(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質に対する結合性を有する分子で修飾された金属粒子を、メルカプト基、ジチオール基又はスルフィド基を有する分子量の異なる２種類以上の水溶性高分子の混合物で被覆することにより製造される金属粒子。
【請求項２】
２種類以上の水溶性高分子の各々の配合比が、0.001〜99.999質量％である、請求項１に記載の金属粒子。
【請求項３】
水溶性高分子が、ポリアルキレンオキシド系高分子である、請求項１又は２に記載の金属粒子。
【請求項４】
水溶性高分子がポリエチレングリコールである、請求項１から３の何れかに記載の金属粒子。
【請求項５】
金属粒子が金コロイド粒子である、請求項１から４の何れかに記載の金属粒子。
【請求項６】
分子量の大きい方の水溶性高分子の分子量が5000〜100000であり、分子量の小さいほう方の水溶性高分子の分子量が1000〜5000である、請求項１から５の何れかに記載の金属粒子。
【請求項７】
（ａ）請求項１から６の何れかに記載の金属粒子、（ｂ）増感反応のための試薬、及び（ｃ）多孔性担体を少なくとも含む、イムノクロマトグラフキット。
【請求項８】
被験物質と、請求項１から６の何れかに記載の金属粒子とをこれらの複合体を形成させた状態で不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する結合性を有する第二の分子を有する不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該金属粒子の複合体を捕捉して該被験物質を検出することを含む、検査方法。
【請求項９】
銀または銀化合物を用いて増幅を行う、請求項８に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属粒子及びそれを用いた検査方法、特にはイムノクロマト検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、イムノクロマトグラフ法における従来の検出法では検出できない極微量で作用する物質が多く、それらの迅速、簡便、且つ高感度の検出法の開発が不可欠である。従来から公知のイムノクロマトグラフ法よりも更に高感度なイムノクロマトグラフ法が求められている。そのため、各種の増幅技術が開発されている。
【０００３】
例えば、この数年にわたって、特異的結合剤と結合性物質の間に生じた凝集体を直接に又は間接的に小さな寸法の金属粒子、特に金粒子によって標識付けすることによって該凝集体を検出するという方法が提案されている。金属粒子の直接的な目視検査の可能性及び発生する信号が永久的であって急速には劣化しにくいという有利性が、金属粒子を簡単で迅速な試験のための興味ある標識物質としている。その上、金属標識、好ましくは金標識は、それによる作業に関連する衛生上の危険がきわめて低いことによって、放射線同位元素標識よりも好適である。コロイド状金標識を抗体標識後、タンパクと高分子による抗体付着していない部分をブロックする方法が一般的であるが、最近、金属粒子表面に結合できる官能基と抗体を共有結合できる反応基を同時に有する水溶性高分子（アセタールーPEG−SH分子量10000）によるコロイド状金標識増幅技術を開示されている（特許文献１）。また、表面プラズモン（SPR）センサーにおいて、金表面に分子量の異なるメルカプト化ポリエチレングリコール（HS-PEG）によって、高分子のブラシ層を形成することによって、タンパク質の非特異吸着を抑制する技術も報告されている（非特許文献１）。しかし、イムノクロマトグラフ法における金属粒子標識を抗体で修飾後、分子量の異なるHS-PEGを用いることによって検出感度を向上させることはまだ報告されていない。
【０００４】
【非特許文献１】Katsumi Uchida.et al.Anal.Chem.2005,77,1075-1080
【特許文献１】特開２００５−２１４９０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高感度な検査方法を行うことが可能な金属粒子、及びそれを用いた検査方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、被験物質と、被験物質に対する結合性を有する分子で修飾された金属粒子とをこれらの複合体を形成させた状態で不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する結合性を有する第二の分子を有する不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該金属粒子の複合体を捕捉して該被験物質を検出することを含む検査方法において、上記金属粒子を、メルカプト基、ジチオール基又はスルフィド基を有する分子量の異なる２種類以上の水溶性高分子の混合物で被覆することによって該検査方法の感度を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、被験物質に対する結合性を有する分子で修飾された金属粒子を、メルカプト基、ジチオール基又はスルフィド基を有する分子量の異なる２種類以上の水溶性高分子の混合物で被覆することにより製造される金属粒子が提供される。
【０００８】
好ましくは、２種類以上の水溶性高分子の各々の配合比は、0.001〜99.999質量％である。
好ましくは、水溶性高分子は、ポリアルキレンオキシド系高分子である。
好ましくは、水溶性高分子はポリエチレングリコールである。
好ましくは、金属粒子は金コロイド粒子である。
【０００９】
本発明によればさらに、（ａ）上記した本発明の金属粒子、（ｂ）増感反応のための試薬、及び（ｃ）多孔性担体を少なくとも含む、イムノクロマトグラフキットが提供される。
本発明によればさらに、被験物質と、上記した本発明の金属粒子とをこれらの複合体を形成させた状態で不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する結合性を有する第二の分子を有する不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該金属粒子の複合体を捕捉して該被験物質を検出することを含む、検査方法が提供される。
好ましくは、銀または銀化合物を用いて増幅を行う。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の金属粒子を用いることにより、イムノクロマトグラフィー測定において高感度で測定を行うことが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明による金属微粒子はイムノクロマトグラフキットに用いるのが好適である。
１．イムノクロマトとは
一般に、イムノクロマトグラフ方法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬（抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された検出用標識物が分散されてなる分散液を移動層として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させると共に、前記分析対象物と検出用標識物とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と検出用標識物の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に検出用標識物が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被検出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
