(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上限臨界溶液温度を有するポリマーが固定化された磁性微粒子であって、該上限臨界溶液温度を有するポリマーが、下記一般式（１）で表されるモノマーを重合させて得られたポリマーである磁性微粒子。
【化１】
0004887530.tif 000020
（式中、Ｒ１１は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１２は単結合または炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示す。）
【請求項２】
上限臨界溶液温度を有するポリマーが、上記一般式（１）で表されるモノマーと、下記一般式（２）で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマーである請求項１記載の磁性微粒子。
【化２】
0004887530.tif 000021
（式中、Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１４は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐状もしくは環状のアルキル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。）
【請求項３】
上限臨界溶液温度を有するポリマーが、上記一般式（１）で表されるモノマーと、ビオチンをその構造の一部とするモノマーとを重合させて得られたポリマーである請求項１記載の磁性微粒子。
【請求項４】
上限臨界溶液温度を有するポリマーが、さらに親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いて重合して得られたポリマーである請求項１〜３の何れか１項記載の磁性微粒子。
【請求項５】
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が、上限臨界溶液温度を有するポリマーに固定化された請求項１または２記載の磁性微粒子。
【請求項６】
相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、ｃＤＮＡとｍＲＮＡ、酵素（活性部位）と基質、酵素（活性部位）と生産物、酵素（活性部位）と競争阻害剤、酵素（補酵素結合部位）と補酵素、酵素（補酵素結合部位）とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Ｆｃ部位とプロテインＡ、Ｆｃ部位とプロテインＧ、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、およびヘパリンとラミニンとの組合せから選ばれた１種以上である請求項５記載の磁性微粒子。
【請求項７】
相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジンである請求項５記載の磁性微粒子。
【請求項８】
上限臨界溶液温度を有するポリマーに固定化された該一対の物質の一方が、ビオチンである請求項５記載の磁性微粒子。
【請求項９】
ビオチンがアビジンと結合したビオチン（以下「アビジン結合ビオチン」と記載する。）である請求項８記載の磁性微粒子。
【請求項１０】
アビジン化酵素をビオチンに結合させた請求項８記載の磁性微粒子。
【請求項１１】
ビオチン化酵素をアビジン結合ビオチンに結合させた請求項９記載の磁性微粒子。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする物質の変換方法。
【請求項１３】
アビジン化抗体をビオチンに結合させた請求項８記載の磁性微粒子。
【請求項１４】
ビオチン化抗体をアビジン結合ビオチンに結合させた請求項９記載の磁性微粒子。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。
【請求項１６】
アビジン化分子シャペロンをビオチンに結合させた請求項８記載の磁性微粒子。
【請求項１７】
ビオチン化分子シャペロンをアビジン結合ビオチンに結合させた請求項９記載の磁性微粒子。
【請求項１８】
請求項１６または１７記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。
【請求項１９】
アビジン化ヒートショックプロテインをビオチンに結合させた請求項８記載の磁性微粒子。
【請求項２０】
ビオチン化ヒートショックプロテインをアビジン結合ビオチンに結合させた請求項９記載の磁性微粒子。
【請求項２１】
請求項１９または２０記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする変性蛋白の改質方法。
【請求項２２】
アビジン化核酸をビオチンに結合させた請求項８記載の磁性微粒子。
【請求項２３】
ビオチン化核酸をアビジン結合ビオチンに結合させた請求項９記載の磁性微粒子。
【請求項２４】
請求項２２または２３記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法により核酸を精製、または濃縮し、該核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項２６】
増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法である請求項２５記載の核酸の検出方法。
【請求項２７】
請求項１〜９の何れか１項記載の磁性微粒子を含有する分離剤。
【請求項２８】
請求項２７記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法。
【請求項２９】
磁性微粒子の存在下、下記一般式（１）で表されるモノマーを重合させることを特徴とする上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
【化３】
0004887530.tif 000022
（式中、Ｒ１１は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１２は単結合または炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示す。）
【請求項３０】
磁性微粒子の存在下、上記一般式（１）で表されるモノマーと、一般式（２）で表されるモノマーとを重合させることを特徴とする請求項２９項記載の上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
【化４】
0004887530.tif 000023
（式中、Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１４は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐状もしくは環状のアルキル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。）
