(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の所望の分子を観察する顕微鏡であって、
前記分子を安定状態から第１励起状態に励起するポンプ光、および前記分子を前記第１励起状態から第２励起状態に励起するイレース光を出射する光源手段と、
該光源手段からの前記ポンプ光および前記イレース光を一部重ね合わせて前記試料に集光する光学系と、
該光学系により集光される前記ポンプ光および前記イレース光と前記試料とを相対的に移動させて前記試料を走査する走査手段と、
前記ポンプ光および前記イレース光の照射により前記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段と、を有し、
前記光源手段は、
前記ポンプ光として、前記試料に集光したときのフォトンフラックスが、前記分子の２光子吸収断面積をσtwo、蛍光寿命をτとしたとき、1/(τσtwo)1/2以上となる所定波長のパルス光を出射し、
前記イレース光として、前記ポンプ光と同一波長で、前記試料に集光したときのフォトンフラックスが1/(τσtwo)1/2未満となるパルス光を出射する、ように構成したことを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
前記光源手段は、
前記ポンプ光として、パルス幅が１ナノ秒未満のパルス光を出射し、
前記イレース光として、パルス幅が１ナノ秒以上のパルス光を出射する、ように構成したことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記光源手段は、一つのレーザ光源を有し、
該レーザ光源から波高値の異なる前記ポンプ光および前記イレース光のパルス光を出射する、ように構成したことを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記光源手段は、前記イレース光の出射に先立って前記ポンプ光を出射する、ように構成したことを特徴とする請求項１，２または３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記ポンプ光と前記イレース光との出射タイミングの差が、前記蛍光寿命よりも短い、ことを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記光源手段は、さらに、前記イレース光を空間変調する空間変調素子を有する、ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記空間変調素子は、前記イレース光が前記試料に中空状に集光されるように空間変調する、ことを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を所定の波長の光により照明して、高い空間分解能で観察する高性能かつ高機能の新規な顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観察するものである。この原理について、図９〜図１２を参照して説明する。図９は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図９に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１０に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１１に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１２に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１１の吸収過程や図１２の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１０のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１１のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１１の励起状態からの蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法は、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能である。すなわち、図９に示す最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有のエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で試料を照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能である。