(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ型多糖生合成を供給する、第１及び第２の機能性タンパク質を含む植物であって、該第１タンパク質が、哺乳動物のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、かつ、該第２タンパク質が、哺乳動物のβ１，３−グルクロニルトランスフェラーゼである前記植物。
【請求項２】
ガラクトース及びグルクロン酸を含む延長されたＮ結合型多糖を含む異種糖タンパク質又はその機能性フラグメントを付加的に含む、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記延長されたＮ結合型多糖が、キシロース残基を本質的に欠く、請求項２に記載の植物。
【請求項４】
前記延長されたＮ結合型多糖が、フコース残基を本質的に欠く、請求項２に記載の植物。
【請求項５】
前記哺乳動物のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の植物。
【請求項６】
前記哺乳動物のβ１，３−グルクロニルトランスフェラーゼが、ラットβ１，３−グルクロニルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の植物。
【請求項７】
前記異種糖タンパク質が、哺乳動物の糖タンパク質である、請求項２に記載の植物。
【請求項８】
前記哺乳動物の糖タンパク質又はその機能性フラグメントが、抗体、ワクチン抗原、ホルモン、細胞接着分子、又は酵素である、請求項７に記載の植物。
【請求項９】
前記哺乳動物の糖タンパク質又はその機能性フラグメントが、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、アンチトリプシン、リパーゼ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）又はコラーゲンである、請求項８に記載の植物。
【請求項１０】
Ｎ型多糖生合成を供給する、第１及び第２の機能性タンパク質を含む植物細胞であって、該第１タンパク質が、哺乳動物のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、かつ、該第２タンパク質が、哺乳動物のβ１，３−グルクロニルトランスフェラーゼである前記植物細胞。
【請求項１１】
ガラクトース及びグルクロン酸を含む延長されたＮ結合型多糖を含む異種糖タンパク質又はその機能性フラグメントを付加的に含む、請求項１０に記載の植物細胞。
【請求項１２】
キシロシルトランスフェラーゼ活性が、ノックアウトされている、請求項１０又は１１に記載の植物細胞。
【請求項１３】
フコシルトランスフェラーゼ活性が、ノックアウトされている、請求項１０又は１１に記載の植物細胞。
【請求項１４】
前記植物細胞が、植物に再生することができる、請求項１０又は１１に記載の植物細胞。
【請求項１５】
前記哺乳動物のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項１０に記載の植物細胞。
【請求項１６】
前記哺乳動物のβ１，３−グルクロニルトランスフェラーゼが、ラットβ１，３−グルクロニルトランスフェラーゼである、請求項１０に記載の植物細胞。
【請求項１７】
前記異種糖タンパク質が、哺乳動物の糖タンパク質である、請求項１１に記載の植物細胞。
【請求項１８】
前記哺乳動物の糖タンパク質又はその機能性フラグメントが、抗体、ワクチン抗原、ホルモン、細胞接着分子、又は酵素である、請求項１７に記載の植物細胞。
【請求項１９】
前記哺乳動物の糖タンパク質又はその機能性フラグメントが、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、アンチトリプシン、リパーゼ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）又はコラーゲンである、請求項１８に記載の植物細胞。
【請求項２０】
哺乳動物のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、哺乳動物のβ１，３−グルクロニルトランスフェラーゼ、及び哺乳動物の糖タンパク質を発現する植物を生産する方法であって、植物細胞又は組織に、以下の：
（ａ）β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸、β１，３−グルクロニルトランスフェラーゼをコードする核酸、及び哺乳動物の糖タンパクをコードする核酸を含むベクターを含むアグロバクテリウム(Agrobacterium）株；又は
（ｂ）β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む第１アグロバクテリウム(Agrobacterium）株、β１，３−グルクロニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む第２アグロバクテリウム(Agrobacterium）株、及び哺乳動物の糖タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む第３アグロバクテリウム(Agrobacterium）株；
のいずれかを接種するステップを含む前記方法。
【請求項２１】
所望の糖タンパク質又はその機能性フラグメントを取得するための方法であって、以下のステップ：
請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物を、該植物が収穫可能な段階に達するまで栽培し、
該植物を収穫し、そして分画して、分画された植物物質を取得し、そして
該分画された植物物質から、少なくとも部分的に該糖タンパク質を単離する
を含む前記方法。
【請求項２２】
前記植物が、ニコチアナ(Nicotiana）、スピロデラ(Spirodella）、ウォルフィア(Wolffia）、ウォルフィエラ(Wolffiella）、及びレムナ(Lemna）からなる群から選ばれる属に属する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物。
【請求項２３】
前記植物が、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana）、トウモロコシ、アオウキクサ(duckweed）、ポテト、及びトマトからなる群から選ばれる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組換え型生物薬剤タンパク質またはそれらを含んでなる（薬剤）組成物などの、有用なタンパク質様物質の製造のための、費用効果を生じかつ汚染の危険のない工場として使用されるトランスジェニック植物における、糖タンパク質のプロセッシングの分野に関する。
【０００２】
たとえば、薬物−分子農業による薬物または薬剤組成物としての組換えタンパク質の創製は、トランスジェニック植物の主要な魅力の一つをなしている。そのことはまた、それらの利用が世論によって最も受け入れられる領域でもある。組換えタンパク質の、圃場での生産から期待されてよい収穫量および好都合の経費に加えて、トランスジェニック植物は細菌、酵母、および動物細胞といった他の生産系を越えた確実な利益を提供する。事実、それらはヒトにとって危険かもしれないウイルスがなく、また種子や塊茎といったそれらの「貯蔵器官」の中に目的のタンパク質を蓄積することができる。このことは、それらの取扱い、それらの輸送、および周囲温度での貯蔵を容易にするとともに、必要に応じたその後の抽出も可能にする。さらに、トランスジェニック植物、またはその部分のあるものは、薬物またはワクチンのベクターとして利用されることが可能である。１９９６年、テャールズ・アルンツェン（Charles Arntzen）（ニューヨーク州、コーネル大学、植物研究のためのボイス・トンプソン研究所（Boyce Thompson Institute for Plant Research））は、ジャガイモによる大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンに対する組換えワクチンの産生を証明した。その有効性はマウスにおいて、また６ヵ月間にわたり５０〜１００グラムの生のトランスジェニックジャガイモを消費してきたボランティアについて行なわれた臨床試験を通して証明されている。もう一つの、カリフォルニア州、ローマ・リンダのチームは、ジャガイモにおいて形成されたコレラに対するワクチンをマウスにおいて首尾よく検査している。
【０００３】
