(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式のピペリジンもしくはピロリジン環系を含んでなる化合物：
【化１】
0004932994.tif 000031
ここで、
R1はQであり；
R2はQ'であり；
QおよびQ'は同一であっても異なっていてもよく、独立に
【化２】
0004932994.tif 000032
であり；
YはCH2、O、S、NHまたは結合であり；
R3およびR4は独立に6〜14個の環炭素原子を含み、かつ、ヘテロ環原子を含まない環であり（なお、この環は完全に飽和されていても部分的に不飽和であってもよく、または芳香環であってもよく、かつ置換されていなくとも置換されていてもよい）；または
R3およびR4は縮合して12〜28個の炭素原子を含む環構造を形成してもよく；
n2は0ないし8であり；かつ
n1は1〜8である。
【請求項２】
YがOまたはCH2である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
n2が0である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
n1が1であり、かつn2が0である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
式：
【化３】
0004932994.tif 000033
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式：
【化４】
0004932994.tif 000034
を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
YがOである、請求項５または６に記載の化合物。
【請求項８】
R3およびR4が独立に芳香環である、請求項５、６または７の何れか一項に記載の化合物。
【請求項９】
式：
【化５】
0004932994.tif 000035
｛式中、
n3およびn4は独立に1〜5であり；
n1は1〜8であり；
R7および各R8は独立に水素であるか、またはアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシおよび低級アルキルからなる群から選択される電子供与基であるか、またはハロ、ニトロおよびニトリルからなる群から選択される電子求引基である｝
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
R7およびR8がハロである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
式：
【化６】
0004932994.tif 000036
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
式：
【化７】
0004932994.tif 000037
を有する、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
YがOである、請求項１１または１２に記載の化合物。
【請求項１４】
R3およびR4が独立に芳香族である、請求項１１、１２または１３に記載の化合物。
【請求項１５】
式：
【化８】
0004932994.tif 000038
｛式中、
n3およびn4は独立に1〜5であり；
n1は1〜8であり；
各R7および各R8は同一であっても異なっていてもよく、独立に水素であるか、またはアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシおよび低級アルキルからなる群から選択される電子供与基であるか、またはハロ、ニトロおよびニトリルからなる群から選択される電子求引基である｝
を有する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１６】
式：
【化９】
0004932994.tif 000039
｛式中、
n3およびn4は独立に1〜5であり；
n1は1〜8であり；
各R7および各R8は同一であっても異なっていてもよく、独立に水素であるか、またはアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシおよび低級アルキルからなる群から選択される電子供与基またはハロ、ニトロおよびニトリルからなる群から選択される電子吸引基である｝
を有する、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１７】
n1が1である、請求項１５または１６に記載の化合物。
【請求項１８】
R3およびR4が表す環は、アミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシおよび低級アルキルからなる群から選択される電子供与基またはハロ、ニトロおよびニトリルからなる群から選択される電子吸引基で置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
構造
【化１０】
0004932994.tif 000040
｛式中、
R1はQであり、かつR2はQ’である｝
を有する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項２０】
R1が
【化１１】
0004932994.tif 000041
である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
n１が1であり、Ｙが結合であり、n２が0である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
R3およびR4が独立にフェニルである、請求項１９ないし２１の何れか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
構造
【化１２】
0004932994.tif 000042
｛式中、
R13およびR12は独立に水素であるか、またはアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシおよび低級アルキルからなる群から選択される電子供与基であるか、またはハロ、ニトロおよびニトリルからなる群から選択される電子求引基である｝
を有する、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２４】
R2が次式で示される請求項２３に記載の化合物：
【化１３】
0004932994.tif 000043
ここで、
YはO、S、NHまたはCH2であり；
R3およびR4は独立に同一であっても異なっていてもよく、6〜14個の環炭素原子を含む環であり（なお、この環は芳香環であり、かつ、置換されていなくともよく、またアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシおよび低級アルキルからなる群から選択される電子供与基またはハロ、ニトロおよびニトリルからなる群から選択される電子吸引基で置換されていてもよい）；
R2のn1は1〜8であり、かつ、R2のn2は0〜8である。
【請求項２５】
YがOである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
R3およびR4が独立に、置換されていなくともよく、またアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシおよび低級アルキルからなる群から選択される電子供与基またはハロ、ニトロおよびニトリルからなる群から選択される電子吸引基で置換されていてもよいフェニル環である、請求項２４または２５に記載の化合物。
【請求項２７】
R2のn1が1である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２８】
R2のn2が0である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２９】
R2のn1が1であり、かつR2のn2が0である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項３０】
式：
【化１４】
0004932994.tif 000044
｛式中、
R12、R13、R14およびR15は独立に水素であるか、またはアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシおよび低級アルキルからなる群から選択される電子供与基であるか、またはハロ、ニトロおよびニトリルからなる群から選択される電子求引基である｝
を有する、請求項２３に記載の化合物。
【請求項３１】
請求項１に記載の化合物の立体異性体。
【請求項３２】
細胞増殖抑制上有効量の請求項１に記載の化合物および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項３３】
純粋な請求項１に記載の化合物。
【請求項３４】
哺乳類において癌細胞増殖を阻害するための、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記哺乳類がヒトである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
癌に苦しむ動物において癌を治療するための請求項３４に記載の医薬組成物であって、前記治療は、かかる治療を必要としている動物に対して、細胞分裂促進性刺激に応答する癌細胞においてＴ様カルシウムチャンネルによる細胞膜を横切ってのカルシウムイオンの流入を阻害する請求項１に記載の化合物からなる有機カルシウム遮断剤を投与することを含んでなり、該カルシウム遮断剤は細胞へのカルシウムの通過を阻害するのに有効な量で存在する医薬組成物。
【請求項３７】
前記医薬組成物の化合物が、カルシウムチャンネルのα1サブユニットと相互作用することによって細胞へのカルシウムの流入を遮断する、請求項３６の医薬組成物。
【請求項３８】
前記α1サブユニットがα1Gまたはα1Hである、請求項３７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願】
本願は1999年4月7日に出願された米国仮出願第60/128,143号からの恩典を主張するものである。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は癌細胞阻害剤として有用な新規化合物、かかる化合物を含有する組成物、電気的非興奮性細胞へのカルシウム流入を阻害する方法、並びに電気的非興奮性細胞の増殖を阻害する方法に関する。
【０００３】
【発明の背景】
癌に対する代謝拮抗剤による細胞傷害性治療がこの疾病に苦しむ人々の延命に成功している。癌治療に対するこのアプローチの究極の目標は、癌細胞の完全な根絶である。すべての残存する癌細胞の排除により治癒がもたらされるが、薬剤耐性またはより悪性の疾病の出現によりこの結果が妨げられることも多い。細胞増殖抑制性癌治療の目標は、すべての癌細胞を排除するのではなく、細胞増殖を阻害することである。癌の増殖を制御することは、ある極限では、疾病を無力化するのに有効である。癌の増殖を完全に制御できなくとも、例えば、細胞増殖抑制性治療が細胞毒性薬により誘導される緩解期間を有意に延長する場合には臨床的な価値があるであろう。
【０００４】
