(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
家族性アルツハイマー病で同定されたプレセニリン１変異のうちの少なくとも５つの変異を有するヒトプレセニリン１形態を発現し、アポトーシスに対する感受性の増大を示す、トランスジェニックマウスであって、
前記変異が、互いに組み合わされているＭ１４６Ｌ、Ｈ１６３Ｒ、Ａ２４６Ｅ、Ｌ２８６Ｖ、Ｃ４１０Ｙであることを特徴とする、前記トランスジェニックマウス。
【請求項２】
ＰＳ１の発現は、遍在プロモーター配列の調節下に置かれる、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
神経変性疾患の治療を意図する化合物の検出用の請求項１〜２のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウスの使用。
【請求項４】
アルツハイマー病の治療を意図する化合物の検出用の請求項１〜２のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウスの使用。
【請求項５】
請求項１〜２のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウスから抽出された細胞であって、家族性アルツハイマー病で同定されたプレセニリン１変異のうちの少なくとも５つの変異を有するプレセニリン１形態を発現し、アポトーシスに対する感受性の増大を示す、前記細胞。
【請求項６】
神経変性疾患の治療を意図する化合物の検出用の請求項５に記載の細胞の使用。
【請求項７】
アルツハイマー病の治療を意図する化合物の検出用の請求項５に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック動物モデル、より詳細には、アルツハイマー病の動物モデルの分野に関する。本発明は、プレセニリン１の多変異形態を発現し、再生可能な末梢組織のアポトーシス現象を検出することができるトランスジェニック動物に関する。
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老人の大多数が発症する進行性神経変性疾患である。この疾患は、臨床レベルでは記憶の喪失および認知機能の低下とて特徴づけられ、神経病態レベルでは細胞内に神経原線維が蓄積した脳およびアミロイド斑を形成するβアミロイド（Ａβ）ペプチドの細胞外蓄積（Ｙａｎｋｅｒら、１９９６）ならびに明白なニューロンの喪失として特徴づけられている。これらの徴候に加えて、非常に多くの他の異常な変化（フリーラジカルに対する保護機構の障害を含む）が存在する。
【０００３】
アミロイド斑は主に、βアミロイドペプチド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解過程の間に生成される４０〜４２個の残基を含むＡβペプチドから構成されている。Ａβの細胞外蓄積は、ＡＤおよび関連障害で非常に特異的である。これらは家族性形態（ＦＡＤ）を含む全てのＡＤ形態の初期のおよび不変の特徴である。ＦＡＤは比較的早期（４０歳と６０歳との間）に発症し、５％のＦＡＤ症例ではＡＰＰ遺伝子の変異（同定された６つの一または二ミスセンス変異を有する）、５０〜７０％のＦＡＤの症例ではプレセニリン１（ＰＳ１）遺伝子の変異（現在、４０個の異なる変異が同定されている）、より少ないＦＡＤ症例ではプレセニリン２（ＰＳ２）遺伝子の変異（記載の２つのミスセンス変異を有する）による（総説として、Ｐｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｓｉｓｏｄｉａ、１９９８を参照のこと）。これら３つの遺伝子の変異は、Ａβ（特に、長期Ａβ４２）の過剰発現およびＡＤの散発性形態と類似の病態および症状の早期発症を誘導するＡＰＰのタンパク質分解の変化を誘導することが示されている。
【０００４】
現在記載されているトランスジェニック動物モデルでは、ＡＤに匹敵する神経損失の徴候は、ニューロンレベルまたはその直接的近傍、特にアポトーシス現象のみで表示されている（Ｃｈｉｕら、１９９９）。しかし、これらのモデルには、いくつかの不利益（特に、ＡＤの徴候の出現を監視するために非常に多数の動物を交配させる必要があること（ほとんどが長期間にわたる（２４日月にも及び得る）、病理学を研究するための計画的屠殺、およびそれによる特に退屈で高価な実験プロトコールを含む）が存在する。
【０００５】
したがって、症状、特に末梢組織におけるＡＤを伴う細胞死の現象を測定可能なＡＤの動物モデルは存在しない。
【０００６】
したがって、本発明は、末梢組織におけるＡＤを伴う症状、特にアポトーシスを測定可能な神経病理学の代表的な新規動物モデルの研究の結果である。
【０００７】
したがって、本発明の第１の主題は、多変異プレセニリン１を発現するアルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルに関する。
【０００８】
トランスジェニック動物は、そのゲノムの修飾を提示するすべての非ヒト動物を意味すると理解される。ゲノムの修飾は、「ノックイン」または「ノックアウト」による１つまたは複数の遺伝子の障害または修飾に起因し得る。この修飾は、従来の障害または変異誘発因子の作用に起因し得るか、「材料と方法」に記載のように部位特異的変異誘発に起因し得る。
【０００９】
ゲノムの修飾はまた、野生型または変異形態の遺伝子の挿入または遺伝子の置換に起因し得る。
【００１０】
ゲノムの修飾は、生殖幹細胞、好ましくは前核で行われるのが有利である。
【００１１】
本発明の文脈では、動物モデルは哺乳動物であることが有利である。特に、これは、従来の形質転換技術を使用して得られるマウス、ラット、またはウサギであり得る。形質転換手順の１つを示す例として、「材料と方法」に記載の２つの受精前核中に修飾遺伝子を含む発現カセットの微量注入法であり得る。
