(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子と、イネ由来の野生型アセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列における95番目に相当するグリシンがアラニンに変異した変異型アセト乳酸シンターゼであってピリミジニルカルボキシ除草剤に対する特異的な抵抗性を有する変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子とを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程と、
上記工程で得られた形質転換細胞をピリミジニルカルボキシ除草剤の存在下で培養する工程とを含み、上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を選択マーカーとして使用することを特徴とする形質転換方法。
【請求項２】
上記変異型アセト乳酸シンターゼは、配列番号２〜１４からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を有するタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の形質転換方法。
【請求項３】
上記宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項１記載の形質転換方法。
【請求項４】
目的遺伝子と、イネ由来の野生型アセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列における95番目に相当するグリシンがアラニンに変異した変異型アセト乳酸シンターゼであってピリミジニルカルボキシ除草剤に対する特異的な抵抗性を有する変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子とを含む組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程と、
上記工程で得られた形質転換植物をピリミジニルカルボキシ除草剤の存在下で育成する工程とを含み、上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を選択マーカーとして使用することを特徴とする植物育成方法。
【請求項５】
上記変異型アセト乳酸シンターゼは、配列番号２〜１４からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を有するタンパク質であることを特徴とする請求項４記載の植物育成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型アセト乳酸シンターゼの所定の位置に変異を導入した変異型アセト乳酸シンターゼを用いた形質転換方法及び植物育成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセト乳酸シンターゼ（以下、「ＡＬＳ」という。）は、ロイシン、バリン及びイソロイシン等の分岐鎖アミノ酸生合成経路における律速酵素であり、植物の成長にとって必須な酵素として知られている。ＡＬＳは、高等植物全体に渡って広く存在していることが知られており、種々の微生物、例えば酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等においても見出されている。
大腸菌及びネズミチフス菌には、ＡＬＳのイソ酵素が３種存在していることが知られている。これら各々のイソ酵素は、酵素の触媒活性を司る分子量の大きい触媒サブユニットと分岐鎖アミノ酸が結合することによりフィードバック阻害剤として機能する分子量の小さい制御サブユニットとからなるヘテロオリゴマーである（Ｃｈｉｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３８５，４０１−４１９，１９９８〔非特許文献１〕）。触媒サブユニットは、それぞれＩ１ｖ  ＩＨ、Ｉ１ｖ  ＧＭ、Ｉ１ｖ  ＢＮオペロンに位置している。一方、酵母菌の場合、ＡＬＳは、単一な酵素であるが、細菌と同様に触媒サブユニットと制御サブユニットとからなり（Ｐａｎｇｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，５２２２−５２３１，１９９９〔非特許文献２〕）、触媒蛋白質サブユニットはＩＬＶ２座位に位置している。
植物におけるＡＬＳの場合も、上述した微生物と同じように触媒サブユニットと制御サブユニットとからなることが知られている（Ｈｅｒｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．４０，７９５−８０６，１９９９〔非特許文献３〕）。例えば、双子葉植物のタバコの場合、ＡＬＳの触媒サブユニットは、ＳｕＲＡ及びＳｕＲＢの２つの遺伝子座位によってコードされ（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８〔非特許文献４〕）、トウモロコシの場合、ＡＬＳの触媒サブユニットは、ａｌｓ１及びａｌｓ２の２つの遺伝子座位にコードされている（Ｂｕｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，５５−６１，１９９１〔非特許文献５〕；Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８，１１８５−１１８７，１９９２〔非特許文献６〕）。触媒サブユニットをコードする遺伝子に関しては、双子葉植物の場合、タバコだけでなくアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ナタネ、ワタ、オナモミ（Ｘａｎｔｈｉｕｍ）、アマランサス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）及びホウキギ（ｋｏｃｈｉａ）等について完全に塩基配列が決定されている（Ｃｈｉｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３８５，４０１−４１９，１９９８〔非特許文献１〕及び国際公開公報Ｗ０９７／０８３２７参照〔特許文献１〕）。単子葉植物でもトウモロコシやイネにおいて塩基配列が完全に決定されている。
スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤並びにピリミジニルカルボキシ系除草剤（以下、「ＰＣ系除草剤」という。）等の除草剤は、このＡＬＳを阻害することによって植物の成長を抑制することが知られている（Ｒａｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５，８２７−８３１，１９８４〔非特許文献７〕；Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６，５４５−５４６，１９８４〔非特許文献８〕；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６，３１０−３１３，１９９１〔非特許文献９〕；Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．１９，５９−６７，１９９４〔非特許文献１０〕）。
