(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体が毛管現象により移動可能な多孔体を有するイムノクロマト用試験具であって、前記イムノクロマト用試験具は、
（１）前記検体中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原が、移動可能な状態で配置された領域、
（２）前記ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域、および
（３）前記ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域を有し、
前記領域（２）に生じる呈色と、前記標準呈色とを比較することにより、前記検体中の前記測定対象物質を半定量するための試験具。
【請求項２】
前記（２）の前記ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域と、前記（３）の前記ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域とが、展開溶媒の展開方向に対して、直列または並列に配置された請求項１記載の試験具。
【請求項３】
前記（１）の前記検体中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原が、移動可能な状態で配置された領域に用いる標識用色素と、前記（３）の前記ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域に用いる標準呈色用色素とが同一の色素である請求項１または２記載の試験具。
【請求項４】
前記標準呈色がヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）１０００ＩＵ／Ｌにおける呈色である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の試験具。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の試験具を用いて検体中の測定対象物質を半定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的クロマトグラフィー（イムノクロマト法）を用いて、検体中の測定対象物質を半定量するための試験具、および該試験具を用いた半定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノクロマト用試験具は、血清または血漿を含む血液、尿などの体液等を検体とし、血清検体中の抗ＨＢs抗原の検出、血清または血漿検体中の抗トレポネーマパリダム抗体の検出、血液型の判定、尿検体中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の検出等に使用されている。【０００３】
図５は、従来のイムノクロマト用試験具の一例を示す概念図であり、図５（ａ）は、イムノクロマト用試験具の平面図であり、図５（ｂ）は、その側面図である。図５（ｃ）は、図５（ａ）と同様の図であるが、使用後のイムノクロマト用試験具を示している。【０００４】
図５（ａ）および（ｂ）に示すイムノクロマト用試験具１１では、シート状の基体１２上にサンプルパッド１３が設けられている。試験具１１を使用する場合、該サンプルパッド１３を測定対象となる検体に浸漬する。サンプルパッド１３に吸収された検体は毛管現象によって、該サンプルパッド１３に隣接して設けられた試薬パッド１４へと移動する。試薬パッド１４には、標識された抗体または抗原が担持されている。【０００５】
サンプルパッド１３に吸収された検体が試薬パッド１４に到達すると、試薬パッド１４に担持されている標識された抗体または抗原が溶出する。検体中の測定対象物質と標識された抗体または抗原とは、複合体を形成することもある。これらを含んだ検体は、毛管現象によって試薬パッド１４に隣接して設けられた多孔体１５へと移動する。多孔体１５に到達した複合体は、毛管現象によって下流方向（図中、サンプルパッド１３の側を上流側とした場合）へと移動する。【０００６】
多孔体１５上には、抗体または抗原を固定した反応領域１６が設けられている。毛管現象によって多孔体１５中を移動してきた抗原、抗体、あるいは前記複合体は、反応領域１６で捕捉される。図５（ｃ）に示すように、この捕捉は、該領域１６での呈色１６′により確認することができる。このようにして、検体中の測定対象物質の有無を、目視により確認することができる。
試験具１１のさらに下流側には、検体中の他の成分および捕捉されなかった測定対象物質等を吸収するための吸収パッド１７が設けられている。【０００７】
また、図示したイムノクロマト用試験具を用いて、検体中の測定対象物質を半定量することもできる。例えば、各々測定対象物質に対する検出感度が異なる反応領域１６を複数設けて、呈色１６′が生じた領域１６の数により、検体中の測定対象物質を半定量することができる。【０００８】
このようなイムノクロマト用試験具、およびこれを用いて検体中の測定対象物質を検出する方法または該測定対象物質を半定量する方法が、特許文献１〜６に記載されている。
