(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族ビニル化合物と芳香族ジビニル化合物と分子中に１つの水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステルとからなる単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させ、これを分散安定剤の存在下に水中に懸濁させて懸濁共重合させて得られた水酸基を有する芳香族ビニル化合物−芳香族ジビニル化合物共重合体からなる多孔質樹脂粒子を固相合成用担体として用いるオリゴヌクレオチドの製造方法であって、上記多孔質樹脂粒子の水酸基にリンカーを結合し、次に、このリンカーの末端から所定の塩基配列となるように、アミダイトを一段ずつ結合した後、リンカー部分を加水分解によって切断して、オリゴヌクレオチドを得ることを特徴とするオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
多孔質樹脂粒子を得るに際して、単量体混合物における分子中に１つの水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステルの割合が０．２〜３０重量％の範囲にあると共に、芳香族ジビニル化合物の割合が２〜３０重量％の範囲にある請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項３】
多孔質樹脂粒子を得るに際して、単量体混合物に対して、有機溶媒を重量比で１〜３倍の範囲にて用いる請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項４】
分子中に１つの水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステルが（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸４−ヒドロキシブチル及び（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルから選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水酸基を有する芳香族ビニル化合物−芳香族ジビニル化合物共重合体からなる多孔質樹脂粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドや核酸等の化学合成に用いられる固相合成法は、固相合成用担体を反応の足場として、アミノ酸やヌクレオチドのユニットを一段ずつ結合して、目的とする配列を有するものを得る方法である。
【０００３】
ペプチドの固相合成用担体としては、従来、非多孔性で高膨潤性の低架橋ポリスチレン粒子が一般的に用いられている (非特許文献１参照)。一方、核酸の固相合成の場合は、同様の固相合成用担体を用いると、例えば、担体中での合成試薬(ヌクレオシドホスホロアミダイト等)の拡散速度が遅いという理由によって、核酸合成の効率が悪くなるので、非膨潤性で且つ比表面積が大きい多孔性ガラス粒子（CPG; Controlled Pore Glass）やシリカゲルが従来から用いられている（特許文献１参照）。CPG やシリカゲルを核酸合成に用いる場合、先ず、シランカップリング剤（例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン）等を用いて上記粒子表面にアミノ基を導入し、次いで、このアミノ基に核酸を切り出すための分解性リンカー(例えば、サクシニル基)を有するヌクレオシドを結合させる。核酸合成は、このヌクレオシド−リンカーを結合した CPG を出発物質として、ホスホロアミダイト法と呼ばれる方法等により行われる。
【０００４】
しかし、近年、核酸医薬品の開発に伴い、核酸をより多く合成することができる固相合成用担体が要求されるようになっている。上記非膨潤性の CPG では比表面積に限界があり、合成量を増やすことが困難であるので、多孔性で膨潤性の架橋ポリスチレン粒子がこれらの目的に応じて開発されている(特許文献２及び３参照)。しかし、核酸を更に高純度且つ高収量で合成することができる、よりコストパフォーマンスのよい固相合成用担体が求められている。
【０００５】
また、これらの架橋ポリスチレン粒子を核酸合成に用いる場合も、前述の CPG やシリカゲルと同様にヌクレオシド−リンカーを結合するために、アミノ基や水酸基のような官能基を導入する必要がある。例えば、スチレンとジビニルベンゼンとクロロメチルスチレンの共重合によって共重合体粒子を製造した後、アンモニア処理してアミノ基を導入する方法や、また、スチレンとジビニルベンゼンとアシルオキシスチレンの共重合によって共重合体粒子を製造した後、加水分解して、水酸基を導入する方法(特許文献４から６参照)等が知られているが、いずれにしても、工程が煩雑である。
【非特許文献１】R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963
【特許文献１】米国特許第４４５８０６６号明細書
【特許文献２】米国特許第６３３５４３８号明細書
【特許文献３】特開昭５８−２１０９１４号公報
【特許文献４】特開昭５２−０２３１９３号公報
【特許文献５】特開昭５８−２１０９１４号公報
