(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭酸水素アルカリ金属塩と、カルボン酸およびカルボン酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物のみからなる増殖栄養源とを含む浄化資材を、土壌および／または地下水中に供給し、該浄化資材を供給した土壌および／または地下水にもともと生息している土着の嫌気性細菌を活性化して有機塩素化合物を分解することを特徴とする汚染土壌・地下水の浄化方法。
【請求項２】
前記浄化資材中の、前記炭酸水素アルカリ金属塩［物質量：ＭＡ（モル）］と前記カルボン酸およびカルボン酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物［物質量：ＭＢ（モル）］との比率が、ＭＡ／ＭＢ（モル比）＝０．２５〜２である、請求項１に記載の汚染土壌・地下水の浄化方法。
【請求項３】
前記有機塩素化合物が、塩化エチレン、塩化エタン、および塩化メタンからなる群から選択される１種以上である、請求項１または２に記載の汚染土壌・地下水の浄化方法。
【請求項４】
前記炭酸水素アルカリ金属塩が、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の汚染土壌・地下水の浄化方法。
【請求項５】
前記カルボン酸およびカルボン酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物が、ヒドロキシ酸およびヒドロキシ酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の汚染土壌・地下水の浄化方法。
【請求項６】
前記カルボン酸およびカルボン酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物が、リンゴ酸、クエン酸およびそれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の汚染土壌・地下水の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汚染土壌・地下水の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、トリクロロエタン、四塩化炭素等、一般に揮発性有機塩素化合物（以下、ＶＯＣと記す）と称される一群の化合物は、ＩＣ等の電子部品の洗浄剤、ドライクリーニングの洗浄剤、金属類の脱脂・洗浄剤、冷媒等に用いられ、産業上の利用価値は高い。しかし、これらＶＯＣは、発ガン性や肝障害・腎障害等、人体への影響が認められる。そのため、特定有害化学物質に指定されており、ＶＯＣによる土壌・地下水の汚染は大きな社会問題となっている。
【０００３】
ＶＯＣにより汚染された土壌・地下水への対策としては、汚染土壌を掘削除去することにより場外に搬出して浄化処理を施した後、その土壌をセメント粘土代替材に利用する、または最終処分場に埋め立てる方法が最も確実である。しかし、掘削や加熱等の浄化処理には多大な資材とエネルギーを消費すること等から、原位置浄化処理による省エネルギーで効率的かつ経済的な浄化処理工法の開発が望まれている。
【０００４】
原位置浄化処理工法としては、地中ガス吸引、地下水揚水等の物理的除去方法が多く用いられてきた。しかし、これら気体や地下水を媒介する除去回収方法は、ＶＯＣが高濃度に存在する場合には効果的であるが、ＶＯＣ濃度が低い場合には回収効率が極めて低くなる。そのため、環境基準を満足するレベルにＶＯＣを除去するには少なくとも数年から十数年以上と極めて長期間を要する。
【０００５】
また、０価の鉄粉のスラリーを土壌中に投入、混合し、鉄粉の還元力によりＶＯＣを分解する原位置浄化処理工法がある。この工法は、１年以内という比較的短期間で環境基準を満足できるレベルまで浄化できる。しかし、重機を用いて地中混合を行うためにエネルギー消費が大きい。さらに、更地以外への適用が困難であることから、稼働中の事業所での実施はほとんど望めない。加えて、この工法では土壌と鉄粉スラリーを入念に混合するため、土壌の泥濘化による地耐力の著しい低下が起きてしまい、これに対する追加措置の実施が必要となる。
【０００６】
また、フェントン試薬を用いてＶＯＣを分解する原位置浄化処理工法もある。この工法は、過酸化水素と二価鉄塩を含む溶液、即ちフェントン試薬液剤を注入する点を除けば、０価の鉄粉を土中に投入、混合する工法と類似の工法であり、鉄粉混合工法と同様の欠点を有している。また、フェントン試薬液剤を用いた浄化処理工法は、浄化に要する期間が数カ月以内と短いものの、過酸化水素が激しく発泡するために土壌中に注入することが困難であるという課題がある。
【０００７】
一方、近年では、これらの従来技術に比べて省エネルギーで経済的な原位置浄化処理工法として、対象汚染土壌にもともと生息する土着の有用な嫌気性細菌群を活性化し、それらの嫌気性細菌が有する還元的脱塩素・分解機能を活用してＶＯＣを分解浄化するバイオスティミュレーション工法が盛んに行われている。この浄化処理工法では、浄化資材を対象汚染土壌に供給し、地下水を媒体としてその浄化資材成分を対象汚染土壌に広く行きわたらせ、土着の嫌気性細菌を活性化することで浄化が行われる。
【０００８】
具体的には、浄化資材として酵母エキスを土壌および／または地下水に供給して、土着の好気性細菌を活性化することでその土壌・地下水を嫌気性雰囲気にした後、酵母エキス等を電子供与体として利用させて嫌気性細菌によるＶＯＣの分解を促進する浄化処理工法が示されている（特許文献１）。
また、酸解離定数が６〜８の有機酸および／またはその塩を用いて嫌気性細菌を活性化してＶＯＣの分解を促進する浄化処理工法が示されている（特許文献２）。
【０００９】
前記浄化処理工法のような汚染土壌・地下水の浄化方法の普及には、ＶＯＣの還元的脱塩素・分解機能に優れた嫌気性細菌の発見が要因として挙げられる（非特許文献１、２）。なかでも、Dehalococcoides（デハロコッコイデス）属細菌（以下、ＤＨＣ属細菌という）はＶＯＣの還元的脱塩素・分解機能に最も優れた嫌気性細菌であり、脱塩素活性を有する細菌の中でも、唯一単独でテトラクロロエチレンをエチレンまで分解無害化できる。その分解経路としては、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）から、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）、塩化ビニルを経て、エチレンと二酸化炭素に至ることが確かめられている。