【請求項３１】
磁性微粒子の存在下、上記一般式（１）で表されるモノマーと、ビオチンをその構造の一部とするモノマーとを重合させることを特徴とする請求項２９記載の上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
【請求項３２】
さらにモノマーとして、親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いることを特徴とする請求項２９〜３１の何れか１項記載の上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
＜技術分野＞
本発明は、磁性微粒子およびその製造方法、微生物の分離方法または濃縮方法、核酸の精製方法、検出方法、または濃縮方法、分離剤、生体物質の分離方法、および物質の変換方法に関する。
＜背景技術＞
アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１９９４年、４１巻、９９〜１０５頁、および、ジャーナルオブファーメンテーションアンドバイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）１９９７年、８４巻、３３７〜３４１頁には、下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と記述する。）を有するポリイソプロピルアクリルアミドを、粒径が１００〜２００ｎｍ程度の磁性微粒子に固定化した刺激応答性磁性微粒子が開示されている。
該刺激応答性磁性微粒子は、その粒子径が１００〜２００ｎｍ程度と微小であることから水によく分散する。該刺激応答性磁性微粒子の水溶液を加熱して、その温度をＬＣＳＴ以上とした場合には、該刺激応答性磁性微粒子が析出、凝集する。この凝集物は磁力で容易に回収可能であることから、該刺激応答性磁性微粒子に抗体や抗原を固定化した刺激応答性磁性微粒子を用い、種々の生体分子や微生物の分離を行う試みがなされている。
しかしながら、前述の方法で生体分子等の分離を行う場合、その目的物質と該刺激応答性磁性微粒子とを含有する溶液の温度をＬＣＳＴ以上にする必要がある。用いる刺激応答性磁性微粒子のＬＣＳＴ、さらには目的物質の熱安定性によっては、目的物質である生体分子等を損傷もしくは失活させてしまう場合があった。
＜発明の開示＞
本発明者らは、前述の従来技術の課題に鑑み鋭意研究を重ねた。その結果、上限臨界溶液温度を有するポリマーを固定化した磁性微粒子を、生体分子等の分離に用いた場合には、その目的物質である生体分子等を損傷もしくは失活させることなく分離、回収することが可能であることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
本発明は以下の構成を有する。
（１）上限臨界溶液温度を有するポリマーが固定化された磁性微粒子。
（２）上限臨界溶液温度を有するポリマーが、下記一般式（１）で表されるモノマーを重合させて得られたポリマーである前記第１項記載の磁性微粒子。
0004887530.tif 000002
（式中、Ｒ１１は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１２は単結合または炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示す。）
（３）上限臨界溶液温度を有するポリマーが、上記一般式（１）で表されるモノマーと、下記一般式（２）で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマーである前記第１項記載の磁性微粒子。
0004887530.tif 000003
（式中、Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１４は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐状もしくは環状のアルキル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。）
（４）上限臨界溶液温度を有するポリマーが、上記一般式（１）で表されるモノマーと、ビオチンをその構造の一部とするモノマーとを重合させて得られたポリマーである前記第１項記載の磁性微粒子。
（５）上限臨界溶液温度を有するポリマーが、さらに親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いて重合して得られたポリマーである前記第２項〜第４項の何れか１項記載の磁性微粒子。
（６）相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が、上限臨界溶液温度を有するポリマーに固定化された前記第１項記載の磁性微粒子。
（７）相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、ｃＤＮＡとｍＲＮＡ、酵素（活性部位）と基質、酵素（活性部位）と生産物、酵素（活性部位）と競争阻害剤、酵素（補酵素結合部位）と補酵素、酵素（補酵素結合部位）とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Ｆｃ部位とプロテインＡ、Ｆｃ部位とプロテインＧ、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、およびヘパリンとラミニンとの組合せから選ばれた１種以上である前記第６項記載の磁性微粒子。
（８）相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジンである前記第６項記載の磁性微粒子。
（９）上限臨界溶液温度を有するポリマーに固定化された該一対の物質の一方が、ビオチンである前記第６項記載の磁性微粒子。
（１０）ビオチンがアビジンと結合したビオチン（以下「アビジン結合ビオチン」と記載する。）である前記第９項記載の磁性微粒子。
（１１）アビジン化酵素をビオチンに結合させた前記第９項記載の磁性微粒子。
（１２）ビオチン化酵素をアビジン結合ビオチンに結合させた前記第１０項記載の磁性微粒子。
（１３）前記第１１項または第１２項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする物質の変換方法。
（１４）アビジン化抗体をビオチンに結合させた前記第９項記載の磁性微粒子。
（１５）ビオチン化抗体をアビジン結合ビオチンに結合させた前記第１０項記載の磁性微粒子。
（１６）前記第１４項または第１５項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。
（１７）アビジン化分子シャペロンをビオチンに結合させた前記第９項記載の磁性微粒子。
（１８）ビオチン化分子シャペロンをアビジン結合ビオチンに結合させた前記第１０項記載の磁性微粒子。
（１９）前記第１７項または第１８項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。
