(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（γ−グルタミン酸）とＬ−フェニルアラニンエチルエステルとをカップリングして得られる両親媒性ポリアミノ酸を含むアジュバント。
【請求項２】
両親媒性ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、請求項１記載のアジュバント。
【請求項３】
ナノ粒子のサイズが１００ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項２記載のアジュバント。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項記載のアジュバントを含む、ワクチン。
【請求項５】
ポリ（γ−グルタミン酸）とＬ−フェニルアラニンエチルエステルとをカップリングして得られる両親媒性ポリアミノ酸を含むアジュバントに、ウイルス抗原を固定化した、生分解性ナノ粒子。
【請求項６】
ウイルス抗原がレトロウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、フラビウイルス抗原、下痢症ウイルス抗原、およびコロナウイルス抗原からなる群から選択されるものである、請求項５記載の生分解性ナノ粒子。
【請求項７】
ウイルス抗原がレトロウイルス抗原である、請求項６記載の生分解性ナノ粒子。
【請求項８】
ウイルス抗原がＨＩＶ抗原である、請求項７記載の生分解性ナノ粒子。
【請求項９】
サイズが１００ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項５から８のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子。
【請求項１０】
抗原がナノ粒子に内包されている、請求項５から９のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子。
【請求項１１】
抗原がナノ粒子表面に存在する、請求項５から９のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子。
【請求項１２】
抗原がナノ粒子に吸着されている、請求項５から９のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子。
【請求項１３】
請求項５から１２のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子を含むワクチン。
【請求項１４】
抗ＨＩＶワクチンである、請求項１３記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アジュバントとしてのポリアミノ酸の使用、ワクチンを製造するためのアジュバントとしてのポリアミノ酸の使用方法、ならびにアジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチンに関する。さらに、本発明は、抗原を固定化したナノ粒子、およびそのワクチンとしての使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性疾患をはじめとする種々の疾患の予防および治療のために、様々なワクチンが開発され用いられている。しかし、ウイルス蛋白質などの抗原を単独で生体に投与したとしても、抗原分子は生体内安定性に乏しく細胞への取り込み効率が不十分なため、現行のワクチン療法では適当な粒子状キャリアーや免疫賦活物質（アジュバント）とエマルジョン化して混合投与するなどの工夫が施されている。しかしながら、例えば、ＨＴＬＶ−１感染症においては、生体のＨＴＬＶ−１に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性あるいは存在頻度が低いことに起因し、既存のアジュバントを用いたＨＴＬＶ−１ワクチンの成功例は報告されていない。また例えば、ＨＩＶなどによるウイルス感染症または癌患者において、感染細胞または癌細胞を特異的に攻撃するＣＴＬを誘導することで治療する試みが成されている。この治療においては効果的にＣＴＬを誘導できるかが重要とされ、そのためにフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのアジュバントが通常用いられているが、安全性や有効性において満足すべき結果は得られていない。従って、本願発明のように、ポリアミノ酸、特にポリ（γ−グルタミン酸）がアジュバントとして優れた効果を発揮するという報告はない。【０００３】
近年、ナノ粒子は、その大きさ故、様々な分野において新たな働きを担うと期待され、研究・開発が進められている。ナノ粒子を治療目的で利用する試みもなされている。例えば、ナノ粒子を薬物の担体として利用する研究があるが（特許文献１および２参照）、ナノ粒子の体内挙動は解明されていないため毒性、安全性が疑わしく、生体への影響が懸念されている。実際の医療に貢献するためには、非分解性ナノ粒子に代わりうる生分解性ナノ粒子の応用展開が必要不可欠である。さらに、ナノ粒子と抗原を結合させるときに、変性、分解などにより抗原の活性が失われてしまい、アジュバントとしての機能を発揮できないという心配もあった。したがって、本願発明のように、ナノ粒子化したポリアミノ酸、特にポリ（γ−グルタミン酸）のアジュバントとしての使用、さらには、抗原を固定化したナノ粒子、およびそのワクチンとしての使用については報告がない。
【特許文献１】特開平６−９２８７０号公報
【特許文献２】特開平６−２５６２２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の解決課題は、安全かつ有効なワクチン用アジュバントを提供すること、ならびにそれを利用したワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ポリアミノ酸、特にポリ（γ−グルタミン酸）が樹状細胞の分化成熟を促進すること、すなわちアジュバントとして作用すること、ならびにその作用がナノ粒子化により増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）アジュバントとしてのポリアミノ酸の使用、
（２）ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物からなる群より選択されるものである、（１）記載の使用、
（３）ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）である（２）記載の使用、
（４）ポリアミノ酸が両親媒化されている、（１）記載の使用、
（５）ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、（１）から（４）いずれか記載の使用、
（６）ワクチンを製造するためのアジュバントとしてのポリアミノ酸の使用方法、
（７）ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物からなる群より選択されるものである、（６）記載の使用方法、
（８）ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）である（７）記載の使用方法、
（９）ポリアミノ酸が両親媒化されている、（６）記載の使用方法、
（１０）ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、（６）から（９）いずれか記載の使用方法、
（１１）アジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチン、
