(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを有効成分として含む、植物の乾燥耐性を向上させると共に花芽形成を遅延させるための薬剤であって、前記ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡが、シロイヌナズナ由来であり、かつ下記(a)〜(d)から選択されたいずれかのＤＮＡである薬剤；
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
(b)配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
(c)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
(d)配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載の薬剤を用いて植物を形質転換することを特徴とする、植物の乾燥耐性を向上させると共に花芽形成を遅延させる方法。
【請求項３】
請求項１に記載の薬剤を用いて形質転換された植物を、さらに、自家受粉、交配法、もしくは細胞融合法によりその子孫を得るか、又は当該形質転換植物の部分を用いてそのクローンを得ることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の転写因子遺伝子を利用した乾燥ストレスに対して耐性の高い植物の作成方法、花芽形成が遅延した植物の作成方法、さらに乾燥耐性が向上し、かつ花芽形成が遅延した形質転換植物の作成方法、およびこれを用いて得られる植物体、ならびにその利用に関し、主として植物育種分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
水不足は、植物にストレスを引き起こし、植物のバイオマス生産性を激減させる。乾燥による栽培植物のバイオマス生産性低下は、深刻な食糧不足や経済的損失といった問題の一因となる。植物の乾燥耐性は、様々な栽培植物において収量の増加、栽培の省力化・省資源化、栽培地域の拡大などに関わる重要な要素である。植物の乾燥耐性の改良によって、このような制限を克服し、植物のバイオマス生産性を向上させることが可能となる。
植物は、本来乾燥条件に対して自身を守る機構を有している。乾燥条件を感知するとシグナル伝達系が活性化し、乾燥への耐性に関係する遺伝子、もしくはそれらの発現を調節する遺伝子の発現が誘導されて適応する。しかし、乾燥条件が過酷であったり、長期にわたる場合には、植物の生理活性が著しく低下し、発達、生育が著しく抑制されたり、枯死に至ったりする。
収穫された果実、野菜や花卉など、土壌から抜き取られた植物個体や植物個体から切り離された器官や組織などの場合には、乾燥ストレスが著しく、短時間でしおれたり、枯死したりするため、様々な栽培植物について経済的な損失の要因となる。
植物の乾燥耐性の改良によって、このような制限を克服し、植物のバイオマス生産性を向上させたり、鮮度保持を延長させたりすることが可能となる。
これまでに、遺伝子組み換え等の技術を用い、浸透圧調整物質の合成能を高めたり、熱ショックタンパク質遺伝子を高発現させることで、植物の乾燥耐性を改良された例が報告されている（非特許文献１）。また、植物が乾燥ストレスなどの環境ストレスにさらされた際に著量に発現するストレス応答性遺伝子に着目し、そのようなストレス応答性遺伝子の発現を誘導するストレス応答性転写因子遺伝子等を用いて乾燥耐性を改良した例はＤＲＥＢ遺伝子など多数報告されている（特許文献２〜６）。そして、傷、低温、重金属によって誘導を受けるストレス応答性転写因子遺伝子の１種であるペチュニア由来のＣ２Ｈ２型ジンクフィンガー転写因子ＺＰＴ２−３遺伝子の場合は、植物に導入して乾燥耐性を付与することができ、かつ導入した植物の生育に悪影響を及ぼさないことが確認されている（特許文献７）が、一般に、環境ストレス応答性の転写因子遺伝子の場合、当該遺伝子を恒常的に過剰発現させた形質転換植物では、生育が不良になるなどの障害が生じる場合が多いことが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、従来ストレス応答性遺伝子の発現を誘導する機能とは直接関係付けられた知見の報告がなかったＢ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子において、植物に導入して乾燥耐性を付与する作用を示す可能性は考えられていなかった。
【０００３】
また、植物のバイオマス生産の観点からみて、花芽形成の時期の制御も重要な課題である。
植物の生活環は、大きく栄養成長相と生殖成長相に分けられる。栄養成長過程では、主に炭酸同化によりバイオマス生産が行われ、植物体が成長する。生殖成長過程では、有性生殖による繁殖のために花芽が形成し、種子を生産する。花芽の形成は、栄養成長から生殖成長への成長相の転換であり、植物生活環の主要な発達プログラムの切り替えである。また、栄養成長期に生産したバイオマスから貯蔵物質に転換し種子・果実等へ蓄積するための代謝的プログラムの切り替えでもある。一年生植物などのように生活環の中で一回だけ繁殖する植物では、花芽形成への切り替えは、同時に個体としての老化への切り替えでもある。したがって、花芽形成の時期の制御は、植物の繁殖戦略にとって重要であり、ほとんどの植物では花芽形成の時期を制御する機構を発達させてきた。このようなことから、多くの栽培植物において、花芽形成の時期を制御することは、植物体としてのバイオマス生産性の向上、種子・果実等の品質および生産性の向上にとって、重要な技術課題である。