【特許文献６】特開平５−０８６１３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、核酸合成を効率よく行なうことができる、即ち、高純度且つ高合成量で核酸を合成することができる、水酸基を有する固相合成用担体を容易に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、芳香族ビニル化合物と芳香族ジビニル化合物と分子中に１つの水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステルとからなる単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させ、これを分散安定剤の存在下に水中に懸濁させて懸濁共重合させることを特徴とする、水酸基を有する芳香族ビニル化合物−芳香族ジビニル化合物共重合体からなる多孔質樹脂粒子の製造方法が提供される。
【０００８】
本発明によれば、このような方法において、単量体混合物における分子中に１つの水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステルの割合が０．２〜３０重量％の範囲にあると共に、芳香族ジビニル化合物の割合が２〜３０重量％の範囲にあることが好ましい。また、上記分子中に１つの水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステルが（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸４−ヒドロキシブチル及び（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。更に、単量体混合物に対して、上記有機溶媒を重量比で１〜３倍の範囲にて用いることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、核酸合成を効率よく行なうことができる固相合成用担体としての水酸基を有する芳香族ビニル化合物−芳香族ジビニル化合物共重合体からなる多孔質樹脂粒子を容易に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明による水酸基を有する芳香族ビニル化合物−芳香族ジビニル化合物共重合体からなる多孔質樹脂粒子の製造方法は、芳香族ビニル化合物と芳香族ジビニル化合物と分子中に１つの水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステルとからなる単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させ、これを分散剤の存在下に水中に懸濁させて懸濁共重合させることからなる。
【００１１】
本発明において、芳香族ビニル化合物として、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、エチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン等の核アルキル置換スチレン、α−メチルスチレン、α−メチル−ｐ−メチルスチレン等のα−アルキル置換スチレン、クロロスチレン等の核ハロゲン化スチレン等を挙げることができるが、これら例示に限定されるものではない。しかし、なかでも、本発明によれば、芳香族ビニル化合物としてスチレンが好ましく用いられる。
【００１２】
本発明において、芳香族ジビニル化合物としては、ジビニルベンゼンやメチルジビニルベンゼンのような核アルキル置換ジビニルベンゼンを挙げることができるが、これら例示に限定されるものではない。しかし、なかでも、ジビニルベンゼンが好ましく用いられる。ジビニルベンゼンは、ｏ−、ｍ−又はｐ−ジビニルベンゼンやこれらの混合物が用いられる。
【００１３】
本発明において、分子中に１つの水酸基を有する(メタ)アクリル酸エステルとは、一般式（Ｉ）
【００１４】
【化１】
0005097506.tif 000002
【００１５】
（式中、Ｒ1は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ2は１つの水酸基を有し、ハロゲン原子又はフェノキシ基を有していてもよい炭素原子数２〜６のアルキル基を示す。）
で表される。
【００１６】
上記一般式で表される分子中に１つの水酸基を有する(メタ)アクリル酸エステルの具体例として、例えば、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル、アクリル酸４−ヒドロキシブチル、メタクリル酸４−ヒドロキシブチル、アクリル酸２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピル、メタクリル酸３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル等を挙げることができる。なかでも、本発明においては、アクリル酸４−ヒドロキシブチル又はアクリル酸２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルが好ましく用いられる。
【００１７】
