(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−エレオステアリン酸含有グリセリドを濃縮した苦瓜種子油を含有する抗腫瘍組成物の製造方法であって、
苦瓜種子油を、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) が産生するリパーゼにより、反応温度１０〜５５℃及び反応時間０．１〜７２時間の反応条件で、（反応後の油層の酸価／反応前の油脂のケン化価）×１００で示される加水分解率５〜５０％まで加水分解処理を行なった後、遊離脂肪酸を除くことを特徴とする上記抗腫瘍組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗腫瘍組成物並びに該抗腫瘍組成物を含有する医薬品及び食品に関する。詳しくは、苦瓜種子油又はリパーゼによる加水分解処理を行ないα−エレオステアリン酸含有グリセリドを濃縮した苦瓜種子油を含有する、種々の異なるタイプの癌の治療に有用な抗腫瘍組成物並びに該抗腫瘍用組成物を含有する医薬品及び食品に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
近年、癌による死亡率は増加し続けており、癌の治療及び症状の軽減に適した治療方法を開発するために多くの研究が行われている。化学療法の分野では、抗生物質（アドリアマイシン、カルチノフィリン等）、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモン剤等が癌細胞に有効な抗腫瘍剤として見出されている。しかしながら、これらの多くの抗腫瘍剤は、癌細胞を攻撃するだけでなく、正常細胞にも作用するので、癌治療を必要とする患者に投与した場合、嘔吐、悪心、食欲不振、脱毛等の副作用を引き起こす問題等があった。
【０００３】
一方、油脂成分は種々の生理作用を有しているが、幾つかの脂肪酸については、癌細胞に対して抑制効果を示すことが見出されている。特に、ｎ−６、ｎ−３系列の不飽和脂肪酸のもつ活性が注目されている（鹿山光編、「ＡＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡ−高度不飽和脂肪酸」、１５０〜１７０頁、１９９５年恒星社厚生閣発行）。脂肪酸は、日常摂取する油脂を構成する成分であることから、より安全な癌の治療薬としての利用が提案されている。また脂肪酸は、癌治療の目的で使用するだけではなく、癌の予防食としての効果も期待できる。最近、リノール酸をアルカリ共役化した共役リノール酸が、癌細胞の増殖抑制効果を持つことが報告されている（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏ．１５、１２４１〜１２４６頁、１９９５年）。その効果については、共役リノール酸が抗酸化活性を有するという説やエイコサノイド代謝への影響等が考えられているが詳細は不明である。その他、パリナリン酸（１８：４，９−シス、１１―トランス、１３−トランス、１５−シス−オクタデカテトラエン酸）やα−エレオステアリン酸（１８：３，９−シス、１１−トランス、１３−トランス）にも抗腫瘍活性があることが見出されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏ．５１、６０２５〜６０３０頁、１９９１年）。またそれ以上に炭素数及び二重結合数の多い共役脂肪酸に関しても抗腫瘍性が報告されている（第３８回油化学討論会講演要旨集：ｐ１６４、ｐ１６７、日本農芸化学会２０００年度大会講演要旨集：ｐ７０、ｐ２６３、日米油化学世界会議（ＪＡＷＣ）２０００  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：ｐ１１８、ｐ２６０、ｐ２６１、特開２０００―２８１５７２号公報、特開２０００―２９０１７８号公報等）。
【０００４】
しかし、これらの知見によれば、多くの共役脂肪酸は、非共役脂肪酸を共役化処理して得ている。共役化処理として水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物、ヨウ素、ヨウ化カリウム、二酸化硫黄やチオール類等の硫黄化化合物等を触媒とし、又は無触媒下で紫外線を照射しながら、窒素ガス等の不活性ガス雰囲気中で１５０〜２５０℃にて５分〜１時間、共役化反応を行って調製している。しかし、これらの反応は大量の触媒や有毒の触媒を使用するほか、極めて高温の反応であるため、副生成物が生じるため収率が悪くなり、また、これらの副生成物による副作用が懸念される。さらに、これらの副生成物を除去するのに、困難を生じている。
