(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌を、リゾプス属もしくはアスペルギルス属の糸状菌と同時に同一培養器内の液体培地中で培養する乳酸菌の培養方法であって、
通気攪拌型発酵槽を用いて通気撹拌培養を１日間行った後、あるいはバッフル付きフラスコを用いてしんとう培養を１日間行った後、５日間または６日間静置培養することを特徴とする乳酸菌の培養方法。
【請求項２】
上記乳酸菌が、ラクトバチルス属細菌、ラクトコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、エンテロコッカス  フェシウム属細菌から選ばれた一種以上であることを特徴とする請求項１に記載の乳酸菌の培養方法。
【請求項３】
上記乳酸菌が、ラクトバチルス  ブレビス、 ラクトバチルス  プランタラム、ラクトバチルス  カゼイ、ラクトバチルス  アシドフィルス、 ラクトバチルス  ガセリ、ラクトバチルス  サリバリス、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシズ  ブルガリクス、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  クレモリス、ラクトコッカス  プランタラム 、ストレプトコッカス  サーモフィルス、 エンテロコッカス  フェカリス、エンテロコッカス  フェシウム から選ばれた一種以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の乳酸菌の培養方法。
【請求項４】
上記リゾプス属糸状菌が、リゾプス  ミクロスポルス、リゾプス  オリゴスポラス、リゾプス  オリゼから選ばれた一種以上であり、上記アスペルギルス属糸状菌が、アスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  サイトイのうち一種以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１に記載の乳酸菌の培養方法。
【請求項５】
上記乳酸菌の培養において使用する乳酸菌種菌およびリゾプス属糸状菌またはアスペルギルス属糸状菌の接種、植菌は、上記乳酸菌接種後４８時間以内において当該糸状菌が培養液中で生存状態であることを条件として、同時に接種することを要さないことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１に記載の乳酸菌の培養方法。
【請求項６】
上記乳酸菌の培養方法における培養温度については、摂氏２７度ないし同３８度の範囲であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１に記載の乳酸菌の培養方法。
【請求項７】
上記液体培地が、大豆たんぱく、乳たんぱく、酵母エキス、麦芽エキス、米粉から選ばれた１種以上を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１に記載の乳酸菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、乳酸菌の培養方法および同方法により得られる乳酸菌培養物、同培養物を含有する飲料、食品、飼料、飼料添加物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は古来より、漬物、畜肉加工品、乳製品等の加工食品製造、酒類、飲料の醸造などに広く使用されている。
【０００３】
また、近年では、伝統的な天然乳酸菌の利用にかわり、液体培地中で人工的に培養されたスターターカルチャーの添加が行われるようになってきた。
【０００４】
一方、乳酸菌の醗酵により生産された食品、飲料の摂取がヒトおよび家畜の健康維持に有効である事は周知されており、乳酸菌ストレプトコッカス  フェカリス（Streptococcus faecalis）, ストレプトコッカス  フェシウム（Streptococcus faecium）, ラクトバチルス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）,  ラクトバチルス  ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus） が日本薬局方外医薬品規格ラクトミンとして、腸管内感染防御に使用され、家畜に関しては、「飼料の安全性の確保および品質の改善に関する法律」に定める省令により平成１４年４月２５日現在、乳酸菌「エンテロコッカス フェカーリス」、「エンテロコッカス フェシウム」、「バチルスコアグランス」、「ラクトバチルス アシドフィルス」、「ラクトバチルス サリバリウス」等が生菌剤として定められている。
【０００５】