しかし、一般に、いくつかの分子は、吸収帯の波長領域が重複するため、単一波長で試料を照明する場合には、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１３は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、Ｓ０の基底状態の分子が、波長λ１の光でＳ１の第１電子励起状態に励起され、さらに波長λ２の光でＳ２の第２電子励起状態に励起されている様子を示している。なお、図１３はある種の分子のＳ２状態からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１３に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１４は、図１３と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１４において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１４の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を、空間的に一部重ね合わせて蛍光領域を抑制すれば、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を利用した超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、従来提案されている超解像顕微鏡にあっては、上述したように、ポンプ光およびイレース光として、波長の異なる２色のレーザ光を要する。例えば、代表的な色素分子であるローダミン６Ｇで染色された試料を観察する場合には、波長５３２ｎｍのポンプ光と、波長６００ｎｍのイレース光とを要することになる。このため、この種の超解像顕微鏡にあっては、構成や調整等が複雑化することが懸念される。
【００１９】
例えば、波長の異なるポンプ光およびイレース光を顕微鏡対物レンズに導入するには、ダイクロイックミラー等の特殊な波長分散性素子を用いて、ポンプ光およびイレース光を、一方を反射、他方を透過させて、空間的に同軸に調整する必要がある。
【００２０】
また、試料から発した蛍光を検出するには、検出器の前方に、ポンプ光およびイレース光をカットし、蛍光のみを透過する光学フィルタや分光素子を配置する必要がある。通常は、検出器の前方に、ポンプ光およびイレース光を確実にブロックできるノッチフィルタを配置するとともに、高強度のイレース光に対処するために、さらに蛍光波長だけを透過させるバンドパスフィルタを配置して、光源散乱光を確実にカットする必要がある。
【００２１】
さらに、顕微鏡対物レンズについても、波長の異なるポンプ光およびイレース光に対して色収差が生じないように設計する必要がある。
【００２２】
その他にも、例えば、反射ミラーについては、反射面にコーティングする光学薄膜を、ポンプ光やイレース光の単独光路で用いる場合には、使用波長で反射率が最適化するように設計する必要があり、共通光路で用いる場合には、異なる２波長に対して反射率が最適化するように設計する必要がある。このため、反射ミラーの設計・製作が面倒でコスト高になることが懸念されるとともに、照明光学系の組み立てに際しては、反射ミラーの種類を間違わないように、細心の注意を払って光路中に配置する必要があり、組み立てが面倒になることが懸念される。
【００２３】
したがって、上記の点に鑑みてなされた本発明の目的は、構成を簡単にできるとともに、組み立ても容易にでき、超解像効果を確実に発現できる顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、試料中の所望の分子を観察する顕微鏡であって、
前記分子を安定状態から第１励起状態に励起するポンプ光、および前記分子を前記第１励起状態から第２励起状態に励起するイレース光を出射する光源手段と、
該光源手段からの前記ポンプ光および前記イレース光を一部重ね合わせて前記試料に集光する光学系と、
該光学系により集光される前記ポンプ光および前記イレース光と前記試料とを相対的に移動させて前記試料を走査する走査手段と、
前記ポンプ光および前記イレース光の照射により前記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段と、を有し、
前記光源手段は、
前記ポンプ光として、前記試料に集光したときのフォトンフラックスが、前記分子の２光子吸収断面積をσtwo、蛍光寿命をτとしたとき、1/(τσtwo)1/2以上となる所定波長のパルス光を出射し、