（１２）ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物からなる群より選択されるものである、（１１）記載のワクチン、
（１３）ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）である（１２）記載のワクチン、
（１４）ポリアミノ酸が両親媒化されている、（１１）記載のワクチン、
（１５）ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、（１１）から（１４）いずれか記載のワクチン、
（１６）ウイルス抗原を固定化した生分解性ナノ粒子、
（１７）ウイルス抗原がレトロウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、フラビウイルス抗原、下痢症ウイルス抗原、およびコロナウイルス抗原からなる群から選択されるものである、（１６）記載の生分解性ナノ粒子、
（１８）ウイルス抗原がレトロウイルス抗原である、（１７）記載の生分解性ナノ粒子、
（１９）レトロウイルス抗原がＨＩＶ抗原である、（１８）記載の生分解性ナノ粒子、
（２０）ポリアミノ酸を骨格とする、（１６）から（１９）のいずれか記載の生分解性ナノ粒子、
（２１）ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物からなる群より選択されるものである、（２０）記載の生分解性ナノ粒子、
（２２）ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）である、（２１）記載の生分解性ナノ粒子、
（２３）ポリアミノ酸が両親媒化されている、（２０）記載の生分解性ナノ粒子、
（２４）抗原がナノ粒子に内包されている、（１６）から（２３）のいずれか記載の生分解性ナノ粒子、
（２５）抗原がナノ粒子表面に存在する、（１６）から（２３）のいずれか記載の生分解性ナノ粒子、
（２６）（１６）から（２５）のいずれか記載の生分解性ナノ粒子を含むワクチン、
（２７）抗ＨＩＶワクチンである、（２６）記載のワクチン、
（２８）（２６）記載のワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の免疫方法、
（２９）（２６）記載のワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象における疾病の治療および／または予防方法、
（３０）疾病がＨＩＶである、（２９）記載の方法、
（３１）疾病の治療および／または予防のためのワクチンを製造するための、（１６）から（２５）記載の生分解性ナノ粒子の使用、
（３２）疾病がＨＩＶである、（３１）記載の使用、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、生分解性であるため安全性の高いポリアミノ酸のアジュバントとしての使用、ワクチンを製造するためのその使用方法、ならびにアジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、γ−ＰＧＡのナノ粒子化による、Ｔリンパ球の３Ｈ−チミジン取り込み量の変化を示すグラフである。
【図２】図２は、フローサイトメーターによる樹状細胞表面分子の測定結果を示す図である。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡ法による樹状細胞から分泌されたサイトカイン量を示すグラフである。
【図４】図４は、γ−ＰＧＡナノ粒子により分化誘導されたｉＤＣのＴリンパ球活性化作用を、Ｔリンパ球の３Ｈ−チミジン取り込み量により示す図である。
【図５】図５は、ＨＩＶ−１抗原を内包するγ−ＰＧＡナノ粒子により誘導されたγ−インターフェロン産生細胞数を示すグラフである。
【図６】図６は、ＨＩＶ−抗原を内包するγ−ＰＧＡナノ粒子により誘導された抗体価を示すグラフである。
【図７】図７は、ＯＶＡ固定化γ−ＰＧＡナノ粒子を用いた腫瘍生着予防実験の結果を示す図である。
【図８】図８は、ＯＶＡ固定化γ−ＰＧＡナノ粒子を用いたＣＴＬ誘導実験の結果を示す図である。
【図９】図９は、Ｔａｘ３８−４６固定化γ−ＰＧＡナノ粒子を用いたＣＴＬ誘導実験の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＯＶＡ固定化γ−ＰＧＡナノ粒子を用いた肺転移抑制試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、１の態様において、アジュバントとしてのポリアミノ酸の使用に関するものである。アジュバントとは、免疫系を刺激し、免疫反応を増強させる物質を意味する。アジュバントにより、例えば、樹状細胞の分化成熟を促進すること、Ｔ細胞を活性化すること、種々のサイトカインの分泌を促進すること、ＣＴＬ誘導率が上昇することなどが可能になる。【００１０】
本発明に用いるポリアミノ酸は、いずれのアミノ酸から構成されていてもよい。アミノ酸以外の構成成分、例えば、糖類、脂質等を含んでいてもよい。好ましいポリアミノ酸は、アミノ酸からなるポリペプチドを主材料あるいは骨格とし、構成成分の５０％以上がアミノ酸である。本発明に用いるポリアミノ酸の構成アミノ酸は１種類であってもよく、複数種類であってもよい。したがって、本発明に用いるポリアミノ酸は１種またはそれ以上の天然アミノ酸または１種またはそれ以上の非天然アミノ酸のいずれかから構成されていてもよく、あるいはそれらの両方から構成されていてもよい。ここで、非天然アミノ酸は天然に存在するアミノ酸以外のものをいい、化学合成されたもの、天然アミノ酸を化学的に修飾したもの等が含まれる。さらに構成アミノ酸はＬ−体であってもＤ−体であってもよいが、Ｌ−体が好ましい。従って、本発明のポリアミノ酸は、その修飾体および誘導体も包含する。ここで、ポリアミノ酸の「修飾体」、「誘導体」という語は当該分野において通常に使用される意味を有する。本発明のポリアミノ酸の修飾体および誘導体の例としては、構成アミノ酸の一部を別のアミノ酸としたもの、あるいは構成アミノ酸の利用可能な官能基を用いて修飾したもの等が挙げられる。具体的には、ポリ（γ−グルタミン酸）のペプチド鎖中に１種またはそれ以上の他のアミノ酸（またはその修飾体もしくは誘導体）を導入したもの、グラフト重合体となっているもの、あるいはポリ（ε−リジン）の構成アミノ酸たるリジンの利用可能なα−位の一部をメチル化したもの等が挙げられる。本発明のポリアミノ酸の修飾体、誘導体の種類およびその製造方法については、当業者が容易に選択し、行うことができるものである。【００１１】
安全性または毒性の面、特に生体内で分解された際の産物の安全性または毒性（無毒であるかあるいは低毒性であること）を考慮すると、本発明のポリアミノ酸は生分解性で、かつ天然アミノ酸から構成されているものが好ましい。本発明のポリアミノ酸を構成する好ましい構成アミノ酸としてはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アスパラギン、アルギニン等が挙げられる。本発明のポリアミノ酸中の構成アミノ酸の結合は一般的にはペプチド結合であるが、それ以外の結合あるいはリンカーにより構成アミノ酸が結合されていてもよい。ペプチド結合以外の結合としては、例えば、エステル結合、エーテル結合等があり、リンカーとしては、例えば、グルタルアルデヒド、ジイソシアネート等があるが、これらに限らない。さらに、本発明のポリアミノ酸の官能基間において架橋されていてもよい。架橋することにより、ポリアミノ酸の物性を変化させ、所望のアジュバント特性を得ることも可能である。架橋剤としては、例えば、カルボジイミド、ジグリシジルエステル等があるが、これらに限らない。ポリアミノ酸は可溶性のものが好ましいが、経時的に徐々に溶解するものであってもよい。またポリアミノ酸の分子量も特に限定されないが、所望の粘度や溶解度に応じて変更され得る。通常は１０００ないし５００万の範囲、好ましくは５０００ないし２００万の範囲である。本発明に用いられる好ましいポリアミノ酸は、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン等であり、さらに好ましいポリアミノ酸は、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（ε−リジン）またはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物等であり、特に好ましいポリアミノ酸は、ポリ（γ−グルタミン酸）である。好ましいポリアミノ酸の選択は、使用する抗原その他の成分との相互作用も考慮すべきである。さらに、本発明に用いる好ましいポリアミノ酸はナノ粒子化されたものである。ナノ粒子化することによりアジュバント作用が増強される（実施例１参照）。ポリアミノ酸の製造は、化学合成法、発酵法などの公知の方法を適宜選択して行うことができる。ナノ粒子の製造方法については後で説明する。【００１２】
