(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−セリン、Ｌ−ホモセリン、又はそれらの薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
骨粗鬆症を予防及び／又は治療する医薬を製造するためのＤ−セリン、Ｌ−ホモセリン、又はそれらの薬学的に許容される塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞分化過程における転写因子であるＮＦＡＴ２の発現を抑制する方法に関する。より詳しくは、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路を抑制することによりＮＦＡＴ２の発現を抑制する方法、更には、ＮＦＡＴ２の発現を制御することによるＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療薬及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とを繰り返すことにより、骨再構築（リモデリング）を行っている。しかし、「骨粗鬆症」や「慢性関節リウマチ」を発症すると、骨吸収が骨形成量を上回るため、骨量の減少が見られる。一方、「大理石骨病」は、骨吸収不全が原因となる病態であり、破骨細胞の分化に異常があって骨組織に破骨細胞が存在しない場合や破骨細胞の機能に異常があって骨吸収が行えない場合等に発症するものと考えられている。
従来、骨粗鬆症の治療法としては、カルシウム剤の直接投与、カルシトニン、ビスホスホネートの使用、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン等のホルモン剤の投与、ビタミンＤ３の投与等が行われてきたが、いずれも決定的な治療方法とは言えない。カルシウム剤は非常に大量に摂取する必要があり、カルシトニンは抗体の出現や経口投与が不可能であり、ホルモン剤は副作用が強く、ビタミンＤ３は効果が低いという欠点があった。また、破骨細胞分化因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦκＢ  ｌｉｇａｎｄ；以下、ＲＡＮＫＬと略記する。）に対する抗ＲＡＮＫＬ抗体等も候補にあがっているが、蛋白質の場合には抗原性や経口投与できない等の問題がある。そこで、新規な骨粗鬆症治療薬の開発が求められていた。【０００３】
また、骨粗鬆症は骨吸収と骨再生のバランスが崩れ、骨分解を担う破骨細胞の形成が亢進することによって引き起こされる。この成熟破骨細胞は多核の細胞であるが、細胞が融合する過程でＮＦＡＴ２（ＮＦＡＴｃ１）遺伝子が必須であることが知られている（特許文献１参照。）。そこでＮＦＡＴ２遺伝子の発現を抑制することができれば破骨細胞の成熟を抑制でき、骨粗鬆症を予防又は治療できる可能性がある。かかるシグナル伝達を利用して破骨細胞形成を制御する技術としては、Ｃａ２＋シグナル伝達を促進又は抑制する方法（特許文献１参照。）、ＩＦＮシグナル伝達を促進又は抑制する工程を含む方法（特許文献２、３参照。）等が知られている。しかし、これらの方法はＣａ２＋のシグナル伝達を制御することから局所的に投与する必要があり、あるいは、蛋白質を投与することから抗原性、経口投与不可等の問題があった。そこで新規な機構に基づく新規なスクリーニング方法の開発が求められていた。
【特許文献１】特開２００４−１５４１３２号公報
【特許文献２】国際公開第２００２／０２４２２８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００２／０２４２２９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規なメカニズムに基づくＮＦＡＴ２関連疾患、例えば骨粗鬆症等の予防又は治療薬、ＮＦＡＴ２関連疾患、例えば骨粗鬆症等の予防又は治療方法及びＮＦＡＴ２関連疾患、例えば骨粗鬆症等の予防又は治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
破骨細胞分化過程において、破骨細胞前駆細胞ではＲＡＮＫＬからのシグナルを受けて分化の進行を担う様々な遺伝子が発現する。発明者は先年マウス細胞株ＲＡＷ２６４と分化誘導因子ＲＡＮＫＬ蛋白質からなる破骨細胞分化誘導系を用いて、マイクロアレイ解析による遺伝子発現と細胞播種密度による分化抑制という独自に見出した現象とを組み合わせることにより、ＲＡＮＫＬにより発現が誘導される転写制御因子ＮＦＡＴ２が多核細胞形成に重要であることを明らかにした。通常、破骨細胞前駆細胞ではＮＦＡＴ２は細胞質でリン酸化されており不活性な状態であるが、ＲＡＮＫＬからのシグナルを受けると、Ｃａ２＋とＣａ２＋−ＣａＭが結合して活性化されたカルシニューリンによりＮＦＡＴ２は脱リン酸化される。脱リン酸化されたＮＦＡＴ２はＲＡＮＫＬによる刺激後約２４〜４８時間で核内へ移行し、細胞融合や骨分解反応を担う諸酵素群等破骨細胞の形成や機能発現に関わる遺伝子発現を誘導する。逆に、ＮＦＡＴ２の阻害剤であるタクロリムス（以下、ＦＫ５０６ともいう。）やシクロスポリンで処理した破骨細胞前駆細胞は、破骨細胞へと分化しない。【０００６】
最近、発明者は上記と同じ実験系を用いて、培地成分中のアミノ酸Ｌ−セリン又はＬ−グリシンのいずれかがＲＡＮＫＬによるＮＦＡＴ２の誘導に必須であることを見出した。このことを確かめるために、Ｌ−セリンのアナログを用いて確かめたところ、Ｄ−セリンやＬ−ホモセリンがＬ−セリンの活性を拮抗阻害し、ＮＦＡＴ２の誘導、多核細胞の形成を抑制することが分かったことから、この現象には分子構造の特異性を認識するメカニズムが働いていることが示唆された。先に述べたように、破骨細胞の相対的な活性化による骨吸収の乱れは骨粗鬆症等の骨疾患の要因であることから、アミノ酸のＬ−セリンならびにＬ−グリシンによる破骨細胞の形成と活性の制御は骨代謝疾患に対する新しい分子標的薬への道を開くものである。【０００７】
本発明者は、アミノ酸であるＬ−セリン又はＬ−グリシンがＮＦＡＴ２遺伝子の発現に必須であること、そして、Ｌ−セリン及びＬ−グリシンが欠乏した状態では、ＮＦＡＴ２遺伝子が発現せず、その結果として破骨細胞の融合がおこらず破骨細胞が成熟しないことを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、破骨細胞形成に必須のＮＦＡＴ２の発現を制御する方法、該制御に用いるための薬剤及び医薬、並びにそのスクリーニング方法に関し、より具体的には、本発明は、
（１）  Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路を抑制することを特徴とするＮＦＡＴ２の発現を抑制する方法、
（２）  ＮＦＡＴ２発現の抑制が、ＮＦＡＴ２遺伝子発現の抑制によるものであることを特徴とする前記（１）記載の方法、
（３）  Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路の抑制をＬ−セリンと拮抗する物質とを接触させることによって行うことを特徴とする前記（１）又は（２）記載の方法、
（４）  Ｌ−セリンと拮抗する物質がＬ−セリン類似物質であることを特徴とする前記（３）記載の方法、
（５）  Ｌ−セリン類似物質がＤ−セリン、Ｌ−ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステル体であることを特徴とする前記（４）記載の方法、
（６）  前記（１）〜（５）のいずれかの方法により、ＮＦＡＴ２の発現を抑制することを特徴とするＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療方法、
（７）  Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路を抑制することを特徴とするＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療方法、
（８）  ＮＦＡＴ２関連疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする前記（６）又は（７）記載の予防及び／又は治療方法、
（９）  有効量のＤ−セリン、Ｌ−ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステル体の投与を含むことを特徴とする、生体内でのＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路抑制プロセス、
（１０）  Ｌ−セリンと拮抗する物質を含有することを特徴とするＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療剤、
（１１）  Ｌ−セリンと拮抗する物質がＤ−セリン、Ｌ−ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステル体であることを特徴とする前記（１０）記載の予防及び／又は治療剤、
（１２）  ＮＦＡＴ２関連疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする前記（１０）又は（１１）記載の予防及び／又は治療剤、
（１３）  破骨細胞形成に及ぼす物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検物質を含む試料の存在下、破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達の抑制又は促進を検出する工程、及び（ｂ）前記Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達の抑制を破骨細胞形成の抑制に、又は前記Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達の促進を破骨細胞形成の促進に関連付ける工程、を含む方法、
（１４）  破骨細胞形成に係わるＬ−セリンと拮抗する物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検物質、Ｌ−セリン及びＲＡＮＫＬを含有する培地で、破骨細胞前駆細胞を培養する工程、及び（ｂ）破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達の抑制を検出する工程、を含む方法、及び
（１５）  破骨細胞形成に係わるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシン様作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検物質及びＲＡＮＫＬを含有し、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンを含有しない培地で破骨細胞前駆細胞を培養する工程、及び（ｂ）破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達の促進を検出する工程、を含む方法、
に関する。【０００８】
さらに、本発明は、
（１６）  ＮＦＡＴ２関連疾患を予防及び／又は治療する医薬を製造するためのＬ−セリンと拮抗する物質の使用、
（１７）  Ｌ−セリンと拮抗する物質がＤ−セリン、Ｌ−ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステル体であることを特徴とする前記（１６）記載の使用、及び
（１８）  ＮＦＡＴ２関連疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする前記（１６）又は（１７）記載の使用、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＮＦＡＴ２の発現の抑制、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現を抑制することができるので、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化を抑制することができる。その結果、破骨細胞による骨破壊を効果的に抑制することができる。また、本発明のＮＦＡＴ２、特にＮＦＡＴ２遺伝子を標的とするシグナル経路によりＮＦＡＴ２の発現、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現を制御する薬剤は、ＮＦＡＴ２に関連する疾患、例えば正常に石灰化された骨基質が量的に減少する骨粗鬆症、自己免疫性関節炎、パジェット病もしくは関節リウマチを含む様々な骨減少性疾患及び骨癌、又は破骨細胞の機能不全によって骨の構築および再構築の異常が生じる骨硬化疾患あるいは免疫性疾患等に対する薬剤として有用である。また、本発明は、Ｌ−グリシン及び／又はＬ−セリンの実効濃度を測定することによる新規なＮＦＡＴ２の発現制御方法のスクリーニング系を提供できるので新規なＮＦＡＴ２の発現制御剤の探索に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験におけるマウスＲＡＷ２６４細胞から破骨細胞への分化を示す図である。図中ＭＮ  ｃｅｌｌｓは多核細胞を示す。
【図２】ＲＡＷ２６４細胞抽出液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中ｍｅｄｉｕｍのＦはＦｒｅｓｈ  ｍｅｄｉｕｍ，Ｃはｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍを示す（以下の図において同じ）。
【図３】ＲＡＮＫＬ刺激後のＲＡＷ２６４細胞抽出液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図４】Ａ）はＮＦＡＴ２−ｓｉＲＮＡ発現細胞抽出液のウエスタンブロッティングの結果を示す図であり、Ｂ）はＲＡＮＫＬ刺激後のＮＦＡＴ２−ｓｉＲＮＡ発現細胞を示す図である。
【図５】ＲＡＷ２６４細胞の播種細胞密度と多角細胞形成率の関係を示す図である。図中細胞密度１倍は２．５×１０４細胞／ｗｅｌｌを示す。
【図６】ＲＡＷ２６４細胞の低密度播種又は高密度播種におけるＲＡＮＫＬ刺激後のＲＡＷ２６４細胞抽出液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図７】異なる細胞密度でのＲＡＷ２６４細胞を播種し、ＲＡＮＫＬ刺激後のＲＡＷ２６４細胞抽出液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中細胞密度１倍は２．５×１０４細胞／ｗｅｌｌを示す。
【図８】異なる培地で分化誘導した場合のＲＡＷ２６４細胞と、該細胞の分化誘導効率を示す図である。
【図９】ＲＡＷ２６４細胞でのＮＦＡＴ２発現における培地成分の変化とＮＥＡＡの影響を示す図である。
【図１０】低密度播種又は高密度播種ＲＡＷ２６４細胞でのＮＦＡＴ２発現におけるＮＥＡＡの影響を示す図である。図中Ｌは低密度播種を、Ｈは高密度播種を示す。
