(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号２のアミノ酸残基２２−４０９、配列番号２９、配列番号２９のアミノ酸残基２５−４０９、配列番号３１、および、配列番号３１のアミノ酸残基２３−４０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたタンパク質。
【請求項２】
配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する核酸によってコードされ、そして、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタンパク質。
【請求項３】
配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸によってコードされ、そして、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタンパク質。
【請求項４】
配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む核酸によってコードされ、そして、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタンパク質。
【請求項５】
ビブリオ科微生物由来である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項６】
配列番号２、配列番号２のアミノ酸残基２２−４０９、配列番号２９、配列番号２９のアミノ酸残基２５−４０９、配列番号３１、および、配列番号３１のアミノ酸残基２３−４０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項７】
配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列と少なくとも９０％の相同性を有する単離された核酸であって、該核酸はβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記単離された核酸。
【請求項８】
配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列を含んでなる単離された核酸。
【請求項９】
配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む単離された核酸であって、該核酸はβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記単離された核酸。
【請求項１０】
請求項６ないし９のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質を発現するビブリオ科の単離された微生物。
【請求項１３】
フォトバクテリウム・フォスフォレウム  ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８８）、フォトバクテリウム属（Photobacterium sp.）  ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７）、または、ビブリオ属（Vibrio sp.）  ＪＴ−ＦＡＪ−１６株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８）である、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質の製造方法であって、以下の工程：
１）請求項１２または１３に記載の微生物を培養し；
２）培養した微生物または培養上清から、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を単離する；
ことを含んでなる、前記製造方法。
【請求項１５】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質の製造方法であって、以下の工程：
１）請求項６ないし９のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる組換えベクターで宿主細胞を形質転換し；
２）形質転換した当該宿主細胞を培養し；そして、
３）培養した宿主細胞または培養上清から、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を単離する；
ことを含んでなる、前記製造方法。
【請求項１６】
シアリル糖鎖の製造方法であって、
（ｉ）請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質、糖供与体基質、および糖受容体基質を含む溶液を調製し；
（ｉｉ）当該溶液においてシアル酸転移反応を行い；そして
（ｉｉｉ）反応溶液から生成したシアリル糖鎖を得る；
ことを含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なβ‐ガラクトシド‐α２，３‐シアル酸転移酵素、当該酵素をコードする遺伝子、当該酵素を生産する微生物および当該酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖転移酵素は、生体内において糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖の生合成に関与する酵素である。そしてその反応生成物である糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖（以下、複合糖質糖鎖）は、生体内において非常に重要な機能を有している。例えば、糖鎖は、主に哺乳類細胞において、分化や発生における細胞間および細胞−細胞外マトリックス間のシグナル伝達や複合糖質のタグとして機能する重要な分子であることなどが明らかにされている。【０００３】
上記のとおり、糖鎖は非常に重要な機能を有しているが、これを応用した具体例として、エリスロポエチンが挙げられる。エリスロポエチンは本来糖タンパク質であるが、糖鎖の数を増加させ、その寿命を向上させた組換えエリスロポエチンタンパク質が作製され、現在市販されている。【０００４】
今後もこのように糖鎖を応用した医薬品、機能性食品等の開発が想定される。そのため、糖鎖を合成・生産する手段としての糖転移酵素の重要性が増大している。【０００５】
これまでに約１５０種類以上の糖転移酵素遺伝子がヒト、マウス、ラットおよび酵母等の真核生物から単離されており、さらにＣＨＯ細胞や大腸菌等を宿主細胞とする生産系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現されている。一方、原核生物である細菌からも、いくつかの糖転移酵素遺伝子が単離されており、さらに大腸菌を用いる組換え生産系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現され、それらの基質特性や酵素化学的な諸性質が明らかにされている。【０００６】
糖鎖を構成する糖の中でも、非還元末端に存在することの多いシアル酸は、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であり、従って、シアル酸転移酵素は、現在重要性が増している糖転移酵素の中で最も需要が高い酵素の一つである。【０００７】
α２，３−シアル酸転移酵素およびその遺伝子に関しては、動物、特に哺乳類由来のものが多く報告されている（例えば、Harduin-Lepers, A. et al., Biochem J., 15;352 Pt 1:37-48 (2000)；Young-Choon Lee et al., J. Biol. Chem., 23;274(17):11958-67 (1999)；Lee, Y-C. et al., J. Biochem., 216, 377-385 (1993)；Chang, M-L. et al., Glycobiology, 5, 319-325 (1995)；Gillespie, W. et al., J. Biol. Chem., 267, 21004-21010 (1992）を参照)。しかし、これらの動物由来の酵素は精製が困難で大量に得られないため非常に高価であり、さらに酵素としての安定性が悪いという問題を有している。【０００８】
これに対し、微生物由来のα２，３−シアル酸転移酵素およびその遺伝子としては、ナイセリア属、キャンピロバクター属、ヘモフィラス属およびパスツレラ属に属する微生物から取得されたものが報告されている（例えば、ＷＯ９７／０４７７４９、ＷＯ９９／０４９０５１、ＷＯ０１／０７７３１４、ＷＯ０３／０２７２９７を参照）。しかし、ビブリオ科に属する微生物から取得されたという報告はなく、また、ビブリオ科に属する微生物にα２，３-シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質が存在するという報告もない。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９７／０４７７４９Ａ号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ９９／０４９０５１Ａ号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ０１／０７７３１４Ａ号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ０３／０２７２９７Ａ号パンフレット
【非特許文献１】Harduin-Lepers, A. et al., Biochem. J., 15;352 Pt 1:37-48 (2000)
【非特許文献２】Young-Choon Lee et al., J. Biol. Chem., 23;274(17):11958-67 (1999)
【非特許文献３】Lee, Y-C. et al., J. Biochem., 216, 377-385 (1993)
【非特許文献４】Chang, M-L. et al., Glycobiology, 5, 319-325 (1995)
【非特許文献５】Gillespie, W. et al., J. Biol. Chem., 267, 21004-21010 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ビブリオ科の微生物に由来する新規なβ‐ガラクトシド‐α２，３‐シアル酸転移酵素、およびそれをコードする遺伝子を提供することである。また、本発明の課題は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素をコードする遺伝子を利用して遺伝子組換え技術により本酵素を高生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意研究に努めた結果、ビブリオ科（Vibrionaceae）に属する微生物がシアル酸を糖鎖中のガラクトース残基、グルコース残基、マンノース残基、フコース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基もしくはＮ−アセチルガラクトサミン残基にα２，３結合で転移させる新規な酵素を生産することを見出し、本発明を完成させた。本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸、ならびに、当該シアル酸転移酵素を製造する方法を提供する。【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。【００１２】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を提供する。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素」とは、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラクトース残基の３位、ラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在するガラクトースの３位、またはガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどの複合糖質を構成しうる単糖であって３位の炭素に水酸基を有する単糖の３位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性」とは、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。また、ここでいうシアル酸とは、シアル酸ファミリーに属するノイラミン酸誘導体を示す。具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、５−デアミノ−５−ヒドロキシノイラミン酸（ＫＤＮ）、ジシアル酸などを示す。【００１３】
本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は、配列番号２、配列番号２９または配列番号３１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は、配列番号１、配列番号２８または配列番号３０の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質である。【００１４】
本発明の配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素において、配列番号２のアミノ酸１−２１はシグナル配列である。したがって、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は、配列番号２のアミノ酸２２−４０９のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は、配列番号１の塩基６４−１２３０の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。【００１５】
本発明の配列番号２９のアミノ酸配列を含んでなる、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素において、配列番号２９のアミノ酸１−２４はシグナル配列であると想定される。したがって、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は、配列番号２９のアミノ酸２５−４０９のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は、配列番号２８の塩基７３−１２３０の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。【００１６】
本発明の配列番号３１のアミノ酸配列を含んでなる、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素において、配列番号３１のアミノ酸１−２２はシグナル配列であると想定される。したがって、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は、配列番号３１のアミノ酸２３−４０２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は、配列番号３０の塩基６７−１２０９の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。【００１７】
本発明はまた、上記の本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の変異体であって、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有する変異タンパク質をも包含する。このような変異タンパク質もまた、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素に含まれる。【００１８】
本発明の変異体タンパク質は、配列番号２、配列番号２のアミノ酸２２−４０９、配列番号２９、配列番号２９のアミノ酸２５−４０９、配列番号３１、および、配列番号３１のアミノ酸２３−４０２からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。【００１９】
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度のアミノ酸を意味する。【００２０】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。【００２１】
なお、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入または付加し、次いで連結する方法もある。【００２２】
本発明の変異体タンパク質はまた、配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
ここで、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、０．５Ｍ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ中で５５℃でハイブリダイゼーションさせた後、４０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ、０．５％ＢＳＡ中で５５℃、１５分を２回、４０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ中で５５℃、１５分を２回、洗浄操作を行うという条件、あるいはMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版、第１巻、1.101-104頁、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（引用によりその全体を本明細書に援用する）等に記載されているように、３０％  脱イオン化ホルムアミド、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．４、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ中で４２℃で、ハイブリダイゼーションさせた後、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、中で室温で１０分を２回、さらに同じバッファー中で５５℃で１時間洗浄操作を行うという条件が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、高度にストリンジェントな条件におけるハイブリダイゼーションとして、例えば、Molecular Cloning（同上）等に記載されている、０．５Ｍ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ中で６５℃でハイブリダイゼーションさせた後、４０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ、０．５％ＢＳＡ中で６５℃、４０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ中で６５℃、洗浄操作を行うという条件が挙げられる。【００２３】
本発明の変異体タンパク質はさらに、配列番号２、配列番号２のアミノ酸２２−４０９、配列番号２９、配列番号２９のアミノ酸２５−４０９、配列番号３１、および、配列番号３１のアミノ酸２３−４０２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上のアミノ酸相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。【００２４】
または、本発明の変異体タンパク質は、配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の相同性を有する核酸によってコードされるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。【００２５】
ここで、アミノ酸配列または核酸塩基配列の相同性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定可能である。例えば、２つのアミノ酸配列の相同性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムやＢＬＡＳＴアルゴリズムなどを用いて、配列情報を比較することによって決定することができる。【００２６】
シアル酸転移酵素活性は、公知の手法、例えば、J. Biochem., 120, 104-110 (1996)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定してもよい。例えば、糖供与体基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を、そして糖受容体基質としてラクトースを用いて酵素反応を行い、反応生成物であるシアリルラクトースの量を評価することで酵素活性を評価することができる。【００２７】