（２０）アビジン化ヒートショックプロテインをビオチンに結合させた前記第９項記載の磁性微粒子。
（２１）ビオチン化ヒートショックプロテインをアビジン結合ビオチンに結合させた前記第１０項記載の磁性微粒子。
（２２）前記第２０項または第２１項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする変性蛋白の改質方法。
（２３）アビジン化核酸をビオチンに結合させた前記第９項記載の磁性微粒子。
（２４）ビオチン化核酸をアビジン結合ビオチンに結合させた前記第１０項記載の磁性微粒子。
（２５）前記第２３項または第２４項記載の磁性微粒子を用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。
（２６）前記第２５項記載の核酸の精製、または濃縮方法により得られた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
（２７）増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法である前記第２６項記載の核酸の検出方法。
（２８）前記第１項〜第１０項の何れか１項記載の磁性微粒子を含有する分離剤。
（２９）前記第２８項記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法。
（３０）磁性微粒子の存在下、上限臨界溶液温度を有するポリマーを重合することを特徴とする上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
（３１）磁性微粒子の存在下、上記一般式（１）で表されるモノマーを重合させることを特徴とする上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
（３２）磁性微粒子の存在下、上記一般式（１）で表されるモノマーと、一般式（２）で表されるモノマーとを重合させることを特徴とする上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
（３３）磁性微粒子の存在下、上記一般式（１）で表されるモノマーと、ビオチンをその構造の一部とするモノマーとを重合させることを特徴とする上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
（３４）さらにモノマーとして、親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いることを特徴とする前記第３０項〜第３３項の何れか１項記載の上限臨界溶液温度を有する磁性微粒子の製造方法。
＜発明を実施するための最良の形態＞
以下、本発明について更に詳しく説明する。
本発明に必須の上限臨界温度（以下「ＵＣＳＴ」と記述する。）を有するポリマー（以下「ＵＣＳＴポリマー」と記述する。）とは、ポリマー含有溶媒において、該ポリマー含有溶媒の温度が特定温度を越えた場合には、該ポリマーが溶媒に溶解した状態となり、該特定温度以下となった場合には、該ポリマーが溶媒中に析出、凝集する性質を有するポリマーのことである。ＵＣＳＴとは該特定温度のことである。また、ＵＣＳＴを境にポリマーの溶解、析出が起こる現象をＵＣＳＴ特性と言う。
前述の溶媒は特に限定されるものではないが、具体的には水、および水を５０重量％以上含有する液体を挙げることができる。さらに水を５０重量％以上含有する液として具体的には、生理食塩水、緩衝液などを挙げることができる。また、ポリマーを含有した状態でＵＣＳＴ特性を示すのであれば、該溶媒は、アセトンなどの有機溶媒と水との混合液であっても良い。
本発明において使用するＵＣＳＴポリマーは、まさにＵＣＳＴを有するポリマーであれば何れのポリマーであっても使用することができる。該ＵＣＳＴポリマーとして具体的には、アクリロイルグリシンアミドのホモポリマー、アクリロイルグリシンアミドと重合性ビオチンモノマーの共重合ポリマー、アクリロイルグリシンアミドとＮホルミルアクリルアミドの共重合ポリマー、アクリルアミドとＮホルミルアクリルアミドの共重合ポリマー、およびアクリルアミドとＮアセチルアクリルアミドの共重合ポリマーなどを挙げることができる。
その中でも下記一般式（１）で表されるモノマー（以下「モノマー（１）」と記述する。）重合させて得られたポリマー、さらに、モノマー（１）と一般式（２）で表されるモノマー（以下「モノマー（２）」と記述する。）とを重合させて得られたポリマーは特に好ましく本発明に使用することができる。
0004887530.tif 000004
一般式（１）中、Ｒ１１は水素原子又はメチル基を示し、本発明においてＲ１１は水素原子であることが好ましい。Ｒ１２は単結合または炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、本発明においてＲ１２はメチレン基がであることが好ましい。
0004887530.tif 000005
一般式（２）中、Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示し、本発明においてＲ１３は水素原子であることが好ましい。Ｒ１４は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐状もしくは環状のアルキル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。アルキル基としては炭素数１〜５の直鎖のアルキル基が好ましく、アルコキシル基およびアルキルアミノ基のアルキル基部分としては、炭素数１〜５の直鎖のアルキル基が好ましい。アリール基としては、フェニル基、およびナフチル基等が挙げられ、複素環基となるものとしてはピリミジン等が挙げられる。
ＵＣＳＴポリマーの重合において、モノマー（１）とモノマー（２）の他に、親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いた場合には、その種類および使用割合を変えることによってＵＣＳＴを制御することが可能である。
使用するモノマーが親水性であるのか、もしくは疎水性であるのかの分類は、重合に用いるモノマー（１）の親水性を基準として行う。つまり、重合に用いるモノマー（１）よりも親水性であるものは親水性モノマーであり、疎水性であるものは疎水性モノマーである。また、重合に用いるモノマー（１）が複数である場合には、その中で最も親水性であるモノマーを基準に分類を行えばよい。
重合に用いるモノマー（１）の種類により異なり、一概に特定することはできないが、具体的にその例を挙げれば、本発明において使用する親水性モノマーとしては、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、およびアリルアミンなどを挙げることができ、疎水性モノマーとしては、アルキル（メタ）アクリレート、スチレン、エチレン、プロピレン、アセチレン等の不飽和炭化水素、アルキルビニルエーテル、およびアルキル（メタ）アクリルアミドなどを挙げることができる。
ＵＣＳＴポリマーの重合に親水性モノマーを用いた場合、ＵＣＳＴは低下する傾向にあり、反対に疎水性モノマーを用いた場合、ＵＣＳＴは上昇する傾向にある。
