(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分を含有する皮膚外用剤組成物において、皮膚吸収増進剤として、シゾフィランにより安定化した蛋白質分解酵素を含有し、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸の誘導体、及びコジックカフェイン酸よりなる群から選ばれたいずれかの活性成分の皮膚吸収を増進させた皮膚外用剤組成物。
【請求項２】
蛋白質分解酵素は、パパイン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ及びペプシンよりなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
安定化した蛋白質分解酵素は、
（１）シゾフィランと過ヨウ素酸塩類とを反応させて、シゾフィラン中のβ−１，６−残基をアルデヒドに作る段階；
（２）前記（１）段階の反応液の残留過ヨウ素酸塩類を除去する段階；
（３）前記（２）段階の溶液に、蛋白質分解酵素を０．００００１〜１０．０重量％の量で添加する段階；
（４）前記（３）段階の溶液に０．０００１〜１．０重量％の還元剤を添加する段階；及び
（５）前記（４）段階の溶液を洗浄する段階；により安定化したものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、皮膚外用剤組成物に含有されている活性成分の皮膚吸収を増進させることができる組成物に関し、より詳細には、β−１，３−グルカン主糖鎖にβ−１，６−残基を有するグルカンで安定化した蛋白質分解酵素を皮膚吸収増進剤として使用することにより、活性成分の皮膚吸収度を改善させた外用剤組成物に関する。
【０００２】
（背景技術）
皮膚は、大きく角質層、表皮層、真皮層の３部分で構成されているが、化粧品のような皮膚外用剤組成物に含有されている活性成分の皮膚吸収において、第１の障壁は、皮膚の最外郭に存在する角質層であることが既に公知されている。
【０００３】
特に、角質層は、ケラチン蛋白質を主成分とする角質細胞と、角質細胞間を構成する脂質層とからなるので、脂溶性活性成分は、円滑に皮膚に吸収されるが、水溶性及び分子量の大きい活性成分は、皮膚を透過することが難しい。したがって、大部分が水溶性である化粧品などの皮膚外用剤に含有されている活性成分は、皮膚への吸収が容易でない。
【０００４】
したがって、従来、このような問題を解決するために、皮膚吸収促進剤として、非極性溶媒、界面活性剤、脂肪酸などを使用する方法が公知されているが［Chen LH, Chien YW,"Enhancement of skin penetration" In "Novel cosmetic delivery systems" 1999, 60; Rhein LD, Robbins CR, Fernee K, Cantore R."Surfactant structure effects on swelling of isolated human stratum corneum", J. Soc Cosmet Chem 1986; 37: 125; Cooper ER, Merritt EW, Smith RL. "Effect of fatty acids and alcohols on the penetration of acyclovir across human skin in vitro" J. Pharm Sci 1985; 74:688］、このような経皮吸収促進剤は、有効成分の皮膚透過をある程度促進するが、分子量が小さくて有効性分と共に皮膚に吸収されて、激しい刺激を引き起こすという問題点があった。その他、水溶性物質の皮膚吸収のために、超音波（sonophoresis）あるいは微細な電気刺激（iontophoresis）を皮膚に附与する方法が公知されているが［Sloan JB, Slotani K. "Iontophoresis in dermatology: a review" J. Am. Acad. Dermatol. 1986,4:671; Langer R." Ultrasound-mediated transdermal protein delivery" Science 1995;269:850］、このような方法は、高価の装備が必要であるという理由などにより、現実的に化粧料のような皮膚外用製剤に適用することは難しい。
【０００５】
一方、上述した方法以外に、酵素を用いて皮膚障壁機能を変化させたり、弱化させることによって、活性成分の皮膚吸収を増進させる方法についての特許が公知されている。例えば、米国特許第５，５３４，２６０号及び第５，２９６，２２２号には、蛋白質分解酵素を添加して、薬物の皮膚吸収を増進させる方法が提示されている。しかし、この方法は、単純に蛋白質分解酵素を添加する方法に過ぎないもので、剤型に含まれた成分物質の影響により、時間が経過するほど、蛋白質分解酵素が変成したり、活性を消失するようになる。その結果、酵素による経皮吸収増進効果を示さないので、活性成分以外にいろいろの成分が含有されている皮膚外用剤に適用するには適合しない。
