(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール類部分及びポリグルタミン酸鎖部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、シチジン系代謝拮抗剤のアミノ基とがアミド結合した構造を有し、下記一般式（１）：
【化１】
0005000512.tif 000015
［式中、Ｒは水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を示し、Ａは水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アシル基又はＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基を示し、ｍは平均値で３〜２００、ｎは平均値で５〜２０００を示し、Ｘはシチジン系代謝拮抗剤残基、水酸基又は疎水性置換基を示し、ｍのうち３〜１００％はＸがシチジン系代謝拮抗剤残基、０〜９５％はＸが水酸基、０〜８０％はＸが疎水性置換基である］
で表される化合物であり、
上記疎水性置換基が式（４）：
【化２】
0005000512.tif 000016
［式中、Ｑは中性アミノ酸の側鎖を表し、ＷはＣ１〜Ｃ６アルキル基又はベンジル基を示す］
で表されるα−アミノ酸誘導体であるか、または、
上記疎水性置換基が、式（５）：
【化３】
0005000512.tif 000017
［式中、Ｔはフェニル基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す］
で表される基である、
シチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項２】
ＲがＣ１〜Ｃ３アルキル基であり、ＡがＣ２〜Ｃ４アシル基であり、ｍが平均値で５〜１００、ｎが平均値で５０〜１０００であり、シチジン系代謝拮抗剤残基が式（２）：
【化４】
0005000512.tif 000018
［式中、Ｚは水素原子又はフッ素原子を示し、−Ｒｆは、式（３）：
【化５】
0005000512.tif 000019
の置換基群より選ばれる基を示す］
で表される基である、請求項１に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項３】
Ｒがメチル基、Ａがアセチル基であり、ｍが平均値で１０〜６０、ｎが平均値で１００〜３００であり、Ｘがシチジン系代謝拮抗剤残基又は水酸基であり、該シチジン系代謝拮抗剤がシタラビン、ゲムシタビン又は５’−デオキシ−５−フルオロシチジンである、請求項１に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項４】
Ｑがイソプロピル基又はベンジル基であり、Ｗがベンジル基である、請求項１又は２に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項５】
Ｔがベンジル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基又は５−フェニルペンチル基である、請求項１又は２に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項６】
Ｒがメチル基、Ａがアセチル基であり、ｍが平均値で１０〜６０、ｎが平均値で１００〜３００であり、シチジン系代謝拮抗剤がシタラビン、ゲムシタビン又は５’−デオキシ−５−フルオロシチジンであり、疎水性置換基がベンジルオキシ基、４−フェニルブトキシ基、（１−ベンジルオキシカルボニル−２−メチル）プロピルアミノ基又は（１−ベンジルオキシカルボニル−２−フェニル）エチルアミノ基である、請求項１に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分とする抗ウイルス剤。
【請求項９】
ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、シチジン系代謝拮抗剤のアミノ基とを有機溶媒中で脱水縮合剤を用いてアミド結合させることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体、その用途及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍あるいはウイルス性疾患の治療を目的として種々のシチジン系代謝拮抗剤の開発が行なわれ、抗腫瘍剤（抗癌剤）としてはシタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）等が、抗ウイルス剤としてはザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）等が臨床で使用されている。【０００３】
しかし、これらシチジン系代謝拮抗剤は強いｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示すにもかかわらず、生体内での代謝・排泄を受けやすいために本来の薬剤が持つ薬効を十分に発揮できなかったり、あるいは高投与量を必要とするものが多い。例えば、ゲムシタビンはｉｎ  ｖｉｔｒｏではパクリタキセルやドキソルビシン等の抗癌剤に匹敵する強い細胞増殖抑制活性を有するのに対し、臨床においては体表面積あたり１回１０００ｍｇ／ｍ２の高投与が必要である。これは、２’−デオキシシチジンの代謝酵素であるシチジン脱アミノ化酵素によって塩基の４位アミノ基が代謝・失活されることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ利用率が低くなるためと考えられている（非特許文献１参照）。【０００４】
ポリマーに薬剤を結合させることにより、生体内における薬物動態が改善し治療効果の向上がみられることがある。非特許文献２には、平均分子量約３００００のポリグルタミン酸類とシタラビンとを結合させた高分子誘導体が記載されている。しかしながら、薬剤の高分子誘導体には免疫反応により過敏反応を示す場合があり、その様な場合には薬剤として繰返し投与ができない。【０００５】
特許文献１にはポリエチレングリコール類にシチジン系誘導体を結合させた高分子誘導体が、非特許文献３にはポリエチレングリコール類の両末端にアスパラギン酸を分枝状に置換させそれにシタラビンを結合させた高分子誘導体が記載されている。しかし、これらの高分子誘導体からの薬剤放出は生体内の酵素による加水分解反応に大きく依存しているため、臨床上における治療効果が患者の個体差に大きく影響される可能性も問題となる。【０００６】
特許文献２にはポリエチレングリコール類とポリアスパラギン酸が縮合したブロック型ポリマーに薬剤を結合した分子がミセルを形成し医薬となることが記載されている。又、特許文献３にはポリエチレングリコール類とポリグルタミン酸が縮合したブロック型ポリマーのグルタミン酸側鎖カルボキシル基に抗癌性物質を結合させた高分子が記載されている。しかしながら、これらには結合する薬剤としてシチジン系代謝拮抗剤に関する記載はない。
【非特許文献１】「キャンサー・サイエンス」、日本癌学会発行、２００４年、第９５巻、１０５−１１１頁（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．９５，ｐ．１０５−１１１（２００４））
【非特許文献２】「キャンサー・リサーチ」（米国）、米国癌学会発行、１９８４年、第４４巻、２５−３０頁（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４４，ｐ．２５−３０（１９８４））
【非特許文献３】「ジャーナル  オブ  コントロールド  リリース」（英国）、エルゼヴィア発行、２００２年、第７９巻、５５−７０頁（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｖｏｌ．７９，ｐ．５５−７０（２００２））
【特許文献１】特表２００３−５２４０２８号公報
【特許文献２】特許第２６９４９２３号公報
【特許文献３】特開平５−９５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、低投与量でより高い効果を有し新規な抗癌剤又は抗ウイルス剤となるシチジン系代謝拮抗剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、シチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体、特にポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物のカルボキシル基と、シチジン系代謝拮抗剤の４位のアミノ基とがアミド結合した構造を有することを特徴とするシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体を見出して、本発明に到達した。【０００９】
即ち、本発明は次の（１）〜（１３）に関する。
（１）ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、シチジン系代謝拮抗剤のアミノ基とがアミド結合した構造を有することを特徴とするシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（２）側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分がポリグルタミン酸鎖からなる、上記（１）に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（３）シチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体が下記一般式（１）：【００１０】
【化１】
0005000512.tif 000002
［式中、Ｒは水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を示し、Ａは水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アシル基又はＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基を示し、ｍは平均値で３〜２００、ｎは平均値で５〜２０００を示し、Ｘはシチジン系代謝拮抗剤残基、水酸基又は疎水性置換基を示し、ｍのうち３〜１００％はＸがシチジン系代謝拮抗剤残基、０〜９５％はＸが水酸基、０〜８０％はＸが疎水性置換基である］
で表される化合物である、上記（１）又は（２）に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（４）ＲがＣ１〜Ｃ３アルキル基であり、ＡがＣ２〜Ｃ４アシル基であり、ｍが平均値で５〜１００、ｎが平均値で５０〜１０００であり、シチジン系代謝拮抗剤残基が式（２）：【００１１】
【化２】
0005000512.tif 000003
［式中、Ｚは水素原子又はフッ素原子を示し、−Ｒｆは、式（３）：【００１２】
