(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４糖のヒアルロン酸オリゴ糖を含有し、かつ、下記（１）〜（７）に示す理化学的性質を有することを特徴とする画分。
（１）当該画分を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて以下の（ａ）および（ｂ）に記載した検出方法により分析すると、いずれの方法によっても実質的に単一なピークを示し、かつ当該ピークの面積が以下の（ａ）および（ｂ）に示す通りとなる。
（ａ）２１０ｎｍの吸収で検出した場合、画分中の全ＨＡオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が８５％以上である。
（ｂ）示差屈折計で検出した場合、画分中の全ＨＡオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が９８％以上である。
（２）当該画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて２１０ｎｍの吸収で検出して分析すると、実質的に単一なピークを示し、かつ、画分中の全ヒアルロン酸オリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が９０％以上である。
（３）当該画分を蛍光標識した後、これを電気泳動によって分析すると、単一なバンドを示し、かつ、他のサイズのＨＡオリゴ糖のバンドが検出されない。
（４）当該画分を構成するＨＡオリゴ糖のモノアイソトピック分子量又は平均分子量の理論値を１とした場合、当該画分の質量分析による実測値が０．９９７〜１．００３（相対値）である。
（５）当該画分を構成するＨＡオリゴ糖における炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）および窒素（Ｎ）のそれぞれの含量比の理論値（重量％）と、当該画分を元素分析することによって得られるそれぞれの元素の実測値（重量％）との差が、いずれも±１（重量％）である。
（６）タンパク質およびＤＮＡの含量が検出限界以下であり、エンドトキシンの含量が０．５ｐｇ／ｍｌ以下である。
（７）当該画分の  １Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ測定の結果が、下記式（１）で示されるＨＡオリゴ糖の構造と矛盾しない。
【化１】
式（１）
0004861596.tif 000015
（式中、ｎ＝１であり、Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示し、Ａｃはアセチル基を示す。）
【請求項２】
請求項１記載の画分を使用したヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分とする医薬。
【請求項３】
医薬が、熱ショック蛋白質発現増強剤、細胞死抑制剤、細胞障害抑制剤、及び細胞・組織保護剤から選ばれるものである、請求項２記載の医薬。
【請求項４】
細胞・組織保護剤が、臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝障害処置剤、ＩＬ−１０産生促進剤、及びＩＬ−８産生抑制剤から選ばれるいずれかの剤であることを特徴とする、請求項３記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒアルロン酸オリゴ糖（以下、「ＨＡオリゴ糖」ともいう）およびその新規な画分に関する。
また本発明は、このＨＡオリゴ糖を有効成分とする医薬（特に、熱ショック蛋白質発現増強剤、細胞死抑制剤、細胞障害抑制剤、又は細胞・組織保護剤（特に、臓器保存剤、潰瘍処置剤、及び肝障害処置剤、ＩＬ−１０産生促進剤、又はＩＬ−８産生抑制剤の用途に用いられるもの）に関する。
背景技術
ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」ともいう）は、その分子サイズに依存して活性や機能が変化することが知られている。例えば、分子量１２０万のＨＡにはＮＦ−κＢの不活性化作用、血管新生抑制作用等が認められるが［Ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｕｍａｎｎ  Ａ，Ｓｃｈｉｎｚｅｌ  Ｒ，Ｐａｌｍ  Ｄ，Ｒｉｅｄｅｒｅｒ  Ｐ，Ｍｕｎｃｈ  Ｇ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９９  Ｊｕｎ  ２５；４５３（３）：２８３−７；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＮ，Ｂｅｅｂｅ  ＤＣ．Ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：１１７７−１１７９，１９８３．］、分子量５０万以下のＨＡは、それらとは逆の活性があることが報告されている［Ｎｏｂｌｅ  ＰＷ，ＭｃＫｅｅ  ＣＭ，Ｃｏｗｍａｎ  Ｍ，Ｓｈｉｎ  ＨＳ．Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ａｎ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ／Ｉ−ｋａｐｐａＢ  ａｌｐｈａ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｏｏｐ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：２３７３−２３７８，１９９６．；Ｗｅｓｔ  ＤＣ，Ｓｈａｗ  ＤＭ．Ｔｕｍｏｕｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｉｎ：Ｌａｕｒｅｎｔ  ＴＣ，ｅｄ．Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８：２２７．］。
このことは、ＨＡオリゴ糖についても多彩な活性が見出される可能性や、ＨＡオリゴ糖のサイズに依存して特異的な活性が見出される可能性を十分に示唆するものといえる。したがって、サイズが異なるＨＡオリゴ糖を組み合わせた場合、相加的・相乗的効果を発揮する場合もありうるし、逆に、あるサイズのＨＡオリゴ糖の活性に対して、別のサイズのＨＡオリゴ糖がアンタゴニストとして作用することも考えられる。
そうすると、まずＨＡオリゴ糖の医薬開発に向けた活性探索の段階において種々のサイズのＨＡオリゴ糖が混在している画分を用いていたのでは、どのサイズのＨＡオリゴ糖が活性本体なのか見出せないばかりか、あるサイズのＨＡオリゴ糖の活性が別のサイズのＨＡオリゴ糖によって打ち消されてしまう可能性もあり、ＨＡオリゴ糖に秘められた重要な生理活性や機能を見逃してしまう可能性がある。
また、ある特定のサイズのＨＡオリゴ糖を医薬として用いる場合にも、そのＨＡオリゴ糖が発揮する機能を妨げるような他のサイズのオリゴ糖を可及的に排除することが必要であり、また、医薬として望ましくない物質を実質的に含有しない、純度が高い画分が求められる。
以上の通り、新規な医薬の創製や提供にあたり、実質的に単一のサイズのＨＡオリゴ糖からなり、他のサイズのＨＡオリゴ糖やその他の不純物を実質的に含有しない高純度のＨＡオリゴ糖画分が求められていた。
一方、熱ショック蛋白質（以下、Ｈｓｐともいう）はストレス蛋白質とも呼ばれ、種々のストレス反応によって生じる障害を防御する蛋白質であり、種々のファミリーが知られている。その中の１つであるＨｓｐ７０ファミリーの熱ショック蛋白質は、熱ショック、過酸化水素、重金属、アミノ酸アナログ、グルコース飢餓などの環境ストレスを生じさせる因子や、発熱、炎症、虚血、ウイルス感染、代謝疾患、心肥大症、酸化的ストレス、細胞組織障害、癌遺伝子や発癌物質などのストレス因子によって生じる蛋白質の構造変化、異常蛋白質の産生などを抑制したり、蛋白質の機能を再生するなどの働きによって、細胞障害や細胞死を防止すると考えられている。
これに関連して、特開平９−２２７３８６号公報には、ＨＡを有効成分とするストレス蛋白質発現増強剤が開示されている。同公報には、その活性成分として２〜２０糖程度のＨＡが好ましい旨（第３頁）、１０糖以下のＨＡがストレス蛋白質の発現の増強あるいは誘導に関与していることが示唆される旨（第６頁）が記載されている。さらにＨＡ不飽和二糖が、ストレス蛋白質の発現を増強し、細胞死を抑制することを示す実験も記載されている（実施例２）。
しかし、本発明のような各種オリゴ糖についての具体的な開示はなく、また後述するＨＡ４糖に特異的に見られる極めて顕著なストレス蛋白質発現増強についても何等開示あるいは示唆されていない。
また、前記のストレス蛋白質の機能からすると、ストレス蛋白質は細胞・組織の保護にも関与していると考えられる。
これに関連しては、特開平１１−２４６３０１号公報には、ＨＡ及び／又はその生理学的に許容される塩を含有してなる移植向けの臓器保存溶液が記載されている。同公報には、ＨＡの平均分子量は１０万以上であることが好ましい旨記載されているが、ＨＡオリゴ糖、およびこれが発揮する優れた効果については記載もないし示唆もない。
発明の開示
本発明は、４糖〜６０糖程度のサイズを有するＨＡオリゴ糖、特に、実質的に単一のサイズのＨＡオリゴ糖からなり、他のサイズのＨＡオリゴ糖やその他の不純物を実質的に含有しない画分を提供することを目的とする。
また本発明は、このようなＨＡオリゴ糖を有効成分とする有用な医薬、特に、より効果が高いＨｓｐ発現増強剤、細胞死抑制剤及び細胞障害抑制剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、優れた細胞・組織保護剤を提供し、これを利用した臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝疾患処置剤、ＩＬ−１０産生促進剤およびＩＬ−８産生抑制剤を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、４糖〜６０糖から選択されるＨＡオリゴ糖、及びこれらオリゴ糖の混合物を特定の方法で分離分画することにより、実質的に目的サイズのオリゴ糖のみからなり、他のサイズのオリゴ糖その他の不純物を実質的に含有しない新規な画分を取得するに至った。
すなわち本発明は、４糖〜６０糖から選択されるサイズを有するＨＡオリゴ糖（以下、「本発明オリゴ糖」ともいう）を提供する。
また本発明は、本発明オリゴ糖を含有し、かつ、下記（１）〜（６）に示す理化学的性質を有することを特徴とする画分（以下、「本発明画分」ともいう）を提供する。
（１）当該画分を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて以下の（ａ）および（ｂ）に記載した検出方法により分析すると、いずれの方法によっても実質的に単一なピークを示し、かつ当該ピークの面積が以下の（ａ）および（ｂ）に示す通りとなる。
（ａ）２１０ｎｍの吸収で検出した場合、画分中の全ＨＡオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が８５％以上である。
（ｂ）示差屈折計で検出した場合、画分中の全ＨＡオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が９８％以上である。
（２）当該画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて２１０ｎｍの吸収で検出して分析すると、実質的に単一なピークを示し、かつ、画分中の全ヒアルロン酸オリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が９０％以上である。
（３）当該画分を蛍光標識した後、これを電気泳動によって分析すると、単一なバンドを示し、かつ、他のサイズのＨＡオリゴ糖のバンドが検出されない。
（４）当該画分を構成するＨＡオリゴ糖のモノアイソトピック分子量又は平均分子量の理論値を１とした場合、当該画分の質量分析による実測値が０．９９７〜１．００３（相対値）である。
（５）当該画分を構成するＨＡオリゴ糖における炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）および窒素（Ｎ）のそれぞれの含量比の理論値（重量％）と、当該画分を元素分析することによって得られるそれぞれの元素の実測値（重量％）との差が、いすれも±１（重量％）である。
（６）タンパク質、ＤＮＡおよびエンドトキシンを実質的に含有しない。
本発明画分はさらに、下記（７）に示す理化学的性質を有することが好ましい。
（７）当該画分の１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ測定の結果が、下記式（１）で示されるＨＡオリゴ糖の構造と矛盾しない。
式（１）
0004861596.tif 000002
（式中、ｎは１〜２９の整数であり、Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示し、Ａｃはアセチル基を示す。）
本発明画分に含まれるＨＡオリゴ糖のサイズは４糖〜２０糖から選択されることが好ましく、４糖〜１６糖から選択されることがより好ましく、４糖〜１４糖から選択されることがさらに好ましく、４糖であることが特に好ましい。
また本発明者らは、本発明オリゴ糖の医薬としての可能性を探索した結果、所定サイズのＨＡオリゴ糖が、極めて顕著なＨｓｐの発現増強作用、細胞死抑制作用及び細胞障害抑制作用を有することを見出し、これにより上記課題を解決しうるＨｓｐ発現増強剤、細胞死抑制剤及び細胞障害抑制剤を提供するに至った。
さらに本発明者らは、本発明オリゴ糖が優れた細胞・組織保護作用を発揮することを見出して細胞・組織保護剤を提供するに至り、さらにこれを用いた臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝障害処置剤、ＩＬ−１０産生促進剤およびＩＬ−８産生抑制剤を提供するに至った。
すなわち本発明は、本発明オリゴ糖を有効成分とする医薬（医薬組成物、以下、「本発明医薬」ともいう）を提供する。この医薬は、Ｈｓｐ発現増強剤、細胞死抑制剤、細胞障害抑制剤、又は細胞・組織保護剤であることが好ましい。
また細胞・組織保護剤は、臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝障害処置剤、ＩＬ−１０産生促進剤、又はＩＬ−８産生抑制剤としての用途に使用されることが好ましい。
本発明医薬及びこれらの剤は、４糖〜２０糖のサイズから選択されるＨＡオリゴ糖を有効成分とすることが好ましく、４糖〜１６糖のサイズから選択されるＨＡオリゴ糖を有効成分とすることがより好ましく、４糖〜１４糖のサイズから選択されることがさらに好ましく、ＨＡ４糖を有効成分とすることが特に好ましい。
上記の通り、ＨＡオリゴ糖の生理活性・機能についての報告はこれまでにも存在した。しかし、分子サイズ・分子構造・純度（他の分子サイズの混入度合い、蛋白質、ＤＮＡなど他の成分の混入度合い、エンドトキシン含有量）等、多角的に保証されたＨＡオリゴ糖を使用している例は、これまでに認められておらず、すなわち、これまでのＨＡオリゴ糖の生理活性・機能の報告においては、混入物の影響が否定されていなかったものである。これに対し、本発明においては、蛋白質、ＤＮＡなど他の成分が実質的に含まれていないＨＡオリゴ糖、さらにはそのようなＨＡオリゴ糖であってかつ実質的に他の分子サイズを含まない特定のサイズのＨＡオリゴ糖の画分を取得し、それらの生理活性・機能を明らかにしたものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明オリゴ糖
本発明オリゴ糖は、４糖〜６０糖から選択されるサイズを有するＨＡオリゴ糖である。
ここで「ＨＡオリゴ糖」とは、ＨＡの構成二糖組成と同様の組成からなるオリゴ糖である。具体的にはＨＡの構成単糖であるグルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とが交互にグリコシド結合しているオリゴ糖を意味する。
すなわち、前記の式（１）で示される構造で代表される非還元末端がグルクロン酸であるオリゴ糖の他、非還元末端がＮ−アセチルグルコサミンであるオリゴ糖もＨＡオリゴ糖に包含される。
非還元末端に位置する糖は、飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含まないもの）でも不飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含むもの）でもよい。なお、以下の説明において、ＧｌｃＡは飽和グルクロン酸を、ΔＧｌｃＡは不飽和グルクロン酸を示すものとする。
なかでも非還元末端に位置する糖が飽和糖であるものが好ましく、具体的には下記式（２）で示されるＨＡオリゴ糖が好ましい。
ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）ｎ−ＧｌｃＮＡｃ    （２）
