(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内で静置培養する培養装置と、前記培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置からなり、前記計測装置は、培養容器内の前記細胞集団の画像を取得する画像取得手段と、前記画像取得手段の培養時間毎の画像から前記細胞の平均投影面積を算出する平均投影面積算出手段と、前記平均投影面積算出手段より算出した前記細胞の平均投影面積から培養細胞のラグタイムを決定するラグタイム決定手段とを備えたことを特徴とする細胞培養評価システム。
【請求項２】
前記ラグタイム決定手段は、培養時間に対する前記細胞の前記平均投影面積と、ラグタイムとの関係式から、培養細胞のラグタイムを算出することを特徴とする請求項１記載の細胞培養評価システム。
【請求項３】
前記ラグタイム決定手段における前記細胞の平均投影面積を前記細胞集団の増殖能の評価パラメータとすることを特徴とする請求項１記載の細胞培養評価システム。
【請求項４】
少なくとも２以上の検体の細胞数の増殖曲線からラグタイムを算出する手段と、各検体の培養時間に対する浮遊系細胞の平均投影面積を算出する手段と、各検体の培養時間における前記細胞の平均投影面積とラグタイムとの相関係数を算出する手段と、基準以上の相関係数の値を有する培養時間での平均投影面積におけるラグタイムとの関係式を算出する手段とを有することを特徴とする細胞培養評価システム。
【請求項５】
培養容器内で静置培養する培養装置と前記培養装置で浮遊系細胞を培養して計測する計測装置とを備え、前記計測装置は、前記培養容器内の前記細胞集団の画像を画像取得手段で取得して、該画像取得手段の画像から細胞の抽出を行って抽出された細胞数の集計、及び抽出された細胞の投影面積の測定を行い、単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とを細胞形態判別手段により判別することを特徴とする細胞培養評価システム。
【請求項６】
培養容器内で静置培養する培養装置と前記培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置からなり、前記計測装置は、培養容器内の前記細胞集団の画像を取得する画像取得手段と、前記画像取得手段の画像から非単一細胞を抽出する抽出手段と、前記抽出手段から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手段と、前記非単一細胞の割合を算出する手段から非単一細胞の増加速度を算出する手段と、前記非単一細胞の増加速度を算出する手段より算出した非単一細胞の増加速度から培養細胞の最小倍化時間を決定する最小倍化時間決定手段とを備えたことを特徴とする細胞培養評価システム。
【請求項７】
前記最小倍化時間決定手段は、培養時間に対する前記細胞集団の非単一細胞の増加速度と、前記細胞集団の最小倍化時間との関係式から、培養細胞の最小倍化時間を算出することを特徴とする請求項６記載の細胞培養評価システム。
【請求項８】
前記最小倍化時間決定手段における前記非単一細胞の増加速度を前記細胞集団の増殖能の評価パラメータとすることを特徴とする請求項６記載の細胞培養評価システム。
【請求項９】
少なくとも２以上の検体の非単一細胞の増加速度を算出する手段と、各検体の非単一細胞の増加速度から浮遊系細胞の倍化時間を算出する手段と、算出した前記細胞の倍化時間から最も短い時間を最小倍化時間とする手段と、所定の培養期間における非単一細胞の増加速度に対する最小倍化時間との相関係数を算出する手段と、基準以上の相関係数の値を有する非単一細胞の増加速度と最小倍化時間との関係式を算出する手段とを有することを特徴とする細胞培養評価システム。
【請求項１０】
培養容器内で静置培養する培養装置と、前記培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置からなり、前記計測装置は、培養容器内で静置培養する前記細胞集団の画像を取得する画像取得手段と、前記画像取得手段の画像から非単一細胞を抽出する抽出手段と、前記抽出手段から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手段と、前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手段から算出した前記非単一細胞の割合から前記細胞集団が増殖刺激されたかを判定する手段とを有することを特徴とする細胞培養評価システム。
【請求項１１】
培養容器内で静置培養する浮遊系細胞集団の画像を取得する画像取得工程と、前記画像取得工程の培養時間毎の画像から前記細胞の平均投影面積を算出する平均投影面積算出工程と、前記平均投影面積算出工程より算出した前記細胞の平均投影面積から培養細胞のラグタイムを決定するラグタイム決定工程とを備えたことを特徴とする細胞培養評価方法。
【請求項１２】
前記ラグタイム決定工程は、培養時間に対する前記細胞の前記平均投影面積とラグタイムとの関係式から、培養細胞のラグタイムを算出することを特徴とする請求項１１記載の細胞培養評価方法。
【請求項１３】
前記ラグタイム決定工程における前記細胞の平均投影面積を前記細胞集団の増殖能の評価パラメータとすることを特徴とする請求項１１記載の細胞培養評価方法。
【請求項１４】
少なくとも２以上の検体の細胞数の増殖曲線からラグタイムを算出する工程と、各検体の培養時間に対する浮遊系細胞の平均投影面積を算出する工程と、各検体の培養時間における前記細胞の平均投影面積とラグタイムとの相関係数を算出する工程と、基準以上の相関係数の値を有する培養時間での前記細胞の平均投影面積におけるラグタイムとの関係式を算出する工程とを有することを特徴とする細胞培養評価方法。
【請求項１５】
培養容器内で静置培養する浮遊系細胞集団の画像を取得する画像取得工程と、前記画像取得工程の画像から細胞の抽出を行って抽出された細胞数の集計、及び抽出された細胞の投影面積の測定を行い、単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とを細胞形態判別工程により判別することを特徴とする細胞培養評価方法。
【請求項１６】
培養容器内で静置培養する浮遊系細胞集団の画像を取得する画像取得工程と、前記画像取得工程の画像から非単一細胞を抽出する抽出工程と、前記抽出工程から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する工程と、前記非単一細胞の割合を算出する工程から非単一細胞の増加速度を算出する工程と、前記非単一細胞の増加速度を算出する工程より算出した非単一細胞の増加速度から培養細胞の最小倍化時間を決定する最小倍化時間決定工程とを備えたことを特徴とする細胞培養評価方法。
【請求項１７】
前記最小倍化時間決定工程は、培養時間に対する非単一細胞の増加速度と、前記細胞集団の最小倍化時間との関係式から、培養細胞の最小倍化時間を算出することを特徴とする請求項１６記載の細胞培養評価方法。
【請求項１８】
前記最小倍化時間決定工程における前記非単一細胞の増加速度を前記細胞集団の増殖能の評価パラメータとすることを特徴とする請求項１６記載の細胞培養評価方法。
【請求項１９】
少なくとも２以上の検体の非単一細胞の増加速度を算出する工程と、各検体の非単一細胞の増加速度から浮遊系細胞の倍化時間を算出する工程と、算出した前記細胞の倍化時間から最も短い時間を最小倍化時間とする工程と、所定の培養期間における非単一細胞の増加速度に対する最小倍化時間との相関係数を算出する工程と、基準以上の相関係数の値を有する非単一細胞の増加速度と最小倍化時間との関係式を算出する工程とを有することを特徴とする細胞培養評価方法。
