(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＴＢ６の複製開始点（ｏｒｉＶ）−ｒｅｐＢ領域を含み、ＭｅｍｂＢ、ＭｏｂＡ、ＯｒｆＩ及びｏｒｉＴ領域を含まないｐＴＢ６由来領域部分と、ｐＵＣ  Ｏｒｉ領域を含む大腸菌由来プラスミド部分とを有し、ｐＵＣ  Ｏｒｉ領域を含む大腸菌由来プラスミド部分が、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）を含まないか、又はアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）の発現産物であるβ−ラクタマーゼのＮ末端領域をコードするＤＮＡが欠失しているプラスミド部分であることを特徴とするビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクター。
【請求項２】
ｐＴＢ６由来領域部分が、配列番号１の３０５〜１５６４番目に示される塩基配列からなる１２６０ｂｐの塩基配列を含むｐＴＢ６由来領域部分からなることを特徴とする請求項１記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクター。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム属微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、又はビフィドバクテリウム・アドレスセンティスであることを特徴とする請求項１又は２記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクター。
【請求項４】
平均コピー数が６〜３０であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターに、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（ＨＵ蛋白質）をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターとターミネーターとの間に所望遺伝子がインフレームで連結された発現ユニットが挿入され、ビフィドバクテリウム属微生物において所望遺伝子を発現することができる発現ベクター。
【請求項６】
所望遺伝子が、抗腫瘍活性を有するサイトカインをコードする遺伝子、血管新生抑制物質をコードする遺伝子、又は抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換しうる酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項５記載の発現ベクター。
【請求項７】
抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換しうる酵素をコードする遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム・ロンガム,ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、又はビフィドバクテリウム・アニマリスであることを特徴とする、請求項８記載のビフィドバクテリウム属微生物。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか記載の発現ベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物。
【請求項１１】
ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、又はビフィドバクテリウム・アニマリスであることを特徴とする、請求項１０記載のビフィドバクテリウム属微生物。
【請求項１２】
請求項６又は７記載の発現ベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項１３】
ｐＴＢ６の複製開始点（ｏｒｉＶ）−ｒｅｐＢ領域を含み、ＭｅｍｂＢ、ＭｏｂＡ、ＯｒｆＩ及びｏｒｉＴ領域を含まず、かつアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）を含まないか又はアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）の発現産物であるβ−ラクタマーゼのＮ末端領域をコードするＤＮＡが欠失していることを特徴とするｐＴＢ６に由来するビフィドバクテリウム属微生物のプラスミド複製ユニット。
【請求項１４】
配列番号１の３０５〜１５６４番目に示される塩基配列からなる１２６０ｂｐの塩基配列を含むことを特徴とする請求項１３記載のｐＴＢ６に由来するビフィドバクテリウム属微生物のプラスミド複製ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターや、該シャトルベクターを利用したビフィドバクテリウム属微生物において所望遺伝子を発現することができる発現ベクターや、該発現ベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物や、該ビフィドバクテリウム属微生物を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)は、グラム陽性の嫌気性細菌で、そのゲノムはＧＣ含量が高い（例えば、非特許文献１参照）。このビフィドバクテリウム・ロンガムは非病原性であり、ヒトや他の動物の大腸における、正常なミクロフローラの大部分を構成している（例えば、非特許文献２参照）。免疫反応を高め（例えば、非特許文献３参照）、癌の発生に対して抑制効果を有し（例えば、非特許文献４参照）、ウイルス感染から宿主を保護し（例えば、非特許文献５，６参照）、抗菌物質を生産する可能性がある（例えば、非特許文献７参照）等、宿主の健康を促進する特性を有するとされている。ビフィドバクテリウム属には、世界中で広く発酵乳製品の調製に使用されているものもある。【０００３】
さらに、ビフィドバクテリウムのプラスミドは、プロバイオティクスのベクターや、感染性疾患の経口ワクチンのベクターへの応用を期待されている。最近の報告によって、全身投与後、低酸素の固形腫瘍にビフィドバクテリウム・ロンガムが蓄積し（例えば、非特許文献８、９参照）、ビフィドバクテリウム・ロンガムｈｕｐプロモーターと融合した大腸菌ｃｏｄＡを保有する組換えプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤが、微生物においてシトシンデアミナーゼを発現することが明らかとなった（例えば、特許文献１及び非特許文献１０、１１参照）。これによって、組換えビフィドバクテリウム・ロンガムが、酵素−プロドラッグ療法に有効であることが裏付けられた。しかし、食品、医薬品及び産業において注目が高まっているものの、主に遺伝子伝達の効率的で複製可能なシステムが欠如しているために、これらの遺伝的な特性についてはほとんど知られていない。【０００４】
前記組換えプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤの構築に用いられたｐＢＬＥＳ１００は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＫ５１のｐＴＢ６と大腸菌のｐＢＲ３２２とから構築されたシャトルベクターである（例えば、非特許文献１２参照）。かかるシャトルベクターｐＢＬＥＳ１００は、２．２×１０４形質転換体／μｇＤＮＡの有効率でビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換し、その細胞中で構造的及び形質分離の点で安定していた（例えば、非特許文献１３参照）。ところが、トランスフェクションの際に、未修飾ＤＮＡを有するプラスミドが制限酵素によって微生物中で切断される可能性があることから、外来遺伝子のクローンニングには、更に高い形質転換率が必要とされる。【０００５】
【特許文献１】特開２００２−９７１４４号公報
【非特許文献１】Scardovi, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology vol 2,     eds. Sneath et al., pp. 1418-1434 (1986)
【非特許文献２】Mitsuoka, Elsevier Applied Science, pp 69-114 (1992)
【非特許文献３】Yasui et al. J. Dairy Sci., 74, 1187-1195 (1991)
【非特許文献４】Reddy et al., Cancer Res., 53, 3914-3918 (1993)
【非特許文献５】Duffy et al., Pediatr. Res., 35, 690-695 (1994)
【非特許文献６】Saaverdra et al., Lancet., 344, 1046-1049 (1994)
【非特許文献７】Ibrahim et al., J. Food Prot., 56, 713-715 (1993)
【非特許文献８】Yazawa et al. Cancer Gene Ther., 7, 269-274 (2000)
【非特許文献９】Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001)
【非特許文献１０】Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-23    66 (2002)
【非特許文献１１】Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-2    03 (2002)
