(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光が照射されて電場増強場を発生させる微細構造体基板の検出面に被検体を接触させまたは前記検出面の近傍に前記被検体を位置させ、
前記被検体が接触しているまたは前記近傍に前記被検体が存在している前記検出面に前記励起光を照射し、
前記検出面およびその近傍から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光を検出して、前記被検体から生じるラマン信号および前記微細構造体基板の前記被検体が配置されていない検出面自体ならびに前記検出面に存在し得る前記被検体と異なる物質からの検出光に起因する、リファレンスとなるバックグラウンド信号を得、
得られた前記被検体のラマン信号の強度を、前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号の強度で除算して、前記被検体のラマン信号を規格化することを特徴とするラマン信号測定方法。
【請求項２】
前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号は、特定の波長における前記バックグラウンド信号である請求項１に記載のラマン信号測定方法。
【請求項３】
前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号の前記特定の波長は、前記被検体のラマン信号の波長とは異なる請求項２に記載のラマン信号測定方法。
【請求項４】
前記リファレンスとなる前記バックグラウンド信号として、複数の特定の波長における前記バックグラウンド信号を得、
これらの複数の特定の波長における前記バックグラウンド信号の強度の和または平均値を求め、求められた前記和または前記平均値で、前記被検体のラマン信号の強度を除算して、前記被検体のラマン信号を規格化する請求項１に記載のラマン信号測定方法。
【請求項５】
前記リファレンスとして得られた複数の前記バックグラウンド信号の各特定の波長は、前記被検体のラマン信号の波長とは異なる請求項４に記載のラマン信号測定方法。
【請求項６】
前記検出光は、前記微細構造体基板の前記被検体が配置されていない検出面自体からのラマン散乱光または蛍光である請求項１〜５のいずれかに記載のラマン信号測定方法。
【請求項７】
励起光が照射されて電場増強場を発生させる検出面が形成され、この検出面に被検体を接触させまたは前記検出面の近傍に前記被検体を位置させるための微細構造体基板と、
前記被検体が接触しているまたは前記近傍に前記被検体が存在している前記微細構造体基板の前記検出面に前記励起光を照射する励起光照射手段と、
前記検出面およびその近傍から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光を検出して、前記被検体から生じるラマン信号および前記微細構造体基板の前記被検体が配置されていない前記検出面自体ならびに前記検出面に存在し得る前記被検体と異なる物質からの検出光に起因する、リファレンスとなるバックグラウンド信号を得る検出手段と、
得られた前記被検体のラマン信号の強度を、前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号の強度で除算して、前記被検体のラマン信号を規格化する規格化処理手段を有することを特徴とするラマン信号測定装置。
【請求項８】
前記検出手段は、前記リファレンスとなる前記バックグラウンド信号として、特定の波長における前記バックグラウンド信号を得る請求項７に記載のラマン信号測定装置。
【請求項９】
前記検出手段によって前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号の前記特定の波長は、前記被検体のラマン信号の波長とは異なる請求項８に記載のラマン信号測定装置。
【請求項１０】
前記検出手段は、前記リファレンスとなる前記バックグラウンド信号として、複数の特定の波長における前記バックグラウンド信号を得、
前記規格化処理手段は、前記検出手段によって得られた前記複数の特定の波長における前記バックグラウンド信号の強度の和または平均値を求め、求められた前記和または前記平均値で、前記被検体のラマン信号の強度を除算して、前記被検体のラマン信号を規格化する請求項７に記載のラマン信号測定装置。
【請求項１１】
前記検出手段によって前記リファレンスとして得られた複数の前記バックグラウンド信号の各特定の波長は、前記被検体のラマン信号の波長とは異なる請求項１０に記載のラマン信号測定装置。
【請求項１２】
前記検出手段によって検出される前記検出光は、前記微細構造体基板の前記被検体が配置されていない検出面自体からのラマン散乱光または蛍光である請求項７〜１１のいずれかに記載のラマン信号測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体を載置した検出面に励起光を照射し、検出面に増強場を発生させた状態で被検体のラマン散乱光を検出するラマン信号測定方法およびラマン信号測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光法は、物質に単波長の光を照射して得られるラマン散乱光を分光して、ラマン散乱光の信号を得る方法であり、物質の同定等に利用されている。ラマン分光法は、生体サンプル等の測定（例えば、同定）に用いることができる。
また、特許文献１のラマン分光法による基質の定量分析方法に記載されているように、測定物質の濃度とラマン散乱光の強度との間には、相関関係があるため、ラマン散乱光の強度から被検体の濃度や量を検出することもできる。
【０００３】
ここで、通常、物質（つまり被検体）から得られるラマン散乱光は信号が微弱であるため高感度で検出することが困難である。
これに対して、特許文献２に記載されている局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子が多数配置され、光が照射されることで増強電場を形成し、ラマン散乱光を増幅させる検出面が形成された微細構造体基板を用いる方法がある。
このように検出面に増強電場を発生させてラマン散乱光の信号強度を大きくするＳＥＲＳ（表面増強ラマン）方式を用いることで、低濃度等により検出面上の被検体が少なくても被検体の検出が可能になる。
【０００４】