前記イレース光として、前記ポンプ光と同一波長で、前記試料に集光したときのフォトンフラックスが1/(τσtwo)1/2未満となるパルス光を出射する、ように構成したことを特徴とするものである。
【００２５】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、
前記光源手段は、
前記ポンプ光として、パルス幅が１ナノ秒未満のパルス光を出射し、
前記イレース光として、パルス幅が１ナノ秒以上のパルス光を出射する、ように構成したことを特徴とするものである。
【００２６】
請求項３に係る発明は、請求項１または２に記載の顕微鏡において、
前記光源手段は、一つのレーザ光源を有し、
該レーザ光源から波高値の異なる前記ポンプ光および前記イレース光のパルス光を出射する、ように構成したことを特徴とするものである。
【００２７】
請求項４に係る発明は、請求項１，２または３に記載の顕微鏡において、
前記光源手段は、前記イレース光の出射に先立って前記ポンプ光を出射する、ように構成したことを特徴とするものである。
【００２８】
請求項５に係る発明は、請求項４に記載の顕微鏡において、
前記ポンプ光と前記イレース光との出射タイミングの差が、前記蛍光寿命よりも短い、ことを特徴とするものである。
【００２９】
請求項６に係る発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡において、
前記光源手段は、さらに、前記イレース光を空間変調する空間変調素子を有する、ことを特徴とするものである。
【００３０】
請求項７に係る発明は、請求項６に記載の顕微鏡において、
前記空間変調素子は、前記イレース光が前記試料に中空状に集光されるように空間変調する、ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、ポンプ光およびイレース光として、同一波長で波高値の異なるパルス光を用いるので、構成を簡単にできるとともに、組み立ても容易にでき、超解像効果を確実に発現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（本発明の概要）
先ず、本発明の実施の形態の説明に先立って、本発明の概要について説明する。本発明の顕微鏡は、分光学的な蛍光抑制過程と２光子励起過程とを利用する。図１および図２は、蛍光抑制過程を説明するための図である。蛍光抑制過程においては、図１に示すように、例えばナノ秒のイレース光パルスを照射すると、蛍光は一挙に抑制されるように見える。しかし、この蛍光抑制効果は、図２に示すように、ピコ秒オーダのイレース光パルスでのＳ１状態からＳ２状態への励起・緩和過程の積み重なりとして理解することができる。
【００３３】
図１および図２において、Ｓ１状態からＳ２状態への励起時間は、イレース光の強度に依存するが、大体、数ピコ秒である。また、緩和時間は、例えば数ピコから数十ピコ秒である。この時間スケールでの支配的な緩和過程は、Ｓ２状態からＳ１状態への無輻射過程であり、カーシャ（Kasha）の法則に従えば、９０％程度の高い確率で生じる。しかし、残りの１０％程度は、内部転換等により、基底状態へ無輻射で緩和する。
【００３４】
図１においては、この励起過程と緩和過程とを、ナノ秒の間に何サイクルも繰り返すので、結果としてＳ１状態をとる確率が減少し、分子蛍光が抑制される。換言すると、ナノ秒よりも短い、例えば、ピコ秒オーダの短い光パルスを照射しても、１サイクルしか上記の励起・緩和過程が生じないので、いくら高強度のイレース光を照射しても、蛍光抑制は殆ど起こらない。
【００３５】
一方、ナノ秒よりも短い光パルスを照射すると、２光子吸収等の非線形効果が発現するようになり、基底状態から別の吸収過程が支配的になる。通常、Ｓ１状態からＳ２状態への励起波長は、Ｓ０状態からＳ１状態への励起波長と比較するとかなり長いので、イレース光強度が低い場合には、Ｓ０状態からＳ１状態への遷移は生じない。したがって、イレース光強度が低い場合には、蛍光発光は観測されない。しかし、近年開発が進んでいる尖頭値の高いフェムト秒のパルス光を照射すると、蛍光抑制を起すことなく、２光子吸収過程を誘導することができる。この原理を用いたのが、２光子顕微鏡法である。
【００３６】
この２光子吸収過程は、一般に、分子のＳ０状態からＳ１状態への励起エネルギーが、入射光の光子エネルギーに対して２倍の大きさを持つと、極めて効率的に起きる。しかも、このとき、Ｓ１状態からＳ２状態への共鳴吸収バンドが存在しても、上記の理由で蛍光抑制の発現を無視することができる。
【００３７】
この現象に着目すると、分子のＳ０状態からＳ１状態への励起エネルギーが、入射光の光子エネルギーに対して２倍の大きさを持ち、かつ、Ｓ１状態からＳ２状態への共鳴吸収バンドにも共鳴する場合には、１色の照明光による超解像顕微鏡法が可能となる。
【００３８】
