(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩の水酸基に、１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を含有するリンカーを介してメトトレキサートが結合しており、該リンカーと該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩とがカルバメート基を形成して結合している、ヒアルロン酸−メトトレキサート結合体であって、
ペプチド鎖を含有するリンカーおよび当該リンカーに結合したメトトレキサートが、式（Ｉ’）または（ＩＩ’）：
【化１】
0005001645.tif 000022
【化２】
0005001645.tif 000023
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基であり；
Ｌは、式（Ｘ）
【化３】
0005001645.tif 000024
（式中、Ｑ１は結合する−ＮＨ−と一緒になって１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、ホルミル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、および置換されていてもよいＣ６−１０アリールスルホニル基からなる群から選択される１個以上の基により置換または保護されていてもよく、当該ペプチド鎖に含まれる各アミド結合は、独立に１個以上のＣ１−６アルキル基および／またはＣ１−６アルキルカルボニル基で窒素原子上を置換されていてもよく、当該残基に含まれる各カルボキシル基は、独立に１または２個のＣ１−６アルキル基で置換されていてもよいアミド基に変換されていてもよく；
Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に水素原子またはＣ１−６アルキル基であり；
Ｑ２はＣ２−２０アルキレンであり、当該アルキレンは１〜５個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび／またはカルボキシル基若しくはＣ１−６アルコキシカルボニル基で置換されていてもよく；
［ＨＡ］はヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の水酸基の位置を表し、リンカーと該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩とが該位置でカルバメート基により結合し；および
「−Ｏ−［ＨＡ］」中の酸素原子「−Ｏ−」は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の任意の位置における水酸基に由来する酸素原子を示す）で表されるリンカーである。］
で表される、ヒアルロン酸−メトトレキサート結合体。
【請求項２】
ヒアルロン酸のＮ−アセチルグルコサミン数に対するメトトレキサートの結合率が０．５％〜４．５％である、請求項１に記載のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体。
【請求項３】
ヒアルロン酸の分子量が６０万ダルトン以上である請求項１又は２に記載のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体を有効成分として含有する関節疾患治療薬。
【請求項６】
関節局所投与製剤である請求項５に記載の関節疾患治療薬。
【請求項７】
式（Ｖａ）または（Ｖｂ）：
【化４】
0005001645.tif 000025
【化５】
0005001645.tif 000026
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基であり；
Ｌ１は、式（Ｘ’）
【化６】
0005001645.tif 000027
または式（Ｘ’’）
【化７】
0005001645.tif 000028
（式中、Ｑ１は結合する−ＮＨ−と一緒になって１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、ホルミル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、および置換されていてもよいＣ６−１０アリールスルホニル基からなる群から選択される１個以上の基により置換または保護されていてもよく、当該ペプチド鎖に含まれる各アミド結合は、独立に１個以上のＣ１−６アルキル基および／またはＣ１−６アルキルカルボニル基で窒素原子上を置換されていてもよく、当該残基に含まれる各カルボキシル基は、独立に１または２個のＣ１−６アルキルで置換されていてもよいアミド基に変換されていてもよく；
Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に水素原子またはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ１３は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、カルボキシミド基、置換されていてもよいヘテロアリール基または置換されていてもよいＣ６―１８アリール基であり；
Ｑ２はＣ２−２０アルキレンであり、当該アルキレンは１〜５個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび／またはカルボキシル基若しくはＣ１−６アルコキシカルボニル基で置換されていてもよい。）である。］
の化合物またはその塩。
【請求項８】
式（Ｖａ）または（Ｖｂ）
【化８】
0005001645.tif 000029
【化９】
0005001645.tif 000030
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基であり；
Ｌ１は、式（Ｘ’）
【化１０】
0005001645.tif 000031
または式（Ｘ’’）
【化１１】
0005001645.tif 000032
（式中、Ｑ１は結合する−ＮＨ−と一緒になって１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、ホルミル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、および置換されていてもよいＣ６−１０アリールスルホニル基からなる群から選択される１個以上の基により置換または保護されていてもよく、当該ペプチド鎖に含まれる各アミド結合は、独立に１個以上のＣ１−６アルキル基および／またはＣ１−６アルキルカルボニル基で窒素原子上を置換されていてもよく、当該残基に含まれる各カルボキシル基は、独立に１または２個のＣ１−６アルキルで置換されていてもよいアミド基に変換されていてもよく；
Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に水素原子またはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ１３は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、カルボキシミド基、置換されていてもよいヘテロアリール基、または置換されていてもよいＣ６―１８アリール基であり；
Ｑ２はＣ２−２０アルキレンであり、当該アルキレンは１〜５個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび／またはカルボキシル基若しくはＣ１−６アルコキシカルボニル基で置換されていてもよい。）である。］
の化合物またはその塩を、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩と反応させ、当該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩の水酸基の位置でカルバメート基により式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物またはその塩を結合させる工程を含む、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩の水酸基に、１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を含有するリンカーを介してメトトレキサートが結合しており、該リンカーと該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩とがカルバメート基を形成して結合している、請求項１〜３のいずれか１項にヒアルロン酸−メトトレキサート結合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒアルロン酸−メトトレキサート結合体、及びその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症（以下、ＯＡとも称す）は加齢を基盤として発症する、いわゆる退行性疾患の一種である。高齢化社会の現在、患者数は増加の一途を辿っているが、未だ十分な診断法、治療法は確立されていない。ＯＡで最初に起こる病態変化は、加齢によるメカニカルストレスが引き金となった関節軟骨の変性と磨耗であると考えられている。この変化は極めてゆるやかな速度で進行し徐々に痛みへと進展する。【０００３】
現在のＯＡ薬物治療では、全身療法として、１）解熱鎮痛薬（アセトアミノフェン）、及び２）非ステロイド性抗炎症薬(以下、ＮＳＡＩＤｓとも称す)、局所療法（関節内注入）として、３）ヒアルロン酸（以下、ＨＡとも称す）製剤及び４）ステロイド製剤が使われている。従来、ＮＳＡＩＤｓをはじめとする全身療法を行っても関節局所の疼痛や腫脹が軽快しない場合、抗炎症作用が最も優れているステロイド製剤の関節内注入が行われてきた。しかし、ステロイド製剤は、関節注入症候群（ステロイド関節症）や全身性の副作用など安全性の面で問題がある。そのため、ステロイド製剤に代わる安全な関節内注入剤として、ＨＡ製剤の有用性が高まりつつある。【０００４】
ＨＡは、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸との繰り返し単位より構成される生体内多糖である。関節液を構成する主成分として関節液の粘弾性、荷重吸収作用および潤滑作用の保持に働いている。また、軟骨マトリックスにおいては、軟骨プロテオグリカンと結合してアグリカンと呼ばれる重合体を形成し、水分保持能と粘弾性の維持に中心的な役割を担っている。【０００５】
分子量約６０万ダルトン以上のＨＡおよびその架橋物を膝関節内に注入するとＯＡの疼痛が除去されることから、ＨＡ製剤はＯＡの治療法の一つとして広く用いられている。また、正常関節液中のＨＡの分子量に近い高分子量タイプのＨＡ製剤（商品名  スベニール（登録商標）、製造販売  中外製薬株式会社）は、日本において関節リウマチ（以下、ＲＡとも称す）に伴う膝の疼痛除去にも適用が認められている。なお、ＨＡの分子量は薬効の強さと相関があり、高分子量タイプのＨＡの方が、低分子量タイプのＨＡよりも持続性に優れ、より強い薬効を示すと言われている。【０００６】
一般に、ＨＡ製剤は、ＯＡ（または関節リウマチ（ＲＡ））の病態で損なわれた関節液の粘性と弾性を正常に戻すことにより疼痛除去していると考えられている。しかし、外部から加えたＨＡ製剤は関節液中から数日以内には消失してしまうにもかかわらず、効果は長期間持続するため、上記の関節液の粘弾性改善とは異なる機序で疼痛除去に働いている可能性も示唆されている。そのような機序の一つとして、後述のＯＡ滑膜炎に対する抑制作用が挙げられる。【０００７】
さて、ＯＡの痛みや炎症の発症メカニズムについては、未だ不明な点が多いが、最近では軟骨の変性によって二次的に引き起こされる滑膜炎との関連性が注目されている。ＯＡ滑膜炎は関節水症や熱感など疼痛、炎症症状の主たる原因となるのみならず、タンパク分解酵素、サイトカインやラジカルの産生を介して関節破壊をも促進するため、ＯＡの病態を進展させる主要な増悪因子と考えられている。また、ＯＡ滑膜炎は、ＲＡで見られるような著しい増殖性変化はないものの、滑膜細胞の増殖、血管新生と充血、滑膜下の浮腫および繊維化など、ＲＡ滑膜炎に共通した面も多く認められている。このように、ＯＡの疼痛や炎症をより効率よく除去し、病態の進展を防ぐという見地から、ＯＡ滑膜炎の制御は重要である。【０００８】
滑膜に対するＨＡの作用は未だ十分には解明されていないが、アイソトープを使った実験から、ＨＡは関節腔よりも滑膜に集積しより長期に存在することが知られている。また、滑膜組織を構成する滑膜細胞の表層には、ＨＡを認識するレセプター〔ＣＤ４４やＲＨＡＭＭ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＨＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）〕が存在し、滑膜細胞は表層のＣＤ４４を介して、分子量２００万以上のＨＡをも細胞内に取り込む機構を備えていることも報告されている。これらの知見から、ＨＡの疼痛除去作用の少なくとも一部は、滑膜への作用を介して発現している可能性が示唆されている。しかしながらＨＡ製剤は、ＯＡ滑膜炎で引き起こされる炎症症状そのものを抑制するまでの作用はなく、炎症症状の強いＯＡやＲＡに対する効果は決して十分ではない。【０００９】
一方、滑膜炎を制御する薬物としては、ＲＡの治療で用いられる修飾性抗リウマチ薬（以下、ＤＭＡＲＤとも称す）と呼ばれる薬物群が良く知られている。その中でも特にメトトレキサート（以下、ＭＴＸとも称す）は、効力が優れていること、作用発現までの時間が比較的短いこと、などの長所を有する薬剤である。しかし、ＭＴＸは全身投与でのみ使用を認められている（現在、日本において、ＲＡ治療薬として医薬品の承認を受けているものはカプセル剤のみである。海外では、錠剤と注射剤が承認を受けている。）ため、治療目的部位である関節以外の部位で、その作用メカニズムに起因する重篤な副作用（肝障害、造血障害、肺障害、消化管障害など）を起こすことが知られている。その結果、使用に当たっては十分な副作用のモニタリングと副作用発症時の対策が不可欠である。こうした副作用の懸念の大きさから、ＭＴＸをはじめとする滑膜炎抑制薬は、ＲＡに比べ症状の軽いＯＡなどの他の関節疾患への適応は認められていない。言い換えれば、ＭＴＸの全身性の副作用を軽減する手段、もしくは薬効発現に必要な部位でのみＭＴＸの作用を発現できる手段を見出せれば、より安全なＲＡ治療法を提供するのみならず、ＯＡを含む広範囲の関節疾患にＭＴＸを用いることが可能となる。【００１０】
ＭＴＸの副作用を軽減し、望ましい薬効のみを引き出す手段として、これまでにもＭＴＸの作用を関節内や滑膜にのみ限局させるための方法がいくつか試みられている。例えば、ＭＴＸを単独で局所投与（関節内投与）する方法が報告されているが、関節内からＭＴＸが速やかに消失してしまうため十分な薬効を発揮できない。また、リポゾーム化したＭＴＸを用いることによって、マクロファージによる貪食能を利用して関節内貯留性を向上させる方法も報告されているが、未だに臨床での有用性は確かめられていない。このように、関節疾患治療薬としてのＭＴＸの副作用を軽減し、期待される薬効のみを引き出すためには、なお技術的な改良が必要である。【００１１】
上述のように、滑膜はＨＡが集積しやすい組織である。また、滑膜細胞はＣＤ４４などのＨＡレセプターを介してＨＡを細胞内に取り込む機構を備えている。そのため、ＨＡは薬物を滑膜に集積させるためのキャリアになりうる可能性が考えられる。これまでに、薬物の生体内キャリアとして、ＨＡを利用する技術はいくつか報告されている。しかし、ＭＴＸを代表例とする関節疾患治療薬、特に滑膜炎制御に適した薬物のドラッグデリバリーシステム（以下、ＤＤＳとも称す）創出に関する技術への応用例はほとんど知られていない。【００１２】
これまでの報告例としては、例えば、ＨＡを含む多糖体にペプチド鎖を介して薬物を結合した多糖体−薬物結合体が知られている（特許文献１：特開平５−３９３０６号、特許文献２：国際公開ＷＯ９４／１９３７６号など）。これらはいずれも癌組織移行性をうたった抗癌剤のＤＤＳ技術に関するものである。【００１３】
特開平５−３９３０６号では、抗癌剤としての目的でＭＴＸが用いられている。しかし、癌組織への移行性と長期体内残留性の無さとを特徴としていることから、抗癌作用を高めるためにＭＴＸの結合率は高く（実施例では６．４〜１９％）、かつ、ＨＡの分子量は低い（実施例では１０万ダルトン）。また、ＨＡの水酸基にイソウレア結合によりペプチド鎖が結合しているので、水溶液中での安定性は低い。【００１４】
一方、ＨＡと薬物とを結合させた結合体（コンジュゲート）を関節疾患治療薬に利用した報告例もある。例えば、国際公開ＷＯ９９／５９６０３号（特許文献２）では、ブチレンアミン基（−Ｃ4Ｈ8ＮＨ−）およびオクチレンアミン基（−Ｃ8Ｈ16ＮＨ−）などのスペーサーを介して結合したＨＡと薬物の結合体が開示されている。当該特許文献において、当該結合体は、細胞外での薬効を想定して、薬物が結合したままの状態で薬効を発現するものとして記載されている。実際、当該結合体ではスペーサーを介しての薬物とＨＡとの結合が比較的強固なため、ＭＴＸのように結合体から遊離しなければ薬効を発揮できない薬物への適応は困難である。【００１５】
それに加え、当該特許文献はマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（以下、ＭＭＰＩとも称す）を薬物として用いた結合体に向けられており、開示された実施例もＭＭＰＩの結合体に関するもののみである。薬物としてＭＴＸを用いた結合体は何ら具体的に開示されておらず、その医薬としての有用性について何らの記載も含まれていない。【００１６】
国際公開ＷＯ０２／４４２１８号（特許文献３）では、１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル基に更に特殊な基（ノルボルネン）を結合させたスペーサーを用い、ノルボルネンとＨＡの水酸基とのカルバメート結合の形成により生成したＨＡ−薬物結合体が開示されている。しかし、当該結合体も特許文献２と同様に細胞外での薬効を想定したものと考えられ、薬物が結合したままの状態で薬効を発現する。従って、結合体から遊離しなければ薬効を発揮できない薬物、例えばＭＴＸへの適応は困難である。さらに、特許文献３は、ＭＭＰＩを薬物として用いた結合体に向けられており、薬物としてＭＴＸを用いた結合体については何ら示唆されていない。【００１７】
以上、述べた通り、上記の文献にはＭＴＸを用いたＨＡ−ＭＴＸ結合体について何ら記載されておらず、ＨＡ−ＭＴＸ結合体を関節疾患治療薬として使用することに関し何ら記載も示唆もされていない。【００１８】
また、先行技術として知られているＨＡ−薬物結合体の合成方法では、合成過程でＨＡの分子量が大きく低下してしまい、ＨＡの薬効が損なわれてしまうことを本発明者らは確認している。従来のＨＡ−薬物結合体の合成方法では一般的な有機合成反応条件や後処理条件が用いられているが、高分子量のＨＡと薬物との結合体を調製するには、さらなる改良が必要である。【００１９】
このように、医薬品として用いるＨＡ−薬物結合体、特に関節疾患治療に適した高分子量のＨＡ−薬物結合体、それを用いた製剤、および当該結合体の合成方法はこれまで知られていなかった。
【特許文献１】特開平５−３９３０６号
【特許文献２】国際公開ＷＯ９９／５９６０３号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ０２／４４２１８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
発明が解決しようとする課題は、関節疾患治療薬として有用な、ヒアルロン酸−メトトレキサート結合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、ヒアルロン酸の水酸基に、ペプチド鎖を含有するリンカーを介してメトトレキサートが結合しており、該リンカーと該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩とがカルバメート結合により共有結合している、ヒアルロン酸−メトトレキサート結合体が、関節疾患治療薬として卓効を有することを見出し、本発明を完成した。【００２２】
すなわち本発明の一つの側面により、ヒアルロン酸の水酸基に、１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を含有するリンカーを介してメトトレキサートが結合しており、該リンカーと該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩とがカルバメート基を形成して結合している、ヒアルロン酸−メトトレキサート結合体が提供される。本発明の１つの実施態様において、当該リンカーは、１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖、および１〜５個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび／またはカルボキシル基またはＣ1-6アルコキシカルボニル基で置換されていてもよいＣ2-20アルキレンジアミン鎖を含むものである。【００２３】
本発明の別の側面により、リンカーに結合したメトトレキサートが、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：【００２４】
【化１】
0005001645.tif 000002
【００２５】
【化２】
0005001645.tif 000003
【００２６】
【化３】
0005001645.tif 000004
【００２７】
【化４】
0005001645.tif 000005
【００２８】
［式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、またはジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基であり；
Ｌ0は、リンカーの結合位置である。］
で表される、上記のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体もまた提供される。【００２９】
また、本発明の別の側面により、ペプチド鎖を含有するリンカーおよび当該リンカーに結合したメトトレキサートが、式（Ｉ’）または（ＩＩ’）：【００３０】
【化５】
0005001645.tif 000006
【００３１】
【化６】
0005001645.tif 000007
【００３２】
［式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、またはジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基であり；
Ｌは、式（Ｘ）【００３３】
【化７】
0005001645.tif 000008
【００３４】
（式中、Ｑ1は結合する−ＮＨ−と一緒になって１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルキルカルボニル基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、ホルミル基、Ｃ1-6アルキルスルホニル基、および置換されていてもよいＣ6-10アリールスルホニル基からなる群から選択される１個以上の基により置換または保護されていてもよく、当該ペプチド鎖に含まれる各アミド結合は、独立に１個以上のＣ1-6アルキル基および／またはＣ1-6アルキルカルボニル基で窒素原子上を置換されていてもよく、当該残基に含まれる各カルボキシル基は、独立に１または２個のＣ1-6アルキルで置換されていてもよいアミド基に変換されていてもよく；
Ｒ11およびＲ12はそれぞれ独立に水素原子またはＣ1-6アルキル基であり；
Ｑ2は１〜５個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび／またはカルボキシル基もしくはＣ1-6アルコキシカルボニル基で置換されていてもよいＣ2-20アルキレンであり；
［ＨＡ］はヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の水酸基の位置を表し、リンカーと該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩とが該位置でカルバメート基により結合し；および
「−Ｏ−［ＨＡ］」中の酸素原子「−Ｏ−」は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の任意の位置における水酸基に由来する酸素原子を表す）で表されるリンカーである。］
で表される、上記のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体が提供される。【００３５】
さらに本発明のその他の側面によれば、上記ヒアルロン酸−メトトレキサート結合体を有効成分として含有する医薬組成物、および関節疾患治療薬もまた提供される。【００３６】
