(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトース、シアル酸、α−ガラクトシドおよびβ−ガラクトシドからなる群から選択される少なくとも一種類の、インターナリゼーションした外来前駆体から出発する遺伝子修飾し、糖ヌクレオチド合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子および外来前駆体の能動輸送によるインターナリゼーションのための透過酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子をさらに含む細胞によるオリゴ糖の製造方法であって、上記外来前駆体がオリゴ糖の生合成に関与するものであり、前記方法が、
(i)  上記外来前駆体から上記オリゴ糖への合成に必要な修飾をすることができる酵素をコードする少なくとも一種類の組換え遺伝子と、該遺伝子を細胞で発現するための成分をも含んでなり（ここで上記酵素は、β−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−グルクロノシル−トランスフェラーゼ、β−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼ、α−２，６−シアリル−トランスフェラーゼ、α−２，８−シアリル−トランスフェラーゼ、α−１，２−フコシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−フコシル−トランスフェラーゼ、およびα−１，４−フコシル−トランスフェラーゼから選択されるグリコシルトランスフェラーゼである）、
上記外来前駆体を分解する酵素活性を欠き、また
細胞を得る段階と、
(ii)  少なくとも一種類の上記外来前駆体の存在下にて、上記細胞による上記外来前駆体の能動輸送の機構に従ってインターナリゼーションおよび上記細胞による上記オリゴ糖の産生を生じさせる条件下で、上記細胞を培養する段階とを含んでなる、方法。
【請求項２】
上記透過酵素が、ラクトース透過酵素、ガラクトシド透過酵素、およびNanT透過酵素からなる群から選択される一または二以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記糖ヌクレオチド合成酵素がＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記細胞が、上記オリゴ糖の生合成に関与する外来前駆体を修飾することができる酵素であって、請求項１に記載のグリコシルトランスフェラーゼと同一であるかまたは異なっている該酵素をコードする少なくとも一種類の組換え遺伝子と、該遺伝子を上記細胞で発現するための成分とを含んでなり、上記細胞が上記外来前駆体を分解する酵素活性を欠いている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記細胞が細菌および酵母から選択された細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞が細菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細菌がEscherichia coli 型の細菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記修飾がグリコシル化、硫酸化(sulfatation)、 アセチル化、リン酸化、スクシニル化、メチル化、およびエノールピルベート基の付加から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記細胞培養を、炭素を基剤とする基質で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記の炭素を基剤とする基質がグリセロールおよびグルコースから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記培養を高細胞密度の培養物を産生する条件下で行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
上記培養段階が、
a)  上記の炭素を基剤とする基質によって確保される指数細胞増殖の第一相、
b)  連続的に添加される上記の炭素を基剤とする基質によって制限される細胞増殖の第二相、
c)  段階b)で添加される基質の量より少ない量の基質を培養物に連続的に加えることによって得られ、高細胞密度培養物で産生されるオリゴ糖の含量を増加させる遅い細胞増殖の第三相
を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記c)相中に細胞培養物に連続的に加えられる基質の量が、上記b)相中に連続的に加えられる基質の量より少なくとも３０％少ない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記外来前駆体をb)相中に添加する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記外来前駆体がラクトースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
上記外来前駆体が、天然または合成のβ−ガラクトシドおよびα−ガラクトシドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
上記外来前駆体の能動輸送がラクトース透過酵素によって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
上記外来前駆体がシアル酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
上記外来前駆体の能動輸送がNanT透過酵素によって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記外来前駆体がシアル酸およびラクトースである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
上記外来前駆体の能動輸送がラクトース透過酵素およびNanT透過酵素によって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記細胞が、LacZ−および／またはNanA−遺伝子型を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
インデューサーを上記培地に添加して、上記能動輸送に関与している上記酵素および／またはタンパク質の上記細胞中での発現を誘発することをも含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
上記インデューサーがイソプロピル＝β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、上記タンパク質がラクトース透過酵素である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
・上記細胞が、LacZ−, LacY＋ の遺伝子型の細菌であり、
・上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼであり、
・上記基質がグリセロールであり、
・上記インデューサーがイソプロピル＝β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、
・上記外来前駆体がラクトースである、
三糖類４−Ｏ−[３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル]−Ｄ−グルコピラノース, (β−Ｄ−ＧｌｃＮａｃ−［１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−Ｄ−Ｇｌｃ）の製造のための、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
・上記細胞が、LacZ−, LacY＋の遺伝子型の細菌であり、
・上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼであり、
・上記インデューサーがイソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、・上記外来前駆体がラクトースである、
ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースおよびポリラクトースアミン（ラクト−Ｎ−ネオ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオース、ラクト−Ｎ−ネオ−デカオース）の製造のための、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素をも含んでなり、上記細胞がNanA-, NanT+の遺伝子型をも有し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ−シンターゼの遺伝子を発現する、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースおよびポリラクトースアミン（ラクト−Ｎ−ネオ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオース、ラクト−Ｎ−ネオ−デカオース）のシアリル誘導体の製造のための、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
α−１，２−フコシル−トランスフェラーゼおよびα−１，３−フコシル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素をも含んでなり、上記細胞がWcaJ-遺伝子型をも有し且つRcsA遺伝子を過剰発現する、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースおよびポリラクトースアミン（ラクト−Ｎ−ネオ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオース、ラクト−Ｎ−ネオ−デカオース）のフコシル誘導体を製造するための、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素をも含んでなり、α−１，２−フコシル−トランスフェラーゼおよびα−１，３−フコシル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素をも含んでなり、上記細胞がNanA-, NanT+, WcaJ-遺伝子型をも有し且つRcsA遺伝子およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ−シンターゼの遺伝子を過剰発現する、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオ−デカオースのシアリルおよびフコシル誘導体を製造するための、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
・上記細胞がLacZ-, LacY+, NanA-またはNanT+遺伝子型の細菌であり、
・上記酵素がＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ−シンターゼおよびα−２，３−シアリル−トランスフェラーゼまたはα−２，６−シアリル−トランスフェラーゼであり、
・上記基質がグリセロールであり、
・上記インデューサーがイソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、・上記外来前駆体がラクトースおよびシアリル酸である、
３′−シアリルラクトース (α−ＮｅｕＡｃ−［２→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ) または６′−シアリルラクトース (α−ＮｅｕＡｃ−［２→６］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ)を製造するための、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