また、特許文献３には、ＳＥＲＳ方式で被検体を検出する方法であって、被検体のラマン散乱光の信号を抽出するために、検出した全体の信号から、被検体のラマン散乱光以外の信号（第２の信号）を除去する方法が記載されている。なお、第２の信号は、処理装置に記憶させているデータであり、被検体を載置していない状態で、ラマン散乱光を検出することにより検出すると記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２５８３４６号公報
【特許文献２】特開２００５−１７２５６９号公報
【特許文献３】米国特許第６８８８６２９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここで、微細構造体基板で発生させた増強電場でラマン散乱光を増強するＳＥＲＳ方式は、微細構造体基板により信号の増強度が決まるため、微細構造体基板に構造のばらつきが多いと、信号のばらつきも大きくなる。つまり、測定に用いる微細構造体基板毎に増強電場の強度が異なったり、１つの微細構造体基板の位置（または領域）毎に増強電場の強度が異なったりすると、増強されるラマン散乱光の信号もばらついてしまう。
このように信号がばらついてしまうと、定量的に被検体の量、濃度を測定することが困難となる。
このため、微細構造体基板を均一に作製するための多くの手法が提案されているが、完全に均一な微細構造体基板を作製することは不可能であり、信号強度の均一性には限界があった。
【０００７】
また、ＳＥＲＳ方式は、微弱なラマン散乱光を増強できるため、高感度で被検体からのラマン散乱光を観測し得るが、被検体からのラマン散乱光のみならず、バックグラウンド（つまり、被検体が配置された検出面から被検体を除いた部分）からのラマン散乱光や蛍光等の光も増強してしまう。そのため、微細構造体基板間で信号のばらつきが大きくなるという問題がある。
【０００８】
従来、特許文献３に記載された方法のように、被検体からのラマン散乱光を高感度で観測するために、検出した全体の信号からバックグラウンドの信号を除去することが行われている。しかしながら、この方法では、微細構造体基板間での信号強度のばらつきを補正することは不可能であった。
また、特許文献３に記載の方法は、被検体のラマン信号のみを検出するための方法であり、被検体を定量的に測定することは記載されていない。また、処置装置に記憶させたデータを用いる場合も、微細構造体基板毎に検出値が変化するため、同様に被検体を定量的に測定することは困難である。
また、被検体以外の物質に起因するラマン信号は取り除くことはできても増強電場による増強度を検出することはできない。したがって、この点においても被検体を定量的に測定することは困難である。
【０００９】
また、ラマン信号を規格化する方法としては、被検体とラマン活性が既知のリファレンス物質とを混ぜ、その信号を比較することにより、ラマン信号を規格化する方法が提案されている。
しかしながら、この方法では、被検体とリファレンス物質とのアフィニティー（親和性）を考慮する必要がある。例えば、被検体とリファレンス物質との間で微細構造体基板との結合し易さが異なる場合、結合し易いものが優先的に微細構造体基板の表面に吸着し、結合し難いものは押し出されることになり、信号強度のばらつきが抑えられない場合がある。
【００１０】
本発明の目的は、上記従来技術に基づく問題点を解消し、微細構造体基板間の信号強度のばらつきを低減することができるラマン信号測定方法およびラマン信号測定装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、励起光が照射されて電場増強場を発生させる微細構造体基板の検出面に被検体を接触させまたは前記検出面の近傍に前記被検体を位置させ、前記被検体が接触しているまたは前記近傍に前記被検体が存在している前記検出面に前記励起光を照射し、前記検出面およびその近傍から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光を検出して、前記被検体から生じるラマン信号および前記微細構造体基板の前記被検体が配置されていない検出面自体ならびに前記検出面に存在し得る前記被検体と異なる物質からの検出光に起因する、リファレンスとなるバックグラウンド信号を得、得られた前記被検体のラマン信号の強度を、前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号の強度で除算して、前記被検体のラマン信号を規格化することを特徴とするラマン信号測定方法を提供するものである。
【００１２】
ここで、前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号は、特定の波長における前記バックグラウンド信号であるのが好ましい。
また、前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号の前記特定の波長は、前記被検体のラマン信号の波長とは異なるのが好ましい。
また、前記リファレンスとなる前記バックグラウンド信号として、複数の特定の波長における前記バックグラウンド信号を得、これらの複数の特定の波長における前記バックグラウンド信号の強度の和または平均値を求め、求められた前記和または前記平均値で、前記被検体のラマン信号の強度を除算して、前記被検体のラマン信号を規格化するのが好ましい。
また、前記リファレンスとして得られた複数の前記バックグラウンド信号の各特定の波長は、前記被検体のラマン信号の波長とは異なるのが好ましい。
また、前記検出光は、前記微細構造体基板の前記被検体が配置されていない検出面自体からのラマン散乱光または蛍光であるのが好ましい。
【００１３】
また、上記目的を達成するために、本発明は、励起光が照射されて電場増強場を発生させる検出面が形成され、この検出面に被検体を接触させまたは前記検出面の近傍に前記被検体を位置させるための微細構造体基板と、前記被検体が接触しているまたは前記近傍に前記被検体が存在している前記微細構造体基板の前記検出面に前記励起光を照射する励起光照射手段と、前記検出面およびその近傍から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光を検出して、前記被検体から生じるラマン信号および前記微細構造体基板の前記被検体が配置されていない前記検出面自体ならびに前記検出面に存在し得る前記被検体と異なる物質からの検出光に起因する、リファレンスとなるバックグラウンド信号を得る検出手段と、得られた前記被検体のラマン信号の強度を、前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号の強度で除算して、前記被検体のラマン信号を規格化する規格化処理手段を有することを特徴とするラマン信号測定装置を提供するものである。