【図１１】ＲＡＷ２６４細胞でのＮＦＡＴ２発現におけるＮＥＡＡの影響を示す図である。
【図１２】ＲＡＷ２６４細胞増殖に対するＮＥＡＡの影響を示す図である。
【図１３】Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍを用いたＲＡＷ２６４細胞でのＮＦＡＴ２発現におけるアミノ酸の影響を示す図である。図中Ａはアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｓはセリンを示す（以下の図において同じ）。
【図１４】Ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉｕｍを用いたＲＡＷ２６４細胞でのＮＦＡＴ２発現におけるアミノ酸の影響を示す図である。
【図１５】Ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉｕｍを用いたＲＡＷ２６４細胞でのＮＦＡＴ２発現におけるセリンアナログの影響を示す図である。図中Ｓｅｒはセリン（以下の図において同じ）を、ＤはＤ−セリンを、Ｌ−ＨｏｍｏはＬ−ホモセリンを示す。
【図１６】ＲＡＷ２６４細胞でのＮＦＡＴ２発現におけるＤ−セリンの影響を示す図である。
【図１７】破骨細胞前駆細胞の細胞密度依存的な多核細胞形成を示す図である。Ａ）マウス骨髄細胞から得た破骨細胞前駆細胞を異なる細胞密度で播種したものを破骨細胞へ分化誘導した結果をＴＲＡＰ陽性細胞数と細胞濃度との関係で示す。Ｂ）は多核細胞の形態を示す。
【図１８】高密度培養での培地中のＬ−セリンの減少とＬ−セリン濃度に依存するＮＦＡＴ２の発現を示す図である。Ａ）ＲＡＷ２６４細胞を低密度あるいは高密度で播種し、ＲＡＮＫＬ存在下あるいは非存在下で培養を行なったときの、培地中のＬ−セリンの量変化を示す。Ｂ）ＲＡＷ２６４細胞を異なる濃度のＬ−セリンを添加した培地で培養した後のＲＡＷ２６４細胞でのＮＦＡＴ２の発現をウエスタンブロッティングの結果で示す。
【図１９】ｃ−Ｆｏｓの発現に対する細胞密度とＬ−セリンの影響を示す図である。Ａ）低蜜度播種したＲＡＷ２６４細胞をＲＡＮＫＬの存在下で培養したときのｃ−Ｆｏｓの発現をウエスタンブロッティングの結果で示す。Ｂ）ＲＡＷ２６４細胞を低密度播種及び高密度播種で培養し、ｃ−Ｆｏｓの発現をウエスタンブロッティングの結果で示す。図中Ｌｏｗは低密度播種を、Ｈｉｇｈは高密度播種を示す。ｃ）ＲＡＷ２６４細胞を低密度播種してＮＥＡＡ、Ｌ−セリン又はＬ−グリシンを添加した培地で培養した後のｃ−ＦｏｓとＮＦＡＴ２の発現をウエスタンブロッティングの結果で示す。各レーンの数値は以下を示す。１：ＮＥＡＡを添加しない培地で培養したＲＡＷ２６４細胞；２：Ｌ−セリンを添加した培地で培養したＲＡＷ２６４細胞；３：Ｌ−グリシンを添加した培地で培養したＲＡＷ２６４細胞；４：Ｌ−セリンとＬ−グリシンを添加した培地で培養したＲＡＷ２６４細胞；５：Ｌ−セリンを含まないＮＥＡＡを添加した培地で培養したＲＡＷ２６４細胞；６：Ｌ−グリシンを含まないＮＥＡＡを添加した培地で培養したＲＡＷ２６４細胞；７：Ｌ−セリンとＬ−グリシンを含まないＮＥＡＡを添加した培地で培養したＲＡＷ２６４細胞；８：ＮＥＡＡを添加した培地で培養したＲＡＷ２６４細胞。
【図２０】骨髄細胞の破骨細胞への分化におけるＬ−セリンの影響を示す図である。Ａ）骨髄細胞の増殖に対するＬ−セリンの影響を示す。縦軸は細胞増殖・細胞死の度合いをＭＴＴ活性によって計測した結果を示す。横軸のセリン濃度×１は通常量（０．１ｍＭ）に等しい。Ｂ）骨髄由来破骨細胞前駆細胞の多核細胞形成に対するＬ−セリンの影響を示す。図左は多核細胞の形成量を示し、図右は細胞の形態を示す。＊はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより有意差（Ｐ＜０．０５）のあることを示す。Ｃ）破骨細胞前駆細胞をＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦで刺激した後４８時間培養した細胞溶解物のウエスタンブロッティングの結果を示す。Ｄ）レトロウイルス感染を介してＮＦＡＴ２を強制発現させた骨髄細胞における多核細胞形成に対するＬ−セリンの影響示す。図左は多核細胞の形成量を示し、図右はＧＦＰ発現細胞とＮＦＡＴ２発現細胞の形態（ＴＲＡＰ染色）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ＮＦＡＴ２の発現を抑制する方法に関する。より詳しくは、破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路を抑制し、ＮＦＡＴ２の発現の抑制、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現を抑制することによって、破骨細胞形成を抑制する方法、更には、ＮＦＡＴ２の発現を制御することによるＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療薬及びそのスクリーニング方法に関する。以下、本発明について、説明する。【００１２】
「Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路」とは、ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦκＢ  ｌｉｇａｎｄ）経路と並ぶ破骨細胞前駆細胞から破骨細胞の形成に必須のシグナル伝達経路をいい、独立した経路であってもよく、他の経路と応答する経路であってもよい。また、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路には、前記シグナル伝達経路と異なる伝達経路であって、その異なる伝達経路の一部でＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンが係わりＮＦＡＴ２が発現、特にＮＦＡＴ２遺伝子が発現するような伝達経路も包含する。従って、破骨細胞前駆細胞においてＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を促進することにより、該細胞の破骨細胞への分化を促進することができ、逆にＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を遮断することにより、該前駆細胞の破骨細胞への分化を阻害することができる。【００１３】
前記「破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）」とは、造血幹細胞を起源とする単球・マクロファージ系細胞（以下、ＣＦＵ−Ｍと略記する。）より分化した単核の破骨細胞前駆細胞が融合して形成される多核巨細胞（Ｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．，Ｒｅｖ．第２０巻，ｐ．３４５，１９９９年）をいう。破骨細胞は、骨基質を消化するコラゲナーゼを分泌し、骨吸収能を示す。また、一般に成熟した破骨細胞には、酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ（以下、ＴＲＡＰと略記する。）、カルシトニン受容体、ビトロネクチン受容体が発現する。このため、コラゲナーゼ、ＴＲＡＰ又はカルシトニン受容体、ビトロネクチン受容体を破骨細胞形成の指標（骨吸収マーカー）とすることができるので、破骨細胞形成は、これらの指標のうち、少なくとも１つの測定に基づいて判断することができる。破骨細胞は、ＴＲＡＰ陽性であって、かつ骨吸収活性を持つ細胞が好ましい。破骨細胞は、上記したようにＣＦＵ−Ｍから分化する。該分化は、具体的には、例えば、骨髄単球・マクロファージ系前駆細胞（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ；ＢＭＭｓ）等が、マクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；Ｍ−ＣＳＦ）、インタイーロイキン−３（ＩＬ−３）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）等の存在下でＲＡＮＫＬの刺激により行なわれ得る。
破骨細胞の形成は、例えば、文献（Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９５巻，ｐ．３５９７−６０２（１９９８年））に従って観察することができる。具体的には、例えば個体であれば、骨切片を作成して骨吸収を観察することができる。また、顕微鏡観察により多核巨細胞を同定したり、ＴＲＡＰ染色や、カルシトニン受容体又はビトロネクチン受容体の発現の検出等の公知の検出方法等により、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ両方で破骨細胞形成を検出することができる。骨吸収能は、公知の方法、例えば象牙切片上のピット形成面積を測定するＰｉｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ法等により評価できる。
前記「破骨細胞前駆細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）」は、破骨細胞に分化し得る単球・マクロファージ系細胞を含み、より特定すれば、Ｍ−ＣＳＦ等に応答して増殖が促進される細胞が好ましい。破骨細胞前駆細胞は、骨髄又は脾臓に含まれる細胞であってもよく、不死化した細胞株であってもよい。また、破骨細胞前駆細胞は造血幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させることもできる。【００１４】
本明細書において、「Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路を抑制する」とは、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンの濃度ならびにそれらの機能情報を伝達するシグナル伝達経路であって、ＮＦＡＴ２（ＮＦＡＴｃ１とも呼ばれるが、以下ＮＦＡＴ２に統一）の発現、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現に関与するシグナル伝達経路を抑制することをいい、シグナル伝達そのものを阻害又は抑制することも含まれる。シグナル伝達経路を抑制することには、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンの拮抗物質を投与してＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンの実効濃度を低下させること、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンの代謝、修飾及び／又は分解を促進することにより実質的にＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンの濃度を低下させること、ならびにＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンの受容体を抗体によりブロックすることも含まれるが、これらに限られない。また、シグナル伝達経路は、該経路のいずれの部分が抑制されてもよく、例えばＬ−セリンもしくはＬ−グリシン又はそれらの誘導体の濃度を感知する受容体又は輸送体等の結合蛋白質の発現抑制やその結合蛋白質からＮＦＡＴ２の発現抑制、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現に至るシグナル伝達経路の抑制等を含む。要するにＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンの濃度あるいは活性が実質的に低下したというシグナルを伝達してＮＦＡＴ２の発現の抑制、特にＮＦＡＴ２の遺伝子の発現を抑制できればシグナル伝達経路の如何なる部分の抑制であってもよい。この場合、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンを原料として合成される物質又はＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンから生成される代謝産物（セリンが付加された脂質、糖等を含む）を介するシグナル伝達によりＮＦＡＴ２の発現の抑制、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現が抑制される場合も含まれる。また、シグナル伝達経路の１ヶ所に限らず複数の箇所が抑制されてもよい。また、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路を抑制するには、前記Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路と異なる伝達経路であって、その該異なる伝達経路の少なくとも一部においてＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンが係わりＮＦＡＴ２が発現、特にＮＦＡＴ２遺伝子が発現する場合において、該Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンの係わり（作用）を抑制することも包含される。【００１５】
ＮＦＡＴ２は、Ｃａ２＋−カルシニューリン依存性に脱リン酸化されて核移行し、活性化される転写因子の１つである。ＮＦＡＴ２は、Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を制御する因子として発見されたが、多くの細胞の機能又は分化において重要な役割を果たす（Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｒ．ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．，Ｃｅｌｌ，第１０９巻：Ｓ６７−Ｓ７９，２０００年）。従って、本発明の方法又は薬剤によりＮＦＡＴ２の発現を抑制することでそのような機能や分化を抑制することができる。ＮＦＡＴ２の具体例としては、例えば、ヒトＮＦＡＴ２  ｍＲＮＡの塩基配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００６１６２に、蛋白質のアミノ酸配列はＮＰ＿００６１５３に示されている。また、ＮＦＡＴ２には、上記特定のアミノ酸配列で示されるＮＦＡＴ２だけでなく、ＮＦＡＴ２と生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、同族体（ホモログ）、誘導体、及び変異体が包含される。ここで同族体（ホモログ）としては、ヒトのＮＦＡＴ２に対応するマウスやラット等他生物種のＮＦＡＴ２が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）等により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。例えば、マウスＮＦＡＴ２  ｍＲＮＡの塩基配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ２３９１６９、ＡＦ０８７４３４（アイソフォームａ）、及びＡＦ０４９６０６（アイソフォームｂ）に、これらがコードするＮＦＡＴ２蛋白質のアミノ酸配列はそれぞれＡＡＣ３６７２５、ＡＡＣ３６７２５、及びＡＡＣ０５５０に示されている。
