(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＡＤＳＣｓ）を含むアレルギー性鼻炎予防及び治療剤。
【請求項２】
脂肪組織由来幹細胞が、鼻腔粘膜に定着することを特徴とする、請求項１に記載のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤。
【請求項３】
脂肪組織由来幹細胞が、好酸球性炎症を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤。
【請求項４】
脂肪組織由来幹細胞が、Ｔｈ２（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ２）免疫反応を減少させることを特徴とする、請求項１に記載のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤。
【請求項５】
Ｔｈ２免疫反応の抑制が、血清内で卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，ＯＶＡ）−特異ＩｇＥ抗体が減少して、ＩｇＧ２ａ抗体が増加することを特徴とする、請求項４に記載のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤。
【請求項６】
Ｔｈ２免疫反応の抑制が、脾臓でＩＬ−４及びＩＬ−５を減少させて、ＩＦＮ−γを増加させることを特徴とする、請求項４に記載のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤。
【請求項７】
脂肪組織由来幹細胞を含むアレルギー喘息予防及び治療剤。
【請求項８】
脂肪組織由来幹細胞が、肺に定着することを特徴とする、請求項７に記載のアレルギー喘息予防及び治療剤。
【請求項９】
脂肪組織由来幹細胞が、好酸球性炎症を抑制することを特徴とする、請求項７に記載のアレルギー喘息予防及び治療剤。
【請求項１０】
脂肪組織由来幹細胞が、Ｔｈ２（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ２）免疫反応を減少させることを特徴とする、請求項７に記載のアレルギー喘息予防及び治療剤。
【請求項１１】
Ｔｈ２免疫反応の抑制が、血清内で卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，ＯＶＡ）−特異ＩｇＥ抗体が減少して、ＩｇＧ２ａ抗体が増加することを特徴とする、請求項１０に記載のアレルギー喘息予防及び治療剤。
【請求項１２】
Ｔｈ２免疫反応の抑制が、脾臓でＩＬ−４及びＩＬ−５を減少させて、ＩＦＮ−γを増加させることを特徴とする、請求項１０に記載のアレルギー喘息予防及び治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織由来幹細胞を含むアレルギー性鼻炎または喘息予防及び治療剤に関するもので、より詳細には、本発明の脂肪組織由来幹細胞は好酸球性炎症を抑制してアレルギー症状を好転させて、抗原特異的なＴｈ２免疫反応を減少させることにより、アレルギー性鼻炎または喘息予防及び治療剤に使用できることに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性鼻炎は、最も有り勝ちなアレルギー疾患や喘息及び副鼻洞炎と連関がある（非特許文献１、非特許文献２）。アレルギー性鼻炎は、徐々に増加していて生活の質に影響を与え、生産能力の減少や治療費負担増加によって社会経済的に問題になっているが、明らかな治療法はまだ見つけられていない。薬物療法は、アレルギー性鼻炎の基本的な治療であるが、薬剤中断時には再発しやすく深刻な副作用を起こし得る。免疫療法は唯一、変形された免疫体系を原状回復させる根本治療になり得るが、治療には数年が必要であり、過敏反応と費用が問題になり得る（非特許文献３）。
【０００３】
喘息は、患者の遺伝的な要因と環境的な要因の相互作用によって発生する複合遺伝疾患である。環境的な要因の代表的な例として、原因アレルゲンの露出によるアレルギー反応が重要であり、最近になって我が国の国民の生活様式の西欧化による原因アレルゲンの増加によって、気管支喘息の有病率が持続的に増加している（非特許文献４）。喘息は、呼吸困難、咳などの症状を誘発して生活の質を落とし、学習、仕事及び作業に対する能率を低下させ、生産性の減少を誘発して社会経済的に重要な問題になっている。最近、免疫学及び分子遺伝学の発展によって気管支喘息の病態生理に対する理解と、それによる新しい治療剤の開発にもかかわらず、気管支喘息による有病率は増加しているのが実情である。特に、既存の治療薬剤に使用されるステロイド剤または気管支拡張剤は、疾病の根本的な治癒ではなく、症状の調節及び予防のための薬剤であり、一生使用しなければならず、それによる個人及び社会の経済的負担は非常に大きい。
【０００４】
骨髄に由来した間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）及び生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で間葉系系統の様々な細胞、すなわち骨、軟骨、脂肪組織または筋肉に分化することができる（非特許文献５、非特許文献６）。ＭＳＣｓは、多くの文献で骨形成不全症、心筋梗塞、肺損傷及び脳梗塞等、損傷した組織の再生に有用であると報告されたことがあり、現在多くの研究においてＭＳＣｓの分化能及び再生能を使用して治療剤に使用する試みが行われている（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。ＭＳＣｓは、分化能を有するのみではなく免疫抑制効果も有していて、同種間の移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）で移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）の発生と重度度を減少させることが報告された（非特許文献１１）。また、ＭＳＣｓは、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）の機能を抑制して樹状突起細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）の機能にも影響を与え得る（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。
【０００５】
脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ）は、骨髄に由来した間葉系幹細胞と類似の表現型を示して（非特許文献１５）、様々な細胞に分化が可能で生体外で免疫抑制効果を示すことが知られている（非特許文献１６）。また、ＡＤＳＣｓは、同種間の免疫反応によって誘導された樹状突起細胞及びＴ細胞でサイトカインの分泌を変化させて、生体外で活性化したＴ細胞及びＢ細胞に免疫抑制効果を示すことが知られている（非特許文献１７）。以前の研究では、ＡＤＳＣｓがミトゲン（ｍｉｔｏｇｅｎ）に反応して混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）及びリンパ球増殖反応を抑制して免疫抑制効果を示すと報告された（非特許文献１６）。また、ＡＤＳＣｓは、同種間の免疫反応によって誘導された樹状突起細胞及びＴ細胞でサイトカインの分泌を変化させて、生体外で活性化したＴ細胞及びＢ細胞に免疫抑制効果を示すことが知られている（非特許文献１７）。
【０００６】
幹細胞は、自己再生と様々な細胞に分化が可能な能力を有している。ＡＤＳＣｓも自己再生能力を示し、間葉系で発生する軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）、造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）、筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅｓ）または内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）など様々な細胞に分化が可能である（非特許文献１８、非特許文献１９）。以前の研究では、ＡＤＳＣｓがミトゲン（ｍｉｔｏｇｅｎ）に反応して混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）とリンパ球増殖反応を抑制して免疫抑制効果を示すと報告した（非特許文献１６）。ＡＤＳＣｓは、骨髄に由来した間葉系幹細胞と同じく損傷した組織の再生と免疫抑制効果を示しながら、骨髄に由来した間葉系幹細胞に比べて豊かな量を容易に得ることができるので、多くの長所を有している。ＡＤＳＣは、ＢＭＳＣと類似のマーカー発現を示し、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５陽性、ＨＬＡ−ＤＲ及びｃ−ｋｉｔ発現に陰性を示す。適切な条件で、ＡＤＳＣ及びＢＭＳＣが造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、脂質細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、軟骨系統（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅｓ）に分化が可能であるが、ＡＤＳＣがＢＭＳＣに比べてさらに優れた増殖能を維持していて、マイクロアレイで異なった遺伝子の発現を示す（非特許文献１５）。
【０００７】
アレルギー疾患の免疫学的発生機序は、主に衛生仮説（ｈｙｇｉｅｎｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ、Ｔｈ１／Ｔｈ２反応の不均衡）で説明している。正常にＴｈ１反応とＴｈ２反応は、お互いに拮抗作用をしながら均衡を維持しているが、気管支喘息を含むアレルギー疾患が発生するためには、Ｔｈ１反応が減少して、Ｔｈ２反応が亢進される免疫体系の不均衡が発生することが核心的な要因であると説明している（非特許文献２０）。アレルギー性鼻炎と喘息のようなアレルギー疾患では、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３による非正常的なＴｈ２免疫反応で好酸球性炎症を招来する。好酸球炎症でＴｈ１とＴｈ２サイトカインは、お互いに拮抗作用をして、選択的なＴｈ２反応の抑制がアレルギー炎症を抑制するのに重要であると言える（非特許文献２１、非特許文献２２）。
【０００８】
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞への分化を決める因子としては、抗原提示細胞とＴ細胞との相互作用、露出した抗原の量、サイトカインの分泌様相など多くの要因があるが、その中でサイトカインは、Ｔｈ１／Ｔｈ２反応を決定する核心的な役割を担当する。Ｔｈ２反応を増加させる代表的なサイトカインには、ＩＬ−４があって、Ｔｈ１反応を増加させるサイトカインでは、ＩＬ−１２が知られている。喘息でＴｈ２細胞媒介による炎症が増加するということは、様々な研究で明かされたが、喘息患者の気管支肺胞洗浄液でＴｈ２細胞で分泌するＩＬ−３、４、５のｍＲＮＡが正常人より増加しているし（非特許文献２３）、ＩＬ−５の濃度も他の肺疾患に比べて高かった（非特許文献２４）。好酸球は、ＩＬ−３、５、ＧＭ−ＣＳＦによって調節して生産され、気道上皮細胞の損傷に関与して気道過敏性を増加させて肥満細胞の脱顆粒化を誘発して、喘息発病に重要な役割をする。また好酸球から分泌するロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ）は、気道収縮、血管透過性を増加させる。
【０００９】
既存の多くの研究は、ＡＤＳＣがＢＭＳＣと類似の表現型を有して分化能があるということを示し、ＢＭＳＣを代替するソースになるということを示していて、ＢＭＳＣと比較した時の最大の長所は、接近性が容易で易しく得ることができ、量的に豊かであるということです。
【００１０】
最近、アレルギー性鼻炎と喘息が、Ｔｈ２細胞による炎症性疾患であることが報告された後、ステロイドなどの抗炎症剤が薬物治療の中心になっている。しかし、根本的な治療のためには、既存の抗炎症剤や気管支拡張剤では不足で、アレルゲンに対する免疫反応と免疫細胞で分泌するサイトカインによる慢性炎症を調節する新しい治療剤が必要である。ＡＤＳＣｓが、ＧＶＨＤモデルで免疫抑制効果を示し、発生と重度度を減少させるという報告があるが、Ｔｈ２免疫反応によるアレルギー疾患でそれを解明した研究はまだ発表されたことがない。
【００１１】
以上のことに鑑みて、本研究では、マウス脂肪組織から間葉系幹細胞を分離して培養した後、それをアレルギー性鼻炎と喘息のマウスモデルの静脈に注射して、前記幹細胞が免疫調節効果と抗炎症効果があることを解明することによって本発明を完成した。
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｅｔｔｉｐａｎｅ  ＲＡ，等，Ｃｌｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７年，第１９巻，２３−３４頁
【非特許文献２】Ｂｌａｉｓｓ  ＭＳ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ，２００７年，第２８巻，１４５−５２頁
【非特許文献３】Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＡＷ，等，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，２００６年，第５巻，２７−３１頁
