(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-20RAの細胞外ドメインを含むポリペプチドおよびIL-20RBの細胞外ドメインを含むポリペプチドを含む可溶性受容体を含む、IL-19を下方調節するために用いられる医薬組成物であって、該IL-20RAの細胞外ドメインを含むポリペプチドが、配列番号：39、または配列番号：40から選択される配列を含み、該IL-20RBの細胞外ドメインを含むポリペプチドが、配列番号：41、または配列番号：42から選択される配列を含む、医薬組成物。
【請求項２】
該IL-20RAの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：39の配列を含み、該IL-20RBの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：41の配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
該IL-20RAの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：40の配列を含み、該IL-20RBの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：42の配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
IL-19を下方調節するための薬剤の製造における、IL-20RAの細胞外ドメインを含むポリペプチドおよびIL-20RBの細胞外ドメインを含むポリペプチドを含む可溶性受容体の使用であって、該IL-20RAの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：39、または配列番号：40から選択される配列を含み、該IL-20RBの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：41、または配列番号：42から選択される配列を含む、使用。
【請求項５】
該IL-20RAの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：39の配列を含み、該IL-20RBの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：41の配列を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該IL-20RAの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：40の配列を含み、該IL-20RBの細胞外ドメインを含むポリペプチドが配列番号：42の配列を含む、請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
炎症は通常、有害な作用物質および傷ついた組織を破壊したり、希釈したり、または囲んだりする、外傷または微生物の侵入に対する局部的な防御反応である。それは、痛み、発熱、発赤、腫れ、および機能の喪失による急性型で特徴付けられる。微細には炎症は、増加した透過性および血流、血漿タンパク質を含む体液の滲出、および炎症域への白血球の移動を伴う、細動脈、毛細血管および細静脈の拡張を含む複雑な一連の出来事を含む。
【０００２】
炎症により特徴付けられる疾患は、人間の罹患および死亡の重大原因である。一般に炎症は、異物ことに微生物の侵入に対する宿主の防御反応として起こる。機械的外傷、毒素、および新生物に対する反応もまた、炎症反応をもたらすだろう。白血球の蓄積および引き続く活性化は、大抵の炎症型の病因における中心的な出来事である。炎症の欠如は、宿主を傷つける。異物として宿主組織に異常と認識され引き起こされた過剰な炎症、または長引いた炎症過程は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、白内障、再灌流障害、および癌から、伝染性髄膜炎、リュウーマチ熱のような感染後症候群、ならびに全身性紅斑性狼瘡およびリューマチ性関節炎のようなリューマチ疾患にわたる幅広い炎症性疾患を導くだろう。これらの種々の疾患の過程における炎症反応の集中性のため、炎症の調節は人間の疾患の予防制御や治療における主要な要素となる。
【０００３】
炎症過程における重要なサイトカインは、IL-19（米国特許No.5,985,614）およびmda7（Jiang, H.ら、 Oncogene 10： 2477-2486 (1995)）である。かくて、1つ以上の、上述の炎症関連タンパク質に関わる炎症を阻害する、作用物質を製造する必要がある。
【０００４】
発明の記述
したがって、本発明は、炎症の治療を必要とする哺乳動物に、炎症を治療するための方法を提供することによりこの必要を満たすものであり、IL-19またはmda7に結合する可溶性のIL-20RA/IL-20RB受容体を提供することを特徴とする。
ここに引用された全ての参照の教えは、参照により全てここに組み入れられている。
【０００５】
定義
発明を詳細に述べる前に、以下の術語を定義することが、本発明を理解するのを助けるであろう。
「親和性標識」（Affinity tag）と言う術語を、第2のポリペプチドを精製もしくは検出したりまたは基質に第2のポリペプチドの付加する部位を提供したりするために、第2のポリペプチドに付加できるポリペプチド分節を示すためにここで用いる。原則として、抗体または他の特定結合物質が利用できるいかなるペプチドまたはタンパク質も、親和性標識として使用できる。
【０００６】
親和性標識は、ポリヒスチジン索、プロテインA（Nilsson ら,EMBO J. 4：1075 (1985); Nilssonら, Methods Enzymol. 198： 3 (1991)）、グルタチオンS転移酵素（Smith and Johnson, Gene 67: 31(1988)）、Glu-Glu親和性標識(Grussenmeyerら, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82: 7952-4 (1985))、サブスタンスP、FlagTMペプチド  (Hoppら, Biotechnology 6: 1204-1210 (1988))、ストレプトアビジン結合ペプチド、あるいは他の抗原性エピトープまたは結合分域を含む。一般には、Fordら,Protein Expression and Purification 2: 95-107 (1991)を見よ。親和性標識をコード化するDNAは、商業的供給者から入手できる（たとえば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）。
【０００７】
術語「対立遺伝子変異体」を、同一の染色体遺伝子座を占める遺伝子の2個以上の選択の如何なるものも示すためにここで用いる。対立遺伝子変異は天然には突然変異を通じて生じ、また母集団内に表現型の多形を生じるだろう。遺伝子の突然変異は、活動しないことができる（コード化されたポリペプチドに変化を生じない）、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するだろう。対立遺伝子変異体と言う術語を、また遺伝子の対立変異株によりコード化されたタンパク質を示すためにもここで用いる。
【０００８】
術語「アミノ端末」および「カルボキシル端末」を、ポリペプチド内の位置を示すためにここで用いる。文脈が許す所では、これらの術語を、近接性または相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列または部分に関して使う。たとえば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル端末を配置されたある配列は、参照配列のカルボキシル端末の近くに位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル端末に位置しない。
【０００９】
「血管新生」は、単独あるいは1個以上の付加化合物と共同で働いて、現存の血管から新しい血管の形成を誘発するための化合物の能力を示す。血管新生活性は、内皮細胞活性化、内皮細胞によるプロテアーゼ分泌の刺激、内皮細胞移動、毛細管萌芽の形成、および内皮細胞増殖として測定できる。
【００１０】
術語「相補体/抗相補体対」は、適切な条件下で非共有結合的に会合した安定な対を形成する同一でない部分を示す。たとえば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補体/抗相補対の原型の1員である。他の模範的な相補体/抗相補体対は、受容体/リガンドの対、抗体/抗原（または部分抗原あるいはエピトープ）の対、センス/アンチセンスポリヌクレオチドの対、その他である。相補体/抗相補体対の引き続く解離が望ましい場合には、相補体/抗相補体対は、好ましくは109M-1より小さい結合親和性を有する。
【００１１】
術語「ポリヌクレオチド分子の相補体」は、相補的塩基配列および参照配列に比較して逆配向を有するポリヌクレオチド分子である。たとえば、配列5’ATGCACGGG3’は、 5’CCCGTGCAT3’に対して相補型である。
術語「コンティグ」（隣接）（Contig）は、他のポリヌクレオチドに対して同一のまたは相補的配列の隣接する(contiguous）伸長を有するポリヌクレオチドを示す。隣接する配列は、ポリヌクレオチドの全体または一部の伸長に沿って、ポリヌクレオチド配列の与えられた伸長に「オーバーラップする」といわれる。たとえば、ポリヌクレオチド配列5’-ATGGCTTAGCTT-3’に対する代表的な隣接は、5’-TAGCTTgagtct-3’および3’gtcgacTACCGA-5’である。
【００１２】
術語「縮重ヌクレオチド配列」は、（ポリペプチドをコード化する参照ポリヌクレオチド分子に比較して）1個以上の縮重したコードンを含むヌクレオチドの配列を示す。縮重したコードンは、ヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUおよびGACトリプレットは、それぞれAspをコード化する）。
【００１３】
術語「発現ベクター」は、その転写を与える追加のセグメントに作用可能に結合した注目のポリペプチドをコードするセグメントを含む、線状または環状の、DNA分子を示すために使われる。そのような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み、また１又は複数の複製起点、1又は複数の選択カーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、などをも含むであろう。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウイルスDNAから誘導されるか、あるいは両方の要素を含むだろう。
【００１４】
術語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用される場合には、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から取り出され、かくて他の、または望ましくないコード配列を含まず、そして遺伝子操作タンパク質製造系での使用に適した型であることを示す。そのような単離された分子は、天然の環境から分離されており、そうしてcDNAおよびゲノムクローンを含むものである。本発明の単離されたDNA分子は、通常関連する他の遺伝子を含まないが、プロモーターおよびターミネーターのような天然に存在する5’および3’の非翻訳領域を含むだろう。関連領域の同定は、当業者には明らかである（たとえば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774-78 (1985)を参照のこと）。
