(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞の分化維持を保つかもしくは脱分化した筋線維芽細胞の再分化を誘導して病巣部位を修復する機能を有する塩酸処理されたＩＶ型コラーゲンから調製されたＩＶ型コラーゲンゲルを、有効成分として含有する筋線維芽細胞系疾患の予防または治療剤。
【請求項２】
筋線維芽細胞系疾患が、ＰＴＣＡ術後もしくはステント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬化症または肝硬変症である請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項３】
筋線維芽細胞系疾患が脳頚動脈硬化症または肺線維症である請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項４】
ＩＶ型コラーゲンが会合し、平均直径５〜３５ｎｍのポアサイズを持つ多角編み目構造を持つゲルである請求項１から３のいずれかに記載の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＰＴＣＡ術後もしくはステント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬化症、肝硬変等、各組織の線維症または硬化症の予防、もしくは進展防止、および治療方法についての分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化症、およびＰＴＣＡもしくはステント留置後の動脈再狭窄は、Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｒｏｓｓの提唱する障害血管モデル仮説（Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６２：８０１−８０９，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．（１９８６）１４：１１５−１２６）に従って生じると考えられている。すなわち、動脈壁に加えられる様々な刺激・傷害による血管内皮細胞の剥離などを契機として、一部の動脈平滑筋細胞は、その形質が分化型から脱分化型に変化し（形質転換）、血管内腔に向かい遊走し増殖し、Ｉ型コラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白の過剰生産、コラーゲン線維の沈着の結果、新生内膜の肥厚を引き起こすというものである。
従って、動脈平滑筋細胞の脱分化型への抑制および脱分化型筋線維芽細胞の再分化を誘導することが、動脈硬化症、動脈再狭窄の防止、治療に役立つと考えられる。現在までのところインビトロの培養系において動脈平滑筋細胞の脱分化型への抑制効果があるものとしては、ＩＧＦ１、インスリン、Ｉ型コラーゲンゲル等が知られている。しかしながらこれらの抑制効果は一時的であり、１週間、１０日の長期間の培養では抑制効果を示さない。更に、血清存在下ではほとんど抑制効果を示さない。また、脱分化型動脈平滑筋細胞を分化型にもどす培養条件はほとんど知られていない。
これまでに動脈硬化症、動脈再狭窄の治療方法として脱分化型動脈平滑筋細胞の増殖抑制、アポトーシスの誘導、また、脱分化型動脈平滑筋細胞のＩ型コラーゲン蛋白の産生抑制（Ｉ型コラーゲンや、ＴＧＦベータのアンチセンスＤＮＡの利用）および、Ｉ型コラーゲン修飾酵素またはプロッセシング酵素の阻害によるコラーゲン線維の形成阻害等が試みられている。
【０００３】
腎糸球体硬化症では、種々の原因で糸球体が障害されると腎臓糸球体メサンギウム細胞が形質転換し、増殖し、糸球体内に過剰な細胞外マトリックス蛋白の沈着を起こすことが観察されている。その結果として、糸球体の硬化をもたらし、最終的には糸球体濾過機能の廃絶から慢性腎不全の病態をもたらすことが知られている。
肝硬変では、肝星細胞が形質転換し、増殖し、また細胞外マトリックス蛋白の過剰産生およびマトリックス蛋白の沈着を生じる。その結果として、肝類洞壁の変化を生み、肝機能の低下をもたらすことが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