（式中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは１〜２９の整数を示す。）
上記式（２）のＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃにおけるグリコシド結合はβ１→３結合であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡにおけるグリコシド結合はβ１→４結合であることが好ましい。
そのなかでも、下記式（１）で示されるＨＡオリゴ糖が特に好ましい。
式（１）
0004861596.tif 000003
（式中、ｎは１〜２９の整数であり、Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示し、Ａｃはアセチル基を示す。）
ただし、後述の実施例に示すように非還元末端に位置する糖が不飽和糖であるものも有意な生理活性を示すものであり、それらも本発明の好ましい態様である。具体的な一例としては下記式で示されるＨＡオリゴ糖が挙げられる。
0004861596.tif 000004
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
上記式で示される非還元末端に不飽和糖を有するＨＡオリゴ糖は後記実施例で使用したΔＨＡ４に相当する。
また、本発明オリゴ糖は塩の形態であってもよく、電離した状態であってもよい。塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩、ガラクトサミン塩、グルコサミン塩等の有機塩基との塩が例示される。なかでもアルカリ金属塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。
本発明オリゴ糖の由来は特に限定されない。例えば、鶏冠、臍帯、豚皮、牛皮、魚類その他の動物の皮、大動脈等や、ＨＡを産生する微生物等から分離、精製されたＨＡを分解処理（例えば酵素分解、化学分解、加熱処理、超音波処理等）する工程を経て製造されるものであってもよい。また、合成（例えば化学合成や酵素合成）の工程を経て製造されるものであってもよい。
酵素分解法としては、ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来）、ヒアルロニダーゼＳＤ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、エンドグルクロニダーゼ（ヒル由来）などのＨＡを分解する酵素をＨＡに作用させる方法が挙げられる（新生化学実験講座「糖質ＩＩ−プロテオグリカンとグリコサミノグリカンー」ｐ２４４−２４８、１９９１年発行、東京化学同人  参照）。上記式（１）のＨＡオリゴ糖を得るためには、ＨＡを分解する酵素として加水分解酵素を用いることが好ましい。
化学分解法としては、アルカリ分解法やジメチルスルホキシド法（ＤＭＳＯ法）等が挙げられる。アルカリ分解法は、具体的には、例えばＨＡの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和することにより行うことができる。ＤＭＳＯ法としてはＮａｇａｓａｗａらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１４１，ｐ９９−１１０，１９８５）が挙げられる。また、塩酸や硫酸等の酸によって加水分解することもできる。
超音波処理法としてはＢｉｏｃｈｅｍ．，３３，ｐ６５０３−６５０７（１９９４）等に記載された方法が挙げられる。
合成による製造方法としてはＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．，ｐ４５３−４３９（１９９３）、国際公開ＷＯ９３／２０８２７等に記載された方法が挙げられる。
このようにして製造された本発明オリゴ糖は、所望の純度に精製することができる。例えば以下に説明するように、実質的に単一のサイズの本発明オリゴ糖からなり、他のサイズのＨＡオリゴ糖その他の不純物を実質的に含有しない程度にまで精製することもできる。
＜２＞本発明画分
本発明画分は、本発明オリゴ糖を含有する画分であって、後述する特定の理化学的性質を有するものである。
前記＜１＞に記載の方法によって本発明オリゴ糖（本発明オリゴ糖を含む画分。「本発明画分」とは異なる。）が得られるが、得られた画分には複数のサイズのＨＡオリゴ糖が混在している。一方本発明画分は、実質的に単一のサイズのＨＡオリゴ糖からなり、他のサイズのＨＡオリゴ糖その他の不純物を実質的に含有しない画分である。本発明画分は以下の方法によって製造することができる。
前記＜１＞に記載の方法によって得られる画分（種々のサイズのオリゴ糖が混在する画分）を、強塩基性陰イオン交換体のカラムにアプライする。強塩基性陰イオン交換体としては、トリメチルアンモニウム基、トリメチルアンモニオメチル基、β−ヒドロキシエチルジメチルアンモニウム基、２−ヒドロキシプロピルアミノ基、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル基、ジメチルエタノールアンモニウム基等を有する陰イオン交換体が例示されるが、トリメチルアンモニオメチル基を有する陰イオン交換体が好ましい。
カラムのサイズはアプライする量等に応じて適宜設定できるが、小スケールの調製の際にはカラム直径１〜５ｃｍ、カラム長５０〜１５０ｃｍ程度が好ましい。また、このようなカラムを２本以上組み合わせることが好ましい。
複数のサイズのＨＡオリゴ糖が混在する画分をこのようなカラムにアプライすると、画分中に含まれるＨＡオリゴ糖がカラム中の強塩基性陰イオン交換体にイオン結合する。
結合したＨＡオリゴ糖は、塩の濃度勾配によって溶出することができる。溶出に用いる塩は特に限定されず、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ等を用いることができるが、ＮａＣｌを用いることが好ましい。
また塩の濃度勾配は、塩濃度０〜０．１Ｍ程度から開始し、０．５Ｍ程度まで上昇させることが好ましい。また塩濃度勾配は直線であることが好ましく、好ましくは０．１Ｍ／４０〜５０時間、より好ましくは０．１Ｍ／４５〜５０時間程度で塩濃度を上昇させる。
また流速は好ましくは８０〜１００ｍｌ／時間、より好ましくは８５〜９５ｍｌ／時間程度とする。
このようなクロマトグラフィー条件を選択することにより、強塩基性陰イオン交換体にイオン結合したＨＡオリゴ糖が、そのサイズの小さいものから順番に溶出する。このことから、ＨＡオリゴ糖の強塩基性陰イオン交換体への結合力はＨＡオリゴ糖のサイズにほぼ比例していると考えられ、その結果、塩の濃度勾配を負荷することによって結合力が弱いオリゴ糖（サイズの小さいオリゴ糖）から順番に溶出されるものと考えられる。本発明画分は、このような強塩基性陰イオン交換体とＨＡオリゴ糖との結合・溶出特性を利用することによって初めて提供されたものである。この方法によれば、高い分離能で、かつ１回のカラム操作により各種サイズのＨＡオリゴ糖を簡便に分離することができ、実質的に単一のサイズのＨＡオリゴ糖からなり、他のサイズのＨＡオリゴ糖やその他の不純物を実質的に含有しない高純度のＨＡオリゴ糖画分（本発明画分）を効率よく製造することができる。
本発明画分に含まれるＨＡオリゴ糖は、４糖〜２０糖のサイズから選択されることが好ましく、４糖〜１６糖のサイズから選択されることがより好ましく、４糖〜１４糖のサイズから選択されることがさらに好ましく、４糖であることが特に好ましい。
このようにして得られた本発明画分は、再度上記のクロマトグラフィーのステップに付してもよい。また、濃縮、脱塩、その他の処理に付してもよい。
本発明画分の保存・流通形態等は特に限定されず、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態のいずれの状態であってもよい。
また、本発明画分中のＨＡオリゴ糖は塩の形態であってもよく、電離した状態であってもよい。塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩、ガラクトサミン塩、グルコサミン塩等の有機塩基との塩が例示される。なかでもアルカリ金属塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。本発明画分を後述の本発明医薬に用いる場合には、これらの塩のうち薬学的に許容される塩を用いることができる。この場合もナトリウム塩であることが特に好ましい。
このようにして得られる本発明画分は、下記（１）〜（６）に示す理化学的性質を全て満たしていることを特徴とする。なお、以下の理化学的性質に示された数値等は、試験や実験の条件、環境、使用機器、試験者の熟練度、その他の要因等によって多少変化しうるものである。従って当該数値は、その数値に厳密に限定されるものではなく、実験条件等による多少の測定結果の違い（当業者に常識的な範囲での数値の相違；当業者が同一の画分であると認識可能な程度の数値の相違）が存することを考慮して解釈すべきものである。
（１）ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて以下の（ａ）および（ｂ）に記載した検出方法により分析すると、いずれの方法によっても実質的に単一なピークを示し、かつ当該ピークの面積が以下の（ａ）および（ｂ）に示す通りとなる。
（ａ）２１０ｎｍの吸収で検出した場合、画分中の全ＨＡオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が８５％以上である。この相対面積は、９０％以上であるものが好ましく、９５％以上であるものがより好ましい。
（ｂ）示差屈折計（以下、「ＲＩ」と略すこともある。）で検出した場合、画分中の全ＨＡオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が９８％以上である。
この理化学的性質は、この画分が実質的に単一のサイズのＨＡオリゴ糖分子から構成されていることを示すものである。また、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものである。
なお、本明細書において「実質的に単一」とは、「完全に単一」の意ではなく、「当業者において単一であると認識される」ことを意味するものである。例えば、一般に、大きいサイズのオリゴ糖においては他のサイズのオリゴ糖を全く含まない画分とすることは困難であり、このことは当技術分野の常識であるといえる。よって、サイズの大きいオリゴ糖画分のクロマトグラフィー分析や質量分析等において、当該オリゴ糖に由来する主要なピークの他に、他のサイズのオリゴ糖に由来する小さなピークが存在したとしても、オリゴ糖のサイズを勘案すると、実質的に単一のピークであると認識されるのが通常である。従って、このような場合には「実質的に単一なピーク」ということができる。
（２）当該画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて２１０ｎｍの吸収で検出して分析すると、実質的に単一なピークを示し、かつ、画分中の全ヒアルロン酸オリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が９０％以上である。この相対面積は、９５％以上であるものが好ましい。
この理化学的性質は、この画分が実質的に単一の電荷を有するＨＡオリゴ糖分子から構成されていること、すなわち均質なＨＡオリゴ糖から構成されていることを示すものである。また、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものである。
なお、例えば式（１）に示す通り、ＨＡオリゴ糖分子中には規則的にカルボキシル基が存在しており、この基は溶液中で電離して−ＣＯＯ−イオンとなる。従って、一定サイズのＨＡオリゴ糖分子中に含まれている−ＣＯＯ−イオンの数は一定であるといえる。従って、画分を構成するＨＡオリゴ糖の電荷が実質的に単一であるということは、実質的に単一のサイズのＨＡオリゴ糖から構成されていることをも示している。
（３）当該画分を蛍光標識した後、これを電気泳動によって分析すると、単一なバンドを示し、かつ、他のサイズのＨＡオリゴ糖のバンドが検出されない。
このことは、クロマトグラフィー以外の手法（電気泳動法）による分析によっても、この画分が実質的に単一のサイズのＨＡオリゴ糖分子から構成されていることが明らかにされることを示すものであり、クロマトグラフィーによる分析の結果を支持するものである。また、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものでもある。
（４）当該画分を構成するＨＡオリゴ糖のモノアイソトピック分子量又は平均分子量の理論値を１とした場合、当該画分の質量分析による実測値がいずれも０．９９７〜１．００３（相対値）である。なお、この相対値は、０．９９８〜１．００２の範囲にあることが好ましく、０．９９９〜１．００１の範囲にあることがより好ましい。
このことは、画分を構成するＨＡオリゴ糖が、分子量（質量）的にも実質的に単一であり、かつ、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものでもある。
（５）当該画分を構成するＨＡオリゴ糖における炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）および窒素（Ｎ）のそれぞれの含量比の理論値（重量％）と、当該画分を元素分析することによって得られるそれぞれの元素の実測値（重量％）との差が、いずれも±１（重量％）である。
また、ＨＡオリゴ糖がナトリウム塩である場合には、さらにナトリウム（Ｎａ）についても同様に±１（重量％）であることが好ましい。
このことは、画分を構成するＨＡオリゴ糖が、元素組成的にも実質的に単一であり、かつ、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものでもある。
（６）タンパク質、ＤＮＡおよびエンドトキシンを実質的に含有しない。
本発明画分中のタンパク質の含有量は、当業者に周知慣用のタンパク質の測定法を用いて測定することができるが、ローリー法が好ましい。この方法によってタンパク質が検出できない場合（検出限界以下の場合）には、タンパク質を実質的に含有しないと判断される。
本発明画分中のＤＮＡの含有量は、当業者に周知慣用のＤＮＡの測定法を用いて測定することができるが、スレッシュホールド法が好ましい。この方法によってＤＮＡが検出できない場合（検出限界以下の場合）には、ＤＮＡを実質的に含有しないと判断される。
本発明画分中のエンドトキシンの含有量は、当業者に周知慣用のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。この方法によってエンドトキシンが検出できない場合（検出限界以下の場合）には、エンドトキシンを実質的に含有しないと判断される。
なお、本明細書において「実質的に含有しない」とは、不純物等が「１分子たりとも含まれていない」という意味ではなく、不純物が含まれていないと当業者に認識される程度（上記検出方法によっても検出できない程度）を意味するものである。仮に将来分析技術が進歩して分子単位での検出が可能となったとしても、この「実質的に含有しない」は、本願の記載内容等に基づいて解釈すべきものである。
さらに本発明画分の好ましい態様の一つにおいては、含まれる実質的に単一のサイズのＨＡオリゴ糖が、非還元末端に飽和グルクロン酸を有するものであり、その場合本発明画分はさらに下記（７）の性質を有する。
（７）当該画分の１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ測定の結果が、下記式（１）で示されるＨＡオリゴ糖の構造と矛盾しない。
式（１）
0004861596.tif 000005
（式中、ｎは１〜２９の整数であり、Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示し、Ａｃはアセチル基を示す。）
このことは、画分を構成するＨＡオリゴ糖が、上記式で示されるＨＡオリゴ糖であって、分子構造的にも実質的に単一であり、かつ、他の不純物を実質的に含有しないことをも示唆するものである。
＜３＞本発明医薬
本発明医薬は、本発明オリゴ糖を有効成分とする医薬である。
本発明医薬の有効成分として用いる本発明オリゴ糖や、その好ましい態様等は、前記＜１＞に記載した通りである。
なかでも、本発明オリゴ糖として４糖〜２０糖から選択されるサイズのもの（ＨＡ４糖〜ＨＡ２０糖）を用いることが好ましく、前記式（２）におけるｎが１〜９の整数から選択されるものを用いることがより好ましく、前記式（１）におけるｎが１〜９の整数から選択されるものを用いることが特に好ましい
より好ましくは、４糖〜１６糖から選択されるサイズの本発明オリゴ糖（ＨＡ４糖〜ＨＡ１６糖）を用いることが好ましく、前記式（２）におけるｎが１〜７の整数から選択されるものを用いることがより好ましく、前記式（１）におけるｎが１〜７の整数から選択されるものを用いることが特に好ましい。