【００１５】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境以外の条件、たとえば血および動物組織から離れて見出されるポリペプチドまたはタンパク質である。好ましい形では、単離されたポリペプチドは、本質的に他のポリペプチド、ことに動物起源の他のポリペプチドを含まない。ポリペプチドを高度に純粋な形で、すなわち95％より高い純度で、より好ましくは99％より高い純度で提供することが好ましい。この文脈で使われる時に、術語「単離された」は、二量体または他の糖鎖形成されたもしくは誘導された形のような、他の物理的な形状での同一ポリペプチドの存在を除外しない。
【００１６】
術語「作用可能に連結した」は、DNAセグメントに関する場合には、セグメントが意図した目的のために協力して機能する、たとえば転写がプロモーターで始まり、そうしてターミネーターまでのコード領域を通して進むように、セグメントが配置されていることを意味する。
術語「オルソログ」（ortholog）は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である一つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オルソログ間の配列の違いは、種分化の結果である。
【００１７】
「パラログ」（paralog）は、生物により作られた別個のしかし構造的に関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子複製を通じて生ずると信じられている。たとえば、a-グロビン、b-グロビン、およびミオグロビンは、お互いにパラログである。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」は、5’から3’端末まで読まれたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖または２本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、RNAおよびDNAを含み、そうして天然源から単離され、in vitroで合成され、または天然および合成分子の組合せから調製されるだろう。ポリヌクレオチドの大きさは、塩基対（「bp」と省略）、ヌクレオチド（「nt」）、またはキロ塩基(「kb」)と表現される。
【００１９】
文脈が許すところでは、後者２つの術語は、単鎖または2重鎖のポリヌクレオチドを表すだろう。本術語が2重鎖分子に適用される時には、それは全長を示すのに使われ、そうして術語「塩基対」と同等であると理解される。２本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は長さが少し異なるだろうし、そうしてその端末は、酵素開裂の結果として食い違うだろうことを当業者は理解する。かくて2重鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドは、対とはならないだろう。その様な対を成さない端末は、一般に長さで20 ntを超えない。
【００２０】
「ポリペプチド」は、天然にまたは合成的に作られたものであれ、ペプチド結合により結ばれたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基よりも小さなポリペプチドは、通常「ペプチド」と言われる。
術語「プロモーター」は、当業界で認識された意味に対して、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の1部を示すためにここで使われる。プロモーター配列は、通常、しかし必ずしもそうではないが、遺伝子の5’の非コーディング領域に見出される。
【００２１】
「タンパク質」は、１個以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、また炭水化物基のような非ペプチド成分を含むことが出来る。炭水化物および他の非ペプチド基質は、タンパク質が作られる細胞によりタンパク質に付加されるだろう、そうして細胞の型により変化する。タンパク質は、ここでそのアミノ酸骨格鎖構造により定義される。炭水化物基のような置換基は、通常詳細に特定されないが、しかしそれにもかかわらず存在するだろう。
【００２２】
術語「受容体」は、生物活性分子（すなわちリガンド）に結合し、そうして細胞へのリガンドの影響を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜に結合した受容体は、細胞外のリガンド結合分域および典型的にはシグナル形質導入に関与する細胞内作用因子分域を含む多分域構造により特徴付けられる。受容体へのリガンドの結合は、作用因子分域と細胞内の他分子との間の相互作用を引き起こす受容体内での立体配座の変化をもたらす。この相互作用は、次いで細胞の代謝を変更する。
【００２３】
受容体-リガンド相互作用に結びつく代謝の出来事は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞カルシウムの起動、膜リピッドの起動、細胞付着、イノシトールリピッドの加水分解、およびリン脂質の加水分解を含む。一般に、受容体は、細胞に結合し、サイトゾルもしくは核であり、また単量体（たとえば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベーターアドレナリン受容体）または多量体（たとえば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポイエチン受容体およびIL-6受容体）であり得る。
【００２４】
術語「分泌シグナル塩基配列」は、より大きなポリペプチドの成分として合成される細胞の分泌経路を通じて、より大きなポリペプチドを支配するポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコード化するDNA配列を示す。より大きなポリペプチドは、分泌経路を通過中に分泌ペプチドを除くために通常開裂される。
【００２５】
術語「スプライス変異株」は、遺伝子から転写されたRNAの代わりの型を示すためにここに使われている。スプライス変異株は、転写したRNA分子内、またはより一般的ではないが別々に転写されたRNA分子の間の、代わりのスプライス部位の使用を通じて天然に生じる、そうして同じ遺伝子から転写された幾つかのmRNAとなるであろう。スプライス変異株は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するだろう。術語スプライス変異株はまた、遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変異株によりコード化されたタンパク質を示すためにここに用いられる。
【００２６】
不正確な分析方法（たとえば、ゲル電気泳動）によって測定されたポリマーの分子量および長さは、概略値であることが理解されよう。そのような値が、「約」Xまたは「概略」Xとして表された時に、Xの表示値は±10％の正確さであると理解されよう。
【００２７】
受容体は、IL-19およびmda7に結合し、そうして「インターロイキン20受容体アルファIL-20RA」と名付けられたポリペプチド、およびインターロイキン20受容体ベータ「IL-20RB」と名付けられたポリペプチドを含むヘテロ2量体であることが発見されている。IL-20RAポリペプチド、それをコード化する核酸、IL-20RAに対する抗体およびそれを産生する方法は、1999年8月31日に公布された米国特許No.5,945,511に開示されている。
【００２８】
配列番号：1〜3は、IL-20RAのポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。IL-20RAの成熟細胞外配列は、配列番号：３を含む。IL-20RBポリペプチド、それをコード化する核酸、IL-20RBに対する抗体およびそれを産生する方法は、1999年3月8日に出願された国際出願No. PCT/US99/03735(公開no. WO 99/46379)に開示されている。IL-20RBの変異株（以後V-IL-20RBとする）は、クローンされており、そうして配列番号：4〜6により定義されている。ここに配列番号：６は、細胞外ドメインである。
【００２９】
可溶性IL-20ヘテロ２量体受容体「IL-20RA/IL-20RB」の調製
可溶性ヘテロ２量体受容体は、配列番号:３（以後IL-20RAと称する）およびIL-20RBの細胞外ドメインまたはIL-20RBのバリアント（vIL-20RB、配列番号:4〜6）の細胞外ドメイン（配列番号:６）を含む。好ましくは、IL-20RAポリペプチドの細胞外ドメインおよびIL-20RBポリペプチドの細胞外ドメインは、お互いに共有結合している。
【００３０】
好ましい具体例において、１個のポリペプチドは、そのカルボキシ端末に融合した免疫グロブリン重鎖の定常領域を有し、そうして他のポリペプチドは、そのカルボキシ端末に融合した免疫グロブリン（Ig）の定常軽鎖を有する。そうしてこれら2個のポリペプチドは、一緒になり、重鎖と軽鎖の間にジスルフィド結合を生じてヘテロ２量体を形成する。他の方法においては、ペプチドリンカーは、ポリペプチドの2個のカルボキシ端末に融合して、共有結合をしたヘテロ２量体を形成する。
【００３１】
IL-20RAおよびIL-20RBの可溶性細胞外ドメインを製造するための方法は、下記を含む：
(a) 第１の分泌シグナル配列に作用可能に結合した転写プロモーターを含む第１のDNA配列及びその下流に読み枠を合せて存在するIL-20RAの細胞外部分をコードするDNAを、宿主細胞に導入し、
（b）第１の分泌シグナル配列に作用可能に結合した転写プロモーターを含む第１のDNA配列及びその下流に読み枠を合せて存在するIL-20RBの細胞外部分をコードするDNA配列ならびにCH1、 CH2 、CH3および CH4からなる群から選ばれた免疫グロブリンの重鎖定常領域ドメインをコード化するDNA配列を、宿主細胞に導入し、
【００３２】
(c) IL-20RAおよびIL-20RBの細胞外ドメインを含む２量体化したヘテロ２量体融合タンパク質の分泌を許す生理学的条件下で、適切な増殖培地中で宿主細胞を増殖させ、そして
（d）２量体化したポリペプチドを宿主細胞から単離する。
１具体例において、第２のDNA配列は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域をさらにコードする。ここでヒンジ領域は、重鎖定常領域分域に結合している。他の具体例において、第２のDNA配列は、免疫グロブリンの重鎖定常領域の上流でおよび適切な読み枠で結合した免疫グロブリン可変領域をさらにコードする。
【００３３】
他の具体例において、IL-20RAおよびIL-20RBの可溶性2量化細胞外分域を産生する方法は、下記を含む：
(a) 第１の分泌シグナル配列に作用可能に結合した転写プロモーターを含む第１のDNA配列及びその下流に読み枠を合せて存在するIL-20RBの細胞外部分をコードするDNAおよび免疫グロブリンの軽鎖定常領域をコードするDNAを、宿主細胞に導入し、
