(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を刺激するための組成物であって、該組成物は、Ｂ細胞特異的発現エレメントに作動可能に連結された２以上のＴ細胞エピトープをコードする核酸配列を含む核酸分子がエキソビボで投与されたＢ細胞を含み、該核酸分子が、該Ｔ細胞エピトープを含む免疫グロブリン分子をコードする、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、ここで前記Ｂ細胞が、血液、または、脾臓、リンパ節、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、扁桃、パイアー斑、鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）、ヴァルダイアー環、および尿生殖器リンパ組織からなる群より選択されるリンパ組織に由来する、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記Ｔ細胞エピトープが、ＣＤ４  Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８  Ｔ細胞応答を刺激する、組成物。
【請求項４】
前記エピトープが抗体応答を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記エピトープがＣＤ４  Ｔ細胞応答を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記エピトープがＣＤ８  Ｔ細胞応答を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記エピトープがＣＤ４  Ｔ細胞応答およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、前記エピトープのうちの１つが抗体応答を刺激し、そして１以上の第２のエピトープがＣＤ４  Ｔ細胞応答およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を刺激する、組成物。
【請求項９】
前記エピトープは、前記免疫グロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）中に挿入されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンが可変領域を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記可変領域が重鎖可変領域である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記可変領域が軽鎖可変領域である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン分子が重鎖を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン分子が軽鎖を含む、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
以前の研究は、成人の免疫応答性宿主中に導入されたプラスミドＤＮＡが、抗体応答を誘導し得ることを示している（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２−１５４（１９９２））。体液性および細胞媒介性免疫の両方が誘導され得ることが、インフルエンザウイルスを用いてすぐに実証され、これらは、インビボでの防御のために十分であった（Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９（１９９３）；Ｆｙｎａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４７８−１１４８２（１９９３））。ＤＮＡワクチン（遺伝的ワクチンとも呼ばれる）は、以下に対して免疫するために適用されてきた：癌（Ｃｏｎｒｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１１６４−１１６８（１９９４））；細菌（Ｔａｓｃｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：８８８−８９２（１９９６）；Ｈｕｙｇｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：８９３−８９８（１９９６））；ウイルス（Ｕｌｍｅｒら、前出、１９９３）；Ｆｙｎａｎら、前出、１９９３；Ｒａｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９５１９−９５２３（１９９４）；Ｄａｖｉｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１５０３−１５０９（１９９４）；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：４１５６−４１６０（１９９３）；および寄生生物（Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９８６６−９８７０（１９９４））。
【０００２】
遺伝的ワクチンは、感染の恐れなしでウイルス感染を模倣するやり方で、ワクチン分子についての「青写真」を宿主に導入する。成人の免疫応答性動物中の体細胞への機能的遺伝子の接種は、天然の感染を模倣しかつ適応性の免疫を開始するための単純な方法である（Ｕｌｍｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：５３１−５３６（１９９６））。
【０００３】
抗原をコードする配列およびそれらを発現するための調節エレメントを含むプラスミドＤＮＡは、非経口的注入（Ｗａｎｇら、前出、１９９３）または粒子ボンバードメント（Ｔａｎｇら、前出、１９９２）によって組織に導入され得る。代表的には、筋肉内経路または皮内経路を介するプラスミドＤＮＡの注入は、好ましくは複数のＤＮＡ接種によって誘導される、抗体、および長時間続く免疫を伴う細胞応答の両方を生じる（Ｓｅｄａｇａｈら、前出、１９９４；Ｘｉａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９：１３２−１４０（１９９４））。しかし、導入遺伝子産物は、循環中でまれにしか見出されず（Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４：１５１−１５９（１９９３））、そして抗原提示がどこで起きるか、そしてそれがどのようにして起きるかについてはほとんど知られていない。
【０００４】
ＤＮＡ接種を介する免疫は、インビボトランスフェクション、産生、および、実証された場合には、導入遺伝子産物の分泌、ならびに特定化された細胞による抗原提示による。しかし、大部分の研究において、インビボでトランスフェクトされた細胞またはこのプロセスに関与する抗原提示細胞のいずれもが同定されていない。ウイルスプロモーターの制御下での外来性ＤＮＡの発現（Ｔａｎｇら、前出、１９９２；Ｕｌｍｅｒら、前出、１９９２；Ｄａｖｉｓら、前出、１９９３；Ｒａｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９５１９−９５２３（１９９４）；Ｗａｎｇら、前出、１９９３；Ｈｕｙｇｅｎら、前出、１９９６；Ｔａｓｃｏｎら、前出、１９９６；Ｓｅｄｅｇａｈら、前出、１９９４；Ｄｏｏｌａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１７３９−１７４６（１９９６））は、組織特異性を制限する。
【０００５】
遺伝的ワクチンは、首尾良く用いられてきたが、その免疫原的な潜在性を開発するためのより効果的な方法を発展させるための必要性が残ったままである。本発明は、この必要性を満たし、そして関連する利点もまた提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、例えば、リンパ組織中のリンパ球に、１以上の異種エピトープをコードする核酸配列に作動可能に連結された造血細胞特異的な発現エレメントを含む核酸分子を、インビボまたはエキソビボで投与することによって、免疫応答を刺激するための方法を提供する。異種エピトープは、免疫グロブリン分子の相補性決定領域に挿入され得る。本発明はまた、異種ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された造血細胞特異的な発現エレメントを含む核酸分子を提供し、ここで異種ポリペプチドは、２以上のＴ細胞エピトープを含む。本発明はまた、異種ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された造血細胞特異的な発現エレメントを含む核酸分子を投与することによって状態を処置する方法を提供し、ここで、この核酸分子は、Ｂ細胞に標的化される。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、免疫に対する合理的かつ効果的なアプローチを提供し、そして造血細胞（例えば、リンパ球）へと標的化された核酸分子（例えば、免疫グロブリンＨ鎖遺伝子）によってコードされるポリペプチドの接種後の抗体応答（Ｂ細胞免疫）および細胞性応答（Ｔ細胞免疫）の誘導に基づく。免疫は、例えば、リンパ器官への直接注射によってリンパ球をトランスフェクトすることによって、または例えば、インビトロでトランスフェクトされたリンパ球の静脈内注射によってエキソビボで得られ得る。本発明の方法は、プラスミドＤＮＡのような核酸分子の１回の接種から再現可能な方法で、免疫を開始するために、免疫学的記憶を確立するために、そして免疫応答をプログラムするために、用いられ得る。
【０００８】
本発明の方法は、ワクチンとして役立ち得る核酸分子を、インビボまたはエキソビボで主に（しかし非排他的に）Ｂ細胞へと送達するための効果的方法に基づく。トランスフェクトされたＢ細胞は、ある量の免疫原性分子を産生し、そして免疫系を免疫応答に対してプログラムする。主に（しかし非排他的に）Ｂ細胞へと核酸分子（例えば、ＤＮＡワクチン）を送達するための方法は、体細胞性導入遺伝子免疫（ＳＴＩ）と呼ばれる。
【０００９】
詳細には、ＳＴＩは、２つの目的を達する：Ｂリンパ球を抗原性物質の強力なミニ工場（ｍｉｎｉｆａｃｔｏｒｙ）として利用すること、およびこれらを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用すること。ＳＴＩは、免疫原性分子の長引いた製造のためにＢ細胞を用いて免疫を誘導する（Ｂ細胞は、１０3分子の抗体／秒を産生し得る（ＬａｎｇｍａｎおよびＣｏｈｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６７５−６９７（１９８７））。それゆえ、導入遺伝子を保有するまさにその細胞による外来ＤＮＡおよび抗原提示の効率的な利用は、１つの操作上の事象において取り組まれる。従って、異種エピトープをコードする核酸分子の、リンパ組織に対する標的化は、Ｂリンパ球における免疫グロブリンの天然の高レベル発現を利用する。
【００１０】
本発明の方法は、免疫応答を刺激する際に効果的である。なぜなら、核酸分子は、造血細胞（例えば、Ｂリンパ球）に対して標的化されるからである。この方法の有効性は、Ｂリンパ球に保有される抗原化（ａｎｔｉｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）抗体遺伝子の自己再生特性および活性化されたＢリンパ球が多くのコピーの導入遺伝子産物を合成する構成的な能力に由来する。
【００１１】
１つの実施形態では、抗体の可変領域は、抗体抗原化と呼ばれる、分子に新たな抗原性特性および免疫原性特性を付与するように異種抗原の別個の配列をコードするように再操作され得る。このアプローチは、抗原化後、抗体が、Ｂ細胞免疫およびＴ細胞免疫の誘導を導くような様式で抗原の構造的模倣物になるような、免疫グロブリンの可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）の改変を可能にする。その結果、抗原化Ｈ鎖遺伝子の接種およびＳＴＩの間の宿主によるトランスジェニックＩｇの合成は、異種Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを有する生物を提供する方法である。抗原化免疫グロブリンを生成する方法は、例えば、１９９６年１２月１０日に発行された米国特許第５，５８３，２０２号および１９９７年８月１９日に発行された同第５，６５８，７６２号に記載されている。
【００１２】
本発明は、抗体およびＴ細胞に媒介される抗原特異的免疫を誘導する方法として、ＳＴＩおよび抗原化抗体遺伝子の組み合わされた使用を提供する。抗原化抗体に対して、免疫応答を刺激するための本発明の方法は、１以上の異種ポリペプチドを発現する核酸（ｎｕｃｅｌｉｃ  ａｃｉｄ）分子を使用し得る。この異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ）ポリペプチドは、リンパ組織内の標的におけるポリペプチドの発現を可能にする発現エレメントに作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｌｙ）連結される。抗原化抗体と同様に、この方法は、リンパ系細胞への核酸分子の投与の際の、標的化された造血細胞のポリペプチド発現能を利用する。この異種ポリペプチドは、免疫応答を惹起し得る１以上のエピトープをコードし得る。
【００１３】
本発明の方法は、例えば、感染性因子、微生物病原体、腫瘍抗原および病理学的プロセスに対する免疫応答を刺激するために有用である。本発明を用いて、感染性因子に対する免疫応答を刺激し得る。このような感染性因子としては、以下が挙げられる：ウイルス（例えば、免疫不全ウイルス１および２、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、日本脳炎（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス、デング熱ウイルスおよび他のレトロウイルス／レンチウイルス）；原生動物（例えば、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、フィラリア症、トキソプラスマ症、鉤虫、条虫類を引き起こす寄生生物）；酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）；細菌（特に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅおよびコレラ（ｃｏｌｅｒａ）を引き起こす細菌、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ／Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、ならびにスピロヘータ（例えば、ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ボレリア、レプトスピラのような病原性細菌）；毒素（例えば、ボツリヌス菌、炭疽、ヘビ毒素、昆虫毒素および戦争関連化学毒素）。
【００１４】
本発明の方法を用いてまた、病理学的状態または疾患状態に対する免疫応答を刺激し得る。この病理学的状態または疾患状態は、例えば、以下であり得る：抗原（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｐ５３、ＭＵＣ−１、テロメラーゼ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、チロシナーゼ、ｇｐ１００）を発現する腫瘍；自己免疫疾患（例えば、糖尿病、重症筋無力症、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、クローン病、ブドウ膜炎；アレルギー（例えば、皮膚炎および喘息（ａｔｈｓｍａ））；代謝障害（例えば、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症）；内分泌障害（例えば、甲状腺、副腎、下垂体、卵巣、精巣の内分泌障害）；精神障害（例えば、双極性障害、精神分裂症）；疼痛（例えば、神経伝達物質および神経ペプチドの変調）；血液障害（例えば、凝固、貧血、血小板減少症）；ならびに歯の障害（例えば、虫歯）。本発明の方法を用いてまた、生殖を制御し得る（例えば、避妊ワクチン接種）。本発明の方法はさらに、移植、および骨髄移植、抗ＨＬＡ免疫を誘導することによって移植患者（例えば、固形器官）を処置するために用いられ得る。本発明は、ウイルス、寄生生物、細菌、アレルギー、自己免疫疾患および腫瘍に対するヒトおよび動物のワクチンの産生のために用いられ得る。本発明の方法は、免疫応答を刺激して、上記のような状態を処置または予防するために有用である。
【００１５】
本発明の方法は、１以上の異種エピトープをコードする核酸分子を、二次リンパ組織における主に（しかし非排他的に）Ｂ細胞へとインビトロまたはインビボのいずれかで投与する工程を含む。二次リンパ組織は、脾臓、リンパ節、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）（扁桃およびパイアー斑（Ｐａｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈｅｓ）を含む）、および鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）（例えば、ヴァルダイアー環（Ｗａｌｄｅｙｅｒ’ｓ  ｒｉｎｇ））および尿生殖リンパ組織であり得る。種々の方法を用いて、核酸分子をリンパ組織へと投与し得る。例えば、核酸分子は、リンパ組織（例えば、リンパ節）へと直接注射され得る。核酸分子はまた、例えば、内視鏡検査に案内される細い針での注射を用いて個体の脾臓へと直接注射され得る。さらなる方法としては、（免疫）−リポソームまたは時間制御放出のための種々の化学構造（例えば、ヒアルロン酸）の生分解性ビーズ内に封入されたＤＮＡの静脈内注射が挙げられる。さらなる方法としては、（免疫）−リポソームまたは時間制御放出のための種々の化学構造（例えば、ヒアルロン酸）の生分解性ビーズ内に封入されたＤＮＡの鼻腔（内）送達が挙げられる。さらなる方法としては、適切な酸耐性薬学的ビヒクル中の、または生弱毒細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）中に操作された、（免疫）−リポソームまたは時間制御放出のための種々の化学構造（例えば、ヒアルロン酸）の生分解性ビーズ内に封入されたＤＮＡの経口送達が挙げられる。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、免疫応答を刺激し得る、分子またはそのフラグメントをいう。ポリペプチドエピトープは、抗体応答のためには少なくとも３アミノ酸長であり、そしてＴ細胞応答のためには少なくとも８アミノ酸長である。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「異種ポリペプチド」とは、核酸分子を参照して使用される場合、そのポリペプチドが、発現エレメントに作動可能に連結された核酸配列によってコードされ、ここで、そのポリペプチドが天然ではその発現エレメントに連結して見出されないことを意味する。このように、このポリペプチドは、この発現エレメントに対して異種である。