【０００５】
一方、天然由来の共役脂肪酸を利用した抗腫瘍性の評価も知られている。特に、優れた抗腫瘍性が報告されているα−エレオステアリン酸はきり油に多く含まれていることが知られている。しかし、きり油は強い毒性と臭いから食用とはされていないのが現状であり、利用には毒性を除くための精製方法や脱臭が必要であるが、安価で簡便な手段は見出されていない。
【０００６】
一方、苦瓜の種子にもα−エレオステアリン酸が含まれていることが知られている。苦瓜は熱帯アジア原産の一年生つる性草本で、中国南部から東南アジア、沖縄、台湾では重要な野菜である。ビタミンＣやミネラルの含有量が極めて多く、健康食品としての利用価値が高い。果実は短楕円形から長円筒形で先が尖っており、普通、食する場合は未熟果の種子部を取り除いており、種子は未利用となっている。
【０００７】
これまでに、苦瓜種子油における栄養学的特性として、ラットの血清脂質、組織脂質に与える影響が知られているほか（Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．、Ｎｏ．４２、ｐ２９０−２９６、１９９８）、ラット血液における酸化の影響が知られている（Ｌｉｐｉｄｓ、Ｖｏｌ．３４、Ｎｏ．２、ｐ１０９−１１４、１９９９）。しかし、苦瓜種子油における抗腫瘍活性については明らかとはなっていなかった。
【０００８】
従って、本発明の目的は、安全性が高く副作用の少ない、実用に供し得る抗腫瘍組成物並びに該抗腫瘍組成物を含有する医薬品及び食品を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、苦瓜種子について種々検討する過程で、苦瓜種子油に抗腫瘍活性が存在し、特に種々の異なるタイプの癌の治療に有用であることを見出し、さらにリパーゼによる加水分解処理を行うことで、容易に、優れた抗腫瘍活性を有する抗腫瘍組成物が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、α−エレオステアリン酸含有グリセリドを濃縮した苦瓜種子油を含有する抗腫瘍組成物の製造方法であって、苦瓜種子油を、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) が産生するリパーゼにより、反応温度１０〜５５℃及び反応時間０．１〜７２時間の反応条件で、（反応後の油層の酸価／反応前の油脂のケン化価）×１００で示される加水分解率５〜５０％まで加水分解処理を行なった後、遊離脂肪酸を除くことを特徴とする上記抗腫瘍組成物の製造方法を提供するものである。
【００１２】
さらに、本発明は、上記抗腫瘍組成物を含有することを特徴とする医薬品及び食品を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる、苦瓜種子油とは、苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  Ｃｈａｒａｎｔｉａ  Ｌ．）の種子から採取される油である。
【００１４】
苦瓜種子油は、以下の方法により得られたものを使用するのが好ましいが、これに限定されない。すなわち、苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ＣｈａｒａｎｔｉａＬ．）の種子を、好ましくは殻を取り除いてから（脱穀工程）、粉砕する（粉砕工程）。さらに、乾燥工程で水分量を低下させる。乾燥方法は凍結乾燥、温風乾燥等があるが、これらに限定されない。乾燥、脱穀及び粉砕の順序はこの限りでない。また、加熱処理（クッキング）を搾油前の前処理として行ってもよい。採油は、上記工程後、圧搾式又は溶剤抽出法で行なうことが好ましい。溶剤抽出法で用いられる溶剤は、ノルマルヘキサン、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、ジクロロエタン、クロロホルム、メタノール等が挙げられ、これらの溶剤を２種以上混合して用いてもよい。好ましくはノルマルヘキサンを用いるのがよい。
【００１５】
得られた油分は、さらに精製工程を経てもよい。精製工程としては、脱ガム、脱酸、水洗、脱色、脱臭、カラムクロマト等があるが、これらに限定されない。
また、これらの工程を２種以上組み合わせて行ってもよい。
【００１６】