さらに本発明の別の側面によれば、上記のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体の製造に利用することができる、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）：【００３７】
【化８】
0005001645.tif 000009
【００３８】
【化９】
0005001645.tif 000010
【００３９】
［式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、またはジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基であり；
Ｌ1は、式（Ｘ’）【００４０】
【化１０】
0005001645.tif 000011
【００４１】
または式（Ｘ'’）【００４２】
【化１１】
0005001645.tif 000012
【００４３】
（式中、Ｑ1は結合する−ＮＨ−と一緒になって１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルキルカルボニル基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、ホルミル基、Ｃ1-6アルキルスルホニル基、および置換されていてもよいＣ6-10アリールスルホニル基からなる群から選択される１個以上の基により置換または保護されていてもよく、当該ペプチド鎖に含まれる各アミド結合は、独立に１個以上のＣ1-6アルキル基および／またはＣ1-6アルキルカルボニル基で窒素原子上を置換されていてもよく、当該残基に含まれる各カルボキシル基は、独立に１または２個のＣ1-6アルキルで置換されていてもよいアミド基に変換されていてもよく；
Ｒ11およびＲ12はそれぞれ独立に水素原子またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ13は、Ｃ1-6アルキル基、カルボキシミド基、置換されていてもよいヘテロアリール基、または置換されていてもよいＣ6-18アリール基であり；
Ｑ2は１〜５個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび／またはカルボキシル基もしくはＣ1-6アルコキシカルボニル基で置換されていてもよいＣ2-20アルキレンである。）である。］の化合物またはその塩が提供される。【００４４】
さらに本発明の別の側面によれば、上記の式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物またはその塩を、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩と反応させ、当該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩の水酸基の位置でカルバメート基により式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物またはその塩を結合させる工程を含む、上記のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体の製造方法もまた提供される。【００４５】
以下本発明の詳細について説明する。【００４６】
本発明のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体（ＨＡ−ＭＴＸ結合体）は新規化合物である（以下、ＨＡ−ＭＴＸ結合体において、ＨＡはヒアルロン酸誘導体、その塩、またはヒアルロン酸の塩であってもよい）。本発明では、ヒアルロン酸（ＨＡ）とメトトレキサート（ＭＴＸ）とを結合させる手段として、ＨＡの水酸基に、ペプチド鎖を含有するリンカーを介してＭＴＸが結合しており、該リンカーと該ＨＡとがカルバメート基を形成して結合している構造を採用したことにより、ＨＡの疼痛除去作用を保持し、かつ、ＭＴＸの滑膜炎軽減作用を併せ持つＨＡ−ＭＴＸ結合体が得られる。即ち、本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体は、滑膜に集積した後、滑膜細胞内に取り込まれ、細胞内でＭＴＸの薬効を発現すると考えられる。【００４７】
従って、本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体をＯＡまたはＲＡ患者の関節内、例えば膝、肩、肘の関節内に投与した場合、従来のＨＡ製剤同様、ＨＡの特性に基づく疼痛除去作用を発現する一方で、滑膜組織に蓄積しながら、徐々に滑膜細胞内に取り込まれ、ＭＴＸを解離することにより、滑膜炎抑制作用を持続的に発現する。これにより、経口投与に比べＭＴＸの投与量を大幅に低減することが可能であり、経口投与で問題となる全身性の副作用を軽減できる。また、投与部位において、ＨＡ製剤とＭＴＸの両者は、作用機序の異なる薬理効果を発現し得るので、両者相俟った相乗的な薬効が期待できる。本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体では、ＨＡ自身が薬効を示すだけでなく、ＭＴＸを限局させるキャリアとしても作用する。【００４８】
即ち、本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体により、関節注入剤としてのＨＡの側面を持ちながら、ＭＴＸの滑膜炎抑制作用を投与関節内でのみ安全に発現させることができる、従来にない優れた関節疾患治療薬が提供される。【００４９】
本発明のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体（ＨＡ−ＭＴＸ結合体）は、ヒアルロン酸の水酸基に、ペプチド鎖を含有するリンカーを介してメトトレキサートが結合しており、該リンカーと該ヒアルロン酸とがカルバメート基を形成して結合しているものである。ここでカルバメート基とは−ＮＲＣＯＯ−基（Ｒとしては、例えば式（Ｘ）のＲ12として記載した基が挙げられる）を指す。カルバメート結合またはカルバメート基による結合とはカルバメート基を介した結合をいう。本発明のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体において、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の任意の水酸基とリンカーとが、カルバメート基を介して結合している状態を「−ＮＲＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］」、「−ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］」または「ＭＴＸ−（ペプチド鎖を含有するリンカー）−Ｏ−［ＨＡ］」などと示し、ここで、「−Ｏ−［ＨＡ］」中に表される酸素原子「−Ｏ−」は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の任意の位置における水酸基に由来する酸素原子である。【００５０】
本発明において「ヒアルロン酸（ＨＡ）」とは、一般にヒアルロン酸と称されている物質、例えばグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとを繰り返し単位として含む高分子多糖であればよく、特に限定はされない。例えば平均分子量５万〜１０００万ダルトンを有する、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから成る二糖の重合体である。ヒアルロン酸の塩には、特に限定はされないが、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、鉄塩、アンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩などが含まれる。ヒアルロン酸及びその塩、並びにそれらの混合物の具体例には、例えば、商品名  スベニール（登録商標：製造販売  中外製薬株式会社）；商品名  アルツ（登録商標：製造  生化学工業株式会社、販売  科研製薬株式会社）；商品名  オペガン（登録商標：製造  生化学工業株式会社、販売  参天製薬株式会社）などが含まれる。本発明において「ヒアルロン酸誘導体」とは、ＨＡから誘導されるＨＡ骨格を有する物質を意味する。ヒアルロン酸誘導体としては、特に限定はされないが、例えば、ＨＡ中の一つ以上のカルボキシル基がエステル化されている物質（例えば、ベンジルエステル化ＨＡ（商品名  Ｈｙａｆｆ（登録商標）、Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ））、ＨＡをホルムアルデヒドで架橋しさらに高分子化した物質（例えば、商品名  Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）、Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ））、ＨＡ中の一つ以上の水酸基がアセチル化されているアセチル化ＨＡ、などを包含する。【００５１】
本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体は、ＨＡの疼痛除去作用を発現させるため、ＨＡ−ＭＴＸ結合体として、臨床での疼痛除去作用が確認されているＨＡと同等の分子量サイズと粘弾性を保持したものであることが好ましい。また、分子量が大きくなると粘弾性が上がりハンドリングが困難になること、および生体内におけるキャリアとしてのＨＡの効果を考慮すると、具体的には、ＨＡ−ＭＴＸ結合体としての分子量が６０万〜６００万ダルトンであることが好ましく、ＨＡ−ＭＴＸ結合体としての分子量が８０万〜６００万ダルトンであることがより好ましく、ＨＡ−ＭＴＸ結合体としての分子量が１００万〜５００万ダルトンであることが特に好ましい。【００５２】
ここで、上記した原料ＨＡの分子量、ＨＡ−ＭＴＸ結合体の分子量は、極限粘度から粘度平均分子量を算出する方法で測定したものである。極限粘度（［η］）から粘度平均分子量（Ｍｗ）への換算は、以下の式を用いて算出することができる。
Ｍｗ＝（［η］／０．０００３６）1.282
本発明のペプチド鎖を含有するリンカーにおけるペプチド鎖は、アミノ酸により構成される。当該アミノ酸には、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、トレオニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、チロシン、トリプトファンなどの天然α−アミノ酸の他に、アルキル側鎖を持つα−アミノ酸（例えば、ノルバリン、ノルロイシン、ｔ−ロイシンなど）、シクロアルキル基で置換されたアラニンやグリシン（例えば、シクロペンチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシンなど）、またはアリール基で置換されたアラニンやグリシン（例えば、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、置換フェニルアラニン、フェニルグリシンなど）などの非天然α−アミノ酸、β−アラニンなどのβ−アミノ酸、γ−アミノ酪酸などのγ−アミノ酸、およびタウリンなどのアミノスルホン酸などが含まれる。本発明のリンカーペプチドにおけるアミノ酸には、その残基が適切に置換または保護されたものも含まれる。例えば、当該残基上の官能基は、保護基を用いて保護され得る。この目的のために使用する保護基は当該技術分野で周知であり、その一部の例は、本明細書の他の段落に記載される。各置換基および保護基、特に保護基の導入方法は、当該技術分野において周知のものを用いればよい。【００５３】
当該リンカーはアミノ酸のみにより構成されていてもよく、またはペプチド鎖の中または末端にアミノ酸以外の化合物に由来する部分を含んでいてもよい。例えば、アルキレンジアミン、オキサアルキレンジアミンのようなジアミノ化合物やコハク酸のようなジカルボン酸化合物がペプチド鎖の中または末端に結合したものなども当該リンカーに含まれる。ペプチド鎖の中または末端にアミノ酸以外の化合物を含む場合で、当該リンカーがＭＴＸのカルボキシル基とヒアルロン酸の水酸基に結合する場合には、アルキレンジアミン、オキサアルキレンジアミンのようなジアミノ化合物がペプチド鎖の末端に存在することが好ましく、４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンがペプチド鎖の末端に存在することが特に好ましい。また、ペプチド鎖を構成するアミノ酸は特に限定されないが、プロテアーゼに対する親和性の観点から、α−アミノ酸が好ましく、ペプチド鎖を含有するリンカーのＭＴＸに結合する末端はα−アミノ酸であることが好ましい。【００５４】
当該ペプチド鎖を構成するアミノ酸の数は、特に限定はされないが、典型的には１〜８であり、好ましくは１〜６であり、特に好ましくは１〜４である。【００５５】
当該ペプチド鎖を構成するアミノ酸の各残基は、独立に１個以上の基により適切に置換または保護され得る。そのような基には、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルキルカルボニル基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、（ｎ−またはｉ−）プロピルオキシカルボニル基、および（ｎ−、ｓ−、またはｔ−）ブトキシカルボニル基）、ホルミル基、Ｃ1-6アルキルスルホニル基（例えば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、および（ｎ−またはｉ−）プロパンスルホニル基）、置換されていてもよいＣ6-10アリールスルホニル基（例えば、ベンゼンスルホニル基、（ｏ−、ｍ−またはｐ−）トルエンスルホニル基、および（１−または２−）ナフタレンスルホニル基）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、置換または保護により、当該残基に含まれるカルボキシル基はＣ1-6アルコキシカルボニル基に、ヒドロキシ基はＣ1-6アルコキシ基またはＣ1-6アルキルカルボニルオキシ基に、アミノ基はＣ1-6アルキルアミノ基、ジＣ1-6アルキルアミノ基、Ｃ1-6アルキルカルボニルアミノ基またはＮ−Ｃ1-6アルキル−Ｃ1-6アルキルカルボニルアミノ基にそれぞれ変換されていてもよい。また、当該残基に含まれるカルボキシル基は、１または２個のＣ1-6アルキル基で置換されていてもよいアミド基に変換されていてもよい。当該残基中にインドール環やイミダゾール環のような含窒素複素環が含まれる場合は、その環上の窒素原子は、各々独立して、Ｃ1-6アルキル基またはＣ1-6アルキルカルボニル基で保護されていてもよい。当該残基中にグアニジノ基が存在する場合には、そこに含まれている窒素原子も、Ｃ1-6アルキル基またはＣ1-6アルキルカルボニル基で保護され得る。窒素原子に対する他の保護基としては、限定されないが、上記したＣ1-6アルコキシカルボニル基、ホルミル基、Ｃ1-6アルキルスルホニル基、置換されていてもよいＣ6-10アリールスルホニル基のような通常用いられるものを選択することもできる。チオール基が当該残基に含まれる場合は、Ｃ1-6アルキル基またはＣ1-6アルキルカルボニル基で保護され得る。また、当該ペプチド鎖に含まれるアミド結合またはペプチド結合も、その窒素原子上をＣ1-6アルキル基および／またはＣ1-6アルキルカルボニル基で置換されていてもよく、例えば−ＣＯＮ（Ｃ1-6アルキル）−に変換されていてもよい。【００５６】
ペプチド鎖を構成するアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、以下のようなものが挙げられる。尚、ターゲットとなる生体内プロテアーゼが存在し、その基質認識アミノ酸配列が既知の場合、その認識部位および／または切断部位を含むアミノ酸配列を用いてもよい。【００５７】
アミノ酸１個からなるペプチド鎖：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、など。好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ。【００５８】
アミノ酸２個からなるペプチド鎖：ＰｈｅＰｈｅ、ＰｈｅＧｌｙ、ＰｈｅＬｅｕ、ＴｙｒＰｈｅ、ＴｒｐＰｈｅ、ＰｈｅＴｒｐ、ＰｈｅＴｙｒ、ＧｌｙＰｈｅ、ＧｌｙＧｌｙ、など。好ましくは、ＰｈｅＰｈｅ、ＰｈｅＧｌｙ。【００５９】
アミノ酸３個からなるペプチド鎖：ＰｈｅＧｌｙＧｌｙ、ＰｈｅＬｅｕＧｌｙ、ＰｈｅＰｈｅＧｌｙ、ＡｓｎＰｈｅＰｈｅ、ＧｌｙＰｈｅＰｈｅ、ＬｅｕＰｈｅＰｈｅ、ＬｅｕＡｌａＬｅｕ、ＡｌａＶａｌＡｌａ、ＧｌｙＡｌａＰｈｅ、ＧｌｙＰｈｅＡｌａ、ＧｌｙＩｌｅＡｌａ、ＧｌｙＩｌｅＰｈｅ、ＧｌｙＬｅｕＡｌａ、ＧｌｙＶａｌＡｌａ、ＧｌｙＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ、など。好ましくは、ＡｓｎＰｈｅＰｈｅ。【００６０】
アミノ酸４個からなるペプチド鎖：ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＰｈｅＬｅｕ、ＧｌｙＰｈｅＰｈｅＡｌａ、ＧｌｙＰｈｅＴｙｒＡｌａ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙＰｈｅ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙＧｌｙ、ＧｌｙＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＧｌｙＰｈｅＴｙｒ、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ、ＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｌａ、ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ、ＡｌａＧｌｙＶａｌＰｈｅ、ＧｌｕＡｓｎＰｈｅＰｈｅ、など。好ましくは、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ。【００６１】
本発明におけるリンカーは、例えば上記式（Ｘ）で示される構造を有していてもよく、その場合Ｑ1は結合する−ＮＨ−と一緒になって上述したような１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を形成する。また、Ｑ2は１〜５個の酸素原子が挿入されるか、またはカルボキシル基またはＣ1-6アルコキシカルボニル基で置換されていてもよいＣ2-20アルキレンである。Ｑ2の具体例としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基、ノナン−１，９−ジイル基、デカン−１，１０−ジイル基、２−メチルプロパン−１，３−ジイル基、２−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルペンタン−１，５−ジイル基、３−エチルペンタン−１，５−ジイル基、２−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、３−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、４−メチルヘプタン−１，７−ジイル基、３−オキサペンタン−１，５−ジイル基、３−オキサヘキサン−１，６−ジイル基、４−オキサヘキサン−１，６−ジイル基、３−オキサヘプタン−１，７−ジイル基、４−オキサヘプタン−１，７−ジイル基、４−オキサオクタン−１，８−ジイル基、３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジイル基、３，６−ジオキサノナン−１，９−ジイル基、３，６−ジオキサ−４−メチルノナン−１，９−ジイル基、４，７−ジオキサデカン−１，１０−ジイル基、４，９−ジオキサドデカン−１，１２−ジイル基、４，７，１０−トリオキサトリデカン−１，１３−ジイル基などが挙げられ、好ましくは、エタン−１，２−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、３−オキサペンタン−１，５−ジイル基、３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジイル基、４，７−ジオキサデカン−１，１０−ジイル基、４，９−ジオキサドデカン−１，１２−ジイル基、４，７，１０−トリオキサトリデカン−１，１３−ジイル基などが挙げられる。【００６２】
本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体は、ＨＡの水酸基に、ペプチド鎖を含有するリンカーを介してＭＴＸが結合し、該リンカーと該ヒアルロン酸とがカルバメート結合により結合するものであればどのような結合様式をとっていてもよい。即ち、ペプチド鎖を含有するリンカーは、
１）ＭＴＸのα位のカルボキシル基；
２）ＭＴＸのγ位のカルボキシル基；および
３）ＭＴＸのアミノ基と結合しうるものであり、さらにこれらの結合様式が複数混在（例えば、ＭＴＸのα位のカルボキシル基で結合した結合体と、ＭＴＸのγ位のカルボキシル基で結合した結合体が混在）していてもよい。プロテアーゼに対する親和性と合成上の観点からは、ペプチド鎖を含有するリンカーはＭＴＸのα位のカルボキシル基及び／またはγ位のカルボキシル基と結合していることが好ましく、当該リンカーはＭＴＸのα位のカルボキシル基と結合していることがより好ましい。【００６３】
本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体において、ペプチド鎖を含有するリンカーおよびその結合様式のうち特に好ましいものは、ペプチド鎖を含有するリンカーがα−アミノ酸からなるペプチド鎖の末端にジアミノ化合物が存在するものであり、そのペプチド鎖のＮ末端がＭＴＸのα位のカルボキシル基に酸アミド結合によって結合し、そのペプチド鎖のＣ末端がジアミノ化合物を介してＨＡの水酸基とカルバメート基により結合しているものである。【００６４】
本発明のヒアルロン酸−メトトレキサート結合体におけるメトトレキサート（ＭＴＸ）部分は、リンカーによる修飾以外に、公知の方法によりプロドラッグ化されていてもよい。【００６５】
本明細書においてＣ1-6アルキル基は、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、３−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、及びｎ−ヘキシル基等を含む。【００６６】
本明細書においてＣ1-6アルキルカルボニルは、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル基、プロピオニル基、２−メチルプロピオニル基、２，２−ジメチルプロピオニル基などの既に定義したアルキル基をアルキル部分として有するものが含まれる。【００６７】
本明細書においてＣ1-6アルコキシは、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルコキシ基を意味し、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基などの既に定義したアルキル基をアルキル部分として有するものが含まれる。【００６８】
本明細書においてＣ1-6アルキルアミノは、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキルアミノ基を意味し、例えばメチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基などの既に定義したアルキル基をアルキル部分として有するものが含まれる。【００６９】
本明細書においてジＣ1-6アルキルアミノは、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のジアルキルアミノ基を意味し、例えばジメチルアミノ基、エチルメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルｎ−プロピルアミノ基などの、同一または異なってもよい既に定義したアルキル基をアルキル部分として有するものが含まれる。【００７０】
本明細書においてＣ2-20アルキレンは、炭素数２〜２０の直鎖または分枝鎖状のアルキレン基を意味し、例えばエチレン基、プロピレン基、ブチレン基、オクチレン基、デカレン基などが含まれる。【００７１】
本明細書においてＣ1-6アルコキシカルボニル基は、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルコキシカルボニル基を意味し、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基などの既に定義したアルキル基をアルキル部分として有するものが含まれる。【００７２】