【００１４】
ここで、前記検出手段は、前記リファレンスとなる前記バックグラウンド信号として、特定の波長における前記バックグラウンド信号を得るのが好ましい。
また、前記検出手段によって前記リファレンスとして得られた前記バックグラウンド信号の前記特定の波長は、前記被検体のラマン信号の波長とは異なるのが好ましい。
また、前記検出手段は、前記リファレンスとなる前記バックグラウンド信号として、複数の特定の波長における前記バックグラウンド信号を得、前記規格化処理手段は、前記検出手段によって得られた前記複数の特定の波長における前記バックグラウンド信号の強度の和または平均値を求め、求められた前記和または前記平均値で、前記被検体のラマン信号の強度を除算して、前記被検体のラマン信号を規格化するのが好ましい。
また、前記検出手段によって前記リファレンスとして得られた複数の前記バックグラウンド信号の各特定の波長は、前記被検体のラマン信号の波長とは異なるのが好ましい。
また、前記検出手段によって検出される前記検出光は、前記微細構造体基板の前記被検体が配置されていない検出面自体からのラマン散乱光または蛍光であるのが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ラマン信号を規格化するためのリファレンス物質を使用する必要がないため、被検体とリファレンス物質とのアフィニティーを考慮する必要がなく、微細構造体基板間の信号強度のばらつきをより低減することができる。すなわち、本発明によれば、表面増強ラマンにより、高い感度で被検体のラマン信号を検出することができ、かつ、微細構造体基板の検出面に発生する増強電場の強度によらず、被検体のラマン信号に比例した信号強度を検出することができる。
これにより、高い精度で正確に被検体を同定し、更に被検体の量および濃度を検出することができる。
また、微細構造体基板の検出面に発生する増強電場の強度によらず、高い精度で被検体のラマン信号を検出できることで、微細構造体基板の製造誤差の許容範囲を大きくすることができ、歩留まりを高くし、かつ製造コストを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に係るラマン信号測定方法およびラマン信号測定装置について、添付の図面に示す実施形態を基に詳細に説明する。
【００１７】
図１は、本発明のラマン信号測定方法を用いるラマン信号測定装置の概略構成を示す正面図であり、図２は、図１に示した微細構造体基板の概略構成を示す斜視図である。
【００１８】
図１は、本発明のラマン信号測定方法に用いるラマン信号測定装置の一実施形態であるラマン信号測定装置１０の概略構成を示す正面図であり、図２は、図１に示したラマン信号測定装置１０の微細構造体基板１２の概略構成を示す上面図である。
【００１９】
図１に示すように、ラマン信号測定装置１０は、微細構造体基板１２と、微細構造体基板１２に励起光を照射する励起光照射手段１４と、検出面１２ａおよびその近傍から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させたラマン散乱光を検出して、被検体６０から生じるラマン信号およびリファレンスとなるバックグラウンド信号を得る検出手段１６と、微細構造体基板１２を支持するチップ支持手段１８と、被検体６０を含有する液体試料Ｓを微細構造体基板１２に滴下する液体試料滴下手段２０と、検出手段１６で検出された被検体６０のラマン信号の強度を規格化する規格化処理手段２２と、規格化処理手段２２での算出結果を表示する表示手段２４とを有する。
なお、図示しないが、ラマン信号測定装置１０は、微細構造体基板１２、励起光照射手段１４、検出手段１６等の各部を覆う筐体や、ラマン信号測定装置１０の内部で発生した迷光を除去するフィルタ等の各種の光学部材や、ラマン信号測定装置１０の動作を制御する制御部等のラマン信号測定装置１０に必要な各種の部材も有する。
【００２０】
図２に示すように、微細構造体基板１２は、誘電体基材３２および誘電体基材３２の一面に配置された導電体３４で構成された基体３０と、誘電体基材３２の導電体３４が配置された面とは反対側の面に配置された金属体３６とを有する。
【００２１】
基体３０は、金属酸化物体（Ａｌ2Ｏ3）で形成された誘電体基材３２と、誘電体基材３２の一面に設けられ、陽極酸化されていない金属（Ａｌ）で形成された導電体３４とを有する。ここで、誘電体基材３２と導電体３４とは、一体に形成されている。
また、誘電体基材３２には、導電体３４が配置される面とは反対側の面から導電体３４側の面に向けて延びる略ストレートな形状（直管形状）の微細孔４０が複数開孔されている。
複数の微細孔４０は、導電体３４が配置される面とは反対側の面側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通して開口が形成され、導電体３４側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通していない。つまり、微細孔４０は、導電体３４までは到達していない孔となる。また、複数の微細孔４０は、励起光の波長より小さい径およびピッチで略規則的に配列されている。
ここで、励起光として可視光を用いる場合は、微細孔４０の配置ピッチを２００ｎｍ以下とすることが好ましい。
【００２２】
金属体３６は、誘電体基材３２の微細孔４０内に充填されている充填部４５と、微細孔４０上に誘電体基材３２の表面より突出して形成され、充填部４５の外径よりも大きい外径を有し、局在プラズモンを誘起し得る大きさの突出部（つまり凸部）４６とからなる複数の棒部４４で構成されている。ここで、金属体３６を形成する材料としては、局在プラズモンを発生させる種々の金属を使用でき、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金等が挙げられる。また、金属体３６は、これらの金属を２種以上含むもので形成してもよい。また、電場増強効果をより高くすることができるため、金属体３６は、Ａｕ、Ａｇ等を用いて形成することがより好ましい。
また、金属体３６の複数の棒部４４は、突出部４６と隣接する突出部４６との離間距離を、数１０ｎｍ以下とすることが好ましい。
また、突出部４６同士の間隔を数１０ｎｍ以下とすることで、励起光の照射時に、突出部４６同士が近接している領域で、非常に増強された電場を形成することができる。なお、この突出部４６同士の間隔が数１０ｎｍ以下で、非常に増強された電場が形成される領域をホットスポットという。