【非特許文献４】Ｋｉｍ  ＹＫ，等  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００２年，第３２巻，１７０６−１２頁
【非特許文献５】Ｐｒｏｃｋｏｐ  ＤＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７年，第２７６巻，７１−４頁
【非特許文献６】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ＭＦ，等  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年，第２８４巻，１４３−７頁
【非特許文献７】Ｈｏｒｗｉｔｚ  ＥＭ，等  Ｂｌｏｏｄ，２００１年，第９７巻，１２２７−３１頁
【非特許文献８】Ｓｈａｋｅ  ＪＧ，等  Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ，２００２年，第７３巻，１９１９−２６頁
【非特許文献９】Ｒｏｊａｓ  Ｍ，等  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００５年，第３３巻，１４５−５２頁
【非特許文献１０】Ｌｉ  Ｙ，等  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００２年，第５９巻，５１４−２３頁
【非特許文献１１】Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  Ｋ，等  Ｌａｎｃｅｔ，２００４年，第３６３巻，１４３９−４１頁
【非特許文献１２】Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  Ｍ，等  Ｂｌｏｏｄ，２００２年，第９９巻，３８３８−４３頁
【非特許文献１３】Ｊｉａｎｇ  ＸＸ，等  Ｂｌｏｏｄ，２００５年，第１０５巻，４１２０−６頁
【非特許文献１４】Ｃｏｒｃｉｏｎｅ  Ａ，等  Ｂｌｏｏｄ，２００６年，第１０７巻，３６７−７２頁
【非特許文献１５】Ｌｅｅ  ＲＨ，等  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４年，第１４巻，３１１−２４頁
【非特許文献１６】Ｐｕｉｓｓａｎｔ  Ｂ，等  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，２００５年，第１２９巻，１１８−２９頁
【非特許文献１７】Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｓ，等，Ｂｌｏｏｄ，２００５年，第１０５巻，１８１５−２２頁
【非特許文献１８】Ｇｉｍｂｌｅ  ＪＭ，等，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，２００７年，第１００巻，１２４９−６０頁
【非特許文献１９】Ｓｅｏ  ＭＪ，等，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００５年，第３２８巻，２５８−６４頁
【非特許文献２０】Ｍｏｓｍａｎｎ  ＴＲ，等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８６年，第１３６巻，２３４８−５７頁
【非特許文献２１】Ｗｉｌｓｏｎ  ＭＳ，等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２００５年，第２０２巻，１１９９−２１２頁
【非特許文献２２】Ｐａｒｋ  Ｙ，等  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１年，第１０８巻，５７０−６頁
【非特許文献２３】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＤＳ，等，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，１９９２年，第３２６巻，２９８−３０４頁
【非特許文献２４】Ｗａｌｋｅｒ  Ｃ，等，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１９９４年，第１５０巻，１０３８−４８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＡＤＳＣｓ）を含むアレルギー性鼻炎または喘息予防及び治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＡＤＳＣｓ）を含むアレルギー性鼻炎予防及び治療剤を提供する。
【００１５】
また、本発明は薬学的に有効な量の脂肪組織由来幹細胞をアレルギー性鼻炎にかかった個体に投与する工程を含む、アレルギー性鼻炎治療方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は薬学的に有効な量の脂肪組織由来幹細胞をアレルギー性鼻炎にかかった個体に投与する工程を含む、アレルギー性鼻炎予防方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は脂肪組織由来幹細胞を含む、アレルギー喘息予防及び治療剤を提供する。
【００１８】
また、本発明は薬学的に有効な量の脂肪組織由来幹細胞をアレルギー喘息にかかった個体に投与する工程を含む、アレルギー喘息治療方法を提供する。
【００１９】
併せて、本発明は薬学的に有効な量の脂肪組織由来幹細胞をアレルギー喘息にかかった個体に投与する工程を含む、アレルギー喘息予防方法を提供する。
【００２０】
本発明（１）は、脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＡＤＳＣｓ）を含むアレルギー性鼻炎予防及び治療剤である。
本発明（２）は、脂肪組織由来幹細胞が、鼻腔粘膜に定着することを特徴とする、本発明(1)のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤である。
本発明（３）は、脂肪組織由来幹細胞が、好酸球性炎症を抑制することを特徴とする、本発明(1)のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤である。
本発明（４）は、脂肪組織由来幹細胞が、Ｔｈ２（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ２）免疫反応を減少させることを特徴とする、本発明(1)のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤である。
本発明（５）は、Ｔｈ２免疫反応の抑制が、血清内で卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，ＯＶＡ）−特異ＩｇＥ抗体が減少して、ＩｇＧ２ａ抗体が増加することを特徴とする、本発明(4)のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤である。
