(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セクレトグラニン３遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号１〜１２それぞれの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における多型から選ばれる１又は２以上の多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満の発症リスクを予測する方法。
【請求項２】
配列番号１〜１２のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブを含む、請求項１に記載の方法に使用するための試薬。
【請求項３】
配列番号１〜１２のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含むDNA断片を増幅することのできるプライマーであって、該塩基の３０〜１００塩基上流の１５塩基以上の配列、又は該塩基の３０〜１００塩基下流の領域に相補的な１５塩基以上の配列を有するプライマーを含む、請求項１に記載の方法に使用するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肥満の検査方法、及び肥満を予防又は治療するための医薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活などのライフスタイルの変化に伴って、肥満の患者が増加している（非特許文献１）。肥満は糖尿病などの疾患にもつながる危険性があるため、早めに肥満発症を予測し、食生活の改善等に努めることが重要である。
肥満に寄与する要因として、遺伝的要因と環境的要因があるが、遺伝的要因として、多くの肥満関連遺伝子が報告されている（非特許文献２）。しかしながら、これらの遺伝子と肥満との関連は必ずしも明確ではなく、より正確に肥満発症を予測できる遺伝子解析法の開発が求められていた。【０００３】
グラニンは膵臓β細胞（インスリン分泌細胞）などの内分泌細胞（非特許文献４）や神経細胞に局在し、ペプチドホルモンや生理活性アミンなどを含む分泌顆粒を形成するタンパク質である。その一つであるセクレトグラニンIII（SCG3）は、脳及び下垂体に特異的なｍRNAとしてクローニングされ、視床下部の弓状核に発現することが報告されている（非特許文献３）。また、SCG3の膵臓β細胞での発現も報告されている（非特許文献４）。しかしながら、SCG3の肥満への関連については全く知られていなかった。
【非特許文献１】Kopelman, P.G. Nature 404, 635-643 (2000)
【非特許文献２】Snyder, E.E. et al.Obes. Res. 12, 369-439 (2004)
【非特許文献３】Ottiger, H.P., Battenberg, E.F., Tsou, A.P., Bloom, F.E. & Sutcliffe, J.G. J. Neurosci. 10, 3135-3147 (1990)
【非特許文献４】Hosaka M et al. Mol Biol Cell. 13, 3388-3399 (2002)
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、肥満の発症や進行、さらには肥満に伴う耐糖能異常、インスリン分泌低下、糖尿病などの合併症の発症を正確に予測するための検査方法を提供することを課題とする。本発明はまた、肥満及びその合併症の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、SCG3遺伝子の一塩基多型が肥満に関連することを見出した。さらに、SCG3遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングすれば、肥満の予防・治療薬が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）セクレトグラニン３遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査する方法。
（２）さらに、前記分析結果に基づいて、肥満患者におけるインスリン分泌低下、耐糖能異常、または糖尿病の発症を予測する、（１）の方法。
（３）前記一塩基多型が、配列番号１〜１２それぞれの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における多型から選ばれる１又は２以上の多型である、（１）または（２）の方法。
（４）配列番号１〜１２のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
（５）配列番号１〜１２のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含むDNA断片を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