【請求項２０】
培養容器内で静置培養する浮遊系細胞集団の画像を取得する画像取得工程と、前記画像取得工程の画像から非単一細胞を抽出する抽出工程と、前記抽出工程から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する工程と、前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する工程から算出した前記非単一細胞の割合から前記細胞集団が増殖刺激されたかを判定する工程とを有することを特徴とする細胞培養評価方法。
【請求項２１】
培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置のコンピュータに記憶した細胞培養評価プログラムであって、培養容器内で静置培養する前記細胞集団の画像を取得する画像取得手順と、前記画像取得手順の培養時間毎の画像から前記細胞の平均投影面積を算出する平均投影面積算出手順と、前記平均投影面積算出手順より算出した前記細胞の平均投影面積から培養細胞のラグタイムを決定するラグタイム決定手順を計測装置のコンピュータに実行させるための細胞培養評価プログラム。
【請求項２２】
培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置のコンピュータに記憶した細胞培養評価プログラムであって、培養容器内で静置培養する前記細胞集団の画像を取得する画像取得手順と、前記画像取得手順からの画像から単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とを判別する細胞形態判別手順と、前記細胞形態判別手順から前記非単一細胞を抽出する抽出手順と、前記抽出手順から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手順と、前記非単一細胞の割合を算出する手順から非単一細胞の増加速度を算出する手順と、前記非単一細胞の増加速度を算出する手順から最小倍化時間を決定する最小倍化時間決定手順を計測装置のコンピュータに実行させるための細胞培養評価プログラム。
【請求項２３】
培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置のコンピュータに記憶した細胞培養評価プログラムであって、培養容器内で静置培養する前記細胞集団の画像を取得する画像取得手順と、前記画像取得手順からの画像から単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とを判別する細胞形態判別手順と、前記細胞形態判別手順から前記非単一細胞を抽出する抽出手順と、前記抽出手順から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手順と、前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手順から算出した前記非単一細胞の割合から前記細胞集団が増殖刺激されたかを判定する手順を計測装置のコンピュータに実行させるための細胞培養評価プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムに関し、特に、浮遊系細胞培養のラグタイム、最小倍化時間の推定評価を効率よく行うこと、および細胞集団が増殖刺激されたかを客観的かつ的確に判定することが可能な細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、浮遊系細胞の増殖能評価方法としては、攪拌などにより均一混合された培養液をサンプリングもしくは培養液の濁度から生存細胞数を計測し、増殖曲線を推定する方法等により行われていた。しかしながら、例えば免疫細胞療法に用いられるＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋｉｌｌｅｒ  細胞（以下ＬＡＫ細胞という）の静置培養においては、細胞同士は接着をして細胞凝集塊を形成して培養面に沈降する。培養中の細胞を含んだ培養液は、均一状態でないためサンプリングや濁度測定の際に、培養液を均一混合する作業を行う必要がある。これらの作業は培養環境を変化させるため、その培養系を評価したことにはならず、培養を継続したまま生存細胞数を測定することは困難であった。また、患者から採取される細胞数は希少なため、測定による損失を無くすことが必要となる。【０００３】
また、人為的な細胞培養では、培養技術者の経験に依存した培養評価に基づいて日単位の操作が行われたり、予め定められたマニュアルに基づき全ての細胞について画一的に培養操作が行われるため、採取した細胞によっては、細胞増殖等の培養が不充分となってしまうことがあった。患者毎に異なる細胞の増殖能力を最大限に引き出すためには、客観的かつ的確に培養を評価する必要がある。【０００４】
このため、個々の接着依存性細胞を無襲撃、非破壊で形態観察測定することによって、その細胞集団全体の増殖能を把握することができるように構成された細胞増殖能評価方法が特許文献１に開示されている。【０００５】
また、培養容器の培地中に浮遊している細胞が培養容器の底面に接着するまでの時間をＣＣＤカメラからの投影画像を処理して接着細胞の選別を行う装置が特許文献２に開示されている。【０００６】
【特許文献１】特開２００２−２１８９９５
【特許文献２】特開２００３−２１６２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞の培養によるオーダーメイド医療等においては、患者から採取した細胞を培養する際には、細胞増殖能としてのラグタイム、最小倍化時間を短期間で効率よく推定評価すること、および細胞集団が増殖刺激されたかを客観的かつ的確に判定することが求められている。【０００８】
ラグタイム（Ｌａｇ  Ｔｉｍｅ、誘導期の時間）を推定評価することが可能となれば、接種した細胞の増殖開始時期が推測可能となり、増殖能が著しく低下した細胞を判定でき、培養継続の有無について判断することができる。【０００９】
また、最小倍化時間を推定評価することが可能となれば、その細胞の増殖能が推定できるようになり、細胞の増殖に合わせて培地を追添加する時間や培養容器を変える時間などが予測可能となる。そのため培養のスケジューリングが可能となる。【００１０】
更に、接種した細胞集団が増殖刺激されたかを客観的かつ的確に判定することができれば、細胞培養を次の段階へ移行するための（例えば、細胞を増殖刺激用の培養容器から増殖用の容器に移す）判断を客観的かつ的確に行うことが可能となる。【００１１】
しかしながら、従来の細胞増殖能評価方法は、培養を行っている細胞集団全体の増殖能を把握することができるが、接種した細胞の増殖開始時期の推測、最小倍化時間を推定評価したり、細胞集団が増殖刺激されたかを客観的かつ的確に判定することができなかった。【００１２】
そこで本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、浮遊系細胞を培養する際に、培養細胞集団の平均細胞投影面積または非単一細胞の増加速度を評価パラメータとして用いることにより、ラグタイムあるいは最小倍化時間を推定評価すること、また細胞集団が増殖刺激されたかを客観的かつ的確に判定することが可能な細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
