(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体的に妨害されるポリマーであり、ここで該ポリマーは、少なくとも１つの末端を有する水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格を含み、該末端は以下の構造に共有結合し：
【化１】
0004861586.tif 000010
ここで：
Ｌは、該水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格の該末端への結合点であり；
Ｑは、ＯまたはＳであり；
ｍは、１〜２０であり；
Ｚは、アルキルおよびアリールからなる群から選択され；そして
Ｘは、脱離基である、
ポリマー。
【請求項２】
前記水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格が、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ならびにそれらのコポリマー、ターポリマー、および混合物からなる群から選択される、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
前記水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格が、ポリ（エチレングリコール）である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項４】
前記ポリ（エチレングリコール）が、２００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの平均分子量を有する、請求項３に記載のポリマー。
【請求項５】
前記水溶性かつ非ペプチド性ポリマーが、２〜３００個の末端を有する、請求項１に記載のポリマー。
【請求項６】
前記Ｚが、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項７】
前記Ｚが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルおよびベンジルからなる群から選択される、請求項１に記載のポリマー。
【請求項８】
前記ｍが、１〜１０である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項９】
前記Ｘが、塩素、臭素、Ｎ−スクシニミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、ヒドロキシル、１−イミダゾリル、およびｐ−ニトロフェニルオキシからなる群から選択される、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１０】
前記ポリマーが以下の構造を有し：
【化２】
0004861586.tif 000011
ここで、
ＰＯＬＹは、水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格であり；
Ｒ’は、キャッピング基または官能基であり；そして
Ｑ、ｍ、ＺおよびＸは、上記で定義された通りであり、
ここで、Ｒ’が、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、活性エステル、活性カルボナート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、チオール、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレートからなる群から選択される官能基である、
請求項１に記載のポリマー。
【請求項１１】
前記Ｒ’がメトキシである、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１２】
前記Ｒ’が−Ｗ−Ｄであり、ここで該Ｗはリンカーであり、そして該Ｄは生物学的に活性な因子であり、ここで、Ｗが、Ｏ、Ｓ、およびＮＨからなる群から選択される、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１３】
前記Ｒ’が−Ｑ（ＣＨ２）ｍＣＨＺＣ（Ｏ）Ｘであり、ここで、該Ｑ、ｍ、ＺおよびＸは上記で定義された通りである、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１４】
前記ＰＯＬＹが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１５】
前記ポリ（エチレングリコール）が、２００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの平均分子量を有する、請求項１４に記載のポリマー。
【請求項１６】
前記Ｚが、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１７】
前記Ｚが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、およびベンジルからなる群から選択される、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１８】
前記ｍが、１〜１０である、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１９】
前記Ｘが、ヒドロキシルである、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項２０】
前記ポリマーが、以下の構造を有し：
【化３】
0004861586.tif 000012
ここで：
ＰＯＬＹは、水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格であり；
Ｒは、中心コア分子であり；
ｑは、２〜３００の整数であり；そして
Ｑ、ｍ、ＺおよびＸは上記で定義された通りである、
請求項１に記載のポリマー。
【請求項２１】
前記ＰＯＬＹが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項２０に記載のポリマー。
【請求項２２】
前記ＰＯＬＹが、２００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの平均分子量を有する、請求項２１に記載のポリマー。
【請求項２３】
前記ポリマーが以下の構造を有し：
【化４】
0004861586.tif 000013
ここで：
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり；そして
Ｘ、ｍおよびＺは、上記で定義された通りである、
請求項１に記載のポリマー。
【請求項２４】
前記Ｘがヒドロキシルである、請求項２３に記載のポリマー。
【請求項２５】
生物学的に活性なポリマー結合体であり、ここで該生物学的に活性ポリマー結合体は、少なくとも１つの末端を有する水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格を含み、該末端は以下の構造に共有結合し：
【化５】
0004861586.tif 000014
ここで：
Ｌは、該水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格の該末端への結合点であり；
Ｑは、ＯまたはＳであり；
ｍは、１から２０であり；
Ｚは、アルキルおよびアリールからなる群から選択され；
Ｗは、リンカーであり；そして
Ｄは、生物学的に活性な因子であり、
ここで、Ｗが、Ｏ、Ｓ、およびＮＨからなる群から選択される、
生物学的に活性なポリマー結合体。
【請求項２６】
前記Ｄが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルからなる群から選択される、請求項２５に記載の生物学的に活性なポリマー結合体。
【請求項２７】
前記水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格が、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ならびにそれらのコポリマー、ターポリマー、および混合物からなる群から選択される、