糖受容体基質に転移したシアル酸の結合様式の決定方法としては、限定するわけではないが、ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法、反応生成物の核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）による分析など、当業者に公知の手法のいずれかを用いて行うことができる。ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法は、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行うことを含む。具体的には、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製）を糖受容体基質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを糖供与体基質として用いて酵素反応を行い、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にかけ、反応生成物の保持時間からシアル酸が転移された位置を特定する。【００２８】
本発明の一態様において本発明の酵素は、ビブリオ科に属する微生物由来、好ましくはビブリオ属（Vibrio spp.）に属する微生物由来、または、好ましくはフォトバクテリウム属（Photobacterium spp.）に属する微生物由来、さらに好ましくは、フォトバクテリウム・フォスフォレウム種（Photobacterium phosphoreum）に属する微生物由来の酵素である。【００２９】
本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の酵素学的性質および理化学的性質は、上記に定義したβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有することを特徴とするほか、限定するわけではないが、至適ｐＨが、ｐＨ５〜１１、ｐＨ５〜１０、ｐＨ５〜９、またはｐＨ５〜７の範囲であり、至適温度が、５〜３５℃、１０〜３５℃、２０〜３５℃、または２０〜３０℃であり、分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で４２，０００±３，０００Ｄａ程度である。【００３０】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素をコードする核酸
本発明は、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素をコードする核酸を提供する。【００３１】
本発明の核酸は、配列番号２、配列番号２のアミノ酸２２−４０９、配列番号２９、配列番号２９のアミノ酸２５−４０９、配列番号３１、および、配列番号３１のアミノ酸２３−４０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする核酸である。本発明の核酸はまた、配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸である。【００３２】
本発明の核酸は、上記の核酸の変異体であって、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。そのような核酸もまた、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素をコードする核酸に含まれる。【００３３】
そのような核酸の変異体は、配列番号２、配列番号２のアミノ酸２２−４０９、配列番号２９、配列番号２９のアミノ酸２５−４０９、配列番号３１、および、配列番号３１のアミノ酸２３−４０２からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。【００３４】
そのような核酸の変異体はまた、配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む核酸であって、該核酸はβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。ここで、ストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件とは、上記で定義したとおりである。【００３５】
そのような核酸の変異体はまた、配列番号１、配列番号１の塩基６４−１２３０、配列番号２８、配列番号２８の塩基７３−１２３０、配列番号３０、および、配列番号３０の塩基６７−１２０９からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の相同性を有する核酸であって、該核酸はβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。ここで、核酸塩基配列の相同性は、上記に示した方法で決定することができる。【００３６】
そのような核酸の変異体はさらに、配列番号２、配列番号２のアミノ酸２２−４０９、配列番号２９、配列番号２９のアミノ酸２５−４０９、配列番号３１、および、配列番号３１のアミノ酸２３−４０２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。ここで、アミノ酸配列の相同性は、上記に示した方法で決定することができる。【００３７】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を発現する微生物
本発明者らは、ビブリオ科に属する微生物が新規なβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を発現することを見いだした。よって本発明は、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を発現する微生物を提供する。本発明の微生物は、ビブリオ科に属し、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物であり、好ましくはビブリオ属（Vibrio spp.)に属するもの、または、好ましくはフォトバクテリウム属（Photobacterium spp.）に属するもの、さらに好ましくは、フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）に属するものである。β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素生産能を有するビブリオ科に属する微生物の例としては、フォトバクテリウム・フォスフォレウム  ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８８）、フォトバクテリウム属  ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７）、および、ビブリオ属  ＪＴ−ＦＡＪ−１６株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８）が挙げられる。なお、上記のビブリオ科の微生物は海洋性細菌であり、海水中または海産の魚介類から分離される。たとえば、本発明のフォトバクテリウム・フォスフォレウム  ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株は石川県産のイカから、フォトバクテリウム属  ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株は石川県産のカマスから、そして、ビブリオ属  ＪＴ−ＦＡＪ−１６株は福岡県産のアジから、それぞれ分離されたものである。【００３８】
本発明の微生物は、例えば以下に説明するようなスクリーニング法を用いて分離することができる。海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を微生物源とする。海水、海砂、海泥はそのままもしくは滅菌海水で希釈し、接種源とする。海産魚介類は表面の粘液等をループで擦り採って接種源としたり、内臓器を滅菌海水中で磨砕した液を接種源とする。これらをマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）や塩化ナトリウム添加ニュートリエントアガー培地（ベクトン・ディッキンソン製）などの平板培地上に塗布し、様々な温度条件下で生育する海洋性微生物を取得する。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）や塩化ナトリウム添加ニュートリエントブロス培地（ベクトン・ディッキンソン製）などの液体培地を用い、それぞれの微生物を培養する。微生物が十分生育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集める。集めた菌体に界面活性剤である０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁する。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕する。この細胞破砕液を酵素溶液として、常法にしたがってシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株を得ることができる。【００３９】
本発明のフォトバクテリウム・フォスフォレウム  ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株、フォトバクテリウム属  ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株、および、ビブリオ属  ＪＴ−ＦＡＪ−１６株も上記のスクリーニング法を用いることで得られた。得られた上記の菌株の菌学的性質および生理学生化学的性質、ならびに１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析による種の同定については、実施例１に詳述する。【００４０】
フォトバクテリウム フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株は２００５年３月１４日付でＮＩＴＥ  ＢＰ−８８として、フォトバクテリウム属（Photobacterium sp.)ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株は２００５年３月１１日付でＮＩＴＥ  ＢＰ−８７として、そして、ビブリオ属（Vibrio sp.）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株は２００５年５月２３日付でＮＩＴＥ  ＢＰ−９８として、いずれも独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ：National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary；日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。【００４１】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を製造する方法
（１）β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を発現する微生物を培養することによる当該酵素の製造方法
本発明の一態様において、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素はビブリオ科に属する微生物由来であり、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物を培地に培養し、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を生産させ、これを採取することによって得られる。【００４２】
ここで用いる微生物としては、ビブリオ科に属し、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素生産能を有する微生物であれば、いずれの菌株でも用いることができる。ビブリオ科の微生物の中でも、ビブリオ属に属するものが好ましく、または、フォトバクテリウム属に属するものが好ましく、そしてフォトバクテリウム・フォスフォレウムに属するものがさらに好ましい。本発明の方法において用いる微生物の例としては、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８８）、フォトバクテリウム属（Photobacterium sp.)ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７）、および、ビブリオ属（Vibrio sp.）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８）が挙げられる。【００４３】
上記微生物の培養に用いる培地としては、それらの微生物が利用し得る炭素源、窒素源、無機物等を含むものを用いる。炭素源としては、ペプトン、トリプトン、カゼイン分解物、肉エキス、ブドウ糖等が挙げられ、好ましくはペプトンを用いる。窒素源としては、酵母エキスを用いるのが好ましい。塩類としては、塩化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ほう酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を適宜組み合わせて用いるのが好ましい。【００４４】
また、上記成分を含んだマリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）を用いてもよい。さらには、上記塩類を適度に含む人工海水を用い、これにペプトン、酵母エキス等を添加した培地を用いてもよい。培養条件は培地の組成や菌株によって多少異なるが、例えば、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株を培養する場合、培養温度は１０〜２８℃、好ましくは２０〜２５℃、培養時間は８〜４８時間、好ましくは１６〜２４時間である。【００４５】
目的とする酵素は菌体内に存在するため、公知の菌体破砕法、例えば超音波破砕法、フレンチプレス破砕法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法などのいずれかの方法を行えばよく、その菌体破砕物から目的とする酵素を分離精製する。本発明の方法における好ましい菌体破砕法は超音波破砕法である。例えば、菌体破砕物から遠心分離により固形物を除去した後に、得られた菌体破砕液上清を市販の陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、ＣＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、ＣＭＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィーおよびネイティブ−ＰＡＧＥ等を適宜組み合わせて電気泳動的に単一バンドになるまで精製することができる。【００４６】
なお、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は完全に精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は精製品であってもよく、または部分精製品であってもよい。【００４７】
（２）組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を製造する方法
本発明は、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素をコードする核酸を含む発現ベクター、および当該発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。そして、本発明は、当該発現ベクターを含有する宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養して、発現された組換えタンパク質を回収することにより組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質を製造する方法も提供する。【００４８】
本発明の組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質を製造するためには、使用する宿主に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、または昆虫遺伝子等から誘導された適当な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結したβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素をコードする核酸配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに、転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列が挙げられる。【００４９】
本発明のベクターに挿入されるβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素をコードする核酸配列は、配列番号１の塩基１−６３、配列番号２８の塩基１−７２、または配列番号３０の塩基１−６６に相当するリーダー配列を含んでいても、含んでいなくてもよく、また、他の生物源由来のリーダー配列に置き換えてもよい。リーダー配列を置き換えることによって、発現したタンパク質を宿主細胞の外に分泌させるように発現システムを設計することも可能である。【００５０】
また、本発明の組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質は、当該酵素をコードする核酸に続いて、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧTMタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどをコードする核酸を連結した核酸をベクターに挿入することにより、融合タンパク質として発現することも可能である。本発明の酵素をこのような融合タンパク質として発現させることにより、当該酵素の精製および検出を容易にすることができる。【００５１】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質の発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母または高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。【００５２】
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または枯草菌が含まれる。大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質は、原核細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含むようにしてもよい。このＮ末端メチオニンは、発現後に組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質から切り離すこともできる。【００５３】
原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に１または２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例には、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のような市販のプラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するのが容易である。適切なプロモーターならびにβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素をコードする核酸のＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, スウェーデン、ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Promega Biotech.、米国、ウイスコンシン州、マディソン）などが含まれる。【００５４】
原核宿主細胞用の発現ベクターにおいて通常用いられるプロモーター配列には、ｔａｃプロモーター、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター（Changら、Nature 275:615, 1978;およびGoeddelら、Nature 281:544, 1979、引用によりその全体を本明細書に援用する。）などが含まれる。【００５５】
また、組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質を酵母宿主内で発現させてもよい。好ましくは、サッカロミセス属（Saccharomyces、例えば、S.cerevisiae ）を用いるが、ピキア属（Pichia）またはクルイベロミセス属（Kluyveromyces）のような他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自立複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多い。酵母α因子リーダー配列を用いて、組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質の分泌を行わせることもできる。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知られている。酵母を形質転換する方法は、例えば、Hinnenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933, 1978（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。【００５６】
