(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のタンパク質を全て発現しないコムギ：
（１）配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-A1タンパク質、
（２）配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-B1タンパク質、
（３）配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-D1タンパク質、
（４）配列番号７の顆粒性澱粉合成酵素-A1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-A1タンパク質、
（５）配列番号９の顆粒性澱粉合成酵素-B1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-B1タンパク質、及び
（６）配列番号11の顆粒性澱粉合成酵素-D1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-D1タンパク質。
【請求項２】
以下のタンパク質が有する酵素活性を全てもたないコムギ：
（１）配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-A1タンパク質、
（２）配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-B1タンパク質、
（３）配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-D1タンパク質、
（４）配列番号７の顆粒性澱粉合成酵素-A1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-A1タンパク質、
（５）配列番号９の顆粒性澱粉合成酵素-B1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-B1タンパク質、及び
（６）配列番号11の顆粒性澱粉合成酵素-D1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-D1タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２記載のコムギ由来の穀粉を含む食品。
【請求項４】
食品がベーカリー食品である、請求項３記載の食品。
【請求項５】
請求項１又は２記載のコムギ由来の穀粉を利用して加工する製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コムギの胚乳において、顆粒性澱粉合成酵素および澱粉合成酵素II型タンパク質を発現しないコムギに関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプンは、グルコースがα-１，４結合で連なった直鎖状のアミロースとα-１,６結合を介して枝分かれ構造をもったアミロペクチンという２つの成分の混合物である。これら成分は種々の酵素の働きによって合成され、穀物においては種子の胚乳部分に蓄積される。アミロースは主に顆粒性澱粉合成酵素遺伝子にコードされる顆粒結合性澱粉合成酵素によって合成されることがわかっている。一方、アミロペクチンは複数の酵素の働きによって合成されている。（可溶性）澱粉合成酵素I型、（可溶性）澱粉合成酵素II型、（可溶性）澱粉合成酵素III型、枝作り酵素、枝切り酵素などである。
またデンプンは高度に結晶化した顆粒の形で植物に貯蔵されている。これに水分を加えて加熱することでデンプン粒は次第に膨潤し、ある一定の温度（糊化ピーク温度）で一気に結晶構造が崩れ糊状になる（糊化）。その後、冷却することで糊化デンプンは次第に粘性が増大しゲル化（老化）する。このような特性や、アミロースとアミロペクチンの含量比は由来する植物種によって大きく異なることが知られている。
デンプンは植物における貯蔵物質であるとともに、動物にとっては重要なエネルギー源である。デンプンを摂取する際には、これを含む穀粒を加工し食品に利用するだけでなく、上記特性を利用し、増粘剤、保水剤、ゲル形成剤などの添加剤として使用される。一方、工業的にも糊やフィルムの原料として古くから利用されている。また、化学的、あるいは物理的に修飾を施した加工デンプンなどにも多くの需要がある。デンプンは貯蔵される器官（種子や塊茎）の重量の大部分を占めており、デンプン特性が変化すれば、これらを利用した上記製品の食感、あるいは加工性などに与える影響は大きいことから、多様な特性を持ったデンプンの開発に対する需要は高い。【０００３】
前述したようなデンプンの特性は植物種によって大きく異なる。しかしながら、同一植物種内でのデンプンの多様性については、アミロース含量の違いによる物性の変化に負うところが大きい。例えばコムギにおいては通常タイプのデンプンであれば、アミロース含量はおよそ３０％前後であるが、含量が２０％前後である低アミロース系統が知られている。低アミロース系コムギデンプンは通常タイプに比べてうどん等麺用粉としての利用に優れているとされ、商業的にも広く栽培されている。また、イネやトウモロコシではアミロース含量が極端に低いモチ性デンプンを蓄積するタイプが知られていたが、コムギでは中村ら（特許文献１）によって初めてモチ性コムギが育種され、通常タイプに比べて独特の加工性や食感を有していることが知られている。アミロース含量はデンプンの特性を表す特徴の一つとしてよく議論されているが、同一植物種内で見た場合、アミロース含量以外の多様性は低い。それゆえコムギ由来デンプンあるいはこれを含むコムギ粉は多様性の低いものとなり、画一的な商品にしかならないため、市場は既に成熟した感がある。このため新たな特性をもったデンプンを蓄積するコムギを開発することができれば、従来とは異なった特徴を与える改良製品、あるいは新たな用途の開発が可能となることから、このようなコムギの開発は切に望まれている。
新規な特性を有するコムギの作出例として、山守らは、アミロペクチン分岐鎖を合成する酵素の１つである澱粉合成酵素II型を欠損したコムギ系統を開発したことを報告している（非特許文献１参照）。このコムギではアミロースが高含量で蓄積されていることも報告されているが、その他の特性に関する研究はほとんど進められておらず、実用化には至っていない。【０００４】
コムギにおいてアミロースは顆粒性澱粉合成酵素遺伝子にコードされている顆粒性澱粉合成酵素タンパク質によって合成されている。異質6倍体であるコムギ染色体には、同祖染色体であるA、B、Dの３つのゲノムが存在する。通常であれば、顆粒性澱粉合成酵素遺伝子は３つ存在し、これらの遺伝子から顆粒性澱粉合成酵素が発現している(顆粒性澱粉合成酵素-A1、顆粒性澱粉合成酵素-B1、顆粒性澱粉合成酵素-D1)。しかし、ゲノムDNA上に生じた変異により、タンパク質が発現されないタイプが存在し、その発現の組み合わせは野生型を含めると8通りとなる。このパターンに応じてアミロース含量に有意な差が見られることが知られており、１つないし２つを欠損したコムギ系統は低アミロース系統、３つ全てを欠損したタイプがモチ性コムギとなる。この欠損パターンを簡便に識別する方法としては胚乳で発現しているタンパク質を直接解析する方法やゲノムDNA配列を元にして調べる方法が確立されている（例えば、特許文献１及び非特許文献２参照）。
一方、澱粉合成酵素II型タンパク質はアミロペクチンの分岐鎖合成に関わる酵素の1つとして知られているが、7A、7B、7D染色体上に存在する3つの澱粉合成酵素II型遺伝子によりコードされている(澱粉合成酵素II型-A1、澱粉合成酵素II型-B1、澱粉合成酵素II型-D1)。澱粉合成酵素II型タンパク質に関しても、欠損パターンを識別する方法が、本発明者らによって既に開発されている。この方法を用いて澱粉合成酵素II型タンパク質に関しても発現パターンが8通りに分類できるが、それぞれのパターンにおけるデンプン特性の多様性に関しては十分には調べられていない。【０００５】
【特許文献１】特開平６−１２５６６９号公報
【非特許文献１】Yamamori et. al., Theor. Appl. Genet (2000)101:21-29
【非特許文献２】Nakamura et. Al., (2002) Genome 45:1150-1156
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は、上記酵素の発現を制御することにより、新たな特性のデンプンを蓄積するコムギを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
新たな特性を有するコムギを得るために鋭意研究を行った結果、特定の遺伝子を変異させ、また特定のタンパク質の発現を制御することによって、非常に高い生デンプン分解率を有するコムギ及び非常に低い糊化デンプン粘度を有するコムギを得ることができた。すなわち、本発明は、（１）配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-A1タンパク質、（２）配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-B1タンパク質、（３）配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-D1タンパク質、（４）配列番号７の顆粒性澱粉合成酵素-A1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-A1タンパク質、（５）配列番号９の顆粒性澱粉合成酵素-B1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-B1タンパク質、及び（６）配列番号１１の顆粒性澱粉合成酵素-D1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-D1タンパク質を全て発現しないコムギを提供する。
また、本発明は、前記タンパク質（１）〜（６）が有する酵素活性を全てもたないコムギを提供する。
また、本発明は、蓄積されるデンプンの30重量％以上が粒径10μm以上のデンプン粒を形成しないコムギを提供する。
また、本発明は、アミロペクチン分岐鎖において、重合度が70までの分岐鎖のうち、重合度３〜５の分岐鎖の数の割合が1.5％以上であるコムギを提供する。
また、本発明は、生デンプンのアミラーゼによる分解率が80％以上であるコムギを提供する。【０００８】
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）の１つ以上を発現せず、かつ、前記タンパク質（４）から（６）の１つ以上を発現しないコムギ（ただし、タンパク質（２）、（４）及び（５）のみを同時に発現しないコムギは除く）を提供する。