【非特許文献１２】Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1    212 (1997)
【非特許文献１３】Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1    212 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターｐＢＬＥＳ１００は、前記のように、２．２×１０４形質転換体／μｇＤＮＡの有効率でビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換、その細胞中で構造的及び形質分離の点で安定していたが、トランスフェクションの際に、未修飾ＤＮＡを有するプラスミドが制限酵素によって微生物中で切断される可能性があることから、外来遺伝子のクローンニングには、更に高い形質転換率が必要とされる。本発明の課題は、ビフィドバクテリウム属微生物での宿主域が広く、ビフィドバクテリウム属微生物中でのコピー数が多く、発現ベクターとして用いた場合、ビフィドバクテリウム属微生物において所望の蛋白質を高発現することができる、ビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターや、該シャトルベクターを利用したビフィドバクテリウム属微生物において所望遺伝子を発現することができる発現ベクターや、該発現ベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物や、該ビフィドバクテリウム属微生物を有効成分とする抗腫瘍剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ビフィドバクテリウム・ロンガムBK51由来のプラスミドｐＴＢ６の全配列（３６２４ｂｐ；配列番号１）を決定し、該ビフィドバクテリウム属微生物のプラスミド複製起点ＯｒｉＶを含む、幾つかの遺伝子配列を同定した。ＯｒｉＶはｄｓｏ、ｓｓｏを含む３５８ｂｐの配列であり、replication protein（ＲｅｐＢ  ６９３ｂｐ）を含む全長約１９００ｂｐのｐＴＢ６由来断片を「ビフィドバクテリウム属微生物の複製ユニット」として利用可能であることを見出した。なお、ＯｒｉＶとＲｅｐＢの一部を含むユニットでは複製能を確認できなかった。また、ビフィドバクテリウム属微生物においては、選択マーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子の発現産物、特にそのＮ末端領域の発現が宿主域拡大の点で好ましくないことを見い出し本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明は、（１）ｐＴＢ６の複製開始点（ｏｒｉＶ）−ｒｅｐＢ領域を含み、ＭｅｍｂＢ、ＭｏｂＡ、ＯｒｆＩ及びｏｒｉＴ領域を含まないｐＴＢ６由来領域部分と、ｐＵＣ Ｏｒｉ領域を含む大腸菌由来プラスミド部分とを有することを特徴とするビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターや、（２）ｐＴＢ６由来領域部分が、配列番号１の３０５〜１５６４番目に示される塩基配列からなる１２６０ｂｐの塩基配列を含むｐＴＢ６由来領域部分からなることを特徴とする上記（１）記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターや、（３）ビフィドバクテリウム属微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、又はビフィドバクテリウム・アドレスセンティスであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターや、（４）平均コピー数が６〜３０であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターや、（５）上記（１）〜（４）のいずれか記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターに、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（ＨＵ蛋白質）をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターとターミネーターとの間に所望遺伝子がインフレームで連結された発現ユニットが挿入され、ビフィドバクテリウム属微生物において所望遺伝子を発現することができる発現ベクターや、（６）所望遺伝子が、抗腫瘍活性を有するサイトカインをコードする遺伝子、血管新生抑制物質をコードする遺伝子、又は抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に転換しうる酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする上記（５）記載の発現ベクターや、（７）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に転換しうる酵素をコードする遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子であることを特徴とする上記（６）記載の発現ベクターや、（８）上記（１）〜（４）のいずれか記載のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物や、（９）ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、または、ビフィドバクテリウム・アニマリスであることを特徴とする、上記（８）記載のビフィドバクテリウム属微生物や、（１０）上記（５）〜（７）のいずれか記載の発現ベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物や、（１１）ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、又は、ビフィドバクテリウム・アニマリスであることを特徴とする、上記（１０）記載のビフ��ドバクテリウム属微生物や、（１２）上記（６）又は（７）記載の発現ベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤や、（１３）ｐＴＢ６の複製開始点（ｏｒｉＶ）−ｒｅｐＢ領域を含み、ＭｅｍｂＢ、ＭｏｂＡ、ＯｒｆＩ及びｏｒｉＴ領域を含まず、かつアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）を含まないか又はアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）の発現産物であるβ−ラクタマーゼのＮ末端領域をコードするＤＮＡが欠失していることを特徴とするｐＴＢ６に由来するビフィドバクテリウム属微生物のプラスミド複製ユニットや、（１４）配列番号１の３０５〜１５６４番目に示される塩基配列からなる１２６０ｂｐの塩基配列を含むことを特徴とする上記（１３）記載のｐＴＢ６に由来するビフィドバクテリウム属微生物のプラスミド複製ユニットに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】プラスミドｐＴＢ６（３６２４ｂｐ）の直線地図及びｏｒｉＶの構造を示す図である。(ａ)；推定上のＲｅｐＢ、ＭｅｍｂＢ、ＭｏｂＡ及び推定のタンパク質ＯｒｆＩを表す。矢印は翻訳の方向を示し、数字はヌクレオチドの位置を示す。（ｂ）；ｓｓｏにおける２組のＩＲ（３０５から４１７）、並びにｄｓｏにおける１組のＩＲ（４８１から５０４）及びＤＲの４つの反復ユニット（三角形）（５７７から６６４）を概略的にｏｒｉＶに表した。図は縮尺比とは関係ない。
【図２】ＲｅｐＢ及びｏｒｉＴにおけるシーケンス配列を示す図である。ＲｅｐＢにおける領域１及び領域２のアミノ酸配列（ａ）、並びにｏｒｉＶにおけるＤＲ（ｂ）及びＩＲ（ｃ）のヌクレオチド配列を配置した。配列上の数字はｐＴＢ６の予測されたＲｅｐＢのアミノ酸位置を示し、点線上の数字はかかる領域におけるアミノ酸の数を示す。（ｂ）におけるヌクレオチド位置はＤＲの遺伝子座を示しており、反復ユニットのヌクレオチド配列を配置した。（ｃ）におけるヌクレオチド位置はＩＲの遺伝子座を示しており、これらの配列を配置した。点で覆われた長方形は、アミノ酸又はヌクレオチドの保存領域を表す。
【図３】ＭｏｂＡにおけるアミノ酸配列及びｏｒｉＶにおけるヌクレオチド配列を示す図である。（ａ）；ｐＴＢ６のＭｏｂＡの部分的なアミノ酸配列（アミノ酸位置１から２７及び１２１から１４５）及びＭＯＢσ系統プラスミドＲＳＦ１０１０（アミノ酸位置１から２７及び１０８から１３１、受託番号Ｍ２８８２９）を配置する。*は、ＭｏｔｉｆIにおけるＤＮＡの切断結合活性に関係する活性ＴｙｒとＭｏｔｉｆIIIにおける３Ｈモチーフとを示す。（ｂ）；ｐＴＢ６の推定上のｏｒｉＶヌクレオチド配列３４５４から３５１０と、ＲＳＦ１０１０のｏｒｉＴにおけるヌクレオチド配列３１６９から３１３２とを配置する。矢印は特徴的なＩＲを示し、矢頭はＲＳＦ１０１０のＭｏｂＡによるｎｉｃサイトを示す。かかる配列の上部又は下部の数字はＭｏｂＡのアミノ酸位置又はｐＴＢ６のヌクレオチド位置を示す。点で表した長方形で覆われた領域は、一致したアミノ酸と相同的なヌクレオチド配列とを示す。