本発明（６）は、Ｔｈ２免疫反応の抑制が、脾臓でＩＬ−４及びＩＬ−５を減少させて、ＩＦＮ−γを増加させることを特徴とする、本発明(4)のアレルギー性鼻炎予防及び治療剤である。
本発明（７）は、薬学的に有効な量の脂肪組織由来幹細胞をアレルギー性鼻炎にかかった個体に投与する工程を含む、アレルギー性鼻炎治療方法である。
本発明（８）は、薬学的に有効な量の脂肪組織由来幹細胞をアレルギー性鼻炎にかかった個体に投与する工程を含む、アレルギー性鼻炎予防方法である。
本発明（９）は、脂肪組織由来幹細胞を含むアレルギー喘息予防及び治療剤である。
本発明（１０）は、脂肪組織由来幹細胞が、肺に定着することを特徴とする、本発明(9)のアレルギー喘息予防及び治療剤である。
本発明（１１）は、脂肪組織由来幹細胞が、好酸球性炎症を抑制することを特徴とする、本発明(9)のアレルギー喘息予防及び治療剤である。
本発明（１２）は、脂肪組織由来幹細胞が、Ｔｈ２（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ２）免疫反応を減少させることを特徴とする、本発明(9)のアレルギー喘息予防及び治療剤である。
本発明（１３）は、Ｔｈ２免疫反応の抑制が、血清内で卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，ＯＶＡ）−特異ＩｇＥ抗体が減少して、ＩｇＧ２ａ抗体が増加することを特徴とする、本発明(12)のアレルギー喘息予防及び治療剤である。
本発明（１４）は、Ｔｈ２免疫反応の抑制が、脾臓でＩＬ−４及びＩＬ−５を減少させて、ＩＦＮ−γを増加させることを特徴とする、本発明(12)のアレルギー喘息予防及び治療剤である。
本発明（１５）は、薬学的に有効な量の脂肪組織由来幹細胞をアレルギー喘息にかかった個体に投与する工程を含むアレルギー喘息治療方法である。
本発明（１６）は、薬学的に有効な量の脂肪組織由来幹細胞をアレルギー喘息にかかった個体に投与する工程を含むアレルギー喘息予防方法である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の脂肪組織由来幹細胞は、鼻腔粘膜及び肺に定着して好酸球の浸潤を抑制してアレルギー症状を好転させ、抗原に特異的なＴｈ２反応を抑制して免疫調節に重要な役割をすることで、アレルギー性鼻炎または喘息予防及び治療剤として有用に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＡＤＳＣｓ）を含むアレルギー性鼻炎予防及び治療剤を提供する。
【００２３】
本発明者等は、ＡＤＳＣｓのアレルギー性鼻炎及び喘息に対する影響を調べるため、マウスの腹部脂肪から脂肪組織を採取して、ＡＤＳＣｓを細胞の残骸から分離した後、培養し、流細胞測定法及び多分化能評価実験を通じて確認した後、卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）を使用して感作させる方式でアレルギー性鼻炎及び喘息マウスモデルを製造した（非特許文献 ２１、非特許文献２２）。
【００２４】
本発明者等は、脂肪組織由来幹細胞が鼻腔粘膜と肺に定着するかどうかを調べるため、アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで蛍光標識子を付着したＡＤＳＣｓを静脈に投与した後、ＯＶＡで感作及び噴霧した。鼻腔粘膜と肺をそれぞれ採取した後、蛍光顕微鏡で観察した結果、ＡＤＳＣｓが抗原を投与しない対照群に比べてアレルギー性鼻炎及び喘息誘発群の鼻腔粘膜と肺で、より多く発見された。したがって、アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで静脈に投与したＡＤＳＣｓが鼻腔粘膜と肺に定着して（図５参照）、アレルゲン（ａｌｌｅｒｇｅｎ）に対する免疫反応が鼻腔粘膜でＡＤＳＣｓの増幅をもたらす重要な環境を提供するということが分かった（非特許文献１８）。
【００２５】
本発明者等は、ＡＤＳＣｓがアレルギー性鼻炎の症状に対して及ぼす影響を調べるため、アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで、ＯＶＡで噴霧中のくしゃみと鼻をこする動作の回数を記録して比較した。前記の結果、くしゃみと鼻をこする動作を合わせた症状点数の平均は、抗原を投与しない対照群に比べてアレルギー性鼻炎及び喘息誘発群で有意に増加し、前記アレルギー性鼻炎及び喘息誘発群に比べてＡＤＳＣｓが投与されたアレルギー性鼻炎及び喘息誘発群で有意に減少した（図６参照）。したがって、本発明のＡＤＳＣｓは、アレルギー性鼻炎の症状を減少させることが分かった。
【００２６】
本発明者等は、ＡＤＳＣｓが鼻腔粘膜及び気管支の好酸球性炎症に及ぼす影響を調べるため、アレルギー性鼻炎及び喘息マウスから採取した鼻腔粘膜と肺組織切片を固定及び染色後、光学顕微鏡で観察した。前記の結果、抗原を投与しない対照群では鼻腔粘膜に炎症細胞の浸潤が全く観察されなかったが、アレルギー性鼻炎及び喘息誘発群の粘膜では炎症細胞、特に好酸球の浸潤が増加し、前記好酸球の浸潤は、ＡＤＳＣｓ投与によって減少し（図７及び図８参照）、肺組織でも小気管支と血管周囲の炎症細胞、特に好酸球の浸潤がＡＤＳＣｓを投与した場合、顕著に減少したことを確認することができた（図９参照）。呼吸器でアレルギー炎症の組織学的変化は、粘液腺（ｍｕｃｏｕｓ  ｇｌａｎｄ）の増加と好酸球の浸潤が特徴であると言える（非特許文献２１）。したがって、ＡＤＳＣｓがアレルギー性鼻炎及び喘息で鼻腔粘膜の好酸球炎症を抑制することを意味すると言える。
【００２７】
本発明者等は、ＡＤＳＣｓが気道の炎症に及ぼす影響を調べるため、アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで気管支肺胞洗浄術を施行した。気管支肺胞洗浄液の総細胞数及び大食細胞の数がＯＶＡ抗原を投与した喘息誘発群に比べて、ＡＤＳＣｓを投与した喘息誘発群で減少していた。特に好酸球の数が有意に減少した（図１０参照）。気管支肺胞洗浄液内のサイトカイン濃度を測定した時、ＡＤＳＣｓを投与した喘息誘発群でＡＤＳＣｓを投与しない喘息誘発群に比べてＩＬ−４、ＩＬ−５の濃度が減少し、ＡＤＳＣｓを静脈に注射して投与した時、標的器官である気道のＴｈ２免疫反応が減少することが分かった（図１１参照）。
【００２８】