【化３】
0005000512.tif 000004
の置換基群より選ばれる基を示す］
で表される基である、上記（３）に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（５）Ｒがメチル基、Ａがアセチル基であり、ｍが平均値で１０〜６０、ｎが平均値で１００〜３００であり、Ｘがシチジン系代謝拮抗剤残基又は水酸基であり、該シチジン系代謝拮抗剤がシタラビン、ゲムシタビン又は５’−デオキシ−５−フルオロシチジンである、上記（３）に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（６）疎水性置換基が式（４）【００１３】
【化４】
0005000512.tif 000005
［式中、Ｑは中性アミノ酸の側鎖を表し、ＷはＣ１〜Ｃ６アルキル基又はベンジル基を示す］
で表されるα−アミノ酸誘導体である、上記（３）又は（４）に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（７）Ｑがイソプロピル基又はベンジル基であり、Ｗがベンジル基である、上記（６）に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（８）疎水性置換基が、式（５）：【００１４】
【化５】
0005000512.tif 000006
［式中、Ｔはフェニル基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す］
で表される基である、上記（３）又は（４）に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（９）Ｔがベンジル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基又は５−フェニルペンチル基である、上記（８）に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（１０）Ｒがメチル基、Ａがアセチル基であり、ｍが平均値で１０〜６０、ｎが平均値で１００〜３００であり、シチジン系代謝拮抗剤がシタラビン、ゲムシタビン又は５’−デオキシ−５−フルオロシチジンであり、疎水性置換基がベンジルオキシ基、４−フェニルブトキシ基、（１−ベンジルオキシカルボニル−２−メチル）プロピルアミノ基又は（１−ベンジルオキシカルボニル−２−フェニル）エチルアミノ基である、上記（３）に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分とする抗腫瘍剤。
（１２）上記（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分とする抗ウイルス剤。
（１３）ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物における側鎖のカルボキシル基と、シチジン系代謝拮抗剤のアミノ基とを有機溶媒中で脱水縮合剤を用いてアミド結合させることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体の製造法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物のカルボキシル基と、シチジン系代謝拮抗剤の４位のアミノ基とがアミド結合した構造を有するが、生体内においてシチジン系代謝拮抗剤を徐放することができ、低投与量で治療効果に優れる抗癌剤又は抗ウイルス剤として有用である。更に、酵素非依存的に薬剤徐放性を有することは、治療効果に対する患者の個体差の影響が少ない誘導体となる。又、ミセルを形成する高分子誘導体は選択的に患部に集積し、より高い効果で副作用が少ない薬剤となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、シチジン系代謝拮抗剤のアミノ基とがアミド結合した構造を有することを特徴とする。【００１７】
本発明における「シチジン系代謝拮抗剤」とは、４−アミノピリミジン−２−オン誘導体で抗腫瘍活性又は抗ウイルス活性を有する化合物であれば特に限定されず、上記式（２）で表される核酸塩基部分がシトシン（Ｚが水素原子）又は５−フルオロシトシン（Ｚがフッ素原子）で、結合している基（Ｒｆ）が上記式（３）の置換基群より選ばれる基である化合物である。【００１８】
更に具体的には、例えば、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、テザシタビン（ｔｅｚａｃｉｔａｂｉｎｅ）、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（５’−ＤＦＣＲ）、トロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）、２’−Ｃ−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）、３’−エチニルシチジン又は（−）−β−Ｌ−ジオキソランシチジン等が挙げられる。【００１９】
本発明において「ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物」における側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分としては、カルボン酸鎖がポリマー主鎖から枝分かれしたグラフト型ポリマーやポリカルボン酸ポリマーが縮合したブロック型ポリマー等が挙げられる。【００２０】
側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分がグラフト型ポリマーである上記の高分子化合物としては、例えば、特開平１１−２７９０８３号公報に記載の、ポリエチレングリコールとアクリル酸類の縮合物とアクリル酸類あるいは無水マレイン酸等とを共重合反応に供し、必要に応じて加水分解反応に付すこと等によって得られるポリマー等が挙げられる。【００２１】
側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分がブロック型ポリマーである上記の高分子化合物としては、末端官能基を有するポリエチレングリコール類と末端に官能基を有するポリカルボン酸とを結合した化合物や、特許文献３に記載されている、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール類で重合を開始するアミノ酸活性化物の重合反応によって得られる化合物等が挙げられる。【００２２】
側鎖にカルボキシル基を有するポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリンゴ酸又はポリグルタミン酸等が挙げられ、好ましくはポリグルタミン酸である。【００２３】
本発明における「ポリエチレングリコール類」としては、両末端又は片末端が修飾されたポリエチレングリコール誘導体でもよく、その場合、両末端の修飾基は同一でも異なっていてもよい。末端の修飾基としては、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基が挙げられ、好ましくは置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基である。【００２４】
置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基におけるＣ１〜Ｃ６アルキル基としては直鎖、分岐鎖又は環状のＣ１〜Ｃ６アルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基又はｔ−ブチル基等であり、特に好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基である。【００２５】
置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基の置換基としては特に限定されないが、例えば、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基等が挙げられ、好ましくはアミノ基である。【００２６】
本発明においては両末端が修飾されたポリエチレングリコール誘導体が好ましく、具体的には、一方の末端がＣ１〜Ｃ６アルキル基で他方の末端がアミノＣ１〜Ｃ６アルキル基であるポリエチレングリコール誘導体が挙げられ、一方の末端がＣ１〜Ｃ３アルキル基で他方の末端がアミノＣ１〜Ｃ４アルキル基であるポリエチレングリコール誘導体が好ましく、特に一方の末端がメチル基で他方の末端がアミノプロピル基であるポリエチレングリコール誘導体が好ましい。【００２７】
本発明における「ポリエチレングリコール類」の重量平均分子量は２００〜５０００００程度であり、好ましくは５００〜１０００００程度、より好ましくは２０００〜５００００程度である。【００２８】
本発明における「ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物」として好ましくはブロック型ポリマーであり、より好ましくはポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシル基を有するポリマーとのブロック共重合体である。【００２９】
ポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシル基を有するポリマーとのブロック共重合体としては、例えば、アルコキシポリエチレングリコール−ポリアクリル酸、アルコキシポリエチレングリコール−ポリメタクリル酸又はアルコキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸等が挙げられ、好ましくはメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸である。【００３０】
本発明における「ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物」の１分子あたりの平均したカルボキシル基数は３〜２００個程度であり、好ましくは５〜１００個程度、より好ましくは１０〜６０個程度である。【００３１】
本発明における「ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物」の重量平均分子量は５００〜５０００００程度であり、好ましくは２０００〜１０００００程度であり、より好ましくは３０００〜５００００程度である。【００３２】
本発明において、ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物にアミド結合しているシチジン系代謝拮抗剤の結合量としては、１個〜カルボキシル基の総数の範囲内であれば特に限定されず、生体内に投与した際に薬効を示す量であればよい。好ましくはポリマーの総カルボキシル基数の３〜１００％、より好ましくは５〜７０％である。【００３３】