【図４】再構成したプラスミドの直線地図を示す図である。ｐＴＢ６（ヌクレオチド位置１から１８７２）のＰｓｔＩ−ＦｓｐIフラグメントをｐＵＣ１８のＰｓｔI−ＦｓｐIIサイトに挿入し、複合プラスミドを得た。ｓｐｃを含むｐＢＬＥＳ１００の１．６ｋｂｐ−ＨｉｎｃII−ＨｉｎｄIIIフラグメントを、ＨｉｎｄIII−ＳｓｐＩフラグメント（４．０ｋｂｐ）又は複合プラスミドのＨｉｎｄIII−FｓｐＩフラグメント（３．４ｋｂｐ）と連結し、それぞれｐＢＲＡＳＴＡ１００（５．６ｋｂｐ）又はｐＢＲＡＳＴＡ１０１（５．０ｋｂｐ）を得た。ｐＵＣ１８の０．６ｋｂｐ−ＳｓｐI−ＦｓｐIフラグメント（短い下線と陰影線を付けた長方形として表す）をＢａｍＨIサイト、並びにｐＢＲＡＳＴＡ１０１のＢａｍＨＩサイト及びＨｉｎｄIIIサイトに挿入し、それぞれｐＢＲＡＳＴＡ１０２（５．６ｋｂｐ）、ｐＢＲＡＳＴＡ１０３（６．２ｋｂｐ）を得た。ＰｓｔI−ＦｓｐIＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド位置１から１８７２）ではなく、ｐＴＢ６のＰｓｔI−ＦｓｐIＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド位置１８７３から３６２４）をｐＵＣ１８のＰｓｔI−ＨｉｎｃIIサイトに挿入することを除いて、ｐＢＲＡＳＴＡ１００の構築と同一の手続きで、プラスミドｐＳＳ０３０Ｓｐ（５．４ｋｂｐ）を構築した。ｐＵＣ１８のＡａｔII−ＨｉｎｃIIサイトにｐＴＢ６のＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド位置４７２から１８７２）を挿入して構築した組換え分子のＡａｔII−ＦｓｐIフラグメント（１．４ｋｂｐ）に、ｓｐｃ（１．３ｋｂｐ）を含むｐＢＬＥＳ１００のＡａｔII−ＥｃｏＲＶフラグメントを連結することによって、プラスミドｐＤＳＯ４４Ｓｐ（４．３ｋｂｐ）を構築した。陰影線付の長方形はｓｓｏ及びｄｓｏを表す。図は縮尺とは関係ない。
【図５】ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと、ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤとの作製過程を示す図である。
【図６】ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるシトシンデアミナーゼタンパク質の発現量の比較結果を示す図である。ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤが、ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤの２〜８倍のシトシンデアミナーゼタンパクを発現していることを示している。
【図７】ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるシトシンデアミナーゼタンパク質酵素活性の比較（５ＦＣ→５ＦＵの変換活性比較）の結果により得られた、経時菌数変化を示す図である。
【図８】ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるシトシンデアミナーゼタンパク酵素活性の比較（５ＦＣ→５ＦＵの変換活性比較）の結果により得られた、５−ＦＵ濃度を示す図である。
【図９】図９のＡは、ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤとビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤの培養後の菌体から抽出したＤＮＡを制限酵素で消化して、アガロースゲル電気泳動により核酸を分離し、AlkPhos Direct Labelling Reagents(Amersham Bioscience社製)を用いてサザン分析法に供した結果を示す図である。また、図９のＢは、ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤとビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤのプラスミドコピー数をシグナル強度より比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターとしては、ｐＴＢ６の複製開始点（ｏｒｉＶ；配列番号１で示される塩基配列の３０５〜６６４番目）−ｒｅｐＢ領域（配列番号１で示される塩基配列の８７２〜１５６４番目）を含み、ＭｅｍｂＢ（配列番号１で示される塩基配列の１５４３〜２３５５番目）、ＭｏｂＡ（配列番号１で示される塩基配列の２２１２〜３３００番目）、ＯｒｆＩ（配列番号１で示される塩基配列の３５８７〜５１７番目）及びｏｒｉＴ領域（配列番号１で示される塩基配列の３４５４〜３５１０番目）を含まないｐＴＢ６由来領域部分と、ｐＵＣ Ｏｒｉ領域を含む大腸菌由来プラスミド部分とを有するシャトルベクターであれば特に制限されないが、配列番号１の３０５〜１５６４番目に示される塩基配列からなる１２６０ｂｐの塩基配列を含む複製ユニット、例えば、配列番号１の３０５〜１５６４番目に示される塩基配列からなる１２６０ｂｐの複製最小ユニット、配列番号１の１〜１９００番目に示される塩基配列からなる１９００ｂｐの複製ユニット、配列番号１の１〜２３５５番目に示される塩基配列からなる２３５５ｂｐの複製最大ユニットが好ましい。このように、ＭｅｍｂＢ、ＭｏｂＡ、ＯｒｆＩ及びｏｒｉＴ領域を含まない、より小さな複製ユニットとして用いることにより、宿主細胞内でのコピー数を高めることができる。また、Biosci．Biotech．Biochem．，61，1211（1997）記載の方法により構築することができるビフィドバクテリウム・ロンガムと大腸菌とのシャトルベクターｐＢＬＥＳ１００よりもコピー数が増大した、例えば平均コピー数が３〜３０、中でも６〜３０と増大したものが好ましい。
【００１１】
また、本発明のシャトルベクターにおけるｐＵＣ Ｏｒｉ領域を含む大腸菌由来プラスミド部分としては、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）を含まないものが好ましく、含んでいたとしても、その発現産物であるβ−ラクタマーゼのＮ末端領域をコードするＤＮＡが欠失したものが好ましい。β−ラクタマーゼのＮ末端領域の欠失発現により、ビフィドバクテリウム属微生物における宿主域を拡大することができる。
【００１２】
上記本発明のシャトルベクターにおけるビフィドバクテリウム属微生物としては、ビフィドバクテリウム属微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B．breve）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B．animalis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B．bifidum）等を具体的に例示することができる。これに対して、前記シャトルベクターｐＢＬＥＳ１００は、ビフィドバクテリウム・ロンガム以外のビフィドバクテリウム属微生物における複製が確認されていない。【００１３】
本発明のシャトルベクターとしては、実施例２におけるシャトルベクターｐＡＶ００１を好適に例示することができる。【００１４】
本発明のｐＴＢ６に由来するビフィドバクテリウム属微生物のプラスミド複製ユニットとしては、ｐＴＢ６の複製開始点（ｏｒｉＶ；配列番号１で示される塩基配列の３０５〜６６４番目）−ｒｅｐＢ領域（配列番号１で示される塩基配列の８７２〜１５６４番目）を含み、ＭｅｍｂＢ（配列番号１で示される塩基配列の１５４３〜２３５５番目）、ＭｏｂＡ（配列番号１で示される塩基配列の２２１２〜３３００番目）、ＯｒｆＩ（配列番号１で示される塩基配列の３５８７〜５１７番目）及びｏｒｉＴ領域（配列番号１で示される塩基配列の３４５４〜３５１０番目）を含まないｐＴＢ６由来領域部分であれば特に制限されず、配列番号１の３０５〜１５６４番目に示される塩基配列からなる１２６０ｂｐの塩基配列を含む複製ユニット、例えば、配列番号１の３０５〜１５６４番目に示される塩基配列からなる１２６０ｂｐの複製最小ユニット、配列番号１の１〜１９００番目に示される塩基配列からなる１９００ｂｐの複製ユニット、配列番号１の１〜２３５５番目に示される塩基配列からなる２３５５ｂｐの複製最大ユニットを好適に例示することができる。【００１５】
本発明のビフィドバクテリウム属微生物において所望遺伝子を発現することができる発現ベクターとしては、上記本発明のビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターに、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（ＨＵ蛋白質）をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターとターミネーターとの間に所望遺伝子がインフレームで連結された発現ユニットが挿入されたベクターであれば特に制限されず、また、上記所望遺伝子としては特に限定されないが、抗腫瘍活性を有するサイトカインや血管新生抑制物質をコードする遺伝子や、低毒性である抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に転換しうる酵素（以下、転換酵素と略す）をコードする遺伝子を好適に挙げることができる。【００１６】