悪性形質転換は、周囲の増殖因子濃度に対する異常に高い感受性と一致した表現型の獲得と関連していることが多い。例えば前立腺癌において、かかる増殖因子の供給源は、癌細胞自身またはパラ分泌様式の周囲の間質に由来する自己分泌であり得る(Russelら,(1998) Clin. Chem. 44(4):705-723, Steiner, M.S. (1993) Urology 42:99-110)。悪性形質転換および癌進行における増殖因子およびそれらの対応する受容体の分子的役割は複雑なものであり、いまだ十分には理解されていない。
【０００５】
増殖因子受容体は、カルシウムの恒常性を調節する経路にリンクしていることが多い。増殖因子とその受容体との間の細胞分裂促進性相互作用は、細胞外Ca2+の流入増大を包括する経路を活性化することができる。適切なリガンドによる増殖因子受容体の関与により、チロシンリン酸化によるホスホリパーゼCの活性化がもたらされる(Exton, J.H. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:481-509)。活性化されたホスホリパーゼCによりホスファチジルイノシトールビスホスフェートが代謝されて、ジアシルグリセロールおよびイノシトール1,4,5-トリホスフェートが生じる(Berridgeら, (1984) Nature 312:315-321)。イノシトールトリホスフェートは内部貯蔵所からCa2+を放出し、この細胞内Ca2+の放出が細胞外Ca2+の流入を誘発する(Berridge,上記)。
【０００６】
癌細胞の増殖におけるCa2+の流入増大の役割は十分には理解されていない。しかしながら、少なくともいくつかの癌細胞系統の増殖は、細胞外Ca2+の除去により細胞周期の特異点において増殖速度が低下するか、または停止され得ることが示されている(Meldolesi, J. (1995) Nat. Med. 1:512-513; Alessandroら, (1996) In Vivo 10:153-160)。免疫不全マウスにおいて、Ca2+流入を遮断する薬剤がヒト黒色腫細胞の転移を遅延させ得ること(Benzaquenら,(1995) Nat. Med. 1:534-540) は、この観察結果と一致している。
【０００７】
癌細胞増殖におけるCa2+流入の役割が先般来知られることとなったが、Ca2+の流入抑制および癌治療を目的としたCa2+流入アンタゴニストの使用は、これまで開発されていなかった。本発明によって初めて、in vitroおよびin vivoの双方において、増殖因子受容体に関連したCa2+流入および増殖因子に促進された細胞増殖をブロックする化合物が開発された。本発明の化合物は、明確な毒性を伴わずに、乳癌細胞および前立腺癌細胞のような癌細胞のCa2+の流入および増殖を阻害するのに有用である。
【０００８】
【発明の概要】
従って、本発明は癌細胞の増殖を遅延させるのに有用であり、かつ次式を有する新規化合物、およびその医薬上許容される塩に向けられている：
【化１８】
0004932994.tif 000002
｛式中、
XはNまたはCHであり；
【化１９】
0004932994.tif 000003
は飽和しており、かつ、O、SおよびNからなる群から選択される1または2個のさらなる環へテロ原子を含んでもよく、残りの環原子は炭素原子である、5〜10員の環であり；
R1は(CH2)n-Z-(R5)、Q、水素または低級アルキルであり；
R2は水素またはQ'であり（ただしR1がQであるか、またはR2がQ'である）；
QおよびQ'は同一であっても異なっていてもよく、独立に
【化２０】
0004932994.tif 000004
であり；
Zは化学結合、CH2、O、SまたはNHであり；
YはCH2、O、SまたはNHであり；
R3、R4およびR5は独立に6〜14個の環炭素原子を含み、かつ、ヘテロ環原子を含まない環であり（なお、この環は完全に飽和されていても部分的に不飽和であってもまたは芳香族であってもよく、かつ、置換されていなくとも、電子供与基または電子求引基で置換されていてもよい）；または
R3およびR4は縮合して12〜28個の炭素原子を含む環構造を形成してもよく；
R10、R6およびR11は独立に水素または低級アルキル（なお、置換されていても、電子求引基または電子供与基で置換されていてもよい）であり；
n2は0ないし8であり；かつ
nおよびn1は独立に1〜8である｝。
【０００９】
これらの化合物はカルシウムアンタゴニストであり、かつ、有効なカルシウムチャンネル遮断薬である。
【００１０】
本発明はまた、医薬上有効な量のこれら化合物およびその医薬担体を含有する医薬組成物に向けられている。本発明はまた、癌に罹患した哺乳類におけるその治療に向けられており、これは哺乳類に対して、細胞増殖を抑制するのに有効な量の該化合物を投与することを含んでなる。本発明はまた、かかる治療を必要とする哺乳類において癌細胞増殖を阻害する方法に向けられており、該方法は、哺乳類に対して、細胞増殖を抑制するのに有効な量の当該化合物を投与することを含んでなる。本発明はまた、哺乳類の電気的非興奮性細胞へのカルシウムの流入を阻害する方法に向けられており、該方法は、哺乳類に対して、哺乳類の電気的非興奮性細胞へのカルシウム吸収を阻害するのに有効な量の当該化合物を投与することを含んでなる。
【００１１】
【発明の詳細な記述】
上記の式において、
【化２１】
0004932994.tif 000005
は、5〜10個の環原子および合計9個までの炭素原子を含む環を指す。環は単環であっても二環であってもよいが、単環であることが好ましい。環は3個までのヘテロ原始を含んでもよく、残る環原子は炭素原子である。本明細書においてヘテロ原子とは、O、SまたはNである。従って、ヘテロ環は1〜3個の窒素原子、または1個の窒素原子および1もしくは2個の硫黄もしくは酸素原子を含み得る。しかしながら、該ヘテロ環は1または2個のへテロ原子を含むことが好ましい。窒素ヘテロ原子に加え、第2または第3の環へテロ原子が存在する場合には、酸素環原子または窒素環原子の何れかであることが好ましい。環が1個のヘテロ原子を含む、すなわちXがNであることが特に好ましい。環が合計5または6個の環原子を含み、これが単環であることが好ましい。
【００１２】
環は好ましくは飽和しているが、部分的に不飽和であってもよい、すなわち、1または2個の炭素二重結合を含んでもよい。しかしながら、好ましい実施態様では、X原子と隣接する環原子の間には二重結合を全く含まない。好ましいヘテロ環部分としては、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニルなどが挙げられる。好ましいヘテロ環としては、イミダゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニルおよびモルホリニルがある。
【００１３】
上記の式中、R1、R11、R2、R10およびR6として特定される種々の置換基は、環原子に結合できる。本明細書で定義されるR1置換基は環原子Xに結合しており、その他の置換基は環中の炭素原子に結合している。
【００１４】
本明細書において「低級アルキル」とは、直鎖であっても分枝であってもよい、1〜6個の炭素原子を含むアルキル基を指す。これらの基としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、s-ブチル、アリールペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。アルキルは1〜4個の炭素原子を含むことが好ましい。最も好ましいアルキル基はメチルである。
【００１５】
「電子求引基」および「電子供与基」とは、水素原子が分子中の同一位を占める場合の水素のものと比較して、それぞれ電子を求引する、または供与する置換基の能力を指す。これらの用語は当業者には十分に理解され、J. March, 第4版 John Wiley & Sons, New York, NY 16-18頁(1992)のAdvanced Organic Chemistryに記載されており、その記載は本明細書の一部として本願に援用される。電子求引基の例としては、ハロ、特に、フルオロ、ブロモ、クロロ、ヨードなど、ニトロ、ニトリルなどが挙げられる。電子供与基の例としては、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシなどをはじめとする低級アルコキシ、低級アルキル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノなどのような基が挙げられる。当業者であれば、上記の置換基はある傾向の状況下では電子供与能を有し、かつ、異なる化学条件または状況下では電子求引能を有し、また、これらもこれらの用語の範囲内にあると考慮されるということを理解するであろう。さらに、本発明は上記で同定される用語から選択される置換基の何れの組合せも想定している。
【００１６】
本明細書で定義されるように、環状構造はQまたはQ'置換基の何れかを含むはずであり、あるいは、本明細書で定義されるように、QおよびQ'の双方を含む場合もある。
【００１７】
QおよびQ'は同一であっても異なっていてもよく、
【化２２】
0004932994.tif 000006
｛式中、n1、Y、n2、R3およびR4は本明細書の定義に同じ｝
で定義される。n2が0であることが好ましい。n1の好ましい値は1〜4であるが、特には1である。また、YはCH2またはOであることが好ましく、特にはOである。R3およびR4の好ましい値は独立に置換されていなくても置換されていてもよいアリール基である。好ましいアリール基はフェニルである。フェニル基は置換されていないかまたはハロ、特に、F、ClまたはBr；低級アルコキシ、例えば、メトキシ；アミノ；ニトロ；ニトリロまたは低級アルキルで置換されていることが好ましい。
【００１８】
上記で定義されるR1は式：(CH2)n-Z-R5（ここで、n、ZおよびR5は上記の定義に同じ）を有する。Zの好ましい値はCH2またはOである。
【００１９】
nは1〜4であることが好ましいが、特には1、2または3である。
【００２０】
好ましいR5は芳香環であり、特には、置換されていないかまたは置換されているフェニルである。置換されている場合には、ハロ、アルコキシ、アルキル、ニトリロ、ニトロまたはアミノで置換されていることが好ましい。
【００２１】
本発明の1つの好ましい実施態様では、本発明の化合物は次式：
【化２３】
0004932994.tif 000007
を有する。
【００２２】
式IAの化合物は次式：
【化２４】
0004932994.tif 000008
｛式中、
R1およびn1は上記の定義に同じであり、かつ
R7およびR8は独立に水素または電子供与基または電子求引基であり、かつn4およびn3は独立に1〜5である｝
を有することがさらにより好ましい。
【００２３】
本発明のもう１つの好ましい実施態様は次式：
【化２５】
0004932994.tif 000009
｛式中、
R1およびR2は上記の定義に同じである｝
の化合物に向けられる。
【００２４】
式IBの化合物のさらにより好ましい実施態様は次式：
【化２６】
0004932994.tif 000010
｛式中、
R1およびR2は上記の定義に同じ｝
を有する。
【００２５】
式IBの化合物の特に好ましい実施態様は次式：
【化２７】
0004932994.tif 000011
｛式中、
R7、R8、R1、n1、n4およびn3は上記の定義に同じ｝
を有する。
【００２６】
上記の式において、R1は次式：
【化２８】
0004932994.tif 000012
｛式中、
R9は水素、電子求引基または電子供与基であり、かつ、n5は1〜5である｝
を有することが好ましい。
【００２７】
もう1つの好ましい実施態様は次式：
【化２９】
0004932994.tif 000013
