(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックスに取り込まれた２つ以上の細胞集団の実質的に均一な混合物を含有してなる偽組織であって、該細胞集団は、各々、１つ以上の特定のマーカーの数に関して互いに実質的に同一である２つ以上の細胞を含み、該２つ以上の細胞集団は１つ以上の該特定のマーカーの数に関して１つの細胞集団とその他では異なる細胞を含み、該マトリックスに取り込まれた細胞は固定されている、偽組織。
【請求項２】
１つ以上のマーカーが、脂質、リポ多糖、糖、タンパク質、ＣＤ−特徴付けありの細胞膜構造体およびＣＤ−特徴付けなしの細胞膜構造体、細胞質、ヌクレオチドならびに核酸からなる群より選択される、請求項１記載の偽組織。
【請求項３】
マーカーが、免疫組織学的技術、免疫細胞学的技術、免疫蛍光を用いたハイブリダイゼーション技術および／または免疫酵素的技術を用いることにより検出可能である、請求項１または２記載の偽組織。
【請求項４】
１つ以上のマーカーが、Ｋｉ−６７等の増殖マーカー；エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプターまたはアンドロゲンレセプター等のホルモンレセプター；細胞骨格化合物；血液学的マーカー；ｃ−ｍｙｃ等のオンコジーン産物；細胞膜成分；核結合レセプター；遺伝子増幅、遺伝子欠失、点変異および転座等の染色体異常；ならびに感染性因子からなる群より選択される、請求項１、２または３記載の偽組織。
【請求項５】
少なくとも１つの細胞集団中の細胞が、インビトロで、培養され、回収され、および／または収集された培養細胞であり、該細胞集団の細胞が任意にトランスフェクトされ、該細胞集団の細胞が、互いに実質的に等しい、請求項１〜４いずれか記載の偽組織。
【請求項６】
２つの異なる細胞集団に由来する細胞の比が、１：１０9〜１０9：１の間にある、請求項１〜５いずれか記載の偽組織。
【請求項７】
マトリックスの材料が、プラスチック、パラフィンおよびパラフィン誘導体、アガロース、非ヘパリン処理血清、コラーゲン、セルロース誘導体、キチン誘導体、キトサン誘導体ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜６いずれか記載の偽組織。
【請求項８】
該１つ以上の細胞集団の該細胞が、マトリックスへの取り込みの前または後に固定または安定化され、該固定／安定化は、ホルマリン、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、酢酸、エタノール、アセトン、ピクリン酸、クロロホルム、二クロム酸カリウムおよび塩化第二水銀からなる群より選択される１つ以上の固定剤を用いて行われ、および／またはマイクロ波加熱もしくは凍結により安定化される、請求項１〜７いずれか記載の偽組織。
【請求項９】
１つ以上の特定のマーカーの数および／または反応有効性に関して１つの細胞集団とその他とでは異なる細胞を含有する２つ以上の細胞集団の実質的に均一な混合物から構成される偽組織を含んでなる、マーカーを含有する細胞画分の定量および定性のための診断キットであって、該細胞がマトリックスに取り込まれ、かつ固定されている、診断キット。
【請求項１０】
偽組織が請求項１〜８いずれかに規定されるものである、請求項９記載の診断キット。
【請求項１１】
マーカーの検出のための成分または成分のセットをさらに含んでなり、該成分または成分のセットが、１つ以上の抗体および／またはその活性な誘導体、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ、合成オリゴ−ヌクレオチド、ＰＮＡ、あるいはＬＮＡを含み、該成分が、１つ以上の酵素および／または蛍光化合物に連結され得、該成分のセットが、酵素および酵素の検出のための試薬である、請求項９または１０記載の診断キット。
【請求項１２】
マーカーがＫｉ−６７タンパク質であり、マーカーの検出のための成分が、Ｋｉ−６７タンパク質に対する抗体であり、該抗体が、ＭＩＢ（登録商標）ファミリーのメンバーである、請求項１１記載の診断キット。
【請求項１３】
請求項１〜８いずれかに規定される２つ以上の偽組織を含んでなり、該２つ以上の偽組織が、１つ以上の特定のマーカーに関して、該特定のマーカーについてのマーカー陽性細胞の数の百分率として規定される異なるマーカー指数を有する、請求項９〜１１いずれか記載の診断キット。
【請求項１４】
ｉ）予め決定された質および／または量のマーカーを有する請求項１〜８いずれかに規定される偽組織を提供する工程；
ｉｉ）細胞画分および偽組織を、マーカー反応の検出のための成分または成分のセットに供する工程；ならびに
ｉｉｉ）偽組織の検出されたマーカー反応を用いることにより細胞画分のマーカーの質および／または量を測定する工程
を含む、インビトロ診断のためのマーカーによって標識される細胞画分のマーカー指数の定性的および／または定量的な測定のための分析方法。
【請求項１５】
請求項９〜１３いずれかに規定される診断キットを用いて行われる、請求項１４記載の分析方法。
【請求項１６】
１つ以上のさらなるマーカーの定性的および／または定量的な測定の工程をさらに含み、該１つ以上のさらなるマーカーが、該１つ以上のさらなるマーカーについて異なるマーカー指数を有する少なくとも１つの細胞集団を含有する１つ以上の偽組織を用いて測定される、請求項１４または１５記載の分析方法。
【請求項１７】
ｉ）１つ以上の特定のマーカーの数に関して互いに実質的に同一である細胞を含有する第１の細胞集団を選択する工程；