（６）セクレトグラニン３遺伝子またはセクレトグラニン３遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、セクレトグラニン３遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、肥満の予防薬又は治療薬をスクリーニングする方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＳＣＧ３遺伝子上のＳＮＰの位置を示す図。＃がランドマークＳＮＰ、＊が挿入／欠失多型、†は1次スクリーニングで解析したSNPｓを示す。
【図２Ａ】各SNPを含むフラグメント（１つ）の転写活性化能をSH-SY5Y細胞において解析した結果を示す図。□はメジャーアレル、■はマイナーアレルに相当するフラグメントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は平均値±SEで示し、有意差は非対ｔ−検定に従った。
【図２Ｂ】各SNPを含むフラグメント（４つ連結したもの）の転写活性化能をSH-SY5Y細胞において解析した結果を示す図。□はメジャーアレル、■はマイナーアレルに相当するフラグメントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は平均値±SEで示し、有意差は非対ｔ−検定に従った。
【図３Ａ】各SNPを含むフラグメント（１つ）の転写活性化能をBE(2)-C細胞において解析した結果を示す図。□はメジャーアレル、■はマイナーアレルに相当するフラグメントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は平均値±SEで示し、有意差は非対ｔ−検定に従った。
【図３Ｂ】各SNPを含むフラグメント（４つ連結したもの）の転写活性化能をBE(2)-C細胞において解析した結果を示す図。□はメジャーアレル、■はマイナーアレルに相当するフラグメントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は平均値±SEで示し、有意差は非対ｔ−検定に従った。
【図４Ａ】各SNPを含むフラグメント（１つ）の転写活性化能をHIT-T15細胞において解析した結果を示す図。□はメジャーアレル、■はマイナーアレルに相当するフラグメントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は平均値±SEで示し、有意差は非対ｔ−検定に従った。
【図４Ｂ】各SNPを含むフラグメント（４つ連結したもの）の転写活性化能をHIT-T15細胞において解析した結果を示す図。□はメジャーアレル、■はマイナーアレルに相当するフラグメントを用いた場合の結果をそれぞれ示している。ルシフェラーゼ活性は平均値±SEで示し、有意差は非対ｔ−検定に従った。
【図５Ａ】ＳＮＰ−２（5’ Flanking -1203）を含むオリゴヌクレオチドを用いたゲルシフト実験の結果を示す図（写真）。C,G,Aはそれぞれの多型に対応するオリゴヌクレオチドを示す。矢印は特異的結合を示している。
【図５Ｂ】ＳＮＰ−９（Intron 1 +190）を含むオリゴヌクレオチドを用いたゲルシフト実験の結果を示す図（写真）。C,G,Aはそれぞれの多型に対応するオリゴヌクレオチドを示す。矢印は特異的結合を示している。
【図６】SCG3遺伝子を含むプラスミドまたはコントロールプラスミドをトランスフェクトしたBE(2)-C細胞の電子顕微鏡による観察結果を示す図（写真）。（A）はコントロールプラスミドをトランスフェクトしたBE(2)-C細胞、（B）はSCG3遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクトしたBE(2)-C細胞の電子顕微鏡像である。矢印（→）は分泌顆粒を示す。（C）はSCG3遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクトしたBE(2)-C細胞を抗SCG3抗体で染色した染色結果を示す像である。矢印（黒三角）はSCG抗体で染色された分泌顆粒を示している。スケールバーは 500 nmを示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、セクレトグラニンIII（SCG3）遺伝子上に存在する肥満に関連する一塩基多型（SNP；single nucleotide polymorphism）を分析し、該分析に基づいて肥満を検査する方法である。肥満としては、例えば、BMI（Body Mass Index；（体重kg）／（身長m）2）が２５以上の状態をいう。なお、本発明において、「検査」とは将来、肥満になるかどうかを予測ための検査、及び肥満の程度が悪化するかどうかを予測するための検査を含む。また、肥満になった場合における、インスリン分泌能の低下や耐糖能異常、糖尿病などの合併症の発症の検査も含む。さらに、肥満が皮下脂肪蓄積によるものであるかどうかの検査も含む。【０００９】
