(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対して感受性が増加した単離Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞であって、該細胞は（ｉ）標的核酸を発現し、且つ（ｉｉ）上昇したレベルの配列番号１により表されるヌクレオチド配列からなる核酸を含み、そしてそこへ導入される分子であって該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に向けられたアンチセンス核酸であるかまたはそれを生じる分子を有し、該配列番号１により表されるヌクレオチド配列が、該アンチセンス核酸が該標的核酸の発現を阻害する度合いを増加することを可能にする、
前記細胞。
【請求項２】
細胞調製物中のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞中の標的核酸の発現を阻害するための方法であって、
（ｉ）  該細胞中で配列番号１により表されるヌクレオチド配列の発現を増加させること、及び
（ｉｉ）  工程（ｉ）を実行する前、それと同時又はそれに続けて、該細胞中へ、該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に向けられたアンチセンス核酸であるか又はそれを生じさせる分子を導入すること、
の工程を含む、前記方法。
【請求項３】
標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対する細胞感受性を増加させる方法であって、該標的核酸を発現する細胞調製物中のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞中で配列番号１により表されるヌクレオチド配列の発現を増加させること、及びその前に、それと同時に又はそれに続けて該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に向けられたアンチセンス核酸であるか又はそれを生じる分子を該細胞中へ導入することを含む、前記方法。
【請求項４】
前記標的核酸が外因性核酸である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１により表されるヌクレオチド配列の発現が、該配列の付加的コピー又は該配列を生じる作用物質を該細胞中へ導入することにより増加する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１により表されるｒｅｓ配列からなる核酸であるＲＮＡｉ因子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、細胞における遺伝子抑制を増強するための方法に関する、そして特にそれは、ＲＮＡｉに随伴する因子類の操作によりＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを増強するための改良法に関する。本発明はまた、ＲＮＡｉを上方制御する（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）因子類だけでなく、下方制御する（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）因子類をも、同定するための方法に関する。それはまた、遺伝子サイレンシングを増強またはモジュレートするために有用な遺伝子構築体およびそうした構築体を内蔵する細胞に関する。
【０００２】
発明の背景
遺伝子発現を特異的に干渉するための、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の使用は、これまで遺伝子的に取扱いにくかったいくつかを含む一連の生物で、その効力が証明されたため、かなり注目されるようになっている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼称されるそれは、ウイルス防御、転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ）エレメントの制御、遺伝的刷込み、および内因性遺伝子調節と関係があるとされてきた。それは、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）、クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）、およびアンチセンスＲＮＡ媒介遺伝子抑制における中心機構であると、仮定されてきた。提案されてきた１つのモデルは、ｄｓＲＮＡが、ｄｓＲＮＡ特異的ヌクレアーゼ類により２１−２５ヌクレオチド（ｎｔ）分子種へ断片化され、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより増幅され、次いで解離され、そして自由に、ＲＮＡヌクレアーゼ媒介性分解により相同ｍＲＮＡを攻撃する、というものである。本技術の適用は、遺伝子機能の精査および疾患状態に関与する遺伝子類の確認を、大いに簡易化すると思われる。
【０００３】
最近、少なくとも２つの異なる戦略が、ｄｓＲＮＡの認識およびｄｓＲＮＡ媒介遺伝子干渉の活性化に関与する多タンパク質複合体とされるものを構成する細胞タンパク質を同定するために、企てられた。第一のものは、ＲＮＡｉに対して完全に欠陥性の変異体を分離するための古典的化学突然変異誘発または挿入型突然変異誘発の使用、および相補性を用いる関連遺伝子類のクローニング、を含む。これらの研究は、植物、線虫および真菌のような遺伝子的に扱い易い生物で行われてきた。記載された遺伝的スクリーンは、抑制の程度が完全なＲＮＡｉ系の使用を含む。該変異誘発は、ＲＮＡｉ効果が完全に逆転される変異体を産生することから、ＲＮＡｉ効果に必要な細胞因子（機能）の消失を示す。したがってこれらの遺伝的スクリーンは、微妙な効果またはＲＮＡｉにおける速度制限または速度決定的役割をもつ因子類を、見逃す可能性が非常に高い。
ＲＮＡｉにおける鍵プレイヤーを見い出すための第二の戦略は、無細胞検定法の使用に関するものであった。ところで、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構成検定法は、細胞状況の外部でＲＮＡｉにインパクトを与える細胞因子類を同定するので、それらの因子類の細胞役割を常に検証しなければならない。
【０００４】
しかし、これらの戦略の主要な欠点は、当該遺伝子がその生物に必須である場合には、同定されないか、当該遺伝子が過剰発現された場合、ＲＮＡｉを増強するであろう遺伝子活性を直接同定しないと思われることである。
したがって、増加および減少の両方の量的活性を選択可能な、一連のＲＮＡｉ効能を証明できるモデルが必要である。これにより、当該遺伝子サイレンシング効果を増強または低減させることができる因子類の同定が、可能になるだろう。それ故、先行技術の１つまたはそれ以上の欠点を克服するか、あるいは少なくとも軽減すること、または有用な代替方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００５】
発明の要約
ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの研究用の分裂酵母モデルの使用を通じ、またこのプロセスに関与する因子類の探索において、ＲＮＡｉ活性の自然レベルは、ＲＮＡｉ活性または効能に随伴する因子類を操作することによって、増強できることが、意外にも見い出された。このように、対応するアンチセンス配列またはその一部の同一プールの存在下で、標的核酸配列の定常状態レベルを上昇させることにより、当該アンチセンス媒介抑制は、維持されるだけでなく、増強されることが、見い出された。これは遺伝子抑制のＲＮＡｉ様機構を示している。また、本明細書でＲＮＡｉ増強配列（ｒｅｓ）と名付けられた（本明細書ではアンチセンス増強配列−ａｅｓとも呼ばれる）いくつかの配列の過剰発現も、ＲＮＡｉを増強する能力をもつことが見い出された。
分裂酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅで増強されるＲＮＡｉ活性のこの能力は、ＲＮＡｉプロセスの分析、およびその活性を上方制御あるいは下方制御する因子類の同定および研究を、可能にするモデル系を提供する。当該系は、それらの結果として生じるタンパク質活性がｉｎ  ｖｉｖｏで増大される場合、ＰＴＧＳ効能を増加するＲＮＡｉ増強遺伝子配列を同定するために、さらに使用されてきた。本発明を例示するのに用いられたモデルおよび記載された方法は、遺伝子発現が、より効率的なモジュレートまたはサイレンシングを必要とする障害の治療にも適用可能である。
【０００６】
第１の側面に従い、細胞中の標的核酸の発現を阻害するための方法が提供されるが、その方法は、
（ｉ）  当該細胞中でＲＮＡｉ因子のレベルを上昇させること、そして
（ｉｉ）  工程（ｉ）を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに当該ＲＮＡｉ因子が増加することを可能にする条件下で、当該細胞中へ導入すること、
の工程を含む。
【０００７】
第２の側面に従い、標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対する細胞感受性を増加させる方法が提供されるが、その方法は、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに当該ＲＮＡｉ因子が増加することを可能にする条件下で、当該細胞中へ事前に、同時に、または後に、導入されたという前提で、当該標的核酸を発現する細胞中で当該ＲＮＡｉ因子のレベルを上昇させることを、含む。
【０００８】
第３の側面に従い、その緩和が標的核酸の発現を阻害することにより媒介される障害に苦しむ患者を治療するための方法が提供されるが、その方法は、
（ｉ）  当該標的核酸が発現される当該患者の細胞中でＲＮＡｉ因子のレベルを上昇させること、そして
（ｉｉ）  工程（ｉ）を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに当該ＲＮＡｉ因子が増加することを可能にする条件下で、そうした細胞中へ導入し、それによって当該患者を治療すること、
の工程を含む。
【０００９】
第４の側面に従い、その緩和が標的核酸の発現を阻害することにより媒介される障害の発症を患者において阻止するための方法が提供されるが、その方法は、
（ｉ）  当該患者が当該障害に悩んでいる場合に、当該標的核酸が発現されるはずの当該患者の細胞中でＲＮＡｉ因子のレベルを上昇させること、そして
（ｉｉ）  工程（ｉ）を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現、もしそうした発現が起るとしたら、それを阻害するはずの程度までに当該ＲＮＡｉ因子が増加することを可能にする条件下で、そうした細胞中へ導入し、それによって当該患者における当該障害の発症を阻止すること、
の工程を含む。
【００１０】
第５の側面に従い、ある特定の標的核酸の発現、またはその産物の活性を阻害することが、ある障害を緩和する可能性があるか否かを決定する方法が提供されるが、その方法は、
（ｉ）  その表現型が、当該障害をもつ患者からの細胞のものと相関する細胞中で、ＲＮＡｉ因子のレベルを上昇させること、そして
（ｉｉ）  工程（ｉ）を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現を阻害する程度までに当該ＲＮＡｉ因子が増加することを可能にする条件下で、当該細胞中へ導入すること、そして