ｉｉ）該１つ以上の特定のマーカーの数に関して互いに実質的に同一である細胞を含有する第２の細胞集団を選択する工程、ここで該第２の細胞集団の該細胞は、１つ以上の該特定のマーカーの数に関して該第１の細胞集団の細胞とは異なる、ならびに
ｉｉｉ）第１および第２の細胞集団をマトリックスに取り込ませる工程、
を含む、請求項１〜８いずれかに規定される偽組織の製造方法。
【請求項１８】
細胞の第２の集団中の細胞の数と比較した細胞の第１の集団中の細胞の数が予め測定され、１：１０9〜１０9：１の間にある、請求項１７記載の偽組織の製造方法。
【請求項１９】
細胞を有するマトリックスを、１００μｍまでの厚みを有する切片に切断する工程をさらに含む、請求項１７または１８記載の偽組織の製造方法。
【請求項２０】
試料中の１つ以上のマーカーの定量および／または定性のための請求項９〜１３いずれか記載の診断キットの使用。
【請求項２１】
増殖指数の測定のための請求項９〜１３いずれか記載の診断キットの使用。
【請求項２２】
癌の診断および治療におけるインビトロ診断のための請求項９〜１３いずれか記載の診断キット。
【請求項２３】
試験試料のマーカー指数の検証のための請求項１〜８いずれかに規定される偽組織の使用。
【請求項２４】
請求項１〜８いずれか記載の偽組織および測定対象の分子の特異的検出のための検出物質を含む、分子の定量的および／または定性的な測定のための検出システム。
【請求項２５】
（ｉ）細胞を含む少なくとも２つの異なる細胞集団の実質的に均一な混合物を含有する偽組織を提供する工程、ここで該細胞集団は、測定対象の少なくとも１つのマーカーの存在において異なり；該偽組織は、予め決定された質および／または量のマーカーを有し、該細胞は、マトリックスに取り込まれ、かつ固定されている；
（ｉｉ）細胞画分および偽組織を、マーカー反応の検出のための成分または成分のセットに供する工程；ならびに
（ｉｉｉ）定性／定量のためのアッセイ内およびアッセイ間の標準として偽組織を用いることによって、細胞画分の少なくとも１つのマーカーの質および／または量を測定する工程
を含む、インビトロ診断のためのマーカーを含む細胞画分のマーカー指数の定量的および／または定性的な測定のための分析方法。
【請求項２６】
該マーカーが、抗体、酵素と連結された化合物、または蛍光化合物により検出される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
抗体が、Ｋｉ−６７タンパク質に対するものである、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜８いずれか記載の偽組織を含んでなり、該偽組織がマーカー指数のアッセイ内およびアッセイ間の標準化のために使用されることを特徴とする、インビトロ診断のためのマーカーを含有してなる細胞画分の定量および定性のための診断キット。
【請求項２９】
マーカーがＫｉ−６７タンパク質であり、マーカーの検出のための成分がＫｉ−６７タンパク質に対する抗体である、請求項２８記載の診断キット。
【請求項３０】
試料中の１つ以上のマーカーの定量および／または定性のための請求項２８または２９記載の診断キットの使用。
【請求項３１】
増殖指数の測定のための請求項２８または２９記載の診断キットの使用。
【請求項３２】
インビトロ診断ならびに癌の診断および治療のための請求項２８または２９記載の診断キット。
【請求項３３】
少なくとも２つの細胞集団に由来する細胞が、均一に分散されてマトリックス内で互いに混合され、アッセイ内およびアッセイ間の標準化のための測定対象のマーカーを含有する規定の量の細胞を有することを特徴とし、該細胞集団は、該マーカーの数に関して１つの細胞集団とその他では異なり、該細胞が、マトリックスに取り込まれ、かつ固定されている、偽組織。
【請求項３４】
試験試料のマーカー指数の検証のための請求項３３記載の偽組織の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
説明
技術分野
本発明は、特にＫｉ−６７タンパク質に対する抗体による試料中の増殖画分の決定などの、医学的診断、予後判定および治療との関連性のためのマーカー指数の定性的および定量的検証に使用するためのツールに関する。
【０００２】
背景技術
マーカーおよびマーカー指数の決定は、様々な医療分野のほとんどで、現代の医学的診断には欠かせない要素になっている。したがって、例えば高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）との関係を決定することは血液検査の日常的手順の一部であり、ＣＤ４陽性血球とＣＤ８陽性血球との関係を決定することはＡＩＤＳ診断の最も重要なパラメーターの一つであり、腫瘍（例えば乳癌）の診断では、ホルモンレセプター状態の決定が手術後の処置の指標とみなされている。様々な構造のほとんどがマーカーとして役立つので、決定方法もまた多様であり、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、化学的および／または生化学的滴定、ＦＡＣＳ、測光法、比濁法、濃度測定による解析などは、いずれも当業者にはよく知られている。
【０００３】
