(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径０．０２〜１０μｍの粒状材料を光反応性架橋剤を含む架橋体構成材料により結合してなる三次元構造体の製造方法であって、液状媒質に前記粒状材料を懸濁し、該懸濁液を支持面に液滴状にして付着させる液滴形成工程と、前記液滴形成工程によって前記支持面に付着させた前記懸濁液の液体成分を、前記光反応性架橋剤の光反応性架橋が起こらない条件で蒸発させ、前記粒状材料の各粒子を自己集合させて三次元に配列化させる粒子配列工程と、前記光反応性架橋剤を含む架橋体構成材料をＵＶ光の照射により架橋させて架橋体を形成し、該架橋体を介して、前記粒子配列工程によって三次元に配列化させた前記粒状材料の各粒子を結合する架橋工程と、を含むことを特徴とする三次元構造体の製造方法。
【請求項２】
前記液滴形成工程において、架橋体構成材料の少なくとも一成分を含有する液状媒質に前記粒状材料を懸濁し、該懸濁液を支持面に液滴状にして付着させる請求項１記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項３】
前記粒子配列工程を経て配列化した粒状材料の各粒子に、架橋体構成材料の少なくとも一成分を添加する請求項１又は２記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項４】
前記架橋体構成材料が、平均分子量１，０００〜１，０００，０００の高分子物質と、前記光反応性架橋剤として、前記高分子物質及び前記粒状材料に結合し得る架橋剤と、を含むものであり、該架橋剤は、（１）前記粒状材料の各粒子が三次元に配列化する前に添加するか、（２）前記粒状材料の各粒子が三次元に配列化する途中に添加するか、（３）前記粒状材料の各粒子が三次元に配列化した後に添加するか、又は（４）予め前記高分子物質に側鎖として導入されている請求項１〜３のいずれか１つに記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項５】
前記高分子物質が、蛋白質、ポリアミノ酸、核酸、及び樹脂からなる群より選ばれた少なくとも一種である請求項４記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項６】
前記高分子物質が、ウシ血清アルブミンである請求項５記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項７】
前記液滴形成工程において、インクジェット方式により、前記懸濁液を支持面に液滴状にして付着させる請求項１〜６のいずれか１つに記載の三次元構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細な粒状材料を、架橋体を介して結合してなり、例えば生化学的反応・分析のための核酸、酵素、抗体、抗原、プローブ等を担持する担体等として利用できる三次元構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ等の各種の粒状材料は、生化学的反応・分析のための核酸、酵素、抗体、抗原、プローブ等を担持する担体等として広く利用されている。試料の反応・分析系を微小領域に集約した微小分析システム（micro-total analysis systems μ-TAS）等においては、その担持担体は、微小分析システム基板上の所望の微細空間位置に配される。
【０００３】
例えば、下記特許文献１には、各々単一のビーズを収容する２次元的に規則的に配列された複数のビーズ固定部位と、前記ビーズ固定部位同士を結合する微細溝とを有する微細構造パターンが表面に形成された硬質基板と、弾性基板と、前記硬質基板の前記微細構造パターンが形成された表面に前記弾性基板を接触させ加圧するための手段とを備えることを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイスの発明が開示されている。
【特許文献１】特開２００７−１７１５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記特許文献１に記載のマイクロ流路ビーズアレイデバイスでは、基板上に微細加工を施してビーズの固定部位となる穴部を設け、この穴部にビーズを配設するので、微細穴部を加工したり、固定位置に配位しないビーズを取り除いた後、ビーズが充填された穴部に蓋をする加工をしたりしなければならず、担持担体としてのビーズの利用が、加工に煩雑な工程を要するプラットフォームに制限されてしまうという問題があった。また、１０マイクロメートル以下の直径のビーズを利用するのには困難を伴うという問題があった。更に、単位スポットとなる１の穴部あたりに単一のビーズが配設されるので、ビーズ直径サイズで規定される以上に担持担体としての有効表面積を稼ぐことができなかった。