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）が有する酵素活性の１つ以上の酵素活性をもたず、かつ、前記タンパク質（４）から（６）が有する酵素活性の１つ以上の酵素活性をもたないコムギ（ただし、タンパク質（２）、（４）及び（５）が有する酵素活性のみをもたないコムギは除く）を提供する。
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）のいずれか２つを発現せず、かつ、前記タンパク質（４）から（６）の１つ以上を発現しないコムギを提供する。
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）が有する酵素活性のいずれか２つの酵素活性をもたず、かつ、前記タンパク質（４）から（６）が有する酵素活性の１つ以上の酵素活性をもたないコムギを提供する。
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）の２つ以上を発現せず、かつ、前記タンパク質（４）から（６）の２つ以上を発現しないコムギを提供する。
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）が有する酵素活性の２つ以上の酵素活性をもたず、かつ、前記タンパク質（４）から（６）が有する酵素活性の２つ以上の酵素活性をもたないコムギを提供する。
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）のいずれか２つを発現せず、かつ、前記タンパク質（４）から（６）をすべて発現しないコムギを提供する。
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）が有する酵素活性のいずれか２つの酵素活性をもたず、かつ、前記タンパク質（４）から（６）が有する酵素活性のすべての酵素活性をもたないコムギを提供する。【０００９】
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）の２つ以上を発現しないコムギであって、顆粒性澱粉合成酵素タンパク質の発現の組合せが前記コムギと同じであってタンパク質（１）から（３）をすべて発現するコムギと比較してデンプンの糊化後の粘度が小さいコムギを提供する。
また、本発明は、前記タンパク質（１）から（３）の２つ以上を発現しないコムギであって、顆粒性澱粉合成酵素タンパク質の発現の組合せが前記コムギと同じであってタンパク質（１）から（３）をすべて発現するコムギと比較してデンプンの糊化後の老化耐性が向上したコムギを提供する。
また、本発明は、 
（７）配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子において、少なくとも位置124〜412の塩基が欠失及び／又は置換した澱粉合成酵素II型-A1遺伝子変異体、（８）配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子において、少なくとも位置6145〜6146の間への1つ以上の塩基が挿入した澱粉合成酵素II型-B1遺伝子変異体、及び（９）配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子において、少なくとも位置2590〜2652の塩基が欠失した澱粉合成酵素II型-D1遺伝子変異体の１つ以上を検出する工程、並びに（４）配列番号７の顆粒性澱粉合成酵素-A1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-A1タンパク質、（５）配列番号９の顆粒性澱粉合成酵素-B1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-B1タンパク質、及び（６）配列番号11の顆粒性澱粉合成酵素-D1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-D1タンパク質の１つ以上を検出する工程を含むことを特徴とする特定コムギの選抜方法を提供する。【００１０】
また、本発明は、胚を除いた成熟種子中にグルコースを0.1重量％以上含有するコムギを提供する。
また、本発明は、胚を除いた成熟種子中にマルトースを0.1重量％以上含有するコムギを提供する。
また、本発明は、胚を除いた成熟種子中にスクロースを１重量％以上含有するコムギを提供する。
ここで、成熟種子とは、「穂首が黄化し、粒はろう状の硬さに達した」（転作全書第1巻  ムギ（農文協編）88ページ）時期の種子であり、かつ発芽の兆候のないものをいう。
また、本発明は、アミロペクチンのグルコース分岐鎖において、重合度が60までの分岐鎖のうち、重合度２〜５の分岐鎖の数の割合が３％以上であるコムギを提供する。
また、本発明は、前記コムギ又は前記コムギ由来のデンプンを含む食品を提供する。
また、本発明は、前記コムギ又は前記コムギ由来のデンプンを含む工業製品を提供する。
また、本発明は、前記コムギ又は前記コムギ由来のデンプンを利用して加工する製品を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のコムギは、（１）配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-A1タンパク質、（２）配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-B1タンパク質、（３）配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-D1タンパク質、（４）配列番号７の顆粒性澱粉合成酵素-A1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-A1タンパク質、（５）配列番号９の顆粒性澱粉合成酵素-B1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-B1タンパク質、及び（６）配列番号11の顆粒性澱粉合成酵素-D1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-D1タンパク質を全て発現しない。【００１２】
配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-A1タンパク質（１）の例としては、配列番号２に記載の配列で表される澱粉合成酵素II型-A1タンパク質又は配列番号２に記載の配列とホモロジーが90%以上である澱粉合成酵素II型-A1タンパク質が挙げられる。ここで、ホモロジー計算はGenetyx(ゼネティックス社)を用いて計算される。
配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-B1タンパク質（２）の例としては、配列番号４に記載の配列で表される澱粉合成酵素II型-B1タンパク質又は配列番号４に記載の配列とホモロジーが90％以上である澱粉合成酵素II型-B1タンパク質が挙げられる。
配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-D1タンパク質（３）の例としては、配列番号６に記載の配列で表される澱粉合成酵素II型-D1タンパク質又は配列番号６に記載の配列とホモロジーが90％以上である澱粉合成酵素II型-D1タンパク質が挙げられる。
配列番号７の顆粒性澱粉合成酵素-A1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-A1タンパク質（４）の例としては、配列番号８に記載の配列で表される顆粒性澱粉合成酵素-A1タンパク質又は配列番号８に記載の配列とホモロジーが90%以上である顆粒性澱粉合成酵素-A1タンパク質が挙げられる。
配列番号９の顆粒性澱粉合成酵素-B1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-B1タンパク質（５）の例としては、配列番号10に記載の配列で表される顆粒性澱粉合成酵素-B1タンパク質又は配列番号10に記載の配列とホモロジーが90％以上である顆粒性澱粉合成酵素-B1タンパク質が挙げられる。
配列番号11の顆粒性澱粉合成酵素-D1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-D1タンパク質（６）の例としては、配列番号12に記載の配列で表される顆粒性澱粉合成酵素-D1タンパク質又は配列番号12に記載の配列とホモロジーが90％以上である顆粒性澱粉合成酵素-D1タンパク質が挙げられる。【００１３】
上記タンパク質（１）〜（６）をコードする遺伝子の有無及び変異を検出することによって、上記タンパク質（１）〜（６）が発現していないことを確認することができる。上記タンパク質（１）〜（６）が発現していないことを確認する方法としては、遺伝子配列の変異を検出することができる方法であれば、当業者に知られた何れの方法であってもよく、例えばPCR法等が挙げられる。
PCR法は、特に限定されず、公知である種々の改良方法を用いることができるが、一例を挙げれば、プライマーのペアー、鋳型（被検）DNAの他にTris-HCl、KCl、MgCl2、各dNTP、TaqDNAポリメラーゼ等の試薬類を混合してPCR反応液とする。PCRの1サイクルは、熱変性、プライマーのアニーリング、DNAポリメラーゼによるDNA合成反応の3つのステップからなっている。各ステップはそれぞれ異なった反応温度と反応時間を必要とするので増幅しようとするDNA領域の塩基配列とその長さによって適切な範囲とする。このような操作のためのthermal cyclerが市販されている。TaqDNAポリメラーゼ、MgCl2の濃度や反応サイクル数等好適なPCR条件の検討、あるいはnestedPCRを用いれば、さらに検出感度を向上させることができる。
PCR反応物は、免疫反応を用いて同定しても、どのように同定してもよいが、電気泳動させて、必要な場合は陽性コントロールや、陰性コントロールを用いて電気泳動像で明瞭なバンドが認められれば、被検物質中に検出物質（顆粒性澱粉合成酵素遺伝子および澱粉合成酵素II型遺伝子変異コムギ）が存在することが確認できる。【００１４】
PCRで使用するプライマーとしては、上記タンパク質（１）〜（６）をコードする遺伝子の変異を検出できるものであれば、どのようなものでも使用できる。
