(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ官能性化合物を含む試料中のアミノ官能性化合物と誘導体化試薬とを反応させて下記一般式（ＩＩ）で示されるアミノ官能性化合物誘導体を生成せしめる工程、
前記アミノ官能性化合物誘導体を段階的な濃度勾配溶出手段を用いる液体クロマトグラフィーにより溶出する工程、及び
前記液体クロマトグラフィーにより溶出されたアミノ官能性化合物誘導体を質量分析法により検出する工程を含み、
前記誘導体化試薬がｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイオド、フェニルイソシアネート、又は３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートであり、
前記段階的な濃度勾配溶出手段が、有機溶媒濃度が段階的に上昇するように有機溶媒の割合を少なくとも２回変化させて最高濃度に達した後に、有機溶媒濃度が低下するように有機溶媒の割合を少なくとも１回変化させ、その後に前記アミノ官能性化合物誘導体のうち少なくとも１つが溶出されるものであり、
前記液体クロマトグラフィーによる溶出工程は、ヒスチジン誘導体、アスパラギン酸誘導体、アルギニン誘導体、ヒドロキシプロリン誘導体、グルタミン酸誘導体、アルギニノコハク酸誘導体、システインスルフィン酸誘導体、システイン酸誘導体、及びβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体の中で最も溶出時間の短いアミノ官能性化合物誘導体とトリプトファン誘導体、リジン誘導体、フェニルアラニン誘導体、１，５−ジアミノペンタン誘導体、ホモロイシン誘導体、トリプタミン誘導体、ホモランチオニン誘導体、チラミン誘導体、システアミン誘導体、プトレシン誘導体、シスタミン誘導体及び２−フェニルエチルアミン誘導体の中で最も溶出時間の長い該誘導体との溶出時間の差が３〜１０分の間にあり、
前記液体クロマトグラフィーは、分離カラムが逆相カラムであり、移動相がギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムの水溶液でｐＨを２．５〜７．５に調整した溶液から選択され、移動相に用いられる有機溶媒がアセトニトリル、メタノール、エタノール、及びこれらと水の混合溶液から選択され、
前記質量分析法による検出工程は、以下の（ａ）群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体、及び（ｂ）〜（ｉ）の少なくとも１つの群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体のそれぞれを分離して検出する
ことを特徴とするアミノ官能性化合物の分析方法。
（ａ）ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、ロイシン誘導体、イソロイシン誘導体、及びノルロイシン誘導体
（ｂ）ザルコシン誘導体、β−アラニン誘導体、及びアラニン誘導体
（ｃ）γ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、β−アミノイソ酪酸誘導体、α−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、α−アミノイソ酪酸誘導体、及びβ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体
（ｄ）１−メチルヒスチジン誘導体、及び３−メチルヒルチジン誘導体
（ｅ）ホモセリン誘導体、及びスレオニン誘導体
（ｆ）５−アミノ吉草酸誘導体、バリン誘導体、及びノルバリン誘導体
（ｇ）４−アミノ安息香酸誘導体、アンスラニル酸誘導体
（ｈ）グルタミン酸誘導体、Ｏ−アセチルセリン誘導体
（ｉ）アンセリン誘導体、ホモカルノシン誘導体
【化１】
0005030586.tif 000014
（式中、Ａｒ２は芳香族性を示す炭素環化合物残基又は複素環化合物残基を表し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｙは酸素原子、硫黄原子、第２級アミン、第３級アミン、又は置換基を有していてもよいメチレン基を表し、Ｒ１は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基又は環を形成する炭素原子を表し、Ｒ２は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。）
【請求項２】
前記アミノ官能性化合物誘導体が、フェニルカルバミルアミノ官能性化合物、３−ピリジルカルバミルアミノ官能性化合物、又はｐ−トリメチルアンモニウムアニリルカルバミルアミノ官能性化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノ官能性化合物が、アスパラギン、アスパラギン酸、Ｏ−アセチルセリン、Ｎα−アセチルリジン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、Ｓ−アミノエチルシステイン、ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、α−アミノアジピン酸、４−アミノ安息香酸、α−アミノイソ酪酸、β−アミノイソ酪酸、５−アミノ吉草酸、α−アミノピメリン酸、α−アミノ−ｎ−酪酸、β−アミノ−ｎ−酪酸、γ−アミノ−ｎ−酪酸、β−アラニン、アラニン、アルギニノコハク酸、アルギニン、アンセリン、アンスラニル酸、イソロイシン、エタノールアミン、エチオニン、エピネフリン、オルニチン、ガラクトサミン、カルノシン、キヌレニン、グリシン、グルタチオン還元型、グルタチオン酸化型、グルタミン、グルタミン酸、サッカロピン、ザルコシン、β−シアノアラニン、α，ε−ジアミノピメリン酸、１，５−ジアミノペンタン、α，γ−ジアミノ酪酸、ジエンコル酸、シスタチオニン、シスタミン、シスチン、システアミン、システイン、システイン酸、システインスルフィン酸、シトルリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジメチルアミン、スレオニン、セリン、タウリン、チラミン、チロシン、テアニン、トリプタミン、トリプトファン、Ｎε，Ｎε，Ｎε−トリメチルリジン、ノルエピネフリン、ノルバリン、ノルロイシン、バリン、ヒスタミン、ヒスチジノール、ヒスチジン、β−ヒドロキシアスパラギン酸、３−ヒドロキシアンスラニル酸、３−ヒドロキシキヌレニン、ヒドロキシチラミン、５−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ピペコリン酸、ヒポタウリン、フェニルアラニン、２−フェニルエチルアミン、フェニルグリシン、プトレシン、プロリン、プロリンアミド、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｏ−ホスホエタノールアミン、ホモアルギニン、ホモカルノシン、ホモシスチン、ホモシステイン、ホモシトルリン、ホモセリン、ホモランチオニン、ホモロイシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、β−Ｎ−メチルアミノアラニン、メチルアミン、１−メチルヒスタミン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、モノメチルエタノールアミン、ランチオニン、リジン、及びロイシンの少なくとも１種である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
アミノ官能性化合物の分析装置であって、
試料中のアミノ官能性化合物と誘導体化試薬とを反応させて下記一般式（ＩＩ）で示されるアミノ官能性化合物誘導体を生成させる反応部と、
前記アミノ官能性化合物誘導体を溶出するクロマトグラフ部と、
前記クロマトグラフ部からの溶出液に含まれるアミノ官能性化合物誘導体を検出する質量分析部とを備え、
前記誘導体化試薬がｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイオド、フェニルイソシアネート、又は３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートであり、
前記クロマトグラフ部が、分離カラム及び当該カラムに段階的な濃度勾配を有する溶出液を供給する送液系を備え、前記分離カラムが逆相カラムであり、
前記クロマトグラフ部は、移動相がギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムの水溶液でｐＨを２．５〜７．５に調整した溶液から選択され、移動相に用いられる有機溶媒がアセトニトリル、メタノール、エタノール、及びこれらと水の混合溶液から選択され、有機溶媒濃度が段階的に上昇するように有機溶媒の割合を少なくとも２回変化させて最高濃度に達した後に、有機溶媒濃度が低下するように有機溶媒の割合を少なくとも１回変化させ、その後に前記アミノ官能性化合物誘導体のうち少なくとも１つが溶出されるように設定され、
前記クロマトグラフ部は、ヒスチジン誘導体、アスパラギン酸誘導体、アルギニン誘導体、ヒドロキシプロリン誘導体、グルタミン酸誘導体、アルギニノコハク酸誘導体、システインスルフィン酸誘導体、システイン酸誘導体、及びβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体の中で最も溶出時間の短いアミノ官能性化合物誘導体とトリプトファン誘導体、リジン誘導体、フェニルアラニン誘導体、１，５−ジアミノペンタン誘導体、ホモロイシン誘導体、トリプタミン誘導体、ホモランチオニン誘導体、チラミン誘導体、システアミン誘導体、プトレシン誘導体、シスタミン誘導体及び２−フェニルエチルアミン誘導体の中で最も溶出時間の長い該誘導体との溶出時間の差が３〜１０分の間に設定され、
前記質量分析部が、以下の（ａ）群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体、及び（ｂ）〜（ｉ）の少なくとも１つの群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体のそれぞれを分離して検出する
ことを特徴とする分析装置。
（ａ）ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、ロイシン誘導体、イソロイシン誘導体、及びノルロイシン誘導体
（ｂ）ザルコシン誘導体、β−アラニン誘導体、及びアラニン誘導体
