(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、またはＬＲＭＫ残基が不変であり且つ抗原提示を高める活性を保持するその改変物、から成るＮ末端；
ｂ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合する、ポリペプチドの形態の抗原エピトープを含んで成るＣ末端；ならびに
ｃ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群であり、該原子はアミノ酸または５−アミノペンタノイル部分である）
を含んで成る、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項２】
介在化学構造が、直線状の様式で配置される４ないし６アミノ酸の長さである、請求項１記載のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項３】
Ｉｉ  ｋｅｙペプチドが、Ｃ末端の短縮によりＬＲＭＫ（配列番号３）に改変されている、請求項１記載のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項４】
Ａｃ−ＬＲＭＫ（配列番号３）−５−アミノペンタノイル−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）−ＮＨ2、Ａｃ−ＬＲＭＫ（配列番号３）−５−アミノペンタノイル−５−アミノペンタノイル−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）−ＮＨ2、Ａｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号９）、Ａｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号１０）、およびＡｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号１１）より成る群から選択される、請求項１記載のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項５】
Ｉｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）の改変が：
ｂ）Ｃ末端からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸の欠失；
ｃ）Ｎ末端の保護；
ｄ）アミノ酸置換；および
ｅ）環化誘導体の生成
より成る群から選択される、請求項１記載のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項６】
Ｉｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）の改変が：
ｂ）Ｄ異性体のアミノ酸；
ｃ）Ｎ−メチルアミノ酸；
ｄ）Ｌ異性体のアミノ酸；
ｅ）改変されたＬ異性体のアミノ酸；および
ｆ）環化誘導体
より成る群から選択される分子での１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換である、請求項１記載のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項７】
ａ）ＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープを、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドに組み込むことであって、該ハイブリッドポリペプチドは；
ｉ）哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、または残基ＬＲＭＫが不変であり且つ抗原提示を高める活性を保持するその改変物、から成るＮ末端；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合するポリペプチドの形態のＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープを含んで成るＣ末端；ならびに
ｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群であり、該原子はアミノ酸または５−アミノペンタノイル部分である）
を含んで成り；かつ
ｂ）生理学的条件下で：
ｉ）段階ａ）のハイブリッドポリペプチド；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞；および
ｉｉｉ）抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原エピトープの提示に対し応答性であるＴ細胞
を接触させること、
を含んで成る、Ｔ細胞へのＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープの提示を高めるインビトロの方法。
【請求項８】
抗原エピトープに対するＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の応答が増大される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｉｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）の改変が：
ｂ）Ｃ末端からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸の欠失；
ｃ）Ｎ末端の保護；
ｄ）アミノ酸置換；および
ｅ）環化誘導体の生成
より成る群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
Ｉｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）の改変が：
ｂ）Ｄ異性体のアミノ酸；
ｃ）Ｎ−メチルアミノ酸；
ｄ）Ｌ異性体のアミノ酸；
ｅ）改変されたＬ異性体のアミノ酸；および
ｆ）Ｄ異性体のアミノ酸
より成る群から選択される分子での１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
ａ）抗原エピトープを、抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドに組み込むことであって、該ハイブリッドポリペプチドは
ｉ）哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、または残基ＬＲＭＫが不変であり且つ抗原提示を高める活性を保持するその改変物、から成るＮ末端；
ｉｉ）抗原エピトープを含んで成るＣ末端；
ｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群であり、該原子はアミノ酸または５−アミノペンタノイル部分である）
を含んで成り；ならびに
ｂ）生理学的条件下で、段階ａ）の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドを、抗原提示細胞、および抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原エピトープの提示に対して応答性であるＴリンパ球と接触させること
を含んで成る、対立性に限定される抗原エピトープのＭＨＣクラスＩＩの対立性の提示の範囲を高めるインビトロの方法。
【請求項１２】
ａ）候補の抗原エピトープを、抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドに組み込むことであって、該ハイブリッドポリペプチドはｉ）哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、または残基ＬＲＭＫが不変であり且つ抗原提示を高める活性を保持するその改変物、から成るＮ末端；
ｉｉ）抗原エピトープを含んで成るＣ末端；ならびに
ｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群であり、該原子はアミノ酸または５−アミノペンタノイル部分である）
を含んで成り；ならびに
ｂ）生理学的条件下で、ハイブリッドポリペプチドを：
ｉ）ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞；および
ｉｉ）抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原エピトープの提示に対して応答性であるＴｈ１もしくはＴｈ２いずれかの細胞
と接触させることにより、ＭＨＣクラスＩＩに限定されるＴｈ１およびＴｈ２刺激の予め決められたパターンを伴い提示活性を表すハイブリッド分子についてスクリーニングすること；ならびに
ＭＨＣクラスＩＩ提示によりＴｈ１およびＴｈ２細胞の予め決められたパターンを刺激するハイブリッドポリペプチドを同定すること
を含んで成る、ＭＨＣクラスＩＩに限定されるＴｈ１およびＴｈ２刺激の予め決められたパターンを表す抗原エピトープを同定するためのインビトロの方法。
【請求項１３】
ｉ）哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、または残基ＬＲＭＫが不変であり且つ抗原提示を高める活性を保持するその改変物、から成るＮ末端；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合するポリペプチドの形態の特定の分子の抗原エピトープを含んで成るＣ末端；ならびに
ｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群であり、該原子はアミノ酸または５−アミノペンタノイル部分である）
を含んで成る、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド
を含んで成る、個体のＴリンパ球への該分子の抗原エピトープのＭＨＣクラスＩＩ提示を高めることによる、該分子に対する個体の免疫応答を調節するための医薬組成物。
【請求項１４】
抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子へのハイブリッドの結合に適切な条件下で、
ｉ）哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、または残基ＬＲＭＫが不変であり且つ抗原提示を高める活性を保持するその改変物、から成るＮ末端；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合するポリペプチドの形態の特定の分子の抗原エピトープを含んで成るＣ末端；ならびに
ｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群であり、該原子はアミノ酸または５−アミノペンタノイル部分である）
を含んで成る、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドで、個体に由来する抗原提示細胞をエクスビボで処理すること；
を含んで成る、個体のＴリンパ球への該分子の抗原エピトープのＭＨＣクラスＩＩ提示を高めることによる、該分子に対する個体の免疫応答を高めるための抗原提示細胞の製造方法。
【請求項１５】
生理学的条件下で、以下の成分：
ａ）Ｔリンパ球に提示される抗原エピトープをその表面上に表す、ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞；ならびに
ｂ）ｉ）哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、または残基ＬＲＭＫが不変であり且つ抗原提示を高める活性を保持するその改変物、から成るＮ末端；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合する抗原結合部位のリガンドを含んで成るＣ末端；ならびに
ｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群であり、該原子はアミノ酸または５−アミノペンタノイル部分である）
を含んで成る、抗原提示を阻害するハイブリッドポリペプチド；ならびに
ｃ）抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による部分ａ）の抗原エピトープの提示に対して応答性であるＴリンパ球
を接触させることを含んで成る、ＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープのＴリンパ球への提示を全般的に阻害するためのインビトロの方法。
【請求項１６】
ｉ）哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、またはＬＲＭＫ残基が不変であり且つ抗原提示を高める活性を保持するその改変物、を含んで成るＮ末端；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合する抗原結合部位のリガンドを含んで成るＣ末端；ならびに
ｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群であり、該原子はアミノ酸または５−アミノペンタノイル部分である）
を含んで成る、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を阻害するハイブリッドポリペプチド
を含んで成る、個体の抗原提示細胞によるＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を全般的に阻害することによる、有益でない免疫応答の生成を伴う疾患についての個体を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
免疫系は、「外来」もしくは「異常な」構造の抗原としての認識により、外来病原体、腫瘍細胞、自己免疫疾患が誘発する過程、アレルゲン、移植片に応答する。それらの抗原の大部分は、宿主の細胞もしくは病原体のいずれかにより合成されるタンパク質である。こうした抗原はペプチドフラグメントにプロセシング（タンパク質分解的に消化）され、これらは抗原提示細胞の表面上のペプチド提示構造において免疫系の応答するリンパ球に提示されることになる。それらのペプチド提示構造は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれる。それらは、それらが最初にＭＨＣ遺伝子座（その遺伝子はマウスの近交系の間の移植片拒絶を制御する）中の多形の対立性遺伝子の産物として認識されたため、その名称を得た。
【０００２】
動物は、「自己」分子由来のペプチドを、「非自己」分子由来のペプチドと区別するために、抗原を提示かつ認識するこうした複雑な方法を発達させた。本発明は、免疫応答の第一段階のこの基礎的な過程を活用するための物質および方法に関する。ここでは、免疫系のワクチン接種のためにあるＭＨＣ分子への選択された抗原ペプチドの装填（ｃｈａｒｇｉｎｇ）を高める化合物および方法を示す。こうしたワクチン接種は、侵襲性の病原体もしくは腫瘍の外来性に対する毒性の応答を高めることができる。本発明の化合物を使用する他の方法は、自己免疫疾患、アレルギーもしくは移植片拒絶を制御するために自己の認識を増強するのに適用することができる。