芳香族ビニル化合物と芳香族ジビニル化合物と分子中に１つの水酸基を有する(メタ)アクリル酸エステルとからなる単量体混合物の懸濁共重合において、単量体混合物中の分子中に１つの水酸基を有する(メタ)アクリル酸エステルの割合は、通常、０．２〜３０重量％の範囲であり、好ましくは、５〜２０重量%の範囲である。単量体混合物中の分子中に１つの水酸基を有する(メタ)アクリル酸エステルの割合が０．２重量％よりも少ない場合は、得られる共重合体からなる多孔質樹脂粒子の有する水酸基量が少なすぎて、例えば、固相合成用担体として用いたときに、得られる合成反応物の量が少ない。他方、単量体混合物中の分子中に１つの水酸基を有する(メタ)アクリル酸エステルの割合が３０重量％よりも多い場合は、例えば、固相合成用担体として用いたときに、得られる多孔質樹脂粒子の水酸基の密度が過度に高く、その結果、空間的に隣接して起こる化学反応が互いに阻害されて、得られる合成反応物の純度が低い。
【００１８】
また、単量体混合物中の芳香族ジビニルベンゼン化合物の割合は、通常、２〜３０重量％の範囲であり、好ましくは、２〜２０重量％の範囲である。単量体混合物中の芳香族ジビニルベンゼン化合物の割合が５重量％よりも少ない場合は、得られる共重合体からなる多孔質樹脂粒子の比表面積が著しく小さいので、例えば、固相合成用担体として用いたときに、得られる合成反応物の量が少ない。他方、単量体混合物中の芳香族ジビニルベンゼン化合物の割合が３０重量％よりも多い場合は、例えば、固相合成用担体として用いたときに、得られる多孔質樹脂粒子が有機溶媒中で膨潤が妨げられるために、得られる合成反応物の量が少ない。
【００１９】
本発明において、芳香族ビニル化合物と芳香族ジビニル化合物と分子中に１つの水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステルとからなる単量体混合物の懸濁共重合は、従来から知られている通常の方法によって行うことができる。従って、例えば、単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させ、別に、分散安定剤を水に溶解させ、次いで、これら２つの溶液を窒素気流下に混合、攪拌して、単量体混合物と重合開始剤を有機溶媒に溶解させた溶液を水中に微小な液滴として分散させた後、昇温して、攪拌下に重合反応させればよい。共重合反応は、通常、攪拌下に反応温度６０〜９０℃で０．５〜４８時間にわたって行えばよいが、しかし、共重合の反応条件はこれに限定されるものではない。
【００２０】
本発明においては、上記有機溶媒としては、炭化水素及びアルコールから選ばれる少なくとも１種が用いられる。本発明において、炭化水素は、脂肪族炭化水素と芳香族炭化水素を含み、脂肪族炭化水素は、飽和、不飽和のいずれでもよいが、好ましくは、炭素数５〜１２の脂肪族飽和炭化水素又はアルキルベンゼンであり、炭素数５〜１２の脂肪族飽和炭化水素として、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、ウンデカン、ドデカン等を挙げることができ、また、アルキルベンゼンとしてトルエン等を挙げることができ。
【００２１】
他方、アルコールとしては、脂肪族アルコールが好ましく用いられ、特に、炭素数５〜１２の脂肪族アルコールが好ましい。好ましい具体例として、例えば、２−エチルヘキシルアルコール、t−アミルアルコール、ノニルアルコール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等を挙げることができる。
【００２２】
本発明によれば、得られる多孔質樹脂粒子が大きい比表面積を有するように、単量体混合物と重合開始剤を溶解させる有機溶媒として、上記炭化水素とアルコールの混合物を用いることが好ましい。この炭化水素とアルコールの混合物において、炭化水素／アルコール重量比は、用いる炭化水素とアルコールの具体的な組合せにもよるが、通常、１／９〜６／４の範囲である。
【００２３】
また、上記有機溶媒は、通常、有機溶媒／単量体重量比にて１〜３の範囲で用いられ、好ましくは、１．２〜２の範囲で用いられる。有機溶媒／単量体重量比が上記範囲を外れるときは、いずれの場合においても、得られる多孔質樹脂粒子の比表面積が小さくなり、例えば、固相合成用担体として用いるときは、化学反応による合成反応物の量が少なくなる。
【００２４】
分散安定剤は、従来から、懸濁重合における分散安定剤として用いられているものであれば、特に限定されることなく、任意のものを用いることができる。そのような分散安定剤として、例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ゼラチン、デンプン、カルボキシルメチルセルロース等の親水性保護コロイド剤、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、ベントナイト等の難溶性無機粉末等を挙げることができる。用いる分散安定剤の量は、特に限定されないが、好ましくは、懸濁重合における水に対して０．０１〜１０重量％の範囲である。分散安定剤の量が懸濁重合において用いる水に対して０．０１重量％よりも少ないときは、懸濁重合の安定性が損なわれて、多量の凝集物が生成し、他方、分散安定剤の量が懸濁重合において用いる水に対して１０重量％よりも多いときは、例えば、固相合成用担体として用いるには微小にすぎる粒子が多数生成する。
【００２５】