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、粒状材料が三次元に配列してなる三次元構造体であって、機械的に安定で、担持担体として様々なプラットフォームに応用可能であって、且つ、占有空間あたりの表面積の大きな三次元構造体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ポリスチレンビーズ等の粒状材料を、高分子物質を含有する液状媒質に懸濁し、その分散媒を徐々に除くと該粒状材料の各粒子が自己集合して三次元に配列し、その三次元に配列した粒状材料同士を架橋することによって、機械的に安定な三次元構造体を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の三次元構造体の製造方法は、平均粒子径０．０２〜１０μｍの粒状材料を光反応性架橋剤を含む架橋体構成材料により結合してなる三次元構造体の製造方法であって、液状媒質に前記粒状材料を懸濁し、該懸濁液を支持面に液滴状にして付着させる液滴形成工程と、前記液滴形成工程によって前記支持面に付着させた前記懸濁液の液体成分を、前記光反応性架橋剤の光反応性架橋が起こらない条件で蒸発させ、前記粒状材料の各粒子を自己集合させて三次元に配列化させる粒子配列工程と、前記光反応性架橋剤を含む架橋体構成材料をＵＶ光の照射により架橋させて架橋体を形成し、該架橋体を介して、前記粒子配列工程によって三次元に配列化させた前記粒状材料の各粒子を結合する架橋工程と、を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の三次元構造体の製造方法によれば、粒状材料を分散させた懸濁液を支持面に液滴状にして付着させた後に、懸濁液の液体成分を蒸発させることにより、粒状材料の各粒子が自己集合し三次元に配列化するので、粒状材料の各粒子が三次元に密に配位しつつ各粒子間に空隙を有している三次元構造となる。そして、その状態で架橋体構成材料を架橋させることにより、架橋体を介して、粒状材料の各粒子を結合することができる。それによって、機械的にも安定な三次元構造体を製造することができる。
また、ＵＶ光を照射して粒状材料の各粒子を結合するので、粒状材料の各粒子が自己集合し三次元に配列化するタイミングにあわせてそのＵＶ光を照射でき、各粒子が配列化する前や、配列が崩れてしまった後に結合してしまうことを防ぐことができる。
【００１５】
本発明の三次元構造体の製造方法においては、前記液滴形成工程において、架橋体構成材料の少なくとも一成分を含有する液状媒質に前記粒状材料を懸濁し、該懸濁液を支持面に液滴状にして付着させることができる。これによれば、その架橋体構成材料の少なくとも一成分を構成成分とする架橋体を介して粒状材料の各粒子を結合することができる。
【００１６】
本発明の三次元構造体の製造方法においては、前記粒子配列工程を経て配列化した粒状材料の各粒子に、架橋体構成材料の少なくとも一成分を添加することができる。これによれば、その架橋体構成材料の少なくとも一成分を構成成分とする架橋体を介して粒状材料の各粒子を結合することができる。
【００１７】
本発明の三次元構造体の製造方法においては、前記架橋体構成材料が、平均分子量１，０００〜１，０００，０００の高分子物質と、前記光反応性架橋剤として、前記高分子物質及び前記粒状材料に結合し得る架橋剤と、を含むものであり、該架橋剤は、（１）前記粒状材料の各粒子が三次元に配列化する前に添加するか、（２）前記粒状材料の各粒子が三次元に配列化する途中に添加するか、（３）前記粒状材料の各粒子が三次元に配列化した後に添加するか、又は（４）予め前記高分子物質に側鎖として導入されていることが好ましい。これによれば、添加されるか、又は予め前記高分子物質に側鎖として導入された架橋剤により、その高分子物質を構成成分とする架橋体が形成され、その架橋体を介して、粒状材料を結合させることができる。
また、前記架橋体が、平均分子量１，０００〜１，０００，０００の高分子物質を含む堅固な構造体となるので、粒状材料の各粒子間に充分な空隙を保ちつつ、機械的にもより安定である。
【００１８】
本発明の三次元構造体の製造方法においては、前記架橋工程において光を照射して前記粒状材料の各粒子を結合することが好ましい。これによれば、粒状材料の各粒子が自己集合し三次元に配列化するタイミングにあわせて光照射できるので、各粒子が配列化する前や、配列が崩れてしまった後に結合してしまうことを防ぐことができる。
【００１９】
本発明の三次元構造体の製造方法においては、前記高分子物質が、蛋白質、ポリアミノ酸、核酸、及び樹脂からなる群より選ばれた少なくとも一種であることが好ましく、ウシ血清アルブミンであることがより好ましい。