請求項１に記載の発明にかかる細胞培養評価システムは、培養容器内で静置培養する培養装置と、前記培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置からなり、前記計測装置は、培養容器内の前記細胞集団の画像を取得する画像取得手段と、前記画像取得手段の培養時間毎の画像から前記細胞の平均投影面積を算出する平均投影面積算出手段と、前記平均投影面積算出手段より算出した前記細胞の平均投影面積から培養細胞のラグタイムを決定するラグタイム決定手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００１４】
請求項２に記載の発明にかかる細胞培養評価システムの前記ラグタイム決定手段は、請求項１に記載の発明において培養時間に対する前記細胞の前記平均投影面積と、ラグタイムとの関係式から、培養細胞のラグタイムを算出することを特徴とするものである。【００１５】
請求項３に記載の発明にかかる細胞培養評価システムは、請求項１に記載の発明において、前記ラグタイム決定手段における前記細胞の平均投影面積を前記細胞集団の増殖能の評価パラメータとすることを特徴とするものである。【００１６】
請求項４に記載の発明にかかる細胞培養評価システムは、少なくとも２以上の検体の細胞数の増殖曲線からラグタイムを算出する手段と、各検体の培養時間に対する浮遊系細胞の平均投影面積を算出する手段と、各検体の培養時間における前記細胞の平均投影面積とラグタイムとの相関係数を算出する手段と、基準以上の相関係数の値を有する培養時間での平均投影面積におけるラグタイムとの関係式を算出する手段とを有することを特徴とするものである。
【００１７】
請求項５に記載の発明にかかる細胞培養評価システムは、培養容器内で静置培養する培養装置と前記培養装置で浮遊系細胞を培養して計測する計測装置とを備え、前記計測装置は、前記培養容器内の前記細胞集団の画像を画像取得手段で取得して、該画像取得手段の画像から細胞の抽出を行って抽出された細胞数の集計、及び抽出された細胞の投影面積の測定を行い、単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とを細胞形態判別手段により判別することを特徴とするものである。
【００１８】
請求項６に記載の発明にかかる細胞培養評価システムは、培養容器内で静置培養する培養装置と前記培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置からなり、前記計測装置は、培養容器内の前記細胞集団の画像を取得する画像取得手段と、前記画像取得手段の画像から非単一細胞を抽出する抽出手段と、前記抽出手段から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手段と、前記非単一細胞の割合を算出する手段から非単一細胞の増加速度を算出する手段と、前記非単一細胞の増加速度を算出する手段より算出した非単一細胞の増加速度から培養細胞の最小倍化時間を決定する最小倍化時間決定手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００１９】
請求項７に記載の発明にかかる細胞培養評価システムの前記最小倍化時間決定手段は、請求項６に記載の発明において、培養時間に対する前記細胞集団の非単一細胞の増加速度と、前記細胞集団の最小倍化時間との関係式から、培養細胞の最小倍化時間を算出することを特徴とするものである。【００２０】
請求項８に記載の発明にかかる細胞培養評価システムは、請求項６に記載の発明において、前記最小倍化時間決定手段における前記非単一細胞の増加速度を前記細胞集団の増殖能の評価パラメータとすることを特徴とするものである。【００２１】
請求項９に記載の発明にかかる細胞培養評価システムは、少なくとも２以上の検体の非単一細胞の増加速度を算出する手段と、各検体の非単一細胞の増加速度から浮遊系細胞の倍化時間を算出する手段と、算出した前記細胞の倍化時間から最も短い時間を最小倍化時間とする手段と、所定の培養期間における非単一細胞の増加速度に対する最小倍化時間との相関係数を算出する手段と、基準以上の相関係数の値を有する非単一細胞の増加速度と最小倍化時間との関係式を算出する手段とを有することを特徴とするものである。
【００２２】
請求項１０に記載の発明にかかる細胞培養評価システムは、培養容器内で静置培養する培養装置と、前記培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置からなり、前記計測装置は、培養容器内で静置培養する前記細胞集団の画像を取得する画像取得手段と、前記画像取得手段の画像から非単一細胞を抽出する抽出手段と、前記抽出手段から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手段と、前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手段から算出した前記非単一細胞の割合から前記細胞集団が増殖刺激されたかを判定する手段とを有することを特徴とするものである。
【００２３】
請求項１１に記載の発明にかかる細胞培養評価方法は、培養容器内で静置培養する浮遊系細胞集団の画像を取得する画像取得工程と、前記画像取得工程の培養時間毎の画像から前記細胞の平均投影面積を算出する平均投影面積算出工程と、前記平均投影面積算出工程より算出した前記細胞の平均投影面積から培養細胞のラグタイムを決定するラグタイム決定工程とを備えたことを特徴とするものである。
【００２４】
請求項１２に記載の発明にかかる細胞培養評価方法の前記ラグタイム決定工程は、請求項１１に記載の発明において、培養時間に対する前記細胞の前記平均投影面積とラグタイムとの関係式から、培養細胞のラグタイムを算出することを特徴とする。【００２５】
請求項１３に記載の発明にかかる細胞培養評価方法は、請求項１１に記載の発明において、前記ラグタイム決定工程における前記細胞の平均投影面積を前記細胞集団の増殖能の評価パラメータとすることを特徴とするものである。
【００２６】
請求項１４に記載の発明にかかる本発明による細胞培養評価方法は、少なくとも２以上の検体の細胞数の増殖曲線からラグタイムを算出する工程と、各検体の培養時間に対する浮遊系細胞の平均投影面積を算出する工程と、各検体の培養時間における前記細胞の平均投影面積とラグタイムとの相関係数を算出する工程と、基準以上の相関係数の値を有する培養時間での前記細胞の平均投影面積におけるラグタイムとの関係式を算出する工程とを有することを特徴とするものである。
【００２７】
請求項１５に記載の発明にかかる細胞培養評価方法は、培養容器内で静置培養する浮遊系細胞集団の画像を取得する画像取得工程と、前記画像取得工程の画像から細胞の抽出を行って抽出された細胞数の集計、及び抽出された細胞の投影面積の測定を行い、単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とを細胞形態判別工程により判別することを特徴とするものである。
【００２８】
請求項１６に記載の発明にかかる細胞培養評価方法は、培養容器内で静置培養する浮遊系細胞集団の画像を取得する画像取得工程と、前記画像取得工程の画像から非単一細胞を抽出する抽出工程と、前記抽出工程から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する工程と、前記非単一細胞の割合を算出する工程から非単一細胞の増加速度を算出する工程と、前記非単一細胞の増加速度を算出する工程より算出した非単一細胞の増加速度から培養細胞の最小倍化時間を決定する最小倍化時間決定工程とを備えたことを特徴とするものである。
【００２９】
請求項１７に記載の発明にかかる細胞培養評価方法の前記最小倍化時間決定工程は、請求項１６に記載の発明において、培養時間に対する非単一細胞の増加速度と、前記細胞集団の最小倍化時間との関係式から、培養細胞の最小倍化時間を算出することを特徴とするものである。【００３０】