微細構造体基板１２は、以上のような構成であり、金属体３６の複数の棒部４４の突出部４６が配置される面が、液体試料Ｓが接触する面、つまり、検出面１２ａとなる。
【００２３】
ここで、微細構造体基板１２の作製方法について説明する。
図３（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体基板１２の作製方法の一例を示す工程図である。
まず、図３（Ａ）に示すような直方体形状の被陽極酸化金属体４８に陽極酸化処理を行う。具体的には、被陽極酸化金属体４８を陽極とし、陰極と共に電解液に浸漬させ、陽極陰極間に電圧を印加することで陽極酸化する。
ここで、陰極としては、カーボンやアルミニウム等が使用される。電解液としては制限されず、硫酸、リン酸、クロム酸、シュウ酸、スルファミン酸、ベンゼンスルホン酸、アミドスルホン酸等の酸を、１種または２種以上含む酸性電解液が好ましく用いられる。
なお、本実施形態では、被陽極酸化金属体４８を直方体形状としたが、その形状は制限されず、種々の形状とすることができる。また、支持体の上に被陽極酸化金属体４８が層状に成膜されたもの等、支持体付きの形態で用いることもできる。
【００２４】
被陽極酸化金属体４８を陽極酸化すると、図３（Ｂ）に示すように、被陽極酸化金属体の表面から該面に対して略垂直方向に酸化反応が進行し、誘電体基材３２となる金属酸化物体（Ａｌ2Ｏ3）が生成される。陽極酸化により生成される金属酸化物体（つまり、誘電体基材３２）は、多数の平面視略正六角形状の微細柱状体４２が隙間なく配列した構造を有するものとなる。
また、各微細柱状体４２は、底面が丸みを帯びた形状となり、更に、略中心部には、表面から深さ方向（つまり、微細柱状体４２の軸方向）に略ストレートに延びる微細孔４０が開孔される。陽極酸化により生成される金属酸化物体の構造は、益田秀樹、「陽極酸化法によるメソポーラスアルミナの調製と機能材料としての応用」、材料技術Vol.15,No.10、1997年、p.34等に記載されている。
【００２５】
また、規則配列構造の金属酸化物体を生成する場合の好適な陽極酸化条件例としては、電解液としてシュウ酸を用いる場合、電解液濃度０．５Ｍ、液温１４〜１６℃、印加電圧４０〜４０±０．５Ｖ等が挙げられる。この条件で生成される微細孔４０は例えば、径が約３０ｎｍ、ピッチが約１００ｎｍである。
【００２６】
次に、誘電体基材３２の微細孔４０に電気メッキ処理を施すことにより、図３（Ｃ）に示すように、充填部４５と突出部４６とからなる棒部４４を形成する。
ここで、電気メッキを行うと、導電体３４が電極として機能し、電場が強い微細孔４０の底部から優先的に金属が析出する。この電気メッキ処理を継続して行うことにより、微細孔１２内に金属が充填されて棒部４４の充填部４５が形成される。充填部４５が形成された後、更に電気メッキ処理を続けると、微細孔４０から充填金属が溢れるが、微細孔４０付近の電場が強いことから、微細孔４０周辺に継続して金属が析出していき、充填部４５上に誘電体基材３２の表面より突出し、充填部４５の径よりも大きい径を有する突出部４６が形成される。
【００２７】
なお、本実施形態の微細構造体基板１２は、陽極酸化を利用して製造されたものであるので、誘電体基材３２の微細孔４０および金属体３６の突出部４６が略規則配列された微細構造体基板１２を簡易に製造できる。また、これら微細孔の配列をランダム配列にすることもできる。
【００２８】
また、本実施形態では、誘電体基材３２の製造に用いる被陽極酸化金属体４８の主成分としてＡｌのみを挙げたが、陽極酸化可能で生成される金属酸化物であれば、任意の金属を使用できる。Ａｌ以外では、Ｔｉ、Ｔａ、Ｈｆ、Ｚｒ、Ｓｉ、Ｉｎ、Ｚｎ等が使用できる。被陽極酸化金属体４８は、陽極酸化可能な金属を２種以上含むものであってもよい。
微細構造体基板１２は以上のようにして作製される。
【００２９】
次に、励起光照射手段１４は、レーザ光源等の光源と光源から出射される励起光Ｌｅを導光する導光系とからなり、特定波長の光（励起光）Ｌｅを射出し、射出した励起光Ｌｅを微細構造体基板１２の検出面１２ａに照射する。
【００３０】
検出手段（つまり分光手段）１６は分光検出器等からなり、励起光照射手段１４から励起光が照射されることにより微細構造体基板１２の検出面で発生する散乱光が入射する位置に配置されている。
検出手段１６は、微細構造体基板１２の検出面１２ａで発生する光を分光し、被検体からのラマン散乱光の信号（ラマン信号）を検出する。また、検出手段１６は、被検体のラマン信号と同時に、微細構造体基板１２に励起光Ｌｅを照射したときに発生するラマン散乱光や蛍光等の信号（バックグラウンド信号）も同時に検出する。
ここで、上記バックグラウンド信号は、微細構造体基板１２の検出面１２ａおよび検出面１２ａに存在し得る被検体６０以外の物質（これらを本明細書では「バックグラウンド」という。）からの光に起因する信号である。上記バックグラウンド信号は、基本的には、微細構造体基板１２の検出面自体からのラマン散乱光または蛍光の信号であると考えられるが、特に限定されない。
上記バックグラウンド信号を得るために検出されるリファレンスとなる検出光としては、微細構造体基板１２に励起光Ｌｅを照射したときに発生するラマン散乱光、蛍光、反射光、吸収光、透過光等が挙げられ、微細構造体基板１２の検出面１２ａ自体からのラマン散乱光または蛍光であるのが好ましい。
【００３１】
支持手段１８は、台座等であり、微細構造体基板１２を導電体３４側から支持し、所定位置に固定する。また、支持手段１８は、微細構造体基板１２に液体が滴下された場合に、液体が微細構造体基板１２上からこぼれないように、微細構造体基板１２の側面の外周を覆う囲いを有する。
【００３２】
液体試料滴下手段２０は、被検体６０を含有する液体試料Ｓを貯留する貯留部２０ａと、貯留部２０ａに貯留されている液体試料Ｓを微細構造体基板１２に滴下する滴下部２０ｂとで構成され、微細構造体基板１２の検出面に対向して配置されている。
【００３３】
貯留部２０ａは、被検体６０を含有する液体試料Ｓを貯留する容器である。この貯留部２０ａは、一定量の液体試料Ｓを貯留している。
ここで、被検体６０が液体に含有されていない物質である場合は、被検体６０を溶媒に分散させて液体試料Ｓを作製すればよい。なお、被検体を分散する溶媒としては、種々の溶媒を用いることができ、例えば、水、エタノールや、種々の物質を溶解させた水溶液（例えば、クエン酸水溶液）等が挙げられる。ここで、本実施形態の場合は、溶媒として、揮発性の溶媒を用いることが好ましく、具体的には、エタノールを用いることが好ましい。
