(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨修復用医薬品を製造するための、ビブリオ・ディアボリカス種から得られ瘢痕形成活性を有するポリサッカライドの使用。
【請求項２】
医薬品が、骨の修復又は充填材であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
医薬品が、骨体内プロステーシス又は骨伝導充填材の被覆材であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ポリサッカライドが、ビブリオ・ディアボリカス種の培養上清から、エタノールでの析出によって得られる請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
ポリサッカライドが
−いずれの中性のポリサッカライドをも含有せず、
−約５０重量％の酸サッカライド含量を有しており、
−約５０重量％のオサミン含量を有しており、
−約２：１：１のモル比のグルクロン酸：Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｎ−アセチルグルコサミンノモサッカライドを有している請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項６】
ポリサッカライドが、骨伝導材及び／又は骨誘導材と混合されてなることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項７】
骨伝導材が、脱タンパクされた及び／又はセラミック化された骨、合成又は天然のリン酸カルシウム、バイオガラスセラミック及びバイオガラスからなる群から選択される請求項６に記載の使用。
【請求項８】
請求項１、５又は６に規定されたポリサッカライドと、骨伝導材及び／又は骨誘導材とからなることを特徴とする骨再構築生体材料。
【請求項９】
請求項１、５又は６に規定されたポリサッカライドによって、少なくともその表面が被覆されてなることを特徴とする骨体内プロステーシス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、瘢痕形成活性を有する医薬品を製造するためのビブリオ・ディアボリカス（Vibrio diabolicus）種によって放出されたポリサッカライドの用途に関し、さらにこのポリサッカライドからなる骨再構築生体適合材料に関する。
骨物質の損失は不能状態であり、回復を遅らせる。骨損失が臨界量を超えると、自発的に回復することはできない（J.P. Schmitz et al., Acta Anat., 1990, 138, 185-192）。回復を導いたり、誘導する骨充填材料は、骨損失の２側面間の連続性を修復させるために用いられなければならない。
【０００２】
非常に長年にわたる移植術は、本質的に、BMP 又は"骨形態形成タンパク"、 オステオカルシン、オステオポンチン及びオステオゲニンのような、骨再構築の生物学的メカニズムを引き起こしたり、促進することができるタンパクを本来的に含有する完全な骨を用いることからなる。自己移植片は、免疫系によって完全に耐性化されているという利点がある。しかし、骨の供給は、個体に限られ、安全にする付加的な外科的介入が合併症の危険を伴う。同種移植片又は異種移植片について、それらは病原体の伝染の危険が存在し、拒絶反応の症状をもたらすかもしれない。
骨移植片の不適合のために、骨置換材料に向けた研究がなされている。これら充填材料は、骨誘導（osteoinductive）又は骨伝導（osteoconductive）材料かもしれない。
【０００３】
骨誘導材料は、充填材料のタンパクやペプチドによる細胞活性のメカニズムにしたがって、組織損失の再生を可能にする。それらは、異所部位での骨形成、つまり、骨外骨形成を誘導することができる。骨誘導物質及びその天然型の骨以外の材料の例として、
−骨異再構築を促進することが証明されている成長因子及びホルモン（特にサイトカイン、IGF又はインシュリン様成長因子及びFGF又は線維芽細胞成長因子）（P.A.Hill ら、Endocrinology, 1995,  136(1), 124131: P. Cuevas et al., Surg. Neurol., 1997, 47, 242-246; G.L.Barnesら、Journal of Bone and Mineral Research, 1999, 14(11), 1805-1815）。M. Isobeら(Journal of Biomedical Materials Research, 1996, 32, 433-438)は、特に、骨組織から抽出されたBMP型の成長因子のラットへの皮下注射を提案している。しかし、それらが臨床的に用いられる場合、一般に、BMP及び他の成長因子やホルモンは一様でない結果をもたらす。その全身系の作用、つまり移植部位に限定されない作用は、損傷部位の組織近傍へのBMPの拡散及び骨でない部位での局所の石灰化の危険がある。さらに、BMPの使用は、種間又は同一種内の汚染を引き起こすかもしれない；