現在、病巣部位で形質転換を起こした動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細胞等の筋線維芽細胞に起因する動脈硬化症、腎糸球体硬化症、肝硬変の予防、進展防止および治療には有効な治療薬がないかもしくは更なる治療薬が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、細胞外マトリックスを用いて動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細胞を分化型で維持する方法、および形質転換して脱分化した動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細胞を再分化させる方法を見いだした。これらのことは病巣部位での筋線維芽細胞の増殖抑制と細胞外マトリックス蛋白の過剰生産、沈着を抑制できることを示す。すなわち形質転換した動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細胞の示す個々の変化、例えば増殖能、細胞外マトリックス蛋白質生産能などを治療の標的にするのではなく、脱分化する前のこれら細胞などの血管周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞の分化を維持するかまたは脱分化した筋線維芽細胞を再分化誘導することによりもとの分化状態の細胞に戻すことにより、ＰＴＣＡ術後もしくはステント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬化症、肝硬変の予防、進展防止、治療することを見いだした。例えばＩＶ型コラーゲンゲルを用いて培養すると、動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細胞の形質を維持することができる。また、ＩＶ型コラーゲンゲルを用いて培養すると、形質転換した細胞をもとの分化状態の細胞に戻すことができる。このような作用を持つ物質を病巣部位に投与することで、病巣部位に存在し、病態を進展させる形質転換細胞を正常な細胞に戻すことができる。これによって、病状を回復、または悪化を防ぐことができる。
すなわち、本発明は下記の（１）〜（５）に関するものである。
（１）血管周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞の分化を維持するかもしくは脱分化した筋線維芽細胞の再分化を誘導して病巣部位を修復する機能を有する細胞外マトリックスを、有効成分として含有する筋線維芽細胞系疾患の予防または治療剤。
（２）筋線維芽細胞系疾患が、ＰＴＣＡ術後もしくはステント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬化症または肝硬変である上記（１）記載の予防または治療剤。
（３）筋線維芽細胞系疾患が脳頚動脈硬化症または肺線維症である上記（１）記載の予防または治療剤。
（４）細胞外マトリックスがＩＶ型コラーゲンゲルまたはＩ型コラーゲンゲルである上記（１）から（３）のいずれかに記載の予防または治療剤。
（５）ＩＶ型コラーゲンが会合し、平均直径５〜３５ｎｍのポアサイズを持つ多角編み目構造を持つゲルである上記（４）記載の予防または治療剤。
【０００６】
【発明の実施の形態】
動脈硬化病巣部位では動脈平滑筋細胞が収縮型から合成型へと変化していることが知られている。病巣部位での動脈平滑筋細胞は、形態の変化、激しい増殖性、過剰な線維状コラーゲンの生産、コラーゲン線維の沈着を伴う形質変化を示し、全て線維芽細胞様の形質となる。このような観察から病理学者は平滑筋由来のこの細胞をｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（筋線維芽細胞）と称している。平滑筋細胞の形質の制御は様々な臓器でみられる線維症または硬化症の発症に深く関わっていると考えられている。動脈平滑筋細胞で生じる線維芽細胞様への形質変化と同様な変化が、血清を含む培地を用いたインビトロの初代培養系でも起きる。すなわち培養系で生じる形質転換細胞は動脈硬化病巣部位でみられる筋線維芽細胞の特徴と同じ特徴を獲得する。
【０００７】
細胞の接着はもとより、細胞の増殖、分化の維持、遺伝子発現、遊走といった、細胞の基本的な機能は、細胞をとりまく細胞外基質の影響を受ける。直接的な証拠は、細胞培養系で基質の細胞への影響を調べる、インビトロの研究から得られている。培養系においては、動脈平滑筋細胞の機能は培養基質として固定化された細胞外基質の影響を受け、制御される。