特許文献１には、液体中の抗原または抗体をイムノクロマト法を原理とするシート状の試験具を用いて測定する方法に関する記載がある。しかしながら、当該文献には、抗原または抗体を半定量することに関する開示、示唆はなく、また、多孔体上に標準呈色を示す領域を有する試験具に関する開示、示唆もない。
特許文献２には、色素標識した抗原または抗体を用いて、液体中の抗原または抗体の存否を測定するための試験具に関する記載がある。しかしながら、当該文献にも、抗原または抗体を半定量することに関する開示、示唆はなく、また、多孔体上に標準呈色を示す領域を有する試験具に関する開示、示唆もない。
特許文献３には、検体溶液中の抗原または抗体を定量するための試験具に関する記載がある。該試験具は、上流から下流に向けて増加する量の捕捉試薬が固定化されている複数の反応領域を有することを特徴とし、発色した反応領域の数によって分析対象を定量するものである。反応領域が複数であることが必須要件であるが、反応領域を複数設けることは、製造工程が煩雑となり好ましくない。また、該試験具には、多孔体上に標準呈色を示す領域を有する試験具に関する開示、示唆はない。
特許文献４には、検体溶液中の抗原または抗体を半定量するための試験具に関する記載がある。該試験具は、粒子標識された抗原または抗体、検体溶液の展開方向に対して直列に並んでいる複数の反応領域を有し、サンドイッチ法の原理により、抗原または抗体の量を半定量的に推測することができる旨の開示がある。反応領域が複数であることが必須要件であるが、反応領域を複数設けることは、製造工程が煩雑となり好ましくない。また、該試験具には、多孔体上に標準呈色を示す領域を有する試験具に関する開示、示唆はない。【０００９】
特許文献５には、同一膜上に一定の色調が現れる部分と検体の濃度依存性の色調が現れる部分を備えた免疫学的クロマト分析片を用いて、該免疫学的クロマト分析片に未知濃度の検体を注入しクロマト展開させた後、一定の色調の現れる部分の色調と、検体の濃度依存性の色調が現れる部分の色調とを光学的濃度測定装置または目視的に読み取り未知検体の濃度を測定する方法が記載されている。当該方法は、対照の呈色領域と、検体の濃度依存性の呈色領域が同一膜上にある点が特徴的であるが、該対照の呈色領域は、検体とは別異の固定化抗体および標識抗体を用いて呈色させるものであり、煩雑であるとともに、特定の検体の濃度に相当する呈色に調整することは容易ではない。
特許文献６には、毛管現象により検体が移動する多孔体上に判定ラインの種別表示が直接印刷されたイムノクロマト用試験具が記載されている。特許文献６に記載されているように、毛管現象により検体が移動する多孔体上に印刷を行うという発想は、特許文献６以前にはなく、該多孔体上に測定対象物質の濃度を測定するのに有用な表示を設けるという思想は従来全くなかった。【００１０】
【特許文献１】特開平７−５５８０８号公報
【特許文献２】特開平１０−７３５９２号公報
【特許文献３】特開平５−５７４３号公報
【特許文献４】特開平８−２７８３０５号公報
【特許文献５】特開２００１−８３１５３号公報
【特許文献６】特開２００１−１３１４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明は、イムノクロマト法を用いて、製造が容易で、かつ検体中に含まれる測定対象物質の濃度を容易に半定量するための新規な試験具、およびこの試験具を用いた半定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記目的を達成するため、検体が毛管現象により移動可能な多孔体を有するイムノクロマト用試験具であって、
前記イムノクロマト用試験具は、
（１）前記検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原が、移動可能な状態で配置された領域、
（２）前記測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域、および
（３）前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域を有し、
前記領域（２）に生じる呈色と、前記標準呈色とを比較することにより、前記検体中の前記測定対象物質を半定量するための試験具（以下、「本発明の試験具」とする。）を提供する。
本発明の試験具の好ましい態様として、前記（２）の前記測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域と、前記（３）の前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域とが、展開溶媒の展開方向に対して、直列または並列に配置された前記試験具が挙げられる。
本発明の試験具の、別の好ましい態様として、前記（１）の前記検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原が、移動可能な状態で配置された領域に用いる標識用色素と、前記（３）の前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域に用いる標準呈色用色素とが同一の色素である前記試験具が挙げられる。
また、本発明は、本発明の試験具を用いて検体中の測定対象物質を半定量する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の試験具は、イムノクロマト用試験具の多孔体上に固定された標準呈色と、測定対象物質が多孔体上に固定された抗体または抗原に捕捉されることによって生じる呈色とを比較することで、検体中に含まれる測定対象物質を容易に半定量することができる。