【０００３】
特定の抗原に対する免疫応答は、ＭＨＣ分子中のそれらの抗原のペプチドフラグメントを認識するＴリンパ球により媒介される。抗原提示細胞（ＡＰＣ）内で、タンパク質分解的にプロセシングされた抗原のペプチドフラグメントは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の抗原ペプチド結合部位に結合されたようになる。これらのペプチド−ＭＨＣ複合体は、その後、応答するＴリンパ球上のＴ細胞受容体による（外来ペプチドおよび提示するＭＨＣ分子の隣接する表面の双方の）認識のため、細胞表面に輸送される。それらのＴリンパ球は、（免疫応答を助けるもしくは抑制するための）免疫調節機能または（例えば細胞傷害性の免疫応答により病原体もしくは腫瘍を消失させるための）エフェクター機能のいずれかを有することができる。抗原特異的な認識事象は、保護的免疫応答、もしくは自己免疫の過程の場合は有害な免疫応答につながる免疫応答カスケードを開始する。
【０００４】
２つのクラスのＭＨＣ分子が、Ｔ細胞への抗原ペプチドの免疫系の提示体として機能する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ほぼＭＨＣクラスＩ分子の合成の時点で、小胞体において感染性ウイルスのような内在性に合成されたタンパク質からのペプチドを受領する。ＭＨＣクラスＩに結合された抗原ペプチドは、細胞表面上で、ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球に提示され、これがその後活性化されたようになり、そしてウイルスを発現する細胞を直接殺すことができる。対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、それらの抗原ペプチド結合部位を不変鎖タンパク質（Ｉｉ）により封鎖されて、小胞体中で合成される。ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉタンパク質のこれらの複合体は、小胞体から後ゴルジ区画に輸送され、そこでＩｉがタンパク質分解により放出され、かつ、特定の抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されたようになる（Ｂｌｕｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３９７５（１９８８）；Ｒｉｂｅｒｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：４７４（１９９２）；Ｄａｉｂａｔａら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：２５５（１９９４）；Ｘｕら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：７２３（１９９４）；Ｘｕら、Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク  ｐ２２７（１９９４）；Ｋｒｏｐｓｈｏｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１３５７（１９９５）；およびＵｒｂａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：７５１（１９９４））。
【０００５】
Ｒ．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ（１９９６）米国特許第５，５５９，０２８号およびＨｕｍｐｈｒｅｙｓら（１９９９）米国特許第５，９１９，６３９号明細書は、それによりＩｉタンパク質が切断されて、切断の経過中にフラグメントを放出して、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位内での抗原ペプチドの結合および固定（ｌｏｃｋｉｎｇ  ｉｎ）を調節する機構を示した（Ａｄａｍｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１６９３（１９９５）；Ａｄａｍｓら、Ａｒｚｎｅｉｍ．Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：１０６９（１９９７）；およびＸｕら、Ａｒｚｎｅｉｍ．Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  印刷中（１９９９））。Ｉｉタンパク質の１セグメント、Ｉｉ（７７−９２）が、その部位の端近くの抗原ペプチドのＮ末端を保持する抗原ペプチド結合部位の外側のアロステリック部位で作用することが見出された。引用される特許は、さらに、３分類の機構による免疫応答のこの最初の調節性の抗原ペプチドを認識する事象を制御するための新規治療化合物および方法を開示した。第一の機構において、抗原ペプチドは、本発明の化合物の作用により、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子からあふれる。
【０００６】
第二において、それらの分子上の抗原ペプチド結合部位の装填は、他の合成ペプチドの結合について、本発明の化合物で促進される。こうした挿入されたペプチド配列は、抗原エピトープ、もしくはにもかかわらずきつく結合して抗原ペプチド結合部位を封鎖する非抗原ペプチド配列のいずれかである可能性がある。第三の機構は、それらの複合体からの抗原ペプチドの会合／解離の速度、および三分子のＭＨＣ分子／抗原ペプチド／Ｔ細胞受容体複合体の成分の相互作用の性質、ならびにさらに、応答するＴリンパ球の分化および機能を調節する様式での補助的な細胞と細胞の相互作用の分子とのその三分子複合体の相互作用を変えることを必要とする。
【０００７】
本発明は、抗原ペプチドとのＩｉ−Ｋｅｙペプチド相同物の共有結合が、抗原エピトープの提示の潜在能力のかなりの増大につながるという驚くべき知見を示す。さらに、Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドの中心の生物学的に活性のセグメントの間のリンカーは、Ｉｉタンパク質由来の特定のペプチド配列である必要はない。例えば反復するメチレン（−ＣＨ2−）基より構成される可変性の単純なリンカーが十分かつ好ましい。
【０００８】
本発明の化合物および方法は、多様な疾患および病状における新規治療および診断化合物として適用することができる。免疫応答の最初の調節性の抗原ペプチドを認識する事象で作用することにより、これらの化合物は多様な毒性の副作用を伴う他の治療薬を上回って好都合である。
【０００９】
本明細書で、１）感染性、悪性、自己免疫およびアレルギー性疾患、ならびに移植片拒絶の抗原エピトープの同定、２）診断の目的上のこうしたエピトープの使用、ならびに３）治療の目的上のこうしたエピトープの使用における利用性を示す。
【００１０】
（発明の要約）
本発明の一局面は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドに関する。該ハイブリッドは、哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）および抗原提示を高める活性を保持するその改変物を含んで成るＮ末端、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合する、ポリペプチドもしくはペプチド模倣構造の形態の抗原エピトープを含んで成るＣ末端、ならびにハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群である）を含んで成る。好ましい態様において、介在化学構造は、いずれかの空間的に別個の様式でＭＨＣクラスＩＩ分子に水素結合することが不可能であり、かつ、好ましくは直線状の様式で同様に配置される約４ないし６アミノ酸の長さである。ハイブリッド中で使用されるＩｉ  ｋｅｙペプチドの改変は、Ｎ末端からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸の欠失、Ｃ末端からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸の欠失、Ｎ末端の保護、アミノ酸置換、および環化誘導体の生成を包含する。一態様において、ハイブリッド中で使用されるＩｉ  ｋｅｙペプチドは、ＬＲＭＫ（配列番号３）へのＣ末端の短縮により改変される。本発明の好ましいハイブリッドは、Ａｃ−ＬＲＭＫ（配列番号３）−５−アミノペンタノイル−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）−ＮＨ2、Ａｃ−ＬＲＭＫ（配列番号３）−５−アミノペンタノイル−５−アミノペンタノイル−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）−ＮＨ2、Ａｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号９）、Ａｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号１０）、もしくはＡｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号１１）を包含する。ハイブリッドで使用されるＩｉ  ｋｅｙペプチドの別の好ましい改変は、ペプチド模倣構造、Ｄ異性体のアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、Ｌ異性体のアミノ酸、改変されたＬ異性体のアミノ酸もしくは環化誘導体での１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換である。Ｉｉ  ｋｅｙペプチドと同等な様式で、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドの情況内で機能する分子の同定方法もまた提示される。
【００１１】
本発明の別の局面は、ＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープを、本発明のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドに組み込むこと、ならびにその後、生理学的条件下で、ハイブリッドポリペプチド、ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞、および抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原エピトープの提示に対し応答性であるＴ細胞を接触させること、を含んで成る、Ｔ細胞へのＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープの提示を高める方法に関する。本方法は、組み込まれた抗原エピトープに対するＭＨＣクラスＩＩの対立性の応答の増大で有用である。ＭＨＣクラスＩＩに限定されるＴｈ１およびＴｈ２刺激の予め決められたパターンを表す抗原エピトープもまた、本発明のハイブリッドに組み込まれる場合により容易に同定することができる。本発明のハイブリッドはまた、個体の特定されたＴリンパ球への特定の分子の抗原エピトープのＭＨＣクラスＩＩ提示を高めることにより、該分子に対する個体の免疫応答を調節するためにも有用である。インビボおよびエクスビボ双方の方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の局面は、Ｔリンパ球へのＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープの提示の全般的阻害方法に関する。該方法は、生理学的条件下で、以下の成分、すなわち、Ｔリンパ球に提示される抗原エピトープをその表面上に表す、ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞；抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原エピトープの提示に対し応答性であるＴリンパ球；ならびに、ｉ）哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、および抗原提示を高める活性を保持するその改変物を含んで成るＮ末端、ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合する抗原結合部位のリガンドもしくはペプチド模倣構造を含んで成るＣ末端、ならびにｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端成分を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸の長さまで伸長する可変性の鎖を形成する原子の共有結合された一群である）を含んで成る、抗原提示を阻害するハイブリッドポリペプチド、を接触させることを含んで成る。本方法は、個体の抗原提示細胞によるＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を全般的に阻害することにより、有益でない免疫応答の生成を伴う疾患について個体を治療するために有用である。ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を阻害する化合物の同定方法もまた提供する。
【００１３】
（発明の詳細な記述）
本発明の局面は、適切な介在化学構造により哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドに共有結合されてハイブリッドポリペプチドを形成する、ＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープが、前駆体の抗原エピトープがそうであるよりも有意により高い効力を伴い抗原提示細胞によりＴリンパ球に提示されるという発見に基づく。形成されるハイブリッドポリペプチドは、本明細書で「ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド」、もしくはより単純に「高めるハイブリッド」と称される。本発明の高めるハイブリッドは、哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチド、もしくは下により詳細に記述される、抗原提示を高める活性を保持するその改変物から構成されるＮ末端を有する。Ｉｉ  ｋｅｙペプチドに、提示されるべき特異的抗原エピトープを共有結合する。Ｉｉ  ｋｅｙペプチドと抗原エピトープの間は、他の２成分を共有結合する介在化学構造である。この介在化学構造は本明細書で「スペーサー」と称される。スペーサーの必要なパラメータを下により詳細に記述する。
【００１４】
哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、および改変された哺乳動物のＩｉ−ｋｅｙペプチドＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号２）が、それらのそれぞれの抗原ペプチドを認識するＴリンパ球ハイブリドーマへのある種のＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原ペプチドの提示を変える能力を有することが既に立証されている（Ｒ．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ（１９９６）米国特許第５，５５９，０２８号；Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、（１９９９）米国特許第５，９１９，６３９号明細書（それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる））。改変されたバージョンのＩｉ−ｋｅｙペプチドを用いた以前の実験は、広範な改変を、活性に対する欠点を伴わずにこのポリペプチドに対しなすことができることを示した。事実、改変はしばしばポリペプチドの抗原提示活性を高めた。下の例示の節に詳述される結果は、抗原提示を高める活性を保持する全部の改変されたＩｉ  ｋｅｙペプチドが、適切に組み込まれる場合に本発明の高めるハイブリッド中で機能することができることを示す。Ｉｉ  ｋｅｙペプチドの改変は、Ｎ末端からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸の欠失、Ｃ末端からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸の欠失、Ｎ末端の保護、アミノ酸置換、および環状ペプチドの導入を包含する。元の配列の最低４個の連続するアミノ酸を保持するＩｉ  ｋｅｙペプチドの欠失、もしくはそれらの置換されたバージョンは、機能的活性を表す。多様な天然もしくは非天然のアミノ酸を、それぞれの残基位置で置換してよい。置換してよい分子のいくつかの例は、ペプチド模倣構造、Ｄ異性体のアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、Ｌ異性体のアミノ酸、改変されたＬ異性体のアミノ酸、および環化誘導体である。加えて、医薬品化学の手順を、ハイブリッドのＮ末端のセグメントの付加的改変を得るための慣例の実験方法を使用して、当業者により適用してもよい。こうした手順の例は、理にかなった薬物設計の方法、Ｘ線回折データ、核磁気共鳴のデータおよび他のコンピュータ使用の方法からの構造情報に基づく分子模型作成、ならびにコンビナトリアル化学合成の生成物のスクリーニング、ならびに天然産物の単離である。高活性を保持することが既知であるＩｉ  ｋｅｙペプチドの改変されたバージョンの例は、ＬＲＭＫ（配列番号３）、ＬＲＭＫＬＰＫ（配列番号４）、ＬＲＭＫＬＰＫＳ（配列番号５）、ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰ（配列番号６）およびＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫ（配列番号７）である。Ｉｉ−ｋｅｙペプチドの他の改変物および改変されたバージョンは、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、（１９９９）米国特許第５，９１９，６３９号およびＨｕｍｐｈｒｅｙｓ（１９９６）米国特許第５，５５９，０２８号明細書に記述される。活性を保持することが既知である、Ｉｉ−ｋｅｙペプチドの１つの改変されたバージョン（ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ、配列番号２）を本明細書で「Ｉｉ−ｋｅｙ相同物」と称する。本明細書で使用されるところのＩｉ  ｋｅｙ相同物という用語は、Ｉｉ  ｋｅｙペプチドそれ自身を包含する。
【００１５】
高めるハイブリッドの「抗原エピトープ」は、なんらかのＴ細胞になんらかのＭＨＣクラスＩＩ分子のなんらかの対立遺伝子により提示されるエピトープである。そういうものとして、抗原エピトープはＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合する。本発明の高めるハイブリッドの生成での使用に選択される「抗原エピトープ」は、使用のためにさらに改変してよい。すなわち、天然のもしくは改変された配列のポリペプチド、ペプチド模倣構造、およびまた天然のもしくは改変されたアミノ酸でない化学構造を、抗原エピトープに包含してよい。加えて、多様な化学的改変、例えば非天然のアミノ酸、または他の主鎖もしくは側鎖部分の全体もしくは一部の付加を抗原エピトープに対しなすことができ、ここで、該改変は、Ｔ細胞刺激に好都合な様式で哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位中の抗原エピトープの結合を保存する。こうした化学構造は、天然のタンパク質配列由来であるいずれかの抗原ペプチドに対する中程度の、わずかな構造的類似をもつことができるか、もしくは明らかな構造的類似をもたなくてもよい。こうした改変はＴ細胞受容体による認識に影響があってももしくはなくてもよい。改変は、抗原エピトープの認識を増大する（例えば、Ｔ細胞受容体の以前に認識しないサブセットによる認識につながる）ことができる。
【００１６】
ハイブリッド中の介在する化学的セグメントもしくは「スペーサー」は、Ｉｉ−ｋｅｙ相同物および抗原エピトープを連結する。２個もしくはそれ以上のこうした介在するセグメントを「スペーサー」と称する。スペーサーは、直線状の様式で配置される場合に、直線状の様式で同様に配置された２０アミノ酸のペプチジル主鎖の原子の長さまで伸長することができる、０から多数までの原子の範囲にわたる原子の共有結合された一群から構成される。好ましくは、スペーサーは直線状に配置される９アミノ酸のペプチジル主鎖の長さより短い。至適には、スペーサーの長さは直線状に配置される４と６アミノ酸との間のペプチジル主鎖の長さである。好ましくは、スペーサーは、いずれかの空間的に別個の様式でＭＨＣクラスＩＩ分子に水素結合することが不可能である。
【００１７】
多様な化学基をアミノ酸の代わりにスペーサーセグメントに組み込んでよい。例は、Ｔｏｕｒｎｉｅｒら、（１９９９）米国特許第５，９１０，３００号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される。好ましい一態様において、スペーサーは、ヘテロ原子により場合によっては中断される脂肪族鎖、例えばＣ2−Ｃ6アルキレン、もしくは＝Ｎ−（ＣＨ2）2-6−Ｎ＝より構成される。あるいは、スペーサーは、Ｏ、ＮもしくはＳのようなヘテロ原子により場合によっては中断される代替単位、例えば疎水性、親油性、脂肪族およびアリール脂肪族配列から構成されてよい。スペーサーのこうした成分は、好ましくは、以下の分類の化合物、すなわちステロール、アルキルアルコール、変動するアルキル官能基をもつポリグリセリド、アルキルフェノール、アルキルアミン、アミド、疎水酸性（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｂｉｃ）ポリオキシアルキレンなどから選ばれる。他の例は、疎水性ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリヒドロキシ酸、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコールポリヒドロキシ酪酸である。スペーサーはまた、酸素原子により分離される、ポリプロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンタメチレンなどのような反復する短い脂肪族鎖を含有してもよい。
【００１８】
スペーサー中で使用することができる付加的なペプチジル配列は、Ｗｈｉｔｌｏｗら（（１９９９）米国特許第５，８５６，４５６号明細書）（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される。一態様において、スペーサーは切断にさらされるその内に組み込まれた化学基を有する。制限なしに、こうした化学基は、プロテアーゼ、化学基もしくは触媒性のモノクローナル抗体により触媒される切断のために設計してよい。プロテアーゼに感受性の化学基の場合、トリプシンの標的（陽イオン性側鎖をもつ２個のアミノ酸）、キモトリプシンの標的（疎水性側鎖をもつ）およびカテプシン感受性（Ｂ、ＤもしくはＳ）が好都合である。「トリプシンの標的」という用語は、トリプシンおよびトリプシン様酵素により認識されるアミノ酸の配列を記述するのに本明細書で使用する。「キモトリプシンの標的」という用語は、キモトリプシンおよびキモトリプシン様酵素により認識されるアミノ酸の配列を記述するのに本明細書で使用する。加えて、触媒性のモノクローナル抗体の化学的標的、および他の化学的に切断される基は、ペプチド合成、酵素触媒作用および一般に有機化学の当業者に公知であり、そして慣例の実験方法を使用してハイブリッド構造中に設計かつ合成することができる。
【００１９】
本発明のハイブリッドは、特徴が完全にペプチドから特徴が実質的に非ペプチドまで変動する。いくつかの相同物は特徴が実質的に低下される（ｒｅｄｕｃｅｄ）かもしくは非ペプチドであるという事実に鑑み、それらは好都合な特性、例えば細胞膜を通る浸透、溶解性、タンパク質分解に対する抵抗性、抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）による不活性化に対する抵抗性、経口での生物学的利用性、およびインビボでのより長い半減期を有することがよりありそうであることができる。
【００２０】
酸性もしくは塩基性の基が構造中に存在する場合、該ハイブリッド分子の製薬学的に許容できる塩もまた本発明の範囲内に包含される。「製薬学的に許容できる塩」という用語は、酢酸塩、アンモニウム塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシル酸塩（ｃａｍｓｙｌａｔｅ）、炭酸塩、塩化物／二塩酸塩、クエン酸塩、クラブラン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩（ｅｄｉｓｙｌａｔｅ）、エストル酸塩（ｅｓｔｏｌａｔｅ）、エシル酸塩（ｅｓｙｌａｔｅ）、フマル酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、ヒドロキシナフトン酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオネート（ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔｅ）、ラウリン酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、粘液酸塩、ナプシル酸塩（ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミド、オレアステ（ｏｌｅａｓｔｅ）、シュウ酸塩、パモン酸塩、パルミチン酸塩、パノエート（ｐａｎｏａｔｅ）、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、スバセテート（ｓｕｂａｃｅｔａｔｅ）、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド（ｔｒｉｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）、吉草酸塩などのような全部の許容できる塩を包含することを意図している。製薬学的に許容できる塩は、溶解性もしくは加水分解の特徴を改変するための投薬形態として使用することができるか、または持続放出もしくはプロドラッグ製剤で使用することができる。本発明の化合物の特定の官能性に依存して、本発明の化合物の製薬学的に許容できる塩は、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛のような陽イオンから、ならびにアンモニア、アルギニン、クロロプロカイン、塩素、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、リシン、Ｎ−メチルグルタミン、オルニチン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ピペラジン、プロカイン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびテトラメチレンジアミン水酸化物などのような塩基から形成させてよい。これらの塩は、標準的手順により、例えば遊離酸を適する有機もしくは無機塩基と反応させることにより製造してよい。アミノのような塩基性基が存在する場合、および酸性塩、すなわち酢酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、パモン酸塩などを投薬形態として使用することができる。
【００２１】
また、存在している酸（−ＣＯＯＨ）もしくはアルコール基の場合、製薬学的に許容できるエステル、例えば酢酸エステル、リンゴ酸エステル、ピバロイルオキシメチルなど、および持続放出もしくはプロドラッグ製剤としての使用のために溶解性もしくは加水分解の特徴を改変するために当該技術分野で既知のエステルを、使用することができる。
【００２２】
本発明のハイブリッド分子、もしくはそれらの成分は、キラル中心を有してよく、そしてそのためにラセミ化合物、ラセミ化合物の混合物、および個々の鏡像異性体もしくはジアステレオマーとして存在することができ、全部のこうした異性体、ならびにそれらの混合物が本発明に包含される。さらに、本発明のハイブリッド化合物の結晶性の形態のいくつかは、多形相として存在することができ、そしてそういうものとして本発明に包含されることを意図している。加えて、本発明の化合物のいくつかは、水もしくは普遍的有機溶媒と溶媒和物を形成することができる。こうした溶媒和物もまた本発明の範囲内に包含される。
【００２３】
本発明の高めるハイブリッドは、ペプチド、もしくはペプチド模倣物、もしくは抗原ペプチドの合成および選択のため開発された方法により合成かつ選択することができる付加的な化学基から構成されてよい。それらの方法および化合物は、以下の特許、すなわちＧｅｙｓｅｎら、（１９８７）米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９９３）米国特許第５，１９４，３９２号；Ｓｃｈａｔｚら、（１９９３）米国特許第５，２７０，１７０号；Ｌａｍら、（１９９５）米国特許第５，３８２，５１３号；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９９６）米国特許第５，５３９，０８４号；Ｐｉｎｉｌｌａら、（１９９６）米国特許第５，５５６，７６２号；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９９７）米国特許第５，５９５，９１５号；Ｋａｙら、（１９９８）米国特許第５，７４７，３３４号；およびＮｏｖａら、（１９９９）米国特許第５，８７４，２１４号明細書（それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に提示される。
【００２４】