【００１２】
これに関して、核酸を含む発現カセットの注入によって本発明の動物モデルを得る。この核酸は、ＤＮＡであることが好ましく、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であっても相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい。
【００１３】
本発明のモデルの文脈において、ＤＮＡは、動物モデルの細胞が多変異タンパク質を発現するように任意のＰＳ１遺伝子をコードする。
【００１４】
非変異ヒトＰＳ１タンパク質配列は、Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９５に記載されている。多変異タンパク質は、互いに組み合わされているか関連する（すなわち、タンパク質中に同時に存在する）少なくとも３つの変異を含むＰＳ１タンパク質を意味すると理解される。本発明の好ましい実施形態によれば、ＤＮＡは５つの変異を含むＰＳ１遺伝子（ＰＳ１Ｍ５）をコードする。
【００１５】
ＰＳ１遺伝子中の変異は、現在文献に記載されている４０の変異の１つであり得る。好ましくは、ＰＳ１遺伝子中の変異は、Ｍ１４６Ｌ、Ｈ１６３Ｒ、Ａ２４６Ｅ、Ｌ２８６Ｖ、Ｃ４１０Ｙ、Ｉ１４３Ｔ、Ｌ２３５Ｐ、Ｐ２６４Ｌ、Ｐ２６７Ｓ、Ｅ３１７Ｇ、Ｇ３８４Ａ、Ｌ３９２Ｖ、Ａ４２６Ｐ、および／またはＰ４３６Ｓである。これらは、互いに部分的に組み合わされている。
【００１６】
本発明のモデルの作製には、互いに組み合わされた変異Ｍ１４６Ｌ、Ｈ１６３Ｒ、Ａ２４６Ｅ、Ｌ２８６Ｖ、Ｃ４１０Ｙが好ましい。
【００１７】
本発明のモデルでは、ＤＮＡは、発現可能な配列、特に転写プロモーター配列の調節下に置かれている。
【００１８】
プロモーター配列は、特にＨＭＧプロモーター（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８９）、ＰＤＧＦプロモーター（Ｓａｓａｈａｒａら、１９９１）、Ｔｈｙ−１プロモーター（Ｌｕｔｈｉら、１９９７）、およびプリオン遺伝子プロモーター（Ｓｃｏｔｔら、１９９２）であり得る。
【００１９】
本発明の特に有利な実施形態によれば、動物モデルは、ＨＭＧプロモーターの調節下に置かれたＭ１４６Ｌ、Ｈ１６３Ｒ、Ａ２４６Ｅ、Ｌ２８６Ｖ、Ｃ４１０Ｙ変異を有するＰＳ１遺伝子を含む。
【００２０】
本発明の動物モデルは、ＡＤにおける細胞死現象を代表する実用モデルに対応しているので非常に有利である。実際、このモデルは、特に細胞のアポトーシスおよび酸化ストレスを含むＡＤを伴う症状を示し、さらに、再生可能な末梢組織細胞におけるこれらの症状を測定可能にする。これらの動物の脳内で酸化ストレス自体もまた出現することに留意すべきである。再生可能な末梢組織は、長期間これらの細胞を再生するいずれもの組織を意味すると理解されるべきである。再生可能な末梢組織の例は、脾臓、肝臓、血液などであり得る。好ましくは血液細胞、さらにより好ましくはリンパ球におけるアポトーシス現象を測定する。リンパ球のうち、本発明にはＴリンパ球が好ましい。
【００２１】
したがって、実施例に記載の結果は、変異ＰＳ１を発現するトランスジェニックマウスはアルツハイマー病に見出される細胞障害を発症し、特にアポトーシス感受性が増大すること示す。さらに、この現象は、Ｍ１４６Ｌ型の単純な天然の病理学的変異体では認められない。この表現型は、特に、同一のｃＤＮＡ上にいくつかの個々の変異、好ましくは５変異をグループ化した非天然の形態を用いて得られる。さらに、遍在プロモーターによる導入遺伝子の異所性発現にもかかわらず、このモデルにより再生可能な末梢組織におけるアポトーシス現象（アルツハイマー病における変異に関連する）を検出可能である。したがって、このモデルにより、さらにより実用的な供給源（動物を屠殺する必要がない）が得られるので、長期的監視が可能である。
【００２２】
さらに、このモデルで非常に明白に認められるカルシウムおよびフリーラジカルの代謝障害は、アルツハイマー病で認められるカルシウム反応および酸化ストレス潜伏期間の増加に類似するので（Ｅｃｋｅｒｔら、１９９７および１９９８）、このモデルの妥当性を高める。
【００２３】
したがって、本発明はまた、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の治療を意図した化合物の検出用の上記の動物モデルの使用に関する。
【００２４】
実際、その有利な性質にもかかわらず、このモデルは、既知のモデルと比較して、特にヒトのＡＤの治療に適切な化合物の検出が可能である。
【００２５】
これらの化合物は、化学分子、ペプチドまたはタンパク質分子、抗体、キメラ分子ならびにアンチセンスＤＮＡまたはリボザイムであり得る。
【００２６】
検出される化合物は、単独でまたは薬学的組成物を得るために薬学的に受容可能な媒介物と組み合わせた薬物として使用することができる。これには、特に等張の滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどまたはこのような塩の混合物）または場合によっては滅菌水または生理食塩水を添加して注射用溶液を構成可能な乾燥、特に凍結乾燥組成物を含み得る。定位的、局所的、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮経路などによって注射を行うことができる。
【００２７】
上記化合物の検出は、特に注射などでの投与による本発明の動物モデルと作用が推定される化合物または化合物の混合物との接触および異なる生化学的および／または組織学的変化（例えば、アポトーシス、細胞内カルシウム、フリーラジカルレベルなどを含む「方法と結果」に記載のものなど）に対する特にモデルの末梢組織レベルでの化合物の効果の測定に基づく。
【００２８】