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質を発現することもできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができる。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウイルス２などから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。哺乳動物宿主細胞内で用いるためのベクターは、例えば、OkayamaおよびBerg（Mol. Cell. Biol., 3: 280, 1983、引用によりその全体を本明細書に援用する）の方法で構築することができる。【００５７】
本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質を産生する１つの方法は、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、当該タンパク質が発現する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に応じてβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質を培養培地または細胞抽出液から回収する。【００５８】
組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質を精製する操作は、用いた宿主の型および本発明のタンパク質を培養培地中に分泌させるかどうかといった要因に従って適宜選択される。例えば、組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質を精製する操作には、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、ＣＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、ＣＭＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィーおよびネイティブ−ＰＡＧＥ等、またはそれらの組み合わせが含まれる。また、組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素に精製を容易にするタグなどを融合させて発現させた場合には、アフィニティークロマトグラフィーによる精製方法を利用してもよい。例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧTMタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを融合させた場合には、それぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）カラム、抗ＦＬＡＧ抗体を連結したカラム、またはグルタチオンを連結したカラム、などを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【００５９】
組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は電気泳動的に単一バンドになるまで精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明のβ−ガラクトシド−２，３−シアル酸転移酵素は精製品であってもよく、または部分精製品であってもよい。【００６０】
抗体
本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質に対する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質、またはそのフラグメント、に対して作製してもよい。ここで、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素のフラグメントは、当該酵素のアミノ酸配列中、少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、または少なくとも３０アミノ酸を含む配列を有するフラグメントである。【００６１】
抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素またはそのフラグメントを、当該技術分野において抗体作製のために用いられる動物、例えば、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギなどに免疫して作製してもよい。抗体はポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、当業者に周知の抗体作製方法に基づいて作製することができる。【００６２】
本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質をアフィニティー精製により回収するのに用いることができる。本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質を、ウエスタンブロッティングやＥＬＩＳＡなどのアッセイにおいて検出するのに用いることもできる。【００６３】
シアリル糖鎖の製造方法
一態様において、本発明は本発明のシアル酸転移酵素を利用したシアリル糖鎖の製造方法を提供する。本発明の方法は、シアリル糖鎖の製造方法であって、
（ｉ）本発明のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素、糖供与体基質、および糖受容体基質を含む溶液を調製し；
（ｉｉ）当該溶液においてシアル酸転移反応を行い；そして
（ｉｉｉ）反応溶液から生成したシアリル糖鎖を得る；
ことを含んでなる、前記方法である。【００６４】
本明細書においてシアリル糖鎖とは、シアル酸を有する糖鎖をいう。本発明の方法においては、本発明の酵素によるシアル酸転移反応より、糖供与体基質のシアル酸が糖受容体基質に転移し、シアリル糖鎖が得られる。【００６５】
本発明の方法に使用可能な糖供与体基質は、本発明のシアル酸転移酵素によるシアル酸転移反応において糖供与体となりうる基質であれば特に限定されない。好ましい本発明の方法に使用可能な糖供与体基質はＣＭＰ−シアル酸であり、より好ましくはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃである。【００６６】
本発明の方法に使用可能な糖受容体基質は、特に限定されないが、ガラクトース残基、グルコース残基、マンノース残基、フコース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、もしくはＮ−アセチルガラクトサミン残基などを有する複合糖質糖鎖もしくはオリゴ糖、または、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミンなどの単糖である。ここで、複合糖質とは、糖質を含む生体分子の総称で、糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質が含まれる。本明細書において複合糖質糖鎖とは、糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質などの複合糖質そのものを意味することもあるし、また、その糖鎖部分を意味することもある。また、オリゴ糖とは、２以上の単糖がグリコシド結合で連結された糖を意味する。オリゴ糖を構成する単糖の数には特に制限はない。また、単糖またはオリゴ糖の還元末端は、アルキル基、ピリジルアミノ基、ベンゾイル基、ベンジル基、パラニトロフェニル基、４−メチルウンベリフェリル基などで修飾されていてもよい。【００６７】
本発明の方法において、本発明の酵素、糖供与体基質、および糖受容体基質を含む溶液は緩衝液であり、例えば、非限定的に、酢酸バッファー、カコジル酸バッファー、リン酸バッファー、ＴＡＰＳバッファー、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＣＨＥＳバッファー、ＣＡＰＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＭＥＳバッファー、ＡＤＡバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ＡＣＥＳバッファー、ＭＯＰＳＯバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、などが含まれる。本発明の方法における、本発明の酵素、糖供与体基質、および糖受容体基質を含む溶液のｐＨは、本発明の酵素が酵素活性を有するｐＨであれば特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１１、ｐＨ５〜１０、ｐＨ５〜９、ｐＨ５〜７である。【００６８】
本発明の方法において、シアル酸転移反応を行う温度は、本発明の酵素が酵素活性を有する温度であれば特に限定されないが、好ましくは、５〜３５℃、１０〜３５℃、２０〜３５℃、２０〜３０℃の範囲で行うことができる。【００６９】
本発明の方法における、反応溶液から生成したシアリル糖鎖を得る工程は、当業者に公知の複合糖質糖鎖、オリゴ糖を精製する手法を用いて行うことができる。例えば、クロマトグラムとしては、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィーなど、またその他の手法としては、限外ろ過による糖鎖の分画・濃縮、糖鎖の結晶化など、もしくはそれらの組み合わせ、などが挙げられるがこれらに限定されない。【００７０】
本発明の酵素は、後述の実施例４、１１、１２および１３に示すように、多くの種類の糖受容体基質にシアル酸をα２，３結合で転移することが可能である。本発明のシアリル糖鎖の製造方法により、一般的には基質特異性が高い公知のシアル酸転移酵素では製造できなかった糖鎖を容易に製造することが可能になる。特にα-ガラクトピラノシド、α-グルコピラノシド、α-マンノピラノシド、α-フコシノピラノシド、β-フコシノピラノシドなどといった糖に効率よくシアル酸を転移する活性を有する酵素は知られていないので、本発明の方法は、これらの糖にシアル酸が付加されたシアリル糖鎖の容易な製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００７１】
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされてきている糖鎖の合成・生産手段を提供するという観点において貢献する。特に、シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つであり、本発明の新規なシアル酸転移酵素の提供は、そのような高い需要に応えるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１−１】図１−１は、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の酵素活性の確認実験における、標品（失活させた粗酵素液、ピリジルアミノ化ラクトースおよびピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトース（ピリジルアミノ化３’−シアリルラクトース）の混合物）のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１−２】図１−２は、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の酵素活性の確認実験のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１−３】図１−３は、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の酵素活性の確認実験における、対照実験（糖供与体であるＣＭＰ−シアル酸を含まない反応液を使用した反応）のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図２】図２は、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来、フォトバクテリウム属  ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来、およびビブリオ属  ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来のα２，３−シアル酸転移酵素（それぞれ配列番号２、２９、３１）、フォトバクテリウム・ダムセラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）、ならびにパスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）のアミノ酸配列間のアラインメントを示す図である。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素についての下線は精製タンパクから決定されたアミノ酸配列を示す。
【図３−１】図３−１は、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産したβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の酵素活性における反応ｐＨの影響を示すグラフである。グラフ中の、黒四角、黒丸、黒三角、黒ひし形、白抜き四角、および白抜き丸のプロットはそれぞれ、酢酸バッファー、カコジル酸バッファー、リン酸バッファー、ＴＡＰＳバッファー、ＣＨＥＳバッファーおよびＣＡＰＳバッファー中で測定した結果を示す。
【図３−２】図３−２は、組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の酵素活性における反応ｐＨの影響を示すグラフである。図３−２ａはＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来、図３−２ｂはＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来、および図３−２ｃはＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素についての結果を示すグラフである。グラフ中の、黒四角、黒丸、黒三角、黒ひし形、白抜き四角、および白抜き丸のプロットはそれぞれ、酢酸バッファー、カコジル酸バッファー、リン酸バッファー、ＴＡＰＳバッファー、ＣＨＥＳバッファーおよびＣＡＰＳバッファー中で測定した結果を示す。
【図４−１】図４−１は、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産したβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の酵素活性における反応温度の影響を示すグラフである。
【図４−２】図４−２は、組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の酵素活性における反応温度の影響を示すグラフである。図４−２ａはＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来、図４−２ｂはＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来、そして図４−２ｃはＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素についての結果を示すグラフである。
【００７３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７４】
実施例１：  β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を発現する微生物のスクリーニングと菌株の同定
海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を接種源とした。この接種源をマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる平板培地上に塗布し、１５℃、２５℃もしくは３０℃で生育する微生物を取得した。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる液体培地を用いてそれぞれの微生物を培養した。微生物が十分成育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集めた。集めた菌体に、０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕した。この細胞破砕液を酵素溶液としてシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株、およびＪＴ−ＦＡＪ−１６株を得た。なお、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株は、スルメイカの表皮から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はカマスの内臓から、およびＪＴ−ＦＡＪ−１６株はアジの内臓から、それぞれ得られた。【００７５】
シアル酸転移活性は、J. Biochem., 120, 104-110 (1996) （引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定した。具体的には、糖供与体基質ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（７０ｎｍｏｌ、14ＣでＮｅｕＡｃをラベルしたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ  ２５０００ｃｐｍを含む、３５６ｃｐｍ／ｎｍｏｌ。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を表す）、糖受容体基質としてラクト−ス（１．２５μｍｏｌ）、ＮａＣｌを０．５Ｍ濃度になるように添加し、および上記に記した方法で調製した酵素を含む反応溶液（３０μｌ）を用いて酵素反応を行った。酵素反応は２５℃で１０分間から３０分間行った。反応終了後、反応溶液に１．９７ｍｌの５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、この溶液をＤｏｗｅｘ１×８（ＰＯ43‐ フォーム、０．２×２ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ製）カラムに供した。このカラムの溶出液（０〜２ｍｌ）に含まれる反応生成物、すなわち、シアリルラクト−スに含まれる放射活性を測定することで、酵素活性を算出した。
（ｉ）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株
得られたＪＴ−ＩＳＨ−４６７株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．５〜２．０μｍ。【００７６】
（２）運動性  −
（３）グラム染色性  −
（４）胞子の有無  −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度  ４℃では＋、２５℃では＋、３０℃では−
（２）集落の色調  特徴的集落色素を産生せず
（３）Ｏ／Ｆテスト  ＋／−
（４）カタラーゼテスト  −
（５）オキシダーゼテスト  ＋
（６）グルコースからの酸産生  −
（７）グルコースからのガス産生  −
（８）発光性  ＋
（９）硝酸塩還元  ＋
（１０）インドール産生  ＋
（１１）ブドウ糖酸性化  −
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ  ＋
（１３）ウレアーゼ  −
（１４）エスクリン加水分解  −
（１５）ゼラチン加水分解性  −
（１６）β‐ガラクトシダーゼ  ＋
（１７）ブドウ糖資化性  −
（１８）Ｌ−アラビノース資化性  −
（１９）Ｄ−マンノース資化性  −
（２０）Ｄ−マンニトール資化性  −
（２１）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性  −
（２２）マルトース資化性  −
（２３）グルコン酸カリウム資化性  −
（２４）ｎ−カプリン酸資化性  −
（２５）アジピン酸資化性  −
（２６）ｄｌ−リンゴ酸資化性  −
（２７）クエン酸ナトリウム資化性  −
（２８）酢酸フェニル資化性  −
（２９）チトクロームオキシダーゼ  ＋
（３０）菌体内ＤＮＡ  のＧＣ含量（モル％）３９．７％
（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析およびＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによる種の同定）