更に、懸濁重合に用いる重合開始剤も、懸濁重合における分散安定剤として、従来から用いられているものであれば、特に限定されることなく、任意のものを用いることができる。そのような重合開始剤として、例えば、ジベンゾイルパーオキサイド、ジラウロイルパーオキサイド、ジステアロイルパーオキサイド、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ)−２−メチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ)−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）シクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ジ−ｔ−ヘキシルパーオキサイド、ｔ−ブチルクミルパーオキサイド、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、１，１，３，３−テトラメチルブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ヘキシルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシイソプロピルモノカルボネート等の過酸化物、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチルブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２，４ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物を挙げることができる。
【００２６】
上述したようにして、単量体混合物と重合開始剤を溶解させた有機溶媒を水中に懸濁させ、懸濁共重合させ、共重合体を沈降させた後、共重合体を洗浄して、共重合体に残存する単量体のほか、有機溶媒や分散安定剤、重合開始剤等の不純物を除去し、精製する。先ず、洗浄用溶媒としては、上記不純物を除去するに有用である溶媒であれば、特に限定されるものではないが、通常、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、トルエン、ヘキサン、テトラヒドロフラン等が用いられる。得られた共重合体を洗浄するには、例えば、懸濁共重合後の共重合体の分散液を吸引濾過し、得られた共重合体を上記洗浄用溶媒中で攪拌、洗浄し、次いで、再度、共重合体を吸引濾過し、同様に、洗浄する操作を繰返せばよい。また、上記洗浄の過程において、必要に応じて、加熱して、共重合体中の揮発性の不純物を除去することもできる。
【００２７】
このようにして、本発明によれば、目的とする芳香族ビニル化合物と芳香族ジビニル化合物と分子中に１つの水酸基を有する（メタ）アクリル酸エステルの共重合体からなる多孔質樹脂粒子を得ることができるが、更に、必要に応じて、これに乾燥や分級等の処理を施してもよい。
【００２８】
このような多孔質樹脂粒子は、例えば、オリゴヌクレオチドを合成するための固相合成用担体として好適に用いることができる。因みに、本発明による多孔質樹脂粒子を固相合成用担体として用いるオリゴヌクレオチドの合成においては、従来から知られている方法によることができる。例えば、本発明による多孔質樹脂粒子の水酸基にリンカーを結合し、次に、このリンカーの末端から所定の塩基配列となるように、アミダイトを一段ずつ結合する。この合成反応は、自動合成装置を用いて行うことができる。例えば、リンカーを結合した多孔質樹脂粒子を装置内のフロー式反応器に充填し、これにアセトニトリル等の各種有機溶媒やアミダイト溶液を順次供給して、反応を繰返させる。最終的には、リンカー部分を加水分解等によって切断して、目的のオリゴヌクレオチドを得ることができる。上記リンカーには、従来から知られているものが適宜に用いられる。例えば、本発明による多孔質樹脂粒子に下記の構造を有するヌクレオシドリンカーを結合して、オリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００２９】
【化２】
0005097506.tif 000003
【００３０】
ここに、○は本発明によって得られる水酸基を有する芳香族ビニル化合物−芳香族ジビニル化合物共重合体からなる多孔質樹脂粒子、ＤＭＴは５’ 位置の保護基ジメトキシトリチル基、Ｂ1 は塩基である。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
冷却機、攪拌機及び窒素導入管を備えた５００ｍＬ容量のセパラブルフラスコを恒温水槽に浸漬し、これにポリビニルアルコール（（株）クラレ製）２．５ｇと蒸留水２５０ｇを入れ、３００ｒｐｍにて攪拌し、溶解させて、ポリビニルアルコール水溶液を調製した。別に、スチレン４９ｇ、メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル３ｇ、ジビニルベンゼン（含有量５５重量％）８ｇ、２−エチルヘキサノール５５ｇ、イソオクタン２５ｇ及び過酸化ベンゾイル(２５重量％含水物)１ｇからなる溶液を調製した。
【００３３】