他の嫌気性細菌（細菌、真菌を含む）は、単独ではＰＣＥまたはＴＣＥをｃｉｓ−ＤＣＥまでしか分解することができないため、ＤＨＣ属細菌はバイオスティミュレーション工法において特に有用な細菌である。
【特許文献１】特許第３５６４５７３号公報
【特許文献２】特開２００２−１３０４号公報
【非特許文献１】「土壌・地下水浄化有用微生物の検出技術とバイオレメディエーション」Matsushita Technical Journal, Vol53. No.1 Oct. 2007
【非特許文献２】「クロロエチレン類の嫌気的微生物分解」  土壌環境センター技術ニュース No.7 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１の汚染土壌・地下水の浄化方法では、酵母エキスを含む浄化資材を供給することにより、土着の好気性細菌を増殖させて酸素を消費させることで土壌・地下水環境を嫌気性雰囲気とした後、嫌気性細菌に酵母エキス等を利用させることでＶＯＣの還元的脱塩素・分解反応を促進する。
しかし、浄化資材の供給は、通常、汚染された土壌や地下水の領域内に設けられた井戸に浄化資材を注入することにより行われるため、初期に種々の好気性細菌が増殖することで注入井戸の孔壁等に微生物膜が形成されたり、対象汚染土壌中において増殖した好気性細菌の遺骸により注入井戸付近の土壌の間隙が閉塞されたりすることで、浄化資材成分の土壌中への速やかな注入・拡散が妨げられることがあった。また、この方法では、まず好気性細菌を増殖させて嫌気性雰囲気とするため、嫌気性細菌によるＶＯＣの還元的脱塩素・分解反応が進行するまでに一定の時間を要する。また、ｃｉｓ−ＤＣＥ等の塩素化数が２個以下の化合物が分解され難く、蓄積しやすいという課題もある。
【００１１】
また、特許文献２の汚染土壌・地下水の浄化方法においても、ＶＯＣの分解の促進効果が充分に得られないことがあった。そのため、ＶＯＣの分解の促進効果に優れ、ｃｉｓ−ＤＣＥ等の塩素化数が２個以下の化合物の分解効率にも優れた汚染土壌・地下水の浄化方法が望まれている。
【００１２】
また、このようなバイオスティミュレーション工法では、通常、浄化資材を土壌および／または地下水中に供給すると、浄化資材中に多く含まれる炭水化物成分の酸化により有機酸が生成し、その有機酸により短期間のうちに浄化資材を供給した領域の土壌および／または地下水のｐＨが低下する。ｐＨが６よりも低くなると、嫌気性細菌によるＶＯＣ分解能が一時的に低下してしまう。
そこで本発明は、ＤＨＣ属細菌等の嫌気性細菌によるＶＯＣの分解を促進する効果に優れ、汚染土壌・地下水を高度に浄化できる浄化方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の汚染土壌・地下水の浄化方法は、炭酸水素アルカリ金属塩と、カルボン酸およびカルボン酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物（以下、本カルボン酸等化合物という）のみからなる増殖栄養源とを含む浄化資材を、土壌および／または地下水中に供給し、該浄化資材を供給した土壌および／または地下水にもともと生息している土着の嫌気性細菌を活性化して有機塩素化合物を分解することを特徴とする方法である。
【００１４】
また、本発明の汚染土壌・地下水の浄化方法は、前記浄化資材中の、炭酸水素アルカリ金属塩［物質量：ＭＡ（モル）］と本カルボン酸等化合物［物質量：ＭＢ（モル）］との比率が、ＭＡ／ＭＢ（モル比）＝０．２５〜２であることが好ましい。
また、前記有機塩素化合物が、塩化エチレン、塩化エタン、および塩化メタンからなる群から選択される１種以上であることが好ましい。
また、前記炭酸水素アルカリ金属塩が、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムであることが好ましい。
また、本カルボン酸等化合物が、ヒドロキシ酸およびヒドロキシ酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物であることが好ましい。
また、本カルボン酸等化合物が、リンゴ酸、クエン酸およびそれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の浄化方法は、ＤＨＣ属細菌等の嫌気性細菌によるＶＯＣの分解を促進する効果に優れており、ＶＯＣに汚染された土壌や地下水を高度に浄化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の汚染土壌・地下水の浄化方法は、炭酸水素アルカリ金属塩と本カルボン酸等化合物とを含む浄化資材を土壌および／または地下水中に供給して有機塩素化合物を分解する方法である。これらの浄化資材を供給することにより、汚染された土壌や地下水にもともと生息する、有機塩素化合物の還元的脱塩素・分解機能（以下、単にＶＯＣ分解能という）を有する土着の嫌気性細菌を活性化することができる。
【００１７】
本発明における有機塩素化合物としては、たとえば、土壌や地下水の汚染物質として特定有害化合物にも指定されている揮発性有機塩素化合物（ＶＯＣ）が挙げられる。ＶＯＣとしては、たとえば、塩化エチレン、塩化エタン、塩化メタン等が挙げられる。
塩化エチレンとしては、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）等が挙げられる。
塩化エタンとしては、トリクロロエタン（ＴＣＡ）、ジクロロエタン（ＤＣＡ）等が挙げられる。
塩化メタンとしては、四塩化炭素（ＣＣｌ４）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）等が挙げられる。
【００１８】
本発明の浄化方法では、有機塩素化合物は、塩化エチレン、塩化エタン、および塩化メタンからなる群から選択される１種以上であることが好ましい。
【００１９】
ＶＯＣ分解能を有する嫌気性細菌（以下、単に嫌気性細菌ともいう）としては、たとえば、Dehalococcoides（デハロコッコイデス）属細菌、Desulfitobacterium（デサルフィトバクテリウム）属細菌、Desulfuromonas（デサルフロモナス）属細菌、Dehalobacter（デハロバクター）属細菌等の微生物が挙げられる。これらの嫌気性細菌は、ｐＨ６〜８の中性条件下においてＶＯＣの分解活性が高いので好ましい。