本発明者らは、澱粉合成酵素II型遺伝子の変異体として、（７）配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子において、少なくとも位置124〜412の塩基が欠失及び／又は置換した澱粉合成酵素II型-A1遺伝子変異体（配列番号27）、（８）配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子において、少なくとも位置6145〜6146の間への1つ以上の塩基が挿入した澱粉合成酵素II型-B1遺伝子変異体（配列番号28）、及び（９）配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子において、少なくとも位置2590〜2652の塩基が欠失した澱粉合成酵素II型-D1遺伝子変異体（配列番号29）を見出した。
したがって、配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子の変異を検出できるプライマーとしては、例えば、
（ｉ）その3'末端が配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子領域の位置124よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子領域の位置412よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、
（ii）その3'末端が配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子領域の位置412よりも下流に欠失部分124〜412を跨ぐ様にしてハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子領域の位置412よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、及び
（iii）その3'末端が配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子領域の位置124よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子領域の位置124よりも上流に欠失部分124〜412を跨ぐ様にしてハイブリダイズするプライマーとの組み合わせが挙げられる。
さらに上記（ｉ）、（ii）、（iii）のプライマーは澱粉合成酵素II型-A1遺伝子領域を特異的に検出できるように設計することが望ましい。具体的には、他のゲノム由来の澱粉合成酵素II型遺伝子領域（澱粉合成酵素II型-B1、澱粉合成酵素II型-D1）と完全マッチしない領域に設計したプライマーである。
具体的には、配列番号13又は14のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号15から17のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせが挙げられる。【００１５】
また、配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子の変異を検出できるプライマーとしては、例えば、
（ｉ）その3'末端が配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子領域の位置6145よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子領域の位置6146よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、
（ii）その3'末端が配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子領域の位置6145〜6146の間に挿入された塩基にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子領域の位置6146よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、
（iii）その3'末端が配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子領域の位置6145よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子領域の位置6145〜6146の間に挿入された塩基にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、及び
（iv）その3'末端が配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子領域の位置6145〜6146の間に挿入された塩基にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子領域の位置6145〜6146の間に挿入された塩基にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせが挙げられる。
さらに上記（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）のプライマーは澱粉合成酵素II型-B1遺伝子領域を特異的に検出できるように設計することが望ましい。具体的には、他のゲノム由来の澱粉合成酵素II型遺伝子領域（澱粉合成酵素II型-A1、澱粉合成酵素II型-D1）と完全マッチしない領域に設計したプライマーである。
具体的には、配列番号18から20のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号21から23のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせが挙げられる。【００１６】
また、配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子の変異を検出できるプライマーとしては、例えば、
（ｉ）その3'末端が配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子領域の位置2590よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子領域の位置2652よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、
（ii）その3'末端が配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子領域の位置2652よりも下流に欠失部分2590〜2652を跨ぐ様にしてハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子領域の位置2652よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、及び
（iii）その3'末端が配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子領域の位置2590よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子領域の位置2590よりも上流に欠失部分2590〜2652を跨ぐ様にしてハイブリダイズするプライマーとの組み合わせが挙げられる。
さらに上記（ｉ）、（ii）、（iii）のプライマーは澱粉合成酵素II型-D1遺伝子領域を特異的に検出できるように設計することが望ましい。具体的には、他のゲノム由来の澱粉合成酵素II型遺伝子領域（澱粉合成酵素II型-A1、澱粉合成酵素II型-B1）と完全マッチしない領域に設計したプライマーである。
具体的には、配列番号24又は25のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号26のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせが挙げられる。【００１７】
また、上記タンパク質（４）〜（６）をコードする遺伝子の変異を検出する方法としては、Nakamura et. Al., (2002) Genome 45:1150-1156に記載の方法を使用することができる。【００１８】
さらに、上記タンパク質（１）〜（６）をコードする遺伝子の変異を検出する方法としてはPCR法以外にLAMP法、NASBA法、LCR法、SDA法、RCR法、TMA法、RT-PCRによるmRNAの定性もしくは定量法等が挙げられる。本遺伝子配列の変異を検出できる方法であればどのような方法を用いても良いが、一例としてLAMP法を挙げれば、Notomiらの報告（Notomi et. al., Nucleic Acids Research (2000). 28, No. 12, e63）にある方法を参考にプライマーを設計する。この時検出したい配列が（１）の配列であれば、配列番号13の位置124から412を挟み込む領域を検出領域としてプライマーを設計すればよい。また検出したい配列が（２）の配列であれば配列番号14の位置6145から6146までの配列の一部を検出領域としてプライマーを設計すればよい。また検出したい配列が（３）の配列であれば配列番号15の2590から2652を挟み込む領域を検出領域としてプライマーを設計すればよい。設計したプライマーに加えて反応に必要な鋳型DNA溶液、dNTP、BstDNApolymerase、およびその他反応に必要な試薬を加えて65℃で反応を行い、産物を適当な方法で検出することで、澱粉合成酵素II型遺伝子変異コムギの検出、もしくはコムギの澱粉合成酵素II型遺伝子タイプの判定を行うことができる。その他の方法でも同様にマニュアルに従って検出系をくみ上げることで同様の検出、判定を行うことが可能である。【００１９】
また、上記タンパク質（１）〜（３）が発現していないことを確認する方法として、山守らの報告（Yamamori et. al., Theor. Appl. Genet (2000)101:21-29）に記載の方法が挙げられる。 
また、上記タンパク質（４）〜（６）が発現していないことを確認する方法として、特開平６−１２５６６９号に記載の方法を使用することもできる。【００２０】
上述の本発明のコムギにおいては、蓄積されるデンプンの30重量％以上が粒径10μm以上のデンプン粒を形成しない。粒径10μm以上のデンプン粒を形成する割合は、電子顕微鏡あるいは、光学顕微鏡を用いてコムギ種子胚乳の断面を観察し、一定面積における10μm以上の粒子の一定面積における割合を求めることによって算出できる。あるいは、デンプンの精製過程において、デンプン粒を形成しない画分とデンプン粒の画分を分離し、その乾燥重量を測定することによって求められる。粒径10μm以上のデンプン粒を形成する割合を低くすることによって、アミラーゼ、プルラナーゼなどのデンプン分解酵素による消化が起こりやすくなり、易消化性デンプンとすることができる。このようなデンプンを用いれば、消化されやすく体内に吸収されやすい食品を提供することができる。また、デンプンはデンプン粒という高次構造を形成（結晶化）しているために、沸騰水中での加熱においても、完全には糊化しないが、本発明によるタイプのデンプンであれば、高次構造を形成していないことが考えられるため、糊化がより短時間、低温度で達成される可能性があり、より低温度、短時間の調理に向いた素材である。低温度、短時間での加熱調理が可能であれば、他の素材に及ぼす加熱の影響を著しく低減できる、あるいは、省エネルギー化を図ることができるなどの利点もある。さらには粒子を形成しないため、フィルム等の原材料として使用するには好適である。【００２１】