腸症の原因細菌に対する伝統的なワクチン接種は、発展途上国において広く実施されるためには「経費がかかりすぎる」と考えられている。しかしながら、たとえば、もはやジャガイモではなくバナナにおける経口ワクチンの産生は、非常に低コストででき、毎年３百万人の子供の死を引きおこす細菌起源の下痢症に対するワクチン接種の一般への実施を可能にするであろう。先進国では、子供達が医者の注射針よりも、バナナやイチゴのワクチンを間違いなく好むであろうと想像することができる。さらに一般的には、分子ファーミング（pharming）は、発展途上国に対し、製薬工場に投資する必要なしに、実質的な量の治療用タンパク質を低コストで製造することを可能にすることができるであろう。
【０００４】
タンパク質様物質の工場としての植物の利点はほとんどが生物薬剤の観点からであるが、植物はまた、たとえばより高い安定性をもたらす糖鎖形成能のため、他のタンパク質、たとえば工業用の酵素などの製造に有用である。今日、治療用の用途のためのタンパク質または糖タンパク質の製造に植物を利用することは、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、コメ、またはナタネが、大部分がヒト起源の、モノクローナル抗体、ワクチン抗原、イヌの胃リパーゼなどの酵素、上皮成長因子、インターロイキン２および４、エリスロポエチン、エンセファリン、インターフェロンといったサイトカイン類、および血清アルブミンといった、哺乳類のタンパク質またはペプチドの製造のための研究対象であるという理由から、科学的想像を大きく越えている。このようなタンパク質のいくつかは、すでにヒトのボランティアにおいてそれらの有効性が証明されているが、しかしそれらの潜在性の免疫原性とそれらの可能なアレルゲン性の特性とは、それらの開発をなお制限している。
【０００５】
いくつかの異種タンパク質は、植物において首尾よく産生されている。これらのタンパク質の中には、モノクローナル抗体、ホルモン、ワクチン抗原、酵素、および血液タンパク質がある（Dieryckら、1997；Florachら、1995；Maら、1995）Mtsumotoら、1163；Saitoら、1991；Thanavalaら、1995）。細菌、酵母、および昆虫細胞のような他の異種の発現系に共有される植物についての主要な制限は、哺乳類に比べて異なるそれらの糖鎖形成プロフィールである。Ｎ結合型多糖をもたない細菌、および高マンノース型多糖のみをもつ酵母と対照的に、植物は複合Ｎ結合型多糖をもつタンパク質を産生することができる。植物糖タンパク質は、α１，３結合したコアのフコースと、哺乳類には見られないβ１，２結合したキシロース残基とを含んでいる複合Ｎ結合型多糖をもつ。（Lerougeら、1998）（図１）。植物のＮ型多糖のコアは、哺乳類におけるように、２個のＧｌｃＮＡｃ1残基により置換されることが可能であり、それらはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩおよびIIにより転移される（Schachter、1991）が、それらの様相は異なっている（Rayonら、1999。いくつかの植物糖タンパク質のＮ型多糖は、付加的にルイスＡ（Ｆｕｃα１，４（Ｇａｌβ１，３）ＧｌｃＮＡｃ）エピトープを含む（Fitchette Laineら、1997；Meloら、1997）。しかしながら、植物糖タンパク質は、哺乳類に見られる特徴的なガラクトース（ＮｅｕＡｃα２、６Ｇａｌβ１，４）を含んでいる複合Ｎ型多糖を欠くとともに、またα１，６結合したコアのフコースも一度もみつかっていない（図１；Schachter、1991）。タバコ植物において産生されたマウスモノクローナル抗体（Maら、1995）は、典型的な植物のＮ型グリコシレーションを有する。４０％の高マンノース多糖および６０％の複合多糖は、キシロース、フコース、および０、１、または２個の末端ＧｌｃＮＡｃ残基を含んでいる（Cabanes Macheteauら、1999）。
【０００６】
一口にいえば、植物由来の糖タンパク質の分析は、植物と哺乳類のグリコシレーション経路のいくつかの段階が、同じではないまでも、非常に類似していることを示してきた。しかしながら、明らかな差異も、特に複合多糖の合成において存在する。植物の複合多糖は一般的により小さく、Ｍａｎ３（ＧｌｃＮＡｃ）２コアに結合したベータ−１，２キシロースまたはアルファ−１，３フコース残基を含む。糖タンパク質上のかかる残基は、高度に免疫原性であることが知られている。このことは、これらの糖を運んでいる組換えタンパク質についての、ある種の適用については、問題を引きおこすであろう。
【０００７】
さらに、哺乳類の糖タンパク質については共通しており、かつしばしば必須であるシアル酸は、植物多糖においては一度もみつかっていない。このことは、グリコシド側鎖上の末端シアル酸の欠損が、インヴィヴォにおける生物学的活性を劇的に低下させることを実験が示しているため、特に関連がある。最もありそうなことには、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体はアシアロ糖タンパク質と結合することが可能であり、それにより当該糖タンパク質の循環からの浄化を生じ、そのことが代謝半減期の減少およびインヴィヴォにおける低い生物活性に反映される。
【０００８】
本発明は、正常には植物に存在しないＮ型多糖生合成を供給する機能性の哺乳類酵素を含んでいる植物を提供する。植物において産生される糖タンパク質を薬剤としての使用により適さないものにするのは、特に当該多糖の「植物」特性である。この「植物」特性は、問題の糖タンパク質に対し、望ましくない抗原性および免疫原性の特性を授けており、そのことはトランスジェニック植物によって産生される糖タンパク質の免疫原性を予防することを意図した戦略を必要とするであろう。当該戦略の目的は、植物細胞のゲノムを、ヒト細胞がそうするようにそれらのタンパク質を熟させる方式で修飾することである。
【０００９】
哺乳類のグリコシルトランスフェラーゼの多くの遺伝子はすでにクローン化されており、それは植物にはあてはまらない。植物系の形質転換の容易さのゆえに、それらが産生する糖タンパク質からなる多糖を「ヒト化」または「哺乳類化」するべく、哺乳類由来のグリコシルトランスフェラーゼにより、植物のゴルジ体を「補足」したいという誘惑は強力である。かかる戦略の成功は、それでもなお明らかではない。特に、植物細胞における組換え糖タンパク質のガラクトシレーションおよびそれに続くシアリレーションは、ガラクトシルおよびシアリルトランスフェラーゼの遺伝子の転移および発現にのみ依存するのではない。このような外来性の酵素はまた、植物細胞に対する有害作用なしに活性があるはずであり、また全体としてトランスジェニック植物に対する有害作用なしに少なからず持続するはずである。
【００１０】
植物におけるテーラーメイドの糖タンパク質の産生のため、植物のグリコシレーションを哺乳類化するべく、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼがノックアウトされることは可能であり、さらに、いくつかの哺乳類グリコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つは発現されねばならない。キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼにノックアウトを供給し、それにより植物の不必要なグリコシレーションポテンシャルを減じることは、たとえば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩをコードしている遺伝子に突然変異を生じたシロイヌナズナが完全に生存可能であったことから（Von Schaewenら、1993）、一つの実行可能な選択肢である。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩは複合多糖の形成を開始する酵素であるため（Schachter、1991）、この植物はキシロースおよびフコーズを含んでいる複合多糖を完全に欠いている。
【００１１】
好ましい態様において、本発明は、機能性の（哺乳類の）タンパク質、たとえば、正常には植物に存在しないＮ型多糖生合成を供給する輸送体または酵素を含んでおり、正常には植物に存在しない少なくとも１つの第２の哺乳類タンパク質またはその機能性フラグメントを付加的に含んでいる植物を提供する。本発明により、哺乳類型のグリコシレーションパターンを有しており、少なくとも前記糖タンパク質がガラクトシレーションされるようにする所望の糖タンパク質を、植物において産生することが提供される。さらに、所望の糖タンパク質は、哺乳類様のグリコシレーションに適したどのような有用な糖タンパク質であってもよい。
【００１２】
