(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつ連続した４〜２０個のアルギニン残基からなるポリアルギニンペプチドを表面に有する脂質膜を備えることを特徴とする脂質膜構造体。
【請求項２】
ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンとの含有量が、前記脂質膜に含有される総脂質量の７０％ (モル比）以上であることを特徴とする請求項１記載の脂質膜構造体。
【請求項３】
前記脂質膜が下記（ａ）又は（ｂ）に示すミトコンドリアターゲティングペプチドを表面に有することを特徴とする請求項１又は２記載の脂質膜構造体。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
前記ミトコンドリアターゲティングペプチドが直接又はリンカ一を介して前記脂質膜の構成成分に結合していることを特徴とする請求項３記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
前記ミトコンドリアターゲティングペプチドのＣ末端が前記脂質膜の構成成分に結合していることを特徴とする請求項４記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
前記ミトコンドリアターゲティングペプチドの量が、前記脂質膜に含有される総脂質量の２〜１０％ (モル比)であることを特徴とする請求項３から５の何れかに記載の脂質膜構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、脂質膜構造体、特に、目的物質をミトコンドリア内に送達可能な脂質膜構造体等に関する。
【背景技術】
【０００２】  従来、ミトコンドリアへのタンパク質導入技術として、ミトコンドリアへの移行能を有するペプチド（例えば、Ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  α等のミトコンドリアターゲティングシグナル（ＭＴＳ））と目的のタンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクターを細胞内に導入し、細胞内で融合タンパク質を発現させる方法が主に採用されてきた（非特許文献１，２，３）。しかしながら、ミトコンドリア膜の物質透過は非常に制限されており、オリゴヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ等をミトコンドリア内へ送達する方法は皆無であった。【０００３】  一方、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等を標的部位に確実に送達するためのベクターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療においては、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等のウイルスベクターが開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少ないリポソームベクターやペプチドキャリアーが注目を集めている。リポソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有している。【０００４】  最近、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの表面をステアリル化オクタアルギニンで修飾することにより、凝縮化ＤＮＡの細胞導入効率が１０００倍、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの細胞への導入効率が１００倍向上したことが報告されている（非特許文献４）。また、表面をステアリル化オクタアルギニンで修飾したリポソームは、原形を保った（インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な状態で）細胞内に導入できることが報告されている（特許文献１，非特許文献４，５）。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレット
【非特許文献１】Ｂ．Ｗ．Ｋｏｎｇ等，「Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ」，２００３年，１６２５巻，９８−１０８頁
【非特許文献２】Ｔ．Ｔａｍｕｒａ等，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」，１９９６年，２２２巻，６５９−６３頁
【非特許文献３】Ｋ．Ｄｉｅｋｅｒｔ等，「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ」，１９９９年，９６巻，１１７５２−７頁
【非特許文献４】Ｋｏｇｕｒｅ等，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」，２００４年，９８巻，３１７−３２３頁
【非特許文献５】カリル・イクラミ等，「ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ」，２００４年，１２４巻，Ｓｕｐｐｌ．４，１１３−１１６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明は、ミトコンドリア内に目的物質を送達することができる脂質膜構造体、及び当該脂質膜構造体の調製に有用なリン脂質誘導体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  上記課題を解決するために、本発明の脂質膜構造体は、膜融合性脂質を含有し、膜透過性ペプチドを有する脂質膜を備えることを特徴とする（請求項１参照）。膜融合性脂質を含有し、膜透過性ペプチドを有する脂質膜は、ミトコンドリア膜と効率よく融合することができる。したがって、ミトコンドリア内へ送達しようとする目的物質を保持している脂質膜構造体（請求項１６参照）は、脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合により目的物質をミトコンドリア内に放出させることができ、これにより、目的物質をミトコンドリア内に送達することができる。すなわち、本発明の脂質膜構造体は、目的物質のミトコンドリア内送達用ベクターとして使用することができる（請求項１７参照）。【０００７】  本発明の脂質膜構造体において、前記膜融合性脂質の含有量が、前記脂質膜に含有される総脂質量の７０％（モル比）以上であることが好ましい（請求項２参照）。膜融合性脂質の含有量を上記範囲とすることにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する融合能を向上させることができる。【０００８】  本発明の脂質膜構造体において、前記膜融合性脂質は、例えば、コーン型脂質であり（請求項３参照）、前記コーン型脂質は、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである（請求項４参照）。【０００９】  本発明の脂質膜構造体において、前記膜透過性ペプチドは、例えば、膜透過性ドメインを有するペプチドであり（請求項５参照）、前記膜透過性ドメインは、好ましくはポリアルギニンであり（請求項６参照）、前記ポリアルギニンは、例えば、連続した４〜２０個のアルギニン残基からなる（請求項７参照）。膜透過性ドメインをポリアルギニンとすることにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する融合能を向上させることができる。また、膜透過性ドメインがポリアルギニンであると、本発明の脂質膜構造体は、原形を保ったまま（インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な状態で）細胞内に移行することができる。したがって、本発明の脂質膜構造体を細胞外に投与すると、本発明の脂質膜構造体は目的物質を保持したまま細胞内に移行し、脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合により目的物質はミトコンドリア内に放出される。【００１０】  本発明の脂質膜構造体において、前記膜透過性ペプチドが前記脂質膜の表面に存在することが好ましい（請求項８参照）。膜透過性ペプチドを脂質膜の表面に存在させることにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する融合能を向上させることができる。【００１１】  本発明の脂質膜構造体において、前記脂質膜が、ミトコンドリアターゲティングシグナルを有することが好ましい（請求項９参照）。これにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができる。【００１２】  本発明の脂質膜構造体において、前記ミトコンドリアターゲティングシグナルは、例えば、下記（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである（請求項１０参照）。
（ａ）配列番号１〜３１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１〜３１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ミトコンドリアへの移行能を有するペプチド【００１３】  本発明の脂質膜構造体において、前記ミトコンドリアターゲティングシグナルは、例えば、直接又はリンカーを介して前記脂質膜の構成成分に結合している（請求項１１参照）。この場合、前記ミトコンドリアターゲティングシグナルのＣ末端が前記脂質膜の構成成分に結合していることが好ましい（請求項１２参照）。これにより、ミトコンドリアターゲティングシグナルの機能（ミトコンドリアへの移行能）を効率よく発揮させることができる。【００１４】  本発明の脂質膜構造体において、前記ミトコンドリアターゲティングシグナルが前記脂質膜の表面に存在することが好ましい（請求項１３参照）。これにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができる。【００１５】  本発明の脂質膜構造体において、前記ミトコンドリアターゲティングシグナルの量が、前記脂質膜に含有される総脂質量の２〜１０％（モル比）であることが好ましい（請求項１４参照）。これにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができる。【００１６】  本発明の脂質膜構造体はリポソームであることが好ましい（請求項１５参照）。本発明の脂質膜構造体がリポソームである場合、本発明の脂質膜構造体の内部に目的物質を封入することにより、目的物質をミトコンドリア内に効率よく送達することができる。【００１７】  上記課題を解決するために、本発明は、次式：Ａ−Ｘ−Ｂ［式中、Ａはミトコンドリアターゲティングシグナルの残基を表し、Ｘは直接結合又はリンカーを表し、Ｂはリン脂質の残基を表す。］で表されることを特徴とするリン脂質誘導体を提供する（請求項１８参照。）本発明のリン脂質誘導体は、脂質膜構造体をミトコンドリアターゲティングシグナルで修飾する（例えば、リポソーム表面をミトコンドリアターゲティングシグナルで修飾する）際に有用である。【００１８】  本発明のリン脂質誘導体において、前記ミトコンドリアターゲティングシグナルのＣ末端が、直接又はリンカーを介してリン脂質に結合していることが好ましい（請求項１９参照）。これにより、ミトコンドリアターゲティングシグナルの機能（ミトコンドリアへの移行能）を効率よく発揮させることができる。【００１９】  本発明のリン脂質誘導体において、前記ミトコンドリアターゲティングシグナルは、例えば、下記（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである（請求項２０参照）。
（ａ）配列番号１〜３１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１〜３１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ミトコンドリアへの移行能を有するペプチド【００２０】  本発明のリン脂質誘導体において、前記リンカーは、例えば、アミノ酸残基、リンカーペプチドの残基又はクロスリンカー試薬の残基である（請求項２１参照）。【００２１】  本発明のリン脂質誘導体において、例えば、前記リン脂質がアミノ基を有し、前記リン脂質が前記アミノ基を介して前記ミトコンドリアターゲティングシグナル又は前記リンカーに結合している（請求項２２参照）。
本発明のリン脂質誘導体において、例えば、前記リン脂質はホスファチジルエタノールアミン類である（請求項２３参照）。
【発明の効果】
【００２２】  本発明により、ミトコンドリア内に目的物質を送達することができる脂質膜構造体、及び当該脂質膜構造体の調製に有用なリン脂質誘導体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の脂質膜構造体の実施形態を模式的に示す一部断面図である。
【図２】ＥＰＣ系リポソームのミトコンドリア膜に対する結合活性（％）を示す図である。
【図３】ＤＯＰＥ系リポソームミトコンドリア膜に対する結合活性（％）を示す図である。
【図４】ＥＰＣ系リポソームのミトコンドリア膜に対する融合活性（ＦＲＥＴ解消率（％））を示す図である。
【図５】ＤＯＰＥ系リポソームミトコンドリア膜に対する融合活性（ＦＲＥＴ解消率（％））を示す図である。
【図６】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図７】ウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図８】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図９】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図１０】ＳＭＣＣ−ＤＯＰＥの合成スキームを示す図である。
【図１１】ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１２】ＦＡＢ−ＭＳの結果を示す図である。
【図１３】ＭＴＳ−ＤＯＰＥの合成スキームを示す図である。
【図１４】ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１５】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を示す図である。
【図１６】リポソームのミトコンドリアへの移行活性を示す図である。
【図１７】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図１８】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【符号の説明】
【００２４】１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ・・・リポソーム
２ａ，２１〜２２ｂ，２１〜２２ｃ，２１〜２３ｄ・・・脂質膜
３・・・目的物質
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】  以下、本発明の脂質膜構造体について詳細に説明する。なお、「膜融合性脂質を含有し、膜透過性ペプチドを有する脂質膜」を以下「ミトコンドリア膜融合性脂質膜」という。【００２６】  本発明の脂質膜構造体は、ミトコンドリア膜融合性脂質膜を有する限り、リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定形の層状構造物等のうち、いずれの構造体であってもよいが、リポソームであることが好ましい。本発明の脂質膜構造体がリポソームである場合、本発明の脂質膜構造体の内部に目的物質を封入することにより、目的物質をミトコンドリア内に効率よく送達することができる。【００２７】  本発明の脂質膜構造体がリポソームである場合、多重膜リポソーム（ＭＬＶ：Ｍｕｌｔｉ  ｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）であってもよいし、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）等の１枚膜リポソームであってもよい。【００２８】  本発明の脂質膜構造体が有するミトコンドリア膜融合性脂質膜の数は特に限定されるものではなく、本発明の脂質膜構造体が複数の脂質膜を有する場合、全ての脂質膜がミトコンドリア膜融合性脂質膜であってもよいし、一部の脂質膜がミトコンドリア膜融合性脂質膜であってもよい。【００２９】  本発明の脂質膜構造体のサイズは特に限定されるものではないが、本発明の脂質膜構造体がリポソーム又はエマルションの場合、粒子径は通常５０ｎｍ〜５μｍであり、球状ミセルの場合、粒子径は通常５〜１００ｎｍであり、ひも状ミセル又は不定形の層状構造物の場合、１層あたりの厚みは通常５〜１０ｎｍであり、このような複数の層が積層していることが好ましい。【００３０】  本発明の脂質膜構造体において、脂質膜（ミトコンドリア膜融合性脂質膜であるか否かを問わない）の構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。【００３１】  脂質は脂質膜の必須の構成成分であり、脂質膜に含有される脂質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常７０％（モル比）以上、好ましくは７５％（モル比）以上、さらに好ましくは８０％（モル比）以上である。なお、脂質膜に含有される脂質量の上限値は、脂質膜を構成する総物質量の１００％である。【００３２】  脂質としては、例えば、以下に例示するリン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