【００２１】
本発明の三次元構造体の製造方法においては、前記液滴形成工程において、インクジェット方式により、前記懸濁液を支持面に液滴状にして付着させることが好ましい。これによれば、支持面に数十マイクロメートルの位置精度で液滴状にして付着させることができるので、前記三次元構造体を所望の場所に、所望の大きさで作製することが容易である。特に、微小分析システム（micro-total analysis systems μ-TAS）に応用する場合に、基板上の所望の微細空間位置に前記三次元構造体を配置することが容易にできる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって得られる三次元構造体によれば、平均粒子径０．０２〜１０μｍの粒状材料が、架橋体を介して結合しているので、粒状材料の各粒子が三次元に密に配位しつつ各粒子間に空隙を有している。したがって、粒状材料の各粒子の表面を被担持物質が結合する担持表面とすることができるので、該三次元構造体の占める空間あたりの担持担体としての有効面積がきわめて大きな三次元構造体とすることができる。また、機械的にも安定である。
【００２３】
また、本発明によって得られる三次元構造体に、生体由来物質又は該生体由来物質に結合するプローブ分子を担持して生体関連分子担持体とすれば、前記三次元構造体における粒状材料の各粒子の表面に生化学的反応・分析のための生体由来物質や、これに結合するプローブ分子が担持されているので、各粒子間の空隙においてその生体由来物質の活性を発揮させることができる。そして、高度に集積した場で酵素反応や結合反応等を行わせることができるので、高感度な反応・分析系及び／又は検出系を構築することができる。
【００２４】
また、本発明の製造方法によれば、粒状材料を分散させた懸濁液を支持面に液滴状にして付着させた後に、懸濁液の液体成分を蒸発させることにより、粒状材料の各粒子が自己集合し三次元に配列化するので、粒状材料の各粒子が三次元に密に配位しつつ各粒子間に空隙を有している三次元構造となる。そして、その状態で架橋体構成材料を架橋させて形成される架橋体を介して粒状材料の各粒子同士を結合させることができるので、機械的にも安定な三次元構造体を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の三次元構造体は以下のようにして得ることができる。
【００２６】
すなわち、平均粒子径０．０２〜１０μｍの粒状材料を液状媒質に懸濁する。その懸濁液を支持面に液滴状にして付着させた後（液滴形成工程）、前記液滴形成工程によって前記支持面に付着させた懸濁液の液体成分を、光反応性架橋剤の光反応性架橋が起こらない条件で蒸発させ、前記粒状材料の各粒子を自己集合させて三次元に配列化させる（粒子配列工程）。そして、光反応性架橋剤を含む架橋体構成材料をＵＶ光の照射により架橋させて架橋体を形成し、該架橋体を介して、前記粒子配列工程によって三次元に配列化させた粒状材料の各粒子を結合する（架橋工程）。
【００２７】
架橋体構成材料は、液滴形成工程において粒状材料を懸濁する液状媒質に配合しておいてもよく、粒子配列工程を経て配列化した粒状材料の各粒子に添加することもできる。なお、粒子配列工程を経て配列化した粒状材料の各粒子に添加する場合には、三次元の配列を崩さないように添加することが重要であるので、例えばキャピラリー現象を利用して、粒状材料の各粒子間に浸透させるようにして添加することが好ましい。
【００２８】
架橋体構成材料としては、平均分子量１，０００〜１，０００，０００の高分子物質と、前記光反応性架橋剤として、この高分子物質及び前記粒状材料を結合し得る架橋剤とを含むものが好ましく用いられる。この場合、液滴形成工程において、液状媒質中に高分子物質と架橋剤とを一緒に含有させてもよく、あるいは、液滴形成工程後に架橋体構成材料を添加してもよい。更に、架橋剤を予め前記高分子物質に側鎖として導入させておくこともできる。したがって、架橋剤の添加は、（１）前記粒状材料の各粒子が三次元に配列化する前に添加するか、（２）前記粒状材料の各粒子が三次元に配列化する途中に添加するか、（３）前記粒状材料の各粒子が三次元に配列化した後に添加するか、又は（４）予め前記高分子物質に側鎖として導入されるかのいずれであってもよい。
【００２９】
架橋体構成材料に用いる高分子物質としては、例えば、蛋白質、ポリアミノ酸、核酸、樹脂などが挙げられる。特にウシ血清アルブミンを好ましく例示できる。また、２種以上の高分子物質を併用して用いてもよい。高分子物質の平均分子量は、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、１０，０００〜１５０，０００がより好ましく、６６，０００〜１７０，０００が更に好ましい。
【００３０】
