(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する微生物回収装置において、
撹拌子と、
前記撹拌子に結合する、前記微生物と結合する抗体と
を備える、微生物回収装置。
【請求項２】
前記撹拌子は、その表面に樹脂がコーティングされている請求項１に記載の微生物回収装置。
【請求項３】
検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する微生物回収装置において、
撹拌子と、
前記膜に対して検査対象水を供給する側に添加され、前記膜の孔径よりも大きい粒径の担体であって、前記微生物と結合する複数の抗体をその表面に有し、前記撹拌子と結合する、担体と
を備える、微生物回収装置。
【請求項４】
前記担体が磁気担体である請求項３に記載の微生物回収装置。
【請求項５】
前記担体の粒径より小さく、前記微生物の粒径より大きい孔径である膜上に、前記担体を添加する手段をさらに備える請求項３に記載の微生物回収装置。
【請求項６】
前記微生物と前記抗体とを解離する解離溶液を用いて、前記微生物を回収する回収手段をさらに備える請求項１又は３に記載の微生物回収装置。
【請求項７】
前記微生物と前記抗体とを解離する溶液が、ｐＨ変化液、イオン強度変化液及び極性変化液の少なくとも１つからなる請求項６に記載の微生物回収装置。
【請求項８】
検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する微生物回収方法において、
前記微生物と結合する複数の抗体を撹拌子に結合させるステップと、
前記膜及び前記撹拌子を備えたろ過器を用いて前記検査対象水をろ過し、前記微生物を抗体に結合させるステップと、
前記微生物と前記抗体とを解離する溶液を添加するステップと、
前記微生物を回収するステップと
を含む、微生物回収方法。
【請求項９】
検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する微生物回収方法において、
前記膜に対して検査対象水を供給する側に、前記膜の孔径よりも大きい粒径の担体を添加するステップであって、前記担体は、前記微生物と結合する複数の抗体をその表面に有し、撹拌子と結合する、ステップと、
前記膜及び前記撹拌子を備えたろ過器を用いて前記検査対象水をろ過し、前記微生物を前記抗体に結合させるステップと、
前記微生物と前記抗体とを解離する溶液を添加するステップと、
前記微生物を回収するステップと
を含む、微生物回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を回収する方法及び装置に関し、特に、河川及び湖沼などの環境水や上下水道の各処理プロセスの処理水など存在する原虫、細菌、ウイルスといった水系感染性微生物を回収する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には多種多様な化学物質が存在するため、水道原水となる河川や湖沼などの環境水も様々な化学物質で汚染されていると考えられる。しかし、このような水環境の水質問題のほかにクリプトスポリジウムなどの原虫類、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７やレジオネラ菌などの細菌、ウイルスなどによる水系感染症の発生が大きな社会問題となっている。
【０００３】
これらの水系感染症の集団発生を防ぐためには水処理プロセスにおける原因微生物を高頻度にモニタリングすることが必要不可欠である。特に新興の水系感染症の原因となっているクリプトスポリジウムやジアルジアなどの原虫の検査方法（例えば、厚生労働省から示された「クリプトスポリジウム暫定対策指針」１９９８年に指針の改正）では、クリプトスポリジウムの検査手順は大きく分けて、試料採取、ろ過濃縮、剥離懸濁、分離精製、免疫蛍光染色、顕微鏡観察からなる。
【０００４】
試料採取ステップでは、容量１０〜２０Ｌのポリエチレン容器に河川水など水道原水は１０Ｌ、浄水や水道水は４０Ｌを採取する。次に、ろ過濃縮ステップでは、直径４７ｍｍ又は９０ｍｍ、ポアサイズ５μｍの親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ディスク膜を加圧又は吸引式の膜ホルダーに取付け、採取した試料を全量ろ過する。クリプトスポリジウムのオーシストは直径４〜５μｍ程度であるので、このステップにより試料中の微粒子とともに混入しているクリプトスポリジウムを分離することができる。剥離懸濁ステップでは、試料をろ過したディスク膜を５０ｍLの遠心管に入れ０．０２％ピロリン酸ナトリウム、０．０３％ＥＤＴＡ−３Ｎａ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０からなる誘出液（１％ＰＥＴ）を添加し、激しく撹拌する。これにより試料中の微粒子とともに膜に捕捉されたクリプトスポリジウムをディスク膜から剥離させる。次に遠心分離を行い、クリプトスポリジウムを含む微粒子と誘出液を分離し、誘出液を取り除き減容化する。続いて、分離精製ステップでは、上述の試料中の微粒子を含む懸濁液からクリプトスポリジウムを分離する。クリプトスポリジウムを特異的に認識する抗体が結合した免疫磁気ビーズを懸濁液に添加し、一定時間撹拌後、免疫磁気ビーズを磁石により容器に固定し、懸濁液を取り除く。免疫磁気ビーズにはクリプトスポリジウムが結合しており、ｐＨ変化により免疫磁気ビーズからクリプトスポリジウムを脱離させ、クリプトスポリジウムを回収する。免疫蛍光染色、顕微鏡観察ステップでは、回収したクリプトスポリジウムに蛍光標識した抗クリプトスポリジウム抗体を添加し、クリプトスポリジウムを標識し、蛍光顕微鏡で観察する。