本発明の別の主題は、上記の動物モデルから取り出した細胞に関し、および神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の治療を意図する化合物の検出での使用に関する。
【００２９】
上記の化合物の検出は、本発明の動物モデルから取り出した細胞と作用が推定される化合物または化合物の混合物との接触および異なるパラメータ（細胞死、Ａβペプチドの生成、フリーラジカルの生成など）に対する全細胞、細胞ホモジネート、または細胞成分分画レベルでの化合物の効果の測定に基づく。
【００３０】
実施例に記載の結果により本発明のモデルの利点が示され、このトランスジェニックモデルの治療ストラテジー（特に抗アポトーシス薬またはより一般的にはＡＤを伴う細胞死制限薬の開発など）における簡単で迅速な測定および監視ツールとしての使用が明白に支持される。
【００３１】
本発明を、以下の実施例を用いてより詳細に記載するが、これらは例示と解釈されるべきであり、限定と解釈されるべきではない。
【００３２】
（図面の簡単な説明）
図１は、トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５（レーン１、５、９）、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌ（レーン２、６、１０）、ＰＳ１ｗｔ（３、７、１１）、および非トランスジェニック（レーン４、８、１２）におけるヒトＰＳ１の発現の分析を示す図である。以下のトランスジェニックマウス組織：リンパ球（レーン１〜４）、脾臓（レーン５〜８）、および脳（レーン９〜１２）を溶解し、ヒトＰＳ１配列（ＰＳ１のＮ末端領域中のエピトープ）に特異的な抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。ホロタンパク質ＰＳ１（約５０ｋＤａ）およびそのＮ末端フラグメントが認められる。導入遺伝子の発現は、３つのトランスジェニックマウスで認められる。タンパク質ＰＳ１Ｍ５のタンパク質内分解切断は認められない。
【００３３】
図２は、基底条件下でのトランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ１４６ＬおよびＰＳ１Ｍ５由来のリンパ球のアポトーシスの増加を示す図である。解離リンパ球における基底条件下でのアポトーシスレベルを測定した。ＰＳ１Ｍ５リンパ球は、ＰＳ１ｗｔ（＊、ｐ＜０．０５）または非トランスジェニック同腹子コントロール（＊＊、ｐ＜０．０５）と比較してより高いアポトーシスレベルを示す。これは、同腹子コントロール（＋、ｐ＜０．０５）と比較したＰＳ１Ｍ１４６Ｌリンパ球にも当てはまる。
【００３４】
図３は、トランスジェニックマウス由来のリンパ球の２．５時間のインキュベーション後のアポトーシスを示す図である。２．５時間のインキュベーション後、ＰＳ１Ｍ５リンパ球は、Ｐｓ１ｗｔ、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌ、または非トランスジェニックコントロール（同腹子）と比較して有意に高いアポトーシスレベル（＊＊＊、ｐ＜０．００１）を示す。
【００３５】
図４は、トランスジェニックマウス由来のリンパ球のデオキシリボース処理によって誘導されたアポトーシスを示す図である。デオキシ−Ｄ−リボース（１０ｍＭ）でのインキュベーション後、アポトーシスレベルは、他の群よりＰＳ１Ｍ５群で有意に高い（＊＊、ＰＳ１ｗｔおよびＰＳ１Ｍ１４６Ｌに対してｐ＜０．０１；＊＊＊、同腹子に対してｐ＜０．００１）。
【００３６】
図５は、トランスジェニックマウス由来のリンパ球の過酸化水素処理によって誘導されたアポトーシスを示す図である。過酸化水素（１ｍＭ）での誘導後、アポトーシスレベルは、他の群よりＰＳ１Ｍ５群で有意に高い（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。他の群の間に相違は認められない。
【００３７】
図６は、トランスジェニックマウス由来のリンパ球のデキサメタゾン処理によって誘導されたアポトーシスを示す図である。デキサメタゾン（１０−７Ｍ）での誘導後、アポトーシスレベルは、他の群よりＰＳ１Ｍ５群で有意に高い（＊、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌおよび同腹子に対してｐ＜０．０５；＊＊、ＰＳ１ｗｔに対してｐ＜０．０１）。他の群の間に相違は認められない。
【００３８】
図７は、トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球中のフリーラジカルレベルの増加を示す図である。フローサイトメトリー（ローダミン１２３）によるマウスリンパ球中の酸化ラジカル種（反応性酸素種）レベルを測定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）で示した。他の群と比較して、トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球中のＲＯＳレベルは有意に高い（＊、ＰＳ１ｗｔに対してｐ＜０．０５；＊＊、同腹子に対してｐ＜０．０１）。
【００３９】
図８は、トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球中の細胞内カルシウム動員の増加を示す図である。停止（基底）条件下の［Ｃａ２＋］ｉレベルを測定した。細胞内カルシウムレベルは、他の群よりトランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球で高い。他の群の間に相違は認められない。
【００４０】
図９は、ＰＨＡでの刺激後のトランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球中の細胞内カルシウム反応の増加を示す図である。ＰＨＡ（１５μｇ／ｍｌ）での分裂促進刺激後および刺激前の［Ｃａ２＋］ｉレベル間の相違が認められた。トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球は、他の群より刺激に対して強力に反応する（ｐ＜０．０１）。他の群の間に相違は認められない。
