(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１〜４からなる群から選択されるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドおよび製薬上許容され得る担体を含む組成物であって、哺乳動物宿主におけるウイルス感染の治療または予防に有効である、前記組成物。
【請求項３】
前記組成物が、ヒト免疫不全ウイルス、単純性疱疹ウイルスおよびサイトメガロウイルスから成る群から選択される一つ以上のウイルスからの感染の治療または予防において有効である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ウイルス感染を治療または予防するための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
ウイルス感染を治療および予防するための医薬の製造におけるペプチドの使用であって、前記ペプチドは配列番号：１〜４からなる群から選択され、さらに前記ペプチドがウイルス生体に対抗するのに十分な有効量で存在する、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗ウイルス特性を有するペプチドに関する。より具体的には、本発明は、広範囲のウイルスに対して活性を示すペプチド、前記ペプチドを含む医薬品組成物、および前記ペプチドを用いてウイルス感染を予防および／または治療する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
近年、ウイルスに対して活性を有する多様なペプチド誘導体群が開示されている。これらのペプチドの例は、Ｂｅａｕｌｉｅｕらに対して発行された米国特許第５，７００，７８０号；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒらに対して発行された米国特許第５，１０４，８５４号；Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒらに対して発行された米国特許第４，８１４，４３２号；Ｄｕｔｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：４３９（１９８６）；およびＤｏｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：４４１（１９８６）に開示されている。しかし、当業者に知られている多くの既知抗ウイルスペプチドは、極めて疎水性であり、故に、生物学的利用能があまり高くない。さらに、これらの既知の抗ウイルスペプチドの多くは、それらの特異的な作用メカニズムのため、数タイプのウイルスに対してしか活性を示さない。加えて、これらの合成ペプチドの多くは、初期ウイルス感染の予防に有効ではないか、または局所塗付した時、機能しない。
【０００３】
今日までに抗ウイルス薬として開発された最も成功したヌクレオシドの一つは、アシクロビルである。アシクロビルは、単純性疱疹ウイルス・タイプＩ（ＨＳＶ−１）、単純性疱疹ウイルス・タイプＩＩ（ＨＳＶ−２）、および水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に対してインヴィトロおよびインビボ阻害活性を有する合成プリンヌクレオシド類似体である。細胞培養において、アシクロビルの最も高い抗ウイルス活性は、ＨＳＶ−１に対してであり、ＨＳＶ−２、ＶＺＶの順で効力が落ちる。しかし、アシクロビルの使用は、禁忌されることがある。その上、一部の単純性疱疹ウイルスは、アシクロビルに対して耐性になってきた。
【０００４】
近ごろ、局所殺ウイルス薬およびコンドーム潤滑剤に組み込んで、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の伝染防止を助けることができる抗ウイルス化合物に向けて、相当な研究がなされている。こうした製品に対する需要は高く、ＨＩＶ感染を予防する適切な抗ウイルスおよび／または殺ウイルス化合物は、先進国および発展途上国の両方でおおいに役立つであろう。
【０００５】
従って、広範囲のウイルスに対して高い活性を示す抗ウイルス薬が、依然として必要である。局所的に塗付することができ、ウイルス感染の予防に有効な抗ウイルス薬も依然として必要である。
【０００６】
（図面の簡単な説明）
図１Ａから１Ｃおよび図１Ｅは、コントロールペプチド（配列番号１６および配列番号１７）との比較で、本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）、（配列番号３）および（配列番号４）によるＨＳＶ−１の用量依存性阻害を示す代表図である。図１Ｃは配列番号１および配列番号１７の細胞障害効果を示す。
【０００７】
図２は、本発明のビオチン化抗ウイルスペプチド（配列番号２）によるウイルス阻害を示す代表図である。
【０００８】
図３は、アシクロビルとの比較として、本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）によるＨＳＶ−１形成の用量依存性阻害を示す代表図である。
【０００９】
図４Ａおよび４Ｂは、本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）が初期のウイルス感染およびウイルスの伝播を阻害することを説明する図である。
【００１０】
図５は、本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）の抗ウイルス活性がウイルス投入量に依存することを説明する図である。
【００１１】
図６Ａおよび６Ｂは、本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）による細胞へのウイルス侵入の阻害を説明する図である。
【００１２】
図７Ａおよび７Ｂは、本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）の侵入期および用量応答を説明する図である。
【００１３】
図８Ａおよび８Ｂは、本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）の殺ウイルス活性を説明する図である。
【００１４】
