(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）、柴胡（BUPLEURI RADIX）、黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）、五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）および赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）を含む原料をエタノールを含む溶剤で抽出してなり、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３である、漢方生薬エキスを有効成分とする、免疫細胞のインターフェロン産生を誘導するための組成物。
【請求項２】
甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
漢方生薬エキスを有効成分とする免疫細胞のインターフェロン産生を誘導するための組成物の作製方法であって、
有効量の甘草、柴胡、黄岑、五味子および赤芍を含み、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３である漢方生薬を準備する工程、
前記漢方生薬をエタノールを含む溶剤で抽出して抽出液を得る工程、
前記抽出液を濃縮して濃縮生成物を得る工程、
前記濃縮生成物を乾燥させる工程、ならびに、
賦形剤を加えて所定の剤型に調製する工程、
を含む作製方法。
【請求項４】
甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である、請求項３記載の作製方法。
【請求項５】
前記溶剤には濃度０．１〜９５％のエタノールが含まれる、請求項３記載の作製方法。
【請求項６】
前記溶剤と前記漢方生薬組成物の重量比が６：１〜１０：１である、請求項３記載の作製方法。
【請求項７】
前記濃縮生成物の固形分が１０〜３０％である、請求項３記載の作製方法。
【請求項８】
前記濃縮生成物を真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥または流動床乾燥により乾燥させる、請求項３記載の作製方法。
【請求項９】
前記賦形剤にはデンプン、麦芽糖、乳糖、ショ糖、マンニトール、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースまたはタルクが含まれる、請求項３記載の作製方法。
【請求項１０】
前記所定の剤型にはカプセル剤、錠剤、散剤または液剤が含まれる、請求項３記載の作製方法。
【請求項１１】
有効量の甘草、柴胡、黄岑、五味子および赤芍を含む原料をエタノールを含む溶剤で抽出してなり、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３である、漢方生薬エキスを有効成分とするＴｏｌｌ様受容体を活性化するための組成物。
【請求項１２】
Ｔｏｌｌ様受容体２、Ｔｏｌｌ様受容体４およびＴｏｌｌ様受容体７を活性化する、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
漢方生薬エキスを有効成分とするＴｏｌｌ様受容体を活性化するための組成物の作製方法であって、
有効量の甘草、柴胡、黄岑、五味子および赤芍を含み、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３である漢方生薬を準備する工程、
前記漢方生薬をエタノールを含む溶剤で抽出して抽出液を得る工程、
前記抽出液を濃縮して濃縮生成物を得る工程、
前記濃縮生成物を乾燥させる工程、ならびに、
賦形剤を加えて所定の剤型に調製する工程、
を含む作製方法。
【請求項１５】
甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である、請求項１４記載の作製方法。
【請求項１６】
前記溶剤には濃度０．１〜９５％のエタノールが含まれる、請求項１４記載の作製方法。
【請求項１７】
前記溶剤と前記漢方生薬組成物の重量比が６：１〜１０：１である、請求項１４記載の作製方法。
【請求項１８】
前記濃縮生成物の固形分が１０〜３０％である、請求項１４記載の作製方法。
【請求項１９】
前記濃縮生成物を真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥または流動床乾燥により乾燥させる、請求項１４記載の作製方法。
【請求項２０】
前記賦形剤にはデンプン、麦芽糖、乳糖、ショ糖、マンニトール、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースまたはタルクが含まれる、請求項１４記載の作製方法。
【請求項２１】
前記所定の剤型にはカプセル剤、錠剤、散剤または液剤が含まれる、請求項１４記載の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は漢方生薬エキスに関し、特に免疫細胞のインターフェロン産生を誘導し、かつＴｏｌｌ様受容体を活性化できる漢方生薬エキスおよびその作製方法に関するものである。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照することによってその全体が組み込まれる２００８年５月８日出願の台湾特許出願第９７１１６９７３号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
インターフェロン（interferon, ＩＦＮ）は最初に発見されたサイトカインであり、そのウィルスの複製を“干渉”する能力によってそのように命名された。インターフェロンは１９５７年にイギリスにおいて２名の研究者、エリック・アイザックス（Alick Isaacs）とジーンリンデンマン（Jean Lindenmann）によって発見された。細胞はウィルスに感染すると、直ちにインターフェロンを作り出してウィルスに抵抗すると同時に、周囲の正常な細胞に警報を発し、警戒を高めることによってウィルスの進入を防ぐ。インターフェロンは大きくＴｙｐｅＩおよびＴｙｐｅＩＩに分けられる。ＴｙｐｅＩのインターフェロンにはインターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−ω、インターフェロン−τがあり、インターフェロン−αおよびインターフェロン−βは大部分の細胞に発現する。またＴｙｐｅＩＩのインターフェロンにはインターフェロン−γがあり、これは一部の免疫細胞、例えばナチュラルキラー細胞（natural killer cell, ＮＫ ｃｅｌｌ）、ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（ＴＨ１）リンパ球およびＣＤ８＋細胞障害性（cytotoxic）Ｔリンパ球においてのみ発現する。
【０００４】
ウィルスに感染すると、ＴｙｐｅＩのインターフェロンの産生が速やかに誘導され、引き続いてそれが標的細胞上のＴｙｐｅＩインターフェロン受容体と結合し、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル経路を作動して、インターフェロン誘導遺伝子（IFN-stimulated genes, ＩＳＧｓ）の発現を誘導する。インターフェロン誘導遺伝子のタンパク質生成物は、インターフェロンがウィルスに対抗する際の最主要戦略となるもので、現時点で５００種を超えるインターフェロン誘導遺伝子タンパク質が同定されているが、これら分子の関与する範囲は非常に幅広く、抗ウィルス（anti-virus）から、アポトーシス（apoptosis）、タンパク質分解（protein degradation）、炎症性細胞応答（inflammatory cell response）、脂質代謝（lipid metabolism）に至るまで多様な機能をカバーする。最もよく知られているインターフェロン誘導遺伝子タンパク質としては、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase acting on RNA, ＡＤＡＲ）、２’,５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ（2’,5’-oligo adenylate synthetase, ＯＡＳ）、ＲＮａｓｅ ＬおよびＭｘタンパクがある。ＰＫＲは真核生物開始因子２２（eukaryotic initiation factor 2, ｅＩＦ２）を抑制することによりウィルスタンパクの合成を阻害し、ＡＤＡＲはウィルスのＲＮＡ編集（RNA editing）を抑制し、ＯＡＳおよびＲＮａｓｅ ＬはウィルスＲＮＡを分解し、Ｍｘタンパクはウィルス複製を抑制することができる。
【０００５】
