(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド基転移またはペプチド転移反応またはエステル化転移反応を触媒する修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼであって、前記セリンヒドロラーゼがシステインと置換された、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１５６、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１６６、Ｓ１’サブサイトのアミノ酸２１７、およびＳ２サブサイトのアミノ酸６２のいずれか１つのアミノ酸残基を有し、前記システインが、システイン中のチオール水素を、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、およびＮ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オンからなる群から選択される置換基で置換することにより修飾された修飾化セリンヒドロラーゼであって、ここで、前記アミノ酸１５６、１６６、２１７、および６２は、それぞれ、各種ズブチリシンによる配列アラインメントを行った場合にバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシンの１５６、１６６、２１７、および６２番目に相当する位置のアミノ酸である修飾化セリンヒドロラーゼ。
【請求項２】
セリンヒドロラーゼがアミド基転移を触媒する、請求項１記載の修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼ。
【請求項３】
セリンヒドロラーゼがペプチド転移を触媒する、請求項１記載の修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼ。
【請求項４】
セリンヒドロラーゼがエステル化転移反応を触媒する、請求項１記載の修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼ。
【請求項５】
システインで置換されたアミノ酸がアスパラギン、ロイシン、メチオニンおよびセリンからなる群から選択される、請求項１記載の修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼ。
【請求項６】
システインで置換された、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１５６、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１６６、Ｓ１’サブサイトのアミノ酸２１７、およびＳ２サブサイトのアミノ酸６２のいずれか１つのアミノ酸残基を有する修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼであって、前記システインが、システインのチオール水素を、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、およびＮ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オンからなる群から選択される置換基で置換することにより修飾された修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼであって、ここで、前記アミノ酸１５６、１６６、２１７、および６２は、それぞれ、各種ズブチリシンによる配列アラインメントを行った場合にバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシンの１５６、１６６、２１７、および６２番目に相当する位置のアミノ酸である修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼ。
【請求項７】
エステル基質を包含する化合物と、アミド基転移またはペプチド転移反応またはエステル化転移反応を触媒する修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼであって、前記セリンヒドロラーゼがシステインと置換された、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１５６、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１６６、Ｓ１’サブサイトのアミノ酸２１７、およびＳ２サブサイトのアミノ酸６２のいずれか１つのアミノ酸残基を有し、前記システインが、システイン中のチオール水素を、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3-、および−Ｓ−ＣＨ3からなる群から選択される置換基で置換することにより修飾された修飾化セリンヒドロラーゼであって、ここで、前記アミノ酸１５６、１６６、２１７、および６２は、それぞれ、各種ズブチリシンによる配列アラインメントを行った場合にバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシンの１５６、１６６、２１７、および６２番目に相当する位置のアミノ酸である修飾化セリンヒドロラーゼと、第一級アミンとを、前記ヒドロラーゼがペプチド結合の形成を触媒する条件下で接触させることを含む、ペプチド結合の形成方法。
【請求項８】
エステル基質を包含する前記化合物がアシル供与体であり、そして第一級アミンがアシル受容体である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記アシル受容体がアミノ酸アミドである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノ酸アミドがペプチド中に存在する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記アシル受容体がＬ−アミノ酸アミドである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記アシル受容体がＤ−アミノ酸アミドである、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記エステル基質がアミノ酸エステルである、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記アミノ酸エステルがペプチド中に存在する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記エステル基質がＬ−アミノ酸エステルである、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
前記エステル基質がＤ−アミノ酸エステルである、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
エステル化転移反応を用いてラセミ第一級および第二級アルコールを分解する方法であって、前記ラセミ第一級または第二級アルコールを、アミド基転移またはペプチド転移反応またはエステル化転移反応を触媒する修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼであって、前記セリンヒドロラーゼがシステインと置換された、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１５６、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１６６、Ｓ１’サブサイトのアミノ酸２１７、およびＳ２サブサイトのアミノ酸６２のいずれか１つのアミノ酸残基を有し、前記システインが、システイン中のチオール水素を、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3-、および−Ｓ−ＣＨ3からなる群から選択される置換基で置換することにより修飾された修飾化セリンヒドロラーゼであって、ここで、前記アミノ酸１５６、１６６、２１７、および６２は、それぞれ、各種ズブチリシンによる配列アラインメントを行った場合にバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシンの１５６、１６６、２１７、および６２番目に相当する位置のアミノ酸である修飾化セリンヒドロラーゼ、およびアシル供与体と接触させ、それにより前記セリンヒドロラーゼがエステル化転移反応を触媒して前記ラセミ第一級または第二級アルコールを分解することを含む、方法。
【請求項１８】
前記第一級または第二級アルコールが脂肪族アルコール、芳香族アルコールおよび複素環式アルコールからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記第一級または第二級アルコールが２−フェニル−１−プロパノール、２−メチル−１−ペンタノールおよび２−オクタノールからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記アシル供与体がカルボン酸エステルおよび活性化エステルからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記カルボン酸エステルがアルキルカルボン酸エステルおよびアラルキルエステルからなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記活性化エステルがモノハロアルキル、ジハロアルキルおよびトリハロアルキルからなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
アミド基転移、エステル化転移またはペプチド転移反応を介してキラル部分を基質に結合する方法であって、エステル化転移反応またはアミド基転移反応に適した反応性部位を有する前記基質、前記キラル部分、およびアミド基転移またはペプチド転移反応またはエステル化転移反応を触媒する修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼであって、前記セリンヒドロラーゼがシステインと置換された、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１５６、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１６６、Ｓ１’サブサイトのアミノ酸２１７、およびＳ２サブサイトのアミノ酸６２のいずれか１つのアミノ酸残基を有し、前記システインが、システイン中のチオール水素を、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3-、および−Ｓ−ＣＨ3からなる群から選択される置換基で置換することにより修飾された修飾化セリンヒドロラーゼであって、ここで、前記アミノ酸１５６、１６６、２１７、および６２は、それぞれ、各種ズブチリシンによる配列アラインメントを行った場合にバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシンの１５６、１６６、２１７、および６２番目に相当する位置のアミノ酸である修飾化セリンヒドロラーゼを前記キラル部分が前記基質に共有的に結合される条件下で接触させることを含む、方法。
【請求項２４】
前記キラル部分がＤアミノ酸、Ｌ−アミノ酸、非環式脂肪族、環式脂肪族、アラルキルＲ−カルボン酸およびアラルキルＳ−カルボン酸、芳香族Ｒ−カルボン酸および芳香族Ｓ−カルボン酸からなる群から選択されるキラルである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記反応が一キラリティーの部分に対して優先的であり、ここで、前記修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼにおいて、前記システイン中のチオール水素が−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３−または−Ｓ−ＣＨ３で置換されている、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記エステル化転移反応がエナンチオマー的に偏った生成物を生じ、ここで、修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼにおいて、前記システイン中のチオール水素が−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３−または−Ｓ−ＣＨ３で置換されている、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
前記基質がアミノ酸またはポリペプチドである、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチド中へのアミノ酸の組み入れ方法であって、アミノ酸エステルと、アミド基転移またはペプチド転移反応またはエステル化転移反応を触媒する修飾化ズブチリシンセリンヒドロラーゼであって、前記セリンヒドロラーゼがシステインと置換された、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１５６、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１６６、Ｓ１’サブサイトのアミノ酸２１７、およびＳ２サブサイトのアミノ酸６２のいずれか１つのアミノ酸残基を有し、前記システインが、システイン中のチオール水素を、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3-、および−Ｓ−ＣＨ3からなる群から選択される置換基で置換することにより修飾された修飾化セリンヒドロラーゼであって、ここで、前記アミノ酸１５６、１６６、２１７、および６２は、それぞれ、各種ズブチリシンによる配列アラインメントを行った場合にバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシンの１５６、１６６、２１７、および６２番目に相当する位置のアミノ酸である修飾化セリンヒドロラーゼ、およびアミノ酸第一級アミンとを、前記セリンヒドロラーゼが前記アミノ酸エステルのアミノ酸とアミノ酸アミンのアミノ酸との間のペプチド結合の形成を触媒する条件下で、接触させることを含む、方法。
【請求項２９】
前記アミノ酸エステルがアシル供与体であり、そして前記アミノ酸アミンがアシル受容体である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記アミノ酸アミンがペプチド中に存在する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記アミノ酸アミンがＬ−アミノ酸アミドである、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記アミノ酸アミンがＤ−アミノ酸アミドである、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
前記アミノ酸エステルがＬ−アミノ酸エステルである、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
前記アミノ酸エステルがＤ−アミノ酸エステルである、請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
前記アミノ酸エステルがペプチド中に存在する、請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
化学修飾突然変異化ズブチリシンセリンヒドロラーゼの製造方法であって、
Ｓ１サブサイトのアミノ酸１５６、Ｓ１サブサイトのアミノ酸１６６、Ｓ１’サブサイトのアミノ酸２１７、およびＳ２サブサイトのアミノ酸６２のいずれか１つのアミノ酸残基がシステイン残基で置換されたズブチリシンセリンヒドロラーゼを提供し、ここで、前記アミノ酸１５６、１６６、２１７、および６２は、それぞれ、各種ズブチリシンによる配列アラインメントを行った場合にバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシンの１５６、１６６、２１７、および６２番目に相当する位置のアミノ酸であり、そして
システイン残基中のチオール水素を、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル  エチルメタンチオスルホネート、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−イソピロピル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、およびＮ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オンからなる群から選択される置換基で置換すること
を含む、方法。
【請求項３７】
システインで置換されたアミノ酸がアスパラギン、ロイシン、メチオニンおよびセリンからなる群から選択される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
エステル化転移活性、アミド基転移活性およびペプチド転移活性からなる群から選択される活性に関して前記修飾化セリンヒドロラーゼをスクリーニングすることをさらに包含する、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、米国特許仮出願番号第60/107,758号（1998年11月10日提出）および第60/113,061号（1998年12月21日提出）（これらの記載内容はともに、参照により本明細書中に含まれる）の35U.S.C.§119下での利益を請求する。
連邦政府後援研究および開発下で成される本発明に対する権利に関する説明
［該当せず］
【０００２】
発明の背景
技術分野
本発明は、セリンヒドロラーゼの分野に関する。特に本発明は、その後化学的に誘導される１以上のシステインを導入するために突然変異化されたセリンヒドロラーゼに関する。これらの化学修飾突然変異体は、酵素活性の変化を示す。
【０００３】
背景
酵素は今日、有機合成における有用な触媒として広範に受け入れられている。しかしながら、天然の野生型酵素は合成化学的関心を有するすべての構造を受容するわけでも、それらが常に合成に必要な望ましい（例えば、エナンチオマー的に純粋な）生成物を生成する訳でもない。酵素の合成適用可能性のこの考え得る制限は認識されており、例えばタンパク質工学処理の部位特異的および無作為突然変異技法を用いて、制御方式でそれらの特異性を変更する何らかの進歩が成されてきた。しかしながら、タンパク質工学処理による酵素特性の修飾は一般に、天然アミノ酸置換の作製に限定されてきた。この制限を克服するための分子生物学的戦略は近年得られた（Cornish et al.（1995）「Angew. Chem. Int. Ed. Engl.」, 34:621-633）が、これらの手法はほとんどの研究室において適用が難しい。
【０００４】
これに対比して、酵素の制御化学修飾は、酵素構造の平易な且つ柔軟な修飾の広範な可能性を提供し、それにより酵素特異性および活性の制御改造に対する広範な可能性を拡げる。化学的修飾による酵素特性の変更は、ズブチリシンＢＰＮ’の活性部位セリン残基のシステインへの化学的形質転換（ＣＨ2ＯＨ→ＣＨ2ＳＨ）によりチオズブチリシンを作製したBender（例えば、Polgar et al.（1966）「J. Am. Chem. Soc.」, 88:3153-3154 ）およびKoshland（例えば、Neet et al.（1966）「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」, 56:1606-1611参照）のグループによる初期の報告において過去に探査されている。
【０００５】
合成の可能性を有するいくつかを含めた化学的に生成された人工酵素における関心は、Wu（例えば、Wu et al.（1989）「J. Am. Chem. Soc.」, 111:4514-4515参照）、Bell他（（1993）「Biochem.」, 32:3754-3762）、Peterson（例えば、Peterson et al.（1995）「Biochem.」, 34:6616-6620参照）、そしてさらに近年ではSuckling（例えば、Suckling et al.（1993）「Bioorg. Med. Chem. Lett.」, 3:542-534参照）により新たにされた。
【０００６】
米国特許第5,208,158号は、１以上のメチオニンがシステインに突然変異化された化学修飾洗剤酵素を記載する。システインは、酸化剤に対する改良された安定性を酵素に付与するために、その後修飾される。改良型安定性はしばしば望ましい特性であるが、しかし他の酵素特性を変えるのも望ましい（例えば特に触媒活性、立体選択性等）。
【０００７】
