(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロゲン酸やカフェー酸等の水溶性のフェノールカルボン酸と、カテキン類または同カテキン類の寡量体とを含むリンゴの果実又はその搾汁液から抽出した粗抽出物、もしくは粗抽出物を精製して得られた総ポリフェノール類を原料とし、所望とするそれぞれのポリフェノール群毎の分離精製のため、スチレン系の吸着樹脂を含むカラムを通すに際して、カラムに通すに先立ち原料液のｐＨを５〜６に調整し、しかる後、このようにｐＨを調整した複数のポリフェノールを含有する原料をスチレン系樹脂より構成される吸着樹脂を通過させ、ポリフェノール類を上記吸着樹脂に吸着させた後、カラムに水を通して、クロロゲン酸やカフェー酸等の水溶性のフェノールカルボン酸を溶出させて分離回収し、次いでカラムに吸着されたままで残存している複数のポリフェノールを所定の溶出液により溶出して、カテキン類または同カテキン類の寡量体を主体とする又はカルコン類およびその配糖体、またはフラボノイドおよびその配糖体を主体とする、それぞれ所望とするポリフェノール群を得ることを特徴とするポリフェノール類の分離、精製方法。
【請求項２】
該所望のポリフェノール群がカテキン類または同カテキン類の寡量体を主体とするものである請求項１記載のポリフェノールの分離、精製方法。
【請求項３】
該所望のポリフェノール群がカルコン類およびその配糖体、またはフラボノイドおよびその配糖体を主体とするものである請求項１記載のポリフェノールの分離、精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、その生理活性から食品、動物用飼料等の添加物や化粧品、医薬品等の原材料として有用なポリフェノールをその生理活性や物理化学的諸性質に応じて分離、精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の研究の蓄積により、ポリフェノールの様々な生理機能が解明されてきた。ここで、ポリフェノールとは、フェノール性水酸基を複数有する成分群の総称であり、さらにフラボノイド類、フェノールカルボン酸類、カテキン類、タンニン類など多岐にわたる成分群に分類される。しかしながら現在産業上利用されているポリフェノールは、原料植物から直接抽出した粗抽出物、もしくはある特定のポリフェノール類を分離、精製したものである。
ところで、最近の研究では、ポリフェノール中の各成分毎の生理機能性が徐々に明らかにされつつあり、産業上利用するに際しても、特定の成分群のみを利用することによる利点も見いだされてきた。特に広範な分子量分布を有するポリフェノールは、生体内での吸収や代謝に関して、成分の分子量の重要性も明らかになってきている。
ポリフェノール類は抗菌、抗ウイルス、抗酸化、活性酸素消去、コレステロール低減、消臭、腸内フローラ改善、抗う蝕、抗動脈硬化、抗がん、抗アレルギー、メラニン生成抑制等など非常に広範な生理作用を有することが明らかとされ、食品、食品素材、食品添加物、飼料添加物、化粧品素材、医薬品等の製造原料としてその生理活性に応じてポリフェノールを効率良く経済的に製造する方法の開発が強く望まれているのが現状である。
ところが、純粋または非常に高純度な単一成分としての天然物由来ポリフェノールは一部の低分子成分のみが、しかも試薬用として市販されているだけであり、例えば非常に有用であることが判明したプロシアニジンの２量体以上のものについては試薬さえも市販されていない。これらを分離、精製するためには、ほとんどの場合逆相系のクロマト法を用いなければならずコストが高くなり産業上の利用は困難である。
ポリスチレンもしくはスチレンジビニルベンゼン系の吸着樹脂を利用したプロアントシアニジンの製造法（特開昭６３−１６２６８５号）やポリフェノールの製造法（特願平６−３００５７８号）が開示されているが、これらの技術は、一連のプロアントシアニジン類あるいはポリフェノール類を分離せずにひとまとめにして取り出す技術である。
また、上記プロアントシアニジンの製造法はポリスチレン系の吸着樹脂に対し、様々なエタノール濃度によるプロアントシアニジンの精製を試みているが、総プロアントシアニジンの回収率を保持しつつ、高純度で精製する方法に関するものであり、プロアントシアニジンをその重合度に応じて分離する方法や各プロシアニジン成分の含有量、さらにはその他のポリフェノール成分の分離精製方法に関しては全く言及されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