腫瘍の診断では、試料の組織薄切片検査および／または細胞学的検査が、やはり決まって選択される方法である。この目的のために、訓練を受けた病理学者は、組織化学的および免疫組織化学的方法および／または細胞化学的および免疫細胞化学的方法を応用することがますます多くなっている。例えば乳癌では、上述したホルモンレセプター状態が免疫組織学的および／または免疫細胞学的に決定される。（以下、免疫組織化学的という用語は免疫組織学的という用語と免疫細胞学的という用語の両方を包含するものとする）。どのマーカーの決定でも、当業者はその試験系が定性的および定量的に検証可能であることを保証しなければならない。一部のマーカーの検証は、内部標準または外部標準に対する較正ならびに陽性対照および陰性対照に対する並行測定による検量線の作成を用いて行うことができる。しかし一般にこれらの検証方法は極めて多くの費用と時間を要する。
【０００４】
免疫組織化学ではこのような検証（特に定量的検証）は無視できない問題である。なぜなら、免疫組織化学マーカー記述用(portrayal) の市販のキットには、内部対照が全く含まれていないか、または例えばホルモンレセプターの場合のように、陽性または陰性のどちらかである細胞調製物が含まれ、すなわち有か無かの決定しかできず、従ってせいぜい半定量的検証と見なすことしかできないからである。
【０００５】
ＤＡＫＯが販売している免疫細胞化学的染色キットＨｅｒｃｐＴｅｓｔTMコード番号Ｋ５２０４では、乳癌に関する染色作業を検証するための対照スライドが知られている。この対照スライドは、既知の強度スコアを持つ不連続で混合されていない３群の細胞株細胞を含んでいる。これらの細胞株細胞群が染色工程で既知の結果を与えるかどうかを照合することによって、その染色工程を検証することができる。
【０００６】
このように実務では、訓練を受けた病理学者は、自分の記録にある十分に特徴付けられた事前テスト済の実例で、検査すべきマーカーの並行決定を行っている。組織は不均一であることが知られているので、この方法は、一方では、技術的に不確実であるか、少なくとも議論の余地があり、また他方では、この方法には倫理的にも疑問の余地があって、それがこの手法の商業化を不可能にしている。
【０００７】
２０世紀初頭以来、増殖活性を決定するためのパラメーターは既に、腫瘍の組織病理学的診断には欠かせない要素となっている。免疫組織学では、細胞分裂周期を制御する構造の記述が、増殖のマーカーとして使用される。関与する細胞周期関連タンパク質の多くは細胞周期の一段階で一過性に発現される。これに対して、Ｋｉ−６７核タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ，Ｊ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８３，３１：１３−２０）は細胞周期の全ての活動期（すなわちＧ１、Ｓ、Ｇ２および分裂期）で検出することができ、一方、休止期細胞（Ｇ０）はこのタンパク質に関して常に陰性である（Ｇｅｒｄｅｓ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８４，１３３：１７１０−１７１５）。これは、Ｋｉ−６７タンパク質発現（Ｋｉ−６７マーカー指数）が、与えられた細胞集団の増殖画分に関する尺度として役立ちうることを意味している。それゆえ、Ｋｉ−６７タンパク質に対する抗体は組織病理学に広い用途を持ち、特にヒト腫瘍形成における悪性度評価のマーカーとしての使用に関する数多くの研究で広く使用されてきた（Ｓａｗｈｎｅｙ，Ｎ．およびＨａｌｌ，Ｐ．Ａ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１９９２，１６８：１６１−１６２、Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ，Ｒ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９３，６８：５９７−５９９、Ｌｅｌｌｅ，Ｒ．Ｊ．ら，Ｃａｎｃｅｒ，１９８７，５９：８３−８８、Ｌｏｋｈｏｒｓｔ，Ｈ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１９８７，７９：１４０１−１４１１、Ｇｅｒｄｅｓ，Ｊ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１９８７，１２８：３３０−３３４および１２９：４８６−４９２）。
【０００８】
様々な腫瘍物に関する過去の研究では、予後マーカーとしてのＫｉ−６７マーカー指数の役割が、異なる形で議論されている。悪性非ホジキンリンパ腫については、どの研究者も一致して、患者の生存期間とＫｉ−６７マーカー指数との相関関係を記述しているが（Ｇｅｒｄｅｓ，Ｊ．ら，１９８７，Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ：４４８−４４９、Ｇｒｏｇａｎ，Ｔ．Ｍ．ら，１９８８，Ｂｌｏｏｄ，７１：１１５７−１１６０、Ｈａｌｌ，Ｐ．Ａ．ら，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９８８，１５４：２２３−２３５）、乳癌の場合、これには一部に論争があった。すなわち、Ｈａｒｂｅｒｇら（「乳癌における予後因子および関連治療因子」Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（ニュルンベルク），１９９７）が多変量解析で相関関係を認めなかったのに対し、Ｑｕｅｒｚｏｌｉ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９６年１１月，４９（１１）：９２６−９３０、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｓ．Ｍ．