請求項２５に記載の生物学的に活性なポリマー結合体。
【請求項２８】
前記水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格が、ポリ（エチレングリコール）である、請求項２５に記載の生物学的に活性なポリマー結合体。
【請求項２９】
前記Ｚが、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである、請求項２５に記載の生物学的に活性なポリマー結合体。
【請求項３０】
前記Ｚが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルおよびベンジルからなる群から選択される、請求項２５に記載の生物学的に活性なポリマー結合体。
【請求項３１】
前記ｍが、１〜１０である、請求項２５に記載の生物学的に活性なポリマー結合体。
【請求項３２】
前記Ｗが、前記活性な因子を前記ポリマー骨格に結合するために使用される、該活性な因子の官能基の残基である、請求項２５に記載の生物学的に活性なポリマー結合体。
【請求項３３】
生物学的に活性なポリマー結合体を調製する方法であり、ここで、該方法は：
少なくとも１つの末端を有するポリマー骨格を含む、水溶性かつ非ペプチド性ポリマーを提供する工程であって、該末端は以下の構造に共有結合し：
【化６】
0004861586.tif 000015
ここで：
Ｌは、該水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格の該末端への結合点であり；
Ｑは、ＯまたはＳであり、
ｍは、１から２０であり、
Ｚは、アルキルおよびアリールからなる群から選択され；そして
Ｘは、脱離基である、工程；
該ポリマーを、生物学的に活性な因子と反応し、以下の構造に共有結合する少なくとも１つの末端を有する生物学的に活性なポリマー結合体を形成する工程であって：
【化７】
0004861586.tif 000016
ここで：
Ｌは、該水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格の該末端への結合点であり；
Ｑは、ＯまたはＳであり；
ｍは、１〜２０であり；
Ｚは、アルキルおよびアリールからなる群から選択され；
Ｗはリンカーであり；そして
Ｄは生物学的に活性な因子であり、
ここで、Ｗが、Ｏ、Ｓ、およびＮＨからなる群から選択される、工程を包含する方法。
【請求項３４】
前記Ｄが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、水溶性かつ非ペプチド性のポリマー、およびこのようなポリマーの加水分解特性を制御する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
親水性ポリマーであるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧと略される）（ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯと略される）としても公知）の分子および表面への共有結合は、バイオテクノロジーおよび医学においてかなり有用である。ＰＥＧは、その最も一般的な形態において、各末端で、ヒドロキシル基で終結した線状ポリマーである：
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
上記のポリマー（α−，ω−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）は、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとしての簡単な形態で表現され得、ここで、−ＰＥＧ−記号は以下の構造単位：
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−
を表すと理解され、ここで、ｎは、代表的に、約３〜約４０００の範囲である。
【０００３】
ＰＥＧは、通常、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（つまり簡潔にはｍＰＥＧ）として使用され、ここで、一方の末端は、比較的不活性なメトキシ基であり、一方、他方の末端は、容易に化学修飾を受けるヒドロキシル基である。ｍＰＥＧの構造は、以下で与えられる。
【０００４】
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのランダムコポリマー、またはブロックコポリマー（以下に示される）は、それらの化学反応においてＰＥＧに密接に関連し、そしてこれらは、多くのその適用においてＰＥＧと置換され得る。
【０００５】
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨＲＯ（ＣＨ２ＣＨＲＯ）ｎＣＨ２ＣＨＲ−ＯＨ
ここで、各Ｒは、独立して、ＨまたはＣＨ３である。
【０００６】
ＰＥＧを分子（例えば、タンパク質）に結合するために、その末端に官能基を有するＰＥＧの誘導体を調製することによって、ＰＥＧを「活性化」することが、しばしば必要である。この官能基は、ＰＥＧに結合される分子上の利用可能な反応基の型に基づいて選択される。例えば、この官能基は、ＰＥＧ−タンパク質複合体を形成するためにタンパク質上のアミノ基と反応するように選択され得る。
【０００７】
ＰＥＧは、水中で、および多くの有機溶媒中で溶解性という性質を有し、毒性がなく、そして免疫原性がないポリマーである。ＰＥＧの１つの用途は、不溶性の分子にポリマーを共有結合し、得られたＰＥＧ−分子「複合体」を可溶性にすることである。例えば、水−不溶性薬物パクリタキセルは、ＰＥＧに結合される場合、水溶性となることが示された。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６０：３３１−３３６（１９９５）。
【０００８】
プロドラッグアプローチ（ここで、薬物は、生理学的条件下で、より複雑な分子（プロドラッグ）の分解によって放出される）は、薬物送達の強力な成分である。プロドラッグは、例えば、生理学的条件下で、分解可能な結合を用いて、ＰＥＧを薬物に結合させることによって形成され得る。インビボでのＰＥＧプロドラッグの寿命は、ＰＥＧを薬物に結合させる官能基の型に基づく。一般に、エステル結合（これは、ＰＥＧカルボン酸の反応によって形成されるか、または薬物上のアルコール基でＰＥＧカルボン酸を活性化させる）は、薬物を放出するような生理学的条件下で加水分解され、一方、アミド結合またはカルバメート結合（薬物上のアミノ基から形成される）は、安定で、そして遊離薬物を放出するために加水分解しない。
【０００９】
ＰＥＧの特定の活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル）の使用は、問題があり得る。なぜなら、これらのエステルは、非常に反応性なので、エステルの加水分解は、水溶液中でほとんどすぐに起こるからである。ＰＥＧエステルからの薬物の加水分解性送達は、末端ＰＥＧの酸素と、結合したカルボン酸またはカルボン酸誘導体のカルボニル基との間のスペーサーでメチレン基の結合数を制御することによって、ある程度まで都合よく制御され得ることが示された。例えば、Ｈａｒｒｉｓらは、米国特許第５，６７２，６６２号において、対応するエステル誘導体において、より少ない加水分解反応性が所望される場合、ＰＥＧブタン酸およびＰＥＧプロパン酸（以下に示される）、ならびにそれらの活性化誘導体を、カルボキシルメチルＰＥＧ（また、以下に示される）の代替物として記載する。
【００１０】
ＰＥＧ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＰＥＧブタン酸
ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＰＥＧプロパン酸
ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
カルボキシメチルＰＥＧ
水性緩衝液において、これらの修飾されたＰＥＧ酸のエステルの加水分解は、カルボキシル基とＰＥＧの酸素との間の−ＣＨ２−スペーサーの数を変化させることによって有用な手法で制御され得る。
【００１１】