α−１，３−フコシル−トランスフェラーゼまたはα−１，２−フコシル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素を含んでなり、細胞がwcaj- lacZ-遺伝子型を有し且つrcsA遺伝子を過剰発現し、上記外来前駆体がラクトースである、３′−フコシルラクトース (β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]−Ｄ−Ｇｌｃ）または２′−フコシルラクトース、α−Ｌ−Ｆｕｃ−［１→２］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−Ｄ−Ｇｌｃを製造するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
・上記細胞がLacZ-, LacY+遺伝子型の細菌であり、
・上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼであり、
・上記基質がグリセロールであり、
・上記インデューサーがイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、・上記外来前駆体がアリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドである、
アリル３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド,（β−Ｄ−ＧｌｃＮａｃ−［１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−１→Ｏ−アリル）を製造するための請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
・上記細胞がLacZ-, LacY+ 遺伝子型の細菌であり、
・上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼであり、
・上記基質がグルコースであり、
・上記インデューサーがイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、・上記外来前駆体がアリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドである、
ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースおよびポリラクトースアミンの類似体であって、グルコース残基がアリル基で置換されているものを製造するための、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
上記外来前駆体がアリル−β−Ｄ−ガラクトシドである、グルコース残基がアリル基で置換されているオリゴ糖類似体を製造するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
上記細胞を少なくとも一種類の同位体で標識した上記炭素基剤の基質上および／または上記同位体で標識した上記外来前駆体の存在下にて培養する、少なくとも一種類の同位体で標識したオリゴ糖を製造するための、請求項９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生物学的に重要なオリゴ糖の微生物学的製造に関する。
【０００２】
オリゴ糖が特にタンパク質の活性および機能に関して重要な生物学的役割を果たしており、従ってそれらがタンパク質の半減期を調節する働きをしており、時にはそれらがタンパク質の構造に関与していることは詳細に立証されている。オリゴ糖は、抗原変異性（例えば、血液グループ）およびNeisseria meningitidisによって引起されるある種の細菌感染症に本質的役割を果たしている。
【０００３】
オリゴ糖は通常は天然供給源から出発する精製によって低収率で得られるので、オリゴ糖の合成は、基礎研究または任意の他の応用の可能性について必要とされる詳細に特性決定されたオリゴ糖を十分な量で供給する上で炭水化物化学の主要な問題となっている(Boons et al., 1996)。
【０００４】
生物学的に重要な複雑なオリゴ糖は、化学的、酵素的または微生物学的に合成する
ことができる。
最近２０年間におけるオリゴ糖の合成についての新規な化学的方法の発達にも拘わらず、オリゴ糖の化学合成は多くの選択的保護および脱保護段階、グリコシド結合が不安定であり、位置特異的カップリングを得ることが困難であり、生産収率が低いため、極めて困難なままである。段階数はオリゴ糖の大きさと共に増加するので、三糖類より長いオリゴ糖を多量に調製することは簡単な問題ではない。ペプチド合成または核酸合成の経験とは逆に、伝統的な合成有機化学では現時点では、簡単な式のオリゴ糖であっても高品質で多量に合成することはできない。
【０００５】
従って、酵素的方法は穏和な条件下でヒドロキシル基の保護の段階なしで位置選択的合成ができるので、この方法が一層一般的になってきている。酵素法の発達は、オリゴ糖の合成経路に関与する酵素をコードする多数の遺伝子のクローニングおよび機能同定によって可能となった。従って、様々な種類の酵素をオリゴ糖のイン・ビトロ合成に用いることができる。グリコシル−ヒドロシラーゼ(glycosyl-hydrosylases)およびグリコシル−ホスホリラーゼの生理学的機能は、オリゴ糖の脱重合であるが、それらは反応平衡および反応速度を制御することによってオリゴ糖の合成にイン・ビトロで用いることもできる。これらの反応についての酵素の基質は、容易に入手することができるが、これらの酵素反応は余り融通の利くものではない。開発された別の方法では、Leloirの生化学経路のグリコシルトランスフェラーゼが用いられており、前駆体およびドナー基質にも強力な位置特異性を示すが、これらのグリコシルトランスフェラーゼはグリコシル−ヒドロラーゼほど容易に入手することはできない。最近になり、組換えＤＮＡ法により、それらのある数をクローニングして製造することができるようになった。しかしながら、この酵素法の主要な限界は、これらの酵素によって用いられる糖ドナーである糖−ヌクレオチドの価格が極めて高いことにある。
【０００６】
組換えオリゴ糖をイン・ビボで産生させる微生物学的経路は、細菌が同時に酵素の生合成、糖−ヌクレオチドの再生、および最終的にオリゴ糖の産生に関与しているので、極めて魅力ある合成経路である。
【０００７】
組換え細菌を用いるオリゴ糖の微生物学的合成の最初の報告は、ある程度まではノジュレーション因子(nodulation factors)の生合成経路の解明の研究と考えることができ、これらの因子は根粒バクテリアによって分泌されるシグナル分子であり、ノジュレーション工程においてマメ科植物によって認識される。ノジュレーション因子は、様々な置換基を有するキト−オリゴ糖からなっている。ノジュレーション因子の生合成に関与するnod遺伝子の機能同定は、一部にはこれらの各種nod遺伝子を発現するEscherichia coliの菌株でイン・ビボで形成されるオリゴ糖を同定することによって行われた (Geremia et al., 1994; Kamst et al., 1995; Spaink et al., 1994; Mergaert et al., 1995)。しかしながら、オリゴ糖自体の製造はこれらの研究の目的ではなく、これらの生成物はごく微量にしか合成されず、放射性前駆体を用いることによってしか同定されなかった。
【０００８】
一方、本発明者らの実験室では、近年(Samain et al., 1997)、nodC（キト−オリゴ糖シンターゼ）遺伝子を含むEscherichia coli株を高細胞密度で培養することによって、「組換え」キト−オリゴ糖を多量に、２g/lを上回る量で産生できた。
【０００９】
しかしながら、このオリゴ糖の微生物学的合成の手法は、前駆体なしで機能するnodC（キト−オリゴ糖シンターゼ）の特異な性質によりキト−オリゴ糖の産生だけに限定されており、具体的には、他の酵素は特異前駆体を糖分解し、それらの活性は細胞中にこの前駆体が存在することによって変化するのである。従って、この前駆体の問題は、この方法の発展および他の種類のオリゴ糖の産生への敷衍を妨げる主要な障害である。
【００１０】
従って、本発明の一つの主題は、  上記細胞によってインターナリゼーションされた少なくとも一種類の外来前駆体であって、目的とするオリゴ糖の生合成経路に関与している前駆体から出発する遺伝子修飾した細胞による上記オリゴ糖の製造方法であって、(i)上記外来前駆体、または上記前駆体から上記オリゴ糖の合成に必要な上記外来前駆体から上記オリゴ糖の生合成経路における中間体の一つを修飾することができる酵素をコードする少なくとも一種類の組換え遺伝子と、該遺伝子を上記細胞で発現するための成分をも含んでなり、上記オリゴ糖、上記前駆体および上記中間体を分解しがちな酵素活性を欠いている細胞を得て、(ii)少なくとも一種類の上記外来前駆体の存在下にて、上記細胞による上記外来前駆体の受動および／または能動輸送の機構に従ってインターナリゼーションおよび上記細胞による上記オリゴ糖の産生を行うことができる条件下で、上記細胞を培養する段階を含んでなる、上記方法である。
【００１１】
特定の態様によれば、本発明は、上記細胞が上記オリゴ糖の生合成経路に関与している外来前駆体を修飾することができる酵素であって、上記方法で用いた酵素と同一であるかまたは異なっている該酵素をコードする少なくとも一種類の遺伝子と、該遺伝子を上記細胞で発現するための成分をもをも含んでなり、上記細胞が上記前駆体を分解しがちな酵素活性を欠いている、上記方法に関する。
【００１２】
「オリゴ糖」という用語は、様々な数の残基、結合およびサブユニットを有する線状または分岐状ポリマーを表すためのものであり、残基の数は１より大きい。オリゴ糖は、加水分解によって数個の単糖分子に転換される炭水化物であり、単糖類は、加水分解によって更に単純な物質に転換することができない糖である。単糖類は、炭化水素を基剤とする鎖における炭素原子の数によってトリオース、テトロース、ペントース、ヘキソースおよびヘプトースに再分類され、それらの分子におけるアルデヒド官能基またはケトン官能基の存在によってアルドースおよびケトースにも再分類される。極めて頻繁に見られる単糖類としては、マンノース、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびＮ−アセチルガラクトサミンが挙げられる。立体異性オリゴ糖の鎖の数は、炭化水素を基剤とする鎖における不整炭素の数が大きいため、極めて大きい。
【００１３】
「外来前駆体」という表現は、上記細胞によってインターナリゼーションされた本発明によるオリゴ糖の生合成経路に関与する化合物を表す。「内因前駆体」という表現は、上記細胞中に天然に存在する本発明によるオリゴ糖の生合成経路に関与している化合物を表すためのものである。
【００１４】
「遺伝子修飾した細胞」という表現は、ＤＮＡ配列の少なくとも一つの変更をそのゲノムに導入して、この細胞に特定の表現型を与えた微生物を表すためのものである。このような変更は、例えば細胞に本発明による化合物を分解しないまたは修飾しない、またはＤＮＡ再編成頻度を減少しない能力を与えることができる。
【００１５】
本発明による方法は、上記細胞は細菌および酵母から選択される細胞であることを特徴とする。本発明の好ましい態様によれば、細菌はEscherichia coli、Bacillus subtilis、Campylobacter pylori、Helicobacter pylori、Agrobacterium tumefaciens、Staphylococcus aureus、Thermophilus aquaticus、Azorhizobium caulinodans、Rhizobium leguminosarum、Neisseria gonorrhoeae、およびNeisseria meningitisからなる群から選択される。本発明の好ましい態様によれば、細菌はEscherichia coliである。本発明のもう一つの態様によれば、細胞は、酵母であり、好ましくはSaccharomyces cerevsae、Saccharomyces pombe、またはCandida albicansである。本発明による細胞は、上記オリゴ糖、上記前駆体、または上記代謝中間体を分解しがちな酵素活性を欠いている。
【００１６】
本発明による酵素をコードする核酸配列は、上記細胞に天然に存在しているか、または当業者に知られている組換えＤＮＡ法によって上記細胞に導入される。本発明の説明において、「核酸」という用語は、二本鎖または一本鎖のＤＮＡ断片、または上記ＤＮＡの転写生成物、および／またはＲＮＡ断片を表すためのものである。好ましい態様によれば、組換えＤＮＡ法によって上記細胞に導入され、目的とするオリゴ糖の生合成経路に関与している酵素をコードする核酸配列はヘテロロガスである。「ヘテロロガス核酸配列」という表現は、本発明による細胞に天然には存在しない核酸配列を表すためのものである。本発明によるヘテロロガス核酸配列は、任意の動物または植物の真核または原核細胞型から得ることができ、またウイルスから得ることもできる。