上記の結合量は、本発明化合物の紫外線吸収スペクトルの強度から求めることができる。又、本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体をアルカリ加水分解することにより遊離するシチジン系代謝拮抗剤を、例えば、高速液体クロマトグラフィー等で定量することによっても求めることができる。【００３４】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体として代表的な化合物は、上記一般式（１）［式中、Ｒは水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を示し、Ａは水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アシル基又はＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基を示し、ｍは平均値で３〜２００、ｎは平均値で５〜２０００を示し、Ｘはシチジン系代謝拮抗剤残基、水酸基又は疎水性置換基を示し、ｍのうち３〜１００％はＸがシチジン系代謝拮抗剤残基、０〜９５％はＸが水酸基、０〜８０％はＸが疎水性置換基である］で表される化合物である。【００３５】
式（１）中、ＲにおけるＣ１〜Ｃ６アルキル基は上記のアルキル基と同じ意味であり、好ましい基も同様である。【００３６】
式（１）中、ＡにおけるＣ１〜Ｃ６アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基又はヘキサノイル基が挙げられ、好ましくはＣ２〜Ｃ４アシル基、例えば、アセチル基又はプロピオニル基であり、より好ましくはアセチル基である。【００３７】
式（１）中、ＡにおけるＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ペントキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、シクロプロポキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基又はシクロヘキシルオキシカルボニル基が挙げられ、好ましくはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基であり、より好ましくはエトキシカルボニル基又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基である。【００３８】
式（１）中、ｍは平均値で３〜２００であり、好ましくは５〜１００程度であり、より好ましくは１０〜６０程度である。【００３９】
式（１）中、ｎは平均値で５〜２０００であり、好ましくは５０〜１０００程度であり、より好ましくは１００〜３００程度である。【００４０】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体の一般式（１）においてＸがシチジン系代謝拮抗剤残基、水酸基又は疎水性置換基であるグルタミン酸誘導体は、ランダムに結合していても、ブロックを形成して結合していてもよい。【００４１】
式（１）中、Ｘにおけるシチジン系代謝拮抗剤残基とは、上記のシチジン系代謝拮抗剤の残基の意味であり、該シチジン系代謝拮抗剤として特に好ましくは、シタラビン、ゲムシタビン又は５’−デオキシ−５−フルオロシチジンが挙げられる。【００４２】
式（１）中、Ｘにおける疎水性置換基としては種々の置換基が挙げられ、シチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体の薬効発現に支障をきたさない限り特に限定されないが、好ましくは上記式（４）［式中、Ｑは中性アミノ酸の側鎖を表し、ＷはＣ１〜Ｃ６アルキル基又はベンジル基を示す］で表されるα−アミノ酸誘導体又は上記式（５）［式中、Ｔはフェニル基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す］で表される基が挙げられる。【００４３】
式（４）のＱにおける中性アミノ酸の側鎖としては、例えば、水素原子、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ベンジル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基等の天然型アミノ酸残基又はｔｅｒｔ−ブトキシメチル基、ベンジルオキシメチル基、ベンジルオキシカルボニルメチル基、２−ベンジルオキシカルボニルエチル基等のアミノ酸残基誘導体等が挙げられ、好ましくはイソプロピル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ベンジル基、ベンジルオキシメチル基、ベンジルオキシカルボニルメチル基、２−ベンジルオキシカルボニルエチル基等であり、より好ましくはイソプロピル基、ベンジル基、ベンジルオキシメチル基又は２−ベンジルオキシカルボニルエチル基であり、特に好ましくはイソプロピル基又はベンジル基である。【００４４】
式（４）のＷにおけるＣ１〜Ｃ６アルキル基としては上記のアルキル基と同じ基が挙げられ、好ましい基も同様である。【００４５】
式（５）のＴにおけるＣ１〜Ｃ６アルキル基としては、上記のアルキル基と同じ意味であり、好ましい基も同様である。式（５）で表される基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロヘキシルメトキシ基、ベンジルオキシ基、２−フェネチルオキシ基、３−フェニルプロポキシ基、４−フェニルブトキシ基、５−フェニルペンチルオキシ基又はジフェニルメトキシ基等が挙げられる。【００４６】
該疎水性置換基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｎ−ペンチルアミノ基、ｎ−ヘキシルアミノ基、シクロプロピルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、シクロヘキシルメチルアミノ基、ジシクロヘキシルメチルアミノ基、アニリノ基、ベンジルアミノ基、２−フェネチルアミノ基、３−フェニルプロピルアミノ基、４−フェニルブチルアミノ基又はジフェニルメチルアミノ基等のアミノ基も挙げられる。【００４７】
式（１）中、Ｘにおける疎水性置換基としては、ベンジルオキシ基、３−フェニルプロポキシ基、４−フェニルブトキシ基、５−フェニルペントキシ基、（１−ベンジルオキシカルボニル−２−メチル）プロピルアミノ基又は（１−ベンジルオキシカルボニル−２−フェニル）エチルアミノ基が特に好ましく、ベンジルオキシ基、４−フェニルブトキシ基、（１−ベンジルオキシカルボニル−２−メチル）プロピルアミノ基又は（１−ベンジルオキシカルボニル−２−フェニル）エチルアミノ基が殊更好ましい。【００４８】
式（１）中、ポリマーの総カルボキシル基数（ｍ）に対して、Ｘがシチジン系代謝拮抗剤残基である割合は３〜１００％、好ましくは５〜７０％であり、Ｘが水酸基である割合は０〜９５％、好ましくは５〜７０％であり、Ｘが疎水性置換基である割合は０〜８０％、好ましくは２０〜７０％である。【００４９】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体において、シチジン系代謝拮抗剤等が結合していない側鎖カルボキシル基が存在する場合、上記カルボキシル基は遊離型又はアルカリ類の塩型でもよい。遊離型で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって目的とする塩型に変換することができ、逆に塩型で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法により遊離型又は目的とする他の塩型に変換することができる。【００５０】
アルカリ類の塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩又はトリエチルアンモニウム塩等が挙げられる。【００５１】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体における側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分を構成する構造単位は、光学異性体が存在する場合は光学活性体でもラセミ体でも任意の割合の混合体でもよい。例えば、側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分がポリグルタミン酸誘導体の場合、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｄ−グルタミン酸、側鎖が置換されたＬ−グルタミン酸又は側鎖が置換されたＤ−グルタミン酸が任意の割合で任意の結合順で結合したポリマーでよい。【００５２】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体として特に好ましい化合物としては、例えば、以下の表１に示す化合物が挙げられる。【００５３】
なお、表１において、Ｂｚｌはベンジル基、Ｖａｌはバリン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｃ４Ｈ８Ｐｈは４‐フェニルブチル基を表す。又、Ｘにおいて置換割合はおよその値であり、表中に示した以外の残余は水酸基である。Ｘのシチジン系代謝拮抗剤としては、シタラビン、ゲムシタビン、５’−デオキシ−５−フルオロシチジン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、３’−エチニルシチジン、２’−Ｃ−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）及び（−）−β−Ｌ−ジオキソランシチジンは以下の化合物である。【００５４】
【化６】
0005000512.tif 000007
0005000512.tif 000008
【００５５】
【表１】
0005000512.tif 000009
0005000512.tif 000010
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、例えば、特許文献３記載の方法に準じて製造されたメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体と、シチジン系代謝拮抗剤とを、溶媒中、脱水縮合剤により縮合することにより製造することができるが、特にこの製造法に限定されるわけではない。【００５６】
上記反応における溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテル等のエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類、１，３−ジメチルイミダゾリジノン等のウレア類又は上記溶媒の混合溶媒等が挙げられ、好ましくはアミド類又はウレア類であり、より好ましくはジメチルホルムアミド又は１，３−ジメチルイミダゾリジノンである。【００５７】
