(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の配列を有する、パーキンと相互作用するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１３及び配列番号４３の配列のいずれかを有するポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１５及び配列番号４５の配列のいずれかを有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項５】
配列番号１の配列を有する請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号１２及び配列番号４２のいずれかの配列を有することを特徴とする請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
請求項４乃至６のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項４乃至６のいずれか一項に記載の核酸を含む組換え欠陥ウイルス。
【請求項９】
配列番号２またはその配列のフラグメントに結合し得る分子の選択段階を含む、パーキンタンパク質の活性を変調するために使用される分子のスクリーニングまたはキャラクタリゼーション方法。
【請求項１０】
配列番号１３、１５、４３及び４５の配列またはそれら配列のフラグメントから選択された配列に結合し得る分子の選択段階を含む、パーキンタンパク質の活性を変調するために使用される分子のスクリーニングまたはキャラクタリゼーション特徴付け方法。
【請求項１１】
請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸または請求項７または８に記載のベクターを含む細胞を前記核酸の発現条件下で培養する段階と、産生されたペプチド化合物を回収する段階とを含む請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド化合物の製造方法。
【請求項１２】
請求項４乃至６のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項７または８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１３】
請求項４乃至６のいずれか一項に記載の核酸をその細胞内に含む非ヒトトランスジェニック動物（ここで、該トランスジェニック動物は、齧歯類、イヌ、ウサギである）。
【請求項１４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載のポリペプチドに対する抗体であることを特徴とする抗体または抗体の前記ポリペプチド結合性のフラグメントもしくは誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、パーキン（ｐａｒｋｉｎｅ）の活性を調節するために有用な組成物及び方法に関する。より特定的には本発明は、パーキンの結合相手となるＰＡＰ１と命名された新規なタンパク質並びに該タンパク質から誘導されるかまたは該タンパク質に相同なペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明はまた、パーキンの活性を少なくとも部分的に変調し得る化合物、特に、パーキンとＰＡＰ１との相互作用に干渉し得る化合物に関する。本発明は、治療及び診断の分野に有用であり、また、新規な医薬の開発に役立つ薬理学的ターゲットを構成するために有用である。
【０００２】
パーキンソン病のいくつかの家族性形態（若年性常染色体劣性疾患）ではパーキンの遺伝子が突然変異している（Ｋｉｔａｄａら，１９９８）。パーキンソン病（Ｌｅｗｙ，１９１２）は、最も代表的な神経変性疾患の１つであり、５５歳以上の人口の１％以上がこの病気に罹患している。この病気に罹患した患者には様々な神経障害が見られるが、これらをパーキンソン症候群と総称する。特徴的な症状は、筋固縮、無動、安静時振戦である。これらの症状は、脳の黒質のドーパミン作動性ニューロンが変性した結果として生じる。
【０００３】
パーキンソン病の大抵の症例は家族性疾患ではない。しかしながら、家族性の症例もある程度は存在しており、そのうちの幾つかは一遺伝子遺伝型の疾患である。現時点では、発症例の少ない幾つかの遺伝性形態で異なる３つの遺伝子が同定されているだけである。第一の形態は、常染色体優性型であり、その原因遺伝子はアルファシヌクレインをコードしている（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら，１９９７）。このタンパク質は、パーキンソン病のマーカーの役割を果たすＬｅｗｙ体と呼ばれる細胞質内封入体に多い成分である（Ｌｅｗｙ，１９１２）。第二の形態は、同じく常染色体優性型であり、ユビキチンのカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１と呼ばれるヒドロラーゼをコードする遺伝子の突然変異に関係がある（Ｌｅｒｏｙら，１９９８）。この酵素はポリマーまたはコンジュゲートの形態のユビキチンをモノマー形態のユビキチンに加水分解すると推測されている。第三の形態は、上記の２つの形態に比べて、常染色体劣性型であること、しばしば４０歳以前に発病すること、及び、Ｌｅｗｙ体が存在しないことを顕著な特徴としている。この形態の患者に対しては、パーキンソン病の治療薬として使用されているドーパミン前駆物質Ｌ−ドーパが極めて有効である。この形態に関与する遺伝子はパーキンと呼ばれる新しいタンパク質をコードしている（Ｋｉｔａｄａら，１９９８）。
【０００４】
パーキンの遺伝子は、染色体６（６ｑ２５．２−ｑ２７）の５００，０００塩基対以上のゲノム領域を含む１２個のエキソンから構成されている。現時点では、病気の初期にこの遺伝子に主として２種類の突然変異、即ち、エキソン２−９を含む領域に種々のサイズの欠失が生じる突然変異、または、終結コドンの早期出現もしくはアミノ酸の変化が生じる点突然変異が存在することが知見されている（Ｋｉｔａｄａら，１９９８；Ａｂｂａｓら，１９９９；Ｌｕｃｋｉｎｇら，１９９８；Ｈａｔｔｏｒｉら，１９９８）。これらの突然変異の特性及び常染色体劣性伝達モードは、パーキンの機能低下がパーキンソン病に至ることを示唆する。
【０００５】
この遺伝子は多くの組織、特に黒質で発現される。種々の選択的スプライシングの結果としてこの遺伝子に対応する複数の転写産物が存在する（Ｋｉｔａｄａら，１９９８；Ｓｕｎａｄａら，１９９８）。脳内に２種類のメッセンジャーＲＮＡが存在しており、一方のメッセンジャーＲＮＡではエキソン５に対応する部分が欠失している。白血球中で同定されたパーキン遺伝子のメッセンジャーＲＮＡはエキソン３、４及び５をコードする領域を含まない。脳内に存在するパーキン遺伝子の長いほうのメッセンジャーＲＮＡは２９６０塩基を含んでおり、４６５アミノ酸から成るタンパク質をコードしている。
【０００６】
このタンパク質のＮ末端部分はユビキチンとの相同性が小さい。Ｃ末端側の半分は、システインに富む領域に対応するＩＢＲ（Ｉｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｒｉｎｇ）ドメインによって分離された２つの“リングフィンガー”モチーフを含み、“ジンクフィンガー”ドメインとして金属と結合し得る（Ｍｏｒｅｔｔ，１９９９）。パーキンがメラミンを含有する黒質のニューロンの細胞質及びゴルジ装置に局在することは免疫組織化学によって証明された（Ｓｈｉｍｕｒａら，１９９９）。更に、このタンパク質はパーキンソン病患者の幾つかのＬｅｗｙ体に存在している。パーキンの細胞性機能はまだ解明されていないが、シナプス小胞内でも、タンパク質の成熟または分解のときにも、また、細胞の増殖、分化または発達のコントロールにおいても、輸送体の役割を果たすと考えられる。若年性常染色体劣性型ではパーキンが存在しない。従って、この機能の喪失が病気の一因であると確信し得る。
【０００７】
従って、ドーパミン作動性ニューロンの変性過程でパーキンタンパク質が果たす正確な役割を解明することは、パーキンソン病の全容を理解しその治療方法を開発するため、より一般的には中枢神経系疾患の全容を理解しその治療方法を開発するために最も重要な課題である。
【０００８】
本発明の目的は、生理的条件下でパーキンと相互作用するパーキンの結合相手を同定することである。パーキンの結合相手は、パーキンの活性を変調し得る化合物、特にドーパミン作動性ニューロンの変性及び／または神経性疾患の進行に関するパーキンの活性を変調し得る化合物を製造または研究する薬理学の新しい対象である。このタンパク質、抗体、対応する核酸及び特異的プローブもしくは特異的プライマーはまた、生物標本、特に神経組織標本中のタンパク質の検出または定量にも役立つ。これらのタンパク質または核酸は、パーキンの活性を変調したり本発明化合物の活性を変調したりするために、パーキンと本発明のポリペプチドとの相互作用を変調するような治療方法にも有用である。
【０００９】
より特定的には本発明は、パーキンと相互作用する新規なヒトタンパク質が出願人らによって知見された結果として得られた。このタンパク質をＰＡＰ１（Ｐａｒｋｉｎｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）またはＬＹ１１１と呼ぶ。ＰＡＰ１タンパク質（配列１または２）は、シナプトタグミンに対してある程度の相同性を有しており、特にパーキンの中央領域（配列３または４で表す）と相互作用し得る。ＰＡＰ１タンパク質はまた、ヒト起原の種々の組織特に肺（配列１２、１３）及び脳（配列４２、４３）から、また、スプライシングに起因する変異体に対応する短縮形態（配列１４、１５、４４、４５）から、クローニングされ、配列決定され、特性決定された。
【００１０】
本発明はまた、パーキンの機能の変調に関与するＰＡＰ１タンパク質の特定領域を同定及び特性決定した結果として得られた。このタンパク質の存在を知見しその機能に関与する領域を解明したことによって、医薬として有用な新規な化合物及び／または組成物を製造すること、及び、このような化合物の工業的なスクリーニング方法を開発することが可能になった。
