(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡内で検査試料を数個の波長で照明するためのレーザー装置を備え、どの励起波長でも同じ試料領域内を励起するために、蛍光顕微鏡の結像レンズ系が、縦方向および横方向色収差に関して補正される蛍光顕微鏡において、
照明光路の平行光路内に補正レンズ系（ＫＯ）を備え、
前記補正レンズ系（ＫＯ）が、平行光路に対する傾きを調整可能である境界面（ＧＦ）を有し、
前記境界面（ＧＦ）が、平ら、かつ前記平行光路に対して傾いて形成されているか、または、前記境界面（ＧＦ）が、球面状であって、前記平行光路に対して垂直に移動可能であり、
前記境界面（ＧＦ）のさまざまな傾きにより、試料照明時の諸波長の重ね合せ誤差を補正することを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記境界面（ＧＦ）が、２つのガラス体の間に形成され、前記２つのガラス体の屈折率が同じであり、その分散が異なることを特徴とする、請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記補正レンズ系（ＫＯ）が、無限焦点アクロマートから形成されることを特徴とする、請求項１または２に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記補正レンズ系（ＫＯ）が、光路内で相前後して位置する２つの無限焦点アクロマートから形成され、前記無限焦点アクロマートが縦方向色収差に関して反対の効果を備えていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記蛍光顕微鏡が２色蛍光相互相関顕微鏡として形成されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項６】
前記蛍光顕微鏡がレーザー走査顕微鏡として形成されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、異なる波長のレーザー光で、主として蛍光相関分光法(FCS)の相互相関分散分析の際に、試料を照射することに関するものである。
しかし、他の顕微鏡システム、たとえばレーザー走査顕微鏡で利用し、また時間分解能良く蛍光を検出するのに利用し、数個の波長を同時にまたは順次に正確に同一の試料位置へ照射するのにも優れた方法である。
【０００２】
【従来の技術】
相互相関FCSでは、異なる２波長の識別した反応対およびそれによる２色の反応生成物の、同時、かつスペクトル上分離された検出が行われる。検出信号の数学方程式は、個々のスペクトル成分が煩雑に寄与することなく、連合した反応対の強度および反応機構について情報をもたらす。
【０００３】
少量の試料領域、直径がエアリーディスク程度のものを、異なる２波長のレーザーで照明することが要求される。両方の領域はこのとき完全に重なり合っていなければならない。
避けられない仕上げ公差および調整公差のため、ある色の横方向収差、およびその結果異なる波長で照射するとき領域の重ね合わせが不十分であることが除去できない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、異なる波長で照明するとき、可能な限り正確な領域の重ね合わせを保証することである。
本発明に従えば、本課題は独立請求項の特徴によって解決される。
推奨する発展法は従属請求項の対象である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明およびその作用および長所を、以下に図示に基づいてより詳細に説明する。
数個の波長の光が照射光路内で結合される。図１に示すように、これは結合レンズ系EOを通じて行われ、結合レンズ系は無限遠に合わせたビームを作り出す。結合レンズ系の後ろには平行光路内に本発明に従う補正レンズ系KOが置かれ、これは光路内において調整の目的のため移動できるように配列されている。
【０００６】
主ビームスプリッターの先には、中間像を作り出す伝達レンズ系UO−スキャナーの後ろに置かれたレーザー走査顕微鏡の走査対物レンズ（たとえばDE 19702793に従う）であってもよい−、また、円筒レンズTLおよび対物レンズObjが試料領域Pの照射をもたらす。
【０００７】
測定信号の検出は検出ユニットDE内で行われるが、これは主ビームスプリッターおよび収束力のある検出レンズ系の後ろにある。検出ユニットは波長分散素子、たとえばダイクロイックビームスプリッター、また、相応のフィルターおよび検出器を包含する。
結合レンズ系EOと伝達レンズ系UOとの間、また、円筒レンズTLと対物レンズObjとの間では、光路は平行である。