（ｉｉｉ）  当該細胞の表現型がここで、当該障害が緩和されいてるか又は当該障害が顕著でない患者からの細胞のものと相関するか否かを決定し、それによって、当該標的核酸の発現またはその産物の活性を阻害することが、当該障害を緩和する可能性があるか否かを決定すること、
の工程を含む。
【００１１】
好ましい実施態様では、前記標的核酸は内因性核酸またはその一部であるが、それは外因性配列またはその一部であってもよい。
好ましくは、前記ＲＮＡｉ因子のレベルは、当該ＲＮＡｉ因子の付加的コピーまたは当該因子を生じる作用物質を、前記細胞中へ導入することにより上昇させる。それ故、内因性ＲＮＡｉ因子の発現を上方制御することも、同じ結果を達成することになり、本発明の一部として本明細書で意図されることが、理解されよう。
【００１２】
好ましくは、前記因子は、遺伝子、ｃＤＮＡ，ＲＮＡまたはタンパク質より成る群から選択される。より好ましくは、前記アンチセンス核酸の転写アクチベーター、前記ＲＮＡｉ機械装置の成分、前記ＤＮＡ複製機械装置の成分、および翻訳機械装置の成分より成る群から選択される因子である。さらに一層好ましくは、ｒｅｓ配列であるＲＮＡｉ因子である。
また好んで、前記因子は、本明細書で定義されるような、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ（ｄｅｄ１），転写因子ｔｈｉ１，ＤＮＡ複製タンパク質ｓｎａ４１，リボソームタンパク質Ｌ７ａ，伸長因子ＥＦ−Ｔｕおよびｒｅｓ１より成る群から選択されてもよい。
【００１３】
さらに好ましい因子類は、Ｗ１８，Ｗ２０，Ｗ２１，Ｗ２３，Ｗ２７，Ｗ２８，Ｗ３０，Ｗ３２，およびＷ４７と本明細書で称する形質転換細胞から得られるｒｅｓ配列により表される。
好ましくは、前記ｒｅｓ配列は、配列番号１から４のいずれか１つにより表される。
前記好ましい細胞は真核生物細胞であり、そしてさらに一層好ましいのは、哺乳動物細胞である。本明細書に記載の当該発明のいくつかの実施態様において、好ましい細胞は、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞である。
【００１４】
好ましくは、前記アンチセンス核酸は、前記標的核酸の一部のみに対応する。
第６の側面に従い、
（ｉ）  ＲＮＡｉ因子をコードする、またはその発現を増加あるいは減少させることができる、発現可能な核酸；
（ｉｉ）  当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子をコードする核酸；そして
（ｉｉｉ）  （ｉ）および（ｉｉ）の核酸が、同じまたは異なる分子上に位置することがあってもよい、医薬的に許容可能なキャリヤー、
を含む、前掲側面のいずれか１つの方法を実行する際に使用するための医薬組成物が提供される。
【００１５】
第７の側面に従い、
（ｉ）  前記標的核酸またはその一部である核酸、または当該標的核酸の細胞内レベルを上昇させることができる因子をコードする発現可能な核酸；
（ｉｉ）  当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子をコードする核酸；そして
（ｉｉｉ）  （ｉ）および（ｉｉ）の核酸が、同じまたは異なる分子上に位置することがあってもよい、医薬的に許容可能なキャリヤー、
を含む、請求項２から１７のいずれか１つの方法を実行する際に使用するための医薬組成物が提供される。
【００１６】
第８の側面に従い、標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対して感受性が増加した細胞が提供されるが、その細胞は、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現を阻害する程度までに前記ＲＮＡｉ因子が増加することを可能にする条件下で、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該細胞中へ導入されたことを前提として、（ｉ）標的核酸を発現する、そして（ｉｉ）上昇したレベルのＲＮＡｉ因子を含む。
好んで前記細胞は真核生物細胞であるが、より好ましいのは、哺乳動物細胞である。上に指摘されたように、本明細書に記載の当該発明のいくつかの実施態様において、好ましい細胞はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞である。
【００１７】
第９の側面に従い、細胞中の標的核酸の発現を阻害するための方法が提供されるが、その方法は、
（ｉ）  当該細胞中で当該標的核酸またはその一部のレベルを増大させること、そして
（ｉｉ）  工程（ｉ）を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに増加を可能にする条件下で、当該細胞中へ導入すること、
の工程を含む。
【００１８】
第１０の側面に従い、標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対する細胞感受性を増加させる方法が提供されるが、その方法は、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までにその増加を可能にする条件下で、当該細胞中へ事前に、同時に、または後に、導入されているという前提で、当該標的核酸を発現する細胞中で当該標的核酸またはその一部のレベルを増大させることを、含む。
【００１９】
第１１の側面に従い、その緩和が標的核酸の発現を阻害することにより媒介される障害に苦しむ患者を治療するための方法が提供されるが、その方法は、
（ｉ）  当該標的核酸が発現される当該患者の細胞中で当該標的核酸またはその一部のレベルを増大させること、そして
（ｉｉ）  工程（ｉ）を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに増加を可能にする条件下で、そうした細胞中へ導入し、それによって当該患者を治療すること、
の工程を含む。
【００２０】
第１２の側面に従い、その緩和が標的核酸の発現を阻害することにより媒介される障害の発症を患者において阻止するための方法が提供されるが、その方法は、
（ｉ）  当該患者が当該障害に悩んでいる場合に、当該標的核酸が発現されるはずの当該患者の細胞中で当該核酸またはその一部のレベルを増大させること、そして
（ｉｉ）  工程（ｉ）を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現、もしそうした発現が起るとしたら、それを阻害するはずの程度までに増加を可能にする条件下で、そうした細胞中へ導入し、それによって当該患者における当該障害の発症を阻止すること、
の工程を含む。
【００２１】
第１３の側面に従い、ある特定の標的核酸の発現、またはその産物の活性を阻害することが、ある障害を緩和する可能性があるか否かを決定する方法が提供されるが、その方法は、
（ｉ）  その表現型が、当該障害をもつ患者からの細胞のものと相関する細胞中で、当該標的核酸のレベルを増大させること、
（ｉｉ）  工程（ｉ）を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現を阻害する程度までに増加を可能にする条件下で、当該細胞中へ導入すること、そして
（ｉｉｉ）  当該細胞の表現型がここで当該障害が緩和されているか又は当該障害が顕著でない患者からの細胞のものと相関するか否かを決定し、それによって、当該標的核酸の発現またはその産物の活性を阻害することが、当該障害を緩和する可能性があるか否かを決定すること、
の工程を含む。
【００２２】
好ましい実施態様では、前記標的核酸は内因性核酸またはその一部であるが、それは外因性配列またはその一部であってもよい。
好ましくは、前記標的核酸のレベルは、当該標的核酸の付加的コピー、またはその細胞内過剰発現を誘導できる作用物質を、前記細胞中へ導入することにより増大させる。過剰発現は、内因性ならびに外因性の標的核酸について達成可能である。好ましくは、当該標的核酸の量を増大するために用いられる核酸は、当該標的核酸の断片、誘導体または類似体である。しかし、当該標的核酸のそっくりそのままの配列を用いてもよいことは理解されよう。
好都合には、前記標的核酸は選択可能なマーカーに連結させてもよい。
好ましい細胞は真核生物細胞であり、そしてさらに一層好ましいのは、哺乳動物細胞である。本明細書に記載の当該発明のいくつかの実施態様において、好ましい細胞はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞である。
【００２３】
好ましくは、前記アンチセンス核酸は、前記標的核酸の一部のみに対応する。
第１４の側面に従い、標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対して感受性が増加した細胞が提供されるが、その細胞は、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現を阻害する程度までに前記ＲＮＡｉ因子が増加することを可能にする条件下で、当該標的核酸のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子が、当該細胞の中へ導入されたことを前提として、（ｉ）当該標的核酸を発現する、そして（ｉｉ）上昇したレベルの当該核酸を含む。
好ましい細胞は真核生物細胞であり、そしてより一層好ましいのは、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞である。
第１５の側面に従い、標的核酸、および当該標的核酸またはその一部のアンチセンスである核酸、をもつ細胞中で当該標的核酸の発現を、実効すること、および／またはモジュレートすることができる細胞因子を同定する方法が提供されるが、その方法は当該細胞中で当該因子を過剰発現することを含み、そしてそこでの当該標的核酸の発現は増強されるか、または部分的に抑制されることも可能である。
【００２４】
第１６の側面に従い、前記１５番側面の方法により同定された因子が提供される。
好ましい因子類は、遺伝子、ｃＤＮＡ，ＲＮＡまたはタンパク質より成る群から選択可能である。より好ましいのは、転写アクチベーターまたは前記アンチセンス核酸、前記ＲＮＡｉ機械装置の成分、前記ＤＮＡ複製機械装置の成分、および翻訳機械装置の成分より成る群から選択される因子である。さらに一層好ましいのは、ｒｅｓ配列をもつ因子である。
好ましい因子類はまた、本明細書で定義されるような、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ（ｄｅｄ１），転写因子ｔｈｉ１，ＤＮＡ複製タンパク質ｓｎａ４１，リボソームタンパク質Ｌ７ａ，伸長因子ＥＦ−Ｔｕおよびｒｅｓ１より成る群から選択することも可能である。
【００２５】
第１７の側面に従い、Ｗ１８，Ｗ２０，Ｗ２１，Ｗ２３，Ｗ２７，Ｗ２８，Ｗ３０，Ｗ３２，およびＷ４７と本明細書で称する形質転換細胞から得られるｒｅｓ配列であるＲＮＡｉ因子が提供される。
第１８の側面に従って、配列番号１から４により表されるｒｅｓ配列であるＲＮＡｉ因子が提供される。
【００２６】
第１９の側面に従い、標的核酸またはその一部、および当該標的核酸またはその一部に対応するアンチセンス核酸またはその一部をもつＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞が提供されるが、そこでの当該標的核酸の発現は増強されるか、または部分的にのみ抑制されることが可能である。
