(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン結合性EGF遺伝子と、前記遺伝子の発現を調節するKeratin2-6gタンパク質遺伝子プロモーターを含む配列番号7に示される塩基配列とを含む組換え体DNAが導入された、トランスジェニックマウス。
【請求項２】
無毛であることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
前記マウスがNCマウスであり、皮膚炎を発症するものであることを特徴とする、請求項１又は２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
皮膚炎がアトピー性皮膚炎又はアトピー性皮膚炎様である、請求項３記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
ヘパリン結合性EGF遺伝子と、前記遺伝子の発現を調節するKeratin2-6gタンパク質遺伝子プロモーターを含む配列番号7に示される塩基配列とを含む組換え体DNAをマウスに導入することを特徴とする、トランスジェニックマウスの作製方法。
【請求項６】
トランスジェニックマウスが無毛であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記マウスがNCマウスであり、トランスジェニックマウスが皮膚炎を発症するものであることを特徴とする、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
皮膚炎がアトピー性皮膚炎又はアトピー性皮膚炎様である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載のトランスジェニックマウスに候補物質を投与することを特徴とする、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
皮膚炎がアトピー性皮膚炎又はアトピー性皮膚炎様である、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節する２型ケラチン遺伝子プロモーターを含む組換え体ＤＮＡが導入された、トランスジェニック非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、以前ヘパリン結合性ＥＧＦがジフテリア菌の産生する毒素（ジフテリア毒素）に対する受容体の本体であるという点に着目して、ＴＲＥＣＫ法という方法を開発した（国際公開第９８／３３８９９号パンフレット、Ｓａｉｔｏ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：７４６−７５０）。すなわち、この方法は、細胞外から加えたジフテリア毒素に対して、マウスの細胞がヒトの細胞に比べ約１，０００倍以上の耐性を有することを利用し、マウスの特定の細胞群のみを特異的に破壊するものであって、その概略は以下の通りである。まず、マウスの細胞・組織特異的プロモーターをヒトに特異的なジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）に結合させた組換え体ＤＮＡを作製し、それをマウス個体に導入することによりトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作製する。このＴｇマウスは導入されたプロモーターによりＤＴＲを細胞の表面上に特異的に発現する。そのため、このＴｇマウスにジフテリア毒素（ＤＴ）を投与すると任意の時期にこのプロモーターを発現する細胞を特異的に破壊することが可能になる。これまでも、この方法を用いることにより、肝炎などのヒト疾患モデルが創出されており、この方法の応用によってさらに様々なモデルが創出可能である。
ところで、アトピー性皮膚炎は、アレルギー反応が原因でおこるアレルギー疾患の一つであり、痒みを伴う慢性の疾患である。近年、このアレルギー疾患は世界的に増加する傾向にあり、特に、幼児での発症率の著しい高まりと共に、疾患の増悪化、高年齢層への拡大というゆゆしき傾向にある。ヒトのアトピー性皮膚炎の原因解明や治療法の開発には、モデルマウスが高く貢献してきた。ＮＣマウスは、近年発見された有用なヒトアトピー性皮膚炎モデルマウスで、ここ１０年来その利用数が激増している。しかし、従来のＮＣマウスは有毛であったため、アトピー性皮膚炎の原因解明や治療法の開発の基礎実験として行う、皮膚炎発症の観察のために剃毛が必要であった。しかし、マウスの剃毛は非常に労力を必要とし、この作業に費やす人的・時間的負担にかかる経費は非常に高いものとなっている。さらに、この剃毛による刺激により、皮膚炎が二次的に発症する場合も多く、剃毛マウスによって観察される初期の皮膚炎が本来のアトピー性のものか、二次的なものかの判定が非常に困難であった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ジフテリア受容体の本体であるヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節する２型ケラチン遺伝子プロモーターを含む組換え体ＤＮＡが導入された結果、無毛という表現型を新しく獲得した、トランスジェニック非ヒト動物を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、ＴＲＥＣＫ法に用いるためのヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節する２型ケラチン遺伝子プロモーターを含む組換体ＤＮＡをマウスに導入して、トランスジェニックマウスを作製したところ、ジフテリア毒素を投与しなくても先天的に無毛であり、かつ、この無毛の状態がメンデル遺伝の様式により子孫へと遺伝しうるマウスを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節する２型ケラチン遺伝子プロモーターを含む組換え体ＤＮＡが導入された、トランスジェニック非ヒト動物。