［リン脂質］
ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等。【００３３】［糖脂質］
グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等。【００３４】［ステロール］
動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、コレスタノール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等。【００３５】［飽和又は不飽和の脂肪酸］
パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸等。【００３６】  膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される膜安定化剤量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、膜安定化剤の含有量の下限値は０である。【００３７】  膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。【００３８】  抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される抗酸化剤量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、抗酸化剤の含有量の下限値は０である。【００３９】  抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。【００４０】  荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される荷電物質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、荷電物質の含有量の下限値は０である。【００４１】  正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。【００４２】  膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される膜タンパク質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常１０％（モル比）以下、好ましくは５％（モル比）以下、さらに好ましくは２％（モル比）以下である。なお、膜タンパク質の含有量の下限値は０である。【００４３】  膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。【００４４】  本発明の脂質膜構造体において、脂質膜（ミトコンドリア膜融合性脂質膜であるか否かを問わない）を構成する脂質として、例えば、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、ｐＨ感受性機能等を有する脂質誘導体を使用することができる。これにより、上記機能のうち１種又は２種以上の機能を脂質膜構造体に付与することができる。脂質膜構造体に血中滞留性機能を付与することにより、脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織による捕捉率を低下させることができる。また、脂質膜構造体に温度変化感受性機能及び／又はｐＨ感受性機能を付与することにより、脂質膜構造体に保持された目的物質の放出性を高めることができる。【００４５】  血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン等のポリエチレングリコール誘導体等が挙げられる。【００４６】  温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられ、ｐＨ感受性機能を付与することができるｐＨ感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。【００４７】  本発明の脂質膜構造体には、標的とするミトコンドリアを含有する細胞、当該細胞が分泌する酵素等を特異的に認識する抗体を保持させることができる。抗体としては、モノクローナル抗体を使用することが好ましく、モノクローナル抗体としては、単一のエピトープに対して特異性を有する１種のモノクローナル抗体を使用してもよいし、各種エピトープに対して特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体を組み合わせて使用してもよい。また、抗体としては、１価抗体又は多価抗体のいずれを使用してもよいし、天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子又はそのフラグメント若しくは誘導体のいずれを使用してもよく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、少なくとも二つの抗原又はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又はクワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ）、トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）等の二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾、加工等が施された誘導体を使用することができる。また、公知の細胞融合、ハイブリドーマ技術、抗体工学等を適用し、合成又は半合成技術によって得られる抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用し、ＤＮＡ組換え技術によって得られる抗体、あるいは標的エピトープに対して中和特性を有する抗体又は結合特性を有する抗体等を使用することができる。【００４８】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜は、その構成成分として膜融合性脂質を含有する。ミトコンドリア膜融���性脂質膜に含有される膜融合性脂質量は特に限定されるものではないが、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される総脂質量の通常７０％（モル比）以上、好ましくは７５％（モル比）以上、さらに好ましくは８０％（モル比）以上である。ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される膜融合性脂質量を上記範囲とすることにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミトコンドリア膜に対する融合能を向上させることができる。なお、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される膜融合性脂質量の上限値は、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される総脂質量の１００％である。【００４９】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される膜融合性脂質は、脂質膜と融合可能である限り特に限定されるものではない。膜融合性脂質が融合可能である脂質膜は、脂質二重層構造を有する限り特に限定されるものではなく、例えば、細胞膜、ミトコンドリア膜等の生体膜、リポソーム膜等の人工膜が挙げられる。膜融合性脂質としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等のコーン型脂質が挙げられる。なお、脂質は、極性基と非極性基の占める割合に従って、コーン（ｃｏｎｅ）型、シリンダー（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ）型、逆コーン（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｃｏｎｅ）型の３種類に大別され、そのうち、コーン型脂質は、疎水性基が親水性基に比べて大きな容積を占める脂質であり、非二重層脂質（ｎｏｎｂｉｌａｙｅｒ  ｌｉｐｉｄ）とも称される（奥直人著，リポソームの作成と実験法，２７−３３頁，広川書店）。脂質二重層中でコーン型脂質が逆ヘキサゴナル構造をとることにより、脂質二重層中に逆ミセル構造が形成され、形成された逆ミセル構造は、膜融合、膜の透過性等に関与すると考えられている。【００５０】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜は、膜透過性ペプチドを有する。膜透過性ペプチドは、ミトコンドリア膜と結合可能な状態でミトコンドリア膜融合性脂質膜に存在し、好ましくはミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面に存在する。膜透過性ペプチドをミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面に存在させることにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミトコンドリア膜に対する融合能が向上させることができる。【００５１】  膜透過性ペプチドがミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面に存在する場合、少なくともミトコンドリア膜融合性脂質膜の外表面に膜透過性ペプチドが存在すればよく、内表面には膜透過性ペプチドが存在していてもよいし存在していなくてもよい。【００５２】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜が有する膜透過性ペプチドは、脂質膜を透過可能である限り特に限定されるものではない。膜透過性ペプチドが透過可能である脂質膜は、脂質二重層構造を有する限り特に限定されるものではなく、例えば、細胞膜、ミトコンドリア膜等の生体膜、リポソーム膜等の人工膜が挙げられる。膜透過性ペプチドとしては、例えば、膜透過性ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ（ＰＴＤ））を有するペプチドが挙げられる。膜透過性ドメインとしては、例えば、ポリアルギニン、ＨＩＶ−１由来のＴａｔ（４８−６０）（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）、ＨＩＶ−１由来のＲｅｖ（３４−５０）（ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ）等が挙げられる。これらの膜透過性ドメインは、アルギニン残基に富んでおり、負電荷を有するミトコンドリア膜と静電的に相互作用することができる。【００５３】  膜透過性ドメインを有するペプチドを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるものではないが、通常４〜５０個、好ましくは６〜４５個、さらに好ましくは７〜４０個である。膜透過性ドメインを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるものではないが、通常４〜４０個、好ましくは６〜３０個、さらに好ましくは７〜２０個である。膜透過性ドメインとしてのポリアルギニンは、通常４〜２０個、好ましくは６〜１２個、さらに好ましくは７〜１０個の連続したアルギニン残基からなる。【００５４】  膜透過性ドメインを有するペプチドは、膜透過性ドメインのみからなっていてもよいし、膜透過性ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に任意のアミノ酸配列を有していてもよい。膜透過性ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列は、剛直性を有するアミノ酸配列（例えば、ポリプロリン）であることが好ましい。ポリプロリンは、柔らかくて不規則な形をとっているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と異なり、直線的で、ある程度の堅さを保持している。また、膜透過性ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基であることが好ましい。負電荷を有する酸性アミノ酸残基が、正電荷を有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、膜透過性ドメインに含まれるアルギニン残基の効果を減弱させる可能性があるためである。【００５５】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜に存在する膜透過性ペプチド量は、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される総脂質量の通常４〜２０％（モル比）、好ましくは６〜１６％（モル比）、さらに好ましくは８〜１２％（モル比）である。ミトコンドリア膜融合性脂質膜に存在する膜透過性ペプチド量を上記範囲とすることにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との結合を契機として、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。【００５６】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜における膜透過性ペプチドの存在態様としては、例えば、膜透過性ペプチドが脂質膜構成成分（例えば、疎水性基、疎水性化合物等）に結合しており、脂質膜構成成分がミトコンドリア膜融合性脂質膜内に保持され、膜透過性ペプチドの一部又は全部がミトコンドリア膜融合性脂質膜から露出している態様が挙げられる。【００５７】  膜透過性ペプチドが結合する脂質膜構成成分は特に限定されるものではなく、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基；コレステロール基又はその誘導体；リン脂質、糖脂質又はステロール；長鎖脂肪族アルコール（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロール等）；ポリオキシプロピレンアルキル；グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数１０〜２０の脂肪酸基（例えば、パルミトイル基、オレイル基、ステアリル基、アラキドイル基等）が好ましい。【００５８】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜はミトコンドリアターゲディングシグナル（ＭＴＳ）を有することが好ましい。これにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との結合を契機として、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。【００５９】  ＭＴＳは、ミトコンドリアへの移行能を発揮し得る状態でミトコンドリア膜融合性脂質膜に存在し、好ましくはミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面に存在する（すなわち、ミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面から露出した状態で存在する）。ＭＴＳをミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面に存在させることにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができる。ＭＴＳがミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面に存在する場合、少なくともミトコンドリア膜融合性脂質膜の外表面にＭＴＳが存在すればよく、内表面にはＭＴＳが存在していてもよいし存在していなくてもよい。【００６０】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜は、１種類のみのＭＴＳを有していてもよいし、２種類以上のＭＴＳを有していてもよい。ミトコンドリア膜融合性脂質膜が有するＭＴＳ量は特に限定されるものではないが、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される総脂質量の通常２〜１０％（モル比）、好ましくは３〜８％（モル比）、さらに好ましくは４〜６％（モル比）である。ミトコンドリア膜融合性脂質膜に存在するＭＴＳ量を上記範囲とすることにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との結合を契機として、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。【００６１】  ＭＴＳはシグナルペプチドであり、多くのものが既に知られ、その種類は特に限定されるものではない。本発明においては、ＭＴＳの機能が保持されている限り、いかなるペプチドも使用することができ、公知のＭＴＳをそのまま使用してもよいし、公知のＭＴＳに変異（１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加）を加えたものを使用してもよい。ＭＴＳは通常２０〜７０個のアミノ酸残基からなり、ＭＴＳには、ミトコンドリア外膜、ミトコンドリア内膜、ミトコンドリア膜間腔、ミトコンドリアマトリックス等のミトコンドリア内の様々な領域への移行能を有するものが含まれるが、本発明においてはいずれのＭＴＳを使用してもよい。【００６２】  ＭＴＳとしては、例えば、下記（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドが挙げられる。