請求項１８に記載の発明にかかる細胞培養評価方法は、請求項１６に記載の発明において、前記最小倍化時間決定工程における前記非単一細胞の増加速度を前記細胞集団の増殖能の評価パラメータとすることを特徴とするものである。【００３１】
請求項１９に記載の発明にかかる細胞培養評価方法は、少なくとも２以上の検体の非単一細胞の増加速度を算出する工程と、各検体の非単一細胞の増加速度から浮遊系細胞の倍化時間を算出する工程と、算出した前記細胞の倍化時間から最も短い時間を最小倍化時間とする工程と、所定の培養期間における非単一細胞の増加速度に対する最小倍化時間との相関係数を算出する工程と、基準以上の相関係数の値を有する非単一細胞の増加速度と最小倍化時間との関係式を算出する工程とを有することを特徴とするものである。
【００３２】
請求項２０に記載の発明にかかる細胞培養評価方法は、培養容器内で静置培養する浮遊系細胞集団の画像を取得する画像取得工程と、前記画像取得工程の画像から非単一細胞を抽出する抽出工程と、前記抽出工程から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する工程と、前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する工程から算出した前記非単一細胞の割合から前記細胞集団が増殖刺激されたかを判定する工程とを有することを特徴とするものである。
【００３３】
請求項２１に記載の発明にかかる細胞培養評価プログラムは、培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置のコンピュータに記憶した細胞培養評価プログラムであって、培養容器内で静置培養する前記細胞集団の画像を取得する画像取得手順と、前記画像取得手順の培養時間毎の画像から前記細胞の平均投影面積を算出する平均投影面積算出手順と、前記平均投影面積算出手順より算出した前記細胞の平均投影面積から培養細胞のラグタイムを決定するラグタイム決定手順を計測装置のコンピュータに実行させることを特徴とするものである。
【００３４】
請求項２２に記載の発明にかかる細胞培養評価プログラムは、培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置のコンピュータに記憶した細胞培養評価プログラムであって、培養容器内で静置培養する前記細胞集団の画像を取得する画像取得手順と、前記画像取得手順からの画像から単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とを判別する細胞形態判別手順と、前記細胞形態判別手順から前記非単一細胞を抽出する抽出手順と、前記抽出手順から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手順と、前記非単一細胞の割合を算出する手順から非単一細胞の増加速度を算出する手順と、前記非単一細胞の増加速度を算出する手順から最小倍化時間を決定する最小倍化時間決定手順を計測装置のコンピュータに実行させることを特徴とするものである。
【００３５】
請求項２３に記載の発明にかかる細胞培養評価プログラムは、培養装置で培養する浮遊系細胞を計測する計測装置のコンピュータに記憶した細胞培養評価プログラムであって、培養容器内で静置培養する前記細胞集団の画像を取得する画像取得手順と、前記画像取得手順からの画像から単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とを判別する細胞形態判別手順と、前記細胞形態判別手順から前記非単一細胞を抽出する抽出手順と、前記抽出手順から前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手順と、前記細胞集団の前記非単一細胞の割合を算出する手順から算出した前記非単一細胞の割合から前記細胞集団が増殖刺激されたかを判定する手順を計測装置のコンピュータに実行させることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００３６】
本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムによれば、ラグタイムを推定評価することにより、接種した細胞の増殖開始時期が推測可能となり、増殖能が著しく低下した細胞を判定でき、培養継続の有無について判断することが可能となる。【００３７】
また、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムによれば、最小倍化時間を推定評価することにより、その細胞の増殖能が推定できるようになり、細胞の増殖に合わせて培地を追添加する時間や培養容器を変える時間などが予測可能となる。そのため培養のスケジューリングが可能となる。【００３８】
更に、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムによれば、非単一細胞の割合を算出することにより、接種した細胞集団が増殖刺激されたかを判定することができ、細胞培養を次の段階へ移行するための（例えば、細胞を増殖刺激用の培養容器から増殖用の容器に移す）判断を客観的かつ的確に行うことが可能となる。【００３９】
更に、推定評価した培養系のラグタイムまたは最小倍化時間があまりにも長い場合、または非単一細胞の割合から細胞集団が増殖刺激されていないと判定される場合にはそれにあわせた処置を迅速に行うことが可能となる。【００４０】
また、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムによれば、オーダーメイド医療での患者から採取される細胞を培養する際には、細胞を破壊、侵襲することなしに、細胞増殖能としてのラグタイム、最小倍化時間を短期間で効率よく推定評価することができる。また、非単一細胞の割合から細胞集団が増殖刺激されたかを客観的かつ的確に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】細胞培養評価システムの構成を示すブロック図である。
【図２】細胞の平均投影面積からラグタイムを算出する工程を示すフローチャートである。
【図３】平均投影面積とラグタイムとの関係を示すグラフである。
【図４】ラグタイムを推定するための関係式を算出するための手順を示すフローチャートである。
【図５】６培養区（ａ〜ｆ）におけるＬＡＫ細胞のラグタイムを示す図である。
【図６】６培養区（ａ〜ｆ）における培養時間に対する細胞の平均投影面積の変化を示す図である。
【図７】細胞の非単一細胞増加速度から最小倍化時間を算出する工程を示すフローチャートである。
【図８】非単一細胞増加速度と最小倍化時間との関係を示すグラフである。
【図９】非単一細胞の増加速度を用いた最小倍化時間を評価推定するための関係式の算出する工程を示すフローチャートである。
【図１０】接種細胞濃度の違いによる培養区および検体の異なる培養区（Ａ〜Ｆ）におけるＬＡＫ細胞の最小倍化時間を示す図である。
【図１１】接種細胞濃度の異なる培養区（×０．５〜×５．０）における、培養時間に対す非単一細胞の割合の変化を示す図である。
【図１２】検体の異なる培養区（Ａ〜Ｆ）における、培養時間に対す非単一細胞の割合の変化を示す図である。
【図１３】接種した細胞集団が増殖刺激されたかを判定する工程を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００４２】
１      細胞培養評価システム
２      培養装置
３      インキュベータ
４      培養容器（フラスコ等）
５      培養容器ステージ
７      ガスボンベ
８      フローメータ
９      フィルター
１０    加湿ビン
