(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒酢中から分離精製されたジヒドロフェルラ酸及び／又はジヒドロシナピン酸を有効成分とする発癌予防剤。
【請求項２】
黒酢中から分離精製された前記ジヒドロフェルラ酸は、前記ジヒドロフェルラ酸を１重量％以上含んでいる、黒酢からの分離組成物を精製したものであることを特徴とする請求項１記載の発癌予防剤。
【請求項３】
黒酢中から分離精製された前記ジヒドロシナピン酸は、前記ジヒドロシナピン酸を０．２重量％以上含んでいる、黒酢からの分離組成物を精製したものであることを特徴とする請求項１記載の発癌予防剤。
【請求項４】
ヒトの大腸癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、膀胱癌細胞、前立腺癌細胞の増殖を抑制する請求項１乃至３のいずれか一項記載の発癌予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、食酢中から分離された抗酸化組成物、食酢分離組成物を有効成分とする発癌予防剤及び食酢分離組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
食酢は、古くから調味料として広く使用されているが、調味のみならず、抗菌等の他の機能も利用されてきた。特に、経験的に酢を摂ると健康によいということが知られており、民間薬的な効用を期待した使われ方もされている。
【０００３】
食酢には、胃液の分泌促進、疲労回復、脂肪肝防御、高血圧の予防、過酸化脂質の低下、コレステロールの低下、血中アルコールの低減等の効果があるとされている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
食酢が抗酸化作用を有することは近年の研究により判明しているが、食酢中のいずれの成分が抗酸化作用に有効であるかに関しては、未だ具体的にされていない。
【０００５】
また、フェルラ酸誘導体が発癌予防活性を有することが明らかにされているが、食酢中に、ジヒドロフェルラ酸及びジヒドロシナピン酸などが存在することは知られていない。
【０００６】
本願発明は、食酢中から分離された極めて優れた抗酸化作用を持つ抗酸化組成物、食酢分離組成物を有効成分とする癌予防に効果的な発癌予防剤及び各種生理活性を有する食酢分離組成物を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、上述の課題に対し、食酢中の成分について、比較的安定なフリーラジカルである２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（以下「ＤＰＰＨ」という。）を用いたラジカル消去活性を指標にして検討を重ねた結果、本願発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本願発明の抗酸化組成物は、食酢中から分離された抗酸化組成物である。この発明の好適形態においては、上記食酢中から分離された抗酸化組成物は、ジヒドロフェルラ酸、ジヒドロシナピン酸のうち一種以上を含有してなる。
【０００９】
本願発明の発癌予防剤は、食酢分離組成物を有効成分とする発癌予防剤である。この発明の好適形態においては、上記食酢分離組成物は、ジヒドロフェルラ酸及び／又はジヒドロシナピン酸を含有してなる。
【００１０】
本願発明の食酢分離組成物は、ジヒドロフェルラ酸、ジヒドロシナピン酸のうち一種以上を含有してなる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本願発明の抗酸化組成物は、食酢中から分離された抗酸化組成物である。本願発明の発癌予防剤は、食酢分離組成物を有効成分とする発癌予防剤である。本願発明の食酢分離組成物は、ジヒドロフェルラ酸、ジヒドロシナピン酸のうち一種以上を含有してなる。