本明細書においてＣ1-6アルキルスルホニル基は、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキルスルホニル基を意味し、例えばメタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ｎ−プロパンスルホニル基などの既に定義したアルキル基をアルキル部分として有するものが含まれる。【００７３】
本明細書においてカルボキシミド基は、環状であっても鎖状であってもよく、１または複数の置換基で置換されていてもよい。式（Ｘ’）及び（Ｘ’’）において、カルボキシミド基はＮ原子でＯ原子と結合する。当該カルボキシミド基の具体例としては、例えばスクシンイミド基、フタルイミド基、５−ノルボルネン−２，３−カルボキシミド基、マレイミド基、グルタルイミド基などが挙げられる。【００７４】
本明細書においてアリール基は、１または複数の置換基で置換されていてもよい炭素数６〜１８のアリール基を意味し、単環式であっても多環式であってもよい。ここで置換基としては、既に定義したＣ1-6アルキル基；既に定義したＣ1-6アルコキシ基；フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン；ニトロ基；既に定義したＣ1-6アルコキカルボニル基；アシル基；水酸基；シアノ基；置換または無置換のアミノ基等が挙げられる。当該アリール基の具体例としては、例えばフェニル基、ニトロフェニル基、フルオロフェニル基、クロロフェニル基、ナフチル基、アントラニル基、などが挙げられる。【００７５】
本明細書においてＣ6-10アリールスルホニル基は、１または複数の置換基で置換されていてもよい炭素数６〜１０のアリール部分を有するアリールスルホニル基を意味し、当該アリール部分は単環式であっても多環式であってもよい。ここで置換基としては、既に定義したＣ1-6アルキル基；既に定義したＣ1-6アルコキシ基；フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン；ニトロ基；既に定義したＣ1-6アルコキカルボニル基；アシル基；シアノ基等が挙げられる。Ｃ6-10アリールスルホニル基の例には、ベンゼンスルホニル基、（ｏ−、ｍ−またはｐ−）トルエンスルホニル基、および（１−または２−）ナフタレンスルホニル基等が含まれる。【００７６】
本明細書においてヘテロアリール基は、１つ以上のヘテロ原子を環中に有する５若しくは６員の芳香環を含有する基を意味し、縮合していてもよく、１または複数の置換基で置換されていてもよい。ヘテロ原子には、窒素、酸素、硫黄が含まれる。置換基には前述のアリール基について記載した置換基やオキソ基が含まれる。ヘテロアリール基には、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、オキサゾリル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、ベンズイミダゾリルが含まれる。中でも、トリアゾリル、トリアジニルが好ましい。【００７７】
本明細書においてトリアゾリル基は、何れの異性体であってもよく、１または複数の置換基で置換されていてもよい。式（Ｘ’）及び（Ｘ’’）において、トリアゾリル基はＮ原子でＯ原子と結合することが好ましい。当該トリアゾリル基の具体例としては、例えばベンゾトリアゾリル基、７−アザベンゾトリアゾリル基、などが挙げられる。【００７８】
本明細書においてトリアジニル基は、何れの異性体であってもよく、１または複数の置換基で置換されていてもよい。式（Ｘ’）及び（Ｘ’’）において、トリアジニル基はＮ原子でＯ原子と結合することが好ましい。当該トリアジニル基の具体例としては、例えば３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジニル基などが挙げられる。【００７９】
本明細書におけるアシル化には、Ｃ1-6アルキルカルボニル化；およびベンゾイル化などが含まれ、当該ベンゾイル基はＣ1-6アルキル、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシなどで置換されていてもよい。【００８０】
本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体におけるＭＴＸの結合率は、薬効を発揮し副作用が軽減される範囲であることが好ましい。本明細書におけるＭＴＸの結合率は、以下の式：【００８１】
【化１２】
0005001645.tif 000013
【００８２】
により算出される。本明細書において、ＭＴＸの結合率は紫外線吸収スペクトルに基づいて算出した値を用いる。ＭＴＸの結合率は、特に限定はされないが、薬効発現の観点から０．５％以上が好ましく、１．０％以上がより好ましい。一方で、ＭＴＸの作用を投与部分に限局させ、ＭＴＸの有する全身性の副作用を低減するためには、結合率は１０％より小さいことが好ましい。また、本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体は、分子量が大きく、かつ、ＭＴＸの結合率が高いと不溶化を起こし合成上の不都合が生じることを考慮すると、ＭＴＸの結合率は０．５％以上かつ４．５％より小さいことが好ましく、１．０％以上かつ４．５％より小さいことが特に好ましい。【００８３】
本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体は、塩として存在することもできるが、その用途を考慮すれば薬学上許容可能な塩であることが好ましい。【００８４】
ＨＡ−ＭＴＸ結合体の薬学的に許容可能な塩には、当該技術分野で通常用いられる非毒性の塩基付加塩、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、またはアンモニウム塩が含まれる。そのような塩基付加塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、鉄塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、ピペリジニウム塩、モルホリニウム塩、ピロリジニウム塩、ベンジルアンモニウム塩、ジエタノールアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等が含まれるが、これらに限定されない。【００８５】
また、ＨＡ−ＭＴＸ結合体の薬学的に許容可能な塩には、当該技術分野で通常用いられる非毒性の無機または有機酸の付加塩も含まれる。そのような酸付加塩の例には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、フッ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、硝酸塩、亜リン酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、糖酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩などが含まれるが、これらに限定されない。【００８６】
本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体の合成にあたっては、ＨＡ、ペプチド鎖を含有するリンカー、ＭＴＸを適当な順番で結合させることによって得ることができる。例えば、ＨＡ−ペプチド鎖を含有するリンカーを構築した後にＭＴＸを導入するルートや、ＭＴＸ−ペプチド鎖を含有するリンカーを構築した後にＨＡに導入するルートが挙げられる。そして、ＭＴＸ−ペプチド鎖を含有するリンカーとＨＡの水酸基との間にカルバメート結合を形成するには、ＭＴＸ−ペプチド鎖を含有するリンカーのアミノ基側を活性化する方法とＨＡの水酸基側を活性化する方法が挙げられる。結合率とＨＡ分子量の制御のし易さを考慮すると、ＭＴＸ−ペプチド鎖を含有するリンカーを構築し活性体とした後にＨＡに導入するルートが好ましい。ここで、活性体としては、式（Ｖａ）及び式（Ｖｂ）：【００８７】
【化１３】
0005001645.tif 000014
【００８８】
【化１４】
0005001645.tif 000015
【００８９】
［式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、またはジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基であり；
Ｌ1は、式（Ｘ’）【００９０】
【化１５】
0005001645.tif 000016
【００９１】
または式（Ｘ’’）【００９２】
【化１６】
0005001645.tif 000017
【００９３】
（式中、Ｑ1は結合する−ＮＨ−と一緒になって１〜８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルキルカルボニル基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、ホルミル基、Ｃ1-6アルキルスルホニル基、および置換されていてもよいＣ6-10アリールスルホニル基からなる群から選択される１個以上の基により置換または保護されていてもよく、当該ペプチド鎖に含まれる各アミド結合は、独立に１個以上のＣ1-6アルキル基および／またはＣ1-6アルキルカルボニル基で窒素原子上を置換されていてもよく、当該残基に含まれる各カルボキシル基は、独立に１または２個のＣ1-6アルキルで置換されていてもよいアミド基に変換されていてもよく；
Ｒ11およびＲ12はそれぞれ独立に水素原子またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ13は水素原子、Ｃ1-6アルキル基、カルボキシミド基、置換されていてもよいヘテロアリール基、または置換されていてもよいＣ6-18アリール基であり；
Ｑ2はＣ2-20アルキレンであり、当該アルキレンは１〜５個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび／またはカルボキシル基若しくはＣ1-6アルコキシカルボニル基で置換されていてもよい。）である。］
が挙げられる。【００９４】
Ｒ13において用いられるヘテロアリール基およびアリール基は、１個以上の置換基により置換されていてもよい。そのような置換基は、限定されないが、アリール基との関係で既に例示されたいずれのものでもよく、例えば、既に定義したＣ1-6アルキル基；フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン；およびニトロ基等である。【００９５】
Ｒ13は、Ｃ1-6アルキル基および置換されていてもよいアリール基が好ましく、フェニル基およびニトロフェニル基（好ましくはｏ−またはｐ−）が特に好ましい。【００９６】
活性体は単離して用いてもよく、ｉｎ−ｓｉｔｕで生成させてから反応させてもよい。また、単離した活性体は、有機合成上許容される塩の形態で提供することもできる。そのような塩は、ＨＡ−ＭＴＸ結合体に関連して既に例示されたいずれの酸付加塩または塩基付加塩でもよい。活性体の塩の例には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、フッ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、硝酸塩、亜リン酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、糖酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、鉄塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、ピペリジニウム塩、モルホリニウム塩、ピロリジニウム塩、ベンジルアンモニウム塩、ジエタノールアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等が含まれるが、これらに限定されない。【００９７】
カルバメート結合形成反応の条件は、ＭＴＸ−リンカーに応じて適宜選択される。例えば、一般に用いられる溶媒と必要に応じて反応促進性の添加剤とを用いて、−２０℃〜５０℃の温度で、数分〜数日間反応させることで行うことができる。【００９８】
溶媒としては、例えば、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルムなどが挙げられる。これらの溶媒は単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。【００９９】
反応促進性の添加剤としては、例えば、相間移動触媒や塩基が挙げられる。相間移動触媒としては、各種のハロゲン化４級アンモニウム、例えばセチルピリジニウムクロライド、テトラブチルアンモニウムブロマイド、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロライドなどが挙げられ、セチルピリジニウムクロライドが好ましい。塩基としては、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリス［２−（２−メトキシエトキシ）エチル］アミンなどが挙げられ、トリブチルアミンが好ましい。これらの添加剤は単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。【０１００】
反応の際、アミノ酸側鎖等の官能基、例えば水酸基、カルボキシル基、アミノ基等は、必要に応じて通常の有機合成において汎用される保護基を用いることができる。【０１０１】
反応温度は、薬効のあるＨＡ−ＭＴＸ結合体が得られる限り特に制限はないが、典型的には−１０℃以上、好ましくは０℃以上であり、４０℃以下、好ましく３０℃以下である。反応時間に特に制限はないが、均一な反応を行うという点からは１時間以上であり、経済的には２４時間以下、好ましくは１２時間以下である。【０１０２】
本発明において「関節疾患」とは、具体的には、関節軟骨欠損、変形性関節症（明らかな原因のない１次性と原因疾患が認められる２次性を含む）、肩関節周囲炎、関節リウマチ、反応性関節炎、ウイルス性関節炎、化膿性関節炎、結核性関節炎、神経性関節症などの疾患を指し、さらに、これら疾患における関節痛（例えば、関節リウマチにおける膝関節痛など）をも包含する。また、「関節疾患治療薬」とは、前記関節疾患の治療に用いられる薬剤だけでなく、予防に用いられる薬剤、病態の進展抑制（悪化の防止や現状維持）等のために用いられる薬剤をも包含する。【０１０３】
本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体は、その有効量に、適宜、製薬上許容しうる担体、賦型剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、香料、着色剤等を加えて医薬組成物として用いることができる。本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体を有効成分とする医薬組成物は、関節疾患治療薬として用いられることが好ましく、その中でも関節局所投与製剤として用いられることが特に好ましい。【０１０４】
本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体を関節疾患治療薬として製剤化するに際しては、特に限定されないが、例えば、生理食塩水やリン酸生理食塩水等に所望の濃度に溶解させ、注射用製剤として製剤化することができる。この際、必要に応じて、酸又は塩基を加えることにより、溶液を所望のｐＨに調整してもよい。また、ナトリウム塩、カリウム塩等の１価の金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩等の２価の金属塩等の無機塩等を加えることにより、溶液を所望の塩濃度に調整してもよい。更に、所望に応じて、安定化剤等が加えられていてもよい。このようにして調製された、本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体を溶解させた溶液を、ディスポーザブル注射筒等の注射器に予め充填させた形で流通させてもよい。本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体を有効成分とする関節疾患治療薬として投与するに際しては、本発明ＨＡ−ＭＴＸ結合体が０．０１％〜１０％ｗ/ｖの溶液濃度、好ましくは０．１％〜２．０％ｗ/ｖの溶液濃度、特に好ましくは０．５％〜１．５％ｗ/ｖの溶液濃度のものを、１回あたり１〜３ｍＬを患者に投与すればよい。但し、この投与量は、医師の指示、対象となる患者、又は疾患の種類やその重篤度、或いはＨＡ−ＭＴＸ結合体の分子量等により、それぞれ最適な投与量に適宜増減してもよい。【０１０５】
本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体は、以下の実施例において説明するとおり、膝関節に病態が発症する関節炎モデルに関節内投与すると、ＨＡには見られない滑膜炎の軽減作用を発現する。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、各被験物質投与群および対照群（ＨＡおよびｖｅｈｉｃｌｅ）において、ｍＢＳＡ溶液を膝関節内に投与した時から測定された膝関節腫脹の経時的推移を示す。
【図２】図２は、図１の各被験物質投与群および対照群のグラフについてのＡＵＣを示す。
【図３】図３は、コラーゲン関節炎モデルにおける膝関節幅の経時的推移を示す。左図は、実施例３−７の化合物または対照薬（ＨＡまたはＶｅｈｉｃｌｅ）を右膝関節内のみに投与された群における、コラーゲン関節炎の誘導直後から測定された右膝関節（投与部位）の幅についての経時的推移を示す。右図は非投与部位である左膝関節幅の経時的推移を示す。グラフは平均±標準誤差で示す。
【図４】図４は、コラゲナーゼ誘導関節炎（ＯＡ）モデルにおける膝関節腫脹の測定結果を示す。左図は、実施例３−７の化合物または対照薬（ＨＡまたはｖｅｈｉｃｌｅ）を投与した群における、関節炎誘導直後から２７日後まで測定された膝関節腫脹の経時的推移を示し、右図は、そのＡＵＣを示す。
【実施例】
【０１０７】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１−１］
２−［Ｎ−［Ｎ−［Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−α−（Ｏ５−メチルグルタミル）］フェニルアラニル］フェニルアラニルアミノ］エチルアミン：ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ4−ＮＨ2（化合物１）の製造
（ａ）Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ4−ＮＨ−Ｂｏｃ（化合物１ａ）の製造
Ｎ−カルボベンゾキシ-Ｌ-フェニルアラニン（Ｃｂｚ−Ｐｈｅ：７．１６ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）とＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−エチレンジアミン塩酸塩（５．００ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ：４．２８ｇ、２８．０ｍｍｏｌ）とＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ：３．０７ｍＬ、２８．０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍＬに溶解し、氷冷撹拌下１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：５．３６ｇ、２８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１日間撹拌した。反応液に１０％クエン酸水溶液を加え、析出した固体をクロロホルムと少量のメタノールに溶かし、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  クロロホルム：メタノール＝９５：５）で精製し、白色固体の標題化合物９．６９ｇを得た。【０１０８】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３７（９Ｈ、ｓ）、２．６９−３．１９（６Ｈ、ｍ）、４．１２−４．２２（１Ｈ、ｍ）、４．９３（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１２．９Ｈｚ、Ｊ＝１５．１Ｈｚ）、６．７５（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．２２−７．３３（１０Ｈ、ｍ）、７．４８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、８．０５（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）。【０１０９】
ＬＣ／ＭＳ：４４１．９（Ｍ＋Ｈ+）４６４．１（Ｍ＋Ｎａ+）。
（ｂ）Ｃｂｚ−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ4−ＮＨ−Ｂｏｃ（化合物１ｂ）の製造
化合物１ａ（９．６９ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍＬに溶解し、１０％パラジウム炭素５００ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１日撹拌した。反応混合物より触媒をろ別後、減圧濃縮した。この残渣とＣｂｚ−Ｐｈｅ（６．９２ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）とＨＯＢＴ（３．７１ｇ、２４．２ｍｍｏｌ）とＮＭＭ（２．６６ｍＬ、２４．２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍＬに溶解し、氷冷撹拌下ＥＤＣ（４．６４ｇ、２４．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１日間撹拌した。反応液に水を加え、１０％クエン酸水溶液、飽和重曹水、水で洗浄し乾燥した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  クロロホルム：メタノール＝９０：１０）で精製し、白色固体の標題化合物１２．８ｇを得た。【０１１０】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３７（９Ｈ、ｓ）、２．６２−３．１８（８Ｈ、ｍ）、４．１８−４．２９（１Ｈ、ｍ）、４．４０−４．５１（１Ｈ、ｍ）、４．９３（２Ｈ、ｓ）、６．７２（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．１０−７．３２（１５Ｈ、ｍ）、７．４６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．９７（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）。【０１１１】
ＬＣ／ＭＳ：５８８．８（Ｍ＋Ｈ+）６１１．１（Ｍ＋Ｎａ+）。
（ｃ）Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ4−ＮＨ−Ｂｏｃ（化合物１ｃ）の製造
化合物１ｂ（１１．１ｇ、１８．９ｍｇ）をメタノール８００ｍＬとＤＭＦ５０ｍＬとＴＨＦ５００ｍＬに溶解し、１０％パラジウム炭素１．００ｇを加え、水素雰囲気下室温で１日撹拌した。反応混合物より触媒をろ別後、減圧濃縮した。この残渣とＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステル（Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）：５．５８ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）とＨＯＢＴ（３．１８ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）とＮＭＭ（２．２９ｍＬ、２０．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１００ｍＬに溶解し、氷冷撹拌下ＥＤＣ（３．９９ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。氷冷撹拌下反応液に１０％クエン酸を加え生じた沈殿を、５％重曹水、水で洗浄後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）で精製し、メタノールを加え沈殿を生じさせ白色粉末の標題化合物１１．１ｇを得た。【０１１２】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３６（９Ｈ、ｓ）、１．６４−１．８０（２Ｈ、ｍ）、２．１７−２．２３（２Ｈ、ｍ）、２．７６−３．１２（８Ｈ、ｍ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、３．９３−４．０３（１Ｈ、ｍ）、４．４０−４．５８（２Ｈ、ｍ）、５．００（２Ｈ、ｓ）、６．６８（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．１８−７．４４（１６Ｈ、ｍ）、７．８４−７．９０（２Ｈ、ｍ）、８．１９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）。【０１１３】