花芽形成は、様々な内的および外的要因の制御を受けている。花芽形成に影響を及ぼす外的要因、すなわち環境要因として主要なのは、光周期すなわち日長および温度である。長日条件あるいは短日条件で花芽形成が促進される植物があり、それぞれ長日植物、短日植物と呼ばれている。これに対して、光周期が花芽形成に影響を及ぼさない中性植物もある。花芽形成の外的要因としての温度の影響としては、低温への暴露である。これによって、春化と呼ばれる過程によって花芽形成が促進される。花芽形成の内的要因は、植物の発達状態による花芽形成の制御機構である。ほとんどの植物種は、幼若な期間には花芽形成が抑制されており、植物体が発達して成熟期にはいることで、花芽の形成が促進される。このような花芽形成の機構は、自律的花芽形成促進経路とも呼ばれている。環境要因依存的花芽形成促進経路と自律的花芽形成促進経路とは、完全に独立な関係ではなく、部分的に共通の経路を通して花芽形成を制御していると考えられている。
さらに、ある種の植物の栽培においては、乾燥ストレスによって未成熟な植物個体において花芽形成が促進されることが知られている。その結果、栽培植物の生産量が低下してしまう。植物に、乾燥耐性と花芽形成遅延の能力を付与することで、このような障害を克服することができる。
いくつかの植物種において、花芽形成に関わる遺伝子が明らかにされている。特にシロイヌナズナにおいては、花芽形成の制御に関与する多くの遺伝子が明らかにされている（非特許文献８）。そのような遺伝子の発現を改良して、花芽形成を促進、もしくは遅延させる試みがなされてきた。これまでに、花芽形成抑制作用を有する不飽和脂肪酸誘導体を有効成分とする花芽形成調整剤（特許文献８）、花芽形成抑制活性タンパク質遺伝子又はそのアンチセンスＤＮＡを用いる花芽形成の制御方法（特許文献９）、ＥＲＦ転写因子ファミリーの花芽形成促進転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質を用いた花芽形成遅延植物体生産方法（特許文献１０）などが知られている。しかしながら、特許文献１０の方法も転写因子自体の作用で植物に花芽形成抑制を付与したものではない。
【０００４】
本発明者らは、以前から植物において有用物質生産やバイオマス生産の効率化に役立つ転写因子遺伝子の探索を目的として、主にシロイヌナズナを用いて、Ｂ−ｂｏｘジンクフィンガー転写因子（以下、ＢＺＦと呼ぶ）の機能解析を進めていた。Ｂ−ｂｏｘ保存配列は、Ｚｎ（亜鉛）との結合性が推定されることから「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガードメイン」と呼ばれているが、Ｃ２Ｈ２型等の他のジンクフィンガードメインのアミノ酸配列との相同性はない。Ｂ−ｂｏｘは最初は動物の転写因子で存在が確認され（非特許文献２）、その後同様のＢ−ｂｏｘを含むジンクフィンガー型転写因子が植物にも存在することが示され（非特許文献３）、Ｂ−ｂｏｘ付近の配列が保存された「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」は、遺伝子ファミリーを形成している（非特許文献４、５）。これら「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」遺伝子のうちＣＣＴドメインを含むタイプの遺伝子はＣＯＬファミリーとよばれ（非特許文献５，６）、いくつかの遺伝子について詳細な機能解析が進んできている。これに対して、ＣＣＴドメインを含まないタイプがＢＺＦファミリーであり、このファミリーに属する遺伝子については、詳細な機能解析に関する報告はほとんどない。そして、「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」遺伝子については、ＢＺＦファミリーのみならず、ＣＯＬファミリーの遺伝子に関しても、植物の乾燥耐性と花芽形成遅延作用とを関連づけた報告はなされていない。またこれまでに、植物の花芽形成を遅延させる作用を示すＢＺＦファミリー転写因子は、知られていない。
【特許文献１】特開２００３−２１９８８２号公報
【特許文献２】特開２０００−６０５５８号公報
【特許文献３】特開２００３−３１００７１号公報
【特許文献４】特開２００５−２５３３９５号公報
【特許文献５】特表２００６−５２２６０８号公報
【特許文献６】特開２００７−１２４９２５号公報
【特許文献７】特開２００５−７３６６９号公報
【特許文献８】特開２００３−７３２０９号公報
【特許文献９】特開２００４−１６２０１号公報
【特許文献１０】特開２００５−２９５８７８号公報
【非特許文献１】Umezawa,T. et al., Curr. Opin.Biotechnol.,17,113 (2006)
【非特許文献２】Borden, K.L.B. (1998) Biochem.CellBiol.,76,351
【非特許文献３】Robson, F. et al. (2001) PlantJ.,28,619