【００１７】
ヘテロロガス核酸配列が得られる原核細胞としては、細菌、特にEscherichia coli、Bacillus subtilis、Campylobacter pylori、Helicobacter pylori、Agrobacterium tumefaciens、Staphylococcus aureus、Thermophilus aquaticus、Azorhizobium caulinodans、Rhizobium leguminosarum、Rhizobium meliloti、Neisseria gonorrhoeae、およびNeisseria meningitisが挙げられる。
【００１８】
ヘテロロガス核酸配列が含まれる単細胞性の真核細胞としては、Saccharomyces cerevisae、Saccharomyces pombe、およびCandida albicansが挙げられる。
【００１９】
好ましい態様によれば、ヘテロロガス核酸配列は植物または動物の真核細胞に含まれている。更に一層好ましい態様によれば、ヘテロロガス核酸配列は哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞に含まれている。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明による細胞は細菌Escherichia coliであり、最近に導入されて本発明による酵素をコードする核酸配列は好ましくは上記の群から選択される細菌に含まれている。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明による酵素をコードする核酸配列は発現ベクターの形態で上記細胞に導入される。このベクターは、プロモーター、翻訳開始および停止シグナル、および転写の調節に適した領域をも含んでなるものでなければならない。このベクターは、連続する世代にわたって細胞中に安定に保持することができなければならず、且つ場合によっては翻訳された酵素の分泌を指定する特定のシグナルを含むことができる。これらの様々な制御シグナルは、用いられる宿主細胞に応じて選択される。このため、核酸配列を選択された宿主内の自律複製ベクターまたは選択された宿主のゲノムに組込まれる組込みベクターに挿入することができる。これらのベクターは、当業者が普通に用いる方法によって調製され、これにより生じるクローンを、例えば熱ショックまたは電気穿孔のような標準的方法によって適当な宿主細胞に導入することができる。
【００２２】
本発明は、本発明による酵素をコードする少なくとも一つの単離された組換え核酸、または上記で定義した少なくとも一種類の組換えベクターによって形質転換することを特徴とする上記細胞にも関する。
【００２３】
本発明による方法は、上記酵素によって行われた修飾がグリコシル化、硫酸化、アセチル化、リン酸化、スクシニル化、メチル化、およびエノールピルベート基の付加、シアリル化、およびフコシル化から選択される。更に詳細には、本発明による方法は、上記酵素がグリコシル化を行うことができる酵素であり、グリコシルトランスフェラーゼ, グリコシル−ヒドロラーゼ、およびグリコシル−ホスホリラーゼから選択される。好ましい態様によれば、グリコシル化を行うことができる酵素はグリコシルトランスフェラーゼである。好ましい態様によれば、本発明によるグリコシルトランスフェラーゼは、β−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−グルクロノシル−トランスフェラーゼ、β−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼ、α−２，６−シアリル−トランスフェラーゼ、α−２，８−シアリル−トランスフェラーゼ、α−１，３−フコシル−トランスフェラーゼ、α−１，４−フコシル−トランスフェラーゼ、およびα−１，２−フコシル−トランスフェラーゼから選択される。本発明に用いられるグリコシルトランスフェラーゼは、特異的アクセプター分子に特異的な活性化糖単位を立体特異的に接合させることができる。活性化した糖は、一般にウリジン二リン酸、グアノシン二リン酸、およびシチジン二リン酸糖誘導体からなる。従って、活性化した糖類は、ＵＤＰ−糖、ＧＤＰ−糖またはＣＭＰ−糖であることができる。
【００２４】
本発明による方法で用いられるグリコシルトランスフェラーゼは以前に報告されており、例えば国際特許出願WＯ９６／１００８６号明細書には、標準的なオリゴ糖の合成が記載されており、第一段階で、様々なグリコシルトランスフェラーゼがNeisseria gonorrhoeaeのlgtA、lgtBおよびlgtC遺伝子を含む組換え細菌で産生され、このようにして産生された組換え酵素を精製した後、オリゴ糖が必要な前駆体および糖−ヌクレオチドの存在下でイン・ビトロで合成される。
【００２５】
本発明のある種の態様によれば、アセチル化を行うことができる酵素は細菌Azorhizobium caulinodansのNodL遺伝子によってコードされる。もう一つの態様によれば、硫酸化を行うことができる酵素は細菌Rhizobium melilotiのNodH遺伝子によってコードされる。
【００２６】
本発明による方法は、上記細胞培養が好ましくは炭素を基剤とする基質で行われ、本発明の特定の態様によれば、上記の炭素を基剤とする基質はグリセロールおよびグルコースから選択される。他の炭素を基剤とする基質を用いることもでき、マルトース、澱粉、セルロース、ペクチンおよびキチンが挙げられる。もう一つの態様によれば、細胞培養は、アミノ酸および／またはタンパク質および／または脂質を含んでなる基質で行われる。
【００２７】
本発明による方法は、上記培養段階が高細胞密度の培養物を産生できる条件下で行われことを特徴としており、この培養段階は上記炭素を基剤とする基質によって確保される指数細胞増殖の第一相、連続的に添加される上記炭素を基剤とする基質によって制限される細胞増殖の第二相、および最後に段階b)で加えた基質の量より少ない量の上記基質を培養物に連続的に添加することによって細胞増殖を減速し、高細胞密度培養物に産生したオリゴ糖の含量を増殖させる第三相を含んでなる。
【００２８】
本発明による方法は、上記相c)中に細胞培養物に連続的に添加した基質の量が、上記相b)中に連続的に添加した基質の量より少なくとも３０％少なく、優先的には５０％、好ましくは６０％少ないことを特徴とする。本発明による方法は、上記外来前駆体を相b)中に添加することをも特徴とする。
【００２９】
本発明の一態様によれば、この方法は、上記外来前駆体が炭水化物性であり、好ましくはオリゴ糖性であることを特徴とする。
【００３０】
本発明による方法の新規性および入手可能性は、細胞の一体性を破壊しないまたはその重大な機能を攻撃しない外来前駆体のインターナリゼーションの二つの様式の使用に基づいている。これは、特に成長およびエネルギー代謝を妨げる有機溶媒を用いる膜透過性化(membrane permeabilization)の標準的手法を除外する。外来前駆体をインターナリゼーションするための二つの可能な様式は、受動または能動輸送機構を用いる。
【００３１】
本発明は、第一に上記外来前駆体が受動輸送機構によってインターナリゼーションされることを特徴とする方法に関する。「受動輸送によるインターナリゼーション」という表現は、血漿膜を横切って外来前駆体の幾らかが受動拡散することを表そうとするものであり、分子流は最高濃度のゾーンから最低濃度のゾーンへ向いており、最終的に平衡の状態となるようにする。受動輸送によるインターナリゼーションは、膜を介して受動的に拡散するのに十分小さく且つ十分疎水性である外来前駆体を用いることにある。アノマー位置がアルキル置換基でブロックされている単糖類前駆体は、この方法でインターナリゼーションすることができる前駆体の一例である。従って、本発明は、上記外来前駆体がアノマー炭素がアルキル基に結合し、好ましくは、上記アルキル基はアリル基である単糖類であることを特徴とする方法に関する。従って、本発明の目的の一つは、アリル基のような官能化可能な基(functionalizable group)を含むことによって、グリコ接合体（ネオ糖タンパク質またはネオ糖脂質）、またはグリコポリマーの化学合成の前駆体として用いることができるオリゴ糖の製造法を提供することである。この理由は、アリル基の二重結合はオゾン分解によって開いてアルデヒドを形成し、オリゴ糖を還元的アミノ化によってタンパク質に接合させることができることである (Roy et al., 1997)。もう一つの経路は、アリル二重結合にシステアミンを付加して、例えばタンパク質のカルボン酸基と反応することができるアミン末端基を形成することである。
【００３２】
特定の態様によれば、本発明による方法は、(β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮａｃ−１→Ｏ−アリル)の製造に関し、この方法は上記細胞が LacZ- 遺伝子型の細菌であり、上記酵素がβ−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼであり、上記基質がグリセロールであり、上記前駆体がアリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド (β−Ｄ−ＧｌｃＮａｃ−１→Ｏ−アリル)であることを特徴とする。最後に、もう一つの特定の態様によれば、本発明による方法は、上記の(β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮａｃ−１→Ｏ−アリル) のアリル基の二重結合が、付加、酸化、またはオゾン分解によって化学的に修飾されていることを特徴とする。
【００３３】
本発明は、上記前駆体を能動輸送機構によってインターナリゼーションすることを特徴とする方法にも関する。「能動輸送によるインターナリゼーション」という表現は、細胞、好ましくは細菌がある種の外来物質または前駆体をその細胞質に選択的に収容して濃縮する能力を表そうとするものである。この輸送は、透過酵素としていられ、酵素として作用するタンパク質性の輸送体によって行われ、透過酵素は誘導触媒、すなわち基質または前駆体の存在下で合成される触媒である。本発明の特定の態様によれば、ラクトースおよびβ−ガラクトシドは、ガラクトシド透過酵素として知られるラクトース透過酵素によって細菌 Escherichia coliの細胞質に能動輸送される前駆体を構成する。従って、本発明は、上記前駆体の能動輸送をラクトース透過酵素によって行うことを特徴とする本発明による方法に関する。ラクトース透過酵素の特異性はかなり広く、ラクトース以外の分子を輸送することができる。
【００３４】
この理由は、これが様々な天然または合成のβ−ガラクトシド、α−ガラクトシド、およびスクロースを輸送することができるからである。従って、本発明の目的の一つは、好ましい態様によれば、上記前駆体がラクトースであり、これが極めて多数の生物活性オリゴ糖に対して塩基残基を構成することを特徴とする方法を提供することである。上記前駆体が、(i) 天然または合成のβ−ガラクトシド、好ましくは４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−フルクトフラノース (ラクチュロース)、３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−アラビノースおよびアリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド由来のもの、(ii) α−ガラクトシド、好ましくはメリビオースおよびラフィノース、およびアリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド, (iii) スクロースからなる群から選択されることを特徴とする方法を提供することも本発明の範囲内にある。
【００３５】
ラクトース透過酵素の特異性は、突然変異によって調節し、マルトースおよびセロビオースのような他の化合物を輸送することもできる。従って、これら総ての化合物をオリゴ糖の合成の前駆体として用いることができる。生成物を次に官能性化するための化学的に反応性基を含むラクトース類似体を前駆体として用いることも、本発明の範囲内にあり、好ましくは、これらの類似体の一つは、アリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドである。組換えＤＮＡ法によって調節することができる他の透過酵素を用いて、様々な種類の前駆体をインターナリゼーションすることも、本発明の範囲内にある。
