(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースにｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．３０以上の化合物を固定化することにより、血液を接触させたときの顆粒球活性化作用が元のセルロースよりも低減することを特徴とするセルロースの改質方法。
【請求項２】
顆粒球活性化作用が血液と接触させたときの顆粒球エラスターゼの濃度上昇差分により表され、該濃度上昇差分が元のセルロースの濃度上昇差分に対し９０％以上低減していることを特徴とする請求項１記載のセルロースの改質方法。
【請求項３】
顆粒球活性化作用が血液と接触させたときのミエロパーオキシダーゼの濃度上昇差分により表され、該濃度上昇差分が元のセルロースの濃度上昇差分に対し９０％以上低減していることを特徴とする請求項１記載のセルロースの改質方法。
【請求項４】
セルロースにｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．３０以上の化合物を固定化することを特徴とする、セルロースが有する顆粒球活性化作用の低減方法。
【請求項５】
ｌｏｇＰ値が２．３０以上の化合物を固定化したセルロースと血液とを接触させたときの顆粒球エラスターゼの濃度上昇差分を、元のセルロースの濃度上昇差分に対し９０％以上低減する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｌｏｇＰ値が２．３０以上の化合物を固定化したセルロースと血液とを接触させたときのミエロパーオキシダーゼの濃度上昇差分を、元のセルロースの濃度上昇差分に対し９０％以上低減する、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液浄化の分野において血液と接触する部位の材料として幅広く利用されているセルロースが有する顆粒球活性化作用を低減するためのセルロースの改質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液透析に代表される血液浄化の分野においては、その血液接触部位の素材としてセルロース系のものが、機械的強度、価格などの点において優れているため、古くから使用されている。しかしながら、このようなセルロース系素材を使用した血液浄化器、例えばセルロース系の素材よりなる血液透析膜は、いわゆる一過性白血球減少症などの副作用を引き起こし、これが患者に与える影響が問題視されてきた。
【０００３】
１９７７年、ピー・アール・クラドック（Ｐ．Ｒ．Ｃｒａｄｄｏｃｋ）らがセルロース系透析膜における一過性白血球減少症の原因が、補体系の活性化によるものであると報告して以来、活性化補体を指標としたセルロース系素材の改質が試みられ、ポリエチレングリコールをグラフト化する方法、ジエチルアミノエチル基を導入する方法により、セルロースの補体活性化作用を低減させることができると報告されている。
【０００４】
一方で近年、セルロースが有する顆粒球活性化作用が問題視されている。顆粒球は異物認識に伴い活性酸素を放出すると共に、アズール顆粒中に含まれる各種酵素を放出する。顆粒球エラスターゼおよびミエロパーオキシダーゼは、アズール顆粒に貯蔵されている中性プロテアーゼであり、一般に顆粒球活性化の指標としてこれらの濃度が測定されている。これまでの研究から、顆粒球エラスターゼおよびミエロパーオキシダーゼの濃度上昇は、補体活性化とは別の機序によるものであると推測されている（ジェイ・ベーラー（Ｊ．Ｂｏｅｈｌｅｒ）ら、ネフロロジー・ダイアリシス・トランスプランテーション（Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）第８巻、１３５９〜１３６５頁、１９９３年）。
【０００５】
顆粒球活性化の臨床的影響としては、産生された活性酸素により、ＬＤＬなどの脂質の酸化（酸化ＬＤＬ）を介して動脈硬化などの血管障害の原因となる可能性（樋口ら、人工臓器 ２６巻４号： ８３５〜８３９頁、１９９７年）や、赤血球膜脂質の過酸化による赤血球膜の脆弱化が貧血の一因となっている可能性（ エス・エス・シュミットマン（Ｓ．Ｓ．Ｓｃｈｍｉｄｔｍａｎｎ）ら、ネフロロジー・ダイアリシス・トランスプランテーション（Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）第５巻、６００〜６０３頁、１９９０年）が指摘されている。
【０００６】