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、無毛であることを特徴とし、さらに、皮膚炎を発症することを特徴とする。皮膚炎としては、アトピー性皮膚炎が挙げられる。
本発明の動物はマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ及びヤギからなる群から選択されるいずれか一種であり、マウスであることが好ましい。
（２）ヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節する２型ケラチン遺伝子プロモーターを含む組換え体ＤＮＡを非ヒト動物に導入することを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物の作製方法。本発明の方法により得られるトランスジェニック非ヒト動物は、無毛であることを特徴とする。
（３）上記（１）記載のトランスジェニック非ヒト動物に候補物質を投与することを特徴とする、皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法。皮膚炎としては、アトピー性皮膚炎が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明のトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（ＮＣ−Ｋｒｔ２−６ｇ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウス）作製用ベクターの一部を示す。
図２は、ＰＣＲ法による導入遺伝子の検出を示す図である。
図３は、生後約一週齢のトランスジェニック個体（Ｔｇ）および野生型（Ｗｉｌｄ）個体の写真である。
図４は、生後約６週齢のトランスジェニック個体の写真である。
図５は、皮膚炎発症トランスジェニック個体の写真である。皮膚の炎症（上図）ならびに痒みによる掻破行動（下図）を示す。
図６は、トランスジェニック個体および野生型個体について、フローサイトメトリーを用いる陽性選別的な方法によりおこなった骨髄細胞および脾臓細胞の細胞表面抗原の比率を示す。
図７は、トランスジェニック個体および野生型個体について、フローサイトメトリーを用いる陽性選別的な方法によりおこなった腹腔内Ｂ細胞の細胞表面抗原の比率を示す。（左：Ｂ１  Ｂ２２０＋ＣＤ５＋、右：Ｂ２  Ｂ２２０＋ＣＤ５−）
図８は、トランスジェニック個体および野生型個体について、フローサイトメトリーを用いる陽性選別的な方法によりおこなった胸腺細胞の細胞表面抗原の比率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、ヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節する２型ケラチン遺伝子プロモーターを含む組換え体ＤＮＡが導入された無毛のトランスジェニック非ヒト動物に関する。
１．組換え体ＤＮＡ
本発明は、ヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節する２型ケラチン遺伝子プロモーターを含む組換え体ＤＮＡが導入されたことにより無毛のトランスジェニック動物が獲得されたことを特徴とする。以下に、本発明の組換え体ＤＮＡについて説明する。
（１）ヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子
本発明のヘパリン結合性ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ；ｈｅｐａｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）遺伝子とは、ジフテリア毒素受容体の本体であり、上記遺伝子には膜結合型と蛋白質分解酵素により遊離型となったものが存在するが、本発明では膜結合型のものを利用する。ヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子の塩基配列を配列番号６に示す。
また、本発明のヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子は、配列番号６に示される塩基配列のほか配列番号６で示される塩基配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヘパリン結合性ＥＧＦをコードするＤＮＡを含む。
このようなヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子は、配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒトのｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。これらの方法については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブによるハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。