【００３６】
β−ガラクトシドは、通常はLacZ 遺伝子によってコードされるβ−ガラクトシダーゼによって細菌の細胞質で加水分解される。この問題を解決するため、用いる前駆体がラクトースおよび／またはβ-ガラクトシドであるときには、β−ガラクトシダーゼ活性を欠いている lacZ- 細菌突然変異体を用いる。従って、本発明の目的の一つは、上記細胞が上記前駆体または上記代謝中間体を分解しがちな酵素活性を欠いていることを特徴とする本発明による方法を提供することでもある。
【００３７】
特定の態様によれば、本発明は、上記前駆体がシアリル酸であることを特徴とする上記方法に関する。このばあいには、上記前駆体の能動輸送は NanT 透過酵素によって行う。
【００３８】
もう一つの特定の態様によれば、本発明は、上記前駆体がシアリル酸およびラクトースであることを特徴とする上記方法に関する。この場合には、上記前駆体の能動輸送はラクトース透過酵素と NanT 透過酵素によって行う。
【００３９】
本発明よる方法では、上記細胞は、上記の（複数の）前駆体を分解しがちな酵素活性を欠いていることがある。
【００４０】
好ましい態様によれば、この方法は、上記細胞が、LacZ- および／または NanA- から選択される遺伝子型を有することを特徴とする。
【００４１】
本発明のもう一つの態様によれば、この方法は、上記培地にインデューサーを添加して、上記細胞に上記酵素および／または上記能動輸送に関与するタンパク質の発現を誘導することをも含んでなることを特徴とし、好ましい態様によれば、本発明による方法は、上記インデューサーがイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、上記タンパク質がラクトース透過酵素であることを特徴とする。
【００４２】
本発明により、初めて複雑なオリゴ糖を１g/lのオーダーの収率で製造することができる。その大きさによっては、オリゴ糖は細菌細胞質に蓄積され、または培地に分泌される。従って、好ましい態様によれば、本発明による方法を用いて三糖類である４−Ｏ−[３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル]−Ｄ−グルコピラノース, (β−Ｄ−ＧｌｃＮａｃ−［１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−Ｄ−Ｇｌｃ)を製造するのであり、これは、上記細胞が LacZ-, LacY+ 遺伝子型の細菌であり、上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼであり、上記基質がグリセロールであり、上記インデューサーがイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、上記前駆体がラクトースであることを特徴とする。
【００４３】
第二の好ましい態様によれば、本発明による方法を用いて、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースおよびポリラクトースアミンを製造するのであり、これは、上記細胞が LacZ-, LacY+ 遺伝子型の細菌であり、上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼであり、上記基質がグルコースであり、上記インデューサーがイソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、上記前駆体がラクトースであることを特徴とする。
【００４４】
第三の好ましい態様によれば、本発明による方法を用いて、アリル３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド, (β−Ｄ−ＧｌｃＮａｃ−［１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−１→Ｏ−アリル)を製造するのであり、これは、上記細胞が LacZ-, LacY+ 遺伝子型の細菌であり、上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼであり、上記基質がグリセロールであり、上記インデューサーがイソプロピル＝β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、上記前駆体がアリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであることを特徴とする。
【００４５】
第四の好ましい態様によれば、本発明による方法を用いて、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースの類似体、およびポリラクトースアミンであって、グルコース残基がアリル基で置換されているものを製造するのであり、これは、上記細胞が LacZ-, LacY+ 遺伝子型の細菌であり、上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼであり、上記基質がグルコースであり、上記インデューサーがイソプロピル＝β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、上記前駆体がアリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであることを特徴とする。
【００４６】
第五の好ましい態様によれば、本発明による方法を用いて、アリル−β−Ｄ−ラクトースアミン (β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮａｃ−１→Ｏ−アリル)を製造するのであり、これは、上記細胞が LacZ-, LacY+ 遺伝子型の細菌であり、上記酵素がβ−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼであり、上記基質がグリセロールであり、上記前駆体がアリル−Ｎ−アセチル β−Ｄ−グルコサミニド (β−Ｄ−ＧｌｃＮａｃ−［１→Ｏ−アリル])であることを特徴とする。
【００４７】
本発明は、ラクトースのグリコシル化によって得られる様々なオリゴ糖を多数製造することができる方法にも関する。具体的には、β−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼ and β−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼをそれぞれコードする遺伝子 lgtA and lgtB の他に、ラクトースを前駆体として用いる細菌性グリコシルトランスフェラーゼの幾つかの遺伝子が最近になってクローニングされている。これらは、 lgtC（β−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ）および Lst (α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼ）である(Gilbert et al., 1997)。これらの遺伝子を本発明による方法で用いることによって、グロボトリオース（Pk 血液抗原）およびシアリル−ラクトースのような分子を生成することができる。更に、本発明による方法によって、 lgtA およびlgtB 遺伝子を Helicobacter pylori由来のα−１，３−フコシル−トランスフェラーゼに対する遺伝子と同時発現することにより (Martin et al., 1997)、Lewisx 五糖類を得ることができる。Lst (α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼ) 遺伝子を添加することにより、シアリルLewisx 六糖類が得られる。
【００４８】
本発明による方法によって、ラクトース以外の外来前駆体のグリコシル化によって得られ、ラクトース透過酵素または他の透過酵素によって輸送される様々なオリゴ糖を多数得ることもできる。
【００４９】
本発明による方法によって、前駆体のイン・ビボ修飾（硫酸化、アセチル化、リン酸化、スクシニル化、メチル化、エノールピルベート基の付加）によって得られる様々なオリゴ糖を多数得ることができる。ある種のオリゴ糖の合成には、外来前駆体の修飾の他に、内在性前駆体の修飾が必要なことがある。従って、K12 Escherichia coli細菌に内在性前駆体の代謝に関与する酵素の遺伝子を導入し、例えばＣＭＰ−シアリル酸、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、またはＧＤＰ−フコースのような通常はこの細菌株によっては産生されないある種の糖−ヌクレオチドを生成させ、目的とするオリゴ糖の合成を行うことが考えられる。例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは、エピメラーゼ遺伝子を本発明による細胞に導入するときには、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから製造することができる。
【００５０】
Contrary to the enzymatic method for the イン・ビトロ合成 of オリゴ糖, which requires the use of very expensive molecules such as ＡＴＰ、アセチル−ＣｏＡ、ＰＡＰＳ（アデノシン＝３′−ホスフェート５′−ホスホスルフェート）、またはホスホ−エノールピルベートのような非常に高価な分子を用いる必要があるオリゴ糖のイン・ビトロ合成の酵素法とは異なり、本発明の利点の一つは、これらの分子が天然では細胞中にリサイクルされるので、オリゴ糖の製造コストを減少させることができることにある。
【００５１】
本発明のもう一つの主題は、３′−シアリルラクトース (α−ＮｅｕＡｃ−［２→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ）または６′−シアリルラクトース (α−ＮｅｕＡｃ−［２→６］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ)の製造のための上記方法であって、
上記細胞が LacZ-、LacY+、NanA- または NanT+ 遺伝子型の細菌であり、
上記酵素がＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ−シンターゼおよびα−２，３−シアリル−トランスフェラーゼまたはα−２，６−シアリル−トランスフェラーゼであり、
・上記基質がグリセロールであり、
・上記インデューサーがイソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、
・上記前駆体がラクトースおよびシアリル酸である
ことを特徴とする、方法に関する。
【００５２】
上記第二の態様を完成する第六の好ましい態様によれば、本発明による方法を用いて、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースのシアリル誘導体およびポリラクトースアミン（ラクト−Ｎ−ネオ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオース、ラクト−Ｎ−ネオ−デカオース）を製造するのであり、これは、, characterized in that it also comprises a α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素をも含んでなり、上記細胞が NanA-、NanT+遺伝子型をも有し、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ−シンターゼ遺伝子を発現し、上記アクセプターがラクトースおよびシアリル酸であることを特徴とする。
【００５３】
本発明のもう一つの主題は、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース、β−Ｄ−Ｇａｌ［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−Ｇｌｃ、β−Ｄ−Ｇａｌ［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−Ｇｌｃ、β−Ｄ−Ｇａｌ［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−Ｇｌｃを製造するための上記方法であって、