かかる発現ユニットにおけるプロモーター及びターミネーターとして、それぞれ配列番号２で示され得る塩基配列のうち、塩基番号１〜１９２で表されるＤＮＡ、塩基番号４７２〜６００で表されるＤＮＡを好適に例示することができる。ＨＵ遺伝子の発現に関わるプロモーター及びターミネーターを有する発現ベクターは、ビフィドバクテリウム・ロンガムのＤＮＡから制限酵素でＨＵ遺伝子を切り出し、これをクローニングベクターの中に組み入れ、さらにＨＵ遺伝子の発現に関わるプロモーターの下流に、所望遺伝子を組み込むことにより作製することができる。該ＨＵ遺伝子の発現に関わるプロモーター及びターミネーターを用いることにより、所望遺伝子を効率よく発現させることができる。ＨＵ遺伝子の単離方法は、ビフィドバクテリウム・ロンガムの染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化する方法を挙げることができる。より具体的には、まずビフィドバクテリウム・ロンガムの染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化し、フェノール処理・エタノール沈殿により精製する。他方、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）もＨｉｎｄIIIで消化し、脱リン酸化処理後、同様に精製する。各々ＤＮＡを連結し、組換え体ＤＮＡを得る。次に該組換えＤＮＡを用いて大腸菌ｍＨ３〔Ｇｅｎｅ，４５，３７（１９８６）〕を常法に従い形質転換し、アンピシリン耐性で、かつテトラサイクリン感受性を示す形質転換体を取得する。取得した形質転換体から常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを常法に従い大腸菌ＹＫ２７４１株〔Ｇｅｎｅ，８９，１３３（１９９０）〕に導入して、該菌株の形質転換を行う。ＹＫ２７４１株はＨＵ遺伝子およびＩＨＦ（インテグレーション  ホスト  ファクター）遺伝子が欠損しているため、低温感受性を呈する株であることを利用して、アンピシリン含有寒天培地に塗布して２７℃にて培養することにより形質転換体を選択できる。次に、上記で得られたＹＫ２７４１株の形質転換体をさらに培養し、常法により該株が保持するプラスミドを抽出し、該プラスミドＤＮＡを常法に従い大腸菌ＹＫ１３４０〔J.Mol.Biol.,204,581(1988)〕に導入して、該菌株の形質転換を行う。得られた形質転換体に対し、Ｍｕファージの感染試験を常法に従い行う。ＹＫ１３４０株はＨＵ遺伝子の欠損株であり、Ｍｕファージはその増殖にＨＵ蛋白質を必要とするため、Ｍｕファージが感染・増殖し、溶菌する形質転換体がビフィドバクテリウム・ロンガム菌由来のＨＵ遺伝子を保有する株の有力な候補となりえる。したがって、アンピシリン耐性を示し、かつＭｕファージが感染・増殖し、溶菌する株が保有するプラスミド選択することにより、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のＨＵ遺伝子の発現に関わるプロモーター及びターミネーターを保有するプラスミドｐＢＬＨＵ１５を得ることができる。また、所望遺伝子の導入部位としては、Ｎｓｖ ＶとＨｐａ Ｉを用いることにより生じた部位が好ましい。【００１７】
上記抗腫瘍活性を有するサイトカインをコードする遺伝子としては、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、β、γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、リンホトキシン（ＬＴ）−β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロフアージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｔ細胞活性化共刺激因子Ｂ７（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、キット・リガンド、オンコスタチンＭ等を挙げることができるが、中でも、ＩＬ−２が好ましい。また、これらを２種以上組み合わせてもよく、例えば、ＩＬ−６とＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−γとの組み合わせ、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γとの組み合わせ、ａｎｔｉ−ＦａｓとＩＦＮ−γとの組み合わせが好ましい。また、サイトカイン以外の抗腫瘍活性を有する物質として、エンドスタチン、アンジオスタチン、クリングル１，２，３，４，５、ＮＫ４などの血管新生抑制物質を有利に用いることができる。【００１８】  上記転換酵素をコードする遺伝子としては、以下のものを挙げることができる。抗腫瘍物質前駆体が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）、抗腫瘍物質が５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、転換酵素としてシトシンデアミナーゼを用いる組み合わせを挙げることができる。また、抗腫瘍物質前駆体が５−アジリジノ−２，４−ジニトロベンズアミド（5−aziridino−2，4−dinitrobenzamide）〔CB1954〕、抗腫瘍物質が２本鎖ＤＮＡに橋状結合をおこすことが知られているアルキル化剤、転換酵素としてニトロリダクターゼを用いる組み合わせを挙げることができる。また、抗腫瘍物質前駆体がガンシクロビル（ganciclovir）、抗腫瘍物質がその代謝物、転換酵素が単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（herpes simplex virus type1 thymidine kinase）〔HSV1−TK〕を用いる組み合わせを挙げることができる。またさらに、抗腫瘍物質をグルクロン酸抱合、グリシン抱合またはリジン抱合などで修飾して人体に低毒な前駆体（不活性化体を含む）とし、転換酵素として該前駆体を脱修飾する酵素を用いることもできる。該前駆体を脱修飾する酵素としては自体公知のものを用いてもよいが、例えば、グルクロン酸抱合された抗腫瘍物質前駆体と、転換酵素がβ−グルクロニダーゼの組み合わせを挙げることができる。【００１９】
本発明のビフィドバクテリウム属微生物としては、上記本発明の発現ベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物であれば特に制限されず、具体的にはビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B．pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（B. thermophirum），ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B．infantis）、ビフィドバクテリウム・アニマリスなどを挙げることができる。中でも、年齢に関係なくヒトの腸内に常在していることが知られているビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティスを宿主細胞として用いることが好ましく、ビフィドバクテリウム・ロンガムを用いることがより好ましい。これらの菌は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手することができ、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ−１５７０７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ−１１８６３、ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ−１５６９７を用いることができる。【００２０】
なお、上記本発明のプラスミド複製ユニット、シャトルベクター、発現ベクター、形質転換ビフィドバクテリウム属微生物の作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル講談社、高木康敬編遺伝子操作実験法講談社、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）[コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）]、モレキュラー・クローニング第２版（Molecular C1oning，2nd ed．）[コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1989）]、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methodsin Enzymol．），194（1991）、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法羊土社（1994）等に記載された方法に従って行うことができる。【００２１】
上記形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物は、嫌気的環境下にある腫瘍組織内でのみ増殖し、腫瘍組織内で抗腫瘍活性を有する物質、転換酵素等を発現することができる。したがって、かかる形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物は、嫌気的環境を有する腫瘍、好ましくは固形腫瘍の治療に有効な医薬として使用される。本発明の抗腫瘍剤としては、上記本発明のビフィドバクテリウム属微生物を有効成分として含有するものであれば特に制限されない。本発明の抗腫瘍剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与などを挙げることができるが、非経口投与が特に好ましい。非経口投与としては、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの投与経略を挙げることができる。経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、溶液剤、カプセル剤または懸濁剤などを挙げることができ、非経口投与に適する製剤の例としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを挙げることができる。本発明においては、注射剤、中でも静脈内注射剤として用いることが好ましい。【００２２】