さらに、上述の本発明のコムギは、アミロペクチン分岐鎖において、重合度が70までの鎖のうち、重合度３〜５のグルコース分岐鎖の数の割合が1.5％以上である。好ましくは、３％以上である。また、上述の本発明のコムギは、重合度が60までの鎖のうち、重合度２〜５のグルコース分岐鎖の数の割合が３％以上である。好ましくは、５％以上である。このような鎖長分布を有することによって、デンプンとしての構造を大きく変化させることができる。実際に本発明では、このようなタイプのデンプンにすることによって、デンプン粒が形成されなくなり、構造上の特性を大きく変化させることができた。実際にデンプン粒を形成できなかった糖成分は滑らかな連続層からなる基底物質として蓄積されており、デンプンの精製過程においては、ゲル様層を形成するなど、物性に多面的な影響を与えている。通常デンプンの精製過程においてゲル様物質が蓄積することはほとんど見られず、例えば、フィルムのような工業製品原料として用いることができる。
また、このゲル様物質は非常に保水力が高いため、保水剤としての利用なども期待できる。
あるいは、表面のコーティング剤として利用することもできる。
なお、アミロペクチンは、α-1,4結合で直鎖状に連なったグルコース鎖がα-1,6結合で枝分かれして結合することによって構成される巨大分子であり、アミロペクチン分子間では、その分子量や枝の数や長さには多様性が見られる。したがって、本発明で示されるアミロペクチンのグルコース分岐鎖の鎖長分布は、種子に蓄積されるアミロペクチン全体における平均的分布を示している。【００２２】
さらに、上述の本発明のコムギは、生デンプンのアミラーゼによる分解率が80％以上である。好ましくは、90％以上である。熱による糊化を行わない生デンプン状態での分解性が向上していることは、このようなデンプンは加熱調理しないでも効率的に消化吸収されやすくなることが考えられる。あるいは生分解性プラスチックの原料として用いることもできる。【００２３】
また、他の本発明のコムギは、（１）配列番号１の澱粉合成酵素II型-A1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-A1タンパク質、（２）配列番号３の澱粉合成酵素II型-B1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-B1タンパク質、（３）配列番号５の澱粉合成酵素II型-D1遺伝子にコードされる澱粉合成酵素II型-D1タンパク質、（４）配列番号７の顆粒性澱粉合成酵素-A1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-A1タンパク質、（５）配列番号９の顆粒性澱粉合成酵素-B1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-B1タンパク質、及び（６）配列番号11の顆粒性澱粉合成酵素-D1遺伝子にコードされる顆粒性澱粉合成酵素-D1タンパク質が有する酵素活性を全てもたない。【００２４】
上記（１）から（３）のタンパク質は前述したように、一般的にはアミロペクチン分岐鎖（α-１,６結合により枝分かれしたグルコース重合体）の合成、特に重合度が中程度の鎖（15から25程度の重合度をもつ鎖）の合成に関与していると言われている。ゆえに、このタンパク質の酵素活性は、基質となるADP-グルコースとアミロペクチンを認識して結合し、ADP-グルコースからグルコースをアミロペクチン分岐鎖の末端に結合させる活性とも考えられる。一方、上記（４）から（６）のタンパク質は基本的にはアミロース合成に関与していると考えられている。よって酵素活性は、基質となるADP-グルコースとアミロースを認識して結合し、ADP-グルコースからグルコースを伸長途中のアミロースの末端に付加する働きであるとも考えられる。
上記（１）から（６）のタンパク質の酵素活性の確認を行うためには、通常用いられているいかなる方法を用いても良い。一例を挙げるなら、この酵素を種子から精製し、基質となる[U-14C]ADP-グルコースやグリコーゲンあるいはアミロペクチン、さらには反応条件を整えるための成分を加えることで反応を行う。一定時間の反応を終えたところで100度に加熱することにより酵素を失活させ、陰イオン交換カラムを用いて未反応の[U-14C]ADP-グルコースを除いた後、グリコーゲンあるいはアミロペクチンに取り込まれた[U-14C]ADP-グルコースの量を、液体シンチレーションカウンターを用いて計測する。別の方法としては、種子より粗精製したタンパク質画分、あるいはデンプン画分（タンパク質含量にして5-10μg）を通常のSDS-PAGEからSDSとβ-mercaptoethanolを除いた条件でのアクリルアミドゲル電気泳動を行う。分離の終わったゲルを50 mM グリシン、100 mM 硫酸アンモニウム、5nM β-mercaptoethanol、5 mM MgCl2、0.5mg/ml 牛血清アルブミン、0.01 mg/ml グリコーゲンあるいはアミロース、4mM ADP-グルコースからなる溶液に浸し、4時間から12時間放置する。その後、0.2% ヨウ素、0.02% ヨウ化カリウムからなる溶液を加えることで染色を行い、酵素活性を判定する方法を用いても良い。
また、前述したようにタンパク質自体の発現を確認する方法、あるいは、酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上の変異を識別する方法を用いてもよい。（１）から（３）のタンパク質において、酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上の変異とは、酵素の基質となるADP-グルコースやアミロペクチンの認識、結合部位における変異、あるいはグルコースをアミロペクチンの非還元末端へ転移する活性中心部位における変異、あるいはN末端に存在するシグナル配列部位における変異等が挙げられる。（４）から（６）のタンパク質において、酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上の変異とは、酵素の基質となるADP-グルコースやアミロースの認識、結合部位における変異、あるいはグルコースをアミロースの非還元末端へ転移する活性中心部位における変異等が挙げられる。特に放射線照射や変異原性化学物質の投与による変異誘発処理を行った場合には、１残基のみのアミノ酸置換を伴う変異が生じる可能性がある。こういった場合にはSDS-PAGEによる確認では識別することが困難な場合が多いため、DNA上の変異を確認する手法が適する。DNA配列上の変異を確認する方法は前述のとおりである。【００２５】
また、他の本発明のコムギは、上記タンパク質（１）から（３）の１つ以上を発現せず、かつ、上記タンパク質（４）から（５）の１つ以上を発現しない（ただし、タンパク質（２）、（４）及び（５）のみを同時に発現しないコムギは除く）。これらのコムギは、従来のコムギに蓄積されるデンプンと比較して、新たな特性が付与されたデンプンを蓄積する。新たな特性とは、例えば糊化液の粘度、糊化ピーク温度、老化耐性、凍結融解耐性、消化酵素による分解性などの改変が挙げられる。特に本発明では、澱粉合成酵素II型タンパク質が１つ以上欠損することにより、欠損しないタイプに比べて糊化度が高くなり、糊化液の粘度が低く、老化度が低くなることを見出した。また、その効果は顆粒性澱粉合成酵素を同時に１つ以上欠損させることで劇的に変化することを見出した。このようなコムギに蓄積されるデンプンは糊化後冷却した時点で従来よりも糊化度の高いデンプンあるいは、粘度の低いデンプン、あるいは老化耐性の向上したデンプンが蓄積される。特に上記タンパク質（１）から（３）の１つを発現せず、上記タンパク質（４）から（６）の２つを発現しないコムギは、（１）から（３）を全て発現し、かつ（４）から（６）のうち２つを発現しないコムギのデンプンに比べて糊化後の老化耐性、凍結融解耐性が劇的に改善されている。あるいは、上記（１）から（３）のタンパク質のうち２つを発現せず、かつ上記タンパク質（４）から（６）を全て発現しないコムギは、糊化液の粘度が非常に低下している。このようなコムギの確認には、上記タンパク質（１）から（６）をコードする遺伝子の有無および変異を検出して確認する方法を用いても良いし、タンパク質自身の発現を確認する方法を用いても良い。あるいは配列番号1から11に記載の遺伝子配列より発現されるRNAを精製し、定性あるいは定量する方法を用いても良い。【００２６】
好ましくは、上記タンパク質（１）から（３）のいずれか２つを発現せず、かつ、上記タンパク質（４）から（６）の１つ以上を発現しないコムギである。これらのコムギは、特に糊化後の粘度が従来のコムギに比べて著しく低下している。この特徴は、特に（１）から（３）のタンパク質のうち２つを発現せず、かつ上記タンパク質（４）から（６）を全て発現しないコムギにおいて著しい。
また、好ましくは、上記タンパク質（１）から（３）の２つ以上を発現せず、かつ、上記タンパク質（４）から（６）の２つ以上を発現しないコムギである。これらのコムギは、特に糊化後の老化耐性が従来のコムギに比べて向上している。この特徴は、特に上記タンパク質（１）から（３）のいずれか２つを発現せず、かつ上記タンパク質（４）から（６）をすべて発現しないコムギにおいて顕著である。【００２７】
また、他の本発明のコムギは、上記タンパク質（１）から（３）が有する酵素活性の１つ以上の酵素活性をもたず、かつ、上記タンパク質（４）から（６）が有する酵素活性の１つ以上の酵素活性をもたない（ただし、タンパク質（２）、（４）及び（５）が有する酵素活性のみをもたないコムギは除く）。
より好ましくは、上記タンパク質（１）から（３）が有する酵素活性の２つ以上の酵素活性を持たず、かつ、上記タンパク質（４）から（６）が有する酵素活性の２つ以上の酵素活性を持たないコムギである。
さらに好ましくは、上記タンパク質（１）から（３）が有する酵素活性のいずれか２つの酵素活性をもたず、かつ、上記タンパク質（４）から（６）が有する酵素活性の１つ以上の酵素活性をもたないコムギである。
より好ましくは、上記タンパク質（１）から（３）が有する酵素活性のいずれか２つの酵素活性をもたず、かつ、上記タンパク質（４）から（６）が有する酵素活性のすべての酵素活性をもたないコムギである。【００２８】