この現象を時間領域で見ると、別の考察が可能となる。例えば、図３に示すように、時間領域でナノ秒のパルスと、尖頭値（波高値）の高いフェムト秒のパルスとを融合すると、２光子過程と蛍光抑制過程とが時間領域で切り分けられて、各々の時間領域で強く発現する。すなわち、尖頭値の高いフェムト秒オーダのパルスが照射された瞬間では、２光子過程による蛍光発光が観測され、それ以外の尖頭値の低いナノ秒オーダのパルスが照射された時間領域では蛍光抑制が起きる。
【００３９】
例えば、ローダミン６Ｇの場合は、パルス幅１ps、尖頭値１GW/cm2程度のパルス光で２光子過程を起すことができ、パルス幅１０ns、尖頭値１０MW/cm2程度のパルス光で蛍光抑制効果を誘導することができる。したがって、例えば、Ｓ１状態の励起寿命内で、先ず、尖頭値の高い例えばピコ秒以下の極短パルス光（以下、適宜、ショートパルスポンプ光とも言う）を試料に照射し、その後、ショートパルスポンプ光の照射から連続して、尖頭値の低い例えばナノ秒オーダのロングパルス光（以下、適宜、ロングパルスイレース光とも言う）を試料に照射すれば、ショートパルスポンプ光の照射による励起で発生した蛍光を抑制することができる。すなわち、試料に照射するレーザパルス波形を、時間領域で波形制御することにより、１色（単一波長）の光を用いる超解像顕微鏡を構成することが可能となる。
【００４０】
図４は、１色の光を用いて超解像顕微鏡を構成する場合のショートパルスポンプ光およびロングパルスイレース光の波形制御を説明する模式図である。図４に示すように、ショートパルスポンプ光は、通常のガウシアンビームに整形して、反射ミラー１およびビームコンバイナ２を経て顕微鏡対物レンズ（図示せず）に入射させる。また、ロングパルスイレース光は、顕微鏡対物レンズにより輪帯状に集光されるように、空間変調素子３により空間変調して、ビームコンバイナ２によりショートパルスポンプ光と同軸上に合成して顕微鏡対物レンズに入射させる。
【００４１】
これにより、試料面において、ショートパルスポンプ光だけが集光する集光点中央部の領域では、２光子吸収過程により強い蛍光が放出され、ロングパルスイレース光が重複して照射される領域、すなわち集光したポンプ光の辺縁部では、蛍光が抑制される。このように、１色の光を用い、そのレーザパルス波形を、時間領域で適切に制御して試料に照射することにより、従来提案されている２波長のレーザ光を用いる場合と同様の超解像効果が期待できる。
【００４２】
ここで、ある波長の光を試料に照射したときに、２光子励起に寄与する光および蛍光抑制に寄与する光は、照射する光のフォトンフラックス(Ie)に依存する。例えば、レーザ光を所定の分子に照射したとき、どれぐらい蛍光が抑制されるかを示す割合（Dip-ratio）をR(Ie)とすると、このR(Ie)は、下記の（１）式により、近似的に求めることができる（例えば、文献「Opt.Eng.vol.44(2005)033602」参照）。
【００４３】
【数１】
0005086765.tif 000002
【００４４】
上記（１）式によれば、Ieが無限大の極限ではR(Ie)は１となり、この状態では、２光子励起が支配的となって蛍光抑制が起こらないことがわかる。
【００４５】
上記（１）を微分すると、Ie=1/(τσtwo)1/2、すなわち臨界限度において、蛍光抑制が働いたときの分子からの蛍光強度R(Ie)は、下記の（２）式で表される最小値を取り、蛍光抑制効果が最大に発現する。
【００４６】
【数２】
0005086765.tif 000003
【００４７】
以上のことから、２光子励起が有効に機能し始めるのは、試料に集光したときのフォトンフラックスが、Ie=1/(τσtwo)1/2以上であり、Ie=1/(τσtwo)1/2未満では、２光子励起の効率が悪く、かつ蛍光抑制効果が効果的に働くため、分子はイレース光励起により発光しない。すなわち、Ie=1/(τσtwo)1/2未満の状態では、蛍光抑制機能が優先する。
【００４８】
例えば、ローダミン６Ｇでは、照明光の波長が７５０ｎｍにおいて、σtwoは2×10-48cm4s、σdipは10-18cm2、τは３．７５nsである。このときの臨界強度は、ほぼ1.2×1028cm-2s-1となる。したがって、臨界強度未満の、例えば、Ie=8.2×1027cm-2s-1の条件では、R(Ie)は０．０４となるので、この場合の照明光は、イレース光として機能する。また、これよりもフォトンフラックスが一桁大きく、かつ臨界強度よりも大きい、例えば、Ie=5×1029cm-2s-1では、R(Ie)は０．５となる。この条件では、分子は２光子で発光するので、この場合の照明光は、ポンプ光として機能する。このように、波長７５０ｎｍの照明光は、ローダミン６Ｇに対しては、フォトンフラックスがIe=1/(τσtwo)1/2を境にして、ポンプ光とイレース光とに機能が分かれる。