本発明は、もう１つの態様において、ワクチンを製造するためのアジュバントとしてのポリアミノ酸の使用方法に関する。ワクチンを製造するためのいずれの工程において、ポリアミノ酸を添加してもよいし、あるいは使用時にポリアミノ酸を他のワクチン構成成分と混合することにより、ワクチンを製造してもよい。ポリアミノ酸の構成成分、構成アミノ酸の結合、好ましいポリアミノ酸、好ましいポリアミノ酸の形態等については上述の通りである。添加するポリアミノ酸の量は、抗原の種類、疾病の種類、対象の状態等に応じて適宜変更することができる。製造されるワクチンは、下記のように様々なものであってよい。ポリアミノ酸のアジュバントとしての能力は高く、ポリアミノ酸に由来する毒性はないか、あるいは低いものであるので、本発明の方法を用いて得られるワクチンは、効果が高く、副作用が低い。【００１３】
本発明は、別の態様において、アジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチンに関するものである。本発明のワクチンにおいて含まれるポリアミノ酸の構成成分、構成アミノ酸の結合、好ましい種類および形態等については上述の通りである。本発明のワクチンは、アジュバントとしてポリアミノ酸、および抗原を含む以外に、例えば、賦形剤、または担体、所望により懸濁化剤、等張化剤、防腐剤などを含んでいてもよい。本発明のワクチンは、本発明のポリアミノ酸以外のアジュバントをさらに含んでいてもよい。その剤形は特に限定されず、いずれのものであってもよく、対象の状態、疾病の種類等の種々の因子に応じて選択することができる。例えば、適当な水性担体中の懸濁液または溶液であってもよく、粉末、カプセル剤、錠剤等であってもよい。ワクチンは凍結乾燥形態であってもよく、これを使用前に適当な賦形剤に懸濁または溶解して用いることができる。本発明のワクチンの投与方法、投与経路および投与回数も特に限定はなく、剤形、対象の状態、疾病の種類等の種々の因子に応じて選択することができる。例えば、本発明のワクチンを注射、輸液、または経口投与により投与してもよく、患部に局所的に投与してもよい。【００１４】
本発明のワクチンにおいて、抗原がポリアミノ酸に固定化されていてもよく、あるいは固定化されていなくてもよい。抗原を固定化しない場合、抗原の選択の幅は著しく広い。疾病の種類、対象の状態等の因子に応じて抗原を適宜選択することにより、所望のワクチンを容易に製造することができる。抗原を固定化した場合については後で説明する。【００１５】
本発明は、１の態様において、抗原を固定化した生分解性ナノ粒子に関するものである。ここで抗原とは免疫反応を惹起できるものを意味し、その形態は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のごときウイルス、結核菌のごとき病原微生物などの病原体自体またはその一部、あるいは蛋白質またはペプチド、あるいは核酸であってもよい。本発明に用いられる好ましい抗原はウイルス抗原であり、その種類は特に限定されず、いずれのウイルス抗原であってもよい。例えば、ＨＩＶ抗原（例えば、ＨＴＬＶ−１抗原）またはＨＴＬＶ抗原（例えば、ＨＴＬＶ−１抗原）のようなレトロウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原または西ナイルウイルス抗原のようなフラビウイルス抗原、ロタウイルス抗原またはノロウイルス抗原のような下痢症ウイルス抗原、およびＳＡＲＳウイルスのようなコロナウイルス抗原などが好ましく、ＨＩＶ抗原またはＨＴＬＶ抗原のようなレトロウイルス抗原がより好ましく、そしてＨＩＶ抗原が最も好ましい。本発明の生分解性ナノ粒子に固定化される抗原は、複数種類、あるいは異なる形態の抗原であってもよい。【００１６】
本発明において抗原を生分解性ナノ粒子に固定化するとは、抗原と生分解性ナノ粒子とが物理的にくっついていることを意味し、好ましくは、抗原を内包すること、あるいは抗原を粒子表面に存在させることである。抗原を生分解性ナノ粒子に固定化する方法は種々の公知方法にて行うことができる。詳しくは後述のとおりである。【００１７】
本発明に用いる生分解性ナノ粒子の材料は種々のものを用いることができるが、生体に投与することからナノ粒子自体およびその分解産物または代謝産物が安全なものが好ましい。本発明の生分解性ナノ粒子の好ましい主成分（好ましくは、抗原を固定化しない状態で５０重量％以上）は、ポリアミノ酸である。さらに、好ましいポリアミノ酸は、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、またはそれらの混合物であり、より好ましくは、ポリ（γ−グルタミン酸）である。これらのポリアミノ酸を構成するアミノ酸間の結合は同じ種類あるいは異なる種類のものであってもよく、例えば、全ての構成アミノ酸がペプチド結合により結合したものであってもよく、あるいは部分的または全体的にペプチド結合以外の結合によりアミノ酸同士が結合したものであってもよい。リンカーを介して結合したものであってもよい。ポリアミノ酸に関しては、前述のアジュバントとしてのポリアミノ酸についての説明も参照のこと。【００１８】
生分解性ナノ粒子の種類、組成、製造方法、形状、サイズ等についての詳細は後述のとおりである。【００１９】
本発明は、もう１つの態様において、上記の抗原を固定化した生分解性ナノ粒子を含むワクチンに関するものである。上述のようにして得られる、抗原を固定化した生分解性ナノ粒子をワクチンとして用いることができる。生分解性ナノ粒子に固定化される抗原を適宜選択して、種々のワクチンを得ることができるが、好ましくは、ＨＩＶ抗原を固定化した生分解性ナノ粒子を含む抗ＨＩＶワクチンである。本発明のワクチンにおいて、抗原の固定化担体およびアジュバントとして用いられるのは生分解性ナノ粒子であり、最終的には生体内の分解酵素により分解されて無毒化あるいは低毒性化されるものである。本発明のワクチンは、抗原を固定化した生分解性ナノ粒子および賦形剤または担体、所望により懸濁化剤、等張化剤、防腐剤などその他の成分を含むものである。担体または賦形剤は、例えば、水、エタノール、またはグリセリンのような水性媒体、あるいは脂肪酸、脂肪配エステルなどの油脂類のような非水性媒体が挙げられる。本発明のワクチンの剤形はいずれのものであってもよく、対象の状態、疾病の種類等の因子に応じて選択することができる。例えば、適当な水性担体中の懸濁液であってもよく、粉末、カプセル剤、錠剤等であってもよい。凍結乾燥したワクチンを、投与前に適当な担体または賦形剤に懸濁して用いるものであってもよい。本発明のワクチンの投与方法、投与経路および投与回数も特に限定はなく、剤形、対象の状態、疾病の種類等の因子に応じて選択することができる。例えば、本発明のワクチンを注射、輸液等、あるいは経口投与により対象に投与してもよく、患部に局所的に投与してもよい。【００２０】