（２）２型ケラチン遺伝子プロモーター
本発明において、ジフテリア毒素受容体を発現させるようなプロモーターとして２型ケラチン遺伝子プロモーターを用いることができる。２型ケラチン遺伝子プロモーターの塩基配列を７に示す。
２型ケラチン遺伝子プロモーターとは、Ｋｅｒａｔｉｎ２−６ｇタンパク質発現に関与するプロモーターである。Ｋｅｒａｔｉｎ２−６ｇタンパク質とは、２型ケラチンの一種で、毛根の内根鞘で特異的に発現されており、従来Ｋ２ｉｒｓと呼ばれていたものと同一である。
２型ケラチン遺伝子プロモーターは、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ／のＥｎｓｅｍｂｌ  ｍｏｕｓｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）より検索し、その塩基配列情報を得ることができる。配列番号７にその塩基配列を示した。
また、本発明の２型ケラチン遺伝子プロモーターは、配列番号７に示される塩基配列のほか配列番号７で示される塩基配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ２型ケラチン遺伝子プロモーター活性を有する領域をコードするＤＮＡを含む。
このような２型ケラチン遺伝子プロモーターは、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒトのゲノムライブラリーから得ることができる。これらの方法については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブによるハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。
（３）遺伝子発現の調節
本発明の組換え体ＤＮＡは、細胞・組織特異的プロモーターである２型ケラチン遺伝子プロモーターを霊長類に特異的なジフテリア毒素受容体であるヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子に結合させたものである。この２型ケラチン遺伝子プロモーターによりヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子が細胞の表面上に特異的に発現する。
ヒトやサルのような霊長類とマウスやラットとでは、ＨＢ−ＥＧＦを構成するアミノ酸配列が微妙に異なっており、ジフテリア毒素が受容体依存的なエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる際のジフテリア毒素に対する結合親和性も異なる。マウスの細胞は、ジフテリア毒素に耐性を示すが、それは、マウスのＨＢ−ＥＧＦはジフテリア毒素との親和性がヒトの受容体に比べ著しく低いために、ジフテリア毒素受容体としての機能が非常に微弱となり、ジフテリア毒素が上記受容体に伴われて細胞内に入れないためである。しかし、マウス細胞にジフテリア毒素受容体であるヒト由来のＨＢ−ＥＧＦ（ｈＨＢ−ＥＧＦ）を発現させると、マウス細胞も導入されたヒト由来のＨＢ−ＥＧＦにより、ジフテリア毒素がヒトと全く同様細胞内に取り込まれるため、マウスの細胞でもジフテリア毒素感受性になることができる。この性質を利用して、標的となる細胞群にｈＨＢ−ＥＧＦを発現させたマウスを作製し、その細胞に障害を与えたい時期にジフテリア毒素を投与すると、標的とする細胞だけを除去したり、一過性的な障害を与えたりすることができる。このような方法をＴＲＥＣＫ（ｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ）法という。本来であれば、そのような組換え体ＤＮＡが導入された個体にジフテリア毒素（ＤＴ）を投与すると任意の時期に２型ケラチン遺伝子プロモーターを発現する細胞を特異的に破壊することが可能になる。しかし、本発明の組換え体ＤＮＡが導入された個体は、ジフテリア毒素を投与しなくても先天的に無毛となる。
なお、ＥＧＦは被毛形成サイクルと密接に関連することが知られている。被毛形成サイクルは、毛周期（ｈａｉｒ  ｃｙｃｌｅ）という伸長と休止のステップを周期的に繰り返しており、具体的には、成長期（ａｎａｇｅｎ）、退行期（ｃａｔａｇｅｎ）及び休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）からなる。成長期（ａｎａｇｅｎ）は２〜６年であり、全ての毛髪の約８５％が成長期にある。退行期（ｃａｔａｇｅｎ）は、成長期後１〜２週間続く。退行期の間に、毛髪の毛包は通常の長さの約１／６まで短くなり、下部が破壊されて、毛乳頭は毛包（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ）からはなれて下部に残る。休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）は退行期の後に続き、５〜６週間続く。この時期の間、毛髪は成長せず、毛髪は毛包に結合したままである。休止期の終わりには、毛包は再び成長期に入り、新しい毛髪が形成される。このように被毛形成サイクルが繰り返されるなかで、ＥＧＦが活性化されることにより休止期から成長期への移行が進行する。一方、ＥＧＦが不活化することにより、成長期から退行期への移行時が行われる。