ヒドロラーゼの活性およびエナンチオ選択性を改良するための多数の方法が研究されてきた。それらには、極限温度（Noritomi  et al.（1996）「Biotechnol. Bioeng.」51:95-99; Saka et al.（1997）「J. Org. Chem.」62:4906-4907; Ullmann et al.（1996）「Tetrahedron:Asymmetry」7:2047-2054; Holmberg et al.（1991）「Biotechnol. Lett.」13:323-326; Phillips（1992）「Enzyme Microb. Technol.」14:417-419; Lam et al.（1986）「J. Org. Chem.」51:2047-2050）、溶媒工学処理（Koshinen et al.（1996）「Enzymatic Reactions in Organic Media」, A.M., Blackie Academic and Professional, London; Gutman et al.（1995）「Adv Biochem Eng/Biotechnol」52:87-128; Griebenow and Klibanow（1997）「Biotechnol. Bioeng.」53:351-362; Bonneau et al.（1993）「Bioorg. Chem.」21:431-438）、基質の構造的変更（Gupta and Kaslauskas（1993）「Tetrahedron:Asymmetry」4:879-888; Sih et al.（1992）Chirality 4:91-97）、インプリンティング（Rich and Dordick,（1997）「J. Am. Chem. Soc.」119:3245-3252; Russell and Klibanov（1988）「J. Biol. Chem.」263:11624-11626）、リオプロテクタント（lyoprotectant）（Dabulis and Klibanow（1993）「Biotechnol. Bioeng.」41:566-571; Khmelnitsky et al.（1994）「J. Am. Chem. Soc.」116:2647-2648）、化学修飾（Scouten（1987）「Methods Enzymol.」135:30-78; Polgar and Bender（1966）「J. Am. Chem. Soc.」88:3153-3154; Wu and Hilvert,（1989）「Am. Chem. Soc.」111:4513-4514）、部位特異的突然変異誘発（Wong et al.（1990）「J. Am. Chem. Soc.」, 112:945-953; Bonneau et al.（1991）「J. Am. Chem. Soc.」, 113:1026-1030; Zhong et al.（1991）「J. Am. Chem. Soc.」113:683-684; Estell et al.（1985）「J. Biol. Chem.」260:6518-6521; Sears and Wong（1996）「Biotechnol. Prog.」, 12:423-433）および無作為突然変異誘発（Reetz et al.（1997）「Angew. Chem. Int. Ed. Engl.」36:2830-2832; Chen and Amold（1993）「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」, 90:5618-5622; Stemmer（1994）「Nature」, 370:389-391）が含まれる。しかしながら、突然変異体酵素の化学修飾は、新規の特性を有する新規のヒドロラーゼの生成方法として十分使用されていない（Gron et al.（1990）「Eur. J. Biochem.」194:897-901）。
【０００８】
発明の要約
本発明は、種々の基質に改良型立体選択性を有する独特の化学修飾突然変異体酵素（ＣＭＭ）を提供する。概して、突然変異体は、１以上のアミノ酸残基（好ましくはサブサイト、例えばＳ1、Ｓ1’またはＳ2中の残基）がシステインで置換されるセリンヒドロラーゼであるが、この場合、システインは、システイン中のチオール水素を、極性芳香族置換基、正電荷を有するアルキルアミノ基、キラル置換基、複素環式置換基およびグリコシドからなる群から選択される部分を包含するチオール側鎖を提供する置換基で置換することにより化学修飾される。本発明の好ましいセリンヒドロラーゼは、アミド基転移またはペプチド転移またはエステル化転移反応を触媒し、最も好ましい態様では、この触媒作用においては立体選択性である。特に好ましいセリンヒドロラーゼとしては、α／βセリンヒドロラーゼ、ズブチリシン型セリンプロテアーゼおよびキモトリプシンセリンプロテアーゼが挙げられ、ズブチリシンは特に好ましいセリンプロテアーゼである。
【０００９】
システインによる置換のために選択される好ましいアミノ酸としては、アスパラギン、ロイシン、メチオニンおよびセリンが挙げられる。置換（例えば、ズブチリシン型酵素における）のための好ましい部位としては、Ｓ1サブサイトのアミノ酸156、Ｓ1サブサイトのアミノ酸166、Ｓ1’サブサイトのアミノ酸217、Ｓ1’サブサイトのアミノ酸222、Ｓ2サブサイトのアミノ酸62が挙げられる。好ましい置換基としては、オキサゾリジノン、正電荷を有するＣ1〜Ｃ15のアルキルアミノ基およびグリコシド（例えば、単糖類、二糖類ならびにペントースおよびヘキソースを包含する少糖類）（例えば、図２参照）が挙げられる。一態様では、好ましい置換基としては、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−エチル−チオール、（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル−エチル−チオール、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチル−チオール、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチル−チオール、Ｎ−（３’−チオ−プロピル）−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−チオ−プロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−チオ−プロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−チオ−プロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−チオ−エチル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−チオ−エチル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−チオ−エチル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−チオ−エチル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−チオ）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オンおよびＮ−（３’−チオ）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オンが挙げられる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、化学修飾突然変異体ズブチリシンを提供する。修飾ズブチリシンは、システインで置換されるＳ1、Ｓ1’またはＳ2サブサイトから選択される１以上のアミノ酸残基を有し、この場合、システインは、極性芳香族置換基、正電荷を有するアルキルアミノ基、負荷電部分を有するアルキル基およびグリコシドからなる群から選択される部分を包含するチオール側鎖を提供する置換基でシステインのチオール水素を置換することにより修飾される。特に好ましいシステイン置換（単数または複数）は、アミノ酸62、アミノ酸156、アミノ酸166、アミノ酸217およびアミノ酸222に存在する。好ましい置換基は、前記および本明細書中に記載した通りである。
【００１１】
本発明は、ペプチド結合の形成方法も提供する。本方法は、好ましくは、エステル基質を包含する化合物を、ヒドロラーゼまたは修飾ズブチリシンがペプチド結合の形成を触媒する条件下で、前記のようなセリンヒドロラーゼおよび／または化学修飾突然変異体ズブチリシンおよび第一級アミンと接触させることを包含する。好ましいエステル基質はアシル供与体であり、そして第一級アミンはアシル受容体（例えば、アミノ酸アミド）である。アシル受容体がアミノ酸アミドである場合、アミノ酸はＤまたはＬアミノ酸であり、任意に、ペプチド中に存在し得る。エステル基質は、ＤまたはＬアミノ酸エステルであり得るし、任意にペプチド中に存在し得る。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、エステル化転移反応を用いてラセミ第一級および第二級アルコールを分解する方法を提供する。これらの方法は、ラセミ第一級または第二級アルコールを前記のようなセリンヒドロラーゼおよび／または修飾突然変異体ズブチリシンならびにアシル供与体と接触させ、それにより前記セリンヒドロラーゼがエステル化転移反応を触媒して前記ラセミ第一級または第二級アルコールを分解することを包含する。好ましい第一級または第二級アルコールとしては、脂肪族アルコール、芳香族アルコールおよび複素環式アルコールが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい第一級または第二級アルコールとしては、２−フェニル−１−プロパノール、２−メチル−１−ペンタノールおよび２−オクタノールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアシル供与体としては、カルボン酸エステル（例えば、アルキル、アラルキル、例えばベンジル、エステルが挙げられるが、これらに限定されない）および活性化エステル（例えば、モノ−および／またはジ−および／またはトリ−ハロアルキル）が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい修飾突然変異体酵素としては、Ｌ２１７Ｃ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3-、Ｎ６２Ｃ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3-およびＮ６２Ｃ−Ｓ−ＣＨ3が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、アミド基転移、エステル化転移またはペプチド転移反応を介してキラル部分を基質に結合する方法を提供する。これらの方法は、エステル化転移反応またはアミド基転移反応に適した反応性部位を有する基質（例えば、ペプチド、アミノ酸等）および前記のような触媒セリンヒドロラーゼを有する部分を接触させて、それによりキラル部分が基質と共有的に結合されることを包含する。好ましいキラル部分としては、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、非環式脂肪族、環式脂肪族、アラルキルＲ−カルボン酸およびアラルキルＳ−カルボン酸、芳香族Ｒ−カルボン酸および芳香族Ｓ−カルボン酸が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい態様では、反応は、一キラリティーの部分に対して選択的である。特に、反応がエステル化転移反応である場合、エステル転移反応は、好ましくはエナンチオマー的に偏った生成物を生じる。
【００１４】
本発明は、ポリペプチド中へのアミノ酸の組み入れ方法も提供する。これらの方法は、アミノ酸エステルを本明細書中に記載したような触媒セリンプロテアーゼおよびアミノ酸第一アミンと、セリンヒドロラーゼがアミノ酸エステルのアミノ酸とアミノ酸アミンのアミノ酸との間のペプチド結合の形成を触媒する条件下で接触させることを包含する。好ましいアミノ酸エステルはアシル供与体であり、そして好ましいアミノ酸アミンはアシル受容体（単数または複数）である。アミノ酸アミドはＤまたはＬアミノ酸アミドであり得るし、任意にペプチド中に存在し得る。同様に、アミノ酸エステルはＤまたはＬアミノ酸エステルであり得るし、任意にペプチド中に存在し得る。
【００１５】
化学修飾突然変異化セリンヒドロラーゼの製造方法も提供される。これらの方法は、好ましくは、１以上のアミノ酸がシステイン残基で置換されたセリンヒドロラーゼを提供し、そしてシステイン残基中のチオール水素を、極性芳香族置換基、正電荷を有するアルキルアミノ基、およびグリコシドからなる群から選択される部分を包含するチオール側鎖を提供する置換基で置換する工程を包含する。特に好ましいヒドロラーゼは、α／βセリンプロテアーゼ、ズブチリシン型セリンプロテアーゼおよびキモトリプシンセリンプロテアーゼであるが、これらに限定されず、ズブチリシンが最も好ましいセリンヒドロラーゼである。システインで置換されるアミノ酸は、好ましくは、Ｓ1、Ｓ1’またはＳ2サブサイトのアミノ酸（例えば、ズブチリシン残基156、166、217、222および62）および／または好ましくはアスパラギン、ロイシン、メチオニンおよびセリンである。特に好ましい置換基は、本明細書中に記載したものである。本方法は、エステル化転移活性、アミド基転移活性およびペプチド転移活性からなる群から選択される活性に関して修飾セリンヒドロラーゼをスクリーニングすることをさらに包含する。スクリーニングは、任意に立体選択性に関するスクリーニングを含み得る。
【００１６】
定義
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中では互換的に用いられる。本用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用する。本用語は、ポリペプチドを作製するアミノ酸を結合する伝統的ペプチド結合に関する変異体も含み得る。
「残基」という用語は、本明細書中で用いる場合、天然、合成または修飾アミノ酸を指す。
【００１７】
酵素という用語は、それ自体恒久的に変えられることなく、他の物質における化学変化を触媒し得るタンパク質を含む。酵素は、野生型酵素または変異体酵素であり得る。本発明の範囲内の酵素としては、プルラナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、グリコシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、グリコシダーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼおよびリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
「突然変異体酵素」とは、一アミノ酸残基をシステイン（またはその他の）残基で置換された酵素である。
「化学修飾」酵素とは、酵素中のその位置に普通は見出されない置換基を保有するよう誘導された酵素である。
「化学修飾突然変異体酵素」または「ＣＭＭ」とは、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基（好ましくはシステイン）で置換された、そして置換残基が残基上に普通は見出されない置換基を保有するよう化学的に誘導される酵素である。
【００１９】
「チオール側鎖基」、「チオール含有基」および「チオール側鎖」とは、互換的に用い得る用語であり、そしてシステインのチオール水素を置換するために用いられる基を含む。一般に、チオール側鎖基は、それを介してチオール側鎖基がシステインのチオール硫黄に結合される硫黄原子を含む。「置換基」とは、典型的には、システインと本明細書中に記載したようなメタンスルホネート試薬とを反応させることにより形成されるジスルフィド結合を介してシステインに結合されたままである基を指す。置換基という用語は好ましくは結合されたままである基（そのチオール基以外）をまさに指すが、しかし置換基とは、全チオール側鎖基も指す。その差は、文脈から明らかになる。
【００２０】
「酵素の結合部位」は、酵素の表面全体の一連のサブサイトから成る。サブサイトに対応する基質残基はＰと呼ばれ、サブサイトはＳと呼ばれる。慣例により、サブサイトは、Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3、Ｓ4、Ｓ1’およびＳ2’と呼ばれる。サブサイトについての考察は、Siezen et al.（1991）「Protein Engineering」, 4:719-737およびFersht（1985）「Enzyme Structure and Mechanism」, 2nd ed. Freeman, New York, 29-30に見出される。好ましいサブサイトとしては、Ｓ1、Ｓ1’およびＳ2が挙げられる。
【００２１】
「立体選択性」または「立体選択的」という用語は、酵素または酵素により触媒される反応に関して用いられる場合、一キラリティーのエナンチオマーの方を選んだ反応生成物の量または濃度の偏りを指す。したがって、立体選択的反応または酵素は、「Ｌ」型より「Ｄ」型が（または「Ｓ」型より「Ｒ」型が）優勢を占めるか、あるいは逆に、「Ｄ」型より「Ｌ」型が（または「Ｒ」型より「Ｓ」型が）優勢を占める反応生成物を生成する。一キラリティーの優勢は、好ましくは検出可能な優勢であり、さらに好ましくは実質的優勢、最も好ましくは統計学的有意の優勢（例えば、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の信頼レベルで）である。
【００２２】
「アミノ酸番号＃＃」または「ＸＸサブサイト中のアミノ酸番号＃＃」という語句は、参照位置のアミノ酸（例えばＳ1サブサイトに存在するバチルス・レンツス（B. lentus）ズブチリシンのアミノ156）および関連酵素中の対応する（相同的）位置のアミノ酸を含むよう意図される。
【００２３】
「セリンヒドロラーゼ」とは、加水分解反応における求核試薬として役立てるために活性セリン側鎖を利用する加水分解酵素である。この用語は、ネイティブおよび合成セリンヒドロラーゼ、ならびに、例えば合成目的で、逆反応を実施するよう工学処理された酵素を含む。
【００２４】
「α／βセリンヒドロラーゼ」とは、コムギ胚芽セリンカルボキシペプチダーゼＩＩを含めた酵素との構造的相同を基礎にしたセリンヒドロラーゼの一族である（例えば、Liao et al.（1992）「Biochemistry」31:9796-9812; Ollis et al.（1992）「Proein Engineering」, 5:197-211参照）。
【００２５】
「ズブチリシン型セリンヒドロラーゼ」とは、ズブチリシンＢＰＮを含めた酵素との構造的相同を基礎にしたセリンヒドロラーゼの一族を指す（Bott et al.（1988）「J. Biol. Chem.」263:7895-7906; Siezen and Leunissen（1997）「Protein Science」6:501-523）。ズブチリシンは、一般的にタンパク質またはペプチドのペプチド結合を切断するよう作用する細菌または真菌プロテアーゼである。本明細書中で用いる場合、「ズブチリシン」とは、天然ズブチリシンまたは組換えズブチリシンを意味する。一連の天然ズブチリシンは、種々の微生物種により産生され、そしてしばしば分泌されることが知られている。この種の成員のアミノ酸配列は、完全には相同でない。しかしながら、この種におけるズブチリシンは、同一または類似型のタンパク質分解活性を示す。この種類のセリンプロテアーゼは、キモトリプシン関連種類のセリンプロテアーゼからそれらを区別する触媒三つ組を限定する共通アミノ酸配列を共有する。ズブチリシンおよびキモトリプシン関連セリンプロテアーゼは、アスパラギン酸塩、ヒスチジンおよびセリンからなる触媒三つ組を有する。ズブチリシン関連プロテアーゼでは、アミノ末端からカルボキシ末端に読み取られるこれらのアミノ酸の相対順序は、アスパラギン酸塩−ヒスチジン−セリンである。しかしながらキモトリプシン関連プロテアーゼでは、相対順序はヒスチジン−アスパラギン酸塩−セリンである。したがって、ズブチリシンは、本明細書中では、ズブチリシン関連プロテアーゼの触媒三つ組を有するセリンプロテアーゼを指す。
【００２６】
「キモトリプシンセリンプロテアーゼ族」とは、γ−キモトリプシンを含めた酵素との構造的相同性を基礎にしたセリンヒドロリアーゼの一族を指す（Birktoft and Blow（1972）「J. Molecular Biology」68:187-240）。
「オキサゾリジノン」という用語は、オキサゾリジン環を含み、ケト基を含有する化合物を指す。
【００２７】
「グリコシド」という用語は、加水分解により糖およびその他の有機物質（例えばアグリコン）に分解し得る有機化合物の一群を指す。好ましいグリコシドは、種々のヒドロキシ化合物と種々の糖の組合せから得られるアセタールである。それらは別々に、グルコシド、マンノシド、ガラクトシド等と呼ぶことができる。好ましいグリコシドとしては、単糖類および少糖類、例えば、ペントースおよびヘキソースサッカリド、例えば、グルコースおよびマンノースサッカリドが挙げられるが、これらに限定されない。
ラセミ混合物の分解とは、ラセミ第一および第二級アルコールがラセミ第一および第二アルコールに分解することを指す。
【００２８】
詳細な説明
本発明は、エステル化転移および／またはアミド基転移および／またはペプチド転移反応を触媒し得る化学修飾突然変異体酵素（ＣＭＭ）を提供する。本発明の好ましい修飾酵素は、反応における高度の立体選択性を保持する。
【００２９】
