(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールを消費する対象における前記アルコールによって生ずる肝臓における脂肪浸潤を予防するための薬剤を製造するための、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドオロテートの使用。
【請求項２】
治療薬を消費する対象における前記治療薬又はその代謝産物によって生ずる肝臓肥大を予防及び／又は治療するための薬剤を製造するための、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドオロテートの使用であって、
前記治療薬がメトトレキセートである、前記使用。
【請求項３】
更に、Ｎ−アセチルシステイン、ビタミンＥ、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＣ、グルタチオン、システイン、メチオニン、及び２−メルカプトエタノールからなる群より選ばれる酸化防止剤を含む、請求項１又は２に記載の薬剤を製造するための５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドオロテートの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．イントロダクション
本発明は、アルコール、治療的に有用な薬剤により及び工業的、食事性及び環境的毒素により生じる組織損傷を、アミノイミダゾールカルボキサミド（ＡＩＣＡ）塩の投与により予防及び／又は抑制するのための方法及び組成物に関する。オロチン酸から得られるもののみよりむしろ５−アミノイミダゾールカルボキサミドの有機酸塩及び無機酸塩の全ての群の使用が本発明の方法により包含される。例えば、ＡＩＣＡは、また、乳酸、コハク酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸を含むがこれらに限定される訳ではない脂肪酸と又はグルコン酸、ガラクトン酸等の糖酸、特には、ペンタ及びポリヒドロキシカルボン酸と反応して、有機酸塩を形成することができ、又は、ＡＩＣＡは、塩酸及びリン酸を含むがこれらに限定される訳ではない無機酸と反応して、本発明の方法に従って使用するのに適切な無機塩を形成することができる。
【０００２】
その方法は、アルコール、治療薬を消費する及び／又は生体異物に付される個体(individual)へ、有効量のアミノイミダゾールカルボキサミド塩を、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ及びその誘導体、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン又はグルコン酸マグネシウムを含むがこれらに限定される訳ではない酸化防止剤を用いて又は用いずに投与することを含む。本発明の実施においては、ＡＩＣＡ塩を含む組成物を用いて、有害及び有毒物質を解毒し、物質の有害な求電子又はフリーラジカルへの生理活性を抑制し、細胞性又は体液性免疫メカニズムの抑圧を抑制し、ダメージ(damaged)組織の標的細胞の再生を刺激し、かつ、エネルギー供給不足を抑制する。本発明の好ましい組成物は、肝細胞、非実質細胞、内皮細胞、ピット細胞(pit cell)及び肝シヌソイド及び胆汁デュエット(bile duet)をラインする他の細胞を含むがこれらに限定される訳ではない組織損傷を特異的に又は優先的に抑制するものである。
【０００３】
２．発明の背景
２．１  アミノイミダゾールカルボキサミド塩
ＡＩＣＡオロテートは、また、“オラザミドオロテート”と称され、動物の核酸へ導入され、また、動物において急性及び慢性の肝臓ダメージにより生じる肝臓の壊死を防止する能力を有する。Miller, C. S.ら, 1950年,     サイエンス112:654。
２．１．１  アミノイミダゾールカルボキサミド塩の化学的性質及び特性
オラザミドは、異なる形態：５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドオロテート、４−アミノ−５−イミダゾールカルボキサミドオロテート又は１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−４−ピリミジンカルボン酸と５−アミノ−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボキサミドとの組み合せ（１：１）、又はオロチン酸と５（又は４）−アミノイミダゾール−４（又は５）−カルボキサミドとの組み合せ（１：１）として入手可能である。イミダゾール環におけるＣ５アミン基は、オロチン酸又は体に対して化学的に適合性の他の有機酸のＣ４カルボキシル基に結合することができる：
【０００４】
【化１】
0005073897.tif 000002
【０００５】
２．１．２  オロチン酸の代謝効果
体に対して臨床的に適合性の有機又は無機酸の各種は、ＡＩＣＡ、プリン経路における中間体と反応するように選ぶことができる。特に望ましいものは、オロチン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、ガラクトン酸、塩酸、リン酸及びペンタ又はポリヒドロキシカルボン酸である。
オロチン酸は、ピリミジン経路における中間体であり、ヒト及び動物の食事におけるその主な源は、牛乳及びその製品である。
【０００６】
２．２  アルコール及び肝臓病
アルコールと肝臓へのダメージとの関連性は、肝硬変がエタノールを多量に摂取する患者に起こるとの臨床的観察を主なベースとする。エタノールは、通常の男性及び女性を含む他の正常動物において肝臓に対して種々の毒性作用を有することが知られている。
アルコールの乱用には、年間で１１６０億ＵＳドルより多くが費やされており、その約１２％が医療の直接費である。一般メディアにおける宣伝、逆宣伝及び描写, 1986年, JAMA 256:1485。アルコール関連病の大流行の基本的理由は、エタノールが、近代社会での不安、憂鬱及び抑圧を和らげるのに有効な薬剤であることである。エタノールの入手容易性及びエタノール消費の社会の許容能力が、広範にかつ侵略的に宣伝されている。公衆は、エタノールを中毒でなく慢性的に使用することにより、深刻な医学的病気及び／又は社会的意義の発展が生じ得ることに無意識であるように思われる。アメリカ合衆国の人口の約４分の３がエタノールを利用する。アメリカ合衆国におけるアルコール依存症の発生率は、約７％であり、男性（１１％）は女性（４．０８％）より高い。Alcohol Health and Research World, 1995, 18:243-8。
アルコール依存症の予防及び／又は治療は、確かな答えのない問題である。従って、エタノールの肝毒性に関する生化学的ベースの理解及びその最終的制御により、アルコールに関連する肝臓病及び医学的合併症を低減及び管理するのに効果的な手段を提供することができる。
