(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの治療的投与量を含んでなる、ヒトまたは動物における血栓閉塞を治療するための医薬組成物であって、該組成物が、ヒトまたは動物に非経口投与され、投与前に中和されることなく血栓閉塞内または近傍に送達される、上記組成物。
【請求項２】
プラスミノーゲン活性化因子のあらゆる機能的痕跡を含まない、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
血栓閉塞が、冠動脈血栓症、深部静脈血栓症、末梢血栓症、塞栓性血栓症、肝臓静脈血栓症、衰弱性血栓症、静脈洞血栓症、静脈血栓症、動脈血栓症、閉塞した動静脈シャント、または閉塞したカテーテル器具より選ばれる血管閉塞である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを含んでなり、該薬剤的に許容できるキャリヤーが緩衝液である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
組成物が凍結乾燥されており、ヒトまたは動物への投与の前に該凍結乾燥された組成物に薬剤的に許容できるキャリヤーが加えられる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
可逆的に不活性化された酸性化プラスミンが、Ｇｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミン、ミニ−プラスミン、ミクロ−プラスミン、またはこれらの末端切断変種である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項７】
抗血栓剤をさらに含んでなる、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項８】
薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーが、水および少なくとも１種の薬剤的に許容できる酸を含んでなる緩衝液であって、酸がカルボン酸、オリゴペプチド、アミノ酸より選ばれた有機酸、または無機酸であり、そして酸性化キャリヤーが４．０未満のｐＨを有する、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項９】
薬剤的に許容できる酸が、ギ酸、酢酸、クエン酸、グリシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパルギン酸、バリンおよびアラニンより選ばれ、そして酸性化キャリヤーが４．０未満のｐＨを有する、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
薬剤的に許容できる酸が酢酸またはクエン酸である、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
薬剤的に許容できる酸が酢酸である、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１２】
２．５と４．０との間のｐＨを有する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
３．０と４．０との間のｐＨを有する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
３．１と３．５との間のｐＨを有する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
可逆的に不活性化された酸性化プラスミンが０．０１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌまでの間の濃度範囲内にある、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
可逆的に不活性化された酸性化プラスミンが０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌまでの間の濃度範囲内にある、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項１７】
酸が１ｍＭから５００ｍＭまでの濃度範囲内にある、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１８】
酸が１ｍＭと５０ｍＭとの間の濃度範囲内にある、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１９】
安定化剤をさらに含んでなる、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項２０】
安定化剤が、グルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、ラクトースまたはトレハロースより選ばれた薬剤的に許容できる炭水化物である、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
炭水化物が０．２％（重量／体積）から２０％（重量／体積）までの範囲内の濃度を有する、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
炭水化物がグルコースでありそしてその濃度が２０％である、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２３】
安定化剤が、グルコサミン、ナイアシンアミドおよびチアミンより選ばれる、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２４】
安定化剤が、０．０１Ｍから０．１Ｍまでの範囲内の濃度を有する、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２５】
組成物の治療的投与量が、０．１ｍｇプラスミン／ｋｇ（体重）と１０．０ｍｇプラスミン／ｋｇ（体重）との間の範囲内にある、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２６】
組成物の治療的投与量が、０．２ｍｇプラスミン／ｋｇ（体重）と４．０ｍｇプラスミン／ｋｇ（体重）との間の範囲内にある、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２７】
組成物の治療的投与量が、１．０ｍｇプラスミン／ｋｇ（体重）と２．０ｍｇプラスミン／ｋｇ（体重）との間の範囲内にある、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２８】
組成物がカテーテル器具により投与される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２９】
血管内カテーテルが血管閉塞に向けられる、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
血管内カテーテルが、組成物を血栓閉塞の近傍またはその中に送達する、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
血管内カテーテルが、血栓閉塞に入りそしてカテーテルが、組成物を血栓閉塞の中に直接送達する、請求項２９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連する出願への言及】
本出願は、１９９９年１１月１３日付け出願の米国特許（ＵＳ）出願番号０９／４３８，３３１号の一部継続出願である。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、一般的にプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを用いる血栓溶解の方法および血栓の近傍へまたは直接その中への酸性化プラスミンの局所送達に関する。この治療方法は、カテーテル誘導供給が可能なあらゆる場所の血栓の溶解に特に適用される。
【０００３】
【背景】
血栓症は、現代世界における罹病および死亡の重要な原因である。急性心筋梗塞および虚血性卒中は、西側世界での死亡および障害の第一および第三の原因である。閉塞性血栓症は、重要な器官への血流の欠失をもたらし、局所酸素不足、細胞壊死および器官機能の欠損を発生する。早期の再疎通をもたらす迅速な血栓の破壊には大きい利益がある。これは細胞死を防ぎ、梗塞の大きさを小さくし、器官機能を保存し、そして早期および後期の死亡を低下させる。血栓溶解治療は、現在世界中で１年間に７５０，０００人以上の患者に施され、一方その数の何倍ものがこの治療により利益を受ける可能性がある。
【０００４】
閉塞性血液クロットの溶解に現在使用される血栓溶解剤は、プラスミノーゲン活性化因子である。数種の異なるプラスミノーゲン活性化因子が現在当面の臨床使用のために利用でき、そして数種の新世代のプラスミノーゲン活性化因子：組織プラスミノーゲン活性化因子、ｔＰＡ、およびその第二世代後継剤のＴＮＫ−ｔＰＡ、ＲＥＴＥＰＬＡＳＥTM（ｔＰＡの欠失変異体）、一本鎖ウロキナーゼ形プラスミノーゲン活性化因子（ｓｃｕＰＡ、またはプロ−ウロキナーゼ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、およびアニソイル化(anisoylated) プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ）が臨床試験の対象となっている。ｔＰＡ、ｓｃｕＰＡ、およびＵＫが通常ヒト内で低レベルで見いだされる。ストレプトキナーゼは強力な血栓溶解活性を有する細菌酵素である。ＡＰＳＡＣは、アニソール化ストレプトキナーゼ−プラスミノーゲン複合体である。すべての場合に、プラスミノーゲン活性化因子は、酵素前駆体プラスミノーゲンを活性プロテアーゼであるプラスミンに変換できる。ｔＰＡおよびｓｃｕＰＡ（およびより低い程度で、ＡＰＳＡＣ）により提供される利点は、これらのプラスミノーゲンの活性化が繊維素特異性であることである。繊維素への結合は、実現すべきこれらの完全なタンパク質分解性の前提条件である(Haber et al., 1989)。ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼは、繊維素の不在下でプラスミノーゲンを活性化できる。繊維素に対するこのような親和性の変化は、全身出血が動物モデル内で起きるという範囲内では重要な結果を有する。しかしこれらの差異は、臨床的には認められていない。
【０００５】
プラスミノーゲン活性化因子は、循環酵素前駆体プラスミノーゲンをプラスミンに活性化することによりそれらの血栓溶解能力を全般的に行使する。哺乳類中の主要な繊維素溶解酵素であるプラスミンは、血漿内で循環する不活性の酵素前駆体プラスミノーゲンから誘導されるトリプシン類似の特異性を有するセリンプロテアーゼである。プラスミノーゲン自体は、Ｎ−末端グルタミン酸残基を有する７９１個のアミノ酸のポリペプチドである。プラスミン活性化因子、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）またはウロキナーゼは、一本鎖プラスミノーゲン分子をＡｒｇ561 −Ｖａｌ562 ペプチド結合で切断して活性プラスミンを産生する。得られたプラスミンの２個のポリペプチド鎖は、２個の鎖間ジスルフィド架橋により一緒に保持される。２５ｋＤａの軽鎖は触媒中心を有しそしてトリプシンおよびその他のセリンプロテアーゼに相同である。重鎖（６０ｋＤａ）は、高度に類似したアミノ酸配列を有する５個の三重ループクリングル構造からなる。これらのクリングルの一部は、繊維素、α2 −アンチプラスミンまたはその他のタンパク質とのプラスミノーゲンおよびプラスミン相互作用に関係するいわゆるリシン−結合部位を含む。
【０００６】
ｔＰＡ、ＵＫおよびＳＫのような現存のプラスミノーゲン活性化因子の治療的使用に関連する固有の問題は、これらの使用に伴う出血合併症であり、これには例えば患者の２０％以上における胃腸内出血が含まれる。臨床的に最も危険な頭蓋内出血は、現在の血管溶解治療の頻繁で致死的な副作用であり、そして患者の約１％に起きる。出血の機序は多元的でありそして保護的な止血性血栓の溶解およびその結果、血管本体の欠損による血管損傷の露出によると考えられる。これは、繊維素溶解系の全身的活性化とこれに付随するクロット形成因子の欠失と組み合わされる。さらに最近の研究の焦点は、改善された繊維素特異性を示す変性プラスミノーゲン活性化因子の生成に置かれている。これは出血合併症の量を低下すると期待された。ある場合には、これらの新しい活性化因子はこれらのクロット形成因子、例えばフィブリノーゲン、第８および第５因子、プラスミノーゲン、およびα2 −アンチプラスミンの循環レベルを保存することに役立つ。これらは血栓内に存在する繊維素分子を特異的に標的としそして結合し、そしてこのように結合した場合にプラスミノーゲンに対してのみ作用する。これは、プラスミノーゲンが血栓の近傍においてのみ活性プロテアーゼプラスミンに切断されそして繊維素の非特異性全身切断のレベルを低下させる結果を有する。しかし、これらの新しいプラスミノーゲン活性化因子を用いる出血性合併症の数は、変化がない。
【０００７】