また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加及び挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のない蛋白質又は（ポリ）ペプチドと、アミノ酸配列が少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９５％、さらにより好ましくは約９７％相同なものを挙げることができる。【００１６】
ＮＦＡＴ２の発現の抑制には、ＮＦＡＴ２遺伝子の発現の抑制、ＮＦＡＴ２遺伝子の転写及び／又は翻訳の抑制、ＮＦＡＴ１の発現及び活性抑制を介した転写抑制（Ｚｈｏｕ  Ｂ  ｅｔ．  Ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７７巻，ｐ．１０７０４，２００２年）、ＮＦＡＴ２  ｍＲＮＡの不安定化の促進、ＮＦＡＴ２蛋白質の分解の促進、外来的にＮＦＡＴ２  ｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸もしくはＮＦＡＴ２  ｍＲＮＡを切断するリボザイム又はＲＮＡｉ等を発現することによるＮＦＡＴ２の発現阻害等が含まれる。好ましいＮＦＡＴ２の発現の抑制は、ＮＦＡＴ２遺伝子の発現の抑制である。
本明細書において遺伝子（又はＤＮＡ）とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する意味で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ及びｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該遺伝子又はＤＮＡには、特定の塩基配列で示される遺伝子又はＤＮＡだけでなく、これらによりコードされる蛋白質と生物学的機能が同等である蛋白質（例えば、同族体（ホモログ）、変異体及び誘導体等）をコードする遺伝子又はＤＮＡが包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする遺伝子又はＤＮＡとしては、ストリンジェントな条件下で、特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子又はＤＮＡを挙げることができる。
ここでストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  （１９８７，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件（ハイブリダイズ後の洗浄条件）として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件（ハイブリダイズ後の洗浄条件）として「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。【００１７】
「Ｌ−セリンと拮抗する物質」とは、前記Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路において、Ｌ−セリンの濃度あるいは活性を実際よりも低く伝えることができる物質をいう。このような物質の例としては、例えば、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのアミノ酸アナログ等が挙げられる。典型的には、Ｄ−セリンやＬ−ホモセリンが挙げられるがこれらに限られず、アミノ酸アナログであって、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路を抑制でき、ＮＦＡＴ２の発現（好ましくはＮＦＡＴ２遺伝子の発現）を抑制できるものであれば制限無く用いることができる。ＮＦＡＴ２の発現は、例えば実施例１０のように培養細胞にＬ−セリンと拮抗する物質を添加してウエスタンブロットにより観察することができる。破骨細胞への分化は、多核化（細胞融合）、ＴＲＡＰ、カルシトニン受容体、ビトロネクチン受容体、コラゲナーゼの発現あるいは骨吸収能のいずれかを指標として判断することができるので、これらの指標がネガティブであることを指標としてＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンと拮抗する物質の効果を測定することもできる。【００１８】
「Ｌ−セリン類似物質」とは、典型的にはＬ−セリンのアミノ酸アナログをいうがこれに限られない。Ｌ−セリン類似物質としては、Ｌ−セリンの全部又は一部と構造的又は機能的に類似し、例えば生体内でＬ−セリンと競合して作用するもの等であればよい。
また、Ｌ−セリン類似物質には、Ｌ−セリンの光学異性体、Ｌ−セリンに側鎖を有する誘導体、Ｌ−セリンの薬学的に許容される塩又はエステル、Ｌ−セリンを原料として合成される物質及びＬ−セリンから生成する代謝産物（セリンが付加された脂質、糖などを含む）であって、Ｌ−セリンと拮抗する物質も含まれるがこれらに限定されない。また、Ｌ−セリン受容体からドラッグデザインによりデザインされた物質であって、Ｌ−セリンと拮抗する物質であってもよい。Ｌ−セリンの薬学的に許容される塩としては、例えばアルカリ金属（カリウム、ナトリウム、リチウム等）の塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモニウム塩（テトラメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等）、有機アミン（トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）の塩、酸付加物塩［無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等）又は有機酸塩（酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、グルクロン酸塩、グルコン酸塩等）など］が挙げられる。Ｌ−セリンのエステル体としては、例えばメチル、エチル、プロピル等の低級アルキル基のエステル体が挙げられる。
また、上記Ｌ−セリン類似物質は水和物又は溶媒和物であってもよい。水和物又は溶媒和物は非毒性かつ水溶性であることが好ましい。水和物としては、例えば１水和物、２水和物、１／２水和物又は４／３水和物等が挙げられ、溶媒和物としては、エタノールの付加物等のアルコール系溶媒和物等が挙げられる。【００１９】
Ｌ−セリン類似物質としては、例えばＤ−セリンやＬ−ホモセリン等が好ましく挙げられる。Ｄ−セリンやＬ−ホモセリンは、その塩又はそれらのエステル体であってもよい。前記塩には薬学的に許容されるものすべてが含まれる。該塩としては、上記したＬ−セリンの薬学的に許容される塩が挙げられる。エステル体としては、上記したＬ−セリンのエステル体が挙げられる。Ｄ−セリンやＬ−ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステル体としては、具体的には、例えばＤ−セリンメチルエステル塩酸塩やＬ−Ｏ−カフェオイルホモセリンなどが挙げられる。【００２０】
ＮＦＡＴ２の発現の抑制、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現を抑制する方法としては、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路に、Ｌ−セリンと拮抗する物質を接触させること等が挙げられる。前記接触は、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンが作用又は会合する蛋白質との接触あるいは前記シグナル伝達経路を有する例えば細胞、組織又は個体等との接触が含まれる。前記接触の結果、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路において、例えばＬ−セリンと拮抗する物質が、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンと例えば競合する等してＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナルの伝達を阻害又は抑制する。【００２１】
本発明の方法によれば、Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路を抑制することにより、ＮＦＡＴ２の発現の抑制、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現を抑制することができる。ＮＦＡＴ２の発現が抑制されると、破骨細胞の形成が阻害される。破骨細胞は骨を吸収する細胞であり、その細胞の異常はＮＦＡＴ２関連疾患、例えば骨粗鬆症や大理石骨病等の骨疾患や免疫疾患の原因となる。このため、本発明の方法は、ＮＦＡＴ２関連疾患、例えば骨粗鬆症や大理石骨病等の骨疾患や免疫疾患を予防又は治療する方法に用いることができる。また、ＮＦＡＴ２は破骨細胞の成熟以外にもインターロイキン−２（ＩＬ−２）等のように免疫反応を活性化するサイトカインの誘導活性を有することが知られていることから、本発明の方法は免疫抑制にも利用できる【００２２】
本発明の方法は、破骨細胞前駆細胞にＬ−セリンと拮抗する物質、例えばＤ−セリンを接触及び／又は導入させることが好ましい。破骨細胞前駆細胞とＬ−セリンと拮抗する物質、例えばＤ−セリンやＬ−ホモセリンを接触させることにより、破骨細胞前駆細胞でのＮＦＡＴ２の発現、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現の抑制を通して、効率よく破骨細胞形成を阻害することができる。
本発明の方法は、哺乳動物に有効量のＬ−セリンと拮抗する物質、例えばＤ−セリン、Ｌ−ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステル体の投与を含む。該投与は、生体内のＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達経路を抑制できれば経口投与又は非経口投与のいずれでもよい。【００２３】
本発明のＮＦＡＴ２遺伝子の発現を抑制する方法に用いられるＬ−セリンと拮抗する物質、例えばＤ−セリンやＬ−ホモセリンは、破骨細胞の形成を抑制することができるので、ＮＦＡＴ２関連疾患、例えば関節リウマチ等の自己免疫性関節炎や、例えば骨粗鬆症等の骨減少性疾患の予防又は治療剤に、あるいは例えば免疫疾患等の免疫抑制剤として用いることができる。
本発明の実施形態の１つとして、例えばＤ−セリンの投与が挙げられる。Ｄ−セリンを投与することにより、ＮＦＡＴ２の発現、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現が抑制される。この抑制に必要なＤ−セリンの濃度はＬ−セリンの約５〜２０倍、好ましくは約１０倍程度である。【００２４】
また、本発明のＮＦＡＴ２発現の抑制、特にＮＦＡＴ２遺伝子の発現を抑制する方法は、破骨細胞の形成を阻害する薬剤等と併用することも好ましい。破骨細胞の形成を阻害する薬剤としては、例えばカルシニューリンの阻害剤等が挙げられる。カルシニューリンの阻害剤としては、ＦＫ５０６、ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ（ＣｙＡ／ＣｓＡ）及びそれらの類似体等が挙げられる。これらのカルシニューリン阻害剤と、本発明にかかるＬ−セリンと拮抗する物質、例えばＤ−セリンやＬ−ホモセリンを同時に投与することにより、骨吸収をより効率よく抑制することが可能となる。【００２５】
本発明のスクリーニング方法は、例えば破骨細胞分化誘導系を用いて行うことができる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）及び（ｂ）を含む：（ａ）  被検物質を含む試料の存在下、破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達の抑制又は促進を検出する工程、
（ｂ）前記Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達の抑制を破骨細胞形成の抑制に、又は前記Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達の促進を破骨細胞形成の促進に関連付ける工程。【００２６】
かかるスクリーニング方法に用いられる細胞としては破骨細胞への分化が可能である、例えば破骨細胞前駆細胞等を挙げることができる。破骨細胞への分化が可能な破骨細胞前駆細胞であれば何れの細胞であっても制限なく用いることができるが、例えば、骨髄マクロファージ系細胞等が好ましく用いられる。より具体的には、ＢＭＭｓ、ＲＡＷ２６４．７細胞（マクロファージ様細胞；ＲＡＷ２６４細胞と略記することもある。）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等が挙げられる。好ましくはＲＡＷ２６４細胞である。特に、マウスＲＡＷ２６４細胞（ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ；  ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  “ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｔｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／ＣＥＬＬ／ＨＴＭＬ／ＲＩＫＥＮ”  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｔｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／ＣＥＬＬ／ＨＴＭＬ／ＲＩＫＥＮ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｔｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．Ｊｐ／ＣＥＬＬ  ／ＨＴＭＬ／ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ．  Ｈｔｍｌから入手可能）は、分化誘導物質であるＲＡＮＫＬの添加で破骨細胞に分化することが知られている細胞である（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２８２，  ２７８−２８３  （２００１））。【００２７】