また、コムギにおいて、上記タンパク質（１）から（３）の２つ以上を発現しないようにすることによって、顆粒性澱粉合成酵素タンパク質の発現の組合せが前記コムギと同じであってタンパク質（１）から（３）をすべて発現するコムギと比較してデンプンの糊化後の粘度を低下させることができる。
また、コムギにおいて、上記タンパク質（１）から（３）の２つ以上を発現しないようにすることによって、顆粒性澱粉合成酵素タンパク質の発現の組合せが前記コムギと同じであってタンパク質（１）から（３）をすべて発現するコムギと比較して、デンプンの糊化後の老化耐性を向上させることができる。【００２９】
以上のことから、上記遺伝子変異体（７）から（９）の１つ以上を検出する工程、及び上記タンパク質（４）から（６）の１つ以上を検出する工程を用いることによって、特定コムギを選抜することができる。ここで、特定コムギとしては、生デンプンの分解率が80％以上であるようなコムギである、上記（１）から（６）のタンパク質を全て持たないようなコムギが挙げられる。あるいは、糊化液の粘度が非常に低いコムギである、上記（１）から（３）のタンパク質のうち（１）および（２）を発現せず、かつ（４）から（６）のタンパク質を全て発現しないコムギが挙げられる。【００３０】
また、本発明のコムギや本発明のコムギ由来のデンプンは、食品に用いることができる。前記食品としては、通常コムギ粉（全粒粉を含む）あるいはデンプンを利用する食品等が挙げられる。例えば、ベーカリー食品、麺類、菓子類、揚げ物、焼き物、練り物、ハンバーグなどのつなぎとしての利用が挙げられる。本コムギより得られる穀粉あるいはデンプンをそのまま利用しても良いし、他の粉と混合して使用しても良い。また、アルコール飲料などの発酵原料、アミノ酸や多糖などの微生物生産のための原料としても用いることができる。
本発明における小麦を利用して作られるベーカリー食品とは、例えば、食パン、フランスパン、ロールパン、菓子パンなどのパン類、イーストドーナツなどの揚げパン類、蒸パン類、ピザパイ等のピザ類、スポンジケーキなどのケーキ類、クッキー、ビスケットなどの焼き菓子類などが挙げられる。これらベーカリー食品を製造するにあたり使用する本発明コムギ由来の穀粉は、通常の製粉工程を経てふすまなどの成分を除いた穀粉を使用しても良いし、分別しない全粒粉を用いても良い。上記ベーカリー食品を製造するためのベーカリー食品用穀粉としては、本発明コムギより得られる上記穀粉をそのまま使用しても良いが、好ましくは他の穀粉と混合して使用することである。他の穀粉とは、強力粉、中力粉、薄力粉等の小麦粉、あるいはこれらには分類されていないコムギ由来の穀粉、ライ麦粉、米粉、デンプン等が挙げられる。本発明のベーカリー食品は、本発明のコムギより得られる穀粉あるいはその他穀粉との混合穀粉に、イースト、重曹などの化学膨張剤、イーストフード、食塩、糖類、油脂類、卵、乳製品、水などの一般にベーカリー食品の製造に使用される各種副原料を配合したものを混練して生地を作り、これを醗酵等により膨化させ、あるいはそのまま焼成または油揚げすることにより製造される。本発明のベーカリー食品の製造に際しては、通常採用されている製造方法、製造装置、凍結方法、凍結装置のいずれを使用しても良い。また必要に応じて、ビタミン、ミネラルなどの添加剤を加えることができる。
以上のようにして製造された本発明コムギ由来の穀粉を含むベーカリー食品は、甘く、独特の風味、香り、歯ごたえのあるものとなる。このような特徴は、本発明コムギ由来穀粉のみを使用した場合にも達成されるが、好ましくは本発明コムギ由来穀粉が0.1〜60質量部、より好ましくは0.5〜50質量部を含むように他の穀粉と混合して使用することで達成できる。
また、本発明のコムギや本発明のコムギ由来のデンプンは、工業製品に用いることができる。前記工業製品としては、粘度安定剤、保水剤、コロイド安定剤、糊、接着剤などが挙げられる。
また、本発明のコムギや本発明のコムギ由来のデンプンは、加工して利用することができる。例えば、酸やアルカリ、あるいは酵素処理によりデキストリンを生成し、これを利用して接着剤、繊維、フィルムなどへ利用する方法が挙げられる。また、このデキストリンのうち水溶性画分は、難消化性デキストリンとして整腸作用などに優れた機能性食品として利用できる。あるいは種々の無機、有機酸と反応させてデンプンエステルを形成させて利用しても良い。特にリン酸と反応させたリン酸デンプンは増粘剤として有用である。【００３１】
また、タンパク質（１）〜（６）をすべて発現しないコムギは、通常のコムギに比べて糖含量が増加している。具体的には、胚を除いた成熟種子中にグルコースを0.1重量％以上含有する。好ましくは、胚を除いた成熟種子中にグルコースを0.3重量％以上含有する。より好ましくは、胚を除いた成熟種子中にグルコースを0.5重量％以上含有する。また、胚を除いた成熟種子中にマルトースを0.1重量％以上含有する。好ましくは、胚を除いた成熟種子中にマルトースを0.3重量％以上含有する。より好ましくは胚を除いた成熟種子中にマルトースを0.5重量％以上含有する。また、胚を除いた成熟種子中にスクロースを１重量％以上含有する。好ましくは、胚を除いた成熟種子中にスクロースを３重量％以上含有する。より好ましくは胚を除いた成熟種子中にスクロースを５重量％以上含有する。
種子中のグルコース、マルトース及びスクロース含量を測定する方法として、種子から低分子糖を抽出し、分析を行うための方法であればいかなる方法を用いてもよい。種子から低分子糖を回収する方法としては、種子を粉砕後、水による抽出、80％エタノールによる抽出、DMSOによる抽出などが考えられるが、操作中にデンプンあるいは多糖がアミラーゼなどの酵素によって分解されて生じる糖と明確に区別するためには、アミラーゼの作用が働かない条件で抽出、測定することが望ましい。また、本発明は小麦胚乳部位に高含量で糖を蓄積する小麦であることから、その測定には種子粒から胚を除いた部分をサンプルとして用いることが好ましい。抽出したサンプルに含まれる低分子糖を同定、定量する方法としては、キャピラリー電気泳動を用いる方法、あるいはHPLCを用いる方法、酵素、化学反応による測定方法などいかなる方法を用いてもよい。【００３２】
本発明のコムギには、上述のコムギを他の品種と交配して得られたF1世代をさらに自家受精あるいは一方の親系統との戻し交配を行うことで、他の有用形質を導入したものも含まれる。例えば、一般的に知られている耐病性の高い品種と上述のコムギを交配し、得られたF1世代を親系統である耐病性の高い品種と戻し交配を行う。得られた次世代の個体に関して、前述した方法により、顆粒性澱粉合成酵素と澱粉合成酵素II型の各タンパク質を所望の組み合わせで発現している個体を選抜する。選抜した個体に関して、さらに戻し交配と選抜とを繰り返すことで、耐病性の高い品種に所望のデンプン特性を付与することができる。あるいは、戻し交配を行う親系統を上述のコムギとし、適切な方法を用いて選抜することで、上述のコムギに耐病性を付与することもできる。他の有用形質としては、グルテン特性、耐倒伏性、秋撒き性、春撒き性、多収性、低温耐性、穂発芽耐性、製粉適性などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
１．サンプル
本発明により開発したコムギ系統の顆粒性澱粉合成酵素および澱粉合成酵素II型タンパク質のタイプを、比較対照とする標準系統（タイプ(i)）あるいは親系統（タイプ(ii)およびタイプ(iii)）と合わせて表１に示す。本発明のために親系統として用いたコムギ系統は、東北農業研究センターにて育成されたコムギ品種モチ乙女（顆粒性澱粉合成酵素欠損型、澱粉合成酵素II型タンパク質は野生型）と外来品種を交配し、そのF5世代の種子で顆粒性澱粉合成酵素を欠損した系統を選抜した（タイプ(ii)）。もう一方の親系統は、同所で育成された澱粉合成酵素II型タンパク質欠損系統を用いた。この系統は一般的に知られている系統である関東79号（澱粉合成酵素II型-B1欠損型）と外国産品種であるTurkey116（澱粉合成酵素II型-D1欠損型）、Chosen57（澱粉合成酵素II型-A1欠損型）の３品種を順次交配し、澱粉合成酵素II型を完全に欠損した系統を選抜した（タイプ(iii)）。
コムギの栽培、交配は定法に従った。親系統となる2品種を交配し、F1世代を得た。これを自家受精させてF2、あるいはそれ以降の世代を得、この中から所望のコムギ系統を2次元電気泳動による顆粒性澱粉合成酵素の有無および、PCR法による、澱粉合成酵素II型遺伝子の遺伝子型（野生型もしくは変異型）を見分けることによって選抜した。比較対照として用いたコムギ系統は一般に栽培され流通している品種である農林61号（タイプ(i)）を用いた。【００３４】
【表１】
0004865705.tif 000002
【００３５】
顆粒性澱粉合成酵素の野生型、欠損型の確認は澱粉結合タンパク質の二次元電気泳動により確認した。方法は次のとおりである。
成熟種子から胚を取り除き、粉砕してから６０μmのふるいを通して粉を準備した。粉２０ｍｇあたり１ｍＬの割合で冷却したＳＤＳバッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２．３％  ＳＤＳ、５％  β―mercaptoethanol、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、２分間ホモジナイズした。この懸濁液を濾過した後、濾液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除き再びＳＤＳバッファーを加えて懸濁し、遠心した。この操作を３回繰り返した後、蒸留水を加えて同様な操作を２回繰り返し、上清を除いて、回収したデンプン層を自然乾燥し、精製澱粉とした。
通常タイプの澱粉であれば、前記デンプンの精製において、ＳＤＳバッファーを加えて濾過した後、遠心した段階で大部分の澱粉は沈殿することによってデンプン粒層を形成し、上層の水層とは明らかに区別される。本発明のタイプ(vii)のコムギにおいては、この段階でデンプン粒層と思われるものは極わずかしか沈殿せず、その上層には白濁した不定形のゲル様物質から構成される層が大量に蓄積され、さらにその上層に水層が形成される。水層を除いた後、糖成分であるこのゲル様層と最下層のデンプン粒層をまとめてその後の操作は前記精製方法と同様に行った。
この精製澱粉10 mg当たり、300μlのLysisバッファー(8 M Ura、2% Nonidet P-40、2 % ampholine (pH 3.5-10)、5% β-mercaptethanol、5% polyvinylpyrrolidone)を加え、2分間100度の熱湯で加熱処理を行った。10分間氷冷した後、澱粉ゲル化液を15000回転、4度で10分間の遠心を行って、その上清200μlを二次元電気泳動に供した。1次元目電気泳動には、3.5%のアクリルアミドゲルからなるIEFを、2次元目は15%のビスアクリルアミドゲルからなるSDS-PAGEを行った。