血栓溶解剤、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼの血管の血栓閉塞の程度の低下における臨床的成功は、確証されている。従って、プラスミノーゲン活性化因子は、急性心筋梗塞および心臓のその他の血栓性症状の治療技術に選択される処置となった。しかしながら、心筋梗塞、閉塞性卒中、深部静脈血栓症および末梢動脈障害を含む種々の障害は、重要な臨床的課題として残り、そして現在使用されている既知のプラスミノーゲン活性化因子は血栓の排除におけるこれらの全般的有用性に影響を与える種々の限定を受ける。心筋梗塞では、血管流量は、患者の約５０％で９０分以内に回復し、一方、急性冠動脈再閉塞は、患者の約１０％で起きる。冠動脈再疎通には、平均して４５分以上を要する。主として頭蓋内出血による残留死亡率(residual mortality)は、まだ血栓溶解処置がない場合の死亡率の少なくとも５０％である。
【０００８】
血栓溶解剤の領域内の大部分の研究は、現存のプラスミノーゲン活性化因子の効力および繊維素特異性の改善ならびに新規薬剤の発見に焦点が当てられている。この努力の多くは、血栓の足場を形成する繊維素へプラスミノーゲン活性化因子に向けられ、そして血流内に投与された場合に活性化因子の薬剤動態を改善することに集中された。これは、活性薬剤への患者の暴露を長期化しそして同伴する望ましくない全身出血の危険を伴う連続投与としてよりも、一括大量投与(bolus dose)としてのこれらの投与を可能とする。
【０００９】
しかし、目的とするプラスミノーゲン活性化因子、例えばＴＮＫ−ｔＰＡ、チスイコウモリ(Vampire bat) 唾液プラスミノーゲン活性化因子を用いる第２相臨床試験の結果に基づいて、新しいプラスミノーゲン活性化因子の安全プロフィールにおいて予想された改善は、血栓治療の後に臨床的には実現されなかった。頭蓋内出血および卒中を含む中程度ないし大規模出血事例の割合は、当初の非変性ｔＰＡと同程度であった。詰まった動脈は早期には開かず、そして再閉塞の速度は変わらなかった。これらの活性化因子の唯一の長所は、長くなった血漿半減期および一括大量投与の可能性であると考えられる。
【００１０】
プラスミノーゲン活性化因子に伴う別の問題は、これらが末梢動脈閉塞（ＰＡＯ）で見いだされる長期クロットの処置において効力が限定されることである。これらの血栓は、典型的には熟成(age) しそして著しい大きさまで成長できる。本来の動脈および移植組織中の両方に見いだされる末梢血栓の平均の大きさは、３１±１１ｃｍである。熟成しそして収縮(retract) した血栓はプラスミノーゲンを欠き、従ってこれらはプラスミノーゲン活性化因子誘導血栓溶解への古い血栓の可能性を限定する。これは、ウロキナーゼを用いて２４時間以上処置されるＰＡＯを有する患者には全く通常のことであり、そしてこの長期間の後でも血管の完全な開通は得られない。プラスミノーゲン基質のレベルが低下している血栓の内部までの直接カテーテルを介する現存の血栓溶解剤の送達に関しては、問題がさらに大きい。
【００１１】
血栓の位置において十分なプラスミンを生成するためのプラスミノーゲン活性化因子の全身投与に関連する問題を回避するための基本的に異なる方法は、プラスミン自体を患者に直接投与することである。これは、プラスミンが最終的にはプラスミノーゲン活性化因子により開始された血栓溶解を媒介する酵素であるからである。収縮した血栓内へ直接の活性プラスミンの直接送達は、これらの血栓の固有のプラスミノーゲン欠失を回避しそしてプラスミノーゲン含有率にかかわらず予測可能、迅速で効果的な血栓溶解を与える。
【００１２】
米国特許（ＵＳ）第５，２８８，４８９号中でReich et al.は、患者の身体内へのプラスミンの非経口投与を含む繊維素溶解処置を開示している。処置の濃度および時間は、活性プラスミンが血管内血栓の部位で、血栓を溶解するかまたは循環フィブリノーゲンレベルを低下させるために十分な濃度に達するために十分であった。しかし、Reich et al.は、身体内に導入する直前にプラスミノーゲンからのプラスミン生成を要求する。
【００１３】
反対に、米国特許（ＵＳ）第３，９５０，５１３号中でJensonは、低ｐＨで安定化されると主張されているブタプラスミン製剤を開示している。このプラスミン溶液は、血栓溶解治療のためにヒトに全身投与する前に中和される。
【００１４】
米国特許（ＵＳ）第５，８７９，９２３号中でYago et al. は、診断薬として有用なプラスミン組成物を開示している。Yago et al. の組成物は、低濃度の中性ｐＨプラスミンおよび１）少なくとも２個のアミノ酸から成るオリゴペプチド、または２）少なくとも２個のアミノ酸、または３）１個のアミノ酸および多価アルコールであってもよい追加の成分からなる。
【００１５】
プラスミンは血栓溶解剤の第二の機序的な種類分類に入り、プラスミノーゲン活性化因子の種類とは明確に異なる。プラスミンは可能な血栓溶解剤として研究されたけれども、多数の技術的な困難がこの繊維素溶解酵素の有効な臨床使用を妨げている。これらの困難は、不活性前駆体、プラスミノーゲンからプラスミンを生成するために使用されるプラスミノーゲン活性化因子のあらゆる機能的痕跡を含まない純粋のプラスミンを製造するという問題を含む。これらの初期プラスミン製剤の血栓溶解活性は、プラスミン自体よりもむしろ結果的に混入したプラスミノーゲン活性化因子の存在による。しかし、混入したプラスミノーゲン活性化因子も、標的血栓とは異なる部位で全身性出血を開始させる。プラスミン製剤のために使用されるストレプトキナーゼの別の欠点は、プラスミン調剤中のこの存在が、発熱およびアナフィラキシーショックを含む不利な免疫応答をしばしば起こすことである。
【００１６】
プラスミンの臨床使用に最も重要な限界は、広い特異性を有するセリンプロテアーゼとして、これが生理的ｐＨにおいて自己分解および活性の欠損の傾向が高いことである。これは使用の前の長期間の貯蔵に適する高品質で安定なプラスミン製剤の製造、および閉塞性血栓を患うヒト患者へのプラスミンの安全で有効な投与に関して厳しい課題をもたらす。
【００１７】
従って、必要とされるのは、プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まずそして標的とした血管血栓閉塞に遭遇した際に活性である活性プラスミンの安定な形を投与する方法である。
【００１８】
さらに必要とされるのは、血栓の内部にカテーテルを介して活性プラスミンの活性化した形を直接送達する血栓の溶解方法である。
【００１９】
さらに、投与した血栓溶解剤が血栓部位に制限されそして低下した全身および特には頭蓋内出血を示す血栓溶解の方法が要求される。
【００２０】
本発明のこれらおよびその他の目的および長所は、以下の説明および請求範囲から完全に明らかになりあるいは本発明の実施により習得されるであろう。
【００２１】
【発明の要旨】
本発明は、血栓溶解治療が、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを直接血栓内にまたはその近傍に投与することにより改善できるという発見に関する。精製されたプラスミンは、生理的ｐＨでは自己分解のために不安定であり、従って、プラスミンは治療的投与のために容易には利用できない。本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない薬剤的に許容できる可逆的に不活性化された繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与することを含んでなる、血管血栓閉塞を有するヒトまたは動物に繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与する方法を提供する。本発明は、薬剤的に許容できるキャリヤーが低緩衝能力を有する、プラスミンおよび薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを含んでなる可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与する方法をさらに提供する。
【００２２】
本発明は、繊維素溶解性組成物がプラスミンおよび薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを含んでなり、薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーが水およびカルボン酸、アミノ酸または低緩衝能力を有するその他の化合物の形の酸より選ばれる薬剤的に許容できる酸を含んでなりそして酸性化キャリヤーが約４．０未満のｐＨを有する、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与する方法も提供する。
【００２３】
本発明は、薬剤的に許容できる安定化剤、例えばこれらの限定はされないが糖または多価アルコールをさらに含んでなる、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンおよび薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーの治療的投与量を投与する方法を提供する。
【００２４】
本発明の一つの態様では、繊維素溶解性組成物は、それぞれの活性化因子を本質的に含まない可逆的に不活性化された酸性化セリンプロテアーゼ、低緩衝能力緩衝液、および場合により安定化剤を含んでなる。このようなセリンプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼＩＩ、カテプシンＧ、前立腺特異性抗原、白血球エラスターゼ、キマーゼ、トリプターゼ、アクロシン、ヒト組織カリクレイン、およびプラスミンを含む。プラスミンは、ミディ(midi)−プラスミン、ミニ(mini)−プラスミン、またはミクロ(micro) −プラスミンを含み、これらに限定はされないＧｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミン、これらの誘導体および変性または末端切断変種を含む。
【００２５】
本発明の方法は、プラスミンを貯蔵のために安定化させる酸性条件および安定化剤を含んでなる。本発明に使用されるプラスミンは、プラスミノーゲンを活性化することにより得られ、そしてプラスミンの安定な製剤を提供するために約４未満のｐＨを有する酸性化溶液中で単離および貯蔵される。本発明の繊維素溶解性組成物は凍結乾燥してもよく、そしてプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない。プラスミン組成物の低緩衝能力は、血栓または血清に投与された場合に生理的ｐＨへの迅速な滴定(titration) を可能とする。血栓溶解治療のためにクロット部位に直接低緩衝能力溶液中で投与された場合に、酸性化プラスミンは迅速に中和されそして活性化される。
【００２６】
本発明の追加の目的、特徴、および長所は、以下に簡単に説明する添付図を関連して考慮して以下に記載の詳細な説明を見れば明確となるであろう。
【００２７】
発明者に既知の本発明実施の最適モードを含む本発明の完全で実行可能な開示を、実施例への参照を含めて以下の本明細書中にさらに具体的に記載する。本説明は、本発明の一般原理を説明することを目的とするものであり、限定的な意味に解釈すべきではない。
【００２８】
本発明は、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを含んでなる繊維素溶解性組成物の使用を可能とする血栓溶解および血管血栓閉塞へのプラスミンの局所送達の方法に対する要求に対応する。本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない薬剤的に許容できる可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量をヒトまたは動物に非経口的に投与し、投与した繊維素溶解性組成物を血栓閉塞と相互作用させ、ヒトまたは動物の血のレベルを測定し、そして血液流量の事前に選定したレベルに到達するまでこれらのステップを反復することを含んでなる、血栓閉塞を有するヒトまたは動物への繊維素溶解性組成物の治療的投与量を投与するための方法を提供する。本発明の方法は、さらに低緩衝能力緩衝液中のプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを含んでなる繊維素溶解性組成物の使用も提供する。本方法は、血栓の中またはその至近の位置への繊維素溶解性組成物の血管内カテーテル直接送達を提供し、これにより繊維素の全身的分解を最小化し、一方では血栓に対する最高プラスミン活性を保持する。
【００２９】
臨床での動脈および静脈カテーテルの増加する使用に伴って、血栓の至近位置または実際にその中への可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの局所投与は、血栓溶解のための魅力的な治療機会を与える。活性セリンプロテアーゼであるプラスミンは、直接血栓溶解剤であって、血栓に近傍における酵素前駆体プラスミノーゲンの存在を必要とするプラスミノーゲン活性化因子とは異なる。活性プラスミンを用いる局所カテーテル−誘導血栓溶解治療は、完全な血栓溶解を達成するように調節ができ、そしてプラスミンはさらに安全な血栓溶解剤である可能性を有し、それは、局所送達のために必要な低い用量が、プラスミノーゲン活性化因子により誘導される高い用量血栓治療にしばしば伴う出血合併症を著しく低下するからであろう。血栓部位の至近部分からのプラスミンのいかなる漏洩も、循環α2 −アンチプラスミンにより迅速に中和される。
【００３０】