また、これらの中でも、Dehalococcoides（デハロコッコイデス）属細菌（ＤＨＣ属細菌、偏性嫌気性細菌）は、単独でＰＣＥをエチレンまで分解無害化できる。ＤＨＣ属細菌は、酸化還元電位（ＯＲＰ）が−２００ｍＶ以下の還元的環境において特に分解活性が高い。
【００２０】
嫌気性細菌によるＶＯＣの還元的脱塩素・分解反応（以下、単に分解反応という）は、主に以下に説明する過程を経ることにより進行する。
塩化エチレンであるＰＣＥは、ＴＣＥ、ｃｉｓ−ＤＣＥ、塩化ビニル（ＶＣ）を経てエチレンまで分解される（非特許文献１、２）。
塩化エタンであるＴＣＡは、ＤＣＡ、塩化エタンを経てエタンまで分解される。塩化メタンであるＣＣｌ４は、クロロフォルム、ＤＣＭを経てメタンまで分解される。また、塩化エタンやＤＣＭは、それ以外の前記ＶＯＣに比べて分解速度が遅いことが知られている（「バイオレメディエーション法におけるｃＶＯＣ分解の検討」第１２回地下水・土壌汚染とその防止対策に関する研究集会  要旨集  Ｓ２−２５）。
【００２１】
［浄化資材］
本発明の浄化方法において土壌および／または地下水中に供給する浄化資材は、炭酸水素アルカリ金属塩と、本カルボン酸等化合物とを含む浄化資材である。
【００２２】
炭酸水素アルカリ金属塩は、汚染土壌および／または地下水中に供給することにより、その領域の土壌および／または地下水中の環境を速やかに嫌気性雰囲気に移行させる役割を果たす。
炭酸水素アルカリ金属塩としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムが好ましい。
【００２３】
本カルボン酸等化合物は、嫌気性細菌の増殖栄養源であり、ＶＯＣの分解反応における有効な水素供与体でもある。本カルボン酸等化合物は、溶解性の点から、炭素原子数２〜１４のカルボン酸であることが好ましい。
本カルボン酸等化合物としては、たとえば、酢酸（炭素原子数２（Ｃ２）、以下同様にして炭素原子数を示す。）、プロピオン酸（Ｃ３）、酪酸（Ｃ４）、吉草酸（Ｃ５）、カプロン酸（Ｃ６）、ヘプチル酸（Ｃ７）、カプリル酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）等の飽和脂肪酸、ピルビン酸（Ｃ３）、エノールピルビン酸（Ｃ３）、オキザロ酢酸（Ｃ４）、コハク酸（Ｃ４）、フマル酸（Ｃ４）、グルタル酸（Ｃ５）、シュウ酸（Ｃ２）、マレイン酸（Ｃ４）、マロン酸（Ｃ３）等が挙げられる。これらのカルボン酸のアルカリ金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００２４】
また、本カルボン酸等化合物としては、嫌気性細菌によるＶＯＣの分解反応を促進する効果に優れる点から、ヒドロキシ酸およびヒドロキシ酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物であることが好ましい。
ヒドロキシ酸としては、たとえば、グリコール酸（Ｃ２）、乳酸（Ｃ３）、グリセリン酸（Ｃ３）、リンゴ酸（Ｃ４）、酒石酸（Ｃ４）、クエン酸（Ｃ６）、イソクエン酸（Ｃ６）、シトラマル酸（Ｃ５）、ロイシン酸（Ｃ６）、メバロン酸（Ｃ６）、シキミ酸（Ｃ７）等が挙げられ、リンゴ酸、クエン酸が好ましい。また、ヒドロキシ酸のアルカリ金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。
【００２５】
本発明における炭酸水素アルカリ金属塩は、汚染土壌および／または地下水中に供給された際に主に炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）と遊離炭酸（Ｈ２ＣＯ３）の形態で存在する。このため、本発明の浄化資材を土壌および／または地下水中に供給することにより、遊離炭酸濃度を高くすることができ、これにより、土壌および／または地下水中の溶存酸素濃度を低下することができ、ＤＨＣ属細菌等の偏性嫌気性細菌の増殖に適した嫌気性雰囲気にしやすくなるので好ましい。
【００２６】
また、本発明において、炭酸水素アルカリ金属塩はｐＨ緩衝作用を有しているため、供給することにより、土壌や地下水のｐＨを嫌気性細菌によるＶＯＣの分解反応に好適な６〜８の範囲に保つことができるので好ましい。
【００２７】
また、炭酸水素アルカリ金属塩は、中性ｐＨ（ｐＨ６〜８）において前記のように主に炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）と遊離炭酸（Ｈ２ＣＯ３）の形態で存在しており、このうち遊離炭酸は鉱物等に対して浸食性を有する。そのため、対象汚染土壌がＶＯＣを溶出し難いシルト・粘土質土壌であっても、遊離炭酸が浸透して作用することにより、土壌に吸着したＶＯＣを地下水中に移行させることができると考えられる。これにより、嫌気性細菌によるＶＯＣの分解反応が充分に促進され、浄化期間が短縮されるので好ましい。
【００２８】
また、本発明において、本カルボン酸等化合物は、嫌気性細菌の増殖栄養源として働き、さらには、ＶＯＣ分解反応における水素供与体としても働くので好ましい。
本発明において、嫌気性細菌によるＶＯＣ分解反応に直接寄与するのは、水素とメタンであると考えられる。水素やメタンの生成には、たとえば、下記式（１）〜（３）に示すように、低分子脂肪族カルボン酸と炭酸水素イオンとが存在することにより発生する。本カルボン酸等化合物は、該低分子脂肪族カルボン酸と同様に反応して水素やメタンを発生することができる。
ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ−  ＋  ３Ｈ２Ｏ  →
ＣＨ３ＣＯＯ−  ＋  ＨＣＯ３−  ＋  Ｈ＋  ＋  ３Ｈ２    （１）
ＨＣＯ３−  ＋  ４Ｈ２  ＋  Ｈ＋  →  ＣＨ４  ＋  ３Ｈ２Ｏ    （２）
ＣＨ３ＣＯＯ−  ＋  Ｈ＋  →  ＣＨ４  ＋  ＣＯ２    （３）
【００２９】
水素供与体にもなり得る嫌気性細菌の栄養源としては、グルコース等の糖類、エチルアルコール等のアルコール類、低級脂肪酸類等の化合物の他に、特許第３５６４５７３号公報（特許文献１）に記載の酵母エキスや、カゼイン分解物等の高分子炭水化物を含む微生物基材、さらには、乳酸等を徐放するポリ乳酸化合物として知られる「ＨＲＣ（水素徐放性化合物）」等が挙げられるが、これらは供給した土壌および／または地下水中の環境を好気性細菌の増殖に好適な富栄養状態としてしまうため、ＤＨＣ属細菌等のような偏性嫌気性細菌の増殖には適さない。