（ｃ）γ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、β−アミノイソ酪酸誘導体、α−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、α−アミノイソ酪酸誘導体、及びβ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体
（ｄ）１−メチルヒスチジン誘導体、及び３−メチルヒルチジン誘導体
（ｅ）ホモセリン誘導体、及びスレオニン誘導体
（ｆ）５−アミノ吉草酸誘導体、バリン誘導体、及びノルバリン誘導体
（ｇ）４−アミノ安息香酸誘導体、アンスラニル酸誘導体
（ｈ）グルタミン酸誘導体、Ｏ−アセチルセリン誘導体
（ｉ）アンセリン誘導体、ホモカルノシン誘導体
【化２】
0005030586.tif 000015
（式中、Ａｒ２は芳香族性を示す炭素環化合物残基又は複素環化合物残基を表し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｙは酸素原子、硫黄原子、第２級アミン、第３級アミン、又は置換基を有していてもよいメチレン基を表し、Ｒ１は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基又は環を形成する炭素原子を表し、Ｒ２は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。）
【請求項５】
前記アミノ官能性化合物が、アスパラギン、アスパラギン酸、Ｏ−アセチルセリン、Ｎα−アセチルリジン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、Ｓ−アミノエチルシステイン、ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、α−アミノアジピン酸、４−アミノ安息香酸、α−アミノイソ酪酸、β−アミノイソ酪酸、５−アミノ吉草酸、α−アミノピメリン酸、α−アミノ−ｎ−酪酸、β−アミノ−ｎ−酪酸、γ−アミノ−ｎ−酪酸、β−アラニン、アラニン、アルギニノコハク酸、アルギニン、アンセリン、アンスラニル酸、イソロイシン、エタノールアミン、エチオニン、エピネフリン、オルニチン、ガラクトサミン、カルノシン、キヌレニン、グリシン、グルタチオン還元型、グルタチオン酸化型、グルタミン、グルタミン酸、サッカロピン、ザルコシン、β−シアノアラニン、α，ε−ジアミノピメリン酸、１，５−ジアミノペンタン、α，γ−ジアミノ酪酸、ジエンコル酸、シスタチオニン、シスタミン、シスチン、システアミン、システイン、システイン酸、システインスルフィン酸、シトルリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジメチルアミン、スレオニン、セリン、タウリン、チラミン、チロシン、テアニン、トリプタミン、トリプトファン、Ｎε，Ｎε，Ｎε−トリメチルリジン、ノルエピネフリン、ノルバリン、ノルロイシン、バリン、ヒスタミン、ヒスチジノール、ヒスチジン、β−ヒドロキシアスパラギン酸、３−ヒドロキシアンスラニル酸、３−ヒドロキシキヌレニン、ヒドロキシチラミン、５−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ピペコリン酸、ヒポタウリン、フェニルアラニン、２−フェニルエチルアミン、フェニルグリシン、プトレシン、プロリン、プロリンアミド、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｏ−ホスホエタノールアミン、ホモアルギニン、ホモカルノシン、ホモシスチン、ホモシステイン、ホモシトルリン、ホモセリン、ホモランチオニン、ホモロイシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、β−Ｎ−メチルアミノアラニン、メチルアミン、１−メチルヒスタミン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、モノメチルエタノールアミン、ランチオニン、リジン、及びロイシンの少なくとも１種である請求項４に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸、ペプチド、及びアミノ酸類似物質等のアミノ官能性化合物を、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）により迅速、簡便且つ高感度に分析する方法、及びそのための装置等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のアミノ酸は、アミノ酸代謝異常症等の疾患の鑑別に有用である。例えば、先天的アミノ酸代謝異常症の診断、肝機能不全の重症度判定や治療の指標、及び栄養状態不良の患者の病態把握などに用いられる。最も有名な例としては、バリン、ロイシン、イソロイシンは分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）と呼ばれ、劇症肝炎や肝不全などの重症肝疾患において合成が低下する。一方、芳香族アミノ酸（ＡＡＡ）であるフェニルアラニンは主として肝臓で代謝を受けるため、代謝が阻害されると血中濃度が上昇する。この結果、両者の比であるＢＣＡＡ／ＡＡＡ比は低値となり、その程度は肝疾患の重症度を反映する。ＢＣＡＡ／ＡＡＡ比は一般にフィッシャー比（Fischer比）と呼ばれ、従来から肝疾患の重症度の判定に用いられてきた（例えば、非特許文献１参照）。また、糖尿病ではフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、バリンが上昇し、アラニンが減少することが知られている（例えば、非特許文献２参照）。【０００３】
アミノ酸の分析法については、ポストカラム誘導体化を原理とするアミノ酸分析計を用いる場合が多い。この方法は、通常、陽イオン交換カラムによりアミノ酸を分離した後、ニンヒドリン発色を行なうが、分析時間が長いことが短所である。最近の研究では、分離カラムや緩衝液の流速等を工夫することにより、タンパク質加水分解物アミノ酸約２０種類を対象とした標準分析法の分析時間は約２０分となっている（例えば、特許文献１参照）。一方、プレカラム誘導体化反応に基づくアミノ酸分析法もさかんに研究されている。タンパク質構成アミノ酸であれば、フェニルイソチオシアネートを試薬とするプレカラム誘導体化法により、約４．５分で分析が可能である。また、本発明者らによって開発された分析試薬を用いるＬＣ−ＭＳ法では、２０種類のアミノ酸を２．８分で分析可能であることが示されているが（例えば、特許文献２参照）、この例ではロイシンとイソロイシンは分離せず、それぞれを同時に分析することはできない。【０００４】
生体内には、タンパク質構成アミノ酸だけでなく、数多くのアミノ酸類似物質が存在する。代表的なものに、タウリン、Ｏ−ホスホエタノールアミン、ヒドロキシプロリン、メチオニンスルホキシド、ザルコシン、α−アミノアジピン酸、シトルリン、α−アミノ−ｎ−酪酸、ピペコリン酸、ホモシステイン、ホモシトルリン、アロイソロイシン、サッカロピン、シスタチオニン、アルギニノコハク酸、システイン−ホモシステイン、β−アラニン、アミノレブリン酸、β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）、γ−アミノ−ｎ−酪酸（ＧＡＢＡ）、ホモシスチン（Ｈｃｙｓ２）、アルギニノコハク酸アンヒドライド、ヒドロキシリジン、アミノエチルシステイン、オルニチン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒルチジンなどであり、生体液に含まれるこれらのアミノ酸類似物質には、様々な生理機能が発見或いは解明されつつある。陽イオン交換カラムによりアミノ酸及びアミノ酸類似物質（これらを総称してアミノ官能性化合物と呼ぶ。）を分離し、ニンヒドリン発色を行なうポストカラム誘導体化を原理とする分析法によれば、これらアミノ官能性化合物４１成分の分析時間は最短でも６０分であり、また、５３成分では１４８分である。（例えば、特許文献３参照。）このような分析時間の長さは、アミノ酸の生理機能研究を妨げる大きな要因の一つとなっている。また、アミノ酸と健康や疾病を関連付ける新たな知見が発見されたとしても、このような処理能力では、その情報を有効に使うことはできない。【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２４３７１５号公報
【特許文献２】国際公開第０３／０６９３２８号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−７１６６０号公報
【非特許文献１】フィッシャー(Fischer JE)外５名、「サージャリー(Surgery)」１９７６年７月、第８０巻、ｐ．７７−９１
【非特許文献２】フェーリッヒ(Felig P)外３名、「糖尿病(Diabetes)」１９７０年、１０月、第１９巻、ｐ．７２７−７２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生体内に含まれる多種類のアミノ酸及びその誘導体、並びにアミノ酸類似物質を含むアミノ官能性化合物を、従来法よりも極めて迅速、簡便且つ高感度に分析する方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らはＬＣ／ＭＳ法によるアミノ官能性化合物の分析方法について種々の改良及び最適化を行った。すなわち、質量分析法において質量が同一であるために分離して検出することが困難な複数のアミノ官能性化合物を液体クロマトグラフィーによって予め分離、溶出し、続いて質量分析法により分離、検出することによって極めて迅速、簡便且つ高感度に多種類のアミノ官能性化合物を同時に分析できることを見出して本発明を完成するに至った。【０００８】
従って、第１の視点において、アミノ官能性化合物を含む試料中のアミノ官能性化合物と誘導体化試薬とを反応させて下記一般式（ＩＩ）で示されるアミノ官能性化合物誘導体を生成せしめる工程、
前記アミノ官能性化合物誘導体を段階的な濃度勾配溶出手段を用いる液体クロマトグラフィーにより溶出する工程、及び
前記液体クロマトグラフィーにより溶出されたアミノ官能性化合物誘導体を質量分析法により検出する工程を含み、
前記誘導体化試薬がｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイオド、フェニルイソシアネート、又は３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートであり、