本発明の化学修飾突然変異体酵素は、１以上のサブサイトの１以上の残基がシステインに突然変異化され、システインが、システインのチオール水素の代わりに結合される置換基を提供するよう誘導される（例えばメタンスルホネート試薬により）セリンヒドロラーゼを包含する。突然変異の部位（単数または複数）および置換基は、エステル化転移、アミド基転移またはペプチド転移反応において野生型酵素より高度の立体選択性を保持する酵素を生成するよう選択される。
【００３０】
突然変異体酵素は、ペプチド合成、エステル化転移、ラセミエステルまたはアミドおよび関連基の立体選択的触媒によるエナンチオマーの分解、洗剤およびその他の洗浄物質、テキスタイル処理、飼料添加物等を含めた広範な種々の情況において有用に存在するが、これらに限定されない。それらの立体選択性のために、突然変異体酵素は、有機合成における工程を触媒する試薬として特に有用である。所望により、突然変異体酵素は、エナンチオマー的により純粋な反応生成物を生成し、ある好ましい態様では、他の方法では難しい反応を触媒するために用い得る。したがって、例えば、一態様では、酵素は、「Ｄ」アミノ酸が「Ｌ」アミノ酸に結合されるアミド基転移反応を触媒するために用い得る。このようなアミド基転移反応を促すために、ある好ましい態様では、修飾酵素は高エステラーゼおよび低アミダーゼ活性を有する。
【００３１】
Ｉ．化学修飾のための突然変異体酵素の生成
Ａ）修飾のための酵素の選択
本発明の修飾のための好ましい酵素としては、セリンヒドロラーゼが挙げられる。セリンヒドロラーゼは、セリン、ヒスチジンおよびカルボン酸塩アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）から成る触媒三つ組を保有し、カルボン酸誘導体、例えばエステル、ペプチドおよびアミド（これらに限定されない）の加水分解およびその顕微鏡的逆反応を触媒することを特徴とする加水分解酵素の一種である。
【００３２】
本発明を包含する好ましいセリンヒドロラーゼとしては、トリプシン−キモトリプシンプロテアーゼ、ズブチリシンプロテアーゼおよびα／βヒドロラーゼが挙げられる。特に好ましい態様では、酵素はプロテアーゼ、さらに好ましくはズブチリシン（例えばバチルス属のBacillus lentisズブチリシン）である。ズブチリシンは、生体触媒に、特にキラル分解、多官能化合物の位置選択的アシル化、ペプチド結合および糖ペプチド合成における使用の増大に見出されつつあるアルカリ性セリンプロテアーゼである。後者２つの用途は、それらが非天然アミノ酸をタンパク質に導入するための部位特異的突然変異誘発の代替物を提供するために、特に興味深いものである。
【００３３】
本発明に用いるためのその他の特に好ましいセリンヒドロラーゼとしては、ズブチリシン類（ズブチラーゼ）、α／βヒドロラーゼまたはトリプシン／キモトリプシン族の構造的セリンヒドロラーゼ酵素に属する酵素を含めたすべてのセリンヒドロラーゼを提供するためのRickが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
Ｂ）修飾のための残基の選択
好ましい態様では、セリンヒドロラーゼにおける修飾のための残基は、合理的に選択される。修飾のために選択される特に好ましいアミノ酸残基としては、サブサイト内の重要な区別部位であると予測される残基が挙げられる。このような残基は、サブサイト残基が系統的に突然変異化され、結合特異性および／または酵素活性に及ぼすこのような突然変異誘発の作用が確定される突然変異誘発実験から確定される。さらに、重要な残基は、タンパク質モデリングソフトウエア（例えばQuanta（Molecular Simulations Inc.）およびFrodo（academic software））を用いて、結晶構造の検査からおよび／または予測タンパク質フォールディングまたはタンパク質−タンパク質相互作用から同定し得る。BergerとSchecterにより限定されたサブサイトでの相互作用を変えるために位置する側鎖は、酵素の結晶学的モデルに基づいて、そして特定の酵素に関する構造的情報が利用可能でない場合、必要ならば、相同酵素に外挿して、選択し得る。バチルス属のB. lentusズブチリシンでは、部位156、166、217および222が重要な基質特異性確定部位である。これらは、本研究のために特異的に同定された部位62とともに、例示される。さらに別の関連部位としては、ズブチリシンにおける位置96、104、107、189および209、ならびに関連酵素における相同位置が挙げられる。
【００３５】
典型的には、小さい、嵩のある、疎水性または疎水性の、あるいは荷電性であり得るが、これらに限定されない置換基の導入が結合部位の配座を変えると予測される残基が選択される。好ましい態様では、このような残基は典型的にはＳ1、Ｓ1’またはＳ2サブサイトにあるが、しかしある場合には、他のサブサイトでの残基の変化も劇的効果を生じ得る。
【００３６】
セリンヒドロラーゼがズブチリシン型セリンヒドロラーゼである特に好ましい一態様では、突然変異のための好ましい残基としては、Ｓ1サブサイトの残基156および166、Ｓ1’サブサイトの残基217および222、ならびにＳ2サブサイトの残基62、Ｌｅｕ96、Ｖａｌ104、Ｉｌｅ107、Ｐｈｅ189およびＴｙｒ209、あるいはその他のズブチリシン型セリンプロテアーゼのサブサイト内の相同位置の残基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
セリンヒドロラーゼがトリプシン−キモトリプシン型セリンヒドロラーゼである別の好ましい態様では、突然変異のための好ましい残基としては、トリプシンのＴｙｒ94、Ｌｅｕ99、Ｇｌｎ175、Ａｓｐ189、Ｓｅｒ190およびＧｌｎ192またはその他のトリプシン−キモトリプシン型セリンヒドロラーゼのサブサイト内の相同位置の残基が挙げられる。
【００３８】
セリンヒドロラーゼがα／βセリンヒドロラーゼであるさらに別の好ましい態様では、突然変異のための好ましい残基としては、カンジダ族のCandida antarticaリパーゼ（Protein Data Bank登録1tca）のＴｒｐ104、Ｔｈｒ138、Ｌｅｕ144、Ｖａｌ154、Ｉｌｅ189、Ａｌａ225、Ｌｅｕ278およびＩｌｅ185、またはその他のα／β型セリンヒドロラーゼのサブサイト内の相同位置の残基が挙げられる。
【００３９】
好ましくは、システインにより酵素中で置換されるアミノ酸は、アスパラギン、ロイシン、メチオニンまたはセリンからなる群から選択される。さらに好ましくは、置換されるアミノ酸は酵素のサブサイト、好ましくはＳ1、Ｓ1’またはＳ2サブサイトに位置する。さらに好ましくは、ズブチリシンでは、置換されるアミノ酸は、Ｎ62、Ｌ217、Ｍ222、Ｓ156、Ｓ166、サイト104、サイト107（Ｓ4）、サイト96（Ｓ2）、サイト189（Ｓ２’）およびサイト209（Ｓ１’／Ｓ３’）、あるいは番号位置がバシラス・アミロリケファシエンツ（Bacilus amyloliquefacients）からの天然ズブチリシン、またはバシラス・レンツス（Bacillus lentus）ズブチリシンのようなその他のズブチリシン中の等価アミノ酸残基に対応するそれらの相同体である。
【００４０】
Ｃ）システインの導入
セリンヒドロラーゼ中の１以上のネイティブ残基に代わるシステインの置換は、当業者に周知のルーチン法を用いて成し遂げ得る。好ましい一態様では、本明細書中に記載した突然変異体は、当該野生型酵素をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発により最も効率的に調製される（例えば、Bacillus lentisズブチリシン）。部位特異的突然変異誘発または非無作為突然変異誘発を実施するための技法は、当業界で既知である。このような方法としては、アラニン走査突然変異誘発（Cunningham and Wells（1989）「Science」, 244, 1081-1085）、オリゴヌクレオチド媒介性突然変異誘発（Adellman et al.（1983）「DNA」, 2, 183）、カセット突然変異誘発（Wells et al.（1985）「Gene」, 344:315）および結合突然変異誘発（Ladner et al. WO88/06630）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明の一態様では、置換アミノ酸残基（例えばシステイン）は、ポリメラーゼ連鎖反応技法を用いてオリゴヌクレオチド媒介性突然変異誘発により選定標的部位に導入される。このアプローチでは、所望のネイティブ酵素（例えばズブチリシン）をコードする遺伝子は、適切なプラスミドにより保有される。さらに好ましくは、プラスミドは、発現ベクター、例えば、ｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐＵＢ、ｐＥＴまたはｐＨＹ４シリーズからのプラスミドである。プラスミドは、便利性のために、または望ましいように、当業者が選択し得る。
【００４２】
部位特異的突然変異誘発のために、選定突然変異部位を含有する断片は、制限エンドヌクレアーゼにより対象酵素をコードする遺伝子から切断され、修飾ＰＣＲ技法における鋳型として用いられる（Higuchi et al.（1988）「Nucleic Acid Res.」, 16, 7351-7367参照）。各標的置換に関しては、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドが不適正プライマーとして用いられて、５’および３ＰＣＲフランキングプライマー間の鎖延長を開始する。その手法としては、２つのＰＣＲ反応が挙げられる。第一のＰＣＲでは、不適正プライマーおよび５’プライマーが、所望の塩基置換を含有するＤＮＡ断片を生成するために用いられる。断片は、電気泳動によりプライマーから分離される。精製後、次にそれは３’プライマーを用いる第二ＰＣＲにおける新規の５’プライマーとして用いられて、所望の塩基置換を含有する完全断片を生成する。シーケンシングによる突然変異の確証後、突然変異体断片は次に、オリジナル断片の位置に挿入し戻される。
【００４３】
別のアプローチでは、本発明のシステイン突然変異体の構築および同定を促すために、カセット突然変異誘発法を用い得る。先ず、セリンヒドロラーゼをコードする遺伝子を得、全体または一部でシーケンシングする。次に、発現酵素中の１以上のアミノ酸の突然変異を作製するのが望ましい点（単数または複数）を同定する。これらの点の側面に位置する配列が、発現された場合に所望の突然変異体をコードするオリゴヌクレオチドで遺伝子の短セグメントを置換するために制限部位の存在に関して評価する。このような制限部位は、遺伝子セグメントの置換を促すために、好ましくはセリンヒドロラーゼ内のユニーク部位である。
【００４４】
しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子中のひどく冗長でない任意の便利な制限部位を用い得るが、但し、制限消化により生成される遺伝子断片は適切な配列中に新たに集め得る。制限部位が選定点から便利な距離内（例えば10〜15ヌクレオチド）の位置に存在しない場合、このような部位は、読み取り枠もコードされるアミノ酸も最終構築において変更されないような方式で遺伝子中のヌクレオチドを置換することにより生成される。適切なフランキング領域を置き、２つの便利な制限部位配列に到達するのに必要な変化を評価する仕事は、遺伝子コードの冗長性、遺伝子の制限酵素地図、および多数の異なる制限酵素によりルーチンに成される。便利なフランキング制限部位が利用可能である場合、前記の方法は、ある部位を含有しないフランキング領域とともにのみ用いられる必要があることに留意せねばならない。
【００４５】
遺伝子の突然変異は、所望の配列に一致させるようその配列を変更するために、例えば一般的に既知の方法にしたがってＭ13プライマー延長を成し遂げられる。遺伝子がクローン化されれば、突然変異化される配列の側面に位置する制限部位は、コグネイト制限酵素で消化され、末端相補的オリゴヌクレオチドカセット（単数または複数）が遺伝子に結合される。すべてのオリゴヌクレオチドが同一制限部位を有するよう合成し得るし、合成リンカーは制限部位を作製するために必要でないために、突然変異誘発はこの方法により非常に簡素化される。
【００４６】
適切なＤＮＡ配列コンピューター検索プログラムは、可能性のある５’および３’便宜フランキング部位を見出す仕事を簡素化する。好ましい態様では、制限部位（単数または複数）の作製に導入されるあらゆる突然変異が、最終構築アミノ酸コード配列に対して不顕性である。標的コドンに対する候補制限部位５’に関しては、配列は、好ましくは、少なくともすべてのヌクレオチドを、しかし候補酵素の切断に対する認識配列５’におけるものに関して、含有する遺伝子中に存在する。例えば、平滑切断酵素SmaI（CCC/GGG）は、近くの５’配列がNCC、CNCまたはCCNを含有した場合、良好な５’候補である。さらに、ＮがＣに変えられる必要がある場合、この変更は、好ましくは、アミノ酸コード配列を無傷のままにしておく。恒久的サイレント突然変異が制限部位を導入するのに必要である場合には、めったに用いられないコドンの導入を回避するよう望み得る。SmaIの同様の状況は、配列NGG、GNGまたはGGNが存在しなければならないことを除けば、３’フランキング部位に充当する。候補酵素を突き止めるための判定基準は、平滑切断酵素に関しては最も緩やかで、４塩基オーバーハング酵素に関しては最も厳格である。概して、多数の候補部位が利用可能である。
【００４７】
当該酵素中にシステイン突然変異体を導入する方法のうち特に好ましいのは、バチルス属のBacillus lentusからのズブチリシン遺伝子（「ＳＢＬ」）に関して説明される。好ましい態様では、ＳＢＬに関する遺伝子は、突然変異誘発のためにバクテリオファージベクター（例えば、Ｍ13ｍｐ19ベクター）中でクローン化される（例えば、米国特許第5,185,258号参照）。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は、Zoller et al.（1983）「Meth. Enzymol.」, 100:468-500に記載された方法にしたがって実施される。突然変異化配列は次にクローン化され、切り取られて、枯草菌B. subtilis宿主中の発現プラスミド（例えばプラスミドＧＧ274）に再導入される。ＰＥＧ（50％）が安定剤として付加される。
【００４８】
このようにして得られた粗製タンパク質濃縮物は、先ずセファデックス（商標）Ｇ−25脱塩マトリックスをｐＨ5.2緩衝液（例えば20 mM酢酸ナトリウム、5 mMＣａＣｌ2）とともに通して、小分子量夾雑物を除去することにより精製される。脱塩カラムからのプール分画は次に、前記の酢酸ナトリウム緩衝液中で強陽イオン交換カラム（例えば、ＳＰセファロース（商標）ＦＦ）に適用され、0〜200 mMＮａＣｌアセテート緩衝液、ｐＨ5.2の一工程勾配を用いてＳＢＬが溶離される。ミリポア精製水に対する溶離剤の透析とその後の凍結乾燥後に、無塩酵素粉末が得られる。
【００４９】
0.1 MＨＣｌを用いて0℃で30分のインキュベーションにより変性される突然変異体および野生型酵素の純度は、均質ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認される（例えば、Pharmacia（Uppsala, Sweden）からのPhast（商標）系を用いて）。ＳＢＬの濃度は、Bradford（1976）「Anal. Biochem.」, 72:248-254の方法を基礎にしたBio-Rad（Hercules, CA）染料試薬キットを用いて確定される。酵素の特異的活性は、下記および実施例に記載されるように確定される。
【００５０】
前記のプロトコールは、他の酵素に関して用いるために、必要ならば、ルーチンに修飾し得ると当業者は理解するだろう。タンパク質の部位特異的修飾のためのその他のプロトコールは当業者に周知であり、例えば、米国特許第5,932,419号および第5,789,166号（Circular site-directed mutagenesis）、第5,705,479号および第5,635,475号（Site-directed mutagenesis modified glycoprotein hormones and methods of use）、第5,556,747号（Method for site-directed mutagenesis）、第5,354,670号（Site-directed mutagenesis of DNA）、第5,352,779号（Site-directed mutagenesis modified DNA encoding glycoprotein hormones and methods of use）、第5,284,760号（Techniques for producing site-directed mutagenesis of cloned DNA）ならびに第5,071,743号（Process for conducting site-directed mutagenesis）に見出し得る。
さらに、部位特異的突然変異誘発用のキットは、市販されている（例えば、Transfomer（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Toyoboから入手可能）参照）。
【００５１】
Ｄ）突然変異化酵素の発現
好ましい態様では、突然変異化タンパク質は、宿主細胞中の異種核酸から発現される。発現タンパク質は次に単離され、必要ならば、精製される。宿主細胞および発現ベクターの選択は、選定酵素およびその供給源に大いに依存する。
【００５２】
有用な発現ベクターは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定組込みまたは宿主細胞のゲノムとは無関係な宿主細胞中のベクターの自律的複製を可能にする因子、ならびに好ましくは形質転換宿主細胞の選択を容易にする１以上の表現型マーカーを含有する。発現ベクターは、プロモーターをコードする制御配列、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、ならびに任意に、レプレッサー遺伝子、選択マーカーまたは種々のアクチベーター遺伝子も含み得る。発現タンパク質の分泌を可能にするために、遺伝子のコード配列の前に、シグナル配列をコードするヌクレオチドが挿入される。制御配列の指示下での発現のためには、本発明により用いられる突然変異化酵素をコードする遺伝子またはｃＤＮＡは、適正な読み取り枠中の制御配列に操作可能的に連結される。
【００５３】
部位特異的突然変異誘発により得られる突然変異体遺伝子を含有するベクターは次に、適切な宿主細胞を形質転換し、発現するためにそれぞれ用いられる。適切な宿主細胞としては、細菌、例えば大腸菌またはバチルス菌、酵母菌、例えばサッカロミセス・セレビシエ、哺乳類細胞、例えばマウス繊維芽細胞、または昆虫細胞が挙げられる。好ましくは、細菌発現系が用いられる。最も好ましくは、宿主はバチルス菌である。タンパク質発現は、外来プラスミドの高レベル発現に都合のよい条件下で形質転換宿主細胞を培養するための選定宿主細胞および発現ベクターのような因子によって当業界で周知の方法により実施される。
【００５４】
ペプチドのクローニングおよび発現の方法は、当業者には周知である（例えば、Sambrook, et al.（1989）「Molecular Cloning: a Laboratory Manual」2nd Ed., Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory）; Berger and Kimmel（1987）「Methods in Enzymology」, Vol. 152:Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc. San DiegoまたはAusbel et al.（1987）「Current Protocols in Molecular Biology」, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York参照）。
前記のように、特に好ましい一発現系は、プラスミドＧＧ274であり、これは次に、枯草菌宿主中で発現される。
【００５５】
ＩＩ．突然変異体酵素の化学修飾
Ａ）突然変異化残基を修飾するための置換基の選択
広範な種々の置換基が、セリンヒドロラーゼ中に導入されるシステイン（単数または複数）を修飾するために用い得る。前記のように、好ましい置換基は、エステル化転移および／またはアミド基転移および／またはペプチド転移反応における酵素の立体選択性を改良するものである。好ましい置換基は、嵩のある（例えば、寸法が少なくとも約4〜6Åで、線状、環状または分枝鎖配座のより多数の分子のうちの３つから成る）および／または疎水性および／または荷電性である。
【００５６】
さらに好ましい態様では、置換基としては、極性芳香族基（例えば、誘導化ベンゼン、例えば、フルオルベンゼン、クロルベンゼン、誘導化５成員環、オキサゾリダドン等）が挙げられる。その他の好ましい置換基としては、正電荷を有するアルキルアミノ基（例えば、正電荷を有するＣ1〜Ｃ50の、さらに好ましくはＣ1〜Ｃ30の、最も好ましくはＣ1〜Ｃ15のアルキルアミノ基）およびグリコシド（例えば、単糖類、またはペントースおよびヘキソースから得られる少糖類およびそれらの誘導体）が挙げられる。エステル化転移活性が望ましい場合、特に好ましい態様は、負電荷（例えば、ＳＯ3-、およびその他の硫酸、ＣＯ2-およびその他の酸性種、例えばリン酸部分等）を保有するアルキル基（例えば、Ｃ1〜Ｃ50、さらに好ましくはＣ1〜Ｃ30、最も好ましくはＣ1〜Ｃ15のアルキル基）を含む。
【００５７】