【００３０】
本カルボン酸等化合物は、供給した土壌および／または地下水中の環境をこのような富栄養状態とせずに低分子脂肪族カルボン酸として働くことができるため、嫌気性細菌によるＶＯＣの分解反応を促進する効果が高いと考えられる。また、その中でもヒドロキシ酸およびヒドロキシ酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物は、分解により乳酸等を経由して酢酸を生成しやすく、前記式（１）および（３）に示した反応による水素およびメタンの生成に特に適しており、ＤＨＣ属細菌の増殖をより促進できると考えられる。そのため、ＶＯＣの分解反応の促進効果がより高くなり、汚染土壌・地下水の浄化性能が向上する。
【００３１】
また、遊離炭酸と、水素供与体である本カルボン酸等化合物の炭化水素とが同時に存在すると、ＶＯＣ分解能を有する嫌気性細菌やメタン生産菌、水素生産菌の増殖に特に適した還元的環境となる。偏性嫌気性であるＤＨＣ属細菌は、硫酸還元によりエネルギーを獲得しており、またメタン生産菌や水素生産菌と共生的な関係にあると推定されている。これらの微生物は共に前記のような還元的環境にある土壌や地下水において増殖しやすいため、炭酸水素アルカリ金属塩と本カルボン酸等化合物とを共に含む浄化資材によって、ＶＯＣの分解反応の促進効果がさらに高くなると考えられる。
【００３２】
本発明の浄化資材は、炭酸水素アルカリ金属塩と本カルボン酸等化合物以外の添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、たとえば、細菌の増殖に必要な微量重金属類が挙げられる。また、ｃｉｓ−ＤＣＥやＤＣＭ等の２塩素化化合物等のＶＯＣの分解速度を低下させすぎない範囲内であれば、前記酵母エキス等を含んでいてもよい。
【００３３】
また、本発明の浄化資材は、窒素やリン、ビタミン類等の栄養塩類を含ませず、主な栄養源を本カルボン酸等化合物のみとすることが特に好ましい。これにより、浄化資材を供給した土壌および／または地下水が比較的貧栄養状態に保たれて、ＤＨＣ属細菌以外の嫌気性細菌や好気性細菌の増殖が抑えられるため、ＤＨＣ属細菌の増殖に有利な環境となる。そのため、ＤＨＣ属細菌以外の嫌気性細菌では分解し難いｃｉｓ−ＤＣＥやＤＣＭ等の２塩素化化合物の分解速度が向上する。
【００３４】
特に好ましい浄化資材は、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムと、ヒドロキシ酸およびヒドロキシ酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上の化合物とを含む浄化資材である。この浄化資材は、供給した土壌および／または地下水中に、水素やメタンの生成に最も適した基質と、ＤＨＣ属細菌の増殖に適した嫌気性雰囲気とを提供できる組み合わせであるため、ＶＯＣの分解反応の促進効果に特に優れる。
【００３５】
［浄化方法］
本発明における浄化資材は、粉体として用いてもよく、水溶液として用いてもよいが、拡散性、および最適な濃度での地下水への供給が可能である点から水溶液として用いることが好ましい。浄化資材を水溶液とする場合、使用する水は特に限定されず、水道水等を用いることができる。
【００３６】
浄化資材の供給方法としては、対象の汚染土壌・地下水の領域における地下水流向の上流側に井戸管を掘削・配置して、その井戸管に浄化資材を注入する方法が特に好ましい。これにより、地下水の流れを利用して浄化資材を汚染された領域に拡散・到達させることができ、汚染土壌・地下水中にもともと生息する土着の嫌気性細菌を活性化・増殖させて、ＶＯＣの分解反応を充分に促進することが容易になる。
【００３７】
浄化資材を汚染土壌に供給する場合の炭酸水素アルカリ金属塩の使用量は、対象の汚染土壌１ｍ３あたり５０〜２５００ｇ／ｍ３とすることが好ましく、１００〜１０００ｇ／ｍ３とすることがより好ましく、１００〜５００ｇ／ｍ３とすることが特に好ましい。
炭酸水素アルカリ金属塩の使用量を５０ｇ／ｍ３以上とすることにより、嫌気性細菌によるＶＯＣの分解反応の促進効果が充分に得られる。また、炭酸水素アルカリ金属塩の使用量を２５００ｇ／ｍ３以下にすれば、浄化に要するコストを抑制できる。
【００３８】
また、浄化資材を汚染土壌に供給する場合の本カルボン酸等化合物の使用量は、対象の汚染土壌１ｍ３あたり１００〜５０００ｇ／ｍ３とすることが好ましく、２００〜２５００ｇ／ｍ３とすることがより好ましく、２００〜１０００ｇ／ｍ３とすることが特に好ましい。
前記化合物の使用量を１００ｇ／ｍ３以上とすることにより、嫌気性細菌によるＶＯＣの還元的脱塩素・分解反応を促進する効果が充分に得られる。また、前記化合物の使用量を５０００ｇ／ｍ３以下とすることにより、汚染土壌中で増殖する微生物菌体および微生物の分泌する多糖類による土壌間隙の閉塞の可能性が低くなり、また浄化に要するコストも抑制できる。
【００３９】
また、浄化資材を汚染地下水に供給する場合の炭酸水素アルカリ金属塩の使用量は、汚染土壌に供給する場合と同様の理由から、対象の汚染地下水１ｍ３あたり５０〜２５００ｇ／ｍ３とすることが好ましく、５０〜１０００ｇ／ｍ３とすることがより好ましく、５０〜５００ｇ／ｍ３とすることが特に好ましい。
また、浄化資材を汚染地下水に供給する場合の本カルボン酸等化合物の使用量は、汚染土壌に供給する場合と同様の理由から、対象汚染土壌１ｍ３あたり１００〜５０００ｇ／ｍ３とすることが好ましく、１００〜２５００ｇ／ｍ３とすることがより好ましく、１００〜１０００ｇ／ｍ３とすることが特に好ましい。
【００４０】
また、本発明における浄化資材中の炭酸水素アルカリ金属塩［物質量：ＭＡ（モル）］と、本カルボン酸等化合物［物質量：ＭＢ（モル）］との比率は、ＭＡ／ＭＢ（モル比）＝０．２５〜２とすることが好ましい。
前記モル比が０．２５以上であれば、浄化資材を供給した汚染土壌および／または地下水の環境を、嫌気性細菌が速やかに増殖するのに充分な嫌気性雰囲気とすることが容易となる。また、前記モル比が２以下であれば、浄化資材を供給した汚染土壌および／または地下水の嫌気性雰囲気下において増殖した嫌気性細菌に充分な量の栄養源を供給して、嫌気性細菌の増殖効率を高くすることが容易になる。
【００４１】