【００１２】
本発明におけるイムノクロマトグラフキットは、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を内蔵していてもよく、前記固定化試薬に結合した前記分析対象物と検出用標識物の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、簡便で、迅速な高感度イムノクロマトグラフを行うことができる。
【００１３】
２．被検試料
本発明のイムノクロマトグラフ方法で分析することのできる被検試料としては、分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
【００１４】
３．被検試料の前処理
本発明のイムノクロマトグラフ方法では、前記被検試料をそのままで、あるいは、前記被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
【００１５】
４．構成
本発明のイムノクロマトグラフ方法において使用することのできるイムノクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるイムノクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。例えば、図１に模式的に従来のイムノクロマトグラフ用ストリップの平面図を模式的に示す。図２に図１で示されたイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。
【００１６】
本発明のムノクロマトグラフ用ストリップ１０は、展開方向（図１において矢印Ａで示す方向）の上流から下流に向かって、試料添加パッド５、金属微粒子標識保持パッド２、クロマトグラフ担体（例えば抗体固定化メンブレン）３、及び吸収パッド４がこの順に、粘着シート５上に配置されている。
【００１７】
前記クロマトグラフ担体３は、捕捉部位３ａを有し、分析対象物と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域である検出ゾーン（検出部と記載することもある）３１を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロールゾーン（コントロール部と記載することもある）３２を更に有する。さらに、検出ゾーン３１およびコントロールゾーン３２は、増幅のための有機銀塩と銀イオンのための還元剤を含有する。
【００１８】
前記標識化物質保持パッド２は、標識化物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバーパット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。
前記試料添加パッド１としては、例えばグラスファイバーパットを用いることができる。
【００１９】
４−１．検出用金属微粒子標識
検出用金属微粒子標識は、金属コロイドのような金属等を用いることができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、１〜５０ｎｍがさらに好ましく。１〜１５ｎｍが特に好ましい。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法（例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｐｐ６９１−６９６，（１９８２））に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識特異結合物質を得ることができる。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．  Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４１，２０，（１９７３）等）により金コロイド粒子を調製することができる。
【００２０】
本発明によれば、検出用標識物として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるイムノクロマトグラフにおいて、前記金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、前記分析対象物と検出用標識物の複合体の形成後に、有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンおよび銀イオンのために還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が前記金属系標識を核として前記金属系標識上に沈着するので、前記金属系標識が増幅され、分析対象物の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のイムノクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。
【００２１】
本発明のイムノクロマトグラフ方法では、分析対象物（抗原又は抗体）と特異的に結合する抗体若しくは抗原、又は標準化合物を標識するのに用いる標識として、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いる。前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識としては、通常のイムノクロマトグラフ方法に用いることができる標識である限り、特に限定されるものではなく、金属コロイド標識としては、例えば、白金コロイド、金コロイド、パラジウムコロイド、又は銀コロイドそして、それらの混合物を挙げることができ、金属硫化物標識としては、例えば、鉄、銀、パラジウム、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を挙げることができる。本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、これらの金属コロイド標識及び／又は金属硫化物標識の１又はそれ以上を標識として用いることができる。
【００２２】
４−２. 被験物質に対する結合性を有する分子
本発明のイムノクロマトグラフ方法における被験物質に対する結合性を有する分子とは、分析対象物に対して特異性を有する結合分子の組である。例えば、抗原-抗体、糖-レクチン、基質-酵素、ホルモン-受容体、核酸-その相補鎖。抗体について、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。
【００２３】
４−３． ブロッキング剤
被験物質に対する結合性を有する分子で被覆された金属微粒子はブロッキング剤でブロックする必要がある。本発明においては、金属コロイド標識のブロッキング剤として、メルカプト基、ジチオール基又はスルフィド基を有する分子量の異なる２種類以上の水溶性高分子の混合物を使用する。
【００２４】
水溶性高分子としては、代表的な化合物を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルフェノール、ポリ安息香酸ビニル、ポリビニルアルコールなどの水溶性高分子が好ましく、特に、ポリエチレングリコールが好適である。２種類以上の水溶性高分子のうち、分子量の大きい方の水溶性高分子の分子量は好ましくは5000〜100000であり、分子量の小さいほう方の水溶性高分子の分子量は好ましくは1000〜5000である。
