(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）発現される所望のコード配列を挿入するためのエンドヌクレアーゼ制限部位の上流のＲＢ４７結合部位ヌクレオチド配列；
ｂ）該ＲＢ４７結合部位ヌクレオチド配列の上流に、操作できるように連結されかつ位置した、プロモーター配列；
ｃ）挿入された所望のコード配列：及び
ｄ）該ＲＢ４７結合部位と結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とする、所望の分子を発現するための発現カセットであって、
ここで、ａ）からｄ）の配列が操作できるように連結されている、発現カセット。
【請求項２】
前記ＲＢ４７結合部位ヌクレオチド配列に結合する前記ポリペプチドが、図１のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基４０２に示されるタンパク質に対して少なくとも９５％の相同性を有する、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記ＲＢ４７結合部位ヌクレオチド配列に結合する前記ポリペプチドが、図１のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基４０２に示されるタンパク質に対して少なくとも９８％の相同性を有する、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項４】
前記プロモーター配列が、ｐｓｂＡ遺伝子に由来する、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記プロモーター配列が、図３のヌクレオチド−２５１位〜−９２位に示される配列を有する、請求項４に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記コード配列が、前記ｐｓｂＡ遺伝子に対して異種である、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記カセットが、プラスミド又はウイルスを含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項８】
更にＲＢ６０をコードするヌクレオチド配列を含み、かつこれに操作できるように連結されている、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項９】
ＲＢ６０をコードする前記ヌクレオチド配列が、図２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記ＲＢ４７結合ポリペプチドが、以下：
ａ）ＲＢ４７であって、該ＲＢ４７ポリペプチドは図１のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基４０２に示されるアミノ酸配列を有する、ＲＢ４７：
ｂ）ＲＢ４７前駆体であって、該ＲＢ４７前駆体ポリペプチドは図１のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６２３に示されるアミノ酸配列を有する、ＲＢ４７前駆体：
ｃ）ヒスチジン修飾されたＲＢ４７であって、該ヒスチジン修飾されたＲＢ４７ポリペプチドは図５のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基４２４に示されるアミノ酸配列を有する、ヒスチジン修飾されたＲＢ４７、
からなる群から選択される、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記ＲＢ４７結合部位ヌクレオチド配列が、図３のヌクレオチド−９１位〜−１位に示される配列を有する、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記プロモーターが真核生物プロモーターである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記プロモーターが原核生物プロモーターである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記プロモーターが、細菌プロモーター、バクテリオファージプロモーター、Ｔ３プロモーター、または、Ｔ７プロモーターである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１６】
前記プロモーターが、構成性プロモーター、または、誘導性プロモーターである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１７】
さらに、複製起点を含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１８】
さらに、選択マーカーを含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１９】
挿入された所望のコード配列が、ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項１９に記載の発現カセット。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の発現カセットを用いて安定に形質転換された細胞。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の発現カセットを用いて形質転換された細胞を含む、発現システム。
【請求項２３】
請求項１に記載の発現カセットを用いて形質転換された葉緑体を含む、発現システム。
【請求項２４】
前記細胞が、原核細胞である、請求項２２に記載の発現システム。
【請求項２５】
前記細胞が、真核細胞である、請求項２２に記載の発現システム。
【請求項２６】
前記細胞が植物細胞または藻類細胞である、請求項２５に記載の発現システム。
【請求項２７】
前記細胞が、ＲＢ４７またはＲＢ６０を内因性に発現する、請求項２６に記載の発現システム。
【請求項２８】
前記細胞が、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ細胞である、請求項２７に記載の発現システム。
【請求項２９】
所望のコード配列を発現する方法であって、以下：
ａ）請求項１に記載の発現カセットを形成する工程；および、
ｂ）細胞中に該発現カセットを導入する工程；
を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記細胞が植物細胞、または藻類細胞である、方法。
【請求項３１】
前記発現カセットが前記細胞中に形質転換される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、ＲＢ４７またはＲＢ６０を内因性に発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
さらに、プロモーター誘導分子を用いて発現を誘導する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
細胞内における所望のコード配列からの組換え分子の調節された産生のための方法であって、ここで、該細胞は、請求項１に記載の発現カセットを含み、ここで、該コード配列の発現は、ＲＢ４７結合部位へのＲＢ４７の結合により活性化され、それによって、該組換え分子が産生される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【化１】
0004997267.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
【化２】
0004997267.tif 000003
【０００３】
【化３】
0004997267.tif 000004
【０００４】
【化４】
0004997267.tif 000005
【０００５】
【化５】
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【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第5,234,834号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する。
【化６】
0004997267.tif 000007
【０００８】
【化７】
0004997267.tif 000008
【０００９】
【化８】
0004997267.tif 000009
【００１０】
【化９】
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【００１１】
【化１０】
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【００１２】
【化１１】
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【００１３】
【化１２】
