(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の被験物質の各々と、複数の被験物質の各々に対する第一の抗体で修飾した各々の標識物質粒子とを同時または段階的に不溶性担体上において展開し、該複数の被験物質の各々に対する第二の抗体の各々を異なる位置に固相化した不溶性担体上の反応部位において、該被験物質と該標識物質粒子を捕捉して、該標識物質粒子の光学的特性を同一の分析条件で測定することによって、該複数の被験物質を同時に定量することを含む免疫学的測定方法において、
複数の被験物質の各々の検出濃度領域は異なり、
上記した各々の標識物質粒子は、各々の標識物質で検出される各々の被験物質の検出濃度領域全域において該被験物質を定量することが可能となるような粒子サイズを有している、
ことを特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項２】
複数の被験物質の各々と、複数の被験物質の各々に対する第一の抗体で修飾した各々の標識物質粒子とをこれらの複合体を形成させた状態で不溶性担体上において展開することを特徴とする請求項１に記載の免疫学的測定方法。
【請求項３】
複数の被験物質の各々を含む試料を不溶性担体上において展開した後、さらに複数の被験物質の各々に対する第一の抗体で修飾した各々の標識物質粒子を該不溶性担体上において展開することを特徴とする請求項１に記載の免疫学的測定方法。
【請求項４】
前記光学的特性が、吸光度、散乱光強度、又は蛍光強度である、請求項１から３の何れかに記載の免疫学的測定方法。
【請求項５】
上記粒子が、蛍光性粒子、着色粒子、又は貴金属粒子である、請求項１から４の何れかに記載の免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出濃度領域の異なる複数の被検物質を同時に検出又は定量するための免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗体を利用した免疫学的測定方法においては、被検物質に対する抗体に蛍光色素、酵素や金コロイドなどの微粒子を標識し、その標識物を検出することが一般的に用いられている。この中でも、特に同一支持体上で複数の被検物質を同時に検出する場合においては、それぞれの抗体に標識する粒子の色調を変えることで可視的に判別する方法が知られている（特許文献１及び２を参照）。しかしながら、これらの方法は被検物質を可視的に検出することにおいては優れた方法と考えられるが、被検物質の定量分析を行う場合においては、標識の吸光波長に応じた検出系を複数用意する必要が生じ、検出器が複雑かつ高価となってしまう欠点があった。
【０００３】
また、要求される測定濃度領域が異なる分析対象物を同一の検出器で定量する場合、被検物質の濃度が高い場合、検出系として感度の低いものを選択するほか、被検物質を含む試料をあらかじめ用手法や分析機によって希釈する方法が一般的であり、要求される測定濃度領域が異なる被検物質を同一基板上で定量するのは困難であった。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−５６３５号公報
【特許文献２】特開平１０−１３２８１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、要求される測定濃度領域が異なる分析対象物を同一の検出器で定量する場合、用手法や分析機による希釈・分注操作が必要となり、操作が煩雑になることや、分析機が大型かつ高価になってしまうなどの欠点があった。本発明は、標識として用いる粒子のスペクトルは変えず、粒子のサイズのみを変化させることによって、測定感度・レンジを調整し、複数の被験物質を同じ分析条件で同時に定量することができる免疫学的測定方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、要求される測定濃度範囲の異なる複数の被験物質を同一担体上において定量する方法において、標識として用いる粒子のスペクトルは変えず、粒子のサイズのみを変化させることによって、測定感度・レンジを調整し、同じ分析条件／機器で複数の被験物質を同時に検出できることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、複数の被験物質の各々と、複数の被験物質の各々に対する第一の抗体で修飾した各々の標識物質粒子とを同時または段階的に不溶性担体上において展開し、該複数の被験物質の各々に対する第二の抗体の各々を異なる位置に固相化した不溶性担体上の反応部位において、該被験物質と該標識物質粒子を捕捉して、該標識物質粒子の光学的特性を測定することによって、該複数の被験物質を同時に検出することを含む免疫学的測定方法において、被験物質に応じて粒子サイズが異なる標識物質粒子を用いることによって検出濃度領域の異なる複数の被験物質を同時に検出することを特徴とする免疫学的測定方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、複数の被験物質の各々と、複数の被験物質の各々に対する第一の抗体で修飾した各々の標識物質粒子とをこれらの複合体を形成させた状態で不溶性担体上において展開する。
好ましくは、複数の被験物質の各々を含む試料を不溶性担体上において展開した後、さらに複数の被験物質の各々に対する第一の抗体で修飾した各々の標識物質粒子を該不溶性担体上において展開する。
好ましくは、前記光学的特性は、吸光度、散乱光強度、又は蛍光強度である。
好ましくは、上記粒子は、蛍光性粒子、着色粒子、又は貴金属粒子である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、粒子標識を用いた免疫学的測定方法において、粒子のサイズを選択することによって、最小検出感度をおよび測定レンジを調整することが可能であり、要求される検出濃度領域が異なる複数の被験物質を同一の担体上で同時に検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．免疫学的測定方法
