(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピテント細菌ゴーストを、細菌ゴーストの膜及び膜−脂質ベシクルの膜の間の融合が行われる条件下に膜−脂質ベシクルと接触させることを含む、閉鎖した細菌ゴーストの製造方法において、細菌ゴーストがグラム陰性細菌に由来する、前記細菌ゴーストの製造方法。
【請求項２】
ゴーストが、異種の膜ポリペプチドを有する組み換え細菌に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
カルシウムから選択される多価の金属カチオンと接触させ、かつ０〜５℃の温度でインキュベートすることによって細菌ゴーストの融合を誘発させる、請求項１または２項記載の方法。
【請求項４】
脂質ベシクルとして、
（ｉ）細菌細胞から選択される均質化された細胞のベシクル、
（ｉｉ）リポソーム、及び／又は
（ｉｉｉ）膜に取り囲まれたウイルス
を使用する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
細菌ゴーストの膜及び脂質ベシクルの膜の間の融合を、カルシウムイオンから選択される２価の金属カチオン及び／又はグリセリン、ポリエチレングリコール又はジメチルスルホキシドから選択される有機凝集剤の存在下に実施する、請求項１から４までのいずれ１項記載の方法。
【請求項６】
更に作用物質を細菌ゴースト中に填塞することを含む、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
遺伝子材料及び、場合により細胞成分を填塞する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
遺伝子材料が、閉鎖した細菌ゴーストの代謝機能の回復のために十分な情報を有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項記載の方法によって得られる閉鎖した細菌ゴースト。
【請求項１０】
インタクトな膜を有する、請求項９記載の閉鎖した細菌ゴースト。
【請求項１１】
少なくとも１つのカプセル化された作用物質を含有する、請求項９又は１０記載の閉鎖した細菌ゴースト。
【請求項１２】
代謝機能を有する、請求項９から１１までのいずれか１項記載の閉鎖した細菌ゴースト。
【請求項１３】
農業分野における、バイオテクノロジーにおける、あるいは医学において医薬品を製造するための、閉鎖した細菌ゴーストの使用。
【請求項１４】
病原によって引き起こされる疾患、腫瘍疾患又は自己免疫疾患の予防、診断及び／又は撲滅用医薬品を製造するための、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
ワクチンを製造するための、請求項１３又は１４記載の使用。
【請求項１６】
組み換えポリペプチドを得るための媒体としての、請求項１３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はベシクル−膜−融合によって閉鎖した細菌ゴーストを製造するための方法並びに前記方法によって得られる細菌ゴーストに関する。閉鎖した細菌ゴーストにおいて、作用物質、例えば遺伝子材料、細胞成分、医薬品作用物質及び農業的な作用物質並びに標識物質又は色素を填塞（Verpackung）することができる。遺伝子材料及び、場合により他の成分、例えば細胞質の成分を細菌ゴーストに填塞する場合に、代謝機能及び、場合により細胞の増殖能を回復させることができる。閉鎖したゴーストは医学、農業分野及びバイオテクノロジーにおいて使用できる。
【０００２】
空の細菌外被、いわゆる細菌ゴーストは、部分的な細胞膜の溶解をもたらす遺伝子をグラム陰性細菌中で制御された異種発現を行うことによって製造できる（ＥＰ−Ａ−０２９１０２１号）。かかる溶解遺伝子のための例は、グラム陰性細菌の細胞壁複合体に挿入され、かつオリゴマー化により内膜と外膜とを通る膜貫通のトンネル構造を形成するポリペプチドをコードするバクテリオファージＰｈｉＸ１７４の遺伝子Ｅである。そのトンネル構造の内径は溶解条件に応じて４０〜２００ｎｍ又は５００〜１０００ｎｍであってよい。このトンネルを通って、細胞の細胞質材料が遊離し、かつインタクトな形態を有する空の細胞外被が残る。細菌ゴーストを弱毒ワクチン又はアジュバントとして使用すること並びに膜中に異種の表面タンパク質を有する組み換え細菌ゴーストを製造することは、ＷＯ９１／１３５５５号及びＷＯ９３／０１７９１号に記載されている。
【０００３】
更に、グラム陽性細菌からのゴーストを、キメラのＥ−Ｌ−溶解遺伝子の使用によって製造してもよい（ＵＳ−Ａ−５０７５２２３号）。
【０００４】
ＤＥ１９９０７７７０．４号において、作用物質を細菌ゴースト中に填塞することが提案されている。ゴースト膜中の細孔に基づいて、ゴースト内部での作用物質の滞留はしばしば高価な措置によってのみ達成できる。
【０００５】
意想外にも、細菌ゴーストをベシクル−膜−融合によって適当な条件下に、細胞の内部空間に連続的な膜を形成して再び閉鎖することができることが認められた。このために、コンピテントな細菌ゴーストを膜−脂質ベシクルと、細菌ゴーストの膜及び膜−脂質ベシクルの膜の間の融合が行われる条件下に接触させる。
【０００６】
特に有利にゴーストは、エシェリキア コリ、クレブシエラ、サルモネラ、エンテロバクター、シュードモナス、ビブリオ、アクチノバシラス、ヘモフィルス、パスツレラ、ボルデテラ、ヘリコバクター、フランシセラ、ブラムバメラ（Brambamella）、エルウィニア、パントエア（Pantoea）、ストレプトマイセス、フランキア、セラチア、アグロバクテリウム、アゾトバクター、ブラディリゾビウム、ブルクホルデリア、リゾビウム、リゾモナス（Rhizomonas）及びスフィンゴモナスから選択されるグラム陰性細菌に由来する。グラム陽性細菌のための特に有利な例はスタフィロコッカス、ストレプトコッカス及びバシラスである。
【０００７】
更に、組み換え細菌に由来し、かつ異種の膜タンパク質を有するゴーストを使用してもよい。改変された外被を有するゴーストは、特にターゲティング、すなわち標的細胞又は標的組織へのゴーストの移送を必要とするヒトの医学又は獣医学的な投与のために有効である。このために、膜外面にターゲット特異的表面分子を有する改変されたゴーストを使用してよい。ターゲット特異的表面マーカー、例えば糖類、例えばマンノース又はフコース、又はタンパク質、例えばエルシニア由来のインバシン又はインバシン誘導体の導入は、相応の膜在の融合ポリペプチドを細菌細胞中で溶解の前に組み換え発現するか、又は／及び適当なレセプター系、例えばストレプトアビジン／ビオチンによって膜に設置することによって実施してよい。
【０００８】
閉鎖した細菌ゴーストの効率的な製造を可能にするために、まず適切にはコンピテント細菌ゴーストを調製する。このために、細菌ゴーストを２価の金属カチオンと接触させ、かつ引き続き低温でインキュベートすることによってコンピテントに作成する。多価の金属カチオンとしては、有利にはアルカリ土類金属イオン、特にカルシウムイオンを使用する。接触は、例えばペレット化されたゴーストを金属イオンを含有し、金属イオンが、例えば５０〜２００ミリモル／ｌの濃度で含まれている水溶液で洗浄することによって実施してよい。引き続き細菌ゴーストを、有利には０〜５℃の温度において十分な時間の間、氷上に設置することでインキュベートする。得られるコンピテントゴーストを直接又は凍結及び引き続いての解凍の後に膜融合のために使用してよい。しかしながら、細菌ゴーストを事前に処理せずに使用してもよい。
