合領域によるものと思われる（Sekimoto, T.ら(1997) EMBO J. 16, 7067-7077）。Kamei, Y.ら (1999) J. Histochem. Cytochem. 47, 363-373は、マウスにおいて、Kapα３ホモローグは多くの組織で発現されることを示し、Kapα３が「限られた数のユニークなカリオフィリックなタンパク質たとえばヘリカーゼQ1」のインポートにある役割を果たしていることを理論化した。Talcott, B. & Moore, M.S. (2000) J. Biol. Chem. 275 (14) 10099-10104によって提供された結果はRCC１がKapα３をそれらの核インポートに用いるタンパク質のグループに含まれることを示唆するものである。
【００１７】
米国特許6,191,269号には、核局在化配列（NLS）の特徴を有し、プロピースの核局在を仲介ができる（Stevensonら, (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 508-13）Ｎ−末端IL−αプロピースT76-NGKVLKKRRLのcDNA配列内に含まれる核局在配列の存在が教示されている。Ｎ−末端IL−αプロピースをコードするcDNAの培養糸球体間質細胞への導入は核の蓄積を生じた（Stevensonら, 前出）。
【００１８】
米国特許5,877,282号は、アンテナペディア  ホメオドメインシグナル配列ペプチドはアミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKKであり、線維芽細胞成長因子シグナル配列ペプチドはAAVALLPAVLLALLAであり、HIV Tatシグナル配列ペプチドはアミノ酸配列CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHであることを教示している。
【００１９】
Schwartze, S.R.ら, Science 285: 1569-1572 (1999) は, TAT融合タンパク質として組織にｉｐ注射したレポータータンパク質, 116 kD β−ガラクトシダーゼが脳血管関門を通過して送達されることを報告している。Schwartzeは、HIV tatタンパク質に由来する１１アミノ酸タンパク質形質導入ドメイン（PTD）をＮ−末端フルオレセインイソチオシアナート (FITC)−Gly−Gly−Gly−Glyモチーフとともに使用した。この著者らはTAT PTDに化学的に架橋されたβ−Galを形質導入する初期の試みが、限られた数の組織において、散在性の弱いβ−Gal活性を生じたことを報告している。彼らは、改善された形質導入は、用いられたインフレーム融合と精製戦略によるものと推論している。
【００２０】
IFNγの核局在化は多重塩基性NLSによってそのＣ末端において仲介され、細胞外および細胞内両者におけるIFNγの生物学的活性の完全な発現が要求される（Subramaniam, Prem S.ら, J. Cell Sci. (2000), 113 (15), 2771-2781）。このNLSは、IFNγによって活性化される転写因子、STAT１αの核トランスロケーションに内在性の細胞内の役割を果たしていると考えられる。なぜならば、NLSを含むＣ−末端領域（95−133）に対する抗体によるIFNγの処理はSTAT１α核トランスロケーションの誘導を遮断するが、これらの抗体IFNα処理細胞におけるSTAT１αの核トランスロケーションには何らの作用も示さないからである。Ｃ−末端NLS領域を欠くヒトIFNγの欠失突然変異体、IFNγ（1−123）は生物学的に不活性であるが、細胞上のIFNγ受容体複合体に、野生型タンパク質の場合と類似のＫdにおいてなお結合することができる。NLSの欠失はIFNγ受容体複合体に結合したのちのIFNγの生物学的活性に要求されるSTAT１α核トランスロケーションを開始させるIFNγの能力を、特異的に消失させる。NLSモチーフを含むマウスIFNγのＣ−末端ペプチド、IFNγ(95−133) は、マウスマクロファージ細胞系によって細胞内に取り込まれた場合に、STAT１αの核トランスロケーションを誘導した。NLSモチーフの欠失では、この細胞内ペプチドの核トランスロケーション能力が特異的に阻害される。IFNγで活性化された細胞では、IFNγはSTAT１αおよびインポーティン−αアナログ、Npi−１を含む複合体の部分として見出され、これはSTAT１αの核インポートを仲介する。STAT１αのチロシンリン酸化、複合体IFNγ／Npi−１／STAT１α複合体の形成およびそれに続くSTAT１αの核トランスロケーションはすべてIFNγ NLSの存在に依存した。
【００２１】
多重塩基性配列、126RKRKRSR132を含有するIFN−γのアミノ酸95−132を表すペプチドはATPおよびGTPの両者を要求するエネルギー依存性様式で自己蛍光タンパク質、APCの核取り込みを特異化する。上述の多重塩基性配列を欠失させた場合は、核インポートは消失した（Subramaniam Pら (1999), J. Biol. Chem. 274 (1), 403-407）。SV40の大Ｔ−抗原のプロト型多重塩基性NLS配列を含むペプチドもまた、IFNγ(95−132) によって仲介される核インポートを阻害することが可能であり、これはIFNγ中のNLSがSV40 T-NLSによって利用されるRan／インポーティン経路の成分を介して機能することを示唆している。無傷のIFNγがAPCにカップリングした場合にもその核インポートを仲介することが可能であり、この核インポートはペプチドIFNγ（95−132）およびSV40 T−NLSペプチドによって遮断され、無傷のIFNγもRan／インポーティン経路を介して核内に輸送されることを示唆している。
【００２２】
核タンパク質は、核膜孔複合体（NPC）と呼ばれる核エンベロープに広がる水性チャンネルを通ってインポートされる。約２０〜４０Da未満のイオンおよび分子は核膜孔複合体を通過して受動的に拡散することができるが、より大きいタンパク質はエネルギーおよびシグナル依存性の飽和経路によって輸送される。核タンパク質のインポートを特定するシグナル（NLS）１は通常、塩基性アミノ酸残基に富んだ短いアミノ酸のストレッチであるが、最近では他のクラスのNLSも報告されている。塩基性アミノ酸型のNLSを含有するタンパク質のインポートにおける開始工程はNLS含有タンパク質が受容体（NLS受容体、インポーティンαおよびカリオフェリンと様々に呼ばれる）に結合している細胞質で起こる（13）。基質−受容体複合体はついで、核膜孔複合体の細胞質表面と会合し、これに細胞質型因子が関与して、核膜孔複合体中の開口チャンネルを通って核内に輸送される。NLS−仲介核インポートのインビボ現象は、細胞質抽出物およびATPを補充されたジギトニン透過性細胞を用いたインビトロ系において再現することができる。このインビトロアッセイにおける輸送は、インビボインポートを遮断する同一の阻害剤で遮断され、迅速かつ容易に定量される。
【００２３】
線維芽細胞成長因子(FGF)−１のＮ−末端におけるNLS、配列NYKKPKL、酸性FGFのプレカーサーは、核トランスロケーションシグナルとしてのその機能によるFGF-1の長期活性化または膜貫通受容体キナーゼの結合および活性化の維持に必要な構造の安定化におけるその役割に影響することが提案されている（Luo, Y.ら, J. Biol. Chem. (1996) 271 (43), 26876-26883）。たとえば、至適活性における外因性ヘパリン依存性の著しい増大とともに、FGF−１の残基NYKKPKLの逐次欠失は熱安定性、プロテアーゼに対する抵抗性、マイトジェン活性および膜貫通受容体に対する親和性を漸進的に消失させる。最大の変化はリジン−ロイシン残基を通じての全配列の欠失から生じた。十分高濃度のヘパリンの存在下には欠失突然変異体は野生型FGF−１に等しいマイトジェン活性を示した。
【００２４】
FGF−１はNTSを含有するが、核トランスロケーションには外因性の、内因性ではない経路が必要とされる。FGF−１のNTS、NYKKPKLはトランスフェクトされたNIH 3T3細胞の核に細菌性β−ガラクトシダーゼ（βgal）遺伝子の発現を指図することができるが、このNTSはFGF−１それ自体またはFGF−１−βgal融合タンパク質のいずれも核へ標的化することはできず、FGF−１には、内因的に発現されたFGF−１の核へのトランスロケーションを妨げる付加的配列が包含されることを示唆している（Zhan, X.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992) 188 (3), 982-91）。
【００２５】
インターフェロン−γ（IFN−γ）は、シグナル伝達にJak−Stat経路を使用するタンパク質であって、サイトカインで細胞外処理した細胞においては核に急速にトランスロケートする。NLSはヒトおよびマウスIFN−γのＣ−末端に同定され、特性が明らかにされている。Larkin Jら, J. Interferon Cytokine Res. (2001) 21 (6), 341-348は、ヒトIFN−γ（Hu IFN−γ）が上流部位に第二のNLSを含有することを報告している。HuIFN−γのアミノ酸122−132を表すマウスIFN−γ中に同定されたNLS配列と同族の一次配列は自己蛍光タンパク質アロフィコシアニン（APC）の核インポートをエネルギー依存的様式で仲介することができた。Hu IFN−γのアミノ酸78−92を表す第二の配列もAPCの核インポートをエネルギー依存的様式で仲介することができたが、その程度は著しく低かった。APCに複合した両配列の核インポートは複合していないHuIFN−γ（122−132）との競合によって強力に遮断された。配列HuIFN−γ（78−82）による競合は、APC−複合HuIFN−γ（78-92）のインポートを効果的に遮断したが、同じ濃度でもAPC−複合HuIFN−γ（122−132）の核インポートは阻害することができず、HuIFN−γ（78-92）はHuIFN-γ（122−132）よりNLSとしての効率が低いことを示唆している。これはNLSの122−132における下流を欠くHuIFN−γの抗ウイルス活性の＞９０％喪失に一致する。APC複合HuIFN−γ（122−132）の核インポートはSV40 T NLSのプロトタイプ多重塩基性NLSを含むペプチドにより阻害され、これは両場合において同じRan／インポーティン細胞性機構が使用されていることを示唆する。