【００４１】
図１０は、トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５およびＰＳ１Ｍ１４６Ｌのリンパ球中の細胞内カルシウムのより遅い動員の潜伏を示す図である。トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球におけるＰＨＡでの分裂促進刺激後に［Ｃａ２＋］ｉがピークに達するまでの時間間隔は長くなり（＊＊、Ｐｓ１ｗｔおよび同腹子に対してｐ＜０．０５）、トランスジェニックマウスＰＳＭ１４６Ｌについてはより程度が低い（＊、Ｐｓ１ｗｔに対してｐ＜０．０５）。マウスＰＳ１ｗｔと非トランスジェニックコントロール（同腹子）の間に相違は認められない。
【００４２】
図１１は、フリーラジカルの保護機構に対するトランスジェニックマウスの脳内のＰＳ１のヒト変異の効果を示す図である。Ａ）酵素スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）の活性レベル。Ｂ）酵素グルタチオンレダクターゼの活性レベル。Ｃ）ＦｅＣｌ３での刺激後の脂質過酸化レベル。トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５の脳内でフリーラジカル（ＳＯＤおよびＧＲ）の解毒機構における有意な減少が認められ（＊、ＰＳ１ｗｔに対してｐ＜０．０５；＊＊、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌに対してｐ＜０．０５）、マウスＰＳ１Ｍ１４６Ｌでは減少傾向を示す。それに対して、刺激脂質過酸化レベルは（フリーラジカルの存在による）、マウスＰＳ１Ｍ５で増加する。
【００４３】
材料と方法
１．プレセニリン１−ＰＳ１の変異誘発
初期ＡＴＧレベルでコザック配列を含むＰＳ１のヒトｃＤＮＡは、以前に記載されている（Ｐｒａｄｉｅｒら、１９９９）。Ｓｃｕｌｐｔｏｒ（商標）インビトロ変異誘発キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ＰＳ１の変異誘発を行った。ＰＳ１のコード領域を、ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化し、一本鎖ＤＮＡを調製した。供給者の指示に従って所望の変異を含むオリゴヌクレオチドを用いて、本発明で使用する５つの変異を移入した：
Ｍ１４６Ｌ、５’ＧＡＧＧＡＴＡＧＴＣＧ＊ＴＧＡＣＡＡＣＡＡＴ３’（配列番号１）、
Ｈ１６３Ｒ、５’ＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣ＊ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴ３’（配列番号２）、
Ａ２４６Ｅ、５’ＧＡＴＧＡＧＣＣＡＴ＊ＧＣＡＧＴＣＣＡＴＴＧ３’（配列番号３）、
Ｌ２８６Ｖ、５’ＧＧＡＧＴＡＡＡＴＧＣ＊ＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡ３’（配列番号４）、
Ｃ４１０Ｙ、５’ＧＧＣＴＡＣＧＡＡＴ＊ＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴ３’（配列番号５）、
＊は相補鎖に移入したヌクレチド変異の位置を示す。５つの組み合わせ変異を含む構築物を得るために、５連続変異誘発を行った。ＰＳ１  ｃＤＮＡの前配列を、各変異誘発についてチェックし、望ましくない変異が存在しないことを確認した。
【００４４】
２．トランスジェニックマウスの作製および同定
導入遺伝子の構築のために、野生型ＰＳ１、ＰＳ１Ｍ１４６、およびＰＳ１Ｍ５のｃＤＮＡを、トランスジェニック発現ベクターＨＭＧの多クローニング部位のＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ制限部位にサブクローニングした（Ｃｚｅｃｈら、１９９７）。ｃＤＮＡを、導入遺伝子の遍在的発現を可能にするＨＭＧレダクターゼ部分的プロモーターの制御下に置く。微量注入のために、発現カセットを酵素ＮｏｔＩでの制限切断後のゲル電気泳動によって生成して、ベクター由来の重要でない配列を除去した。最終濃度２．５ｎｇ／μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液の精製導入遺伝子および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを取り、受精マウス卵母細胞の２つの前核のうちの１つに注入した。生き残った胚を、養母の卵管に移植する。導入遺伝子の存在を、ＰＣＲおよびサザンによって分析した。配列（配列番号６）５’−ＴＡＡ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  Ｃ−３’および（配列番号７）５’−ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＡＡＧ−３’を有するヒトＰＳ１配列に特異的なオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲを行い、５５０ｂｐの増幅フラグメントを得た。サザン分析のために、ＨＭＧ発現カセットの第１のイントロンに対応する１．２ｋｂのＰｓｔＩ−ＳａｌＩフラグメントをα３２Ｐで標識し、導入遺伝子および内因性ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の検出用のプローブとして使用した。後者の分析によって、導入遺伝子内にいかなる主要な再構成もいかなる欠失も存在しないことを証明することができる。動物取扱についてのフランスでの規則にしたがって、マウスを交配した。