プラスミン精製、および貯蔵、ならびにその治療への使用および送達に伴う数多くの技術的問題があった。プラスミンは活性セリンプロテアーゼであり、そして生理的ｐＨにおいて自己消化および不活性化される。不幸なことには、プラスミン分解は、生体内血栓溶解のために必要なｐＨ範囲内で最も顕著である。
【００３１】
本発明内に組み込まれる繊維素溶解性組成物は、精製の間の酸性緩衝液内のプラスミンの維持、ならびに薬剤的に許容できる低緩衝能力緩衝液を有する酸性化キャリヤー中のその製剤を含み、これによりプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない可逆的に不活性化された酸性プラスミン含有繊維素溶解性組成物を提供する。繊維素溶解性組成物が、ヒトまたは動物への組成物の投与を可能とする薬剤的に許容できるキャリヤー、例えば限定はされないが水、生理的塩類溶液、またはその他の溶剤の添加により再構成してもよい凍結乾燥組成物であることは本発明の範囲内にあると考える。血管開通の回復に関するその効力は、生体外アッセイおよび生体内ラビット頸静脈血栓溶解モデルで証明された。
【００３２】
本明細書中に使用される用語「可逆的に不活性化された」は、規定の条件の組合せ下では本質的に活性ではないがしかし条件の別の組合せに転移されると活性形に変換する酵素活性を呼ぶ。
【００３３】
本明細書中に使用される用語「薬剤的に許容できるキャリヤー」は、レシピエントのヒトまたは動物により生理的に許容されるあらゆるキャリヤーを呼び、水、塩溶液、生理的塩類溶液、または繊維素溶解剤、例えばプラスミンが溶解または懸濁されるその他のあらゆる液体またはゲルを含み、これらに限定はされない。「薬剤的に許容できるキャリヤー」は、約４．０未満のｐＨを有するプラスミン溶液を与えそして低または皆無の緩衝能力を有するあらゆる薬剤的に許容できる化合物を含んでもよい。
【００３４】
本明細書中に使用される用語「低緩衝能力緩衝液」は、ｐＨが感知できる程度まで変化を始める前に緩衝液が中和できる酸または塩基の量を呼ぶ。本明細書中に使用される場合に、低緩衝能力緩衝液は、低緩衝能力緩衝溶液の量に対して少量の酸または塩基の添加によりｐＨが顕著に調節される。この用語は、塩酸、硝酸および硫酸を含みこれに制限はされない強酸により酸性化され、そして緩衝能力を有していない溶液を含むと考える。
【００３５】
本明細書中に使用される用語「生理的ｐＨ」は、約ｐＨ６．５〜約７．５の間、さらに典型的には約ｐＨ７．１〜約７．５の間のｐＨを呼ぶ。
【００３６】
本明細書中に使用される用語「血栓」は、血管または血液と接触する器具（例えばカテーテル器具またはシャント）内の血栓を呼ぶ。血栓は、繊維素を含んでなってもよくそして血小板、赤血球、白血球、脂質またはこれらのあらゆる組合せをさらに含んでなってもよく、これらに限定はされない。「血栓」は、環状血栓、球状血栓、ヒアリン血栓、壁状血栓、層状血栓または白色血栓であってもよくこれらに限定はされない。
【００３７】
本明細書中に使用される用語「血栓閉塞」は、血栓性クロットの形成による血管の部分的または完全な遮断を呼び、ここで血栓は少なくとも繊維素を含んでなる。閉塞した血管は、静脈、動脈、細静脈、細動脈、毛細血管、血管床または心臓であってもよくこれらに限定はされず、そしてヒトまたは動物身体のあらゆる血管分布器官または組織内にあってもよい。血栓閉塞は、補綴血管および合成、ヒトまたは動物由来の移植組織を含みこれらに限定はされないカテーテルまたはその他の移植物であってもよく、そして繊維素を含んでなる閉塞により効果的に遮断されている。
【００３８】
本明細書中に使用される用語「カテーテル器具」は、身体内に入ってもよいあらゆるカテーテルまたは管状器具を呼び、そして動脈カテーテル、心臓カテーテル、中心(central) カテーテル、中心静脈カテーテル、静脈内カテーテル、バルーンカテーテル装置、末梢挿入中心カテーテル、肺動脈カテーテルまたはトンネル状中心静脈カテーテルおよび動静脈シャントを含み、これらに限定はされない。
【００３９】
本明細書中に使用される用語「薬剤的に許容できる酸性化キャリヤー」は、約４．０未満のｐＨまで酸性化されたあらゆる薬剤的に許容できるキャリヤーを呼ぶ、「薬剤的に許容できる酸性化キャリヤー」は、低または皆無の緩衝能力の緩衝液、例えば無機酸の添加により約４．０未満のｐＨまで酸性化されたカルボン酸、例えばこれらに限定はされないがギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、クエン酸、コハク酸、乳酸またはリンゴ酸、または少なくとも１種のアミノ酸、例えばこれらに限定はされないがグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、トレオニンまたはグルタミンまたは少なくとも１種の無機酸、例えばこれらに限定はされないが硫酸、塩酸、硝酸またはリン酸またはこれらのあらゆる組合せを含んでなってもよい。薬剤的キャリヤーの酸部分が、薬剤的に許容できるキャリヤー中のｐＨを約４．０の値未満に保持する少なくとも１種の生理的に許容される緩衝液、オリゴペプチド、無機または有機イオンまたはこれらのあらゆる組合せであることは本発明の範囲内であると考える。
【００４０】
本明細書中に使用される用語「炭水化物」は、あらゆる薬剤的に許容できる糖類または二糖類、例えばこれらに限定はされないがグルコース、フルクトース、マルトースまたはマンノース、ソルビトールおよびマンニトールを含み、これらに限定はされない糖アルコール、および多糖類、例えばこれらに限定はされないがデキストリン、デキストラン、グリコーゲン、デンプンおよびセルロース、またはヒトまたは動物に薬剤的に許容できるこれらのあらゆる組合せまたは誘導体を呼ぶ。
【００４１】
本明細書中に使用される用語「安定化剤」は、少なくとも１種の化合物、例えばこれらに限定はされないが、グリセロール、アスコルビン酸、ナイアシンアミド、グルコサミン、チアミンまたは無機塩、例えばこれらに限定はされないが塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムまたはプラスミンの製剤の安定性を増加するこれらのあらゆる組合せを呼ぶ。
【００４２】
本明細書中に使用される用語「可逆的に不活性化された酸性化プラスミン」は、生理的条件下でタンパク質分解的に繊維素を切断する能力があるが、しかし約ｐＨ２．５〜約４．０のｐＨに置かれた場合には可逆的に不活性化されるプラスミンのあらゆる触媒活性形を呼ぶ。本明細書中に使用される用語「不活性化」は、生理的ｐＨにおける活性と比較して酵素活性における全面的または本質的な低下を呼ぶ。本明細書中に使用される用語「活性プラスミン」は、プラスミンがタンパク質分解的に繊維素を切断可能である条件下にあるプラスミンを呼ぶ。用語「プラスミン」は、Ｇｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミン、これらの誘導体、変性または末端切断された変種を含み、これらに限定はされない。用語「末端切断された(truncated) 変種」は、その全体を引用して本明細書中に編入する米国特許（ＵＳ）第４，７７４，０８７号に開示されているようなミディ−プラスミン、ミニ−プラスミンまたはミクロ−プラスミンを含み、これらに限定はされない。
【００４３】
本明細書中に使用される用語「抗凝固剤」は、血栓の形成を阻害できるあらゆる化合物を呼び、ヒルイジン、ヘパリン、血栓阻害因子、血小板阻害因子、血小板凝固阻害因子およびこれらのあらゆる誘導体または組合せを含み、これらに限定はされない。
【００４４】
本明細書中に使用される用語「セリンプロテアーゼ」は、タンパク質分解的に繊維素を切断できるあらゆるセリンプロテアーゼを呼び、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼＩＩ、カテプシンＧ、前立腺特異性抗原、白血球エラスターゼ、キマーゼ、トリプターゼ、アクロシン、ヒト組織カリクレインを含み、これらに限定はされない。
【００４５】
プラスミノーゲン活性化因子を用いる現在の血栓溶解治療の一つの限界は、血栓周囲またはその中でのプラスミノーゲン利用可能性である。血栓への繊維素溶解剤の局所送達は、ここでプラスミン自体が血栓に直接投与される強力な治療剤であることを可能とする。現在血栓溶解剤として使用されている種々のプラスミノーゲン活性化因子とは異なり、プラスミンを用いる直接局所血栓溶解治療は、クロット溶解を達成するために必要なあらゆるレベルまで強化できる。これは、プラスミンが繊維素ポリマーに直接作用するからである。さらに、プラスミンは、血栓内またはその近傍に直接送達されると、慣用の血栓溶解治療に典型的には伴う全身出血の付随的低下を伴って投与されるさらに低い有効用量を可能とする。過剰のプラスミンは、循環α２−アンチプラスミンにより迅速に不活性化されることもできる。
【００４６】
従って、本発明の高度に精製されたプラスミンは、コーン画分(Cohn Fraction) ＩＩ＋ＩＩＩから精製されたプラスミノーゲンから調製された。プラスミンの純度は９５％を越え、そして比活性は、１８〜２３ＣＵ／ｍｇの範囲内であった。プラスミン製剤は、ウロキナーゼ、またはプラスミンへのプラスミノーゲンの変換のために使用されるあらゆるその他のプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まなかった。本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まないプラスミンが、哺乳類血清、組換えプラスミノーゲンまたは末端切断プラスミノーゲン、例えばこれらの限定はされないが、その全体を引用して本明細書中に編入する米国特許（ＵＳ）第４，７７４，０８７号中でWu et al. により開示されたように、ミニ−プラスミノーゲンおよびミクロ−プラスミノーゲンを含み、これらに限定はされないあらゆる原料から調製されてもよいことも包含する。
【００４７】
本発明のプラスミンは、ベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合することによりプラスミノーゲン活性化因子を本質的に除去するまで精製されそして次いで溶離されるプラスミンを捕集しそして低緩衝能力緩衝液を含む酸性化した薬剤的に許容できるキャリヤー中に保管された。結果は、約２．５〜約４．０の範囲内の低いｐＨが、プラスミン組成物を室温以上に保持しても大幅に安定化した。いかなる一つの理論もにとらわれないが、この低いｐＨ値においては、プラスミンはさもなければ自己分解に導くであろうセリンプロテアーゼ活性をもう有していないと考えられ、これは、約７．０〜７．５の間の生理的ｐＨでプラスミンが貯蔵された場合に見られることである。
【００４８】
可逆的に不活性化された酸性化プラスミンが本発明の方法に従って血栓内に直接またはその至近位置に投与された場合に、低または皆無の緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、約７．４の生理的ｐＨにある血清緩衝能力と遭遇する。薬剤的に許容できるキャリヤーの低緩衝能力は中和され、これにより、プラスミンはその活性状態に復帰しそして血栓の繊維素をタンパク質分解的に消化する。
【００４９】
血栓内またはその至近位置に投与されるまではプラスミンをタンパク質分解不活性とし、そして同様にあらゆるプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まないプラスミン調製の方法を最初に使用することにより、望ましくない全身出血を誘発する可能性は低下される。過剰に投与されたプラスミンは、循環血清阻害因子、例えばα2 −アンチプラスミンにより迅速に不活性化され、そしてさもなければ離れた位置で繊維素溶解を誘発するように循環する比較的安定なプラスミノーゲン活性化因子は本質的に存在しない。
【００５０】
酸性化されたプラスミンは、低または皆無の緩衝能力を有する薬剤的に許容できるキャリヤー、例えば、これに限定されるものではないが、５ｍＭグリシン水溶液中で容易に貯蔵できる。ｐＨが約２．５〜４．０の範囲内である場合には、あらゆる薬剤的に許容できるイオンを単独または組み合わせて使用してもよい。典型的には、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、３．１〜３．５のｐＨに維持される。低ｐＨを維持するためにキャリヤー中に混合される薬剤的に許容できる酸性イオンは、オリゴペプチド、少なくとも１種のアミノ酸、または有機もしくは無機酸またはこれらの組合せより選ばれてもよい。安定化は、炭水化物であってもよく、これに限定はされない少なくとも１種の薬剤的に許容できる化合物の含有によりさらに増強されてもよい。
【００５１】
本発明の低ｐＨプラスミン組成物の治療有効用量を用いる患者内の血栓閉塞を処置する方法の説明は、本出願と共通して譲渡されそして同時に出願された米国特許（ＵＳ）出願番号第 号、名称「可逆的に不活性化された酸性化プラスミン」(Reversibly Inactivated Acidified Plasmin)に開示され、そしてその全体を引用することにより本明細書中に編入する。
【００５２】
さらに、本発明の可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物を製造するための方法は、本出願と共通して譲渡されそして同時に出願された米国特許（ＵＳ）出願番号第 号、名称「可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の製造のための方法」(Process for the Production of a Reversible Inactivated Plasmin Composition)に開示され、そしてその全体を引用することにより本明細書中に編入する。