【０００９】
膜融合は細菌ゴーストの膜及び脂質ベシクルの間の融合を含む。脂質ベシクルは、天然又は合成の起源に由来してよく、かつ有利にはリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンを有する脂質二重層を有してよい。例えば、細胞、特に細菌細胞を超音波によるか、又はフレンチプレス中で均質化することにより生じるベシクルを使用してよい。他方で、合成脂質ベシクル、例えばリポソームを使用してもよい。
【００１０】
更に、脂質ベシクルとして膜に取り囲まれた（membranumhuellte）ウイルス、例えばポックスウイルス、チョルドポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ハパドナウイルス（ＤＮＡウイルス）並びにコロナウイルス、パラミクソウイルス、バンヤウイルス、オルトミクソウイルス、アレナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス（ＲＮＡウイルス）が適当である。もちろん、前記の脂質ベシクルの組合せを使用してもよい。
【００１１】
細菌ゴーストと脂質ベシクルとの融合は、有利には細菌ゴーストの膜と脂質ベシクルの膜のいずれも液体状態にある条件、例えば≧３０℃、例えば３７℃の温度で実施する。融合を達成するために膜は密接されるので、細菌ゴーストと脂質ベシクルとの間の静電的反発力は克服され、かつ膜は出発材料中で不安定である。かかる条件は、例えば超遠心の間に達成される。静電的反発力の克服のための他の方法は、例えば膜の分子生物学、構造及び機能（Molecular Biology of Membranes, Structure and Function）、ハワード（Howard R. Petty）、第８章：２９７〜３４５頁に記載されており、かつ化学的融合原、例えばポリエチレングリコール、グリセリン、ＤＭＳＯ及び／又はポリヒスチジンの使用を含み、これらは表面電位を低下させ、従って静電的反発力の低減をもたらす。リン脂質含有のベシクルの使用において、融合はカルシウムの添加によって改善できる。ウイルス性の脂質ベシクルの使用において、融合はウイルス膜中のタンパク質、例えばインフルエンザ−血球凝集素、センダイ−Ｆ−タンパク質、セムリキ フォレスト−スパイク糖タンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）−ＶＳＶＧタンパク質などの存在によって改善できる。更に、分子生物学の手法（Methods inMolecular Biology）、第４８巻：動物細胞のエレクトロポレーション及び電気融合のプロトコール（Animal Cell Electroporation and Electrofusion Protocols）；ケンネス（Kenneth L. White）、第２３章、２８３〜２９３頁でのように電気融合（Elektrofusion））技術を使用してもよい。
【００１２】
特に有利には、細菌ゴーストの膜及び脂質ベシクルの間の融合は助剤、例えば２価の金属カチオン、特にカルシウムイオン及び／又は有機凝集助剤、例えばグリセリン、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ポリヒスチジン又はそれらの組合せの存在下に実施する。２価の金属イオンの濃度は、有利には１０ｍＭから２５ｍＭの範囲にある。有機凝集剤の濃度は、有利には１０〜２５％（w/v）の範囲にある。
【００１３】
本発明の重要な範囲は、閉鎖した細菌ゴーストに作用物質を填塞することを含む。作用物質は、細菌ゴーストの内部に輸送可能であり、そこで場合により固定化可能な作用物質である任意の各作用物質であってよい。作用物質のための例は、薬理学的作用を有する物質、標識物質、農業的に有用な物質、色素であるが、また遺伝子材料及び細胞成分、例えば細胞抽出物、細胞抽出物の成分又は細胞小器官、例えばリボソームであってよい。
【００１４】
作用物質の填塞は種々の方法及び様式で実施してよい。このように作用物質は填塞の前にゴースト中に導入され、かつそこで場合により固定化されてよい。更に作用物質は填塞媒体中に溶解された形で存在していてもよい。更に、作用物質をゴーストとの融合のために使用される脂質ベシクルに填塞することが可能である。脂質ベシクル中への作用物質の填塞のための方法は公知であり、例えばＪ．トリート（J. Treat et al.）、感染、疾患及び癌の治療におけるリポソーム（Therapy of Infections, Diseases and Cancer）、Ｇ．ロペス−ベレシュタイン（G. Lopez-Berestein）及びＩ．Ｊ．フィドラー（I.J. Fidler）、編集（Liss, New York, 1989）、３５３〜３６５頁、（ドキソルビシン）；Ｇ．ロペス−ベレシュタインの同書、３１７〜３２７頁（アンフォテリシンＢ）；Ｅ．Ｓ．クライネマン他（E.S. Kleineman et al）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９：４６６５（１９８９）、Ｇ．ポステ（G.Poste）他の同書、４２，１４１２（１９８２）：Ｇ．Ｒ．アルヴィング（Alving）他、ワクチン４、１６６（１９８６）（ワクチン）；Ａ．Ｇ．アリソン（Allison）及びＧ．グレゴリアディス（Gregoriadis）、ネイチャー２５２：２５２（１９７４）（ワクチン）；Ｖ．Ｖ．ラナーデ（Ranade）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８９）２９：６８５−６９４；Ｓ．Ｓ．デイヴィス（Davis）、Ｄｒｕｇｓ Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．（１９８５）１１：６３３−６４０；Ｔ．Ｍ．アレン（Allen）、Ｄｒｕｇｓ（１９９８）５６：７４７−７５６；Ｐ．Ｐ．スペイサー（Speiser）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｉｎｄ Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９１）１３：３３７−３４２；Ｒ．シンフ（Singh）及びＳ．Ｐ．ヴィアス（Vyas）、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．（１９９６）１３：１０７−１１１；Ｐ．Ｎ．シェック（Shek）他、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ（１９９４）２：４３１−４４２；Ｚ．パヴェリック（Pavelic）他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９９９）８：３４５−３５１；Ｊ．Ｍ．ソロヴィッツ（Sollovitz）他、Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．（１９９８）２９：４０９−４３０並びにこれらに引用される文献部位を参照のこと。
【００１５】