（ａ）配列番号１〜３１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１〜３１のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ミトコンドリアへの移行能を有するペプチド【００６３】  配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ラット肝臓由来のスクシニルＣｏＡシンテターゼのＭＴＳのＣ末端側の数残基が欠失したものである。【００６４】  ＭＴＳ（例えば配列番号１〜３１記載のアミノ酸配列）のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の個数は、ＭＴＳの機能が保持される限り特に限定されるものではないが、通常１〜３個、好ましくは１〜２個である。【００６５】  ＭＴＳ（例えば配列番号１〜３１記載のアミノ酸配列）のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の位置は、ＭＴＳの機能が保持される限り特に限定されるものではないが、Ｃ末端側であること（すなわち、Ｎ末端側のアミノ酸配列が保存されること）が好ましい。【００６６】  ＭＴＳを有するタンパク質がミトコンドリアに送達された後、ＭＴＳはタンパク質から切断されるが、厳密にどの領域がＭＴＳとしての機能を果たすか明確になっていない場合もある。この場合、タンパク質の切断部位よりもＮ末端側に位置する領域を含むペプチドをＭＴＳとして使用することができる。ＭＴＳとして使用するペプチドが、タンパク質の切断部位よりもＣ末端側に位置する領域を含む場合、欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の位置は、タンパク質の切断部位よりもＣ末端側である（すなわち、タンパク質の切断部位よりもＮ末端側のアミノ酸配列は保存される）ことが好ましい。【００６７】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜に対するＭＴＳの結合態様は特に限定されるものではなく、例えば、ＭＴＳは脂質膜構成成分に直接又はリンカーを介して結合する。ＭＴＳのいずれの部分が脂質膜構成成分と結合してもよいが、Ｃ末端が脂質膜構成成分と結合することが好ましい。これにより、ＭＴＳの機能（ミトコンドリアへの移行能）を効率よく発揮させることができる。【００６８】  ＭＴＳが直接又はリンカーを介して結合する脂質膜構成成分は特に限定されるものではないが、脂質であることが好ましく、リン脂質であることがさらに好ましい。ＭＴＳが直接又はリンカーを介して結合する脂質膜構成成分が脂質、特にリン脂質であると、ＭＴＳを安定かつ簡便に脂質膜表面に提示することができるとともに、脂質膜表面に提示されるＭＴＳの密度をコントロールしやすい。【００６９】  ＭＴＳが直接又はリンカーを介して結合する脂質としては、例えば、炭素数１０〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸（例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等）の残基（アシル基）を１個又は２個以上有する脂質が挙げられ、具体的には、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カルジオリピン類、スフィンゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホスホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、デオキシホスファチジルコリン���、プラスマロゲン類やホスファチジン酸類、これらの誘導体等が挙げられる。これらのうち、後述するように、アミノ基を有する脂質が好適に使用され、アミノ基を有する脂質としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、オクタデセニルオクタデカノイルグリセロホスフォエタノールアミン、ジオレオイルグリセロホスフォエタノールアミン−（Ｎ−ドデカニルアミン）、ジオレオイルグリセロホスフォエタノールアミン−（Ｎ−ヘキサノイルアミン）、ジパルミトイルグリセロホスフォエタノールアミン−（Ｎ−ドデカニルアミン）、ジパルミトイルグリセロホスフォエタノールアミン−（Ｎ−ヘキサノイルアミン）、ジステアロイルグリセロホスフォエタノールアミン−［Ｎ−アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］、ステアロイル−アラキドノイル−グリセロ［ホスフォ−Ｌ−セリン］、オクタデシル−アセチル−グリセロホスフォエタノールアミン、アルカエチジルエタノールアミン、ヒドロキシアルカエチジルエタノールアミン、サイクリックアルカエチジルエタノールアミン、カルダルカエチジルエタノールアミン等が挙げられる。なお、脂質には、塩の形態のものも含まれる。塩の種類は特に限定されるものではないが、塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；シュウ酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；アンモニウム塩等の有機塩基等が挙げられる。【００７０】  ＭＴＳと脂質膜構成成分とを直接結合させる場合、ＭＴＳが有する官能基（ＭＴＳに人為的に導入された官能基を含む。）と、脂質膜構成成分が有する官能基（脂質膜構成成分に人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させる。これによりＭＴＳと脂質膜構成成分とは共有結合を介して結合する。共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、水酸基／カルボキシル基、マレイミド基／ＳＨ基等が挙げられ、これらの官能基同士の反応は公知の方法に従って行うことができる。【００７１】  例えば、ＭＴＳと、アミノ基を有する脂質膜構成成分とは、ＭＴＳがＣ末端に有するカルボキシル基と、脂質膜構成成分が有するアミノ基とを反応させてアミド結合を形成させることにより、直接結合させることができる。この反応は、酸ハライド法、活性エステル化法等を利用して行うことができる。【００７２】  酸ハライド法では、不活性溶媒中でＭＴＳをハロゲン化剤で処理して酸ハライドとした後、得られた酸ハライドと脂質膜構成成分のアミノ基と反応させる。ハロゲン化剤としては、例えば、チオニルクロリド、チオニルブロミドのようなチオニルハライド類、スルフリルクロリド、スルフリルブロミド等のスルフリルハライド類；三塩化燐、三臭化燐、三沃化燐等の三ハロゲン化燐類；五塩化燐、五臭化燐、五沃化燐等の五ハロゲン化燐類；オキシ塩化燐、オキシ臭化燐、オキシ沃化燐等のオキシハロゲン化燐類等を使用することができる。反応溶媒は、適宜検討して決めればよいが、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；ジメチルホ���ムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；アセトニトリル等のニトリル類；ギ酸エチルエステル、酢酸エチルエステル等のエステル類、これらの混合溶媒等を使用することができる。反応温度は、適宜検討すればよいが、通常０℃〜溶媒の還流温度であり、好ましくは室温〜溶媒の還流温度である。酸ハライドとリン脂質のアミノ基との反応では、必要に応じて、トリエチルアミン、ピリジン等の有機塩基を添加してもよい。【００７３】  活性エステル化法では、溶媒中でＭＴＳのカルボキシル基を活性エステル化剤と反応させて活性エステルとした後、脂質膜構成成分のアミノ基と反応させる。活性エステル化剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等のＮ−ヒドロキシ化合物類；１，１’−オキザリルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール等のジイミダゾール類；２，２’−ジピリジルジサルファイド等のジサルファイド類；Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート等のコハク酸化合物類；Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィニッククロライド等のホスフィニッククロライド化合物類；Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキザレート、Ｎ，Ｎ’−ジフタルイミドオキザレート、Ｎ，Ｎ’−ビス（ノルボルネニルスクシンイミジル）オキザレート、１，１’−ビス（ベンゾトリアゾリル）オキザレート、１，１’−ビス（６−クロロベンゾトリアゾリル）オキザレート、１，１’−ビス（６−トリフルオロメチルベンゾトリアゾリル）オキザレートのようなオキザレート化合物類等を使用することができる。反応溶媒は、適宜検討して決めればよいが、例えば、メチレンクロリド、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；酢酸エチルエステル等のエステル類、これらの混合溶媒等を使用することができる。得られた活性エステルと脂質膜構成成分のアミノ基との反応は、縮合剤、例えば、アソジカルボン酸ジエチル−トリフェニルホスフィン等のアゾジカルボン酸ジ低級アルキル−トリフェニルホスフィン類；Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナート等のＮ−低級アルキル−５−アリールイソオキサゾリウム−３’−スルホナート類；ジエチルオキシジフォルメート等のオキシジフォルメート類；Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等のＮ，Ｎ’−ジシクロアルキルカルボジイミド類；ジ−２−ピリジルジセレニド等のジヘテロアリールジセレニド類；トリフェニルホスフィン等のトリアリールホスフィン類；ｐ−ニトロベンゼンスルホニルトリアゾリド等のアリールスルホニルトリアゾリド類；２−クロル−１−メチルピリジニウムヨーダイド等の２−ハロ−１−低級アルキルピリジニウムハライド類；ジフェニルホスホリルアジド等のジアリールホスホリルアジド類；Ｎ，Ｎ’−カルボジイミダゾール等のイミダゾール誘導体；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等のベンゾ��リアゾール誘導体；Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等のジカルボキシイミド誘導体；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等のカルボジイミド誘導体；１−プロパンホスホン酸環状無水物等のホスホン酸環状無水物類等の存在下で行えばよい。反応温度は、適宜検討すればよいが、室温付近が好ましい。【００７４】  ＭＴＳと脂質膜構成成分とをリンカーを介して結合させる場合、脂質膜構成成分が有する官能基（脂質膜構成成分に人為的に導入された官能基を含む。）と、リンカーが有する官能基（リンカーに人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させるとともに、ＭＴＳが有する官能基（ＭＴＳに人為的に導入された官能基を含む。）と、リンカーが有する官能基（リンカーに人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させる。これにより、脂質膜構成成分とリンカーとが共有結合を介して結合するとともに、ＭＴＳとリンカーとが共有結合を介して結合する。共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、水酸基／カルボキシル基、マレイミド基／ＳＨ基等が挙げられ、これらの官能基同士の反応は公知の方法に従って行うことができる。ＭＴＳと脂質膜構成成分とをリンカーを介して結合させる場合、脂質膜構成成分とリンカーとを反応させた後、ＭＴＳを反応させてもよいし、ＭＴＳとリンカーとを反応させた後、脂質膜構成成分を反応させてもよい。【００７５】  リンカーとしては、例えば、アミノ酸残基、リンカーペプチド、多価（例えば２価）のクロスリンカー試薬等が挙げられる。【００７６】  リンカーペプチドを構成するアミノ酸残基の個数は特に限定されるものではないが、通常２〜１０個、好ましくは２〜８個である。リンカーペプチドのアミノ酸配列は任意のアミノ酸配列でよいが、リンカーペプチドのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基であることが好ましい。負電荷を有する酸性アミノ酸残基が、正電荷を有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、膜透過性ドメインに含まれるアルギニン残基の効果を減弱させる可能性があるためである。【００７７】  多価のクロスリンカー試薬は特に限定されるものではないが、例えば、アミノ基及びＳＨ基との反応指向性を有する２価のクロスリンカー試薬が挙げられ、アミノ基及びＳＨ基との反応指向性を有する２価のクロスリンカー試薬としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。【００７８】
【化１】
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【００７９】
【化２】
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【００８０】
【化３】
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【００８１】
【化４】
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【００８２】
【化５】
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【００８３】
【化６】
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【００８４】
【化７】