｛式中、
本明細書に定義のように、R1はQであり、かつ、R2は水素またはQ'である｝を有する。
【００２８】
本発明の化合物は実質的に純粋であること、すなわち、実質的に不純物を含まないことが好ましい。本発明の化合物は、少なくとも75重量%純度であることが最も好ましく、90重量%純度よりも高いことがより好ましく、約95重量%純度よりも高いことが最も好ましい。
【００２９】
また、本発明の化合物は鏡像異性体的に純粋であること、すなわち、R1置換基に結合している非対称炭素の周りで、実質的に1種の異性体型、例えば、実質的にR（またはD）立体異性体または相当するS（またはL）立体異性体で存在することが好ましい。この炭素位置での立体化学はS（またはL）配置であることが好ましい。
【００３０】
種々の変形のための種々のマーカッシュ基のすべての順列組合せが本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。さらに、それから生じる種々の鏡像異性体も本発明の範囲内にあると考えられる。
【００３１】
本発明の好ましい化合物は、本明細書の図面の簡単な説明における図４０の説明に列記されている。
【００３２】
本発明の化合物は、当該技術で認識されている技術によって、市販の出発物質から製造される。本発明の化合物を製造するための例示的な手順を以下に概説する。
【００３３】
例えば、次式II：
【化３０】
0004932994.tif 000014
｛式中、
Xは窒素である｝
の化合物を、アミド形成条件下で、R20COOHまたはそのアシル化誘導体（例えば、低級アルキルエステル）と反応させて、対応するアミド：
【化３１】
0004932994.tif 000015
｛式中、
R1、R10、R11およびR6は上記の定義に同じであり、
R20は(CH2)n-1-ZR5、
【化３２】
0004932994.tif 000016
HまたはR1のアルキル基よりも1個少ないCH2基を含む低級アルキルであり、かつ、
Lはトシレート、メシレート、ハライド（例えば、クロリド、ブロミドまたはヨーダイド）などのような良好な脱離基である｝
を形成する。
【００３４】
その生成物をルイス酸、例えば、AlCl3の存在下でリチウムアルミニウムヒドリドなどのカルボニル還元剤と反応させて、対応するアルカンを形成する。その生成物を置換反応条件下でR2L1（ここで、R2は上記の定義と同じであり、L1は良好な脱離基、例えば、ハライド、トシレートまたはメシレートである）と反応させて、本発明の生成物を形成する。
【００３５】
R2中のYがOであり、かつ、XがNHである場合には、生成物は上記の手順の変法で形成する。例えば、
【化３３】
0004932994.tif 000017
を、アミド形成条件下でR20COOHまたはアシル化誘導体と反応させて、次式：
【化３４】
0004932994.tif 000018
｛式中、R16は低級アルキルであり、かつ、R20は上記の定義に同じである｝
で示される生成物を形成する。上記の生成物をAlCl3などのルイス酸の存在下でリチウムアルミニウムヒドリドなどの還元剤と反応させる場合には、この試薬は対応するアミドを還元するだけでなくエステル官能基も還元して以下の化合物：
【化３５】
0004932994.tif 000019
を形成する。
【００３６】
対応するアルコールを、式：
【化３６】
0004932994.tif 000020
｛式中、Lはハライド、トシレート、メシレートなどのような良好な脱離基である｝で示される分子と水酸化物などの強塩基の存在下で反応させ、あるいは、LがOHである場合には、酸触媒、例えば、パラトルエンスルホン塩基の存在下にウィリアムソン反応条件下で反応させて、本発明の化合物を形成する。
【００３７】
両合成において、R1はCH2-R20を含むよう定義されることに留意すべきであろう。
【００３８】
しかしながら、R1がHである場合には、式IIの化合物は上記のような求核反応条件下において、R2L2と共に加熱して式Iの生成物を形成する。
【００３９】
Xが炭素である場合には、式Iの化合物は式III
【化３７】
0004932994.tif 000021
のカルボニル化合物をグリニャール反応条件下でグリニャール試薬R1MgX1と反応させることで対応する式IV
【化３８】
0004932994.tif 000022
｛式中、R1、R10、R11、R6およびLは上記の定義に同じであり、かつ、X1はハライドである｝
で示されるアルコールを形成してもよい。なお、式IIIのカルボニル化合物は、対応するアルコールから、該アルコールをKMNO4、CrO3、K3Cr2O7などのような先行技術において知られている酸化剤を用いて酸化条件下で酸化することにより製造される。
【００４０】
式IV中のOH官能基は、例えば、アルコールをトシレートまたはその他のスルホネート（例えば、メシレート）に変換し、次いで、その生成物を両性非プロトン性溶媒、例えば、Et2O中でLiAlH4またはNaBH4などのような還元剤と反応させて対応するアルカンを形成させような、当技術分野で公知の技術によってCHに変換される。
【００４１】
【化３９】
0004932994.tif 000023
次いで、生成物を上記のような置換反応条件下でR2Lと反応させて、本発明の化合物を形成する。
【００４２】
使用する試薬との反応性を有する基が置換基R1、R2、R6、R10またはR11に存在する場合には、反応前にそれらを当技術分野で公知の保護基と反応させることにより、それらを保護できる。保護基の例は、Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, New York, NY 1981による「有機合成における保護基」と題された本に記載されており、その内容は本明細書の一部として本願に援用される。
【００４３】
上記の反応では、反応物または生成物との反応性がない溶媒中において反応を実施することが好ましい。アミド形成反応では、メチレンクロリド、クロロホルムなどのような溶媒中で反応を実施することが好ましく、他方、グリニャール反応および還元反応では、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのようなエーテル中で反応を実施することが好ましい。置換およびウィリアムソン反応は、好ましくはヘキサン、ペンタン、ヘキサン、トルエン、石油エーテルなどのような不活性溶媒中で実施する。各工程において、反応は所望の生成物を形成するのに有効な温度で実施する。好ましくは、これらの温度は約0℃ないし溶媒の還流温度の範囲にわたり、特定の反応により異なる。当業者ならば反応条件は容易に決定できる。しかしながら、グリニャール反応に関しては、反応は凍結温度付近（例えば。0℃以下）で実施するのが好ましく、他方、置換およびウィリアムソン反応では、反応は還流温度で実施するのが好ましい。
【００４４】
下記の実施例は、上記の概略図を用いて本発明の化合物を製造するための、例示的手順を示すものである。
【００４５】
本発明の化合物は、約0.5mgないし約100mg/体重kg/日の範囲の量で投与される場合に優れた細胞増殖抑制活性を示す。好ましい投与計画は、約1mg/kg/日ないし約50mg/kg/日の範囲にわたる。この投与計画は医師により最適な治療応答を提供するよう調節することができる。例えば、毎日数個に分割した用量を投与してもよいし、または治療状況の緊急により必要とされるように比例的に減らしてもよい。明らかに実施上の利点としては、有効化合物を経口、静脈（水に可溶性である場合には）、筋肉内または皮下経路などによる便宜な方法で投与できるということである。
【００４６】
例えば、有効化合物は不活性賦形剤と共に、または同化性可食担体と共に経口投与してもよいし、あるいは、硬カプセルもしくは軟カプセルに封入してもよいし、あるいは、打錠してもよいし、あるいは、治療食の食物中で直接摂取してもよい。経口投与治療用には、有効化合物を賦形剤と混合して、経口摂取可能な錠剤、舌下錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、カシェ剤などの形態で用いてもよい。かかる組成物および製剤は少なくとも1％の有効化合物を含むべきである。組成物および製剤のパーセンテージはもちろん異なってよく、便宜には、単位の重量の約5ないし約80％の間であり得る。かかる治療上有用な組成物中の有効化合物量は好適な用量が得られるようなものである。好ましい本発明の組成物または製剤は経口単位投与形が約3ないし1000mgの間の有効化合物を含むように製造する。
【００４７】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた以下のものを含んでもよい。トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、ラクトースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、冬緑油などの香料添加剤もしくはチェリー人口香味料を加えてもよい。単位投与形がカプセル剤である場合には、上記の種類の物質に加え、液体担体を含んでもよい。種々のその他の物質がコーティングとして、あるいは物理的な単位投与型を改良するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤はセラック、糖または双方でコーティングしてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は有効化合物、甘味剤としてのスクロース、保存料としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーもしくはオレンジフレーバーなどの人口香味料を含んでもよい。もちろん、何れかの単位投与形を製造するのに用いる何れの物質も医薬上純粋で、かつ、用いる量では実質的に無毒であるべきである。さらに、有効化合物を徐放性製剤および処方に組み込んでもよい。例えば、有効成分がイオン交換樹脂に結合している徐放性投与形が考えられ、これは所望により樹脂の放出能を改良するために拡散障壁コーティングで被覆してもよい。
【００４８】
有効化合物はまた非経口または腹腔内投与してもよい。また、分散物はグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中ならびにオイル中に製造すればよい。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を抑制するための保存料を含む。
【００４９】
注射可能な使用に好適な医薬形態は滅菌水溶液（水に可溶性である場合には）または滅菌注射可能溶液または分散物の即時製造用分散物および滅菌散剤を含む。すべての場合において、形態は無菌でなければならず、かつ、容易に注射できる程度の流動性がなければならない。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護しなければならない。担体は例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合には所望の粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の防止は種々の抗菌性および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合には、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能組成物の長期間吸収は組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを用いることで達成できる。