顆粒性澱粉合成酵素検出の結果を図１に示す。顆粒性澱粉合成酵素−A1、B1、D1はそれぞれ図１Ａに示される位置に検出されるが、タイプ(vii)のコムギ系統からは全くバンドが検出されなかった（図１Ｂ）。よってタイプ(vii)のコムギは顆粒性澱粉合成酵素が完全に欠損している。【００３６】
澱粉合成酵素II型の確認は、本発明者らによって既に開発されている（特願2004-153904）方法を用いた。方法は以下のとおりである。種子を発芽させ、幼葉からのゲノムDNAをキアゲン社製DNeasy plant miniキットを用いて行った。発芽した種子の幼葉を100 ｍｇとり、液体窒素中でパウダー状になるまですりつぶした。すりつぶしたサンプルを1.5 ml容チューブに移し、その後キットに添付のバッファーＡＰ１とＲＮａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて65度で10分間加熱した。次にバッファーＡＰ２を加えて氷上で５分間放置した後、析出した沈殿物を遠心操作により取り除いた。上澄み液にバッファーＡＰ３を加えて混合した後、全量をｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに供し、遠心操作を行いＤＮＡをメンブランに吸着させた。バッファーＡＷによる洗浄を２回行った後、バッファーＡＥを加えて５分間放置し、遠心によりＤＮＡ溶液を回収した。
３つの澱粉合成酵素II型をコードする遺伝子配列上に生じた配列変異をPCR法により確認した。用いたプライマー配列は次のとおりである。
澱粉合成酵素II型-A1  SSIIAF1：GCGTTTACCCCACAGAGC（配列番号13）
SSIIAR1：ACGCGCCATACAGCAAGTCATA（配列番号17）
澱粉合成酵素II型-B1  SSIIBF1：ATTTCTTCGGTACACCATTGGCTA（配列番号20）
SSIIBR1：TGCCGCAGCATGCC（配列番号23）
澱粉合成酵素II型-D1  SSIIBF1：GGGAGCTGAAATTTTATTGCTTATTG（配列番号24）
SSIIBR1：TCGCGGTGAAGAGAACATGG（配列番号26）
ＰＣＲ反応液は以下のように調整した。反応にはLA Taq (タカラバイオ社)を用いた。
プライマーはＦＡＳＭＡＣ社製のものを用いた。
0004865705.tif 000003
ＰＣＲ増幅装置にはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。
0004865705.tif 000004
ＰＣＲ増幅反応液は３％アガロースゲルによる電気泳動に供した後、エチジウムブロマイド染色を行い、各プライマーによる至適サイズのＤＮＡ増幅バンドを確認することによってサンプル中の野生型及び変異型遺伝子の有無を判定した。タイプ(i)の対照品種および、タイプ(vii)のコムギの遺伝子型判定を行った結果を図２に示す。タイプ(vii)では３つの澱粉合成酵素II型遺伝子全てが、変異型であることを示している。以上のことから、タイプ(vii)のコムギは顆粒性澱粉合成酵素および澱粉合成酵素II型が完全に欠損していることがわかる。【００３７】
（SDS-PAGEによる澱粉合成酵素II型と顆粒性澱粉合成酵素の欠損の確認）
各サンプルにおける澱粉合成酵素II型タンパクと顆粒性澱粉合成酵素タンパクの発現をSDS-PAGEにより確認した。タイプ(i)、タイプ(ii)、タイプ(iii)及びタイプ(vii)から精製したデンプン1mgあたり14μlのSDSバッファーを加えて５分間煮沸後、２分間氷冷した。15,000rpm、４℃、５分間の遠心後、上清を回収し、SDS-PAGE用サンプルとした。SDS-PAGEには、アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドの比率が30:0.135となるように混合したアクリルアミド溶液を終濃度12.5％となるように調製したアクリルアミドゲルを使用し、その他は定法に従って電気泳動を行った。泳動後のタンパクの検出には、銀染色キット（第一化学薬品）を用いた。
この結果からもタイプ(vii)では澱粉合成酵素II型及び顆粒性澱粉合成酵素タンパクをすべて持たないことが確認された（図１３）。【００３８】
２．蓄積されるデンプンにおける粒径10μm以上のデンプン粒を形成しないデンプンの割合
蓄積されるデンプンにおける粒径10μm以上のデンプン粒を形成しないデンプンの割合を算出する場合、上記デンプンの精製において、ＳＤＳバッファーでの洗浄と水による洗浄を行った後、ゲル様層と最下層のデンプン粒層をスパーテルで分離した。それぞれの画分をあらかじめ秤量しておいた1.5 mlチューブに移し、湿重量を測定した。自然乾燥によりサンプルを乾燥した後、乾燥重量を測定した。通常タイプのデンプンであれば、デンプン粒層がほぼ100％であり、ゲル様層はほとんど形成されない。これに対して、本発明によるタイプ(vii)のコムギ由来のデンプン粒層の乾燥重量は22 mgであったのに対してゲル様層の乾燥重量は13 mgであった。よって回収した澱粉画分の総重量に占めるゲル様層の重量は約37%であった。【００３９】
３．電子顕微鏡観察
タイプ(vii)のコムギ系統で産出される種子における電子顕微鏡写真を図３に示す。成熟コムギ種子を粗く砕き、その破断面を電子顕微鏡（キーエンス社）で観察した。タイプ(i)の野生型澱粉と比較して、タイプ(vii)の澱粉粒はいびつな形となり、数も少なく、大部分が滑らかな基底物質から構成されている。【００４０】
４．鎖長分布解析
４．１
タイプ(i)、タイプ(ii)、タイプ(iii)およびタイプ(vii)のデンプンに含まれるアミロペクチンを構成するグルコース分岐鎖の鎖長分布解析を行った結果を図4〜6に示す。方法は次のとおりである。精製デンプンを秤量し、デンプン1ｍｇ当たり60μＬの250 mM NaOHを加え、20分間煮沸することで完全糊化した。冷却後、酢酸1.9μＬ、50mM 酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）240μＬ、２％アジ化ナトリウム3.75μＬを加えた後、Isoamylase（ナカライ社）を1μＬ加え、37℃で攪拌しながら16時間反応を行った。反応終了後、20分間煮沸して酵素を失活した後、14000rpm、20℃、２分間の遠心を行って上清を取得し、レジン（Bio-Rad社製）を加えて脱イオンを行った。遠心してレジンを沈殿させた後、上清を新しいチューブに移して酵素処理により生じたオリゴ糖の濃度をPark-Johnson法の変法（生物化学実験法19 「澱粉・関連糖質実験法」  中村道徳・貝沼圭二編  学会出版センター、P123）により定量した。試料溶液を適当に希釈し、その50μlに対して、25 μlの0.1% フェリシアン化カリウムと25μlのシアン化カリウム溶液（0.48 gのNa2CO3、0.92ｇのNaHCO3、0.065gのKCNを水に溶解し、100 mlとしたもの）を加え、密栓して沸騰水中で15分間加熱した。その後、氷上で10分間冷却し、0.3%の鉄ミョウバン溶液（1.5gのFe・NH4(SO4)2・H2Oを50mM硫酸500mlに溶解したもの）を125μl加え、室温で20分間放置した後、715 nmの吸光度を測定した。０から10mMの間で濃度を変えたglucose溶液を同様の処理を行って測定した値から検量線を作成し、この検量線を用いて試料溶液中の還元末端基の定量を行った。各サンプル５nmol相当量を分取し、真空遠心乾燥を行い、鎖長分布解析用試料とした。鎖長分布解析には、ベックマン社製PA糖鎖解析キットを用いた。乾燥したサンプルにmaltose quantitative control/mobility markerを2μl加え、再び真空遠心乾燥を行った。乾燥したサンプルに1Ｍ  Sodium Cyanoborohydride溶液を2μＬ加え、さらにAPTS labeling reagentを加えた。37℃、暗所で4時間の反応を行い、46μＬの蒸留水を加えて反応を停止した。さらにこのサンプルから５μＬをとり、蒸留水で40倍に希釈して測定用サンプルとした。グルコース重合度の異なるオリゴ糖の分離定量にはベックマン社キャピラリー電気泳動装置ＰＡＣＥｓｙｓｔｅｍ５０００を用いた。分離用キャピラリーにはｅＣＡＰ  Ｎ−ＣＨＯキャピラリーを用い、高圧で５秒間サンプルを注入した後、ｅＣＡＰ糖分析ゲルバッファを用いて30ｋＶ、30分間の泳動を行った。得られたピークチャートから、グルコース重合度3以上70以下のオリゴ糖の各ピーク面積を算出し、ピーク面積の合計を100％として、各ピークが占める面積の割合を求めた。タイプ(i)のコムギ系統から得られたパターンを標準とし、各サンプルの対応するピークの割合から、タイプ(i)の相当するピークの割合を引いた値をグラフにした。タイプ(vii)では、標準系統であるタイプ(i)に比較して、重合度３から１０のグルコース側鎖の割合が顕著に増加し、逆に重合度１１から２４のグルコース側鎖の割合が低下している（図４）。
これは親系統であるタイプ(ii)（図５）あるいはタイプ(iii)（図６）のパターンとは明らかに異なっている。特にアミロース含量が１％以下でかつ重合度3から5のグルコース側鎖の割合が低下したことで、澱粉粒構造を取ることができなった糖成分が滑らかな基底物質を構成することになったと考えられる。【００４１】
４．２
種子から胚を除き、乳棒と乳鉢で粉砕した後、1.5mlチューブに移した。粉砕した種子重量１mgあたり50μlの100％DMSOを加えた。密栓して30分間煮沸することで完全糊化を行い、遠心により不溶性成分を除去した。得られたサンプル溶液20μlに対して0.5Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（pH 4.0）を２μl、isoamylase(ナカライ社)を７unit加えて水で100μlにメスアップした（反応１）。
同時に、この反応液のうちあらかじめ煮沸することにより失活しておいたisoamylaseを用いて同一サンプルを処理することで、サンプル中にあらかじめ含まれている遊離状態のオリゴ糖の測定を行うためのサンプルとした（反応２）。37℃で16時間以上反応した後、５分間煮沸してisoamylaseを失活させ、反応１に関して反応により生じたグルコース分岐鎖の濃度をPark-Johnson法の変法（前述）により算出し、オリゴ糖10nmol分に相当する溶液量を真空遠心乾燥した。反応２に関しては反応１で求めた溶液量と等量を乾燥した。この後、１Ｍ Sodium Cyanoborohydride（in THF）溶液２μlを加え、さらに２μlのAPTS labeling reagentを加えて暗所60℃、90分間の反応を行った。46μlの水を加えて反応を停止し、さらに水で40倍に希釈して測定用サンプルとした。PACEsystem5000を用いた解析は前述と同様の方法で行った。反応１から得られた各グルコース分岐鎖のピーク面積値から、反応２から得られた対応するピークの面積値を引くことで、イソアミラーゼ処理により生じたグルコース分岐鎖の値を算出した。重合度１以上、60以下の分岐鎖に関して面積値を算出し、それらの合計を100％として各ピークが占める面積の割合を求めた。