ら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９５年１１月，１５（６Ｂ）：２７１７−２７２２、Ｃｌａｈｓｅｎ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，１９９８年２月，１６（２）：４７０−４７９、Ｒｏｚａｎ，Ｓ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９８年２月，７９  （１）：２７−３３、Ｊａｎｓｅｎ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９８年８月，７８（４）：４６０−４６５、Ｍｏｌｉｎｏ，Ａ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９７年８月，７４（４）：４３３−４３７は、多変量統計解析におけるモノクローナル抗体ＭＩＢ−１によるパラフィン切片中のＫｉ−６７タンパク質の記述が、乳癌において独立した予後パラメーターであることを、最終的に証明している。Ａａｌｔｏｍａら，１９９７，Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．３２：４１０−４１５およびＢｏｒｒｅら，１９９８，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５９：１６０９−１６１４は、Ｋｉ−６７マーカー指数が前立腺癌についても独立した予後パラメーターであることを実証したが、Ｃｏｅｔｚｅら，１９９７，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７：２１４−２１８は予後指標としてのＫｉ−６７マーカー指数の価値を疑問視し、Ｕｚｏａｒｕら，１９９８，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６７：３３−３７は、Ｋｉ−６７マーカー指数は患者の生存に関して有意な予後判定を何ら可能にしないとさえ結論した。
【０００９】
ホルモンレセプターを例に挙げて上記に示したように、免疫染色技術の標準化および定量的分析の内部検証は、Ｋｉ−６７マーカー指数の発達(promotion) にもかかわらず、現在に至るまで可能にはなっていない。
【００１０】
発明の概要
したがって本発明の目的は、特に医学的予後判定、免疫組織化学的診断などの医学的診断において、マーカー指数の定性的および／または定量的検証に使用するためのツール、ならびに特にＫｉ−６７マーカー指数の検証および治療との関連性の決定を行うためのツールを提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、マーカー指数検証用のツールであって、比較的迅速かつ使用が容易であり、信頼のおける結果を与えることができるツールを提供することである。
【００１２】
本発明のもう１つの目的は、マーカー指数検証用のツールであって、その製造から使用までの耐久時間が長いツールを提供することである。
【００１３】
これらの目的およびその他の目的は特許請求の範囲に定義する本発明によって達成される。
【００１４】
詳細な説明
すなわち本発明は偽組織と呼ばれるツールを提供する。本発明の偽組織は、マトリックスに取り込まれた２つまたはそれ以上の細胞集団を含有する。
【００１５】
各細胞集団の特徴は、それが１つまたはそれ以上の特定のマーカー（すなわちその特定偽組織を使って検証することができるマーカー指数のマーカー）の数に関して互いに実質的に同一である２つまたはそれ以上の細胞を含むということである。「特定のマーカーの数に関して互いに実質的に同一である２つまたはそれ以上の細胞」という用語は、それら２つまたはそれ以上の細胞のマーカーの数が、好ましくは互いに約２０％を越えて変動すべきでなく、また好ましくは１０％未満であることを意味する。２つまたはそれ以上の細胞集団は、前述の１つまたはそれ以上のマーカーに関して互いに異なっていて、ある集団に由来する細胞は、前述の特定のマーカーのうちの１つまたはそれ以上のマーカーの数に関して、別の集団の偽組織中の細胞とは相違するようになっているものとする。ある細胞集団中の２つまたはそれ以上の細胞上の特定のマーカーの数は、その集団中の細胞上の平均マーカー数とその偽組織中の別の細胞集団中の当該特定のマーカーの平均数との差の１０％を越えて変動しないことが、一般に好ましい。
【００１６】
少なくとも２つの細胞集団に由来する細胞は、多かれ少なかれマーカーを含む点または領域を持つパターンが形成されるように、マトリックス中で互いに混合されることが好ましい。少なくとも２つの細胞集団に由来する細胞は、実質的に均一な混合物として混合されることで、実質的に均一なマーカーのパターンを与えることが、特に好ましい。
【００１７】
マーカーは原則として、何らかの手段によって（例えば免疫組織学的技術、免疫細胞学的技術、免疫蛍光を用いるハイブリダイゼーション技術および／または免疫酵素技術を利用して）検出することができるマーカーであれば、どのタイプのマーカーであってもよい。そのようなマーカーは、有機物質でも無機物質でもよく、例えば脂質、リポ多糖、糖、タンパク質、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの内因性酵素、ＣＤの解析がなされたまたはなされていない細胞膜構造、細胞質成分、ヌクレオチドおよび核酸からなる群より選択される。マーカーには特に、診断上重要な任意のマーカーが含まれ、とりわけＫｉ−６７などの増殖マーカー；エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプターまたはアンドロゲンレセプターなどのホルモンレセプター；細胞骨格化合物；血液学的マーカー；ｃ−ｍｙｃなどのオンコジーン産物；細胞膜成分；核結合レセプター；遺伝子増幅、遺伝子欠失、点変異および転座などの染色体異常；ならびに感染性因子などが挙げられる。