本発明による免疫学的測定は、例えば、イムノクロマトグラフによって行うことができる。一般に、イムノクロマトグラフ方法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬（抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された検出用標識物が分散されてなる分散液を移動層として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させると共に、前記分析対象物と検出用標識物とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と検出用標識物の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に検出用標識物が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被検出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
【００１１】
２．被検試料
本発明の免疫学的測定方法で分析することのできる被検試料としては、複数種の分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
【００１２】
３．被検試料の前処理
本発明の免疫学的測定方法では、前記被検試料をそのままで、あるいは、前記被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
【００１３】
４．構成
本発明の免疫学的測定方法において使用することのできるイムノクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるイムノクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。イムノクロマトグラフ用ストリップとしては、例えば、展開方向の上流から下流に向かって、試料添加パッド、標識物質粒子保持パッド、クロマトグラフ担体（例えば抗体固定化メンブレン）、及び吸収パッドがこの順に、粘着シート上に配置されているものを用いることができる。
【００１４】
４−１．検出用標識物質粒子
本発明では、複数の被験物質の各々に対する第一の抗体で修飾した標識物質粒子を用いる。検出用の標識物質粒子としては、光学的特性（例えば、吸光度、散乱光強度、又は蛍光強度など）を測定することによって、該標識物質粒子を検出できるものであれば特に限定されず、好ましくは、蛍光性粒子、着色粒子、又は貴金属粒子を用いることができる。着色粒子としては、例えば、金属コロイドのような金属等を用いることができる。担体粒子（又はコロイド）の平均粒径は、０．０２〜１０μｍの範囲が好ましい。色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も着色粒子として使用することができる。従来公知の着色金属コロイドはいずれも標識用着色粒子として使用することができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、１〜１００ｎｍがさらに好ましい。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法（例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｐｐ６９１−６９６，（１９８２））に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識特異結合物質を得ることができる。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．  Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４１，２０，（１９７３）等）により金コロイド粒子を調製することができる。また、蛍光性粒子としては、例えば蛍光色素を含有した粒子を用いることができる。粒子の素材としてはポリスチレン、ＰＭＭＡなどの有機物やＳｉＯ２などの無機物を使用することができる。蛍光粒子の平均粒径としては、約１ｎｍ〜３μｍが好ましく、１０ｎｍ〜１μｍがさらに好ましい。蛍光性粒子と特異結合物質との結合は、従来公知である化学結合法や物理吸着法を用いて行うことができる。
【００１５】
本発明の免疫学的分析方法では、分析対象物（抗原又は抗体）と特異的に結合する抗体若しくは抗原、又は標準化合物を標識するのに用いる標識として、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いることができる。前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識としては、通常のイムノクロマトグラフ方法に用いることができる標識である限り、特に限定されるものではなく、金属コロイド標識としては、例えば、白金コロイド、金コロイド、パラジウムコロイド、又は銀コロイドそして、それらの混合物を挙げることができ、金属硫化物標識としては、例えば、鉄、銀、パラジウム、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を挙げることができる。本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、これらの金属コロイド標識及び／又は金属硫化物標識の１又はそれ以上を標識として用いることができる。さらに、標識としては蛍光性粒子を用いることもできる。
【００１６】
本発明においては、被験物質に応じて粒子サイズが異なる標識物質粒子を用いることを特徴とする。粒子サイズは特に限定されないが、一般的には１０ｎｍ〜１０μｍの範囲内で複数の粒子サイズを有する標識物質粒子を用いることができる。
【００１７】
４−２．抗体
本発明の免疫学的測定においては、分析対象物に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。
【００１８】
４−３．クロマトグラフ担体
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
【００１９】