タイプ(i)に比べてタイプ(vii)は明らかに重合度２から５までの分岐鎖の割合が増加していた（図７及び８）。実施例の図４では、重合度３以上の分岐鎖に関して解析しているが、本実施例では重合度２のピークと重なってしまうmaltose quantitative control/mobility markerを用いずに解析したことで、重合度２の分岐鎖のピーク面積も明らかになった。この結果、タイプ(vii)においては重合度２のピークもタイプ(i)に比べて顕著に高くなっていた。
また、タイプ(ii)のアミロペクチンはタイプ(i)とほぼ同じ構造を有しており（図５）、アミロペクチンの鎖長構造には変化はほとんど見られない。これに対してタイプ(ii)と同じモチ性タイプ(vi)、(x)（図１２）においては、タイプ(ii)に比べて重合度２から10程度の分岐鎖の割合が増加し、11から25の鎖が低下している。これはアミロペクチン構造に変化がおきていることを示しており、その結果DSCにおける糊化ピーク温度が低下し、糊化後の溶液粘度が低下したと考えられる。【００４２】
５．アミロース含量の測定方法
各コムギ系統のデンプンにおけるアミロース含量を測定した。測定方法は以下のとおりである。精製澱粉1 mg当たり、25μlのエタノールを加え、さらに1M 水酸化ナトリウム溶液を225μl加えて10分間沸騰水中で加熱することにより、デンプンを糊化した。この糊化液を水で10倍に希釈し、50μlを測定用に分取した。これに1Mの酢酸を10μl、ヨード液を20μl、水を920μl加えてよく混合し、27度で20分間放置した後、620 nmの吸光度を測定した。これとは別に馬鈴薯由来アミロースを検量線作成用試料、ワキシコーン由来澱粉（アミロースを含まない澱粉）をブランクとして、同様の処理を行った。各試料の吸光度からワキシコーンより求められた吸光度の値を引き、検量線のデータに当てはめることによって、各試料のアミロース含量を測定した。【００４３】
６．生デンプンのα-amylaseによる分解
生デンプンのα-amylase処理による消化による分解性の検討については、次のようにして行った。実施の方法は「澱粉・関連糖質実験法、Ｐ１８９〜Ｐ１９２」を参考に改良した方法で行った。タイプ(i)、(ii)、(iii)、(vii)のコムギ系統由来の生澱粉を秤量し水で１％の懸濁液になるように調整した。この懸濁液２０μＬずつ３本に分け（Ｉ、II、IIIとする）、ＩとIIには０．８Ｍ  酢酸バッファー（ｐＨ６．０）を２３０μＬ加えた。IIIには２Ｍ  ＮａＯＨを１０μＬ加えた後、５０℃で５分間加熱することで完全糊化澱粉サンプルとした。１Ｍ  酢酸２０μＬで中和した後、０．８Ｍ  酢酸バッファー（ｐＨ６．０）を２００μＬ加えた。この後Ｉ、IIIにはα―Ａｍｙｌａｓｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を１０Ｕ加えた。IIには同α―Ａｍｙｌａｓｅを２０分間煮沸して失活した溶液を等量加えた。全サンプル４０℃にて攪拌しながら反応を行った。１２時間後、反応液を水で５倍希釈して、４℃に保存することにより反応を停止した。α―Ａｍｙｌａｓｅ処理により生じたオリゴ糖を上記Park-Johnson法の変法により定量した。次式により生澱粉の分解率を産出した。
（Ｉ−II）／（III−II）＊１００【００４４】
７．糊化度
加熱による糊化後、室温まで冷却した際の溶液の白濁の程度および糊化度を調べた。方法は「澱粉・関連糖質実験法、Ｐ１８９〜Ｐ１９２」を参考に改良した方法で以下のようにして行った。タイプ(i)、(iii)、(iv)、(v)の精製澱粉を秤量し水で１％の懸濁液になるように調整した。この懸濁液２０μＬずつ３本に分け（Ｉ、II、IIIとする）、ＩとIIは２０分間煮沸し、室温まで冷却した。このときの各サンプルの白濁の程度を目視により確認した。この後、４℃にて２時間保存した後、０．８Ｍ  酢酸バッファー（ｐＨ６．０）を２３０μＬ加えた。IIIには２Ｍ  ＮａＯＨを１０μＬ加えた後、５分間煮沸を行い、室温まで冷却してから１Ｍ  酢酸２０μＬで中和した後、０．８Ｍ  酢酸バッファー（ｐＨ６．０）を２００μＬ加えた。この後Ｉ、IIIにはβ―Ａｍｙｌａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製）およびＰｕｌｌｕｌａｎａｓｅ（林原生物化学研究所製）を５μＬずつ加えた。IIには同種類の酵素を２０分間煮沸して失活した溶液を等量加えた。全サンプル４０℃にて攪拌しながら反応を行った。３０分後、反応液を水で５倍希釈して、４℃に保存することにより反応を停止した。酵素処理により生じたオリゴ糖を上記Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法の変法により定量した。各サンプルのオリゴ糖濃度を算出した後、次式により糊化度を算出した。
（Ｉ−II）／（III−II）＊１００【００４５】
８．粘度
各コムギ系統由来澱粉を糊化後、６０度まで冷却した場合の溶液の粘度を測定した。測定方法は次のとおりである。精製澱粉を秤量し、蒸留水にて４％の澱粉懸濁液を調製した。沸騰水中で２０分間煮沸し、６０℃にて保存した。この糊液１００μＬを垂直に立てた内径１ｍｍのガラス管に移し、液面の先端が５ｃｍの距離を落下するのに要した時間を測定した。一方、ワキシコーン（豊年社製）を２％から０．５％刻みで７．５％まで調製した各種澱粉溶液を同様に糊化、保温し、同じように落下速度を測定して検量線を作成した。一方、ワキシコーンは同じ濃度にて、糊化後６０℃での粘度をラピッドビスコアナライザーにより測定し、これを用いて検量線を作成した。ワキシコーンを用いて作成した検量線に各種コムギ由来澱粉溶液の６０℃での落下速度を当てはめることによって、相対的粘度を算出した。【００４６】
９．糊化後の凍結融解耐性
凍結融解耐性の検討は次のようにして行った。各試料の精製デンプンに水を加えて５％の澱粉懸濁液とした。20分間煮沸を行って澱粉懸濁液を糊化した後、室温まで冷却し、まずこの時点での糊化液の様子を観察した。室温まで冷却したことにより、白濁し、ゲル化したサンプルには、その度合いによって「高」、「中」、「低」の評価を行った。また、白濁もゲル化も見られなかったサンプルには、「白濁せず」という評価を行った。これらの糊液あるいは、ゲル化したサンプルを−80℃で1時間凍結した後、25度で30分間融解するという操作を10回繰り返した後、サンプルの様子を観察した。10回目の融解を終了した時点でゲル化していたものには「×」を、ゲル化の度合いが低かったものについては「△」を、ゲル化がほとんど見られなかったものには「○」の評価を行った。【００４７】
各タイプのコムギのデンプンについて、上記の特性評価の結果を下記表２にまとめる。
【表２】
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【００４８】
タイプ(vii)に関して述べると、前述したように糖成分が澱粉粒構造を取ることができなくなったため、α―Ａｍｙｌａｓｅのような分解酵素の影響を受けやすくなり、生澱粉での分解性が顕著に増加したものと考えられる。このような糖成分を主成分とするタイプ(vii)コムギ系統は、食品として使用した場合の加工性、あるいは消化性において、従来とは全く異なる利用方法を与えることができる。具体的には、易消化性パン、麺、あるいは菓子類などが挙げられる。また飼料用作物としては好適であろう。また、澱粉粒を形成する系統に比して、加工時における糊化エネルギー量は非常に少なくてすむ。つまり低温での調理が可能であり、加熱が他の食物成分に与える影響を最小限にとどめることができる。合わせて糊化後の凍結融解耐性にも優れていることから、特に冷蔵、冷凍保存用食品への利用に適する。さらに加えるなら、タイプ(vii)澱粉は澱粉精製時に吸水性が他のものに比べて非常に高い。吸水量が高ければゲル化剤として利用した場合に少量で多量の水分を吸水することが可能である。あるいはゼリー状食品へ応用する場合にも少量での調製が可能となる。また難消化性デンプンの作成に応用することも可能である。
アミロースは、これを合成する顆粒性澱粉合成酵素遺伝子の組み合わせによって、その含量が変化することは広く知られている。一方で、前述したように澱粉合成酵素II型を全て欠損させた場合には、野生型に比べてアミロース含量が顕著に増加することが知られている（タイプ（iii））。以上のことから、顆粒性澱粉合成酵素の組み合わせが同じものどうしであれば、同時に澱粉合成酵素II型を１つないし、２つ欠損させた場合には、見かけ上のアミロース含量は増加すると考えられたが、実際には見かけ上のアミロース含量はほぼ同程度の値（タイプ(iv)とタイプ(ix)、タイプ(v)とタイプ(viii)を比較）であるか、若干ながら低下する傾向が見受けられた（データは示さない）。
老化耐性（「白濁の度合い」の高いほうが耐性に劣る）の検討では、顆粒性澱粉合成酵素のタイプが同一であっても、同時に澱粉合成酵素II型を欠損させた場合に耐性が上がっており（タイプ(iv)とタイプ(ix)、タイプ(v)とタイプ(viii)を比較）、糊化後の糊液の相対粘度においては低下していた（タイプ(ii)とタイプ(vi)、(vii)を比較）。
以上のことから、顆粒性澱粉合成酵素だけでなく、同時に１つ以上の澱粉合成酵素II型を欠損させることによって、従来の各種低アミロース含量コムギと同程度のアミロース含量を有しており、かつ老化耐性の向上したコムギ、あるいは糊化した後の糊液の粘度が低下したコムギを作出することができた。またこの効果は、澱粉合成酵素II型を２つ以上欠損させた場合に、より効果が大きいことが分かった。低アミロースコムギは麺用粉として広く用いられており、糊化、老化特性の改良はこのような用途に改善効果をもたらす可能性がある。また、その他餃子、饅頭などの皮用などへの応用も考えられる。
また、本発明によるタイプ(vi)のコムギに関しては、顆粒性澱粉合成酵素が全て欠損し、澱粉合成酵素II型が１つだけ発現しているタイプであるが、タイプ(ii)のコムギに比べて粘度が著しく低下している。タイプ(ii)の小麦は糊化後冷却した場合の糊液の粘度が低いことが知られているが、タイプ(vi)はそれ以上の低い粘度を示す新規特性を有している。
以上のデータは従来、顆粒性澱粉合成酵素の発現の有無によるコムギ系統の選抜では選抜することができなかったタイプのデンプンを蓄積するコムギ系統を選抜することが可能であったことを示している。
