(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＭｃｍ３に特異的に結合し得るモノクローナル抗体であって、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２３８８を有するハイブリドーマ細胞株から得られ得るモノクローナル抗体と同じヒトＭｃｍ３のエピトープと反応する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
免疫組織学的かつ免疫生化学的の両方で、ヒトＭｃｍ３に結合し得る、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、合成抗体、または遺伝的に改変された抗体である、請求項１または２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
検出可能な物質で標識された、請求項１、２または３記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
検出可能な物質が、蛍光標識、放射性標識、酵素標識、または発光標識を含む、請求項４記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２３８８を有するハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項７】
受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２３８８を有するハイブリドーマ細胞株。
【請求項８】
ヒトＭｃｍ３タンパク質のインビトロ検出のための、請求項１〜６いずれか記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項９】
試料中のヒトＭｃｍ３の免疫組織学的、免疫細胞学的または免疫生化学的なインビトロ検出のための請求項８記載の使用。
【請求項１０】
試料が、血清、血液試料、痰、尿、組織、生検材料、婦人科学的試料、および細針吸引試料からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項８または９記載の使用。
【請求項１１】
ヒトＭｃｍ３が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット法、ファーウエスタンブロット法、免疫沈降法、アフィニティークロマトグラフィー、ＦＡＣＳ、および磁気ビーズへの結合からなる群より選ばれる方法により検出される、請求項８、９、または１０記載の使用。
【請求項１２】
試料中の増殖細胞のインビトロ検出のための請求項１〜６いずれか記載のモノクローナル抗体の使用であって、該抗体がヒトＭｃｍ３を検出し、それによって、試料中の増殖細胞を検出し、該検出が、Ｋｉ−６７およびｐ２７を検出する工程をさらに含む、使用。
【請求項１３】
癌細胞または新生物細胞のインビトロ検出におけるパラメータを提供するための請求項１〜６いずれか記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１４】
(i)試料が、血清、血液試料、痰、尿、組織、生検材料、婦人科学的試料、および細針吸引試料からなる群より選ばれることを特徴とするか、または
(ii)ヒトＭｃｍ３が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット法、ファーウエスタンブロット法、免疫沈降法、アフィニティークロマトグラフィー、ＦＡＣＳ、および磁気ビーズへの結合からなる群より選ばれる方法により検出される、請求項１２または１３記載の使用。
【請求項１５】
ヒトＭｃｍ３タンパク質の精製のための請求項１〜６いずれか記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１６】
該モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法を含む、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
請求項１〜６いずれか記載のモノクローナル抗体を含有してなる、Ｍｃｍ３検出用組成物。
【請求項１８】
薬学的に許容しうる担体、アジュバントまたは添加剤と共に、請求項１〜６いずれか記載のモノクローナル抗体を含有してなる、腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項１９】
疾患の診断方法または腫瘍の治療方法に使用するための、請求項１〜６いずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
腫瘍の治療のための医薬組成物の調製における請求項１〜６いずれか記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項２１】
請求項１〜６いずれか記載のモノクローナル抗体に細胞を曝露する工程を含む、細胞周期、ＤＮＡ複製または細胞増殖のいずれかを中断または阻害するためのインビトロ方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヒトタンパク質Ｍｃｍ３に対するモノクローナル抗体、その製造方法およびその使用に関する。
【０００２】
従来技術
