(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長の異なる複数の励起光でサンプルを励起する光源部と、この励起光を用いてサンプルを走査するスキャナ部と、励起されたサンプルが発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラとを備えた共焦点スキャナ顕微鏡において、
前記光源部は、
前記複数の波長のうちの第１の波長の励起光を出力する第１の光源および第２の光源と、
前記複数の波長のうち、前記第１の波長と異なる波長の励起光を出力する光源群と、
前記第１の光源から出力される前記第１の波長の励起光と、前記光源群に含まれる一の光源から出力される励起光とを合成する第１の波長選択性光ファイバカプラと、
前記第２の光源から出力される前記第１の波長の励起光と、前記光源群に含まれる他の一の光源から出力される励起光とを合成する第２の波長選択性光ファイバカプラと、
前記第１の波長選択性光ファイバカプラを経由して合成された励起光を伝送する第１の光ファイバと、
前記第２の波長選択性光ファイバカプラを経由して合成された励起光を伝送する第２の光ファイバと、
を備え、
前記第１の光ファイバおよび前記第２の光ファイバは共通の光ファイバ束を構成することを特徴とする共焦点スキャナ顕微鏡。
【請求項２】
波長の異なる複数の励起光でサンプルを励起する光源部と、この励起光を用いてサンプルを走査するスキャナ部と、励起されたサンプルが発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラとを備えた共焦点スキャナ顕微鏡において、
前記光源部は、
前記複数の波長のうちの第１の波長の励起光を出力する第１の光源および第２の光源と、
前記複数の波長のうち、前記第１の波長と異なる波長の励起光を出力する第３の光源と、
前記第１の光源から出力される前記第１の波長の励起光と、前記第２の光源から出力される前記第１の波長の励起光とを合成する光ファイバカプラと、
前記光ファイバカプラを経由して合成された励起光を伝送する第１の光ファイバと、
前記第３の光源から出力される励起光を伝送する第２の光ファイバと、
を備え、
前記第１の光ファイバおよび前記第２の光ファイバは共通の光ファイバ束を構成することを特徴とする共焦点スキャナ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点スキャナ顕微鏡に関し、特に、多波長光源の全部又は一部に出力が弱い光源を含む場合でも高速撮像できる共焦点スキャナ顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、共焦点スキャナ顕微鏡が注目されている。共焦点スキャナ顕微鏡は、サンプルを励起する光源部と、サンプルから出た蛍光を検出する光検出部等からなり、次の特許文献１では多波長光源を用いて撮像する共焦点スキャナ顕微鏡の発明が記載されている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２１２４３４号公報
【０００４】
本発明は特許文献１の図１に記載された発明の光源部に改良を加えたものであるため、先ず、特許文献１の図１に記載された発明を説明する。
【０００５】
図８は従来の共焦点スキャナ顕微鏡の一実施例を示す構成図である。光源部１０は、複数の多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃと、光源からの光の通過と遮断を制御するスイッチング手段１４と、光透過帯域の異なるフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃから構成されている。
【０００６】
スイッチング手段１４を通過した光はフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃを透過して光ファイバ束１５から光源の数に対応して複数本に分離された光ファイバ１５ａ，１５ｂ，１５ｃに入射し、光ファイバ束１５の他端から出射して、ミラー１６に入射する。ミラー１６はこの光を反射してコリメータレンズ１７に入射する。コリメータレンズ１７は入射光を平行光として、マイクロレンズアレイディスク２に入射する。
【０００７】