アミド基転移またはペプチド転移活性が望ましいか、および／または高度のキラル特性が望ましい場合、特に好ましい置換基としては、極性芳香族基が挙げられ、オキサゾリジノンが最も好ましい。本発明で用いるための典型的オキサゾリジノンとしては、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−エチル−チオール、（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル−エチル−チオール、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチル−チオール、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチル−チオール、Ｎ−（３’−チオ−プロピル）−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−チオ−プロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−チオ−プロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−チオ−プロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−チオ−エチル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−チオ−エチル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−チオ−エチル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（２’−チオ−エチル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン、Ｎ−（３’−チオ）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オンおよびＮ−（３’−チオ）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
その他の特に好ましい態様としては、図２に示された置換基が挙げられるが、これらに限定されない。その他の特に好ましい態様としては、図２に示された置換基、ならびに不斉合成に適用される一般的に利用可能なキラル助剤および配位子のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
Ｂ）システインとの置換基のカップリング
システイン上のＲ基は、所望の置換基をシステインとカップリングするために活用し得る便利な相対的に反応性のチオール基（−ＳＨ）を提供する。好ましい態様では、システインと反応した場合に、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）によりシステインと共有結合した当該置換基を生じるメタンチオスルホネート試薬として誘導された当該置換基が提供される。
【００６０】
好ましい態様では、メタンチオスルホネート試薬（単数または複数）を用いた化学修飾は、Berglund et al.（1997）「J. Am. Chem. Soc.」, 119:5265-5255およびDeSantis et al.（1998）「Biochemistry」, 37:5968-5973により記載されているように実行される。要するに、メタンチオスルホネート（ＭＴＳ）試薬の1 M溶液200μLを、70 mMのＣＨＥＳ、5 mMのＭＥＳ、2 mMのＣａＣｌ2、ｐＨ9.5中のシステイン突然変異体の溶液（5〜10 mg/ml、3.5 mL）に付加する。ＭＴＳ試薬を、30分間に亘って、２部分に分けて付加する。反応混合物を、連続転倒混合しながら20℃に保持する。特異的活性を追跡調査して（例えば、suc-ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いて）、そして残留遊離チオールに関して試験して（例えば、エルマン試薬を用いて）、反応物をモニタリングする。反応が完了したら、反応混合物を、5 mMＭＥＳおよび2 mMＣａＣｌ2、ｐＨ6.5を含有するセファデックス（商標）ＰＤ−10Ｇ25カラム上に載せる。次に、タンパク質分画を1 mMＣａＣｌ2に対して透析して、透析物を凍結乾燥する。
【００６１】
システインと結合されるものである置換基が反応基を保有するある種の場合には、反応基は適切な遮蔽／保護基で誘導体化されて、カップリング中の望ましくない反応を防止し得る。同様に、セリンヒドロラーゼが、誘導体化されない１以上のシステインを含有する場合、これらのシステイン上のチオール基（単数または複数）は、適切な保護基（例えば、ベンジル、トリチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ＭＯＭ、アセチル、チオカルボネート、チオカルバメート等）で誘導体化し得る。遮蔽／保護基の使用は、当業者には周知である（例えば、「Protective Groups in Organic Synthesis」Theodora W. Greene and Peter G.M. Wuts Third Edition, Wiley-Interscience, Toronto,（1999）, pp.454-493参照）。
【００６２】
ＩＩＩ．所望の活性に関する化学修飾突然変異体のスクリーニング
化学修飾突然変異体は、典型的には、単数または複数の当該活性に関してスクリーニングされる。このような活性としては、アミダーゼ活性、エステラーゼ活性、アミダーゼ対エステラーゼ活性の比、立体選択性、エステル化転移、アミド基転移、ペプチド転移反応等が挙げられる。このような活性に関する検定は、当業者に周知である。
【００６３】
例えば、アミダーゼおよび／またはエステラーゼ活性に関する検定は、Plettner et al.（1998）「Bioorg. Med. Chem. Lett」, 8:2291-2296により記載されたような顕微滴定プレート上で迅速に実施し得る。好ましい一態様では、ｋcat／ＫMは、近似値として低基質濃度での限定事例のミカエリス−メンテンの式を用いて、生成式の速度（ｖ）から、微小滴定プレートフォーマットで得られる（［Ｓ］および［Ｅ］がそれぞれ基質および酵素濃度である等式１）：［Ｓ］＜＜ＫMに関してはＶ≒（Ｋcat／ＫM）［Ｓ］［Ｅ］。アミダーゼ検定のためには約5 x 10-7 Mで、そしてエステラーゼ検定のためには約5 x 10-8 Mで2 mMＣａＣｌ2、ｐＨ6.5を含有する5 mMの４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）中で、酵素ストック溶液を調製する。基質溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製する。アミダーゼ基質ｓｕｃＡＡＰＦ−ｐＮａストックは1.6 mMで、これはウエル中で0.8 mMを示す。エステラーゼ基質イソスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−チオベンジルエステル（ｓｕｃＡＡＰＦ−ＳＢｎ）ストック溶液は1.0 mMであり、これはウエル中で0.05 mMを示す。0.005％トゥイーンを含有する0.1 Mトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）ｐＨ8.6中で検定を実行する。エステラーゼ検定用のトリス緩衝液は、0.375 nMのＤＴＮＢを含有する。この緩衝液は、高ｐＨの緩衝液のために２〜３時間以内にＤＴＮＢが分解するので、直ぐに用いる必要がある。
【００６４】
各酵素溶液の試料（約150μL）を、酵素装填プレートのウエルの第１、第５または第９カラムに入れる。列Ａ〜ｇは酵素を含有し、列ＨはＭＥＳ緩衝液を含有する。別個の検定プレート（Corning、平底、96ウエル）上には、10μLの基質溶液および180μLの緩衝液が実行に用いられるカラムに沿ってウエル中に分散される。検定プレート上のカラム１〜４は、装填プレートのカラム１中の酵素の４つの反復試験片を含有する。カラム５〜８は、装填プレートのカラム５中の酵素の４つの反復試験片を含有する。
【００６５】
８チャンネルピペットで装填プレートから検定プレートに酵素溶液10μLを移すことにより、反応を開始させる。アミダーゼ検定に関しては、４つのカラムを１回の実施のために開始させる。エステラーゼ検定に関しては、１回の実施に２つのカラムを開始させる。一次カラムへの酵素の付加と読み取り開始との間の時間的遅延は、約22〜30秒（アミダーゼ）および10〜15秒（エステラーゼ）である。開始直後、プレートをTitertech Multiscan MCC340読取機（動的モードにプログラムされる、フィルター414 nm、遅れ時間0.0分、ブランク列Ｈの自動バックグラウンド控除による5秒の間隔）（Labsystems, Finland）に載せて、1.0分（アミダーゼ）または30秒間（エステラーゼ）読み取る。進行曲線のほぼ線状部分を通り越した長期読み取り（約50％まで変換）は、低い評価の速度を提供する。読取機からの出力は、プログラムされた全時間の、5秒間隔で測定された、4114 nm/分での吸光度の変化の平均速度を表す。これらのデータは、ｐ−ニトロアニリドに関する、および３−カルボキシレート−４−ニトロチオフェノレートに関する吸光係数（例えば、ｐ−ニトロアニリドに関してはｅ414＝8581 M-1cm-1、ならびにｅ414＝8708 M-1cm-1）を用いて、ＭＳ-1での速度に変換される。両吸光係数は、検定の場合と同じ条件およびバックグラウンド控除を用いて、読取機で測定される。速度は活性酵素濃度に関して矯正され、各酵素に関する４つの反復試験片は平均化される。
【００６６】
前記のプロトコールは例示であって、本発明を限定するものではなく、当業者によるルーチンの実験により多数の修正および変更を成し得ると理解される。
ある態様では、その他の触媒活性が検定される（例えば、アミド基転移、ペプチド転移、エステル化転移反応）。さらに、ある態様では、基質特異性および／または立体選択性も測定される。
【００６７】
このような検定は、ルーチン方法を用いて実施し得る。したがって、例えばエステル化転移またはアミド基転移活性は、実施例に記載したのと同様に測定し得る。同様に、立体選択性は、当業者に既知の多数の方法により測定し得る。一態様では、立体選択性は、実施例に記載されているように、立体選択的液体または気体クロマトグラフィー手法（例えば、Chiralcelカラム、Daicei Chemical Industries, Ltd.を使用）を用いて測定される。
【００６８】
化学修飾突然変異体酵素の産生およびこのような修飾酵素の特殊な活性に関するスクリーニングは、高スループット法で調べることができる。典型的には、このような方法は、多数の化合物の産生およびスクリーニングを自動化し、促進するためにロボット工学を利用する。効率的高スループットスクリーニング系では、典型的には、唯１人のルーチンオペレーターの関与により、何十万の反応体／反応を２〜３日でスクリーニングし得る。高スループットスクリーニング系は、市販されている（例えば、Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA等参照）。これらの系は、典型的には、すべての試料および試薬ピペッティング、液体計量、時限インキュベーション、ならびに検定に適した検出器（単数または複数）中のマイクロプレートの最終読取りを含めた全手法を自動化する。これらの形造可能な系は、高スループットおよび迅速始動、ならびに高度の柔軟性および注文作製化を提供する。このような系のメーカーは、種々の高スループットを詳細なプロトコールに提供する。したがって、例えばZymark Corp.は、遺伝子転写、配位子結合等の変調を検出するためのスクリーニング系を記載する技術的報告を提供する。
【００６９】
ＩＶ．本発明のＣＭＭの使用
図１に示すように、ズブチリシンは、先ずアシル酵素中間物質を生成し、次にこれを第一級アミンと反応させてペプチド生成物を生成することにより、エステル基質から開始するペプチド結合形成を触媒し得る。この態様では、好ましい酵素は高エステラーゼ活性を有してアシル酵素生成を促し、次に、低アミダーゼ活性を有して所望の生成物のペプチド結合の加水分解を最小限にする。一般的に、ズブチリシンはこの要件を満たさず、一態様では、ズブチリシンのエステラーゼ−アミダーゼへの選択性の改良は、本発明の一特徴である。
【００７０】
本発明の別の特に好ましい特徴は、修飾突然変異体酵素を用いて得られる立体選択性の改良である。実施例に示したように、修飾突然変異体酵素は、ラセミアルコールを分解するために、そしてプロキラルおよびメソジオールを立体選択的にアシル化するために利用し得る。
【００７１】
本発明の立体選択的修飾酵素は、特殊なキラル部分とのペプチド結合の形成を触媒するためにも用い得る。特に、ペプチド合成プロトコールにおけるＤアミノ酸のカップリングは、問題であることが判明した。本発明の修飾酵素は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸を個々のアミノ酸またはポリペプチド中に存在するアミノ酸に優先的に結合する便利な且つ効率的なメカニズムを提供する。
【００７２】
酵素的ペプチド結合は、この方法が基質の最小防護を要し、穏かな条件下で進行し、ラセミ化を引き起こさないために、種々のペプチドの調製のための魅力的な方法である（Wong et al.（1994）41-130ページ, In:Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, Pergamon Press, Oxford）。前記のように、本発明の化学修飾突然変異化酵素は、ペプチド合成におけるアシル供与体としてＤ−アミノ酸エステルを、またはペプチド合成におけるアシル受容体としてα−分枝鎖アミノ酸アミドを組み入れて、種々のジペプチドを生じ得る。これらの反応は、野生型酵素を用いてはできない。
【００７３】
したがって、本発明の修飾酵素は、例えば所望の反応を触媒し、および／またはある種の立体選択性を付与するために有機合成に用い得る。
もちろん、本発明の修飾酵素は、より多くの「伝統的」用途にも利用し得る。したがって、例えば本発明の修飾酵素（特にプロテアーゼおよび／またはリパーゼ）は、6.5〜12.0のｐＨを有する既知の粉末および液体洗剤中に、約0.01〜約5質量％、好ましくは約0.1質量％〜約0.5質量％のレベルで処方し得る。これらの洗剤洗浄組成物または添加物としては、その他の酵素、例えば既知のプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはエンドグリコシダーゼ、ならびにビルダーおよび安定剤も挙げることができる。
【００７４】
特に好ましい態様では、修飾ズブチリシンは種々の洗剤組成物を処方するのに用いられる。多数の既知の化合物が、このような洗剤組成物中で有用な適切な界面活性剤である。これらの例としては、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、陰イオン性または両イオン性洗剤が挙げられる（例えば、米国特許第4,404,128号および第4,261,868号参照）。適切な洗剤処方物は、米国特許第5,204,015号の実施例７に記載されたものである。本発明の修飾酵素は、洗剤組成物中での性能改良を提供し得る（従来既知の添加物と比較して）。洗浄性能改良は、典型的には、標準洗浄周期後に標準評価手法（例えば光反射率）で測定した場合の、ある種の修飾酵素感受性のしみ、例えば草または血液の洗浄増大を指す。
【００７５】
当業界は、洗浄組成物として用い得る異なる処方物に通じている。典型的組成物の他に、本発明の修飾酵素は、ネイティブまたは野生型酵素が用いられるあらゆる目的のために用い得るということは容易に理解される。したがって、これらの修飾酵素は、例えば棒状または液体石鹸用途、食器ケア処方物、コンタクトレンズ洗浄溶液または製品、ペプチド合成、飼料用途、例えば飼料添加物または飼料添加物の調製、廃棄物処理、テキスタイル用途、例えば布帛の処理に、ならびにタンパク質製造における融合開裂酵素として用い得る。
【００７６】
別の好ましい態様では、本発明の修飾酵素は、テキスタイルの処理方法に用いられる。本方法は、ある種の酵素感受性しみ（例えば草または血液のしみ）に耐性のテキスタイルを生成するのに有効な条件下で、本発明の化学修飾突然変異体酵素をテキスタイルと接触させることを包含する。本方法は、例えば絹または羊毛を処理するために用い得る。このような布帛の酵素処理は当業者には既知であり、例えばResearch Disclosure 216,034、欧州特許第134,267号、米国特許第4,533,359号および欧州特許第3,244,259号に記載されている。
【００７７】
さらに別の態様では、本発明の修飾酵素は、動物の飼料、例えば穀類ベースの飼料の調製に用いられる。酵素は、本質的にあらゆる穀類飼料に、例えば１以上のコムギ、オオムギ、トウモロコシ、サトウモロコシ、ライムギ、エン麦、ライ小麦およびコメを包含する穀類に混入し得る。穀類ベースの飼料の穀類構成成分はタンパク質の供給源を構成するが、しかし通常は、飼料中の補足的タンパク質種、例えば魚粉、肉または野菜から得られるものを含む必要はない。野菜タンパク質の供給源としては、ダイズ、ナタネ、キャノーラ、ダイズ粉、ナタネ粉およびキャノーラ粉が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
動物用飼料中の修飾酵素の含入は、飼料の粗製タンパク質値および／または消化性および／またはアミノ酸含量を増大させ得る。これは、飼料に付加される代替タンパク質源および／またはアミノ酸補足物の量の低減を可能にする。
本発明の修飾突然変異体酵素に関する使用の前記の記載は説明のためであって、任意の特別な使用制限を作製するものではない。本発明の酵素の用途は無数であり、本明細書中に列挙した用途に限定されないと理解される。
【００７９】
Ｖ．化学修飾突然変異体を含有するキットおよび製品
さらに別の態様では、本発明は、本発明の修飾突然変異体を合成しおよび／またはスクリーニングするためのキットを提供する。このようなキットは、好ましくは、本明細書中に記載されているようにシステインで置換される１以上のアミノ酸残基を有する１以上の突然変異体セリンヒドロラーゼを含む。キットは、突然変異体セリンヒドロラーゼを誘導体化するために用い得る本明細書に記載したような１以上のメタンスルホネート試薬を付加的に含み得る。このようなキットは、このような誘導体化を実施するための１以上の試薬および／または装置を付加的に含み得る。
【００８０】
さらに、キットは、本明細書中に記載したような１以上の所望の活性に関して化学修飾突然変異体酵素をスクリーニングするための適切な基質および／または反応体を含み得る。
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載した修飾突然変異体酵素の使用のためのキットを提供する。このようなキットは、好ましくは、本明細書中に記載したような１以上の化学修飾突然変異体セリンヒドロラーゼを含有する１以上の容器を含有する。このようなキットは、本明細書中に記載した１以上の反応に修飾酵素を用いるための適切な試薬および／または基質も含み得る。
【００８１】
さらに、キットは、本明細書中に記載した合成、用途または検定方法の実施に関する指示（即ち、プロトコール）を含有する使用説明資料を含み得る。したがって、例えば好ましい一態様では、使用説明資料は、本明細書中に記載した１以上のメタンスルホネート試薬を用いて突然変異体酵素を誘導体化するプロトコールを提供する。別の態様では、使用説明資料は、ペプチド結合の形成を触媒する場合の修飾酵素の使用を記載するプロトコールを提供し得る。使用説明資料は、典型的には書面または印刷物を包含するが、しかしそれらはこのようなものに限定されない。このような使用説明を収容し、それらを末端使用者に伝え得るあらゆる媒体が、本発明により意図される。このような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）等が挙げられるが、これらに限定されない。このような媒体は、このような使用説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。
【００８２】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するために提示されるが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１：エナンチオマー的に純粋なキラル助剤によるズブチリシンBacillus lentusシステイン突然変異体の共有修飾は活性の顕著な変化を引き起こす
メタンチオスルホネート試薬は、システインのチオール基との反応を介して酵素中に事実上非限定性構造的修飾を導入するために用い得る。エナンチオマー的に純粋な（Ｒ）および（Ｓ）キラル助剤メタンチオスルホネート配位子の、ズブチリシンBacillus lentusのシステイン突然変異体との共有結合は、ジアステレオマー酵素間の触媒活性のめざましい変化を誘導する。低基質近似値を用いるアミダーゼおよびエステラーゼ動的検定を用いて、化学修飾突然変異体に関するｋcat／ＫM値を確定し、活性の３倍までの差がジアステレオマー酵素間に認められた。フェニルまたはベンジルオキサゾリジノン配位子をメチレン単位により突然変異体Ｎ62Ｃと連結する炭素鎖の長さを変えると、逆転して、ジアステレオマー酵素がより活性になる。同様に、Ｓ166Ｃでフェニルオキサゾリジノンからベンジルオキサゾリジノンに配位子を変えると、逆転してジアステレオマー酵素がより活性になる。Ｓ166ＣおよびＬ217Ｃでのキラル修飾は、高エステラーゼｋcat／ＫMおよび高エステラーゼ対アミダーゼ比の両方を有するＣＭＭを生じ、ジアステレオマー酵素間の大きな差を有する。