上記反応における脱水縮合剤としては、シチジン系代謝拮抗剤の４位アミノ基とカルボキシル基との縮合反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくはＤＭＴ−ＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド）、又は２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリンが挙げられる。【００５８】
上記反応の反応温度は通常、４〜６０℃であるが、好ましくは１５〜５０℃である。【００５９】
上記反応後、必要に応じて自体公知の分離手段、例えば、減圧濃縮、溶媒抽出、結晶化、透析、クロマトグラフィー等を適宜適用して目的化合物を単離、精製することができる。【００６０】
上記の方法でＸがシチジン系代謝拮抗剤残基のみか、シチジン系代謝拮抗剤残基と水酸基とからなる高分子誘導体が得られる。【００６１】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体が疎水性置換基を有する場合、例えば、特許文献３に記載の方法に準じて製造されたメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体のカルボキシル基の一部に疎水性置換基を導入して得られるポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖の未置換のカルボキシル基と、シチジン系代謝拮抗剤のアミノ基とを前記のように有機溶媒中、脱水縮合剤を用いて縮合して製造することができる。【００６２】
疎水性置換基の導入は、例えば、疎水性置換基がアルコキシ基の場合には対応するアルコールと該カルボキシル基とを溶媒中、脱水縮合剤により縮合（エステル化）すること、又は対応するハロゲン化アルキル等と該カルボキシル基とを溶媒中、塩基の存在下に求核置換反応に供することによって為され、例えば、疎水性置換基が置換アミノ基の場合には対応するアミン類と該カルボキシル基とを溶媒中、脱水縮合剤により縮合（アミド化）することにより製造可能である。【００６３】
上記脱水縮合反応（エステル化反応）における溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、前記のメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体とシチジン系代謝拮抗剤とを脱水縮合させる際に使用できる溶媒と同様な溶媒が使用でき、好ましい溶媒も同様である。脱水縮合剤としてはアルコールとカルボキシル基との脱水縮合反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル又はピバリン酸クロリドである。【００６４】
脱水縮合反応の際、反応補助剤を用いてもよく、該反応補助剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール又は４−ジメチルアミノピリジン、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピリジン等が挙げられる。【００６５】
脱水縮合反応の反応温度は通常４〜６０℃であり、好ましくは１５〜５０℃である。反応時間は２時間〜数日であり、好ましくは４〜４８時間である。【００６６】
上記求核置換反応における溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、前記のメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体とシチジン系代謝拮抗剤とを脱水縮合させる際に使用できる溶媒と同様な溶媒が使用でき、好ましい溶媒も同様である。塩基としては、例えば、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩類；水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物類；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物類；リチウムメトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類；トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）等の有機アミン類等が挙げられ、好ましくは有機アミン類である。【００６７】
上記求核置換反応の反応温度は通常４〜６０℃であり、好ましくは室温〜５０℃である。反応時間は１時間〜数日であり、好ましくは４〜４８時間である。【００６８】
上記脱水縮合反応（アミド化反応）における溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、前記のメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体とシチジン系代謝拮抗剤とを脱水縮合させる際に使用できる溶媒と同様な溶媒が使用でき、好ましい溶媒も同様である。脱水縮合剤としてはアミン類とカルボキシル基との縮合反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル、ピバリン酸クロリド、ＤＭＴ−ＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド）、ＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート）又はＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）である。【００６９】
上記脱水縮合反応の際、反応補助剤を用いてもよく、該反応補助剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール又は４−ジメチルアミノピリジン、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピリジン等が挙げられる。【００７０】
脱水縮合反応の反応温度は通常４〜６０℃で行なわれ、好ましくは室温〜５０℃で、反応時間は１時間〜数日で行なわれ、好ましくは４〜４８時間である。【００７１】
なお、高分子化合物への疎水性置換基とシチジン系代謝拮抗剤との結合反応順は問わないので、混合して反応させてもよいが、多官能基を有する活性本体であるシチジン系代謝拮抗剤の反応及び分解を回避するため、高分子担体へ疎水性置換基を導入した後に、シチジン系代謝拮抗剤を結合させるのが好ましい。【００７２】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、水溶液中でポリエチレングリコール類部分を外殻とするミセルを形成していてもよい。ミセルの形成については、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法又は動的光散乱法等により確認することができる。【００７３】
本発明において、シチジン系代謝拮抗剤が結合していないカルボキシル基が疎水性置換基と結合することによりミセルを形成しやすくなる。【００７４】
本発明には上記のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分とする抗腫瘍剤又は抗ウイルス剤も含まれる。該シチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、そのまま投与することも、又、医薬上許容できる物質と混合した薬学的組成物として投与することもできる。薬学的組成物の剤型は注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、坐剤等いかなるものでもよい。又、これらの製剤は医薬用に用いられる種々の補助剤、即ち、担体やその他の助剤、例えば、安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等の添加剤を含有していてもよい。【００７５】
製剤中におけるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体の含量は製剤により種々異なるが、通常０．１〜１００重量％、好ましくは１〜９８重量％である。【００７６】
シチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分とする本発明の抗腫瘍剤の適用は特に限定されないが、例えば、非小細胞肺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫等に使用され得る。【００７７】
シチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分とする本発明の抗ウイルス剤の適用は特に限定されないが、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、帯状疱疹、単純ヘルペスウイルス感染症等に使用され、感染予防目的にも使用され得る。【００７８】
本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体の投与方法として、経口、注射、直腸内投与、門脈内投与、臓器の灌流液に混合、患部臓器への局所投与等いずれの投与方法でも可能であるが、好ましくは非経口的投与であり、より好ましくは注射による静脈内投与、動脈内投与又は患部臓器への局所投与である。本発明のシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体の投与量は、病状、投与方法、患者の状態、年齢、体重等により異なるが、通常、体表面積１ｍ２あたり１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜２０００ｍｇであり、これを１日１回又は数回に分けて投与してもよい。又、この投与は連日行なうこともできるが、数日から数ヶ月の間をおいて反復投与を行なってもよい。必要に応じて上記以外の投与方法、投与量、投与スケジュールを用いることができる。【００７９】
本発明の高分子誘導体にはプロドラッグを結合した場合も含まれる。ここで、プロドラッグとは生物学的に活性な親化合物の化学的誘導体であって、投与すると生体内で該親化合物を遊離するものである。
【実施例】
【００８０】
以下に、実施例、参考例及び試験例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