図９Ａおよび９Ｂは、本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）のインビボでの活性を説明する図である。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
以下の説明では、多数の用語を広範に使用する。本発明の理解を助けるために、本明細書における定義を設ける。
【００１６】
抗ウイルスペプチド：  抗ウイルスペプチドは、少なくとも膜通過性ペプチドの一部分、あるいはその断片または誘導体を含み、有効量で投与した時、薬理学的に有効な抗ウイルス薬である。
【００１７】
有効量：  抗ウイルスペプチドの所定量、すなわち、治療または予防効果のためにインビボでまたは局所的にウイルス生物に対して有効であるために十分なペプチドの量。
【００１８】
膜通過性ペプチド（膜通過性モチーフ）：  そのペプチドが脂質二重層を横断して、細胞または細胞内区画に侵入することができるようにするアミノ酸配列を有するペプチド。
【００１９】
製薬上許容され得る担体：  中に含まれている薬理活性抗ウイルスペプチドと反応しないかまたはその有効性を低下させない非毒性賦形剤を一つ以上含む、哺乳動物に抗ウイルスペプチドを投与するために許容され得る繕いビヒクル。
【００２０】
溶解性タグ：  荷電アミノ酸から成る短いペプチド配列であり、これをより長い不溶性ペプチド配列の末端残基に取り付けると、水性媒体への溶解度を向上させるであろう。
【００２１】
本出願では、全体を通してアミノ酸に標準一文字略名を用いる。Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒら、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（生物化学の原理）」，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐ．１１３（１９８３）を参照のこと。本出願におけるすべてのアミノ酸配列は、各配列の末端における最も左のアミノ残基がアミノ末端残基であり、各配列の右端の残基がカルボキシル末端残基である、標準命名法を用いて示す。本明細書に記載するペプチドのアミノ酸は、ペプチド配列の前にｌまたはｄで示すように（表１を参照のこと）、左旋性アミノ酸または右旋性アミノ酸のいずれかであり得る。
【００２２】
本発明は、膜通過性ペプチドに基づく新規抗ウイルスペプチドに関する。多様な膜通過性ペプチドが当業者においてよく知られている。膜通過性ペプチドは、局所的に塗付されるか、またはインビボで適用された時のような活性を含む広範囲の抗ウイルス活性を示すことを意外にも、思いがけなく発見した。膜通過性ペプチドから誘導される本発明の抗ウイルスペプチドの例を下の表１に記載するが、当該記述分野において既知の一切の膜通過性ペプチドを用いることができる。例えば、Ｐｏｏｇａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１２：６７（１９９８）およびＯｅｈｌｋｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４１５：１９６（１９９７）を参照のこと。
【００２３】
【表１】
0004896333.tif 000002
【００２４】
本発明の抗ウイルスペプチドは、有効量で単独に用いることができる。大部分の膜通過性ペプチドが可溶性であるとはいえ、一部はそうではないが、不溶性膜通過性モチーフは、以下の方法によって抗ウイルスペプチドに用いることができる。抗ウイルスペプチドが製薬上許容され得る水溶性担体に不溶性である場合には、溶解性タグを抗ウイルスペプチドに付加させることができる。
【００２５】
表１に示したように、配列番号１から４は、共有結合した溶解性タグを有している。本発明は、共有結合した溶解性タグを部分的に含むと共に、以下の配列：（Ｘ１）ｎ−Ａ−Ａ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｌ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ａ−Ｐ−（Ｘ２）ｍ（配列番号１４）または（Ｘ１）ｎ−Ｐ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｌ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ａ−（Ｘ２）ｍ（配列番号１５）（式中のＸ１およびＸ２は、各Ｘ１および各Ｘ２が同じまたは異なる電荷のアミノ酸残基であることができる、一つ以上の荷電アミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｒ）から選択され；式中のｎは、０または３から１０の値を有し、ｍは、０または３から１０の値を有し、この場合、一つの実施形態において、ｍ＝０またはｎ＝０のいずれかである）を有するような新規抗ウイルスペプチドに関する。溶解性タグの一つの例は、Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｋ（配列番号１６）である。好ましい実施形態において、溶解性タグのすべての荷電アミノ酸残基は、正電荷のアミノ酸残基である。本発明者は、不溶性膜通過性ペプチドが、溶解性タグに結合した時、広範囲のウイルスに対して強い抗ウイルス活性を示す抗ウイルスペプチドを生ずることを意外にも、思いがけなく発見した。
【００２６】
多くの膜通過性ペプチドは、溶解性タグを必要とすることなく本発明の抗ウイルスペプチドとして機能することができる。表１を参照のこと。さらに、溶解性タグは、一部の膜通過性ペプチドの溶解性を向上させることができるが、これらの特定の膜通過性ポリペプチドは、溶解性タグを組み込まずとも抗ウイルスペプチドとして適切であり得る。
【００２７】
本発明の抗ウイルスペプチドは、それらの末端アミノ酸残基に取り付けられた多様な反応性タグを有することができる。こうしたタグは、本発明の合成ペプチドの検出／取出しに有用である。こうしたタグには、ほんの一例としてビオチン、ならびに当業者によく知られている他の一切のタグを挙げることができる。配列番号２、５から１２および実施例２は、こうした反応性タグの加入を示している。
【００２８】