さらに、生分解性ナノ粒子の材料や、構成成分、分子量、サイズ、その他のパラメーターを適宜変更して、抗原の放出速度および放出時間をコントロールすることもできる。そのための方法も当該分野において公知である。例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）と疎水性アミノ酸のグラフト共重合体からなるナノ粒子の場合、疎水性アミノ酸の種類、含量を制御することにより、徐放性のワクチンを得ることもできる。また、例えば、特定の臓器または部位に局在する酵素により分解されうる結合を、生分解性ナノ粒子と免疫原との結合、あるいは生分解性ナノ粒子中に導入して、特定の臓器または部位で免疫原が放出されるようにしてもよい。【００２１】
本発明のワクチンを種々の疾病の予防および治療を目的として種々の対象に投与することができる。本発明のワクチンを適用しうる疾病ならびに投与対象は特に限定されない。かかる予防および治療は、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に抗原をＭＨＣクラスＩ分子と共に提示させ、これを特異的に認識するＣＴＬを誘導させ、このＣＴＬにより癌細胞または感染細胞などを傷害することによるものであってもよい。したがって、本発明により予防および治療される疾患は、悪性腫瘍、またはウイルス、細菌などの病原体により生じる感染症などである。悪性腫瘍は、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、膀胱癌、白血病、悪性黒色腫などを含み、感染症は、成人Ｔ細胞白血病、肝炎、後天性免疫不全症などを含む。例えば、本発明のワクチンを成人Ｔ細胞白血病の治療に使用することもできる（実施例８参照）。【００２２】
本発明はまた、上記ウイルス抗原を固定化した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の免疫方法を提供するものである。本発明のワクチンに含まれる生分解性ナノ粒子に固定化されるウイルス抗原を適宜選択することで、対象において当該ウイルス抗原に特異的なＣＴＬまたは抗体の誘導などの免疫反応を誘導することができる。本発明のワクチンの投与方法、投与経路、投与回数等は、対象の状態、ウイルス抗原の種類等種々の因子に応じて適宜選択できる。【００２３】
本発明はまた、上記ウイルス抗原を固定化した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象における疾病の治療および／または予防方法を提供するものである。本発明のワクチンに含まれる生分解性ナノ粒子に固定化されるウイルス抗原を適宜選択することで、例えば、後天性免疫不全症候群、ヒトＴ細胞白血病、レトロウイルス感染症、インフルエンザ、Ｃ型肝炎、西ナイルウイルス感染症、ロタウイルス感染症、ノロウイルス感染症、およびＳＡＲＳ、ならびに種々の腫瘍などの広範囲の疾病を治療および／または予防することができる。本発明のワクチンの投与方法、投与経路、投与回数等は、例えば、対象の状態、疾病の種類、ウイルス抗原の種類等の種々の因子に応じて適宜選択できる。【００２４】
本発明はさらに、疾病の治療および／または予防のためのワクチンを製造するための、上記ウイルス抗原を固定化した生分解性ナノ粒子の使用に関するものである。生分解性ナノ粒子に固定化するウイルス抗原を適宜選択することで、例えば、上述の疾病のような様々な疾病の治療および／または予防のためのワクチンを製造することが可能となる。【００２５】
本発明はさらに、対象を免疫するためのワクチンを製造するための、上記ウイルス抗原を固定化した生分解性ナノ粒子の使用に関するものである。生分解性ナノ粒子に固定化するウイルス抗原を適宜選択することで、対象において当該ウイルス抗原に特異的な免疫反応を誘導するワクチンを製造することが可能となる。【００２６】
本発明は、もう１つの態様において、抗原を固定化した生分解性ナノ粒子に関するものである。本発明に用いる生分解性ナノ粒子の材料は種々のものを用いることができ、それらは当該分野においてよく知られており、適宜選択して用いることができる。生体に投与することから当該ナノ粒子自体およびその分解産物または代謝産物が安全なもの、あるいは無毒または低毒性であるものが好ましい。かかる好ましい材料として、ポリペプチド、多糖、ポリ有機酸、あるいはこれらの混合物などがある。【００２７】
ポリペプチドを主材料とする生分解性ナノ粒子（「生分解性ポリペプチドナノ粒子」と称する）は天然アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば、エステル化アミノ酸など）、アミノ酸誘導体または合成アミノ酸、あるいはこれらの混合物を含むポリアミノ酸を骨格とするものであってよいが、天然アミノ酸からなるものが安全性や毒性の面からより好ましい。そのような天然アミノ酸からなる好ましいポリアミノ酸の例としてはポリ（γ−グルタミン酸）、ポリε−リジン、ポリ（α−Ｌ−リジン）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリアスパラギン、並びにそれらの修飾体や誘導体等が挙げられる。「修飾アミノ酸」、「アミノ酸誘導体」、「修飾体」、「誘導体」という語は当該分野において通常使用される意味を有するものとする。また、生分解性ポリペプチドナノ粒子は単一種のアミノ酸からなっていてもよく、２種以上のアミノ酸からなっていてもよい。生分解性ポリペプチドナノ粒子においてすべての構成アミノ酸間の結合が同じ種類のものであってもよく、異なる種類のものであってもよい。例えば、すべての構成アミノ酸がペプチド結合によって結合したものであってもよく、部分的あるいは全体的にペプチド結合以外の結合によりアミノ酸が結合したものであってもよい。アミノ酸の結合はリンカーを介するものであってもよい。例えば、親水性ポリアミノ酸の側鎖に疎水性アミノ酸を導入して、所望の親水性―疎水性のバランスとすることもできる。したがって、例えば、ポリペプチドがγ−グルタミン酸とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト重合体であってもよい。なお、本発明の生分解性ポリペプチドナノ粒子は、ポリペプチドを主成分（好ましくは、抗原を固定化しない状態で５０重量％以上）とするものであり、好ましくは、ポリペプチドを骨格とするものである。本発明の生分解性ポリペプチドナノ粒子は、その骨格やその他の部分にポリペプチドやアミノ酸以外の成分を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。本発明の生分解性ポリペプチドに関しては、前述のアジュバントとしてのポリアミノ酸についての説明も参照のこと。【００２８】
多糖を主材料とする生分解性ナノ粒子（「生分解性多糖ナノ粒子」と称する）は天然多糖、修飾多糖、または多糖誘導体または合成多糖、あるいはこれらの混合物を含むものであってよいが、天然多糖からなるものが安全性や毒性の面からより好ましい。そのような天然多糖からなる好ましい生分解性ナノ粒子の例としては、プルラン、キトサン、アルギン酸、ペクチン、ガードラン、デキストラン等が挙げられる。「修飾多糖」、「多糖誘導体」という語は当該分野において通常使用される意味を有するものとする。また、生分解性多糖ナノ粒子は単一種の糖からなっていてもよく、２種以上の糖からなっていてもよい。さらに、生分解性多糖ナノ粒子はすべての構成糖が同じ種類の結合によって結合したものであってもよく、部分的あるいは全体的に異なる種類の結合によって構成糖が結合したものであってもよい。例えば、α−１，６結合とα−１，４結合が混在していてもよい。また、糖の結合はリンカーを介するものであってもよい。なお、本発明の生分解性多糖ナノ粒子は、多糖を主成分（好ましくは、抗原を固定化しない状態で５０重量％以上）とするものであり、好ましくは、多糖を骨格とするものである。本発明の生分解性多糖ナノ粒子は、その骨格やその他の部分に糖類以外の成分を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。【００２９】