当該分野では、活性化ポリマー誘導体の加水分解を制御するさらなる方法が未だに必要である。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも１つの末端カルボン酸またはカルボン酸誘導体の基を有する水溶性かつ非ペプチド性のポリマーの群を提供する。このポリマーの酸または酸誘導体の基は、カルボン酸のカルボニル基に隣接する炭素（α−炭素）上のアルキル基またはアリール基の存在によって、立体的に妨害される。アルキル基またはアリール基の立体的影響は、ポリマー誘導体の加水分解の速度のより大きな制御を可能にする。例えば、活性化カルボン酸誘導体（例えば、スクシンイミジルエステル）と生物学的に活性なポリマー複合体（例えば、小さな薬物分子、酵素またはタンパク質のような生物学的に活性な因子に本発明のポリマーを結合させることから生じる）の両方は、α−炭素のアルキル基またはアリール基の存在に起因して、より加水分解に対して安定である。
【００１３】
本発明の立体的に妨害されたポリマーは、少なくとも１つの末端を有する水溶性かつ非ペプチド性のポリマー骨格を含み、この末端は、以下の構造
【００１４】
【化８】
0004861586.tif 000002
に共有結合しており、
ここで：
Ｌは、ポリマー骨格の末端への結合点であり；
Ｑは、ＯまたはＳであり；
ｍは、０〜約２０であり；
Ｚは、アルキル、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群から選択され；そして
Ｘは、脱離基である。
【００１５】
適切な水溶性かつ非ペプチド性のポリマー骨格の例としては、以下が挙げられる：ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチレン化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびそれらのコポリマー、ターポリマー、ならびに混合物。１つの実施形態において、ポリマー骨格は、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）である。
【００１６】
Ｚ部分の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルおよびベンジルが挙げられる。１つの実施形態において、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたは置換アルキルである。
【００１７】
脱離基Ｘは、例えば、ハロゲン（例えば、塩素、臭素、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、ヒドロキシル、１−イミダソリルおよびｐ−ニトロフェニルオキシであり得る。
【００１８】
本発明はまた、本発明のポリマーおよび生物学的活性な薬剤の生物学的に活性な複合体ならびにこれらの複合体を作製する方法を包含する。
【００１９】
Ｚ部分として使用されるアルキル基またはアリール基の長さまたはサイズを変化させることによって、本発明のポリマーは、このポリマーを用いて調製されるポリマー誘導体の加水分解に対する安定性を制御および操作する能力の増強を提供する。加水分解の速度のよりよい制御は、当業者が、特定の分解特性を必要とする特異的な最終用途のために、ポリマー構築物を目的に合わせて作製する（ｔａｉｌｏｒ）ことを可能にする。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
用語「官能基」、「活性な部分」、「活性化基」、「反応性部位」、「化学的に反応性な基」および「化学的に反応性な部分」は、分子の異なる、規定可能な部分または単位をいうために、当該分野および本明細書中で使用される。この用語は、化学分野で幾分同義であり、そしていくらかの機能または活性を発揮する分子の部分を示すために、本明細書中で使用され、そして他の分子と反応性である。用語「活性な」は、官能基と組み合わせて使用される場合、反応させるために強力な触媒または高度に非実用的な反応条件を必要とする求電子基または求核基と対照的に、他の分子上の求電子基または求核基と容易に反応する官能基を含むことを意図される。例えば、当該分野において理解されるように、用語「活性なエステル」は、アミンのような求核基と容易に反応するエステルを含む。代表的に、活性なエステルは、数分間で水性媒体中でアミンと反応し、一方、特定のエステル（例えば、メチルエステルまたはエチルエステル）は、求核基と反応するために強力な触媒を必要とする。
【００２１】
用語「結合」または「リンカー」は、通常、化学反応の結果として形成され、そして代表的には、共有結合である基あるいは結合をいうために、本明細書中で使用される。加水分解に対して安定な結合は、その結合が、水中で実質的に安定で、そして有用なｐＨで、例えば、生理学的な条件下で、長時間の間、おそらく不確実であっても、水と反応しないことを意味する。加水分解に対して不安定な結合または分解可能な結合は、その結合が、水中または水溶液（例えば、血液を含む）中で分解可能であることを意味する。酵素に対して不安定または分解可能な結合は、その結合が、１以上の酵素によって分解され得ることを意味する。当該分野において理解されるように、ＰＥＧおよび関連ポリマーは、ポリマー骨格に、またはポリマー骨格とポリマー分子の１以上の末端官能基との間のリンカー基に分解可能な結合を含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸または活性化ＰＥＧカルボン酸と生物学的に活性な因子上のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合は、一般に、薬剤を放出するための生理学的条件下で加水分解する。他の加水分解に対して分解可能な結合としては、以下が挙げられる：カーボネート結合；アミンおよびアルデヒドの反応から生じるイミン結合（例えば、Ｏｕｃｈｉら、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ、３８（１）：５８２−３（１９９７）を参照（これは、本明細書中で参考として援用される）；アルコールをリン酸基と反応させることによって形成されるリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応生成物であるヒドロゾン結合（ｈｙｄｒｏｚｏｎｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）；アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタール結合；ホルマートとアルコールの反応生成物であるオルトエステル結合；例えば、ＰＥＧのようなポリマーの末端でのペプチドのアミン基とカルボキシル基によって形成されるペプチド結合；ならびに例えば、ポリマーの末端でのホスホラミダイト基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合。
【００２２】
用語「生物学的に活性な分子」、「生物学的に活性な部分」または「生物学的に活性な薬剤」は、本明細書中でで使用される場合、生物学的生物（ウイルス、細菌、真菌、植物、動物およびヒトを含むが、これらに限定されない）の任意の物理的または生化学的特性に影響し得る任意の物質を意味する。特に、本明細書中で使用される場合、生物学的に活性な分子は、ヒトまたは他の動物における疾患の診断、治療緩和、処置または予防のため、あるいはさもなければ、ヒトまたは動物の肉体的または精神的健康を増強するために意図される任意の物質を含む。生物学的に活性な分子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセル。本発明における使用に適切な生物学的に活性な薬剤のクラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗生物質、殺真菌薬、抗ウイルス薬剤、抗炎症性剤、抗腫瘍薬剤、心血管薬剤、抗不安剤、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤など。
【００２３】