Ｍｃｍは、最初にパン種のＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において記載された。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製開始に重要な役割を演じることが知られており、このことは、余剰染色体ＤＮＡセグメントであるミニクロモソームの伝達率(transmittance) におけるその決定的な役割により、パン種で示された（Ｍａｉｎｅら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９８４、１０６：３６５−３８５）。この特徴は、これらのタンパク質をミニクロモソーム維持、Ｍｃｍと命名することの根拠となった。Ｍｃｍファミリーのタンパク質は、進化に関して高度に保持されている。
【０００３】
現在６個のタンパク質（Ｍｃｍ２、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７）がヒト系統で記載されており、これらは、ＤＮＡ複製に必要なタンパク質複合体を形成し他の細胞周期に依存した構造とともに、１９８８年にＪ．Ｊ．ＢｌｏｗとＲ．Ａ．Ｌａｓｋｅｙ（Ｎａｔｕｒｅ，３３２：５４６−５４８）によりＤＮＡ複製許可（license)因子としてすでに仮定されている。Ｍｃｍ３タンパク質は、Ｍｃｍ５と生化学的に強固な結合を形成することにより、重要な役割を演じる（Ａ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，  Ｒ．Ｋｎｉｐｐｅｒｓ，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，２４７：１３６−１４１）。Ｍｃｍ３とＭｃｍファミリーの他のメンバーは、細胞周期においてこのような根本的な機能をもっているため、検出システム、好ましくは免疫生化学的かつ免疫組織学的な検出が望まれている。かかる検出は、その方法で医療診断、好ましくは癌診断の新しいパラメーターが達成することができるため必要である。
【０００４】
ヒトＭｃｍタンパク質はウサギにおいて免疫原性であることが知られている（Ｔｈｏｍｍｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：１０６９−１０７４）。しかしながら、公知のポリクローナル抗血清は、免疫生化学的な解析（ウエスタンブロット）で単一特異的に反応しないかおよび／またはすぐにかつ常套的な免疫組織学における問題なしに適用できないかのいずれかである（Ｈｕ，Ｂ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１：５２８９−５２９３）。したがって、医療診断においてＭｃｍ３の検出方法として役に立ち得る手近な手段はない。
【０００５】
発明の要約
したがって、本発明の目的は、単独でまたは互いに組み合わせて行われる生化学的なシステムや組織学的なシステムでもＭｃｍ３タンパク質をすばやく、かつ単一特異的に検出する手段を提供することにある。この検出は、単独でまたは他の公知のマーカーと組み合わせて行われ得る。
【０００６】
本発明によれば、これは、Ｍｃｍ３タンパク質に対する、免疫生化学的および免疫組織化学的な検出システムの両方に適用でき、それにより、これらの検出が単独でまたは組み合わせて行われ得るモノクローナル抗体により達成される。
【０００７】
さらに、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが開示される。
【０００８】
本発明の他の局面は、本発明のモノクローナル抗体を含有してなる、診断用組成物および検出キットの提供である。
【０００９】
さらに他の局面は、試料中におけるＭｃｍ３の検出のため本発明のモノクローナル抗体の使用である。
【００１０】
さらに、本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマのそれぞれの産生に関する方法が開示されている。
【００１１】
最後に、本発明は、該モノクローナル抗体を含有してなる医薬調製物および薬物ならびにある種の疾患の治療用薬剤の調製へのモノクローナル抗体の使用に関する。
【００１２】
また、異常型ＭｃＭ３のレベルもしくは活性に関連する、またはＭｃＭ３の活性もしくはレベルの調節から利益を得ることができる疾患または障害の治療方法は、本発明の範囲内である。前記方法は、例えば、被験体に局所的または全身的のいずれかで、本発明のＭＣｍ３抗体を含有する組成物の薬学上有効量を投与することを含む。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明によれば、Ｍｃｍ３タンパク質に対する、免疫生化学的および免疫組織化学的な検出システムに適用でき、それにより、これらの検出が単独でまたは組み合わせて処理され得るモノクローナル抗体が提供される。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体は、あらゆる動物またはヒトから得ることができ、それによりマウスのモノクローナル抗体が好ましい。
【００１５】
さらに、前記モノクローナル抗体は、遺伝子操作により生化学的に改変され得る、即ち、それは、Ｍｃｍ３の認識に必要であり、前記抗体にさらなる有利な特性を与える他の部位と置換される部位を、完全にまたは部分的におそらく欠損している抗体で合成され得る。
【００１６】