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【００８５】
【化８】
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【００８６】
【化９】
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【００８７】
【化１０】
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【００８８】  多価のクロスリンカー試薬は、例えば、ＭＴＳに含まれる官能基、及び脂質膜構成成分が有する官能基と反応することにより、ＭＴＳと脂質膜構成成分とを結合させることができる。こうして、次式（１）：Ｍ−Ｘ−Ｌ［式中、ＭはＭＴＳの残基を表し、Ｘはクロスリンカー試薬の残基を表し、Ｌは脂質膜構成成分の残基を表す。］で表される、ＭＴＳと脂質膜構成成分との結合体が形成される。【００８９】  また、多価のクロスリンカー試薬は、例えば、リンカーペプチドに含まれる官能基、及び脂質膜構成成分が有する官能基と反応することにより、リンカーペプチドと脂質膜構成成分とを結合させることができる。そして、脂質膜構成成分に結合したリンカーペプチドが有するカルボキシル基又はアミノ基と、ＭＴＳが有するアミノ基又はカルボキシル基とをアミド結合させることにより、ＭＴＳと脂質膜構成成分とを結合させることができる。こうして、次式（２）：Ｍ１−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ１−Ｘ１−Ｌ１又は次式（３）：Ｍ１−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ１−Ｘ１−Ｌ１［式中、Ｍ１はＭＴＳの残基を表し、Ｘ１はクロスリンカー試薬の残基を表し、Ｙ１はリンカーペプチドの残基を表し、Ｌ１は脂質膜構成成分の残基を表す。］で表される、ＭＴＳと脂質膜構成成分との結合体が形成される。なお、式（２）及び（３）は、結合体における結合様式を明確に示したものであり、式（２）における「−ＮＨ−ＣＯ−」は、ＭＴＳが有するアミノ基とリンカーペプチドが有するカルボキシル基とのアミド結合であり、式（３）における「−ＣＯ−ＮＨ−」は、ＭＴＳが有するカルボキシル基とリンカーペプチドが有するアミノ基とのアミド結合である。【００９０】  アミノ基及びＳＨ基との反応指向性を有する２価のクロスリンカー試薬は、例えば、ＭＴＳに含まれるシステイン残基（好ましくはＭＴＳのＣ末端に位置するシステイン残基）が有するＳＨ基、及び脂質膜構成成分が有するアミノ基と反応することにより、ＭＴＳと脂質膜構成成分とを結合させることができる。こうして、次式（４）：Ｍ２−Ｓ−Ｘ２−ＮＨ−Ｌ２［式中、ＭはＭＴＳの残基を表し、Ｘ２はクロスリンカー試薬の残基を表し、Ｌ２は脂質膜構成成分の残基を表す。］で表される、ＭＴＳと脂質膜構成成分との結合体が形成される。なお、式（４）は、結合体における結合様式を明確に示したものであり、「−Ｓ−Ｘ２−」は、ＭＴＳが有するＳＨ基とクロスリンカー試薬が有する官能基（例えばマレイミド基）との反応により形成され、「−Ｘ２−ＮＨ−」は、クロスリンカー試薬が有する官能基（例えば−ＣＯＯＲ［Ｒは脱離基を表す。］）と脂質膜構成成分が有するアミノ基との反応により形成される。【００９１】  また、アミノ基及びＳＨ基との反応指向性を有する２価のクロスリンカー試薬は、例えば、リンカーペプチドに含まれるシステイン残基が有するＳＨ基、及び脂質膜構成成分が有するアミノ基と反応することにより、リンカーペプチドと脂質膜構成成分とを結合させることができる。そして、脂質膜構成成分に結合したリンカーペプチドが有するカルボキシル基又はアミノ基と、ＭＴＳが有するアミノ基又はカルボキシル基とをアミド結合させることにより、ＭＴＳと脂質膜構成成分とを結合させることができる。���うして、次式（５）：Ｍ３−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ３−Ｓ−Ｘ３−ＮＨ−Ｌ３又は次式（６）：Ｍ３−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ３−Ｓ−Ｘ３−ＮＨ−Ｌ３［式中、Ｍ３はＭＴＳの残基を表し、Ｘ３はクロスリンカー試薬の残基を表し、Ｙ３はリンカーペプチドの残基を表し、Ｌ３は脂質膜構成成分の残基を表す。］で表される、ＭＴＳと脂質膜構成成分との結合体が形成される。なお、式（５）及び（６）は、結合体における結合様式を明確に示したものであり、式（５）における「−ＮＨ−ＣＯ−」は、ＭＴＳが有するアミノ基とリンカーペプチドが有するカルボキシル基とのアミド結合であり、式（６）における「−ＣＯ−ＮＨ−」は、ＭＴＳが有するカルボキシル基とリンカーペプチドが有するアミノ基とのアミド結合であり、式（５）及び（６）における「−Ｓ−Ｘ３−」は、ＭＴＳが有するＳＨ基とクロスリンカー試薬が有する官能基（例えばマレイミド基）との反応により形成され、「−Ｘ３−ＮＨ−」は、クロスリンカー試薬が有する官能基（例えば−ＣＯＯＲ［Ｒは脱離基を表す。］）と脂質膜構成成分が有するアミノ基との反応により形成される。【００９２】  なお、上記反応において、保護基を導入することにより目的とする反応を効率的に行えることがある。保護基の導入は、例えば、「プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス」（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｇｒｅｅｎ，第３版  １９９９年  Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ）等を参照すればよい。【００９３】  本発明の脂質膜構造体には、ミトコンドリア内に送達しようとする目的物質が保持されていることが好ましい。本発明の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の内部（例えば、脂質膜構造体の内部に形成された空隙）、脂質膜の表面、脂質膜中、脂質膜層中、脂質膜層表面等に目的物質を保持することができる。脂質膜構造体が例えばリポソーム等の微粒子である場合、微粒子内部に目的物質を封入することができる。【００９４】  目的物質の種類は特に限定されるものではなく、例えば、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体等が挙げられ、診断、治療、予防等の目的に応じて適宜選択することができる。目的物質が疾病の診断、治療、予防等を目的とした物質である場合、目的物質を保持した脂質膜構造体は、医薬組成物の構成成分として使用することができる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。【００９５】  目的物質が遺伝子である場合、細胞内への遺伝子導入効率を向上させる点から、脂質膜構造体は、遺伝子導入機能を有する化合物を有することが好ましい。遺伝子導入機能を有する化合物としては、例えば、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジドデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジヘキサデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジオクタデセノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’Ｏ”−トリデカノイル−Ｎ−（ω−トリメチルアンモニオデカノイル）アミノメタンブロミド、ノル［α−トリメチルアンモニオアセチル］−ジドデシル−Ｄ−グルタメート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、３−β−［ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール等が挙げられる。これらの遺伝子導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の内部（例えば、脂質膜構造体の内部に形成された空隙）、脂質膜中、脂質膜表面、脂質膜層中、脂質膜層表面に存在（結合）させることができる。【００９６】  目的物質は、脂質膜構造体（特に脂質膜構造体の内部）に、目的物質の凝集体として保持されていることが好ましい。これにより、目的物質を効率よくミトコンドリア内に送達することができる。【００９７】  目的物質の凝集体は、目的物質のみから構成されていてもよいし、目的物質以外の物質（例えば、目的物質を保持する担体）を含んでいてもよい。【００９８】  目的物質が正に帯電している場合、例えば、目的物質とアニオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負に帯電している場合、例えば、目的物質とカチオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負及び正のいずれにも帯電していない場合、目的物質と所定の担体とを適当な様式（例えば、物理的吸着、疎水結合、化学結合等）で結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。複合体化の際、目的物質とカチオン性物質又はアニオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する目的物質の凝集体を調製することができる。【００９９】  目的物質が核酸である場合、核酸とカチオン性物質と静電的に結合させて複合体化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸の凝集体を調製することができる。【０１００】  目的物質の凝集体を調製する際に使用できるカチオン性物質は、分子中にカチオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。カチオン性物質としては、例えば、カチオン性脂質（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））；カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体（例えばステアリル化誘導体）；ポリエチレンイミン、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、グルコサミン等のポリカチオン性ポリマー；プロタミン又はその誘導体（例えば硫酸プロタミン）；キトサン等が挙げられるが、これらのうち特にステアリル化ポリアルギニンが好ましい。ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は通常４〜２０個であり、好ましくは６〜１２個、さらに好ましくは７〜１０個である。カチオン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。【０１０１】  目的物質の凝集体を調製する際に使用できるアニオン性物質は、分子中にアニオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。アニオン性物質としては、例えば、アニオン性脂質；アニオン性基を有する高分子；ポリアスパラギン酸等の酸性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；キサンタンガム、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースポリスチレンスルホン酸塩、ポリサッカライド、カラギーナン等のポリアニオン性ポリマー等を使用することができる。アニオン性物質が有するアニオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。アニオン性基は負に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、末端カルボキシル基を有する官能基（例えば、コハク酸残基、マロン酸残基等）、リン酸基、硫酸基等が挙げられる。【０１０２】  本発明の脂質膜構造体の形態は特に限定されるものではなく、例えば、乾燥した混合物の形態、あるいは水系溶媒に分散した形態又はこれを乾燥若しくは凍結した形態等が挙げられ、各形態の脂質膜構造体は、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて製造することができる。【０１０３】  以下、各形態の脂質膜構造体の製造方法を説明するが、本発明の脂質膜構造体の形態及びその製造方法はこれらに限定されるものではない。
乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の構成成分全てを一旦クロロホルム等の有機溶媒に溶解させた後、エバポレータによる減圧乾固又は噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。【０１０４】  水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体は、乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体を水系溶媒に添加した後、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することによって製造することができる。また、水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体は、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法等によって製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を使用して、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。【０１０５】  水系溶媒（分散媒）の組成は、特に限定されるべきものではなく、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地等が挙げられる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、脂質膜構造体をさらに安定して分散させるために、単糖類（例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等）、二糖類（例えば、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等）、三糖類（例えば、ラフィノース、メレジノース等）、多糖類（例えば、シクロデキストリン等）、糖アルコール（例えば、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等）等の糖又はその水溶液；グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール又はその水溶液等を加えてもよい。水系溶媒（分散媒）に分散した形態の脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、物理的安定性の面（例えば、凝集等を防止する面）から、水系溶媒（分散媒）中の電解質を極力なくすことが好ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０〜８．０）に設定すること、又は窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが好ましい。【０１０６】  水系溶媒に分散した脂質膜構造体を乾燥又は凍結させた形態の脂質膜構造体は、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を凍結乾燥、噴霧乾燥等の公知の方法により乾燥又は凍結することによって製造することができる。水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した後、これを乾燥する場合、脂質膜構造体の長期保存が可能となる他、乾燥した脂質膜構造体に目的物質含有水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるため、目的物質を効率よく脂質膜構造体に保持させることが可能となる等の利点がある。