前記段階的な濃度勾配溶出手段が、有機溶媒濃度が段階的に上昇するように有機溶媒の割合を少なくとも２回変化させて最高濃度に達した後に、有機溶媒濃度が低下するように有機溶媒の割合を少なくとも１回変化させ、その後に前記アミノ官能性化合物誘導体のうち少なくとも１つが溶出されるものであり、
前記液体クロマトグラフィーによる溶出工程は、ヒスチジン誘導体、アスパラギン酸誘導体、アルギニン誘導体、ヒドロキシプロリン誘導体、グルタミン酸誘導体、アルギニノコハク酸誘導体、システインスルフィン酸誘導体、システイン酸誘導体、及びβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体の中で最も溶出時間の短いアミノ官能性化合物誘導体とトリプトファン誘導体、リジン誘導体、フェニルアラニン誘導体、１，５−ジアミノペンタン誘導体、ホモロイシン誘導体、トリプタミン誘導体、ホモランチオニン誘導体、チラミン誘導体、システアミン誘導体、プトレシン誘導体、シスタミン誘導体及び２−フェニルエチルアミン誘導体の中で最も溶出時間の長い該誘導体との溶出時間の差が３〜１０分の間にあり、
前記液体クロマトグラフィーは、分離カラムが逆相カラムであり、移動相がギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムの水溶液でｐＨを２．５〜７．５に調整した溶液から選択され、移動相に用いられる有機溶媒がアセトニトリル、メタノール、エタノール、及びこれらと水の混合溶液から選択され、
前記質量分析法による検出工程は、以下の（ａ）群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体、及び（ｂ）〜（ｉ）の少なくとも１つの群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体のそれぞれを分離して検出する
ことを特徴とするアミノ官能性化合物の分析方法が提供される。
（ａ）ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、ロイシン誘導体、イソロイシン誘導体、及びノルロイシン誘導体
（ｂ）ザルコシン誘導体、β−アラニン誘導体、及びアラニン誘導体
（ｃ）γ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、β−アミノイソ酪酸誘導体、α−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、α−アミノイソ酪酸誘導体、及びβ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体
（ｄ）１−メチルヒスチジン誘導体、及び３−メチルヒルチジン誘導体
（ｅ）ホモセリン誘導体、及びスレオニン誘導体
（ｆ）５−アミノ吉草酸誘導体、バリン誘導体、及びノルバリン誘導体
（ｇ）４−アミノ安息香酸誘導体、アンスラニル酸誘導体
（ｈ）グルタミン酸誘導体、Ｏ−アセチルセリン誘導体
（ｉ）アンセリン誘導体、ホモカルノシン誘導体
【０００９】
【化１】
0005030586.tif 000002
（式中、Ａｒ２は芳香族性を示す炭素環化合物残基又は複素環化合物残基を表し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｙは酸素原子、硫黄原子、第２級アミン、第３級アミン、又は置換基を有していてもよいメチレン基を表し、Ｒ１は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基又は環を形成する炭素原子を表し、Ｒ２は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。）
【００１０】
また、第２の視点において、アミノ官能性化合物の分析装置であって、
試料中のアミノ官能性化合物と誘導体化試薬とを反応させて上記一般式（ＩＩ）で示されるアミノ官能性化合物誘導体を生成させる反応部と、
前記アミノ官能性化合物誘導体を溶出するクロマトグラフ部と、
前記クロマトグラフ部からの溶出液に含まれるアミノ官能性化合物誘導体を検出する質量分析部とを備え、
前記誘導体化試薬がｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイオド、フェニルイソシアネート、又は３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートであり、
前記クロマトグラフ部が、分離カラム及び当該カラムに段階的な濃度勾配を有する溶出液を供給する送液系を備え、前記分離カラムが逆相カラムであり、
前記クロマトグラフ部は、移動相がギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムの水溶液でｐＨを２．５〜７．５に調整した溶液から選択され、移動相に用いられる有機溶媒がアセトニトリル、メタノール、エタノール、及びこれらと水の混合溶液から選択され、有機溶媒濃度が段階的に上昇するように有機溶媒の割合を少なくとも２回変化させて最高濃度に達した後に、有機溶媒濃度が低下するように有機溶媒の割合を少なくとも１回変化させ、その後に前記アミノ官能性化合物誘導体のうち少なくとも１つが溶出されるように設定され、
前記クロマトグラフ部は、ヒスチジン誘導体、アスパラギン酸誘導体、アルギニン誘導体、ヒドロキシプロリン誘導体、グルタミン酸誘導体、アルギニノコハク酸誘導体、システインスルフィン酸誘導体、システイン酸誘導体、及びβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体の中で最も溶出時間の短いアミノ官能性化合物誘導体とトリプトファン誘導体、リジン誘導体、フェニルアラニン誘導体、１，５−ジアミノペンタン誘導体、ホモロイシン誘導体、トリプタミン誘導体、ホモランチオニン誘導体、チラミン誘導体、システアミン誘導体、プトレシン誘導体、シスタミン誘導体及び２−フェニルエチルアミン誘導体の中で最も溶出時間の長い該誘導体との溶出時間の差が３〜１０分の間に設定され、
前記質量分析部が、以下の（ａ）群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体、及び（ｂ）〜（ｉ）の少なくとも１つの群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体のそれぞれを分離して検出する
ことを特徴とする分析装置が提供される。
（ａ）ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、ロイシン誘導体、イソロイシン誘導体、及びノルロイシン誘導体
（ｂ）ザルコシン誘導体、β−アラニン誘導体、及びアラニン誘導体
（ｃ）γ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、β−アミノイソ酪酸誘導体、α−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、α−アミノイソ酪酸誘導体、及びβ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体
（ｄ）１−メチルヒスチジン誘導体、及び３−メチルヒルチジン誘導体
（ｅ）ホモセリン誘導体、及びスレオニン誘導体
（ｆ）５−アミノ吉草酸誘導体、バリン誘導体、及びノルバリン誘導体
（ｇ）４−アミノ安息香酸誘導体、アンスラニル酸誘導体
（ｈ）グルタミン酸誘導体、Ｏ−アセチルセリン誘導体
（ｉ）アンセリン誘導体、ホモカルノシン誘導体
【００１１】
本発明の他の好ましい実施形態は、以下の発明を実施するための最良の形態において詳細に示される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、代表的な生体アミノ官能性化合物約４０種類を短時間で、例えば、１０分以内で分析することができ、従来のアミノ酸分析計に比べて分析時間を著しく短縮することができる。従来は、ロイシンやイソロイシンのような質量の同じアミノ酸については質量分析法のみでは同時分析は困難であったが、本発明の方法により、これらの生体アミノ酸を含む１００種類以上のアミノ官能性化合物を同時に、且つ極めて短時間に分析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の方法において、アミノ官能性化合物誘導体を生成する典型的な反応式を示す。
【図２】本発明の方法において、液体クロマトグラフィーの段階的な濃度勾配溶出パターンの典型的な例を示す。
【図３】本発明の１つの実施形態に係るアミノ官能性化合物の分析装置の構成図である。
【図４（ａ）】実施例の例２：分析例１において、４０種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図４（ｂ）】実施例の例２：分析例１において、４０種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図４（ｃ）】実施例の例２：分析例１において、４０種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図５（ａ）】実施例の例３：分析例２において、４０種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図５（ｂ）】実施例の例３：分析例２において、４０種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図５（ｃ）】実施例の例３：分析例２において、４０種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図６（ａ）】実施例の例４：分析例３において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図６（ｂ）】実施例の例４：分析例３において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図６（ｃ）】実施例の例４：分析例３において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図７（ａ）】実施例の例５：分析例４において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図７（ｂ）】実施例の例５：分析例４において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図７