【００１８】
上記のマーカーとその検出方法は全て当技術分野では広く知られているので、ここではこれ以上詳しく説明しない。
【００１９】
偽組織の細胞集団中の細胞はどのタイプの細胞であってもよく、インビボまたはインビトロで生育する真核細胞は好ましい。細胞はどの増殖期にあってもよい。マトリックスに包埋された細胞株細胞（より好ましくは２つまたはそれ以上の細胞株細胞の混合物）は偽組織であると理解される。このような偽組織は組織学的（より好ましくは免疫組織学的）検査にかけることができるべきである。
【００２０】
細胞集団のうちの少なくとも１つに含まれる細胞は、インビトロで培養され、回収されおよび／または収集される培養細胞であることが好ましい。細胞は、例えば単離されたウイルスＤＮＡゲノムを用いて、トランスフェクトまたは形質転換されてもよい。ある細胞集団の細胞は好ましくは互いに実質的に同一であり、前述の実質的に同一な細胞は、より好ましくは単一の細胞株である。
【００２１】
本発明の偽組織を使って信頼性の高い決定を達成するには、各細胞集団の細胞またはマーカーの比率を知っておくべきである。
【００２２】
ある偽組織中の２つまたはそれ以上の異なる細胞集団に由来する細胞の比率は、マーカーの検出感度に依存して変化しうる。一般に、ほとんどのマーカーについては、２つの異なる細胞集団に由来する細胞の好ましい比率は１：１０9 〜１０9 ：１の間隔、好ましくは１：２０〜２０：１の間隔にある。
【００２３】
マトリックスの材料は、マーカーまたはマーカーの検出に支障をきたさず、しかもマーカーまたはマーカーの検出に支障を来すことなくそのマトリックス中に細胞を取り込むことができる材料であれば、どの材料でもよい。さらにまた、マトリックスの材料は２０℃で寸法的に安定であること、および好ましくは例えば５０ｎｍおよび１００μｍなどの微細な切片に切断できることが好ましい。マトリックスの材料は、好ましくは、プラスチック、パラフィンおよびパラフィン誘導体、アガロース、非ヘパリン処理血清、コラーゲン、セルロース誘導体、キチン誘導体、キトサン誘導体、生体高分子、フィブリン凝塊およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００２４】
偽組織は、好ましくは約１００μｍまでの厚さ、より好ましくは５０ｎｍ〜１００μｍの厚みを有する薄い切片、さらに好ましくは８０〜１２０ｎｍの切片または２〜５μｍの切片の形態として提供することができる。
【００２５】
細胞をマトリックスに取り込む前または取り込んだ後に、好ましくは細胞を固定することができる。ホルマリン、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、酢酸、エタノール、アセトン、ピクリン酸、クロロホルム、二クロム酸カリウムおよび塩化第二水銀からなる群より選択される１つまたはそれ以上の固定剤を用いて行われる固定および／またはマイクロ波加熱または凍結を用いる安定化など、一般的な細胞固定法は原則としてどれでも使用することができる。広く知られているように、固定剤による処理は細胞を安定化するために十分な時間をかけて行うべきであるが、同時に、細胞の構造および特定のマーカーが保存されるように、好ましくは十分に短くしておくべきでもある。
【００２６】
また本発明は、アッセイ内およびアッセイ間で標準化を行うための偽組織を含む診断キットに関する。
【００２７】
マーカーを含む細胞画分を定量および定性するための本発明の診断キットは、１つまたはそれ以上の特定のマーカーの数および／または有効反応性に関して細胞集団毎に異なる細胞を含む２つまたはそれ以上の細胞集団を含有してなる偽組織を含む。上記１つまたはそれ以上の細胞集団は、好ましくは、上述のようにマトリックスに取り込まれる。
【００２８】
上記診断キットは、好ましくは、マーカーまたはマーカー群を検出するための成分または成分のセットをさらに含んでもよい。マーカーまたはマーカー群を検出するための成分は、当然、検出すべきマーカーまたはマーカー群に依存するが、ほとんどの診断および予後判定用途ならびに治療との関連性の決定には、検出手段に、１つまたはそれ以上の抗体および／またはその活性な誘導体、ＤＮＡもしくはＲＮＡプローブ、合成オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡを含む成分または成分のセットが含まれる。この場合、前述の成分は好ましくは１つまたはそれ以上の酵素および／または蛍光化合物に連結することができ、前述の成分のセットは好ましくは酵素および酵素検出用試薬である。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態として、本キットは、増殖指数の検出および検証用キットであり、この診断キットは、特定のマーカーにＫｉ−６７タンパク質が含まれる上記に記載の偽組織を含み、マーカーの検出のための成分はＫｉ−６７タンパク質に対する抗体である。また前述の抗体は、好ましくはＭＩＢ（登録商標）ファミリーのメンバーであり、より好ましくはＭＩＢ（登録商標）−１である。
【００３０】
さらに好ましい実施形態として、本診断キットは、種間交差反応性に乏しいＫｉ−６７タンパク質に対する抗体、ならびに既定のマーカー指数（好ましくはＫｉ−６７マーカー指数）を持つ細胞株混合物を含有してなる固定パラフィン包埋偽組織または偽組織の顕微鏡切片、ならびに検出試薬類を含む。