（b）第２の分泌シグナル配列に作用可能に結合した転写プロモーターを含む第２のDNA構築物及びその下流に読み枠を合せて存在するIL-20RAの細胞外部分をコードするDNA配列ならびにCH1、 CH2 、CH3および CH4からなる群から選ばれた免疫グロブリンの重鎖定常領域ドメインをコードするDNA配列を、宿主細胞に導入し、
【００３４】
(c) IL-20RAおよびIL-20RBの細胞外ドメインを含む２量体化したヘテロ２量体融合タンパク質の分泌を許す生理学的条件下で、適切な増殖培地中で宿主細胞を増殖させ、そして
（d）２量体化したポリペプチドを宿主細胞から単離する。
１具体例において、第２のDNA配列は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域をさらにコードする。ここでヒンジ領域は、重鎖定常領域に結合している。他の具体例において、第２のDNA配列は、免疫グロブリンの重鎖定常領域の上流でおよび適切な読み枠で結合した免疫グロブリン可変領域をさらにコードする（米国特許No.5,843,725を参照のこと）。
【００３５】
ポリヌクレオチド
一般的に、cDNA配列は、ここに記述されたポリペプチをコードする。本発明のポリペプチをコードするcDNA配列は、ポリペプチドの各アミノ酸残基がコドンによりコードされ、そうして各コドンが3個のヌクレオチドを含む、１連のコドンを含む。該アミノ酸残基は、下記の様に夫々のコドンによりコードされる。
アラニン(Ala)は、GCA、GCC、GCG、またはGCTによりコードされる；
システイン(Cys)は、TGCまたはTGTによりコードされる；
アスパラギン酸(Asp)は、GACまたはGATによりコードされる；
【００３６】
グルタミン酸(Glu)は、GAAまたはGAGによりコードされる；
フェニルアラニン(Phe)は、TTCまたはTTTによりコードされる；
グリシン(Gly)は、GGA、GGC、GGG、GGTによりコードされる；
ヒスチジン(His)は、CACまたはCATによりコードされる；
イソロイシン(Ile)は、ATA、ATCまたはATTによりコードされる；
リジン(Lys)は、AAAまたはAAGによりコードされる；
ロイシン(Leu)は、TTA、TTG、CTA、CTC、CTGまたはCTTによりコードされる；
メチオニン(Met)は、ATGによりコードされる；
アスパラギン(Asn)は、AACまたはAATによりコードされる；
【００３７】
プロリン(Pro)は、CCA、CCC、CCGまたはCCTによりコードされる；
グルタミン(Gln)は、CAAまたはCAGによりコードされる；
アルギニン(Arg)は、AGA、AGG、CGA、CGC、CGGまたはCGTによりコードされる；
セリン(Ser)は、AGC、AGT、TCA、TCC、TCGまたはTCTによりコードされる；
スレオニン（Thr）は、ACA、ACC、ACGまたはACTによりコードされる；
バリン(Val)は、GTA、GTC、GTGまたはGTTによりコードされる；
トリプトファン（Trp）は、TGGによりコード化される；および
チロシン(Tyr)は、TACまたはTATによりコード化される。
【００３８】
アミノ酸を合成し、そうしてtRNAをアミノアシル化する方法は、当業界で知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写と変換は、大腸菌S30抽出物ならびに商業的に入手出来る酵素および他の試薬を含む無細胞系で達成される。タンパク質は、クロマトグラフィーで精製される。たとえば、Robertson ら, J. Am. Chem. Soc. 113: 2722(1991); Ellman ら, Methods Enzymol.202: 301(1991); Chungら, Science 259: 806-809 (1993);およびChungら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-1019 (1993)を見よ。
【００３９】
第２の方法において、変換は、突然変異したmRNAおよび化学的にアミノアシル化した抑圧遺伝子tRNAの微量注入によりXenopus（アフリカツメガエル）の卵胞細胞で達成される（Turcattiら, J. Biol. Chem. 271: 19991-19998 (1996)）。第3の方法で、大腸菌は、置換されるべき天然アミノ酸(たとえば、フェニルアラニン)の不在下、および望ましい非天然由来のアミノ酸（たとえば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニンまたは4-フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【００４０】
非天然由来のアミノ酸は、その天然の対応物の代わりにタンパク質に組み込まれる。Koideら, Biochem. 33: 7470-7476 (1994)を参照のこと。天然由来のアミノ酸は、in vitroな化学修飾により非天然由来の種に変換できる。化学修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために、位置指定の変異誘発と組み合わせることができる（Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403 (1993)）。
限定数の非保存的なアミノ酸、遺伝子コードによりコード化されていないアミノ酸、非天然由来のアミノ酸、および非天然のアミノ酸は、アミノ酸残基と置換されるだろう。
【００４１】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、位置指定変異誘発またはアラニン走査式変異誘発のような、当業界で知られた方法に従って同定できる（Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989);Bass ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-502 (1991)）。後者の技術において、単一のアラニン突然変異を、分子の各残基に導入し、そうしてその結果の突然変異分子を、分子の活性に決定的であるアミノ酸残基を同定するために下記に開示した如く生物活性を試験する。Hilton ら, J. Biol. Chem. 271: 4699- 708, 1996を参照にこと。
【００４２】
リガンド-受容体相互作用の位置は、推定接触部位アミノ酸の突然変異と関連して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、または光親和性標識のような技術により決定される如く、構造の物理分析により決定することも出来る。たとえば、de Vos ら, Science 255: 306  -312 (1992); Smithら, J. Mol. Biol.224:899-904(1992); Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64 (1992) を参照のこと。
【００４３】
多数のアミノ酸置換は、Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-57 (1988)またはBowie and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156 (1989) により開示されているような、既知の変異誘発および選別の方法を用いて行い、かつ試験することが出来る。 要約すると、これらの著者は、ポリペプチドの2箇所以上を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、そうして各位置で許容出来る置換のスペクトルを決定するために突然変異ポリペプチドの配列を決定するための方法を開示している。使用できる他の方法は、ファージ表示法を含む (たとえば、Lowmanら, Biochem. 30:10832-10837 (1991); Landerら, 米国特許No.5,223,409; Huse, 世界知的所有機関公布 WO 92/06204)および領域指定変異誘発（Derbyshireら, Gene 46:145 (1986); Nerら, DNA 7: 127 (1988)）。
【００４４】
開示されたIL-20RAおよびIL-20RBのDNAの変異株ならびにポリペプチド配列は、Stemmer,Nature 370: 389-391, (1994)、Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751 (1994)および世界知的所有機関公布WO 97/20078に開示されている如く、DNAシャフリングを通じて産生できる。要約すると、変異株DNAは、先ず親DNAを無作為に細分割し、次に無作為に導入された点突然変異をもたらすPCRを用いてin vitroで再構成する相同組換えにより産生される。この技術は、工程に付加的な変化度を導入するために、対立変異株または他の種からのDNAのような、親DNAの種を用いて変更できる。変異誘発および分析の追加的反復を伴う望ましい活性のための選択および選別は、一方では致命的な変化に抗する選別を同時に行いながら、望ましい突然変異のための選別による配列の迅速な「進化」を提供する。
【００４５】
ここに開示された如く変異誘発方法は、宿主細胞内のクローンされ、突然変異されたポリペプチドの活性を検出するために、高処理能力の、自動選別方法と組み合わせる事が出来る。活性ポリペプチドをコード化する突然変異DNA分子は、宿主細胞から回収され、そうして新式の設備を使って迅速に配列を決定できる。これらの方法は、関心事のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定でき、そうして未知の構造のポリペプチドに応用できる。
【００４６】
タンパク質の製造
ポリペプチドは、通常の技術に従って、遺伝子操作をされた宿主で製造できる。適切な宿主細胞は、外来DNAで形質転換または形質移入し、そして培養で育成できる細胞型であり、細菌、菌類細胞、および培養された高等真核細胞を含む。真核細胞、ことに多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化されたDNA分子を操作し、外来DNAを種々の宿主細胞に導入するための技術は、以下に開示されている：Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、およびAusbelら編集、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987)。
【００４７】
一般に、ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内での、一般に転写プロモーターおよびターミネーターを含む発現に必要な他の遺伝子要素に作用可能に連結される。当業者はある系内では選択マーカーが別個のベクターにより提供されるだろうことを認識しているが、ベクターもまた一般に１個以上の選択マーカーおよび１または複数の複写起点を含み、そうして外来DNAの複写は、宿主細胞ゲノム中に組込みにより提供されるだろう。プロモーターの選択、ターミネーター、選択的標識、ベクターおよび他の要素は、当業界の水準内の通常の設計事項である。多くのその様な要素は、文献に記載されており、商業的供給者を通じて入手できる。
【００４８】
ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）を、発現ベクター中に提供する。分泌シグナル配列は、天然ポリペプチドの配列でり、または他の分泌されるタンパク質（たとえば、t-PA）に由来し、あるいはそれ自体合成されるであろう。分泌シグナル配列は、DNA配列に作用可能に結びついている、すなわち２個の配列は、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、正しい読み枠に入れられ、位置付けられる。分泌シグナル配列は、注目のポリペプチドをコードするDNA配列に対して一般に5’に配置される。しかしある種の分泌シグナル配列は、注目のDNA配列の何処にでも配置されるだろう（たとえば、Welchら,米国特許No.5,037,743; Hollandら,米国特許No.5,143,830を見よ）。
【００４９】
あるいは、本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、他のポリペプチドを分泌経路に導くために使われる。本発明は、その様な融合ポリペプチドを提供する。本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、他のペプチドを分泌経路に導くために、追加のペプチドに、好ましくはアミノ端末で融合する。その様な構築物は、当業界で知られた数多くの応用を有する。たとえば、新規の分泌シグナル配列融合構築物は、受容体のような通常の非分泌タンパク質の活性成分の分泌を指示できる。その様な融合は、分泌経路を通じてペプチドを指示するためにin vivo またはin vitroで使用されるだろう。
【００５０】
培養された哺乳動物の細胞は、本発明内の適切な細胞である。外来DNAを哺乳動物宿主細胞に導入する方法は、燐酸カルシウム仲介形質移入（Wiglerら, Cell 14: 725 (1978); Coraso and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603 (1981); Graham and Van der Eb, Virology 52: 456(1973)）、電気穿孔（Neumannら, EMBO J 1: 841-845 (1982)）、DEAE-デキストラン仲介形質移入（Ausbelら,同上）、およびリポソーム仲介形質移入（Hawley-Nelsonら, Focus 15: 73 (1993); Ciccaroneら, Focus 15: 80 (1993)）、ならびにウイルスベクター（Miller and Rosman, Bio Techniques 7: 980 (1989); Wang and Finer, Nature Med, 2: 714(1996)）を含む。
【００５１】
培養された哺乳動物細胞内での組換えポリペプチドの製造は、以下に開示されている：たとえば、Levinsonら、 米国特許No.4,713,339; Hagenら、 米国特許No.4,784,950; Palmier、米国特許No.4,579,821;およびRingold、米国特許No.4,656,134。適切な培養哺乳動物細胞は、COS-1(ATCC No. CRL 1650)、COS-7(ATCC No. CRL 1651)、BHK(ATCC No. CRL 1632)、BHK 570(ATCC No. CRL 10314)、293(ATCC No. CRL 1573);Grahamら, J. Gen. Virol.36: 59 (1977)およびチャイニーズハムスター卵巣細胞株である（たとえば、CHO-K1; ATCC No. CCL 61）。
【００５２】
追加の適切な細胞株は当業界で知られており、Maryland州 Rockvilleにある American Type Culture Collection（国際細菌命名規約）のような公的寄託所から入手できる。一般に、SV-40またはサイトメガロウイルスからのプロモーターのような強い転写プロモーターが好ましい。たとえば、米国特許No.4,956,288を見よ。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのもの（米国特許No.4,579,821およびNo.4,601,978）およびアデノウイルスの主要後期プロモーターを含む。
【００５３】
薬剤選択法は、外来のDNAが挿入された培養哺乳動物細胞を選択するために通常に使われる。その様な細胞を、一般に「トランスフェクタント」と呼ぶ。選択的作用物質の存在下培養され、関心事の遺伝子をその子孫に渡す事の出来る細胞を、「安定なトランスフェクタント」と呼ぶ。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する抵抗性をコード化する遺伝子である。選択は、G-418等のようなネオマイシン型の薬剤の存在下で達成される。選択系はまた、関心事の遺伝子の発現水準を増加するためにも使われ、この工程を「増幅」と呼ぶ。
【００５４】
増幅は、低水準の選択的作用物質の存在下、トランスフェクタントを培養し、そうして導入された遺伝子の高水準の産物を産生する細胞を選択するために、選択的作用物質の量を増加することにより達成される。好ましい増幅可能な選択的標識は、ジヒドロ葉酸塩還元酵素であり、これはメトトレキセートに抵抗性を与える。
【００５５】
他の薬剤抵抗性遺伝子（たとえば、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、多剤抵抗性遺伝子、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）もまた使用できる。緑色蛍光タンパク質のような変更された表現型、またはCD4、CD8、Class I MHC、胎盤アルカリ性燐酸酵素のような細胞表面タンパク質を導入する代わりの標識は、FACS選別または磁気ビーズ分離技術のような方法により、非形質移入細胞から形質移入細胞を選別するために使用されるだろう。
【００５６】
植物細胞、昆虫細胞および鳥の細胞を含む、他の真核細胞もまた、宿主として使用できる。植物細胞内で遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクター・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinkarら, J. Biosci.(Bangalore)11:47 (1987)により検討された。昆虫細胞の形質変換およびそこでの外来のポリペプチドの産生は、Guarinoら, 米国特許No.5,162,222および世界知的所有機関公布WO 94/06463により開示されている。昆虫細胞は、通常キンウワバ科核多角体病ウイルス（AcNPV）から誘導される組換えかん状ウイルスで感染できる。
【００５７】
ポリペプチドをコードするDNAは、2つの方法のうちの1法により配列をコードするAcNPVポリヘドリン遺伝子の代わりに、かん状ウイルスゲノムに挿入される。第1の方法は、野生型のAcNPVとAcNPV配列により隣接された遺伝子を含む転写ベクターとの間の均質なDNAの再結合を行う伝統的方法である。適切な昆虫細胞、たとえばSF9細胞を野生型AcNPVで感染し、AcNPVポリヘドリン遺伝子プロモーターに操作可能に結合したポリヌクレオチド、ターミネーター、およびフランキング配列を含む転写ベクターで形質導入する。
【００５８】
King, L. A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, (Chapman & Hall, London); O’Reilley, D.R.ら, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual(Oxford University Press, New York, New York, 1994);およびRichardson, C.D.編Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, (Humana Press, Totowa, NJ 1995)を参照のこと。昆虫細胞内の天然の組換えにより、ポリヘドリンプロモーターにより働かされたコーディング配列を含む組換えかん状ウイルスを生ずる。組換えウイルスストックを、業界で通常使用されている方法で作る。
【００５９】
組換えかん状ウイルスを作る第２の方法は、Luckow, V.A.ら,J. Virol 67: 4566 (1993) に記述されている転位因子に基づく系を使う。この系は、Bac-to-Bac kit (Life Technologies, Rockville, MD)として売られている。この系は、“bacmid”と呼ばれる巨大プラスミドとして大腸菌に維持されているかん状ウイルスゲノムに、ポリペプチドをコード化するDNAを動かすためにTn7転位因子を含む転写ベクターpFastBac1TM(Life Technologies)を使う。pFastBac1TM転写ベクターは、関心事の遺伝子の発現を働かすために、AcNPVポリヘドリンプロモーターを使う。しかしながら、pFastBac1TM は相当程度修飾できる。
【００６０】
ポリヘドリンプロモーターは、除去および、かん状ウイルス塩基性タンパク質プロモーター（Pcor、p6.9またはMPプロモーターとしても知られている）で置換可能で、かん状ウイルス感染で既に発現され、そうして分泌されたタンパク質を発現するのに便利である事が示されている。Hill-Perkins, M.S. and Posse, R.D., J. Gen Virol 71: 971 (1990); Bonning, B.C.ら, J. Gen Virol 75: 1551 (1994);およびChazenbalk, G.D., and Rapoport, B., J. Biol Chem 270:  1543(1995)を参照のこと。
【００６１】
そのような転写ベクター構築物で、短いまたは長い版の塩基性タンパク質プロモーターが使用できる。さらに、昆虫タンパク質から誘導された分泌シグナル配列で、天然の分泌シグナル配列を置換する転写ベクターが構築できる。たとえば、脱皮ステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチMelittin(Invitrogen, Carlsbad, CA)、またはかん状ウイルスgp67(PharMingen, San Diego, CA)は、天然の分泌シグナル配列を置換するために、構築物内に使用できる。さらに、転写ベクターは、発現されたポリペプチドのC-またはN-端末エピトープ標識、たとえば、Glu-Gluエピトープ標識をコードするDNAとの枠内融合を含むことができる（Grussenmeyer, T. ら,Proc.Natl Acad Sci.82:7952 (1985))。
【００６２】
当業界で知られた技術を用いて、組換え遺伝子を含む転写ベクターを、大腸菌に形質変換し、組換えかん状ウイルスを表示する遮られたlacZ遺伝子を含むbacmidのために選別する。組換えかん状ウイルスゲノムを含むbacmid DNAを、通常の技術を用いて単離し、そうしてスポドフトラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、たとえばSf9細胞を形質移入するために使用する。ポリペプチドを発現する組換えウイルスは、引き続き産生される。組換えウイルス株を、当業界で普通に使われる方法で産生する。
【００６３】