（ｃ）】実施例の例５：分析例４において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図８（ａ）】実施例の例６：分析例５において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図８（ｂ）】実施例の例６：分析例５において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図８（ｃ）】実施例の例６：分析例５において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図９】実施例の例７：分析例６において、１７種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１０（ａ）】実施例の例９：分析例７において、１０６種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１０（ｂ）】実施例の例９：分析例７において、１０６種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１０（ｃ）】実施例の例９：分析例７において、１０６種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１０（ｄ）】実施例の例９：分析例７において、１０６種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１０（ｅ）】実施例の例９：分析例７において、１０６種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１１（ａ）】実施例の例１０：分析例８において、３８種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１１（ｂ）】実施例の例１０：分析例８において、３８種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１１（ｃ）】実施例の例１０：分析例８において、３８種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１２（ａ）】実施例の例１２：分析例９において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１２（ｂ）】実施例の例１２：分析例９において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１２（ｃ）】実施例の例１２：分析例９において、３９種類のアミノ官能性化合物を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【符号の説明】
【００１４】
１０  反応部
２０  クロマトグラフ部
２１  分離カラム
２２  インジェクションバルブ
２３ａ、２３ｂ  ポンプ
２４ａ、２４ｂ  溶離液
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（定義）
本発明において、「アミノ官能性化合物」とは、分子内に第１級アミン及び／又は第２級アミンを有する化合物（塩の形態でもよい。）を意味し、これらの第１級アミンや第２級アミンは１個でも複数でもよい。また、試料中に存在するアミノ官能性化合物は１種でも複数種の混合物でもよい。当該アミノ官能性化合物としては、アミン類（第１級アミン、第２級アミン等）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリアミン等を挙げることができ、具体的には、下記の表１に示したものが含まれる。このような化合物を複数種含んでいてもよい。例えば、アミノ酸の複数種混合物、アミノ酸１種以上とペプチド１種以上の混合物、アミノ酸１種以上とアミン１種以上の混合物等を挙げることができる。【００１６】
【表１】
0005030586.tif 000003
【００１７】
「誘導体化試薬」とは、上記アミノ官能性化合物と反応させて下記一般式（Ｉ）で示されるアミノ官能性化合物誘導体を生成することができる試薬をいう。【００１８】
【化２】
0005030586.tif 000004
（式中、Ａｒ１は置換基を有してもよい炭化水素、又は芳香族性を示す炭素環若しくは複素環を含む置換基を表し、Ｒ１は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基又は環を形成する炭素原子を表し、Ｒ２は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、Ａｒ１とＲ１、又はＲ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。）。上記式（Ｉ）において、Ａｒ１と窒素原子との結合は、芳香族性を示す炭素環又は複素環が直接窒素原子に結合する場合のほか、カルボニル基（−ＣＯ−）やアミド基（−ＮＨＣＯ−）等を介して窒素原子と結合してもよく、或いは当該窒素原子が炭素環又は複素環の一部を構成してもよい。このようなアミノ官能性化合物誘導体の構造としては、例えば：【００１９】
【化３】
0005030586.tif 000005
【００２０】
【化４】
0005030586.tif 000006
【００２１】
【化５】
0005030586.tif 000007
を例示することができる。上記一般式（Ｉ）におけるＲ１は水素原子又は上記（Ｂ）の化合物の場合には、環を形成する炭素原子となる場合がある。アミノ官能性化合物がアミノ酸の場合、Ｒ２は置換基として少なくともカルボキシル基を有するアルキル基を意味する。当該アミノ酸がプロリンの場合はＲ１とＲ２は一緒になって環を形成している。アミノ官能性化合物にはアミノ酸以外の種々の化合物を含み、この場合にはＲ２はカルボキシル基以外の置換基、例えば、水酸基、スルホン酸基、フェニル基等を有していてもよいアルキル基である。【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、上記アミノ官能性化合物誘導体は、下記一般式（ＩＩ）で示される化合物である。【００２３】
【化６】
0005030586.tif 000008
（式中、Ａｒ２は芳香族性を示す炭素環化合物残基又は複素環化合物残基を表し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｙは酸素原子、硫黄原子、第２級アミン、第３級アミン、又は置換基を有していてもよいメチレン基を表し、Ｒ１は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基又は環を形成する炭素原子を表し、Ｒ２は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。）【００２４】
従って、一つの実施形態において、上記アミノ官能性化合物誘導体は、フェニルカルバミルアミノ官能性化合物、３−ピリジルカルバミルアミノ官能性化合物、フェニルチオカルバミルアミノ官能性化合物、３−ピリジルチオカルバミルアミノ官能性化合物、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリルカルバミルアミノ官能性化合物、又はｐ−ジメチルアンモニウムアニリルカルバミルアミノ官能性化合物である。【００２５】
このようなアミノ官能性化合物誘導体を生成せしめるための誘導体化試薬としては種々のものが使用されるが、好ましくは下記一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で示される置換イソチオシアネート芳香族化合物、置換イソシアネート芳香族化合物、置換スクシンイミジルカルバメート芳香族化合物、置換カルバモイルハライド芳香族化合物、又は置換カルバモイルアルコキシ芳香族化合物が挙げられる。【００２６】
【化７】
0005030586.tif 000009
【００２７】
【化８】
0005030586.tif 000010
（式中、Ａｒ２は芳香族性を示す炭素環化合物残基又は複素環化合物残基を表し、Ｒ’はフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基、又はアルコキシ基を表し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｙは酸素原子、硫黄原子、第２級アミン、第３級アミン、又は置換基を有していてもよいメチレン基を表す。）【００２８】
より具体的には、例えば、以下の表２に示したようなアミノ基と反応性の高い公知の化合物を用いることができる。【００２９】
【表２】
0005030586.tif 000011
【００３０】
或いは、本発明の特に好ましい実施形態として、本発明者らによって上記特許文献２に報告されている下記一般式（Ｖ）で示されるカルバメート化合物を含有する誘導体化試薬が挙げられる。【００３１】
【化９】
0005030586.tif 000012
上記式中、カルバメート基の窒素原子に結合するＡｒ２は芳香属性を示す炭素環化合物又は複素環化合物残基を表し、当該芳香環は一つ以上の置換基を有していてもよく、Ａｒ２基とカルバメート基の窒素原子との結合はＡｒ２基中当該環を構成する炭素原子と当該カルバメート基の窒素原子とが結合し、当該カルバメート化合物は塩の形態であってもよい。【００３２】
当該式（Ｖ）において、Ａｒ２に関し、炭素環化合物残基としてそれぞれ置換基を有していてもよいフェニル基、ナフチル基（１−及び２−ナフチル基）、アントリル基（１−、２−及び５−アントリル基）等を、また、複素環化合物残基としてそれぞれ置換基を有していてもよいピリジル基（２−、３−及び４−ピリジル基）、ピラジル基、キノリル基（２〜８−キノリル基）、アクリジル基（１〜４−及び９−アクリジル基）、クマリル基（５〜８−クマリル基）等を挙げることができる。当該基は芳香環に置換基を一つ以上有することができる。置換基として、炭素数１〜５のアルキル基、ナフチル基、フェニル基等の芳香族基、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、カルボキシル基、水酸基、ニトロ基、ジアゾ基、シアノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数２〜７のアシル基（アセチル基、ベンゾイル基等）、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基等を挙げることができる。アミノ官能性化合物を高感度で検出するためには、中でも、極性置換基、特に溶液中でイオン化し易い置換基を有することが好ましく、例えばスルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基等を挙げることができる。【００３３】