【０００８】
本発明においては、筋線維芽細胞系疾患とは線維症または硬化症に係わる疾患を示し、上記したＰＴＣＡ術後もしくはステント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化とともに、腎糸球体硬化症および肝硬変、さらには脳頚動脈硬化症、肺線維症が挙げられる。また、本発明において血管周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞とは、筋線維芽細胞になる前の分化状態の細胞を示し、即ち、例えば動脈平滑筋細胞、肝星細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞などの血管内皮細胞の裏打ちにある周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞を示す。また、本発明において細胞外マトリックスとは生体内にあるのとほぼ同じ構造、機能を有する細胞外マトリックスを示し、例えば生体内に存在するコラーゲンがこれに相当し、特にＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンが好ましくＩＶ型コラーゲンが特に好ましい。本発明において具体的にはＩＶ型コラーゲンおよびＩ型コラーゲンともゲルタイプが好ましく、特にＩＶ型コラーゲンゲルが好ましい。また、ＩＶ型コラーゲンゲルでは平均直径５〜３５ｎｍ、好ましくは１０〜２５ｎｍのポアサイズを持つ多角編み目構造のものが好ましく、これはＫｏｉｃｈｉ  Ｎａｋａｚａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２０，８８９−８９４（１９９６）に記載の方法によって得ることができる。従来生体内と同様な構造を持ったＩＶ型コラーゲンゲルを製造することは困難であったが最近上記のＫｏｉｃｈｉ  Ｎａｋａｚａｔｏらの方法によって製造が可能となり、本発明への適用も可能となった。例えば生体から単離したＩＶ型コラーゲン分子から造ったゲルは直径１８ｎｍのポアサイズを持つ多角編み目構造を持ち、これがラミナデンサの骨格構造と同じである。上記文献には特定の食塩濃度、温度の条件下でＩＶ型コラーゲン溶液はゲル化して、多角編み目構造をつくり（平均直径１５．５ｎｍのポアサイズ）、ゲルの硬さは特に蛋白濃度と温度、インキュベーション時間に依存することが報告されている。
【０００９】
本発明による細胞外マトリックスによって細胞の分化を維持または再分化誘導を起こす点についての作用機序は次の通りである。
組織中のコラーゲン会合体とその場に存在する細胞のタイプとの関係では、コラーゲン会合体がその場の細胞の形質分化を維持するといった生物学的な意義があると考えられる。以後に記述する実施例で述べるように、例えば組織中ではＩＶ型コラーゲンと接して存在している動脈平滑筋細胞が、組織中ではＩＶ型コラーゲンとは接していない皮膚の線維芽細胞と同様の形態、増殖能をもってプラスティック培養皿の上では生育するが、ＩＶ型コラーゲンゲル上では全く異なった形態、増殖能を示す。
【００１０】
様々な細胞外マトリックスを用いてインビトロで細胞を培養すると、細胞の形態、増殖能、蛋白発現能などが異なることがよく知られている。また、同じコラーゲンタイプ、例えばＩ型コラーゲンであっても、分子状のＩ型コラーゲンと線維状のＩ型コラーゲンでは細胞に与える作用が異なる事も知られている。このような細胞外マトリックスの細胞に対する異なった作用は、インテグリンに代表される細胞表面の細胞外マトリックス受容体を介して起きると考えられている。本発明の細胞外マトリックスが持つ細胞の分化維持または再分化誘導作用についても細胞表面の受容体を介して発現していることも考えられ、特にゲル化したＩＶ型コラーゲンを認識する１種または複数種の受容体によると推測される。
【００１１】
次に本発明の細胞外マトリックス、特にＩＶ型コラーゲンゲルを用いての上記疾患に対する治療法について説明する。
本発明のＩＶ型コラーゲンゲルを製剤として用いるには、単独でもよいが必要に応じ薬学的に許容される安定化剤、保存剤、賦形剤などや、成型性や徐放性を調節するための添加剤を必要に応じて加えることができる。このようにして得られたものを目的に応じて適宜加工する。
例えば、通常の粉砕器を用いて粒径に粉砕し、これを圧縮成型してペレット、ズポ等の皮下投与、生体内埋め込みまたは体腔内挿入して用いることができる。また、粉砕して得た粉末を手術時に病巣部位に添布して治療効果を得ることができる。