【０００７】
２．３  治療薬及び肝臓病
薬剤誘発肝臓病は、一般的プラクチスにおいて発生するのは稀であるが、薬剤反応に悪影響を及ぼすため、全入院(admission)の２〜３％を占める。Lewis, J. H.ら, 1989年, Med. Clin. North Am. 73:775。薬剤関連肝臓病理学について発行ｓれた編集物は、種々の肝臓病の原因に含まれる５００〜１０００の治療薬を挙げる。Zimmerman, H. J., 1990, Semin. Liver. Dis. 10:322。肝臓障害を生じさせる潜在性を有する薬剤は、“直接的”又は“予測可能な”肝臓毒及び“予測不能な”肝臓毒に分けられる。直接的肝臓毒は、予測可能な用量依存性方法で肝臓ダメージを生じさせ、それらは、主に肝小葉の特定領域に影響する肝細胞の壊死をもたらす。予測不能な肝臓毒は、重要な炎症性反応と通常関連し、壊死及び／又は胆汁うっ帯からなり、散在性の肝臓損傷をもたらす。肝臓毒性の理解における有意な利点の代わりに、数種の薬剤が肝細胞を損傷させ又は死滅させ、又はその機能を変化させるメカニズムが、大方知られておらず、制御されていないままである。
【０００８】
２．４  工業的及び環境的毒素及び肝臓病
肝臓は、環境的又は職業的／工業的毒素による損傷可能性が高く、なぜなら、それは、生体異物として知られるこれらの物質に胃腸の後に付される最初の器官であるからである。肝臓の代謝により、通常、これらの物質が解毒される。しかしながら、生体異物の肝臓代謝により、親化学物質より非常に高い肝臓毒性の生体異物が生じ得る。肝臓毒性がもたらされるが、これは、マイルドな肝機能障害から壊死までの生体異物又は毒素範囲へ偶発的又は意図的に付されることからヒトに生じる。生体異物は、栄養素と反応し、それらを破壊し、又はそれらを利用不能にするかもしれず、これは、変化した吸収又は解毒又は代謝速度の変化による。次に、栄養欠乏により、生体異物の毒性作用が強化されるかもしれない。通常用いられる化学物質が健康危険を示すことの理解は、これらの物質に直接付される産業労働者のみならず、環境中、食品中又は家庭においてこれらの偏在性有毒物質に知らずに付される一般公衆に、重大な心遣いを思い起こさせる。
【０００９】
本発明は、アルコールにより生じる組織ダメージの予防及び治療のための方法に関するものであり、それは、ＡＩＣＡ塩をそれらを必要とする個体へ投与することを含む。
本発明は、また、薬剤誘発肝臓病の防止及び治療のための方法に関するものであり、それは、ＡＩＣＡ塩をそれらを必要とする個体へ投与することを含む。
本発明は、更に、生体異物及び／又は毒素への暴露の肝毒性作用の予防及び治療のための方法を包含し、それは、ＡＩＣＡ塩をそれらを必要とする個体へ投与することを含む。
本発明は、また、ＡＩＣＡ塩をそれらを必要とする個体へ投与することにより、エタノールの酸化、及びエタノール酸化におけるアセトアルデヒド、毒素及び反応性中間体の毒性作用を抑制する方法に関するものである。
本発明は、また、ＡＩＣＡ塩をそれらを必要とする個体へ投与することにより、求電子又はフリーラジカル等の反応性生体異物への治療薬の転化を抑制する方法に関するものである。
本発明は、また、ＡＩＣＡ塩をそれらを必要とする個体へ投与することにより、肝毒性生体異物を解毒して無害な代謝物にする方法又は親化学物質より非常に肝毒性の高い代謝物へ生体異物が転化するのを抑制する方法に関するものである。
本発明は、また、アルコール、治療薬及び生体異物により生じる細胞性及び液性免疫の抑圧を防止する方法に関するものであり、それは、有効量のＡＩＣＡ塩をそれらを必要とする個体へ投与することを含む。
【００１０】
本発明は、また、肝細胞の再生を誘発する方法に関するものであり、それは、有効量のＡＩＣＡ塩をそれらを必要とする個体へ投与することを含む。
本発明は、また、アルコールにより生じる肝臓ダメージの防止及び治療のための方法に関するものであり、それは、ＡＩＣＡ塩と、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ及びその誘導体、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン及びグルコン酸マグネシウムからなる群より選ばれる酸化防止剤とを、それらを必要とする個体へ投与することを含む。
本発明は、また、アルコールにより生じる肝臓ダメージの防止及び治療のための方法に関するものであり、それは、ＡＩＣＡ塩と、ジスルフィラム、パーギリン、レセルピン及びスルホニル尿素からなる群より選ばれるアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤とを投与することを含む。
本発明は、薬剤誘発肝臓病の防止及び治療のための方法に関するものであり、それは、ＡＩＣＡ塩と、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ及びその誘導体、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン及びグルコン酸マグネシウムからなる群より選ばれる酸化防止剤とを、それらを必要とする個体へ投与することを含む。
本発明は、更に、生体異物及び／又は毒素の肝毒性作用を防止及び治療するための方法を包含し、それは、ＡＩＣＡ塩と、ビタミンＥ、ビタミンＣ、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン及びグルコン酸マグネシウムからなる群より選ばれる酸化防止剤とを、それらを必要とする個体へ投与することを含む。
【００１１】
４．図面の簡単な説明
本発明の十分な理解のために、添付図に関連しては、以下の記載を参照されたい。その中において、図１は、全体的又は平均で表される毎週の全食品摂取及び平均体重についてのエタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテート(orazamide orotate)の相互作用を示す図である。統計的分析は、ａ）Kruskal-Wallis ANOVA on Ranks (p<0.05 vs.オラザミドオロテート*)；ｂ）２−方法のANOVAとSNK post-hoc試験 (p.<0.05 vs. 他の全て**)により行った。
図２は、初期体重（平均＋／−ＳＤとして表したデータ）を示す図である。２−方法のANOVAにより有意差は観察されなかった。
図３は、体重（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートでの６週間の処理の結果を示す図である。＊として表した統計的有意差は、p.<0.05で、２−方法のANOVAとSNK post-hoc試験により試験した。