Ａｒ２の具体な例として、下記の基を挙げることができる：
フェニル基、ナフチル基（１−及び２−ナフチル基）、アントリル基（１−、２−及び５−アントリル基）、ピリジル基（２−、３−及び４−ピリジル基）、ピラジル基、キノリル基（３−、６−及び８−キノリル基）、９−アクリジル基、６−クマリル基、ｐ−ジアルキルアミノフェニル基、ｐ−トリアルキルアンモニウムフェニル基、１−（３−トリアルキルアンモニウム）ナフチル基、１−（５−トリアルキルアンモニウム）ナフチル基、１−（３−ジアルキルアミノ）ナフチル基、１−（５−ジアルキルアミノ）ナフチル基、ｐ−スルホフェニル基、１−（３−スルホ）ナフチル基、１−（５−スルホ）ナフチル基、ｐ−ホスホフェニル基、１−（３−ホスホ）ナフチル基、１−（５−ホスホ）ナフチル基、ｐ−グアニジノフェニル基、１−（３−グアニジノ）ナフチル基、１−（５−グアニジノ）ナフチル基等。上記ジアルキルアミノ基及びトリアルキルアンモニウム基のアルキル基はそれぞれ独立的に、炭素数１〜５のアルキル基を表すことができる。これらの誘導体化試薬の調製方法及びそれらを用いたアミノ酸の標識方法は、上記特許文献２に詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。【００３４】
（本発明の分析方法）
本発明の分析方法における上記アミノ官能性化合物と誘導体化試薬との反応（標識化反応）には特に困難は無い。反応条件は、このような試薬を用いて標識する場合の一般的な条件（Iwaki, K., Yoshida, S., Nimura, N., Kinoshita, T., Takeda, K., and Ogura, H., Chromatographia 23 899 (1987)参照。）を用いればよいが、好ましくはアミノ官能性化合物をｐＨ値８〜１０程度の環境下で、アルコール類を除く適当な有機溶媒で溶解した溶液と誘導体化試薬とを混合した後、６０℃程度に加熱する等の条件を好適に採用することができる。誘導体化試薬の使用量については、アミノ官能性化合物の量、特にその中に含まれる全第１級アミン及び第２級アミンの量を考慮して、アミノ官能性化合物に対し、１０〜１０００倍モル（当量）程度、好ましくは１００〜１０００倍モル（当量）程度使用し、全てのアミノ基、イミノ基に対して標識できるようにする。【００３５】
アミノ官能性化合物、例えばアミノ酸は図１に示したような反応によりアミノ官能性化合物誘導体とすることができる。図１（ａ）の反応式によれば、アミノ酸を異なる誘導体化試薬であるフェニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＰＡＨＳ）又はフェニルイソシアネート（ＰＩＣ）と反応させた場合にも同一のアミノ官能性化合物誘導体が生成することが示される。同様に、図１（ｂ）では、アミノ酸を３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）又はピリジルイソシアネート（ＰｙＩＣ）と反応させた場合にも同一のアミノ官能性化合物誘導体が生成することが分かる。従って、本発明の方法は、誘導体化反応の結果生じたアミノ官能性化合物誘導体の構造が上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される構造である点に特徴を有し、それらの構造を有する限り、どのような誘導体化試薬を用いて反応を行う方法も本発明の範囲に含まれる。【００３６】
本発明の分析方法における「液体クロマトグラフィー」とは、液体を移動相とするクロマトグラフィーによる分離手法であって、固定相カラムを選択することによって加圧下で操作が可能な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）として種々の用途に用いられている。分離機構は、分配、吸着、イオン交換、サイズ排除等の種々の機構に分類されるが、最も頻繁に使用されるカラムは逆相固定相で分配によって分離され、試料はより極性の低い固定相に保持され、極性を持つ移動相によって溶出される。【００３７】
「段階的な濃度勾配溶出手段（ステップワイズグラジエント）」とは、移動相の極性や塩強度などを段階的に変化させることであって、例えば、溶離液に含まれる有機溶媒の割合を図２に示したように変化させることをいう。図２において、溶離液に含まれる有機溶媒の割合は分析時間の経過と共に階段的に変化するが、濃度勾配の無い状態又は緩やかな濃度勾配の状態から、それよりも急激な濃度勾配を有する状態へと非直線的に変化することをいう。好ましくは、有機溶媒の割合を少なくとも２回、より好ましくは３回以上変化させることにより効率的な分離を行うことができる。なお、最適なステップワイズグラジエントは、分析対象となるアミノ官能性化合物誘導体の種類や用いる有機溶媒の種類によって異なる。また、分離能は溶出時間を長くすると改善されるため、直線的な濃度勾配溶出手段（リニアーグラジエント法）を用いた場合にも溶出時間を長くすることによって本発明と同様の効果が得られる場合もある。用いる有機溶媒としてはカラムの充填剤やサイズなどの種類に併せて種々の溶媒を適宜選択することができるが、例えば、逆相カラムを用いたＨＰＬＣの場合には、酸としてはギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ヘプタフルオロ酪酸を、塩基としては、アンモニア、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミンを、また、これらの塩溶液によってｐＨを調製した溶液、望ましくは、ギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムの５〜５０ｍＭ水溶液でｐＨを２．５〜７．５に調整した溶液、また有機溶媒としてはアセトニトリル、メタノール、エタノール、及びこれらと水の混合溶液を用いることが好ましい。【００３８】
上記液体クロマトグラフィーによる溶出工程における好ましい実施形態において、ヒスチジン誘導体、アスパラギン酸誘導体、アルギニン誘導体、ヒドロキシプロリン誘導体、グルタミン酸誘導体、アルギニノコハク酸誘導体、システインスルフィン酸誘導体、システイン酸誘導体、及びβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体の中で最も溶出時間の短いアミノ官能性化合物誘導体とトリプトファン誘導体、リジン誘導体、フェニルアラニン誘導体、１，５−ジアミノペンタン誘導体、ホモロイシン誘導体、トリプタミン誘導体、ホモランチオニン誘導体、チラミン誘導体、システアミン誘導体、プトレシン誘導体、シスタミン誘導体及び２−フェニルエチルアミン誘導体の中で最も溶出時間の長い該誘導体との溶出時間の差が３〜２０分の間、より好ましくは３〜１０分の間に設定することができる。迅速な分析を行うためには、この溶出時間差をできるだけ短くした方がよいが、用いる分離カラムの性能と対象サンプルの種類を考慮して当該溶出時間差を適宜設定することができる。【００３９】
本発明において使用する質量分析法は、上記液体クロマトグラフィーにより溶出されるアミノ官能性化合物をエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、及びソニックスプレーイオン化法（ＳＳＩ）などの方法で正イオンあるいは負イオンにイオン化し、気相で測定する方法である。生じたイオンは四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、及び磁場型などの質量分離装置にかけられ、質量と電荷の比により分離される。さらに三連四重極型の装置のように質量分離装置を複数個直列につなぐことにより（ＭＳ／ＭＳ）、選択性の高い測定が可能になる。【００４０】
例えば、三連四重極装置においては、１番目の四重極でアミノ官能性化合物誘導体の質量を測定した後、注目するアミノ官能性化合物誘導体のみを２番目の四重極に送り込んで、そこで衝突誘起解離（Collision-induced dissociation; CID）によってフラグメント化し、そのフラグメントの質量を３番目の四重極で極めて高感度に測定することができる。【００４１】
このことを利用して、下記に示す２種類の測定方法、即ち、プリカーサーイオンスキャン法（Precursor Ion Scan）、セレクテッドリアクションモニタリング法（Selected Reaction Monitoring (SRM)法）により、第一のマスアナライザーでアミノ官能性化合物と前記標識試薬との反応体のイオンを、第二のマスアナライザーで試薬由来のフラグメントイオンを検出することで極めて選択性が高く、高感度な分析を達成することができる。【００４２】
このような方法に用いる誘導体化試薬としては、ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＤＡＨＳ）、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）、アミノピラジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート（ＡＱＣ）、９−アミノアクリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート等が挙げられる。【００４３】
一方、誘導体化試薬に前記カルバメート化合物の中、試薬のイオン性が小さい化合物を選択した場合、ＣＩＤにより同様に選択的な開裂が発生するが、質量分析計内で陽イオンを観測するように設定すると、試薬由来の構造がニュートラルロスし、［アミノ酸＋Ｈ］がフラグメントイオンとして観測される。このことを利用して、コンスタントニュートラルロススキャン法（Constant Neutral Loss Scan）により、質量分析計で陽イオンを観測するように設定することにより、第一のマスアナライザーでアミノ酸と試薬の反応体のイオンを、第二のマスアナライザーで試薬骨格由来の構造がニュートラルロスしたアミノ酸由来のイオンを検出することで、極めて選択性が高く高感度なアミノ酸分析が達成される。このような方法に用いる誘導体化試薬としては、１−ナフチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＮＡＨＳ）が挙げられる。【００４４】
＜好適な質量分析方法＞