本発明の膜通過性ペプチドの誘導体および断片も、抗ウイルスペプチドとして有用であることが判った。本発明は、膜通過性モチーフの一つ以上のアミノ酸残基が欠失しているかまたは他のアミノ酸残基に置換された膜通過性モチーフを含む新規抗ウイルスペプチドに関する。こうした置換された、または断片の膜通過性モチーフは、抗ウイルス活性を保持していなければならない。その置換膜通過性モチーフまたは断片を含む本発明の抗ウイルスペプチドは、以下の実施例に記載する方法によって抗ウイルス活性について検査することができる。実施例２は、表１に記載した配列番号３によって示されるような置換膜通過性モチーフを含む抗ウイルスペプチドが、抗ウイルス活性を保持していることを示している。この誘導体は、両方のプロリンアミノ酸残基がペプチドのカルボキシ末端に位置しているという点のみが、配列番号１と異なる。本発明の抗ウイルスペプチドの可能性ある活性断片を表２に記載する。
【００２９】
【表２】
0004896333.tif 000003
こうした誘導体および断片は、本発明の範囲内である。
【００３０】
本発明のペプチドは、アミノ酸残基および／またはペプチド断片の伝統的な溶液結合法、および望まれる場合には、固相技術などのペプチド合成に一般に用いられる方法を取り入れた方法によって、調製することができる。こうした方法は、以下の実施例で説明する。当業者においてよく知られているペプチド合成についてのなんらかの方法、例えば、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｂｋｅ，  ｉｎ  「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ペプチド）」，Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２−１２８（１９６５）；「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ（ペプチド：  分析、合成、生物学）」，（編集  Ｅ．Ｇｒｏｓｓら），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１−８，（１９７９−１９８７）；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  ｉｎ「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（固相ペプチド合成）」，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）；Ｗｉｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０５３７（１９９２）；およびＲｉｍｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７２：９８６（１９９８）を用いることができる。
【００３１】
以下の実施例に示すように、本発明の抗ウイルスペプチドは、広範な外皮膜および非外皮膜ウイルスに対して抗ウイルス活性を示す。こうした外皮膜ウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ベシクロウイルス（ＶＳＶ）、単純性疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、および他の疱疹ウイルス、例えば、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＥＢＶ、ウマ疱疹ウイルス（ＥＨＶ）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）が挙げられるが、それらに限定されない。非外皮膜ウイルスの例には、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）およびアデノウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３２】
本発明の抗ウイルスペプチドのウイルス複製に対する阻害効果を示すための方法は、以下の実施例で教示するようなよく知られている細胞培養技術である。こうした方法は、当業者によく知られている。Ｗｉｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０５３７（１９９２）を参照のこと。
【００３３】
抗ウイルス薬としての抗ウイルスペプチドの治療上の有効性は、実験動物において、例えば、実施例１０に示すようなネズミモデルを用いることによって、示すことができる。
【００３４】
さらに、本発明の薬理活性ペプチドの治療効果は、当業者によく知られている技術により、ヒトにおいて示すことができる。例えば、Ｋｉｌｂｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４；１３０２（１９９８）を参照のこと。
【００３５】
本発明の抗ウイルスペプチドは、温血動物、例えば、ヒト、ウマ、他の哺乳動物などに本ペプチドを局所投与することによって、抗ウイルス薬として用いられるだろう。本ペプチドは、一つ以上の製薬上許容され得る担体を含むビヒクル中で投与することができ、その割合は、ペプチドの化学的特性の中の溶解度、選択される投与経路および標準生物学的投与によって決定される。本ペプチドの処方に適するビヒクルまたは担体は、標準的な製薬テキストに記載されている。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの製薬科学）」，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）を参照のこと。
【００３６】
局所投与用の抗ウイルスペプチドは、有効量の抗ウイルスペプチド、典型的には０．１から１０％、好ましくは５％の抗ウイルスペプチドを含有する製薬上許容され得るビヒクル中で処方することができる。こうした製剤は、溶液、クリームまたはローションの形態であり得る。本発明の抗ウイルスペプチドは、皮膚または口腔または生殖腔の一部のウイルス感染を治療するために用いることもできる。本抗ウイルスペプチドは、より多種多様なウイルスを治療するために、独自でまたは組合せて用いることができる。こうした局所塗付は、手袋、コンドームおよび当業者に知られている他のバリヤーなどの着用者を保護するためのバリヤー材に施すことができる。