【０００４】
−損傷部位に存在する成長因子と結合して酵素分解からそれらを保護する、カルボキシメチル、ベンジルアミド、硫酸塩及びスルホン酸塩（"CMDBS"とよばれる）から選択される置換基を有するデキストラン誘導体ならびに硫酸ヘパリン（D.Aviezerら、The Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(1), 114-121; F.Blanquaertら、Journal of Biomedical Materials Research, 1999, 44,  63-72; M.L.Colombierら、Journal de Parodontologie et d'Implantologie Orale, 1998, 17(4), 403-413; M.Tardieuら、Journal of Cellular Physiology, 1992, 150, 194203）。これらの化合物は、使用されるために、コラーゲンのようなベクターを必要とする（A.Meddahiら、 Diabetes & Metabolism, 1996, 22, 274-278; A.Meddahiら、Path. Res. Pract., 1994, 190, 923-928）。A. Meddahiら(1994, ibid)は、コラーゲン緩衝液に浸漬したCMDBS K（83% のカルボキシメチル基、23% のベンジルアミン基及び13%スルホン酸基からなる）とよばれる特殊なデキストラン誘導体が、ラットの頭蓋冠に導入した３ｍｍの大きさの骨欠陥を３週間後に部分的に充填することを可能にしたことを証明している。しかし、これらの結果は、そのような期間では基準臨界径が５〜８ｍｍである臨界量の損傷に外挿することはできない；
が挙げられる。
【０００５】
さらに、骨伝導材料は、それらの名前が示すように、それ自体でいくらかの骨形成をもたらすことなく、修復を伝導するにすぎない。それらは、骨修復の生物学的症状の支持物として機能し、所定時間後に再吸収されることを意図し、新たに形成された骨組織にとって代わられる。骨伝導材料の例として、
−たとえば、人間又は牛起源の全てのその除タンパクされた及び／又はセラミック化の形態の骨（F.A.Papayら、The Journal of Craniofacial Surgery, 1996, 7(5), 347-351）；
−リン酸三カルシウム、２相性リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト又は珊瑚のような合成又は天然のリン酸カルシウム（F.A.Papayら、ibid; N.B.A.Naamanら、The International Journal of Oral and Maxillofacial Implants, 1998, 13(1), 115-120; M.Trecantら、Clinical Materials, 1994, 15, 233240）
−生物ガラスセラミック、生物ガラス
が挙げられる。
【０００６】
骨再構築に関するこの技術機能の不適合及び不利の観点において、発明者らは、骨再構築に使用することができ、骨物質の大量の損失、つまり、臨界量異常の量の損失の再構築に適切な生体材料を提供することを目的とする。この生体材料は、骨再構築の末端で、生体適合性、非免疫源及び再吸収可能でなければならない。
本発明者らは、意外にも、これらの目的を、特定のポリサッカライド、つまり、ビブリオ・ディアボリカス種によって放出されるポリサッカライドを用いて達成されることを見出した。
本発明の対象は、ビブリオ・ディアボリカス種によって放出されるポリサッカライド（"エキソポリサッカライド（exopolysaccharide）"と称される）の使用であり、その株は、CNCM(Collection nationale de Cultures de Microorganismes [National collection of cultures of microorganisms], 28 rue du Docteur Roux; 75724 Paris, France)に１９９５年１０月１７日に、Ｉ−１６２９の番号で、瘢痕形成活性を有する医薬品を製造するために寄託されている。
