(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チアメトキサム殺虫剤の量を決定するための、サンプルのイムノアッセイで有用な抗体であって、当該抗体が、（Ｉ）免疫原性キャリアータンパク質にコンジュゲートされたチアメトキサムハプテンでヒト以外の動物を免疫化することによって産生されたポリクローナル抗体であり、そして（ＩＩ）チアメトキサム殺虫剤に特異的に結合する、抗体、
ここで、当該抗体は、下記式；
【化１】
0004980536.tif 000032
[式中、Ａは２−クロロチアゾール−５−イルであり、
ＲおよびＲ３は独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ１およびＲ２は独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、またはＲ１およびＲ２はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたはオキサジアジン環を形成し、そして
ＸはＮ−ＮＯ２またはＮ−ＣＮである]
の化合物に選択性である。
【請求項２】
下記式の化合物；
【化２】
0004980536.tif 000033
[式中、Ａは２−クロロチアゾール−５−イルであり、
Ｒ３は水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ１およびＲ２は独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、またはＲ１およびＲ２はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたはオキサジアジン環を形成し、
ｎは１ないし４の整数であり、そして
ＸはＮ−ＮＯ２またはＮ−ＣＮである]。
【請求項３】
下記式の請求項２に記載の化合物。
【化３】
0004980536.tif 000034
【請求項４】
下記式の請求項２に記載の化合物。
【化４】
0004980536.tif 000035
【請求項５】
下記式のタンパク質コンジュゲート；
【化５】
0004980536.tif 000036
[式中、Ａは２−クロロチアゾール−５−イルであり、
Ｒ３は水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ１およびＲ２は独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、またはＲ１およびＲ２はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたはオキサジアジン環を形成し、
ｎは１ないし４の整数であり、
ＸはＮ−ＮＯ２またはＮ−ＣＮであり、そして
ＰＲはDiptheriaウイルスからの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン）、ウシ血清アルブミン、カチオン化ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オバアルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択されるキャリアー分子のタンパク質残基であり；またはアルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼからなる群より選択される酵素残基である]
【請求項６】
下記式の請求項５に記載のタンパク質コンジュゲート。
【化６】
0004980536.tif 000037
【請求項７】
サンプル中のチアメトキサム殺虫剤の濃度を決定する方法であって、
（ａ）当該チアメトキサム殺虫剤に選択性である固定された抗体を有する固相を提供するステップ、
（ｂ）当該サンプルを、既知の量のチアメトキサム殺虫剤ハプテン−酵素コンジュゲートの存在下、固定された抗体と接触させるステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の固相を洗浄し、すべての非結合ハプテン−酵素コンジュゲートおよびサンプルを除去するステップ、
（ｄ）当該ハプテン−酵素コンジュゲートについて特異的な色原性基質を、ステップ（ｃ）の洗浄した固相と反応させ、色原体を生成させるステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）によって生成された色原体の量を測定し、抗体の結合したハプテン−酵素コンジュゲートの量を決定し、および得られた量より当該サンプル中のチアメトキサム殺虫剤の量を決定するステップ、
の各ステップを含む、方法、
ここで、当該抗体は、下記式；
【化７】
0004980536.tif 000038
[式中、Ａは２−クロロチアゾール−５−イルであり、
ＲおよびＲ３は独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ１およびＲ２は独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、またはＲ１およびＲ２はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたはオキサジアジン環を形成し、そして
ＸはＮ−ＮＯ２またはＮ−ＣＮである]
の化合物に選択性である。
【請求項８】
当該サンプルが、好適な溶媒中で植物繁殖材料を抽出することによって得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
当該植物繁殖材料が種子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
当該種子が、キャノーラ、ソルガム、コムギ、ワタ、トウモロコシまたはスイートコーンからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
当該抗体が、免疫原性キャリアータンパク質にコンジュゲートされたチアメトキサム殺虫剤でヒト以外の動物を免疫化することによって産生されるポリクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
当該免疫原性キャリアータンパク質が、Diptheriaウイルスからの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン）、ウシ血清アルブミン、カチオン化ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オバアルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択されるキャリアー分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
チアメトキサム殺虫剤の量を決定するための、サンプルのイムノアッセイに用いられるキットであって、１または２以上の容器中に、
（ａ）当該チアメトキサム殺虫剤に選択性である固定された抗体を有する固相、
（ｂ）チアメトキサムハプテンにコンジュゲートされた酵素を含む酵素コンジュゲート、
を組み合わせて含む、キット、
ここで、当該抗体は、下記式；
【化８】
0004980536.tif 000039
[式中、Ａは２−クロロチアゾール−５−イルであり、
ＲおよびＲ３は独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ１およびＲ２は独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、またはＲ１およびＲ２はそれらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリンまたはオキサジアジン環を形成し、そして