【００１１】
従って、本発明の第一の目的は、ＰＡＰ１タンパク質（またはそれらのホモローグ）とパーキン（特にヒトのパーキン）との相互作用を少なくとも部分的に変調し得るかまたはこれらのタンパク質の相互作用段階に干渉し得る化合物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、ＰＡＰ１タンパク質、そのフラグメント、誘導体及びホモローグを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ＰＡＰ１タンパク質、そのフラグメント、誘導体またはホモローグをコードする核酸、このような核酸を含むベクター、このような核酸またはベクターを含む組換え細胞、及び、このような核酸をその細胞内に含むヒト以外の哺乳動物を提供することである。
【００１４】
本発明はまた、ＰＡＰ１タンパク質、そのフラグメント、誘導体及びホモローグに結合し得る抗体、特にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、より好ましくはＰＡＰ１タンパク質と結合することができＰＡＰ１タンパク質とパーキンとの相互作用を少なくとも部分的に阻害し得る抗体に関する。
【００１５】
本発明の別の目的は、任意の生物標本中のｐａｐ１遺伝子または該遺伝子の１つの領域を検出または増幅するために有用なＰＡＰ１特異的ヌクレオチドプローブまたはプライマーを提供することである。
【００１６】
本発明はまた、医薬組成物、遺伝的異常の検出方法、上記に定義のようなポリペプチドの産生方法、活性化合物のスクリーニングまたはキャラクタリゼーションの方法に関する。
【００１７】
上述のように、本発明の第一の目的は、ＰＡＰ１タンパク質（またはそのホモローグ）とパーキンとの相互作用の段階に少なくとも部分的に干渉し得る化合物を提供することである。
【００１８】
本文中で使用されたＰＡＰ１タンパク質という用語は、タンパク質自体及び該タンパク質のすべての相同形を意味する。相同形という用語は、考察中のタンパク質に等価であり、種々の細胞、特にヒト細胞またはヒト以外の生物の細胞に由来し、同じタイプの活性を有しているすべてのタンパク質を意味する。このようなホモローグはまた、配列２を有しているＰＡＰ１タンパク質の天然変異体、特に多形性に起因する変異体またはスプライシングに起因する変異体を含意する。このようなホモローグはまた、コーディング核酸（特に配列１の核酸）との間のハイブリダイゼーション実験によって得られる。本文中で使用された範囲では、この種の配列が、特許請求の範囲に記載のＰＡＰ１タンパク質の生理的挙動と同様の生理的挙動に導くための有意な一致パーセンテージを有していれば十分である。有意な一致パーセンテージという用語は、少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、いっそう好ましくは９５％のパーセンテージを意味する。この観点から、ヒト起原の組織から同定された配列１３、１５、４３及び４５は配列２の変異体及び／またはホモローグである。従って、ＰＡＰ１という名称はこれらのポリペプチドも包含する。
【００１９】
本文中で使用された範囲では、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の“一致パーセンテージ”は、最適に位置合せした２つの配列を比較ウインドウで比較することによって決定される。
【００２０】
従って、比較ウインドウの内部に存在するヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、（付加または欠失を含まない）基準配列に比較して２つの配列の最適な位置合せが得られるような付加または欠失（例えば“ギャップ”）を含み得る。
【００２１】
パーセンテージを計算するためには、比較した２つの配列（核酸配列またはペプチド配列）について同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が観察される位置の数を測定し、双方の配列の塩基またはアミノ酸残基の一致が存在する位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で除算し、次いで、得られた商に１００を乗算することによって、配列一致パーセンテージを得る。
【００２２】
比較用配列の最適位置合せは、ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ＰＡＣＫＡＧＥ，ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＧＲＯＵＰ（ＧＣＧ）社，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｏｃｔｏｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩＳＣＯＮＳＩＮのパッケージに含まれた公知のアルゴリズムを用いたコンピュータ処理によって行うことができる。
【００２３】
例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア（１９９６年３月のＢＬＡＳＴ  １．４．９バージョン、１９９８年２月のＢＬＡＳＴ  ２．０．４バージョン及び１９９８年９月のＢＬＡＳＴ  ２．０．６バージョン）を用い、端数切り捨てパラメーターを排他的に使用することによって（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５；４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９−３４０２）配列一致パーセンテージを計算し得る。ＢｌａｓｔはＡｌｔｓｃｈｕｌら（前出）のアルゴリズムを用いて基準“リクエスト”配列に類似／相同の配列を探索する。使用するリクエスト配列及びデータベースはペプチド配列または核酸配列でもよく、それらの任意の組合せでもよい。
【００２４】
本発明化合物による干渉は種々の形態で現れる。例えば、化合物はＰＡＰ１タンパク質またはその相同形の１つとパーキンとの相互作用を少なくとも部分的に抑制、阻害または刺激する。好ましくは化合物が、例えば２つのポリペプチド間の相互作用を検出するツーハイブリッド型システムまたは非細胞性システム中で上記のような相互作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで変調し得る。好ましい本発明化合物は、この相互作用を少なくとも部分的に変調し得る化合物であり、より好ましい本発明化合物は、化合物の非存在下のコントロールに比較してこの相互作用を少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％増進させるかまたは阻害し得る化合物である。
【００２５】
本発明の特定実施態様では、化合物が配列４で表されたパーキンの領域と配列２、１３、１５、４３または４５で表されたＰＡＰ１タンパク質との間の相互作用の段階に干渉し得る。
【００２６】
本発明の特定実施態様では、化合物がＰＡＰ１タンパク質またはその相同形の１つとパーキンとの相互作用ドメインの処に結合し得る。
【００２７】
本発明化合物は多様な種類及び起原を有し得る。特に、ペプチド型、核酸型（即ち、塩基の連鎖を含む核酸、特にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）、脂質型、糖型の化合物、抗体などでよく、より普遍的には有機または無機のすべての分子を包含する。
【００２８】
第一種類の本発明化合物はペプチド型である。ペプチドという用語は、アミノ酸の連鎖を含むすべての分子、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体（または抗体のフラグメントまたは誘導体）を含意し、これらのペプチドは場合によっては修飾されていてもよくまたは別の化合物もしくは化学基に結合してもよい。この観点から、“ペプチド”という用語はより特定的には、５０個以下のアミノ酸、より好ましくは４０個以下のアミノ酸の連鎖から成る分子を意味する。ポリペプチド（またはタンパク質）は好ましくは５０−５００個またはそれ以上のアミノ酸を含む。
【００２９】
第一の好ましい実施態様によれば、本発明化合物は、ペプチド配列２またはその誘導体のいずれか１つの全部または一部、特にペプチド配列１３、１５、４３または４５またはそれらの誘導体の全部または一部を含むペプチド化合物、より特定的には配列２、１３、１５、４３または４５を含むＰＡＰ１タンパク質である。
【００３０】
本文中で使用された誘導体という用語は、１つまたは複数の遺伝性修飾及び／または化学的修飾によって生じた遺伝コードの変性が原因で考察中の配列から異なるすべての配列、並びに、核酸配列１またはそのフラグメント例えば核酸配列１２、１４、４２または４４またはそれらのフラグメントとハイブリダイズする配列によってコードされておりＰＡＰ１タンパク質またはそのホモローグの１つとパーキンとの相互作用の段階に干渉する能力を有しているすべてのペプチドを意味する。遺伝性修飾及び／または化学的修飾という用語は、１つまたは複数の残基の突然変異、置換、欠失、付加及び／または修飾のいずれかを意味する。誘導体という用語はまた、別の細胞ソース、特にヒト細胞またはヒト以外の生物の細胞に由来し考察中の配列と同種の活性を有している考察中の配列に相同の配列を意味する。このような相同配列はハイブリダイゼーション実験によって得られる。ハイブリダイゼーションは、核酸ライブラリーを出発物質とし、天然型配列またはそのフラグメントをプローブとして使用し種々のハイブリダイゼーション条件下で行う（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。更に、“フラグメント”または“部分”という用語は、考察中の分子の部分であって連続する５個以上の残基、好ましくは連続する９個以上の残基、より好ましくは連続する１５個以上の残基を含むすべての部分を意味する。典型的なフラグメントは少なくとも２５個の連続する残基を含み得る。
【００３１】