ＴｙｐｅＩのインターフェロンは、ウィルスに直接対抗できるのみならず、免疫調節（immunomodulatory）にも関与し、自然および獲得免疫反応において重要な役割を担う。例えば、ＩＬ−１５を産生してナチュラルキラー細胞の生存および増殖を促す他、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０分子の発現を刺激して、樹状細胞（dendritic cell）の成熟化を促進することもできる。さらにＴｙｐｅＩのインターフェロンは、形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid dendritic cell, ｐＤＣ）の分化を誘導して成熟した抗原提示細胞（antigen presenting cell）とさせることもできる。獲得免疫に関しては、ＴｙｐｅＩのインターフェロンは、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球の活性化、ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（ＴＨ１）リンパ球およびＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球の生存、Ｂリンパ球の分化と増殖において重要な役割を果たす。
【０００６】
このようにＴｙｐｅＩのインターフェロンは抗ウィルス、細胞増殖の調節（regulators of cell growth）および免疫調節の能力を備えることから、すでに臨床治療に応用されている。米、英、日、独などをはじめとする先進国にて認可されているその適応症には、（１）ウィルスにより引き起こされる疾病、例えば慢性Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎、尖圭コンジローマ、エイズ患者に発症の多いカポジ肉腫（Kaposi's sarcoma）など、（２）血液疾患、例えば有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、低悪性度非ホジキンリンパ腫など、（３）その他の腫瘍、例えばメラノーマ（Melanoma）、腎細胞癌、基底細胞癌などがある。
【０００７】
インターフェロンの産生は免疫系の伝達係であるＴｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor, ＴＬＲ）の活性化によって誘導されることが、現在すでに研究により分かっている。Ｔｏｌｌは１９８８年頃にショウジョウバエの体内で発見され、後に哺乳動物においてもＴｏｌｌに極めて類似する受容体が発見された。これがＴｏｌｌ様受容体と称されるものである。外来の異物が侵入してくると、Ｔｏｌｌ様受容体は、病原体の病原体関連分子パターン（pathogen-associated molecular patterns, ＰＡＭＰｓ）を識別することにより、シグナル伝達経路を介してサイトカイン（ＴｙｐｅＩインターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、インターフェロン−α）、化学走化性物質、ＭＨＣおよび共刺激分子（co-stimulatory molecules）を含む下流の遺伝子の発現を起こさせる。また誘導型一酸化窒素合成酵素（inducible nitric oxide synthase, ｉＮＯＳ）および抗菌性ペプチド（antimicrobial peptides）の発現を誘導して、外来の病原体を直接破壊することもできる。Ｔｏｌｌ様受容体は、自然免疫という防御の第一線を発動するだけでなく、抗原提示細胞（例えば樹状細胞（dendritic cell））の成熟化を誘導することを通して獲得免疫反応を活性化しもする。微生物が体内に侵入したとき、樹状細胞自身のＴｏｌｌ様受容体が病原菌を識別し、ＭＨＣ分子が抗原を表面に提示することにより、ナイーブＴリンパ球が活性化される。そして、Ｔｏｌｌ様受容体に誘導されて産生したＩＬ−１２が、活性化されたＴリンパ球をさらにＴｈ１リンパ球に分化し、獲得免疫反応が発動される。このようにして慢性ウィルス感染への抵抗に協力し、最終目的であるウィルス排除が達成されることとなり、防御メカニズムにより強力かつ特異的な保護が提供される。
【０００８】
現在までに確認されているＴｏｌｌ様受容体は、Ｔｏｌｌ様受容体１からＴｏｌｌ様受容体１０まで１０種あり、これらは細菌、ウィルス、真菌および原生動物など各種の外来の異物を認識することができる。Ｔｏｌｌ様受容体は構造上２つの部分、（１）外来の異物の認識を担う細胞外のロイシンリッチリピート（leucine-rich repeat, ＬＲＲ）ドメインと、（２）例えばＭｙＤ８８（myeloid differentiation factor-88 ）、ＴＩＲＡＰ／ＭＡＬ（TIR-associated protein）、ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１（Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-β）およびＴＲＡＭ／ＴＩＲＰ／ＴＩＣＡＭ−２（Toll-receptor-associated molecule）などの下流のアダプタータンパクと作用して、細胞外シグナル調節キナーゼ（Extracellular Signal-regulated Kin, ＥＲＫ）、ｐ３８、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（c-Jun N-terminal kinase）およびＮＦ−ｋＢを活性化し、炎症性サイトカイン（pro-inflammatory cytokine）であるＩＬ−１、ＩＬ−６、インターフェロン−αおよびＴｙｐｅＩのインターフェロンの産生を誘導する細胞内のＴｏｌｌ−インターロイキン−１受容体（Toll-interleukin-1 receptor, ＴＩＲ）ドメインを有している。
【０００９】
哺乳動物において最初に発見されたのはＴｏｌｌ様受容体４であり、これはＢリンパ球、樹状細胞、単球（monocytes）、マクロファージ（macrophages）、顆粒球（granulocytes）およびＴリンパ球といった多くの免疫細胞に発現するもので、呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus, ＲＳＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（hepatitis C virus, ＨＣＶ）およびマウス乳癌ウイルス（mouse mammary tumor virus, ＭＭＴＶ）など多数の外来ウィルスを認識できると共に、ＭｙＤ８８とＴＩＲＡＰとの作用を介して大量のインターフェロンの産生を誘導する。
【００１０】
すべてのＴｏｌｌ様受容体のうち、Ｔｏｌｌ様受容体２が最も多くのＰＡＭＰｓを認識でき、それらＰＡＭＰｓは主に細菌由来のものであって、リポアラビノマンナン（lipoarabinomannan, ＬＡＭ）、リポポリサッカリド（lipopolysaccharide, ＬＰＳ）、リポタイコ酸（lipoteichoic acid, ＬＴＡ）、ペプチドグリカン（peptidoglycan, ＰＧＮ）およびその他のリポタンパク（lipoprotein）、糖脂質（glycolipid）、糖タンパク（glycoprotein）などである。またＴｏｌｌ様受容体２は、麻疹ウィルス（measles virus, ＭＶ）、ヒトサイトメガロウィルス（human cytomegalovirus, ＨＣＭＶ）、Ｃ型肝炎ウィルスなどのウィルスの侵入をも認識でき、防御メカニズムにおいて重要な役割を担っている。
【００１１】
Ｔｏｌｌ様受容体７は、単球、Ｂリンパ球および樹状細胞などの免疫細胞に高度に発現し、外来の物質の侵入を認識したときに極めて大量のＴｙｐｅＩインターフェロン、特にインターフェロン−αを産生することができ、自然免疫において重要な役割を果たす。Ｔｏｌｌ様受容体７は主にヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus, ＨＩＶ）およびＶＳＶなどウィルス由来のＧ／ＵリッチｓｓＲＮＡ（G/U-rich ssRNA）を感知することができ、ウィルス排除に無視することのできない影響力を持つ。
【００１２】
医薬面での発展に目を向けると、Ｔｏｌｌ様受容体９拮抗剤が現在すでに臨床試験の段階に入っている。この拮抗剤は、樹状細胞を刺激してＩＬ−１２および極めて大量のインターフェロン−αを産出させると共に、Ｂリンパ球の増殖と抗体分泌を誘導することができ、インターフェロン−αでの治療に失敗したＨＣＶ患者に優れた効果をあげている。また、Ｔｏｌｌ様受容体７拮抗剤は幅広い抗ウィルス応答（antiviral response）を誘導し、多種のサイトカイン、特にインターフェロン−αを放出させることができるため、各種ＨＣＶ遺伝子型の患者において高いウィルス排除率が得られている。