この溶液を上記ポリビニルアルコール水溶液に加え、窒素気流下、室温にて攪拌速度５００ｒｐｍで攪拌した後、８０℃に昇温して、８時間、懸濁共重合を行った。このようにして得られた粒子状の共重合体を蒸留水とアセトンを用いて濾過、洗浄した後、容器中にて全量が約１Ｌとなるようにアセトン中に分散させた。 次いで、この分散液を静置し、共重合体粒子が沈殿して、容器を傾けても、器底の沈殿が乱れない程度になるまで放置した後、上澄みのアセトンを除いた。容器中に再度、アセトンを加え、全量を約５００ｍＬにして、上述したように、静置し、上澄みのアセトンを除く操作を１０回以上繰返して、共重合体粒子を分級した。このようにして得られた共重合体粒子の分散液を濾過し、得られた共重合体粒子を減圧乾燥して、スチレン−メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル−ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔質樹脂粒子を粉末として得た。
【００３４】
得られた多孔質樹脂粒子について以下の分析を行った。
【００３５】
（メジアン径）
レーザー回折／散乱法（レーザー回折／散乱式粒度分布装置、（株）堀場製作所製ＬＡ−９２０）にて測定した。
【００３６】
（平均細孔直径）
水銀圧入法（水銀ポロシメータ、Quantachrome Instruments 製 PoreMaster 60GT）にて測定した。
【００３７】
（水酸基量）
ＪＩＳ  Ｋ  ００７０に基づき、滴定によって測定した。即ち、測定対象の多孔質樹脂粒子の水酸基を既知量のアセチル化試薬（無水酢酸／ピリジン）によってアセチル化し、このアセチル化において消費されなかった無水酢酸量を水酸化カリウムによる滴定で求めることによって、試料の水酸基量を算出した。具体的には以下のとおりである。無水酢酸２５ｇとピリジンを加えて全量１００ｍＬにしたものをアセチル化試薬として用いた。測定試料（乾燥した多孔質樹脂粒子）０．５〜２ｇをフラスコに秤り取り、上記アセチル化試薬０．５ｍＬとピリジン４．５ｍＬとを正確に加えた。フラスコ中の混合物を９５〜１００℃にして２時間経過した後、室温まで放冷し、その後、蒸留水１ｍＬを加えた。１０分間加熱して、アセチル化に消費されなかった無水酢酸を分解した。フラスコの全量をビーカーに移し、蒸留水で全量１５０ｍＬに希釈した後、０．５規定の水酸化カリウム水溶液で滴定した。別に、測定試料を入れずに、上記と同様の操作によってブランク測定を行った。
【００３８】
測定試料の水酸基量は下記式から求めた。
【００３９】
Ａ＝（Ｂ−Ｃ）×０．５（ｍｏｌ／Ｌ）×ｆ×１０００÷Ｍ
【００４０】
ここに、Ａ（μｍｏｌ／ｇ）は試料の水酸基量、Ｂ（ｍＬ）はブランク測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量、Ｃ（ｍＬ）は測定試料の測定における水酸化カリウム水溶液の滴定量、fは水酸化カリウム水溶液のファクター、Ｍ（ｇ）は試料の重量である。
【００４１】
測定の結果、メジアン直径は７７μｍ、平均細孔径１５ｎｍ、水酸基量２８０μｍｏｌ／ｇであった。
【００４２】
実施例２
実施例１において、単量体として、スチレン４７ｇ、アクリル酸２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピル６ｇ及びジビニルベンゼン(含有量５５重量％)７ｇを用いると共に、有機溶媒として２−エチルヘキサノール６３ｇとイソオクタン２７ｇを用いた以外は、実施例1と同様にして、スチレン−アクリル酸２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピル−ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔質樹脂粒子を粉末として得た。この多孔質樹脂ビーズについて、実施例1と同様にして分析を行った結果、メジアン直径８５μｍ、平均細孔径２６ｎｍ、水酸基量３６０μｍｏｌ／ｇであった。
【００４３】
実施例３
実施例１において、単量体として、スチレン４７ｇ、アクリル酸４−ヒドロキシブチル６ｇ及びジビニルベンゼン(含有量５５重量％)７ｇを用いると共に、有機溶媒として１−デカノール７０ｇを用いた以外は、実施例1と同様にして、スチレン−アクリル酸４−ヒドロキシブチル−ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔質樹脂粒子を粉末として得た。この多孔質樹脂粒子について、実施例1と同様にして分析を行った結果、メジアン直径７５μｍ、平均細孔径２４ｎｍ、水酸基量５９０μｍｏｌ／ｇであった。
【００４４】
参考例１
(ヌクレオシドサクシネートリンカーの結合)
実施例２において得られた多孔質樹脂粒子に、以下のようにして、オリゴヌクレオチド固相合成のためのＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカー (5'-O-dimethoxytrityl-  tymidine-3'-succinate trimethylammonium salt) を結合した。即ち、乾燥した多孔質樹脂粒子１ｇ、ＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカー０．１５ｇ、ＨＢＴＵ (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) ０．０９ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．０９ｍＬ及びアセトニトリル１０ｍＬを５０ｍＬ容量のガラス容器に入れて混合し、室温で攪拌下に１２時間反応させた。反応終了後、得られた反応混合物をアセトニトリルにて洗浄、濾過した後、全量が２５ｍＬになるようにアセトニトリル中に分散させ、ＣＡＰ−Ａ(２０％無水酢酸／８０％アセトニトリル)５ｍＬ、ＣＡＰ−Ｂ(２０％Ｎ−メチルイミダゾール／3０％ピリジン／５０％アセトニトリル)２．５ｍＬ及び４−ジメチルアミノピリジン０．０２５ｇを加えて混合し、室温で攪拌下に６時間反応させた。反応終了後、得られた反応混合物をアセトニトリルにて洗浄、濾過した後、減圧乾燥して、ＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカー付加多孔質樹脂粒子を得た。ＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカーの付加量は６０μｍｏｌ／ｇであった。