【００２６】
核局在化の機構としては、NLSモチーフの強力な保存があるものと思われる。DNA結合タンパク質を核内に封入する場合には、存在するDNA結合機構の部分が進化に用いられたように思われる。Cokol, M.ら（EMBO Rep. (2000), 1(5), 411-415）は真核タンパク質の１７％以上が核にインポートされるものと推定して、文献から実験的に確証されたNLSの９１のセットを分析後、このセットを「インシリコ突然変異」によって繰り返した２１４のセットの可能性のあるNLSに拡大した。この最終セットは、すべての既知核タンパク質の４３％にマッチし、非核タンパク質はなかった。CokelらNLSおよびDNA結合領域両者が知られているタンパク質の９０％についてNLSとDNA結合領域の間に重複を見出したが、２１４のNLSモチーフ中５６のみがDNA結合領域に重複した。これらの５６のNLSによって、ヒト、ハエ、蠕虫および酵母における約８００種の部分的DNA結合領域が新たに予測された。
【００２７】
さらに最近になって、NLSシグナルペプチドはDNAの構造変化を誘導できることが報告されている。Lupinus luteusからの植物酵素であるグルタミニル−tRNAシンテターゼGlnRSはＮ−末端にリジンに富んだポリペプチド、KPKKKKEKとしてNLSを含有する（Krzyzanik, A.ら, Mol. Biol. Rep. (2000), 27 (1), 51-54）。ルピンGlnRSのNLS配列に由来する２つの合成ペプチド（２０および８アミノ酸長）はDNAと相互作用する。さらに、短い８アミノ酸のペプチドは、Ｂ型からＺ型へのDNAのコンフォーメーション変化を引き起こす。この観察はGlnRSのリーダー配列中におけるNLSポリペプチドの存在がタンパク質の輸送のみならず、遺伝子発現の調節に必要なことを明らかに示唆している。これは、DNAの構造変化におけるNLSシグナルペプチドの役割を最初に示唆した報告である。
【００２８】
通常、種の中のNLS配列には強力な保存が認められる。たとえば、TGF−βシグナル伝達に関与する主要なSmadタンパク質であるSmad ３タンパク質のNLSはＮ−末端領域に塩基性モチーフ、Lys40−Lys−Leu−Lys−Lys44を有し、これは、経路特異的なすべてのSmadタンパク質中で保存され、そのリガンドに対する応答においてSmadの核インポートを必要とする。Smadタンパク質はトランスフォーミング成長因子−β（TGF−β）および関連サイトカインの細胞内メディエーターである。Xiao, Z.ら（J. Biol. Chem. (2000), 275 (31), 23425-23428）は核局在化においてNLSが果たす役割を同定した。この著者らは単離Smad ３ MH１ドメインがインポーティンβへの有意に特異的な結合を示し、これはNLSにおける突然変異により減弱または消失すことを証明した。完全長のSmad３はインポーティンβに弱いが特異的な結合を示し、これはＩ型TGF−β受容体によるリン酸化後に増強される。これに反し、インポーティンαとSmad３またはそのMH１ドメインの間には相互作用は観察されず、Smadタンパク質の核トランスロケーションはインポーティンβへの直接結合によることが示される。この著者らは、経路特異的なSmadすべてのタンパク質（Smad １、２、３、５、８および９）の活性化が保存されたNLSモチーフを露出させ、ついで直接インポーティンβに結合し、核のトランスロケーションを誘導すると結論した。
【００２９】
すべて細胞において、細胞の脂質二重層細胞膜は荷電分子通過の選択的障害として作用し、それとともに疎水性巨大分子の内在化は古典的輸送経路により達成される（Hawiger, J., Curr Opin. Chem. Biol. 3, 89-94, 1999; Schwarze, S.R.ら, Trends in Cell Biology, 10, 290-295, 2000）。これらの古典的内在化機構には、受容体仲介エンドサイトーシスまたはトランスポート依存性取り込みが関与する（Cleves, A.E., Current Biology, 7, R318-R320 (1997)）。これに反し、古典的インポートおよび／またはエキスポートシグナルを欠く分子数の増加が見出された（Cleves, A.E., Current Biology, 7, R318-R320 (1997)）。これらの分子は、慣用的ではなくその機構はほとんど分かっていないプロセスを用いて直接、細胞質または核コンパートメントにアクセスすることができる。これらの新規な機構は、一般的に「非古典的」と呼ばれ、使用される輸送経路は非定型的である。後者に関連する例はHIV−１ TAT（Frankel, A.D. & Pabo, C.O., Cell, 55, 1189-1193 (1988)）、ヘルペスウイルスVP22（Elliott, G. & O'Hare, P., Cell, 88, 223-233 (1997)）およびアンテナペディア, Antp（Derossi, D.ら, J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994)）の遺伝子コードタンパク質中に見出される。HIV-I TAT（Helland, D.E.ら, J. Virol. 65, 4547-4549 (1991)）およびVP22（Pomeranz, L.E. & Blaho, J.A., J. Virol. 73, 6769- 6781 (1999)）の完全長タンパク質が迅速に細胞膜内外にトランスロケートされることは現在では十分確立されている。実際別個のペプチド領域が、単独でまたはキメラカーゴペプチドとの組み合わせおよびタンパク質を細胞コンパートメント内にトランスロケートすることができるこれらのタンパク質両者内に同定されている（Lindgren, M.ら, Trends Pharmacol. Sci. 3, 99-103 (2000), Derossi, D.ら Trends Cell Biol., 8, 84-87(1998), Prochiantz, A., Current Opinion in Cell Biology 12, 400-406 (2000), Steven, R. Scnwarze, S.R.ら, Trends in Cell Biology 10, 290-295 (2000)）。これに反して、完全長Antpタンパク質が生物学的膜を横断することは示されなかったが、そのコード領域内に由来する１６アミノ酸の合成ペプチドは強力な膜透過性能力を有する（Derossi, D.ら, Trends Cell Biol. 8, 84-87 (1998)）。これらの核によって使用される非定型的輸送の受け入れられた概要は「伝達」（transduction）と呼ばれたが（Schwarze, S.R.ら, Trends in Cell Biology 10, 290-295 (2000)）、現在は受容体およびエネルギー依存性ですべての細胞型においてC4で生じる著しく迅速な膜透過性経路として定義されている（Schwarz, S.R. & Dowdy, S.F., Trends Pharmacol. Sci. 21, 45-48 (2000)）。所定のことに、これらの３つのタンパク質はすべて転写調節に関与する核タンパク質であり、それぞれの形質導入ペプチドはアルギニンおよびリジンに富んだアミノ酸のストリングである（Schwarz, S.R. & Dowdy, S.F., Trends Pharmacol. Sci. 21, 45-48 (2000)）。しかしながらこれらの類似性とは無関係に、これらの形質導入ペプチドは多くの異なる特性たとえばアミノ酸配列、配列の長さ、細胞性局在、および膜透過の活性を有する。すなわち、それぞれの形質導入配列は細胞および組織を透過することができるが、それらが同じ非定型的輸送機構を使用しているか否かはまだ確立されていない。
【００３０】
最後に、米国特許6,022,950号は、動物の細胞に上記ハイブリドタンパク質を結合させるのに有効な細胞結合ポリペプチドリガンドの結合ドメイン部分のハイブリド分子、細胞のサイトゾールへ細胞質膜を横切って、上記第三の部分をトランスロケートする天然に存在するタンパク質のトランスロケーションドメイン、および細胞に導入される化学物質の使用が教示されている。しかしながらその特許はトキシンのトランスロケーションドメインを教示するものである。トランスロケーションドメインを有することが知られている天然に存在するタンパク質には、ジフテリアトキシンおよびシュウドモナスエキソトキシンＡが包含され、また他のトキシンおよび非トキシン分子が同様に包含される。ジフテリアトキシンおよびシュウドモナスエキソトキシンＡのトランスロケーションドメインは十分特徴づけられていて（たとえば、Hochら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1692-1696, 1985; Colombattiら, J. Biol. Chem. 261: 3030-3035, 1986 およびDeleersら, FEBS Lett. 160: 82-86, 1983参照）、ならびに他の分子におけるこのようなドメインの存在および位置がHwangら, Cell 48: 129-136, 1987およびGrayら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2645-2649, 1984に採用された方法を用いて決定することができる。
【００３１】