ハイブリッドの活性は、Ｔ細胞による抗原ペプチド配列の認識に対する影響を検出する一連の免疫学的アッセイの１種もしくはそれ以上で決定する。下の例示の節に詳述される実験は、以下のハイブリッド、すなわちＡｃ−ＬＲＭＫ（配列番号２）−５−アミノペンタノイル−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）−ＮＨ2；Ａｃ−ＬＲＭＫ（配列番号２）−５−アミノペンタノイル−５−アミノペンタノイル−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）−ＮＨ2；Ａｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号９）；Ａｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号１０）；およびＡｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号１１）への抗原エピトープＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号８）の組み込みの利用性を立証する。これらのハイブリッドのそれぞれは、組み込まれない抗原エピトープＡｃ−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号８）より高い効力で、応答するＴ細胞ハイブリドーマを刺激することが示された。この決定は、抗原提示細胞へのハイブリッドおよび抗原エピトープの結合を濃度の関数として測定すること、次いで抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位へ結合されたエピトープを認識するＴ細胞受容体を有するＴ細胞ハイブリドーマによる認識によりなされた。使用された抗原提示細胞はＣＨ２７細胞系であり、また、使用されたＴ細胞ハイブリドーマはＴｐｃ９．１  Ｔハイブリドーマ細胞系であった。実験方法の付加的な詳細は下の例示に提示する。
【００２５】
これらの結果は、試験されたハイブリッドのそれぞれが、対照抗原エピトープよりかなりより大きな活性を有することを立証する。とりわけ、組み込まれない抗原エピトープからの最大の刺激の半分の終点は約２０ｎＭである。ハイブリッドＡｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ2（配列番号１０）およびＡｃ−ＬＲＭＫ（配列番号３）−５−アミノペンタノイル−５−アミノペンタノイル−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）−ＮＨ2での最大の刺激の半分の終点は約５０ｐＭである。メチレンスペーサーを使用するハイブリッドの活性は、Ｉｉタンパク質の天然の配列をもつものに匹敵する。これらの実験は、Ｉｉ−Ｋｅｙコア配列および抗原エピトープのハイブリッドのインビトロでの効力を立証し、また、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合する抗原エピトープの抗原提示の効力が、本発明の高めるハイブリッドへの組み込みに際して増大されることを示す。それらはまた、Ｉｉ  Ｋｅｙ配列をもつ登録事項（ｒｅｇｉｓｔｒｙ）中のＩｉタンパク質の一次配列由来のペプチド配列が必要とされず、かつ、さらに至適でないことも立証する。
【００２６】
付加的なアッセイ系を、本発明の高めるハイブリッド中に抗原エピトープを組み込むことの影響を測定するのに使用することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子中の抗原エピトープの認識のための代替の読出し情報を伴うアッセイは、制限なしに、Ｂ細胞からの免疫グロブリン産生の効力を測定すること、細胞傷害性Ｔ細胞の生成の効力を測定すること、および、Ｔ細胞受容体もしくは別の生物学的に関連する分子について異系交配される、近親交配される、類遺伝子性である、トランスジェニックである動物からの本来のＴ細胞の使用を包含する。
【００２７】
本発明の高めるハイブリッドの存在はまた、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されるエピトープの位置を変えることによる、存在する他の抗原エピトープに対するＴ細胞の応答の阻害もしくは調節活性も有する。この点に関して、該ハイブリッドはまた、ＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原提示の、全部の他の抗原エピトープに関しての全般的阻害剤としても機能する。この点に関して、該ハイブリッドはまた、「ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を阻害するハイブリッドポリペプチド」もしくは単に「阻害するハイブリッド」とも称することができる。
【００２８】
Ｔ細胞刺激活性を有しない、ＭＨＣクラスＩＩ分子抗原結合部位に結合する分子は、それが結合するこうしたＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位の遮断剤であると考えられる。遮断剤の結合は、存在する抗原エピトープの結合を阻害もしくは解放する。こうした分子は免疫抑制剤としての価値を有する。本発明の阻害するハイブリッドはまた、抗原エピトープにより通常占有される位置に遮断剤を組み込むことによっても作成することができる。阻害するハイブリッドへの遮断剤の組み込みは、遮断剤の阻害活性を高める。「抗原結合部位のリガンド」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子抗原結合部位に結合する分子を指すのに本明細書で使用する。この用語は、抗原エピトープおよび非抗原分子双方を包含する。
【００２９】
類似のパラメータが、抗原エピトープについて上で列挙されるもののような、阻害するハイブリッドを生成させるのに使用される抗原結合部位のリガンドの物理的要件に当てはまる。阻害するハイブリッドを生成させるのに使用される抗原結合部位のリガンドは、天然もしくは改変された配列、またはペプチド模倣配列、あるいは、若干のＴ細胞により認識される既知の抗原ペプチドにより占有されることが示される空間の全体でもしくは部分的に哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが立証されるもしくは考えられる特徴を有する、天然のもしくは改変されたアミノ酸を包含しない化学構造、のいずれかのペプチド配列を包含すると本明細書で定義する。抗原結合部位のリガンドは天然のアミノ酸のみから構成される必要はないが、しかし、例えば非天然のアミノ酸、または他の主鎖もしくは側鎖部分の全体としてもしくは一部分の多様な改変物から構成されることができ、この改変は、所望の結果を果たす様式での、適しては哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位への結合につながる。こうした化学構造は、天然のタンパク質配列由来であるいずれかの抗原ペプチドに対する中程度の、わずかな構造的類似をもってよいか、もしくは明らかな構造的類似をもたなくてもよい。
【００３０】
本発明のハイブリッドに組み込まれる場合に阻害活性を有する抗原結合部位のリガンドは、以下の群の特許（それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）、すなわちＳｅｔｔｅら、（１９９８）米国特許第５，７３６，１４２号；Ａｄａｍｓら、（１９９８）米国特許第５，８１７，７５７号；Ｇａｅｔａら、（１９９７）米国特許第５，６７９，６４０号；Ｋｕｂｏら、（１９９７）米国特許第５，６６２，９０７号；Ｒｏｂｂｉｎｓら、（１９９８）米国特許第５，８４３，６４８号；およびＫａｗａｋａｍｉら、（１９９８）米国特許第５，８４４，０７５号明細書の１つもしくはそれ以上に記述される、またはその方法の使用により発見される化合物の１つであることができる。
【００３１】
慣例の実験手順を使用して本発明のハイブリッドを阻害することにより、別の抗原エピトープ（例えば標準もしくは対照の抗原エピトープ）に対するＴ細胞応答の阻害もしくは調節の影響を測定するためのアッセイを、当業者により設計することができる。こうしたアッセイにおいては、阻害するハイブリッドを、他の抗原エピトープの添加の前、同時、もしくは後のいずれかで標準アッセイ混合物に添加する。ハイブリッドの添加が他の抗原エピトープの添加の前もしくは後に起こる場合、ハイブリッドは１回以上投与してよい。こうした付加的アッセイは、変動する環境下で利用性を有する（例えば、生理学的条件下での、免疫応答の阻害につながる至適のハイブリッド構造、もしくは合成ペプチドによる置き換えを伴う内在性にプロセシングかつ装填された抗原ペプチドの排除につながる至適のハイブリッド構造の検出）。
【００３２】
本発明の別の局面は、本発明の高めるハイブリッドの情況内でＩｉ  ｋｅｙペプチドと同等の様式で機能する分子の同定方法である。こうした分子は新規Ｉｉ  ｋｅｙ相同物を包含し、また、外観上は関係しない分子もまた包含してよい。こうした分子は、例えば化合物のライブラリー（例えば、天然の供給源からの分子、もしくはコンビナトリアルケミストリーの合成により産生される分子のライブラリー）から得られかつ同定される。その目的のために、候補分子のライブラリーを調製し、そして、そのライブラリー中の各分子を、適切なスペーサーにより抗原エピトープのＮ末端に共有結合して、候補ハイブリッドを形成する。ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを候補分子として使用する場合には、ハイブリッドの候補分子のＮ末端セグメントの各アミノ酸を、自動化合成方法によりハイブリッド配列のＣ末端のアミノ酸残基から出発するＣからＮの方向の合成の経過中に、ハイブリッドのＮ末端セグメントに付加することができる。例えば上に列挙される特許に示される方法によるペプチド模倣性の合成の場合には、ポリマー合成の慣例の実験方法を使用する。有機の環に基づく（ｒｉｎｇ−ｂａｓｅｄ）化合物のコンビナトリアル化学合成の場合には、こうした化合物はスペーサーにより抗原ペプチドに共有結合される。相同物のライブラリーで調製することができるこうした有機の環に基づく化合物の例は、以下の特許（それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）、すなわちＶａｌｅｒｉｏら、（１９９７）米国特許第５，６２７，２１０号；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、（１９９８）米国特許第５，７８３，５７７号；Ｎｅｆｚｉら、（１９９８）米国特許第５，７８６，４４８号；Ｏｓｔｒｅｓｈら、（１９９９）米国特許第５，８５６，１０７号；およびＭｅｙｅｒら、（１９９９）米国特許第５，８５９，１９０号明細書に示される。付加的な改変は、当業者による慣例の実験により、理にかなった薬物設計の方法、コンビナトリアル化学合成の生成物のスクリーニング、および天然の供給源からの単離物のスクリーニングにより同定することができる。
【００３３】
この方法での使用のための抗原エピトープは、抗原エピトープの上の記述に従うべきである。好ましくは、信頼できるＴ細胞ハイブリドーマ応答アッセイがそのために利用可能である抗原エピトープ（例えばハトチトクロームＣエピトープ）を使用する。この方法での使用のためのスペーサーもまた、スペーサーの上の記述に従うべきである。
【００３４】
候補分子を抗原エピトープに適切に連結すれば、生じられたハイブリッドを、ＭＨＣクラスＩＩ分子の情況で抗原提示細胞により提示される抗原エピトープに特異的であるＴ細胞ハイブリドーマ応答アッセイを使用して、抗原提示を高める活性について試験する。抗原提示を高める活性を有するハイブリッドをこのアッセイにより同定し、ハイブリッドの同定は、同定されるハイブリッドのＮ末端内に組み込まれる対応する候補分子がこの情況内でＩｉ  ｋｅｙペプチドに同等な様式で機能することの表示である。この方法はまた、Ｉｉ  ｋｅｙペプチドに同等な様式でもまた機能する特異的分子（例えば理にかなった設計により生じられる分子）の同定での使用にも適合させることができる。こうした分子を適切なハイブリッドに単に組み込むことができ、そしてその後、該ハイブリッドを、上述されるような抗原提示を高める活性について試験することができる。
【００３５】
本発明はまた、上述される方法により同定されるＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドの情況内で機能する分子、およびまた該分子を組み込む全部の高めるハイブリッドも包含する。
【００３６】
別の点において、本発明は、Ｔリンパ球に対するＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープの提示を高める方法に関する。この方法において、ＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープが、上述される本発明の高めるハイブリッドのＣ末端に適切に組み込まれる。生じられる高めるハイブリッドをその後、生理学的条件下で、ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞に接触させ、抗原提示細胞は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原エピトープの提示に対し応答性であるＴ細胞と接触しているか、もしくはその後接触させる。この方法は、抗原エピトープの上に列挙される記述に従う全部の抗原エピトープでの使用に適する。インビトロでのこうした増強のアッセイ方法の例は、下の例示の節、および本開示に列挙される米国特許に詳述される。
【００３７】
Ｔリンパ球へのＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープの提示を高める方法は、疾患の診断および治療において広範な応用を見出している。診断的抗原エピトープに対するＴ細胞の応答は、疾患の診断で、とりわけ病因の感染性病原体に関して、しばしば測定される。こうした診断的抗原エピトープを組み込ませる本発明の高めるハイブリッドの使用は、これらのインビトロ診断アッセイの感受性を実質的に増大させることができる。感染性疾患および癌の場合は、病原体もしくは癌特異的と同定される抗原エピトープを本発明の高めるハイブリッドに組み込むことができ、そして該ハイブリッドをその後使用して、病原体もしくは癌特異的なＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原エピトープに対するＴｈ応答を開始させることができる。この応答はＴヘルパー細胞の活性化および拡張につながり、それは順に樹状細胞を活性化もしくは「許可」して、侵襲する生物体に対する効果的なＭＨＣクラスＩに限定される細胞傷害性Ｔリンパ球応答を開始させる。自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶の場合は、病原性の免疫応答を誘発する特異的抗原エピトープを同定し、そしてその後本発明の高めるハイブリッドに組み込む。該ハイブリッドをその後使用して、Ｔ細胞応答をダウンレギュレートすることができるＴｈ２応答に至る様式でＴ細胞を刺激する。この場合、サプレッサー細胞応答の刺激を使用して病原性の免疫応答をダウンレギュレートする。Ｔリンパ球の予め決められたサブセットを特異的に刺激する高めるハイブリッドの同定方法を下述する。疾患の治療におけるこうしたハイブリッドの付加的方法および利用性を下で考慮する。