本発明ＵＣＳＴポリマー重合の際の、各モノマーの組成は特に限定されるものではないが、モル比で通常、モノマー（１）：モノマー（２）：その他のモノマー＝９５〜２０：１〜６０：０〜４０の割合であり、好ましくは９５〜５０：１〜５０：０〜２０の割合である。
本発明に使用する磁性微粒子の素材は、常温で磁性を示す物質であれば有機物質であっても無機物質であっても良い。本発明においては以下のものに特定されるものではないが、磁性を示す物質として具体的には、酸化ニッケル粒子、フェライト粒子、マグネタイト粒子、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石の微粒子、およびヘマタイト粒子などを挙げることができる。
該磁性微粒子の粒子径は、該磁性微粒子を分散させた溶媒に磁力をかけた場合であっても、その磁力によって該磁性微粒子が吸着されないサイズであればよく、本発明においては特に限定されるものではないが、１ｎｍ〜１μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。
本発明に使用する磁性微粒子の調製方法について、マグネタイトを用いた場合を例にとって説明する。オレイン酸ナトリウムとドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムとを用いてマグネタイトを二重のミセルとし、このミセルを水溶液中に分散させることにより、粒径が数十ｎｍである磁性マグネタイト微粒子を得ることができる。この方法はバイオカタライシス（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）１９９１年、第５巻、６１〜６９頁に記載の方法である。
本発明の磁性微粒子は、ＵＣＳＴポリマーが固定化されたものであり、且つ微粒であることから、該磁性微粒子それ自体もＵＣＳＴを有する。
本発明における該磁性微粒子およびＵＣＳＴポリマーのＵＣＳＴとは、具体的には、該磁性微粒子またはＵＣＳＴポリマーを水に対して１重量％の割合で水に添加した磁性微粒子またはＵＣＳＴポリマー含有水を加熱して清澄状態とし、次いで該磁性微粒子またはＵＣＳＴポリマー含有水の温度を１分あたり１℃の割合で降下させて行き、該磁性微粒子またはＵＣＳＴポリマー含有水の可視光透過率が、清澄状態時の１／２の値になった時点の温度である。
該磁性微粒子またはＵＣＳＴポリマー含有水の可視光透過率が、清澄状態時の１／２の値になって、さらに昇温乃至降温してもある温度範囲で１／２の値が保持される場合がある。この温度範囲の上限を昇温時のＵＣＳＴと言い、同下限を降温時のＵＣＳＴと言う。この両者の差（温度範囲）をスイッチング範囲言う。このスイッチング範囲は狭ければ狭いほど良く、本発明においては１０℃以下であることが好ましく、より好ましくは０℃である。
本発明磁性微粒子のＵＣＳＴは特に限定されるものではないが、本発明の磁性微粒子を分離剤として使用する場合には、０〜５０℃の範囲であることが好ましく、特に好ましくは０〜４０℃の範囲である。
本発明において、ＵＣＳＴポリマーの磁性微粒子への固定化は、何れの作用によるものであっても構わない。物理的な吸着であっても、水素結合や共有結合などの化学結合によるものであっても良い。固定化方法として具体的には、磁性微粒子の存在下にＵＣＳＴポリマーを重合する方法、溶媒中においてＵＣＳＴポリマーと磁性微粒子とを接触させる方法、磁性微粒子にＳＨ基などの官能基を有するカップリング剤を結合させ、該官能基を基点としてＵＣＳＴポリマーをグラフト重合させる方法などを挙げることができる。
その中でも、磁性微粒子の存在下にＵＣＳＴポリマーを重合する方法で得られた本発明の磁性微粒子は、その含有液中において溶解と析出・凝集との繰返しを行った場合であっても、固定化されたＵＣＳＴポリマーが該磁性微粒子から脱離しにくいことから好ましい。
さらに、磁性微粒子の存在下、モノマー（１）のみ、もしくはモノマー（１）とモノマー（２）とを重合させる方法は、本発明により好ましく用いることができ、磁性微粒子の存在下、親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上、モノマー（１）、およびモノマー（２）を重合させる方法は、本発明に特に好ましく用いることができる。
具体的には、各モノマーを、磁性微粒子をけん濁させた溶液へ添加し、窒素置換下、攪拌しながら重合開始剤（例えば過硫酸アンモニウムや過硫酸カリウム）および重合促進剤（例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）を添加し、数時間攪拌することでポリマーが物理吸着した磁性微粒子を調製することが出来る。
本発明磁性微粒子のＵＣＳＴは、該磁性微粒子に固定化されているＵＣＳＴポリマー固有のＵＣＳＴと同じ温度であることが好ましい。また、本発明磁性微粒子は、その溶解液中において溶解と析出・凝集との繰返しを行った場合であっても、固定化されたＵＣＳＴポリマーがしっかり保持されているものであることが好ましい。
ＵＣＳＴを有し、且つ液中において凝集する本発明の磁性微粒子は、その凝集物が磁力によって容易に回収することができることから、溶液中における目的物質の分離、回収、および濃縮などに極めて有効に用いることができる。
相互に特異的作用を有する一対の物質とは、イオン間の相互作用、水素結合、疎水的相互作用、および金属原子に対する配位などの相互作用によって特異的に相互に吸着する物質であり、具体的には、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、ｃＤＮＡとｍＲＮＡ、酵素（活性部位）と基質、酵素（活性部位）と生産物、酵素（活性部位）と競争阻害剤、酵素（補酵素結合部位）と補酵素、酵素（補酵素結合部位）とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Ｆｃ部位とプロテインＡ、Ｆｃ部位とプロテインＧ、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、ヘパリンとラミニン、ポリチミンとｍＲＮＡ、大腸菌抗体と大腸菌、および抗体（ＩｇＧ）と抗ＩｇＧとの組合せを挙げることができる。
その中でも、ビオチンとアビジンとの組合せは本発明に最も好ましく使用することができる。ＵＣＳＴポリマーにビオチンを固定化した場合には、アビジンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となり、ＵＣＳＴポリマーにアビジンを固定化した場合には、ビオチンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となる。
なお、本発明においてビオチンは、イミノビオチンであってもよく、アビジンはストレプトアビジンであっても良い。何れの場合も本発明の効果を得ることができる。
その際の目的物質は特に限定されるものではないが、例えば酵素、抗体、核酸、分子シャペロン、およびヒートショックプロテインなどを挙げることができる。