上記形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物に、それ自体公知の後処理を行ってもよい。例えば遠心分離などにより粗精製を行ってもよい。また、所望により粗精製を行った後、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）又は乳酸配合リンゲル液など当該分野で従来から使用されている溶媒に溶解または懸濁させてもよい。また、所望により凍結乾燥または噴霧乾燥を行い、粉状物又は粒状物にしてもよい。【００２３】
本発明の抗腫瘍剤としては、上記形質転換されたビフィドバクテリウム属菌の溶液もしくは懸濁液、または粒状もしくは粉状の乾燥物をそのまま投与してもよい。しかし、一般的には、有効成分である上記の物質と１または２以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。このような医薬組成物は、それ自体製剤学の分野で周知または慣用の方法に従って製造することが可能である。【００２４】
経口投与に適する液体製剤の製造には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの製剤用添加物を用いることができる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤を用いることができる。【００２５】
非経口投与に適する製剤のうち注射剤や点滴剤などの血管内投与用製剤は、好ましくはヒト血液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物から選ばれる水性媒体を用い、常法に従って適当な助剤とともに溶液、懸濁液または分散液として調製することができる。腸内投与のための坐剤は、例えばカカオ脂、水素化脂肪または水素化カルボン酸などの担体を用いて調製することができる。噴霧剤は、ヒトの口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分である本発明に係るビフィドバクテリウム属微生物を微細な粒子として分散させて吸収を促進することのできる担体を用いて調製することができる。このような担体として、例えば、乳糖またはグリセリンなどを用いることができる。その他、エアロゾルやドライパウダーなどの形態の製剤として調製することができる。非経口用の製剤の製造には、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を用いることができる。なお、本発明の抗腫瘍剤の形態およびその製造方法は、上記に具体的に説明したものに限定されることはない。【００２６】
本発明の抗腫瘍剤の投与量および投与頻度は特に限定されず、ビフィドバクテリウム属菌が有する遺伝子の種類、治療すべき病態の種類、投与経路、患者の年齢および体重、症状、および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。例えば、静脈内注射で全身投与する場合は、成人一日あたり約２×１０６〜２×１０７個／ｂｏｄｙ程度を投与することが好ましく、腫瘍内局所投与の場合は、腫瘍１個につき約５×１０８個程度投与することが好ましい。しかし、投与量はこの特定の例に限定されることはない。【００２７】
本発明にかかる抗腫瘍剤は、嫌気的環境を有する腫瘍、好ましくは各種固形癌に適用できる。固形癌としては、例えば大腸癌、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、扁平上皮癌などが挙げられる。【００２８】
本発明の医薬は、他の医薬等と併用してもよい。特に、転換酵素をコードする遺伝子を導入したビフィドバクテリウム属菌を投与する場合、抗腫瘍物質前駆体の投与は必須である。ただし、かかる抗癌物質前駆体は、転換酵素をコードする遺伝子を導入したビフィドバクテリウム属菌と、一製剤を成していてもよいし、また、別々の製剤であって同時にまたは間隔を空けて投与してもよい。また、ラクツロース（Lactulose）を併用することが好ましい。ラクツロースはビフィドバクテリウム属菌の栄養源であり、かつ、ヒト、マウスおよびブタは代謝することができないため、ラクツロースを投与することにより腫瘍組織内特異的にビフィドバクテリウム属菌の菌数が増加するからである。投与量は、成人一日あたり約２４〜４８ｇ／ｂｏｄｙ程度が好ましく、投与頻度に問わない。また、本発明の医薬は他の抗腫瘍剤等と組み合わせて用いることができる。【００２９】
本発明に係る患者に投与されたビフィドバクテリウム属菌は、抗生物質で簡単に殺すことができる。このことは、本発明に係る遺伝子輸送システムの安全性をより高めるために重要である。【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
（プラスミドｐＴＢ６の構造解析）
［材料及び方法］
１．菌株、プラスミド及び培地
本発明に使用した菌株及びプラスミドを表１に例挙した。ＬＢブロス（１０ｇのBacto-tryptone、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、及び０．１％のグルコース／リットル）中、３７℃で好気的に大腸菌を培養し、１．５％の寒天を含むＬＢブロスにコロニーを形成させた。５０ｍＭのスクロース、０．３４％のシステイン、０．０２％のアスコルビン酸ナトリウムを補充したＭＲＳブロス（Difco Laboratories社製、米国）中、３７℃で嫌気的に、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ（非特許文献１２参照）を培養した。必要に応じて、抗生物質（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｐ）及び／又は７５μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（Ｓｐ））を添加した。非特許文献１２記載の方法に準じて、Gas-Pak嫌気システム（BBL社製、米国）を使用して、１．５％の寒天を含むブロス上でコロニーを形成させた。【００３２】
【表１】
0004989231.tif 000002
【００３３】
２．プラスミドＤＮＡの単離及び分子操作
付属のマニュアルに記載の手順に従い、Qiagen Plasmid Kit（QIAGEN社製、米国）を使用して、改良したアルカリ溶菌法でプラスミドＤＮＡを抽出した。ビフィドバクテリウム・ロンガムを、０．９％のＮａＣｌで洗浄し、アルカリ溶菌の前にリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で３０分間処理し、フェノール処理の前にプロテイナーゼＫ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１５分間処理した。【００３４】
非特許文献１２記載の方法に準じて、コンピテントビフィドバクテリウム・ロンガム細胞を調製した。対数期の後期の細胞を５０ｍＭの緩衝スクロース液で３回洗浄し、元の培養物の体積の約１／１００の氷温のグリセリン（１０％ｖ／ｖ）に再び懸濁した。また、文献（Takeuchi et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 598-603 (2002)）記載の方法に準じて、コンピテント大腸菌を調製した。非特許文献１２記載の方法に準じて、２００Ωの平行抵抗、２．５ｋＶ／ｃｍ及び２５μＦで、GenePulser装置（Bio-Rad Labs.社製、米国）を使用し、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ及び５０μｌのバクテリア液を用いてエレクトロポレーションを行った。【００３５】
ＤＮＡの増幅は、GeneAmp PCR System 9600及びLATaqポリメラーゼ（TAKARA社製）を用いて行った。２つのプライマー［５’−ＧＧＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＧＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡ−３’（配列番号４）］を使用し、ＰＣＲによってｐＵＣ１８からＣｏｌＥ１oriを増幅した。次に、ｐＢＲＡＳＴＡ１０２を構築するために、２つのプライマー［５’−ＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴ−３’（配列番号５）及び５’−ＣＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴ−３’（配列番号６）］を使用して、また、ｐＢＲＡＳＴＡ１０３を構築するために、２つのプライマー［５’−ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴ−３’（配列番号７）及び５’−ＣＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴ−３’（配列番号８）］を使用して、ａｍｐのプロモータに近接する半分を、ｐＵＣ１８から増幅した。他のＤＮＡ操作は全て、文献（Sambrook et al., Molecular cloning : a laboratory manual 2ndeds. Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）に記載される方法に準じて行った。【００３６】