SCG3遺伝子としては、ヒトSCG3遺伝子が好ましく、例えば、GenBank Accession No. AC020892に登録された配列を有する遺伝子を挙げることができる。ただし、該遺伝子は人種の違いなどによって１又は複数の塩基に置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。【００１０】
肥満に関連するSCG3遺伝子の一塩基多型部位は特に制限されないが、例えば、以下に示すSNP-1、SNP-2、SNP-5、SNP-9、SNP-11、SNP-12、SNP-16、SNP-17、SNP-20、SNP-26、SNP-27、SNP-29が挙げられる。【００１１】
【表１】
0005083800.tif 000002
【００１２】
表１において、例えば、SNP-1はGenBank Accession No. AC020892の144248番目の塩基におけるアデニン（A）／グアニン（G）の多型を意味し、この塩基がAである場合は肥満になる確率が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、SNP-1がAA＞AG＞GGの順で肥満になる確率が高い。なお、SNP locationの5’ Flankingは、転写開始点を基準とした位置を示している。例えば、SNP-1は５’隣接領域内の、転写開始点より1492塩基上流の塩基におけるSNPである。dbSNPはNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。この欄が空欄のSNPはdbSNPデータベースに登録されていない新規SNPである。
その他のSNPについても同様であるが、いずれについても左側の塩基が肥満になりやすい塩基である（例えば、SNP-2の場合、A/CのうちAの場合が肥満になりやすく、SNP-5の場合、G/CのうちGの場合が肥満になりやすい）。
なお、SNP-1、SNP-2、SNP-5、SNP-9、SNP-11、SNP-12、SNP-16、SNP-17、SNP-20、SNP-26、SNP-27又はSNP-29について、SNP塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２に示した。それぞれ６１番目の塩基が多型を有する。
これらの塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」とは、ヒトSCG3遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がSNP以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。【００１３】
上記SNPの塩基の種類を調べることによって、肥満を検査することができる。検査するSNPの数は、一種類でもよいし、複数でもよい。なお、SNP-1がAであれば他のSNPも左側の塩基（SNP-2＝A、SNP-5＝G、SNP-9＝A、SNP-11＝C、SNP-12＝A、SNP-16＝C、SNP-17＝A、SNP-20＝G、SNP-26＝C、SNP-27＝T、SNP-29＝T）であるというように、上記SNPのタイプは互いに相関するため、一箇所のみを解析することによっても十分正確な肥満の予測を行うことができる。なお、SCG3遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。【００１４】
肥満患者においては、SNP-2がCC（SNP-1はGG）の場合、インスリンの分泌量が少なく、血糖値が上昇する傾向がある。したがって、肥満患者においてSCG3遺伝子の一塩基多型を調べることで、肥満患者が、インスリン分泌低下、耐糖能異常、または糖尿病を引き起こす可能性について予測することもできる。【００１５】
SCG3遺伝子の一塩基多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。一塩基多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。【００１６】
SCG3遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の一塩基多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。【００１７】
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。【００１８】
また、PCRによる増幅の有無を調べることによっても解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。【００１９】
また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、SCG3遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。【００２０】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。【００２１】
ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。【００２２】
なお、本発明の検査法においては、SCG3遺伝子の多型に加え、他の遺伝子の多型を解析し、それらの遺伝子の多型の組合わせに基いて肥満の検査を行ってもよい。他の遺伝子としては、βアドレナリンレセプター遺伝子（日本臨床、2002 Jul;60 Suppl 7:565-70.）やレプチン遺伝子（Hum Genet., 2001, vol.108(3), p233-236）などが挙げられる。【００２３】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、肥満を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、SCG3遺伝子における上記多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜１２のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さはより好ましくは、１５〜３５塩基である。
また、プライマーとしては、SCG3遺伝子における上記多型部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜１２のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましい。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
なお、上記のようなプローブやプライマーは肥満患者がインスリン分泌低下、耐糖能異常、または糖尿病を引き起こすかどうかを予測するためにも用いることができる。【００２４】
＜３＞スクリーニング方法
本発明者の研究により、SCG3は食欲調節に深く関与することが知られている弓状核、室傍核、視床下部外側野に局在することが明らかとなり、SCG3はこれらの部位において食欲の調節に関与するペプチドホルモンの分泌に関与していることが強く示唆された。以上のことから、SCG3遺伝子の発現を調節する物質をスクリーニングすることにより、肥満の予防薬又は治療薬となりうる候補物質を得ることができる。また、肥満に伴う、耐糖能異常、インスリン分泌低下、糖尿病などの合併症の予防薬又は治療薬となりうる候補物質を得ることもできる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、SCG3遺伝子またはSCG3遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、セクレトグラニン３遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、肥満またはその合併症の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法である。【００２５】
SCG3遺伝子を発現する細胞としては、神経系の細胞が好ましく、SH-SY5Y細胞（ATCC CRL-2266）やBE(2)-C細胞（ATCC CRL-2268）、HIT-T15細胞（ATCC CRL-1777）などを用いることができる。
SCG3遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を用いる場合、SCG3遺伝子のプロモーターとしては、上述したSNPを含む領域が好ましく、該遺伝子の転写開始点の上流の少なくとも１．５ｋｂｐを含む領域が好ましい。また、プロモーターはその一部を用いてもよく、例えばSNPを含む１０〜５０ｂｐの短い領域を用いてもよい。SNPを含むプロモーターを使用する場合、SNPの塩基としては肥満の危険度が低い方の塩基（例えば、SNP-2の場合はC、SNP-9の場合はG）を含むプロモーターが好ましい。
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが例示できる。これらのレポーター遺伝子をSCG3遺伝子のプロモーターに連結し、これを哺乳類細胞に遺伝子を導入するために用いられるプラスミドに組み込み、リポフェクションなどの通常の方法にて細胞にトランスフェクションする。【００２６】
上記のような神経細胞又はレポーター遺伝子が導入された細胞に医薬候補物質を添加し、SCG３遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する。
医薬候補物質としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドであってもよい。スクリーニングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。候補物質の中からSCG３遺伝子又はレポーター遺伝子の発現量を変化させるものを選択することにより、肥満薬の候補物質を得ることができる。なお、「変化」とは、医薬候補物質が、非添加時に比べて、SCG3遺伝子の発現量を増加させること、および減少させることを含む。