このようにして得られた苦瓜種子油分には、トリグリセライドが５０〜９９重量％含まれており、その構成脂肪酸中に占めるα−エレオステアリン酸の割合は２０〜６０重量％である。
【００１７】
上記苦瓜種子油は、トリグリセリドのままでもよく、その他のエステル、遊離脂肪酸もしくは金属塩の形態にしてもよく、本発明では、いずれの形態も苦瓜種子油として扱う。
【００１８】
上記苦瓜種子油のエステルとしては、上記苦瓜種子油と、炭素数１〜１０のアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンからなる群から選ばれた１種又は２種以上のアルコール類とのエステル等が挙げられる。
【００１９】
また、上記苦瓜種子油の金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩及びマグネシウム塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上の金属塩等が挙げられる。
【００２０】
さらに、上記苦瓜種子油は、上記のエステルもしくは金属塩の形態の他、アミドやリン脂質等の任意の他の薬理学上許容される形態であってもよい。
【００２１】
また、上記苦瓜種子油はリパーゼによる選択的な加水分解処理を行うことで、α−エレオステアリン酸含有グリセリドを濃縮せしめ、さらに優れた抗腫瘍活性を示す。すなわち、上記苦瓜種子油において、加水分解率５〜５０％、好ましくは１０〜４０％の範囲まで加水分解する。該加水分解率が５％未満ではα−エレオステアリン酸含有グリセリドの充分な高濃度化が行われず、５０％を超えるとα−エレオステアリン酸含有グリセリドの回収率が好ましくない。
【００２２】
本発明で、加水分解に使用するリパーゼとしては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌が生産するものやその他の細菌由来のものが挙げられる。かかるリパーゼについては、市販のものを用いることができ、例を挙げると、バクテリア由来のリパーゼとしては、シュードモナス属に属する微生物、好ましくはシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）が産生するリパーゼ（天野製薬（株）製、ＬｉｐａｓｅＰＳ）が挙げられる。但し、本発明に使用するリパーゼは、上記シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来のものに限らない。例えば、一次構造に相同性のあるリパーゼは同じような作用特性を示すので、シュードモナス属だけでなく、アルカリゲネス属、アクロモバクター属、クロモバクテリウム属、スタフィロコッカス属等に属するバクテリア由来のリパーゼもこの加水分解反応には有効である。
【００２３】
上記加水分解反応については、反応系中の苦瓜種子油の量として１〜９０重量％で行なうのが好ましく、より好ましくは１０〜８０重量％であり、水の量は１０〜９９重量％で行なうのが好ましく、より好ましくは２０〜９０重量％である。苦瓜種子油／水（重量比）としては０．０１〜９．０で行なうのが好ましく、より好ましくは０．１１〜４．０である。
【００２４】
加水分解に使用されるリパーゼの使用形態は特に限定されず、セライトやイオン交換樹脂、セラミック担体等に固定化されたリパーゼを用いてもよいが、リパーゼをそのまま用いるのが好ましい。リパーゼの添加量は反応液１ｇに対して２〜５０００ユニットが好ましく、更には５〜１０００ユニットである。ここでの１ユニットとは、オリーブ油を基質として、１分間に１μモルの脂肪酸が生成するのに必要なリパーゼ量を示す。
【００２５】
本発明では加水分解率を５〜５０％、好ましくは１０〜４０％の範囲にコントロールすることが必要で、リパーゼの添加量、反応温度、反応時間、撹拌速度、反応系中の苦瓜種子油と水の重量比等の反応条件を調製することで上記範囲に加水分解率をコントロールできる。具体的には、苦瓜種子油、水、加水分解用リパーゼの存在下（添加順序は特に限定されない）で、反応条件として、反応温度を１０〜５５℃、好ましくは２０〜４０℃、反応時間を０．１〜７２時間、好ましくは０．５〜１０時間、撹拌速度を０〜８００ｒｐｍに調整するとよい。反応は大気下で行っても良いが、不活性ガス、例えば窒素ガス等の雰囲気下で行うとより好ましい。
【００２６】
尚、本発明でいう加水分解率とは、油脂中の脂肪酸グリセリドが加水分解により脂肪酸として遊離するときの割合（％）であり、
加水分解率＝（反応後の油層の酸価／反応前の油脂のケン化価）×１００
で示される。
【００２７】