通常クロマトグラフ担体の一部に検出用物質を固定化させて検出ゾーンを作製する。検出用物質は、検出用物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、検出用物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。
【００２０】
４−４．試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
【００２１】
４−５．標識物質粒子保持パッド
標識物質粒子保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した検出用標識物を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
【００２２】
４−６．吸収パッド
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により分析対象物の測定に合った速度を設定することができる。
【００２３】
５．免疫検査の方法
以下、本発明の免疫学的測定方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法について説明する。サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物（抗原）に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第１抗体を、予め標識化しておく。第２抗体を、適当な不溶性支持体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等の薄膜状支持体やポリスチレン、ＰＭＭＡ、ガラス等の基板等）上に固定し、分析対象物（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第１抗体を更に接触させると、被検試料中に分析対象物が存在する場合には、固定化第２抗体と分析対象物（抗原）と標識化第１抗体とからなる免疫複合体が形成される。
【００２４】
サンドイッチ法では、固定化第２抗体と分析対象物（抗原）と第１抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第１抗体を除去し、続いて、例えば、不溶性支持体における固定化第２抗体を固定した領域の光学的特性を測定することによって、複数の被験物質を同時に検出することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１：抗hCG抗体修飾蛍光粒子（直径１００ｎｍ）の作成
２％蛍光粒子溶液（Ｆ８８０１、直径１００ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５０μＬに５０ｍＭ ＭＥＳバッファー(ｐＨ ６．０)１５０μＬおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液１００ μＬを加え室温で１５分間攪拌した。４００ ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を５ μL加え室温で一晩攪拌した。２ ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を ５０μＬ添加し３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）にて、粒子を沈降させた。上清を取り除き、ＰＢＳ (ｐＨ７．４)を５００μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００ μＬ加え、蛍光粒子を再分散させることで、抗体修飾蛍光粒子溶液を得た。
【００２６】
実施例２：抗hCG抗体修飾蛍光粒子（直径２１０ｎｍ）の作成
２％蛍光粒子溶液（Ｆ８８１０、直径２１０ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５０μＬに５０ ｍＭ ＭＥＳバッファー(ｐＨ ６．０)１５０μＬおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液１００μＬを加え室温で１５分間攪拌した。４００ ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を５μL加え室温で一晩攪拌した。２ ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を５０μＬ添加し３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）にて、粒子を沈降させた。上清を取り除き、ＰＢＳ (ｐＨ７．４)を５００μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００ μＬ加え、蛍光粒子を再分散させることで、抗体修飾蛍光粒子溶液を得た。
【００２７】
実施例３：抗hCG抗体修飾蛍光粒子（直径５００ｎｍ）の作成
２％蛍光粒子溶液（Ｆ８８１２、直径５００ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５０μＬに５０ｍＭ ＭＥＳバッファー(ｐＨ ６．０)１５０μＬおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液１００ μＬを加え室温で１５分間攪拌した。４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を５μL加え室温で一晩攪拌した。２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を ５０μＬ添加し３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）にて、粒子を沈降させた。上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を５００μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、蛍光粒子を再分散させることで、抗体修飾蛍光粒子溶液を得た。