図４は、体重増加（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートでの６週間の処理の結果を示す図である。*p.<0.05で、２−方法のANOVAとSNK post-hoc試験による。
【００１２】
図５は、最終体重（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。*p.<0.05 vs. C&O (Kruskal-Wallis ANOVA Ranksによる)。
図６は、最終肝臓質量（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。*p.<0.05 vs. 他の全て(２−方法のANOVAとSNK post-hoc試験による)。
図７は、肝臓質量：体重比（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。*p.<0.05 vs. C; Kruskal-Wallis ANOVA on Ranksである。
図８は、最終腎臓（右腎及び左腎）質量（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。処理間において統計的差はなかった。
図９は、腎臓質量：体重比（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。*p.<0.05 vs. O; Kruskal-Wallis on Ranksである。
【００１３】
図１０は、最終副腎質量（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。*p.<0.05 vs. C, O, X及びXO; ２−方法のANOVAとSNK post-hoc試験である。
図１１は、副腎質量（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。*p.<0.05 vs. C, O, X及びXO; ２−方法のANOVAとSNK post-hoc試験である。
図１２は、肝臓中におけるＴＢＡＲＳ（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。統計的有意差はなかった。
図１３は、スクシネート、チトクロムＣ及びTriton X100でインキュベートされた肝ミトコンドリアによる酸素消費についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。結果は電子伝達系の数（平均＋／−ＳＤとして表現）を示す。*p.<0.05 (E+EO) vs. (C+O); p.<0.05 vs. (X+X)) vs. (C+O); p.<0.05 vs. O, C. E, XO, 2-方法のANOVAである。
図１４は、肝臓中における脂肪浸潤（平均＋／−ＳＤとして表現）についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。*p.<0.05 vs. C; Kruskal-Wallis ANOVA on Ranksである。
【００１４】
５．発明の詳細な記載
本発明の方法は、有効量のＡＩＣＡの無機酸塩又は有機酸塩を、アルコール及び／又は治療的に有用な薬剤を利用する個体又は工業的、食事性及び環境的毒素に付される者に投与して、これらの物質により生じる肝臓損傷を防止及び／又は抑制することを包含する。
他のＡＩＣＡ塩、又は酸化防止剤特性を有し、かつ、肝細胞の再生を強化する物質が治療剤として有用であり得ることが当業者には明らかであろう。そのような更なる化合物は、本件明細書に記載の肝細胞損傷アッセイを用いて確認することができる。
ＡＩＣＡ塩のみ又はその酸化防止剤との組み合わせの、有害及び有毒物質を解毒する能力、有害求電子又はフリーラジカルに対する物質の生理活性を阻害する能力、細胞性又は体液性免疫メカニズムの抑圧を抑制する能力、肝細胞の再生を刺激する能力及び／又はエネルギー供給不足を抑制する能力は、アルコール、治療的に有用な薬剤及び工業的及び環境的毒素により生じる肝臓損傷の防止及び治療における使用に対する効き目又は有効性に貢献する。これらの起こり得る作用メカニズムは、如何なる方法においても本発明の範囲を制限することを意味するものではなく、単に説明及び／又は例示目的のために使用される。
【００１５】
５．１  アルコールの代謝及び肝臓損傷のメカニズム
アルコールは蓄えておくことができず、摂取されたエタノールの９０~９５%が体の中において代謝されてアセトアルデヒド及びアセテートとなる。残部は、無傷で、肺及び腎臓を介して及び汗中に排出される。肝臓中におけるエタノールの酸化は、ほぼ完全なエタノールメカニズムを説明し、少量が、腎臓、筋肉、腸及び肺において酸化される。健康な個体は、１６０〜１８０ｇ／日より多くの代謝を行うことができない。
エタノール酸化は、肝細胞のサイトゾル内の酵素により及び小胞体へ結合する酵素により触媒される。アルコールのアセトアルデヒドへの転化は、サイトゾルにおいて起こり、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）により異化される。
【００１６】
【化２】
0005073897.tif 000003
【００１７】
ミトコンドリア及びサイトゾル中におけるアセトアルデヒドは有害で、膜ダメージ及び細胞の壊死をもたらすかもしれない。アセトアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）によりアセテートに転化される。
【００１８】
【化３】
0005073897.tif 000004
【００１９】
アセテートは、酸化されて、二酸化炭素及び水となるかもしれず、又は、クエン酸回路により脂肪酸を含む他の生化学的に重要な化合物へ転化されるかもしれない。ＮＡＤは、アルコールがアルデヒドへ及び更にアセテートへ転化されるとき水素受容体であり補助因子(co-factor)である。生じたＮＡＤＨはミトコンドリア内へ輸送(shuttle)され、肝臓内の酸化還元状態及びＮＡＤＨ：ＮＡＤ比が変更される。生じた水素は、脂肪酸を燃料として置き換え、かつ、トリグリセリドの蓄積及び脂肪肝が続く。肝臓の酸化還元状態が変化し、タンパク質合成が抑制され、脂質過酸化が上昇する。Situnayake, R. D.ら, 1990, Gut 31:1311。
アルコールを酸化する際のＮＡＤＨ：ＮＡＤ比における顕著な上昇により、乳酸アシドーシス、ケトーシス、コラーゲン形成、変更ステロイド代謝及び障害糖新生が生じる。
アセトアルデヒドは、エタノールによる肝損傷において主要因子である。アセトアルデヒドは、タンパク質、脂質及びＤＮＡに結合して、安定及び不安定な付加物を形成し、それにより、細胞の主要機能がダメージを受ける。数種の付加物は、“新抗原(neoantigen)”の振るまいをし、免疫応答及び免疫介在損傷(immune-mediated injury)を刺激する。アセトアルデヒドは、細胞グルタチオン、内在性フリーラジカルスカベンジャーと反応する及び消耗させることにより酸化応力を促進させる。Lauterberg, B. H.及びBilzer, M., 1988, J. Hepatol 7:384及びBloor, J. H.ら, 1994, Adv. Interm. Med 39:49。