２．トランスジェニック動物
本発明のトランスジェニック動物は、無毛であり、さらに、アトピー性皮膚炎を自然発症することを特徴とする。以下に本発明のトランスジェニック動物の製法及びその表現形質について説明する。
（１）トランスジェニック動物の作製方法
本発明のトランスジェニック動物（その子孫を含む。）は、遺伝子組換え技術を用いて上記組換体ＤＮＡを非ヒト哺乳動物のゲノムに導入することによって得ることができる。本発明に用いられる非ヒト哺乳動物の種類は、特に限定されるものではない。たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ及びヤギなどが挙げられる。本発明では取り扱いが容易で繁殖しやすいマウスが好ましい。
トランスジェニック動物の作製は、例えばマウスを用いた標準的な方法、すなわち初期受精卵を用いたマイクロインジェクション法、あるいはＥＳ細胞による導入法で行うことができる。
マイクロインジェクション法では、トランスジェニック動物作製のためのマイクロインジェクションに用いる導入遺伝子、例えば本発明における図１に示すごとく作製された発現カセットを含むクローニングベクターを作製し、次いで制限酵素切断等により、該発現ベクターから発現カセットを切り出し、精製したＤＮＡ断片を受精したマウス卵細胞の前核中に例えば、標準的手法（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら，（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って注入する。トランスジェニックマウスの同定のために、耳穿孔片（ｅａｒ−ｐｕｎｃｈｅｄ  ｐｉｅｃｅｓ）もしくは尾組織からゲノムＤＮＡを調製する。すなわち、穿孔片もしくは尾組織片をＰＣＲ緩衝液／非イオン性界面活性剤及びプロテイナーゼＫ（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ８）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ゼラチン、０．４５％ＮＰ−４０、０．４５％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中に入れ、５５℃で一晩インキュベートする。インキュベート後、プロテインキナーゼＫを失活させるために、９５℃で１５分間インキュベートし、得られた溶液をＤＮＡ試料とする。導入遺伝子の確認のために、例えば本発明におけるｈＨＢ−ＥＧＦ遺伝子領域を増幅するためのプライマー
５’−ＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＧ−３’（配列番号４）及び
５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＣＧ−３’（配列番号５）
を使用し、導入したｈＨＢ−ＥＧＦ遺伝子領域を鋳型としてＰＣＲ反応によって増幅する。ＰＣＲの反応組成はＴａＫａＲａ  Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社）および付随の反応液を使用し、ＰＣＲ反応は９４℃で２分の反応の後、９８℃で１０秒、６０℃で１分、７２℃で３分のセットを３４サイクル、続き７２℃で４分行うことにより目的とするＤＮＡ断片を増幅することが可能である。
ＥＳ細胞による導入法では、得られた組換体ＤＮＡをＥＳ細胞に導入する。ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊に由来し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株及び新しく樹立した細胞株のいずれをも使用することができる。例えばＴＴ２細胞株、ＡＢ−１細胞株、Ｊ１細胞株、Ｒ１細胞株等を使用することができる。これらのどのＥＳ細胞株を用いるかは、実験の目的又は方法により適宜選択することができる。ＥＳ細胞への遺伝子導入は、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの方法を採用することができるが、簡便に多数の細胞を処理できる点でエレクトロポレーション法が好ましい。
導入遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲ法によりスクリーニングすることによって検定することができる。あるいは、薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子を含むベクターを用いることによってセレクションを行ってもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子などが挙げられ、レポーター遺伝子としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子などが挙げられる。
導入遺伝子の組込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すことにより、宿主胚の細胞塊に組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親に移植して発生及び生育させることにより、キメラトランスジェニック動物が得られる。そして、仮親から生まれた子（マウスの場合は約１７日で子が生まれる）のうちキメラ動物を選ぶ。キメラの寄与率が高い動物は、生殖系列の可能性が高いが、キメラ動物を正常な動物と交配することにより、生殖系列のキメラ動物であることの確認が可能である。その後、正常な雌と交配し、Ｆ１を得て変異動物系統を樹立する。