細胞性局在の制御機構、細胞内輸送の調節に関与するタンパク質、細胞質膜および核エンベロープについての様々な性質および制御機構を教示するかなり大量の文献があることを考慮すれば、哺乳動物タンパク質に由来するポリペプチドが非古典的機構を使用する細胞質膜を通じて形質導入され、それによって所定の化合物のインビトロ、エキソビボおよびインビボにおける送達デバイスとして役立つ膜透過性ペプチドとして有用であることは予期されなかった。また所定の化合物の細胞内送達のための非タンパク質由来の方法、たとえば、エレクトロポレーション、リポソームによる膜融合、DNAコーティングマイクロプロジェクタイルによる高速ボンバードメント、リン酸カルシウム−DNA共沈物とのインキュベーション、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、修飾ウイルス核酸によるインフェクション、および単一細胞、通常は卵子による直接マイクロインジェクション等を教示するかなりの論文がある。これらの方法は比較的非効率的で、送達された所定の化合物を含む細胞は比較的低率にしか得られず、大部分の方法は明らかに現実的なインビボ送達が可能なものではない。多くの方法は細胞に対して毒性があり、比較的高率にアポトーシスを生じる。したがって、所定の化合物の簡単な、より効率的な細胞への送達方法には大きい必要性がある。
【００３２】
【発明の開示】
本発明は所定の化合物のインビトロ、エキソビボおよびインビボ送達のための担体として有用な、哺乳動物および酵母由来のポリペプチドに関する。本発明はまた、それらを含有する組成物、ならびに、所定の化合物を、インビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて送達する方法を提供する。
【００３３】
添付の図面において：
図１．（Ａ）PASの位置、細胞質の局在、および核局在配列（NLS、ただし図中には核局在ドメイン(NLD) として示した）を示すhPER１融合構築体の模式図。融合構築体の名称および位置は左側に示す。数はhPER１タンパク質の最初および最後のアミノ酸残基である。各融合タンパク質の主要な蓄積部位は右側にまとめる。（ｎ）核、（no）核小体、（c）細胞質、（diff）散在性。すべての構築体はＮ−末端にEYFPをタグした。ヒトおよびマウスPER１−NLSのアラインメントは最下部に示す。
【００３４】
図１．（Ｂ）上記図１Ａに記載のhPER１融合タンパク質の生存細胞における細胞性局在。CHO細胞は各パネルの最上部に指示した融合構築体によって一過性にトランスフェクトし、EYFPレポーター（緑）細胞下の局在をトランスフェクト１０時間後に蛍光顕微鏡により可視化した。対照としてはEYFPベクター単独を用いた（５. EYFPベクター参照）。
【００３５】
図２．（Ａ）CHO細胞における膜透過性アッセイ。Ｎ−末端をビオチン化した合成ペプチド、hPER１−PTD、Flag−hPER１−PTD、Flag−TAT−PTD（陽性対照）およびFlag−Flag（陰性対照）を、培養液中の生存CHO細胞における細胞膜の透過能力についてアッセイした。内在化したペプチドの細胞下局在はストレプトアビジン−Alexa 594（赤）または抗−flag mAb（緑）のいずれかによる二色染色法を用いて決定した。第三のカラムはオーバーレイ（黄色）である。さらに細胞内および核内局在を確認するためには共焦点顕微鏡を用いた。共焦点造影の単一セクションを示す。
【００３６】
図２．（Ｂ）ビオチン化ペプチド, hPER１−NLD（hPER１−PTDとしても知られる）の標的核を、ストレプトアビジン−Alexa 594蛍光（緑）を用いてTAT−PTDおよび Flag−Flag（陰性対照）と比較した。核の染色には５ng／mLのHoechst 33258（青、中央のカラム）を用いた。第三カラムは共焦点造影のオーバーレイである。
【００３７】
図３．hPER1−PDTのアラニン走査。ビオチン化hPER１−NPDは指示した位置をアラニンの単一アミノ酸残基置換により合成し、CHO細胞における膜透過をアッセイした。細胞はペプチド濃度１０μM, ３７℃において１０分間インキュベートしたのち、洗浄、固定し、透過性にして、標識ストレプトアビジン Alexa−594（赤, ２μg／mL）によりRTで１５分間検出した。対照ペプチドはhPER1 Ｎ−末端アミノ酸残基486−500とした。
【００３８】
図４．セロトニン5HT2A受容体のhPER−MPP融合ペプチドによる活性化。
（Ａ）hPER１−MPPおよびTAT−PTDペプチドは単独で、または第一の細胞内ループＩ１（SLEKKLQNATN）もしくは5HT2A受容体、遺伝子アクセス番号 M86841）由来のＣ−末端膜貫通７ドメインTM7（KTYRSAFSRYIQYKENKKPLQLI）のいずれかと融合させて合成した。受容体の活性は標準FLIPR分析を用いて、外因性および内因性Ca+2レベルをアッセイした。ペプチドの名称は次の通りである：Ｔ（TAT−PTD）、Ｐ（hPER１−MPP）、Ｉ１（細胞内ループ １）、Ｔ−Ｉ１（TAT−PTD−II）、Ｐ−Ｉ１（hPER1−MPP−II）、TM7 (Ｃ−末端ドメイン)、TTM7 (TAT−PTD−TM7)、PTM7 (hPER1−MPP−TM7)、およびＳ (セロトニン)。
【００３９】
図４．（Ｂ）PTM7（黒丸）およびTTM7（黒菱形）ペプチドの用量反応。セロトニン（対照、白三角）は１０μMの最大受容体刺激濃度で使用した。
【００４０】
図５．更なるPTDの同定。PTDの候補配列は、キーワードとして「転写因子」と注釈された遺伝子バンク中のタンパク質コード領域から翻訳されたペプチド配列で、SwissPro, PRF, PIR−Protein info Resourceを含む複合バイオインフォーマティクス法を用いて探索した。本発明者らは最初、すべて既知または候補のNLSについて探索した。第二に、本発明者らは変性パターンの発生 [R／H／K]−[R／H／K]−[R／H／K]−[R／H／K]を探索するためPHI−BLAST（Pattern−Hit Initiate BLAST）、(Ｘ)n（式中、ｎは４またはそれ以上の整数であり、Ｘは常に独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンから選択される）を採用した。7374の候補PTD配列が見出された。２つの探索から、本発明者らは（Ａ）これらの配列に対するビオチン化ペプチドを合成し、または（Ｂ）GFPとのインフレーム融合タンパク質を創製し、CHO細胞にトランスフェクトした。１２のペプチド中の９は形質導入され、すべての配列がトランスフェクトされた細胞中の核に局在することが見出された。hPER１−PTD、hPER３−PTDおよびTAT−PTDペプチドを陽性対照として使用した。６つの陽性配列と２つの陰性配列が見られる。数は母体タンパク質配列内のアミノ酸残基数、およびこれらのタンパク質についての遺伝子バンク受入番号を以下に指示するように表す。すなわち (M24899, ヒト甲状腺ホルモンα−１；L12699, ヒトHomeoboxタンパク質Engrailed 1 HME1；X16416, ヒトプロト癌遺伝子チロシンプロテインキナーゼABL1；Q02575 ヒトHEN1／NSLC1；Q02577, ヒトHEN２／NSLC２；AAA74561, ラットHNF３；CAB65887, ショウジョウバエcAMP依存性転写因子)。３つの陰性ペプチドは（V01512, c−Fos；AAD53184, ヒト cyclin L ania−6a；CAB66914, Arabindopsis β−zip転写因子）である。
【００４１】
図６．hPER−PTDはβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬する：HIV TAT形質導入ペプチドの少なくとも一つの特徴は細胞および組織にタンパク質を運搬するその能力である。したがって、本発明者らはhPER１形質導入ペプチドがβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬できるか否かを決定すること追求した。この実験を実施するためには、本発明者らはFrankelら（1989, (19): 7397-401）によるプロトコールに従い、hPER１−PTDまたはhPER−PTD R7Aを完全長のβ−ガラクトシダーゼに化学的に連結し、これらの接合体またはβ−ガラクトシダーゼ単独がCHO細胞に形質導入する能力をアッセイした。図６左側に示すように、hPER−PTDβ−ガラクトシダーゼの融合は、X−galの添加後の細胞に青色によって指示されるようにβ−ガラクトシダーゼについて陽性の酵素活性を示した。しかしながら、hPER−MPP R7Aβ−ガラクトシダーゼ（中央）もβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独（右側）もX−gal添加後に青色の染色反応を示さないように、細胞内に入ることはできなかった。これらのデータはTATペプチドのようなhPER１−PTDは細胞の中に多量のタンパク質（１２０kD）を運搬することができるということを示している。
【００４２】
【発明の詳述】
本発明はヒトPeriod１（hPER１）タンパク質が、現在ではMPPとしても同定され、所定の化合物の細胞内送達のためのデバイスとして有用なNLSを含むことの発見に基づくものである。hPER１は概日リズムの調節に関与し、hPER１が隣接する細胞に局在する能力は概日リズムを調節するその全体的生物学的機能にきわめて重要である。hPER１内に同定されたNLSは、以前に同定されたNLS配列内にフィットせず、その同定は、MPPとしても機能する他のNLS配列の探索のためのアルゴリズムの同定を生じる。
【００４３】
Period1（hPER１）は、転写調節に関与する核タンパク質である。それは生物時計の「ギア」における必須の成分であり（Brown SA & Schibler U, Current Opinion in Genetics & Development 9, 588-594 (1999), Dunlap JC, Cell 96, 271-290 (1999)）、マウスでの研究によりPER１の核への移入がCLOCK／BMAL転写複合体のダウンレキュレーションに必須であることを示した（Gekakis Nら, Science 280, 1564-1569 (1998), Yagita Kら, Genes Dev 14, 1353-1363 (2000), Lowrey PLら, Science 288, 483-492 (2000)）。しかしながら、今日までヒトPER1の機能性NLSは明らかにされていなかった。本発明者らは、hPER１内にNLSを同定し、１６アミノ酸および１３アミノ酸配列（図３．HPER１−NLSペプチド参照）が強力な膜透過能力を有することを証明した。この研究ではさらに同じく核タンパク質に由来する４つのMPPの同定がなされた。