【００８３】
この実施例では、キラル助剤から得られるエナンチオマー的に純粋なＭＴＳ配位子の、ＳＢＬのシステイン突然変異体との共有結合により誘導される酵素触媒作用における変化を説明する（合成図１，図２）。マンデル酸、ならびにグリシン、バリン、フェニルグリシン、フェニルアラニンおよびシス−１−アミノ−インダノールから構築されるいくつかのオキサゾリジノンを選択した。ホモキラルＭＴＳ配位子をＳＰＬのシステイン突然変異体と共有結合して、ジアステレオマー化学修飾突然変異体（ＣＭＭ）組を作製し、単に一部位でのキラル環境の差による酵素活性変化の観察を可能にした。この方法は、ジアステレオマー的酵素間の任意の差が単に配位子の空間的配向によるものであるため、酵素触媒作用の非常に微細且つ精密なプローブとして作用する。
【００８４】
エナンチオマー的に純粋なＭＴＳ配位子１ａ−ｉ（図２）を合成し、ＳＢＬのＮ62Ｃ、Ｓ156Ｃ、Ｓ166ＣおよびＬ217Ｃ突然変異体を化学修飾するために用いた。これらの残基を、ＳＢＬのＸ線結晶構造（Genencor International Inc. Brookhaven data base entry 1JEA of SBLでRick Bottにより解明されたＸ線構造）を基礎にして標的化した。Ｎ62Ｃは、Ｈｉｓ−64近くのＳ2ポケット（Schechter and Berger（1967）「Biochem. Biophys. Res. Commun.」27:157-162による名称）中に存在する。Ｓ156ＣおよびＳ166Ｃは、Ｓ1ポケットの底に存在する。しかしながら、Ｓ156Ｃは、露呈された表面にあり、Ｓ166Ｃはポケット内方に隠蔽される。Ｌ217Ｃは、脱離基が結合される場所であるＳ1’に見出される。それらの特性を調べ、選択性のあらゆる変化をプローブするために、これら新規のジアステレオマー的ＣＭＭに関して、アミダーゼおよびエステラーゼ活性の動的検定を実行した。
【００８５】
結果
ＭＴＳ試薬１ａ−ｉの合成
マンデル酸塩ベースのＭＴＳ配位子の合成のために、（Ｒ）−マンデル酸、（Ｒ）−２を、ＮａＯＨ／Ｈ2Ｏ中でＭｅ2ＳＯ4でＯ−メチル化して（Reeve and Christoffel（1950）「J. Am. Chem. Soc.」72:1480-1483）、（Ｒ）−３を収率37％で得た（合成図２）。酸、（Ｒ）−３を、ＴＨＦ中のボランを用いて収率72％で還元して、アルコール、（Ｒ）−６として、これを定量的にＣＨ2Ｃｌ2中でメシレート、（Ｒ）−８に転換した。メシレートを、還流アセトン中のＬｉＢｒの作用により臭化物、（Ｒ）−１０（73％）に転換して、ＤＭＦ中のＮａＳＳＯ2ＣＨ3を用いて、臭化物、（Ｒ）−１０から収率84％でメタンチオスルホネート（Ｒ）−１ａを生成した。（Ｓ）−マンデル酸から同様の方法で、メタンチオスルホネート（Ｓ）−１ａを製造した（合成図２、図３参照）。
【００８６】
同様のアプローチは、（Ｒ）−１ｂの合成を可能にした（合成図２）。（Ｒ）−マンデル酸（Ｒ）−２をエステル化して（Ｒ）−４を生じ、これをそのメトキシメチルオキシエーテル、（Ｒ）−５として、優れた収率（２工程に関して90％）で保護化した。メチルエーテル類似体に関するのと同一条件を用いて、エステル（Ｒ）−５をＬｉＢＨ4で還元してアルコール（Ｒ）−７（98％）として、これをメシレート（Ｒ）−９に、次に臭化物（Ｒ）−１１（２工程に関して80％）に転換した。この臭化物をＤＭＦ中でＮａＳＳＯ2ＣＨ3と２日間反応させて、（Ｒ）−１２を収率61％で得た。ＴＦＡ／Ｈ2Ｏの作用によりアルコールを脱保護化して、ＭＴＳ試薬（Ｒ）−１ｂを収率82％で得た。（Ｓ）−マンデル酸から同様の方法で、メタンチオスルホネート（Ｓ）−１ｂを製造した。
【００８７】
オキサゾリジノンベースのメタンチオスルホネート配位子の合成を合成図３に示す（図４）。オキサリジノンは、不斉合成におけるキラル助剤として広範に用いられてきたし、不斉誘導の程度は、アルキル化からアルドール反応からDiels-Alder付加までの範囲の化学的形質転換において優れている（Gage and Evans（1990）「Org. Synth.」, 68:77-91; Ager et al.（1997）「Aldrichimica Acta」, 30:3-12）。市販のオキサゾリジノン、１３−（Ｒ）−１６は、ＤＭＳＯ／ＫＯＨ中の１，３−ジブロムプロパンまたは１，２−ジブロムエタンでアルキル化されて（Isele and Luttringhaus（1971）「Synthesis」, 266-268）、臭化物、１７−（Ｒ）−２２を生じ、そして２工程に亘って収率38〜61％でメタンチオスルホネート、１ｃ−（Ｒ）−１ｈに転換される。（Ｓ）オキサゾリジノンから同一方法で、ＭＴＳ試薬（Ｓ）−１ｄ−（Ｓ）−１ｈを製造した。
【００８８】
シス−１Ｒ−アミノ−２Ｓ−インダノール、（Ｒ）−２３の（１Ｒ，２Ｓ）オキサゾリジノン、（Ｒ）−２４を、ＣＨ2Ｃｌ2中での（Ｒ）−２３、トリホスゲンおよびＥｔ3Ｎの反応により、定量的収率で調製した（合成図４、図５）（Sibi et al.（1995）「Tetrahedron Lett.」, 36:8961-8964）。次に（Ｒ）−２４を１，３−ジブロムプロパンでアルキル化して、臭化物、（Ｒ）−２５を製造し、これをＮａＳＳＯ2ＣＨ3と反応させて、（Ｒ）−１ｉを得た（２工程に関して収率49％）。同様の方法で、シス−１Ｓ−アミノ−２Ｒ−インダノールからＭＴＳ試薬（Ｓ）−１ｉを合成した。
【００８９】
酵素動的検定
前記と同様に生成したズブチリシン突然変異体を、ホモキラルＭＴＳ試薬で修飾した。 新規のＣＭＭの特性化を、それらの活性部位のＰＭＳＦ滴定（Hsia et al.（1996）「Anal. Biochem.」, 242:221-227）、残留チオール（すべての場合に≦2％）のEllman滴定（Ellman et al.（1961）「Biochem. Pharmacol.」, 7:88-95）、ＦＰＬＣ精製（すべての場合に分子量±6質量単位）後のＥＳ−ＭＳにより、そしてすべてが１つの帯域を示した非変性勾配ゲルにより実施した。
【００９０】
アミダーゼおよびエステラーゼ動的検定を、これらの新規のジアステレオマー的ＣＭＭに関して実行した。特異性定数（ｋcat／ＫM）を得るために低基質濃度を用いて両検定を実行し、これによりＣＭＭの性能についての考えを得て、ジアステレオマー性酵素の比較が可能になった（低基質濃度で、（ｋcat／ＫM）＝ｖinitial／［酵素］［基質］）。結果を表１に示す。
【表１】
0004932990.tif 000002
【００９１】
考察
分子の一ジアステレオ面を遮断し、したがって他の面に強いて反応させて、単一ジアステレオマーを生成させるための不斉有機合成において、キラル助剤が用いられる。エナンチオマー的に純粋な（Ｒ）および（Ｓ）キラル助剤ＭＴＳ配位子の、ＳＢＬシステイン突然変異体との共有結合は、酵素活性に顕著な変化を引き起こした。これらの変化は、ジアステレオマー性酵素を比較した場合、単に配位子立体中心での空間配向の差のためであると思われる。ジアステレオマー酵素間の触媒活性における異常な差は、図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃで比較し得る。
【００９２】
Ｎ62Ｃ
Ｎ62Ｃ  ＣＭＭのうち、Ｎ62Ｃ−ｅ組のジアステレオマーＣＭＭは、高触媒活性およびジアステレオマー間の大差の両方を示すことに関して顕著である。Ｎ62Ｃ−（Ｒ）−ｅは、優れたアミダーゼ（ＷＴより2.2倍良好）であり、そして優れたエステラーゼ（ＷＴより3.9倍良好）でもある。さらに、（Ｓ）−ジアステレオマーは良好なアミダーゼ（308 mM-1s-1）およびエステラーゼ（6564 mM-1s-1）であるが、しかし（Ｒ）−ジアステレオマーと同様に良好であるというわけではない。したがって、２つのジアステレオマーＣＭＭ間には、エステラーゼ性能（（Ｒ）は（Ｓ）より2.1倍良好である）に関して大差があり、アミダーゼ活性において中等度の差がある。同時に、アキラル修飾突然変異体（Ｎ62Ｃ−ｅ）はＷＴと同様に良好なアミダーゼ（181 mM-1s-1）に過ぎず、Ｎ62Ｃ−（Ｒ）−ｅより不十分なエステラーゼ（9185 mM-1s-1）である。これらの観察は、オキサゾリジノン環の４つの位置でのフェニル基の付加が酵素活性を増大するだけでなく、その付加は（Ｒ）−フェニルでなければならないことを示す。したがって、Ｎ62Ｃでの（Ｒ）−ｅ修飾は、独自の方法で酵素に影響を及ぼしている。３つの酵素、Ｎ62Ｃ−ｃおよびＮ62Ｃ−ｅ組に関して個々のｋcatおよびＫM値を測定し、これらの結果を、比較のためのＷＴ値とともに、表２に示す。低基質近似値を用いた動的検定はｋcat／ＫM値をわずかに低く見積もるが、しかしジアステレオマー酵素間の触媒活性の比は依然としてほぼ同一であるということは明らかである。
【表２】
0004932990.tif 000003
【００９３】
Ｎ62Ｃの（Ｒ）−１ｅ、（Ｓ）−１ｅおよび１ｃによる修飾は、ＫMを低減し、これは基質の良好な結合を示し、そしてアミダーゼ活性の場合には、これらのＮ62Ｃ  ＣＭＭはＷＴと同様のｋcat値を有するために、ｋcat／ＫM増大源であるというのがこのＫM作用である。しかしながら、これらの酵素に関するエステラーゼ活性の変化は、より複雑である。Ｎ62Ｃ−（Ｒ）−ｅおよびＮ62Ｃ−ｃは、ＷＴより有意に高いｋcatと低いＫM値を示し、全体的にＷＴよりそれぞれ5.4倍および3.7倍良好なエステラーゼ活性を示す。Ｎ62Ｃ−（Ｓ）−ｅＣＭＭは、これらの特性を示さない。それは基質を非常に良好に結合せず、低基質濃度でその最大代謝回転の半分を達成する（ＫM＝0.15 mM）が、しかし、そのｋcat（1106 s-1）はＷＴよりはるかに低い。したがって、オキサゾリジノン上の４Ｒ−フェニル置換は、ｋcatを増大し、ＫMを低下することにより、全体的触媒性能を改良すると考えられる。
【００９４】
これらの結果に基づいて改良するための試みにおいて、エチル結合フェニルおよびベンジルオキサゾリジノンＮ62Ｃ  ＣＭＭを調製した（Ｎ62Ｃ−ｇおよびＮ62Ｃ−ｈ）。意外なことに、修飾が最良の酵素を作るという逆転が認められた。プロピル結合ＣＭＭ（Ｎ62Ｃ−ｅおよびＮ62Ｃ−ｆ）の場合、（Ｒ）修飾は、フェニルおよびベンジル基の両方に関して、最良のアミダーゼおよびエステラーゼであった。しかしながら、（Ｓ）修飾は、これらの同一基がエチル結合された場合に、最良であった。これは、それぞれ第二級アルコール、β−分枝鎖第一級アルコールおよびγ−分枝鎖第一級アルコールに関して、（Ｓ）から（Ｒ）へ、そして（Ｓ）に戻る、ＷＴにより触媒されるエステル化転移反応に関する基質選択の裏返りを思い起こさせる（Lloyd et al.（1998）「Tetrahedron:Asymmetry」, 9:551-561）。しかしながら、本発明の状況では、基質は変化しない。むしろ、基質を生成物に転換する酵素の能力は、共有結合配位子の立体中心、ならびに酵素主鎖と立体中心との間の連結に存在する結合数によって変えられる。
【００９５】
Ｓ166Ｃ
Ｓ166Ｃでの修飾は、活性に大差を有する多数組のジアステレオマーＣＭＭを生成した。主として、１ａ、１ｂ、１ｆ、１ｇ、１ｈおよび１ｉ修飾は、ジアステレオマーＣＭＭ間に２倍より大きい変異を有するＣＭＭを生成した。任意組のＣＭＭの最大差は、3.2の［ｋcat／ＫM（Ｒ）］／［ｋcat／ＫM（Ｓ）］比を有するＳ166Ｃ−ｂを用いて達成された。特に、Ｓ166Ｃでのフェニルおよびベンジルオキサゾリジノンによる修飾は、Ｎ62Ｃでの同一修飾と同様の方法で、ジアステレオマーＣＭＭがより大きい触媒活性を有するよう逆転させる。しかしながら、Ｓ166Ｃでは、逆転は、オキサゾリジノン配位子の立体中心に直接メチレン単位を付加することにより引き起こされる。（Ｒ）−フェニルオキサゾリジノン修飾（（Ｒ）−ｅおよび（Ｒ）−ｇ）は、（Ｓ）類似体より良好なＳ166Ｃ  ＣＭＭを生成するが、（Ｓ）−ベンジルオキサゾリジノン（（Ｓ）−ｆおよび（Ｓ）−ｈ）は（Ｒ）より有意に良好なＳ166Ｃ  ＣＭＭを生じる。
【００９６】
これらのＣＭＭはどれも、ＷＴ活性より有意に大きい活性を示さなかったが、Ｓ166Ｃ−（Ｓ）−ｇおよびＳ166Ｃ−（Ｓ）−ｉは良好なエステラーゼ（それぞれ4069 mM-1s-1および4556 mM-1s-1）であり、110および96という高エステラーゼ／アミダーゼ比を有し、それらをペプチド結合触媒の良好な候補とする（図７Ａ）。Ｓ166Ｃ−（Ｓ）−ａおよびＳ166Ｃ−（Ｓ）−ｂは、Ｓ166Ｃ（４）およびＷＴに比して相対的に高いエステラーゼ／アミダーゼ比（48および62）を有するが、しかしこれら２つのＣＭＭは非常に貧弱なエステラーゼである。面白いことに、Ｓ166Ｃでのキラル修飾に関しては、（Ｓ）−配位子は一貫して、（Ｒ）−配位子より高いエステラーゼ対アミダーゼ比を有するＣＭＭを生じるが、但し、１ｆの場合は、２つのジアステレオマー酵素は同様の比を有する。
【００９７】
Ｌ217Ｃ
Ｌ217Ｃでのキラル修飾は、それらの高エステラーゼ／アミダーゼ比のために、ペプチド結合触媒として用い得る多数のＣＭＭを生成した（図７Ｂ）。Ｌ217Ｃ−（Ｓ）−ｄは、非常に高いエステラーゼｋcat／ＫM（9296 mM-1s-1）および低アミダーゼ値（104 mM-1s-1）を有して、89という相対的に高いエステラーゼ／アミダーゼ比をそれに与える。Ｌ217Ｃ−（Ｒ）−ｆは、88という同様の比および良好なエステラーゼｋcat／ＫM（6435 mM-1s-1）を有する。Ｌ217Ｃは基（109）で最高比を有するが、これはそのより低いエステラーゼｋcat／ＫM（5540 mM-1s-1）により緩和される。したがって、これらのＣＭＭは、エステルアシル供与体およびアミン求核性物質からのペプチド結合の形成を非常に効率的に触媒するはずである。ジアステレオマーＣＭＭ間に大差は観察されなかった。
【００９８】
Ｓ156Ｃ
１ａ、１ｂおよび１ｅによるＳ156Ｃの修飾は、高活性またはジアステレオマー間の大差を有する酵素を明示しなかった。これは、Ｓ156Ｃ側鎖が表面に露呈されいるため、それゆえ配位子修飾体はポケットから指示するかまたはポケットと密接に関連していないので、意外ではない。この理由のために、空間的配向のためと予測される種類の微妙な変異はＳ156Ｃで見出されなかった。その結果、さらなる修飾は、この変異体についてはしなかった。
【００９９】
結論
エナンチオマー的に純粋なＭＴＳ配位子によるシステイン突然変異体の修飾は、酵素活性におけるかなりの変化をもたらすということが判明している。低基質近似値を用いたアミダーゼおよびエステラーゼ動的検定では、ジアステレオマー酵素間の活性に3倍までの差が認められた。Ｎ62Ｃ−（Ｒ）−ｅは、特に顕著であった。そのアミダーゼｋcat／ＫMは、そのジアステレオマーＮ62Ｃ−（Ｓ）−ｅより1.56倍良好であり、そしてＷＴより3倍良好であった。さらに、Ｎ62Ｃ−（Ｒ）−ｅのエステラーゼｋcat／ＫMは、そのジアステレオマーより2.6倍良好であり、そしてＷＴより5.4倍良好であった。フェニルまたはベンジルオキサゾリジノン配位子を連結する炭素鎖の長さをメチレン単位によりＮ62Ｃに変えると、逆転して、ジアステレオマー酵素はより活性になる。同様の方法で、Ｓ166Ｃでのフェニルからベンジルオキサゾリジノン配位子への変更は、逆転して、ジアステレオマー酵素はより活発になる。本論文中で考察したＣＭＭのペプチド結合およびエステル転移能力を調べる研究が進行中である。さらに、荷電基を含有するエナンチオマー的に純粋な配位子のＳＢＬ突然変異体との結合を追跡中である。
【０１００】
実験
ズブチリシンBacillus lentusのＮ62Ｃ、Ｌ217Ｃ、Ｓ166ＣおよびＳ156Ｃ突然変異体を、一般的方法により調製し、精製した（Stabile et al.（1996）「Bioorg. Med. Chem. Lett.」6:2501-2506）。パーキン−エルマーラムダ２分光光度計で、分光分析的測定を実施した。
【０１０１】
Electrothermal IA9000シリーズデジタル融点装置を用いて融点を測定したが、未訂正である。パーキン−エルマー243Ｂ旋光計を用いて、光学的回転データを得た。化合物を、それらの1H（200 MHz）および13C（50.3 MHz）ＮＭＲスペクトルにより同定し、Varian GeminiＮＭＲ分光計を用いて走行させて、ＥＩスペクトルに関してはMicromass 70-250S（二重焦点）質量分析計を、ＦＡＢスペクトルに関してはMicromass ZAB-SEを用いて、ＨＲＭＳデータを得た。エナンチオマー的過剰量のメタンチオスルホネート（（Ｒ）−１ａ、（Ｓ）−１ａ、（Ｒ）−１ｂおよび（Ｓ）−１ｂ）を、ヘキサン：イソプロパノール溶離系を用いたChiralcel OJカラムでのＨＰＬＣにより測定した。エナンチオマー的過剰量（ｅｅ）の臭化物（（Ｒ）−18、（Ｓ）−18、（Ｒ）−19、（Ｓ）−19、（Ｒ）−20、（Ｓ）−20、（Ｒ）−21、（Ｓ）−21、（Ｒ）−22、（Ｓ）−22、（Ｒ）−25および（Ｓ）−25）を、同一溶離系を用いたChiralcel ODカラムでのＨＰＬＣにより測定した。
【０１０２】
メタンチオスルホネート試薬の調製
（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−エチルメタンチオスルホネート（（Ｒ）−１ａ）
（Ｒ）−マンデル酸（4.678 g, 30.75 mmol）を6 MのＮａＯＨ（50 mL, 300 mmol）中に溶解し、ジメチルスルフェート（14.6 mL, 154 mmol）を１時間に亘って添加し、温度を50℃に保持した。さらに１時間撹拌後、Ｈ2Ｏ（50 mL）を添加し、溶液を12 MのＨＣｌでｐＨ1の酸性にした。混合物をＮａＣｌを用いて飽和させて、ＥｔＯＡｃ（3 x 100 mL）で抽出し、抽出物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。減圧下で濾過および蒸発後、固体を微粉砕して、ヘキサン（100 mL）中で15分間還流し、熱濾過した。不溶性（Ｒ）−マンデル酸（2.71 g, 58％）を回収し、減圧下でヘキサンを蒸発させて、（Ｒ）−２−メトキシ−マンデル酸、（Ｒ）−３（1.91 g, 37％）を生成し、これを次の工程に直接用いた。
【０１０３】
（Ｒ）−３（1.91 g, 11.46 mmol）をＡｒ下に置いて、ドライＴＨＦ（15 mL）を添加した。その結果生じた溶液を0℃に冷却して、1 MＢＨ3・ＴＨＦ（17.2 mL, 17.2 mmol）を１分間に亘って添加した。氷浴を除去し、反応物を20℃に温めた。一夜攪拌後、反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（200 mL）／飽和水性ＮａＨＣＯ3（100 mL）の撹拌混合物に注ぎ入れた。水性層をＮａＣｌで飽和して、ＥｔＯＡｃ（3 x 150 mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ分画を結合してＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下で濾過し、蒸発させた。段階勾配（25％ＥｔＯＡｃ／75％ヘキサン〜33％ＥｔＯＡｃ／67％ヘキサン）を用いてフラッシュクロマトグラフィーを実行して、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−１−エタノール、（Ｒ）−６（1.26 g, 72％）を無色油として得た。［α］25D＝-114.6（ｃ1.27, ＥｔＯＨ）［Aller et al.（1995）「J. Org. Chem.」, 60:4449-4460）、［α］25D＝-117.3（ｃ1.006, ＥｔＯＨ）］；ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、文献（Barrett and Rys（1995）「Chem. Soc. Perkin Trans.」1:1009-1017）と同一であった。
【０１０４】
（Ｒ）−６（1.25 g, 8.213 mmol）およびＥｔ3Ｎ（2.29 mL, 16.43 mmol）をＡｒ下でＣＨ2Ｃｌ2（20 mL）中に溶解し、0℃に冷却した。ＭｓＣｌ（0.95 mL, 12.27 mmol）を１分間に亘って添加し、10分間撹拌した。氷浴を除去し、溶液を一夜攪拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（200 mL）／飽和水性ＮａＨＣＯ3（100 mL）中に注ぎ入れ、撹拌して、ＮａＣｌで飽和した。水性層をＥｔＯＡｃ（3 x 150 mL）で抽出し、結合有機分画をＭｇＳＯ4で乾燥した。減圧下で濾過、蒸発後、粗製生成物を、50％ＥｔＯＡｔ／50％ヘキサンを用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−１−エチルメタンスルホネート、（Ｒ）−８を定量的に（1.88 g）、無色油として得た。［α］25D＝-97.4（ｃ1.36, ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.30-7.40（5H,m）,4.47-4.52（1H,m）,4.20-4.36（2H,m）,3.30（3H,s）,2.99（3H,s）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ136.6, 128.8, 126.9, 81.5, 72.7, 57.0, 37.6.