例えば、バラ科植物、特にリンゴ由来のポリフェノールでは、フェノールカルボン酸類（クロロゲン酸、カフェ−酸、ｐ−クマル酸とそのエステル体等）、カテキン酸（（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン）、カテキンの寡量体であるプロアントシアニジン類（プロシアニジンＢ1、プロシアニジンＢ2、プロシアニジンＣ1等）、高分子型プロアントシアニジン（７量体以上）、カルコン類（フロリジン、フロレチンキシログルコシド等）などと、多成分が含有されている。しかし、現在産業上利用されているのは、これら多成分群を包括的含有しているポリフェノールであり、個々のポリフェノール化合物の生理活性についての研究が進歩するに共に、より特定のポリフェノールのみからなるポリフェノールの提供が産業界から要望されているのが現状である。例えば、縮合型タンニンが抗アレルギー活性を示すことがBiosci. Biotechnol. Biochem., 62(6),1284-1289,1998に報告されているが、その際の縮合型タンニンの分離精製にはＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーが採用されて居り、工業的観点からみれば、充分な採算性を有している分離精製法とは言えない。
また、日本薬学会第１１７ 年会講演要旨集２ P132(1997)講演番号26［A5］16-2にはプロシアニジン２量体類が育毛活性を示すことが報告されているが、現在までにプロシアニジン２量体類を豊富に含有するポリフェノール類を工業的規模で分離、精製する方法については報告されていない。
本発明は、特定の生理活性を有するポリフェノール群を高純度に含むポリフェノール化合物を提供する方法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
ポリフェノール類には、詳細な分析ができない成分も多数含まれているが、本発明者らは特に、プロアントシアニジン類の分子量別分画および高分子型分子量の解析等を行い、Rapid Comm. Mass Spectrom.,11,31-36(1997)、日本農芸化学会誌、72,306(1998)等にその結果を報告している。
本発明者らは、これらの知見をもとにしてこのように植物から直接抽出したポリフェノール含有粗抽出物、もしくはより精製度を高めたポリフェノール類を選択的に精製したものから、成分群を特定したポリフェノール、または特定の成分群を高純度で含有するポリフェノールを、より効率良く、しかも経済的、工業的に製造するための製造法を検討した。
その結果、クロロゲン酸やカフェー酸等の水溶性のフェノールカルボン酸と、カテキン類または同カテキン類の寡量体とを含むリンゴの果実又はその搾汁液（果実のジュースを含む）から抽出した粗抽出物、もしくは粗抽出物を精製して得られた上記のポリフェノール類を含む総ポリフェノール類を原料とし、スチレン系の吸着樹脂を含むカラムにかけ、所望のポリフェノール類を吸着させ、吸着させたポリフェノール類をその成分の特性に応じた所定の溶出液を用いて溶出させるに際して、先ずカラムに水を通して、クロロゲン酸やカフェー酸等の水溶性のフェーノルカルボン酸を分離回収し、次いで所定の溶出液を使用することにより、フェノールカルボン酸、プロアントシアニジン等の縮合型タンニン類を含むフラバン−３−オールの１〜３量体、４〜１５量体、カルコン・フラボノイド類などの所望とするポリフェノール成分毎にそれぞれ効率良く分離、精製できることを見いだし本発明を完成するに至ったものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明において使用する複数のポリフェノール成分を含有する原料としては、リンゴ、ナシ、モモなどのバラ科植物の果実（未成熟果実をも含む）又はその搾汁液、植物体（組織培養により得られるカルスをも含む）の有機溶媒抽出物が使用できる。また、特開平７−２８５８７６号公報に開示されている果実ポリフェノールも原料として好適に使用できる。
本発明において、所定の生理活性を有するポリフェノール化合物として分離、精製可能なポリフェノール群としては、フェノールカルボン酸類やそのエステルより構成されたフェノール酸類、及び／又はポリフェノールと有機酸のエステルからなるポリフェノール群、カテキン類およびカテキン類の寡量体（ｎ≦６）（別称：プロアントシアニジン）からなるポルフェノール群、カルコン類やその配糖体、及び／又はフラボノイドやその配糖体からなるポルフェノール群が含まれる。
【０００６】