【００４４】
PER１は概日時計における中心成分であり、その核への移入は毎日の振動の調節に重要な役割を果たしている（Jin, X.ら, Cell 96, 57-68 (1999)；Sangoram, A.M.ら, Neuron 21, 1101-13, (1998)）。欠失および融合タンパク質分析を用いて、本発明者らはhPER１の核局在に必要かつ十分なNLSを同定した。hPER１のNLSが古典的な核局在コンセンサスモチーフに一致せず、したがって、標準的なNLS探索操作を使用しては同定されなかったので、この機能分析が必要であった。本発明者らは、レポータータンパク質およびタグされたhPER１フラグメント（P1−F2〜P1−F7）の核局在をトランスフェクト細胞に導入するためには、hPER１−NLSの単一コピーで十分であることを示す。HPER１−NLS は、hPER１のアミノ酸（830〜845）の間に位置し、利用可能なデータベース中の他のPERまたは他の核タンパク質には見出されない、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンに富んだ１３個のアミノ酸のストリング（表１参照）内に包埋されている。したがって、PER２およびPER３は核タンパク質ではあるが（Jin, X.ら, Cell 96, 57-68 (1999)）、それらは、それらの核インポートのために別の配列および／または機構を使用することが明らかである。
【００４５】
塩基性残基に富む核タンパク質の限られた数のペプチドフラグメントは、受容体なしでの、エネルギー依存性様式で細胞膜内に透過することが示されている。このような３種のタンパク質からの配列、TAT、AntpおよびVP22は細胞および組織内に未確定の機構により透過し、融合分子を運搬する能力をもつことが証明されている。たとえば、Frankelらに発行された米国特許5,804,604、5,747,641、5,674,980、5,670,617および5,652,122号参照。これにはカーゴ分子の細胞内送達のための、９アミノ酸のHIV TAT由来のポリペプチド（Arg−Lys−Lys−Arg−Arg−Gln−Arg−Arg−Arg）の使用が教示されている。
【００４６】
hPER１、hPER１−NLSおよび他のMPP間の類似性は、本発明者らにhPER１−MPPが膜透過能力を有するか否かの検討を急がせることになった。ここに示す免疫組織化学的および細胞学的データはhPER１−MPPが様々な細胞型においてMPPとして機能することを指示している。HPER１−MPPは核細胞質ならびに核小体において強力なフォーカル染色を示し、hPER１−MPPの核下におけるアドレスは、核内に分散し、核に濃縮されていないhPER１（P1−FL）タンパク質とは異なることを示唆する。hPER１−MPPの核透過は、負に荷電した残基の添加または細胞の４％PFAによる前固定ではその配列が逆転する条件下（逆hPER１−MPP）にも遮断されず（未公表の観察）、後者は透過が受容体および膜依存性であるとの考え方を支持する。これらの結果は、遅い、温度、エネルギーおよび受容体依存性機構を使用して細胞膜に結合し、それを横切る、シグナルペプチド配列由来と記載されている他のペプチドクラス（Hawiger, J., Curr Opin Immunol. 9, 189-94 (1997)）、DNA抗体（Deng, S.X.ら, Int Immunol. 12, 415-423 (2000)）、および他のタンパク質ドメイン（Lindgren, M.ら, Trends Pharmacol Sci. 3, 99-103 (2000)）とは対照的である。
【００４７】
他のMPPの同定は、膜ペプチド透過に必要な機構および構造的要求の理解の欠如により限られていた。特異的なペプチド構造および／または電荷が膜透過に重要と思われることはアラニン走査実験で証明され、アルギニン７における単一アミノ酸の変化がMPPの可能性に重要であるように思われる。野生型hPER１−MPPを生存細胞または前固定および透過化細胞中、修飾P1−R7Aと比較すると（データは示していない）、P1−R7Aのみが透過性を欠いたが、核標的化において細胞をいったん透過性にすれば透過性を示す。この所見はアルギニン７が構造に基づく透過に主要な役割を有し、したがって将来の構造−機能の研究に有用なモデルを提供する。TATペプチドに対する構造決定基は報告されていないが、Antpの場合２つのトリプトファン残基を２つのフェニルアラニンで置換すると透過性は消失する（Le Roux Iら, Proc Natl Acad Sci USA, 90, 9120-9124 (1993)）。hPER1−MPPはトリプトファン残基を含有しないので、これら２つのペプチドの間の膜透過は異なる機構により起こるものと思われる。
【００４８】
完全長のHIV TATおよびVP22は、いずれも古典的分泌シグナル配列を欠き、したがって非古典的機構によってエキスポートされるもので、また非古典的様式で細胞内に「形質導入」によるインポートされうるものである（Prochiantz, A., Current Opinion in Cell Biology 12, 400-406 (2000)）。したがって多分、hPER１が概日時計情報を、隣接するSCNニューロンまたは概日アウトプット経路に完全長TATおよびVP22タンパク質の場合と同様な「形質導入」機構によって配布すると推測することは興味がある。しかしながら単にタンパク質の本体内に膜透過性配列を有することでは、完全長Antpタンパク質が細胞からのエキスポートも、また細胞内へのインポートもされないように、膜透過能力は必ずしも付与されない。すなわち、Antpペプチドの細胞内への非古典的透過が生理学的な関連をもつとは考え難く、Antp同様、完全長hPER1が細胞膜透過タンパク質であることを示唆する証拠もない。しかしながら、これらの所見は、本発明者に他のMPP含有タンパク質を探索する元気を与えることになった。タンパク質データベースを核タンパク質内に塩基性残基のストリングを同定するために設計されたアルゴリズムで探索することによって、本発明者らは、膜透過性ペプチドの可能性がある何百もの領域を明らかにし、幾つかの種から４つの付加的MPPを見出したのである（図５参照）。これらのおよび付加的なデータベースの採掘探索により、MPP様の配列が共通であり、広い様々なタンパク質中に存在することが示唆される。しかしながら、レポーター配列に融合した場合、常に核の局在を付与するとは限らない多くのNLS候補と同様に（Moroianu, J., J Cell Biochem 32-33, 76-83 (1999)）、MPPの可能性は実験により機能的に決定しなければならない。形質導入または非形質導入いずれのタンパク質もMPP領域をコードできることは明らかであるように思われるが、MPP様配列を含有するタンパク質が正常な生理学的過程を活性化し、急速に細胞ドメイン内に細胞内局在するためにこれらのドメインを使用するかどうかという所定の問題が残る。形質導入現象に伴う効率は、とくに細胞内情報の急速な送達が重要な場合に細胞の同調、発生および分化の規範の場合と同様に重要である。
【００４９】
MPPが細胞内コンパートメントに分子を運搬する能力は十分に確かめられつつある（Lindgren, M.ら, Trends Pharmacol Sci. 3, 99-103 (2000)；Derossi, D.ら, Trends Cell Biol. 8, 84-87 (1988)）。他のMPPと同様に、hPER１−MPPおよびここに同定された他のMPPは所定の化合物たとえば大きな分子、すなわちペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカライド、他の有機分子を迅速かつ効率的に細胞内に送達することができる。ここに示すデータは、セロトニンおよび／またはアドレナリン７TM作動性受容体由来のペプチドと融合したhPER１−MPPがリガンド活性化受容体の作用を模倣することを示し、hPER１−MPPが所定の化合物を細胞内コンパートメントに局在させることを確認し、生理学的に関連するシグナリングが所定の化合物に連結したMPPによって開始できるとの考え方を支持する。ここに記載の方法を用い、本発明は標的に連結したMPPを使用する標的の有効性および／または特異的な酵素もしくは酵素に連結したMPPの使用を、酵素機能不全の結果または経路内における改変、補正もしくは補償方法としての治療戦略に拡大することができる。さらに、特異的受容体に連結したMPPを用いる治療戦略は、機能不全受容体または正常もしくは異常受容体の発現の改変、補正または補償方法として使用することができる。
【００５０】
ここに提供された結果を考え合わせると、哺乳動物タンパク質、さらに特定すればヒト核タンパク質によってコードされたMPPはその細胞透過が膜依存性であり、おそらくペプチド構造に依存することを示している。hPER１−MPPは特異的な細胞下部位に標的化されるが、他の巨大分子を細胞内標的に効率的に送達する可能性がある。
【００５１】
さらに重要な点は、本発明はまたNLSドメインに基づく新規なMPPマッピングの最初の例を提供し、多くのMPP様の領域が、広く多様なタンパク質を含むことを示唆している。ここに提供されたデータはMPPがNLSの部分に基づくかもしくはNLSの部分と重複するか、または新規なペプチドであることを示している。
【００５２】
NLS配列を同定する方法は本技術分野では周知であり、ネイティブなタンパク質が核内に移行する能力の付与として以前に同定されたNLSを包含するか、または以前に同定されたNLSとの実質的な配列ホモロジーに基づいている。また、NLSは配列欠失実験によって同定されてもよい。たとえば、Luo, J.C., Shibuya, M., A variant of nuclear localization signal of bipartite-type is required for the nuclear translocation of hypoxia inducible factors (1α, 2α and 3α), Oncogene 2001 Mar 22; 20 (12): 1435-44またはHodel, M.R., Corbett, A.H., Hodel, A.E., Dissection of a nuclear localization signal. J Biol Chem. 2001 Jan 12; 276 (2): 1317-25 参照）。