本発明において使用する質量分析法には特に制限は無いが、より好ましい例として幾つか紹介する。
<Selected Ion Monitoring>
ＳＩＭでは、あらかじめ選択された特定のｍ／ｚ比のみをモニターすることにより目的の質量をもつ化合物を高い精度で検出することができる。【００４５】
＜Precursor Ion Scan＞
プリカーサーイオンスキャン分析では、第一のマスアナライザー（Ｑ１等）は指定された質量範囲に従ってスキャンされ、この範囲のイオンは、例えばＱ２での衝突誘起解離により解離する。このとき第二のマスアナライザー（Ｑ３等）は、特定のフラグメントイオン（例えば、ＴＡＨＳの場合ｍ／ｚ＝１７７）を選択するように設定する。得られるスペクトルには特定のフラグメントイオンを生成するプリカーサーイオン（親イオン）だけが記録される。【００４６】
＜Selected Reaction Monitoring (SRM)＞
ＳＲＭ分析では、対象となるイオンを第一のマスアナライザー（Ｑ１等）で選択し、このイオンを衝突セルの中で解離させ、第二のマスアナライザー（Ｑ３等）で特定のフラグメントイオン（例えば、ＴＡＨＳの場合ｍ／ｚ＝１７７）を選択してモニタリングする。この方法により、定量対象化合物と同一の保持時間でかつプリカーサーイオンと同一の質量を有する夾雑成分が存在しても、夾雑成分が定量対象化合物のフラグメントイオンを生じない限り、その影響を排除できるので、感度・選択性が飛躍的に向上する。【００４７】
＜Constant Neutral Loss Scan＞
コンスタントニュートラルスキャン分析では、第一のマスアナライザー（Ｑ１等）は指定された質量範囲に従ってスキャンされ、この範囲のイオンは、例えばＱ２での衝突誘起解離により解離する。このとき第二のマスアナライザー（Ｑ３等）は、特定のニュートラルフラグメント（例えば、１−ナフチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートの場合ｍ／ｚ＝１７０）を選択するように設定する。得られるスペクトルにはある特定の中性分子が脱離する全てのプリカーサーイオン（親イオン）を検出するスキャン法を採用する。【００４８】
質量分析は、その分析対象物質の質量に起因するイオンを検出できるために、極めて選択性の高い検出方法として、広く使用されている。本発明においては、分析対象を規則的な開裂を発生させる誘導体化試薬を設計することで、アミノ官能性化合物のより選択性の高い検出方法が得られる。更に、イオン性の高い誘導体化試薬を設計した場合には、アミノ官能性化合物の高感度分析を達成することができる。【００４９】
また、一般的に質量分析においては、低分子領域に夾雑物が多く、それがノイズの原因となり、分析対象の検出能を妨げる要因となるが、一つ以上の芳香環を誘導体化試薬に導入することで、分子量を大きくし、ノイズの少ない領域での測定を達成することができる。【００５０】
アミノ酸の検出限界は、アミノ酸の種類によって異なるが、四重極質量分析計、例えばＡＰＩ３６５タイプの検出器（アプライドバイオシステムズ）を用い、ＳＲＭモードを選択した場合、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）で２〜４０ｆｍｏｌ程度、ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＤＡＨＳ）で３〜２０００ｆｍｏｌ程度、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）で３〜１８０ｆｍｏｌ程度、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート（ＡＱＣ）で２〜２００ｆｍｏｌ程度であり、一般的な蛍光標識試薬を凌ぐことができることが確認される。特に、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート（ＡＱＣ）は蛍光標識試薬として市販されているものであるが、その検出限界は数百ｆｍｏｌと報告されている。ＳＲＭでの測定では、蛍光法と同等から最大で百倍の感度改善が見られる。【００５１】
本発明の方法による検出は、誘導体化標識されたアミノ官能性化合物の質量に起因するイオンで行われるため、それ以外の化合物、例えば、標識試薬や標識試薬の加水分解物、その他、標識反応により形成される予期せぬ夾雑物の障害を受けることなく、分析対象を測定することができる。【００５２】
本発明において、安定同位体を含むアミノ官能性化合物を用いることで測定の精度を向上することができる。例えば、１３Ｃ、２Ｈ（Ｄ）、１５Ｎ及び１８Ｏ等の天然存在比の低い安定同位体、あるいは放射性同位元素を含むアミノ官能性化合物を内部標準物質とする方法や、前記同位体を含む誘導体化試薬を用いてアミノ官能性化合物を誘導体化したものを内部標準物質として用いることで、生体試料分析におけるマトリックス効果やそれに伴うイオン化抑制の影響を低減し、測定精度を上げることができる。分析対象となるアミノ官能性化合物の種類、試料中の濃度及び分析条件により最適な内部標準物質を選択することで定量精度は飛躍的に向上する。好ましくは、分析対象となるアミノ官能性化合物のすべての内部標準物質を用いることが望ましい。【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、上記質量分析法による検出工程は、以下の（ａ）群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体、及び（ｂ）〜（ｉ）の少なくとも１つの群より選択される２以上のアミノ官能性化合物誘導体のそれぞれを分離して検出することができる。
（ａ）ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、ロイシン誘導体、イソロイシン誘導体、及びノルロイシン誘導体
（ｂ）ザルコシン誘導体、β−アラニン誘導体、及びアラニン誘導体
（ｃ）γ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、β−アミノイソ酪酸誘導体、α−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、α−アミノイソ酪酸誘導体、及びβ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体
（ｄ）１−メチルヒスチジン誘導体、及び３−メチルヒルチジン誘導体
（ｅ）ホモセリン誘導体、及びスレオニン誘導体
（ｆ）５−アミノ吉草酸誘導体、バリン誘導体、及びノルバリン誘導体
（ｇ）４−ヒドロキシ安息香酸誘導体、アンスラニル酸誘導体
（ｈ）グルタミン酸誘導体、Ｏ−アセチルセリン誘導体
（ｉ）アンセリン誘導体、ホモカルノシン誘導体【００５４】
上記（ａ）〜（ｉ）の各群には、それぞれ質量が同一のアミノ官能性化合物誘導体が示されるが、本発明の方法によれば、これら各群に含まれるアミノ官能性化合物誘導体のそれぞれを分離して検出するように溶出工程の条件設定をすることができ、このため多種類のアミノ官能性化合物を含む試料を用いてこれらを同時に分析することが可能となる。従って、本発明の方法は、これら全てのアミノ官能性化合物を含む試料を用いてもよいが、少なくともロイシン、イソロイシン及びノルロイシンから選択される２以上のアミノ官能性化合物を含む試料を用いてこれら複数のアミノ官能性化合物誘導体を同時に分析する方法を含む。【００５５】
（本発明の分析装置）
本発明の分析装置は、例えば、図３に示したように、上記本発明の分析方法を実施するために必要な構成要素（部分）からなる。これらの構成要素としては、少なくとも、試料中のアミノ官能性化合物と誘導体化試薬とを反応させる反応部１０と、前記反応部１０で生成したアミノ官能性化合物誘導体の液体クロマトグラフィーにより溶出するクロマトグラフ部２０と、前記クロマトグラフ部２０からの溶出液に含まれるアミノ官能性化合物誘導体を検出する質量分析部３０とを含む。前記溶出部２０は、分離カラム２１及び当該カラムに段階的な濃度勾配を有する溶出液を供給する溶出系、例えば、溶離液２４ａ（２４ｂ）をカラムに送るためのポンプ２３ａ（２３ｂ）等が含まれる。溶出液に濃度勾配をつけるために複数のポンプ（２３ａ、２３ｂ）を用いることができる。また、クロマトグラフ部２０は、上記反応部１０で生成したアミノ官能性化合物誘導体を導入するためのインジェクションバルブ２２を備える。【００５６】
クロマトグラフ部２０から溶出されたアミノ官能性化合物誘導体は、質量分析部３０において、まずイオン化される。タンパク質やペプチド等の試料をイオン化するために最も一般的に用いられる技術として、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）及びマトリクス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、ソニックスプレーイオン化法（ＳＳＩ）などがあるが、本発明の装置において、液体クロマトグラフィーからの溶出液に含まれるアミノ官能性化合物誘導体をイオン化させる方法としてはＥＳＩ法を用いることが好ましい。イオン化のための効率的な熱伝導やガス化方法を備えた多くのシステムが用いられる。【００５７】
続いて、質量分析部３０は、イオン化した試料から選択された質量対電荷比(m/z)内においてイオンを分離する。質量分析部は分析データの感度や分解能、質量の正確さやマススペクトルデータから得られる情報の豊富さに重要な役割を果たしている。イオンの分離方法としては、現在、６種類の基本的なタイプに分類することができ、それらは、磁場型、電場型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、四重極型、及びフーリエ変換サイクロトロン型である。これらはそれぞれ長所と短所があり、単独で又は互いに連結して用いることができるが、ＥＳＩによるイオン化では通常、四重極質量分析部が用いられる。最新の四重極質量分析計（例えば、ＡＰＩ４０００（アプライドバイオシステムズ））による測定では、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（TAHS）標識後のアミノ酸の検出限界は殆どのアミノ酸で１ｆｍｏｌ以下となる。【００５８】
本発明の分析装置は、上記各構成要素（ユニット）を自動的に連結し、反応部１０から質量分析部３０までをオートメーション化することができる。例えば、９６穴のウェルプレートで血漿等の試料を保存するユニットを追加し、これより自動サンプリング装置により所定量の試料を採取して反応部１０へ移送し、更に、誘導体化されたアミノ官能性化合物を液体クロマトグラフィーのオートサンプラー等を用いて自動的にクロマトグラフ部２０へインジェクションすることができる。これにより極めてハイスループットな分析が可能となる。