薬理学的作用を有する物質のための例は、ポリペプチド、例えば抗体、治療的作用を有するポリペプチド、例えばサイトカイン、インターフェロン、ケモカインなど、酵素及び免疫原ポリペプチド又はペプチドである。作用物質のための他の例は、核酸、例えばＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、特に治療的核酸、例えば遺伝子治療のための、有利には染色体に組み込み可能なベクターの形で存在する核酸又は核酸−ワクチン、アンチセンス核酸又はリボザイムのための核酸である。作用物質のための更なる例は、低分子作用物質、ペプチド、ホルモン、抗生物質、抗腫瘍剤、ステロイド、免疫調節薬などである。作用物質は細菌ゴースト中に溶解された形で、懸濁液として及び／又はエマルジョンとして、場合により適当な担体物質及び／又は補助物質との組合せで存在してよい。更に、作用物質は診断用標識物質、例えば蛍光性物質、色素又はＸ線造影剤であってもよい。
【００１６】
また非医学的作用物質、例えば農業分野からの作用物質、例えば殺虫剤、除草剤、線虫に対する薬剤、土壌改善のための酵素、肥料、増殖促進剤、大気中のより良好な加湿（Durchfeuchtung）又は水結合のための水結合タンパク質をゴースト中に填塞してよい。別の使用は、印刷工業のための染料、例えば免疫学的検出可能性を有する偽造安全インキの填塞及びビタミン又は食品工業のためのプロバイオティカの填塞である。同様に化粧品剤又は塩のような物質又は別のイオン性物質の填塞が可能である。
【００１７】
作用物質は細菌ゴースト中に固定化された形で存在してよい。作用物質の固定化は共有又は非共有の相互作用、例えば静電的相互作用、高親和性の生物学的相互作用を用いて、機械的滞留又は２つ以上の前記の可能性の組合せによって実施できる。
【００１８】
本発明の有利な実施態様において、作用物質の固定化は直接又は間接的な相互作用を介してゴーストの膜の内側、例えば細胞質膜の内側に組み込み膜成分として、又は非組み込みの膜成分として膜上に停留して局在している受容体によって実施する。受容体は、例えば１つ以上の膜アンカーを介してゴーストの細胞質膜に組み込まれ、かつ少なくとも１つの膜アンカードメイン並びに少なくとも１つの受容体ドメインを有する相応の融合タンパク質の異種発現によって細菌細胞中で、ゴーストに溶解させる前に生じる異種ポリペプチドであってよい。受容体ドメインのための有利な例は、アビジン又はストレプトアビジンであり、これらはビオチン又はビオチン類似体と高親和性結合を形成可能である。特に有利にはストレプトアビジンである。細菌ゴーストでのストレプトアビジンの停留は、有利には、細菌の細胞質膜中のＣ末端膜アンカーを有するストレプトアビジン−融合タンパク質の組み換え発現によってゴーストの形成に導く溶解の前に実施する。更にまた別の受容体ドメイン、例えば抗体結合部位、レクチン、ＤＮＡ結合タンパク質、シャペロン、酵素などであり、これらは結合パートナーと高親和性に結合できる。
【００１９】
選択的に、作用物質はゴースト内部で遊離形でも存在してよい。それというのもゴーストの閉鎖により膜を通しての作用物質の損失は実質的に排除されるからである。
【００２０】
本発明の特に有利な実施形において、遺伝子材料及び、場合により細胞質成分、例えば細胞小器官、例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、ＲＮＡ、ＡＴＰ、アミノ酸、ヌクレオチド、翻訳タンパク質及び転写タンパク質もしくは酵素、ＤＮＡ複製酵素及び因子、逆イオン及び微量元素を細菌ゴーストに中に填塞し、引き続き膜融合を実施する。前記のように機能的細胞を、遺伝子材料が閉鎖された細胞の代謝機能の回復のために十分な情報を有する場合に再構築できる。特に有利な実施形において遺伝子材料は、それどころか閉鎖された細菌ゴーストの増殖能の回復のために十分な情報をも有する、すなわち再び増殖可能な細胞が生じる。この場合にゴーストに導入される遺伝子材料は、有利には部分的に、例えば少なくとも５０％、特に有利には少なくとも９０％が欠失した細菌ゲノム及び／又は染色体外遺伝子材料、例えばプラスミド又は、ウイルスゲノムを含み、これらは同じ種、例えば細菌外被に由来してよい。もちろん、場合により部分的に欠失した他の生物、特に別の細菌種の遺伝子材料を含むゲノムを使用してもよい。また複数の異なる種からの遺伝子材料を有する“組み換え”ゲノムを填塞する。選択的にまた人工ゲノム又は人工染色体をゴースト中に導入してよい。
【００２１】
従って他の対象は前記の方法によって得られる閉鎖した細菌ゴーストである。閉鎖した細菌ゴーストはインタクトな膜、すなわちゴーストの内側を外界から分離する連続的な脂質層、有利には連続的な脂質二重層を有する。閉鎖した細菌ゴーストは、カプセル化された作用物質を有し、代謝機能を有し、かつ増殖能を有してよい。
【００２２】
本発明による閉鎖したかつ場合により作用物質で負荷されたゴーストの製造は、まず公知の方法に従った、例えば細菌細胞を溶解遺伝子、有利にはファージＰｈｉＸ１７４の遺伝子Ｅ又はキメラＥ−Ｌ−遺伝子で形質転換することによる細菌ゴーストの製造を含む。細菌細胞中での溶解遺伝子の発現は、有利には調節可能な発現調節配列によって、例えば温度調節可能なプロモーター／リプレッサー系λ−ｐＲ／ｃｌ８５７によって実施する。この発現調節系の場合には、形質転換された細菌を３０℃未満の温度で培養する。有利には≧４０℃への温度上昇によって、温度感受性のλｃｌ８５７リプレッサーは不活性化され、かつ溶解遺伝子が発現し、これは細胞外被内の膜貫通のトンネル構造の形成に導き、その際、これらの細胞は数分以内に溶解する。突然変異されたλ−プロモーター／オペレーター系によって、細菌の培養はより高い温度又はより低い温度、例えば３７℃でも可能である（ＷＯ９８／０７８７４号）。また細菌ゴーストを遠心分離によって回収し、かつ洗浄及び場合により凍結乾燥の後に前記の膜融合手順を行う。ゴーストを事前に作用物質で負荷すべき場合には、これらのゴーストを填塞されるべき作用物質を含有する溶液及び／又は懸濁液と、細菌ゴースト中に十分な作用物質量の浸透が可能な条件下で接触させてよい。必要に応じて、更に作用物質分子をゴーストの膜の内側に固定化できる受容体物質を添加する。受容体分子の添加は、ゴーストと填塞されるべき作用物質との接触の前、同時に又はその後に実施してよい。選択的及び／又は付加的に遊離の作用物質を填塞媒体に添加し、かつ／又は脂質ベシクル中にカプセル化してよい。
【００２３】
本発明の実施形は閉鎖したかつ場合により作用物質を有するゴーストを医学目的のために使用することである。作用物質、例えば薬理学的作用物質、抗原、抗体又は核酸をゴーストを介して投与することは、あらゆる種類の疾患の予防及び／又は撲滅、例えば病原、例えばウイルス、細菌、寄生虫又は菌類によって引き起こされる疾患の撲滅、又は腫瘍疾患又は自己免疫疾患の予防及び／又は撲滅、又は遺伝子治療のために適当である。作用物質としては、この場合それぞれの疾患に対して作用を有する、輸送後及び場合により標的細胞への内在化の後にその生理学的作用を生じる物質を使用する。本発明は、また作用物質の組合せの投与も可能である、すなわちゴーストが複数の異なる作用物質を含有するか、又はそれぞれ異なる作用物質を有するゴーストの混合物を使用してよい。更にゴーストを介して作用物質を投与することは、診断目的（イメージング）のためにも使用できる。
【００２４】
特に有利な使用は、遺伝子治療のための担持媒体及びターゲティング媒体として細菌ゴーストを使用することである。核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡのゴーストへの填塞によって、現存の核酸媒体、例えばリポソームの特異性の欠乏を決定的に改善できる。担持媒体としての細菌ゴーストの利点は、これらが核酸での負荷のための高い許容性を有することにある。これらは更にベクターとして危険ではない。それというのも生きている細胞外被ではないからである。
【００２５】