SCG３遺伝子の発現量はRT-PCR、定量PCR、ノーザンブロット、ELISA、Western blotting、In situ hybridization、免疫組織染色などの方法により測定することができる。レポーター遺伝子の発現量はレポーター遺伝子の種類にもよるが、蛍光強度などによって測定することができる。
SCG３遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を変化させた物質を抗肥満薬の候補物質として選択することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。【００２８】
（１）多型解析
まず、以下のようにして、肥満に関連するSNPの探索を行った。
東京医科大学、大阪大学などの大学病院や豊中市病院、大手前病院などの病院の外来患者から選ばれた肥満患者（BMI≧３０）を解析の対象とした。２次的肥満や遺伝的肥満の患者は解析対象から除いた。
対照の被験者は東京医科大学などで検診を受けた通常体重のボランティアから任意に選んだ。
各被験者より書面のインフォームドコンセントを得たうえで、各施設の倫理委員会及び理化学研究所の承認を得たプロトコルに基づいて解析を行った。【００２９】
＜DNAの調製とSNPジェノタイピング＞
試料として、各被験者の血液サンプルから染色体DNAを、通常の手順にて調製した。
JSNPデータベース（A database of Japanese Single Nucleotide Polymorphisms；snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html）から任意に選んだ６２６６３種類のSNPｓを、94人の日本人の肥満患者（症例１；39名の男性及び55名の女性、平均年齢４７±２歳、BMI３６．３±０．５ｋｇ／ｍ２）において、インベーダーアッセイ（Ohnishi, Y. et al. J. Hum. Genet. 46, 471-477 (2001)）によりジェノタイピングを行った。これらのSNPｓのジェノタイプとアレル頻度を一般的な日本人からなる６５８人（対照１）と比較した。その結果、SCG3遺伝子上のSNP（5’ Flanking-1492  AC020892.7_144248又はrs3764220；IMS-JST118085）が肥満との相関を示し、メジャーアレル（A）とマイナーアレル（G）の比較でｐ＝０．０２を示すことがわかった（表２、３の上段参照）。【００３０】
したがって、このSCG3遺伝子に注目し、別の肥満患者（症例２；３７９名の男性及び４１７名の女性、平均年齢４９±１歳、BMI３４．３±０．２ｋｇ／ｍ２）及び通常体重の対照被験者（コントロール２；２８５名の男性及び４８９名の女性、平均年齢５２±１歳、BMI２１．６±０．１ｋｇ／ｍ２）について、SCG3遺伝子上に存在する上記ランドマークSNP (5’ Flanking 領域-1492)の多型をさらに調べた。【００３１】
結果を表２、３（下段）に示す。このSNPは、メジャーアレル（A）とマイナーアレル（G）の比較でｐ＝0.000032、マイナーアレルホモ体（GG）とその他（AG、AA）の比較でｐ＝0.0000035と、肥満に対して非常に高い相関を示すことがわかった。
ジェノタイプ分布、アレル頻度はχ２乗検定又はFisher’s exact testによって解析した。
表2のHWEテストはHardy-Weinberg equilibrium test（Nealsen, D.M., Ehm, M.G. & Weir, B.S. Am. J. Hum. Gent. 63, 153-1540 (1998)）を示す。【００３２】
【表２】
0005083800.tif 000003
【００３３】
【表３】
0005083800.tif 000004
【００３４】
次に、上記症例２及び対照２について、ＳＣＧ３遺伝子内の他のＳＮＰについても調べた。なお、各SNPｓのSCG3遺伝子上の位置関係を図１に示した。
その結果（表４）、11種類のＳＮＰの型はＳＮＰ−１とほとんど完全に相関しており（Δの欄参照）、肥満とも有意に相関する（χ２ P value参照）ことがわかった。危険率（Odds ratio）及び95%信頼区間（c.i.）はWoolfの方法に従った。また、相関の非平衡係数（Δ）はDelvin, B. & Rish, N. Genomics 29, 311-322 (1995)に従った。
以上より、これらの多型を解析することにより、肥満を予測できることが示唆された。【００３５】
【表４】
0005083800.tif 000005
【００３６】