【０１０７】  凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合、水系溶媒（分散媒）に、例えば、単糖類（例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノ���トール、リボース、キシロース等）、二糖類（例えば、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等）、三糖類（例えば、ラフィノース、メレジノース等）、多糖類（例えば、シクロデキストリン等）、糖アルコール（例えば、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等）等の糖又はその水溶液を加えておくことにより、脂質膜構造体を安定に長期間保存することができる。また、凍結する場合、水系溶媒（分散媒）に、例えば、上記糖又はその水溶液；グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール又はその水溶液を加えておくことにより、脂質膜構造体を安定に長期間保存することができる。水系溶媒（分散媒）には、糖と多価アルコールとを組み合わせて加えてもよい。脂質膜構造体が分散した水系溶媒（分散媒）における糖又は多価アルコールの濃度は特に限定されないが、糖の濃度は２〜２０％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましく、５〜１０％（Ｗ／Ｖ）であることがさらに好ましい。また、多価アルコールの濃度は、１〜５％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましく、２〜２．５％（Ｗ／Ｖ）であることがさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）として緩衝液を用いる場合、緩衝剤の濃度は５〜５０ｍＭであることが好ましく、１０〜２０ｍＭであることがさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）における脂質膜構造体の濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体に含有される脂質総量の濃度に換算して０．１ｍＭ〜５００ｍＭであることが好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭであることがさらに好ましい。【０１０８】  抗体を保持させた脂質膜構造体は、脂質膜構造体を製造した後、抗体を添加し、抗体を脂質膜の表面に結合させることにより製造することができる。また、抗体を保持させた脂質膜構造体は、脂質膜構造体を製造した後、抗体及び抗体中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体を添加し、抗体を脂質膜の表面に結合させることにより製造することができる。【０１０９】  目的物質を保持する脂質膜構造体を含有する医薬組成物の形態は特に限定されるものではなく、例えば、乾燥した混合物の形態、あるいは水系溶媒に分散した形態又はこれを乾燥若しくは凍結した形態が挙げられ、各形態の医薬組成物は、上記した各形態の脂質膜構造体と同様に製造することができる。【０１１０】  乾燥した混合物の形態の医薬組成物は、例えば、脂質膜構造体の構成成分と目的物質とを一旦クロロホルム等の有機溶媒で溶解させて混合物を得た後、これをエバポレータによる減圧乾固又は噴霧乾燥機による噴霧乾燥に付することにより製造することができる。【０１１１】  目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物の製造方法としては、以下のように複数の方法が公知となっており、脂質膜構造体における目的物質の保持様式、混合物の性状等に応じて、製造方法を適宜選択することができる。【０１１２】〔製造方法１〕
製造方法１は、脂質膜構造体の構成成分と目的物質とを一旦クロロホルム等の有機溶媒で溶解させて混合物を得た後、これをエバポレータによる減圧乾固又は噴霧乾燥機による噴霧乾燥に付することにより、脂質膜構造体及び目的物質を含む乾燥混合物を製造し、次いで、これに水系溶媒を添加した後、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行うことにより、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である。脂質膜構造体の大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。製造方法１は、脂質膜構造体及び目的物質を含む乾燥混合物を製造するために、脂質膜構造体の構成成分及び目的物質を有機溶媒に溶解する必要があるが、脂質膜構造体の構成成分と目的物質との相互作用を最大限に利用することができる利点がある。すなわち、脂質膜構造体が層状構造を有する場合にも、目的物質は多重層の内部にまで入り込むことが可能であり、目的物質の脂質膜構造体への保持率を向上させることができる利点がある。【０１１３】〔製造方法２〕
製造方法２は、脂質膜構造体の構成成分を有機溶媒で一旦溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に目的物質を含む水系溶媒を添加して乳化を行うことにより、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である。脂質膜構造体の大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。製造方法２は、有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解し得る目的物質に適用することができる。製造方法２は、脂質膜構造体がリポソームの場合に内水相部分にも目的物質を保持させることができる利点がある。【０１１４】〔製造方法３〕
製造方法３は、水系溶媒に分散したリポソーム、エマルション、ミセル、層状構造物等の脂質膜構造体に、さらに目的物質を含む水系溶媒を添加することにより、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である。製造方法３は、水溶性の目的物質に適用することができる。製造方法３は、既に製造された脂質膜構造体に外部から目的物質を添加する方法であることから、目的物質が高分子の場合、目的物質が脂質膜構造体の内部に入り込めず、脂質膜構造体の表面に存在（結合）した存在様式をとる可能性がある。脂質膜構造体がリポソームである場合、製造方法３によって、目的物質がリポソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造（一般的には「複合体」又は「コンプレックス」と呼ばれる）を形成されることが知られている。製造方法３は、脂質膜構造体単独の水系分散液をあらかじめ製造するため、乳化時における目的物質の分解等を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御を行い易い。したがって、製造方法１及び製造方法２に比べて、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を容易に製造することができる。【０１１５】〔製造方法４〕
製造方法４は、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を乾燥することにより得られた乾燥物に、目的物質を含む水系溶媒を添加することにより、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である。製造方法４は、製造方法３と同様に、水溶性の目的物質に適用することができる。製造方法４と製造方法３との相違点は、脂質膜構造体と目的物質との存在様式にあり、製造方法４では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した後、これを乾燥させた乾燥物を製造することから、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるためには、上述したように水系溶媒に糖又はその水溶液、好ましくはショ糖又はその水溶液、あるいは乳糖又はその水溶液を添加した溶媒を使用することが好ましい。目的物質を含む水系溶媒を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに速やかに水和し始め、脂質膜構造体が再構築され、このとき、目的物質が脂質膜構造体内部に保持された形態の脂質膜構造体が製造される。【０１１６】  製造方法４では、脂質膜構造体単独の水系分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の目的物質の分解等を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御も行い易い。したがって、製造方法１及び製造方法２に比べて、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を容易に製造することができる。また、一旦凍結乾燥又は噴霧乾燥を行うため、製剤（医薬組成物）としての保存安定性を保証し易く、乾燥製剤を目的物質の水溶液で再水和しても大きさ（粒子径）を元に戻せることや、高分子の目的物質であっても、脂質膜構造体内部に目的物質を保持させ易いこと等の利点がある。したがって、目的物質が高分子の場合、製造方法３では、目的物質が脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとる可能性があるが、製造方法４ではこの点で大きく異なる。【０１１７】  目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造するための他の方法としては、リポソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば逆相蒸発法等を採用することができる。脂質膜構造体の大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した分散液を乾燥させる方法としては、凍結乾燥や噴霧乾燥等が挙げられ、水系溶媒としては、上記糖又はその水溶液、好ましくはショ糖又はその水溶液、あるいは乳糖又はその水溶液を添加した溶媒を使用することが好ましい。目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した分散液を凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられ、水系溶媒としては、上記糖又はその水溶液、あるいは上記多価アルコール又はその水溶液を添加した溶媒を使用することが好ましい。【０１１８】  目的物質の凝集体が全体として正に帯電している場合、脂質膜を構成する脂質としてアニオン性脂質（酸性脂質）を使用すれば、目的物質の凝集体が保持され脂質膜を効率よく製造することができ、目的物質の凝集体が全体として負に帯電している場合、脂質膜を構成する脂質としてカチオン性脂質（塩基性脂質）を使用すれば、目的物質の凝集体が保持された脂質膜構造体を効率よく製造することができる。アニオン性脂質（酸性脂質）としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が挙げられ、カチオン性脂質（塩基性脂質）としては、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ：ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ：ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニオプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ  ｐｒｏｐａｎｅ：ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ジメチル−アミノエタン）−カルバモルコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロオキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ：ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミネカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ：ＤＯＳＰＡ）、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジドデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジヘキサデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジオクタデセノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’，Ｏ”−トリデカノイル−Ｎ−（ω−トリメチルアンモニオデカノイル）アミノメタンブロミド、ノル［α−トリメチルアンモニオアセチル］−ジドデシル−Ｄ−グルタメート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド等が挙げられる。【０１１９】  本発明の脂質膜構造体において、ミトコンドリア膜融合性脂質膜が膜透過性ペプチドを介してミトコンドリア膜と結合すると、これを契機として、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合が誘起され、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に保持された目的物質は、ミトコンドリア内に放出される。この結果、目的物質はミトコンドリア内に送達される。したがって、本発明の脂質膜構造体は、目的物質のミトコンドリア内送達用ベクターとして使用することができる。【０１２０】  本発明の脂質膜構造体が標的とするミトコンドリアは、細胞から分離されたミトコンドリアであってもよいし、細胞内に存在するミトコンドリアであってもよい。本発明の脂質膜構造体が標的とするミトコンドリアが由来する生物種は特に限定されるものではなく、例えば、動物、植物、微生物等が挙げられるが、動物が好ましく、哺乳動物がさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。本発明の脂質膜構造体が標的とするミトコンドリアを含有する細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。【０１２１】  本発明の脂質膜構造体が標的とするミトコンドリアが細胞内に存在するミトコンドリアである場合、本発明の脂質膜構造体は、ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移行した脂質膜構造体の最外層に位置するように構成されることが好ましい。これにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜は、細胞内に存在するミトコンドリアと効率よく膜融合することができる。【０１２２】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移行した脂質膜構造体の最外層に位置するような構成を有する脂質膜構造体の一実施形態であるリポソームとしては、図１（ａ）に示すように、脂質膜２ａと、脂質膜２ａの内側に封入された目的物質３とを備えた１枚膜リポソーム１ａであって、脂質膜２ａがミトコンドリア膜融合性脂質膜であり、脂質膜２ａの表面に存在する膜透過性ペプチドが膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有する（好ましくは膜透過性ペプチドがポリアルギニンからなる）１枚膜リポソーム１ａが挙げられる。１枚膜リポソーム１ａは、脂質膜２ａの表面に存在する膜透過性ペプチドを介して、原形を保ったまま（インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な状態で）、細胞外から細胞内に移行することができる。細胞内に移行した後、脂質膜２ａが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介してミトコンドリア膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２ａとミトコンドリアの外膜との膜融合が誘起され、脂質膜２ａの内側に封入された目的物質３は、ミトコンドリア内に放出される。【０１２３】  １枚膜リポソーム１ａにおいて、脂質膜２ａがＭＴＳを表面に有することが好ましい。これにより、脂質膜２ａのミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、脂質膜２ａとミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質膜２ａとミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。