ＵＣＳＴポリマーにアビジンが固定化された場合には、アビジンのビオチン結合４サイトのうち最大３サイトを開いた状態に保つことが可能であることから、ビオチン化された目的物質をさらに効率よく分離、回収することが可能となる。
しかしながら、現実的にはアビジンを直接ＵＣＳＴポリマーに固定化することは困難であることから、アビジンをＵＣＳＴポリマーに比較的容易に固定化するには、ビオチンを介してＵＣＳＴポリマーに固定化することが好ましい。つまり、アビジンはアビジン結合ビオチンのかたちでＵＣＳＴポリマーに固定化されていることが好ましい。
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が、ＵＣＳＴポリマーに固定化された本発明の磁性微粒子を用いれば、そのもう一方の物質、該物質が固定化された物質を容易に分離、回収することが可能となる。
例えば、酵素をＵＣＳＴポリマーに固定化した磁性微粒子を酵素反応に用いれば、従来の固定化酵素を用いた酵素反応に比べ、より速い速度で基質を変換することが可能である。その際使用される酵素は特に限定されるものではないが、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、分解酵素、異性化酵素、および合成酵素などを挙げることができる。
基質の変換により生成した物質は、本発明の磁性微粒子と該生成物質とを含有する溶液の温度を下げることにより、該磁性微粒子のみを析出させ、析出した該磁性微粒子のみを磁力を用いて取り除くことにより、酵素と該生成物質とを容易に分離することができる。
抗体をＵＣＳＴポリマーに固定化した磁性微粒子を用いれば、溶液中の微生物の分離、濃縮を効率よく行うことができる。その際に使用する抗体はモノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であっても良い。
溶液中の微生物の分離方法、濃縮方法は特に限定されるものではないが、具体的には、微生物を含有する溶液に該磁性微粒子を添加し、微生物と該磁性微粒子とを充分に接触させた後、該溶液の温度を下げることにより、微生物を吸着した磁性微粒子のみを析出させ、析出した磁性微粒子のみを磁力を用いて取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の微生物を容易に分離、濃縮することが可能である。
例えば、使用する抗体がサルモネラ抗体であれば、食品懸濁液中のサルモネラ菌だけを容易に分離、濃縮することが可能であることから、任意の抗体が固定化された本発明の磁性微粒子と適当な検出試薬とを組み合わせることによって、感度の高い微生物検査キットもしくは診断薬を作ることも可能である。
分子シャペロンやヒートショックプロテインをＵＣＳＴポリマーに固定化した磁性微粒子は、溶液中における、酵素や抗体の安定性を高めることから、その繰り返し利用が可能となり、工業レベルでの蛋白質生産、物質生産を補助することが出来る。通常、分子シャペロンのような蛋白質は高価なため、工業レベルでの使用は困難である。
塩基をＵＣＳＴポリマーに固定化した磁性微粒子を、核酸を含有する溶液に添加し、該磁性微粒子と核酸とを充分に接触させた後、該溶液の温度を下げることにより、核酸を吸着した磁性微粒子のみを析出させ、析出した磁性微粒子のみを磁力を用いて取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の核酸を容易に分離、濃縮することが可能である。また、該核酸の分離、濃縮方法は、特定遺伝子の精製、濃縮、検出等に応用することも可能である。
また、複数種類の核酸と該磁性微粒子とを含有する混合液中で、ハイブリダイゼーションを充分に行った後、該混合液の温度を下げることにより核酸ごと凝集、回収を行った後、再度温度を上げることで容易に任意の核酸の精製、検出、濃縮を行うことが出来る。
例えば目的とするＤＮＡと相補的な配列を有するビオチン化ＤＮＡやビオチン化ポリチミンを用いることで、目的ＤＮＡやｍＲＮＡを濃縮、精製することが出来る。得られた核酸を各種遺伝子増幅法により増幅させることで、感度良く核酸を検出することが出来る。核酸の増幅方法は特に限定されないが、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法が本発明に好ましく用いることができる。
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、本発明の磁性微粒子に固定化されたＵＣＳＴポリマーに固定化する方法は特に限定されるものではなく、既に合成されたＵＣＳＴポリマーに該一対の物質の一方を固定化する方法（以下「固定化法」と記載する。）や、該一対の物質の一方を構造の一部とするモノマーと、重合によりＵＣＳＴポリマーを形成するモノマーとを重合させることにより、ＵＣＳＴポリマーに該一対の物質の一方を導入する方法（以下「重合法」と記載する。）などを挙げることができる。
前述の固定化法としては共有結合であることが好ましいが、イオンコンプレックスや電荷移動錯体を利用した結合、生化学的親和性等を利用した結合であってもよい。
抗体や酵素などの蛋白質をＵＣＳＴポリマーに結合させる場合であれば、該蛋白質が有するアミノ基やカルボキシル基等の官能基の反応性を利用して、ＵＣＳＴポリマーと該蛋白質とを結合させればよい。
例えば、蛋白質のアミノ基を利用する場合は、ＵＣＳＴポリマーにカルボキシル基を導入して、下記に示すような反応式でアミド結合を作ることができる。
0004887530.tif 000006
また、下記に示すようなアルデヒド基を利用する方法、エポキシ基を利用して、ＵＣＳＴポリマーと蛋白質とを結合させても良い。
0004887530.tif 000007
また、該蛋白質のカルボキシル基を利用する場合であれば、ＵＣＳＴポリマーにアミノ基を導入して、下記に示すような反応式でアミド結合を作ることができる。
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また、例えば、メタクリル酸のカルボキシル基などを、上記モノマーや他のモノマーに共重合させて、カルボキシル基など適当な官能基を持つようにＵＣＳＴポリマーを設計することにより、カルボジイミド等を用いる既知の蛋白質固定化方法により酵素や抗体などの蛋白質を、ＵＣＳＴポリマーに固定化することも出来る。
ＵＣＳＴポリマーに抗体を導入して蛋白質と結合させる場合、該結合は、ｐＨが中性付近の燐酸、トリスバッファーの中で行われることが好ましい。また、塩濃度は目的に応じて適宜設定できる。
一方、重合法は、ポリマー中への重合比を比較的制御しやすいことから本発明に好ましく用いることが出来る。
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、本発明の磁性微粒子に固定化されたＵＣＳＴポリマーに固定化する方法について、ビオチンをその構造の一部とするモノマーを用いた該重合法を例にとって詳細に説明する。