組換えウイルスを、宿主細胞、典型的にはコアオヨトウ、スポドプテラ・フラギペルダ（Spodoptera frugiperda）、から誘導された細胞株を感染するために使う。一般には、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994)を参照のこと。他の適切な細胞株は、トリコプルシア・ニイ（Trichoplusia ni）から誘導したHigh Five OTM細胞株（Invitrogen）である(米国特許No.5,300,435)。商業的に入手出来る無血清培地が、細胞を育て、維持するために使用される。
【００６４】
適切な培地は、Sf9細胞用にはSf900 IITM (Life Technologies)またはESF921TM (Expression Systems)、T. ni細胞用にはEx-cellO405TM (JRH Biosciences, Lenexa, KS)またはExpress FiveOTM (Life Technologies)である。細胞は、組換えウイルス株が0.1から10の感染多重度（MOI）で、より典型的には3近くで添加される時に、約2〜5 x 105から 1〜2 x 106細胞の接種密度で育てられる。組換えウイルス感染細胞は、典型的に感染後12〜72時間で組換えポリペプチドを産生し、培地に種々の効率でそれを分泌する。
【００６５】
培地は通常感染後48時間で収穫する。遠心分離を培地から細胞を分離するために使う（上澄み液）。ポリペプチドを含む上澄み液を、通常0.45μmの細孔径を有するミクロポアフィルターを通して濾過する。操作は、入手できる実験室マニュアルに通常記述されている（King, L.A. and Possee, R.D., 同上; O’Reilly, D.R.ら, 同上; Richardson, C.D., 同上）。上澄み液からのポリペプチドの引き続く精製は、ここに記述した方法を使って達成できる。
【００６６】
酵母細胞を含む真菌細胞もまた、本発明内で使用できる。この観点から特別に関心のある酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）および ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）である。外来DNAでサッカロミセス・セレビシエ（S. carevisiae）を形質変換しそこから組換えポリペプチドを産生する方法は、下記に開示されている。たとえば、Kawasaki, 米国特許No.4,599,311; Kawasakiら,米国特許No.4,931,373; Brake,米国特許No.4.870,008; Welch ら,米国特許No.5,037,743; およびMurray ら,米国特許No.4,845,075である。
【００６７】
形質変換された細胞は、選択的標識、普通には薬剤耐性または特定の養分（たとえば、ロイシン）の不在下で成長する能力、により決定される表現型により選択される。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、Kawasaki ら(米国特許No.4,931,373)により開示されたPOTIベクター系である。これは、形質変換された細胞がグルコース含有培地での成長により選択されることを許す。
【００６８】
酵母で使用するための適切なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子（たとえば、Kawasaki,米国特許No.4,599,311; Kingsman ら, 米国特許No.4,615,974;および Bitter,米国特許No.4,977,092を参照のこと）、およびアルコール脱水素酵素遺伝子からのそれらを含む。米国特許No.4,990,446、No.5,063,154、 No.5,139,936および No.4,661,454も参照のこと。
【００６９】
ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・グイレルモンディー（Pichia guillermondii）およびカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）を含む他の酵母用の形質変換系は、当業界で知られている。
【００７０】
たとえば、Gleesonら, J. Gen. Microbial.132: 3459(1986)およびCregg,米国特許No.4,882,279を参照のこと。アスペルギルス（Aspergillus）細胞は、Mc Knightら,米国特許No.4,939,349の方法に従って、使用されるだろう。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質変換する方法は、Sumino ら, 米国特許No.5,162,228により開示されている。Neurosporaを形質変換する方法は、Lambowitz,米国特許No.4,486,533により開示されている。
【００７１】
組換えタンパク質の製造用宿主としてのピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）の使用は、世界知的所有機関WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536およびWO 98/02565に開示されている。ピキア・メタノリカ（P. methanolica）を形質変換するのに使うDNA分子は、普通2重鎖、環状プラスミドとして調製され、好ましくは形質変換前に線状にされる。ピキア・メタノリカ（P. methanolica）でのポリペプチド製造用に、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはピキア・メタノリカ（P. methanolica）アルコール利用遺伝子（AUG1またはAUG2）のようなピキア・メタノリカ（P. methanolica）遺伝子のそれであることが好ましい。
【００７２】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトン合成酵素（DHAS）、蟻酸塩脱水素酵素（FMD）、および過酸化水素分解酵素（CAT）遺伝子のそれらを含む。宿主染色体へのDNAの組込みを促進するために、宿主のDNA配列をプラスミドの完全発現分節の両端に配置することが好ましい。ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）で使うための適切な選択できる標識は、ピキア・メタノリカ（P.methanolica）ADE2遺伝子であり、これはホスホリボシル-5-アミノイミダゾルカルボキシラーゼ(AIRC; EC 4.1.1.21)をコード化し、そしてこれはアデニンの不在下でade2宿主細胞を成長させる。
【００７３】
メタノールの使用を最小にする事が望ましい大規模な工業プロセス用には、メタノール利用遺伝子（AUG1およびAUG2）両者を除去した宿主細胞の使用が望ましい。分泌タンパク質の製造のために、空胞性タンパク質分解酵素遺伝子（PEP4およびPRB1）を欠く宿主細胞が好ましい。ピキア・メタノリカ（P. methanolica）細胞への注目のポリペプチドをコード化するDNAを含むプラスミドの導入を促進するためにエレクトロポレーション（電気穿孔）を使う。2.5〜4.5kV/cm、好ましくは約3.75 kV/cmの電場強度をもつ指数関数的に減衰するパルス状電場、および1〜40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒の時間定数(t)を用いる電気穿孔により、ピキア・メタノリカ（P. methanolica）細胞を形質変換することが好ましい。
【００７４】
大腸菌細菌種を含む原核宿主細胞、バシルス（Bacillus）、および他の属もまた本発明内の有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質変換し、そこにクローン化された外来DNA配列を発現するための技術は、当業界でよく知られている（たとえば、Sambrookら, 同上を参照のこと）。大腸菌のような細菌中でポリペプチドを発現する時には、ポリペプチドは細胞質中に、典型的に不溶性の顆粒として、維持され、または細菌の分泌配列によりぺリプラズム空間に導かれるだろう。前者の例において、細胞は崩壊し、顆粒を回収し、そうしてたとえばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を使って変性する。
【００７５】
変性したポリペプチドを、次に尿素溶液ならびに還元および酸化グルタチオンの組合せに対しての透析、次いで緩衝生理食塩水に対しての透析によるような、変性剤の希釈により、再折り畳みおよび２量体化することができる。後者の例においては、周辺細胞質空間の中身を解放するために細胞を破砕し（たとえば、音波または浸透圧の衝撃により）、タンパク質を回収することにより、またそれにより変性および再折り畳みを不要にすることにより、可溶性で機能的な形で周辺細胞質空間からポリペプチドを回収できる。
【００７６】
形質変換されたまたは形質移入された宿主細胞は、選ばれた宿主細胞の成長に必要な栄養素および他の成分を含む培養培地中で普通の手順に従って培養される。確定されたまたは複雑な培地を含む、多くの適切な媒質は、当業界で知られており、通常炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地はまた、必要に応じて、成長因子または血清のような成分をも含むだろう。生育培地を、たとえば、発現ベクターに乗せられたりまたは宿主細胞の中に共形質移入されたりする選択的標識で補われる、薬剤選択または必須栄養素の欠乏により、外生的に付加されたDNAを含む細胞用に通常選択する。
【００７７】
ピキア・メタノリカ（P. methanolica）細胞を、約25℃から35℃の温度で、炭素、窒素、および微量の栄養素の適切な原料源を含む培地で培養する。液体培養は、小フラスコの振蕩または発酵器の多孔分散のような通常の方法で十分な空気吹き込みを行う。ピキア・メタノリカ（P. methanolica）に対する好ましい培養培地は、YEPD（2% D-グルコース、2% BactoTM Peptone（Difco Laboratories, Detroit, MI）、1%  BactoTM酵母抽出物（Difco  Laboratories）、0.004%アデニンおよび0.0006% L-ロイシン）である。
【００７８】
タンパク質の単離
本発明のポリペプチドを80%以上の純度、より好ましくは90%以上の純度、さらにより好ましくは95%以上の純度に精製することが好ましく、そうしてことに好ましくは、製薬的純粋状態であって、汚染性巨大分子、ことに他のタンパク質および核酸に関して99.9%より高い純度であり、そうして感染性および発熱性物質を含まない。好ましくは、精製ポリペプチドは、本質的に他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを含まない。
【００７９】
発現された組換えポリペプチド（またはキメラポリペプチド）は、分画および/または通常の精製法ならびに培地を用いて精製できる。硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ抽出は、試料の分画に使えるだろう。模範的精製工程は、ヒドロキシアパタイト、粒径排除、FPLCおよび逆相高性能液体クロマトグラフィーを含むだろう。適切なクロマトグラフィーの媒質は、誘導デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ、などを含む。PEL、DEAE、QAEおよびQ誘導体が好ましい。