加水分解反応後、リパーゼを含む水層を除去し、油脂分を得るが、ここに濃縮されたα−エレオステアリン酸含有グリセリドを主成分とするグリセリドと、反応によって生成したα−エレオステアリン酸以外の遊離脂肪酸を主成分とする遊離脂肪酸が含まれる。従って、アルカリ脱酸法、分子蒸留法、カラムクロマト法等の公知の方法によって遊離脂肪酸を除くことが必要である。このようにして、リパーゼ処理されたα−エレオステアリン酸含有グリセリド濃縮苦瓜種子油が得られる。
【００２８】
上記α−エレオステアリン酸含有グリセリド濃縮苦瓜種子油は、グリセリドの形態のままでもよく、その他のエステル、遊離脂肪酸もしくは金属塩の形態に変換してもよい。
【００２９】
上記濃縮苦瓜種子油のエステルとしては、上記濃縮苦瓜種子油と、炭素数１〜１０のアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリンからなる群から選ばれた１種又は２種以上のアルコール類とのエステル等が挙げられる。
【００３０】
また、上記濃縮苦瓜種子油の金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩及びマグネシウム塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上の金属塩等が挙げられる。
【００３１】
さらに、上記リパーゼ処理した濃縮苦瓜種子油は、上記のエステルもしくは金属塩の形態の他、アミドやリン脂質等の任意の他の薬理学上許容される形態であってもよい。本発明では、いずれの形態もリパーゼによる加水分解処理を行なった濃縮苦瓜種子油として扱う。
【００３２】
上記苦瓜種子油及び濃縮苦瓜種子油の抗腫瘍剤としての作用機序は、該種子油中に含有されるα−エレオステアリン酸又はその誘導体に由来するものと推測されるが、その詳細は不明である。しかしながら、上記苦瓜種子油及び濃縮苦瓜種子油を有効成分とする本発明の抗腫瘍組成物は、後述の実施例に示すように組織に関係なく種々の腫瘍に対して有効な抗腫瘍細胞作用を示す。従って、本発明の抗腫瘍組成物を様々な態様で腫瘍患者に投与することにより極めて有効な抗腫瘍効果を示すと期待される。
【００３３】
上記苦瓜種子油、苦瓜種子油由来脂肪酸グリセリド、濃縮苦瓜種子油、それらの遊離脂肪酸、脂肪酸のエステルもしくは金属塩又はその他の形態物を有効成分とする本発明の抗腫瘍組成物を医薬として使用する場合の形態は、制限されるものではなく、投与方法や適用される腫瘍の種類、形状及び存在部位等に応じて、注射液、座薬、軟膏、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤等の種々の形態を適宜選択することができる。さらに、上記形態に応じて、薬理上許される希釈剤、安定剤、賦形剤等を含有させることができる。
【００３４】
本発明の抗腫瘍組成物における上記苦瓜種子油、苦瓜種子油由来脂肪酸グリセリド、濃縮苦瓜種子油、それらの遊離脂肪酸、脂肪酸のエステルもしくは金属塩又はその他の形態物の含有量は、後述する投与量（治療上有効量）を目安にし、１日の服用回数や用量を考慮して決定すればよい。本発明の抗腫瘍組成物の投与方法としては、静脈内注射、皮下注射、座薬、軟膏等による非経口投与方法、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等による経口投与法が可能である。
【００３５】
また、本発明の抗腫瘍組成物は、食用油脂組成物、食用乳化油脂組成物、ベーカリー製品、調理食品、飲料等の各種飲食品に混合してもよい。このような飲食品としては、具体的にはマーガリン、ショートニング、クリーム、アイスクリーム、バター、チーズ、スープ、パン、ケーキ、ビスケット、クラッカー、クッキー、ジャム等が挙げられ、必要に応じて、デキストリン、乳糖、澱粉等の賦型剤や香料、色素等と共にペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等としても利用できるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の抗腫瘍組成物の投与量は、治療上有効量であり、腫瘍の種類等により一概に言えないが、おおよそ、例えば成人（体重６０ｋｇ）の場合、１日当たり上記苦瓜種子油及び濃縮苦瓜種子油の量として１０〜５０００ｍｇ、好ましくは２０〜３０００ｍｇである。本発明の抗腫瘍剤組成物は、適宜、公知の抗腫瘍剤を含む他の治療薬と併用することもできる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。尚、以下の実施例１及び２のうち、実施例２が本発明の実施例であり、実施例１は参考例である。
