(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価する方法であって、
前記サルにおける配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型を検出する工程を含み、
前記多型が、該遺伝子における、４４５５Ｇ＞Ａ、４４５６Ｃ＞Ｔ、６０３３ＴＧ＞Ａ、９７７１Ａ＞Ｔ、１２１２９Ｔ＞Ｃ、１２１３８Ａ＞Ｇ、及び１２１４０Ｇ＞Ｔからなる群から選択されるいずれか１以上の多型であって、前記薬物代謝酵素の発現および／または機能を阻害または抑制するものである場合に、前記サルをモデル動物として試験することに対して肯定的な評価をする、方法。
【請求項２】
モデル動物として用いるために、薬物代謝パターンがヒトに近いサルを選択する方法であって、
サルにおける配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型を検出する工程を含み、
前記多型が、該遺伝子における、４４５５Ｇ＞Ａ、４４５６Ｃ＞Ｔ、６０３３ＴＧ＞Ａ、９７７１Ａ＞Ｔ、１２１２９Ｔ＞Ｃ、１２１３８Ａ＞Ｇ、及び１２１４０Ｇ＞Ｔからなる群から選択されるいずれか１以上の多型であって、前記薬物代謝酵素の発現および／または機能を阻害または抑制するものである場合に、モデル動物として前記サルを選択することを特徴とする、方法。
【請求項３】
モデル動物として用いるために、薬物代謝パターンがヒトに近いサルを選択する方法であって、
サルにおける配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素の発現および／または機能を測定する工程を含み、
前記薬物代謝酵素の発現および／または機能が欠失または抑制されている場合に、モデル動物として前記サルを選択することを特徴とする、方法。
【請求項４】
薬物代謝パターンがヒトに近いサルを作出する方法であって、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子において多型６０３３ＴＧ＞Ａをヘテロ接合体またはホモ接合体で有する個体を選択する第１工程と、
前記第１工程で選択された個体と、別の個体とを交配させる工程と、を含む、方法。
【請求項５】
薬物動態試験、薬効試験及び／又は安全性試験に用いられるサルであるモデル動物であって、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子において多型６０３３ＴＧ＞Ａをヘテロ接合体またはホモ接合体で有する、モデル動物。
【請求項６】
ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することを目的とする、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型であって、該遺伝子における、４４５５Ｇ＞Ａ、４４５６Ｃ＞Ｔ、６０３３ＴＧ＞Ａ、９７７１Ａ＞Ｔ、１２１２９Ｔ＞Ｃ、１２１３８Ａ＞Ｇ、及び１２１４０Ｇ＞Ｔからなる群から選択されるいずれか１以上の多型を含むことにより当該薬物代謝酵素の発現および／または機能が欠失または抑制されているサルの使用。
【請求項７】
サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価することを目的とする、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素の使用。
【請求項８】
サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価することを目的とする、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子、または多型６０３３ＴＧ＞Ａを含む該遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サル特異的な薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型、およびその多型を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、新薬開発の過程では、代謝のパターンがヒトに非常に似ていることから、サルをモデル動物として用いた代謝試験を含む薬物動態試験、薬効試験、安全性試験等が広く行われている。しかしながら、最近一部の薬物について、サルの代謝パターンがヒトの代謝パターンと異なる場合あるとの報告がなされている（非特許文献１〜４）。
薬物の代謝には、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）と呼ばれる酵素が深く関与している。ＣＹＰは遺伝子ファミリーを形成しており、ヒトではこれまでに５０種類を超えるＣＹＰ遺伝子の存在が報告され、他の哺乳動物も多くのＣＹＰ遺伝子を有することが知られている。ＣＹＰは、鉄イオンを配位したヘムタンパク質であり、各ＣＹＰの構造は極めて類似しているが、基質や代謝活性がそれぞれ異なっている。
ＣＹＰは、アミノ酸配列の相同性に基づいて分類され、各ＣＹＰは、例えば「ＣＹＰ１Ａ１」というようにＣＹＰに続けてファミリー名（数字）、サブファミリー名（アルファベット）、固有名（数字）を表記することによって特定される。