【０００７】
ビブリオ・ディアボリカス種(株HE800から単離され、ビブリオ属に属する)の物理化学的な特徴及び代謝特性は、WO98/38327の番号で公開され、イフレマー（IFREMER）の名前でのＰＣＴ国際出願に記載されている。
特に上述した瘢痕形成活性を有する医薬品は、例えば、骨体内プロステーシスのような骨修復又は充填材料（例えば、歯科補てつ物及び関節補てつ物）を製造するために骨修復活性を有している。
特に有利であるのは、上述したポリサッカライドは、骨体内プロステーシス又は骨伝導充填材料の被覆を製造するために用いることができる。そのようなポリサッカライドで被覆された骨伝導充填剤又は骨体内プロステーシス（チタンからなる歯科骨内部人工器官又は整形外科のセメントなしのチタンからなる関節補てつ物のような）は、実際、非常に迅速にレシピエントの骨に結合することができる。
また、本発明の対象は、少なくともその表面の一部が、上述したポリサッカライドで被覆された骨体内プロステーシスである。
【０００８】
本発明で使用することができるポリサッカライドは、例えば、ビブリオ・ディアボリカス種の培養上清からエタノールで沈積させることによって得ることができるポリサッカライドである。このポリサッカライドは、
−いかなる中性ポリサッカライドをも含まない、
−約５０重量％の酸サッカライド含量を有し、
−約５０重量％のオサミン含量を有し、
−グルクロン酸：Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｎ−アセチルグルコサミンモノサッカライドを約２：１：１のモル比で含有する。
そのようなポリサッカライドの構造は、H.Rougeauxらによる論文（Carbohydrate Research, 1999, 322, 40-45）に詳細に説明されている。それらは、本来の形態又は化学的誘導体の形態で使用することができ、ポリサッカライドは、例えば、硫酸基で官能化されている。
本発明で使用されるポリサッカライドは、付される最終的な処理（粉砕は粉末を得ることを可能にし、凍結乾燥は綿のような外観を有するポリマーを結果として生じ、乾燥は線維質を得ることを可能にする）に応じて、乾燥した形態、つまり、綿のような、繊維質の又は微粉の形態であってもよい。また、本発明で使用されるポリサッカライドは、水和物の形態、例えば、ヒドロゲルの形態であってもよい。膜又は三次元の胞状構造の固体の形態でのポリサッカライドのような使用を想定してもよい。
【０００９】
変形として、本発明に使用されるポリサッカライドは、骨伝導及び／又は骨誘導材と混合されてもよい。
そのような骨伝導材は、特に、S.P.A.D. 研究所 (Quetigny, France) 及びOSTE会社(Clermont-Ferrand, France)によってそれぞれLaddec（登録商標）及びLubboc（登録商標）の名前で市販されている骨のような、脱タンパクされた及び／又はセラミック化された骨、合成又は天然のリン酸カルシウム（β型リン酸三カルシウム、２相性燐酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト又は珊瑚等）、バイオガラスセラミック及びバイオガラス（例えば、PHARMADENT研究所(Levallois-Perret, France)によって市販されているBioglas（登録商標）及びPerioglas（登録商標））からなる群から選択することができる。
本発明で使用されるポリサッカライドと混合することができる骨誘導材は、ホルモン又は成長因子、特に、BMPであってもよい。骨誘導材と混合するポリサッカライドは、例えば、損傷部位に直接BMPを供給することによって、修復率を増加させることができる。本発明で使用されるポリサッカライドは、ビブリオ・ディアボリカス種によって放出され、骨誘導材の支持物として機能し、酵素による分解からそれを保護する。
【００１０】
また、本発明の対象は、ビブリオ・ディアボリカス種によって放出されるポリサッカライド（その株は、CNCMに１９９５年１０月１７日に、Ｉ−１６２９の番号で寄託されている）と、さらに、例えば、上述した骨伝導及び／又は骨誘導材とからなることを特徴とする骨再構築生体材料である。
上記組み合わせに加え、本発明は、さらに、以下の記載から明らかになるであろう他の組み合わせからなり、それは、骨修復におけるビブリオ・ディアボリカス細菌によって産生されるポリサッカライドの使用の例を参照する。しかし、これらの例は、実例としてのみ示しており、いかなる限定を構成するものではないことが明確に理解されるべきである。