更に特に有利な使用は核酸−ワクチンの製造、特にＤＮＡワクチンの製造のための細菌ゴーストの使用並びに核酸−ワクチン、特にＤＮＡワクチンのための担持媒体及び／又はターゲティング媒体としての細菌ゴーストの使用である。
【００２６】
核酸ワクチン接種のための担持媒体又はターゲティング媒体としての細菌ゴーストは効果的かつ長期継続する特異的な免疫応答の形成をもたらす。核酸を含有する細菌ゴーストは一次抗体を提示する細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞及びマクロファージによって特異的受容体により受容され、かつ抗原タンパク質に断片化される。更に填塞されたＤＮＡ配列によってコードされる抗原が高い効率でＡＰＣ中で発現される。これは、抗原がＡＰＣの表面上でＭＨＣ−Ｉ及び／又はＭＨＣ−ＩＩ構造と関連してＴ−リンパ球に提示され、かつ免疫応答を誘導できることに起因する。それに関連して、調査の結果、抗原プロセシング及び提示はＭＨＣ−Ｉ及びＩＩ−複合体によって実施できることが判明し、その際、体液性及び細胞性の免疫応答が誘導され、例えば免疫応答は生菌での細菌性の感染の場合にも観察される。
【００２７】
細菌ゴースト中に填塞された核酸は、有利には受け取り側の生物中で複製不可能な形にある。該核酸は、標的細胞中で発現されるべき抗原をコードする配列を発現可能な形で、すなわち標的細胞中で活性な発現調節配列、例えば高い遺伝子発現を可能にするプロモーター及び場合によりエンハンサー、転写されたｍＲＮＡの正確な終結を保証するためのポリアデニル化配列、及び／又は高いタンパク質生成を可能にするための翻訳開始配列との機能的な結合において有する。更に核酸は大量の核酸量の増幅をＥ．ｃｏｌｉのような細菌中で可能にする細菌性複製起点、原核性の選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性のための遺伝子、発現高の容易な測定を可能にするレポーター遺伝子、ＧＦＰ遺伝子及び／又は免疫調節配列を有してよい。
【００２８】
有利には核酸は、ＤＮＡ、特に有利にはプラスミドＤＮＡであり、これらは環状及び／又は直鎖状で存在していてよい。しかしながら、ＲＮＡ−ワクチン又は転写可能であるが、高められた生理学的安定性を有する核酸類似体をベースとするワクチンの使用も可能である。
【００２９】
抗原をコードする配列の発現を駆動するプロモーターは有利には強力なウイルスのプロモーター／エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター／エンハンサー、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０のプロモーター／エンハンサー及び、特に有利にはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター／エンハンサーである。転写ターミネーターとしては、ＳＶ４０から又はウシ成長ホルモン遺伝子、有利にはウサギ−β−グロブリン遺伝子からのポリアデニル化配列を使用してよい。
【００３０】
この場合に、抗原としては各疾患に関連するポリペプチド又は発現により標的細胞に免疫応答を誘導するそのペプチド断片が使用される。また本発明は組合せワクチンの投与も可能であり、すなわち例えば該ゴーストは、例えば同じ病原体又は異なる病原体に由来してよい多数の種々の抗原をコードする核酸を含有してよく、又はゴーストとそれぞれ異なる抗原をコードする核酸との混合物を使用できる。
【００３１】
本発明の実施態様において、いわゆる細菌ゴースト及び抗原をコードする核酸の同種の組合せを使用してよく、その際、例えば細菌ゴーストは、核酸ワクチンによってコードされる抗原と同じ種又は同じ生物に由来する表面構造を有する。場合により、ゴーストはその表面上に、コードされる抗原に相当する表面構造さえも有してよい。このゴースト／核酸の同種の組合せは、特に細菌性の感染に対するワクチン接種のために該当するが、相応の表面構造を有する組み換えゴーストの使用において別の疾患、例えばウイルス性疾患に対するワクチン接種に拡張できる。
【００３２】
それに対して選択的に異種のゴースト／核酸の組合せが使用される。かかる異種の組合せの場合には、細菌ゴーストは一般にアジュバント機能を満たす。しかしながら、病原性細菌に由来するゴーストを異種の核酸と組み合わせて、２種の異なる病原体に対する組合せワクチンとして使用する実施態様であってもよい。
【００３３】
最後に、細菌ゴーストは担持媒体又はターゲティング媒体として農業分野のために適当である。農業分野では除草剤、殺真菌剤及び／又は殺虫剤のような作用物質を撒播するために使用できる。
【００３４】
作用物質含有のゴーストの医薬品的投与は一般的な方法、例えば経口、気体で、例えば経鼻、眼内、局所又は非経口、例えば筋内、腹腔内、静脈内又は皮下で実施する。
【００３５】
ゴーストの投与は、有利には病原体による生物の天然の感染が行われるのと同じ経路で実施する。従って、主な侵入口が胃腸管である病原性病原体（Ｅ．ｃｏｌｉ、サルモネラ、ビブリオ又はヘリコバクター）の撲滅のために予定されている作用物質を有する細菌ゴーストは経口で投与してよい。肺炎の病原からの、相応の作用物質を含有するゴースト、例えばアクチノバシラス、パスツレラ、シュードモナス又はヘモフィルスは有利には気体状で投与する。
【００３６】
作用物質を有する細菌ゴーストの本発明による投与はヒトの医学のためだけでなく、獣医学のためにも、特に家畜又は有用動物、例えばイヌ、ネコ、ブタ、ウシなどの保護的接種のために適当である。
【００３７】
農業的な使用形のために、土壌、空気及び水を介して又はカプセルとして種子にゴーストを与えてよい。
【００３８】
細菌ゴーストを介しての作用物質の適用は従来の適用形に対して多くの利点を有する。このように、既に強力な作用を得るために少量の作用物質量で十分である。更に標的細胞／組織−特異的な作用物質投与が可能である。既に免疫原作用を有する細菌ゴースト外被に基づいて、アジュバント効果が達成される。ゴースト中に閉じこめられた作用物質は生理学的プロセス、例えば酵素、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ又はヒドロラーゼによる分解に対して保護されている。更に他の作用物質との組合せも可能である。最後に、細菌ゴーストは廉価に製造でき、かつ作用物質を簡単にかつ廉価に配合できる。
【００３９】
天然の細胞と比較して機能的に制限されたゲノムを有する代謝機能もしくは増殖能を有する閉鎖された細菌ゴーストは、細胞プロセスの調査のために使用できる。更に再構築されたゴーストを、例えば弱毒化された生ワクチンとして使用できる。それというのも、弱毒化度は相応のゲノムにおける操作に基づいて非常に容易にかつ確実に制御できるからである。最後に、機能的に再構築されたゴーストをバイオテクノロジーにおいても、例えば組み換えタンパク質、特に組み換えヒトタンパク質の製造のために大工業的プロセスにおいて使用できる。妨害されたゲノムを有する本発明による細胞は出発細胞と比較して非常に低い代謝の複雑性を有し、かつ従ってより高い生産能力を達成するために的を絞って操作することができる。より高い安全性は更なる利点である。それというのも該細胞は天然の細菌細胞に対して非常に低い生存能を有するからである。
【００４０】
更に本発明を以下の図面及び実施例によって説明されるべきである。
【００４１】
図１はコバルト及び銅のイオンの作用に関する図を示している。
【００４２】
図２は蛍光性ＤＮＡで充填されたゴーストを示し、これはヘキスト（Hoechst）３３３２４色素による相応の写真を含む。
【００４３】