用語「アルキル」、「アルケン」、および「アルコキシ」は、それぞれ、直鎖および分枝アルキル、アルケンおよびアルコキシを含む。用語「低級アルキル」とは、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルをいう。用語「アルコキシ」とは、例えば、式−ＯＲまたはＲＯＲ１（ここで、ＲおよびＲ１は、それぞれ、独立して選択されたアルキルである）の酸素置換アルキルをいう。用語「置換アルキル」および「置換アルケン」とは、それぞれ、１以上の非妨害置換基で置換されたアルキルおよびアルケンをいい、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチルなど）；アセチレン；シアノ：アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシなど）；低級アルカノイルオキシ（例えば、アセトキシ）；ヒドロキシ；カルボキシル；アミノ；低級アルキルアミノ（例えば、メチルアミノ）；ケトン；ハロ（例えば、クロロまたはブロモ）；フェニル；置換フェニルなど。用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、ヨウ素および臭素を含む。
【００２４】
「アリール」は、１以上の芳香族環（それぞれ５または６個の炭素原子）を意味する。複数のアリール環は、ナフチルのように縮合されていてもよいし、またはビフェニルのように縮合されていなくてもよい。アリール環はまた、１以上の環式炭化水素、ヘテロアリール、または複素環式環と縮合されていてもよいし、または縮合されていなくてもよい。
【００２５】
「置換アリール」は、置換基として１以上の非妨害基を有するアリールである。
【００２６】
「非妨害置換基」は、安定な化合物を与える基である。適切な非妨害置換基またはラジカルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ハロ；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アルカリール、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ６〜Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルフォニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ３〜Ｃ１０アルキル）（ここで、ｍは、１〜８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、ニトロアルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、Ｃ２〜Ｃ１０チオアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、−ＯＨ、−ＳＯ２、＝Ｓ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）−Ｓ−（Ｃ６〜Ｃ１２アリール）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１２アリール）、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）（ここで、各ｍは、１〜８である）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、それらの塩など。本明細書中で使用される場合、各Ｒは、Ｈ、アルキルまたは置換アルキル、アリールまたは置換アリール、アラルキル、あるいはアルカリールである。
【００２７】
本発明は、立体的に妨害されたポリマーを提供し、このポリマーは、少なくとも１つの末端を有する水溶性かつ非ペプチド性のポリマー骨格を含み、この末端は、以下の構造：
【００２８】
【化９】
0004861586.tif 000003
に共有結合し、
ここで：
Ｌは、このポリマー骨格の末端への結合点であり；
Ｑは、ＯまたはＳであり；
ｍは、０〜約２０であり；
Ｚは、アルキル、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群から選択され；そして
Ｘは脱離基である。
【００２９】
水溶性かつ非ペプチド性のポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）（すなわち、ＰＥＧ）であり得る。しかし、他の関連ポリマーもまた、本発明の実施における使用に適すること、および用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は、この点において包括的であって、排他的でないことを意図することが理解されるべきである。用語ＰＥＧは、その任意の形態のポリ（エチレングリコール）を含み、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアーム（ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄ）ＰＥＧ、フォーク状（ｆｏｒｋｅｄ）ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、ペンダント（ｐｅｎｄｅｎｔ）ＰＥＧ、またはその中に分解可能な結合を有するＰＥＧが挙げられる。
【００３０】
ＰＥＧは、代表的に、透明で、無色、無臭で、水に可溶性で、熱に安定で、多くの化学薬剤に対して不活性であり、加水分解も変質もせず、そして一般に、非毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であると考えられ、つまり、ＰＥＧは、害を引き起こすことなく、生きた組織または生物と共存し得るということである。さらに具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性であり、つまり、ＰＥＧは、体内で免疫応答を引き起こす傾向がないということである。体内でいくつかの望ましい機能を有する分子（例えば、生物学的に活性な薬剤）に結合される場合、ＰＥＧは、その薬剤をマスクする傾向があり、そしてどんな免疫応答も減少または除去し得、その結果、生物は、その薬剤の存在に耐え得る。ＰＥＧ複合体は、実質的な免疫応答を引き起こしたり、あるいは凝固または他の望ましくない影響を引き起こしたりする傾向がない。式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（ここで、ｎは、約３〜約４０００、代表的に、約３〜約２０００である）を有するＰＥＧは、本発明の実施において有用な１つのポリマーである。約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、ポリマー骨格として特に有用である。
【００３１】
ポリマー骨格は、直鎖または分枝鎖であり得る。分枝ポリマー骨格は一般的に、当該分野で公知である。典型的に、分枝ポリマーは、中心分枝コア部分およびこの中心分枝コアに連結した複数の直鎖ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは一般的に、分枝形態で使用され得、この分枝形態は、様々なポリマー（例えば、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトール）にエチレンオキシドを添加することによって調製され得る。この中心分枝部分はまた、いくつかのアミノ酸（例えば、リジン）から誘導され得る。分枝ポリ（エチレングリコール）は、一般形態、Ｒ−（ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして表され得、ここで、Ｒは、コア部分（例えば、グリセロールまたはペンタエリスリトール）を表し、そしてｍは、アームの数を表す。マルチアームＰＥＧ分枝（例えば、米国特許第５，９３２，４６２号（これは本明細書中で参考として援用される）に記載される分枝はまた、ポリマー骨格として使用され得る。
【００３２】
分枝ＰＥＧはまた、ＰＥＧ（−ＹＣＨＺ２）ｎで表されるフォーク状ＰＥＧの形態であり得、ここで、Ｙは、結合基であり、そしてＺは、規定の長さの原子鎖によりＣＨに結合された活性末端基である。
【００３３】