【００１３】
近年ではすでに多くの抗ウィルス薬が研究・開発されており、臨床治療に広く利用されている。例として、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウィルス（influenza virus）、アデノウィルス（adenovirus）、ＨＩＶおよびＨＣＶなど多種のウィルスの増殖を抑制することが実験により確認されたヌクレオシドアナログ（nucleside analog）の一種であるリバビリン、Ａ型インフルエンザウィルスのＭ２膜タンパクを抑制するよう作用して、Ａ型インフルエンザウィルスの脱穀を阻害し、後続の複製を行えなくするアマンタジン、ＨＩＶの逆転写酵素（reverse transcriptase）を抑制し、ウィルスのＲＮＡがＤＮＡへ逆転写できなくなるようにすることで、ＤＮＡの合成を中断させるジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｄＩ）、ザルシタビン（ｄｄｃ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）およびラミブジン（３ＴＣ）などが挙げられる。
【００１４】
多数の抗ウィルス薬が次々と臨床に用いられ効果をあげてはいるが、ここ数年で多くの薬剤に耐性ウィルスが発生してきている。耐性が生じるのはウィルスの遺伝子が突然変異することによって抗ウィルス薬がその作用の標的を失ってしまうことに主な原因があり、例えば次のような例を挙げることができる。ＨＳＶのチミジンキナーゼ（thymidine kinase）遺伝子が突然変異することでアシクロビル（acyclovir）およびガンシクロビル（ganciclovir）などが細胞内で有効な成分に転換し得ずこれら薬物に対して耐性が生じる。Ａ型インフルエンザウィルスのＭ２タンパク遺伝子の突然変異によりアマンタジン（amantadine）またはリマンタジン（rimantadine）に対する耐性が生じる。ＨＩＶ逆転写酵素またはプロテアーゼ（protease）遺伝子の突然変異もまた耐性を招来する原因となる。ＨＣＶの非構造（non-structural）５Ａおよびエンベロープ遺伝子（envelope gene）２−糖タンパクの遺伝子の突然変異は、ＨＣＶにインターフェロンに対する耐性を生じさせる。
【００１５】
昨今ではますます多くの薬剤が免疫調節の方向で発展しており、宿主の自然および獲得免疫反応を刺激することにより外来の微生物を排除する目的を達成している。免疫調節は漢方薬治療の得意とするところである。漢方生薬には双方向調節（または免疫調節）作用があり、かかる作用は、正常な有機体に対してはあまり影響はないが、免疫が失調を起こした有機体に対しては有効に作用して有機体の免疫の不足または過剰状態を修正し、回復させて免疫の安定を維持するといった形で表れ、これによれば正常な有機体の免疫能力が増強され、かつ病原因子が取り除かれる。
【００１６】
漢方生薬は天然のままの構造と活性を保ったものであって、数千年にわたる選別・篩い分けの結果、残った確実に治療効果のある薬物である。
【００１７】
ウィルス性疾患の種類は多岐にわたっており、例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、流行性髄膜炎、ウィルス性肺炎、エンテロウィルス、ＡＩＤＳウィルスなど実に多く、その病原性、潜伏期間および感染ルートは疾患の種類によりそれぞれ異なっている。臨床実験により、数多くの漢方生薬がウィルス性疾患の治療に顕著な効果を示すことが証明されている。
【００１８】
例えば特許文献１は、金銀花、連翹から超臨界抽出および水抽出ならびに黄岑から水抽出したエキスが、抗インフルエンザウィルス作用を有することを開示している。特許文献２は、白花蛇舌草（Hedyotis diffuse）など１４種の薬材から作製される注射剤とカプセル剤について、延べ人数で５人に対し臨床試験を行った結果、これらに抗ＡＩＤＳウィルス作用が認められたと開示している。特許文献３は、金銀花、甘草、竜葵などを含んでなる複合漢方薬ＨＨＴ８８８−４が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、人体のリンパ球中の９８％以上のＡＩＤＳウィルス活性を抑制したと開示している。特許文献４は、薑黄、黄耆、桑寄生、虎杖の漢方生薬エキスについて、臨床試験でＣ型肝炎の治療に顕著な効果が確認されたと開示している。
【００１９】
上述以外にも、漢方薬は、現代医学による薬物治療と併用しての補助療法にも応用されている。例えば、特許文献５は、大棗などより組成されるＰＨＹ９０６を化学療法における薬物およびウィルス性疾患治療に併用すると、治療効果を高め、クオリティ・オブ・ライフを向上すると共に、毒性と副作用を低減することができ、米国ではすでに第ＩＩ相臨床試験に入っていると開示する。特許文献６は、冬虫夏草および?耆から組成され、Ｃ型肝炎の併用療法（インターフェロンおよびリバビリン）と組み合わせてＣ型肝炎を治療するＣ型肝炎補助治療薬を開示しており、臨床試験において持続的なウィルス排除率が７０％以上に達し、治療効果を高めるのみならず、治療後の再発率を低減することもできるとしている。
【００２０】
さらに免疫系の観点から見ると、ウィルス性肝炎の治療において、インターフェロン産生の誘発は極めて指標的な意義を持つ。特許文献７は、夾竹桃および甘草エキスについて、マウス脳心筋炎ウイルス（encephalo-myocarditis virus, ＥＭＣＶ）に感染したヒト扁平上皮癌細胞（ＨＥｐ−２ ｃｅｌｌ）に対する抗ウィルス試験を行ったところ、ウィルスを有効に低減することを確認し、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ実験においてもインターフェロン−γの産生を誘導するという結果が出たと示している。
【００２１】
人体の免疫系においてすでに１０種のＴｏｌｌ様受容体（Toll-like receptors, ＴＬＲ）が確認されており、人体が体内外の病原体（ウィルス、細菌または真菌）から脅威をうけたとき、これらＴＬＲは、個別に対応する免疫反応をそれぞれ識別して作動させる。由来のそれぞれ異なる病原分子が特定のＴＬＲと結合することによって一連の反応が誘発され、病原体の侵襲から細胞が保護されることになる。ＴＬＲによる治療法は、ＴＬＲの免疫反応への対応に高度の特異性があるという原理を利用し、治療がなされる特定の病症に対し刺激剤（アゴニスト）または遮断剤（アンタゴニスト）を与えて免疫調節を行うことを通し病症の治療効果を達成するというものである。他の免疫系を利用した治療方法とは異なり、ＴＬＲ治療法は、疾病の治療に高度な特異性があるので、病原体を有効かつ持続的に抑制できるだけでなく、自然免疫系が非特異的に活性化されることに伴う副作用またははその他の症状を低減させることもできる。
【００２２】
最近、コリー・ファーマシューティカル・グループ社（Coley Pharmaceutical Group）が、合成の短鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）によりＴＬＲ−９を制御するＴＬＲ治療薬アクチロン（Actilon）を開発した。このＯＤＮｓはＤＮＡのような配列を有する短鎖化合物であり、病原体の侵入時にＴＬＲ−９が認識する病原体のＣｐＧモチーフを模倣したものである。ＴＬＲ−９は、発現された後、免疫系における一連のシグナル伝達を作動させ、インターフェロンの産生を誘発する。上記治療薬はこうした機序によってＣ型肝炎などウィルス性疾患の治療を行うものであり、現在、第Ｉｂ相臨床試験の段階に入っている。また、アナディス・ファーマシューティカル社（Anadys Pharmaceutical）が開発したのは、ＴＬＲ−７を発現させるＡＮＡ２４５およびＡＮＡ９７５ （経口薬）であり、それぞれすでに第Ｉｂおよび第Ｉａ相臨床試験段階に入っている。
【００２３】
上記以外に、ＴＬＲ治療法の研究において、天然エキスを使った試験も行われている。特許文献８は、エキナセアなどのハーブから抽出したメラニン（Melanin）エキスについて、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ／Ｍｏｎｏｃｙｔｅ試験系（NF-kappa B/luciferase）で試験を行ったところ、ＴＬＲ−２およびＴＬＲ−４の発現を誘発できたと示している。
【００２４】
【特許文献１】米国特許第６７８７１６５号明細書
【特許文献２】米国特許第６６９６０９４号明細書
【特許文献３】米国特許第６２１４３５０号明細書
【特許文献４】米国特許第６４２６０９８号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０２１１１８０号明細書
【特許文献６】台湾特許第Ｉ２５８３７３号明細書
【特許文献７】国際公開番号ＷＯ０２１０２３９５号公報