【００１２】
本願発明において用いられる食酢は、醸造酢であり、例えば、黒酢、米酢、穀物酢、アルコール酢、果実酢等が挙げられるが、黒酢であることが好ましい。食酢の中でもとりわけ黒酢が高いＤＰＰＨラジカル消去活性を有するからである。
【００１３】
黒酢には、水分、酢酸等の有機酸、アミノ酸等の窒素化合物、炭水化物を中心に、カリウムやカルシウム等のミネラル類、ビタミンＢ１、Ｂ２等のビタミン類などの成分が含まれている。
【００１４】
黒酢の原料としては、玄米及び水を基本とするが、麦、大豆、酵母等を用いることがある。
【００１５】
黒酢については、脂質代謝改善、赤血球変形能改善、抗アレルギー作用、血圧調節及び血糖調節等の多くの生体調節機能を有することが確認されている。
【００１６】
なお、本願発明において好ましく用いられる黒酢には、広く一般に黒酢と呼ばれるものはすべて含まれ、天然壺酢製法によるものに限定されない。
【００１７】
本願発明において、抗酸化組成物、発癌予防剤又は食酢分離組成物を得る方法としては、食酢中に含まれるジヒドロフェルラ酸やジヒドロシナピン酸などの有効成分を分離することができればどのようなものでもよく、特に限定されないが、例えば、吸着剤、減圧濃縮、分配抽出、溶媒抽出、凍結乾燥、膜分離などのいずれか一種以上を用いた方法を例示することができる。
【００１８】
具体的には、例えば、食酢を樹脂カラムに一定時間通液した後、樹脂カラムへの吸着物を溶出させ、その溶出液から溶媒を除去し、残留物から有効成分を抽出して、その抽出物を減圧濃縮するという方法を採用すると、処理が簡便で、短時間に効率よく食酢中から抗酸化組成物、発癌予防剤又は食酢分離組成物を得ることができる。
【００１９】
前記方法において、樹脂カラムへの吸着物を溶出させる溶媒としては、メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム等を使用することができ、残留物からの有効成分の抽出溶媒には、例えば、酢酸エチル、水、エタノール、メタノール、クロロホルム、アセトニトリル、ブタノール、１−プロパノール、ジエチルエーテルなどを使用することができる。
【００２０】
本願発明の抗酸化組成物や食酢分離組成物は、そのまま用いるだけでなく、濃縮したり、凍結乾燥や噴霧乾燥等により乾燥したり、必要成分を精製したりして用いることができ、本願発明の効果を妨げない範囲で各種物質を混合することもできる。
【００２１】
本願発明の発癌予防剤は、それ自体又は適宜製剤上の賦形剤、結合剤、希釈剤等と混合してなるものであり、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ剤、注射剤など任意の剤型で、経口的又は非経口的に投与することができる。
【００２２】
本願発明の食酢分離組成物は、大腸癌細胞、肺癌細胞及び膀胱癌細胞を含む難治性腫瘍を構成する腫瘍細胞の増殖を抑制する性質、悪性腫瘍、心筋梗塞、脳卒中、リウマチ、各種生活習慣病（動脈硬化、糖尿病等）、肝障害などの疾患や、ストレス、老化の原因とされる、活性酸素や過酸化脂質に由来する生体内のラジカルを捕捉する性質、生体内の細胞による一酸化窒素の生成を抑制することにより、生体内での過剰な一酸化窒素が関連する自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、悪性腫瘍、肝障害、肺障害等の諸疾患を治療、予防する性質を具備しており、ヒトを含む哺乳類において多彩な生理作用を発揮する。
【００２３】
なお、本願発明の食酢分離組成物には、前記生理作用の観点から、ジヒドロフェルラ酸が１重量％以上又はジヒドロシナピン酸が０．２重量％以上含まれていることが好ましい。
【００２４】