【０００６】
これより、本発明者らは、化粧品などのような皮膚外用剤に含有された活性成分の皮膚吸収を増進できる方法について研究を重ねた結果、β−１，３−グルカン主糖鎖に規則的なβ−１，６−残基を有するグルカンにより安定化した蛋白質分解酵素を、皮膚外用剤組成物において皮膚吸収増進剤として使用する場合、活性成分の皮膚吸収度合いが増進されるという事実を知見し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第５，５３４，２６０号
【特許文献２】
米国特許第５，２９６，２２２号
【非特許文献１】
Chen LH, Chien YW,"Enhancement of skin penetration" In "Novel cosmetic delivery systems" 1999, 60
【非特許文献２】
Rhein LD, Robbins CR, Fernee K, Cantore R."Surfactant structure effects on swelling of isolated human stratum corneum", J. Soc Cosmet Chem 1986; 37: 125
【非特許文献３】
Cooper ER, Merritt EW, Smith RL. "Effect of fatty acids and alcohols on the penetration of acyclovir across human skin in vitro" J. Pharm Sci 1985; 74:688
【非特許文献４】
Sloan JB, Slotani K. "Iontophoresis in dermatology: a review" J. Am. Acad. Dermatol. 1986,4:671
【非特許文献５】
Langer R." Ultrasound-mediated transdermal protein delivery" Science 1995;269:850
【０００８】
（発明の開示）
したがって、本発明の目的は、組成物内に含有された活性成分の皮膚吸収を増進させることができる皮膚外用剤組成物を提供することにある。
【０００９】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、蛋白質分解酵素を、シゾフィランを用いて安定化させた後、これを、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸の誘導体、及びコジックカフェイン酸よりなる群から選ばれたいずれかの活性成分を含有する皮膚外用剤組成物において皮膚吸収増進剤として使用して、活性成分の皮膚吸収を増進させたもので、皮膚刺激を誘発せずに、角質層の構造を変形したり、角質層を除去することにより、活性成分の皮膚吸収を増進させることができる。
【００１０】
本発明の組成物において皮膚吸収増進剤として用いられた安定化蛋白質分解酵素は、本出願人が出願した「安定化した酵素または蛋白質を製造する方法及びこれにより提供される安定化酵素または蛋白質を含有する外用剤組成物」（大韓民国特許公開第２０００−６０７７１（２０００年１０月１６日））に記載された方法による。すなわち、（１）グルカンを過ヨウ素酸塩類と反応させ、グルカン中のβ−１，６−残基をアルデヒドに作る段階；（２）前記（１）段階の反応液の残留過ヨウ素酸塩類を除去する段階；（３）前記（２）段階の溶液に蛋白質分解酵素を０．００００１〜１０．０重量％の量で添加する段階；（４）前記（３）段階の溶液に、０．０００１〜１．０重量％の還元剤を添加する段階；及び（５）前記（４）段階の溶液を洗浄する段階により蛋白質分解酵素を安定化させる。
【００１１】
上述した方法に用いられるグルカンは、β−１，３−グルカン主糖鎖にβ−１，６−残基を有するグルカンであって、化学反応方法によってβ−１，６−残基にのみ反応基を作ることができるグルカンである。このグルカンの種類は、特に限定されるものではないが、例えば、スエヒロタケ（Schizopyllum commune）により生産されたシゾフィラン（schizophyllan）、スクレロチニア属（Sclerotinia sp.）菌株により生産されたスクレログルカン（scleroglucan）、椎茸（Lentinus edodes）により生産されたレンチナン（lentinan）等である。
【００１２】
一方、上述した方法により安定化される蛋白質分解酵素は、その種類が特に限定されるものではないが、例えば、パパイン、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、ペプシン等を使用することができる。
【００１３】