本発明者等は、ＡＤＳＣｓがＴヘルパー細胞類型２（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ２、Ｔｈ２）免疫反応に及ぼす影響を調べるため、アレルギー性鼻炎及び喘息マウスでＯＶＡ噴霧後、胸郭を切開して左心室を穿刺して血清を得た後、Ｔｈ２免疫反応と係ったＯＶＡ特異ＩｇＥ、ＩｇＧ１抗体とＴｈ１免疫反応と係ったＯＶＡ特異ＩｇＧ２抗体をエライザ（ＥＬＩＳＡ）方法を使用して測定した。前記結果、抗原を投与しない対照群に比べてＯＶＡ抗原を投与したアレルギー性鼻炎及び喘息誘発群のＯＶＡ特異ＩｇＥ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体濃度は、有意に増加した。また、ＡＤＳＣｓが投与されたアレルギー性鼻炎及び喘息誘発群でＯＶＡ特異ＩｇＥ濃度は有意に減少して、ＩｇＧ２ａ濃度は有意に増加したが、ＩｇＧ１濃度は意味ある差を示さなかった。したがって、鼻腔粘膜によって定着されたＡＤＳＣｓがＴｈ２免疫反応を抑制するということが分かった（図１２参照）。
【００２９】
本発明者等は、ＡＤＳＣｓがＴヘルパー細胞類型２（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  ２、Ｔｈ２）免疫反応に及ぼす影響を調べるため、アレルギー性鼻炎及び喘息マウスでＯＶＡ噴霧後、脾臓細胞の浮遊物を培養して脾臓上澄み液でＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γ濃度をエライザ方法で測定した。前記の結果、脾臓の上澄み液でＩＬ−４及びＩＬ−５の濃度は、抗原を投与しない対照群に比べてＯＶＡ抗原を投与したアレルギー性鼻炎及び喘息誘発群で有意に増加したので、鼻腔粘膜と肺でアレルギー炎症は、Ｔｈ２サイトカインによってよく誘発されるということを確認することができた。また、ＡＤＳＣｓが投与されたアレルギー性鼻炎及び喘息誘発群で有意に減少し、ＩＦＮ−γ濃度は、アレルギー性鼻炎及び喘息誘発群に比べてＡＤＳＣｓが投与されたアレルギー性鼻炎及び喘息誘発群で有意に増加したが、ＩＬ−１０の濃度は意味ある差を示さなかった。したがって、ＡＤＳＣｓがＴｈ２免疫反応をＴｈ１免疫反応に転換させることを意味すると言える（図１３参照）。
【００３０】
本発明の治療剤は、ＡＤＳＣｓに薬学的に許容可能な塩を添加することができる。前記薬学的に許容可能な塩は、遊離酸（ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ）によって形成された付加塩が有用である。適合する遊離酸としては、有機酸と無機酸を使用することができ、無機酸では塩酸、臭素酸、硫酸及びリン酸などを使うことができ、有機酸では、クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、ギ酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロアセト酸、ベンゾ酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、ガラクツロン酸、エンボン酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸などを使用することができる。さらに、薬学的に許容可能な塩だけではなく、通常の方法によって調剤することができるすべての塩、水和物及び溶媒化物をすべて含むことができる。
【００３１】
本発明の治療剤は、臨床投与時に吸入、噴霧及び注射などの非経口で投与が可能で、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。すなわち、本発明の治療剤は、実際臨床投与時に非経口の様々な剤形で投与することができ、製剤化する場合には普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤及び界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び座薬が含まれる。非水性溶剤と懸濁剤では、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。座薬の基剤では、ハードファット（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴ−ル、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール及びゼラチンなどを使用することができる。本発明の治療剤は、非経口投与時の注射剤、噴霧剤、吸入剤及び鼻腔投与用組成物などを使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の方法を実施するのおいて、投与される治療剤の量に影響を及ぼす因子としては、これに限定されるものではないが、投与方式、投与頻度、治療が進行中の特定疾病、疾病の深刻性、疾病の病歴、個体が異なる治療剤とともに協力治療法が進行中かどうかの有無、及び治療が進行中の個体の年齢、身長、体重、健康、及び身体条件を含む。一般的に治療が進行中の患者の体重が増加するほど、この製剤をより多くの量を投薬することが好ましい。
【００３３】
本発明の治療剤は、患者の免疫反応を刺激するのに効果的な量で投与することができる。例えば、ヒトに１回ないし数回に分けて投与することができ、投与量は細胞数が、２×１０３個／ｋｇ〜２×１０９個／ｋｇであることが好ましく、２×１０５個／ｋｇ〜２×１０７個／ｋｇであることがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳しく説明する。
但し、下記実施例及び実験例は、本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容が実施例及び実験例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
＜実施例１＞アレルギー性鼻炎及び喘息マウスモデルの製造
＜１−１＞動物の準備
８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをヒョウチャンサイエンス（大邱、韓国）から購入して通常的な実験環境で飼育した。動物実験に関する研究計画は、プサン大学校病院の動物倫理審議委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）によって承認を受けた。
【００３６】
＜１−２＞アレルギー性鼻炎及び喘息誘発
マウスは、卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，ＯＶＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して感作させた。実験第１日目及び１４日目に１ｍｇの水酸化アルミニウムに溶解したＯＶＡ２５μｇ（全体用量２００μｌ）をマウスの腹腔内に注射して感作させた（非特許文献２１、非特許文献２２）。２１〜２３日目に超音波噴霧器（ＮＥ−Ｕ１２，Ｏｍｒｏｎ，日本）を使用してリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）に溶解した５％卵白アルブミンを実験動物の鼻に噴霧して、アレルギー性鼻炎及び喘息マウスモデルを製作した（図１参照）。