【００２０】
アルコール性肝臓疾患における障害体液性免疫は、ＩｇＡの堆積及び血清免疫グロブリンレベルの上昇により示される。障害細胞性肝損傷は、エタノール変化肝細胞膜抗原と反応する抗体により示される。Neuberger, J.ら, 1984, Gut 25:300。
１０〜１５％のアルコールが、ミクロソームｐ４５０エタノール酸化システム（ＭＥＯＳ）により代謝される。Ｐ４５０−ＩＩ−Ｅ１は、このシステムの部分であり、アルコールにより及びアセトアミノフェンや生体異物等の数種の薬剤により誘導可能である。Lieber, C. S., 1995, N. Engl. J. Med. 333:1058。このことは、肝毒性であり、治療量で与えられたときに深刻な肝損傷を生じさせ得る薬剤に対するアルコールの感受性を説明する。Ｐ４５０−ＩＩ−Ｅ１の誘導は、酸素消費、アセトアルデヒド生成を上昇させ、脂質過酸化を促進する。ミクロソーム過酸化の間、損傷性の反応性酸素ラジカル又はフリーラジカルが生成され、脂質過酸化が開始される。エタノールの代謝には、酸素の過剰供給、ＭＥＯＳの誘導及び小胞体の増殖に適合する要件が求められる。ＭＥＯＳの活性は、還元型ヌクレオチドの利用の助けとなる。過剰な還元当量により、反応性酸素種の発生がもたらされる。
【００２１】
食品中における脂肪の量及びタイプは、アルコール性肝臓疾患にみられる障害を引き起こす際の重要な決定因子である。飽和脂肪は、アルコール性肝臓疾患の発達に対して比較的保護的であり、ポリ不飽和脂肪酸は、より深刻な肝損傷と関連する。Nanji, A. A.及びFrench, S. W., 1986, Alcoholism Clin Exp Res. 10;217;及びFrench, S. W., 1993, Alcohol 23:97。
コーンオイルとエタノールを与えたラットにおいては、肝損傷の進行は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及びプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）の生成の低減、及び非実質性の肝細胞によるロイコトリエンＢ（ＬＴＢ４）及びトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）の生成の上昇に付随する。アルコール供給を続けると、エイコサノイドの比が、ＰＧＥ２及びＰＧＩ２から離れてＴＸＢ２へ移行する。これは、肝細胞における脂質過酸化のレベルにより、アラキドン酸カスケードの酵素の活性が変化し、かつ、ＴＸＢ２の合成が上昇するためである。Nanji, A. A.ら, 1994, Life Sci. 55:611; 及びNanji, A. A.ら, 1994, Mol. Cell Biochem. 140:85。
トロンボキサンが肝損傷を引き起こし得るメカニズムは知られていないが、ＴＸＡ２誘導血管収縮及び低酸素症、単離肝細胞におけるろ過胞形成及び炎症を包含し得る。Horton, A. A.及びWood, J. M., 1990, Biochem. Biophys. Acta. 319:1022;及びGoldman, G.ら, 1991, Cir. Res. 68:1013。
【００２２】
従って、脂質過酸化物及び関連フリーラジカル成分、例えば、ＴＸＡ２の生成を抑制することを目的とする介入は、アルコール誘導性肝損傷に対する保護作用を発揮することが期待され得る。トロンボキサンＡ２合成は、イミダゾール化合物、例えば、アミノイミダゾールカルボキサミドにより抑制され得る。Horrobin, D. F.ら, 1978, Med. Hypothesis 4:178-184;及びTerano, S.ら, 1985, Adv. Prost. Thromb. Leuk Res. 15-315。また、ＡＩＣＡは、酸化防止性を有し、かつ、スーパーオキシドジスムターゼ活性を上昇させることが知られている。Muzces, G.ら, 1990, Acta Physiologica Hungaria 76:183-190。
本発明において、ＡＩＣＡ塩の投与により、トロンボキサンＡ２の抑制、脂質過酸化物及びフリーラジカルに対する強化された酸化防止防護及び上昇ヌクレオチド合成が生じる。より具体的には、ＡＩＣＡオロテートの投与により、アルコール誘導性肝損傷の予防及び／又は抑制並びにダメージ肝臓組織の再生が生じる。本発明における酸化防止剤との組み合せでのＡＩＣＡ塩が、また、アルコール誘導性肝損傷の予防及び治療に有用である。
【００２３】
５．２  薬剤誘導性肝臓疾患
肝臓は、特に、薬剤代謝と関連しており、肝臓により貪欲に吸収される薬剤は、高い初回通過代謝を有するとされる。口から得られる薬剤の肝クリアランスは、薬剤代謝酵素の能力、固有クリアランス、肝臓の血流量及び血漿タンパク結合の程度に依存する。
主な薬剤代謝システムは、肝細胞の滑面小胞体のミクロソームフラクション中に存在する。対象酵素は、混合機能モノオキシゲナーゼ、チトクローム、ｃ−レダクターゼ及びチトクロームＰ４５０である。サイトゾルにおける還元ＮＡＤＰＨは、補助因子である。
酵素誘導物質としては、バルビツレート、アルコール、麻酔剤、血糖降下剤及び抗痙攣剤、グリセオフルビン、リファンピシン、グルテチミド、フェニルブタゾン及びメプロバメートが挙げられる。薬剤治療後の肝臓の増大は、酵素誘導と関連し得る。
薬剤代謝及び毒性代謝物の生成は、肝細胞の滑面小胞体に位置するヘモプロテイン(haemoprotein)のＰ４５０システムにより行われる。少なくとも５０のＰ４５０が確認されており、Ｐ４５０−Ｉ、Ｐ４５０−ＩＩ及びＰ４５０−ＩＩＩの３群が関連している。肝細胞損傷をもたらす最も直接的な肝臓毒には、チトクロームＰ４５０酵素を介した反応性代謝物に対する活性化が求められる。表１にヒト肝臓Ｐ４５０の数種の特性を記載する。Watkins, P. B., 1990, Simin. Liver Dis. 10;235。
【００２４】
0005073897.tif 000005
【００２５】
エタノールがＰ４５０−ＩＩ−Ｅ１を誘導するので、それにより、また、アセトアミノフェン及びアスピリンの毒性が強化される。同様に、Ｐ４５０−ＩＩ−Ｅ１を誘導するイソニアジドで治療した患者は、上昇したアセトアミノフェン毒性を有する。Murphy, P.ら, 1990, Ann Intern. Med. 113:799。