【０１０５】
（Ｒ）−８（1.88 g, 8.160 mmol）およびＬｉＢｒ（3.54 g, 40.76 mmol）を、新鮮蒸留アセトン（20 mL）中でＣａＣｌ2乾燥管下で20分間還流した。冷却、蒸発して減圧下で乾燥後、ヘキサン（30 mL）を添加し、混合物を濾過した。濾液を減圧下で蒸発させ、段階勾配（ヘキサン〜5％ＥｔＯＡｔ／95％ヘキサン）を用いて、粗製生成物のフラッシュクロマトグラフィーを実行して、（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−１−エチルブロミド、（Ｒ）−10（1.284 g, 73％）を無色油として得た。［α］25D＝-71.6（ｃ1.26，ＭｅＯＨ）［Casey et al.（1969）「Am. Chem. Soc.」, 91:2789-2790、（Ｓ）エナンチオマーに関して、［α］25D＝＋73（ＭｅＯＨ）］；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.31-7.40（5H,m）,4.36-4.42（1H,m）,3.45-3.60（2H,m）,3.32（3H,s）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ139.0, 128.6,128.5, 126.7, 83.4,  57.2, 36.2；ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ9Ｈ11ＯＢｒに関する計算値、213.9993；実測値、213.9988.
【０１０６】
（Ｒ）−10（1.28 g, 5.951 mmol）およびナトリウムメタンチオスルホネート（1.04 g, 7.752 mmol）を、Ａｒ下でドライＤＭＦ（10 mL）中に溶解して、70℃に加熱した。24時間撹拌後、ＤＭＦを減圧下で蒸発させた。粗製生成物をＥｔＯＡｃ中に溶解し、濾過して、濾液を減圧下で蒸発させた。段階勾配（5％ＥｔＯＡｔ／95％ヘキサン〜33％ＥｔＯＡｃ／67％ヘキサン）を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより表題化合物（Ｒ）−１ａ（1.235 g, 84％,ｅｅ≧98％）を無色油として得た。［α］25D＝-90.4（ｃ0.94, ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.31-7.39（5H,m）,4.42-4.48（1H,m）,3.41-3.46（2H,m）,3.27（3H,s）, 3.24（3H,s）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ139.0, 128.7, 128.5, 126.6,  82.3,  56.9, 50.3, 43.4；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ10Ｈ14Ｏ3Ｓ2＋Ｈに関する計算値、247.0463；実測値、247.0470.
【０１０７】
（Ｓ）−２−メトキシ−２−フェニル−エチルメタンチオスルホネート（（Ｓ）−１ａ）
（Ｒ）−３と同様の方法で、（Ｓ）−３を調製した。（Ｓ）−マンデル酸（4.00 g, 26.29 mmol）から（Ｓ）−１（1.301 g, 30％）を得た。
（Ｒ）−６と同様の方法で、（Ｓ）−６を調製した。（Ｓ）−３（1.20 g, 7.221 mmol）から（Ｓ）−６（0.903 g, 82％）を得た。そのＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−６と同一であった。［α］25D＝+115.0（ｃ1.26, ＥｔＯＨ）。
（Ｒ）−８と同様の方法で、（Ｓ）−８を調製した。（Ｓ）−６（0.883 g, 5.802 mmol）から（Ｓ）−８（1.33 g, 100％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−８と同一であった。［α］25D＝+95.0（ｃ1.70, ＣＨＣｌ3）。
【０１０８】
（Ｒ）−10と同様の方法で、（Ｓ）−10を調製した。（Ｓ）−８（1.33 g, 5.773 mmol）から（Ｓ）−10（1.02 g, 81％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−10と同一であった。［α］25D＝+72.4（ｃ1.15,ＭｅＯＨ）。
（Ｒ）−１ａと同様の方法で、（Ｓ）−１ａを調製した。（Ｓ）−10（1.00 g, 4.649 mmol）から（Ｓ）−１ａ（0.961 g, 84％,ｅｅ≧98％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−１ａと同一であった。［α］25D＝+93.8（ｃ1.002, ＣＨＣｌ3）；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ10Ｈ14Ｏ3Ｓ2＋Ｈに関する計算値、247.0463；実測値、247.0474.
【０１０９】
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルメタンチオスルホネート（（Ｒ）−１ｂ）
（Ｒ）−マンデル酸（2.568 g, 16.87 mmol）および２，２−ジメトキシプロパン（5.1 mL, 41.48 mmol）をＭｅＯＨ（100 mL）中に溶解し、12 MのＨＣｌ（100 mL）を添加した。その結果生じた溶液をＣａＣｌ2管下で20時間撹拌し、減圧下で蒸発、乾燥させた。ＥｔＯＡｃ（100 mL）および飽和水性ＮａＨＣＯ3（100 mL）を添加し、水性相をＥｔＯＡｃ（3 x 100 mL）で抽出した。有機分画をＭｇＳＯ4で乾燥させ、減圧下で蒸発後、（Ｒ）−メチルマンデレート、（Ｒ）−４を定量的に（2.78 g）白色固体として得たが、これは次の工程のために十分な純度を有した。
【０１１０】
（Ｒ）−４（1.695 g, 10.20 mmol）およびフーニッヒの塩基（Hunig's base）（6.22mL, 35.70mmol）をＡｒ下で０℃でドライＣＨ2Ｃｌ2（25 mL）中に溶解した。ＭＯＭ−Ｃｌ（2.32 mL, 30.55 mmol）を１分間に亘って溶液に滴下し、反応物を20℃で16時間撹拌した。溶液を、ＥｔＯＡｃ（200 mL）／氷／3 MＨＣｌ（100 mL）の混合物に注ぎ入れ、5分間撹拌した。水性層をＥｔＯＡｃ（3 x 150 mL）で抽出し、結合有機分画をＭｇＳＯ4で乾燥させた。段階勾配（10％ＥｔＯＡｃ／90％ヘキサン〜25％ＥｔＯＡｃ／75％ヘキサン）を用いてフラッシュクロマトグラフィーを実行して、（Ｒ）−２−メチルオキシメトキシメチルマンデレート、（Ｒ）−５（1.935 g, 90％）を無色油として得た。［α］25D＝-133.5（ｃ1.41, ＣＨＣｌ3）［Barrett and Rys（1995）「Chem. Soc. Perkin Trans.」1:1009-1017）、（Ｓ）エナンチオマーに関しては、［α］25D＝+5.9（ｃ1.11, ＣＨＣｌ3）］；ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、文献（Barrett and Rys（1995）「Chem. Soc. Perkin Trans.」1:1009-1017）と同一であった。
【０１１１】
（Ｒ）−５（1.924 g, 9.152 mmol）をＡｒ下で0℃でドライＴＨＦ（50 mL）中に溶解して、ＬｉＢＨ4（0.498 g, 22.87 mmol）を添加した。反応物を20℃で16時間撹拌し、次にＥｔＯＡｃ（200 mL）／飽和水性ＮａＨＣＯ3（150 mL）中に注ぎ入れた。反応物を沈澱させた後、水性層をＥｔＯＡｃ（3 x 200 mL）で抽出し、結合有機分画をＭｇＳＯ4で乾燥した。粗製生成物を、段階勾配（25％ＥｔＯＡｔ／75％ヘキサン〜33％ＥｔＯＡｃ／67％ヘキサン）を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（Ｒ）−２−メチルオキシメトキシ−２−フェニル−１−エタノール、（Ｒ）−７（1.63 g, 98％）を無色油として得た。［α］25D＝-189.9（ｃ1.72, ＣＨＣｌ3）；［Ko and Eliel（1986）「J. Org. Chem.」, 51:5353-5362）、（Ｓ）エナンチオマーに関しては、［α］25D＝+196（ｃ2.67, ＣＨＣｌ3）］；ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、文献（Ko and Eliel（1986）「J. Org. Chem.」, 51:5353-5362）と同一であった。
【０１１２】
（Ｒ）−８と同様の方法で、（Ｒ）−２−メチルオキシメトキシ−２−フェニル−１−エチルメタンスルホネート、（Ｒ）−９を調製した。（Ｒ）−７（1.530 g, 8.396 mmol）を定量的に（Ｒ）−９（2.175 g）に転換した。［α］25D＝-141.6（ｃ1.10,ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.35（5H,s）,4.89-4.95（1H,m）,4.56-4.65（2H,ABq）,4.25-4.40（2H,m）,3.36（3H,s）,2.95（3H,s）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ136.6, 128.7, 127.1, 94.4, 75.5, 72.3, 55.6, 37.4.
【０１１３】
（Ｒ）−10と同様の方法で、（Ｒ）−２−メチルオキシメトキシ−２−フェニル−１−エチルブロミド、（Ｒ）−11を調製した。（Ｒ）−９（2.035 g, 7.817 mmol）を（Ｒ）−11（1.536 g, 80％）に転換した。［α］25D＝-130.9（ｃ1.29,ＭｅＯＨ）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.35（5H,s）,4.82-4.88（1H,m）,4.57-4.66（2H,ABq）,3.49-3.65（2H,m）,3.43（3H,s）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ139.0, 128.6, 128.5, 126.9, 94.5, 77.7, 55.8, 36.2；ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ10Ｈ13Ｏ2Ｂｒに関する計算値、2４４.００９９；実測値、244.0091.
【０１１４】
（Ｒ）−１ａと同様の方法で、（Ｒ）−２−メチルオキシメトキシ−２−フェニル−１−エチルメタンチオスルホネート、（Ｒ）−12を調製した。（Ｒ）−10（1.458 g, 5.948 mmol）を（Ｒ）−12（1.005 g, 61％）に転換した。［α］25D＝-149.6（ｃ2.23,ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.36（5H,s）,4.88-4.94（1H,m）,4.56（2H,s）,3.48-3.51（2H,m）,3.40（3H,s）,3.23（3H,s）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ139.0, 128.7, 128.6, 126.9, 94.3, 76.3, 55.9, 50.5, 43.4；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ11Ｈ16Ｏ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、277.0569；実測値、277.0600.
【０１１５】
（Ｒ）−12（0.864 g, 3.126 mmol）をＨ2Ｏ（10 mL）中に懸濁し、トリフルオロ酢酸（10 mL）を0℃で添加した。溶液を20℃で40時間撹拌し、減圧下で揮発性物質を蒸発させて、ほぼ乾燥させた。Ｈ2Ｏ（20 mL）を添加し、懸濁液を蒸発して乾燥させた。最後に、トルエン（50 mL）を添加し、溶液を蒸発して乾燥させた。粗製生成物を、段階勾配（25％ＥｔＯＡｔ／75％ヘキサン〜33％ＥｔＯＡｃ／67％ヘキサン）を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（Ｒ）−１ｂ（0.689 g, 95％,ｅｅ≧98％）を白色結晶として得た。分析試料をエーテル／ヘキサンから再結晶した。融点48.5〜49.5℃；［α］25D＝-63.1（ｃ0.89, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）3470 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.3８（5H,ｓ）,5.00-5.06（1H,m）,3.44-3.49（2H,m）,3.26（3H,s）,2.60（1H,br s）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ141.5, 128.7,128.5, 125.9, 73.0, 50.5, 44.8；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ9Ｈ12Ｏ3Ｓ2＋Ｈに関する計算値、233.0307；実測値、233.0326.
【０１１６】
（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチルメタンチオスルホネート（（Ｓ）−１ｂ）
（Ｒ）−４と同様の方法で、（Ｓ）−４を調製した。（Ｓ）−マンデル酸（3.176 g, 20.87 mmol）から粗製（Ｓ）−４（3.45 g, 定量的）を得て、これを次の工程に直接用いた。
（Ｒ）−５と同様の方法で、（Ｓ）−５を調製した。（Ｓ）−４（3.45 g, 20.76 mmol）から（Ｓ）−５（3.014 g, 69％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−5と同一であった。［α］25D＝+131.6（ｃ1.74, ＣＨＣｌ3）。
【０１１７】
（Ｒ）−７と同様の方法で、（Ｓ）−７を調製した。（Ｓ）−５（2.995 g, 14.25 mmol）から（Ｓ）−７（2.565 g, 99％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−７と同一であった。［α］25D＝+193.2（ｃ1.30, ＣＨＣｌ3）。
（Ｒ）−９と同様の方法で、（Ｓ）−９を調製した。（Ｓ）−７（2.467 g, 13.54 mmol）から（Ｓ）−９（3.486 g, 99％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−９と同一であった。［α］25D＝+135.5（ｃ1.40,ＣＨＣｌ3）。
【０１１８】
（Ｒ）−11と同様の方法で、（Ｓ）−11を調製した。（Ｓ）−９（3.486 g, 13.39 mmol）から（Ｓ）−11（2.822 g, 86％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−11と同一であった。［α］25D＝+125.8（ｃ1.21,ＭｅＯＨ）。
（Ｒ）−12と同様の方法で、（Ｓ）−12を調製した。（Ｓ）−11（0.863 g, 3.521 mmol）から（Ｓ）−12（0.541 g, 56％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−12と同一であった。［α］25D＝+153.4（ｃ2.43,ＣＨＣｌ3）。
【０１１９】
（Ｒ）−１ｂと同様の方法で、表題化合物（Ｓ）−１ｂを調製した。（Ｓ）−12（0.526 g, 1.903 mmol）から（Ｓ）−１ｂ（0.419 g, 95％,ｅｅ≧98％）を白色結晶として得て、これをエーテル／ヘキサンから再結晶した。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−１ｂと同一であった。融点47.0〜48.0℃；［α］25D＝+63.3（ｃ1.676, ＣＨＣｌ3）；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ9Ｈ12Ｏ3Ｓ2＋Ｈに関する計算値、233.0307；実測値、.
【０１２０】
Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−２−オキサゾリジノン（１ｃ）
ドライＤＭＳＯ（5 mL）中の１，３−ジブロムプロパン（6.4 mL, 63.05 mmol）の冷却溶液（15〜20℃）に、ＫＯＨ粉末（0.920 g, 16.40 mmol）を添加した。２−オキサゾリジノン（1.100 g, 12.63 mmol）を5分間に亘って少量で添加し、反応物を20℃で4時間撹拌した。混合物をエーテル（100 mL）およびＨ2Ｏ（20 mL）で稀釈し、水性相をエーテル（3 x 50 mL）で抽出した。ＭｇＳＯ4で乾燥後、段階勾配（25％ＥｔＯＡｔ／75％ヘキサン〜50％ＥｔＯＡｃ／50％ヘキサン）を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｎ−（３’−ブロムプロピル）−２−オキサゾリジノン、１７（1.48 g, 56％）を得た。ＩＲ（正味）1747 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ4.30（2H,t,J=7.2 Hz）,3.57（2H,t,J=8.2 Hz）,3.33-3.43（4H,q）,2.03-2.17（2H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.4, 61.7, 45.0, 43.0, 30.4, 29.9；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ6Ｈ10ＮＯ2Ｂｒに関する計算値、207.9972；実測値、207.9957.
