(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＶ−２由来逆転写酵素αサブユニット、ＲＡＶ−２由来逆転写酵素βサブユニット、ＤＮａｓｅ、ヒト由来Ｄｉｃｅｒ  ＰＡＺドメインポリペプチドから選択される所望のポリペプチドをコードする遺伝子とトリガーファクターをコードする遺伝子とがベクターにより導入された宿主を低温条件にさらすことによって所望のポリペプチドとトリガーファクターとの融合タンパク質の発現を誘導する工程を包含するポリペプチドの製造方法であって、ここで、前記の所望のポリペプチドをコードする遺伝子とトリガーファクターをコードする遺伝子は前記の融合タンパク質をコードするように接続されており、前記の所望のポリペプチドをコードする遺伝子は、プロモーターの下流に、コールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡの下流に接続されて宿主に導入されている、ポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
所望のポリペプチドをコードする遺伝子が大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡの下流に接続されて宿主に導入されていることを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項３】
宿主が大腸菌である請求項１または２記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項４】
プロモーターの下流に、
（ａ）コールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡ、
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡの下流に位置し、所望のポリペプチドがトリガーファクターとの融合タンパク質として発現されるように前記ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入できる部位に位置する、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入に使用可能な制限酵素認識配列、を有するＤＮＡ、および
（ｃ）トリガーファクターをコードする遺伝子
を有する発現ベクター。
【請求項５】
大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡを含有する請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
大腸菌で複製しうるプラスミドである請求項４または５記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターとシャペロン遺伝子を組み込んだベクターとを発現させて、低温条件下で目的タンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、種々の生物のゲノム解析が終了しつつあり、今後は遺伝子の発現産物であるタンパク質の網羅的な機能解析へと進むと考えられている。個々のタンパク質の性質を明らかにするとともに、タンパク質同士の相互作用を網羅的に解析することで、生命現象解明の一助としようとする研究が急速に増えつつある。一方、各種の生理活性物質と特異的に結合し、その作用を伝達する細胞内受容体タンパク質も、その受容体タンパク質と結合する活性物質が、新規医薬品の候補物質となり得ることから、その３次元構造決定に重大な関心が持たれ、新規医薬品のスクリーニングにおいて注目されている。このようなタンパク質の性質を決定しようとする場合、該当する遺伝子をベクター遺伝子上に組み込み、バクテリア、酵母、昆虫細胞等の宿主にトランスフォーメーションし、発現させて得られる組み換えタンパク質の性質を調べる方法が一般的である。【０００３】
タンパク質の正しい性質を評価する際、そのタンパク質が、正しい立体構造に折り畳まれているか否かが非常に重要となる。しかしながら、異種生物由来のタンパク質を、上述の宿主発現系を用いたタンパク質発現法で作製しようとする場合、しばしばタンパク質のフォールディング異常により、立体構造の異なった異常型タンパク質しか得られないケースに遭遇する。このようなタンパク質は宿主内で封入体と呼ばれるアグリゲートを形成する。封入体の形成は、発現タンパク質を宿主菌体内のタンパク質分解酵素による分解から保護し、また遠心分離により菌体から容易に分離することを可能ならしめるという利点を持つが、目的である生物学的に活性なタンパク質をえるためには、封入体を変性可溶化した後、再生（リフォールデリング）する必要がある。この可溶化・再生の操作は、個々のタンパク質ごとに試行錯誤を繰り返し経験的に行われているが、満足な回収率が得られないことが多いばかりか、必ずしも再生できるとは限らない。また、大腸菌でプロテアーゼにより分解を受けて、高い発現量に達しない異種タンパク質も少なくない。このような発現産物の不溶化や分解に対する解決手段はまだ十分に確立されたとは、言い難く、上述の宿主発現系で生物学的に活性なタンパク質を大量に生産することには必ずしも成功していないのが現状である。この問題を解決するために、シャペロン等を共発現させることが試みられており、いくつかの報告がなされている（例えば、特許文献１〜３参照）。【０００４】
ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥは、タンパク質の折り畳み（フォールディング）に協調して働くシャペロンである。まず、ＤｎａＪが、基質である折り畳まれていないタンパク質に結合すると、ＤｎａＫ上のＡＴＰが加水分解され、折り畳まれていないタンパク質−ＤｎａＪ−ＤｎａＫ（ＡＤＰ結合型）複合体を形成し、次に、ＧｒｐＥによって、ＡＤＰ／ＡＴＰ交換が起こり、基質タンパク質が複合体から遊離すると考えられている（例えば、非特許文献１参照）。トリガーファクター（Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ）は、タンパク質のフォールディングに関与する分子シャペロンの１つであり、細胞内でフォールディング途上のターゲットタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応（ＰＰＩａｓｅ活性）を触媒する活性を有するものである。【０００５】
大腸菌内で不溶化する外来タンパク質を可溶化するために、外来タンパク質をＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳと共発現させることにより、可溶化することに成功した例が多く知られている。例えば、チロシンキナーゼ（例えば、非特許文献２、３参照）、グルタミン酸ラセマーゼ（例えば、非特許文献４参照）、ジヒドロ葉酸還元酵素（例えば、非特許文献５参照）等が挙げられる。さらに、ＤｎａＫの共発現でヒト成長ホルモンの溶解性が向上した例（例えば、非特許文献６参照）やＤｎａＪの共発現でトランスグルタミナーゼが可溶化した例（例えば、特許文献４参照）、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥの共発現によりチロシンキナーゼが可溶化した例（例えば、非特許文献２参照）が知られている。【０００６】
また、大腸菌内で不溶化するタンパク質を、シャペロン等との融合タンパク質として発現させることにより可溶化させる試みもなされている。例えば、マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチームＦａｂ抗体フラグメントを、古細菌由来のシャペロンであるＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質として発現させることによって可溶化させる事に成功した例が知られている（特許文献７参照）。【０００７】
しかし、すべてのタンパク質の発現やフォールディング問題が上記の方法によって解決できている訳ではない。そのため、タンパク質を効率的に生産する方法の確立が強く望まれていた。【０００８】
一方、対数増殖期の大腸菌の培養温度を３７℃から１０〜２０℃に低下させると大腸菌の増殖は一時的に止まり、その間にコ−ルドショックタンパク質と呼ばれる一群のタンパク質の発現が誘導される。該タンパク質はその誘導レベルに応じて第Ｉ群（１０倍以上）と第II群（１０倍未満）に分けられ、第Ｉ群のタンパク質としては、ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＧ、及びＣｓｄＡなどが挙げられる（例えば、非特許文献７、８参照）。中でもＣｓｐＡ（例えば、特許文献５参照）は、３７℃から１０℃への温度シフトの１.５時間後にその発現量は全菌体タンパク質の１３％までに達することから（例えば、非特許文献９参照）、低温における組換えタンパク質の生産にｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターを利用することが試みられてきた。
ｃｓｐＡ遺伝子を用いた低温条件下での組換体タンパク質発現系は、上述のように該遺伝子のプロモーターが低温において高効率で転写を開始させること以外に、以下のような有効性が示されている。
（１）ｃｓｐＡ遺伝子から転写された翻訳可能なｍＲＮＡが機能を有するＣｓｐＡタンパク質をコードしていない場合、より具体的には、ＣｓｐＡタンパク質のＮ末端配列の一部のみをコードしている場合には、このようなｍＲＮＡはコールドショックタンパク質も含めた他の大腸菌タンパク質の発現を長時間阻害し、その間は該ｍＲＮＡの翻訳が優先的に行われる（例えば、非特許文献７、特許文献６参照）。この現象はＬＡＣＥ（ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｃｓｐＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）効果と呼ばれている。
（２）ｃｓｐＡ遺伝子の開始コドンから１２塩基下流の位置には、１５塩基からなるダウンストリームボックス（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｏｘ）と呼ばれる配列があり、低温条件下での翻訳効率を高いものにしている。
（３）ｃｓｐＡ遺伝子ｍＲＮＡの転写開始点から開始コドンまでにある１５９塩基からなる５’非翻訳領域は、ＣｓｐＡの発現に対して、３７℃では負の、低温条件下では正の影響を与えている。
特に上記（１）の現象は、ｃｓｐＡ遺伝子を利用して目的のタンパク質のみを特異的に発現させる可能性を示唆するものであり、高純度の組換えタンパク質生産、構造解析のための同位体標識されたタンパク質の調製への応用が期待されている。
しかしながら、上記の低温条件下での組換体タンパク質発現系もすべての組換えタンパク質に適用可能なものではない。タンパク質はそれぞれ固有の分子量、等電点、アミノ酸組成を有し、また、その機能の発現のためには特有の高次構造を形成する必要がある。タンパク質の中には上記の発現系をもってしても十分な発現量が達成できないもの、活性を有するタンパク質を取得できないものが存在している。【０００９】
【特許文献１】特開平１１−９２７４号公報
【特許文献２】特開２０００−２５５７０２号公報
【特許文献３】特開２０００−１８９１６３号公報
【特許文献４】特開平８−３０８５６４号公報
【特許文献５】国際公開第９０／０９４４７号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９８／２７２２０号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００４／００１０４１号パンフレット
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第９１巻、１０３４５−１０３４９頁（１９９４）
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第４０巻、６３５−６４４頁（１９９４）
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第９２巻、１０４８−１０５２頁（１９９５）
【非特許文献４】Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１７巻、４９５−４９８頁（１９９５）
【非特許文献５】Ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｅｎｇ．、第７巻、９２５−９３１頁（１９９４）
【非特許文献６】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１０巻、３０１−３０４頁（１９９２）
【非特許文献７】Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７８巻、第４９１９〜４９２５頁（１９９６）
【非特許文献８】Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７８巻、第２９９４〜２９９７頁（１９９６）
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８７巻、第２８３〜２８７頁（１９９０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、目的とするポリペプチドを効率よく、また、活性を保持した状態で製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、目的とするポリペプチド、タンパク質をコードする遺伝子を、低温条件下での組換体タンパク質発現系により発現させる際に、使用する宿主中でのシャペロン遺伝子の発現を増強させておくことによって、従来の方法では可溶性タンパク質を発現させることが困難であったものを、活性のある可溶性タンパク質として発現できることを見出した。
