(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、没食子酸カテキン、没食子酸エピカテキン、没食子酸ガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン、ルチン、ケルセチン及びアントシアニンからなる群から選ばれる１種以上のポリフェノール、トレハロース及び電解質からなり、必要に応じて浸透圧剤をさらに含み、ポリフェノールの濃度が０．０１〜３．５ｍＭの範囲にあり、トレハロースの濃度が５０〜２４０ｍＭの範囲にあり、前記電解質が、有機酸のナトリウム塩又はカリウム塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムからなる群から選ばれる１以上であることを特徴とする細胞・組織保存液。
【請求項２】
ポリフェノールがカテキンである請求項１に記載の細胞・組織保存液。
【請求項３】
トレハロースがα，α−トレハロースである請求項１又は２に記載の細胞・組織保存液。
【請求項４】
浸透圧剤が、ヒドロキシエチル澱粉及び／又はデキストラン澱粉である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞・組織保存液。
【請求項５】
ヒドロキシエチル澱粉が、０．４〜０．８の置換度及び２０００００〜９０００００の平均分子量を有する請求項４に記載の細胞・組織保存液。
【請求項６】
有機酸が、グルコン酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、β−ヒドロキシ酪酸及びクエン酸から選ばれる１以上である請求項１〜５のいずれかに記載の細胞・組織保存液。
【請求項７】
さらに、ＡＴＰ、プロスタグランジン及び抗生物質からなる群から選ばれる１以上を含む請求項１〜６のいずれかに記載の細胞・組織保存液。
【請求項８】
浸透圧が２７０〜４５０Ｏｓｍ／ｌの範囲にある請求項１〜７のいずれかに記載の細胞・組織保存液。
【請求項９】
ｐＨが７〜８の範囲にある請求項１〜８のいずれかに記載の細胞・組織保存液。
【請求項１０】
次の組成からなり、ポリフェノールが、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、没食子酸カテキン、没食子酸エピカテキン、没食子酸ガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン、ルチン、ケルセチン及びアントシアニンからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする細胞・組織保存液。
ポリフェノール                                        ０．０１〜２０００ｍＭ
トレハロース                                                ５０〜２４０ｍＭ
Ｎａ＋                                                      １０〜１４０ｍＭ
Ｋ＋                                                          ４〜１４０ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４２−                                  ４〜１４０ｍＭ
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、有機酸又は有機酸アニオン    １５〜１５０ｍＭ
ヒドロキシエチル澱粉                                          １〜８０ｇ／ｌ
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞を保存し、また臓器、肢体、皮膚その他の組織を保存するための液体に属する。
背景技術
臓器を移植する場合、臓器提供者から摘出した移植臓器を手術時まで保存する。また、不慮の事故により切断された指、腕等の肢体を吻合する場合、肢体を手術時まで保存する。このように、生化学の分野あるいは医学の分野においては、細胞、及び臓器・肢体・皮膚等の組織を保存するケースがある。細胞及び組織を保存する際には、その構造及び機能が損なわれないように、細胞・組織保存液に浸漬させた状態で保存する。従来の細胞・組織保存液としては、例えばユーロ−コリンズ液（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ液）やＵＷ液（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ液）がある。
ユーロ−コリンズ液は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸水素ナトリウム及びブドウ糖を含有する溶液である。この保存液は、機能維持力の高い腎臓には利用できるものの、肺等の臓器については保護作用が十分ではなく、また機能維持期間が短い。一方、ＵＷ液は、不浸透剤としてラクトビオン酸ナトリウムとラフィノース、膠質浸透圧剤としてヒドロキシエチル澱粉を含有し、さらにアデノシンやインスリンを含有する溶液である。この保存液では、保護作用が増し、機能維持期間も長くなるが、製剤学的に不安定である。