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号３に示した。この塩基配列はフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）基準株であるＡＴＣＣ１１０４０株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、相同率１００％の高い相同性を示した。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株はフォトバクテリウム属に属することが明らかとなった。しかしながら、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は細菌の全ゲノムの一部でしかないので、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列による同定解析は種レベルの極めて近縁な生物間の距離に対しては誤差が非常に大きいとされている。そこで、属内における菌株の類縁関係の定量的な評価に一般的に用いられているＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験法を用い、種の決定を行った。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株およびフォトバクテリウム・フォスフォレウム基準株であるＮＣＩＭＢ１２８２株（ＡＴＣＣ１１０４０株と同一株）の全ＤＮＡを抽出し、供試した。その結果、８４．７％の高い相同値（DNA-DNA relatedness）が得られた。一般に、同一種間のＤＮＡ−ＤＮＡ相同値は６０％以上を示すことから、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株はフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）と同定された。なお、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験は「微生物の分類・同定実験法」（鈴木健一郎・平石  明・横田  明  編、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、２００１年９月、参照によりその全体を本明細書に援用する）に従い、マイクロプレートを用いたフォトビオチン標識法によって行った。
（ｉｉ）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株
得られたＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．０〜１．５μｍ。【００７７】
（２）運動性  ＋
（３）グラム染色性  −
（４）胞子の有無  −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度  ４℃では−、２５℃では＋、３０℃では＋、３７℃では−
（２）集落の色調  特徴的集落色素を産生せず
（３）Ｏ／Ｆテスト  ＋／−
（４）カタラーゼテスト  ＋
（５）オキシダーゼテスト  ＋
（６）グルコースからの酸産生  ＋
（７）グルコースからのガス産生  ＋
（８）発光性  −
（９）硝酸塩還元  ＋
（１０）インドール産生  ＋
（１１）ブドウ糖酸性化  −
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ  ＋
（１３）ウレアーゼ  −
（１４）エスクリン加水分解  −
（１５）ゼラチン加水分解性  −
（１６）β‐ガラクトシダーゼ  ＋
（１７）ブドウ糖資化性  −
（１８）Ｌ−アラビノース資化性  −
（１９）Ｄ−マンノース資化性  −
（２０）Ｄ−マンニトール資化性  −
（２１）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性  −
（２２）マルトース資化性  −
（２３）グルコン酸カリウム資化性  −
（２４）ｎ−カプリン酸資化性  −
（２５）アジピン酸資化性  −
（２６）ｄｌ−リンゴ酸資化性  −
（２７）クエン酸ナトリウム資化性  −
（２８）酢酸フェニル資化性  −
（２９）チトクロームオキシダーゼ  ＋
（３０）Ｏ／１２９感受性、１０μｇ  −、１５μｇ  ＋
（３１）菌体内ＤＮＡ  のＧＣ含量（モル％）３９．４％
（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析）
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号３２に示した。【００７８】
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はマリンアガー上での生育性、桿菌、グラム染色性、グルコース発酵的分解性、Ｏ／１２９感受性などの形態観察および生理・生化学的性状試験の結果からビブリオ科に属することが示された。さらに、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）基準株ＡＴＣＣ１１０４０の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列に最も相同性が高く、その相同率は９９．２％であること、次にフォトバクテリウム・イリオピスカリウム（Photobacterium iliopiscarium）基準株ＡＴＣＣ５１７６０の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列に相同性が高く、その相同率は９９．１％であることが明らかとなった。これらの結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株はフォトバクテリウム属（Photobacterium sp.）に属する微生物であることが明らかとなった。
（ｉｉｉ）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株
得られたＪＴ−ＦＡＪ−１６株の性質は以下の通りであった：
（菌学的性質）
（１）細胞の形態は桿菌で、大きさは０．７〜０．８μｍ×１．２〜１．５μｍ。【００７９】
（２）運動性  −
（３）グラム染色性  −
（４）胞子の有無  −
（生理学生化学的性質）
（１）生育温度  ４℃では＋w、２５℃では＋、３０℃では＋、３７℃では＋
（２）集落の色調  淡黄色〜クリーム色
（３）Ｏ／Ｆテスト  ＋／＋
（４）カタラーゼテスト  ＋
（５）オキシダーゼテスト  ＋
（６）グルコースからの酸産生  ＋
（７）グルコースからのガス産生  −
（８）硝酸塩還元  ＋
（９）インドール産生  −
（１０）ブドウ糖酸性化  ＋
（１１）アルギニンジヒドロラーゼ  −
（１２）ウレアーゼ  −
（１３）エスクリン加水分解  ＋
（１４）ゼラチン加水分解性  −
（１５）β‐ガラクトシダーゼ  ＋
（１６）ブドウ糖資化性  −
（１７）Ｌ−アラビノース資化性  −
（１８）Ｄ−マンノース資化性  −
（１９）Ｄ−マンニトール資化性  −
（２０）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性  −
（２１）マルトース資化性  −
（２２）グルコン酸カリウム資化性  −
（２３）ｎ−カプリン酸資化性  −
（２４）アジピン酸資化性  −
（２５）ｄｌ−リンゴ酸資化性  −
（２６）クエン酸ナトリウム資化性  −
（２７）酢酸フェニル資化性  −
（２８）チトクロームオキシダーゼ  ＋
（２９）Ｏ／１２９感受性、  −
（３０）マンイトール発酵性、  ＋
（３１）イノシトール発酵性、  ＋
（３２）アラビノース発酵性、  ＋
（３３）ラムノース発酵性、  −
（３４）サッカロース発酵性、  −
（３５）生育性（ＮａＣｌ）、３％ＮａＣｌ＋、４％ＮａＣｌ＋、６％ＮａＣｌ＋、
（３６）デンプン加水分解、  −
（３７）Ｔｗｅｅｎ８０分解、  −
（３８）Ｈ2Ｓ産生、  −
（３９）アセトイン産生（ＶＰテスト）、  −
（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析）
ＪＴ−ＦＡＪ−１６株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号３３に示した。【００８０】
ＪＴ−ＦＡＪ−１６株はマリンアガー上での生育性、桿菌、グラム染色性、グルコース発酵的分解性、Ｏ／１２９感受性などの形態観察および生理・生化学的性状試験の結果からビブリオ科に属することが示された。さらに、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はビブリオ・ルモイエンシス（Vibrio rumoiensis）基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列に最も相同性が高く、その相同率は９９．５％であることが明らかとなった。これらの結果から、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株はビブリオ属（Vibrio sp.）に属する微生物であることが明らかとなった。
実施例２：  フォトバクテリウム フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７からのβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の抽出および精製
マリンアガー２２１６平板培地上で継代培養したフォトバクテリウム フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株のコロニーから菌体をループで採取し、マリンブロス２２１６液体培地１０ｍｌに接種し、２５℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。【００８１】
本培養は、以下の手順で実施した。２０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎｅおよび４  ｇ／ＬのＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔを加えたマリンブロス２２１６培地を１０００ｍｌ容のコブ付フラスコに３００ｍｌ張り込み、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）で滅菌した。これを３６本（合計１０．８Ｌ）用意した。各々のフラスコに前培養液１０ｍｌを接種し、２５℃、毎分１８０回転で２４時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。湿重量で約６０ｇを得た。【００８２】
この菌体を、９９０ｍｌの０．２％トリトンＸ−１００および３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。菌体破砕液を４℃、１００，０００×ｇで１時間、遠心分離を行い、上清を得た。得られた上清を、透析膜チューブに入れ、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）中で４℃、塩化ナトリウムが２０ｍＭ程度になるまで透析した。透析後、溶液中に沈澱が生じたため、４℃で、１００，０００×ｇで１時間遠心分離を行い、沈殿を取り除いた。【００８３】
この粗酵素液を、０．２％トリトンＸ−１００なる界面活性剤を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＰｒｅｐ  １６／１０  ＤＥＡＥ  ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス製）という陰イオン交換カラムに吸着させ、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍ付近で溶出された酵素活性を有する画分を回収した。【００８４】
回収した画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、予め０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に吸着させ、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）から０．２％トリトンＸ−１００を含む５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）へ直線濃度勾配法で溶出させ。その結果、リン酸緩衝液濃度が１２５ｍＭ付近に溶出された酵素活性を有する画分を回収した。【００８５】
この画分をＭｏｎｏＱ  ５／５０  ＧＬ（アマシャムバイオサイエンス製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  カコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ  塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が３００ｍＭ付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収した。【００８６】
この画分を、０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  カコジレート緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈し、ＭｏｎｏＱ  ５／５０  ＧＬ（ファルマシア製）陰イオン交換カラムに吸着させた。０．２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ７．０）から１Ｍ  塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ、直線濃度勾配法で溶出させた。塩化ナトリウム濃度が３００ｍＭ付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収した。【００８７】
この画分を０．２％トリトンＸ−１００および０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍希釈し、ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス製）ゲルろ過カラムで分画した。０．２％トリトンＸ−１００および０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  カコジレート緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出させた。【００８８】
活性のあった画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの濃度は１２．５％）した結果、目的酵素は単一のバンドを示し、約３９，０００の分子量を示した。この画分の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて約３５０倍に上昇した（表１）。【００８９】
粗酵素液からのＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のα２，３−シアル酸転移酵素の精製について、上述したそれぞれの精製工程を経た試料の酵素活性を表１に示す。酵素活性は、実施例１に記載したのと同様にJ. Biochem. 120, 104-110(1996)に記載されている方法で測定した。また、タンパク質の定量はCoomassie Protein Assay Reagent（PIERCE製）を用いて、添付されたマニュアルにしたがってタンパク質の定量を行った。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量とした。【００９０】
【表１】
0004856636.tif 000002
【００９１】
実施例３：  ピリジルアミノ化糖鎖を用いたシアル酸結合様式の決定
実施例２で得られた酵素を用い、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルアミノ化糖鎖としては、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製）を用い分析した。糖受容体基質が２．０μＭ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが５．７μＭおよび酵素が２０ｍＵ／ｍｌとなるように、それぞれを２０ｍＭ  カコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）２５μｌ中に溶解し、２５℃下で３時間反応させた。反応終了後、１００℃で２分間反応溶液を処理することにより酵素を失活させた。その後、ＨＰＬＣで反応生成物の分析を行った。【００９２】
ＨＰＬＣシステムとしてＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ１０Ａ（島津製作所製）を用い、分析カラムにはＴａｋａｒａ  ＰＡＬＰＡＫ  Ｔｙｐｅ  Ｒ（タカラバイオ製）を用いた。０．１５％  Ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．０）で平衡化したカラムに溶出液Ａ（１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）で希釈した反応液を注入した。ピリジルアミノ化糖鎖の溶出には溶出液Ａ（１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）および溶出液Ｂ（０．５％、ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）を用い、３０〜１００％溶出液Ｂの直線濃度勾配法（０〜３５分）および１００％溶出液Ｂ（３５〜５０分）により、順次ピリジルアミノ化糖鎖を溶出した。なお、分析は以下の条件で行った（流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：蛍光（Ｅｘ：３２０ｎｍ、Ｅｍ：４００ｎｍ））。【００９３】
その結果、本酵素を用いることにより、ピリジルアミノ化ラクトースからピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトース（ピリジルアミノ化３’−シアリルラクトース）が合成されることが明らかとなった。
実施例４：  ＪＴ−ＩＳＨ−４６７菌株が生産するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を用いた単糖・二糖類へのシアル酸の転移（シアル酸含有糖鎖の製造）
（材料および方法）
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７菌株から調整した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて部分精製したα２，３−シアル酸転移酵素を用いて、各種の単糖・二糖類へのシアル酸の転移を確認するために、以下の実験を行った。【００９４】
各種の糖受容体基質を用いたシアル酸転移反応
反応溶液２４μｌ中に、糖供与体基質ＣＭＰ−14Ｃ−ＮｅｕＡｃ（４００ｎｍｏｌ（１５６００ｃｐｍ）、反応溶液中での最終濃度：１６．６ｍＭ）、各種糖受容体基質（１０μｍｏｌ、反応溶液中での最終濃度：２００ｍＭ）、シアル酸転移酵素（０．１３ｍＵ）、ＮａＣｌ（反応溶液中での最終濃度：５００ｍＭ）からなる反応溶液を調製して、２５℃で４時間、酵素反応を行った。なお、糖受容体基質として用いた単糖・二糖類は、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−β−OMe）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）、ラクト−ス（Gal−β1,4−Glc）、Ｎ−アセチルラクトサミン（Gal−β1,4−GlcNAc）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニド（Gal−β1,3−GlcNAc−β−OMe）の６種類を用いた。【００９５】
酵素反応終了後、反応溶液に１．９８ｍｌの５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）を添加して酵素反応を停止した。その後、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）で希釈した酵素反応溶液（２ｍｌ）を、ＡＧ１−×２Ｒｅｓｉｎ（ＰＯ43‐ フォーム、０．２×２ｃｍ）カラムに供した。このカラムは、ＡＧ１−×２Ｒｅｓｉｎ（ＯＨ‐ｆｏｒｍ、BIO-RAD社製）を１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）に懸濁し、３０分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液（０〜２ｍｌ）の放射活性を測定した。このカラムの溶出液には、反応で生じた14Ｃ−ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）が結合した反応生成物および未反応の糖受容体基質が含まれるが、未反応のＣＭＰ−14Ｃ−ＮｅｕＡｃはカラムに保持されたままである。従って、酵素反応の結果生じた各種シアル酸含有糖鎖由来の14Ｃの放射活性は、全て反応生成物由来であり、この画分の放射活性から酵素活性を算出することができる。【００９６】
上記の方法を用いて、それぞれの糖受容体基質に転移されたＮｅｕＡｃの放射活性を測定して転移されたシアル酸を算出した。
（結果）