好ましい態様において、本発明は、正常には植物に存在しないＮ型多糖生合成を供給する前記機能性の哺乳類酵素が、（ヒトの）β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを含む、本発明による植物を提供する。植物では見つかっていない重要な哺乳類酵素は、このβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。この酵素をコードしているｃＤＮＡは、いくつかの哺乳類種からクローン化されている（Masriら、1988；Schaperら、1986）。当該酵素はβ１，４結合している活性化された糖供与体ＵＤＰ−Ｇａｌから、Ｎ結合型および他の多糖のＧｌｃＮＡｃ残基へガラクトースを転移する（図１）。これらのガラクトース残基は、たとえば抗体の機能性において重要な役割を果たすことが示されている（Boydら、1995）。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、最近、培養中のＳｆ９昆虫細胞のＮ型グリコシレーション経路を延長するべく、昆虫の細胞培養に導入されており（Hollisterら、1998；JarvisおよびFinn、1996）、これらの培養物の、異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいるバキュロウイルスの発現ベクターによる感染を可能にしている。異種タンパク質のＮ結合型多糖は、ある程度、より広範囲にプロセスされ、前記昆虫細胞培養物におけるがガラクトシレーションされた組換え糖タンパク質の産生を可能にすることが示された。また、タバコ細胞の懸濁培養物への導入は、内在タンパク質がガラクトシレーションされたＮ結合型多糖の産生を生じる結果となった（Palacpacら、1999）。しかしながら、これらの植物の細胞培養物においては、異種の糖タンパク質は産生されず、かかる異種タンパク質が細胞培養物中でまったくガラクトシレーションされないことは言うまでもない。さらに、今日まで、哺乳類のグリコシレーションパターンを含んでいるトランスジェニック植物は、当該技術において開示されていない。哺乳類の細胞系には多くのグリコシレーション突然変異体が存在する（Stanleyおよびloffe、1995；Stanleyら、1996）。しかしながら、完全な生物体における同様の突然変異は、この生物体についていくぶん深刻な機能不全を引きおこす（Asanoら、1997；HermanおよびHovitz、1999；LoffeおよびStanley、1994）。それゆえ一般的には、細胞単独よりもさらに大きい全体（凝集した組織または全生物体など）における、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現もまた、たとえば胚発生および／または器官形成の間に、かかる機能不全をもたらすことが一層予期される。事実、現在まで、Ｎ結合型多糖を、少なくともガラクトースの付加によらずに延長する能力を有している、昆虫または植物などの、完全に成長した非哺乳類の生物体が開示されている報告は、これまで全く作成されていない。多くの真核多細胞生物から、ＣＨＯ、Ｓｆ９、およびハイブリドーマ細胞系といった不死化された細胞系が生みだされてきた。このような細胞系は何世代にもわたって培養されており、多くの突然変異を運ぶことが可能であり、かつそれらが由来したそのままの生物体の機能化に必須である多くの特性が不足してるか、または失っている可能性がある。後者を例証するべく、これらの不死化された細胞系が完全なそのままの生物体に再生することができないという事実は、このような不死化された細胞系では重要なシグ��リング経路および細胞−細胞のコミュニケーションに関係する成分が欠けていることを示している。文献からは、ＣＨＯ細胞（StanleyおよびLoffe、1995；Stanleyら、1996）またはＳｆ昆虫細胞系（JarvisおよびFinn、1996；Hollisterら、1998）といった不死化された真核細胞系のＮ結合型グリコシレーション機構が、これらの細胞系の生存能力に、明らかな負の影響を及ぼすことなく、修飾可能であることが知られているが、対照的に完全な生物体では、同様の突然変異がいくぶん深刻な機能不全を引きおこす（Asenoら、1997；HermanおよびHorvitz、1999；LoffeおよびStanley、1994）。事実、生存可能な生物体に再生する能力を有する真核細胞において、天然には生じないＮ結合型多糖が形成される方法で、Ｎ結合型グリコシレーションが延長されることが可能であるという報告は作成されていない。明らかに、正常細胞と比較して、不死化された細胞系は適応性があり、新しい、正常ではないタイプのＮ結合型グリコシレーションに対し耐性があるが、そのままの生物体に発生する能力が欠損している。
【００１３】
また、不死化されたタバコＢＹ２細胞のＮ型グリコシレーション機構の修飾も報告されている。この細胞系へのＧａｌＴの導入は、内在性タンパク質のガラクトシレーションされたＮ結合型多糖の産生を生じる結果となる（Palacpacら、1999）。しかしながら、このＢＹ２細胞系からの細胞は、生存可能なタバコ植物に再生することはできない。加えて、本特許出願の他の箇所に記述されたように、最も大きい集団は異常なハイブリッド型の多糖（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃＧａｌ）であり、ＢＹ２細胞系における、導入されたガラクトシルトランスフェラーゼの未成熟な作用と、異常なゴルジ体の形態学およびガラクトシルトランスフェラーゼの局在性が示唆された。このことは、この細胞系が正常なタバコ植物の細胞とは有意にことなるというさらなる証拠を提供する。
【００１４】
現在にいたるまで、Ｎ結合型多糖を、少なくともガラクトースの付加によらずに延長する能力を有しながら、完全に成長した昆虫または植物などの非哺乳類の生物体が開示されている報告は作成されていない。
【００１５】
驚いたことに、本発明は次に、かかる非哺乳類の生物体であって、正常には植物に存在しないＮ型多糖の生合成を供給しそれによってたとえば、ガラクトースの付加によりＮ結合型多糖を延長する能力を供給する（機能性の）哺乳類酵素が供給されている植物を提供する。好ましい態様において、本発明は、前記酵素が安定した発現を示すかかる植物を提供する。前記第２の哺乳類タンパク質を越えて、本発明によって提供されるような植物により、第３の哺乳類タンパク質が発現されることも提供される。実験部分は、抗体の軽および重鎖の双方か、またはそれらの（機能性の）フラグメントをコードしている核酸を含むかかる植物を提供する。もちろん、完全なタンパク質が発現されることは必要ではなく、本発明はまた本発明による植物に、フラグメントのみ、好ましくは前記第２の哺乳類糖タンパク質の機能性フラグメントのみの発現を供給し、前記フラグメントが全タンパク質の少なくとも１つの活性を有しており、さらに、たとえば切断されたポリペプチド鎖か、または完全にではなく延長された、たとえばガラクトースを用いて延長されただけの多糖によって特徴づけられるようにする。
【００１６】
好ましい態様においては、本発明は、前記第２の哺乳類タンパク質またはその機能性のフラグメントが、キシロースおよび／またはフコースを欠く延長されたＮ結合型多糖を含む、本発明による植物を提供する。図３からわかるように、植物由来のガラクトシレーションされた糖タンパク質は、なおキシロースおよびフコース残基を含んでもよい。
【００１７】
このことは、これらの糖タンパク質が本質的にはキシロースおよびフコース残基を欠いている、植物細胞培養物由来のガラクトシレーションされた糖タンパク質とは対照的である（Palacpacら、1999）。植物の細胞培養物においては、このことは未成熟のＮ結合型多糖に対するβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの作用の結果であり、非天然のガラクトシレーションされた「ハイブリッド型」のＮ結合型多糖を生じる結果となり、これらにおいてはゴルジ体マンノシダーゼIIおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIは、もはやそれらの機能を果たすことはできない。したがって、好ましい態様においては、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、植物においては、当該酵素がゴルジ体において天然の基質に対して作用する方式で発現される（図５）。このことは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、ゴルジ体マンノシダーゼII、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIの作用の後であることを意味する（さらに植物においては、これらの酵素が別の方法では阻害されないと仮定すれば、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼの作用の後または最中である）。本発明は、そのガラクトシレーションが哺乳類において起きているように、本質的に天然である植物を提供する。