ＸはＮ−ＮＯ２またはＮ−ＣＮである]
の化合物に選択性である。
【請求項１４】
当該抗体が、免疫原性キャリアータンパク質にコンジュゲートされたチアメトキサムでヒト以外の動物を免疫化することによって産生されるポリクローナル抗体である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
該酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、農薬のイムノアッセイに、およびそのようなアッセイを実施する抗体および試薬に関する。本発明は、そのようなアッセイを実施する方法に、およびそのような方法を実施するための試薬を含むキットにさらに関する。本発明は、サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤の検出および定量への特定の適用を有する。
【０００２】
殺虫剤
作物で害虫を制御するための合成殺虫剤の使用は、広く実施されている。この実施は高く商業上の成功を得ており、これはそのような制御によって作物収量が増加できることが示されたからである。しかし、殺虫剤の有効な使用は、害虫の抵抗性および環境へ、および作業者への曝露の問題の観点から健全な管理を必要とする。この問題に適用される１つの解決は、在来の急性毒性殺虫剤の必要性を減少させるために、そして環境負荷率を減少させるために、新しい、より高活性の殺虫剤を供給することである。
【０００３】
市場で顕著な認知を得ている、ある新しいクラスの殺虫剤は、いわゆる「ネオニコチノイド」殺虫剤である。このクラスの化合物は、例えば、イミダクロプリド、アセタミプリド、およびチアメトキサムであってそれぞれ米国特許番号４７４２０６０および５３０４５６６およびＥＰ５８０５５３Ａ２に記載されたものを含む。
【０００４】
殺虫剤を植物繁殖材料（plant propagation materials）（例えば種子）に直接に処理することは、単独で、または茎葉またはうねへの殺虫剤の適用と組み合わせて適用されるときに、環境へのおよび作業者への曝露、および害虫の抵抗性の確立の減少の必要性と取り組む適用の対象である。しかし、種子コーティング器具を正確にキャリブレーションし、殺虫剤を斉一に種子材料に適用し、とりわけ殺虫剤の成績および種子ファイトトキシンによる問題を回避することを確保するために、注意が払われなければならない。分析的測定を使用して、種子コーティング装置が正確にキャリブレーションされているか、正確に作動しているか、そして種子の処理されたロットが出荷され得るか決定することができる。
【０００５】
しかし、種子の殺虫剤の残留の検出のための伝統的な方法は、極端に時間消費性で高価で有り、なぜなら、それらは高度に特別な高価な分析手法、例えば、ガス−液体または高速液体クロマトグラフィーを要するからである。両方のクロマトグラフィー的技術は、高価な装置であって維持するために費用がかかり、そして高度に熟練した技術によって操作されなければならないものを要する。種子処理施設および栽培者は、通常はそのような装置または常勤の人員を有せず、したがって種子サンプルを外部分析実験室に発送しなければならない。サンプルがそのような実験室によって即答式に分析されるとき、処理施設は発送のおよそ２４時間後に分析データを受け得る。より迅速でない分析では、より長い遅延がある。これらの遅延は、機械の長時間の無駄な時間をコーティング施設にもたらす。コーティングされた種子の発送がまた遅延する。
【０００６】
当業界に、既存の測定技術をより低廉に、より効率的そしてより容易に管理可能にする緊急の必要性が存在する。望まれる方法はまた、圃場条件下の実験室外で有用であり、したがってそれらは栽培者または種子処理人員に、種子サンプル上の所定の殺虫剤の存在および濃度についての情報を速やかに容易に提供する。この点で、当該方法が他の産物からの活性農薬材料を識別し、そして種子上に存在する所望の活性成分の定量的決定を可能とすることが重要である。しかし、古典的な分析方法の多くの深刻な限界がいまだ存在する。これらの限界のあるものを、イムノアッセイ技術の使用によって克服する。
【０００７】
農薬のイムノアッセイおよび検出
医学的および獣医学的使用が先ず発達したが、イムノアッセイは農業上の領域でのより多くの応用が見出され始めた。例えば、イムノアッセイは、作物病害、アフラトキシンおよびある種の抗生物質の検出および定量に利用可能である。農薬検出のためのイムノアッセイは、科学文献に記載され（以下参照）、これらはほんの過去１０年内で商業ベースで利用可能となった。
【０００８】
イムノアッセイは、高度に特異的な抗体試薬および比較的単純な分析器具により、広範囲の標的材料を検出および／または定量する。装置または操作条件より抗体が、分析特異性を提供する。イムノアッセイはしたがって比較的粗サンプルについて実施することができる。さらに、イムノアッセイ法を、遠隔の、非実験室セッティングでの使用のために最適化し、特別な実験室だけでなく圃場での使用も可能とする。
【０００９】
免疫学的方法は、ある種の除草剤の検出について既知であり、これらは２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（Fleeker, J., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70:874-878(1986)）、クロスルフロン（Kelley, M. et al., J. Agric. Food Chem. 33:962-965(1985)）、ハロアセトアミド（Winzenburger, P. A.et al.(欧州特許公開EP340198, 1989)）、およびジフルベンズロン（Wie, S. I.et al., J. Agric. Food Chem. 30:949-957(1982)）、メタラキシル（Newsome, W. H., J. Agric. Food Chem. 33: 528-530(1985))およびパラチオン（Ercegovich, C. D. et al., J. Agric. Food Chem. 29:559-563(1981)）を含む種々の農薬を含む。アトラジンの免疫学的検出についての方法がまた記載されている（米国特許番号4530786）。シアナジン、ジクロホップ−メチル、フェンタクロルフェノール、２，４，５−Ｔおよびテルブトリンについての免疫学的アッセイもまた既知である。
【００１０】
前記のすべての免疫学的方法は、適当な抗原（免疫原）で免疫化された宿主動物（典型的にはウサギ）から得られたポリクローナル抗血清を利用した。より最近に、アトラジンおよびその誘導体に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）および分解産物、およびそのようなｍＡｂｓのイムノアッセイにおける使用が開示された（Schlaeppi et al., 欧州特許公開EP365818(1990)）。
【００１１】
その低分子量のために、殺虫剤は、免疫原性でなく、そして動物宿主から特異的抗体を誘発しない。ゆえに、殺虫剤イムノアッセイの開発は多くのステップ、ハプテンの設計の開始、より高分子量の免疫原性「キャリアー」タンパク質へののコンジュゲーションを許容しながら殺虫剤分子の構造的特異性を維持する殺虫剤の誘導体を要する。さらに、これらの生産のプロセス中の抗体のスクリーニングのために、化学的構造が動物を免疫化するために使用されるハプテンと異なる、さらなるハプテンをまた調製し得る。最終的にひとたび抗体調製を得られれば（ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか）、十分に感受性のイムノアッセイが開発されるはずである。