【００２８】
実施例４：抗体固定化メンブレンの作製
２５ｍｍ×２００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、ＨｉＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＨＦ２４０、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から８ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した固定化用抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ６６０１  ＳＰＲ−５、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液をインクジェット方式の塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて幅１ｍｍ程度のライン状に塗布した。同様に、下から１２ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）,ウサギＦ（ａｂ‘）２, 品番５６６−７０６２１、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 重量％カゼイン（乳由来、品番０３０−０１５０５、和光純薬）含有50 mMホウ酸バッファー（ｐＨ  ８．５））５００ｍＬをバットに入れ、そのまま３０分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５重量％スクロース、０．０５重量％コール酸ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））５００ｍＬに移して浸し、そのまま３０分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【００２９】
実施例５：イムノクロマトメンブレン、キットの作製
バック粘着シ−ト（ＡＲｃａｒｅ９０２０、ニップンテクノクラスタ社）に、実施例４で作製した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗ｈＣＧ抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約２ｍｍ重なるように反応溶液保持パッドを貼り付け、約４ｍｍ重なるようにして反応溶液保持パッド下側に試料添加パッド（１８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５ｍｍ重なるように吸収パッド（２０ｍｍ×１５０ｍｍに切ったセルロ−ス膜（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を4枚重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を５ｍｍ幅になるように短辺に平行にギロチン式カッタ−（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、５ｍｍ×５５ｍｍのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。これらをプラスチックケ−ス（ニップンテクノクラスタ社）に入れ、試験用イムノクロマトグラフキットとした。
【００３０】
実施例６：抗hCG抗体修飾蛍光粒子（直径１００ｎｍ）を用いたｈＣＧアッセイ
１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）でｈＣＧ（リコンビナントｈＣＧ  R−506、ロート製薬）溶液の希釈系列を作製し、これを溶液Ａとした。また、実施例１で作製した抗hCG抗体修飾蛍光粒子（直径１００ｎｍ）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で０．０１％に調製し、これを反応液Ｂとした。
【００３１】
反応液Ａ（５０μＬ）と反応液Ｂ（５０μＬ）を混合し１分間静置した後、全量を実施例５で作製したイムノクロマトグラフキットに点着し、溶液を展開させた。１５分間経過したところで、テストライン上の蛍光強度をイメージアナライザ（ＬＡＳ−４０００、富士フイルム社）を用いて測定し、ｈＣＧ濃度と蛍光強度の関係をプロットした。（図１及び表１）
【００３２】
実施例７：抗hCG抗体修飾蛍光粒子（直径２１０ｎｍ）を用いたｈＣＧアッセイ
反応液Ｂとして実施例２で作製した抗hCG抗体修飾蛍光粒子（直径２１０ｎｍ）を用いたこと以外、実施例６に記載の方法に従ってｈＣＧ濃度と蛍光強度の関係をプロットした。（図１及び表１）
【００３３】
実施例８：抗hCG抗体修飾蛍光粒子（直径５００ｎｍ）を用いたｈＣＧアッセイ
反応液Ｂとして実施例３で作製した抗hCG抗体修飾蛍光粒子（直径５１０ｎｍ）を用いたこと以外、実施例６に記載の方法に従ってｈＣＧ濃度と蛍光強度の関係をプロットした。（図１及び表１）
【００３４】
【表１】
0004980944.tif 000002
【００３５】
実施例９：抗ミオグロビン抗体修飾蛍光粒子（直径１００ｎｍ）の作成
２％蛍光粒子溶液（Ｆ８８０１、直径１００ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５０ μＬに５０ ｍＭ ＭＥＳバッファー(ｐＨ ６．０)１５０μＬおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ミオグロビンモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＭｙｏｇｌｏｂｉｎ  ７００１  ＳＰＲ−１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液１００ μＬを加え室温で１５分間攪拌した。４００ ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を５ μL加え室温で一晩攪拌した。２ ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を ５０μＬ添加し３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）にて、粒子を沈降させた。上清を取り除き、ＰＢＳ (ｐＨ７．４)を５００μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００ μＬ加え、蛍光粒子を再分散させることで、抗体修飾蛍光粒子溶液を得た。