各ＣＹＰの基質が異なるとともに、最近では、各ＣＹＰの遺伝子多型ごとに代謝活性や基質特異性が異なることが報告されており（例えば特開２００４−４号公報；特許文献１）、薬効や毒性の発現に見られる、個体差、性差、年齢差、種差、人種差の原因の一つとして、ＣＹＰの分子種や多型に関する研究が進められている。
サルの中でも、カニクイザルの代謝パターンはヒトに非常によく似ていることから、薬物代謝酵素の活性もヒトと略同様であると考えられていた。しかしながら、これまでにカニクイザルのＣＹＰｃＤＮＡは６種類しかGenBankに報告されておらず、ヒトＣＹＰとの基質の違いや、サルの個体間での相違についてはほとんど知られていなかった。しかしながら、現に、ヒトとカニクイザルとで、代謝パターンの異なる薬物が存在することも明らかとなっている。
そこで、本発明者らは、カニクイザルの肝臓ｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトＣＹＰ遺伝子との相同性が比較的高い２１種類の異なるＣＹＰクローンを同定し、各クローンのｃＤＮＡについて全長の塩基配列を決定した。
そして、この中に、他のＣＹＰ遺伝子に比較して、ヒト遺伝子と相同性の低いＣＹＰ２Ｃ（以下「新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ」という）遺伝子が含まれることを見出し、この遺伝子は、カニクイザルを含む旧世界ザルおよび新世界ザルでは発現しているが、ヒトや大型類人猿には存在しないこと、カニクイザル肝臓で発現している全ＣＹＰに占める新規ｍｆＣＹＰ２Ｃの割合が推定で２８．０％と非常に高いこと等を確認した。
さらに新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質を、大腸菌を用いて発現させたところ、このタンパク質がある種の薬物に対して代謝活性を示すことを明らかにした。
【特許文献１】特開２００４−４号公報
【非特許文献１】Nartimatsu S. et al., Chem Biol Interact (2000) 127:73-90
【非特許文献２】Sharer JE. et al., Drug Metab Dispos (1995) 23:1231-1241
【非特許文献３】Stevens JC. et al., Drug Metab Dispos (1993) 21:753-760
【非特許文献４】Weaver RJ. et al., Xenobiotica (1999) 29:467-482
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒトに最も近い動物としてin vivoでの薬効、毒性の評価試験に使われてきたサルであるが、サル特異的な薬物代謝酵素である新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子の発見により、ヒトとの違いが遺伝子レベルで存在することが明らかとなってきた。
従って、サルを用いた薬物動態試験、薬効試験、安全性試験等の結果から、ヒトにおける薬物動態を推測し、ヒトにおける安全性を高めるためには、この酵素の薬物代謝への影響を適切に評価する必要があるとともに、この薬物代謝酵素の機能をできるだけ抑えることが望ましい。
そこで、本発明は、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃの薬物動態試験等への影響を適切に評価し、サルをモデル動物として用いることの是非を判断する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、さらに、モデル動物として用いるために、薬物代謝パターンがヒトに近いサルを選択する方法を提供すること、および薬物代謝パターンがよりヒトに近いサルを作出する方法を提供すること、を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するために、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子の機能が十分に抑制された個体、または当該遺伝子そのものが欠損された個体を作出若しくは選択することができれば、よりヒトに近いモデル動物として有用であると考え、まず、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子について網羅的な一塩基多型（Single Nucleotide polymorphism; ＳＮＰ）の検出を行った。その結果、エクソン３に存在する一塩基欠損型ＳＮＰを有する個体を見出すことに成功し、このＳＮＰが存在すると、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質が発現しないことを大腸菌を用いた発現系で確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価する方法であって、前記サルにおける配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型を検出する工程を含み、前記多型が、前記薬物代謝酵素の発現および／または機能を阻害または抑制するものである場合に、前記サルをモデル動物として試験することに対して肯定的な評価をする、方法；