【００１８】
同様に、用語「異種エピトープ」とは、発現エレメントに作動可能に連結された核酸配列によってコードされるエピトープであって、ここで、このエピトープは天然では、この発現エレメントに連結して見出されない、エピトープをいう。異種エピトープが免疫グロブリンに含まれる場合、このエピトープは、免疫グロブリンには通常見いだされない。それゆえ、この免疫グロブリンは、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｇｏｕｓ）エピトープ配列を含む。このような異種エピトープ配列は、抗原性エピトープならびにレセプター部位として機能するレセプター様結合ドメインまたは結合領域（例えば、ＨＩＶについてのヒトＣＤ４またはＣＣＲ５の結合ドメイン、ホルモンレセプター結合リガンド、レチノイドレセプター結合リガンド、および細胞接着を媒介するリガンドまたはレセプター）を含み得る。
【００１９】
本発明の核酸分子によってコードされるエピトープは、発現エレメントに作動可能に連結される。本明細書中で使用される場合、「発現エレメント」は、遺伝子エレメント（例えば、エピトープをコードする核酸）の発現を指向し得る核酸調節エレメントである。発現エレメントとしては、例えば、作動可能に連結された遺伝子エレメント（例えば、ポリペプチドまたはエピトープをコードする遺伝子エレメント）の発現を可能にし得る、プロモーターおよび／またはエンハンサーが挙げられ得る。特に有用なプロモーターおよびエンハンサーは、造血細胞において機能するプロモーターおよびエンハンサー（「造血細胞発現エレメント」と称される）である。このような造血発現エレメントは、造血起源の細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）における発現を可能にし得る。これらのプロモーターおよびエンハンサーは、造血細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）に特異的であり得る。本明細書中で使用される場合、「造血細胞特異的発現エレメント」とは、造血細胞または特定の造血細胞に特異的である発現エレメント（例えば、Ｂ細胞特異的またはＴ細胞特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサー）をいう。代表的なＢ細胞特異的発現エレメントは、実施例に開示される。当業者は、造血細胞特異的発現エレメントがわかるかまたは容易に決定し得る。造血細胞特異的発現エレメントは、造血細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）中で天然に存在する発現エレメントであり得る。
【００２０】
本発明において使用される核酸分子は、１以上の異種エピトープを含む免疫グロブリン分子をコードし得る。このエピトープは、免疫グロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）中に挿入され得る（例えば、Ｋａｂａｔら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９８７）を参照のこと）。このエピトープは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３内に挿入され得る。さらに、１以上のエピトープが、任意のＣＤＲ内に挿入され得る。従って、同じエピトープが、単一のＣＤＲ内に複数回挿入され得るかまたは異なるＣＤＲ内に複数回挿入され得る。異なるエピトープはまた、同じＣＤＲ内に挿入され得るかまたは異なるＣＤＲ内に挿入され得る。従って、単一のＣＤＲは、単一のエピトープ、複数コピーの同じエピトープまたは２以上の異なるエピトープを同じＣＤＲに有し得る。６程度の（またはおそらくより多くの）エピトープが、Ｉｇポリペプチド鎖の可変領域の３つのＣＤＲ内に挿入され得るようである。これらの方法は、米国特許第５，５８３，２０２号および同第５，６５８，７６２号に記載される抗原化免疫グロブリンを利用する。
【００２１】
一般的に、１より多くのエピトープを投与して免疫（ｉｍｍｕｅ）応答を刺激する場合、複数のエピトープは、同じ核酸分子にコードされる。同じプラスミド上にコードされる場合、複数のエピトープは、同じ発現エレメントに作動可能に連結され得、そして融合ポリペプチドとして発現され得るか、または、複数のエピトープは複数コピーの発現エレメントから発現され得る。複数のエピトープはまた、異なる発現エレメントから発現され得る。さらに、同じエピトープは、異なる核酸分子（例えば、異なるプラスミド）において投与され得る。同様に、異なるエピトープは、１つの核酸分子において投与され得るか、または複数の核酸分子において（例えば、異なるプラスミド上で）投与され得る。複数のエピトープをコードする異なる核酸分子を用いることにより、単一の核酸分子にコードされ得るよりも多くのエピトープの投与が可能である。
【００２２】
本発明において有用な免疫グロブリン分子は、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、またはそれらの機能的フラグメントを含み得る。例えば、単一のＣＤＲは、免疫グロブリン（本明細書中で抗原化抗体として使用される）が免疫応答を刺激するように機能する場合、機能的フラグメントであり得る。この免疫グロブリンはまた、本明細書中に記載されるような可変領域の２または３のＣＤＲを含み得る。さらに、本発明において有用な免疫グロブリン分子は、重鎖または軽鎖であり得る。免疫グロブリン分子のエフェクター機能は、免疫グロブリン分子の定常領域によって付与され得る。それゆえ、免疫グロブリン分子は、定常領域を含み得る。定常領域は、所望により、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、ニワトリまたはラクダに由来し得る。しかし、免疫グロブリンの機能的フラグメントが免疫応答を刺激するように機能する場合、定常領域は本発明の免疫グロブリンには必要でないことが理解される。
【００２３】
本発明はまた、１以上の異種ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された発現エレメント（例えば、造血細胞特異的発現エレメント）を含む核酸分子を提供する。この異種ポリペプチドは、１以上のエピトープとして作用し得る。さらに、このエピトープは、サイトカインとの融合体として発現され得る。エピトープが融合ポリペプチド（例えば、サイトカインとの融合体）として発現される場合、このエピトープは、サイトカインに近接して融合され得るか、またはエピトープとサイトカインとの間に介在配列が存在し得る。このサイトカインは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２であり得る。本発明の核酸分子の発現エレメントは、造血発現エレメントであり得る。
【００２４】
本発明はさらに、免疫応答を刺激するための方法を提供し、この方法は、１以上の異種エピトープをコードする核酸配列に作動可能に連結された造血細胞特異的発現エレメントを含む核酸分子をリンパ系細胞にエキソビボで投与する工程を包含する。このリンパ系細胞は、脾臓、リンパ節、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、扁桃、パイアー斑、鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）、ヴァルダイアー環および尿生殖リンパ組織からなる群より選択される、血液またはリンパ組織に由来し得る。
【００２５】
本発明はさらに、免疫応答を刺激するための方法を提供し、この方法は、１以上の異種エピトープを含む核酸配列に作動可能に連結された造血細胞特異的発現エレメントを含む核酸分子をリンパ系細胞に投与する工程を包含し、ここで、このリンパ系細胞は、リンパ節、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、扁桃、パイアー斑、鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）、ヴァルダイアー環および尿生殖リンパ組織からなる群より選択される、血液組織またはリンパ組織に存在する。
【００２６】
本発明はまた、免疫応答を刺激するための方法を提供し、この方法は、１以上の異種エピトープをコードする核酸配列に作動可能に連結された発現エレメント（例えば、造血細胞特異的発現エレメント）を含む核酸分子をリンパ組織に投与する工程を包含する。このリンパ組織は、脾臓、リンパ節、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、扁桃、パイアー斑、鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）、ヴァルダイアー環および尿生殖リンパ組織からなる群より選択される、血液組織またはリンパ組織に由来し得る。
【００２７】
本発明の方法を用いて、免疫応答を刺激し得る。惹起された免疫応答は、抗体応答、ＣＤ４  Ｔ細胞応答またはＣＤ８  Ｔ細胞応答であり得る。２つの主要なクラスのＴ細胞（Ｔヘルパー細胞およびＴ細胞傷害性細胞と呼ばれる）が区別され得る。Ｔヘルパー細胞およびＴ細胞傷害性細胞へのＴ細胞の分類は一般に、細胞表面での、それぞれ、ＣＤ４タンパク質またはＣＤ８タンパク質のいずれかの存在に基づく。本発明の方法を用いて、抗体応答、ＣＤ４  Ｔ細胞応答もしくはＣＤ８  Ｔ細胞応答、または３つ全ての応答を含む、これらの応答のうちの２以上の任意の組み合わせを惹起し得る。例えば、本発明の方法を用いて、抗体応答およびＣＤ４  Ｔ細胞応答を刺激し得る。本発明の方法を用いてまた、抗体応答およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を刺激し得る。さらに、本発明の方法を用いて、ＣＤ４  Ｔ細胞応答およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を刺激し得る。さらに、本発明の方法を用いて、抗体応答、ＣＤ４  Ｔ細胞応答およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を刺激し得る。さらに、本発明の方法を用いて、複数のＣＤ４  Ｔ細胞応答（例えば、２以上の、３以上の、または５以上のＣＤ４  Ｔ細胞応答）を刺激し得る。同様に、複数のＣＤ８  Ｔ細胞応答は、本発明の方法を用いて刺激され得る。従って、所定の型の抗原または状態について所望される免疫応答の型に依存して、当業者は、最も適切な免疫応答、抗体、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞応答を選択して、所定の状態または潜在的な状態について最適化された免疫応答を提供し得る。
【００２８】
本発明はまた、異種ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されている、造血細胞特異的発現エレメントを含む、核酸分子を提供する。ここで、この異種ポリペプチドは、２以上のＴ細胞エピトープを含む。これらのＴ細胞エピトープは、ＣＤ４エピトープおよびＣＤ８エピトープ、２つのＣＤ４エピトープ、ならびに２つのＣＤ８エピトープからなる群より選択され得る。この異種ポリペプチドは、１以上のＢ細胞エピトープをさらに含み得る。
【００２９】
本発明はさらに、１以上の異種エピトープをコードする核酸配列に作動可能に連結されている、造血細胞特異的発現エレメントを含む、核酸分子を提供する。ここで、この核酸配列は、前記１以上のエピトープを含む免疫グロブリン分子をコードし、かつこの１以上のエピトープは、この免疫グロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に挿入されており、この異種ペプチドは、２以上のＴ細胞エピトープを含む。
【００３０】
本明細書中に開示されるように、脾臓リンパ球に標的化されるＨ鎖遺伝子の単回接種は、免疫を惹起し（実施例Ｉを参照のこと）、免疫学的記憶を確立し（実施例ＩＩＩを参照のこと）、そして免疫応答を予測可能および再現可能にプログラムするのに十分である。マウス系における実験（インビトロおよびインビボでの）は、この導入遺伝子のＨ鎖ポリペプチドが、内因性軽鎖に会合し（実施例ＩＶ）、そしてトランスジェニックＩｇが、１５ｎｇ／ｍｌと３０ｎｇ／ｍｌとの間の量で分泌される（実施例Ｉ）ことを実証する。トランスジェニックＩｇの合成後、５〜７日目までに、トランスジェニックＩｇの抗原決定基に特異的な抗体およびＴ細胞からなる免疫応答を生じる。この抗体応答は、ほぼ無限に検出可能なまま残存する。適切な抗原でのブースター注射に際して、代表的な二次免疫応答が誘導される。
【００３１】
その最も単純な形態において、ＳＴＩは、プラスミドＤＮＡがリンパ系器官内に直接注射され、そこで、プラスミドＤＮＡが、小節および小節内（Ｂリンパ球）に到達するモデルによって反映される。あるいは、ＳＴＩは、エキソビボプロセスとして現実化され、ここで、正常なリンパ球が、インビトロでトランスフェクトされ、その後インビボで注射される（実施例ＩＸ）。いずれかの場合において、導入遺伝子をコードする外来ＤＮＡを取り込むＢリンパ球は、その導入遺伝子を機能的なポリペプチド鎖に転写および翻訳する。アセンブルされたポリペプチドは、異種エピトープを保持するトランスジェニックＩｇ（抗原化された（ａｎｔｉｇｅｎｉｚｅｄ）トランスジェニックＩｇ）を形成する。分泌されたトランスジェニックＩｇは、Ｂリンパ球による、トランスジニックＩｇ上に生じた抗原決定基に対する免疫応答を誘発する。トランスジェニックＩｇはまた、Ｔ細胞を活性化し得る。Ｔ細胞決定基ペプチドは、この導入遺伝子を保有するＢリンパ球（直接提示）、または樹状細胞（ＤＣ）（二次刺激）のいずれかによって、プロセシングおよび提示される。免疫のプロセスは、血流およびリンパ系に到達する分泌されたトランスジェニックＩｇを介して、他の二次リンパ器官に対して迅速に伝播する（実施例ＶＩ）。応答が、時間につれて進化するように、単独の、または特異的抗体と複合体化されたトランスジェニックＩｇは、濾胞性樹状細胞（ＦＤＣ）によって捕捉され、そして記憶応答の間に再利用されるために樹状突起に沿って保存される。
【００３２】
分泌されたトランスジェニックＩｇは、二次抗原のプロセシングおよび提示のために、Ｆｃレセプターを介してＡＰＣを標的化し得、従って、免疫惹起の部位から遠位のリンパ系組織のための抗原ペプチド供給源として作用する。このことから、免疫が、その惹起部位からどのようにして伝播し得るかが容易に理解される。実際に、導入遺伝子を保持する細胞は、他のリンパ系器官をコロニー形成しない（実施例ＩＩを参照のこと）。トランスジェニックＩｇは、接種した器官から遊出し、そして血流およびリンパを介してリンパ系の他の区域に拡散する。ここで、それらは、新規に免疫を促進し得る。免疫学的アジュバント中の抗原または抗原ペプチドが、リンパ節をドレインする場合においてのみＴ細胞を活性化する（Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：３２７−３３９（１９９４））、従来の免疫化システムとは異なり、ＳＴＩの間、可溶性トランスジェニックＩｇの拡散を伴う活性化されたＴ細胞の動員は、体内全体のＴ細胞免疫の伝播を容易にする（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）。
【００３３】
トランスジェニックＩｇにおいて、Ｂ細胞エピトープは、それらが由来するネイティブ抗原の形状に近似する、制御された形状的および空間的特性を有して発現される。Ｂ細胞上の抗原レセプターは、抗原の三次元構造を介してそれらの抗原を認識し、そして立体的および静電気的に相補的な大きい領域にわたって相互作用を確立して結合するので、抗体ループ中のＢ細胞エピトープの発現は、ネイティブ構造と交差反応する抗体を誘導する。対して、Ｔ細胞の活性化は、抗原が小さいペプチドの形態で提示されることを必要とする。本明細書中に開示されるように、ＣＤＲループにおいて発現されたＴ細胞ペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の状況下で、容易にプロセシングおよび提示される（実施例ＶＩおよびＶＩＩ、ならびにＺａｎｅｔｔｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１３０：１２５−１５０（１９９２）；Ｚａｇｈｏｕａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６３１−６３５（１９９５）；Ｚａｇｈｏｕａｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：２２４−２２７（１９９３）；Ｂｉｌｌｅｔｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５：７７６−７８３（１９９５）を参照のこと）。従って、体細胞性遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）の間に、トランスジェニックＩｇを保持および合成するＢ細胞は、Ｔ細胞ペプチドの自己再生供給源となる。
【００３４】
哺乳動物におけるタンパク質の素晴らしい微小工場（ｍｉｃｒｏｆａｃｔｏｒｙ）であることに加えて、Ｂリンパ球はまた、Ｔリンパ球に以下の抗原を提示し得る：（ｉ）それらの膜Ｉｇレセプターを介してインターナライズされた抗原（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：５３７−５３９（１９８５））、および（ｉｉ）それら自体のＩｇを含む分泌タンパク質のペプチド（ＷｅｉｓｓおよびＢｏｇｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２８２−２８６（１９８９）；Ｂｉｌｌｅｔｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７７６−７８３（１９９５））。これらの特性から、Ｂリンパ球は、プラスミドＤＮＡでの遺伝子標的化および免疫のストラテジーのための、理想的な基質を構成する。
【００３５】
本明細書中、実施例ＶＩにおいてに開示されるように、１２残基のＢ細胞エピトープと会合した１２残基のＴｈ細胞決定基をコードするＤＮＡの単回の脾臓内接種（体細胞性導入遺伝子免疫と呼ばれるプロセス）の後、細胞性免疫応答をインビボで分析した。本明細書中で開示されるように、ＣＤ４  Ｔ細胞は、容易に活性化され、そしてＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を産生する（限定されない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）表現型の特性）。脾臓において発生するが、Ｔ細胞応答性は、体内の全てのリンパ節に対して、即座に、かつ類似の特性を有して伝播することが見い出された。単回接種はまた、限界希釈分析によって決定されるように、一次エフェクターＴ細胞とは異なるサイトカインプロフィールを提示する記憶Ｔ細胞による、長期の免疫記憶を確立するのに効果的であった。これらの研究は、二次リンパ器官において免疫を直接的に惹起することによって、当業者が、末梢部位に投与されるアジュバント中の従来のＤＮＡまたはタンパク質のワクチンを使用する特性とは、異なる特性を有する免疫応答を発生するという証拠を提供する。