さらに、上記の方法において、目的とするポリペプチド、タンパク質をシャペロンとの融合タンパク質として発現させた場合、目的タンパク質の可溶化に特に有効であることを見出した。この方法による目的タンパク質の可溶化の効果は、従来から知られていたタンパク質とシャペロンとを融合タンパク質として発現させる方法や、低温条件下での組換体タンパク質発現系を用いて目的タンパク質を発現させる方法によるそれぞれの効果からは、全く予想し得ない驚くべきものであった。
本発明は、例えば、目的遺伝子を組み込んだベクターとシャペロン遺伝子を組み込んだベクターを同一宿主内に導入し、両遺伝子の発現を誘導して効率よく目的ポリペプチドを発現させる方法を提供する。【００１２】
本発明の第１の発明は、所望のポリペプチドをコードする遺伝子が導入された宿主を低温条件にさらすことによって前記ポリペプチドの発現を誘導する工程を包含するポリペプチドの製造方法であって、前記宿主においてさらにシャペロンをコードする遺伝子の発現を増強することを特徴とするポリペプチドの製造方法に関する。
第１の発明においてシャペロン遺伝子をコードする遺伝子の発現を増強する手段としては、宿主シャペロン遺伝子の発現の誘導、宿主染色体上のシャペロン遺伝子の改変、宿主へのシャペロン遺伝子の導入、シャペロン遺伝子の発現が増強された宿主の使用が例示される。
第１の発明には、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、トリガーファクターから選択されるシャペロンをコードする遺伝子が好適に使用される。
第１の発明において、所望のポリペプチドをコードする遺伝子はコールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡの下流に接続されて宿主に導入されていることができ、前記コールドショックタンパク質遺伝子としては大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子が例示される。
第１の発明において、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡとシャペロンをコードする遺伝子は、ベクターにより宿主に導入する事ができる。また、前記所望のポリペプチドをコードするＤＮＡとシャペロンをコードする遺伝子は、所望のポリペプチドとシャペロンとの融合タンパク質をコードするように接続されていても良い。前記の所望のポリペプチドとしては、ラウス関連ウイルス２（ＲＡＶ−２）由来逆転写酵素αサブユニット、ＲＡＶ−２由来βサブユニット、ＤＮａｓｅ、ヒト由来Ｄｉｃｅｒ  ＰＡＺドメインポリペプチドが例示される。
第１の発明に使用される宿主としては、大腸菌が例示される。【００１３】
本発明の第２の発明は、所望のポリペプチドの製造に使用されるプラスミドベクターのセットであって、
（１）プロモーターの下流に
（ａ）コールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡ、
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡの下流に位置する、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入に使用可能な制限酵素認識配列、を有する第１のベクター；および
（２）シャペロンをコードする遺伝子を有する第２のベクター、
を含有し、前記（１）、（２）のベクターの複製起点が不和合性を示さないように選択されていることを特徴とする。
第２の発明において、第１のベクターとしては大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡを含有するもの、また、第２のベクターとしてはＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、トリガーファクターから選択されるシャペロンをコードする遺伝子を含有しているものがそれぞれ例示される。前記のベクターには大腸菌で複製しうるプラスミドを使用することができる。【００１４】
本発明の第３の発明は、発現ベクターに関し、プロモーターの下流に、
（ａ）コールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡ、
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡの下流に位置する、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入に使用可能な制限酵素認識配列、を有するＤＮＡ、および
（ｃ）シャペロンをコードする遺伝子
を有することを特徴とする。
第３の発明の発現ベクターとしては、大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡを含有するもの、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、トリガーファクターから選択されるシャペロンをコードする遺伝子を含有するものが例示される。
第３の発明においては、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入に使用可能な制限酵素認識配列が、所望のポリペプチドがシャペロンとの融合タンパク質として発現されるように前記ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入できる部位に位置していてもよい。
前記の発現ベクターは大腸菌で複製しうるプラスミドであってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法により、従来は発現が困難であったポリペプチドを著量に、また、活性を有する状態で取得することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、共発現によるｈＤｉ−ＡＳＩの発現試験結果を示す図である。ＡおよびＢはそれぞれＣＢＢ染色および抗体染色の結果を示す。図中、Ｔは細胞抽出液画分、Ｓは可溶性画分を示す。
【図２】図２は、ＲＴａｓｅαおよびＲＴａｓｅβとトリガーファクターとの融合タンパク質の発現試験結果を示す図である。ＡおよびＢはそれぞれ単独発現および共発現の結果を示し、ＣおよびＤはそれぞれＴ７プロモーター発現系による融合発現およびコールドショック発現系による融合発現の結果を示す。図中、αはＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅα、βはＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβ、Ｔは細胞抽出液画分、Ｓは可溶性画分、Ｐは不溶性画分を示す。
【図３】図３は、ＤＮａｓｅとトリガーファクターとの融合タンパク質の発現試験結果を示す図である。Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ単独発現系、共発現系および融合発現系の結果を示す。図中、Ｓは可溶性画分、Ｐは不溶性画分を示す。
【図４】図４は、ＤＮａｓｅの活性測定結果を示す図である。図中、Ｍは基質のみ、１は対照の超音波破砕可溶性画分を用いてＤＮａｓｅ活性測定を行った結果、２は融合発現系の超音波破砕可溶性画分を用いてＤＮａｓｅ活性測定を行った結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について説明する。
（１）コールドショックベクター
本発明に使用される、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターは、宿主の培養温度を通常の生育温度よりも低くシフトさせる処理、すなわちコールドショックにより、前記ポリペプチドの発現が誘導されるものであり、本発明においては発現ベクターとして使用される。本明細書において「低温」なる用語は、宿主の通常の生育温度よりも低い温度をいう。以下、前記のベクターをコールドショックベクターと記載することがある。また、当該ベクターを利用した所望のポリペプチドの発現系を、コールドショック発現系と記載する事がある。当該ベクターとしては、コールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡを保持し、その下流に所望のポリペプチドをコードする遺伝子が接続されたものを使用することができる。本明細書において「下流」なる用語は、転写の方向に関して下流の位置をいう。
特に本発明を限定するものではないが、好適な態様において、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターは下記の各要素を含有することを特徴とする：
（Ａ）使用する宿主中でその作用を示すプロモーター、
（Ｂ）（Ａ）のプロモーターの作用を調節するための調節領域、及び
（Ｃ）コールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域、あるいは該非翻訳領域に少なくとも１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加が施された領域をコードする領域。
以下にその詳細を説明する。【００１８】
上記（Ａ）のプロモーターは特に限定はなく、使用する宿主中でＲＮＡの転写を開始する活性を有するものであればよい。詳しくは、任意のプロモーターを上記（Ｃ）のコールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコードする領域と組み合わせて使用することにより、低温応答性のプロモーターとして利用することができるプロモーターである。
また、上記（Ｂ）の調節領域としては、（Ａ）のプロモーターの下流に位置する遺伝子の発現を制御可能なものであれば特に限定はない。例えば、プロモーターより転写されたｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）を転写するような領域をベクターに導入しておくことにより、プロモーター下流の遺伝子からの目的タンパク質の翻訳を阻害することができる。アンチセンスＲＮＡの転写を（Ａ）のプロモーターとは異なる適当なプロモーターの制御下に置くことにより、目的ポリペプチドの発現を調節することができる。また、種々の遺伝子の発現調節領域に存在するオペレーターを利用してもよい。例えば、大腸菌ラクトースオペロン由来のｌａｃオペレーターを本発明では使用することができる。ｌａｃオペレーターは適当な誘導物質、例えばラクトースやその構造類似体、特に好適にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（ＩＰＴＧ）の使用によってその機能を解除し、プロモーターを作用させることが可能である。このようなオペレーター配列は、通常、プロモーター下流の転写開始点付近に配置される。
上記（Ｃ）のコールドショックタンパク質ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコードする領域とは、ｍＲＮＡの開始コドンよりも５’側の部分をコードしている領域である。大腸菌のコールドショックタンパク質遺伝子（ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、及びｃｓｄＡ）にはこの領域が特徴的に見出されており［Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７８巻、第４９１９〜４９２５項（１９９６）；Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７８巻、第２９９４〜２９９７項（１９９６）］、これらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡのうちの５’末端より１００塩基以上の部分がタンパク質に翻訳されていない。この領域は遺伝子発現の低温応答性に重要であり、任意のタンパク質のｍＲＮＡの５’末端にこの５’非翻訳領域を付加することにより、該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳が低温条件下で起こるようになる。このコールドショックタンパク質ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域は、その機能を保持する範囲においてその塩基配列に１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加が施されたものであってもよい。【００１９】
本明細書において「領域」とは核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）上のある範囲を指す。また、本明細書に記載の「ｍＲＮＡの５’非翻訳領域」とは、ＤＮＡからの転写によって合成されるｍＲＮＡのうち、その５’側に存在し、かつタンパク質をコードしていない領域を言う。以降の本明細書においては該領域を「５’−ＵＴＲ（５’−Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ）」と記載する。なお、特に断らない限り５’−ＵＴＲは大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子のｍＲＮＡ、あるいはこれが改変されたものの５’非翻訳領域をさす。【００２０】