上記細胞が LacZ-, LacY+, WcaJ-遺伝子型の細菌であり、rcsAを過剰発現し、
上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、およびα−１，３−フコシル−トランスフェラーゼであり、
・上記基質がグルコースであり、
・上記インデューサーがイソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、
上記前駆体がラクトースである
ことを特徴とする、方法に関する。
【００５４】
第七の好ましい態様によれば、本発明による方法を用いて、３′−フコシルラクトース（β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]−Ｄ−Ｇｌｃ）または２′−フコシルラクトース（β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→２］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]−Ｄ−Ｇｌｃ）を製造するのであり、これは、α−１，３−フコシル−トランスフェラーゼまたはα−１，２−フコシル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素を含んでなり、細胞がwcaj- lacZ-遺伝子型を有し且つrcsA遺伝子を過剰発現し、上記前駆体がラクトースであることを特徴とする。
【００５５】
第八の好ましい態様によれば、本発明による方法を用いて、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースのフコシル誘導体およびポリラクトースアミン（ラクト−Ｎ−ネオ−ヘキサオース, ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオース, ラクト−Ｎ−ネオ−デカオース）を製造するのであり、これは、 characterized in that it also comprises a α−１，２−フコシル−トランスフェラーゼおよびα−１，３−フコシル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素をも含んでなり、上記細胞がWcaJ-遺伝子型をも有し且つRcsA遺伝子を過剰発現し、上記アクセプターがラクトースであることを特徴とする。
【００５６】
第九の好ましい態様によれば、本発明による方法を用いて、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオ−デカオースのシアリルおよびフコシル誘導体を製造するのであり、これは、α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素、およびα−１，２−フコシル−トランスフェラーゼおよびα−１，３−フコシル−トランスフェラーゼから選択される上記酵素をも含んでなり、上記細胞はまた NanA-, NanT+, WcaJ-遺伝子型を有し且つ RcsA 遺伝子およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ−シンターゼに対する遺伝子を過剰発現し、上記アクセプターはラクトースおよびシアリル酸であることを特徴とする。
【００５７】
上記態様１〜９の方法は、グルコース残基がアリル基で置換され、上記前駆体がラクトースよりはむしろアリル−β−Ｄ−ガラクトシドであるオリゴ糖類似体を製造するために行うことができる。
【００５８】
本発明のもう一つの目的は、放射性同位体で標識しまたは濃縮したオリゴ糖の製造方法を提供することであって、このようなオリゴ糖は基礎生物学または立体配座分析研究にとって極めて貴重である。従って、本発明は、少なくとも一種類の放射性同位体で標識したオリゴ糖の製造方法であって、上記細胞を上記放射性同位体で標識しおよび／または上記放射性同位体で標識した上記前駆体の存在下にて培養することを特徴とする方法に関する。放射性同位体は、好ましくは14C、13C、3H、35S、32P、33Pからなる群から選択される。
【００５９】
本発明は、本発明による方法によって得ることができるオリゴ糖にも関する。
【００６０】
特定の態様によれば、本発明は、上記の方法によって得ることができるグリコ接合体またはグリコポリマーの化学合成に用いることができる活性化オリゴ糖であって、アリル基の二重結合が付加、酸化またはオゾン分解によって化学的に修飾されていることを特徴とする上記オリゴ糖に関する。
【００６１】
本発明によるオリゴ糖は、広汎な治療および診断用途に用いられ、例えば、細胞付着を伴う疾患の宿主の治療において細胞表面レセプターをブロックする薬剤として用いることができ、または栄養補助食品、抗菌薬、抗転移薬、および抗炎症薬として用いることができる。従って、本発明は、医薬生成物としての、特に生物膜の付着を選択的に防止することを目的とする医薬生成物としてのオリゴ糖に関する。本発明によるオリゴ糖は、癌、炎症、心疾患、糖尿病、細菌感染症、ウイルス感染症および神経疾患の治療を目的とする医薬生成物として、および移植組織を目的とする医薬生成物として用いることもできる。本発明は、本発明によるオリゴ糖と薬学上許容可能なビヒクルを含んでなる医薬組成物にも関する。
【００６２】
最後に、本発明は、特に植物の生長および防御を目的とする本発明によるオリゴ糖の農業および栽培学的使用にも関する。具体的には、オリゴ糖はリゾビウム／マメ科植物の共生において支配的な役割を果たしている。実際に、真菌または植物の糖タンパク質または壁の加水分解によって得られるある種のオリゴ糖は、植物ホルモンとして、または植物の防御反応の誘発剤として作用することができる。
【００６３】
生物学的に重要な複雑なオリゴ糖をキログラムのオーダーでの製造を初めて可能にしたので、本発明による方法の産業上の利点は明らかである。興行的規模での合成を想定する生物学的に重要なオリゴ糖は総て、現在のところはmgの規模でしか入手できず、且つ極端に高価格であるが（百万FFr/gまで）、本発明の微生物学的経路によって産生されるこれらの化合物の原価は極めて低価格である。
【００６４】
本発明の特徴および利点を、下記の例および図を読むことにより一層明瞭に明らかになるであろう。図の要点を、下記に示す。
【００６５】
例１  材料および方法
1.1.  プラスミドおよび細菌株の起源
Escherichia coli K12 の菌株 JM 107 および JM 109 (Yannisch-Perron et al., 1984) を、記載した総てのオリゴ糖製造例の宿主細胞として用いた。菌株は、DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)から得た。菌株 JM 109 の遺伝子型は、下記の通りである：F traD36 laclq Δ(lacZ)M15 proA+B+/e14-(McrA-) Δ(lac-proAB) supE44 recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 relA1。菌株 JM 107 の遺伝子型は、recA1 遺伝子が不活性化されないことを除き、菌株 JM 109 の遺伝子型と同一である。
【００６６】
Neisseria meningitis MC58の遺伝子lgtAおよびlgtBは、Dr W. Wakarchuk (Institute for Biological Sciences, National Research Council of Canada, 100 Sussex Drive, Ottawa, Ontario, K1A OR6, Canada) によって、lgtA遺伝子（本明細書では、pCWlgtAと表す）を含むものと、他方のlgtB遺伝子を含むもの（本明細書では、pCWlgtBと表す）との二種類のプラスミドpCWの形態で供給された。これらの二種ルウの遺伝子の配列は、GenBankデーターバンクからU25839の番号で入手可能である。プラスミドpLitmus28は、New Englands Biolabs社から購入した。プラスミドpBBR1MCSは、Dr M. Kovach (Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University, Shreveport, LA 71130-3932, USA)によって供給された。
【００６７】
Neisseria meningitis MC58のＣＭＰ−シアリル酸シンターゼおよびα−２，３−シアリル−トランスフェラーゼに対する遺伝子は、Dr M. Gilbert (Institute for Biological Sciences, National Research Council of Canada, 100 Sussex Drive, Ottawa, Ontario, K1A OR6, Canada)によって二種類のプラスミドNSY-01およびNST-01の形態で供給された。プラスミドNSY-01は、ＣＭＰ−シアリル酸シンターゼ (Gilbert et al., 1997)に対する遺伝子(GenBank U60146)を含むプラスミドpT7-7の誘導体である。プラスミドNST-01は、α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼ (Gilbert et al., 1996)に対する遺伝子(GenBank No. U60660)を含むプラスミドpBluescript Sk-の誘導体である。
【００６８】
Helicobacter pyloriのα−１，３−フコシル−トランスフェラーゼに対する遺伝子fucTは、pET-21a由来のプラスミドpHP0651の形態でDr S. Martin (Glaxo Wellcome Research and Development, Gunnels Wood Road, Stevenage, Hertfordshire, SG1 2NY, UK)によって供給された。配列は、GenBankから入手可能である(AE000578, 遺伝子HP0651)。
【００６９】
1.2.  サブクローニング
Sambrook et al. (1989)によって記載されている分子生物学の標準的手法を用いた。
【００７０】
プラスミドpBBlgtBの構築: lgtB遺伝子を含む０．８３５kbのＤＮＡ断片を、プラスミドpCWlgtBをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで消化することによって得た。この断片を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで予備消化したベクターpLitmus28にサブクローニングし、プラスミドpLitlgtBを形成した。lgtB遺伝子を含む０．９kb断片をプラスミドpLitlgtBからＸｈｏＩおよびＨｉｎｄIIIで消化することによって切り取り、 ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄIIIで予備消化したプラスミドpBBR1MCSにサブクローニングし、プラスミドpBBlgtBを形成した。
【００７１】
プラスミドpBBnsyの構築:  ＣＭＰ−シアリル酸シンターゼに対する遺伝子を含む断片を、プラスミドNSY-01からＸｂａＩで消化することによって切り取り、ＸｂａＩで予備消化したプラスミドpBBR1MCSにサブクローニングして、プラスミドpBBnsyを形成した。
【００７２】
プラスミドpBBLntの構築:  構築物pCWlgtA (Gilbert et al.) に含まれるlgtA遺伝子を、いずれもＨｉｎｄIII部位を含むプライマーCTTTAAGCTTCCGGCTCGTATAA（センス、上流プロモーター）およびGACAGCTTATCATCGATAAGCTT （アンチセンス、lgtA末端）を用いてプラスミドのUV5 tactacプロモーターと同時にＰＣＲによって増幅した。次に、１．３kbの増幅した断片を、ベクターpBBlgtBのＨｉｎｄIII部位にサブクローニングした。
【００７３】
プラスミドpBBLntRcsAの構築:
rcsA遺伝子 (Stout et al., 1991) を、最初にプライマーAGGGTACCCATGTTGTTCCGTTTAG (ＫｐｎＩ部位、rcsA左) およびAATCTAGAGTAATCTTATTCAGCCTG (ＸｂａＩ部位、rcsA右)を用いてJM 109由来のゲノムＤＮＡから出発してＰＣＲによって増幅した後、ベクターpBBR1-MCSのＫｎｐＩ-ＸｂａＩ部位にクローニングした。次に、ベクターpBBR1-MCS-rcsAをＫｐｎＩで消化することによって遺伝子の上流を開いて、平滑にし(Amershamキット)、ＸｂａＩで消化し、構築物pBBLntのＳｍａＩ-ＸｂａＩ部位に挿入し、lgtB-UV5tactac-lgtA組立体の下流にクローニングし、rcsAをUV5 tactacプロモーターの制御下に置いた。