【００３６】
強力なＴｈ（ＣＤ４）細胞決定基をコードする導入遺伝子をマウスに接種する場合、活発なＣＤ４  Ｔ細胞応答が誘発される（Ｇｅｒｌｏｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：３７８２−３７８９（１９９９））。Ｔｈ細胞の活性化は、再現可能であり、そして多量のＩＬ−２ならびに比例する量のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の同時産生によって、常に特徴付けられる。従来のＤＮＡ免疫は、Ｔｈ１応答を支持する（Ｒｏｍａｎら、前出、１９９７；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１６２３−１６３１（１９９７））。ＳＴＩは、限定されないＣＤ４  Ｔ細胞を活性化する。
【００３７】
強力なクラスＩ  ＭＨＣ制限Ｔ（ＣＤ８）細胞決定基をコードする導入遺伝子をマウス内に接種する場合、保護を伴う特異的ＣＤ８  Ｔ応答を測定した（実施例ＶＩＩを参照のこと）。本明細書中に開示された結果は、ＳＴＩが、Ｔ細胞ペプチドの内因性供給源として作用し、インビボでの免疫原性についての基本的な要件を満足することを示す。
【００３８】
本明細書中に開示されるように、使用される、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖をコードするプラスミドＤＮＡは、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサーエレメントの制御下にある（Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０（１９８３）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｃｅｌｌ  ３３：７１７−７２８（１９８３）；ＧｒｏｓｓｃｈｅｄｌおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｃｅｌｌ  ４１：８８５−８９７（１９８５）；Ｍａｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ４１：４７９−４８７（１９８５））。
【００３９】
体細胞性の導入遺伝子免疫によって提供される免疫原性刺激の型は、この導入遺伝子を保持するＢリンパ球が、生存し、トランスジェニックＩｇを合成および分泌する限り、この生物中に存続し得る。この導入遺伝子は、宿主Ｂ細胞の寿命を通して宿主中で存続し得、このＢ細胞が死んだ場合に消失する。これは、濾胞性樹状細胞によって果たされる「デポー効果」と共に、抗原が不在の場合の半減期が、２〜３週間程度と推定される、記憶Ｂ細胞の誘導および維持に重要であり得る（ＧｒａｙおよびＳｋａｒｖａｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：７０−７３（１９８８））。
【００４０】
本明細書中に記載される結果は、微生物病原体に対する抗原特異的免疫を誘導するための、ＳＴＩの使用を例示する（実施例ＩＩＩを参照のこと）。ＳＴＩは、疎水性テトラペプチド配列Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＮＡＮＰ）の３回の反復である、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアスポロゾイトの表面に発現され、Ｈ鎖遺伝子のＣＤＲ３中に操作されたＢ細胞エピトープに対して免疫した。このアミノ酸配列は、スポロゾイト周辺（ＣＳ）タンパク質の中心部分に複数のタンデムな反復で存在する（Ｚａｖａｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１４３６−１４４０（１９８５））。このエピトープに対する抗体は、マラリアの地方病領域で生活する人々（Ｚａｖａｌａら、前出、１９８５；Ｎａｒｄｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０６：５９７−６０１（１９７９））、および照射済スポロゾイトをワクチン接種されたボランティア（Ｃｌｙｄｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２６６：３９８−４０３（１９７３）；Ｃａｌｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６９５−２７０１（１９９２）；Ｅｇａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．４９：１６６−１７３（１９９３））において発生する。
【００４１】
本明細書中、実施例ＩＩＩに開示されるように、ヒトマラリア寄生生物Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに対する免疫は、体細胞導入遺伝子免疫を使用して誘導された。配列Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＮＡＮＰ）の３回の反復である、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトのＢ細胞エピトープをＣＤＲ３中にコードする、免疫グロブリン重鎖遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの単回接種は、全てのマウスにおいてＮＡＮＰに対する抗体を誘導した。
【００４２】
本発明の方法を使用して、Ｔ細胞応答（例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８  Ｔ細胞応答）を刺激し得る。免疫グロブリン（Ｉｇ）の超可変ループを使用して、抗原の別個のペプチド配列（抗原化された抗体）を発現し得る（Ｚａｎｅｔｔｉ、Ｎａｔｕｒｅ，３５５：４６６（１９９２））。これらは、Ｔリンパ球、ＣＤ４+およびＣＤ８+において特異的応答を誘導するエピトープのアミノ酸配列であり得る。
【００４３】
本明細書中、実施例ＶＩにおいて開示されるように、１２残基のＢ細胞エピトープと会合した１２残基のＴｈ細胞決定基をコードするＤＮＡの単回の脾臓内接種（体細胞性導入遺伝子免疫と呼ばれるプロセス）の後、細胞性免疫応答をインビボで分析した。本明細書中で開示されるように、ＣＤ４  Ｔ細胞は、容易に活性化され、そしてＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を産生する（限定されない表現型の特性）。脾臓において発生するが、Ｔ細胞応答性は、体内の全てのリンパ節に対して、即座に、かつ類似の特性を有して伝播することが見い出された。単回接種はまた、限界希釈分析によって決定されるように、一次エフェクターＴ細胞とは異なるサイトカインプロフィールを提示する記憶Ｔ細胞による、長期の免疫記憶を確立するのに効果的であった。
【００４４】
これらの研究は、体細胞性導入遺伝子免疫が、インビボにおいてＴｈ細胞応答性を誘導するための有用な方法である証拠を提供する。
【００４５】
本発明の方法はまた、Ｔ細胞応答（例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞応答）との組合せでの抗体応答を刺激するために有用である。このような組み合わせられた応答は、連合認識と称され得る。同じ抗原由来の複数のエピトープを含むこと、または同じ分子において異なる免疫学的機能を有するエピトープの組み合わせが、本発明の核酸分子において使用され得る。例えば、タンパク質抗原に対するこの抗体応答は、Ｂ細胞とＴヘルパー（Ｔｈ）細胞が同じ分子の異なる決定基に特異的である場合に生じる最適な条件での、Ｂ細胞とＴｈ細胞との間の協調を必要とする（連合認識）（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１８−２７（１９７１））。
【００４６】
本明細書中で開示されるように、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリア寄生生物のスポロザイト周辺（ＣＳ）タンパク質のＢ細胞エピトープ（Ｚａｖａｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１４３６−１４４０（１９８５））およびＴｈ細胞エピトープ（Ｍｕｎｅｓｉｎｇｈｅら、前出、１９９１；Ｎａｒｄｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１６０３−１６０６（１９８９））を表す、２つの異なる１２アミノ酸長のペプチドをコードする、抗原化された抗体の遺伝子を発現させて、そして試験した。同じＶHドメインのＣＤＲ３およびＣＤＲ２の操作は、この抗原化された抗体分子のインビボでの分泌を有意にもたらさなかった。脾臓にこの遺伝子を接種したマウスは、Ｂ細胞エピトープのみをコードする遺伝子を受けたマウスよりも、高度にＢ細胞エピトープに対して応答する抗体をマウントした。インビトロ研究は、この２つのエピトープが、インビボにおいて独立して免疫原性であることを確証した（実施例ＩＶを参照のこと）。
【００４７】
本発明の方法を、連合認識についての方法を同様に使用して、Ｔｈ／Ｔｈ応答を刺激し得る。順応性の免疫応答の発生における連合（連結）認識事象の重要性は、一般的に認識されるが、同じ概念が、同じ分子上のＴｈ細胞エピトープ間の協調的相互作用に適用するか否かは、未だ未知である。ＳＴＩの状況下での抗原化された抗体遺伝子を使用する実験は、このことがこのケースに当てはまることを明らかにした（図３５および実施例Ｘを参照のこと）。
【００４８】
本明細書中に開示されるように、それぞれ、同じ遺伝子のＣＤＲ２およびＣＤＲ３において発現される２つのＴｈ細胞エピトープは、インビボで独立して免疫原性であった（図３６および実施例Ｘ）。
【００４９】
ＣＤＲにおけるＩｇ  Ｖ領域遺伝子を操作し、そして複数の異種ペプチドを発現する能力は、ワクチン接種の目的のための、所望の効果に依存する、複雑な予め決定された抗原特異性および／または相補的免疫原性機能の分子の設計における新たな可能性を開く（例えば、Ｂ／Ｔｈ、Ｔｈ／ＴｈまたはＴｈ／ＣＴＬエピトープ）。
【００５０】
ＳＴＩの重要な特徴は、持続的な免疫記憶の確立である。初回刺激後６週、３０週または１０４週での、アジュバント中のγ１ＮＡＮＰタンパク質のブースター免疫は、真正の記憶応答を生じる。特異的記憶もまた、マウスを、初回刺激後６週でＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生生物でチャレンジした場合に、存在する（実施例ＩＩＩを参照のこと）。
【００５１】
本明細書中で開示されるように、天然の免疫学的アジュバントである、ＧＭ−ＣＳＦは、ＳＴＩによる免疫の能力を増大することが示された（実施例Ｖを参照のこと）。ＤＮＡ／ＧＭ−ＣＳＦキメラワクチンとして初回刺激時に与えられたＧＭ−ＣＳＦは、その後ブースター免疫で使用される抗原の形態に無関係に、記憶応答の程度を増強する。
【００５２】
本明細書中で開示されるように、抗原化された抗体／ＧＭ−ＣＳＦ  ＤＮＡワクチンでの初回刺激は、その後ブースター免疫で使用される抗原の形態に無関係に、規定されたドデカペプチドＢ細胞決定基に対する記憶応答の程度を増強する（実施例Ｖ）。本明細書中に開示される結果は、免疫応答（免疫記憶を含む）のモジュレーターとしての、インビボでのＧＭ−ＣＳＦの活性についての役割を規定する。
【００５３】
本明細書中に開示されるように、本発明の核酸分子は、リンパ系細胞に対して標的化され得る。このリンパ系細胞は、インビボまたはエキソビボで標的化され得る。例えば、上記に記載されるように、核酸分子をインビボで個体に投与して、リンパ系細胞を標的化し得る。例えば、この核酸分子をリンパ組織に投与して、そのリンパ組織における造血細胞（リンパ系細胞を含む）の標的化を生じ得る。しかし、本発明の核酸分子が、その核酸分子にコードされるエピトープの発現のために、造血細胞（例えば、リンパ系細胞）の標的化を生じる任意の方法または経路によって投与され得ることが、理解される。
【００５４】
本明細書中（実施例ＩＸ）で開示されるように、本発明の核酸分子はまた、エキソビボで投与され得る。例えば、造血細胞（リンパ系細胞を含む）が、ある個体または免疫学的に適合性の個体から得られ得、そして本発明の核酸分子が、これらの細胞にエキソビボで投与され得る。核酸分子を細胞にエキソビボで投与する方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、リン酸カルシウム沈殿およびエレクトロポレーションが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９８）を参照のこと）。核酸分子をエキソビボで細胞に投与する方法はまた、実施例Ｘに記載される。次いで、これらのリンパ系細胞（ここでは、その核酸分子を含み、そしてそのコードされたエピトープを発現する）は、個体に投与され得る。次いで、エピトープを発現するこれらのリンパ系細胞は、免疫応答を刺激し得る。
【００５５】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を投与することによってある状態を処置する方法を提供する。ここで、この核酸分子は、造血細胞に標的化される。本発明はまた、ある状態を処置する方法を提供し、この方法は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されている、Ｂ細胞特異的発現エレメントを含む核酸分子を含む、非ウイルスベクターを投与する工程を包含し、ここで、この核酸分子は、Ｂ細胞に標的化され、そしてこの異種ポリペプチドを発現する。同様に、Ｔ細胞を、異種ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている、Ｔ細胞特異的発現エレメントを含む、非ウイルスベクターで標的化し得る。本明細書中で使用される場合、「非ウイルスベクター」とは、ベクターとして機能し得るが、ウイルス中にカプセル化もされず、ウイルスゲノムにコードもされない、核酸分子をいう。免疫応答を刺激するための、エピトープを発現する核酸分子の投与は、上記の状態を処置するために有用である。造血細胞を標的化することによる、ある状態を処置するための本発明の方法は、Ｂ細胞またはＴ細胞を標的化することによって使用され得る。ある状態を処置するための本発明のこの方法は、Ｂ細胞を標的化する場合に特に有用である。
【００５６】
本発明はさらに、ある状態を処置する方法を提供し、この方法は、１以上の異種ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されている、造血細胞特異的発現エレメントを含む、核酸分子を投与することによる。ここで、この核酸分子は、造血細胞に標的化される。この標的化された造血細胞は、ある状態を処置するための異種ポリペプチドを発現するように作用する。本発明の方法は、ある状態を処置するための治療ポリペプチドを投与するのに有利である。本発明の方法を使用して、例えば、ホルモン、サイトカイン、凝固因子または免疫グロブリンを発現させ得る。例えば、個体が、ホルモンまたはサイトカインの発現の増加が有益である状態を有する場合、このような個体は、ホルモンまたはサイトカインのポリペプチドを発現する核酸分子の投与によって処置され得る。例えば、免疫不全によって特徴付けられる状態を有する個体は、ＩＬ−２またはＩＮＦ−γのようなサイトカイン、あるいは本明細書中に開示されるような、他のサイトカインを投与することによって処置され得るか、または免疫グロブリンを投与することによって処置され得る。同様に、血友病のような状態に罹患している個体は、例えば、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子のような凝固因子をコードする核酸を投与することによって処置され得る。当業者は、所定の状態を処置するために発現させるのに適切なポリペプチドを容易に決定し得る。
【００５７】
本発明の方法を使用して、目的の広範な種々の疾患関連遺伝子産物を発現させることによって状態を処置し得、これは目的の疾患を処置または予防するために使用され得る。例えば（そして例示目的のためのみであるが）、この遺伝子は、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、凝固因子、アンチセンスＲＮＡ、調節タンパク質、リボザイム、融合タンパク質などをコードし得る。従って、この方法を使用して、以下のような治療用タンパク質を供給し得る：第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、エリトロポイエチン（米国特許第４，７０３，００８号）、α−１−アンチトリプシン、カルシトニン、増殖因子、インスリン、低密度リポタンパク質、アポリポタンパク質Ｅ、ＩＬ−２レセプターおよびそのアンタゴニスト、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫応答変更因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン（ＩＦＮα、β、またはγ）、神経発育因子、グルコセレブロシダーゼ、コロニー刺激因子、インターロイキン（ＩＬ）１〜１５、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球、マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アデノシンデアミナーゼ、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、巨核芽球促進リガンド（ｍａｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）（ＭＰＬ、すなわちトロンボポエチン）。治療用ポリペプチドは、例えば、遺伝的障害（例えば、凝固因子障害、筋糖原病およびα−１−アンチトリプシン欠損）の処置および予防のために有用であり得る。本発明の方法はまた、接着分子（例えば、インテグリンのような）のリガンドを発現させて、例えば、接着機能（例えば、新脈管形成）をブロックするために使用され得る。
【００５８】
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアおよび本発明の核酸分子を含む、薬学的組成物に関する。従って、本発明の方法は、エピトープをコードする本発明の核酸分子を含む薬学的組成物を利用し得る。薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野において周知であり、そしてこれには、以下が挙げられる：水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョン（生理学的緩衝化生理食塩水、アルコール／水性の溶液または他の溶媒もしくはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油または注射可能な有機エステル）））。
【００５９】
薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、投与される核酸分子を安定化させるためか、またはその核酸分子の吸収を増加させるために作用する、生理的に受容可能な化合物を含み得る。このような生理的に受容可能な化合物としては、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量ポリペプチド、抗菌剤、不活性ガス、または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。核酸分子は、さらに、他の成分（例えば、ペプチド、ポリペプチド、および炭水化物）と複合体化され得る。核酸分子はまた、例えば、ワクチン銃を使用して、個体に投与され得る微粒子またはビーズに複合体化され得る。当業者は、薬学的に受容可能なキャリア（生理的に受容可能な化合物を含む）の選択が、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを知る。上述に記載したように、投与経路は、二次リンパ組織内に直接注射することによる経路であり得る。
【００６０】
投与は、リンパ組織以外であるが、リンパ組織を標的化する部位であり得る。本発明の核酸は、例えば、静脈内注射によって血液を介して全身に投与され得、そしてリンパ組織内のリンパ系細胞に標的化され得る。鼻腔内投与または経口投与もまた、使用され得る。例えば、本発明の核酸を含むバクテリア形態中のベクターは、経口的に投与され得、そしてパイアー斑を標的化する。
【００６１】
本発明のインビボでの方法およびエキソビボでの方法の両方において標的化されるＢ細胞およびＴ細胞は、正常な細胞（すなわち、非腫瘍細胞）である。これらの細胞は、処理されていなくとも、そして刺激されていなくとも良い。
【００６２】
以下の実施例は、例示するために意図されるが、本発明を制限しない。
【００６３】
（実施例Ｉ）
（免疫グロブリン重鎖をコードするＤＮＡでの体細胞性導入遺伝子免疫）
本実施例は、脾臓内への直接注射によるプラスミドＤＮＡでの免疫を記載する。
【００６４】
プラスミドＤＮＡの調製方法および脾臓内への注射による免疫方法は、（Ｇｅｒｌｏｎｉら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：６１１−６２５（１９９７））、図１に記載されるとおりである。
【００６５】
マウスに、１接種あたり１００μｇのプラスミドＤＮＡを接種した。すべてのＤＮＡ接種を、免疫グロブリンアジュバントの非存在下で実施した。４つの基本的な接種経路を使用した。ａ）筋内。プラスミドＤＮＡを、滅菌生理食塩水３０μｌ容量において、四頭に注射した。その後、マウスは、毎週間隔で３回の追加免疫注射を受けた（合計４回注射）。ｂ）皮下。プラスミドＤＮＡを、滅菌生理食塩水２５〜５０μｌ容量において、背部に注射した。その後、マウスは、毎週間隔で３回の追加免疫注射を受けた（合計４回注射）。ｃ）静脈内。プラスミドＤＮＡを、尾静脈を介して、滅菌生理食塩水溶液５０〜１００μｌ容量で注射した。その後、マウスは、毎週間隔で３回の追加免疫注射を受けた（合計４回注射）。ｄ）脾臓内。プラスミドＤＮＡを、滅菌生理食塩水溶液３０μｌ容量で注射した。
【００６６】
マウスを、腹腔内で、ミョウバンに吸着されたアフィニティー精製γ１ＷＴタンパク質で免疫した（マウス１匹あたり５０μｇ）。γ１ＷＴタンパク質で追加免疫されたマウスは、皮下的に、不完全フロイントアジュバント中で乳化された５０μｇのタンパク質を受けた。
【００６７】
マウスの血清中におけるγ１ＷＴ  Ｈ鎖導入遺伝子ポリペプチドの存在を、ＥＬＩＳＡ捕捉アッセイ（ＢｉｌｌｅｔｔａおよびＺａｎｅｔｔｉ、Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １：４１−５１（１９９２））によって検出した。簡潔には、ＰＢＳＡ中における個々のマウス血清の１：１０希釈物を、ヒトγグロブリンに対するヤギ抗体（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングされた９６ウェルプレート上でインキュベートした。血清中の免疫グロブリンＨ鎖導入遺伝子産物の濃度を、既知量のヒトγグロブリンを用いて作成された検量線に対するＯ．Ｄ．値をプロットすることによって算出した。
【００６８】
脾臓組織からのゲノムＤＮＡの抽出およびゲノムＤＮＡの配列決定のために、ＤＮＡ接種後１７日目に脾臓を回収し、−１７０℃で凍結させ、そして液体窒素中で組織を粉砕することによって、細胞を調製した。代表的には、ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．；Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ  ＣＡ）を使用して、１０ｍｇの脾臓組織から抽出した。マウスＶH６２についての２つの特異的プライマーＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧおよびＡＴＧＣＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴＡＡＣを用いて、ゲノムＤＮＡから５２０ｂｐのセグメントをＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９４℃で４５秒間、５４℃で４５秒間、および７２℃で４５秒間の３０回。ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ  Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）中にクローン化した。以前に１７日目に接種された脾臓のゲノムＤＮＡ由来の６つのクローン、およびトランスフェクトーマＢ細胞（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、前出、１９８９）のゲノムＤＮＡ由来の４つのクローンを、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ２．０  ＤＮＡ配列決定キット（ＵＳＢ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＯＨ）を用いるジデオキシターミネーター法により、２つのプライマーＡＡＣＡＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＧおよびＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧ（それぞれ、ＦＲ１の最初のコドンの１０ｂｐ前方およびＦＲ４の３’末端にアニーリングする）を用いて、両鎖において配列決定した。
【００６９】
マウスを、脾臓内経路を介して免疫し、そして他の接種経路（例えば、筋内、皮下、および静脈内）を介する場合と比較した。表１は、種々の経路を通して接種されたマウスにおいてＥＬＩＳＡ法により決定された抗免疫グロブリン応答を、各場合における注射回数と共に示す。顕著な抗体応答は、脾臓内経路を介して１回接種されたマウスにおいてのみ観察された（Ｉ群）。脾臓内経路を介して１回接種され、そして静脈内で３回追加免疫されたマウス（Ｖ群）もまた応答したが、３回のさらなる静脈内注射は、実質的に類似した抗体力価を生じたので、論理的に結論付けると、Ｖ群において観察された抗体応答は、脾臓内接種の効果を主に反映しているということである。皮下経路は、２匹のマウスのみにおいて、弱い応答を生じた（ＩＩＩ群）。筋内または静脈内に４回接種されたマウスにおいて、全く抗体応答は検出されなかった（ＩＩ群およびＩＶ群）。従って、組織特異的調節エレメントの制御下における免疫グロブリンＨ鎖遺伝子の使用は、脾臓内接種後にのみ免疫を産生した。
【００７０】
表１．γ１ＷＴ  ＤＮＡを接種されたＣ５７Ｂ１／６マウスにおける、γ１ＷＴタンパク質と反応する抗体の産生：接種経路の効果
【００７１】
【表１】
0005000807.tif 000002
a最初の接種後２１日目に収集した血清において、抗体力価の値を測定および算出した。
bマウスの大プールの前接種（ｐｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）値は、２．３（ｌｏｇ）であった。この力価を算出した終点陽性血清希釈物は、０．２００以上のＯＤ値（Ａ492）であった。
【００７２】
Ｈ鎖導入遺伝子産物は、抗免疫グロブリン抗体との免疫複合体の形成におそらく起因して、２６日目を超えて検出され得なかった。従って、脾臓内経路を介した免疫グロブリンＨ鎖ＤＮＡの接種は、２６日目まで、１００％の場合で、導入遺伝子免疫グロブリン産物の測定可能な分泌を産生した。
【００７３】
表２．ＤＮＡの単回脾臓内接種後のＣ５７Ｂ１／６マウスの血清における導入遺伝子免疫グロブリン産物の検出
【００７４】
【表２】
0005000807.tif 000003
提示された血清中の導入遺伝子産物の値は、各個々のマウスについての最大検出の日に対応する。循環する導入遺伝子免疫グロブリンの決定を、上記のようの実施した。実験およびＥＬＩＳＡを、独立して、異なる時点で実施した。
【００７５】
ＤＮＡ配列決定を使用して、宿主細胞ＤＮＡ中でのインビボ永続性が、導入遺伝子に体細胞変異を引き起こさせるか否かを決定した。体細胞変異は、ＶＤＪコード領域の特性であるので（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：２７１−２７５（１９８４））、この領域のみを特徴付けた。このＶＤＪコード領域（５２０ｂｐ）を、上記のような特異的プライマーを用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。全体で、接種した脾臓のゲノムＤＮＡに由来する６つのクローンおよび参照として供されたトランスフェクトーマＢ細胞のゲノムＤＮＡに由来する４つのクローンにおいて、配列決定を実施した。６つのクローンのヌクレオチド配列では、クローンＳＰ７のフレームワーク３における単一変換（ＣからＴへの）変異を除いて、変異は示されなかった。単一の（ＣからＴへの）変異はまた、トランスフェクトーマＢ細胞のＤＮＡ由来のクローンＴＲ３８中のフレームワーク２において観察された（図２）。従って、脾臓内接種後１７日目の完全な形態において回収された導入遺伝子のＶＤＪコード領域は、過剰変異の証拠を示さなかった。従って、インビボでの導入遺伝子における体細胞変異の欠損が観察された。
【００７６】
これらの結果は、核酸分子が、リンパ組織である脾臓に投与されて、免疫応答を誘発し得ることを実証する。
【００７７】
（実施例ＩＩ）
（体細胞性導入遺伝子免疫におけるＢリンパ球のインビボでの役割）
本実施例は、体細胞性導入遺伝子免疫におけるＢリンパ球の役割を記載する。
【００７８】
プラスミドの調製および免疫は、以下（Ｘｉｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６３５２−６３５７（１９９７））に記載される。
【００７９】
プラスミドγ１ＮＡＮＰ（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｑ．４：２１５−２２０（１９９０ａ））（図１）は、キメラＨ鎖遺伝子を保有し、ここで生産的に再配置されたマウスＶ領域遺伝子は、ヒトγ１  Ｃ領域遺伝子に連結されている。このＨ鎖遺伝子のＶ領域を、３つのＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ反復（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、前出、１９９０ａ）をコードするヌクレオチド配列の導入によって、第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）中において改変した。このプラスミド中のプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、Ｉｇ  Ｈ鎖遺伝子中で構成的に存在するものであり、そして以前に記載されている（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、前出、１９８９）。プラスミドｐＳＶｎｅｏは、マウスＶ領域およびヒトγ１  Ｃ領域遺伝子を欠く、元々のプラスミドベクターである（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２−２０７６（１９８１））。
【００８０】
γ１ＮＡＮＰまたは合成ペプチド（ＮＡＮＰ）ｎに対する抗体を、アフィニティー精製された抗体γ１ＮＡＮＰ（２．５μｇ／ｍｌ）または合成ペプチド（５μｇ／ｍｌ）でコーティングされた９６ウェルのポリビニルマイクロタイタープレート上で検出した。血清を、ＰＢＳＡ中で希釈した。結合した抗体を、ヒトγ−グロブリンと吸着したマウスγ−グロブリンに対するＨＰ結合体化ヤギ抗体を使用して、明らかにした（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）。結合したペルオキシダーゼは、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよびＨ2Ｏ2を添加することによって、明らかにした。試験を二連で実施した。血清中の導入遺伝子Ｈ鎖免疫グロブリンの存在は、捕捉ＥＬＩＳＡ（実施例Ｉを参照のこと；ＢｉｌｌｅｔｔａおよびＺａｎｅｔｔｉ、前出、１９９２）を使用して検出した。
【００８１】
ＤＮＡ配列決定のために、ＶＤＪコード領域全体を含む５６６ｂｐのＤＮＡフラグメントを、再配置されたマウスＶHに特異的な２つのプライマー（ｐＣＬおよびｐＣＤ）を使用して、脾臓ゲノムＤＮＡから増幅した。このフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）中にサブクローン化した。プラスミドＤＮＡを、形質転換したＤＨ５γ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから抽出し、そしてＳＥＱＵＥＮＡＳＥ  ２．０  ＤＮＡ配列決定キット（ＵＳＢ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＯＨ）を用いるジデオキシターミネーター法により、２つのプライマー（ｐＳＥおよびｐＣＤ）（ＦＲ１の前方および反対方向からＦＲ４の末端にアニーリングする）を用いて配列決定した。
【００８２】
蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）のために、脾臓細胞を、接種後１５日目、２１日目、および２８日目に収集された脾臓組織、ならびに未処理マウスから回収された脾臓組織を粉砕することによって調製した。細胞懸濁物を、０．５％ＰＢＳＡで２回洗浄し、そして溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）で処理することによって赤血球を取り除いた。リンパ球を、フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化ラット抗マウスＬｙ−５（Ｂ−２２０）Ｐａｎ  Ｂ細胞（Ｃａｌｔａｇ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化ラット抗マウスＣＤ４（Ｃａｌｔａｇ）、およびＦＩＴＣ結合体化ラット抗マウスＣＤ８（Ｃａｌｔａｇ）を用いて、４℃にて２０分間示差的に染色した。細胞懸濁物を、０．５％ＰＢＳＡ中で２回洗浄し、そしてＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）中で５×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞を、ＦＡＣＳＴＡＲ（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）において分類した。ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＡＭＰ  Ｂｌｏｏｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１×１０6個のＢリンパ球またはＴリンパ球から抽出した。ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって増幅し、そして１％アガロースゲル上で、泳動した。引き続いて、これを、（32Ｐ）標識化ｐＮＡＤオリゴヌクレオチドを用いて、サザンブロットハイブリダイゼーションのために、ナイロンメンブレンに転写した。
【００８３】
Ｂリンパ球が、導入遺伝子に対するインビボでの標的細胞集団であることを実証するために、以下の実験を実施した。プラスミドＤＮＡの接種の２週間後から開始し、脾臓Ｂリンパ球およびＴリンパ球を、ＦＡＣＳ分類によって、高純度（９７〜９９％）で単離した（図３）。ゲノムＤＮＡを２つの細胞集団から抽出し、そしてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲを、以下のプライマーの合計４つのセットを用いて実施した：ｐＣＬおよびｐＣＤ；ｐＳＥおよびｐＮＡＤ；ｐＮＥＬおよびｐＮＥＤ；ならびに、ｐγＡ１およびｐγＡ２。ｐＣＬγ（−１０７ｎｔ〜−８５ｎｔ：５’−ＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧ−３’）およびｐＣＤγ（４５９ｎｔ〜４３９ｎｔ：５’−ＡＴＧＣＴＣＡＴＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴＡＡＣ−３’）を使用して、導入遺伝子のＶＤＪ領域全体を増幅した。ｐＳＥγ（−３２ｎｔ〜−１１ｎｔ：５’−ＡＡＣＡＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣ−３’）およびｐＮＡＤγ（３５２ｎｔ〜３３３ｎｔ：５’−ＧＡＧＡＧＴＡＧＧＧＴＡＣＴＧＧＧＴＴＴ−３’）は、ＣＤＲ３における遺伝マーカー（ＮＡＮＰ）3の増幅に特異的であった。ｐＮＥＬγ（１６９ｎｔ〜１８９ｎｔ：５’−ＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＣＴ−３’）およびｐＮＥＤγ（３６６ｎｔ〜３４６ｎｔ：５’−ＧＴＡＧＴＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＡ−３’）は、ネスト化ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）についての内部プライマーであった。ｐγＡ１γ（１８４ｎｔ〜２０１ｎｔ：５’−ＴＧＧＧＣＣＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＣ−３’）およびｐγＡ２γ（４２７ｎｔ〜４０８ｎｔ：５’−ＣＧＴＴＴＧＧＣＣＴＴＡＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’）を、（Ｈａｒｒｉｓら、Ｇｅｎｅ  １１２：２６５−２６６（１９９２））において示された配列に従うマウスβ−アクチン遺伝子を増幅するために設計した。ＰＣＲは、９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、および７２℃で４５秒間の３０サイクル；０．３μＭの各プライマー；０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）および５０ｍＭ  ＫＣｌ中）；および１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）から構成された。サザンブロット分析のためのＰＣＲ産物を、１％  ｗ／ｖアガロースゲルにおいて分解し、そしてＨＹＢＯＮＤ−Ｎナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）上にブロットした。このメンブレンを、（γ32Ｐ−ＡＴＰ）の存在下で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ順方向反応を使用して標識されたオリゴヌクレオチドｐＮＡＤとハイブリダイズさせた。１５日目の時点で、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の両方において、異なる増幅産物が容易に検出可能であった。しかし、２１日目および２８日目の両方の時点では、Ｂ細胞においてのみ、特異的増幅が観察された。サザンブロットハイブリダイゼーションによって、増幅産物の特異性が確認された。これらの結果は、脾臓中のＢリンパ球は、導入遺伝子が長期間持続する標的細胞集団であることを示唆した。