前記検出を伴う本発明の好ましいモノクローナル抗体、即ち、モノクローナルマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、１９９９年２月１６日に番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２３８８下でブラウンシュバイクのドイツ微生物・細胞培養収蔵有限責任会社（Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) （ＤＳＭＺ）に寄託された。
【００１７】
「抗体」という用語は、本明細書に用いられるように、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、Ｍｃｍ３に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、ペプシンなどの酵素で前記抗体を処理することで生成され得るＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）2 フラグメントが含まれる。本発明は、Ｍｃｍ３に結合するモノクローナル抗体を提供する。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本発明に用いられるように、Ｍｃｍ３の特定のエピトープと免疫反応することができる唯一の種類の抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。したがって、典型的にはモノクローナル抗体組成物は、免疫反応するＭｃｍ３に対する単独の結合親和性を示す。
【００１８】
異常型ＭｃＭ３活性に「関連する」または「特徴づけられる」疾患、障害または状態は、異常型ＭＣｍ３活性により引き起こされるまたはこれが一因となっている被験体における疾患、障害または状態をいう。
【００１９】
「処置する」という用語は、本明細書に用いられるように、前記状態または疾患の少なくとも１つの症状を治療する並びに改善することを包含することが意図される。
【００２０】
モノクローナル抗Ｍｃｍ３抗体は、Ｍｃｍ３免疫原で適当な被験体を免疫化することにより調製することができる。適切な免疫原性調製物は、例えば、組み換え的に発現されたＭｃｍ３タンパク質または化学的に合成されたＭｃｍ３ポリペプチドを含有し得る。さらに該調製物は、フロイント完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバント、または類似の免疫刺激剤を含有し得る。免疫原性Ｍｃｍ３調製物での適当な被験体の免疫化は、抗Ｍｃｍ３抗体応答を誘導する。
【００２１】
免疫処理した被験体における抗Ｍｃｍ３抗体力価は、固定化Ｍｃｍ３を使用する固定酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いる標準的な技術により経時的にモニターされ得る。所望であれば、Ｍｃｍ３に対する抗体分子を、哺乳動物から（例えば、血液から）単離し、さらにプロテインＡクロマトグラフィーなどの周知の技術により精製してＩｇＧ画分を得ることができる。免疫後の適当な時間に、例えば、抗体力価が最高である場合、抗体産生細胞を被験体から得ることができ、そしてＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）により初めて記載されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎら、（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら、（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら、（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．４  ７６：２９９７−３  １；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５も参照のこと）、さらに最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、モノクローナル抗体と癌治療、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）またはトリオーマ（trioma) 技術などの標準的な技術によりモノクローナル抗体を調製するのに使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを製造する技術は、周知である（一般に、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ：Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒら、（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１３６）。簡単には、不死化細胞株（典型的には、骨髄腫）を、前記のようにＭｃｍ３免疫原で免疫化された哺乳動物由来のリンパ球（典型的には脾細胞）に融合し、そして得られるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングしてＭｃｍ３に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００２２】