【００３１】
上記に記載の好ましい診断キットはＫｉ−６７マーカー指数の検証にとりわけ適している。しかし、当業者には明らかなように、本キットおよび偽組織には、様々な形で変更を加えることができる。ホルモンレセプター陽性および陰性細胞株細胞を、対応するキット用の偽組織の製造に使用することにより、本発明は、レセプター状態の免疫組織化学的決定の検証にも使用することができる。同様に、乳癌におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２）遺伝子およびタンパク質発現の決定についても、同じことが言える。ＣＤ４陽性ＣＤ８陰性細胞株細胞とＣＤ４陰性ＣＤ８陽性細胞株細胞を、対応するキット用の偽組織の製造に使用することにより、本発明は、Ｔ４／Ｔ８比の決定の検証にも適する。したがって本発明は、様々なマーカー指数のほとんどの検証に使用することができる。
【００３２】
本発明の診断キットは、好ましくは、２つまたはそれ以上の上記に記載の偽組織〔ここに、それら２つまたはそれ以上の偽組織は、特定のマーカーの１つまたはそれ以上に関して、マーカー指数（これはその特定のマーカーに関するマーカー陽性細胞の数を百分率で表したものと定義される）が異なっている〕を含むことができる。１つのキットに２つまたはそれ以上の偽組織を含めることにより、さらにいっそう信頼のおける検証を達成することができる。
【００３３】
さらに本発明は、インビトロ診断を目的として、マーカーによって標識された細胞画分のマーカー指数の定性的および／または定量的決定を行うための分析方法に関する。この方法は本発明の偽組織の使用を含み、また好ましくは本発明の診断キットの使用も含みうる。この方法は、
ｉ）予め決定されたマーカーの質および／または量を有する請求項１〜８のいずれか記載の偽組織を提供する工程、
ｉｉ）細胞画分および偽組織をマーカー反応の検出のための成分または成分のセットに供する工程、
ｉｉｉ）偽組織の検出マーカー反応を用いることにより、細胞画分マーカーの質および／または量を決定する工程、を含む。
【００３４】
本発明の分析方法は、１つまたはそれ以上の追加マーカーの定性的および／または定量的決定を含むことができ、その場合、１つまたはそれ以上の追加マーカーは、前述の１つまたはそれ以上のさらなるマーカーに関して異なるマーカー指数を持つ少なくとも１つの細胞集団を含む１つまたはそれ以上の偽組織を利用して決定される。
【００３５】
本発明の分析方法を使用する場合、本発明のキットを利用してあるマーカーの記述を行うための各検出系列には、それぞれ対応する偽組織におけるそのマーカーの記述が含まれる。したがって、訓練を受けた病理学者は、マーカーの記述を定性的に判断する（反応が十分に起こったかどうか）ことができると共に、マーカーの記述を定量的に検証する（その検出系列で既定のマーカー指数が達成され、したがって検出が有効であるか、それとも既定のマーカー指数の既定の偏差閾値（通例、±標準偏差）に達しないか既定の偏差閾値を越えたために、検出が無効であるか）ことができる。
【００３６】
本発明によれば、本分析方法を利用して検査される物質として、例えば組織試料、細胞調製物および細胞／血液塗沫標本を挙げることができる。
【００３７】
マーカー指数は一部、他とは異なる形で設定される(promoteｄ) 。上述のように、ＡＩＤＳの診断では、ＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞との関係がいわゆるＴ４／Ｔ８比として記述される。しかし一般的には、マーカー指数は、ある集団のマーカー陽性細胞数を百分率で表したものを意味する。後者の定義はＫｉ−６７マーカー指数にも当てはまる。
【００３８】
また本発明は、偽組織の製造方法であって、
ｉ）１つまたはそれ以上の上記に記載の特定のマーカーの数に関して互いに実質的に同一である細胞を含有する第１の細胞集団を選択する工程、
ｉｉ）前述の１つまたはそれ以上の上記に記載の特定のマーカーの数に関して互いに実質的に同一である細胞を含有する第２の細胞集団（この第２の細胞集団の細胞は上述のように前述の１つまたはそれ以上の特定のマーカーの数に関して前述の第１の細胞集団の細胞とは異なっている）を選択する工程、
ｉｉｉ）第１の細胞集団および第２の細胞集団を上記に記載のマトリックスに取り込ませる工程、を含む方法に関する。
【００３９】
細胞集団中の細胞の数は上記に定義したとおりである。マトリックスへの取り込みの前または後に、好ましくは、細胞を上述のように固定することができる。
【００４０】
細胞を含むマトリックスはまず塊（例えば管状の塊）として用意し、次いで、その塊を好ましくは約１００μｍまでの厚み、より好ましくは５０ｎｍ〜１００μｍの厚みを有する切片、さらに好ましくは８０〜１２０ｎｍの薄い切片または２〜５μｍの厚い切片に切断することができる。望ましい切片の厚さは、使用しようとする検出方法に大きく依存し、当業者は特定の検出方法に最適な厚さを容易に見いだすことができるだろう。
【００４１】
特許請求の範囲に記載するように、本発明の診断キットおよび偽組織は、試料中の１つまたはそれ以上のマーカーの定量的および／または定性的測定に、増殖指数の決定に、また好ましい実施形態として、癌の診断および処置におけるインビトロ診断に使用することができる。
【００４２】
実施例
以下に好ましい実施形態を挙げて本発明をより詳しく説明するが、本発明は決して以下の好ましい実施形態によって限定されない。
【００４３】