本発明のスクリーニング方法において、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞形成には、通常、Ｍ−ＣＳＦの存在下にＲＡＮＫＬで破骨細胞前駆細胞を刺激するのが好ましい。具体的には、例えばＢＭＭ又はＥＳ細胞等から破骨細胞を形成させるには、Ｍ−ＣＳＦ存在下でＲＡＮＫＬ刺激を行う。Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの濃度は適宜調節することができる。例えばＭ−ＣＳＦの濃度は約１〜２０ｎｇ／ｍＬ、好ましく約５〜１５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約８〜１２ｎｇ／ｍＬ程度である。また、ＲＡＮＫＬの濃度は約１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましく約５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約８０〜１２０ｎｇ／ｍＬ程度である。また、Ｍ−ＣＳＦ非依存的にＲＡＮＫＬに応答して破骨細胞に分化する細胞、例えばＲＡＷ２６４細胞等は、破骨細胞形成においてＭ−ＣＳＦが存在しなくても破骨細胞に分化できるので、ＲＡＮＫＬ刺激のみ行なえばよい。この場合、ＲＮＡＫＬの濃度は、上記した濃度と同様である。また、本発明のスクリーニング方法においては、例えば凍結ラット破骨細胞前駆細胞（骨髄由来）とＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬを含有した専用培地、更にＰｉｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ用に象牙質切片をセットした破骨細胞培養キット（株式会社ホクドー製）等も好ましく用いることができる。【００２８】
被検物質を含む試料としては特に制限はなく、例えば、アミノ酸類縁体のライブラリー、合成低分子物質のライブラリー、精製蛋白質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出物、微生物由来物質等が挙げられる。【００２９】
Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達の検出は、ＮＦＡＴ２の発現を指標におこなうことができる。ＮＦＡＴ２の発現は、例えばＮＦＡＴ２と特異的に結合する抗体を用いて、ウエスタンブロット、ドットブロット又はスロットブロット等の公知の方法を用いて検出することができる。具体的には、例えばウエスタンブロット法は、一次抗体としてＮＦＡＴ２抗体を用いた後、二次抗体として例えばＨＲＰ（西洋わさびパーオキシダーゼ）等の化学発光試薬、125Ｉ等の放射性同位元素、蛍光物質等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の化学発光、放射性同位元素、蛍光物質等に由来するシグナルを化学発光検出器、放射線測定器、蛍光検出器等で検出し、測定することによって実施できる。【００３０】
また、ＮＦＡＴ２の発現は、前記した蛋白質を指標とする以外に、遺伝子発現レベルの検出を指標とすることも好ましい。遺伝子発現レベルのＮＦＡＴ２遺伝子の検出は、前記細胞から調製したＲＮＡ又は該ＲＮＡから転写された当該ＲＮＡに対して相補的なポリヌクレチドと、例えば、ＮＦＡＴ２遺伝子又はＮＦＡＴ２遺伝子のプロモーター領域等を用いて、例えばノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等公知の方法の他、ＤＮＡチップ等を利用して実施できる。前記遺伝子としては、ＮＦＡＴ２結合配列〔ＧＧＡＡＡＡ及びその類似配列（例えばＧＧＡＡＡＮ等，ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，又はＧ），Ｍａｃｉａｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，第２０巻，ｐ．２４７６−２４８９，２００１年〕を含むＤＮＡ、好ましくはさらにＮＦＡＴ２及び転写因子ＡＰ−１（アクチベータープロテイン−１）結合配列〔ＴＧＡ［Ｇ／Ｃ］ＴＣＡ及びその類似配列（例えばＴＧＮＮＴＣＡ等、ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，又はＧ）、Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ新用語ライブラリー「転写因子」、実験医学  別冊，羊土社，ｐｐ．２０４−２０５〕を含むＤＮＡが好ましい。また、前記ＤＮＡの下流に所望のレポーター遺伝子を結合したものも好ましく用いることができる。レポーター遺伝子を結合することにより、レポーター活性等を指標としてレポーター遺伝子の発現量を定量することによりＮＦＡＴ２プロモーターからの転写をモニターできる。具体的なプロモーター配列としては、ＴＲＡＰプロモーター、又はカルシトニンプロモーター（Ｐ３プロモーター）等が挙げられる。レポーター遺伝子としてはルシフェラーゼ遺伝子、蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ，ＹＦＰ，ＢＦＰ等）、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β―ガラクトシダーゼ遺伝子等が挙げられる。また、ＮＦＡＴ２により誘導される遺伝子としては、ＮＦＡＴ２に依存的な、例えば、ＴＲＡＰ、カルシトニンレセプター（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、カテプシンＫ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ）、カルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ＩＩ；ＣＡ  ＩＩ）、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）−９等の遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子のＮＦＡＴ２結合部位を含むプロモーター配列を前記レポーターに連結するプロモーターとして好適に用いることができる。これらの遺伝子は破骨細胞の最終分化において誘導され、複数のＮＦＡＴ２及びＡＰ−１結合部位を含む（Ａｎｕｓａｋｓａｔｈｉｅｎ，Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，第２７６巻，ｐ．２２６６３−２２６７４，２００１年；Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ１．，第８８巻，ｐ．８９−９７，２００１年；Ｍｏｔｙｃｋｏｖａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９８巻，ｐ．５７９８−５８０３，２００１年；Ｒｅｄｄｙ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．，第１０巻，ｐ．６０１−６０６，１９９５年）。【００３１】
またＮＦＡＴ２遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、ＮＦＡＴ２遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子等のマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来の蛋白質の活性を測定することで実施することもできる。本発明のＮＦＡＴ２の発現制御物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。この意味において「ＮＦＡＴ２遺伝子」の概念には、ＮＦＡＴ２遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましく、具体的には上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子等のレポーター遺伝子もまた使用することができる。ここでＮＦＡＴ２遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１ｋｂ、好ましくは約２ｋｂを用いることができる。融合遺伝子の作成、及びマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。【００３２】
指標とするＮＦＡＴ２蛋白質又はＮＦＡＴ２遺伝子発現の抑制又は促進は、被検物質を添加しない対照細胞でのＮＦＡＴ２蛋白質又はＮＦＡＴ２遺伝子もしくはＮＦＡＴ２誘導性プロモーターによるレポーター遺伝子の発現量と、被検物質を添加した細胞におけるＮＦＡＴ２蛋白質又は前記遺伝子の発現量を比較することにより行なうことができる。例えば被検物質を添加した細胞におけるＮＦＡＴ２蛋白質又は前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しない対照細胞でのＮＦＡＴ２蛋白質又は前記遺伝子の発現量の約９０％以下、好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは２０％以下、とりわけ好ましくは１０％以下に低くなる場合に、当該被検物質を破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を抑制する候補物質として選択することができる。また逆に、例えば被検物質を添加した細胞におけるＮＦＡＴ２蛋白質又は前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しない対照細胞でのＮＦＡＴ２蛋白質又は前記遺伝子の発現量の約１１０％以上、好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１３０％以上、特に好ましくは１５０％以上に高くなる場合に、当該被検物質を破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を促進する候補物質として選択することができる。
また、指標とするＮＦＡＴ２蛋白質又はＮＦＡＴ２遺伝子発現の抑制又は促進と破骨細胞形成の抑制又は促進との関連付けは、指標とするＮＦＡＴ２蛋白質又はＮＦＡＴ２遺伝子発現が抑制される場合は、破骨細胞形成も同程度に抑制されるものとし、指標とするＮＦＡＴ２蛋白質又はＮＦＡＴ２遺伝子発現が促進される場合は、破骨細胞形成も同程度に促進されるものとする。【００３３】
通常、骨粗鬆症といった骨代謝異常疾患に罹患した患者の骨組織には、特異的に、破骨細胞の分化・活性化の亢進が見られるとともにＮＦＡＴ２（ＮＦＡＴ２遺伝子）が発現している。すなわち、本発明のスクリーニング方法はＮＦＡＴ２又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現を抑制する物質を探索することによって、破骨細胞形成に関連する骨代謝異常疾患の予防又は治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
候補物質の選別は、発現誘導物質によって誘導されるＮＦＡＴ２の発現又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現が被検物質の存在によって抑制されることを指標にして実施できる。すなわち発現誘導物質存在下で被検物質を接触させた細胞のＮＦＡＴ２の発現又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現が、発現誘導物質存在下で被検物質を接触させない対照細胞に比して低くなることをもって、当該被検物質を候補物質として選択することができる。具体的には被検物質を含む試料の存在下、上記方法でＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を測定し、対照に比べ該シグナル伝達を促進又は抑制する物質を選択する。対照の条件としては、該被検物質を含まないか、あるいはより低用量で含む場合であり、典型的には、被検物質の非存在下（例えば被検物質の添加に用いた担体のみの添加）における場合が挙げられる。また、対照の条件として、被検物質をより低い用量で含む場合を用いれば、物質の用量依存性が明らかとなる。また、発現誘導物質存在下で被検物質を接触させた細胞のＮＦＡＴ２の発現又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現が、破骨細胞形成を調節する公知の化合物を接触させる陽性対照細胞に比して低くなること又は高くなることをもって、当該被検物質を候補物質として選択することもできる。この場合、陽性対照として用いた化合物の存在下における場合と比べ、該Ｌ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を促進又は抑制させる物質を選択できる。このようなスクリーニングにおいては、陽性対照とした化合物に比べより高い効果を有する物質を得ることができる。【００３４】
また、大理石骨病といった骨代謝異常疾患に罹患した患者は、破骨細胞の形成不全等が見られるとともにＮＦＡＴ２（ＮＦＡＴ２遺伝子）の発現が低下している。すなわち、本発明のスクリーニング方法はＮＦＡＴ２又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現を促進する物質を探索することによって、破骨細胞形成に関連する骨代謝異常疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
候補物質の選別は、発現誘導物質によって誘導されるＮＦＡＴ２の発現又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現が被検物質の存在によって促進されることを指標にして実施できる。すなわち発現誘導物質存在下で被検物質を接触させた細胞のＮＦＡＴ２の発現又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現が、発現誘導物質存在下で被検物質を接触させない対照細胞に比して高くなることをもって、当該被検物質を候補物質として選択することができる。具体的には被検物質を含む試料の存在下、上記方法でＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を測定し、対照に比べ該シグナル伝達を促進又は抑制する物質を選択する。対照の条件等は、上記ＮＦＡＴ２及び／又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現を抑制する物質の探索と同様である。【００３５】