本発明では新規デンプンを有する6倍体コムギを発明しているが、本発明を応用すれば同じような効果をもつ4倍体コムギを作出することができる。6倍体コムギと4倍体コムギの交雑後代から4倍体コムギが得られることは古くから知られている。よって顆粒性澱粉合成酵素と澱粉合成酵素II型を所望の組み合わせで発現する本発明コムギと4倍体コムギを交配し、その後代から上記選抜方法を組み合わせることで、顆粒性澱粉合成酵素と澱粉合成酵素II型を所望の組み合わせで持った4倍体小麦を選抜することができる。4倍体コムギにはデュラムコムギなどが挙げられる。【００４９】
10．マルトース及びグルコース含量の測定
測定に使用する種子サンプルは、糖含量測定用サンプルとは別にあらかじめ軽く粉砕し、135℃、２時間乾燥を行って、乾燥前後の重量変化から水分含量をあらかじめ算出しておく。
タイプ（ｉ）及びタイプ（vii）のコムギの胚を除いた成熟種子を液体窒素中ですりつぶし、すりつぶした粉重量10mgあたり１mlのDMSOを加えてよく混和し、時々攪拌しながら室温に静置した。1.5時間後に13,000rpm、５分間遠心し、上清を新しいチューブに移し変えた。10分間煮沸した後、一定量を正確に測り取り、真空乾燥した（DMSO抽出サンプル）。
また、タイプ（ｉ）及びタイプ（vii）のコムギ胚を除いた乾燥種子を液体窒素中ですりつぶした後、粉重量10 mgあたり1 mlの80% エタノールを加えて密閉して煮沸を20分間行った。冷却後、10,000 rpm、5分間遠心し、一定量を正確に測り取り真空乾燥した（エタノール抽出サンプル）。
これらサンプルを鎖長分布解析で述べた方法と同様に、１Ｍ Sodium Cyanoborohydride溶液を２μl、APTS labeling reagentを２μl加え、37℃、暗所で4時間の反応を行った後、46μlの蒸留水を加えて反応を停止した。さらに蒸留水で40倍に希釈し、測定用サンプルとした。分析装置及び条件は鎖長分布解析で述べた方法と同条件で測定した。あらかじめ標準物質を用いて作成しておいた検量線をもとに、グルコース及びマルトースのピーク面積から濃度を算出し、種子乾燥重量あたりの各糖濃度を算出し、サンプル間の比較を行った。【００５０】
11．スクロース含量の測定
タイプ（ｉ）及びタイプ（vii）のコムギの胚を除いた成熟種子を液体窒素中ですりつぶした後、粉重量10mgあたり１mlの80％エタノールを加えて蓋を密閉して煮沸を20分間行った。冷却後、10,000rpm、５分間遠心し、上清の一定量を正確に測り取り真空乾燥した。乾燥前の体積と同じ量の滅菌水を加えてサンプルを溶解後、0.45μmのフィルターを通すことによってろ過を行い、さらに分画分子量10,000の限外ろ過膜を用いてろ過したサンプルをスクロース測定溶液とした。サンプル中のスクロース含量の分析にはHewlettPackard社製HPキャピラリー電気泳動装置を用い、市販のバッファー（basic anion buffer for HPCE（Agilent社））及びキャピラリー（CE standard capillary （50μm、104cm）（Agilent社））を用いて分離を行った。あらかじめ市販のスクロースを用いて作成しておいた検量線に照らし合わせてサンプル中のスクロース含量を算出し、サンプル間の比較を行った。【００５１】
（糖含量測定の結果）
商業的に広く使用されているものと同じタイプであるタイプ（ｉ）に比べてタイプ（vii）ではグルコースが少なくとも5倍以上、マルトースが少なくとも10倍以上、スクロースが少なくとも2倍以上含量していることが認められた。またタイプ（vii）の種子は口にしても甘さを感じるレベルにまでこれらの糖が含有されており、従来タイプには無かった新規な特徴と言える。糖含量の増加により、本発明の小麦を食品へ加工する際に新たに糖成分を添加する必要がなくなるだけでなく、糖そのものを供給する原材料としての使用も可能になる。【００５２】
12．糊化特性（DSC）
各コムギから精製したデンプンを、約３mgずつ秤量し、３倍量の水を加えて半日以上加水した。このサンプルを密封セルに封じ込み、示差走査熱量測定計により、30℃から105℃まで5℃/minの速度で昇温を行い、糊化開始温度(T0)、糊化ピーク温度(Tp)、糊化終了温度（Tc）、およびエンタルピーを測定した。
この結果、タイプ（vii）の親系統であるタイプ（ii）は野生型であるタイプ（ｉ）に比べてT0が上昇し、もう一方の親系統であるタイプ（iii）では低下していた。これに対してタイプ（vii）では、親系統であるタイプ（iii）よりもさらに低い糊化ピーク温度を示していた。にもかかわらずエンタルピーはタイプ（iii）よりも大きくなっており、非常に特徴的な特性であると言える。また、３つの顆粒性澱粉合成酵素を全て欠損したモチタイプのデンプン（タイプ(ii)）は、３つの顆粒性澱粉合成酵素をすべてもつタイプ(i)に比べて糊化ピーク温度が高くなることは広く知られている。これに対して、タイプ(vi)はアミロースを持たないタイプでありながら、タイプ(i)よりも糊化ピーク温度が低くなっている。顆粒性澱粉合成酵素だけでなく、澱粉合成酵素II型を同時に２つ欠損させることで糊化ピーク温度やエンタルピーを低下させることができた。
DSC測定における糊化ピーク温度が低くなれば、より低い温度での糊化が可能になり、加工性に大きな影響を与えるだけでなく、加熱に適さない素材などとの加工が可能になる。さらには低い温度で糊化が進めば、よりアミラーゼなどの分解を受けやすくなり、これらによって遊離された糖がさらに甘みを感じさせることにもつながり、食味へも大きな影響を及ぼすことが考えられる。【００５３】
【表３】
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【００５４】
13．可溶性ポリグルカン（water soluble polyglucan, WSP）含量の測定
胚を取り除いた成熟種子を破砕し、65μmのナイロンメッシュを通った画分を使用した。回収した画分をメタノール中で15分間煮沸した後、遠心して沈殿部分を回収した。この沈殿をさらに90％メタノールで洗浄し、遠心して回収した後、乾燥して重量を測定した。約50 mgのサンプルを秤量し、1 mgに対して20μlの水を加え、20分間室温で攪拌しながら可溶性ポリグルカンを抽出した。600×g、20分間の遠心で可溶性画分と不溶性画分を分けて回収した。このうち不溶性画分からは再度水による抽出を行い、可溶性画分と不溶性画分を回収した。1回目と2回目の可溶性画分は混合してこの後の操作に使用した。
混合した可溶性画分は除タンパクを行うために５％の終濃度になるようにトリクロロ酢酸（TCA）を加えて氷上で3.5時間静置した。2,400×g、10分間の遠心で沈殿したタンパク層を除き、上清に3倍量のメタノールを加えてWSPを沈殿させ、遠心して回収後、乾燥して重量を測定した。
上記の水不溶性画分に関しては、水1050μlを加えて懸濁した後、150μlのトルエンを加え、1時間攪拌することで除タンパク処理を行った。700×g、10分間の遠心で沈殿を回収した。除タンパク処理をさらに２回繰り返し、最終的に回収した沈殿は水による洗浄を３回、メタノールによる洗浄を１回行った後、真空乾燥し重量を測定した。各サンプルとも、水不溶性画分の重量とWSPの重量を合計することで全糖量の重量とし、これに対するWSP重量の比率を算出した（図１４）。Type(i)、(ii)、(iii)に対してtype(vii)では明らかにWSPの含量が増加していた。【００５５】
14．ベーカリー食品
ベーカリー食品の製造には、本発明コムギのうち、タイプ(vii)のものを使用した。収穫した成熟種子を種子100 gあたり、1.5 mlの水を加えてよく混合し、30分間テンパリングを行った後、ブラベンダー社製テストミルQuadrumat Jr.を用いて製粉し小麦粉を得た。このときの歩留りは、46重量％であった。次に表４及び表５に示す配合と下記製造工程で食パンを製造した。表４のうち、ショートニング以外のものを混合し、ミキサーで低速１分間、高速で２分間ミキシングを行った（27℃）。ミキサーを止めてショートニングを加えた後、再度低速１分、高速３分間のミキシングを行い、捏ね上げた生地を27℃、湿度75％で90分間醗酵させた。パンチ後、再度同条件で30分間醗酵し、100 gに分割して丸め、20分間のベンチを行った。モルダーにて整形した後、38℃、湿度85％の醗酵室にて40分間ホイロを行い焼成した（205℃、20分間）。
上記条件で製造した食パンの風味及び食感を10名のパネラーにより評価した。表６に挙げた項目と評価基準に従って５段階評価し、各項目における平均値を算出した。この平均値を合計することによって各試験区の総合評価とした（表７）。この結果から、本発明コムギから得られる穀粉を使用することで甘みを有し、香りや味といった風味の強いベーカリー食品を製造できることを確認した。また、ベーカリー食品を製造する場合には、0.1〜60質量部使用するのが好ましく、0.5〜50質量部使用するのがより好ましいことが分かった。【００５６】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】タイプ(i)の二次元電気泳動により得られる泳動結果の模式図である。
【図１Ｂ】タイプ(vii)の二次元電気泳動結果である。
【図２】タイプ(i)の対照品種および、タイプ(vii)のコムギの遺伝子型判定を行った結果である。
【図３】タイプ(vii)のコムギ系統で産出される種子における電子顕微鏡写真である。
【図４】タイプ(vii)系統由来澱粉中のアミロペクチンを構成するグルコース側鎖の鎖長分布解析結果（(vii)−(i)）である。
【図５】タイプ(ii)系統由来澱粉中のアミロペクチンを構成するグルコース側鎖の鎖長分布解析結果（(ii)−(i)）である。
【図６】タイプ(iii)系統由来澱粉中のアミロペクチンを構成するグルコース側鎖の鎖長分布解析結果（(iii)−(i)）である。
【図７】タイプ(i)系統由来澱粉中のアミロペクチンを構成するグルコース側鎖の鎖長分布解析結果である。
【図８】タイプ(vii)系統由来澱粉中のアミロペクチンを構成するグルコース側鎖の鎖長分布解析結果である。
【図９】成熟種子中のグルコース含量を示すグラフである。
【図１０】成熟種子中のマルトース含量を示すグラフである。
【図１１】成熟種子中のスクロース含量を示すグラフである。
【図１２】タイプ(x)系統由来澱粉中のアミロペクチンを構成するグルコース側鎖の鎖長分布解析結果である。
【図１３】SDS-PAGEによる電気泳動結果である。
【図１４】成熟種子中の可溶性ポリグルカン含量を示すグラフである。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図１３】
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【配列表】
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