２０    計測装置
２１    ＣＣＤカメラ
２２    ＸＹＺステージ
２３    ステージドライバー
２４    ＬＥＤ照明装置
２５    ＬＥＤ電源装置
３０    コンピュータ
３１    ビデオメモリ回路
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下図面を参照して、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムの実施の形態について説明する。なお、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムは、浮遊系細胞を培養する際に、培養細胞集団の平均細胞投影面積または非単一細胞の増加速度を評価パラメータとして用いることにより、細胞増殖能としてのラグタイムあるいは最小倍化時間を推定評価することができるようにしたものである。また、非単一細胞の割合から細胞集団が増殖刺激されたかを判定することができるようにしたものである。【００４４】
以下に図１を参照して、細胞培養評価システムの構成について説明する。図１は、細胞培養評価システムの構成を示すブロック図である。図１に示すように、細胞培養評価システム１は、細胞の培養を行う培養装置２と培養装置２で培養する細胞を計測する計測装置２０とから構成されている。なお、図１に示す、点線で囲んだものが培養装置２であり、図１に示す一点鎖線で囲んだものが計測装置２０である。細胞培養評価システム１の培養装置２は、一定の温度を保って細胞の培養を行うインキュベータ３と、細胞を培養する培養容器（フラスコ等）４と、培養容器４を搭載する培養容器ステージ５とからなる。また、ガスボンベ７等から培養容器４に供給する混合ガスの流量を制御するフローメータ８と、フローメータ８と加湿ビン１０との間に位置するフィルター９と、混合ガスの加湿を行う加湿ビン１０とを有している。なお、培養容器４に供給する混合ガスは、培養する細胞種によって適宜選択するようにする。ガスボンベ７等から供給する混合ガスは、フローメータ８からフィルター９を通り、加湿ビン１０を介して培養容器４に供給するようになっている。【００４５】
細胞培養評価システム１の計測装置２０は、インキュベータ３内部に収納したＸＹＺステージ２２と、ＸＹＺステージ２２に搭載されて３次元方向に移動可能な画像取得手段としてのＣＣＤカメラ２１と、ＸＹＺステージ２２に搭載されてＣＣＤカメラ２１と共に２次元方向に移動可能なＬＥＤ照明装置２４とを有している。【００４６】
ＸＹＺステージ２２は、ステージのＸ軸、Ｙ軸およびＺ軸を駆動するモータを備えており、各モータはステージドライバー２３により制御されて、所定の位置に移動して位置決めを行うようになっている。【００４７】
ＸＹＺステージ２２に搭載されたＣＣＤカメラ２１は、培養容器ステージ５に置かれた培養容器４の底部を撮像するようになっている。ＣＣＤカメラ２１は、ＸＹＺステージ２２により垂直方向の移動が可能であり、ＣＣＤカメラ２１のフォーカス調整が行えるようになっている。【００４８】
ＬＥＤ照明装置２４は、培養容器４を介してＣＣＤカメラ２１の直上に位置するように設定されており、ＬＥＤ電源装置２５により点灯、消灯の制御、照度のコントロールが行うようになっている。【００４９】
なお、培養容器４の直上に位置するＬＥＤ照明装置２４に変えて、光源からの光をファイバーでガイドした光ファイバー照明装置等、他の照明装置を使用してもよい。また、画像取得手段としてのＣＣＤカメラ２１は、ＭＯＳ型カメラ等の他のイメージセンサを使用するようにしてもよい。【００５０】
また、図１に示すように、細胞培養評価システム１の計測装置２０は、ＣＣＤカメラ２１からの画像データの処理、ステージドライバー２３およびＬＥＤ電源装置２５の制御、培養細胞のラグタイムまたは最小倍化時間の推定処理を行うコンピュータ３０を備えている。【００５１】
コンピュータ３０は、演算、制御を行うＣＰＵと、処理プログラム、データの記憶を行う記憶装置（メモリ）と、データの入力、コマンド等を入力する入力装置としてのキーボード、マウスおよび出力装置としてのモニター等との接続を行うための入出力回路と、ＣＣＤカメラ２１からの映像データを記憶するビデオメモリ回路３１を有している。ＣＣＤカメラ２１からの映像データは、ビデオメモリ回路３１のメモリに記憶される。メモリに記憶した映像データは、ＣＰＵにより読み出し可能となっている。また、コンピュータ３０は、Ｘ軸、Ｙ軸およびＺ軸駆動用のモータを制御するステージドライバー２３およびＬＥＤ照明装置２４を制御するＬＥＤ電源装置２５をコントロールできるようになっている。【００５２】
また、コンピュータ３０は、ステージドライバー２３およびＬＥＤ電源装置２５を制御して、ＣＣＤカメラ２１の画像データをビデオメモリ回路３１のメモリに記憶する制御プログラムと、ビデオメモリ回路３１のメモリに記憶した画像データを解析処理する画像処理プログラムと、相関係数の算出、最小二乗法による関係式の算出等の演算処理を行う演算処理プログラムと、培養細胞のラグタイムまたは最小倍化時間の推定処理を行う推定処理プログラム等を記憶している。コンピュータ３０は、これらのプログラムを実行して細胞培養評価を行うようになっている。【００５３】
次に、上記構成よりなる細胞培養評価システム１を用いた浮遊系細胞の培養評価方法について述べる。なお、浮遊系細胞としては、例えば末梢血単核球、ＬＡＫ細胞、神経幹細胞、ＥＳ細胞等が知られており、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムは、これらの細胞に対して適用するものである。これらの浮遊系細胞を以下単に細胞と称する。【００５４】
培養容器４内の細胞の増殖能を評価するために、ラグタイムおよび最小倍化時間を用いる。ここで、ラグタイムとは細胞を接種した時から増殖開始までに要する誘導期の時間をいう。また、最小倍化時間とはある時間における細胞がその時間における細胞数の倍の細胞数になるまでに要する時間をいう。また、増殖刺激とは、培養を開始してから抗体が細胞を刺激し、増殖を促すことをいう。【００５５】
ラグタイムを推定評価することが可能となれば、接種した細胞の増殖開始時期が推測可能となり、増殖能が著しく低下した細胞を判定でき、培養継続の有無について判断することが可能となる。【００５６】
また、最小倍化時間を推定評価することが可能となれば、その細胞の増殖能が推定できるようになり、細胞の増殖に合わせて培地を追添加する時間や培養容器を変える時間などが予測可能となる。そのため培養のスケジューリングが可能となる。【００５７】
更に、非単一細胞の割合を算出することにより細胞集団が増殖刺激されたかどうかを自動的に判定することが可能となれば、細胞培養を次の段階へ移行させる（例えば、細胞を増殖刺激用の培養容器から増殖用の容器に移す）判断を客観的かつ的確に行うことが可能となる。【００５８】
最初に、第１の実施の形態として培養中の細胞の平均投影面積からラグタイムを算出する工程について図２に示すフローチャートを参照して説明する。【００５９】
図２に示すように、細胞に対し増殖刺激を行うために抗体を固層化した培養容器４（図１に示す）に、培養用培地に懸濁した細胞を接種して培養を開始する（ステップＳ１）。なお、固層化する抗体は接種する細胞により適切なものを選択するようにする。例えば、ＬＡＫ細胞を培養する場合には抗ＣＤ３抗体を固層化するようにする。【００６０】
抗体を固層化する方法としては、例えば抗ＣＤ３抗体を生理食塩水等に溶解し抗ＣＤ３抗体溶液を作成し、その溶液を培養容器の培養面に浸漬し、常温で静置する。静置する時間としては１時間程度が好ましい。その後、生理食塩水等で培養面を洗浄し培養に使用する。接種する細胞数は、例えばＬＡＫ細胞を培養する場合には、使用培養面積あたり２．２×１０４個／ｃｍ２以上が好ましい。これは前記数値未満で接種すると増殖が低下する可能性があるためである。【００６１】