【００３７】
全身投与用の本発明の抗ウイルスペプチドは、静脈内、皮下または筋肉内注射によって、単独で、または製薬上許容され得るビヒクルもしくは担体と併用で投与することができる。注射による投与には、バッファーまたは保存薬、ならびに溶液を等張性にするために足る量の製薬上許容され得る塩もしくはグルコースなどの他の溶質を含有することもできる、無菌水性ビヒクル中の溶液で、抗ウイルスペプチドを用いることが好ましい。本発明の抗ウイルスペプチドは、当業者においてよく知られている治療上許容され得る塩の形態で得ることができる。
【００３８】
本発明の抗ウイルスペプチドの投薬量は、投与の形態によって変化し、併用するために選択される特定の抗ウイルスペプチド（複数を含む）に依存するであろう。さらに、治療を受ける特定の宿主によって変化するであろう。一般に、本抗ウイルスペプチドは、一切の有害なまたは有毒性の副作用を生じることなく、選択したウイルス（複数を含む）に対して抗ウイルス薬として有効な結果を一般に生じるだろう濃度水準で、最も好ましくは投与される。
【００３９】
以下に説明する実施例を参照しながら、本発明をさらに説明する。別様に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術および科学用語は、本発明の当業者が一般に説明するものと同じ意味を有する。本明細書中に記載するものと類似のまたは同等のあらゆる方法および材料が発明の実施に用いることができるが、好ましい方法および材料を記載した。別様に言及しない限り、本明細書中で用いるまたは考察する技術は、当業者によく知られている標準的な方法である。これらの材料、方法および実施例は、説明のためのものであって、制限するためのものではない。本明細書に引用するすべての参考文献は、参照により取り入れる。
【００４０】
実施例１−プロトコルおよび材料
細胞培養およびウイルス：  （Ｇｒａｕら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｒｈａｌ．ａｎｄ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３０：２４７４（１９８９））に記載されているような、Ｖｅｒｏ細胞を成長させ、ＨＳＶ−１  ＫＯＳの高力価株を調製するための手順を用いた。Ｖｅｒｏ細胞は、５％の仔ウシ血清および５％のウシ胎仔血清（標準培地）を補充したカーボネート緩衝ＤＭＥＭ中で保持した。一部の研究については、細胞を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓで緩衝した血清を含まないＤＭＥＭ（ｐＨ７．４）に切り換え、実験的処理の前に３０分間その培地に適応させた。Ｖｅｒｏ細胞は、ミクロタイタープレートのウエル（０．２８ｃｍ２）に、１日後に使用するために３．５×１０４細胞／ウエル（８×１０４細胞／ウエル）、または３日後に使用するために１×１０４細胞／ウエル（２×１０５細胞／ウエル）のいずれかで接種された。
【００４１】
プラーク減少アッセイ：  ミクロタイタープレート内の集密Ｖｅｒｏ細胞は、４０μＬの培地に、３７℃で１時間、感染させた。指示した場合を除き、４０μＬの培地中でのペプチド処理は、感染の１時間前から１時間後まで続いた。吸着時間終了時点で、培養物に１００μＬの標準培地を再供給した。２日後、プラーク形成の点数付けを行い、１ウエルにつき点数付けされたプラーク数を、ペプチド不在の状態で数えた数に対して正規化した。接眼マイクロメータを用いて、最も大きいプラークの直径（Ｌ）およびそれに対して９０°角での直径（Ｓ）を測定することによって、プラークサイズ（π／２×Ｌ×Ｓ）を決定した。プラークが、１０未満の円型細胞を含んでいたか、ウエルの側面に接触していた場合を除いて、最初の４０の点数付けプラークの各々のサイズを測定した。
【００４２】
収量低下アッセイ：  感染３日後、ミクロタイタープレート内のＶｅｒｏ細胞培養物を３回凍結（−８０℃）融解（３７℃）した。ピペット操作を繰り返すことによって細胞を懸濁させ、ミクロタイタープレートをベックマンＴＪ−６型卓上遠心分離器内で１０分間、７００ｘｇで回転させた。ウイルスを含有する上清を標準培地中で、連続的に希釈し、Ｖｅｒｏ細胞について力価測定した。Ｇｒａｕら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３０：２４７４（１９８９）によって教示されているように、クリスタルバイオレットを用いて単層を染色した後、プラークを数えた。
【００４３】
付着アッセイ：  ＨＳＶ−１  ＫＯＳを［３２Ｐ］−オルトホスフェートで標識して、比放射能  ０．０１ｃｐｍ／ｐｆｕにした。簡単に言うと、Ｖｅｒｏ細胞を５．０の感染多重度で感染させ、感染の６時間後に、［３２Ｐ］−オルトホスフェート（０．５ｍＣｉ／ｍＬ）を添加した。感染の１８時間後、細胞および培地を別々に回収した。細胞を３回の凍結融解サイクルに付し、細胞破壊片を２０００ｘｇで１０分間、遠心分離することによってペレット化した。Ｖｉｓａｌｌｉら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２９：１６７（１９９３）によって教示されているように、凍結融解上清は、培地と混合し、ウイルスは、２６％のスクロース密度勾配クッションによる遠心分離によってペレット化した。使用にあたって、ウイルスペレットをＰＢＳに再懸濁させた。ミクロタイタープレート内の集密Ｖｅｒｏ細胞を血清を含まないＤＭＥＭに移し、氷を用いて冷却して、４℃で保持した。３０分後、ペプチドを添加し、６０分後、細胞を２時間、３２Ｐ−ウイルス（２×１０４ｃｐｍ／ウエル）と共にインキュベートした。標識付けした後、細胞を氷冷培地ですすいだ。その後、結合した３２Ｐは、ＰＢＳ中、１％のＤＳＤおよび１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて定量的に抽出し、ベックマンＬＳ５８０１液体シンチレーション・カウンターで数えた。
【００４４】