前記モル比は、本カルボン酸等化合物としてリンゴ酸を用いる場合には、ＭＡ／ＭＢ＝０．２５〜１．５とすることがより好ましい。また、本カルボン酸等化合物としてクエン酸を用いる場合には、ＭＡ／ＭＢ＝０．５〜２．０とすることがより好ましい。
【００４２】
以上説明したように、本発明の浄化方法は、炭酸水素アルカリ金属塩と本カルボン酸等化合物とを含む浄化資材を用いることにより、嫌気性細菌によるＶＯＣの分解反応を促進して、汚染土壌・地下水を高度に浄化できる。これは、本発明の浄化資材が、水素やメタンの生成に適した基質を供給するのに適しているために、それらの水素やメタンを利用して増殖やＶＯＣの分解反応を行うＤＨＣ属細菌を効率的に活性化できるためであると考えられる。
また、本発明の浄化方法では、炭酸水素アルカリ金属塩を用いることで、浄化資材を供給した土壌および／または地下水中の遊離炭酸（Ｈ２ＣＯ３）濃度を高めることができる。そのため、偏性嫌気性細菌であるＤＨＣ属細菌の増殖に好適な嫌気性雰囲気に速やかに移行することができ、ＶＯＣの分解反応の促進効果が高いと考えられる。
【００４３】
一方、特許文献１のような浄化方法では、ＤＨＣ属細菌等の偏性嫌気性細菌の増殖速度が好気性細菌や通性嫌気性細菌の増殖速度よりも遅いことから、土壌および／または地下水の環境が酵母エキス等の添加により富栄養状態となることでＤＨＣ属細菌が増殖し難い環境となっており、ｃｉｓ−ＤＣＥ等の塩素化数が２個以下の２塩化化合物が分解され難かったと考えられる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例における％はｗ／ｖ％を意味する。
＜汚染土壌の浄化＞
本発明の浄化方法による実汚染土壌の浄化について以下に説明する。
実汚染土壌の浄化では、実汚染土壌をカラムに充填し、さらに各種浄化資材水溶液を供給・浸透した後、一定期間経過後にカラム下部から土壌カラム溶出水を採取し、土壌カラム溶出水のＶＯＣ濃度、ｐＨ、酸化還元電位（ＯＲＰ）を測定することにより浄化性能を評価した。
【００４５】
ＶＯＣを含有する実汚染土壌としては、千葉県市原市にあるＴＣＥ使用履歴の確認された工場より採取した実汚染土を用いた。この実汚染土試料は、湿潤状態のまま、ガラス瓶に上部間隙のない状態まで充填して採取し、これを密封した後、クーラーボックスにドライアイスを適量入れて冷蔵状態で輸送した。実験施設に移送後は、３℃に保った冷蔵庫内に保存し、速やかに試験に供した。
【００４６】
実汚染土壌の浄化では、炭酸水素アルカリ金属塩として炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）を用いた。また、カルボン酸のアルカリ金属塩としてコハク酸ナトリウム、ＤＬリンゴ酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム（以上、和光純薬工業社製）を用いた。
また、それ以外の栄養源として、グルコース（ブドウ糖、和光純薬工業社製）を用いた。
【００４７】
［実施例１］
浄化資材としては、水道水を用いて、０．２５％ＤＬリンゴ酸ナトリウム（０．１８Ｍ）、０．１５％炭酸水素ナトリウム（０．１８Ｍ）を含む浄化資材水溶液を調製した。この浄化資材水溶液は脱気した後に試験に使用した。また、水道水は一晩室温で容器に汲み置いて開放放置し、活性塩素イオンを気散させたものを用いた。
【００４８】
滅菌済みの１００ｍＬ容量ガラス製カラムの底部に少量のガラスウールを詰め、該カラムに前記実汚染土壌７０ｍＬを転圧充填し、前記浄化資材水溶液７０ｍＬをカラム上部より供給しながら余剰の土壌間隙水をカラム下部より回収した。カラム上部は、充填土壌上部の空隙が供給した浄化資材水溶液で満たされている状態でシリコンキャップにより密栓した。また、カラム下部の筒先部は、筒先にシリコンチューブを連結し、浄化資材水溶液を満たした状態で該シリコンチューブを金属バインダーで締め付けて厳重にシールした。
ついで、密封した前記カラムを１５℃定温の保温庫内の暗所に静置した。浄化資材水溶液の供給処理後、６週（４２日）、１２週（８４日）、１８週（１２６日）経過後に、前記カラムの上部より浄化資材水溶液７ｍＬを新たに注入し、同時にカラム下部のシリコンチューブを締め付けた金属バインダーを緩めて余剰の土壌カラム溶出液（約７ｍＬ）をガラス製バイアル瓶に採取した。
【００４９】
［実施例２］
用いた浄化資材の組成を表１に示すように変更した以外は実施例１と同様にして土壌カラム溶出液を採取した。
【００５０】
［比較例１］
実汚染土試料として採取した実汚染土壌を滅菌したものを用い、かつ浄化資材の代わりに水道水を用いた以外は実施例１と同様にして土壌カラム溶出液を採取した。実汚染土壌の滅菌は１２０℃で１５分間行った。
【００５１】
［比較例２〜６］
用いた浄化資材の組成を表１に示すように変更した以外は実施例１と同様にして土壌カラム溶出液を採取した。
【００５２】
［参考例１］
浄化資材の組成を０．１５％炭酸水素ナトリウムのみとして、実施例１と同様にカラムに供給した後、すぐに（０日後）土壌カラム溶出液を採取した。
【００５３】
【表１】
0005001187.tif 000002
【００５４】
実施例１〜２および比較例１〜６で得られた土壌カラム溶出液におけるＶＯＣ濃度は、ガラス製バイアル瓶の土壌カラム溶出液上部の空気の一部を採取し、それをガスクロマトグラフィー測定装置に導入して定量するヘッドスペースガスクロマトグラフィー法により測定した。また、参考例１の土壌カラム溶出液におけるＶＯＣ濃度も同様にして測定した。
実施例１〜２、比較例１〜６、および参考例１の土壌カラム溶出液におけるＶＯＣ濃度の測定結果を表２および図１〜２に示す。尚、浄化資材を用いずに水道水のみを使用して、参考例１と同様にすぐに（０日後）に採取した土壌カラム溶出液におけるＶＯＣ濃度を基準値とした。
また、実施例１〜２、比較例１〜６で得られた土壌カラム溶出液のｐＨと酸化還元電位（塩化銀電極を使用）の測定を行った。ｐＨと酸化還元電位の測定については、浄化資材をカラムに供給した後に、すぐに土壌カラム溶出液を採取した０日後についても測定を行った。ｐＨおよび酸化還元電位の測定結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
0005001187.tif 000003
【００５６】