アセトアミノフェンと同様に、アスピリンは、用量関連した可逆性型の肝毒性の良好に実証された(well-documented)原因である。米国において現在入手可能な非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）のうち、ジクロフェナク、スリンダク及びフェニルブタゾンが最も高い肝毒性の危険を有し；ピロキシカム、イブプロフェン、ナプロキセン及びフェノプロフェンは中程度の危険を有する。Tolman, K. G., 1990, J. Rheumatol. (Suppl.)22:6。
【００２６】
Ｐ４５０酵素により生成される反応性代謝物、多くの場合に求電子又はフリーラジカルは、タンパク質、脂質及び核酸との共有結合性付加物を形成し、それは、それらの機能の崩壊を導く。酸化方法は、また、細胞ダメージの原因において基礎的重要性を有すると思われる。脂質過酸化は、数種のタイプの薬剤誘導肝損傷において顕著である。求電子結合(electrophilic conjugate)は、また、細胞内酸化防止剤、例えばグルタチオンとのコンプレックス形成(complex)をし、それらの供給を消耗させる。酸化剤ストレスにより、ミトコンドリアの損傷が生じ、細胞エネルギー生成の機能障害及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）欠乏をもたらし、最終的に毒性肝損傷へと導かれる。Mehendale HMら, 1994, FASE J8:1285。
セクション５．１で上述したように、ＡＩＣＡ塩のみ又は酸化防止剤との組み合わせの介入は、ＴＸＡ２−誘導性血管収縮を抑制すること、及び脂質過酸化及びフリーラジカル生成を抑制することにより、上昇した血流をもたらす。より具体的には、本発明におけるＡＩＣＡオロテートの使用により、薬剤誘導性肝毒性の予防及び／又は抑制、ダメージ肝臓組織の再生、ヌクレオチドの再生及びエネルギー供給がなされる。
【００２７】
５．３  工業的及び環境的毒素により生じる肝疾患
摂取された化学物質、毒素又は因子による肝損傷の可能性は非常に高く、なぜなら、肝臓は、これらの物質に付される、胃腸管の後の最初の組織であるからである。肝代謝は、通常、これらの物質を解毒する。しかしながら、化学物質の肝代謝により、親化学物質より一層肝毒性の代謝物が生じ得る。毒素に対する肝臓の応答は、種々の要因、例えば、用量、暴露器官、暴露経路、個体年齢、他の薬剤又は毒素に対する同時暴露、確立された肝疾患の存在又は不存在、及び有害物質に暴露された個体の固有感受性により決定される。
通常及び頻繁に用いられる化学化合物が発ガンの危険を示すとの認識により、これらの物質に直接的に付される工業的労働者についてのみならず、環境において、食品において、及びそれらの食品又は家庭においてこれらの物質に付される公衆にとって深刻な懸念が提起される。
種々の分類法を用いて、それらが急性、亜急性又は慢性肝炎を生じさせる臨床症状に従って、又は、それらがそれらの肝毒性を生じさせるメカニズムに従って肝臓毒が分類されている。
【００２８】
アルコールの消費により、上気道及び消化管及び肝臓のヒトガン、胃、すい臓、肺、尿路及び乳房のガンの危険性が上昇する。数種のラインの証拠により、作用メカニズムが、エタノール及び／又はアルコール飲料の他の構成成分による遺伝毒薬(genotoxicant)の腫瘍化作用の増大であり得ることが示される。Driver, H. E.及びSwann, P. F., 1987, Anticancer Res. 7:309。
表２に、数種の重要な科学物質及びそれらの用途及び肝毒性を記載する。Pond, S. M.ら, 1982, West J. Med. 137:509。
【００２９】
0005073897.tif 000006
【００３０】
四塩化炭素は、有力な肝毒性の例であり、その毒性は、肝臓の混合機能オキシダーゼ酵素による毒性代謝物への親化合物の代謝変換に大きく依存する。毒性は、用量、付される動物の年齢、種及び性別に関連する。肝臓チトクロームＰ４５０を刺激することが知られている物質、例えばバルビルレート及びアルコールは、四塩化炭素の肝毒性をポテンテート(potentate)する。生成される肝損傷のメカニズムは、脂肪蓄積及び壊死を包含する。
四塩化炭素は、一連の反応において、Ｐ４５０システムにより代謝されて、タンパク質及びＤＮＡとの反応及び脂質過酸化により肝臓ダメージを生じるフリーラジカルとなる。
【００３１】
他の肝毒素としては、次のものが挙げられるが、これらに限定される訳ではない：ニトロ芳香族化合物、ニトロパラフィン、マッシュルーム、金属（例えば、アンチモン、ヒ素、鉛、ベリリウム、カドミウム、クロム、銅、リン及びタリウム）、毒性ナタネ油、ヘキサクロロベンゼン、タンニン酸、コカイン、アフラトキシン、農薬、ポリ塩化ビフェニル、塩化ビニル、ダイオキシン、フタル酸エステル及び塩化ベンジル。四塩化炭素と同様に、これらの肝毒素又は生体異物のいくつかは、タンパク質及びＤＮＡとの反応を引き起こし、最終的に肝臓壊死を引き起こすフリーラジカル及び有毒代謝物へと代謝される。
セクション５．１及び５．２において上述したように、本発明において、ＡＩＣＡ塩のみ又は酸化防止剤との組み合せを投与して、有毒代謝物及びフリーラジカルの形成を防止及び抑制する。より具体的には、本発明においてＡＩＣＡオロテートの使用により、薬剤誘導性肝毒性の予防及び抑制、肝細胞の再生及び工業的、環境的肝毒素の解毒がもたらされる。
【００３２】
５．４  ＡＩＣＡ塩の選択及び用量(dosage)
本発明により、アルコール、ある種の治療薬又は食品又は環境的毒素により誘導される組織損傷を抑制する、多くの異なる、アミノイミダゾールカルボキサミドの有機酸塩、例えば、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドオロテート（ＡＩＣＡオロテート）又は４−アミノ−５−イミダゾールカルボキサミドオロテート（ＡＩＣＡオロテート）又は１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−４−ピリミジンカルボン酸化合物と５−アミノ−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボキサミドとの組み合わせ（１：１）又はオロチン酸化合物と５（又は４）−アミノイミダゾール−４（又は５）−カルボキサミドとの組み合せ（１：１）；ＡＩＣＡと、脂肪酸、例えば乳酸、コハク酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、又は糖酸、例えばグルコン酸、ガラクトン酸等、特には、有機酸塩を形成するためのペンタ及びポリヒドロキシカルボン酸との塩；及び無機酸塩、例えば、本発明の方法に従った使用に適するＡＩＣＡの塩酸塩及び／又はリン酸塩を提供する。
【００３３】
５．５  用量及び配合
ＡＩＣＡ塩又は５−アミノ又は置換アミノ１，２，３−トリアゾールの塩を、アルコール、数種の薬剤及び食品又は環境的毒素により誘導される組織損傷の抑制のために哺乳類に投与するための医薬品へ配合することができる。