上記粒状材料としては、特に制限はなく、例えばポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、ポリ塩化ビニルビーズ、ゼラチンビーズ、ナイロンビーズ、ポリウレタンビーズなどを用いることができる。その粒子径は、上記粒状材料の各粒子が自己集合して三次元の配列化を生じさせることができる範囲であることが必要であり、平均粒子径０．０２〜１０μｍであることが好ましく、平均粒子径１〜７．０μｍであることがより好ましく、平均粒子径２．５〜５．０μｍであることが更により好ましい。
【００３１】
上記粒状材料を懸濁させた懸濁液を支持面に液滴状にして付着させるためには、ガラス、シリコン、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等を材料とする基板表面を支持面として用いることができる。特に、ＰＤＭＳ基板を用いれば、ＰＤＭＳを半硬化状にしたものを上記支持面として用いた後に、完全硬化してビーズ等をＰＤＭＳ基板に接着固定化できるので、好ましい。
【００３２】
上記粒状材料を懸濁させる液状媒質としては、上記粒状材料の各粒子を分散させることができる媒質であって、且つ、上記支持面を損傷しない媒質であれば特に制限はなく、水などを用いることができる。
【００３３】
上記光反応性架橋剤としては、特に光反応性官能基であるアジド基（−Ｎ３基）を有する架橋剤が挙げられる。これによれば、ポリスチレンビーズなどの骨格炭素部分に直接に共有結合を形成させることができるので好ましい。  
【００３４】
また、架橋体構成材料として、平均分子量１，０００〜１，０００，０００の高分子物質に、光反応性官能基を有する架橋剤を予め側鎖として導入したものを用いることもできる。これによれば、側鎖に光反応性官能基が結合しているので、別途架橋剤を添加しなくても、光照射するだけで架橋させることができる。
【００３５】
架橋は、上記粒状材料と上記高分子物質との共存下、架橋剤が架橋作用を発揮させる条件にすることにより行う。例えば、アジド基を有する架橋剤であれば、光（ＵＶ）を照射してアジド基を活性化してアルキル骨格の炭素元素等と共有結合させることができる。アジド基を有する架橋剤としては、光反応性官能基を有する「光架橋剤」、ATFB-SE(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid, succinimidyl ester)、ATFB-STP ester (4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid, STP ester, sodium salt)、4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzyl amine, hydrochloride、PEAS-AET (N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamide)、benzophenone-4-maleimide、benzophenone-4-isothiocyanate、4-benzoylbenzoic acid, succinimidyl ester等を好ましく例示することができる。
【００３７】
本発明においては、上記懸濁液の液体成分を蒸発させて除き、上記粒状材料の各粒子を自己集合させて三次元に配列化させ、架橋剤又は高分子物質に側鎖として予め導入された架橋剤の官能基による架橋反応を行わせる。したがって、上記粒状材料の各粒子が配列化する前や、配列が崩れてしまった後に結合してしまうことがないように、上記懸濁液の液体成分を蒸発させて除くタイミングと、架橋作用を発揮させるタイミングとを図ることが重要であり、架橋は、上記粒状材料と上記高分子物質との共存下、上記粒状材料の各粒子が三次元に配列化した状態で架橋剤又は高分子物質に予め導入された官能基が架橋作用を発揮させる条件にすることにより行う。
【００３８】
好ましい態様を挙げると、例えば、アジド基を有する架橋剤をあらかじめ上記高分子物質に共有結合させておき、その高分子物質を含有する液状媒質に粒状材料を懸濁し、その懸濁液を支持面に液滴状にして付着させ、その懸濁液の液体成分を蒸発させて除き、ＵＶを照射してアジド基を活性化して反応させることができる。更に、上記懸濁液の液体成分の蒸発の際には、湿度や温度を調節して、上記粒状材料の各粒子の自己配列化のタイミングを調節することができる。
【００３９】
以下には、本発明において、粒状材料の各粒子を、架橋剤により高分子物質を介して結合する一態様について説明する。
【００４０】