これら除草剤に対して抵抗性を有する植物としては、ＡＬＳをコードする遺伝子において、種を越えて保存されている保存領域中の１個又は２個のアミノ酸置換を引き起こす１個又は２個の塩基置換を有しているものが知られている。例えば、スルホニルウレア系除草剤に対して強い抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（Ｋａｔｈｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８〔非特許文献１１〕；Ｍｏｕｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，１８８，４９１−４９７，１９９２〔非特許文献１２〕；Ｇｕｔｔｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉ．４３，１７５−１７８，１９９５〔非特許文献１３〕；Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７３８１−１７３８５，１９９５〔非特許文献１４〕及び特開昭６３−７１１８４号公報参照〔特許文献２〕）、イミダゾリノン系除草剤に対して強い抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（Ｍｏｕｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，１８８，４９１−４９７，１９９２〔非特許文献１２〕；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２，３４１−３４５，１９９９〔非特許文献１５〕及び特開平５−２２７９６４号公報参照〔特許文献３〕）、ＰＣ除草剤に対して強い抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（ＷＯ０２／４４３８５Ａ１〔特許文献４〕及びＷＯ０３／０８３１１８Ａ１〔特許文献５〕参照）、或いはスルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、ＰＣ除草剤に対して抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（Ｋａｔｈｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８〔非特許文献１１〕；Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７３８１−１７３８５，１９９５〔非特許文献１４〕；Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６，４１９−４２５，１９９５〔非特許文献１６〕；Ａｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１，１３５３，１９９６〔非特許文献１７〕；Ｒａｊａｓｅｋａｒａｕｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１９，１１５−１２４，１９９６〔非特許文献１８〕、特開昭６３−７１１８４号公報〔特許文献２〕、特開平４−３１１３９２号公報〔特許文献６〕、Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５６３３４３７，１９９７〔特許文献７〕、ＷＯ０２／４４３８５Ａ１〔特許文献４〕及びＷＯ０３／０８３１１８Ａ１〔特許文献５〕参照）が挙げられる。
また、スルホニルウレア系除草剤に特異的に抵抗性を示すＡＬＳを有する個体とイミダゾリノン系除草剤に特異的に抵抗性を示すＡＬＳを有する個体とを掛け合わせて、両方に抵抗性を示す植物体を作る試みもなされている（Ｍｏｕｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２４３，１７８−１８４，１９９４〔非特許文献１９〕）。さらに、ＡＬＳをコードする遺伝子を人為的に除草剤抵抗性遺伝子へ変えることも行われており（Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３，３５９−３６８，１９９６〔非特許文献２０〕、特開昭６３−７１１８４号公報〔特許文献２〕、特開平５−２２７９６４号公報〔特許文献３〕、特表平１１−５０４２１３号公報〔特許文献８〕参照）、１個のアミノ酸の欠失がスルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に抵抗性を示すことが明かにされている（特開平５−２２７９６４号公報〔特許文献３〕参照）。
上述のように除草剤に対する抵抗性を有するＡＬＳ及びＡＬＳをコードする遺伝子について精力的に研究されてきた経緯があるが、ＰＣ系除草剤抵抗性を指標とし、ＰＣ系除草剤に対してのみ特異的な抵抗性を有する変異ＡＬＳ遺伝子については現在までに報告が無かった。特定の除草剤に対して特異的な抵抗性を有する変異ＡＬＳ遺伝子が得られれば、当該変異ＡＬＳ遺伝子を様々な用途に使用できると考えられるが、ＰＣ系除草剤に対する特異性の点で有用な変異ＡＬＳ遺伝子については現在までに報告されていない。
【非特許文献１】Ｃｈｉｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３８５，４０１−４１９，１９９８
【非特許文献２】Ｐａｎｇｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，５２２２−５２３１，１９９９
【非特許文献３】Ｈｅｒｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．４０，７９５−８０６，１９９９
【非特許文献４】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８
【非特許文献５】Ｂｕｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，５５−６１，１９９１
【非特許文献６】Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８，１１８５−１１８７，１９９２
【非特許文献７】Ｒａｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５，８２７−８３１，１９８４
【非特許文献８】Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６，５４５−５４６，１９８４
【非特許文献９】Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６，３１０−３１３，１９９１
【非特許文献１０】Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．１９，５９−６７，１９９４
【非特許文献１１】Ｋａｔｈｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８
【非特許文献１２】Ｍｏｕｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，１８８，４９１−４９７，１９９２
【非特許文献１３】Ｇｕｔｔｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉ．４３，１７５−１７８，１９９５
【非特許文献１４】Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７３８１−１７３８５，１９９５