本ベクターには上記に列記されたコールドショックタンパク質遺伝子由来の５’−ＵＴＲをコードする領域を使用することができるが、特に大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子由来のものが好適に使用できる。さらに、低温特異的なポリペプチドの発現に寄与しうる範囲でその塩基配列を一部改変したものであってもよく、例えば上記（Ｂ）に示したオペレーターの導入などによってこの領域の塩基配列が改変されたものであってもよい。また、このコールドショックタンパク質遺伝子の５’−ＵＴＲをコードする領域は（Ａ）のプロモーターと発現させようとするポリペプチドをコードする遺伝子の開始コドンとの間に配置され、また、該領域上にオペレーターが導入されていてもよい。【００２１】
また、上記構成要素に加えて、用いる宿主のリボソーマルＲＮＡのアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する塩基配列を５’非翻訳領域の下流に含有させることにより発現効率を上昇させることができる。例えば、大腸菌の場合、１６ＳリボソーマルＲＮＡの１４６７−１４８１の位置にアンチダウンストリームボックス配列が存在し、この配列と高い相補性を示す塩基配列を含有するコールドショックタンパク質のＮ末端ペプチドをコードする領域を用いることができる。さらに、目的タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列（ターミネーター）が配置されたベクターはベクターの安定性が向上し目的タンパク質の高発現に有利である。【００２２】
本ベクターは、ベクターとしての目的を達成できるものであれば一般的に用いられるベクター、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルスなどのいずれであってもよい。また、本発明のベクターに含有される上記の構成要素以外の領域としては、例えば、複製起点、選択マーカーとして使用される薬剤耐性遺伝子、オペレーターの機能に必要な調節遺伝子、例えば、ｌａｃオペレーターに対してはｌａｃＩｑ遺伝子、などを有することができる。また、本発明のベクターは宿主に導入された後にはそのゲノムＤＮＡ上に組み込まれてもかまわない。【００２３】
以下に、具体的なプラスミドベクターの構築をあげる。なお、本明細書においては特に限らない限り、大腸菌ＣｓｐＡタンパク質を「ＣｓｐＡ」、該タンパク質の発現に関与する遺伝子上の領域を「ｃｓｐＡ遺伝子」、該遺伝子のプロモーター領域を「ｃｓｐＡプロモーター」と記載する。また、ＧｅｎｅＢａｎｋ遺伝子データベースに受託番号Ｍ３０１３９として登録、公開されている天然のｃｓｐＡ遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号１に当該配列を示す）において、塩基番号４２６が主要な（ｍａｊｏｒ）転写開始点（＋１）、塩基番号６０９〜６１１がＳＤ配列（リボソーム結合配列）、塩基番号６２１〜６２３及び８３２〜８３４がそれぞれＣｓｐＡの開始コドン及び終止コドンである。したがって、該配列中で５’−ＵＴＲをコードするのは塩基番号４６２〜６２０の部分である。また、前記の一部改変された５’−ＵＴＲとしては国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載されたものが例示される。本願実施例において使用されたｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターが有している５’−ＵＴＲ領域はその一例であり、その塩基配列を配列表の配列番号２に示す。【００２４】
また、目的の遺伝子の発現効率を向上させるために、１６ＳリボソーマルＲＮＡ中に存在するアンチダウンストリームボックス配列に高い相補性を有する塩基配列（ダウンストリームボックス配列）を本ベクターに導入することができる。大腸菌ＣｓｐＡのＮ末端部分をコードする領域に存在するダウンストリームボックス配列は、上記のアンチダウンストリームボックス配列に対して６７％の相補性しか有していない。これをより高い相補性、好ましくは８０％以上の相補性を有する塩基配列、特に好ましくは１００％の相補性を有する塩基配列（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列）とすることにより、その下流に接続された遺伝子をより高い効率で発現させることが可能になる。
さらに、本ベクターは、発現された目的の遺伝子産物の精製を容易にするためのペプチドであるタグ配列をコードする塩基配列や、タグ配列のような目的の遺伝子産物中の余分なペプチドの除去に利用されるプロテアーゼ認識アミノ酸配列をコードする塩基配列を導入することができる。
精製用のタグの配列としては、数個のヒスチジン残基からなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓ  Ｔａｇ）やマルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが使用できる。ヒスチジンタグを付加されたポリペプチドはキレーティングカラムを使用して容易に精製することができ、他のタグ配列についてもこれらに特異的な親和性を有するリガンドを使用することにより、簡便に精製することができる。また、余分なペプチドの除去に利用されるプロテアーゼとしては、ファクターＸａ、トロンビン、エンテロキナーゼ等を使用することができ、本ベクターにこれらのプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を導入すればよい。【００２５】
（２）シャペロンの発現の増強
本発明のポリペプチドの製造方法は、目的とするポリペプチドをコードする遺伝子の発現の際に、シャペロンをコードする遺伝子の発現を増強させることを特徴とする。
本発明において、シャペロンとは、タンパク質のフォールディングに関与するタンパク質であればいかなるタンパク質でも構わない。例えば、大腸菌由来ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、トリガーファクター等が挙げられる。
特に本発明を限定するものではないが、コールドショックベクターを用いたポリペプチドの発現においては、ポリペプチド内のプロリンの異性化に関与するタンパク、例えばトリガーファクター［Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔａｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＰＩａｓｅ）とも呼ばれる］の使用が好ましい。前記のシャペロンは、大腸菌由来のものに限定されず、例えば、古細菌、酵母、微生物、好冷菌由来などのシャペロンを利用することが出来る。【００２６】
上記のシャペロン遺伝子の発現の増強は、染色体上のシャペロンをコードする遺伝子の発現誘導の他、染色体上のシャペロン遺伝子の改変（コピー数の増加やプロモーターの挿入）、シャペロン遺伝子の宿主への導入、宿主への変異導入によるシャペロン遺伝子高発現株の取得等、公知の手法により達成されうる。
染色体上のシャペロン遺伝子の発現誘導は、例えば宿主において前記シャペロンの発現が誘導される条件が知られているものであれば、当該条件を利用して実施することができる。染色体上のシャペロン遺伝子の改変は、宿主染色体について相同組換えを利用した遺伝子の挿入や部位特異的変異導入の手法を使用して実施することができる。例えば、宿主染色体上の誘導したいシャペロンをコードする遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターを挿入しておき、このプロモーターを介して発現を誘導することができる。
さらに、別の態様としては、ポリペプチドの発現に使用される宿主についてシャペロン遺伝子の発現が増強されている変異株を取得し、これを宿主として使用することが挙げられる。変異株の取得は、公知の方法、例えば宿主微生物を薬剤や紫外線のような変異原で処理した後にシャペロン遺伝子の発現が増強されている株を選抜することによって実施できる。
ここで、シャペロンをコードする遺伝子の発現の増強とは、宿主中のシャペロンタンパク質の量がその通常の量に比較して増加していることを意味する。上記の操作によりシャペロン遺伝子の発現が増強されているかどうかは、例えば当該シャペロンを認識する抗体を利用してシャペロンタンパク質を測定するか、あるいは当該シャペロンをコードする遺伝子より転写されるｍＲＮＡ量を公知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡアレイを使用するハイブリダイゼーション等によって測定し、確認することができる。
目的タンパク質の発現レベルを低下させず、前記シャペロンの発現量や発現時期を最適化するために、シャペロンの発現と目的タンパク質の発現は独立して制御できる方が有利である。このためにはシャペロン遺伝子を制御可能なプロモーターの下流に置くことが好ましい。さらに、シャペロンの発現に用いる制御可能なプロモーターとしては、目的タンパク質の発現に用いられるプロモーターと異なるものが好ましい。【００２７】
前記のシャペロン遺伝子の発現の増強は、当該シャペロン遺伝子をベクターに挿入して宿主に導入し、実施することもできる。ベクターには、ベクターとしての目的を達成できるものであれば一般的に用いられるベクター、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルスなどのいずれであってもよい。
通常、同一宿主に近縁の２種のプラスミドは安定に共存できない。この現象を不和合性という。本発明において、シャペロン遺伝子を含有するベクターとしてプラスミド（以下シャペロンプラスミドと記載することがある）を使用する場合は、目的タンパク質の発現ベクターと不和合性を示さないレプリコンを有するものを使用可することが好ましい。例えば、目的タンパク質の発現ベクターとして国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ０７等ＣｏｌＥ１レプリコンをもつものを用いる場合、シャペロンプラスミドには、ｐＡＣＹＣベクターに存在するｐ１５Ａレプリコン等を使用することができる。【００２８】
本発明において、シャペロン遺伝子を含有するベクターによる形質転換の際に選択が容易に行われるように、必要に応じて選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。かかる選択マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性（Ａｍｐr）遺伝子、カナマイシン耐性（Ｋｍr）遺伝子、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍr）遺伝子等が挙げられるが、外来タンパク質発現ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子とは異なることが望ましい。【００２９】
本発明において使用するシャペロンプラスミドの具体例としては、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥおよびＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳを発現するプラスミドｐＧ−ＫＪＥ８、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳを発現するプラスミドｐＧｒｏ７、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥを発現するプラスミドｐＫＪＥ７、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳおよびトリガーファクターを発現するプラスミドｐＧ−Ｔｆ２、トリガーファクターを発現するプラスミドｐＴｆ１６（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。【００３０】
シャペロンをコードする遺伝子は、上記のようにベクターを使用して宿主に導入する他、宿主染色体に組み込んで使用することもできる。【００３１】
本発明において、発現させる外来タンパク質としては、宿主内で不安定化及び／または不溶化する外来タンパク質であれば、いかなるタンパク質でも構わない。かかる外来タンパク質としては、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体成分、血液アルブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転写調節因子及びウイルス構成タンパク質があげられる。【００３２】
本発明の発現ベクターは宿主に導入されて目的タンパク質の発現に供される。上記宿主としては特に限定されず、例えば、細菌等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫細胞、ほ乳類細胞等が挙げられるが、使用される宿主と発現ベクターの特性は適合しなければならない。例えば、ほ乳類細胞系においてタンパク質を発現する場合、発現ベクターは、ほ乳類細胞のゲノムから単離された、例えばマウスメタロチオネインプロモーター等のプロモーターや、これらの細胞で増殖するウイルスから単離された、例えばバキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター等のプロモーターを用いることが好ましい。【００３３】
上記宿主としては、なかでも大腸菌等の原核生物が好適に用いられる。グラム陰性細菌を宿主として用いる場合、タンパク質の発現は、細胞質であっても、ペリプラズム領域への発現であっても良い。【００３４】