ｌａｃＺ＋ウイルス（ｈｒＲ３）侵入アッセイ：  ９６ウエルのミクロタイタープレート内の集密Ｖｅｒｏ細胞培養物をＨｅｐｅｓで緩衝した、血清を含まないＤＭＥＭに移し、３０分間、氷を用いて４℃に冷却し、４０μＬの培地中、４℃で１時間、ｈｒＲ３で感染させた。氷冷培地ですすぐことによって、未付着ウイルスを除去した。ＥＢと呼ばれる抗ウイルスペプチド配列番号１、もしくはスクランブルドバージョンの膜通過性ペプチドＲ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａに付着したＲＲＫＫテトラペプチド（配列番号１６）を含むコントロールペプチド（（配列番号１７）（ＥＢＸと呼ばれる）での処理、またはペプチドを含まない培地での擬似処理を、前述したように血清を含まないＤＭＥＭ中で行った。ウイルスの侵入を、培養物を３７℃に変えることによって開始させた。一切の残存細胞外ウイルスを不活性化するために、培養物をＰＢＳですすぎ、低ｐＨのクエン酸バッファー（Ｈｉｇｈｌａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３３５６（１９８７）によりクエン酸  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １３５ｍＭ、ｐＨ３．０）に２３℃で、１分間さらした。クエン酸塩をＰＢＳですすぎ落とし、培養物が２３℃で３０分間、５ｘのＰＢＳ中、０．５％のグルタルアルデヒドで固定されるまで培養物を血清補充ＤＭＥＭ中で保持して、２μＭのＭｇＣｌ２、１．３ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６および１．３ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を含有する１ｘのＰＢＳ中のＸ−ｇａｌ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；ＢＰ１６１５−１）を用いて２３℃で１時間または一晩、β−ガラクトシダーゼ活性について染色し、青いｌａｃＺ＋細胞の存在を点数付けした。
【００４５】
殺ウイルスアッセイ：  ＨｒＲ３（１．２×１０６ｐｆｕ／ｍＬ）を７０μＬの血清を含まないＤＭＥＭ（ｐＨ７．４）中、３７℃で、１時間、多様な濃度のＥＢまたはＥＢＸとともにインキュベートした。血清補充ＤＭＥＭを用いて処理ウイルスを２００倍に希釈し、約１時間後に、１日前にＶｅｒｏ細胞（３．５ｘ１０４細胞／ウエル）を播いたミクロタイターウエルに関する感染性について検定した。４０または１００マイクロリットル量の希釈ウイルスを１または２時間、３７℃で吸着させ、ｌａｃＺ＋細胞を８時間後に点数付けした。一部の実験では、残存する感染性ウイルスを検定する前に、先ず、一定量の希釈ウイルスを一晩、４℃で、Ｈｅｐｅｓで緩衝して血清を補充した６０倍過剰量のＤＭＥＭに透析する（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ；ＭＷＣＯ  １２−１４，０００）か、または注射器によって０．２２μｍの膜（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。
【００４６】
トリパンブルー排除アッセイ：  血清を含まないまたは血清を補充したＤＭＥＭ中の未感染Ｖｅｒｏ細胞を３７℃で１時間、抗ウイルスペプチド配列番号１またはコントロールペプチドＥＢＸ（配列番号１７）で処理し、ＰＢＳですすいで、２３℃で５分間、ＰＢＳ中０．４％のトリパンブルーで染色し、再びＰＢＳですすいで、空気乾燥させた。
【００４７】
電子顕微鏡検査法：  Ｖｉｓａｌｌｉら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２９：１６７（１９９３）による精製ＨＳＶ−１  ＫＯＳウイルス粒子（２．５ｘ１０７ｐｆｕ／ｍＬ）を５から６０分間、４または２３℃で、２５ｍＭのＨｅｐｅｓで緩衝した４０μＬの血清を含まないＤＭＥＭ（ｐＨ７．４）中の２５μＭの抗ウイルスペプチド配列番号１またはコントロールペプチドＥＢＸ（配列番号１７）で処理した。一定量（１０μＬ）をピオロホルムポリ−Ｌ−リシン被覆グリッドに５分間、２３℃で吸着させた。グリッドをＰＢＳですすぎ、ｐＨ〜６に調整した水中の２％のリンタングステン酸（ＰＴＡ）で染色して、空気乾燥させた。あるいは、ウイルスをグリッドに予め吸着させ、その後、ペプチドで処理した。５μＬのＰＢＳ中、合計４ｘ１０９ｐｆｕ／ｍＬの精製ＨＳＶ−１  ＫＯＳを２３℃で５分間、被覆グリッドに塗付し、２５ｍＭのＨｅｐｅｓで緩衝した血清を含まないＤＭＥＭバッファー（ｐＨ７．４）でそのグリッドを一回すすいで、３７℃で３０分間、同じ培地中５ｍＭのＥＢまたはＥＢＸ  １５μＬで処理した。抗ウイルスペプチド配列番号１およびＥＢＸの高濃縮溶液のｐＨは、使用前に、ＮａＯＨで７．４に再調整した。ペプチド含有溶液の蒸発を防止するために、各グリッドをＨｉｒａｏｋａフレキシブル染色プレート内に保持し、０．５ｍＬのポリプロピレン微量遠心分離管から製造された小型ベルジャーをかぶせた。このベルジャーは、その半分が、グリッドの被覆表面に面することを満たすように、十分に小さく１５μＬほどの大きさであった。その後、全アセンブリを湿潤チャンバ内で、３０分間、３７℃でインキュベートした。処理後、グリッドは、ＰＴＡで染色する前に、ＤＭＥＭで２回、ＰＢＳで１回すすぎ、乾燥させた。グリッドは、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−１２００ＥＸ電子顕微鏡において、１５，０００および４０，０００倍の倍率で検査した。
【００４８】
ペプチド合成：  ペプチドの合成および分析は、ウィスコンシン大学マジソン校のバイオテクノロジー・センターで行った。合成は、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１３：３５（１９７９）およびＦｉｅｌｄｓら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．４：９５（１９９１）による改良を伴う、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：７１２９（１９６３）によって最初に説明された原理に従って、自動合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３２Ａ「Ｓｙｎｅｒｇｙ」）を用いて、２５ピコモルスケールで行った。分解したペプチドを冷ｔ−ブチルメチルエーテルで沈降させ、水に溶解して、ＨＰＬＣ分析（純度）およびエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（分子質量、表１参照）によって検査した。溶液中のペプチド濃度は、Ｓｅｇｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ，２ｎｄｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７６）によって教示されたように、２１５および２２５ｎｍでの吸光度の読み取りによって決定した。