図３は蛍光性ＤＮＡで充填されたゴースト（コバルトもしくは銅の添加有り及び無し）を示している。
【００４４】
図４はカルセインで充填された、及び充填されていないゴースト（ベシクル有り及び無しもしくはカルシウム含有及び不含）を示している。
【００４５】
例１
１．  材料及び方法
１．１．  Ｅ．ｃｏｌｉゴーストの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２細胞（ストラタジーン（Stratagene））を溶解プラスミドｐＭＬ１（Szostak et al. J. Biotechnol. 44 (1996), 161-170）で形質転換した。該形質転換体を抗生物質を有するＬＢ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）中で２８℃において培養した。１ｌの培地に、個々の形質転換体コロニーに由来しかつ培養器（Typ MRD 60TE, Meredos GmbH, Bovenden, Deutschland）のための前培養として使用されるオーバーナイト培養を接種した。細菌を培養器中で１０ｌの容量で通気下に、かつ６００ｎｍにおいて０．４の光学密度が達成されるまで培養した。３０分後に、０．２ＭのＭｇＳＯ４を添加し、かつその２０分後に溶解タンパク質Ｅの発現を２８℃から４２℃に温度を上げることによって誘導した。１時間後に、これらの細胞を４０００ｇでの遠心分離によって回収した。蒸留水（最終容量５ｌ）中でのペレットの再懸濁は迅速な溶解をもたらした。該ゴーストを大量のトリス緩衝された塩溶液（ＴＢＳ）中で２回洗浄し、かつ引き続き凍結乾燥した。
【００４６】
１．２．  膜−脂質ベシクルの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２細胞を３７℃でＬＢ培地中で培養し、かつ後の対数増殖期に回収した。リン酸緩衝された塩溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４での３回の洗浄の後に、これらの細胞をアリコートのＰＢＳ中に再懸濁させ（タンパク質濃度２６ｍｇ／ｍｌ）、かつ−７０℃で凍結させた。該懸濁液１０ｍｌを融解後にフレンチプレス中で９００ｐｓｉ（大型のセル）でプレスした。細胞残留物及び大きい方の断片を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分）によって分離した。上清中に含まれるベシクルを２８５０００ｇ（６０分）での超遠心分離によってペレット化し、かつ次いでトリスバッファーｐＨ７．５中に取る（タンパク質濃度約４ｍｇ／ｍｌ）。ベシクル懸濁液は４℃で約１週間貯蔵できる。
【００４７】
１．３．  融合コンピテント細菌ゴーストの製造
ゴースト懸濁液（タンパク質濃度４〜６ｍｇ／ｍｌ）の細胞を遠心分離によってペレット化し、かつもう一度、同容量の氷冷の１００ｍＭのＣａＣｌ２で洗浄した。更に使用する前に、該ゴーストを２〜３時間氷上に置き、もしくは−７０℃で凍結させ、かつ消費の前に氷上で融解させる。しかしながら、この段階はゴーストの閉鎖のために必ずしも必要ではない。
【００４８】
１．４．  作用物質による細菌ゴーストの充填
７５μｌのゴースト懸濁液を１３０００ｒｐｍ（５分間）でペレット化し、かつ７５μｌの融合バッファー（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ５，６又は７）中に取った。充填されるべき作用物質は既にバッファー中に溶解されていた。作用物質のための例はＯＮＰＧ（８ｍｇ／ｍｌ）、カルセイン（２′，２′−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−アミノメチル］フルオレセイン；ＭＷ６２２．５；フルカ オーストリア（Fluka Austria）；０．６６ｍＭ）、５′−フルオレシン標識されたＤＮＡ（長さ：４００ｂｐ）及びスルホローダミン（ＭＷ５８０．６；シグマ；１０ｍＭ）であった。
【００４９】
蛍光標識されたＤＮＡの製造は以下のようであった：
古細菌性ファージθＣＨ１のＤＮＡの４００ｂｐをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させ、同時にフルオレセイン標識されたプライマー（Oligo sequencing service, Universitaet Wien）によって５′−末端で標識した。反応（１．７５ｎＭのｄＮＴＰ、０．５μＭのプライマー、１ｎｇ／μｌのファージＤＮＡ、０．０２Ｕ／μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー）は以下の条件で実施した：４分間の前変性、３５サイクル：３０秒９４℃／３０秒６０℃／２分間６８℃。ＤＮＡ断片の精製をキアゲン 精製キット（Qiagen Purification Kit）で実施した。
【００５０】
細菌ゴーストと膜−脂質ベシクルとの融合
１．４による７５μｌの融合バッファーに２８℃での１段階ないし２段階のインキュベートの後に７５μｌのベシクル懸濁液及びカルシウム（最終濃度２５ｍＭ）を添加した。短時間のボルテックス処理の後に、該懸濁液を３７℃で一晩インキュベートした。引き続き超遠心（ＴＬＡ１００．３ローター中で５００００ｒｐｍ）を３７℃で３０分間実施した。
【００５１】
１．６．  作用物質の填塞の証明
１．６．１．  ＯＰＮＧ
超遠心によってペレット化された閉鎖されたゴーストをトリスバッファーｐＨ７．５で、上清中にもはやＯＮＰＧがないことが確認できるまで少なくとも３回洗浄した。引き続き閉鎖されたゴーストにクロロホルム／ＳＤＳ（３３μｌずつ）を混合し、ボルテックス処理し、１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、かつ細胞内容物を有する上清を分離した。前記のようにして填塞されたＯＮＰＧを遊離させ、かつ引き続きβ−ガラクトシダーゼの添加及び黄色の色素への変換の後に検出できた。この調査結果は、ゴーストの閉鎖及び作用物質のカプセル化が行われたことを示している。
【００５２】
コントロールとして、ベシクル、ＯＰＮＧ又は細菌ゴーストを含有しない融合の項目を実施した。こうして、ＯＮＰＧが非特異的にゴーストもしくはベシクルに結合せず、もしくはＯＮＰＧはベシクル中に閉じこめられないことが証明された。
【００５３】
１．６．２．  カルセイン及びＤＮＡ
カルセインもしくは標識されたＤＮＡで充填されているゴーストを、蛍光顕微鏡において、もしくはＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ベクトン ディキンソン）によってＣｏ２＋（５０ｍＭ）もしくはＣｕ２＋（１％w/v）の添加後に調査した。膜が透過性でないが、カルセインもしくはフルオレシン標識されたＤＮＡの蛍光が効果的に消光されるコバルトの添加の後に依然として蛍光を有するゴーストを検出できるが、膜透過作用を有する銅添加（これはカルセイン及びフルオレシン標識されたＤＮＡの消光のための非常に有効な薬剤でもある）の後に蛍光を観察できないのであれば、このことは効果的な膜融合、またゴースト膜の完全性の回復のための明らかな示唆である。
【００５４】
填塞された４００ｂｐの断片（並びにゴーストＤＮＡ）を、ヌクレオチドを着色せずにインタクトなＤＮＡにのみインターカレーションする膜透過作用を有するＤＮＡ色素であるヘキスト３３３４２で付加的に着色し、かつインターカレーションした色素のＵＶによる励起によってＤＡＰＩフィルタを用いて蛍光が観察でき、かつ従って４００ｂｐの断片はなおもインタクトに閉鎖したゴースト中に存在することが証明された。