【００８０】
模範的クロマトグラフィー媒質は、フェニル、ブチル、またはオクチル基の誘導媒質、たとえばPhenyl-Sepharose FF (Pharmacia)、Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montogomeryville, PA)、Octyl-Sepharose (Pharmacia)など；またはポリアクリル酸樹脂、たとえばAmberchrom CG 71 (Toso Haas) などを含む。適切な固体支持物は、使用条件下で不溶な、ガラスビーズ、シリカ基盤の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂、その他である。これらの支持物は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、水酸基、および/または炭水化物部分によりタンパク質を付加させる反応基で修飾されるだろう。
【００８１】
カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学に対するカルボキシルおよびアミノ誘導体を含む。これらの、および他の固体媒質は、当業界で良く知られておりまた広く使われており、そうして商業的供給者から入手できる。媒質を支持する受容体ポリペプチドを結合する方法は、当業界で良く知られている。特定の方法の選択は、通常の設計の問題であり、選択された支持物の性質により一部分決定される。たとえば、Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988)を参照のこと。
【００８２】
ポリペプチドは、その性質の活用により単離できる。抗体のFc定常領域に融合するタンパク質は、「プロテインA」カラムの方法により単離できる（Methods in Enzymol., Vol, 182,“Guide to Protein Purification”, M.. Deutscher編,page 529-539 (Acad. Press, San Diego, 1990)）。本発明の追加的具体例で、注目のポリペプチドの融合および親和性標識（たとえば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン分域）は、精製を促進するために構築されるだろう。
【００８３】
さらに、当業界で記述されている方法を使って、ポリペプチド融合または交配タンパク質は、ポリペプチドの領域またはドメインを使って構築される（Sambrookら、同上、 Altschulら、 同上, Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 511 (1994)）。これらの方法により、より大きなドメインまたは注目のポリペプチドの領域の生物学的重要性を決定できる。その様なハイブリドは、反応動態を変え、結合し、基質特異性を抑制しまたは拡張し、ポリペプチドの組織および細胞局在性を変更するだろうし、また未知の構造のポリペプチドに応用できる。
【００８４】
融合タンパク質は、融合タンパク質の各成分を調製しそうして化学的にそれらを結合させることにより、当業界に知られた方法で調製できる。あるいは、適切な読み枠内で融合タンパク質の両成分をコード化するポリヌクレオチドは、既知の技術を使って形成でき、ここに記述した方法で発現される。たとえば、生体機能を与えるドメインの一部または全部は、本発明のポリペプチドと、他のファミリー構成員からの機能的に同等なドメインとの間で交換できる。その様なドメインは、これに限定されるものではないが、分泌シグナル配列、保存された、および重要なこのファミリーのドメインまたは領域を含む。その様な融合タンパク質は、構築された融合に従って、本発明のポリペプチドもしくは他の知られたファミリのタンパク質と同じまたは類似の生体機能の性格特性を持つことが期待されるだろう。
【００８５】
IL-19またはmda7を阻害するのに必要なIL-20RA/IL-20RB可溶性受容体の量は、投与法、目標部位、患者の生理学的状態、および他の投与薬物を含む、多くの異なる因子に依存する。かくて治療用量は、安全性および有効性を最適化するために滴定されるべきである。典型的に、in vitroで使われた用量は、これらの試薬のin vivo投与に対する有効量についての有益な指針を与えるだろう。特定の疾患の治療に対する有効用量の動物実験は、ヒトの用量のさらなる予想指標を与える。投与法は、経口、静脈内、腹膜内、筋肉内、経皮、あるいは噴霧形またはネブライザ-もしくはアトマイザーで肺または気管内への投与を含む。
【００８６】
医薬的に受容できる担体は、少し例をあげれば、水、生理食塩水、緩衝剤を含む。用量範囲は、通常1日当たり体重1Kg当たり1μgから1000μgである。 しかしながら、用量は、通常の技術を有する医者により決定される如く、通常これより多かったり少なかったりする。医薬処方および用量範囲の完全な議論は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版., (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996)およびGoodman and Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 第9版(Pergamon Press 1996)を見よ。
本発明は、以下の非限定的な例によりさらに説明される。
【００８７】
例１. IL-20RB変異株のクローニング
1. IL-20RB
1999年3月8日に出願された国際特許出願No.PCT/US99/03735に、クラスIIサイトカイン受容体ファミリーの2個の新規構成員が記述された。IL-20RBは、1999年8月31日に公布された米国特許No.5,945,511のクラスIIサイトカイン受容体IL-20RAと31%の相同性がある。IL-20は、クラスIIサイトカインファミリーの1員であるIL-10の同族体である。IL-20RBはクラスIIサイトカイン受容体であり、胎性腎臓、胎性小腸、胎性卵巣、正常な皮膚および乾癬皮膚に発現されるという事実から、IL-20RBはIL-20受容体のサブユニットのもっともらしい候補とされた。
【００８８】
２. IL-20RBコード領域のクローニング
２個のPCRプライマーは、1999年3月8日に出願された国際特許出願No. PCT/US99/03735(公布No.WO 99/46379)からの配列に基づいて設計された：ZC25480（配列番号：7）は、EcoRI制限部位にATG(Met1)コドンを含み、ZC25481（配列番号：8）は、XhoI制限部位に停止コドン(TAG)を含む。PCR増幅を、ヒトのケラチン細胞（HaCaT）cDNAライブラリーDNAを鋳型として、ならびにZC25480（配列番号：7）およびZC25481（配列番号：8）をプライマーとして使用して達成した。
【００８９】
PCR反応を、以下の様に行った：インキュベーションを94℃で1分間、ついで94℃で30秒間および68℃で2分間のサイクルを30回行い、68℃で4分間の追加的インキュベーションを行った後、反応を4℃で貯蔵した。PCR産物を1%アガロースゲル上で移動させ、１kb DNAバンドを観察した。PCR産物をゲルから切り取り、DNAをQIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いて精製した。精製DNAをEcoRIおよびXhoIで消化し、pZP7Nと呼ばれるpZPベクター中にクローン化した。pZPプラスミドは、マウスのメタロチオネイン−１プロモーター、ヒトtPAリーダーペプチド、コード配列の挿入のための多重制限部位、Glu-Glu標識、およびヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。
【００９０】
プラスミドはまた大腸菌の複製起点、SV40プロモーターを有する哺乳動物選択マーカー発現ユニット、DHFR遺伝子のみならず、エンハンサーおよび複製起点、ならびにSV40ターミネーターを有する。幾つかのIL-20R？-pZP7Nクローンの配列を決定した。それらは皆、PCT/US99/03735:(配列IL-20R？-pZP7N)におけるIL-20RB?の特許配列、146Pro(CCC)-Thr(ACC)、148His(CAT)-Asp(GAT)、および171Thr(ACG)-Arg(AGG)と比較して、3個の非保存的突然変異を含む。
【００９１】
IL-20R?-pZP7Nクローンでの3個の置換を確認するために、鋳型として3個の異なるcDNA原料源---胎性皮膚マラソンcDNA、HaCaT cDNAライブラリーDNA、および前立腺平滑筋cDNAライブラリーDNA---を用いて、PCR増幅作用を遂行した。PCR産物をゲル精製し、配列を決定した。3個のPCR産物の夫々の配列は、IL-20R?-pZP7Nクローンのそれと一致した。
【００９２】
例２. IL-20RA受容体-Ig融合タンパク質
発現ベクターpEZE3を、組換えIL-20受容体-Ig融合タンパク質を発現するために使用した。pEZE3は、pDC312から誘導した。pDC312は、Immunex Corporationから許可を受けて得られた。pDC312および pEZE3は、WO 97/25420に記述されているごとく、EASEセグメントを含む。発現ベクターにEASEセグメントが存在すると、安定な細胞プール中で組換えタンパク質の発現を2〜8倍に改善できる。
【００９３】
pEZE3は、哺乳動物細胞で、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で、3個までの異なるタンパク質を発現するために使用されるだろう3重シストロン発現ベクターである。pEZE3発現ユニットは、CMVエンハンサー/プロモーター、アデノウイルス3連リーダー配列、第1の組換えタンパク質のためのコード領域の挿入用多重クローニング部位、ポリオウイルス２型内部リボソーム侵入部位、第２の組換えタンパク質のためのコード領域挿入用第２の多重クローニング部位、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位、マウスジヒドロ葉酸還元酵素コードセグメント、およびSV40転写ターミネーターを含む。さらに、pEZE3は、大腸菌複製起点および細菌のベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
【００９４】
IL-20受容体-Ig融合タンパク質は、野生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域に融合したヒト細胞外ドメインの２本の鎖および突然変異したヒトの免疫グロブリンガンマ１定常領域に融合した２ヒトIL-20Rタンパク質細胞外ドメインの２本の鎖からなるジスルフィド結合したヘテロ4量体である。ヒト免疫グロブリンガンマ１定常領域は、FcRI結合およびC1q補体結合を低下させるためのアミノ酸置換を含む。
【００９５】