【００７４】
1.3.  培養条件
通常の培養および接種物の調製は、ＬＢ培地で行った(Sambrook et al., 1989)。高細胞密度培養物は、下記の組成を有する培地を１リットルの初期容積で含む２リットル発酵槽で調製した：グリセロール (17.5 g.l-1)またはグルコース (15 g.l-1)、, NH4H2PO4 (7 g.l-1)、KH2PO4 (7 g.l-1)、MgSO4 7H2O (1 g.l-1)、チアミンHCl (4.5 mg.l-1)、微量元素の溶液(7.5 ml.l-1)、クエン酸 (0.5 g.l-1)、KOH (2 g.l-1)。MgSO4 は別個にオートクレーブ処理し、チアミンは濾過滅菌する。微量元素の溶液は、下記のものを含む: ニトリロトリアセテート (70 mM, pH 6.5)、クエン酸第二鉄 (7.5 g.l-1)、MnCl2 4H2O (1.3 g.l-1)、CoCl2 6H2O (0.21 g.l-1)、CuCl2 2H2O (0.13 g.l-1)、H3BO3 (0.25 g.l-1)、ZnSO4 7H2O (1.2 g.l-1)、Na2MoO4 2H2O (0.15 g.l-1)。抗生物質アンピシリン(50 mg.l-1)およびクロラムフェニコール(25 mg.l-1)を添加して、各種プラスミドの存在を確保する。供給溶液は、グリセロール (500 g.l-1)またはグルコース (400 g.l-1)、MgSO4 7H2O (12 g.l-1)、および微量元素の溶液(25 ml.l-1)を含む。
【００７５】
高細胞密度培養物を、２％で接種する。培養中に、溶存酸素含量を空気の流速を手動で制御し、攪拌速度を自動的に調節することによって２０％飽和度に保持する。ｐＨは、アンモニア水(15% w/v)を加えることによって自動的に６．８に保持する。温度は、菌株JM 109(pCWlgtA)については３４℃に保持し、菌株JM 109(pCWlgtA, pBBlgtB)については２８℃に保持する。高密度培養法は、一般に三相を含んでなり、対数増殖の第一相であって、最初に培地に含まれている炭素を基剤とする基質(グリセロールまたはグルコース)によって確保され、増殖が炭素源によって制限されるようになるときに開始する第二相であり、炭素源は次いでグリセロールを4.5 g.h-1.l-1 またはグルコースを3.6 g.h-1.l-1 の速度で連続的に加える。第三相では、この速度を６０％まで減少させて、増殖を鈍化し、オリゴ糖含量を増加する。
【００７６】
1.4.  オリゴ糖の分析
培養中に試料(1 ml)を採取し、直ちに微量試験管で遠心分離する。上清を保持して、細胞外オリゴ糖を分析する。細菌ペレットを水1 mlに再分散した後、１００℃の水槽で３０分間インキュベーションし、細胞を破壊する。二回目の遠心分離の後、上清を保持して、細胞内オリゴ糖を分析する。
【００７７】
ラクトース濃度を、酵素測定キット(Roche製診断薬)を用いて測定する。オリゴ糖に含まれるＮ−アセチル−グルコサミン残基を、上記のように酸加水分解によって遊離させた後(Samain et al., 1997)、Reissig et al., (1955)の方法によって比色定量する。説明における、「加水分解可能なＧｌｃＮＡｃ」という用語は、この方法で分析したＧｌｃＮＡｃの量を意味する。
【００７８】
ノイラミニダーゼによる処理を用いるおよび用いないラクトースの分析により、シアリル−ラクトース濃度を推定することができる。
【００７９】
総フコースを、Dische and Shettles (1948)のシステイン塩酸塩法によって比色により測定する。
【００８０】
1.5.  オリゴ糖の精製
培養が終了したならば、菌体を遠心分離によって回収する。上清を保持して、細胞外オリゴ糖を精製する。菌体を水１リットルに再分散した後、熱処理（１００℃、３０分間）によって透過性にし、細胞内オリゴ糖を放出する。二回目の遠心分離の後、これらのオリゴ糖を上清にて回収する。
【００８１】
それぞれ細胞外および細胞内オリゴ糖を含む第一および第二の上清を、活性炭に吸着させる（上清１リットル当たり１００g）。蒸留水で洗浄した後、オリゴ糖を５０％（v/v）エタノールで希釈し、蒸発により濃縮し、凍結乾燥する。
【００８２】
オリゴ糖をBiogel P4のカラム(4.5 cm × 95 cm)上で、立体排除クロマトグラフィーによって約３００mgのオリゴ糖混合物を注入して分離する。溶出は、蒸留水を用いて４０ml.h-1の流速で行う。
【００８３】
非フコシルオリゴ糖をBiogel P4のカラム(4.5 cm × 95 cm)上で、立体排除クロマトグラフィーによって約３００mgのオリゴ糖混合物を注入して分離する。溶出は、蒸留水を用いて４０ml.h-1の流速で行う。
【００８４】
フコシルオリゴ糖を、６０℃で恒温保持したBiogel P2のカラム(1.5 cm × 200 cm)上で立体排除クロマトグラフィーによって約３０mgのオリゴ糖混合物を注入して分離する。溶出は、蒸留水を用いて３０ml.h-1の流速で行う。
【００８５】
シアリルラクトースを、Dowex 1X4-400樹脂（HCO3- 形態）に結合することによって中性オリゴ糖から分離し、NaHCO3のグラディエント(0 −100 mM)で溶出する。次に、重炭酸塩を溶出液をＨ＋形態のDowex 50X4-400樹脂で処理することによって除去する。
【００８６】
1.6.  アリルβ−Ｄ−グルコシドの調製
アリル β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびアリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを、Lee and Lee (1974)によって報告された方法によって合成した。
【００８７】
1.7. オリゴ糖の同定および構造の特性決定
質量分光計(Nermag R-1010C)を用いて、質量スペクトルを得た。それぞれの実験について、初期マトリックス容積は４μlである。生成物は、ＦＡＢ＋モードで分析した。
【００８８】
ＮＭＲスペクトルは、Brucker AC300分光計を用いて得た。
【００８９】
1.8. 菌株JM 107-nanA-の構築
シアリル酸を代謝することができないJM 107株を、ＮｅｕＡｃアルドラーゼ (Plumbridge et al., 1999)をコードするnanA遺伝子(Nanオペロン)の挿入不活性化によって調製した。nanA遺伝子の中心の両側で二回のＰＣＲ増幅反応を行い、ＢａｍＨＩ制限部位を挿入した。
【００９０】
nanAの右手部分を含んでなる第一の１．６kbＢａｍＨＩ-ＸｂａＩ断片を、プライマーAAAGGATCCAAGATCAGGATGTTCACGおよびGCTCTAGAATGGTAATGATGAGGCACを用いてJM 109のゲノムＤＮＡから増幅し、ベクターpUC19のＢａｍＨＩとＸｂａＩ部位の間にクローニングし、ベクターpUC-nan1.6を形成した。nanAの左手部分を含んでなる第二の２．１kb ＫｐｎＩ-ＢａｍＨＩ断片を、プライマーAAAGGATCCGCGTAGGTGCGCTGAAACおよびAAAGGTACCTCAGGCCACCGTTAGCAGを用いて増幅し、ベクターpUC-nan1.6のＫｐｎＩとＢａｍＨＩ部位との間にクローニングし、ベクターpUC-nan3.7を形成した。次に、カナマイシン耐性遺伝子(pUC-4K, Pharmacia cassette)を、pUC-nan3.7のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。nanA::kanを含む４．９kb ＳａｃＩ−ＸｂａＩ断片を、自殺ベクターpCVD442の同一部位に挿入した(Donnenberg and Kaper, 1991)。このプラスミドを用いて、相同組換えによってカナマイシン耐性およびシアリル酸（JM 107-nanA-株）の代謝不能について選択したJM 107 nanA::kan突然変異体を得た。
【００９１】
1.9. JM 107col-DE3株の構築
コラン酸を合成する能力を、グルコシル−トランスフェラーゼをコードするwcaJ遺伝子の挿入不活性化によって抑制した(Stevenson et al., 1996)。wcaJ遺伝子を含む１．８kbＤＮＡ断片と隣接ＤＮＡを、JM 109由来のゲノムＤＮＡを用いて出発するＰＣＲによって増幅し、プライマーCCACGATCCACGTCTCTCC (右 wcaJ)およびAAGCTCATATCAATATGCCGCT (左 wcaJ)を用いてベクターpTOPO2.1に挿入した (Invitrogen PCR クローニングキット)。次に、これをpUC19ベクターのＥｃｏＲＩ部位に転移した。このようにして得たベクターを、ＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、次いでwcaJの中心に存在するＡｐｏＩ部位にカナマイシン耐性遺伝子を付加させた。組換えＤＮＡwcaJ::kanを、最後に自殺ベクターpCVD442に転移させ、相同組換えによって、クローニングに用いたプライマーを用いるＰＣＲによって選択された不活性化遺伝子を含むJM 107ゲノム突然変異体を産生させた(JM 107-col-株)。
【００９２】
JM 107-col-を、Novagen製リソゲナイゼーションキットを用いてファージλDE3について溶原性にした。
【００９３】
例２：  三糖類 ４−Ｏ−[３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル]−Ｄ−グルコピラノース, (β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−Ｄ−Ｇｌｃ)の製造
原理を、図１に示す。Escherichia coli K12のJM 109株を用い、これにプラスミドpCWlgtA lgtA遺伝子を導入した。JM 109株はlacZ-であり、すなわちラクトースを加水分解できない。一方、lacY+は、ラクトース透過酵素を合成することができることを意味する。lgtA遺伝子は、β−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼ (LgtA)をコードし、これはＮ−アセチル−グルコサミン単位をラクトースのガラクトースに転移させる。
【００９４】
JM 109 (pCWlgtA)株およびJM 109コントロール株も、炭素およびエネルギー源としてのグリセロール上で高細胞密度で培養した(Samain et al., 1997)。培地に最初に含まれるグリセロール(17.5 g/l)によって提供された第一の対数増殖相の後、増殖をグリセロールによって制限し、これを次に４．５g.h-1.l-1の量で連続的に加えた。この第二の培養相中に、９０mg.h-1.l-1のラクトースを連続的に導入した。ＩＰＴＧ (イソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトシド) (0.5 mM)も、この相の開始時に注入し、ラクトース透過酵素およびβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼの発現を誘導した。図２に記載されているように、添加したラクトースは培地に実質的に蓄積されず、ラクトースが実際に細菌細胞によってインターナリゼーションされていることを示した。 is indeed internalized by the bacterial cells. A large accumulation in the culture medium of a compound containing Ｎ−アセチルグルコサミン(加水分解性ＧｌｃＮＡｃ)を含む化合物が培地に多量に蓄積されていることが、JM 109 (pCWlgtA)株で観察される。生成した加水分解性ＧｌｃＮＡｃの量(3.8 mmol/l)は、消費されたラクトースの量(3.5 mmol/l)にほぼ化学量論的に相当し、インターナリゼーションしたラクトースの総てがLgtAによってグリコシル化されたことを示唆している。
【００９５】