〔２〕前記多型が、前記薬物代謝酵素をコードする遺伝子における、１４０Ｃ＞Ａ、１５１Ａ＞Ｃ、４３２６Ｇ＞Ｔ、４３４１Ｃ＞Ｔ、４３８９Ｇ＞Ａ、４４５５Ｇ＞Ａ、４４５６Ｃ＞Ｔ、６０３３ＴＧ＞Ａ、９７７１Ａ＞Ｔ、１０９２９Ａ＞Ｔ、１２０１５Ｇ＞Ａ、１２１２９Ｔ＞Ｃ、１２１３８Ａ＞Ｇ、１２１４０Ｇ＞Ｔ、１６５３７Ｔ＞Ａ、１６５４０Ｇ＞Ａ、１８９６２Ｃ＞Ｔからなる群から選択されるいずれか１以上の多型である、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕モデル動物として用いるために、薬物代謝パターンがヒトに近いサルを選択する方法であって、サルにおける配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型を検出する工程を含み、前記多型が、前記薬物代謝酵素の発現および／または機能を阻害または抑制するものである場合に、モデル動物として前記サルを選択することを特徴とする、方法；
〔４〕前記多型が、前記薬物代謝酵素をコードする遺伝子における、１４０Ｃ＞Ａ、１５１Ａ＞Ｃ、４３２６Ｇ＞Ｔ、４３４１Ｃ＞Ｔ、４３８９Ｇ＞Ａ、４４５５Ｇ＞Ａ、４４５６Ｃ＞Ｔ、６０３３ＴＧ＞Ａ、９７７１Ａ＞Ｔ、１０９２９Ａ＞Ｔ、１２０１５Ｇ＞Ａ、１２１２９Ｔ＞Ｃ、１２１３８Ａ＞Ｇ、１２１４０Ｇ＞Ｔ、１６５３７Ｔ＞Ａ、１６５４０Ｇ＞Ａ、１８９６２Ｃ＞Ｔからなる群から選択されるいずれか１以上の多型である、上記〔３〕に記載の方法；〔５〕モデル動物として用いるために、薬物代謝パターンがヒトに近いサルを選択する方法であって、サルにおける配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素の発現および／または機能を測定する工程を含み、前記薬物代謝酵素の発現および／または機能が欠失または抑制されている場合に、モデル動物として前記サルを選択することを特徴とする、方法；
〔６〕薬物代謝パターンがヒトに近いサルを作出する方法であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子において多型６０３３ＴＧ＞Ａをヘテロ接合体またはホモ接合体で有する個体を選択する第１工程と、前記第１工程で選択された個体と、別の個体とを交配させる工程と、を含む、方法；
〔７〕薬物動態試験、薬効試験及び／又は安全性試験に用いられるモデル動物であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子において多型６０３３ＴＧ＞Ａをヘテロ接合体またはホモ接合体で有する、モデル動物；
〔８〕ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することを目的とする、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子に多型を含むことにより当該薬物代謝酵素の発現および／または機能が欠失または抑制されているサルの使用；
〔９〕前記多型が、前記薬物代謝酵素をコードする遺伝子における、１４０Ｃ＞Ａ、１５１Ａ＞Ｃ、４３２６Ｇ＞Ｔ、４３４１Ｃ＞Ｔ、４３８９Ｇ＞Ａ、４４５５Ｇ＞Ａ、４４５６Ｃ＞Ｔ、６０３３ＴＧ＞Ａ、９７７１Ａ＞Ｔ、１０９２９Ａ＞Ｔ、１２０１５Ｇ＞Ａ、１２１２９Ｔ＞Ｃ、１２１３８Ａ＞Ｇ、１２１４０Ｇ＞Ｔ、１６５３７Ｔ＞Ａ、１６５４０Ｇ＞Ａ、１８９６２Ｃ＞Ｔからなる群から選択されるいずれか１以上の多型である、上記〔８〕に記載の方法；
〔１０〕サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価することを目的とする、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素の使用；および、
〔１１〕サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価することを目的とする、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子、または多型６０３３ＴＧ＞Ａを含む該遺伝子の使用、に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、サルの新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子の特定の多型、または新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質を検出することにより、当該サルをモデル動物として利用することの是非を評価することができる。また、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子、または新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の発現および／または機能が欠如または抑制されているサルは、薬物代謝パターンがよりヒトに近いと考えられるので、このようなサルを選択することにより、医薬品の開発により適したモデル動物を得ることができる。特に、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子において６０３３ＴＧ＞Ａで表される多型をホモ接合体で有する個体は、よりヒトに近い薬物代謝パターンを有するモデル動物として有用であるものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明に係る、サルをモデル動物としてヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価する方法は、サルにおける配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型を検出する工程を含むものである。