【００４９】
また、蛍光検出可能なＳ１状態の分子を２光子励起により生成するためには、ナノ秒以下の短パルス光の励起照射で十分であるが（例えば、文献「Opt.Eng.vol.44(2005)033602」参照）、Ｓ１状態の分子をＳ２状態に励起して効率的に蛍光を抑制するためには、励起過程が安定状態として平衡するナノ秒以上の長い時間の照射を要する。これらのことが、ポンプ光およびイレース光の照射時間の目安となる。
【００５０】
以下、本発明の実施の形態について、ローダミン６Ｇにより染色された試料を観察する超解像顕微鏡を例にとって説明する。
【００５１】
ここで、ローダミン６Ｇは、水中では、例えば図５に示すように、Ｓ０の基底状態からＳ１状態への吸収波長領域が、波長５３０ｎｍを中心励起波長として、波長４８０ｎｍから波長５４０ｎｍまで広がっている。また、蛍光バンドは、波長５６０ｎｍを中心に、波長５４０ｎｍから波長６００ｎｍの波長領域に広がっている。さらに、Ｓ１状態からＳ２状態への吸収バンドは、５００ｎｍより長波長から８００ｎｍ近傍までの比較的広い領域に展開している。なお、図５において、横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は吸収率・蛍光効率を示している。
【００５２】
ところが、近年では、波長７４０ｎｍ〜８４０ｎｍを中心とする近赤外の領域において、２光子励起過程によりＳ０状態からＳ１状態への吸収が可能な蛍光スペクトルが観測されている（例えば、文献「A.Fischer.et.al.Appl.Opt.34.1989(1995)」参照）。その一方で、ナノ秒レーザを用いた２波長蛍光分光法では、上記の波長領域において、Ｓ１状態からＳ２状態への吸収による蛍光抑制効果が確認されている。
【００５３】
そこで、以下に説明する本発明の実施の形態にかかる超解像顕微鏡では、波長７７５ｎｍのレーザ光を、ポンプ光およびイレース光として用いる。
【００５４】
（第１実施の形態）
図６は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成図である。本実施の形態は、２台のファイバレーザ光源１１および２１を用いて、ポンプ光およびイレース光を生成する。
【００５５】
ファイバレーザ光源１１は、半導体レーザ１２、コリメータレンズ１３、カップリングレンズ１４、ファイバ増幅器１５、カップリングレンズ１６および倍波結晶素子１７を有して構成する。半導体レーザ１２は、波長９００ｎｍの赤外光を出射する赤外半導体レーザを用い、この半導体レーザ１２から出射されたレーザ光を、コリメータレンズ１３により平行光にした後、カップリングレンズ１４を経てファイバ増幅器１５に導入する。
【００５６】
ファイバ増幅器１５は、レーザ活性媒質として、例えばエルビウムイオンをドープした、コア直径が２μｍ程度、長さが１０ｍｍ程度のファイバ増幅器を用い、このファイバ増幅器１５に半導体レーザ１２からの波長９００ｎｍの赤外レーザ光を導入することにより、波長１．５５μｍのシングルモードのレーザ光を光増幅して出射させる。なお、ファイバ増幅器１５は、そのコア構造や長さを最適化することにより、ファイバ端から１００Ｗ〜数十ｋＷの出力のレーザ光を出射することが可能である。
【００５７】
ファイバ増幅器１５から出射される波長１．５５μｍのレーザ光は、カップリングレンズ１６を経て倍波結晶素子１７に入射させて倍波変換し、これにより倍波結晶素子１７から波長７７５ｎｍのレーザ光を出射させる。
【００５８】
一方、ファイバレーザ光源２１は、ファイバレーザ光源１１と同様に、半導体レーザ２２、コリメータレンズ２３、カップリングレンズ２４、ファイバ増幅器２５、カップリングレンズ２６および倍波結晶素子２７を有して構成して、倍波結晶素子２７から波長７７５ｎｍのレーザ光を出射させる。
【００５９】
本実施の形態では、ファイバレーザ光源１１の半導体レーザ１２を、制御部３１によりパルスジェネレータ３２を介して駆動して、半導体レーザ１２から図３に示したようにフェムト秒オーダの時間幅を有するショートパルス光を出射させ、これにより倍波結晶素子１７から波長７７５ｎｍの尖頭値（波高値）の高いポンプ光を出射させる。
【００６０】
また、ファイバレーザ光源２１の半導体レーザ２２は、制御部３１によりパルスジェネレータ３３を介して、ファイバレーザ光源１１の半導体レーザ１２と同期して駆動して、半導体レーザ２２から図３に示したようにナノ秒オーダの時間幅を有するロングパルス光を出射させ、これにより倍波結晶素子２７から波長７７５ｎｍの尖頭値（波高値）の低いイレース光を出射させる。
【００６１】
ファイバレーザ光源１１から出射されるポンプ光は、反射光学素子３４、ビームコンバイナ３５、ハーフミラー３６および顕微鏡対物レンズ３７を経て、走査ステージ３８上の試料３９に集光し、これにより試料３９内の所望の分子（ここでは、ローダミン６Ｇ）を励起する。