入射したレーザ光は一つ一つのマイクロレンズで各々に対応配置されたピンホールディスク表面での反射光（ノイズ光）が減少し、Ｓ／Ｎ比も向上される。マイクロレンズアレイディスク２とピンホールディスク３の間にはダイクロイックミラー４が配置されており、励起光はこのダイクロイックミラー４を通過する。
【０００８】
ピンホールディスク３のピンホールを出たレーザ光は、対物レンズ５を通過後、サンプル６を励起する。サンプル６から出た蛍光は再び対物レンズ５とピンホールディスク３のピンホール３を通過し、ダイクロイックミラー４で反射して光検出部２０に導かれる。
【０００９】
光検出部２０は、ダイクロイックミラー２２ａ，２２ｂ，２２ｃと、バリアフィルタ２５ａ，２５ｂ，２５ｃと、レンズ２４ａ，２４ｂ，２４ｃと撮像カメラ８ａ，８ｂ，８ｃより構成されている。バリアフィルタ２５は透過波長特性の異なる複数のフィルタから構成されている。バリアフィルタ２５を透過した出力光はレンズ２４により集光されて撮像カメラ８に入射する。撮像カメラ８は、撮像画像を増幅し、電気信号に変換して出力する。
【００１０】
画像収集装置３０は撮像カメラ８が出力する電気信号を画像データに変換して保存する。画像表示装置４０は、通常コンピュータが用いられ、画像収集装置３０に格納された画像を読み出し、適宜に処理を行って表示画面に表示する。
【００１１】
このような構成における動作を次に説明する。光源部１０では３つの多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃから発せられた光をそれぞれスイッチング手段１４およびフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃを介して複数に分離された光ファイバ１５ａ，１５ｂ，１５ｃの一端に入射する。
【００１２】
光ファイバ束１５から出射された光はミラー１６で反射しコリメータレンズ１７に入射する。コリメータレンズ１７により平行光となった光はマイクロレンズアレイディスク２に入射する。なお、光ファイバ１５の出力光を直接レンズ１７に入射させることができる場合には、ミラー１６は不要である。
【００１３】
サンプル６から発せられる蛍光には通常複数の波長が含まれている。例えば、第１のダイクロイックミラー２２ａでは波長λ１の光を透過し、他の波長の光は反射する。次に、第２のダイクロイックミラー２２ｂでは、第１のダイクロイックミラー２２ａで反射した光を受けて、波長λ２の光を反射し、他の波長の光を透過する。第３のダイクロイックミラー２２ｃでは第２のダイクロイックミラー２２ｂを透過した光を受けて、波長λ３の光を反射する。
【００１４】
このようにして３つのダイクロイックミラー２２ａ，２２ｂ，２２ｃにより分岐して、３つの波長の蛍光をそれぞれ個別に出力する。ダイクロイックミラー２２からの出力はバリアフィルタ２５ａ，２５ｂ，２５ｃに入力する。このバリアフィルタ２５で透過波長領域を狭めることにより、目的とする波長以外を除去し目的とする波長のみを撮像カメラ８に入射させることができ、画像のＳＮ比を向上することができる。
【００１５】
バリアフィルタを透過したそれぞれの出力光はレンズ２４ａ，２４ｂ，２４ｃによってそれぞれ集光され撮像カメラ８ａ，８ｂ，８ｃに入射する。３台の撮像カメラはそれぞれ撮像画像を電気信号に変換して出力する。画像収集装置３０は、この電気信号をデジタル画像データに変換し、ダイクロイックミラーで分岐した蛍光の色と対応付けて保存する。
【００１６】
画像表示装置４０は、画像収集装置３０に保存された画像データとフィルタの情報を読み出し、元の蛍光色に再構成（カラー再構成）して蛍光画像を画面表示する。また、カラー再構成しないで蛍光画像を表示させることももちろん可能である。このようにして、ダイクロイックミラーにより分岐した波長の各蛍光像を同時計測することができる。
【００１７】
次に光ファイバ束から出力した光のずれ量について説明する。図９では３本を束ねたときにコア間に１２５μｍのずれがある。このずれは少ないほうが鮮明な画像表示には有利である。しかし、これ以上クラッドを細くしてコア間を近づけるのは技術的、経済的に難しい。
【００１８】
図１０はコリメータレンズ１７と、マイクロレンズアレイディスク２と、ピンホールディスク３と、対物レンズで構成された従来のスキャナ部において、コアの間隔が１２５μｍのずれを有する場合に光ファイバ束から出射した光軸のずれ量の変化を演算により求めた結果を示すイメージ図である。