さらに好ましくは、４糖〜１４糖から選択されるサイズの本発明オリゴ糖（ＨＡ４糖〜ＨＡ１４糖）を用いることが好ましく、前記式（２）におけるｎが１〜６の整数から選択されるものを用いることがより好ましく、前記式（１）におけるｎが１〜６の整数から選択されるものを用いることが特に好ましい。
なかでも本発明オリゴ糖として４糖のもの（ＨＡ４糖）を用いることが好ましく、前記式（２）におけるｎが１のものを用いることがより好ましく、前記式（１）におけるｎが１のものを用いることが特に好ましい。ＨＡ４糖を用いることにより、種々の優れた薬理作用を発揮させることができる。
なお、前記式（１）および（２）は、非還元末端に飽和グルクロン酸を有する本発明オリゴ糖を示すが、本発明医薬の具体的用途によっては、非還元末端に不飽和グルクロン酸を有する本発明オリゴ糖であってもよく、その場合の好ましいサイズも上記と同様である。
さらに好ましくは、本発明医薬の有効成分として本発明画分を用いる。製剤化に用いる本発明画分およびその好ましい態様は、前記＜２＞に記載した通りである。また、本発明画分に含有されるＨＡオリゴ糖の好ましいサイズについても、前記と同様である。
本発明画分を用いることにより、本発明医薬中のＨＡオリゴ糖の含有率を高めることができ、また医薬として混入が許されない物質を実質的に含有しない本発明医薬を製造することができる。
本発明医薬は公知の方法により製剤化することができる。製剤化にあたり、本発明医薬の有効成分であるＨＡオリゴ糖に悪影響を与えず、かつ本発明医薬の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。
なお、本発明医薬は、有効成分として本発明画分を含むことが好ましいが、４糖〜６０糖から選択されるサイズを有するＨＡオリゴ糖を有効成分とすることから、少なくともこのようなＨＡオリゴ糖が有効量含有されていればよく、本発明医薬の効果に影響を与えない限りにおいては、他の分子サイズのＨＡオリゴ糖や、オリゴ糖の域を超えるサイズのＨＡを含んでいても差し支えない。
本発明医薬は、Ｈｓｐの発現増強用途、細胞死抑制用途、細胞障害抑制用途、又は細胞・組織保護用途の医薬であることが好ましく、これらの用途に応じて以下のような剤とすることができる。
［１］Ｈｓｐ発現増強剤
本明細書における「発現増強」という用語は、「発現量の増加」及び「活性の増強」の双方の意味を包含する。したがって、本明細書における「熱ショック蛋白質発現増強剤」（Ｈｓｐ発現増強剤）という用語は、「熱ショック蛋白質（Ｈｓｐ）の発現量を増加させる剤」及び「Ｈｓｐの活性を増強させる剤」の双方の意味を包含する。
（１）Ｈｓｐ発現増強剤の投与方法・剤形等
本発明医薬をＨｓｐ発現増強剤とする場合、ＨＡオリゴ糖のうち４糖のものを用いることが極めて好ましい。これによって、極めて優れたＨｓｐ発現増強作用が発揮される。
Ｈｓｐ発現増強剤の投与方法は、ＨＡオリゴ糖によるＨｓｐ発現増強効果が発揮される限りにおいて特に限定されないが、例えば注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等が挙げられる。また、このような投与方法に応じて適宜剤形を選択することができ、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等を採用することができる。
Ｈｓｐ発現増強剤中のＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）の含量も特に限定されないが、例えば、Ｈｓｐ発現増強剤を注射剤として提供する場合には、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とするのが好ましい。
例えば、Ｈｓｐ発現増強剤を注射剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、または凍結乾燥物のいずれであってもよい。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤として投与することができる。
前記の通り、Ｈｓｐ発現増強剤の有効成分としては特にＨＡ４糖が好ましいが、さらに他の分子サイズのＨＡオリゴ糖を含んでいても差し支えない。しかし後述の実施例からも明らかな通り、ＨＡ４糖が特異的に極めて顕著なＨｓｐ発現増強作用を示すことから、Ｈｓｐ発現増強剤中のＨＡ４糖の含有率を上げればそれだけ高い効果を得ることができ、また他の分子サイズのＨＡオリゴ糖と同一の効果を維持しつつ投与量を減少させることができる。従って、Ｈｓｐ発現増強剤中のＨＡオリゴ糖は実質的に４糖のみからなるものが特に好ましく、ＨＡ４糖以外のＨＡオリゴ糖は添加しないことが望ましい。
（２）Ｈｓｐ発現増強剤の投与対象等
Ｈｓｐ発現増強剤は、細胞の障害又は細胞死などに起因する疾患において、Ｈｓｐによる防御作用が示唆される多くの疾患、例えば心臓疾患（心筋梗塞など）、尿細管障害、循環器疾患、脳疾患（脳卒中など）、神経疾患などの血管狭窄や虚血による虚血性疾患、後天性免疫不全症候群、免疫抑制剤や抗癌剤の投与による胸腺細胞の障害、末梢Ｔ細胞の減少、免疫不全症等の免疫関連疾患、肝炎、潰瘍性大腸炎などの炎症、外傷、細菌感染症、ウイルス感染症、アルツハイマー病、糖尿病、肥大症、川崎病、精神分裂病、発熱、代謝疾患、癌などへの効果が期待される。
また細胞の障害又は細胞死などに起因する疾患のみならず、Ｈｓｐによる細胞・組織保護作用が期待される対象に対してもＨｓｐ発現増強剤を適用することができる。この点については、後述する「細胞・組織保護剤」において詳述する。
Ｈｓｐ発現増強剤が投与される動物は、脊椎動物、特に哺乳動物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。Ｈｓｐ発現増強剤はこれら疾患の予防、進行抑制（悪化防止）、症状の改善または治療等を目的として投与することができるが、予防薬として投与されることが好ましい。
Ｈｓｐ発現増強剤におけるＨＡオリゴ糖、特にＨＡ４糖の配合量、１回あたりの投与量、投与間隔等は、増強剤の投与方法、投与形態、使用目的等、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、ＨＡ４糖の臨床投与量として成人１人１回当り３００〜７５００ｍｇが例示される。またＨｓｐ発現増強剤の投与間隔は、１日１回程度でもよく、１日２〜３回に分けてもよい。
Ｈｓｐ発現増強剤は、ストレス蛋白発現増強作用に関する実験用の試験試薬としても使用することができる。
［２］細胞死抑制剤
細胞死抑制剤は、Ｈｓｐの発現増強作用を利用した用途の１つである。すなわち、ＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）は、Ｈｓｐの発現増強作用に止まらず、実際に細胞死抑制作用をも発揮することから、これを細胞死抑制の目的に応用したものである。
この細胞死抑制剤を適用することができる疾患は、Ｈｓｐの発現増強によって細胞死が抑制できる疾患である限りにおいて特に限定されないが、Ｈｓｐ発現増強剤の説明において例示した疾患が好ましい。
この細胞死抑制剤が投与される動物、投与の目的、ＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）の配合量、投与量、投与間隔等については、Ｈｓｐ発現増強剤と同様である。
［３］細胞障害抑制剤
細胞障害抑制剤は、ＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）がＨｓｐの発現増強作用に止まらず、実際に細胞障害抑制作用をも発揮することから、これを細胞障害抑制の目的に応用したものである。
この細胞障害抑制剤を適用することができる疾患は、Ｈｓｐの発現増強によって細胞障害が抑制できる疾患である限りにおいて特に限定されないが、Ｈｓｐ発現増強剤の説明において例示した疾患が好ましい。
この細胞障害抑制剤が投与される動物、投与の目的、ＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）の配合量、投与量、投与間隔等については、Ｈｓｐ発現増強剤と同様である。
［４］細胞・組織保護剤
細胞・組織保護剤は、ＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）がＨｓｐの発現増強作用に止まらず、実際に細胞・組織保護作用をも発揮することから、これを細胞・組織保護の目的に応用したものである。
この細胞・組織保護剤は、Ｈｓｐによる細胞・組織保護作用が期待される対象に適用することができる。例えば、細胞・組織の保護が求められる疾患等、あるいは生体外に摘出された細胞・組織の保護等に用いることができる。
細胞あるいは組織の保護が求められる疾患としては、消化性潰瘍（胃・十二指腸潰瘍等）、胃炎、肝障害（肝炎等）、潰瘍性大腸炎、虚血性心疾患、心筋症、脳卒中、脳梗塞等が挙げられる。
この細胞・組織保護剤は、具体的には以下の剤として使用されることが好ましい。
（１）潰瘍処置剤・肝障害処置剤
前記の細胞・組織保護剤を、潰瘍処置のための剤とすることで潰瘍処置剤とすることができ、肝障害処置のための剤とすることで肝障害処置剤とすることができる。なお、本発明にいう「処置」とは該当する疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）及び治療を目的として該疾患を有する動物に投与することをいい、「処置剤」とはそのような処置に用いられる薬剤をいう。
（２）ＩＬ−１０産生促進剤・ＩＬ−８産生抑制剤
前記の細胞・組織保護剤は、ＩＬ−１０の減少に起因する疾患や、ＩＬ−１０の産生促進が求められる疾患等の処置にも用いることができる。この細胞・組織保護剤をＩＬ−１０の産生促進のための剤とすることにより、ＩＬ−１０産生促進剤とすることができる。
また、この細胞・組織保護剤は、ＩＬ−８の増加に起因する疾患や、ＩＬ−８の産生抑制が求められる疾患等の処置にも用いることができる。この細胞・組織保護剤をＩＬ−８の産生抑制のための剤とすることにより、ＩＬ−８産生抑制剤とすることができる。
このような剤の投与対象となる動物や、投与の目的等については、Ｈｓｐ発現増強剤における説明と同様である。
（３）臓器保存剤
前記の細胞・組織保護剤は、生体外に摘出された細胞・組織の保護の目的等に用いることもできる。この細胞・組織保護剤を、生体外に摘出された細胞や組織の保存のための剤とすることによって、例えば臓器保存剤とすることができる。具体的には、移植用に摘出した臓器（肝臓、腎臓、心臓、肺等）をこの臓器保存剤で灌流したり、この臓器保存剤中で保存、保持等することにより、かかる臓器の細胞・組織傷害（浮腫、細胞死等）を抑制することができる。
細胞・組織保護剤におけるＨＡオリゴ糖の配合量、１回あたりの投与（使用）の量、間隔等は、投与（使用）の方法、形態、目的等、具体的な状況に応じて個別に決定することができる。
例えば細胞・組織保護剤を潰瘍処置剤、肝障害処置剤、ＩＬ−１０産生促進剤、ＩＬ−８産生抑制剤等としてヒトに投与する場合、ＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）の臨床投与量として成人１人１回当り１２０〜６０００ｍｇが例示される。
この細胞・組織保護剤を、生体外に摘出された細胞・組織の保護を目的として使用する場合には、液剤、灌注用剤、用時溶解用固形剤等として製剤化することができる。臓器保存剤として用いる場合は、保存ないし保持をする臓器の大きさ、保存時間、温度等、具体的な状況に応じて、ＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）の配合量等を個別に決定することができる。
この細胞・組織保護剤中のＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）の濃度も特に限定されないが、例えば、注射剤（溶液）あるいは臓器保存のための液剤として提供する場合には、１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ程度とするのが好ましい。
細胞・組織保護剤を注射剤、あるいは液剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、または凍結乾燥物のいずれであっても良い。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ、ボトル等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤あるいは液剤として使用できる。
本発明はさらに、以上のような剤だけではなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞または生体組織等の適用対象にＨＡオリゴ糖（特にＨＡ４糖）を作用させ、該適用対象においてＨｓｐの発現を増強し、細胞死を抑制し、細胞障害を抑制し、又は細胞・組織を保護（例えば、臓器を保存し、潰瘍を処置し、肝障害を処置し、ＩＬ−１０の産生を促進し、又はＩＬ−８の産生を抑制）する方法も包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
以下、ＨＡ４糖画分を「ＨＡ４」、ＨＡ６糖画分を「ＨＡ６」、ＨＡ８糖画分を「ＨＡ８」、という要領で略記する。
（実施例１）  本発明オリゴ糖及び本発明画分の製造と理化学的性質
１．本発明オリゴ糖及び本発明画分の製造
鶏冠から分離・精製されたＨＡのナトリウム塩を原料として、以下の方法によって本発明オリゴ糖及び本発明画分を製造した。なお、原料としたＨＡのナトリウム塩は、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動（泳動緩衝液：ピリジン−ギ酸緩衝液、電流：１５ｍＡ、泳動時間：３０分間）によって単一のバンドを示し、ＨＡ以外のグリコサミノグリカン（コンドロイチン、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｄ、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸）は検出されなかった。
（製造例１）  ヒアルロニダーゼによる分解
ＨＡのナトリウム塩２５ｇを、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１．１Ｌに溶解した。これに、ウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼ（５．３４２ユニット／ｍｇ；生化学工業株式会社製）２００ｍｇを添加して、３７°℃で９時間反応させた。
反応後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清を、陰イオン交換基としてトリメチルアンモニオメチル基を有する強塩基性陰イオン交換体であるＤｏｗｅｘ  １ｘ２（１００−２００ｍｅｓｈ）（ダウケミカル社製）イオン交換カラム（φ１．５ｘ１２３ｃｍ）にアプライし、ＮａＣｌの直線濃度勾配（０．０１Ｍ〜０．５０Ｍ）によって溶出した。得られた画分中のウロン酸をカルバゾール法（ｃａｒｂａｚｏｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ）で検出することにより、ＨＡオリゴ糖を含む画分をスクリーニングした。適当な画分をプールして濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０（ファルマシア社製；φ３ｘ１２４）で脱塩した後、凍結乾燥した。
得られた画分の凍結乾燥重量を以下のカッコ内に示す。
ＨＡ４（３３０ｍｇ）、ＨＡ６（１２１０ｍｇ）、ＨＡ８（３０５ｍｇ）、ＨＡ１０（１６２５ｍｇ）、ＨＡ１２（６８５ｍｇ）、ＨＡ１４（６２０ｍｇ）、ＨＡ１６（４３０ｍｇ）、ＨＡ１８（２１０ｍｇ）、ＨＡ２０（２０２ｍｇ）、ＨＡ２２（８１９ｍｇ）、ＨＡ２４（１９７ｍｇ）、ＨＡ２６（１８７ｍｇ）、ＨＡ２８（１５９ｍｇ）、ＨＡ３０（１３７ｍｇ）、ＨＡ３２（１２２ｍｇ）、ＨＡ３４（１０２ｍｇ）、ＨＡ３６（９１ｍｇ）、ＨＡ３８（８９ｍｇ）、ＨＡ４０（６５ｍｇ）、ＨＡ４２（７６ｍｇ）、ＨＡ４４（６１ｍｇ）、ＨＡ４６（５８ｍｇ）、ＨＡ４８（４６ｍｇ）、ＨＡ５０（４８ｍｇ）、ＨＡ５２（２１ｍｇ）
（製造例２）  コンドロイチナーゼＡＣＩによる分解
ＨＡのナトリウム塩８ｇを、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）５００ｍｌに溶解した。
これに、コンドロイチナーゼＡＣＩ（生化学工業株式会社製）３２ユニットを添加して、３７℃で６時間反応させた。