【００５３】
プラスミン組成物の投与は、一括大量投与(bolus) としてまたは長期間の輸液として血栓内へ直接、または血栓から短距離の近傍の部位のみへプラスミンを送達し、その際にこれが血栓と迅速に遭遇できるあらゆる方法により可能である。血栓への距離を最短化することによりまたはクロット内への直接投与により、送達針またはカテーテルと血栓との間に存在する血清内のプラスミン阻害因子へのプラスミンの暴露が低減される。本発明は、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンがカテーテルにより血栓に送達されてもよいことを意図する。本発明は、カニューレ挿入針、例えばこれには限定されないが注射器針を血栓内への可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの注入に使用してもよいこともさらに意図する。しかし、ヒトまたは動物内の特定の位置へ液体を局所的に投与するための当該技術分野の熟練者に既知のあらゆる手段が、本発明の範囲内である。血管または冠動脈血栓へのカテーテル送達は、特に血栓内でのプラスミンの位置決定における正確さをさらに可能とする。本発明は、低緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの血栓への局所送達の方法を提供するけれども、ヒトまたは動物内に移植されたカテーテルの繊維素閉塞へのこれらの可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の送達も本発明の範囲内である。
【００５４】
生体外での 125Ｉ−繊維素標識血栓溶解アッセイを用いて、プラスミンが投与量依存の様式で血栓を溶解できることが示された。繊維素溶解は、血栓周囲の血漿内のα2 −アンチプラスミンまたはα2 −ミクログロブリンのいずれかの欠失により、ならびにすべての阻害因子の欠失（例えばＰＢＳ中）により促進された。これらの結果は、プラスミンによる血栓溶解が内因性プラスミン阻害因子により著しく厳格に調節され、そしてさらに安全な血栓溶解治療の基礎を提供することを示す。
【００５５】
カテーテルを介して血栓に直接局所的に投与された低緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミン（１〜３ｍｇ／ｋｇ）の生体内効力を、ラビット頸静脈血栓溶解モデルにおけるｔＰＡ（０．５および１．０ｍｇ／ｋｇ）と比較した。血栓溶解の速度を測定した。さらに、第８因子およびフィブリノーゲンの消費、ならびに表皮細胞出血時間(Cuticle bleeding time) （ＣＢＴ）を全身溶解状態の指標として測定した。ｔＰＡの０．５ｍｇ／ｋｇと比較して、プラスミンは、同等または著しく良好な血栓溶解、同等の第８因子およびフィブリノーゲンの消費および類似したＣＢＴを１ｍｇ／ｋｇ投与量で示した。３ｍｇ／ｋｇのプラスミンでは著しく増加した消費およびＣＢＴであった。ｔＰＡの１ｍｇ／ｋｇと比較すると、プラスミンおよびｔＰＡの両方共に、非常に類似した血栓溶解速度と同時に３ｍｇ／ｋｇプラスミンにおいてフィブリノーゲンの著しく低い消費を示した。
【００５６】
このように、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、有効かつ安全に貯蔵されそして血栓溶解剤として、ヒトまたは動物に投与の前に中和することなくカテーテル支援局所血栓溶解の間に使用できる。プラスミンは、ｔＰＡと比較して優れてはいないにしても同等の繊維素溶解活性を有し、そして安全性プロフィールは局所血栓溶解剤送達のこの動物モデルでは少なくとも同等と考えられる。
【００５７】
可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性酵素が、ミニ−プラスミンおよびミクロ−プラスミンを含みこれらに限定はされないプラスミン、プラスミンの誘導体、例えばこれらの末端切断形であってもよく、これらに限定はされないことは、本発明の範囲内に入ると考えられる。
【００５８】
本発明は、血管の血栓閉塞または閉塞したカテーテル器具の至近位置または直接その中へのプラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない液状繊維素溶解性組成物製剤の治療的投与量を投与する方法を提供する。本発明は、プラスミンが約４．０のｐＨで投与される前に安定化されてもよい、血管血栓閉塞への液状可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の治療的投与量を送達する方法をさらに提供する。本発明は、血管血栓閉塞または血栓内に直接低緩衝能力緩衝液内の液状可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの治療的投与量を投与する方法を提供し、その際、プラスミン組成物は、プラスミンにタンパク質分解的に繊維素を切断することを可能とする生理的ｐＨに復帰する。
【００５９】
本発明の一つの態様では、本発明の方法は、血栓閉塞を有するヒトまたは動物を特定し、低緩衝能力緩衝液中の薬剤的に許容できる可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物の治療的投与量をヒトまたは動物に投与し、投与された繊維素溶解性組成物に血栓閉塞と相互作用をさせ、ヒトまたは動物の血管流量のレベルを測定し、そして血管流量の事前選択レベルに達するまで繊維素溶解性組成物を投与するステップを反復するステップを含んでなる。
【００６０】
本発明の別の態様では、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物は、プラスミンおよび低緩衝能力緩衝液を含む薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを含んでなる。
【００６１】
本発明のさらに別の態様では、薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーは、水および薬剤的に許容できる酸を含んでなり、その際、酸は、カルボン酸、オリゴペプチド、アミノ酸であってもよく、しかしこれらには限定はされない有機酸、または無機酸であり、そして低または皆無の緩衝能力を有し、そして酸性化キャリヤーは約４．０未満のｐＨを有する。
【００６２】
さらに別の態様では、薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーは、水およびギ酸、酢酸、クエン酸、グリシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、およびアラニン酸形より選ばれる薬剤的に許容できる酸を含んでなり、その際、酸性化キャリヤーは約４．０未満のｐＨを有する。
【００６３】
別の態様では、薬剤的に許容できる酸は、酢酸またはクエン酸由来の酸である。
【００６４】
さらに別の態様では、薬剤的に許容できる酸は、酢酸の酸形である。
【００６５】
本発明の方法の一つの態様では、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物は、約２．５と約４．０の間のｐＨを有する。本発明の方法の別の態様では、繊維素溶解性組成物は約３．７のｐＨを有する。
【００６６】
本発明の方法の別の態様では、プラスミンは約０．０１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでの間の濃度範囲内にある。本発明の方法の別の態様では、プラスミンは、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌまでの間の濃度範囲内にある。
【００６７】
本発明の方法の別の態様では、酸性イオンは、約１ｍＭから約５００ｍＭまでの間の濃度範囲内にある。本発明の方法の別の態様では、酸性イオンは、約１ｍＭと約５００ｍＭとの間の濃度範囲内にある。
【００６８】
本発明の方法を実施するための態様は、生理的に受容できるプラスミン安定化剤を含んでなり、ここで、炭水化物はグルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、ラクトースまたはトレハロースから選ばれ、ここで、糖は約０．２％（重量／体積）から約２０％（重量／体積）までの範囲内の濃度を有する。一つの態様では、糖はグルコースでありそしてその濃度は約２０％である。
【００６９】
本発明の方法の態様は、約０．０１ｍｇ（プラスミン）／ｋｇ（体重）と１０ｍｇ（プラスミン）／ｋｇ（体重）との間の範囲内の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの治療的投与量をさらに含んでなる。
【００７０】
本発明の方法の態様では、可逆的に不活性化された酸性化繊維素溶解性組成物は、血管内または血栓内に投与される。本発明の方法の一つの態様では、低ｐＨ緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、血管内カテーテル器具により血栓内に直接またはその近傍に投与される。本発明の方法のさらに一つの態様では、血管内カテーテルは、血管閉塞に向けられる。
【００７１】
本発明は、ある程度の具体性をもって記載されるけれども、多数の別法、変形、および変種は、本開示を参考にして当該技術分野の熟練者には明らかであることは自明である。従って、本発明の精神および範囲内に入るあらゆるこのような別法、変形、および変種は、記載の請求項に包含されると考えられる。
【００７２】
下記の実施例は、好ましい態様および本発明の有用性を説明するために提示されるが、しかしこれを限定すると解釈すべきではない。
【００７３】
下記の実施例中に開示した技術は、本発明の実施において良好に機能するように本発明者により発見された技術であり、従ってその実施の好ましいモードを構成すると考えることができることは当該技術分野の熟練者により認められるであろう。しかし、当該技術分野の熟練者は、本開示を参考として、開示された特定の態様内で多数の変化を行い、この場合にも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることも認めるであろう。
【００７４】
【実施例】
実施例１：試験したタンパク質の供給源
プラスミノーゲンは、Deutsch & Mertz(1970) により記載されたようにしてＬｙｓ−セファロース上のアフィニティークロマトグラフィーによりコーン画分(Cohn Fraction) ＩＩ＋ＩＩＩペーストから精製した。すなわち、ペースト２００ｇを０．１５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．８の２リットル中に再懸濁した。懸濁液を一晩、３７℃でインキュベーション、１４，０００ｒｐｍで遠心分離、ガラス繊維を通して濾過そしてＬｙｓ−セファロース４Ｂ(Pharmacia) ５００ｍｌと混合した。プラスミノーゲンの結合は、室温で２時間であった。次いで、Ｌｙｓ−セファロースを２リットルガラスフィルター上に移し、そして数回、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１５Ｍクエン酸ナトリウムを用いて２８０ｎｍにおける吸光率が０．０５未満に下がるまで洗浄した。結合プラスミノーゲンを０．２Ｍε−アミノカプロン酸の２００ｍｌ部分を用いて３回溶離した。溶離したプラスミノーゲンを０．４ｇ（固体硫酸アンモニウム）／ｍｌ（プラスミノーゲン溶液）を用いて沈降させた。粗（純度８０〜８５％）プラスミノーゲンの沈降物を４℃で保管した。
【００７５】
低分子量ウロキナーゼ（ＬＭＷ−ウロキナーゼ）(Abbokinase-Abbott Laboratories, Chicago, Ill.) をさらにベンズアミジン−セファロース上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。次いでＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂと、５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．５中のＬＭＷ−ウロキナーゼ１．３ｍｇとを混合してウロキナーゼをカプリングし、そしてカプリング緩衝液、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０  ５ｍｌを用いて希釈した。
【００７６】
この溶液をあらかじめ膨潤したＣＮＢｒ−活性化セファロース５ｍｌと直ちに混合し、そして０．１Ｍ  ＨＣｌ中で洗浄した。カプリングは氷上での振とう４時間で起きた。過剰のＣＮＢｒ活性基を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いてブロックした。ウロキナーゼ−セファロースのそれぞれのバッチを５回使用しそしてサイクルの間には４℃で水中の５０％グリセロール中に保管した。組織プラスミノーゲン活性化因子(ACTIVASE TM )はGenentech から入手した。プラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲンおよびα−トロンビン（３７９３Ｕ／ｍｌ）はEnzyme Research, Incから入手した。α2 −アンチプラスミンは、Athens Research Technologiesから入手した。商業的に入手できるプラスミンは、Haemotologic Technologies, Inc. から入手した。色素原性プラスミン基質Ｓ２２５１はChromogenix から入手した。 125Ｉ−標識ヒトフィブリノーゲン（１２５〜２５０μＣｉ／ｍｇ）はAmersham Pharmacia Biotechから入手した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、調製済８−２５％グラジエントゲルおよびＳＤＳ−緩衝ストリップを用いるPharmacia Phast System装置中で行った。