【００１９】
コリメータレンズ１７でコリメートされた光はマイクロディスクレンズ2に入射する。この入射時点でずれは３３.５μｍとなる。ここで絞られた光がピンホールディスク３を通過した時点では７μｍに減少し、対物レンズ（４０倍）５を経てサンプルを照射する時点では０.２６μｍのずれになる。これらの値は現在使用しているレンズのデータから計算した値である。
【００２０】
図１１はピンホールディスク３面上での集光スポット（ａ）とピンホールディスク３を透過した直後（ｂ）の光の断面強度分布を示すもので、現在使用しているピンホールの直径の場合、７μｍのずれを有する光の透過（減衰）具合を示している（ｂ図に示すＧ点はずれによる波形カットの状態を示している）。発明者らの計算によればずれがない場合の透過率は８６.９％、７μｍ、ずれた場合の透過率は８６.３％であり、光軸のずれが７μｍあったとしてもほとんど影響がないことが分かる。
【００２１】
このように、従来の共焦点スキャナ顕微鏡では多波長光源を用いて撮像することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
ところが、出射光パワーが低い光源や光ファイバとの光結合が低い光源を用いる場合、光ファイバ束から出射される光パワーが弱くなるため、撮像カメラの露光時間を長くする必要があり、その結果、高速撮像に不向きとなる。
【００２３】
この問題は、出射光パワーが低い光源や光ファイバとの光結合が低い光源（例えば、図１２の光源１１ｃ、１１ｄ）を用いる場合、図１３に示すように同じ光源１１ｃ、１１ｄを複数用意して対応可能である。しかしながら、同じ光源を複数用いると、多色励起に制限がかかってしまう。また、光源の種類を増やすために、束ねる光ファイバの本数を増やすと、光ファイバコア間のずれが大きくなり鮮明な画像を得るには不利になってしまう。
【００２４】
本発明は、これらの問題点に鑑みてなされたものであり、多波長光源の全部又は一部に出力が弱い光源を含む場合でも高速撮像できる共焦点スキャナ顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
このような課題を達成するために請求項１記載の発明は、
波長の異なる複数の励起光でサンプルを励起する光源部と、この励起光を用いてサンプルを走査するスキャナ部と、励起されたサンプルが発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラとを備えた共焦点スキャナ顕微鏡において、
前記光源部は、
前記複数の波長のうちの第１の波長の励起光を出力する第１の光源および第２の光源と、
前記複数の波長のうち、前記第１の波長と異なる波長の励起光を出力する光源群と、
前記第１の光源から出力される前記第１の波長の励起光と、前記光源群に含まれる一の光源から出力される励起光とを合成する第１の波長選択性光ファイバカプラと、
前記第２の光源から出力される前記第１の波長の励起光と、前記光源群に含まれる他の一の光源から出力される励起光とを合成する第２の波長選択性光ファイバカプラと、
前記第１の波長選択性光ファイバカプラを経由して合成された励起光を伝送する第１の光ファイバと、
前記第２の波長選択性光ファイバカプラを経由して合成された励起光を伝送する第２の光ファイバと、
を備え、
前記第１の光ファイバおよび前記第２の光ファイバは共通の光ファイバ束を構成する。
【００２６】
また、請求項２記載の発明は、
波長の異なる複数の励起光でサンプルを励起する光源部と、この励起光を用いてサンプルを走査するスキャナ部と、励起されたサンプルが発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラとを備えた共焦点スキャナ顕微鏡において、
前記光源部は、
前記複数の波長のうちの第１の波長の励起光を出力する第１の光源および第２の光源と、
前記複数の波長のうち、前記第１の波長と異なる波長の励起光を出力する第３の光源と、
前記第１の光源から出力される前記第１の波長の励起光と、前記第２の光源から出力される前記第１の波長の励起光とを合成する光ファイバカプラと、