【０００５】
以下に示す特許文献１〜３には、微生物の計測装置が記載されている。特に、特開２００５−２４５３１７には、検出対象の微生物と特異的に結合する抗体を、磁気ビーズに結合させ、その微生物を集めてシースフローデバイスを用いて微生物を検出することが記載されている。同様に、特開２００６−１９４６３５及び特開２００６−３４５８３２にも、免疫磁気ビーズ法を用いて微生物を検出することが記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２４５３１７
【特許文献２】特開２００６−１９４６３５
【特許文献３】特開２００６−３４５８３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
浄水処理プロセスにおいて、環境中に存在する水系感染性微生物を適切に除去あるいは消毒殺菌し安全な水道水を供給するためには、検出対象微生物を高頻度に測定し、その測定結果を処理プロセスにフィードバックする必要がある。
しかしながら、クリプトスポリジウムなどの病原性原虫類、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７やレジオネラ菌などの細菌、ウイルスの検査方法、特にクリプトスポリジウムの検査方法は前述のとおり、クリプトスポリジウムを捕捉し回収するとき、試料の微粒子によりディスク膜が目詰まりをおこし、短時間でろ過速度が低下するため全試験工程にかかる時間が長くなり迅速な測定ができず、大量の試料を効率よく処理できないという問題もある。また、蛍光顕微鏡観察では他の微生物との識別に高度な熟練を要するため、１時間に１回あるいは１日に１回程度の高頻度な測定が望まれている。さらに、上述のろ過濃縮及び剥離懸濁にけるクリプトスポリジウムの回収率は多くの場合、数十％〜８０％前後と変動が大きく、計測値のバラツキも大きい。さらに計測値の再現性や検出精度の面から改善すべき問題点が多い。
【０００８】
このように微生物の検査において検査精度が低いことや操作が複雑であるため熟練した技術が必要であり、長時間の作業のため作業者の負担が大きいため、作業ステップの自動化や省力化が望まれている。
【０００９】
本発明は、上述の問題点を鑑み、大量の試料水中から微生物を短時間で高効率で分離することを課題とする。また、本発明は、作業の自動化及び省力化を図る。さらに、膜閉塞物質を分散、溶解し、膜の目詰まりを防ぐことも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明は、検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する第１の微生物回収装置を提供する。この第１の微生物回収装置は、撹拌子と、撹拌子に結合する、微生物と結合する抗体と、微生物と抗体とを解離する解離溶液を用いて、微生物を回収する回収手段とを備える。撹拌子は、その表面に樹脂がコーティングされていることが好適である。ここで、樹脂は、耐薬品性に優れたフッ素樹脂が使用されることが好適である。また、撹拌子は、その表面にアミノ基がコーティングされていることが望ましい。検出対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。微生物と抗体とを解離する溶液は、ｐＨ変化溶液、イオン強度変化液及び極性変化液の少なくとも１つからなることが望ましい。
【００１１】
また、本発明は、検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する第２の微生物回収装置を提供する。この第２の微生物回収装置は、撹拌子と、膜に対して検査対象水を供給する側に添加され、膜の孔径よりも大きい粒径の担体であって、微生物と結合する複数の抗体をその表面に有し、撹拌子と結合する、担体と、微生物と抗体とを解離する解離溶液を用いて、微生物を回収する回収手段とを備える。ここで、担体が磁気担体であることが好適である。検出対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。微生物と抗体とを解離する溶液は、ｐＨ変化溶液、イオン強度変化液及び極性変化液の少なくとも１つからなることが望ましい。
【００１２】
さらに、本発明は、検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する第３の微生物回収装置を提供する。この第３の微生物回収装置は、膜に対して検査対象水を供給する側に添加され、膜の孔径よりも大きい粒径の担体であって、微生物と結合する複数の担体をその表面に有する、担体と、微生物と抗体とを解離する解離溶液を用いて、微生物を回収する回収手段とを備える。検出対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。微生物と抗体とを解離する溶液は、ｐＨ変化溶液、イオン強度変化液及び極性変化液の少なくとも１つからなることが望ましい。