【００４５】
３．免疫ブロッティング
トランスジェニックマウス（ＰＳ１ｗｔ、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌ、およびＰＳ１Ｍ５）および非トランスジェニックコントロールマウス（同腹子）の脳組織および脾臓を、氷上のプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む０．３２Ｍスクロース溶液中でホモジナイズした。細胞破片を４℃、１５００ｇで５分間の遠心分離によって除去した。精製細胞の画分から同一の様式でリンパ球溶解物を調製した。上清中のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質試験（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を使用して測定した。ＰＳ１の検出のために、２５μｇのタンパク質抽出物を、８Ｍ尿素および５０ｍＭジチオスレイトールを含む５６℃のＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液中で２０分間インキュベートした。タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分画した。タンパク質をニトロセルロースフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｆｒａｎｃｅ）に移した後、フィルターをＰＢＳ中で５分間加熱して感度を上げ、直ちに５％（ｗ／Ｖ）の脱脂粉乳のＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）溶液中で１時間飽和し、ヒト抗ＰＳ１一次抗体（Ａｂ）、ＭＡＢ１５６３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）と共に４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ緩衝液のみで１／１０，０００に希釈した。抗体の結合を、製造者の指示に従って西洋ワサビペルオキシダーゼと抱合した抗ＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｆｒａｎｃｅ）および化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｆｒａｎｃｅ）で検出した。
【００４６】
４．リンパ球の調製
リンパ球を、新たに分離したマウス脾臓から調製した。脾臓を、ＲＰＭＩ緩衝液中でホモジナイズし、ホモジネートを１０ミクロンのフィルターに通した。細胞ホモジネートを遠心分離および再懸濁で数回洗浄する。赤血球の溶解後、細胞数を、顕微鏡での計数によって決定する。
【００４７】
Ｔリンパ球を得るために、抗Ｂ細胞抗体を保有する磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍｏｕｓｅ  ｐａｎ  Ｂ、Ｄｙｎａｌ、Ｎｏｒｗａｙ）への付着およびビーズの分離によってＢ細胞を対抗選択した。フローサイトメトリー分析で同定したところ、残存細胞は、８０％以上がＴリンパ球（ＣＤ３陽性）である。
【００４８】
５．アポトーシスの測定
アポトーシス細胞の割合を定義するＧ１期のＤＮＡ含量を測定するために、種々の処理時間後に、Ｔリンパ球を遠心分離で分離し、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ、Ｍｕｎｉｃｈ）を含む溶解緩衝液（０．１％クエン酸ナトリウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の細胞ペレットを取り出した。サンプルを４℃で１〜２時間保存後、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｎｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア）を行った。細胞死を以下の種々の処理によって誘導した：２−デオキシ−Ｄ−リボース（ｄ−Ｒｉｂ、１０ｍＭ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、１ｍＭ）、およびデキサメタゾン（ｄｅｘ、１０−７Ｍ）で２．５時間。未処理で測定した細胞死を、インビトロ自発的アポトーシスと定義する。
【００４９】
６．細胞内カルシウムの測定
ＲＰＭＩ緩衝液中のＴ細胞画分を取り出し、Ｆｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の存在下でインキュベートする。ＨＢＳＳ緩衝液の添加によってインキュベーションを終了させ、数回遠心分離によって上清を洗浄して培地由来の色素を除去する。最終的に、ＨＢＳＳ緩衝液中のＴ細胞画分を取り出し、細胞内カルシウムの測定まで氷上で保存する。
【００５０】
Ｆｕｒａ−２蛍光を、以前に記載されているように（Ｅｃｋｅｒｔら、１９９３）波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起および５１０ｎｍで発光させるＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ発光分光計を使用して測定した。細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉを、２２４ｎＭのＫｄ値を使用した以前に記載のＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚの比（Ｅｃｋｅｒｔら、１９９７）から計算した。リンパ球におけるカルシウム動員の刺激物質として、ＰＨＡ−Ｐ（Ｓｉｇｍａ、Ｍｕｎｉｃｈ）を１５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。