吸着樹脂として用いられるスチレン系樹脂としては、例えばダイヤイオンＨＰ２０、ＨＰ２０ＳＳ、ＨＰ２１、ＳＰ２０６、セパビーズＳＰ７０、ＳＰ２０７、ＣＨＰ３Ｃ、ＣＨＰ５Ｃ、ＣＨＰ２０Ｐ（以上、何れも三菱化成工業社製）、アンバーライトＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−２０００（何れもオルガノ社製）等が好適な例として挙げられる。
吸着樹脂に吸着させるに際しては、原料のポリフェノール含有溶液を適当な溶液、好ましくは脱イオン水で希釈することが好ましい。希釈の目処としては、カラムに通す液中に含まれる総ポリフェノールの濃度が３０％ないし０．１％、好ましくは１０％〜１％となるようにすればよい。
尚、所望とするポリフェノールをより多く効率的に分離、精製するには該所望とするポリフェノールの物理化学的特性を考慮してより適切な吸着樹脂を選定し使用すればよい。
なお、カラムに通す前に液のｐＨを４〜９、好ましくは５〜６に調整する。
カラムを通すときのポリフェノールを含む原料溶液の液温は１０〜３５℃、好ましくは室温（２２℃±２）とすることがポリフェノール群の分離、精製操作中の変性を防止する上で好ましい。
【０００７】
ポリフェノール類の溶出液としては水、アルカリ、酸、アルコール類、エステル類、ケトン類またはそれらの混合液が用いられ、溶出するポリフェノール類の特性に応じて最適な溶出液を調製することが好ましい。
最適な溶出液を調製するに際しては、溶出させるポリフェノール成分の特性に応じて、例えば順次溶出液の溶解性や極性を変更して、その溶出液の極性に対応させた形で所望とするポリフェノール群を溶出させればよい。溶出させる極性の目処としては所望とするポリフェノール群を溶出することができる極性よりも若干高く、所望とするポリフェノール群以外のポリフェノール群を溶出させることはできない極性を選定するようにすればよい。
例えば、最初にＵＶ吸収能が高いフェノール酸から実質的に構成され、構成成分である各フェノール酸の合計純度が９５％以上、より好ましくは９８％以上からなるフェノール酸よりなるポリフェノール群を分離、精製するためには、原料溶液のｐＨを５〜７に調整したのちカラムに負荷し、さらに脱イオン水（ｐＨ５〜７）を使用して所望とするフェノール酸より構成されるポリフェノール群をカラムより溶出させればよい。
また、カテキン類の１〜１５量体を主として含むポリフェノール群を分離、溶出させるためには、脱イオン水で充分に洗浄した後、例えばエタノールを２０％ｖ／ｖ以下を含む水溶液を使用してカラムより溶出させればよい。カルコン＋フラボノイド類から構成されるポリフェノール群を得ようとするには、脱イオン水で充分に洗浄後、３０％ｖ／ｖ以下のエタノールを含む水溶液で充分に洗浄後、高濃度のエタノール水溶液、例えば６５％ｖ／ｖエタノール水溶液で溶出させて得ればよい。
【０００８】
このように、所望とするポリフェノール群を分離、精製するためには、溶出液の極性を所望とするポリフェノールを高純度に含むポリフェノール群の物理化学的性質にあわせて変えて溶出することができる。
なお、ここに所望とするポリフェノール群とは少なくとも共通の生理活性を示しうる２種類以上のポリフェノールを高純度、換言すれば所望とするポリフェノール群を構成する各ポリフェノールの合計純度が７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上含むものをいう。このようなポリフェノール群の例としてはフェノール酸、カテキン類のオリゴマー（寡量体）よりなるポリフェノール群、カルコンとフラボノイドなどからなるポリフェノール群が挙げられる。
所望とするポリフェノール群を溶出させる溶出液の特性としては、極性以外に、ｐＨ、溶媒のポリフェノール群の溶解度などが挙げられる。溶出に際しては、これらの特性を単独及び／又は組み合わせて溶出液の特性を所望とするポリフェノール群の特性に対応した形で、順次変更して使用すればよい。
【０００９】
溶出時の溶出液の液温は上記カラムを通すために調製する溶液と同一の温度であればよく、ことさら高温まで加熱する必要はない。
なお、所望とするポリフェノール群を含む各分画の溶出の際に使用する溶出液の液量はカラムの容量の１〜６倍、好ましくは１〜３倍の量使用することが好ましい。
【００１０】
【実施例】
以下実施例により、本発明をさらに具体的に示すが、この一例に限定されるものではない。
〔分析方法〕
分析は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。ただし、各成分の試薬が市販されていないものが多いため、各成分間で吸光係数が異なり実際の定量値には正確に対応しないが、純度は紫外部２８０ｎｍの吸光度を指標としたＨＰＬＣ純度で表した。