本発明のスクリーニング方法に用いられる培地としては、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられるが、破骨細胞前駆細胞を破骨細胞に分化させるために用いられるものであり、動物細胞、特に造血幹細胞の培養に用いられる栄養培地であればいずれも好ましく用いることができる。このような培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ‘ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、最小ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＭＥＭ）、α−ＭＥＭ培地（α−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；α−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｏｃｏｖｅ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（ケンブレックス社）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（ケンブレックス社）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社）又はＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社）などが挙げられる。【００３６】
より具体的には、本発明のスクリーニング方法は、例えば破骨細胞形成のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系を用いて行うことができる。具体的には、例えば、非接触性骨髄細胞（２４穴プレートの１ウェル当たり５×１０５細胞）を約１０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを含む例えばα−ＭＥＭで２日間培養し、約１００ｎｇ／ｍＬの可溶性ＲＡＮＫＬ、約１０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦの存在下でさらに３日間培養して破骨細胞を形成させる系を利用できる。ここに被検物質を含む試料を添加して培養する。また、ｉｎ  ｖｉｖｏの系であれば、例えば卵巣摘出等による骨粗鬆症モデルマウスやエンドトキシン誘導性骨吸収動物モデルを用いた系が挙げられる。さらには、ＥＳ細胞からの破骨細胞形成系を利用することができる。ＥＳ細胞を用いたスクリーニング系においては、破骨細胞形成に関わる所望の遺伝子を欠損する細胞を用いることができる。遺伝子欠損ＥＳ細胞からの破骨細胞形成系を用いれば、被検物質が破骨細胞形成シグナルのどのシグナル経路に関与するのかについて、有益な情報を得ることができる。
このスクリーニングの結果、被検物質を含む試料の添加により、対照の条件下と比較してＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達が有意に促進又は抑制されれば、用いた被検試料は破骨細胞形成を調節する物質の候補となる。このスクリーニング方法により単離される物質は、破骨細胞形成を制御するために有用であり、骨代謝疾患の予防薬や治療薬の開発の上でも有用である。【００３７】
また本発明のスクリーニング方法は、破骨細胞形成に及ぼす物質の効果を検査する方法でもあるので、本方法により、破骨細胞形成を抑制する物質を同定することができる。
また、本発明のスクリーニング方法を用いて、破骨細胞形成に係わるＬ−セリンと拮抗する物質をスクリーニングすることもできる。この場合、Ｌ−セリンとＲＡＮＫＬを含有する培地に被検物質を添加して、破骨細胞前駆細胞を培養し、上記と同様に破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を測定することが好ましい。測定の結果、ＮＦＡＴ２の発現又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現の抑制が認められるか前記発現が認められなければ、被検物質がＬ−セリンの拮抗物質であると同定できる。同定されたＬ−セリンの拮抗物質は、破骨細胞形成を抑制する物質として好ましく用いることができる。前記抑制の程度は、被検物質を添加した細胞におけるＮＦＡＴ２蛋白質又は前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しないで培養した破骨細胞前駆細胞（対照細胞）でのＮＦＡＴ２蛋白質又は前記遺伝子の発現量の約９０％以下、好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは２０％以下、とりわけ好ましくは１０％以下である。この場合において、Ｌ−グリシンを介してＮＦＡＴ２又はＮＦＡＴ２遺伝子が発現する場合を除外するため、培地はＬ−グリシンを含有しないものを用いるのが好ましい。具体的は、例えばα−ＭＥＭからＬ−グリシンを除いた培地に任意のＬ−セリンを添加した培地を調製し、調製した培地を用いて、例えばＢＭＭ又はＥＳ細胞をＭ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下で培養を行うか、あるいは例えばＲＡＷ２６４細胞をＲＡＮＫＬの存在下で培養を行う。Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの濃度は上記した濃度と同様である。
【００３８】
また、本発明のスクリーニング方法は、破骨細胞形成に係わるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシン様物質をスクリーニングする方法でもある。この場合においては、上記した培地の成分からＬ−セリン及びＬ−グリシンを除いた培地に被検物質を添加して破骨細胞前駆細胞を培養し、上記と同様に破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を測定することが好ましい。測定の結果、ＮＦＡＴ２の発現又はＮＦＡＴ２遺伝子の発現の促進が認められれば、被検物質がＬ−セリン及び／又はＬ−グリシン様物質であると同定できる。同定されたＬ−セリン及び／又はＬ−グリシン様物質は、破骨細胞形成を促進する物質として好ましく用いることができる。前記促進の程度は、被検物質を添加した細胞におけるＮＦＡＴ２蛋白質又は前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しないで培養した破骨細胞前駆細胞（対照細胞）でのＮＦＡＴ２蛋白質又は前記遺伝子の発現量の約１１０％以上、好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１３０％以上、特に好ましくは１５０％以上である。具体的には、例えばα−ＭＥＭからＬ−セリン及びＬ−グリシンを除いた培地を調製し、調製した培地を用いて、例えばＢＭＭ又はＥＳ細胞をＭ−ＣＳ及びＲＡＮＫＬの存在下で培養を行うか、あるいは例えばＲＡＷ２６４細胞をＲＡＮＫＬの存在下で培養を行う。Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの濃度は上記した濃度と同様である。
【００３９】
本発明のスクリーニングにより得られた物質は、破骨細胞形成の阻害剤又は促進剤として用いることができる。臨床適用のための物質の投与条件は、本明細書に記載した破骨細胞形成系を用いて決定することができる。すなわち、上記検査方法を用いて投与量、投与間隔、投与ルートを含む投与条件を検討し、適切な予防又は治療効果が得られる条件を決定することができる。このような物質は、ＮＦＡＴ２関連疾患等に対する予防又は治療のための医薬となる。物質はそのままもしくは自体公知の薬学的に許容できる所望の添加剤、例えば賦形剤（例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース等）、結合剤（例えばデンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液等）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム等）、崩壊剤（例えばデンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウム等）、溶剤（例えば注射用水、滅菌精製水、生理食塩水、緩衝液、植物油等）、乳化剤（例えばステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴール、アラビアゴム、ポピドン等）、懸濁剤（例えばカルメロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポピドン等）、安定剤（例えば亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）、保存剤（例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等）などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する剤形（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤等の非経口投与剤等）などに応じて経口投与又は非経口投与することができる。また、上記医薬組成物は、放出制御物質と共に徐放性製剤、ＤＤＳ（ドラッグデリバリー）製剤とすることもできる。前記放出制御物質としては、自体公知の例えばα−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸，乳酸，ヒドロキシ酪酸等），ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等），ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）などの１種以上から無触媒脱水重縮合で合成された重合体、共重合体あるいはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸等）、無水マレイン酸系共重合体（例、スチレン−マレイン酸共重合体等）などの生体内分解性高分子物質等が挙げられる。【００４０】
患者への投与は、有効成分の性質や調製される剤形に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内、又は経口的に行われ得るがそれらに限定されない。投与は全身的又は局所的にされ得るが、全身投与による副作用が問題となる場合には病変部位への局所投与が好ましい。投与量、投与方法は、医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状等により変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。【００４１】
上記医薬組成物は、ＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療剤として用いることができる。ＮＦＡＴ２関連疾患としては、破骨細胞により骨量が低下する骨軟化性疾患又は破骨細胞の形成不全や機能不全による骨硬化性疾患が挙げられる。骨軟化性疾患としては、例えば原発性骨粗鬆症、加齢性（老人性）骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症等が挙げられる。続発性骨粗鬆症としては、内分泌・代謝異常によるもの（例えば副甲状腺機能亢進症、性腺機能不全症、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、神経性食思不振症候群、Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ症候群等）、炎症によるもの（例えば慢性関節リウマチ等）、先天性疾患に基づくもの（例えば骨形成不全症、ホモシスチン尿症、肥満細胞症、肥満細胞腫、ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ等）、血液疾患に基づくもの（例えば多発性骨髄腫等）、薬剤に基づくもの（例えばステロイド骨粗鬆症等）が挙げられる。骨硬化性疾患としては、例えば大理石骨病等が挙げられる。【００４２】
本発明の医薬組成物は、通常、総組成物の重量で、約０．１〜９０質量％の治療薬物（上記物質）を含む。投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、非経口投与では、一日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．００１〜３００ｍｇ、より好ましくは約０．０１〜１００ｍｇである。しかし、疾患状態、体重、及び治療に対する患者の個々反応、治療薬物が投与される組成物の種類、及び投与形態、病気の経過の段階に依存して、これら投与速度を適宜調整することが好ましい。従って、上記した最小投与量より少なく使うことがときには適量であり、一方、他の場合には治療効果を得るために上限を越える必要がある。投与は１〜数回に分けて行うことができ、一日約１〜５回投与することができる。対象となる個体としては、例えばヒト又はマウス、ラット、ウサギ、イヌもしくはサル等の非ヒト哺乳動物、及びその他の脊椎動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒト骨破壊性疾患又は骨硬化疾患に対する予防法又は治療法を開発するためのモデルとする上でも有用である。これにより、ＮＦＡＴ２関連疾患、例えば骨粗鬆症や自己免疫性関節炎における骨破壊や大理石骨病等における破骨細胞の形成不全や機能不全を予防する新たな治療プロトコルを開発することができる。【００４３】
本発明の医薬組成物は、ＮＦＡＴ２関連疾患の治療及び予防に有用である。特に本発明の破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を抑制する物質を含有する医薬組成物は、破骨細胞による骨吸収が関与する骨減少性疾患の治療予防及び／又は予防に有用である。主要な治療対象となる具体的疾患としては、特に関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）を含む自己免疫性関節炎が挙げられる。関節リウマチは、自己免疫性の慢性炎症性疾患であり、増殖した滑膜が活発に骨軟骨へと侵入し、多発性の関節破壊をもたらす。本発明のＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療剤は、この関節骨破壊を防止するために好適に用いられる。