参考例１の土壌カラム溶出液のＶＯＣ濃度は、表２に示すように、水道水を用いた基準値のＶＯＣ濃度よりも高く、ＴＣＥでは約３倍量が検出された。この結果より、炭酸水素アルカリ金属塩が土壌からのＶＯＣ脱着に一定の効果があることが確認された。また、水道水による土壌カラム溶出液のＶＯＣ濃度の測定結果から、汚染原因物質であるＴＣＥに対して分解中間体であるｃｉｓ−ＤＣＥが２倍以上存在すること、および少量のＶＣが存在することが確認できる。本実施例ではＴＣＥ使用履歴が確認されている実汚染土壌を用いており、ｃｉｓ−ＤＣＥやＶＣは用いられていないため、これらが確認されたことでＶＯＣ分解能を有する嫌気性細菌が存在していることがわかった。
【００５７】
また、本発明の浄化方法である実施例１および２では、ＴＣＥおよびｃｉｓ−ＤＣＥの分解が速やかに行われ、１２６日後にはＴＣＥおよびｃｉｓ−ＤＣＥの濃度が共に環境基準値（ＴＣＥ：０．０３ｍｇ／Ｌ、ｃｉｓ−ＤＣＥ：０．０４ｍｇ／Ｌ）よりも低くなった。
【００５８】
一方、炭酸水素アルカリ金属塩もカルボン酸のアルカリ金属塩も用いていない比較例２〜３、およびカルボン酸のアルカリ金属塩しか用いていない比較例４〜６では、実施例に比べてＶＯＣの分解速度に劣っており、１２６日後においてもＴＣＥおよびｃｉｓ−ＤＣＥの濃度が共に環境基準値を大きく上回っていた。また、滅菌した比較例１では、嫌気性微生物が死滅するためにＶＯＣ濃度がほとんど変化しなかった。
【００５９】
また、ｐＨについては、表２に示すように、実施例１および２では、０日後にｐＨが８弱を示した後、ｐＨ７前後を推移しており、嫌気性細菌によるＶＯＣの分解反応に好適なｐＨ環境が維持されていた。
一方、浄化資材としてグルコースを用いた比較例３では、４２日後にｐＨが４．９まで低下しており、ＶＯＣの分解反応に好適なｐＨ環境を維持できていなかった。比較例１〜２および４〜６については、ｐＨは６〜８の範囲内で維持されていた。
【００６０】
また、酸化還元電位については、表２に示すように、実施例１および２における酸化還元電位は低下速度が速く、浄化資材を供給した実汚染土壌がＤＨＣ属細菌の増殖に有利な還元的環境に速やかに移行していた。
一方、比較例１〜６の酸化還元電位の変化は、実施例に比べて低下速度が遅く、ＤＨＣ属細菌の増殖に有利な還元的環境に移行する速度に劣っていた。
【００６１】
＜汚染地下水の浄化＞
以下、本発明の浄化方法による実汚染地下水の浄化について説明する。
実汚染地下水の浄化では、実汚染地下水をガラス製バイアル瓶に収容し、浄化資材を供給して培養条件を設定した後、一定期間経過後にそのバイアル瓶内の培養液（汚染地下水に浄化資材を供給したもの）のＶＯＣ濃度を測定することにより浄化性能を評価した。
【００６２】
ＶＯＣを含有する実汚染地下水としては、千葉県市原市にあるＴＣＥ使用履歴の確認された工場より採取した実汚染地下水を用いた。この実汚染地下水は、工場において採取した複数の地下水試料を冷蔵保管、移送して試験室に持ち帰った。
実汚染地下水の浄化では、炭酸水素アルカリ金属塩として炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）を用いた。また、カルボン酸のアルカリ金属塩としてＤＬリンゴ酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム（いずれも和光純薬工業社製）を用いた。
【００６３】
［実施例３］
地下水試料５０ｍＬを１００ｍＬ容量褐色バイアル瓶に加えた後、気相部をガス（Ｎ２（ｖｏｌ．）：ＣＯ２（ｖｏｌ．）＝９０：１０)で置換し、テフロン（登録商標）コーティングしたブチルゴム栓で蓋をして、アルミシールにより密封することによりガラスバイアル瓶試験試料を作成した。
ついで、このバイアル瓶に、培養液中の浄化資材が０．０２５％炭酸水素ナトリウム（０．０３Ｍ）、０．０７５％ＤＬリンゴ酸ナトリウム（０．０４２Ｍ）となるように、浄化資材濃厚溶液（水道水により調製）を注射筒により注入した後、１２週後まで１５℃で静置培養した。ついで、１２週後にバイアル瓶の蓋を開封して培養液を採取し、実施例１と同様の方法でガスクロマトグラフィー測定装置によりＶＯＣ濃度を測定した。また、同一条件のガラスバイアル瓶試験試料をさらに４本作成し、２週後、４週後、６週後、９週後についても同様にＶＯＣ濃度の測定を行った。
尚、地下水試料の初期のＶＯＣ濃度を測定したところ、ＴＣＥ濃度は７．２ｍｇ／Ｌ、ｃｉｓ−ＤＣＥ濃度は０．８ｍｇ／Ｌであった。
【００６４】
［実施例４］
培養液中の浄化資材の条件を表３に示す通りに変更した以外は、実施例３と同様にしてＶＯＣ濃度の測定を行った。
【００６５】
［比較例７］
浄化資材を用いずに水道水のみ用いた以外は、実施例３と同様にしてＶＯＣ濃度の測定を行った。
【００６６】
［比較例８〜９］
培養液中の浄化資材の条件を表３に示す通りに変更した以外は、実施例３と同様にしてＶＯＣ濃度の測定を行った。
実施例３〜４および比較例７〜９におけるＶＯＣ濃度の測定結果を表３および図３〜４に示す。
【００６７】
【表３】
0005001187.tif 000004
【００６８】
表３に示すように、実施例３および４の実汚染地下水の浄化では、共に１２週という短期間でＴＣＥの分解がなされており、ＴＣＥおよびｃｉｓ−ＤＣＥの濃度が共に環境基準値未満となった。
一方、比較例７〜８では、ＴＣＥの分解速度が実施例３および４に比べて劣っており、１２週後のＴＣＥおよびｃｉｓ−ＤＣＥの濃度が共に環境基準値を大きく上回っていた。
【００６９】
＜遺伝子解析＞
実施例３〜４および比較例７〜９について、培養液中にＤＨＣ属細菌が増殖したか否かを遺伝子解析により判定した。
遺伝子解析は、図５に示すような流れで行った。まず、培養液中に増殖した細菌の遺伝子を回収、抽出し（工程（１））、その遺伝子からＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法により特定のＤＮＡ断片を数万倍以上に増幅した（工程（２））。ついで、増幅したＤＮＡ断片を電気泳動により解析し（工程（３））、真性細菌に特徴的と思われるＤＮＡ断片を回収、精製（工程（４））して、それらのＤＮＡ断片の塩基配列を解析した（工程（５））。そして、塩基配列の解析結果とＤＮＡデータベースと照合して、ＤＨＣ属細菌遺伝子との相同性を解析することによりＤＨＣ属細菌の増殖を確認した（工程（６））。また、初期の実汚染地下水（以下、初期試料という）についても同様の遺伝子解析を行った。
【００７０】
［工程（１）：細菌遺伝子の抽出・精製］