また、ＩＶ型コラーゲンゲルを含む懸濁性注射剤として患部に局所注入することも可能であり、この場合の注射用溶媒としては例えば落花生油、ゴマ油、ひまし油、オリーブ油等の植物油が挙げられる。
【００１２】
本発明の細胞外マトリックス、特にＩＶ型コラーゲンゲルを動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬化症、肝硬変症に適用させるに当たっては、投与経路および投与される患者の年齢、体重等によって投与量が異なり、適宜増減される。通常ＩＶ型コラーゲンゲル又はＩ型コラーゲンゲルとして１０ｍｇ〜１０ｇ／体重の範囲の投与量であり、これを適宜増減させながら投与する。
例えばＰＴＣＡ術時、または術後、患部に当該ＩＶ型コラーゲンゲルペレットを留置、ステント留置時にはステントとともに患部に当該ＩＶ型コラーゲンゲルペレットを留置する。ＩＶ型コラーゲンゲルペレットはＩＶ型コラーゲン溶液とリン酸緩衝液の混合液を金型に入れ、４℃で保温し、成型することができる。この際、製剤の形状としては、円筒状、球状、円柱状、針状、ボタン状など使用する部位に適合した形に成型し、患部に留置することができる。また、ステントの血管壁との接触部位にＩＶ型コラーゲンゲルを成型する際には、ステントと金型の組み合わせにより、ステント、ＩＶ型コラーゲンゲルの一体成型をすることができる。ＰＴＣＡ術時、または術後の患部には例えば、円筒状のＩＶ型コラーゲンゲルを患部の動脈内に留置する。
【００１３】
【実施例】
実施例１
次に本発明の実施例としてＩＶ型コラーゲンゲル及びＩ型コラーゲンゲルを細胞培養の基質として用い、１０％血清存在下での筋線維芽細胞様の動脈平滑筋細胞の基本的な細胞機能、即ち形態、増殖能やマーカー蛋白の発現に対するＩＶ型コラーゲンゲル及びＩ型コラーゲンゲルの作用を調べた。
（１）細胞培養
ヒト動脈平滑筋細胞は、３代継代したものをＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（米国、サンディエゴ）より購入した。この細胞は改変ＭＣＤＢ１３１培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）に１０％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳとする）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）、１０ｎｇ／ｍｌの組み換え上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、２ｎｇ／ｍｌの組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、５μｇ／ｍｌのインスリン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを加えたもの（以下増殖培地とする）を用いて３７℃、５％ＣＯ2 下で培養した。増殖因子、インスリン、抗生物質はＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐ．より購入した。細胞は通常直径１００ｍｍの培養皿で維持した。細胞が密に生育した時に、０．２５％  トリプシン、０．０２％  ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（Ｍｇ++，Ｃａ++を含まない、以下ＰＢＳ（−）とする）に細胞を接触させ、細胞を皿よりはがした後、１：４の分割割合で、継代した。筋線維芽平滑筋細胞（以下Ｍ−ＳＭＣとする）は動脈平滑筋細胞（以下Ａ−ＳＭＣとする）を１００ｍｍ培養皿で３〜５回継代し、９〜１３回分裂を繰り返させることによって得、様々な基質上で培養した。
【００１４】
（２）基質の調製と細胞培養