【００２５】
金属粒子表面に結合できる官能基としてメルカプト基、ジチオール基又はスルフィド基を有する水溶性高分子の使用方法は特に限られていないが、２種類以上のものは、交互に使用してもよい、同時に混ぜてから使用してもよい。
２種類以上の水溶性高分子の配合比ｒとしては、以下のように定義する。3種類のブロッキング剤が使われる場合を例として、ｒ＝a/(a+b+c)ｘ100％。a,b,cは分子量の異なる金属粒子表面に結合できる官能基を持つ水溶性高分子（例えば、メルカプトポリエチレングリコール、HS-PEG）。上記ロッキング剤の配合比ｒは０．００１質量％〜９９．９９９質量％が好ましい。
【００２６】
４−４．クロマトグラフ担体
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
【００２７】
通常クロマトグラフ担体の一部に検出用物質を固定化させて検出ゾーンを作製する。検出用物質は、検出用物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、検出用物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。
【００２８】
４−５．試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
【００２９】
４−６．標識化物質保持パッド
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した検出用標識物を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
【００３０】
４−７．吸収パッド（吸水材）
吸水材は、抗体固定化メンブレン3よりもサンプルの吸収性能が高いことが好ましいがその素材は特に限定されず、例えば、濾紙，吸い取り紙，ガラス繊維布、ガラスフィルター、紙タオル等の紙が最も好ましい。その他にも脱脂綿，石英ウール，ガラスウール，ウール，絹，綿，麻，アクリル，レーヨン，ナイロン，ニトロセルロース，酢酸セルロース，再生セルロース，ガラス繊維等の繊維から成る布や不織布等も使用することができる。また、デキストラン，ムタン，レバン，セルロースパウダー等を固形に形成したものも使用可能である。
【００３１】
５．免疫検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法について説明する。サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物（抗原）に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第２抗体を、予め標識化しておく。第１抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定し、分析対象物（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第２抗体を更に接触させると、被検試料中に分析対象物が存在する場合には、固定化第１抗体と分析対象物（抗原）と標識化第２抗体とからなる免疫複合体が形成される。
【００３２】
サンドイッチ法では、固定化第１抗体と分析対象物（抗原）と第２抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第２抗体を除去し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化第１抗体を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第２抗体の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化第２抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時に薄膜状支持体に添加することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第２抗体の標識からの信号を増幅する。
【００３３】
５．増幅液
本発明において、使用することのできる増幅液とは、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液のことである。
【００３４】
本発明では、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、どんなものでも増幅液として用いることができる。
【００３５】
６．銀を含む化合物
本発明で用いる銀含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。
本発明に用いられる有機銀塩は、還元可能な銀イオンを含む有機化合物である。本発明で用いられる、還元可能な銀イオンを含む化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体など何でも良い。例えば、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀などが知られている。
【００３６】
また、還元剤の存在下で５０℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する銀塩または配位化合物であってもよい。
本発明に用いられる有機銀塩は、アゾ−ル化合物の銀塩およびメルカプト化合物の銀塩より選ばれる化合物であってもよい。好ましくは、アゾ−ル化合物としては含窒素ヘテロ環化合物であり、より好ましくはトリアゾ−ル化合物およびテトラゾ−ル化合物である。メルカプト化合物は、メルカプト基またはチオン基を分子内に少なくとも１つ有する化合物である。
【００３７】
本発明における窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩は、好ましくはイミノ基を有する化合物の銀塩である。代表的な化合物としては次にあげるものであるが、これらの化合物に限定されることはない。１，２，４−トリアゾ−ルの銀塩、又はベンゾトリアゾ−ルおよびその誘導体の銀塩（例えば、メチルベンゾトリアゾ−ル銀塩又は５−クロロベンゾトリアゾ−ル銀塩）、米国特許第４，２２０，７０９に記載されているフェニルメルカプトテトラゾ−ルのような１Ｈ−テトラゾ−ル化合物、米国特許第４，２６０，６７７に記載のイミダゾ−ルおよびイミダゾ−ル誘導体。この種の銀塩のうち、特に好ましい化合物はベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩、又はこれらの２つ以上の混合物である。
【００３８】
本発明に用いられる窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩として最も好ましくは、ベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩である。
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物は、好ましくは５つまたは６つの原子を含むヘテロ環化合物である。この場合に環中の原子の少なくとも１つは窒素原子であり、その他の原子は炭素、酸素、硫黄原子である。このようなヘテロ環化合物としてはトリアゾ−ル類オキサゾ−ル類、チアゾ−ル類、チアゾリン類、イミダゾ−ル類、ジアゾ−ル類、ピリジン類、およびトリアジン類が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００３９】