これらの他に、従来の保存液として、特開平６−４０８０１号に開示された保存液（以下、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液）がある。この保存液では、ユーロ−コリンズ液よりも細胞及び組織に対する保護作用が優れていて、機能維持期間も長く、しかも製剤学的に安定している。
本発明の課題は、従来の保存液よりも保護作用に優れていて、構造及び機能を長期間維持することができる細胞・組織保存液を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、鋭意検討した結果、ポリフェノールを有効成分とする本発明の細胞・組織保存液を完成することができた。ポリフェノールは抗酸化作用をもつため、本発明の保存液は細胞及び組織に対して高い保護作用を備える。よって、本発明の保存液によると、細胞及び組織の構造及び機能を長期間維持することが可能である。
本発明の保存液において、ポリフェノールとしては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、ルチン、クロロゲン、ケルセチン、アントシアニン、フラボノイドなどがある。これらの化合物は、お茶、そば、コーヒー、タマネギ、むらさき芋などの植物より抽出され得る。また、これらの化合物は化学合成されても良い。好ましいポリフェノールの濃度は、０．０１ｍＭ〜２０００ｍＭ、更に好ましくは０．１ｍＭ〜２００ｍＭ、特に好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭである。
細胞及び組織に対する保護作用をさらに高めるために、本発明の保存液にトレハロースを含有させても良い。トレハロースには、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース及びβ，β−トレハロースの３種が存在するが、いずれを用いても良い。好ましくは天然に存在するα，α−トレハロースを用いる。好ましいトレハロースの濃度は、５０ｍＭ〜２４０ｍＭである。
本発明の保存液では、細胞及び組織が保存中に膨張又は収縮するのを防ぐために、浸透圧が２７０〜４５０Ｏｓｍ／ｌの範囲にあると好ましい。また、細胞の酸性分解を防止するためには、ｐＨが７〜８の範囲にあるのが望ましい。本発明の保存液の浸透圧及びｐＨをこれらの範囲にするには、適当な浸透圧剤や電解質を加えると良い。
浸透圧剤としては、ヒドロキシエチル澱粉、デキストラン澱粉等の膠質浸透圧剤がある。ヒドロキシエチル澱粉は、置換度が０．４〜０．８の範囲のもので、平均分子量２０００００〜９０００００のものが好ましく、さらに好ましくは平均分子量３５００００〜８０００００のものである。電解質としては、有機酸のナトリウム塩若しくはカリウム塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムを例示することができる。また有機酸としては、グルコン酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、β−ヒドロキシ酪酸及びクエン酸がある。
本発明の保存液の好ましい組成は次の通りである。
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本発明の保存液のより好ましい組成は次の通りである。
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これら以外にも、例えばＭｇ＋＋及びＣａ＋＋を１〜１０ｍＭずつ含有させても良い。さらに、他の添加物、例えばＡＴＰ等の細胞賦活剤、プロスタグランジン等の血管拡張剤、抗生物質を加えることができる。但し、製剤学的に安定させるため、インスリンのような不安定な化合物は添加されないのが望ましい。また、本発明の保存液の使用方法については、特に限定はないが、例えば、細胞又は組織を本発明の保存液に浸漬して、そのまま低温保存又は凍結保存すると良い。
発明を実施するための最良の形態
−実施例１−
約５０℃の蒸留水８００ｍｌに、お茶から抽出されたカテキン１ｇ（３．４５ｍｍｏｌ）、α、α−トレハロース４１ｇ（１２０ｍｍｏｌ）、ヒドロキシエチル澱粉（平均分子量４２９０００、置換度０．５５）３０ｇ、グルコン酸ナトリウム２１．８１ｇ（１００ｍｍｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．０８５ｇ（６．５ｍｍｏｌ）、及びリン酸水素二カリウム３．２２２ｇ（１８．５ｍｍｏｌ）を溶解した後、蒸留水を加えて全量を１０００ｍｌとした。これを直ちに濾過し、ガラス瓶に入れて密栓した後、蒸気滅菌することにより、浸透圧３７０ｍＯｓｍ／ｌ、ｐＨ７．４０の保存液を得た。
−試験例１−
実施例１で得た保存液（実施例１液）の臓器保護作用について、下記のラット肺体外灌流モデルにより調べた。また、比較として、カテキンを添加しない以外は実施例１と同じように調製された保存液（ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液）、及びユーロ−コリンズ液についても、同様に調べた。本試験は、３０匹の雄性ルイスラット（体重３００ｇ〜３５０ｇ）を無作為に１０匹ずつ３群（Ｉ群、ＩＩ群、ＩＩＩ群）に分けて行われ、保存液としてＩ群にはＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液を、ＩＩ群には実施例１液を、ＩＩＩ群にはユーロ−コリンズ液をそれぞれ使用した。