本発明のシャペロンベクター及び発現ベクターを宿主に導入する方法としては特に限定されず、公知の種々の方法を用いることができ、例えば、トランスフェクションとしてリン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リポソーム融合、核注入、ウイルス又はファージ感染等が挙げられる。本発明の発現ベクターを内包する宿主もまた、本発明の１つである。宿主に導入する手順としてはシャペロンベクターと発現ベクターを同時に導入する一段階方式であっても、シャペロンベクターを導入した後に発現ベクターを導入するまたは、発現ベクターを導入した後にシャペロンベクターを導入する二段階方式であってもよい。共形質転換菌のスクリーニング法としては、選択マーカー遺伝子に応じた薬剤により行うことができる。外来タンパク質の発現は、例えば、ウェスタンブロッティングなどにより確認することができる。【００３５】
本発明の１つの態様として、前記のコールドショックベクター、シャペロン遺伝子を含有するベクターを組み合わせた、ポリペプチド発現用のベクターセットが挙げられる。この態様において、コールドショックベクターとしては、目的に応じて発現させることが望まれるポリペプチドをコードする遺伝子を挿入可能なものが好ましく、例えば、（ａ）コールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡ、ならびに、（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡの下流に位置する、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入に使用可能な制限酵素認識配列、を有するものが例示される。【００３６】
さらに、本発明の別の態様として、前記のコールドショックベクターにシャペロンをコードする遺伝子を挿入したベクターが挙げられる。この場合、単一のベクターで宿主を形質転換することにより、目的のポリペプチドを発現に使用できる形質転換体が作製できる。
この態様においては、シャペロンをコードする遺伝子と目的のポリペプチドをコードする遺伝子とがイン・フレームで結合され、シャペロンと目的のポリペプチドとの融合タンパク質が発現されるような位置に、目的のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入に使用可能な制限酵素認識配列を配してもよい。シャペロンと目的のポリペプチドとの融合タンパク質は、シャペロンが目的のポリペプチドのＮ末端側に連結されても、Ｃ末端側に連結されても、その両方に連結されてもよい。また、前記融合タンパク質は、シャペロンと目的のポリペプチドとの間にリンカーとなるアミノ酸、又はペプチドを有していても良い。このようなリンカーの鎖長は、１〜５０アミノ酸である事が好ましく、更に好ましくは３〜４０アミノ酸であり、最も好ましくは５〜３０アミノ酸である。また、リンカーのアミノ酸配列は、プロテアーゼの認識配列であっても良く、複数のプロテアーゼ認識配列が並列に挿入されたものであっても良い。このようなプロテアーゼ認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ、Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ（いずれもタカラバイオ社製）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）といった各種プロテアーゼの認識配列が例示される。前記のプロテアーゼの認識配列は、好適には４〜８アミノ酸からなる配列が例示される。【００３７】
前記のベクターに目的のポリペプチドをコードする遺伝子を挿入して適当な宿主に導入する事により、目的のポリペプチドとシャペロンとの融合ポリペプチドを取得する事ができる。該融合ポリペプチドがプロテアーゼの認識配列を含むリンカーを有している場合には、プロテアーゼ消化によってシャペロンと分離された目的のポリペプチドを得る事ができる。【００３８】
（３）ポリペプチドの製造方法
本発明におけるポリペプチドの製造は、例えば以下のような工程で実施される。
目的とするポリペプチドをコードする遺伝子をコールドショックベクターの、コールドショックタンパク質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコ−ドするＤＮＡの下流に挿入する。こうして作製された組換え発現ベクターを適切な宿主に導入して形質転換体を作製する。【００３９】
前記の、シャペロンをコードする遺伝子を含有するベクターを併用する場合には、さらに該ベクターを前記の形質転換体に導入する。また、コールドショックベクターがシャペロンをコードする遺伝子を保持するものである場合には、当該ベクターのみで宿主を形質転換すればよい。【００４０】
前記の形質転換体を通常の条件で培養する。例えば、大腸菌の場合には３７℃前後で培養すればよい。シャペロンについては培養のすべての工程で宿主中に発現させていてもよく、また、目的のポリペプチドの発現と同時期に発現を誘導してもよい。シャペロン遺伝子の発現の誘導は宿主中のシャペロン遺伝子の存在状態に応じて行えばよく、例えば、宿主が本来有しているシャペロン遺伝子の発現を誘導したい場合には、それに適した条件に宿主を置けばよい。シャペロンをコードする遺伝子が異種のプロモーターの制御下にある場合、例えばシャペロン遺伝子がベクターに挿入されて宿主に導入されている場合には、その転写を制御しているプロモーターに適した手段で発現の誘導が実施される。なお、定常的にシャペロン遺伝子の発現が増強されている宿主を使用する場合、前記のような誘導操作は必要ではない。【００４１】
目的のポリペプチドの発現の誘導は、通常、前記のように一般的な培養温度で細胞数を増加させた後に実施される。この状態から培養温度を低下させることによって宿主にコールドショック応答が誘導され、この結果として目的のポリペプチドの発現が優先的に行われるようになる。培養温度は、特に本発明を限定するものではないが、例えば一般的な培養温度から５℃以上、好ましくは１０℃以上低下させてコールドショック応答が誘導される。この際、プロモーターの下流にオペレーターを保持するコールドショックベクターが使用されている場合には、適切な手段で当該オペレーターの機能を解除し、プロモーターを誘導してもよい。
前記のコールドショックの後、さらに低温で形質転換体の培養を継続し、ポリペプチドを発現させる。こうして得られる培養物より目的のポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。培養物からのポリペプチドの精製は、前記培養物より回収された形質転換体細胞、培養液上清、もしくはその両方から実施することができる。ポリペプチドの精製は、硫安分画、限外ろ過、各種クロマトグラフィーなどの公知のタンパク精製手法を組み合わせて実施すればよい。【００４２】
さらに、発現されたポリペプチドを適当なリガンドを介して担体に結合する形態に設計することにより、その精製を容易にすることができる。例えば、前記ポリペプチドのＮ末端側に、ヒスチジン６残基程度のタグ付加されるようベクターを設計すると、得られた融合ポリペプチドは、ニッケル等の金属をキレートした担体に、ヒスチジン残基を介して結合することができる。この担体を用いれば、宿主由来のタンパク質と発現されたポリペプチドとを簡単に分離できる。担体に結合した発現されたポリペプチドは、プロテアーゼでリンカーを切断することにより、目的ポリペプチドのみを簡単に担体から遊離させることができる。もちろん、切断することなく、発現されたポリペプチドのまま担体から遊離させることも、イミダゾールで溶出すれば可能である。上記ヒスチジンタグ以外にも、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ又はその一部分をタグとし、グルタチオン樹脂によるアフィニティーにより精製する方法や、マルトース結合タンパク質又はその一部をタグとし、マルトース樹脂により精製する方法等を適用してもかまわない。
その他、抗体とのアフィニティーを用いてもかまわない。上記の精製タグは、発現タンパク質のＮ末端側に設計しても、Ｃ末端側に設計してもいずれであってもかまわない。これらの遺伝子操作や、アフィニティー精製方法は、当業者には一般的に理解されているものである。【００４３】
前記のようにコールドショックベクターを使用したポリペプチドの発現系では、目的のポリペプチド以外のポリペプチドの発現は抑制されることから、本願発明の方法は高純度のポリペプチドの製造において有利である。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｊ．サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。【００４５】
実施例１  シャペロン共発現によるｈＤｉ−ＡＳＩの発現検討
（１）発現ベクターの構築
ヒト由来ＤｉｃｅｒのＰＡＺ＋ＲＮａｓｅＩＩＩドメインよりなるポリペプチド（ヒト由来Ｄｉｃｅｒ  のアミノ酸配列のＮ末端側より６７９〜１９２４番目）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。
まず、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＡＢ０２８４４９で公開されている塩基配列より、配列表の配列番号４及び５記載の塩基配列を有する合成プライマー５及び６をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー５は、制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号３）のアミノ酸番号６７９〜６８５に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３６にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー６は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号３）のアミノ酸番号１９１９〜１９２４に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３５にもつ。【００４６】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡ（ヒトｃＤＮＡライブラリー、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ、タカラバイオ社製）２μｌ、５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマー５、１０ｐｍｏｌの合成プライマー６、０．５ＵのＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【００４７】
反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約２．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００４８】
次に国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの記載に基づき、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＭＭ０４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５２３）（平成９年（１９９７年）１０月３１日（原寄託日）に日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託）に保持されたプラスミドｐＭＭ０４７を出発材料としてｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２を構築した。プラスミドｐＣｏｌｄ０８Ｎｃ２は、上流側より順番にｃｓｐＡプロモーター、ｌａｃオペレーター、改変された大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子由来５’−ＵＴＲ、マルチクローニングサイトを有するプラスミドである。また、当該プラスミドは、ｌａｃＩ遺伝子、大腸菌１６ＳリボソーマルＲＮＡ中に存在するアンチダウンストリーム配列に完全に相補的なダウンストリームボックス配列、６個のヒスチジン残基からなるヒスチジンタグおよびファクターＸａの認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列、をそれぞれ有している。ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターが有している５’−ＵＴＲ領域の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。【００４９】
このｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターを上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。【００５０】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩとした。当該プラスミドは、ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩと命名、表示され、平成１５年９月２６日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７６として寄託されている。このｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩは、ヒト由来Ｄｉｃｅｒ  アミノ酸配列（配列番号３）のアミノ酸番号６７９〜１９２４のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列表の配列番号６記載の塩基配列、配列番号７記載のアミノ酸配列）を含むプラスミドである。前記プラスミドから発現させたタンパク質は、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列、Ｈｉｓ  ｔａｇ配列、並びにＦａｃｔｏｒ  Ｘａ配列を有している。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号８に、塩基配列を配列表の配列番号９に示す。【００５１】