今回糖受容体基質として用いた６種類の単糖、二糖いずれにもシアル酸が転移していることが明らかとなった（表２参照）。今回糖受容体基質として用いた糖類の中では、Ｎ−アセチルラクトサミンに最も多くのシアル酸が転移していることが明らかとなった。【００９７】
【表２】
0004856636.tif 000003
【００９８】
実施例５：  フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列解析および当該遺伝子の形質転換
（１）ゲノムＤＮＡの精製とゲノムライブラリーの作成
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株の菌体ペレット約０．５ｇから、Qiagen Genomic-tip 100/G（Qiagen社製）を用いて、キット添付の説明書きに従って、約１００μｇのゲノムＤＮＡを調製した。１−２μｇのＤＮＡに対して、０．１〜０．２ユニットの四塩基認識の制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを反応させ、部分分解を行った。反応バッファーは酵素に添付のものを用い、反応条件は３７℃、３０分とした。反応終了後、反応液に最終濃度２５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．０を加え、フェノール・クロロホルム処理を行った。ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、ＴＥ  ４００μｌに溶解した。遠心チューブ（日立製作所製４０ＰＡ）に、グラジエント作製装置を用いて、４０％シュークロースバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０，１Ｍ  ＮａＣｌ）と１０％シュークロースバッファーから、４０−１０％のグラジエントを作製し、そこへ上記の部分分解ＤＮＡ溶液を重層した。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ７０Ｈ、ローター：ＳＲＰ２８ＳＡ）を用いて、２６，０００ｒｐｍ、２０℃、１５時間遠心した。遠心後チューブの底部に２５Ｇの針で穴を空け、底部の液から１ｍｌずつ回収した。回収したゲノムＤＮＡを含むサンプルの一部を、サブマリン電気泳動糟を用い、０．５−０．６％アガロースゲル／ＴＡＥバッファー中で、２６Ｖ、２０時間電気泳動を行い、９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡを含む画分を把握した。マーカーとしてλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた。９−１６ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を含む画分にＴＥを２．５ｍｌ加えシュークロース濃度を下げた後，エタノール沈殿、リンスを行い、少量のＴＥに溶解した。【００９９】
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株のゲノムライブラリー作成のためのベクターとして、λＤＡＳＨ  ＩＩ（Stratagene製）を用いた。λＤＡＳＨ  ＩＩ／ＢａｍＨＩベクターとゲノムＤＮＡ断片のライゲーション反応はStratagene製のライゲーションキットを用いて、１２℃で一晩行った。反応後、反応液をGigaPack III Gold Packaging extractと反応させ、ゲノムＤＮＡが組み込まれたλベクターをファージ粒子に取り込ませた。ファージ液は５００μｌのＳＭバッファーと２０μｌのクロロホルム中で４℃保管した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｐ２）（Stratagene製）をＬＢＭＭ（ＬＢ＋０．２％マルトース＋１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4）中でＡ600＝０．５になるまで培養し、この培養液２００μｌに、適量のファージ溶液を加え、３７℃で１５分間培養した。ここへ４８℃で保温したＮＺＹトップアガロースを４ｍｌ加え、混合し、ＮＺＹアガープレート（直径９ｃｍのプラスチックシャーレ）にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩培養し、プラーク数を数え、ｔｉｔｅｒを計算したところ、ライブラリーサイズは約３０万ｐｆｕ（plaque forming unit）と算出された。
（２）プライマー設計とプローブ作成
Procise 494 cLC Protein Sequencing System（Applied Biosystems製）を用いて、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ末端（Ｎ末端）アミノ酸配列、および内部アミノ酸配列を決定した。【０１００】
Ｎ末端アミノ酸配列の決定は、次のようにして行った。当該シアル酸転移酵素を５／２０％グラジエントゲル（ＡＴＴＯ製）にてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、当該酵素をＰＶＤＦ膜に吸着させ、アミノ酸配列分析装置により、アミノ末端側１０個のアミノ酸の配列を決定した。その結果、当該酵素のＮ末端アミノ酸配列はＸＮＳＤＳＫＨＮＮＳ（配列番号４）であった。【０１０１】
また、内部アミノ酸配列の決定は、次のようにして行った。当該シアル酸転移酵素を５／２０％グラジエントゲル（ＡＴＴＯ製）にてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルを染色した後、目的のバンドを切り出し、リジルエンドペプチダーゼを含むトリスバッファー（ｐＨ８．５）を加え、３５℃、２０時間の処理を行った。その後、溶液の全量を逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８  ３．５μｍ）に供して、断片ペプチドを分離した。アミノ酸配列分析装置により、当該酵素の内部アミノ酸配列は、ＳＬＤＳＭＩＬＴＮＥＩＫ（配列番号５）、ＦＹＮＦＴＧＦＮＰＥ（配列番号６）およびＧＨＰＳＡＴＹＮＱＱＩＩＤＡＨＮＭＩＥＩＹ（配列番号７）を有することが明らかとなった。【０１０２】
上記のように決定されたフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７由来α２，３−シアル酸転移酵素の部分アミノ酸配列、即ちＮ末アミノ酸配列：ＸＮＳＤＳＫＨＮＮＳ（配列番号４）と、三箇所の内部アミノ酸配列のうち、二箇所の内部アミノ酸配列：ＦＹＮＦＴＧＦＮＰＥ（配列番号６）およびＧＨＰＳＡＴＹＮＱＱＩＩＤＡＨＮＭＩＥＩＹ（配列番号７）を基に以下のｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーを設計、合成した。即ち、Ｎ末端のアミノ酸配列：ＸＮＳＤＳＫＨＮＮＳ（配列番号４）から、下記の表３に示す３本のプライマー（Ｉはイノシン）を合成した。【０１０３】
【表３】
0004856636.tif 000004
【０１０４】
また、内部アミノ酸配列：ＧＨＰＳＡＴＹＮＱＱＩＩＤＡＨＮＭＩＥＩＹ（配列番号７）から下記の表４に示す４本のプライマーを合成した。【０１０５】
【表４】
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【０１０６】
さらに、内部アミノ酸配列：ＦＹＮＦＴＧＦＮＰＥ（配列番号６）から下記の表５に示す２本のプライマーを合成した。【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
これらのプライマーを用いて、上記（１）で抽出・精製したＪＴ−ＩＳＨ−４６７株のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとなるＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分長ＤＮＡを増幅した。プライマー組み合わせは、Ｎ末端配列由来の３本のプライマーのそれぞれと、４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２）、４６７ｉｎ１ＦＷ２（配列番号１４）もしくは４６７ｉｎ２ＦＷ（配列番号１６）の９つの組み合わせ、４６７ｉｎ１ＲＶ（配列番号１１）もしくは４６７ｉｎ１ＲＶ２（配列番号１３）と４６７ｉｎ２ＦＷ（配列番号１６）の２つの組み合わせ、さらに４６７ｉｎ２ＲＶ（配列番号１５）と４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２）もしくは４６７ｉｎ１ＦＷ２（配列番号１４）の２つの組み合わせの、総計１３組み合わせである。ＰＣＲ反応は以下のように行った。５０μｌの反応液中に、ゲノムＤＮＡ  ２５０ｎｇ、１０(  Ｅｘ  ｔａｑバッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰｓ  ４μｌ，プライマーをそれぞれの配列について５ｐｍｏｌｅ，Ｅｘ  ｔａｑ（タカラバイオ製）０．５μｌ、をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ社）を用いて、９６℃  ３分を１回、９６℃  １分、５０℃  １分、７２℃  ２分を４０回、７２℃  ６分を１回行った。その結果、９つのプライマー組み合わせ（４６７Ｎ−ＲＶ（配列番号８）と４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２）、４６７Ｎ−ＲＶ（配列番号８）と４６７ｉｎ２ＦＷ（配列番号１６）、４６７ｉｎ１ＲＶ（配列番号１１）と４６７ｉｎ２ＦＷ（配列番号１６）、４６７ｉｎ２ＲＶ（配列番号１５）と４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２）の組み合わせ以外の９つ）において、ＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物のうち、特異的かつ高い増幅効率の得られた組み合わせ（４６７Ｎ−ＲＶ３（配列番号１０）と４６７ｉｎ１ＦＷ（配列番号１２））由来のＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Invitrogen製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition（引用によりその全体を本明細書に援用する））に従いプラスミドＤＮＡを抽出した。このクローンに関して、Ｍ１３プライマー（タカラバイオ製）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer製）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定した。【０１０９】
決定されたＤＮＡ塩基配列（９２９ｂｐ：配列番号１７）に関して、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅＢａｎｋデータベースに対して、ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索を行った。その結果、有意な相同性を示すＤＮＡ配列は検出されなかった。これは本発明によって明らかにされた、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のＤＮＡ塩基配列が新規な配列であることを意味する。次に、この塩基配列をアミノ酸に翻訳して、再度ＢＬＡＳＴサーチをかけたところ、フォトバクテリウム・ダムセラ（Photobacterium damselae）のα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と３０％の相同性、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株（Pasteurella multocida subsp. multocida）Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質  ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）と２６％の相同性、へモフィルス・デュクレイ（Haemophilus ducreyi）３５０００ＨＰ株の仮定上のタンパク質  ＨＤ００５３（ＡＡＰ９５０６８）と２１％の相同性が検出された。さらに、翻訳されたアミノ酸配列は、上記の精製酵素から直接決定された内部アミノ酸配列：ＦＹＮＦＴＧＦＮＰＥ（配列番号６）とＳＬＤＳＭＩＬＴＮＡＩＫ（配列番号５）の全体を含み、Ｎ末アミノ酸配列：ＸＮＳＤＳＫＨＮＮＳ（配列番号４）と、内部アミノ酸配列：ＧＨＰＳＡＴＹＮＱＱＩＩＤＡＨＮＭＩＥＩＹ（配列番号７）の一部を含んでいた。以上の結果から、クローニングされたＤＮＡは、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の一部であり、かつ本発明のフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列は、既報配列と３０％程度しか相同性を示さない新規なアミノ酸配列であることが明らかとなった。
（３）スクリーニングと遺伝子クローニング
上記（２）でクローン化されたフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクターから制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、これをプローブとして、上記（１）作製したフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。直径９ｃｍの丸形シャーレにλＤＡＳＨ  ＩＩ／ＢａｍＨＩ  ベクターキット（Stratagene製）の説明書きに従って、約３００−５００ｐｆｕのファージを宿主菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｐ２）とともにプレーティングした。プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行いＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。プローブはrediprime IITM DNA labelling system（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて32Ｐラベルした。ハイブリダイゼーションは０．５Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．２、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で６５(Ｃで一晩、洗浄の条件は４０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ中で６５℃、１５分を２回、４０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ  ７．２、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で６５(Ｃ、１５分を２回行った。１次スクリーニングで約５，０００ｐｆｕのファージから２４個のポジティブクローンが得られた。うち１８個のクローンに関して、プラークの精製を兼ねた２次スクリーニングを行った。その結果、６種類の選抜・精製プラークを得ることが出来た。【０１１０】
これらのプラークを回収し、それぞれ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｐ２）とともに、一枚数万ｐｆｕとなるようにＮＺＹプレートにプレーティングし、一晩３７℃で保温した。プラークが一面に出ている６枚のプレートにＳＭバッファーを４ｍｌづつ注ぎ、４℃で一晩静置した。パスツールピペットで、ファージプレートライセートを回収し、QIAGEN Lambda Mini Kit（キアゲン製）で、λＤＮＡを抽出、精製した。これら６種類のλＤＮＡ、および（１）で精製したＪＴ−ＩＳＨ−４６７株の全ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ  ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記の９２９ｂｐのプローブ（配列番号１７）を用いて、上述のようにサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＥｃｏＲＩ消化では、９ｋｂまたはそれ以上のバンドが検出された。一方、ＨｉｎｄＩＩＩ消化の場合、全てのλＤＮＡ、ゲノムＤＮＡともに４．６ｋｂのバンドが検出された。そこで、λＤＮＡを再度ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、４．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を回収し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に、常法に従いクローニングした。【０１１１】
次に、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の全塩基配列を決定するため、同遺伝子の部分ＤＮＡ配列（上述、９２９ｂｐ：配列番号１７）を基に以下の表６に示すプライマーを合成した。【０１１２】
【表６】
0004856636.tif 000007
【０１１３】
これらのプライマーを用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer製）で、４．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片の内部塩基配列を解析し、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の内部、およびその近傍の塩基配列を解析した。その結果、配列表の配列番号１の配列を得た。この配列は、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全塩基配列である。最初のＡＴＧの上流には同じ読み枠で、翻訳終止コドンが現れるのでこれが、本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。【０１１４】
フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のＯＲＦは、１２３０塩基からなり、４０９個アミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。このアミノ酸配列は、精製酵素から決定された４箇所のアミノ酸配列全てを完全に含む。Ｎ末のアミノ酸配列の一文字目が解読されていなかったが、遺伝子から演繹されるこの部分のアミノ酸はＣｙｓ（システイン）であった。また成熟タンパクのＮ末端は、配列表の配列番号２の配列のうちの第２２番目のＣｙｓであることから、初めの２１アミノ酸からなる配列は、フォトバクテリウム・フォスフォレウムにおいてはプロセッシングを受け、除去されると考えられた。遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）を用いて、本発明のフォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質全長、およびその遺伝子全長と、それらのホモローグの全長同士の相同性を解析したところ、アミノ酸配列では、フォトバクテリウム・ダムセラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と３２％の相同性、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）と２８％の相同性を有し、そして、遺伝子ＤＮＡ配列ではそれぞれと、５３％、５１％の相同性を有していた。
（４）発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。【０１１５】
フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７で解析を行ったところ、Ｎ末端の２４アミノ酸が、シグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長（本実施例において４６７−Ｎ０Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマー  ４６７−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉ（配列番号２７）および４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｂｍ（配列番号２６）、さらにシグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子（本実施例において４６７−Ｎ２Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマー  ４６７−２３ＳＴ−Ｎ２−Ｎｃｏ（配列番号２５）および４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｂｍ（配列番号２６）を設計、合成した（表７）。【０１１６】
【表７】
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【０１１７】