【００５０】
滅菌注射可能溶液は適当な溶媒中の所望量の有効化合物を上記で列挙された種々のその他の成分と混合することにより、要すれば、次いで濾過滅菌することにより製造する。一般に、分散物は種々の滅菌した有効成分を、上記に列挙されたものからの基礎分散媒および必要とされるその他の成分を含む滅菌ビヒクル中に取り込むことで製造する。滅菌注射可能溶液を製造するための滅菌散剤の場合には、好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより有効成分および何れかのさらなる所望の成分の粉末をそれまでに滅菌濾過したその溶液から得る。
【００５１】
本明細書において「医薬上許容される担体」とは、何れかおよびすべての溶媒、分散媒、被膜、抗菌性および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤などを含む。医薬上有効な物質のためのかかる媒質および薬剤の使用は当技術分野で十分に公知である。何れかの通常の媒質または薬剤が有効成分と適合しない範囲を除いて、治療組成物におけるその使用が考えられる。また、組成物中に補足有効成分を組み込んでもよい。
【００５２】
投与および用量の均一性を容易にするためには、単位投与形の親組成物を処方することが特に有利である。本明細書において単位投与形とは治療される哺乳類被験体にとり単位用量として好適な物理的に別個の単位を意味し、各単位は所望の治療効果を提供するよう計算された所定量の有効物質を必要とされる医薬担体と組み合わせて含む。本発明の新規単位投与形の仕様は(a)有効物質および達成される特定の治療効果の独特な特徴および(b)身体の健康が本明細書に詳細に開示されるように損なわれている病状を有する被験生体において疾病を治療するためにかかる有効物質を混合するという技術に内在する限界により決定され、かつ直接的に左右される。
【００５３】
主有効成分は、有効量での便宜かつ有効な投与のために、上記のように単位投与形中に好適な医薬上許容される担体と混合する。単位投与形は、例えば、約3ないし約1000mgの範囲の量で主有効化合物を含み得る。割合で示せば、有効化合物は一般に約1ないし約750mg/ml担体で存在する。組成物が補足有効成分を含む場合には、用量はその成分の通常の投与量および方法に関係して決定される。
【００５４】
特に断りのない限り、%は重量%である。
【００５５】
以下、本発明をよりよく理解すべく、実施例を挙げて本発明を説明するが、これらに限定するものではない。
【００５６】
一般法
A.TH-1177の合成.  TH-1177を次の3つの簡便な工程で合成した(図1)。工程1でアミドを形成し、工程2がアミドの還元であり、工程3がWilliamsonエーテル形成によるエーテル形成である。
【００５７】
工程1：ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジンホスホニウム(PyBOP)および2当量のN-メチルモルホリンを用いてL-プロリンメチルエステルと4-メトキシフェニル酢酸とをカップリングして、黄色がかった油状物質1-［2-(4-メトキシフェニル)アセチル］ピロリジン-2-カルボン酸メチルを生成した。
【００５８】
工程2：続いて、得られたアミドをLiAlH4およびAlCl3によりTHF中においてアミノアルコールに還元した。
【００５９】
工程3：工程2の生成物を少量の酢酸エチルに溶解し、15%HCl/酢酸エチル溶液を加え、さらに回転真空装置を用いて溶媒を蒸発させることにより、無色の油状物質をそのアミンアルコール塩に変えた。還流トルエン中の触媒パラ-トルエンスルホン酸を用いるWilliamson条件下でその塩と4-クロロベンズヒドロールとをカップリングした。茶色がかった最終油状物質を酢酸エチルおよびヘキサンの50:50混合物を用いるシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより単離し、NMRおよび質量分析法にて確認した。TH-1177をin vitroで用いるにはDMSOに、in vivoで用いるにはエタノールに溶解した。
【００６０】
最後のカップリングを除き、すべての工程により75%を超える収率を得た。PyBOPにより、種々のアミンおよび酸とのカップリングによりアミドを形成する、安全かつ極めて信頼性ある方法が提供される。それは、酸ハロゲン化物の形成またはジシクロヘキシルカルボジアミドのような他のカップリング剤の使用より優れていることが示された。LiAlH4およびAlCl3を1:3比で用いるある工程ではアミドおよびエステル両方の効率よい還元が達成される。最終生成物の純度については、アルデヒドの形成を避けるのに十分な量の水素化物が存在していることが重要である。これらの研究の完了させるためにバッチ間にNMRまたは質量分析特性における差のないTH-1177の3つの異なる合成を用いた。各バッチをin vitroにおけるPC3およびLNCaP前立腺癌細胞増殖を阻害するその能力について評価したところ（実施例4参照）、各バッチのIC50値はアッセイの分散内にあった。
【００６１】
TH-1177の3工程合成（図1）により、容易にかつ効率的に、多数のものを対象とし得る合成例の概略が提供される。
【００６２】
以下に挙げる他の化合物は上記手法の変形により製造される。すべての場合において、工程2および工程3は極めて類似している。
【００６３】
B.TH-1087の合成.
工程1：イソニペコチン酸エチル(1当量)および4-メトキシフェニル酢酸（1.2当量）と1当量のベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジンホスホニウム(PyBOP)、および1.2当量の塩化メチレン中のN-メチルモルホリン(NMM)とを反応させて窒素ガスのような不活性ガス下、室温で30分〜1時間攪拌した。溶媒を蒸発させた。
【００６４】
工程2：工程1の生成物（1当量）と1当量のLiAlH4および1/3当量のAlCl3（LiAlH4に対して）とを反応させた。さらに厳密にいえば、攪拌子および乾燥THFを入れた丸底フラスコに、AlCl3およびLiAlH4を慎重に加えた。次いで得られた溶液を約1時間攪拌した。工程1のアミド生成物を最小限の量の溶媒(THF)に溶解し、シリンジにより極めてゆっくりと攪拌溶液に加えてアルコールを生成した。反応が完了した後にTHFを蒸発させた。
【００６５】
工程3：工程2の生成物を少量の酢酸エチルに溶解することにより、工程2の生成物をアミノアルコールからアミノアルコール塩に変えた。15%HCl/酢酸エチル溶液をそれに加えた。回転真空装置により溶媒を蒸発させることでその塩を単離した。攪拌子および溶媒を入れた丸底フラスコに塩（1当量）を加えた。これに0.5当量のp-TsOHおよび1.1当量のベンズヒドロールを加え、完了するまで混合物を還流した。生成物を酢酸エチルおよびヘキサンの50:50混合物を用いるシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより単離した。
【００６６】
C.TH-2029.  工程3において4-クロロベンズヒドロールを使用すること以外は、実施例Bの手法に従った。
【００６７】
D.TH-2043.  工程3において4,4’-ジクロロベンズヒドロールを使用すること以外は、実施例Bの手法に従った。
【００６８】
E.TH-1203.  工程1においてニペコチン酸エチルを使用すること以外は、実施例Bの手法に従った。
【００６９】
F.TH-1205.  工程3において4-クロロベンズヒドロールを使用すること以外は、実施例Cの手法に従った。
【００７０】
G.TH-1019.  工程1において3-(2-メトキシフェニル)プロピオン酸を使用すること以外は、実施例Bの手法に従った。
【００７１】
H.MMR-64.  攪拌子およびトルエンを入れた丸底フラスコに、5当量のジフェニル酢酸、続いて5当量のDMFを加えた。この溶液を温度が平衡に達するまで0℃で攪拌した。0℃に達したら塩化オキサリルをゆっくりと加え、溶液を室温まで加温した。それを室温で約1時間攪拌し、さらにそれを氷(0℃)上に戻してピペリジン（1当量）をゆっくりと加えた。反応物を室温まで加温し、完了するまで攪拌した。トルエンを回転蒸発により除去してアミドを単離した。
【００７２】
攪拌子および乾燥THFを入れた丸底フラスコに、１当量のLiAlH4および1/3当量のAlCl3（LiAlH4に対して）をゆっくりと加えた。得られた溶液を約1時間攪拌した。上記で生成したアミド（1当量）を最小限の量のTHFに溶解し、シリンジにより極めてゆっくりと攪拌溶液に加えた。
【００７３】
I.MMR-70.
工程1：攪拌子およびトルエンを入れた丸底フラスコに、5当量のジフェニル酢酸、続いて5当量のDMFを加えた。この溶液を温度が平衡に達するまで0℃で攪拌した。0℃に達したら塩化オキサリルをゆっくりと加え、溶液を室温まで加温した。それを室温で約1時間攪拌し、さらにそれを氷(0℃)上に戻してイソニペコチン酸エチル（1当量）をゆっくりと加えた。アミンを加えた後にさらに溶液を室温まで加温し、完了するまで反応物を攪拌した。
【００７４】
工程2：Bの工程2の手法に従った。
【００７５】
工程3：Bの工程3の手法に従った。
【００７６】
J.MMR-92.  工程3において4-クロロベンズヒドロールを使用すること以外は、実施例Iの手法に従った。
【００７７】
K.MMR-100.  工程3において4,4’-ジクロロベンズヒドロールを使用すること以外は、実施例Iの手法に従った。
【００７８】
L.MMR-104.  工程3において9-フルオレノールを使用すること以外は、実施例Iの手法に従った。
【００７９】
M.TH-1113.  工程3においてベンズヒドロールを使用すること以外は、TH-1177の手法に従った。
【００８０】
N.TH-1211.  工程1において塩酸プロリンメチルエステルのD異性体を使用すること以外は、TH-1177の手法に従った。
【００８１】
O.TH-2019.  工程3において4,4’-ジクロロベンズヒドロールを使用すること以外は、TH-1177の手法に従った。
【００８２】
P.TH-2129.  工程3において4,4’-ジメトキシベンズヒドロールを使用すること以外は、TH-1177の手法に従った。
【００８３】
Q.TH-2083.  工程1において3-(4-メトキシフェニル)プロピオン酸を使用し、かつ工程3においてベンズヒドロールを使用すること以外は、TH-1177の手法に従った。
【００８４】
R.TH-2085.  工程3において9-フルオレノールを使用すること以外は、TH-2083の手法に従った。
【００８５】
S.TH-2151.  工程1において3-(2-メトキシフェニル)プロピオン酸を使用し、かつ工程3において4-クロロベンズヒドロールを使用すること以外は、TH-2083の合成手法に従った。
【００８６】
T.TH-2153.  工程3において4,4’-ジメトキシベンズヒドロールを使用すること以外は、TH-2151の合成手法に従った。
【００８７】
U.TH-2209.  工程3において4-ブロモベンズヒドロールを使用すること以外は、TH-1177の合成手法に従った。
【００８８】
V.TH-2149.  2-(1-メチルピロリジン-2-イル)-エタン-1-オールを少量の酢酸エチルに溶解した。これに15%HCl/酢酸エチル溶液を加えた。回転真空装置により酢酸エチルを除去し、それによってアミン塩が生成した。この塩（1当量）にトルエン、0.5当量のパラトルエンスルホン酸および1.1当量のベンズヒドロールを加えた。完了するまで反応物を還流した。