参考例１  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日本油脂株式会社製、平均分子量１２０００、１６ｇ）をジメチルスルホキシド（３２０ｍＬ）に溶解し、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート  Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＧ−ＮＣＡ、９．４８ｇ；ポリエチレングリコールに対して２７当量）を加え、３０℃にて一晩撹拌した。イソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、６．４Ｌ）撹拌下に反応液を滴下し、更に３時間撹拌した。析出した沈殿物をろ取し、イソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、４００ｍＬ）にて洗浄した。得られた生成物（２２．７８ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３７０ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（６．８３ｍＬ）を加えて、２０℃にて一晩撹拌した。イソプロピルエーテル−酢酸エチル混合溶媒（４：１、３．７Ｌ）撹拌下に滴下し、更に３時間撹拌した。析出した沈殿物をろ取し、イソプロピルエーテル−酢酸エチル混合溶媒（４：１、３００ｍＬ）にて洗浄した。得られた生成物（２２．９２ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３７０ｍＬ）に溶解し、５％パラジウム炭素（５５％含水、２．５０ｇ）を加えて、水素雰囲気下３０℃にて４時間、次いで室温にて一晩撹拌した。パラジウム炭素をろ別後、ろ液をイソプロピルエーテル−酢酸エチル混合溶媒（４：１、５Ｌ）撹拌下に滴下し、更に１時間撹拌した。析出した沈殿物をろ取し、イソプロピルエーテル−酢酸エチル混合溶媒（４：１、３００ｍＬ）にて洗浄した。得られた生成物（１６ｇ）を蒸留水（８００ｍＬ）に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて液性をｐＨ１１に調整した。蒸留水を加えて最終液量を１６００ｍＬとし、塩化ナトリウム（８０ｇ）を加えた。この溶液を吸着樹脂ＨＰ−２０ｓｓ（三菱化学製、５００ｍＬ）のカラムに通塔し、５％塩化ナトリウム水溶液（２０００ｍＬ）及び蒸留水（２００００ｍＬ）にて洗浄後、５０％アセトニトリル水溶液（２５００ｍＬ）にて溶出した。目的物を含む溶出画分を陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（ダウケミカル社製、プロトン型、１００ｍＬ）のカラムに通塔、溶出し、更に５０％アセトニトリル水（１５０ｍＬ）にて溶出した。目的物を含む溶出画分を液量が約３００ｍＬになるまで減圧下に濃縮した後、凍結乾燥して、標記化合物（１５．８４ｇ）を得た。【００８１】
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボン酸数）は、２６．２２であった。
参考例２  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約４１のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
参考例１記載の方法に従い、ポリエチレングリコールに対してＢＬＧ−ＮＣＡを４５当量用いることにより標記化合物を得た。【００８２】
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボン酸数）は、４１．４５であった。
参考例３  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２４のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
参考例１記載の方法に従い、ポリエチレングリコールに対してＢＬＧ−ＮＣＡを２５当量用いることにより、標記化合物を得た。【００８３】
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボン酸数）は、２３．７０であった。
参考例４  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約３２のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
参考例１記載の方法に従い、ポリエチレングリコールに対してＢＬＧ−ＮＣＡを３５当量用いることにより、標記化合物を得た。【００８４】
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボン酸数）は、３１．７１であった。
参考例５  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約３６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
参考例１記載の方法に従い、ポリエチレングリコールに対してＢＬＧ−ＮＣＡを４０当量用いることにより、標記化合物を得た。【００８５】
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボン酸数）は、３５．９０であった。
参考例６  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２１のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
参考例１記載の方法に従い、ポリエチレングリコールに対してＢＬＧ−ＮＣＡを２３当量用いることにより、標記化合物を得た。【００８６】
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボン酸数）は、２１．３８であった。
参考例７  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
参考例１記載の方法に従い、ポリエチレングリコールに対してＢＬＧ−ＮＣＡを３０当量用いることにより、標記化合物を得た。【００８７】
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボン酸数）は、２６．４８であった。
参考例８  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２４のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物とＬ−フェニルアラニンベンジルエステルとのアミド結合体の合成
参考例３記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２４のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（１．５３３ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３２ｍＬ）に溶解し、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルの４−トルエンスルホン酸塩（０．４６４ｇ）、ＴＦＦＨ（０．２８６ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６７２ｍＬ）及び２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピリジン（０．４９５ｇ）を加えて３７℃にて２０時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（６４ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（２５６ｍＬ）を滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を３０％アセトニトリル水（４５ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液にアセトニトリル（１５ｍＬ）を加え、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型）に通塔し、５０％アセトニトリル水にて溶出した。目的化合物を含む溶出画分を減圧下１／２容量まで濃縮後、凍結乾燥して、標記化合物（１．６８９ｇ）を得た。【００８８】
本化合物を加水分解後、遊離したベンジルアルコールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＰｈｅ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して３２．８％であった。【００８９】
加水分解の方法
標記化合物（３４．４８ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加えて４０℃にて１時間撹拌した。酢酸にて中和後、蒸留水にて希釈して正確に５ｍＬ溶液とした。【００９０】
ＨＰＬＣの分析条件（ベンジルアルコールの分析）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（粒径５μｍ）、４．６φ×１５０ｍｍ；
カラム温度：４０℃；
溶離液  Ａ液：１％リン酸水溶液、Ｂ液：アセトニトリル；
グラジエント：Ｂ液％（時間、分）３０（０）、８０（１０）；
流速：１ｍＬ／分；
検出器（検出波長）：ＵＶ（２６０ｎｍ）
参考例９  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約４１のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物とＬ−フェニルアラニンベンジルエステルとのアミド結合体の合成
参考例２記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約４１のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（１７６．５ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．３ｍＬ）に溶解し、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルの４−トルエンスルホン酸塩（６３．０ｍｇ）、ＴＦＦＨ（３８．９ｍｇ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１７．３μＬ）及び２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピリジン（８７．０ｍｇ）を加えて３７℃にて２２時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（１０．６ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（４２．４ｍＬ）を滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を２０％アセトニトリル水（１６ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、９ｍＬ）に通塔し、５０％アセトニトリル水にて溶出した。目的化合物を含む溶出画分を凍結乾燥して、標記化合物（１９４．０ｍｇ）を得た。【００９１】