実施例２：活性プラスミンの精製
（ｉ）ウロキナーゼ−セファロースを用いるプラスミンへのプラスミノーゲンの活性化
プラスミノーゲンをプラスミンに切断して、固定化プラスミノーゲン活性化因子を用いることによる最終製剤の混入がないプラスミンが得られた。ウロキナーゼはプラスミノーゲンを直接切断する。ウロキナーゼによるプラスミノーゲン活性化は、ｔＰＡの場合のように繊維素の存在には依存はせず、そしてウロキナーゼはヒトタンパク質である。これらの因子、およびその比較的低コストは、ウロキナーゼを好ましい活性化因子とするが、しかしこれは、繊維素分解が可能な活性プラスミンを生成するｔＰＳ、ストレプトキナーゼまたはその他の切断手段の使用を排除するものではない。粗プラスミノーゲンの硫酸アンモニウム沈降物を１４，０００ｒｐｍで遠心分離しそして１０ｍＭリシン、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０を含む４０ｍＭ  Ｔｒｉｓを用いる最小体積中に再懸濁し、１０〜１５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度に達した。プラスミノーゲン溶液を同じ緩衝液に対して一晩透析し硫酸アンモニウムを除去した。透析したプラスミノーゲン溶液（１０〜２０ｍｌ）を等量の１００％グリセロールを用いて希釈しそしてウロキナーゼ−セファロース５ｍｌと混合した。５０％グリセロールの使用は、活性化の間に形成されるプラスミンの自己分解を低下する。プラスミンは５０％グリセロール中で安定でありそして長期間−２０℃でこの溶液中に貯蔵できる。
【００７７】
プラスミノーゲン活性化は、室温で２時間〜２４時間の間にウロキナーゼ−セファロースの新鮮度に依存して起きた。ウロキナーゼ−セファロースの新しいバッチを用いると、活性化は２時間で完了できた。しかし、これは劣化し、そして数回のサイクルの後に効率が低下し、プラスミノーゲン活性化の進行を測定するために還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用を必要とした。活性化が完了すると、プラスミン溶液をガラスフィルターを用いてウロキナーゼ−セファロースから濾過し、そして直ちにベンズアミジン−セファロースに適用した。
（ｉｉ）ベンズアミジン−セファロース上のプラスミンの捕捉
プラスミンはトリプシン類似の特異性を有するセリンプロテアーゼなので、ベンズアミジン−セファロースは活性プラスミンの捕捉が可能なアフィニティー吸収剤である。５０％グリセロール中のプラスミノーゲン溶液を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いて平衡化した５０ｍｌのベンズアミジン−セファロースカラムに、流量３ｍｌ／分で加えた。３〜７℃で３ｍｌ／分でカラムに流した。非−結合ピークの初期部分は、高分子量不純物を含んでいた。非−結合ピークの残りの部分は、残留非−活性化プラスミノーゲンおよびプラスミンの不活性自己分解生成物であった。
（ｉｉｉ）低ｐＨ緩衝液を用いる結合プラスミンの溶離
中性ｐＨ条件での不活性化からプラスミンを保護するために、酸性溶離条件を選定した。ベンズアミジン−セファロースに結合したプラスミンを、０．５Ｍ
ＮａＣｌを含む０．２Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ３．０を用いて溶離した。結合ピークは、典型的には３個のプール、すなわち２個の初期ピークＢ１およびＢ２、およびＢ３として溶離する物質の本体ピークに別れた。
【００７８】
非−還元性ゲル分析は、すべての３個のプールが高純度（＞９５％）プラスミンを含むことを明らかにした。しかしゲル分析は、プラスミンの重鎖および軽鎖に加えて、１０〜１５ｋＤａの範囲内の一部の低分子量バンドがプラスミンの部分的内部切断分解の結果であることを明らかにした。
【００７９】
ピークＢ１の初期部分は、典型的には低分子量不純物の大部分を含んでいた。Ｂ２およびＢ３のプールは、分解程度が低かった。結合ピークの初期部分は、プラスミン活性をほとんど有していず、そして通常廃棄された。この物質中の活性の欠失は、クロマトグラフィーの間の自己分解によるらしく、それは、溶離物質中にグリセロールが存在せず、そして初期部分のｐＨが平衡および溶離する緩衝液のｐＨの中間、典型的にはｐＨ６〜６．５の範囲内にあるからである。プラスミノーゲン活性化因子を本質的に含まない溶離したプラスミンを、２Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ３．０（捕集体積の１０％）を含む管中に捕集した。
（ｉｖ）酸性化した水（ｐＨ３．７）中の溶離物質の配合
溶離したプラスミンを、氷酢酸を用いて約ｐＨ３．７に酸性化した水に対して、または０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含み氷酢酸を用いて約ｐＨ３．７に酸性化した水に対して透析した。
【００８０】
低緩衝能力緩衝液を含みそして約２．５〜約４．０の間のｐＨを有する薬剤的に許容できる酸性化キャリヤーを生成するあらゆる酸が使用できる。例えば、その他の酸およびアミノ酸、例えばこれらに限定するものではないが、ギ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、安息香酸、セリン、トリオニン、バリン、グリシン、グルタミン、イソロイシン、β−アラニンおよびこれらの誘導体を含み、これらに限定はされない無機酸、カルボン酸、脂肪酸およびアミノ酸を単独またこれらのあらゆる組み合わせで、約２．５〜約４．０の間の薬剤的に許容できるキャリヤー中のｐＨをを維持するものの使用が本発明の範囲内と考えられる。
【００８１】
プラスミンは酸性化した水中では著しく安定であり、そして生体外および生体内試験のためにこの形で効果的に使用できる。プラスミン特異性活性は、Robbins & Summaria(1970)が記載した適応化カゼイン溶解アッセイを用いて測定した。酸性化した水中の４％カゼイン溶液１ｍｌおよび６７ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４の適当な体積をポリカーボネート試験管に加えた。溶液を渦攪拌しそして３７℃で１０分間インキュベーションした。プラスミン試料または緩衝液（ブランク）をそれぞれの管に１５秒間隔で加え、十分に攪拌しそして３７℃で３０分間インキュベーションした。１５％トリクロロ酢酸３ｍｌを加えて反応を停止し、沈降物を１５分間形成させた。管を３２００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を小ビンに移しそしてそれぞれの試料のＡ280 を測定した。それぞれの試料の比カゼイン溶解活性は次式により算出した。
【００８２】
【数１】
0004988115.tif 000002
【００８３】
プラスミン濃度は、０．１％溶液に対する１．７の吸光係数を用いて分光分析的に決定した。
実施例３：プラスミンのｐＨ依存安定性
プラスミンは、その触媒活性の鐘形ｐＨ依存性を示す。図１に示すように、プラスミンはｐＨ７．５〜８．０で極大酵素活性を有し、そしてその活性は酸性側およびアルカリ性側のｐＨの両方で急速に低下する。プラスミンは、最も不活性であり、そしてｐＨ４．０以下では触媒中心内のヒスチジンのプロトン化により可逆的に不活性であり、これはRobbins & Summaria(1976)およびCastellino & Powell(1981) により証明されている。
【００８４】
プラスミンは、生理的ｐＨでは著しく不安定である。プラスミンの重鎖および軽鎖の両方は室温および４℃で数時間中で劇的に分解した。プラスミンは、０．０４Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中に１ｍｇ／ｍｌで配合し、そして２２℃または４℃で６時間インキュベーションした。インキュベーションの間に、プラスミンの本体(integrity) を２時間毎に還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて分析した。重鎖および軽鎖の両方共に２２℃および４℃で数時間中で急速に分解し、これを図１に示す。
【００８５】
【表１】
0004988115.tif 000003
【００８６】
（初期時点でのプラスミンの不変の重鎖および軽鎖を１００％として正規化した）
１ｍｇ／ｍｌにおけるプラスミンを種々の酸性条件下、３７℃で１４日間インキュベーションした。プラスミン重鎖および軽鎖の変化を還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。プラスミンを０．０４Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４中に１ｍｇ／ｍｌで配合しそして同様に４℃で６時間インキュベーションした。インキュベーションの間に、プラスミン試料の活性を２時間毎に色素原効力(chromogenic potency) アッセイにより測定した。プラスミン効力は、ＭＬＡ１６００Ｃ分析装置(Pleasantville, NY) を用いて定量的に測定した。プラスミンは、色素原基質Ｓ−２４０３（Ｄ−ピログルタミル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−リシン−ｐ−ニトロアニリン  ヒドロクロリドまたはｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡと短縮）を加水分解してペプチドおよび色素原基ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を生成する。色素形成の速度は、動力学的に４０５ｎｍで測定した。加水分解された基質の量は、試料中のプラスミン活性に比例した。標準曲線は、色素形成の速度（ＯＤ／分）のプラスミン標準の効力に対する線型相関から作製した。線型式と未知試料について観察された速度とを一緒に未知の効力を算出するために使用した。プラスミンの効力は、ｍｇ／ｍｌの単位で報告した。
【００８７】
プラスミンの本体は、生理的ｐＨにおけるインキュベーションにより著しく低下し、これを表２に示す。
【００８８】
【表２】
0004988115.tif 000004
【００８９】
（初期時点でのプラスミン溶液の活性を１００％として正規化した）
この中性ｐＨ溶液中で、プラスミン活性は、４℃で６時間後に７０％以上低下した。
【００９０】
ｐＨ３．７の酸性化水中に配合されたプラスミンは安定である。この形で数カ月間低温で、活性低下またはタンパク質分解または酸性性質の分解生成物の出現がなく保管できた。図２および表３のデータは、４℃および室温におけるプラスミンの安定性を示す。
【００９１】
【表３】
0004988115.tif 000005
【００９２】
（インキュベーション前のそれぞれの配合物内の不変の重鎖および軽鎖を１００％として正規化した。ＨＡｃ／ＮａＡｃ＝酢酸／酢酸ナトリウム）
４℃で、プラスミンは少なくとも９カ月間安定である。室温でも、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンは、少なくとも２カ月は安定である。室温における長期安定性は、これがこの配合物を血栓溶解投与の長期治療計画に適合させるので重要である。例えば、血栓溶解剤、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼの３６時間投与は、末梢動脈閉塞の治療において慣用であるからである。ＳＤＳゲルのそれぞれのレーン内での全タンパク質に関する重鎖割合に対するｐＨのプロットを図３に示す。この結果は、緩衝液の種類または緩衝液濃度とは無関係に、約３．１〜３．５のｐＨ安定性極大を実証する。
【００９３】
生理的ｐＨへの転移により完全に活性となる可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの能力は、カゼイン溶解アッセイおよび 125Ｉ−繊維素−標識血栓溶解アッセイにおけるその活性によっても明らかにされる。これらの両方のアッセイはｐＨ７．４で行われ、そしてｐＨの変化および等電点（ｐＨ５〜５．５）を通る間にプラスミン活性が完全に回復した。プラスミンは低緩衝能力溶剤中に配合され、そして、緩衝された溶液、例えば血漿に加えられると、これは迅速に中性または生理的ｐＨを直ちに取り、そし等電点を通る遅い過程に通常は伴う沈降は起きない。
実施例４．プラスミンはプラスミノーゲン／プラスミノーゲン活性化因子混合物と同じ固有繊維素溶解効力を有する。
【００９４】
プラスミンは、プラスミノーゲン／プラスミノーゲン活性化因子混合物と同じ固有繊維素溶解効力を有する。プラスミンの繊維素溶解効力をＬｙｓ−プラスミノーゲンとｔＰＡとの混合物のものと比較した。これらの実験は、ＰＢＳ中に浸漬した 125Ｉ−放射能標識繊維素血栓から成る規定の系内で行った。図４は、緩衝された環境内で、プラスミンを用いて達成される血栓溶解が、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンとｔＰＡとの混合物とほとんど一致することを示す（それぞれ曲線ａおよびｂ）。同時に、ｔＰＡ単独（曲線ｃ）またはいかなるタンパク質も存在しない場合（曲線ｄ）には血栓溶解が観察されなかった。ｔＰＡ単独を用いて得られたデータは、その活性がその基質、プラスミノーゲンに依存し、効果的な血栓溶解剤であることを示す。