ここでは、まず、高分子物質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いる。このウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の側鎖アミノ基に、光架橋剤であるATFB-SE (4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid, succinimidyl ester)を用いて、光反応性官能基（Ｎ３基；アジド基）を導入する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）以外の蛋白質を用いても同様に光反応性官能基（Ｎ３基；アジド基）を導入することができることは勿論である。その反応を模式的に表すと下記のように表すことができる。また、図１（ａ）にはその模式図を示す。
【００４１】
【化１】
0005050267.tif 000002
【００４２】
次に、上記のようにして光反応性官能基が導入された蛋白質をポリスチレンビーズ等の粒状材料に導入する。反応を模式的に表すと下記のように表すことができる。
【００４３】
【化２】
0005050267.tif 000003
【００４４】
すなわち、ＵＶ照射でＮ３基（アジド基）を活性化し、ポリスチレンビーズ等のアルキル骨格の炭素部分等に共有結合させることができる。そして、蛋白質１分子中に２箇所以上にＮ３基（アジド基）を導入しておけば、架橋剤により高分子物質を介して粒状材料の各粒子同士を結合することができる。図１（ｂ）にはその架橋態様の模式図を示す。また、蛋白質同士も架橋され得るので、この場合は、蛋白質の重合体を介して粒状材料の各粒子が結合する。図１（Ｃ）にはその架橋態様の模式図を示す。
【００４５】
このようにして得られた三次元構造体では、構造体の厚さ寸法領域当たりに複数個の上記粒状材料の各粒子を含み、空隙を保ちつつ三次元に密に配列している。平均粒子径０．１〜１０μｍの粒状材料を用いた場合、その空隙はおよそ０．０５〜１０μｍの幅となる。更に、上記高分子物質を成分として含む架橋体が上記粒状材料の各粒子間に形成されているので機械的にも安定である。
【００４６】
上記の三次元構造体には、これに生体由来物質又は該生体由来物質に結合するプローブ分子を担持して、生体関連分子担持体とすることができる。
【００４７】
生体由来物質としては、核酸、酵素、抗体、抗原等が挙げられる。また、生体由来物質に結合するプローブ分子としては、抗体エピトープ等の合成ペプチド断片、ヒスチジンＴａｇ導入蛋白質精製のためのニッケルキレート官能基、ビオチン、グルタチオン、アビジン等が挙げられる。具体的には、例えば、所定の抗原に対する特異抗体を担持しておき、ＥＬＩＳＡ法に応用することができる。また、例えば、オリゴヌクレオチドを担持しておき、相補的に結合するＤＮＡのクローニングや定量などに応用することができる。
【００４８】
これらの生体由来物質又は該生体由来物質に結合するプローブ分子を上記の三次元構造体に担持するには、通常用いられる架橋方法等で行うことができる。そのための官能基として、例えば、−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基、−ＳＨ基などを有する粒状材料を用いるか、粒状材料に−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基、−ＳＨ基などの官能基を導入してもよく、更には、上記高分子物質として用いたものの官能基を利用するか、上記高分子物質として用いたものに官能基を導入することができる。例えば、−ＮＨ３基対−ＣＯＯＨ基を架橋するための架橋剤、又は−ＮＨ３基対−ＳＨ基を架橋するための、いわゆる二官能性架橋剤等を用いることによって効率よく導入することができる。このような架橋剤としては、−ＮＨ２基対−ＣＯＯＨ基を架橋するための架橋剤として、１，１−カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩等、−ＮＨ２基対−ＳＨ基を架橋するための架橋剤として、N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate（ＳＰＤＰ）、N-(8-Maleimidocapryloxy)sulfosuccinimide、N-(6-Maleimidocaproyloxy)sulfosuccinimide等が挙げられる。
【００４９】
なお、生体由来物質又は該生体由来物質に結合するプローブ分子が、それ自体、上記架橋体構成材料として架橋体の一部を構成していてもよい。
【００５０】
本発明においては、上記懸濁液を支持面に液滴状にして付着させる工程を、インクジェット方式により行うことができる。ここでインクジェット方式とは、上記高分子物質を含む液状媒質に粒状材料を懸濁した懸濁液を噴射ノズルから上記支持面に直接に吹き付けて定着させる方式をいう。従来の印刷技術では、インクジェット方式によりピコリットル単位で数十マイクロメートルの位置精度で吹き付けることも可能であるので、これを応用して、特に、微小分析システム（micro-total analysis systems μ-TAS）の基板上の所望の微細空間位置に配置される担持担体としての加工が容易に行うことができる。