本化合物を参考例８と同様の方法で加水分解後、遊離したベンジルアルコールを参考例８と同様な条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＰｈｅ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して３２．６％であった。
参考例１０  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約３２のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物とＬ−フェニルアラニンベンジルエステルとのアミド結合体の合成
参考例４記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約３２のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（６６８ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１３ｍＬ）に溶解し、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルの４−トルエンスルホン酸塩（２８２ｍｇ）、ＴＦＦＨ（１７５ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４５μＬ）を加えて４０℃にて２０時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（２６ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（１０４ｍＬ）を滴下した。析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水（１６ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、１０ｍＬ）に通塔し、５０％アセトニトリル水にて溶出した。目的化合物を含む溶出画分を凍結乾燥して、標記化合物（７６２ｍｇ）を得た。【００９２】
本化合物を参考例８と同様の方法で加水分解後、遊離したベンジルアルコールを参考例８と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＰｈｅ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して４１．８％であった。
参考例１１  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約３６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物とＬ−バリンベンジルエステルとのアミド結合体の合成
参考例５記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約３６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（５３１ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０．６ｍＬ）に溶解し、Ｌ−バリンベンジルエステルの４−トルエンスルホン酸塩（１９５ｍｇ）、ＴＦＦＨ（１３５ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２８８μＬ）を加えて４０℃にて３０時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（２０ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（８０ｍＬ）を滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を３０％アセトニトリル水（２５ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液に陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、３ｍＬ）を加え、３０分間撹拌後、樹脂をろ去した。目的化合物を含むろ液を凍結乾燥して標記化合物（５５９ｍｇ）を得た。【００９３】
本化合物を参考例８と同様の方法で加水分解後、遊離したベンジルアルコールを参考例８と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＶａｌ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して４１．３％であった。
参考例１２  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物とＬ−フェニルアラニンベンジルエステルとのアミド結合体の合成
参考例１記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（６．００ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）に溶解し、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルの塩酸塩（２．０８ｇ）、ＤＭＴ−ＭＭ（２．３７ｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２４ｍＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、１５００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を９７重量％ＤＭＦ水（１５０ｍＬ）に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、１５ｍＬ）を加え、２時間室温で撹拌後、樹脂をろ去し、樹脂をＤＭＦ（７５ｍＬ）にて洗浄した。得られたろ液を、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）（２４００ｍＬ）に滴下し、３０分間攪拌後、析出した沈殿物をろ取し、標記化合物（６．８８ｇ）を得た。【００９４】
本化合物を参考例８と同様の方法で加水分解後、遊離したベンジルアルコールを参考例８と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＰｈｅ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところ、ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して６２．４％であった。
参考例１３  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と臭化ベンジルとのエステル結合体の合成
参考例１記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（３４２ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６．８ｍＬ）に溶解し、臭化ベンジル（２９．０μＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５３．１μＬ）を加えて３７℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（１３．６ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（５４．４ｍＬ）を滴下した。１時間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水（２０ｍＬ）に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、４ｍＬ）に通塔し、５０％アセトニトリル水にて溶出した。目的化合物を含む溶出画分を減圧下１／２容量まで濃縮後、凍結乾燥して、標記化合物（３５２ｍｇ）を得た。【００９５】
本化合物を参考例８と同様の方法で加水分解後、遊離したベンジルアルコールを参考例８と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して２５．０％であった。
参考例１４  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と４−フェニルブチルブロミドとのエステル結合体の合成
参考例７記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（２．３３ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）に溶解し、４−フェニルブチルブロミド（６８２ｍｇ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ、５９８μＬ）を加えて３８℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、５００ｍＬ）に滴下した。１時間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、５ｍＬ）を加え、２時間撹拌後、樹脂をろ去後、ろ液を凍結乾燥して、標記化合物（２．５４ｇ）を得た。【００９６】
本化合物を参考例８と同様な条件で加水分解後、遊離した４−フェニルブタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物の４−フェニルブトキシ基の結合率を求めたところ、ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して６５．７％であった。
実施例１  式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｎの平均値が２７２、ｍの平均値が２１、Ｘがゲムシタビン又は水酸基であるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
参考例６記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２１のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（７５９ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（３３０ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１９２μＬ）を加えて、３７℃にて撹拌した。溶解後、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、３００ｍｇ）を加えて、３７℃にて２０時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（３０ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（１２０ｍＬ）を滴下した。１時間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を２５％アセトニトリル水（４０ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を凍結乾燥して、標記化合物（１０７８ｍｇ）を得た。【００９７】