メルカプト基またはチオン基を持つ化合物の銀塩のうち代表的な化合物を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない。
３−メルカプト−４−フェニル−１，２，４−トリアゾ−ルの銀塩、２−メルカプト−ベンズイミダゾ−ルの銀塩、２−メルカプト−５−アミノチアゾ−ルの銀塩、メルカプトトリアジンの銀塩、２−メルカプトベンゾオキサゾ−ルの銀塩、および米国特許第４，１２３，２７４記載の化合物の銀塩。
【００４０】
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物としては、ヘテロ環を含まない化合物を用いることも出来る。ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体としては、総炭素数が１０以上の脂肪族または芳香族炭化水素化合物が好ましい。
ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体のうち有用な化合物としては以下に挙げるものがあるが、これらに制限されるわけではない。
チオグリコ−ル酸銀塩（例えば炭素原子数１２から２２までのアルキル基を持つＳ−アルキルチオグリコ−ル酸の銀塩）、ジチオカルボン酸の銀塩（たとえばジチオ酢酸の銀塩又はチオアミドの銀塩）
【００４１】
カルボン酸の銀塩を持つ有機化合物もまた好ましく用いられる。例えば、直鎖のカルボン酸である。具体的には、Ｃ数６〜２２のカルボン酸が好ましく用いられる。加えて芳香族カルボン酸の銀塩である。芳香族カルボン酸とその他のカルボン酸の例として、以下の化合物が挙げられるが、これらに限定されることはない。
置換または無置換の安息香酸銀（例えば３，５−ジヒドロキシ安息香酸銀、ｏ−メチル安息香酸銀、ｍ−メチル安息香酸銀、ｐ−メチル安息香酸銀、２，４−ジクロロ安息香酸銀、アセタミド安息香酸銀、およびｐ−フェニル安息香酸銀）、タンニン酸銀、フタル酸銀、テレフタル酸銀、サリチル酸銀、フェニル酢酸銀、又はピロメリット酸銀。
【００４２】
本発明においては米国特許第３，３３０，６６３に記載されたようなチオエ−テル基を含む脂肪酸銀もまた好ましく用いられる。エ−テルまたはチオエ−テル結合を含む炭化水素鎖を有するか、α−位（炭化水素基の上）またはオルト位（芳香族基の上）に立体的に遮蔽された置換基を有する可溶性のカルボン酸銀も用いることができる。これらは、塗布溶媒中で溶解性が向上し、光散乱が少ない塗布物になる。
そのような銀のカルボン酸塩は、米国特許第５，４９１，０５９に記載されている。ここで記載されている銀塩の混合物はどれでも、本発明においては必要に応じて使うことができる。
【００４３】
米国特許第４，５０４，５７５に記載のスルホン酸塩の銀塩もまた、本発明の態様においては使用することが出来る。
さらに、本発明においては例えば米国特許第４，７６１，３６１と米国特許第４，７７５，６１３に記載のアセチレンの銀塩も使用することが出来る。米国特許第６，３５５，４０８に記載のコア−シェル型銀塩として提供されることもできる。これらの銀塩は、一つ以上の銀塩から成るコアと一つ以上の異なる銀塩からなるシェルで構成される。
【００４４】
本発明中において、非感光性銀源としてもう一つ有用なものは米国特許６４７２１３１に記載の２つの異なった銀塩から構成される銀の二量体合成物である。そのような非感光性の銀の二量体合成物は２つの異なる銀塩から成る。前記二種の銀塩が直鎖の飽和炭化水素基を銀の配位子として含む場合にはそれら配位子の炭素原子数の差が６以上である。
有機銀塩は、銀として一般に０．００１モル／ｍ2〜０．２モル／ｍ2、好ましくは０．００１モル／ｍ2〜０．０５モル／ｍ2含有される。
【００４５】
本発明に用いられる無機銀塩、もしくは銀錯体は、還元可能な銀イオンを含む化合物である。好ましくは、還元剤の存在下で５０℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する無機銀塩、もしくは銀錯体である。
本発明に用いられる無機銀塩は、例えば、ハロゲン化銀（塩化銀、臭化銀、塩臭化銀、ヨウ化銀、塩ヨウ化銀、塩ヨウ臭化銀、およびヨウ臭化銀等）、チオ硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、チオシアン酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、および亜硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩等が挙げられる。
【００４６】
本発明に用いられる無機銀塩は、好ましくはハロゲン化銀である。
本発明に用いられるハロゲン化銀の粒子形成方法は、写真業界でよく知られており、例えば、リサーチディスクロージャー１９７８年６月の第１７０２９号、及び米国特許第３，７００，４５８号に記載されている方法を用いることができるが、具体的にはゼラチンあるいは他のポリマー溶液中に銀供給化合物（例えば、硝酸銀）及びハロゲン供給化合物を添加することにより調製される。
【００４７】
ハロゲン化銀の粒子サイズは、検査ノイズを小さくする上で微細であることが好ましく、具体的には０．２０μｍ以下、より好ましくは０．１０μｍ以下、更に好ましくはナノ粒子の範囲がよい。ここでいう粒子サイズとは、ハロゲン化銀粒子の投影面積（平板粒子の場合は主平面の投影面積）と同面積の円像に換算したときの直径をいう。
チオ硫酸銀、チオシアン酸銀、および亜硫酸銀等もハロゲン化銀と同様の粒子形成方法により銀供給化合物（例えば、硝酸銀）及びチオ硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、チオシアン酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、および亜硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）を混合することにより調製される。
【００４８】
また、一般に増幅液中の銀イオン濃度が高すぎると、増幅液中で銀イオンが還元されてしまうので、それを防ぐ為に錯化剤を用いて銀イオンが錯体を形成するようにしてもよい。このような錯化剤としては、グリシン、ヒスチジンのようなアミノ酸及び複素環式塩基や、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、プリン、ピリジン、アミノピリジン、ニコチンアミド、キノリン、その他類似の芳香族複素環式系が知られており、例えばヨーロッパ特許第0293947号中に記載されている。また、錯塩形成剤としては、チオ硫酸塩やチオシアン酸塩なども用いることができる。
【００４９】
本発明に用いられる銀錯体は、例えば、チオ硫酸塩と銀イオンの錯体、チオシアン酸塩と銀イオンの錯体、またはこれらの複合銀錯体、および、シュガーチオン誘導体と銀イオンの錯体、環状イミド化合物（例えば、ウラシル、ウラゾール、５−メチルウラシル、バルビツール酸など）と銀イオンの錯体、１，１−ビススルホニルアルカン類と銀イオンの錯体である。本発明に用いられる好ましい銀錯体は、環状イミド化合物（例えば、ウラシル、ウラゾール、５−メチルウラシル、バルビツール酸など）と銀イオンの錯体である。