まず、３ｍｌのエンフルラン（大日本製薬株式会社販売、商品名：エトレン（登録商標））が入った集気瓶にラットを入れて、ラットに吸入麻酔をかけ、その後、ネンブタール１ｍｌを腹腔内に注入した。そして、気管を切開してカニューレを挿入し、ベンチレーターと接続して換気した。開腹及び開胸の後、ヘパリン０．３ｍｌを腹腔大静脈に注入した。次に、別のカニューレを右心室から肺動脈に穿刺挿入して、エアーを抜きながら内套を除去し、さらに三方活栓を介してカニューレにチューブを接続してエアーを抜いた。下大静脈及び大動脈を切断し、左心耳及び右心室を切開した。その後、保存液１ｍｌ（プロスタグランジンＥ１を５μｇ含む）をチューブよりゆっくりフラッシュした。さらに、保存液５０ｍｌ（プロスタグランジンＥ１を５μｇ含む）を２０ｃｍの落差を利用してフラッシュした。続いて、気管及び右心室に挿入した各カニューレを牽引しながら心肺ブロックを摘出した。そして、摘出された心肺ブロックを保存液が入ったシャーレに浸漬し、４℃で保存した。
１５時間保存後、心肺ブロックから右肺を除去し、残った心左肺を潅流回路に接続した。潅流回路は、温度３７℃、湿度１００％の箱内に設置されており、またこの回路にはラットの新鮮な心肺ブロックも接続させている。潅流液としては、３匹のラット（ヘパリン１０００Ｕ／匹投与）から得られた新鮮な混合静脈血３０ｍｌを用い、潅流速度４ｍｌ／分の条件下で６０分間潅流した。潅流中、１５時間保存後の心左肺については、１００％の酸素ガスによって、一回換気量３ｍｌ、換気回数６０回／分の条件下で換気し、一方、新鮮な心肺ブロックについては、４％の酸素、８％の二酸化炭素及び８８％の窒素からなる混合ガスによって、一回換気量３ｍｌ、換気回数６０回／分の条件下で換気した。これにより潅流液の酸素濃度及び二酸化炭素濃度をほぼ一定とした。また、肺水腫による浸出液がチューブから漏れる場合には、潅流を中止した。
潅流開始後１０分経過時、６０分経過時における心左肺のシャント率、平均肺動脈圧及び最高気道内圧を調べた。さらに、６０分間潅流後あるいは潅流中止後の心左肺の湿乾重量比を求め、これから肺水腫の発生の程度を調べた。表１に結果を示す。
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表１に見られるように、いずれの項目についても、ＩＩ群、Ｉ群、ＩＩＩ群の順に有意に低かった。即ち、保存液の臓器保護作用は、実施例１液、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液、ユーロ−コリンズ液の順に高かった。この結果は、ポリフェノールであるカテキンが実施例１液には含まれているのに対してＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液及びユーロ−コリンズ液には含まれていないことから、ポリフェノールが高い臓器保護作用を有するということを示す。また、トレハロースが実施例１液及びＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液には含まれているのに対してユーロ−コリンズ液には含まれていないことから、トレハロースも臓器保護作用を有するということを示す。以上より、ポリフェノールを含有する保存液は高い臓器保護作用を備え、ポリフェノール及びトレハロースを含有する保存液はより高い臓器保護作用を備えることが明らかとなった。
−実施例２−
ＣｅｌｌｖａｔｉｏｎＴＭ（フナコシ株式会社製）という市販の細胞凍結保存液（Ｃｅｌｌｖａｔｉｏｎ液）３０ｍｌに、お茶から抽出されたカテキン０．２ｇ（０．６９ｍｍｏｌ）を溶解した後、Ｃｅｌｌｖａｔｉｏｎ液を加えて全量を５００ｍｌとした。これにより、ポリフェノールを含む凍結用保存液を得た。
−試験例２−
実施例２で得た保存液（実施例２液）の凍結保存における細胞保護作用について、下記のようにして調べた。また、比較として、Ｃｅｌｌｖａｔｉｏｎ液の細胞保護作用についても、同様に調べた。
まず、ＭＤＣＫ（大日本製薬株式会社製、原ＡＴＴＣ株番号ＣＣＬ−３４、生存率９５％）という市販のセルタイプの犬腎臓細胞を用意し、これを６００〜８００ｒｐｍで１０分間遠心した。続いて、上清を取り出し、１×１０６〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように上清に保存液を加えて静かに懸濁した。この懸濁液を１０個のプラスチック製バイアルに１．５ｍｌずつ分注し、各バイアルを封じて２５分間室温で放置した。その後、各バイアルを断熱容器に入れ、−７０℃のフリーザーに２時間放置した。次に、各バイアルを液体窒素の蒸気相に移して２４時間放置した後、液体窒素の液相に移し、このまま凍結保存した。３０日後、各バイアルを取り出し、３７℃の水浴中で速やかに融解した。融解後に、各バイアルを７０％のエタノールで拭いて、７０分間室温で放置した。そして、各バイアル内の細胞を計数し、細胞生存率を求めた。