ＬＣ／ＭＳ：７３２．４（Ｍ＋Ｈ+）、７５４．４（Ｍ＋Ｎａ+）。
（ｄ）ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ4−ＮＨ−Ｂｏｃ（化合物１ｄ）の製造
化合物１ｃ（３４８ｍｇ、０．４７６ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬとテトラヒドロフラン１０ｍＬに懸濁し、１０％パラジウム炭素３３ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１．５時間撹拌した。反応混合物より触媒をろ別後、減圧濃縮した。この残渣と４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］安息香酸：１９７ｍｇ、０．５４７ｍｍｏｌ）とＨＯＢＴ（７６ｍｇ、０．４９９ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）４ｍＬに溶解し、氷冷撹拌下Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ、５５μＬ、０．４９９ｍｍｏｌ）とＥＤＣ（１０５ｍｇ、０．５４７ｍｍｏｌ）を加え、室温で４日間撹拌した。反応液に５％重曹水を加え生じた沈殿をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）、続いて、アミンシリカゲル（ＮＨ−ＤＭ１０２０、１００−２００ｍｅｓｈ、富士シリシア化学株式会社製）カラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）で精製し、黄色粉末の標題化合物３６２ｍｇを得た。【０１１４】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３５（９Ｈ、ｓ）、１．７８−１．９４（２Ｈ、ｍ）、２．２３（２Ｈ、ｍ）、２．６９−３．１０（８Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２７−４．５２（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６３（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．７０（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ）、７．０６−７．２５（１０Ｈ、ｍ）、７．４６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６６−７．８８（５Ｈ、ｍ）、８．０６−８．１７（２Ｈ、ｍ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１１５】
ＬＣ／ＭＳ：９０５．５（Ｍ＋Ｈ+）。
（ｅ）ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ4−ＮＨ2（化合物１）の製造
化合物１ｄ（３６０ｍｇ、０．３９８ｍｍｏｌ）に、氷冷下、トリフルオロ酢酸５ｍＬを加え１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、残渣をアミンシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝１００：１０、２回）で精製し、黄色粉末の標題化合物２７５ｍｇを得た。【０１１６】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．８０−１．９６（２Ｈ、ｍ）、２．２０−２．２８（２Ｈ、ｍ）、２．４５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．７０−３．１０（６Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２６−４．５２（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．０６−７．２１（１０Ｈ、ｍ）、７．４６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６５−７．７３（３Ｈ、ｍ）、７．８５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、８．０８−８．１６（２Ｈ、ｍ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１１７】
ＬＣ／ＭＳ：８０５．３（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２］
４，７，１０−トリオキサ−１３−［Ｎ−［Ｎ−［Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−α−（Ｏ５−メチルグルタミル）］フェニルアラニル］フェニルアラニルアミノ］トリデカニルアミン：ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２）の製造
（ａ）Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ−Ｂｏｃ（化合物２ａ）の製造
Ｎ−カルボベンゾキシ-Ｌ-フェニルアラニン（Ｃｂｚ−Ｐｈｅ：８５２ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）とＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（７６０ｍｇ、２．３７ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ：３６３ｍｇ、２．３７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６ｍＬに溶解し、氷冷撹拌下１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：５４６ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加え、１０％クエン酸水溶液、５％重曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝１００：３）で精製し、油状の標題化合物１．３５ｇを得た。【０１１８】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ１．４３（９Ｈ、ｓ）、１．５６−１．７４（４Ｈ、ｍ）、３．０６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、３．１７−３．５８（１６Ｈ、ｍ）、４．３０−４．３９（１Ｈ、ｍ）、４．９８（１Ｈ、ｂｒ）、５．０８（２Ｈ、ｓ）、５．５０（１Ｈ、ｂｒ）、６．４０（１Ｈ、ｂｒ）、７．１６−７．３２（１０Ｈ、ｍ）。【０１１９】
ＬＣ／ＭＳ：６２４．３（Ｍ＋Ｎａ+）。
（ｂ）Ｃｂｚ−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ−Ｂｏｃ（化合物２ｂ）の製造
化合物２ａ（１．３５ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）をメタノール１２ｍＬに溶解し、１０％パラジウム炭素２００ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で４時間撹拌した。反応混合物より触媒をろ別後、減圧濃縮した。この残渣とＣｂｚ−Ｐｈｅ（１．０７ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）とＨＯＢＴ（５１４ｍｇ、３．３６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍＬに溶解し、氷冷撹拌下ＥＤＣ（６８８ｍｇ、３．５９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加え、１０％クエン酸水溶液、５％重曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝１００：３）で精製した。ｎ−ヘキサンを加えると白色沈殿物を生じ、ろ取して標題化合物１．５６ｇを得た。【０１２０】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ１．４３（９Ｈ、ｓ）、１．６０−１．７８（４Ｈ、ｍ）、２．９６−３．６０（２０Ｈ、ｍ）、４．４２−４．５９（２Ｈ、ｍ）、４．９６−５．０７（３Ｈ、ｍ）、５．４１（１Ｈ、ｂｒ．ｄ）、６．３９（１Ｈ、ｂｒ）、６．７３（１Ｈ、ｂｒ．ｄ）、７．０８−７．３１（１５Ｈ、ｍ）。【０１２１】
ＬＣ／ＭＳ：７７１．３（Ｍ＋Ｎａ+）。
（ｃ）Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ−Ｂｏｃ（化合物２ｃ）の製造
化合物２ｂ（５００ｍｇ、０．６６８ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶解し、１０％パラジウム炭素１５０ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１日撹拌した。反応混合物より触媒をろ別後、減圧濃縮した。この残渣とＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステル（Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）：２１７ｍｇ、０．７３４ｍｍｏｌ）とＨＯＢＴ（１０２ｍｇ、０．６６８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ５ｍＬに溶解し、氷冷撹拌下ＥＤＣ（１４１ｍｇ、０．７３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加え、１０％クエン酸水溶液、５％重曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝１００：５）で精製した。ｎ−ヘキサンを加えると白色沈殿物を生じ、ろ取して標題化合物５２９ｍｇを得た。【０１２２】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３６（９Ｈ、ｓ）、１．５０−１．８５（６Ｈ、ｍ）、２．２０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、２．７０−３．１０（８Ｈ、ｍ）、３．２５−３．４８（１２Ｈ、ｍ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、３．９３−４．０２（１Ｈ、ｍ）、４．２０−４．６０（２Ｈ、ｍ）、５．００（２Ｈ、ｓ）、６．７７（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．１０−７．４５（１６Ｈ、ｍ）、７．８２（１Ｈ、ｂｒ．ｔ、Ｊ＝６．１Ｈｚ）、７．９１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、８．２２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）。【０１２３】
ＬＣ／ＭＳ：９１４．３（Ｍ＋Ｎａ+）。
（ｄ）ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ−Ｂｏｃ（化合物２ｄ）の製造
化合物２ｃ（５１４ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をメタノール３０ｍＬに懸濁し、１０％パラジウム炭素１００ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１．５時間撹拌した。反応混合物より触媒をろ別後、減圧濃縮した。この残渣と４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］安息香酸：２８１ｍｇ、０．８６４ｍｍｏｌ）とＨＯＢＴ（１３２ｍｇ、０．８６４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ５ｍＬに溶解し、氷冷撹拌下ＥＤＣ（１６６ｍｇ、０．８６４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。反応液に５％重曹水を加え生じた沈殿をアミンシリカゲル（ＮＨ−ＤＭ１０２０、１００−２００ｍｅｓｈ、富士シリシア化学株式会社製）カラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  １回目、ジクロロメタン：メタノール＝１００：７、２回目、クロロホルム：メタノール＝１００：４）で精製し、黄色粉末の標題化合物４１５ｍｇを得た。【０１２４】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３６（９Ｈ、ｓ）、１．４８−１．６１（４Ｈ、ｍ）、１．８１−１．９２（２Ｈ、ｍ）、２．２４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、２．７０−３．１０（８Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．４７（１２Ｈ、ｍ）、３．５４（３Ｈ、ｓ）、４．２５−４．５０（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．７６−６．８３（３Ｈ、ｍ）、７．０６−７．２４（１０Ｈ、ｍ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６７−７．８０（４Ｈ、ｍ）、７．８６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、８．０９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、８．１５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１２５】
ＬＣ／ＭＳ：１０８７．５（Ｍ＋Ｎａ+）。
（ｅ）ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２）の製造
化合物２ｄ（４１３ｍｇ、０．３８８ｍｍｏｌ）に、氷冷下、トリフルオロ酢酸３ｍＬを加え４０分間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、残渣をアミンシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝１００：７、２回）で精製し、黄色粉末の標題化合物３４４ｍｇを得た。【０１２６】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．４９−１．９５（４Ｈ、ｍ）、１．８１−１．９２（２Ｈ、ｍ）、２．２４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、２．７０−３．１０（８Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．４７（１２Ｈ、ｍ）、３．５４（３Ｈ、ｓ）、４．２５−４．５０（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．７６−６．８３（３Ｈ、ｍ）、７．０６−７．２４（１０Ｈ、ｍ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．８３（１Ｈ、ｂｒ．ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ）、８．０１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、８．０９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、８．１５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１２７】
ＬＣ／ＭＳ：９６５．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２’］
４，７，１０−トリオキサ−１３−［Ｎ−［Ｎ−［Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−α−（Ｏ５−エチルグルタミル）］フェニルアラニル］フェニルアラニルアミノ］トリデカニルアミン：ＭＴＸ（Ｅｔ）−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２’）の製造
実施例１−２と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステル（Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ））の代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−エチルエステル（Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＥｔ））を用いて、黄色粉末の標題化合物１．０２ｇを得た。【０１２８】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．１３（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、１．４９−１．６１（４Ｈ、ｍ）、１．８０−１．９６（２Ｈ、ｍ）、２．１９−２．２８（２Ｈ、ｍ）、２．５３−２．５８（２Ｈ、ｍ）、２．７２−３．１２（６Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２７−３．４７（１２Ｈ、ｍ）、４．００（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、４．２８−４．５０（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６２（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．０８−７．２１（１０Ｈ、ｍ）、７．４６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６５−７．８８（５Ｈ、ｍ）、８．０８−８．１８（２Ｈ、ｍ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１２９】
ＬＣ／ＭＳ：９７９．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ2−ＮＨ2（化合物３）の製造
実施例１−２と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，９−ジオキサ−１，１２−ドデカンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物２２１ｍｇを得た。【０１３０】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．４７−１．６０（８Ｈ、ｍ）、１．８０−１．９５（２Ｈ、ｍ）、２．２０−２．２９（２Ｈ、ｍ）、２．６０（２Ｈ、ｔ）、２．７０−３．１０（６Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．５０（８Ｈ、ｍ）、３．５４（３Ｈ、ｓ）、４．２５−４．４９（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６０（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．０６−７．２０（１０Ｈ、ｍ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７０（２Ｈ、ｄ）、７．７３（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．８３（１Ｈ、ｄ）、８．１０（１Ｈ、ｄ）、８．１１（１Ｈ、ｄ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１３１】
ＬＣ／ＭＳ：９４９．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−４］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ8Ｈ16Ｏ2−ＮＨ2（化合物４）の製造
実施例１−２と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７−ジオキサ−１，１０−デカンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物４０７ｍｇを得た。【０１３２】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５０−１．５７（４Ｈ、ｍ）、１．８５−１．９１（２Ｈ、ｍ）、２．２１−２．２８（２Ｈ、ｍ）、２．６０（２Ｈ、ｔ）、２．７０−３．１３（６Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．４５（８Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２７−４．４９（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６０（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．０７−７．２１（１０Ｈ、ｍ）、７．４３（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６９（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．７５（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．８５（１Ｈ、ｄ）、８．０８（１Ｈ、ｄ）、８．１３（１Ｈ、ｄ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１３３】
ＬＣ／ＭＳ：９２１．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−５］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ6Ｈ12Ｏ2−ＮＨ2（化合物５）の製造
実施例１−２と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物１４８ｍｇを得た。【０１３４】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．８１−１．９１（２Ｈ、ｍ）、２．２０−２．２５（２Ｈ、ｍ）、２．６１−２．６４（２Ｈ、ｔ）、２．７０−２．９７（６Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２７−３．４７（８Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２７−４．４７（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６２（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．０６−７．２５（１０Ｈ、ｍ）、７．４６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．８５（１Ｈ、ｄ）、７．９２（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．０７（１Ｈ、ｄ）、８．１５（１Ｈ、ｄ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１３５】