【００１８】
グリコシルトランスフェラーゼのＮ−末端の細胞質、膜貫通、および幹状領域は、ＥＲおよびゴルジ膜における当該酵素の局在性を決定する。天然または所望のグリコシレーションを供給するべく、グリコシルトランスフェラーゼはそれらが哺乳類において生じるように植物において発現されることが可能であるが、異なるグリコシルトランスフェラーゼの２つの、または２つの部分の間の融合タンパク質として発現されることも可能である。この場合には、局在性は１つの酵素により、また触媒活性は第２の酵素により決定される。実例として、植物のキシロシルトランスフェラーゼの細胞質、膜貫通、および幹状領域と、哺乳類のガラクトシルトランスフェラーゼの触媒性ドメインとの間の融合は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性とキシロシルトランスフェラーゼの局在性とをもつ酵素を提供する。
【００１９】
もし、キシロースおよび／またはフコースを欠く延長されたＮ結合型多糖を含んでいる糖タンパク質をさらに分離すること、またはこれらをさらに精製された方法で産生することを要求するとすれば、いくつかの可能性が開かれている。一つには、（イムノ）アフィニティ精製またはサイズ排除クロマトグラフィーまたは電気泳動といった、必要とされる精製を成就させるためのいくつかのタイプの精製技術が存在する。さらに、もう一つの選択肢は、出発材料植物として、そのキシロースおよび／またはフコース付加の責任遺伝子がノックアウトされている植物を使用することである。
【００２０】
もう一つの態様においては、本発明は、ガラクトースを含んでいる前記Ｎ結合型多糖が、それに付加されたシアル酸をさらに含んでいる、本発明による植物を提供する。特に、多糖へのシアル酸の付加を触媒する酵素である、シアリルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子の、植物系への移入は、インヴィヴォでの使用の間に一層安定した糖タンパク質をもたらすため、可能な治療法のためにはより適している。本発明はこれとともに、シアル酸の生合成経路の植物への移入を提供する。本発明においては、植物と呼ぶ場合には、他に明記されない限り、藻類から高木にわたる植物の全範囲の意である。植物は一般に、抗体およびホルモンのようなある種の糖タンパク質の機能の増強に必要な糖鎖であるシアル酸を、そのＮ結合型多糖において欠如しており、またシアリレーションのための基質もいまだ見つかっていない。本発明は、そのタンパク質上にＮｅｕＡｃを含んでいるＮ結合型多糖を産生する能力をもつ植物を提供する。このことを確立するべく、５個までの異なる異種遺伝子が植物において発現される（表１）。シアル酸を産生する生合成能をもつ植物を提供するべく、シアル酸生合成経路において活性をもつ５個までの酵素をコードしている遺伝子が、植物に形質転換される。細菌および哺乳類起源に由来するこれらの酵素が知られている。すなわちＧｌｃＮＡｃ−２エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃシンターゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ輸送体、およびＮｅｕＡｃトランスフェラーゼ。当該酵素をコードしているすべての遺伝子は、所望であれば発現を追跡するための（ＦＬＡＧ）タグが与えられ、たとえばタバコおよびトウモロコシに形質転換される。
【００２１】
もう一つの好ましい態様においては、本発明は、ガラクトースを含んでいる前記Ｎ結合型多糖が、グルコロン酸（glucoronic acid）、グルコロニル（glucoronyl）、硫酸塩、スルホン、フコース、または前記ガラクトースに結合されることによりガラクトースを延長することができる他の化合物を、さらに含んでいるか、または延長している、本発明による植物を提供する。このことは、グリコシド側鎖上の末端シアル酸の欠損が、インヴィヴォにおける生物学的活性を劇的に低下させることを実験が示しているため、特に関連がある。最もありそうなことには、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体はアシアロ糖タンパク質と結合することが可能であり、それにより当該糖タンパク質の循環からの浄化を生じ、そのことが代謝半減期の減少およびインヴィヴォにおける低い生物活性に反映される。たとえばＧｌｃＡか、またはシアル酸以外の他の延長性の基は、シアル酸の存在と同じ効果をもっており、それはそのようにして修飾されたタンパク質の、たとえば肝臓細胞のアシアロ糖タンパク質受容体に対する結合を妨げ、それにより治療用物質、すなわち薬剤組成物として用いられた場合に、かかるタンパク質の半減期、およびしたがって浄化時間を効果的に増大させる。本発明はしたがって、少なくともガラクトースを含んでいる延長されたＮ結合型多糖を含んでおり、前記ガラクトースが、シアル酸と同様の方法で機能するべく、Ｇｌｃａなどを用いてガラクトースを延長することが可能な化合物によりさらに延長される、生物体由来の、本文においては特に植物由来の、糖タンパク質またはその機能性フラグメントを提供する。たとえば本発明は、そのタンパク質上にＮ結合型多糖を含んでいるＧｌｃＡを産生する能力をもつ植物を提供する。このことを確立するべく、たとえばグルクロニルトランスフェラーゼ（Terayamaら、PNAS 94 ; 6093 - 6098、1997）をコードしている遺伝子は、当該技術において周知であるかまたは本文に開示された方法を用いて、本発明による植物において発現される。
【００２２】
この観点において、本発明は植物に限定されず、本発明による糖タンパク質（本質的にはシアリレーションされていない）を産生する能力をもち、ガラクトースを含んでいる前記Ｎ結合型多糖が、たとえばガラクトースに結合されたグルクロン酸をさらに含むか、またはグルクロン酸により延長され、本質的にはシアル酸の存在と同様の効果をもつ、動物、菌類、または酵母といった他の生物体、または哺乳類の細胞系または昆虫の細胞系などの細胞系も提供する。本発明は、それが生物学的半減期および浄化時間を増大する点においてシアル酸の存在と本質的には同様の効果をもつ、グルクロン酸によるガラクトースの延長に限定されない。スルホトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、またはその他酵素を発現することにより、硫酸塩、フコース、または他のいかなる化合物もガラクトースに対して結合されることが可能であって、それにより炭水化物基は延長され、あるいは、硫酸塩、フコース、または他の化合物をガラクトース残基に転移する他の酵素が、半減期を増大するべく用いられることが可能である。したがって本発明は、活性成分として糖タンパク質を含んでなる薬剤組成物の半減期を増大させるか、または浄化時間を改良するための方法であって、ガラクトースに結合された化合物を、前記糖タンパク質に供給することを含んでおり、それによりシアル酸機能を置換または供給し、したがってアシアロ糖タンパク質受容体との、少なくとも減じられた反応性を提供し、好ましくは前記受容体が肝臓細胞上に少なくとも存在するようにする。
【００２３】
また、１つより多い化合物がガラクトースに転移されることが可能であり、たとえばグルクロン酸は、硫酸塩をグルクロン酸に転移するスルホトランスフェラーゼを発現することにより、硫酸塩によって延長される。本発明はこのような場合に限定されず、シアル酸以外の他の化合物によるガラクトースの延長が、シアル酸を用いた延長と同様の効果をもつ。シアル酸以外の他の化合物によるガラクトースの延長は、たとえば他の化合物、細胞、または生物体との相互作用において、独自に機能をもつことが可能である。
【００２４】
さらに、シアル酸により延長される以外の当該化合物も利益をもつが、次のグルクロン酸、またはフコース基の硫酸塩を当該物質に用いた例では、容易に認識されることが可能であり、したがってシアル酸により延長される類似の内在性化合物から区別される。たとえば、糖タンパク質ホルモン、またはエリスロポエチン（ＥＰＯ）などの、グリコシレーションされたタンパク質を含んでなる薬剤組成物は、正常にはシアル酸が供給されるが、次にたとえばスルホン、またはグルクロン酸を用いたものは、容易に認識されることが可能であり、外来成分の検出を容易にする。
【００２５】
一つの実例として、図６は、特異抗体（マウスモノクローナル抗体４１２）のＧｌｃＡβ１、Ｇａｌ構造への結合にによって明らかに示されているように、ヒトのβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼと、ラットのβ１，３グルクロニルトランスフェラーゼとが、所望の構造ＧｌｃＡβ１、Ｇａｌをその糖タンパク質上に形成することを示している。