（２）共形質転換体の調製
ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを発現するｐＧｒｏ７、ＤｎａＫおよびＤｎａＪならびにＧｒｐＥを発現するｐＫＪＥ７，ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳならびにトリガーファクターを発現するｐＧ−Ｔｆ２、トリガーファクターを発現するｐＴＦ１６（いずれもタカラバイオ社製）それぞれのシャペロンプラスミド各１ｎｇと、上記のプラスミドｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＡＳＩ各１ｎｇとを用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行った。【００５２】
ｐＧｒｏ７、ｐＫＪＥ７，ｐＧ−Ｔｆ２、ｐＴＦ１６のそれぞれとｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＡＳＩを保持する共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。得られた各シャペロンとｈＤｉ−ＡＳＩとを共発現するクローンをそれぞれＴ１，Ｔ２、Ｔ３，Ｔ４と命名した。【００５３】
また対照として、ｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＡＳＩのみを用いて大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換し、アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た形質転換体を作製した。このシャペロンを導入しない従来の発現系のクローンをＣ１と命名した。【００５４】
（３）ｈＤｉ−ＡＳＩの発現
（１）で得られた各形質転換体を用いて、ｈＤｉ−ＡＳＩの発現を調べた。培養には、５ｍｌのＬＢ液体培地（組成：１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）を使用した。ただし、対照であるＣ１の培養にはクロラムフェニコールを含まない培地を用いた。【００５５】
各形質転換体は３７℃で培養した。培養開始する際に、Ｔ１，Ｔ２，Ｔ４の培地にはＬ−アラビノース（終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、またＴ３の培地にはテトラサイクリン（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を添加してシャペロンを発現誘導した。濁度がＯＤ６００＝０．４程度に達した時点で、１５℃で１５分間培養後、培養液に終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、更に１５℃で２４時間培養を行うことでｈＤｉ−ＡＳＩの発現を誘導した。【００５６】
ｈＤｉ−ＡＳＩの発現誘導を２４時間行ったのち、菌体を回収した。得られた菌体を超音波破砕し、細胞抽出液画分を調製、ついで１５、０００×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分について、約３．７５×１０６個の菌数分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＣＢＢ染色（Ａ）、あるいは抗Ｈｉｓタグ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いたウェスタンブロッティングにより解析した結果（Ｂ）を図１に示す。【００５７】
図１に示したように従来の発現系である対照のＣ１では、細胞抽出液画分に分子量１４４０００の目的タンパク質が確認されたが、可溶性画分にはほとんど検出されなかった。一方で、Ｔ４にみられるようにｈＤｉ−ＡＳＩとトリガーファクターを共発現した場合には、対照と比較してｈＤｉ−ＡＳＩの細胞抽出液画分が増加していることが観察された。さらに、その大部分が可溶性画分に検出された。ｈＤｉ−ＡＳＩと他のシャペロンとの共発現を行ったＴ１，Ｔ２，Ｔ３では、可溶性画分にはほとんど検出されなかった。【００５８】
以上のように、シャペロンを導入しない従来の発現系、あるいはＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ、ＤｎａＫおよびＤｎａＪならびにＧｒｐＥ，ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳならびにトリガーファクターを発現するシャペロン共発現に比べ、トリガーファクターとの共発現によりｈＤｉ−ＡＳＩの発現量、可溶性度の増大効果が得られることが示された。【００５９】
（４）発現、精製
上記（２）で調製したｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩとｐＴｆ１６を用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを５００ｍｌのＴＢ液体培地（バクトトリプトン ６ｇ、バクト−イースト  エキス １２ｇ、グリセロール ２ｍｌ、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、アンピシリン２５ｍｇ）２本に植菌した。植菌後にアラビノースを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃、１３０ｒｐｍの条件で対数増殖期まで培養し、その後１５℃に冷却した。冷却後にＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、１３０ｒｐｍ、１５℃の条件で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、３．３ｇの湿菌体を得た。湿菌体３．３gを１３．１６ｍｌのｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ 塩化マグネシウム、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ベーリンガーマンハイム社製）］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ  ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。
上記上清の抽出液  約１３ｍｌを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のように行なった。
すなわち、樹脂容積にして１０ｍｌ分のＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）をφ５０ｍｍのカラムに充填し蒸留水３０ｍｌで洗浄した。その後ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  １００ｍｌで洗浄し、樹脂を回収した。上記の菌体破砕液より調製した約１３ｍｌの上清を添加し、４℃で約１時間、ロータリーシェイカーで穏やかに混和した。その後、この目的タンパク質の吸着した樹脂をφ５０ｍｍのカラムに充填し、５０ｍｌのｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。次に５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール］で樹脂を洗浄後、５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、８００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール］、続いて５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡで洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除去を行った。
洗浄後、３０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＣ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール、１００ｍＭ  イミダゾール］で溶出操作を行った。溶出サンプルについてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（アミコン社製）を用いて濃縮を行ない、１０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＤ［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、２５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１ｍＭ  ＤＴＴ 、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  グリセロール］を加え濃縮を行った。この操作を２回繰り返した。次に、５００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＥ［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、２５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１ｍＭ  ＤＴＴ 、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０％  グリセロール］に対して透析を行ない、約２２０μｌのタンパク質サンプルを得た。その一部について１０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、分子量約１４４，０００の位置に目的タンパク質のバンドが確認され、これを以下の活性の確認に使用した。【００６０】
（５）ｄｓＲＮＡ分解活性の測定
（４）で調製したタンパク質サンプルについて、ｄｓＲＮＡ分解活性を測定した。活性測定は以下のようにして行った。
先ず、活性測定に用いた基質となるｄｓＲＮＡを、ＴｕｒｂｏＳｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＴＳ社製）を用いて、その添付プロトコールに従って合成した。
すなわち、プラスミドｐＱＢＩ１１２５（和光純薬社製）に挿入されているＲｅｄ−ｓｈｉｆｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ＧＦＰと略称する）をコードする遺伝子（配列表の配列番号１０にその塩基配列を示す）をプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）に挿入したｐＤＯＮ−ｒｓＧＦＰを鋳型とし、配列表の配列番号１１記載のＴ７プロモーター配列をもった合成プライマー３と配列表の配列番号１２記載の合成プライマー４を用いてＰＣＲを行い、増幅産物を得た。次に得られた２本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＲＮＡ合成反応により約７００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡを調製した。上記方法で調製したｄｓＲＮＡ  １μｇ、上記（３）で調製したタンパク質サンプル  １μｌ、５×反応緩衝液（１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１２．５ｍＭ  塩化マグネシウム）  ２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。３７℃で１８時間反応後、反応液の１０μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色して切断産物の確認を行なった。その結果、約２１塩基対の分解産物が確認され、ｄｓＲＮＡ分解活性が確認された。
以上のように、本発明の方法によってｄｓＲＮＡ分解活性を保持したタンパク質が発現されることが示された。【００６１】
実施例２  ＲＴａｓｅαおよびＲＴａｓｅβの発現検討
下記の操作により、目的タンパク質単独での発現、目的タンパク質とトリガーファクターの共発現、目的タンパクとトリガーファクターとの融合タンパク質の発現の比較を行った。また、融合タンパク質の発現に関しては、発現システムとして、コールドショックベクターを使用する系（コールドショック発現系）、Ｔ７プロモーターとＴ７ＲＮＡポリメラーゼとを組み合わせた発現系（Ｔ７プロモーター発現系）の２通りを用いた。
（１）プラスミドベクターの構築