次に、上記症例２及び対照２について、さらに、BMI、血中インスリン値、血糖値、血中コレステロール値、血中トリグリセリド値、血中HDL−コレステロール値及び血圧を測定し、それらのパラメーターとSNP-2（5’ Flanking-1203）の多型との関連を調べた。結果を表５に示す。
その結果、肥満患者ではC/Cの場合にBMI、血中インスリン値、血中トリグリセリド値及び血圧が低く、血糖値が高い傾向を示した。一方で、対照群ではこれらのパラメーターは多型によって違いは見られなかった。
上記結果より、肥満患者の中でも、SNP-2のC/C型を有する患者はインスリン抵抗性に応答して血糖値を下げるためのインスリンを十分に分泌できないため、耐糖能異常や糖尿病に陥る可能性が高くなることが示唆された。【００３７】
【表５】
0005083800.tif 000006
【００３８】
次に、肥満の有無に関係なくランダムに選ばれた403人の日本人被検者（男性144名、女性259名；年齢48±1歳）について、BMI、内臓脂肪面積、皮下脂肪面積を測定し、SNP-2の多型との関係を調べた。結果を表６に示した。皮下脂肪面積、内臓脂肪面積と、BMIの相関は、それぞれ0.77 (p<0.001) 、0.50 (p<0.001)であった。皮下脂肪面積は内臓脂肪面積に対し、有意に相関を示した (r=0.27, p<0.001)。【００３９】
【表６】
0005083800.tif 000007
【００４０】
SNP-2の多型と皮下脂肪面積および内臓脂肪面積との相関を明らかにするため、SNP-2の多型をAAとその他（AC、CC）に分け、重回帰分析を行った（表７）。その結果、AA型 (n = 306, P = 0.0015), 女性 (P < 0.0001) 及びBMIの増加(P < 0.0001) は、皮下脂肪面積の増加に有意に相関した (R2 = 0.67)。SNP-2の多型は皮下脂肪面積に独立して影響を与えることがわかった。一方、内臓脂肪面積に対しては有意な相関を示さなかった。【００４１】
【表７】
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【００４２】
（２）SCG遺伝子の転写解析
ＳＮＰ−１、ＳＮＰ−２、ＳＮＰ−５は５’隣接領域に、ＳＮＰ−９、ＳＮＰ−１１、ＳＮＰ−１２はイントロン1内に存在する。したがって、これらの多型がＳＣＧ３遺伝子の転写に与える影響を調べるために、以下の実験を行った。
各ＳＮＰにつき、メジャーアレル又はマイナーアレルを含む２０ｂｐ領域に相当する2本鎖オリゴヌクレオチドまたはそれが４つ連結したものに、５’側にNheIサイト、３’側にXbaIサイトを導入したオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。SV40プロモーターに連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含むpGL3-Promoter Vector（Promega）に上記オリゴヌクレオチドを組み込んでレポータープラスミドを構築した。オリゴヌクレオチドが組み込まれたことはシークエンスによって確認した。このレポータープラスミドを、トランスフェクション効率の内部標準としてのphRL-TKベクター（Promega）とともに、リポフェクトアミン2000（Invitrogen）を用いてSH-SY5Y細胞又はBE(2)-C神経芽細胞腫細胞にトランスフェクションした。24時間後に細胞を回収し、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。【００４３】
なお、SH-SY5Y細胞およびBE(2)−C細胞はATCC（American Tissue Culture Collection）より購入した。これらは2mMグルタミン、５％ウシ胎児血清、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを添加したadvanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium（Invitrogen）を用いて培養した。【００４４】
SH-SY5Y細胞、BE(2)-C細胞を用いた結果を図２、３にぞれぞれ示す。ＳＮＰ−２及びＳＮＰ−９を含むフラグメントが転写活性化能を有することがわかった。また、これらのフラグメントの転写活性化能はいずれもマイナーアレルのほうが高いことがわかった。さらに、SNP-2を含む３３ｂｐの2本鎖オリゴヌクレオチド（以下の段落で用いたフラグメントと同じ）でも、マイナーアレルで転写活性能が高いことを確認した。
また、SCG3は膵臓のβ細胞で発現していることが報告されていることから、ハムスターの膵臓β細胞株であるHIT-T15 細胞においても、上記と同様の転写解析を行った。（図４）。その結果、HIT-T15細胞でも同様の結果が得られたが、SH-SY5Y細胞よりも転写活性は弱かった。これはヒトとハムスターという種の違いによるものと考えられた。【００４５】
次に、これらのＳＮＰ部位にタンパク質が結合するかを調べるため、以下の実験を行った。