培養が終了したならば、細胞を遠心分離によって除去し、上清に含まれているオリゴ糖を活性炭へ吸着させ、エタノールで溶出することによって精製する。含まれるオリゴ糖を次に、Biogel P4カラム上でそれらの分子量によって分離する。単一の支配的な化合物が見いだされた。質量分光法およびＮＭＲデーターは、この化合物が実際にＧｌｃＮＡｃ残基がラクトース分子に付加することによって形成された三糖類 (β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ)であることを示している。実際に、ＦＡＢ＋モードの質量スペクトルは、m/z５４６に疑似分子イオン［Ｍ＋Ｈ］＋ の存在を示している（図３）。１ＨＮＭＲスペクトルにより、三糖類の構造、アセチル基の存在、および２個のＯ−グリコシド結合のβ配置が明らかにされている（図４）。１３ＣＮＭＲスペクトルも、ＧｌｃＮＡｃとガラクトースとの結合が実際に１，３型であることを示している（図５）。
【００９６】
例３：  ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースおよびポリラクトースアミンの製造
原理を、図６に示す。E. coli JM 109株を、それぞれ遺伝子lgtA (上記で使用）およびlgtB（ LgtBとして知られているβ−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼをコード）を有する二種類のプラスミドpCWlgtAおよびpBBlgtBを用いて同時形質転換した。JM 109 (pCWlgtA, pBBlgtB)株を、グルコースを増殖基質として用いて高細胞密度で培養した。第二相の開始時に、ラクトースを高濃度(5 g.l-1)または低濃度(1 g.l-1)で加え、０．１mM ＩＰＴＧ を加える。株JM 109 (pCWlgtA)で見られたのとは反対に、この株の培養中に加水分解性ＧｌｃＮＡｃの培地への放出は極めて弱いものである。一方、加水分解性ＧｌｃＮＡｃは、この細菌に多量に見いだされる（図７）。ラクトースの供給が１g.l-1であるときには、ラクトースの完全なインターナリゼーション(2.9 mmol.l-1)および １．４５g.l-1 (6.5 mmol.l-1)の結合ＧｌｃＮＡｃの総生産、すなわちアクセプターラクトース分子当たり２分子を上回るＧｌｃＮＡｃの組込みが見られる。ラクトースを高濃度で添加すると、インターナリゼーションは不完全であり(3 g.l-1、すなわち8.7 mmol.l-1)、ＧｌｃＮＡｃの生成も約６．５mmol.l-1である。この場合には、ＧｌｃＮＡｃ/ラクトースモル比は１に近く、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースの合成と整合性がある。
【００９７】
細胞内オリゴ糖画分の精製によって、Biogel P4上のクロマトグラフィーによって良好に分離されている幾つかの主要化合物を得ることができた。質量分光法およびＮＭＲデーターは、これらの化合物が下記の構造に相当することを示している：ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース［Ｍ＋Ｈ］＋ = ７０８; ラクト−Ｎ−ネオ−ヘキサオース ［Ｍ＋Ｈ］＋ = ７０８; ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオース［Ｍ＋Ｎａ］＋ = １４６０、および好ましくはラクト−Ｎ−ネオ−デカオース。これら各種の化合物のそれぞれの比は、加えるラクトースの量によって変化する。例えば、ラクトースが５g.l-1 では、主生成物はラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースである（図８Ａ）。一方、ラクトースの供給を減少させると(1 g.l-1)、一層高重合度の化合物の形成が促進され、ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオースが主生成物となる（図８Ｂ）。
【００９８】
ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースのより高級なポリラクトースアミン同族体の形成は、 LgtAがラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースを用いて中間体の五糖類を形成させることができ、これはLgtBによってグリコシル化されてラクト−Ｎ−ネオ−ヘキサオースを生じることによって説明される。後者の化合物は、それ自身が新規なグリコシルサイクルの前駆体であり、ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオースなどラクト−Ｎ−ネオ−デカオースまでを成形する。
【００９９】
奇数残基を有し、非還元末端位置にガラクトースを有するオリゴ糖には、有意な形成は見られない。これは、分子の伸張がLgtBによって触媒されるガラクトシル化によるよりはLgtAによるＧｌｃＮＡｃの組込みによって制限されることを示している。
【０１００】
例４:  アリル３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド, (β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−１→Ｏ−アリル)の製造
JM 109株(pCWlgtA)を、グリセロール上で高細胞密度で培養した。培養の第二相の開始時に、０．７５g.l-1のアリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよび０．１mMのＩＰＴＧを加える。アリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの完全インターナリゼーションが９時間後に見られ、細胞外培地に加水分解性ＧｌｃＮＡｃが化学量論的に出現する。細胞外培地に含まれるオリゴ糖を、例２と同様の方法で精製する。得られた主生成物のＦＡＢ＋モードでの質量スペクトルは、m/z４２４に構造β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ→Ｏ−アリルに相当する疑似分子イオン［Ｍ＋Ｈ］＋の存在を示している。
【０１０１】
例５:  β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-１→Ｏ−アリルの製造
JM 109株 (pBBlgtB)を、グリセロール上で高細胞密度で培養した。培養の第二相の開始時に、０．５g.l-1のアリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド (β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-１→Ｏ−アリル) を加える。最初の５時間で、細胞外加水分解性ＧｌｃＮＡｃの量が約３０％減少し、これはアリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドの部分インターナリゼーションを示している。同時に、加水分解性ＧｌｃＮＡｃおよびβ結合ガラクトース残基（β−ガラクトシダーゼで加水分解可能)のほぼ化学量論的細胞内生成も見られる。これらの結果は、最初に添加されたアリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドの３０％がlgtB遺伝子によってコードされる活性によってガラクトシル化されていることを示している。精製の後、予想化合物（β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-１→Ｏ−アリル）は、質量分光法およびＮＭＲによって確かめた。
【０１０２】
例６:  ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースの類似体およびグルコース残基がアリル基で置換されているポリラクトースアミンの製造
JM 109株 (pCWlgtAおよびpBBlgtB)を、ラクトースの供給を０．６５g.l-1のアリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの添加に変えたことを除き、例３と同様の方法で培養した。例３の方法に従って精製した後、三種類の主生成物が得られる。質量分光法データーは、これらの三種類の化合物が下記の三、五、および七糖類に相当することを示している:
β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−１→Ｏ−アリル, ［Ｍ＋Ｈ］= ５８６;
β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−１→Ｏ−アリル, ［Ｍ＋Ｈ］= ９５１;
β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−[１→4）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−１→Ｏ−アリル, ［Ｍ＋Ｈ］= １３１６。
【０１０３】
例７:  ３′−シアリルラクトース (α−ＮｅｕＡｃ−［２→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ)の製造
原理を図９に示す。シアリル酸およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの整合西洋の遺伝子はE. coli K12には存在しない。しかしながら、E. coli K12は、シアリル酸を分解することができ(Plumbridge and Vimr, 1999)、外来シアリル酸が細胞中に入るようにできる透過酵素(NanT)を含んでいる。このシアリル酸は、通常は次にアルドラーゼ(NanA)によって異化される。
【０１０４】
Escherichia coli K12 JM 107-nanA-株（例１）およびJM 107コントロール株であって、それぞれα−２，３−シアリル−トランスフェラーゼ およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼの遺伝子を含む二種類の適合性プラスミドNST-01およびpBBnsyを導入したものを用いた。この株はnanA活性を欠き、従って分子内シアリル酸を分解することができない。しかしながら、これはラクトース透過酵素 (lacY)およびシアリル透過酵素(nanT)遺伝子を含んでおり、外来シアリル酸およびラクトースをインターナリゼーションすることができる。従って、インターナリゼーションしたシアリル酸を、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼの作用によってＣＭＰ−ＮｅｕＡｃへ活性化し、α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼの作用によって細胞内ラクトースに転移させることができる。
【０１０５】
JM 107-nanA-株(Nst-01, pBBnsy)およびNanA活性を有するJM 107コントロール株(Nst-01, pBBnsy)を、グリセロール上で高細胞密度で培養した。５時間の培養の第二相の開始時に、ラクトース(1.5 g.l-1)、ＩＰＴＧ (0.1 mM)およびシアリル酸 (0.6 g.l-1)を加える。第三相の培養の期間中、１００mg.h-1.L-1のシアリル酸、および２００mg.h-1L-1 のラクトースを連続的に導入する。
【０１０６】
菌株JM 107-nanA-(Nst-01, pBBnsy)の培養の終了時に、ノイラミニダーゼで処理したまたは処理しないラクトースの酵素分析により、シアリルラクトースの総産生量を２．６g.l-1と計算することができる。この産生は、細菌細胞(1.5 g.l-1)および細胞外培地(1.1 g.l-1)で部分的に見られる。JM 107コントロール株(Nst-01, pBBnsy)の場合には、シアリルラクトースの産生はずっと低く(150 mg.l-1)、実質的に総てのシアリル酸が細菌によって分解されてしまったことを示している。
【０１０７】
細胞内および細胞外オリゴ糖は、活性炭に吸着させ、エタノールで溶出することによって精製される。アニオン交換樹脂上での精製の後、一種類だけの生成物がＨＰＬＣによって検出される。ＦＡＢ＋モードでの質量スペクトルは、m/z６５６に二種類の疑似分子イオン［Ｍ＋Ｈ］＋ およびm/z ６７８にシアリルラクトースのナトリウム塩に相当する［Ｍ＋Ｎａ］の存在を示している。
【０１０８】
例８:  ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースフコシル誘導体の製造
E. coli K12では、ＧＤＰ−フコースの整合性のための遺伝子が、細胞外多糖類であるコラン酸の整合性に関与しているオペロンの一部を形成している(Stevenson et al., 1996)。このオペロンの発現は、タンパク質RcsAが関与する複雑な調節ネットワークによって制御される(Stout et al., 1991)。従って、rcsA遺伝子の過剰発現はコラン酸、従ってＧＤＰフコースの整合性の遺伝子の過剰産生によって反映される (Russo and Singh, 1993)。