大腸菌由来のトリガーファクター遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３、４５４３５７番目〜４５５６５５番目）より、配列表の配列番号１３及び１４記載の塩基配列を有する合成プライマーＴＦＮ及びＴＦＣＰをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。
上記合成プライマーＴＦＮは、大腸菌由来トリガーファクターのアミノ酸配列のＮ末端より１〜９番目のアミノ酸をコードする塩基配列を持ち、さらに塩基番号４〜９に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を持つ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＴＦＣＰは、大腸菌由来トリガーファクターのアミノ酸配列のＣ末端より１〜９番目のアミノ酸をコードする塩基配列に相補的な塩基配列、プロテアーゼＦａｃｔｏｒ  Ｘａの認識配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列、及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を持つ合成ＤＮＡである。次に、大腸菌ＨＢ１０１（タカラバイオ社製）より、ＰＣＲの鋳型となるゲノムＤＮＡを抽出した。【００６２】
その後、上記合成プライマー及びゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件を以下に示す。すなわち、上記で調製した鋳型ＤＮＡ１μｌ、１０μｌの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（タカラバイオ社製）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１００ｐｍｏｌの合成プライマーＴＦＮ、１００ｐｍｏｌの合成プライマーＴＦＣＰ、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。前記反応液をＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃２分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【００６３】
反応終了後、該反応液１００μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約１．５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００６４】
次にプラスミドベクターｐＣｏｌｄＩＩ（タカラバイオ社製）を制限酵素ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、さらに末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングにより確認した。続いて、得られたプラスミドのトリガーファクター遺伝子配列中の制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３、４５５１０７番目〜４５５１１２番目）を消失させる為、該部位にサイレント変異を導入した。こうして得られたコールドショック発現系を持ち、大腸菌由来トリガーファクター遺伝子配列を含む組換えプラスミドをｐＣｏｌｄＴＦと命名した。【００６５】
また、Ｔ７プロモーター発現系によって目的タンパク質と大腸菌由来トリガーファクターとの融合タンパク質を発現させる為のプラスミドベクターについても、以下のように作製した。【００６６】
まず、ｐＣｏｌｄＴＦを制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＥｃｏＯ１０９Ｉ（タカラバイオ社製）で２重消化し、さらに末端を脱リン酸処理したものを調製し、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＯ１０９Ｉ消化ＤＮＡ断片を得た。次に、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２を制限酵素ＥｃｏＲＩ及び制限酵素ＥｃｏＯ１０９Ｉで２重消化し、１％アガロースゲル電気泳動によりそのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＯ１０９Ｉ消化物を抽出精製し、上記ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＯ１０９Ｉ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む）上で生育させた。こうして得られたｐＣｏｌｄＴＦのマルチクローニングサイトを改変した組換えプラスミドをｐＣｏｌｄＴＦ−ＩＩと命名した。【００６７】
さらに、ｐＣｏｌｄＴＦ−ＩＩを制限酵素ＸｂａＩ（タカラバイオ社製）で消化し、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）により平滑末端化した後、制限酵素ＮｄｅＩで消化し、大腸菌由来トリガーファクター遺伝子を含むＮｄｅＩ−平滑末端断片を得た。【００６８】
次に、プラスミドベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で消化し、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより平滑末端化した。さらに、制限酵素ＮｄｅＩで消化後、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記大腸菌由来トリガーファクター遺伝子を含むＮｄｅＩ−平滑末端断片ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む）上で生育させた。こうして得られたＴ７プロモーター発現系を持ち、大腸菌由来トリガーファクター遺伝子配列を含む組換えプラスミドをｐＥＴＴＦと命名した。【００６９】
（２）ＲＴａｓｅαおよびＲＴａｓｅβ発現ベクターの構築
ラウス関連ウイルス２（Ｒｏｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ２、ＲＡＶ−２）由来の逆転写酵素αサブユニット（以下、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅα）のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＢＡＡ２２０９０のうち、Ｎ末端より１〜５７２番目のアミノ酸）をもとに、コードされるアミノ酸配列を変化させる事なく大腸菌のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を変更し、さらに制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列及び制限酵素ＸｂａＩの認識配列をそれぞれ前記配列の両端に持つよう設計した配列（配列表の配列番号１５）を持った二本鎖ＤＮＡを合成した。【００７０】
また、ラウス関連ウイルス２（Ｒｏｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ２、ＲＡＶ−２）由来の逆転写酵素βサブユニット（以下、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβ）のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＢＡＡ２２０９０）をもとに、コードされるアミノ酸配列を変化させる事なく大腸菌のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を変更し、さらに制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列及び制限酵素ＸｂａＩの認識配列をそれぞれ前記配列の両端に持つよう設計した配列（配列表の配列番号１６）を持った二本鎖ＤＮＡを合成した。【００７１】
次に、制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製），およびＸｂａＩ（タカラバイオ社製）を用いて、上記２種類の合成二本鎖ＤＮＡをそれぞれ二重消化し、１％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的のサイズのＤＮＡ断片を電気泳動ゲルより回収・精製し、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅαをコードする遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片、及びＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβをコードする遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００７２】
続いて、（１）で調製したｐＣｏｌｄＴＦを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで二重消化し、さらに末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記２種類のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片とそれぞれ混合した後、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。これらのトリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅαとの融合蛋白質、及びトリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβとの融合蛋白質をコールドショック発現系で発現するプラスミドをそれぞれｐＣｏｌｄＴＦ−α、ｐＣｏｌｄＴＦ−βと命名した。【００７３】
また、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅαを単独で発現するプラスミド、及びＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβを単独で発現するプラスミドについて、ｐＣｏｌｄＴＦに換えて実施例１で構築したｐＣｏｌｄ０８Ｎｃ２を用いる点以外は、それぞれｐＣｏｌｄＴＦ−α、ｐＣｏｌｄＴＦ−βと同様の方法で調製した。調製したプラスミドは、それぞれｐＣｏｌｄ０８−α、ｐＣｏｌｄ０８−βと命名した。【００７４】
一方、トリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅαとの融合蛋白質、及びトリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβとの融合蛋白質をＴ７プロモーター発現系で発現するプラスミドについては、以下のように作製した。【００７５】
前記のｐＣｏｌｄＴＦ−αおよびｐＣｏｌｄＴＦ−βを制限酵素ＸｂａＩ（タカラバイオ社製）で消化し、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）により平滑末端化した。さらに、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的のサイズのＤＮＡ断片を電気泳動ゲルより回収・精製し、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅαをコードする遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−平滑末端ＤＮＡ断片、及びＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβをコードする遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−平滑末端ＤＮＡ断片を得た。【００７６】
次に、（１）で調製したｐＥＴＴＦを制限酵素ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で消化し、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより平滑末端化した。さらに、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記２種類のＥｃｏＲＩ−平滑末端ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む）上で生育させた。これらのトリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅαとの融合蛋白質、及びトリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβとの融合蛋白質をＴ７プロモーター発現系で発現するプラスミドをそれぞれｐＥＴＴＦ−α、ｐＥＴＴＦ−βと命名した。【００７７】
（３）形質転換体の調製
トリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅαの融合蛋白質をコールドショック発現系で発現するｐＣｏｌｄＴＦ−αを用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行った。形質転換体は、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。【００７８】
また、トリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβの融合蛋白質をコールドショック発現系で発現するｐＣｏｌｄＴＦ−βで大腸菌ＢＬ２１を形質転換した形質転換体も、同様の方法で調製した。