【００１３】
また、上記課題を解決するために、本発明は、検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する第１の微生物回収方法を提供する。この第１の微生物回収方法は、微生物と結合する複数の抗体を撹拌子に結合させるステップと、膜を用いて検査対象水をろ過し、微生物を抗体に結合させるステップと、微生物と抗体とを解離する溶液を添加するステップと、微生物を回収するステップとを含む。撹拌子は、その表面に樹脂がコーティングされていることが好適である。ここで、樹脂は、耐薬品性に優れたフッ素樹脂が使用されることが好適である。また、撹拌子は、その表面にアミノ基がコーティングされていることが望ましい。検出対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。微生物と抗体とを解離する溶液は、ｐＨ変化溶液、イオン強度変化液及び極性変化液の少なくとも１つからなることが望ましい。なお、本発明の微生物回収方法は、上記手順で行うことが好ましいが、上記手順に限定されるものではない。
【００１４】
また、本発明は、検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する第２の微生物回収方法を提供する。この第２の微生物回収方法は、膜に対して検査対象水を供給する側に、膜の孔径よりも大きい粒径の担体を添加するステップであって、担体は、微生物と結合する複数の抗体をその表面に有し、撹拌子と結合する、ステップと、膜を用いて検査対象水をろ過し、微生物を抗体に結合させるステップと、微生物と抗体とを解離する溶液を添加するステップと、微生物を回収するステップとを含む。ここで、担体が磁気担体であることが好適である。検出対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。微生物と抗体とを解離する溶液は、ｐＨ変化溶液、イオン強度変化液及び極性変化液の少なくとも１つからなることが望ましい。
【００１５】
さらに、本発明は、検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収する第３の微生物回収方法を提供する。この第３の微生物回収方法は、膜に対して検査対象水を供給する側に、膜の孔径よりも大きい粒径の担体を添加するステップであって、担体は、微生物と結合する複数の抗体をその表面に有する、ステップと、膜を用いて検査対象水をろ過し、微生物を抗体に結合させるステップと、微生物と抗体とを解離する溶液を添加するステップと、微生物を回収するステップとを含む。検出対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。微生物と抗体とを解離する溶液は、ｐＨ変化溶液、イオン強度変化液及び極性変化液の少なくとも１つからなることが望ましい。
【００１６】
界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤等を使用する。具体的には、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソスビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）、ｎ−テトラデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−４０）、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ））プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から選択される少なくとも一を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の微生物回収方法及び装置は、試料水中の病原性微生物を試料水から分離するとき、膜の微細孔内又は表面上に試料中の夾雑物が蓄積することによってろ過性能が低下することを防止するものである。さらに、本発明の微生物回収方法及び装置は、短時間で、自動的に検出対象の微生物を膜から回収することができる。よって、作業の自動化及び省力化を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明に係る微生物回収方法及び装置の実施の形態について説明する。
図１に、本発明に係る微生物回収方法を実施する装置に用いるろ過器１００についてその一実施の形態を示す。なお、本発明に係る微生物回収方法及び装置では、様々な微生物を計測することができる。本実施の形態では、その一例として、クリプトスポリジウムを計測する。
【００１９】
図１に示すように、本実施の形態に係るろ過器１００は、その本来の機能を果たすトラックエッチ膜１０１（以下、膜１０１）を備えている。膜１０１は、メッシュクロス１０２を支持体とし、膜固定パッキン１０３で固定されている。この全体をフローセル上部１０４とフォローセル下部１０５とで挟み込んでいる。これによって、膜１０１を介して試料水とろ液が分離できる構造となる。
【００２０】