【０１０９】
ＧＤＰフコースの利用可能性を増加させるため、本発明の方法は、rcsA遺伝子が過剰発現され（ＧＤＰ−フコースの整合性の遺伝子を過剰産生する）およびコラン酸の整合性に本質的な遺伝子一つが不活性化されている（コラン酸の産生が完全に抑制され且つＧＤＰ−フコースの使用のための競合が回避されている）E. coliの菌株を用いることにある。
【０１１０】
反復単位の最初のグルコース残基の転移に関与しているwcaJ遺伝子が例１によって不活性化され且つ二種類のプラスミドpHP0651およびpBBLnt、または二種類のプラスミドpHP0651およびpBBLntRcsAが導入された菌株JM 107-col-DE3を用いた。プラスミドpHP0651は、Helicobacter pyloriのα−１，３−フコシル−トランスフェラーゼに対するfucT遺伝子を含む。このフコシル−トランスフェラーゼはアクセプターとしてラクトースではなく、Ｎ−アセチルラクトースアミンおよびラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースを用いる(Martin et al., 1997)。プラスミドpBBLntは、lgtAおよびlgtB遺伝子を含む。プラスミドpBBLntRcsAは、lgtA、lgtBおよびrcsA遺伝子を含む。
【０１１１】
二種類の株JM 107-col-DE3 (pHP0651, pBBLnt)およびJM 107-col-DE3 (pHP0651, pBBLntRcsA)を、例３と同様にして５g.l-1 のラクトースの存在下にて培養した。培養の第三相の終了時に、これら二種類の菌株によって産生された加水分解性ＧｌｃＮＡｃの量(1.7 g.l-1)は、例３において菌株JM 109 (pCWlgtA, pBBlgtB)を用いて得たものに匹敵した。培養の終了時におけるフコースの比色分析では、これらに種類の株の間に大きな差が示され、株JM 107-col-DE3 (pHP0651, pBBLntRcsA)についてはフコース産生は１g.l-1 であったが、株JM 107-col-DE3 (pHP0651, pBBLnt)については０．２５g.l-1 に過ぎなかった。フコシルオリゴ糖は、細胞内画分では７０％を上回る量で見いだされた。
【０１１２】
細胞内画分を活性炭に吸着させ、Biogel P2上で立体排除クロマトグラフィーにより精製することによって、四種類の主生成物を分離することができる。
【０１１３】
化合物１は、Biogel P2上でのその溶出容積およびその薄層移動によって、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースに相当する。
【０１１４】
化合物２の質量スペクトルは、 m/zに８５４にラクト−Ｎ−フコペンタオースのモル質量に相当する疑似分子イオン［Ｍ＋Ｈ］＋の存在を示している。３２７の二次イオンの存在は、分子がグルコース残基でフコシル化されており、下記の構造を有することを示している：
β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−Ｇｌｃ
【０１１５】
主化合物３の質量スペクトルは、m/z１０００、１０２２、および１０３８に下記の構造を有するラクト−Ｎ−ジフコヘキサオース分子の［Ｍ＋Ｈ］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋および［Ｍ＋Ｋ］＋ の三形態に相当する３個の疑似分子イオンの存在を示している。
β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−(β−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−Ｇｌｃ.
【０１１６】
化合物４の質量スペクトルにより、ラクト−Ｎ−ジフコオクタオース分子の［Ｍ＋Ｈ］＋ および［Ｍ＋Ｎａ］＋形態に相当するm/z １３６５および１３８８の二種類の疑似分子イオンを同定することができる。m/z５１２における二次イオンの存在は、非還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基がフコースを有することを示している。ＮＭＲデーターは、 フコース残基の１Ｈプロトンがアノマー性に感受性であり、このフコース残基はグルコースに結合していることを示している。これらの結果により、化合物４について下記の構造を提案することができる。
β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ-[１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−(α−Ｌ−Ｆｕｃ−[１→３]）−β−Ｄ−Ｇｌｃ.
【０１１７】
REFERENCES
1.    Boons (1996) Tetrahedron 52, 1095-1121.
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【図面の簡単な説明】
【図１】  三糖類 ４−Ｏ−[３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル]−Ｄ−グルコピラノース, (β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−［１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−Ｄ−Ｇｌｃ)の製造方法の原理
ラクトース（β−Ｄ−Ｇａｌ−［１−４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ）を、ラクトース透過酵素（Lac 透過酵素）によって細胞中に輸送する。菌株はLacZ- 突然変異体であるので、ラクトースは細胞で加水分解することができない。lgtA 遺伝子の発現により、LgtA 酵素を産生し、これがＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからラクトース分子に移す。形成された三糖類（β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−［１−３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１−４］−Ｄ−Ｇｌｃ）は、培地に排出される。
【図２】  コントロール菌株 JM 109 およびグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子 LgtAを含む菌株 JM 109 (pCWlgtA) の高細胞密度培養
ラクトースを連続的に加え、残留ラクトースを酵素法によって測定する。培地の加水分解可能なＧｌｃＮＡｃの濃度を、酸加水分解の後に比色法によって測定する。添加したラクトースは、連続的に添加したラクトースの総蓄積量を表す。
【図３】  菌株 JM 109 (lgtA)の培養上清から精製した三糖類 ４−Ｏ−[３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル]−Ｄ−グルコピラノース,（β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−［１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−Ｄ−Ｇｌｃ）のＦＡＢ＋モードでの質量スペクトル
二種類の疑似分子イオン［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋Ｎａ］＋が、m/z ５４６および５６８に観察される。β−Ｄ− ＧｌｃＮＡｃ−［１−３］−ＩＰＴＧの存在によるm/z４４２におけるイオン［Ｍ＋Ｈ］＋も観察される。これは、This indicates that the used to induce Lac 透過酵素およびLgtAを誘導するのに用いたＩＰＴＧ (イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトース）もグリコシル化されていることを示唆している。
【図４】  三糖類 ４−Ｏ−[３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル]−Ｄ−グルコピラノース,（β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−［１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−Ｄ−Ｇｌｃ）の３２３°ＫにおけるプロトンＮＭＲスペクトル
１．４ppmにおけるシグナルは、グリコシル化したＩＰＴＧ誘導体のイソプロピル基のプロトンによるものである。
【図５】  三糖類 ４−Ｏ−[３−Ｏ−(２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル]−Ｄ−グルコピラノース, (β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−［１→３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１→４］−Ｄ−Ｇｌｃ）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル
【図６】  ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース(β−Ｄ−Ｇａｌ−［１−４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−［１−３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１−４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ）の製造方法の原理
ラクトース (β−Ｄ−Ｇａｌ−［１−４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ）を、Lac 透過酵素によって細胞中に輸送する。菌株は LacZ- 突然変異体であるので、ラクトースは細胞中で加水分解することができない。lgtA 遺伝子の発現により、LgtA 酵素を産生し、これがＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからラクトース分子に移す。次に、形成された三糖類を、ガラクトース分子をＵＤＰ−Ｇａｌから移して、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース（β−Ｄ−Ｇａｌ−［１−４］−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−［１−３］−β−Ｄ−Ｇａｌ−［１−４］−β−Ｄ−Ｇｌｃ）を形成する LgtB によって前駆体として用いる。
【図７】  菌株JM 109 (pCWlgtA, pBBlgtB)の高細胞密度培養
高濃度（５g.l-1）および低濃度（１g.l-1）のラクトースの存在下での培養。
【図８】  初期濃度５g.l-1(A)および１g.l-1(B)のラクトースの存在下での菌株JM 109 (pCWlgtA, pBBlgtB) によって産生されるオリゴ糖の Biogel P4 上での分離
ピーク１、２、３および４は、それぞれラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオース、およびラクト−Ｎ−ネオ−デカオースに相当する。
【図９】  シアリルラクトースの製造方法の原理
ラクトースおよびシアリル酸 (ＮｅｕＡｃ) を、ラクトース透過酵素 (lacY) およびシアリル酸透過酵素 (nanT)によって細胞中にインターナリゼーションする。菌株はlacZ- and nanA- 突然変異体であるので、これらの二種類の化合物は細胞中で分解されない。ＣＭＰ−ＮｅｕＡシンターゼおよびα−２，３−シアリル−トランスフェラーゼの発現により、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃにインターナリゼーションしたシアリル酸が活性化され、細胞内ラクトースへ移行する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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