【０００８】
本発明に従えば、２つの平行光路の１つの中にある補正レンズ系KOを通じて、発生する横方向色収差の補正が行われる。
補正レンズ系は、屈折率は等しいが分散が異なるガラスを組み合わせて無限焦点として作用するものから成る。補正レンズ系の内部境界面GFにおいて分散がジャンプしていることによって、ビームが通過する際にこれが波長に依存して光軸に関して異なる方向に偏向する。
【０００９】
所望の補正効果を得るには、種々の技術的実現法が可能である。
最初の長所を持った解決法は、平行照射光が光軸から外れてこのような補正部材を通過する際に、平凸レンズと平凹レンズとの間にあるアーチ型の境界面で屈折率ジャンプがあることの利用に基づく。異なる波長は、その方向（横方向色収差）およびその収束・発散（距離色収差）に関して異なった影響を受ける。
【００１０】
可能性のある１つの実現法が実施例１に従って構成され、図２によって図解されている。他の実現法が実施例２、３、４に対応するガラスの組み合わせによって特徴付けられている。
【００１１】
実施例１および２は相反する構成になっている。すなわち、一方はクラウンガラスレンズが集光し、フリントガラスレンズが散光し、他方はその逆である。この解決法は等価であり、単に横方向色収差を補償するために必要な調整移動方向によってのみ決定される。距離色収差への作用は反対となる。
【００１２】
実施例３および４では、反対に作用する無限焦点アクロマートによって、距離色収差の影響が斜光の波長について補償される。このために、実施例１および２、もしくは２および１が組み合わされている。
【００１３】
最初に実施例１および２に記載の両補正部材が光路内の中央に投入され、次にそのうちの１基が軸外に移動させられる。
実施例３および４は距離色収差に関して副作用がない。距離色収差を光路全体の設計で顧慮するのであれば、実施例１および２を投入するのが有利である。
【００１４】
【実施例１】
0004887556.tif 000002
【００１５】
【実施例２】
0004887556.tif 000003
【００１６】
【実施例３】
0004887556.tif 000004
【００１７】
【実施例４】
0004887556.tif 000005
【００１８】
他の長所を持つ解決法として、１つの平面境界面での屈折率ジャンプに基づくもので、この境界面の傾斜角が可変であり、ビーム方向の影響が波長に依存するという解決法がある。調整可能な可変のウェッジ角を有する解決法は、図３およびそれに属する実施例５に図解詳述されている。
【００１９】
半球形の保持器HK中で回転可能なガラス球GKは異なる材質で構成されている（クラウンガラス・フリントガラス）。境界面GFでは入射角に応じて異なる屈折が生じ、これは波長に依存する。保持器HKの材質は隣接する半球の材質それぞれに応じているため、ビームは保持器HKによって影響を受けない。
【００２０】
実施例５は距離色収差に副作用を受けず、これによって光学的に実施例３および４と同等である。しかし構成に必要な空間は大きくなる。
また考え得るのは、可変のウェッジ角を有する数基のガラス楔を配列し、ある特定の波長について発散を作るようにすることで、これらのガラス楔は光路内で交換可能・回転可能に配列できるようにする。
【００２１】
【実施例５】
0004887556.tif 000006
【００２２】
補正レンズ系を実施例１ないし４および図２で光軸に垂直に動かすことによって、もしくは実施例５および図３で接合した球を回転させることによって、偏向の強さを調整し、それによって既存の横方向色収差を試料内で除去できる。
【００２３】
（中間の）波長gはどんな補正レンズ系の状態でもこの選択例では正確に通過して行くが、波長rおよびbは異なった偏向をする。
補正レンズ系の調整は実用上照射領域を直接観察し、あるいはまた間接的に解析信号、たとえば相互相関信号を評価しながら行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従う補正レンズ系を有する、相互相関FCSまたは他の顕微鏡検出法のための規範的配列
【図２】実施例１に記載の、平行光路内に投入された補正レンズ系への光程図
【図３】実施例５に記載の、平行光路内に投入された補正レンズ系への光程図
【符号の説明】
P     試料領域
Obj   対物レンズ
TL    円筒レンズ
UO    伝達レンズ系
DE    検出ユニット
KO    補正レンズ系
EO    結合レンズ系
【図１】
0004887556.tif 000007
【図２】
0004887556.tif 000008
【図３】
0004887556.tif 000009