ヒトIL-20RB細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合構築物を、オーバーラップPCRにより形成した。IL-20RBコーどドメインは、アミノ酸1〜230からなる。IL-20RBドメインのPCR増幅のための鋳型として、前もって形成したIL-20RBヒトカッパ軽鎖定常領域発現構築物を使用した。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:９）(zc27,522)および（配列番号:10）(zc27,684)を、IL-20RBドメインを増幅するために使用した。野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域全体を使用した。野生型のヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域ドメインのPCR増幅のための鋳型として、前もって形成したIL-20RBヒトカッパ軽鎖定常領域発現構築物を使用した。
【００９６】
オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:11）(zc27,625)および（配列番号:12）(zc27,685)を、野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域を増幅するために使用した。２個のタンパク質コードセグメントを、オリゴヌクレオチド（配列番号:９）(zc27,522)および（配列番号:12）(zc27,685)を用いるオーバーラップPCRにより結合した。(Gly4Ser)3ペプチドリンカーを、2個のタンパク質ドメインの間に挿入した。該(Gly4Ser)3ペプチドリンカーを、PCRプライマー（配列番号:11）(zc27,625)および（配列番号:10）(zc27,684)上にコードした。
【００９７】
ヒトIL-20RA細胞外ドメイン−ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域融合構築物は、夫々別個のPCR増幅により形成した４個の別個のDNA構成体を、オーバーラップPCRすることにより形成した。
第１の構成体は、最適化されたtPA(組織プラスミノーゲン活性化因子)シグナル配列を含んだ。otPAシグナル配列を、先に社内で形成した発現ベクターを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番後:13）(zc27,525)および（配列番号:14）(zc27,526)を使用して増幅した。
【００９８】
第２の構成体は、アミノ酸1〜214からなるIL-20RA細胞外ドメインコード領域を含んだ。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:15）(zc27,524)および（配列番号:16）(zc27,674)を、先に形成したIL-20RAのクローンを鋳型として用いて、IL-20RA？セグメントを増幅するために使用した。
【００９９】
ヒトガンマ１重鎖定常領域を、２個のセグメントから形成した。CH1ドメインを含む第１のセグメントは、野生型ヒトガンマ１重鎖定常領域のクローンを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:17）（zc27,676)および（配列番号:18）(zc28,077)を用いて増幅した。残りのヒンジ、ヒト免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域のCH2および CH3ドメインを含む第２のセグメントを、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:19）(zc28,076)および（配列番号:20）(zc27,523)を用いてPCR増幅により形成した。
【０１００】
4個のタンパク質コードドメインは、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:13）（zc27,525)および（配列番号:20）(zc27,523)を用いてオーバーラップPCRにより結合した。(Gly4Ser)3ペプチドリンカーを、zcytor7およびCH1タンパク質ドメインの間に挿入した。該(Gly4Ser)3ペプチドリンカーを、PCRプライマー（配列番号:17）（zc27,676)および（配列番号:16）(zc27,674)上にコードされた。
IL-20RB細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合コードセグメントを第２のMCSにクローン化した。一方、ヒトIL-20RA細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域融合コードセグメントをpEZE3の第1MCS中にクローン化した。
【０１０１】
プラスミドを、CHO細胞を形質移入するために使用した。細胞をヒポキサンチンまたはチミジンを含まない培地内で選択し、形質変換遺伝子をメトトレキセートを用いて増幅した。タンパク質の存在を抗ヒトガンマ1重鎖定常領域および抗ヒトカッパ軽鎖抗体を用いてウェスタンブロット法により分析した。
IL-20RB細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合タンパク質およびDNA配列は、配列番号： 21および22に示されている。
IL-20RA細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域融合タンパク質およびDNA配列は、配列番号：23および24に示されている。
【０１０２】
例３. IL-20RA/B受容体-Ig融合タンパク質
発現ベクターpEZE3を、組換えIL-20RA/B受容体-Ig融合タンパク質を発現するために使用した。pEZE3は、pDC312から誘導する。pDC312は、Immunex Corporationからの許可を受けて得られた。pDC312およびpEZE3は、WO 97/25420に記述されているごとくEASEセグメントを含む。発現ベクターのEASEセグメントの存在は、安定細胞プールでの組換えタンパク質の発現を2〜8倍に改善できる。
【０１０３】
pEZE3は、哺乳動物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に、3個までの異なるタンパク質を発現するのに使用されるだろう３重シストロン発現ベクターである。pEZE3発現ユニットは、CMVプロモーター/プロモーター、アデノウイルウス３連リーダー配列、第１の組換えタンパク質のコード領域の挿入のための多重クローニング部位、ポリオウイルス２型内部リボソーム侵入部位、第２の組換えタンパク質のコード領域の挿入のための第２の多重クローニング部位、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位、マウスジヒドロ葉酸還元酵素用コードセグメント、およびSV40転写ターミネーターを含む。さらにpEZE3は、転写の大腸菌複製起点および細菌性ベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
【０１０４】
IL-20RA/B受容体-Ig融合タンパク質は、野生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域に融合したヒトIL-20RBタンパク質細胞外ドメインの２本の鎖および組換えヒト免疫グロブリンガンマ1定常領域に融合したヒトIL-20RAタンパク質細胞外ドメインの２本の鎖からなるジスルフィド結合４量体である。ヒト免疫グロブリンガンマ１定常領域は、FcRI結合およびC1q補体結合を低下させるためのアミノ酸置換を含む。
【０１０５】
ヒトIL-20RB細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合構築物を、オーバーラップPCRにより形成した。IL-20RBコードセグメントは、アミノ酸1〜230からなる。前もって形成したIL-20RBセグメントのPCR増幅のために、先に形成したIL-20RBヒトカッパ軽鎖定常領域発現構築物を鋳型として使用した。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:９)（zc27,522)および（配列番号: １0）(zc27,684)を用いて、IL-20Rセグメントを増幅した。全野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域を使用した。野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域セグメントのPCR増幅のために、以前に形成したIL-20RBヒトカッパ軽鎖定常領域発現構築物を鋳型として使用した。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:11）（zc27,675)および（配列番号:12）(zc27,685)を使用して、野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域を増幅した。２個のタンパク質コードするドメイン、オリゴヌクレオチド（配列番号:9)（zc27,522)および（配列番号:12）(zc27,685)を使用し、オーバーラップPCRにより結合した。(Gly4Ser)3ペプチドリンカーを、2個のタンパク質分域の間に挿入した。(Gly4Ser)3ペプチドリンカーは、PCRプライマー（配列番号:11（zc27,675)および（配列番号:10）(zc27,684)上にコードされた。
【０１０７】
ヒトIL-20RA細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域融合構成体を、夫々別個のPCR増幅反応により形成した4個の別個のDNA構成体をオーバーラップPCRすることにより形成した。
第１の構成体は、最適化されたtPA(組織プラスミノーゲン活性化因子)シグナル配列を含んだ。otPAシグナル配列を、先に社内で形成した発現ベクターを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:13）(zc27,525)および（配列番号:14）(zc27,526)を使用して増幅した。
第２の構成体は、アミノ酸１から214までからなるIL-20RA細胞外ドメインコード領域を含んだ。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:15）(zc27,524)および（配列番号:16）(zc27,674)を、IL-20RAの先に形成したクローンを鋳型として用いて、IL-20RA分節を増幅するために使用した。
【０１０８】
ヒトガンマ１重鎖定常領域は、２個のセグメントから形成された。CH1ドメインを含む第１のセグメントは、野生型ヒトガンマ1重鎖定常領域のクローンを鋳型として使い、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:17）（zc27,676)および（配列番号:18）(zc28,077)を用いて増幅した。残りのヒンジ、ヒト免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域のCH2および CH3ドメインを含む第２のセグメントを、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号:19）(zc28,076)および（配列番号:20）(zc27,523)を用いてPCR増幅により形成した。
【０１０９】