従って、セルロースが有する顆粒球活性化作用を低減しうるセルロースの改質方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、セルロースが有する顆粒球活性化作用を低減しうるセルロースの改質方法、該方法により改質されたセルロース、および該改質セルロースが使用された血液浄化器を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、セルロースが有する顆粒球活性化作用を抑制しうるセルロースの改質方法につき鋭意検討した。その結果、セルロースにｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．３０以上の化合物を固定化することにより、血液を接触させたときの顆粒球活性化作用が元のセルロースよりも大幅に低減することを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、セルロースにｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．３０以上の化合物を固定化するセルロースの改質方法であって、該改質により血液を接触させたときの顆粒球活性化作用が元のセルロースよりも大幅に低減することを特徴とするセルロースの改質方法に関する。
【００１０】
また本発明は、該方法により改質された改質セルロースに関する。
【００１１】
また本発明は、該改質セルロースが血液接触部に使用された血液浄化器に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のセルロースの改質方法は、ｌｏｇＰ値が２．３０以上の化合物をセルロースに固定化してなる。ｌｏｇＰ値は化合物の疎水性のパラメーターとなり、代表的なオクタノール−水系での分配係数Ｐの求め方は次の通りである。まず、化合物をオクタノール（もしくは水）に溶解し、これに等量の水（もしくはオクタノール）を加え、グリッフィン・フラスク・シェイカー（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｆｌａｓｋ  ｓｈａｋｅｒ）（グリッフィン・アンド・ジョージ・リミテッド（Ｇｒｉｆｆｉｎ ＆Ｇｅｏｒｇｅ  Ｌｔｄ．）製）で３０分間振盪する。その後２,０００ｒｐｍで１〜２時間遠心分離し、オクタノール層および水層中の化合物濃度の測定を分光学的またはＧＬＣ等の種々の方法により測定する。それぞれの測定値を次式に代入することにより、ｌｏｇＰ値が求められる。
【００１３】
Ｐ＝Ｃｏｃｔ／Ｃｗ
Ｃｏｃｔ：オクタノール層中の化合物濃度
Ｃｗ        ：水層中の化合物濃度
【００１４】
これまでに多くの研究者らにより種々の化合物のｌｏｇＰ値が実測されているが、それらの実測値はシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らによって整理されている（「パーティション・コーエフィシエンツ・アンド・ゼア・ユーシズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ  ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ  ＡＮＤＴＨＥＩＲ  ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、７１巻、５２５頁、１９７１年」参照）。
【００１５】
また実測値の知られていない化合物についてはアール・エフ・レッカー（Ｒ．Ｆ．Ｒｅｋｋｅｒ）がその著書「ザ・ハイドロフォビック・フラグメンタル・コンスタント(ＴＨＥ  ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ  ＦＲＡＧＭＡＮＴＡＬ  ＣＯＮＳＴＡＮＴ」，エルセビア・サイエンティフィック・パブリッシング・カンパニー・アムステルダム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（１９７７）中に示している疎水性フラグメント定数ｆを用いて計算した値（Σｆ）が参考となる。疎水性フラグメント定数は数多くのｌｏｇＰ実測値をもとに、統計学的処理を行い決定された種々のフラグメントの疎水性を示す値であり、化合物を構成するおのおののフラグメントのｆ値の和はｌｏｇＰ値とほぼ一致すると報告されている。
【００１６】
セルロースの改質に有効な方法の探索にあたり、種々のｌｏｇＰ値を有する化合物を固定し検討した結果、ｌｏｇＰ値が２．３０以上、好ましくは２．７５以上、さらに好ましくは２．９０以上の化合物がセルロースの改質に有効であることがわかった。たとえばアルキル基の場合、酢酸セルロース、すなわちセルロースにＣＨ3ＣＯ−（アセチル基：ｌｏｇＰ＝１．７０）を導入したものと化学的に同一であるものは、セルロースに比べ改質効果が認められるが、ｎ−オクチルアミン（ｌｏｇＰ＝２．９０）を固定化したセルロースは、それを大幅に上回る改質効果が得られることがわかった。またｎ−オクチルアミンを、アルキル鎖長が長く、より疎水性が高いセチルアミン（Σｆ＝７．２２）に変えても、ほぼ同等以上のセルロース改質効果が得られた。
【００１７】
これらの結果より、本発明のセルロースの改質は、ｌｏｇＰ値２．３０以上の化合物の固定によりセルロースに導入された原子団が、セルロースと顆粒球の間の相互作用を減弱していると考えられる。ｌｏｇＰ値２．３０以上の化合物の固定化によりセルロースが大幅に改質される、すなわち血液を接触させたときの顆粒球活性化作用が元のセルロースよりも低減する機序の詳細は不明であるが、固定化されたｌｏｇＰ値２．３０以上の化合物は血液中の蛋白質、特に血液中に多量存在するアルブミンの一部を疎水性相互作用により吸着することでその表面が覆われるため、セルロースが有する顆粒球を活性化する作用を減弱せしめていることが推測される。