なお別の分枝形態である、ペンダントＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端においてよりむしろＰＥＧ骨格に沿って、反応性基（例えば、カルボキシル）を有する。
【００３４】
これらの形態のＰＥＧに加えて、このポリマーはまた、その骨格中に弱い結合または分解可能な結合を伴って調製され得る。例えば、ＰＥＧは、そのポリマー骨格中にエステル結合を有して調製され得、これは加水分解に供される。以下に示すように、この加水分解により、このポリマーは低分子量のフラグメントに分解される：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
用語、ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧは、上記の形態の全てを表すかまたは含むことが当業者に理解される。
【００３５】
多くの他のポリマーもまた、本発明に適切である。非ペプチド性かつ水溶性であり、２〜約３００個の末端を有するポリマー骨格は、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、他のポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（ポリプロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとポリエチレングリコールとのコポリマーなど）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）（例えば、米国特許第５，６２９，３８４号（これは本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されるもの）、ならびにそれらのコポリマー、ターポリマーおよび混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変わり得るが、典型的に、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、しばしば、約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲である。
【００３６】
当業者は、実質的に水溶性でありかつ非ペプチド性のポリマー骨格についての上記のリストは、決して網羅的ではなく、単なる例示であり、そして上記の質を有する全てのポリマー材料が意図されることを理解する。
【００３７】
Ｚ部分に適切なアルキル基およびアリール基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、およびベンジルが挙げられる。一実施形態において、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたは置換アルキルである。
【００３８】
α炭素とＱ部分との間の任意のＣＨ２スペーサーは、この分子の加水分解速度をさらに遅らせる効果を提供し得る。一実施形態において、ｍは、１〜約１０である。
【００３９】
Ｘ部分は、脱離基であり、これは、Ｘを含む分子と求核試薬との反応により、このＸが置換され得ることを意味する。Ｘがヒドロキシであるようないくつかの場合において、この基を有効な脱離基にするために、この基は、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような分子との反応によって活性化されなければならない。適切なＸ部分の例としては、ハロゲン（例えば、塩素および臭素）、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、ヒドロキシル、１−イミダゾリル、およびｐ−ニトロフェニルオキシが挙げられる。１つの局面において、このポリマーは、末端カルボン酸基を有する（すなわち、Ｘがヒドロキシルである）。
【００４０】
一実施形態において、本発明のポリマーは、以下の構造を有する：
【００４１】
【化１０】
0004861586.tif 000004
ここで、
ＰＯＬＹは、水溶性かつ非ペプチド性のポリマー骨格（例えば、ＰＥＧ）であり；
Ｒ’は、キャッピング基であり；そして
Ｑ、ｍ、およびＸは、上記で定義された通りである。
【００４２】
Ｒ’は、このタイプのポリマーに適切な当該分野で公知の任意のキャッピング基であり得る。例えば、Ｒ’は、アルコキシ基（例えば、メトキシ）のような比較的不活性なキャッピング基であり得る。
【００４３】
あるいは、Ｒ’は、官能基であり得る。適切な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル）、活性カルボネート（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカルボネート）、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、保護されたアミン、ヒドラジン、保護されたヒドラジン、チオール、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトリシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）が挙げられる。この官能基は典型的に、生物学的に活性な因子上の官能基への結合について選択される。理解されるように、選択されたＲ’部分は、Ｘとの反応が起こらないよう、Ｘ基と適合性でなければならない。
【００４４】
当該分野で理解されるように、用語「保護された」とは、特定の反応条件下で化学的に反応性の官能基の反応を防止する保護基または部分の存在をいう。保護基は、保護される化学的に反応性の基のタイプに依存して変わる。例えば、この化学的に反応性の基が、アミンまたはヒドラジンである場合、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から選択され得る。この化学的に反応性の基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。この化学的に反応性の基がカルボン酸（例えば、ブタン酸またはプロピオン酸）、またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジルまたはアルキル基（例えば、メチルまたはエチル）であり得る。当該分野で公知の他の保護基もまた、本発明において使用され得る。
【００４５】
文献における末端官能基の特定の例としては、以下が挙げられる：Ｎ−スクシンイミジルカルボネート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同第５，４６８，４７８号を参照のこと）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎら、Ｍａｌａｒｏｍｏｌ，Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｐｌｉｐｓｋｙら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｋ．１９：１１７７（１９８３）を参照のこと）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｓｚら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１（１９７８）を参照のこと）、スクシンイミジルプロピオネートおよびスクシンイミジルブタノエート（例えば、Ｏｌｓｏｎら、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１７０−１８１頁、ＨａｒｒｉｓおよびＺａｐｌｉｐｓｋｙ編、ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９７を参照のこと；米国特許第５，６７２，６６２もまた参照のこと）、スクシンイミジルスクシネート（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５（１９８４）、およびＪｏｐｐｉｃｈら、Ｍａｃｒｏｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）を参照のこと）、スクシンイミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