【００４９】
実施例２−抗ウイルスペプチドの抗ウイルス活性
抗ウイルスペプチドＥＢ（配列番号１）は、ＨＳＶ−１  ＫＯＳでのＶｅｒｏ細胞培養物の感染中に存在する時、有効な抗ウイルス薬であり、図１Ａ（●）、図１Ｂ（●）および図１Ｄ（○）に示すようにプラーク形成を阻害し、濃度に依存して最高８桁までウイルスの収量を低下させた（図１Ｅ参照）。コントロールペプチドの図１Ａ（○）および図１Ｂ（○）ＥＢＸと比較して、抗ウイルスペプチドＥＢは、はるかに有効な抗ウイルス薬であり、血清の存在（図１Ａ）または不在（図１Ｂ）に依存して１０または１００倍低い濃度で感染を阻害した。
【００５０】
血清不在の状態でのトリパン排除によって測定した時、抗ウイルスペプチドＥＢの細胞障害効果は、抗ウイルス濃度（図１Ｂ、（●）；ＩＣ５０＝０．７μＭ）より１００倍高い（図１Ｃ、（●）；ＩＣ５０＝６８μＭ）濃度でしか見られなかった。血清が存在する状態では、細胞障害効果は、最初、ＥＢ  ２００μＭ（図１Ｃ、（△））で見られた。細胞障害効果は、コントロールペプチドＥＢＸ（配列番号１７）には随伴しなかった（図１Ｃ、（○））。
【００５１】
荷電アミノ末端Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｋテトラマーは、疎水性の別の状況では抗ウイルス性のペプチドＥＢの溶解性の向上に有用であることがわかったが、それ自体は重要な抗ウイルス活性を一切有さない。血清が存在する状態では、抗ウイルス活性は、２００μＭの高き濃度でも、遊離Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｋテトラマー（配列番号１６）には随伴しなかった（図１Ａ、（▲））。
【００５２】
別の実験において、遊離Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｋテトラマー（配列番号１６）は、血清を含まない条件のもと、１．３ｍＭのＩＣ５０値で、Ｖｅｒｏ細胞のｈｒＲ３感染を阻害することを発見した（データは、示していない）。高濃度（１００倍までモル過剰）であるが、非抗ウイルス濃度の遊離Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｋペプチド（配列番号１６）は、抗ウイルスペプチドＥＢの活性と競合することはできず、抗ウイルスペプチドＥＢによるｈｒＲ３感染の阻害を再現することはできないことも発見した（データは、示していない）。
【００５３】
膜通過性タンパク質配列の誘導体が抗ウイルス活性を示すかどうかを調査するために、中央のプロリン残基をカルボキシ末端に移動させた、ＥＢＰＰと呼ばれる修飾抗ウイルスペプチド（配列番号３）を試験した。このＥＢＰＰペプチド（表１）は、プラーク（図１Ｄ）および収量低下アッセイ（データは、示していない）の両方で、元のＥＢペプチドの２倍、活性であった。
【００５４】
ビオチンを有するようにＥＢペプチドを修飾し（配列番号２）、上に記載したように、活性について検査した。図２に示すように、ビオチン化ＥＢは、本質的にＥＢと同じほど有効であった。従って、ペプチドのビオチン化は、活性に対してごくわずかな効果しか生じなかった。
【００５５】
本発明の多数の他の抗ウイルスペプチドおよびコントロールの抗ウイルス活性を上に記載したように測定した。その結果を以下の表３に示す。図１Ｅに示すように、「ＬＡＬＡ」と呼ばれる抗ウイルスペプチド配列番号４は、ＥＢと類似した抗ウイルス活性を示す。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
実施例３−抗ウイルスペプチド対アシクロビルの抗ウイルス活性の比較
実施例１で調製したＶｅｒｏ細胞をＨＳＶ−１で感染させ、実施例１に記載したようにウイルス生産について検定した。本発明の抗ウイルスペプチドＥＢ（配列番号１）の抗ウイルス活性を、現行のＨＳＶ抗ウイルス性ヌクレオシド標準物質アシクロビルの抗ウイルス活性と比較した。ＨＳＶで感染させる１時間前に、二つのペプチドをＶｅｒｏ細胞に添加した。図３が示すように、アシクロビルは、低投薬量で最高の活性を示すが、高濃度、すなわち有効成分の１０μＭを越える濃度では、ＥＢが、最も大きな抗ウイルス活性を示した。
【００５８】
実施例４−早期効果および細胞間伝播に対する効果
本発明の抗ウイルスペプチドは、ウイルスのライフサイクルの早期に作用することが測定された。図４Ａに示すように、ＥＢは、感染１時間後に始まって継続的に存在する時に比べ、感染中および感染１時間前および１時間後に存在する時、実質的に有効であった（各々、ＩＣ５０＝５．５μＭ、（○）  対  ＩＣ５０＝２４、（●））。さらに、吸着前および吸着中に存在する時、ＥＢは、プラークサイズに対して効果を生じなかった。ＥＢペプチドが、感染後継続的に存在した時、プラークの拡大は、用量に依存する形で阻害された（図４Ａ，（△）；ＩＣ５０＝１２μＭ）。個々のプラークを確実に測定できるようにするために、細胞培養物を非常に低い多重度（ｍｏｉ＜０．０１）で感染させ、プラークサイズを非常に早期に（感染１日後）顕微鏡で測定した。図４Ｂに示すように、未処理のコントロールウエルでは、プラークサイズが広く分布し（黒棒；平均：６６，０００±６２００μｍ２）、これに対して、感染１時間後、ＥＢの増加濃度が追加されたことによって、分布は、より小さいサイズのクラスに向かって累進的にシフトした（例えば、２５μＭのＥＢは、平均プラークサイズを７０％有意に低下させて、６９００±２６００μｍ２にした；ｔ＝６．８８；影つき棒）。対照的に、たとえプラークの数が感染後の処理に比べて猛烈に減少したが、感染後１時間未満のＥＢの存在は、プラークサイズに対して効果を生じなかった。従って、６および１２μＭのＥＢ（６８，０００±１１，０００μｍ２）で一時的な処理を施した後の混合平均プラークサイズは、コントロールと区別がつかなかった。ＥＢは、ウイルス感染の初期段階で作用し、感染後に添加した時プラークサイズを低下させるように見えた。