ＬＣ／ＭＳ：８９３．６（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−６］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ4Ｈ8Ｏ−ＮＨ2（化合物６）の製造
実施例１−２と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−オキサ−１，５−ペンタンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物５２ｍｇを得た。【０１３６】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．８４−１．９２（２Ｈ、ｍ）、２．２０−２．２７（２Ｈ、ｍ）、２．６０−２．６４（２Ｈ、ｔ）、２．７１−２．９９（６Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．４５（４Ｈ、ｍ）、３．５４（３Ｈ、ｓ）、４．２７−４．５０（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．０５−７．２１（１０Ｈ、ｍ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．８４（１Ｈ、ｄ）、７．９１（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．０７（１Ｈ、ｄ）、８．１５（１Ｈ、ｄ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１３７】
ＬＣ／ＭＳ：８４９．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−７］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ5Ｈ10−ＮＨ2（化合物７）の製造
実施例１−１と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−１，２−エチレンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−１，５−ペンタンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物１４８ｍｇを得た。【０１３８】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．１６−１．５６（６Ｈ、ｍ）、１．８１−１．９７（２Ｈ、ｍ）、２．２１−２．２９（２Ｈ、ｍ）、２．６９−３．０６（６Ｈ、ｍ）、３．２３（３Ｈ、ｓ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２５−４．５０（３Ｈ、ｍ）、４．８０（２Ｈ、ｓ）、６．６５（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．０８−７．２４（１０Ｈ、ｍ）、７．５０（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６０−７．８９（５Ｈ、ｍ）、８．１０−８．１６（２Ｈ、ｍ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１３９】
ＬＣ／ＭＳ：８４７．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−８］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−Ｌｙｓ−ＯＭｅ（化合物８）の製造
実施例１−２と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジンメチルエステルを用いて、黄色粉末の標題化合物１７８ｍｇを得た。【０１４０】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．２５−１．３４（４Ｈ、ｍ）、１．５６−１．６９（２Ｈ、ｍ）、１．7５−１．９０（２Ｈ、ｍ）、２．１８−２．２５（２Ｈ、ｂｒ．ｔ）、２．５０−２．６０（２Ｈ、ｍ）、２．６５−３．０７（４Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．５４（３Ｈ、ｓ）、３．６０（３Ｈ、ｓ）、４．１５−４．６０（４Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６３（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．００−７．２５（１０Ｈ、ｍ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６２（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．８０（１Ｈ、ｄ）、８．０５（１Ｈ、ｄ）、８．１６（１Ｈ、ｄ）、８．３０（１Ｈ、ｄ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１４１】
ＬＣ／ＭＳ：９０５．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−９］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物９）の製造
実施例１−２（ａ）の工程のＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシグリシンを用いた以外は、実施例１−２と同様の方法で、黄色粉末の標題化合物５２８ｍｇを得た。【０１４２】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５１−１．６４（４Ｈ、ｍ）、１．８４−１．９４（２Ｈ、ｍ）、２．２１−２．３０（２Ｈ、ｍ）、２．５５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ）、２．７８−２．９２（１Ｈ、ｍ）、３．０３−３．７６（１７Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２６−４．５２（２Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６３（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．１１−７．２４（５Ｈ、ｍ）、７．４７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６２−７．７２（４Ｈ、ｍ）、８．０４−８．１６（２Ｈ、ｍ）、８．２８（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１４３】
ＬＣ／ＭＳ：８７５．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１０］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ2−ＮＨ2（化合物１０）の製造
実施例１−９と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，９−ジオキサ−１，１２−ドデカンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物３００ｍｇを得た。【０１４４】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．４７−１．５０（４Ｈ、ｍ）、１．５４−１．６０（４Ｈ、ｍ）、１．８２−１．９５（２Ｈ、ｍ）、２．２５−２．２８（２Ｈ、ｍ）、２．５８（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．８２−２．８７（１Ｈ、ｍ）、３．０２−３．０７（３Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．４１（８Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、３．５５−３．６３（２Ｈ、ｍ）、４．２８−４．４７（２Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６０（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．０９−７．１８（５Ｈ、ｍ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．５９（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．６６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、８．０２（１Ｈ、ｄ）、８．０８（１Ｈ、ｄ）、８．２６（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１４５】
ＬＣ／ＭＳ：８５９．３（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１１］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨ−Ｃ8Ｈ16Ｏ2−ＮＨ2（化合物１１）の製造
実施例１−９と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７−ジオキサ−１，１０−デカンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物３００ｍｇを得た。【０１４６】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５３−１．６２（４Ｈ、ｍ）、１．８２−１．９２（２Ｈ、ｍ）、２．２０−２．２７（２Ｈ、ｍ）、２．５０−２．６０（２Ｈ、ｔ）、２．８１−２．８６（１Ｈ、ｍ）、２．９７−３．０８（３Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．４７（８Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、３．５５−３．７３（２Ｈ、ｍ）、４．２４−４．４７（２Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６０（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ）、７．１２−７．２１（５Ｈ、ｍ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６０（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．６３（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６９（２Ｈ、ｄ）、８．０３（１Ｈ、ｄ）、８．１０（１Ｈ、ｄ）、８．２８（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１４７】
ＬＣ／ＭＳ：８３１．３（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１２］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨ−Ｃ6Ｈ12Ｏ2−ＮＨ2（化合物１２）の製造
実施例１−９と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物１８１ｍｇを得た。【０１４８】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．８３−１．９２（２Ｈ、ｍ）、２．２１−２．２７（２Ｈ、ｍ）、２．６０−２．６５（２Ｈ、ｔ）、２．７５−３．１０（２Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２３−３．４６（１０Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、３．５５−３．７５（２Ｈ、ｍ）、４．２５−４．５２（２Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．１０−７．２０（５Ｈ、ｍ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６３−７．７２（４Ｈ、ｍ）、８．００（１Ｈ、ｄ）、８．１０（１Ｈ、ｄ）、８．２７（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１４９】
ＬＣ／ＭＳ：８０３．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１３］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨ−Ｃ4Ｈ8Ｏ−ＮＨ2（化合物１３）。【０１５０】
実施例１−９と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−オキサ−１，５−ペンタンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物３１８ｍｇを得た。【０１５１】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．８２−１．９５（２Ｈ、ｍ）、２．２２−２．２７（２Ｈ、ｍ）、２．５９−２．６４（２Ｈ、ｔ）、２．７３−３．１５（２Ｈ、ｍ）、３．２３（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．３８（６Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、３．４６−３．７７（２Ｈ、ｍ）、４．２３−４．５１（２Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６２（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．１０−７．１７（５Ｈ、ｍ）、７．４７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６３−７．７５（４Ｈ、ｍ）、８．０２（１Ｈ、ｄ）、８．１１（１Ｈ、ｄ）、８．２７（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１５２】
ＬＣ／ＭＳ：７５９．３（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１４］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｒｏ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物１４）の製造
実施例１−２（ａ）の工程でＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−プロリンを用いた以外は、実施例１−２と同様の方法で、黄色粉末の標題化合物３８２ｍｇを得た。【０１５３】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１，４９−２．０３（１０Ｈ、ｍ）、２．１９−２．３０（２Ｈ、ｍ）、２．５５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．６２−３．６９（２１Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２８−４．３８（１Ｈ、ｍ）、４．６３−４．７５（１Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６０（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．１４−７．２９（５Ｈ、ｍ）、７．４７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６６−７．７２（４Ｈ、ｍ）、７．９４−８．１０（２Ｈ、ｍ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１５４】
ＬＣ／ＭＳ：９１５．３（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１５］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅβＡｌａ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物１５）の製造
実施例１−２（ａ）の工程でＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−β−アラニンを用いた以外は、実施例１−２と同様の方法で、黄色粉末の標題化合物１８０ｍｇを得た。【０１５５】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５２−１．６２（４Ｈ、ｍ）、１．７８−１．９５（２Ｈ、ｍ）、２．１６−２．２２（４Ｈ、ｍ）、２．５６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、２．７１−３．４８（２１Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．１０（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、４．２１−４．３０（１Ｈ、ｍ）、４．３８−４．４９（１Ｈ、ｍ）、４．８０（２Ｈ、ｓ）、６．５９（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．１０−７．２１（５Ｈ、ｍ）、７．４３（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６５−７．７４（３Ｈ、ｍ）、７．８３−７．８９（２Ｈ、ｍ）、７．９６（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．０８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１５６】
ＬＣ／ＭＳ：８８９．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１６］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅβＡｌａ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ4−ＮＨ2（化合物１６）の製造
実施例１−１（ａ）の工程でＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−β−アラニンを用いた以外は、実施例１−１と同様の方法で、黄色粉末の標題化合物１９４ｍｇを得た。【０１５７】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．８０−１．９４（２Ｈ、ｍ）、２．１８−２．２６（４Ｈ、ｍ）、２．５４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．１Ｈｚ）、２．７４−３．０８（６Ｈ、ｍ）、３．２３（３Ｈ、ｓ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２４−４．４８（２Ｈ、ｍ）、４．８０（２Ｈ、ｓ）、６．５９（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．１３（５Ｈ、ｓ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６５−７．８６（５Ｈ、ｍ）、７．９６（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．０９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１５８】
ＬＣ／ＭＳ：７２９．３（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１７］
ＭＴＸ−α−Ｐｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物１７）の製造
実施例１−２（ｂ）の工程を省略した以外は実施例１−２と同様の方法で、黄色粉末の標題化合物４９６ｍｇを得た。【０１５９】
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．４９−１．５９（４Ｈ、ｍ）、１．８２−１．８９（２Ｈ、ｍ）、２．１９−２．２７（２Ｈ、ｍ）、２．５５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．７３−３．１０（４Ｈ、ｍ）、３．２３（３Ｈ、ｓ）、３．１７−３．４８（１２Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２１−４．２８（１Ｈ、ｍ）、４．３８−４．４５（１Ｈ、ｍ）、４．８０（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ），６．８３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ）、７．１１−７．２０（５Ｈ、ｍ）、７．４６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．８３（１Ｈ、ｔ）、７．９２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、８．１２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１６０】
ＬＣ／ＭＳ：８１８．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１８］
ＭＴＸ−α−Ｉｌｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物１８）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−イソロイシンを用いて、黄色粉末の標題化合物５６２ｍｇを得た。【０１６１】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ０．７６−０．８０（６Ｈ、ｍ）、０．９９−１．１０（１Ｈ、ｍ）、１．３６−１．４５（１Ｈ、ｍ）、１．４９−１．７３（５Ｈ、ｍ）、１．８８−２．０７（２Ｈ、ｍ）、２．３３−２．３８（２Ｈ、ｍ）、２．５５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．９８−３．４８（１４Ｈ、ｍ）、３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、４．０５−４．１３（１Ｈ、ｍ）、４．４０−４．４８（１Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６０（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．４６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６６−７．７２（３Ｈ、ｍ）、７．９８（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．１２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）
ＬＣ／ＭＳ：７８４．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−１９］
ＭＴＸ−α−Ｉｌｅ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ4−ＮＨ2（化合物１９）
実施例１−１８と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−１，２−エチレンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物３２０ｍｇを得た。【０１６２】