用語「標的核酸の発現を阻害すること」は、本発明の関係において用いられる場合、当該標的核酸が細胞に導入された遺伝子またはその一部であるか、あるいはそれが内因性遺伝子であるか、否かを問わず、遺伝子発現の低減または排除を、非限定的に包含することが意図される。
【００２７】
用語「ＲＮＡｉ因子」は、ＲＮＡｉ活性を増強することが可能な、任意の、天然に存在する、修飾された、または合成の、分子をその範疇に含むことが意図される。この定義は、本明細書でＲＮＡｉ増強配列（ｒｅｓ）と呼ばれる因子類をその範疇に含む。用語ｒｅｓは、用語ａｅｓ（アンチセンス増強配列）と互換的に、本明細書では用いられてもよい。
【００２８】
「ＲＮＡｉ因子レベルを増強すること」は、トランスフェクション、
上方制御、または技術分野で知られる他の手段により達成可能なことは、当業者により理解されるであろう。
【００２９】
用語「アンチセンス核酸分子」は、本発明の関係において用いられる場合、ＲＮＡまたはＤＮＡを包含し、そして特定の標的ＲＮＡ転写産物またはその遺伝子に関係する領域（類）含むことが、意図される。また、逆向き反復、センスＲＮＡなどを含む、アンチセンス配列を生じる分子を含むことも意図される。
用語「当該アンチセンス核酸分子が当該遺伝子の発現を阻害する程度までに当該ＲＮＡｉ因子が増加することを可能にする条件」は、有効であるのに十分高いが、当該細胞を害するほどには高くない、遺伝子発現の阻害の概念を含むことが意図される。その有効濃度範囲は、技術分野で知られる日常的な方法論を用いて決定可能である。
【００３０】
「患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」に対する基準は、ヒト、動物（マウス）、植物、または他の生物形態を含むことが意図される。
「細胞」に対する基準は、酵母、哺乳動物、植物などのような、真核生物細胞を包含することが意図される。
【００３１】
用語「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」は、ウイルス感染（ＨＩＶ，ＨＰＶ，など）、癌、自己免疫疾患および他の慢性および急性疾患を含むことが、理解されるだろう。
用語「表現型」は、本発明の関係において用いられる場合、細胞染色、形態学、成長、および同じような特徴を含むことが意図される。
【００３２】
好ましい実施態様の説明
ｉｎ  ｖｉｖｏでアンチセンスＲＮＡ技術の特徴を研究するためにｌａｃＺ分裂酵母モデルを用いて（１−４）、標的遺伝子抑制の程度はアンチセンスＲＮＡのレベルに依存性であることが明らかにされている（図２Ａ）（１）。このモデルを開発する過程で、アンチセンスＲＮＡの同一プールの存在下で、前記ｌａｃＺ標的ｍＲＮＡの定常状態レベルを２０倍に増加させることにより、そのアンチセンス媒介抑制は、維持されるだけでなく、増強されることが、意外にも見い出された（図２Ｂ）。この効果は前記標的ｍＲＮＡに非依存性であったことを証明するために、フレームシフト変異を含むｌａｃＺ遺伝子（βガラクトシダーゼ酵素を翻訳することを不能にする）を、アンチセンス発現株で共発現させた。やはり、ｌａｃＺ阻害の付加的促進が観察された（図２Ｂ）。これらの観察は、付加的ｄｓＲＮＡの潜在的形成および結果としての遺伝子サイレンシングの促進と符合する。それらはまた、当該ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングが、本系で用量依存的なことを示している。ｄｓＲＮＡが分裂酵母における標的遺伝子阻害で鍵成分であったことをさらに示すために、ｌａｃＺ標的ｍＲＮＡの存在下で２．５ｋｂの内部相補性をもつｌａｃＺ逆向き反復を発現させることによりｄｓＲＮＡを産生した。この構築体の発現も、ｌａｃＺ発現株におけるβガラクトシダーゼ活性を、完全長アンチセンスＲＮＡに対するのと同様なレベルまで低減させた（図２Ｃ）。全体としてこれらのデータは、ｄｓＲＮＡの潜在的形成、しかし必ずしもアンチセンスＲＮＡ：標的ｍＲＮＡハイブリッドではない、を増加させると、Ｓ．ｐｏｍｂｅにおける標的遺伝子発現の効率的干渉をもたらすことを示唆した。
【００３３】
分裂酵母におけるもう１つの標的配列を特異的に干渉するためのｄｓＲＮＡの能力をテストするため、組込みｃ−ｍｙｃ−ｌａｃＺ融合カセットを含む株でセンスおよびアンチセンスｃ−ｍｙｃ配列を共発現させた（３）。ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子のエキソン２からの７９２塩基対（ｂｐ）アンチセンスｃ−ｍｙｃ断片は、当該ｃ−ｍｙｃ−ｌａｃＺ融合標的株内のβガラクトシダーゼ活性を４７％抑制することが、以前見い出された（３）。βガラクトシダーゼ検定は、前記標的株中の当該アンチセンスおよびセンスｃ−ｍｙｃ構築体の共発現が、当該アンチセンスｃ−ｍｙｃベクター単独と比較して、ｃ−ｍｙｃ抑制を増強することを、証明した（図２Ｄ）。前記アンチセンスおよびセンスｃ−ｍｙｃ構築体で、ｌａｃＺ標的のみを発現する株の形質転換は、βガラクトシダーゼ活性の下方制御を全くもたらさなかったことから、ｄｓＲＮＡの作用は配列特異的であることを示した（図２Ｄ）。上記の観察のすべて、ならびに、追加のｄｓＲＮＡに応答した標的ｍＲＮＡレベルの低減（データ不掲示）は、ＲＮＡｉに随伴する特徴に一致する。これは、酵母におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子調節の最初の事例であり、そしてゼブラフィッシュ以外のすべての他の生物でのＲＮＡｉと異なり、細胞内ｄｓＲＮＡの濃度に依存性のようである。生物間のＲＮＡｉ効力における変動は、ＲＮＡｉ経路のいくつかの成分の欠如または低発現またはＲＮＡｉ阻害物質の存在によると思われる。本出願人ら（ｗｅ）は、ＲＮＡｉに関与する因子類の同定のためのこの遺伝的モデルを、このたびさらに開発した。
【００３４】
何ら特定の機構に拘束されることを願わずに、ＲＮＡｉ中の標的ｍＲＮＡの転写後分解を媒介する多タンパク質複合体が存在する可能性がある。当該ＲＮＡｉ現象に関与するいくつかの遺伝子が、パンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）および線虫類（ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）における遺伝的スクリーンを通じて明らかにされている。これらの遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｑｄｅ−１，ｅｇｏ−１），ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼ（ｑｄｅ−３），ＲＮアーゼＤ相同体（ｍｕｔ−７），および推定翻訳開始因子（ｒｄｅ−１，ｑｄｅ−２）を含む。遺伝子類ｍｕｔ−２，ｒｄｅ−２，ｒｄｅ−４，およびｒｄｅ−７も、ＲＮＡｉの開始または維持のいずれかに関与することが明らかにされている。加えて、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）無細胞検定は、ＲＮＡｉが、標的されたｍＲＮＡのヌクレアーゼ分解により媒介されるのに対して、２１−２５ｎｔＲＮＡ分子種が、特定の転写後遺伝子干渉に対して内在性らしいことを、示した。ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡの鎖解離に必要と思われるＡＴＰに依存性であることも、明らかにされている。しかし、前記ＲＮＡｉ経路における提唱された多タンパク質複合体で見つからない成分は、恐らくＲＮＡヘリカーゼである。
【００３５】
上記の分裂酵母におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの用量依存性は、ＲＮＡｉに関与する遺伝子の同定に、過剰発現戦略を用いることを可能にした。突然変異誘発戦略に比較して、過剰発現は、もしそうでなければ細胞生存に不可欠な遺伝子の同定を可能にしている。また、ＲＮＡｉ活性を量的に増強または低減する細胞因子類の決定も可能である。本モデルにおいてＲＮＡｉ活性の媒介でテストされた最初の遺伝子は、ｎｍｔ１転写因子ｔｈｉ１であった。この遺伝子は、分裂酵母で過剰発現されると、ｎｍｔ１発現を特異的に上方制御することが明らかにされている。アンチセンスＲＮＡ媒介遺伝子抑制はＳ．ｐｏｍｂｅで用量依存性であることを、本出願人らが以前明らかにしているように（１）、ｔｈｉ１の過剰発現は、ｎｍｔ１駆動アンチセンスｌａｃＺＲＮＡの産生増加およびそれによる標的遺伝子抑制の増強をもたらすであろうと、仮定された。ｔｈｉ１オープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅し、そしてＢａｍＨＩ断片としてｐＲＥＰ４中へサブクローン化した。このベクターは次いで、ＲＢ３−２／ｐＧＴ２中へ形質転換し、そしてβガラクトシダーゼ検定を実施した。予測されたように、アンチセンスＲＮＡだけを発現する株に比較して、ｌａｃＺ抑制が増強された（図７）。この結果は、分裂酵母におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制の強さに影響する宿主コード因子類が存在することを示し、そしてまた当該過剰発現戦略を有効とした。
【００３６】
研究された２番目の遺伝子は、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ遺伝子、ｄｅｄ１であった。Ｄｅｄ１は、不妊性のサプレッサー、チェックポイントおよびストレス応答のサプレッサー、および一般的翻訳開始因子として既に特徴づけられた必須遺伝子である。ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子調節の現行モデルに従えば、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼは、標的ｍＲＮＡを特異的に分解する短い一本鎖ＲＮＡ断片の生成のために、ｄｓＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと共に、必要らしい。それ故、分裂酵母におけるこの遺伝子の過剰発現は、ｄｓＲＮＡの巻き戻しを促進することによって、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの効率を増強可能と論証された。前記アンチセンスｌａｃＺベクターとｄｅｄ１ベクターとの共発現は、前記アンチセンス発現株に比較して、さらに５０％もｄｓＲＮＡ媒介ｌａｃＺ阻害を顕著に増強した（図６Ａ）。当該アンチセンスｌａｃＺベクターの不在下にｄｅｄ１が過剰発現された場合、βガラクトシダーゼ活性は対照株と同程度だったことは、その効果がｄｓＲＮＡの存在に依存的であること示した（図６Ａ）。当該ｄｅｄ１ベクターは、完全長アンチセンス遺伝子より効果が低いことが既に明らかにされている短いアンチセンスｌａｃＺベクター（１６）と共に、共発現も行われた。やはり、ｄｅｄ１の過剰発現は、ｄｓＲＮＡ媒介ｌａｃＺ阻害を促進した（図６Ｂ）。このように、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼの過剰発現は、分裂酵母におけるＲＮＡｉを大いに増強することが明らかにされた。
【００３７】