本願発明において、有効成分の効能や効果をより効果的に発揮させるため、上述の方法により得られた抗酸化組成物、発癌予防剤又は食酢分離組成物を精製することは好ましい。ここで、抗酸化組成物、発癌予防剤又は食酢分離組成物を精製する方法は、特に限定されないが、例えば、吸着剤、減圧濃縮、分配抽出、溶媒抽出、凍結乾燥、乾固、膜分離のいずれか一種以上を用いた方法を例示することができる。
【００２５】
具体的には、例えば、イオン交換樹脂などを充填したカラムに精製しようとする組成物を負荷した後、溶媒をカラムに通液して目的成分を溶出させ、その溶出液を溶媒抽出した後、この抽出液を減圧濃縮した濃縮物をシリカゲルなどを充填したカラムに負荷して溶媒を通液し、溶出液について、ＤＰＰＨラジカル消去活性を測定し、ＤＰＰＨラジカル消去活性の高かった画分を集め、溶媒を留去し、乾固する方法を採用すると、夾雑成分をよりよく取り除き、有効成分の精製が良好となる。
【００２６】
前記方法において、精製しようとする組成物を負荷したカラムに通液する溶媒としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等を使用することができる。溶出液を抽出する溶媒としては、例えば、酢酸エチル、水、エタノール、メタノール、クロロホルム、アセトニトリル、ブタノール、１−プロパノール、ジエチルエーテル等が挙げられるが、酢酸エチルを用いるのが好ましい。濃縮物を負荷したカラムに通液する液体としては、例えば、ヘキサン、酢酸エチル混合液やヘキサン、メタノール混合液を使用することができる。
【００２７】
ＤＰＰＨラジカル消去活性は、常法を用いて測定することができる。
【００２８】
なお、前記方法で、黒酢を分離した場合、ヘキサン、酢酸エチル混合液の濃度比を段階的に変化させながら通液した後の溶出液には、ＤＰＰＨラジカル消去活性の高い２つの画分が存在する。この２つの画分のうち、一方の画分にはジヒドロフェルラ酸が濃縮されたものとなり、他方の画分にはジヒドロシナピン酸が濃縮されたものとなる。
【００２９】
【実施例】
（１）食酢分離組成物の作製
（実施例１）
黒酢（タマノイ酢株式会社製）５０リットル（約５０ｋｇ）を、樹脂カラム（オルガノ株式会社製、製品名：アンバーライトＸＡＤ−４）に１２時間通液した。その後、樹脂カラムに吸着した吸着物（吸着画分）を１２リットルのメタノールで溶出させて溶出液１ａを得た。
【００３０】
その溶出液１ａを減圧濃縮してメタノールを留去し、残留物１ｂを得た。
【００３１】
残留物１ｂを酢酸エチルで抽出し、抽出液１ｃを得た。
【００３２】
抽出液１ｃを減圧濃縮し、本願発明となる食酢分離組成物１を２０ｇ得た。この食酢分離組成物１を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量したところ、ジヒドロフェルラ酸が６．３重量％、ジヒドロシナピン酸が１．０重量％含まれていることがわかった。
【００３３】
（２）食酢分離組成物の抗酸化作用
（実施例２）
実施例１と同様の操作を繰り返し、食酢分離組成物２を得た。
【００３４】
樹脂（東ソー株式会社製、製品名：ＤＥＡＥ  トヨパール）５００ｍｌを充填したカラムに食酢分離組成物２を２０ｇ負荷し、その後、リン酸緩衝溶液を通液した。この溶出液（ＤＥＡＥ非吸着画分）を酢酸エチルで抽出し、抽出液を減圧濃縮し、濃縮物２ａを９ｇ得た。
【００３５】
９ｇの濃縮物２ａを４２０ｇのシリカゲルを充填したカラムに負荷し、ヘキサン、酢酸エチル混合液を濃度比８：２から０：１００に段階的に変化させながら通液し、溶出液を３０ｍｌずつ採取した。
【００３６】
それぞれの溶出液について、以下の方法によりＤＰＰＨラジカル消去活性を求めた。
【００３７】
イ）溶出液をエタノール又は水に溶解させた溶液０．２ｍｌに、１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝溶液０．８ｍｌと０．５ｍＭのＤＰＰＨエタノール溶液１ｍｌを加え、よく撹拌した後に遮光して室温で２０分間放置し、試験体とした。