反応後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清を、Ｄｏｗｅｘ  １ｘ２（１００−２００ｍｅｓｈ）（ダウケミカル社製）イオン交換カラム（φ４．５ｘ１２３ｃｍ）にアプライし、ＮａＣｌの直線濃度勾配（０．０１Ｍ〜０．５０Ｍ）によって溶出した。得られた画分中のウロン酸をカルバゾール法（ｃａｒｂａｚｏｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ）で検出することにより、ＨＡオリゴ糖を含む画分をスクリーニングした。適当な画分をプールして濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０（ファルマシア社製；φ３ｘ１２４）で脱塩した後、凍結乾燥した。
得られた画分の凍結乾燥重量を以下のカッコ内に示す。なお「Δ」は非還元末端糖が不飽和糖であることを示す。
ΔＨＡ４（１３３ｍｇ）、ΔＨＡ６（１３３ｍｇ）、ΔＨＡ８（８４ｍｇ）、ΔＨＡ１０（１０９ｍｇ）、ΔＨＡ１２（１００ｍｇ）、ΔＨＡ１４（１０１ｍｇ）、ΔＨＡ１６（７３ｍｇ）、ΔＨＡ１８（３１ｍｇ）、ΔＨＡ２０（９ｍｇ）（製造例３）  ＤＭＳＯ法
ＨＡのナトリウム塩１０ｇを、０．１Ｍ  ＨＣｌを１０％含有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３Ｌに溶解した。１０５℃で１６時間加熱処理した。
処理後、Ｄｏｗｅｘ  １ｘ２（１００−２００ｍｅｓｈ）（ダウケミカル社製）イオン交換カラム（φ３．０ｘ７８ｃｍ）にアプライしてクロマトグラフィーを行った。溶出はＮａＣｌの直線濃度勾配（０．０１Ｍ〜０．５０Ｍ）により行った。得られた画分中のウロン酸をカルバゾール法（ｃａｒｂａｚｏｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ）で検出することにより、ＨＡオリゴ糖を含む画分をスクリーニングした。適当な画分をプールして濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０（ファルマシア社製；φ３ｘ１２４）で脱塩した後、凍結乾燥した。
得られた画分の凍結乾燥重量を以下のカッコ内に示す。
ＨＡ２（５０ｍｇ）、ＨＡ４（１１００ｍｇ）、ＨＡ６（２３２ｍｇ）、ＨＡ８（１０１５ｍｇ）、ＨＡ１０（１０３３ｍｇ）、ＨＡ１２（４５９ｍｇ）
このようにして得られた各種サイズのＨＡオリゴ糖を、以下の種々の分析に付した。
２．本発明画分の理化学的性質
前記製造例１で得られた各ＨＡオリゴ糖（ナトリウム塩）画分について、種々の理化学的性質を調べた。
（１）ゲル濾過クロマトグラフィーによる分析
使用カラム：ＴＳＫＧｅｌ２５００＋３０００＋４０００ｐｗｘｌ（東ソー株式会社）
溶媒：０．０５Ｍ  ＮａＣｌ
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ、及び示差屈折計（ＲＩ）
試料のアプライ量：ＨＡオリゴ糖として２００μｇ／ショット
試料としてＨＡ４（ロット１）〜ＨＡ１４を用いた場合の溶出曲線を、図１〜図６に示す。各図の上段は２１０ｎｍで検出した結果を、下段は示差屈折計で検出した結果を示す。
これらの図から、いずれの画分も実質的に単一なピークを示すことがわかる。
また、画分中の全ＨＡオリゴ糖のピーク面積の和に対するメインのＨＡピークの相対面積は、表１に示す通り、２１０ｎｍの吸収で検出した場合にはいずれも８５％以上であり、示差屈折計（ＲＩ）で検出した場合にはいずれも９８％以上であった。
0004861596.tif 000006
（２）イオン交換クロマトグラフィーによる分析
カラム：ＹＭＣ  ＮＨ２カラム（株式会社ワイエムシィ）
溶媒：ＮａＨ２ＰＯ４を用いた０Ｍから０．８Ｍまでの濃度勾配
流速：１ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ
試料のアプライ量：ＨＡオリゴ糖として２０μｇ／ショット
試料としてＨＡ４（ロット１）〜ＨＡ１４及びＨＡ４８〜ＨＡ５２を用いた場合の溶出曲線を、図７〜図１５に示す。これらの図から、いずれの画分も実質的に単一なピークを示すことがわかる。また、画分中の全ＨＡオリゴ糖のピーク面積の和に対するメインのＨＡピークの相対面積は、表２に示す通りいずれも９０％以上であった。
0004861596.tif 000007
（３）蛍光標識ゲル電気泳動による分析
ＨＡ４、ＨＡ６、ＨＡ８、ＨＡ１０、ＨＡ１２、ＨＡ１４およびＨＡ１６のそれぞれを以下の通り処理した。併せて、ＨＡオリゴ糖の混合物画分（ＨＡ２糖も含まれる；以下、「混合物」と略記する）についても同様に処理した。
（３−１）蛍光標識オリゴ糖の調製
それぞれの画分に含まれるＨＡオリゴ糖を、ＦＡＣＥＲＮ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｇｌｙｋｏ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて蛍光標識した。
ＨＡオリゴ糖として約２ｎｍｏｌ（混合物についてはＨＡ２糖単位として約２０ｎｍｏｌ）を含有する量の画分を、０．５ｍＬプラスチックチューブ中で遠心式凍結真空乾燥機（ＳｐｅｅｄＶａｃ，ＡＳ１６０，ＳＡＶＡＮＴ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ  ＩＮＣ．ＮＹ．Ｕ．Ｓ．Ａ）によって乾燥した。乾燥後、それぞれのチューブに８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸二ナトリウム塩（ＡＮＴＳ）溶液（ＧＬＹＫＯ，Ｌ２，Ｐａｒｔ＃５００５８：ｒｅｃｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ＯＬＩＧＯ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｄｙｅ）を５μＬずつ加え、攪拌後室温で１５分放置した。さらに、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（ＧＬＹＫＯ，Ｌ１，Ｐａｒｔ＃５００５６：Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ）を５μＬずつ加え、密封して３６℃で１６時間インキュベートした。
インキュベート後、遠心式凍結真空乾燥機に約１５分間かけ、部分乾燥させた後、蒸留水を加えて２０μＬに合わせた。
（３−２）蛍光標識オリゴ糖の電気泳動
電気泳動はＧＬＹＫＯ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｇｅｌ（ＧＬＹＫＯ，Ｐａｒｔ＃６０２００；架橋度３６％のポリアクリルアミドゲル）を用いて行った。
ＯＬＩＧＯ  Ｇｅｌ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＬＹＫＯ，Ｐａｒｔ＃７０００）１包を蒸留水に溶かして１．５Ｌとし、氷中で冷却しておいた。
ゲルボックス（ＧＬＹＫＯ，ＧＬＹＫＯ  Ｇｅｌ  Ｂｏｘ，Ｐａｒｔ＃４００２６）に冷却水を循環させ、冷却しておいたＲｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを入れ、ゲルをセットした。ゲルボックスごと氷につけ、冷やした。
蛍光標識したＨＡオリゴ糖を含むそれぞれの画分溶液から２μＬをとり、蒸留水３μＬとＬｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＬＹＫＯ，Ｐａｒｔ＃５００６４）５μＬを混合した。混合物溶液は、その２μＬをＬｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬと混合した。これをそれぞれ４μＬずつゲルにアプライした。それぞれの画分は、１レーンあたりＨＡオリゴ糖として８０ｐｍｏｌのアプライ量とした。
１０００Ｖの定電圧で１６０分間電気泳動し、ＵＶトランスイルミネーター（ｍｏｄｅｌ  ＮＬＭ−２０Ｅ，ＵＶＰ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で３６５ｎｍの光を照射することにより発せられる蛍光を、インスタントカメラ（ＭＡＭＩＹＡ，Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ＳＤ，ｆ＝１２７ｍｍ）およびインスタントフィルム（ＰｏｌａｌｏｉｄＲＰｏｌａｐａｎ  Ｔ６６７，ｉｓｏ３０００，Ｐｏｌａｐｏｉｄ  ｃｏｒｐ．ＭＡ．Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて記録した。結果を図１６に示す。
図１６中のレーンと試料の関係は以下の通りである。
レーン１：混合物、レーン２：ＨＡ４、レーン３：ＨＡ６、レーン４：ＨＡ８、レーン５：ＨＡ１０、レーン６：ＨＡ１２、レーン７：ＨＡ１４、レーン８：ＨＡ１６
混合物は梯子状のバンドを示したが、分画された各オリゴ糖画分は、すべてそれぞれのサイズに応じた泳動度で単一のバンドを形成し、かつ、他のサイズのＨＡオリゴ糖のバンドは検出されなかった。
また、サイズの小さいものほど大きな泳動度が得られた。それぞれ画分におけるオリゴ糖のバンドの位置（泳動位置）は、混合物が示した梯子状バンドのそれぞれサイズの位置とよく一致し、複数のサイズのオリゴ糖の混合物でも、それぞれの分子の泳動度に影響がないことが示された。
ＧＬＹＫＯ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｇｅｌは架橋度３６％のポリアクリルアミドゲルである。８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸二ナトリウム塩（ＡＮＴＳ）は３価の負電荷を持つ蛍光物質である。
電荷を持たない２−Ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｏｎ（ＡＭＡＣ）を蛍光物質とした場合、このゲルではどのオリゴ糖もほとんど泳動しなかった。このことから、この高架橋度ゲルでの電気泳動にはＨＡオリゴ糖自身の負電荷だけでは不足で、結合しているＡＮＴＳの電荷が必要であることが示唆された。また、糖鎖骨格と相互作用することが知られているホウ酸は使用していないので、オリゴ糖のサイズとポリアクリルアミドの網目との直接の相互作用が泳動度を左右していることが示唆された。
Ｇｌｙｋｏ社の他のゲル（架橋度２０％または２１％）では、ＡＮＴＳラベルした場合、ＨＡ８糖以下では分離できないか、またはＨＡ４糖以下が泳動前線と重なってしまい、検出できなかった。
（４）質量分析
質量分析は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＥＳＩＭＳ）により行った。
（４−１）方法
（４−１−１）分析試料
ＨＡ４（ロット１）、ＨＡ６、ＨＡ８、ＨＡ１０、ＨＡ１２、ＨＡ１４、ＨＡ１６、ＨＡ４８、ＨＡ５０およびＨＡ５２を、それぞれ２．６ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、６．５ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように水溶液を調製して分析した。
なお、ＨＡオリゴ糖に関する分子量の理論値については、ＨＡ４糖〜５２糖が下記式（１）で表される構造を有していることに基づいて求めた。
式（１）
0004861596.tif 000008
（式中、ｎは１〜２９の整数であり、Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示し、Ａｃはアセチル基を示す。）
（４−１−２）試薬
試験に用いたメタノール（和光純薬）および蒸留水（和光純薬）はＨＰＬＣ用を、ぎ酸アンモニウム（和光純薬）は特級をそれぞれ使用した。
（４−１−３）機器及び機材
１）ＨＰＬＣシステム
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ：バイナリポンプ、デガッサ、オートサンプラ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
２）質量分析計
三連四重極型質量分析計：ＴＳＱ（サーモクエスト）
（４−１−４）ＥＳＩＭＳ分析条件
質量分析計への試料の導入は、質量分析計に繋いだＨＰＬＣシステムに各試料溶液を５μｌ又は１０μｌ注入することにより行った。ＨＰＬＣおよびＥＳＩＭＳの分析条件を以下に示す。
１）ＨＰＬＣ
移動相：１０ｍＭ  ぎ酸アンモニウム水溶液／メタノール＝８０／２０
流速  ：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
カラム：なし
注入量：１０μｌ
２）ＥＳＩＭＳ
プローブ：Ｏｆｆ−ａｘｉｓ
イオンモード：陰イオンモード
イオン化法：ＥＳＩ法（エレクトロスプレーイオン化法）
ＥＳＩスプレー電圧：４．５ｋＶ
ヒーティドキャピラリー温度：３５０℃
Ａｕｘｉｌｉａｒｙガス：３５ｕｎｉｔｓ
Ｓｈｅａｔｈガス：５０ｐｓｉ
スキャン範囲：ｍ／ｚ１０−２５００又は１０−４０００
スキャン時間：１．５ｓｅｃ又は３ｓｅｃ．
（４−１−５）Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ解析
観測されたＥＳＩＭＳスペクトルから分子量を推定するためのＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ解析は、解析ソフトＸｃａｌｉｂｕｒ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ（サーモクエスト株式会社）を用いて行った。
（４−２）結果
ＨＡ４〜ＨＡ１６の陰イオンＥＳＩＭＳスペクトル測定の結果をまとめて表３及び表４に、ＨＡ４〜ＨＡ１６およびＨＡ４８〜ＨＡ５２のスペクトルを図１７〜図２３に示す。
0004861596.tif 000009
0004861596.tif 000010
以上の結果においては、いずれもＨＡオリゴ糖由来と考えられる各種分子関連イオンが観測されており、ＨＡ４（ロット１）がＨＡ４糖、ＨＡ６がＨＡ６糖、ＨＡ８がＨＡ８糖、ＨＡ１０がＨＡ１０糖、ＨＡ１２がＨＡ１２糖、ＨＡ１４がＨＡ１４糖、ＨＡ１６がＨＡ１６糖、ＨＡ４８がＨＡ４８糖、ＨＡ５０がＨＡ５０糖、およびＨＡ５２がＨＡ５２糖に相当するものと解して矛盾がないものである。
以上の結果に基づき、モノアイソトピック分子量の理論値を１とした場合における、メインピークの実測値の相対値を求めた。結果を表５Ａに示す。なお、ＨＡ４については［Ｍ−Ｈ］−についての実測値と理論値を用いた。
0004861596.tif 000011
また、平均分子量の理論値を１とした場合における、メインピークの実測値の相対値を求めた。結果を表５Ｂに示す。なお、ＨＡ４については［Ｍ−Ｈ］−についての実測値と理論値を用いた。
0004861596.tif 000012
これらの結果から、本発明画分を構成するＨＡオリゴ糖のモノアイソトピック分子量又は平均分子量の理論値を１とした場合、当該画分の質量分析による実測値がいずれも０．９９９〜１．００１（相対値）の範囲内であることが示された。
（５）元素分析
ＨＡ４（ロット１）、ＨＡ６、ＨＡ８、ＨＡ１０、ＨＡ１２、ＨＡ１４およびＨＡ１６をそれぞれ８０℃で２時間減圧乾燥し、直ちに元素分析器で測定した。結果を表６に示す。
0004861596.tif 000013
この結果、本発明画分を構成するＨＡオリゴ糖（ナトリウム塩）における炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）、窒素（Ｎ）およびナトリウム（Ｎａ）のそれぞれの含量比の理論値（重量％）と、当該画分を元素分析することによって得られるそれぞれの元素の実測値（重量％）との差は、いずれも±１（重量％）であることが示された。
（６）核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）
ＨＡオリゴ糖画分の１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを、ＶＡＲＩＡＮ  ＵｎｉｔｙＩｎｏｖａ  ５００型を用いて測定した。測定溶媒はＤ２Ｏを使用した。内部標準をｔ−ＢｕＯＨ（１Ｈ：１．２３ｐｐｍ，１３Ｃ：３２．４６１ｐｐｍ）とし、測定温度を２３℃として測定を行った。各ＨＡオリゴ糖画分についての結果を以下に示す。また、それぞれのスペクトルを図２４〜図４０に示す。
（６−１）ＨＡ４（ロット１）の測定結果
５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
２．００４（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），２．０１８，２．０１９（３Ｈ，ＮＡｃ），３．２９２−３．３２６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２ｄ），
３．３５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝７．９Ｈｚ，Ｊ２，３＝９．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），