ｄｓＲＮＡ分裂酵母モデルにおいてｃＤＮＡライブラリーを過剰発現させることにより、本出願人らは、前記ＲＮＡｉ経路で役目をもつ可能性がある４つの新規遺伝子を同定した。同定された既知遺伝子はいずれも必須であり、ＤＮＡ，ＲＮＡまたは核酸結合タンパク質と自然会合しており、ＲＮＡｉ細胞因子の予測と一致している。加えて、当該３つの既知ｃＤＮＡのうちの２つは、翻訳の過程に関与するタンパク質をコードした。これらの知見は、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼの本出願人らの以前の同定（ＲａｐｏｎｉおよびＡｒｎｄｔ，投稿中）および、ＲＮＡｉにおける翻訳開始因子の関与およびリボソーム画分とのリボヌクレアーゼ活性の共精製の報告類と共に、これは、ＲＮＡｉが機能する１つの部位らしいことを示唆している。あるいは、ＤＮＡヘリカーゼ類および翻訳成分類のような種々のタンパク質が当該ＲＮＡｉ機械装置の部分として同定されたことは、特定の細胞タンパク質類が１つ以上の多タンパク質複合体中へ補給される可能性を意味している。後者の条件下で、これらの特定タンパク質の過剰発現は、ｄｓＲＮＡを認識し、そして標的遺伝子抑制を媒介するＲＮＡｉ複合体の生成をもたらす可能性がある。これらのタンパク質のいくつかは、ＲＮＡｉにおいて速度制限または速度決定性であると思われ、これらの因子の補足を通じてのみ、ＲＮＡｉにおけるそれらの役割が明らかにされる。ＲＮＡｉ多タンパク質複合体（類）中の以前に同定されたコア（ｃｏｒｅ）タンパク類に加えて、ＥＦ  Ｔｕ，Ｌ７ａ，ｓｎａ４１およびｒｅｓ１のようなさらなる因子類も、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制における役割について編入される可能性があることが、何ら特定の機構に拘束されることを願わずに、提議される。
【００３８】
上記の過剰発現戦略は、ＲＮＡｉにおいて役割をもつ必須遺伝子類を同定することにより、突然変異誘発に伴ういくつかの限界を克服する。加えて、この戦略は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＮＡｉの効力を修飾する細胞因子類の単離を可能にすることにより、これらの他のシステムを補完する。ＲＮＡｉのこれらのモジュレーターの役割は、多様と思われ、当該ｄｓＲＮＡの認識および増幅、低分子２１−２５ｎｔ  ｄｓＲＮＡの標的ｍＲＮＡへの送達、アンチセンスおよび標的ｍＲＮＡ鎖間の会合、およびＲＮＡｉ複合体形成を含む。あるいは、これらのモジュレーターは、ＲＮＡｉの速度または、細胞型内の、あるいは異なる型の転写後遺伝子サイレンシングのための異なる複合体の形成を、制御する可能性がある。特定のＲＮＡｉモジュレーター類の過剰発現が分裂酵母においてｄｓＲＮＡ媒介遺伝子調節を増強したという事実は、同様なアプローチが、他の生物におけるＲＮＡｉモジュレーター類を同定するのに使用可能なことを示す。加えて、共抑制、クエリングおよびアンチセンスＲＮＡを含む異なる型の転写後遺伝子サイレンシングと共に、これらの因子の共発現は、これらの方法の効能を増強する１つの方途と考えられる。哺乳動物細胞および組織に対して、あるいはこの型の調節に多少とも反抗的であった遺伝子に対して、ＲＮＡｉを適用するためには、このことは特に大切と思われる。
【００３９】
本発明は、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼの内在性関与を、ＲＮＡｉにおける鍵成分として、初めて証明している。さらに、その過剰発現は、本系におけるＲＮＡｉ活性の増加をもたらすので、それは律速的な可能性がある。当該ｄｅｄ１コード化ＲＮＡヘリカーゼのこの能力は、ＡＴＰアーゼ，ＲＮＡヘリカーゼおよびＲＮＡ結合活性のそれら３つのコアドメインとともに、ヘリカーゼ類のＤＥＡＤボックスファミリーのメンバーとしてのその活性と符合する。これらは、当該酵素が、以下のように遺伝子抑制を増強できるようにする可能性がある：（ｉ）解離的機構では、それは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと共に、ｃＤＮＡを産生するためのｄｓＲＮＡの巻き戻しか、あるいは相同性転写産物への結合を増強するための断片化ｄｓＲＮＡの鎖分離か、のいずれかを媒介する可能性がある、および／または（ｉｉ）会合機構では、それは、短いｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的ｍＲＮＡとのＡＴＰ依存性交換を触媒する可能性がある。ＲＮＡｉを示す他の生物におけるｄｅｄ１相同体の存在は、当該ＲＮＡｉ機械装置における本成分の全般的関与をさらに支持している。
【００４０】
本発明はまた、ＲＮＡｉに関与する必須細胞因子類を迅速に同定するために、Ｓ．ｐｏｍｂｅに基づく新規のそして定量性の遺伝的システムを初めて提供する。本モデルの使用は、効率的なＲＮＡｉ活性への極めて重要な貢献体として、ＲＮＡヘリカーゼ活性を証明することを可能にし、そしてＥＦ  Ｔｕ，Ｌ７ａ，ｓｎａ４１および未同定遺伝子ｒｅｓ１を含む新規ＲＮＡｉ因子類を単離した。本発明はまた、遺伝子サイレンシングが、その種のＲＮＡｉ因子類の併存発現により増強される可能性があることも、証明している。
本発明はここで、本発明のいくつかの好ましい実施態様の非限定的実施例に関して、より詳しく説明される。
【００４１】
【実施例】
実施例１：本発明を例示するために使われる材料および方法
Ｓ．ｐｏｍｍｂｅ培地および操作
すべての酵母株は標準ＹＥＳおよびＥＭＭ培地（６）で維持した。ｎｍｔ１転写の抑制は、ＥＭＭ培地にチアミンを４μＭの終濃度に添加することにより、達成した（７）。酵母細胞はエレクトロポレーションによりプラスミドＤＮＡで形質転換し（８）、そして安定な組込み体は既述のように同定した（６）。ガラスビーズ処置（９）を使ってゲノムＤＮＡを単離し、それをサザン分析およびＰＣＲ診断に用いた。全ＲＮＡは既述のように抽出した（１０）。
【００４２】
Ｓ．ｐｏｍｍｂｅ株およびプラスミド構築
低発現ｌａｃＺ株，ＫＣ４−６（ｈ-，ｕｒａ４：：ＳＶ４０−ｌａｃＺ，ｌｅｕ１−３２）の構築は既述されている（２）。より高いレベルのβガラクトシダーゼを発現する株ＲＢ３−２（ｈ-，ｕｒａ４：：ａｄｈ１−ｌａｃＺ，ｌｅｕ１−３２）も既述されている（１）。ｃ−ｍｙｃ：ｌａｃＺ融合を含む標的株は既述されている（３）。
【００４３】
長いｌａｃＺアンチセンスを含むエピソームプラスミドｐＧＴ２および対応する対照プラスミド類の構築は、記載されている（２）。プラスミドｐＲＥＰ４−Ａｓは、ｐＧＴ２中に含まれるｌａｃＺ  ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＲＥＰ４中へサブクローニングすることにより、作製した（１１）。ｐＲＥＰ４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２遺伝子がＳ．ｐｏｍｂｅ  ｕｒａ４選択マーカーで置換されていることを除いて、ｐＲＥＰ１と同一である。エピソーム的に発現されるアンチセンスｌａｃＺの定常状態レベルを減少させるために、ｐＧＴ２からのｌａｃＺ  ＢａｍＨＩ断片をそれぞれｐＲＥＰ４２およびｐＲＥＰ８２中へサブクローニングすることにより、プラスミドｐＲＥＰ４２−ＡｓおよびｐＲＥＰ８２−Ａｓを構築した。これらのプラスミドは、ｎｍｔ１プロモーターのＴＡＴＡボックス中に突然変異をもつｐＲＥＰ４の誘導体である（１２）。不具の（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）ｌａｃＺベクターｐＧＴ６２は、ｐＧＴ２のＣｌａＩ部位を末端充填し、そして再連結することにより作製した（２）。このフレームシフト化断片は、次いで、ｐＲＥＰ４のＢａｍＨＩ部位中へサブクローン化し、プラスミドｐＭ５４−３を作製した。
【００４４】
ｌａｃＺパンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）組込みベクターｐＭ３０−８は、ｐＬ１２１−１４を作製するために、自己相補的リンカー５´ＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ３´を用い、ＮｏｔＩ部位をｐＲＩＰ１／ｓのＸｍａＩ部位へまず導入して（１１）、産生した。次いで、そのフレームシフト化ｌａｃＺ遺伝子の５´端の２．５ｋｂ配列（２）をＰＣＲ増幅し、フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー５´ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＧＡＡＡＧＡ３´およびリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー５´ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＧＧＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＴＡ３´を用い、それをＮｏｔＩ末端に与えた。この産物は、ＴＡクローニングキット（ＴＯＰＯ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，サンディエゴ、カリフォルニア、米国）を用いてクローン化し、そして次に、アンチセンス配向でｐＬ１２１−１４のＮｏｔＩ部位中へサブクローン化した。当該組込みベクターを、ｓｕｐ３−５／ａｄｅ６−７０４相補系（１３）を用いることにより、単一コピーで標的株中へ導入した。次いで、当該完全長フレームシフト化ｌａｃＺ断片を、前記２．５ｋｂアンチセンス断片の上流にセンス配向で、本ベクターのＢａｍＨＩ部位中へ導入し、ｐＭ３０−８を作製した。本ベクターのエピソーム版（ｐＭ５３−１）は、Ｐｓｔ１  ｓｕｐ３−５断片を除き、そしてＥｃｏＲＩ断片のような自己複製配列を導入することにより作製した（１１）。当該パンハンドル構築体がｉｎ  ｖｉｖｏでｄｓＲＮＡを形成する能力をテストするため、前記フレームシフト化ｌａｃＺ断片を、ベクター類ｐＭ５４−３およびｐＭ５３−１中の機能性ｌａｃＺ断片と置換して、それぞれベクター類ｐＭ８５−１およびｐＭ８１−２を作製した。ｌａｃＺパンハンドル転写産物を形成できないベクターｐＭ９１−１は、ｐＭ８１−２から２．５ｋｂＮｏｔＩ  ｌａｃＺ断片を除き、そしてそれをセンス配向に再導入することにより、作製した。
【００４５】
ｃ−ｍｙｃアンチセンス構築体ｐＣＭ−１７の作製は、別途記載されている（３）。ｐＣＭ−１７からの７９２ｂｐ  ＢｇｌＩＩ  ｃ−ｍｙｃ断片を、センス配向でｐＲＥＰ４のＢａｍＨＩ部位中へサブクローン化し、ｐＮ１２−１を作製した。
ｄｅｄ１およびｔｈｉ１オープンリーディングフレーム類は、分裂酵母ゲノムＤＮＡ（１９１３株）から増幅した。ｄｅｄ１を増殖し、フォワードプライマー５´ＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＴＣＡＧ３´およびリバースプライマー５´ＡＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡＴＡＡＣＡＣ３´を用いて、それをＢａｍＨＩ末端に与えた。ｔｈｉ１を増殖し、フォワードプライマー５´ＡＴＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＡＧＡ３´およびリバースプライマー５´ＡＴＧＡＧＡＴＣＴＡＡＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣ３´を用いて、それをＢｇｌＩＩ末端に与えた。ＰＣＲ産物は精製し（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット）、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩのいずれかで消化し、ゲル精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、そしてセンス配向でｐＲＥＰ４のＢａｍＨＩ部位中へサブクローン化した。