【００５９】
実施例５−抗ウイルスペプチドによるウイルスの凝集
本発明の抗ウイルスペプチドがウイルスを凝集させることを電子顕微鏡により示した。有効に視覚化するために必要なため、高濃度の精製ウイルス粒子を２５μＭのＥＢとともにインキュベートし、被覆グリッドに吸着させて、ＰＴＡで染色した。結果は、ほぼすべての粒子が比較的数少ない大きな凝集体中に見られることを示した。対照的に、未処理ウイルス、すなわち２５μＭのＥＢＸで処理したウイルス粒子は、ほぼすべて、個々に、均質に、グリッド表面に分散しているのがわかった。凝集体の中のＰＴＡ染色された個々のウイルス粒子は、視覚的にコントロール粒子と区別がつかなかった。このことは、ＥＢがウイルス粒子において全体的な構造的異常を誘導しなかったことを示す。ＥＢ誘導凝集体は、室温ならびに４℃で急速に（＜５分）形成された。
【００６０】
実施例６−ウイルス投入量に関して抗ウイルスペプチドの抗ウイルス活性
多様な濃度のＥＢが存在する状態で、１９、２１０および５７００ｐｆｕ／ウエルの投入量のｈｒＲ３で培養物を感染させ、８時間後にｌａｃＺ＋細胞を点数付けした。得られたＩＣ５０値は、図５に示すように、各々、０．６６、１．２および１１μＭであった。
【００６１】
重要なことは、図５中の挿入図に示すように、２１０ｐｆｕ／ウエルの中間投入量より上では、この投入量より下の場合より、ウイルス力価の増大にともないＩＣ５０が大きく増大した。もしＥＢが単に、高いウイルス投入量でより効率的に（すなわち低いＩＣ５０で）作用するはずの凝集剤として作用するのならば、ＩＣ５０とウイルス力価の間に逆の相関が予想されよう。従って、これらの実験では、ウイルスの凝集は、ＥＢの抗ウイルス活性に対していかなる重大な貢献もなしていない。さらに、ＥＢの抗ウイルス活性がウイルスの濃度に強く依存しているという事実は、本発明の抗ウイルスペプチドがウイルスの成分と相互作用しているということを示唆している。
【００６２】
実施例７−ウイルス侵入の阻害
前吸着されたｈｒＲ３ウイルスを用いた追加研究は、本発明の抗ウイルスペプチドの抗ウイルス作用（複数を含む）がウイルスの吸着にも、ウイルスの凝集にも関係しないが、ウイルス侵入の阻害には関係することを示した。これらの研究において、ｈｒＲ３ウイルスは、血清を含まないＤＭＥＭに氷冷した２５μＭのＥＢまたはＥＢＸを添加する前に、４℃で１時間、予め細胞に吸着させた。４℃でさらに１時間後、培養物を３７℃にシフトさせて、ウイルスの侵入を開始させた。温度シフト後、１５分間隔で、低ｐＨのクエン酸バッファーを用いて培養物を洗浄することによって、細胞外に残存する一切のウイルスを不活性化した。次に、培養物をすすぎ、固定するまで、ペプチドを含まない血清を補充したＤＭＥＭに戻した。温度シフトの８時間後にβ−ガラクトシダーゼについて染色した。
【００６３】
図６Ａに示すように、擬似処理コントロール培養物（○）におけるウイルス侵入は、３７℃に変えた１５から３０分後に開始し、約６０分後に６．５ｍｍ２あたり約３４０ｌａｃＺ＋細胞（すなわち、１４５０  ｌａｃＺ＋細胞／ウエル）のレベルで完了した。ＥＢペプチドで処理した細胞株では、ｌａｃＺ＋細胞の数を９０％より多く減少させた（●）。ＥＢＸペプチドは、ｌａｃＺ＋細胞（▲）の数を有意には減少させなかった。ＥＢおよびＥＢＸをウイルス吸着前に添加した時、本質的に同じ結果が得られた（データは、示していない）。ペプチドを各クエン酸処理直後に添加した時、ＥＢは、もはやｌａｃＺ＋細胞の成長に対して一切効果を生じなかった（図６Ｂ、（●）；図６Ａ、（○）参照）。ＥＢＸも、クエン酸処理直後に添加した時、ｌａｃＺ＋細胞の成長を有意には阻害しなかった（図６Ｂ、（▲））。このように、ＥＢは、早期ＩＣＰ６プロモータからのｌａｃＺ遺伝子の発現に対しては効果を生じなかったが、選択的にウイルスの侵入を阻害した。
【００６４】
この結論は、前吸着ウイルスでの感染のＥＢ感受性期が、ｈｒＲ３感染細胞におけるｌａｃＺ遺伝子の発現より明確に先行する（図７Ａ）という発見によって強められる。さらに、ｈｒＲ３を４℃で１時間、細胞に前吸着させて、未付着ウイルスをすすぎ落とし、細胞をさらに１時間、４℃で保持した。次に、培養物を３７℃に切り替える前に、３０分間、２３℃に変えた。より漸進的な３７℃への変化によって、細胞相が後続の頻繁な培地交換を通して無傷でいることができる。ウイルス吸着直後、連続的な１時間間隔で、５０μＭのＥＢを用いて、１時間、細胞を処理した。感染後１時間から４時間の間、ウイルス侵入は、７０から８０％阻害された。その後、感染は、もはや有意には阻害されなかった（図７Ｂ、●））。擬似処理後、並行培養物を直ちに固定させ、Ｘ−ｇａｌを用いて染色した。これらの培養物において、青い（ｌａｃＺ＋）細胞は、最初、感染の７時間後に現れ、それらの数は、次の３時間、ほぼ直線的に増加した（図７Ａ、（○））。感染後７時間までに、ＥＢは、阻害性ではなくなった。従って、ＥＢは、早期短期感受性期間中しかウイルス侵入を阻害せず、一旦、ウイルスが細胞に侵入してしまうと、ｌａｃＺ遺伝子の発現およびβ−ガラクトシダーゼ活性の発生に対して効果を生じなかった。図７Ｂに示すように、ＥＢは、ＩＣ５０＝１５μＭ（●）で、用量に依存する形で前吸着ウイルスの侵入を阻害したのに対して、ＥＢＸは、殆ど有効ではなかった（ＩＣ５０ 〜１００μＭ；（○））。
【００６５】
実施例８  −  抗ウイルスペプチドの殺ウイルス効果
ウイルス粒子に対する本発明の抗ウイルスペプチドの結合は、非可逆的なウイルスの不活性化を導くことがわかった。殺ウイルスアッセイは、ｈｒＲ３を用いて行った。最初の実験（図８Ａ）では、ＥＢは、ＩＣ５０＝４４μＭ（●）で、濃度に依存する形でウイルス粒子の感染を阻害したのに対して、ＥＢＸは、阻害効果を有さなかった（○）。阻害を達成するためにわずかに高い濃度のＥＢを必要とする第二の実験では（図１０Ｂ、（●）；ＩＣ５０＝６９μＭ）、処理ウイルス粒子が非可逆的に不活性化されることもわかった。すなわち、ＥＢで処理し、その後、希釈したウイルス粒子の一定量は、一切の可逆的に結合したＥＢを捕捉してしまうことが可能な血清含有培地に一晩透析している間、再び活性化することができなかった（図１、（●）；Ａ対Ｂを参照）。その代わり、透析後に回収したウイルス粒子（あらゆるＥＢ濃度で３１％）は、非透析コントロールと全く同じように不活性のままであった（図８、（△）対（●））。