また、本発明のＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療剤が適用され得る他のＮＦＡＴ２関連疾患としては、歯周病が挙げられる。また、本発明のＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療剤は、巨細胞腫、癌骨転移、及び色素性絨毛結節滑膜炎（ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｖｉｌｌｏｎｏｄｕｌａｒ  ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ；ＰＶＳ）を含む、破骨細胞による骨吸収亢進を病態とする様々な疾患に対しても適用され得る。また、骨粗鬆症及び癌の高カルシウム血症の治療への適用も期待される。さらに、パジェット病、肝炎やエイズに伴う骨量減少、白血病や多発性骨髄腫に伴う骨吸収・骨破壊、人工関節周囲の骨吸収（ルースニング）に対する予防及び／又は治療にも適用され得る（Ｒｏｄａｎ，Ｇ．Ａ．＆  Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８９巻，ｐ．１５０８−１５１４（２０００）；Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，第４０２巻，ｐ．３０４−３０９（１９９９）；Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，第４３巻，ｐ．２５９−２６９（２０００）；Ｈｏｎｏｒｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，第６巻，ｐ．５２１−５２８（２０００））。本発明により、破骨細胞の形成及び機能の制御による新たな治療介入が可能となる。
また、本発明の破骨細胞前駆細胞におけるＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンのシグナル伝達を促進する物質を含有する医薬組成物は、破骨細胞の形成又は機能不全による骨硬化性疾患や骨の吸収障害の予防及び／又は治療に有用である。従って、本発明のＮＦＡＴ２関連疾患の予防及び／又は治療剤は、大理石骨病等の破骨細胞の形成不全又は機能不全に基づく疾患に用いることができる。【００４４】
また本発明は他のＮＦＡＴ２発現抑制（又は促進）剤や破骨細胞形成阻害（又は促進）剤と併用することもできる。そのような併用例としては、例えば、骨減少性疾患の治療のためのキットであって、カルシニューリン阻害剤、及びＤ−セリンを含むキットが挙げられる。カルシニューリン阻害剤とＤ−セリンとを併用することによって、破骨細胞形成に関して相乗的な抑制効果を得ることが期待できる。カルシニューリン阻害剤としては、特にシクロスポリンＡ及びＦＫ５０６が好ましく挙げられる。【００４５】
本明細書に記載した発明は、当業者であれば様々な改変を容易に思いつくことが可能であろうが、それらの態様は本発明の範囲に含まれる。なお本明細書に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
［１］培地の調製
９．４ｇのＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ［ニッスイ社製］を１Ｌの培養用蒸留水に溶かし、１２０℃、１５分間、高圧蒸気滅菌した。高圧蒸気滅菌後、室温まで冷ました培地に、１０ｍＬの滅菌済みの培養用蒸留水で溶かした０．２９２ｇのＬ−グルタミン［ニッスイ社製］、２５ｍＬの７．５％炭酸水素ナトリウム、１０ｍＬの非必須アミノ酸混合液（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ：ＮＥＡＡ；Ｌ−セリン，Ｌ−アラニン，Ｌ−グリシン，Ｌ−アスパラギン酸，Ｌ−グルタミン酸，Ｌ−プロリン及びＬ−アスパラギン各１０ｍＭ）［ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製］、１００ｍＬのウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した。非必須アミノ酸の各成分はナカライテスク社（京都）、Ｌ−ホモセリン及びＤ−セリンはシグマ社（米国）からそれぞれ購入した。〔３Ｈ〕−Ｌ−セリンはアマシャム・バイオサイエンスから購入した。各種非必須アミノ酸を個別に添加する場合は、上記混合液を使用した際の最終濃度と同じ濃度になるように加えた。また、Ｌ−ホモセリン及びＤ−セリンに関しては、その都度記述する。血清の透析にはＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）６  再生二トロセルロース透析膜（ＭＷＣＯ１０００）［Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製］を用いた。まず、１０ｃｍ程度に透析膜を切って培養用蒸留水で簡単に濯いだ。次に、透析膜を１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５％炭酸水素ナトリウム溶液に浸し、６０℃、１時間洗浄した後に１Ｌの培養用蒸留水で５分間洗浄した。この培養用蒸留水での洗浄は３回繰り返した。洗浄後は透析膜に血清を入れ、４℃で一晩透析処理を行った。
マウス骨髄細胞からの破骨細胞前駆細胞誘導のための培地は、α−ＭＥＭ［シグマ社製］を１Ｌの培養用蒸留水に溶かし、１２０℃、１５分間、高圧蒸気滅菌した。高圧蒸気滅菌後、室温まで冷却した培地に１００ｍＬのウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加し、終濃度５ｎｇ／ｍＬになるようにＭ−ＣＳＦ［シグマ社製］を添加した。【００４７】
［２］細胞の培養と維持
マウスの単球マクロファージ由来細胞株ＲＡＷ２６４を１０ｃｍプレートに播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％において、１０ｍＬの上記培地で培養した。プレート一面に細胞が増えたら、増殖した細胞の１／１０を継代し、以後３日ごとに継代を行った。
マウス骨髄細胞１×１０６個／ウェルを２４ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦ入りのα−ＭＥＭ中で３７℃、ＣＯ２濃度５％で一日培養し、非接着性の細胞のみを回収した。これをさらに１００ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦ存在下で培養し、３日間培養後に浮遊細胞を除去したものを破骨細胞前駆細胞とした。【００４８】
［３］可溶性ＲＡＮＫＬの調製
ＲＡＮＫＬ遺伝子を有するマウスストローマ細胞ＳＴ２からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したＲＮＡ  ３μｇから作成したｃＤＮＡ  １μｇを鋳型として、配列番号１に示す配列（５’−ＣＡＡＴＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧ−３’）を有するオリゴヌクレオチドをセンスプライマー、配列番号２に示す配列（５’−ＣＡＡＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＡＡＴＧ−３’）を有するオリゴヌクレオチドをアンチオセンスプライマーとしてＰＣＲ法を行って、ＲＡＮＫＬ遺伝子を増幅した。なお、ＰＣＲ法はＰｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用い、付属のプロトコルに従って５０μＬの系で９４℃１５秒、５２℃３０秒、及び６８℃１分のサイクルを５サイクル行った後、９４℃１５秒、５６℃３０秒、６８℃１分のサイクルを１５サイクル行うことによって実施した。かかるＰＣＲ法で増幅させて得られたＲＡＮＫＬ遺伝子を制限酵素ＭｎｕＩで切断し、ＲＡＮＫＬのＣ末端領域２４４アミノ酸をｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のコード領域の下流に位置するＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位に挿入してベクターｐＧＥＸ−２ＴＫ−ＲＡＮＫＬを作製した。このｐＧＥＸ−２ＴＫ−ＲＡＮＫＬ［可溶性ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ］及び、標準ベクターであるｐＧＥＸ−２ＴＫ［ＧＳＴ蛋白質］をそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９へ導入して組換え蛋白質の発現に用いた。これらの大腸菌を最終濃度５０ｎｇ／ｍＬになるようにアンピシリンを添加したＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ［ＤＩＦＣＯ社製］２．５ｇ，Ｂａｃｔ  ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ［ＤＩＦＣＯ社製］１５ｇ，ＮａＣｌ［ナカライテスク社製］５ｇ／１Ｌ  Ｈ２Ｏ）培地に入れて３７℃で一夜前培養し、続いてＯＤ６００Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ培地５００ｍＬあたりに対して、前培養液５ｍＬ加えて３７℃で、培地の吸光度（波長：６００ｎｍ）が０．６〜０．８の範囲になるまで主培養を行った。その後ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を最終濃度０．２５ｍＭになるように添加し、蛋白質の発現誘導を開始し、１８℃で約１２時間培養した。
上記で培養した大腸菌を集菌後、上清を捨ててから菌体をＮＥＴ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ナカライテスク社製］）で２回洗浄した。再び上清を捨て、氷上にて主培養液の１／２５０量のＮＥＴＮ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％ＮＰ−４０［シグマ社製］）に大腸菌を懸濁し、超音波処理（３０秒，２回）を行って大腸菌を破壊した。主培養液量の１／１０００量のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ４Ｂ（５０％  ｓｌｕｒｒｙ  ［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ社製］をあらかじめＮＥＴＮ緩衝液で平衡化させておき、先の上清に加え４℃で８時間反応させた。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，１ｍＭ  ２−ＭＥ，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４  ［ナカライテスク社製］）で３回洗い、ビーズ１ｍＬあたり１．６ｍＬのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ＮａＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ［ナカライテスク社製］；ｐＨがアルカリ側であることを確認する。）を加え、１時間以上反応させて可溶性ＲＡＮＫＬを溶出した。破骨細胞分化誘導に対するＬＰＳの影響を極力防ぐために内毒素除去カラム（Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  Ｇｅｌ［ＰＩＥＲＣＥ］）に通した。得られた可溶性ＲＡＮＫＬは適量を分注して液体窒素で凍結して−８０℃で保存した。分化誘導を行う際は適宜解凍して用いた。【００４９】
［４］ＲＡＷ２６４細胞の分化誘導
ＲＡＷ２６４細胞は２４穴プレートには２．５×１０４個、３．５ｃｍプレートには１０×１０４個、６ｃｍプレートには２０×１０４個、１０ｃｍプレートには５０×１０４個になるように播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％において２４時間培養した。その後、可溶性ＲＡＮＫＬを含む培地と交換し（０時間）、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。７２時間後、再び新しく調製した可溶性ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを含む新鮮培地と交換し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で２４時間培養した。この一連の操作により、ＲＡＮＫＬ添加９６時間後にプレート一面に破骨細胞の形成が確認できる（図１）。
［５］骨髄細胞からの破骨細胞の分化誘導
破骨細胞への分化誘導はＴａｋａｈａｓｈｉ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ  ｆｏｒｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  （２００３），  ｐｐ．  １２９−１４４．に示す方法に従った。
骨髄細胞から［細胞の培養と維持］で示す方法によって得た破骨細胞前駆細胞を２４ウェルプレートに１×１０４個／ウェルで播種し、一日培養した。その後５００ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬと１００ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを添加し、誘導を行なった。３日ごとに前述の量のＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦを含む新鮮培地に交換した。
［６］レトロウイルスによるＮＦＡＴ２の強制発現
ＮＦＡＴ２遺伝子あるいは比較対象としてＧＦＰ遺伝子をレトロウイルスベクターｐＣＸ４ｐｕｒｏに組み込み、ピューロマイシンによる薬剤選択で各々の発現ベクターを得た。これらの発現ベクターをパッケージング細胞株Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ（Ｐｌａｔ−Ｅ）にｐＥ−ｅｃｏベクター及びｐＧＰベクター（Ｔａｋａｒａ社製）とともに導入し、この細胞を４８時間培養した。上清を０．２２μｍ  ｐｏｒｅ  ｆｉｌｔｅｒでフィルトレーションしたものをレトウイルスのストックとした。破骨細胞前駆細胞をレトロウイルス存在下で一晩培養し、続いて前述の通り破骨細胞への分化誘導を行なった。【００５０】
［７］細胞固定とＴＲＡＰ染色
上記［４］により破骨細胞が形成されたプレートの培地をサクションで除き、５００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてプレートを洗い、ＰＢＳを完全に取り除く。この操作をもう一度繰り返した後に、５００μＬのメタノールを静かに加え、３０秒経過後にメタノールを除いてプレートをよく乾かした。