また、本発明の試験具は、測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、多孔体上に固定された状態で配置された領域（反応領域）、および、測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域を有することから、同一条件下で反応領域の呈色と標準呈色とを比較することが可能であり、高い精度が得られる。
また、本発明の試験具は、少なくとも１つの反応領域と、標準呈色を示す領域があれば、半定量が可能であることから、半定量するために複数の反応領域を必須要件とする試験具に比べて、簡便に製造することができる。また、標準呈色を示す領域については、色素等を、抗体、抗原等を介さず、直接多孔体上に固定していることから、抗体、抗原等を介して固定することを必須要件とする試験具に比べて、簡便に製造することができる。また間接的に抗原抗体反応などの反応を介さないので本試験具を使用するにあたって、前記標準呈色の色調が様々な使用条件の違いに全く影響されない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の試験具の一実施形態の概念図である。
【図２】図２は、図１の試験具の側面図である。
【図３】図３は、各種濃度に調整したｈＣＧに本発明の試験具を浸漬した後の標準呈色８および呈色６′の呈色度の度合いの経時変化を見たグラフである。
【図４】図４（ａ）〜（ｅ）は、実施例で使用された試験具の平面図であり、図４（ａ）は尿検体に浸漬する前の未使用の試験具、図４（ｂ）はｈＣＧ濃度２５ＩＵ／Ｌの検体を用いて半定量を実施した後の試験具、図４（ｃ）はｈＣＧ濃度１０００ＩＵ／Ｌの検体を用いて半定量を実施した後の試験具、図４（ｄ）はｈＣＧ濃度１００００ＩＵ／Ｌの検体を用いて半定量を実施した後の試験具、図４（ｅ）はｈＣＧ濃度０ＩＵ／Ｌ（陰性）の検体を用いて半定量を実施した後の試験具を示している。
【図５】図５（ａ）は従来のイムノクロマト法用試験具を示す概念図であり、試験具を平面図により示している。図５（ｂ）は図５（ａ）に示す試験具の側面図である。図５（ｃ）は、図５（ａ）と同様の図であるが、使用後の試験具を示している。
【符号の説明】
【００１５】
１：試験具
２：基体
３：サンプルパッド
４：試薬パッド
５：多孔体
６：反応領域
６′：呈色
７：吸収パッド
８：標準呈色
９：領域
９′：呈色
１１：試験具
１２：基体
１３：サンプルパッド
１４：試薬パッド
１５：多孔体
１６：反応領域
１６′：呈色
１７：吸収パッド
２０：保護フィルム
２１：透明部分
２２：窓
２３，２３′，２３″：不透明部分
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、図面を参照して、本発明の試験具について説明する。
図１は、本発明の試験具の一実施形態の概念図であり、図２は図１に示す試験具の側面図である。
図１および図２に示す試験具１は、シート状の基体２上にサンプルパッド３、試薬パッド４、多孔体５および吸収パッド７が形成されている。試験具１のうち、試薬パッド４、多孔体５および吸収パッド７は、保護フィルム２０により被覆されている。【００１７】
以下、本発明の試験具１の各構成要素について説明する。
図１に示す試験具１において、各構成要素はシート状の基体２上に形成されている。基体２は、イムノクロマト法の際に各構成要素中を通過する検体を吸収または透過することがなく、かつ検体が接触した際に、検体を変性させることのない材料で作製される。このような材料としては、医療用具に使用されるプラスチック材料、具体的には例えば、塩化ビニル、ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル樹脂、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリスチレン、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ＡＢＳ樹脂等が挙げられる。また、基体２は、表面に撥水撥油加工が施された紙製であってもよい。【００１８】
サンプルパッド３は、検体が滴下される、または検体中に浸漬される部位であり、検体中に不溶性物質が存在している場合、該不溶性物質を除去するフィルターとしても作用する。この観点から、サンプルパッド３は、孔径２０μｍ〜１００μｍ、好ましくは３０μｍ〜４０μｍの不織布または多孔質膜が例示されるが、特にこれらに限定されない。サンプルパッド３に使用可能な材料としては、一定量の検体を採取でき、親水性であり、フィルター機能を有するものであれば特に限定されず、例えば、再生セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリアクリロニトリル、エチレン酢酸ビニル、ポリウレタン、ポリメチルメタクリレート、ナイロン樹脂、ガラス繊維、パルプ、綿、レーヨン、アクリル、ポリエステルなどが例示されるが、特にこれらに限定されない。【００１９】