【特許文献８】国際公開番号ＷＯ０４０９３５１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
ウィルス耐性の問題を解決するため、本発明は多種の漢方生薬を組み合わせなるて複合漢方生薬を提供する。その原理は、同じ標的ウィルスに作用する多種の異なる薬物またはウィルスの異なる部位に作用する多種の薬物を同時に用いて治療を行うことによって、相加効果が生じるだけでなく、ウィルスがある薬物に耐性を持っていても他にも有効な薬物が含まれているために治療の成功率も高まる、というものである。さらに漢方生薬は天然の構造と活性を保ったものであって、数千年にわたって選別・篩い分けがなされてきた結果残った確実に治療効果のある薬物である。そこで本発明は、漢方薬の多面的効果、双方向調節作用、温和・無毒および顕著な免疫増強作用などの長所に基づいて、ウィルス疾患に対し治療効果を有する漢方生薬エキスを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
１実施形態において本発明は、免疫細胞のインターフェロン産生を誘導し、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor）を活性化する漢方生薬エキスであって、有効量の甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）、柴胡（BUPLEURI RADIX）および黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）を含む原料を抽出してなり、甘草と柴胡と黄岑の重量比が１〜５：１〜５：１〜５または１〜２：１〜２：１〜２である漢方生薬エキスを提供する。
【００２７】
甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）にはウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）またはスペイン甘草（Glycyrrhiza glabra）が含まれる。柴胡（BUPLEURI RADIX）には北柴胡（Bupleurum chinense）または狭葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium）が含まれる。黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）には黄金花（Scutellaria baicalensis）が含まれる。
【００２８】
本発明に係る漢方生薬エキスの原料は、五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）および赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）をさらに含む。甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比は１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３または１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である。五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）には朝鮮五味子（Schisandra chinensis）または南五味子（Schisandra sphenanthera）が含まれる。赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）にはエビスグスリ（Paeonia lactiflora）または川赤芍（Paeonia veitchii）が含まれる。
【００２９】
本発明に係る漢方生薬エキスは、Ｔｏｌｌ様受容体２、Ｔｏｌｌ様受容体４またはＴｏｌｌ様受容体７を含む複数のＴｏｌｌ様受容体を活性化する。
【００３０】
本発明に係る漢方生薬エキスは、免疫調節機能を強化でき、ウィルス感染性疾患の治療の用いることができる。
【００３１】
別の実施形態において本発明は、免疫細胞のインターフェロン産生を誘導し、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor）を活性化する漢方生薬エキスの作製方法であって、有効量の甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）、柴胡（BUPLEURI RADIX）および黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）を含み、甘草と柴胡と黄岑の重量比が１〜５：１〜５：１〜５または１〜２：１〜２：１〜２である漢方生薬組成物を準備する工程と、漢方生薬組成物を溶剤で抽出して抽出液を得る工程と、抽出液を濃縮して濃縮生成物を得る工程と、濃縮生成物を乾燥させる工程と、賦形剤を加えて所定の剤型に調製する工程と、を含む漢方生薬エキスの作製方法を提供する。
【００３２】
甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）にはウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）またはスペイン甘草（Glycyrrhiza glabra）が含まれる。柴胡（BUPLEURI RADIX）には北柴胡（Bupleurum chinense）または狭葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium）が含まれる。黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）には黄金花（Scutellaria baicalensis）が含まれる。
【００３３】
漢方生薬組成物は、有効量の五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）および赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）をさらに含む。甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比は１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３または１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である。五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）には朝鮮五味子（Schisandra chinensis）または南五味子（Schisandra sphenanthera）が含まれる。赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）にはエビスグスリ（Paeonia lactiflora）または川赤芍（Paeonia veitchii）が含まれる。
【００３４】
溶剤には水または濃度０．１〜９５％のエタノールが含まれ、かつ溶剤と漢方生薬組成物の重量比は６：１〜１０：１である。濃縮生成物の固形分は１０〜３０％である。本発明で用いる乾燥方法には真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥または流動床乾燥が含まれる。賦形剤にはデンプン、麦芽糖、乳糖、ショ糖、マンニトール、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースまたはタルクが含まれる。形成される所定の剤型にはカプセル剤、錠剤、散剤または液剤が含まれる。
【００３５】
本発明（１）は、有効量の甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）、柴胡（BUPLEURI RADIX）および黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）を含む原料を抽出してなり、甘草と柴胡と黄岑の重量比が１〜５：１〜５：１〜５である、免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスである。
本発明（２）は、甘草と柴胡と黄岑の重量比が１〜２：１〜２：１〜２である、本発明(1)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスである。
本発明（３）は、原料に有効量の五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）および赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）がさらに含まれる、本発明(1)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスである。