【００６２】
また、ファイバレーザ光源２１から出射されるイレース光は、空間変調素子であるスパイラル位相板４１により中空ビームが形成されるように位相変調した後、反射ミラー４２を経てビームコンバイナ３５によりポンプ光と空間的に同軸に合成して、ハーフミラー３６および顕微鏡対物レンズ３７を経て、走査ステージ３８上の試料３９に集光する。
【００６３】
ビームコンバイナ３５は、ポンプ光の偏光方向とイレース光の偏光方向とが直交する場合には、偏光ビームスプリッタにより構成して、ポンプ光とイレース光とを空間的に同軸に合成する。また、スパイラル位相板４１は、例えば、図７に拡大平面図を示すように、石英基板の中央部を光軸対称に８角形状に８分割し、その８分割した領域を、イレース光の例えば中心波長に対して、位相差が光軸の周りに２πで周回するように、λ／８ずつ位相を異ならせて階段状にエッチングして形成する。このスパイラル位相板４１をイレース光が通過すると、光軸対象位置では位相が反転しているので、顕微鏡対物レンズ３７により集光すると中空ビームとなる。
【００６４】
走査ステージ３８は、試料３９へのポンプ光およびイレース光の照射に同期して、制御部３１により、顕微鏡対物レンズ３７の光軸と直交する平面内で２次元移動し、これにより試料３９をポンプ光およびイレース光で２次元走査する。
【００６５】
一方、ポンプ光およびイレース光の照射により、試料３９から発生する蛍光（光応答信号）は、顕微鏡対物レンズ３７およびハーフミラー３６を経てショートパスフィルタ４３に入射させ、ここでポンプ光およびイレース光をブロックし、蛍光のみをプロジェクションレンズ４４に導いて光電子増倍管４５で受光する。この光電子増倍管４５の出力は、図示しないコンピュータに取り込んで、２次元蛍光画像を得る。なお、ローダミン６Ｇの蛍光帯は、波長５５５ｎｍをピークとして、前後４０ｎｍ程度のバンドを有するので、ショートパスフィルタ４３は、例えば波長６００ｎｍ以上の長波長側をカットするように構成して、波長７７５ｎｍのポンプ光またはイレース光の散乱光が光電子増倍管４５に入射しないようにする。
【００６６】
したがって、図６に示す超解像顕微鏡は、２台のファイバ光源１１，２１を含んで光源手段を構成し、ビームコンバイナ３５、ハーフミラー３６および顕微鏡対物レンズ３７を含んで光学系を構成し、走査ステージ３８を含んで走査手段を構成し、さらに、ショートパスフィルタ４３、プロジェクションレンズ４４および光電子増倍管４５を含んで検出手段を構成している。
【００６７】
本実施の形態におけるように、ローダミン６Ｇにより染色された試料を観察する場合、波長７７５ｎｍの光を用いた場合の２光子吸収断面積σtwo(λ)は、200×10-50cm4s程度である。また、この波長領域で、実質的にＳ１状態から蛍光抑制に寄与する蛍光抑制断面積σdip(λ)は、10-17cm2程度である。
【００６８】
ここで、ポンプ光のパルス幅ｔを５psとした場合に、検出に必要なＳ１状態の分子を生成するための光子密度（フォトンフラックス：Ｉ）を見積もる。ローダミン６Ｇの１分子について、Ｓ１状態をとる確率をｎ１(t)とすると、レート方程式は、下記の（３）式で表される。
【００６９】
【数３】
0005086765.tif 000004
【００７０】
上記（３）式に、例えば、Ｉ＝1029cm-2s-1を代入すると、ｎ１(t)は０．１となり、蛍光現象が飽和することなく、十分な蛍光強度が得られることが分かる。この光子密度は、顕微鏡対物レンズ３７の開口数を１．４として集光する場合のポンプ光の強度に換算すると、８５Ｗとなる。
【００７１】
さらに、超解像機能の発現に必要なフォトンフラックス：Ieを見積もる。イレース光無照射時に対する蛍光強度の比Ｒ（Dip-Ratio）は、下記の（４）式で与えられる。
【００７２】
【数４】
0005086765.tif 000005
【００７３】
ここで、ローダミン６ＧのＳ１状態における蛍光寿命τは、例えばメタノール中で３．７５nsであるので、イレース光のパルス幅を３．７５ns以上に設定し、例えば、Ｉｅ＝1026cm-2s-1と仮定すると、Ｒ＝０．２１となる。この値は、超解像効果を発現するのに十分なフォトンフラックスである。このフォトンフラックスを、同様に、顕微鏡対物レンズ３７の開口数を１．４として集光する場合のイレース光の強度に換算すると、３４０ｍＷとなる。このイレース光強度であれば、上記（３）式のｎ１(t)は８×１０−５となり、イレース光自体の２光子励起による発光は、完全に無視することができる。
【００７４】
なお、上記のポンプ光およびイレース光のそれぞれの強度は、対応する半導体レーザ１２，２２自体から出射するパルス光の尖頭値（波高値）および／または対応するファイバ増幅器１５，２５のコア構造や長さを適切に制御して設定する。