【００５３】
本発明の好ましい膜透過ペプチド（MPP, ペプチド形質導入ドメインまたは「PTD」としても知られる）は小さなポリペプチドであり、哺乳動物または酵母タンパク質のNLSに由来するか、またはそのNLSと重複してもよい。好ましい哺乳動物タンパク質は、ヒト、霊長類、マウスまたはラットである種のタンパク質である。一般にNLSが由来するタンパク質と処置される細胞は同じ種のものであることが好ましい。ヒトの細胞を処置する場合には、とくにヒト種の細胞の使用が好ましい。NLSは広範なクラスの酵素内に見出され、核タンパク質、転写因子、サイトカインおよびキナーゼに限定されるものではない。好ましいMPPは核タンパク質または転写因子に由来するものである。また本発明のMPPは配列−(Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ)n−（式中、ｎは１〜７の整数であり、Ｘはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される）からなる小さなペプチドである。小さなMPPを使用するのが好ましく、したがってｎは１〜５の整数であることが好ましく、１〜３の整数であることがさらに好ましい。適当なMPPが選択された実施態様を表１および実施例５に示す。
【００５４】
MPPおよび／または所定の化合物は別個に、たとえば化学合成経路によって化学的に合成し、市販されている試薬が利用できる。別法として、MPPおよび／または所定の化合物がポリペプチドである場合には、組換え技術によって合成し、既知の方法によって精製してもよい。宿主細胞、クローニングベクター、プロモーターおよびオリゴヌクレオチドリンカーは周知であり、市販品を利用することができる。組換え技術を使用する方法論および精製方法も周知である（Current Protocols in Molecular Biology, 4 Vols. Wiley参照）。一般に、組換え技術は大規模な製造に適していて、大量生産が経済的である。また、MPPは特異的なプロテアーゼによる前駆体の分解によっても得ることができる。
【００５５】
所定の化合物は、MPPのＮ−末端またはＣ−末端に化学的架橋を介してMPPに結合または連結させて、MPPと所定の化合物とを、たとえばジスルフィドまたはエステル結合させた複合（また融合ともいう）体とされる。別の実施態様において興味ある化合物がペプチドである場合は、MPPの融合配列と所定の化合物をコードするベクターを、そのベクターの発現を可能にする条件下に、ペプチドを宿主細胞により組換え技術で合成してMPPと所定の化合物の融合体とされる。
【００５６】
他の実施態様においては、MPPと所定の化合物は化学リンカーを介して結合または連結させてもよい。化学リンカーは本技術分野において周知であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（MBS）、Ｎ−エチルオキシカルボニル−２−エチルオキシ−1,2−ジヒドロキノリン（EEDQ）、Ｎ−イソブチルオキシ−カルボニル−２−イソブチルオキシ−1,2−ジヒドロキノリン（IIDQ）が包含されるがそれらに限定されるものではない。好ましいリンカーはまた、単量体化合物たとえば単一アミノ酸とくに好ましくは側鎖の小さいアミノ酸、または小さなポリペプチドもしくは数個のアミノ酸のポリマー化合物である。好ましいポリペプチドリンカーは１５個のアミノ酸またはそれ未満、さらに好ましくは１０個のアミノ酸またはそれ未満である。さらに好ましいポリペプチドリンカーは５個またはそれ未満のアミノ酸である。別の実施態様においては、リンカーは小さなポリペプチド鎖をコードする核酸、好ましくは１５個のアミノ酸またはそれ未満をコードする核酸である。さらに好ましいリンカーは１０個のアミノ酸またはそれ未満の小さなポリペプチド鎖をコードする核酸である。なおさらに好ましいリンカーは５個またはそれ未満のアミノ酸の小さなポリペプチド鎖、たとえばGly−Phe−Leu−Gly、Gly−Gly、Gly−LeuまたはGly等をコードする核酸である。
【００５７】
組換え技術は上述のように、融合MPP、リンカーおよび所定の化合物の発現に使用することが可能であり、本技術分野において周知である。
【００５８】
他の実施態様においては、リンカーは切断可能なリンカーとすることが可能であり、選択された組織または細胞に送達されたならば、MPPと所定の化合物の切断が起こる。このような実施態様においては、細胞または組織は、切断可能なリンカーを切断することができる内因性（天然に存在する酵素または組換え操作によって発現する酵素）、または外因性（たとえば、注射、吸収等）酵素である。切断に適当な酵素の使用には、たとえばKEX2プロテアーゼ認識部位（Lys, Arg）を、グルコアミラーゼと所望のポリペプチドの間に挿入して、ネイティブなアスペルギルスKEX2様プロテアーゼの活性の結果として融合タンパク質から所望のポリペプチドのインビボ放出を可能にする例が包含される（Contrerasら, 1991; Broekhuijsenら, 1993; Wardら, 1995）。切断可能なリンカーペプチドの他の例には認識配列Asp−Asp−Asp−Asp−Lysからなり、その融合タンパク質はエンテロキナーゼで切断することができる。
【００５９】
別法として、リンカーは生物分解性とすることも可能であり、所定の化合物はMPPと所定の化合物の融合体から、加水分解および／または細胞内部における酵素的切断によって脱着される。たとえば、腫瘍は特異的なプロテアーゼを発現することが多く、細胞毒素物質のプロドラッグの送達に使用される。リンカーはライソソームプロテアーゼたとえばカテプシンＢ、ＣまたはＤに対し選択的でありうる。プロドラッグの送達と引き続くそれらの活性化は良く知られたところで、このようなアプローチは早過ぎるリンカーの血中での加水分解により有意に低い全身毒性をもたらし、結果として大量の所定の化合物、すなわちドラッグまたは細胞毒性物質が腫瘍部位に送達される。たとえば、Higuchi, T. & Stella, V.によりプロドラッグについての完全な考察が提供されている（Pro-drug as Novel Delivery Systems, A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society のVol. 14, 1975参照）。容易に切断可能な基の例にはアセチル、トリメチルアセチル、ブタノイル、メチルスクシノイル、ｔ−ブチルスクシノイル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、ベンゾイル、３−アミノシクロヘキシリデニル等が包含される。
【００６０】
所定の化合物は任意の有機分子であり、小有機分子、ペプチド、リポタンパク質および他の修飾タンパク質、ポリサッカライド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドならびに医薬的、予防的、診断的および／または研究的に興味があると考えられる任意の他の化合物が包含される。所定の化合物は医薬的に既知の性質を有する小さい有機分子であってよく、したがって本発明は患者を所定の化合物で処置する方法として使用することができる。また、所定の化合物は機能未知の新規なタンパク質であってもよく、したがって本発明は所定の化合物の機能を同定する方法として使用することができる。他の実施態様においては、所定の化合物はアンチセンス分子であり、したがって本発明は転写を変化させる方法として使用することができる。さらに他の実施態様においては、所定の化合物はプロドラッグであり、たとえば不活性型であるが細胞内で活性化することができる。他の実施態様においては所定の化合物は細胞毒性物質であり、したがって本発明は細胞毒性物質を細胞に送達する方法として使用することができる。所定の化合物にはまた、複合MMPを発生させるのに有用であり、新しいMMPの同定のためのタンパク質を検出できる検出可能なタンパク質が包含される。検出可能なタンパク質には、GFP、β−ガラクトシダーゼ、放射標識タンパク質およびビオチン化タンパク質、細胞に検出可能な表現型を付与できるタンパク質が包含される。
【００６１】
本発明は、所定の化合物をインビトロ、エキソビボまたはインビボにおいて細胞内に送達するために使用できる。たとえば送達は、インビトロにおいては、複合したMPPと所定の化合物を細胞に細胞外添加することによって行われる。送達は、エキソビボにおいては、複合したMPPと所定の化合物を、患者から取り出した培養サンプルたとえば血液、組織または骨髄に細胞外または外因的に添加し、この処置されたサンプルを患者に戻すことによって行われる。インビボにおいては、送達は複合したMPPと所定の化合物を患者への経皮的投与、吸入、または注射によって行われる。
【００６２】
本発明においては任意の型の細胞が使用できる。細胞は哺乳動物、細菌、ウイルスまたは酵母の起源とすることができる。細胞は腫瘍のスクリーニングに一般的に使用される培養細胞とすることができる。培養細胞の例にはCHO、HEK293T、HeLa およびNIH3T3が包含される。細胞はMPP複合体によるエキソビボ処置に適当な患者からの培養細胞で、患者に再導入される細胞とすることができる。細胞は処置される患者と同じ患者またはそれ以外の患者からの細胞であっても良い。
【００６３】
MPPと所定の化合物との複合体からなる本発明の組成物は治療、予防、診断または研究の目的で使用される。組成物にはさらに、アジュバント、安定剤等、組成物の取り扱い、安定性および保存性を改良する添加物からなる。
【００６４】