また、ラクトバチルス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus等による免疫の強化については、 British Journal of Nutrition (2000) 83:167-176（Gillら）の報告がある。
【０００６】
前述薬剤は生菌剤であるが、近年、グラム陽性菌の細胞壁成分が免疫を担当するリンパ球を活性化させる機構が明らかにされ、Immunity 11(1999)443-451 (Takeuchiら)あるい
は J.Biol.Chen.274(1999) 17406-17409(Schwandnerら)などの報告がある。
【０００７】
さらに、乳酸菌の細胞壁をもちいた、継代培養免疫細胞の刺激については、Journal of Food Protection, Vol.62, No. 12, (1999)1435-1444(Tejada-Simonら)の報告がある。
【０００８】
このように、乳酸菌の菌体は、食品、飼料産業において価値の高い、広い範囲の用途をもつものである。しかしながら、当該菌の本質により、液体培地中で人工的に培養する場合は培養の進行によって乳酸等の生育阻害物質の蓄積のため、増殖後急速に死滅、減少を起こし、高い密度で菌体をえることが困難であり、また、最大増殖時において短時間に保存処理されなければならない事が周知されている。
【０００９】
このため、従来は培養後の低濃度の培養物を遠心分離等で濃縮することが行われ、また、ろ過を行いながら基質を供給して培養する、という方法が出願されている(例えば、特
許文献１および特許文献２参照）。さらに、蓄積物をカルシウムで中和する方法も出願されている(例えば、特許文献３参照）。
【特許文献１】特公平６−６９３６７号公報
【特許文献２】特開２００１−２１１８７８号公報
【特許文献３】特開平０８−０５６６５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、低濃度の培養物を濃縮することは培養に係る装置規模を大にする事を要し、ろ過培養については複雑な装置設備を使用する事を要する。また、中和による方法では、製品に残存するカルシウムのため脱水後の菌体の成分重量比は低くならざるをえない。前記発明の実施例では得られた菌体密度は１０9個／gr.以下である。このため小規模かつ、複雑でない、汎用の培養装置を用い、多量の金属イオンを使用せずに乳酸菌を高密度かつ、長時間にわたって高密度の菌数を維持できる培養方法の実現がのぞまれる。
【００１１】
この問題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、上記のような欠点を有せず、極めて高い効率と生産性を有する乳酸菌の高密度培養方法を見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以上の目的を達成するための手段として、乳酸菌を微生物醗酵槽をもちいて培養を開始する際において、その乳酸菌の植菌の前、あるいは同時、もしくはその乳酸菌の植菌の後にリゾプス（Rhizopus）属糸状菌もしくは、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌を接種し、当該乳酸菌と共にリゾプス（Rhizopus）属糸状菌もしくは、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌を培養することにより、乳酸菌を単独で培養する他の方法に比して極めて高い乳酸菌密度に至るまで培養を継続を可能とさせることにより高い効率で乳酸菌培養物を得るとともに、長時間にわたって高密度の菌数を維持できる培養方法を提供するものである。
本発明にかかる乳酸菌の培養方法は、乳酸菌をリゾプス属もしくはアスペルギルス属の糸状菌と同時に同一培養器内の液体培地中で培養する乳酸菌の培養方法であって、
通気攪拌型発酵槽を用いて通気撹拌培養を１日間行った後、あるいはバッフル付きフラスコを用いてしんとう培養を１日間行った後、５日間または６日間静置培養することを特徴とするものである。
【００１３】
さらに、本発明は、乳酸菌をリゾプス（Rhizopus）属糸状菌もしくは、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌とともに培養することによりえられた高い乳酸菌密度の培養液あるいは、その培養液の精製物をもちいて、飲料、食品、飼料、飼料添加物、医薬品を製造する方法を提供するものである。
【００１４】
請求項３に記載のように、 上記乳酸菌が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、ラクトコッカス（Lactococcus）属細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属細菌、エンテロコッカス  フェカリス（Enterococcus fecalis）属細菌から選ばれた一種以上であることが好ましい。