４．０２７（ｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．５Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．６Ｈｚ，Ｈ−２ａα），４．４５３（ｄ，Ｊ１，２＝７．９Ｈｚ，Ｈ−１ｄ），４．４６０（ｄ，Ｈ−１ｂβ），４．５０２（ｄ，０．６Ｈ，Ｈ−１ｂα），４．５５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ｃ），４．７０５（ｄ，０．４Ｈ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４４（ｄ，０．６Ｈ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図２４に示す。
１２５ＭＨｚ  １３Ｃ−ＮＭＲ  δ；
２４．８４，２５．０９，２５．３６（ＮＨＣＯＣＨ３），５５．８１（Ｃ−２ａα），５７．０９（Ｃ−２ｃ），５８．４４（Ｃ−２ａβ），６３．４０，６３．５７（Ｃ−６ａ  ｏｒ  Ｃ−６ｃ），
７５．２９，７５．３３（Ｃ−２ｂα  ｏｒ  Ｃ−２ｂβ），７５．５８（Ｃ−２ｄ），９３．９２（Ｃ−１ａα），
９７．６１（Ｃ−１ａβ），１０３．４４（Ｃ−１ｃ），
１０５．８０，１０５．８４，１０５．９５（Ｃ−１ｂα  ｏｒ  Ｃ−１ｂβ  ｏｒ  Ｃ−１ｄ），
１７７．００，１７７．０４，１７７．４１，１７７．６８，１７７．８０，１７８．３３（ｃａｒｂｏｎｙｌ）
解析の基礎としたスペクトルを図２５に示す。
これらの結果は、前記式（１）においてｎ＝１で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（６−２）ＨＡ６の測定結果
５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
２．００２，２．０１０，２．０１７（９Ｈ，ＮＡｃ），３．２９１−３．３６８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２ｂ，Ｈ−２ｄ  ａｎｄ  Ｈ−２ｆ），
４．０２６（ｄｄ，０．６Ｈ，１，２＝３．５Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．６Ｈｚ，Ｈ−２ａα），
４．４５２，４．４５９（ｄ×２，２．４Ｈ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１ｂβ，Ｈ−１ｄ  ａｎｄ  Ｈ−１ｆ），
４．５００（ｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝７．９Ｈｚ，Ｈ−１ｂα），
４．５４４，４．５５０（ｄ×２，２Ｈ，Ｊ１，２＝８．５Ｈｚ，Ｊ１，２＝８．５Ｈｚ，Ｈ−１ｃ  ｏｒ  Ｈ−１ｅ），
４．７０２（ｄ，Ｊ１，２＝８．３Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４２（ｄ，０．６Ｈ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図２６に示す。
１２５ＭＨｚ  １３Ｃ−ＮＭＲ  δ；
２４．８４，２５．０９，２５．３５（ＮＨＣＯＣＨ３），５５．８１（Ｃ−２ａα），
５７．０９，５７．１６（Ｃ−２ｃ  ｏｒ  Ｃ−２ｅ），５８．４４（Ｃ−２ａβ），
６３．４０，６３．５７（Ｃ−６ａ  ｏｒ  Ｃ−６ｃ  ｏｒ  Ｃ−６ｅ），
７５．２８，７５．３１，７５．３４，７５．５７（Ｃ−２ｂα  ｏｒ  Ｃ−２ｂβ  ｏｒ  Ｃ−２ｄ  ｏｒ  Ｃ−２ｆ），
９３．９２（Ｃ−１ａα），９７．６１（Ｃ−１ａβ），
１０３．４０，１０３．４５（Ｃ−１ｃ  ｏｒ  Ｃ−１ｅ），
１０５．８０，１０５．８５，１０５．９４，１０６．０２（Ｃ−１ｂα  ｏｒ  Ｃ−１ｂβ  ｏｒ  Ｃ−１ｄ  ｏｒ  Ｃ−１ｆ），
１７６．９７，１７７．４０，１７７．６８，１７７．８０，１７８．２７（ｃａｒｂｏｎｙｌ）
解析の基礎としたスペクトルを図２７に示す。
これらの結果は、前記式（１）においてｎ＝２で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−［（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）］２−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（６−３）ＨＡ８の測定結果
５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
２．００２，２．００３，２．００８，２．０１６（１２Ｈ，ＮＡｃ），３．２９０−３．３６８（ｍ，４Ｈ，Ｈ−２ｂ，Ｈ−２ｄ，Ｈ−２ｆ  ａｎｄ  Ｈ−２ｈ），
４．０２５（ｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．５Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．６Ｈｚ，Ｈ−２ａα），
４．４５０，４．４５８（ｄ×２，３．４Ｈ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１ｂβ，Ｈ−１ｄ，Ｈ−１ｆ  ａｎｄ  Ｈ−１ｈ），
４．５００（ｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１ｂα），
４．５３９，４．５４３，４．５５０（ｄ×３，３Ｈ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｊ１，２＝８．５Ｈｚ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ｃ  ｏｒ  Ｈ−１ｅ  ｏｒ  Ｈ−１ｇ），４．７０２（ｄ，０．４Ｈ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４２（ｄ，０．６Ｈ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図２８に示す。
１２５ＭＨｚ  １３Ｃ−ＮＭＲ  δ；
２４．８４，２５．０９，２５．３５（ＮＨＣＯＣＨ３），５５．８２（Ｃ−２ａα），
５７．１０，５７．１６（Ｃ−２ｃ，Ｃ−２ｅ  ａｎｄ  Ｃ−２ｇ），５８．４４（Ｃ−２ａβ），
６３．４０，６３．５７（Ｃ−６ａ，Ｃ−６ｃ  ａｎｄ  Ｃ−６ｅ），
７５．２８，７５．３４，７５．５７（Ｃ−２ｂ，Ｃ−２ｄ，Ｃ−２ｆ  ａｎｄ  Ｃ−２ｈ），
９３．９２（Ｃ−１ａα），９７．６１（Ｃ−１ａβ），
１０３．３９，１０３．４５（Ｃ−１ｃ，Ｃ−１ｅ  ａｎｄ  Ｃ−１ｇ），
１０５．８０，１０５．８５，１０５．９５，１０６．０４（Ｃ−１ｂ  ｏｒ  Ｃ−１ｄ  ｏｒ  Ｃ−１ｆ  ｏｒ  Ｃ−１ｈ），
１７６．９３，１７７．４０，１７７．６８，１７７．８０，１７８．２７（ｃａｒｂｏｎｙｌ）
解析の基礎としたスペクトルを図２９に示す。
これらの結果は、前記式（１）においてｎ＝３で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−［（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）］３−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（６−４）ＨＡ１０の測定結果
５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
２．００１，２．００７，２．０１６（１５Ｈ，ＮＡｃ），４．０２５（ｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．６Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．６Ｈｚ，Ｈ−２ａα），
４．４４１−４．４６５（ｍ，Ｈ−１ｂβ，Ｈ−１ｄ，Ｈ−１ｆ，Ｈ−１ｈ  ａｎｄ  Ｈ−１ｊ），４．４９９（ｄ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１ｂα），
４．５３８，４．５４９（ｄ×２，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ｃ，Ｈ−１ｅ，Ｈ−１ｇ  ａｎｄ  Ｈ−１ｉ），
４．７０１（ｄ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４１（ｄ，０．６Ｈ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図３０に示す。
１２５ＭＨｚ  １３Ｃ−ＮＭＲ  δ；
２４．８４，２５．０９，２５．３５（ＮＨＣＯＣＨ３），５５．８２（Ｃ−２ａα），
５７．１０，５７．１６（Ｃ−２ｃ，Ｃ−２ｅ，Ｃ−２ｇ  ａｎｄ  Ｃ−２ｉ），５８．４４（Ｃ−２ａβ），
６３．３７，６３．５７（Ｃ−６ａ，Ｃ−６ｃ，Ｃ−６ｅ，Ｃ−６ｇ  ａｎｄ  Ｃ−６ｉ），
７５．３５，７５，５８（Ｃ−２ｂ，Ｃ−２ｄ，Ｃ−２ｆ，Ｃ−２ｈ  ａｎｄ  Ｃ−２ｊ），
９３．９２（Ｃ−１ａα），９７．６１（Ｃ−１ａβ），
１０３．３９，１０３．４６（Ｃ−１ｃ，Ｃ−１ｅ，Ｃ−１ｇ  ａｎｄ  Ｃ−１ｉ），
１０５．８０，１０５．８６，１０５．９４，１０６．０５（Ｃ−１ｂ，Ｃ−１ｄ，Ｃ−１ｆ，Ｃ−１ｈ  ａｎｄ  Ｃ−１ｊ），
１７６．９４，１７６．９９，１７７．４１，１７７．６８，１７７．８１，１７８．３０（ｃａｒｂｏｎｙｌ）
解析の基礎としたスペクトルを図３１に示す。
これらの結果は、前記式（１）においてｎ＝４で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−［（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）］４−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（６−５）ＨＡ１２の測定結果
５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
２．００２，２．００６，２．０１６（１８Ｈ，ＮＡｃ），４．０２５（ｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．６Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．７Ｈｚ，Ｈ−２ａα），
４．４４０−４．４６５（ｍ，Ｈ−１ｂβ，Ｈ−１ｄ，Ｈ−１ｆ，Ｈ−１ｈ，Ｈ−１ｊ  ａｎｄ  Ｈ−１ｌ），４．４９８（ｄ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１ｂα），
４．５３８，４．５４９（ｄ×２，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ｃ，Ｈ−１ｅ，Ｈ−１ｇ，Ｈ−１ｉ  ａｎｄ  Ｈ−１ｋ），
４．７０１（ｄ，Ｊ１，２＝８．５Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４１（ｄ，０．６Ｈ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図３２に示す。
１２５ＭＨｚ  １３Ｃ−ＮＭＲ  δ；
２４．８４，２５．０９，２５．３５（ＮＨＣＯＣＨ３），５５．８２（Ｃ−２ａα），
５７．０９，５７．１６（Ｃ−２ｃ，Ｃ−２ｅ，Ｃ−２ｇ  ａｎｄ  Ｃ−２ｉ），５８．４４（Ｃ−２ａβ），
６３．３７（Ｃ−６ａ，Ｃ−６ｃ，Ｃ−６ｅ，Ｃ−６ｇ  ａｎｄ  Ｃ−６ｉ），７５．３５，７５．５８（Ｃ−２ｂ，Ｃ−２ｄ，Ｃ−２ｆ，Ｃ−２ｈ  ａｎｄ  Ｃ−２ｊ），
９３．９２（Ｃ−１ａα），９７．６１（Ｃ−１ａβ），
１０３．４０，１０３．４５（Ｃ−１ｃ，Ｃ−１ｅ，Ｃ−１ｇ  ａｎｄ  Ｃ−１ｉ），
１０５．８０，１０５．８６，１０６．０５（Ｃ−１ｂ，Ｃ−１ｄ，Ｃ−１ｆ，Ｃ−１ｈ  ａｎｄ  Ｃ−１ｊ），
１７６．９５，１７７．４０，１７７．８０，１７８．３１（ｃａｒｂｏｎｙｌ）
解析の基礎としたスペクトルを図３３に示す。
これらの結果は、前記式（１）においてｎ＝５で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−［（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）］５−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（６−６）ＨＡ１４の測定結果
５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
２．００１，２．００６，２．０１６（２１Ｈ，ＮＡｃ），４．０２４（ｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．６Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．６Ｈｚ，Ｈ−２ａα），
４．４３９−４．４６４（ｍ，Ｈ−１ｂβ，Ｈ−１ｄ，Ｈ−１ｆ，Ｈ−１ｈ，Ｈ−１ｊ，Ｈ−１ｌ  ａｎｄ  Ｈ−１ｎ），４．４９８（ｄ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１ｂα），
４．５３７，４．５４９（ｄ×２，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｊ１，２＝８．３Ｈｚ，Ｈ−１ｃ，Ｈ−１ｅ，Ｈ−１ｇ，Ｈ−１ｉ，Ｈ−１ｋ  ａｎｄ  Ｈ−１ｍ），
４．７０１（ｄ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４１（ｄ，０．６Ｈ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図３４に示す。
１２５ＭＨｚ  １３Ｃ−ＮＭＲ  δ；
２４．８４，２５．０９，２５．３４（ＮＨＣＯＣＨ３），５５．８１（Ｃ−２ａα），
５７．０９，５７．１５（Ｃ−２ｃ，Ｃ−２ｅ，Ｃ−２ｇ  ａｎｄ  Ｃ−２ｉ），５８．４３（Ｃ−２ａβ），
６３．３６，６３．５７（Ｃ−６ａ，Ｃ−６ｃ，Ｃ−６ｅ，Ｃ−６ｇ  ａｎｄ  Ｃ−６ｉ），
７５．３５，７５．５８（Ｃ−２ｂ，Ｃ−２ｄ，Ｃ−２ｆ，Ｃ−２ｈ  ａｎｄ  Ｃ−２ｊ），
９３．９１（Ｃ−１ａα），９７．６１（Ｃ−１ａβ），
１０３．４０（Ｃ−１ｃ，Ｃ−１ｅ，Ｃ−１ｇ  ａｎｄ  Ｃ−１ｉ），
１０５．８０，１０５．８５，１０５．９４，１０６．０７（Ｃ−１ｂ，Ｃ−１ｄ，Ｃ−１ｆ，Ｃ−１ｈ  ａｎｄ  Ｃ−１ｊ），
１７６．９５，１７７．４０，１７７．６７，１７７．８０，１７８．３０（ｃａｒｂｏｎｙｌ）
解析の基礎としたスペクトルを図３５に示す。
これらの結果は、前記式（１）においてｎ＝６で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−［（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）］６−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（６−７）ＨＡ１６の測定結果
５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
２．００２，２．００６，２．０１６（２４Ｈ，ＮＡｃ），４．０２４（ｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．６Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．６Ｈｚ，Ｈ−２ａα），
４．４３４−４．４６４（ｍ，Ｈ−１ｂβ，Ｈ−１ｄ，Ｈ−１ｆ，Ｈ−１ｈ，Ｈ−１ｊ，Ｈ−１ｌ，Ｈ−１ｎ  ａｎｄ  Ｈ−１ｐ），
４．４９８（ｄ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１ｂα），
４．５３７，４．５４９（ｄ×２，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｊ１，２＝８．３Ｈｚ，Ｈ−１ｃ，Ｈ−１ｅ，Ｈ−１ｇ，Ｈ−１ｉ，Ｈ−１ｋ，Ｈ−１ｍ  ａｎｄ  Ｈ−１ｏ），
４．７０１（ｄ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４１（ｄ，０．６Ｈ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図３６に示す。
１２５ＭＨｚ  １３Ｃ−ＮＭＲ  δ；
２４．８４，２５．０９，２５．３５（ＮＨＣＯＣＨ３），５５．８２（Ｃ−２ａα），
５７．１０，５７．１６（Ｃ−２ｃ，Ｃ−２ｅ，Ｃ−２ｇ，Ｃ−２ｉ，Ｃ−２ｋ，Ｃ−２ｍ  ａｎｄ  Ｃ−２ｏ），