このような誘導体またはフラグメントは、種々の目的で、特に治療効果の増強または副作用の抑制などの目的、あるいは、これらの誘導体またはフラグメントに新規な薬理学的及び／または生物学的特性を付与するなどの目的で作製され得る。
【００３２】
ＰＡＰ１タンパク質及び相同形から誘導されたペプチドとしては特に、パーキンと相互作用する能力を有しているが非機能化されたエフェクター領域を含むペプチドが挙げられる。このようなペプチドは、ＰＡＰ１タンパク質及びその相同形のエフェクター領域に欠失、突然変異または破壊を生じさせることによって得られる。このような修飾は例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、付加要素もしくは合成配列の導入、または、初期要素の欠失もしくは置換によって得られる。上記に定義したような誘導体が作製されたとき、これらの誘導体がＰＡＰ１タンパク質またはその相同形とパーキンの結合部位との結合を部分的に阻害する活性を有していることを証明できる。このために、当業者に公知の任意の技術を使用し得ることは明らかであろう。
【００３３】
本発明はまた、上記のような配列のフラグメントを提供する。このようなフラグメントは種々の方法で作製し得る。特に、当業者に公知のペプチドシンセサイザーを使用し、本出願で与えた配列に基づいて、化学的方法で合成できる。また、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞宿主中で発現させる遺伝的方法によって合成できる。この場合、ヌクレオチド配列は、本出願で与えたペプチド配列及び遺伝コードに基づいてオリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して化学的に合成できる。ヌクレオチド配列はまた、本出願で与えた配列を出発材料とし当業者に公知の技術に従って酵素切断、結合、クローニングなどを行うことによって作製してもよく、または、これらの配列から作製したプローブでＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって作製してもよい。
【００３４】
更に、本発明のペプチド、即ち、ＰＡＰ１タンパク質及び相同形とパーキンとの相互作用を少なくとも部分的に変調し得るペプチドはまた、パーキンとの相互作用を生じるＰＡＰ１タンパク質及び相同形の部位に対応する配列を有するペプチドであってもよい。
【００３５】
別の本発明ペプチドは、細胞標的に対して上記に定義のペプチドと競合的に相互作用するペプチドである。このようなペプチドは特に、考察中のペプチドの配列に基づいて合成でき、上記に定義のペプチドとの競合能力を測定できる。
【００３６】
本発明の特別な目的はＰＡＰ１タンパク質を提供することである。より特定的には配列２またはそのフラグメントもしくは誘導体を含むＰＡＰ１タンパク質、例えば配列１３、１５、４３、４５またはそのフラグメントを含むＰＡＰ１タンパク質を提供することである。
【００３７】
本発明の別の目的は、上記に定義のようなポリペプチドに対するポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはこれらの抗体のフラグメントもしくは誘導体を提供することである。このような抗体は、当業者に公知の方法によって作製できる。特にこれらの抗体は、本発明のペプチド化合物（特に、配列２の全部または一部を含むポリペプチドまたはペプチド）に対して動物を免疫感作し、血液を採取し、抗体を単離することによって調製できる。これらの抗体はまた、当業者に公知の技術に従ってハイブリドーマを調製することによって作製できる。
【００３８】
より好ましくは、本発明の抗体または抗体フラグメントは、特許請求の範囲に記載のペプチドとパーキンとの相互作用を少なくとも部分的に変調する能力を有している。
【００３９】
更にこれらの抗体はまた、生物標本中のＰＡＰ１の発現を検出及び／または定量するために使用でき、その結果として、ＰＡＰ１タンパク質の活性化状態に関する情報を得るために使用できる。
【００４０】
抗体のフラグメントまたは誘導体は例えばフラグメントＦａｂ、Ｆａｂ′２、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、などである。特に、元になる抗体の抗原特異性を保存しているすべてのフラグメントまたは誘導体が包含される。
【００４１】
より好ましくは本発明の抗体は、配列２、１３、１５、４３または４５を含むＰＡＰ１タンパク質、特にパーキンとの相互作用に関与するＰＡＰ１タンパク質の領域と結合し得る。より好ましくはこれらの抗体（またはフラグメントまたは誘導体）は、配列２の残基１から残基３４４までの配列中に存在するエピトープと結合し得る。
【００４２】
本発明はまた、医薬として有用な非ペプチド性化合物または非ペプチド単独性化合物に関する。即ち、本出願に記載した活性タンパク質モチーフから医薬用途に適合する非ペプチド単独性のＰＡＰ１活性変調分子を作製することが可能である。特に、ペプチドの活性モチーフを非ペプチド性構造または非ペプチド単独性構造と共に複製すればよい。
【００４３】
本発明の目的はまた、本発明のペプチド化合物をコードする核酸のいずれかを提供することである。本発明は特に、配列１、１２、１４、４２もしくは４４の全部または一部を含む核酸またはその誘導体の１つを提供する。本文中に使用された誘導配列という用語は、配列１で示された配列または該配列のフラグメントとハイブリダイズして本発明のペプチド化合物をコードする任意の配列を意味しており、また、遺伝コードの縮重に基づいて上記の配列から得られる配列を意味している。本発明の核酸は例えば核酸配列１２、１４、４２または４４の全部または一部を含む。
【００４４】
本発明は更に、配列１に対してまたは配列１のフラグメントに対して有意な一致パーセンテージを有しておりかつＰＡＰ１タンパク質の生理的挙動に類似の生理的挙動を有しているペプチド化合物をコードする配列に関する。有意な一致パーセンテージという用語は、少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、いっそう好ましくは９５％のパーセンテージを意味する。
【００４５】
本発明の種々のヌクレオチド配列は人工的に産生された配列でもよくそうでなくてもよい。ヌクレオチド配列は例えば、ゲノム配列、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッド配列、合成配列または半合成配列である。これらの配列は、ＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー）のスクリーニングによって得ることもでき、化学合成によって得ることもでき、ライブラリーのスクリーニングによって得られた配列の化学的または酵素的な修飾を含む混成方法によって得ることもでき、核酸またはタンパク質のデータベース中のホモロジーの探索、などによって得ることもできる。上述のようなハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，９．５２−９．５５頁）によって記載された条件下で行うのが好ましい。
【００４６】
ハイブリダイゼーションは高緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で行うのが有利である。本発明で使用された“高緊縮性ハイブリダイゼーション条件”という用語は、以下の条件を表す。
【００４７】
１−膜の競合及びプレハイブリダイゼーション：
−４０μｌのサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）と４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）とを混合する。
−９６℃で５分間変性し、次いで混合物を氷浴に浸漬させる。
−ＳＳＣ  ２×バッファを除去し、膜を収容したハイブリダイゼーション管に４ｍｌのホルムアミドミックスを注入する。
−２つの変性ＤＮＡの混合物を加える。
−回転しながら４２℃で５−６時間インキュベートする。
【００４８】
２−標識プローブの競合：
−標識し精製したプローブに、非特異的ハイブリダイゼーション量に従って１０から５０μｌのＣｏｔ  Ｉ  ＤＮＡを添加する。
−９５℃で７−１０分間変性する。
−６５℃で２−５時間インキュベートする。
【００４９】
３−ハイブリダイゼーション：
−プレハイブリダイゼーションミックスを除去する。
−４０μｌのサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）と４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）とを混合する。９６℃で５分間変性し、次いで混合物を氷浴に浸漬させる。
−ハイブリダイゼーション管に４ｍｌのホルムアミドミックス、２つのＤＮＡの混合物及び標識プローブ／変性Ｃｏｔ  Ｉ  ＤＮＡを加える。
−回転しながら４２℃で１５−２０時間インキュベートする。
【００５０】
４−洗浄
−周囲温度の洗浄用２×ＳＳＣで洗浄する。
−周囲温度の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで５分間ずつ２回洗浄する。
−６５℃の０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで１５分間ずつ２回洗浄する。
膜をサランラップに包んで露光する。
【００５１】
上記のハイブリダイゼーション条件は、２０ヌクレオチドから数１００ヌクレオチドまでの範囲の種々の長さの核酸分子を高緊縮性条件下でハイブリダイズするために好適な条件である。
【００５２】
勿論、ハイブリダイゼーションさせるべき核酸及び選択された標識の種類に適応するように上記のハイブリダイゼーション条件を当業者に公知の技術に従って変更することができる。
【００５３】
例えば、ＨＡＭＥＳ  ＆  ＨＩＧＧＩＮＳ（１９８５）の著作（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉａｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）またはＦ．ＡＵＳＵＢＥＬら（１９９９）の著作（Ｃｕｒｒｅｎｔｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）に含まれている教示に従って適正なハイブリダイゼーシヨン条件に調整し得る。