リンパ球と不死化細胞株とを融合するのに使用される、多くの周知のプロトコールのいずれかを、抗Ｍｃｍ３モノクローナル抗体を発生させる目的に利用することができる（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら、（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、上述；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ、上述；Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、上述、を参照のこと）。さらに、当業者は、このような方法に多くのバリエーションがあり、同様に有用であり得ることを認識するだろう。典型的には、不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳類種に由来する。たとえば、本発明の免疫原性調製物で免疫されたマウス由来のリンパ球を不死化マウス細胞株と融合することにより、マウスハイブリドーマを作製することができる。不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のあるマウス骨髄腫細胞株である。標準的な技術に従い、融合パートナーとして任意の多くの骨髄腫細胞株、例えば、Ｐ３−ＮＳ  ｌ／ｌ−Ａｇ４−ｌ；Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株、を用いることができる。典型的には、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合する。次いで、融合から得られるハイブリドーマ細胞を、未融合の骨髄腫細胞を殺す（未融合の脾細胞は形質転換されないので数日後に死ぬ）ＨＡＴ培地を用いて選択する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、Ｍｃｍ３に結合する抗体についてハイブリドーマ培地上清をスクリーニングすることにより検出される。
【００２３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するかわりに、Ｍｃｍ３で組み換えコンビナトリアル（combinatorial)免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによりモノクローナル抗Ｍｃｍ３抗体を同定し、単離することができ、それによりＭｃｍ３に結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離する。ファージディスプレイライブラリーをつくり、スクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ファルマシアの組み換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーンＳｕｒｆＺＡＰ（登録商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを生み出し、スクリーニングする際の使用に特に影響を受けやすい方法や試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／０９６９０号；Ｌａｄｎｅｒら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｊ＼ｔＵＣ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４に見られうる。
【００２４】
さらに、標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる、ヒトおよび非ヒト部位の両方を含有するキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組み換え抗Ｍｃｍ３抗体は、本発明の範囲内である。かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の組み換えＤＮＡ技術により、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，Ｓ６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２  Ｓ，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＳｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載の方法を用いて製造され得る。抗Ｍｃｍ３モノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術によりＭｃｍ３を単離するのに使用され得る。抗Ｍｃｍ３抗体は、Ｍｃｍ３の発現の存在量およびパターンを評価するためにＭｃｍ３タンパク質を（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）検出するのに使用され得る。抗Ｍｃｍ３抗体は、臨床試験の手順の一部として、例えば、所定の治療プログラムの効力を決定するために、組織のタンパク質レベルをモニターするのに、診断的に使用することができる。検出は、検出可能な物質に抗体を結合すること（即ち、物理的に連結すること）により、促進され得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、置換基、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれる。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、（−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ）が含まれる；好適な置換基複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる；好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、Ｃｙ色素、アレキサ色素またはフィコエリトリンが含まれる；発光物質の例にはルミノールが含まれる；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、そして好適な放射性物質の例には 125Ｉ、 131Ｉ、35Ｓまたは 3Ｈが含まれる。