多くのＡＩＣＡ又はトリアゾール塩化合物は、薬学的に適合性の対イオンを有する有機酸塩、それらが単に水溶性である形態として提供され得る。薬学的に適合性の塩は、脂肪酸、例えば、乳酸、コハク酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸、又は糖酸、例えば、グルコン酸、ガラクトン酸等、特にはペンタ及びポリヒドロキシカルボン酸を含むがこれらに限定される訳ではない多くの酸、及び塩酸及びリン酸を含むがこれらに限定される訳ではない無機酸を用いて形成することができる。塩は、相当遊離塩基形である水性又は他のプロトン性(protonic)溶剤中においてより溶解性の傾向にある。
【００３４】
治療化合物又は医薬組成物は、静脈内、腹腔内、皮下的、筋肉内、くも膜下腔内、経口的、直腸的、局所的に、又はエアゾールにより投与することができる。  経口投与に適する配合物としては、希釈液、例えば、生理的食塩水、水又はＰＥＧ４００等に溶解した活性化合物の液体溶液；それぞれが所定量の活性物質を固体、粒状物又はゼラチンとして含むカプセル又はタブレット；適切な媒体中におけるサスペンション；及びエマルションが挙げられる。
非経口投与に適する配合物としては、バッファー、酸化防止剤及び保存剤を含む水性又は非水性の等張無菌溶液が挙げられる。配合物は、単位服用量又は複数回服用量のシール容器内のものであってもよい。
【００３５】
６．  実施例：オラザミドオロテートにより、肝臓についてのメトトレキセート及びエタノールの作用が変更される。
６．１  メトトレキセート
メトトレキセートは、テトラヒドロ葉酸レダクターゼを抑止することによりプリン合成を抑制する抗腫瘍性薬剤であり、進行性リウマチ様関節炎、ガン及びレトラクタブル乾癬の治療に使用される。Hall, Pら, 1991, Hepatology 14:906-910。メトトレキセート治療の不本意な副作用としては、脂肪肝、巣状壊死及び肝硬変が挙げられる。ラットモデルにおける脂肪肝の生成は、１００〜１２５μｇ／ｋｇ体重の範囲の用量での治療後に報告されている：通常は深刻な肝臓の炎症及び壊死をもたらす高い用量（２００〜５００μｇ／ｋｇ体重）により、低い用量で数週間から高い用量で２〜３日以内に動物の死をもたらす。低い用量モデルは、メトトレキセートでの十分に長い（６週）処理で、ヒトに観察される（組織学的）肝臓合併症のアレーを誘導することができる。
【００３６】
肝臓脂肪浸潤のメカニズムは、メトトレキセートがトリグリセリド合成を強化するが脂質代謝を低減させないと思われるので十分に理解されない。Arsaether Nら, 1988, Biochim. Biophys. Acta. 958:70-80。ミトコンドリア呼吸（状態ＩＩＩ）は、急性用量のメトトレキセートにより低減される。Amanoto Nら, 1989, Cell Biochem Funct. 7:129-134。しかしながら、呼吸鎖についての直接的作用は、観察されていない。これらの急性作用がいかに慢性低用量処理と関連するのかについては知られていない。メトトレキセートは、プリン合成及び最終的にタンパク質合成を抑制するので、この葉酸代謝拮抗薬での長期的処理は肝臓ミトコンドリア機能に悪影響し、十分な機能障害がもたらされて、肝臓脂肪、炎症、壊死及び肝硬変が生じるという可能性がある。
【００３７】
６週を越える低用量メトトレキセート処理により、数種の動物において巣状壊死が生じるので、細胞壊死が、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦの上昇合成を生じる炎症応答を刺激し得ることに注意することが重要である。次に、これらのサイトカインは、急性期炎症応答要素：シクロオキシゲナーゼ２（ｃｏｘ２）及びＩＬ−８の発現を刺激する。活性好中球及びマクロファージの連続的補充は、その後、更なる組織ダメージ及び壊死をもたらし（Zhang Dら, 1995, Biochem. J. 310:143-148）、長期的処理後の重大な肝臓ダメージの可能性を引き起こす。ミトコンドリア機能の低減は、低減されたエネルギー供給のために適切な修復工程を低減又は防止することにより炎症誘導性ダメージの生成を激化(exacerbate)し得る。
慢性エタノール消費により、脂肪肝、及び肝臓における炎症応答の生成がもたらされる。酵素機能におけるエタノール誘導性変化に次ぐ活性酸素種（ＲＯＳ）の生成は、炎症応答を開始する生化学的因子であるかもしれない。Ekstrom Gら, 1989, Biochem Pharmacol. 38:1313-1319。
【００３８】
６．２  方法：オラザミドオロテートの作用を、メトトレキセート又はエタノールのいずれかを与えたラットにおいて試験した。
６．２．１  動物飼育(care)
ＳＤラットを、Holtzman Laboratory Animals (Madison, WI)から得て、１２時間の明暗サイクル（７：３０に点灯）で２２℃に維持した動物飼育設備においてステンレス鋼メッシュボトムのカゴにおいて別々に飼育(house)した。体重増加及び組織質量は従属変数であったので、動物の体重を測定し、次いで、各グループが同一変化での同一体重にできるだけ近くなるように、次のグループに入れた：グループ１＝コントロール（Ｃ）；グループ２＝オロテート（Ｏ）；グループ３＝メトトレキセート（Ｘ）；グループ４＝メトトレキセート＋オロテート（ＸＯ）；グループ５＝エタノール（Ｅ）；グループ６＝エタノール＋オロテート（ＥＯ）。
【００３９】
全ての動物に、研究の初日に“コントロール”液体食品を与えた。Ｅグループが摂取した食品の量を毎日測定し、他の動物には、先の日にＥグループにより摂取された量の食品を毎日与えた。エタノール供給動物は、食事の摂取を制限する傾向にあるので、非エタノール供給動物は、通常、これらの条件下においてそれらの与えた食事を全て摂取した。これを行って、各グループ間における栄養及びカロリーの差が最小なものとすることを確実なものとした。エタノールは、第２日について３％エタノール（ｗ／ｖ）で開始し、第３日について４％、次いで、第４日から研究の最終まで５％で維持して液体食品を進行的に供給した。（５％エタノールは、それらの全カロリー摂取のおよそ３６％に等しい）。
Ｘ処理のために、１００μｇ／ｍｌ溶液を毎日調製し、十分なＸを適切な液体食品に添加して、１００μｇ／ｋｇ／日に等しい摂取とした。Ｏ処理のために、希釈剤ＮａＯＨ中におけるＯの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製し、十分なＯを適切な液体食品に添加して、１０ｍｇ／ｋｇ／日の摂取とした。
【００４０】
６．２．２  組織標本及び組織学
コロロホルム投与による致死後、肝臓を除去し、肝臓葉１つの０．５ｃｍ2×０．５ｃｍ厚さ部分をホルマリン中に置き、肝臓葉１つを用いて、ミトコンドリアを単離した。肝臓の残部を、はさみで細かく刻み、その後、１ｍＭのＤＥＴＡＰＡＣ及び０．１ｍＭのＢＨＴ（アッセイ手段の間のＴＢＡＲＳの人為的形成を防止するため）及びＴＢＡＲＳ及び炎症サイトカイン（測定される）を含むトリスバッファーＫＣｌ（Ｐｈ７．４）の全１０容量中においてホモゲナイズした。