【００３８】
〔実施例１〕
苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  Ｃｈａｒａｎｔｉａ  Ｌ．）の種子から殻を取り除き、真空凍結乾燥機（東京理科機械（株）製、ＦＤ−１）で４８時間乾燥した後、粉砕器（共立理工（株）製、ＳＫ−Ｍ２）で粉砕した。得られた粉砕物からノルマルヘキサンを用いて抽出を行い粗抽出物（苦瓜種子油）を得た。
【００３９】
次に、上記のようにして得られた苦瓜種子油を被験物として用い、得られた抽出物に水酸化ナトリウムを溶解したエタノールを加え加水分解を行って遊離の脂肪酸を得て、以下のようにして腫瘍細胞に対する細胞毒性試験を行った。
【００４０】
＜腫瘍細胞に対する細胞毒性試験方法＞
被験物質をエタノールに溶解し、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭ１−１６４０培地により適宜希釈して９６穴プラスチック培養プレートの各穴に０．１ｍｌずつ添加した（各穴のエタノール濃度は０．１％以下となるように調整した）。ここに上記培地で５×１０４個／ｍｌに調整したヒト結腸癌細胞（ＨＴ−２９）を０．１ｍｌずつ分注した後、炭酸ガスインキュベーター内で３７℃、４８時間培養した。培養後、培養プレート１穴あたり、２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホ−フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（５０ｍｇ／ｍｌ）及びフェナジンメトスルフェート（１．５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ１μｌずつ加え、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。苦瓜種子油（被験物質）を含まない培地で培養したヒト結腸癌細胞についても同様に吸光度を測定し、次式に従ってヒト結腸癌細胞の増殖阻止率を算出した。
【００４１】
増殖阻止率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
Ａ：被験物質を添加した培地で培養した細胞の吸光度
Ｂ：被験物質無添加の培地で培養した細胞の吸光度
【００４２】
その結果を下記表１に示す。これにより本発明品が、ヒト結腸癌細胞に対して、優れた増殖阻止効果があることが分かる。
【００４３】
〔実施例２〕
苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  Ｃｈａｒａｎｔｉａ  Ｌ．）の種子から殻を取り除き、真空凍結乾燥機（東京理科機械（株）製、ＦＤ−１）で４８時間乾燥した後、粉砕器（共立理工（株）製、ＳＫ−Ｍ２）で粉砕した。得られた粉砕物からノルマルヘキサンを用いて抽出を行い粗抽出物を得た。
【００４４】
得られた粗抽出物にシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）が産生するリパーゼ（天野製薬（株）製、ＬｉｐａｓｅＰＳ）を油１ｇに対して２００ユニットになるように溶解した蒸留水を加えて、撹拌しながら４０℃で１時間加水分解反応を行った後、リパーゼを含む水層を除去し、７％含水フロリジル（和光純薬（株）製、Ｆｌｏｒｉｓｉｌ）を充填したカラムに適用し、エーテル／メタノール（９８：２）で溶出してグリセリド画分を得た。α−エレオステアリン酸含量が５０．６重量％であった苦瓜種子油はリパーゼによる加水分解処理によって、７８．５重量％に濃縮された。
【００４５】
次に、上記のようにして得られた濃縮苦瓜種子油に水酸化ナトリウムを溶解したエタノールを加え加水分解を行って遊離の苦瓜脂肪酸を得て、実施例１と同様にしてヒト結腸癌細胞（ＨＴ−２９）を用いた細胞毒性試験を行い、細胞の増殖阻止率を求めた。
【００４６】
その結果を下記表１に示す。これにより本発明品が、ヒト結腸癌細胞に対して、優れた増殖阻止効果があることがわかる。
【００４７】
【表１】
0005099946.tif 000002
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、安全性が高く副作用の少ない、実用に供し得る抗腫瘍組成物並びに該抗腫瘍組成物を含有する医薬品及び食品を提供することができる。