【０１２１】
（Ｒ）−１ａと同様の方法で、表題化合物１ｃを調製した。１７（1.316 g, 6.325 mmol）を１ｃ（1.013g, 67％）に転換した。それを、ＥｔＯＡｃ／エーテルから再結晶した。融点36〜37.5℃；ＩＲ（正味）1748 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ4.32（2H,t,J=7.4 Hz）,3.56（2H,t,J=8.4 Hz）,3.35（2H,t,J=6.7 Hz）,3.31（3H,s）,3.14（2H,t,J=7.0 Hz）,1.96-2.10（2H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.5, 61.7, 50.4, 44.6, 42.9, 33.2, 27.6；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ7Ｈ13ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、240.0364；実測値、240.0365.
【０１２２】
Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−イソプロピル−２−オキサゾリジノン（（Ｒ）−１ｄ）
１７と同様の方法で、Ｎ−（３’−ブロムプロピル）−（Ｒ）−４−イソプロピル−２−オキサゾリジノン（Ｒ）−18を調製した。（Ｒ）−４−イソプロピル−２−オキサゾリジノン（0.518 g, 4.011 mmol）から、（Ｒ）−18（0.626 g, 62％、ｅｅ≧98％）を無色油として得た。［α］25D＝-2.7（ｃ1.87, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1748 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ4.20（1H,t,J=8.8 Hz）,4.04（1H,dd,J=9.0, 5.3）,3.69-3.77（1H,m）,3.47-3.58（1H,m）,3.40（2H,t,J=6.5 Hz）, 3.06-3.20（1H,m）,2.25-1.99（3H,m）,0.86（6H,t,J=7.4Hz）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.3, 62.7,59.6, 40.6, 30.2, 27.7, 17.5, 14.2；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ9Ｈ16ＮＯ2Ｂｒに関する計算値、250.0441；実測値、250.0419.
【０１２３】
（Ｒ）−１ａと同様の方法で、表題化合物（Ｒ）−１ｄを調製した。（Ｒ）−18（0.530 g, 2.119 mmol）を（Ｒ）−１ｄ（0.492g, 83％）に転換した。［α］25D＝-22.3（ｃ1.37, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1744 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ4.25（1H,t,J=9.0 Hz）,4.07（1H,dd,J=9.0, 5.4 Hz）,3.73-3.81（1H,m）,3.50-3.65（1H,m）,3.33（3H,s）,3.07-3.21（3H,m）,1.98-2.13（3H,m）,0.90（3H,d,J=7.0Hz）, 0.86（3H,d,J=6.8 Hz）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.6, 62.9,59.2, 50.5, 40.5, 33.5, 27.9, 27.6, 17.6, 14.2；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ10Ｈ19ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、282.0834；実測値、282.0842.
【０１２４】
Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−イソプロピル−２−オキサゾリジノン（（Ｓ）−１ｄ）
（Ｒ）−18と同様の方法で、（Ｓ）−18を調製した。（Ｓ）−４−イソプロピル−２−オキサゾリジノン（0.504 g, 3.902 mmol）から、（Ｓ）−18（0.558 g, 57％、ｅｅ≧98％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−18と同一であった。［α］25D＝+3.4（ｃ3.42, ＣＨＣｌ3）。
（Ｒ）−１ｄと同様の方法で、表題化合物（Ｓ）−１ｄを調製した。（Ｓ）−18（0.493 g, 1.971 mmol）から、（Ｓ）−１ｄ（0.435g, 78％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−１ｄと同一であった。［α］25D＝+23.2（2.27, ＣＨＣｌ3）； ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ10Ｈ19ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、282.0834；実測値、282.0833.
【０１２５】
Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（（Ｒ）−１ｅ）
１７と同様の方法で、Ｎ−（３’−ブロムプロピル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（Ｒ）−19を調製した。（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（0.322 g, 1.970 mmol）から、（Ｒ）−19（0.370 g, 66％、ｅｅ≧98％）を無色油として得た。［α］25D＝-35.8（ｃ3.10, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1748 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.26-7.45（5H,m）,4.79（1H,dd,J=8.8,6.3 Hz）,4.63（1H,dd,J=8.6,8.6 Hz）,4.15（1H,dd,J=8.8,6.4 Hz）,3.30-3.54（3H,m）,2.89-3.03（1H,m）, 1.90-2.12（2H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.2, 137.7, 129.3, 129.2, 126.9, 69.8,60.3, 41.1, 30.2, 29.9；ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ12Ｈ14ＮＯ2Ｂｒに関する計算値、283.0208；実測値、283.0197.
【０１２６】
（Ｒ）−１ａと同様の方法で、表題化合物（Ｒ）−１ｅを調製した。（Ｒ）−19（0.346 g,1.218 mmol）を（Ｒ）−１ｅ（0.344g, 89％）に転換した。［α］25D＝-70.5（ｃ0.84, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1746 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.26-7.43（5H,m）,4.81（1H,dd,J=8.8,6.6 Hz）,4.65（1H,dd,J=8.6,8.6 Hz）,4.16（1H,dd,J=8.6,6.6 Hz）,3.40-3.55（1H,m）,3.29（3H,s）,2.90-3.15（3H,m）, 1.82-1.97（2H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.4, 137.5, 129.4, 129.3, 127.1, 69.9,60.0, 50.6, 41.0, 33.4, 27.5；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ13Ｈ17ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、316.0678；実測値、316.0678.
【０１２７】
Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（（Ｓ）−１ｅ）
（Ｒ）−19と同様の方法で、（Ｓ）−19を調製した。（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（0.964 g, 5.911 mmol）から、（Ｓ）−19（0.955 g, 57％、ｅｅ≧98％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−19と同一であった。［α］25D＝+33.3（ｃ2.50, ＣＨＣｌ3）。
【０１２８】
（Ｒ）−１ｅと同様の方法で、表題化合物（Ｓ）−１ｅを調製した。（Ｓ）−19（0.870 g, 3.062 mmol）から、（Ｓ）−１ｅ（0.814g, 84％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−１ｅと同一であった。［α］25D＝+68.8（1.21, ＣＨＣｌ3）； ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ13Ｈ17ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、316.0678；実測値、316.0683.
【０１２９】
Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（（Ｒ）−１ｆ）
１７と同様の方法で、Ｎ−（３’−ブロムプロピル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（Ｒ）−20を調製した。（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（0.499 g, 2.816 mmol）から、（Ｒ）−20（0.454 g, 54％、ｅｅ≧98％）を無色油として得た。［α］25D＝-14.3（ｃ2.06, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1751 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.14-7.36（5H,m）,3.96-4.21（3H,m）,3.10-3.65（5H,m）,2.61-2.72（1H,m）,2.04-2.27（2H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.0, 135.2, 128.9, 128.8, 127.1, 66.7,56.6, 40.8, 38.5, 30.5, 30.2；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ13Ｈ16ＮＯ2Ｂｒに関する計算値、298.0441；実測値、298.0416.
【０１３０】
（Ｒ）−１ａと同様の方法で、表題化合物（Ｒ）−１ｆを調製した。（Ｒ）−20（0.364 g,1.221 mmol）を（Ｒ）−１ｆ（0.362g, 90％）に転換した。［α］25D＝-31.7（ｃ1.33, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1745 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.14-7.34（5H,m）,3.98-4.21（3H,m）,3.48-3.61（1H,m）,3.32（3H,s）,3.04-3.30（4H,m）,2.61-2.73（1H,m）, 1.98-2.11（2H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.2, 135.2, 128.9, 128.8, 127.1, 66.7,56.1, 50.4, 40.7, 38.4, 33.3, 27.8；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ14Ｈ19ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、330.0834；実測値、330.0834.
【０１３１】
Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（（Ｓ）−１ｆ）
（Ｒ）−20と同様の方法で、（Ｓ）−20を調製した。（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（0.504 g, 2.844 mmol）から、（Ｓ）−20（0.558 g, 66％、ｅｅ≧98％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−20と同一であった。［α］25D＝+14.1（ｃ2.50, ＣＨＣｌ3）。
（Ｒ）−１ｆと同様の方法で、表題化合物（Ｓ）−１ｆを調製した。（Ｓ）−20（0.449 g, 1.506 mmol）から、（Ｓ）−１ｆ（0.458g, 92％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−１ｆと同一であった。［α］25D＝+29.9（1.19, ＣＨＣｌ3）； ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ14Ｈ19ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、330.0834；実測値、330.0844.
【０１３２】
Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトエチル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（（Ｒ）−１ｇ）
10当量の１，２−ジブロムエタンおよび3当量のＫＯＨを用いた以外は、１７と同様の方法で、Ｎ−（３’−ブロムエチル）−（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（Ｒ）−21を調製した。（Ｒ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（0.261 g, 1.599 mmol）から、（Ｒ）−21（0.387 g, 90％、ｅｅ≧98％）を無色油として得た。［α］25D＝-54.1（ｃ1.80, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1749 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.26-7.46（5H,m）,4.98（1H,dd,J=8.8,6.6 Hz）,4.67（1H,dd,J=8.8,8.8 Hz）,4.16（1H,dd,J=8.8,6.6 Hz）,3.75-3.87（1H,m）,3.42-3.53（1H,m）, 3.12-3.36（2H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.0, 137.4, 129.4, 129.3, 127.0, 70.0,60.4, 43.8, 28.6；ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ11Ｈ12ＮＯ2Ｂｒに関する計算値、269.0051；実測値、269.0055.
【０１３３】
（Ｒ）−１ａと同様の方法で、表題化合物（Ｒ）−１ｇを調製した。（Ｒ）−21（0.392 g,1.462 mmol）を（Ｒ）−１ｇ（0.320g, 73％）に転換した。［α］25D＝-28.8（ｃ1.32, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1749 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.29-7.43（5H,m）,4.88（1H,dd,J=8.9,6.6 Hz）,4.67（1H,dd,J=8.8,8.8 Hz）,4.18（1H,dd,J=8.8,6.5 Hz）,3.59-3.76（1H,m）,3.28（3H,s）,3.10-3.26（3H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.1, 137.3, 129.4, 129.3, 127.1, 69.9,60.3, 50.7, 41.8, 33.6；ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ12Ｈ15ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、302.0521；実測値、302.0529.
【０１３４】
Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトエチル）−（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（（Ｓ）−１ｇ）
（Ｒ）−21と同様の方法で、（Ｓ）−21を調製した。（Ｓ）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（0.381 g, 2.335 mmol）から、（Ｓ）−21（0.564 g, 89％、ｅｅ≧98％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−21と同一であった。［α］25D＝+54.6（ｃ1.85, ＣＨＣｌ3）。
（Ｒ）−１ｇと同様の方法で、表題化合物（Ｓ）−１ｇを調製した。（Ｓ）−21（0.532 g, 1.969 mmol）から、（Ｓ）−１ｇ（0.450g, 76％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−１ｇと同一であった。［α］25D＝+27.8（1.30, ＣＨＣｌ3）； ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ12Ｈ15ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、302.0521；実測値、302.0534.
【０１３５】
Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトエチル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（（Ｒ）−１ｈ）
10当量の１，２−ジブロムエタンおよび3当量のＫＯＨを用いた以外は、１７と同様の方法で、Ｎ−（３’−ブロムエチル）−（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（Ｒ）−22を調製した。（Ｒ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（0.386 g, 2.178 mmol）から、（Ｒ）−22（0.372 g, 60％、ｅｅ≧98％）を無色油として得た。［α］25D＝-16.7（ｃ1.35, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1748 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.12-7.40（5H,m）, 3.81-4.30（4H,m）,3.38-3.63（3H,m）,3.11-3.20（1H,m）,2.66-2.76（1H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ157.8, 135.2, 129.0, 127.3, 67.1,56.9, 44.1, 38.7,29.1；ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ12Ｈ14ＮＯ2Ｂｒに関する計算値、284.0286；実測値、284.0281.
【０１３６】
（Ｒ）−１ａと同様の方法で、表題化合物（Ｒ）−１ｈを調製した。（Ｒ）−22（0.334 g,1.175 mmol）を（Ｒ）−１ｈ（0.363g, 98％）に転換した。［α］25D＝+4.5（ｃ1.10, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1748 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.15-7.39（5H,m）,4.02-4.29（3H,m）,3.72-3.89（1H,m）,3.14-3.58（4H,m）,3.38（3H,s）,2.65-2.75（1H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ158.1, 135.2, 129.0, 127.3, 67.2,57.0, 50.7, 42.0, 38.7, 33.9；ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ13Ｈ17ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、316.0677；実測値、316.0683.
【０１３７】
Ｎ−（２’−メタンチオスルホナトエチル）−（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（（Ｓ）−１ｈ）
（Ｒ）−22と同様の方法で、（Ｓ）−22を調製した。（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（0.371 g, 2.094 mmol）から、（Ｓ）−22（0.375 g, 63％、ｅｅ≧98％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−22と同一であった。［α］25D＝+15.6（ｃ1.55, ＣＨＣｌ3）。
【０１３８】
（Ｒ）−１ｈと同様の方法で、表題化合物（Ｓ）−１ｈを調製した。（Ｓ）−22（0.328 g, 1.154 mmol）から、（Ｓ）−１ｈ（0.245g, 67％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−１ｈと同一であった。［α］25D＝-5.8（1.20, ＣＨＣｌ3）； ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ13Ｈ17ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、316.0677；実測値、316.0664.
【０１３９】
Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン（（Ｒ）−１ｉ）
（１Ｒ、２Ｓ）−シス−１−アミノ−２−インダノール（0.980 g, 6.569 mmol）を丸底フラスコに入れ、乾燥Ａｒ雰囲気を確立した。乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（50 mL）およびＥｔ3Ｎ（1.9 mL, 13.63 mmol）を添加し、その結果生じた溶液を-60℃に冷却した。トリホスゲン（0.64 g, 2.157 mmol）の添加時に、冷却浴を除去し、反応物を1時間に亘って20℃に温めた。次に反応物をＣＨ2Ｃｌ2（100 mL）およびＨ2Ｏ（50 mL）に注ぎ入れ、水性層をＣＨ2Ｃｌ2（3 x 100 mL）で抽出した。ＭｇＳＯ4で乾燥後、有機層を減圧下で蒸発させて、（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、（Ｒ）−24（1.15 g、定量的）を白色結晶として得たが、これは反応列の次の工程のために十分な純度であった。分析試料をＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンから再結晶した。融点205.5〜206.5℃；［Ghosh et al.（1992）「J. Chem. Soc. Chem. Commun.」1673-1674,エナンチオマーに関しては205℃］。［α］25D＝+107.7（ｃ1.25, ＣＨＣｌ3）；［同上、エナンチオマーに関しては［α］25D＝-79.4（ｃ1.4, ＣＨＣｌ3）］。 ＩＲ（ＫＢｒ）3255, 1752, 1707 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）δ7.24-7.43（4H,m）,5.39（1H,t,J=7.5Hz）,5.21（1H,d,J=7.0Hz）,3.42（1H,dd,J=17.7, 6.2Hz）,3.20（1H,d,J=17.9Hz）,2.90（1H,br s）；13Ｃ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）δ159.1, 142.5, 141.0, 129.7, 128.3, 126.2, 125.8, 80.8, 61.7,39.3；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ10Ｈ9ＮＯ2＋Ｈに関する計算値、176.0771；実測値、176.0681.
【０１４０】
１７と同様の方法で、 Ｎ−（３’−ブロムプロピル）−（３ａＲ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン、（Ｒ）−25を調製した。（Ｒ）−24（1.007 g, 5.748 mmol）から、（Ｒ）−25（1.11 g, 65％、ｅｅ≧98％）を無色油として得た。［α］25D＝+31.3（ｃ1.61, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（正味）1748 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.24-7.45（4H,m）,5.31（1H,dt,J=7.4, 3.1Hz）,5.14（1H,d,J=7.7Hz）,3.23-3.70（6H,m）,2.12-2.34（2H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ157.1, 140.5, 138.0, 129.8, 127.4, 125.8, 125.1, 77.1, 64.1,41.0, 39.3, 30.4, 30.1；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ13Ｈ14ＮＯ2Ｂｒ＋Ｈに関する計算値、296.0285；実測値、296.0254.
【０１４１】
（Ｒ）−１ａと同様の方法で、表題化合物（Ｒ）−１ｉを調製した。（Ｒ）−25（0.925 g,3.123 mmol）を（Ｒ）−１ｉ（0.882g, 86％）に転換した。それをＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶した。融点94.0〜95.0℃；［α］25D＝+17.7（ｃ1.28, ＣＨＣｌ3）；ＩＲ（ＫＢｒ）1729 cm-1；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ7.26-7.38（4H,m）,5.32（1H,dt,J=7.4, 3.0Hz）,5.14（1H,d,J=7.6 Hz）,3.36-3.69（4H,m）,3.32（3H,s）,3.14-3.22（2H,m）,2.10-2.23（2H,m）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ157.2, 140.6, 137.9, 129.7, 127.4, 125.8, 125.0, 77.2, 63.7,50.4, 40.9, 39.2, 33.4, 27.5；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z:Ｃ14Ｈ17ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、328.0677；実測値、328.0683.