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ０．７６−０．８０（６Ｈ、ｍ）、０．９６−１．０８（１Ｈ、ｍ）、１．３４−１．４８（１Ｈ、ｍ）、１．６２−１．７０（１Ｈ、ｍ）、１．８５−２．０３（２Ｈ、ｍ）、２．３６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、２．９５−３．０８（２Ｈ、ｍ）、３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、４．０６−４．１２（１Ｈ、ｍ）、４．３８−４．４５（１Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．４３（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６４−７．７２（４Ｈ、ｍ）、７．９２（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．７Ｈｚ）、８．１２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、８．５７（１Ｈ、ｓ）。【０１６３】
ＬＣ／ＭＳ：６２４．２（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２０］
ＭＴＸ−α−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２０）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いて、黄色粉末の標題化合物６００ｍｇを得た。【０１６４】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５０−２．０３（８Ｈ、ｍ）、２．２４−２．３１（２Ｈ、ｔ）、２．３４−２．４０（２Ｈ、ｔ）、２．４９−２．５７（２Ｈ、ｔ）、２．９７−３．５２（１４Ｈ、ｍ）、３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．５３（３Ｈ、ｓ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．１５−４．３６（２Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．４６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．８４（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．９５（１Ｈ、ｄ）、８．１４（１Ｈ、ｄ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１６５】
ＬＣ／ＭＳ：８１４．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２１］
ＭＴＸ−α−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−ＮＨ−Ｃ2Ｈ4−ＮＨ2（化合物２１）の製造
実施例１−２０と同様の方法で、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの代わりにＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−１，２−エチレンジアミンを用いて、黄色粉末の標題化合物２８３ｍｇを得た。【０１６６】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．７１−２．０９（４Ｈ、ｍ）、２．２８（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、２．３９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、２．５３（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．１Ｈｚ）、２．９９−３．０５（２Ｈ、ｍ）、３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．５４（３Ｈ、ｓ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、４．１４−４．３６（２Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．４３（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６５−７．７９（４Ｈ、ｍ）、７．９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、８．１４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１６７】
ＬＣ／ＭＳ：６５４．１（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２２］
ＭＴＸ−α−Ｔｙｒ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２２）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−チロシンを用いて、黄色粉末の標題化合物１３３ｍｇを得た。【０１６８】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５１−１．６２（４Ｈ、ｍ）、１．８５−１．９５（２Ｈ、ｍ）、２．２３−２．３１（２Ｈ、ｍ）、２．５１−２．５８（２Ｈ、ｔ）、２．６３−２．９１（２Ｈ、ｍ）、２．９５−３．１６（２Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２７−３．５４（１２Ｈ、ｍ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、４．２２−４．３５（２Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．５７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、６．９２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．４７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６７−７．８８（５Ｈ、ｍ）、８．１３（１Ｈ、ｄ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１６９】
ＬＣ／ＭＳ：８３４．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２３］
ＭＴＸ−α−Ｔｒｐ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２３）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−トリプトファンを用いて、黄色粉末の標題化合物１７１ｍｇを得た。【０１７０】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５０−１．６１（４Ｈ、ｍ）、１．８４−１．９７（２Ｈ、ｍ）、２．２３−２．３２（２Ｈ、ｍ）、２．５０−２．５６（２Ｈ、ｔ）、２．９２−３．１５（４Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２９−３．４５（１２Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２９−４．４９（２Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６４（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８０（２Ｈ、ｄ）、６．９２（１Ｈ、ｔ）、７．０４（１Ｈ、ｔ）、７．１０（１Ｈ、ｓ）、７．２６（１Ｈ、ｄ）、７．４４（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．５１（１Ｈ、ｄ）、７．６５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６９（２Ｈ、ｄ）、７．８２（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．９３（１Ｈ、ｄ）、８．１０（１Ｈ、ｄ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）、１０．８０（１Ｈ、ｓ）。【０１７１】
ＬＣ／ＭＳ：８５７．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２４］
ＭＴＸ−α−Ｓｅｒ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２４）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンを用いて、黄色粉末の標題化合物４１６ｍｇを得た。【０１７２】
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５０−１．６３（４Ｈ、ｍ）、１．９０−２．０８（４Ｈ、ｍ）、２．３９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、２．５５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．０５−３．４８（１６Ｈ、ｍ）３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、４．１３−４．２０（１Ｈ、ｍ）、４．３３−４．４１（１Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．４４（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６６−７．８０（５Ｈ、ｍ）、８．１９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１７３】
ＬＣ／ＭＳ：７５８．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２５］
ＭＴＸ−α−Ｌｅｕ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２５）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシンを用いて、黄色粉末の標題化合物２８３ｍｇを得た。【０１７４】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ０．８０−０．８７（６Ｈ、ｄ）、１．４３−１．６４（７Ｈ、ｍ）、１．９０−２．０６（２Ｈ、ｍ）、２．３４−２．３０（２Ｈ、ｔ）、２．５３−２．５８（２Ｈ、ｔ）、３．０４−３．０８（２Ｈ、ｍ）、３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．３３−３．４７（１２Ｈ、ｍ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、４．１９−４．３７（２Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６２（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６４−７．８５（５Ｈ、ｍ）、８．１０（１Ｈ、ｄ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）
ＬＣ／ＭＳ：７８４．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２６］
ＭＴＸ−α−Ｖａｌ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２６）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−バリンを用いて、黄色粉末の標題化合物５９０ｍｇを得た。【０１７５】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ０．７９（６Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、１．５２−１．５９（４Ｈ、ｍ）、１．８５−２．０４（３Ｈ、ｍ）、２．３３−２．３５（２Ｈ、ｔ）、２．５６−２．５８（２Ｈ、ｔ）、２．９３−３．５５（１４Ｈ、ｍ）、３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、４．０３−４．０８（１Ｈ、ｍ）、４．４２−４．４７（１Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６２（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．４５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６１−７．７２（４Ｈ、ｍ）、７．９８（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．１３（１Ｈ、ｄ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）
ＬＣ／ＭＳ：７７０．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２７］
ＭＴＸ−α−Ｈｉｓ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２７）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ヒスチジンを用いて、黄色粉末の標題化合物８１ｍｇを得た。【０１７６】
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．４９−１．５８（４Ｈ、ｍ）、１．９０−２．０４（２Ｈ、ｍ）、２．３９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．５５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、２．８３（２Ｈ、ｍ）、３．０２（２Ｈ、ｍ）、３．１６−３．４７（１２Ｈ、ｍ）、３．２３（３Ｈ、ｓ）、３．５７（３Ｈ、ｓ）、４．２２（１Ｈ、ｍ）、４．３２（１Ｈ、ｍ）、４．８０（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．７２（１Ｈ、ｓ）、６．８４（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．１０−７．７０（５Ｈ、ｍ）、７．７７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、８．３６（１Ｈ、ｂｒ）、８．５７（１Ｈ、ｓ）。【０１７７】
ＬＣ／ＭＳ：８０８．３（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２８］
ＭＴＸ−α−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２８）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−プロリンを用いて、黄色粉末の標題化合物６８３ｍｇを得た。【０１７８】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５８（４Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ）、１．６９−２．１０（６Ｈ、ｍ）、２．４４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、２．６０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、２．９１−３．７５（１９Ｈ、ｍ）、３．５７（３Ｈ、ｓ）、４．１８−４．２５（１Ｈ、ｍ）、４．６１−４．７２（１Ｈ、ｍ）、４．７７（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．４４（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６９−７．８０（４Ｈ、ｍ）、８．１５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１７９】
ＬＣ／ＭＳ：７６８．３（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−２９］
ＭＴＸ−α−βＡｌａ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２９）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−β−アラニンを用いて、黄色粉末の標題化合物２３０ｍｇを得た。【０１８０】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．４９−１．６２（４Ｈ、ｍ）、１．７９−２．０２（２Ｈ、ｍ）、２．２１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、２．３２（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、２．５６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．００−３．６１（１９Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２９−４．３８（１Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．４３（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６１−７．９１（３Ｈ、ｍ）、７．７２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、８．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１８１】
ＬＣ／ＭＳ：７４２．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３０］
ＭＴＸ−γ−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物３０）の製造
実施例１−２と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−α−メチルエステルを用いて、黄色粉末の標題化合物３１２ｍｇを得た。【０１８２】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．４９−１．６０（４Ｈ、ｍ）、１．７６−１．９８（２Ｈ、ｍ）、２．０９−２．２０（２Ｈ、ｍ）、２．５６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．６２−３．１６（６Ｈ、ｍ）、３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．２７−３．４８（１２Ｈ、ｍ）、３．５９（３Ｈ、ｓ）、４．２７−４．５３（３Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．１６−７．２３（１０Ｈ、ｍ）、７．４８（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６８−７．７４（３Ｈ、ｍ）、７．８３（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、８．０１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、８．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、８．３６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１８３】
ＬＣ／ＭＳ：９６５．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３１］
ＭＴＸ−γ−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ6Ｈ12Ｏ2−ＮＨ2（化合物３１）の製造
実施例１−５と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−α−メチルエステルを用いて、黄色粉末の標題化合物８０ｍｇを得た。【０１８４】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．７５−１．９７（２Ｈ、ｍ）、２．０８−２．１７（２Ｈ、ｍ）、２．５９−２．６２（２Ｈ、ｔ）、２．５８−３．０５（６Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．１５−３．５２（８Ｈ、ｍ）、３．５９（３Ｈ、ｓ）、４．２３−４．５２（３Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６３（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．１１−７．２１（１０Ｈ、ｍ）、７．４４（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７０（２Ｈ、ｄ）、７．９４−８．１２（３Ｈ、ｍ）、８．３５（１Ｈ、ｄ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）
ＬＣ／ＭＳ：８９３．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３２］
ＭＴＸ−γ−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ4Ｈ8Ｏ−ＮＨ2（化合物３２）の製造
実施例１−６と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−α−メチルエステルを用いて、黄色粉末の標題化合物４９ｍｇを得た。【０１８５】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．７３−１．９７（２Ｈ、ｍ）、２．０８−２．１８（２Ｈ、ｍ）、２．６０−２．６５（２Ｈ、ｔ）、２．５９−３．０２（６Ｈ、ｍ）、３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．１３−３．４４（４Ｈ、ｍ）、３．５９（３Ｈ、ｓ）、４．２５−４．５３（３Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６３（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．０９−７．２５（１０Ｈ、ｍ）、７．４３（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．９５−８．１０（３Ｈ、ｍ）、８．３６（１Ｈ、ｄ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１８６】
ＬＣ／ＭＳ：８４９．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３３］
ＭＴＸ−γ−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物３３）の製造
実施例１−９と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−α−メチルエステルを用いて、黄色粉末の標題化合物６９３ｍｇを得た。【０１８７】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５０−１．６８（４Ｈ、ｍ）、１．８０−２．０２（２Ｈ、ｍ）、２．１２−２．２７（２Ｈ、ｍ）、２．５５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、２．７１−２．７９（１Ｈ、ｍ）、２．９６−３．１４（３Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．３８−３．７４（１２Ｈ、ｍ）、３．５９（３Ｈ、ｓ）、４．２８−４．４８（２Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６２（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．１４−７．２８（５Ｈ、ｍ）、７．４７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６３−７．７３（４Ｈ、ｍ）、８．１９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、８．２９−８．３６（２Ｈ、ｍ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１８８】