また、脂質膜２ａがＭＴＳを表面に有することにより、細胞内に移行したリポソームをミトコンドリアへ選択的に移行させることができる。【０１２４】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移行した脂質膜構造体の最外層に位置するような構成を有する脂質膜構造体の別の実施形態であるリポソームとしては、図１（ｂ）に示すように、脂質膜２１ｂ��、脂質膜２１ｂの外側に位置する脂質膜２２ｂと、脂質膜２１ｂの内側に封入された目的物質３とを備えた２枚膜リポソーム１ｂであって、脂質膜２１ｂ及び２２ｂがミトコンドリア膜融合性脂質膜であり、脂質膜２２ｂの表面に存在する膜透過性ペプチドが膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有する（好ましくは膜透過性ペプチドがポリアルギニンからなる）２枚膜リポソーム１ｂが挙げられる。２枚膜リポソーム１ｂは、脂質膜２２ｂの表面に存在する膜透過性ペプチドを介して、原形を保ったまま（インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な状態で）、細胞外から細胞内に移行することができる。細胞内に移行した後、脂質膜２２ｂが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介してミトコンドリアの外膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２２ｂとミトコンドリアの外膜との膜融合が誘起され、リポソームはミトコンドリアの外膜を通過する。ミトコンドリアの外膜を通過したリポソームにおいて、脂質膜２２ｂはミトコンドリアの外膜との膜融合により消失しているが、脂質膜２１ｂは保持されている。ミトコンドリアの外膜を通過した後、脂質膜２１ｂが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介してミトコンドリアの内膜と結合すると、これを契機として、脂質膜２１ｂとミトコンドリアの内膜との膜融合が誘起され、脂質膜２１ｂの内側に封入された目的物質３は、ミトコンドリア内に放出される。【０１２５】  ２枚膜リポソーム１ｂにおいて、脂質膜２１ｂ及び２２ｂがＭＴＳを表面に有することが好ましい。これにより、脂質膜２１ｂ及び２２ｂのミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、脂質膜２１ｂ及び２２ｂとミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質膜２１ｂ及び２２ｂとミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。また、脂質膜２２ｂがＭＴＳを表面に有することにより、細胞内に移行したリポソームをミトコンドリアへ選択的に移行させることができる。【０１２６】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移行した脂質膜構造体の最外層に位置するような構成を有する脂質膜構造体の別の実施形態であるリポソームとしては、図１（ｃ）に示すように、脂質膜２１ｃと、脂質膜２１ｃの外側に位置する脂質膜２２ｃと、脂質膜２１ｃの内側に封入された目的物質３とを備えた２枚膜リポソーム１ｃであって、脂質膜２１ｃがミトコンドリア膜融合性脂質膜であり、脂質膜２２ｃが膜融合性脂質を含有する２枚膜リポソーム１ｃが挙げられる。脂質膜２２ｃに含有される膜融合性脂質としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等の中性脂質；コレステロールコハク酸、カルジオリピン等のアニオン性脂質（酸性脂質）が挙げられ、脂質膜２２ｃに含有される膜融合性脂質量は、脂質膜２２ｃに含有される総脂質量の通常５０％（モル比）以上、好ましくは６０％（モル比）以上、さらに好ましくは７０％（モル比）以上である。なお、膜融合性脂質の含有量の上限値は１００％である。【０１２７】  ２枚膜リポソーム１ｃは、エンドサイトーシスを介して、細胞外から細胞内に移行することができる。エンドサイトーシスを介して細胞内に移行した２枚膜リポソーム１ｃは、エンドソーム内に取り込まれるが、エンドソーム��と脂質膜２２ｃとが膜融合することにより、エンドソームから脱出することができる。エンドソームから脱出したリポソームにおいて、脂質膜２２ｃはエンドソーム膜との膜融合により消失しているが、脂質膜２１ｃは保持されている。エンドソームから脱出した後、脂質膜２１ｃの内側に封入された目的物質３は、１枚膜リポソーム１ａの場合と同様にして、ミトコンドリア内に放出される。【０１２８】  また、２枚膜リポソーム１ｃは、脂質膜２２ｃと細胞膜との膜融合を介して、細胞外から細胞内に移行することができる。細胞内に移行したリポソームにおいて、脂質膜２２ｃは細胞膜との膜融合により消失しているが、脂質膜２１ｃは保持されている。細胞内に移行した後、脂質膜２１ｃの内側に封入された目的物質３は、１枚膜リポソーム１ａの場合と同様にして、ミトコンドリア内に放出される。【０１２９】  ２枚膜リポソーム１ｃにおいて、脂質膜２２ｃに含有されるアニオン性脂質量が、脂質膜２２ｃに含有される膜融合性脂質量の１５％（モル比）以上、好ましくは２０％（モル比）以上である場合、エンドソーム内が酸性（ｐＨ５．５〜６．５）に変化することにより、又は酸性条件下（ｐＨ５．５〜６．５）で２枚膜リポソーム１ｃと細胞とを接触させることにより、脂質膜２２ｃとエンドソーム膜又は細胞膜とは効率よく膜融合することができる。【０１３０】  ２枚膜リポソーム１ｃにおいて、脂質膜２１ｃがＭＴＳを表面に有することが好ましい。これにより、脂質膜２１ｃのミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、脂質膜２１ｃとミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質膜２１ｃとミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。また、脂質膜２１ｃがＭＴＳを表面に有することにより、細胞内に移行したリポソームをミトコンドリアへ選択的に移行させることができる。【０１３１】  ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移行した脂質膜構造体の最外層に位置するような構成を有する脂質膜構造体の別の実施形態であるリポソームとしては、図１（ｄ）に示すように、脂質膜２１ｄと、脂質膜２１ｄの外側に位置する脂質膜２２ｄと、脂質膜２２ｄの外側に位置する脂質膜２３ｄと、脂質膜２１ｄの内側に封入された目的物質３とを備えた３枚膜リポソーム１ｄであって、脂質膜２１ｄ及び２２ｄがミトコンドリア膜融合性脂質膜であり、脂質膜２３ｄが膜融合性脂質を含有する３枚膜リポソーム１ｄが挙げられる。脂質膜２３ｄに含有される膜融合性脂質の種類及び量は、脂質膜２２ｃと同様である。【０１３２】  ３枚膜リポソーム１ｄは、エンドサイトーシスを介して、細胞外から細胞内に移行することができる。エンドサイトーシスを介して細胞内に移行した３枚膜リポソーム１ｄは、エンドソーム内に取り込まれるが、エンドソーム膜と脂質膜２３ｄとが膜融合することにより、エンドソームから脱出することができる。エンドソームから脱出したリポソームにおいて、脂質膜２３ｄはエンドソーム膜との膜融合により消失しているが、脂質膜２１ｄ及び２２ｄは保持されている。エンドソームから脱出した後、脂質膜２１ｄの内側に封入された目的物質３は、２枚膜リポソーム１ｂの場合と同様にして、ミトコンドリア内に放出される���【０１３３】  また、３枚膜リポソーム１ｄは、脂質膜２３ｄと細胞膜との膜融合を介して、細胞外から細胞内に移行することができる。細胞内に移行したリポソームにおいて、脂質膜２３ｄは細胞膜との膜融合により消失しているが、脂質膜２１ｄ及び２２ｄは保持されている。細胞内に移行した後、脂質膜２１ｄの内側に封入された目的物質３は、２枚膜リポソーム１ｂの場合と同様にして、ミトコンドリア内に放出される。【０１３４】  ３枚膜リポソーム１ｄにおいて、脂質膜２１ｄ及び２２ｄがＭＴＳを表面に有することが好ましい。これにより、脂質膜２１ｄ及び２２ｄのミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、脂質膜２１ｄ及び２２ｄとミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質膜２１ｄ及び２２ｄとミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。また、脂質膜２２ｄがＭＴＳを表面に有することにより、細胞内に移行したリポソームをミトコンドリアへ選択的に移行させることができる。【０１３５】  本発明の脂質膜構造体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれにおいても使用することもできる。本発明の脂質膜構造体をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、本発明の脂質膜構造体に保持された目的物質の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
【実施例】
【０１３６】〔実施例１〕ミトコンドリア膜に対する結合活性及び融合活性を有するリポソームのスクリーニング
（１）ＥＰＣ系リポソームの調製
卵黄ホスファチジルコリン（ｅｇｇ  ｙｏｌｋ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ：ＥＰＣ）と表１（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される１種の脂質とを９：２（モル比）の割合で有機溶媒（クロロホルム）に溶解した後、ガラス試験管に加え、有機溶媒を除去してガラス試験管底に薄膜を形成させた。そこに、ミトコンドリア単離液（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｕｆｆｅｒ，以下「ＭＩＢ」という。）（２５０ｍＭ  ショ糖，２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，溶媒は水）を加え、脂質膜を水和させた後、超音波処理を行い、適当な大きさ（２００〜３００ｎｍ）のＥＰＣ系リポソームを調製した（総脂質濃度０．５〜０．５５ｍＭ）。なお、調製したＥＰＣ系リポソームはいずれも１枚膜リポソームである。【０１３７】（２）ＤＯＰＥ系リポソームの調製
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ＤＯＰＥ）と表１（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される１種の脂質とを９：２（モル比）又は１：１（モル比）の割合で有機溶媒（クロロホルム）に溶解した後、上記（１）と同様にして、適当な大きさ（２００〜３００ｎｍ）のＤＯＰＥ系リポソームを調製した（総脂質濃度０．５〜０．５５ｍＭ）。なお、調製したＤＯＰＥ系リポソームはいずれも１枚膜リポソームである。【０１３８】
【表１】
0005067733.tif 000012
【０１３９】  なお、ＥＰＣ系リポソーム又はＤＯＰＥ系リポソームの調製の際、結合活性測定用リポソームのリポソーム膜には、１モル％ＮＢＤ（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ）標識化ＤＯＰＥ（励起波長（Ｅｘ）４７０ｎｍ，蛍光波長（Ｅｍ）５３０ｎｍ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を含有させ、融合活性測定用リポソームのリポソーム膜には、１モル％ＮＢＤ標識化ＤＯＰＥ及び０．５モル％ローダミン（Ｒｈｏ）標識化ＤＯＰＥ（励起波長（Ｅｘ）５６０ｎｍ，蛍光波長（Ｅｍ）５９０ｎｍ）を含有させた。【０１４０】（３）リポソーム表面のステアリル化オクタアルギニン（ＳＴＲ−Ｒ８）による修飾
ＥＰＣ系リポソーム又はＤＯＰＥ系リポソーム懸濁液１００μＬに、ステアリル化オクタアルギニン溶液（ステアリル化オクタアルギニン濃度：２ｍｇ／ｍＬ，溶媒：水）４．６４μＬ（ＥＰＣ系リポソーム，ＤＯＰＥ系リポソーム［ＤＯＰＥ：Ｘ＝９：２］の場合）又は４．２３μＬ（ＤＯＰＥ系リポソーム［ＤＯＰＥ：Ｘ＝１：１］の場合）を添加し、室温で一定時間インキュベートすることにより、リポソーム膜にステアリル化オクタアルギニンを分配させた（ステアリル化オクタアルギニンの分配量：総脂質量の１０モル％）。こうして、オクタアルギニン（アルギニン８重合体）を表面に有するＥＰＣ系リポソーム又はＤＯＰＥ系リポソームを調製した。【０１４１】  以下、オクタアルギニンを表面に有しないＥＰＣ系リポソームを「ＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＥＰＣ系リポソーム」、オクタアルギニンを表面に有するＥＰＣ系リポソームを「ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム」、オクタアルギニンを表面に有しないＤＯＰＥ系リポソームを「ＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＤＯＰＥ系リポソーム」、オクタアルギニンを表面に有するＤＯＰＥ系リポソームを「ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム」という。【０１４２】（４）結合活性測定
リポソームのミトコンドリア膜に対する結合活性は、ラット肝臓から単離したミトコンドリアと、１モル％ＮＢＤ標識化ＤＯＰＥを含有する蛍光標識リポソームとを用いて、以下のように評価した。
ラット肝臓からミトコンドリアを単離し、ＭＩＢ中に１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈してミトコンドリア溶液を調製した。ミトコンドリア溶液９０μＬにリポソーム懸濁液１０μＬを添加してサンプルを調製した。２つのサンプルを調製しておき、各サンプルを２５℃で３０分間インキュベーションした後、一方のサンプルはＦａｌｌサンプルとして遮光冷蔵保存し、他方のサンプルは遠心分離（１６０００×ｇ，１０分，４℃）後、上清（ミトコンドリアと結合しなかったリポソームを含有する画分）を除去し、沈殿（ミトコンドリアと結合したリポソームを含有する画分）をＭＩＢで洗浄し、遠心分離（２０４００×ｇ，２分，４℃）で再分離（２回）し、Ｆサンプルとして遮光冷蔵保存した。各サンプルに等量の１％Ｔｒｉｔｏｎを加え、撹拌した後、蛍光強度を測定し、次式に基づいて結合活性（％）を算出した。【０１４３】
【数１】
0005067733.tif 000013
【０１４４】［式中、ＦはＦサンプルの蛍光強度（蛍光波長５３０ｎｍ）を表し、ＦａｌｌはＦａｌｌサンプルの蛍光強度（蛍光波長５３０ｎｍ）を表す。］【０１４５】  ＥＰＣ系リポソームのミトコンドリア膜に対する結合活性（％）を図２に示し、ＤＯＰＥ系リポソームミトコンドリア膜に対する結合活性（％）を図３に示す。なお、図２及び図３中、□はＳＴＲ−Ｒ８非修飾リポソーム、■はＳＴＲ−Ｒ８修飾リポソームを示す。また、図３（ａ）は、ＤＯＰＥと表１（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される１種の脂質との混合比が９：２（モル比）であるＤＯＰＥ系リポソームを示し、図３（ｂ）は、ＤＯＰＥと表１（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される１種の脂質との混合比が１：１（モル比）であるＤＯＰＥ系リポソームを示す。【０１４６】  図２及び図３に示すように、ＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＥＰＣ系リポソーム及びＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＤＯＰＥ系リポソームにおいては、ミトコンドリア膜に対する結合活性が認められなかったが、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム及びＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームにおいては、ミトコンドリア膜に対する結合活性が認められた。【０１４７】（５）融合活性測定
リポソームのミトコンドリア膜に対する融合活性をＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用して評価した。