【００４６】
サザンおよびノーザン分析
核酸電気泳動および膜転移は、記載（１４）のように実施した。サザンおよびノーザンブロットは、製造会社の説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に従って、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を用いハイブリッド形成させた。ＤＮＡプローブ類は、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い32Ｐ標識した。プローブ類は、ｐＩ２−１からの９６０ｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ  ｌａｃＺ断片（１），ｐＧＴ１１３からの５７０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ  ｕｒａ４−３´断片（１５）、およびｐＲＩＰ１／ｓからの２．２ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＳａｃＩ  ｎｍｔ１断片を、含んでいた。放射性シグナルは、オートラジオグラフィーにより検出し、りん光画像分析により定量した（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）．
【００４７】
プラスミド分布分析
ＲＢ３−２株のプラスミド共形質転換体は、選択的条件下で１−２ｘ１０7細胞／ｍｌの細胞密度まで増殖させた。各培養の段階希釈を行い、細胞は単一コロニーについて３回、ＹＥＳ，ＥＭＭ，ＥＭＭ＋ロイシン、およびＥＭＭ＋ウラシル寒天培地のそれぞれの上にプレートした。ＹＥＳ上に増殖したコロニーの数は生細胞の総数として数え、一方、ＥＭＭ上に増殖しているコロニーは、ｕｒａ４含有（ｐＲＥＰ４基盤）およびＬＥＵ２含有（ｐＲＥＰ１基盤）プラスミドの両方を含むサンプル集団中の細胞を表した。ｕｒａ４含有プラスミドまたはＬＥＵ２含有プラスミドのいずれか一方を含む細胞は、それぞれＥＭＭ＋ロイシンおよびＥＭＭ＋ウラシルプレートから同定した。選択培地上に増殖させたコロニーの数の、生コロニーの総数の対する比を、プラスミドを含んだ、選択下で増殖させた、集団中の細胞の比率の量的尺度として使用した。
【００４８】
βガラクトシダーゼ検定法
当該ｌａｃＺ遺伝子コード化産物であるβガラクトシダーゼの発現を、既述のように（Ｒａｐｏｎｉら、２０００）細胞透過性化プロトコルを用いて定量した。半定量オーバーレイ検定法も、酵母形質転換体の迅速スクリーニングに採用した（３）。
【００４９】
アンチセンスＲＮＡ効力を変えるＳ．ｐｏｍｂｅ  ｃＤＮＡクローン類の単離
Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ｃＤＮＡライブラリーを、Ｂｒｕｃｅ  ＥｄｇａｒおよびＣｈｒｉｓ  Ｎｏｒｂｕｒｙ（５）によりｐＲＥＰ３Ｘｈｏ中に最初に構築した。当該ベクターｐＲＥＰ３Ｘｈｏは、ＬＥＵ２マーカーを含むｐＲＥＰ３由来であり、そして挿入体類はｎｍｔ１プロモーターの制御下にある（１１）。全部で５μｇのライブラリーＤＮＡを、エピソームアンチセンスｌａｃＺベクターｐＲＥＰ４−ｌａｃＺＡＳを含むＲＢ３−２株中へ形質転換し、対数中期までＥＭＭ液体培地中で増殖させた。次いで形質転換体は、ＥＭＭ固形培地上にプレートし、そして３０℃で３日間増殖させた。コロニーは、０．５Ｍリン酸ナトリウム、０．５％アガロース、２％ジメチルホルムアミド，０．０１％ＳＤＳ，および５００μｇ／ｍｌ  Ｘ−ＧＡＬ（Ｐｒｏｇｅｎ，オーストラリア）を含む培地でオーバーレイした。次いで、プレートは３７℃で３時間インキュベートし、目的のコロニーを回収して、βガラクトシダーゼ活性を検定した。
【００５０】
プラスミド分離
制限ウラシルおよび１ｍｇ／ｍｌ  ５−フルオロオロト酸を含むＥＭＭ上に、株をプレートした（６）。次いで株を、選択および非選択培地上にレプリカプレートした。選択培地上で増殖しなかったコロニーは、ｕｒａ４含有アンチセンスプラスミドを消失したとものと同定された。ｐＲＥＰ基盤プラスミドの有糸分裂安定性を決定するため、出願人らは、既述のプラスミド分離法を用いた（１６）。この方法は、選択培地で増殖させた細胞の３０％までが、常在性プラスミドを含まないことを、示した。
【００５１】
実施例２：アンチセンス効力への標的ｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの定常状態レベルの影響
アンチセンス媒介遺伝子抑制における標的ｍＲＮＡ定常状態レベルの役割を明らかにするために、本出願人らは、弱および強両構成的プロモーターの制御下で、ｌａｃＺ標的遺伝子類を調節するための長いｌａｃＺアンチセンスＲＮＡ（２）の能力を、検討した。低レベル発現株ＫＣ４−６は、染色体ＩＩＩ中のｕｒａ４遺伝子座に組込まれているＳＶ４０初期プロモーターにより駆動されるｌａｃＺ遺伝子を含んでいた（図１Ａ；（２））。高レベルｌａｃＺ発現株ＲＢ３−２は、強分裂酵母ａｄｈ１プロモーターおよびｕｒａ４遺伝子からの３´プロセシングシグナルの制御下に当該ｌａｃＺ遺伝子を置き、そしてこの発現カセットを前記ｕｒａ４遺伝子座に組込むことによって、構築した（図１Ｂ；（１））。両株の特性解明は、ＲＢ３−２がＫＣ４−６より２０倍も多くｌａｃＺｍＲＮＡを発現し、一方、βガラクトシダーゼに約４０倍の増加も検出された（データ不掲示）。両株は、ｌａｃＺアンチセンス遺伝子含有プラスミド（ｐＧＴ２）およびその対応センス対照プラスミド（ｐＧＴ６２）で形質転換した。βガラクトシダーゼ検定は、当該アンチセンスＲＮＡが、ＫＣ４−６でβガラクトシダーゼ活性を４５％抑制したのに対し、同じＲＮＡが、ＲＢ３−２でβガラクトシダーゼ活性を５２％低減させたことを、示した（図２Ｂ）。ｌａｃＺの不具版を発現する対照プラスミドｐＧＴ６２で形質転換した場合、いずれの株においてもβガラクトシダーゼ活性の低減は全く見られなかった。これらの結果は、ＲＢ３−２において当該ｌａｃＺ標的ｍＲＮＡの定常状態レベルが２０倍増加したにもかかわらず、アンチセンス媒介下方制御の効力は、維持されるだけでなく増強されることを、示した。ＲＢ３−２株で証明された遺伝子抑制の増加は、当該ｌａｃＺ標的遺伝子の小領域を標的したアンチセンス分子を用いた場合にも見られたが、それほど顕著ではなかった。これらのデータは、標的ｍＲＮＡにおける増加が、標的遺伝子抑制の増強をもたらすことがあることを、示唆した。
【００５２】
安定に組込まれたアンチセンスｌａｃＺ遺伝子は用量依存的に作用し、またアンチセンスＲＮＡの定常状態レベルは、ゲノム位置効果および導入遺伝子コピー数に依存することが、既に証明されている（１）。ここで、低ｌａｃＺ発現標的株ＫＣ４−６および高ｌａｃＺ発現標的株ＲＢ３−２の両方において、エピソーム的に発現されたアンチセンスＲＮＡの定常状態レベルの役割を検討した。それぞれが、ｎｍｔ１プロモーターの制御下のｌａｃＺアンチセンス遺伝子を含むが、異なる選択マーカーを含む、プラスミドｐＧＴ２およびｐＲＥＰ４−Ａｓで、ＫＣ４−６およびＲＢ３−２を共形質転換することにより、ｌａｃＺアンチセンスＲＮＡの発現を増加させた。アンチセンスＲＮＡの定常状態レベルを減少させるために、プラスミドｐＲＥＰ４２−ＡｓおよびｐＲＥＰ８２−ＡＳを採用した。これらのベクター中のｎｍｔ１プロモーターはＴＡＴＡボックス配列中に欠失を含み、それらは、転写のレベルに影響するが、転写開始またはチアミン抑制性の部位には何のインパクトも与えない（１２）。異なるアンチセンス遺伝子含有プラスミドのそれぞれを、適切な場合には、栄養要求性を補完するために対照プラスミドで共形質転換した。これにより、それぞれが、同じｌａｃＺアンチセンス遺伝子を含むが、異なるプロモーター能力をもつ、ＲＢ３−２およびＫＣ４−６両方の一群の共形質転換体が得られた。各共形質転換体は、アンチセンスＲＮＡ定常状態レベルおよびβガラクトシダーゼ活性について、分析された。表１は、両株共に、標的抑制の程度が、アンチセンスｌａｃＺ  ＲＮＡ発現の増加と共に増強することを、示す。
【００５３】
【表１】
0004901051.tif 000002
【００５４】
これらのデータは、アンチセンスＲＮＡ媒介遺伝子阻害が、Ｓ．ｐｏｍｂｅで用量依存性であるという既報（１）と合致する。しかし、各共形質転換体について、βガラクトシダーゼ抑制の程度は、低ｌａｃＺ発現株ＫＣ４−６より、高ｌａｃＺ発現株ＲＢ３−２で１０−１５％大きく、低レベルの標的ｍＲＮＡがアンチセンス効力を制限する可能性があることを、ここでも証明した。
【００５５】
実施例３：  アンチセンスＲＮＡ媒介標的遺伝子抑制へのセンスＲＮＡ増加の影響
遺伝子抑制の増加が、アンチセンスＲＮＡ：標的ｍＲＮＡハイブリッドまたはアンチセンスＲＮＡ：センスＲＮＡハイブリッドの形成によるか否かを決定するために、機能性βガラクトシダーゼへ翻訳不能なｌａｃＺ版を、ｌａｃＺアンチセンス遺伝子を発現する株で共発現させた。もし当該遺伝子発現経路の阻害のために、アンチセンスＲＮＡが標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成することが必要であれば、その場合、当該センスＲＮＡの過剰発現が、利用可能なアンチセンス分子に対する標的と競合するはずで、その結果、ｌａｃＺ遺伝子抑制に減少が起るはずである。最初に、アンチセンスおよびセンス両ｌａｃＺベクターを、別々の標的株に単一コピーで組込み、次いで相互に交雑させた。当該アンチセンス遺伝子だけを含む株では、βガラクトシダーゼ活性は約４０％低減したが（図３；（１））、センスｌａｃＺだけを発現する株では低減はなかった（データ不掲示）。しかし、両相補的転写産物を発現する株（Ｍ６２−１）では、βガラクトシダーゼ活性は５０％低減した（図３）。これらの結果は、アンチセンスＲＮＡの存在下でセンスＲＮＡの細胞内濃度を増加すること、したがって、さらに多くのｄｓＲＮＡを潜在的に生成させることは、標的遺伝子抑制を促進することを、示唆している。
【００５６】
細胞内ｄｓＲＮＡの潜在的形成をさらに増加させるため、エピソームのセンスｌａｃＺプラスミド（ｐＭ５４−３；図２Ｂ）を、エピソームのアンチセンスｌａｃＺプラスミドｐＧＴ２で、標的株ＲＢ３−２中へ共形質転換した。これらの配列は両方共、強条件ｎｍｔ１プロモーターにより発現され、そしてＲＮＡ分析は、各転写産物が、チアミンの不在下で増殖した時に、高レベルで発現されていたことを明らかにした（図４Ａ）。両ＲＮＡがＲＢ３−２中で共発現された場合、当該標的ｌａｃＺは、前記アンチセンスプラスミドだけを発現する株での５０％に比べて、６５％抑制された（図２Ｂ）。ノーザン分析は、エピソーム的に発現されたｎｍｔ１駆動導入遺伝子類の全相対的レベルが、いずれかのベクターが単独で発現された場合より、約６０％高いことを、証明した（図４Ａ）。これらの相補的ＲＮＡ転写産物の発現は、単一コピー組込み体と比べて、高レベルにあるが、追加の１５％抑制が観察されたに過ぎなかった。
【００５７】