Ｉ型コラーゲンは、Ｙａｍａｔｏら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ２４，１５７−１６２，１９９２に記載された方法に従って、ラット尾の腱の酸抽出によって得た。Ｉ型コラーゲンゲルの調製と、そのゲル上での細胞培養も上記文献に記載された方法に従って行った。即ち、Ｉ型コラーゲン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）６倍容に対し、３倍容の３倍濃度の増殖培地（ＦＢＳを含まない）と、１倍容のＦＢＳを４℃で混合し、最終コラーゲン濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにした。そのうち一部（５００μｌ）を２４穴の培養皿に加え、ゲル化のため、３７℃で保温した。７．２ｘ１０3 個の細胞を含む１ｍｌの細胞懸濁液をそれぞれのゲル上に撒布し、５％ＣＯ2 下、３７℃で培養した。培地は３日おきに交換した。ＩＶ型コラーゲンゲルの調製は、４℃で９倍容のＩＶ型コラーゲン溶液（２ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭ塩酸）に１倍容の２００ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．３、（１．５Ｍ食塩を含む）を混ぜ、最終濃度１．８ｍｇ／ｍｌとした。得られた溶液の一部（５００μｌ）を２４穴培養皿に加えた。培養皿は少なくとも５日間は４℃で保温し、細胞がゲル表面にのるまで十分に固くゲル化した。培地は３日おきに交換した。細胞の形態は位相差顕微鏡で拡大率１００倍で観察した。
【００１５】
（３）細胞増殖の検定
細胞増殖の定量化を次のようにして行った。即ち、Ｉ型コラーゲンゲルまたはＩＶ型コラーゲンゲル上で培養した細胞をＰＢＳ（−）で洗い、そこに細胞を懸濁するために０．２％  バクテリアルコラゲナーゼ（和光純薬）及び１ｍＭ  塩化カルシウムを含むＰＢＳ（−）を５００μｌ加え、３７℃、２時間保温した。ばらばらになった細胞の数をコールターカウンターで計測した。測定は、培養２日、５日、１０日目にそれぞれ３連で行った。
【００１６】
（４）免疫細胞化学的解析
Ｉ型コラーゲンゲルまたはＩＶ型コラーゲンゲルで３日および７日間培養したＭ−ＳＭＣを４℃、１８時間４％パラホルムアルデヒドで固定後、０．５％  トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ（−）溶液で２５℃、９０分間処理し、浸透を容易にした。そして、非特異的結合を防ぐために３０分間、０．２％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）溶液に浸した後、５００倍に希釈した抗平滑筋ミオシン重鎖モノクローナル抗体（クローン  ｈＳＭ−Ｖ、シグマ、米国）または抗ヒトβ１インテグリンモノクローナル抗体（ＭＡＢ  １９７７，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．、米国）とともに４℃にて１８時間保温した。１５０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、米国）にさらした後、細胞を共焦点レーザー走査型顕微鏡で拡大率４００倍で観察した。非免疫マウスＩｇＧ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、米国）を抗平滑筋ミオシン重鎖モノクローナル抗体や抗ヒトβ１インテグリンモノクローナル抗体の代わりにコントロールとして用いた。
【００１７】
（５）エンドセリン−１処理
Ｉ型コラーゲンゲルまたはＩＶ型コラーゲンゲルの上でＭ−ＳＭＣを３日間増殖培地で培養した。その細胞を１ｎＭのヒトエンドセリン−１（ＰｅｐｔｉｄｅＩｎｓｔ．，Ｉｎｃ．、大阪）で処理し、位相差顕微鏡で３７℃下で１５分間観察した。顕微鏡写真を１分おきに撮影した。ヒトエンドセリン−１を添加しない細胞をコントロールとして用いた。
【００１８】
（６）結果
培養下のＭ−ＳＭＣの形態：
１０％ＦＢＳ存在下で、継代数３のＡ−ＳＭＣを９〜１３回分裂回数までプラスチック上で繰り返し継代を行うと、Ａ−ＳＭＣは高い増殖能を獲得した。これらの細胞を筋線維芽様平滑筋細胞、Ｍ−ＳＭＣと表記する。Ｍ−ＳＭＣをＩＶ型コラーゲンゲルで培養すると、細胞はＩ型コラーゲンゲルで培養したのと同様に、細胞が広がり伸長するのが遅くなった。一度細胞が伸長し始めると、およそ２日間は伸長を続けた。その後、よく伸びた細胞の先端は周りのやはり伸長した細胞との細胞−細胞間の接合点の明白な形成によっては区別がつかなくなった。細胞間の接合は培養している細胞全体に及び、ついには図１で示すような編み目様の多細胞構造を形成した。編み目構造の形成は、培養開始３日目に完成し、１４日を過ぎても維持された。ＩＶ型コラーゲンゲルを用いて培養した動脈平滑筋細胞の３日目の形態を図１に示した。多細胞からなる編み目構造はバクテリアルコラゲナーゼ処理により破壊すると、細胞は互いに離れ、最後は丸くなった。しかし、丸くなった細胞を集めて再びプラスチックの培養皿に蒔くと、細胞は増殖能を高じたスピンドル様の形態を再びとり始めた。これらのことは、ＩＶ型コラーゲンゲル上で抑制されたＭ−ＳＭＣの増殖は可逆的であることを示している。