ポリ有機酸（ポリペプチドについては上述のごとし）を主材料とする生分解性ナノ粒子（「生分解性ポリ有機酸ナノ粒子」と称する）は天然ポリ有機酸、修飾ポリ有機酸、ポリ有機酸誘導体または合成ポリ有機酸、あるいはこれらの混合物からなるものであってよいが、天然ポリ有機酸からなるものが安全性や毒性の面からより好ましい。そのような天然ポリ有機酸からなる好ましい生分解性ナノ粒子の例としては、ポリ乳酸ナノ粒子、ポリグリコール酸ナノ粒子、ポリカプロラクトンナノ粒子等が挙げられる。「修飾ポリ有機酸」、「ポリ有機酸誘導体」という語は当該分野において通常使用される意味を有するものとする。また、生分解性ポリ有機酸ナノ粒子は単一種の有機酸からなっていてもよく、２種以上の有機酸からなっていてもよい。さらに、生分解性ポリ有機酸ナノ粒子は、同じ結合により有機酸が結合したものであってもよく、部分的あるいは全体的に異なる結合によって有機酸が結合したものであってもよい。また、有機酸の結合はリンカーを介するものであってもよい。なお、本発明の生分解性ポリ有機酸ナノ粒子は、ポリ有機酸を主成分（好ましくは、抗原を固定化しない状態で５０重量％以上）とするものであり、好ましくは、ポリ有機酸を骨格とするものである。本発明の生分解性ポリ有機酸ナノ粒子は、その骨格やその他の部分にポリ有機酸やアミノ酸以外の成分を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。【００３０】
本発明に用いる生分解性ナノ粒子の形状は特に限定されないが、一般的には球状である。そのサイズは通常１００ｎｍ〜１０μｍであり、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍである。このようなサイズにすることによって、例えば、単位重量あたりの粒子表面積増加に伴う抗原固定化量の増加、抗原提示細胞への抗原の取り込み促進、それに伴うＣＴＬの活性化、抗体産生の誘導などの効果が生じる。球状以外の形状のナノ粒子についても、好ましいサイズは球状のナノ粒子に準じるものとする。【００３１】
本発明に用いる生分解性ナノ粒子は公知の方法を適用することにより製造することができる。生分解性ポリペプチドナノ粒子の製造には、例えば、液中乾燥法、噴霧乾燥法、球形晶析法、溶媒置換法（沈殿・透析法）、直接超音波分散法を用いることができる。例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（ε−リジン）からなる生分解性ナノ粒子は、溶媒置換法により製造することができる。生分解性多糖ナノ粒子の製造には、例えば、直接分散法を用いることができる。生分解性ポリ有機酸ナノ粒子の製造には、例えば、エマルジョン−液中乾燥法を用いることができる。このような方法を適宜選択あるいは組み合わせて、生分解性ナノ粒子の材料、構成成分、分子量、サイズ、電荷その他のパラメーターを目的に応じたものとすることができる。さらに、所望によりナノ粒子を結合するマトリクス間を架橋してもよい。【００３２】
生分解性ナノ粒子に固定化する抗原は種々のものを用いることができる。抗原としては、例えば、蛋白質またはペプチド、あるいは核酸であってもよく、ウイルス、細菌、真菌などの病原体あるいはその一部分であってもよい。例えば、腫瘍抗原などを生分解性ナノ粒子に固定化してもよい。投与対象の状態、例えば、動物種、年齢、体重、健康状態、すでにかかっている疾病または素因の様な予防および／または治療すべき疾病の種類などに応じて抗原を適宜選択して、生分解性ナノ粒子に固定化することができる。生分解性ナノ粒子に固定化する抗原は１種類であってもよく、２種以上であってもよい。【００３３】
生分解性ナノ粒子への抗原の固定化は種々の公知方法にて行うことができる。例えば、共有結合、イオン結合、分子間力による結合法、吸着による方法、あるいは包括法などが知られている。例えば、生分解性ナノ粒子上の官能基と抗原が有する官能基とを共有結合させて固定化してもよく、生分解性ナノ粒子の電荷と抗原の電荷が相反する場合にはイオン結合により固定化してもよい。包括法は、例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）生分解性ナノ粒子に蛋白性の抗原を固定化する場合には、ポリ（γ−グルタミン酸）に疎水性アミノ酸を共有結合により導入し、これを有機溶媒に溶解し、次に抗原水溶液に滴下することにより、固定化することができる。また、結合法、吸着法および／または包括法を適宜組み合わせて抗原を生分解性ナノ粒子に固定化してもよい。したがって、抗原は生分解性ナノ粒子に内包されていてもよく、あるいは生分解性ナノ粒子の表面に存在していてもよく、このような固定化様式は、ワクチンの使用目的（例えば、対象、疾病の種類等）に応じて適宜選択することができる。本発明の抗原を固定化した生分解性ナノ粒子においては、抗原の立体構造は生分解性ナノ粒子との結合あるいは生分解性ナノ粒子における内包によっては影響されず、例えば凍結乾燥後であってもその固定化蛋白質の量や性質に変化が少なく、長期間保存可能であるという利点を有する。【００３４】
本発明は、さらなる態様において、ワクチンを製造するための、抗原を固定化した生分解性ナノ粒子の使用に関する。【００３５】
本発明は、もう１つの態様において、上記抗原を固定化した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の免疫方法に関するものである。生分解性ナノ粒子の材料等については上述の通りである。本発明のワクチンに含まれる生分解性ナノ粒子に固定化される抗原を適宜選択することで、対象において当該抗原に特異的なＣＴＬまたは抗体の誘導などの免疫反応を誘導することができる。例えば、ウイルスなどの病原体またはその一部を抗原として用いて対象において種々の感染症に対する免疫を生じさせることができる。また例えば、腫瘍抗原を固定化した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを用いた場合、対象において腫瘍特異的な免疫反応が誘導される。本発明のワクチンの投与方法、投与経路、投与回数等は対象の状態、抗原の種類等の種々の因子に応じて適宜選択できる。【００３６】
本発明は、もう１つの態様において、上記抗原を固定化した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の治療および／または予防方法に関するものである。生分解性ナノ粒子の材料等については上述の通りである。本発明のワクチンに含まれる生分解性ナノ粒子に固定化される抗原を適宜選択することで、広範囲の疾病を予防および／または治療することができる。例えば、ウイルスなどの病原体またはその一部を抗原として用いて対象にける種々の感染症を治療および／または予防することができる。また例えば、腫瘍抗原を固定化した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを用いることで、対象の腫瘍を治療および／または予防することができる。本発明のワクチンの投与方法、投与経路、投与回数等は、例えば、対象の状態、疾病の種類、抗原の種類等の種々の因子に応じて適宜選択できる。【００３７】
本発明は、別の態様において、疾病の治療および／または予防のためのワクチンを製造するための、上記抗原を固定化した生分解性ナノ粒子の使用に関するものである。生分解性ナノ粒子の材料等については上述の通りである。生分解性ナノ粒子に固定化する抗原を適宜選択することで、対象において当該抗原に特異的な免疫反応を有するワクチンを製造することが可能となる。【００３８】