０．１Ｍ酢酸（ｐＨ５．２）を含む０．０２６Ｍ酒石酸と、０．１Ｍ酢酸（ｐＨ５．２）を含む１２．５ｍｇ／ｍＬ  ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＢＩ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅを２４：１の割合で混合した溶液にＦＡＳＴ  ＧＡＲＮＥＴ  ＧＢＣを適量加え、０．８μｍフィルターに通した溶液をＴＲＡＰ染色液とした。細胞固定したプレートに５００μＬ  のＴＲＡＰ染色液を加え、３７℃で１時間以上反応を行った。この時点で、ＴＲＡＰ活性を有する細胞は赤紫色を呈する。反応後、ＴＲＡＰ染色液を除き、超純水でプレートを洗浄した（図１；ＴＲＡＰ−ｓｔａｉｎｅｄ  ＭＮ  ｃｅｌｌｓ）。【００５１】
［８］骨吸収活性
形成された多核細胞が骨吸収活性を有することを確認した。ヒドロキシアパタイトプレート〔ＢＤ  Ｂｉｏ  Ｃｏａｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）〕上で分化誘導を行い、多核細胞形成後に、ｖｏｎ  ｋｏｓｓａ染色法により、分解されたリン酸カルシウムを測定した（図１；ＨＡ  ｐｌａｔｅｓ）。分解された領域が白く見える。【００５２】
［９］細胞抽出液の調製
特記しない場合は、一定時間後培養プレートを氷上に移し、培地上清を除去した。４℃に冷やしたＰＢＳで細胞を２回洗浄後、適量のＥＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％  ＮＰ−４０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，１００ＫＩＵ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎｅ，２０ｍＭ  ＮａＦ，２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）を加えて細胞を掻き取り、氷上で３０分間静置した。その後、ピペッティングにより細胞を破壊し、遠心（１５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）後、上清のみを氷上のエッペンドルフチューブに移し、これを細胞抽出液とした。細胞抽出液は液体窒素で凍結して、−８０℃で保存した。
ＮＥＡＡの添加効果を調べる実験においては、３５ｍｍ径プレートに１×１０５個の細胞を播種し、一晩〜２４時間後にＲＡＮＫＬ刺激を行った。一定時間（９−２４時間）後に培地を除き、５秒ほど傾けてさらに残った培地を除き、ＰＢＳで洗わずそのまま３０μＬのＥＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄（リンス）し、スクレイパーで回収した。その後、５分間１００℃で加熱し、超音波破砕機（トミー）で１０秒間、５回の処理を行い、細胞を破壊した。遠心（１５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）後、上清のみを氷上のエッペンドルフチューブに移し、これを細胞抽出液とした。細胞抽出液は液体窒素で凍結して、−８０℃で保存した。【００５３】
［１０］ウエスタンブロッティング
調製した細胞抽出液の蛋白質量をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定し、各サンプルの蛋白質量を同一にした後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。泳動後、ブロッティングタンクを用いて、ウエット式ブロッティングによりＰＶＤＦ膜[ＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉＤｅｎｅ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製］に蛋白質を転写した。転写後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳで５分間洗浄し、５％Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ／ＰＢＳで１時間、ブロッキングした。ＰＢＳで５分間、ＰＢＳＴで１０分間、ＰＢＳで５分間、ＰＢＳで５分間の順でＰＶＤＦ膜を洗浄した後、５％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した一次抗体を２時間以上反応させた。反応後、ＰＢＳで５分間、ＰＢＳＴで１０分間、ＰＢＳで５分間の順でＰＶＤＦ膜を洗浄した。次に、ＰＶＤＦ膜を、５％Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ／ＰＢＳで希釈した二次抗体を室温で４５分間反応させた後、ＰＢＳで５分間、ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ／Ｔｗｅｅｎ）で１０分間、ＰＢＳで５分間の順でＰＶＤＦ膜を洗浄し、ＥＣＬ［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製］、又はＥＣＬ  Ｐｌｕｓ［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製］  で分離された蛋白質を検出した。
これらのプロトコルで下記の条件でウエスタンブロッティングを行った結果を図２に示す。
ウエスタンブロッティングに用いた抗体：
・抗マウスＮＦＡＴ２  抗体［Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製］（１／５００希釈）
・抗マウスｃ−Ｆｏｓ抗体［Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製］（１／５０００希釈）
・抗マウスβ−ａｃｔｉｎ抗体［シグマ社製］（１／８０００希釈）
二次抗体として、
・ヤギ抗体に対して、ウシ抗ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ［Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製］
・マウス抗体に対して、羊抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製］
・ラビット抗体に対して、プロテインＡ−ＨＲＰ［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製］｀
用いたサンプル量：
ＮＦＡＴ２：１０〜２０μＬ／ｌａｎｅ→ＥＣＬ  ｐｌｕｓで検出（１〜５分くらい）
ａｃｔｉｎ：〜５μＬ／ｌａｎｅ→ＥＣＬで検出（１分以下）
以下の実施例におけるウエスタンブロッティングにおいて、該条件は上記と同様である。【００５４】
［１１］回収培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）の調製法
５×１０５個のＲＡＷ２６４細胞を１０ｃｍプレートに播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％において、一夜培養した。翌日、プレートから培地を除き、ＰＢＳで２回洗浄した後に、培地を１０ｍＬ注入し、３７℃、ＣＯ２濃度５％において２４時間培養した。その後、プレートから培地を回収し、これを０．２μｍフィルターに通して細胞を取り除いた。これを低密度回収培地とした。また、４０×１０５個のＲＡＷ２６４細胞を１０ｃｍプレートに播種し、同様の方法で回収した培地を高密度回収培地とした。また、培地を３７℃、ＣＯ２濃度５％において２４時間培養しただけの培地を、Ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉｕｍとした。これらの培地を４℃にて保存し、破骨細胞の分化誘導を行う際は、これらの培地に必要量の可溶性ＲＡＮＫＬを加えた。
【実施例２】
【００５５】
ＮＦＡＴ２ｓｉＲＮＡの設計とＲＡＷ２６４細胞への導入、発現クローンの単離
ＮＦＡＴ２  遺伝子の配列の中から標的配列（５’−ＧＧＴＡＣＧＴＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＧＧ−３’；配列番号３）を選び、該当するＤＮＡをｐＳＵＰＥＲ  ベクター  （Ｏｌｉｇｏ  Ｅｎｇｉｎｅ，  ＵＳ）に組み込み発現させた。このベクターをネオマイシン耐性カセットとともにＲＡＷ２６４細胞に導入し、ＮＦＡＴ２−ｓｉＲＮＡ発現細胞株を選択した。
【実施例３】
【００５６】
ＮＦＡＴ２の誘導
「材料と手法」で示した条件下でＲＡＷ２６４細胞を播種し、ＲＡＮＫＬ刺激を加えることにより、分化誘導を行った。ＲＡＮＫＬ刺激（＝０時間）後、経時的に細胞抽出液を調製し、抗ＮＦＡＴ２抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ＮＦＡＴ２の発現を確認した（図３）。ＲＡＮＫＬ刺激後少なくとも１２時間からＮＦＡＴ２蛋白質の発現が確認されるとともに、４８時間以降もその発現が確認された。なお、β−ａｃｔｉｎは、使用した蛋白質量を確認するためのものである（以下の実験においても同様）。
【実施例４】
【００５７】
［１］多核細胞形成に及ぼすＮＦＡＴ２発現の効果
ＲＡＮＫＬ刺激によりＲＡＷ２６４細胞から多核細胞が形成される過程でＮＦＡＴ２が果たしている役割を確かめるために、実施例２で作成したＮＦＡＴ２−ｓｉＲＮＡ発現細胞株を使用した。ここでは、前記ＮＦＡＴ２−ｓｉＲＮＡ発現細胞株の代表例として２つのクローン、ＫＤ−１，ＫＤ−４を示す。これらの株では確かにＮＦＡＴ２の蛋白質の発現レベルが著しく低下しているのが確認できる。なお、ＭＯＣＫとは、ｓｉＲＮＡを発現するために用いたベクターそのものを導入した株である（図４Ａ）。ＲＡＷ２６４親細胞株をＲＡＮＫＬ刺激した場合では、９６時間後に多核の細胞の形成が、ＧＳＴ刺激では単核細胞がそれぞれ見られるのに対し、ＫＤ−１あるいはＫＤ−４を同じ条件で分化誘導をかけても、多核細胞の形成が見られない（図４Ｂ）。このことから、ＮＦＡＴ２の発現が多核細胞形成に必須であることが分かる。【００５８】
［２］多核細胞形成効率に及ぼす細胞播種密度の効果
ディッシュにＲＡＷ２６４細胞を播種する際に、細胞数をそれぞれ、通常分化誘導を行う細胞密度（２．５×１０４個／ウエル）の０．５倍、１倍、２倍、４倍、８倍に調整し、同一条件下で破骨細胞への分化誘導を行った。それぞれの細胞は誘導終了後ＴＲＡＰ染色を行い、ＴＲＡＰ陽性細胞を染色した。その結果、通常条件下での細胞密度をピークにして細胞密度が高くなるほど、破骨細胞の分化誘導効率（多核細胞形成率）は減少し、８倍の細胞密度では破骨細胞の形成はほとんど確認できなかった（図５）。この際、細胞密度が０．５倍のプレートでも分化誘導効率が約６０％まで低下したが、これはプレート中の細胞の絶対数が少ないため、必然的に形成される破骨細胞も少なくなったことが原因だと考えられる（図６）。【００５９】
［３］骨髄細胞の多核細胞形成効率に及ぼす細胞播種密度の効果
同様の現象はＲＡＷ２６４細胞のかわりにマウス骨髄細胞から調製した細胞系においても見られた。マウス骨髄細胞から誘導した破骨細胞前駆細胞を２４ウェルプレートに播種する際に、細胞数をそれぞれ、通常分化誘導を行なう細胞密度（１．０×１０４個／ウェル）の０．５倍、１倍、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍に調製し、「実施例１」で示した条件下で破骨細胞への分化誘導を行なった。それぞれの細胞の誘導終了後ＴＲＡＰ陽性細胞を染色した。その結果、ＲＡＷ２６４細胞マウス細胞の場合と同様に細胞密度が高くなるほど破骨細胞の形成が起こらなくなることが確認された（図１７Ａ、Ｂ）。このように、より生体内の現象を反映する骨髄細胞系でもＲＡＷ２６４細胞と同様の現象が再現された。
【実施例５】
【００６０】
ＮＦＡＴ２の発現に及ぼす細胞播種密度の効果
図３、４の結果は、ＮＦＡＴ２の発現が多核細胞形成への進行に重要であることを示唆している。そこで、ＮＦＡＴ２蛋白質の発現が細胞密度に依存していることをウエスタンブロッティングで確認した。なお、プレートに播種した細胞密度は分化誘導を行う細胞密度のそれぞれ１倍（２．５×１０４個／ウエル）、２倍、４倍、８倍密度に調整し、ＲＡＮＫＬ刺激後、同一条件下で２４時間培養した細胞の抽出液を用いた。その結果、ＮＦＡＴ２蛋白質の発現が、細胞密度に依存（反比例）して減少することが確認された（図７）。
【実施例６】
【００６１】
多核細胞の形成に及ぼす培地成分の効果
上に記したように、高密度〔８倍密度：（２×１０５個／ウエル）〕で細胞を播種すると、通常の条件で分化誘導を行っても多核細胞の形成効率は著しく低下する。この原因を明らかにするために、高密度で播種した培養プレートから２４時間後に培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を回収し、その培地を用いて通常条件下（低密度播種）で分化誘導を行った。９６時間後、ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍと新鮮培地（ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉｕｍ）とで多核細胞の形成効率を比較したのが図８である。
この実験から、ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍを用いた場合には、例え細胞数が低密度であっても、分化誘導の効率が低下していることが分かる。このことから、高密度で培養した結果、培地成分に何らかの変化が生じ、それが多核細胞形成を抑制していることが示唆された。
【実施例７】
【００６２】
ＮＦＡＴ２の発現回復におけるＮＥＡＡの効果
培地成分の変化とＮＦＡＴ２の発現変化ならびに多核細胞形成との関連を調べるために、ＮＦＡＴ２の発現を指標にして、多核細胞の形成に関わる要因を探った。培地成分が変化する原因として、（１）高密度培養下で何か阻害活性因子が分泌される、（２）高密度下で培地の成分が変化する、が考えられた。そこで、ＮＥＡＡの存在下［ｐｒｅ−ＮＥＡＡ（＋）］、非存在下［ｐｒｅ−ＮＥＡＡ  （−）］でｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍを作成し、その後回収したｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍで次の培養（低密度）を行う際にＮＥＡＡを添加する効果（ｐｏｓｔ−ＮＥＡＡ）を調べた。その結果、ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ調製時のＮＥＡＡ（ｐｒｅ−ＮＥＡＡ）の有無は大して重要ではなく、むしろ後から添加するＮＥＡＡ（ｐｏｓｔ−ＮＥＡＡ）の影響が大きいことが分かった（図９）。従って、（低密度で）培養を開始する時点でＮＥＡＡを加えるかどうかが、ＮＦＡＴ２の発現に重要であることが示唆された。このことを確かめるために、ＮＥＡＡを省いた場合に、ＮＦＡＴ２の発現にどのような影響が出るかを調べた（図１０）。その結果、低密度培養下（Ｌ）でｐｏｓｔ−ＮＥＡＡを加えると、ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍでもＮＦＡＴ２の発現が誘導されることが再確認された。新鮮培地で、高密度培養条件下（Ｈ）で培養する際にＮＥＡＡを抜くと、ＮＦＡＴ２への抑制効果が増大することから、培地中に阻害活性が存在するという可能性よりも、ＮＥＡＡの有無が阻害活性の有無と連関している可能性がより強く示唆された。以上のことをさらに確認するために、高密度培地を作成する際に、ＦＢＳ、グルタミン酸ならびにＮＥＡＡを加える時期をｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ作成時（ｐｒｅ−）あるいはＲＡＮＫＬ添加時（ｐｏｓｔ−）に設定して、前述と同様に低密度の条件で細胞培養を行った。結論として、ＲＡＮＫＬ添加時（＝ｐｏｓｔ）に、ＮＥＡＡを加えると誘導レベルが高くなることが明らかとなった。すなわち、ＮＥＡＡの添加の有無がＮＦＡＴ２の発現レベルと密接に関連していることが分かった（図１１）。