【００５４】
特定的な本発明の核酸は配列２またはそのフラグメントもしくは誘導体を含むポリペプチドをコードしており、特にヒトＰＡＰ１タンパク質をコードしている。有利な本発明の核酸は、核酸配列１、１２、１４、４２または４４を含む核酸である。
【００５５】
このような核酸を本発明のペプチド化合物の製造に使用できる。従って本出願は、本発明の核酸を含む細胞を該核酸の発現条件下で培養する段階と、産生されたペプチド化合物を回収する段階とから成るペプチド化合物の製造方法に関する。この場合、ペプチド化合物をコードする部分は一般に、細胞宿主中で該ペプチド化合物を発現させ得るシグナルのコントロール下に配置されている。使用される細胞宿主に応じてこれらのシグナル（プロモーター、ターミネーター、分泌“リーダー”配列、など）の選択を変更できる。更に、本発明の核酸が自律複製ベクターまたは組込みベクターの一部を構成してもよい。特に自律複製ベクターは、自律複製配列を選択宿主中で使用することによって作製し得る。組込みベクターは、例えば相同的組換えによってベクターを組込むことができる宿主のゲノムの幾つかの領域に相同な配列を使用することによって作製できる。組込みベクターの種類には、プラスミドベクター、エピソームベクター、染色体ベクター、ウイルスベクター、などがある。
【００５６】
組換え法によって本発明のペプチド化合物を産生させるために有用な細胞宿主は真核細胞または原核細胞のいずれでもよい。適当な真核宿主としては、動物細胞、酵母または真菌類がある。酵母としては特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、ＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓまたはＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母が挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＰＣ１２細胞、などが挙げられる。真菌類としては特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種が挙げられる。原核細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような細菌の使用が好ましい。
【００５７】
本発明の目的は更に、本発明の核酸またはベクターを細胞中に含むヒト以外の哺乳動物を提供することである。
【００５８】
このような哺乳動物（齧歯類、イヌ、ウサギ、など）はＰＡＰ１の特性研究及び治療用化合物の同定に有用である。このようなトランスジェニック動物のゲノムの修飾は、１つまたは複数の遺伝子を“ノックイン”または“ノックアウト”によって改変するかまたは修飾することによって得られる。この修飾は、従来の変性剤または突然変異誘発物質によって行われてもよく、または、調節的突然変異誘発によって行われてもよい。ゲノムの修飾はまた、野生型または突然変異型の（１つまたは複数の）遺伝子の挿入または置換によって得られる。ゲノムの修飾は、生殖細胞株及び前核に対して行うのが有利である。トランスジェニック生物を作製するためには、修飾された遺伝子を含む発現カセットを２つの受精前核にマイクロインジェクションによって注入する。従って本発明の動物は、核酸を含む発現カセットの注入によって得られる。好ましくはこの核酸はＤＮＡであり、該ＤＮＡはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）でもよくまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）でもよい。
【００５９】
本発明のトランスジェニック動物は当業者に公知の慣用の技術に従って作製し得る。当業者は特に、米国特許ＵＳ４，８７３，１９１、ＵＳ５，４６４，７６４及びＵＳ５，７８９，２１５に記載されているようなトランスジェニック動物の作製方法、特にトランスジェニックマウスの作製方法を参照し得る。これらの文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００６０】
簡単に説明すると、本発明の核酸を含むポリヌクレオチド構築物をＥＳ型の細胞株系に挿入する。ポリヌクレオチド構築物の挿入は、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５１：５０３−５１２）によって記載されたような電気穿孔によって行うのが好ましい。
【００６１】
電気穿孔段階で処理した細胞を次に、ポリヌクレオチド構築物の存在に基づいてスクリーニングし（例えばラベルを用いて選択するか、または、ＰＣＲ、またはサザン型のＤＮＡ電気泳動ゲル分析を用いる）、場合によっては、相同的組換えイベントを生じさせた後、外因性ポリヌクレオチド構築物をそのゲノムに組込んだ陽性細胞を選択する。このような技術は例えばＭＡＮＳＯＵＲら（Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６：３４８−３５２）によって記載されている。
【００６２】
次に、ＢＲＡＤＬＥＹ（１９８７，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ  ｍｉｃｅ．：Ｅ．Ｊ．ＲＯＢＥＲＴＳＯＮ  Ｅｄ．ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐａｇｅ１１３）によって記載されたような手順で、選択した陽性細胞を単離し、クローニングし、３．５日齡のマウスの胚盤胞に注入する。次に胚盤胞を雌の宿主動物に導入し、胚の発達を出産時期まで追跡する。
【００６３】
代替方法では、ＷＯＯＤら（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０：４５８２−４５８５）またはＮＡＧＹら（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０：８４２４−８４２８）に記載されたような手順で、選択した陽性ＥＳ型細胞を、２．５日齡の８−１６細胞期の胚（桑実胚）と接触させて、ＥＳ細胞のインターナリゼーションを生じさせ、生殖系になる細胞を含めた胚盤胞の広い範囲にＥＳ細胞のコロニーを形成させる。
【００６４】
次いで、後代がポリヌクレオチド構築物（トランスジーン）を組込んでいるか否かを判定するために後代を試験する。
【００６５】
本発明の核酸はまた、医薬として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは遺伝子のアンチセンス鎖の作製に役立つ。アンチセンス配列は、所与の遺伝子のコーディング鎖に相補的な短鎖オリゴヌクレオチドであり、転写されたｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできるので、該ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを阻害し得る。従って本発明の目的は、パーキンに対するＰＡＰ１タンパク質の相互作用を少なくとも部分的に阻害し得るアンチセンス配列を提供することである。このような配列は、上記に定義した核酸配列の全部または一部から構成され得る。このような配列は一般的には、パーキンと相互作用するペプチドをコードする配列に相補的な配列であるかまたは配列フラグメントである。このようなオリゴヌクレオチドは、分割などによって作製されてもよく、または、化学合成によって作製されてもよい。
【００６６】
特許請求の範囲に記載された配列は遺伝子治療の分野で、アンチセンス配列またはＰＡＰ１タンパク質とパーキンとの相互作用を変調し得るペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで導入及び発現させるために使用し得る。このためには、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与し得るウイルス性または非ウイルス性のベクター（Ｋａｈｎら，１９９１）に配列を組込む。本発明に好適なウイルス性ベクターとしては特に、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）またはヘルペスウイルスのようなベクターが挙げられる。本出願の目的はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸、特に配列２またはその誘導体の全部または一部を含むポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸、例えば、配列１２、１４、４２または４４またはそれらの誘導体の全部または一部を含むポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を含む組換え欠陥ウイルスを提供することである。
【００６７】
本発明はまた、上記に定義のヌクレオチド配列またはそれらの相補鎖とハイブリダイズし得る合成または非合成のヌクレオチドプローブを提供する。このようなプローブは、ＰＡＰ１の発現もしくは超発現を検出するため、または、遺伝的異常（誤ったスプライシング、多型、点突然変異、など）を証明するために、診断ツールとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用され得る。これらのプローブはまた、別の細胞ソース、好ましくはヒト由来の細胞から上記に定義のようなペプチドをコードする相同核酸配列を発見し単離するために使用され得る。本発明のプローブは一般的に少なくとも１０個の塩基を含んでおり、例えば上記配列の１つまたはそれらの相補鎖全体を含んでいてもよい。これらのプローブは使用に先立って標識するのが好ましい。このために当業者に公知の種々の技術を使用し得る（放射性標識、蛍光標識、酵素標識、化学的標識、など）。
【００６８】