号を参照のこと）、ベンゾトリアゾールカルボネート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号を参照のこと）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｋ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）を参照のこと）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １：２５１（１９８５）を参照のこと）、ｐ−ニトロフェニルカルボネート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：１４１（１９８５）、およびＳａｒｔｏｒｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５（１９９１）を参照のこと）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２：２９（１９８４）、およびＫｏｇｅｎ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）を参照のこと）、ｏ−ピリジル−ジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）を参照のこと）、アクリロール（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５８１（１９９３）を参照のこと）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号を参照のこと）。さらに、２分子の本発明のポリマーはまた、アミノ酸のリジンと結合して、二置換リジンを形成し得、この二置換��ジンは次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでさらに活性化されて、活性なＮ−スクシンイミジル部分を形成し得る（例えば、米国特許第５，９３２，４６２号を参照のこと）。上記の参考文献の全ては、本明細書中で参考として援用される。
【００４６】
Ｒ’はまた、構造−Ｗ−Ｄを有し得、ここでＷは、リンカーであり、そしてＤは、生物学的に活性な因子である。あるいは、このポリマー構造は、Ｒ’が−Ｑ（ＣＨ２）ｍＣＨＺＣ（Ｏ）Ｘ（ここで、Ｑ、ｍ、ＺおよびＸは上記で定義された通りである）であるような、ホモ二官能性分子であり得る。
【００４７】
本発明のマルチアームポリマーの例を以下に示す：
【００４８】
【化１１】
0004861586.tif 000005
ここで、
ＰＯＬＹは、水溶性かつ非ペプチド性ポリマー骨格（例えば、ＰＥＧ）であり；
Ｒは、中心コア分子（例えば、グリセロールまたはペンタエリスリトール）であり；
ｑは、２〜約３００の整数であり；そして
Ｑ、ｍ、ＺおよびＸは、上記で定義された通りである。
【００４９】
本発明のポリマーのさらなる例としては、以下の構造のポリマーが挙げられる：
【００５０】
【化１２】
0004861586.tif 000006
ここで、
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり；そして
Ｘ、ｍおよびＺは、上記で定義された通りである。
【００５１】
本発明のポリマーは、活性であろうとなかろうと、反応混合物から精製され得る。精製の１つの方法は、ポリマーが本質的に不溶性であり、反応物が可溶性である溶媒からの沈殿を包含する。適切な溶媒としては、エチルエーテルまたはイソプロパノールが挙げられる。あるいは、このポリマーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを使用して精製され得る。
【００５２】
上記の実施形態全てにおいて、αアルキル基またはαアリール基（Ｚ）の存在は、このアルキル基またはアリール基の立体効果および電子的効果に起因して、このポリマーに加水分解に対するより大きな安定性を与える。立体効果はまた、メチル基をエチル基で置換した場合のように、アルキル基またはアリール基のサイズを大きくすることによって増加し得る。言い換えると、Ｚ中の炭素原子の数が増加するにつれて、加水分解の速度は減少する。上記のように、この立体効果の使用は、カルボキシル基からのＱ部分の距離を変えること（すなわち、ｍの値の制御）によって得られる電子的効果と組み合わせて適用され得る。ｍおよびＺの両方を制御することによって、加水分解速度は、より柔軟な様式で調節され得る。
【００５３】
酵素分解を生じる酵素触媒反応は、酵素の活性部位とポリマーとの間の正確な空間的なフィットを含むため、立体効果も同様に、これらの反応において非常に重要であり得る。本発明のポリマーはまた、加水分解に加えて酵素分解をよりよく調節または制御するために使用され得る。
【００５４】
本発明のポリマーは、生物学的に活性な因子に結合される場合、得られるポリマー結合体の加水分解速度を調節するのを助ける。例として、本発明のポリマーがアルコールまたはチオールと結合されて、それぞれ、エステルまたはチオエステルを形成する場合、このエステルまたはチオエステルは加水分解に対してより安定である。従って、アルコールまたはチオール基を有する薬剤は、本発明のポリマーで誘導体化され、そしてこのようなエステルまたはチオエステルからの薬物の加水分解性放出は、αアルキル基またはαアリール基の選択によって制御され得る。
【００５５】
本発明は、少なくとも１つの末端を有する水溶性かつ非ペプチド性のポリマー骨格を含む生物学的に活性なポリマー結合体を提供し、この末端は、以下の構造に共有結合される：
【００５６】
【化１３】
0004861586.tif 000007
ここで、
Ｌは、ポリマー骨格の末端への結合点であり；
Ｑは、ＯまたはＳであり；
ｍは、０〜約２０であり；
Ｚは、アルキル、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群から選択され；
Ｗは、リンカーであり；そして
Ｄは、生物学的に活性な因子である。
【００５７】
このリンカーＷは、生物学的に活性な因子をポリマー骨格に結合するために使用される官能基の残基である。一実施形態において、Ｗは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００５８】
適切な生物学的に活性な因子の例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルが挙げられる。
【００５９】
本発明はまた、式Ｉのポリマーを生物学的に活性な因子と反応させることによって、本発明のポリマーの生物学的に活性な結合体を調製する方法を含む。
【００６０】
以下の実施例は、本発明の例示のために示され、本発明の限定とみなされるべきではない。
【００６１】
（実施例）
（実施例１）
（ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２ＨおよびｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２ＮＳ（ＮＳ＝Ｎ−スクシンイミジル）の調製）
反応：
【００６２】
【化１４】
0004861586.tif 000008
（１．ｍＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＮの調製）
ＭＰＥＧ５０００ＯＨ（４．０ｇ）およびメタクリロニトリル（１．０ｍｌ）を、ベンゼン（５．０ｍｌ）、ジクロロメタン（６．５ｍｌ）およびＫＯＨ（Ｈ２Ｏ中５０％；０．１５ｍｌ）の混合物中、室温で３日間撹拌した。得られた混合物に、１０％水性ＮａＨ２ＰＯ４（２００ｍｌ）を添加した。この混合物を１０分間撹拌し、その後２００ｍｌのジクロロメタン（１００＋５０＋５０ｍｌ）で抽出した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮し、そしてエチルエーテル（５０ｍｌ）中に沈殿させた。この沈殿物を濾過によって回収し、真空下、室温で乾燥させて、３．１７ｇの白色の粉末を得た。ＮＭＲ：（ｄｍｓｏ−ｄ６，ｐｐｍ）：１．０３４８（ｄ，α−ＣＨ３）；２．５５（ｍ，ＣＨ）；３．１５（ｂｒ  ｍ，ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）。