本発明に用いられる銀錯体は、通常知られている塩形成反応により調製することができる。例えば、水もしくは水混和性溶媒中で水溶性銀供給体（例えば、硝酸銀）と銀錯体に対応する配位子化合物とを混合することにより調製される。調製された銀錯体は、透析法もしくは限外濾過法などの公知の脱塩方法により副成する塩類を除去して用いることが出来る。
【００５０】
無機銀塩もしくは銀錯体は、銀として一般に０．００１モル／ｍ2〜０．２モル／ｍ2、好ましくは０．０１モル／ｍ2〜０．０５モル／ｍ2含有される。
また、無機銀塩または銀錯体を使用する場合は、無機銀塩もしくは銀錯体の溶剤を含有することが好ましい。本発明に用いられる溶剤としては、上記の銀錯体の項で説明した銀錯体を形成する配位子として用いられる化合物が好ましく用いられる。例えば、チオ硫酸塩、チオシアン酸塩、シュガーチオン誘導体、環状イミド化合物、および１，１−ビススルホニルアルカン類糖である。本発明に用いられる溶剤として、より好ましくは、ウラシル、ウラゾール、５−メチルウラシル、バルビツール酸などの環状イミド化合物である。本発明に用いられる溶剤は、銀イオンに対してモル比で０．１モル〜１０モルの範囲で好ましく用いられる。
【００５１】
７．銀イオンのための還元剤
銀イオンのための還元剤は、銀（Ｉ）イオンを銀に還元することができる無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩が知られており、本発明に用いることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe+2を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。
本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
【００５２】
また、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料は、たとえば米国特許第６，０２０，１１７号（バウアーほか）で記述されるように、本発明において用いることができる。
【００５３】
「アスコルビン酸還元剤」はアスコルビン酸、その誘導体との複合体を意味する。アスコルビン酸還元剤は下記のように多くの文献において記載されており、例えば米国特許第５，２３６，８１６号（プロルほか）とその中で引用されている文献が挙げられる。
本発明における還元剤として、アスコルビン酸還元剤が好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含む。そのような化合物は含む以下にあげるものであるが、これらに限定されるわけではない。
【００５４】
Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばガンマ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸、たとえば米国特許第５，４９８，５１１、ＥＰ−Ａ−０５８５，７９２、ＥＰ−Ａ−０５７３７００、ＥＰ−Ａ−０５８８４０８、米国特許第５，０８９，８１９、米国特許第５，２７８，０３５、米国特許第５，３８４，２３２、米国特許第５，３７６，５１０、ＪＰ７−５６２８６、米国特許第２，６８８，５４９、およびＲｅｓｅａｃｈ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ３７１５２（１９９５年３月）に記載されているような化合物。
【００５５】
これらの化合物のうち、好ましくは、Ｄ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）かイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）であり、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
ヒンダードフェノール類も単独で、または一つ以上の硬調化還元剤とコントラスト強化剤と組み合わせて好ましく用いられる。
【００５６】
ヒンダードフェノールは、ベンゼン環上に一つだけの水酸基を有し、少なくとも一つの置換基を水酸基に対してオルト位に有する化合物である。ヒンダードフェノール還元剤は複数の水酸基を別々のベンゼン環に持っていれば、複数の水酸基を有していて構わない。
ヒンダードフェノール還元剤は、たとえば、ビナフトール類（すなわちジヒドロキシビナフトール類）、ビフェノール類（すなわちジヒドロキシビフェノール類）、ビス（ヒドロキシナフチル）メタン類、ビス（ヒドロキシフェニル）メタン類（すなわちビスフェノール類）、ヒンダ−ドフェノール類、およびヒンダードナフトール類が挙げられ、これらは置換されていて構わない。
【００５７】
代表的なビナフトール類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
１，１’−ビ−２−ナフトール、１，１’−ビ−４−メチル−２−ナフトール、および米国特許第３，０９４，４１７号と米国特許第５，２６２，２９５号に記載されている化合物。
代表的なビフェノール類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
２−（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチル−５−メチルフェニル）−４−メチル−６−ｎ−ヘキシルフェノール、４，４’−ジヒドロキシ−３，３’，５，５’−テトラ−ｔ−ブチルビフェニル、４，４’−ジヒドロキシ−３，３’，５，５’−テトラメチルビフェニル、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００５８】
代表的なビス（ヒドロキシナフチル）メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
４，４’−メチレンビス（２−メチル−１−ナフト−ル）、米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００５９】
代表的なビス（ヒドロキシフェニル）メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
ビス（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチル−５−メチルフェニル）メタン（ＣＡＯ−５）、１，１’−ビス（２−ヒドロキシ−３，５−ジメチルフェニル）−３，５，５−トリメチルヘキサン（ＮＯＮＯＸまたはＰＥＲＭＡＮＡＸ  ＷＳＯ）、１，１’−ビス（３，５−ｄｉ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）メタン、２，２’−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン、４，４’−エチリデン−ビス（２−ｔ−ブチル−６−メチルフェノ−ル）、２，２’−イソブチリデン−ビス（４，６−ジメチルフェノ−ル）（ＬＯＷＩＮＯＸ  ２２１Ｂ４６）、２，２’−ビス（３，５−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００６０】
代表的なヒンダードフェノールは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
２，６−ジ−ｔ−ブチルフェノール、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，４−ジ−ｔ−ブチルフェノール、２，６−ジクロロフェノール、２，６−ジメチルフェノール、および２−ｔ−ブチル−６−メチルフェノール。