１モル％ＮＢＤ標識化ＤＯＰＥ及び０．５モル％Ｒｈｏ標識化ＤＯＰＥを含有する蛍光標識リポソームがミトコンドリアと結合してもミトコンドリア膜と融合しなければ、蛍光標識リポソームはそのままの状態で存在する。この場合、ＮＢＤとＲｈｏとが非常に近接して存在するので、ＦＲＥＴが誘導され、ＮＢＤの蛍光が消失する。一方、蛍光標識リポソームがミトコンドリア膜と融合している場合には、ミトコンドリア膜上にＮＢＤ標識化ＤＯＰＥ及びＲｈｏ標識化ＤＯＰＥが拡散するので、ＦＲＥＴが解消され、ＮＢＤの蛍光が回復する。【０１４８】  ミトコンドリア溶液９０μＬにリポソーム懸濁液１０μＬを添加し、２５℃で３０分間インキュベーションし、Ｆサンプルを調製した。ＭＩＢ９０μＬにリポソーム懸濁液１０μＬを添加し、２５℃で３０分間インキュベーションし、Ｆ０サンプルを調製した。また、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ９０μＬにリポソーム懸濁液１０μＬを添加し、２５℃で３０分間インキュベーションし、Ｆｍａｘサンプルを調製した。各サンプルに４７０ｎｍの励起光を照射したときに発せられる蛍光スペクトル（蛍光波長５３０ｎｍ）を測定し、次式に基づいてＦＲＥＴ解消率（％）を算出し、Ｔｒｉｔｏｎによってリポソームを破壊したときのＦＲＥＴ解消率を１００％として、リポソームのミトコンドリア膜に対する融合活性を評価した。【０１４９】
【数２】
0005067733.tif 000014
【０１５０】［式中、ＦはＦサンプルの蛍光強度（蛍光波長５３０ｎｍ）を表し、Ｆ０はＦ０サンプルの蛍光強度（蛍光波長５３０ｎｍ）を表し、ＦｍａｘはＦｍａｘサンプルの蛍光強度（蛍光波長５３０ｎｍ）を表す。］【０１５１】  Ｆ０サンプルでは、ＦＲＥＴが誘導されているためＮＢＤの蛍光が消光する。Ｆｍａｘサンプルでは、Ｔｒｉｔｏｎによりリポソームが破壊され、ＮＢＤとＲｈｏとの分子間距離が大きくなっているためＦＲＥＴが解消され、ＮＢＤの蛍光が回復する。Ｆサンプルでは、リポソームがミトコンドリア膜と融合したときにＦＲＥＴが解消され、ＮＢＤの蛍光が回復する。【０１５２】  ＥＰＣ系リポソームのミトコンドリア膜に対する融合活性（ＦＲＥＴ解消率（％））を図４に示し、ＤＯＰＥ系リポソームミトコンドリア膜に対する融合活性（ＦＲＥＴ解消率（％））を図５に示す。なお、図４及び図５中、□はＳＴＲ−Ｒ８非修飾リポソーム、■はＳＴＲ−Ｒ８修飾リポソームを示す。また、図５（ａ）は、ＤＯＰＥと表１（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される１種の脂質との混合比が９：２（モル比）であるＤＯＰＥ系リポソームを示し、図５（ｂ）は、ＤＯＰＥと表１（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される１種の脂質との混合比が１：１（モル比）であるＤＯＰＥ系リポソームを示す。【０１５３】  図４及び図５に示すように、ＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＥＰＣ系リポソーム、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム及びＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＤＯＰＥ系リポソームにおいて、ミトコンドリア膜に対する融合活性はほとんど認められなかったが、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームにおいて、ミトコンドリア膜に対する顕著な融合活性が認められた。【０１５４】  以上の結果から、リポソーム膜がミトコンドリア膜と融合するためには、リポソーム膜表面に存在するオクタアルギニンを介したリポソーム膜とミトコンドリア膜との結合、及びリポソーム膜に含有される膜融合性脂質ＤＯＰＥを介したリポソーム膜とミトコンドリア膜との融合が必要であることが明らかとなった。また、リポソーム膜に含有されるＤＯＰＥ量の比率を低下させた場合（図４（ｂ）参照）、リポソーム膜のミトコンドリア膜に対する融合活性が低下したことから、リポソーム膜のミトコンドリア膜に対する融合活性は、リポソーム膜に含有されるＤＯＰＥ量の比率によって変動することが明らかとなった。【０１５５】〔実施例２〕生細胞内におけるリポソームの動態解析
ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームが、生細胞内においても、ミトコンドリア膜に対する融合活性を発揮し、リポソーム内封物質をミトコンドリア内に導入できることを確認するために、ＨｅＬａ細胞内にＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームを導入して細胞内動態を観察した。なお、ＳＴＲ−Ｒ８修飾リポソームは、原形を保ったまま（インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な状態で）細胞内に導入できることが知られている（カリル・イクラミ等，「ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ」，２００４年，１２４巻  Ｓｕｐｐｌ．４，１１３−１１６頁；Ｋｏｇｕｒｅ等，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」，２００４年，第９８巻，３１７−３２３頁）。【０１５６】  前日に４×１０４細胞／ｍＬの濃度で６ｃｍディッシュに播種したＨｅＬａ細胞の培地を無血清培地と交換した後に、１０モル％ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム（リポソームの内部にＧＦＰタンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を封入）を最終総脂質濃度が１３．７５μＭとなるように加え、３７℃，５％ＣＯ２存在下で１時間インキュベーションした。その後、血清添加培地と交換し、さらに３７℃で１時間インキュベーションした。共焦点レーザー顕微鏡による観察の前に、培地に１ｍＭ  ｍｉｔｏｆｌｕｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を最終濃度が１００ｎＭとなるように加え、３７℃，５％ＣＯ２存在下で２０分間インキユベーションし、ミトコンドリアを染色した。リポソームの細胞内動態は共焦点レーザー顕微鏡（ＬＭＳ  ５１０，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて観察し、ミトコンドリア（赤）とリポソームの内封物ＧＦＰ（緑）の局在を確認した（共局在する場合、黄色）。【０１５７】  共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を図６に示す。なお、図６（ａ）は、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：２）を用いた場合の結果、図６（ｂ）は、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム（ＤＯＰＥ：ＳＭ＝９：２）を用いた場合の結果、図６（ｃ）は、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム（ＤＯＰＥ：ＰＡ＝９：２）を用いた場合の結果を示す。また、「透過光」は透過光による細胞像、「Ｍｔ」はミトコンドリア（赤）の局在、「ＧＦＰ」はＧＦＰ（緑）の局在、「重ね合わせ」は透過光による細胞像に重ね合わせたミトコンドリア（赤）及びＧＦＰ（緑）の局在を示す。【０１５８】  ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソームを用いた場合には、ミトコンドリアと内封物質ＧＦＰとの共局在（黄色）は確認されなかったが、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームを用いた場合には、ミトコンドリアと内封物質ＧＦＰとの共局在（黄色）が確認された。このことから、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームによれば、内封物質ＧＦＰをミトコンドリア内に導入できることが明らかとなった。【０１５９】〔実施例３〕ミトコンドリア内へのタンパク質送達
（１）リポソームのミトコンドリアへの導入
実施例１と同様にしてラット肝臓ミトコンドリア溶液（ミトコンドリアタンパク質１０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、１ｍＬずつチューブに分注した。実施例１と同様にして、１０モル％ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：ＳＭ＝９：２，ＥＰＣ：ＰＡ＝９：２）及び１０モル％ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム（ＤＯＰＥ：ＳＭ＝９：２，ＤＯＰＥ：ＰＡ＝９：２）（いずれのリポソームの内部にもＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）が封入されている）を調製し、リポソーム溶液１００μＬ（ＧＦＰ  １２５ｎｇ／μＬ，総脂質  ０．５５ｍＭ）をラット肝臓ミトコンドリア溶液に添加した後、２５℃で３０分間インキュベーションした。この時、ネガティブコントロールには同量のＧＦＰを添加した。その後、遠心分離し（１６０００×ｇ，１０分，４℃）、上清を除去した。沈殿をＩＭ（＋）［ＩＭ（−ＢＳＡ）（７０ｍＭ  スクロース，２２０ｍＭ  Ｄ−マンニトール，２．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））５０ｍＬに５０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ溶液５００μＬを添加したもの］で洗浄し、遠心分離し（２０４００×ｇ，２分，４℃）、上清を除去した。同様の操作を繰り返した後、沈殿をＩＭ（＋）１００μＬに再懸濁し、ミトコンドリア溶液（ミトコンドリアタンパク質１００ｍｇ／ｍＬ）とした。【０１６０】（２）ミトコンドリア内分画
（１）で調製したミトコンドリア溶液１００μＬをバイアル瓶に分注し、１．２５％  ジギトニン溶液（ジギトニンをＩＭ（＋）で溶解したもの）をミトコンドリア溶液に等量加え、４℃で１５分間穏やかに撹拌し、ミトコンドリア外膜の剥離を行った（Ｊ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎａｗａｌｔ．Ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｕｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｎｅｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１：３１０−２３（１９７４））。その後、ＩＭ（＋）６００μＬを反応溶液に加え、反応を停止させた。反応終了後、ミトコンドリア溶液を遠心分離し（１００００×ｇ，１０分，４℃）、上清を別のチューブに移し、沈殿をＩＭ（＋）で洗浄した。同様の条件で遠心分離し、上清を別のチューブに移した。得られた上清を合わせ、遠心分離し（１４４０００×ｇ，１０分，４℃）、得られた沈殿をＩＭ（＋）１００μＬに再懸濁し、外膜（ＯＭ：ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）画分とした。また、上清を再び同条件で遠心分離し、得られた上清を膜間腔（ＩＭＳ：ｉｎｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｃｅ）画分とした。得られたサンプルは、１％ＳＤＳ存在下、ＢＳＡを標準物質としてＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いてタンパク量を測定した後、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＩＭ（＋）を用いて希釈し、−８０℃で保存した。【０１６１】（３）ウェスタンブロット
得られたサンプルと等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ，４％  ＳＤＳ，１２％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＢＰＢ（適量））を混合し、変性させたサンプル５μＬをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１５％）にアプライし、泳動した。泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜（日本ジェネティクス）に転写した（ＢＥ−３３０，ＢＩＯ  ＣＲＡＦＴ）。転写後のＰＶＤＦ膜をブロッキング後、抗体反応を行い、目的のＧＦＰのバンドを検出した。１次抗体（Ａｎｔｉ−ＧＦＰ，Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ（ＳＩＧＭＡ））、２次抗体（ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体）を各々１０００倍希釈して用い、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってバンドを検出した。【０１６２】（４）結果
結果を図７に示す。なお、図７中、「ＯＭ」はＯＭ画分の結果、「ＩＭＳ」はＩＭＳ画分の結果を示し、（ａ）はネガティブコントロールの結果、（ｂ）はＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：ＳＭ＝９：２）の結果、（ｃ）はＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：ＰＡ＝９：２）の結果、（ｄ）はＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム（ＤＯＰＥ：ＳＭ＝９：２）の結果、（ｅ）はＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム（ＤＯＰＥ：ＰＡ＝９：２）の結果を示す。【０１６３】  図７に示すように、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：ＳＭ＝９：２，ＥＰＣ：ＰＡ＝９：２）を用いた場合、ＯＭ画分ではＧＦＰの３３ｋＤａのバンドが観察されたが、ＩＭＳ画分では観察されなかった。一方、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム（ＤＯＰＥ：ＳＭ＝９：２，ＤＯＰＥ：ＰＡ＝９：２）を用いた場合、ＯＭ画分及びＩＭＳ画分の両方でＧＦＰの３３ｋＤａのバンドが観察された。なお、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームを用いた場合にＯＭ画分及びＩＭＳ画分で観察された２８ｋＤａのバンドもＧＦＰのバンドである可能性がある。この結果から、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームによれば、内封物質ＧＦＰをミトコンドリアの膜間腔に導入できることが明らかとなった。【０１６４】〔実施例４〕生細胞ミトコンドリアに対するリポソームの膜融合能の評価
（１）リポソームの調製
実施例１と同様にして、１０モル％ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：ＳＭ＝９：２）及び１０モル％ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム（ＤＯＰＥ：ＳＭ＝９：２）を調製した。ただし、総脂質量の０．５モル％のＮＢＤ−ＤＯＰＥ（緑色）を脂質膜に含有させた。また、リポソーム内部の水相マーカーとして１ｍｇ／ｍＬ  Ｄｅｘｔｒａｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）（青色）を封入した。【０１６５】（２）共焦点レーザースキャン顕微鏡観察