【００１９】
Ｍ−ＳＭＣの増殖：
プラスチック培養皿で９回分裂回数まで繰り返し継代されたＭ−ＳＭＣ  は強い増殖能を獲得した。ＩＶ型コラーゲンゲルではＭ−ＳＭＣは２１日間の培養でも全く増殖しなかった。他の増殖因子を加えても固化したＩＶ型コラーゲンゲルで抑えられた増殖は全く回復しなかった。細胞増殖の停止は細胞のアポトーシスによるものではない。なぜならば増殖を停止したＭ−ＳＭＣをバクテリアルコラゲナーゼ処理し、プラスチック上で再培養すると細胞増殖を開始したからである。
【００２０】
培養下での収縮型Ａ−ＳＭＣのマーカー蛋白の発現：
Ａ−ＳＭＣの分化は通常α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭＨ）、ｃａｌｄｅｓｍｏｎなどの平滑筋特異的細胞骨格蛋白が発現しているか否かを調べることで評価する。これらのマーカー蛋白のうち、ＳＭＨは一般的に収縮型Ａ−ＳＭＣに最も特異的で信頼性が高いと考えられている（Ｂｉｒｕｋｏｖ，Ｋ．Ｇ．ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０４，４６−５３，１９９３）。解析には骨格筋、心筋、非筋肉細胞のミオシンと交雑反応しない抗体であることが重要である（Ｌｏｎｇｔｉｎｅ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３３，１７９−１８４，１９８５）。そのような抗ＳＭＨモノクローナル抗体を使って、異なった基質で１３回分裂回数のＭ−ＳＭＣについてＳＭＨの発現を免疫細胞化学的に解析した。ＳＭＨはＩＶ型コラーゲンゲルで３日間培養したＭ−ＳＭＣで強く染まり、再分化構築が確認された。この現象について図２に示した。Ｉ型コラーゲンゲルで培養した細胞では、ＳＭＨは発現しているようだがほんのわずかであった。培養７日目になると、ぼんやりとした、弱いＳＭＨの反応がＩ型コラーゲンゲルで培養した細胞で認められた。対照的に、強い免疫染色はＩＶ型コラーゲンゲルで培養したＭ−ＳＭＣで見られ、７日目でもＳＭＨの強い発現の維持を示した。非特異的ＩｇＧを用いた場合は、培養３日目、７日目とも蛍光発色は認められなかった。
【００２１】
エンドセリン−１を添加した培養でのＭ−ＳＭＣの収縮：
培養３日目の１３分裂回数のＭ−ＳＭＣに終濃度１ｎｍ／ｍｌとなるようにエンドセリン−１を添加し、Ｍ−ＳＭＣがエンドセリン−１によって収縮するのか否かを調べた。エンドセリン−１を添加すると、ＩＶ型コラーゲンゲルで培養したＭ−ＳＭＣのみがわずかに、また緩やかに多細胞ネットワーク構造のなかで形態を変化させた。１分おきに撮影した１５枚の写真はわずかではあるが明らかな細胞編み目構造の一部の動きを捉えていた。細胞の動きは１５分後には観察されなくなった。形態の変化はＭ−ＳＭＣの収縮によるものと思われた。
【００２２】
製剤例１
ＩＶ型コラーゲンゲルを粉砕し、この微粒子１ｇをゴマ油１０ｍｌに懸濁させ油性懸濁型製剤を得た。
【００２３】
製剤例２
ＩＶ型コラーゲンゲルを粉砕し、得られた粉末１ｇを金型によって圧縮成型を行いステント一体型製剤を得た。
【００２４】
【発明の効果】
ＩＶ型コラーゲンゲル等の細胞外マトリックスを用いて、分化維持を保つかもしくは脱分化した動脈平滑筋細胞を再分化させることにより動脈再狭窄等の筋線維芽細胞系疾患を予防、治療することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、生物（細胞）の形態を示す写真であり、具体的にはＩＶ型コラーゲンゲル上で培養した動脈平滑筋細胞の培養３日目の形態を示した写真である。
【図２】図２は、生物（細胞）の形態を示す写真であり、具体的にはＩＶ型コラーゲンゲルで培養した時の培養３日目の動脈平滑筋細胞のＳＭＨの発現を調べたものであり、ＩＶ型コラーゲンゲルが動脈平滑筋細胞の再分化を誘導する効果を示した写真である。
【図１】
0005030319.tif 000002
【図２】
0005030319.tif 000003