実施例１：ビブリオ・ディアボリカス細菌によって産生されるエキソポリサッカライドの取得
a)ビブリオ・ディアボリカスの培養
株HE800 をグルコース(40 g/l)が強化された2216E培地(Oppenheimer, J. Mar. Res., 1952, 11, 10-18) で培養する。産生を、P.Vincentら、Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60, 41344141に記載されたように、グルコース含有２２１６Ｅ培地１リットルを含有する２リットルの醗酵槽中で、３０℃、ｐＨ７．４で行う。約４８時間の培養後、培養培地は、６０ｒｐｍで１００センチポアズのオーダーの粘度を有する。
【００１１】
b)エキソポリサッカライドの精製
蒸留水での５０：５０希釈後、細菌を２時間、２００００ｇで遠心分離によって培養培地から単離する。次いで、塩化ナトリウムを、この塩濃度が２０ｇ／ｌになるように希釈溶液に添加する。溶液を室温に維持し、ポリサッカライドを４℃にて純粋なエタノールを用いた上清から沈積させる。ポリサッカライドを回収し、次いで、F.Talmontら(Food Hydrocolloids, 1991, 5, 171172) 又はP.Vincentら(ibid)によって示された方法によって、エタノールの割合を増加するエタノール／水（70/30、80/20、90/10及び100/0（重量）)での数回の洗浄に付す。
得られたポリマーを３０℃で乾燥し、室温で維持する。このようにして、培養物１リットルにつき、約４．５ｇの精製されたポリサッカライドを得た。
実施例２：インビボにおける骨充填生体材料としてのボビブリオ・ディアボリカス細菌によって産生されたエキソポリサッカライドの使用
【００１２】
a)プロトコル
体重２７５〜２９９ｇの１０匹の６〜７週齢のウィスター系ラットを用いた。ラットは、麻酔の１時間半前に、Imalgene（登録商標）製剤中のケタミン(100 mg/kg) (Merial, Lyons, France)での筋肉鎮静及びRobinul（登録商標）(0.01 mg/kg, Vetoquinol, Lure, France)での皮下前投薬の後、Nesdonal（登録商標）(0.1 ml/100 g, Specia Rhone Poulenc Rorer, Montrouge, France)を用いた非経口麻酔に付した。
P.Cuevasら(Surg. Neurol., 1997, 47, 2426)又はC. Boschら(Cleft Palate Cranofacial Journal, 1995, 32(4), 311-317)によって示されたプロトコルに従って、直径５ｍｍの骨孔を、ラットの頭蓋冠における両頭頂葉での中央矢状縫合のいずれかの側に形成する。動物の頭蓋骨をクリッパー、次いで２枚刃の電気かみそりを用いてそぐ。外科術部位の術前後の消毒を１０％皮膚ベタジン（Asta Medica, Merignac, France）で行う。正中切開を約２０ｍｍにわたって行い、骨膜がそうであるように、皮膚組織を背部に湾曲させる。骨孔は、生理食塩水での洗浄下、直径１．４ｍｍの球形のダイヤモンドカッター（基準801.104.014 (Komet, France)）で形成される。１つの孔を右頭頂骨に、他の孔を左頭頂骨に、硬膜に損傷を与えないように配慮しながら形成する。
【００１３】
一旦、２つの骨孔を形成すると、実施例１で得られたエキソポリサッカライド （１〜２ｍｇ）を、その天然型（綿と同様の外観を有する乾燥構造）で、右頭頂骨に形成された空洞に配置し、一方、第２の空洞は充填せず、対照として用いる。骨膜を、Vicryl（登録商標）３．０吸収性縫合糸(Johnson & Johnson Intl., Brussels, Belgium)を用いて縫合し、皮膚層用の縫合は非吸収性材料で行われる。
次いで、動物をケージに入れ、２週間後、ペントバルビタール（Dolethal（登録商標）、Vetoquinol, Lure, France）を注射することによって屠殺する。頭蓋冠を除去し、ホルムアルデヒドで固定し、組織学的に調査される前に脱塩する。
b)結果