上記の融合発現系の比較例として、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅα、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβを単独発現系で発現する形質転換体、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅαとトリガーファクターとの共発現系で発現する形質転換体、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβとトリガーファクターとの共発現系で発現する形質転換体、トリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅαとの融合蛋白質をＴ７プロモーター発現系で発現する形質転換体、及びトリガーファクターとＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβとの融合蛋白質をＴ７プロモーター発現系で発現する形質転換体についても調製した。【００７９】
単独発現系で発現する形質転換体は、プラスミドｐＣｏｌｄ０８−α、およびｐＣｏｌｄ０８−βを用いてＢＬ２１を形質転換する点以外は、前記の融合蛋白質をコールドショック発現系で発現する形質転換体の調製方法と同様の方法で得た。【００８０】
共発現系で発現する形質転換体の調製は以下の方法により行った。まず、プラスミドｐＣｏｌｄ０８−αおよびｐＣｏｌｄ０８−βのそれぞれと、プラスミドｐＴｆ１６とを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行った。次に、ｐＣｏｌｄ０８−αおよびｐＣｏｌｄ０８−βのそれぞれと、プラスミドｐＴｆ１６とを保持する共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ１００μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングする事により得た。【００８１】
融合蛋白質をＴ７プロモーター発現系で発現する形質転換体は、プラスミドｐＥＴＴＦ−α、およびｐＥＴＴＦ−βを用いる点、およびＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換する点以外は、前記の融合蛋白質をコールドショック発現系で発現する形質転換体の調製方法と同様の方法で得た。
（４）ＲＴａｓｅαおよびＲＴａｓｅβの発現
（３）で得られた各形質転換体を用いて、ＲＴａｓｅαおよびＲＴａｓｅβの発現を調べた。コールドショック発現系で融合蛋白質を発現する形質転換体、および単独発現系の形質転換体の培養には、５ｍｌのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）を用いた。また、共発現系の形質転換体の培養には、５ｍｌのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、０．５ｍｇ／ｍｌのアラビノースを含む）を用いた。それぞれの形質転換体は３７℃で培養し、濁度がＯＤ６００＝０．４程度に達した時点で１５℃、１５分間培養後、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、更に１５℃で２４時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を２４時間行ったのち、菌体を回収した。【００８２】
また、Ｔ７プロモーター発現系で融合蛋白質を発現する形質転換体の培養には、５ｍｌのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）を用い、形質転換体は３７℃で培養した後、濁度がＯＤ６００＝０．４程度に達した時点で培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、更に３７℃で３時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を３時間行ったのち、菌体を回収した。【００８３】
上記により得られた各菌体をＰＢＳで懸濁、超音波破砕し、細胞抽出液画分を調製、ついで１５、０００×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分について、約３．７５×１０６個の菌体分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＣＢＢ染色により解析した結果を図２に示した。【００８４】
図２に示したように、ｐＣｏｌｄ０８−α又はｐＣｏｌｄ０８−βで目的蛋白質を単独発現させた場合（Ａ）、およびｐＣｏｌｄ０８−αとｐＴｆ１６又はｐＣｏｌｄ０８−βとｐＴｆ１６を用いて目的タンパク質とトリガーファクターを共発現させた場合（Ｂ）には、細胞抽出液画分にＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅα、ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅβそれぞれの分子量６３０００Ｄａ、９８０００Ｄａに対応する発現産物が確認されたが、可溶性画分にはほとんど検出されなかった。また、ｐＥＴＴＦ−α又はｐＥＴＴＦ−βを用いて目的タンパク質とトリガーファクターとの融合蛋白質をＴ７プロモーター発現系で発現した場合（Ｃ）には、細胞抽出液画分に検出された目的タンパク質の大部分が不溶性画分に検出された。一方、ｐＣｏｌｄＴＦ−α又はｐＣｏｌｄＴＦ−βを用いて目的タンパク質とトリガーファクターを融合発現した場合（Ｄ）には、細胞抽出液画分に検出された目的タンパク質の大部分を可溶性画分に検出することができた。【００８５】
実施例３  ＤＮａｓｅの発現
（１）ＤＮａｓｅ発現ベクターの構築
ＤＮａｓｅを単独で発現するプラスミドとして、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３１３）（平成１７年２月１６日（原寄託日）に日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託）を用いた。当該プラスミドは、２５４アミノ酸残基からなるＤＮａｓｅをコードする塩基配列を含み、該ＤＮａｓｅにＨｉｓ−Ｔａｇ、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ認識配列、並びにリンカー配列が付加された２７１アミノ酸残基の融合タンパク質が発現されるように構築されている。【００８６】
次に、トリガーファクターとＤＮａｓｅとの融合タンパク質を発現するプラスミドの構築を以下のように行った。
まず、上記ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１の塩基配列より、配列表の配列番号１７及び１８記載の塩基配列を有する合成プライマーＮＵＣＮ及びＮＵＣＣをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。合成プライマーＮＵＣＮは、ＤＮａｓｅのＮ末端より１〜７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を持ち、さらに塩基番号４〜９に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を持つ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＮＵＣＣは、ＤＮａｓｅのＮ末端より２４７〜２５４番目のアミノ酸をコードする塩基配列に相補的な塩基配列を持ち、さらに塩基番号４〜９に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を持つ合成ＤＮＡである。【００８７】
次に、上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡ（ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１）１μｌ、１０μｌの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（タカラバイオ社製）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１００ｐｍｏｌの合成プライマーＮＵＣＮ、１００ｐｍｏｌの合成プライマーＮＵＣＣ、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。前記反応液をＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。【００８８】
反応終了後、該反応液１００μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約０．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１％アガロースゲル電気泳動によりそのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００８９】
次に、実施例２（２）で調製したｐＣｏｌｄＴＦを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで二重消化し、さらに末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記２種類のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片とそれぞれ混合した後、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを調製した。トリガーファクターとＤＮａｓｅとの融合タンパク質を発現するプラスミドをｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１と命名した。【００９０】
（２）形質転換体の調製
トリガーファクターとＤＮａｓｅの融合蛋白質を発現するｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行った。形質転換体は、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。【００９１】
また、上記の融合発現系の比較例として、ＤＮａｓｅを単独発現系で発現する形質転換体、ＤＮａｓｅとトリガーファクターとの共発現系で発現する形質転換体についても調製した。【００９２】
単独発現系で発現する形質転換体は、プラスミドｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を用いてＢＬ２１を形質転換する点以外は、前記の形質転換体の調製方法と同様の方法で得た。
共発現系で発現する形質転換体の調製は以下の方法により行った。まず、プラスミドｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１と、プラスミドｐＴｆ１６とを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行った。次に、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１と、プラスミドｐＴｆ１６とを保持する共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ１００μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングする事により得た。【００９３】
（３）ＤＮａｓｅの発現
（２）で得られた各形質転換体を用いて、ＤＮａｓｅの発現を調べた。融合発現系および単独発現系の形質転換体の培養には、５ｍｌのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）を用いた。また、共発現系の形質転換体の培養には、５ｍｌのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、０．５ｍｇ／ｍｌのアラビノースを含む）を用いた。それぞれの形質転換体は３７℃で培養し、濁度がＯＤ６００＝０．８程度に達した時点で１５℃、１５分間培養後、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、更に１５℃で２４時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を２４時間行ったのち、菌体を回収した。得られた菌体をＰＢＳで懸濁、超音波破砕し、細胞抽出液画分を調製、ついで１５、０００×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分の０．０５ＯＤ分（ＯＤ６００）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％ゲル）に供した。ＣＢＢ染色により解析した結果を図３に示した。【００９４】
図３に示したように、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を用いて、目的蛋白質を単独発現させた場合（Ａ）、およびｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１とｐＴｆ１６を用いて目的タンパク質とトリガーファクターを共発現させた場合（Ｂ）には、可溶性画分および不溶性画分に発現産物である分子量３１０００ＤａのＤＮａｓｅに対応する明確なバンドは、ＣＢＢ染色レベルでは検出されなかった。一方、ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を用いてＤＮａｓｅとトリガーファクターを融合発現した場合（Ｃ）には、目的タンパク質に由来するバンドを可溶性画分に検出することができた。【００９５】