滴下部２０ｂは、貯留部２０ａに貯留されている液体試料Ｓを一定量微細構造体基板１２に滴下する。ここで、滴下部２０ａとしては、スポイト等を用いることができる。
液体試料滴下手段２０は、以上のような構成であり、滴下部２０ｂにより貯留部２０ａに貯留されている所定量の液体試料Ｓを微細構造体基板１２の検出面１２ａ上に滴下する。
【００３４】
規格化処理手段２２は、検出手段１６から送られたデータを演算処理する演算部２６と、検出手段１６から送られたデータや、演算部２６での演算結果等を記憶する記憶部２８とを有する。規格化処理手段２２は、検出手段１６で検出した被検体のラマン信号を規格化し、被検体６０の量または濃度を算出する。
【００３５】
表示手段２４は、液晶ディスプレイ等の画像を表示する装置であり、規格化処理手段２２から送られた算出結果、ラマン信号等の情報を表示する。
ラマン信号測定装置１０は、基本的に以上のような構成である。
【００３６】
以下、ラマン信号測定装置１０の作用について説明することで、本発明のラマン信号測定方法についてより詳細に説明する。
ここで、図４（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明のラマン信号測定方法の一実施形態を示す工程図である。
【００３７】
まず、微細構造体基板１２を支持手段１８の所定位置に載置し、所定位置に固定する。
また、検出対象である被検体６０を含有する液体試料Ｓを貯留部２０ａに入れる。
次に、図４（Ａ）に示すような微細構造体基板１２の検出面１２ａ上に、液体試料滴下手段２０から液体試料Ｓを微細構造体基板１２の検出面１２ａ上に滴下する。
これにより、液体試料Ｓを微細構造体基板１２と支持手段１８とで貯留し保持している状態となり、図４（Ｂ）に示すように、微細構造体基板１２の検出面１２ａに被検体６０を含有する液体試料Ｓが接触している状態となる。
【００３８】
次に、検出面１２ａを乾燥させて、接触している液体試料の液体成分（溶媒）を除去する。これにより、図４（Ｃ）に示すように、突出部４６の周りに被検体６０が付着した状態となる。
【００３９】
次に、励起光照射手段１４から励起光Ｌｅを射出し、被検体６０が付着している検出面１２ａを照明する。
【００４０】
微細構造体基板１２の検出面１２ａは、励起光照射手段１４から射出された光で照明されることで、金属体３６の突出部４６の表面で局在プラズモンが発生し、増強された電場が形成される。
更に、微細構造体基板１２では、金属体３６の突出部４６の表面で電場をより増強させる局在プラズモン共鳴も効果的に発生する。ここで、局在プラズモン共鳴は、局在プラズモンにより局在的に集団運動している金属の自由電子が光の電場に共鳴して振動することで電場がより増強される現象である。微細構造体基板の凹凸形状である突出部４６（つまり凸部）では、入射した光の波長と凹凸形状の大きさとが一致した領域で、突出部４６の自由電子が光の電場に共鳴して振動し、入射された光が高い効率で電場に変化され、突出部４６の周辺の電場がより増強される。
このように、微細構造体基板では、検出面で電場増強効果を得ることができ、増強された電場が形成される。なお、微細構造体基板は、電場をより強くすることができるため、突出部で局在プラズモン共鳴が発生するように励起光の波長、突出部の大きさを設計、調整することが好ましいが、少なくとも突出部に局在プラズモンが発生すればよい。
【００４１】
また、検出面１２ａの被検体６０は、特定波長の励起光が入射されることによりラマン散乱光を発生させる。
また、バックグラウンド（微細構造体基板１２の検出面１２ａおよび検出面１２ａに存在し得る被検体６０以外の物質）も、特定波長の励起光が入射されることによりラマン散乱光を発生する。更に、例えば微細構造体基板１２ａの金属体４４を金で構成した場合等に、特定波長の励起光が入射されることにより微細構造体基板１２ａは蛍光を発生することがある。
被検体６０およびバックグラウンドから発生したラマン散乱光や蛍光等の光は、局在プラズモンに起因して発生された増強電場によって増強される。
ここで、被検体６０から射出されるラマン散乱光は、検出する被検体の種類によって信号が変化する。
【００４２】
検出手段１６は、微細構造体基板１２の検出面１２ａからの光を分光し、被検体６０のラマン信号を検出する。また、検出手段１６は、被検体６０のラマン信号と同時に、リファレンスとなるバックグラウンド信号も同時に検出する。
その後、検出した信号を規格化処理手段２２に送る。
【００４３】
ここで、図５は、規格化処理手段２２による被検体の量または濃度を算出する工程の一実施形態を示すフロー図である。
まず、特定の波長λmを選択する（ステップＳ１０）。具体的には、波長λmとして、検出された被検体６０のラマン信号の波長λrとは異なる波長を選択し、好ましくは、被検体６０のラマン信号の半値幅と異なる波長を選択する。
【００４４】
なお、図示していないが、未知の物質を被検体６０として用いている場合、上記波長λmを特定する工程（ステップＳ１０）の前に、検出された信号と記憶部２８に記憶されている種々の物質のラマン信号とを比較して被検体を同定し、被検体６０のラマン信号の波長λrを特定するのが好ましい。被検体６０として既知の物質を用いている場合は、この工程を省略することができる。
【００４５】
次に、被検体６０のラマン信号の強度を、特定の波長λmにおけるバックグラウンド信号の強度で除算（割り算）する（ステップＳ１２）。これにより、被検体６０のラマン信号は規格化される。
【００４６】
次に、規格化されたラマン信号に基づいて、被検体の量または濃度を算出する（ステップＳ１４）。なお、濃度は、液体試料滴下手段２０から滴下された液体試料の量を加味することで算出することができる。
【００４７】
以下、図６を参照して、規格化処理手段２２による被検体の量または濃度を算出する工程の他の実施形態を説明する。
図６は、規格化処理手段２２による被検体の量または濃度を算出する工程の他の実施形態を示すフロー図である。
まず、特定の波長λmを複数選択する（ステップＳ２０）。波長λmは、図５に示す実施形態における波長λmと同様の基準で選択できるが、本実施形態では複数の互いに異なるλmを選択する。例えば、波長λmとして、検出された被検体６０のラマン信号の波長λrとは異なる波長の中から、互いに異なる波長λ１、λ２、・・・λｎを選択する。
選択する波長λmの数は、２つ以上であれば良い。
【００４８】
なお、図５に示す実施形態と同様に、未知の物質を被検体６０として用いている場合、上記波長λmを特定する工程（ステップＳ２０）の前に、被検体６０に起因するラマン信号と、記憶部２８に記憶されている種々の物質のラマン信号とを比較して被検体６０を同定し、被検体６０のラマン信号の波長λrを特定するのが好ましい。