【００３８】
別の点において、本発明は、ペプチド合成のためのコンビナトリアルケミストリーの手順を使用する、所定の（予め決められた）Ｔリンパ球もしくはそれ由来のクローン細胞を刺激する特異的抗原エピトープの同定方法に関する。本発明の高めるハイブリッドにより産生されるＭＨＣクラスＩＩに限定されるＴ細胞刺激の増大された感受性は、所定のＴリンパ球を用いる、Ｔ細胞刺激活性についての多数の異なる分子のスクリーニングを実行可能にする。該方法において、候補ペプチドもしくは化合物のライブラリーを提供もしくは合成する。ライブラリー中の各候補化合物を、上述されるスペーサーによる共有結合により、また上述される哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙ相同物にそのＮ末端で独立に結合して、本発明の高めるハイブリッドに類似したハイブリッドを生じさせる。これらのハイブリッドのそれぞれをその後、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子の情況で提示される場合に予め決められたＴリンパ球を刺激する能力について試験する。これは、各それぞれのハイブリッド産物を、抗原提示細胞、および、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子の情況で提示される適切な抗原エピトープに対し応答することができるＴリンパ球と接触させることにより、達成することができる。好ましい一態様において、こうしたアッセイは多数の候補をスクリーニングするために大スケールで実施する。抗原提示細胞により提示される場合にＴリンパ球を刺激すると決定されるハイブリッドは、定義によりＴリンパ球を刺激する抗原エピトープを含有する。
【００３９】
候補化合物は、多様な供給源、例えば天然に入手可能な分子のライブラリー、およびまたコンビナトリアルケミストリーのライブラリーから得てよい。一態様において、候補化合物の合成の方法は必要なハイブリッドを生じさせることにまで拡張される。多くの場合、こうしたライブラリーは、ある配列位置で１個もしくは数個のアミノ酸を定義するある組の可能な配列を伴い設計される。ＣからＮの方向で続くそれらのペプチドの合成の経過において、スペーサー配列の１個もしくはそれ以上の残基が付加され、次いでＩｉ  ｋｅｙの所望の残基すなわちＮ末端セグメントが付加される。候補化合物は、本明細書で定義されるところの抗原エピトープのための潜在的な物質もしくは成分として上で同定されるいずれかの物質もしくは成分から構成されてよい。至適には、候補化合物は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合すると予測されるポリペプチドもしくはペプチド模倣構造である。
【００４０】
本発明はまた、この方法により同定される特異的抗原エピトープを包含することも意図している。この特異的抗原エピトープが組み込まれた高めるハイブリッドもまた包含される。
【００４１】
候補化合物はまた、遺伝子レベルでの多様性のインビトロの生成方法、次いでポリペプチジル配列の発現により得てもよい。上のスクリーニングにより同定される化合物は、同一のもしくは付加的なアッセイでスクリーニングされる付加的な下位ライブラリーの基礎として使用することができる。ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびインビトロＲＮＡ−タンパク質融合技術のような多様な方法を、抗原エピトープ配列の多様性を生成させるのに使用することができる。こうした方法は、以下の特許（それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）、すなわちＨｕａｎｇら、（１９９６）米国特許第５，５１６，６３７号；Ｇａｒｒａｒｄら、（１９９８）米国特許第５，８２１，０４７号；Ｋａｙら、（１９９８）米国特許第５，８５２，１６７号；Ｃｏｌｌｉｎｅｓら、（１９９８）米国特許第５，９２５，５５９号明細書に部分的に提示される。これらの方法のいくつかはまた、以下の刊行物、すなわちＲｏｂｅｒｔｓら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７；Ｈａｎｅｓら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１４１３０、Ｊｅｒｍｕｔｕｓら、（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：５３４にも部分的に提示される。これらの方法に関して、一方法は、遺伝子の方法によるポリペプチジル産物への配列ＬＲＭＫ（配列番号３）およびその改変物の導入を必要とする。その産物の直線状配列中のＬＲＭＫ（配列番号３）モチーフの配置（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）は、抗原エピトープに関して、上述されるスペーサーを使用して適切に分離される。ポリペプチジル産物の創製、発現および分析、ならびに好都合な特性をもつ１種もしくはそれ以上のポリペプチジル産物の選択のための慣例の実験方法が当業者に公知である。
【００４２】
抗原提示細胞による抗原エピトープの提示の全体的効力を増大させることに加えて、本発明の高めるハイブリッド中への抗原エピトープの組み込みもまた、対立遺伝子的に限定される抗原エピトープが提示されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の範囲を高めることができる。抗原エピトープに対する高めるハイブリッドの増大された対立遺伝子の範囲は、ある範囲のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を発現する抗原提示細胞を用いる上述されたアッセイ手順を実施することにより検出される。ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の該範囲は所望の範囲を反映すべきである。ＭＨＣクラスＩＩ分子の複数の対立遺伝子についてのこうしたアッセイ系の例は、Ｒ．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ、（１９９６）米国特許第５，５５９，０２８号、およびＨｕｍｐｈｒｅｙｓら、（１９９９）米国特許第５，９１９，６３９号明細書（それらの内容は上に組み込まれた）に提示される。所望の範囲のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を伴う最大の活性を表すハイブリッドを、使用のため選択する。予め決められた範囲の対立遺伝子の活性が、既知の疾患もしくは他の医学的病状との関係を有することができる。好ましい一態様において、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の範囲は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存型糖尿病に関連するＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子から選択される。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子のこうした選択、ならびに、こうした対立遺伝子に対する反応性についてアッセイするための抗原提示細胞系、ならびにＴ細胞系およびハイブリドーマの選択は、容易に入手可能な材料および慣例の実験条件を使用して、当業者により容易に確かめられる。
【００４３】
別の局面において、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩに限定されるＴｈ１およびＴｈ２刺激の予め決められたパターンを表す抗原エピトープの同定もしくは選択方法に関する。刺激の所望の予め決められたパターンは、Ｔ細胞へのＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原ペプチドの提示におけるＴｈ１応答のみ、もしくはＴｈ２応答のみの刺激、またはＴｈ１およびＴｈ２双方を刺激することであってよい。候補の抗原エピトープを、本発明の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドに適切に組み込む。ＭＨＣクラスＩＩに限定されるＴｈ１およびＴｈ２刺激の所望のパターンを伴い提示活性を表す高めるハイブリッドを、その後、生成される高めるハイブリッドから同定する。所望の活性を表すハイブリッド分子についてのスクリーニングは、ハイブリッドポリペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞、および抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原エピトープの提示に対し応答性であるＴ細胞と接触させることにより達成する。ハイブリッドおよび細胞の接触は生理学的条件下で起こるべきである。Ｔｈ１およびＴｈ２応答のアッセイのための手順は、以下の特許（それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）、すなわちＤａｙｎｅｓら、（１９９６）米国特許第５，５４０，９１９号；Ｐｏｗｒｉｅら、（１９９７）米国特許第５，６０１，８１５号；Ｍｅｔｚｇｅｒら、（１９９７）米国特許第５，６６５，３４７号；Ｈｓｕら、（１９９８）米国特許第５，７７６，４５１号；Ｓｅｄｌａｃｅｋら、（１９９８）米国特許第５，８３０，８８０号明細書；Ｄａｙｎｅｓら、（１９９８）米国特許第５，８３７，２６９号；Ｒｅｅｄ（１９９９）米国特許第５，８７９，６８７号；Ｗａｎｇ（１９９９）米国特許第５，８９５，６４６号；Ｂａｕｍａｎｎら、（１９９９）米国特許第５，８９７，９９０号；およびＬｅｖｉｔｔら、（１９９９）米国特許第５，９０８，８３９号明細書に記述されるとおり実施することができる。
【００４４】
Ｔｈ１およびＴｈ２の刺激は、一般にサイトカイン放出アッセイにより測定する。所望のＴｈ１および／もしくはＴｈ２刺激パターンに相関するサイトカイン放出を生じさせることにおいて最大の活性を表す高めるハイブリッドを、同定しかつ使用のため選択する。好ましい一態様において、サイトカイン放出の予め決められたパターンは、疾患もしくは他の身体状態の増強もしくは抑制と関連するパターンを反映する。例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、もしくはインスリン依存型糖尿病のような自己免疫疾患に関連するサイトカイン放出パターンを生じさせるハイブリッドが好ましい。加えて、感染性疾患およびアレルギーに関連するサイトカイン放出パターンに対する好都合な影響について、ハイブリッドを選択することができる。動物実験およびそれらの動物における応答の付随するインビトロアッセイの双方を包含し、かつ、他のインビトロアッセイを包含する、Ｔｈ１およびＴｈ２の刺激を決定するのに適切なアッセイの選択および実施は、容易に入手可能な材料および慣例の実験条件を使用して、当業者により容易に確かめられる。
【００４５】
本発明の高めるハイブリッドポリペプチドは、個体のＴリンパ球への特定の分子の抗原エピトープのＭＨＣクラスＩＩ提示を高めることにより、該分子に対する個体の免疫応答を調節するのに使用することができる。免疫応答の調節は増強もしくは抑制であってよく、そして刺激されるそれぞれＴリンパ球、Ｔ−ヘルパーもしくはＴサプレッサーのサブセットに対応する。どのリンパ球が刺激されるかは、投与される特定の高めるハイブリッドにより決定され、該特定のハイブリッドは、上述される所望のＴリンパ球刺激パターンについて選択される。適切な高めるハイブリッドを生成させかつ選択すれば、それを個体の抗原提示細胞へのハイブリッドの送達に適切な条件下で個体に投与する。高めるハイブリッドの適切な送達のために製薬学的に許容できる担体を使用してよい。本発明の高めるハイブリッドの適する製剤は、制限なしに、局所、経口、全身および非経口の製薬学的製剤を包含する。製剤ならびに投与の方法および用量は下により詳細に論考する。
【００４６】
上述される個体の免疫応答の調節方法は、疾患もしくは病状を伴う個体の治療的治療における使用を見出している。高められた免疫応答が患者の治療において有益であると考えられる抗原エピトープを最初に選択する。一態様において、抗原エピトープが由来する分子が病因論である役割を演じている。あるいは、抗原エピトープは、病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）のような有害な病原体（ａｇｅｎｔ）、もしくは病原体に感染した細胞上で見出されるエピトープであってよい。本明細書で使用されるところの「治療的治療」という用語は、疾患の兆候もしくは症状を改善すること、またはある疾患に罹っていることが同定されるもしくは考えられる個体における疾患の進行を停止することを包含することを意図している。本明細書で使用されるところの「予防」という用語は、ある疾患の認識可能な兆候もしくは症状を経験することを開始しなかったかもしれない個体における、疾患に対する根底にある原因もしくは疾患に対する素因を作る関連する因子を改善することを包含することを意図している。
【００４７】
疾患は、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、リケッチアもしくは他の感染性病原体、またはこうした病原体の組み合わせにより引き起こされるかもしくはそれらによる感染症に関連する感染性疾患であってよい。治療は疾患のトキシンに対し向けてよい。エピトープ派生に好ましいトキシンは、制限なしに、ブドウ球菌のエンテロトキシン、毒性ショック症候群トキシン、レトロウイルス抗原（例えばヒト免疫不全ウイルス由来の抗原）、連鎖球菌の抗原、マイコプラズマ、ミコバクテリウムおよびヘルペスウイルスを包含する。高度に好ましいトキシンは、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥ1-3、ＳＥＤおよびＳＥＥである。
【００４８】
疾患もしくは病状は、自己免疫過程、例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、エリテマトーデス、糖尿病、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、皮膚筋炎、天疱瘡および他の類似の過程であると考えてよい。本発明の化合物および方法の効果を評価するのに使用することができる自己免疫疾患のこうしたモデル系の例は、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、インスリン依存型糖尿病、および実験的アレルギー性脳脊髄炎である。これらの実験を実施するための手順は、Ｃｌａｒｋら、（１９９４）米国特許第５，２８４，９３５号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に提示される。
【００４９】