【００２６】
シアル酸以外の他の化合物を用いたガラクトースの延長もまた、植物における組換えタンパク質の産生のために利点をもつことが可能である。それは、ガラクトシダーゼおよび／または他のグリコシダーゼをＮ型多糖の分解から防御することにより、糖タンパク質または糖タンパク質の多糖を、より安定化することができる。そのようにすることにより、ガラクトシレーションを増大させることができる。それはまた、たとえば、特異抗体、レクチン、または他の化合物による、親和精製を容易にすることにより、精製の手法においても役立つ。もし所望であれば、それによりガラクトースが延長されたか、またはさらに含められた化合物は、組換え糖タンパク質の精製の後、たとえば特異的なグリコシダーゼ、ホスファターゼ、または他の適当な酵素により除去されることが可能である。
【００２７】
もう一つの好ましい態様においては、本発明は、ガラクトースを含んでいる前記Ｎ結合型多糖が、ガラクトースに直接結合されていない他の糖残基、たとえばコアのアルファ１，６結合したフコース、またはベータ１，４またはβ１，６結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をさらに含んでいる、本発明による植物を提供する。このことを確立するべく、たとえば、コアのアルファ１，６フコシルトランスフェラーゼまたは／およびＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼIII、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼIV、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＶ、および／またはＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼVIをコードしている遺伝子または複数の遺伝子が、当該技術において周知の、または本文において開示された方法を用いて、本発明による植物において発現される。
【００２８】
全般的に、本文においては、図１に示されたものと同様の、すなわち、これに制限されないが、β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼおよびグルクロニルトランスフェラーゼといったＮ結合型グリコシレーションに関与する典型的な哺乳類タンパク質を欠いている、典型的な植物様のグリコシレーションパターンをもつ植物種における、異種糖タンパク質の産生用に、Ｎ結合型グリコシレーションを仕立てるための方法が提供されている。
【００２９】
商業上興味のある仕立てられた糖タンパク質を産生する形質転換された植物を安定して生成することは、Ｎ型グリコシレーション修飾酵素をコードしているヌクレオチド配列と、商業上興味のある異種糖タンパク質をコードしている遺伝子との双方を含んでいる（バイナリー）ベクターを含んでいるアグロバクテリウム属の菌種を、植物の細胞または組織に接種することにより、確立されることが可能である。別法として、商業上興味のある仕立てられた糖タンパク質を産生する安定に形質転換された植物は、各々が、Ｎ型グリコシレーション修飾酵素をコードしているヌクレオチド配列か、または商業上の興味の糖タンパク質をコードしているヌクレオチド配列のどちらかを含んでいるベクターを運んでいる２つまたはそれより多いアグロバクテリウム属の菌種を、同時に接種することにより（同時形質転換）生成されることが可能である。別法として、商業上興味のある仕立てられた糖タンパク質を産生する安定に形質転換された植物は、修飾されたＮ型グリコシレーションをもつ植物の、商業上興味のあるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を発現する植物との（多数の）交配により発生されることが可能である。これらのすべての手法において、ベクターはまた、選択薬剤に対する耐性を与えるヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００３０】
Ｎ型グリコシレーションに関与するタンパク質と、商業上の興味の糖タンパク質またはポリペプチドとの充分な発現を得るため、当該ヌクレオチド配列は、当業者には周知の、宿主植物の特別な転写および翻訳機構に適応されてよい。たとえば、コドンの利用を改善するべく、コード領域におけるサイレント突然変異が導入されてよく、また関連する植物組織における前記遺伝子の発現を駆動するべく、特異的なプロモーターが使用されてよい。発生により調節されるか、または随意に導入されることが可能なプロモーターは、適切な時期に、たとえば植物組織が圃場から収穫された後に、調節された条件下に持ちこまれた時だけに使用されてもよい。これらのすべての場合に、グリコシレーション修飾タンパク質と、商業上の興味の糖タンパク質との発現カセットの選択は、それらが同一の細胞において、前記糖タンパク質に対する所望の翻訳後修飾を可能にするべく発現するようにされるべきである。
【００３１】
詳細な記述の中で本発明は前述のとおりタバコ植物、または少なくともタバコ属に関係する植物を提供するが、しかしながら、シロイヌナズナまたはトウモロコシ、あるいはそれらに関連する植物などの、比較的容易に形質転換可能な他の植物についての、本発明への使用もまた特に提供される。組換え糖タンパク質の産生用には、アオウキクサの使用が特別な利益をもたらす。
【００３２】
当該植物は一般に小型であり、栄養出芽により無性的に繁殖する。それにもかかわらず、ほとんどのアオウキクサの種は根、茎、花、種子、および葉を含め、すべて、より大きな、植物の組織および器官を有する。アオウキクサは安価に、また単純な液体溶液の表面上の浮遊植物として非常に速く生育可能であり、またそれらはそこから容易に収穫されることが可能である。それらはまた、栄養豊富な廃液上でも生育可能であり、価値ある産物を産生するとともに、同時に再利用のため廃液を浄化する。製薬上の適用に特に関係することには、アオウキクサは封じ込められ、管理された状況下において、室内で育成可能である。安定に形質転換されたアオウキクサは、たとえば、Ｎ型グリコシレーション修飾酵素をコードしいている１つまたはそれより多い興味のヌクレオチド配列、および／または、商業上興味のある異種の糖タンパク質をコードしている遺伝子を含む各々の（バイナリー）ベクターを含んでいるアグロバクテリウム属の菌種を用いた（同時）接種の後の、組織または細胞から再生されることが可能である。アオウキクサ植物は、たとえばスピロデラ（Spirodella）属、ミジンコウキクサ（Wolffia）属、ウォルフィエラ（Wolffiella）属、またはアオウキクサ（Lemna）属、コウキクサ（Lemna minor）、レムナ・ミニスクラ（Lemna miniscula）、イボウキクサ（Lemna gibba）を含む。
【００３３】
トマトの果実における発現もまた、特別の利益を提供する。トマトは封じ込められ、管理された状況下において、温室内で容易に生育されることが可能であり、トマトの果実のバイオマスは、一年中連続して莫大な量が収穫可能である。興味の糖タンパク質を含んでいる水気の多い分画は、トマトの果実の残りの部分から容易に分離されることが可能であり、そのことが糖タンパク質のより容易な分離を可能にする。トウモロコシの穀粒、ジャガイモの塊茎、ナタネまたはヒマワリの種子を含むが、これに限定されない他の作物の貯蔵器官における発現もまた、それについての収穫および加工の技術が適切である生物体においては、莫大な量のバイオマスを提供する魅力的な選択肢である。
【００３４】
このように、本発明は、ガラクトースを用いてＮ結合型多糖を延長する付加的な所望の能力を持つ組換えタンパク質を発現することが可能な、トランスジェニックタバコ、シロイヌナズナ、またはトウモロコシ、ジャガイモ、トマト、またはアオウキクサといったトランスジェニック植物を供給するための方法であって、前記トランスジェニック植物を、少なくとも１つの機能性の哺乳類タンパク質、たとえば輸送体または正常には植物に存在しないＮ型多糖生合成を供給する酵素を含んでいる本発明の植物と交配すること、前記交差からの子孫を収穫することならびに前記組換えタンパク質を発現している所望の子孫植物を選択すること、および、正常には植物に存在しない哺乳類様Ｎ型多糖生合成に関与する機能性の（哺乳類の）酵素を発現すること、を含む方法を提供する。好ましい態様においては、本発明は、少なくともガラクトースを含んでいる延長されたＮ型多糖を含んでいる前記組換えタンパク質を発現している所望の子孫植物を選択する方法をさらに含んでいる、本発明による方法を提供する。詳細な説明の中で、タバコ植物を用いてそれらを交配している、本発明による方法についてのさらなる記述が、実施例として示されている。