【００４９】
次に、上記で選択した各波長λmにおけるバックグラウンド信号の強度の和または平均値を求め、この値で被検体６０のラマン信号の強度を除算（割り算）する（ステップＳ２２）。これにより、被検体６０のラマン信号は規格化される。
【００５０】
次に、規格化されたラマン信号に基づいて、被検体の量または濃度を算出する（ステップＳ２４）。なお、濃度は、液体試料滴下手段２０から滴下された液体試料の量を加味することで算出することができる。
【００５１】
以上に説明したように、被検体の量または濃度が算出される。
次に、規格化処理手段２２で算出した被検体の種類および被検体の量、濃度を表示手段２４で表示する。
ラマン信号測定装置１０は、以上のようにして被検体を同定し、量および濃度を算出する。
【００５２】
以上に説明したように、ラマン信号測定装置１０によれば、被検体６０のラマン信号の強度を、特定の波長λmにおけるバックグラウンド信号の強度、または複数の波長λmにおけるバックグラウンド信号の強度の和もしくは平均値で除算することにより、被検体６０のラマン信号を規格化することで、微細構造体基板１２間の信号強度のばらつきを低減することができる。また、ラマン信号を規格化するためのリファレンス物質を使用する必要がないため、被検体とリファレンス物質との親和性を考慮する必要がなく、信号強度のばらつきをより低減することができる。
これにより、微細構造体基板の検出面に形成される突出部にバラツキがあり、検出面に形成される増強電場が微細構造体基板毎に不均一となり、ＳＥＲＳによるラマン散乱光の増強度が不均一となっても、高い精度で定量的に被検体を検出することができる。
また、微細構造体基板の検出面での増強電場が不均一であっても高い精度で定量的に被検体を検出できる。その結果、検出面で発生させる増強電場が不均一な微細構造体基板も、つまり、異なる強度の増強電場を発生させる微細構造体基板も用いることができる。これにより、利用できる微細構造体基板の許容範囲を大きくすることができ、歩留まりを高くすることができ、製造コストを抑制することができる。
【００５３】
ここで、ラマン信号測定装置１０は、微細構造体基板１２の突出部４６に特異的結合物質を固定することが好ましい。
微細構造体基板の突出部に特異的結合物質を配置することで、微細構造体基板の突出部と特定の被検体（つまり、特異的結合物質と結合する特性を有する被検体）とを結合させることができる。
【００５４】
特異的結合物質としては、以下のような物質を用いることができる。
被検体が蛋白質、ペプチドおよびアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被検体とイオン結合する特異的結合物質としては、被検体と反対の電荷を有する表面修飾基を用いることができ、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、第四級アンモニウム基、イミダゾール基、グアニジニウム基、およびこれらの誘導体基等の表面修飾基が挙げられる。また、突出部は、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
また、被検体が蛋白質、ペプチドおよびアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被検体と共有結合する特異的結合物質としては、Ｎ−ヒドロキシスクニンイミジルエステル等の反応性エステル基、カルボジイミド基、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール基、ヒドラジド基、スルファニル基、反応性ジスルフィド基、マレイミド基、アルデヒド基、エポキシ基、（メタ）アクリレート基、ヒドロキシ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、およびこれらの誘導体基等の表面修飾基が挙げられる。また、突出部は、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
ここで、特異的結合物質としては、例示した表面修飾基の中でも、反応性エステル基、ヒドラジド基、スルファニル基、および反応性ジスルフィド基等を用いることが好ましい。
なお、上記記載中、「反応性」とは被検体と反応性を有することを意味する。
【００５５】
更に、突出部には、被検体とイオン結合する特異的結合物質および共有結合する特異的結合物質の両方を固定することが特に好ましい。
この場合、突出部に対して、被検体とイオン結合する特異的結合物質と、被検体と共有結合する特異的結合物質とを同時に固定してもよいし、これらの特異的結合物質を順次固定してもよい。また、これらの特異的結合物質の表面修飾位置は特に制限されず、これらの特異的結合物質同士が互いに結合していてもよいし、これらの特異的結合物質が互いに独立して突出部に結合していてもよい。
【００５６】
また、突出部に対して、被検体とイオン結合する特異的結合物質を固定し、更にこの特異的結合物質を、被検体と共有結合する特異的結合物質で活性化することも特に好ましい。
例えば、はじめに突出部に被検体とイオン結合するカルボキシ基を導入し、更に導入したカルボキシ基を反応性エステル基、ヒドラジド基、スルファニル基および反応性ジスルフィド基等の被検体と共有結合する官能基の形態に誘導して、活性化することが好ましい。
被検体とイオン結合する特異的結合物質と、被検体と共有結合する特異的結合物質とが互いに近接するため、１つ１つの被検体がイオン結合および共有結合によって突出部の表面に対して強固に吸着させることができる。
【００５７】
ここで、被検体とイオン結合する表面修飾基と、被検体と共有結合する表面修飾基とを両方備えた特異的結合物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、１０−カルボキシ−１−デカンチオール、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、７−カルボキシ−１−へプタンチオール、１６−メルカプトヘキサデカン酸、１１，１１’−チオジウンデカン酸等の自己組織化膜を形成する分子；アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロース等のヒドロゲル、またはこれらの誘導体（例えばカルボキシメチル誘導体）；ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール等の水膨潤性有機ポリマー等が挙げられる。