【００７５】
以上のように、本実施の形態の超解像顕微鏡によれば、同一波長のポンプ光およびイレース光を用いるので、これらの光軸を同軸に合成するビームコンバイナとして、例えば両者の偏光方向を直交させることにより、ダイクロイックミラー等の高価な素子を用いることなく、安価な偏光ビームスプリッタを用いて合成することができる。また、ポンプ光およびイレース光の共通光路におけるハーフミラー３６や顕微鏡対物レンズ３７等の各光額素子の設計も容易になり、光学系全体のスループットを低下させることなく、収差を劇的に低減することが可能となる。
【００７６】
また、超解像顕微鏡の空間分解能は、下記の（５）式で与えられることが知られている（例えば、文献「Opt.Eng.vol.44(2005)033602」）。
【００７７】
【数５】
0005086765.tif 000006
【００７８】
したがって、本実施の形態の場合、τ：３．７５ns、σ：10-17cm2、Ie：1026cm-2s-1、λe：７７５ｎｍ、であるので、顕微鏡対物レンズ３７の開口数（NA）を１．４として、空間分解能（Γ）を演算すると、ほぼ１４３ｎｍとなる。これに対し、ポンプ光の単独照射、すなわち、波長７７５ｎｍの２光子励起で得られる空間分解能は、レイリーの式（０．６１×λ／ＮＡ）から、ほぼ３３８ｎｍであるので、本実施の形態によれば、空間分解能を従来の顕微鏡の２倍以上も向上できる。
【００７９】
（第２実施の形態）
図８は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成図である。本実施の形態は、波長７５５ｎｍの赤外光を出射する１台の半導体レーザ５１を用いて、ポンプ光およびイレース光を生成する。このため、制御部５２の制御のもとに、パルスジェネレータ５３から図３に示したような急峻な立ち上がりを有する駆動パルスを半導体レーザ５１に供給して、半導体レーザ５１を駆動する。
【００８０】
このように、半導体レーザ５１に急峻な立ち上がりを有する駆動パルスを供給すると、半導体レーザ５１からは、発光の立ち上がりで、ピコ秒オーダの極めて狭い時間幅で、波長７５５ｎｍの発光を含む発光チャープピークが現れる。その後は、波長７５５ｎｍで安定したナノ秒オーダの波高値の低いロングパルスが現れる。このようなレーザ発光特性は、半導体レーザにおいて一般的な特性である。
【００８１】
半導体レーザ５１から出射されたレーザ光は、コリメータレンズ５５により平行光にして、波長分散特性を有する非線形光学素子５６に入射させる。非線形光学素子５６は、尖頭値（波高値）の高いパルス入射光に対しては、光カー効果により偏光面を９０度回転させて出射させ、尖頭値の低いパルス入射光に対しては、偏光面を回転させることなく出射させるように構成する。
【００８２】
すなわち、非線形光学素子５６は、尖頭値の高いパルス光が入射した場合には、媒質内で高次の非線形光学効果を誘導して、瞬間的に媒質の屈折率分布を変化させ、これにより電気感受率すなわち電気的応力テンソルを変化させて、入射光の位相を著しく変化させて偏波面を９０度回転して出射させ、尖頭値の低いパルス光が入射した場合には、通常の線形的な応答により、入射光を透過させるように、光の波長および強度に対して光学媒質の長さや材質を適切に構成する。このような非線形光学素子５６は、通常の石英やプラスチックのような有機材を用いて簡単かつ安価に構成することができる。
【００８３】
非線形光学素子５６を出射したレーザ光は、偏光ビームスプリッタ５７に入射させて、例えば偏光面が回転されたショートパルスは偏光ビームスプリッタ５７で反射させてポンプ光として出射させ、偏光面の回転を受けないロングパルスは偏光ビームスプリッタ５７を透過させてイレース光として出射させる。したがって、本実施の形態の超解像顕微鏡は、半導体レーザ５１、コリメータレンズ５５、非線形光学素子５６および偏光ビームスプリッタ５７を含んで光源手段を構成している。
【００８４】
偏光ビームスプリッタ５７から出射されるポンプ光は、第１実施の形態と同様に、反射光学素子３４、ビームコンバイナ３５、ハーフミラー３６および顕微鏡対物レンズ３７を経て、走査ステージ３８上の試料３９に集光し、これにより試料３９内の所望の分子を励起する。
【００８５】
また、偏光ビームスプリッタ５７から出射されるイレース光は、反射光学素子６１および６２を経て、第１実施の形態と同様のスパイラル位相板４１に入射させ、ここで中空ビームが形成されるように位相変調した後、反射ミラー４２を経て偏光ビームスプリッタからなるビームコンバイナ３５によりポンプ光と空間的に同軸に合成して、ハーフミラー３６および顕微鏡対物レンズ３７を経て、走査ステージ３８上の試料３９に集光する。
【００８６】