該疾患もしくは病状は、アレルギーの過程、例えば喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、局所皮膚炎、大腸炎、および特定のアレルゲンでもしくは定義されるアレルゲンなしで開始もしくはそれと関連する他のこうした過程であると考えてよい。こうしたアレルゲンの例は、植物、動物、細菌、寄生虫のアレルゲン、および接触過敏症を引き起こす金属に基づくアレルゲンである。本発明での使用に好ましいアレルゲンは、雑草（ｗｅｅｄ）、草（ｇｒａｓｓ）、ラッカセイ、ダニ、ノミおよびネコ抗原である。
【００５０】
あるいは、疾患もしくは病状は、増殖性もしくは悪性の過程、例えば癌、良性前立腺肥大、乾癬、腺腫、あるいは内在性の起源の、あるいはウイルスまたは他の感染性、刺激性もしくは環境的過程に応答する、他の細胞増殖であってよい。
【００５１】
本明細書で使用されるところの「哺乳動物」という用語は、ヒト種ならびに全部の他の哺乳動物種を包含することを意味している。本発明の化合物および方法は、全部の哺乳動物種の個体で発生する疾患および病状の治療に適用してよい。本明細書で使用されるところの「個体」という用語は、ヒト種を包含するいずれかの哺乳動物種の１つを指す。ヒト種の個体で発生する、および例として本明細書で挙げられる疾患および病状は、同一の生物体もしくは病原性の過程により引き起こされるにしろ、または関連する生物体もしくは病原性の過程により引き起こされるにしろ、または未知もしくは他の既知の生物体および／もしくは病原性の過程により引き起こされるにしろ、別の種で発生する匹敵する疾患もしくは病状を包含する。本明細書で使用されるところの「医師」という用語は、獣医師、または哺乳動物種の個体の診断および／もしくは治療に参画するいかなる個人もまた包含する。
【００５２】
本発明は、適する製薬学的製剤中での薬物、化合物のプロドラッグ、もしくは化合物の薬物代謝物としての化合物の投与もまた提供する。化合物「の投与」もしくは「を投与すること」という用語は、疾患の治療もしくは予防の必要な個体に、本発明の化合物を、薬物、化合物のプロドラッグ、もしくは化合物の薬物代謝物として提供することを意味すると理解される。上に示される疾患および病状の１種もしくはそれ以上の治療もしくは予防での使用のための主薬もしくはメンバーの有効成分として、本発明のハイブリッドポリペプチドの１種もしくはそれ以上を含有するこうした薬物は、局所、経口、全身および非経口投与のための慣習的ベヒクル中の広範な治療的投薬形態で投与することができる。投与の経路および計画は、治療されるべき疾患もしくは病状に依存して変動することができ、そして当業者により決定されるべきである。例えば、該化合物は、例えば錠剤、カプセル剤（それぞれが持効性および持続放出製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口投薬形態で、もしくは注入により投与することができる。同様に、それらはまた、静脈内（ボーラスもしくは注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）法のいずれかによる）、腹腔内、皮下、閉鎖を伴いもしくは伴わずに局所、または筋肉内の形態でも投与してよい。これらの形態の全部は、製薬学的技術の当業者に公知である。
【００５３】
生成物の１日用量は、成人ひとりあたり１日あたり０．００１から１，０００ｍｇまでの範囲にわたって変動してよい。経口投与のためには、該組成物は、好ましくは、治療の経過中の患者の兆候および症状に従った投薬量の症候的調節のために、０．００１から１，０００ｍｇまで、好ましくは０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、１０．０、２０．０、５０．０、１００．０ミリグラムの有効成分を含有する錠剤の形態で提供する。薬物の有効量は、通常、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬量レベルで供給する。該範囲は、より具体的には、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから７ｍｇ／ｋｇ体重までである。
【００５４】
有利には、本発明の適する製剤は単一の１日用量で投与してよいか、または全１日投薬量を、例えば１日２、３もしくは４回の分割された用量で投与してよい。本発明の高めるハイブリッドポリペプチドを使用して、上に列挙される疾患もしくは病状の治療に有用な医薬もしくは作用物質を製造してよい。さらに、本発明の化合物は、適する鼻内ベヒクルの局所使用を介して鼻内の形態で、もしくは当業者に公知の経皮皮膚貼付剤の形態を使用して経皮経路を介して投与することができる。経皮送達系の形態で投与されるためには、投薬量の投与は、もちろん、投薬計画を通じて間歇的よりはむしろ継続的であることができる。
【００５５】
疾患の治療および予防のためには、本発明のハイブリッドポリペプチドは、局所投与に採用される製薬学的に許容できる担体と組み合わせで有効成分を含んで成る製薬学的組成物で投与してよい。局所の製薬学的組成物は、例えば、皮膚への適用に適合された、溶液、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、シャンプー剤もしくはエアゾル製剤の形態であってよい。本発明の化合物を含有するこれらの局所製薬学的組成物は、通常、製薬学的に許容できるベヒクルとの混合状態で約０．００５％ないし５重量％の有効成分を包含する。
【００５６】
例えば上に列挙される疾患および病状の治療および予防のためには、本発明のハイブリッドポリペプチドを、こうした疾患および病状の治療で有用であることが既知の他の作用物質と一緒に使用してよい。有効成分を同時に投与することができる、１種以上の有効成分を用いる組み合わせ治療のためには、有効成分は同時に投与することができるか、もしくはそれらを時差的な時間で別個に投与することができる。
【００５７】
本発明の組成物を利用する投薬計画は、例えば患者の型、種、齢、体重、性別および医学的状態、治療されるべき病状の重症度、ならびに使用されるその特定の化合物を包含する多様な因子に従って選択する。通常に熟練した医師は、疾患もしくは病状の進行を予防、阻止もしくは停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方することができる。毒性なしにかもしくは許容できる毒性を伴うかのいずれかで効力を生じる範囲をもつ薬物の濃度の達成における至適の精度は、標的部位への該薬物の利用可能性の動力学に基づく計画を必要とする。この方法は、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を必要とし、そして当業者の能力内にある。
【００５８】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述される化合物は、有効成分を形成することができ、そして、典型的には、意図される投与形態に関して適して選択される適する製薬学的希釈剤、賦形剤もしくはｃａｒｄｅｒ（集合的に本明細書で「ｃａｒｄｅｒ物質」と称される）との混合状態で（すなわち経口の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤など）、かつ慣習的な製薬学的実務と矛盾せずに投与される。例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態での経口投与のためには、有効成分を、エタノール、グリセロール、水などのような経口の非毒性の製薬学的に許容できる不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望もしくは必要な場合は、適する結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた混合物に組み込むことができる。適する結合剤は、制限なしに、デンプン、ゼラチン、ブドウ糖もしくはβ−乳糖のような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アラビアゴム、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成のガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋などを包含する。これらの投薬形態で使用される滑沢剤は、制限なしに、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを包含する。崩壊剤は、制限なしに、デンプン、メチルセルロース、アガ（ａｇａ）、ベントナイト、キサンタンガムなどを包含する。
【００５９】
液体の形態は、合成および天然のガム、例えばトラガカント、アラビアゴム、メチルセルロースなどのような適して香味をつけられた懸濁化剤もしくは分散剤であってよい。使用してよい他の分散剤はグリセリンなどである。非経口投与のためには、滅菌の懸濁剤および溶液が望ましい。静脈内投与が望ましい場合は、適する保存剤を一般に含有する等張製剤を使用する。
【００６０】
有効成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡもしくはＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどのような当該技術分野で公知の多様な担体物質と混合して、例えばアルコール溶液、局所清浄剤、洗浄用クリーム剤、皮膚ゲル剤、皮膚ローション剤およびクリームもしくはゲル製剤のシャンプー剤を形成することができる。
【００６１】
本発明のハイブリッドポリペプチドはまた、小型単層小胞、大型単層小胞および多層小胞のようなリポソーム送達系の形態でも投与することができる。リポソームは、例えばコレステロール、ステアリルアミンおよび多様なホスファチジルコリンを包含する多様な化合物から形成することができる。
【００６２】
本発明のハイブリッドポリペプチドもしくはその製剤は、薬物の制御放出の達成で有用な一分類の生物分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋されたもしくは両親媒性のブロックコポリマーに結合してよい。
【００６３】
本発明のハイブリッドポリペプチドおよびそれらの製剤は、容易に入手可能な出発原料、試薬および慣習的な合成手順を使用して製造することができる。これらの反応において、それら自身が当業者に既知であるがしかし本明細書でより詳細に挙げられない変形物を利用することもまた可能である。
【００６４】
個体のＴリンパ球への抗原エピトープのＭＨＣクラスＩＩ提示を高めるために、本発明の高めるハイブリッドを個体に直接投与することに対する一代替として、抗原提示細胞の集団を個体から得かつ本発明の高めるハイブリッドでエクスビボで処理してよい。これらの細胞は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子へのハイブリッドの結合に適切な条件下で、高めるハイブリッドで処理する。処理されれば、抗原提示細胞を、処理された細胞の個体のＴリンパ球との物理的接触を促進する条件下で個体に投与する。上述されるとおり、免疫応答に対する影響（増強もしくは抑制）は、Ｔ細胞のどのサブセットが高めるハイブリッドにより優先的に刺激されるかに依存することができる。免疫応答の増強は、例えば癌細胞もしくは感染性生物体のいずれかに対する細胞傷害性の応答に際して好都合な効果を有するかもしれない。あるいは、Ｔサプレッサー細胞応答の増強は、特定の分子に対する免疫応答を抑制する効果を有するかもしれない。こうした抑制は、自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症もしくはエリテマトーデスの病因性の抗原からの抗原エピトープを利用する場合に治療効果を有するかもしれない。本発明の化合物および方法を用いる、患者からの細胞のエクスビボでの処理のための方法および手順は、以下の特許（それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）、すなわちＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９８）米国特許第５，１２６，１３２号；Ｃｈａｄａら、（１９９７）米国特許第５，６９３，５２２号；Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、（１９９８）米国特許第５，８４９，５８６号；Ｇｒｕｂｅｒら、（１９９９）米国特許第５，８５６，１８５号；およびＫｒｉｅｇｌｅｒら、（１９９９）米国特許第５，８７４，０７７号明細書から適合してよい。
【００６５】
別の点において、本発明の化合物および方法は、Ｃｅｌｉｓら、（１９９８）米国特許第５，８４６，８２７号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される化合物および方法を使用して、細胞傷害性のＴリンパ球の生成を促進するためにエクスビボ条件下で使用することができる。
【００６６】
本発明の別の局面は、ＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原ペプチドのＴリンパ球への提示の阻害方法である。上に論考されるとおり、抗原結合部位のリガンドは、主要組織適合遺伝子クラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合するいずれかのペプチドもしくは分子を構成し、また、こうした分子はＴリンパ球を刺激する活性を有してももしくは有しなくてもよい。スペーサーによるＩｉ−ｋｅｙ相同物への抗原結合部位のリガンドの連結は、ＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原提示の全般的阻害で高められた活性を有するハイブリッドを生じさせる。ＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原エピトープのＴリンパ球への提示を全般的に阻害するためには、抗原提示を阻害するハイブリッドポリペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩに限定されるＴリンパ球に提示される抗原エピトープをその表面上に表すＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞に接触させる。その作用の結果は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原エピトープの提示に対し応答性であるＴリンパ球の機能を調節する。
【００６７】