【００５１】
図２には、本発明の三次元構造体を、PDMS（Polydimethylsiloxane）の基板上に形成したときの模式図を示す。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
<実施例１>  
上述した光架橋剤、ATFB-SE (4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid, succinimidyl ester)を用い、常法に従い、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の側鎖アミノ基に光反応性官能基であるアジド基を導入した。
【００５４】
具体的には、ＤＭＳＯ中にATFB-SE を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、その０．１ｍｌを、ＢＳＡを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解したもの１ｍｌと混合し室温で１時間インキュベートした。１．５Ｍ ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ水溶液０．１ｍｌを添加し１時間インキュベートして反応を完全に停止させた。
【００５５】
上記のようにして得た光反応性官能基導入後のＢＳＡ含有反応液と、平均粒子径５μｍのポリスチレンビーズ（Duke Scientific Corporation社製）を６％（ｗ／ｖ）の濃度で水に懸濁させたものを用いて、ビーズ濃度が１％（ｗ／ｖ）であり、ＢＳＡ含有換算濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌ、となるように水に混合してビーズ懸濁調製液とした。
【００５６】
６０℃で３０分間焼成したPDMS（Polydimethylsiloxane）の基板を用意し、上記ビーズ懸濁調製液をその基板上にマイクロピペットで２．５μｌ滴下した。
【００５７】
湿度４０％以上の容器内で24時間以上かけてゆっくり乾燥させた後、UV (254 nm)を３０分間照射した後、水で３回洗浄して、PDMS（Polydimethylsiloxane）の基板上に、平均粒子径５μｍのポリスチレンビーズを結合してなる三次元構造体を得た。図３にはその電子顕微鏡写真を示す。
【００５８】
図３に明らかなように、この三次元構造体のポリスチレンビーズは、およそ０．５〜５μｍの間隔をあけて略規則的に配列していた。また、その空隙の一部にはビーズを架橋する構造体が形成していた。また、この三次元構造体は、水で１５回洗浄しても崩れなかった。したがって、反応場として用いるのに十分な機械的安定性があることが示唆された。
【００５９】
<実施例２>  
上記ビーズ懸濁調製液中のＢＳＡ含有換算濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるように混合した以外は、実施例１と同様にして、三次元構造体を得た。図４にはその電子顕微鏡写真を示す。
【００６０】
図４に明らかなように、この三次元構造体のポリスチレンビーズは、およそ０．５〜５μｍの間隔をあけて略規則的に配列していた。また、この三次元構造体は、水で１５回洗浄しても崩れなかった。したがって、反応場として用いるのに十分な機械的安定性があることが示唆された。
【００６１】
<実施例３>  
上記ビーズ懸濁調製液中のＢＳＡ含有換算濃度が１．５ｍｇ／ｍｌとなるように混合した以外は、実施例１と同様にして、三次元構造体を得た。図５にはその電子顕微鏡写真を示す。
【００６２】
図５に明らかなように、この三次元構造体のポリスチレンビーズは、およそ０．５〜５μｍの間隔をあけて略規則的に配列していた。また、この三次元構造体は、水で１５回洗浄しても崩れなかった。したがって、反応場として用いるのに十分な機械的安定性があることが示唆された。
【００６３】
<実施例４>  
上記ビーズ懸濁調製液中のＢＳＡ含有換算濃度が３．０ｍｇ／ｍｌとなるように混合した以外は、実施例１と同様にして、三次元構造体を得た。図６にはその電子顕微鏡写真を示す。
【００６４】
図６に明らかなように、この三次元構造体のポリスチレンビーズは、およそ０．５〜５μｍの間隔をあけて略規則的に配列していた。また、この三次元構造体は、水で１５回洗浄しても崩れなかった。したがって、反応場として用いるのに十分な機械的安定性があることが示唆された。