前記第１の光ファイバカプラを経由して合成された励起光を伝送する第１の光ファイバと、
前記第３の光源から出力される励起光を伝送する第２の光ファイバと、
を備え、
前記第１の光ファイバおよび前記第２の光ファイバは共通の光ファイバ束を構成する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明では次のような効果がある。波長選択性光ファイバカプラを用いて励起光の強度を上げるので、高速撮像が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、図面を参照して本発明による共焦点スキャナ顕微鏡を説明する。図１は本発明の第１実施形態の構成図である。光源１１ｃ、１１ｄ、１１ｅ、１１ｆは出射光パワーが低い光源や光ファイバとの光結合が低い光源である。また、光源１１ｃと１１ｅ、１１ｄと１１ｆは、それぞれ同じ波長を出力する光源である。
【００２９】
波長選択性光ファイバカプラ５０ａ、５０ｂは、ポートAから波長λ3の光源１１ｃ、ポートＢから波長λ4の光源11dを入射させると、ポートCからは、λ1とλ2の合波された光（λ1＋λ2）が出力される。
【００３０】
この時、ポートAからポートC、ポートBからポートCの透過率は、共に90％以上である。このような特性の光ファイバカプラは、一般に波長選択性光ファイバカプラと呼ばれている。波長選択性光ファイバカプラは、一般に2本の光ファイバを束ねて加熱し溶融延伸して融着させて製造するものであり、2本の光ファイバ間のモード結合に波長依存性があることを利用して波長選択性を実現する。
【００３１】
以下、図１の具体例を示す。例えば、光源１１ｃと光源１１ｅが同じ光パワーの光源である場合、スイッチング手段１４ｃ、１４ｅをスルーにすると、波長選択性光ファイバカプラ５０の透過率は一般に９０％以上であるので、１つの光源を使用した場合に比べて２倍弱の光パワーが光ファイバ束１５から出射される。また、スイッチング手段１４ｃ、１４ｄをスルーにした場合は、波長選択性光ファイバカプラ５０で合波された光が光ファイバ束１５から出射される。なお、光ファイバ束１５から出射した後の動作は図８と同様なので説明を省略する。
【００３２】
また、図１は波長選択性光ファイバカプラを、光ファイバ束のポート3とポート4に接続しているが、光ファイバ束のどのポートで使用しても良い。また、波長選択性光ファイバカプラ５０と光ファイバ束１５のポートの接続は、光コネクタ接続や融着接続等どのような接合方法でも構わない。さらに、図１は、波長選択性光ファイバカプラ５０を２セット用いているが、必要に応じて増やしても良い。
【００３３】
また、図１に示すように不要なポートDは、斜めカットする等して光ファイバ端面で反射しないよう終端すれば良い。他の手法としては、ポートDに光検出器を接続して光源の光出力パワーをモニタしても良い。
【００３４】
次に、図２を参照して本発明の他の実施例を説明する。図２は、図１の波長選択性光ファイバカプラの代わりに、光結合または分岐用として使用される光ファイバカプラを用いた構成を示す。この光ファイバカプラは特性上、同じ波長の光源を入射させて使用することが可能である。このような光ファイバカプラは、波長選択性光ファイバと同様に２本の光ファイバを束ねて加熱し溶融延伸して融着させて製造する。
【００３５】
波長選択性光ファイバと異なるのは、ファイバコア間の近接している距離（結合長）によって、分岐比を調節している点である。具体的には、ポートAからポートCの透過率が90％になる時、相反性によりポートBからポートCの透過率は10％になる。
【００３６】
この図２の発明でも、出射光パワーが低い光源の光強度を上げることができるので、撮像カメラの露光時間を短くでき、その結果、高速撮像が有利になる。
【００３７】
ところで、特許文献１に記された光ファイバ束は３本構成であるが、本発明では４本構成である。従って、クラッドの径の影響でコア間距離は本発明の方が長くなり、光軸にずれが生ずる。一般に、光軸のずれは少ないほど良いため、以下の説明においては、光軸のずれが広がったことによる影響について検討する。なお、波長選択性光ファイバカプラは、光ファイバで構成しているので、光ファイバ束自身では光軸のずれは生じない。
【００３８】