ろ過器１００内の圧力変化により、膜１０１が変形して伸びることがある。これによって、膜１０１の孔径が広がることがある。したがって、本実施の形態では、試料水の供給圧による膜１０１の変形を防ぐため、ろ液が流下でき、膜１０１の形状を保持できる支持体の上に膜１０１を固定した。支持体としてはメッシュクロス１０２を用いることができる。例えば、ポリプロピレン製の目開き３０メッシュクロス（ＮＢＣ社）を用いることができる。また、樹脂製の焼結板も用いることができる。具体的には、例えば、ポリプロピレン製の通過径２００μｍのプラスチックフィルター板（フロン工業）を用いることができる。
【００２１】
フローセル上部１０４には、試料水供給口１１１と、試料回収口１１２、廃液排出口１１６と、試料水から分離された微生物を含む懸濁液を空気圧により回収するための加圧／吸気口１１３とが設けられている。フローセル下部１０５には、ろ液排出口１１４と、洗浄水供給口１１５とが設けられている。試料水から分離された微生物を回収するため、試料回収口１１２は、下側に傾けた構造であることが望ましい。これにより、クリプトスポリジウムを含む液を試料回収口１１２に流下させ、効率よく回収することができる。
【００２２】
本実施の形態では、磁石入りの撹拌子１０６が、膜１０１上に設けられる構造とする。撹拌子１０６は、フローセルの下部１０５に設置されたマグネティックススターラーによって回転する。マグネティックススターラーは、フローセル上部１０４に設置されてもよい（図示せず）。
【００２３】
図６（ａ）に示すように、撹拌子１０６と、抗クリプトスポリジウム抗体６２とを結合させる。結合には、グルタルアルデヒド等を用いることができる。また、撹拌子１０６は、その表面に予め、アミノ基又は樹脂をコーティングしたものであってもよい。樹脂は、耐薬品性に優れたフッ素樹脂であることが望ましい。抗体６２を固定する高分子樹脂としては、例えば、ナイロン、ポリスチレン等が用いられる。
【００２４】
次に、図２及び図３を用いて、本発明に係る微生物回収方法の第１の実施形態について説明する。図２は、本発明に係る微生物回収方法を実施する装置について第１の実施の形態を示す。図３は、本発明に係る微生物回収方法を実施する第１の実施の形態についてその流れを示す。
【００２５】
本実施の形態の装置は、上記図１について説明したろ過器１００と、試料タンク２１１と、洗浄液タンク２１２と、廃液タンク２１３、試料回収タンク２１４と、抗体タンク２０３、解離液タンク２０４、ポンプ２０８、負圧圧力計２０９と、正圧圧力計２１０と、バルブ（２１６〜２２９）とを備える。ろ過器１００は、ラインＬ２１によって試料タンク２１１、洗浄液タンク２１２及び抗体タンク２０３と、ラインＬ２２によって洗浄液タンク２１２及び解離液タンク２０４と、ラインＬ２３、２４によって廃液タンク２１３と、ラインＬ２５によって試料回収タンク２１４とそれぞれ接続されている。
【００２６】
図３に従って、第１の実施形態をさらに説明する。まず、バルブ２１８、２１９、２１６を開き抗体供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ３０１）。廃液タンク２１３内は減圧され、ろ過器１００内も減圧されるため担体溶液はろ過器１００内に吸引される。ろ液は膜１０１を通過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク２１３内に排出される。ここで、廃液タンク２１３は耐圧性のものを使用することが望ましい。このとき、エアポンプ２０８による吸引圧力は負圧圧力計２０９で測定される。膜の破断圧力は、６９ｋＰａである。したがって、安全をみて、吸引圧力が４５〜５０ｋＰａになるようにエアポンプの運転を制御する。これにより試料水は一定圧力でろ過される。また、例えば、試料中の鋭利な粒子が膜を傷つけて膜が破断した場合、４５〜５０ｋＰａに制御されていた吸引圧力が正圧側に急激に変化するため、この圧力変動をモニタすることで試料調整の運転中止を判断することができる。次に、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２１６、２１９、２２８を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放として残圧を除く（ステップ３０２）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００２７】
次に、河川原水などの環境試料にクリプトスポリジウムの誘出液として用いられている、例えば、１００％ＰＥＴ（２％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム、３％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ−３Ｎa、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０）を終濃度０．１％ＰＥＴになるように検査対象水に添加する。なお、２％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム及び３％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ−３Ｎaは緩衝液として用い、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０は界面活性剤として用いている。続いて、塩酸を終濃度０．１Ｎ（規定）になるように添加して撹拌する（ステップ３０３）。このとき、Ｔｗｅｅｎ８０の終濃度は０．０１％（ｖ／ｖ）とする。この試料水を試料タンク２１１に移す（ステップ３０４）。ここで、酸の種類としては、硝酸、クエン酸なども挙げることができ、濃度は例えば０．０１モル／Ｌ〜０．２モル／Ｌとする。