【非特許文献１５】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２，３４１−３４５，１９９９
【非特許文献１６】Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６，４１９−４２５，１９９５
【非特許文献１７】Ａｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１，１３５３，１９９６
【非特許文献１８】Ｒａｊａｓｅｋａｒａｕｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１９，１１５−１２４，１９９６
【非特許文献１９】Ｍｏｕｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２４３，１７８−１８４，１９９４
【非特許文献２０】Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３，３５９−３６８，１９９６
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ９７／０８３２７号
【特許文献２】特開昭６３−７１１８４号公報
【特許文献３】特開平５−２２７９６４号公報
【特許文献４】国際公開公報ＷＯ０２／４４３８５号
【特許文献５】国際公開公報ＷＯ０３／０８３１１８号
【特許文献６】特開平４−３１１３９２号公報
【特許文献７】Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許番号ＵＳＰ５，６３３，４３７号
【特許文献８】特表平１１−５０４２１３号公報
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、ＰＣ系除草剤に対する特異性に優れた変異ＡＬＳ遺伝子を使用して、形質転換細胞を効率よく選択することができる方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、特定の変異を有するＡＬＳがＰＣ系除草剤に対して極めて高度な抵抗性を示すことを明らかにし、当該変異を有するＡＬＳをコードする遺伝子を選抜マーカーとして使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）  目的遺伝子と、イネ由来の野生型アセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列における９５番目に相当するグリシンがアラニンに変異した変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子とを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程と、
上記工程で得られた形質転換細胞をピリミジニルカルボキシ除草剤の存在下で培養する工程とを含み、上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を選択マーカーとして使用することを特徴とする形質転換方法。
（２）  上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（１）記載の形質転換方法。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における９５番目のアラニンを除く、少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
（３）  上記宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする（１）記載の形質転換方法。
（４）  目的遺伝子と、イネ由来の野生型アセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列における９５番目に相当するグリシンがアラニンに変異した変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子とを含む組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程と、
上記工程で得られた形質転換植物をピリミジニルカルボキシ除草剤の存在下で育成する工程とを含み、上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を選択マーカーとして使用することを特徴とする植物育成方法。
（５）  上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（４）記載の植物育成方法。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における９５番目のアラニンを除く、少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−１３６１８６号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、イネ由来の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列とイネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列とを比較した結果を示す。
図２−１は、イネ由来の変異型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列とイネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列とを比較した結果を示す。
図２−２は、イネ由来の変異型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列とイネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列とを比較した結果を示す。
図２−３は、イネ由来の変異型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列とイネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列とを比較した結果を示す。
図３は、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを含む発根培地におけるＧ９５Ａ−１系統及びＧ９５Ａ−２系統由来のクローン個体における発根を観察した結果を示す写真である。
図４は、Ｇ９５Ａ変異型ＡＬＳ発現ベクターの作製方法を説明する模式図である。
図５は、野生型ＡＬＳに対する阻害５０％濃度を基準としたＧ９５Ａ変異型ＡＬＳの薬剤抵抗性比（ＲＳ比）を示す特性図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアセト乳酸シンターゼタンパク質（以下、「変異型ＡＬＳタンパク質」という。）は、野生型ＡＬＳタンパク質における所定の部位を変異させることによって得ることができる。イネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質においては、Ｎ末端のメチオニンから数えて９５番のアミノ酸がグリシンである。本発明の変異型ＡＬＳタンパク質では、この９５番目のグリシンがアラニンに置換されている。すなわち、イネ由来の本発明に係る変異型ＡＬＳタンパク質は、９５番目のグリシンがアラニンに置換された（Ｇ９５Ａと表記する）アミノ酸配列を有している。イネ由来の変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子（以下、「変異型ＡＬＳ遺伝子」という。）の塩基配列及び変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。