【００１２】
現代のイムノアッセイで使用される基本的な戦略は、多くの引用文献に記載された（例えば、Voller, A. et al., eds., Immunoassays For The 80's, University Park, 1981; Voller, A., ''The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)'', Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associate Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Voller, A et al., J. Clin. Pathol. 31: 507-520(1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523(1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1980）参照。既知の量の所望のアナライトを使用するキャリブレーション曲線の作成が、それぞれのアプローチに不可欠である。
【００１３】
一般に使用される「標識抗体」法は、エライザ（ＥＬＩＳＡ）と称される。ここで、農薬のタンパク質コンジュゲート（「コーティング」または「スクリーニング抗原」と呼ばれる）は、抗農薬抗体が生成される、農薬免疫原中に使用されるキャリアータンパク質と構造的に関係のないタンパク質を使用して調製する。コーティング抗原コンジュゲートは固相支持体、例えば、マイクロプレートウェルの表面上に固定され、反応当たりの固相農薬の固定化量を生じる。既知の量の抗体を試験サンプルと共に添加する。
【００１４】
固定された農薬は、限定された数の抗体結合部位について、未知のサンプル中の遊離の農薬と競合する。液体相中の抗体とアナライトの間の相互作用は、抗体の固相農薬への結合を阻害する。固相に結合した抗体は、抗農薬抗体の重鎖の定常領域に特異的な、酵素がコンジュゲートされた第２抗体によって検出される。多くの、酵素が結合した第２抗体は、そのような使用のために、商業的に入手可能である。非結合第２抗体を洗浄後、固定された第２抗体を、結合した第２抗体の量に直接比例的に形成される呈色反応産物を生じる、酵素のための色原性基質を添加することによって典型的には検出する。こうして反応産物の量は、未知サンプル中のアナライトの量に反比例的である。
【００１５】
「標識抗体」法の修飾は、コーティング抗原の使用を排除する。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）は抗農薬抗体を固相上に固定する。農薬ハプテンは、酵素に共有結合し、そして得られた酵素コンジュゲートを、抗農薬抗体でコートされたマイクロウェルまたは培養管中のサンプルとインキュベーションする。サンプル中の農薬は、固定された抗体に結合する農薬ハプテン−酵素コンジュゲートと競合する。固相を洗浄して非結合材料を除去し、そして抗体が結合した酵素コンジュゲートを色原性基質の添加によって検出する。例えば、Bushway, R.J., L.P.Perkins, S.A.Savage, S.L. Lekousi, and B. S.Ferguson. 1988. Determination of atrazine residue in water and soil by enzyme immunoassay. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 40:674-654; Fleeker, J. R. and L.W. Cook. 1991. Reliability of Commercial enzyme immunoassay in detection of atrazine in water. P. 78-85 in M.Vanderlann, L.H. Stanker, B.E, Watkins, and D.W. Roberts., eds. Immunoassays for Trace Chemical Analysis. ACS Symposium Series 451. Washington D.C.: American Chemical Society参照。
【００１６】
圃場または種子処理施設で実施できる、活性成分、例えば殺虫剤で処理した種子を分析する方法の農業分野での必要性が存在する。
【００１７】
本発明は、抗ネオニコチノイド抗体を生成するためのネオニコチノイドハプテンおよび免疫原、並びにイムノアッセイによるサンプル中の１または２以上のネオニコチノイド殺虫剤の存在を定量するための抗体、方法、試薬、およびキットを提供する。本発明は、植物繁殖材料、例えば、種子に適用されるネオニコチノイド殺虫剤の濃度の定量への特定の適用を有する。
【００１８】
本発明のイムノアッセイ方法によって、種子処理施設での人員が、適用される活性成分の量を定量的に測定することが可能となり、ここで、ネオニコチノイド殺虫剤が種子に適用される。該方法は、種子から活性成分の迅速な抽出および迅速な抽出溶液のイムノアッセイに基づく測定に関係する。これの測定を使用して種子コーティング装置が正確にキャリブレーションされたか、正確に作動しているか、および種子の処置されたロットが出荷され得るか決定することができる。このアッセイを、通常の実験室的装置および試薬のみを必要として、操作するほど簡単であるように設計する。したがって、イムノアッセイを実施する経験のない人員が、少しの練習試行の後に、試験を首尾よく実行できる。
【００１９】
抗原性ネオニコチノイドコンジュゲート（免疫原）を、ネオニコチノイド農薬ハプテンのキャリアー分子、例えば、Diptheriaウイルスからの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン）、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オバアルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンのネオニコチノイドハプテンへのコンジュゲーションによって作成することができることが見出された。誘導された材料、例えば、誘導されたウシ血清アルブミン、カチオン化ウシ血清アルブミン等のコンジュゲートをまた生成することができる。A. Muckerheide, R. Apple, A. Pesce and J. G. Michael(1987)J. Immunol. 138:833-837参照。これらの免疫原を次いで、収集され得るネオニコチノイドハプテンに対する抗体を産生する宿主動物に注射することができる。これらの抗体を次いで種々のイムノアッセイ手法に利用し、殺虫剤または抗体のいずれかを標識するための種々の既知のマーカーを使用して、対応するネオニコチノイド殺虫剤を検出し得る。イムノアッセイのある実施態様では、ネオニコチノイド殺虫剤誘導体または抗体のいずれかを固定する。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を、本発明の実施で使用することができる。該抗体は、種子コーティング製剤に含まれる他のネオニコチノイド殺虫剤を含む他の農薬活性成分の存在下でさえも、所望のネオニコチノイド殺虫剤（複数含む）に選択的に結合することを示すことができる。
【００２０】