【００３６】
実施例１０：抗心筋トロポニンＩ抗体修飾蛍光粒子（直径５００ｎｍ）の作成
２％蛍光粒子溶液（Ｆ８８１２、径５００ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５０ μＬに５０ ｍＭ ＭＥＳバッファー(ｐＨ ６．０)１５０μＬおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗心筋トロポニンＩモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈcＴＮＩ  ９７０１  ＳＰＲＮ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液１００ μＬを加え室温で１５分間攪拌した。４００ ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を５ μL加え室温で一晩攪拌した。２ ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を ５０μＬ添加し３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）にて、粒子を沈降させた。上清を取り除き、ＰＢＳ (ｐＨ７．４)を５００μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００ μＬ加え、蛍光粒子を再分散させることで、抗体修飾蛍光粒子溶液を得た。
【００３７】
実施例１１：抗体固定化メンブレンの作製
２５ｍｍ×２００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、ＨｉＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＨＦ２４０、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から８ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した固定化用抗ミオグロビンモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＭｙｏｇｌｏｂｉｎ  ７００４  ＳＰ−１、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液をインクジェット方式の塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて幅１ｍｍ程度のライン状に塗布した。同様に、下から１２ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗心筋トロポニンＩモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈｃＴＮＩ  ９７０５  ＳＰＲＮ−５、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（0.5重量％カゼイン（乳由来、品番０３０−０１５０５、和光純薬）含有50 mMホウ酸バッファー（ｐＨ  ８．５））５００ｍＬをバットに入れ、そのまま３０分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５重量％スクロース、０．０５重量％コール酸ナトリウム、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））５００ｍＬに移して浸し、そのまま３０分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【００３８】
実施例１２：イムノクロマトメンブレン、キットの作製
バック粘着シ−ト１（ＡＲｃａｒｅ９０２０、ニップンテクノクラスタ社）に、実施例１１で作製した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗ミオグロビン抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約２ｍｍ重なるように反応溶液保持パッドを貼り付け、約４ｍｍ重なるようにして反応溶液保持パッド下側に試料添加パッド（１８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５ｍｍ重なるように吸収パッド（２０ｍｍ×１５０ｍｍに切ったセルロ−ス膜（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を4枚重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を５ｍｍ幅になるように短辺に平行にギロチン式カッタ−（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、５ｍｍ×５５ｍｍのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。これらをプラスチックケ−ス（ニップンテクノクラスタ社）に入れ、試験用イムノクロマトグラフキットとした。
【００３９】
実施例１３：ミオグロビンと心筋トロポニンＩの同時アッセイ
それぞれの濃度が０．０１％ｓｏｌｉｄとなるように抗心筋トロポニンＩ抗体修飾蛍光粒子（直径５００ｎｍ）および抗ミオグロビン抗体修飾蛍光粒子（直径１００ｎｍ）の混合液を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)で調製し、これを反応液Ｃとした。
ミオグロビンおよび心筋トロポニンＩを表２に示す濃度で含む溶液(1)〜(5)を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)で調製し、これを反応液Ｄとした。