【００３５】
本発明により提供される前記方法を用いて、本発明はまた、前記組換えタンパク質を発現しており、かつ正常には植物に存在しない、哺乳類様Ｎ型多糖生合成に関与する機能性の（哺乳類の）酵素を発現している植物も提供する。かかる植物が提供されているからには、本発明はまた、所望の糖タンパク質またはその機能性のフラグメントを産生するためのトランスジェニック植物の利用法も提供しており、特に前記糖タンパク質またはその機能性のフラグメントが少なくともガラクトースを含んでいる伸長されたＮ型多糖を含んでいることを特徴とする。
【００３６】
本発明はさらに、たとえば少なくともガラクトーを含んでいる延長されたＮ結合型多糖を含んでいる、所望の糖タンパク質またはその機能性のフラグメントを取得する方法であって、本発明による植物を、前記植物が収穫可能な段階、たとえば、有益な収穫を可能にするべく充分なバイオマスが生育したときに達するまで栽培すること、続いて、当該技術において周知の確立された技術を用いて当該植物を収穫すること、および分画された植物材料を取得するべく、当該技術において周知の確立された技術を用いて、前記植物を分画すること、さらに少なくとも部分的には前記糖タンパク質を前記分画された植物材料から単離すること、を含む方法を提供する。詳細な説明においては（たとえば図４参照）、少なくともガラクトースを含んでいる延長されたＮ結合型多糖が供給されている抗体が提供されることがさらに説明されている。
【００３７】
したがって本発明は、少なくともガラクトースを含んでいる延長されたＮ結合型多糖を含んでおり、たとえば、前文において説明された方法により取得される、植物由来の糖タンパク質またはその機能性のフラグメントを提供する。少なくともガラクトースを含んでおり、延長された多糖ををもつ植物由来のかかる糖タンパク質は、本質的には、植物において発現されることが可能ないかなる所望の糖タンパク質であってもよい。たとえば、抗体、ＦＳＨ、ＴＳＨ、および他のホルモン糖タンパク質、ＥＰＯなどの他のホルモン、アンチトリプシンまたはリパーゼのような酵素、ＮＣＡＭまたはコラーゲンのような細胞接着分子は、植物において産生されることが可能であり、本質的には哺乳類のグリコシレーションパターンが供給されている。かかるタンパク質の発現は、当該技術において周知の方法を用いることにより実行されることが可能である。たとえば、アグロバクテリウムに仲介される形質転換、エレクトロポレーション、または粒子照射による安定した発現により、しかしまたＰＶＸのようなウイルスベクターまたは他の方法を用いた一過性の発現によっても、グリコシルトランスフェラーゼまたは他のタンパク質は多糖生合成を延長しており、および／または前記糖タンパク質は、ある種の組織または器官における発現を促進するべく、特異的なプロモーターの支配下に発現されることが可能であった。
【００３８】
このように、本発明はまた、本発明によるかかる植物由来の糖タンパク質またはその機能性のフラグメントの、たとえば抗体、ホルモン、ワクチン抗原、酵素、またはその他を用いた患者の治療のための、薬剤組成物の製造のための利用法も提供する。糖タンパク質またはその機能性のフラグメントを含んでなる、かかる薬剤組成物は、現在も供給されている。本発明は詳細な説明において、それに制限されることなくさらに説明される。
【００３９】
詳細な説明
哺乳類のＮ型多糖の生合成に関与しており、植物には存在しない１つの重要な酵素は、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。ここでは、一例として、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのタバコ植物における安定した発現について記述される。このような植物の生理機能は、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを導入することによって明らかに変化することはなく、特性は遺伝性である。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現しているタバコ植物を、マウス抗体の重および軽鎖を発現している植物と交配することにより、ハイブリドーマに産生された抗体と類似した量の末端ガラクトースを有する抗体を産生した。したがってここでは、外来性の酵素が首尾よく植物に導入されることが可能であることが示される。
【００４０】
ガラクトースを含んでいる糖タンパク質には、明らかな増加が観察される。さらに、この特徴は遺伝性であり、ガラクトシルトランスフェラーゼ植物と野性型との間には、何ら可視的な表現型の差異はない。これらの植物において産生されたマウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生された抗体に匹敵する末端ガラクトースの度合を有する。このことは、内在性のタンパク質だけではなく、組換えにより発現された哺乳類タンパク質もガラクトシレーションされることを示している。
【００４１】
材料および方法
プラスミドおよび植物の形質転換
ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを含んでいる植物形質転換ベクターは、以下のように構築された。すなわちｐｃＤＮＡＩ−ＧａｌＴの１．４ｋｂのＢａｍＨI／ＸｂａIフラグメント（Aokiら、1992；YamaguchiおよびFukuda、1995）はｐＵＣ１９の対応する部位に結合された。続いて、このフラグメントは周辺のＫｐｎＩおよびＨｉｎｃII部位を用いて再び単離され、ｐＲＡＰ３３のＫｐｎＩおよびＳｍａＩ部位へクローン化された（ｐＲＡＰ３３−ＨｇａｌＴと命名された）。ＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を用いて、ｐＲＡＰ３３−ＨｇａｌＴのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−ｃＤＮＡ−Ｎｏｓターミネーターカセットが、バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（van Engelenら、1995）にクローン化された。公開されているプロトコールに対する変更は、アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍ．）とのインキュベーションの後、リーフディスクは１ｍｇ／ｍｌのＮＡＡおよび０．２ｍｇ／ｍｌのＢＡＰと、カルスおよびシュート誘導性培地における細菌の増殖を阻害するための０．２５ｍｇ／ｍｌのセフォタキシムおよびバンコマイシンの使用を含んでいる培地中で、３日間インキュベートされた。２５の発根したシュートがインヴィトロから土壌へ変えられ、これらの植物の葉の物質が分析された。
【００４２】
ノーザンブロッティング
トランスジェニック植物におけるβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのＲＮＡレベルは、ノーザンブロッティング（Sambrookら、1989）により分析され、トランスジェニックおよび対照植物の葉からＲＮＡが、記述されたように単離された（De Vriesら、1991）。サンプルあたり１０μｇの全ＲＮＡが使用された。ブロットは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ−ＨｇａｌＴから単離された、全ＧａｌＴｃＤＮＡを含んでいる、［32Ｐ］ｄＡＴＰ標識されたＳｓｔＩ／ＸｈｏＩフラグメントを用いてプローブされた。
【００４３】
糖タンパク質分析
タバコの全タンパク質抽出物は、液体窒素中での葉の粉砕により調製された。粉砕された材料は、１０倍のＳＤＳｐａｇｅ負荷緩衝液（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌｐＨ６．８、６％グリセロール、０．４％ＳＤＳ、２０ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｉｇ／ｍｌのブロモフェノールブルー）中に希釈された。１００℃にて５分間のインキュベーションの後、不溶性物質はペレット化された。上清（１２．５μｌ／サンプル）が１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流され、ニトロセルロースにブロットされた。ブロットは、ＴＢＳ中の０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０中にて一晩ブロックされ、 ＴＢＳ−０．１％ツイーン−２０中の、ペルオキシダーゼを結合したＲＣＡ120（トウゴマアグルチニン、シグマ）（１μｇ／ｍｌ）とともに２時間インキュベートされた。ブロットはＴＢＳ−０．１％ツイーン−２０中で１０分間、４回洗浄され、ルミライト・ウェスタンブロッテシングサブストレート（Lumi-Light western blotting substrate）（ロシュ）とともにインキュベートされ、ルミナリスト（luminalyst）（ロシュ）中で分析された。西洋ワサビペルオキシダーゼに対して作製されたウサギのポリクローナル抗体（ＨＲＰ、ロックランド・イムノケミカルズ）は、（Fayeら、1993）による蜂毒ホスホリパーゼを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、複合植物多糖のキシロースおよびフコースに対する反応性において分離された。ウサギ抗ルイスＡ抗体は、記述されたように調製された（Fitchette Laineら、1997）。ブロットは、ＴＢＳ中の２％粉乳を用いてブロックされ、抗ＨＲＰ、抗キシロース、抗フコース、または抗ルイスＡを用いた同様の緩衝液中にてインキュベートされた。第２の抗体としてアルカリ性ＨＲＰを結合したヒツジ抗マウスが用いられ、前文に記述されたように検出された。