【実施例】
【００５９】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６０】
＜例１：アミノ官能性化合物の誘導体化の具体的な手順１＞
アミノ官能性化合物を含む試料としてアミン標準溶液２０μＬに、硼酸緩衝液（硼酸塩200mM、EDTA5mM）６０μＬを添加した。この混合物に、標識試薬溶液（HPLC等級アセトニトリル1mL中に誘導体化試薬5mg）２０μＬを添加した。得られた混合物を１０分間、５５℃で加熱した。加熱後、得られたアミノ官能性化合物の誘導体化物の混合物を用いて、逆相の液体クロマトグラフィーで分離後、質量分析装置に導入した。その際に、得られた誘導体化物の混合物は液体クロマトグラフィーの移動相Ａで１０倍に希釈しておく。
（１）移動相Ａ：５０ｍＭ酢酸水溶液をアンモニア水でｐＨ６．０に調製した水溶液
（２）移動相Ｂ：１２５ｍＭ酢酸水溶液をアンモニア水でｐＨ６．０に調製した水溶液とメタノールを４：６で混合した溶液
（３）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００シリーズ
（４）検出器：質量分析装置  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ４０００
（５）温度：４０℃【００６１】
＜例２：分析例１＞
ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイオド（TAHS）により前記例１に記載した反応条件によって調製した４０種のアミノ官能性化合物の混合物の誘導体化物を逆相ＨＰＬＣにより分離し、Selected Ion 
Monitoring（ポジティブイオンモード）において検出した。【００６２】
逆相ＨＰＬＣにおける分離カラムはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＡＱ  内径２．０ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子径３μｍ（資生堂）を用い、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎで勾配条件は以下の通りである。時間（移動相Ｂの比率）０分から０．２５分（３％）、０．２５分から１分（３％から１５％）、１分から１．７５分（１５％）、１．７５分から２．３５分（１５％から３４％）、２．３５分から５分（３４％から３５％）、５．０１分から５．１分（５０％から７０％）、５．１分から５．７分（７０％）、５．７１分から１２分（３％）。なお、メタノール濃度について表したグラジエントパターンを図２の（ａ）に示した。【００６３】
分析した結果を図４に示す。ＴＩＣ(Total Ion  Chromatogram)は、４０種類のアミノ官能性化合物の溶出パターンを連続的に示したものである。抽出イオンクロマトグラム(XIC)は、これら４０種類の化合物を分離して検出したパターンを示す。また、それぞれのアミノ官能性化合物を単独で、又は数種の混合物として検出したパターンをそれらの下に示した。図４から明らかなように、４０種類のアミノ官能性化合物のそれぞれを分離して約９分間で検出できることが分かる。【００６４】
＜例３：分析例２＞
ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイオド（TAHS）により前記例１に記載した反応条件によって調製した４０種のアミノ官能性化合物の混合物の誘導体化物を逆相ＨＰＬＣより分離し、Selected Reaction Monitoring（ポジティブイオンモード）において検出した。【００６５】
逆相ＨＰＬＣにおける分離カラムはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＡＱ  内径２．０ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子径３μｍ（資生堂）を用い、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎで勾配条件は以下の通りである。時間（移動相Ｂの比率）０分から０．２５分（３％）、０．２５分から１分（３％から１５％）、１分から１．７５分（１５％）、１．７５分から２．３５分（１５％から３４％）、２．３５分から５分（３４％から３５％）、５．０１分から５．１分（５０％から７０％）、５．１分から５．７分（７０％）、５．７１分から１２分（３％）。【００６６】
分析した結果を図５に示す。本分析例においても上記分析例１と同様に約９分間で４０種類のアミノ官能性化合物のそれぞれを分離して検出できることが分かる。【００６７】
＜例４：分析例３＞
３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）により前記例１に記載した反応条件によって調製した３９種のアミノ官能性化合物の混合物の誘導体化物を逆相ＨＰＬＣより分離し、Selected Ion Monitoring（ポジティブイオンモード）において検出した。【００６８】
逆相ＨＰＬＣにおける分離カラムはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＡＱ  内径２．０ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子径３μｍ（資生堂）を用い、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎで勾配条件は以下の通りである。時間（移動相Ｂの比率）０分から０．５分（１３％）、０．５１分から４分（５０％）、４．０１分から６分（８０％）、６．０１分から１２分（１３％）。なお、メタノール濃度について表したグラジエントパターンを図２の（ｂ）に示した。【００６９】
分析した結果を図６に示す。本分析例においても上記分析例１及び２と同様に約８分間で３９種類のアミノ官能性化合物のそれぞれを分離して検出できることが分かる。【００７０】
＜例５：分析例４＞
３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）により前記例１に記載した反応条件によって調製した３９種のアミノ官能性化合物の混合物の誘導体化物を逆相ＨＰＬＣより分離し、Selected Reaction Monitoring（ポジティブイオンモード）において検出した。【００７１】
逆相ＨＰＬＣにおける分離カラムはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＡＱ  内径２．０ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子径３μｍ（資生堂）を用い、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎで勾配条件は以下の通りである。時間（移動相Ｂの比率）０分から０．５分（１３％）、０．５１分から４分（５０％）、４．０１分から６分（８０％）、６．０１分から１２分（１３％）。【００７２】
分析した結果を図７に示す。本分析例においても上記分析例１〜３と同様に約８分間で３９種類のアミノ官能性化合物のそれぞれを分離して検出できることが分かる。【００７３】
＜例６：分析例５＞
フェニルイソシアネート（ＰＩＣ）により前記例１に記載した反応条件によって調製した３９種のアミノ官能性化合物の混合物の誘導体化物を逆相ＨＰＬＣより分離し、Selected Ion Monitoring（ポジティブイオンモード）において検出した。【００７４】
逆相ＨＰＬＣにおける分離カラムはＳｕｐｅｒＯＤＳ  内径２．０ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子径２μｍ（ＴＯＳＯＨ）を用い、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで勾配条件は以下の通りである。時間（移動相Ｂの比率）０分から０．０１分（１３％）、０．０１分から２分（６０％）、２．５分から４．５分（１００％）、４．５１分から１０分（１３％）。【００７５】
分析した結果を図８に示す。本分析例においても上記分析例１〜４と同様に約６分間で３９種類のアミノ官能性化合物のそれぞれを分離して検出できることが分かる。【００７６】
＜例７：分析例６＞
３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）により前記例１で記載した反応条件によって調製した１７種のアミノ酸誘導体（ロイシン誘導体、イソロイシン誘導体、ノルロイシン誘導体、ザルコシン誘導体、β−アラニン誘導体、アラニン誘導体、γ−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、β−アミノイソ酪酸誘導体、α−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、α−アミノイソ酪酸誘導体、β−アミノ−ｎ−酪酸誘導体、１−メチルヒスチジン誘導体、３−メチルヒスチジン誘導体、ホモセリン誘導体、スレオニン誘導体、バリン誘導体、及びノルバリン誘導体）の混合物を逆相ＨＰＬＣにより分離し、Selected Reaction Monitoring（ポジティブモード）において検出した。逆相ＨＰＬＣにおけるカラムはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＡＱ  内径２．０ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子径３μｍ（資生堂）を用い、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎで勾配条件は以下の通りである。時間（移動相Ｂの比率）０分から０．５分（１３％）、０．５１分から４分（５０％）、４．０１分から６分（８０％）、６．０１分から１２分（１３％）。【００７７】
その結果を図９に示す。図９の各チャートに示したように、質量数が同一の複数のアミノ官能性化合物、例えば、ザルコシン誘導体、β−アラニン誘導体、及びアラニン誘導体を分離して検出できることが分かる。【００７８】
＜例８：アミノ官能性化合物の誘導体化の具体的な手順２＞