安定化した蛋白質分解酵素は、皮膚外用剤組成物に、組成物の総重量に対して０．０００１〜９９．９９９９重量％の量で含有され、活性成分の皮膚吸収を増進させる。本発明における外用剤組成物は、その剤型において特に限定されるものではなく、例えば、柔軟化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、栄養クリーム、メーキャップベース、リップスティック、パック、ジェル、シャンプー、リンス、ヘアトニック、石鹸などの剤型を有する化粧料であり、また、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、噴霧剤などの経皮投与型剤型を有する外用剤である。
【００１４】
一方、本発明の皮膚吸収増進剤により皮膚吸収度が増加されることができる活性成分は、皮膚外用剤組成物において通常的に使われる活性成分であって、その種類が特に限定されるものではないが、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコービックリン酸塩、Ｌ−アスコービックグルコシド等のようなＬ−アスコルビン酸の水溶性誘導体、ビタミンＢ群、コウジ酸、コジックカフェイン酸、コジックアミノプロピルリン酸塩、ヒドロキノン、アルブチン、水またはエタノールのような極性溶媒を使用して、緑茶及び葡萄種子などのような天産物から抽出した水溶性天然抽出物などがある。
【００１５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明がこれらの例に限定されるものではない。
【００１６】
＜参照例１＞安定化したパパインの製造
１）分子量が２００万の０．５重量％のシゾフィラン水溶液５０ｍｌに過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）２ｇを添加し、４℃の暗所で１時間攪拌した。
２）反応されたシゾフィラン溶液を、分子量限界１０，０００の透析膜に入れ、４℃の暗所で４８時間透析した。透析は、２，５００ｍｌの水中に１２時間毎に水を交換しながら実施した。
３）シゾフィラン溶液の体積が約１００ｍｌ程度と増加した時、０．１重量％のパパインを入れ、この溶液を２時間４℃の暗所で攪拌した。
４）シゾフィラン−パパイン溶液にホウ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ4）０．０５ｇを入れ、４時間攪拌した後、リシン０．１ｇを入れ、４℃の暗所で２時間攪拌した。
５）シゾフィラン−パパイン溶液を、前記２）と同様の方法で透析し、シゾフィラン−パパイン結合体溶液であるＧＥ−１を得た。
前記方法により製造されたＧＥ−１の収率は、酵素活性度を基準に９５％である。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
＜製造方法＞
１）精製水に１〜７の成分を添加した後、攪拌して完全に溶解させた。
２）エタノールに１０〜１２の成分を添加した後、攪拌して完全に溶解させた。
３）前記１）の溶液を攪拌しながら、前記２）の溶液をゆっくり添加した。
４）前記３）に８の成分を添加し、ジェルを形成した。
５）真空脱気させて気泡を除去し、水相ジェル型化粧料を得た。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
＜製造方法＞
１）Ａ（成分１〜７）とＢ（成分８〜１０）を各々７５℃まで加熱した。
２）ＢにＡを少しずつ添加しながら、７，０００ｒｐｍ速度で乳化攪拌し、Ａを全量添加した後、直ちに成分１４と１６を添加した後、２分間乳化攪拌した。
３）成分１１と１５を添加した後、２分間乳化攪拌した。
４）前記３）を１分間２，５００ｒｐｍで攪拌して、空気を脱気した。
５）前記４）を氷水に浸漬し、２８〜３０℃まで冷却した。
６）冷却された組成物に成分１２または１３を添加した後、２，０００ｒｐｍで攪拌して混合した。
７）組成物を常温で２４時間放置し、安定化して、油中水型乳化化粧料を得た。
【００２１】
［試験例１］コウジ酸の皮膚吸収測定
コウジ酸の皮膚吸収は、ギニーピッグ皮膚を対象としてフランツ（Frantz）透過セルを用いて測定した。実験前、ギニーピッグの腹部部分の皮膚を採取し、平方１cm2の面積に切断した後、これを透過鏡の直径が０．９cmの透過セルに静置した後、クランプで固定した。皮膚の一方の面には、測定しようとする実施例１及び比較例１の化粧料を０．５ｍｌ塗布し、他方の面には、精製水とグリセリンが１：１重量比で混合された溶媒と接触するようにした。実験時の温度は、実際皮膚温度である３２℃を維持した。実験開始後、一定時間毎に溶媒の一部を採取した後、ＨＰＬＣを用いて皮膚に吸収されたコウジ酸の量を測定し、その結果を表３に示した。
【００２２】
【表３】
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【００２３】
一般に、化粧の持続時間が４時間から８時間であることを勘案する時、表３から、コウジ酸の皮膚吸収は、安定化した蛋白質分解酵素が組成物に添加される場合が、添加されない場合より最小４倍以上増加することが分かる。
【００２４】