【００２８】
バルブ２１５、２１６を開き試料供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ３０５）。廃液タンク２１３内は減圧され、ろ過器１００内も減圧されるため試料水はろ過器１００内に吸引される。ろ液は膜１０１を透過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク２１３内に排出される。
【００２９】
クリプトスポリジウム６３は、撹拌子表面上の抗クリプトスポリジウム抗体６２と結合する（図６（ａ））。抗クリプトスポリジウム６２は、例えば、ＩｇＧ−３кのマウス抗クリプトスポリジウムモノクローナル抗体（バイオジェネシス社）を用いる。クリプトスポリジウム６３の粒径は４〜６μｍであるため、クリプトスポリジウム６３は、抗体６２に捕捉されなくても、膜１０１上に一度捕捉されるが、そのブラウン運動によりやがて抗体６２に捕捉される。一方、試料中に含まれる、粒径が３μｍ未満である夾雑物は膜１０１の細孔を通過して排除される。試料水のろ過が終了したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２１６、２１５を閉じ、バルブ２２４、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放として残圧を除く（ステップ３０６）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００３０】
次に、ｐＨが中性付近の洗浄液をろ過器１００内に通水し、ろ過器１００及び膜１０１上に捕捉された夾雑物を洗い流す。バルブ２１７、２１９、２１６を開き洗浄水供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０７）。
【００３１】
洗浄液には、上記のように、例えば、誘出液１００パーセントＰＥＴを希釈した０．１％ＰＥＴ溶液を用いる。この誘出液は「クリプトスポリジウム、解説と試験方法」（日本水道協会）に記載されている誘出液であり、クリプトスポリジウムの試験方法で用いられている。この誘出液のｐＨは、例えば７〜８である。これは粒子の分散剤として用いられている。洗浄液は０．１％ＰＥＴに限らず、ｐＨは中性付近の緩衝液も使用することができ、界面活性剤を含んでいることが好ましい。
【００３２】
一定の洗浄時間が経過した後、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２１６、２１９、２１７を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３０８）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００３３】
次に、バルブ２１７、２２０、２３０を開き洗浄水逆流流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０９）。その後、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３０、２２０、２１７を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３１０）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００３４】
続いて、バルブ２２９、２２０、２３０を開き解離溶液供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ３１１）。このとき予め設定した量の解離溶液が膜１０１上に溜まるまでエアポンプ２０８を作動する。次に、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３０、２２０、２２９を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３１２）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００３５】
続いて、バルブ２１８、２２３を開き試料回収流路を形成し、バルブ２２２を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３１３）。これにより、ろ過器の加圧／吸気口からエアが供給され、ろ過器１００は加圧され、ろ過器内に溜まったクリプトスポリジウムを含む溶液は、試料回収タンク２１４に圧送される。クリプトスポリジウムを含む溶液を回収したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２３、２１８を閉じ、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３１４）。大気開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００３６】