【００６１】
代表的なヒンダードナフトールは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
１−ナフトール、４−メチル１−ナフトール、４−メトキシ１−ナフトール、４−クロロ１−ナフトール、２−メチル１−ナフトール、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００６２】
本発明に用いることのできる還元剤として、米国特許第５，４６４，７３８に記載されるようなスルホニルヒドラジンを含む置換ヒドラジンがある。この他の有用な還元剤は、例えば、米国特許第３，０７４，８０９、米国特許第３，０９４，４１７、米国特許第３，０８０，２５４および米国特許第３，８８７，４１７に記載されている。米国特許第５，９８１，１５１に記載の補助還元剤もまた有用である。
還元剤として、ヒンダードフェノール還元剤とその他以下に挙げるような様々な補助還元剤から選ばれる化合物と組み合わせて用いられる場合もある。さらにコントラスト強化剤を加えた３成分の還元剤の混合物もまた有用である。補助還元剤としては米国特許第５，４９６，６９５に記載のトリチルヒドラジド、ホルミル−フェニルヒドラジドを用いることができる。
【００６３】
コントラスト強化剤を還元剤とともに用いることができる。コントラスト強化剤としては例えば、下記の化合物が有用であるが、これらに限定されるわけではない。
ヒドロキシルアミン（ヒドロキシルアミンとアルキルとアリ−ル置換誘導体を含む）、米国特許第５，５４５，５０５に記載のアルカノールアミンとフタル酸アンモニウム、米国特許第５，５４５，５０７に記載のヒドロキサム酸化合物、米国特許第５，５５８，９８３に記載のＮ−アシルヒドラジン化合物、米国特許第５，６３７，４４９に記載の水素原子ドナー化合物。
【００６４】
全ての還元剤と有機銀塩の組み合わせが等しく効果があるわけではない。好ましい組合せの一つは、有機銀塩としてベントリアゾ−ルの銀塩又はその置換化合物、又はその混合物と、還元剤としてアスコルビン酸型還元剤である。
本発明における還元剤は、有機銀中の銀に対して１質量％〜１０質量％（乾燥質量）含まれる。多層構造において、還元剤が有機銀塩を含む層以外の層に加えられるならば、わずかに割合は高く、およそ２質量％〜１５質量％がより望ましい。補助還元剤は、およそ０．００１質量％〜１．５質量％（乾燥重）含まれる。
【００６５】
８．その他の助剤
増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅液に最適なｐＨに調整することができる。
【００６６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６７】
実施例では、ｈＣＧ検出系で本発明のイムノクロマトグラフキットが高感度であることを以下に実証する。
（１）検出用標識物である抗hCG抗体修飾金コロイド(直径50nm)の作成
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに50 mM KH2PO4バッファー（pH 7.0 ）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、50 μg / mLの抗hCGモノクローナル抗体（Anti-hCG 5008 SP-5、Medix Biochemica社）溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、4ｍMのHS-PEG（メルカプトポリエチレングリコール（Mw.10000、品名SUNBRIGHT ME-100SH、日本油脂）水溶液を550 μL加え攪拌し、5分静置した。その後、4ｍMのHS-PEG（メルカプトポリエチレングリコール（Mw.2000、品名SUNBRIGHT ME-020SH、日本油脂）水溶液を550 μL加え攪拌し、5分静置。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、遠心（himacCF16RX、日立）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この際の遠心時間を15分とした。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 % BSA, 0.1 % NaN3）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、15分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。
【００６８】
（２）金コロイド抗体保持パットの作成
上記の（１）で作成した各抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（20 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 5 % スクロース）及び水により希釈し、520 nmのODが1.5となるように希釈した。この溶液を、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
【００６９】
（３）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作製
２５ｍｍ×２００ｍｍに切断したニトロセルロ−スメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、ＨｉＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＨＦ１２０ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作製した。メンブレンの長辺を下にし、下から８ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した固定化用抗ｈＣＧモノクロ−ナル抗体（Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ６６０１  ＳＰＲ−５、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液をインクジェット方式の塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて幅１ｍｍ程度のライン状に塗布した（「検出部」を形成する。）。同様に、下から１２ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したコントロ−ル用抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ウサギＦ（ａｂ’）２，品番５６６−７０６２１、和光純薬）溶液をライン状に塗布した（「コントロール部」を形成する。）。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番０３０−０１５０５、和光純薬）含有５０ｍＭホウ酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝８．５））５００ｍＬをバットに入れ、そのまま３０分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５質量％スクロ−ス、０．０５質量％コール酸ナトリウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ＝７．５））５００ｍＬに移して浸し、そのまま３０分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンを得た。