アミノ官能性化合物を含む試料としてアミノ官能性化合物標準混合溶液２０μＬに、０．２Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ８．８）を添加した。この混合物に、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート試薬溶液（１０ｍｇの誘導体化試薬をＬＣ／ＭＳ用のアセトニトリル１ｍＬ中に溶解）を２０μＬ添加した。得られた混合物を１０分間、５５℃で加熱した。加熱後、得られたアミノ官能性化合物誘導体混合物を逆相の液体クロマトグラフィーで分離後、質量分析装置に導入した。その際、得られたアミノ官能性化合物誘導体混合物は、０．１％のギ酸水溶液１００μＬで中和後、液体クロマトグラフィーの移動相Ａを３００μＬ加えて希釈しておく。
（１）移動相Ａ：２５ｍＭギ酸水溶液をアンモニア水でｐＨ６．０に調製した水溶液
（２）移動相Ｂ：アセトニトリルと精製水を６：４で混合した溶液
（３）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００シリーズ
（４）検出器：質量分析装置  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ４０００
（５）温度：４０℃【００７９】
＜例９：分析例７＞
３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）により前記例８に記載した反応条件によって調製した１０６種のアミノ官能性化合物の混合物の誘導体化物を逆相ＨＰＬＣにより分離し、Selected Reaction Monitoring（ポジティブモード）において検出した。逆相ＨＰＬＣにおける分離カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌＣ８−３内径２．１ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子系３μｍ（ジーエルサイエンス）を用い、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎで勾配条件は以下の通りである。時間（移動相Ｂの比率）０分から１．２５分（４％）、１．２５分から１．２６分（４％から１５％）、１．２６分から５分（１５％から２０％）、５分から５．５分（２０％から５０％）、５．５分から６．５分（５０％から９５％）、６．５分から６．７５分（９５％）、６．７６分から１２分（４％）。【００８０】
分析した結果を図１０に示す。図１０に示したように、約９分間で１０６種類のアミノ官能性化合物のそれぞれを分離して検出できることが分かる。【００８１】
＜例１０：分析例８＞
３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）により前記例８に記載した反応条件によって調製した３８種のアミノ官能性化合物の混合物の誘導体化物を逆相ＨＰＬＣにより分離し、Selected Ion Monitoring（ポジティブモード）において検出した。逆相ＨＰＬＣにおける分離カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌＣ８−３内径２．１ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子系３μｍ（ジーエルサイエンス）を用い、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎで勾配条件は以下の通りである。時間（移動相Ｂの比率）０分から１．２５分（４％）、１．２５分から１．２６分（４％から１５％）、１．２６分から５分（１５％から２０％）、５分から５．５分（２０％から５０％）、５．５分から５．５１分（５０％から９５％）、５．５１分から６．５分（９５％）、６．５１分から１２分（４％）。【００８２】
分析した結果を図１１に示す。図１１に示したように、約８分間で３８種類のアミノ官能性化合物のそれぞれを分離して検出できることが分かる。【００８３】
＜例１１：アミノ官能性化合物の誘導体化の具体的な手順３＞
アミノ官能性化合物を含む試料としてアミノ官能性化合物標準混合溶液２０μＬに、０．２Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ８．８）を添加した。この混合物に、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート試薬溶液（１０ｍｇの誘導体化試薬をＬＣ／ＭＳ用のアセトニトリル１ｍＬ中に溶解）を２０μＬ添加した。得られた混合物を１０分間、５５℃で加熱した。加熱後、得られたアミノ官能性化合物誘導体混合物を逆相の液体クロマトグラフィーで分離後、質量分析装置に導入した。その際、得られたアミノ官能性化合物誘導体混合物は、０．１％のギ酸水溶液１００μＬで中和後、液体クロマトグラフィーの移動相Ａを３００μＬ加えて希釈しておく。
（１）移動相Ａ：２５ｍＭギ酸水溶液
（２）移動相Ｂ：アセトニトリルと精製水を６：４で混合した溶液
（３）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００シリーズ
（４）検出器：質量分析装置  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ４０００
（５）温度：４０℃【００８４】
＜例１２：分析例９＞
３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）により前記例１１に記載した反応条件によって調製した３９種のアミノ官能性化合物の混合物の誘導体化物を逆相ＨＰＬＣにより分離し、Selected Reaction Monitoring（ポジティブモード）において検出した。逆相ＨＰＬＣにおける分離カラムはＡｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８  内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子系３μｍ（ウォーターズ）を用い、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎで勾配条件は以下の通りである。時間（移動相Ｂの比率）０分から０．５分（０％）、０．５分から２．２５分（０％から１２％）、２．２５分から２．２６分（１２％から１８％）、２．２６分から５．５分（１８％から２２％）、５．５分から６分（２２％から５０％）、６分から６．２５分（５０％から９０％）、６．２５分から６．５分（９０％）、６．５１分から１２分（０％）。【００８５】
分析した結果を図１２に示す。図１２に示したように、約１０分間で３９種類のアミノ官能性化合物のそれぞれを分離して検出できることが分かる。
本発明は、以下の形態を含む。
アミノ官能性化合物を含む試料中のアミノ官能性化合物と誘導体化試薬とを反応させて下記一般式（Ｉ）で示されるアミノ官能性化合物誘導体を生成せしめる工程、前記アミノ官能性化合物誘導体を段階的な濃度勾配溶出手段を用いる液体クロマトグラフィーにより溶出する工程、及び前記液体クロマトグラフィーにより溶出されたアミノ官能性化合物誘導体を質量分析法により検出する工程を含むことを特徴とするアミノ官能性化合物の分析方法。
【化１０】
0005030586.tif 000013
（式中、Ａｒ１は置換基を有してもよい炭化水素、又は芳香族性を示す炭素環若しくは複素環を含む置換基を表し、Ｒ１は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基又は置換基を有していてもよい飽和又は不飽和のアルキル基を表し、Ｒ２は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、Ａｒ１とＲ１、又はＲ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。）
試料中のアミノ官能性化合物と誘導体化試薬とを反応させて上記一般式（Ｉ）で示されるアミノ官能性化合物誘導体を生成させる反応部と、前記アミノ官能性化合物誘導体を溶出するクロマトグラフ部と、前記クロマトグラフ部からの溶出液に含まれるアミノ官能性化合物誘導体を検出する質量分析部とを備えることを特徴とするアミノ官能性化合物の分析装置。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の方法によれば、生体アミノ酸を含む１００種類以上のアミノ官能性化合物を極めて短時間に、例えば１０分以内に分析できることから、これらアミノ官能性化合物に関連する食品、医薬品、医療や分析機器の分野において有用である。
【図１】
0005030586.tif 000016
【図２】
0005030586.tif 000017
【図３】
0005030586.tif 000018
【図４（ａ）】
0005030586.tif 000019
【図４（ｂ）】
0005030586.tif 000020
【図４（ｃ）】
0005030586.tif 000021
【図５（ａ）】
0005030586.tif 000022
【図５（ｂ）】
0005030586.tif 000023
【図５（ｃ）】
0005030586.tif 000024
【図６（ａ）】
0005030586.tif 000025
【図６（ｂ）】
0005030586.tif 000026
【図６（ｃ）】
0005030586.tif 000027
【図７（ａ）】
0005030586.tif 000028
【図７（ｂ）】
0005030586.tif 000029
【図７（ｃ）】
0005030586.tif 000030
【図８（ａ）】
0005030586.tif 000031
【図８（ｂ）】
0005030586.tif 000032
【図８（ｃ）】
0005030586.tif 000033
【図９】
0005030586.tif 000034
【図１０（ａ）】
0005030586.tif 000035
【図１０（ｂ）】
0005030586.tif 000036
【図１０（ｃ）】
0005030586.tif 000037
【図１０（ｄ）】
0005030586.tif 000038
【図１０（ｅ）】
0005030586.tif 000039
【図１１（ａ）】
0005030586.tif 000040
【図１１（ｂ）】
0005030586.tif 000041
【図１１（ｃ）】
0005030586.tif 000042
【図１２（ａ）】
0005030586.tif 000043
【図１２（ｂ）】
0005030586.tif 000044
【図１２（ｃ）】
0005030586.tif 000045