【非特許文献４】Griffiths, S. et al (2003) PlantPhysiol.,131,1855
【非特許文献５】Lagercranz, U. and Axelsson, T.(2000) Mol.Biol.Evol.,17,1499
【非特許文献６】Nagaoka, S. and Takano, T. (2003)J.Exp.Bot.,54,2231
【非特許文献７】Thompson,J.D.et al.(1994)Nucl.Acids Res.,22,4673
【非特許文献８】Baurle, I. and Dean, C. (2006)Cell,125,655
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、転写因子遺伝子を利用して、植物の生育に悪影響を与えることなく乾燥耐性を向上させる方法、及び／又は植物の花芽形成を遅延させる方法、及び乾燥耐性が向上した、及び／又は植物の花芽形成を遅延させた、生産性が良い植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らはシロイヌナズナの「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」のうちのＢＺＦファミリーに属するＢＺＦ１転写因子遺伝子に着目してその機能を検討していく中で、ＢＺＦ１遺伝子をシロイヌナズナに導入して複数のＴ１世代の形質転換植物を作成し、それぞれのＴ１植物について自家受粉による継代によってＴ３世代の植物体を得て、ＢＺＦ１遺伝子が高レベルで発現していることを確認した。Ｔ３世代の植物の形質を野生型植物と詳細に比較することによって、ＢＺＦ１遺伝子が植物に対して乾燥耐性を付与する可能性及び花芽形成を遅延させる可能性があることに気づき、乾燥ストレスに対する耐性及び花芽形成能を詳細に検討した。その結果、形質転換植物が野生型及びコントロール形質転換植物と比較して顕著な乾燥耐性を示し、及び花芽形成の遅延を示し、しかも形態異常や極端な生育不良を示さないことが確認された。複数の形質転換株のＴ３世代において上記の形質が確認されたことから、乾燥耐性の向上及び花成の遅延という形質は、子孫にも安定して受け継がれる形質であると考えられる。
本発明者らはＢＺＦ１遺伝子を植物に遺伝子導入して発現させることにより、植物の乾燥耐性を向上させること、および花芽形成が遅延することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明者らは、シロイヌナズナ及びイネの「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」ファミリーに属する転写因子をゲノムデータベースで検索し、それぞれ３１個および３２個を見いだし、分子系統解析および保存ドメイン・モチーフの比較解析を行ってきた（図５，６）。
植物のＢ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子ファミリーは、さらに、Ｂ−ｂｏｘの他にＣＣＴドメインとよばれる保存領域を含むＣＯＬファミリーと、ＣＣＴドメインを含まないＢＺＦファミリーとに大別される。前者のＣＯＬファミリーに属する遺伝子の機能解析は進んでおり、たとえばシロイヌナズナ由来のＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子は花成促進の機能を有している（非特許文献４，５）。シロイヌナズナゲノムでは、このＣＯＬファミリーの遺伝子は１７個存在することが知られている。後者のＢＺＦファミリーに属する遺伝子については、十分な構造の検討や機能の解明が進んでおらず、ＢＺＦファミリーのうちで構造や機能が検討された例は、（非特許文献６）のＳＴＯ遺伝子を高発現させたシロイヌナズナでは、高塩ストレス条件下で見られるシロイヌナズナの生育抑制のうち、根の伸長抑制のみがやや回復するというものである。シロイヌナズナのＢＺＦファミリーのうち、このＳＴＯ遺伝子はＢ−ｂｏｘを２つもつグループに属しており、ＢＺＦ１遺伝子は、従来詳細な機能解析の報告がなされていないＢ−ｂｏｘを１つしか含まないグループに属する。シロイヌナズナで、当該グループに属する遺伝子はＢＺＦ１遺伝子を含めて４遺伝子あり、ＢＺＦ１と最も高い相同性を示すシロイヌナズナのＢＺＦ２は、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析（非特許文献７）によると、アミノ酸配列全体では４７％の同一性を示す。（以下、本発明において単に「同一性」というとき、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析による「同一性」を指す。なお、「同一性」は、「相同性」ということもある。）
このように、ＢＺＦ２とＢＺＦ１とは、全アミノ酸配列では、それほど類似していないものの、Ｂ−ｂｏｘのアミノ酸配列の保存性が極めて高いので、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析では９５％の同一性を示す。Ｂ−ｂｏｘドメイン以外にもアミノ酸配列の相同性が高い保存モチーフを有しており（図５）、同一のグループに属する。（以下、「ＢＺＦ−Ｉ」グループという。）