【００１５】
請求項４に記載のように、上記乳酸菌が、ラクトバチルス  ブレビス（Lactobacillus brevis）、 ラクトバチルス  プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス  カゼイ（Lactobacillus casei）、 ラクトバチルス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス  サリバリス（Lactobacillus salivalius）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシズ（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、ブルガリクス、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp.cremoris）、ラクトコッカス  プランタラム（ Lactococcus plantarum）、ストレプトコッカス  サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、エンテロコッカス  フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス  フェシウム（Enterococcus faecium） から選ばれた一種以上であることが好ましい。
【００１６】
請求項５に記載のように、上記リゾプス（Rhizopus）属糸状菌が、リゾプス  ミクロスポルス（Rhizopus microsporus）、リゾプス  オリゴスポラス（Rhizopus  oligosporus）、リゾプス  オリゼ（Rhizopus oryzae）から選ばれた一種以上であり、上記アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌が、アスペルギルス  オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス  サイトイ（Aspergillus saitoi）のうち一種以上であることが好ましい。
【００１７】
請求項８に記載のように、上記液体培地が、大豆たんぱく、乳たんぱく、酵母エキス、麦芽エキス、米粉から選ばれた１種以上を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
上記のとおり、本発明の乳酸菌培養方法によれば、乳酸菌を単独で培養する他の方法に比して極めて高い乳酸菌密度に至るまで培養を継続を可能とさせることにより高い効率で乳酸菌培養物を得るとともに、長時間にわたって高密度の菌数を維持することができる。また、高い乳酸菌密度の培養液あるいは、その培養液の精製物をもちいて、飲料、食品、飼料、飼料添加物、医薬品を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に係る乳酸菌の培養方法についての実施の形態を説明する。
【００２０】
本発明に係る乳酸菌の培養においては、通気攪拌型醗酵槽内の殺菌された適温にある培地に前培養した乳酸菌種菌、リゾプス（Rhizopus）属糸状菌もしくは、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌を接種し、通気攪拌を行った後、通気を停止、もしくは制限して必要とされる菌密度に達するまで培養温度の管理を継続して行うことができる。
【００２１】
本発明に係る乳酸菌の培養において使用する通気攪拌型醗酵槽は汎用の通気攪拌型醗酵槽であればよく、細菌用、酵母用、糸状菌用を問わず使用することができる。
【００２２】
本発明に係る乳酸菌の培養において培地の殺菌は、使用する醗酵設備により、殺菌済み醗酵槽に熱交換器等で殺菌した培地を無菌的に投入して行う事ができ、また未殺菌の培地を醗酵槽内に投入した後に加熱殺菌をして行うことができる。
【００２３】
本発明に係る乳酸菌の培養において使用する培地は、糖質、有機窒素を主な炭素源、有機窒素を主な窒素源として構成し、当該乳酸菌およびリゾプス（Rhizopus）属糸状菌、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の栄養要求性に適合したミネラル、ビタミンを含むものを使用する。
【００２４】
本発明に係る乳酸菌の培養において使用する培地の糖質は、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、デキストリン、デンプン、のうち１以上を含むものが使用でき、有機窒素としてはたんぱく質、たんぱく分解物、アミノ酸のうち１以上を含むものが使用できる。
【００２５】