新規なMPPを同定する方法も本発明の一部である。膜透過性ペプチドを同定するための一方法は、配列−(Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ)n−（式中、ｎは１〜７の整数であり、Ｘはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される）および検出可能なタンパク質たとえばGFP、β−ガラクトシダーゼ等からなるペプチド接合体を作り出し、このペプチド接合体を細胞に添加し、ペプチド接合体が細胞質および／または細胞核内に局在するか否かを決定する。膜透過性ペプチドを同定する他の方法では、哺乳動物または酵母タンパク質の核局在配列に由来するか、またはそれと重複するペプチドと、検出可能なタンパク質たとえばGFP、β−ガラクトシダーゼ等からなるペプチド接合体を作り出し、ペプチド接合体を細胞に添加し、ペプチド接合体が細胞質および／または細胞核内に局在するか否かを決定する。
【００６５】
アミノ酸に対しては次の略号を使用する。
ＡはAlaまたはアラニンを示す。
ＣはCysまたはシステインを示す。
ＤはAspまたはアスパラギン酸を示す。
ＥはGluまたはグルタミン酸を示す。
ＦはPheまたはフェニルアラニンを示す。
ＧはGlyまたはグリシンを示す。
ＨはHisまたはヒスチジンを示す。
ＩはIleまたはイソロイシンを示す。
ＫはLysまたはリジンを示す。
ＬはLeuまたはロイシンを示す。
ＭはMetまたはメチオニンを示す。
ＮはAsnまたはアスパラギンを示す。
ＰはProまたはプロリンを示す。
ＱはGlnまたはグルタミンを示す。
ＲはArgまたはアルギニンを示す。
ＳはSerまたはセリンを示す。
ＴはThrまたはスレオニンを示す。
ＶはValまたはバリンを示す。
ＷはTrpまたはトリプトファンを示す。
ＹはTyrまたはチロシンを示す。
タンパク質は左側にＮ−末端がくるように記載する。
【００６６】
以下の略号を使用する。
「v/v」：容量対容量
「EYFP」：配列Glu−Tyr−Phe−Proのペプチドフラグメント
「ORF」：オープンリーディングフレーム
「PCR」：ポリメラーゼ連鎖反応
「CHO」：チャイニーズハムスター卵巣細胞
「HEK293T」：ヒト胚腎臓細胞
「HeLa」：上皮腺癌細胞
「NIH3T3」：スイスマウス胚線維芽細胞
「DMSO」：ジメチルスルホキシド
「FCS」：ウシ胎児血清
「DMEM」：ダルベッコの改良イーグル培地
「PBS」：リン酸緩衝食塩溶液
「BSA」：ウシ血清アルブミン
「Ｃ−末端」：カルボキシ末端
「Ｎ−末端」：アミノ末端
「PTD」：ペプチド形質導入ドメイン
「GPCR」：Ｇ蛋白共役受容体
「TM」：GPCRの膜貫通ドメイン
「Ｔ」：GPCRの細胞内ループ
「5HT2A」：セロトニン受容体２Ａ
「mAb」：モノクローナル抗体
【００６７】
【実施例】
実施例１  hPer１内のNLSの同定
プラスミドの構築
ここに記載するすべてのhPer１フラグメントは、EYFPへのインフレームＣ−末端融合体としてクローン化する。EYFP−hPer１ ORF、P1−NおよびP1−NX（図１Ａ）はEcoRIおよびXhoI消化フラグメントをEYFP−C1ベクター（Clontech）に挿入して作り出される。他のフラグメントは完全長hPer１cDNAからPCR増幅し、EYFP−C1ベクターにサブクローニングした。各フラグメントの最初および最後の残基は図１Ａに示す。すべての構築体は自動DNA配列決定によって確認した。
【００６８】
細胞培養およびDNAトランスフェクション
CHO、HeLaおよび293T細胞を、１０％ウシ胎児血清（FCS）、５０単位／mLのペニシリン、５０μgのストレプトマイシンおよび４mMのＬ−グルタミン酸を補充したダルベッコの改良イーグル培地（以下、完全DMEMと呼ぶ）中に３７℃、５％CO2で維持する。細胞のトランスフェクションは２−ウエルのLab−Tekカバーグラス（Nunc Inc.）中でLIPOFECT−AMINETM（登録商標）試薬（Life Technologies）を用いて製造業者の説明書に従って行った。
【００６９】
ペプチドおよびペプチドの内在化
ペプチドは商業ベースの業者（Bio Synthesis）によって合成された。ペプチドの内在化には、細胞を２−ウエルLab−Tekカバーグラス中２×１０5細胞／ウエルの濃度に取り一夜培養する。ペプチドをPBSで指示された濃度に希釈したDMSO中に溶解する。単層の細胞を適当なペプチド／PBS溶液と１μMの標準濃度において、とくにほかに指示がなければ室温（RT）で１０分間インキュベートする。４℃の実験では、プロトコールはすべてのインキュベーションを４℃で固定操作が終了するまで実施した以外はすべて同一とした。
【００７０】
免疫蛍光および顕微鏡検査
EYFP融合タンパク質の発現および細胞下局在の直接検出には、トランスフェクトされた細胞を直接固定しないで、またはPBS中４％（v/v）のホルムアルデヒドにより４℃で２０分間固定し、ついで洗浄したのちに直接検査した。ビオチン化ペプチドの間接的な免疫検出には、固定した細胞をPBSで２回洗浄し、PBS中0.3％Triton X-100により４℃で２０分間浸透させたのち、PBS中２％BSAで室温においてブロックした。ついで細胞をPBSで洗浄し、0.2％ Tween 20に１：400で希釈し、PBS中室温で1時間、ストレプトアビジン−FITC（登録商標, Sigma）またはAlex 499（分子プローブ）とインキュベートした。２×５分間PBSで、ついで１回PBS中0.3％ Triton X-100により室温で２０分間洗浄した。一部の実験では、核をPBS中５０ng／mLのHoechst 33258 (Sigma) または３μg／mLのプロピジウムヨウ化物で染色した。蛍光の細胞下局在をOlympus顕微鏡上で分析した。共焦点像はZeiss共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM phoibos 1000）で撮影した。
【００７１】
PER１の核内移入がその重要な機能であることは周知であるが、標準的なプロフィル走査プログラムを用いたのではNLS候補は同定されなかった（Shearman, L.P.ら, Neutron 19, 1261-1269 (1997), Yagita, K.ら, Genes Dev. 14, 1353-1363 (2000)）。hPER１のNLSを実験的に決定するためには、３つの完全長hPER１（P1−FL）を構築し、P1−N、P1−NMおよびP1−Cと命名した（図１Ａ）。ついでこれらの構築体がCHO中の核に局在する能力を分析した。生存細胞中のhPER１の検出を促進するためにはEYEPタグを使用したが、Ｎ−末端Flagタグで作成されたhPER１構築体は同一の細胞学的分布パターン提供するのでhPER１融合タンパク質の局在には見かけ上寄与しなかった（データは示していない）。一過性のトランスフェクション後、P1−FLおよびP1−NMタンパク質の両者は、トランスフェクトした細胞の核にトランスフェクション後１０時間までに発現したが、P1−NおよびP1−Cは細胞質中のみに蓄積した（図１Ｂ）。EYFPベクターの対照は核および細胞質の両者に分散した。これらの結果はhPER１中の機能性NLSが本発明者らにより領域Mと名づけられたP1−NおよびP1−Cの間に局在することを示すものである。
【００７２】
さらにNLSを領域M（アミノ酸481−890）に局在化させるため、一連の８つの欠失構築体、P1−F1〜P1−F8を作り出し、各突然変異体の細胞下分布を、図１ＡおよびＢに示すようにしてアッセイした。領域Ｍのアミノ酸581（P1−F2）から位置821（P1−F7）までの順次欠失によって核の局在化を生じた。更なるアミノ酸821から841（P1−F8）までの欠失は、トランスフェクトされた細胞内にEYFPベクターの対照の場合と類似の局在化パターンを有する分散性の蛍光パターンを生じた。これらのデータはNLSがアミノ酸821と890の間に存在し、Ｍ領域のＣ−末端に位置することを示している。この観察はhPER1アミノ酸830−845を含有する付加的なEYFP融合タンパク質P1−NLSの構築によって確認された。この領域はNLSとして機能すると思われる塩基性残基のストリングを含有する（Weis, K., Trends Biochem. Sci. 23, 185-189 (1998), Truant, R. & Cullen, B.R., Mol Cell Biol. 19, 1210-1217 (1999)）。予想通り、P1−NLSはトランスフェクトされた細胞の１００％に核局在を示した（図１Ｂ）。付加的な融合構築体における他のPER１領域では核の局在化は起こらなかった（データは示していない）。したがって本発明者らはhPER１のNLS（hPER1−NLS）はアミノ酸830−845内に局在すると結論した。興味深いことには構築体P1−F1はそれがNLSを含有するかどうかとは無関係に、密に細胞質への局在パターンを示し、この領域も細胞質局在ドメインを含んでまだ同定されていないという公表所見を支持している（Vielhaver, E.ら, Mol Cell Biol. 20, 4888-4899 (2000)）。配列のアラインメントは、hPER１−NLSはヒトおよびマウスPER１タンパク質の間で保存されていることを示すが（図１Ａ）、他のNLS候補または他のヒト、マウスもしくはショウジョウバエのPERでは保存されていなかった。本発明者らの研究の完了後に、Vielhaverら (2000) は本発明者らが同定した１６アミノ酸配列を含有するさらに長いマウスPER１−NLSを同定し（Vielhaver, E.ら, Mol Cell Biol. 20, 4888-4899 (2000)）、すなわち本発明者らの発見を支持している。
【００７３】
実施例２  hPER１−NLSはMPPをコードする
３つの同定された遺伝子によりコードされたMPP（TAT, AntpおよびVP22）に共通な２つの特徴は、それらが核タンパク質に由来すること、およびそれらが塩基性アミノ酸残基から構成されることである（Lindgren, M.ら, Trends Pharmacol Sci. 3, 99-103 (2000)）。hPER1も、そのNLSが塩基性アミノ酸に富んでいる核タンパク質である（SRRHHCRSKAKRSRHH, 図１参照）。これらの類似性が、本発明者らをhPER−NLSもMPPとして機能するか否かの決定に導くことになった。この仮説を試験するため、本発明者らは数種のＮ−末端ビオチン化ペプチド；hPER１−MPP、Flagに標的化したhPER１−MPP、Flagに標的化したTAT−PTD、Flag−Flag単独を合成した（下記表１参照）。