図１に示す計測装置２０のコンピュータ３０は、培養開始から２４時間経過した後、ＬＥＤ電源装置２５に制御信号を出力して、培養容器４を介してＣＣＤカメラ２１の直上に位置するＬＥＤ照明装置２４を点灯するようにする。培養容器４上部より照明を行うことにより細胞および細胞凝集塊を形成する非単一細胞の画像を分析しやすくするためである。また、ＸＹＺステージ２２を移動して、ＣＣＤカメラ２１のレンズ先端部が例えば培養容器４の底面の中心付近に位置するようにステージドライバー２３を制御する（ステップＳ２）。【００６２】
次に、培養容器４の底面よりＣＣＤカメラ２１にて画像の撮影を行い、ＣＣＤカメラ２１からの画像データをコンピュータ３０内のビデオメモリ回路３１に記憶するようにする（ステップＳ３）。コンピュータ３０は画像処理プログラムを実行して、ビデオメモリ回路３１に記憶した画像データを読み出して、二値化処理を行う。二値化処理した画像データから単一細胞の抽出を行う（ステップＳ４）。抽出した単一細胞の投影面積を計測して、計測した値をメモリに記憶する（ステップＳ５）。画像内の全ての単一細胞の抽出が完了したかをチェックして（ステップＳ６）、全ての単一細胞の計測が終了後に、単一細胞の平均投影面積を算出する（ステップＳ７）。なお、単一細胞の平均投影面積を算出する平均投影面積算出工程は、平均投影面積算出手段としてのコンピュータ３０によって行われる。【００６３】
次に、コンピュータは、単一細胞の平均投影面積とラグタイムとの前もって組み込まれている関係式（以後に述べる（１）に示す直線の方程式）をメモリから読み出して、算出した細胞の平均投影面積の値を関係式に代入して、ラグタイムを算出する（ステップＳ８）。なお、ラグタイムを算出するラグタイム決定工程は、ラグタイム決定手段としてのコンピュータ３０によって行われる。図３は、平均投影面積とラグタイムとの関係を示すグラフである。なお、単一細胞の平均投影面積とラグタイムとの関係式は、図３に示す直線から導き出されたものである。以上述べたように、培養開始から２４時間経過した後の培養中の細胞画像を用いて細胞の平均投影面積を測定することにより、細胞の平均投影面積からラグタイムが算出されて、その培養区の細胞増殖能としてのラグタイムを評価することが可能となる。【００６４】
次に、単一細胞の平均投影面積からのラグタイムを推定するための関係式の算出について図３乃至図６を参照して説明する。図４は、ラグタイムを推定するための関係式を算出するための手順を示すフローチャート、図５は、６培養区（ａ〜ｆ）におけるＬＡＫ細胞のラグタイムを示す図、図６は、６培養区（ａ〜ｆ）における培養時間に対する細胞の平均投影面積の変化を示す図である。【００６５】
以下に、図４に示すフローチャートを参照して、ラグタイムを推定するための関係式を算出するための手順を説明する。図４に示すように、最初に末梢血単核球の採取を行う（ステップＳ２０）。末梢血単核球の採取は、異なるドナーより末梢血７．５ｍｌを真空採血管を用いて採血を行う。採取した検体数は６であり、それぞれにａからｆの記号を割り当てる。採取した末梢血を遠心分離（１７１０×ｇ、２０ｍｉｎ）によりヒト末梢血単核球に分離する（ステップＳ２１）。【００６６】
次に、抗ＣＤ３抗体を固層化した６−ｗｅｌｌ培養容器に自己血漿８％を含む培地および末梢血単核球を２．２×１０４個／ｃｍ２となるように接種し、３７℃、５％ＣＯ２  ａｉｒにて維持されたインキュベータ３にて培養する（ステップＳ２２）。【００６７】
７日間の培養期間中２４時間ごとにサンプリングを行い、撮影した培養細胞の画像または血球計算盤を用いて細胞数の計測を行う（ステップＳ２３）。その結果から細胞の増殖曲線を作成し、誘導期および対数増殖期のグラフの傾きを最小二乗法により算出し、二つのグラフの交点をラグタイムとして算出する（ステップＳ２４、ラグタイムを算出する工程）。なお、ラグタイムを算出する工程は、ラグタイムを算出する手段としてのコンピュータ３０によって行われる。【００６８】
図５は、６培養区（ａ〜ｆ）におけるＬＡＫ細胞のラグタイムを示す図である。図５に示すように、細胞接種から増殖開始までの誘導期の時間であるラグタイムは、６培養区（ａ〜ｆ）において５４時間から７５時間と幅広い分布を示す。【００６９】
また、各培養における個別細胞の挙動変化について培養期間中観察を行い、全ての培養区（ａ〜ｆ）において細胞は大きく肥大する挙動変化が確認された。図１に示す細胞培養評価システム１により培養時間８４時間まで１２時間ごとに培養細胞の画像を撮影して（ステップＳ２５）、個別細胞の平均投影面積について算出を行う（ステップＳ２６、平均投影面積を算出する工程）。なお、平均投影面積を算出する工程は、平均投影面積を算出する手段としてのコンピュータ３０によって行われる。【００７０】
図６は、６培養区（ａ〜ｆ）における培養時間に対する細胞の平均投影面積の変化を示す図である。図６に示すように、接種直後の平均投影面積は、全ての培養区（ａ〜ｆ）において約５０μｍ２で推移し、その後培養７５時間以降に細胞は肥大化を開始し、平均投影面積が増加する傾向が見られる。また細胞投影面積増加の傾向は、培養区によって異なることが示され、各培養区における増殖能に関連していることが示されている。【００７１】
次に、図６に示す培養時間毎の培養区（ａ〜ｆ）の平均投影面積と図３に示す培養区（ａ〜ｆ）のラグタイムとの相関係数を算出する（ステップＳ２７、相関係数を算出する工程）。なお、相関係数を算出する工程は、相関係数を算出する手段としてのコンピュータ３０によって行われる。【００７２】
図３に示すように、培養２４時間での平均細胞投影面積と各培養区（ａ〜ｆ）におけるラグタイムとの関係を試みたところ、相関係数−０．９７１という高い相関性を示した。すなわち培養２４時間で細胞画像を撮影し、平均細胞投影面積を評価パラメータとして用いることにより、その培養区におけるラグタイムを推定評価することが可能となる。相関係数が最も−１に近い平均投影面積とラグタイムから最小二乗法等により関係式を算出する（ステップＳ２８、関係式を算出する工程）。なお、算出した相関係数は、前もって設定した基準値（例えば相関係数が−１〜−０．９）と比較して、基準以上のもの（基準値を満たすもの）を選択するようにしてもよい。関係式を算出する工程は、関係式を算出する手段としてのコンピュータ３０によって行われる。また、関係式は、平均投影面積ＡＣ、ラグタイムｔＬに関する（１）に示す直線の方程式で表される。【００７３】
ｔＬ＝ａ×ＡＣ＋ｂ  ・・・（１）
但し、ａおよびｂは、最小二乗法で算出された係数である。評価パラメータとしての平均投影面積ＡＣを（１）の直線の方程式に代入することにより、ラグタイムｔＬが算出される。【００７４】
以上により、平均投影面積からラグタイムを推定するための関係式が算出され、算出された関係式をコンピュータ３０に記憶して、ラグタイムを推定する処理に用いる。【００７５】
次に、第２の実施の形態として細胞の細胞凝集塊を形成する非単一細胞増加速度から最小倍化時間を算出する工程について図７に示すフローチャートを参照して説明する。【００７６】
細胞に対し増殖刺激を行うために抗体を固層化した培養容器４に、培養用培地に懸濁した細胞を接種して培養を開始する（ステップＳ４０）。コンピュータ３０は、培養開始から２４時間、４８時間、７２時間経過した後、ＬＥＤ電源装置２５に制御信号を出力して、培養容器４を介してＣＣＤカメラ２１の直上に位置するＬＥＤ照明装置２４を点灯するようにする。培養容器４上部より照明を行うことにより細胞および細胞凝集塊を形成する非単一細胞の画像を分析しやすくするためである。また、ＸＹＺステージ２２を移動して、ＣＣＤカメラ２１のレンズ先端部が例えば培養容器４の底面の中心付近に位置するようにステージドライバー２３を制御する（ステップＳ４１）。次に、培養容器４の底面よりＣＣＤカメラ２１にて培養開始から２４時間、４８時間、７２時間毎に画像撮影を行い、画像データをコンピュータ３０内のビデオメモリ回路３１に記憶するようにする（ステップＳ４２）。【００７７】