Ｔ細胞への抗原エピトープの提示の阻害を立証するためのインビトロアッセイは、Ｒ．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ、（１９９６）米国特許第５，５５９，０２８号；およびＨｕｍｐｈｒｅｙｓら、（１９９９）米国特許第５，９１９，６３９号明細書（それらの内容は引用することにより組み込まれている）に提示される。ハイブリッドの生物学的活性、例えば抗原特異的Ｔリンパ球活性化を阻害する能力もまた、多様な系でアッセイしてよい。一例示的プロトコルにおいて、過剰のハイブリッドを、既知のＭＨＣ発現の抗原提示細胞、例えばＨＬＡ−ＤＲ１、および既知の抗原特異性、例えば破傷風トキシン（８３０−８４３）およびＭＨＣ限定（再度、ＤＲ１）のＴ細胞クローン、ならびに抗原ペプチドそれ自身（破傷風トキシン（８３０−８４３））とともにインキュベートする。アッセイ培養物を、１ないし４日のような、Ｔ細胞増殖に十分な時間インキュベートし、そしてその後増殖を定量する。その定量は、インキュベーションの最後の１８時間にトリチウム化されたチミジンを適用することにより、もしくはＨＴ−２細胞（その増殖は、応答するＴ細胞によるインターロイキンの放出に依存しかつインキュベーションの最後の１８時間にトリチウム化されたチミジンを適用することにより測定する）の第二の培養物への上清液の移動により、実施してよい。阻害剤を受容しなかった対照に比較したパーセント阻害をその後計算する。インビトロアッセイにおけるハイブリッド、および抗原提示の他の阻害剤の能力は、インビボでの免疫応答を阻害するこうした化合物の能力に相関されることができる。インビボ活性は、例えば、ペプチドにより認識される特定のＭＨＣ分子に限定されることが既知の抗原、および免疫調節性のハイブリッドを投与することにより、動物モデルで測定してよい。Ｔリンパ球をその後動物から取り出し、そしてある用量範囲の抗原とともに培養する。刺激の阻害は慣習的手段、例えばトリチウム化されたチミジンを適用し、そして適切な対照と比較することにより測定する。ある種の実験の詳細は当業者に容易に明らかである。
【００６８】
本発明の阻害するハイブリッドへの抗原ペプチド結合部位リガンドの組み込みにより生じられる活性の増強は、阻害活性のより迅速かつ正確な検出を見込む。この高められた検出は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を阻害する新規化合物の同定を可能にする。この点において、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を阻害する化合物の同定方法に関する。該方法は、抗原結合部位のリガンドであることが予測される候補化合物のライブラリーを提供すること、および、スペーサーにより各候補化合物を独立に哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙ相同物に共有結合すること（その結果、Ｉｉ  ｋｅｙ相同物がＮ末端にありかつ候補化合物がＣ末端にある）を必要とする。この生成物は「候補の抗原提示を阻害するハイブリッドポリペプチド」もしくは「候補の阻害するハイブリッド」と称する。その後、個々の候補の阻害するハイブリッドを、天然に存在する配列の抗原ペプチドをそのＭＨＣクラスＩＩ分子のいくつか中で発現する抗原提示細胞、および抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子の情況で提示されるその抗原エピトープに応答するＴリンパ球に接触させることにより、候補の阻害するハイブリッドをスクリーニングする（Ｔリンパ球活性化アッセイとしてもまた知られる）。その後、候補の阻害するハイブリッドの接触が対照反応に比較してＴリンパ球の活性化を低下させたかどうかを決定する。該アッセイにおける低下されたＴリンパ球活性化の決定は、ハイブリッド中に組み込まれた候補化合物、および候補の阻害するハイブリッドそれ自身が、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示の阻害剤であることの表示である。
【００６９】
候補の阻害するハイブリッドの生成における使用のための候補化合物は、天然に産生される産物、組み合わせ的に生成されたペプチド、ペプチド模倣物、もしくは他の有機化合物であってよい。
【００７０】
本発明はまた、上述された方法により同定される阻害する分子および阻害するハイブリッドも包含する。インビトロの応用に関して、抗原提示のこうした阻害剤の主たる使用は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原ペプチド結合部位の封鎖の継続を伴うもしくは伴わない、内在性に結合された抗原ペプチドのいずれかの排出から利益を得るインビボでの臨床応用においてであることができる。こうしたハイブリッドは、上で論考されるとおり、自己免疫疾患の治療で応用を見出すことができる。
【００７１】
本発明の別の局面は、個体に本発明の阻害するハイブリッドを投与して個体のＴリンパ球の応答を全般的に阻害することにより、ある抗原エピトープに特異的なＴリンパ球の応答を阻害することによる、疾患をもつ個体の治療的治療方法に関する。阻害するハイブリッドの許容できる製剤、ならびに投与の方法および計画は、本発明の高めるハイブリッドの上述される製剤ならびに投与の方法および計画に対応する。
【００７２】
本発明の化合物および方法は、本発明の抗原ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子の２本の鎖の一方のＮ末端に共有結合されるよりはむしろ、ＭＨＣクラスＩＩ分子上のそれぞれの受容体部位で非共有結合するＩｉタンパク質のフラグメントに連結されるという事実において、Ｋａｐｐｌｅｒら、（１９９８）米国特許第５，８２０，８６６号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）のものと似ていない。加えて、本発明は、抗原ペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ分子（必ずしもＩｉ−ｋｅｙ相同物の結合のための部位ででなく）、もしくはＭＨＣクラスＩＩ分子およびＴ細胞受容体、例えば抗原提示細胞とＴリンパ球との間の結合により形成される複合体と相互作用する付加的な細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４に対する適する親和性を伴い結合する他の化合物に連結される構築物を包含する。こうしたハイブリッドは、本明細書の別の場所に記述されるような、薬物設計の古典的方法、またはコンビナトリアル合成の生成物のスクリーニング、もしくは天然の産物の単離により、ＭＨＣクラスＩＩ分子の構造モデルから設計することができる。
【００７３】
本発明の化合物および方法は、Ｃｌａｒｋら、（１９９４）米国特許第５，２８４，９３５号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）の化合物において、トキシンが、ＭＨＣクラスＩＩ分子、もしくは、抗原ペプチドが例えばＭＨＣクラスＩｉ分子の鎖の一方のＮ末端でＭＨＣクラスＩＩ分子に共有結合される複合体の抗原ペプチドのいずれかに複合されるという事実において、その発明のものと似ていない。
【００７４】
本発明の化合物および方法は、Ｓｔａｎｔｏｎら、（１９９８）米国特許第５，８０７，５５２号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）の化合物においては、抗原エピトープが、定期的に空間を空けられた抗原エピトープの非共有結合された多量体を創製するような様式で相互作用する、両親媒性のらせん状ペプチドのセグメントにより結合されることにおいて、引用される発明のものと似ていない。
【００７５】
本発明の化合物および方法は、改変されたＩｉ配列が、抗原提示細胞への改変された遺伝子のトランスフェクション後に発現される、Ｉｉタンパク質の配列中で置換された抗原エピトープを含んで成るものと似ていない（Ｂａｒｔｏｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１１５９（１９９８）；Ｆｕｊｉｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５９：６０７（１９９８）；Ｍａｌｃｈｅｒｅｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１５２４（１９９８）；Ｓｔｕｍｐｔｎｅｒら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６：５８０７（１９９７）；Ｖａｎ  Ｂｅｒｇｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：７４９９（１９９７））。少なくとも、こうした構築物は、Ｉｉタンパク質とＭＨＣクラスＩＩ分子との間で形成される複合体の細胞内輸送を、抗原／Ｉｉタンパク質プロセシングおよびＭＨＣクラスＩＩペプチド装填のために後ゴルジ区画に向けることに有利であるように表される（Ｂａｋｋｅら、Ｃｅｌｌ  １６：７０７（１９９０）；Ｌａｍｂら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３４７８（１９９２））。本発明に特定の分子および細胞の生物学的機構は、そのために好都合に活用されない。
【００７６】
本開示を考えれば、慣例の実験が新規治療方法の開発につながることができる。下の例示の節に提示されるデータは生物学的活性についてのマウスのアッセイを使用する実験で生成されるとは言え、類似の結果を、インビトロおよび生理学的条件下でヒト細胞を用いて見出すことができる。慣例の実験は、Ｉｉ−ｋｅｙ配列由来のハイブリッド構築物およびスペーサーのセグメントの至適化を可能にすることができる。
例示
実施例１．Ｉｉ−Ｋｅｙコアモチーフと抗原エピトープとの間に変動するスペーサーをもつハイブリッドペプチドの設計および合成
Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドの活性のコアおよび抗原エピトープを、１つの「ハイブリッド」ペプチド中で共有結合した。こうした構築物は、該ハイブリッド中に組み込まれる抗原エピトープのＭＨＣクラスＩＩ分子による提示に対するＩｉ−Ｋｅｙ構造の影響の高められた能力および他の機能的利益を得るために作成した。２種の生物学的に活性の単位の間に配置された多様なスペーサー（長さおよび組成）を有した数種のハイブリッドを、生物学的活性の測定のため生成した。
【００７７】
ハイブリッドの設計における第一の構造的問題は、活性に必要とされるＩｉ−Ｋｅｙコアペプチドの程度であった。Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドの最小の活性配列ＬＲＭＫ（配列番号３）を使用して、本研究で試験されるべきであったハイブリッドを生じさせた。このテトラペプチドは、以前に、ＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原ペプチドの提示に対する影響についてのアッセイで試験された一連のＩｉ−ｋｅｙペプチドのいずれかのメンバーの最大活性の少なくとも５０％を保持することが決定された（Ａｄａｍｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１６９３（１９９５）；Ａｄａｍｓら、Ａｒｚｎｅｉｍ．Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：１０６９（１９９７））。Ｉｉタンパク質の配列中でＬＲＭＫ（配列番号３）のＣ末端から伸長する付加的残基をもつペプチドは、以前に、ＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチド装填の増強についての基礎的アッセイで、より大きな活性を表すことが決定された。しかしながら、この一連の相同物については、Ｉｉ−ｋｅｙペプチド部分はＬＲＭＫ（配列番号３）を利用して一定に保持した。
【００７８】
一連のハイブリッドペプチド中の抗原エピトープもまた一定に保持した。それはハトチトクロームＣ（ＰＧＣＣ）抗原エピトープＰＧＣＣ９５−１０４、ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）であった。
【００７９】
表Ｉに列挙される一連のハイブリッドを、活性に対するスペーサーの長さおよび組成の影響を試験するために設計した。この一連の化合物の設計のための理論的根拠は、部分的に、Ｉｉタンパク質由来のペプチドおよび抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチドを結合する溝中にどのように結合するかについての知識から引き出された。インフルエンザウイルスヘマグルチニン、ＨＡ（３０７−３１９）（Ｓｔｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：２１５−２２１（１９９４））からの抗原ペプチド、および切断されたロイペプチンに誘導されるペプチド（ＣＬＩＰ）（Ｇｈｏｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：４５７−４６２（１９９５））として知られるＩｉ−タンパク質由来のペプチド、Ｉｉ（８６−１０２）を使用して集められた以前のＸ線結晶学的分析は、ＨＬＡ−ＤＲ１（ＭＨＣクラスＩＩ分子）の抗原ペプチド結合部位の２種のペプチドの分子の向きを示した。抗原ペプチド結合部位中でＣＬＩＰが占有する位置を、よりきつく結合する抗原ペプチドの交換においてＣＬＩＰを包含する弱く結合するペプチドの除去で機能するＨＬＡ−ＤＭ分子が不足した細胞系で同定した（Ｓｅｔｔｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１８０１（１９９２）；Ａｖｖａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７６３−７７２（１９９４）；Ｓｌｏａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：８０２−８０５（１９９５）；Ｄｅｎｚｉｎら、Ｃｅｌｌ  ８２：１５５−１６３（１９９５））。Ｉｉ−Ｋｅｙのコア、ＬＲＭＫ（配列番号３）は、同定された一連のＣＬＩＰペプチドの最長のもののＮ末端に対し遠位である（Ｃｈｉｃｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：７６４（１９９２））。しかしながら、一連のＩｉ−Ｋｅｙペプチドのより長い相同物（ＬＲＭＫ（配列番号３）のＣ末端から伸長する）が、より長い形態のＣＬＩＰのＮ末端の一次アミノ酸配列と重なり合う。
【００８０】
表Ｉのハイブリッド６は、抗原エピトープＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）まで、Ｉｉタンパク質残基ＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫ（配列番号１２）のスペーサーを伴いＣ末端に伸長して、Ｉｉ−Ｋｅｙコア配列ＬＲＭＫ（配列番号３）から構成されたハイブリッドであった。「参照のハイブリッド」のスペーサーセグメントであるべきＩｉタンパク質の配列のこの割り当ては、ハイブリッド６の結晶学的像をＸ線結晶学により以前に確立された２種のそれぞれの像と重ね合わせることにより達した。それらの像は、ＨＡ（３０７−３１９）、およびＨＬＡ−ＤＲ１  ＭＨＣクラスＩＩ分子結合ポケットに結合されたＣＬＩＰのものであった（Ｓｔｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：２１５−２２１（１９９４）、Ｇｈｏｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：４５７−４６２（１９９５））。それら２種の結晶学的像において、ＨＬＡ−ＤＲ１  ＭＨＣクラスＩＩ分子のＰ１疎水性ポケットは、ＣＬＩＰのＩｉ配列のメチオニン99、もしくはＨＡ（３０７−３１９）ペプチドのＬｅｕ87で満たされた。ＰＧＣＣ（９５−１０４）のＩｌｅ95もまた疎水性Ｐ１ポケット中に存するであろうことを理にかなって予測することができる。従って、ハイブリッド６は、Ｌｙｓ90による、そしてその後ＰＧＣＣ（９５−１０４）の配列をもつハイブリッドのＣ末端までのＩｉタンパク質の配列から構成された。Ｉｉタンパク質と抗原ペプチドの配列の間のハイブリッド配列中の「交差」は、ＨＬＡ−ＤＲ１のＰ１疎水性ポケットに結合されることが期待される残基位置の直前で起こった。