【００８９】
W.TH 3101.  工程1において4-メトキシフェニル酢酸の代わりに4-フルオロフェニル酢酸を使用すること以外は、TH-1177の合成手法に従った。
【００９０】
X.TH 3104.  4-メトキシフェニル酢酸の代わりに2-メトキシフェニル酢酸を使用すること以外は、TH-1177の合成手法に従った。
【００９１】
Y.TH 3105.  4-メトキシフェニル酢酸の代わりに3-メトキシフェニル酢酸を使用すること以外は、TH-1177の合成手法に従った。
【００９２】
A〜Yで同定された様々な生成物を以下の表1に示す：
【００９３】
【表１−１】
0004932994.tif 000024
【００９４】
【表１−２】
0004932994.tif 000025
【００９５】
【表１−３】
0004932994.tif 000026
【００９６】
【表１−４】
0004932994.tif 000027
本発明の化合物は抗腫瘍薬として有用である。例えば、本発明の化合物は白血病、特にリンパ性白血病などの悪性腫瘍および固体腫瘍、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、癌腫（例えば、腺癌）、黒色腫、リンパ腫、肉腫（例えば、骨肉腫など）、肺、結腸、肝臓、生殖器（例えば精巣、子宮）、皮膚、骨ならびに結合組織、中枢神経系(CNS)、例えば脳および膠ならびにシュワン細胞をはじめとする末梢神経等の組織から発生した悪性腫瘍または腫瘍の治療に有効である。
【００９７】
限定されるものではないが、本発明の化合物はカルシウムチャンネル遮断剤であると考えられる。
【００９８】
有糸分裂促進物質によるなどの刺激に応じて、カルシウムの細胞内濃度の上昇がもたらさせると考えられる。本明細書において使用される「有糸分裂促進物質」とは、細胞の分裂かつ増殖を誘発する薬剤、すなわち有糸分裂の刺激剤をいう。有糸分裂促進物質の例としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、ブラジキニン、血小板由来増殖因子(PDGF)、等のような増殖刺激因子が挙げられる。限定されるものではないが、増殖刺激因子は細胞上にあるその受容体と協働し、その結果として、段階的反応によりイノシトール三リン酸(IP-3)が生成すると考えられる。さらに、限定されるものではないが、IP-3は特定の細胞内受容体と結合して、小胞体のような細胞内貯蔵プールからのカルシウム放出を誘発し、後に細胞外カルシウムの細胞への流入を引き起こすと考えられる。
【００９９】
カルシウムの流入は数多くの細胞プロセス、特に細胞活性化および増殖の重大なシグナルであると考えられる。その流入は、包括的にカルシウムチャンネルとして知られる膜貫通細孔により制御される。カルシウムチャンネルが開くと、カルシウムはその電気化学的勾配に従って細胞質ゾルへと流入する。これらのチャンネルは伝導性および平均開放時間のような生物物理学的特性により、および種々の薬剤に対する相対的感受性により分類される。
【０１００】
L、N、P、Q、R、SおよびTのような様々な種類の公知のカルシウムチャンネルが存在する。しかしながら、限定されるものではないが、癌細胞はT系統のカルシウムチャンネルに類似した特性を有するカルシウムチャンネルを所有していると考えられる。さらに、限定されるものではないが、癌に関連のある細胞増殖は、T様カルシウムチャンネルを通過するカルシウムの細胞質ゾルまたは細胞内部への流入により活性化されるとも考えられる。
【０１０１】
本明細書において使用される「T様チャンネル」とは、Tチャンネルの特性を有するカルシウムチャンネルをいう。しかしながら、真のTチャンネルではないT様チャンネルは、カルモジュリンのような第二メッセンジャーにより刺激される。
【０１０２】
さらに、本発明の化合物は本来、T様カルシウムチャンネルアンタゴニストであると考えられる。すなわち、それらはカルシウムのT様カルシウムチャンネルの透過およびその細胞への流入を遅らせ、および／または妨げ、その結果としてそれらは細胞増殖の遅延に有効であると考えられる。さらに、とりわけT様カルシウムチャンネルは、カルシウムの流入が非電位関門(NVG)チャンネルにより管理されていると考えられる電気的非興奮性細胞に見られる。限定されるものではないが、癌はこれらの種類のチャンネルを通過するカルシウムの細胞質ゾルへの流入と関連しており、かつ本発明の化合物が、非電位関門チャンネルによりカルシウムの流入が管理されているこれらの種類のTチャンネルを通過するカルシウムの透過を妨げ、それによって、本発明の化合物により癌細胞の無秩序な増殖が阻害されると考えられる。
【０１０３】
本明細書において使用される「電気的非興奮性細胞」とは、電気的に興奮性でない何れかの細胞、すなわちニューロンおよび筋肉細胞で発生するような活動電位を示さない細胞をいう。これらの細胞では、原形質膜における電気的活動電位応答によりカルシウムの流入は起こらない。電気的非興奮性細胞は、T様カルシウム受容体により調整されるカルシウムチャンネルを有している。
【０１０４】
本発明の化合物は、ほとんどの化学療法薬とは異なっている。数多くある従来の癌化学治療薬は細胞傷害性であり、癌細胞を殺すことによりそれらが治療的に有利に働く。一方、本発明の化合物はカルシウム流入の妨害により作用し、癌細胞の増殖を制御する細胞増殖を抑止または遅延させ、このようにして病気による影響を効果的に消滅させる。
【０１０５】
本発明者らはカルシウム流入を阻害し、および／または非興奮性細胞における細胞増殖を阻害する化合物が癌の治療に有効であることを見出した。本明細書において使用される「治療する」とは、患者の健康状態が改善するか、または病気の進行が遅れるように病状を改善することを意味する。
【０１０６】
本発明の別の実施態様では、かかる疾患に苦しむ動物における癌を治療する方法であって、該動物に細胞分裂促進性刺激に応答する癌細胞の細胞膜にわたるカルシウムイオンの流入を妨害、および／または遅延させるカルシウム遮断剤を投与することを含む方法に向けられる。好ましいカルシウム遮断剤は、少なくとも1つの炭素−炭素結合を含有する有機化合物である。よって、無機化合物でないことが好ましい。カルシウム遮断剤は、細胞外カルシウムイオンの細胞への通過を妨げるのに有効な量で存在する。存在するカルシウム遮断剤の好ましい有効量は上記の通りである。好ましいカルシウム遮断剤は、少なくとも1個の窒素環ヘテロ原子を含有するヘテロ複素環を含有している。少なくとも1個の環ヘテロ原子が窒素である限り、環が5〜10個の環原子および1〜3個のヘテロ原子を含有していることがより一層好ましい。複素環が飽和していることが特に好ましい。
【０１０７】
本発明の好ましい実施態様では、カルシウム遮断剤がT様カルシウムチャンネルのようなカルシウムチャンネルを遮断することにより、カルシウムイオンの癌細胞への流入を妨害または遅延させる。限定されるものではないが、カルシウムチャンネル遮断剤がT様カルシウムチャンネルのα1Gまたはα1Hサブユニットようなα1サブユニットと相互に作用することにより、カルシウムの細胞への流入を妨害または遅延させると考えられる。好ましいカルシウム遮断剤は上記の式Iの化合物である。
【０１０８】
種々の試験化合物の有効性は、以下に記載するような非興奮性細胞を用いてカルシウムアンタゴニスト活性を測定する試験により、または癌細胞における増殖の減退を記録することにより調べることができる。
【０１０９】
これらのアッセイに有用な好適な電気的非興奮性細胞としては、活性化または増殖にカルシウムの流入が必要であるが、ニューロンで発生するような電気的活動電位によりカルシウムの流入が起こらない如何なる細胞も含まれる。非興奮性細胞としては、リンパ球、および血液上皮細胞、結合組織細胞ならびに腺細胞をはじめとする分泌性細胞の他の形成された成分が挙げられる。in vivoアッセイにおける使用に特に好ましい電気的非興奮性細胞には、Jurkat細胞（Tリンパ球）、MDA-468（乳癌細胞系）、PC-3（前立腺癌細胞系）、A-549（肺癌細胞系）、HCT-116（結腸癌細胞系）、SK-OV3（卵巣癌細胞系）、MIA PaCa-2（膵臓癌細胞系）、および電気的に非興奮性である他の細胞種または細胞系の何れもが含まれる。上記細胞系はAmerican Type Culture Collection, Manassas, VAから入手可能である。
【０１１０】
以下に記載するアッセイにおいて使用する細胞系は、当技術分野で公知の標準手法を用いて維持され、かつ生存状態が保たれた。例えば、ホルモン耐性LNCaP-FRGおよびホルモン感受性PC3前立腺癌については、ATCC(Manassas, VA)から入手した細胞をグルタミンおよびSerXtend(Irvine Scientific)を含有する5%ウシ胎児血清を補給したRPMI 1640中で維持した。培養に使用するウシ胎児血清は、血清を56℃で1時間維持することにより熱失活させた。
【０１１１】
当技術分野では種々のアッセイが知られているが、本発明者らは以下のアッセイを利用した。
【０１１２】
細胞内Ca2+濃度の測定：  細胞を1μMのCa2+感受性蛍光色素indo-1(indo-1/AM, Molecular Probes, Eugene, OR)のアセトキシ-メチルエステルを含有する増殖培地において37℃で1時間インキュベートした。細胞をバッファーA（10mM HEPES、pH 7.4、1mM MgCl2、3mM KCl、1mM CaCl2、140mM NaCl、0.1% グルコース、1%ウシ胎児血清）で3回洗浄し、最終濃度106/mlまで懸濁した。刺激の前に細胞を37℃まで加温した。また刺激の前に細胞を薬剤、カルシウムチャンネルアンタゴニストと共にインキュベートし、IC50値を調べた。［Ca2+］における変化を従前に公開されている方法、引用することにより本明細書の一部とされるHaverstick, et al. (1998) Cell Calcium, 23: 361-368; Densmore, et al. (1996) Am. J. Physiol., 271:C1494-1503、を用いてS LM 8100C分光蛍光計(SLM/Aminco, Urbana, IL)で記録した。
【０１１３】
(1)生理学的リガンドまたは(2)小胞体(ER)ATPアーゼ阻害剤の何れかを用いて、カルシウムの細胞への流入を適切に刺激する。好ましくは生理学的リガンドを用いてカルシウムの細胞への流入を刺激する。
【０１１４】
本明細書において使用される「生理学的リガンド」とは、電気的に非興奮性の細胞上で受容体と結合してCa2+の細胞への流入を刺激するリガンドである。これらのリガンドは使用する電気的非興奮性細胞により様々である。例えば、Jurkat細胞に関する使用に好適なリガンドとして、抗原、例えばOKT3のT様細胞受容体に対する抗体が挙げられる。MDA-468細胞に関する使用に好適なリガンドとしては、上皮細胞増殖因子または形質転換増殖因子が挙げられる。PC-3細胞に関する使用に好適なリガンドとしては、上皮細胞増殖因子またはアデノシンのようなプリンアゴニストが挙げられる。これらは引用することにより本明細書の一部とされるCarpenter and Cohen, 1990, J. Biol. Chem. 265: 7709-7712; Crabtree and Clipstone, 1994. Annu. Rev. Biochem. 63: 1045-1083;およびGardner, P. 1989. Cell 59: 15-20で概説されている。これらの試薬はSigma、CALBIOCHEMおよびResearch Diagnostics(Flanders, NY)のような供給者から入手可能である。