回収したクリプトスポリジウムを含む試料に、蛍光物質により標識され、クリプトスポリジウムと特異的に結合する標識抗体を添加する。蛍光標識されたクリプトスポリジウムを蛍光顕微鏡やフローサイトメーターで検出する。
【００３７】
次に、図２及び図４を用いて、本発明に係る微生物回収方法の第２の実施形態について説明する。図４は、本発明に係る微生物回収方法を実施する第２の実施の形態についてその流れを示す。なお、第２の実施形態では、第１の実施形態での抗体タンク２０３を担体タンク２０５に置き換えた装置を使用する。上述した第１の実施形態と重複する箇所はその説明を省略する。
【００３８】
まず、バルブ２２８、２１９、２１６を開き担体供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ４０１）。次に、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２１６、２１９、２２８を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放として残圧を除く（ステップ４０２）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００３９】
図６（ｂ）には、微生物回収方法を実施する第１の装置における微生物捕捉方法の概念図を示す。担体６１は、磁性担体であり、撹拌子１０６と結合する。また、担体６１は、その表面に複数のアミノ基を有しており、例えば、グルタルアルデヒド等により、抗クリプトスポリジウム抗体６２と共有結合する。
【００４０】
担体６１の粒径は、膜１０１の孔径よりも大きいものとする。例えば、孔径が３μｍである膜１０１を用いてクリプトスポリジウム６３を分離する場合、粒径が５μｍである担体６１を用いる。
【００４１】
次に、河川原水などの環境試料にクリプトスポリジウムの誘出液を終濃度０．１％ＰＥＴになるように添加する。続いて、塩酸を終濃度０．１Ｎ（規定）になるように添加して撹拌する（ステップ４０３）。この試料水を試料タンク２１１に移す（ステップ４０４）。
【００４２】
バルブ２１５、２１６を開き試料供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ４０５）。廃液タンク２１３内は減圧され、ろ過器１００内も減圧されるため試料水はろ過器１００内に吸引される。ろ液は膜１０１を透過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク１１３内に排出される。
【００４３】
クリプトスポリジウム６３は、担体６１の表面上の抗クリプトスポリジウム抗体６２と結合する（図６（ｂ））。ここで、クリプトスポリジウム６３の粒径は４〜６μｍであるため、クリプトスポリジウム６３は、担体６１に捕捉されなくても、膜１０１上に一度捕捉されるが、そのブラウン運動によりやがて担体６１に捕捉される。一方、試料中に含まれる、粒径が３μｍ未満である夾雑物は膜１０１の細孔を通過して排除される。
【００４４】
試料水のろ過が終了したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２１６、２１５を閉じ、バルブ２２４、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放として残圧を除く（ステップ４０６）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００４５】
次に、ｐＨが中性付近の洗浄液をろ過器１００内に通水し、ろ過器１００及び膜１０１上に捕捉された夾雑物を洗い流す。バルブ２１７、２１９、２１６を開き洗浄水供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ４０７）。廃液タンク２１３内は減圧され、ろ過器内も減圧されるため洗浄水タンク２１２の洗浄水はろ過器１００内に吸収される。洗浄水は膜１０１を透過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク２１３内に排出される。このとき、エアポンプ２０８による吸引圧力は負圧圧力計２０９で測定される。膜の破断圧力は６９ｋＰａであるので安全をみて、吸引圧力が４５〜５０ｋＰａになるようにエアポンプ２０８の運転を制御する。
【００４６】
一定の洗浄時間が経過した後、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２１６、２１９、２１７を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ４０８）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。一定の洗浄時間は、廃液のｐＨが中性付近になるまでの時間を予め測定することによって決定される。
【００４７】