例えば、被検体がアデニンの場合、被検体とイオン結合する表面修飾基と、被検体と共有結合する表面修飾基とを両方備えた特異的結合物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）等が好ましく用いられる。
【００５８】
ここで、微細構造体基板１２の検出面１２ａに液体試料Ｓを接触させた後、検出面１２ａを乾燥させる手段としては、種々の手段を用いることができ、滴下後、一定時間経過させることで自然乾燥させても、検出面を加熱する加熱機構を設け、積極的に溶媒を蒸発させてもよい。
【００５９】
また、ラマン信号測定装置１０では、必ずしもラマン信号の検出時に検出面１２ａを乾燥させる必要はなく、検出面１２ａが濡れた状態、つまり液体試料Ｓの溶媒成分が検出面１２ａに接触している状態でラマン信号を検出してもよい。
特に、乾燥された状態では被検体が反応して別の物質となる場合は、液体試料Ｓの溶媒が検出面１２ａに接触している状態でラマン信号を検出することが好ましい。
【００６０】
また、微細構造体基板の形状は、微細構造体基板１２の形状に限定されず、基体上に局在プラズモンを誘起し得る大きさの凸部が形成されていればよく、種々の形状とすることができる。
【００６１】
図７（Ａ）は、微細構造体基板の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図７（Ｂ）は、図７（Ａ）の上面図である。
図７（Ａ）および図７（Ｂ）に示す微細構造体基板８０は、基体８２と基体８２上に配置された多数の金属微粒子８４とで構成されている。
基体８２は、板状の基板である。基体８２は、金属微粒子８４を電気的に絶縁して支持可能な材料で形成すればよく、材料としては、例えば、シリコン、ガラス、イットリウム安定化ジルコニア（ＹＳＺ）、サファイヤ、シリコンカーバイド等が挙げられる。
【００６２】
多数の金属微粒子８４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさの微粒子であり、基体８２の一面上に分散された状態で固定されている。
ここで、金属微粒子８４は、上述した金属体３６で例示した各種金属で形成することができる。また、金属微粒子８４の形状は特に限定されず、例えば、丸型でも、直方体型でもよい。
このような構成の微細構造体基板８０も金属微粒子８４が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属微粒子８４の周りに局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
【００６３】
次に、図８は、微細構造体基板の他の一例の概略構成を示す上面図である。
図８に示す微細構造体基板９０は、基体９２と基体９２上に配置された多数の金属ナノロッド９４とで構成されている。
ここで、基体９２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００６４】
金属ナノロッド９４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさであり、短軸長さと長軸長さが異なる棒状の金属ナノ粒子であり、基体９２の一面に、分散された状態で固定されている。金属ナノロッド９４は、その短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さは励起光の波長よりも小さいサイズのものである。金属ナノロッド９４は、上述した金属微粒子と同様の金属で作製することができる。なお、金属ナノロッドの詳細な構成については、例えば、特開２００７−１３９６１２号公報に記載されている。
ここで、微細構造体基板９０は、上述した微細構造体基板８０と同様の方法で作製することができる。
このような構成の微細構造体基板９０も金属ナノロッドが配置された検出面に励起光が照射されることで、金属ナノロットの周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体基板９０を用いた場合も、微細構造体基板１２および微細構造体基板８０と同様に、微細構造体基板を作製することができ、更に、被検体を高い感度で検出することができる。
【００６５】
次に、図９（Ａ）は、微細構造体基板の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図９（Ｂ）は、図９（Ａ）の断面図である
図９に示す微細構造体基板１００は、基体１０２と基体１０２上に配置された多数の金属細線１０４とで構成されている。
ここで、基体１０２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００６６】
金属細線１０４は、局在プラズモンを誘起し得る線幅の線状部材であり、基体１０２の一面に格子状に配置されている。金属細線１０４は、上述した金属微粒子、金属体と同様の金属で作製することができる。また、金属細線１０４の作製方法は、特に限定されず、蒸着、メッキ等、金属配線を作製する種々の方法で作製することができる。
ここで、金属細線１０４の線幅は、光によって金属中で振動する電子の平均自由行程以下であることが好ましく、具体的には５０ｎｍ以下、特に３０ｎｍ以下であることが好ましい。また、金属細線１０４の配置パターンは、特に限定されない。例えば、複数の金属細線を交差させずに、互いに平行に配置してもよい。また、金属細線の形状も直線に限定されず、曲線としてもよい。
【００６７】
このような構成の微細構造体基板１００も金属細線が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属細線の周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体基板１００を用いた場合も、微細構造体基板１２、微細構造体基板８０および微細構造体基板９０と同様に、微細構造体基板を作製することができ、更に、被検体を高い感度で検出することができる。
【００６８】
また、微細構造体基板は、上述した微細構造体基板１２、微細構造体基板８０、微細構造体基板９０および微細構造体基板１００にも限定されず、ぞれぞれの局在プラズモンを誘起し得る凸部を組み合わせた構成としてもよい。
また、基体に蒸着して金属微粒子を形成する場合は、基体上への蒸着を種々の方向から行うようにしてもよい。