【００５５】
２．  結果
種々の特性を有する多数の種々の物質をゴーストの充填のために使用した。β−ガラクトシダーゼのための水溶性基質としてのＯＮＰＧは低分子量を有し、該基質は酵素反応の後に測光的に検出できる。フルオレセイン標識されたＤＮＡ、匹敵するサイズの分子及びカルセイン、場合により親水性の小分子は、蛍光顕微鏡による充填されたゴーストの光学的な調査のために用いられる。カルセイン（フルオレセインの誘導体）及びフルオレセイン（４００ｂｐのＤＮＡの５′−標識）の蛍光は効果的にカチオンの銅及びコバルト（D.A. Kendall, R.C. MacDonald, J. Biological Chemistry 257(1982), 13892-13895; Oku N. et al., Biochim. biophys. Acta 691(1982), 332-340）によって消光でき、その際、Ｃｕ２＋イオンは膜を透過するが、Ｃｏ２＋イオンは透過しない。コバルトの添加は２つの効果、すなわち第一に閉じこめられていない外部カルセインもしくはＤＮＡの蛍光の消光並びに第二にコバルトが拡散できない内膜の完全な回復の効果を有する。銅の添加は蛍光の完全な消光に作用する。それというのも蛍光は外側のカルセインもしくはフルオレセインの蛍光も、閉じこめられたカルセインもしくはフルオレセイン（ＤＮＡ標識）の蛍光も完全に消光されるからである。図１〜４を参照のこと。
【００５６】
カルセイン（１０ｍＭ）で充填されたゴーストはコバルト（５０ｍＭ）の添加の後に顕微鏡で観察された。消光溶液は、ゴーストを増殖させてはならず、かつ機械的作用によって再び開放させてはならないという利点を有する。これは本来のイメージを提供すべきである。
【００５７】
更に充填されたゴーストを洗浄し、次いでコバルトを使用して写真を撮り、かつコバルトを使用せずに写真を撮って、かつ計数した（図４参照）。この図面において、充填されかつ閉鎖されたゴースト、負荷されたベシクル不含のゴースト、充填反応によって透過性になったベシクル及びカルセインとインキュベートされた株Ｅ．ｃｏｌｉＮＭ５２２のインタクトな細胞をコバルトの添加後に示している。ベシクルはゴーストの閉鎖のため、もしくはゴースト膜の完全な回復のために必要であると明白である。それというのも全ての負荷されたゴーストの大多数が蛍光を有さないからである。ベシクルは、充填反応の間にカルセインまでも受容し、カルセインはその際コバルトイオンのために認容性でない。更にインタクトな細菌はカルセインを非特異的に結合しないか、又は能動的に受容しないことを示すことができた。
【００５８】
コバルトの存在下での洗浄の前及び後に撮られた顕微鏡写真に基づいて、以下のデータが得られた（消光剤の添加は、カルセインの場合には不可欠である。それというのも遊離のカルセインの高い蛍光に基づいて写真を撮ることができないからである）。ベシクルの質及び種類に依存して、全てのゴーストの２０〜６０％（平均して３８％）がコバルト添加の後に緑色の蛍光を発光する。図５におけるグラフは、ゴーストに対する洗浄の影響を示している。蛍光を有するゴーストの数は洗浄の後に２２％だけ低下し、更なるコバルトの添加の後に更に２１％だけ低下し、従って全体で４３％だけ低下した。つまり、本来の閉鎖されたゴーストの５７％は１回の洗浄の後にも閉鎖され続け、もしくは依然としてカルセインは蛍光シグナルを提供するのに十分にゴースト中に保持される。
【００５９】
図５：ゴーストに対する洗浄の影響；コバルト添加後の閉鎖されたゴーストを示している。本来の、すなわち洗浄前の閉鎖されたゴーストは１００％として選択される。
【００６０】
【外１】
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【００６１】
コバルトイオンはカルセインの蛍光を１００％にまで消光できないので、各場合において確実な残留蛍光を残し、該蛍光はまた肉眼によってもなおも明るく感じられ、もしくは写真に写ることがある。従って個々のゴーストのための蛍光の量的な測定が重要である。ただ、負荷されたゴースト並びに負荷され閉鎖されたゴーストの割合の正確な特定を実施できるに過ぎない。このために、蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用した。
【００６２】
消光溶液を添加しないか、もしくは蛍光標識されたＤＮＡ又はスルホローダミンＢを負荷のために使用する場合には、ゴーストの＞９０％をレポーター物質で負荷できることが判明した（顕微鏡）。従って負荷効率は既にＯＮＰＧでの調査によって示されえたように非常に高い。閉鎖率については証明はできなかった。
【００６３】
蛍光性ＤＮＡ（ＤＮＡ*）もしくはカルセインで充填されたゴーストを別々に検討した。それというのも両者のレポーター物質の消光能の差異が生じるからである。以下の調査項目を現存する調査プロトコールに従って実施した：
１．  ＥＣＧ＋カルセイン又はＤＮＡ*＋ベシクル
２．  ＥＣＧ＋カルセイン又はＤＮＡ*−ベシクル
３．  ＥＣＧ＋カルセイン又はＤＮＡ*＋ベシクル
４．  カルセイン又はＤＮＡ*＋ベシクル
５．  ベシクル
調査項目において１つの成分を省く場合には、該成分を常に同じカルセインもしくはＤＮＡ*濃度が生じるように当量のバッファーと交換した。
【００６４】
負荷されかつ閉鎖されたゴーストをコバルトの添加の後にコバルト添加前の蛍光の＞８％の蛍光を有するゴーストゲート中の粒子として定義した（根拠：コバルトはカルセインの蛍光の少なくとも９２％、最大で９４％を消光する）。ここで種々の調査日に測定された閉鎖率をまとめた（第１表参照）。
【００６５】
第１表：ゴースト懸濁液中の閉鎖したゴースト（ＥＣＧ）のパーセント割合；両者の平行に並べられた調査項目（ａ−ｅ）は明らかに膜ベシクルの存在もしくは不在により異なっている。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
つまり全ての検出されたゴーストの０．６２〜４３．４５％がカルセインで負荷されており、かつ閉鎖されている。
【００６８】
調査項目３、４及び５からの値は挙げられる閉鎖効率が既に較正されている空試験値として用いられる。顕微鏡測定でのように閉鎖率において非常に大きな変動が生じる。調査項目ｄ及びｅ（０＋０．６２％）における閉鎖率は否定的に評価し、閉鎖効率＜３％は従ってバックグラウンドである。閉鎖効率の変動は種々の膜ベシクル調製物又は種々の期間のゴーストの貯蔵によって説明できる。恐らく貯蔵の期間及び種類はゴーストの閉鎖能に影響を及ぼす（貯蔵条件：−８０℃でＰＢＳ中のゴースト）。
【００６９】
示されるＦＡＣＳデータから、ベシクルは閉鎖のために必ずしも必要ではないことは明らかである。ゴースト調製物中になおも非常に多くの膜ベシクルが含まれており、かつ場合により調査条件はゴーストの融合を互いに促進するということが仮定される。第１表のデータはしかしながら、カルセインの蛍光の完全な消光は閉鎖されたゴースト中では不可能であることも示している。
【００７０】
フルオレシン標識されたＤＮＡ
遊離フルオレシン標識されたＤＮＡのコバルト及び銅による比較的不利な消光能の蛍光測定的な測定に応じて、以下の負荷されかつ閉鎖されたゴーストのための定義がもたらされる：コバルト添加後の蛍光がコバルト添加前の蛍光の＞４０％である粒子は閉鎖しているとみなした。ここで、種々の調査日で測定した閉鎖率をまとめる（第２表参照）。
【００７１】