本発明（４）は、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３である、本発明(3)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスである。
本発明（５）は、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である、本発明(4)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスである。
本発明（６）は、免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法であって、
有効量の甘草、柴胡および黄岑を含み、甘草と柴胡と黄岑の重量比が１〜５：１〜５：１〜５である漢方生薬組成物を準備する工程、
前記漢方生薬組成物を溶剤で抽出して抽出液を得る工程、
前記抽出液を濃縮して濃縮生成物を得る工程、
前記濃縮生成物を乾燥させる工程、ならびに、
賦形剤を加えて所定の剤型に調製する工程、
を含む作製方法である。
本発明（７）は、前記漢方生薬組成物が有効量の五味子および赤芍をさらに含む、本発明(6)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（８）は、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３である、本発明(7)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（９）は、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である、本発明(8)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（１０）は、前記溶剤には水または濃度０．１〜９５％のエタノールが含まれる、本発明(6)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（１１）は、前記溶剤と前記漢方生薬組成物の重量比が６：１〜１０：１である、本発明(6)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（１２）は、前記濃縮生成物の固形分が１０〜３０％である、本発明(6)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（１３）は、前記濃縮生成物を真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥または流動床乾燥により乾燥させる、本発明(6)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（１４）は、前記賦形剤にデンプン、麦芽糖、乳糖、ショ糖、マンニトール、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースまたはタルクが含まれる、本発明(6)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（１５）は、前記所定の剤型にはカプセル剤、錠剤、散剤または液剤が含まれる、本発明(6)の免疫細胞のインターフェロン産生を誘導する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（１６）は、有効量の甘草、柴胡および黄岑を含む原料を抽出してなり、甘草と柴胡と黄岑の重量比が１〜５：１〜５：１〜５である、Ｔｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスである。
本発明（１７）は、Ｔｏｌｌ様受容体２、Ｔｏｌｌ様受容体４およびＴｏｌｌ様受容体７を活性化する、本発明(16)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスである。
本発明（１８）は、甘草と柴胡と黄岑の重量比が１〜２：１〜２：１〜２である、本発明(16)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスである。
本発明（１９）は、原料に有効量の五味子および赤芍がさらに含まれる、本発明(16)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスである。
本発明（２０）は、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３である、本発明(19)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスである。
本発明（２１）は、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である、本発明(20)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスである。
本発明（２２）は、Ｔｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法であって、
有効量の甘草、柴胡および黄岑を含み、甘草と柴胡と黄岑の重量比が１〜５：１〜５：１〜５である漢方生薬組成物を準備する工程、
前記漢方生薬組成物を溶剤で抽出して抽出液を得る工程、
前記抽出液を濃縮して濃縮生成物を得る工程、
前記濃縮生成物を乾燥させる工程、ならびに、
賦形剤を加えて所定の剤型に調製する工程、
を含む作製方法である。
本発明（２３）は、前記漢方生薬組成物が有効量の五味子および赤芍をさらに含む、本発明(22)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（２４）は、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３である、本発明(23)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（２５）は、甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比が１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である、本発明(24)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（２６）は、前記溶剤には水または濃度０．１〜９５％のエタノールが含まれる、本発明(22)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（２７）は、前記溶剤と前記漢方生薬組成物の重量比が６：１〜１０：１である、本発明(22)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（２８）は、前記濃縮生成物の固形分が１０〜３０％である、本発明(22)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（２９）は、前記濃縮生成物を真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥または流動床乾燥により乾燥させる、本発明(22)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（３０）は、前記賦形剤にはデンプン、麦芽糖、乳糖、ショ糖、マンニトール、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースまたはタルクが含まれる、本発明(22)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法である。
本発明（３１）は、前記所定の剤型にはカプセル剤、錠剤、散剤または液剤が含まれる、本発明(22)のＴｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキスの作製方法である。
【発明の効果】
【００３６】
本発明に係る漢方生薬エキスは甘草、柴胡および黄岑などから抽出されてなり、免疫細胞のインターフェロン産生を誘導し、かつＴｏｌｌ様受容体を活性化することができる。本発明に係る漢方生薬エキスは多種の漢方生薬を組み合わせてなる複合漢方生薬であるため、相加効果が得られるのみでなく、ウィルス性疾患の治療に際し、ウィルスが当該漢方生薬エキス中の薬物に耐性を持っていたとしても他にも有効な薬物が含まれていることより治療の成功率が高まる。また、本発明は、多面的効果、双方向調節作用、温和・無毒および顕著な免疫増強作用などといった漢方薬の長所も備えている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