本発明の実施に適用することができる、サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤の測定のための検出方法は、バイオセンサーおよび酵素的、蛍光、化学発光およびラジオイメトリックシステムを含む。そのようなアッセイは、異種性または同種性フォーマットを使用し得、そしてマイクロウェルプレート、培養管、および固相としてのラテックスビーズまたは粒子を使用し得る。
【００２１】
本発明のイムノアッセイを使用し、サンプル、例えば植物繁殖材料におけるネオニコチノイド殺虫剤化合物、例えばイミダクロプリド、ニテンピラム、アセタミプリド、チアメトキサム、チアクロプリドおよびクロチアジンの濃度を決定する。
【００２２】
本発明は、ネオニコチノイド殺虫剤の存在についてサンプルを試験するためのイムノアッセイを提供する。そのようなイムノアッセイでは、ネオニコチノイド（抗原）／抗体反応を、反応産物の検出を可能とする、抗原または抗体のいずれかを標識する種々のマーカーを使用して、種々の方法によって検出することができる。さらに、抗原または抗体のいずれかの固定は、多くの場合に検出を容易化する。
【００２３】
抗原／抗体アッセイを、異種性および同種性の、２種のカテゴリーに一般に分類することができる。異種性アッセイは、反応産物の検出に先立ち、結合標識成分の遊離標識成分からの分離を要する。同種性アッセイは、そのような分離ステップを要しない。該アッセイはさらに（１）例えば、抗原が標識抗体について固相抗原と競合する場合、または抗原が標識抗原と、固相抗体について競合する場合、競合的であり、または（２）標識と抗体または抗原の間に直接的な関連性がある場合、非競合的であることができる。
【００２４】
本発明の実施でイムノアッセイ法を使用して、サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤を検出することができ、これらは酵素、蛍光化学発光およびバイオセンサーイムノアッセイ、並びにラジオイムノアッセイを含む。エライザ（ＥＬＩＳＡ）において、本発明に従って、所望のネオニコチノイド殺虫剤（複数含む）に対応するハプテンを、酵素で直接的に標識し、または酵素で標識された抗体であって適当な条件で基質との反応を触媒するものの使用によって間接的に標識することができる。酵素活性は典型的には、呈色反応産物、すなわち、目によって容易に検出され、または分光器または反射率的手段によって測定され得る呈色終点の形成によって検出する。
【００２５】
本発明での使用のための蛍光イムノアッセイ技術では、所望のネオニコチノイド殺虫剤（複数含む）に対応するハプテンを、蛍光色素で直接的に、または蛍光色素標識抗体で間接的に標識することができる。蛍光色素は、放射（例えば、紫外線）を吸収し、それによって励起され、そして光（例えば可視光）を放射する色素である。
【００２６】
本発明のある実施態様では、サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤の濃度を決定する方法は以下のステップを含む：
【００２７】
（ａ）当該ネオニコチノイド殺虫剤に選択性である固定された抗体を有する固相を提供するステップ、
（ｂ）当該サンプルを、既知の量のネオニコチノイド殺虫剤ハプテン−酵素コンジュゲートの存在下、固定された抗体と接触させるステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の固相を洗浄し、すべての非結合ハプテン−酵素コンジュゲートおよびサンプルを除去するステップ、
（ｄ）当該ハプテン−酵素コンジュゲートについて特異的な色原性基質を、ステップ（ｃ）の洗浄した固相と反応させ、色原体を生成させるステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）によって生成された色原体の量を測定し、抗体の結合したハプテン−酵素コンジュゲートの量、およびそれゆえに当該サンプル中のネオニコチノイド殺虫剤の量を決定するステップ。
【００２８】
ある実施態様ではこのイムノアッセイを、抗体がコーティングされた管、ネオニコチノイドハプテン−酵素コンジュゲート、酵素基質、および比色シグナルの生成を終結させる溶液を含んでいる、キットの形態で供給する。
【００２９】
ポリクローナル抗体の使用に言及して本発明をしばしば説明する一方、当業者はまた、ポリクローナル抗体の使用への別形として、モノクローナル抗体を使用し得ることを認識する。用語「抗体」はここでは一般に、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を意味するために使用する。
【００３０】
本発明の実施での使用のためのネオニコチノイド殺虫剤へのモノクローナル抗体は、当業者に周知の、免疫化およびハイブリドーマ培養技術を使用して作成する。好適なハイブリドーマ細胞株は、抗体を産生している細胞およびハツカネズミ種から誘導したミエローマ細胞の融合によって好ましくは生産する。抗体を産生している細胞は好ましくは脾臓細胞である。任意の好適なミエローマ細胞株を使用し得るが、しかしナンバーが一般に利用されるよく特性把握された細胞株の使用が望ましい。
【００３１】
同様に、本発明の実施での使用のためのネオニコチノイド殺虫剤へのポリクローナル抗体をまた、当業者に周知の技術を使用して作成する。
【００３２】
本発明はまた、少なくとも１種のネオニコチノイド殺虫剤に結合するポリクローナルＩｇＧ抗体であって：（ａ）ネオニコチノイド殺虫剤または生物学的に許容されるキャリアータンパク質に結合された免疫学的に等価なものを含む予め決定された量の組成物を宿主に投与するステップ、（ｂ）宿主から血清を収集するステップ、および（ｃ）該血清からＩｇＧ抗体を精製するステップ、
を含む方法によって産生される、抗体調製を提供する。
【００３３】
前記の様に、本発明のイムノアッセイには、植物繁殖材料に適用されたネオニコチノイド殺虫剤の量を検出するときの特定の適用を有する。用語「植物繁殖材料」は植物のすべての発生部分、例えば後者の増殖に使用することができる種子および栄養植物体、例えば挿し木および塊茎（例えばジャガイモ）を意味すると理解される。例えば、種子（厳格な意味で）、根、果実、塊茎、球根、根茎、および植物の一部を言及し得る。発芽後または土壌から出芽後に移植されるべき発芽した植物および幼植物をまた言及し得る。浸漬による全体または一部の処理によって移植の前に幼植物を保護し得る。
【００３４】
ある実施態様では、本発明のアッセイによって検出可能なネオニコチノイド殺虫剤は以下の式によって表され、
【化１０】
0004980536.tif 000002
ここで、Ａは２−クロロピリド−５−イルまたは２−クロロチアゾール−５−イルであり、
ＲおよびＲ３は、独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ１およびＲ２は、独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、またはＲ１およびＲ２は、付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリジンまたはオキサジアジン環を形成し、そして
ＸはＮ−ＮＯ２またはＮ−ＣＮである。
【００３５】
別の実施態様では、本発明のアッセイによって検出可能なネオニコチノイド殺虫剤は、以下の式によって表され、
【化１１】
0004980536.tif 000003
ここで、Ａ、Ｒ３およびＸは上記式（Ｉ）と同じ意味である。
【００３６】