図１に、イネ由来の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列とイネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列とを比較した結果を示す。なお、図１において、一列目のアミノ酸配列は変異型ＡＬＳタンパク質を示し、二列目のアミノ酸配列は野生型ＡＬＳタンパク質を示している。
イネ由来の変異型ＡＬＳ遺伝子（配列番号１）は、イネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子と比較して、野生型ＡＬＳタンパク質における９５番目のグリシンをコードするコドンがアラニンをコードするコドンに置換されたものである。図２−１〜図２−３に、イネ由来の変異型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列とイネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列とを比較した結果を示す。なお、図２−１〜図２−３において、一列目の塩基配列は変異型ＡＬＳ遺伝子を示し、二列目の塩基配列は野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を示している。
この変異型ＡＬＳ遺伝子は、日本型イネ品種である台中６５号のゲノムＤＮＡに存在する野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子に対して、上述したような変異を導入することによって得ることができる。変異を導入する手法としては、従来より公知の手法を使用することができ、例えば、部位特異的変異導入法を用いることができる。部位特異的変異導入法は、市販のキット、例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造株式会社製）、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ（プロメガ社製）、ＥｘＳｉｔｅ（ストラタジーン社製）等を使用して行うことができる。なお、変異ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、ＰＣ系除草剤感受性の野生株培養細胞をＰＣ系除草剤の存在下で培養し、その後、出現したＰＣ系除草剤に対する抵抗性を示す変異株培養細胞から得ることができる。
本発明に係る変異型ＡＬＳ遺伝子は、配列番号１に示したイネ由来の遺伝子に限定されず、広く植物由来のＡＬＳ遺伝子から取得することができる。例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、大豆、棉、アブラナ、サトウダイコン、イタリアングラス、タバコ及びシロイヌナズナ等に由来するＡＬＳ遺伝子に、同様の変異を導入することによって本発明に係る変異型ＡＬＳ遺伝子を取得することができる。ここで、同様の変異とは、イネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質における９５番目のグリシンに相当するグリシン（植物によっては９５番目ではない場合がある）をアラニンに置換する変異を意味する。
トウモロコシ由来の２種類の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。コムギ由来の２種類の変異型ＡＬＳタンパク質の部分アミノ酸配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。ワタ由来の２種類の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７及び８に示す。ナタネ由来の２種類の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。タバコ由来の２種類の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１及び１２に示す。イタリアングラス由来の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。シロイヌナズナ由来の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
変異型ＡＬＳタンパク質は、由来に依存せず、イネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質における９５番目のグリシンに相当するグリシンがアラニンに置換されている限り、ＰＣ系除草剤に対して特異的に抵抗性を示すものとなる。
変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質と比較して、ＰＣ系除草剤に対する優れた抵抗性を有する。このことは、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌等の発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターで形質転換された大腸菌から得られる変異型ＡＬＳの除草剤感受性を調べることにより判断することができる。
ここで、ＰＣ系除草剤としては、化１に示すように、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−Ｓｏｄｉｕｍ，ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ，ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃを例示することができる。
【化１】
0004968685.tif 000002
ＰＣ系除草剤に対して特異的に抵抗性を示すとは、ＰＣ系除草剤を除く、スルホニルウレア系除草剤やイミダゾリノン系除草剤に対する抵抗性が、ＰＣ系除草剤に対する抵抗性と比較して著しく低いことを意味する。なおスルホニルウレア系除草剤としては、化２に示すように、Ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ，ｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｍｅｔｈｙｌ，ｐｙｒａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｅｔｈｙｌ，ｉｍａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎを例示することができる。
【化２】
0004968685.tif 000003
イミダゾリノン系除草剤としては、化３に示すように、ｉｍａｚａｑｕｉｎ，ｉｍａｚａｐｙｒを例示することができる。
【化３】
0004968685.tif 000004