（４）ＤＮａｓｅ活性の測定
（３）で調製した融合発現系の超音波破砕可溶性画分について、ＤＮａｓｅ活性を測定した。対照として、インサートを導入していないｐＣｏｌｄＴＦベクターのみを用いて形質転換した大腸菌の超音波破砕可溶性画分についても取得し、同時に活性測定を行った。対照の超音波破砕可溶性画分は、ｐＣｏｌｄＴＦを用いる点以外は、前記（２）、（３）と同様の方法で得た。
活性測定にはλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ（タカラバイオ社製）を基質として用いた。λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  １μｇ、超音波破砕可溶性画分０．０２５ＯＤ分（ＯＤ６００）、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とし、２０℃で２時間反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行った。結果を図４に示す。
図４より、対照の超音波破砕可溶性画分を用いた場合（レーン１）は基質の分解がほとんど確認できないのに対し、ＤＮａｓｅとトリガーファクターの融合発現系の超音波破砕可溶性画分を用いた場合（レーン２）は基質が分解され、ＤＮａｓｅの活性が確認された。【００９６】
実施例４  ｈＤｉ−ＰＡＺの発現検討
（１）発現ベクターの構築
ヒト由来ＤｉｃｅｒのＰＡＺドメイン（ヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列のＮ末端側より８９５〜１０６４番目）を含むポリペプチド（ヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列のＮ末端側より８９２〜１０６４番目、以下ＰＡＺと称する事がある）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。
まず、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＡＢ０２８４４９で公開されている塩基配列より、配列表の配列番号１９及び２０記載の塩基配列を有する合成プライマー１及び２をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー１は、制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号３）のアミノ酸番号８９２〜８９８に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３６にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー２は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号３）のアミノ酸番号１０５８〜１０６４に相当する塩基配列を塩基番号１５〜３６にもつ。【００９７】
上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては、実施例１−（２）で調製したｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＡＳＩを用いた。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、１０μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマー５、１０ｐｍｏｌの合成プライマー６、０．５ＵのＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ２分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【００９８】
反応終了後、該反応液９５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約５３０ｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００９９】
ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターを上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、さらに末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液６μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。【０１００】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドをｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＰＡＺとした。このｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＰＡＺは、ヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号３）のアミノ酸番号８９２〜１０６４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。前記プラスミドから発現させたタンパク質は、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列、Ｈｉｓ−ｔａｇ配列、並びにＦａｃｔｏｒ−Ｘａ配列を有している。【０１０１】
また、トリガーファクターとＰＡＺとの融合蛋白質を発現するプラスミドを、ベクターとして実施例２−（１）で調製したｐＣｏｌｄＴＦ−ＩＩを用いる点以外は、上記のｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＰＡＺの調整方法と同様の方法で調製し、このプラスミドをｐＣｏｌｄＴＦ／ｈＤｉ−ＰＡＺと命名した。【０１０２】
（２）形質転換体の調製
トリガーファクターとｈＤｉ−ＰＡＺの融合蛋白質を発現するｐＣｏｌｄＴＦ／ｈＤｉ−ＰＡＺを用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行った。形質転換体は、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。【０１０３】
上記の融合発現系の比較例として、ｈＤｉ−ＰＡＺを単独発現系で発現する形質転換体、ｈＤｉ−ＰＡＺとトリガーファクターとの共発現系で発現する形質転換体についても調製した。【０１０４】
単独発現系で発現する形質転換体は、プラスミドｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＰＡＺを用いてＢＬ２１を形質転換する点以外は、前記の融合発現系で発現する形質転換体の調製方法と同様の方法で得た。共発現系で発現する形質転換体の調製は以下の方法により行った。まず、プラスミドｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＰＡＺとプラスミドｐＴｆ１６とを用いて大腸菌Ａ１９を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行った。次に、ｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＰＡＺとプラスミドｐＴｆ１６とを保持する共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングする事により得た。【０１０５】
（３）ｈＤｉ−ＰＡＺの発現
（２）で得られた各形質転換体を用いて、ｈＤｉ−ＰＡＺの発現を調べた。融合発現系および単独発現系の形質転換体の培養には、３ｍｌのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）を用いた。また、共発現系の形質転換体の培養には、３ｍｌのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、０．５ｍｇ／ｍｌのアラビノースを含む）を用いた。それぞれの形質転換体は３７℃で培養し、濁度がＯＤ６００＝０．４程度に達した時点で１５℃、１５分間培養後、培養液に終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、更に１５℃で２４時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を２４時間行ったのち、菌体を回収した。得られた菌体を菌体破砕液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ））で懸濁、超音波破砕し、細胞抽出液画分を調製、ついで１５、０００×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分について、約２．５×１０６個の菌体分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＣＢＢ染色により解析した。【０１０６】
その結果、ｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＰＡＺで目的蛋白質を単独発現させた場合、およびｐＣｏｌｄ０８／ｈＤｉ−ＰＡＺとｐＴｆ１６を用いて目的タンパク質とトリガーファクターを共発現させた場合には、細胞抽出液画分に目的タンパク質の分子量２４０００Ｄａに対応する発現産物が確認されたが、可溶性画分にはほとんど検出されなかった。一方、ｐＣｏｌｄＴＦ／ｈＤｉ−ＰＡＺを用いて目的タンパク質とトリガーファクターを融合発現した場合には、対照と比較して胞抽出液画分の目的タンパク質量が増加していた。さらに、その大部分を可溶性画分に検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の方法により、目的のポリペプチドを著量に、活性を有する状態で、かつ高純度に製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
SEQ ID NO:2; A gene encoding mutated 5'-UTR of Escherichia coli cspA gene
SEQ ID NO:4; Synthetic primer 5 to amplify a gene encoding human dicer mutant
SEQ ID NO:5; Synthetic primer 6 to amplify a gene encoding human dicer mutant
SEQ ID NO:6; A gene encoding human dicer mutant
SEQ ID NO:7; An amino acid sequence of human dicer mutant
SEQ ID NO:8; An amino acid sequence of human dicer mutant
SEQ ID NO:9; A gene encoding human dicer mutant
SEQ ID NO:10; A gene encoding red-shift green fluorescent protein.
SEQ ID NO:11; Synthetic primer 3 to amplify a gene encoding red-shift green fluorescent protein
SEQ ID NO:12; Synthetic primer 4 to amplify a gene encoding red-shift green fluorescent protein
SEQ ID NO:13; Synthetic primer TFN to amplify a gene encoding Trigger Factor
SEQ ID NO:14; Synthetic primer TFCP to amplify a gene encoding Trigger Factor
SEQ ID NO:15; A gene encoding RAV-2 reverse transcriptase alpha subunit
SEQ ID NO:16; A gene encoding RAV-2 reverse transcriptase beta subunit
SEQ ID NO:17; Synthetic primer NUCN to amplify a gene encoding DNase
SEQ ID NO:18; Synthetic primer NUCC to amplify a gene encoding DNase
SEQ ID NO:19; Synthetic primer 1 to amplify a gene encoding human dicer PAZ domain
SEQ ID NO:20; Synthetic primer 2 to amplify a gene encoding human dicer PAZ domain
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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