より高いレベルの標的遺伝子抑制の欠如に対する１つの説明は、プラスミド分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）である。Ｓ．ｐｏｍｍｂｅは不対称分離を受けるため、その結果、有糸分裂は、分離するプラスミドを欠く娘細胞を産生する（１７）。それ故、全集団で見られた前記６５％抑制レベルを、ｕｒａ４基盤およびＬＥＵ２基盤プラスミドを含む細胞だけについて補正した場合、抑制のレベルはほぼ１００％に近づく（データ不掲示）。全体として、これらのデータは、必ずしもアンチセンスＲＮＡ：標的ｍＲＮＡハイブリッドでなくてもよい、ｄｓＲＮＡの潜在的形成を増加させることが、Ｓ．ｐｏｍｍｂｅにおける標的遺伝子発現の効率的干渉に必要なことを、示唆している。しかし、植物および線虫で見られるＲＮＡｉの現象と違い、分裂酵母で証明されたｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制は、細胞内ｄｓＲＮＡの濃度に依存的であるようで、あるいは強力な遺伝子サイレンシングを誘発するためには、閾値レベルのｄｓＲＮＡが必要である。
【００５８】
実施例４：  ｌａｃＺ遺伝子発現へのｌａｃＺ逆向き反復の影響
分裂酵母における遺伝子発現を阻害するｄｓＲＮＡの能力をさらに検討するため、本出願人らは、２．５ｋｂ逆向き反復をもつ完全長３．５ｋｂフレームシフト化ｌａｃＺ配列を含むベクターを、作製した。この構築体は、おそらく強い分子内ＲＮＡ二重鎖を形成するはずの、２．５ｋｂの自己相補性をもつ長さ約７ｋｂの転写産物を生成する。この遺伝子は、単一コピーで分裂酵母中へ先ず組込まれ、そして次に、ＲＢ３−２株と交雑された。得られた株は、当該単一コピー逆向き反復遺伝子および標的ｌａｃＺを含み、当該逆向き反復の転写が活性化された時、βガラクトシダーゼ活性の低減を全く示さなかった。サザン分析は、当該カセットが無傷であること（データ不掲示）を、確認し、一方、ＲＮＡ分析は、前記７ｋｂ転写産物が生成されていたが、エピソーム的に発現されたアンチセンスｌａｃＺより１０分の１ほどに少ないことを、示した（図４ＡおよびＢ）。当該逆向き反復ＲＮＡの定常状態レベルを増加するため、本出願人らは、このカセットを含むエピソーム性プラスミドｐＭ５３−１を作製した。ＲＮＡ分析は、このベクターがエピソーム的に発現されたアンチセンスｌａｃＺと同じようなレベルに発現されることを、証明した（図４Ａ）。ＲＢ３−２中で発現された場合、ｐＭ５３−１は、βガラクトシダーゼ活性を４０％阻害したが（図２Ｃ）、一方、培養培地へのチアミンの添加は、βガラクトシダーゼ活性を対照レベルに戻した。
【００５９】
遺伝子阻害がＲＮＡ二重鎖を形成するこの構築体によったことを確認するために、ｄｓＲＮＡに対するｉｎ  ｖｉｖｏ検定法を開発した。この目的のため、ｌａｃＺ単独（ｐＭ８５−１），ｌａｃＺ逆向き反復（ｐＭ８１−２），およびセンス配向で両配列をもつｌａｃＺ反復（ｐＭ９１−１）を含め、機能性ｌａｃＺ配列を含む一連のベクターを作製した（図５Ａ）。次いでこれらのベクターは組込み標的配列を欠く株（ＮＣＹＣ２０３７；ｈ+，ｕｒａ４−Ｄ１８）中に導入し、そして得られた形質転換体をＸ−ＧＡＬ含有アガロースでオーバーレイした。対照ベクター類を含む両株は、高レベルのβガラクトシダーゼを生成したが、一方、ｌａｃＺ逆向き反復を発現する株は、生成しなかった（図５Ｂ）。いずれの場合にも、ノーザン分析は、株が当該導入遺伝子を発現していることを、証明した。これらの結果は、βガラクトシダーゼを産生するために、前記逆向き反復ＲＮＡが、効率的に翻訳されなかったことを示しており、強い分子内ヘアピン構造の形成による可能性が非常に高い。まとめると、これらの結果は、分子内ハイブリッド形成によりｄｓＲＮＡを形成する能力をもつ構築体が、高レベルで発現されると、標的遺伝子発現を干渉することを明らかにしており、ｄｓＲＮＡは、分裂酵母で、用量依存的に標的遺伝子抑制を媒介することを、やはり示している。
【００６０】
実施例５：  分裂酵母におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの遺伝子特異性
分裂酵母においてｄｓＲＮＡが、他の標的配列を特異的に干渉する能力をテストするため、センスおよびアンチセンスｃ−ｍｙｃ配列を、組込みｃ−ｍｙｃ−ｌａｃＺ融合カセットを含む株で共発現させた（図１Ｄ；（３））。ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子のエキソン２からの７９２ｂｐアンチセンスｃ−ｍｙｃ断片（ＣＭ−１７と命名）は、ｃ−ｍｙｃ−ｌａｃＺ融合標的株（ＡＭＬ１）内でβガラクトシダーゼ活性を４７％抑制することが、既に見い出されている（３）。ＣＭ−１７は次にセンス配向でｐＲＥＰ４中へサブクローン化し、ｐＮ１２−１を作製した。当該アンチセンスｃ−ｍｙｃベクター（ｐＣＭ−１７）および当該センスｃ−ｍｙｃベクターは、独立にまた一緒に、ＡＭＬ１中へ形質転換した。βガラクトシダーゼ検定は、当該アンチセンスおよびセンス構築体の共発現が、当該アンチセンスｃ−ｍｙｃベクター単独に比べて、ｃ−ｍｙｃ抑制を付加的に１３％増強することを証明した（図２Ｄ）。当該アンチセンスおよびセンスｃ−ｍｙｃ構築体によるＲＢ３−２の形質転換は、βガラクトシダーゼ活性の下方制御を全くもたらさなかったことから、ｄｓＲＮＡの作用は遺伝子特異的であることが示された（図２Ｄ）。これらの結果は、ｄｓＲＮＡが、ヒト起源のものを含め分裂酵母での複数の標的を特異的に干渉できることを、証明している。
【００６１】
実施例６：  翻訳因子の過剰発現は分裂酵母におけるＲＮＡｉを増強することがある
上記の分裂酵母におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの用量依存性は、ＲＮＡｉに関与する遺伝子を同定するための、過剰発現戦略の使用を可能にした。突然変異誘発戦略に比べて、過剰発現は、別のやり方では細胞生存に必須の遺伝子類の同定を可能にする。また、ＲＮＡｉ活性を量的に増強または低減する細胞因子類も決定可能である。本モデルでＲＮＡｉ活性の媒介についてテストした最初の遺伝子は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ遺伝子ｄｅｄ１であった。Ｄｅｄ１は、不妊性のサプレッサー、チェックポイントおよびストレス応答のサプレッサー、および一般的翻訳開始因子として従来特徴づけられた必須遺伝子である。ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子調節の現行モデルに従えば、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼは、標的ｍＲＮＡを特異的に分解する短い一本鎖ＲＮＡ断片の形成のために、ｄｓＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと共に、必要らしい。それ故、本出願人らは、分裂酵母における本遺伝子の過剰発現は、ｄｓＲＮＡの巻き戻しを促進することによって、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの効率を増強可能と論証した。アンチセンスｌａｃＺベクターとｄｅｄ１ベクターとの共発現は、アンチセンス発現株に比較して、さらに５０％もｄｓＲＮＡ媒介ｌａｃＺ阻害を有意に増強した（図６Ａ）。当該アンチセンスｌａｃＺベクターの不在下にｄｅｄ１が過剰発現された場合、βガラクトシダーゼ活性は対照株と同程度だったことは、その効果がｄｓＲＮＡの存在に依存的であること示した（図６Ａ）。当該ｄｅｄ１ベクターも、前記完全長アンチセンス遺伝子より効果が低いことが既に明らかにされている短いアンチセンスｌａｃＺベクターと共に、共発現された（２）。やはり、ｄｅｄ１の過剰発現は、ｄｓＲＮＡ媒介ｌａｃＺ阻害を促進した（図６Ｂ）。このように本出願人らは、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼの過剰発現が、分裂酵母におけるＲＮＡｉを大いに増強することを明らかにした。ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼはＲＮＡｉにおける鍵成分であると最近示唆されてきたが、その内在的関与を証明したのは今回が初めてである。さらに、その過剰発現は、本系におけるＲＮＡｉ活性の増加をもたらすので、それは明らかに律速的な可能性がある。当該ｄｅｄ１コード化ＲＮＡヘリカーゼのこの能力は、ＡＴＰアーゼ，ＲＮＡヘリカーゼおよびＲＮＡ結合活性のそれら３つのコアドメインとともに、ヘリカーゼ類のＤＥＡＤボックスファミリーのメンバーとしてのその活性と符合する。これらは、当該酵素が、以下のように遺伝子抑制を増強できるようにすると、考えられる：（ａ）解離的機構では、それは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと共に、ｃＤＮＡを産生するためのｄｓＲＮＡの巻き戻しか、あるいは相同性転写産物への結合を増強するため断片化ｄｓＲＮＡの鎖分離か、のいずれかを媒介する可能性がある、および／または（ｂ）会合機構では、それは、短いｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的ｍＲＮＡとのＡＴＰ依存性交換を触媒する可能性がある。ＲＮＡｉを示す他の生物におけるｄｅｄ１相同体の存在は、当該ＲＮＡｉ機械装置における本成分の全般的関与をさらに支持している。
【００６２】
実施例７：  転写因子の過剰発現は分裂酵母におけるＲＮＡｉを増強することがある
【００６３】
検討された２番目の遺伝子はｎｍｔ１転写因子ｔｈｉ１であった。この遺伝子は、分裂酵母で過剰発現されると、ｎｍｔ１を特異的に上方制御することが明らかにされている。アンチセンスＲＮＡ媒介遺伝子抑制はＳ．ｐｏｍｂｅで用量依存性であることを、本出願人らが以前明らかにしているように（１）、ｔｈｉ１の過剰発現は、ｎｍｔ１駆動アンチセンスｌａｃＺ  ＲＮＡの産生増加およびそれによる標的遺伝子抑制の増強をもたらすであろうと、仮定された。当該ｔｈｉ１オープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅し、そしてＢａｍＨＩ断片としてｐＲＥＰ４中へサブクローン化した。このベクターは次いで、ＲＢ３−２／ｐＧＴ２中へ形質転換し、そしてβガラクトシダーゼ検定を実施した。予測されたように、アンチセンスＲＮＡを単独に発現する株に比較して、ｌａｃＺ抑制が増強された（図７）。この結果は、分裂酵母におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制の効力を調整する宿主コード因子類が存在することを示し、そしてまた当該過剰発現戦略を実証した。
【００６４】
実施例８：  新規ＲＮＡｉ調整因子類のスクリーニング