重合によりＵＣＳＴポリマーを形成するモノマーとしては、Ｎアクリロイルグリシンアミド、Ｎホルミルアクリルアミド、Ｎアセチルアクリルアミド、アクリルアミド、重合性ビオチン誘導体などを挙げることが出来、一方、ビオチンをその構造の一部とするモノマーとしては、ビオチンの末端カルボキシル基を用いた（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリレート誘導体などを挙げることが出来るが、本発明においてこれらに限定されるものではない。
該重合法において好ましく使用することができるＵＣＳＴポリマーを形成するモノマーとしては、前述のモノマー（１）を挙げることができ、ビオチンをその構造の一部とするモノマーとしては、下記一般式（３）で表される重合性ビオチン誘導体を挙げることができる。
0004887530.tif 000009
一般式（３）中、Ｒ２は水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基を示す。Ｔは酸素原子又は＝ＮＨ基を示す。Ｗは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基もしくは炭素数１〜５のアルキレン基を示す。Ｕは単結合又は−ＮＨ−基を示す。Ｘは単結合又は炭素数１〜８の炭化水素結合、酸素原子もしくは−ＮＨ−基を示す。Ｙは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基、−ＮＨ基−、１，２−ジオキシエチレン基もしくは１，２−ジアミノエチレン基を示す。Ｚは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基、炭素数１〜５のアルキレン基、酸素原子もしくは−ＮＨ−基を示す。Ｖは単結合又は炭素数１〜５のアルキレン基を示す。
さらに、モノマー（１）として具体的に、下記一般式（４）で表されるアクリロイルグリシンアミドを挙げることができる。
0004887530.tif 000010
一般式（３）で表されるモノマーの中でも、下記一般式（５）〜（７）で表される重合性ビオチン誘導体は、該重合法に好ましく使用することができる。
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一般式（５）〜（７）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜４のアルキレン基を示し、Ｒ５は炭素数２又は３のアルキレン基を示す。Ｘ１は酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｘ２〜Ｘ５はそれぞれ独立に、酸素原子又は−ＮＨ−基を示す。Ｔ、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ上記一般式（３）における定義と同じである。
上記一般式（５）で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式（８）で示されるビオチン又はビオチン誘導体の側鎖カルボキシル水酸基を適当な脱離基に変換後、下記一般式（９）で示されるアクリル誘導体と縮合反応させることにより得ることができる。
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上記一般式（６）で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式（１０）で示されるビオチン誘導体を、適当なアクリル化剤（メタクリル化剤等も含む。例えばアクリル酸、アクリル酸クロリド、無水アクリル酸、アクリロキシスクシンイミド等のアクリル化剤、メタクリル酸、メタクリル酸クロリド、無水メタクリル酸、メタクリロキシスクシンイミド等のメタクリル化剤などが挙げられる。）と反応させることにより得ることができる。
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ここで、一般式（１０）で表されるビオチン誘導体は、一般式（８）で表されるビオチン又はビオチン誘導体を適当な還元剤で還元して得られるアルコール体（Ｘ４＝酸素原子）の水酸基を、脱離基機能を有する官能基に変換し、変換後の該アルコール体とアミン誘導体（Ｘ４＝−ＮＨ−）とを置換反応させることにより得ることができる。
上記一般式（７）で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式（１１）で示されるビオチン誘導体を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エーテル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン等の非プロトン性溶媒中で、一般式（１２）で示されるイソシアネート物質と反応させることにより得ることができる。
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さらに、下記一般式（１３）で表される重合性ビオチン誘導体は、該重合法に特に好ましく使用することができる。
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さらに、該重合法に好ましく使用することができるモノマーとして、一般式（１４）で表されるビオチンメタクリアミド誘導体、および一般式（１５）で表されるビオチン誘導体が挙げられる。
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本発明の磁性微粒子を、磁性微粒子の存在下ＵＣＳＴポリマーを重合する方法によって製造した場合には、未反応のモノマーや塩などの夾雑物が反応液に共存している。該夾雑物の除去は、透析によって行ってもよく、または溶液の温度をＵＣＳＴ以下とし、凝集させ凝集物を磁石で回収後上清を取り除くことによって行っても良い。
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方の、ＵＣＳＴポリマーへの固定化は、前述のように相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、ＵＣＳＴポリマーに直接固定化しても良いが、固定化の作業が簡便であることから、ビオチンとアビジンとの結合を介してＵＣＳＴポリマーに固定化されていることが好ましい。例えば、アビジンが固定化された酵素を、アビジンとビオチンとの間の特異的吸着作用を利用して、ビオチンが固定化されたＵＣＳＴポリマーに固定化すればよい。
さらに好ましくは、例えば、ビオチンが固定化された酵素を、アビジン結合ビオチンが固定化されたＵＣＳＴポリマーに固定化することである。前述のように該アビジン結合ビオチンは、最大３つのビオチン化酵素を固定化することが可能であることから、より高い効率での基質の変換、分離、回収が可能となる。当然のことながら、これは酵素に限定されるものではなく、前述の相互に特異的作用を有する一対の物質であれば、同様の効果が得られる。
本発明の分離剤は、本発明の磁性微粒子を含有するものであれば特に限定されるものではないが、該磁性微粒子の分離剤に対する含有割合が１〜１００重量％の範囲であることが好ましく、特に好ましくは２〜３０重量％の範囲である。