好ましい実施態様では、本発明のイムノアッセイはネオニコチノイド殺虫剤についてのポリクローナル抗体を使用する。これらの抗体は、免疫化した動物の血清から得ることができる。免疫化を免疫原（ハプテン−ＰＰＤ抗原性コンジュゲート）を、抗体を産生する種、典型的には哺乳動物および好ましくはウサギまたはヒツジに注射することによって達成することができる。典型的には、当初に注射し、次いで一連の次の追加免疫注射をし、抗体応答を最大化する。最適には、注射養生法（injection regime）は、ニュージーランドホワイトラビットに与えられる複数投与である。注射される免疫原の量は変化され、しかし、抗体の検出可能な量を誘発するのに十分でなければならない。抗体産生を、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡまたは間接蛍光イムノアッセイアッセイを使用して試行採血で得られる血清を分析することによって確認することができる。
【００３７】
既知のイムノメトリックアッセイで使用されるのと同じ標識を使用し、本発明で使用するハプテンを標識することができる。これらのうち、酵素、例えばアルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼを含むレポーター分子（ＲＭ）を述べ得る。加えて、蛍光、発光または放射活性標識、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ルミノール、アクリジウムおよび放射活性同位体、１２５Ｉ等、またはコロイド粒子、例えば金およびセレニウム等を使用することができる。最後に、ランタニドキレートフルオロフォア、例えば、ユーロピウムおよびテルビウムを使用し、時間分解性蛍光シグナルを発生させることができる。最も一般的な酵素的マーカーは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリフォスファターゼである。
【００３８】
ある実施態様では、分光光度計を使用して、サンプル中のネオニコチノイドの量を検出する。しかし、本発明の方法を、当業者は適合させ、色原性ディテクターの他の型で使用することができる。同様に、検出可能反応産物は、発色団に限定されず、前記のような他の標識を含む。
【００３９】
以下の式（ＩＡ）、（ＩＢ）および（ＩＩＡ）のハプテンが、抗原性ネオニコチノイドコンジュゲート（免疫原）およびアッセイコンジュゲートを生成するのに有用であると見出された。
ハプテン（ＩＡ）
【化１２】
0004980536.tif 000004
【００４０】
ここで、Ａは２−クロロピリド−５−イルまたは２−クロロチアゾール−５−イルであり、
Ｒ３は、水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ１およびＲ２は独立的に水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、またはＲ１およびＲ２は、それらが付着されている窒素原子と一体となってイミダゾリジンまたはオキサジアジン環を形成し、
ｎは１ないし５の整数（好ましくは３ないし５の整数）であり、そして
ＸはＯ、Ｎ−ＮＯ２またはＮ−ＣＮである。
【００４１】
ハプテン（ＩＢ）
【化１３】
0004980536.tif 000005
ここで、Ａ、Ｒ１、Ｒ２およびＸは式（ＩＡ）で定義したのと同じ意味であり、そして
Ｅは、共有単結合であり、または式−（ＣＨ２）ｍ−の連結部分であり、ここでｍは１ないし３の整数である。
【００４２】
実施例１：ハプテン（ＩＩＩＡ）
【化１４】
0004980536.tif 000006
ここで、Ａ、Ｒ３、Ｘおよびｎは式（ＩＡ）で定義したのと同じ意味である。
【００４３】
ハプテン（ＩＩＩＢ）
【化１５】
0004980536.tif 000007
ここで、Ａ、Ｒ３、およびＸは式（ＩＡ）で定義したのと同じ意味であり、Ｅは式（ＩＢ）で定義したの同じ意味である。
【００４４】
式（ＩＩＩＡ）および（ＩＩＩＢ）のハプテンを以下の方法論と類似するように調製することができる：
【化１６】
0004980536.tif 000008
【００４５】
所望のハプテン（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）を以下の式の化合物から選択される適当な２−アミノエタンチオール誘導体を使用することによって調製し：
【化１７】
0004980536.tif 000009
ここでＲは前記式（Ｉ）についてと同じ意味である。
【００４６】
以下のハプテンが本発明の実施で特に有用であるとわかり：
【化１８】
0004980536.tif 000010
ここで、ｎはそれぞれの場合に、１ないし５の整数であり、好ましくは３ないし５の整数である。
【００４７】
抗原性ネオニコチノイドコンジュゲート（免疫原）およびアッセイコンジュゲートを、それぞれの場合に応じて、ネオニコチノイド農薬ハプテンのキャリアー分子またはレポーター分子へのコンジュゲーションによって作成することができ、当業者に既知の技術を使用し得る。２つの基本的アプローチをとった。その第１は、コンジュゲートの一部となるリンカーの使用である。これらのリンカーは、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性であり、そして例えば、基質タンパク質中のシステイン部分のチオール基を介してジスルフィド結合を形成することのできるもの、またはＮ−末端アミノ基またはアミノ側鎖またはリジン残基および活性化アシル部分の間のアミド結合、例えばスクシンイミジルエステルの形成のできるものを含む。一般に、このアプローチは、リンカー上の高度に反応性の官能基に関係し、そしてコンジュゲーションのための基質に関して妥当に軽便である。しかしより反応性の小さいことがある官能基、例えば、ヒドラゾン形成の可能であるものを使用することがしばしば有用である。
【００４８】
２種のタンパク質部分をコンジュゲートさせるの特に有用である、第２のアプローチは、例えば、コンジュゲートの１のメンバーのカルボキシル部分の、他方の遊離アミノ基との反応によって、新しいペプチド結合の形成をもたらすカルボジイミドのような脱水剤を使用する。この場合に、該試薬はコンジュゲートの一部とならない。
【００４９】
カルボキシル基は活性化されないから、この反応は特に容易ではない；カルボジイミドは、活性中間体を提供し、そして水のエレメントを除去することによって平衡を移動させ、ペプチド結合を形成する。
【００５０】
コンジュゲーションへの両方のアプローチは、一般に水性溶媒中で実行され、なぜなら、コンジュゲートを形成しているタンパク質材料は容易に変性されるからである。タンパク質は、水性環境中で安定であるべく設計し、そして溶媒、例えば、水性媒体にかなり類似であると考えられる、エタノール中でさえも変性すると知られる。また、タンパク質コンジュゲート構成要素は、非水性溶媒中で比較的不溶性である傾向がある。
【００５１】
以下の式のハプテンコンジュゲートは、本発明の実施に有用であると見出され：
【化１９】
0004980536.tif 000011
ここで、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｎおよびＸは前記式（ＩＡ）中と同じ意味であり、そしてＰＲはタンパク質残基であり：（１）キャリアー分子、例えば、Diptheriaウイルスからの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン）、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オバアルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンであって免疫原の場合におけるもの、または（２）レポーター分子（ＲＭ）例えば、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼである。
【００５２】
加えて、以下の式のハプテンコンジュゲートは同様に有用であり：
【化２０】