ＬＣ／ＭＳ：８７５．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３４］
ＭＴＸ−γ−Ｐｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物３４）の製造
実施例１−１７と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−α−メチルエステルを用いて、黄色粉末の標題化合物４８０ｍｇを得た。【０１８９】
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．４９−１．５８（４Ｈ、ｍ）、１．７９−２．００（２Ｈ、ｍ）、２．１０−２．２７（２Ｈ、ｍ）、２．５５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、２．６９−２．９３（２Ｈ、ｍ）、２．９６−３．１２（２Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２６−３．４８（１２Ｈ、ｍ）、３．５９（３Ｈ、ｓ）、４．２５−４．３３（１Ｈ、ｍ）、４．３８−４．４６（１Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６２（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．１０−７．２４（５Ｈ、ｍ）、７．４４（１Ｈ、ｂｒ）、７．７０（１Ｈ、ｂｒ）、７．７２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．９５（１Ｈ、ｔ）、８．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、８．３５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１９０】
ＬＣ／ＭＳ：８１８．４（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３５］
ＭＴＸ−γ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物３５）の製造
実施例１−２０と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸−α−メチルエステルを用いて、黄色粉末の標題化合物４３８ｍｇを得た。【０１９１】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５２−２．０６（８Ｈ、ｍ）、２．２２−２．３０（４Ｈ、ｍ）、２．５３−２．５８（２Ｈ、ｔ）、３．０３−３．１５（２Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．５４（１２Ｈ、ｍ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、３．６１（３Ｈ、ｓ）、４．１３−４．４０（２Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６３（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．４４（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．９０（１Ｈ、ｂｒ．ｔ）、７．９９（１Ｈ、ｄ）、８．３７（１Ｈ、ｄ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１９２】
ＬＣ／ＭＳ：８１４．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３６］
ＭＴＸ−α−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物３６）の製造
実施例１−２と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｄ−フェニルアラニンを用いて、黄色粉末の標題化合物３１３ｍｇを得た。【０１９３】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．４０−１．５９（４Ｈ、ｍ）、１．７４−１．８３（２Ｈ、ｍ）、２．０４−２．１１（２Ｈ、ｍ）、２．５６−２．５８（２Ｈ、ｔ）、２．５９−３．１２（６Ｈ、ｍ）、３．２１（３Ｈ、ｓ）、３．１７−３．５１（１２Ｈ、ｍ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２４−４．４４（３Ｈ、ｍ）、４．７８（２Ｈ、ｓ）、６．６２（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．１０−７．２６（１０Ｈ、ｍ）、７．４５（２Ｈ、ｍ）、７．６４（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．７２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、８．１８（２Ｈ、ｍ）、８．４３（１Ｈ、ｄ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）。【０１９４】
ＬＣ／ＭＳ：９６５．６（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３７］
ＭＴＸ−γ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物３７）の製造
実施例１−３０と同様の方法で、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｄ−フェニルアラニンを用いて、黄色粉末の標題化合物８５ｍｇを得た。【０１９５】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５１−１．６１（４Ｈ、ｍ）、１．７４−２．０２（２Ｈ、ｍ）、２．１１−２．１６（２Ｈ、ｍ）、２．５４−２．５９（２Ｈ、ｔ）、２．６２−３．１２（６Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．２５−３．５３（１２Ｈ、ｍ）、３．６０（３Ｈ、ｓ）、４．３１−４．４６（３Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６１（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．０８−７．２６（１０Ｈ、ｍ）、７．４４（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、７．６６−７．７７（４Ｈ、ｍ）、８．０６（２Ｈ、ｍ）、８．３６（１Ｈ、ｄ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１９６】
ＬＣ／ＭＳ：９６５．６（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３８］
ＭＴＸ−α−ＡｓｎＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物３８）の製造
実施例１−２と同様に、通常のペプチド合成法に従ってペプチド鎖を伸張し、黄色粉末の標題化合物１４５ｍｇを得た。【０１９７】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５２−１．５９（４Ｈ、ｍ）、１．８７−２．０２（２Ｈ、ｍ）、２．３２−３．４８（２４Ｈ、ｍ）、３．２２（３Ｈ、ｓ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、４．２４−４．５６（４Ｈ、ｍ）、４．７９（２Ｈ、ｓ）、６．６０（２Ｈ、ｂｒ．ｓ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．０４−７．７５（１７Ｈ、ｍ）、８．０７−８．２６（４Ｈ、ｍ）、８．５６（１Ｈ、ｓ）。【０１９８】
ＬＣ／ＭＳ：１０７９．５（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例１−３９］
ＭＴＸ−α／γ−ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物３９）の製造
実施例１−２と同様に、通常のペプチド合成法に従ってペプチド鎖を伸張し、黄色粉末の化合物７２３ｍｇを得た。ＬＣ／ＭＳ解析により、精製過程で異性化を生じα／γの混合物（α：γ＝３：１）となっていること（化合物３９）を確認した。【０１９９】
ＬＣ／ＭＳ：１０４５．７（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例２−１］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5の製造
ＭＴＸ（Ｅｔ）−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２’：５００ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）をジメチルアセタミド５．１ｍＬに溶解し、−１０℃で、フェニルクロロフォルメート（７０．９μＬ、０．５６ｍｍｏｌ）を加え８０分撹拌した。反応液に、酢酸エチル２０ｍＬ、ｎ−ヘキサン１０ｍＬ、水２０ｍＬを加え、析出した沈殿をろ取し、黄色粉末の標題化合物４９２ｍｇを得た。【０２００】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．１３（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、１．４９−１．９５（６Ｈ、ｍ）、２．１９−２．２８（２Ｈ、ｍ）、２．７４−３．１６（８Ｈ、ｍ）、３．２４（３Ｈ、ｓ）、３．２７−３．４９（１２Ｈ、ｍ）、４．００（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、４．２８−４．５２（３Ｈ、ｍ）、４．８５（２Ｈ、ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．０７−７．３８（１５Ｈ、ｍ）、７．７１−７．８９（６Ｈ、ｍ）、８．０９−８．１８（２Ｈ、ｍ）、８．４７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、８．６５（１Ｈ、ｓ）、８．６５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）。【０２０１】
ＬＣ／ＭＳ：１０９９．４（Ｍ＋Ｈ+）、１１２１．５（Ｍ＋Ｎａ+）。
［実施例２−２］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2の製造
ＭＴＸ（Ｅｔ）−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物２’：５０９ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）をジメチルアセタミド５．２ｍＬに溶解し、氷冷下、ｐ−ニトロフェニルクロロフォルメート（１１５ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を加え９０分撹拌した。反応液に、酢酸エチル２０ｍＬ、ｎ−ヘキサン１０ｍＬ、水２０ｍＬを加え、析出した沈殿をろ取し、黄色粉末の標題化合物４８９ｍｇを得た。【０２０２】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．１３（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、１．５０−１．９５（６Ｈ、ｍ）、２．１９−２．２８（２Ｈ、ｍ）、２．７１−３．２０（８Ｈ、ｍ）、３．２４（３Ｈ、ｓ）、３．２７−３．４９（１２Ｈ、ｍ）、４．００（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、４．３０−４．５２（３Ｈ、ｍ）、４．８５（２Ｈ、ｓ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．０９−７．２１（１０Ｈ、ｍ）、７．３９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ）、７．７１−７．９０（５Ｈ、ｍ）、８．０２−８．１８（３Ｈ、ｍ）、８．２４（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ）、８．５５（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）、８．６５（１Ｈ、ｓ）、８．７６（１Ｈ、ｂｒ．ｓ）。【０２０３】
ＬＣ／ＭＳ：１１４４．４（Ｍ＋Ｈ+）、１１６６．４（Ｍ＋Ｎａ+）。
［実施例２−３］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（２ＴＦＡ塩）の製造
実施例２−１と同様の方法で、ＭＴＸ（Ｅｔ）−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2の代わりにＭＴＸ−α−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物９）を用いて反応を行なった後に、溶媒として０．１％ＴＦＡ−ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏを用いたＨＰＬＣ分取を行い、黄色粉末の標題化合物５７．６ｍｇを得た。【０２０４】
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．５８（２Ｈ，ｍ）、１．６８（２Ｈ，ｍ）、１．９０（２Ｈ，ｍ）、２．２４（２Ｈ，ｍ）、２．８３（２Ｈ，ｍ）、３．０３−３．６７（１６Ｈ，ｍ）、３．２５（３Ｈ，ｓ）、３．５５（３Ｈ，ｓ）、４．３０（１Ｈ，ｍ）、４．４４（１Ｈ，ｍ）、４．８８（２Ｈ、ｓ）、６．８２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．０７−７．１７（５Ｈ，ｍ）、７．３６（２Ｈ，ｍ）、７．５０（１Ｈ，ｂｒ）、７．６１（１Ｈ，ｍ）、７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、８．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、８．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）、８．２７（１Ｈ，ｍ）、８．６２（１Ｈ，ｂｒ）、８．７１（１Ｈ，ｓ）、９．０９（１Ｈ，ｓ）、９．２９（１Ｈ，ｓ）。
ＬＣ／ＭＳ：９９５．３（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例２−４］
ＭＴＸ−α−Ｉｌｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5(２ＴＦＡ塩)の製造
実施例２−１と同様の方法で、ＭＴＸ（Ｅｔ）−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2の代わりにＭＴＸ−α−Ｉｌｅ−ＮＨ−Ｃ10Ｈ20Ｏ3−ＮＨ2（化合物１８）を用いて反応を行なった後に、溶媒として０．１％ＴＦＡ−ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏを用いたＨＰＬＣ分取を行い、黄色粉末の標題化合物１２７．９ｍｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ０．７７（３Ｈ，ｍ）、１．０２（１Ｈ，ｍ）、１．３８（１Ｈ，ｍ），１．５７−１．７０（４Ｈ，ｍ）、１．９０−２．０７（２Ｈ，ｍ）、２．０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ）、２．３４（２Ｈ，ｍ）、３．００−３．５５（１８Ｈ，ｍ）、３．２５（３Ｈ，ｓ）、４．０６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、４．４２（１Ｈ，ｍ）、４．８７（２Ｈ，ｓ）、６．８２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．１９（１Ｈ，ｍ）、７．３５（２Ｈ，ｍ）、７．５０（１Ｈ，ｂｒ）、７．７１（４Ｈ，ｍ）、７．９７（１Ｈ，ｍ）、８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、８．６２（１Ｈ，ｂｒ）、８．７１（１Ｈ，ｓ）、９．１０（１Ｈ，ｓ）、９．２９（１Ｈ，ｓ）。【０２０５】
ＬＣ／ＭＳ：９０４．２（Ｍ＋Ｈ+）。
［実施例２−５］
上記実施例２−１と同様にして、実施例１−１〜１−８、１−１０〜１−１７、１−１９〜１−３８の化合物をそれぞれフェニルカルバメート体に変換することが可能であった。
［実施例２−６］
上記実施例２−２と同様にして、実施例１−１〜１−３８の化合物をそれぞれｐ−ニトロフェニルカルバメート体に変換することが可能であった。
［実施例３−１］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
ヒアルロン酸ナトリウム塩（２００mｇ、分子量：約２５０万）に、セチルピリジニウムクロライド（０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解した液を添加した後、減圧濃縮した。この残渣に、実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．０１０mmoｌ）をジクロロメタン：メタノール=９：１（１０ｍＬ）に溶解した液を添加した後、減圧濃縮し、さらに真空乾燥した。この残渣に、トリブチルアミン（０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解した液を添加した後、減圧濃縮した。この残渣に超純水（７５ｍＬ）を添加し、室温で１時間撹拌した。この反応液に塩化ナトリウム（２．２５g）を添加し、室温で１．５時間撹拌した後、エタノール（７５ｍＬ）をゆっくり添加し、室温で１時間撹拌した。この溶液にエタノール（７５ｍＬ）を滴下してエタノール析出を行い、析出物を遠心分離により分離した。【０２０６】
析出物を超純水（６０ｍＬ）に溶解し、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（７．５ｍＬ）を添加し、５℃にて２時間撹拌した。この溶液に１Ｎの塩酸（７．５ｍＬ）を添加することにより中和し、さらに塩化ナトリウム（２．２５g）を添加した後、エタノール（１５０ｍＬ）を滴下してエタノール析出を行い、析出物を遠心分離により分離した。【０２０７】
析出物を超純水（７５ｍＬ）に溶解し、塩化ナトリウム（２．２５g）を添加した後、エタノール（１５０ｍＬ）を滴下してエタノール析出を行い、析出物を遠心分離により分離した。【０２０８】
さらに析出物を超純水（１００ｍＬ）に溶解し、塩化ナトリウム（６g）を超純水（１００ｍＬ）に溶解した液を添加した後、０．４５μｍのフィルター（ステリベックスＨV：ミリポア）でろ過し、以後無菌的に濾液にエタノール（４００ｍＬ）を滴下してエタノール析出を行い、析出物を濾取し、真空乾燥した。【０２０９】
この析出物をリン酸緩衝液（２ｍＭリン酸ナトリウム、１５４ｍＭ塩化ナトリウム・pＨ７．２）（１５ｍＬ）に溶解し、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。【０２１０】
ヒアルロン酸を標準物質とするゲルろ過法により求めた分子量は約２４４万であった。また、得られた結合体のＭＴＸの結合率は、紫外吸収（２５９ｎm）を測定することにより算出したところ、１．０%であった。
1Ｈ―ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ１．６３−１．７０（ｍ）、１．７０−１．８１（ｍ）、１．８４−１．９３（ｍ）、２．０２（ｂｒ．ｓ）、２．１０−２．２０（ｍ）、２．６０（ｍ）、２．７８（ｍ）、２．９０（ｍ）、３．００（ｍ）、３．１３−３．２５（ｍ）、３．３３（ｓ）、３．３４（ｂｒ．ｓ）、３．５１（ｂｒ．ｓ）、３．５８（ｂｒ．ｓ）、３．６４（ｂｒ．ｓ）、３．７１（ｂｒ．ｓ）、３．８３（ｂｒ．ｓ）、４．１８（ｔ）、４．４５（ｂｒ．ｓ）、４．５６（ｂｒ．ｓ）、４．８８（ｄ）、４．９５（ｄ）、６．７７（ｄ）、６．９６−７．１０（ｍ）、７．７２（ｄ）、８．６７（ｓ）
［実施例３−２］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−１と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（２００ｍｇ、分子量：約２５０万）と実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．０２３ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−１と同様の方法で求めた分子量は約２４８万であり、ＭＴＸの結合率は１．８%であった。
1Ｈ―ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ１．６３−１．７０（ｍ）、１．７０−１．７９（ｍ）、１．８３−１．９０（ｍ）、１．９２−１．９５（ｍ）、２．０２（ｂｒ．ｓ）、２．１２−２．１９（ｍ）、２．５９（ｍ）、２．７８（ｍ）、２．９１（ｍ）、３．００（ｍ）、３．１２−３．１８（ｍ）、３．１８−３．２５（ｍ）、３．３３（ｓ）、３．３４（ｂｒ．ｓ）、３．５１（ｂｒ．ｓ）、３．５７（ｂｒ．ｓ）、３．６４（ｂｒ．ｓ）、３．７１（ｂｒ．ｓ）、３．８３（ｂｒ．ｓ）、４．１８（ｔ）、４．４６（ｂｒ．ｓ）、４．５５（ｂｒ．ｓ）、４．８８（ｄ）、４．９４（ｄ）、６．７７（ｄ）、６．９５−７．０９（ｍ）、７．７２（ｄ）、８．６７（ｓ）
［実施例３−３］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−１と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（２００ｍｇ、分子量：約２２０万）と実施例２−２で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2（０．０５０ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−１と同様の方法で求めた分子量は約２１０万であり、ＭＴＸの結合率は２．９%であった。
1Ｈ―ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ１．５９−１．６９（ｍ）、１．６９−１．８１（ｍ）、１．８２−１．９０（ｍ）、２．０２（ｂｒ．ｓ）、２．１２−２．２０（ｍ）、２．６０（ｍ）、２．７８（ｍ）、２．９０（ｍ）、３．００（ｍ）、３．１３−３．２６（ｍ）、３．３３（ｓ）、３．３５（ｂｒ．ｓ）、３．５２（ｂｒ．ｓ）、３．５８（ｂｒ．ｓ）、３．７１（ｂｒ．ｓ）、３．８４（ｂｒ．ｓ）４．１９（ｔ）、４．４６（ｂｒ．ｓ）、４．５６（ｂｒ．ｓ）、４．８７（ｄ）、４．９５（ｄ）、６．７８（ｄ）、６．９３−７．１０（ｍ）、７．７２（ｄ）、８．６７（ｓ）
［実施例３−４］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−１と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（２００ｍｇ、分子量：約２２０万）と実施例２−２で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2（０．０２５ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−１と同様の方法で求めた分子量は約２１６万であり、ＭＴＸの結合率は２．０%であった。