【００５１】
７．フリーラジカルの測定
フリーラジカル（ＲＯＳ）の生成を、蛍光顕示剤としてジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用したフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｎｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって定量した。細胞を、ＤＨＲ（最終濃度１０μＭ）の存在下の１ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液中で再懸濁し、振盪浴上で３７℃で１５分間インキュベートする。ＤＨＲのその蛍光誘導体ローダミン１２３への変換を定量し、平均慶応強度（ＭＦＩ）として示す。
【００５２】
８．脳組織の調製
３〜４月齢のマウスを使用し、断頭によって屠殺した。脳を取り出し、氷上の緩衝液中で強く洗浄した。組織（小脳を含む）を秤量し、直ちに−２０℃で凍結した。組織をそれぞれ５ｍＭおよび２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中でＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを使用してホモジナイズして、それぞれ１／１０および１／５（重量／体積）に希釈したホモジネートを得た。
【００５３】
９．ＣｕＺｎＳＯＤおよびグルタチオンレダクターゼ活性の試験
脳ホモジネート（１／５  ｗ／ｖ）を、４℃、８５００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を使用して、ＳＯＤおよびグルタチオンレダクターゼ（ＧＳ）活性を測定した。ＳＯＤ活性を、ＳＯＤ−５２５型キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。このキットは、スーパーオキシドジムスターゼによって加速されるアルカリ性自己酸化を受ける特異的試薬（Ｒ１）を使用する。第２の試薬（Ｒ２）を使用して、メルカプタン（グルタチオンなど）による干渉を取り除いた。ＳＯＤ−５２５活性の１単位を、Ｒ１の自己酸化レベルを倍加した活性として定義する。特定のキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＧＲ活性を同様に分析した。このキットは、分光光度計によって検出される３４０ｎｍの吸光度の減少を伴うＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ＋への酸化レベルを測定する。ＧＲ活性の１単位を、２５℃、ｐＨ７．６での１μＭのＧＳＳＧの還元によって定義する。
【００５４】
１０．脳組織内の基底および刺激脂質過酸化（ＬＰＯ）の測定
（刺激ＬＰＯ）またはその他（基底ＬＰＯ）、ＦｅＣｌ３、および１００μＭを含む緩衝液中の脳ホモジネート（１／１０、ｗ／ｖ）を、３７℃で３０分間撹拌水浴中でインキュベートする。インキュベーション後、ホモジネートを、３０００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を使用して、ＬＰＯ−５８６型キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用したマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）濃度の測定によって脂質過酸化を検出する。このキットは、中温（４５℃）でＭＤＡと反応する特定の発色団を使用する。
【００５５】
（実施例）
実施例１
導入遺伝子ＰＳ１ｗｔ、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌ、およびＰＳ１Ｍ５に対応するタンパク質の免疫検出
トランスジェニックマウスＰＳ１ｗｔ、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌ、およびＰＳ１Ｍ５（多変異体）を作製した。導入遺伝子をヒトＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼプロモーター（脳を含む高度な遍在性発現を付与するハウスキーピング遺伝子）（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８９、Ｃｚｅｃｈら、１９９７および１９９８）の調節下に置く。マウスホモログを認識しないヒトＰＳ１配列に特異的な抗体を使用して脾臓および脳組織ならびにリンパ球画分について導入遺伝子（ヒトＰＳ１）の発現レベルの分析を行った（図１）。脳内では（図１、レーン９〜１２）、ＰＳ１のＮ末端フラグメントは、ＰＳ１ｗｔよりもＰＳ１Ｍ１４６Ｌで高いレベルの支配的種であり、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌについて、ホロタンパク質（完全なタンパク質、約５０ｋＤａ）が検出可能であるので、これは、以前に述べられているように高いＰＳ１発現でのタンパク質内分解過程の飽和を示す。これに対して、ＰＳ１Ｍ５（多変異体）については、タンパク質内分解は完全に消滅し、ホロタンパク質のみが検出可能である。脾臓およびリンパ球で類似の結果が認められ、これら全ての組織においてばらつきはあるが検出可能レベルの発現が認められた。
【００５６】
実施例２
多変異ＰＳ１トランスジェニックマウスから単離されたリンパ球における自発的アポトーシスの促進
この実施例の目的は、多変異ＰＳ１を発現する動物モデルの末梢細胞が長期継続的な自発的アポトーシスを促進することを証明することである。
【００５７】