ヒトＫｉ−６７タンパク質に対するいくつかの抗体は他の種のＫｉ−６７タンパク質との交差反応性が乏しいことを示す。したがって、例えばモノクローナル抗体ＭＩＢ−１は、パラフィン切片中のヒトＫｉ−６７タンパク質の記述に極めて適している。しかしパラフィン切片上のマウス対応物の検出は、抗体ＭＩＢ−１ではうまく行うことができない。この限定された種間交差反応性を、既定のＫｉ−６７マーカー指数を持つ偽組織の製造に使用する。
【００４４】
偽組織の製造
ヒト細胞株（好ましくはＩＭ−９）および非ヒト（好ましくはマウス）細胞株（特に好ましくはＡｇ８）を標準的条件で播種し、対数増殖期に収集し、死細胞および細胞片を密度遠心分離によって分離する。培養培地で１回洗浄した後、Ｓｙｓｍｅｘ製血小板計数器ＰＬ−１００（Ｓｙｓｍｅｘ  ＴＯＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃｓ  ＧｍＢＨ（ハンブルグＤ−２２４１９タルペン１５Ａ））で細胞数を決定する。そのために、細胞懸濁液１０μｌを緩衝液（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｃｅｌｌｐａｃｋ  ＰＫ−３０Ｌ２０リットル、発注番号８３４−００１１−６）５ｍｌとよく混合し、二重決定として計数を行う。（カウンターの設定：弁別器（discrimmator）：血液１０、血小板６；感度：１；アラーム時間：１１）。この計数に基づいて、１×１０7 細胞を偽組織の製造に使用する。
【００４５】
使用した試薬：フィブリノゲン：Ｆ４７５３、Ｓｉｇｍａ；バッチ：６０ｍｇを試験ビーカーに入れ、０．９％ＮａＣｌ溶液１０ｍｌをゆっくり添加する。３７℃で１０分間放置した後、溶液が透明になるまでピペットで再懸濁する。このようにして調製した溶液は２４時間安定である。
【００４６】
トロンビン：Ｔ９０１０、Ｓｉｇｍａ；バッチ：１バイアルを三回蒸留した水５００μｌに溶解し、よく再懸濁する。溶解した状態で−２０℃に保存したアリコートは６ヶ月間安定である。１．５ｍｌスクリューチューブに入れた１×１０7 細胞を１２００ｒｐｍで遠心分離し、上清をデカントする。ペレットをよく再懸濁する（約５００〜１００μｌ）。フィブリノゲン溶液２００μｌを細胞に加え、よく再懸濁する。次にトロンビン溶液１００μｌをこれに加え、短時間混合し、氷上で３０分間インキュベートする。これを行うと、細胞を含むフィブリン凝塊が形成されるので、次いで、それを常法によりホルマリンで固定し、パラフィンに包埋する（４％ホルマリン、少なくとも３０分、最大６０時間；市販の自動化装置（例えばＳｈａｎｄｏｎ社のＨｙｐｅｒｃｅｎｔｅｒ（商標））でパラフィンへの包埋を遂行）。次に、標準的方法によって作製したパラフィン切片を実施例と同様に免疫細胞化学的に染色した。
【００４７】
実施例１に記述するように、マウス細胞株Ａｇ８の偽組織のパラフィン切片はＭＩＢ−１に関して予想通り完全に陰性だった。上述のように製造したヒト細胞株ＩＭ９の偽組織のパラフィン切片は、ＭＩＢ−１に関してほとんど１００％陽性だった。これは、単にこれらの細胞株を様々な割合で混合するだけで、ＭＩＢ−１陽性細胞のパーセンテージが所望する任意の値である偽組織を製造することができるに違いないことを意味する。実施例２では実際にその通りであることを実証する。ＭＩＢ−１検出キットTMで、ヒトＫｉ−６７タンパク質に対する抗体による増殖画分の決定の対照に、偽組織調製物を用いることにより、この決定の定性的かつ定量的内部検証が初めて可能になった。
【００４８】
実施例１
ＩＭ９またはＡｇ８細胞株細胞１００％からなる細胞を含有する偽組織のＭＩＢ−１免疫染色
Ｍｏｎｏｔｅｃ社（ハンブルグ）製の下記の試薬を使用し、下記の処方に従って、１〜３μｍ厚切片を染色した。
【００４９】
ＭＩＢ−１検出キットの試薬
染色法の説明
脱パラフィンおよび再水和
免疫染色の前に、包埋剤を除去するために、スライドに載せるパラフィン切片を脱パラフィンしなければならない。次に切片を再水和しなければならない。不十分な脱パラフィンおよび不十分な再水和は非特異的染色の増加および特異的染色の減少につながる場合があるので、絶対に避けるべきである。
【００５０】
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【００５１】
第１工程：切片をキシレン槽で５（±１）分間インキュベートする。槽の変更およびインキュベーションを１回繰り返す。
【００５２】
第２工程：過剰の液分を切った後、切片を１００％アルコール槽で５（±１）分間インキュベートする。槽の変更およびインキュベーションを１回繰り返す。
【００５３】
第３工程：過剰の液分を切った後、切片を７０％アルコール槽で５（±１）分間インキュベートする。槽の変更およびインキュベーションを１回繰り返す。
【００５４】
第４工程：過剰の液分を切った後、切片を４０％アルコール槽で５（±１）分間インキュベートする。槽の変更およびインキュベーションを１回繰り返す。
【００５５】
第５工程：過剰の液分を切った後、切片を蒸留水槽で５（±１）分間インキュベートする。槽の変更およびインキュベーションを１回繰り返す。
【００５６】
キシレン槽、アルコール槽および水槽は４０切片毎に交換しなければならない。
【００５７】
免疫染色プロトコール：
第１工程：ペルオキシダーゼブロッキング剤
過剰の蒸留水をよく切る。試薬類が確実に切片を覆うように、非発塵性布でスライドの周りを徹底的に注意深く乾燥させる。次に切片を湿室に入れ、切片に１００μｌのペルオキシダーゼブロッキング剤（バイアル１）を載せる。（必要な場合は、１００μｌを越える量を適用しなければならない）。