本発明に係る乳酸菌の培養において使用する培地の当該乳酸菌およびリゾプス（ Rhizopus）属糸状菌、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の栄養要求性に適合したミネラル、ビタミンは、当該栄養要求性が既知の場合は、これらを選択して添加して、未知の場合あるいは既知の場合であっても、培地として、酵母、酵母エキス、麦芽、麦芽エキス、大豆、大豆分解物、乳、カゼイン分解物、小麦等の穀類およびこれら穀類の抽出物ないし分解物、きのこ菌体、子実体およびこれらきのこの抽出物ないし分解物の内から選ばれる１以上の天然物を含むものを使用することで充足することができる。
【００２６】
本発明に係る乳酸菌の培養において使用する乳酸菌種菌の菌株としては、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属から選ばれた一種以上が使用できる。
【００２７】
本発明に係る乳酸菌の培養において使用するリゾプス（Rhizopus）属糸状菌、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の菌株としては、リゾプス  ミクロスポルス（Rhizopus microsporus）、リゾプス  オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）、リゾプス  オリゼ（Rhizopus oryzae）、アスペルギルス  オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス  サイトイ（Aspergillus saitoi）から選ばれた一種以上が使用できる。
【００２８】
本発明に係る乳酸菌の培養において使用する乳酸菌種菌および リゾプス（Rhizopus）属糸状菌、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の菌株の前培養としては、小型醗酵槽、フラスコ、試験管等による液体培養により行うことができる。
【００２９】
本発明に係る乳酸菌の培養において使用する乳酸菌種菌および リゾプス（Rhizopus）属糸状菌、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の接種、植菌は同時に接種することを要さず、ただし乳酸菌接種後４８時間以内において当該糸状菌が培養液中で生存状態であることが必要である。すなわち乳酸菌接種前３日以内、乳酸菌接種後１日以内に当該糸状菌が接種されていれば好適である。
【００３０】
本発明に係る乳酸菌の培養における培養は好適な条件で、菌密度が１０10個／gr.を超
えるまで行うことができる。また、培養の終了は、通常の乳酸菌培養と同様に乳酸菌接種後の時間、水素イオン濃度、有機酸蓄積量などに基づき、あるいは菌体量の測定によりその時を定める。
【００３１】
本発明に係る乳酸菌の培養における培養温度については、摂氏２７度ないし同３８度の範囲において好適に培養することができる。
【００３２】
本発明に係る乳酸菌の培養物を含む飲料、食品、飼料、飼料添加物、医薬品の製造において培養液をそのまま利用する場合においては、培養の後醗酵槽より排出後、速やかに、あるいは排出せずに冷却を行って培養物を取得することができる。
【００３３】
本発明に係る乳酸菌の培養物を含む飲料、食品、飼料、飼料添加物、医薬品の製造において培養物の精製物を利用する場合においては、培養の後醗酵槽より排出後、速やかに、冷却を行ってあるいは冷却を行いながら、培養液を濃縮、ろ過、遠心分離のうち一以上を行い、培養物の乳酸菌菌体画分を取得する。さらに当該菌体画分の洗浄を行ってもよい。
【００３４】
本発明に係る乳酸菌の培養物を含む飲料、食品、飼料、飼料添加物、医薬品の製造において、取得した培養物は冷蔵、凍結、凍結乾燥、噴霧乾燥、グリセリン添加により安定化させたものを使用することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を示して本発明の乳酸菌培養方法を説明する
実施例１．
乳酸菌ラクトバチルス  ブレビス IFO3345(財団法人発酵研究所）およびリゾプス  オリゴスポラス NRRL2710（秋田今野商店、日本国秋田県）を３００mlバッフル付きしんとうフラスコ中のｐH5.5に調整した大豆製品GP-SL（吉原製油、日本国大阪府)7.5%を単一栄養とした１００ｍｌの培地に接種し、また比較のためにリゾプス  オリゴスポラス NRRL2710は接種せずに、摂氏２８度で、ロータリーシェイカーをもちいた２００rpmのしんとう培養を１日間行った後６日間静置し、MRS培地プレート寒天法によるコロニー計数をもちいて得た乳酸菌生菌数を接種の有無を対照して比較した結果、表１にしめすとおり、リゾプス属糸状菌との共培養により、培養7日後の乳酸菌の菌密度は著しく増加した。
【００３６】
【表１】
0004901113.tif 000002
【００３７】
実施例２．