本発明はまた、ＰＡＰ１をコードする核酸の全部または一部を増幅し得るプライマーまたはプライマー対、例えば、配列１６−４１から選択された配列をもつプライマーに関する。
【００６９】
本発明の目的は更に、少なくとも１つの上記に定義の化合物、特にペプチド化合物を有効成分として含むすべての医薬組成物を提供することである。
【００７０】
本発明の目的は特に、少なくとも１つの上記に定義の抗体及び／または抗体フラグメントを有効成分として含むすべての医薬組成物、並びに、少なくとも１つの上記に定義の核酸またはベクターを有効成分として含むすべての医薬組成物を提供することである。
【００７１】
本発明の目的はまた、ＰＡＰ１タンパク質とパーキンとの相互作用を増強または抑制し得る化学分子を有効成分として含むすべての医薬組成物を提供することである。
【００７２】
本発明の目的は更に、上記に定義のようなペプチド、抗体、化学分子及びヌクレオチド配列が互いにまたは別の有効成分と会合している医薬組成物を提供することである。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、パーキンタンパク質の活性を変調し、その結果としてドーパミン作動性ニューロンの生存を維持するために使用され得る。より特定的にはこれらの医薬組成物の所期の目的は、ＰＡＰ１タンパク質とパーキンとの相互作用を変調することである。例えばパーキンソン病のような中枢神経系の疾患の治療を所期の目的とする医薬組成物が好ましい。
【００７４】
本発明の目的はまた、パーキンの活性を変調するためまたは中枢神経系疾患をタイピングするために上記のような分子を使用することである。本発明では特に、パーキンの活性を少なくとも部分的に変調するためにこれらの分子を使用する。
【００７５】
本発明はまた、配列２または配列４またはそれらのフラグメント（または誘導体）に結合し得る分子の選択から成る、パーキンの機能に対して活性の分子をスクリーニングまたはキャラクタリゼーションする方法に関する。該方法は好ましくは、１種または複数の被験分子を配列２または配列４またはそれらのフラグメント（または誘導体）を含むポリペプチドとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる段階と、配列２（特に残基１−残基３４４の範囲に含まれる領域）または配列４に結合し得る分子を選択する段階とから成る。被験分子は様々な種類の分子（ペプチド、核酸、脂質、糖など、またはこれらの分子の混合物、例えば、組合せライブラリー、など）でよい。上述のように、上記の方法でパーキンの機能に対して活性であると同定された分子は、パーキンタンパク質の活性を変調するために使用でき、神経変性病理を治療するための強力な治療薬となる。
【００７６】
本発明の別の利点は、非限定代表例を表す以下の実施例及び図面から明らかであろう。
【００７７】
（図面の簡単な説明）
図１：ベクターｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）の概略図
図２：一次５′−ＲＡＣＥ実験の結果。８個のクローンが得られた。初期電子配列を図の下端に示す
図３：二次５′−ＲＡＣＥ実験の結果。一次実験で得られた８個のクローンのうちの２個だけ（クローンＡ１２及びＤ５）が有効であった。初期電子配列を図の下端に示す。ＤＮＡ及びタンパク質の完全配列は配列１２−１５に示す
図４：二次５′−ＲＡＣＥ実験のクローンＣ５及びＤ４の編成の詳細図。判明したコンセンサス配列を図の上部に示す
図５：ヒト脳から単離した転写産物の構造
図６：ヒト脳のＬＹ１１１（全長）の核酸及びタンパク質の配列。二重下線：ジンクフィンガードメインの保存システイン；太字：Ｃ２１ドメイン；イタリック体：Ｃ２２ドメイン
図７：ヒト脳のＬＹ１１１（短縮形）の核酸及びタンパク質の配列。二重下線：ジンクフィンガードメインの保存システイン；太字：Ｃ２１ドメイン；イタリック体：Ｃ２２ドメイン
図８：ＣＯＳ−７細胞中で発現後の短縮形ＬＹ１１１タンパク質（８ｂ）または全長ＬＹ１１１タンパク質（８ａ）の局在
図９：ヒト肺のＬＹ１１１（非短縮形）の核酸及びタンパク質の配列。
【００７８】
図１０：ヒト脳のＬＹ１１１（短縮形）の核酸及びタンパク質の配列。
【００７９】
使用材料及び使用技術
（１）酵母株：
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ属のＬ４０株（Ｍａｔａ，ｈｉｓ３Ｄ２００，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ａｄｅ２，ＬＹＳ２：：（ｌｅｘＡｏｐ）４−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：（ｌｅｘＡｏｐ）８−ＬａｃＺ，ＧＡＬ４，ＧＡＬ８０）を使用して、一方の結合タンパク質がＬｅｘＡタンパク質に融合しているときのタンパク質−タンパク質相互作用を検証した。ＬｅｘＡタンパク質は、リポーター遺伝子ＬａｃＺ及びＨｉｓ３の発現をコントロールするＬｅｘＡ応答要素を認識し得る。
【００８０】
上記酵母株を以下の培養培地で培養した。
完全ＹＰＤ培地：−酵母エキス（１０ｇ／リットル）（Ｄｉｆｃｏ）
−バクトペプトン（２０ｇ／リットル）（Ｄｉｆｃｏ）
−ブドウ糖（２０ｇ／リットル）（Ｍｅｒｃｋ）
この培地に２０ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固形培地にした。最小ＹＮＢ培地：−酵母窒素基（アミノ酸非含有）（６．７ｇ／リットル）
（Ｄｉｆｃｏ）  −ブドウ糖（２０ｇ／リットル）（Ｍｅｒｃｋ）
この培地に２０ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固形培地にする。また、ＣＳＭ培地［ＣＳＭ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ，−Ｈｉｓ（６２０ｍｇ／リットル）、ＣＳＭ−Ｔｒｐ（７４０ｍｇ／リットル）またはＣＳＭ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ（６４０ｍｇ／リットル）（Ｂｉｏ１０１）］及び／または２．５ｍＭの３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを加えてアミノ酸及び／または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを補充する。
【００８１】
（２）細菌株：
遺伝子型ｓｕｐＥ，ｈｓｄΔ５，ｔｈｉ，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ），Ｆ′［ｔｒａ  Ｄ３６  ｐｒｏ  Ａ＋Ｂ＋ｌａｃＩｑｌａｃＺΔＭ１５］をもつ大腸菌ＴＧ１株を使用してプラスミドを構築し、使用した組換えプラスミドの増幅及び単離手段とした。
【００８２】
この大腸菌株を以下の培地で培養した。
ＬＢ培地：−ＮａＣｌ（５ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ）
−バクトトリプトン（１０ｇ／リットル）（Ｄｉｆｃｏ）
−酵母エキス（５ｇ／リットル）（Ｄｉｆｃｏ）
この培地に１５ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固形培地にする。
【００８３】
アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。この抗生物質は、この抗生物質に耐性の遺伝子をマーカーとして含むプラスミドを受容した細菌の選択に役立つ。
【００８４】
遺伝子型ｓｕｐＥ４４，ａｒａ１４，ｇａｌＫ２，ｌａｃＹ１，Δ（ｇｐｔ−ｐｒｏＡ）６２，ｒｐｓＬ２０（Ｓｔｒｒ），ｘｙｌ−５，ｍｔｌ−１，ｒｅｃＡ１３，Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ），ＨｓｄＳ−（ｒ−ｍ−）をもつ大腸菌ＨＢ１０１株を、ヒトリンパ球ｃＤＮＡライブラリーから得られたプラスミドの増幅及び単離手段として使用した。
【００８５】
この大腸菌株を以下の培地で培養した。
Ｍ９培地：−Ｎａ２ＨＰＯ４（７ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ）
−ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ）
−ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ）
−ＮａＣｌ（０．５ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ）
−ブドウ糖（２０ｇ／リットル）（Ｓｉｇｍａ）
−ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）（Ｐｒｏｌａｂｏ）
−サイアミン（０．００１％）（Ｓｉｇｍａ）
この培地に１５ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固形培地にする。ＨＢ１０１株が増殖できるようにするためにはロイシン（５０ｍｇ／リットル）（Ｓｉｇｍａ）及びプロリン（５０ｍｇ／リットル）（Ｓｉｇｍａ）をＭ９培地に加える必要がある。
【００８６】
リンパ球ｃＤＮＡのツーハイブリッドライブラリーからプラスミドを選択するときには、プラスミドがＬｅｕ２選択マーカーを有しているので培地にロイシンを添加しなかった。
【００８７】
（３）プラスミド：
ベクターｐＬｅｘ９（ｐＢＴＭ１１６）（Ｂａｒｔｅｌら，１９９３）：細菌リプレッサーＬｅｘＡをコードする配列の下流でターミネーターの上流に多重クローニング部位を含むｐＧＢＴ１０に相同の５ｋｂのベクター。このベクターは融合タンパク質を形成するために使用した。
【００８８】
ｐＬｅｘ−ＨａＲａｓＶａｌ１２：哺乳動物のＲａｆタンパク質との相互作用が知られている（Ｖｏｊｔｅｋら）Ｖａｌ１２位に突然変異をもつＨａＲａｓタンパク質をコードする配列を含む、国際特許出願ＷＯ９８／２１３２７に記載されているようなプラスミドｐＬｅｘ９。このプラスミドは、Ｌ４０株におけるＰＡＰ１タンパク質の相互作用特異性を試験するために使用した。