ハリスのヘマトキシリン（Baxter Scientific Products）及びエオシン染色を、標準手段を用いてホルマリン固定サンプルについて行った。Luna LG: Manual of histological staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology, 3rd Ed. NY, McGraw-Hill, 1968。肝臓の各固定サンプル片（８μｍ）をガラススライドに集め、キシレンを用いて脱ろうし、かつ、段階的アルコールに通過させることにより再水和（re-hydrate）した。試験片を、ヘマトキシリンで染色し、エオシンで対比染色した（Ｈ＆Ｅ）。スライドを、その後、キシレン混和性マウンティング媒体で標本にし、カバーガラスをつけた。Ｈ＆Ｅ染色肝臓サンプルの明らかな組織壊死、脂肪肝及び炎症の程度を観察した。
【００４１】
６．２．３  ＲＯＳ生成のマーカー
マロンジアルデヒド及び他の過酸化生成物を、各サンプルにおいて、チオバルビツル酸反応生成物の量を測定することにより測定した。Andersen H Jら, 1993, Free Radical Biol. Med. 15:37-48。簡易に、１ｍｌのホモジネートを０．５ｍｌのＴＣＡと混合し、遠心分離して、変性タンパクをペレット化した。上清（０．５ｍｌ）を、その後、０．７％チオバルビツル酸（７％Ｈ2Ｏ中：酢酸、１：１）と混合し、３０分間ボイルした。冷却後、５３２ｎｍで、マロンジアルデヒド当量を与える１５３，０００ｍｏｌ-1のモル吸光係数を用いて読み取った。
【００４２】
６．２．４  炎症のマーカー
急性期炎症応答についての処理の作用を、ホモジネートの１６，０００×ｇ上清におけるＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２及びＩＬ−８の濃度を、ドット−ブロット手段により測定し、本質的に上述したようなデンシトメトリーにより定量化した。Ardies C Mら, 1996, Cancer Letters 103:209-218。抗体を、Genzyme and Sigmaから購入したが、これは、それらの抗体が、ラットサイトカイン及び急性期タンパク質と交差反応するからである。簡易に、各サンプルのタンパク質濃度を、記載されたようなクマシーブリリアントブルー色素を用いて３通り測定した。Brandford M M, 1975, Anal. Biochem. 72:248-254。サンプルを、その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍｌに希釈して、１０、３０及び９０μｇの各サンプルをニトロセルロース膜にスポットした。８０℃で１０分間の乾燥後、ブロットをＰＢＳ中において５％乾燥ミルクで６０分間ブロックし、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ又はＣＯＸ−２を認識する抗体で１２時間インキュベートした。洗浄及び再ブロック後、ブロットを、金（１０ｎｍ粒子）と結合(conjugate)する第２抗体を用いて６時間インキュベートした。ブロットを、その後、洗浄し、銀染色で発現させて、黒色スポットを生成させた（そこでは、すでに第１抗体が適切な抗原を認識している）。この技術により、１０ｎｇ程度の少ない抗原を可視化することができる。
【００４３】
６．２．５  ミトコンドリアの電子伝達系
ミトコンドリアを、本質的に記載されたように肝臓から単離した。Hakvoort, TDM, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4996-5000。簡易に、肝臓を、２２０ｍＭのマンニトール、２０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのコハク酸Ｎａ塩、２．５ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＰＭＳＦ及び１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中においてホモゲナイズし、ホモゲネートを１０００×ｇで遠心分離して、細胞破壊片を除去し、その後、上清を１２，０００×ｇで遠心分離して、ミトコンドリアをペレット化した。ペレットを、均質バッファー中における再懸濁により洗浄し、再び１２，０００×ｇで遠心分離した。単離したミトコンドリアを、１０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク濃度に再懸濁した。酸素摂取を、１０ｍＭのスクシネート、１ｍＭのチトクロームｃ及び０．５％のトリトンＸ−１００の存在下において測定した。これらの洗浄剤分裂(detergent-disrupted)状態下において、酸素摂取量は、ミトコンドリアタンパク質のｍｇあたりの電子伝達系の数にのみ依存する。
【００４４】
６．２．６  統計的分析
３タイプの毒素処理（Ｃ、Ｘ及びＥ）を２レベルの保護（なし及びＯ）で用いたので、変動の保護（３×２）２因子分析による処理（ＡＮＯＶＡ）を用いてデータを分析した。
【００４５】
６．３  結果
ＳＤラットを、栄養的に適切な液体食品中における１００μｇ／ｋｇ体重の用量でのメトトレキセートを用いて処理した。エタノール誘導性作用とメトトレキセートとのものを比較するために、エタノールを、ラットに、液体食品中において３６％カロリーの用量で与えた。オラザミドオロテートを食品に１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で添加して、オラザミドオロテートがメトトレキセート−又はエタノール−誘導性変化をもたらし得るかを測定した。全ての動物には、エタノール処理グループにより摂取された食品の量をペアフィードして、同様のカロリー及び栄養摂取を確実なものとしたが、これは、エタノールにより食品摂取が抑制されるからである。随意的により少なく消費する動物は、より少ない量食べるのが可能であり、なぜなら、これが、潜在的薬剤効果を示すからである。
【００４６】
６週間の処理経過後の食品摂取、体重、肝臓質量、腎臓質量及び副腎質量の変化を図１〜１１に表した。図１に表されているように、ＥＯ処理により、ほけの全てのものと比較して、食品摂取において有意な現象が生じたが、５週間後にＸグループは、食品摂取が低減し始めた。エタノールの存在下において、オラザミドオロテートは、エタノールのみの場合よりも更に食品摂取を低減させるように相互作用すると思われる。対照的に、Ｘ処理では、最後の２週のみにおいて食品摂取が低減しているが、Ｏ処理では、食品の消費が変更されているようにはみえない。６週間経過後、ＸＯグループのみが、体重増加における有意な減少を示した（図４）。Ｘは肝臓肥大をもたらし、Ｏは上昇を防止する傾向があると思われるが（図７）、エタノールは肝臓を有意に増大させ、Ｏは、Ｅ誘導性肝臓肥大に変化を与えない。腎臓についての効果はなかったが、例外としては、ＥＯ処理後に優位に腎臓が増大した（図９）。Ｅ及びＥＯにより副腎質量が有意に増大するので、いくらかのタイプのストレス応答が潜在的に示される。