具体的には、ＢＺＦ−Ｉグループの転写因子に共通な保存モチーフとしては、以下の３種類がある。
（１）「ＣＭ−１」：配列番号３で表されるアミノ酸配列をコンセンサス配列とする保存モチーフ（Ｂ−ｂｏｘドメインに相当）
（２）「ＣＭ−２」：「ＣＭ−１」モチーフのＣ末端に位置する配列番号４で表されるアミノ酸配列をコンセンサス配列とする保存モチーフ
（３）「ＣＭ−３」：Ｎ末側の富酸性アミノ酸領域とＣ末側の富セリン領域とに挟まれた配列番号５で表されるアミノ酸配列をコンセンサス配列とする保存モチーフ
イネのＢ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子の分子系統解析、及びそのシロイヌナズナとの比較解析により、イネのＢＺＦファミリーにもＢＺＦ１に分子系統上近縁のタンパク質ＯｓＢＺＦ１が存在しており、Ｂ−ｂｏｘドメインと共に、ＢＺＦ１と共通する上記保存モチーフも保存されていることから、同じ「ＢＺＦ−Ｉ」グループに属する（図６）。イネのＯｓＢＺＦ１は、ＢＺＦ１とのアミノ酸配列の相同性は、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析によると３１％の同一性であり、配列全体としての相同性はあまり高くない。これに対して、Ｂ−ｂｏｘでは６８％の同一性である。
したがって、ＢＺＦ−Ｉグループに属する転写因子とは、配列番号２のＢＺＦ１タンパク質と３１％以上の同一性を有し、かつ「ＣＭ−１」、「ＣＭ−２」、及び、Ｎ末側の富酸性アミノ酸領域とＣ末側の富セリン領域とに挟まれた「ＣＭ−３」の３つの保存モチーフを有している転写因子であると定義することができる。
一般に、同じファミリーに属し、共通の保存モチーフを持つ転写因子の機能は生物種によらず普遍性があるが、単子葉植物であるイネにも同一グループの転写因子が存在していることからみても、モデル植物であるシロイヌナズナで確認されたＢＺＦ１における植物の乾燥耐性を向上させる機能及び植物の花芽形成抑制作用は、双子葉、単子葉を問わず、植物一般で同様の機能を示すと考えられる。
【０００８】
本発明は、植物の乾燥耐性を高めるため、及び／又は花芽形成を遅延させるためのＢＺＦ−Ｉ転写因子遺伝子の利用に関するものであり、以下に記載の発明を提供するものである。
〔１〕  ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを有効成分として含む、植物の乾燥耐性を向上させるための、及び／又は花芽形成を遅延させるための薬剤。
〔２〕  ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡもしくは当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞又は組織であって、当該細胞又は組織を再生することで、乾燥耐性が向上した、及び／又は花芽形成が遅延した形質転換植物を得ることができる、形質転換植物細胞又は組織。
〔３〕  ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを用いて形質転換されたことを特徴とする、乾燥耐性が向上した、及び／又は花芽形成が遅延した、形質転換植物又はその部分。
〔４〕  形質転換植物が、ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを用いて形質転換された植物の子孫あるいはクローンである、前記〔３〕に記載の形質転換植物又はその部分。
〔５〕  形質転換植物又はその部分が、植物個体、種子、植物器官、植物組織、又は植物細胞である、前記〔３〕又は〔４〕に記載の形質転換植物又はその部分。
〔６〕  ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを用いて形質転換することを特徴とする、植物の乾燥耐性を向上させるための、及び／又は植物の花芽形成を遅延させるための、植物の形質転換方法。
〔７〕  ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを用いて形質転換された植物を、さらに、自家受粉、交配法、もしくは細胞融合法によりその子孫を得るか、又は当該形質転換植物の部分を用いてそのクローンを得ることを特徴とする、前記〔６〕に記載の植物の形質転換方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、乾燥耐性が向上した形質転換植物が提供される。また、本発明により、花芽形成が遅延した形質転換植物が提供される。さらに、本発明により、乾燥耐性が向上し、かつ花芽形成が遅延した形質転換植物が提供される。花芽形成の遅延によって、植物バイオマス生産の増大が可能となる。乾燥耐性の向上によって、または乾燥耐性の向上と共に花芽形成が遅延することによって、環境ストレス条件下での植物生産の効率化と、栽培の省力化と節水化、栽培地域の拡大等が可能となり、また、栽培植物の植物個体、もしくはその有用部分の寿命の延長と収量の増加が可能となる。また、植物の生産性が向上することで、植物体内で合成・蓄積される種々の有用物質の生産性の向上にも有効である。さらに、収穫後の寿命の延長あるいは鮮度の保持が向上することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．本発明において「植物の乾燥耐性が向上する」とは、対象植物の乾燥に対する耐性を野生型の植物と比較して向上させることをいう。植物の乾燥耐性は、実施例２に示したように、本発明の遺伝子を用いて形質転換した植物を、コントロール（ＧＵＳ）遺伝子を用いて形質転換した植物及び野生型の植物と共に栽培した後、水やりを一定期間停止し、再度水やりを開始した後の生存率を調べることにより評価することができる。