【００３７】
＜実施例２＞ＡＤＳＣｓの製造
＜２−１＞ＡＤＳＣｓの分離及び培養
脂肪組織は、マウスの腹部脂肪から採取した。ＡＤＳＣｓを分離するために、脂肪組織を同量のＰＢＳで洗った後、３７℃で３０分間０．０７５％コラゲナーゼ類型I（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅI）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を処理した後、１０％牛胎血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）を含むα−ＭＥＭ（α−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で中和して、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞の残骸を除去するために沈殿物を１００μｍナイロン網紗に通過させて条件培地（α−ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ））の下に３７℃／５％ＣＯ２環境で一晩の間培養した。培養後に残っている付着しない赤血球を除去するためにＰＢＳで洗った後、条件培地の下に３７℃／５％ＣＯ２環境で１週間程度培養した後、単層の癒着した細胞が合わされると細胞を０．０５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理して、１０％ＦＢＳが含まれたα−ＭＥＭ培地に浮遊させた後、２，０００細胞／ｃｍ２の濃度で２次培養した。
【００３８】
＜２−２＞ＡＤＳＣｓの確認
培養した細胞の表現型を評価するために、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ３４及び抗ＣＤ３１抗体で染色した後、ＦＡＣスキャンアルゴンレーザーサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ  ａｒｇｏｎ  ｌａｓｅｒ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して発現を分析した。その結果、培養細胞の表現型は、ＣＤ４４は９９．４６％、ＣＤ１０５は９８．０３％、ＣＤ３４は１．９０％及びＣＤ３１は４．９９％が発現されることを確認した（図２参照）。したがって、前記培養細胞が、ＡＤＳＣｓであることが分かった。
【００３９】
また、ＡＤＳＣｓの多分化能評価実験のために、脂肪細胞への分化はＡＤＳＣをアディポゲニック培地（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ：１０％ＦＢＳ，１μｍ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，１００μｇ／ｍＬ  ３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，５μｇ／ｍＬ  ｉｎｓｕｌｉｎ，ａｎｄ  ６０μｍ  ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ  ｉｎ  α−ＭＥＭ）培地に１〜２週間培養した後、オイルレッドＯ（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ）染色を施行して細胞内脂質の蓄積を観察し、骨細胞への分化はＡＤＳＣを骨完成培養（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ）（１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、１０μｍ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ａｎｄ  ５０μｇ／ｍＬ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  α−ＭＥＭ）で２〜３週間培養した後、アリザリンレッド（ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ）染色を施行して、細胞外基質の石灰化を観察することで評価した。その結果、ＡＤＳＣｓは、それぞれ２週または３週後、脂肪細胞または骨細胞への分化を確認した（図３及び図４参照）。
【００４０】
＜実施例３＞アレルギー性鼻炎及び喘息マウスにＡＤＳＣｓの投与
３７℃環境で５分間Ｔｒｙ−ＥＤＴＡでＡＤＳＣｓを培養した後、ＡＤＳＣｓをＰＢＳで洗った後、細胞に蛍光標識子（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）ＣＭ−Ｄｉｌ）２μＭを付着して、再び３７℃環境で５分間培養した後、４℃で１５分間追加でさらに培養した。脂肪組織由来幹細胞の効果を調べるために、ＯＶＡを噴霧する３日前から毎日２×１０６細胞／ｍｌの幹細胞を尾静脈に注射した（図１参照）。本実験は、各グループ当たり５匹ずつ、下記のように大きく３グループに区分した。対照群は、ＰＢＳに感作して鼻に噴霧したがＡＤＳＣｓを投与したグループで、ＯＶＡ群はＯＶＡに感作して鼻に噴霧してアレルギー性鼻炎及び喘息を作った後、ＰＢＳを投与したグループであり、ＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群はＯＶＡに感作して鼻に噴霧してアレルギー性鼻炎及び喘息を作った後、ＡＤＳＣｓを投与したグループである。
【００４１】
＜実験例１＞ＡＤＳＣｓの鼻腔粘膜と肺に定着に対する確認
ＯＶＡで２回感作した後、ＯＶＡを噴霧する前に蛍光標識子（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）ＣＭ−Ｄｉｌ（レッド），Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｐｒｏｖｅｓ，米国）を付着したＡＤＳＣｓを静脈に投与した。最後にＯＶＡ噴霧後、４８時間にケタミンハイドロクロライド（ｋｅｔａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（０．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射してマウスを犠牲にした。鼻腔粘膜と肺を採取した後、−２０゜Ｃで７μｍの厚さにスライスした後、蛍光顕微鏡で鼻腔粘膜と肺を観察した。
【００４２】
その結果、免疫蛍光染色で赤色の蛍光標識子陽性のＡＤＳＣｓが、対照群に比べてＯＶＡ群の鼻腔粘膜と肺でさらに多く発見された。したがって、アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで静脈に投与したＡＤＳＣｓが、鼻腔粘膜と肺に定着したことが分かる（図５参照）。
【００４３】