【００６３】
（２．ｍＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＮＨ２の調製）
ｍＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＮ（３．１７ｇ）を、１４ｍｌの濃塩酸に溶解し、そしてこの溶液を室温で３日間撹拌した。得られた溶液を水で３００ｍｌに希釈し、そして４５ｇのＮａＣｌを添加した。生成物をジクロロメタン（３×１００ｍｌ）で抽出し、そしてこの抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥した。この溶液を濃縮し、そして生成物をエチルエーテル（５０ｍｌ）中に沈殿させた。この生成物を濾過によって回収し、そして真空下、室温で乾燥させて、２．６ｇの白色粉末を得た。ＮＭＲ：（ｄｍｓｏ−ｄ６，ｐｐｍ）：０．７１４（ｄ，α−ＣＨ３）；３．５１（ｂｒ  ｍ，ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）。
【００６４】
（３．ｍＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２Ｈの調製）
８％ＫＯＨ（１００ｍｌ）中のｍＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＮＨ２（２．６ｇ）の溶液を、室温で３日間撹拌し、次いで、ＨＣｌでｐＨを２に調整した。生成物を１００ｍｌの塩化メチレンで抽出し、そしてこの抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥した。次いで、この溶液を濃縮し、そして２００ｍｌのエチルエーテルを添加することによって、この生成物を沈殿させた。この生成物を濾過によって回収し、真空下、室温で乾燥させて、１．７ｇの白色粉末を得た。この生成物を、ＥＤＡＥセファロースのカラムクロマトグラフィーでさらに精製し、このカラムは、初めに水で溶離し、次いで、１Ｍ  ＮａＣｌで溶離した。この生成物を、ＮａＣｌ希釈液から塩化メチレンで抽出し、そして有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。塩化メチレン溶液を濃縮し、そして生成物が、約３０ｍｌのエチルエーテルから沈殿した。これを濾過によって回収し、そして真空下、室温で乾燥させて、０．８ｇの白色粉末を得た。Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２５０のゲル透過クロマトグラフィーは、単一のピークを示した。
１Ｈ  ＮＭＲ：（ｄｍｓｏ−ｄ６，ｐｐｍ）：１．０３５（ｄ，α−ＣＨ３）；２．５５（ｍ，ＣＨ）；３．５１（ｂｒ  ｍ，ＰＥＧ骨格のＣＨ２）。ＰＥＧ骨格のプロトン  対  αメチルのプロトンの積分比は、１００％の置換を示した。
【００６５】
（４．ＣＨ３−Ｏ−ＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２ＮＳ（ＮＳ＝Ｎ−スクシンイミジル）の調製）
ＣＨ３−Ｏ−ＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２Ｈ（０．６ｇ）を５０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、そして２ｍｌの塩化メチレン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０１４４ｇ）およびＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０２６）を添加した。一晩撹拌した後、この混合物を濾過し、そして濾液を減圧下で濃縮した。この濾液をイソプロパノールに添加することによって生成物を沈殿させ、次いで、濾過によって回収し、そして真空下で乾燥して、０．４ｇの白色粉末を得た。ＰＥＧ骨格のプロトンの積分と、ＮＳ基のプロトンの積分との比較は、１００％の置換を示した。
１Ｈ  ＮＭＲ：（ｐｐｍ，ｄｍｓｏ−ｄ６）：１．２０（ｄ，ＣＨ３−ＣＨ）；２．８１（ｓ，ＮＳ）；３．５１（ｂｒ  ｍ，ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）。
【００６６】
（実施例２）
（ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２ＨおよびｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２ＮＳの調製）
反応：
【００６７】
【化１５】
0004861586.tif 000009
（１．ＣＨ２−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）（ＣＯ２Ｈ）２の調製）
乾燥ジオキサン（１５０ｍｌ）中のメチルマロン酸ジエチル（９．６ｍｌ）を、アルゴン下で、トルエン（６０ｍｌ）中のＮａＨ（２．４ｇ）に滴下した。トルエン（２５０ｍｌ）中のＭＰＥＧ５０００メシレート（３０ｇ）を共沸蒸留して、１５０ｍｌのトルエンを除去し、そして残渣を上記のメチルマロン酸ジエチル溶液に添加した。３〜４時間還流した後、これを減圧下で乾固するまでエバポレートし、そして減圧下で一晩乾燥させた。次いで、この乾燥した物質を、１Ｎ  ＮａＯＨ（２００ｍｌ）に溶解し、この溶液を室温で２日間撹拌し、そして１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを３に調整した。約１５％の濃度になるまでＮａＣｌをこの溶液に添加し、次いで、３５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で数回抽出した。合わせた抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮し、そしてイソプロパノール／エーテル（１：１）を添加することによって生成物を沈殿させた。この生成物を濾過によって回収し、減圧下で一晩乾燥して、２４．７ｇの生成物を白色の粉末として得た。ＧＰＣ（Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２５０）は、この生成物の純度が９８％であることを示した。
１Ｈ  ＮＭＲ：（ｄｍｓｏ−ｄ６，ｐｐｍ）：１．２７（ｓ，ＣＨ３−Ｃ）；１．９６（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ）；３．５１（ｂｒ  ｍ，ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）。
【００６８】
（２．ＣＨ３−Ｏ−ＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２Ｈの調製）
ＣＨ３−Ｏ−ＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）（ＣＯ２Ｈ）２（２０ｇ）を３００ｍｌのトルエンに溶解し、得られた溶液を３時間還流した。次にこの溶液を真空下で濃縮し、そしてイソプロパノール／エーテル（１：１）を用いて沈殿させた残物を濾過により回収し、そして真空下で一昼夜乾燥させ、１８．８ｇの白色粉末を得た。ＧＰＣ（ウルトラハイドロゲル２５０）は、９５％純水である産物を示した。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄｍｓｏ−ｄ６、ｐｐｍ）：１．０６１（ｄ、ＣＨ３−ＣＨ）；２．４０（ｑ、ＣＨ）；１．５１（ｍ、ＣＨ２−ＣＨ）；１．８０（ｍ、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ）；３．５１（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）。
【００６９】
（３．ＣＨ３−Ｏ−ＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２ＮＳ（ＮＳ＝Ｎ−スクシンイミジル)の調製）