【００１１】
２．本発明において「花芽形成が遅延された」とは、対象植物の花芽形成をコントロール（ＧＵＳ）遺伝子を用いて形質転換した植物及び野生型の植物と比較して遅延させることをいう。本発明の花芽形成時期は、花茎が抽苔するまでの本葉の枚数を調べることにより評価することができる。
【００１２】
３．「ＢＺＦ−Ｉ転写因子」について：
本発明において、「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」とは、「Ｂ−ｂｏｘ」とよばれる、Ｚｎ（亜鉛）との結合性がある保存配列を有する転写因子であり、各種動植物の幅広い生物種において見出されている転写因子である。
本発明において、「ＢＺＦ−Ｉ転写因子」とは、植物のＢ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子ファミリーのうち、「ＣＯＬファミリー（Ｂ−ｂｏｘの他にＣＣＴドメインを含む）」以外の、ＣＣＴドメインを含まないタイプの「ＢＺＦファミリー」に属するものであり、そのうちで、Ｂ−ｂｏｘ保存領域を１つしか含まないグループであって、かつ図５に示されたＢＺＦ−Ｉグループの保存領域および保存モチーフを有する転写因子である。
Ｂ−ｂｏｘドメインは、「CXXCXXXXXXX(X)CXXXXXXXCXXCXXXXHXXXXXXX(X)H」というシステイン、ヒスチジン骨格を有する保存領域である。本願におけるＢＺＦ−Ｉグループの「ＣＭ−１」モチーフは、図５に示される「CXLCXXXARXYCXXDXAXLCWXCDXXVHGANFLVAXH」という共通配列を有する。「ＣＭ−２」の保存モチーフは、「CXXCXXXTPWXAXGXXLGPTXSXCEXC」という共通配列を有している。「ＣＭ−３」保存モチーフは、「ＮＱＶＶＰ」である。「ＣＭ−３」保存モチーフのＮ末端側に富酸性アミノ酸領域が、「ＣＭ−３」保存モチーフのＣ末端側には富セリン領域が位置する。
典型的にはシロイヌナズナ由来のＢＺＦ１遺伝子であって、たとえば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、本発明において特に好適に用いることができる。
【００１３】
また、乾燥耐性を向上させる作用、花芽形成を遅延させる作用、または乾燥耐性と共に花芽形成抑制作用を有するＤＮＡであれば、「配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」も含まれる。典型的には、ＢＺＦ１遺伝子をコードする配列番号１で表された塩基配列情報を利用して適当なプライマー対を設計し、たとえば配列番号６及び７のプライマー対を用いて植物から調製したｍＲＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、得られる増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて常套手段により調製された植物由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。
また、形質転換植物に乾燥耐性を向上させる作用、花芽形成を遅延させる作用、または乾燥耐性と共に花芽形成抑制作用を付与するＤＮＡであって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも本発明で用いられる。
したがって、本発明の「ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡ」として典型的には、以下のＤＮＡを包含する。
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
(b)配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
(c)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
(d)配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
４．形質転換植物の作出方法
上記ＤＮＡを挿入するベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。上記ＤＮＡが挿入されたベクターは、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法によって、植物細胞に導入することができる。本発明の実施例では、典型的なアグロバクテリウム法を用いた。
本発明は、上記ＤＮＡやベクターが導入された形質転換植物細胞から育成または再生された、乾燥耐性が向上した植物体を提供する。本発明における「乾燥耐性が向上した植物体」とは、野生型の植物体と比較して乾燥に対する耐性が人為的に向上されている植物体をいう。