【００８４】
導入遺伝子を、ゲノムＤＮＡから配列決定した。導入遺伝子のＶＤＪ領域を、脾臓ゲノムＤＮＡから増幅し、サブクローン化し、そしてジデオキシターミネーター法によって配列決定した。３ヶ月後においてさえ、インビボで、導入遺伝子のＶＤＪ領域内に過剰変異の証拠は見出されなかった（表３）。
【００８５】
表３．脾臓ゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲで生成されたクローンにおける導入遺伝子変異の欠失
【００８６】
【表３】
0005000807.tif 000004
＊塩基対配列の総数あたりの変異の数
＊＊ＦＲ３におけるサイレント（ＣからＴへの）変異。
【００８７】
これらの結果は、プラスミドＤＮＡでのインビボ接種が少なくとも３ヶ月の間に脾臓のＢ細胞においてその導入遺伝子の発現をもたらしたことを示す。
【００８８】
（実施例ＩＩＩ）
（体細胞導入遺伝子免疫による微生物病原体に対する免疫）
本実施例は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリア寄生生物のＢ細胞エピトープをコードする核酸分子を投与して、その寄生生物抗原に対する免疫応答を誘導することを記載する。
【００８９】
使用するプロトコルは下記に記載される（Ｇｅｒｌｏｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：８７６〜８８１（１９９７））。
【００９０】
γ１ＮＡＮＰおよびｐＳＶ２Ｎｅｏは、図１および実施例ＩＩに記載される。合成ペプチド（ＮＡＮＰ）ｎに対する抗体の検出を、実施例ＩＩに記載される通りに行った。他の基質は、このγ１ＮＡＮＰタンパク質およびＲ３２ＬＲ抗原を含んだ。
【００９１】
１：５０希釈した血清を、種々の希釈（１：２５〜１：８００）の風乾したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトとの免疫蛍光反応性についてアッセイした。このアッセイは、以前に記載された通りに実施した（Ｗｉｒｔｚら、Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６３：１６６〜１７２（１９８７））。蛍光強度を０〜４＋にランク付けした。０は検出可能な蛍光なしを示し、そして４＋はそのスポロゾイトの表面全体にわたる強い蛍光を示す。β＋蛍光強度を有するサンプルは、ポジティブとみなした。
【００９２】
マウスに、実施例Ｉにて詳説した通りに、滅菌した生理食塩水３０μｌ中１００μｇのプラスミドＤＮＡを、脾臓内接種した。表４に記載する実験において、マウスを、生理食塩水中１００μｇのプラスミドＤＮＡ  γ１ＮＡＮＰで、尾静脈を介する静脈内投与によってブーストした。
【００９３】
表４．初回刺激免疫およびブースター免疫の後に抗体がＮＡＮＰペプチドと反応する場合の力価（ｌｏｇ10）
【００９４】
【表４】
0005000807.tif 000005
＊すべての初回刺激注射を、脾臓内経路を介して行った。ブースター注射を、２００日目に行った。１つのグループ（グループ１、静脈内で行った）以外のすべてにおいて、ブースター注射を皮下にて行った。
【００９５】
マウスに、滅菌生理食塩水溶液中のアフィニティー精製したγ１ＮＡＮＰタンパク質で、脾臓内（ｉ．ｓ．）接種した。外科手順は上記の通りであった。マウスに、完全フロイントアジュバント中に乳化した、アフィニティー精製したγ１ＮＡＮＰタンパク質（５０μｇ／マウス）で皮下免疫した。このγ１ＮＡＮＰタンパク質でブーストしたマウスに、不完全フロイントアジュバント中に乳化したタンパク質５０μｇを皮下に与えるか、またはミョウバン上に吸着させたこのγ１ＮＡＮＰタンパク質５０μｇを腹腔内に与えた。不完全ＤＭＥＭ中の照射した１０5個のスポロゾイトを、０．４ｍｌ容積にて腹腔内注射した。マウスを、眼窩後から採血した。
【００９６】
プラスミドγ１ＮＡＮＰ  ＤＮＡ  γ１ＮＡＮＰの接種は、そのペプチドＮＡＮＰに対する一次応答を誘導する。表４は、抗ＮＡＮＰペプチド抗体がＨ鎖導入遺伝子（γ１ＮＡＮＰ  ＤＮＡ）で初回刺激したマウスで見出された（グループＩおよびＩＩ）、ＥＬＩＳＡ抗体応答をまとめる。抗体が１４日目までに現れ、そして２８日目までにプラトーに達した（ｌｏｇ  ２．８）（表４）。マウスにブースター注射を与えた場合、循環する抗体が、２００日間持続した。インタクトな抗原化抗体γ１ＮＡＮＰに対する抗体応答は、その合成ペプチドに対する応答と平行した。５０μｇのγ１ＮＡＮＰタンパク質を脾臓内接種されたマウス（グループＩＶ）は、測定可能ないかなる抗ペプチド応答もマウントしなかったが、そのインタクトなγ１ＮＡＮＰ抗体に対する穏やかな力価の上昇が測定された。ｐＳＶｎｅｏプラスミドまたはオボアルブミンのいずれかを注射されたコントロールグループは、免疫前の値よりも高くバックグラウンドを超えるいかなる抗体応答も発生しなかった。コントロールとして使用した合成ペプチドＤＥＮＧＮＹＰＬＱＣに対して同じ血清を試験した場合、何の結合も観察されなかった。
【００９７】
ＮＡＮＰペプチドに対する記憶応答を、γ１ＮＡＮＰ  ＤＮＡにより誘導した。プラスミドγ１ＮＡＮＰ  ＤＮＡ  γ１ＮＡＮＰの一回の脾臓内接種が、Ｈ鎖導入遺伝子のＣＤＲ３において発現される（ＮＡＮＰ）３ペプチドに対する免疫学的記憶を誘導するに、十分であった。表４は、不完全フロイントアジュバント中のγ１ＮＡＮＰタンパク質の皮下ブースター注射の後の、二次抗ペプチド応答を示す（グループＩＩおよびＩＶ）。合成ＮＡＮＰペプチドに対する抗体力価が、グループＩＩにおけるすべての動物において上昇し、そしてインタクトなγ１ＮＡＮＰタンパク質に対する応答と平行した。対照的に、γ１ＮＡＮＰ  ＤＮＡの第２の静脈注射でブーストされたマウスにおいて、何の既往性応答も生じなかった（グループＩ）。これはおそらく、血漿ＤＮＡｓｅによるプラスミドＤＮＡの迅速な分解が原因である。可溶性γ１ＮＡＮＰタンパク質での脾臓内（ｉ．ｓ．）接種により初回刺激されそしてγ１ＮＡＮＰタンパク質で皮下にてブーストされたマウス（グループＩＶ）における抗体応答は、その組換えタンパク質単独を使用する一次免疫にて観察される抗体応答と同様であった。ＮＡＮＰに対する何の抗体応答も、コントロールマウス（グループＩＩＩおよびＶ）にて検出されなかった。
【００９８】
γ１ＮＡＮＰ  ＤＮＡでの免疫は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトに対する免疫学的記憶応答を誘導した。体細胞導入遺伝子免疫が、この寄生生物のネイティブのＣＳたんぱく質と遭遇する際に免疫学的記憶について初回刺激し得るか否かを確認するために、マウスに、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトの単回注射によりブーストした。生じた抗体応答を、ＥＬＩＳＡにより測定した。比較のために、マウスを２つのグループに分けた。１つのグループは、プラスミドＤＮＡ  γ１ＮＡＮＰ（またはそのコントロールγ１ＷＴ）で脾臓内（ｉ．ｓ．）初回刺激した。第２のグループは、完全フロイントアジュバント中の抗原化抗体γ１ＮＡＮＰで皮下初回刺激した。初回刺激の４５日後、マウスに、１０5個のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトの単回腹腔内ブーストをするか、または皮下注射により不完全フロイントアジュバント中の抗原化抗体γ１ＮＡＮＰでブーストした。コントロールグループは、プラスミドγ１ＷＴ  ＤＮＡまたは生理食塩水で初回刺激し、その後スポロゾイトでブーストしたマウスを含んだ。γ１ＮＡＮＰ  ＤＮＡで初回刺激しそしてスポロゾイトでブーストしたマウス（図４）は、コントロールプラスミドＤＮＡかまたは生理食塩水単独で初回刺激したマウスには存在しない、ＮＡＮＰに対する二次応答をマウントした。さらに、スポロゾイトに対する既往性応答は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の抗原化抗体γ１ＮＡＮＰで初回刺激したマウスにおいてよりも、γ１ＮＡＮＰ  ＤＮＡで初回刺激したマウスにおいて大きかった（図４Ａおよび４Ｃ）。同様の結果は、捕捉抗原として組換えＲ３２ＬＲに対するＥＬＩＳＡによって血清を試験した場合に、得られた（図４Ｂおよび４Ｄ）。
【００９９】
これらの血清はまた、間接的免疫蛍光アッセイにより、風乾したスポロゾイトの表面と強力に反応し（表５）、このことにより、このＤＮＡ免疫されたマウスが、標的病原体の表面上に存在するのと実質的に同様な立体構造を有するＢ細胞エピトープで初回刺激されていることが、確認された。
【０１００】
表５．ＩＦＡによるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトと反応する抗体
【０１０１】
【表５】
0005000807.tif 000006
＊初回刺激注射およびブースター注射は、上記の通りであった。血清を、４匹のマウス各々のプールとして試験した。値は、最後のポジティブな希釈の逆数を示す。
【０１０２】
これらの結果は、微生物病原体Ｐ．ｆａｉｃｉｐａｒｕｍに対する免疫を、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍエピトープをコードする核酸分子の投与により誘導し得ることを示す。
【０１０３】
（実施例ＩＶ）
（免疫グロブリン遺伝子を使用する、異種Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープでのワクチンの操作）
本実施例は、異種Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを免疫グロブリンのＣＤＲに挿入して、プラスミドＤＮＡとして投与した場合に、免疫学的応答を増強することを記載する。
【０１０４】
実験手順は、下記に記載される（Ｘｉｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：８８２〜８８６（１９９７））。
【０１０５】
プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3を、下記の通りに操作した。生成により再編成されたマウスＶＨのＥｃｏＲＩフラグメント（２．３ｋｂ）を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳにクローン化して、プラスミドｐＶＨを生じた。部位特異的変異誘発を、２１マーのオリゴヌクレオチドプライマー２つを使用して実施した。そのプライマーの１つ
【０１０６】
【化１】
0005000807.tif 000007
は、ＣＤＲ３にてアニーリングして、３ｂｐ（ＴＡＣ、太字）を導入して、Ａｓｐ７１８部位を生成し、そしてもう１つ
【０１０７】
【化２】
0005000807.tif 000008
は、ＣＤＲ２にてアニーリングして、３ｂｐ（ＣＣＡ、太字）を導入して、ＮｃｏＩ部位を生成する。これらのプライマーは、ウラシル化した、ｐＶＨの相補鎖にアニーリングし、そしてその変異鎖が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で合成および連結された。２つの特有の部位（１つはＣＤＲ３中（Ａｓｐ７１８）およびもう１つはＣＤＲ２中（ＮｃｏＩ））を含む、プラスミドｐＶＨ−ＴＡＣ／ＣＣＡを、形質転換、個々のコロニーのスクリーニングおよびＤＮＡ配列決定（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ  ２．０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ＵＳＢ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＯＨ）による確認の後に得た。（ＮＡＮＰ）３配列をコードする一対の相補的オリゴヌクレオチド
【０１０８】
【化３】
0005000807.tif 000009
（アンチセンス）を合成し、アニーリングし、そしてＡｓｐ７１８部位にクローン化した。ＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰ配列をコードする一対の相補的オリゴヌクレオチド
【０１０９】
【化４】
0005000807.tif 000010
（アンチセンス）を、ＮｃｏＩ部位に同様にクローン化した。その挿入および適切な方向を、ジデオキシ配列決定（ＳＥＱＵＥＮＣＡＳＥ  ２．０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ＵＳＢ）により確認した。次いで、この操作したＣＤＲ３およびＣＤＲ２を保有する２．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントを、発現ベクターｐＮγ１（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、前出、１９８９）に、特有のＥｃｏＲＩ部位を使用してヒトγ１定常（Ｃ）領域から上流にサブクローニングして、プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3を得た。プラスミドγ１ＮＡＮＰは、３つのＮＡＮＰ反復をコードするヌクレオチド配列を導入することによってＣＤＲ３のみが改変された、生成により再編成されたマウスＶ領域遺伝子を保有する（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、前出、１９９０ａ）。これらのプラスミド中のプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントは、Ｉｇ  Ｈ鎖遺伝子中に構成的に存在するものである（Ｓｏｌｌａｚｏら、前出、１９８９）。
【０１１０】
組換え抗体γ１ＷＴおよびγ１ＮＡＮＰを、以前に記載された通りに産生および精製した（ＢｉｌｌｅｔｔａおよびＺａｎｅｔｔｉ、前出、１９９２；Ｓｏｌｌａｚｏら、前出、１９８９）。循環する導入遺伝子Ｈ鎖Ｉｇ中の６個および８個の軽鎖の検出を、以下のように行った。手短かには、血清導入遺伝子Ｈ鎖Ｉｇを、ヒトＩｇＧ１に対するヤギ抗体（１０μｇ／ｍｌ）でコートした９６ウェルプレート上に、一晩４℃でインキュベートすることによって捕捉した。マウス軽鎖の存在を、ヒトＩｇに吸着したマウス６個または８個の軽鎖に対するＨＰ結合体化ヤギ抗体（Ｃａｌｔａｇ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）の１：２０００希釈物を使用して、評価した。このアッセイを、上記の通り継続した。試験は２連で行った。
【０１１１】
同じＩｇ  Ｖ領域遺伝子における２つの別個のエピトープの操作を、それぞれ、Ａｓｐ７１８（Ｓｏｌｌａｚｏら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．３：５３１〜５３９（１９９０ｂ））およびＮｃｏＩ部位を含むＣＤＲ３およびＣＤＲ２にて実施した。発現されたタンパク質において、両方のＣＤＲは、Ｖドメインの同じβ−シート上のβ鎖を相互連結するループである。これらの２つのＣＤＲの改変は、適切なＶＨ／ＶＬ足場と適合可能であると予期されたが、Ｖドメインの異なる２つのシートを連結するＣＤＲ１の操作は、このポリペプチドの誤った折り畳みを生じ得る。使用したＢ細胞エピトープは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生生物のＣＳ抗原由来のテトラペプチドＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＮＡＮＰ）の３回反復から構成された(Ｚａｖａｌａら、前出、１９８５）。
【０１１２】
使用したＴｈ細胞エピトープは、ペプチドＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰ）であり、これは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣＳ抗原の５’領域に位置する保存されたペプチド配列である。このペプチドは、免疫ヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球により認識され（Ｎａｒｄｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１６０３〜１６０６（１９８９））、マウスにおいていくつかのＭＨＣハプロタイプについて免疫原性であり（Ｍｕｎｅｓｉｎｇｇｈｅら、前出、１９９１）、そしてマラリアに対する多抗原ペプチドワクチンに含まれている。
【０１１３】
ｐＶＨのＣＤＲ３およびＣＤＲ２を、図５に示されるように操作した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化された生成により再編成されたマウスＶHを保有する２．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ（ｐＶＨ）を、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発により改変して、２つの特有のクローニング部位（ＣＤＲ３中のＡｓｐ７１８部位（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、前出、１９９０ａ）およびＣＤＲ２中のＮｃｏＩ）を導入した（ｐＶＨ−ＴＡＣ／ＣＣＡ）。３つのＮＡＮＰ反復をコードする一対の相補的合成オリゴヌクレオチドを、このＡｓｐ７１８部位にクローン化し、一方ＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰ配列をコードする対を、ｐＶＨ−ＴＡＣ／ＣＣＡのＮｃｏＩ部位にクローン化した。ヌクレオチドの挿入および正確な方向を、ＰＣＲによりチェックし、そして配列決定により確認した（図５Ａ）。次いで、操作した２．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントを、発現ベクターｐＮγ１の特有のＥｃｏＲＩ部位にクローン化して、プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3を生じた（図５Ｂ）。従って、プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3のＶ領域遺伝子は、ＣＳ抗原の異なる２つのエピトープ（１つはＣＤＲ３中そしてもう１つはＣＤＲ２中）をコードする。