【実施例８】
【００６３】
ＲＡＷ２６４細胞の増殖に対するＮＥＡＡの効果
上記の実験は、ＮＥＡＡがＮＦＡＴ２の発現に重要な役割をしていることを示唆するものであった。しかし、ＮＥＡＡがＲＡＷ２６４細胞の増殖自身に何か影響を与えているのではないかという懸念があったので、ＮＥＡＡが細胞の増殖そのものには影響しないということを確かめるために、グルタミン（Ｇｌｎ）、ＮＥＡＡならびに血清の有無の条件で２４時間ＲＡＷ２６４細胞を培養した。その結果、細胞の増殖ならびに生存は血清、グルタミンの有無に大きく影響されるが、非必須アミノ酸の有無には殆ど影響されないことが分かった（図１２）。
【実施例９】
【００６４】
ＮＥＡＡ中のセリン及びグリシンの効果
これまでの実験より、ＮＥＡＡがＮＦＡＴ２の発現に関わることが示唆されたので、ＮＥＡＡ混合液に含まれる７種類のアミノ酸のうちどのアミノ酸が重要なのかを決定するための実験を行った（図１３）。まず、血清はアミノ酸を始めとして様々な物質、分子を含んでいるため、バックグラウンドの要因となる可能性がある。そこで、アミノ酸を含む低分子量分子を除くため、これ以後透析処理を行った血清（Ｆ＊）を用いた。Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍについて、調製時のＮＥＡＡ（ｐｒｅ−ＮＥＡＡ）の有無は重要ではなく、むしろ後から添加するＮＥＡＡ（ｐｏｓｔ−ＮＥＡＡ）の影響が大きいことを再確認できた。図１３の右７レーンでは７種のＮＥＡＡのうち、各アミノ酸を順次一つずつ抜いたものを用意し、ＲＡＮＫＬと同時にｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍに戻した。セリンを除去したＮＥＡＡではシグナルの回復が弱くなっている。なお、この実験はＲＡＮＫＬ刺激後１２時間の細胞溶解液を用いて実験を行った。
図１３で行なった実験からは、セリンの関与が示唆された。しかし、その条件下ではＮＥＡＡ全種類を戻しても回復のレベルが限られたものであり、ダイナミックレンジが小さくなってしまうきらいがあったので、より定量的に行うために、新鮮培地（Ｆ）を作成する際に順次アミノ酸を抜いたＮＥＡＡを用いた実験を行った（図１４）。その結果、セリンがないと、他のＮＥＡＡ成分があってもＮＦＡＴ２の誘導が著しく低下することが分かった。逆に、他のＮＥＡＡがない状態でセリンのみを戻すと、ほぼ完全にＮＦＡＴ２の発現レベルが回復した。また、グリシンでも少し回復が見られた。これらのことから、ＮＥＡＡの中でもセリンが決定的な要因であることが明らかとなった。
【実施例１０】
【００６５】
セリンアナログによるＮＦＡＴ２発現、多核細胞形成への阻害効果
以上の結果から、ＭＥＭ培地を用いたＲＡＷ２６４細胞からの多核細胞形成過程において、ＲＡＮＫＬ刺激によりＮＦＡＴ２が誘導される際に、ＮＥＡＡとしてはセリンの存在が必要十分であることが示唆された。また、グリシンにも弱いながら同様の誘導活性が認められた。これらのことから、セリンの構造異性体（Ｌ−セリン、Ｄ−セリン、Ｌ−ホモセリン）を用いることにより、そのＮＦＡＴ２誘導活性を拮抗阻害的に抑制できる可能性が考えられたので、まず、Ｄ−セリン及びＬ−ホモセリンという２種類の物質を用いてその可能性を検証した。
まず、Ｄ−セリン及びＬ−ホモセリンともそれ自身ではＮＦＡＴ２の発現を誘導する活性を示さなかった。一方、Ｄ−セリンを、Ｌ−セリンに対して過剰量を加えていったところ、１０倍量添加した場合に、Ｌ−セリンによるＮＦＡＴ２の発現活性を抑制することが確かめられ、一方でＬ−ホモセリンではＤ−セリンに比べて弱い阻害活性が認められた（図１５）。
次に、Ｄ−セリンの多核細胞形成への影響を調べた（図１６）。その結果、以下のことが分かった。（１）血清の透析処理による影響はない（図１６Ａ）、（２）Ｌ−セリンがないと分化の途中までは進行するが、多核細胞の形成は殆ど見られない（図１６Ｂ）、（３）Ｄ−セリン＋ＲＡＮＫＬによる４日間の培養後、細胞の生存率が悪くなる（図１６Ｃ）、（４）Ｌ−セリンにより生存は回復する（図１６Ｄ）、（５）さらに過剰量のＤ−セリンを作用させると、再び多核細胞の形成効率が落ちる（図１６Ｅ）。
【実施例１１】
【００６６】
［１］Ｌ−セリン依存的なＮＦＡＴ２の発現
実施例１０の実験結果から、複数のセリン構造異性体の内、Ｌ−セリンがＮＦＡＴ２の発現と多核細胞形成に関与することが示された。ＮＦＡＴ２の発現がＬ−セリンに依存することを確かめるために次の実験を行なった。ＲＡＷ２６４細胞を通常密度条件（２．５×１０４個／ウェル；以下、通常密度において同じ。）、１０％ＦＢＳ存在下の通常培地で２時間培養を行なった。その際、培地に添加するＬ−セリンをそれぞれ通常量（×１；０．１ｍＭ）の０倍、０．１倍、０．３倍、１倍の濃度になるように調製した。培養後の細胞におけるＮＦＡＴ２の発現量を、抗ＮＦＡＴ２抗体を用いたウエスタンブロッティングによって確認した（図１８Ｂ）。その結果、ＲＡＷ２６４細胞中のＮＦＡＴ２蛋白発現量は培地中のＬ−セリン存在量に比例して増加することが示された。Ｌ−セリンを含まない培地（×０）ではＮＦＡＴ２の発現は見られなかった。このことから、ＮＦＡＴ２の発現にはＬ−セリンが必要であり、さらにその効果は量依存的であることが確かめられた。【００６７】
［２］Ｌ−セリンの存在量に及ぼす細胞播種密度の効果
多核細胞形成が細胞播種密度によって影響を受けることから、高密度になるにつれて培地中のＬ−セリンの量が減少していることが考えられた。そこで高密度での細胞播種を行なったときの培地中のＬ−セリンの濃度を測定した。ＲＡＷ２６４細胞を低密度（ｌｏｗ：２．５×１０４個／ウェル）あるいは高密度（ｈｉｇｈ：２×１０５個／ウェル）で播種し、ＲＡＮＫＬ存在下〔（＋）ＲＡＮＫＬ〕あるいは非存在下〔（−）ＲＡＮＫＬ〕で〔３Ｈ〕−Ｌ−セリン（１０μＣｉ／ｍＬ）を含む通常培地で２４時間培養した。複数のタイムポイント（０．５，１，２，４，８，２４時間）で培地１０μＬ中に存在するＬ−セリンを３Ｈの放射能を指標としてシンチレーションカウンターを用いて測定した。その結果、培養時間に比例して培地中のＬ−セリンの存在量が低下し、その減少率が高密度条件下では低密度条件下よりも高いことが示された（図１８Ａ）。ＲＡＮＫＬの有無によってＬ−セリンの減少量に大きな変化がないことから、培地中のＬ−セリンの存在量の減少は、主に細胞播種密度によることが明らかとなった。以上の結果から、細胞密度の上昇による多核細胞形成阻害は、培地中のＬ−セリンの存在量の低下に起因するＮＦＡＴ２の発現量減少が原因となることが確かめられた。
【実施例１２】
【００６８】
［１］骨髄細胞の増殖に対するＬ−セリンの効果
ＮＥＡＡの存在、中でもＬ−セリンがＮＦＡＴ２の発現に重要な役割を果たしていることが明らかとなり、次にＲＡＷ２６４細胞のかわりにマウス骨髄細胞について、Ｌ−セリンの効果を検討した。まず、Ｌ−セリンがマウス骨髄細胞の増殖に関与するかどうかを調べるため、骨髄細胞を透析処理したＦＢＳを用いて３日間培養した。その際、添加するＬ−セリンの濃度を通常（×１；０．１ｍＭ）の０倍、０．１倍、０．３倍、３倍、１０倍とし、その他については「実施例１」に示したとおりである。細胞の増殖は、ＭＴＴアッセイを測定することにより評価した。ＭＴＴアッセイはＭＴＴ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｋｉｔ  （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．  Ｃａ，ＵＳＡ）を用いた。その結果、Ｌ−セリンはＮＦＡＴ２の発現に必要であるものの、細胞の増殖にはほとんど影響しないことがわかった（図２０Ａ）。これはＲＡＷ２６４細胞を用いた「実施例８」に記載の実験と同様の結果である。【００６９】
［２］骨髄細胞の多核細胞形成に対するＬ−セリンの効果
次に、骨髄細胞において多核細胞形成とＬ−セリンの関係を確かめた。骨髄細胞から誘導した破骨細胞前駆細胞を通常密度で播種し、Ｌ−セリン単独あるいはＬ−セリン非存在のＮＥＡＡを培地中に添加した場合について、それぞれ「実施例１」に示した方法で破骨細胞誘導を行ない、５日間培養後にＴＲＡＰ染色を行なった。その結果Ｌ−セリン非存在下では破骨細胞前駆細胞の多核細胞形成が抑制されるという、ＲＡＷ２６４細胞の場合と同様の結果を得た（図２０Ｂ）。
【実施例１３】
【００７０】
［１］ｃ−ｆｏｓの発現におよぼすＬ−セリンの効果
現在、ＮＦＡＴ２の発現には転写因子ｃ−ｆｏｓが関わっていることが知られている（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ，  ３，  ８８９−９０１；Ｍａｔｓｕｏ，  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  ２６４７５−２６４８０）。ＮＦＡＴ２の発現は細胞密度に比例して減少することから、実施例３と同様の条件下でのｃ−Ｆｏｓの発現を調べた。ＲＡＷ２６４細胞を通常密度、ＲＡＮＫＬ存在下で４８時間培養し、複数のタイムポイントで回収後、抗ｃ−Ｆｏｓ抗体を用いたウエスタンブロッティングによってｃ−Ｆｏｓ蛋白量を測定した（図１９Ａ）。ｃ−Ｆｏｓ蛋白の発現量はＲＡＮＫＬ刺激後１２時間から２４時間をピークに発現が減少した。また、ＲＡＷ２６４細胞を低密度（通常密度）および高密度（８倍）で２４時間培養後、各々の細胞溶解液中のｃ−Ｆｏｓ蛋白質の発現量を抗ｃ−Ｆｏｓ抗体を用いてウエスタンブロッティングにより比較したところ、高密度条件下ではｃ−Ｆｏｓ蛋白質量は減少することが示された（図１９Ｂ）。
以上の結果から、ｃ−Ｆｏｓの発現もまた細胞密度依存的であることが示された。更にｃ−ＦｏｓとＬ−セリンの関係を調べるために以下のような実験を行なった。ＲＡＷ２６４細胞を低密度（通常密度）に播種し、ＮＥＡＡとＬ−セリン及び／又はＬ−グリシンを異なる組み合わせで培地に添加したものをそれぞれ２４時間培養した。２４時間後に細胞を回収し、抗ＮＦＡＴ２抗体および抗ｃ−Ｆｏｓ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった（図１９Ｃ）。その結果、ＮＦＡＴ２及びｃ−ＦｏｓはともにＬ−セリン依存的に発現することが示された。従ってＬ−セリンはｃ−Ｆｏｓの発現制御を介してＮＦＡＴ２の発現を制御している可能性が示された。【００７１】
［２］骨髄細胞のｃ−Ｆｏｓ及びＮＦＡＴ２発現におよぼすＬ−セリンの効果
さらに骨髄細胞から誘導される破骨細胞におけるｃ−Ｆｏｓ及びＮＦＡＴ２の発現がＬ−セリン依存的に起こることを確かめるため、破骨細胞前駆細胞を通常密度で培養し、Ｌ−セリン存在下あるいは非存在下で破骨細胞への分化誘導を行なった。４８時間培養後抗ｃ−Ｆｏｓ抗体あるいは抗ＮＦＡＴ２抗体を用いたウエスタンブロッティングを行ない、ｃ−ＦｏｓとＮＦＡＴ２それぞれの蛋白質発現を検出した。その結果、Ｌ−セリン非存在下ではｃ−ＦｏｓおよびＮＦＡＴ２の発現は減少しており、これら２分子の発現がＬ−セリン依存的であることが、より生体を反映している骨髄細胞においても確かめられた（図２０Ｃ）。【００７２】
［３］骨髄細胞の多核細胞形成に対するＮＦＡＴ２の効果
これまでの結果から、骨髄細胞においても破骨細胞への分化誘導時の多核細胞形成にはＬ−セリンとＮＦＡＴ２の発現が重要であることが示された。ここでＬ−セリンとＮＦＡＴ２の両方の発現が多核細胞形成過程に必須かどうかを検討するために、レトロウイルス感染を介してＮＦＡＴ２を強制発現させた破骨細胞前駆細胞を通常密度で培養し、Ｌ−セリン存在下あるいは非存在下で破骨細胞への分化誘導実験を行なった。５日間培養後にＴＲＡＰ染色を行なった結果、Ｌ−セリン非存在下においてもＮＦＡＴ２の強制発現によってＬ−セリン存在下とほぼ同量の多核細胞形成が行なわれることが明らかとなった（図２０Ｄ）。ＮＦＡＴ２のかわりにＧＦＰを発現させた細胞ではセリン非存在下では多核細胞形成が起こらなかったことから、多核細胞形成にはＮＦＡＴ２が必須であり、Ｌ−セリンの存在がなくともＮＦＡＴ２さえ発現すれば破骨細胞の形成が起こることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の方法は、ＮＦＡＴ２関連疾患の予防又は治療方法として有用である。また、本発明の薬剤は、ＮＦＡＴ２に関連する疾患、例えば骨粗鬆症、自己免疫性関節炎、パジェット病又は関節リウマチを含む様々な骨減少性疾患及び骨癌、又は大理石骨病等の骨硬化性疾患、あるいは免疫性疾患等に対する副作用の少ない薬剤として有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、新規なＮＦＡＴ２の発現制御剤の探索に有用である。
【図１７】
0004934812.tif 000002
【図１８】
0004934812.tif 000003
【図１９】
0004934812.tif 000004
【図２０】
0004934812.tif 000005
【図１】
0004934812.tif 000006
【図２】
0004934812.tif 000007
【図３】
0004934812.tif 000008
【図４】
0004934812.tif 000009
【図５】
0004934812.tif 000010
【図６】
0004934812.tif 000011
【図７】
0004934812.tif 000012
【図８】
0004934812.tif 000013
【図９】
0004934812.tif 000014
【図１０】
0004934812.tif 000015
【図１１】
0004934812.tif 000016
【図１２】
0004934812.tif 000017
【図１３】
0004934812.tif 000018
【図１４】
0004934812.tif 000019
【図１５】
0004934812.tif 000020
【図１６】
0004934812.tif 000021
【配列表】
0004934812000001.app