第２表：コバルト添加後の閉鎖されたゴーストのパーセント割合；データはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）によって調べられた。
【００７２】
【表２】
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【００７３】
つまり、全てのゴーストの平均して３６．３％がＤＮＡ*で負荷されており、かつ閉鎖されている。閉鎖率における変動はカルセインの例でのように種々のベシクル調製物及びゴーストの可能な変法によって明らかにできる。更に、ゴーストの超遠心は、例えば負荷効率を測定する分析的定量試験でのように、上清からゴーストを分離することが絶対的に必要でない場合には必ずしも必要とされない。
【００７４】
例２
翻訳−転写系及びβ−Ｇａｌ発現プラスミドの填塞
１．  材料及び方法
リプレッサーｃｌ８５７の精製を、従来記載される方法（Frinha MA, Keopinski AM; Can. J. Microbiol (1997)43:220-226; Johnson AD, Pabo CO, Sauer RT; Methods Enzymol. (1980) 65:839-56）に従って実施した。β−ガラクトシダーゼの発現のために、プラスミドｐＣＳ−ｌａｃ（Jechlinger W, Szostak MP, Lubitz W (1998)Gene218: 1-7）及びｐＡＷＪ−ｌａｃ（Jechlinger W, Szostak MP, Witte A, Lubitz W;(1999) FEMS Microbiol Letters 173:347-352）を使用した。両方のプラスミドにおいて、β−ガラクトシダーゼ遺伝子は温度感受性のプロモーター下にある。ｐＣＳ−ｌａｃの場合には酵素発現の誘導は３７℃から２８℃への温度降下によって実施し、ｐＡＷＪ−ｌａｃの場合には３７℃から４２℃への温度上昇によって実施した。転写−翻訳アッセイとのプラスミド（プロメガ）の填塞は現存の填塞プロトコールによって膜ベシクルを使用して、かつ使用せずに実施した。２．５μｌの１０ｍＭのアミノ酸ミックス、１０μｌのＳ３０−プレミックス、７．５μｌのＳ３０−抽出物及び２．５μｌの１０ｍＭのＳメチオニンからなる転写−翻訳アッセイをプラスミド（濃縮マキシプレパレーション（Konz.Maxipraeparation）、キアゲン）及び精製されたリプレッサーと一緒に混合し、更にＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２−ゴーストを３７℃で拡散によって負荷し、かつ３７℃で膜ベシクルによって閉鎖した。実施された閉鎖反応の後に、該ゴーストを融合バッファーで３回洗浄し、かつ次いでβ−ガラクトシダーゼの発現を温度降下もしくは上昇（前記の段落参照）によって誘導する。ｐＡＷＪ−ｌａｃの場合には０、１０、２０、３０及び６０分後に、かつｐＣＳ−ｌａｃの場合には０、１、２、３、４時間後に、それぞれ１アリコートずつのゴースト懸濁液を採取し、ゴーストをグルタルアルデヒドによって固定し、かつＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド；着色溶液：０．２％のＸ−Ｇａｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６・３Ｈ２Ｏ、５ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６、ＰＢＳ（リン酸緩衝された食塩水）中）の添加によってβ−ガラクトシダーゼ発現に対して調査した。β−ガラクトシダーゼが形成される場合に、本来無色のＸ−Ｇａｌがラクトースと青色のインドールに分離する。つまり、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞は青色を呈し、次いで顕微鏡において１００倍の拡大率で計数した。
【００７５】
２．  結果及び議論
菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２のゴーストを２つの原核生物のためのβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（ｐＡＷＪ−ｌａｃ及びｐＣＳ−ｌａｃ）、リプレッサーｃｌ８５７及び市販の転写−翻訳アッセイで負荷し、膜ベシクルによって閉鎖した。β−ガラクトシダーゼの発現は洗浄されたゴーストにおいて温度降下もしくは上昇によって誘導した。Ｘ−Ｇａｌの添加によって、ｐＣＳ−ｌａｃの場合には２８℃での３時間のインキュベートの後に全てのゴーストの０．３＋０．８％は軽く青色に着色するが、４時間後に深い青色に着色する、すなわち該ゴーストはβ−ガラクトシダーゼを発現し、ｐＡＷＪ−ｌａｃの場合には既に２０分後に全てのゴーストの０．５〜２％はβ−Ｇａｌ発現を行うことを示すことができる。ゴーストの閉鎖が行われない場合に、Ｔｋ−Ｔｌ−アッセイはゴーストから洗出され、かつβ−ガラクトシダーゼを発現せず、従って青色呈色は起こらない。誘導を行わなければ、同様にβ−ガラクトシダーゼ活性は検出できない。
【００７６】
例３
ｐＥＧＦＰの填塞及び種々の細胞系統におけるＧＦＰの発現
一連の調査によって、結腸内皮細胞、マクロファージ及び樹状細胞による標識されたゴーストの効果的な受容及び“薬剤放出”が示されており、またゴーストによって真核細胞の遺伝子ターゲティングが潜在的に可能かどうかを調査した。この調査のために、マクロファージＲＡＷ１６４．７及びヒトの結腸内皮細胞Ｃａｃｏ−２を使用した。ヒトのコドンを使用して真核性プロモーター（ＣＭＶ）下ににＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）をコードするプラスミドｐＥＧＦＰ（クロンテック）をゴースト中に填塞して、細胞と一緒にインキュベートした。遺伝子ターゲティングが可能であるべきならば、真核細胞はＥＧＦＰを発現せねばならず、かつ従って４８８ｎｍでの励起により緑色に蛍光を発せねばならない（発光最大５０７ｎｍ）。
【００７７】
１．  材料及び方法
ゴースト製造のために使用される菌株：Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２及びビブリオ コレラ
プラスミドｐＥＧＦＰ（クロンテック）の填塞は現存の負荷プロトコールによってベシクルを使用して、かつ使用せずに実施した。それというのもＤＮＡの場合には、必ずしも閉鎖が行われる必要が無く、既に示されるようにＤＮＡはゴーストに結合するからである。過剰のＤＮＡをゴーストの洗浄及び引き続きのＤＮＡアーゼＩ消化によって除去した。填塞されたプラスミドはコードされたＥＧＦＰのＰＣＲによって検出できた。
【００７８】
真核細胞をゴーストの添加前に３〜５時間相応の細胞培養シャーレで培養した。ｐＥＧＦＰで負荷されたゴーストを細胞（マクロファージＲＡＷ２６４．７；ＡＴＴＣ：ＨＴＰ−３７、ヒトの結腸内皮細胞Ｃａｃｏ−２；ＡＴＴＣ：ＴＩＢ７１）に導入（ＭＯＩ：１０〜１００）し、かつ一晩インキュベートした。受容されていないゴーストを次いで培地で取り出し、細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ新たな培養培地を添加した。更なるインキュベート（全体でゴーストの添加の４８時間後）細胞を蛍光顕微鏡でＧＦＰ発現に対して調査した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック、遺伝子バンク アクセッションＵ５５７６２）の記載：ヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前早期プロモーター；強化緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＥＧＦＰ）；ＳＶ４０複製起点。