【００９５】
これらのデータは、阻害因子およびその他の血漿中に存在するタンパク質因子が存在しない場合に、精製プラスミンと、ｔＰＡとｔＰＡを用いて活性化されたＬｙｓ−プラスミノーゲンとの組み合わせとの間に繊維素血栓を溶解する能力に差異がないことを示す。活性プラスミンの血栓溶解効力を評価するために、 125Ｉ−繊維素標識繊維素血栓溶解アッセイを、血漿環境内で血漿血栓を用いて行った。
実施例５．プラスミン活性調節におけるプラスミン阻害因子の役割
125Ｉ−繊維素標識血栓溶解アッセイ。プラスミンの繊維素溶解性は、Lijnen et al(1986)により記載されたようにヒトクエン酸化血漿内に浸漬した放射能標識血漿血栓からなる生体外系内で測定された。すべての実験に使用した血漿は、３７℃で解凍し、分割し、再凍結しそして−８０℃で貯蔵した単一ドナー血漿であった。 125Ｉ−標識フィブリノーゲンの原液は、バイアルの内容物（約１１０μＣｉ／バイアル）を０．１５Ｍクエン酸ナトリウム１．０ｍｌを用いて再水和して調製しそして４℃で保管した。
【００９６】
125Ｉ−フィブリノーゲン１０μｌを、３７℃の血漿２５０μｌを含むポリカーボネート試験管に加え、そして短時間攪拌した。１０〜２０μＭの最終濃度まで０．１Ｍ  ＣａＣｌ2 を用いて希釈したα−トロンビン２５μｌを血漿に加えた。放射能標識した血栓を５分間、３７℃で熟成させ、次いでＰＢＳを用いて洗浄した。血漿または緩衝液２．２５ｍｌを含む試験管内に管あたりに血栓１個づつで血栓を移した。
【００９７】
それぞれの血栓について基線放射能試料を測定した。それぞれの血栓を加えた後にそれぞれの管にプラスミンを加えた。実験の間は血栓を３７℃に戻した。遊離される放射能の測定のために指定の時点で別の試料を取り出した。血栓溶解の程度は、血漿内へ血栓から遊離された放射能の量と、反応管内の可溶性放射能の全量との比率から算出した。百分率で表した標識繊維素分解生成物の放出を時間に対してプロットした。
【００９８】
血漿環境に加えて、一部の血栓溶解実験は、緩衝液環境内またはα2 −アンチプラスミンまたはα2 −マクログロブリン活性を欠く血漿を用いて行った。α2 −アンチプラスミン欠失血漿は、Wiman(1980) 記載のようにして、正常の血漿をクリングル１−３−セファロースカラム(Kringle 1-3-Sepharose column)を通して得られた。α2 −マクログロブリン−不活性化血漿は、０．１ＭメチルアミンBarrett et al.(1979)を用いて２時間、３７℃で通常の血漿を処理し、引き続いて４℃でＰＢＳに対して透析して得られた。
【００９９】
上記の血漿溶解アッセイを用いて、プラスミンが投与量依存の様式で血漿血栓を溶解できることが示され、これを図５および６に示す。プラスミンの量を増加して 125Ｉ−繊維素標識血漿血栓に加え、そして血栓溶解の程度を放射能の遊離を測定して評価した。（ａ）反応管内のプラスミン０．１５ｍｇ／ｍｌ、（ｂ）０．３０ｍｇ／ｍｌ、（ｃ）０．４５ｍｇ／ｍｌ、（ｄ）０．６０ｍｇ／ｍｌ、（ｅ）プラスミンを加えない対照。図６のデータは、プラスミンは血漿雰囲気中でも活性でありそして血漿血栓を溶解できることを証明する。この現象は、投与量依存性である。同時に、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンとｔＰＡとの混合物とは異なり、プラスミン単独による血栓溶解は、血漿環境内で完了までは進行しない。血栓溶解は、２時間後に停止する傾向がある。いかなる一つの理論にとらわれることは望まないけれども、この現象は、血漿環境内の種々のプロテアーゼ阻害因子の存在により説明でき、そして、特にα2 −アンチプラスミンによる非−血栓−結合プラスミンの迅速な阻害による。
【０１００】
プラスミン触媒血栓溶解における血漿阻害因子の役割を評価するために、正常の血漿およびα2 −アンチプラスミン、α2 −マクログロブリンもしくはすべての阻害因子を欠く血漿試料、またはＰＢＳを用いて、一連の血栓溶解実験を行った。
【０１０１】
図６から分かるように、プラスミン−誘導繊維素溶解は、血栓周囲の血漿中のα2 −アンチプラスミンまたはα2 −マクログロブリンのいずれかの欠失により促進され、そしてすべての阻害因子が存在しないとさらに促進された。これらの結果は、プラスミンのよる血栓溶解が、内因性血漿プラスミン阻害因子による非常に厳格な生理的制御下にあり、従ってさらに安全な血栓溶解治療のための基礎を提供する。
【０１０２】
プラスミノーゲン活性化因子−誘導血栓溶解の反対に、プラスミンを用いる血栓溶解は、これらの阻害因子により制御できる。プラスミノーゲン活性化因子−誘導血栓溶解は、実際的な観点から人体内に限定はされない血漿中に存在するプラスミノーゲンの内部供給を利用する。反対に、プラスミン−誘導血栓溶解は、プラスミンの外部供給に全面的に依存する。患者に対するプラスミン投与の休止は、血栓溶解の迅速な休止をもたらすはずでありそしてさらに安全な治療のための基礎を提供する。
実施例６：末梢動脈閉塞（ＰＡＯ）の生体外モデル内の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンおよびｔＰＡの比較
熟成し収縮したクロットは、効果的なクロット溶解のためにすべてのプラスミノーゲン活性化因子により要求される基質であるプラスミノーゲンを欠失する(Rabbie et al. Thrombosis and Haemostasis 1996、 75(1)、 127-33)。熟成したクロットはプラスミノーゲン活性化因子による溶解を著しく起こしにくい。
【０１０３】
熟成クロットは、機序的およびこれらのタンパク質組成の両方において心筋梗塞または卒中を起こすクロットとは異なる。これらは典型的には末梢動脈内に見いだされそして著しい大きさに成長できる。本来の動脈内に見いだされる末梢クロットの平均の大きさは、Ouriel et al. の記載のように１４．８±１１ｃｍである。プラスミノーゲン活性化因子により独占的に代表される現在の血栓溶解剤は、これらの種類のクロットの溶解にはほとんど無効である。典型的には、ＰＡＯの患者をウロキナーゼを用いて２４時間以上処置しそしてこの長期間の後でも、血管の完全な開通には達しない。クロットの内部へカテーテルを介して血栓溶解剤が送達された場合に、この状況は悪化し、さらにこれらの効力について要求されるプラスミノーゲン基質の近接を妨げるであろう。
【０１０４】
収縮クロットの溶解のための別の方法は、クロットの内部へのカテーテルを介する活性プラスミン直接送達である。収縮クロット内への直接の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの送達は、これらのクロットの固有のプラスミノーゲン欠失を回避しそしてプラスミノーゲン含有量に関係なく予測可能、迅速そして有効なクロット血栓溶解剤を提供する。さらに、血漿中の本来のプラスミン阻害因子、α2 −アンチプラスミンの豊富な存在は、クロットの近傍から逃げるあらゆるプラスミンの瞬間的不活性化に役立ち、これにより離れた場所の繊維素溶解およびこれにより起きる出血エピソードを回避する。
【０１０５】
長期間収縮したクロットの溶解に対するプラスミンおよびｔＰＡの効力を比較するために、我々はＰＡＯを有する患者内に形成されたクロットのパラメーターを模擬する生体外モデルを開発した。
【０１０６】
生体外ＰＡＯモデル。新しいヒト全血を３０ｘ０．９５ｃｍガラス管中に捕集しそして添加剤を加えないで自発的にクロット化させた。管を２０時間、３７℃でインキュベーションして完全に収縮させた。米国標準試験ふるいＤ１６の１４メッシュを用いて収縮したクロットを血清から分離しそしてこれらの重量を測定した。脚部動脈内の平均クロット大きさ（０．６ｘ１２ｃｍ）に近いさらに小さい直径のグラス管内に血液クロットを移した。複数のサイドポートを有するパルススプレイカテーテル(pulse-spray catheter)（１１ｃｍ噴射先端を有するフランスサイズ(French size) ５、Cook, Inc.）をクロット内に挿入しそして本発明に従う血栓溶解性可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物、またはｔＰＡを１ｍｇ／ｍｌで、１時間の時間間隔で１ｍｌづつ加えた。注入の回数は、血栓溶解剤の投与量に依存する。クロット溶解の程度は、残留クロットの重量により測定しそしてクロット重量減少の百分率として表した。このモデルはＰＡＯモデルと呼ばれる。静脈血液をクロット形成のために使用したけれども、これはＰＡＯ患者内の見いだされるクロットの大きさを模擬している。ｔＰＡおよび本発明に従う可逆的に不活性化された酸性化プラスミンをこのモデル内で試験し、その結果を以下に記載する。
【０１０７】
プラスミンは、新しいクロットの溶解のためにｔＰＡと同様に有効であり、そしてｔＰＡおよびプラスミンを２０時間熟成した収縮クロットの溶解のために使用して第８因子により完全に架橋させる場合とは異なる。ｔＰＡは、このようなクロットを溶解することは不可能である。ｔＰＡ処理クロットを用いて得られるクリット重量低下は、投与量をクロット当たりに５ｍｇに上昇させても対照と同様である。
【０１０８】
反対に、プラスミンは、完全に収縮および架橋したクロットの両方に対して有効である。プラスミンの溶解効果に投与量依存性がありそして５回注入（すなわち全体でプラスミン５ｍｇ）の後、クロットはほとんど完全に溶解される。同様の一連の実験で、収縮および架橋したヒト血栓を溶解することへの不適性がウロキナーゼを用いて観察された。従って、局所的に送達されたプラスミンは、ｔＰＡおよびその他のプラスミノーゲン活性化因子よりもさらに効果が高い血栓溶解剤である。
【０１０９】
これらの生体外データは、クロット溶解を開始および維持するためにｔＰＡはその基質であるプラスミノーゲンのクロット中での存在を必要とすることを示す。従って、プラスミンは新しいかまたはプラスミノーゲンに富むクロットの溶解に対してはｔＰＡと同様に効果的であるが、長期に収縮してプラスミノーゲンが少ないクロットの溶解に対しては、ｔＰＡおよびその他のプラスミノーゲン活性化因子よりもプラスミンはさらに有効である。さらに、本実施例中に示したデータは、クロット内部に直接注入された場合に、プラスミンがその可逆的に不活性化されたされた酸性化形で有効であることを証明する。
【０１１０】
ガラス管内のクロットは、血栓または繊維素血栓がヒトまたは動物内に置かれたカテーテル内に形成し、そしてカテーテルが閉塞されるモデルでもある。
実施例７：ラビット頸静脈血栓症モデル
局所投与活性プラスミンの生体内での効力および安全性は、Collen et al., (1983) のラビット頸静脈血栓症モデルにより決定した。このモデルを要約すると以下である：ラビット（２〜３ｋｇ）をケタミン／キシラジン(xylazine)を用いて鎮静させ、そしてペントバルビタール（５〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間）の希釈溶液の投与のために２２Ｇ静脈カテーテルを耳血管内に入れた。頸を剃りそして血圧測定および血液試料採取のために動脈カテーテルを頸動脈内に入れた。呼吸を容易にするために気管内チューブを入れるために気管切開を行った。鈍的切開を用いて頸静脈を注意して顔面血管までこれを含んで分離した。顔面血管内に２４Ｇカテーテルを入れそして分離した顔面血管の遠くおよび近傍の両方で頸血管をクランプした。分離した血管部分を生理的塩類溶液を用いて数回洗浄しそして血液を完全に落とした。分離した部分をトロンビン溶液（５００Ｕ／ｍｌ）を用いて数回洗浄した。最後の洗浄の後、動脈カテーテルから動脈血試料０．５ｍｌを採取し、 125Ｉ標識フィブリノーゲン５０μｌ（約１μＣｉ）と迅速に混合した。顔面血管を介して、血管部分が完全に拡張するまで分離した血管内に混合物を迅速に注入した。鉗子を用いて血管をマッサージして血栓を混合し、乾燥を防ぐために暴露した頸血管の上に一片のサランラップを置いた。血栓上の冷フィブリノーゲンの析出を防ぐためにヘパリン（１００ＩＵ／ｋｇ）を投与した。血栓を３０分間熟成させそしてクリップを取り除いた。
【０１１１】
血栓の安定性は、３０分間の平衡期間を通じて監視した。標識した血栓の溶解（溶解率％）を血栓上に直接設置したＧＩＬＥガンマカウンタープローブを用いて連続的に測定した。
実施例８：静脈血流の回復
血栓溶解を生理的情報を得るために、別の一連の実験での血栓溶解の別の指標として血流回復を使用した。これらの実験において、トランソニック流量計(Transonic Flowmeter) に接続した閉塞血栓（放射能標識なし）から遠くに近似的な大きさとした流れプローブを配置しそして静脈血流測定を１分毎に行った。
【０１１２】
血栓形成前の基線血流は、１２〜１８ｍｌ／分でありそしてデータは基線の％として表した。静脈血流の回復割合および第８因子およびフィブリノーゲンの消費量は、図７には６０分のものを示し、そして図８には９０分のものを示した。０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの投与量において、ｔＰＡは６０分後にそれぞれ１６±４％および２１±１０％の基線血流回復を誘導した。１．０ｍｇ／ｋｇおよび２．０ｍｇ／ｋｇにおけるプラスミンは、それぞれ基線血流の２０±１％および３３±１％の回復を誘導した。９０分では、ｔＰＡ注入は血流のそれぞれ１８±３％および２６±１１％回復をもたらし、そしてプラスミンはそれぞれ２５±５％および３４±６％の血流回復をもたらした。