また、本発明は、花芽形成が遅延された植物体を提供する。「花芽形成が遅延された植物体」とは、野生型の植物体と比較して花芽形成が人為的に遅延されている植物体をいう。
さらに、本発明は、乾燥耐性が向上し、かつ花芽形成が遅延された植物体を提供する。
本発明は、上記ＤＮＡが導入された細胞から作出された植物体のみならず、その子孫あるいはクローンをも提供する。一旦、ゲノム内に上記ＤＮＡやベクターが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫あるいはクローンを得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
そして、本発明は、植物の乾燥耐性を向上させるための、又は植物の花芽形成を遅延させるための、及び、植物の乾燥耐性を向上させると共に、植物の花芽形成を遅延させるための形質転換方法を提供する。当該方法は、上記ＤＮＡやベクターを植物細胞に導入する工程および上記ＤＮＡやベクターを導入された細胞から植物体を育成または再生する工程を含むものである。
上記ＤＮＡが挿入されたベクターは、当業者に公知の方法によって、植物細胞に導入することができる。形質転換植物細胞から植物体を育成または再生する工程は、植物の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、シロイヌナズナであればCloughら（Plant J.16:735-743(1998)）の方法、あるいはAkamaら（Plant Cell Reports12:7-11(1992)）の方法が挙げられる。また、イネであればHieiら（Plant J.6:271-281(1994)）あるいはFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett.2:74-75(1985)）の方法を用いることができる。
そして、本発明において「形質転換植物」というとき、上記ＤＮＡを導入して作成した形質転換植物のみならず、当該植物の有性生殖によって得られた種子を生育させた子孫植物、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により得られた子孫植物あるいはクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物のすべてを含む概念である。本発明の実施例では、ＢＺＦ１遺伝子が導入された形質転換植物を自家受粉させて得られた種子を生育させたＴ３世代又はＴ４世代を用いている。
【実施例】
【００１５】
（実施例１）  遺伝子の植物への導入
遺伝子の単離、遺伝子導入用の組換えベクター及び形質転換植物の作製は、公知の方法で行うことができる。本実施例においては、シロイヌナズナ植物由来のＢＺＦ１のｃＤＮＡを単離し、植物発現ベクターを作製して、アグロバクテリウムを用いてシロイヌナズナに形質転換し、ＢＺＦ１過剰発現形質転換植物を得た。
【００１６】
（１）ＢＺＦ１遺伝子のクローニング
シロイヌナズナ幼植物体より全ＲＮＡを抽出し、これを鋳型にして、 オリゴ（ｄＴ）を用い、逆転写酵素を作用させて、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。この１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー：5’-CACCATGGGGAAGAAGAAGTGCGAGTTATG-3’(配列番号６)、リバースプライマー：5’-TCAATAAAACGAAGACGACGATGATG-3’(配列番号７)を用いてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを単離した。ＰＣＲの条件は９８℃３０秒、（９８℃１０秒、５２−７０℃３０秒、７２℃２５秒）×３０サイクル、７２℃１０分の後、４℃で保持した。増幅した断片は、約６５０ｂｐであり、目的の長さであった。ｃＤＮＡのエントリーベクターへのクローニングは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯクローニングキットを用いて行った。マニュアルに従って、フォワードプライマーは、ATGの前にCACC配列を付加したものを用いた。
【００１７】
（２）ＢＺＦ１遺伝子の植物発現ベクターの作成
ＢＺＦ１遺伝子を植物で構成的に発現させるための植物発現ベクターは以下のように作製した。上記（１）で得られたＢＺＦ１遺伝子の完全長ｃＤＮＡを含んだエントリークローンと、発現ベクター（デスティネーションベクターｐＫ２ＧＷ７、Karimiら(2002)Trends in Plant Science;7(5):193-195）を混合し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙＰＣＲクローニングシステムのマニュアルに従ってＬＲ反応によりＢＺＦ１遺伝子の完全長ｃＤＮＡを含んだ発現クローンを得た。構築されたＢＺＦ１遺伝子高発現ベクター（ｐＫ２ＧＷ７−Ｐ３５Ｓ：：ＢＺＦ１）は、図１に示すように、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域、本発明のＢＺＦ１ｃＤＮＡをコードするポリヌクレオチドおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネーター領域を含む。これを以後のシロイヌナズナへの遺伝子導入に用いた。