ＰＳ野生型（変異なし）を発現するトランスジェニックマウスから単離したリンパ球は、同一の腹子（同腹子）由来の非トランスジェニックコントロールと同レベルの基底アポトーシス（２．８％）を有する（図２）。これに対して、この自発的アポトーシスは、変異ＰＳ１−Ｍ１４６Ｌまたは多変異ＰＳ１Ｍ５を発現するトランスジェニックマウスで非常に増加する（６％）。
【００５８】
非常に興味深いことに、アポトーシス刺激を行わない２．５時間の培養後では、ＰＳ１Ｍ５のリンパ球の自発的アポトーシスレベルは、ＰＳ１ｗｔまたは単純な変異体ＰＳ１Ｍ１４６Ｌまたは非トランスジェニックコントロールよりも高かった（図３）。
【００５９】
これらの結果は、本発明のトランスジェニック動物の細胞、特に末梢組織（特にリンパ球）の細胞がコントロールと比較してより高い自発的アポトーシスを示すだけでなく、長期間それが持続することを示す。
【００６０】
実施例３
ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックマウス由来のリンパ球におけるデオキシリボースでの処理によって誘導されたアポトーシスの増加
本実施例の目的は、デオキシリボースによって誘導されたアポトーシスが多変異ＰＳ１マウスモデルでさらにより高いことを証明することである。
【００６１】
２−デオキシ−Ｄ−リボース（ｄ−Ｒｉｂ）での処理による誘導後、トランスジェニックリンパ球ＰＳ１Ｍ５のアポトーシスレベルは、ＰＳ１ｗｔ、単純な変異体ＰＳ１−Ｍ１４６Ｌ、または非トランスジェニックコントロールよりも有意に高い（図４）。
【００６２】
インキュベーション後のアポトーシスの増加は、多変異ＰＳ１の発現によるアポトーシスストレスに対する反応の増加（感作）を示す。基底アポトーシスに増加と組み合わせて、これらの結果は、多変異形態のＰＳ１のトランスジェニック発現により、リンパ球などにおけるアポトーシスに対する感受性がさらにより高くなることを明白に示す。
【００６３】
実施例４
ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックマウス由来のリンパ球における過酸化水素での処理によって誘導されたアポトーシスの増加
本実施例の目的は、過酸化水素によって誘導されたアポトーシスが多変異ＰＳ１マウスモデルでさらにより高いことを証明することである。
【００６４】
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）での処理による刺激後、ＰＳ１Ｍ５のリンパ球におけるアポトーシスレベルは、他のトランスジェニックまたは非トランスジェニックよりも有意に高い（ｐ＜０．００１、図５）。ＰＳ１ｗｔ（Ｓ１８２）と単純な変異ＰＳ１Ｍ１４６Ｌのトランスジェニックリンパ球または非トランスジェニックコントロールとの間で有意な相違はない。
【００６５】
異なるストレスによる誘導後のこのアポトーシスの増加は、このモデルで認めら得たアポトーシスに対する過敏症の一般的性質を示す。
【００６６】
実施例５
ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックマウス由来のリンパ球におけるデキサメタゾンでの処理によって誘導されたアポトーシスの増加
本実施例の目的は、デキサメタゾンでの処理によって誘導されたアポトーシスが多変異ＰＳ１マウスモデルでさらにより高いことを証明することである。
【００６７】
同様に、デキサメタゾンでの刺激後、ＰＳ１Ｍ５のリンパ球におけるアポトーシスレベルは、他のトランスジェニックまたは非トランスジェニックよりも有意に高い（ｐ＜０．０１、図６）。ＰＳ１ｗｔ（Ｓ１８２）と単純な変異ＰＳ１Ｍ１４６Ｌのトランスジェニックリンパ球または非トランスジェニックコントロールとの間で有意な相違はない。
【００６８】
第３の異なるストレスによる誘導後のアポトーシスの増加により、多変異ＰＳ１（単純変異ではない）のトランスジェニック発現によって付与されるアポトーシスに対する過敏症の一般的性質が確認される。
【００６９】
実施例６
ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックマウスのリンパ球中のフリーラジカルレベルの増加
マウスリンパ球中の酸化フリーラジカル因子（反応性酸素種）レベルを、フローサイトメトリーによって測定した。ＲＯＳレベルは、他の群と比較してトランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５（ｐ＜０．０５）のリンパ球で有意に高い（図７）。他の群の間で有意な相違は認められないにもかかわらず、ＲＯＳレベルの増加傾向は、同腹子コントロールとトランスジェニックＰＳ１ｗｔおよびＰＳ１Ｍ１６４Ｌとの間で認められる。
【００７０】
このＲＯＳレベルの増加は、基底条件下でこのモデルのアポトーシスに対する過敏症の基礎となり得る生化学的パラメータ（ＡＤに非常に影響を与える）の障害を検出可能であることを示す。
【００７１】
実施例７
ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックマウスのリンパ球における細胞内カルシウム動員の向上
アポトーシスは細胞内カルシウムレベルによって調整されるので、トランスジェニックマウスのリンパ球を分析した。停止状態では、コントロールならびにトランスジェニックマウスＰＳ１ｗｔおよびＰＳ１Ｍ１４６Ｌの［Ｃａ２＋］ｉレベルは同一である（約１５０ｎＭ以下）。多変異体ＰＳ１Ｍ５は、基底レベルのわずかな増加が認められた（２００ｎＭを超える）（図８）。
【００７２】
分裂促進刺激後（ＰＨＡ、１５μｇ／ｍｌ）、細胞内カルシウムレベルは、コントローマウスならびにトランスジェニックマウスＰＳ１ｗｔおよびＰＳ１Ｍ１４６Ｌで約７０ｎＭに増加する（図９）。それに対して、マウスＰＳ１Ｍ５では、この増加は１９０ｎＭであり、これは他の群と統計学的に異なる（ｐ＜０．０１）。したがって、基底条件下での［Ｃａ２＋］ｉレベルがより高いだけでなく、刺激に対する明白な応答も高いので、絶対レベルがさらにより高くなる（他の群の２００〜２２０ｎＭと比較して４００ｎＭ、これは統計学的に有意に異なる）。