本発明においては、変異型ＡＬＳ遺伝子を利用することによって、目的遺伝子を効率よく形質転換することができる形質転換方法を構築することができる。すなわち、変異型ＡＬＳ遺伝子は、植物形質転換実験における選択性マーカーとして使用することができる。例えば、目的遺伝子を用いて植物細胞を形質転換する場合、変異型ＡＬＳ遺伝子と目的遺伝子とを有する組換えベクターを植物細胞内に導入した後、当該植物細胞をＰＣ系除草剤の存在下で培養する。その結果、ＰＣ系除草剤の存在下で生存する植物細胞には、変異型ＡＬＳ遺伝子と共に目的遺伝子が導入されたことが判る。また、目的遺伝子及び変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子が植物細胞の染色体に組み込まれたかどうかは、その植物の表現型を観察した後、ゲノムサザーンハイブリダイゼーション或いはＰＣＲによって、これらの遺伝子のゲノム上の存在を調べることで確認することができる。
植物を形質転換する手法としては、従来より公知の手法を使用することができる。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて外来遺伝子を標的植物細胞に導入する手法を例示することができる。
具体的には、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ配列を含んでいるバイナリーベクターに変異型ＡＬＳ遺伝子及び目的遺伝子を挿入する。このＴｉプラスミドを大腸菌等に形質転換する。次に、大腸菌等で増殖させた変異型ＡＬＳ遺伝子及び目的遺伝子を保持するバイナリーベクターを、ヘルパープラスミドを含んでいるアグロバクテリウム菌に形質転換する。そして、このアグロバクテリウム菌を、標的とする植物に感染させた後、形質転換植物を同定する。同定された形質転換植物が培養細胞の場合には、従来より公知の手法により、その植物細胞を完全な植物に再生させることができる。
また、変異型ＡＬＳ遺伝子及び目的遺伝子を有する組換えベクターを、標的とする植物に形質転換する場合、従来より公知の手法を用いて直接的に植物体に導入してもよい。さらに、変異型ＡＬＳ遺伝子及び目的遺伝子を有する組換えベクターを形質転換する方法としては、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を使用することができる。
一方、変異型ＡＬＳ遺伝子及び目的遺伝子は、単子葉植物及び双子葉植物等のいかなる種類の植物に形質転換してもよい。変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を形質転換する対象の作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、大豆、棉、アブラナ、サトウダイコン及びタバコ等を挙げることができる。さらに、変異型遺伝子及び目的遺伝子を導入することによって、芝草や樹木等を形質転換してもよい。
いずれの場合であっても、変異型ＡＬＳ遺伝子を植物に形質転換することによって、当該植物に対して、ＰＣ系除草剤に対して特異的な抵抗性を付与することができる。特に、ＰＣ系除草剤は、スルホニルウレア系除草剤やイミダゾリノン系除草剤と異なり水溶性であるため、取扱いが容易であり有機溶媒による宿主細胞への影響を排除できるため、形質転換における薬剤として使用することが好ましい。また、ＰＣ系除草剤は、イミダゾリノン系除草剤よりも約１００倍強いＡＬＳ阻害活性を示すので、微量のＰＣ除草剤で形質転換体を選抜できる。
以下、本発明を実施例を用いて更に詳細に説明する。ただし、本発明の技術範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
葯培養由来カルスの誘導
イネ品種「台中６５号」の穂ばらみ期において一核期の葯が最も多く得られる、葉耳間長６〜８ｃｍの幼穂を採取した。その際、茎は止葉前葉の節の下で水切りし、幼穂を直接包んでいる止葉と止葉前葉の２枚以外の葉を除去した。
茎の基部を水を含ませたペーパータオルで包み、ビニール袋で覆い暗黒下・１０℃で５〜１０日間の低温処理を行った。その後、クリーンベンチ内で幼穂を取り出し、７０％エタノールで１０分滅菌し、滅菌したキムタオル（クレシア、東京）上で乾かした。一核期の葯が含まれる半透明の穎花を滅菌したピンセットで開き、葯のみを取り出し、カルス誘導培地（Ｎ６ＣＩ培地、表１）に置床した。これを連続明期・３０℃で培養し、３週間毎に新しい培地に継代した。
【表１】
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【実施例２】
【０００７】
Ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−Ｓｏｄｉｕｍによる葯培養カルスの選抜
カルス誘導後５週間目の葯培養由来カルスを０．２５μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−Ｓｏｄｉｕｍを含むカルス誘導培地で４週間培養した。次に、増殖したカルスを０．５μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを含む再分化培地（表２）で４週間培養し、アルビノの再分化植物を得た。継代は全て２週間毎に行った。
【表２】
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【実施例３】
【０００８】
Ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性検定
上述の方法で選抜された個体の２系統をＧ９５Ａ−１系統及びＧ９５Ａ−２系統とし、アルビノ個体であったため、ＭＳ培地で培養し株分けして増殖した。
Ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性の程度を検定するため、０、１、５、１０、２０μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを含む発根培地（表３）へＧ９５Ａ−１系統から株分けしたクローン個体を移植した（図３Ａ：シャーレ左側、アルビノのため白色）。クローン個体の少ないＧ９５Ａ−２系統は５μＭのみで検定を行った。対照区としては播種後２週間目の野生型台中６５号を用い（図３各シャーレ右側）、移植後１週間目（図３Ｂ）、２週間目（図３Ｃ）の植物体を観察した。その結果、Ｇ９５Ａ−１及びＧ９５Ａ−２の両系統とも、全ての濃度のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ含有培地で新たな発根が見られ抵抗性を示したが、対照区の野生型はｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−Ｓｏｄｉｕｍ含有培地で全て枯死した。
【表３】
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【実施例４】
【０００９】
Ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性アルビノ系統のＡＬＳ遺伝子配列解析