【０１１５】
本明細書において使用される「小胞体(ER)ATPアーゼ阻害剤」とは、小胞体から細胞質へのカルシウムの放出を刺激し、次にカルモジュリンを活性化し、後にカルシウムの細胞への流入を活性化する何れもの化合物である（ER ATPアーゼ阻害剤の概説については、Thastrup, O, Agents and Actions (1990), 29: 8-15; Inesi and Sagara, Archives of Biochem. and Biophys., 298:313-7およびDarby, et al., Biological Signals (1993), 2: 293-304参照）。好ましいER ATPアーゼ阻害剤として、シクロピアゼン酸(Sigma， St. Louis, MOから入手可能)およびタプシガルギン(Sigmaから入手可能)が挙げられる。
【０１１６】
細胞増殖の測定：  LNCaP細胞2.5×104／ウェルまたはPC3細胞5×104／ウェルを、薬剤またはビヒクル(DMSO)の存在下、双方とも最終容量100μlにおいて、3組、標準平底96ウェル組織培養プレートに入れた。特に断りのない限り、細胞はCO2インキュベーターにおいて37℃で48時間増殖させた。相対的細胞増殖は製造業者により記載されるように自動プレートリーダーを用いるCellTiter 96水性細胞増殖アッセイ(Promega, Madison, WI)により調べた。結果を略式に計算して3組の測定量の平均とした。
【０１１７】
48時間の増殖では、細胞をカルシウムチャンネルアンタゴニストと共にまたはカルシウムチャンネルアンタゴニストを加えずに培養した。カルシウムチャンネルアンタゴニストのIC50値を求めた。本発明者らは乳癌細胞系、前立腺癌細胞系およびリンパ球性白血病細胞系に関して、上記のアッセイの何れかまたはその双方において、約10μM未満、さらに好ましくは5μM未満、最も好ましくは2μM未満のIC50値を有する化合物が、哺乳類、特にヒトをはじめとする患者の癌の治療に有効であることを見出した。さらに、好ましい化合物はイミダゾール部分を含有していない。本発明者らは本発明の化合物がこれらの細胞系においてこの著しい効力を有していることを見出した。
【０１１８】
本発明者らは膵臓腫瘍細胞系、卵巣腫瘍細胞系、肺腫瘍細胞系のような固体腫瘍の他の細胞系に関して、上記のアッセイの何れかまたはその双方において約30μM未満、さらに好ましくは約20μM未満、最も好ましくは約10μM未満のIC50を示す化合物が、哺乳類、特にヒトをはじめとする患者の癌の治療に有効であることを見出した。さらに、本発明者らは本発明の化合物がこれらの細胞系においてこの著しい効力を有していることを見出した。
【０１１９】
以下に記載する数多くの実施例においてもin vivoアッセイを行った。
【０１２０】
動物研究：  すべてのプロトコールについてはthe Animal Care Committee of the University of Virginiaに承認されたものであった。SCIDマウスをthe University of Virginia Department of Comparative Medicineの保護隔離施設に収容し、すべての職員は施設への入る際、および動物を処理する際には殺菌処理を行った。各日の注入直前にTH-1177をエタノールに溶解して滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で10倍に希釈した。各動物につき注入量0.5mlを使用した。ビヒクルはPBSにより希釈したエタノールからなった。mlにつき2×106まで懸濁する前に3回滅菌PBSで洗浄して注入用のPC3細胞を調製した。各動物には図9に示される試験0日目にIP注入により0.5mlの細胞を施した。各動物には試験1日目にビヒクルまたは薬剤開始の1日のIP注入を施した。
【０１２１】
統計法：  in vivoにおける生存データをPrism 2.01(GraphPad Software, San Diego, CA)により解析した。薬剤処理によりマウスが対照動物よりも早く、移植した癌に倒れる確率は論理的にあり得ないため、Kaplan-Meier解析の結果を片側確率として示す。
【０１２２】
実施例1
TH-1177がヒト前立腺癌細胞において容量性Ca2+流入を阻害した。電気的非興奮性細胞では「容量性」Ca2+流入と呼ばれる現象によるその内部貯蔵組織からのCa2+の放出によりCa2+流入が引き起こされる(引用することにより本明細書の一部とされるPutney, J. W., Jr. (1986) Cell Calcium, 7: 1-12; Haverstick, et al., (1993) Mol. Biol. Cell, 4: 173-184; Kohn, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1307-1311)。細胞のタプシガルギンによる処理により、容量性流入を起こすことができる。タプシガルギンは小胞体のCa2+-ATPアーゼを阻害してこのコンパートメントから細胞質ゾルへ調整されないCa2+の漏出を起こすことにより、特定の受容体との関連なく、Ca2+流入を引き起こす (引用することにより本明細書の一部とされるThastrup, et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2466-2470; Takemura, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 12266-12271)。
【０１２３】
図2Aに示されるように、タプシガルギンの前にTH-1177をLNCaPヒト前立腺癌細胞の懸濁液に加えることにより、［Ca2+］iの上昇についての用量依存的阻害がなされた。また、TH-1177は刺激後に加えた際にタプシガルギンにより起こされる［Ca2+］iの上昇を抑えた(図2B)。図2Bにおいて100秒の時点で見られる［Ca2+］iの上昇は［Ca2+］流入だけによるものであった。よって、TH-1177の作用にはCa2+流入の阻害が介在していた。
【０１２４】
実施例2
TH-1177が受容体の関連するCa2+流入を阻害した。P2 プリン受容体は前立腺癌細胞をはじめとする数多くの種類の細胞のCa2+流入経路の活性化に関連している(Fang, et al. (1992) J. Clin. Invest. 89: 191-196)。タプシガルギンにより誘導されるTH-1177の容量性Ca2+流入を阻害する能力により、この化合物が特定の受容体の関連により引き起こされるCa2+流入を阻害することが示された。P2受容体はCa2+流入をはじめとする多様な生化学的事象を誘発する細胞外ATPと結合する(Fang, et al. 上記)。ATPをLNCaPヒト前立腺癌細胞の懸濁液に加えることにより、［Ca2+］iが急速に上昇した。これは予めTH-1177を加えることにより阻害された(図3A)。また、図3Bに示されるように、ATP後に加えたTH-1177により、P2受容体の関連により高まる［Ca2+］iの低下が起こった。
【０１２５】
またPC3前立腺癌細胞により、ATPで刺激した際の［Ca2+］iの上昇が示された(図3)。図4Aに示した試験では、細胞をATPにより刺激する前にTH-1177を加えた。またTH-1177により、プリン受容体の関連により引き起こされる［Ca2+］iの上昇についての濃度依存的阻害が起こった。ATPを加えた後、70秒で内部貯蔵プールからのカルシウム放出は十分に過剰であり（例えば、以下の図5参照）、基準を超えた［Ca2+］iの高さの維持は細胞外コンパートメントからのCa2+流入に依存していた。図4Bに示されるように、TH-1177をATPで予め処理した細胞に加えることにより、［Ca2+］iの低下が起こった。よって、TH-1177はCa2+流入経路と相互に影響し合う。
【０１２６】
Ca2+流入の阻害におけるTH-1177の有効性を、Ca2+流入を100%阻害すると考えられる細胞外Ca2+とEGTAとのキレート化の効力との比較により評価した。これらの条件下において、LNCaP細胞についてのTH-1177のIC50は3μMであり、PC3細胞についてのIC50が16μMであった。
【０１２７】
上記に示したデータにより、TH-1177がCa2+流入を遮断することで刺激による［Ca2+］iの上昇を阻害することが示された。図5ではEGTAを細胞外媒質に加えることで細胞外Ca2+が極めて低下した。これらの条件下において、ATPをPC3（図5A）またはLNCaP（図5B）細胞の何れかに加えることにより［Ca2+］iが上昇したが、細胞外Ca2+の存在下よりも過度的でありかつその大きさが小さかった。これらの上昇は内部貯蔵プールからのCa2+の放出を示した。TH-1177の添加によるこの［Ca2+］iにおける変化の大きさへの影響はなかった。このことによりTH-1177がCa2+放出を妨害しないことがわかり、TH-1177が内部プールからのCa2+の放出からさかのぼる生化学的事象に対して作用しないことが示された。細胞外Ca2+の存在下においてTH-1177により引き起こされる［Ca2+］iの上昇の阻害はP2プリン受容体の関連により開かれる［Ca2+］流入経路の遮断によるものであった（図3および4）。
【０１２８】
実施例3
TH-1177が細胞増殖抑制機構によりin vitroにおける前立腺癌細胞増殖を阻害した。Ca2+流入の阻害についてはin vitroにおける癌細胞の増殖を制限することが示されてきた。P2プリン受容体の関連により刺激されるような、内部貯蔵組織からのCa2+の放出により引き起こされるCa2+流入を遮蔽するTH-1177の能力により、この薬剤がin vitroにおける前立腺癌細胞の増殖を阻害し得るという可能性が示唆された。
【０１２９】
図6に示されるように、TH-1177はLNCaPおよびPC3細胞増殖双方の濃度依存的阻害をもたらした。LNCaP増殖阻害についてのIC50は4μM（図6A）であり、PC3前立腺癌細胞についての値は14μMであった（図6B）。LNCaPおよびPC3細胞の3μMおよび16μMのCa2+流入阻害についてのIC50を比べると、それぞれ、TH-1177がこれら2種類の細胞においてCa2+流入の遮断に必要なものと同様の濃度で増殖を阻害したことが明らかであった。多くの従来の癌化学治療薬は細胞傷害性であり、癌細胞を殺すことによりそれらが治療的に有利に働く。一方、Ca2+流入の阻害により作用する薬剤（すなわち、細胞増殖抑制剤）は細胞死を誘導するよりもむしろ細胞増殖を抑止するようである(Meldolesi, J. (1995) Nat. Med., 1: 512-513)。この可能性に向け、薬剤を洗い流す前の2または3日間、阻害しないでまたはTH-1177に曝露してLNCaP（図7）前立腺癌細胞を増殖させた。両細胞系はTH-1177不在下では増殖したが、化合物が存在する場合には増殖が停止した。
【０１３０】
2または3日間の曝露後にTH-1177を除去すると、TH-1177に曝露しなかった細胞に見られたものと同様の増殖率へと回復した（図7）。同様の結果がPC3前立腺癌細胞にも見られた。よって、前立腺癌細胞はTH-1177の存在下では、この薬剤の不在下で培養した細胞に比べ、静止状態にあった。
【０１３１】
図7に示す試験では、TH-1177により前立腺癌細胞の増殖性表現型の長期にわたる変更が起こらないことが示された。
【０１３２】
図8に示す試験ではこの可能性のさらなる評価が行われた。
【０１３３】