ここで、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素とは、本発明者らが見出した新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質である。このタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：３に、また新規ｍｆＣＹＰ２ＣのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に示す。尚、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃは、the Committee on Standardized P450 Nomenclatureにより、ＣＹＰ２Ｃ７６と名付けられたため、本願明細書および図面においてＣＹＰ２Ｃ７６と表記されることもある。
また、本明細書において「サル」とは、旧世界ザル、新世界ザル、原猿類等を含み、大型類人猿を除く霊長類を意味する。  発明者らは、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃを以下の方法によって見出した。
まずカニクイザル肝臓ｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトＣＹＰ遺伝子と高い相同性を持つｃＤＮＡについて全長の塩基配列を決定し、新規なもの含む２１種類のカニクイザルのＣＹＰ遺伝子を同定した。これらのＣＹＰ遺伝子のほとんどは、対応するヒトのＣＹＰ遺伝子との相同性が約９５％であったが、一つだけヒトＣＹＰ２ＣのｃＤＮＡと最大で７９％しか相同性を示さない遺伝子を発見し、これを新規ｍｆＣＹＰ２Ｃとした。
新規ｍｆＣＹＰ２Ｃがサル特異的な遺伝子であるのか、これまでにヒトのホモログが同定されていなかっただけなのかを確認するため、遺伝子特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、他の霊長類における新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子の有無を調べた。その結果、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子は、旧世界ザルまたは新世界ザル等、ヒトや大型類人猿を除く霊長類には存在するが、ヒトや、チンパンジーおよびオランウータンといった大型類人猿には存在しない新規な遺伝子であることが確認され、これを新規ｍｆＣＹＰ２Ｃとした。また、ヒトおよびチンパンジーのゲノム・データベースを用いてブラスト検索を行ったが、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃと９０％以上の相同性を示すＣＹＰ２Ｃ遺伝子は見出されず、このことも、本発明に係るタンパク質がサル特異的であることを支持する結果であった。
また、各組織由来のサンプルから全ＲＮＡを抽出し、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、１８Ｓ  ｒＲＮＡまたはβ−アクチン発現量で定量値を補正したところ、肝臓における発現量が圧倒的に多いが、他のＣＹＰ２Ｃが発現しない心臓、筋肉、脳、精巣等にも少量の発現が見られ、また雄と雌で約２倍の発現量の差があることが認められた。
さらに、カニクイザル肝臓ｃＤＮＡライブラリー中における各ＣＹＰ遺伝子のコピー数を全ＣＹＰ遺伝子のコピー数で割ることによって算出した、カニクイザル肝臓で発現している全ＣＹＰに占める新規ｍｆＣＹＰ２Ｃの推定の割合は、２８．０％と非常に高いことが明らかとなった。
新規ｍｆＣＹＰ２Ｃは、例えば、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子を適当なベクターに挿入し、このベクターを用いて宿主を形質転換することによって発現させ、得ることができる。
本発明者らは、こうして得た組換え新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質が、tolbutamideおよびtestosteroneに対して代謝活性を示し、S-mephenytoinおよびtaxolに対しては示さないことを確認した。【０００７】
本発明において「配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素」とは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素と同一の機能を有する限り、１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されている等の変異が生じているものも含む。