上記のようにして得られるキメラトランスジェニック動物は、相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体として得られる。相同染色体の両方に組換体ＤＮＡを有するホモ接合体を得るためには、Ｆ１動物のうち相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。組換体ＤＮＡの発現は、ＰＣＲにより確認することができる。
このトランスジェニック動物のうち、無毛の表現型を呈するものを自然交配あるいは体外受精により継代することにより、無毛のトランスジェニック動物（これらの子孫を含む。）が作製される。
（２）無毛動物
無毛動物とは、無毛の表現型を獲得した、体表の全部又は一部に被毛がない、あるいは著しく被毛が少ない状態の動物をいう。
従来は、実験動物を手術等の実験に供する場合は、手術部位の周辺を剃毛処理する必要があるがその場合、感染症を起こすおそれがあった。また、ヒトアトピー性皮膚炎モデルマウスの皮膚炎発症の初期観察も、この剃毛による刺激により、皮膚炎が二次的に発症し、初期のアトピー性皮膚炎の発症の観察を困難にしているといった弊害があった。本発明の無毛動物は、そのような弊害なく実験を行うことができる点で有用である。
ＴＲＥＣＫ法では、導入遺伝子を破壊させたい時期にあわせてジフテリアトキシンを投与することが必要である。しかし本発明の無毛マウスは、ジフテリアトキシンを投与しなくても先天的に無毛であるため、安全性に優れているばかりか、簡素化された操作により、人的、時間的、経費的な節減が図られる点でも優れている。
（３）皮膚炎発症動物
皮膚炎とは、皮膚に起こる何らかの炎症をいい、皮脂症も含まれる。特に、本発明の皮膚炎発症動物は、アトピー性皮膚炎を発症する。アトピー性皮膚炎とは、アレルギー疾患の一つであり、痒みを伴う慢性の疾患である。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、アレルゲンにさらされるとアトピー性皮膚炎を自然発症する。
発明者らは、以前から、ヒトアトピー性皮膚炎の原因遺伝子を特定するために、本皮膚炎を発症する動物モデルであるＮＣマウスを使用している。しかし、このＮＣマウスは有毛であったために、初期の皮膚炎発症を観察するためには上記のように剃毛が必要であり、このＮＣマウスの遺伝的性質を全く変化させずに、被毛だけを欠損するような新しいＮＣマウスの遺伝背景を持った無毛突然変異が必要となった。例えば、本発明のトランスジェニックマウスは、被毛の形成に重要な役割を果たしていると考えられるＫｒｔ２−６遺伝子のプロモーターを単離して、ジフテリア毒素受容体ｃＤＮＡと結合したＤＮＡ組換体を、このＮＣマウスに遺伝子導入を行うことにより作製しうる。このトランスジェニックマウスの系統は、無毛であり、ジフテリア毒素を投与しなくても皮膚炎を発症しうる。この無毛という表現型は、メンデルの法則に従って子孫に遺伝する。この無毛マウスの遺伝的特性は、無毛という表現型以外の遺伝的背景は既存のＮＣマウスと同一であるが、無毛である点で上記の利点を有し、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎発症モデル動物として、有用性がより高い。
皮膚炎を発症したことの確認については、全身、又は、顔面、頭部、頸部、四肢、耳介部、背部いずれかもしくは、それらの複数ヵ所の皮膚組織において、紅斑、丘疹、痂皮、鱗屑、のいずれかもしくは複数の合併した症状が現れ、脱毛、出血、痂皮形成をともなう場合もある。さらにマウス個体においては、上記症状に加えて掻破行動を伴うものも多数観察される。これらの症状のごく初期の変化も含めた状態をもって、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎の発症とする。
上記のように、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、剃毛による二次的皮膚炎が起こらず、アトピー性皮膚炎等の発症モデル動物として有用である。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、解剖学的な免疫担当組織、例えば胸腺および脾臓等の形態的観察において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物特有の異常所見は観察されない。例えば、本発明のトランスジェニックマウスについては、その免疫系を構成する細胞集団を既存のＮＣマウスと比較するために、免疫担当細胞の細胞表面抗原を、フローサイトメトリーを用いる陽性選別的な方法により比較検討することができる。免疫担当細胞のうち、胸腺由来細胞としては、ＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原陽性細胞、ＣＤ４抗原陽性細胞、ＣＤ８抗原陽性細胞、ＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原陰性細胞、ＣＤ４抗原およびＣＤ２５抗原陽性細胞などがあげられる。