【００７０】
（４）イムノクロマトグラフキットの作製
バック粘着シ−ト１（ＡＲｃａｒｅ９０２０、ニップンテクノクラスタ社）に、（３）で作製した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗ｈＣＧ抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約２ｍｍ重なるように２で作製した金コロイド抗体保持パッド２を貼り付け、約４ｍｍ重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド５（１８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバ−パッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５ｍｍ重なるように吸収パッド４（２０ｍｍ×5ｍｍ（比較例）に切ったセルロ−ス膜（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を５ｍｍ幅になるように短辺に平行にギロチン式カッタ−（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、５ｍｍ×５５ｍｍのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。これらをプラスチックケ−ス（ニップンテクノクラスタ社）に入れ、試験用イムノクロマトグラフキットとした。
【００７１】
（５）銀塩増幅による感度評価
１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーにｈＣＧ（リコンビナントｈＣＧ  Ｒ−５０６、ロ−ト製薬（株）製）を溶解し、各濃度の試験用ｈＣＧ溶液を作製した。
各試験用イムノクロマトグラフキットに、各濃度の試験用ｈＣＧ溶液を１００μＬ滴下し、10分静置した。このメンブレンをケースから取り出し、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーを700μL入れたマイクロチューブ（ビーエム機器株式会社、BM4020）に検体滴下部が液に漬かるように立てかけ、このまま1時間洗浄した。
【００７２】
このメンブレンンを、以下の増幅液Ａを200μL入れたマイクロチューブ（ビーエム機器株式会社、BM4020）に検体滴下部が液に漬かるように立てかけた。増幅液を吸い上げ、検出ラインに増幅液が到達した時点を0分とし、30秒経過したらこのメンブレンを取り出し、直ちに3分間水洗を行った。このとき検出ラインを目視した際の着色度合いを、着色が濃い「C」、着色がある「D」、薄い着色がある「E」、僅かに薄い着色がある「E-」、着色がない「0」、の５段階で判別した。
【００７３】
銀増幅液Ａの組成と作成法
1)増幅液A-1の作成
水325gに、硝酸鉄（III）九水和物（和光純薬、095-00995）を水に溶解して作成した1mol/Lの硝酸鉄水溶液40mL、クエン酸（和光純薬、038-06925）10.5g、ドデシルアミン（和光純薬、123-00246）0.1g、界面活性剤Ｃ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ  0.44gを溶解させる。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10%,）を40mL加える。この溶液80mLを測りとり、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬、091-00855）を11.76g加えこれを増幅液A-1とした。
2）増幅液A-2の作成
硝酸銀溶液10ｍＬ（10ｇの硝酸銀を含む）に水を加えて全体量が100gとなるようにし、増幅液A-2（10重量%硝酸銀水溶液）を作成した。
3）増幅液Ａの作成
増幅液A-1  40mLを測りとり、増幅液A-2を4.25mL加え攪拌し、増幅液Ａとした。
【００７４】
実施例１
上記作成法により、作成したイムノクロマトキット（ブロッキング剤が分子量2000と10000のHS-PEGを16.7％と83.3％で混合して、金コロイドを処理したもの）を用い、銀塩増幅法によって、キットの感度を評価した。
【００７５】
比較例１
上記作成法により、作成したイムノクロマトキット（ブロッキング剤が従来法の1 %ポリエチレングリコール（PEG  Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）と10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）で、金コロイドを処理したもの）を用い、銀塩増幅法によって、キットの感度を評価した。
【００７６】
比較例２
上記作成法により、作成したイムノクロマトキット（ブロッキング剤が分子量20000のHS-PEGで金コロイドを処理したもの）を用い、銀塩増幅法によって、キットの感度を評価した。
【００７７】
結果：
表１に示した結果から、実施例1と比較例１により、抗体で被覆された後の標識金微粒子をブロッキングする時、分子量の異なるHS-PEGを混合使用することによって、従来法と比べ、感度が大きくアップできた。また、比較例２より、1種類のHS-PEGのみを使用する場合、感度アップ効果はなかった。
【００７８】
【表１】
0004980945.tif 000002
【００７９】
次に、断片化抗体として、F(ab')2化抗インフルエンザ抗体を使用した次のようなイムノクロマトキットを作製し、本発明の効果を示す。
【００８０】
（６） F(ab')2化抗インフルエンザA型ウイルス抗体の作製
抗インフルエンザA型ウイルス抗体（品番7307、メディックスバイオケミカ社）を使用し、ImmunoPureR IgG1 Fab and F(ab')2 Preparation Kit（品番 44880、ピアース社）を用いて作製した。
【００８１】
（７） F(ab')2化抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体の作製
抗インフルエンザB型ウイルス抗体（品番1131、ヴァイロスタット社）とリシルエンドペプチダーゼ（品番125-05061、和光純薬）をモル比で1：100となるように50 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.5)で希釈し,37℃で3時間反応させた。その後、ImmunoPure (A) IgG Purification Kit（品番 44667、ピアース社）で  F(ab')2化抗体を精製した。
【００８２】
（８） F(ab')2化抗インフルエンザウイルス抗体修飾金コロイドを使用したキットの作製
抗体修飾金コロイド溶液の作製は、（６）と（７）で作製したでＡ型Ｂ型抗体それぞれに対し、以下の同様な操作を行った。