【００４４】
植物交配
Ｍｇｒ４８（Smantら、1997）は、タバコ植物において発現されたマウスモノクローナルＩｇＧである。形質転換に用いられた構築物は、タバコにおいて発現されたモノクローナル抗体２１Ｃ５と同等であった（van Engelenら、1994）。 β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを高発現する選択されたタバコ植物の花は、Ｍｇｒ４８抗体を発現している植物を用いて受粉された。Ｆ１世代は播種され、植物は、葉の抗体発現については、ＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスでプローブされたウェスタンブロットにより、またガラクトシルトランスフェラーゼ発現については、前文に記述されたようにＲＣＡによりスクリーンされた。
【００４５】
タバコからのＩｇＧ１の精製
収穫したばかりのタバコの葉は、液体窒素中で粉砕された。５０gの粉末化された植物材料に対し、１０ｍＭ  Ｎａ2Ｓ2Ｏ5、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、および５gのポリビニルポリピロリドを含んでいる２５０ｍｌのＰＢＳが添加された。１時間浸した後（４℃にて回転しつつ）、遠心分離（１５分、１５，０００ｇ、４℃）により不溶性物質が除去された。上清は１ｍｌのプロテインＧ−アガロースビーズとともに一晩インキュベートされた（４℃にて回転しつつ）。ビーズはカラム内で集められ、１０体積のＰＢＳにより洗浄された。結合されたタンパク質は、０．１ＭグリシンｐＨ２．７を用いて溶出され、１ＭトリスｐＨ９．０（溶出物ｍｌあたり５０μｌ）と混合することにより、直ちに中性にされた。
【００４６】
精製された抗体は、ウェスタンブロット上の重鎖に対するＨＲＰ結合されたヒツジ抗マウスの結合の、ハイブリドーマの培地（Smantら、1997）から精製された既知の濃度のＭｇｒ４８を用いた比較により定量化された。
【００４７】
ハイブリドーマＭｇｒ４８と、植物に産生されたＭｇｒ４８は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に流され、前文に記述されたようにブロットされた。ＲＣＡを用いた検出は、前文に記述されたとおりであった。抗体検出のため、ブロットはＨＲＰ結合されたヒツジ抗マウスを用いてプローブされ、ルミライトウェスタンブロッティングサブストレートを用いて前文に記述されたように検出された。
【００４８】
結果
ヒトβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼはタバコにおける内在性タンパク質をガラクトシレーションする。
【００４９】
ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Masriら、1988）は、完全なコーディング配列を含むｃＤＮＡを含んでいるプラスミドｐＢＩＮＰＬＵＳ−ＨｇａｌＴの、アグロバクテリウム介在性のリーフディスク形質転換により、タバコ植物に導入された。カナマイシン耐性について選択された２５の植物が、ノーザンハイブリダイゼーションにより、ｍＲＮＡレベルについて分析された（図２Ａ）。同じ植物が、ガラクトース結合性レクチン、ＲＣＡ120（トウゴマレクチン）により分析された。ＲＣＡは、β１，４−ＧａｌＴの反応産物（Ｇａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ）と結合したが、他の末端β結合したガラクトース残基にも結合した。ＲＣＡは、トランスジェニックではない対照のタバコ植物から単離された１つまたはそれより多いさらに高分子のタンパク質と結合する（図２Ｂ）。おそらく、これらはアラビノガラクタンまたは類似のタンパク質である。ＲＣＡはアラビノガラクタンタンパク質と結合することが知られている（Schindlerら、1995）。ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて形質転換された多数の植物においては、さらに、タンパク質のスミアに対するＲＣＡの結合が観察される。このことは、これらの植物においては多くのタンパク質が末端のβ結合型のガラクトース残基を含むことを示している。ガラクトシルトランスフェラーゼＲＮＡの発現レベルと、トランスジェニック植物のＲＣＡ活性との間には、良好な相互関係がある。トランスジェニック植物において発現されたヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、それゆえタバコ植物における内在性の糖タンパク質をガラクトシレーションすることが可能である。
【００５０】
ガラクトシレーションされたＮ型多糖は、植物のキシロシル−およびフコシルトランスフェラーゼに対する不十分な受容体であることが周知であるため（JohnsonおよびChrispeels、1987）、キシロースおよびフコースエピトープの発生に対するβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現の影響が、特異抗体により調査された。キシロースおよびフコースの双方のエピトープと反応するポリクローナルウサギ抗ＨＲＰ抗体は、対照およびトランスジェニック植物の双方から単離されたタンパク質に対する結合に、明らかな差異を示す（図３）。
【００５１】
組換えにより産生された抗体は効果的にガラクトシレーションされる。
組換えにより発現されたタンパク質に対するβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現の効果が調べられた。マウスモノクローナル抗体を発現しているタバコ植物と交配するべく、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現している３つのタバコ植物（図２から  ｎｏ．ＧａｌＴ６、ＧａｌＴ８、およびＧａｌＴ１５）が選ばれた。モノクローナル抗体、ｍｇｒ４８を発現しているこの植物は（Smantら、1997）、発明者らの実験室においてあらかじめ発生された。当該３つの植物の花は、ｍｇｒ４８を用いて受粉された。Ｆ１世代のうち、各々の交配について１２の子孫植物が、抗体およびβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの双方の発現について、材料および方法に記述された方法により分析された。ＧａｌＴ６ｘｍｇｒ４８およびＧａｌＴ１５ｘｍｇｒ４８の交配では、ｍｇｒ４８およびＧａｌＴの双方の発現のある植物は何も見つからなかった。いくつかは、ＧａlＴ８ｘｍｇｒ４８の交配において見つけられた。このような植物のうちの２つ（ｎｏ．１１および１２）が、さらなる分析用に選ばれた。
【００５２】
プロテインＧアフィニティを用いて、ｍｒｇ４８を発現しているタバコ植物からと、ｍｇｒ４８とβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの双方を発現している当該２つの選ばれた植物から抗体が単離された。同量の単離された抗体もタンパク質ゲル上に流され、さらにブロットされた。ハイブリッド細胞、タバコ、および交配ＧａlＴ８ｘｍｇｒ４８−１１および１２からのｍｇｒ４８に対する、ヒツジ抗マウスＩｇＧおよびＲＣＡの結合が比較された（図４）。ヒツジ抗マウスＩｇＧは、単離された４つの抗体すべての重および軽鎖の双方に結合した。ＲＣＡは、対照的に、ハイブリドーマおよびＧａｌＴ植物の産生した抗体に結合したが、ｍｇｒ４８のみを発現している植物において産生された抗体には結合しなかった。抗体の重および軽鎖に対する、ヒツジ抗マウスＩｇＧおよびＲＣＡの結合が定量化される場合、ＧａlＴ８ｘｍｇｒ４８−１１および１２に対するＲＣＡの相対的な反応は（ＲＣＡ結合／ヒツジ抗マウスＩｇＧ結合）、各々ハイブリドーマに産生された抗体の比よりも１．２７および１．６３倍高い。このことは、ＧａｌＴ植物において産生された抗体の多糖に対するＲＣＡの結合が、ハイブリドーマの産生した抗体に対するよりも一層高いことを示している。ハイブリドーマからのｍｇｒ４８のガラクトシレーションは定量されていないが、このことは、これらの植物において産生された抗体のガラクトシレーションが非常に有効であることの強力な徴候である。