0004980536.tif 000012
ここでＡ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ＥおよびＸは上記式（ＩＢ）中と同じ意味である。
【００５３】
以下コンジュゲートが、本発明の実施に特に有用であると見出され：
【化２１】
0004980536.tif 000013
ここでそれぞれの場合のｎは１ないし５の整数であり、好ましくは３ないし５の整数である。
【００５４】
試験されるべきサンプル中の抗原性ネオニコチノイドまたはハプテン−ＲＭコンジュゲートを結合するための本発明のプロセスで使用する非標識ポリクローナル抗体を、イムノメトリックアッセイで一般に使用される任意の支持体上に固定化することができる。これらに含まれ得るのは、濾紙、ラテックまたはポリスチレンビーズおよびポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレンまたは他の適当なマイクロウェルプレートまたは試験管である。この支持体を、天然または合成起源の任意のポリマー、または非晶質材料、例えばガラスから作成することができる。反応ストリッピングのためにニトロセロロースまたはナイロンの膜、そしてビーズまたはマイクロプレートのためにポリビニル、ポリプロピレン、ポリスチレンまたは他のプラスチックを使用するのが有利である。アガロース、アクリルアミドまたはラテックスに基づくゲルまたは粒子もまた使用することができる。加えて、当業界で既知の任意のイムノクロマトグラフィー装置、試験ストリッピングおよびラテラルフロー装置を本発明のプロセスに適合させることができる。好適なラテラルフロー装置には、米国特許４３６６２４１に開示されたラテラルフロー装置の型を述べることができる。抗体をそのような材料に結合させる技術は、当業者に周知である。支持体に結合された抗体を得る好適なソースは、例えば、Beacon Analytical Systems, Inc.(Portland, Maine)である。
【００５５】
アッセイでの使用のための種子サンプルを調製するために、ネオニコチノイド処理したロットからの種子の代表のサブサンプル（例えば、５ないし１００グラムのキャノーラ種子；１０ないし２００グラムのソルガム、コムギ、ワタ、トウモロコシまたはスイートコーン種子）を好適な溶媒、例えばアセトン、アセトニトリル、エタノール、イソプロパノール、メタノール、または種々のパーセンテージの水とのこれらの溶媒の混合物に分散させる。好適な溶媒―水混合物は、例えば、１ないし５０％  ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏおよび１ないし２０％  アセトニトリル／Ｈ２Ｏを含む。分散した種子を、撹拌して混合し、それから約２０分間超音波バスに置き、次いでさらに撹拌する。内容物を処理に付する。既知の一部の液体抽出物を取り、既知量の溶液、例えば、１％アセトニトリル／水に添加する。抽出物をさらに希釈し、キャリブレーション曲線の範囲に抽出したネオニコチノイドの濃度をもっていく。１０００ないし６００００倍の希釈が有用であると見出された。イムノアッセイは実行におよそ３５分かかる。分析のため抽出物の抽出および調製はおよそ３０分かかる。したがって種子サンプルをおよそ１時間と５分で抽出、分析することができる。ある実施態様では、２種の種子サンプル（種子サンプルにつき５サブサンプルまで）を１度に分析することができる。
【００５６】
本発明に従うイムノアッセイで、約１万ｐｐｍないし１／２ｐｐｂのネオニコチノイド殺虫剤の濃度を検出することができる。しかし、該方法は、サンプルまたはサンプル抽出物中のネオニコチノイド殺虫剤の量がキャリブレーション曲線の範囲内に入り、または入るように適当に希釈され得る限り、存在する任意の量のネオニコチノイド殺虫剤に好適である。
【００５７】
抗原の調製、ポリクローナル抗体の産生およびイムノアッセイを以下の非限定的実施例によってより詳細に例示する。
【００５８】
実施例
実施例１  チアメトキサムハプテンのための合成手法
【化２２】
0004980536.tif 000014
【００５９】
１．１  ２−メチル−１−ニトロイソ尿素
Ｏ−メチルイソ尿素サルフェート（３８．５ｇ）
を硝酸（１２０ｍｌ）／硫酸（２８０ｍｌ）混合物に０℃で溶解し、そして０℃で２時間撹拌する。該混合物を破砕氷に注意深く撹拌しながら注ぎ、それから濾過によって破砕氷を除去する。針状結晶ｄを酢酸エチルに溶解し、そして炭酸カリウムを添加して溶液をアルカリ性にする。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過する。濾液を濃縮し、白色粉末を得る（５ｇ）。
【００６０】
１．２
３ｇのメチル４−アミノブチレートヒドロクロリド（１．１ａ）および１５ｍｌの水から溶液を調製する。ｐＨを、溶液をアイスバスで冷却しながら、２Ｎ  ＮａＯＨの滴状の添加によって１１に調節する。反応フラスコにｐＨ電極および温度計を装着し、そして得られた透明塩基性溶液を急速に撹拌し、２−メチル−１−ニトロイソ尿素（２．３８ｇ）を小量ずつ添加し、溶液の温度を２℃以下に保持する。添加を完了して、反応物を０℃で１．５時間撹拌する；ｐＨは９．６で安定化した。ＴＨＦ（１ｍｌ）を添加し、そしてさらに２時間撹拌する。反応物を水で希釈し、酢酸エチルに注ぐ。有機相を分離の後、有機フラクションを硫酸マグネシウムで乾燥し、溶液を濾過する。濾液を濃縮し、透明オイルを得る。粗オイルを３：１のジクロロメタン／アセトニトリルで溶出させるシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーし、７５０ｍｇの所望の産物を白色固体として得る。
【００６１】
１．３
１．２からの産物（１．４４ｇ）をパラホルムアルデヒド（４２２ｍｇ）、メタンスルホン酸（.０２３ｍｌ）、および蟻酸（１０ｍｌ）と合わせ、そして５５℃で１５時間加熱する。反応物を減圧で濃縮する。得られた褐色のオイルをトルエン中に懸濁し、そして溶液を共沸的にストリッピングし乾燥させる。得られたオイルを１：１：１のＴＨＦ／ジオキサン／アセトニトリルに溶解し、そして過剰のジアゾメタンで処理する。この溶液を３０分間撹拌し、反応物を酢酸と処理する。反応混合物をオイルに濃縮する。酢酸エチル中にオイルを再構成し、薄い重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、そしてオイルに再濃縮する。このオイルを３：１のジクロロメタン／アセトニトリルにおけるフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、６５８ｍｇの所望のオキサジアジンアミンブチルエステル（１．３）を透明オイルとして提供する。
【００６２】
１．４
１．３からの産物（１．１ｇ）ｄをアセトニトリル（５０ｍｌ）に溶解し、そして３ｇの炭酸カリウムを添加する。クロロメチルクロロチアゾールを１度に添加し、反応混合物を５５℃で２０時間加熱する。反応混合物を室温に冷却し、そして除去して固体を除去する。得られた褐色のろ液をオイルに濃縮する。オイルを３：１のジクロロメタン／アセトニトリルにおけるフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、８９４ｇの所望の化合物を黄褐色オイルとして得る。
【００６３】
１．５
８ｍｌの濃ＨＣｌおよび１ｍｌの水中に化合物１．４（３７２ｍｇ）を溶解し、室温で６時間撹拌する。反応混合物を水で希釈し、そして４．５のｐＨとなるまで１Ｎ  ＮａＯＨの添加によって注意深く塩基性化する。酢酸エチルで抽出し、そして有機フラクションを硫酸マグネシウムで乾燥する。乾燥有機フラクションをオイルに濃縮し、そして１：１のジクロロメタン／アセトニトリルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、所望の産物１．５を得る（１００ｍｇ）。