【００１８】
本発明において、セルロースに固定化される化合物としては、ｌｏｇＰ値が２．３０以上の化合物であれば特別な制限なしに用いることができる。ただし、セルロースに化合物を化学結合法によって結合する場合には化合物の一部が脱離することが多いが、この脱離基が化合物の疎水性に大きく寄与している場合、すなわち脱離により担体上に固定される原子団の疎水性がΣｆ＝２．３０より小さくなるような場合には本発明の主旨から考えて、本発明に用いる化合物としては不適当である。この代表例を一つあげると、安息香酸イソペンチルエステル（Σｆ＝４．１５）をエステル交換により水酸基を有する担体上に固定する場合があげられる。この場合実際に担体上に固定される原子団はＣ6Ｈ5ＣＯ−であり、この原子団のΣｆは１以下である。このような化合物が本発明で用いる化合物として適当かどうかは、脱離基の部分を水素に置き換えた化合物のｌｏｇＰ値が２．３０以上かどうかにより判断すれば良い。
【００１９】
ｌｏｇＰ値が２．３０以上の化合物の中でも不飽和炭化水素、アルコール、アミン、チオール、カルボン酸およびその誘導体、ハロゲン化物、アルデヒド、ヒドラジド、イソシアナート、グリシジルエーテルなどのオキシラン環含有化合物、ハロゲン化シラン等のように担体への結合に利用できる官能基を有する化合物が好ましい。この様な化合物の代表例としてはｎ−ヘプチルアミン、ｎ−オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、２−アミノオクテン、ナフチルアミン、フェニル−ｎ−プロピルアミン、ジフェニルメチルアミンなどのアミン類、ｎ−ヘプチルアルコール、ｎ−オクチルアルコール、ドデシルアルコール、ヘキサデシルアルコール、１−オクテン−３−オール、ナフトール、ジフェニルメタノール、４−フェニル−２−ブタノールなどのアルコール類ならびにこれらのアルコールのグリシジルエーテル類、ｎ−オクタン酸、ノナン酸、２−ノネン酸、デカン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ジフェニル酢酸、フェニルプロピオン酸などのカルボン酸類ならびにこれらの酸ハロゲン化物、エステル、アミドなどのカルボン酸誘導体、塩化オクチル、臭化オクチル、塩化デシル、塩化ドデシルなどのハロゲン化物、オクタンチオール、ドデカンチオールなどのチオール類、ｎ−オクチルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシランなどのハロゲン化シラン類、ｎ−オクチルアルデヒド、ｎ−カプリンアルデヒド、ドデシルアルデヒドなどのアルデヒド類などがあげられる。
【００２０】
これらの他にも、前記の例示化合物の炭化水素部分の水素原子がハロゲン、窒素、酸素、イオウなどのヘテロ原子を含有する置換基、他のアルキル基などで置換された化合物のうち、ｌｏｇＰ値が２．３０以上の化合物、前述のシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らの総説「パーティション・コーエフィシエンツ・アンド・ゼア・ユーシズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ  ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ  ＡＮＤ  ＴＨＥＩＲ  ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ)、７１巻、５２５頁、１９７１年」」中の５５５ページから６１３ページの表に示されているｌｏｇＰ値が２．３０以上の化合物などを用いることができるが、本発明においてはこれらのみに限定されるものではない。
【００２１】
なお、これらの化合物はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を組み合わせてもよく、さらにはｌｏｇＰ値が２．３０未満の化合物との組み合わせで用いてもよい。
【００２２】
本発明のセルロースの改質方法はｌｏｇＰ値が２．３０以上の化合物をセルロースに固定して得られるが、その固定化方法としては公知の種々の方法を特別な制限なしに用いることができる。しかしながら、本発明の改質セルロースが使用された血液浄化器の滅菌時あるいは治療時においては、固定化された化合物の脱離溶出を極力抑えることが安全上重要であり、そのためには共有結合法により固定化することが好ましい。
【００２３】
本発明における血液浄化器とは、血液透析器、吸着型血液浄化器、血漿分離器、人工肝臓、人工肺などのように、血液の浄化を目的に使用されるものをいう。
本発明における顆粒球エラスターゼは、好中球エラスターゼと呼ばれることもあり、両者は同一の物質を指すものである。
【００２４】