各成分の定性は、入手可能な成分に関してはそれを標準物質とし、入手できない成分に関しては、フォト・ダイオード・アレー検出器による紫外部吸収特性を解析し、成分群を特定した。さらに、プロアントシアニジン類に関しては、Rapid Comm. Mass Spectrom., 11,31-36(1997)、および日本農芸化学会誌、72,306(1998)に記載の手法により分画・分析した。
〔実施例〕
特開平７−２８５８７６号に記載されている方法により調製したリンゴからのポリフェノール抽出物を原料として使用し、以下の方法により各ポリフェノール群を分離、精製した。
試料のポリフェノール溶液（濃度２２％ｗ／ｗ：２５０ｍｌ）を脱イオン水で５倍に希釈し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを６．０に調整し、スチレン系合成吸着樹脂を充填したカラム（吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０：三菱化学社製；カラム：φ５０×５００ｍｍ）に室温で通液した。先ず、脱イオン水を３カラム容量通液し、以上のカラム通過液（以下ＦＴと称する）を画分１とした。
次に、１０％ｖ／ｖエタノール水溶液を室温で３カラム容量通液し、そのＦＴを画分２とした。
次に、１５％ｖ／ｖエタノール水溶液を室温で３カラム容量通液し、そのＦＴを画分３とした。
次に、２０％ｖ／ｖエタノール水溶液を室温で３カラム容量通液し、そのＦＴを画分４とした。
次に、２５％ｖ／ｖエタノール水溶液を室温で３カラム容量通液し、そのＦＴを画分５とした。
次に、３０％ｖ／ｖエタノール水溶液を室温で３カラム容量通液し、そのＦＴを画分６とした。
次に、６５％ｖ／ｖエタノール水溶液を室温で３カラム容量通液し、そのＦＴを画分７とした。
ポリフェノール群の特性に応じて溶出液の極性、ｐＨを順次変更した溶出液を使用して分画した画分１〜画分７をＨＰＬＣにより各成分および成分群の純度を分析し、表１に示した。
【００１１】
【表１】
0004856298.tif 000002
【００１２】
さらに、各画分を成分群にまとめたものが表２である。
【００１３】
【表２】
0004856298.tif 000003
【００１４】
表２に示したように、画分１からはフェノール酸を高純度に含有するポリフェノール抽出液が得られた。
同様に、画分２からは１〜３量体を約４７％、または１〜６量体を約９１％含有するポリフェノール抽出液が得られた。
同様に、画分３からは１〜３量体を約７５％、または１〜６量体を約１００％含有するポリフェノール抽出液が得られた。
同様に、画分４からは３〜１５量体を約１００％含有するポリフェノール抽出液が得られた。
同様に、画分５からは４〜１５量体を約５０％、またはカルコンおよびフラボノイド類を約３６％含有するポリフェノール抽出液が得られた。
同様に、画分６からはカルコンおよびフラボノイド類を約５６％含有するポリフェノール抽出液が得られた。
同様に、画分７からはカルコンおよびフラボノイド類を約８８％含有するポリフェノール抽出液が得られた。
【００１５】
使用例（紫外線吸収剤としての作用）
上記実施例で得られた画分１であるフェノール酸を構成成分とするポリフェノール群を２０ｍｇ秤り取り、これを１ｌの蒸留水に溶解して調製した被験液を用いて、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２０００）を用いて波長２００〜４００ｍｍの光を照射しながらスキャンニングして紫外線吸収量を測定した。その結果を図１に示す。図１の結果から紫外線吸収剤として画分１のフェノール酸よりなるポリフェノール群は有用であると判断された。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、食品、食品素材、食品添加物、飼料添加物、化粧品素材、医薬品等の製造原料として、また、抗菌、抗ウィルス、抗酸化、活性酸素消去、コレステロール低減、抗がん、抗アレルギー、メラニン生成抑制などの非常に広範な生理作用を有する有用なポリフェノール類から、使用目的に応じた成分群を、安全に効率良く経済的かつ簡便な方法で、収率よく得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に係わる分離、精製法により得られたフェノール酸より構成されるポリフェノール群の紫外線の吸収率を示すチャートである。
【図１】
0004856298.tif 000004