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【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ  ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ  ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ  ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図４】図４は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含むＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入のための領域、ＲＢ４７コード領域、ＲＢ６０コード領域、並びに転写終結点（ＴＳ）を含み複製起点及び選択マーカーが隣接している３’側フランキング領域を含む、発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、実施例４Ａに更に説明されている。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図６】図６は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、ＲＢ４７コード領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｅに更に説明されている。
【図７】図７は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇに更に説明されている。
【図８】図８は、実施例４Ｇ１）において更に説明されている本発明の構築物によって発現された破傷風菌毒素の１本鎖抗体のウェスタンブロットである。
【図９】図９は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、翻訳終止コドンＴＡＡを含んでいる細菌のルシフェラーゼＡ及びＢタンパク質のコード配列の挿入のための領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１０】図１０は、葉緑体中で発現された細菌性ルシフェラーゼタンパク質の蓄積を示しており、実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１１】図１１は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、二量体ＩｇＡ（ｄＩｇＡ）の異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ３）に更に説明されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
【化１３】
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【化１４】
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【００１６】
【化１５】
0004997267.tif 000016
【００１７】
【化１６】
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【００１８】
【化１７】
0004997267.tif 000018
【００１９】
【化１８】
0004997267.tif 000019
【００２０】
【化１９】
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【００２１】
【化２０】
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【００２２】
【化２１】
0004997267.tif 000022
【００２３】
【化２２】
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【００２４】
【化２３】
0004997267.tif 000024
【００２５】
【化２４】
0004997267.tif 000025
【００２６】
【化２５】
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【００２７】
【化２６】
0004997267.tif 000027
【００２８】
【化２７】
0004997267.tif 000028
【００２９】
【化２８】
0004997267.tif 000029
【００３０】
【化２９】
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【００３１】
【化３０】
0004997267.tif 000031
【００３２】
【化３１】
0004997267.tif 000032
【００３３】
【化３２】
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【００３４】
【化３３】
0004997267.tif 000034
【００３５】
【化３４】
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【００３６】
【化３５】
0004997267.tif 000036
【００３７】
【化３６】
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【００３８】
【化３７】
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【００３９】
【化３８】
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【００４０】
【化３９】
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【００４１】
【化４０】
0004997267.tif 000041
【００４２】
【化４１】
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【００４３】
【化４２】
0004997267.tif 000043
【００４４】
【化４３】
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【００４５】
【化４４】
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【００４６】
【化４５】
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【００４７】
【化４６】
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【００４８】
【化４７】
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【００４９】
【化４８】
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【００５０】
【化４９】
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【００５１】
【化５０】
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【実施例】
【００５２】
【化５１】
0004997267.tif 000052
【００５３】
【化５２】
0004997267.tif 000053
【００５４】
【化５３】
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【００５５】
【化５４】
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【００５６】
【化５５】
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【００５７】
【化５６】
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【００５８】
【化５７】
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【００５９】
【化５８】
0004997267.tif 000059
【００６０】
【化５９】
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【００６１】
【化６０】
0004997267.tif 000061
【００６２】
【化６１】
0004997267.tif 000062
【００６３】
【化６２】
0004997267.tif 000063
【００６４】
【化６３】
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【００６５】
【化６４】
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【００６６】
【化６５】
0004997267.tif 000066
【００６７】
【化６６】
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【００６８】
【化６７】
0004997267.tif 000068
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
0004997267.tif 000081
【図７】
0004997267.tif 000082
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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