本発明における顆粒球活性化作用の評価は、以下に従い実施する。すなわち、ヘパリンで抗凝固したヒト新鮮血液４ｍｌに対し、表面積で約３０ｃｍ2に相当する割合で評価対象物質を加え、３７℃で１２０分可能な限り無菌、かつエンドトキシン汚染のない状態で緩やかにバッチ接触させた後、該血液から血漿を調製し、その血漿中の顆粒球エラスターゼ濃度および／あるいはミエロパーオキシダーゼ濃度を測定する。ネガティブコントロール（ＮＣ）としては、血液のみを同条件で振盪したものとし、ＮＣの場合との差分を濃度上昇差分とし、これを顆粒球活性化作用の指標とする。
【００２５】
また、改質の効果は、以下の式より求められる改質率により評価する。
【数１】
0004988975.tif 000002
【００２６】
【実施例】
以下に、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
粒径約４６０μｍ、蛋白質の排除限界分子量が約２０，０００のセルロース粒子（ＣＰ４６０）１７０ｍｌに水を加え全量を３４０ｍｌとした後、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０ｍｌを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン３１ｍｌを加え、４０℃で撹拌下２時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ化ＣＰ４６０を得た。
【００２８】
このエポキシ化ＣＰ４６０の６．６ｍｌにｎ−オクチルアミン（ｌｏｇＰ＝２．９０）１５０ｍｇを加え、５０(Ｖ／Ｖ)％エタノール水溶液中、５０℃で静置下、３０時間反応させた。反応終了後、５０（Ｖ／Ｖ）％エタノール水溶液、エタノール、５０（Ｖ／Ｖ）％エタノール水溶液、水の順に充分に洗浄し、ｎ−オクチルアミン固定化ＣＰ４６０を得た。
【００２９】
このｎ−オクチルアミン固定化ＣＰ４６０に滅菌処理を施した後、その０．４ｍｌをパイロジェンフリーのポリプロピレン製チューブに計り取り、血液１ｍｌあたり７国際単位のヘパリンを加え抗凝固した血液４ｍｌを加え、密栓後、３７℃で可能な限り無菌かつエンドトキシンが存在しない状態で緩やかに振盪した。１２０分後に血液と粒子を分離し、血液から血漿を採取した後、血漿中の顆粒球エラスターゼ、およびミエロパーオキシダーゼ濃度を、顆粒球エラスターゼ測定キット（メルク社）およびミエロパーオキシダーゼ測定キット（バイオキシテック社）によりそれぞれ測定した。結果を表１に示す。
【００３０】
（実施例２）
ｎ−オクチルアミンをセチルアミン（Σｆ＝７．２２）に変えたほかは実施例１と同様にしてセチルアミン固定化ＣＰ４６０をえた。このセチルアミン固定化ＣＰ４６０を用い、実施例１と同様にして血液との接触実験、ならびに各成分の測定を行った。結果を表１に示す。
【００３１】
（比較例１）
ＣＰ４６０に滅菌を施した後、その０．４ｍｌをパイロジェンフリーのポリプロピレン製チューブにはかりとり実施例１と同様にして血液との接触実験、ならびに各成分の測定を行った。結果を表１に示す。
【００３２】
（比較例２）
ＣＰ４６０を粒径約５００μｍの酢酸セルロース粒子（ＣＡＰ５００）に変えたほかは比較例１と同様にして血液との接触実験、ならびに各成分の測定を行った。結果を表１に示す。
【００３３】
（比較例３）
ＣＰ４６０の代わりに同体積の生理食塩液を加えたほかは比較例１と同様にして血液との接触実験、ならびに各成分の測定を行った。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0004988975.tif 000003
【００３５】
表１の結果から、セルロースそのもの（比較例１）では白血球、とりわけ顆粒球活性化の指標である顆粒球エラスターゼおよびミエロパーオキシダーゼの濃度が著しく上昇している。さらにはセルロースにアセチル基（ｌｏｇＰ＝１．７０）を導入したものと化学的に同一である酢酸セルロース（比較例２）では、これら指標の濃度はセルロースそのものよりも低くなっているものの充分ではない。一方ｌｏｇＰ値が２．３０以上の化合物を固定化した場合（実施例１、実施例２）では、これら指標の濃度上昇が著しく低減し、該濃度上昇差分は元のセルロースの濃度上昇差分に対し、顆粒球エラスターゼ、ミエロパーオキシダーゼの両者ともに９０％以上低減している。このことは、表中の改質率の値からわかる。また、ネガティブコントロール（比較例３）と比較すると、顆粒球エラスターゼ、ミエロパーオキシダーゼの濃度はほぼ同レベルであり、顆粒球活性化作用がごく軽度である、すなわち、セルロースによる顆粒球の活性化のような問題がなく、セルロースが劇的に改質されていることがわかる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のセルロースの改質方法により、セルロースが有する顆粒球活性化作用を劇的に低減することが可能であり、機械的強度、価格などの点において優れ、なおかつ顆粒球活性化作用が少ない血液浄化器用の素材、ならびに血液浄化器を提供することができる。