本発明はさらに、担体としての生分解性ナノ粒子の使用を提供するものである。ここで、担体（本明細書においてキャリアーともいう）とは、例えば、抗原のような物質を所望の部位へ運ぶことができる物質のことである。目的組織、細胞等に応じて生分解性ナノ粒子の大きさを適宜選択することで、担体としての生分解性ナノ粒子の効果を増強することができる。例えば、抗原提示細胞は直径５０ｎｍ〜３μｍの粒子状物質を効率よく取り込む性質を有していることが知られていることから、本発明の生分解性ナノ粒子をかかる大きさに調節してもよい。本発明のナノ粒子は生分解性であるため、生体にとって無毒であるか、あるいは低毒性であるという利点を有する。生分解性ナノ粒子の材料、好ましいポリアミノ酸等については上述の通りである。【００３９】
本発明はさらに、担体として生分解性ナノ粒子を含む医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は生分解性ナノ粒子を含んでいればいずれのものであってもよい。生分解性ナノ粒子の材料、好ましいポリアミノ酸等については上述の通りである。【００４０】
本発明は、さらに、医薬組成物を製造するための担体としての生分解性ナノ粒子の使用方法を提供するものである。医薬組成物に含まれる物質はいずれのものであってもよく、例えば、腫瘍抗原またはウイルス抗原などの抗原であってもよいし、抗原提示細胞活性化効果が知られている物質などであってもよい。生分解性ナノ粒子の材料、好ましいポリアミノ酸等については上述の通りである。【００４１】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。実施例において、ポリ（γ−グルタミン酸）をγ−ＰＧＡと略称する。
【実施例１】
【００４２】
γ−ＰＧＡのアジュバント作用
マウスの下肢より単離した骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養し、未熟樹状細胞（ｉＤＣ）を得た。次に、ｉＤＣを１００μｇ／ｍｌ  γ−ＰＧＡ、１００μｇ／ｍｌ  γ−ＰＧＡナノ粒子（サイズ；１７７ｎｍ）を含む培地で２日間培養した後、得られた細胞を同種異系マウス由来Ｔリンパ球と３日間共培養した。その後、Ｔリンパ球を３Ｈ−チミジンと１６時間インキュベーションし、取り込み量を測定することにより、γ−ＰＧＡおよびγ−ＰＧＡナノ粒子がｉＤＣを成熟樹状細胞（ｍＤＣ）へと分化誘導し、さらにこのｍＤＣがＴリンパ球を活性化するかを調べた。ネガティブコントロールとして、γ−ＰＧＡを含まない培地で培養したｉＤＣを用いた。結果を、ネガティブコントロールの３Ｈ−チミジン取り込み量を１００（％）としたときの値として表す（図１）。γ−ＰＧＡが、Ｔリンパ球の３Ｈ−チミジンの取り込み量を増大させること、すなわちｉＤＣをｍＤＣへと分化成熟させ、このｍＤＣがＴリンパ球を活性化すること、さらにγ−ＰＧＡをナノ粒子化することにより、この作用、すなわちアジュバント作用が増強されることが分かった。
【実施例２】
【００４３】
γ−ＰＧＡナノ粒子による樹状細胞（ＤＣ）の分化成熟の促進
Ａ．γ−ＰＧＡナノ粒子によるＤＣ表面分子の発現の増加
実施例１記載の方法に従い得られたｉＤＣを、７５、１５０、３００μｇ／ｍｌ  γ−ＰＧＡナノ粒子をそれぞれ含む培地で２日間培養した後、ＤＣの分化成熟に伴い発現が増加する細胞表面分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ、およびＭＨＣクラスＩＩ）をフローサイトメーターにより測定した。ネガティブコントロールとして、γ−ＰＧＡナノ粒子を含まない培地で培養したｉＤＣを、そしてポジティブコントロールとして、ＤＣの分化誘導物質として知られているＬＰＳ（リポ多糖）を含む培地で培養して得られたｍＤＣを用いた。γ−ＰＧＡナノ粒子は、濃度依存的にＣＤ４０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩの発現を増加させること、すなわちｉＤＣをｍＤＣへと分化誘導し、活性化させることができることが分かった（図２参照）。【００４４】
Ｂ．γ−ＰＧＡナノ粒子によるＤＣのサイトカイン産生量の増加
実施例１記載の方法に従い得られたｉＤＣを、γ−ＰＧＡナノ粒子（７５、１５０または３００μｇ／ｍｌ）と共にインキュベーションした。２、６、２４、４８時間後の培養上清を回収し、ＤＣより産生、分泌されたサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＴＮＦ−α）をＥＬＩＳＡ法にて定量した。ネガティブコントロールとして、γ−ＰＧＡナノ粒子を含まない培地にて同じ時間インキュベーションしたｉＤＣ、そしてポジティブコントロールとして、ＬＰＳと共に同じ時間インキュベーションして得られたｍＤＣを用いた。γ−ＰＧＡナノ粒子は、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生量を増大させることが分かった（図３参照）。さらに、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生量の増大は、γ−ＰＧＡナノ粒子の濃度に依存して増強されることが分かった。これらのサイトカインは、ＤＣの分化成熟に伴い産生量が増加するため、γ−ＰＧＡナノ粒子はｉＤＣをｍＤＣへと分化誘導し、活性化することをさらに確認することができた。
【実施例３】
【００４５】
γ−ＰＧＡナノ粒子により分化誘導されたｉＤＣのＴリンパ球活性化作用
実施例１記載の方法に従い、ｉＤＣをγ−ＰＧＡナノ粒子（７５、１５０または３００μｇ／ｍｌ）を含む培地で２日間培養して分化誘導した。次に、得られた細胞を同種異系マウス由来Ｔリンパ球と４日間共培養した。その後、Ｔリンパ球を３Ｈ−チミジンと１６時間インキュベーションし、取り込み量を測定することにより、分化誘導されたｉＤＣのＴリンパ球活性化作用を調べた。ネガティブコントロールとして、γ−ＰＧＡナノ粒子を含まない培地にて培養したｉＤＣを、そしてポジティブコントロールとして、ＬＰＳにより分化成熟させて得られたｍＤＣを用いた。Ｔリンパ球の３Ｈ−チミジン取り込み量はｉＤＣを分化誘導する際のγ−ＰＧＡナノ粒子の濃度に依存して増加すること、すなわち、γ−ＰＧＡナノ粒子のＴリンパ球活性化作用は濃度に依存して増強されることが確認できた（図４参照）。
【実施例４】
【００４６】
ＨＩＶ−１抗原（ｐ２４）を内包するγ−ＰＧＡナノ粒子によるγ−インターフェロン産生細胞の誘導
６から８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを、ｐ２４抗原を内包するγ−ＰＧＡ（ｐ２４−ＮＰ）を用いて７日間隔で３回免疫した。コントロールとして、ＰＢＳ（ネガティブコントロール）、γ−ＰＧＡナノ粒子（ＮＰ）またはｐ２４抗原（ｐ２４）単独、ｐ２４抗原とγ−ＰＧＡナノ粒子の混合物（ｐ２４＋ＮＰ）を用いた。用いたγ−ＰＧＡナノ粒子およびｐ２４抗原の量は、１回の免疫当たりそれぞれ１ｍｇ、２５μｇであった。最終免疫の１０日後、脾臓から細胞を回収し、１０ｍｇ／ｍｌ  ｐ２４ペプチド（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号：１））または１０ｍｇ／ｍｌ  組換えｐ２４タンパク質と共に２４時間インキュベーションした。ｐ２４特異的ＩＦＮ−γ産生細胞数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（BD Bioscience）にて決定した。全データを１×１０６細胞当たりの平均スポット形成数（ＳＦＵ）±ＳＥを用いて表す。統計的有意性をｔ検定を用いて検定した。結果を図５に示す。ｐ２４単独免疫群およびｐ２４＋ＮＰ免疫群と比べて、ｐ２４−ＮＰ免疫群においてＩＦＮ−γ産生細胞が多く誘導されることが分かった。