【００７４】
【表１】
0004896356.tif 000002
【００７５】
ペプチドはそれらの細胞膜を透過する能力についてアッセイした。細胞内の局在を、ストレプトアビジンで標識したALEXA試薬による直接染色または抗−Flag mAbによる間接染色、ついで標識した二次抗体の添加によりアッセイした。培養細胞に１０μMのhPER1−MPP、Flag−hPER１−MPPおよびFlag TAT−PTDペプチドを添加した場合、１００％の細胞に迅速な透過が見出された（図２Ａおよび図５）。いずれの検出法によっても、hPER１−MPP、Flag−タグ hPER１−MPPおよびFlagタグTAT−PTDは細胞質全体に分散性に分布しているのが観察されたが、核および核小体内に分離した焦点のようにみえる細胞下ドメイン内に濃縮されていた。これに反して、ビオチン化陰性対照ペプチド、Flag−FlagおよびhPER１領域に由来するいくつかの他のペプチドは、背景の染色とほとんど識別不可能であり、高濃度でも、核または核小体は染色されなかった（データは示していない）。共焦点顕微鏡検査を用いてFlag−タグhPER１−MPPの細胞内および核内染色、および陰性対照ペプチドは内在化されないことを確認した（図２Ａ）。
【００７６】
hPER１−MPPは細胞膜を迅速に透過し、TAT−PTDペプチドと類似の効率で核領域内に局在した（図２Ｂ）。同一の結果がCHO、HEK293T、HeLa、NIH3T3およびラットの一次表層ニューロンを用いて得られ（データは示していない）、細胞型依存性の透過を示した。
【００７７】
hPER１−MPPの内在化は迅速に（５分以内に）、４℃および３７℃においてもまた細胞膜を固定したのちにも、同じ効力で起こる（データは示していない）。すなわち、hPER１のアミノ酸配列830−845は融合タンパク質における核／核小体局在シグナルタンパク質として、ならびにMPPとして機能し、膜透過は旧来の受容体−仲介エンドサイトーシス機構に依存しない。
【００７８】
実施例３  アルギニン７はhPER１−MPP活性に必須である
今日まで、MPPが細胞膜を横切る機構ならびに基本構造は明らかにされていなかった。したがって本発明者らは、膜透過の可能性に必須の性質を維持するために重要な鍵となる残基がhPER１−MPP内にあるか否かを探索することとした。本発明者らは、hPER１−MPP中の各アミノ酸を別個にアラニンに置換し（表２）、これらの突然変異ペプチドが、野生型hPER１−MPPに比較して、生存細胞を透過する能力についてアッセイした。
【００７９】
【表２】
0004896356.tif 000003
【００８０】
図３に示すように、大部分の単一アラニン置換は野生型ペプチドに比べて、膜透過能にほとんど影響を示さない。しかしながら、アルギニン７をアラニンに変えると（R7A）、検出可能な細胞学的シグナルは、陰性対照ペプチドで観察される程度まで低下した。すなわち、アルギニン７のアラニンへの突然変異はhPER１−MPPの膜透過性を有意に低下させた。アルギニン７をグルタミン酸に変えたのちにも（R7E）同じことが観察された（データは示していない）。さらに、hPER１−MPPからＮ−末端セリンおよび２個のＣ−末端ヒスチジンを同時に欠失させると（hPER１−MPP13）、ペプチドの陽性膜透過の可能性に対してはほとんど全体的に作用を示さなかった（図３）。
【００８１】
アルギニン７残基はhPER１−MPPの細胞透過能に重要な役割を果たしている。したがって、本発明者らはR7A突然変異が融合タンパク質P1−NLSの核局在に影響するかどうかを決定することを探索した。融合タンパク質、P1−R7A（アルギニン７がアラニンに突然変異）でトランスフェクトされたCHO細胞は、野生型P1−NLSに類似の強力な核染色を示した（データは示していない）。P1−R7A突然変異融合タンパク質においては、核局在は正常のようにみえるが、核小体への細胞下での標的化は破壊されている（データは示していない）。これらのデータは、膜透過性および核小体への標的化が単一のR7アミノ酸残基によって影響されることを示し、またhPER１−NLSの核転座は別個の異なる決定基を有することを示す。
【００８２】
実施例４  hHPER１−MPPによる機能性分子の送達
MPPの特徴の一つはタンパク質およびペプチドを細胞内に運搬する能力である。本発明者らは、Fawellら 1994（Fawell, S.ら, Proc Natl Acad Sci USA 91, 664-668 (1994)）に記載されたように、hPER１−MPPのβ−ガラクトシダーゼへのカップリングおよび培養液中の細胞への融合タンパク質の送達に成功した。しかしながら、MPPの機能的有用性をさらに拡大するため、本発明者らはhPER１−MPPを生理学的に関連する生物学的に活性なペプチドとの融合体について試験した。Wessおよび共同研究者（1993）らはＧタンパク質共役型受容体（GPCR）スーパーファミリーの保存された膜貫通セグメント７（TM7）の機能的役割を提示している。TM7とともに、第三の細胞内ループ（Ｉ３）がGPCRカルシウムシグナリングにおいて重要な役割を果たしている（Wess, J.M.ら, EMBO J. 12, 331-338 (1993)）が、細胞内ループ１および２（Ｉ１およびＩ２）は重要でなないように思われる。セロトニン受容体、5HT2Aを用いて、本発明者らはhPER１−MPPおよびTAT−PTDのＩ１およびTM7ドメインから設計されたペプチドとの融合での受容体を活性化する能力について実験的に試験した。ビオチン化ペプチドhPER１−MPP TM7、TAT−PTD TM7、hPER１−MPP I1、TAT−PTD I1、hPER−MPP、TAT−PTD、TM7またはI1を１０μMの濃度で、5HT2A受容体CHO安定細胞系とインキュベートした、ペプチドの膜透過をストレプトアビジン−Alexa 594を用いて上述のようにアッセイした。図４Ａに示すように、受容体シグナリングは、カルシウム応答のレベルで測定して、外因性セロトニン、hPER１−MPP TM7およびTAT−PTD TM7の添加により活性化された。しかしながら、TM7単独または他のいずれのペプチドもカルシウム応答を発生できなかった。さらに、hPER１−MPP TM7およびTAT−PTD TM7による受容体の活性化はペプチドの濃度に依存する（図４Ｂ）。活性化ペプチド、TM7、hPER１−MPPまたはTAT−PTDとの融合体の添加濃度を増大させると、用量依存的様式でカルシウム応答を生じる。TAT−PTD TM7は hPER１−MPP TM7よりも強力な5HT2A受容体のアクティベーターであるように思われる。この結果の簡単な説明は、TAT−PTD TM7が細胞質に hPER１−MPP TM7より多く局在している、またはhPER１−MPP TM7より大きな細胞透過能力を有するものであるが、本発明者らはそのようなことは観察しなかった。本研究室において、また hPER１−MPP をβ−アドレナリン性活性化ペプチドと融合させて使用して同様の結果を得た（データは公表していない）。これらのデータは hPER１−MPPが細胞膜を透過することを支持するのみでなく、それはタンパク質を細胞内コンパートメントに運搬し、生物学的なシグナル伝達現象を開始することを示すものである。
【００８３】
実施例５  他の遺伝子コードされたMPPの同定
hPER１は転写調節に関与することを計画した核タンパク質であり、またこれまで天然に存在するタンパク質に由来するすべてのPTDは転写因子である（TAT, AntpおよびVP22）ことから、本発明者らは、ゲノム内に他のPTD配列が存在するか否かを探索した。この目的では、本発明者らは２つのアプローチを使用した。最初に本発明者らは、すべて既知のおよび可能性のあるNLSについてNCBIの非重複タンパク質データベースを探索した（表１, 10−17）。本発明者らはNLSアミノ酸配列に相当するペプチドを合成し、ペプチド形質導入についてアッセイした。表１および図５に示すように、合成した７つのペプチドの６つは、hPER１−PTDおよびTAT−PTDと類似の膜透過特性を示した。これらのタンパク質は、甲状腺ホルモン受容体α−１、ホメオボックスタンパク質HME1およびプロト癌遺伝子タンパク質ABL−１のヒトタンパク質に包含された。さらに（表１および図５）本発明者らは、これらのペプチド配列とGFPの間にインフレームな融合タンパク質を創製し、ついでCHOまたはHEK293T細胞にトランスフェクトした場合、すべての配列は融合タンパク質に核局在性を付与した。
【００８４】
本発明者らのPTDを同定する第二のアプローチは、NCBIの非重複タンパク質データベースコレクションを変性アルゴリズムによる探索を包含した（図５の脚注参照）。これらの探索パラメーターを用いて、本発明者らは533,291の配列を見出し、アルゴリズムの条件は129,169回（24％）満足された。本発明者らの探索を「転写因子、サイトカインまたはチロシンキナーゼ」のいずれかを包含するように限定すると、8280の転写因子タンパク質配列が同定され、そのアルゴリズムパターンは7374回（89％）生じ、2333のサイトカインタンパク質配列内にはそのパターンは450回（19％）生じ、2513のチロシンキナーゼタンパク質内ではそのパターンは843回（36％）生じた。アルゴリズムは核タンパク質内で最も頻繁に起こるので本発明者らは６つの「転写因子」配列についてPTDと推定されるペプチドを合成して、細胞内に透過するそれらの能力をアッセイした。表１の結果18−23行および図３Ａに示すように、試験した６ペプチドの４つがhPER１−PTDおよびTAT−PTDに類似の膜透過性を示した。これらのタンパク質には２種のヒトタンパク質、HEN1／NSLC−１およびHEN２／NSLC−２が含まれ、ニューロンの分化および発達に関与すると報告されている（Uittenbogaad, M., Peavy, D.R. & Chiaramello, A., 1999）。bHLH遺伝子NSCL1の発現は小脳顆粒細胞の成長および分化の役割が示唆されている（J. Neurosci. Res. 57: 770-781; Lipkowitz, S.ら, 1992）。ヒトNSCL−１およびNSCL−２遺伝子の比較構造特性。２つの塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス遺伝子は発達中の神経系（J. Biol. Chem. 267: 21065-21071）、ラットHNF−３（17）およびショウジョウバエcAMP依存性転写因子（18）で発現した。さらに、本発明者らこれらのペプチドとこれらのペプチドとGFPの間にインフレームな融合タンパク質を創製し、ついでCHOまたはHEK293T細胞にトランスフェクトした場合、すべての配列は融合タンパク質に核局在性を付与した。これらの結果はPTD配列がNLS内にまたはそれと重複して見出されることを示している。しかしながら、すべてのNLSは、SV40、hPER2、C−FOS、Cyclin L ania−６およびβZip転写因子NLSにおいて明らかなようにPTDではない（表１）。これらの結果はまたPTD配列がゲノムを通じて広く、とくに核タンパク質において使用されていることを示唆するものである。