ここで、微細構造体基板は、基体上に金属微粒子を配置してから、基体上へ、金属膜を蒸着し、凸部を形成することが好ましい。このように金属微粒子配置してから、金属膜を蒸着することで、金属微粒子の間に金属膜（微細な金属微粒子）を形成することができ、金属微粒子と金属膜とを近接させることができるため、微細構造体基板の検出面のホットスポットをより多くすることができる。
【００６９】
また、上記実施形態では、液体試料滴下手段により液体試料を微細構造体基板の検出面に滴下したが、本発明はこれに限定されず、微細構造体基板の表面に液体試料を供給する流路を形成し、この流路に液体試料を流すことで、検出面に液体試料を供給してもよい（つまり、検出面に液体試料を接触させてもよい）。
また、被検体を溶媒に溶解させて液体試料とせずに、被検体をそのまま微細構造体基板の検出面に付着させる方法を採用してもよい。
【００７０】
また、上記実施形態では、被検体のラマン信号をより高感度に検出可能となる点から、更に、上記規格化ステップにおいて規格化した被検体のラマン信号から、バックグラウンド信号を除去するバックグラウンド除去ステップを有するのが好ましい。
【００７１】
以上、本発明に係るラマン信号測定方法について詳細に説明したが、本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良や変更を行ってもよい。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を示して、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
まず、微細構造体基板として上述した図２に示す構造の微細構造体基板１２を１２個準備し、基板１〜１２とした。そして、基板１を微細構造体基板１２として図１に示すラマン信号測定装置１０の所定位置に載置し、固定した。
次に、被検体６０（キーバンドが１３６０ｃｍ-１のローダミン６Ｇ）を、エタノールに溶解させて、１００μＭの液体試料Ｓを調製した。この液体試料Ｓをスポイトにより基板１の検出面に滴下し、乾燥させて被検体６０を検出面１２ａの表面に付着させた。
次に、出力２ｍＷ、励起波長７８５ｎｍの半導体レーザを検出面１２ａに照射し、検出面１２ａで増強場を発生させ、増強された被検体６０のラマン信号およびバックグラウンド信号を顕微ラマン分光装置（堀場ジョバンイボン社製、ＬａｂＬＡＭ  ＨＲ−８００）で検出した。検出された被検体６０のラマン信号およびバックグラウンド信号を図１０に示す。
次に、特定の波長λmとして、被検体６０のラマン信号の波長λr（１３６０ｃｍ-１）とは異なる波長であるという理由から１０００ｃｍ-１を選択した。
次に、被検体６０のラマン信号の強度を、波長λm（１０００ｃｍ-１）におけるバックグラウンド信号の強度で除算することにより、被検体６０のラマン信号を規格化した。
【００７３】
基板１を準備しておいた基板２と交換し、上記で準備した液体試料を基板２の検出面に上記と同じ量滴下し、乾燥させて被検体６０を検出面１２ａの表面に付着させた。次に、上記と同様に、被検体６０のラマン信号およびバックグラウンド信号を検出し、更に、被検体６０のラマン信号の強度を、波長λm（１０００ｃｍ-１）におけるバックグラウンド信号の強度で除算することにより、被検体のラマン信号を規格化した。
また、基板３〜１２を用いて、上記と同様に、規格化した被検体のラマン信号を求めた。
【００７４】
基板１〜１２を用いて検出された被検体６０のラマン信号およびバックグラウンド信号を図１０に示す。
図１０に示すように、測定時（規格化前）の強度は、各微細構造体基板間でのばらつきが大きく、ＣＶ値は４０％であった。一方、規格化後の強度は、各微細構造体基板間でのばらつきが低減され、ＣＶ値は２０％であった。ここで、ＣＶ値（変動係数）は、測定データの分布の拡がり（ばらつき）を数量的に表す指標であり、ＣＶ値が小さいほど強度のばらつきが少ないと言える。
このように、特定の波長におけるバックグラウンド信号の強度を用いて被検体のラマン信号を規格化することで、微細構造体基板で発生する増強電場の強度によらず、高い精度で被検体の強度を検出することができる。
更に、規格化した強度に基づいて検出を行うことにより、高い精度で被検体の量または濃度を検出できる。
以上より本発明の効果は明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明のラマン信号測定方法を用いるラマン信号測定装置の一実施形態の概略構成を示すブロック図である。
【図２】図１に示すラマン信号測定装置の微細構造体基板の一実施形態の概略構成を示す斜視図である。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体基板の作製方法を示す工程図である。
【図４】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明のラマン信号測定方法の一実施形態を示す工程図である。
【図５】規格化処理手段による被検体の量または濃度を算出する工程の一実施形態を示すフロー図である。
【図６】規格化処理手段による被検体の量または濃度を算出する工程の他の実施形態を示すフロー図である。
【図７】（Ａ）は、微細構造体基板の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の部分上面図である。
【図８】微細構造体基板の他の一例の概略構成を示す上面図である。
【図９】（Ａ）は、微細構造体基板の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の断面図である。
【図１０】基板１〜１２を用いて検出した被検体のラマン信号およびバックグラウンド信号を示す。
【符号の説明】
【００７６】
１０  ラマン信号測定装置
１２、８０、９０、１００  微細構造体基板
１４  励起光照射手段
１６  検出手段
１８  支持手段
２０  液体試料滴下手段
２０ａ  貯留部
２０ｂ  滴下部
２２  規格化処理手段
２４  表示手段
２６  演算部
２８  記憶部
３０、８２、９２、１０２  基体
３２  誘電体基材
３４  導電体
３６  金属体
４０  微細孔
４２  微細柱状体
４４  棒部
４５  充填部
４６  突出部
４８  被陽極酸化金属体
６０  被検体
９４  金属ナノロッド
１０４  金属細線
Ｓ  液体試料
【図１】
0005097590.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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