従って、「配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素をコードする遺伝子」も、当該遺伝子がコードするタンパク質が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素と同一の機能を有する限り、配列番号：１または３に記載の塩基配列において、１若しくは複数個（例えば、１〜１００個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されている等の変異が生じているものも含む。【０００８】
本発明に係る、サルをモデル動物としてヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価する方法では、サルの有する多型が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素の発現および／または機能を阻害若しくは抑制するものである場合に、そのサルをモデル動物として試験することに対し、肯定的な評価がなされる。
これまでに見出されたサルＣＹＰ遺伝子の中で、対応するヒトＣＹＰ遺伝子が存在しないものは、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子のみであることから、上述のように新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子が薬物代謝についてのヒトとサルの種差の一因となっている可能性が高い。また、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質が、ある種の薬物に対して代謝活性を有することは上述の通りである。従って、この遺伝子の発現および／または機能を阻害または抑制する多型を有しているサルは、薬物代謝パターンに関するヒトとの相違が、より小さいものと考えられる。【０００９】
本発明に係る、サルをモデル動物としてヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価する方法で検出する「多型」とは、新規mfCYP2C遺伝子の塩基配列上の変化を意味し、かかる変化は、薬物代謝酵素の発現および／または機能を阻害若しくは抑制する限り、塩基の付加、欠失、挿入、置換のいずれであってもよく、変化を生じる塩基の数も限定されない。変化の頻度が高いものを多型と呼び、低いものを変異と呼ぶ概念もあるが、本発明においては、多型と変異を区別しない。
本発明に係る方法で検出する多型としては、一の塩基のみが通常と異なる一塩基多型（ＳＮＰ）が好ましく、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子の発現を阻害または抑制するＳＮＰとしては、例えば、１４０Ｃ＞Ａ、１５１Ａ＞Ｃ、４３２６Ｇ＞Ｔ、４３４１Ｃ＞Ｔ、４３８９Ｇ＞Ａ、４４５５Ｇ＞Ａ、４４５６Ｃ＞Ｔ、６０３３ＴＧ＞Ａ、９７７１Ａ＞Ｔ、１０９２９Ａ＞Ｔ、１２０１５Ｇ＞Ａ、１２１２９Ｔ＞Ｃ、１２１３８Ａ＞Ｇ、１２１４０Ｇ＞Ｔ、１６５３７Ｔ＞Ａ、１６５４０Ｇ＞Ａ、１８９６２Ｃ＞Ｔ等が挙げられる。ここで、１４０、１５１等の数字は、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子において翻訳開始点を＋１として数えた場合の塩基配列の番号である。また、Ｔ＞Ｇ、Ｃ＞Ａは、それぞれＴがＧに置換されていること、ＣがＡに置換されていることを示す。６０３３ＴＧ＞Ａは、翻訳開始点を＋１番目としたときに６０３３番目のＴおよび６０３４番目のＧが欠失し、かわりにＡが挿入されていることを意味する。従って、６０３３ＴＧ＞Ａの場合には、フレームシフトが生じる。
本発明者らは、大腸菌を使用した発現実験において、６０３３ＴＧ＞Ａで表される多型を有する新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子からは、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質が発現しないことを確認した。
尚、翻訳開始点とは、配列番号：３で表される塩基配列の９６８番目のアデニン（Ａ）をいう。
６０３３ＴＧ＞Ａで表されるＳＮＰが含まれる新規ｍｆＣＹＰ２ＣのｃＤＮＡの配列を配列番号：１００に示す。
なお、ＳＮＰにより、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の合成が阻害または抑制されるかどうかは、例えば、サルの肝臓サンプルを用いて、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロットあるいは免疫組織化学染色等、当業者であれば公知の方法に従って容易に確認することができる。【００１０】
本発明に用いられる多型の検出方法は、特に限定されず、様々な公知の方法を採用することができ、例えば、以下のような方法を用いることができる。
１．ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法