【００２５】
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、更に後述する一次スクリーニングストラテジーで製造することができる。多数の調製されるハイブリドーマは、Ｍｃｍ３タンパク質に対して単一特異的ではないか、または免疫生化学的検出システムにのみ適用できるが、免疫組織学的システムでは適用できない（またはその逆）かのいずれかであるため、生成されるハイブリドーマ細胞の初期試験では、両方の特性を有する本発明のモノクローナル抗体を製造するためにこのストラテジーを必要とする。
【００２６】
本発明の特性を有する遺伝学的に改変された抗体および／または合成抗体の作製について、例えば、前記のようにして得られるモノクローナル抗体から開始することができる。これについて、モノクローナル抗体のＭｃｍ３結合領域を解析し、前記の検出に必要な部分および不必要な部分を同定するのに好適である。次いで、前記必要な部分は修飾することができ、前記不必要な部分は完全にまたは部分的に除去することができ、そして、それぞれ、抗体にさらに有利な特性を与える部分と置換することができる。また、抗体の結合領域以外の部分は、修飾、除去、または置換され得る。特にＤＮＡ組み換え技術は前記測定に好適であることは当業者に公知である。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体は、生化学的検出システムおよび組織学的検出システムの両方において単一特異的にＭｃｍ３を検出することが特徴である。したがって、該抗体は、非常に異なる試料におけるＭｃｍ３発現の迅速な検出に好適である。
【００２８】
本明細書の文脈において、「試料」という用語は、本発明の目的に適するすべての種類の試料を包含することが意図される。かかる試料の例は、血清、痰（sputum）、尿、液、組織および生検材料である。特に、該試料は血液試料または婦人科学的試料でありうる。
【００２９】
これらの特徴のため、本発明の抗体は、例えばウエスタンブロットまたは免疫沈降により得られる定量的発現パラメータを用い、例えば免疫組織化学により測定される組織トポロジー分散解析が比較に基づいて解析される、診断的課題への適用に非常に好適である。
【００３０】
本発明の抗体を用い、Ｍｃｍ３発現の単一特異的検出が、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよび免疫沈降などの逐一行う免疫生化学的検出法において（本発明ではウエスタンブロットが好ましい）、または免疫組織化学的組織、好ましくは常套手段により固定化およびパラフィン包埋した組織において高い信頼度で行われうる。このため、本発明の抗体は、適切であれば上述のように標識してもよく、あるいは自身もしくは他の試薬に対する標識抗体と組み合わせて使用してもよい。
【００３１】
本発明のモノクローナル抗体は、ＤＮＡ前駆体の集合(assembly)をインビボで阻害し得、それゆえ、細胞増殖を阻害し得る。したがって、これらの抗体またはその上記誘導体は、増加した細胞増殖を伴う疾患状態の治療に好適である。かかる疾患の例は、腫瘍（tumour）、アレルギー、自己免疫疾患、瘢痕形成、炎症およびリウマチ病ならびに移植の防御反応の抑制である。
【００３２】
医薬組成物または薬の製造のため、本発明のモノクローナル抗体を単独で、または一般的な担体、アジュバントおよび／または添加剤と組み合わせて使用しうる。該抗体は、全身、局部、皮下、鞘内および局所の適用ならびに注腸による適用に好適である。このため、それらは、適切な溶媒中に溶解して、好ましくは水溶液として、リポソームの形態で、エマルジョンとして、または固体状態で、例えば粉末として、もしくはマイクロカプセルの形態で適用され得る。
【００３３】
あるいはまた、本発明のモノクローナル抗体は、異なる医薬的活性剤を用いる併用療法において投与しうる。本発明のモノクローナル抗体を配合しうるか、あるいはまた併用療法において投与しうる医薬的活性剤は、例えば、他の抗原に対する抗体、特にモノクローナル抗体であり得、したがって、本発明のモノクローナル抗体と、関連する疾患状態の病因に関与する他の抗原に対する１種以上の（モノクローナル）抗体とを含有する「カクテル」を提供する。
【００３４】
特に治療上有用な効果を生み出すための、本発明のモノクローナル抗体を配合しうるか、あるいはまた併用療法において投与しうるさらなる活性剤は、治療する疾患状態に依存し、例えば、市販品として入手可能なγ−グロブリンおよび免疫グロブリン製剤、抗生物質、殺菌製品、抗菌剤および抗腫瘍剤またはそれらの２種以上の混合物である。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、腫瘍の治療において特に有利に使用しうる。すなわち、そのままで、または放線などの、従来の腫瘍治療法を妨害する他の治療法（therapeutical ）および治療形態のそれぞれと組み合わせて使用しうる。かかる妨害は、ビンブラスチン（vinblastin）もしくはシスプラチンなどの非特異的細胞分裂抑制因子（cytostatica ）において、いずれも副次的に、すなわち反復適用後に生じるか、または腎臓癌腫などの特定の腫瘍に初発的に存在する。