３．ＤＮＡシーケンシング及び配列解析
ＰｓｔＩを用いてｐＢＬＥＳ１００を切断し、ｐＴＢ６の全長ＤＮＡ（３．６ｋｂｐ）を調製し、Ｓａｕ３ＡＩ又はＡｌｕＩで分解を行った後、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトでサブクローンニングした。ALF express II DNA sequencer及びThermo Sequenase Cycle Sequencing Kit 又はThermo Sequenase CyTM 5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit （Amersham Pharmacia Biotech社製）でシーケンシングを行い、DNASIS-Mac v2.2及びGENETYX-MAC softwareを用いて、コンピュータを利用した配列アセンブリ並びに配列解析を実施した。相同性検索には、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴサーバを使用した。【００３７】
［結果］
１．プラスミドの構造
シャトルベクターｐＢＬＥＳ１００の構成要素である、ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＫ５１のｐＴＢ６の完全なヌクレオチド配列（３，６２４ｂｐ）を決定した。ｐＴＢ６（図１ａ）の中に、４つのオープンリーディングフレーム（Ｏｒｆ）、すなわちＲｅｐＢ(８７２から１５６４)、ＭｅｍｂＢ(１５４３から２３５５)、ＭｏｂＡ(３３００から２２１２)、仮定されるタンパク質ＯｒｆＩ（３５８７から１から５１７）が、データベース検索から予測された。ｐＴＢ６のＧＣ含量は６５．１モル％であり、そのレベルはビフィドバクテリウム・ロンガムのゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡに通常観察されるものであった。【００３８】
ｐＴＢ６の全ヌクレオチド配列は、Rolling Circle Replication型（ＲＣＲ型）プラスミドのファミリー群１に属するビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミド、ｐＫＪ３６（３，６２５ｂｐ）及びｐＢ４４（３，６２４ｂｐ）に９５％の相同性を示し、ｐＮＡＣ２（３，６８４ｂｐ）に９２％、ｐＢＬＯ１（３，６２６ｂｐ）に８９％の相同性を示した。群１のプラスミドのｐＤＯＪＨ１０Ｌ(１０，０７３ｂｐの５３０８から８９９９)にも、９２％という高い相同性が検出された（表２）。【００３９】
【表２】
0004989231.tif 000003
【００４０】
２．ＲｅｐＢ及びｏｒｉＶ
ｐＴＢ６の予測したＯｒｆのアミノ酸同一性を表２に示した。ＲｅｐＢ（２３０アミノ酸（ａａ））は、ｐＫＪ３６の全ＲｅｐＢ（２３０ａａ）、ｐＢ４４のＲｅｐＢのａａ５４から２８３領域、及びｐＤＯＪＨ１０ＬのＲｅｐＢのａａ５４から２８１領域、ｐＮＡＣ２及びｐＢＬＯ１に対して、それぞれ９２％、９１％、９０％、８９％、及び８１％の同一性を示した。２つの局所部位である領域１（ａａ１１７からａａ１３８）及び領域２（ａａ１８３からａａ１８８）は、これらのプラスミドに保存されていなかった（図２ａ）。【００４１】
複製開始点ｏｒｉＶはｄｓｏ（二本鎖開始点）とｓｓｏ（一本鎖開始点）とからなり、リーディング鎖及びラギング鎖の複製の開始に必要である(Del Solar et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev.,62, 434-494 (1998))。かかる複製開始点を、ｐＴＢ６のヌクレオチド位置３０５と６６４との間の領域に推定した（図１ｂ）。ＩＲの２セット（３０５から４１７）がｓｓｏで検出され、ＩＲ（４８１から５０４）及びＤＲ（５７７から６４４）がｄｓｏで検出された（図１ｂ）。最後の１つが３'末端でＴを有すること以外は、ＤＲは４つの同一の２２ｍｅｒ（５’−ＡＡＣＣＴＡＣＡＣＣＡＡＡＡＧＧＧＧＡＧＣＧ−３’；配列番号９）からなり、１１ヌクレオチド（５’−ＣＡＡＡＡ−３’及び５’−ＧＧＡＧＣＧ−３’）は、ｐＫＪ３６、ｐＢ４４、ｐＮＡＣ２、ｐＤＯＪＨ１０Ｌ、及びｐＢＬＯ１のＤＲに保存されていた（図２ｂ）。ｄｓｏにおけるＩＲのヌクレオチド配列も、ループ領域の２つのヌクレオチドを除いて、これらのプラスミドに保存されていた（２４ヌクレオチド中２２）（図２ｃ）。【００４２】
３．ＭｏｂＡ及びｏｒｉＴ
ＭｏｂＡは、プラスミドを接合的に可動化するためのプライマリーＤＮＡプロセッシングタンパク質である(Becker et al., J. Bacteriol., 185, 3538-3546 (2003))。ｐＴＢ６の推定上のＭｏｂＡのアミノ酸同一性は、ｐＫＪ３６、ｐＢ４４、ｐＮＡＣ２、ｐＢＬＯ１及びｐＤＯＪＨ１０Ｌの推定上のＭｏｂＡに対して、それぞれ、８５％、８５％、５８％、５７％及び４６％であった（表２）。ｐＴＢ６のＭｏｂＡは、ＭＯＢΩファミリーのプラスミドＲＳＦ１０１０のＭｏｂＡに対しても、顕著な類似性を示した(Francia et al., FEMS Microbiol. Rev., 28, 79-100 (2004))。ＤＮＡ切断−結合作用に関わるモチーフＩ(Francia et al., FEMS Microbiol. Rev., 28, 79-100 (2004))のチロシン残基、及びモチーフＩによる転移の開始を助けるモチーフIIIの３Ｈモチーフは、ｐＴＢ６のＭｏｂＡに保存されている（図３ａ）。ＲＳＦ１０１０のｏｒｉＴでは、逆位方向反復と隣り合った１３ｍｅｒヌクレオチド配列、５’−ＧＴＡＡＧＴＧＣＧＣＣＣＴ−３’（配列番号１０）がＭｏｂＡによって切断される（図３ｂ）が、ヌクレオチド位置３４５４から３５１０は、ＲＳＦ１０１０(Francia et al., FEMS Microbiol. Rev., 28, 79-100 (2004))のｏｒｉＴに見られたものと類似した構造を示した。ｐＴＢ６のｏｒｉＴが、１３ｍｅｒ配列のｎｉｃ部位で、ｐＴＢ６から発現したＭｏｂＡによって切断されることが、これらの結果から予測された。【００４３】
４．ＭｅｍｂＢ及びＯｒｆ１
ｐＫＪ３６及びｐＤＯＪＨ１０ＬのＭｅｍｂＢは、ｐＴＢ６の推定上のＭｅｍｂＢとそれぞれ８８％及び５７％のａａ同一性を示した。ｐＴＢ６の推定上のＯｒｆＩは、１８４ａａからなり、ｐＢ４４のＯｒｆ、ｐＮＡＣ２のＯｒｆIII、ｐＤＯＪＨ１０ＬのＯｒｆII、及びｐＢＬＯ１のＯｒｆＩに対して、かなり低いａａ同一性（３０％から３１％）を示した（表２）。これらのタンパク質の機能は、未だ明らかにされていない。【００４４】
５．プラスミドの複製に必須の領域
プラスミドの複製の制御を理解するためには、プラスミドの複製に必須のＤＮＡ領域を知ることが大切である。本発明者らは、ｐＵＣ１８、ｐＴＢ６のｏｒｉＶ−ｒｅｐＢ領域（ヌクレオチド位置１から１８７２）、及びｐＢＬＥＳ１００のｓｐｃ（１．１ｋｂｐ）からなる組換えプラスミドを構築した（表３、図４）。その結果生じたプラスミドｐＢＲＡＳＴＡ１００及びｐＢＲＡＳＴＡ１０１を大腸菌ＨＭＳ１７４から抽出し、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａに転移させた。表３に示すように、いずれのプラスミドも効率的にビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換した。プラスミドｐＢＲＳＴＡ１００は、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａに効率的（５．９×１０４形質転換体／μｇＤＮＡ）に形質転換された。これは、既に報告されているｐＢＬＥＳ１００（２．２×１０４形質転換体／μｇＤＮＡ）と同じく高効率であった。ｐＢＲＡＳＴＡ１００と比較して、４０倍優れた転移効率（２．５×１０６形質転換体／μｇＤＮＡ）が、ｐＢＲＡＳＴＡ１０１の場合に見られた。これらのプラスミドは、構造や形質分離の点で、形質転換体において安定していた。また、ｐＵＣ１８、ｐＴＢ６ｄｓｏ−ｒｅｐＢ及びｓｐｃからなるｓｓｏ欠損プラスミドｐＤＳＯ４４Ｓｐ（表３、図４）は、１．３×１０６形質転換体／μｇＤＮＡという高効率で、ビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換した（表３）。一方、ｍｏｂＡ及びｍｅｍｂＢの一部（１８７３ｂから３６２４ｂ）を保有するが、ｏｒｆＩ、ｏｒｉＶ及びｒｅｐＢを保有しない組換えプラスミドｐＳＳＯ３０Ｓｐは、ビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換することが全くできなかった（表３）。これらの結果から、ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるｐＴＢ６の複製には、ｄｓｏ−ｒｅｐＢ領域の存在だけで十分であり、ｓｓｏ領域は必須ではないという結論が下された。【００４５】
【表３】
0004989231.tif 000004
【００４６】
６．ビフィドバクテリウム・ロンガムの高効率形質転換