【化２３】
0004980536.tif 000015
【００６４】
実施例２−５  チアメトキサムハプテン
実施例１の合成方法論を使用して、中間体１．１ａを式ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ（１．１ｂ）の適当なアナログ化合物で置換することによって、表１に示す以下のチアメトキサムハプテンを調製し、ここでｎは１ないし５の整数であり、ＲはＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００６５】
表１
【表１】
0004980536.tif 000016
【００６６】
実施例６−９  チアメトキサムハプテン
実施例１の合成方法論を使用して、中間体１．１ａを適当な下記式のアナログ化合物（１．１ｃ）
【化２４】
0004980536.tif 000017
（ここでＥは共有単結合または連結部分−（ＣＨ２）ｍ−であり、ここでｍは１ないし３の整数であり、ＲはＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルである）
で置換することによって、表２に示す以下のチアメトキサムハプテンを調製する。
【００６７】
表２
【表２】
0004980536.tif 000018
【００６８】
実施例１０  デス−ニトロイミノチアメトキサムハプテンの合成手法
【化２５】
0004980536.tif 000019
【００６９】
手法
チアメトキサム−酪酸ハプテン（１００ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）およびアニソール（６．５ｍｌ）を、マグネチックスターラーバーおよび還流コンデンサーを備えた１０ｍｌ丸底フラスコ中で合わせる。フラスコをオイルバスに置き、そして２時間１６５℃で加熱する。アニソールを５０℃で５時間減圧で除去する。得られたオイル産物（９０．２ｍｇ）はＨＰＬＣ分析によれば９３％純度である。
【００７０】
特性把握のための分光学的データ
【表３】
0004980536.tif 000020
【００７１】
実施例１１−１８  デス−ニトロイミノチアメトキサムハプテン
実施例１０の合成方法論を使用して、実施例１で得た化合物を実施例２−９の適当なアナログ化合物で置き換えることによって、表３に示す以下のデス−ニトロイミノチアメトキサムハプテンを調製する。
【００７２】
表３
【表４】
0004980536.tif 000021
【００７３】
実施例１９−２７  イミダクロプリドハプテン
実施例１の合成方法論を使用して、１．２で得たニトログアニジル誘導体または実施例２−９に示したような式１．１ｂまたは１．１ｃの適当なアナログで中間体１．１ａを置き換えることによって得たそのアナログの使用によって、表４に示す以下のイミダクロプリドのハプテンを調製する。
【００７４】
表４
【表５】
0004980536.tif 000022
【００７５】
実施例２８−３６  デス−ニトロイミノイミダクロプリドハプテン
実施例１０の合成方法論を使用して、実施例１で得た化合物を実施例１９−２７の適当なアナログ化合物で置き換えることによって表５に示す以下のデス−ニトロイミノイミダクロプリドハプテンを調製する。
【００７６】
表５
【表６】
0004980536.tif 000023
【００７７】
実施例３７−４５  クロチアジンハプテン
実施例１の合成方法論を使用して、１．２で得たニトログアニジル誘導体または中間体１．１ａを実施例２−９に示すような式１．１ｂまたは１．１ｃの適当なアナログで置き換えることによって得たそのアナログの使用によって、表６に示す以下のクロチアジンのハプテンを調製する。
【００７８】
表６
【表７】
0004980536.tif 000024
【００７９】
実施例４６−５４  デス−ニトロイミノクロチアジンハプテン
実施例１０の合成方法論を使用して、実施例１で得た化合物を実施例３７−４５の適当なアナログ化合物で置き換えることによって表７に示す以下のデス−ニトロイミノクロチアジンハプテンを調製する。
【００８０】
表７
【表８】
0004980536.tif 000025
【００８１】
実施例５５−６３  チアクロプリドハプテン
式（ＩＩＩＡ）および（ＩＩＩＢ）のハプテンに特異的な合成方法論を使用して、表８に示すクロチアジンの以下のハプテンを調製する。
【００８２】
表８
【表９】
0004980536.tif 000026
【００８３】
実施例６４  チアメトキサム免疫原の調製
６４．１
０．０１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の精製タンパク質誘導体（ツベルクリン、ＰＰＤ）の溶液を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製する。０．５ｍｌアリコートのこの溶液のｐＨを、０．１Ｍ  ＨＣｌで４．５−５．０に調節する。
【００８４】
６４．２
２５０μｌの０．１Ｍ  ２−（Ｎ−モルフォリノ）−エタンスルフォン酸、ｐＨ４．５中に、実施例１からのチアメトキサムハプテン（１ｍｇ）を溶解する。ハプテンおよびＰＤＤ溶液を合わせる。
【００８５】
６４．３
１ｍｇの１−（ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を１００μｌの蒸留した、脱イオン水に溶解する。ただちにＥＤＣ溶液を３．２のハプテン−ＰＰＤ溶液に添加する。ハプテン−ＰＰＤ−ＥＤＣ溶液をローテーションによって室温で２時間混合する。反応混合物を１０００−２０００ダルトン分子量カットオフを有する透析バッグに移す。４８時間、３回交換／日で２リットルの４℃のＰＢＳに対して徹底的に透析する。
【００８６】
実施例６５  イミダクロプリド免疫原の調製
実施例６４の方法論を使用して、実施例２１のハプテンを使用してイミダクロプリド免疫原を調製する。
【００８７】
実施例６６  クロチアジン免疫原の調製
実施例６４の方法論を使用して、実施例３９のハプテンを使用してクロチアジン免疫原を調製する。
【００８８】
実施例６７  チアクロプリド免疫原の調製
実施例６４の方法論を使用して、実施例５７のハプテンを使用してクロチアジン免疫原を調製する。
【００８９】
実施例６８  免疫化スケジュールおよび抗体の収集
最初の免疫化のために、実施例６４の免疫原をフロイントの完全アジュバントに溶解する。メスのニュージーランドホワイトラビットに、およそ２５μｇの免疫原をそれぞれの部位に注射により接種する。同様にヒツジを免疫化し、ただしおよそ３８μｇの免疫原をそれぞれ部位に注射する。
次の免疫化で、免疫原をフロイントの不完全アジュバントに溶解する。動物を免疫化の間に４週間休ませ、免疫化の１０日後に集血する。追加免疫注射を投与し、そして９月にわたり動物を集血し、それぞれの点で全採血する。
ポリクローナル抗体を当業者に既知の技術を使用して収集する。
【００９０】
実施例６９  ハプテン−酵素コンジュゲートの調製
実施例１からのチアメトキサムハプテン（３．１ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（４．０ｇ）、およびＥＤＣ（４．６ｇ）を小さいバイアルにおいて合わせる。これらの材料を穏やかな流れの窒素下で１５分間室温で乾燥する。
【００９１】
６９．２
乾燥ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）を添加し、混合物を１分間超音波処理する。得られた溶液を終夜室温でインキュベーションする。