【００８９】
ｐＬｅｘ９−ｃＡＰＰ：ＦＥ６５のＰＴＢ２ドメインとの相互作用が知られているＡＰＰタンパク質の細胞質ドメインをコードする配列を含むプラスミドｐＬｅｘ９。このプラスミドは、Ｌ４０株におけるＰＡＰ１タンパク質の相互作用特異性を試験するために使用した。
【００９０】
（４）合成オリゴヌクレオチド：
ＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣ  ＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧ  ＣＡＧＧＴＡＧ（配列５）
ＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣ  ＣＴＡＣＡＣＡＣＡＡ  ＧＧＣＡＧＧＧＡＧ（配列６）ＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位とに挟まれたパーキンの中央領域に対応するＰＣＲフラグメントを得るために使用したオリゴヌクレオチド。
ＧＣＧＴＴＴＧＧＡＡ  ＴＣＡＣＴＡＣＡＧ（配列７）
ＧＧＴＣＴＣＧＧＴＧ  ＴＧＧＣＡＴＣ（配列８）
ＣＣＧＣＴＴＧＣＴＴ  ＧＧＡＧＧＡＡＣ（配列９）
ＣＧＴＡＴＴＴＣＴＣ  ＣＧＣＣＴＴＧＧ（配列１０）
ＡＡＴＡＧＣＴＣＧＡ  ＧＴＣＡＧＴＧＣＡＧ  ＧＡＣＡＡＧＡＧ（配列１１）
ＰＡＰ１遺伝子に対応するインサートを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｙｓｔｅｒｍ  ＡＢＩ  ３９４−０８装置で合成する。合成したオリゴヌクレオチドをアンモニア水によって合成マトリックスから剥離させ、１０倍容のｎ−ブタノールで２回沈降させ、次いで水に入れる。光学密度の測定によって定量する（１ＯＤ２６０は３０μｇ／ｍｌに対応する）。
【００９１】
（５）プラスミドＤＮＡの調製
ＤＮＡ精製キットを製造業者であるＱｕｉａｇｅｎによって指示されたプロトコルに従って使用してプラスミドＤＮＡの少量生産及び大量生産を行った：
−Ｑｕｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット，ｒｅｆ：２７１０６−Ｑｕｉａｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキット，ｒｅｆ：１２１６３。
【００９２】
（６）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるＤＮＡの酵素増幅：
ＤＮＡマトリックス、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、ＰＣＲバッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、０．０１％のゼラチン）、各１０−２０ピコモルのオリゴヌクレオチド及び２．５ＩＵのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の存在下、最終容量１００μｌでＰＣＲ反応を行う。標本が蒸発しないように混合物を２滴のパラフィン油で覆う。Ａｐｐｌｉｇｅｎｅの“Ｃｒｏｃｏｄｉｌｅ  ＩＩ”装置を使用した。
【００９３】
マトリックス変性温度としては９４℃、ハイブリダイゼーション温度としては５２℃、酵素による伸長温度としては７２℃を使用した。
【００９４】
（７）結合：
すべての結合反応は、１００−２００ｎｇのベクター、０．１−０．５μｇのインサート、４０ＩＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ酵素（Ｂｉｏｌａｂｓ）及び結合バッファ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．８；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１０ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのＡＴＰ）の存在下、最終容量２０μｌで３７℃で１時間行った。陰性対照はインサートの非存在下でベクターを結合させることによって作製した。
【００９５】
（８）細菌の形質転換：
プラスミドによる細菌の形質転換は、以下のプロトコルで行う。１０μｌの結合容量を使用してＴＧ１細菌をＣｈｕｎｇの方法（Ｃｈｕｎｇら，１９８９）に従って形質転換させる。形質転換後の細菌をアンピシリンを加えたＬＢ培地で平板培養し、３７℃で１６時間インキュベートする。
【００９６】
（９）ＤＮＡの分離及び抽出：
Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）のアガロースゲル電気泳動によってＤＮＡをサイズに基づいて分離する。ＴＢＥバッファ（９０ｍＭのトリス塩基；９０ｍＭのホウ酸塩；２ｍＭのＥＤＴＡ）中の１％アガロースゲル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用する。
【００９７】
（１０）プラスミドＤＮＡの蛍光配列決定：
配列決定技術としては、Ｓａｎｇｅｒの方法（Ｓａｎｇｅｒら，１９７７）を基本とし、この方法をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発された蛍光による配列決定に応用できるように修正した方法を使用した。使用したプロトコルは、システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，１９９７）の考案者によって記載されたプロトコルである。
【００９８】
（１１）酵母の形質転換：
Ｇｉｅｔｚによって開発された従来の酵母形質転換技術（Ｇｉｅｔｚら，１９９２）を以下のように修正した方法で酵母にプラスミドを導入する：
特にリンパ球ｃＤＮＡライブラリーによって酵母を形質転換させる場合には、使用される酵母がＬｅｘＡタンパク質に融合したパーキンの中央部分をコードするプラスミドｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）を含む。この酵母をアミノ酸ＣＳＭ−Ｔｒｐを補充した２００ｍｌのＹＮＢ最小培地中、３０℃で撹拌下に１０７細胞／ｍｌの密度になるまで培養する。上記プロトコルに従って酵母を形質転換させるために、各々に５μｇのライブラリーを加えておいた５０μｌ容の１０本の管に細胞浮遊液を注ぎ分けた。熱ショックを２０分間与え、次いで遠心によって細胞を収集し、１００ｍｌのＹＰＤ培地に再浮遊させて３０℃で１時間維持し、ＣＳＭ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐを補充した１００ｍｌのＹＮＢ培地に再浮遊させて３０℃で３時間３０分間維持した。ＣＳＭ−Ｔｒｐ，−Ｌｅｕを補充した固形ＹＮＢ培地に形質転換細胞を種々の希釈度で平板培養することによって形質転換効率を測定した。培養物を３０℃で３日間維持した後、得られたコロニーを計数し、リンパ球ライブラリーのＤＮＡ１μｇあたりの形質転換率を算定した。
【００９９】
（１２）酵母から抽出したプラスミドの単離：
３０℃で１６時間インキュベートした５ｍｌの酵母培養物を遠心し、２００μｌの溶菌バッファ（１Ｍのソルビトール、０．１ＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、１２．５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ）に入れ、３７℃で１時間インキュベートする。次に、ＤＮＡ精製キット、Ｑｕｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット，ｒｅｆ２７１０６を製造業者であるＱｕｉａｇｅｎが指示したプロトコルに従って使用して溶菌液を処理する。
【０１００】
（１３）β−ガラクトシダーゼの活性試験：
ばらばらにした酵母クローンを収容したシャーレにニトロセルロースシートを予め配置する。次いでこのシートを液体窒素に３０秒間浸漬させて酵母を破裂させ、β−ガラクトシダーゼ活性を遊離させる。解凍後、ニトロセルロースシートのコロニー付着面を上にして別のシャーレに配置する。このシャーレには、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に４０ｍｇ／ｍｌの濃度で１５μｌのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む１．５ｍｌのＰＢＳ溶液（６０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４，ｐＨ７）を予め含浸させたＷｈａｔｍａｎペーパーを敷いておく。次にシャーレを３７℃のオーブンに入れる。１２時間後に膜上のコロニーが青色に変色すると試験結果は陽性であると判定する。
【０１０１】
実施例１：パーキンの中央部分と細菌リプレッサーＬｅｘＡとの融合タンパク質を発現させ得るベクターの構築
ツーハイブリッドシステムを使用するライブラリースクリーニングでは、パーキンの中央領域が細菌リプレッサーＬｅｘＡのようなＤＮＡ結合タンパク質に融合していることが必要である。この融合タンパク質を発現させるために、配列３または４で表される配列中に存在するパーキンの中央領域をコードする配列をＬｅｘＡタンパク質に対応する配列と同じ読取り枠に導入したベクターｐＬｅｘ９（材料及び方法の項参照）を使用する。
【０１０２】
アミノ酸１３５を起点とするパーキンの中央領域の１５６個のアミノ酸に対応する４６８ｂｐのＤＮＡフラグメントがオリゴヌクレオチド（配列５及び６）からＰＣＲによって得られた。これらのオリゴヌクレオチドはまた、５′末端にＥｃｏＲＩ部位を導入し、３′末端に終結コドン及びＢａｍＨＩ部位を導入した。ＬｅｘＡタンパク質をコードする配列の下流でプラスミドｐＬｅｘ９の多重クローニング部位のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にＰＣＲフラグメントを導入し、ベクターｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）（図１）を作製した。