【００３６】
かかる抗体の投与量は、治療している症状および治療のレシピエントにより変わるが、成人患者に対して１〜約１００ｍｇの範囲であり、好ましくは１〜１０ｍｇを、通常、ある一定期間、毎日投与する。１〜５ｍｇを投与する二部投与（two part dosing ）治療プログラム（regime）が好ましい。
【００３７】
別の好ましい態様では、Ｍｃｍ３の検出は、タンパク質Ｋｉ−６７およびｐ２７の検出と組み合わせて行われる。
【００３８】
過去１６年間で組織病理学的診断に使用された細胞周期関連タンパク質のうち、最も言及されたものの１つはＫｉ−６７タンパク質である（Scholzen T  および Gerdes J (2000) J Cell Physiol 182: 311-322; Gerdes J, Schwab U, Lemke H および Stein H (1983). Int. J. Cancer 31, 13-20 ）。Ｋｉ−６７タンパク質は、増殖中の細胞において発現されるが、細胞が休止状態に入ると速やかに消失する（Baisch, H および Gerdes, J (1987). Cell Tissue Kinet. 20 (4), 387-391 ）。臨床研究により、Ｋｉ−６７抗原は、多くの異なるヒト新生物、例えば、乳癌（Jansen RL, Hupperets PS, Arends JW, Joosten-Achjanie SR, Volovics A, Schouten HC  および Hillen HF (1998). Br. J. Cancer, 78:460-465）、軟組織肉腫、髄膜腫(meningeoma)（Perry A, Stafford SL, Scheithauer BW, Suman VJ  および Lohse CM (1998). Cancer 82: 2262-2269）、前立腺癌（Mashal RD, Lester S, Corless C, Richie JP, Chandra R, Propert KJ  および Dutta A (1996) Cancer Res 56(18):4159-63 ）および非ホジキンリンパ腫（Gerdesら (1984), J. Immunol. 133:1710-1715）における独立した予後マーカーであることが示されている。
【００３９】
タンパク質ｐ２７は、細胞周期中の規定のチェックポイントでサイクリン依存性キナーゼ複合体に結合し、不活化することにより細胞周期の進行を調節するサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫＩ）ファミリーに属する（Toyoshima H および Hunter T (1994) Cell 78(1):67-74 ）。ｐ２７の発現は、正常発達組織における、また無調節化（deregulated ）成長を示す腫瘍における分化の強力なマーカーとしての役割を果たす（Lloyd RV, Jin L, Qian X および Kulig E (1997) Am J Path 150: 401-407., Zhang P, Wong C, DePinho RA, Harper JW および Elledge SJ (1998) Genes Dev 12(20):3162-3167 ）。
【００４０】
３種のタンパク質を同時に検出する、組織の組み合わせ染色を行うことは、個々の腫瘍成長を決定する細胞の増殖プロセスおよび分化プロセスのより詳細な評価を可能にする。ＭＣＭ３タンパク質は、増殖を停止したが、ｐ２７タンパク質発現の非存在により最終的に分化していない細胞において発現されるが、Ｋｉ−６７は増殖中の細胞のみで発現される。ｐ２７は、休止細胞において見出され得るが、増殖中の細胞では見られない。Ｋｉ−６７、ＭＣＭ３およびｐ２７は、障害性細胞成長および腫瘍形成（tumorgenesis）の詳細な特徴付けに適する相補的生物学的特性を規定する一組のパラメータを提供する。腫瘍診断はまた、これらのマーカーの組み合わせ評価から利益を得ることもあり、これは、個々の患者にとって最も適切な治療概念を選択するのに役立ちうる。
【００４１】
本発明を以下の実施例により説明する。
【００４２】
実施例
実施例１
本発明のモノクローナル抗体の産生
マウスを免疫処置（immunisation）に用いた。組換えヒトＭｃｍ３タンパク質を抗原として用いた。
【００４３】
免疫処置および融合の説明
１日目：１００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中１００μｇのＭｃｍ３タンパク質を、１００μｌのフロイントアジュバントと完全かつ充分に混合し、続いてマウスに注射した。
【００４４】
１４日目：１００μｌのＰＢＳ中５０μｇのＭｃｍ３タンパク質を、１００μｌのフロイントアジュバントと完全かつ充分に混合し、続いてマウスに注射した。
【００４５】
２１日目：１００μｌのＰＢＳ中５０μｇのＭｃｍ３タンパク質を、１００μｌのフロイントアジュバントと完全かつ充分に混合し、続いてマウスに注射した。
【００４６】