その結果、Ｃｅｌｌｖａｔｉｏｎ液で凍結保存した細胞の生存率が平均８３％であるのに対して、実施例２液で凍結保存した細胞の生存率は平均９０％となり、実施例２液における生存率の方が有意に高かった。これにより、ポリフェノールを含有する保存液は高い細胞保護作用を備えるということが判った。
−実施例３−
臓器の虚血再灌流に伴う酸化ストレスに対するポリフェノールの保護効果を、肺胞上皮細胞を用いた細胞培養モデルで検討した。実験方法及び結果を以下の細胞培養実験１−３に示す。
細胞培養実験１
（１・１）この実験は、肺胞上皮細胞から酸化ストレスにより産生されるＩＬ−８に対する緑茶ポリフェノールの抑制効果を検討するものである。
（１・２）使用した細胞：肺胞上皮細胞Ａ５４９株
（１・３）緑茶ポリフェノール（ファーマフーズ株式会社製）組成
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（１・４）方法
Ａ５４９細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４−ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈで培養し、１６時間後、緑茶ポリフェノール含有培地（緑茶ポリフェノール濃度：０−０．４ｍＭ）に培地交換し２時間培養を行った。その後Ｈ２Ｏ２（最終濃度４００μＭ）及び炎症性サイトカインＴＮＦ−α（最終濃度２０ｎＭ）にて刺激し、１，３，６時間後に培地を採取し、ＥＬＩＳＡ法（ＥＬＩＳＡ吸光度測定器：ＮＪ−２００１  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−８  Ｓｅｔ）を用いて培地中ＩＬ−８濃度を測定した。
（１・５）結果
Ｈ２Ｏ２およびＴＮＦ−α刺激によってＡ５４９細胞から産生されるＩＬ−８は増大し、この産生増大は緑茶ポリフェノールによって用量依存的に抑制された（表２及び表３）。これらの結果より、緑茶ポリフェノールは酸化ストレスに伴う肺胞上皮細胞からのＩＬ−８産生を抑制することが明らかになった。
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細胞培養実験２
（２・１）この実験は、ＩＬ−８産生の制御に重要な役割を果たしている２つのｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）、すなわちｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）及びｐ３８の活性化（リン酸化）に対する緑茶ポリフェノールの効果を検討するものである。
（２・２）使用した細胞：細胞培養実験１と同じ
（２・３）緑茶ポリフェノール組成：細胞培養実験１と同じ
（２・４）方法
Ａ５４９細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で６０ｍｍ  ｄｉｓｈで培養し、２４時間後、緑茶ポリフェノール含有培地（緑茶ポリフェノール濃度：０．４ｍＭ）に培地交換して２時間培養。その後、Ｈ２Ｏ２（最終濃度４００μＭ）にて刺激し、３０分後（ｐ３８  ＭＡＰＫ）および６０分後（ＪＮＫ）にＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによるタンパクの定量を行い、ｐ３８とＪＮＫの活性化（リン酸化）の程度を検討した。なお、予備実験ではＨ２Ｏ２による刺激の後、ｐ３８  ＭＡＰＫは３０分後、ＪＮＫは６０分後に最も強く活性化することを確認した。
（２・５）結果
ＪＮＫ，ｐ３８  ＭＡＰＫは緑茶ポリフェノールによって表４に示すように活性化が抑制された。
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これらの結果から、緑茶ポリフェノールによるＩＬ−８産生抑制には、ｐ３８およびＪＮＫのリン酸化抑制が関与していると考えられた。
細胞培養実験３
（３・１）この実験は、緑茶ポリフェノールの肺胞上皮細胞に対する安全性を確認するものである。
（３・２）使用した細胞：細胞培養実験１と同じ
（３・３）緑茶ポリフェノール組成：細胞培養実験１と同じ
（３・４）方法
Ａ５４９細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で９６−ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈで培養し、２４時間後、緑茶ポリフェノール含有培地（緑茶ポリフェノール濃度：０−０．４ｍＭ）に培地交換して８時間培養を行った。その後、トリパンブルー染色を行い、総細胞数と生存細胞数を計測し、細胞生存率を計算した。
（３・５）結果
表５に示すように緑茶ポリフェノールは、０−０．４ｍＭの濃度でＡ５４９細胞の生存率に影響を与えなかった。この結果より、緑茶ポリフェノールの肺胞上皮細胞に対する安全性が確認された。
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産業上の利用可能性
本発明の保存液は、細胞及び臓器・肢体・皮膚等の組織に対して高い保護作用を示す。よって、本発明の保存液によると、細胞及び組織の構造及び機能を長期間維持することが可能である。