脾臓および骨髄細胞としては、ＣＤ３抗原およびＣＤ４抗原陽性細胞、ＣＤ３抗原およびＣＤ８抗原陽性細胞、ＣＤ４抗原およびＣＤ２５抗原陽性細胞などがあげられる。Ｂ細胞としてはＩｇＭ抗原およびＣＤ１９抗原などがあげられる。樹状細胞としては、ＣＤ１１ｃ抗原、ＣＤ１１ｂ抗原陽性、Ｂ２２０抗原陰性細胞、ＣＤ１１ｃ抗原およびＣＤ１１ｂ抗原陽性、Ｂ２２０抗原陰性細胞、ＣＤ１１ｃ抗原、ＣＤ１１ｂ抗原、Ｂ２２０抗原陽性細胞などがあげられる。単球としてはＣＤ１１ｂ抗原およびＧｒ−１抗原陽性細胞、ＣＤ１１ｂ抗原陽性およびＧｒ−１抗原陽性高発現細胞、ＣＤ１１ｂ抗原およびＧｒ−１抗原低発現細胞などがあげられる。ＮＫ細胞としてはＮＫ１．１抗原陽性、ＤＸ５抗原陽性発現細胞などがあげられる。ＮＫＴ細胞についてはＮＫ１．１抗原陽性、ＤＸ５抗原陽性ＣＤ３抗原陽性発現細胞などがあげられる。腹腔内Ｂ細胞としてはＢ２２０抗原陽性、ＣＤ５抗原陽性のＢ１細胞、Ｂ２２０抗原陽性、ＣＤ５抗原陰性のＢ２細胞などがあげられる。末梢血リンパ球としてはＣＤ６９抗原陽性およびＣＤ８０抗原陽性細胞などがあげられる。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、既存のＮＣマウスと免疫機能に関与する細胞を特徴づける上記の細胞表面抗原の陽性選別的な方法により比較した場合、何らかの免疫担当細胞の欠損または統計学的に有意な細胞数の差異は認められず、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、既存のＮＣマウスと同等な免疫系を保持しているといえる。
３．皮膚炎治療薬のスクリーニング方法
本発明は、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎を発症するトランスジェニック非ヒト動物に、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎治療のための薬物の候補物質（被験物質）を投与することにより、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、本発明のトランスジェニック非ヒト動物またはその一部に薬物候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた非ヒト動物又はその一部において標的とする疾患と相関関係を有する指標値を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎の症状を軽減または消滅させるか否かを確認することで、候補物質をスクリーニングすることができる。
「トランスジェニック非ヒト動物又はその一部」とは、動物の生体の全身、及び限定された組織又は器官の両者を含む。限定された組織又は器官の場合は、動物から摘出されたものも含む。本発明では、皮膚が好ましい。
候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸及び有機酸など）や塩基（例えば、金属塩など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
試験動物を候補物質で接触させる方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、試験動物の症状、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。好ましくは、塗布である。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、ある候補物質を投与した場合に、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎の症状が緩和もしくは消失したことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を、皮膚炎治療薬として選択することが可能である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
発現ベクターの構築
Ｋｒａｔｉｎ２−６ｇタンパク質発現に関与するプロモーターおよびエンハンサー配列が含まれると想定されるＫｒａｔｉｎ２−６ｇ遺伝子の開始コドンより上流約９ｋｂの塩基対（配列番号７）について、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓｌ／）から取得した。取得した塩基対を増幅するために、
５’−ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧＧＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡＣ−３’（配列番号１）
及び
５’−ＡＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＣＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号３）
をプライマーとして使用し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応によって増幅した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）由来のゲノムＤＮＡは当研究室において標準的な方法により調製され、保存されているものを使用した。