【０１１４】
導入遺伝子Ｈ鎖抗体のインビボ発現を決定した。実施例Ｉにおいて記載されるように、ＩｇＨ鎖遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡの脾臓内接種後、導入遺伝子Ｉｇを、１５ｎｇ／ｍｌと３０ｎｇ／ｍｌとの間の範囲の量で循環において不変的に検出した  １０。類似の量を、ＣＤＲ３におけるＮＡＮＰエピトープをコードする抗原化Ｈ鎖遺伝子で接種したマウスにおいて検出した（実施例ＩＩＩを参照のこと）。プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3で接種したマウスは、プラスミドＤＮＡγ１ＮＡＮＰで接種したマウスによって分泌される導入遺伝子Ｈ鎖Ｉｇと比較可能な量で導入遺伝子Ｈ鎖Ｉｇを分泌した（２９．４ｎｇ／ｍｌ対３３．３ｎｇ／ｍｌ）。これらの結果は、２つのＣＤＲループにおける改変が、内因性の軽鎖に関連する導入遺伝子Ｈ鎖Ｉｇの折り畳みおよび分泌に影響しないことを示す。これはまた、２つのＣＤＲにおける異種ペプチドの挿入を有する導入遺伝子Ｈ鎖が、従来のＩｇＨ鎖遺伝子のようにインビボで操作されることを示唆する。
【０１１５】
２つの異種エピトープを有する導入遺伝子Ｈ鎖Ｉｇの免疫原性を、プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3の直接の脾臓内接種によって分析した。プラスミドγ１ＮＡＮＰで接種したマウスはコントロールとなる。抗（ＮＡＮＰ）３抗体を産生する両方の群のマウスは、両方の例において、このＣＤＲ３ループが免疫原性であったことを示している（図６）。しかし、プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3で接種されたマウスにおける抗ＮＡＮＰ応答は、プラスミドγ１ＮＡＮＰで接種されたマウスにおいてよりも強かった（図６Ａ対６Ｂ）。プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3で接種したマウスが、（ＮＡＮＰ）３およびＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰペプチドの両方に対して反応性である抗体を産生した（図６Ｂおよび６Ｄ）のに対して、プラスミドγ１ＮＡＮＰで接種したマウスは、（ＮＡＮＰ）３のみに対して抗体を産生した（図６Ａおよび６Ｃ）。（ＮＡＮＰ）３に対する抗体は、ＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰと交差反応しないので、プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3で接種されたマウスは、２つの異なる抗体集団（ＣＤＲ３における（ＮＡＮＰ）３ペプチドに対する抗体およびＣＤＲ２におけるＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰペプチドに対する抗体）を産生した。
【０１１６】
これらの結果は、２つの操作されたＣＤＲは、独立してインビボで免疫原性であったということ、およびＣＤＲ２におけるＴｈ細胞決定基の存在が、ＣＤＲ３におけるＢ細胞エピトープに対する抗体の産生を増強したことを実証する。
【０１１７】
（実施例Ｖ）
（体細胞導入遺伝子免疫化後の免疫学的記憶を、ＧＭ−ＣＳＦでの初回刺激によって正に作用する）
本実施例は、投与された核酸分子をＧＭ−ＣＳＦで初回刺激した場合の増強された免疫学的記憶を記載する。
【０１１８】
使用されるプロトコルを、以下に記載する（Ｇｅｒｌｏｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１８３２−１８３８（１９９８））。
【０１１９】
プラスミドγ１ＮＡＮＰ／ＧＭ−ＣＳＦ（ＤＮＡ／ＧＭ−ＣＳＦ）を定常部分のＣＨ３ドメインの３’末端からＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーでプラスミドｐ３１５９由来のマウスＧＭ−ＣＳＦコード配列をクローニングすることによってプラスミドγ１ＮＡＮＰ（実施例ＩＩ）から構築した（Ｔａｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：７５５−７５８（１９９３））。
【０１２０】
ＤＮＡワクチン接種は、実施例Ｉに記載されるように３０μｌの滅菌生理食塩水溶液中１００μｇのプラスミドＤＮＡの単一脾臓内接種からなる。アフィニティー精製されたγ１ＮＡＮＰタンパク質で免疫したマウスに、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）においてタンパク質（５０μｇ／マウス）の皮下注射をした。ブースター注射は、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）において乳化されたアフィニティー精製されたγ１ＮＡＮＰタンパク質（５０μｇ／マウス）の単一の皮下注射か、または０．４ｍｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ最少培地において腹腔内に注射された１０5の放射線照射されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトかのいずれかからなる。スポロゾイトを、記載のように感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｆｒｅｅｂｏｒｎｉ蚊において産生した（Ｗｉｒｔｚら、前出、１９８７）。
【０１２１】
合成ペプチド（ＮＡＮＰ）ｎおよびγ１ＮＡＮＰに対する抗体を、実施例１１のように行った。抗体のアイソタイプを、マウスＩｇＭクラスおよびマウスＩｇＧ１クラスに特異的なヤギ抗体を用いて決定した（Ｃａｌｔａｇ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）（実施例ＩＩＩを参照のこと）。
【０１２２】
ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＦＡ中抗原化抗体によって誘導される免疫応答を高める。この抗ＮＡＮＰ応答を、ＤＮＡ／ＧＭ−ＣＳＦまたはＤＮＡで初回刺激し、続いて、ＩＦＡ中抗原化抗体γ１ＮＡＮＰでブーストしたマウスにおいて測定した。ＤＮＡではなくＤＮＡ／ＧＭ−ＣＳＦの接種は、１次応答の間のＩｇＧ１抗体を誘導した。ＩＦＡ中の抗体γ１ＮＡＮＰでのブースター注射は、ＤＮＡ／ＧＭ−ＣＳＦ初回刺激マウスにおけるＩｇＧ１力価を上昇した。この抗体力価は、ＤＮＡ単独で初回刺激されたマウスにおいてよりもＤＮＡ／ＧＭ−ＣＳＦで初回刺激したマウスにおいて平均４倍高かった（４．１〜４．４対３．５〜３．８）（表６）。
【０１２３】
【表６】
0005000807.tif 000011
ａ）示された２つの実験は、独立して行った。各群は、４匹のマウスからなる。初回刺激を、ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＧＭ−ＣＳＦの単一脾臓内接種によって行った。ブースター免疫を、ＩＦＡ中γ１ＮＡＮＰ抗体を用いて３５日目に与えた。プールされた血清を、合成ペプチド（ＮＡＮＰ）ｎまたは示された抗原化抗体全体に対して試験した。
ｂ）値は、最後の正希釈の逆数として示された抗体力価をいう。対応するｌｏｇ１０力価を丸括弧において示した。
【０１２４】
ＧＭ−ＣＳＦは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトの注射によって誘導される免疫応答を高めた。プラスミドＤＮＡの接種によって初回刺激されたマウスは、代表的な２次応答をともなうＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトによるブースター免疫に対して応答する（実施例ＩＩＩを参照のこと）。寄生体によるブースターは、ＤＮＡ単独で初回刺激されたマウスと比較して４倍高いＤＮＡ／ＧＭ−ＣＳＦで初回刺激したマウスにおけるＩｇＧ１抗ＮＡＮＰ抗体力価を生じた（Ｌｏｇ４．７対４．１）（図７、左のパネル）。生理食塩水で初回刺激されたかつスポロゾイトでブースターされたマウスにおいて、抗体を検出しなかった（ネガティブコントロール）。ＩｇＭ抗体に対する効果は、最少であった（図７、右のパネル）。従って、初回刺激中に与えられたＧＭ−ＣＳＦは、ブースター免疫において使用された抗原の組成物とは関係なくＩｇＧ１記憶応答を高める。
【０１２５】
（実施例ＶＩ）
（ＣＤ４Ｔ細胞の体細胞導入遺伝子による活性化は、中立のＴ細胞の一般化された免疫および免疫学的記憶を誘導する）
本実施例は、エピトープをコードする核酸分子の投与を用いるＣＤ４  Ｔ細胞の活性化を記載する。
【０１２６】
使用されたプロトコルは、以下に記載される（Ｇｅｒｌｏｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３７８２−３７８９（１９９９））。
【０１２７】
プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3を、実施例ＩＶに記載のように操作した。プラスミドγ１ＮＡＮＰは、図１に記載する。組換え抗原化抗体γ１ＮＶ2ＮＡ3およびγ１ＮＡＮＰをトランスフェクション細胞において産生し、そして実施例ＩＶにおいて記載のように精製した（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、前出、１９９０ａ）。
【０１２８】
マウスを、実施例１に先に記載のように５０μｌの滅菌生理食塩水溶液中１００μｇのプラスミドを用いて脾臓内接種した。フロイント不完全アジュバントにおいて乳化されたアフィニティー精製されたγ１ＮＶ2ＮＡ3抗体の単一皮下注射（５０μｇ／マウス）によって初回刺激した後、ブースター注射を、９０日目、１１０日目、１２０日目および１５０日目で投与した。
【０１２９】
収集の時点で、マウスを屠殺し、そしてリンパ節および脾臓を取り出した。単一細胞懸濁物を、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、グルタミン、７．５％胎仔ウシ血清および５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓａｎｔａ  Ａｎａ  ＣＡ）において、３連で合成ペプチドＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰまたはＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で培養した（１０6細胞／ｍｌ）。この細胞を、１０％  ＣＯ2下で３７℃で３日間インキュベートした。（3Ｈ）−チミジンを１μＣｉ／ウェルで添加し、そしてこの細胞を、３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。細胞をＴｏｍｔｅｃ  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いてガラス繊維濾過マット上で収集し、そして放射能を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｔａｐｌａｔｅ；Ｗａｌｌａｃ；Ｔｕｋｕ  Ｆｉｎｌａｎｄ）において測定した。結果を刺激指数（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）（Ｓ．Ｉ）として示した。（合成ペプチドの存在下で培養された細胞の１分あたりの数）／（ペプチドの非存在下で培養された細胞の１分あたりの数）の比として計算した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）刺激を、ポリクローナルアクチベーターおよび正コントロールとして使用した。
【０１３０】
ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞を、ＤＮＡ接種によって７日前に免疫したマウスの脾細胞から抗体および補体媒介性枯渇によって単離した。簡潔には、細胞懸濁液（３０×１０6細胞／ｍｌ）を、氷上で３０分間ＣＤ８（３．１５５）またはＣＤ４（ＲＬ１７２）に対するモノクローナル抗体で処置した。洗浄後、抗Ｔ細胞抗体を、氷上で３０分間マウス抗ラット（ＭＡＲ１８．５）モノクローナル抗体を用いて交差結合し、そしてウサギ補体を、３７℃で３０分間で２回添加した。次いで、この細胞懸濁液を２回洗浄し、そしてＲＰＭＩ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において５×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。別個の細胞画分の純度を、フィコエリスリン（ＰＥ）−結合体化抗ＣＤ４モノクローナル抗体および蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化抗ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を用いてＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いるＦＡＣＳｃａｎでの分析によって評価した。
【０１３１】
培養上清を、最初の播種から４０時間後に収集し、そして−２０℃で保存した。３つの別個の３連培養物由来の上清を、各マウスからプールした。ＩＬ−２活性を、（１１Ｂ１１細胞株、ＡＴＣＣから精製した）抗ＩＬ−４の存在下でＩＬ−２依存性ＮＫ．３細胞およびＩＬ−４依存性ＮＫ．３細胞を利用するバイオアッセイにおいて決定した。簡潔には、１００μｌ（培地中１：２希釈）の４０時間培養上清を、１００μｌのＮＫ．３細胞（１０6／ｍｌ）に２連で添加し、そして３６時間インキュベートした。（3Ｈ）−チミジンを、最後の１２時間に１μＣｉ／ウェルで添加した。細胞を、上記のように収集した。結果を、１分あたりの数として示した。
【０１３２】
ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを、抗体１１Ｂ１１およびビオチン化抗ＩＬ−４（ＢＶＤ６、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ＴＲＦＫ５、ならびにビオチン化ＴＲＦＫ４およびＲ４６Ａ−２およびビオチン−ＸＭＧ１．２（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）をそれぞれ用いて先に記載のようにＥＬＩＳＡによって同一の４０時間培養上清において測定した。標準曲線を、精製したＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮ−ｇ（それぞれのＸ６３．Ａｇ細胞株由来の上清）を用いて作製した。試験は、２連で行った。
【０１３３】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源として、未初回刺激マウス由来の脾細胞を使用し、そしてＬＰＳ／デキストラン（２５μｇ／ｍｌ）で２４時間培養し、そして２５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で３０分間処理した。使用の前に、ネイティブマウス、初回刺激マウス、または初回刺激し、かつブーストしたマウス由来の脾細胞を、５０μｇ／ｍｌの合成ペプチドＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰ（−ＮＶＤＰ−）の存在下で９６ウェル平底プレートにおいて２×１０6／ｍｌ  ＡＰＣと混合した。細胞の各希釈を、４８回繰り返して、プレートした。上清を３６時間後に収集し、そして各培養物の２０μｌをＮＫ．３細胞株を、用いてＩＬ−２活性について試験した。3Ｈ−チミジン取り込みの値が、抗原を含まない複製コントロール培養物の平均＋２標準偏差よりも高かった場合、単一培養上清は、ポジティブとみなした。サイトカイン産生細胞の頻度を、Ｗａｌｄｍａｎによって記載されたプログラムを用いて計算し、そして最大尤度分析を用いて計算した。
【０１３４】
脾細胞を、Ｔｈ細胞決定基を発現する抗原化抗体または対応する１２マーのＴｈ細胞決定基ペプチド（図８Ａ）での再刺激後の培養物において増大した１００μｇのγ１ＮＶ2ＮＡ3ＤＮＡの単一脾臓内接種から７日後に収集した。細胞を、ＣＤＲ２における異種ペプチドによる特異的活性化を実証する、Ｂ−［（ＮＡＮＰ）３］細胞ペプチドではなく、Ｔ−（−ＮＶＤＰ−）細胞ペプチドを用いて培養した場合、増殖が起る。−ＮＶＤＰ−を発現する抗原化抗体を用いて培養した後の増殖はまた、抗体分子内のＣＤＲ２ペプチドはＡＰＣによって処理され、かつ提示されることが示唆される。ＣＦＡ中抗原化抗体で免疫されたマウス由来の細胞の増殖性応答を比較した場合、ＳＴＩは、同様のまたはより大きい規模の応答を誘導した。Ｔ細胞の特異的活性化を、マークされたＩＬ−２の産生によって達成した（図８Ｂ）。−ＮＶＤＰ−ペプチドでインビトロ再刺激した培養物において測定したＩＬ−２のより低い量は、より高い範囲で増大していたこれらの培養物における細胞のように、より高い消費をおそらく反映する。
【０１３５】
７日目と１４日目で収集した脾細胞はまた、１型表現型および２型表現型に対する任意の増殖が起るか否かを評価するために、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の産生についてアッセイした（図９）。異なる量であったが、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の両方を検出し、そしてＩＬ−５は非存在であった。ＩＦＮ−γ特異的活性はＩＬ−４よりも平均で１００倍低く、かつＩＬ−４は代表的には、ＩＦＮ−γよりも非常に低い量で分泌されるので、これらの結果は、両方のサイトカインは比例的に産生され、そしてＳＴＩを介して活性化された細胞が残存しているままである（すなわち、中立（Ｔｈ０））ことを示した。
【０１３６】
活性化された細胞を、ＣＤ４+Ｔリンパ球であると決定した。ＣＤ４+Ｔ細胞を、増殖およびサイトカインを作製する細胞集団として正式に定義した。７日前に免疫したマウス由来の脾細胞を、ＣＤ８またはＣＤ４および補体に対して特異的なモノクローナル抗体でインビトロでの処理によってＣＤ４+細胞およびＣＤ８+細胞を枯渇した。フローサイトメトリーによって、この２つの集団の純度は、それぞれ９４％（ＣＤ４）および９９％（ＣＤ８）であった（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。次いで、この２つの細胞集団を、ネイティブマウス由来の新鮮なＡＰＣおよび合成ペプチド−ＮＶＤＰ−の添加によってインビトロで培養した。増殖はＣＤ４+Ｔ細胞集団で起ったが、ＣＤ８+Ｔ細胞集団では起らなかった（図１０Ｅ）。同様に、ＩＬ−２産生を、ＣＤ４+Ｔ細胞集団でのみ検出した（図１０Ｆ）。これらの結果は、ＳＴＩが、ＣＤ４+Ｔリンパ球を選択的に活性化することを実証する。
【０１３７】