本化合物を加水分解後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で２０．８％（ｗ／ｗ）（ポリカルボン酸のカルボキシル基に対して５８．０％）であった。又、本発明化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．３％以下であった。【００９８】
加水分解の方法
標記化合物（３．６０ｍｇ）をメタノール（０．５ｍＬ）に溶解し、濃アンモニア水（０．５ｍＬ）を加えて密栓し、３７℃にて１時間撹拌した。酢酸にて中和後、蒸留水にて希釈して正確に１０ｍＬ溶液とした。【００９９】
ＨＰＬＣの分析条件（ゲムシタビンの分析）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（粒径５μｍ）、４．６φ×１５０ｍｍ；
カラム温度：４０℃；
溶離液：９５％リン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．９）−５％アセトニトリル；
流速：１ｍＬ／分；
検出器（検出波長）：ＵＶ（２７５ｎｍ）
実施例２  式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｎの平均値が２７２、ｍの平均値が２４、Ｘがゲムシタビン、水酸基又はＬ−フェニルアラニンベンジルエステル残基であるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
参考例８記載の化合物（１．２９８ｇ）及び塩酸ゲムシタビン（０．３６６ｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２６ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２１３ｍＬ）を加えて３７℃にて撹拌した。溶解後、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、０．３６２ｇ）を加えて３７℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（５２ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（２０８ｍＬ）を滴下した。１時間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を２５％アセトニトリル水（４０ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を凍結乾燥して、標記化合物（１．３３０ｇ）を得た。【０１００】
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で１０．７％（ｗ／ｗ）（ポリカルボン酸のカルボキシル基に対して２８．１％）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．３％以下であった。
実施例３  式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｎの平均値が２７２、ｍの平均値が４１、Ｘがゲムシタビン、水酸基又はＬ−フェニルアラニンベンジルエステル残基であるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
参考例９記載の化合物（１６５ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（６７．４ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３．３ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３９．２μＬ）を加えて３７℃にて撹拌した。溶解後、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、５６．０ｍｇ）を加えて３７℃にて２３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（６．６ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（２６．４ｍＬ）を滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を１０％アセトニトリル水（１６ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を凍結乾燥して標記化合物（１８３ｍｇ）を得た。【０１０１】
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で２１．２％（ｗ／ｗ）（ポリカルボン酸のカルボキシル基に対して４２．６％）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．３％以下であった。
実施例４  式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｎの平均値が２７２、ｍの平均値が２６、Ｘがゲムシタビン、水酸基又はベンジルオキシ基であるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
参考例１３記載の化合物（２９５ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（１０８．５ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６３．１μＬ）を加えて３７℃にて撹拌した。溶解後、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、９８．２ｍｇ）を加えて３７℃にて２３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（１２ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（４８ｍＬ）を滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を１０％アセトニトリル水（１６ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を凍結乾燥して、標記化合物（３３４ｍｇ）を得た。【０１０２】
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で２０．５％（ｗ／ｗ）（ポリカルボン酸のカルボキシル基に対して４９．９％）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は５．１％であった。
実施例５  式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｎの平均値が２７２、ｍの平均値が３６、Ｘがゲムシタビン、水酸基又はＬ−バリンベンジルエステル残基であるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
参考例１１記載の化合物（５１５ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（１３４ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０．３ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７７．９μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、１６６ｍｇ）を加えて４０℃にて２０時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（２０．６ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（８２．４ｍＬ）を滴下した。析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を３０％アセトニトリル水（２０ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を凍結乾燥して、標記化合物（５７４ｍｇ）を得た。【０１０３】
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で１４．１％（ｗ／ｗ）（ポリカルボン酸のカルボキシル基に対して２８．８％）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。
実施例６  式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｎの平均値が２７２、ｍの平均値が２６、Ｘがゲムシタビン、水酸基又はＬ−フェニルアラニンベンジルエステル残基であるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
参考例１２記載の化合物（３．０ｇ）及び塩酸ゲムシタビン（４９２ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２８６μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、５０８ｍｇ）を加えて４０℃にて２４時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）（７５０ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水（５０ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（３Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を凍結乾燥して、標記化合物（２．９４ｇ）を得た。【０１０４】
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で４．６７％（ｗ／ｗ）（ポリカルボン酸のカルボキシル基に対して１１．９％）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。