５８．４４（Ｃ−２ａβ），
６３．３７，６３．５７（Ｃ−６ａ，Ｃ−６ｃ，Ｃ−６ｅ，Ｃ−６ｇ，Ｃ−６ｉ，Ｃ−６ｋ，Ｃ−６ｍ  ａｎｄ  Ｃ−６ｏ），
７５．３５，７５．５８（Ｃ−２ｂ，Ｃ−２ｄ，Ｃ−２ｆ，Ｃ−２ｈ，Ｃ−２ｊ，Ｃ−２ｌ，Ｃ−６ｎ  ａｎｄ  Ｃ−６ｐ），
９３．９２（Ｃ−１ａα），９７．６１（Ｃ−１ａβ），
１０３．４０（Ｃ−１ｃ，Ｃ−１ｅ，Ｃ−１ｇ，Ｃ−１ｉ，Ｃ−１ｋ，Ｃ−１ｍ  ａｎｄ  Ｃ−１ｏ），
１０５．８０，１０５．８６，１０５．９５，１０６．０８（Ｃ−１ｂ，Ｃ−１ｄ，Ｃ−１ｆ，Ｃ−１ｈ，Ｃ−１ｊ，Ｃ−１ｌ，Ｃ−１ｎ  ａｎｄ  Ｃ−１ｐ），
１７６．９８，１７７，４１，１７７．６８，１７７．８１，１７８．３３（ｃａｒｂｏｎｙｌ）
解析の基礎としたスペクトルを図３７に示す。
これらの結果は、前記式（１）においてｎ＝７で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−［（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）］７−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（６−８）ＨＡ４８の測定結果
５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
１．９９８，２．００５，２．０１６（７２Ｈ，ＮＡｃ），４．０２４（ｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．６Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．６Ｈｚ，Ｈ−２ａα），
４．３９５−４．４７０（ｍ，ＧｌｃＡ−ｕｎｉｔ），
４．４９８（ｄ，Ｊ１，２＝８．０Ｈｚ，Ｈ−１ｂα），
４．５３７，４．６１０（ｄ×２，Ｊ１，２＝８．２Ｈｚ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−ｕｎｉｔ），
４．７００（ｄ，Ｊ１，２＝８．３Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４１（ｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．６Ｈｚ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図３８に示す。
この結果は、前記式（１）においてｎ＝２３で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−［（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）］２３−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（６−９）ＨＡ５０の測定結果
５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
２．００５，２．０１７（７５Ｈ，ＮＡｃ），４．０２４（ｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．６Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．６Ｈｚ，Ｈ−２ａα），４．３９０−４．４７０（ｍ，ＧｌｃＡ−ｕｎｉｔ），
４．４９８（ｄ，Ｊ１，２＝７．９Ｈｚ，Ｈ−１ｂα），
４．５３７，４．６１０（ｄ×２，Ｊ１，２＝８．１Ｈｚ，Ｊ１，２＝８．１Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−ｕｎｉｔ），
４．７０１（ｄ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４１（ｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．６Ｈｚ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図３９に示す。
この結果は、前記式（１）においてｎ＝２４で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−［（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）］２４−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（６−１０）ＨＡ５２の測定結果
５００Ｍ  １Ｈ−ＮＭＲ  δ；
２．００５，２．０１７（７８Ｈ，ＮＡｃ），４．０２４（ｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．６Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．６Ｈｚ，Ｈ−２ａα），
４．３７５−４．４７５（ｍ，ＧｌｃＡ−ｕｎｉｔ），
４．４９８（ｄ，Ｊ１，２＝８．２Ｈｚ，Ｈ−１ｂα），
４．５３６，４．６１０（ｄ×２，Ｊ１，２＝８．１Ｈｚ，Ｊ１，２＝８．１Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−ｕｎｉｔ），
４．７０１（ｄ，Ｊ１，２＝８．４Ｈｚ，Ｈ−１ａβ），５．１４１（ｄ，０．６Ｈ，Ｊ１，２＝３．４Ｈｚ，Ｈ−１ａα）
解析の基礎としたスペクトルを図４０に示す。
この結果は、前記式（１）においてｎ＝２５で示される構造（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ−［（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−（Ｓｏｄｉｕｍ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎａｔｅ）］２５−（１→３）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅの構造）と矛盾しないものである。
（７）ＨＡオリゴ糖以外の不純物
それぞれの画分について、以下の不純物の含量を測定した。
（７−１）タンパク質
タンパク質含量は、ウシ血清アルブミンを標準物質として、ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社製）で測定した。
（７−２）ＤＮＡ
ＤＮＡは、スレッシュホールド法（ＤＮＡ測定装置：スレッシュホールド（米国モレキュラーデバイス社製））で測定した。
（７−３）エンドトキシン
エンドトキシンは、トキシカラーシステム（商品名；生化学工業株式会社製）を用いたリムルス試験法により測定した。
それぞれの画分中のタンパク質、ＤＮＡ及びエンドトキシンの含量の測定結果を表７に示す。
0004861596.tif 000014
この結果から、本発明画分中のタンパク質およびＤＮＡの含量はいずれも検出限界以下であり、またエンドトキシンの含量も実質的に影響がない程度であり、いずれも実質的に含有しないと結論された。
（実施例２）Ｈｓｐ発現の増強作用
＜材料等＞
（１）被験物質等
まず、本実施例において用いた被験物質等を説明する。
被験物質（カッコ内は以下で用いる略号を示す。また下記式中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ｇａｌはガラクトース残基を、（６Ｓ）は６−０−硫酸エステルを、−はグリコシド結合を、Δは不飽和糖であることを表す。）
・ＨＡ飽和２糖（ＨＡ２）
ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ不飽和２糖（ΔＨＡ２）
ΔＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和４糖（ＨＡ４）
ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ不飽和４糖（ΔＨＡ４）
ΔＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和６糖（ＨＡ６）
ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ
１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ不飽和６糖（ΔＨＡ６）
ΔＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和８糖（ＨＡ８）
ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和１０糖（ＨＡ１０）
ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和１２糖（ＨＡ１２）
ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和２〜１８糖の混合物（ＨＡ２−１８）
・ＨＡ飽和８〜１４糖の混合物（ＨＡ８−１４）
・ＨＡ（重量平均分子量８４万；ＨＡ８４）
・Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）（Ｌ４）
・Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）β１−３Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）（Ｌ４Ｌ４）
ＨＡ飽和オリゴ糖は、前記の製造例１で製造されたＨＡオリゴ糖画分を使用した。
またＨＡ不飽和オリゴ糖は、ＨＡをコンドロイチンＡＣ−１リアーゼ（コンドロイチナーゼＡＣＩフラボ；生化学工業株式会社製）で処理して得られた分解産物を、前記製造例１と同様の方法で分画することにより得た（製造例２参照）。
Ｌ４及びＬ４Ｌ４は、国際公開ＷＯ９６／１６９７３に記載の方法で調製した。
被験物質は、以下の薬効薬理試験に応じて所定の濃度となるように生理食塩水に溶解して用いた。生理食塩水に溶解した後のエンドトキシン濃度はいずれも０．３ＥＵ／ｍＬ以下であり、また鉄含量はいずれも２０ｐｐｍ以下であった。
（２）細胞、培地
Ｋ５６２細胞（ＪＣＲＢ００１９；ヒト白血病細胞）、ＰＣ−１２細胞（ＪＣＲＢ０７３３）
Ｋ５６２細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
またＰＣ−１２細胞は、１０％ウマ血清および５％ウシ新生仔血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｄ−グルコース（１，０００ｍｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１１０ｍｇ／ｌ）、炭酸水素ナトリウム（３．７ｇ／ｌ）を含有する）５７５ｍｌに、２０％グルコース水溶液を１０ｍｌ添加した培地で培養した。
＜１＞ＨＳＦ１のリン酸化に対する作用
ＨＳＦ１（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒ  １）蛋白質は、Ｈｓｐ７０の転写因子であることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３３５５−３３５８（１９９６））。またＨＳＦ１蛋白質は、リン酸化されることによって活性化し、このリン酸化はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上でのバンドのシフト（見かけ分子量が約６６ｋＤａから約８１ｋＤａにシフトする）によって検出することができる。このことを利用して、各種サイズのＨＡオリゴ糖をストレスを与えたＫ５６２細胞に作用させて、上記バンドのシフトを検出することによりＨＳＦ１のリン酸化（活性化）の程度を調べた。
（１）実験１
ＨＡ４、ΔＨＡ４、ＨＡ６、ＨＡ８、ＨＡ２−１８およびＨＡ８−１４のそれぞれについて、前記細胞を含む培養液中に１、１０または１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、その後直ちに４２℃の環境下に移すことによって熱ショックを与え、２０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を遠心分離によって回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度１０％）を行った。次いで一次抗体として抗ＨＳＦ１モノクローナル抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎｅ社製）を、二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ社製）を用いたウェスタンブロッティングを行い、６６ｋＤａのバンド（リン酸化されていないＨＳＦ１）から８１ｋＤａのバンド（リン酸化されたＨＳＦ１）へのシフトを検出した。
その結果、ＨＡ４、ΔＨＡ４、ＨＡ６およびＨＡ２−１８を添加した細胞において、ＨＡオリゴ糖の添加量に依存して８１ｋＤａバンドへのシフトが見られた。ＨＡ８−１４でははっきりした変化は見られなかった。ＨＡ８では逆にバンドシフトの阻害が見られた。
（２）実験２
実験１の再現性を確認するため、ＨＡ４、ΔＨＡ４、ＨＡ８およびＨＡ８４を用いて、培養液へのＨＡの添加量を１００ｎｇ／ｍｌのみとし、熱ショックを４３℃とした以外は実験１と同様にして、バンドシフトを検出した。結果を図４１に示す。図４１中、左から１番目のレーンは３７℃条件下（ＨＡオリゴ糖無添加）の細胞の抽出物、同２番目のレーンは４３℃条件下（ＨＡオリゴ糖無添加）の細胞の抽出物、最も右のレーンは標準としてのＨＳＦ１（バクテリア由来）を同様に検出したものである。
図４１より、ＨＡ４およびΔＨＡ４を添加した細胞においてＨＳＦ１のバンドのシフトが見られ、かつ６６及び８１ｋＤａの両方のＨＳＦ１自体の量も増加していた。一方ＨＡ８では６６ｋＤａのＨＳＦ１の量の増加は見られたが、８１ｋＤａへのバンドのシフトは見られなかった。またＨＡ８４では変化は見られなかった。
（３）実験３（比較実験）
実験２で観察された作用が、ＨＡオリゴ糖の糖鎖骨格構造に特異的なものであるか否かを調べるために、以下のコンドロイチンオリゴ糖を用いた比較実験を行った。コンドロイチン（以下、Ｃｈという）は、ＨＡにおけるＧｌｃＮＡｃがガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）に置換されている点のみがＨＡと異なっており、グリコサミノグリカンである点及び硫酸基を有していない点などはＨＡと共通している。従って、ＣｈはＨＡと構造的に極めて類似した物質であるといえ、そのオリゴ糖についても同様である。
・Ｃｈ飽和４糖（Ｃｈ４）
ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ
・Ｃｈ飽和６糖（Ｃｈ６）
ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ
・Ｃｈ飽和８糖（Ｃｈ８）
ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡβ１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ
これらのＣｈ飽和オリゴ糖は、Ｎａｇａｓａｗａらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１４１，ｐ９９−１１０，１９８５）に準じて、ＨＣｌを含有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）でＣｈを処理して得られた分解産物を、陰イオン交換クロマトグラフィーでサイズごとに分画することによって得た。
これらのオリゴ糖を用いて、実験２と同様の実験を行った。その結果、いずれのＣｈオリゴ糖を添加した細胞においても、ＨＳＦ１のバンドのシフトあるいはＨＳＦ１自体の量の増加は観察されなかった。
この実験から、Ｃｈオリゴ糖には、ＨＡオリゴ糖において見られるようなＨＳＦ１の活性化や発現増強作用がないことが示された。このことは、かかる作用がＨＡオリゴ糖の糖鎖骨格構造に特異的なものであることを示すものである。
これらの実験から、ＨＡ４糖及びこれを含む画分（ＨＡ２−１８）は、特に顕著にＨＳＦ１を活性化することが明らかとなった。
＜２＞Ｈｓｐの発現に対する作用
＜１＞より、ＨＡ４糖がＨｓｐ７０の発現に必要な因子（ＨＳＦ１）を他のサイズのＨＡと比較してより顕著に活性化することが明らかになったので、ストレスを与えたＫ５６２細胞中のＨｓｐの発現が実際にＨＡ４糖の作用によって他のサイズのＨＡを使用した場合よりもより顕著に増加しているか否かを調べるため、以下の実験を行った。