３７日目：１００μｌのＰＢＳ中５０μｇのＭｃｍ３タンパク質を、１００μｌのフロイントアジュバントと完全かつ充分に混合し、続いてマウスに注射した。
【００４７】
３９日目にマウスを無痛的に屠殺した。脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞と融合した。完全成長に達したハイブリドーマを得た。
【００４８】
ハイブリドーマ上清みのスクリーニングとクローン化
まず、完全成長に達したハイブリドーマの上清みをスポット・ブロット（spot-blot ）・アッセイにおいて試験した。このため、１ｍｌの組換えヒトＭｃｍ３含有（２ｎｇ／ｍｌ）ＰＢＳを、１ｃｍ×０．５ｃｍの大きさのニトロセルロース膜片に置いた。これらの小片を４８穴プレートに置き、１５分間室温で乾燥した。続いて、ブロッキングバッファー（puffer）（ＰＢＳ、０．００５Ｔｗｅｅｎ  ２０、４％ゼラチン）とともに４５分間室温でインキュベートした。ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５％ゼラチン）での数回の洗浄工程後、ハイブリドーマ上清みとともに６０分間室温でインキュベートした。ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５％ゼラチン）での数回の洗浄工程後、市販品として入手可能なホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体（Dianova 、ハンブルク）（製造業者の指示書に従って１：１００００に希釈）を添加した。ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５％ゼラチン）とともに室温で１時間インキュベートした後、アルカリホスファターゼ検出反応を、顕色溶液（３６ｍＭ  ５’ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート；４００ｍＭニトロブルーテトラゾリウム、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ）を用い、１０分間室温で行った。
【００４９】
スポット・ブロット試験において陽性であったハイブリドーマ上清みを、続いて免疫組織学的に試験した。このため、パラフィン切片、例えば扁桃を標準的な手法（２×１００％キシレン、２×１００％ＥｔＯＨ、２×７０％ＥｔＯＨ、２×４０％ＥｔＯＨ）に従って脱水した後、水中で手短に洗浄した。次いで、加圧炉（pressure cooker ）内で１〜５分間、クエン酸バッファーｐＨ６（１ｌに対して２．１ｇクエン酸一水和物をｐＨ６に２Ｎ  ＮａＯＨで調整する）中で切片を加熱（cook）した。炉を開口した後、切片を直ちに冷（ＲＴ）ＴＢＳ中で洗浄し、続いて加湿チャンバ内で３０分間、ハイブリドーマ上清みとともにインキュベートした。ＴＢＳ中で数回洗浄した後、切片に結合した抗体を間接イムノペルオキシダーゼ法により検出し、ヘマラムで染色し、包埋し、鏡検にて評価した。
【００５０】
本発明の抗体は以下の染色パターンを示す。該抗体は、増殖領域の細胞の核と主に反応し、これは、ヒト扁桃の胚中心内の暗いゾーンの細胞がＭｃｍ３に対して陽性に染色されるという事実により示される。同様に、正常粘膜の基底層付近の細胞はＭｃｍ３特異的抗体と反応する。Ｍｃｍ３染色はまた、口腔粘膜の非増殖細胞コンパートメントに属する中間層および上層にも見られたということは注目に値する。
【００５１】
スポット・ブロットおよび免疫組織学の両方において陽性であったハイブリドーマをクローン化し、それらがモノクローナルとなるまで再クローン化した。独立したモノクローナル抗体を得た。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、ブラウンシュヴァイクの Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) に、１９９９年２月１６日に番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２３８８で寄託した。
【００５２】
実施例２
ポリクローナルウサギ抗Ｍｃｍ３抗体および本発明のモノクローナル抗体を用いた細胞溶解物のウエスタンブロット解析
細胞株ＨＥＬＡ（Ｈ）およびＣＨＯ（Ｃ）の細胞溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）に供した。ゲル中で分離したタンパク質を、ｗｅｔ−ブロッティングチャンバ内のニトロセルロース膜に一晩で移した。次いで、希釈したウサギ抗Ｍｃｍ３抗血清（Hu, B.ら、Nucleic Acid Res., 1993, 21: 5289-5293）（０．１５μｇ／ｍｌ）とともに１時間室温でこの膜をインキュベートした。ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５％ゼラチン）での数回の洗浄工程後、市販品として入手可能なホスファターゼ結合ヤギ−ウサギ抗体（製造業者（Dianova 、ハンブルク）の指示書に従って１：１００００に希釈）を添加した。１時間室温でインキュベートし、もう一度ＴＮＴ−バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐｈ７．５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で洗浄した後、製造業者の指示書に従って、ＥＣＬシステム（Amersham Life Science 、ブラウンシュヴァイク）を用いる化学蛍光法により検出を行った。