上記の２系統の葉（約０．５×１ｃｍ）を１．５ｍｌチューブに入れ、５０℃で２時間以上乾燥させた。チューブ内に直径３ｍｍのガラスビーズＢＺ−３（井内盛栄堂）を４粒入れ、ミキサーミルＭＭ３００（Ｒｅｔｓｃｈ）で葉を粉砕した後、３００μｌの抽出バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ．７．５）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ）を加えて懸濁した。この懸濁液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上清２００μｌを新しいチューブに移し、２００μｌイソプロパノールを加えた。これを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、得られた沈澱を３分間真空乾燥した。この沈澱に５０μｌの１／５×ＴＥを加えた後１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、これをゲノムＤＮＡ溶液とした。
調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲ−ダイレクトシークエンシングによりＡＬＳ遺伝子の全領域の配列を解析した。ＰＣＲにはＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いた。反応は、９４℃１分で初期変性後、９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃４０秒のサイクルを４０回行った。ＡＬＳＦ２とＡＬＳ２Ｒのプライマーの組み合わせの場合はＰＣＲｘエンハンサー（インビトロジェン社）を加え、９４℃１分で初期変性後、９４℃１分、５０℃１分、７２℃１分のサイクルを４０回行った。それぞれのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、Ｍｉｎｉ  Ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
このＰＣＲ産物を鋳型として、ＡＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔを用いて下記のプライマーによりシークエンス反応を行った。ＡＬＳＦ２、ＡＬＳ２Ｒのプライマーを用いる場合はシークエンスＲｘエンハンサー溶液Ａ（インビトロジェン社）を加えた。シークエンス反応条件は９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分を３５サイクルで行った。シークエンス反応後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により塩基配列を決定した。
ＡＬＳＦ２（５’−ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の−１２−９番目に対応；配列番号１５）
ＡＬＳ２Ｒ（５’−ＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の３２６−３４５番目に対応；配列番号１６）
ＡＬＳ１２（５’−ＧＣＡＡＣＣＡＡＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣ−３，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の４３６−４５５番目に対応；配列番号１７）
ＡＬＳ２２（５’−ＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＴＧＡＣＧＣ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の６２０−６３９番目に対応；配列番号１８）
ＡＬＳ１３（５’−ＧＡＡＴＴＧＣＧＣＴＧＧＴＴＴＧＴＴＧＡ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の８６８−８８７番目に対応；配列番号１９）
ＡＬＳ２３（５’−ＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＧ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１０５１−１０７１番目に対応；配列番号２０）
ＡＬＳ２４Ｆ（５’−ＧＧＴＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＣＡＴ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１５３７−１５５６番目に対応；配列番号２１）
ＡＬＳ２４Ｒ（５’−ＡＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＡＣ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１５３８−１５５７番目に対応；配列番号２２）
ＡＬＳ２５（５’−ＣＡＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＡＣＡＴＡＧＧＣＣ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１９１９−１９８９番目に対応；配列番号２３）
こうして上記２系統のＡＬＳ遺伝子配列を調べたところ、両者ともにＡＬＳの９５番目のアミノ酸が１塩基置換によりグリシン（ＧＧＣ）からアラニン（ＧＣＣ）へ置換していた。
【実施例５】
【００１０】
ＧＳＴ融合Ｇ９５Ａ変異型ＡＬＳを発現するベクターの作製
ｐＵＣ１８ベクターに組み込んだイネ由来Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ  ２点変異型ＡＬＳ（ＷＯ０２／４４３８５Ａ１参照）を鋳型として、９５番目のグリシン部分のコドンを縮重したセンスプライマーＡＬＳ−Ｍ５（５’−ＴＡＣＣＣＧＧＧＣＮＮＮＧＣＧＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣＡ−３’：アミノ酸配列で９２−１０１番目に対応；配列番号２４）と１９１−１９６番目のアミノ酸配列に対応するアンチセンスプライマーＡＬＳ−ＲｓｐＡ（５’−ＴＧＴＧＣＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧＡ−３’；配列番号２５）で増幅したＰＣＲ生成物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクターにクローニングし、このベクターで常法により大腸菌（ＨＢ−１０１株）を形質転換した。
同プライマーセットによりコロニーＰＣＲを行いシークエンス解析し、９５番目のグリシン（ＧＧＣ）部分がセリン（ＡＧＣ）、システイン（ＴＧＣ）、チロシン（ＴＡＴ）、アラニン（ＧＣＡ）、バリン（ＧＴＧ）、ロイシン（ＣＴＧ）、イソロイシン（ＡＴＡ）、メチオニン（ＡＴＧ）、トリプトファン（ＴＧＧ）、フェニルアラニン（ＴＴＴ）、アスパラギン酸（ＧＡＴ）、グルタミン酸（ＧＡＧ）、アルギニン（ＣＧＧ）に変異したコロニーを得た。アラニン変異体については、大腸菌を液体培養後、プラスミドを抽出し、ＳｍａＩで切断した。電気泳動後アガロースゲルから変異型ＡＬＳ遺伝子断片を精製し、ＳｍａＩで消化後にＢＡＰ処理して精製したイネ由来Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ  ２点変異型ＡＬＳ遺伝子を組み込んだｐＵＣ１８ベクターにライゲートした。出来上がったＧ９５Ａ／Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ  ３点変異型ＡＬＳ遺伝子を持つｐＵＣ１８ベクターからＧ９５Ａ部分を含むＮｃｏＩ断片を切り出し、ＮｃｏＩ処理後にＢＡＰ処理した野生型ＡＬＳ遺伝子が組込んだ大腸菌タンパク発現ベクター（ｐＧＥＸ−２Ｔ）とライゲートし、Ｇ９５Ａ  １点変異型ＡＬＳ遺伝子を持つｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクターを得た（図４）。