クローニング用にプライマーに予め組み込んだ制限酵素ＰｃｉＩ（４６７−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉ）、ＮｃｏＩ（４６７−２３ＳＴ−Ｎ２−Ｎｃｏ）、ＢａｍＨＩ（４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｂｍ）部位を下線で示した。翻訳開始コドンＡＴＧ、翻訳終止コドンに対応する相補配列ＴＡＡを四角で囲んだ。さらに、プライマー配列のうち、制限酵素部位より３’側で、鋳型ＤＮＡとアニーリングする部分の配列を太字で示した。ＰＣＲ時の鋳型ＤＮＡは、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子全長を含む上記ＨｉｎｄＩＩＩ  ４．６ｋｂ断片が組み込まれたプラスミドを用いた。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型ＤＮＡ  １００ｎｇ、１０×  Ｅｘ  ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ  ４μｌ、プライマー  ５０ｐｍｏｌｅ、Ｅｘ  ｔａｑ（タカラバイオ製）  ０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ製）を用いて、９６℃  ３分を１回、９６℃  １分、５０℃  １分、７２℃  ２分を１５回、７２℃  ６分を１回行った。その結果、４６７−Ｎ０Ｃ０でおよそ１．２ｋｂ、４６７−Ｎ２Ｃ０でおよそ１．１ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物のうち、４６７−Ｎ０Ｃ０を制限酵素ＰｃｉＩ（New England Biolab製）とＢａｍＨＩ（タカラバイオ製）で二重消化し、そして、４６７−Ｎ２Ｃ０を制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ製）とＢａｍＨＩで二重消化した後、ゲル精製した。大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia LKB製）を用いた。このベクターを同じ制限酵素ＰｃｉＩとＢａｍＨＩ、または制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで二重消化しゲル精製したものを、制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物とTakara Ligation Kit（タカラバイオ製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＴＢ１にトランスフェクトした。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析し、インサートの組み込みを確認した。ＰＣＲ反応による塩基の変化を調べるため、４６７−Ｎ０Ｃ０では二つのクローンを、４６７−Ｎ２Ｃ０では３つのクローンの全塩基配列を決定した。その結果、４６７−Ｎ０Ｃ０においては一つのクローン（ＩＳＨ４６７−Ｎ０Ｃ０第一クローン）で配列番号１の塩基配列のうち、第５６９番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に変化し、これによりコドンがＡＡＣからＡＧＣに変化し、配列番号２のアミノ酸配列のうち第１９０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）がセリン（Ｓｅｒ）に変化していた。ＡｓｎとＳｅｒは同じ極性アミノ酸である。一方、もう一つのクローン（ＩＳＨ４６７−Ｎ０Ｃ０第二クローン）では塩基の変化は一つも無く、配列番号１の塩基配列が確認された。次に３つの４６７−Ｎ２Ｃ０クローンの全塩基配列を決定した。その結果、第一および第二クローンの２つにアミノ酸置換を伴う塩基の変異が見つかった。即ち、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第一クローンでは、配列番号１の塩基配列の４７６番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に変異しており、これによりコドンがＴＴＴからＴＣＴに変わり、１５９番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換されていた。ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第二クロー��では、配列番号１の塩基配列の７８番目のチミン（Ｔ）が欠失し、これにより、フレームシフトが起き、正しいタンパク質が翻訳されない。一方、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローンでは、変異は検出されず、配列番号１のうち第７３番目の塩基から第１２３０番目の塩基までの配列そのものを含んでいた。
（５）発現誘導と活性測定
上記（４）で得られた４６７−Ｎ０Ｃ０の２クローン、４６７−Ｎ２Ｃ０の３クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行った。各クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００mｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、Ａ６００＝０．５程度になるまで３０℃で菌を前培養し、その後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、３０℃でさらに４時間振とう培養した。培養液２ｍｌ中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、２００μｌの０．３３６％トリトンＸ−１００および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  ビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、活性測定に供試した。反応は２反復で行い、反応組成は実施例１と同様に行った。但し、反応時間は１５時間とした。その結果、下記の表８に示すように、ＩＳＨ４６７−Ｎ０Ｃ０第一クローンの粗酵素液中およびＩＳＨ４６７−Ｎ０Ｃ０第二クローンの粗酵素液中には、糖供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ中の１４ＣでラベルされたＮｅｕＡｃを糖受容体基質であるラクトースに転移する因子、即ちシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。また、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第一クローンおよびＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローンの粗酵素液中にもシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。一方、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第二クローンの粗酵素液中および粗酵素液なしの反応液中にはシアル酸転移酵素活性が含まれていなかった。以上の結果から、ＩＳＨ４６７−Ｎ０Ｃ０第一クローンもしくは第二クローン、または、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第一クローンもしくは第三クローンを導入した大腸菌にはシアル酸転移酵素が発現されていることが明らかとなった。
【０１１８】
【表８】
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【０１１９】
（６）α−２，３シアル酸転移活性の確認
上記（５）の粗酵素液を用いて、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第一クローンを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がα−２，３シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。実施例３と同様に、糖受容体としてピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ社製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０２６）を用い、酵素反応を行った。反応終了後、９５℃で５分間、反応溶液を熱処理することにより酵素を失活させ、ＨＰＬＣで分析した。なお、酵素反応は、ピリジルアミノ化ラクトースが２．０μＭ、ＣＭＰ−シアル酸が５．７μＭとなるように、それぞれを２０ｍＭ  カコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）２５μｌ中に溶解し、２５℃下で６時間行った（反応１）。一方、ＣＭＰ−シアル酸を含まない反応液を供試した対照実験（反応２）を行った。また、標品の保持時間を明らかにするため、熱処理（９５℃、５分間）によって失活させた粗酵素液を加え、ピリジルアミノ化ラクトースおよびピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトース（ピリジルアミノ化３’−シアリルラクトース）（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０２９）を添加した試験を行った。【０１２０】
標品の分析結果（図１−１）から、ピリジルアミノ化ラクトースの保持時間は４．１分、ピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトース（ピリジルアミノ化３’−シアリルラクトース）の保持時間は５．４分であることが示された。これにより反応２（図１−３）では検出されない保持時間５．３分のピーク（図１−２）がピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトース（ピリジルアミノ化３’−シアリルラクトース）であることが明らかとなった。すなわち、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第一クローンを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がα−２，３シアル酸転移活性を有することが証明された。【０１２１】
また、同様にＩＳＨ４６７−Ｎ０Ｃ０第一クローンおよび第二クローン、ならびにＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローンについても、当該クローンを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がα−２，３シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。その結果、大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応において、いずれのクローンについても反応生成物としてピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトース（ピリジルアミノ化３’−シアリルラクトース）のピークが検出された。よって、これらの酵素がα−２，３シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。
実施例６：  フォトバクテリウム属細菌ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと、塩基配列解析および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性と同酵素遺伝子の存在の確認
実施例１でシアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったフォトバクテリウム属ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株において、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在するか否かを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。実施例５の（１）に記載した方法で、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の菌体ペレットからゲノムＤＮＡを調製した。次に実施例５の（３）に記載した方法により、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ  ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記のＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブとして用いて、実施例５の（３）に記載した方法でサザンハイブリダイゼーションを行った。ただしハイブリダイゼーション温度、および洗浄処理の温度は、５５℃とした。その結果、ＥｃｏＲＩ消化では、１６ｋｂのバンドが検出された。一方、ＨｉｎｄＩＩＩ消化の場合、５ｋｂと２．７ｋｂのバンドが検出された。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株にはＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明らかとなった。
（２）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニング
次に、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングを行った。実施例５の（１）に記載した方法により、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムＤＮＡから、λＤＡＳＨ  ＩＩ（Stratagene製）を用いて、ゲノムライブラリーを構築した。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。ただし、実施例６の（１）と同様にハイブリダイゼーション、および洗浄の温度は５５℃とした。その結果、プラーク精製を兼ねた二次選抜までに、１２クローンを得、うち６つのλＤＮＡを、実施例５の（３）のようにQIAGEN Lambda Mini Kit（キアゲン製）を用いて精製した。さらにこのうち３クローンのλＤＮＡサンプル、およびＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の全ゲノムＤＮＡについて、制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動で分画し、上述の様にナイロンメンブレンフィルターに転写した。このフィルターを用いて、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、サザン分析を行った。ハイブリダイゼーション、洗浄の温度は５５℃とした。その結果、ＥｃｏＲＩ消化の場合、１２ｋｂまたはそれ以上のバンドが検出されたのに対し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化の場合は、３つ全てのλＤＮＡサンプルとＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の全ゲノムＤＮＡに関して、５ｋｂと２．７ｋｂの二本のバンドが検出された。そこでλＤＮＡサンプルを再度ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これら５ｋｂと２．７ｋｂの二本のＤＮＡ断片をゲル精製し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に常法に従いクローニングした。【０１２２】
次に、これらのクローンに関して、Ｍ１３プライマー（タカラバイオ製）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片と２．７ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片の両端の塩基配列を決定した。その結果、５ｋｂ断片の片側のＤＮＡ配列、および２．７ｋｂの片側のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列が、データベース検索の結果ともに、シアル酸転移酵素と相同性を示した。ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株の同酵素の遺伝子のＤＮＡを完全に決定するため、ＨｉｎｄＩＩＩ  ２．７ｋｂ断片から得られたＤＮＡ配列を基に、下記の表９のプライマーを合成し、塩基配列決定に用いた。【０１２３】
【表９】
0004856636.tif 000010
【０１２４】
その結果、配列表の配列番号２８の配列を得た。この配列は、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全塩基配列である。最初のＡＴＧの上流には同じ読み枠で翻訳終止コドンが現れるので、これが本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。フォトバクテリウム属  ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のＯＲＦは、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のそれと同様に、１２３０塩基からなり、４０９個のアミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号２９に示す。遺伝子内部にはＨｉｎｄＩＩＩ部位を有していた。ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７を用いて核酸、およびアミノ酸配列の解析を行ったところ、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子は、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子と９２％の相同性を有していた。またアミノ酸配列でも、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素と９２％の相同性を示した。さらに、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列は、フォトバクテリウム・ダムセラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と３３％の相同性、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）と２９％の相同性を示し、遺伝子ＤＮＡ配列ではそれぞれと、５４％、５０％という相同性であった。【０１２５】
（３）発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。【０１２６】
ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７で解析を行ったところ、Ｎ末端の２４アミノ酸が、シグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長（本実施例において２２４−Ｎ０Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマー２２４−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉ（配列番号３５）、２２４−２３ＳＴ−Ｃ０ｎｅｗ−Ｂｍ（配列番号３７）、さらにシグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子（本実施例において２２４−Ｎ１Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマー２２４−２３ＳＴ−Ｎ１−Ｎｃｏ（配列番号３６）、２２４−２３ＳＴ−Ｃ０ｎｅｗ−Ｂｍ（配列番号３７）を設計、合成した（表１０）。【０１２７】
【表１０】
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【０１２８】
クローニング用にプライマーに予め組み込んだ制限酵素ＰｃｉＩ（２２４−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉ）、ＮｃｏＩ（２２４−２３ＳＴ−Ｎ１−Ｎｃｏ）、ＢａｍＨＩ（２２４−２３ＳＴ−Ｃ０ｎｅｗ−Ｂｍ）部位を下線で示した。翻訳開始コドンＡＴＧ、および翻訳終止コドンに対応する相補配列ＴＡＡを四角で囲んだ。さらに、プライマー配列のうち、鋳型ＤＮＡとアニーリングする部分の配列を太字で示した。プライマー２２４−２３ＳＴ−Ｎ０−Ｐｃｉの場合、後のクローニング用にＰｃｉＩ部位を導入したことで、翻訳開始コドンＡＴＧ直後のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換される。このため、翻訳開始メチオニンの直後のアミノ酸配列がロイシン（Ｌｅｕ）からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換される。ＬｅｕとＰｈｅは同じ疎水性のアミノ酸であること、この部分はシグナルペプチド領域であることから、この変異によって酵素活性に大きな変化をもたらす可能性は低いと判断した。【０１２９】