【実施例５】
【００４７】
ＨＩＶ−１抗原（ｐ２４）を内包するγ−ＰＧＡナノ粒子による抗原特異的抗体の誘導
６から８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを、ｐ２４抗原を内包するγ−ＰＧＡナノ粒子（ｐ２４−ＮＰ）を用いて２週間間隔で２回免疫した（ｎ＝４）。コントロールとして、ＰＢＳ（ネガティブコントロール）、γ−ＰＧＡナノ粒子（ＮＰ）またはｐ２４抗原（ｐ２４）単独、およびｐ２４抗原とフロイントの完全アジュバントの混合物（ｐ２４＋ＣＦＡ）を用いた。用いたγ−ＰＧＡナノ粒子およびｐ２４抗原の量は、それぞれ１回の免疫当たり１ｍｇ、２５μｇであった。最終免疫の１０日後、血液を採取し、その血清中に含まれる抗原特異的抗体レベルを測定した。最終抗体価を、免疫していないマウスより２ＳＤ（約０．１）大きい吸光度（４５０ｎｍ）となる、最終希釈度の逆数として表す。統計的有意性をｔ検定を用いて検定した。結果を図６に示す。ｐ２４単独免疫群と比べて、ｐ２４−ＮＰ免疫群の血清における抗体価が非常に高いことが分かった。さらにこれは、既知のアジュバントであるＣＦＡを用いて免疫した群（ｐ２４＋ＣＦＡ）に匹敵する値であった。【００４８】
実施例４および５の結果から、本発明の抗原固定化生分解性ナノ粒子を含むワクチン、特に抗ＨＩＶワクチンの有効性が明らかとなった。また、γ−ＰＧＡナノ粒子がアジュバントとての効果を有することがさらに確認できた。
【実施例６】
【００４９】
ＯＶＡ固定化γ−ＰＧＡ（ポリ（γ−グルタミン酸））ナノ粒子を用いた腫瘍生着予防実験
Ａ．材料
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（雌性、６週齢）は日本ＳＬＣより、フロイントの完全アジュバントは、和光純薬工業より購入した。ＯＶＡ発現細胞であるＥＧ７細胞はAmerican Type Culture Collectionより購入し、培養には、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（和光純薬工業）を含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）を用いた。【００５０】
Ｂ．方法
γ−ＰＧＡ（分子量３００，０００）６０７ｍｇ（４．７ｕｎｉｔ  ｍｍｏｌ）を５４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３水溶液（ｐＨ８．５）１００ｍｌに溶解した。次に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）９０１ｍｇ（４．７ｍｍｏｌ）およびＬ−フェニルアラニンエチルエステル（Ｌ−ＰＡＥ）１０８０ｍｇ（４．７ｍｍｏｌ）を添加し、攪拌しながら室温で一晩反応させた。反応後、生じた溶液を透析膜（分子量分画５０，０００）を用いて水で３日間透析を行い、次に、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物をエタノール１００ｍｌに添加し、一晩攪拌した。生じた溶液を遠心分離（１，５００×ｇ、２０分間）し、沈殿物を減圧乾燥し、γ−ＰＧＡ−ｇ−Ｌ−ＰＡＥを得た。γ−ＰＧＡ−ｇ−Ｌ−ＰＡＥ  １００ｍｇをＤＭＳＯ  １０ｍｌに溶解して１０ｍｇ／ｍｌとし、次に１０ｍｇ／ｍｌ  γ−ＰＧＡ−ｇ−Ｌ−ＰＡＥと２ｍｇ／ｍｌ  ＯＶＡ（ＳＩＧＭＡ）溶液とを１ｍｌずつ当量混合し、反応させた。反応後、１４，０００×ｇにて１５分間遠心した。上清を除去し、ＰＢＳにて再分散を行った。この操作を繰り返し、未反応のＯＶＡを除去した。最終的に、１０ｍｇ／ｍｌ  ＯＶＡ内包γ−ＰＧＡナノ粒子を製造した。このように両親媒化γ−ＰＧＡは、蛋白質溶液に分散させるだけで目的蛋白質を簡便かつ効率よく、均一に内包し得ることが分かった。【００５１】
マウスへの免疫は、ＯＶＡ  １００μｇ、１０μｇを含むサンプル  １００μｌを皮下注射することにより行った。フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）を当量の２ｍｇ／ｍｌ  ＯＶＡ蛋白質溶液と充分に混和し、エマルジョン化したものをコントロールとして用いた。免疫の１週間後、ＥＧ７細胞をマウス１匹当たり１×１０６細胞／５０μｌにて腹部への皮内注射により播種した。ＥＧ７細胞播種後、腫瘍径を経日的に測定し、以下に示す式に従い腫瘍体積を算出した。
（腫瘍体積：ｍｍ３）＝（腫瘍の長径：ｍｍ）×（腫瘍の短径：ｍｍ）２×０．５２３６【００５２】
Ｃ．結果
図７に示すように、ＰＢＳで免疫した群と比較して、ＯＶＡ内包γ−ＰＧＡナノ粒子で免疫した群（γ−ＰＧＡ／ＯＶＡナノ粒子（１００）または（１０））では、顕著な腫瘍増殖遅延を確認した。ＯＶＡを含まないγ−ＰＧＡナノ粒子およびＯＶＡにより免疫した群（ｅｍｐｔｙ  γ−ＰＧＡナノ粒子／ＯＶＡ（１００）または（１０））において、若干の腫瘍生着遅延が見られたが、これはγ−ＰＧＡナノ粒子表面に吸着したＯＶＡが抗原提示細胞内に取り込まれたことによるものだと考えられる。これらの結果より、γ−ＰＧＡナノ粒子が抗原提示細胞に取り込まれやすい性質を有していることが示される。さらに、本実施例で得られたＯＶＡ内包γ−ＰＧＡナノ粒子は、現在動物実験レベルで最も強いＣＴＬ誘導能を保持していることが知られているフロイント完全アジュバント免疫群（ＣＦＡ／ＯＶＡ（１００））よりも、強力な抗腫瘍効果を示した。また、本実施例で得られたＯＶＡ内包γ−ＰＧＡナノ粒子は凍結乾燥により保存が可能であり、細胞毒性も認められないことが確認され、ワクチン担体およびアジュバントとしての条件を十分に兼ね備えていることがわかった。
【実施例７】
【００５３】
ＯＶＡ固定化γ−ＰＧＡナノ粒子を用いたＣＴＬ誘導実験
Ａ．材料
ＯＶＡ発現ＥＬ４細胞は東北大学加齢研究所・癌細胞保存施設より供与いただき、培養には、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（和光純薬工業）、および１０％  牛胎児血清（ＦＢＳ）を含む、完全ＲＰＭＩ１６４０倍地（ＳＩＧＭＡ社）を用いた。マイトマイシンＣは和光純薬工業、組換えマウスＩＬ−２はPeprotech社、そしてＮａ２５１ＣｒＯ４はAmersham Bioscience社より購入した。Ｃ５７／ＢＬ６マウス、フロイントの完全アジュバント、ＥＧ７細胞については、実施例６に記載の通りである。【００５４】
Ｂ．方法
ＯＶＡ内包γ−ＰＧＡナノ粒子を実施例６に記載のように製造した。マウスへの免疫は、ＯＶＡ  １００μｇ、２５μｇを含むサンプル  １００μｌを皮下注射することにより行った。免疫の１０日後、脾臓細胞をナイロンメッシュに通し単一細胞とし、単核球を回収した。それぞれの免疫マウスより回収した単核球（４×１０６細胞／ｍｌ）を、３０μｇ／ｍｌ  マイトマイシンＣで３０分間処理したＥＧ７（４×１０５細胞／ｍｌ）と、１０Ｕ／ｍｌ  マウスＩＬ−２を含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で５日間共培養（３７℃、５％  ＣＯ２）し、エフェクター細胞とした。標的細胞には、Ｎａ２５１ＣｒＯ４で標識（０．５６  ＭＢｑ／１０６細胞、３７℃、１時間）したＥＬ４細胞およびＥＧ７細胞を用いた。標的細胞を１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに入れ、次に、エフェクター細胞を１２．５、２５、５０、１００×１０４細胞／ウェルの濃度で加え、３７℃にて４時間インキュベーションし、上清中の５１Ｃｒ活性を測定した。ＣＴＬ活性を以下に示す式に従い算出した。