【００５８】
室温で１０（±１）分間インキュベートする。
【００５９】
次に、洗浄瓶を使って切片を蒸留水または洗浄緩衝液で注意深くすすぐ。その際、液体の噴流が切片に触れないように注意を払うべきである。
【００６０】
第２工程：抗原回収
スライドキュベットを水槽に入れ、それを、蒸留水に１：５０希釈した抗原回収液（バイアル７）で満たす。水槽を加熱して抗原回収液を９５〜９９℃にする。次にペルオキシダーゼブロック切片をこれらのキュベットに入れ、温度を再び９５〜９９℃にした後、９５〜９９℃で６０（±１）分間インキュベートする。
【００６１】
スライドキュベットを温水槽から出し、切片を室温の新しい洗浄緩衝液に移し、３（±１）分間インキュベートした後、洗浄緩衝液の交換および洗浄のサイクルを２回繰り返す。
【００６２】
第３工程：一次抗体ＭＩＢ−１および／または陰性対照試薬
過剰の洗浄緩衝液を切り、切片の周囲を上述のように乾燥させる。
【００６３】
切片をバイアル２の一次抗体１００μｌで覆うか、または切片をバイアル４の陰性対照試薬１００μｌで覆う。
【００６４】
室温で３０（±１）分間インキュベートする。
【００６５】
次に、洗浄瓶を使って切片を蒸留水または洗浄緩衝液で注意深くすすぎ（その際、液体の噴流が切片に触れないように注意を払うべきである）、切片を新しい洗浄緩衝液に移し、３（±１）分間インキュベートした後、第２工程と同様に、洗浄緩衝液の交換および洗浄のサイクルを２回繰り返す。
【００６６】
第４工程：検出試薬
過剰の洗浄緩衝液を切り、切片の周囲を上述のように乾燥させる。
【００６７】
切片をバイアル３の検出試薬１００μｌで覆う。
【００６８】
室温で３０（±１）分間インキュベートする。
【００６９】
次に、洗浄瓶を使って切片を蒸留水または洗浄緩衝液で注意深くすすぎ（その際、液体の噴流が切片に触れないように注意を払うべきである）、切片を新しい洗浄緩衝液に移し、３（±１）分間インキュベートした後、第２工程と同様に、洗浄緩衝液の交換および洗浄のサイクルを２回繰り返す。
【００７０】
第５工程：発色反応
過剰の洗浄緩衝液を切り、切片の周囲を上述のように乾燥させる。
【００７１】
バイアル５のＤＡＢ基質１ｍｌをガラス製試薬容器に入れ、ＤＡＢ色素原１０μｌをこれに加える。その溶液のうち１００μｌを切片に加える。
【００７２】
室温で１０（±１）分間インキュベートする。
【００７３】
次に上述のように洗浄する。
【００７４】
マイヤーのヘマトキシリンで対比染色を行った後、カイザーのグリセリンゼラチン（Ｆａｒａｍｏｕｎｔ（登録商標）またはＤｅｐｅｘ（登録商標）などの包埋剤）で覆う。
【００７５】
染色の評価は、３人の人間が顕微鏡でそれぞれ２００細胞を数えて、染色した材料中の陽性細胞の百分率を決定することによって行う。
【００７６】
Ａｄ  ＡＧ８偽組織
陰性対照試薬およびＭＩＢ−１抗体による染色は全て陰性だった。すなわち陽性細胞の存在率は０％だった。アッセイ内およびアッセイ間偏差ならびに観察者内および観察者間偏差は０だった。
【００７７】
Ａｄ  ＩＭ９偽組織
陰性対照試薬による染色は全て予想通り陰性だった。陽性細胞０％。
【００７８】
陰性対照試薬に関するアッセイ内およびアッセイ間偏差ならびに観察者内および観察者間偏差は０だった。
【００７９】
ＩＭ９偽組織のＭＩＢ−１染色切片はほとんど常に１００％の陽性細胞（平均値９９．８３３％）を示した。表１ａおよび１ｂに記載の試験系列では、観察者内および観察者間偏差ならびにアッセイ間偏差は極めて小さかった。
【００８０】
実施例２
所定量のＡＧ８およびＩＭ９細胞を含む偽組織の免疫染色
それぞれ所定量のＡＧ８および／またはＩＭ９細胞を使って、上記のように偽組織のパラフィンブロックを製造した（０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５および１００％）。
【００８１】
次にパラフィン切片を実施例１で述べたように免疫染色した。
【００８２】
陰性対照試薬による染色は全て、予想通り、どのブロックについても陰性だった。陽性細胞０％。陰性対照試薬に関するアッセイ内およびアッセイ間偏差ならびに観察者内および観察者間偏差は０だった。
【００８３】
２系列の実験を行った。
【００８４】
ＭＩＢ−１に関する結果。２つの系列に関する観察者内染色をそれぞれ表１ａおよび表１ｂに要約し、図１および図２に示す。これからわかるように、得られた値はいずれも参照値に極めて近く、信頼区間内である。
【００８５】
表２では、観察者内試験の平均値を計算し、結果をアッセイ間変動性として図３に示す。
【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
実施例３
偽組織の免疫染色
それぞれ５０％量のＲａｊｉ細胞株（ヒト）とＡｇ８細胞株（マウス）またはＪｕｒｋａｔ細胞株とＡｇ８細胞株を含む偽組織も製造した。これらの偽組織の切片のＭＩＢ−１染色の結果は、ＩＭ９とＡｇ８の５０％偽組織に関して実施例２に記述した範囲と同じ範囲にあった。したがって偽組織は他の細胞株細胞の組合わせでも確実に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、観察者内変動性、系列１を示す。
【図２】  図２は、観察者間変動性、系列２を示す。
【図３】  図３は、アッセイ間変動性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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