乳酸菌Lactobacillus brevis IFO3345(財団法人発酵研究所）および糸状菌Rizopus oryzae ATCC48005(American Type Culture Collection、米国)、 Aspergillus oryzae、Aspergillus saitoiを半合成培地をもちいて培養した。乳酸菌の前培養は、ＭＲＳ培地中で摂氏３０度において1日間の静置培養を行い、糸状菌の前培養は、２００mlバッフル付きし
んとうフラスコ中のｐH5.5に調整した大豆製品GP-SL（吉原製油、日本国大阪府)7.5%を単一栄養とした１００ｍｌの培地中で摂氏２８度で、２日間、ロータリーシェイカーをもちいた２００rpmのしんとう培養を行った。本培養は、２００mlバッフル付きしんとうフラ
スコ中のｐH5.5に調整した０．５％グルコース、２．０％酵母エキス（Difco製）、ミネ
ラル（水１リットルあたりK2HPO4:1g、MgSO4・7H2O:200mg、FeSO4・7H2O:10mg、CaCl2:10mg、およびMn、Mo、Cu、Co、Znを無機塩として各0.02-0.5mg）の半合成培地中で摂氏２８度で、ロータリーシェイカーをもちいた２００rpmのしんとう培養を１日間行った後、５
日間まで静置した。
【００３８】
比較対照として、糸状菌の前培養物を接種しない、乳酸菌のみの培養も同条件で行った。
【００３９】
各々の乳酸菌菌数をMRS培地プレート寒天法によるコロニー計数をもちいて得た、乳酸
菌菌数の増減を比較対象した結果、表２に示すとおり、Rizopus属糸状菌、Aspergillus属糸状菌との共培養により、乳酸菌の最大菌数は増大し、かつ乳酸菌の減少が著しく抑制された。
【００４０】
乳酸菌数（個／ml）の推移
【表２】
0004901113.tif 000003
【００４１】
実施例３．
実施例１の方法と同様の方法で乳酸菌Lactobacillus brevis IFO3345(財団法人発酵研
究所）およびRizopus oligosporus  NRRL2710（秋田今野商店、日本国秋田県）を３００mlバッフル付きしんとうフラスコ中のｐH5.5に調整した大豆製品GP-SL（吉原製油、日本国大阪府)7.5%を単一栄養とした１００ｍｌの培地に接種あるいは接種せずに、摂氏２８度
で、ロータリーシェイカーをもちいた２００rpmのしんとう培養を１日間行った後、６日
間静置した。これに加え、実施例２の方法と同様のグルコース、酵母エキス、ミネラルからなる半合成培地でをもちいて、その他の点では実施例１と同様の方法で培養を行った。実施例２と同様に MRS培地プレート寒天法によるコロニー計数をもちいて乳酸菌生菌数の推移を得た結果、表３に示すとおり、Rizopus属糸状菌との共培養により、乳酸菌菌数の
減少はいずれの培地においても著しく抑制された。
【００４２】
乳酸菌（個／ｍｌ）の推移
【表３】
0004901113.tif 000004
【００４３】
実施例４．
実施例１の方法と同様の方法で乳酸菌およびRizopus oligosporus  NRRL2710（秋田今
野商店、日本国秋田県）を３００mlバッフル付きしんとうフラスコ中のｐH5.5に調整した大豆製品GP-SL（吉原製油、日本国大阪府)7.5%を単一栄養とした１００ｍｌの培地に接種あるいは接種せずに、摂氏２８度で、ロータリーシェイカーをもちいた２００rpmのしん
とう培養を１日間行った後、５日間静置した。乳酸菌として、実施例１のLactobacillus brevis IFO3345(財団法人発酵研究所）に加え、Lactobacillus acidophilus NBRC13951、Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis NBRC3073、 Lactobacillus plantarum NBRC12519、Lactobacillus casei subsp. CaseiNBRC15883、Lactococcus lactis subsp.lactisNBRC12007、 Enterococcus faecalis NBRC3971を使用した。 MRS培地プレート寒天法によ
るコロニー計数をもちいて得た乳酸菌生菌数を接種の有無を対照して比較した結果、表４にしめすとおり、Rizopus属糸状菌との共培養により、培養６日後の乳酸菌の菌密度は著
しく増加した。
【００４４】
【表４】
0004901113.tif 000005
【００４５】
実施例５．
実施例１の方法で得た乳酸菌Lactobacillus brevis IFO3345(財団法人発酵研究所)および Rizopus oligosporus NRRL2710 の共培養物を加熱殺菌後、そのまま真空凍結乾燥を行って得た固形物を粉砕した、粉末５ｇを２００ｍｌの水および市販の牛乳にけんだくし、官能評価したところいずれも呈味、香味の点で飲用に好適であった。