Ｔ細胞免疫は、他の２次リンパ系器官に拡散することが見出された。初回刺激が、一般化されたＴ細胞活性化を誘導する、範囲を決定することは、本研究と密接に関係がある。実験の第一のセットにおいて、他の２次リンパ系器官に対する免疫の拡散は、鼡径細胞、腸間膜細胞および頸部リンパ節細胞のプールにおける細胞増殖およびＩＬ−２産生を測定することによってモニターした。７日後、リンパ節プールのＤＮＡ取り込み細胞は、−ＮＶＤＰ−でのインビトロでの再刺激の際に特異的に増殖したが、Ｂ細胞エピトープ細胞での再刺激の際には増殖しなかった（図１１Ａ）。脾細胞と比較した場合、リンパ節における増殖は、より小さな規模であった。１４日目に、リンパ節細胞における応答の規模は、脾細胞に対して顕著に達する比較可能な値に上昇した。２１日目に、残存する増殖活性のみが、リンパ節および脾細胞の両方において存在する。増殖性応答の規模および特異性を、対応する培養上清におけるＩＬ−２のレベルによって反映した（図１１Ｂ）。これらの反応速度論的分析は、リンパ節におけるＴ細胞活性化が、免疫のプロセスを開始した器官において平行することを示した。正確な解剖学的分布に従って収集されたリンパ節の細胞（下部（膝窩の、尾の、坐骨の、および腰部の）、中部（腸間膜の、腎臓の、および上胃部の）、および上部（腋窩の、上腕の、深大脳および浅頸））は、類似のＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生を有した（図１１Ｄおよび１１Ｅ）。
【０１３８】
ＳＴＩの他のパラメーターに対する関係において、これらの応答の速度分析は、いくつかの興味深い点を明らかにした。リンパ節および脾臓における刺激指数の間の比が計算された場合、１４日まで、リンパ節におけるＴ細胞応答性が流行性であったことが、明白になった。さらに、リンパ節における増殖性応答のピークは、血清におけるトランスジェニックＩｇのピーク値に相関するようであった（図１１Ｃ）。比例パターンが、トランスジェニックＩｇの分泌とＴ細胞免疫伝播との間に存在することを、この結果は示す。
【０１３９】
抗体応答に対するＴｈおよびＢ細胞エピトープの連結された認識の効果が決定された。Ｔｈ細胞決定因子およびＢ細胞エピトープの両方をコードする導入遺伝子を与えられたマウスは、Ｂ細胞エピトープ保有遺伝子で免疫されたマウスよりも高い抗体力価を一貫して産生した（図１２）。第２に、ＮＶＤＰ決定因子によるＴｈ細胞の特異的活性を、ＩｇＧ１スイッチに対するＩｇＭを促進するのに十分であると決定した。Ｔｈ／Ｂダブルエピトープ導入遺伝子を与えられたマウスは、ＩｇＭおよびＩｇＧ１抗体を発達させた（図１２）。これらの結果は、Ｔ細胞免疫が、Ｂ細胞エピトープに結合されたＴｈ細胞決定因子によって誘発されたことを示す。このＢ細胞エピトープは、抗体力価を強めることによって、かつアイソタイプの転換を促進することによって、Ｂ細胞応答を最適化する。
【０１４０】
インビボでの抗原に対する２度目の曝露に対する応答を決定した。抗原応答性Ｔ細胞の頻度は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の抗原化抗原γ１ＮＶ2ＮＡ3（５０μｇ）でブースター免疫の後により高かった（表７）。比較目的で、ＬＤＡ研究もまた、１度のＤＮＡ接種後、４日および７日で行われた（表７）。４日および７日目に、頻度は、それぞれ１／９０，２００（グループＩＩ）および１／５０，５００（グループＩＩＩ）であった。ＩＦＡ中のタンパク質抗原で初回刺激した４日間、頻度は、１／６０，０００（グループＶＩＩ）であった。記憶応答の間の平均頻度は、２．５〜４倍高い１／２１，９００であった。表７はまた、ＤＮＡ初回刺激直後の抗原応答性Ｔ細胞が、ネイティブ前駆体よりも７５倍に高めたが、１１０日までに１／４２４，５００（グループＶ）に下がったことを示す。まとめると、これらの結果は、ＳＴＩによる初回刺激は、Ｔ細胞記憶を確立することを示す。抗原との再遭遇は、より速い、かつより高度に特異的な応答を誘導した。
【０１４１】
（表７．Ｔｈ決定因子に特異的なＣＤ４  Ｔ細胞の頻度）
【０１４２】
【表７】
0005000807.tif 000012
a値は、２つの独立した実験の平均を表す。
b値は、３つの独立した実験の平均を表す。ブースター免疫を９０日〜１１０日に行った。
c脾臓細胞を収集し、そしてブースター免疫後、４日間、培地に配置した。
【０１４３】
本明細書中に開示された結果は、ＣＤ４  Ｔ細胞を活性化し、耐久性Ｔ細胞記憶を確立するために、ＳＴＩが有効な方法であることを示す。抗原反応性Ｔ細胞の頻度は、長期間初回刺激された動物において３〜４倍、そしてブースター免疫後、再び数倍に増加した。さらに、応答は、第１の応答より速く、免疫性記憶の機能的な定義に一致した。すべての可能性において、初期のエフェクターＴ細胞は、静止記憶細胞を生じた。この細胞は、２４〜４８時間後、抗原によって再び分離されるまで、脾臓およびリンパ節を通じたプールとして再循環することが既知である。
【０１４４】
（実施例ＶＩＩ）
（体細胞導入遺伝子免疫は、ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化し、そしてウイルスのチャレンジに対して保護する）
この実施例は、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ８由来のエピトープをコードする核酸分子の投与を用いたＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を記載する。
【０１４５】
使用されるプロトコルは、Ｂｉｌｌｅｔｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７７６−７８３（１９９５）に部分的に記載される。
【０１４６】
Ｈ鎖遺伝子を操作し、第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）において、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）抗原の配列由来の１３アミノ酸残基を発現した（図１３）。このＮＰペプチドは、Ｈ−２ｂマウス（ｍｉｄｅ）におけるＤｂ対立遺伝子と結合している。
【０１４７】
マウスを１００μｇのプラスミドＤＮＡ／接種を用いて接種した。すべてのＤＮＡ接種を実施例１に示されるように脾臓内で行った。１２週間後、不完全フロイントアジュバント内に乳化された５０μｇの合成ペプチドＡＳＮＥＮＮＥＴＭＥＳＳＴＬ（アミノ酸残基３６６−３７４）（ＮＰペプチド）でマウスのグループをさらにブーストした。コントロールグループは、不完全（ｃｏｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）フロイントアジュバント中に乳化された５０μｇのＮＰペプチドで２度免疫されたマウス（ポジティブコントロール）、または処置を受けていない同齢のグループのマウス（ネガティブコントロール）からなる。
【０１４８】
マウスは、１０×ＬＤ５０用量の感染性相同ウイルスを用いて鼻腔内でチャレンジされた。チャレンジ後、重量の減少および生存について、マウスをモニターした。
【０１４９】
細胞毒性を、４時間５１Ｃｒ放出アッセイを使用して脾臓細胞について試験した。簡単には、ＲＭＡＳ（Ｈ２ｂ）標的細胞を、Ｎａ５１Ｃｒｏ４（１５０ｍＣｉ／１×ｄ１０６細胞）を用いて、１時間３７℃で、５％のＣＯ２の雰囲気下で、ＮＰペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を含むか、含まないで標識した。次いで洗浄し、そして１０％ＦＣＳを補充した培養培地に再懸濁した。１００μｌの５１Ｃｒ標識標的細胞（２．５×１０５細胞／ｍｌ）を、１００μｌ中に、種々の（１００：１）のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、エフェクター細胞と混合した。このプレートを４時間３７℃で、５％ＣＯ２中でインキュベートし、次いで５００ｇで４分間遠心分離した。１００μｌの上清を除去し、そしてγカウンターでカウントした。自発的および最大５１Ｃｒの放出を、標的細胞を培地のみでか、または１％Ｔｒｉｔｏｎ１００×の存在下で、それぞれインキュベートすることによって決定した。三通りのウェルから以下のように細胞毒性の百分率を算出した：［実験の放出−自発的放出／最大放出−自発的放出］×１００。
【０１５０】
インビトロでの初期の研究は、Ｉｇ  Ｈ鎖導入遺伝子を保有するＢ細胞が、プロセスし、そして細胞毒性（ＣＤ８）Ｔ細胞に対するＴ細胞ペプチド中に存在し、そして高い効率で溶解されること実証した（Ｂｉｌｌｅｔｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７７６−７８３（１９９５））。例えば、第３のＣＤＲ中でＮＰペプチドＡＳＮＥＮＮＥＴＭＥＳＳＴＬを発現するために操作されたＨ鎖遺伝子でトランスフェクトされたＢリンパ腫細胞（Ｄｂ）は、用量依存の様式で特異的ＣＴＬによって効率的に殺され、細胞内プロセシングおよび細胞の表面でのＮＰペプチドの提示を示す。
【０１５１】
一連の実験において、この導入遺伝子を接種されたＣ５７ＢＬ６マウスは、ＣＴＬ応答を発達することが示された。接種されたマウス由来の脾臓細胞を、免疫後三週間で収集し、そして従来の細胞毒性アッセイにおいて、ＮＰペプチドでパルスされたＲＭＡＳ標的細胞を殺す能力について試験した。ペプチドを含まないＲＭＡＳ細胞は、コントロールとして役立った。このアッセイにおいて、本発明者らは、６０〜７５％の間のマウスが、インフルエンザＮＰペプチドに特異的な細胞毒性Ｔ細胞応答を産生したことを見出した。
【０１５２】
記憶ＣＴＬの保護および誘発はまた、実証された（図１４を参照のこと）。示された実験において、マウス（１０／グループ）を、ＳＴＩを介してか、不完全フロイントアジュバント中の合成ペプチドを用いてのいずれかで（ｗｉｔｈｅｒ）ワクチン接種した。マウスの１グループは、未処置のままにし、そしてコントロールとして役立てた。ワクチン接種の３月後、マウスは、１０×ＬＫ５０の用量の感染性インフルエンザウイルスでの鼻腔内チャレンジ（すなわち、１０回のマウスのｒ５０％の致死用量）を受けた。示されるように、アジュバント中の合成ペプチドでワクチン接種されたすべての未処置のマウスは、１１日までに死んだ。示されるように、体細胞導入遺伝子免疫でワクチン接種されたマウスの大多数（５０および６０％）は、生存した。
【０１５３】
（実施例ＶＩＩＩ）
（体細胞導入遺伝子免疫化の間の２つのＴｈ細胞エピトープ間のポジティブな相互制御）
この実施例は、腫瘍抗原（それ自体、細胞性応答を誘導し得ない）の決定因子に対するＣＤ４  Ｔ細胞のインビボでの活性化を記載する。これは、マラリア寄生生物の優性Ｔ細胞エピトープに結合した腫瘍エピトープをコードする核酸分子での免疫化によって得られる。
【０１５４】
２つのＨ鎖遺伝子が操作され、ＣＤＲ３において、腫瘍抗原ＭＵＣ−１のタンデム反復由来の２つのアミノ酸配列（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰおよびＤＴＲＰ３）を発現した（Ｇｅｎｄｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８４：６０６０−６０６４（１９８７））。ＭＵＣ−１抗原の１つのエピトープをコードする各々の遺伝子はまた、操作され、ＣＤＲ２内でマラリア寄生生物Ｐ．Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの外膜由来のＴｈ細胞決定因子ＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰをコードした（Ｎａｒｄｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１６０３−１６０６（１９８９））。対応するプラスミドベクターは、γ１ＮＶ２ＶＴＳＡ３（図１５）およびγ１ＮＶ２ＤＴＲＰ３と呼ばれる。
【０１５５】
ＭＵＣ−１−由来ペプチド配列のみをコードするプラスミドＤＮＡは、インビボでの増殖応答を誘発し得ない。しかし、プラスミドγ１ＮＶ２ＶＴＳＡ３およびγ１ＮＶ２ＤＴＲＰ３は、それぞれのＭＵＣ−１エピトープに対する強力な応答を誘発した（図１６）。１つのＭＵＣ−１エピトープをコードするＤＮＡで免疫された８匹のマウスは、単独でＴ細胞応答を発達させなかった。逆に、応答は、マラリア寄生虫由来のＭＵＣ−１エピトープおよび非相同Ｔｈ細胞決定因子に結合してコードする遺伝子で免疫されたすべてのマウスにおいて生じた。
【０１５６】
これらの結果は、弱い免疫原性エピトープが、強力な非相同性Ｔｈ細胞決定因子との結合によって免疫原性を与えられ得ることを示す。この発見は、ＭＵＣ−１に基づいたワクチンの開発と関連するが、また他の腫瘍抗原に対するＴ細胞免疫の発展とも関連する。
【０１５７】
これらの結果は、２つのＴｈ細胞決定因子Ｔ細胞の連結された結合が、弱いＴ細胞決定因子（例えば、腫瘍抗原）に対して免疫するために利用することができることを示す。これらの結果は、体細胞導入遺伝子免疫の原理に沿った免疫化のために使用される遺伝子における連結されたＴｈ／Ｔｈ結合が、本来であれば乏しいまたは非免疫原性Ｔｈ細胞決定因子を免疫原性し得ることを示す。これらの結果は、この原理は、強力なＴ細胞免疫が所望されるすべての抗原に対してワクチン接種するために適用可能であることを示す。
【０１５８】
（実施例ＩＸ）
（エキソビボでの体細胞導入遺伝子免疫化は、Ｔ細胞免疫を誘発する。）
この実施例は、エキソビボＳＴＩを使用する抗原特異的なＣＤ４  Ｔ細胞の誘導を記載する。第１のインビトロ工程において、正常脾臓リンパ球はプラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3でトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、リンパ球は、正常マウスの静脈内に注射された。
【０１５９】
示された実験（表８）において、マウスは、２００ｍｌの滅菌生理食塩水内の異なる数のトランスフェクトされたリンパ球を注射された（尾の静脈内に）。トランスフェクトされた細胞の注射後、１４日マウスを屠殺した。単一の脾臓細胞懸濁液を、３通りに培養した。合成ペプチドＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＰまたはＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰ（５０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、グルタミン、７．５％胎児ウシ血清および５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）において培養した（１０6細胞／ｍｌ）。細胞を３７℃で、１０％ＣＯ2中で、３日間インキュベートした。（3Ｈ）チミジンを、１μＣｉ／ウエルで添加し、そして細胞を３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。細胞をＴｏｍｔｅｃ細胞回収機を使用してガラスファイバーフィルターマット上に回収し、そして放射能を液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｔａｐｌａｔｅ；Ｗａｌｌａｃ；Ｔｕｋｕ  Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。結果は、（合成ペプチドの存在下で培養された細胞のカウント／分）／（ペプチドの存在下で培養された細胞のカウント／分）の比として算出したＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（Ｓ．Ｉ．）として表した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）刺激を、ポリクローナル活性化因子およびポジティブコントロールとして使用した。血清を使用し、トランスジェニック産物（ＴｇＩｇ）およびＴｇＩｇに対する抗体の存在を検出した。
【０１６０】
表８に記載される結果は、特異的な増殖応答が、２０，０００〜７０の注射されたポジティブ細胞／マウスの範囲に渡って、すべてのマウスにおいて検出されたことを示す。この増殖応答は、用量応答曲線に続き、そして応答は特異的であった。Ｔｈ細胞決定因子を欠く導入遺伝子を保有するトランスジェニックリンパ球を注射されたコントロールマウスは、試験された任意の細胞濃度で応答しなかった。
【０１６１】
（表８．エキソビボでのＳＴＩは、ＣＤ４  Ｔ細胞応答を誘導する。用量応答分析）
【０１６２】
【表８】
0005000807.tif 000013
ネイティブＣ５７Ｂ１／６マウスは、プラスミドγ１ＮＶ2ＮＡ3をトランスフェクトされた合成リンパ球を、静脈内に注射された。２匹のマウスのグループの各々は、導入遺伝子を保有する細胞の１度の注射（２０，０００〜７０細胞／マウス）を受けた。細胞の免疫化後、２週間でマウスを屠殺し、そして脾臓細胞を調製し、そしてコントロールとしての−ＮＶＤＰ−ペプチドまたは（ＮＡＮＰ）3ペプチドの存在下で従来のＣＤ４  Ｔ細胞増殖アッセイで試験した。コントロールマウスを、コントロール導入遺伝子、（ＮＡＮＰ）3ペプチドをコードするが、ＣＤ４  Ｔ細胞決定因子、−ＮＶＤＰをコードしないプラスミドγ１ＮＡ3を保有する等数の脾臓細胞で同様に免疫した。結果は、−ＮＶＤＰ−ペプチドを用いてインビトロで再刺激された培養物のｃｐｍ  −  培地単独での培養物のｃｐｍ、として表される。Ｂ細胞エピトープ（ＮＡＮＰ）3で３再刺激されたコントロール培養物の値（ｃｐｍ）は、示されない。なぜなら、培地単独での培養物の値（ｃｐｍ）に等しいからである。
【０１６３】
本明細書中に開示される結果は、エキソビボでのＳＴＩは、ＣＤ４  Ｔ細胞を活性化するのに有効な方法であることを示す。抗原特異的免疫は、１つのＣＤＲ内で、Ｔｈ細胞決定因子をコードするＩｇ  Ｈ鎖遺伝子でトランスフェクトされた正常リンパ球の静脈内注射によって容易に誘導された。エキソビボでのＳＴＩを介した免疫化は、用量応答免疫化の特徴を有する増殖応答を誘導した。
【０１６４】
（実施例Ｘ）
（体細胞導入遺伝子は、ヒトＢ細胞についてインビトロで機能する。）
この実施例は、免疫グロブリン遺伝子をコードする細菌プラスミドＤＮＡを使用するヒトＢ細胞の自発的トランスフェクションを記載する。
【０１６５】
Ｒａｊｉ（ＭＨＣクラスＩＩ+）およびＲＪ２．２．５（ＭＨＣクラスＩＩ-改変体）は、２％グルタミンが補充された１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中で培養された。プラスミドＤＮＡγ１ＮＡＮＰおよびＰＣＲ方法論は、実施例ＩＩに記載される。
【０１６６】