続いてＰＣＲを行い、発現ベクターに組み込むためのＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を増幅した。鋳型ＤＮＡは、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を含む上記λＤＮＡを用いた。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型ＤＮＡ  １００ｎｇ、１０×  Ｅｘ  ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ  ４μｌ、プライマー  ５０ｐｍｏｌｅ、Ｅｘ  ｔａｑ（タカラバイオ製）０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００(ASTEK製）を用いて、９６℃  ３分を１回、９６℃  １分、５０℃  １分、７２℃  ２分を１５回、７２℃  ６分を１回行った。その結果、２２４−Ｎ０Ｃ０でおよそ１．２ｋｂ、そして２２４−Ｎ１Ｃ０でおよそ１．１ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物を、制限酵素ＰｃｉＩ（New England Biolab社製）とＢａｍＨＩ（２２４−Ｎ０Ｃ０の場合）、または制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ（２２４−Ｎ１Ｃ０の場合）で二重消化した後、ゲル精製した。大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａを用いた。このベクターを同じ制限酵素ＰｃｉＩとＢａｍＨＩ（２２４−Ｎ０Ｃ０を導入する場合）、または制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ（２２４−Ｎ１Ｃ０を導入する場合）で二重消化しゲル精製したものを、制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物とTakara Ligation Kit（タカラバイオ製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＴＢ１にトランスフェクトした。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析して、インサートの組み込みを確認し、そして２２４−Ｎ０Ｃ０（ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０第一クローン）、ならびに２２４−Ｎ１Ｃ０（ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローン）の全塩基配列を確認した。その結果、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０第一クローンにおいては、上述のＬｅｕからＰｈｅへの置換が確認されたが、それ以外は塩基配列の変異はなかった。同様にＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローンの場合は、塩基配列の変異はなく、所望の塩基配列、即ち配列表の配列番号２８のうち、第７３番目の塩基から第１２３０番目の塩基までを含んでいた。
（４）発現誘導と活性測定
実施例５（５）と同様に、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０第一クローンおよびＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローンの２クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行い、酵素活性を測定した。その結果、下記の表１１に示すように、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０第一クローンおよびＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローンの粗酵素液中にシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。【０１３０】
【表１１】
0004856636.tif 000012
【０１３１】
（５）α−２，３シアル酸転移酵素活性の確認
実施例５（６）と同様に、ＩＳＨ２２４−Ｎ０Ｃ０第一クローンおよびＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローンをそれぞれ大腸菌に導入して酵素を発現させ、ピリジルアミノ化ラクトースを糖受容体として用いる反応により、α−２，３シアル酸転移酵素活性を調べた。大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応生成物をＨＰＬＣにより評価した結果、いずれのクローンを用いた反応についてもピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトース（ピリジルアミノ化３’−シアリルラクトース）のピークが検出された。この結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来のシアル酸転移酵素がα−２，３シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。
実施例７：  ビブリオ属細菌ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと塩基配列解析、および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性と同酵素遺伝子の存在の確認
実施例１でシアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったビブリオ属  ＪＴ−ＦＡＪ−１６株において、フォトバクテリウム・フォスフォレウム  ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在するか否かを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。実施例５の（１）に記載した方法で、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株の菌体ペレットからゲノムＤＮＡを調製した。次に実施例５の（３）に記載した通り、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画後、０．４Ｍ  ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングにより、ゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記の９２９ｂｐのプローブ（配列番号１７）を用いて、実施例５の（３）に記載した方法でサザンハイブリダイゼーションを行った。ただしハイブリダイゼーション温度、および洗浄処理の温度は、５５℃とした。その結果、ＥｃｏＲＩ消化で、３．６ｋｂのバンドが、ＨｉｎｄＩＩＩ消化で、７ｋｂのバンドが検出された。即ちＪＴ−ＦＡＪ−１６株にはＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明らかとなった。【０１３２】
（２）ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニング
次に、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングを行った。実施例５の（１）に記載した方法で、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のゲノムＤＮＡから、λＤＡＳＨ  ＩＩ（Stratagene製）を用いて、ゲノムライブラリーを構築した。ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。ただし、ハイブリダイゼーション実験はECL direct labelling & detection system（アマシャムバイオサイエンス製）を使用した。キット添付の説明書きに従ってプローブを作成した。ハイブリダイゼーションは、キット中のハイブリダイゼーションバッファーにブロッキング試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、３７℃で４時間行った。洗浄は、０．４％ＳＤＳ、０．５Ｘ  ＳＳＣ中で、５０℃で２０分を２回、２Ｘ  ＳＳＣ中で室温、５分を１回行った。シグナルの検出は、キット添付の説明書きに従った。【０１３３】
その結果、プラーク精製を兼ねた一次選抜で、１２クローンを得、うち６つのλＤＮＡを、実施例５の（３）のようにQIAGEN Lambda Mini Kit（キアゲン製）を用いて精製した。さらにこれらのλＤＮＡサンプル、およびＪＴ−ＦＡＪ−１６株の全ゲノムＤＮＡに関して、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動で分画し、上述の様にナイロンメンブレンフィルターに転写した。このフィルターを用いて、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（９２９ｂｐ；配列番号１７）をプローブに用い、ＥＣＬシステムを用いて、上述と同じ条件でサザン分析を行った。その結果、６つ全てのλＤＮＡサンプルとＪＴ−ＦＡＪ−１６株の全ゲノムＤＮＡについて、３．６ｋｂのバンドが検出された。そこでλＤＮＡサンプルを再度ＥｃｏＲＩで消化し、この３．６ｋｂのＤＮＡ断片をゲル精製し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩ部位に常法に従いクローニングした。【０１３４】
次に、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を含むと考えられたＥｃｏＲＩ  ３．６ｋｂ断片に関して、Ｍ１３プライマー（タカラバイオ製）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer，Perkin Elmer製）で、両端の塩基配列を決定した。その結果、片側の端のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列が、データベース検索でフォトバクテリウム・ダムセラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と２７％の相同性を示した。ＪＴ−ＦＡＪ−１６株のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子の全塩基配列を完全に決定するため、ＥｃｏＲＩ  ３．６ｋｂ断片から得られたＤＮＡ配列を基に、下記の表１２に記載のプライマーを合成し、塩基配列決定に用いた。【０１３５】
【表１２】
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【０１３６】
得られた塩基配列データからさらに以下の表１３に記載のプライマーを設計、合成し、全塩基配列の決定を行った。【０１３７】
【表１３】
0004856636.tif 000014
【０１３８】
その結果、配列表の配列番号３０の配列を得た。この配列は、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全塩基配列である。最初のＡＴＧの上流には同じ読み枠で翻訳終止コドンが現れるので、これが本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子のＯＲＦは、１２０９塩基からなり、４０２個アミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号３１に示す。ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７を用いて核酸、およびアミノ酸配列の解析を行ったところ、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子は、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株およびＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子と、それぞれ６９．７％および６８％の相同性を有していた。またアミノ酸配列でも、それぞれ、６４．７％および６４．８％の相同性を示した。さらに、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列は、フォトバクテリウム・ダムセラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と３０．５％の相同性、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質  ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）と２７．３％の相同性を示し、遺伝子ＤＮＡ配列ではそれぞれと、５１．２％、４８．３％という相同性であった。【０１３９】
（３）発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、およびＮ末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。【０１４０】
ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７で解析を行ったところ、Ｎ末端の２２アミノ酸が、シグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長（本実施例においてＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマーＦＡＪ２３ＳＴＮ０−ＢｓｐＨＩ（配列番号４３）、ＦＡＪ２３ＳＴＣ０−ＢａｍＨＩ（配列番号４５）、さらにシグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子（本実施例においてＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマーＦＡＪ２３ＳＴＮ１−ＢｓｐＨＩ（配列番号４４）、ＦＡＪ２３ＳＴＣ０−ＢａｍＨＩ（配列番号４５）を設計、合成した（表１４）。【０１４１】
【表１４】
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【０１４２】
クローニング用にプライマーに予め組み込んだ制限酵素ＢｓｐＨＩ（ＦＡＪ２３ＳＴＮ０−ＢｓｐＨＩ、ＦＡＪ２３ＳＴＮ１−ＢｓｐＨＩ）、ＢａｍＨＩ（ＦＡＪ２３ＳＴＣ０−ＢａｍＨＩ）部位を下線で示した。翻訳開始コドンＡＴＧ、翻訳終止コドンに対応する相補配列ＴＡＡを四角で囲んだ。さらに、プライマー配列のうち、鋳型ＤＮＡとアニーリングする部分の配列を太字で示した。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現ベクターに組み込むためのＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を増幅した。鋳型ＤＮＡは、同遺伝子を含む上記３．６ｋｂのＤＮＡ断片を用いた。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型ＤＮＡ  ３００ｎｇ、１０×  Ｅｘ  ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ  ４μｌ、プライマー  ５０ｐｍｏｌｅ、Ｅｘ  ｔａｑ（タカラバイオ製）  ０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ製）を用いて、９６℃  ３分を１回、９６℃  １分、５０℃  １分、７２℃  ２分を１０回、７２℃  ６分を１回行った。その結果、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０でおよそ１．２ｋｂ、ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０でおよそ１．１ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物を、ＴＡクローニング用ベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Invitrogen製）に、ＴＡクローニングキット（Invitrogen製）に添付された説明書に従って、クローニングした。大腸菌はＴＢ１を使用した。得られたコロニーから常法でプラスミドを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩでＰＣＲ産物のベクターへの導入を確認した。導入の確認されたプラスミドサンプルを、制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで二重消化した後、１．２ｋｂ（ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０）または１．１ｋｂ（ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０）断片をゲル精製した。これらのＤＮＡサンプルを、予め制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで二重消化した大腸菌発現用ベクターｐＴｒｃ９９Ａに、Takara Ligation Kit（タカラバイオ製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＴＢ１に組み込んだ。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析を行いインサートの組み込みを確認し、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０の代表クローン１つ（ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０第一クローン）ならびにＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０の代表クローン２つ（ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンおよびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第二クローン）の全塩基配列を確認した。その結果、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０第一クローンの場合、塩基配列の変異はなく、所望の塩基配列、即ち、配列表の配列番号３０のうち、第１番目の塩基から第１２０９番目の塩基までを含んでいた。一方、ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０の場合、その第一クローンには塩基配列の変異はなく、所望の塩基配列、即ち、配列表の配列番号３０うち、第６７番目の塩基から第１２０９番目の塩基までを含んでいた。第二クローンでは、配列番号３０の塩基のうち、第６３１番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に変化していた。これによりコドンがＡＣＡからＧＣＡに変化し、アミノ酸がスレオニン（Ｔｈｒ）からアラニン（Ａｌａ）に変化していた。これ以外には塩基置換は存在しなかった。【０１４３】
（４）発現誘導と活性測定
実施例５（５）と同様に、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０第一クローン、ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンおよび第二クローンの３クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行い、酵素活性を測定した。その結果、下記の表１５に示すように、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０第一クローンならびにＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンおよび第二クローンの粗酵素液中にシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。【０１４４】
【表１５】
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【０１４５】
（５）α−２，３シアル酸転移活性の確認