［試験例２］アスコルビン酸の皮膚吸収測定
実施例２及び比較例３の油中水型乳化化粧料を使用することを除いて、試験例１と同様の方法で皮膚に吸収されたアスコルビン酸の量を測定し、その結果を表４に示した。
【００２５】
【表４】
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【００２６】
表４から、アスコルビン酸の皮膚吸収は、安定化した蛋白質分解酵素が組成物に添加される場合が、添加されない場合より最小６倍以上増加することが分かる。
【００２７】
【表５】
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【００２８】
＜製造方法＞
１）Ａ（成分１〜９及び成分１７）とＢ（成分１０〜１２）を各々７５℃まで加熱した。
２）ＡにＢを添加し、７，５００ｒｐｍの速度で５分間乳化攪拌した。
３）前記２）に成分１３を添加し、５分間７，５００ｒｐｍの速度で乳化攪拌した。
４）前記３）を、冷却水を用いて２５℃まで冷却させた。
５）前記４）に成分１４〜１６を添加し、２５００ｒｐｍで攪拌、混合した。
６）２４時間の間、常温に放置し、安定化させて、軟膏を得た。
【００２９】
［試験例３］  ヒドロキノンの皮膚吸収測定
実施例３及び比較例５の軟膏を使用することを除いて、試験例１と同様の方法で、皮膚に吸収されたヒドロキノンの量を測定し、その結果を表６に示した。
【００３０】
【表６】
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【００３１】
表６から、安定化した蛋白質分解酵素を含有する場合のヒドロキノンの吸収量が、含有しない場合より６倍以上増加することが分かる。
【００３２】
［試験例４］製造後３０日が経過した水相ジェル型化粧料のコウジ酸皮膚吸収測定
製造後３０日が経過した実施例１と比較例２の水相ジェル型化粧料を使用して、試験例１と同様の方法で、皮膚に吸収されたコウジ酸の量を測定し、その結果を表７に示した。
【００３３】
【表７】
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【００３４】
表７から、パパインを含有する化粧料であっても、安定化されないパパインを含有する比較例２の場合、製造してから３０日が経過した後には、パパインが化粧料内の他の成分の影響により酵素の活性がほとんどなくなり、パパインによる経皮吸収増進効果をほとんど示さないことが分かる。
【００３５】
［試験例５］製造後３０日が経過した油中水型乳化化粧料のアスコルビン酸皮膚吸収測定
製造後３０日が経過した実施例２と比較例４の油中水型乳化化粧料を使用して、試験例２と同様の方法で、皮膚に吸収されたアスコルビン酸の量を測定し、その結果を表８に示した。
【００３６】
【表８】
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【００３７】
表８から、パパインを含有する化粧料であっても、安定化していないパパインを含有する比較例４の場合、製造してから３０日が経過した後には、パパインが化粧料内の他の成分の影響により酵素の活性がほとんどなくなり、パパインによる経皮吸収増進効果をほとんど示さないことが分かる。
【００３８】
［試験例６］製造後３０日が経過した軟膏のヒドロキノン皮膚吸収測定
製造後３０日が経過した実施例３と比較例６の軟膏を使用して、試験例３と同様の方法で、皮膚に吸収されたヒドロキノンの量を測定し、その結果を表９に示した。
【００３９】
【表９】
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【００４０】
表９から、パパインを含有する軟膏であっても、安定化していないパパインを含有する比較例６の場合、製造してから３０日が経過した後には、パパインが軟膏化内の他の成分の影響により酵素の活性がほとんどなくなり、パパインによる経皮吸収増進効果をほとんど示さないことが分かる。
【００４１】
［試験例７］皮膚損傷観察
前記試験例１と同様の方法で、実施例１〜３の外用剤を塗布した後、塗布後２４時間が経過したギニーピッグの皮膚を、フランツ透過セルから取り出して目視により観察した。
その結果、実施例１〜３の外用剤を塗布した場合、いずれも皮膚損傷は観察されなかった。したがって、安定化した蛋白質分解酵素は、皮膚に損傷を与えないながら、活性成分を效果的に透過させることができることが分かる。
【００４２】
［試験例８］皮膚安定性
蛋白質分解酵素の皮膚安定性を調べるために、生きている無毛マウスを対象とし、背中の一部に実施例１〜３の外用剤を一日に一度ずつ３０日間３００ｍｌずつ同一部位に塗布しながら、毎日目視により皮膚の膨らみ、紅斑などの皮膚刺激を観察した。その結果、いかなる症状も観察されなかった。
【００４３】
（産業上の利用可能性）
本発明の皮膚吸収増進剤は、皮膚刺激、皮膚損傷などの問題がなく、角質層との親和度が低いか、分子量が大きくて、皮膚吸収が難しい皮膚活性成分の皮膚吸収増進に適用可能である。