アンチセンスｌａｃＺ発現株における分裂酵母ｃＤＮＡライブラリー（５）の過剰発現は、βガラクトシダーゼ活性が、アンチセンスＲＮＡ発現株単独で証明されたものより有意に低減された、一連の形質転換体を明らかにした。当該スクリーニング戦略を図８に示す。形質変換体は、選択プレート上で増殖させ、Ｘ−ＧＡＬ含有培地でオーバーレイし、半定量的仕方で視覚的に分析可能な青色の表現型を作製した（図９Ａ）（３）。スクリーンした１２，０００の形質転換体から、バックグラウンドの形質転換体と比較して、４８が低減した青色表現型をもつと最初に同定された。これらのうち、２５が、液体βガラクトシダーゼ検定により定量された場合、アンチセンスＲＮＡ媒介ｌａｃＺ抑制で再現可能な増強を証明した（図９Ｂ）。観察された効果が前記ｃＤＮＡ挿入断片の転写によったことを証明するため、形質転換体をチアミンの存在下で増殖させた。ｎｍｔ１プロモーターのこの抑制は、すべての形質転換体でβガラクトシダーゼ活性の対照レベルへの帰還をもたらした（図９Ｂ）。このことは、その抑制増強が、ｌａｃＺレポーター突然変異のような他の遺伝的事象ではなく、ｃＤＮＡの発現によることを、示した。当該作用がｄｓＲＮＡの存在に依存していたか否かを決定するために、当該アンチセンスプラスミドを当該形質転換体から分離し、そして当該株について再度βガラクトシダーゼ活性を検定した。前記２５形質転換体のうち９体は、親株で見られたβガラクトシダーゼのレベルへの帰還を証明したことから、当該作用はｄｓＲＮＡに依存性であることを示した（図９Ｂ）。これらの形質転換体で発現されるｃＤＮＡ類は、ＲＮＡｉ増強配列（ｒｅｓ）と名付けられた。すべての形質転換体は、正常な増殖表現型を示したことから、当該常在性ｃＤＮＡ類は、当該細胞の一般的生物学に影響しなかったことを示した。アンチセンスＲＮＡの不在下では、前記残り１６形質転換体は、低減βガラクトシダーゼ活性を保留したことから、遺伝子サイレンシングの増強は、ｄｓＲＮＡの存在に依存性でなかったことが示された。このことは、これらの株におけるｃＤＮＡコード化タンパク質類が、転写のレベルまたは当該タンパク質の安定性あるいは機能で、ｌａｃＺに影響していた可能性を、示唆している。
【００６５】
前記ライブラリープラスミド類がａｅｓ含有株（ｒｅｓ含有株ともいう）から回収され、そしてそれらのｃＤＮＡ挿入断片の配列が決定された。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ分析は、ミトコンドリア伸長因子Ｔｕ（ＥＦ  Ｔｕ）のドメイン２および３の相同体としてクローンＷ１８，Ｗ２０，およびＷ３０（ａｅｓ２と命名）を同定した。ＥＦ  Ｔｕは、ペプチド伸長のためにリボソーム中のＡ部位へｔＲＮＡを輸送するのに一役買っている必須タンパク質である。形質転換体Ｗ２１，Ｗ２３，およびＷ３２（ａｅｓ３と命名）中のｃＤＮＡは、分裂酵母ＯＲＦｓのスクリーンで同定された推定タンパク質に相同的であった。興味深いことに、当該ｃＤＮＡ挿入断片は、ＤＮＡ複製に関与することが既に示されている分裂酵母遺伝子ｓｎａ４１の３´ＵＴＲのアンチセンス鎖にも相同的であった。したがって、ａｅｓ３は、アンチセンスＲＮＡ活性の増強に１つ以上の機構で作動する可能性がある。形質転換体Ｗ４７（ａｅｓ４と命名）中のｃＤＮＡは、６０Ｓリボソームサブユニットの成分であるリボソームタンパク質Ｌ７ａのアンチセンス鎖に相同的であった。ａｅｓはまた、生物機能未知の小ＯＲＦを含んでいた。形質転換体Ｗ２７およびＷ２８（ａｅｓ１と命名）中の挿入断片は、細胞増殖に必須の遺伝子のスクリーンで同定されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓからの推定タンパク質と相同性を共有した。これらのユニークな因子類を共発現するアンチセンスｌａｃＺ株中における遺伝子サイレンシング増強の正確なレベルを知るために、三次定量βガラクトシダーゼ検定を実施した（図９Ｃ）。この分析は、これらの因子が、アンチセンス抑制を５０％まで増強することを示した。これらの結果は、ｃＤＮＡライブラリーの過剰発現が、アンチセンスＲＮＡにより媒介される抑制効果を拡大する新規補因子類を同定するための有効な方法であることを、証明した。
【００６６】
ａｅｓ１はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの仮定タンパク質（ＡＪ３９０５１９）のアミノ酸４から２０２と４３％の同一性を共有した。  ａｅｓ２は翻訳伸長因子ＥＦ  Ｔｕ（ＡＬ０４９７６９）のヌクレオチド１０４５２から９４８４と９９％の同一性を共有した。ａｅｓ３は、Ｄ８９２３９  Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ＯＲＦ（Ｄ８９２３９）のヌクレオチド７７６から１１４５と９４％の同一性を、そしてＤＮＡ複製因子ｓｎａ４１（ＡＢ００１３７９）のアンチセンス鎖のヌクレオチド３２４６から２８７６と９３％の同一性を、共有した。ａｅｓ３はまた、その３´末端にＧＡ反復配列の２２０ｎｔストレッチも含有した。ａｅｓ４は、リボソームタンパク質Ｌ７ａのアンチセンス鎖(ＡＪ００１１３３)のヌクレオチド９６７８から８８９７と９９％の同一性を、そしてリボソームタンパク質Ｌ４のアンチセンス鎖（ＡＢ００５７５０）のヌクレオチド１３６５から５８４と９９％の同一性を、共有した。括弧内の検索数字は、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース中のアクセス番号を指す（ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースは、次のウエッブサイトからアクセスできる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００６７】
ＥＦ  Ｔｕは真核生物ＥＦ１αに類似しており、ペプチド伸長のためにリボソーム中のＡ部位へｔＲＮＡを輸送することにより作用する。ＥＦ１αは、アクチン結合、微小管切断、細胞形質転換、細胞老化、タンパク質ユビキチン化、およびタンパク質折りたたみを含む多様な細胞活動にも関係するとされている必須タンパク質である。ＥＦ  Ｔｕ発現株の詳細な分析は、それが、アンチセンスＲＮＡ媒介ｌａｃＺサイレンシングをさらに１５％増強することを、示した（図９Ｃ）。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ特異的ヌクレアーゼにより２１−２５ｎｔ分子種へ断片化され、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより増幅され、そしてＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼにより解離されると、されている。次いでそれらの低分子アンチセンス断片は、ＲＮＡヌクレアーゼ媒介分解により、自由に相同性ｍＲＮＡを攻撃する。会合機構は、短いｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的ｍＲＮＡとのＡＴＰ依存性交換を触媒する可能性があると、最近示唆されている。これは、断片化ｄｓＲＮＡのリボソームへの輸送を含む可能性があり、そこで、ｔＲＮＡ複合体と競合的に反応して、相補的アンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合する。これは、当該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の標的ｍＲＮＡとの会合を可能にするだろうが、それは、後者が構造的に露出された状態にあり、両者が翻訳を阻害し、リボヌクレアーゼ分解のために当該ｍＲＮＡを標的にする場合である。何ら特定の作用機構に拘束されることを願わずに、ＥＦ  Ｔｕは、ＲＮＡｉ依存性の短いｄｓＲＮＡ分子種に結合することにより作用し、それらを当該作用部位へもたらす可能性がある。
【００６８】
ｓｎａ４１によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ複製に関与することが以前に示されている。ｓｎａ４１は、ＣＤＣ４５と相同性が低く、相補的配列の発現を容易にできるＤＮＡヘリカーゼの性質をもつ可能性もある。当該アンチセンスプラスミドと標的ＤＮＡ配列とは、分子間相補性により、異所的に対形成することも考えられる。そのような対形成は、ＲＮＡ発現を阻害し、結果として細胞内ｄｓＲＮＡのレベルを低減することもありえる。同様に、逆向き反復ＤＮＡ配列の分子内対形成も、ＲＮＡ発現に干渉する可能性もある。ＤＮＡヘリカーゼ性質をもつタンパク質の過剰発現は、さらに多くのｄｓＲＮＡ生成を容易にし、それが今度はＲＮＡｉ効果を増強することもありえる。さらに、ＣＤＣ４５変異体は、プラスミド分離の速度増加を示す。プラスミド損失がｓｎａ４１の過剰発現により阻止されるならば、その時にはさらに多くのｄｓＲＮＡが生成され、本系における、より有効なＲＮＡｉをもたらすと思われる。こうしてみると、通常はＤＮＡおよび／またはＲＮＡ代謝および機能に関与する他のタンパク質も、ＲＮＡｉ調整および／または増強に一役買う可能性があると、予想するのもあながち不合理ではない。
【００６９】
Ｌ７ａタンパク質は６０ｓリボソームサブユニットの一部である。何ら特定の作用機構に拘束されることを願わずに、このタンパク質の過剰発現によるＲＮＡｉ増強は合理的であるが、それは短いｄｓＲＮＡ分子種がリボソームにおいて標的ｍＲＮＡと鎖置換を受ける可能性があると仮定されるからである。当該Ｌ７ａリボソームタンパク質は、ｉ）ｄｓＲＮＡまたはその巻き戻された型の、リボソームのＡ部位へのドッキングを媒介すること、ｉｉ）アンチセンス鎖の標的ｍＲＮＡとの会合を助けること、および／またはｉｉｉ）ｄｓＲＮＡをリボソーム複合体へシャトルすること、によりＲＮＡｉで働く可能性もある。
上で言及されたａｅｓ因子類の代表的なヌクレオチド配列は、下記に提示され、そして配列番号１から４と同定される：
【００７０】
【化１】
0004901051.tif 000003
【００７１】
【化２】
0004901051.tif 000004
【００７２】
【化３】
0004901051.tif 000005
【００７３】
【化４】
0004901051.tif 000006
【００７４】
実施例９：  新規ＲＮＡｉ因子類のアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ媒介遺伝子調節への影響
アンチセンスＲＮＡ、共抑制、およびｄｓＲＮＡ媒介干渉が同様な機構を共有する可能性を示唆するＰＴＧＳについての最近の研究によって、本出願人らは、ａｅｓ因子の過剰発現も、ｄｓＲＮＡ媒介調節を増強するか否かを、明らかにしたいと考えた。ｄｓＲＮＡが、本分裂酵母モデルで遺伝子抑制を媒介できることを証明したので、アンチセンス増強配列のｄｓＲＮＡ媒介調節への作用をテストした。この目的のために、前記ａｅｓ２遺伝子を、ｌａｃＺ標的遺伝子を含む酵母株中でｌａｃＺパンハンドル構築体と共発現させた。これらの条件下で、本形質転換体は、パンハンドルｌａｃＺ  ＲＮＡのみを発現する形質転換体と比べると、βガラクトシダーゼ活性のさらに３０％抑制を示した（図１０参照）。この結果は、ミトコンドリア伸長因子ＥＦ  Ｔｕの２つのドメインをコードする当該ａｅｓ２遺伝子が、アンチセンスＲＮＡ媒介遺伝子阻害だけでなく、ｄｓＲＮＡ媒介の遺伝子阻害も促進することを示す。
【００７５】
さらに、これら２つの形の調節は、ｌａｃＺアンチセンスＲＮＡの存在下でＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼｄｅｄ１を過剰発現すること、およびこのヘリカーゼが、対照株に比較してさらに５０％遺伝子抑制を増強したことを示すことにより、関係づけられることが示された（実施例６）。ｄｅｄ１は活性および不活性の両方のアンチセンスプラスミドについてテストされ、そして遺伝子サイレンシングのｄｅｄ１増強は活性アンチセンスＲＮＡのみに依存性であることが証明された（図１１参照）。これは、不活性アンチセンスＲＮＡとのＲＮＡ二重鎖形成の欠如、およびその結果としてのＲＮＡヘリカーゼに対する基質の欠如、による可能性がある。
【００７６】
本発明の方法は、一連のＲＮＡｉ効力の証明に、遺伝子サイレンシングを増強または低減する新しい因子類の同定に、遺伝子発現の阻害または遺伝子発現のアンチセンス阻害に対する感受性の増加に、遺伝子発現の阻害または下方制御を必要とする障害の治療または予防に、役立つ。