【００５３】
α２，６シアリルトランスフェラーゼ、β１，３−グルクロニルトランスフェラーゼ、およびβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードしているｃＤＮＡを用いた植物発現ベクターの構築。
【００５４】
入手可能なβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼベクターは、α２，６−シアリルトランスフェラーゼおよびβ１，３−グルクロニルトランスフェラーゼクローンと、容易に結合するための適切なフォーマットにはなかった。それゆえ、ＰＣＲを用いることにより、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡ、α２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡ、およびβ１，３−グルクロニルトランスフェラーゼｃＤＮＡのコーディング領域が、植物の発現ベクターにクローン化された。構築物は、１つの形質転換だけの後のトランスジェニック植物における当該酵素の同時発現を可能にするべく、ガラクトシルトランスフェラーゼが、１つのベクター内でシアリルトランスフェラーゼ、またはグルクロニルトランスフェラーゼのいずれかと結合するように作られている。ガラクトシルトランスフェラーゼ発現は、３５Ｓプロモーターにより制御されており、一方シアリルトランスフェラーゼおよびグルクロニルトランスフェラーゼの発現は、２´プロモーターにより制御されている。
【００５５】
治療および診断目的のための、利用しやすく、標準化されており、ＬＨ活性のないことが保証されている、ＦＳＨの供給源が必要である。
ＦＳＨ製剤は、普通はヒツジまたはブタの脳下垂体に由来しており、それはＬＨの（痕跡の）存在と、プリオン様タンパク質による汚染の危険性を常に暗示している。脳由来のＦＳＨの、植物に産生された組換えＦＳＨへの置換は、このような問題を排除する良い方法であるかもしれない。しかしながら、生物活性のある動物糖タンパク質の植物における産生は、治療用の目的には特に、植物に特異な糖の側鎖の、哺乳類型の多糖への修飾を必要とする。本発明は、ｂＦＳＨまたはｂＦＳＨＲのための遺伝子を含んでいる組換えタバコモザイクウイルス、ＴＭＶを用いて、哺乳類型の多糖を形成することが可能な、安定に形質転換されたタバコ植物を感染することによる、組換えｂＦＳＨを提供する。
【００５６】
ｐＫＳ（＋）ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターへの単鎖（ｓｃ）ｂＦＳＨの構築、ｓｃ−ｂＴＦＳＨ−ＴＭＶおよびｓｃ−ｂＦＳＨ−ＨＩＳ−ＴＭＶの構築
ｂＦＳＨ−αおよびｂＦＳＨ−βサブユニットの２つの別々の遺伝子の、植物における同時発現の必要性を回避するため、発明者らはｂＦＳＨ融合遺伝子の構築を決定した。
【００５７】
重複ＰＣＲにより、発明者らはベータサブユニットのカルボキシル末端を、アルファサブユニットのアミノ末端へ（リンカーなしに）融合した。さらに６xＨＩＳタグをアルファサブユニットのＣ末端につけている第２のｓｃ−ｂＦＳＨバージョンを構築したが、このことは発明者らに、植物からの当該組換えタンパク質を精製することを可能にするであろう。
【００５８】
ｓｃ−ｂＦＳＨおよびｓｃ−ｂＦＳＨ−ＨＩＳの双方は、クローニングベクターｐＫＳ（＋）ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔへサブクローン化された。クローンの正しさは、配列分析により確認された。
【００５９】
ｓｃ−ｂＦＳＨはＴＭＶベクターへサブクローン化された。インヴィトロの転写物を作成し、Ｎ．ベンタハミアナ（Bentahamiana）植物に接種するべく、２つのポジティプなクローンが選ばれた。数日後、植物は典型的なウイルス感染の症候を示し、そのことは当該組換えＴＭＶクローンの感染能力を暗示した。全体的に感染された葉においてｓｃ−ｂＦＳＨＲＮＡが安定して発現されるかどうかを検査するため、感染されたＮ．ベンタハミアナの葉から、接種後８日のＲＮＡが単離され、ｂＦＳＨ特異プライマーを用いて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応が行なわれた。すべての場合において、本発明者らは、期待された大きさのＰＣＲフラグメントを取得しており、本発明者らのｓｃ−ｂＦＳＨ−ＴＭＶ構築物の安定性が示唆される。感染された植物の抽出物は、 ｓｃ−ｂＦＳＨが発現されかつ正しく折りたたまれているかどうかを測定するべく、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡに使用された。
【００６０】
使用された略語
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
Ｆｕｃ：フコース
Ｇａｌ：ガラクトース
ＧａｌＴ：α１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
ＲＣＡ：トウゴマアグルチニン
【００６１】
【表１】
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【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  哺乳類および植物の複合Ｎ結合型多糖間の主要な差異。描かれているのは典型的なＮ結合型多糖である。哺乳類および植物には、延長されるかまたは切断された双方の変形体が生じる。
【図２】  ＲＮＡレベルと、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの産物との比較。上部パネル：２５のトランスジェニック植物から単離された全ＲＮＡのノーザンブロットであり、形質転換されていない対照植物（０）を含んでおり、ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼプローブを用いて検出された。下部パネル：糖タンパク質の末端ガラクトース残基を検出するべく、ＲＣＡを用いてプローブされた同じ植物のウェスタンブロット。Ｍ．は分子量マーカーを示す。
【図３】  野性型およびβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ植物（図２からのｎｏ．８）から単離されたタンパク質に対する、レクチンおよび抗体の結合を示しているウェスタンブロット。Ａ：図２と同様のＲＣＡ、Ｂ：抗ＨＲＰ（キシロースおよびフコースの双方を検出する）抗体、Ｃ：抗キシロース抗体、Ｄ：抗フコース抗体。）
【図４】  ハイブリドーマ培養物（Ｈｙｂ）、タバコ植物（ｐｌａｎｔ）およびβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを同時発現しているタバコ植物（ＧａｌＴ11およびＧａｌＴ１２）において産生された精製された抗体に対する、ＲＣＡおよびヒツジ抗マウスＩｇＧの結合を示しているウェスタンブロット。Ｈ．Ｃ．：重鎖、Ｌ．Ｃ．軽鎖。
【図５】  ガラクトシルトランスフェラーゼを発現しているタバコ細胞培養物が非天然のハイブリッドＮ型多糖を産生するのに対し、ガラクトシルトランスフェラーゼを発現しているタバコ植物は、天然の哺乳類様ガラクトシレーションを有する。天然のガラクトシレーションを取得するためには、ガラクトシルトランスフェラーゼはマンノシダーゼIIおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼIIの後に作用しなければならない。
【図６】  ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびラットβ１，３グルクロニルトランスフェラーゼを発現している８つの植物、および野性型の対照植物（−）から単離されたタンパク質に対する、グルクロン酸−ガラクトース（ ＧｌｃＡβ１，３Ｇａｌ ）構造に対して指令された抗体（４１２）の結合により、ＧｌｃＡβ１，３Ｇａｌ構造の発現を示しているウェスタンブロット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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