サンプルパッド３に滴下された検体は、毛管現象によって下流方向、すなわち試薬パッド４へと移動する。以下、本明細書において、試験具１のサンプルパッド３の側を上流側とし、その反対側を下流側とする。また、サンプルパッド３に滴下された検体と言った場合、サンプルパッド３を検体に浸漬された結果、該サンプルパッド３中に含まれた検体をも意味する。【００２０】
試薬パッド４の材質としては、サンプルパッド３と同様に、不織布または多孔質膜が例示されるが、特にこれらに限定されない。試薬パッド４には、検体中の測定対象物質と特異的に結合可能な抗体または抗原が色素等の標識物質で標識された状態で担持されている。
測定対象物質と特異的に結合可能な抗体または抗原は、測定対象物質に応じて適宜選択される。測定対象物質が尿検体中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）である場合、抗ｈＣＧ抗体、より詳細には、抗ｈＣＧマウスポリクローナル抗体、抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体等が使用される。測定対象物質がアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）である場合、抗ＡＦＰ抗体が使用される。測定対象物質が抗ＨＩＶ抗体である場合、ＨＩＶ抗原ペプチド等が使用される。測定対象物質が、半定量が必要な癌マーカーである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である場合、例えば、抗ヒトＰＳＡウサギ抗体等が使用される。
標識物質としては、可視的に発色が認められるものであれば特に限定されないが、例えば、金コロイドに代表される金属コロイド、非金属コロイド、染料ゾルもしくは分散染料のような染料粒子、ラテックス粒子または着色微粒子等が挙げられる。中でも、発色性に優れ、色調及び粒子径が豊富であり、抗体もしくは抗原への標識化方法が複数存在する等の観点から、染料若しくは顔料で着色されたラテックス微粒子またはポリスチレン微粒子が好ましい。尚、この標識化方法は当業者により周知されており、吸着による方法や化学結合による方法などがある。とりわけ、染料若しくは顔料で着色された、粒径０．５μｍ以下、好ましくは粒径０．０５〜０．５μｍの、球状または略球状をしたラテックス微粒子またはポリスチレン微粒子が好ましい。最も好ましくはブルーラテックスである。【００２１】
標識された抗体または抗原は、移動可能な状態で試薬パッド４に担持されている。ここで、移動可能な状態で担持されているとは、未使用時、すなわち試薬パッド４が乾燥している状態では、標識された抗体または抗原が試薬パッド４中に保持されているが、使用時、すなわち検体の到達によって試薬パッド４が湿潤すると、標識された抗体または抗原は移動可能となることを意味する。このためには、試薬パッド４が標識された抗体または抗原を吸着しない材料でなければならないが、吸着してしまう材料であれば、あらかじめ別のＢＳＡなどの不活性な蛋白質でマスキング処理することで使用できる。そうして標識された抗体または抗原は、例えば試薬パッド４に含浸させた後、凍結乾燥することで、試薬パッド４に保持されている。
したがって、試験具１では、試薬パッド４が、検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原が移動可能な状態で配置された領域をなしている。【００２２】
サンプルパッド３に滴下された検体は、毛管現象により試薬パッド４へと移動する。このため、試薬パッド４の孔径は、サンプルパッド３よりも孔径が同じか小さいことが好ましい。試薬パッド４の孔径は、１μｍ〜５０μｍが例示され、好ましくは５μｍ〜３０μｍである。【００２３】
図１および図２に示す試験具１では、毛管現象による検体の移動を容易にするため、サンプルパッド３と試薬パッド４とが一部積層した状態になっている。但し、毛管現象によって検体が適切に移動できるのであれば、サンプルパッド３と試薬パッド４とは、単に隣接して配置されていてもよく、更には同一パッドとしてもよい。【００２４】
試薬パッド４に検体が到達すると、検体中の測定対象物質と、パッド４中の標識された抗体または抗原とは、毛管現象によって下流方向へ、すなわち多孔体５へと移動する。なお、測定対象物質と標識された抗原または抗体とが、抗原と抗体の関係にある場合には、両者の一部または全部は抗原−抗体複合体を形成し、これも下流方向へ、すなわち多孔体５へと移動する。図１および図２に示す試験具１では、この移動を容易にするため、試薬パッド４と多孔体５とが一部積層した状態になっている。但し、毛管現象によって、検体が適切に移動できるのであれば、試薬パッド４と多孔体５とは、単に隣接して配置されていてもよく、更には試薬パッド４が多孔体５をかねてもよく、その逆でもよい。【００２５】
多孔体５は、その構造がスポンジ状の細孔を有したもの、又は、網目状を有したものであって、毛管現象によって検体が移動可能な媒体である。図１および図２に示す試験具１では、シート状の多孔質膜として示されている。多孔体５の材料としては、イムノクロマト法が実施可能であれば特に限定されないが、具体的には例えば、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、エチレン酢酸ビニル、ポリウレタン、ポリメチルメタクリレート、ナイロン樹脂、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）等の多孔性合成ポリマー等を原料とする織布、不織布やメンブラン、グラスファイバーフィルター、各種の濾紙等が挙げられ、セルロース、セルロース誘導体、多孔性合成ポリマーを用いたものが好ましく、ニトロセルロースを用いたものが特に好ましい。多孔体５の孔径は、１μｍ〜３０μｍが例示され、好ましくは１μｍ〜２０μｍである。【００２６】