実施例９：表皮細胞出血時間（ＣＢＴ）
６０分における表皮細胞出血時間を図９に示す。生理的塩類溶液処理は、１３±１分の出血時間をもたらした。０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの投与量におけるｔＰＡは、それぞれ１３±２分および２５±４分の出血時間をもたらし、一方、プラスミンは１．０ｍｇ／ｋｇおよび２．０ｍｇ／ｋｇの投与量においてそれぞれ１７±３％および１９±１％分の出血時間をもたらした。可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを用いた場合と比較して、ｔＰＡは長いＣＢＴを示し、プラスミンが投与され血清因子により迅速に阻害される場合よりも、内因性プラスミノーゲンのｔＰＡ活性化による全身繊維素溶解がさらに広範であることを証明する。
実施例１０：ラビット繊維素溶解出血モデル
プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡと比較してさらに大きいプラスミンの安全性は、繊維素溶解性出血の確実な指標を表す繊維素溶解出血の実証されたラビットモデルで証明され、これはMarder et al.,(1992)に記載されている。
【０１１３】
プラスミンおよびｔＰＡの血栓溶解的に等価の投与量（体積１０ｍｌ）を、再出血の発生および期間、および選択された血漿凝固および繊維素溶解パラメーターに対するこれらの相対的効果のために耳−穿刺モデルで比較した。プラスミン（２．０または４．０ｍｇ／ｋｇ）およびｔＰＡ（１．０または２．０ｍｇ／ｋｇ）の２種類の投与量を、外頸静脈内に装入したカテーテルを介してラビット内に６０分間注入した。それぞれの繊維素溶解剤の注入の前、その間およびその後でメス刃を用いる耳穿刺（耳あたりに約６個）を、出血時間および再出血の両方について観察した。一次出血時間は、それぞれの注入開始に対して−３０、−１０、０、１０、３０、６０、７０、９０、１２０および１８０分で行った。クエン酸処理血液試料（５ｍｌ）を、それぞれの繊維素溶解剤の注入の前、その間、および２時間後まで採取した。これらの血液試料をフィブリノーゲン、第８因子、およびα2 −アンチプラスミンについてアッセイした。それぞれの実験群は、ラビット５匹から成っていた。
【０１１４】
一次出血時間は、注入開始のそれぞれの時点後９０分時点までのｔＰＡ群で、長くなる傾向があった（表４）。
【０１１５】
【表４】
0004988115.tif 000006
【０１１６】
この効果は、３０分および７０分の実験時間におけるｔＰＡおよびプラスミンの高投与量群の比較において、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１１７】
表５は、４個の実験群のそれぞれにおいて観察された再出血の発生を示す。
【０１１８】
【表５】
0004988115.tif 000007
【０１１９】
結果は、プラスミノーゲン活性化因子であるｔＰＡの出血活性とプラスミンのそれとを差別した。ｔＰＡ処置動物１０匹中の９匹とは異なって、いずれのプラスミン処理した動物も再出血を示さなかった。
【０１２０】
表６Ａは、１．０ｍｇ／ｋｇｔＰＡ投与群に対する活性部位および再出血のすべての部位における平均再出血時間を表示する。表６Ｂは、２．０ｍｇ／ｋｇ投与量群に対する相当するデータを表示する。
【０１２１】
【表６】
0004988115.tif 000008
【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
活性部位における再出血は、ｔＰＡの２種類の投与量群の間の差別を示し、ｔＰＡの１．０ｍｇ／ｋｇ投与と比較して２．０ｍｇ／ｋｇ投与ではさらに長い再出血期間であった。血液化学測定からの結果を表７〜９に示す。
【０１２４】
表７は、実験期間で測定したフィブリノーゲンのレベルを示す。ｔＰＡ注入後の平均フィブリノーゲンレベルは、プラスミン注入後よりもさらに迅速にそしてさらに低い最下点まで低下した。
【０１２５】
【表８】
0004988115.tif 000010
【０１２６】
第８因子に対する平均値（表８）は、プラスミン注入動物よりもｔＰＡ注入動物の実験時間の大部分でさらに低く、それぞれのプラスミン群に対してそれぞれのｔＰＡ群の６０分実験時間では統計的有意に達した。
【０１２７】
【表９】
0004988115.tif 000011
【０１２８】
ｔＰＡを投与された動物中の第８因子の回復は、プラスミンを投与された動物とほぼ同様の濃度（初期値の５０〜６０％）であった。ｔＰＡの２種類の投与量の比較は、より高い投与量で第８因子のさらに急速な低下を示し、そしてより低い投与量では第８因子のさらに劇的なリバウンド増加を示した。
【０１２９】
表９に示すα2 −アンチプラスミンに対する平均値は、プラスミン注入動物と比較してｔＰＡ注入動物では大部分の実験時間でさらに低かった。
【０１３０】
【表１０】
0004988115.tif 000012
【０１３１】
統計的有意性は、ｔＰＡ群およびいずれのプラスミン投与群のそれぞれの間で１０分および６０分実験時間で到達し、そして高投与量ｔＰＡ群および相当する低投与量プラスミン投与群の間で７０分および９０分実験時間で到達した。
実施例１１：ミニ−プラスミンによる繊維素溶解
ミニ−プラスミンは、最初の４個のクリングルドメインを欠くプラスミンの末端切断バージョンである。これは、エラスターゼを用いるプラスミノーゲンの限定されたタンパク質分解により生成するミニ−プラスミノーゲンから調製できる。ミニ−プラスミンは、完全な大きさのプラスミンよりもクロット溶解にさらに有効であり、それは、（ａ）ミニ−プラスミンはプラスミンよりも小さく（３８ｋＤａに対して８４ｋＤａ）それでクロット内部にさらに容易に拡散でき、そして（ｂ）ミニ−プラスミンはクリングル１のα2 −アンチプラスミン結合部位を欠き、従ってクロットに架橋するα2 −アンチプラスミンによる阻害に抵抗性であるからである。α2 −アンチプラスミンは、しばしば血栓溶解治療への熟成クロットの抵抗性の原因となる。ミニ−プラスミノーゲンは、Sottrup-Jensen etal. (1975)の記載のようにして精製した。ミニ−プラスミノーゲンへのミニ−プラスミンへの変換、その精製および形成は、実施例２のプラスミンに関する記載と正確に同じプロトコールを用いて行った。
【０１３２】
ミニ−プラスミンの血栓溶解能力を、実施例６記載の生体外ＰＡＯモデルを用いて等モル濃度でプラスミンのものと比較した。クロットを２０時間熟成し、プラスミン（１ｍｇ／ｍｌ）またはミニ−プラスミン（０．４５ｍｇ／ｍｌ）の１ｍｌの２回の投与量をカテーテルを介してクロットに送達した。注入の間に、クロットを３７℃で１時間インキュベーションした。血栓溶解の程度は、クロット重量低下により測定した。生理的塩類溶液を注入したクロットを対照として使用した。クロットの大きさは０．６  ｘ  １２ｃｍ。
【０１３３】
図１０に示すように、等モル量で使用された場合に、ミニ−プラスミンは、プラスミンよりも高いクロット溶解を起こす。０．４５ｍｇ／ｍｌでのニミ−プラスミンの２回１−ｍｌ注入の後のクロット重量低下は、４４．３±４．４％であり、一方１ｍｇ／ｍｌでのプラスミンの２回１−ｍｌ注入は、３６±１．７％のクロット重量低下であった。カテーテルを介してクロットに直接またはその内部に送達された場合に、ミニ−プラスミンはプラスミンよりもさらに効果的な血栓溶解剤であり得る。
実施例１２：プラスミンの局所カテーテルプラスミン投与の効力
カテーテルを介して局所投与されたプラスミン（１〜２ｍｇ／ｋｇ）の生体内効力を、ラビット頸静脈血栓溶解モデルにおいてｔＰＡ（０．５および１．０ｍｇ／ｋｇ）のものと比較した。２種類の方法を血栓溶解を評価するために使用した。１）放射能標識血栓を用いる溶解百分率の実時間測定、および２）流動プローブおよび流量計の適用による基線血流の回復。血栓溶解の速度を測定しそして実施例６の記載と同様にして９０分間定量した。同時に、第８因子およびフィブリノーゲンの消費ならびに表皮出血時間（ＣＢＴ）を全身溶解状態の指標として測定した。これらの局所投与研究のために、カテーテル（ＰＥ５０）を周辺耳静脈を介して遮断性血栓の１ｃｍ以内まで進めた。ｔＰＡの２種の投与量０．５および１．０ｍｇ／ｋｇおよびプラスミンの２種の投与量１．０ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇを使用した。これらの投与量が、３０分間で注入した全体積１０．０ｍｌ中に含まれていた。放射能標識した血栓を用いて６０および９０分における溶解百分率を測定し、そして、非標識血栓を用いる別の一連の実験で、同じ時点での血流の回復百分率を測定した。０分および６０分で得た動脈血液試料（４ｍｌ）をフィブリノーゲンおよび第８因子レベルの測定のために使用した。第８因子レベルレベルおよびフィブリノーゲン濃度は、ＭＬＡ  Electra 800 凝固タイマーおよびフィブリノーゲン・アッセイセットを用いて測定した。第８因子レベルは、標準曲線を作製するためにヒト第７因子を用いてCOATEST VIII C4 アッセイにより測定した。０分および６０分における表皮出血試験は、ラビットの爪をその先端でイヌ尾トリマーを用いて切除して測定した。血栓が形成されるまで２分毎に爪に接触しないようにして濾紙を用いて血液を軽く叩き、そして濾紙は血液を落とさない(wick)ようにした。結果は、平均±ＳＥＭで表し、そして群間の有意の差異を評価するために多重比較試験のためのBoniferori法に従う一方向ＡＮＯＶＡを使用した。Ｐ＜０．０５を有意と考えた。
【０１３４】
プラスミンまたはｔＰＡ（全体積１０ｍｌ）を、血栓の近く１ｃｍに入れたカテーテルを介して３０分間注入した。等量の生理的塩類溶液を対照として用いた。１．０〜２．０ｍｇ／ｋｇのプラスミン投与をｔＰＡの０．５ｍｇ／ｋｇ投与と比較した。多重比較検定のためのDunn法による１方向ＡＮＯＶＡを統計的評価のために使用した（ *は０．５ｍｇ／ｋｇにおけるｔＰＡと比較したｐ＜０．０５、または＃は１．０ｍｇ／ｋｇのｔＰＡと比較したもの）。
【０１３５】
ｔＰＡ（０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ）と比較して、局所的に注入されたプラスミン（１．０〜２．０ｍｇ／ｋｇ）は、同等または著しく良好な血栓溶解を誘導し、同時により少ない第８因子およびフィブリノーゲン消費ならびにＣＢＴであった。プラスミン処置のリスク／利益評価は、プラスミンの２倍の投与量（重量基準）がｔＰＡと同等の出血副作用を誘導した。従って、プラスミンは、カテーテル支援局所血栓溶解の間の血栓溶解剤として効果的にそして安全に使用できる。プラスミンは、ｔＰＡと比較して同等または優れた溶解活性を有し、そして安全プロフィールは局所血栓溶解送達のこの動物モデルで同等と考えられる。
【０１３６】
血栓溶解の程度は、血漿内へ血栓から遊離された放射能の量と、反応管内の放射能の全量との比から算出した。標識した繊維素分解生成物の遊離を百分率で表して時間に対してプロットした。
【０１３７】
標識血栓の溶解割合および第８因子およびフィブリノーゲンの消費は、インキュベーション時間６０分（図１１）および９０分（図１２）で示す。０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇにおいて、ｔＰＡはそれぞれ１６±２％および２１±２％溶解を誘導し、１．０ｍｇ／ｋｇおよび２．０ｍｇ／ｋｇにおけるプラスミンはそれぞれ２６±３％および３３±４％溶解を誘導した。９０分において、ｔＰＡ注入はそれぞれ２１±２％および２６±２％溶解をもたらし、これはそれぞれ３１±４％および３６±２％の溶解を誘導するプラスミンと比較される。
実施例１３：プラスミン処置対ｔＰＡ処置のリスク／利益評価
血栓溶解のラビットモデルにおけるプラスミンの広範な比較薬理学評価（リスク／利益）を決定した。プラスミンの効力をｔＰＡのものと比較した。効力の指標として溶解および血流の回復の百分率を使用した。これらの分析は、別々の実験で行った。これらの血栓溶解剤により誘導されるそれぞれの副作用は、第８因子およびフィブリノーゲンの消費を測定しそして出血時間を評価して比較した。これは、近似的なリスク／利益プロフィールの決定を可能とした。
【０１３８】
リスクプロフィールを決定するために、溶解状態および出血の誘導のための代理マーカーとして第８因子の消費を用いて、ｔＰＡに対するＥＤ50を算出した。第８因子の消費は、第８因子(Kogenatee) の再補充による出血副作用および正常止血状態への復帰に直接関係した。少なくとも１０匹（動物）／投与量のＮを用いる０．１ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇの範囲のｔＰＡ投与量を試験した。１．０ｍｇ／ｋｇがｔＰＡに関する臨床投与量と考えられる。ｔＰＡに関して算出したＥＤ50は１．８ｍｇ／ｋｇであった。局所投与プラスミンに関する同様の計算は、３．６ｍｇ／ｋｇのＥＤ50を与えた。従って、プラスミンの二倍の投与（重量基準）がｔＰＡと同様の出血副作用を示した。同等のリスクプロフィール、すまわち凝固タンパク質消費および出血におけるｔＰＡとプラスミンとの投与量を用いる効力（溶解および血流の百分率）は、図１３に示すように算出された。試験したすべての当量リスク投与量、ｔＰＡ（０．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ）およびプラスミン（１．０〜３．０ｍｇ／ｋｇ）において、プラスミンは、ｔＰＡと比較して、少なくとも同等またはさらに良好な溶解速度および血流回復を誘導した。従って、薬理学データは、カテーテル送入により接近できる血栓の溶解処理のためにプラスミンを考慮するように推奨するために十分である。