【０１０３】
ＤＮＡの配列決定によって構築物を検証した。この検証から、このフラグメントがＰＣＲ反応中に生じる突然変異を有していないこと、及び、ＬｅｘＡに対応するフラグメントの読取り枠と同じ読取り枠に融合していることが判明した。
【０１０４】
実施例２：リンパ球融合ライブラリーのスクリーニング
この実施例ではツーハイブリッド法（Ｆｉｅｌｄｓ  ＆  Ｓｏｎｇ，１９８９）を使用した。融合ライブラリーのスクリーニングによって、ＧＡＬ４のトランスアクチベータードメインに融合タンパク質を産生し実施例１に記載の有益なタンパク質（パーキンの中央領域）と相互作用できるクローンを同定し得る。この相互作用によってトランスアクチベーターが復元され、Ｌ４０株中でリポーター遺伝子Ｈｉｓ３及びＬａｃＺの発現を誘発し得る。
【０１０５】
このスクリーニングを行うために、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｂｅｎａｒｏｕｓ（Ｐｅｙｔａｖｉら，１９９９）によって提供されたヒト末梢リンパ球に由来のｃＤＮＡから作製された融合ライブラリーを選択した。リンパ球ライブラリーによって酵母を形質転換させ、後述する手順で陽性クローンを選択した。
【０１０６】
スクリーニングの際には、少なくとも１つの酵母中に融合ライブラリーの独立プラスミドの各々とプラスミドｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）とが十分な確率で共存していなければならない。この確率が十分に維持されるためには、酵母が高い形質転換効率を有していることが重要である。このために、１μｇのＤＮＡあたり２．６×１０５の細胞を形質転換させるという形質転換効率を与える酵母形質転換プロトコルを選択した。更に、異なる２つのプラスミドによって酵母の同時形質転換を行うと形質転換効率が低下するので、好ましい方法としてプラスミドｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）によって予め形質転換させた酵母を使用した。表現型Ｈｉｓ−，Ｌｙｓ−，Ｌｅｕ−，Ａｄｅ−をもつこの菌株Ｌ４０  ｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）を、融合ライブラリーの５０μｇのプラスミドＤＮＡによって形質転換させた。この量のＤＮＡから概算で１．３×１０７の形質転換細胞を得ることができたが、この数は、ライブラリーを構成する独立プラスミドの数をやや上回る数に対応する。この結果から、ライブラリーのプラスミドのほぼ全部が酵母を形質転換させるために役立ったと考えることができる。機能性トランスアクチベーターを復元し得る形質転換細胞の選択は、２．５ｍＭの３−アミノ−１，２，４−トリアゾール及び６２０ｍｇ／リットルのＣＳＭ（Ｂｉｏ１０１）を補給したヒスチジン、ロイシン及びトリプトファン非含有のＹＮＢ培地で行った。
【０１０７】
この選択によって、表現型Ｈｉｓ＋を有している多数のクローンが得られた。得られたクローンの有効性を別のリポーター遺伝子ＬａｃＺの発現によって検査するために、これらの形質転換体にβ−ガラクトシダーゼ活性試験を行った。１１５個のクローンがタンパク質−タンパク質相互作用に対応できる二重表現型Ｈｉｓ＋，β−Ｇａｌ＋を有していた。
【０１０８】
実施例３：選択クローン中のライブラリーのプラスミドの単離
パーキンの中央領域と相互作用できるタンパク質を同定するために、ツーハイブリッドスクリーニングによって選択した酵母に含まれていた融合ライブラリーのプラスミドを抽出した。このようなプラスミドを大量に得るためには、この単離に先立って、陽性酵母株のＤＮＡ抽出物によって大腸菌を形質転換しておくことが必要である。この抽出物に含まれているライブラリーのプラスミドは酵母／大腸菌シャトルプラスミドなので、細菌体内で容易に複製し得る。ロイシン欠失培地におけるロイシン要求性ＨＢ１０１菌株の相補性によってライブラリーのプラスミドを選択した。
【０１０９】
ＤＮＡ抽出物による酵母の形質転換後に得られた細菌コロニーのプラスミドＤＮＡを、制限酵素消化及びＤＮＡフラグメントのアガロースゲル分離によって分析した。分析した１１５個のクローン中で、ライブラリーの１つのプラスミドを含むクローンが残りのクローンとは異なるプロフィルを有していた。このプラスミドをｐＧＡＤ−Ｌｙ１１１ｂと命名し、より詳細に検討した。
【０１１０】
実施例４：同定されたプラスミドに含まれていたインサートの配列決定
同定されたプラスミドに含まれていたインサートを配列決定するために、先ず第一段階で、リンパ球ｃＤＮＡライブラリー挿入ＥｃｏＲＩ部位の近傍のＧＡＬ４ＴＡ配列に相補的な配列７のオリゴヌクレオチドを使用した。次に第二段階で、配列決定の進行中に得られたインサートの配列に対応する配列８から配列１１のオリゴヌクレオチドを使用した。得られた配列を配列１に示す。このようにして同定されたタンパク質をＰＡＰ１（パーキン結合タンパク質１）と命名した。
【０１１１】
このインサートの配列とデータバンクＧＥＮＢａｎｋ及びＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂ）に含まれていた配列とを比較すると、シナプトタグミンファミリーの種々の構成員にタンパク質レベルで２５％の相同性を示した。シナプトタグミンは脳及びその他の組織で発現される少なくとも１１個の異なる遺伝子によってコードされている膜タンパク質ファミリーの構成員である。これらは非反復のトランスメンブランドメインとＣ２と呼ばれる２つのカルシウム調節ドメインとを含んでいる。シナプトタグミンとＰＡＰ１タンパク質との相同性はこのドメインに見出される。その他の有意な相同性は全く観察されなかった。
【０１１２】
実施例５：パーキンの中央領域とＰＡＰ１タンパク質との相互作用特異性の分析
ＰＡＰ１タンパク質に対応するフラグメントとパーキンの中央領域との相互作用特異性を決定するために、無関係の別のタンパク質と共に特異的ツーハイブリッド相互作用試験を実施した。この試験を行うために、プラスミドｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎ（１３５−２９０）に代えて、それぞれがＡＰＰの細胞質ドメインまたはＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインに融合したＨａＲａｓＶａｌ１２タンパク質をコードしている対照プラスミドｐｌｅｘ９−ｃＡＰＰまたはｐＬｅｘ９−ＨａＲａｓＶａｌ１２、及び、ツーハイブリッドライブラリーのスクリーニングの際に単離されたプラスミドによってＬ４０株を形質転換させた。タンパク質−タンパク質相互作用を判定するために、種々のプラスミドによって形質転換させた細胞に対してβ−Ｇａｌ活性試験を行った。この試験の結果によれば、ツーハイブリッドライブラリーのスクリーニングの際に単離されたプラスミド及びプラスミドｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）によって形質転換させた酵母だけがβ−Ｇａｌ＋活性を有しており、従ってＰａｒｋｉｎｅの中央領域とＰＡＰ１タンパク質との相互作用を示した。このＰＡＰ１フラグメントはｃＡＰＰタンパク質またはＨａＲａｓＶａｌ１２タンパク質と相互作用しないと考えられるので、この相互作用は特異的であることが判明する。
【０１１３】
従ってこれらの結果は、パーキンと特異的に相互作用し得るＰＡＰ１と命名された新規なタンパク質の存在を示す。シナプトタグミンに近縁のこのタンパク質は既知タンパク質に対しては有意な相同性を全く有していないので、治療用途または診断用途で、抗体、プローブまたはペプチドを産生させるため、あるいは、活性分子をスクリーニグするために使用することができる。
【０１１４】
実施例６：ヒト肺ＤＮＡライブラリーからのＰＡＰ１遺伝子のクローニング
ヒトＰＡＰ１遺伝子の完全配列を同定し変異形態の存在を特性決定する目的で、配列１を２つの電子伸長方法で処理した。この処理によって、配列１に比べて３３０ｂｐの伸長を有しているそれぞれ１６４４ｂｐ及び１６４６ｂｐの２つの電子配列が得られた。しかしながらこれらの配列を分析すると、翻訳後のコンセンサス領域が明らかな違いを有していた。即ち、一方の配列では４２０ａａのＯＲＦ、他方の配列では２３０ａａのＯＲＦが得られた。得られたタンパク質配列を既知の配列に比較すると、ヒトシナプトギャミンＩ（ｐ６５）（ｐ２１５７９）とオーバーラップする２９３個のアミノ酸で２４％の相同性が判明した。シナプトギャミンＩの機能は、シナプスのゾーンにシナプス小胞を輸送しているときの膜相互作用の調節機能である。シナプトギャミンＩはある程度特異的に酸性リン脂質と結合する。更に、シナプトギャミンと活性化プロテインキナーゼＣ受容体との間でカルシウム依存性相互作用が報告されている。シナプトギャミンはまた、別の３つのタンパク質、即ち、ノイレキシン、シンタキシン及びａｐ２と結合し得る。同定された配列とシナプトギャミンファミリーとの間の相同性がいずれも早期に急激に消滅することを考察すると、同定された配列は天然配列に比較して欠失を有している可能性が大きい。この仮説を検証し、配列の有効性を確認するために、１６４４ｂｐの配列を使用してＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定の実験を行った。得られた配列は４２０ａａのＯＲＦを含んでおり、同程度のシナプトギャミン相同性を有している。
【０１１５】
もっと長い配列を作製するため、及び、得られた配列がスプライシング形態に対応するか否かを検証するために、ヒト肺のｃＤＮＡ調製物に対してオリゴＬ１及びＬ２を使用し、有効性が確認された配列の３′領域から５′−ＲＡＣＥによる伸長実験を行った。
【０１１６】
得られた結果を図２に示す。これらの結果は、６個の異なる５′末端に対応する８個のクローンが同定されたことを示す。３つのクローン（クローンＡ１２、Ｆ２、Ｆ１２）はＯＲＦを遮断するＳＴＯＰコドンを含んでおり、クローンＡ３はＯＲＦを全く含んでいない。ＲＴ−ＰＣＲ及びｎｅｓｔｅｄ  ＲＴ−ＰＣＴによって種々の転写物の存在を確認した（表１）。
【０１１７】
【表１】