【００８１】
残存するハイブリッドペプチドは、二次構造の慎重な考慮、ならびに、抗原ペプチドの結合する溝の溝内のポリプロリルタイプＩＩ（ＰＰＩＩ）ヘリックスとしてのＩｉおよび抗原ペプチドの整列から設計した。Ｘ線結晶学的像は、ＣＬＩＰおよび抗原ペプチドそれぞれがポリプロリルタイプＩＩヘリックスの二次構造中で渦巻き状に巻くことを示す。この型のヘリックス中では、ターンあたりのアミノ酸反復頻度が、より良好に知られるα−ヘリックス中で見出されるターンあたり３．２アミノ酸に対照的に、３．０アミノ酸である。２種の型のヘリックスの長さ方向軸に沿って見ると、ＰＰＩＩヘリックスは、α−ヘリックス中で見出されるようなターンあたりの距離の約２倍「伸ばされて」いる。ＰＰＩＩヘリックスは、α−ヘリックスを安定化するターン間の水素結合を有しない。すなわち、α−ヘリックス中では、残基ｉのペプチジル主鎖のイミドのプロトンが残基ｉ＋３のペプチジル主鎖のカルボニルに水素結合する。ペプチジル主鎖のターンに沿ったこの内的安定化により、α−ヘリックスはエネルギー的に相対的に強い局所的二次構造を形成する。それらのヘリックスは、相互の上および他の局所的二次構造上の双方でタンパク質内で折り畳まることができる。対照的に、ＰＰＩＩ配置は、タンパク質：タンパク質相互作用の認識単位としてタンパク質中で使用される。こうしたＰＰＩＩヘリックスは、例えば、なんらかの細胞表面事象により構造もしくは間隔が変えられる膜貫通受容体の細胞内ドメインの細胞内タンパク質による認識を媒介するＳＲ−１ドメイン中で見出される。Ｔ細胞により認識されるような抗原エピトープもまたＰＰＩＩ構造のように渦巻き状に巻く。こうしたＰＰＩＩ構造は、とは言っても、α−ヘリックスについて可能であろうよりは、抗原の配列の変動する側鎖の表示のためのより広範な領域を可能にするはずである。これは等辺の錐体構造をもたらし、その中で、抗原ペプチドのヘリックスの１つの隆起に沿った残基が、ＭＨＣ  ＩＩ分子中の抗原ペプチドが結合する裂け目の基部で疎水性ポケットに結合する。抗原ペプチドのＰＰＩＩヘリックスの他の２個の隆起に沿った側鎖は、Ｔ細胞受容体との相互作用のためのＭＨＣ分子の表面に沿った浅いポケット中で露出される。ＭＨＣクラスＩＩおよびＴＣＲ分子の側鎖のおよそ約２倍の原子が、その配列がα−ヘリックスよりはむしろＰＰＩＩヘリックスである場合に、抗原配列の各側鎖を接触することができる。２本の反平行ヘリックスの間の、抗原ペプチドが結合する谷の内で、結合されたペプチドのＰＰＩＩのらせん状の配置が、普遍的に同定される抗原エピトープの第一の残基を超えて最低５残基の位置、Ｎ末端に伸長する。Ｉｉ配列のＰ87は、その間にＣＬＩＰもしくは抗原ペプチドのいずれかを座らせる２本の反平行のα−ヘリックスにより形成される谷の端で、Ｘ線結晶学により特徴づけられる。
【００８２】
Ｉｉ−Ｋｅｙコア構造ＬＲＭＫ（配列番号３）を抗原エピトープＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）に架橋する、ハイブリッドペプチドの可能な相互作用のモデル作成は、ＬＲＭＫ（配列番号３）官能基および抗原エピトープをＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するハイブリッドのスペーサー中の原子の相互作用に対する構造的要件についてのいくつかの仮説を生じさせる（表Ｉ）。一仮説において、スペーサーのアミノ酸の側鎖の原子は、該スペーサーがＰＰＩＩヘリックスとして渦巻き状に巻く場合にのみ、ＭＨＣクラスＩＩ分子の特定の残基と至適に相互作用する。この見方をハイブリッド６で試験した。そのハイブリッドにおいては、Ｉｉタンパク質の配列中のＬＲＭＫ91（配列番号３）に対しすぐＣ末端の完全な１０アミノ酸残基がスペーサーを構成し、Ｘ線結晶学的モデルの重ね合わせに際してみられるＣＬＩＰのＩｉタンパク質配列とＨＡ抗原ペプチドとの間の登録事項を保存した。ハイブリッド６が、生物学的に活性であった唯一の試験されたハイブリッドであった場合には、抗原の配列の第一の残基に対し遠位の谷中のＭＨＣクラスＩＩ残基が接触されなければならないと結論することができた。
【００８３】
代替の一仮説は、スペーサー中の残基の数個のみがハイブリッドペプチド中で機能上必要とされることである。ハイブリッド５（表Ｉ）は、Ｉｉタンパク質の配列中のＬＲＭＫ91（配列番号３）に対しすぐＣ末端の最初の７残基のみがスペーサーとして存在したように設計した。ハイブリッド４においては、Ｉｉタンパク質の配列中のＬＲＭＫ91（配列番号３）に対しすぐＣ末端の最初の４残基のみがスペーサーとして機能する。ハイブリッド５および４がハイブリッド６のものに匹敵する活性を有した場合には、この知見は、ポリプロリルタイプＩＩ（ＰＰＩＩ）ヘリックスとしての介在セグメントの二次構造が決定的に重要でないことを示すとみられる。この知見はまた、ＭＨＣクラスＩＩ分子中の決定的に重要な接触残基、およびおそらくこうした相互作用に決定的に重要である主鎖位置（例えばペプチジルカルボニルもしくはイミノ残基）の探索も促進するとみられる。
【００８４】
付加的なハイブリッドは、スペーサー中のＩｉタンパク質配列の明示的な残基に対する要件を試験した。スペーサー配列中のＩｉタンパク質の特定の残基に対する要件を見出すことは、こうしたスペーサーがそれらの活性部位でＰＰＩＩヘリックスのように渦巻き状に巻かれなければならないという見方を支持することができた。これらのハイブリッド中で、スペーサーのアミノ酸残基をε−アミノ吉草酸（「ａｖａ」）残基で置き換えた。ハイブリッド３は２個のａｖａ残基を含有し、また、ハイブリッド２は１個のａｖａ残基を含有した。これらのハイブリッドペプチドはそれぞれハイブリッド５およびハイブリッド４の相同物であった。アミノ基−メチレン架橋−カルボキシル基を包含するａｖａ残基の直線状の伸長は、トリペプチジル単位の主鎖の長さを近づける。これらの「欠失相同物」すなわちハイブリッド５およびハイブリッド４が生物学的活性を所有した場合には、ＭＨＣクラスＩＩ抗原ペプチドを結合する谷とのスペーサーの側鎖原子の特異的相互作用に対する機能的要件が存在しないと結論することができた。
【００８５】
本研究で使用されたハイブリッドペプチドは、エキソペプチダーゼの活性を阻害するために、Ｎ末端で全部アセチル化し、また、Ｃ末端でアミド化した。
【００８６】
【表１】
0004856336.tif 000002
【００８７】
表Ｉのペプチドは、コモンウェルス  バイオテクノロジーズ  インク（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、６０１  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＶＡ  ２３２２５により合成された。各ペプチドの純度および組成は、ＨＰＬＣ分離および質量分析法により確認した。
実施例２．ハイブリッドペプチドの生物学的活性
表Ｉに列挙される一連のペプチドの生物学的活性を、Ｔハイブリドーマ応答アッセイを用いて測定した。スズメガのチトクロームＣエピトープＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）に特異的であるＴ細胞ハイブリドーマを、その抗原ペプチド、もしくは表Ｉに列挙される抗原ペプチドおよびコアのＩｉ−Ｋｅｙ配列の一連のハイブリッドのメンバーで刺激した。ハイブリッドは多様な長さのスペーサーと結合した。スペーサーは、Ｉｉタンパク質の天然の配列中のアミノ酸、もしくは５−アミノ−ｎ−吉草酸（ａｖａ；５−アミノペンタン酸）のメチレン（−ＣＨ2−）基のいずれかを含有した。抗原提示細胞およびＴ細胞ハイブリドーマの培養物を、３μＭからの抗原ペプチドの連続的４倍希釈物とともにインキュベートした。応答は、それに抗原刺激培養物（２４時間の刺激期間）の上清を移したＨＴ−２培養物によるトリチウム化されたチミジンの取込みを測定することにより測定した。ハイブリッド１（抗原ペプチド）に対する最大の応答の半分の終点は約２０ｎＭであった。ハイブリッド５および２での最大の刺激の半分の終点は約５０ｐＭであった。メチレンスペーサーを有したハイブリッド（ハイブリッド２および３）の活性は、Ｉｉタンパク質の天然の配列をもつものに匹敵した。これらの実験は、Ｉｉ−Ｋｅｙコア配列と抗原ペプチドとの間のハイブリッドのインビトロの効力を立証する。
【００８８】
これらの実験の結果は、有効な治療薬が、選択された抗原エピトープへの可変性の鎖によるＩｉ−Ｋｅｙコア配列、例えばＬＲＭＫ（配列番号３）の共有交雑形成（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）から生じられることを示す。該可変性の鎖は、長さが３から６ペプチジル単位まで伸長することができ、また、ＭＨＣクラスＩＩ分子にいずれかの空間的に別個の様式で水素結合しない単純な反復単位から構成されることができる。こうした短い単純な可変性のスペーサーは、結晶学的データから示されるような、ＬＲＭＫ（配列番号３）と、ＣＬＩＰと抗原ペプチドとの間の推定の交差部位との間のＩｉタンパク質中に天然に存在する１０アミノ酸から構成されるスペーサーを有するハイブリッド７の至適に及ばない活性により示されるとおり、特定のアミノ酸残基から構成されるより長いスペーサーに対する増大された活性を生じる。
【００８９】
【表２】
0004856336.tif 000003
【００９０】
表ＩＩに対する説明。１分あたり１０００カウントでの抗原エピトープに対する免疫学的応答を、３μＭのストック溶液からのハイブリッド（４倍）連続希釈物の希釈係数の関数として提示する。
実験
このアッセイのために、以下の成分を一次培養の同一の時点で添加した：（ａ）抗原エピトープを含有するハイブリッドペプチド（表Ｉ）；（ｂ）特異的抗原ペプチドの結合および抗原ペプチド特異的Ｔ細胞ハイブリドーマへのその提示に必要とされるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を含む、マイトマイシンＣ処理されたＭＨＣクラスＩＩ陽性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）；（ｃ）抗原ペプチドおよびその提示を限定するＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に特異的なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に限定されるＴ細胞ハイブリドーマ。この一次培養物のインキュベーションの終了時に、その上清のアリコートを、インターロイキン依存性のリンパ芽球様細胞系とのインキュベーションのため第二の培養ウェルに移す。一次培養物中で活性化されたＴ細胞ハイブリドーマから放出されたインターロイキンによるその第二の指標細胞の刺激の程度を、その第二の培養物のＨＴ−２指標細胞のＤＮＡへのトリチウム化されたチミジンデオキシリボース｛［3Ｈ］ＴｄＲ｝の取込みを定量することにより測定する。
【００９１】
Ｉｉ−Ｋｅｙコア配列ＬＲＭＫ（配列番号３）とＰＧＣＣ９５−１０４すなわちハトチトクロームＣ９５−１０４、ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号８）との間のハイブリッドを、Ｅkにより提示する。該ペプチドをリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ；０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）に溶解した。溶液を濾過により滅菌した。Ｔｐｃ９．１  Ｔハイブリドーマは、マウスのクラスＩＩ  ＭＨＣ対立遺伝子Ｅk上に提示されるハトチトクロームＣ８１−１０４ペプチドに特異的である。Ｈ−２k対立遺伝子を発現するＣＨ２７  Ｂ細胞リンパ腫系統を抗原提示細胞として使用した。
【００９２】
抗原ペプチド特異的なＴ細胞活性化を以下の手順により測定した。マイトマイシンＣ処理されたＣＨ２７細胞（ＡkＥk）ＡＰＣを、細胞５×１０6個／ｍＬをダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／１０ｍＭ  Ｎ−２（ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）中で０．０２５ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））とともに３７℃で２０分間インキュベートすること、次いで４容量のＤＭＥＭ−５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳでの２回の洗浄により生成させた。Ｔ細胞ハイブリドーマは各アッセイ前に２２００ラドを照射した。
【００９３】
一次培養物アッセイのために、５×１０4個のマイトマイシンＣ処理されたＡＰＣ、５×１０4個のＴハイブリドーマ細胞、および抗原エピトープを含有するペプチドの３μＭからの連続的４倍希釈物を、完全ＤＭＥＭ―５％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１×非必須アミノ酸（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、５×１０-5Ｍ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）中、ｐＨ７．２〜７．４で培養した。Ｔハイブリドーマ細胞（Ｔ）およびＡＰＣのみを含有するウェルを、バックグラウンドのＴ細胞活性化についてモニターするために包含し；また、ＴおよびＡＰＣおよび抗原ペプチドを含有するウェルを、各ＡＥ１０１系統のペプチドによる非特異的Ｔハイブリドーマ活性化についてモニターするために包含した。各培養物からの上清（２０、４０もしくは７５μｌのアリコート）を２４時間後に取り出し、そして、２４時間のＨＴ−２アッセイの最後の５時間の間に１μＣｉ／ウェルで添加された［3Ｈ］ＴｄＲの取込みにより測定されるような、１×１０4個のインターロイキン依存性のＨＴ−２リンパ芽様細胞（それぞれ１４０、１２０もしくは７５μｌの完全ロズウェル  パーク  メモリアル  インスティテュート（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液−５％ＦＣＳに添加された）の成長に対するそれらの影響についてアッセイした。全部のアッセイについて、報告される値は、±１０％未満の平均標準誤差を伴う三重のウェルの平均である。刺激の程度はアッセイの間で変動したため、通常は、一次培養物および二次のＨＴ−２指標培養物の双方において、異なる時点で実施されたアッセイの間の比較のため、標準もしくは参照ペプチドを常に包含した。