実施例１４：Ｎ−末端配列決定により特性検討されたプラスミン試料の分解ペプチド
プラスミン試料の分解ペプチドを以下のようにＮ−末端配列決定により特性決定した。プラスミン組成物を２ｍＭ酢酸を含む低ｐＨ値、すなわち２．５未満のｐＨおよび３．５および３．８のｐＨで配合した。プラスミン試料を、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、これを図１４に示す。タンパク質バンドをＰＶＤＦ膜に転移させ、クーマシー・ブルーＲ−２５０（Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA) を用いて染色し、そしてバンドをメスで切り取った。
【０１３９】
Ｎ−末端配列分析は、Hewlett Packard 241 タンパク質配列決定装置(Hewlett Packard, Inc., Glen Allen, VA) を用いて膜から直接行った。プラスミンの相当する断片が同定できるように、それぞれのバンドについて１０回のサイクルを行った。それぞれのバンドの分子量をInvitrogen, Inc(San Diego, CA)から入手できるMark 12 マーカーを用いるデンシトメトリー分析を用いて決定した。
【０１４０】
ｐＨ３．８におけるプラスミンのインキュベーションにより生成した３種のポリペプチドは、位置（Ｌｙｓ−プラスミンに対する数値）トレオニン（Ｔ１０５）、グリシン（Ｇ１９０）およびグルタミン酸（Ｅ６２３）で始まった。プラスミンの既知のアミノ酸配列から、最初の２種のポリペプチドは重鎖由来であり、そして第三は軽鎖由来であると決定された。図１５に示すように、Ｎ−末端アミノ酸の前のアミノ酸は、アルギニンまたはリシン（Ｋ１０４、Ｒ１８９、およびＫ６２２）のいずれかであった。プラスミンがリシンおよびアルギニンのカルボキシル側でタンパク質を切断することが一般に知られている。これらの結果は、ｐＨ３．８におけるプラスミンの組成物が、自己分解を受けやすいことを証明した。
【０１４１】
ｐＨ２．２におけるプラスミンのインキュベーションにより生成した３種のポリペプチドは、Ｎ−末端のプロリンから始まっていた。プラスミンの既知のアミノ酸配列から、これらの３種のポリペプチドは、位置Ｐ６３、Ｐ１５５、およびＰ３４７から始まる重鎖由来であることが決定され、これを図１５に示す。それぞれのプロリンの前のアミノ酸は、アスパラギン酸であった（Ｄ６２、Ｄ１５４、およびＤ３４６）。アスパラギン酸−プロリン（Ｄ−Ｐ）ペプチド結合が酸で切れやすいことは一般に知られている。これらの結果は、ｐＨ２．２におけるプラスミンの組成物では、ペプチド結合の酸加水分解を受けやすいことを証明した。
実施例１５：低ｐＨ配合安定化プラスミン中の糖類
プラスミンをｐＨ２．５〜４．０で下記の糖類の少なくとも１種類を用いて下記の酸の１種類中に配合した。酸の群は、酢酸、クエン酸、セリン、トレオニン、イソロイシン、バリン、グルタミン、β−アラニン、またはその他の酸の１ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲内のものを含む。糖類の群は、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、ラクトース、グルコースおよびトレハロースの０．２％〜２０％を含む。いかなる賦形剤も含まないプラスミン配合物を対照として含ませた。すべての試料を３７℃で７日間インキュベーションした。プラスミン本体の変化を還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。
【０１４２】
図１６に示した結果は、糖類がｐＨ３．５でプラスミンに安定化作用を有しそして低ｐＨでの可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの貯蔵からの利益を改善することを実証する。
実施例１６：非−炭水化物安定化剤を用いる可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の安定化
可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物を本発明に従い、非−炭水化物安定化剤として加えたグルコサミン、ナイアシンアミド、シトルリンまたはチアミンの０．１Ｍを含むｐＨ３．７の５ｍＭ酢酸中、１ｍｇ／ｍｌで配合した。いかなる賦形安定化剤も含まない可逆的に不活性化された酸性化プラスミン配合物を対照として含ませた。すべての試料を３７℃で７日間インキュベーションし、プラスミン本体の変化を非還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。図１７を参照すると、試験したすべての非−糖類安定化剤が３７℃で７日間の試験期間で、可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の安定性を改善した。
【０１４３】
可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物も本発明に従い、安定化剤として１５０ｍＭ塩化ナトリウムを用いて、２ｍＭ酢酸、ｐＨ３．４中、１ｍｇ／ｍｌで配合した。同じ配合であるがしかし塩化ナトリウムを含まないものも調製しそして対照として含めた。試料を４℃で２８日間インキュベーションした。プラスミン本体の変化は、上記の実施例３記載のようにして非還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。値は、１００％の値を与えた０日目の対照に対して正規化された。表５で、結果は４℃で貯蔵したプラスミンが、塩化ナトリウムを含む低ｐＨ配合よりもさらに安定であったことを証明した。
【０１４４】
【表１１】
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【０１４５】
実施例１７：プラスミンは酸性化した生理的塩類溶液の比例する大量を中和できる
生理的ｐＨにおいて血清１ｍｌにより中和できる本発明の可逆的に不活性化された酸性化プラスミン組成物の体積を推定するために、一連の滴定実験を行った。血清の体積１ｍｌは、ＰＡＯ患者の動脈内に見いだされる平均的に収縮したクロットの液相体積を表すと推定される。本発明に従う可逆的に不活性化された酸性化プラスミンがその中で配合されるものに典型的な酸性化（ｐＨ３．７）低緩衝能力緩衝液を用いて血清（１ｍｌ）を滴定した。図１８に示すように、血清１ｍｌは、酸性化生理的塩類溶液約１５０ｍｌを中和できる。後者の体積は、末梢動脈閉塞の処置のために必要な可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの考えられる体積を越える。
【０１４６】
従って、低緩衝能力緩衝液中の可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの配合物は、有効で安定な薬剤組成物のための基礎を提供する。このような組成物は、患者への製剤の送達の間に著しい効力の低下を伴うプラスミンを用いない処置のために必要な時間で、室温で可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの投与を可能とする。
実施例１８：低ｐＨで安定化されたトリプシンはさらに高いｐＨ環境への転移により再活性化できる
トリプシン（１６．４ｍｇ、Sigma Chemical Co.  カタログ番号T-1426）を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）２．２８ｍｌ中に溶かした。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて事前に平衡化させたベンズアミジン−セファロース(Pharmaciaコード番号17-0568-01）の１ｍｌ−カラムにトリプシン溶液を加えた。このカラムをこの後者の緩衝液４ｍｌを用いて洗浄すると、溶離物吸光度（２８０ｎｍ）の０．０３未満への低下をもたらした。２００ｍＭグリシン／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ３．０）の体積０．５ｍｌを用いて不活性化された状態にあるこのカラムからトリプシンが溶離した。このカラムから溶離した第３〜第５の０．５ｍｌ画分は、吸光度（２８０ｎｍ）のピーク値を含み、そしてプールした。このプールしたトリプシン溶離物の吸光度（２８０ｎｍ）は、９．２２と決定された。トリプシンの吸光係数（１％溶液に対するＥ280 ＝１７．０９）およびトリプシンの分子量（２４，０００）に基づいて、このプールしたカラム溶離物内の全トリプシンタンパク質の濃度は、２２５μＭと算出された。
【０１４７】
このプールしたカラム溶離物内のトリプシン活性部位の濃度は、Case & Shaw, Biochem. Biophys. Res. Commun. 29, 508(1967) に記載され、その全体を引用して本明細書中に編入する方法によりｐ−ニトロフェニルグアニジノベンゾアートを活性部位滴定剤として使用して決定された。このアッセイは、ｐＨ８．３において、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）７００μｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム／１％グリシン（ｐＨ７．０）２００μｌおよびｐ−ニトロフェニルグアニジノベンゾアート（ジメチルホルムアミド内に溶解）１０μｌも含むアッセイ混合物内にプールしたトリプシンカラム溶離物の少量（１００μｌ）を希釈して行った。この混合組成物の最終ｐＨは８．３と測定された。このアッセイ中で形成されたｐ−ニトロフェノールのトリプシン−依存性量は、４１０ｎｍで測定した。４１０ｎｍおよびｐＨ８．３におけるｐ−ニトロフェノールに対する吸光係数（１６，５９５Ｍ-1）に基づいて、１．０１ｍｌアッセイ中に存在したこのプールしたトリプシンカラム溶離物１００μｌは、キュベット中に存在した２２．９５μＭトリプシン活性部位の濃度に一致した。従って、プールしたトリプシンカラム溶離物の初期原溶液は、２３１μＭトリプシン活性部位を含んでいた。後者の値は、存在する全トリプシンタンパク質の濃度（２２５μＭ）に、実験誤差の範囲内で一致する。これらの結果は、トリプシンが低ｐＨに調整できそして次いでその活性部位の再活性化を伴って高ｐＨ環境に転移できることを示している。
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、色素原性基質Ｓ２２５１を用いて測定したプラスミン活性のｐＨ依存性を示す。
【図２】  図２は、カゼイン溶解アッセイにより測定した酸性化水（ｐＨ３．７）中のプラスミン安定性を示す。
【図３】  図３は、ＰＢＳ中のプラスミンによる繊維素血栓溶解を示す。
【図４】  図４は、血栓溶解におけるプラスミンまたはｔＰＡとプラスミノーゲンとの有効性を示す。
【図５】  図５は、活性プラスミンの血栓溶解効力を示す。
【図６】  図６は、プラスミン−誘導血栓溶解に対する血漿阻害因子の効果を示す。
【図７】  図７は、６０分における血流回復、ならびに第８因子およびフィブリノーゲン消費に対するｔＰＡまたはＬｙｓ−プラスミンの局所投与を比較する。
【図８】  図８は、９０分における血流回復、ならびに６０分における第８因子およびフィブリノーゲン消費に対するｔＰＡまたはＬｙｓ−プラスミンの局所投与を比較する。
【図９】  図９は、表皮出血時間に対するｔＰＡとプラスミンとの局所投与の効果を示す。
【図１０】  図１０は、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンまたはミニ−プラスミンの等モルを用いる収縮血液クロットの溶解を示す。
【図１１】  図１１は、６０分における血栓溶解、ならびに第８因子およびフィブリノーゲン消費に対するｔＰＡおよびプラスミンの局所投与を比較する。
【図１２】  図１２は、９０分における血栓溶解、ならびに６０分における第８因子およびフィブリノーゲン消費に対するｔＰＡおよびプラスミンの局所投与を比較する。
【図１３】  図１３は、ｔＰＡに対するプラスミンのリスク／利益評価を示す。
【図１４】  図１４は、２．２、３．５または３．７のｐＨにおけるプラスミン組成の進行性分解を示す。
【図１５】  図１５は、ｐＨ２．２および３．８においてプラスミン中に生成した切断部位を示す。
【図１６】  図１６は、炭化水素安定化剤を用いた３．７のｐＨにおける可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの３７℃での安定性を示す。
【図１７】  図１７は、安定化剤としてグルコサミン、ナイアシンアミド、チアミンまたはシトルリンを用いたｐＨ３．７における可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの３７℃における安定性を示す。
【図１８】  図１８は、ヒト血清を用いる、種々の低緩衝能力緩衝液を含むプラスミン溶液の滴定を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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