【００６６】
ウイルスの不活性化に対するウイルス凝集の可能な寄与率を評価するために、ＥＢで処理し、その後、希釈したウイルス粒子のさらなる一定量を、残存する感染力について検定する前に、０．２２μｍの膜を通して濾過した。ＥＢが不在または低濃度（≦３μＭ）の状態では、８０から８５％のウイルス粒子が膜上に捕捉された。しかし、膜への付着を向上させ、および／またはウイルスを凝集させるより高濃度のＥＢに一度だけでもさらされると、残存ウイルス粒子は保持された（図８Ｂ、（▲））。ウイルス粒子の付着特性におけるこうした変化は、ウイルスの不活性化に求められるＥＢ濃度よりかなり下で誘発された（図８Ｂ、（▲）対（●）、（△））。
【００６７】
グリッドに前吸着させ（凝集を回避するため）、５ｍＭのペプチドにさらしたＰＴＡ染色ウイルス粒子の電子顕微鏡検査法によって、最も厳密なＥＢ処理の効果を検査した。ＥＢ処理ウイルス粒子は、ＥＢ処理粒子中のウイルスエンＶｅｒｏプの輪郭がさほど多形性でなかったことを除き、本質的には擬似処理ウイルス粒子と同じように見え、このことは、ＥＢが、ウイルス粒子を安定させたことを示唆する。５ｍＭで、ＥＢＸは、ＥＢと同じ効果を有した。
【００６８】
実施例９−抗ウイルスペプチドのインビボ活性
本発明の抗ウイルスペプチドは、局所的に塗付した時、インビボ活性を示す。ＨＳＶ−１株ＫＯＳを、室温で、ＰＢＳ中、２５μＭの濃度のＥＢペプチドまたはＥＢＸペプチド、いずれかとともに、１時間インキュベートした。次に、本発明者が以前に記載したように（Ｂｒａｎｄｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．３６，２０９（１９９２））、各々１０匹のマウスのグループの角膜を犠牲にして、５．０ｘ１０５のプラーク形成ユニットを用いて感染させた。
【００６９】
簡単には、マウスをハロセンで麻酔し、横に３回、縦に３回、角膜にひっかき傷をつけ、ウイルスを含有する液滴５μＬを角膜の上に乗せた。その後、マウスをおりに戻し、回復させた。ＫＯＳで感染させたが、ペプチドにはさらしていないコントロールグループも含めた。マウスは、感染後にはペプチドで処理しなかった。
【００７０】
感染後、多様な時間に、本発明者が以前に記載したように（同じ参考文献）、角膜疾患の重度を測定した。簡単に言えば、血管新生は、次のように点数付けした：  ０は、血管新生なし；１＋は、血管新生を伴う角膜が２５％未満；２＋は、血管新生を伴う角膜が２５から５０％；および３＋は、血管新生を伴う角膜が５０％より多い。角膜炎は、次のように点数付けした：０は、角膜混濁なし；１＋は、混濁、一部の虹彩細部が可視；２＋は、混濁、虹彩細部が不明瞭；３＋は、角膜が全体的に不透明；４＋は、角膜が穿孔され、混濁している。データは、３つのグループ各々についての各日の平均疾患スコアとして報告する。結果を図９に示す。
【００７１】
以下の参考文献をさらに参照して取り入れる：
【００７２】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  本発明の抗ウイルスペプチドのウイルスプラーク形成への、血清の存在下での用量依存的阻害を示す代表図である。
【図１Ｂ】  本発明の抗ウイルスペプチドによるウイルスプラーク形成への、血清の不存在下での用量依存的阻害を示す代表図である。
【図１Ｃ】  本発明の抗ウイルスペプチドによるウイルスの細胞障害効果に対する影響を調べた実験結果を示す図である。
【図１Ｄ】  本発明の抗ウイルスペプチドによるウイルスプラーク形成への用量依存的阻害を示す代表図である。
【図１Ｅ】  本発明の抗ウイルスペプチドによるウイルス阻害を示す代表図である。
【図２】  本発明のビオチン化抗ウイルスペプチド（配列番号２）によるウイルス阻害を示す代表図である。
【図３】  アシクロビルとの比較として、本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）によるＨＳＶ−１形成の用量依存性阻害を示す代表図である。
【図４Ａ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）が初期のウイルス感染およびウイルスの伝播を阻害することを説明する図である。
【図４Ｂ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）が初期のウイルス感染およびウイルスの伝播を阻害することを説明する図である。
【図５】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）の抗ウイルス活性がウイルス投入量に依存することを説明する図である。
【図６Ａ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）による細胞へのウイルス侵入の阻害を説明する図である。
【図６Ｂ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）による細胞へのウイルス侵入の阻害を説明する図である。
【図７Ａ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）の侵入期および用量応答を説明する図である。
【図７Ｂ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）の侵入期および用量応答を説明する図である。
【図８Ａ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）の殺ウイルス活性を説明する図である。
【図８Ｂ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）の殺ウイルス活性を説明する図である。
【図９Ａ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）のインビボでの活性を説明する図である。
【図９Ｂ】  本発明の抗ウイルスペプチド（配列番号１）のインビボでの活性を説明する図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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