本発明を、特定の実施例および好ましい実施態様に関して、説明したが、本明細書に記載の本発明の概念および精神から逸脱しない変更および修正も、本発明の範疇にあると考えるのは、当業者には明瞭であろう。
【００７７】
参考文献
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１７．  Ｈｅｙｅｒ，Ｗ．−Ｄ．，Ｓｉｐｉｃｚｋｉ，Ｍ．＆  Ｋｏｈｌｉ，Ｊ．（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，８０−８９．
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、標的遺伝子およびアンチセンス断片。ａ，ＫＣ４−６株は低レベルのｌａｃＺ  ＲＮＡを発現することを示す。当該ｌａｃＺ発現カセットは、染色体ＩＩＩ上のｕｒａ４遺伝子座に組込まれ、そしてＳＶ４０初期プロモーター，Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子およびＳＶ４０  ３´プロセシングシグナルで構成されている。ｕｒａ４遺伝子座の５´および３´フランキングＤＮＡ配列は、指示のとおりである。ｂ，高レベルのｌａｃＺ  ＲＮＡを発現するＲＢ３−２株は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ａｄｈ１プロモーター，ｌａｃＺコード領域，およびＳ．ｐｏｍｂｅ  ｕｒａ４  ３´プロセシングシグナルを含む発現カセットを含む。ｃ，完全長３．５ｋｂアンチセンスｌａｃＺ断片を示す。不具（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）センス断片は、ＣｌａＩカット（ｃｕｔ）ｌａｃＺベクターを末端充填し、それ自身に再連結することにより作製した。ｄ，ＡＭＬ１株は、ｕｒａ４遺伝子座に組込まれたｃ−ｍｙｃ−ｌａｃＺ融合カセットを含む。ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子のエキソン２および３を標的として採用した。ｃ−ｍｙｃアンチセンス断片の相対的位置を示す。転写開始部位は曲矢印で示す。直矢印は、特定のＤＮＡ断片についての転写の正常方向を表す。
【図２】  図２は、分裂酵母におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを示す。ａ，強力なａｄｈ１ｌプロモーターの制御下で組込まれたｌａｃＺ遺伝子を含む分裂酵母株を、ｌａｃＺアンチセンスベクターで形質転換した。当該アンチセンス遺伝子は、弱ｎｍｔ４１プロモーター（低アンチセンス）、単一コピーで強ｎｍｔ１プロモーター（１５）（中アンチセンス）、または多コピーでｎｍｔ１プロモーター（高アンチセンス）の制御下にあった。最大アンチセンスＲＮＡを発現する株について、異なる選択マーカーを含む２つのエピソームｎｍｔ１駆動アンチセンスベクターを標的株中へ共形質転換した。ｂ，弱ＳＶ４０プロモーター（低標的）または強ａｄｈ１プロモーター（高標的）の制御下で組込まれたｌａｃＺ遺伝子を含む分裂酵母株を、アンチセンスｌａｃＺベクターまたはアンチセンスｌａｃＺおよびセンスｌａｇＺベクターで形質転換した。適切な選択マーカーを含むベクターで株を形質転換し、栄養要求性を補完した。ｃ，ｌａｃＺ逆向き反復ベクターを、高発現ｌａｃＺ標的株中で発現させた。当該アンチセンス構築体だけを発現する株も示してある。ｄ，組込みｃ−ｍｙｃ−ｌａｃＺ融合遺伝子を含む分裂酵母株を、前記センス構築体、アンチセンス構築体、または両者で形質転換した。アンチセンスおよびセンス構築体は、高発現ｌａｃＺ株中でも発現させた。すべての株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。
【図３】  図３は、センスおよびアンチセンス遺伝子の単一コピーの共発現の影響を示す。標的ｌａｃＺ単独（ＲＢ３−２）、標的およびアンチセンス遺伝子の単一コピー（Ｋ４０−７）、および標的およびアンチセンスおよびフレームシフト化ｌａｃＺ両遺伝子（Ｍ６２−１）を含む株について、βガラクトシダーゼ活性を検定した。ｐＲＥＰ２およびｐＲＥＰ４は、それぞれＬＥＵ２およびｕｒａ４選択マーカーを含む親プラスミドである。株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。各試料につき、３つの独立コロニーを３回検定した。
【図４】  図４は、分裂酵母株におけるＲＮＡ発現プロファイルを示す。ａ，標的株ＲＢ３−２を、ｌａｃＺ逆向き反復ベクター（ｐＭ５３−１）で形質転換し、またはアンチセンス（ｐＧＴ２）およびセンス（ｐＭ５４−３）ベクターで共形質転換し、そしてチアミンの不在下で対数中期まで増殖させた。各株から全ＲＮＡを１％変性アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、そして放射能標識した２．２ｋｂ  ｎｍｔ１断片でプローブした。エピソームｌａｃＺシグナルは、内因性ｎｍｔ１転写産物に標準化し、りん光画像分析により定量した。エピソームｌａｃＺ発現の相対的レベルを示す。ｂ，安定に組込まれたｌａｃＺ逆向き反復遺伝子の単一コピーを含むＭ３８−１株を、チアミンの不在下で対数中期まで増殖させ、そのＲＮＡを単離し、そしてノーザンブロット法で分析した。“パンハンドル”ｌａｃＺ  ＲＮＡの相対的定常状態レベルを、エピソーム発現されたアンチセンスｌａｃＺ  ＲＮＡに比較して、示す。
【図５】  図５は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｓＲＮＡ検定法を示す。ａ，ｌａｃＺ逆向き反復が分子内ＲＮＡ二重鎖を形成する能力を検定するために用いた構築体を示す。各ベクターは、Ｘ−ＧＡＬの存在下で増殖させた場合、形質転換株に青色表現型を与える機能性ｌａｃＺ断片を含む。ｐＭ８１−２生成転写産物の推定二次構造を示す。ｂ，２０３７株を、チアミンの不在下にベクターｐＭ８５−１，ｐＭ９１−１およびｐＭ８１−２で形質転換した。単一コロニーを最小培地プレート上にストリークし、５００μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌおよび０．０１％ＳＤＳを含む０．５％アガロース培地でオーバーレイした。
【図６】  図６は、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子調節へのｄｅｄ１の影響を示す。ａ，ｄｅｄ１遺伝子を組込みｌａｃＺ遺伝子を含む分裂酵母株で共発現させた。アンチセンスｌａｃＺベクターで、およびそれ無しで形質転換された株のβガラクトシダーゼ活性を示す。ｂ，標的株は、短いｌａｃＺアンチセンス遺伝子を発現するベクターで、または短いアンチセンスｌａｃＺベクターおよびｄｅｄ１発現ベクターの両方で、形質転換した。株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。
【図７】  図７は、アンチセンスｌａｃＺ発現株におけるｔｈｉ１の過剰発現を示す。アンチセンスｌａｃＺベクターで、およびそれ無しで形質転換された標的株ＲＢ３−２のβガラクトシダーゼ活性を示す。アンチセンス発現株におけるｔｈｉ１遺伝子の過剰発現も示す。株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。
【図８】  図８は、ＲＮＡｉモジュレート因子類に対する過剰発現スクリーニング法を示す。ａｄｈ１プロモーターの制御下で組込まれたｌａｃＺ遺伝子およびｎｍｔ１駆動ｌａｃＺアンチセンス遺伝子を含むエピソームベクターとを含む標的株を、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ｃＤＮＡライブラリーで形質転換する。ライブラリー断片は、ｎｍｔ１プロモーターにより駆動する。形質転換体は、ｌａｃＺコード化青コロニー色表現型の変化について、個々にスクリーンする。次いでこれらの形質変換体は、チアミンの存在および不在下に、βガラクトシダーゼ活性を定量的に検定される。次いで、当該アンチセンスベクターは、ｌａｃＺ抑制のｃＤＮＡ依存性修飾を示す形質転換体から分離する。その作用がｄｓＲＮＡの存在に依存するか否かを決定するために、三次βガラクトシダーゼ検定を行う。ｃＤＮＡベクターを、関心株から回収し、配列決定し、そしてＢＬＡＳＴＮ分析にかける。
【図９】  図９は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ｃＤＮＡライブラリーの過剰発現スクリーンを示す。ａ，形質転換体を、最小培地プレート上で増殖し、Ｘ−ＧＡＬ含有培地でオーバーレイした。青色表現型の低減を示したもの（黒矢印）は、さらに分析した。青色表現型の増強を示した形質転換体も、同定した（白矢印）。ｂ，青色表現型に視覚的低減を示した形質転換体は、チアミンの不在下で液体培養中のβガラクトシダーゼ活性を検定した。チアミンは、当該増強ｌａｃＺ抑制がＲＮＡ発現に依存性であったことを証明するために、培地に添加した。形質転換体は、アンチセンスベクター分離後に、βガラクトシダーゼ活性を再び検定した。ｃ，ｄｓＲＮＡ発現株におけるユニークなｒｅｓ遺伝子の過剰発現。
【図１０】  図１０は、ｌａｃＺパンハンドル媒介遺伝子サイレンシングを示す。（Ａ）ｌａｃＺパンハンドル構築体は、逆向き５´２．５ｋｂ  ｌａｃＺ断片が続く、完全長不具ｌａｃＺ遺伝子を含む。分子内ハイブリッド形成は、２．５ｋｂ  ＲＮＡ二重鎖および１ｋｂループをもつＲＮＡを産生する。（Ｂ）エピソーム的に発現されたパンハンドルｌａｃＺ  ＲＮＡ（７．０ｋｂ）の相対的定常状態レベルを、エピソーム的に発現されたアンチセンスｌａｃＺ  ＲＮＡ（４．５ｋｂ）に比較して示す。当該ｌａｃＺシグナルは、内因性ｎｍｔ１転写産物（１．３ｋ）に標準化し、りん光画像分析により定量した。（Ｃ）当該標的株は、エピソーム的に発現されたｌａｃＺパンハンドルで形質転換し、そしてβガラクトシダーゼ活性を分析した。適切なプラスミドを共導入し、栄養要求性を補完した。少なくとも３つの独立したコロニーを、各株につき３回検定した。当該パンハンドルＲＮＡ（陰影線づけ）の発現を撤廃するため、チアミンの存在下で形質転換体を検定した。（Ｄ）当該標的ｌａｃＺ株は、パンハンドルベクター単独で、またはパンハンドルおよびａｅｓ２ベクターの両方で、形質転換した。
【図１１】  図１１は、ｄｅｄ１およびｌａｃＺアンチセンス遺伝子の共発現を示す。ｄｅｄ１遺伝子およびアンチセンスｌａｃＺベクターで共形質転換した標的株のβガラクトシダーゼ活性を示す。ｄｅｄ１はｕｒａ４基盤プラスミドｐＲＥＰ４から発現され、一方当該アンチセンス遺伝子はＬＥＵ２基盤プラスミドｐＲＥＰ２から発現された。アンチセンスＲＮＡｓまたはｄｅｄ１  ＲＮＡ単独を発現する株も示す。株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。３つの独立したコロニーを、各株につき３回検定した。
【図１２】  図１２は、ａｅｓ１因子についてのＤＮＡ配列を示す。
【図１３】  図１３は、ａｅｓ２因子についてのＤＮＡ配列を示す。
【図１４】  図１４は、ａｅｓ３因子についてのＤＮＡ配列を示す。
【図１５】  図１５は、ａｅｓ４因子についてのＤＮＡ配列を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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