実施例３〜４および比較例７〜９の培養液については、ＶＯＣ濃度を測定した培養液の残りを−８０℃で保管しておき、これらの培養液から遺伝子を回収、抽出した。
具体的には、培養液および初期試料中の細菌をフィルター（保持粒径０．２μｍ）上に捕集した後、MO Kit（ＭＯ  Ｂｉｏ社製）を用いて遺伝子を抽出、精製した。捕集量は初期試料で１０００ｍＬ、培養液で３０ｍＬとした。
【００７１】
［工程（２）：ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅］
抽出、精製した遺伝子を鋳型として、下記プライマーを用いてＰＣＲ法を行い、１６ＳｒＤＮＡ（１６Ｓ沈降速度を示すリボゾームＤＮＡ）のＶ３領域部位を増幅した。本実施例におけるＰＣＲ法は、精度を向上させる目的でＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを採用した。増幅したＤＮＡ断片はＤＧＧＥ法（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）によりＤＮＡ断片の回収、精製を行うため、２回目のＰＣＲにはＧＣクランプ付（ＧＣに富む配列）プライマー（３４１ＦＧＣ）を用いた。
【００７２】
本実施例におけるＰＣＲに使用したプライマーの配列を以下に示す。
９０７ｒ（配列番号１）：５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ−３’
３４１Ｆ（配列番号２）：５’−ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＣＡＧ−３’
３４１ＦＧＣ（配列番号３）：５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’
５３４Ｒ（配列番号４）：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’
また、本実施例におけるＰＣＲでは、複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）としてTakara Ex Taq（タカラバイオ社製）を用いた。
【００７３】
ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
１回目のＰＣＲは、抽出した遺伝子を鋳型として用い、プライマーとして３４１Ｆと９０７ｒを用いた。
また、ＰＣＲは以下に示すプログラムで行い、（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のサイクルを２５回行った。
９６℃：５分
９６℃：１分（Ｉ）
５５℃：３０秒（ＩＩ）
７２℃：３０秒（ＩＩＩ）
７２℃：５分
４℃：∞
【００７４】
２回目のＰＣＲは、１回目のＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片を鋳型として用い、プライマーとして３４１ＦＧＣ（ＧＣクランプ付）と５３４Ｒを用いた。また、ＰＣＲは以下に示すプログラムで行い、（ＩＶ）〜（ＶＩ）のサイクルを２５回行った。
９６℃：５分
９６℃：１分（ＩＶ）
５５℃：３０秒（Ｖ）
７２℃：１分（ＶＩ）
７２℃：５分
４℃：∞
【００７５】
［工程（３）：増幅ＤＮＡ断片の解析］
（工程（３）−１：アガロース電気泳動による増幅ＤＮＡ断片の確認）
２回目のＰＣＲの終了後、ＤＧＧＥゲル（変性剤濃度勾配ゲル）による電気泳動を行う前に、アガロースゲルによる電気泳動（以下、アガロース電気泳動という）を行ってＰＣＲによる増幅ＤＮＡ断片の有無を確認した。増幅ＤＮＡ断片の確認は、電気泳動後にアガロースゲルを１ｍｇ／μＬのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む緩衝溶液に浸漬してＤＮＡを染色した後、ＵＶトランスイルミネータ上でＤＮＡバンド（ＥｔＢｒで染色されたＤＮＡ断片）を確認することにより行った。
【００７６】
（工程（３）−２：増幅ＤＮＡ断片の解析）
アガロース電気泳動により確認した増幅ＤＮＡ断片について、ＤＣｏｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いたＤＧＧＥ法による解析を行った。電気泳動に使用したＤＧＧＥゲル中の変性剤（尿素、ホルムアミド）の濃度勾配は３０％から７０％まで変化するように設定した。また、ポリアクリルアミドの重合剤濃度は、濃度勾配の精度を高くする点から低濃度に設定した。さらに、各々のＤＮＡ断片（ＤＮＡバンド）の分離能を高めるために、電気泳動中の電圧を低くして、電気泳動時間を長く設定した。ＤＧＧＥ法における電気泳動の条件を表４に示す。表４中のＴＥＭＥＤは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンである。
【００７７】
【表４】
0005001187.tif 000005
【００７８】
ＤＧＧＥ法による電気泳動後、ＤＧＧＥゲルを１ｍｇ／μＬのＥｔＢｒを含む緩衝溶液に浸漬し、ＤＮＡを染色してＵＶトランスイルミネータ上でＤＮＡバンド（染色されたＤＮＡ断片）を確認した。実施例３、実施例４、比較例７、および初期試料についてのＤＧＧＥ法による解析結果を図６に示す。図６におけるレーンＭは、電気泳動による解析におけるマーカーとしてＤＮＡラダー製品であるDGGE MAKER II（ニッポンジーン社製）を電気泳動したものである。
【００７９】
［工程（４）：増幅ＤＮＡ断片の抽出・精製］
ついで、図６に示すように、真性細菌に特徴的であると思われる増幅ＤＮＡ断片（バンド番号１〜２４）をそれぞれＤＧＧＥゲルごと切り出して回収した後、それら各々のゲルをＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に一晩浸漬して、ＤＧＧＥゲル中の増幅ＤＮＡ断片をＴＥ溶液中に抽出した。
【００８０】
ついで、前記増幅ＤＮＡ断片の塩基配列の解析に不具合を生じる可能性のあるＧＣクランプ部分を除くため、鋳型としてＴＥ溶液中に抽出した各々の増幅ＤＮＡ断片、プライマーとして３４１Ｆと５３４Ｒを用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、ＧＣクランプが付加されていないＤＮＡ断片が得られる。
また、ＰＣＲは以下に示すプログラムで行い、（ＶＩＩ）〜（ＩＸ）のサイクルを２５回行った。
９６℃：５分
９６℃：１分（ＶＩＩ）
５５℃：３０秒（ＶＩＩＩ）
７２℃：３０秒（ＩＸ）