特定の多型を有する遺伝子では、制限酵素による切断によって生じる断片の長さが異なることを利用して、多型を検出する方法である。検出しようとする多型を含む領域をＰＣＲによって増幅した後、増幅産物に変異部を認識する制限酵素を作用させ、断片を電気泳動法等により分離、同定する。生じた断片の長さから制限酵素による切断の有無、ひいては多型の有無を確認することができる。
２．ＡＳＰ（Allele Specific Primer）−ＰＣＲ
多型を含む領域にハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを行い、多型を有する場合、当該プライマーと鋳型ＤＮＡとの間にミスマッチが生じるため伸長反応が起こらないことを利用する方法である。増幅産物を電気泳動法等により分離、同定し、増幅の有無を確認することによって、試料ＤＮＡの多型の有無を知ることができる。
３．一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）法
サルから抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅した後、１本鎖に解離させると、１本鎖ＤＮＡは塩基対形成をはじめとする種々の分子ない相互作用で、塩基配列に依存した固有の高次構造をとり、わずかな塩基配列の違いが存在しても、高次構造が変化する。そのため１本鎖ＤＮＡをポリアクリル・アミド中で電気泳動すると、高次構造の違いに応じて移動度も異なり、この移動度の違いを検出することによって多型の有無を判定することができる。
４．変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）法
尿素、ホルムアミド等の変性剤の濃度に勾配をつけたポリアクリルアミドゲル上で、必要に応じて制限酵素等で処理したサル由来の被検ＤＮＡサンプルと、正常ＤＮＡ断片との混合物の電気泳動を行ってサンプルを分離する。多型に起因するミスマッチが存在すると、より低い濃度の変性剤で１本鎖に解離するため、ミスマッチのない２本鎖より泳動速度が速くなる。従って、正常ＤＮＡサンプルのバンドと比較することによって、１本鎖の存在の有無を検出することが可能となり、結果として多型の有無を検出することができる。
５．マイクロアレイを用いる方法
マイクロアレイ上に固定されたプローブＤＮＡと、サル由来のＤＮＡまたはＲＮＡサンプルとのハイブリダイゼーションを検出して、多型の有無を解析する方法である。ハイブリダイゼーションの有無を検出する方法や、プローブＤＮＡの３'末端を多型の予想される部位にあわせてハイブリダイゼーションさせ、標識したジデオキシヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼを添加して、伸長反応の有無を検出する方法等がある。標識は、蛍光色素、放射性物質、電気化学的に検出できる化合物等各種選択することができる。
６．Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法
シーケンス反応を化学発光で検出する方法である。サル由来の被検ＤＮＡをＰＣＲで増幅した後、１本鎖ＤＮＡを精製し、適当なプライマーをハイブリダイズさせてからデオキシヌクレオチドを一塩基ずつ添加する。伸長反応に伴って発生するピロリン酸がカスケード反応を開始させ、生じたＡＴＰによりルシフェリンを基質としてルシフェラーゼが発光する。この発光を検出することにより被検ＤＮＡの塩基配列を決定することができ、高精度に多型を検出できる（Alderborn, A. et ao.: Genome Res. (2000) 28:1249-1258）
その他、質量分析計（MALDI TOF-MS等）を用いて、質量の違いにより多型を検出する方法や、クエンチャーと蛍光色素によって標識されたアレル特異的オリゴと、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応を行ってタイピングするＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ等が挙げられる。【００１１】
本発明は、またモデル動物として用いるために、薬物代謝パターンがヒトに近いサルを選択する方法も提供する。上述のように新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子の発現および／または機能が阻害若しくは抑制されている個体においては、サル特異的な薬物代謝酵素の活性が阻害または抑制され、薬物代謝パターンがヒトに近いと考えられる。「多型」等の用語の意義や検出方法は上述のとおりであり、ここでは説明を省略する。
かかる変異はヘテロ接合体であってもホモ接合体であってもよいが、ホモ接合体を有するサルを選択することがより好ましい。
ここで、「薬物代謝パターンがヒトに近いサル」とは、代謝される薬物の種類や代謝産物等がヒトに類似し、薬物動態試験、薬効試験、毒性試験等の結果もヒトと近似したサルを意味する。このようなサルの試験結果からは、ヒトの試験結果を予測することができ、医薬品開発の過程で、ヒトを用いた臨床試験に先立って行われる前臨床試験等において有用である。