【００４５】
（オリゴヌクレオチドの合成)
上記ＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカー付加多孔質樹脂粒子を合成用カラムに詰め、Applied Biosystems 3400 DNA 合成機にセットして、合成スケール１μｍｏｌ、ＤＭＴ-off の条件にてオリゴヌクレオチドｄＴ２０（チミン２０塩基のオリゴヌクレオチド) の合成を行った。多孔質樹脂粒子からのオリゴヌクレオチドの切り出し及び脱保護は、濃アンモニア水を用いて、５５℃で１２時間反応させて行った。紫外線吸光度測定（２６０ｎｍ）から得られたオリゴヌクレオチドのＯＤ収量を表１に示す。
【００４６】
得られたオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ測定 (ウォーターズ製アライアンスＵＶシステム、ＹＭＣ製 Hydrosphere C18) から求めた全長オリゴヌクレオチド (２０塩基配列のオリゴヌクレオチド) の割合を表１に示す。
【００４７】
参考例２
(ヌクレオシドサクシネートリンカーの結合)
実施例３において得られた多孔質樹脂粒子に、参考例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカーを結合して、ＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカー付加多孔質樹脂粒子を得た。ＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカーの付加量は１２７μｍｏｌ／ｇであった。
【００４８】
(オリゴヌクレオチドの合成)
上記ＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカー付加多孔質樹脂粒子を用いて、参考例１と同様にして、オリゴヌクレオチドｄＴ２０を合成した。参考例１と同様にして、オリゴヌクレオチドのＯＤ収量及び全長オリゴヌクレオチドの割合を表１に示す。
【００４９】
比較例１
(多孔質樹脂粒子の調製)
実施例1において、単量体として、スチレン４８ｇ、ｐ−アセトキシスチレン３．５ｇ、ジビニルベンゼン(含有量５５重量%)７ｇを用いると共に、有機溶媒として２−エチルヘキサノール５２ｇとイソオクタン２３ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、粉末状のスチレン−ｐ−アセトキシスチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔質樹脂粒子を粉末として得た。
【００５０】
冷却機及び攪拌機を備えた５００ｍＬ容量のセパラブルフラスコを恒温水槽に浸漬し、これに上記多孔質樹脂粒子２０ｇ、エタノール１００ｇ及び水酸化ナトリウム水溶液(５重量％)５０ｇを入れて、攪拌速度４００ｒｐｍで攪拌した後、７５℃に昇温して、１２時間にわたって加水分解反応を行った。得られた溶液を中和した後、蒸留水とアセトンを用いて、濾過洗浄した。得られた多孔質樹脂粒子を減圧乾燥して、スチレン−４−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔質樹脂粒子を得た。
【００５１】
得られた多孔質樹脂ビーズについて、実施例１と同様にして分析を行った結果、メジアン直径８６μｍ、平均細孔径３３ｎｍ、水酸基量４２２μｍｏｌ／ｇであった。
【００５２】
(オリゴヌクレオチドの合成)
参考例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３'−サクシネートリンカーを付加した多孔質樹脂粒子 (付加量５４μｍｏｌ／ｇ及び１５０μｍｏｌ／ｇ) を調製し、それぞれを用いて、オリゴヌクレオチドｄＴ２０の合成を行った。参考例１と同様にして，オリゴヌクレオチドのＯＤ収量及び全長オリゴヌクレオチドの割合を表１に示す。
【００５３】
【表１】
0005097506.tif 000004
【００５４】
参考例１の多孔質樹脂粒子 (リンカー付加量６０μｍｏｌ／ｇ) を用いた場合と比較例１の多孔質樹脂粒子(リンカー付加量５４μｍｏｌ／ｇ)を用いた場合を比較すると、参考例１は、全長オリゴヌクレオチドの割合を比較例１と同等の高い値に維持しつつ、オリゴヌクレオチドのＯＤ収量(合成収量)を高くすることができる。
【００５５】
同様に、参考例２の多孔質樹脂粒子 (リンカー付加量１２７μｍｏｌ／ｇ) を用いた場合と比較例１の多孔質樹脂粒子(リンカー付加量１５０μｍｏｌ／ｇ)を用いた場合を比較すると、参考例２は、全長オリゴヌクレオチドの割合を比較例１と同等の高い値に維持しつつ、オリゴヌクレオチドのＯＤ収量(合成収量)を高くすることができる。