LNCaP細胞を3種類の濃度のうち1つの濃度においてTH-1177を継続的に存在させてまたは化合物不在で4時間増殖させた。次いで細胞培養培地をTH-1177を含有しない培地に置き換えてさらに48時間維持した。さらに、予め処理した細胞培養物が同じ第2の処理を受けるようにTH-1177を図8に示す濃度ですべての細胞培地に加えた。TH-1177での予備処理によるこの化合物の第2の曝露に対する応答への影響はなかった（図7）。この観察によりTH-1177は増殖を阻害するために存在するのであって、TH-1177によりこれらのヒト前立腺癌細胞系の薬剤感受性表現型の変更が起こらないことが示された。
【０１３４】
実施例4
in vitroにおけるリンパ球前立腺および乳癌細胞増殖の阻害。
【０１３５】
図10〜29に示されるように、TH-1087、TH-1113、TH-1211およびTH-1205により、Jurkat、PC3、LNCaP、MDA-468およびMDA-361細胞増殖の濃度依存的阻害が起こった。
【０１３６】
図30〜39に示されるように、MMR-64、MMR-70により、Jurkat、PC3、LNCaP、MDA-468およびMDA-361細胞増殖の阻害が起こった。
【０１３７】
実施例5
TH-1177はin vivoにおいて前立腺癌進行を遅延させた。TH-1177が前立腺癌に対するin vivo活性を有する可能性についての調査を開始するため、SCIDマウスにPC3細胞をIP注入により接種した。1日後、TH-1177またはビヒクル単独で1日のIP注入を開始した。TH-1177を3mg/kgまたは10mg/kgの何れかの用量で投与した。これらの用量は高血圧症の治療用に患者に口から施与するCa2+チャンネル遮断剤の一般的な用量範囲に基づいて選択した。また1日用量は1日1回の治療管理の一般的に好ましい用量に基づいて選択した。図9に示されるように、TH-1177投与に関連する寿命の長さに用量依存的延長があった。TH-1177により、3mg/kg/日の用量では34%(p=0.047)、10mg/kg/日の用量では38%(p=0.0044)の延命があった。
【０１３８】
図9の試験ではTH-1177投与に関連する毒性のないことが示されたが、さらにこの薬剤をとりわけ可能性ある毒性について調べた。腫瘍のない4匹のSCIDマウスにTH-1177を180mg/kg/日の用量で施与した。処置したマウスはすべて手入れが行き届いており、処置中は活動的であった、解剖では著しい異常は認められなかった。腎臓、副腎、心臓および肝臓のサンプルは能動的肝臓造血機能をはじめとする組織学的試験の正常値の範囲内であった。
【０１３９】
実施例6
上記の測定細胞増殖アッセイを用いて、細胞系Jurkat、LNCaP（前立腺癌細胞）、PC-31（前立腺癌細胞）、DU145（前立腺癌細胞）、MDA-468（乳癌細胞）、MDA-36（乳癌細胞）、MCF-7（乳癌細胞）、MIA PaCa-2（膵臓癌細胞）、Hep G2（肝臓癌細胞）、A549（非小細胞肺癌細胞）、NCI H460（非小細胞肺癌細胞）、HT-29（結腸癌細胞）、HCT-116（結腸癌細胞）およびSK OV-3（卵巣癌細胞）を、TH-1177、TH-1205、TH-1201、TH-2109、TH-2029、TH-2043、TN-2085およびTH-2279の存在下において培養した。IC50値(μM)を以下の表にする：
【表２】
0004932994.tif 000028
IC50値(μM)
実施例7
実施例6の細胞増殖試験を繰り返し、TH-3101、TH-3104およびTH-3105をそれぞれ、種々の細胞系：Jurkat、LNCaPおよびMDA-361において試験した。その結果を以下の表にする：
【表３】
0004932994.tif 000029
実施例8
LNCaPの増殖試験におけるTH-1177および他の関連する薬剤についてのIC50値(μM)を、（上記の細胞内カルシウム濃度測定手法に従って得られた）LNCaP細胞に関するカルシウム流入阻害についてのIC50値に対してプロットした。
【０１４０】
結果を図面により図40で示す。図面により2つの機能が一次相関していることが明らかに示される。
【０１４１】
実施例9
アフリカツメガエル卵母細胞を、引用することにより本明細書の一部とされるCribbs, et al. in Circulation Research, 1998, 83, 103-109に記載の手法に従って調製したヒト心臓のカルシウムチャンネルのα1Hサブユニットでトランスフェクトした。Cribbs, et al.の論文に記載の手法に従ってα1H配列をトランスフェクションベクターpcDNA3のEcoRV-X baI部位にクローニングすることによりα1Hプラスミドを得た。アフリカツメガエル卵母細胞(35mm皿あたり1×105)を2μgのα1H-Txプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をKCl 140(mmol/L)、EGTA 10、MgCl2 1、CaCl2 1、ブドウ糖 10、およびHEPES 10を含有する標準脱分極浴溶液(pH 6.4)により脱分極した。ラプチャード・パッチ法(ruptured patch method)によりBaCl2 10(mmol/L)、TEA-Cl 140、CsCl 6、およびHEPES 10を含有する溶液(TEA-OHでpH 7.4に調整)中、荷電担体として用いたBa2+によって全細胞の記録を行った。ピペット内溶液はCsCl 55(mmol/L)、CsSO3 75、MgCl2 10、EGTA 0.1、およびHEPES 10(CsOHでpH 7.2に調整)を含有していた。電流はAxopatch 200A、Digidata 1200 A/DコンバーターおよびpCLAMPソフトウェア(Axon Instruments, Inc.)を用いて記録した。
【０１４２】
脱分極した細胞において細胞の電流を時間に対して記録した（対照）。対照プロットの記録後、数分以内に細胞を再び脱分極した。この時点で浴にさらに10μM TH-1177を入れた。対照として同じ時間長の電流を記録した。電流は約0pAで記録した。次いで10μM TH-1177を入れた浴中の細胞を再び脱分極化した。この時点でTH-1177を含有する浴媒質を吸引して取り出し、媒質を脱分極する新たなカルシウム媒質と置き換えて電流を測定した。
【０１４３】
結果を図面により図41で示す。この試験によりTH-1177がこれらの細胞の細胞膜を渡るカルシウムの能力を阻害していることがはっきりと示される。
【０１４４】
実施例10
細胞をCribbs, et al. FEBS Letters, 66, 54-58 (2000)に記載の手法に従って調製した2μgのα1Gサブユニットでトランスフェクトしたことを除き、実施例9の手法を繰り返した。ここでこの細胞を実施例9の脱分極媒質を用いて脱分極した。電流が最大のレベルに到達したら、さらに10μM TH-1177を媒質に加えて電流の変化を観察した。電流は約0pAで記録した。電流を一定に保ち、実施例9の手法に従ってTH-1177を洗い落とし、再び電流値の変化を記録した。
【０１４５】
電流の変化をプロットし、そのプロットを図42で示す。
【０１４６】
この試験でもまたTH-1177がα1Gサブユニットでトランスフェクトしたアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜を渡るカルシウムの能力を完全に阻害していることが示される。TH-1177を洗い落とすことで細胞膜を渡るカルシウムの能力は回復する。
【０１４７】
実施例9および10のデータから本発明の化合物、例えばTH-1177およびその同類のものがT様カルシウムチャンネルを阻害することが明らかに示される。
【０１４８】
上記の好ましい具体例および実施例は本発明の範囲および精神を例示するものである。これらの具体例および実施例によって他の具体例および実施例が当業者には明らかとなる。他の具体例および実施例は本発明の範囲内と考えられる。
【０１４９】
よって本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  TH-1177の化学合成を表す。
【図２】  LNCaP細胞におけるタプシガルギンによって刺激されたCa2+流入に対するTH-1177の作用を図示する。LNCaP細胞は300nMのタプシガルギンで刺激して受容体独立的にCA2+の流入を開始させた。示された濃度のTH-1177をタプシガルギンでの刺激前に（パネルA）または流入経路が開かれた後に加えた（パネルB）。
【図３】  LNCaP細胞におけるATPによって刺激されたCa2+流入に対するTH-1177の作用を図示する。1mMのATPで受容体依存的に刺激されたCa2+流入に対する10μMのTH-1177の作用をATPでの刺激前に（パネルA）または流入経路が開かれた後に加えた（パネルB）TH-1177で調べた。
【図４】  PC3細胞におけるATPで刺激されたCa2+流入に対するTH-1177の作用を図示する。1mMのATPで受容体依存的に刺激されたCa2+流入に対する示された濃度のTH-1177の作用はATPでの刺激前に（パネルA）または流入経路が開かれた後に加えた（パネルB）TH-1177で調べた。
【図５】  内部貯蔵所からのCa2+の放出に対するTH-1177の作用を図示する。内部貯蔵プールからのCa2+の放出に媒介されるIF3に対するTH-1177の作用をEGTAの添加で細胞外Ca2+をキレート化して放出成分を明らかにすることでモニターした。示された濃度のTH-1177を30秒で、次いで、2.5mMのEGTAを60秒で加え、90秒で受容体を1mMのATPで刺激した。パネルA：PC3細胞。パネルB：LNCaP細胞。
【図６】  細胞増殖に対するTH-1177の作用を図示する。100:1希釈の2.5×104細胞のLNCaP細胞（パネルA）または100:1希釈の5×104のPC3細胞（パネルB）を示された濃度のTH-1177の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は4回の測定の平均である。
【図７】  LNCaP細胞を薬剤の不在下または1μM（パネルA）もしくは3μM（パネルB）のTH-1177と共に2.5×105細胞でプレーティングし、1日目に3本のフラスコに入れ、2日目から5日目まで各フラスコ中の生細胞数を測定した。2、3および4日目に、すべてのフラスコを遠心分離し、TH-1177を含むか含まない新鮮培地を示したように加えた。各場合における細胞増殖に対する作用を図示する。
【図８】  LNCaP細胞を示された濃度のTH-1177の不在下（非処理細胞）または存在下（前処理）で48時間増殖させた。培地を除去して薬剤を含まない培地を48時間加えた。次いで、薬剤を含まない培地を除去して薬剤を含む培地をすべての細胞に72時間加えた。図示されたデータはこのプロセスの最終での相対的な細胞数を示す。
【図９】  TH-1177を用いた動物実験の結果を表および図で示す。1日目にSCIDマウスに１×106個のPC3細胞を接種した。マウスは毎日ビヒクル（薬剤を用いない、○）または3mg/kg（●）もしくは10mg/kg（□）のTH-1177の注射を受けた。この群の動物の生存曲線を示す。