尚、本発明に係るモデル動物として用いるために、薬物代謝パターンがヒトに近いサルを選択する方法では、サルにおける新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の発現および／または機能を測定し、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の発現および／または機能が欠如または抑制されている場合に、そのサルをモデル動物として選択してもよい。新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の発現および／または機能が阻害または抑制されているかどうかは、例えば、サルの肝臓サンプルを用いて、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロットまたは免疫組織化学染色等、当業者であれば公知の方法に従って容易に確
認することができる。【００１２】
本発明はさらに、薬物代謝パターンがヒトに近いサルを作出する方法を提供する。具体的には、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子において６０３３ＴＧ＞Ａで表される多型をヘテロ接合体またはホモ接合体で有するサルを選択し、これらのサルと別のサルを交配させることによって、得ることができる。ヘテロ接合体−ヘテロ接合体、ヘテロ接合体−ホモ接合体、ホモ接合体−ホモ接合体、ヘテロ接合体−ワイルドタイプ、ホモ接合体−ワイルドタイプのいずれの組合わせであってもよい。
上記ＳＮＰを有する動物は、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子および新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の機能が欠失あるいは限りなく抑制された動物となり、非常にヒトに近いモデルとして、薬効・毒性評価試験等に有用である。
また、本発明は、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することを目的とする、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の発現および／または機能が阻害または抑制されているサルの使用方法をも提供する。このようなサルを使用した薬物動態試験、薬効試験、安全性試験はより信頼性が高く、ヒトの結果に近いものとして評価することができる。ここでサルを使用するとは、上記試験を行うことを目的として、医薬品候補化合物をサルに投与することを意味する。
また、本発明は、サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価することを目的とする、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の使用方法をも提供する。ここで、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の使用とは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにかかわらず、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質を検出すること、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質の活性を測定すること、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質とある種の化合物を反応させること等を意味するが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価することを目的とする、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子、または６０３３ＴＧ＞Ａで表される多型を有する新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子の使用方法をも提供する。ここで、遺伝子の使用とは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにかかわらず、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子を検出すること、上記多型を有する新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子を検出すること等を意味するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１３】
〔組織サンプルの調製およびRNAの抽出〕
組織サンプルは、6匹のカニクイザル（雄雌各3匹）、2匹のアカゲザル（雄）、2匹のコモン・マーモセットから採取した。
また、オランウータンとチンパンジーの組織サンプルも用意した。
RNA分解を防ぐため、すべてのサンプルは採取直後に液体窒素により凍結させ、液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いてすりつぶし、粉状にした。