その他の成分としてはフェライト粒子、マグネタイト粒子、およびヘマタイト粒子などを挙げることができる。
本発明の分離剤を用いれば、微生物、核酸、タンパク、ペプチド、抗原、環境ホルモンなどの分離を容易に行うことが出来る。
＜実施例＞
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細にかつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１  ［磁性微粒子の調製］
磁性微粒子を以下の方法により調製した。
１Ｌ容のフラスコ内で硫酸第一鉄（７水和物）８３．４ｇおよび亜硝酸ナトリウム１０．４ｇを蒸留水５００ｍｌとよく混合し、４０℃で２０分間撹拌した。その後、濃アンモニウム１２５ｍｌを添加し、不溶物を集め、蒸留水で２回洗浄し、マグネタイトを得た。得られたマグネタイトを１Ｌ容のフラスコ内で蒸留水５００ｍｌに添加し、溶液の温度を８０℃とした後、オレイン酸ナトリウム７．５ｇを添加し、同温度で２０分間撹拌した。その後、１Ｎの塩酸でｐＨを５．５に調整し、得られた不溶物をろ過により集め、蒸留水で２回洗浄し、オレイン酸の層を有するマグネタイトを得た。これを再度１Ｌ容のフラスコに添加し、蒸留水を５００ｍｌ添加し、溶液の温度を７０℃とした後、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム７．５ｇを添加し一晩撹拌し、５０〜１００ｎｍの粒径を有する磁性微粒子の黒色透明水溶液を得た。この磁性微粒子を使用して、ＵＣＳＴポリマーが固定化された本発明の磁性微粒子を以下の方法により調製した。
実施例２  ［ＵＣＳＴポリマーが固定化された磁性微粒子（以下「ＵＣＳＴ微粒子」と記載する。）の調製］
３００ｍｌ容のフラスコ内に実施例１で調製した磁性微粒子４ｍｌ、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド２．１３ｇ、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド１２．７ｍｇおよび蒸留水９４ｍｌを添加し５０℃でよく撹拌した。そこに０．１ｇの過硫酸カリウムを添加し、室温で６時間撹拌した。得られた黒色透明溶液を一昼夜透析し、ＵＣＳＴ磁性微粒子溶液を得た。得られた黒色透明溶液のＵＣＳＴを測定したところ、１８℃であった。このＵＣＳＴは生理食塩水中や１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でもほとんど変化しなかった。
実施例３  ［水溶液中からのアビジンの分離］
実施例２で得られたＵＣＳＴ磁性微粒子５０μｌ、１．０％アビジン溶液５０μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、蒸留水８００μｌを試験管中で良く混合した後、氷水中に置き、溶液の温度をＵＣＳＴ以下にした。このＵＣＳＴ磁性微粒子凝集物をネオジ磁石（０．４３Ｔ）により回収し、上清部分１００μｌを取り出し、ＳＤＳによる変性処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により上清からアビジンに対応するバンドが無くなっていることを確認した。
実施例４  ［卵白中からのアビジンの特異的分離］
実施例２で得られたＵＣＳＴ磁性微粒子５０μｌ、１．０％アビジン溶液５０μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、蒸留水４５０μｌ、２．５％の卵白溶液４００μｌを試験中で良く混合した後、氷水中に置き溶液の温度をＵＣＳＴ以下にした。凝集物をネオジ磁石により回収し、上清部分１００μｌを取り出し、ＳＤＳによる変性処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより上清からアビジンに対応するバンドのみが無くなっていることを確認した。
実施例５  ［ＵＣＳＴ磁性微粒子へのアビジン化酵素の固定化］
実施例２で得られたＵＣＳＴ磁性微粒子溶液１００μｌ、市販のアビジン化ペルオキシダーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１０００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ及び蒸留水７００μｌを添加し、良く混合した。得られた溶液を冷却し、磁石によりＵＣＳＴ磁性微粒子凝集物を回収し、上清１９００μｌを取り除いた後、新たに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９００μｌを添加し、アビジン化ペルオキシダーゼを固定化したＵＣＳＴ磁性微粒子溶液を調製した。この溶液はＵＣＳＴ以上では溶解し、ＵＣＳＴ以下では凝集した。この溶液の温度を恒温槽により変化させ、溶解、凝集および磁石による回収の操作を行い、それぞれの上清のペルオキシダーゼの活性を下記に示すペルオキシダーゼの活性測定法により測定した。なお、磁石によるＵＣＳＴ磁性微粒子の回収後は毎回上清１９００μｌを取り除き、新たに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９００μｌを添加した。
（ペルオキシダーゼ活性測定法）
１００ｍＭ過酸化水素１００μｌ、５０ｍＭフェノール１００μｌ、５０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン１００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、蒸留水５８０μｌを吸光度計のセル内で予め混合し、そこへ上記調製した溶液よりサンプリングした２０μｌを添加し、再び良く混合した後、生成物を５００ｎｍの吸収の増加により測定した。なお、以上の操作は３０℃で行った。
上記の方法により繰り返し本発明のＵＣＳＴ磁性微粒子の凝集、溶解を行った場合の上清の酵素活性を測定した結果を下記に示す。なお、酵素活性は最初の溶解時の活性を１００とした場合の比活性で示した。
0004887530.tif 000017
この結果よりＵＣＳＴ磁性微粒子に固定化されたアビジン化ペルオキシダーゼはＵＣＳＴ磁性微粒子と共に溶解、凝集を繰り返しかつ同作業の繰り返しによってもペルオキシダーゼ活性は無くならないことが明らかとなった。
実施例６  ［アビジン化ＵＣＳＴ磁性微粒子へのビオチン化酵素の固定］