【００５３】
図１において確認できるように、ポリクローナル抗Ｍｃｍ３ウサギ抗体は、見かけ分子量１０５ｋＤａの予期した明白な主タンパク質のバンドに加えて、分子量が５０ｋＤａ〜９０ｋＤａの範囲のさらなるタンパク質を示すことが判明した。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗Ｍｃｍ３抗体は、見かけ分子量１０５ｋＤａの予期したタンパク質のバンドのみを示した。
【００５５】
さらに、免疫組織化学的研究において、本発明のモノクローナル抗体は、Ｍｃｍ３の検出に対する有用性を示す。
【００５６】
実施例３
本発明の抗Ｍｃｍ３抗体を用いる免疫沈降
１μｇの抗Ｍｃｍ３一次抗体を１０μｌのＤｙｎａビーズ（Dynal M280ヒツジ抗マウス、Dynal 、ハンブルク）に添加し、回転下４℃で３０分間インキュベートする。
【００５７】
細胞調製物（１×１０6 細胞）を、プロテアーゼインヒビターを含有する免疫沈降バッファー（１８ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３％ヘキサデシルメチル−アンモニウムブロミド、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＤＴＴ）中に入れ、５分間加熱し、氷上で冷却し、遠心分離（５分間、１４０００ｒｐｍ）する。過剰の液体をＤｙｎａｌビーズ／一次抗体複合体に添加し、ローラー上で３０分間４℃でインキュベートする。
【００５８】
次いで、Ｄｙｎａｌ磁気濃縮器内にチューブを２０秒間入れ、過剰の液体を除去する。磁気ビーズを５００μｌのＮＥＴ（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  １８ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ５ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ）中に再懸濁し、再度磁気濃縮器内に入れ、２０秒後に上清みを除去する。このようにして、ビーズを数回洗浄する。
【００５９】
こうして精製したＭｃｍ３を、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析しうる。
【００６０】
実施例４
永久細胞株細胞の核における本発明の抗Ｍｃｍ３抗体のマイクロインジェクション
マイクロインジェクションのためにＣＥＬＬｏｃａｔｅ（登録商標）カバーガラス上でＨＥｐ−２を培養し、対数増殖期間において使用した。本発明の抗Ｍｃｍ３抗体および関連性のない対照抗体のそれぞれを、光学顕微鏡の制御（control ）下（インジェクション圧１３０ｈＰａ；インジェクション時間０．３〜０．５秒）、トランスジェクター（transjector ）およびマイクロマニピュレータ（micro manipulator ）で核内にマイクロインジェクトした。次いで、インジェクトされた細胞を、ブロモデソキシウリジン（ＢｒｄＵ）含有（０．１ｍＭ）培地とともに６時間培養した。固定化（５分間、４％パラホルムアルデヒド、室温）後、カバーガラスをＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で３回洗浄し、１００％ＥｔＯＨ中で１０分間−２０℃でインキュベートした後、直接０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ＴＢＳ中に１０分間室温で移すことにより接着性細胞の透過を行った。次いで、市販品として入手可能なＣｙ３結合ヤギ抗マウス抗体（Dianova 、ハンブルク）（製造業者の指示書に従ってＰＢＳ／１０％ウシ血清アルブミン中で希釈）を用いてインジェクトされた抗体を検出した。細胞内に固定化されたＢｒｄＵの検出のために２Ｍ  ＨＣｌ中で６０分間３７℃で調製物をまずインキュベートした。続いて、調製物をまず蒸留水で数回洗浄し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。次に、加湿チャンバ内で一晩４℃で、市販品として入手可能なＦＩＴＣ標識抗ＢｒｄＵ抗体（Boehringer Mannheim, Mannheim ）（製造業者の指示書に従って希釈）とともにインキュベートを行った。次いで、調製物を充分に５回ＰＢＳ中で１０分間洗浄し、９０％グリセロール中ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン）で覆い、蛍光顕微鏡で評価した。
【００６１】
対照抗体をインジェクトされたほとんどすべての細胞が、ＢｒｄＵもまた取り込み、したがって、実験中、正常な細胞周期を経過したことがわかった。対照的に、本発明の抗Ｍｃｍ３抗体をインジェクトした細胞の２０％〜５０％のみがＢｒｄＵを取り込んだ。したがって、これらの細胞の増殖は本発明の抗体により阻害された。
【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明のモノクローナル抗体（右側）および当該技術分野で公知のポリクローナル抗体（左側）を用いるウエスタンブロットを示す。本発明の抗体は、１つのバンドのみを認識し、一方ポリクローナル抗体は５０〜９０ｋＤａの範囲のさらなるバンドを検出することが明確に示されている。ＨはＨｅＬａ細胞およびＣはＣＨＯ細胞を示す。
【図１】
0004980516.tif 000002