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【０１１８】
プライマー対Ｕ３−Ｌ３及びＣ−Ｂは配列の共通フラグメントに特異的であり、オリゴＡ及びＵ１は初期配列及びクローンＣ１１に特異的であり、オリゴＬ４は初期配列に特異的であり、プライマーＵ２はクローンＡ３に特異的である。種々のクローンの共通領域に局在するオリゴＬ３及びＬ７（図２）によって二次５′−ＲＡＣＥを行った。得られた結果を図３及び図４に示す。種々の転写物の存在をＲＴ−ＰＣＲ及びｎｅｓｔｅｄ  ＲＴ−ＰＣＴによって確認した（表２）。
【０１１９】
【表２】
0004861590.tif 000003
【０１２０】
プライマー及びオリゴヌクレオチドの配列を表３及び４（配列１６−３７）に示す。
【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
これらの結果を総合すると、ヒト肺から同定されたＰＡＰ１タンパク質の長いアイソフォーム（図９、配列１２及び１３）及び短いアイソフォーム（図１０、配列１４及び１５）に対応するコンセンサス配列は有効である。以後の実施例ではこのタンパク質をＬＹ１１１と呼ぶ。長いアイソフォームは配列１２の残基２３７−２０６９に局在する１８３３ｂｐのＯＲＦによってコードされており、６１０個のアミノ酸を含んでいる。ポリアデニル化シグナルはヌクレオチド２３１５以後に局在している。短いアイソフォームは配列１４の残基４２９−１３７０に局在する９４２ｂｐのＯＲＦによってコードされており、３１３個のアミノ酸を含んでいる。ポリアデニル化シグナルはヌクレオチド１６１６以後に局在している。
【０１２４】
次に、プローブ（ａｍｐｌｉｍｅｒＣＤ及びＥ−Ｆ）によって種々のヒト組織に対するノーザンブロット実験を行うと、筋肉で６ｋｂの転写産物、心臓で３ｋｂの転写産物、胎児肝で６ｋｂの転写産物が検出された。、更に、ヒト胎児脳の転写産物のクローニングについて実施例７に記載する。
種々のタンパク質データベースで種々の相同試験を実施した。その結果を以下の表５に示す。
【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
実施例７：ヒト胎児脳の相補的ＤＮＡを用いたＰＡＰ１の２つの全長転写産物（Ｌｙ１１１Ｂ）のクローニング
ヒト脳内に全長（“完全”）Ｌｙ１１１ｂ転写産物が存在することを確認するために、ヒト胎児脳に由来の相補的ＤＮＡからＰＣＲを実施した（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＬｙＦ１（ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＧＣＧ  ＴＧＡ  ＣＧＣ、図５、配列３８）及びＨＡ７１（ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ、配列３９）を使用した。約２キロ塩基の短いＤＮＡフラグメントを増幅した。この一次ＰＣＲの産物をｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲのマトリックスとして使用した。このＰＣＲにはオリゴヌクレオチドＬｙＥｃｏＦ（ＧＣＡＣＧＡＡＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ、配列４０）及びＨＡ７２（ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＴＴＧ、配列４）を使用した。増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ（オリゴヌクレオチドＬｙＥｃｏＦに組込んだ）及びＢｓｔＥＩＩ（図２）で消化し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、次いでそれらの配列を決定した。得られたクローンの配列を解析すると、ヒト胎児脳に２つの全長転写産物Ｌｙ１１ｂが存在し得ることが判明した（図５）。第一の転写産物（Ｌｙ１１１ｂｆｕｌｌＡ）はヒトの肺で同定されたｍＲＮＡに対応し（実施例６）、６０９アミノ酸のタンパク質（ｐＬｙ１１１ｂｆｕｌｌＡ；図５及び６の配列４２及び４３）をコードしている。第二の転写産物（Ｌｙ１１１ｂｆｕｌｌＢ）は共通の一次ｍＲＮＡの選択的スプライシング産物を表す可能性が高い。この転写産物はＬｙ１１ｂｆｕｌｌＡに等しいが、ヒト肺で有効性が確認された配列のヌクレオチド７５２と９５６との間の配列が存在しない（配列４２）。従って、Ｌｙ１１１ｂｆｕｌｌＢは、アミノ酸１７２−２４０のドメイン（図５、７、配列４４−４５）が欠失したｐＬｙ１１１ｆｕｌｌＡに等しい５４１個のアミノ酸から成るタンパク質（ｐＬｙ１１１ｂｆｕｌｌＢ）をコードしている。２つのタンパク質ｐＬｙ１１１ｂｆｕｌｌＡ／ｆｕｌｌＢは、酵母で同定されたアミノ酸１３５−２９０を含むパーキンのフラグメントと相互作用するドメイン（初期配列Ｌｙ１１１ｂ、図５）を組込んでおり、従って理論的にこの相互作用を維持し得る。
ｐＬｙ１１１ｂｆｕｌｌＡ／ｆｕｌｌＢタンパク質はＲＩＭ／Ｒａｂｐｈｉｌｉｎｅファミリーに属する。
【０１２７】
ｐＬｙ１１１ｂｆｕｌｌＡ／ｆｕｌｌＢはＲＩＭ／ｒａｂｐｈｉｌｉｎｅファミリーのタンパク質に相同性を有しており（Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｓｕｇｉｔａ  Ｓ  ＆  Ｓｕｄｈｏｆ  ＴＧ，Ｔｈｅ  ＲＩＭ／ＮＩＭ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃ２  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０００）２７５，２００３３−２００４４）、特にｇｒａｎｕｌｏｐｈｉｌｉｎｅｓに相同性を有している（Ｗａｎｇ  Ｊｉｅ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｔ，Ｙｏｋｏｔａ  Ｈ  ＆  Ｉｚｕｍｉ  Ｔ．Ｎｏｖｅｌ  Ｒａｂｐｈｉｌｉｎ−３−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃａｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４，２８５４２−２８５４８）。該タンパク質の特徴は、Ｎ末端部にジンクフィンガードメインが存在し、Ｃ末端部に２つのＣ２ドメインが存在することである（図６及び図７）。ＲＩＭ／ｒａｂｐｈｉｌｉｎｅファミリーのタンパク質のジンクフィンガードメインはＲａｂタンパク質との相互作用に関与していた。Ｒａｂタンパク質はＧＴＰに結合するタンパク質なので、真核細胞の膜輸送機構の必須成分である。また、ＲＩＭ／ｒａｂｐｈｉｌｉｎｅファミリーのタンパク質のＣ２ドメインがリン脂質との相互作用を介して膜に結合し得ることは既に文献に記載されている。
ＣＯＳ−７系の細胞におけるｐＬｙ１１１ｂｆｕｌｌＡ／ｆｕｌｌＢタンパク質の発現：パーキン遺伝子との共存的局在
転写産物Ｌｙ１１１ｂｆｕｌｌＡ／Ｂのコーディング配列を真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３に、Ｎ末端ｍｙｃエピトープをコードする配列に位相合せして挿入した（ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃＬｙ１１１ｂｆｕｌｌＡ／Ｂ）。これらのベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７系の細胞は、約６７ｋＤａの見掛け分子量をもつタンパク質（ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃＬｙ１１１ｂｆｕｌｌＡ）と６０ｋＤａの見掛け分子量をもつタンパク質（ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃＬｙ１１１ｂｆｕｌｌＢ）とを産生する。これらの分子量は予想分子量に一致する。Ｎ末端ｍｙｃエピトープに対する抗体で免疫標識することによってこのタンパク質を検出すると、このタンパク質は、ＣＯＳ−７系の細胞の細胞質、細胞突起及びときには核の内部に不均一に点状に分布している（図８ａ，ｂ、カラムＡ）。ＣＯＳ−７系の細胞中で抗パーキンＡｓｐ５抗体を用いて検出されたパーキンによってこれらのタンパク質が超発現するとき（図８ａ，ｂ、カラムＢ）、これらのタンパク質の相似的分布及び共存的局在が観察される（図８ａ，ｂ、カラムＣ）。
【０１２８】
（参考文献）
【０１２９】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ベクターｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）の概略図である。
【図２】  一次５′−ＲＡＣＥ実験の結果を示す。
【図３】  二次５′−ＲＡＣＥ実験の結果を示す。
【図４】  二次５′−ＲＡＣＥ実験のクローンＣ５及びＤ４の編成の詳細図を示す。
【図５】  ヒト脳から単離された転写物の構造を表す。
【図６】  ヒト脳のＬＹ１１１（全長）の核酸及びタンパク質の配列を示す。二重下線：ジンクフィンガードメインの保存システイン；太字：Ｃ２１ドメイン；イタリック体：Ｃ２２ドメイン。
【図７】  ヒト脳のＬＹ１１１（短縮形）の核酸及びタンパク質の配列を示す。二重下線：ジンクフィンガードメインの保存システイン；太字：Ｃ２１ドメイン；イタリック体：Ｃ２２ドメイン。
【図８ａ】  ＣＯＳ−７細胞中で発現後の短いＬＹ１１１タンパク質（８ｂ）または長いＬＹ１１１タンパク質（８ａ）の局在を示す。
【図８ｂ】  ＣＯＳ−７細胞中で発現後の短いＬＹ１１１タンパク質（８ｂ）または長いＬＹ１１１タンパク質（８ａ）の局在を示す。
【図９】  ヒト肺のＬＹ１１１（非短縮形）の核酸及びタンパク質の配列を示す。
【図１０】  ヒト脳のＬＹ１１１（短縮形）の核酸及びタンパク質の配列を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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