多孔体５は、測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が固定された領域６（反応領域）を有する。領域６に固定される抗体または抗原は、測定対象物質に応じて適宜選択することができる。具体的には、測定対象物質がｈＣＧである場合、抗ｈＣＧ抗体、より詳細には、抗ｈＣＧマウスポリクローナル抗体、抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体等を使用することができる。測定対象物質がＡＦＰである場合、抗ＡＦＰ抗体を使用することができる。測定対象物質が抗ＨＩＶ抗体である場合、ＨＩＶ抗原ペプチド等を使用することができる。測定対象物質がＰＳＡである場合、抗ＰＳＡマウスモノクローナル抗体、抗ＰＳＡウサギ抗体等を使用することができる。尚、これらの固定化の方法は、たとえば多孔体５がニトロセルロースやナイロンなどの場合、上述の抗体または抗原の溶液を直接に塗布し乾燥することによって容易に固定化することができる。また直接塗布、乾燥することで固定化できないグラスファイバーフィルターや濾紙などの多孔体の場合には、多孔体の活性化や、固定化する抗体または抗原の活性化などによる前処理を施すことによって容易に固定化でき、これらの固定化の方法は当業者によく知られた技術である。【００２７】
毛管現象によって、多孔体５中を移動してきた抗原、抗体および／または複合体は、領域６に固定された抗体または抗原により捕捉される。標識物質を含んだ抗原、抗体および／または複合体が捕捉されると、領域６に生じる呈色として確認することができる。ここで領域６に生じる呈色の色調は、用いるイムノクロマト法（試薬の組合せ）と検体中の測定対象物質の濃度に依存する。例えば、検体中の抗原と試薬パッド４に保持されていた標識抗体により形成された複合体を、反応領域における固定化抗体で捕捉する場合においては、検体中の測定対象物質の濃度が高いと、領域６で捕捉される複合体が増加するため、強い色調の呈色を生じ、検体中の測定対象物質の濃度が低いと、領域６で捕捉される複合体が減少するため、弱い色調の呈色を生じる。一方、例えば、検体中の抗原と、試薬パッド４に保持されていた標識抗原との競合反応において、反応領域で標識抗原を固定化抗体により捕捉する場合においては、検体中の測定対象物質の濃度が高いと、領域６で捕捉される標識抗原が減少するため、弱い色調の呈色を生じ、検体中の測定対象物質の濃度が低いと、領域６で捕捉される標識抗原が増加するため、強い色調の呈色を生じる。【００２８】
多孔体５は、測定対象物質の特定濃度における呈色に対応する標準呈色８が固定された領域を有している。すなわち、試験具１では、測定対象物質を特定濃度（以下、「基準濃度」という。）含む検体を使用した場合に、領域６に生じる呈色と等しい色調を有する領域が多孔体５上に形成されている。尚、標準呈色８の固定化の方法にあっても前記反応領域と同様の固定化方法を利用することができる。【００２９】
本発明の試験具では、各々試験具１の多孔体５上に存在する、領域６に生じる呈色の色調と、標準呈色８の色調とを比較することで、検体中の測定対象物質を容易に半定量することができる。すなわち、例えば、検体中の抗原と試薬パッド４に保持されていた標識抗体により形成された複合体を、反応領域における固定化抗体で捕捉する場合においては、領域６に生じる呈色の色調が標準呈色８の色調よりも弱い場合、検体中の測定対象物質の濃度が基準濃度よりも低いことになる。領域６に生じる呈色の色調が、標準呈色８の色調よりも強い場合、検体中の測定対象物質の濃度が基準濃度よりも高いことになる。領域６に生じる呈色の色調が、標準呈色８の色調と同程度の場合、検体中の測定対象物質の濃度が基準濃度と同程度ということになる。また、領域６に呈色が生じなかった場合、検体中に測定対象物質が存在しないか、あるいは検出感度以下であることを意味する。したがって、本発明の試験具１は、領域６における呈色の有無により、測定対象物質の特定の感度における定性評価を行うこともできる。
さらにまた、領域６に生じる呈色の色調と、標準呈色８の色調とを光学的濃度計等を用いて比較することで、検体中の測定対象物質の濃度を正確に測定することができる。【００３０】
多孔体５は、毛管現象によってその内部を検体が移動するため、標準呈色８は多孔体５の表面に固定されていることが好ましい。ここで、標準呈色８は、試薬パッド４に担持される抗体または抗原を標識するのに使用した標識物質であることが好ましい。したがって、金コロイドに代表される金属コロイド、非金属コロイド、染料ゾルもしくは分散染料のような染料粒子、ラテックス粒子または着色微粒子等が好ましく例示される。中でも、発色性に優れ、色調及び粒子径が豊富であり、抗体もしくは抗原への標識化方法が複数存在する等の観点から、染料若しくは顔料で着色されたラテックス微粒子またはポリスチレン微粒子が好ましい。尚、この標識化方法は当業者により周知されており、吸着による方法や化学結合による方法などがある。とりわけ、染料若しくは顔料で着色された、粒径０．５μｍ以下、好ましくは粒径０．０５〜０．５μｍの、球状または略球状をしたラテックス微粒子またはポリスチレン微粒子が好ましい。最も好ましくはブルーラテックスである。