４個のコードドメインは、オリゴヌクレオチド（配列番号:13)（zc27,525)および（配列番号:20）(zc27,523)を用いてオーバーラップPCRにより結合した。(Gly4Ser)3ペプチドリンカーを、zcytor7およびCH1タンパク質ドメインの間に挿入した。該(Gly4Ser)3ペプチドリンカーは、、PCRプライマー（配列番号:17)（zc27,676)および（配列番号:16）(zc27,674)上でコードされた。
IL-20RB細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合コードセグメントを第２のMCSにクローン化した。一方、ヒトIL-20RA細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域融合コードセグメントをpEZE3の第1MCS中にクローン化した。
【０１１０】
プラスミドを用いて、CHO細胞を形質移入した。細胞をヒポキサンチンまたはチミジンを含まない培地内で選択し、形質転換遺伝子をメトトレキセートを用いて増幅した。タンパク質の存在を抗ヒトガンマ１重鎖定常領域および抗ヒトカッパ軽鎖抗体を用いてウェスタンブロット法により分析した。
IL-20RB細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合タンパク質およびDNA配列は、配列番号：21および22に示されている。その成熟ポリペプチド配列は、配列番号：41に示される。
IL-20RA細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域融合タンパク質およびDNA配列は、配列番号：23および24に示されている。その成熟ポリペプチド配列は、配列番号：39である。
【０１１１】
例４. IL-20受容体ヘテロ2量体の構築
分泌されるhIL-20RA/hIL-20RBヘテロ２量体を発現するベクターを構築した。この構築物において、hIL-20RAの細胞外ドメインをIgGガンマ1（IgGγ1）の重鎖に融合した。一方、IL-20RBの細胞外ドメインをヒトカッパ軽鎖（ヒトκ軽鎖）に融合した。
【０１１２】
IgGガンマ1およびヒトκ軽鎖融合ベクターの構築
IgGγ1の重鎖を、Zem229R哺乳動物発現ベクター（ATCC寄託No.69447）に、5’EcoRIおよび3’NheI部位を有する受容体のどの細胞外部分もクローンされ、その結果N端末細胞外ドメイン-C端末IgGγ1融合を生じるように、クローン化した。この構築物に使われたIgGγ1構成体を、鋳型としてClontech hFetal Liver cDNAライブラリーからIgGγ1配列を単離するためにPCRを用いて形成した。oligos（配列番号： 25）ZC11,450および（配列番号：26）ZC11,443を用いてPCR反応を以下のように行った：94℃で60秒、53℃で60秒、および72℃で120秒を40サイクル、ならびに72℃で7分間。
【０１１３】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、QiaQuickTM(Qiagen)ゲル抽出キットを用いて精製した。単離した990 bpのDNA構成体を、M1uIおよびEcoRI（Boerhinger-Mannheim）で消化し、エタノールで沈殿させ、M1uI/EcoRIリンカーからなる oligos（配列番号：27） ZC11,440および（配列番号：28）ZC11,441と共に、ここに開示された標準的分子生物学技術を用いて、先にM1uIおよびEcoRIで消化したZem229R中に結合した。この一般的なクローニングベクターを、Vector#76 hIgGgamma1 w/Ch1 #786 Zem229R(Vector#76)と呼ぶ。IgGγ1の重鎖に融合したhIL-20RAの細胞外分域のポリヌクレオチド配列を配列番号：29に、そして対応するポリペプチド配列を配列番号：30に示す。その成熟配列は、配列番号：40である。
【０１１４】
ヒトκ軽鎖をZem228R哺乳動物発現ベクター（ATCC寄託No.69446）に、5’EcoRI部位および3’KpnI部位を有する受容体のどの細胞外部分もクローンされ、その結果N端末細胞外ドメイン-C端末ヒトκ軽鎖融合を生じるように、クローン化した。この構築物に使われたヒトκ軽鎖構成体を、上で使われたと同じClontech hFetal Liver cDNAライブラリーからのヒトκ軽鎖配列を単離するためにPCRを用いて形成した。oligos（配列番号：31）ZC11,501および（配列番号：32）ZC11,451を用いてPCR反応を上述の条件下で行った。
【０１１５】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、QiaQuickTM(Qiagen)ゲル抽出キットを用いて精製した。単離した315 bpのDNA構成体を、M1uIおよびEcoRI（Boerhinger-Mannheim）で消化し、エタノールで沈殿させ、上述したM1uI/EcoRIリンカーと共に、ここに開示された標準的分子生物学技術を用いて、先にM1uIおよびEcoRIで消化したZem229R中に結合した。この遺伝子クローニングベクターを、Vector#77hκlight#774Zem228R（Vector#77）と呼ぶ。ヒトカッパ軽鎖に融合したIL-20RBの細胞外部分のポリヌクレオチド配列を配列番号：33に、そして対応するポリペプチド配列を配列番号：34に示す。その成熟配列は、配列番号：42である。
【０１１６】
融合ベクター構築物へのhIL-20RAおよびIL-20RB細胞外ドメインの挿入
上述の構築ベクターを用いて、ヒトIL-20RAをIgGγ1に融合させた構築物を形成した。この構築は、下記に述べる条件下でoligos（配列番号：35）ZC12,909および（配列番号：36）ZC26,564を有するhIL-20RA/IgG Vector#102からのヒトIL-20RA受容体をPCRすることにより行った：94℃で60秒、57℃で60秒、および72℃で120秒を30サイクル、ならびに72℃で7分間である。結果のPCR産物を、ここに記述したごとくEcoRIおよびNheIで消化し、ゲル精製し、予め消化されたEcoRIおよびNheIならびにバンド精製したVector#76（上述）中に結合した。結果のべクターを、ヒトIL-20Rα/IgGgamma1融合（hIL-20RA/Ch1 IgG）が正しいことを確認するために配列を決定した。hIL-20RA/Ch1 IgGgamma1#1825 Zem229RベクターをVector#195と名付けた。
【０１１７】
κlightにIL-20RBを融合させた個別の構築物もまた構築した。IL-20RB/ヒトκ軽鎖の構築は、上述のごとくoligos（配列番号：37）ZC26,602および（配列番号：38）ZC26,599を有するDR1/7N-4からPCRし、結果のバンドを、EcoRIおよびKpnIで消化し、ついでこの製品を予め消化されたEcoRIおよびKpnIおよびバンド精製したVector#77（上述）中に結合した。結果のベクターを、IL-20RB/ヒトκ軽鎖融合（IL-20RB/κlight）が正しいことを確認するために配列を決定した。このIL-20RB/κlight#1833Zem228RベクターをVector#194と名付けた。
【０１１８】
ヒトIL-20RAおよびIL-20RB受容体の共発現
上述のVector#194およびVector#195の夫々約16μgを、製造者の指示に従って、LipofectaminePlusTM試薬(Gibco/BRL)を用いて、BHK-570細胞（ATCC No. CRL- 10314）に共形質移入した。形質移入された細胞を、1μMのメトトレキセート（MTX）(Sigma, St. Louis, MO)を含むDMEM + 5%FBS(Gibco/BRL)中で10日間および0.5 mg/mL G418(Gibco/BRL)で10日間選択した。結果の形質移入物のプールをもう1度、10μΜ MTXおよび0.5mg/mL G418中で10日間選択した。
【０１１９】
２重に選択した細胞の生成プールを使用して、タンパク質を形成した。3工場（Nunc, Denmark）のこのプールを用いて、8 Lの無血清順化培地を形成した。この順化培地を、1 mLのプロテインAカラム上を通過させ、750 μLずつの10分画を溶出した。最も高濃度の4分画をプールし、PBSに対して透析した（10 kD MWカットオフ）。最後に、透析物は、BCA(Pierce)により分析し、317 μg/mLの濃度を有することを見出した。この8 Lの精製から総量951μgを得た。
【０１２０】
例５. Baf3/IL-20RA/IL-20RB安定細胞系の増殖分析
例の目的：
本例の目的は、IL-19がIL-20RA/IL-20RBヘテロ2量体受容体を発現する細胞系に結合できるか否かを決定することであった。
IL-19をBaf3/IL-20RA/IL-20RB安定細胞系で用量作用増殖分析を行った。増殖分析を以下のように組み立てた：
【０１２１】
-第1日： 96孔培養皿に1孔当り5000細胞で、6ng/mLから0.01ng/mLまでのIL-19および対照物の用量作用を接種し、細胞を37℃でインキュベートした。
-第4日：20μLのAlamar Blueを各孔に置き、細胞を37℃で一晩インキュベートした。
-第５日：培養皿をFluoresces Units(544nm ex./590nm em.)の自動化培養皿読取り機にかけた。データを以下に示す。
結果：以下のデータは、各孔の細胞数であり、細胞がIL-19に対する用量依存性作用で増殖したことを示す。
【０１２２】
【表１】
0004908723.tif 000002
【０１２３】
【表２】
0004908723.tif 000003
【０１２４】
例６. IL-19の中和分析法
例の目的：
本例の目的は、可溶性IL-20RA/IL-20RBヘテロ２量体受容体がIL-19を中和できるか否かを決定することであった。
-第１日：IL-20RA/IL-20RBヘテロ2量体受容体を発現する幼児ハムスター腎臓（BHK）細胞を1000細胞/孔で96孔培養皿にて培養した。
【０１２５】
-第２日：細胞をその作用を下方調整するために無血清培地で再培養した。
-第３日：IL-19を含む3つの異なる溶液を調製した。第１の溶液は0.1ng/mLの濃度を有し、第２は1ng/mL、第３は10ng/mLの濃度を有した。
対照実験として、夫々のIL-19溶液の100μL分割を、IL-19により引き起こされた細胞増殖の水準を決定するために、異なる細胞を含む孔に置いた。
【０１２６】
第2の実験で、10μg/mL濃度の可溶性IL-20RA/IL-20RBヘテロ2量体受容体を含む100μL溶液を、各IL-19溶液の100μL分割と混合し、溶液を完全に混合するために渦巻き攪拌をした。溶液を次に室温で30分間静置した。混合溶液を次いで、IL-20RA/IL-20RB受容体を発現するBHK細胞を含む3孔に夫々置いた。細胞を含むミクロタイター培養皿を37℃で4時間インキュベーとし、照度計で読んでデータを集めた。
下表のデータは、実験の最後に存在する細胞数を示す。表示されている如く、可溶性受容体は、3つの全ての濃度（ことに、より高濃度）においてIL-19単独の活性と比較して、IL-19の活性を幾分中和した。
【０１２７】
【表３】
0004908723.tif 000004
【０１２８】
【表４】
0004908723.tif 000005
【配列表】
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