【００８５】
実施例６  β−ガラクトシダーゼを有するhPER−PTD
HIV TAT形質導入ペプチドの少なくとも一つの特徴は細胞または組織にタンパク質を運搬するその能力である。したがって、本発明者らは、hPER１形質導入ペプチドがβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬できるか否かを探索した。この実験を行うためには、本発明者らはFrankelら（PNAS 1989 (19): 7397-401）のプロトコールに従い、hPER１−PTDまたはhPER−PTD R7A（Arg7をAlaで置換）を完全長β−ガラクトシダーゼに化学的に連結し、これらの接合体およびβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独をCHO細胞に形質導入する能力をアッセイした。図６のパネル１に示すように、hPER−PTDとβ−ガラクトシダーゼの融合体とインキュベートした細胞はX−galの添加後青色の着色によって示されるように、β−ガラクトシダーゼに対し陽性の酵素活性を示した。しかしながら、hPER−MPP R7Aβ−ガラクトシダーゼもβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独も、X−galの添加後に青色に染色される反応性により示されないように、細胞を入れることができなかった（パネル２および３）。これらのデータは、TATペプチドと同様、hPER１−PTDは大きな（120kD）タンパク質を細胞内に運搬できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  PASの位置、細胞質の局在、および核局在配列（NLS, ただし図中には核局在ドメイン（NLD）として示した） を示すhPER１融合構築体の模式図。融合構築体の名称および位置は左側に示す。数はhPER１タンパク質の最初および最後のアミノ酸残基である。各融合タンパク質の主要な蓄積部位は右側にまとめる。（ｎ）核、（no）核小体、（ｃ）細胞質、（diff）散在性。すべての構築体はＮ−末端にEYFPをタグした。ヒトおよびマウスPER１−NLSのアラインメントは最下部に示す。
【図１Ｂ】  図１Ａに記載のhPER１融合タンパク質の生存細胞における細胞性局在。CHO細胞は各パネルの最上部に示した融合構築体によって一過性にトランスフェクトし、EYFPレポーター（緑）細胞下局在をトランスフェクト１０時間後に蛍光顕微鏡法により可視化した。対照としてはEYFPベクター単独を用いた（５. EYFPベクター参照）。
【図２Ａ】  CHO細胞における膜透過性アッセイ。Ｎ−末端をビオチン化した合成ペプチド、hPER１−PTD、Flag−hPER−PED、Flag−TAT−PTD（陽性対照）およびFlag−Flag（陰性対照）を、培養液中の生存CHO細胞における細胞膜の透過能についてアッセイした。内在化したペプチドの細胞下局在はストレプトアビジン−Alexa 594（赤）または抗−flag mAb（緑）のいずれかによる二色染色法を用いて決定した。第三のカラムはオーバーレイ（黄色）である。さらに、細胞内および核内局在を確認するためには共焦点顕微鏡を用いた。共焦点造影の単一セクションを示す。
【図２Ｂ】  ビオチン化ペプチド, hPER1−NLD（hPER１−PTDとしても知られる）の核標的化を、ストレプトアビジン−Alexa 594蛍光（緑）を用いてTAT−PTDおよび Flag−Flag（陰性対照）と比較した。核の染色には５ng／mLのHoechst 33258（青、中央のカラム）を用いた。第三カラムは共焦点造影のオーバーレイである。
【図３】  hPER１−PDTのアラニン走査。ビオチン化hPER１−NPDは指示した位置をアラニンの単一アミノ酸残基置換により合成し、CHO細胞における膜透過をアッセイした。細胞はペプチド濃度１０μM, ３７℃において１０分間インキュベートしたのち、洗浄、固定し、透過性にして、標識ストレプトアビジン Alexa−594（赤, ２μg／mL）によりRTで１５分間検出した。対照ペプチドはhPER１ Ｎ−末端アミノ酸残基486−500とした。
【図４Ａ】  セロトニン5HT2A受容体とhPER１−MPP融合ペプチドによる活性化のhPER１−MPPおよびTAT−PTDペプチドは単独でまたは第一の細胞内ループＩ１（SLEKKLQNATN）もしくは5HT2A受容体、遺伝子アクセス番号 M86841）由来のＣ−末端膜貫通７ドメインTM7（KTYRSAFSRYIQYKENKKPLQLI）のいずれかと融合させて合成した。受容体の活性は標準FLIPR分析を用いて、外因性および内因性Ca+2レベルをアッセイした。ペプチドの名称は次の通りである：Ｔ（TAT−PTD）、Ｐ（hPER-MPP）、Ｉ１（細胞内ループ１）、Ｔ−Ｉ１（TAT−PTD−II）、Ｐ−Ｉ１（hPER１−MPP−Ｉ１）、TM7 (Ｃ−末端ドメイン)、TTM7 (TAT−PTD−TM7)、PTM7（hPER１−MPP−TM7）およびＳ (セロトニン)。
【図４Ｂ】  PTM7（黒丸）およびTTM7（黒菱形）ペプチドの用量反応。セロトニン（対照、白三角）は１０μMの最大受容体刺激濃度で使用した。
【図５Ａ】  付加的PTDの同定。PTDの候補配列は、キーワードとして「転写因子」と注釈された遺伝子バンク中のタンパク質コード領域から翻訳されたペプチド配列で、SwissPro, PRF, PIR−Protein info Resource, PDBを含む複合バイオインフォーマティクス法を用いて探索した。本発明者らは最初はすべて既知または候補NLSについて探索した。第二に本発明者らは変性パターンの発生 [R／H／K]−[R／H／K]−[R／H／K]−[R／H／K]を探索するためPHI−BLAST（Pattern-Hit Initiate BLAST）、(Ｘ)n（式中、ｎは４またはそれ以上の整数であり、Ｘは常に独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンから選択される）を採用した。7374の候補PTD配列が見出された。２つの探索から本発明者らは（Ａ）これらの配列に対するビオチン化ペプチドを合成し、または（Ｂ）GFPとのインフレーム融合タンパク質を創製し、CHO細胞にトランスフェクトした。１２のペプチド中の９つは形質導入され、すべての配列がトランスフェクトされた細胞中の核に局在することが見出された。hPER１−PTD、hPER3−PTDおよびTAT−PTDペプチドを陽性対照として使用した。６つの陽性配列と２つの陰性配列が示された。数は母体タンパク質配列内のアミノ酸残基数、およびこれらのタンパク質についての遺伝子バンク受入番号を以下に示すように表す。すなわち (M24899, ヒト甲状腺ホルモンα−１；L12699, ヒトHomeoboxタンパク質Engrailed 1 HEME1；X16416, ヒトプロト癌遺伝子チロシンプロテインキナーゼABL1；Q02575 ヒトHEN1／NSLC1；Q02577, ヒトHEN2／NSLC2；AAA74561, ラットHNF3；CAB65887, ショウジョウバエcAMP依存性転写因子)。３つの陰性ペプチドは（V01512, c−Fos；AAD53184, ヒト cyclin L ania-6a；CAB66914, Arabindopsis β−zip転写因子）である。
【図５Ｂ】  図５Ａの続きである。
【図６】  hPER−PTDはβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬する。HIV TAT形質導入ペプチドの少なくとも一つの特徴は細胞および組織にタンパク質を運搬するその能力である。したがって、本発明者らはhPER１形質導入ペプチドがβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬できるか否かを決定すること追求した。この実験を実施するためには本発明者らはFrankelら（1989, (19): 7397-401）によるプロトコールに従い、hPER１−PTDまたはhPER−PTD R7Aを完全長のβ−ガラクトシダーゼに化学的に連結し、これらの接合体またはβ−ガラクトシダーゼ単独がCHO細胞に形質導入する能力をアッセイした。図６の左側に示すように、hPER−PTDβ−ガラクトシダーゼの融合は、X−galの添加後の細胞に青色によって示されるようにβ−ガラクトシダーゼについて陽性の酵素活性を示した。しかしながら、hPER−MPP R7Aβ−ガラクトシダーゼ（中央）のみならずβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独（右側）でもX−gal添加後に青色の染色反応を示さないように、細胞内に入ることはできなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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