但し、標準呈色８は、測定対象物質の特定濃度における呈色と同一の色調である限り、色素、染料、顔料等、他の物質を用いて形成してもよい。
また、測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域（反応領域６）と、測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域（標準呈色８）とは、展開溶媒の展開方向に対して、直列または並列に配置されていることが好ましく、直列に配置されていることが最も好ましい。また、両者が近傍に位置することが好ましい。具体的には、両者の距離は２０ｍｍ以内であることが好ましく、１０ｍｍ以内であることがより好ましい。
なお、展開溶媒は、通常検体に含有されうるものであれば特に限定されない。例えば、水（検体中に含まれる水分を含む）；生理食塩水；アセトン等の有機溶媒等が挙げられる。
展開溶媒の展開方向は、図１においては、サンプルパッド３から吸収パッド７への方向である。
また、検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原が、移動可能な状態で配置された領域（試薬パッド４）に用いる標識用色素と、測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域（標準呈色８）に用いる標準呈色用色素は、同一の色素であるのが好ましく、ラテックス粒子であるものがさらに好ましい。【００３１】
標準呈色８として示される基準濃度や検出感度は、測定対象物質の種類や、試験具の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、試験具１が尿検体中のｈＣＧの量を測定するものである場合、検出感度は２５ＩＵ／Ｌ、基準濃度は１０００ＩＵ／Ｌであることが好ましい。ｈＣＧの検出感度を２５ＩＵ／Ｌとした場合、領域６の発色の有無により妊娠診断が可能となる。基準濃度を１０００ＩＵ／Ｌとした場合、子宮外妊娠、流早産、絨毛性腫瘍の予後判定などの評価が可能となる。結果として、ｈＣＧ濃度２５ＩＵ／Ｌと１０００ＩＵ／Ｌを基準として、検体中の測定対象物質が一回の測定で半定量可能となる。例えば、血液中のＰＳＡの量を測定するものである場合、検出感度は１ｎｇ／ｍＬ、基準濃度は４ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。ＰＳＡの検出感度を１ｎｇ／ｍＬとした場合、領域６の発色の有無により前立腺肥大の診断が可能となり、基準濃度を４ｎｇ／ｍＬとした場合、前立腺癌の診断が可能となる。結果として、一回の操作でＰＳＡ濃度１ｎｇ／ｍＬと４ｎｇ／ｍＬを基準として、検体中のＰＳＡ濃度の半定量が可能となる。【００３２】
上記したように、多孔体５中を移動する検体中の測定対象物質の部分あるいは全部は、領域６に固定された抗体または抗原により捕捉される。一方、検体中の他の成分および捕捉されなかった測定対象物質等は、多孔体５中を下流方向へと移動する。図１および２に示す試験具１には、これらを吸収するための吸収パッド７が設けられている。吸収パッド７は、多孔体５中を移動してきた検体を吸収して、保持できるものである限り特に限定されない。したがって、吸収パッド７は、ろ紙、不織布、多孔質膜等、液体を吸収してその内部に保持する目的で従来使用されているものを広く使用することができる。吸収パッド７は、シリカゲルのような吸水性・吸湿性を有する物質を含んでいてもよい。【００３３】
上記したように、検体中に測定対象物質が含まれていない場合または含まれていても検出感度以下である場合、領域６に呈色は生じず、試験具１は、外見上未使用時と変化がない。このため、本発明の試験具１は、試験終了を確認するための機構を有していることが好ましい。図１および図２に示す試験具１では、多孔体５の標準呈色８が固定された領域よりも下流側に、検体が到達した際に発色を生じる領域９が設けられている。多孔体５を被覆する保護フィルム２０のうち、該領域９を被覆する部分には、透明な窓２２が設けられている。図１において、保護フィルム２０のうち、部分２１および２２は透明であり、部分２３、２３′、２３″は不透明である。
図１および図２に示す試験具１では、該領域９および窓２２が試験終了を確認する機構をなす。すなわち、多孔体５中を移動してきた検体が領域９に到達すると発色を生じ、この発色は窓２２により確認することができる。これにより、試験が終了したことを確認することができる。【００３４】
この目的のため、領域９には種々の発色剤が含浸または固定化される。領域９に含浸または固定化される発色剤としては、所定のｐＨの液状試料との接触により発色する発色剤、具体的には例えば、エオシンＢ、フロキシンＢ、ベンゾパープリン４Ｂ、コンゴーレッド、ブロムフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、２，５−ジニトロフェノール、またはこれらの関連物質が挙げられる。また、発色剤は、検体が領域９に到達した際に、その水分によって発色するものであってもよい。