【００４７】
肝臓サンプルは、ホルマリン中に固定され、スライド標本にされ、かつ、病理学者により試験され、Ｅ及びＥＯの両グループにおいて有意な脂肪浸潤が観察され、ＥＯ処理では、Ｅ処理の場合より低い（図１４）。研究が長期間行われた場合に、又は異なる用量が用いられた場合に、このパラメーターにおいてＯについて保護的作用がみられた。コントロール及びＸグループの肝臓において脂肪堆積を有意には上昇させない傾向がＯにみられた。オロテートが、エタノール処理ラットの肝臓において脂肪堆積を減少させるように思われる理由は知られていない。
チオバルビツル酸反応生成物（脂質過酸化の指標）を、肝臓ホモゲネートにおいて測定し、差は観察されず、進行中の過酸化反応がないことが示された（図１２）。化学的処理による毒性反応の主要細胞作用の１つは、脂質過酸化の上昇速度を含む、一連の細胞応答を開始するカルシウムの流入である。
【００４８】
肝臓ミトコンドリアにおける電子伝達系の数についての処理作用は、図１３に示す。Ｘにより、電子伝達系の数の有意な減少が誘導され、それは、Ｏの共投与により防止された。対照的に、Ｅについて同一のパラメータを低減する傾向がみられ、ＯについてＥ誘導性減少を強化する傾向がみられた。ＸがＤＮＡ合成を妨害するので、タンパク質合成の速度に最終的に影響がでると予測され得る。明らかに、ミトコンドリアは、タンパク質合成の変化に対して非常に感受性であり、このパラメーターにおける減少は、より明らかな病理学的徴候が観察される前に観察することができる。おそらく、６週間の処理後に観察される減少（及びＯによる明らかな減弱）は、長期間の処理後の他の測定において明らかであろう遅い進行性毒性反応における最初の段階である。
ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＴＮＦ及びＣＯＸ−２のレベルは、肝臓のサンプルにおいて測定し、使用した用量で処理作用の徴候は、これらのパラメーターのいずれについてもみられなかった。これらの負の結果は、病理学的試験において観察された炎症の欠如と一致する。
【００４９】
本発明は、実施例に記載された実施態様により範囲を制限されるものではなく、実施例は、本発明のある態様の説明的なものとして意図されており、機能的に等しい方法のいずれも本発明の範囲内にある。明らかに、本件明細書に示した及び記載したもの以外にも本発明に対する種々の変更が当該技術分野における当業者にとって先の記載から明らかであろう。そのような変更は、本発明の範囲内に入ることが意図される。
種々の文献を本件明細書において引用したが、これらの開示内容は本件明細書に含まれるものとする。
従って、先の記載から明らかのもののうち上記目的が効率的に達成されることが明らかであり、かつ、幾らかの変化が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく記載された上記方法及び構造においてなされるために、上記記載に含まれる及び図に示された全ての事項は、説明的なものであり、制限を意味するものではないと解釈されるべきである。
また、上記特許請求の範囲は、本件明細書に記載された一般的及び特定の特徴、及び言語上でそこに含まれるとされ得る本発明の範囲の陳述のすべてをカバーすることが意図されていると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  全体的又は平均で表される毎週の全食品摂取及び平均体重についてのエタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図２】  初期体重を示す図である。
【図３】  体重についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートでの６週間の処理の結果を示す図である。
【図４】  体重増加についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートでの６週間の処理の結果を示す図である。
【図５】  最終体重についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図６】  最終肝臓質量についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図７】  肝臓質量：体重比についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図８】  最終腎臓（右腎及び左腎）質量についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図９】  腎臓質量：体重比についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図１０】  最終副腎質量についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図１１】  副腎質量についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図１２】  肝臓中におけるＴＢＡＲＳについての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図１３】  スクシネート、チトクロムＣ及びTriton X100でインキュベートされた肝ミトコンドリアによる酸素消費についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図１４】  肝臓中における脂肪浸潤についての、エタノール、メトトレキセート及びオラザミドオロテートの相互作用を示す図である。
【図１】
0005073897.tif 000007
【図２】
0005073897.tif 000008
【図３】
0005073897.tif 000009
【図４】
0005073897.tif 000010
【図５】
0005073897.tif 000011
【図６】
0005073897.tif 000012
【図７】
0005073897.tif 000013
【図８】
0005073897.tif 000014
【図９】
0005073897.tif 000015
【図１０】
0005073897.tif 000016
【図１１】
0005073897.tif 000017
【図１２】
0005073897.tif 000018
【図１３】
0005073897.tif 000019
【図１４】
0005073897.tif 000020