走査ステージ３８は、半導体レーザ５１のパルス駆動に同期して、制御部５２により、顕微鏡対物レンズ３７の光軸と直交する平面内で２次元移動し、これにより試料３９をポンプ光およびイレース光で２次元走査する。その他の構成および動作は、第１実施の形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。
【００８７】
本実施の形態の超解像顕微鏡によれば、第１実施の形態と同様の効果が得られる他、１つの半導体レーザ５１から出射されたレーザ光を、その尖頭値に応じて非線形光学素子５６により偏光面を選択的に９０度回転させて、偏光ビームスプリッタ５７によりポンプ光とイレース光とに分離して出射させるようにしたので、第１実施の形態の場合よりも、光源手段をより簡単かつ安価に構成できる利点がある。
【００８８】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、走査ステージ１７により試料１８を２次元走査するようにしたが、同軸となったポンプ光とイレース光との光路中に、２枚の揺動ミラーを有する２次元のガルバノスキャナを配置して２次元走査するように構成したり、１次元の走査ステージと１次元のガルバノスキャナとを組み合わせて、２次元走査するように構成したり、することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ナノ秒のイレース光パルスによる分子の蛍光抑制過程を説明するための図である。
【図２】ピコ秒のイレース光パルスによる分子の蛍光抑制過程を説明するための図である。
【図３】本発明の原理を説明する２光子過程と蛍光抑制過程とを示す図である。
【図４】１色の光を用いて超解像顕微鏡を構成する場合のショートパルスポンプ光およびロングパルス光の波形制御を説明する模式図である。
【図５】ローダミン６Ｇを観察する場合の吸収波長帯域および蛍光バンドを示す図である。
【図６】本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部構成図である。
【図７】図６に示すスパイラル位相板の構成を示す拡大平面図である。
【図８】本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成図である。
【図９】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１０】図９に示す分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１１】図９に示す分子の第２励起状態を示す概念図である。
【図１２】図９に示す分子が第２励起状態から基底状態に戻る状態を概念的に示す図である。
【図１３】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１４】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【符号の説明】
【００９０】
１  反射ミラー
２  ビームコンバイナ
３  空間変調素子
１１，２１  ファイバレーザ光源
１２，２２  半導体レーザ
１３，２３  コリメータレンズ
１４，２４  カップリングレンズ
１５，２５  ファイバ増幅器
１６，２６  カップリングレンズ
１７，２７  倍波結晶素子
３１  制御部
３２，３３  パルスジェネレータ
３４  反射光学素子
３５  ビームコンバイナ
３６  ハーフミラー
３７  顕微鏡対物レンズ
３８  走査ステージ
３９  試料
４１  スパイラル位相板
４２  反射ミラー
４３  ショートパスフィルタ
４４  プロジェクションレンズ
４５  光電子増倍管
５１  半導体レーザ
５２  制御部
５３  パルスジェネレータ
５５  コリメータレンズ
５６  非線形光学素子
５７  偏光ビームスプリッタ
６１，６２  反射光学素子
【図１】
0005086765.tif 000007
【図２】
0005086765.tif 000008
【図３】
0005086765.tif 000009
【図４】
0005086765.tif 000010
【図５】
0005086765.tif 000011
【図６】
0005086765.tif 000012
【図７】
0005086765.tif 000013
【図８】
0005086765.tif 000014
【図９】
0005086765.tif 000015
【図１０】
0005086765.tif 000016
【図１１】
0005086765.tif 000017
【図１２】
0005086765.tif 000018
【図１３】
0005086765.tif 000019
【図１４】
0005086765.tif 000020