図３（Ａ）は３本構成の光ファイバ束の断面図であり、図３（Ｂ）は４本構成の光ファイバ束の断面図である。光ファイバを４本にすると、最大となるコア間距離は、125μｍのルート３倍となるため177μmとなる。
【００３９】
図４は、３本構成の光ファイバを４本構成にしたことによる影響について検証した表である。発明者等の計算によれば、コア間距離が177μｍとなるとピンホールディスク３の入射面では9.7μｍ光軸がずれることが分かる。この様子を図示したのが図５である。図５（Ａ）は従来の光軸のずれを説明したものであり、図５（Ｂ）と比較するために掲載したものである。一方、図５（Ｂ）は本発明の光軸のずれを説明した図面である。
【００４０】
図５においては、発明者等の計算によればピンホールディスク３の透過率は、１．ずれが無い場合には86.9％であり、２．従来の３本構成の場合（つまり7μmずれた場合）には86.3％であり、図１のように４本構成の場合（つまり9.7μmずれた場合）には84.8％である。従って、４本構成にしても３本構成と比べて殆ど影響は無いことが分かる。
【００４１】
図６は、本発明の第２の実施例の構造図である。図１との相違点は、光ファイバ束には偏波保持光ファイバを用いている点である。光ファイバ束１５のポート3とポート4の偏波軸（slow軸）は、図６のＺ視図を示した図７のように直交配置されている。なお、光源１１の偏波軸と光ファイバ束１５のslow軸は合致している。
【００４２】
この第２実施形態によれば、例えば光源１１ｃと１１ｅ、１１ｄと１１ｆが、それぞれ可干渉性の高い同一波長のレーザ光源の場合、光ファイバ束の後段に配置された図示しないコリメータレンズ（図８のレンズ１７に相当する。）によって空間的に発生する干渉ノイズを極力抑えることができる。
【００４３】
以上説明したように、本発明によれば、波長選択性光ファイバカプラ５０を用いることにより励起光の強度を上げることができるので、高速撮像が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の光源部の構成図である。
【図２】本発明の光源部の説明を補足する図面である。
【図３】（Ａ）は３本構成の光ファイバ束の断面図であり、（Ｂ）は４本構成の光ファイバ束の断面図である。
【図４】コア間距離が広がったことによるデメリットを検証した表である。
【図５】（Ａ）は従来の光軸のずれを説明したものであり、（Ｂ）は本発明の光軸のずれを説明した図面である。
【図６】本発明の第２の実施例の構造図である。
【図７】図６のＺ視図であり、直交配置されている様子を説明する図面である。
【図８】従来の共焦点スキャナ顕微鏡の構成図である。
【図９】従来の３本シングルモードファイバの光軸のずれを説明した図面である。
【図１０】レンズの組み合わせによりコアの間隔が狭まる様子を示すイメージ図である。
【図１１】ピンホールディスク面上およびピンホール透過直後の光の断面強度分布を示す図である。
【図１２】出射光パワーが低い光源１１ｃ、１１ｄを含む多波長光源の例である。
【図１３】図１２の光源１１ｃ、１１ｄを複数用意して強度を高める例である。
【符号の説明】
【００４５】
２        マイクロレンズアレイディスク
３        ピンホールディスク
４        ダイクロイックミラー
５        対物レンズ
６        サンプル
８        映像カメラ
１０      光源部
１１      多波長光源
１２      フィルタ
１４      スイッチング手段
１５      光ファイバ束
１６      ミラー
１７      レンズ
２０      光検出部
２２      ダイクロイックミラー
２４      レンズ
２５      バリアフィルタ
３０      画像収拾装置
４０      画像表示装置
【図１】
0005083618.tif 000002
【図２】
0005083618.tif 000003
【図３】
0005083618.tif 000004
【図４】
0005083618.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005083618.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005083618.tif 000013
【図１３】
0005083618.tif 000014