上述した本発明の目的、特徴および長所がより明りょうとなるよう、以下に添付の図面を参照にしながら、実施例を挙げて詳細に説明する。
【００３８】
１実施形態において本発明は、免疫細胞のインターフェロン産生を誘導し、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor）を活性化する漢方生薬エキスであって、有効量の甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）、柴胡（BUPLEURI RADIX）および黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）を含む原料を抽出してなる漢方生薬エキスを提供する。
【００３９】
漢方生薬エキスの原料において、甘草と柴胡と黄岑の重量比は約１〜５：１〜５：１〜５または１〜２：１〜２：１〜２である。
【００４０】
甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）としてはウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）またはスペイン甘草（Glycyrrhiza glabra）を挙げることができる。柴胡（BUPLEURI RADIX）としては北柴胡（Bupleurum chinense）または狭葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium）を挙げることができる。黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）としては黄金花（Scutellaria baicalensis）を挙げることができる。
【００４１】
上記漢方生薬エキスの原料は、有効量の五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）および赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）をさらに含んでいてもよい。甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比は約１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３または１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である。五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）としては朝鮮五味子（Schisandra chinensis）または南五味子（Schisandra sphenanthera）を挙げることができる。赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）としてはエビスグスリ（Paeonia lactiflora）または川赤芍（Paeonia veitchii）を挙げることができる。
【００４２】
上記漢方生薬エキスは、例えばＴｏｌｌ様受容体２、Ｔｏｌｌ様受容体４およびＴｏｌｌ様受容体７といった複数のＴｏｌｌ様受容体を活性化することができる。
【００４３】
別の実施形態において本発明は、免疫細胞のインターフェロン産生を誘導し、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor）を活性化する漢方生薬エキスの作製方法を提供する。該作製方法は次の工程を含む。先ず、有効量の甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）、柴胡（BUPLEURI RADIX）および黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）を含む漢方生薬組成物を準備する。甘草と柴胡と黄岑の重量比は約１〜５：１〜５：１〜５または１〜２：１〜２：１〜２である。次に、漢方生薬組成物を溶剤で抽出して抽出液を得る。用いる溶剤は水または濃度０．１〜９５％のエタノールとすることができ、溶剤と漢方生薬組成物の重量比は約６：１〜１０：１である。続いて、抽出液を濃縮して濃縮生成物を得る。濃縮生成物の固形分は約１０〜３０％である。次いで、濃縮生成物を乾燥させる。濃縮生成物を乾燥させる方法は真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥または流動床乾燥とすることができる。さらに、賦形剤を加えて所定の剤形に調製する。賦形剤はデンプン、麦芽糖、乳糖、ショ糖、マンニトール、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースまたはタルクとすることができる。また、所定の剤形は、錠剤、散剤または液剤などであってよい。
【００４４】
甘草（GLYCYRRHIZAE RADIX）としてはウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）またはスペイン甘草（Glycyrrhiza glabra）を挙げることができる。柴胡（BUPLEURI RADIX）としては北柴胡（Bupleurum chinense）または狭葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium）を挙げることができる。黄岑（SCUTELLARIAE RADIX）としては黄金花（Scutellaria baicalensis）を挙げることができる。
【００４５】
上記漢方生薬エキスの原料は、有効量の五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）および赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）をさらに含んでいてもよい。甘草と柴胡と黄岑と五味子と赤芍の重量比は約１〜５：１〜５：１〜５：１〜３：１〜３または１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である。五味子（SCHISANDRAE FRUCTUS）としては朝鮮五味子（Schisandra chinensis）または南五味子（Schisandra sphenanthera）を挙げることができる。赤芍（PAEONIAE RUBRA RADIX）としてはエビスグスリ（Paeonia lactiflora）または川赤芍（Paeonia veitchii）を挙げることができる。
【００４６】
所定重量％の甘草、柴胡、黄岑、五味子および赤芍を取ってこれを原料とし、重量比で６から１０倍の０．１〜９５％エタノールで１回または複数回抽出する。次いで、濃縮終点の固形分が１０〜３０％となるように濃縮を行う。次に、賦形剤を添加してから、含水量が２〜１０％となるように濃縮混合液を凍結乾燥し、さらにその乾燥物を、粒度が３５メッシュ未満の粉末になるように粉砕する。最後に、得られた乾燥漢方生薬エキス粉末をハードカプセル中に充填する。各カプセル剤には、約１．３５±０．０９ｇの漢方生薬エキス製剤に相当する量が充填される。漢方生薬エキスの濃縮比は２〜３倍である。
【００４７】
本発明では、好中球（neutrophil）、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞を試験の主体として、インターフェロンの産生とＴｏｌｌ様受容体２、Ｔｏｌｌ様受容体４、Ｔｏｌｌ様受容体７の発現を観察し、これを薬剤のスクリーニングの基準とした。
【実施例】
【００４８】
本発明に係る漢方生薬エキスの作製
実施例１
黄金花（Scutellaria baicalensis）４ｋｇ、北柴胡（Bupleurum chinense）４ｋｇ、ウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）４ｋｇ、エビスグスリ（Paeonia lactiflora）４ｋｇ、朝鮮五味子（Schisandra chinensis）４ｋｇ（薬材の重量比１：１：１：１：１）、および３０％エタノール溶液２００ｋｇをそれぞれ取り、１時間還流させて加熱抽出した。２回抽出した後、得られた抽出液を１００メッシュのフィルターでろ過し、濃縮終点の固形分が１５％になるように減圧濃縮した。続いて、マルトデキストリン２ｋｇを添加し、凍結乾燥を行った。その乾燥物を粉砕して３５メッシュ未満の粉末にし、さらに二酸化ケイ素１２０ｇおよびステアリン酸マグネシウム６０ｇを混入した。最後に、乾燥漢方生薬エキス粉末を０号のハードカプセルに充填した。各カプセル剤の充填量は５６５±４０ｍｇであり、漢方生薬エキス製剤は約１．３５±０．０９ｇとなった。
【００４９】
実施例２