Ｒａｊｉ（ＭＨＣクラスＩＩ+）およびＲＪ２．２．５（ＭＨＣクラスＩＩ-改変体）を収集し、そして滅菌生理食塩水で徹底的に（ｔｈｒｏｕｇｈｌｙ）洗浄し、カウントし、そして３００μｌのリン酸緩衝液生理食塩水中に種々の濃度で再分布した。５μｇのプラスミドＤＮＡ（γ１ＮＡＮＰ）を細胞懸濁液に添加し、そして３７℃で、１時間、５％ＣＯ2雰囲気下でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を生理食塩水で洗浄し、そして完全培養培地に置き、３７℃で、５％ＣＯ2で２４時間増殖させた。取り込みおよびトランスフェクションを、２４時間後に収集した細胞において評価した。ゲノムＤＮＡをＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、そして、ＶＤＪ特異的プライマーを使用する２回のネスト化されたＰＣＲに供した（実施例ＩＩを参照のこと）。ＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイド染色をした１％アガロースゲルで分析した。２４時間後、ＲａｊｉおよびＲＪ２．２．５細胞の両方において導入遺伝子をＰＣＲを用いて検出し、このことは、導入遺伝子の取り込みおよび統合を示唆する。異なる実験において、１０5のトランスフェクトされた細胞の合計のＲＮＡは、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルムを使用する培養の７日後に１度の工程で抽出された。マウスのトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）細胞株を、ポジティブコントロールとして使用した。ＲＴ−ＰＣＲによって、Ｈ鎖導入遺伝子産物をコードするＲＮＡを、トランスフェクトされたＲａｊｉにおいて検出したが、トランスフェクトされていないＲａｊｉ細胞において検出しなかった。
【０１６７】
この適用の全体に渡って、種々の刊行物が参照された。それらのすべてにおいて、これらの刊行物の開示は、本発明のに関係のある最新技術をより十分に記載するために本願における参考として本明細書中に援用される。
【０１６８】
上記の実施例に関連して、本発明が記載されてきたが、本発明の精神から逸脱しないで種々の変更がなされ得ることを理解されるべきである。従って、本発明は、請求項のみによって限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、プラスミドＤＮＡγ１ＷＴおよびそのγ１ＷＴ−ＴＡＣ改変体およびγ１ＮＡＮＰ改変体の模式図を示す。γ１ＷＴ  Ｈ鎖構築物は、プラスミドベクターｐＮｅｏｙ１中に存在するヒトγ定常（Ｃ）領域遺伝子とマウスＶＨ６２遺伝子との間の融合産物（２．３ｋｂ）である（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：４５３−４５７（１９８９））。ＶH領域遺伝子は、生産的に再配列され、そしてＣ領域遺伝子は、ゲノム配置中にある。改変体γ１ＷＴ−ＴＡＣおよびγ１ＮＡＮＰは、ＣＤＲ３中の太字で示すヌクレオチドの挿入を含む。各プラスミドＤＮＡは、組織特異的発現に必要とされる、調節配列、プロモーター（Ｐｒ）、およびエンハンサー（Ｅｎ）を有する。プラスミドＤＮＡ  γ１ＮＡＮＰにおいて、ヒトγ１  Ｃ領域遺伝子は、３つのＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ反復をコードするヌクレオチド配列の導入によって、第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）において改変されている、生産的に再配列されたマウス可変（Ｖ）領域遺伝子に連結されている。これらのプラスミドにおいて、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントは、ＩｇＨ鎖遺伝子中に構成的に存在するエレメントである。Ｎｅｏr＝ネオマイシン耐性遺伝子；Ａｍｐr＝アンピシリン耐性遺伝子；ＰＲ＝プロモーター；ＥＮ＝エンハンサー；ＣH＝重鎖Ｃ領域；ＶH＝重鎖可変領域；ＦＲ＝フレームワーク領域；ＣＤＲ＝相補性決定領域。
【図２】  図２は、γ１ＷＴ−ＴＡＣ  ＤＮＡの生産的に再配列されたＶＤＪ領域に対応するゲノムＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を示す。５２０ｂｐフラグメントを、（１）プラスミドＤＮＡγ１ＷＴ−ＴＡＣを１７日前に接種した脾臓から抽出したゲノムＤＮＡ、および（２）プラスミドＤＮＡ  γ１ＷＴを構成的に有するＪ５５８Ｌ細胞から増幅した（Ｓｏｌｌａｚｚｏら、前出、１９８９）。この増幅された産物を、反対方向からの２つの異なるプライマーを使用して、クローニングおよび配列決定した。一番上のヌクレオチド配列はγ１ＷＴ−ＴＡＣでありれ、参照として役立つ。ＳＰ７−ＳＰ１２は、脾臓ゲノムＤＮＡから産生した６つのクローンを同定する。ＴＲ３５−ＴＲ３８は、トランスフェクト細胞に由来する４つのゲノムＤＮＡクローンを同定する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。この研究は、インビボでの注入後に、導入遺伝子が体細胞変異を受けないことを示す。
【図３】  図３は、脾臓Ｂリンパ球およびＴリンパ球の単離および精製したリンパ球集団中での導入遺伝子Ｈ鎖の検出を示す。ＤＮＡ接種したマウスの脾臓からのＢリンパ球およびＴリンパ球を分類し、そして示した時間に、蛍光活性化セルソーターで精製した。
【図４】  図４は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓでのチャレンジ後の、プラスミドＤＮＡ  γ１ＮＡＮＰを用いて誘発された既往抗体性応答を示す。マウスを、プラスミドγ１ＮＡＮＰを用いて初回免疫するか、または抗原化抗体γ１ＮＡＮＰもしくはＣＦＡ中の抗原化抗体γ１ＮＡＮＰで初回免疫した。コントロールグループには、プラスミドγ１ＷＴ  ＤＮＡまたは生理食塩水を接種した。４５日目のマウスには、示されるように、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトまたはＩＦＡ中の抗原化抗体γ１ＮＡＮＰ（５０μｌ）のいずれかを皮下で用いて、ブースター免疫を与えた。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを、不完全ＤＭＥＭ中に腹腔内接種した（１０9）。血液サンプルを、４５日目に収集し（ブースター注入の前に）、そして引き続いて、ブースター１５日後および３５日後に収集した。合成ペプチド（ＮＡＮＰ）ｎ（パネルＡおよびＣ）と反応性の抗体および組換えタンパク質Ｒ３２ＬＲ（パネルＢおよびＤ）と反応性の抗体が、ＥＬＩＳＡによって検出された。値は、１：１６００の希釈で試験した、プールした血清（４マウス／グループ）の吸光度（Ａ492）を表す。
【図５】  図５は、２つの異種エピトープを有する免疫グロブリンＨ鎖遺伝子の操作および発現を示す。パネルＡは、変異誘発ベクターの模式図、（ＮＡＮＰ）３の導入、およびＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰコード配列、ならびに、挿入後の、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の、部分的なヌクレオチド配列を示す。合成オリゴヌクレオチドおよびｐＶＨ−ＴＡＣ／ＣＣＡの作製のための変異誘発工程は、実験プロトコルに詳述されている。（ＮＡＮＰ）３およびＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰをコードする相補的合成オリゴヌクレオチドの２対を、ｐＶＨ−ＴＡＣ／ＣＣＡの、ＣＤＲ３のＡｓｐ７１８部位およびＣＤＲ２中のＮｃｏＩ部位でクローニングした。挿入物を、ジデオキシ鎖ターミネーション配列決定によって確認した。パネルＢは、それぞれ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３において２つの異種エピトープについてのコード配列を有するプラスミドＤＮＡ  γ１ＮＶ2ＮＡ3の模式図を示す。ヒトγ１定常（Ｃ）領域遺伝子は、ゲノム配置にある。ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３は、γ１遺伝子のＣ領域中の対応するドメインである。組織特異的発現のためのプロモーター（Ｐｒ）およびエンハンサー（Ｅｎ）エレメントならびにネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏr）およびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐr）を示す。パネルＣは、軽鎖と対をなす抗原化Ｈ鎖遺伝子産物の模式図を示す。ＣＤＲ２およびＣＤＲ３中の操作されたエピトープを示す（スケールは同一ではない）。
【図６】  図６は、ＣＤＲ３エピトープおよびＣＤＲ２エピトープのインビボ免疫原性を示す。マウスを、プラスミドＤＮＡ  γ１ＮＡＮＰ（黒四角）またはγ１ＮＶ2ＮＡ3（白四角）で免疫した。これらの血清を、合成ペプチド（ＮＡＮＰ）ｎ（パネルＡおよびＢ）またはＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰ（パネルＣおよびＤ）でのＥＬＩＳＡによって試験した。値は、１：１６００希釈で試験された血清の吸光度（４９２ｎｍ）であり、そして平均（±標準誤差）として表現される。各グループは４マウスからなる。（*）は、パネルＢ対パネルＡで示される値の間の統計学的な有意性を示す。有意性は、７日目でｐ＜０．０１、１４日目でｐ＜０．０５であった。時間は、ＤＮＡ接種後の日数である。
【図７】  図７は、ＧＭ−ＣＳＦが、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを用いるブースター免疫後に、既往抗体性反応の抗ＮＡＮＰ抗体応答を強調することを示す。縦軸は抗体力価（Ｌｏｇ１０）であり、（ＮＡＮＰ）ｎペプチドで測定される。実験グループは、下側に同定される。矢印は、ブースター免疫が与えられた場合の時間（４５日目）を示す。値は、同じ時点で収集された血清のプールの結合である。各グループは、４マウスから構成された。
【図８】  図８は、ＳＴＩによるＴリンパ球の抗原特異性活性化を示す。パネルＡは、Ｂ細胞エピトープをコードするプラスミドＤＮＡ  ｇ１ＮＡＰ（４マウス）、Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープをコードするγ１ＮＶ2ＮＡ3（４マウス）、またはコントロールプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（２マウス）を接種したＣ５７Ｂ１／６マウスからの脾臓細胞の増殖性応答を示し、そして７日目に収集した。細胞を、横座標に沿って示される抗原の存在下で培養した。結果は、平均±Ｓ．Ｄ．として表現される刺激指数である。結果は、２つの独立した実験に対応する。ＡｇＡｂ＝抗原化抗体。試験は３連で行った。パネルＢは、パネルＡにおいて示される同じＣ５７Ｂ１／６マウスからの脾臓細胞培養におけるＩＬ−２産生を示す。結果を、インジケーターであるＮＫ．３細胞の増殖性応答の１分間あたりの計数（ｃｐｍ）で表現し、そして平均±Ｓ．Ｄ．として表現される。
【図９】  図９は、初回応答の間のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のレベルを示す。免疫７日後および１４日後に収集した脾臓細胞を、Ｔｈ細胞決定基に対応する合成ペプチド（５０Ｙｇ／ｍｌ）と４０時間インキュベートした。３連の培養からの上清を収集し、そしてＩＦＮ−γまたはＩＬ−４に特異的な捕捉ＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【図１０】  図１０は、活性化細胞がＣＤ４+細胞であることを示す。ＤＮＡ接種の７日後、脾臓細胞集団を調製し、そして抗体および補体によって、ＣＤ８+細胞枯渇（パネルＣ）またはＣＤ４+細胞枯渇（パネルＤ）させた。未分離のＣＤ８+細胞（パネルＡ）および未分離のＣＤ４+細胞（パネルＢ）を参照として示す。未分画（総計）、分離したＣＤ４およびＣＤ８、ならびに再構築（ＣＤ４＋ＣＤ８）Ｔ細胞集団の増殖性応答（パネルＥ）ならびにＩＬ−２産生（パネルＦ）を示す。刺激指数およびＩＬ−２産生を決定した。
【図１１】  図１１は、脾臓内ＤＮＡ接種によって誘導されたＴ細胞免疫がリンパ節まで広がることを示す。γ１ＮＶ2ＮＡ3ＤＮＡ接種の７日後、１４日後、または２１日後に収集された鼡径部、腸間膜、および頸部リンパ節、ならびに脾臓細胞のプールにおける細胞増殖（パネルＡ）およびＩＬ−２産生（パネルＢ）。リンパ節は、４マウス／実験から単離した。血清中の血清トランスジェニックＩｇ（ｎｇ／ｍｌ）を、各時点での６匹の異なるマウスの平均±ＳＤとして表現する（パネルＣ）。以下から収集したリンパ節の細胞増殖（パネルＤ）およびＩＬ−２産生（パネルＥ）：（１）腋窩、上腕、深頸、および浅頸（上部）；（２）腸間膜、腎臓、および上腹部（中間部）；ならびに（３）膝窩、仙骨、坐骨、および腰椎（下部）、ＤＮＡ接種１４日後のリンパ節。リンパ節を、６匹のマウスから単離した。
【図１２】  図１２は、抗体応答に対する、Ｔｈ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの関連した認識の効果を示す。ＴエピトープおよびＢエピトープ（三角）、Ｂ細胞エピトープ（四角）、またはコントロールプラスミド（丸）をコードするプラスミドＤＮＡを接種されたマウスにおけるＢ細胞エピトープ反応性抗体の力価（Ｌｏｇ）（パネルＡ）。Ｂ細胞エピトープのみをコードするプラスミドＤＮＡ（パネルＢ）、またはＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープをコードするプラスミドＤＮＡ（パネルＣ）を接種したマウスの血清中でのＥＬＩＳＡにおいて決定される、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＭ抗体、およびＩｇＧ２ａ抗体の力価（ｌｏｇ）。すべての記号は単一のマウスを示す。すべてのマウスを１４日目に試験した。試験を、二連で行った。
【図１３】  図１３は、プラスミドＤＮＡ  γ１ＮＰの模式図を示す。このＨ鎖コードプラスミドは、第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）におけるインフルエンザウイルスヌクレオタンパク質（ＮＰ）抗原（３６６−３７９）の配列から、１３アミノ酸残基を発現するように操作された、ヒトγ１Ｃ領域のマウスＶＨとの融合物の産物である。このＮＰペプチドは、Ｈ−２ｂマウスにおいてＤｂ対立遺伝子に付随して提示される。ＣＤＲ３領域のコード鎖を太字で示し、ＮＰコード配列に下線を付す。インフルエンザペプチド３６６ＡＳＮＥＮＭＥＴＭＥＳＳＴＬ３７９のアミノ酸配列を太字で示す。Ｂ、ＢａｍＨＩ；ＲＩ、ＥｃｏＲＩ；Ｎｅｏ、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性；Ａｍｐ、アンピシリン耐性。Ｈ鎖遺伝子を、単一のＫｐｎＩ／Ａｓｐ１７８部位、およびインフルエンザウイルスＮＰ抗原（ＡＳＮＥＮＭＥＴＭＥＳＳＴＬ）の残基３６６−３７９をコードする、相補的オリゴヌクレオチド（５’ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＡＣＡ，ＣＴＴ  ３’）、５’ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＴＴＧ、ＡＴＴ、ＣＣＡ、ＴＡＧ、ＴＣＴ、ＣＣＡ、ＴＡＴ、ＴＴＴ、ＣＡＴ、ＴＧＧ，ＡＡＧ、ＣＧＧ  ３’は、変異誘発したＶＨ領域の９４Ｖと９５Ｐとの間に導入した。２．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントによってコードされる操作されたＶＨＮＰを、１２．８ｋｂベクターｐＮγ１に含まれるヒトγ１定常（Ｃ）領域遺伝子から上流にクローニングした。
【図１４】  図１４は、脾臓内接種を介してプラスミドＤＮＡ  γ１ＮＰ（ＤＮＡ）でワクチン投与し、そして１０ＬＤ50インフルエンザウイルスでチャレンジしたマウスにおける生存曲線を示す。他のグループは、プラスミドＤＮＡγ１ＮＰで初回免疫し、その後、合成ペプチド（免疫学的アジュバント中のインフルエンザウイルスＮＰ抗原ＡＳＮＥＮＭＥＴＭＥＳＳＴＬ）でブーストするか（ＤＮＡ＋ペプチド）、または免疫学的アジュバント中のＮＰ合成ペプチドＡＳＮＥＮＭＥＴＭＥＳＳＴＬ、その後、同じ合成ペプチドでブーストした（ペプチド＋ペプチド）。ウイルスを用いるチャレンジを、初回免疫３ヶ月後に与えた。
【図１５】  図１５は、免疫グロブリンＨ鎖遺伝子の、２つの異種Ｔｈ細胞エピトープでの操作を例証する。Ｈ鎖遺伝子は、プラスミドベクターγ１ＮＶ２ＶＴＳＡ３によってコ−ドされる。ＶＨ領域は、マウスＶ領域遺伝子のＶＤＪ再配列を含む２．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩゲノムフラグメントである（図１を詳細に参照のこと）。ヒトγ１定常（Ｃ）領域遺伝子は、ゲノム配置中にある。ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３は、γ１遺伝子のＣ領域中の対応するドメインをいう。組織特異的発現のためのプロモーター（Ｐｒ）エレメントおよびエンハンサー（Ｅｎ）エレメントならびにネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏr）およびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐr）を示す。ＶＨ領域は、右のパネルに示されるような２つの異種決定基をコードするように変異誘発によって改変される。矢印は、宿主細胞によって提供されるトランスジェニックＨ鎖および軽鎖（Ｌ鎖）から構成される翻訳された他の構造を示す。ＣＤＲ２およびＣＤＲ３におけるアミノ酸配列が示され、そして、マラリア寄生虫Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの外被由来のＴｈ細胞決定基ＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰ（ＣＤＲ２において）および腫瘍抗原ＭＵＣ−１のタンデムリピート由来のＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰエピトープ（ＣＤＲ３において）に対応する。ＣＤＲ＝相補性決定領域。Ｈ＝重（鎖）；Ｃ＝定常領域。スケールは同一ではない。
【図１６】  図１６は、潜在性の／サブドミナントなエピトープに対する増殖性応答への、ドミナントなＴｈエピトープおよび潜在性の／サブドミナントなＴｈエピトープの連結性認識の効果を示す。Ｔｈ／Ｔｈ連結性認識が、ＭＵＣ−１抗原から免疫原性Ｔ細胞決定基を与えるために必要である。マウスに、示されるように、プラスミドＤＮＡを接種した。脾臓細胞を、１５日目に収集し、そして、５０μｇ／ｍｌの合成ペプチド（ＤＴＲＰ）３およびＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰ（ＶＴＳＡと示す）の存在下で、インビトロで４日間再刺激した。両方の配列は、腫瘍抗原ＭＵＣ−１のＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰタンデムリピートに含まれる。上付き数字は、異種抗原配列が挿入されたＣＤＲを示す。下付き数字は、特定のＣＤＲの状況において、括弧内の配列が反復される回数の数を示す。示された結果は、３回の独立した実験の累積である。各グループは、８〜１０マウスから構成される。結果を、刺激指数として表現する。棒は、刺激指数±ＳＥＭの平均を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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