上記のように、ｐＢＲＡＳＴＡ１００と比較して４０倍を超える高効率で、又はｐＢＬＥＳ１００と比較して１００倍を超える高効率で、プラスミドｐＢＲＡＳＴＡ１０１がビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換したことが明らかとなった。ｐＢＲＡＳＴＡ１００及びｐＢＬＥＳ１００は、正常なａｍｐを保有しており、ｐＢＲＡＳＴＡ１０１はプロモーターに近接するａｍｐの半分の欠損変異（０．６ｋｂｐ−ＳｓｐＩ−ＦｓｐＩＤＮＡセグメントの欠損）を有していた。ａｍｐにおける欠損が、実際に形質転換に影響を与えることを確認するために、かかる０．６ｋｂｐフラグメントをｐＢＲＡＳＴＡ１０１のＢａｍＨＩサイトに挿入し、結果として得られたｐＢＲＡＳＴＡ１０２（図４）を大腸菌ＨＭＳ１７４から抽出し、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａに転移させた。表３に示すとおり、ｐＢＲＡＳＴＡ１００の場合と比較してほぼ同じ形質転換率が、ｐＢＲＡＳＴＡ１０２を用いて得られた（７．５×１０４形質転換体／μｇＤＮＡ）。ｐＢＲＡＳＴＡ１０３が、ｐＢＲＡＳＴＡ１０２のＨｉｎｄIII部位に０．６ｋｂｐフラグメントを挿入することによって構築されたことから、このプラスミドにはかかるフラグメントのコピーが２つ存在し（図４）、フラグメントのコピー数に比例して形質転換能が更に低下することが示された。これらのプラスミドを大腸菌ＨＭＳ１７４に転移させた場合には、このような形質転換率の低下は見られなかった。０．６ｋｂｐ−ＤＮＡによって惹起されるプラスミドの制限の正確なメカニズムは未だ解明されていないが、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａに形質移入した０．６ｋｐｂ−ＤＮＡが切断され、プラスミドの複製が制限されることが、これらの結果から示唆された。【００４７】
［考察］
本発明において、ビフィドバクテリウム・ロンガムプラスミドｐＴＢ６のヌクレオチド配列を決定し、推定上のＯｒｆのａａ配列を予測した。配列解析から、ｐＴＢ６が、Corneau et al.によって報告(Plasmid, 51, 87-100 (2004))された、ＲＣＲプラスミドファミリー群１に関わるプラスミドであることが明らかとなった。群１のプラスミド、特にｐＫＪ３６とｐＴＢ６ｒｅｐＢの高いａａ同一性及びｏｒｉＶヌクレオチド配列の高い相同性から、ローリングサークルメカニズムによってｐＴＢ６が複製することが、はっきりと示唆された。【００４８】
ＭＯＢΩ系統のプラスミドのｏｒｉＴに保存されているヌクレオチド配列を、ｐＴＢ６の推定上のｏｒｉＴに同定した。また、ＭＯＢΩ系統のプラスミドのモチーフＩ及びモチーフIIIに対する、推定上のＭｏｂＡにおけるモチーフＩ及びモチーフIIIの顕著な類似性も、ｐＴＢ６に見出された。この結果から、因子が宿主細胞又は他のプラスミドから更に供給された場合に、ｐＴＢ６が可動化することが示唆された。この点から、ｍｅｍｂＢ及びｏｒｆＩに加えてｏｒｉＴ及びｍｏｂＡを欠損したプラスミドｐＢＲＡＳＴＡ１０１及びｐＤＳＯ４４Ｓｐが、遺伝子転移の安全な媒体として有用であることを確信した。【００４９】
最近、Nakamura et al.及びFujimori et al.は、ｐＢＲ３２２及びｐＴＢ６の複合プラスミドであるｐＢＬＥＳ１００を用い、ビフィドバクテリウム・ロンガムにおいて大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子（codA）を発現させることに成功した。これにより、ビフィドバクテリウム・ロンガムにおける外来遺伝子の発現に、ｐＴＢ６が有用なベクターであることが示された。しかし、ビフィドバクテリウムが部位特異的エンドヌクレアーゼを産生することが知られており、したがって、ビフィドバクテリウム細胞に導入された場合に、非修飾ＤＮＡは損傷する場合がある(Khosaka et al., Gene. 17, 117-122 (1982), Khosaka et al., FRBS Lett., 14, 63, 170-174 (1983), Khosaka et al., Gene 31, 251-255 (1984), Skrypina et al., Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol., 5, 15-16 (1988))。小型のプラスミドである、ｐＢＲＡＳＴＡ１０１及びｐＤＳＯ４４Ｓｐは、ｏｒｉＴ及びｍｏｂＡを欠損し、高い形質転換能を有していることから、本発明者らは、ビフィドバクテリウム・ロンガムにおいて外来遺伝子をクローニングし、発現させるために実用的であることを確信している。
【実施例２】
【００５０】
（シャトルベクターｐＡＶ００１の構築）
［プラスミドの構築］
ｐＢＬＥＳ１００よりエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のスペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼ（ＡＡＤカセット）を含む配列をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen社製）にサブクローニングし、ｐＣＲＴＯＰＯ−ＳｃａＩ−ＡＡＤ−Ｅａｍ１１０５Ｉを作製した。なお、フォワードプライマーにＳｃａＩ、リバースプライマーにＥａｍ１１０５Ｉ制限酵素サイトをそれぞれ付加した。【００５１】  図５に示すように、Invitrogen社より購入したクローニングベクターｐＧＦＰｕｖ（DEFINITION：Cloning vector pGFPuv. ACCESSION：U62636  VERSION：U62636.1 GI：1490528）はＧＦＰｕｖ遺伝子とその両端のマルチクローニングサイト（Multi-Cloning Site、MCS）、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌プラスミド複製起点のＯｒｉ（ｐＵＣ  Ｏｒｉ）より構成されている。【００５２】
このｐＧＦＰｕｖのアンピシリン耐性遺伝子部位を制限酵素Ｅａｍ１１０５ＩとＳｃａＩを用いて切断し、取り除いた長断片を作製した。同様に制限酵素Ｅａｍ１１０５ＩとＳｃａＩを用いて、ｐＣＲＴＯＰＯ−ＳｃａＩ−ＡＡＤ−Ｅａｍ１１０５Ｉを切断したＡＡＤカセット含む断片（約１１００ｂｐ）を作製した。上記２つの断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合したｐＧＦＰｕｖ−ＳｐＲを作製した。なお、作製したプラスミドｐＧＦＰｕｖ−ＳｐＲのスペクチノマイシン耐性形質付与を、また同時にアンピシリン耐性形質の欠失をそれぞれ大腸菌にて確認した。【００５３】
ｐＧＦＰｕｖ−ＳｐＲを制限酵素ＳａｌＩ（ＧＦＰｕｖ遺伝子上流のマルチクローニングサイト内に存在）とＳｐｅＩ（ＧＦＰｕｖ遺伝子下流のマルチクローニングサイト内に存在）で消化し、ＧＦＰｕｖ遺伝子を削除したプラスミドｐＡＶＮを作製した。【００５４】
実施例１で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム由来プラスミドｐＴＢ６の全塩基配列情報より、ＲｅｐＢ，ＳＤＯ，ＤＤＯ，ＡＴ−rich repeats，DnaA-binding motifsを含む約１９００ｂｐの配列をビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミド複製ユニットとして同定した。【００５５】
ｐＴＢ６よりビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミド複製ユニットを含む約１９００ｂｐをＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯベクターへサブクローニングしたｐＣＲＴＯＰＯ−ＡｐａＩ−１９００−ＳｃａＩを作製した。なお、フォアードプライマーにＡｐａＩ、リバースプライマーにＳｃａＩ制限酵素サイトをそれぞれ付加した。【００５６】
ｐＡＶＮを制限酵素ＡｐａＩとＳｃａＩで消化した長断片（約２４００ｂｐ）と同様にｐＣＲＴＯＰＯ−ＡｐａＩ−１９００−ＳｃａＩを制限酵素ＡｐａＩとＳｃａＩで消化した短断片（約１９００ｂｐ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した、ビフィドバクテリウム・ロンガム−大腸菌シャトルベクターｐＡＶ００１（約４３００ｂｐ）を作製した。
【実施例３】
【００５７】
（シトシンデアミナーゼ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ）
［発現ベクターの構築］
次に、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩで切断し、ＨＵ遺伝子プロモーター、大腸菌由来のシトシンデアミナーゼ遺伝子とＨＵ遺伝子ターミネーター含む約２９００ｂｐを抜き出した。同様にシャトルベクターｐＡＶ００１をマルチクローニングサイト内にある制限酵素切断部位でＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩで切断した長断片に、上記の約２９００ｂｐ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合したｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（約７１００ｂｐ）を作製した。【００５８】
［ビフィドバクテリウム・ロンガム内プラスミドコピー数の比較］