さらにまた、多孔体５の窓２２よりも上流側の領域に、例えば不透明部分２３′で被覆された領域に、検体が到達した際に溶解するように、水溶性の色素を含浸させておき、検体中に溶解されて移動する色素を窓２２で確認するものであってもよい。
また、標識された抗原もしくは抗体と特異的に反応する成分、例えば標識抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体を用いた場合は抗マウスヒツジ抗体などを領域９に固定化しておいても、当該目的を達し得る。
また、測定に関与しない標識抗体や標識ビオチンやキーホールヘモシアン等を試薬パッド４に保持させておき、上記標識抗体と特異的に反応する抗体または抗原やアビジンもしくは抗キーホールヘモシアニン抗体を領域９に固定化しておいても当該目的を達成できる。【００３５】
以上、図を用いて本発明の試験具について詳細に説明したが、本発明の試験具は図示した形態に限定されない。本発明の試験具は、検体が毛管現象によって移動可能な多孔体を有するイムノクロマト用試験具であって、下記（１）〜（３）の領域を有するものを広く使用することができる。
（１）前記検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原が、移動可能な状態で配置された領域、
（２）前記測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域、および
（３）前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域。【００３６】
したがって、本発明の試験具は、特表平１−５０３１７４号公報、特開平６−１８０３２０号公報、特開平６−１６０３８８号公報に記載されているイムノクロマト用の試験装置のように、多孔体等の構成要素を収容するケーシングを有していてもよい。また、本発明の図に例示した保護フィルム２０は、本発明の試験具に必須ではない。
多孔体上に固定される反応領域および／または標準呈色の形状も、図示したように線状に限定されず、他の形状であってもよい。また、多孔体上には、各々測定対象物質の異なる濃度における呈色に対応する複数の反応領域および／または標準呈色が固定されていてもよい。【００３７】
本発明の試験具は、生物由来の種々の液体試料に対して適用することができる。このような液体試料としては、具体的にはたとえば、血液、血漿、血清、唾液、尿、ふん便抽出液、組織抽出液等が挙げられる。これらの液体試料に含有される測定対象物質としては、抗原あるいは抗体として機能する各種蛋白質やペプチド、複合蛋白質、脂質、複合脂質、核酸、レクチン、糖鎖あるいはこれを有する化合物、ビオチン、アビジン、ホルモン、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、レセプター、リガンド、薬物、薬物代謝産物、分析対象物の誘導体などであり、さらに具体的には、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）、ベータ２ミクログロブリン（β２ｍ）、フェリチン、ＨＢｓ抗原、エストロゲン、ＰＳＡ等およびこれらに対する抗体が例示される。本発明においては、抗体、抗原、核酸、アビジン、ビオチンが好ましく利用され、抗体あるいは抗原が特に好ましい。
なお、本発明の試験具は、上に例示したような測定対象物質の標準品を生理食塩水等に溶解して調製した溶液に対しても適用することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明の試験具をさらに説明する。
本実施例では、図１および図２に示す試験具１を使用した。
試験具１の各構成は以下の通りであった。
基体２：ポリエステル製、縦１２５ｍｍ×横８ｍｍ×厚さ０．２５ｍｍ
サンプルパッド３：縦３０ｍｍ×横８ｍｍ×厚さ０．３ｍｍの不織布（ベンリーゼ、旭化成社製）を接着した。
試薬パッド４：縦１５ｍｍ×横８ｍｍ×厚さ０．３ｍｍの不織布（ガラス繊維、ミリポア社製）に、標識された抗体（標識物質として、青色染料で着色されたラテックス粒子（粒径０．３μｍの球状粒子）を結合させた抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体）を充填して凍結乾燥させたものを使用した。これを基体２上に接着させた。
サンプルパッド３と試薬パッド４とは、端部同士が積層されている（縦約４ｍｍ分）。
多孔体５：ニトロセルロース膜（縦２５ｍｍ×横８ｍｍ×厚さ２３５μｍ、孔径約８μｍ）を基体２上に接着させた。
多孔体５と試薬パッド４とは、端部同士が積層されている（縦２ｍｍ分）。
多孔体５上に、１．５ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体を塗布し、乾燥させることで、該モノクローナル抗体を領域６に固定させた。
標準呈色８：濃度１０００ＩＵ／Ｌ（基準濃度）のｈＣＧが領域６で抗体に捕捉された際の呈色と同一の色調になるように、標準呈色８として、標識物質として使用したのと同じラテックス粒子（青色染料で着色）を多孔体５の表面に固定した。
試験終了を表す指標として、多孔体５の標準呈色８よりも下流側の領域９に、発色剤としてエオシンＢを含侵させて乾燥させた。
吸収パッド７：縦２０ｍｍ×横８ｍｍ×厚さ０．４ｍｍの不織布（ガラス繊維、ワットマン社製）を基体２上に接着した。