【００９２】
６９．３
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（８．５ｍｇ）を小さいバイアルにおいて、カルボネートバッファー（２．９ｍＬ、０．０５Ｍ  ｐＨ９．６）中に溶解する。バイアルをアイスバスに置く。
【００９３】
６９．４
６．２からの全部で１００μｌのハプテン−ＮＨＳ−ＥＤＣ溶液を、ゆっくりと１時間かけて添加し、そして混合物を撹拌しながら２時間インキュベーションする。
反応混合物を、ＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．２）で平衡させたセファデックスＧ−２５Ｍカラムを通過させる。酵素コンジュゲートを最初３．０ｍＬの溶出液中において収集し、等体積のグリセロールを添加し、−２０℃で貯蔵する。
【００９４】
実施例７０  チアメトキサムで処理したキャノーラ種子のイムノアッセイ
種子抽出物の一部を、予測された濃度のチアメトキサムがキャリブレーション曲線の範囲内、すなわち０．５ないし１２０ｐｐｂとなるように１％  ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏに希釈する。抗体でコートした管をラベルし、そして管ラックにおき、その結果最初および最後の管が標準であり、そして残りの標準およびサンプルを混ぜる。管ラックはそれぞれの管をつかんでおり、その結果ラックは管を失うことなくひっくり返し得る。アリコートの標準またはサンプル（０．５ｍＬ）をすべての対応する管に添加する。酵素コンジュゲート溶液（０．５ｍＬ）をすべての管に添加する。ラックはおだやかに振とうし、すべての管の内容物を混合する。管を室温で２０分間インキュベーションする。ラックをひっくり返しすべての管の内容物をデカンテーションさせる。蒸留Ｈ２Ｏをすべての管に添加し、反転的洗浄ビン（flip-top wash bottle）を使用してオバーフローさせ、そして洗浄液をデカンテーションする。管をさらに３回洗浄する。最後の洗浄の後、ラックをひっくり返し、そして管を穏やかに清潔なペーパータオルでたたいて過剰の洗浄液を除去する。
【００９５】
酵素基質（０．５ｍＬ）をすべての管に添加し、これを室温で１０分間インキュベーションする。ラックをこのインキュベーション中穏やかに２．５分ごとに振とうする。酸性の停止溶液（１Ｍ  ＨＣｌ、０．５ｍＬ）をすべての管に添加し、シグナル発生を終結させる。表１０に示されるように、この反応産物の吸光度を４５０ｎｍで測定する。標準の吸光度を使用してキャリブレーション曲線、Ｙ＝ｍＬｎ（Ｘ）＋Ｂの式の回帰関数を構成する。それぞれのサンプルの吸光度を該関数に代入し、そして希釈したサンプル中のネオニコチノイド農薬の濃度を決定する。得られた濃度に希釈ファクターを乗じてもとのサンプル中のネオニコチノイド農薬の量を算出する。
【００９６】
表１０  チアメトキサムイムノアッセイのための典型的標準曲線
【表１０】
0004980536.tif 000027
１単位はｐｐｂ
【００９７】
チアメトキサム標準の応答を記述する関数を回帰分析によって作成する。このデータセットは、Ｙ＝−.１９１ Ｌｎ（Ｘ）＋１．２３、ｒ＝−.９９９の標準曲線をもたらし、ここにＹ＝分析応答であり、Ｘ＝チアメトキサム標準の濃度である。
【００９８】
実施例７１  チアメトキサムで処理した作物種子の交差反応性試験
７１．１  種子の抽出
処理した種子のサンプルを、５０ｇのワタ、トウモロコシ、ソルガム、スイートコーンおよびコムギまたは４０ｇのキャノーラを、６オンス広口ビンに無作為に加えることによってサブサンプル化する。キャノーラを４回サブサンプル化し、他の種子種類は５サブサンプルを使用する。溶媒（１５０ｍｌ）を添加し、硬くフタをしシールする。ワタ種子は５％アセトニトリル／水で抽出し、一方、他の種子では２０％メタノール／水の溶媒系を使用する。ビンを手で３０秒間強く振とうし、室温で２０分間ウォーターバスに超音波処理しながら置く。サンプルを前記の様に２回およそ５分間振とうする。各ビンの内容物をおよそ５分間据え、アリコート（０．１０ｍｌ）を分析のために取る。アリコートを１％メタノール／水に希釈し、標準曲線の範囲に止まるようにする。
【００９９】
７１．２  イムノアッセイ分析
抗体コートしたポリスチレン培養管をラベルし、そして管ラックに置き、その結果最初および最後の管が標準であり、そして残りの標準およびサンプルを混合する。サンプルおよび標準溶液（０．５０ｍｌ）を対応する管に添加する。同じくらいの体積の酵素コンジュゲート溶液を添加する。ラックを穏やかに振とうし、溶液およびセットを混合し、室温で２０分間インキュベーションする。すべての管の内容物を、ラックをステンレススチールパンの上でひっくり返すことによって除去する。各管を蒸留水でオーバーフローしながら洗浄する。ラックを流しの上でひっくり返し洗浄水を捨てる。洗浄を４回反復する。次いでラックをひっくり返し、そしてペーパータオルで軽くたたき、残りの洗浄液のほとんどを除去する。（管に残っているいくらかの液体はアッセイの結果に影響を及ぼさない。）酵素基質溶液（０．５０ｍｌ）を管に添加し、これを室温で１０分間インキュベーションする。ラックを穏やかに２．５分間隔で振とうし、酵素へ基質の十分な供給を維持することを確保する。青色呈色シグナルの発生を酸性停止溶液（０．５０ｍｌ）の添加によって終結させる。各管の溶液の吸光度を分光光度計的に４５０ｎｍで測定する。
【０１００】
サンプル中のアナライトの濃度を、ｙ＝ｍ  ｌｎ（ｘ）＋ｂの式の回帰関数から決定する。
【０１０１】
７１．３  交差反応性決定
イムノアッセイの交差反応性、または特異性を評価し、種子コーティングに見出される他の試験物質がチアメトキサムの測定を妨害するかどうか決定する。試験物質を１％メタノール／水中に１０００ないし０．０１ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度に溶解する。それぞれの濃度のアリコートを前記の様に分析する。この範囲のそれぞれの試験物質の反応性を、Brady, J. F; Turner, J.; Skinner, D. H.''Application of a triasulfuron enzyme immunoassay to the analysis of incurred residues in soil and water sample''. J. Agric. Food Chem. 1995, 43:2542-2547に以前記載されたように決定する。
【０１０２】
７１．４  結果
分析した試験物質のなかで、チアメトキサムのみがイムノアッセイに有意に反応性であると見出される（以下の表９）。したがってこのイムノアッセイはチアメトキサムに特異的である。
種子の処理したロットのサブサンプルをイムノアッセイおよびＨＰＬＣによって分析した。これらの分析結果を表１１に示す。表１１は、チアメトキサムについて、４０種子サンプルの、ポリクローナル抗体を使用する平均値のイムノアッセイ結果およびＨＰＬＣ分析の相関を記載する。最良の適合回帰線は、類似の結果がそれぞれの方法によって得られたことを指摘している。
【０１０３】
0004980536.tif 000028
１パーセンテージとして表されるチアメトキサムの反応性に対する試験物質の反応性
２ＮＲ、非反応性
【０１０４】
多くの別形態および修飾形態が、広く記載の本発明の精神または範囲から離れることなく、前記の本発明について作成され得ることが、当業者によって認識される。
【０１０５】
【表１１】
0004980536.tif 000029
【０１０６】
【表１２】
0004980536.tif 000030
【０１０７】
【表１３】
0004980536.tif 000031