【００１８】
（３）ＢＺＦ１遺伝子のシロイヌナズナへの導入
上記（２）にて構築した発現ベクターをｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ法により、アグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入した。なお遺伝子の導入はコロニーＰＣＲにより確認した。形質転換用シロイヌナズナは、２２℃、連続明条件で栽培し、摘心を行って腋芽の数を増加させた。感染の前日には、蕾を残して、鞘と開花した花は取り除いた。
一方、形質転換したアグロバクテリウムを、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＹＥＰ培地およびＹＥＢ培地を用いて、２８℃で２４時間程度前培養した後、２７℃で２４時間程度本培養を行った。得られた培養液を集菌し、形質転換用培地に懸濁した。
Ｆｌｏｒａｌ−ｄｉｐ法(Clough and Bent,1998)に従って、蕾を懸濁液に約1分浸した。処理後の植物はラップで乾燥を防ぎ、２２℃連続明条件に一晩おいた後に、土に水を通して懸濁液を希釈した。同条件下でそのまま生育を行い、Ｔ１種子を得た。Ｔ１種子は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＭＳ培地を用いて、２２℃、連続明条件で発芽・生育させることによって選抜を行った。このＴ１植物からＴ２種子を得た。Ｔ２種子は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭＳ培地を用いて、２２℃連続明条件のもとで発芽・生育させることによって選抜を行った。このＴ２植物からＴ３種子、Ｔ３植物からＴ４種子を得た。Ｔ３種子及びＴ４種子は、上記のＴ２種子選抜と同様にカナマイシン選抜を行った。Ｔ３またはＴ４世代の形質転換植物を以下の実験に用いた。
【００１９】
（４）形質転換植物におけるＢＺＦ１遺伝子の発現
ＢＺＦ１遺伝子を導入した形質転換植物７系統（＃１−３、＃１１−６、＃１２−７、＃１３−３、＃１４−３、＃１５−１、＃１６−７）およびコントロール形質転換植物（ＧＵＳ）及び野生型植物（Ｃｏｌ−０）から全ＲＮＡを抽出し、０．５μｇを鋳型に用い、オリゴ（ｄＴ）,逆転写酵素を作用させて、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。この1本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー：5’-CACCATGGGGAAGAAGAAGTGCGAGTTATG-3’(配列番号６)、リバースプライマー：5’-TCAATAAAACGAAGACGACGATGATG-3’(配列番号７)を用いてＰＣＲを行った結果を図２に示す。この結果から、形質転換植物７系統すべてが導入遺伝子を高レベルで発現していることが示された
【００２０】
（実施例２）  形質転換シロイヌナズナ植物の乾燥耐性
ＢＺＦ１形質転換植物（＃１−３）、コントロール形質転換植物（ＧＵＳ）及び野生型植物（Ｃｏｌ−０）を、連続光のもとで、人工土壌で播種後１７日栽培した後、１５日間、灌水を停止して乾燥させた。この後、灌水を再開し、５日後の生存率を調べた。その結果、図３のように、コントロール形質転換植物と野生型植物は灌水停止後１３日〜１５日で植物体地上部はほぼ萎れた状態となり、灌水を再開しても回復せずにそのまま枯死するが、ＢＺＦ１形質転換体は灌水停止後１３日では萎れず、１５日後にやっと地上部が萎れはじめた。その後灌水再開すると回復し、再び正常な生育を示した。これらの結果から、ＢＺＦ１遺伝子を高レベルで発現させることによって、形質転換植物が乾燥耐性を獲得することが示された。また、形質転換植物は生育や形態上の異常は認められないことから、ＢＺＦ１遺伝子の過剰発現は植物の生育等には悪影響を及ぼさないと考えられた。
すなわち、潅水を停止して乾燥させると、ＢＺＦ１形質転換植物は、野生型植物やＧＵＳ形質転換植物に比べると植物体地上部の萎れが遅く、乾燥に対して耐性を示す。また、野生型植物やコントロール形質転換植物の大部分が萎れる乾燥状態で潅水を再開すると野生型植物とコントロール形質転換植物は回復せずにそのまま枯死するが、ＢＺＦ１形質転換体の大部分は回復し、再び正常な生育を示すようになった。
【００２１】
（実施例３）  形質転換シロイヌナズナ植物の花芽形成の遅延
ＢＺＦ１形質転換植物を、野生型植物（Ｃｏｌ−０）やコントロール形質転換植物（ＧＵＳ）と共に、長日条件で栽培した。図４の（Ａ）は、４９日後の、野生型植物、コントロール形質転換植物、ＢＺＦ１形質転換植物の状態を示す。ＢＺＦ１形質転換植物は、野生型植物（Ｃｏｌ−０）やコントロール形質転換植物と比較して花芽形成が遅延し、一方、展開する本葉は厚みがあり、かつ枚数も野生型植物やコントロール形質転換植物に比べて多くなった。