７２℃：５分
４℃：∞
【００８１】
ついで、ＰＣＲによる増幅ＤＮＡ断片（ＧＣクランプなし）についてアガロース電気泳動を行うことにより、目的ＤＮＡ断片（ＧＣクランプが取り除かれたＤＮＡ断片）を不純物（目的ＤＮＡ断片以外に増幅されたＤＮＡ断片）から分離させ、前記のＥｔＢｒを含む緩衝溶液で染色した後にＵＶトランスイルミネータ上で確認した。また、染色されたＤＮＡバンドの蛍光強度から目的ＤＮＡ断片の量を確認した。その後、それぞれの目的ＤＮＡ断片をアガロースゲルごと切り出し、QIAquickII Purification Kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）により抽出、精製した。
【００８２】
［工程（５）：精製ＤＮＡ断片の塩基配列の解析］
精製したＤＮＡ断片（以下、精製ＤＮＡ断片）を鋳型、３４１Ｆをプライマーとして用い、ダイターミネーター法キット（Big Dye Terminator v3.0 Cycle Sequencing、ＡＢＩ社製）により精製ＤＮＡ断片を鋳型にしたＤＮＡの伸長／停止反応（ＰＣＲ、プログラムはＤＮＡシークエンシング用のもの）を行った後、ABI Prism310 Genetic Analyzer（ＡＢＩ社製）により塩基配列の解析を行った。尚、３４１Ｆをプライマーとして用いた場合に塩基配列の解析が不充分であった精製ＤＮＡ断片については、５３４Ｒをプライマーとして用いて再度塩基配列の解析を行った。
【００８３】
［工程（６）：塩基配列の相同性解析］
各々の精製ＤＮＡ断片の塩基配列の解析結果をもとに、インターネットによりＤＤＢＪ（Data Bank of Japan、日本）、ＧｅｎＢａｎｋ（アメリカ合衆国）、ＥＭＢＬ（European Molecular Biology Laboratory、ヨーロッパ）のＤＮＡデータベースを参照して、精製ＤＮＡ断片の塩基配列とＤＨＣ属細菌遺伝子の塩基配列とに相同性が認められるか否かを解析した。
【００８４】
工程（６）における塩基配列の相同性解析の結果、バンド番号１９のＤＮＡ断片がＤＨＣ属細菌遺伝子の塩基配列と合致することがわかった。
また、この塩基配列の解析結果と工程（４）における蛍光強度からのＤＮＡ断片量の確認結果から、実施例３〜４および比較例７〜９における培養液中のＤＨＣ属細菌の数を見積もった結果を表５に示す。
【００８５】
【表５】
0005001187.tif 000006
【００８６】
表５に示すように、ＶＯＣの分解反応が促進された実施例３および４の培養液では、多くのＤＨＣ属細菌が増殖していることがわかった。また、比較例７〜９では、ＤＨＣ属細菌の増殖はほとんど確認できなかった。
【００８７】
＜現地実証試験＞
四塩化炭素（ＣＣｌ４）汚染が確認されている工場敷地内において、本発明の浄化方法の現地実証試験を実施した。浄化資材は、炭酸水素アルカリ金属塩として炭酸水素ナトリウム、カルボン酸のアルカリ金属塩としてＤＬリンゴ酸ナトリウムを用い、これらを水道水に溶解した浄化資材水溶液を使用した。
【００８８】
対象汚染地層内に設置した観測井戸の地下水流向の上流側の３ｍ離れた地点に、浄化資材注入用の井戸管（以下、注入井戸という）を掘削して設置した。この注入井戸に浄化資材水溶液を注入することにより、地下水の流れを利用して汚染地層領域に浄化資材成分を拡散させ、一定期間経過後に対象汚染地層におけるＶＯＣの浄化性能を評価した。
【００８９】
観測井戸および注入井戸には、いずれも砂質帯水層に相当する地表面から深度４〜６ｍの範囲に開口部分（ストレーナー）が設けられている。この注入井戸に浄化資材水溶液５０００Ｌ（浄化資材０．４％、４ｋｇ／１０００Ｌ）を１０日間に渡って、水頭圧による自然流下により注入した。
浄化資材水溶液は、水道水１０００ＬにＤＬリンゴ酸ナトリウム２．５ｋｇ（１８．７モル）と炭酸水素ナトリウム１．５ｋｇ（１７．９モル）を溶解し、浄化資材水溶液中の炭酸水素ナトリウムとＤＬリンゴ酸との比率をほぼ１：１として調製したものを使用した。
浄化資材水溶液の注入開始後から１０週間後までの間、観測井戸におけるＣＣｌ４、クロロフォルム、ジクロロメタンの地下水濃度を２〜３週間おき（３週後、６週後、８週後、１０週後）に測定した。地下水の水質を測定した結果を表６および図７に示す。
【００９０】
【表６】
0005001187.tif 000007
【００９１】
表６および図７に示すように、本発明の浄化方法により、ＣＣｌ４により汚染された対象汚染地層および地下水を高度に浄化することができた。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の浄化方法によれば、土壌や地下水中にもともと存在する有用な嫌気性細菌を容易に活性化し、ＶＯＣの分解反応を促進させて汚染土壌・地下水を早期に浄化することができる。特に、該浄化資材を用いて原位置でのバイオスティミュレーション工法を実施する場合、一般に分解速度が緩やかで蓄積し易いｃｉｓ−ＤＣＥ、ＤＣＭ等の蓄積が少なく、速やかな土壌・地下水の浄化を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】実施例１〜２および比較例１〜６におけるＴＣＥ濃度の測定結果を示した図である。
【図２】実施例１〜２および比較例１〜６におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の測定結果を示した図である。
【図３】実施例３〜４および比較例７〜９におけるＴＣＥ濃度の測定結果を示した図である。
【図４】実施例３〜４および比較例７〜９におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の測定結果を示した図である。
【図５】本実施例における遺伝子解析の流れを示したフロー図である。
【図６】本実施例の遺伝子解析における、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片のＤＧＧＥ法による解析写真である。
【図７】本実施例の現地実証試験におけるＶＯＣ濃度の測定結果を示した図である。
【図１】
0005001187.tif 000008
【図２】
0005001187.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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