【００３８】
ロ）吸光度計で試験体の５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３９】
ハ）試験体のかわりに、最終１ｍＭになるようにトロロックスを加えたものを１００％ラジカル消去の対照とした。
【００４０】
ニ）ＤＰＰＨラジカル消去活性の消去率は、消去率（％）＝［｛（溶媒）−（試験体）｝／｛（溶媒）−（トロロックス）｝］×１００を用いて求めた。なお、（溶媒）は、試験体の代わりにエタノールを入れたものであり、（  ）内は５１７ｎｍにおける吸光度である。
【００４１】
その結果、２７０〜３３０番目の画分（以下、画分「２ｂ」という。）と３４６〜３７０番目の画分（以下、画分「２ｃ」という。）のＤＰＰＨラジカル消去活性が高かった。
【００４２】
ＤＰＰＨラジカル消去活性の高かった、画分２ｂと画分２ｃを集めて、溶媒を減圧濃縮で留去し、乾固した。
【００４３】
６０ｇのシリカゲルを充填したカラムに画分２ｂを９００ｍｇ負荷し、クロロホルム、メタノール混合液（９：１）を通液した。溶出液を３０ｍｌずつ採取し、それぞれの溶出液について、上述の方法により、ＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去活性の高かった、９〜１１番目の画分を集めて、溶媒を減圧濃縮で留去し、乾固して１５０ｍｇ得た。これを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりさらに分取をして本願発明である食酢分離組成物２Ｂを３３ｍｇ得た。この食酢分離組成物２Ｂは、液体クロマト質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によりジヒドロフェルラ酸であることを同定した。
【００４４】
５０ｇのシリカゲルを充填したカラムに画分２ｃを３５０ｍｇ負荷し、へキサン、酢酸エチル混合液（５：５）を通液した。溶出液を３０ｍｌずつ採取し、それぞれの溶出液について、上述の方法により、ＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去活性が高かった、１９〜２６本目の画分を集めて、溶媒を減圧濃縮で留去し、乾固して１１０ｍｇ得た。これをＴＬＣによりさらに分取をして本願発明である食酢分離組成物２Ｃを１３ｍｇ得た。この食酢分離組成物２Ｃは、ＬＣ−ＭＳ、ＮＭＲにより、ジヒドロシナピン酸であることを同定した。
【００４５】
なお、ＤＰＰＨラジカルを５０％消去したときの濃度（ＩＣ５０）が低いほど、ＤＰＰＨラジカル消去活性が高いといえるため、ＩＣ５０の値からＤＰＰＨラジカル消去活性の強さを知ることができる。ＩＣ５０の値は、直接測定することは困難であるが、濃度と消去率の関係を表したグラフから求めることができる。
【００４６】
黒酢、食酢分離組成物２、食酢分離組成物２Ｂ、食酢分離組成物２ＣのＩＣ５０を表１に示す。
【００４７】
【表１】
0005040016.tif 000002
【００４８】
ＩＣ５０の値より、食酢分離組成物２、食酢分離組成物２Ｂ及び食酢分離組成物２ＣのＤＰＰＨラジカル消去活性は、いずれも黒酢より桁違いに高く、食酢分離組成物２、食酢分離組成物２Ｂ、食酢分離組成物２Ｃの順に高くなることがわかった。即ち、本願発明の食酢分離組成物は、ＤＰＰＨラジカル消去活性が非常に高く、抗酸化組成物として極めて優れた抗酸化作用を有することがわかった。
【００４９】
（３）ＡＯＭ誘発ラット大腸ＡＣＦの抑制効果
（実施例３）
実施例１と同様の操作を繰り返し、食酢分離組成物３を得た。
【００５０】
４２匹の雄Ｆ３４４ラットを６群に分け、以下の条件で飼育した。
【００５１】