1Ｈ―ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ１．６１−１．７０（ｍ）、１．７０−１．８０（ｍ）、１．８２−１．９２（ｍ）、２．０２（ｂｒ．ｓ）、２．１２−２．２０（ｍ）、２．６０（ｍ）、２．７８（ｍ）、２．９０（ｍ）、３．０１（ｍ）、３．１２−３．２５（ｍ）、３．３３（ｓ）、３．３４（ｂｒ．ｓ）、３．５２（ｂｒ．ｓ）、３．５８（ｂｒ．ｓ）、３．７２（ｂｒ．ｓ）、３．８３（ｂｒ．ｓ）４．１８（ｔ）、４．４６（ｂｒ．ｓ）、４．５６（ｂｒ．ｓ）、４．８７（ｄ）、４．９５（ｄ）、６．７７（ｄ）、６．９５−７．１０（ｍ）、７．７２（ｄ）、８．６７（ｓ）
［実施例３−５］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−１と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（２００ｍｇ、分子量：約２２０万）と実施例２−２で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2（０．０１５ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−１と同様の方法で求めた分子量は約２１１万であり、ＭＴＸの結合率は１．６%であった。
1Ｈ―ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ１．６３−１．７１（ｍ）、１．７１−１．７９（ｍ）、１．８３−１．９０（ｍ）、２．０２（ｂｒ．ｓ）、２．１２−２．２０（ｍ）、２．６０（ｍ）、２．７８（ｍ）、２．９０（ｍ）、３．０１（ｍ）、３．１２−３．２５（ｍ）、３．３３（ｓ）、３．３４（ｂｒ．ｓ）、３．５２（ｂｒ．ｓ）、３．５８（ｂｒ．ｓ）、３．７２（ｂｒ．ｓ）、３．８３（ｂｒ．ｓ）４．１８（ｔ）、４．４６（ｂｒ．ｓ）、４．５６（ｂｒ．ｓ）、４．８８（ｄ）、４．９５（ｄ）、６．７７（ｄ）、６．９５−７．１０（ｍ）、７．７３（ｄ）、８．６７（ｓ）
［実施例３−６］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
ヒアルロン酸ナトリウム塩（１００ｍｇ，分子量：約２３０万）にセチルピリジニウムクロライド（０．２５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解した液と、実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．００４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン：メタノール＝８：２（５ｍＬ）に溶解した液を添加した後、減圧濃縮し、さらに真空乾燥した。この残渣に、トリブチルアミン（０．２５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した液を添加した後、減圧濃縮した。この残渣に超純水（４０ｍＬ）を添加し、５℃で１．５時間撹拌した。この反応液に塩化ナトリウム（１．１７ｇ）を超純水（５ｍＬ）に溶解した液を添加し、室温で１時間撹拌した。この溶液にエタノール（９０ｍＬ）をゆっくり滴下してエタノール析出を行い、室温で１時間撹拌した後、析出物を遠心分離により分離した。【０２１１】
析出物を超純水（３５ｍＬ）に溶解し、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（５ｍＬ）を添加し、５℃にて１時間攪拌した。この溶液に１Ｎの塩酸（５ｍＬ）を添加することにより中和し、さらに塩化ナトリウム（１．１７ｇ）を超純水（５ｍＬ）に溶解した液を添加したのち、エタノール（１００ｍＬ）を滴下してエタノール析出を行い、析出物を遠心分離により分離した。【０２１２】
析出物を超純水（４０ｍＬ）に溶解し、塩化ナトリウム（１．１７ｇ）を超純水（５ｍＬ）に溶解した液を添加した後、エタノール（１００ｍＬ）を滴下してエタノール析出を行い、析出物を遠心分離により分離した。【０２１３】
さらに析出物を超純水（５０ｍＬ）に溶解し、塩化ナトリウム（３ｇ）を超純水（５０ｍＬ）に溶解した液を添加したのち、０．４５μｍのフィルター（ステリベックスＨＶ：ミリポア）でろ過し、以後無菌的にろ液にエタノール（２００ｍＬ）を滴下してエタノール析出を行い、析出物をろ取し、真空乾燥した。【０２１４】
この析出物をリン酸緩衝液（２ｍＭリン酸ナトリウム、１５４ｍＭ塩化ナトリウム、pH７．２）（８．６ｍＬ）に溶解し、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。ヒアルロン酸を標準物質とするゲルろ過法により求めた分子量は約２１６万であった。また、得られた結合体のＭＴＸの結合率は、紫外吸収（３０４ｎｍ）を測定することにより算出したところ、１．１％であった。
［実施例３−７］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（５００ｍｇ，分子量：約２３０万）と実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．０４０ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約２１０万、ＭＴＸの結合率は２．０％であった。
［実施例３−８］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（５００ｍｇ，分子量：約２３０万）と実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．０６３ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約２１３万、ＭＴＸの結合率は２．５％であった。
［実施例３−９］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（５００ｍｇ，分子量：約２３０万）と実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．０４４ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約２３２万、ＭＴＸの結合率は２．６％であった。
［実施例３−１０］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（５００ｍｇ，分子量：約２３０万）と実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．０９４ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約２０５万、ＭＴＸの結合率は３．８％であった。
［実施例３−１１］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（１００ｍｇ，分子量：約８６万）と実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．００４ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約８６万、ＭＴＸの結合率は１．２％であった。
［実施例３−１２］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（１００ｍｇ，分子量：約８６万）と実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．００８ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約８３万、ＭＴＸの結合率は２．０％であった。
［実施例３−１３］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（１００ｍｇ，分子量：約８６万）と実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．０１９ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約８５万、ＭＴＸの結合率は３．３％であった。
［実施例３−１４］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（１００ｍｇ，分子量：約３５万）と実施例２−１で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＰｈｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．００４ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約３５万、ＭＴＸの結合率は１．１％であった。
［実施例３−１５］
ＭＴＸ−α−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（１００ｍｇ，分子量：約２３０万）と実施例２−３で得られたＭＴＸ−α−ＰｈｅＧｌｙ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．００８ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約２３２万、ＭＴＸの結合率は２．４％であった。
［実施例３−１６］
ＭＴＸ−α−Ｉｌｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−［ＨＡ］の製造
実施例３−６と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（１００ｍｇ，分子量：約２３０万）と実施例２−４で得られたＭＴＸ−α−Ｉｌｅ−ＮＨＣ10Ｈ20Ｏ3ＮＨＣＯ−Ｏ−Ｃ6Ｈ5（０．００８ｍｍｏｌ）を反応させ、標題のＨＡ−ＭＴＸ結合体の水溶液を得た。実施例３−６と同様の方法で求めた分子量は約２２６万、ＭＴＸの結合率は２．２％であった。【０２１５】
上記実施例３−１と同様にして、以下のＨＡ−ＭＴＸ結合体も合成することが可能である。【０２１６】
【表１】
0005001645.tif 000018
【０２１７】
［実験例１］
分子量／粘弾性の測定
実施例３の結合体の粘弾性及び対照としてのヒアルロン酸の粘弾性を、ＣＳＬ５００型ストレス制御式レオメーター（Ｃａｒｒｉ−Ｍｅｄ社製）で、直径４ｃｍのコーンを用い、３７℃で測定した。
［実験例２］
滑膜細胞増殖抑制作用
ヒト滑膜細胞（ＨＦＬＳ）を用いて、ＴＮＦ−α刺激による細胞増殖亢進に対する本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体の影響を検討した。関節リウマチ（ＲＡ）の主病巣は、滑膜組織であり、その特徴の一つとして、滑膜細胞が異常増殖して肉芽組織（パンヌス）を形成し、関節の軟骨・骨を破壊することが知られている。また、変形性関節症（ＯＡ）でも二次性の滑膜炎が見られる。ＯＡにおいては、ＲＡで見られるような滑膜細胞の著しい増殖変化はないものの、滑膜炎は膝ＯＡの特徴である関節水症や疼痛、熱感といった炎症症状の原因となる（宮坂信之ら編集、「骨・関節疾患」２００３年、朝倉書店）。従って、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αで亢進した滑膜細胞の増殖を阻害する化合物は、ＲＡおよびＯＡの病態進行抑制や治療のために薬剤となる。【０２１８】
被験物質として実施例３のＨＡ−ＭＴＸ結合体の無菌水溶液を使用した。ＨＦＬＳはＲＡ患者由来のヒト滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＲＡ、ＣＡ４０４−０５、Ｌｏｔ  Ｎｏ．：１４９３）とＯＡ患者由来のヒト滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＯＡ、ＣＡ４００−０５、Ｌｏｔ  Ｎｏ．：１４４２）をＣＥＬＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮＳ．より購入して使用した。【０２１９】
ＨＦＬＳは９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して５％ＦＢＳ、1ｘ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ）含有Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地にて３時間培養した。細胞付着後、ＴＮＦ−α（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、各濃度のＨＡ−ＭＴＸ結合体を添加して５日間培養した。培養終了２日前に、３７ｋＢｑ／ｗｅｌｌの［3Ｈ］−デオキシウリジン（ＭＯＲＡＶＥＫ）を加え、細胞内への［3Ｈ］−デオキシウリジン取り込み量(放射活性)をシンチレーションカウンターで測定した。細胞の回収は０．０５％トリプシン−０．２％ＥＤＴＡで細胞を剥がして行った。【０２２０】
各実験で測定した各被験物質の放射活性は、被験物質を添加せず培養した群の放射活性をｃｏｎｔｒｏｌとして、相対値(％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ)を算出した。ＨＡ−ＭＴＸ結合体のＭＴＸ濃度は、ヒアルロン酸１ｍｇ／ｍＬあたりフリーのカルボキシル基が２．４９ｘ１０-3ｍｏｌ／Ｌ（１ｇ／４０１／Ｌ：４０１はＮ−アセチルグルコサミン＋グルクロン酸の分子量）であることから、この値にＭＴＸの結合率を乗じて算出した。（ＭＴＸ結合率１％のＨＡ−ＭＴＸ結合体１ｍｇ／ｍＬの場合、ＭＴＸ濃度は２．４９ｘ１０-5ｍｏｌ／Ｌとした。）得られた値を使用して４  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ法（解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０２および４．０２）により細胞増殖阻害活性（ＩＣ50値）を算出した。【０２２１】
ＨＦＬＳ−ＲＡにおけるＨＡ−ＭＴＸ結合体のＩＣ50値を表２に、ＨＦＬＳ−ＯＡにおけるＨＡ−ＭＴＸ結合体のＩＣ50値を表３に示す。【０２２２】
【表２】
0005001645.tif 000019
【０２２３】
表２の結果より、検討したＨＡ−ＭＴＸ結合体はいずれもＴＮＦ−α刺激によるＨＦＬＳ−ＲＡの細胞増殖亢進を抑制する作用を有することが確認された。【０２２４】
【表３】
0005001645.tif 000020
【０２２５】
表３の結果より、検討したＨＡ−ＭＴＸ結合体はいずれもＴＮＦ−α刺激によるＨＦＬＳ−ＯＡの細胞増殖亢進を抑制する作用を有することが確認された。【０２２６】
［実験例３］
ｍＢＳＡ誘導単関節炎モデルに対する膝関節腫脹抑制効果
本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体のｉｎ  ｖｉｖｏでの滑膜炎抑制作用を、ラットmethylated bovine serum albumin （ｍＢＳＡ）誘導単関節炎モデルの膝関節腫脹の抑制効果にて評価した。本実験で用いられたｍＢＳＡ誘導単関節炎モデルは、抗原誘発関節炎モデルとして汎用されるものであり、滑膜炎を誘発することが知られている(Sven E. Andersson, et al. The Journal of Rheumatology (1998) 25:9, 1772-7)ことから、本モデルで認められるｉｎ  ｖｉｖｏにおける関節腫脹の抑制効果は、滑膜炎抑制作用であると考えることができる。滑膜炎をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制する化合物は、滑膜炎を伴う関節疾患（ＲＡやＯＡなど）の治療薬として有用である。【０２２７】
動物はＬＥＷ／Ｃｒｊ系ラット（日本チャールズ・リバー、６週齢、雄）を使用した。関節炎を誘導する２１日および１４日前に、２ｍｇ／ｍＬのｍＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）水溶液と等量のFreund’s complete adjuvant（Ｄｉｆｃｏ）で作製した乳濁液０．５ｍＬをラットのわき腹に皮下投与した。関節炎は２ｍｇ／ｍＬのｍＢＳＡ水溶液５０μＬを右膝関節内投与して誘導した。左膝関節は無処置で各個体のコントロールとした。被験物質（無菌水溶液）および対照薬であるヒアルロン酸は関節炎誘導７日および１日前と７日後に、５０μＬを右膝関節内投与した。【０２２８】
膝関節腫脹の測定は両膝関節の幅をノギスで測定して、左右差（右膝直径−左膝直径）を膝関節腫脹とした。関節炎誘導直前より２週間後まで週２回の頻度で膝関節幅を測定して、その経時的推移からＡＵＣ（Area Under the Curve の略。曲線下面積ともいう。ここでは、関節腫張の経時的曲線下の面積を示す。）を算出した。測定時ごとにＡＵＣの平均値および標準偏差を算出し、被検物質投与群とＨＡ投与群間で対応のないｔ検定を行い、危険率５％未満の場合に有意差ありと判断した。統計解析はSAS version 6.12または8.02（ＳＡＳインスティチュートジャパン）を使用した。また、各被験物質のＡＵＣはＨＡ投与群をcontrolとして、各被験物質の相対値(% of control)を算出した。【０２２９】
本発明の各ＨＡ−ＭＴＸ結合体の効果を上記の方法で検討した結果を表４に示す。【０２３０】
【表４】
0005001645.tif 000021
【０２３１】
表４に示される結果より、今回検討したＨＡ−ＭＴＸ結合体はいずれも、ＨＡ投与群に比べ、関節炎モデルの膝関節腫脹を有意に抑制することが明らかとなった。また、ＨＡに結合するＭＴＸの結合率の影響に注目すると、特に、ＭＴＸの結合率が１．１から３．８％（実施例３）の場合に、関節炎モデルの膝関節腫脹をＨＡ投与群に比べて有意に抑制することが示唆された。【０２３２】
［実験例４］
実験例３の方法に従い、本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体の有用性を検証する目的で、１）実施例３−１０で調製したＨＡ−ＭＴＸ結合体（無菌水溶液）の投与群、２）そのＨＡ−ＭＴＸ結合体が含有するＭＴＸと同量のＭＴＸを含む溶液の投与群、および３）その結合体が含有するのと同量のＭＴＸおよびヒアルロン酸（ＨＡ）の混合物（ＨＡ＋ＭＴＸ）の投与群の間で関節腫脹抑制作用を比較した。対照薬として、ＨＡおよびＶｅｈｉｃｌｅ（２ｍＭリン酸緩衝液、０．９％ＮａＣｌ）を用いた。本実験例においては、ＨＡとしてスベニール（ＳＶＥ、中外製薬株式会社）を用いた。本試験の膝関節腫脹の経時的推移を図１に、及びそのＡＵＣを図２に示す。図１および図２に示される結果より、ＭＴＸ単体およびＭＴＸとＨＡの混合物に比べ、ＨＡ−ＭＴＸ結合体は、関節炎モデルの関節腫脹に対する著しく強い抑制作用を有することが確認された。従って、ＭＴＸとＨＡとの結合は、ＭＴＸの関節腫脹抑制作用を著しく向上させることが明らかとなった。【０２３３】
以上のことより、本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体は、ＨＡには認められないｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＮＦ−α刺激によるヒト滑膜細胞の増殖抑制作用、及び、ｉｎ  ｖｉｖｏでの滑膜炎を軽減する作用（関節炎を発症するモデルにおいて）を有することが明らかとなった。また、関節炎モデルにおいては、ＭＴＸ単独およびＨＡとＭＴＸの混合物では十分な滑膜炎の軽減作用が認められないのに対し、ＨＡ−ＭＴＸ結合体は強力な滑膜炎の軽減作用を発揮することが明らかとなった。【０２３４】
［実験例５］
コラーゲン関節炎モデルに対する影響
ＨＡ−ＭＴＸ結合体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける滑膜炎抑制作用を、関節リウマチ（ＲＡ）のモデルとして汎用されるラットコラーゲン関節炎モデル（金ら、「関節外科」（１９９８）、Ｖｏｌ．１７、Ｎｏ．２、１１１−２１）にて評価した。本モデルで炎症を抑制する本発明化合物は、ＲＡに代表される自己抗原誘発の免疫疾患治療に有用である。【０２３５】
動物はＤＡ／Ｓｌｃラット（日本エスエルシー（株）、１１週齢、メス）を使用した。ウシ II 型コラーゲン（コラーゲン技術研修会）を０．０１ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液に１．５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解して、これに等量のFreund's incomplete adjuvant（Ｄｉｆｃｏ）を加えて乳濁液を作製した。この乳濁液をラットの背部皮内４ヵ所に１ヵ所当たり約０．１ｍＬで合計０．４ｍＬ投与し、関節炎を誘発した。実施例３−７の被験物質(無菌水溶液)および対照薬であるヒアルロン酸（ＨＡ）とＶｅｈｉｃｌｅ（２ｍＭリン酸緩衝液、０．９％ＮａＣｌ）は、感作当日より、５日に１回の割合で、５０μＬを右膝関節内にのみ投与を行った。左膝関節は無処置とした。また、病態モデルの対照として、関節炎を誘導しない動物（Ｎｏｒｍａｌ）の右膝関節内にＶｅｈｉｃｌｅを投与した。【０２３６】
膝関節腫脹の変化は両膝の関節幅をノギスで測定して正常群の関節幅と比較することで観察した。関節炎誘導直前より３０日後まで、週２回程度の割合で観察した。膝関節幅の測定値については、測定時ごとに平均値および標準誤差を算出し、被験物質群とＨＡ投与群間で対応のないｔ検定を行い、危険率５％未満の場合に有意差ありと判断した。統計解析はSAS version 8.02（ＳＡＳインスティチュートジャパン）を使用した。【０２３７】
本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体の効果を上記の方法で検討した結果を図３に示す。【０２３８】
図３に示される結果より、本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体は、ＨＡ投与群に比べてコラーゲン関節炎の誘導により腫脹した関節幅を有意に抑制し、その関節幅の経時的推移は、正常群とほぼ同等レベルであった。また、この効果は、ＨＡ−ＭＴＸ結合体を投与した部位（右膝）においてのみ観察され、非投与部位（左膝）においては認められなかった。このように、本化合物が、投与部位に限局して、作用を発現できることが明らかとなった。【０２３９】
［実験例６］
コラゲナーゼ誘導関節炎（ＯＡ）モデルに対する関節腫脹抑制効果
ＨＡ−ＭＴＸ結合体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける滑膜炎抑制作用を、コラゲナーゼ誘導ＯＡモデルラットにて評価した。コラゲナーゼ誘導ＯＡモデルは関節内にコラゲナーゼ水溶液を注入することにより、軟骨組織のコラーゲンを直接消化して、関節内で炎症を誘発するモデルである。このモデルは関節軟骨変性や滑膜炎などのヒトＯＡ病態と類似した病理組織学的変化を示し、ＯＡ治療薬の評価に有用である(Takanori K. et al., Osteoarthritis and Cartilage (1998) 6, 177-86)。従って、本モデルの炎症を抑制する化合物はＯＡ治療薬として有用である。【０２４０】
動物はＳＤ／Ｃｒｊ系ラット（日本チャールズ・リバー、６週齢、雄）を使用した。１．５％ Collagenase （ＳＩＧＭＡ）溶液５０μＬを右膝関節腔内に投与して関節炎を誘導した。左膝関節は、各個体のコントロールとするために無処置にした。実施例３−７の被験物質(無菌水溶液)および対照薬であるヒアルロン酸（ＨＡ）とＶｅｈｉｃｌｅ（２ｍＭリン酸緩衝液、０．９％ＮａＣｌ）は、関節炎誘導の７および１日前より、週１回の割合で５０μＬを右膝関節内に投与した。【０２４１】
膝関節腫脹の測定は、両膝関節の幅をノギスで測定して、その左右差（右膝直径−左膝直径）を求めて膝関節腫脹とした。関節炎誘導直前より２０日後まで、週２回程度の頻度で膝関節幅を測定して、その経時的推移を示すグラフのＡＵＣを算出した。測定時ごとにＡＵＣの平均値および標準誤差を算出し、被検物質投与群とＨＡ投与群間で対応のないｔ検定を行い、危険率５％未満の場合に有意差ありと判断した。【０２４２】
本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体の効果を上記の方法で検討した結果を図４に示す。図４中の左図にＨＡ−ＭＴＸ結合体の典型的な関節腫脹の経時変化を示し、そこから求めたＡＵＣを図４中の右図に示した。【０２４３】
これらの結果より、ＨＡ−ＭＴＸ結合体は、コラゲナーゼ誘導関節炎モデルにおいて、ＨＡ投与群が示す関節腫脹と比べて有意に関節腫脹を抑制することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２４４】
本発明のＨＡ−ＭＴＸ結合体により、関節注入剤としてのＨＡの側面を持ちながら、ＭＴＸの滑膜炎抑制作用を投与関節内でのみ安全に発現させることができる、従来にない効果を有する、優れた関節疾患治療薬が提供される。
【図１】
0005001645.tif 000033
【図２】
0005001645.tif 000034
【図３】
0005001645.tif 000035
【図４】
0005001645.tif 000036