＜実験例２＞アレルギー性鼻炎症状の測定
ＯＶＡで噴霧中、最後の１５分間マウスのくしゃみと鼻をこする動作の回数を実験過程を知らない３人の観察者によって記録し、各群別でお互いに比較した。測定値は、対応のないｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ）を使用して統計分析を実施し、その結果はＳＰＳＳソフトウエアーパッケージバージョン１２．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して、ｐ＜０．０５を統計学的に意味あるとした。以下、実験例の統計学的分析は前記方法と同様に実施した。
【００４４】
その結果、くしゃみと鼻をこする動作を合わせた症状点数の平均は、対照群に比べてＯＶＡ群で有意に増加し（ｐ＜０．００１）、ＯＶＡ群に比べてＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群で有意に減少した（ｐ＝０．００９）（図６参照）。
【００４５】
＜実験例３＞気管支肺胞洗浄液内サイトカイン濃度測定
ＯＶＡ誘発４８時間後、ケタミンとキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）をマウス腹腔内に投与して痲酔した。マウスを解剖台に固定した後、胸部を切開して器官を露出させてカテーテルを挿入した後、結紮した。無菌性生理食塩水で０．７５ｍｌずつ２回注入して気管支肺胞洗浄を施行したが、開胸した部位で肺が膨脹することを観察して過膨張しないようにしてソフトに洗浄しながら得られる気管支肺胞洗浄液の容積が約１．５ｍｌになるように２回洗浄した。気管支肺胞洗浄液を４℃で１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液はサイトカインの測定のために分離した後、ＦＢＳ−ＩＭＤＭ２ｍｌを入れて浮遊させて細胞数を測定した後、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）を施行してスライドに塗抹してＤｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ染色を施行し、光学顕微鏡１０００倍視野で最小限３００個以上の炎症細胞を観察して好酸球、大食細胞、中性球及びリンパ球に分類して細胞の分率を評価した。気管支肺胞洗浄液の上澄み液でＩＬ−４、ＩＬ−５及びＴＧＦ−βの濃度をエライザ法を使用して測定した。
【００４６】
その結果、気管支肺胞洗浄液内細胞数は、ＯＶＡ群に比べてＡＤＳＣｓ治療群で有意に減少し、好酸球数が顕著に減少した（ｐ＜０．０５）（図１０参照）。気管支肺胞洗浄液内のＩＬ−４、ＩＬ−５及びＴＧＦ−βの濃度は、ＯＶＡ群に比べてＡＤＳＣ治療群（ＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ）で有意に減少した（各々ｐ＝０．０１８、ｐ＝０．０１２及びｐ＝０．０３９）（図１１参照）。
【００４７】
＜実験例４＞組織学的検査及び鼻腔粘膜で好酸球測定
マウスを犠牲にした後、採取した鼻腔粘膜を１０％中和されたホルマリンに浸漬した後、室温で２４時間組織固定をしてパラフィンブロックを製作した。４μｍで組織切片を作ってヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオジン（ｅｏｓｉｎ）染色をして、４００倍光学顕微鏡下で観察した。好酸球の測定は、実験過程を知らない二名の観察者が任意に選定した５ヶ所の視野で、一視野全体に浸潤されたすべての好酸球の数を測定して各群別にお互いに比較した。
【００４８】
その結果、対照群では鼻腔粘膜に炎症細胞の浸潤が全く観察されなかった。ＯＶＡ抗原を投与したアレルギー性鼻炎及び喘息マウスの鼻腔粘膜では、炎症細胞特に好酸球の浸潤が増加した。好酸球の浸潤は、ＯＶＡ群に比べてＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群で有意に減少して（ｐ＝０．０１）、ＡＤＳＣｓ投与は、鼻腔粘膜のアレルギー炎症の発生を抑制した（図７及び図８参照）。
【００４９】
＜実験例５＞気道病理組織検査
気管支肺胞洗浄が終わってカテーテルを通じて１０％ホルマリン溶液を入れた後、器官を切って肺と心臓を一緒に除去した後、これを１０％ホルマリンが入っている容器に入れて固定した。以後、パラフィンで包埋（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）した後、３ｍｍ厚さの切片を作ってヘマトキシリン−エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）で染色して組織所見を評価した。その結果、気道組織検査でＯＶＡ群に比べて、ＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群で著しく血管周囲及び気道周囲の炎症が減少した（図９参照）。
【００５０】
＜実施例６＞血清内ＯＶＡ特異ＩｇＥ及びＩｇＧ測定
ＯＶＡ噴霧後４８時間に胸郭を切開して、左心室を穿刺して血液２〜３ｍｌを採取して遠心分離を通じて血清を得た。Ｔヘルパー細胞類型２（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ２、Ｔｈ２）免疫反応と係ったＯＶＡ特異ＩｇＥ、ＩｇＧ１抗体とＴｈ１免疫反応と係ったＯＶＡ特異ＩｇＧ２抗体をエライザ方法を使用して測定した。９６ウェルマイクロタイタープレート（ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をＰＢＳ（ｐＨ９．８）で溶解した１００μｌ／ウェルＯＶＡでコーティング後、４℃で一晩留置（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して室温で１時間ウェルをブロッキング緩衝溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（４％ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。段階的に希薄したそれぞれの血清１００μｌ／ウェルを各ウェルに入れた後、室温で２時間反応させて０．１％ＰＢＳ−ツイーン２０緩衝溶液で洗った後、ＨＲＰ−結合抗マウスＩｇＥ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１：４０００）、ＩｇＧ１（１：５０００）またはＩｇＧ２ａ（１：５０００）を各ウェルに添加して室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗ってすべてのウェルを１００μｌテトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で追加反応させた後、吸光度４５０ｎｍでエライザプレートリーダー機（ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で測定した。