保護フィルム：サンプルパッド３を除いて、試験具１の上部を透明部分２１、２２および不透明部分２３、２３′、２３″を有する保護フィルム（ポリエチレンテレフタレート製）を用いて被覆した。【００３９】
この試験具１を用いて、測定対象物質をヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）として、半定量を実施した。
ｈＣＧ（国立医薬品食品衛生研究所製）を以下の各種濃度で含むように、０．１％ＢＳＡを含む生理食塩水で希釈した溶液に、試験具１のサンプルパッド３部分を、約３秒間浸漬させた。次に、保護フィルム２０が上になるように試験具１を水平方向に約３分間静置した。窓２２に反応が終了したことを示す呈色９′が明確に生じた時点で、標準呈色８と領域６の呈色６′をデンシトメータで測定した。
ここで、検体は、ｈＣＧ濃度が０ＩＵ／Ｌ（陰性）、２５ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ、２５０ＩＵ／Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、１０００ＩＵ／Ｌおよび１００００ＩＵ／Ｌのものを使用した。
以下に、各濃度の検体の領域６の呈色６′の呈色度の度合をデンシトメータから得られた数値で示す。【００４０】
【表１】
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【００４１】
いっぽう、標準呈色８の呈色度の度合をデンシトメータで測定した値は９８００であった。
陰性検体では殆ど発色せず、２５ＩＵ／Ｌで発色、濃度が上がるにつれて発色も増強し、１０００ＩＵ／Ｌでほぼ標準呈色と同等の発色を示し、それ以上の濃度では標準呈色より強い発色を示し、半定量の試験具として有用であった。【００４２】
さらに、この試験具１を用いて、経時的な呈色度の変化の有無を確認した。すなわち、サンプルパッド３が浸かるように、試験具１を濃度調整した検体中に約３秒間浸漬させた。次に、保護フィルム２０が上になるように試験具１を水平方向に約３〜３０分間静置し、各時間の標準呈色８と領域６の呈色６′をデンシトメータで測定した。
ここで、検体は、ｈＣＧ濃度が０ＩＵ／Ｌ（陰性）、２５ＩＵ／Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、１０００ＩＵ／Ｌおよび１０6ＩＵ／Ｌのものを使用した。
図３および下記表に、呈色度の度合をデンシトメータから得られた数値の経時変化として示した。【００４３】
【表２】
0004988546.tif 000003
【００４４】
なお、呈色度は、各濃度３回測定した平均値である。標準呈色の数値は、各濃度３回（合計１５回）の平均値である。
３０分までの経時変化を見ると、標準呈色８や各濃度での領域６の呈色６′における発色が試験開始後５〜１０分でピークを示し、その後は多孔体５に対する検体の供給量減少に伴う多孔体５の乾燥により発色度が低下した。測定開始から時間が経過しても、陰性検体では殆ど発色せず、２５ＩＵ／Ｌで発色、１０００ＩＵ／Ｌでほぼ標準呈色と同等の発色、それ以上の濃度では標準呈色より強い発色を示す傾向は変わらず、半定量の試験具として有用であった。
なお、表１、表２および図３に示した本試験結果は、デンシトメータで測定した結果として数値で示したが、目視による判定においても、呈色の有無および標準呈色との強弱の観点では、同じ結果が得られた。【００４５】
図４は、半定量を実施した前後の試験具１を示した平面図である。図４（ａ）は検体に浸漬する前の未使用の試験具、（ｂ）はｈＣＧ濃度２５ＩＵ／Ｌの尿検体を用いて半定量を実施した後の試験具、（ｃ）はｈＣＧ濃度１０００ＩＵ／Ｌの検体を用いて半定量を実施した後の試験具、（ｄ）はｈＣＧ濃度１００００ＩＵ／Ｌの検体を用いて半定量を実施した後の試験具、（ｅ）はｈＣＧ濃度０ＩＵ／Ｌ（陰性）の検体を用いて半定量を実施した後の試験具を各々示している。
図４から明らかなように、半定量を実施した後の試験具１であることは、窓２２に生じる呈色９′により確認できる（図４（ｂ）〜（ｅ））。陰性検体を使用した例では、領域６に呈色は生じず、透明部分２１からは標準呈色８のみが確認された。一方、ｈＣＧを含んだ検体では、ｈＣＧと標識された抗体との複合体が領域６で抗体に捕捉されたことを示す呈色６′が確認された。この呈色６′は検体中のｈＣＧ濃度により色調が異なっていた。具体的には、ｈＣＧ濃度が基準濃度よりも低い２５ＩＵ／Ｌの検体を使用した例では、呈色６′は標準呈色８に比べてはるかに色調が弱かった（図４（ｂ））。ｈＣＧ濃度が基準濃度と等しい１０００ＩＵ／Ｌの検体を使用した例では、呈色６′の色調は標準呈色８とほぼ同一であった（図４（ｃ））。ｈＣＧ濃度が基準濃度よりも高い１００００ＩＵ／Ｌの検体を使用した例では、呈色６′の色調は標準呈色８よりも強かった（図４（ｄ））。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、免疫学的クロマトグラフィー（イムノクロマト法）を用いて、検体中の測定対象物質を半定量するための試験具、および該試験具を用いた半定量方法に関するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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