【００６５】
<実施例５>  
上記ビーズ懸濁調製液中のＢＳＡ含有換算濃度が５．０ｍｇ／ｍｌとなるように混合した以外は、実施例１と同様にして、三次元構造体を得た。図７にはその電子顕微鏡写真を示す。
【００６６】
図７に明らかなように、この三次元構造体のポリスチレンビーズは、およそ０．５〜５μｍの間隔をあけて略規則的に配列していた。また、この三次元構造体は、水で１５回洗浄しても崩れなかった。したがって、反応場として用いるのに十分な機械的安定性があることが示唆された。
【００６７】
<実施例６>  
上記ビーズ懸濁調製液中のＢＳＡ含有換算濃度が６．６７ｍｇ／ｍｌとなるように混合した以外は、実施例１と同様にして、三次元構造体を得た。図８にはその電子顕微鏡写真を示す。
【００６８】
図８に明らかなように、この三次元構造体のポリスチレンビーズは、およそ０．５〜５μｍの間隔をあけて略規則的に配列していた。また、この三次元構造体は、水で１５回洗浄しても崩れなかった。したがって、反応場として用いるのに十分な機械的安定性があることが示唆された。
【００６９】
なお、上記実施例４〜６で得られた三次元構造体は、支持体から剥離しても構造体を維持していた。これらの三次元構造体は、内部に大表面積を有する膜素材等として有用であると考えられた。
【００７０】
<比較例１>  
ＵＶ照射しない以外は実施例１と同様に三次元構造体の調製操作を行った。乾燥後、ビーズは基板上にとどまっていたが、水で洗浄操作を施すと配列がくずれ、２次元で配列したビーズの上に積層していたビーズの一部は流去してしまった。
【００７１】
<実施例７>  
BSAの代わりにAnti-IgAを用いてポリスチレンビーズを結合してなる三次元構造体を作成した。
【００７２】
ビーズ上述した光架橋剤、ATFB-SE (4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid, succinimidyl ester)を用い、常法に従い、Anti-IgAの側鎖アミノ基に光反応性官能基であるアジド基を導入した。
【００７３】
具体的には、ＤＭＳＯ中にATFB-SE を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、その０．１ｍｌを、１ｍｇ／ｍｌのAnti-IgA１ｍｌと混合し室温で１時間インキュベートした。
【００７４】
上記のようにして得た光反応性官能基導入後のAnti-IgA含有反応液と、平均粒子径２．５μｍのポリスチレンビーズ（Duke Scientific Corporation社製）を５％（ｗ／ｖ）の濃度で水に懸濁させたものを用いて、ビーズ濃度が１％（ｗ／ｖ）であり、Anti-IgA含有換算濃度が０．７３ｍｇ／ｍｌ、となるように混合してビーズ懸濁調製液とした。
【００７５】
６０℃で１時間焼成したPDMS（Polydimethylsiloxane）の基板を用意し、上記ビーズ懸濁調製液をその基板上にインクジェットで２５０滴（約１６０ｎＬ）吐出した。
【００７６】
湿度約８５％の容器内で２４時間以上かけてゆっくり乾燥させた後、UV (254 nm)を３０分間照射した後、水で３回洗浄して、PDMS（Polydimethylsiloxane）の基板上に、平均粒子径２．５μｍのポリスチレンビーズを結合してなる三次元構造体を得た。図９にはその電子顕微鏡写真を示す。
【００７７】
図９に明らかなように、この三次元構造体のポリスチレンビーズは、およそ０．５〜５μｍの間隔をあけて略規則的に配列していた。また、この三次元構造体は、水で１５回洗浄しても崩れなかった。したがって、ＢＳＡのかわりにAnti-IgAを用いても、反応場として用いるのに十分な機械的安定性があることが示唆された。
【００７８】
<実施例８>  
ビーズを基板上に滴下・凝集(乾燥)させた後、三次元に配列したビーズ構造体の端に架橋体構成材料を滴下し、ビーズによる三次元構造の内部に架橋体構成材料を浸透させることで、三次元構造体を作成した。
【００７９】
まず、架橋体構成材料をビーズによる三次元構造の内部に浸透させることができるかどうかを確認する目的で、以下のような実験を行った。
【００８０】
平均粒子径２．５μｍのポリスチレンビーズ（Duke Scientific Corporation社製）を、ビーズ濃度が５％（ｗ／ｖ）となるように水に懸濁し、ＰＤＭＳ上にインクジェットで２５０滴（約１６０ｎＬ）吐出し、乾燥させた。その顕微鏡写真を図１０に示す。
【００８１】
図１０に示すように、このビーズ構造体は、ビーズ粒子の配列が規則正しく、全体的な形もきれいであった。
【００８２】
上記ビーズ構造体の端から１００μｍ離れた位置に、モデル物質として蛍光物質(１０−４Ｍ Resorufin)を２５０滴吐出し、ビーズ構造体の中心部の蛍光強度を測定した。その結果を、図１１に示す。