【実施例６】
【００１１】
Ｇ９５Ａ変異型ＡＬＳ遺伝子を組み込んだｐＧＥＸ−２Ｔベクターの塩基配列確認
本ベクターで形質転換された大腸菌（ＪＭ１０９株）を２ｍｌ＊１０本３７℃で１２時間培養し、プラスミド抽出装置（ＴＯＭＹ  ＤＰ−４８０）によりプラスミドを抽出（５００μｌ）後、遠心濃縮により２００μｌ程度まで濃縮した。ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で脱塩し最終的には２００μｌの滅菌水で溶出した。このプラスミドをＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｅｒ．１．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンス反応を行った。［総容量２０μｌ（鋳型ＤＮＡ１３μｌ、プライマー（３．２ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、ｐｒｅ−ｍｉｘ４μｌ、ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ２μｌ）、反応条件：初期ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ９６℃（５ｍｉｎ）、ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ９６℃（５ｓｅｃ）−ａｎｎｅａｌｉｎｇ５０℃（５ｓｅｃ）−ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ６０℃（４ｍｉｎ）のサイクルで４０回、最終サイクルのｅｌｏｎｇａｔｉｏｎは６０℃（９ｍｉｎ）］シークエンス反応後、ＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い反応液中の蛍光塩基をゲル濾過により除去した。反応サンプルをＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ  ３１０  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｒで測定し、シークエンスを確認した。シークエンス用のプライマーとしては以下の配列のプライマーを用いた。
ＰＧＥＸ−５（５’−ＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の上流側；配列番号２６）
ＡＬＳ−ＲｓｐＣ（５’−ＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＴＣＧＣＣＴＡ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の２５８−２７５番目に対応；配列番号２７）
ＡＬＳ−Ｍ１（５’−ＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＴＴ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の５１０−５３９番目に対応；配列番号２８）
ＡＬＳ−Ｒｓｐ３（５’−ＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＴＣＧＡＴＧＡＡＴ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の７２０−７３８番目に対応；配列番号２９）
ＡＬＳ−Ｒｓｐ７（５’−ＡＡＣＴＧＧＧＡＴＡＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の８８６−９０６番目に対応；配列番号３０）
ＡＬＳ−Ｒｓｐ１（５’−ＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１１９２−１２１２番目に対応；配列番号３１）
３−１−３（５’−ＧＡＴＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＴＴＣＧ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１３４６−１３６２番目に対応；配列番号３２）
４−８３−１０（５’−ＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＣＣＡＴＴＧ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１４５７−１４７３番目に対応；配列番号３３）
３−１−４（５’−ＡＧＧＴＧＴＣＡＣＡＧＴＴＧＴＴＧ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１５０６−１５２２番目に対応；配列番号３４）
ＡＬＳ−ＲｓｐＢ（５’−ＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧ−３’，センスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１８９２−１９１３番目に対応；配列番号３５）
ＡＬＳ−Ｒｓｐ２（５’−ＡＧＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の１９０６−１９２６番目に対応；配列番号３６）
ＰＧＥＸ−３（５’−ＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧ−３’，アンチセンスプライマー，ＡＬＳ遺伝子の下流側；配列番号３７）
【実施例７】
【００１２】
Ｇ９５Ａ変異型ＡＬＳの発現とＡＬＳの調製
実施例６で作製したＧ９５Ａ変異型ＡＬＳ遺伝子を持つｐＧＥＸ−２Ｔ及び野生型ＡＬＳ遺伝子を持つｐＧＥＸ−２Ｔ（ＷＯ０２／４４３８５Ａ１参照）で形質転換した大腸菌を、２ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて２７℃でそれぞれ振とう培養（前培養）した。この前培養液１ｍｌを用いて２５０ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で、それぞれ本培養を行った。一晩培養後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えてさらに３時間〜４時間培養することによって、ＧＳＴ融合タンパク質の発現誘導を行った。なお、菌体はＡＬＳ抽出緩衝液（３０％グリセロールと０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５）で洗浄後−８０℃で保存した。
大腸菌からのＡＬＳの調製と精製は次の方法で行った。先ず、−８０℃に保存しておいた大腸菌のペレットを、ＡＬＳ抽出緩衝液に懸濁した（培養液５０ｍｌから得られたペレットに対して２．５ｍｌのＡＬＳ抽出緩衝液を添加）。この懸濁液を超音波処理（Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社製、Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  Ｗ−２２５Ｒ、マイクロチップ、アウトプットコントロール８、約１秒インターバル、４０秒２回）した後、４℃、１５０００×ｇで２０分間遠心し、その上澄を粗酵索溶液とした。これにより、ＧＳＴ融合Ｇ９５Ａ変異型ＡＬＳタンパク質及びＧＳＴ融合野生型ＡＬＳタンパク質の粗酵素溶液を調製した。