ＰＣＲの反応組成はＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社）および付随の反応液を使用した。ＰＣＲ反応は９４℃で２分の後、９８℃で１０秒、６８℃で１２分のセットを３２サイクル、続き７２℃で１２分行った。
次に、上記のごとく増幅したＰＣＲ産物を鋳型とし、
５’−ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧＧＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡＣ−３’（配列番号１）
及び
５’−ＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＡＡＡＧＧＴＧＣ−３’（配列番号２）
をプライマーとして使用し、ＰＣＲ反応によって増幅した。ＰＣＲの反応組成はＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社）および付随の反応液を使用した。ＰＣＲ反応は９４℃で２分の後、９８℃で１０秒、６８℃で１２分のセットを３２サイクル、続き７２℃で１２分行った。
上記のように増幅したＫｒａｔｉｎ２−６ｇプロモーターおよびエンハンサー配列をＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩによって切断し、ヒトＨＢ−ＥＧＦ発現ベクター（Ｓａｉｔｏ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：７４６−７５０）に組み込んだ。
上記の手順によって構築した発現ベクターｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦの主要部の構成を図１に、ベクターの全配列を配列番号８に示す。
【実施例２】
【０００７】
トランスジェニックマウスの作製
実施例１で作製したＤＮＡ断片を含むクローニングベクターを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（オペロン社）によって取得し、クローニングベクターを制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ（１μｇ／ｕｎｉｔ）により、３７℃１時間処理した。さらにこの制限酵素処理が施された試料はアガロースゲル電気泳動によってマイクロインジェクションに用いるＤＮＡ断片を分離し、次いでこれをＱＩＡＥＸ  ＩＩ（オペロン社）によって精製した。精製したＤＮＡ断片を受精したＮＣマウス卵細胞の前核中に標準的手法（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら，（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って注入した。
このように導入遺伝子が組込まれたマウスの受精卵を仮親に移植して発生及び生育させトランスジェニックマウスを得た。
トランスジェニックマウス同定のために、尾組織片よりゲノムＤＮＡを調製した。すなわち、尾の組織片０．１ｇをＰＣＲ緩衝液／非イオン性界面活性剤及びプロテイナーゼＫ（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ゼラチン、０．４５％ＮＰ−４０、０．４５％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中にいれ、５５℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、プロテイナーゼＫを失活させるために、９５℃で１５分間インキュベートし、得られた溶液をＤＮＡ試料とした。
導入遺伝子の確認のために、
５’−ＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＧ−３’（配列番号４）及び
５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＣＧ−３’（配列番号５）
をプライマーとして使用し、導入した遺伝子領域を鋳型としてＰＣＲ反応によって増幅した。ＰＣＲの反応組成はＴａＫａＲａ  Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社）および付随の反応液を使用した。ＰＣＲ反応は９４℃で２分の後、９８℃で１０秒、６０℃で１分、７２℃で３分のセットを３４サイクル、続き７２℃で４分行った。
結果を図２に示す。図２は、ｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦ−トランスジェニック（Ｔｇ）における導入遺伝子をＰＣＲによって検出したもので、レーン１は非導入個体のＤＮＡを用いたＰＣＲ反応、レーン２は導入個体のＤＮＡを用いたＰＣＲ反応、レーン３はポジティブコントロール発現ベクターｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦを鋳型として用いたＰＣＲ反応、レーン４は、ネガティブコントロールすなわち蒸留水を鋳型としてＰＣＲ反応をおこなったもの、及び、レーン５はマーカー（２５０−１００００ｂｐ）をそれぞれ示す。
その結果、ｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦ遺伝子はレーン２のマウスゲノムに存在することが確認された（図２）。以下２のマウスをｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦ−Ｔｇとして用いた。