反応液Ｃ（５０μＬ）と反応液Ｄ（５０μＬ）を混合し１分間静置した後、全量を実施例１２で作製したイムノクロマトグラフキットに点着し、溶液を展開させた。１５分間経過したところで、ミオグロビンおよび心筋トロポニンＩのテストライン上の蛍光強度をイメージアナライザ（ＬＡＳ−４０００、富士フイルム社）を用いて測定し、ミオグロビンおよび心筋トロポニンＩの濃度と蛍光強度の関係を表２に示した。
【００４０】
【表２】
0004980944.tif 000003
【００４１】
実施例１４：抗ミオグロビン抗体修飾蛍光粒子（直径５００ｎｍ）の作成
２％蛍光粒子溶液（Ｆ８８１２、直径５００ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５０ μＬに５０ ｍＭ ＭＥＳバッファー(ｐＨ ６．０)１５０μＬおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ミオグロビンモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＭｙｏｇｌｏｂｉｎ  ７００１  ＳＰＲ−１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液１００ μＬを加え室温で１５分間攪拌した。４００ ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を５μL加え室温で一晩攪拌した。２ ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を ５０μＬ添加し３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）にて、粒子を沈降させた。上清を取り除き、ＰＢＳ (ｐＨ７．４)を５００μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００ μＬ加え、蛍光粒子を再分散させることで、抗体修飾蛍光粒子溶液を得た。
【００４２】
実施例１５：抗心筋トロポニンＩ抗体修飾蛍光粒子（直径１００ｎｍ）の作成
２％蛍光粒子溶液（Ｆ８８０１、直径１００ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５０μＬに５０ｍＭ ＭＥＳバッファー(ｐＨ ６．０)１５０μＬおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗心筋トロポニンＩモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈcＴＮＩ  ９７０１  ＳＰＲＮ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液１００ μＬを加え室温で１５分間攪拌した。４００ ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を５ μL加え室温で一晩攪拌した。２ ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を ５０μＬ添加し３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）にて、粒子を沈降させた。上清を取り除き、ＰＢＳ (ｐＨ７．４)を５００μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００ μＬ加え、蛍光粒子を再分散させることで、抗体修飾蛍光粒子溶液を得た。
【００４３】
比較例１：ミオグロビンと心筋トロポニンＩの同時アッセイ
それぞれの濃度が０．０１％ｓｏｌｉｄとなるように抗心筋トロポニンＩ抗体修飾蛍光粒子（直径５００ｎｍ）および抗ミオグロビン抗体修飾蛍光粒子（直径５００ｎｍ）の混合液を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)で調製し、これを反応液Ｃとした。
ミオグロビンおよび心筋トロポニンＩを表３に示す濃度で含む溶液(1)〜(5)を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)で調製し、これを反応液Ｄとした。
反応液Ｃ（５０μＬ）と反応液Ｄ（５０μＬ）を混合し１分間静置した後、全量を実施例１２で作製したイムノクロマトグラフキットに点着し、溶液を展開させた。１５分間経過したところで、ミオグロビンおよび心筋トロポニンＩのテストライン上の蛍光強度をイメージアナライザ（ＬＡＳ−４０００、富士フイルム社）を用いて測定し、ミオグロビンおよび心筋トロポニンＩの濃度と蛍光強度の関係を表３に示した。
【００４４】
【表３】
0004980944.tif 000004
【００４５】
比較例２：ミオグロビンと心筋トロポニンＩの同時アッセイ
それぞれの濃度が０．０１％ｓｏｌｉｄとなるように抗心筋トロポニンＩ抗体修飾蛍光粒子（直径１００ｎｍ）および抗ミオグロビン抗体修飾蛍光粒子（直径１００ｎｍ）の混合液を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)で調製し、これを反応液Ｃとした。
ミオグロビンおよび心筋トロポニンＩを表４に示す濃度で含む溶液(1)〜(5)を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)で調製し、これを反応液Ｄとした。
反応液Ｃ（５０μＬ）と反応液Ｄ（５０μＬ）を混合し１分間静置した後、全量を実施例１２で作製したイムノクロマトグラフキットに点着し、溶液を展開させた。１５分間経過したところで、ミオグロビンおよび心筋トロポニンＩのテストライン上の蛍光強度をイメージアナライザ（ＬＡＳ−４０００、富士フイルム社）を用いて測定し、ミオグロビンおよび心筋トロポニンＩの濃度と蛍光強度の関係を表４に示した。
【００４６】
【表４】
0004980944.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、抗体修飾蛍光粒子の粒子サイズと検出感度／レンジの関係を示す。
【図１】
0004980944.tif 000006