【００８３】
図１１に示すように、吐出から数分で、ビーズ構造体の中心部まで蛍光物質が浸透した。したがって、この方法により、ビーズによる三次元構造の内部にまで有効に架橋体構成材料を浸透させることができることが明らかとなった。
【００８４】
上述した実施例１〜６におけるＢＳＡのかわりにAnti-IgAを用いて三次元構造体を作成した。
【００８５】
そのために、上述した光架橋剤、ATFB-SE (4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid, succinimidyl ester)を用い、常法に従い、Anti-IgAの側鎖アミノ基に光反応性官能基であるアジド基を導入した。
【００８６】
具体的には、ＤＭＳＯ中にATFB-SE を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、その０．１ｍｌを、１ｍｇ／ｍｌのAnti-IgA１ｍｌと混合し室温で１時間インキュベートした。
【００８７】
他方、平均粒子径２．５μｍのポリスチレンビーズ（Duke Scientific Corporation社製）を１％（ｗ／ｖ）の濃度で水に懸濁させたものを、６０℃で１時間焼成したＰＤＭＳの基板上にインクジェットで２５０滴（約１６０ｎＬ）吐出し、湿度約８５％の容器内で２４時間以上かけてゆっくり乾燥させ、ビーズ構造体を得た。そして、上記光反応性官能基導入後のAnti-IgA含有反応液を、ビーズ構造体の端から１００μｍ離れた位置に２５０滴吐出し、湿度約８５％の容器内で24時間以上放置してビーズ構造体の内部に浸透させた後、ＵＶを照射し，水で３回洗浄した。その結果得られた三次元構造体の顕微鏡写真を図１２に示す。
【００８８】
<試験例１>  
上記実施例７や実施例８で得られた三次元構造体は、架橋体構成材料としてAnti-IgAを用いているので、そのAnti-IgAは三次元構造体の架橋体の構成成分となっているとともに、それ自体でＩｇＡと結合することができる。したがって、生体関連分子担持体を構成している。そこで、実施例８で得られた三次元構造体を用いて、ヒトＩｇＡの段階希釈溶液に対するＥＬＩＳＡを行った。また、比較のために、上記実施例８において、ビーズを滴下せず、光反応性官能基導入後のAnti-IgA含有反応液のみをＰＤＭＳの基板上に滴下し、光照射したものを調製し、同様にＥＬＩＳＡを行った。その結果を図１３に示す。
【００８９】
図１３に示すように、ビーズを架橋した三次元構造体では，良好な抗体と抗原の結合が見られるのに対して、Anti-IgAを直接ＰＤＭＳ基板上に固化した場合には、シグナルが弱く、良好な抗体と抗原の結合が見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】(ａ)は光反応官能基を導入した蛋白質の模式図、（ｂ）は１分子の蛋白質を介して粒状材料の各粒子が結合する架橋態様の模式図、（Ｃ）は２分子の蛋白質を介して粒状材料の各粒子が結合する架橋態様の模式図である。
【図２】本発明の三次元構造体を、PDMS（Polydimethylsiloxane）の基板上に形成したときの模式図である。
【図３】実施例１の三次元構造体の電子顕微鏡写真である。
【図４】実施例２の三次元構造体の電子顕微鏡写真である。
【図５】実施例３の三次元構造体の電子顕微鏡写真である。
【図６】実施例４の三次元構造体の電子顕微鏡写真である。
【図７】実施例５の三次元構造体の電子顕微鏡写真である。
【図８】実施例６の三次元構造体の電子顕微鏡写真である。
【図９】実施例７の三次元構造体の電子顕微鏡写真である。
【図１０】平均粒子径２．５μｍのポリスチレンビーズの懸濁液をＰＤＭＳ上にインクジェットで２５０滴吐出し、乾燥させたものの顕微鏡写真である。
【図１１】ビーズ構造体の中心部の蛍光強度を測定した結果を示す図表である。
【図１２】実施例８の三次元構造体の電子顕微鏡写真である。
【図１３】ヒトＩｇＡの段階希釈液に対するＥＬＩＳＡの結果を示す図表である。
【図１】
0005050267.tif 000004
【図２】
0005050267.tif 000005
【図３】
0005050267.tif 000006
【図４】
0005050267.tif 000007
【図５】
0005050267.tif 000008
【図６】
0005050267.tif 000009
【図７】
0005050267.tif 000010
【図８】
0005050267.tif 000011
【図９】
0005050267.tif 000012
【図１０】
0005050267.tif 000013
【図１１】
0005050267.tif 000014
【図１２】
0005050267.tif 000015
【図１３】
0005050267.tif 000016