ＨＡ２、ΔＨＡ４、ＨＡ６、ＨＡ８４及びＬ４Ｌ４のそれぞれについて、前記細胞を含む培養液（３７℃）中に１、１０または１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。その後直ちに４３℃の環境下に移すことによって熱ショックを与え、２０分間インキュベートした。その後培養液を３７℃に戻してさらに２時間インキュベートした後、細胞を遠心分離によって回収し、上記＜１＞と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。次いで一次抗体として抗Ｈｓｐ７２モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を、二次抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧモノクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ社製）を用いたウェスタンブロッティングを行い、Ｈｓｐ７２を検出した。Ｈｓｐ７２は、Ｈｓｐ７０ファミリーのメンバーの１つで、最も代表的なものであり、ストレスにより発現が誘導及び増強されることが知られている。
結果を図４２に示す。図４２のａにおける最も左のレーンは熱ショックを与えず（３７℃）、かつ被験物質を加えずに同様にＨｓｐ７２を検出したものであり、最も右のレーンはスタンダードのＨｓｐ７２（バクテリア由来Ｈｓｐ７２；ｂＨｓｐ７２）を同様に検出したものである。図４２中のｂは、熱ショックを与えない細胞にΔＨＡ４を添加した際のＨｓｐ７２の発現を同様に検出したものである。
図４２のａに示した結果から明らかな通り、熱ショック（４３℃）を与えた場合（左から２番目のレーン）、３７℃で被験物質無添加とした場合（最も左のレーン）と比較してＨｓｐの発現が増強された。また、各ＨＡオリゴ糖の存在下ではＨｓｐの発現がさらに増強され、ΔＨＡ４の存在下ではＨｓｐの発現が特に強力に増強された（左から３〜５番目のレーン）。
このように、ΔＨＡ４を添加した細胞（熱ショックを与えたもの）においてはＨｓｐ７２の強い発現が見られたが、他のサイズのＨＡを添加した細胞ではΔＨＡ４を添加した場合のような強いＨｓｐ７２の発現増強は見られなかった。
また熱ショックを与えない細胞においては、ΔＨＡ４によるＨｓｐ７２の発現の増強は見られなかった。このことからＨＡ４糖は、ストレスがない条件下ではＨｓｐの発現にほとんど影響を与えないにもかかわらず、一旦ストレスが負荷されると、極めて急速かつ顕著にＨｓｐの発現を増強することが明らかになった。＜３＞細胞死の抑制作用
上記実験により、ＨＡ４糖がストレス下で細胞中のＨｓｐの発現を他のサイズのＨＡオリゴ糖よりも強く増強することが明らかになったことから、ＨＡオリゴ糖が実際にストレスに曝された細胞の死をより強く抑制するか否かを調べるため、以下の実験を行った。
ＰＣ−１２細胞は、血清を含まない培養液中ではアポトーシスに陥ることが知られている。
そこでΔＨＡ２、ＨＡ４、ΔＨＡ４、ＨＡ６、ΔＨＡ６、ＨＡ８、ＨＡ１０、ＨＡ１２、ＨＡ８４、Ｌ４、Ｌ４Ｌ４のそれぞれを、ＰＣ−１２細胞を含む（血清含まない）培養液中に１００ｎｇ／ｍｌの濃度となるように添加し、２４時間後に細胞をトリパンブルーで染色し、全細胞数に対する生存細胞（トリパンブルーで染色されなかった細胞）数の割合を算出した。
結果を図４３に示す。図４３の結果から判る通り、ＨＡ４糖、特にＨＡ４は、他のサイズのＨＡオリゴ糖や他の種類のオリゴ糖に比して、顕著に細胞死を抑制した。
＜４＞細胞組織保護作用
１．臓器保存の面から見た細胞・組織保護作用
（１）臓器保存液の調製
１００ｎｇ／ｍｌのＨＡ４糖を含むユーロコリンズ液（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ液；Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．，１７９，ｐ１５４−１６０（２０００））を被験溶液（以下、「ＨＡ４（＋）」とも表記する）とした。対照として、ユーロコリンズ液（以下、「ＨＡ４（−）」とも表記する）を用いた。
（２）被験物質の投与等
１１週齢のＳＤ系雄ラットを、「ＨＡ４（＋）」使用群（ｎ＝５）、「ＨＡ４（−）」使用群（ｎ＝５）、および正常群（ｎ＝５）に分けた。開腹して臓器（肝臓）を摘出後、「ＨＡ４（＋）」使用群および「ＨＡ４（−）」使用群に、それぞれの溶液約４０ｍｌを、脱血して肝全体の色が薄くなるまで灌流した後、３７℃で２時間インキュベートした。
（３）評価
インキュベート後、各群の臓器の湿重量／乾重量比（組織傷害による浮腫の程度の指標）の算出、ＨＥ染色した組織切片の光学顕微鏡観察（肉眼による組織傷害程度の観察）、クロマチン濃縮の画像解析およびＴＵＮＥＬ法（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１９，ｐ４９３−５０１（１９９２））による解析（細胞死の程度の評価）を行った。
（３−１）臓器の湿重量／乾重量比の結果を図４４に示す。なお図４４中の＊は、ｐ＜０．０５（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）で有意差があることを示す。
図４４の結果から、「ＨＡ４（＋）」使用群は、「ＨＡ４（−）」使用群に比して有意に湿重量／乾重量比が低下していた。このことから、ＨＡ４糖は臓器の保存により引き起こされる組織傷害による浮腫を有意に抑制することが示された。
（３−２）ＨＥ染色した組織切片の光学顕微鏡観察の結果、「ＨＡ４（−）」使用群では浮腫、組織融解（細胞質の消失）、核濃縮等が観察された。これに対し、「ＨＡ４（＋）」使用群は正常群とほぼ同様の像が観察され、「ＨＡ４（−）」に見られるような顕著な組織傷害は観察されなかった。
（３−３）クロマチン濃縮の画像解析
細胞死の程度を評価する１方法として、ＨＥ染色した組織切片を用いて、細胞のクロマチン濃縮の画像解析（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ＰＬＵＳＴＭ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．１；Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ製）を行い、画像濃度を比較した。細胞死が起きてクロマチンが濃縮すると、その部分はＨＥによって濃く染色される。クロマチンが濃縮している細胞が多いほど顕微鏡画像全体の濃度が高まるため、これを指標に評価した。
結果を図４５に示す。なお図４５中の＊は、ｐ＜０．０５（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）で有意差があることを示す。
図４５の結果から、「ＨＡ４（−）」使用群では正常群に比して有意に画像濃度が高まったが、「ＨＡ４（＋）」使用群は正常群に比して有意な画像濃度の上昇は見られなかった。
（３−４）ＴＵＮＥＬ法による解析
細胞死の程度を評価する１方法として、ＴＵＮＥＬ法を用いたＤＮＡの断片化の程度を解析した。細胞がアポトーシスを起こすとＤＮＡが断片化することが知られている。ＴＵＮＥＬ法はＤＮＡの末端を染色する方法であり、ＤＮＡが断片化されている細胞が多いとＴＵＮＥＬ染色の程度が高まることから、細胞死（アポトーシス）の程度の指標とすることができる。
保存後の組織切片をＴＵＮＥＬ染色して光学顕微鏡で肉眼観察し、１ｍｍ２あたりのＴＵＮＥＬ染色細胞数をカウントした。併せて、それぞれの組織切片ごとの組織障害の程度を、「重度」、「中度」、「軽度」、「極めて軽度」の４段階で評価した。なおこの評価は、客観性を確保するためにブラインドで行った。前者の結果を図４６に、後者の結果を図４７に示す。なお図４６中の＊は、ｐ＜０．０５（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）で有意差があることを示す。
図４６の結果から、「ＨＡ４（−）」使用群ではＴＵＮＥＬ染色された細胞が極めて多く観察されたのに対し、「ＨＡ４（＋）」使用群ではＴＵＮＥＬ染色された細胞は極めて少なく、ほぼ正常群と同程度であった。また図４７の結果から、「ＨＡ４（−）」使用群では「重度」「中度」の組織障害が８割の組織切片で観察されたが、「ＨＡ４（＋）」使用群では「重度」の組織障害は観察されず、２割の組織切片で「中度」の組織障害が観察されるに止まった。
以上の結果から、ＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）は、臓器保存の面において優れた細胞・組織保護効果を有することが明らかになった。
２．潰瘍に対する効果の面から見た細胞・組織保護作用
（１）投与用被験溶液の調製
被験物質をカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に溶解し、投与用の被験溶液とした。濃度は、後述の投与量に応じ、かつ投与液量が１０ｍｌ／ｋｇとなるように決定した。
また陽性対照溶液として、既存の胃炎・胃潰瘍治療剤（ｔｅｐｒｅｎｏｎｅ、ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ；商品名セルベックス；エーザイ）をＣＭＣに溶解したものを用いた。濃度は、投与量１ｍｇ／ｋｇ（臨床用量）、かつ投与液量が１０ｍｌ／ｋｇとなるように決定した。陰性対照溶液としては０．５％ＣＭＣを用いた。
（２）被験物質の投与等
５週齢のＳＤ系雄ラットを、「陰性対照溶液」投与群（ｎ＝８）、「ＨＡ４  ４ｍｇ／ｋｇ」投与群（ｎ＝８）、「ＨＡ４  ２０ｍｇ／ｋｇ」投与群（ｎ＝８）、「ＨＡ４  １００ｍｇ／ｋｇ」投与群（ｎ＝８）および「陽性対照溶液」投与群（ｎ＝８）に分けた。
第１回目の投与の前日の１６：００から各群のラットを絶食させ、その翌日の８：００に上記各溶液を経口投与した後に水浸拘束した。水浸拘束は翌日の８：００まで（２４時間）行った。途中、１６：００および２４：００に第１回目投与と同様に各溶液を投与した。
その後各ラットを解剖し、胃を摘出した。摘出した胃は１０％緩衝ホルマリンを注入して膨張させて襞を伸ばして固定した。その後、胃壁に付着している血液を水洗した除去した。
（３）評価
黒褐色に変性している潰瘍部の面積率（潰瘍面積／腺胃の面積）を画像解析装置（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ＰＬＵＳＴＭ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．１；Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ製）で測定した。結果を図４８に示す。なお図４８中の＊および＊＊は、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）で有意差があることを示す。
図４８の結果から、ＨＡ４を投与した群はいずれも陰性対照溶液投与群に比して有意に潰瘍部の面積率が低下していた。特にＨＡ４  ２０ｍｇ／ｋｇ投与群および同１００ｍｇ／ｋｇ投与群は、陽性対照溶液群よりも潰瘍部面積率が低かった。
以上の結果から、ＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）は、潰瘍に対する効果の面においても、優れた細胞・組織保護効果を有することが明らかになった。またＨＡオリゴ糖の経口投与によっても、上記のような優れた効果が得られることが明らかとなった。さらに、この実験ではＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）を予め投与した後に水浸拘束しており、かつ、潰瘍が発生するまでには水浸拘束開始後しばらく時間を要することから、この実験の結果はＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）が予防効果を有することを示しているともいえる。
３．肝障害に対する効果の面から見た細胞・組織保護作用
実験１  四塩化炭素モデルを用いた実験
（１）投与用被験溶液の調製
被験物質を生理食塩液に溶解し、投与用の被験溶液とした。濃度は、後述の投与量に応じ、かつ投与液量が５ｍｌ／ｋｇとなるように決定した。
また陽性対照溶液として、後述の四塩化炭素肝障害モデルに対する効果が報告されている（薬物療法、第９巻、特集号ｐ４６−５３）ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド；わかもと製薬）を、投与量１０ｍｇ／ｋｇで用いた。また陰性対照溶液としては生理食塩液を用いた。
（２）被験物質の投与等
５週齢のＳＤ系雄ラットを、「陰性対照溶液」投与群（ｎ＝８）、「ＨＡ４  ２ｍｇ／ｋｇ」投与群（ｎ＝８）、「ＨＡ４  １０ｍｇ／ｋｇ」投与群（ｎ＝８）、「ＨＡ４  ５０ｍｇ／ｋｇ」投与群（ｎ＝８）および「陽性対照溶液」投与群（ｎ＝８）、「正常群」（ｎ＝８）に分けた。
第１回目の投与の前日の１６：００から各群のラットを絶食させ、その翌日の８：００前に四塩化炭素（ＣＣｌ４）を１００ｍｇ／ｋｇ経口投与した。その後８：００に上記各溶液を腹腔内投与した。その後絶食状態のまま飼育し、１６：００および２４：００に第１回目投与と同様に各溶液を投与した。２４：００の投与後に給餌し、翌日８：００に各ラットを解剖した。
（３）評価
解剖後、血液を採取して、ＧＯＴ活性及び白血球数の測定を行った。ＧＯＴ活性の測定は臨床化学自動分析装置（ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡ  Ｓ；日本ロシュ）を用い、白血球数の測定は自動血球測定装置（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｋ−２０００；Ｓｙｓｍｅｘ社製）を用いて行った。
前者の結果を図４９、後者の結果を図５０に示す。なお図４９および図５０中の＊は、ｐ＜０．０５（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）で有意差があることを示す。
図４９より、ＨＡ４  ５０ｍｇ／ｍｌ投与群において、陰性対照溶液投与群に比して有意なＧＯＴ活性の低下が見られた。また図５０より、いずれのＨＡ４投与群においても、陰性対照溶液投与群に比して有意な末梢白血球数の減少が見られ、ＦＡＤに比しても白血球数が減少していた。このことから、ＨＡ４糖は肝障害に対する効果の面からも細胞・組織保護効果を有することが明らかになった。さらに、この実験では四塩化炭素を予め投与した後にＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）を投与しているが、四塩化炭素によって肝障害が発生するまでには四塩化炭素投与後しばらく時間を要することから、この実験の結果はＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）が予防効果を有することを示しているともいえる。
また本実験においては、末梢血中のＩＬ−１０およびＩＬ−８の濃度も併せて測定した。
ＩＬ−１０は、ストレス蛋白質（細胞がストレスを受けると発現し、細胞を保護する作用を有する蛋白質）の一種であるＨｓｐ７０と関連していることが報告されており（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４（５），ｐ２７１１−２７１７（２０００））、またコンカナバリンＡによって惹起された肝炎をＩＬ−１０が抑制したとの報告もある（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，３１（２），ｐ７５−８３  １９９９）。
またＩＬ−８は、カドミウムやアルコールによる肝障害モデルにおいて、発現量が上昇していることが明らかとなっており（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１６３，ｐ２３１−９（２０００），Ａｃｔａ  Ｇａｓｔｒｏ−Ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａ  Ｂｅｌｇｉｃａ，５７（３−４），Ｐ２５５−９（１９９４））、さらにＨｓｐ７０の発現誘導によりＩＬ−８の発現が抑制されたとの報告もある（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４，ｐ５４１６−２３（２０００））。
末梢血中のＩＬ−１０は、ＩＬ−１０  Ｒａｔ  ＥＬＩＳＡ（ＥＮＤＯＧＥＮ社製）で測定した。ＩＬ−８は、パナテストＡシリーズ  ラットＣＩＮＣ−１（ＩＬ−８）（株式会社パナファームラボラトリーズ）で測定した。ＩＬ−１０の測定結果を図５１に、ＩＬ−８の測定結果を図５２に示す。なお図５１および図５２中の＊＊は、ｐ＜０．０１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）で有意差があることを示す。
図５１より、ＨＡ４の投与量依存的に血中ＩＬ−１０濃度が増加しており、ＨＡ４  ５０ｍｇ／ｋｇ投与群においては陰性対照溶液投与群に比して血中ＩＬ−１０濃度が有意に高いことがわかる。また図５２より、ＨＡ４の投与量依存的に血中ＩＬ−８濃度が減少していることがわかる。