今回作製したｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤとｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤをそれぞれ導入した組換えビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと、ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを作製し、それぞれのプラスミドの存在をＰＣＲにより確認した。ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤとビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤをそれぞれＭＲＳ培地（ＯＸＩＤ）３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した培養液から遠心分離により菌体（１×１０９ＣＦＵ）を分離し、Puregene DNA Isolation Kit（Gentra Systems社製）を用いて総ＤＮＡを抽出した。上記の回収した総ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＥｃｏ８１Ｉを用いて消化し、アガロースゲル電気泳動により核酸を分離し、AlkPhos Direct Labelling Reagents(Amersham Bioscience社製)を用いてサザン分析法にてプラスミドのコピー数を比較した（図９のＡ参照）。なお、シグナルの感光法として、アルカリフォスファターゼにより化学発光させた核酸をＸ線フィルムに感光した。シグナル強度の比較は感光したＸ線フィルムをゲルスキャニングシステム（ATTO社製）を用いてスキャンし、スキャンイメージをＣＳアナライザー（software,ATTO社製）を用いて分析し、プラスミドのコピー数を求めたところ、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤのプラスミドのコピー数は約３．２６／ｃｅｌｌであるのに対して、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミドのコピー数は約１１．６８／ｃｅｌｌであり、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤは約３．６倍プラスミドコピー数が多いことが確認され、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤと比較してｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド複製数に有意な差が認められた（図９Ｂ参照）。【００５９】
［ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるシトシンデアミナーゼタンパクの発現量の比較］
ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤとビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤをそれぞれＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した培養液から遠心分離により菌体（１×１０９ＣＦＵ）を分離し、超音波破砕後、菌体内タンパクをそれぞれ抽出した。上記抽出したタンパクをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ウエスタン分析法にてシトシンデアミナーゼタンパクのシグナル強度を比較した。なお、一次抗体としてウサギ抗シトシンデアミナーゼモノクローナル抗体（Sawaday Technology社製）、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ−抗ウサギイムノグロブリンＧ複合体（Santa Cruz Biotechnology, Inc社製）をそれぞれ用いた。シグナルの感光法として、ＥＣＬ法により発光させＸ線フィルムに感光した。シグナル強度の比較は感光したＸ線フィルムをゲルスキャニングシステム（ATTO社製）を用いてスキャンし、スキャンイメージをＣＳアナライザー（software,ATTO社製）を用いて発現量を比較した。結果を図６に示す。シグナル強度の比較によりビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤは、ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤの２〜８倍のシトシンデアミナーゼタンパクを発現していることが明らかになった。【００６０】
［ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるシトシンデアミナーゼタンパク酵素活性の比較（５ＦＣ→５ＦＵの変換活性比較）］
ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（Ｄ）とビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（Ｂ）に加えて、コントロールとしてビフィドバクテリウム・ロンガムの野生株（Ａ）と、シトシンデアミナーゼ遺伝子が導入されていないビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶＮ（Ｃ）をそれぞれＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した培養液から遠心分離により菌体（２×１０９ＣＦＵ）を分離し、４．５ｍｌのＭＲＳ培地に再度懸濁した。次に最終濃度２ｍｇ／ｍｌとなるよう０．５ｍｌの５ＦＣ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し３７℃嫌気条件下で培養した。０、４、８、１８、２４時間ごとの培養液から、遠心分離により菌体を取り除いた上清をそれぞれ回収し、ガスクロ分析（5FU GC-MS methods, BML）により変換された５ＦＵ濃度を測定した。経時菌数変化を図７に、５−ＦＵ濃度を図８にそれぞれ示す。分析の結果、４時間後では約１．８３倍、８時間後では約１．５２倍、１８時間後では約１．３４倍、２４時間後では約１．５７倍、平均で約１．５７倍ビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（Ｄ）はビフィドバクテリウム・ロンガム：：ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（Ｂ）と比較して５ＦＵ変換量が多かったことが明らかになった。【００６１】
（シトシンデアミナーゼ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのビフィズス菌属への遺伝子導入）
表４に示す菌株にシトシンデアミナーゼ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤをエレクトロポーレーション法により導入した組換えビフィズス菌を作製した。【００６２】
【表４】
0004989231.tif 000005
現在、インファンティスとラクテニスは分類学上、ロンガムのサブスピーシーズ（亜種）としてロンガムに含まれているが、従来はビフィドバクテリウム属の別個の菌種として知られていた。【００６３】
（組換えビフィズス菌のシトシンデアミナーゼ活性の測定）
それぞれの組換えビフィズス菌の培養後の培養液より菌体を遠心分離し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む緩衝液に懸濁し、超音波破砕機で菌体を破砕した。その後、この破砕液を遠心分離し、不要な画分を取り除いた上清を蛋白抽出試料とした。総蛋白量０．０５ｍｇに相当する蛋白抽出試料液をとり、総和が２５０μLになるように緩衝液を正確に加え、更に２０ｍＭ ５ＦＣ溶液２５０μLを正確に加え、３７℃の水浴中で６０分間インキュベートした。ここへトリクロル酢酸を加え抽出後、水酸化ナトリウムで中和した試料をＨＰＬＣを用いて生成された５ＦＵ量と残存５ＦＣ量を測定した。ＨＰＬＣによる測定は２回行い測定誤差が少ないことを確認した。【００６４】
新規シャトルベクターであるｐＡＶ００１を用いたシトシンデアミナーゼ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤは、表４中の５株の菌株に導入可能であった。また、その導入遺伝子であるシトシンデアミナーゼは実際に活性のある蛋白質として高発現し、且つ高活性であった（表５参照）。【００６５】
【表５】
0004989231.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によると、ビフィドバクテリウム属微生物での宿主域が広く、ビフィドバクテリウム属微生物中でのコピー数が多く、発現ベクターとして用いた場合、ビフィドバクテリウム属微生物において所望の蛋白質を高発現することができる、ビフィドバクテリウム属微生物と大腸菌とのシャトルベクターや、該シャトルベクターを利用したビフィドバクテリウム属微生物において所望遺伝子を発現することができる発現ベクターや、該発現ベクターで形質転換されたビフィドバクテリウム属微生物や、該ビフィドバクテリウム属微生物を有効成分とする抗腫瘍剤を得ることができる。
【図１】
0004989231.tif 000007
【図２】
0004989231.tif 000008
【図３】
0004989231.tif 000009
【図４】
0004989231.tif 000010
【図５】
0004989231.tif 000011
【図６】
0004989231.tif 000012
【図７】
0004989231.tif 000013
【図８】
0004989231.tif 000014
【図９】
0004989231.tif 000015
【配列表】
0004989231000001.app