次に、ビデオメモリ回路３１に記憶した画像データを読み出して、二値化処理を行う。二値化処理した画像データから細胞の抽出を行い（ステップＳ４３）、抽出した細胞数の集計を行う（ステップＳ４４）。また、抽出した細胞の投影面積を測定する（ステップＳ４５）。【００７８】
次に、抽出した細胞を単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とに判別する。単一細胞と非単一細胞との判別は、投影面積が１００μｍ２以上のものを非単一細胞と判断する（ステップＳ４６）。なお、１００μｍ２以上のものを非単一細胞と判断する基準は、培養初期の単一細胞の投影面積が最大でも１００μｍ２未満であり、投影面積が１００μｍ２以上のものは、２つ以上の細胞が接触した状態であり、非単一細胞を形成していることに基づいている。なお、単一細胞と非単一細胞とを判別する細胞形態判別工程は、細胞形態判別手段としてのコンピュータ３０によって行われる。【００７９】
次に、判別した非単一細胞を抽出して、抽出した非単一細胞の数を集計する（ステップＳ４７）。全ての細胞の投影面積の測定が完了したかをチェックする（ステップＳ４８）。全ての細胞の投影面積を測定が完了後にステップＳ４４で集計した細胞数に対する非単一細胞の割合を算出する（ステップＳ４９）。培養開始から２４時間、４８時間、７２時間毎に算出した非単一細胞の割合の変化から非単一細胞の増加速度を算出する（ステップＳ５０）。なお、非単一細胞を抽出する抽出工程、非単一細胞の割合を算出する工程および非単一細胞の増加速度を算出する工程は、非単一細胞を抽出する抽出手段、非単一細胞の割合を算出する手段および非単一細胞の増加速度を算出する手段としてのコンピュータ３０によって行われる。【００８０】
次に、コンピュータは、算出した非単一細胞増加速度と最小倍化時間との関係式（以後に述べる（２）に示す直線の方程式）に算出した非単一細胞増加速度の値を代入して、最小倍化時間を算出する（ステップＳ５１）。なお、最小倍化時間を算出する最小倍化時間決定工程は、最小倍化時間決定手段としてのコンピュータ３０によって行われる。図８は、非単一細胞増加速度と最小倍化時間との関係を示すグラフである。非単一細胞増加速度と最小倍化時間との関係式は、図８に示す直線から導き出されたものである。【００８１】
すなわち、培養中の経時的な細胞画像を用いて細胞及び非単一細胞の投影面積を測定し、非単一細胞の割合を経時的に算出し、培養２４時間から７２時間における非単一細胞の増加速度を算出することにより、その培養区の細胞増殖能としての最小倍化時間を評価することが可能となる。【００８２】
次に、非単一細胞の増加速度を用いた最小倍化時間を推定するための関係式の算出について図８乃至図１２を参照して説明する。図９は、非単一細胞の増加速度を用いた最小倍化時間を評価推定するための関係式の算出する工程を示すフローチャート、図１０は、接種細胞濃度の違いによる培養区および検体の異なる培養区（Ａ〜Ｆ）におけるＬＡＫ細胞の最小倍化時間を示す図、図１１は、接種細胞濃度の異なる培養区（×０．５〜×５．０）における、培養時間に対す非単一細胞の割合の変化を示す図、図１２は、検体の異なる培養区（Ａ〜Ｆ）における培養時間に対す非単一細胞の割合の変化を示す図である。【００８３】
以下に、図９に示すフローチャートを参照して、最小倍化時間を推定するための関係式の算出するための手順を説明する。【００８４】
使用する細胞は、抗ＣＤ３抗体を固層化した培養容器４に自己血漿８％を含む培地および末梢血単核球を２．２×１０４個／ｃｍ２となるように接種し、３７℃、５％ＣＯ２  ａｉｒに維持されたインキュベータ３にて培養する（ステップＳ６０）。【００８５】
採取した検体数は７であり、そのうちの１つの検体で様々な接種細胞濃度（×０．５、×１．０、×３．０、×５．０）になるようにし、他の６個の検体にそれぞれをＡからＦの記号を割り当てる。なお、接種細胞濃度の×０．５、×３．０、×５．０のデータは２．２×１０４個／ｃｍ２を×１．０として１／２倍、３倍、５倍の密度となるように接種したものである。【００８６】
７日間の培養期間中２４時間ごとにサンプリングを行い、血球計算盤を用いて細胞数の計測を行う（ステップＳ６１）。２４時間ごとに４８時間における非単一細胞の増加速度を最小二乗法にて求め（増加速度を算出する工程）、細胞の倍化時間を算出する（倍化時間を算出する工程）。２４時間ごとの倍化時間のうち最も短い時間を最小倍化時間とする（ステップＳ６２、最も短い時間を最小倍化時間とする工程）。なお、増加速度を算出する工程、倍化時間を算出する工程および最も短い時間を最小倍化時間とする工程は、増加速度を算出する手段、倍化時間を算出する手段および最も短い時間を最小倍化時間とする手段としてのコンピュータ３０によって行われる。【００８７】
図１０は、接種細胞濃度の違いによる培養区（×０．５、×１．０、×３．０、×５．０）および検体の異なる培養区（Ａ〜Ｆ）におけるＬＡＫ細胞の最小倍化時間を示す図である。  【００８８】
図１０に示すように、接種細胞濃度の違いによる培養区（×０．５〜×５．０）の最小倍化時間は接種細胞濃度が高い培養区ほど小さな値を示すことが確認された。また検体の異なる培養区（Ａ〜Ｆ）では、様々な最小倍化時間を示し、検体ごとに細胞増殖能が異なることが示された。【００８９】
次に、ステップＳ６０と同様の手順で細胞培養を行い、各培養区において培養時間８４時間まで１２時間ごとに画像撮影を行い（ステップＳ６３）、撮像画像より投影面積の測定を行う（ステップＳ６４）。接種された細胞は、培養面に固層化された抗体により刺激を受け、細胞同士の接触を頻繁に行うことが確認される。細胞が培養面を転がるように移動し、他の細胞に出会うと細胞同士が接着し非単一細胞を形成するようになる。そして非単一細胞同士も積極的に合一し、さらに大きな非単一細胞を形成する。【００９０】
そこで培養初期の単一細胞の投影面積が最大でも１００μｍ２未満であることを利用して、投影面積が１００μｍ２以上のものを非単一細胞として判別する（ステップＳ６５）。投影面積が１００μｍ２以上のものは、２つ以上の細胞が接触した状態であり、細胞間接触が生じている状態であり、非単一細胞と判断する。次に、全細胞数に対する投影面積が１００μｍ２以上であった非単一細胞の割合を算出する（ステップＳ６６）。【００９１】
図１１は、接種細胞濃度の異なる培養区（×０．５〜×５．０）における、培養時間に対す非単一細胞の割合の変化を示す図である。図１２は、検体の異なる培養区（Ａ〜Ｆ）における培養時間に対す非単一細胞の割合の変化を示す図である。  【００９２】
図１１および図１２より接種細胞濃度の異なる培養区（×０．５〜×５．０）においては接種細胞濃度が増加するに伴い、非単一細胞の増加速度は速くなることが確認された。これは培養面積あたりの細胞数が増加することにより、細胞同士の接触頻度が増加し、積極的な細胞集塊形成が行われたと考えられる。また６検体の培養区（Ａ〜Ｆ）においては、検体ごとに初期の非単一細胞の割合および増加速度が異なっていることが示されている。【００９３】