イ）１、２、３、４群（各８匹）には、水にそれぞれ０重量％、０．０５重量％、０．１重量％、０．２重量％の食酢分離組成物３を混ぜた溶液を４週間にわたって与えた。発がん物質であるＡＯＭ（アゾキシメタン）は、水又は食酢分離組成物３を混ぜた溶液を与え始めてから７日後と１４日後に、１回当たり２０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙを与えた。
【００５２】
ロ）５群（５匹）には、水に０．２重量％の食酢分離組成物３を混ぜた溶液のみを与えた。
【００５３】
ハ）６群（５匹）には、ＡＯＭも投与せず、水を与え、コントロールとした。
４週間後、大腸を取り出してホルマリンで固定し、大腸粘膜に発生しているＡＣＦ（大腸癌前駆病変：ａｂｅｒｒａｎｔ  ｃｒｙｐｔ  ｆｏｃｉ）をメチレンブルーで染色してその数を測定した。
【００５４】
ラットの数、食酢分離組成物３の濃度、ＡＯＭの有無、ＡＣＦの発生個数の一覧を表２に示す。
【００５５】
【表２】
0005040016.tif 000003
【００５６】
水に食酢分離組成物３を含有させた溶液を与えた２群、３群及び４群は、水に食酢分離組成物３を含有させなかった１群に比べ、ＡＣＦの発生個数を減少させることができた。即ち、ジヒドロフェルラ酸、ジヒドロシナピン酸を含んだ本願発明の食酢分離組成物をラットに与えることにより大腸癌前駆病変であるＡＣＦの発生を抑えることができ、本願発明の食酢分離組成物は、発癌予防剤としてがん予防に有効であることがわかった。
【００５７】
（４）ヒト癌細胞増殖抑制効果
（実施例４）
実施例１と同様の操作を繰り返し、食酢分離組成物４を得た。
【００５８】
ヒト大腸癌由来細胞株ＣＡＣＯ−２、ヒト肺癌由来細胞株Ａ５４９、ヒト乳癌由来細胞株ＭＣＦ−７、ヒト膀胱癌由来細胞株５６３７、ヒト前立腺癌由来細胞株ＬＮＣａＰを以下の方法により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖抑制試験に供した。細胞の種類、初発細胞数及び培地の一覧を表３に示す。
【００５９】
【表３】
0005040016.tif 000004
【００６０】
継代培養した各種細胞をそれぞれ一定量、一定の培地で懸濁し、該懸濁液を９６穴マイクロプレートに８０μｌずつ注入した。これを５％炭酸ガス培養器中で、３７℃に保ち、２４時間培養した。その後、食酢分離組成物４を含む検体を２０μｌ添加し、上記と同様の条件で、ＣＡＣＯ−２は９６時間、その他は７２時間培養した。その後、培養液にａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）１０μｌを添加し、上記と同様の条件で３時間培養した。上清を回収し、マイクロプレートリーダーで蛍光強度（励起波長５４４ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）を測定した。
【００６１】
食酢分離組成物４を添加しなかったものの蛍光強度を増殖率１００％とし、これに対する細胞増殖抑制率５０％濃度（ＩＣ５０）を求めた。
【００６２】
各種細胞に対する食酢分離組成物４のＩＣ５０を表４に示す。
【００６３】
【表４】
0005040016.tif 000005
【００６４】
本願発明の食酢分離組成物は、発癌予防剤として、ヒトの各種癌細胞に対し良好な増殖抑制効果を示した。
【００６５】
【発明の効果】
本願発明の抗酸化組成物は、極めて優れた抗酸化作用を持つ。
【００６６】
本願発明の発癌予防剤は、各種癌細胞に対して増殖抑制効果があり、発癌予防に有効に作用する。
【００６７】
本願発明の食酢分離組成物は、難治性腫瘍を構成する腫瘍細胞を抑制する性質、活性酸素や過酸化脂質に由来する生体内のラジカルを捕捉する性質、生体内の細胞による一酸化窒素の生成を抑制する性質を具備しており、ヒトを含む哺乳類において多彩な生理作用を発揮するため、抗腫瘍作用、ラジカル捕捉作用、一酸化窒素生成の抑制作用を発揮する生薬として、例えば、食品分野、化粧品分野、医薬品分野において有利に用いることができる。