【００７３】
さらに、非常に急速なカルシウム反応を示す非トランスジェニックコントロールと比較して、ＰＨＡでの刺激後の［Ｃａ２＋］ｉピークに達する潜伏期間は、ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックのリンパ球で非常に増加し、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌがそれに次ぐ程度であるが（図１０）、ＰＳ１ｗｔでは認められない。
【００７４】
リンパ球におけるカルシウム反応のレベルおよび速度の相違は、細胞内カルシウムの動員過程の実質的変化がこのモデルの多変異体ＰＳ１の発現によることを示す。
【００７５】
ＡＤ患者のリンパ球におけるカルシウム反応の速度の変化は以前に証明されており、この動物モデルの妥当性を高める。
【００７６】
実施例８
脳内のフリーラジカルの代謝研究
アルツハイマー病に関する、本発明のトランスジェニックマウスで認められた欠失の妥当性を確認するために、これらの動物の脳内の病理学的障害を同一視できるかどうかを調査した。フリーラジカルは、プレセニリンに関連するアポトーシス現象に関連し、ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックマウスのリンパ球での障害が実施例６で証明されているので、特にフリーラジカルに対する保護機構を分析した。
【００７７】
３〜４月齢の動物について分析を行った。トランスジェニックマウスＰＳ１ｗｔと比較して、ＰＳ１Ｍ１６４Ｌは脳内で約２０％のＳＯＤ活性レベルの現象を示す（図１１Ａ）。ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックではさらに減少する（−２８％、ｐ＜０．０５）。
【００７８】
グルタチオンレダクターゼ活性はまた、ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックの脳内で有意に減少する（−２７％、ｐ＜０．０５）。これに対して、この適度な活性効果において、ＰＳ１−Ｍ１４６Ｌトランスジェニックで真に適度な減少が示されている（図１１Ｂ）。
【００７９】
基底脂質過酸化レベルは、全てのマウス群で同一であった。これに対して、ＦｅＣｌ３での刺激後、ＰＳ１Ｍ５トランスジェニックで脂質過酸化レベルが増加する（＋２０％、図１１Ｃ）。
【００８０】
したがって、多変異ＰＳ１Ｍ５トランスジェニック若年成体（３〜４月齢）では、フリーラジカルからの保護機構の欠陥および脳内の脂質過酸化に対する感受性の増大が認められる。この効果は、これら２つの組織中で導入遺伝子が人為的に発現するこれら導入遺伝子のリンパ球で認められるアポトーシスに対する感受性の増大、細胞内カルシウム動員の障害、および酸化フリーラジカル種レベルの増加と完全に相関する。フリーラジカルに対する保護機構の欠陥はまた、アルツハイマー病患者で明らかであるので、この動物モデルの妥当性が確認される。
【００８１】
【参考文献】
【００８２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５、ＰＳ１Ｍ１４６Ｌ、ＰＳ１ｗｔ、および非トランスジェニックにおけるヒトＰＳ１の発現の分析を示す図である。
【図２】  基底条件下でのトランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ１４６ＬおよびＰＳ１Ｍ５由来のリンパ球のアポトーシスの増加を示す図である。
【図３】  トランスジェニックマウス由来のリンパ球の２．５時間のインキュベーション後のアポトーシスを示す図である。
【図４】  トランスジェニックマウス由来のリンパ球のデオキシリボース処理によって誘導されたアポトーシスを示す図である。
【図５】  トランスジェニックマウス由来のリンパ球の過酸化水素処理によって誘導されたアポトーシスを示す図である。
【図６】  トランスジェニックマウス由来のリンパ球のデキサメタゾン処理によって誘導されたアポトーシスを示す図である。
【図７】  トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球中のフリーラジカルレベルの増加を示す図である。
【図８】  トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球中の細胞内カルシウム動員の増加を示す図である。
【図９】  ＰＨＡでの刺激後のトランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５のリンパ球中の細胞内カルシウム反応の増加を示す図である。
【図１０】  トランスジェニックマウスＰＳ１Ｍ５およびＰＳ１Ｍ１４６Ｌのリンパ球中の細胞内カルシウムのより遅い動員の潜伏を示す図である。
【図１１Ａ】  フリーラジカルの保護機構に対するトランスジェニックマウスの脳内のＰＳ１のヒト変異の効果を示す図であり、酵素スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）の活性レベルを示す。
【図１１Ｂ】  フリーラジカルの保護機構に対するトランスジェニックマウスの脳内のＰＳ１のヒト変異の効果を示す図であり、酵素グルタチオンレダクターゼの活性レベルを示す。
【図１１Ｃ】  フリーラジカルの保護機構に対するトランスジェニックマウスの脳内のＰＳ１のヒト変異の効果を示す図であり、ＦｅＣｌ３での刺激後の脂質過酸化レベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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