【０１４２】
Ｎ−（３’−メタンチオスルホナトプロピル）−（３ａＳ−シス）−３，３ａ，８，８ａ−テトラヒドロ−２Ｈ−インデノ［１，２−ｄ］−オキサゾール−２−オン（（Ｓ）−１ｉ）
（Ｒ）24と同様の方法で（Ｓ）−24を調製した。（1Ｓ，２Ｒ）−シス−１−アミノ−２−インダノール（1.09 g, 7.306 mmol）から、（Ｓ）−24（1.27 g,定量的）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−24と同一であった。融点205.0〜207.0℃；［α］25D＝-109.7（ｃ1.30, ＣＨＣｌ3）。
【０１４３】
（Ｒ）25と同様の方法で（Ｓ）−25を調製した。（Ｓ）−24（1.023 g, 5.839 mmol）から、（Ｓ）−25（0.940 g, 54％、ｅｅ≧98％）を得た。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−25と同一であった。［α］25D＝-30.5（ｃ1.82, ＣＨＣｌ3）。
（Ｒ）−１ｉと同様の方法で、表題化合物（Ｓ）−１ｉを調製した。（Ｓ）−25（0.840 g, 2.836 mmol）から、（Ｓ）−１ｉ（0.838g, 90％）を得た。それをＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶した。その1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲデータは、（Ｒ）−１ｉと同一であった。融点94.0〜95.0℃；［α］25D＝-18.7（1.38, ＣＨＣｌ3）； ＨＲＭＳ（ＥＩ）m/z:Ｃ14Ｈ17ＮＯ4Ｓ2＋Ｈに関する計算値、3２８.0677；実測値、3２８.06９4.
【０１４４】
部位特異的化学修飾
ＰＥＧ（10,000）被覆ポリプロピレン試験管中でＭＥＳ緩衝液（10 mMＭＥＳ、1 mMＣａＣｌ2、ｐＨ5.8）中に保存したＳＢＬ突然変異体1.25 mLに、20℃の0.75 mLのＣＨＥＳ緩衝液（70 mMＣＨＥＳ、5 mMＭＥＳ、2 mMＣａＣｌ2、ｐＨ9.5）およびメタンチオスルホネート試薬の１つ（ＣＨ3ＣＮ中の0.5 M溶液100μL）を添加し、混合物を反転回転機中で撹拌した。30分後、全修飾反応物は、エルマン検定に対して陰性であったが、これは遊離チオールの不存在を示す。完全反応を確実にするために、さらに100μLのメタンチオスルホネート溶液を添加し、反応をさらに30分間継続させた。反応溶液を、ＭＥＳ緩衝液（5 mMＭＥＳ、2 mMＣａＣｌ2、ｐＨ6.5）で予備平衡させた使い捨て脱塩カラム（Pharmacia Biotech PD-10，セファデックスＧ−25Ｍ）上で精製した。ＣＭＭをＭＥＳ緩衝液（5.0 mL）で溶離し、ＭＥＳ緩衝液（10 mMＭＥＳ、1 mMＣａＣｌ2、ｐＨ5.8）に対して透析（ＭＷＣＯ12〜14,000）して、次にフラッシュ凍結し、-20℃で保存した。ｐＨ4.2で勾配（8〜25％）ゲルを非変性化し、Pharmacia Phast-Systma（Pharmacia Application File No. 300）上を陰極に向かって走行させて、ある単一帯域として出現させることにより、修飾酵素を分析した。その親システイン突然変異体およびＷＴ酵素と平行して、ＣＭＭの各々を分析した。
【０１４５】
酵素特性化
ＥＳ−ＭＳ分析前に、走行緩衝液として5％アセトニトリル、0.01％ＴＦＡを用いたSource 15RPCマトリックス（17-0727-20（Pharmacia））上でのＦＰＬＣ（BioRad, Biologic System）によりＣＭＭを精製し、一工程勾配中の80％アセトニトリル、0.01％ＴＦＡで溶離した。PE SCIEX API III生体分子質量分析機で、エレクトロスプレー質量スペクトルを記録した。
【０１４６】
【表３】
0004932990.tif 000004
【０１４７】
Ｎ62Ｃ、Ｌ217Ｃ、Ｓ166Ｃ、Ｓ156ＣおよびそれらのＣＭＭの遊離チオール含量を、エルマン試薬（ε412＝13600 M-1cm-1）（Ellman et al.,（1961）「Biochem. Pharmacol.」, 7:88-95）リン酸塩緩衝液0.25 M、ｐＨ8.0を用いた滴定により、分光測光的に測定した。
フッ化物イオン感受性電極（Orion Research 96-09）により測定した場合のａ−トルエンスルホニルフルオリド（Aldrich Chemical Co. Inc.）との酵素反応時のフッ化物放出をモニタリングすることにより、活性酵素濃度を、前に記載されたのと同様に測定した（Hsia et al.（1996）「Anal. Biochem.」242:221-227）。この方法で測定される活性酵素濃度を用いて、各ＣＭＭに関する動的パラメーターを算出した。
【０１４８】
動的測定
低基質近似値を用いて確定される特異性定数を、アミダーゼ活性（ε410＝8800 M-1cm-1）に関してｐＨ8.6で0.005％トゥイーン80および1％ＤＭＳＯを含有する0.1 Mトリス中で25℃で、0.05および0.1 mMＮ−Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡで、エステラーゼ活性（ε412＝13600 M-1cm-1）に関してｐＨ8.6でＤ0.005％トゥイーン80および1％のＤＭＳＯ中の37.5 mMＤＴＮＢを含有する0.1 Mトリス中で25℃で、0.015および0.03 mMＮ−Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ＳＢｎで、測定した。一般的走行は、980μLの0.1 Mトリス、0.005％トゥイーン80を含有する６つのプラスチックキュベットをｐＨ8.6で25℃に平衡させることから成る。ＤＭＳＯ中の基質（10μL）を添加し、ゼロ点規正のために機械にそれを戻す前に、キュベットを２回振盪した。直ちに、20 mMＭＥＳ、1 mMＣａＣｌ2、ｐＨ5.8中の酵素（10μL）を添加し、キュベットを8秒遅れで機械に戻した。初期速度データを記録し、それを用いて、ｋcat／ＫMを算出した。エステラーゼデータを調整して、基質のバックグラウンド加水分解を説明した。
【０１４９】
アミダーゼ活性に関してはＮ−Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質の８つの濃度（0.05 mM〜3.0 mM）で、エステラーゼ活性に関してはＮ−Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ＳＢｎ基質の８つの濃度（0.015 mM〜2.0 mM）で測定した初期速度データの曲線適合（GraFit（登録商標）3.03）により、25℃でミカエリス−メンテン定数を測定した。
【０１５０】
実施例２：ズブチリシンBacillus lentusの化学修飾突然変異体は野生型より良好にエステル化転移反応を触媒する
本実施例では、エステル化転移反応を用いたラセミ第一および第二級アルコールの分解のための優れた酵素触媒を作製するために、併合型部位特異的突然変異誘発および化学修飾戦略を用いた。ズブチリシンBacillus lentusの化学修飾突然変異体Ｎ62Ｃ−Ｓ−ＣＨ3は、野生型より速く、β−分枝鎖第一級アルコールによるＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンビニルエステルのエステル化転移反応を触媒する。ズブチリシンBacillus lentusのシステイン突然変異体Ｍ222Ｃは、第二級アルコールを用いた場合、野生型より高い収率（１−フェニルエタノールおよび２−オクタノールでそれぞれ収率90％および92％対野生型に関しては19％および10％）および良好なエナンチオ選択性を生じた。
【０１５１】
ヒドロラーゼ触媒化エステル化転移反応は、ラセミアルコールを分解するために、そしてプロキラルおよびメソジオールを立体選択的にアシル化するために、広範に用いられる（Faber（1996）「Biotransformations in Organic Chemistry」, 3rd Ed., Springer-Verlag, Heidelberg）。この点では、セリンプロテアーゼは、リパーゼおよびエステラーゼと比較して限定用途を見出した（同上）。これに対する１つの理由は、他のヒドロラーゼと比較した場合の、多数のセリンプロテアーゼの高基質特異性である（Faber上記、Sears and Wong（1996）「Biotechnol. Prog.」, 12:423-433）。近年、セリンプロテアーゼズブチリシンBacillus lentus（ＳＢＬ）の合成的可能性を拡張するための試みにおいて、ラセミアルコールとのＳＢＬ−触媒化エステル化転移反応のアシル供与体としてのＮ−Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅビニルエステル、２（図８）の使用を報告した（Lloyd et al.（1998）「Tetrahedron Asymmetry」, 9:551-561）。本実施例は、ＳＢＬの基質特異性を変えるための併合部位特異的突然変異誘発および化学修飾戦略を用いたこれらの解決のための全体的化学的収率および立体選択性の程度を改良するための可能性を説明する。
【０１５２】
前記の、そしてBerglund et al.（196）「Bioorg. Med. Chem. Lett.」, 6:2507-2512に記載されているように、ＳＢＬのシステイン突然変異体および化学的修飾突然変異体（ＣＭＭ）を調製し、特性化し、それらの間の最良のエステラーゼを、比較評価のために選択した（Plettner et al.（198）「Bioorg. Med. Chem. Lett.」, 8:2291-2296）。３つのＣＭＭ（Ｌ217Ｃ−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3−、Ｎ62Ｃ−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3−、Ｎ62Ｃ−Ｓ−ＣＨ3）および２つの突然変異体酵素（Ｌ217ＣおよびＭ222Ｃ）を、各々、ＫＣｌマトリックス中に包埋し（Khmelnitsky et al.（1994）「J. Am. Chem. Soc.」116:2647-2648）、これを用いて、前に記載された（Lloyd et al.（1998）「Tetrahedron Asymmetry」, 9:551-561）ように、アシル供与体２および、ラセミ第一級および第二級アルコール１（図８）の間のｔｅｒｔ−ＢｕＯＨにおけるエステル化転移反応を触媒した。２つの第一級アルコール（２−フェニル−１−プロパノールおよび２−メチル−１−ペンタノール）および１つの第二級アルコール（２−オクタノール）を、本試験のためのそれぞれの求核性物質として用いた。結果を表４に示す。
【０１５３】
Ｌ217ＣおよびＬ217Ｃ−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3-ＣＭＭは、野生型（ＷＴ）と同様の収率およびde（ジアステレオマー過剰率）で、２つの第一級アルコールとの反応を触媒したが、しかしＬ217Ｃだけは、２−オクタノールを求核性物質として用いて、ＷＴと同様の良好な収率を得た。Ｍ222Ｃは、３つのアルコールすべてに関して、より低い収率を生じた。Ｎ62Ｃ−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3-は、２−フェニル−１−プロパノールが求核性物質である場合に、ＷＴより高い生成物の収率を生じた。２−メチル−１−ペンタノールとの反応に関しては、触媒としてＮ52Ｃ−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3-を用いて、２つの第一級アルコール（２−フェニル−１−プロパノールに関しては97％および２−メチル−１−ペンタノールに関しては79％）に関して、ＷＴ（26％de）を上回る生成物エステル（41％）のdeの有意の改良を生じた。ＷＴからの立体化学選択における変化は、ＣＭＭのいずれに関しても観察されなかった。
【０１５４】
【表４】
0004932990.tif 000005
【０１５５】
溶媒の性質および温度は、エナンチオ選択性に影響を及ぼすことが知られており（Lam et al.（1996）「Biotechnol. Lett.」, 13:323-326）、そしてＮ62Ｃ−Ｓ−ＣＨ3触媒性エステル化転移反応に及ぼすこれらのパラメーターの作用を次に考察した。本試験では、ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ中で、50℃でも、相対的に遅い速度が低温作用の精査を妨げるために、例証的溶媒としてＣＨ3ＣＮを選択した。ズブチリシンＢＰＮのＭ222Ａ突然変異体が立体的障害性アミン求核物質の、エステルアシル供与体とのより迅速な初期反応を可能にすることが判明しているために、我々の試験のこの部分にＭ22Ｃを含めた（Sears et al.（1994）「J. Am. Chem. Soc.」, 116:6521-6530）。結果を表５に示す。
【０１５６】
【表５】
0004932990.tif 000006
【０１５７】
ＣＨ3ＣＮ中で4℃で、Ｍ222ＣおよびＮ62Ｃ−Ｓ−ＣＨ3は、ＷＴより良好に成し遂げた。両酵素は、ＷＴより迅速に第一および第二級アルコールのエステル化転移反応を触媒し、ＷＴに匹敵するdeを示した。特に、それらは、立体的障害性第二級アルコールが求核性物質として用いられた場合に、ＷＴよりはるかに高い生成物エステルの収率を生じた。
【０１５８】
Ｍ222Ｃは、１−フェニルエタノールを用いてほぼ定量的収率の生成物エステルを、そして２−オクタノールを用いて優れた収率（92％）を生じた。Ｍ222Ｃは、両第二級アルコールに関して90％以上に生成物エステルのdeを改良し、そしてＮ62Ｃは２−オクタノールに関して97％deで生成物エステルを生じた。
【０１５９】
これらの結果から、Ｎ62ＣおよびＭ222Ｃはともに、ＷＴより良好なエステル化転移触媒であることが分かった。この理由は、異なると思われる。Ｎ62Ｃ−Ｓ−ＣＨ3は、Ｍ222Ｃより高い収率で、且つ短い時間で第一級アルコールと２のエステル化転移を触媒するが、しかし第二級アルコールに関してはその逆が言える。その場合、Ｍ222Ｃは１−フェニルエタノールおよび２−オクタノールをそれぞれ98％および92％の収率で２と効率的に結合する。
【０１６０】
特定の理論に縛られずに考えると、アルコールのα−炭素での分枝がＳＢＬのＳ1’ポケット（Schechter and Berger（1967）「Biochem. Biophys. Res. Commun.」27:157-162による名称）により不十分に耐容されるため、ＷＴは第二級アルコールで低収率を生じる。ＳＢＬの残基222は、酵素を脱アシル化し、触媒周期を完了するために、求核性物質がアシル−酵素中間体に接近する位置に非常に近い領域であるＳ1およびＳ1’−ポケット間の境界に存在する。したがって、メチオニンが位置222でより小さいシステインに置換される場合、この重要な領域におけるより大きい空間はより多くの立体障害性求核性物質をアシル−酵素中間体と反応させると予測するのは理にかなっている。
【０１６１】
これはちょうど、第二級アルコールのＭ222Ｃ触媒化反応に関して観察されたことである。これに対比して、ＢＳＬの残基623はＳ2ポケットにあり、したがって、この残基の任意の突然変異または修飾がＳ1’ポケットに有意に影響を及ぼすとは思えない。それにもかかわらず、Ｎ62Ｃ−Ｓ−ＣＨ3は、第二級アルコールに関しては、ＷＴよりかなり高い収率を生じる。さらに、このＣＭＭは、ＷＴまたはＭ222Ｃよりはるかに迅速に第一級アルコールのエステル化転移反応を触媒した。Ｎ62Ｃ−Ｓ−ＣＨ3は、より高い代謝回転率のために、Ｍ222ＣまたはＷＴより迅速にエステル化転移反応を触媒した（Plettner et al.（198）「Bioorg. Med. Chem. Lett.」, 8:2291-2296）が、しかし第二級アルコールの場合、触媒的効率の改良は、負の立体障害因子を完全に克服し得なかったと思われる。
【０１６２】
要するに、ＣＭＭアプローチの将来的可能性は、Ｎ62Ｃ−Ｓ−ＣＨ3およびＭ222ＣがともにＷＴより優れたエステル化転移触媒であり、Ｎ62Ｃ−Ｓ−ＣＨ3は、第一級アルコールがアシル供与体として２とともに用いられる場合に、ＷＴより短い反応時間でエステル化転移反応においてより高い収率を生じるという事実から明らかである。さらに、Ｍ222Ｃそれ自体は、第二級アルコールのエステル化転移のための優れた触媒であることが判明している。
【０１６３】
本明細書中に記載した実施例および態様は、例証目的だけのためであって、それにかんがみて、種々の修正または変更が当業者に示唆され、そして本出願の精神および範囲内、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるものと理解される。本明細書中で引用した出版物、特許および特許出願はすべて、参照により本明細書中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図２】  図２は、合成図１；キラル補助物質によるＳＢＬ突然変異体の修飾を説明する。
【図３】  図３は、合成図２；マンデル酸塩ベースの配位子の合成を説明する。
【図４】  図４は、合成図３；オキサゾリジノンベースの配位子の合成を説明する。
【図５】  図５は、合成図４；インダノールベースの配位子の合成を説明する。
【図６Ａ】  図６Ａは、Ｎ62Ｃ  ＣＭＭ特異性定数の比較を説明する。
【図６Ｂ】  図６Ｂは、Ｓ166Ｃ  ＣＭＭ特異性定数の比較を説明する。
【図６Ｃ】  図６Ｃは、217Ｃ  ＣＭＭ特異性定数の比較を説明する。
【図７Ａ】  図７Ａは、Ｓ166Ｃ  ＣＭＭにおけるエステラーゼ対アミダーゼ活性比の変化を説明する。
【図７Ｂ】  図７Ｂは、Ｌ217Ｃ  ＣＭＭにおけるエステラーゼ対アミダーゼ活性比の変化を説明する。
【図８】  図８は、触媒として化学修飾突然変異体酵素を用いたアルコールによるＮ−アセチル−１−フェニルアラニンビニルエステルのエステル化転移反応に関する反応図を説明する。
【図１】
0004932990.tif 000007
【図２】
0004932990.tif 000008
【図３】
0004932990.tif 000009
【図４】
0004932990.tif 000010
【図５】
0004932990.tif 000011
【図６Ａ】
0004932990.tif 000012
【図６Ｂ】
0004932990.tif 000013
【図６Ｃ】
0004932990.tif 000014
【図７Ａ】
0004932990.tif 000015
【図７Ｂ】
0004932990.tif 000016
【図８】
0004932990.tif 000017