黄金花（Scutellaria baicalensis）２．５ｇ、北柴胡（Bupleurum chinense）２．５ｇ、ウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）２．５ｇ、エビスグスリ（Paeonia lactiflora）７．５ｇ、朝鮮五味子（Schisandra chinensis）７．５ｇ（薬材の重量比１：１：１：３：３）、および３０％エタノール溶液２５０ｇをそれぞれ取り、１時間還流させて加熱抽出した。２回抽出した後、得られた抽出液を１００メッシュのフィルターでろ過してから、減圧濃縮および凍結乾燥を行い、その乾燥物を粉砕して粉末を得た。
【００５０】
実施例３
黄金花（Scutellaria baicalensis）１２．５ｇ、北柴胡（Bupleurum chinense）６．２５ｇ、ウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）６．２５ｇ（薬材の重量比２：１：１）、および３０％エタノール溶液２５０ｇをそれぞれ取り、１時間還流させて加熱抽出した。２回抽出した後、得られた抽出液を１００メッシュのフィルターでろ過してから、減圧濃縮および凍結乾燥を行い、その乾燥物を粉砕して粉末を得た。
【００５１】
実施例４
黄金花（Scutellaria baicalensis）６．２５ｇ、北柴胡（Bupleurum chinense）１２．５ｇ、ウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）６．２５ｇ（薬材の重量比１：２：１）、および３０％エタノール溶液２５０ｇをそれぞれ取り、１時間還流させて加熱抽出した。２回抽出した後、得られた抽出液を１００メッシュのフィルターでろ過してから、減圧濃縮および凍結乾燥を行い、その乾燥物を粉砕して粉末を得た。
【００５２】
実施例５
黄金花（Scutellaria baicalensis）６．２５ｇ、北柴胡（Bupleurum chinense）６．２５ｇ、ウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）１２．５ｇ（薬材の重量比１：１：２）、および３０％エタノール溶液２５０ｇをそれぞれ取り、１時間還流させて加熱抽出した。２回抽出した後、得られた抽出液を１００メッシュのフィルターでろ過してから、減圧濃縮および凍結乾燥を行い、その乾燥物を粉砕して粉末を得た。
【００５３】
実施例６
黄金花（Scutellaria baicalensis）５ｇ、北柴胡（Bupleurum chinense）５ｇ、ウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）５ｇ、エビスグスリ（Paeonia lactiflora）５ｇ、朝鮮五味子（Schisandra chinensis）５ｇ（薬材の重量比１：１：１：１：１）、および純水２５０ｇをそれぞれ取り、１時間還流させて加熱抽出した。２回抽出した後、得られた抽出液を１００メッシュのフィルターでろ過してから、減圧濃縮および凍結乾燥を行い、その乾燥物を粉砕して粉末を得た。
【００５４】
実施例７
黄金花（Scutellaria baicalensis）５ｇ、北柴胡（Bupleurum chinense）５ｇ、ウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）５ｇ、エビスグスリ（Paeonia lactiflora）５ｇ、朝鮮五味子（Schisandra chinensis）５ｇ（薬材の重量比１：１：１：１：１）、および５０％エタノール溶液２５０ｇをそれぞれ取り、１時間還流させて加熱抽出した。２回抽出した後、得られた抽出液を１００メッシュのフィルターでろ過してから、減圧濃縮および凍結乾燥を行い、その乾燥物を粉砕して粉末を得た。
【００５５】
実施例８
黄金花（Scutellaria baicalensis）５ｇ、北柴胡（Bupleurum chinense）５ｇ、ウラル甘草（Glycyrrhiza uralensis）５ｇ、エビスグスリ（Paeonia lactiflora）５ｇ、朝鮮五味子（Schisandra chinensis）５ｇ（薬材の重量比１：１：１：１：１）、および９５％エタノール溶液２５０ｇをそれぞれ取り、１時間還流させて加熱抽出した。２回抽出した後、得られた抽出液を１００メッシュのフィルターでろ過してから、減圧濃縮および凍結乾燥を行い、その乾燥物を粉砕して粉末を得た。
【００５６】
本発明に係る漢方生薬エキスの好中球およびＴリンパ球に対する細胞毒性
実施例９
先ず、９６ウェルプレートに細胞を播種した。次いで、本発明に係る漢方生薬エキス（実施例１で作製したもの）を加え、さらにアラマーブルー色素（Alamarblue dye）１０μｌを加えて３７℃のインキュベーターで１６時間培養し、５７０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光値を測定した。結果は図１Ａと１Ｂに示すとおりであり、該漢方生薬エキスには、好中球およびＴリンパ球に対し明らかな細胞毒性がないことが確認された。
【００５７】
本発明に係る漢方生薬エキスの免疫細胞表面インターフェロン産生誘導試験
実施例１０
先ず、抹消血液から分離したＴリンパ球およびナチュラルキラー細胞の細胞株（ＮＫ９２）を用意し、それに本発明に係る漢方生薬エキス（実施例１で作製したもの）を加え、２４時間経過後、上層液を取り、ＥＬＩＳＡでインターフェロンの含量を測定した。その結果、図２Ａに示すように、漢方生薬エキスの濃度の増加に伴ってインターフェロン−γの発現量も増加しており、用量反応が表れた。かかる現象は、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞株（ＮＫ９２）のいずれにおいても似たような傾向を示した。さらに、ＰＣ−ＩＬ−１２を陽性対照とし、同様の方式でインターフェロン−αの含量を測定したところ、図２Ｂおよび２Ｃに示すように、漢方生薬エキスは１００μｇ／ｍｌでナチュラルキラー細胞株（ＮＫ９２）のインターフェロン−α産生を誘導できることが確認され、また、抹消血液から分離したＴリンパ球を系とした誘導試験では、２５０〜１０００μｇ／ｍｌにおいて顕著なインターフェロン−α産生誘導が認められた。
【００５８】
実施例１１
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例３で作製したもの）を取りインターフェロン−γの誘導活性試験を行った。結果、試料濃度５００μｇ／ｍｌで免疫細胞からインターフェロン−γ産生を誘導できることが確認され、その値は９４．３±１５．７ｐｇ／ｍｌに達した（陽性対照に用いたＩＬ−１２では、４０ｎｇ／ｍｌの濃度で、免疫細胞から５０±２．０４ｐｇ／ｍｌのインターフェロン-γが産生された）。
【００５９】
実施例１２
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例５で作製したもの）を取りインターフェロン−γの誘導活性試験を行った。結果、試料濃度５００μｇ／ｍｌで免疫細胞のインターフェロン−γ産生を誘導できることが確認され、その値は１２９．１±８．５ｐｇ／ｍｌに達した（陽性対照に用いたＩＬ−１２では、４０ｎｇ／ｍｌの濃度で、免疫細胞から５０±２．０４ｐｇ／ｍｌのインターフェロン-γが産生された）。
【００６０】
実施例１３
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例６で作製したもの）を取りインターフェロン−γの誘導活性試験を行った。結果、試料濃度１０００μｇ／ｍｌで免疫細胞のインターフェロン−γ産生を誘導できることが確認され、その値は９５．２±１５．７ｐｇ／ｍｌに達した（陽性対照に用いたＩＬ−１２では、４０ｎｇ／ｍｌの濃度で、免疫細胞から５０±２．０４ｐｇ／ｍｌのインターフェロン-γが産生された）。
【００６１】
実施例１４
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例７で作製したもの）を取りインターフェロン−γの誘導活性試験を行った。結果、試料濃度１０００μｇ／ｍｌで免疫細胞のインターフェロン−γ産生を誘導できることが確認され、その値は１５６３．６±４４．９ｐｇ／ｍｌに達した（陽性対照に用いたＩＬ−１２では、４０ｎｇ／ｍｌの濃度で、免疫細胞から５０±２．０４ｐｇ／ｍｌのインターフェロン-γが産生された）。
【００６２】
実施例１５
乾燥物（実施例８で作製したもの）を適量取り、インターフェロン−γの誘導活性試験を行った。結果、試料濃度５００ｕｇ／ｍｌで免疫細胞のインターフェロン−γ産生を誘導できることが確認され、その値は８０．２±２４．６ｐｇ／ｍｌに達した（陽性対照に用いたＩＬ−１２では、４０ｎｇ／ｍｌの濃度で、免疫細胞から５０±２．０４ｐｇ／ｍｌのインターフェロン-γが産生された）。
【００６３】
本発明に係る漢方生薬エキスのラットインターフェロン産生誘導試験
実施例１６