上記のように作製されたｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦ−Ｔｇは無毛であるため、これを既存のＮＣマウスと自然交配することにより得られた産仔について示したものが図３である。すなわちｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦ導入遺伝子を保持する個体は無毛の状態を呈する（左側：Ｔｇと表記）。一方、ｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦ導入遺伝子を保持しない個体は有毛（右側：野生型と表記）のままである。本発明のｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦ−Ｔｇは自然交配により、この無毛の状態がメンデル遺伝の様式により子孫へと遺伝しうるマウスである。
上記のごとく、自然交配により得られた産仔は継続的に無毛状態を呈する。図４は、生後より無毛を呈するｍＫｒ２−６ｇＰｒｏ−ｈＨＢ−ＥＧＦ−Ｔｇの６週齢の写真である。
室温、湿度、明暗期が調節されたコンベンショナル施設内で飼育した本発明マウスはアトピー性皮膚炎発症例を示す（図５）。図５のマウスは上記条件下で通常飼育した８週齢の個体を示す。図５のうち、上図はこの飼育室内に存在するアレルゲンの感作によるアトピー性皮膚炎の発症を示し、下図はアトピー性皮膚炎発症個体の痒みによる掻破行動を示している。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、解剖学的な免疫担当組織、例えば胸腺および脾臓等の形態的観察において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物特有の異常所見は観察されなかった。さらに、その免疫系を構成する細胞集団を既存のＮＣマウスと比較するため、フローサイトメトリーを用いる陽性選別的な方法により免疫担当細胞の細胞表面抗原を比較検討した。用いた免疫担当細胞は以下の通りである。すなわち、胸腺由来細胞は、ＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原陽性細胞、ＣＤ４抗原陽性細胞、ＣＤ８抗原陽性細胞、ＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原陰性細胞、ＣＤ４抗原およびＣＤ２５抗原陽性細胞である。脾臓および骨髄細胞は、ＣＤ３抗原およびＣＤ４抗原陽性細胞、ＣＤ３抗原およびＣＤ８抗原陽性細胞、ＣＤ４抗原およびＣＤ２５抗原陽性細胞である。Ｂ細胞はＩｇＭ抗原およびＣＤ１９抗原である。樹状細胞は、ＣＤ１１ｃ抗原、ＣＤ１１ｂ抗原陽性、Ｂ２２０抗原陰性細胞、ＣＤ１１ｃ抗原およびＣＤ１１ｂ抗原陽性、Ｂ２２０抗原陰性細胞、ＣＤ１１ｃ抗原、ＣＤ１１ｂ抗原、Ｂ２２０抗原陽性細胞である。単球はＣＤ１１ｂ抗原およびＧｒ−１抗原陽性細胞、ＣＤ１１ｂ抗原陽性およびＧｒ−１抗原陽性高発現細胞、ＣＤ１１ｂ抗原およびＧｒ−１抗原低発現細胞である。ＮＫ細胞はＮＫ１．１抗原陽性、ＤＸ５抗原陽性発現細胞である。ＮＫＴ細胞はＮＫ１．１抗原陽性、ＤＸ５抗原陽性ＣＤ３抗原陽性発現細胞である。腹腔内Ｂ細胞はＢ２２０抗原陽性、ＣＤ５抗原陽性のＢ１細胞、Ｂ２２０抗原陽性、ＣＤ５抗原陰性のＢ２細胞である。末梢血リンパ球はＣＤ６９抗原陽性およびＣＤ８０抗原陽性細胞である。本発明のトランスジェニックマウスを、既存のＮＣマウスと免疫機能に関与する細胞を特徴づける上記の細胞表面抗原の陽性選別的な方法により比較した場合、免疫担当細胞の欠損または統計学的に有意な細胞数の差異は何ら認められず、本発明のトランスジェニックマウスは、既存のＮＣマウスと同等な免疫系を保持していると考えるのが妥当であるとの結果が得られた。骨髄細胞、脾臓細胞、腹腔内Ｂ細胞および胸腺細胞の細胞表面抗原の比率を例として図６〜８に示す。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明のトランスジェニック動物は無毛のため、通常のＮＣマウスで初期段階のアトピー性皮膚炎の発症等を観察するために行っていた剃毛をする必要がない。従って、剃毛により誘導される二次的な皮膚炎が起きないため、初期のアトピー性皮膚炎等の皮膚炎の発症の有無が明確に判断できるという極めて優れた効果を有する。
また、本発明のトランスジェニック動物は、無毛であり、剃毛による皮膚への刺激が起こらないため、アトピー皮膚炎等の皮膚炎発症メカニズムの解明やアトピー性皮膚炎等の皮膚炎治療薬の開発に有用である。さらに、これらのモデル動物は、アトピー皮膚炎等の皮膚炎への詳細な発症機構の解明に向けて新たな研究領域を切り開くことができる。
【配列表フリーテキスト】
【０００９】
配列番号１：  プライマー
配列番号２：  プライマー
配列番号３：  プライマー
配列番号４：  プライマー
配列番号５：  プライマー
配列番号８：  ベクター
［配列表］
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【図１】
0005083820.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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