まず、アビジンのビオチン結合サイト３カ所が空いている状態のアビジン化ＵＣＳＴ磁性微粒子を得るため、実施例２で得られたＵＣＳＴ磁性微粒子５０μｌに１．０％アビジン溶液１００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、蒸留水３５０μｌを試験中で良く混合した後、氷水中に置き溶液の温度をＵＣＳＴ以下にした。凝集物をネオジ磁石（０．４３Ｔ）により回収し、ポリマーとの結合部位以外のビオチン結合サイトが空いているアビジン化ＵＣＳＴ磁性微粒子を得た。この磁性微粒子１００μｌ、市販のビオチン化ペルオキシダーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１０００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ及び蒸留水７００μｌを添加し、良く混合した。得られた溶液を冷却し、磁石により凝集物を回収し、上清１９００μｌを取り除いた後、新たに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９００μｌを添加し、ビオチン化ペルオキシダーゼを固定化したアビジン化ＵＣＳＴ磁性微粒子を調製した。この磁性微粒子を使って、実施例５と同様に溶解、凝集回収を繰り返し、上清の酵素活性を測定した結果を下記に示す。なお、酵素活性についても同様に最初の溶解時の活性を１００とした場合の比活性で示した。
0004887530.tif 000018
この結果よりアビジンの固定化されたＵＣＳＴ磁性微粒子に結合したビオチン化ペルオキシダーゼは、ＵＣＳＴ磁性微粒子と共に溶解、凝集を繰り返しかつ同作業の繰り返しによってもペルオキシダーゼ活性は無くならないことが明らかとなった。
実施例７  ［ＵＣＳＴ磁性微粒子への分子シャペロンの固定化］
市販のビオチン化されたヒートショックプロテインＨＳＰ７０を１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によく混合させた後、５μｌを取り出し、変性処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＨＳＰ７０のバンドを確認した。続いて上記ビオチン化ＨＳＰ７０のリン酸ナトリウム緩衝溶液５０μｌに実施例６で調製した、ポリマーとの結合部位以外のビオチン結合サイトが空いているアビジン化ＵＣＳＴ磁性微粒子５０μｌを加え、良く混合したのち、実施例３と同様に溶液を冷却させ磁性微粒子を凝集後、磁石により回収し、上清のＨＳＰ７０を同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ上清にはＨＳＰ７０は無く、磁性微粒子に固定化されたアビジンと結合していることが確認された。
実施例８  ［微生物の分離濃縮方法］
市販のビオチン化サルモネラ抗体を実施例６で調製した、ポリマーとの結合部位以外のビオチン結合サイトが空いているアビジン化ＵＣＳＴ磁性微粒子に固定化した。ビオチン化サルモネラ抗体がこのように固定化されたことはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い確認を行った。続いてサルモネラ菌が１個／ｍｌになるように調整した菌けん濁液２０ｍｌにこのビオチン化サルモネラ抗体固定化ＵＣＳＴ磁性微粒子溶液１ｍｌを添加してよく撹拌後、実施例３と同様に溶液を冷却し、磁性微粒子を凝集後、磁石により回収し、上清を取り除き１ｍｌの溶液とした。この凝集体の溶液を予め滅菌し、５０℃にインキュベートしていたブレインハートインフュージョン寒天培地２０ｍｌに添加し、すばやく混合後、シャーレに広げ、寒天が固まるまで放冷し、３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後のコロニー数を計測した結果を下記に示した。また、これら総ての操作はクリーンベンチ内にて行った。また、対照として、該ＵＣＳＴ磁性微粒子を添加せず、最初に調整した菌けん濁液１ｍｌ中の菌数を同様に測定した。
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この結果より、サルモネラ菌はこの磁性微粒子により濃縮されていることが明らかである。
実施例９  ［ＵＣＳＴ磁性微粒子への核酸の固定化］
市販のビオチン化ラベルされたＤＮＡ断片５００μｌ（５０〜１０００ｂｐ）に蒸留水４５０μｌ、実施例６で調製した、ポリマーとの結合部位以外のビオチン結合サイトが空いているアビジン化ＵＣＳＴ磁性微粒子５０μｌを加え、良く混合したのち、実施例３と同様に溶液を冷却し、該ＵＣＳＴ磁性微粒子を凝集後、磁石により回収し、上清のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により確認したところ、いずれのＤＮＡ断片も該ＵＣＳＴ磁性微粒子に結合していることが示唆された。ＲＮＡについても同様の実験を行い、該ＵＣＳＴ磁性微粒子への結合を確認した。
実施例１０
Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミドの代わりに、メタクリルアクリルアミド２５２ｍｇを用いた以外は、実施例２に準じてＵＣＳＴ磁性微粒子を調製した。得られた磁性微粒子のＵＣＳＴは２℃であった。
実施例１１
Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミドの代わりに、Ｎアセチルアクリルアミド２５１ｍｇを用いた以外は、実施例２に準じてＵＣＳＴ磁性微粒子を調製した。得られた磁性微粒子のＵＣＳＴは６℃であった。
実施例１２
Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミドの代わりに、Ｎホルミルアクリルアミド１３２ｍｇを用いた以外は、実施例２に準じてＵＣＳＴ磁性微粒子を調製した。得られた磁性微粒子のＵＣＳＴは１６℃であった。
実施例１３
Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミドの代わりに、Ｎホルミルアクリルアミド２２１ｍｇを用いた以外は、実施例２に準じてＵＣＳＴ磁性微粒子を調製した。得られた磁性微粒子のＵＣＳＴは３０℃であった。
実施例１４
Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミドの代わりに、アクリルアミド２３７ｍｇを用いた以外は、実施例２に準じてＵＣＳＴ磁性微粒子を調製した。得られた磁性微粒子のＵＣＳＴは１０℃であった。
実施例１５
Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミドの代わりに、Ｎアセチルアクリルアミド１８８ｍｇを用いた以外は、実施例２に準じてＵＣＳＴ磁性微粒子を調製した。得られた磁性微粒子のＵＣＳＴは１２℃であった。
実施例１６
Ｎ−アクリロイルグリシンアミド、およびＮ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミドの代わりに、アクリルアミド１．１８ｇ、Ｎホルミルアクリルアミド２７５ｍｇを用いた以外は、実施例２に準じてＵＣＳＴ磁性微粒子を調製した。得られた磁性微粒子のＵＣＳＴは１４℃であった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２０００年８月２１日出願の日本特許出願Ｎｏ．２０００−２４９８１７に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
＜産業上の利用可能性＞
上限臨界溶液温度を有するポリマーを固定化した本発明の磁性微粒子を生体分子等の分離に用いた場合には、その目的物質である生体分子等を損傷もしくは失活させることなく分離、回収することが可能である。