次に細胞凝集塊形成挙動に基づいた、培養区の増殖能評価を試みた。図１１および図１２に示した非単一細胞の割合の経時的変化より、各培養区の培養２４時間から７２時間における非単一細胞増加速度を算出し（ステップＳ６７）、最小倍化時間との相関を調べる（相関係数を算出する工程）。その結果を図８に示す。最小倍化時間と非単一細胞の増加速度は、相関係数−０．９６４と非常に高い相関を示した。これは、細胞間接触の増加速度が速い培養区ほど倍化時間が短くなり、集団細胞増殖能が高くなることを示している。なお、算出した相関係数は、前もって設定した基準値と比較して、基準以上のもの（基準値を満たすもの）を選択するようにする。図１１および図１２から算出した非単一細胞の増加速度と図１０で得られた最小倍化時間から最小二乗法等により関係式を算出する（ステップＳ６８、関係式を算出する工程）。関係式は、非単一細胞の増加速度Ｖａ、最小倍化時間ｔｄに関する（２）に示す直線の方程式で表される。なお、相関係数を算出する工程および関係式を算出する工程は、相関係数を算出する手段および関係式を算出する手段としてのコンピュータ３０によって行われる。【００９４】
ｔｄ＝ｃ×Ｖａ＋ｄ  ・・・（２）
但し、ｃおよびｄは、最小二乗法で算出された係数である。評価パラメータとしての非単一細胞の増加速度Ｖａを（２）の直線の方程式に代入することにより、最小倍化時間ｔｄが算出される。【００９５】
以上により、非単一細胞の増加速度から最小倍化時間を推定するための関係式が算出され、算出された関係式をコンピュータ３０に記憶して、最小倍化時間を推定する処理に用いる。【００９６】
以上説明したように、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムによれば、ラグタイムを推定評価することにより、接種した細胞の増殖開始時期が推測可能となり、増殖能が著しく低下した細胞を判定でき、培養継続の有無について判断することが可能となる。【００９７】
また、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムによれば、最小倍化時間を推定評価することにより、その細胞の増殖能が推定できるようになり、細胞の増殖に合わせて培地を追添加する時間や培養容器を変える時間などが予測可能となる。そのため培養のスケジューリングが可能となる。【００９８】
更に、推定評価した培養系のラグタイムまたは最小倍化時間があまりにも長い場合にはそれにあわせた処置を迅速に行うことが可能となる。【００９９】
また、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムによれば、オーダーメイド医療での患者から採取される細胞を培養する際には、細胞を破壊、侵襲することなしに、細胞増殖能としてのラグタイム、最小倍化時間を短期間で効率よく推定評価することができる。【０１００】
以上、細胞増殖能としてのラグタイム、最小倍化時間の推定評価について述べたが、次に、第３の実施の形態として、接種した細胞集団が増殖刺激されたかを判定する工程について図１３に示すフローチャートを参照して説明する。接種した細胞集団が増殖刺激されたかを自動的に判定することができれば、細胞培養における細胞を増殖刺激用の培養容器から次の段階の増殖用の容器に移すための判断を客観的かつ的確に行うことが可能となる。【０１０１】
接種した細胞集団が増殖刺激されたかの判定は、まず培養中の細胞集団の画像を取得し、次に画像内の非単一細胞を抽出し、非単一細胞の割合を算出することによって行われ、具体的には算出された非単一細胞の割合を予め設定した閾値（例えば非単一細胞の割合が５０〜１００％）と比較することによって行われる。【０１０２】
図１３は、接種した細胞集団が増殖刺激されたかを判定する工程を示すフローチャートである。なお、図１３に示すフローチャートと、図７に示す細胞の非単一細胞増加速度から最小倍化時間を算出する工程のフローチャートと重複する個所については、説明を簡略し、異なる工程について詳述する。【０１０３】
図１３に示すように、最初に、細胞に対し増殖刺激を行うために抗体を固層化した培養容器４に、培養用培地に懸濁した細胞を接種して培養を開始する（ステップＳ７０）。図１に示すコンピュータ３０は、培養経過時間を監視して（ステップＳ７１）、培養開始から１２時間経過毎に、ＬＥＤ電源装置２５に制御信号を出力して、培養容器４を介してＣＣＤカメラ２１の直上に位置するＬＥＤ照明装置２４を点灯し、また、ＸＹＺステージ２２を移動して、ＣＣＤカメラ２１のレンズ先端部が例えば培養容器４の底面の中心付近に位置するようにステージドライバー２３を制御する（ステップＳ７２）。次に、培養容器４の底面よりＣＣＤカメラ２１にて画像撮影を行い、画像データをコンピュータ３０内のビデオメモリ回路３１に記憶するようにする（ステップＳ７３）。【０１０４】
次に、ビデオメモリ回路３１に記憶した画像データを読み出して、二値化処理を行う。二値化処理した画像データから細胞の抽出を行い（ステップＳ７４）、抽出した細胞数の集計を行う（ステップＳ７５）。また、抽出した細胞の投影面積を測定する（ステップＳ７６）。【０１０５】
次に、抽出した細胞を単一細胞と細胞凝集塊を形成する非単一細胞とに判別する。単一細胞と非単一細胞細との判別は、投影面積が１００μｍ２以上のものを非単一細胞と判断する（ステップＳ７７）。なお、単一細胞と非単一細胞細とを判別する細胞形態判別工程は、細胞形態判別手段としてのコンピュータ３０によって行われる。【０１０６】
次に、判別した非単一細胞を抽出して、抽出した非単一細胞の数を集計する（ステップＳ７８）。全ての細胞の投影面積の測定が完了したかをチェックする（ステップＳ７９）。全ての細胞の投影面積を測定が完了後にステップＳ７５で集計した細胞数に対する非単一細胞の割合を算出して、培養開始からの培養時間と共にコンピュータのメモリに記憶する（ステップＳ８０）。【０１０７】
次に、コンピュータ３０は、算出した非単一細胞の割合を前もって設定した非単一細胞の割合の閾値と比較して（ステップＳ８１）、非単一細胞の割合が閾値未満の場合には、培養時間が前もって設定した培養期限を越えているかをチェックする（ステップＳ８２）。培養時間が培養期限を越えている場合には、培養中の細胞集団が増殖刺激されていないと判定して、表示装置等に細胞集団の増殖刺激なしのメッセージを発するようにする（ステップＳ８３）。培養時間が培養期限以内の場合には、ステップＳ７１に移行して、培養時間が１２時間経過した後再度ステップＳ７２以後を実行する。なお、非単一細胞の割合の閾値は、図１１又は図１２の培養時間に対す非単一細胞の割合の変化を示す図等から決定するようにする。【０１０８】
また、ステップＳ８１の比較処理で非単一細胞の割合が閾値以上の場合には、コンピュータ３０は培養中の細胞集団が増殖刺激されたと判定して、表示装置等に細胞集団の増殖刺激完了のメッセージを発するようにする。これにより、細胞集団が増殖刺激されたことが判定されて、細胞培養における細胞を増殖刺激用の培養容器から次の段階の増殖用の容器に移すことが可能となる（ステップＳ８４）。【０１０９】
なお、図１３に示す接種した細胞集団が増殖刺激されたかを判定する工程では、培養時間毎の非単一細胞の割合が算出されてメモリに記憶されており、このデータを使用して非単一細胞増加速度が算出することができるため、最小倍化時間を算出することも可能である。【０１１０】
以上述べたように、本発明による細胞培養評価システム、細胞培養評価方法および細胞培養評価プログラムによれば、非単一細胞の割合から、細胞集団が増殖刺激をされたかを判定することができ、細胞培養を次の段階へ移行するための（例えば、細胞を増殖刺激用の培養容器から増殖用の容器に移す）判断を客観的かつ的確に行うことが可能となる。【０１１１】
更に、非単一細胞の割合から細胞集団が増殖刺激されていないと判定される場合にはそれにあわせた処置を迅速に行うことが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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