【実施例８】
【００１３】
発現ＡＬＳの活性測定
活性測定反応に使用する反応溶液は、２０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭのチアミンピロリン酸、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド、１０ｍＭのバリン（大腸菌由来のＡＬＳ活性を阻害するために添加）並びに２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）からなる溶液に、活性測定対象のＧＳＴ融合ＡＬＳを混合したものである。この反応溶液を０．５ｍｌ使用した。測定反応は、測定対象のＧＳＴ融合ＡＬＳを添加した後、３７℃で３０分行った。また、測定反応は、０．０５ｍｌの６Ｎ硫酸を添加することにより停止させた。次に、反応が終了した反応溶液を３７℃で６０分間インキュベートした。これにより、反応溶液中に含まれるアセト乳酸をアセトインに変化させた。次に、反応溶液中に含まれるアセトインを定量するため、０．５％（ｗ／ｖ）のクレアチン０．０５ｍｌと２．５Ｎの水酸化ナトリウムに溶かした５％（ｗ／ｖ）のα−ナフトール０．０５ｍｌとを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、反応溶液における吸光度５２５ｎｍを比色することでアセトインを定量し、ＡＬＳ活性を評価した。なお、反応０時間を対照区とした。薬剤の阻害活性を調べる場合には、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍとｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｓｉｕｍは１００倍濃度の水溶液を作製して反応液中へ添加した。水溶性の低いｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃ、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ、ｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｍｅｔｈｙｌ、ｉｍａｚａｑｕｉｎ並びにｉｍａｚａｐｙｒは１００倍濃度のアセトン溶液を作製して反応液中へ添加した。
【実施例９】
【００１４】
Ｇ９５Ａ変異型ＡＬＳの薬剤感受性
発現させたＧ９５Ａ変異型ＡＬＳに対する各種ＡＬＳ阻害剤の阻害活性を調べた結果、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｓｉｕｍ並びにｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃの阻害活性は極めて弱かったが（１００μＭで５０％以下の阻害活性）、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎの阻害活性は強く、また、ｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｍｅｔｈｙｌ、ｉｍａｚａｑｕｉｎ並びにｉｍａｚａｐｙｒも阻害活性を示すことがわかった（表４）。
【表４】
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なお、表４中単位無しの数値は全て阻害５０％濃度で単位はμＭ、単位が％のものは１００μＭでの阻害％を示している。ＳＥは標準誤差である。
そこで、Ｇ９５Ａ変異型ＡＬＳに対する各薬剤の阻害５０％濃度と野生型ＡＬＳ（ＧＳＴ融合野生型ＡＬＳ）に対する阻害５０％濃度を比較して、野生型ＡＬＳに対する阻害５０％濃度を基準としたＧ９５Ａ変異型ＡＬＳの薬剤抵抗性比（ＲＳ比）を算出したところ、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｓｉｕｍ並びにｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃのＲＳ比はそれぞれ１６，０００倍以上、９，１００倍以上、１３，０００倍以上であったが、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ、ｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｍｅｔｈｙｌ、ｉｍａｚａｑｕｉｎ並びにｉｍａｚａｐｙｒのＲＳ比は０．１９、４０、０．８２、４．９であり、Ｇ９５Ａ変異型ＡＬＳはＰＣ除草剤に対して特異的に強い抵抗性を示すことが判明した（表５及び図５）。なお、図５においてＢＳはｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍであり、ＰＳはｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｓｉｕｍであり、ＰＭはｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃであり、ＣＳはｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎであり、ＢＭはｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｍｅｔｈｙｌであり、ＩＱはｉｍａｚａｑｕｉｎであり、ＩＰはｉｍａｚａｐｙｒである。
【表５】
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〔まとめ〕
以上の実施例より、イネ由来の野生型ＡＬＳタンパク質に対してＧ９５Ａ変異が導入された変異型ＡＬＳタンパク質は、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対して特異的に抵抗性を示すことが明らかとなった。このように優れた特異性を示す変異型ＡＬＳタンパク質の特性を利用することによって、変異型ＡＬＳタンパク質を発現する細胞と発現しない細胞とをＰＣ系除草剤の存在下で確実に効率よく選抜できることが判明した。
なお、上述した実施例ではイネ由来のＡＬＳ遺伝子を使用しているが、本発明の技術的範囲はイネ由来の変異型ＡＬＳ遺伝子を用いた形質転換方法に限定されるものではない。一般に、ＡＬＳ遺伝子は、異なる植物間で高い相同性を有することが知られている。また、ＡＬＳ遺伝子における特定の変異が、複数種の植物において同様の影響を与えることも知られている。よって、本実施例により、例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、大豆、棉、アブラナ、サトウダイコン及びタバコに由来する、Ｇ９５Ａ変異と同じ変異を有する変異型ＡＬＳタンパク質も同様にピリミジニルカルボキシ除草剤に対して特異的に抵抗性を示すことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、ＰＣ系除草剤に対して極めて高度な抵抗性を示す変異型アセト乳酸シンターゼを選択マーカーとして利用することによって、効率に優れた形質転換方法を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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