【００７９】
２．  結果及び議論
細胞培養シャーレ中でインバース顕微鏡（inversmikroskope）において、Ｅ．ｃｏｌｉゴーストでのトランスフェクションの後に、マウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７の場合に約１０-５〜１０-４のＧＦＰの発現効率が観察された。またチャンバースライド中で培養された細胞の写真を撮った。ヒトの結腸癌細胞Ｃａｃｏ−２の場合にＥ．ｃｏｌｉゴーストを使用した場合に１０％までの細胞が、かつＶ．コレラゴーストを使用した場合に７％までの細胞がＥＧＦＰを発現した（図６を参照）。評価は蛍光顕微鏡で計数によって実施した。
【００８０】
例４
マクロファージ、Ｃａｃｏ−２及びＨｅｐＧ２における薬剤放出
水溶性作用物質をゴーストで輸送でき、かつ規定の作用部位に運び、かつそこで遊離できることを示すために、カルセインを自己消光を起こす濃度で填塞し、かつゴーストをファゴサイトーシスするマクロファージ、Ｃａｃｏ−２及びＨｅｐＧ２に導入した。填塞されたカルセインを有するゴーストがファゴサイトーシスされ、かつファゴリソソーム中で“分解”される場合に、カルセインの希釈によってコンパートメント中に蛍光が観察されるべきである。
【００８１】
１．  材料及び方法
ゴーストを２００ｍＭのカルセインもしくはｐＨを安定化する赤色蛍光性の色素スルホローダミンＢ（１０μＭ；シグマ）で負荷し、かつベシクルで前記のように閉鎖した。２００ｍＭの濃度から、カルセイン分子はそれ自体と蛍光を発しない、すなわちそれ自体が色素を消光する錯体を形成する。充填されたゴーストを融合バッファー中で２４時間透析した後に蛍光顕微鏡中で観察し、自己消光を調べた。コントロールとして遊離のカルセインもしくは遊離のスルホローダミンＢが用いられる。細胞系統ＲＡＷ２４６．７のマクロファージをゴーストと一緒に２時間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄し、かつインバース顕微鏡において直ちにもしくは２４時間のインキュベート後に４８０ｎｍでの励起により発光フィルタを用いて５２０ｎｍで観察し、かつ写真に撮った。
【００８２】
２．  結果及び議論
２００ｍＭのカルセインで充填された（〜３０〜４０％）のゴーストは蛍光顕微鏡において蛍光が示されず、これは自己消光されるカルセインの効果的な填塞が推測される。ここで、ほぼ全てのマクロファージは負荷されたゴーストを受容し、かつカルセインもしくはスルホローダミンは細胞質の小胞状のコンパートメント、例えばエンドソーム、リソソーム又はエンドリソソームに遊離するが、暗く現れる細胞核中には遊離しない。コンパートメント中へのカルセインの遊離は濃度の低下及び自己消光効果の打ち消しをもたらし、それによってマクロファージ中の作用物質遊離が可能であると証明された。遊離カルセインはマクロファージによって同様に受容されるが、実質的に僅かな濃度である。同じことは、ヒトの結腸癌細胞（Ｃａｃｏ−２）及びヒトの肝細胞（ＨｅｐＧ２）のいずれにおいて、より低い効率で示される場合でも可能である（図７参照）。
【００８３】
例５
填塞及び印刷インキ
赤色印刷インキをゴースト中に填塞し、かつ填塞されたインキの特性をインキ単独と比較して、紙及びニトロセルロースへの付着性に関して調査した。
【００８４】
１．  材料及び方法
株エシェリキア コリＮＭ５２２のゴーストを使用した。大きな顔料を除去するために１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した赤色印刷インキを填塞した。インキの填塞の後にゴーストを複数回食塩水で洗浄して、填塞されていないインキもしくは過剰のインキを除去した。
【００８５】
填塞されたインキ及び填塞されていないインキのいずれも紙もしくはニトロセルロース膜上に施与した。乾燥後に、その紙もしくは膜を種々の環境要素、例えば熱（６０℃）、光、水、エタノール又はクロロホルムに晒した。インキもしくは填塞されたインキの強さ及びゴーストの付着特性を観察した。
【００８６】
ゴーストの検出をなおもゴースト中に存在するＤＮＡのエチジウムブロミドによる着色によって実施した。膜もしくは紙をエチジウムブロミド中に１分間浸し、水で軽く洗浄し、次いでＵＶ灯（２６５ｎｍ）下で調査した。エチジウムブロミドはＤＮＡ中にインターカレーションし、かつ次いでＵＶ光での励起により淡赤色に蛍光を発した。白色の紙がＵＶ光を反射するという事実に基づいて赤色の紙を使用した。それというのもこの紙上ではエチジウムブロミド−ＤＮＡ複合体の淡赤色蛍光はより良好に観察できるからである。
【００８７】
２．  結果
ゴーストもしくはインキの付着特性に関する観察を以下の表に示した。インキもしくは填塞されたインキの陽性の検出を＋で、もしくは陰性の検出を−で示した。ゴーストの色の強さもしくは蛍光シグナルが弱い場合には（＋）を使用した。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
３．  まとめ
ゴーストはニトロセルロース上に基本的に紙よりも良好に付着する。熱、光及び水又はエタノールによる多数の洗浄はゴーストもしくはインキの付着に殆ど影響がない。膜もしくは紙の水もしくはエタノール中への１週間の浸漬の後に、インキもしくはゴーストのいずれの容易な洗出効果が観察できた。エタノールと水とを比較する場合には、インキはゴーストよりも良好にエタノールによって洗出されるが、ゴーストは水によってインキよりも良好に洗出される。しかしながら基本的に、インキは、これがゴースト中に填塞されるか、もしくはゴーストと混合される場合には紙もしくはニトロセルロース膜に良くも悪くも付着することが保証されねばならない。
【００９０】
更にインキとゴーストとの混合は、微細な顔料がおそらくゴーストに付着するので十分な場合がある。ゴースト中へのインキの填塞は従ってインキの場合には必ずしも必要というわけではない。
【００９１】
ゴースト−インキ混合物の利点はむしろゴーストの抗原特性におけるよりも、改善されたインキの付着特性において僅かである。それというのもそのＤＮＡもしくはタンパク質が明らかなように分子生物学的方法によって細胞表面で検出でき、かつ該インキは偽造安全性であるからである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はコバルト及び銅のイオンの作用に関する図を示している。
【図２】  図２は蛍光性ＤＮＡで充填されたゴーストを示し、これはヘキスト３３３２４色素による相応の写真を示している。
【図３】  図３は蛍光性ＤＮＡで充填されたゴースト（コバルトもしくは銅の添加有り及び無し）を示している。
【図４】  図４はカルセインで充填された、及び充填されていないゴースト（ベシクル有り及び無しもしくはカルシウム含有及び不含）を示している。
【図５】  図５：ゴーストに対する洗浄の影響；コバルト添加後の閉鎖されたゴーストを示している。
【図６】  図６はｐＥＧＦＰの填塞及び種々の細胞系統におけるＧＦＰの発現の試験結果を示している。
【図７】  図７はマクロファージ、Ｃａｃｏ−２及びＨｅｐＧ２における薬剤放出の試験結果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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