まず、各SNP（ＳＮＰ−２又はＳＮＰ−９）を含む３３ｂｐの2本鎖オリゴヌクレオチドを、ジゴキシゲニンゲルシフトキットを用いてジゴキシゲニン-11-ddUTPで標識した。
NE-PER抽出試薬（Pierce）を用いてSH-SY5Y細胞又はBE(2)-C細胞から核抽出物を調製し、上記ジゴキシゲニン-11-ddUTPラベルした2本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベートした。競合アッセイには、核抽出物を標識オリゴヌクレオチドの100倍過剰量の非標識オリゴヌクレオチドとプレインキュベートした後に標識オリゴヌクレオチドとインキュベートした。タンパク質-DNA複合体を、0.5Xトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー中、５％の非変性ポリアクリルアミドゲルにて分離した。ゲルをナイロン膜に移し、シグナルを化学発光検出システム（Roche）を用い、製造元のプロトコルに従って検出した。【００４６】
結果を図５に示す。ＳＮＰ−２又はＳＮＰ−９のいずれのフラグメントにおいても矢印の位置に核タンパク質の特異的な結合が見られた。この結合は、マイナーアレルに対応するフラグメントでのみ見られ、メジャーアレルに対応するフラグメントでは見られなかった。このことから、転写に関与する核タンパク質がこれらの領域に結合してSCG3遺伝子の転写を調節しており、メジャーアレルの場合にはこの調節が起こらない可能性が示唆された。【００４７】
（３）SCG3の組織分布の解析
次に、ＳＣＧ３の組織分布を調べるため、In situハイブリダイゼーション及び２重ラベル免疫組織化学を行った。
オスのマウス（B57BL/6、８週齢）を三共ラボサービスより購入した。マウスはTissue Fixative（Genostaff）を用いて還流することにより固定化し、パラフィンで包埋した。組織片（４μm）を脱パラフィン化し、RNAプローブをハイブリダイズさせた。
プローブは、マウスcＤＮＡ（GenBank Accession No. NM_009130）の９４３〜１３８３番目に相当する４４１ｂｐのＤＮＡ断片をpＧＥＭ-Ｔ-Ｅａｓｙベクター（Promega）に組み込み、センスとアンチセンスのＲＮＡプローブを生成させ、これをDIG RNAラベリングミックス（Roche）を用いて標識することにより調製した。
ジゴキシゲニン標識RNAプローブを、上記組織片に42℃で18時間ハイブリダイズさせた。結合した標識物質はアルカリフォスファターゼ標識DIG抗体及びアルカリフォスファターゼの基質であるNBT-BCIPを用いて検出した。
その結果、SCG3のｍRNAは弓状核（ARC）、室傍核（PVN）、視床下部外側野（LHA）のいずれにも検出された。【００４８】
次に免疫組織染色を行った。組織切片（厚さ４μｍ）を、オレキシンB（１：５００  Chemicon）、MCH（melanin-concentrating hormone）（１：５００  Phenix Pharmaceuticals）、NPY（neuro peptide Y）（１：２００  Chemicon）、BDNF(Brain-derived neurotrophic factor) （１：１００  Santa Cruz）又はPOMC（proopiomelanocortin）（１：５００  Phenix Pharmaceuticals）のいずれかに対するウサギポリクローナル抗体と、SCG3に対するヤギポリクローナル抗体（１：２００  Santa Cruz）の組み合わせのそれぞれと4℃で一晩インキュベートした。切片を洗浄し、蛍光標識された2次抗体（ヤギIgGに対するAlexa Fluor568ロバポリクローナル抗体、及びウサギIgGに対するAlexa Fluor488ロバポリクローナル抗体；いずれも１：２０００  Molecular Probe）を加え、室温で2時間インキュベートした。2重免疫蛍光をオリンパスのBX51顕微鏡にて観察した。【００４９】
その結果、SCG3タンパク質は主にARC、LHAおよびPVNに検出された。
ARCは食欲調節に関わる部位であり、NPYやPOMCニューロンが存在する。2重免疫染色の結果、ARC内では、SCG3タンパク質はNPYやPOMCと同じ部位に局在していることが確かめられた。
一方、LHAは、食欲抑制に関与するオレキシンやMCHが存在する部位である。2重免疫染色の結果、SCG3タンパク質は、LHA内ではその一部がオレキシンBやMCHと同じ部位に局在することが確かめられた。
ARC        LHA        PVN
SCG3          ○        ○          ○
BDNF          ○        ○          ○
NPY           ○        −          −
POMC          ○        −          −
オレキシンＢ  −        ○          −
MCH           −        ○          −【００５０】