次に、バルブ２１７、２２０、２３０を開き洗浄水逆流流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ４０９）。これにより、膜１０１上に捕捉された夾雑物を排除することできる。その後、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３０、２２０、２１７を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ４１０）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００４８】
続いて、バルブ２２９、２２０、２３０を開き解離溶液供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ４１１）。次に、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３０、２２０、２２９を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ４１２）。
【００４９】
続いて、バルブ２１８、２２３を開き試料回収流路を形成し、バルブ２２２を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ４１３）。これにより、ろ過器の加圧／吸気口からエアが供給され、ろ過器１００は加圧され、ろ過器内に溜まったクリプトスポリジウムを含む溶液は、試料回収タンク２１４に圧送される。このとき試料回収口のチューブは膜１０１上の直上まで接近し、ろ過器１００も試料回収口側に傾いており、溶液が試料回収口に溜まっていることが望ましい。
【００５０】
クリプトスポリジウムを含む溶液を回収したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２３、２１８を閉じ、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ４１４）。大気開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００５１】
回収したクリプトスポリジウムを含む試料に、蛍光物質により標識され、クリプトスポリジウムと特異的に結合する標識抗体を添加する。蛍光標識されたクリプトスポリジウムを蛍光顕微鏡やフローサイトメーターで検出する。
【００５２】
次に、図２及び図５を用いて、本発明に係る微生物回収方法の第３の実施形態について説明する。図５は、本発明に係る微生物回収方法を実施する第３の実施の形態についてその流れを示す。なお、第３の実施形態では、図１に示すろ過器１００は撹拌子１０６を備えていない。
【００５３】
図５に従って、第３の実施形態をさらに説明する。なお、上述した第１の実施形態と重複する箇所はその説明を省略する。まず、バルブ２２８、２１９、２１６を開き担体供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ５０１）。次に、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２１６、２１９、２２８を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放として残圧を除く（ステップ５０２）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００５４】
図６（ｃ）には、微生物回収方法を実施する装置における他の微生物捕捉方法の概念図を示す。担体６４は、その表面に複数のアミノ基を有しており、例えば、グルタルアルデヒド等により、抗クリプトスポリジウム抗体６２と共有結合する。担体６４の粒径は、膜１０１の孔径よりも大きいものとする。例えば、孔径が３μｍである膜１０１を用いてクリプトスポリジウム７３を分離する場合、粒径が５μｍである担体７４を用いる。
【００５５】
次に、河川原水などの環境試料に、クリプトスポリジウムの誘出液を終濃度０．１％ＰＥＴになるように添加する。続いて、塩酸を終濃度０．１Ｎ（規定）になるように添加して撹拌する（ステップ５０３）。この試料水を試料タンク２１１に移す（ステップ５０４）。
【００５６】
バルブ２１５、２１６を開き試料供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ５０５）。廃液タンク２１３内は減圧され、ろ過器１００内も減圧されるため試料水はろ過器１００内に吸引される。ろ液は膜１０１を透過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク１１３内に排出される。
【００５７】
クリプトスポリジウム６３は、担体６４の表面上の抗クリプトスポリジウム抗体６２と結合する（図６（ｃ））。ここで、クリプトスポリジウム６３の粒径は４〜６μｍであるため、クリプトスポリジウム６３は、担体６４に捕捉されなくても、膜１０１上に一度捕捉されるが、そのブラウン運動によりやがて担体に捕捉される。一方、試料中に含まれる、粒径が３μｍ未満である夾雑物は膜の細孔を通過して排除される。
【００５８】
次に、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２１６、２１５を閉じ、バルブ２２４、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放として残圧を除く（ステップ５０６）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００５９】