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに２0 mM Boraxバッファー（pH 8.5）1 mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、150 μg / mLのF(ab')2化抗体溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、ブロッキング剤Ａを加え、5分静置した。次に、ブロッキング剤Ｂを加え、5分静置した。この溶液を8000×ｇ、４℃、30分間遠心（himacCF16RX、日立社）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05％PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1％BSA, 0.1％NaN3）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。
【００８３】
（９）金コロイド抗体保持パッドの作成
このようにして作製した各抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（20 mM Tris-HＣlバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 5 % スクロース）及び水により希釈し、それぞれ520 nmのODが3.0となるように希釈した。これら溶液を1：1の比率で混合し、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッドに1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
【００８４】
（１０）抗インフルエンザ抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作製
25 mm×200 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から7 mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した抗インフルエンザA型ウイルス抗体溶液をインクジェット方式の塗布機を用いて幅1 mm程度のライン状に塗布した。同様に、下から10 mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した抗インフルエンザB型ウイルス抗体溶液をインクジェット方式の塗布機を用いて幅1 mm程度のライン状に塗布した。さらに、下から13 mmの位置に0.5 mg / mLとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50 ℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 w%カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5 w%スクロース、0.05 w%コール酸ナトリウム、50 mM Tris-Hcl（pH 7.5））500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンを作製した。
【００８５】
（１１）キットの組み立て
バック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）に、3で作成した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約2 mm重なるように2で作成した金コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約4 mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（18 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5 mm重なるように吸収パッド（5 mm×100 mmに切ったセルロース膜（Cellulose Fiber Sample Pad、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を5 mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（CM4000、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、イムノクロマト用ストリップを作成した。これらをプラスチックケース（ニップンテクノクラスタ社）に入れ、試験用イムノクロマトキットとした。
【００８６】
比較例３
上記インフルエンザイムノクロマトキット作製法に関し、ブロッキング剤Ａを550 μLの 1％ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液、ブロッキング剤Ｂを1.1 mL の10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液とした。
【００８７】
比較例４
上記インフルエンザイムノクロマトキット作製法に関し、ブロッキング剤Ａを1.1 mL の4ｍM HS-PEG（メルカプトポリエチレングリコール（Mw.20000、品名SUNBRIGHT ME-200SH、日本油脂）水溶液とし、ブロッキング剤Ｂとしては何も加えなかった。
【００８８】
実施例２
上記インフルエンザイムノクロマトキット作製法に関し、ブロッキング剤Ａを550 μL の4ｍM HS-PEG（メルカプトポリエチレングリコール（Mw.10000、品名SUNBRIGHT ME-100SH、日本油脂）水溶液、ブロッキング剤Ｂを550 μL の4ｍM HS-PEG（メルカプトポリエチレングリコール（Mw.2000、品名SUNBRIGHT ME-020SH、日本油脂）水溶液とした。
【００８９】
（１２）銀塩増幅による感度評価
hCG系での（５）銀塩増幅による感度評価 の方法で、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーに、抗原としてｈＣＧの代わりに、クイックS-インフルA・B「生研」陰性/陽性コントロール（品番322968、デンカ生研）の陽性コントロールを使用し、それ以外に関しては同様の方法で、作製したイムノクロマトキットの感度評価を行った。今回使用した抗原液には、インフルエンザウイルスＡ型とＢ型の両方の抗原が含まれているので、抗原が存在する場合には、Ａ型とＢ型を同時に検出することがある。
【００９０】
結果：
表２の実施例２と比較例３により、断片化抗体を使用した場合に関しても、抗体で被覆された後の標識金微粒子をブロッキングする時、分子量の異なるHS-PEGを混合使用することによって、従来法（比較例３）と比べ、感度が大きくアップし、本発明の効果が確認できた。また、比較例４より、1種類のHS-PEGのみを使用する場合は、感度アップ効果はなかった。
【００９１】
【表２】
0004980945.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、イムノクロマトグラフキットの一態様を模式的に示す平面図である。
【図２】図２は、図１で示されたイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。
【符号の説明】
【００９３】
１：バック粘着シート
２：金属コロイド抗体保持パッド
３：抗体固定化メンブレン
３ａ： 捕捉部位
３１：検出部
３２：コントロール部
４：吸水パッド
５：試料添加パッド
１０：イムノクロマトグラフキット
【図１】
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【図２】
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