図４の（Ｂ）は、それぞれの植物における、花茎が抽苔するまでの本葉の枚数を６〜１２個体について調べた結果を示す。ＢＺＦ１形質転換植物の２系統（＃１−３−１、＃１１−６）では、それぞれ平均１８．１枚、及び１３．８枚であるのに対して、野生型植物では平均１０．３枚、コントロール形質転換植物では平均１０．０枚であり、ＢＺＦ１形質転換植物における１．４〜１．８倍程度の本葉の枚数増加を確認した。
【００２２】
(実施例４)  形質転換シロイヌナズナ植物の花芽形成のバイオマス生産量の増大
同様に、野生型植物（Ｃｏｌ−０）、コントロール形質転換植物（ＧＵＳ）、ＢＺＦ１形質転換植物（＃１−３−１、＃１１−６）について、長日条件で栽培した植物体を用いて抽苔時の植物体の地上部（花茎を除いた部分）の生重量を測定した。この時期は、およそＳｔａｇｅ６．００〜６．１０(Boyes et al.,Plant Cell,13:1499-1510(2001))の生育段階に相当する。ここで、Ｓｔａｇｅ６．００〜６．１０とは、１番花の開花から最終的に開花した全花の１０％に相当する開花が終了するまでの期間を指す。
図７に示されるように、野生型植物、及びコントロール形質転換植物がそれぞれ０．３０ｇ、及び０．３４ｇであるのに対し、ＢＺＦ１形質転換植物２系統（＃１−３−１、＃１１−６）は、それぞれ１．０３ｇ、及び１．３２ｇであり、ＢＺＦ１形質転換植物では、３〜４倍もの生重量を示した。この結果から、ＢＺＦ１遺伝子の過剰発現により、花芽形成が遅延すると同時にバイオマス生産量が向上することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明のＢＺＦ１遺伝子の発現が高められた形質転換植物では、乾燥耐性が向上し、環境ストレス条件下での植物バイオマス生産の効率化、栽培の省力化と節水化、栽培地域の拡大などが可能となる。乾燥地域の緑化への効果も期待される。また、花芽形成を遅延させることができるので、寿命が延長し、植物バイオマスの生産量の向上が期待される。さらに乾燥耐性の向上と共に花芽形成も遅延させることができるので、寿命が延長し、かつ乾燥ストレスに耐性であることによって、植物バイオマス生産の効率化、栽培の省力化と節水化、栽培地域の拡大などが可能となる。また、より多くの二酸化炭素を同化して、植物バイオマス生産の収量が増加することが期待される。伝統的な農林業における植物生産だけでなく、ビルの屋上や植物工場など人工気象条件における生産効率の増大、栽培の省力化・省資源化にも利用出来る。生産される植物バイオマスの利用の形態としては、伝統的な農林業の生産物の利用の仕方に加え、バイオマス燃料やバイオプラスチックの原料としての利用も考えられる。また、植物体内で合成・蓄積される種々の有用物質の生産性の向上にも有効である。さらに、収穫した植物体や植物体の一部の寿命の延長や鮮度の保持の向上により、商品価値の減少の軽減、輸送や貯蔵コストの低減に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＢＺＦ１遺伝子を植物で構成的に発現させるためのベクターの模式図
【図２】形質転換植物におけるＢＺＦ１遺伝子の過剰発現を示すＲＴ−ＰＣＲの結果野生型植物（Ｃｏｌ−０）、コントロール形質転換植物（ＧＵＳ）および３５Ｓ：：ＢＺＦ１形質転換植物（＃１−３，＃１１−６，＃１２−７，＃１３−３，＃１４−３，＃１５−１，＃１６−７）におけるＢＺＦ１遺伝子の発現を示す。フォワードおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＢＺＦ１形質転換植物７系統すべてでＢＺＦ１遺伝子が過剰発現している。
【図３】ＢＺＦ１遺伝子の発現により形質転換植物（シロイヌナズナ）の乾燥耐性が向上したことを示す写真。野生型植物（Ｃｏｌ−０）、コントロール形質転換植物（ＧＵＳ）、ＢＺＦ１形質転換植物の乾燥耐性。連続光のもとで植物を１７日間栽培した後、１５日間灌水を停止した後、５日間灌水を再開した後、の植物の状態を示す。野生型植物とコントロール形質転換植物は回復せずにそのまま枯死したが、ＢＺＦ１形質転換植物は回復し、再び正常な生育を示した。
【図４】ＢＺＦ１遺伝子の発現により形質転換植物（シロイヌナズナ）の花芽形成が遅延したことを示すもので、シロイヌナズナの野生型植物（Ｃｏｌ−０）、コントロール形質転換植物（ＧＵＳ）、ＢＺＦ１形質転換植物についての、（Ａ）長日条件で４９日栽培後の生育状態及び花芽形成の状態の比較した写真。（Ｂ）花芽形成までの本葉の枚数の比較（２系統＃１−３−１、＃１１−６について、１２個体および６個体の平均）。
【図５】ＢＺＦ−Ｉグループに属するシロイヌナズナ及びイネのＢＺＦ遺伝子がコードするタンパク質中の保存モチーフ配列
【図６】シロイヌナズナ及びイネのＢＺＦファミリーの分子系統解析図
【図７】シロイヌナズナの野生型植物（Ｃｏｌ−０）、コントロール形質転換植物（ＧＵＳ）、ＢＺＦ１形質転換植物（＃１−３−１、＃１１−６）について、Ｓｔａｇｅ６．００〜６．１０(Boyes et al.,2001)の生育段階にある植物体の地上部（花茎を除いた部分）の生重量の比較。
【図１】
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【図７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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