続いて、ｐＨが中性付近の洗浄液をろ過器１００内に通水し、ろ過器１００及び膜１０１上に捕捉された夾雑物を洗い流す。バルブ２１７、２１９、２１６を開き洗浄水供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ５０７）。一定の洗浄時間が経過した後、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２１６、２１９、２１７を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ５０８）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００６０】
次に、クリプトスポリジウムを捕捉した担体を、担体の粒径よりも小さく、かつクリプトスポリジウムの粒径よりも大きい孔径を持つ膜１０１上に移す（ステップ５０９）。ここで、粒径が３μｍ以上で膜１０１の孔径より小さい夾雑物は排除される。なお、担体６４は、膜１０１に対して逆流洗浄を行うことによって、別の場所に移動する。または、膜の一次側を加圧することによって別の場所に移動する。ここで、別の場所としては、図示しない例えば担体収容機器を採用することができる。担体収容機器は、例えば、図１に示すろ過器１００と同様の構成を備えるように構成することができる。
【００６１】
このような構成の担体収容機器は、ろ過器１００と同様に図１の他の機器にラインを通して接続することができる。
このような構成の担体収容機器に対し、バルブ２２９、２２０、２３０を開き解離溶液供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ５１０）。次に、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３０、２２０、２２９を閉じ、バルブ２２４、２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ５１１）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００６２】
続いて、バルブ２１８、２２３を開き試料回収流路を形成し、バルブ２２２を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ５１２）。これにより、ろ過器の加圧／吸気口からエアが供給され、ろ過器１００は加圧され、ろ過器内に溜まったクリプトスポリジウムを含む溶液は、試料回収タンク２１４に圧送される。
【００６３】
クリプトスポリジウムを含む溶液を回収したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２３、２１８を閉じ、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ５１３）。大気開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００６４】
回収したクリプトスポリジウムを含む試料に、蛍光物質により標識され、クリプトスポリジウムと特異的に結合する標識抗体を添加する。蛍光標識されたクリプトスポリジウムを蛍光顕微鏡やフローサイトメーターで検出する。
【００６５】
本明細書において特定の実施形態を例示の目的で説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更を行ってもよい。従って、本発明は、上述した実施形態には限定されず、それらの等価物の全範囲に照らして添付の特許請求の範囲により規定される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明に係る微生物回収方法及び装置のろ過器の概略図である。
【図２】本発明に係る微生物回収方法を実施する装置の構成図である。
【図３】本発明に係る微生物回収方法の第１の実施形態のフローチャートである。
【図４】本発明に係る微生物回収方法の第２の実施形態のフローチャートである。
【図５】本発明に係る微生物回収方法の第３の実施形態のフローチャートである。
【図６】（ａ）第１の実施形態の微生物捕捉方法を示す概念図を示す。（ｂ）第２の実施形態の微生物捕捉方法を示す概念図を示す。（ｃ）第３の実施形態の微生物捕捉方法を示す概念図を示す。
【符号の説明】
【００６７】
１００  ろ過器
１０１  膜
１０２  メッシュクロス
１０３  膜固定パッキン
１０４  フローセル上部
１０５  フローセル下部
１０６  磁石入り撹拌子
２０３  抗体タンク
２０４  解離液タンク
２０５  抗体タンク
２０８  エアポンプ
２０９  負圧圧力計
２１０  正圧圧力計
２１１  試料タンク
２１２  洗浄水タンク
２１３  廃液タンク
２１４  試料回収タンク
２１５〜２２９  バルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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