【図１０】  ジャーカット細胞の細胞増殖に対するTH-1087の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのジャーカット細胞を示された濃度のTH-1087の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図１１】  PC3細胞の細胞増殖に対するTH-1087の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのPC3細胞を示された濃度のTH-1087の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図１２】  LNCaP細胞の細胞増殖に対するTH-1087の作用を表および図で示す。100μlの2.5×104個/mlのLNCaP細胞を示された濃度のTH-1087の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図１３】  MDA-468細胞の細胞増殖に対するTH-1087の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-468細胞を示された濃度のTH-1087の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図１４】  MDA-361細胞の細胞増殖に対するTH-1087の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-361細胞を示された濃度のTH-1087の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図１５】  ジャーカット細胞の細胞増殖に対するTH-1113の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのジャーカット細胞を示された濃度のTH-1113の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図１６】  PC3細胞の細胞増殖に対するTH-1113の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのPC3細胞を示された濃度のTH-1113の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図１７】  LNCaP細胞の細胞増殖に対するTH-1113の作用を表および図で示す。100μlの2.5×104個/mlのLNCaP細胞を示された濃度のTH-1113の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図１８】  MDA-468細胞の細胞増殖に対するTH-1113の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-468細胞を示された濃度のTH-1113の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図１９】  MDA-361細胞の細胞増殖に対するTH-1113の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-361細胞を示された濃度のTH-1113の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２０】  ジャーカット細胞の細胞増殖に対するTH-1211の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのジャーカット細胞を示された濃度のTH-1211の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２１】  PC3細胞の細胞増殖に対するTH-1211の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのPC3細胞を示された濃度のTH-1211の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２２】  LNCaP細胞の細胞増殖に対するTH-1211の作用を表および図で示す。100μlの2.5×104個/mlのLNCaP細胞を示された濃度のTH-1211の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２３】  MDA-468細胞の細胞増殖に対するTH-1211の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-468細胞を示された濃度のTH-1211の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２４】  MDA-361細胞の細胞増殖に対するTH-1211の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-361細胞を示された濃度のTH-1211の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２５】  ジャーカット細胞の細胞増殖に対するTH-1205の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのジャーカット細胞を示された濃度のTH-1205の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２６】  PC3細胞の細胞増殖に対するTH-1205の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのPC3細胞を示された濃度のTH-1205の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２７】  LNCaP細胞の細胞増殖に対するTH-1205の作用を表および図で示す。100μlの2.5×104個/mlのLNCaP細胞を示された濃度のTH-1205の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２８】  MDA-468細胞の細胞増殖に対するTH-1205の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-468細胞を示された濃度のTH-1205の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図２９】  MDA-361細胞の細胞増殖に対するTH-1205の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-361細胞を示された濃度のTH-1205の不在下（100%の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３０】  ジャーカット細胞の細胞増殖に対するMMR-64の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのジャーカット細胞を示された濃度のMMR-64の不在下（100％の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３１】  PC3細胞の細胞増殖に対するMMR-64の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのPC3細胞を示された濃度のMMR-64の不在下（100％の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３２】  LNCaP細胞の細胞増殖に対するMMR-64の作用を表および図で示す。100μlの2.5×104個/mlのLNCaP細胞を示された濃度のMMR-64の不在下（100％の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３３】  MDR-648細胞の細胞増殖に対するMMR-64の作用を表および図で示す。100μｌの5×104個/mlのMDR-468細胞を示された濃度のMMR-64の不在下（100％の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３４】  MDA-361細胞の細胞増殖に対するMMR-64の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-361細胞を示された濃度のMMR-64の不在下（100％の細胞増殖）または存在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３５】  ジャーカット細胞の細胞増殖に対するMMR-70の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのジャーカット細胞を示された濃度のMMR-70の不在下（100%の細胞増殖）または不在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３６】  PC3細胞の細胞増殖に対するMMR-70の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのPC3細胞を示された濃度のMMR-70の不在下（100%の細胞増殖）または不在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３７】  LNCaP細胞の細胞増殖に対するMMR-70の作用を表および図で示す。100μlの2.5×104個/mlのLNCaP細胞を示された濃度のMMR-70の不在下（100%の細胞増殖）または不在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３８】  MDA-468細胞の細胞増殖に対するMMR-70の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-468細胞を示された濃度のMMR-70の不在下（100%の細胞増殖）または不在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図３９】  MDA-361細胞の細胞増殖に対するMMR-70の作用を表および図で示す。100μlの5×104個/mlのMDA-361細胞を示された濃度のMMR-70の不在下（100%の細胞増殖）または不在下で48時間増殖させた。結果は6回の測定の平均である。
【図４０】  本発明の例示的化合物によるLNCaP細胞におけるカルシウム流入の阻害と増殖の相関関係を図示する。化合物に関する凡例は以下に示される。
【化２０】
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【図４１】  TH-1177の、カルシウムのカルシウムチャンネルのα1Hサブユニットでトランスフェクトされたアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜通過を阻害する能力を図示する。凡例Aは10μMのTH-1177を培地に加えた場合のグラフであり、BはTH-1177の洗浄に関する作用を示すグラフであり、Cは対照である。
【図４２】  TH-1177の、カルシウムのカルシウムチャンネルのα1Gサブユニットでトランスフェクトされたアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜通過を阻害する能力を図示する。点1は10μMのTH-1177を培地に加えた時間を示し、点2はTH-1177の洗浄を実施した時間である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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