実施例５（６）と同様に、ＦＡＪ−Ｎ０Ｃ０第一クローン、ならびに、ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンおよび第二クローンの３クローンをそれぞれ大腸菌に導入して酵素を発現させ、ピリジルアミノ化ラクトースを糖受容体として用いる反応により、α−２，３シアル酸転移酵素活性を調べた。大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応生成物をＨＰＬＣにより分析した結果、いずれのクローンを用いた反応においてもピリジルアミノ化α２，３−シアリルラクトース（ピリジルアミノ化３’−シアリルラクトース）のピークが検出された。この結果から、ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来のシアル酸転移酵素がα−２，３シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。
実施例８：各種シアル酸転移酵素タンパク質のアミノ酸配列のマルチアライメント分析
遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス社製）を用いて、マルチアライメント分析を行った。その結果、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来、フォトバクテリウム属  ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来、およびビブリオ属  ＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来のα２，３−シアル酸転移酵素（それぞれ配列番号２、２９、３１）、フォトバクテリウム・ダムセラのα２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）、ならびに、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ株Ｐｍ７０の仮定上のタンパク質ＰＭ０１８８（ＡＡＫ０２２７２）は図２のようなアラインメントを示した。なお、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来α２，３−シアル酸転移酵素についての下線は精製タンパク質から決定されたアミノ酸配列を示す。
実施例９：β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の酵素活性の至適ｐＨおよび至適温度
調製した精製酵素を用い、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローン、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローン、およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンが生産する組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の至適ｐＨおよび至適温度を調べた。
（１）酵素活性の至適ｐＨ
酢酸バッファー（ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、およびｐＨ５．０）、カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、およびｐＨ７．０）、リン酸バッファー（ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、およびｐＨ８．０）、ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、およびｐＨ９．０）、ＣＨＥＳバッファー（ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、およびｐＨ１０．０）、ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１０．０、ｐＨ１０．５、およびｐＨ１１．０）を調製し、これを用いて２５℃で各ｐＨにおける酵素活性を測定した。【０１４６】
その結果、図３−１および図３−２に示すように、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素ではｐＨ５．０において、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローンではｐＨ５．５において、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローンではｐＨ５．０において、ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンではｐＨ５．５において、酵素活性が最大であった。そして、いずれの酵素でもｐＨ５．０〜ｐＨ７．０あるいはｐＨ９．０まで高い活性であった。なお、各ｐＨにおける酵素活性は最大活性を示したｐＨにおける酵素活性を１００とする相対活性で示した。
（２）酵素活性の至適温度
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素ではｐＨ５．０において、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローンではカコジル酸バッファー（ｐＨ５．５）を用いて、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローンではカコジル酸バッファー（ｐＨ５．０）を用いて、ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンではカコジル酸バッファー（ｐＨ５．５）を用いて、５℃から４５℃までの５℃毎の反応温度において、酵素活性を測定した。【０１４７】
その結果、図４−１および図４−２に示すように、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素では２５℃において、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローンでは２５℃において、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローンでは３０℃において、ＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンでは２０℃において、酵素活性が最大であった。そして、いずれの酵素でも１５℃あるいは２０℃〜３０℃あるいは３５℃まで高い活性であった。なお、温度における酵素活性は最大活性を示した温度における酵素活性を１００とする相対活性で示した。
実施例１０：β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の質量分析
フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素、ならびに、ＩＳＨ４６７−Ｎ０Ｃ０第二クローン、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローン、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローン、およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンが生産する組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の精製酵素を、レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置（株式会社島津製作所MALDI-TOFMS  AXIMA-CFR）によって質量分析した結果、分子量はそれぞれ４５，０２６Ｄａ、４５，０２３Ｄａ、４４，０７５Ｄａ、４３，９９６Ｄａ、および４３，９２１Ｄａであった。【０１４８】
ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローン、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローン、およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローンについては、質量分析の結果とアミノ酸配列から推定された分子量は一致した。しかしながら、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株が生産するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素、およびＩＳＨ４６７−Ｎ０Ｃ０第二クローンについては、質量分析の結果とアミノ酸配列から推定された分子量は一致しなかった。これは、これらの二つの酵素のアミノ酸配列にリポボックスと呼ばれる共通配列（Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ：配列番号２のアミノ酸残基１９〜２２）が含まれるため、細菌内で、この共通配列のＣｙｓのアミノ末端側で切断され、リポボックス中のＣｙｓに脂質が付加されたためとと考えられる（Madan Babu, M. and Sankaran, K., Bioinformatics., 18, 641-643 (2002)）。
実施例１１：組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の受容体基質特異性（単糖・二糖類・三糖類）の比較
（材料および方法）
ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローン組換え大腸菌、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローン組換え大腸菌、およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローン組換え大腸菌から調製した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドまで精製したβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を用いて、各種の単糖、二糖類および三糖類へのシアル酸の転移活性の有無を調べるために、以下の実験を行った。【０１４９】
各種の糖受容体基質を用いたシアル酸転移反応
反応溶液２４μｌ中に、糖供与体基質ＣＭＰ−１４Ｃ−ＮｅｕＡｃを含むＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（２１．９ｎｍｏｌ、反応溶液中での最終濃度：０．８７４ｍＭ）、２０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶解した各種糖受容体基質（１μｍｏｌ、反応溶液中での最終濃度：４２ｍＭ）、シアル酸転移酵素（酵素量は表脚注に示した）、ＮａＣｌ（反応溶液中での最終濃度：５００ｍＭ）からなる反応溶液を調製し、表脚注の条件で反応した。なお、糖受容体基質として用いた単糖は、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Man−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−マンノピラノシド（Man−β−OMe）、メチル−α−Ｌ−フコシノピラノシド（Fuc−α−OMe）、メチル−β−Ｌ−フコシノピラノシド（Fuc−β−OMe）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）の１０種類を用いた。二糖類として、ラクト−ス（Gal−β1,4−Glc）、Ｎ−アセチルラクトサミン（Gal−β1,4−GlcNAc）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニド（Gal−β1,3−GlcNAc−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α１，３−ガラクトピラノシド（Gal−α1,3−Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−ガラクトピラノシド（Gal−β1,3−Gal−β−OMe）の５種類を用いた。三糖類として、２’−フコシルラクト−ス（Fuc-α1,2-Galβ1,4-Glc ）の１種類を用いた。但し、表１８に示す糖鎖、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α１，３−ガラクトピラノシド（Gal−α1,3−Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β１，３−ガラクトピラノシド（Gal−β1,3−Gal−β−OMe）および２’−フコシルラクト−ス（Fuc-α1,2-Gal-β1,4-Glc）については最終濃度８．４ｍＭで反応させた。
【０１５０】
酵素反応終了後、反応溶液に１．９８ｍｌの５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）を添加して酵素反応を停止した。その後、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）で希釈した酵素反応溶液（２ｍｌ）を、ＡＧ１−×２Ｒｅｓｉｎ（ＰＯ43‐ フォーム、０．２×２ｃｍ）カラムに供した。このカラムは、ＡＧ１−×２Ｒｅｓｉｎ（ＯＨ‐ｆｏｒｍ、BIO-RAD社製）を１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）に懸濁し、３０分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液（０〜２ｍｌ）の放射活性を測定した。このカラムの溶出液には、反応で生じた14Ｃ−ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）が結合した反応生成物および未反応の糖受容体基質が含まれるが、未反応のＣＭＰ−14Ｃ−ＮｅｕＡｃはカラムに保持されたままである。従って、酵素反応の結果生じた各種シアル酸含有糖鎖由来の14Ｃの放射活性は、全て反応生成物由来であり、この画分の放射活性から酵素活性を算出することができる。【０１５１】
上記の方法を用いて、それぞれの糖受容体基質に転移されたＮｅｕＡｃの放射活性を測定して転移されたシアル酸を算出した。
（結果）
今回糖受容体基質として用いた１６種類の単糖、二糖、三糖のいずれにも高効率でシアル酸が転移していることが明らかとなった（表１６、表１７および表１８）。なお、各受容体基質に対する相対活性は、ラクトースに対するシアル酸転移活性を１００とした値である。【０１５２】
【表１６】
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【０１５３】
【表１７】
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【０１５４】
【表１８】
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【０１５５】
実施例１２：組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の糖タンパク質に対する受容体基質特異性
ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローン組換え大腸菌、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローン組換え大腸菌およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローン組換え大腸菌から調製した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドまで精製したβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を用いて、糖タンパク質へのシアル酸の転移活性の有無を調べるために、以下の実験を行った。【０１５６】
糖受容体基質として、アシアロフェツインを用いた。２ｍｇのアシアロフェツインを１ｍｌの２０ｍＭ  Bis-tris緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて、糖受容体基質溶液とした。糖供与体基質としてＣＭＰ−14Ｃ−ＮｅｕＡｃを含むＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを用いた。糖受容体基質溶液４０μｌ、糖供与体基質５μｌ（２２．８ｎｍｏｌ（約１９，０００ｃｐｍ））、酵素溶液５μｌ（いずれも１０ｍＵ）を混合して、２５℃、２時間インキュベートしてシアル酸転移反応を行った。反応終了後、反応溶液を０．１Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したセファデックスＧ−５０スーパーファイン（０．８ｘ１８．０ｃｍ）に供して、ゲルろ過を行った。糖タンパク質が含まれるゲルろ過の溶出液画分（２〜４ｍｌの画分）を集め、この画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定することで、糖受容体基質に転移したシアル酸の定量を行った。【０１５７】
その結果、表１９に示すように、いずれの酵素もアシアロフェツインにシアル酸を転移することが明らかとなった。【０１５８】
【表１９】
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【０１５９】
実施例１３：組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素のＰＡ糖鎖に対する受容体基質特異性
ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０第三クローン組換え大腸菌、ＩＳＨ２２４−Ｎ１Ｃ０第一クローン組換え大腸菌およびＦＡＪ−Ｎ１Ｃ０第一クローン組換え大腸菌から調製した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドまで精製したβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素を用いて、PA糖鎖へのシアル酸の転移活性の有無を調べるために、以下の実験を行った。【０１６０】
実施例３と同様に、糖受容体としてピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ社製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０２６）、ピリジルアミノ化GM1-pentasaccharide（Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc-PA、タカラバイオ社製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０３２）およびピリジルアミノ化GD1b-hexasaccharide（Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-8Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc-PA、タカラバイオ社製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０３４）を用い、表脚注の条件で、酵素反応を行った。反応終了後、９５℃で５分間、反応溶液を熱処理することにより酵素を失活させ、ＨＰＬＣで分析した。【０１６１】
その結果、ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０２６を受容体基質にした場合、いずれの酵素においても、ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０２９標品と同一溶出時間のピークが検出された。同様にして、ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０３２を受容体基質にした場合にはＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０３３標品と同一溶出時間のピークが、ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０３４を受容体基質にした場合、ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０３６標品と同一溶出時間のピークが、それぞれ検出された。従って、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来およびＪＴ−ＦＡＪ−１６株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素は、供試したＰＡ糖鎖の非還元末端にあるガラクトースに、シアル酸をα２，３結合で転移する活性を有することが明らかとなった。
。【０１６２】
【表２０】
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【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされてきている糖鎖の合成・生産手段を提供する。特に、シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つである。本発明の新規なシアル酸転移酵素は、糖鎖を応用した医薬品、機能性食品等の開発に利用することが可能である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【配列表】
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