実施例７  式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｎの平均値が２７２、ｍの平均値が２６、Ｘがゲムシタビン、水酸基又は４−フェニルブチルアルコール残基であるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
参考例１４記載の化合物（２．０７ｇ）及び塩酸ゲムシタビン（３７５ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１８μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、３８６ｍｇ）を加えて４０℃にて２４時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、７５０ｍＬ）に滴下した。１時間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水（２５ｍＬ）に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（３Ｌ×３）にて透析した．透析した溶液を凍結乾燥して、標記化合物（２．０５ｇ）を得た。【０１０５】
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で７．３５％（ｗ／ｗ）（ポリカルボン酸のカルボキシル基に対して１７．５％）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。
実施例８  式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｎの平均値が２７２、ｍの平均値が３２、Ｘがシタラビン又は水酸基であるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
参考例４記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約３２のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（１３０ｍｇ）及びシタラビン（５０．０ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．６ｍＬ）にて溶解後、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、６３．６ｍｇ）を加えて４０℃にて２４時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（５．２ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（２０．８ｍＬ）を滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を２０％アセトニトリル水に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を凍結乾燥して、標記化合物（１４３ｍｇ）を得た。【０１０６】
本化合物を加水分解後、遊離したシタラビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のシタラビン含量を求めたところ、シタラビン換算で２２．５％（ｗ／ｗ）（ポリカルボン酸のカルボキシル基に対して５９．２％）であった。【０１０７】
加水分解の方法
標記化合物（３．２０ｍｇ）をメタノール（０．５ｍＬ）に溶解し、濃アンモニア水（０．５ｍＬ）を加えて密栓し、３７℃にて１時間撹拌した。酢酸にて中和後、蒸留水にて希釈して正確に１０ｍＬ溶液とした。【０１０８】
ＨＰＬＣの分析条件（シタラビンの分析）
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  Ｆ５（粒径５μｍ）、４．６φ×２５０ｍｍ；
カラム温度：４０℃；
溶離液：リン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．９）；
流速：１ｍＬ／分；
検出器（検出波長）：ＵＶ（２７５ｎｍ）
実施例９  式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｎの平均値が２７２、ｍの平均値が３２、Ｘがシタラビン、水酸基又はＬ−フェニルアラニンベンジルエステル残基であるシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
参考例１０記載の化合物（２６７ｍｇ）及びシタラビン（５０．０ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．３ｍＬ）にて溶解後、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、６３．６ｍｇ）を加えて、４０℃にて２１時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、エタノール（１０．６ｍＬ）にて希釈し、撹拌下、ジイソプロピルエーテル（４２．４ｍＬ）を滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を３０％アセトニトリル水に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した。透析した溶液を凍結乾燥して、標記化合物（２９０ｍｇ）を得た。【０１０９】
本化合物を実施例８と同様の方法で加水分解後、遊離したシタラビンを実施例８と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のシタラビン含量を求めたところ、シタラビン換算で１１．３％（ｗ／ｗ）（ポリカルボン酸のカルボキシル基に対して３１．５％）であった。
試験例１  酵素非存在下における薬剤放出性試験
実施例１の化合物（図１中では化合物１と表記）、実施例２の化合物（図１中では化合物２と表記）又は実施例７の化合物（図１中では化合物７と表記）をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、３７℃にて定温放置した。放出されたゲムシタビン量をＨＰＬＣにて経時的に測定し、使用した化合物中の全ゲムシタビン量に対する放出されたゲムシタビン量の割合を求めた。結果を図１に示す。この結果、本発明の化合物は酵素に依存せずに薬剤を徐放することが示された。
試験例２  マウス血漿中における薬剤放出性試験
実施例１の化合物（２．３ｍｇ；図２中では化合物１と表記）又は実施例２の化合物（３．７ｍｇ；図２中では化合物２と表記）をリン酸緩衝生理食塩水（０．１ｍＬ、ｐＨ７．４）に溶解後、マウスより採血し調製した血漿（０．４ｍＬ）を４倍量（ｖ／ｖ）加えて３７℃にて定温放置した。経時的に５０μＬずつ取り、５０％メタノール水（４５０μＬ）にて希釈した。メンブランフィルター（孔径０．４５μｍ）にて除タンパク処理した後、放出されたゲムシタビン量をＨＰＬＣにて測定し、使用した化合物中の全ゲムシタビン量に対する放出されたゲムシタビン量の割合を求めた。結果を図２に示す。本発明の化合物は血漿中でも薬剤を徐放することが示された。
試験例３  担癌マウスに対する抗腫瘍効果（１）
マウス皮下で継代しているマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍塊を約２ミリメートル角のブロックにし、套管針を用いてマウス皮下に移植した。腫瘍移植後７日目に実施例１の化合物（表２中では化合物１と表記）、実施例２の化合物（表２中では化合物２と表記）、実施例４の化合物（表２中では化合物４と表記）又は対照薬としての塩酸ゲムシタビンを５％ブドウ糖注射液にて溶解し、表２に示す投与量で静脈内に単回投与した。投与開始日及び投与開始後７日目の腫瘍体積を下記の式により算出し、投与開始日に対する投与開始後７日目の相対腫瘍体積を求めた。結果を表２に示す。【０１１０】
【数１】
0005000512.tif 000011
【０１１１】
【表２】
0005000512.tif 000012
この結果、本発明の化合物は、対照薬である塩酸ゲムシタビンと比較して低投与量で同等以上の抗腫瘍効果を有することが明らかである。又、疎水性置換基を有する本発明化合物（実施例２の化合物又は実施例４の化合物）は、疎水性置換基を有しない化合物（実施例１の化合物）に比べて、更に少ない投与量で同等の効果を有することが示された。
試験例４  担癌マウスに対する抗腫瘍効果（２）
マウス皮下で継代しているマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍塊を約２ミリメートル角のブロックにし、套管針を用いてマウス皮下に移植した。腫瘍移植後７日目に実施例７の化合物（表３中では化合物７と表記）又は対照薬としてのゲムシタビンを５％ブドウ糖注射液にて溶解し、表３に示す投与量で静脈内に単回投与した。投与開始日及び投与開始後１０日目の腫瘍体積を試験例３と同様に算出し、投与開始日に対する投与開始後１０日目の相対腫瘍体積を求めた。結果を表３に示す。【０１１２】
【表３】
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この結果、本発明の化合物は、対照薬である塩酸ゲムシタビンと比較して低投与量で同等以上の抗腫瘍効果を有することが明らかである。
試験例５  担癌マウスに対する抗腫瘍効果（３）
マウス皮下で継代しているマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍塊を約２ミリメートル角のブロックにし、套管針を用いてマウス皮下に移植した。腫瘍移植後７日目に実施例８の化合物（表４中では化合物８と表記）、実施例９の化合物（表４中では化合物９と表記）又は対照薬としてのシタラビンを５％ブドウ糖注射液にて溶解し、表４に示す投与量で静脈内に単回投与した。投与開始日及び投与開始後１０日目の腫瘍体積を試験例３と同様に算出し、投与開始日に対する投与開始後１０日目の相対腫瘍体積を求めた。結果を表４に示す。【０１１３】
【表４】
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この結果、本発明の化合物は、対照薬であるシタラビンと比較して低投与量でより高い抗腫瘍効果を有することが明らかである。又、疎水性置換基を有する化合物（実施例９の化合物）は、疎水性置換基を有しない化合物（実施例８の化合物）に比べて、更に少ない投与量で同等の効果を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】酵素非存在下における薬剤放出の経時変化を示す。
【図２】マウス血漿中における薬剤放出の経時変化を示す。
【図１】
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【図２】
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