ＣＨ３−Ｏ−ＰＥＧ５０００−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２Ｈ（３．８ｇ）を４０ｍｌの塩化メチレンおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０９４ｇ、１．０７当量）に溶解し、そして３ｍｌの塩化メチレン中のＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１６６ｇ、１．０７当量）を加えた。一昼夜攪拌後、この混合物を濾過し、濾液を真空下で濃縮した。この産物を、イソプロパノールとエチルエーテルとの１：１混合液に濾液を添加することによって沈殿し、次に濾過により回収し、真空下で乾燥し、３．２ｇの白色粉末を得た。ＰＥＧ骨格プロトンの積分とＮＳ基上のプロトンの積分の比較は、９５％を超える置換を示した。１Ｈ  ＮＭＲ（ｐｐｍ、ｄｍｓｏ−ｄ６）：１．２３５（ｄ、ＣＨ３ＣＨ−）；１．７６（ｍ、１．９０  ｍ、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ−）；２．８１（ｓ、ＣＨ２ＣＨ２（ＮＳ上））；２．９１（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ−）；３．５１（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）。
【００７０】
（実施例３）
（活性化したα−アルキルアルカン酸を用いるリゾチームのＰＥＧ化）
５０（ｐＨ６．５）緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム／５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中のリゾチーム溶液（３ｍｇ／ｍｌ）４ｍｌに、２０ｍｇのＰＥＧアルカン酸のＮ−スクシンイミジルエステルを加え、２２℃での反応の進行を２０５ｎｍの波長のキャピラリー電気泳動によりモニターした。未反応のタンパク質に対応するピーク面積を時間に対してプロットし、そしてＰＥＧ化反応におけるリゾチームの半減期をこのプロットから決定した。Ｎ−スクシンイミジルｍＰＥＧ５Ｋα−メチルプロパン酸を使用する半減期は１００分であった。一方、Ｎ−スクシンイミジルｍＰＥＧ５Ｋα−メチル酪酸を使用する半減期は１２０分であった。α−アルキル化されていないアナログ、ｍＰＥＧ５ＫＮ−スクシンイミジルプロパン酸またはｍＰＥＧ５ＫＮ−スクシンイミジル酪酸のいずれかを使用するＰＥＧ化についての半減期は３０分であった。
【００７１】
（実施例４）
（Ｎ−スクシンイミジルｍＰＥＧ５Ｋα−アルキルアルカン酸の加水分解率）
加水分解の研究をｐＨ８．１および２５℃で実施した。代表的な実験において、ＰＥＧアルカン酸およびＰＥＧαアルキルアルカン酸のＮ−スクシンイミジルエステルの１−２ｍｇを３ｍｌの緩衝液に溶解し、キュベットに移した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ｕｖ−ｖｉｓｉｂｌｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して２６０ｎｍでの吸光度をモニターした。加水分解の半減期を一次速度論プロットから決定した。Ｎ−スクシンイミジルｍＰＥＧ５Ｋα−メチルプロパン酸およびＮ−スクシンイミジルｍＰＥＧ５Ｋα−メチル酪酸について、加水分解に関する半減期は、それぞれ３３分および４４分であった。一方、対応するアルキル化されていないアナログ、Ｎ−スクシンイミジルｍＰＥＧ５Ｋα−メチルプロパン酸およびｍＰＥＧ５Ｋ酪酸について、半減期は２０分であった。
【００７２】
（実施例５）
（８アームＰＥＧ２０ＫＤａキニジンα−メチル酪酸）
８アームＰＥＧ２０ＫＤａキニジンα−メチル酪酸（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）をＣＨＣｌ３（３×５０ｍｌ）とともに真空中共沸で乾燥させ、そしてＣＨ２ＣＨ２（２５．０ｍｌ）に再溶解した。この透明な溶液にキニジン（０．５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（触媒量）を添加した。次に、ＤＣＣ（１ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中０．３１０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物をアルゴン下、室温で１７時間攪拌させた。次にこの混合物を真空下で濃縮し、そして残留シロップをトルエン（１００ｍｌ）に溶解し、Ｃｅｌｉｔｅのプラグを介して濾過した。トルエンを真空下４５℃で除去し、残留物を５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で処理し、２−プロパノール（３００ｍｌ）に分散させた。真空下でのさらなる乾燥が、１Ｈ  ＮＭＲによって示されるように１００％置換を有する純水な産物（２．０ｇ、９９％）を生じた。
【００７３】
（実施例６）
（逆相ＨＰＬＣによる８アームＰＥＧ２０ＫＤａキニジンα−メチル酪酸の加水分解研究）
Ｃ−１８カラム（Ｂｅｔａｓｉｌ  Ｃ１８、１００Ｘ２、５μｍ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＨＰ−１１００ＨＰＬＣシステムに使用した。溶離液Ａは、水中の０．１％ＴＦＡであった。一方、溶離液Ｂはアセトニトリルであった。
【００７４】
純粋な緩衝液における加水分解研究について、キニジン結合体を最終濃度８ｍｇ／ｍｌになるように１０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解した。生じる溶液を３７℃で封をしたバイアル（各々０．２ｍｌ）にピペットで入れた。合間に時々、バイアルを取り、それに０．２ｍｌのアセトニトリルを加えた。濾過後、サンプルをＵＶ検出器を備えるＲＰ−ＨＰＬＣにより２２８ｎｍの波長で分析した。データの最小二乗速度論処理により、加水分解について４６時間の半減期を得た。
【００７５】
（実施例７）
（（ピバロイルオキシ）メチルｍＰＥＧ５ＫＤａ−α−メチル酪酸）
ｍＰＥＧ５ＫＤａ−α−メチル酪酸（１６．８ｇ、３．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５００ｍｌ）に溶解し、真空下で約１００ｍｌに濃縮した。ジクロロメタン（１００ｍｌ）をアルゴン下で添加し、この溶液を室温で攪拌させた。この透明で無色の溶液にＤＢＵ（２．４ｍｌ、１６．２ｍｍｏｌ）続いてクロロメチルピバレート（２．４ｍｌ、１６．６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液をアルゴン下で１７時間室温で攪拌させた。次に、この溶液を乾燥するまで濃縮し、２−プロパノール（３００ｍｌ）に溶解し、氷浴で冷却し、濾過により回収された白色固体を得た。真空下でさらに乾燥し、（ピバロイロキシ）メチルｍＰＥＧ５ＫＤａ−α−メチル酪酸（１４．５ｇ、約８６％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ｄｍｓｏ−ｄ６、３００ＭＨｚ）δ１．０８（ｄ、３Ｈ、Ｊ  ７．１  Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＰＯＭ）、１．１４（ｓ、９Ｈ、ＯＣＨ２ＣＯ（ＣＨ３）３）、１．５５−１．６９（ｍ、２．８Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨＡＨＢＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＰＯＭ）、１．７３−１．８５（ｍ、１３Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨＡＨＢＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＰＯＭ）、２．４９−２．６０（ｍ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ−（ＣＨ３）ＣＯＰＯＭ）、３．５１（ｂｓ、４５４Ｈ、ＰＥＧ骨格）、５．７０（ｓ、１．９Ｈ、ＣＯＣＨ２ＰＯＭ）（ＰＯＭ＝ピバロイルオキシメチル）。