この結果からＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）は、ＩＬ−１０の産生促進効果およびＩＬ−８の産生抑制効果をも有していることが明らかとなった。このことから、ＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）はＩＬ−１０の産生促進やＩＬ−８の産生抑制を介して前記細胞・組織保護効果を発揮する可能性も考えられる。またＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）は、ＩＬ−１０の減少やＩＬ−８の増加に起因する疾患や、ＩＬ−１０の産生促進やＩＬ−８の産生抑制が求められる疾患等の処置剤としても利用しうることが示された。
実験２  コンカナバリンＡモデルを用いた実験
ＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）が、四塩化炭素モデル以外の肝障害モデルにも有効か否か確認するために、コンカナバリンＡモデルを用いた実験を行った。
（１）投与用被験溶液の調製
投与用の被験溶液の調製、濃度、投与量、および投与液量等については、実験１と同様である。
また陽性対照溶液として、強力ネオミノファーゲンＣ（Ｓｔｒｏｎｇｅｒ  Ｎｅｏ−Ｍｉｎｏｐｈａｇｅｎ  Ｃ；ミノファーゲン製薬）を、投与量５ｍｇ／ｋｇで用いた。この量は当該薬剤の最高の臨床用量である。また陰性対照溶液としては生理食塩液を用いた。
（２）被験物質の投与等
８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、「陰性対照溶液」投与群（ｎ＝１２）、「ＨＡ４  ２ｍｇ／ｋｇ」投与群（ｎ＝１２）、「ＨＡ４  １０ｍｇ／ｋｇ」投与群（ｎ＝１２）、「ＨＡ４  ５０ｍｇ／ｋｇ」投与群（ｎ＝１２）および「陽性対照溶液」投与群（ｎ＝１２）、「正常群」（ｎ＝８）に分けた。
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；シグマ社）を１５ｍｇ／ｋｇ尾静脈投与した。その後上記各溶液を尾静脈投与した。その後２４時間飼育した。
（３）評価
腹部大静脈より全血液を採取し、臨床化学自動分析装置（ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡ  Ｓ；日本ロシュ）を用いてＧＰＴ活性及びＧＯＴ活性を測定した。また肝臓を摘出して、肝臓の状態を肉眼で評価した。
その結果、ＧＰＴの平均値は「陰性対照溶液」投与群で約５６００（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）であった。これに対し「ＨＡ４  １０ｍｇ／ｋｇ」投与群及び「ＨＡ４  ５０ｍｇ／ｋｇ」投与群ではそれぞれ約２２００（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）及び約１２００（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）であり、いずれも「陰性対照溶液」投与群に対して有意に低かった（ｐ＜０．０１；Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。なお、「陽性対照溶液」投与群は約４０００（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）であった。
また、ＧＯＴの平均値は「陰性対照溶液」投与群で約６０００（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）であった。これに対し「ＨＡ４  １０ｍｇ／ｋｇ」投与群及び「ＨＡ４  ５０ｍｇ／ｋｇ」投与群ではそれぞれ約２０００（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）及び約１０００（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）であり、いずれも「陰性対照溶液」投与群に対して有意に低かった（ｐ＜０．０１；Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。なお、「陽性対照溶液」投与群は約４４００（Ｉ．Ｕ．／Ｌ）であった。
また肝臓の肉眼所見の結果、「ＨＡ４  １０ｍｇ／ｋｇ」投与群及び「ＨＡ４  ５０ｍｇ／ｋｇ」は、いずれも「陰性対照溶液」投与群および「陽性対照溶液」投与群に対して障害の程度が低かった。
このことから、ＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）はコンカナバリンＡによって惹起される肝障害に対しても効果を発揮することが示され、ＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）が種々の肝障害に対して有効であることが示唆された。さらにこの実験も四塩化炭素モデルと同様に、ＨＡオリゴ糖（ＨＡ４糖）が予防効果を有することを示しているともいえる。
なお本発明の各剤は、そもそもＨＡオリゴ糖自体の安全性が高いことに加え、上記実施例の結果からも、その安全性が推定される。
産業上の利用可能性
本発明オリゴ糖は、本発明医薬の有効成分等として有用である。
本発明画分は、所望のサイズのＨＡオリゴ糖を含有し、他のサイズのオリゴ糖その他の不純物を実質的に含有しないＨＡオリゴ糖画分であり、ＨＡオリゴ糖の生理活性探索用の試薬、分析用のスタンダード、医薬品自体ないしその素材として極めて有用である。
本発明オリゴ糖を有効成分とする医薬、特にＨｓｐ発現増強剤は、前記実施例の結果からも明らかな通り、特定サイズのＨＡオリゴ糖が、他のサイズのＨＡオリゴ糖には見られない顕著な効果を発揮することから極めて有用である。さらに、この特定サイズのＨＡオリゴ糖を選択することにより、他のサイズのＨＡオリゴ糖と同一の効果を維持しつつ投与量を減少させることもできることから、より安価かつ安全性の高い剤としうる点においても、極めて有利である。
さらに、本発明オリゴ糖を有効成分とする細胞死抑制剤、細胞障害抑制剤、及び細胞・組織保護剤（例えば、臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝障害処置剤、ＩＬ−１０産生促進剤、またはＩＬ−８産生抑制剤）は、前記実施例の結果からも明らかな通り、優れた薬理効果を発揮し、かつその安全性も高いことから極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＡ４をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。上段の縦軸は２１０ｎｍの吸収を、下段の縦軸はＲＩの吸収を示す。また横軸はいずれも溶出時間を示す。
図２は、ＨＡ６をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図１と同様である。
図３は、ＨＡ８をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図１と同様である。
図４は、ＨＡ１０をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図１と同様である。
図５は、ＨＡ１２をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図１と同様である。
図６は、ＨＡ１４をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図１と同様である。
図７は、ＨＡ４を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸は２１０ｎｍの吸収を、横軸は溶出時間を示す。
図８は、ＨＡ６を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図７と同様である。
図９は、ＨＡ８を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図７と同様である。
図１０は、ＨＡ１０を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図７と同様である。
図１１は、ＨＡ１２を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図７と同様である。
図１２は、ＨＡ１４を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図７と同様である。
図１３は、ＨＡ４８を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図７と同様である。
図１４は、ＨＡ５０を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図７と同様である。
図１５は、ＨＡ５２を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図７と同様である。
図１６は、蛍光標識オリゴ糖の電気泳動の結果を示す図である。
図１７は、ＨＡ４（ロット１）のマススペクトルを示す図である。
図１８は、ＨＡ６（上段）、ＨＡ８（中段）及びＨＡ１０（下段）のマススペクトルを示す図である。
図１９は、ＨＡ６（上段）、ＨＡ８（中段）及びＨＡ１０（下段）についてのＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎの結果を示す図である。
図２０は、ＨＡ１２（上段）、ＨＡ１４（中段）及びＨＡ１６（下段）のマススペクトルを示す図である。
図２１は、ＨＡ１２（上段）、ＨＡ１４（中段）及びＨＡ１６（下段）についてのＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎの結果を示す図である。
図２２は、ＨＡ４８（上段）、ＨＡ５０（中段）及びＨＡ５２（下段）のマススペクトルを示す図である。
図２３は、ＨＡ４８（上段）、ＨＡ５０（中段）及びＨＡ５２（下段）についてのＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎの結果を示す図である。
図２４は、ＨＡ４についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２５は、ＨＡ４についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２６は、ＨＡ６についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２７は、ＨＡ６についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２８は、ＨＡ８についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２９は、ＨＡ８についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３０は、ＨＡ１０についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３１は、ＨＡ１０についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３２は、ＨＡ１２についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３３は、ＨＡ１２についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３４は、ＨＡ１４についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３５は、ＨＡ１４についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３６は、ＨＡ１６についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３７は、ＨＡ１６についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３８は、ＨＡ４８についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３９は、ＨＡ５０についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図４０は、ＨＡ５２についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図４１は、ＨＡ４糖による熱ショック後のＨＳＦ１の活性化を示す図である。
図４２は、ＨＡ４糖による熱ショック後のＨｓｐ７２の発現を示す図である。
図４３は、各種ＨＡオリゴ糖による血清飢餓により誘導されるの細胞死（アポトーシス）の抑制の程度を示す図である。
図４４は、ＨＡ４糖による臓器の浮腫の抑制効果を示す図である。
図４５は、ＨＡ４糖による細胞のクロマチン濃縮の抑制効果を示す図である。
図４６は、ＨＡ４糖によるＴＵＮＥＬ染色細胞数の減少を示す図である。
図４７は、ＨＡ４糖による細胞・組織障害の抑制効果を示す図である。
図４８は、ＨＡ４糖による胃潰瘍抑制効果を示す図である。
図４９は、ＨＡ４糖による肝障害抑制効果（ＧＯＴ活性）を示す図である。
図５０は、ＨＡ４糖による肝障害抑制効果（白血球数）を示す図である。
図５１は、ＨＡ４糖によるＩＬ−１０産生促進効果を示す図である。
図５２は、ＨＡ４糖によるＩＬ−８産生抑制効果を示す図である。
【図１】
0004861596.tif 000016
【図２】
0004861596.tif 000017
【図３】
0004861596.tif 000018
【図４】
0004861596.tif 000019
【図５】
0004861596.tif 000020
【図６】
0004861596.tif 000021
【図７】
0004861596.tif 000022
【図８】
0004861596.tif 000023
【図９】
0004861596.tif 000024
【図１０】
0004861596.tif 000025
【図１１】
0004861596.tif 000026
【図１２】
0004861596.tif 000027
【図１３】
0004861596.tif 000028
【図１４】
0004861596.tif 000029
【図１５】
0004861596.tif 000030
【図１６】
0004861596.tif 000031
【図１７】
0004861596.tif 000032
【図１８】
0004861596.tif 000033
【図１９】
0004861596.tif 000034
【図２０】
0004861596.tif 000035
【図２１】
0004861596.tif 000036
【図２２】
0004861596.tif 000037
【図２３】
0004861596.tif 000038
【図２４】
0004861596.tif 000039
【図２５】
0004861596.tif 000040
【図２６】
0004861596.tif 000041
【図２７】
0004861596.tif 000042
【図２８】
0004861596.tif 000043
【図２９】
0004861596.tif 000044
【図３０】
0004861596.tif 000045
【図３１】
0004861596.tif 000046
【図３２】
0004861596.tif 000047
【図３３】
0004861596.tif 000048
【図３４】
0004861596.tif 000049
【図３５】
0004861596.tif 000050
【図３６】
0004861596.tif 000051
【図３７】
0004861596.tif 000052
【図３８】
0004861596.tif 000053
【図３９】
0004861596.tif 000054
【図４０】
0004861596.tif 000055
【図４１】
0004861596.tif 000056
【図４２】
0004861596.tif 000057
【図４３】
0004861596.tif 000058
【図４４】
0004861596.tif 000059
【図４５】
0004861596.tif 000060
【図４６】
0004861596.tif 000061
【図４７】
0004861596.tif 000062
【図４８】
0004861596.tif 000063
【図４９】
0004861596.tif 000064
【図５０】
0004861596.tif 000065
【図５１】
0004861596.tif 000066
【図５２】
0004861596.tif 000067