ビブリオ・ディアボリカス細菌によって放出されたポリサッカライドは、試験された全ての動物に対して、ラットの頭蓋冠に形成された空洞に充填することによって骨修復を可能にする。組織学の観点から、炎症作用は認められず、使用されたポリサッカライドはもはや検出可能ではなく、２週間のうちに新たに形成された骨は、完全に組織化された。コラーゲン線維が配向し、骨芽細胞は骨の表面を被覆し、骨細胞が存在する。この骨は、組織学的には正常である。また、新血管新生が顕著に認められ、皮膚の結合組織が抑制されていない状態で増殖していないことが観察された。さらに、皮膚の瘢痕形成は、増殖現象なく、優れた質である。
【００１４】
c)比較実験
ビブリオ・ディアボリカス細菌によって放出されたポリサッカライドの瘢痕形成特性を表１に示すＡ、Ｂ及びＣと名づけられた他の３種のポリサッカライドと比較した。
ポリサッカライドＡは、褐藻類の高分子量（１００万ｇ／モルのオーダー）フカン（fucan）である。
ポリサッカライドＢは、Raguenesら、Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(1), 67-73 によって示され、ＳＴ７１６と名づけられ、ブタペスト条約に準じて１９９５年１０月１７日にCNCM (Collection nationale de Cultures de Microorganismes [National collection of cultures of microorganisms])にIFREMERによって、番号Ｉ−１６２７で寄託され、28 rue du Docteur Roux, Parisのパスツール研究所に所有された、Alteromonas macleodii subsp. Fijiensisの株によって産生される。精製形態でのポリサッカライドの産生は、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ９９／６７４１１号に記載されている。
【００１５】
ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ９９／６７４１１号に記載されているように、ポリサッカライドＢは、グルコース、ガラクトース、グルクロン酸、ガラクツロン酸及びマンノースピルビン酸エステルからなり、これら種々の構成要素は、それぞれモル比１：１：１：２：１で表され、３つのサッカライド残分が主鎖を形成し、分岐点がガラクツロン酸残分からなる六糖類繰り返し単位に混合される。後者へのグラフト化は、４位と６位とにピルビン酸エステルでマンノース残分が終端化された側鎖である。
ポリサッカライドＢは、以下の式（Ｉ）に対応する基本六糖類単位からなる。
【００１６】
【化１】
0004895461.tif 000002
【００１７】
ポリサッカライドＣは、H.Rougeauxら、Carbohydrate Research, 1999, 315, 273-285で公開された文献に記載されているように、ＨＤＹ７２１と名づけられたPseudoalteromonas株の培養上清から４０％（重量）エタノールを用いた析出によって製造される。このポリサッカライドの基本八糖類単位は、以下の式(II)に対応する。
【００１８】
【化２】
0004895461.tif 000003
【００１９】
３種のポリサッカライドＡ、Ｂ及びＣ並びにビブリオ・ディアボリカス細菌によって放出されたポリサッカライドの瘢痕形成活性を評価するために、上記のａ）で示したのと同じ外科的プロトコルを用いた。結果は、新たに形成された骨の表面を、はじめに形成された孔のそれと比較することによって定量化し、この比較を、孔の充填の割合に換算して示す。以下の表１は、ゼロ(0%)、わずか(25%まで)、並(50%まで)、広範(99%まで)又は完全(100%) な孔の充填を観察した動物の数を示す。
【００２０】
【表１】
0004895461.tif 000004
【００２１】
したがって、試験されたポリサッカライドの中でも、ビブリオ・ディアボリカス細菌によって放出されたポリサッカライドのみが、ラットの頭蓋冠に形成された孔を完全に修復することが明白である。
d)結果
このように、ビブリオ・ディアボリカス細菌によって放出されたポリサッカライドは、ラットの頭蓋冠における臨界サイズの骨欠陥（直径５ｍｍ）を充填することを、再現可能に約２週間で、可能にする。８ｍｍ空洞及び４週間の器官での試験もまた、良質の完全な修復を可能にする。臨界損傷は、ＢＭＰの使用で観察された抑制されていない作用なく、アドインテグラム（ad-integrum）を再構築する。使用されたポリサッカライドは、いかなる炎症反応を引き起こさず、完全に周辺組織に再吸収される。したがって、ビブリオ・ディアボリカス細菌によって放出されるポリサッカライドは、骨修復を増強する材料を構成する。その作用は、そのオリジナルの物理化学的特性のためである。また、同じ期間で、対照の孔の８０％の回復をもたらす。