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例１で作製したもの）を適量取り、ｉｎ ｖｉｖｏインターフェロン−γ誘導活性試験を行った。Ｗｉｓｔａｒラットを対照群、中濃度群および高濃度群に分け、対照群には水、中濃度群には漢方生薬エキス５ｇ／ｋｇ、高濃度群には漢方生薬エキス１０ｇ／ｋｇをそれぞれ２８日間連続して与え、２９日目に採血して血中のＩＦＮγ産生を測定した。その結果図３に示すように、本発明に係る漢方生薬エキスが動物体内のＩＦＮγの産生を顕著に誘導できることが認められ、雌ラットでは特に優れた効果が見られた。
【００６４】
本発明に係る漢方生薬エキスのＰＢＭＣ／Ｔ細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）発現に対する影響
実施例１７
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例１で作製したもの）を適量取り、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７の活性試験を行った。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７の抗体を用いて細胞表面マーカー染色を行った後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で直接分析した。その結果、低用量（２５０ｕｇ／ｍｌ）で、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４またはＴＬＲ７のいずれについても７５％以上の発現を誘導できることがわかった。図４Ａ〜４Ｉを参照されたい。
【００６５】
実施例１８
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例２で作製したもの）を取りＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７の活性試験を行った。その結果は図５Ａ〜５Ｉに示すとおりである。試験濃度が５００ｕｇ／ｍｌのときに６５％以上のＴＬＲｓの発現を誘導できることが確認された。
【００６６】
実施例１９
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例３で作製したもの）を取りＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７の活性試験を行った。その結果は図６Ａ〜６Ｉに示すとおりである。試験濃度が低用量（２５０ｕｇ／ｍｌ）でも６０％以上のＴＬＲｓの発現を誘導できることが確認された。
【００６７】
実施例２０
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例４で作製したもの）を取りＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７の活性試験を行った。その結果は図７Ａ〜７Ｉに示すとおりである。試験濃度が低用量（２５０ｕｇ／ｍｌ）のときでも８５％以上のＴＬＲｓの発現を誘導できることが確認された。
【００６８】
実施例２１
本発明に係る漢方生薬エキス（実施例５で作製したもの）を取りＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７の活性試験を行った。その結果は図８Ａ〜８Ｉに示すとおりである。試験濃度が低用量（２５０ｕｇ／ｍｌ）のときでも８０％以上のＴＬＲｓの発現を誘導できることが確認された。
【００６９】
実施例２２
本発明の漢方生薬エキス（実施例６で作製したもの）を取りＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７の活性試験を行った。その結果は図９Ａ〜９Ｉに示すとおりである。試験濃度が低用量（２５０ｕｇ／ｍｌ）のときでも８５％以上のＴＬＲｓの発現を誘導できることが確認された。
【００７０】
実施例２３
本発明の漢方生薬エキス（実施例７で作製したもの）を取りＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７の活性試験を行った。その結果は図１０Ａ〜１０Ｉに示すとおりである。試験濃度が低用量（２５０ｕｇ／ｍｌ）のときでも９４％以上のＴＬＲｓの発現を誘導できることが確認された。
【００７１】
実施例２４
本発明の漢方生薬エキス（実施例８で作製したもの）を取りＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７の活性試験を行った。その結果は図１１Ａ〜１１Ｉに示すとおりである。試験濃度が低用量（２５０ｕｇ／ｍｌ）のときでも７５％以上のＴＬＲｓの高度な発現を誘導できることが確認された。
【００７２】
以上、好適な実施形態を挙げて本発明を説明したが、本発明はこれら実施形態に限定はされないと解されるべきであり、つまり本発明は、（当業者であれば明らかであるように）添付の特許請求の範囲は、かかる各種変更および均等なアレンジがすべて包含されるように、最も広い意味に解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ】本発明に係る漢方生薬エキスの好中球に対する細胞毒性を示した図である。
【図１Ｂ】本発明に係る漢方生薬エキスのＴリンパ球に対する細胞毒性を示した図である。
【図２Ａ】本発明に係る漢方生薬エキスがナチュラルキラー細胞およびＴリンパ球のＩＦＮ−γ発現を促進できることを示す図である。データは３回の独立した実験の平均値±標準差を示し、＊は中濃度群と比較したときのｐ＜０．０５を示す。
【図２Ｂ】本発明に係る漢方生薬エキスがナチュラルキラー細胞のＩＦＮ−α発現を促進できることを示す図である。データは３回の独立した実験の平均値±標準差を示し、＊は中濃度群と比較したときのｐ＜０．０５を示す。
【図２Ｃ】本発明に係る漢方生薬エキスがＴリンパ球のＩＦＮ−α発現を促進できることを示す図である。データは３回の独立した実験の平均値±標準差を示し、＊は中濃度群と比較したときのｐ＜０．０５を示す。
【図３】本発明に係る漢方生薬エキスが動物（ｉｎ ｖｉｖｏ）のＩＦＮ−γ発現を促進できることを示す図である。＊は対照群と比較したときのｐ＜０．０５を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明に係る漢方生薬エキスのＰＢＭＣ／Ｔ細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）発現に対する影響を示す図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｉは、本発明に係る漢方生薬エキスのＰＢＭＣ／Ｔ細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）発現に対する影響を示す図である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｉは、本発明に係る漢方生薬エキスのＰＢＭＣ／Ｔ細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）発現に対する影響を示す図である。
【図７】図７Ａ〜図７Ｉは、本発明に係る漢方生薬エキスのＰＢＭＣ／Ｔ細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）発現に対する影響を示す図である。
【図８】図８Ａ〜図８Ｉは、本発明に係る漢方生薬エキスのＰＢＭＣ／Ｔ細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）発現に対する影響を示す図である。
【図９】図９Ａ〜図９Ｉは、本発明に係る漢方生薬エキスのＰＢＭＣ／Ｔ細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）発現に対する影響を示す図である。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｉは、本発明に係る漢方生薬エキスのＰＢＭＣ／Ｔ細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）発現に対する影響を示す図である。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｉは、本発明に係る漢方生薬エキスのＰＢＭＣ／Ｔ細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）発現に対する影響を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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