（４）SCG3タンパク質の細胞内局在
SCG3タンパク質の細胞内局在を調べるため、神経細胞を用いて免疫染色を行った。
SCG3遺伝子のコード領域を、PstIサイトを有する５’プライマー及びSalIサイトを有する３’プライマー、及び鋳型として視床下部のｃDNAを用いたRT-PCRにより増幅した。PCR産物を制限酵素で消化した後、同酵素で消化したpBIベクター（Clonetech）に組み込んだ（pBI-SCG3）。一方、preproオレキシン、POMC、proNPY、proMCHのそれぞれをコードする遺伝子をMluIサイトを有する５’プライマー及びEcoRVサイトを有する３’プライマーを用いたRT-PCRにより増幅した。増幅産物をMluI及びEcoRV で消化し、同酵素で消化したpBI-SCG3にそれぞれ組み込んだ（pBI-SCG3-preproorexin、pBI-SCG3-POMC、pBI-SCG3-proNPY、pBI-SCG3-proMCH）。
pBI-SCG3-preproorexin、pBI-SCG3-POMC、pBI-SCG3-proNPY、pBI-SCG3-proMCHを、それぞれ、pTet-Offベクター（Clonetech）を含むSH-SY5Y細胞またはBE(2)-C細胞にリポフェクトアミン2000試薬（Invitrogen）を用いてトランスフェクトした。免疫細胞染色のために、PBSで洗浄後、細胞を４％パラフォルムアルデヒドで15分固定した。細胞をさらに０．５％Triton X-100で処理し、PBSで洗浄し、１％BSAで室温、2時間ブロッキングし、４℃で一晩インキュベートした。上記の組織染色と同様に、オレキシン、POMC、NPY又はMCHのいずれかに対する抗体及びSCG3抗体で反応させ、次いで、蛍光標識された2次抗体を反応させた。細胞は共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて観察した。【００５１】
その結果、SCG3は顆粒状の構造を形成し、オレキシン、MCH、NPY及びPOMCと細胞内局在が同じであることがわかった。以上より、SCG3はこれらの食欲調節に関与するペプチドの分泌を担っており、SNPによってこの発現や機能に変化が生じることにより、肥満が起こることが示唆された。【００５２】
（５）電子顕微鏡による解析
SCG3遺伝子を含むプラスミドまたはコントロールプラスミドでトランスフェクトしたBE(2)-C細胞において、SCG3の局在を免疫電子顕微鏡解析によって調べた。
まず、開始コドンの前にKozak配列及びNotI認識配列を付加した５’プライマー、及び終止コドンの後にEcoRI認識配列を付加した３’プライマーを用い、視床下部のcDNAからヒトSCG3遺伝子のコード領域を増幅した。増幅産物をNotIとEcoRIで消化した後、pcDNA3.1(-) ベクター (Invitrogen)のNotI部位とEcoRI部位の間に挿入した。得られたpcDNA-SCG3 を、FuGENE6 Transfection Reagent (Roche)を用いて、BE(2)-C 細胞にトランスフェクトした。48 時間後、細胞をPBSで洗浄し、0.05% トリプシン−0.53 mM EDTA (Invitrogen)で処理してディッシュからはがし、遠心分離を行って細胞を回収した。
回収した細胞を2.5% グルタルアルデヒドを含むカコジル酸バッファー（pH7.2）で固定化し、次いで、2% 四酸化オスミウムで処理し、脱水した後、エポキシ樹脂に包埋した。超薄片を酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。
一方、免疫組織染色のためには、回収した細胞を4% パラホルムアルデヒドを含むカコジル酸バッファー（pH7.2）で固定化し、脱水し、LR-WHITE（登録商標）樹脂に包埋した。超薄片を抗SCG3ヤギポリクローナル抗体(Santa Cruze；200倍希釈)で処理し、次いで、5 nm の金で標識された抗ヤギIgGウサギ抗体(Amersham Bioscience)で処理した。
それぞれの像を透過型電子顕微鏡(JEOL)を用いて観察した（図６）。SCG3遺伝子をトランスフェクトしたBE(2)-C 細胞では顆粒が観察されたが、コントロールベクターをトランスフェクトした細胞では観察されなかった。免疫電子顕微鏡解析の結果、顆粒は抗SCG3抗体で染色され、SCG3 が神経細胞内で分泌顆粒を形成していることがわかった。
【産業上の利用の可能性】
【００５３】
本発明の検査方法により、肥満の発症リスクや進行を正確に予測することができるため、肥満を予防したり、進行を抑えたりすることができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、肥満の新規な予防・治療薬を得ることができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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