【００５１】
その結果、ＯＶＡ抗原を投与したＯＶＡ群のＯＶＡ特異ＩｇＥ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体濃度は、抗体がほとんど検出されない対照群に比べて有意に増加した（各々ｐ＝０．００２、ｐ＜０．００１）。ＯＶＡ特異ＩｇＥ濃度は、ＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群で有意に減少し（ｐ＝０．０３９）、ＩｇＧ２ａ濃度はＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群で有意に増加した（ｐ＝０．０１）。ＩｇＧ１濃度は、ＯＶＡ群とＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群間に有意な差を示さなかった。Ｔｈ２免疫反応の優位を意味するＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ割合は、ＯＶＡ群で対照群に比べて有意に増加し（ｐ＜０．００１）、ＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群で有意に減少した（ｐ＜０．００１）。したがって、ＡＤＳＣｓがＴｈ２免疫反応を抑制すると言える（図１２参照）。
【００５２】
＜実施例７＞脾臓でサイトカインの発現分析
最後のＯＶＡ噴霧後４８時間に脾臓を除去して３ｍｌ培養溶液が入っている皿に移した後、脾臓を圧迫して細かく潰した。赤血球がない脾臓細胞の浮遊物を、９６ウェルカルチャープレート（ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）に２×１０５細胞／ウェルの濃度で投入した後、１００ｎｇ／ｍｌのＯＶＡとともに１０％ＦＢＳ、グルタミン２ｍｍ、ピルビン酸ナトリウム１ｍｍと抗生剤が添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。４８時間培養後、脾臓上澄み液でＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γ濃度をそれぞれサンドイッチエライザ（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ：Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）方法で測定した。
【００５３】
その結果、脾臓の上澄み液でＩＬ−４及びＩＬ−５の濃度は、ＯＶＡ群で対照群に比べて有意に増加し（各々ｐ＝０．０２、ｐ＝０．０４２）、ＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群で有意に減少した（各々ｐ＝０．０３、ｐ＝０．０４６）。反対に、ＩＦＮ−γ濃度は、ＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群でＯＶＡ郡に比べて有意に増加した（ｐ＝０．００４）。ＩＬ−１０の濃度は、ＯＶＡ＋ＡＤＳＣｓ群とＯＶＡ郡間に有意な差を示さなかった。したがって、ＡＤＳＣｓが、Ｔｈ２免疫反応をＴｈ１免疫反応に転換させることを意味すると言える（図１３参照）。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスモデルの製造過程を示した図である。
【図２】脂肪組織由来幹細胞の表現型を評価するため、流細胞分析法を使用して発現を分析した結果を示した図である。
【図３】脂肪組織由来幹細胞の脂肪細胞への分化を示した図である。
【図４】脂肪組織由来幹細胞の骨細胞への分化を示した図である。
【図５】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスの鼻腔粘膜及び肺に定着した脂肪組織由来幹細胞を蛍光顕微鏡（倍率×２００）で観察した結果を示した図で：Ａ：アレルギー性鼻炎及び喘息誘発群の鼻腔粘膜；Ｂ：対照群の鼻腔粘膜；Ｃ：アレルギー性鼻炎及び喘息誘発群の肺組織；及びＤ：対照群の肺組織である。
【図６】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで脂肪組織由来幹細胞が、アレルギー性鼻炎症状に及ぼす影響を示したグラフである（＊  Ｐ＜０．００１，†  Ｐ＝０．００９）。
【図７】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスの鼻腔粘膜で脂肪組織由来幹細胞の影響に対する組織学的分析のために光学顕微鏡（倍率×４００）で観察した結果を示した図で：Ａ：対照群；Ｂ：アレルギー性鼻炎及び喘息誘発群；及びＣ：脂肪組織由来幹細胞を投与したアレルギー性鼻炎及び喘息誘発群である。
【図８】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで脂肪組織由来幹細胞が、鼻腔粘膜の好酸球性炎症に及ぼす影響を示したグラフである（＊  Ｐ＝０．０４，†  Ｐ＝０．０１）。
【図９】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで脂肪組織由来幹細胞が気道炎症に及ぼす影響を評価するため、肺の組織学的分析のために光学顕微鏡（倍率×２００）で観察した結果を示した図である。
【図１０】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで脂肪組織由来幹細胞が、気道炎症に及ぼす影響を評価するため、気管支肺胞洗浄液内炎症細胞を示したグラフである（＊  ｐ＜  ０．０５）。
【図１１】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで脂肪組織由来幹細胞が、気管支肺胞洗浄液内サイトカイン濃度に及ぼす影響を示したグラフである（＊  ｐ＜  ０．０５）。
【図１２】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで脂肪組織由来幹細胞が、血清抗原特異的抗体類型に及ぼす影響を示したグラフである（＊  Ｐ＝０．００２，†  Ｐ＝０．０３９，‡  Ｐ＜０．００１，§  Ｐ＝０．０３９，‖  Ｐ＝０．０１，¶  Ｐ＜０．００１，＊＊  Ｐ＜０．００１）。
【図１３】アレルギー性鼻炎及び喘息マウスで脂肪組織由来幹細胞が、脾臓上澄み液サイトカインに及ぼす影響を示したグラフである（＊  Ｐ＝０．０２，†  Ｐ＝０．０３，‡  Ｐ＝０．０４２，§  Ｐ＝０．０４６，‖  Ｐ＝０．００６，¶  Ｐ＝０．００４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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