２．５ｃｍディッシュ（２ｍＬ培養液）に４×１０４細胞／ｍＬで細胞を播き、２４時間培養した。培養後、培養液を除去し、無血清培地（抗生物質を含まない）１ｍＬを添加し、リポソーム（脂質量０．５５ｍＭ）２５μＬを添加後、インキュベーションした（３７℃，１時間，５％ＣＯ２）。次に、１ｍＬ  ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、血清添加培地と交換して１時間同条件でインキュベーションした。その後にｍｉｔｏ  ｆｌｕｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）によってミトコンドリアを染色し、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＭＳ  ５１０，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）による観察を行った。【０１６６】（３）結果
結果を図８及び９に示す。なお、図８は、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：ＳＭ＝９：２）の結果、図９は、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソーム（ＤＯＰＥ：ＳＭ＝９：２）の結果を示す。また、「透過光」は透過光による細胞像、「ミトコンドリア（赤）」はミトコンドリア（赤）の局在、「ＮＢＤ−ＤＯＰＥ（緑）」はＮＢＤ−ＤＯＰＥ（緑）の局在、「Ｄｅｘｔｒａｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ（青）」はＤｅｘｔｒａｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ（青）の局在、「重ね合わせ」は透過光による細胞像に重ね合わせたミトコンドリア（赤）、ＮＢＤ−ＤＯＰＥ（緑）及びＤｅｘｔｒａｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ（青）の局在を示す。【０１６７】  ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソームを用いた場合、ＮＢＤ−ＤＯＰＥ（緑）とＤｅｘｔｒａｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ（青）とが、ミトコンドリア（赤）の外側に共局在（水色）していた。このことから、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＥＰＣ系リポソームは、ミトコンドリア膜に結合できるが、ミトコンドリア膜と融合できず、内封物質Ｄｅｘｔｒａｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅをミトコンドリア内に導入できないことが明らかとなった。一方、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームを用いた場合、Ｄｅｘｔｒａｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ（青）が単独でミトコンドリア（赤）の内側に局在していた。また、ミトコンドリア（赤）とＤｅｘｔｒａｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ（青）とが共局在（ピンク色）していた。これらのことから、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＤＯＰＥ系リポソームは、ミトコンドリア膜に結合できるとともに、ミトコンドリア膜と融合でき、内封物質Ｄｅｘｔｒａｎ  ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅをミトコンドリア内に導入できることが示された。【０１６８】〔実施例５〕ミトコンドリアターゲティング（ＭＴＳ）−脂質誘導体の合成
リポソーム表面をラット肝臓由来のスクシニルＣｏＡシンテターゼ由来ＭＴＳ（配列番号１，Ｒ．Ｍａｊｕｍｄａｒ  ａｎｄ  Ｗ．Ａ．Ｂｒｉｄｇｅｒ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６８：２９２−９（１９９０））で修飾するために、ＭＴＳ−脂質誘導体としてＭＴＳ−ＤＯＰＥを合成した。なお、結果は示さないが、ラット肝臓由来のスクシニルＣｏＡシンテターゼ由来ＭＴＳ（配列番号１）がヒト細胞ミトコンドリアへの移行能を示すことは確認済みである。【０１６９】  ＭＴＳ−ＤＯＰＥは、ＭＴＳのＣ末端ＣｙｓのＳＨ基とＤＯＰＥのアミノ基とをクロスリンカー試薬ＳＭＣＣ（４−（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−１−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）を介して連結させることにより合成した（図１０及び１３）。なお、図１０及び１３中、ＤＯＰＥの構造は模式的に示される。【０１７０】（１）ＳＭＣＣ−ＤＯＰＥの合成（図１０）
エッペンドルフチューブにＣＨＣｌ３  ２００μＬ、ＤＯＰＥ  ５００ｎｍｏｌ、ＳＭＣＣ  ５００ｎｍｏｌ及びトリエチルアミン１μｍｏｌを加え、室温で１２時間遮光振とうし、反応させた（反応液Ａ）。反応終了後、凍結乾燥し、溶媒を除去し、メタノール５０μＬを用いて再度溶解した。ＨＰＬＣ分析より目的生成物が得られていることを確認した（図１１）。なお、ＨＰＬＣ分析において、移動相としてＡ緩衝液［０．１％  ＴＦＡの再蒸留水（ＤＤＷ）溶液］及びＢ緩衝液［０．１％  ＴＦＡのＣＨ３ＣＮ溶液］を使用し、３０〜７０％  Ｂ緩衝液で１０分、次いで９０〜１００％  Ｂ緩衝液で１０分、次いで１００％  Ｂ緩衝液で１０分のグラジエントをかけた。さらに、ＳＭＣＣ−ＤＯＰＥを分取し、ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）による質量分析を行い、分子量も目的生成物と一致することを確認した（図１２）。なお、ＦＡＢ−ＭＳによる質量分析において、測定機器としてはＪＥＯＬ  ＪＭＳ−ＨＸ１００を使用し、溶剤としてはメタノールを使用し、マトリックスとしてはＮＢＡ（ｍ−ニトロベンジルアルコール）を使用した。【０１７１】（２）ＭＴＳとＳＭＣＣ−ＤＯＰＥとの結合（図１３）
ＳＭＣＣ−ＤＯＰＥの合成後、反応液Ａのうち半量の１００μＬ（２５０ｎｍｏｌ）、及びＭＴＳのＤＭＳＯ溶液（脱気済み）１００μＬ（１２５ｎｍｏｌ）をエッペンドルフチューブに加え、室温で１時間遮光静置し、反応させた。反応終了後、凍結乾燥し、溶媒を除去し、メタノール／ＤＭＳＯ（１：３）１００μＬを用いて再度溶解した。その後、ＨＰＬＣ精製を行った（図１４）。なお、ＨＰＬＣは上記と同様にして行った。精製したＭＴＳ−ＤＯＰＥの質量分析をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−Ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により行い、分子量が目的生成物と一致することを確認した（図１５）。なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析において、測定機器としてはＶＯＹＡＧＥＲ  ＤＥＰＲＯを使用し、溶剤としては１０％  ＴＦＡのＣＨ３ＣＮ溶液を使用し、マトリックスとしてはＣＨＣＡを使用した。質量分析の結果より、得られた生成物をＭＴＳ−ＤＯＰＥとした。【０１７２】〔実施例６〕ＭＴＳ修飾リポソームのミトコンドリアへの移行能の評価
（１）リポソームの調製
試験管内に５モル％  ＭＴＳ−ＤＯＰＥを含む脂質膜を形成後、脂質膜を水和させ、超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例１と同様）、ＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＭＴＳ修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：２）を調製した。なお、「ＭＴＳ修飾」とは、リポソーム表面がＭＴＳで修飾されていることを意味する。また、実施例１と同様にして、５モル％ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＭＴＳ非修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝９：２）、ＳＴＲ−Ｒ８及びＭＴＳ非修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ；ＤＤＡＢ＝９：２，ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：２）を調製した。【０１７３】（２）ホモジネート溶液の調製
ＨｅＬａ細胞をＭＩＢ（＋）［２５０ｍＭ  スクロース，２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４］で洗浄後、１．０×１０７細胞／ｍＬとなるようにＭＩＢ（＋）に懸濁した（以下、氷上操作）。ダウンスホモジナイザーで、２０回ホモジネートし、ホモジネート溶液を調製した。得られたサンプルは、１％  ＳＤＳ存在下、ＢＳＡを標準物質としてＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いてタンパク量を測定した後に、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＭＩＢ（＋）を用いて希釈し、−８０℃で保存した。【０１７４】（３）ミトコンドリアへの移行能の評価
５４０μＬホモジネート溶液［１μｇ／μＬタンパク質］に６０μＬリポソーム（１モル％  ＮＢＤ−ＤＯＰＥ含有）を添加した。コントロールとして６０μＬ  ＭＩＢ（＋）を添加したものを調製した。２５℃で３０分間インキュベーションした後、１００μＬを分注し［Ｆａｌｌ］、残りは遠心分離操作に用いた。５００μＬのサンプルを遠心分離後（７００×ｇ，１０分，４℃）、得られた上清４００μＬを遠心分離し（１６０００×ｇ，１０分，４℃）、得られた沈殿４００μＬをＭＩＢ（＋）で懸濁した［Ｆｍｔ］。【０１７５】  １００μＬのサンプルに同量の１％  Ｔｒｉｔｏｎ溶液（９９μＬ  ＭＩＢ（−），１μＬ  Ｔｒｉｔｏｎ）を加えて懸濁し、最終濃度０．５％  Ｔｒｉｔｏｎとなるように調整した後、蛍光強度測定（ｅｘ：４７０ｎｍ，ｅｍ：５３０ｎｍ）を行い、下記式から算出したミトコンドリアへの移行活性（％）に基づいて、リポソームのミトコンドリアへの移行能を評価した。【０１７６】移行活性（％）＝ミトコンドリアに移行したリポソームの蛍光強度［Ｆｍｔ］／添加した全てのリポソームの蛍光強度［Ｆａｌ１］×１００【０１７７】  結果を図１６に示す。図１６に示すように、リポソーム表面をＭＴＳで修飾することにより、リポソームにミトコンドリアへの選択的な移行能を付与できることが明らかとなった。【０１７８】〔実施例７〕生細胞内におけるリポソームの動態解析
（１）リポソームの調製
試験管内に脂質膜を形成後、ＧＦＰ溶液（１２５ｎｇ／μＬ，以下同様）を加えて脂質膜を水和させ、超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例１と同様）、ＳＴＲ−Ｒ８及びＭＴＳ非修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：２）を調製した。【０１７９】  試験管内に５モル％  ＭＴＳ−ＤＯＰＥを含む脂質膜を形成後、ＧＦＰ溶液を加え脂質膜を水和させ、超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例１と同様）、ＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＭＴＳ修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：２）を調製した。なお、「ＭＴＳ修飾」とは、リポソーム表面がＭＴＳで修飾されていることを意味する。【０１８０】  試験管内に１０モル％ＳＴＲ−Ｒ８を含む脂質膜を形成後、ＧＦＰ溶液を加えて脂質膜を水和させ、超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例１と同様）、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＭＴＳ非修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：２）を調製した。【０１８１】  試験管内に５モル％ＭＴＳ−ＤＯＰＥを含む脂質膜を形成後、ＧＦＰ溶液を加えて脂質膜を水和させ、超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例１と同様）、ＭＴＳ修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：２）を形成させた。その後、リポソーム溶液にＳＴＲ−Ｒ８を総脂質量の１０モル％となるように添加し、ＳＴＲ−Ｒ８及びＭＴＳ修飾ＥＰＣ系リポソーム（ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝９：２）を調製した。【０１８２】  なお、いずれのリポソームの内部にもＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）が封入されている。【０１８３】  実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞内にリポソームを導入し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞内動態を観察し、ミトコンドリア（赤）とリポソームの内封物ＧＦＰ（緑）の局在を確認した（共局在する場合、黄色）。【０１８４】  共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を図１７及び１８に示す。なお、図１７（ａ）は、コントロール（ＧＦＰ溶液を細胞に添加）の結果、図１７（ｂ）は、ＳＴＲ−Ｒ８及びＭＴＳ非修飾ＥＰＣ系リポソームの結果、図１７（ｃ）は、ＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＭＴＳ修飾ＥＰＣ系リポソームの結果、図１８（ａ）は、ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＭＴＳ非修飾ＥＰＣ系リポソームの結果、図１８（ｂ）は、ＳＴＲ−Ｒ８及びＭＴＳ修飾ＥＰＣ系リポソームの結果を示す。また、「透過光」は透過光による細胞像、「ミトコンドリア」はミトコンドリア（赤）の局在、「ＧＦＰ」はＧＦＰ（緑）の局在、「重ね合わせ」は透過光による細胞像に重ね合わせたミトコンドリア（赤）及びＧＦＰ（緑）の局在を示す。【０１８５】  ＳＴＲ−Ｒ８及びＭＴＳ非修飾ＥＰＣ系リポソーム、ＳＴＲ−Ｒ８非修飾ＭＴＳ修飾ＥＰＣ系リポソームを用いた場合、細胞内にＧＦＰ（緑）の局在は確認されなかった。このことから、リポソーム表面をＭＴＳで修飾したただけでは、リポソームを細胞内に導入できないことが明らかとなった。【０１８６】  ＳＴＲ−Ｒ８修飾ＭＴＳ非修飾ＥＰＣ系リポソームを用いた場合、細胞内にＧＦＰ（緑）の局在が確認されるとともに、ミトコンドリア（赤）周辺にＧＦＰ（緑）の局在が確認された。このことから、リポソーム表面をＳＴＲ−Ｒ８で修飾することにより、リポソームを細胞内に導入できること、及び細胞内に移行したリポソームがミトコンドリア膜に結合できることが明らかとなった。但し、ミトコンドリア（赤）とＧＦＰ（緑）との共局在（黄色）は観察されなかったことから、リポソーム表面をＳＴＲ−Ｒ８で修飾しただけでは、リポソームにミトコンドリア膜に対する融合能を付与できないことが明らかとなった。【０１８７】  ＳＴＲ−Ｒ８及びＭＴＳ修飾ＥＰＣ系リポソームを用いた場合、ミトコンドリア（赤）とＧＦＰ（緑）との共局在（黄色）が確認された。ＳＴＲ−Ｒ８及びＭＴＳ修飾ＥＰＣ系は、リポソームＳＴＲ−Ｒ８修飾ＭＴＳ非修飾ＥＰＣ系リポソームと同様に、ミトコンドリア膜に対する融合能は有しないと考えられるので、ミトコンドリア（赤）とＧＦＰ（緑）との共局在（黄色）は、リポソームがミトコンドリア膜に極めて近接して存在することを意味する。すなわち、リポソーム表面をＭＴＳで修飾することにより、リポソームをミトコンドリア膜に極めて近接した状態で結合させることができることが明らかとなった。リポソームがミトコンドリア膜に極めて近接した状態で結合できれば、リポソーム膜とミトコンドリア膜との膜融合を誘起しやすくなると考えられる。また、ＧＦＰ（緑）がミトコンドリア（赤）以外の部分（細胞質、その他のオルガネラ）にはほとんど観察されなかったことから、リポソーム表面をＭＴＳで修飾することにより、リポソームにミトコンドリアへの選択的な移行能を付与できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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