溶解（％）＝１００×｛（エフェクター細胞による５１Ｃｒ遊離量）−（自然５１Ｃｒ遊離量）｝／｛（最大５１Ｃｒ遊離量）−（自然５１Ｃｒ遊離量）｝【００５５】
Ｃ．結果
γ−ＰＧＡナノ粒子を用いて免疫したマウスの脾臓において、ＯＶＡ特異的ＣＴＬの誘導が認められた（図８（ａ）および（ｂ））。これは、ＣＦＡ／ＯＶＡ免疫群（図８（ｄ））よりも強力な抗腫瘍作用を示した。ＯＶＡ単独免疫群ではＣＴＬ活性は全く認められなかった（図８（ｅ））。ｅｍｐｔｙ  γ−ＰＧＡナノ粒子／ＯＶＡ群（図８（ｃ））において、若干のＣＴＬ活性が見られたが、これはγ−ＰＧＡナノ粒子表面に吸着したＯＶＡが抗原提示細胞内に取り込まれたことによるものであると考えられる。これらの結果から、生分解性であるγ−ＰＧＡナノ粒子が抗原提示細胞に取り込まれやすい性質を有していること、ならびにＣＴＬ誘導抗原キャリアーおよびアジュバントとして極めて優れた性能を有していることが示された。
【実施例８】
【００５６】
Ｔａｘ３８−４６固定化γ−ＰＧＡナノ粒子を用いたＣＴＬ誘導実験
Ａ．材料
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（雌性、６週齢）は日本ＳＬＣより購入した。マウス繊維芽細胞（Ｌ９２９）はＡＴＣＣより購入し、培養には、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（和光純薬工業）、および１０％  牛胎児血清（ＦＢＳ）を含む、完全ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社）を用いた。Ｔａｘ３８−４６ペプチドはＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社より購入した。フロイントの完全アジュバント、Ｎａ２５１ＣｒＯ４に関しては、上記の通りである。【００５７】
Ｂ．方法
ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）のマウスＨ−２ＫＫ拘束性エピトープである、Ｔａｘ３８−４６ペプチド内包γ−ＰＧＡナノ粒子を実施例６の記載のように製造した。マウスへの免疫は、Ｔａｘ３８−４６ペプチド  １００ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌを含むサンプル  １００μｌずつ、１週間おきに計３回皮下注射するこで行った。最終免疫の１０日後、実施例７に記載のように単核球を回収した。単核球（１×１０７細胞／ｍｌ）を、３０μｇ／ｍｌ  マイトマイシンＣで３０分間処理し、１μＭ  Ｔａｘ３８−４６ペプチドを作用させたＬ９２９細胞（２．５×１０６細胞／ｍｌ）と４：１の割合で混合し、１０Ｕ／ｍｌ  マウスＩＬ−２を含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で５日間共培養（３７℃、５％  ＣＯ２）し、エフェクター細胞とした。標的細胞には、１μＭ  Ｔａｘ３８−４６ペプチドを作用させたＬ９２９細胞をＮａ２５１ＣｒＯ４で標識（０．５６  ＭＢｑ／１０６細胞、３７℃、１時間）したものを用いた。標的細胞を１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに入れ、次に、エフェクター細胞を１２．５、２５、５０、１００×１０４細胞／ウェルの濃度で加え、３７℃にて４時間インキュベーションし、上清中の５１Ｃｒ活性を測定した。ＣＴＬ活性を以下に示す式に従い算出した。
溶解（％）＝１００×｛（エフェクター細胞による５１Ｃｒ遊離量）−（自然５１Ｃｒ遊離量）｝／｛（最大５１Ｃｒ遊離量）−（自然５１Ｃｒ遊離量）｝【００５８】
Ｃ．結果
図９（ａ）に示すように、γ−ＰＧＡナノ粒子を用いて免疫したマウスの脾臓において、ＰＢＳ免疫群（図９（ｄ））と比較して、Ｔａｘ３８−４６特異的ＣＴＬの誘導が認められた。これは、ＣＦＡ／Ｔａｘ３８−４６免疫群（図９（ｂ））よりも強力な抗腫瘍作用であった。また、Ｔａｘ３８−４６単独免疫群ではＣＴＬ活性は全く認められなかった（図９（ｃ））。この実施例で得られたＴａｘ３８−４６固定化ナノ粒子もまた、実施例６および７で得られたものと同様の性質・特徴を有していた。
【実施例９】
【００５９】
ＯＶＡ固定化γ−ＰＧＡナノ粒子を用いた腫瘍肺転移抑制試験
Ａ．材料
Ｂ１６メラノーマ細胞にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子と共にＯＶＡ  ｃＤＮＡを導入したＢ１６−ＯＶＡ細胞は熊本大学大学院医学薬学研究部免疫識別学分野  西村泰治先生より供与いただき、培養には１０％  ＦＢＳ、５０μＭ  ２−ＭＥおよび２００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢを含むＤＭＥＭを用いた。Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Ｈ−２ｂ；７〜１０週齢、雌性）は日本ＳＬＣより購入した。その他の材料は上述の通りである。【００６０】
Ｂ．方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈内にＢ１６−ＯＶＡ細胞（１×１０６細胞）を投与した。接種後０、３、７日目に、上述の通り製造したＯＶＡ内包γ−ＰＧＡナノ粒子（γ−ＰＧＡナノ粒子／ＯＶＡ）、ＣＦＡによりエマルジョン化したＯＶＡ（ＣＦＡ／ＯＶＡ）またはＯＶＡ溶液（ＯＶＡ単独）を背部皮下に投与することで免疫した（ｎ＝９）。用いたＯＶＡは１００μｇであった。ネガティブコントロールとしてＰＢＳを投与した。２５日目に肺を摘出してブアン溶液（ピクリン酸飽和溶液：ホルムアルデヒド：氷酢酸＝１５：３：１）にて固定し、肺表面の転移コロニー数を実体顕微鏡下で計測した。統計的有意性をマン・ホィットニー検定を用いて検定した。結果を、ＰＢＳ投与群における転移コロニー数に対する割合（％）として表す（図１０）。【００６１】
Ｃ．結果
γ−ＰＧＡナノ粒子／ＯＶＡ免疫群（ｐ＜０．０１）は、高い肺転移能を有するＢ１６−ＯＶＡ細胞の肺への生着を妨げる肺転移抑制効果を有することが確認できた。さらにその効果はＣＦＡ／ＯＶＡ（ｐ＜０．０１）よりも強力なものであった。また、γ−ＰＧＡナノ粒子／ＯＶＡが治療においても有用であることが確認できた。
【実施例１０】
【００６２】
γ−ＰＧＡナノ粒子投与局所の病理組織学的解析によるγ−ＰＧＡナノ粒子の安全性の評価
Ａ．方法
１０ｍｇ／ｍｌ  γ−ＰＧＡナノ粒子、等量のＰＢＳでエマルション化したＣＦＡおよびＩＦＡ、またはＰＢＳ（２０μｌ／マウス）をマウス足蹠皮下に投与した。投与後７日目に足蹠を切断し、１０％  中性緩衝ホルマリンによる固定処理を行った後、パラフィンブロックに包埋した。５μｍの組織切片を作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色した標本の病理組織学的観察を行った。
Ｂ．結果
ＣＦＡおよびＩＦＡを投与したマウスの皮下組織において炎症反応が誘導されているのに対して、γ−ＰＧＡナノ粒子は投与局所に若干の障害を与えるのみであり、観察された炎症性細胞の浸潤も僅かななものであった（データは示していない）。γ−ＰＧＡナノ粒子が高い安全性を有することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明により、安全かつ有効なアジュバントおよびそれを利用したワクチンが得られるので、医薬品等の分野、例えば、疾病の予防薬、治療薬あるいは診断薬の製造分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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