続いて、Polytron PT1200E（Kinematica社）を用いて、粉状になった組織をTRIzol（Invitrogen社）中でホモジナイズし、製品の指示書に従って全RNAを抽出した後、電気泳動によってRNAサンプルの完全性（integrity）を確認した。抽出した全RNAは、DNase I（Takara株式会社）で処理した後、GenElute Mammalian Total RNA Mini Kit（Sigma-Aldrich社）により精製した。
一方、アフリカミドリザルのサンプルとしてのCOS1細胞（ATCCより入手）、及び、ヒト肝細胞のサンプルとしてのHepG2細胞（理化学研究所より入手）は、サイトウらの方法（Saito et al., J Biol Chem, (2001) 276:38010-38022）によって培養した。細胞からのRNA抽出と、それに続くDNase I処理は、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用い、製品の指示書に従って行った。
〔カニクイザルCYP2CのcDNAの単離〕
まず、カニクイザルの肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングにすることにより、ヒトCYPに相同的の高いクローンを同定した。同定したクローンについて、インサートの全長をPCRにより増幅した。PCRは、以下を含む全量20μlの反応液中で行った。
・プライマー（各0.4μM）
FW: 5'-TCAGTGGATGTTGCCTTTAC-3'  （配列番号：４）
RV: 5'-TGTGGGAGGTTTTTTCTCTA-3'  （配列番号：５）
・dNTP（0.22μM）
・MgCl2(2mM)
・AmpliTaq Gold Taq polymerase（Applied Biosystems社）(1 unit)
反応条件は、最初の変性を95℃10分で行った後、95℃20秒、55℃20秒、72℃3分のサイクルを35回繰り返し、最終伸長を72℃10分とした。
1％アガロースゲル上で解析した後、PCR産物を精製し、ABI Prism BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）による塩基配列解析に用いた後、ABI-3730 DNA Analyzer（Applied Biosystems社）を使用して電気泳動を行った。
〔配列解析〕
得られた配列データを配列解析のためにDNASIS Pro（Hitachi Software社）にインポートした。ベクターの配列をトリミングした後、すべてのデータを視覚的に精査し、配列の質が不適切な領域を除去してから、各配列を統合した。
ホモロジー・サーチは、BLAST program（National Center for Biotechnology Information）によって行った。相同性の高いCYPcDNA配列を識別するために、cDNAおよびアミノ酸配列についてClustral Wを用いたマルチプル・アライメントを実行した。
発明者らが見出した21のカニクイザルのCYPのうち、mfCYP2C9v1、mfCYP2C9v3および新規mfCYP2C、ならびに公知のカニクイザルCYP遺伝子であるmfCYP2C20のマルチプル・アライメントの結果を図２に示す。上段からmfCYP2C20（配列番号：６）、mfCYP2C9v1（配列番号：７）、mfCYP2C9v3（配列番号：８）、新規mfCYP2C（配列番号：９）である。
尚、新規mfCYP2C、mfCYP2C9v1、及びmfCYP2C9v3は、the Committee on Standardized P450 Nomenclatureにより、それぞれCYP2C76、CYP2C43、及びCYP2C75と名付けられ、GenBankに、accession number DQ074806、DQ074805、DQ074807としてそれぞれ登録された。本明細書および図面においては、新規mfCYP2C、mfCYP2C9v1、及びmfCYP2C9v3、CYP2C76、CYP2C43、及びCYP2C75のいずれの表記も用いられる。
新規mfCYP2CのcDNAの塩基配列（配列番号：１）を図１に示す。
新規mfCYP2CのcDNAは、アミノ酸数が489であるオープン・リーディング・フレームを有しており、これまでに知られているヒト及びサルのすべてのCYP2Cよりも一残基少なかった。塩基配列から推測されるアミノ酸配列は、疎水性が非常に高いN末端や、ヘム結合領域、6つの基質認識部位等（Gotoh, (1992), J. Biol Chem 267:83-90）、他のCYP2C分子に共通するアミノ酸配列を含んでいた。
cDNAの塩基配列を用いて、ヒト及びチンパンジーゲノムに対して、mfCYP2CホモログのBlat検索（UCSC Genome Bioinformatics）も行った。
相同性検索の結果を表１に示す。【００１４】
【表１】
0005063117.tif 000002
mfCYP2C9v1およびmfCYP2C9v3は、ヒトCYP2Cのアミノ酸に対して約92％の相同性を示し、これはCYP2C20等、公知のカニクイザルのCYP2C遺伝子と同じレベルであった。
しかしながら、新規mfCYP2Cのアミノ酸は、いずれのヒトCYP2Cのアミノ酸に対しても相同性が約71％しかなく、またGenBankデータベースにおいてもこれ以上の相同性を示すヒトcDNAは存在しなかった。
塩基配列の結果は、デフォルト・パラメータによるPHYLIPを使用して分子進化系統樹を描くためにも用いた。分子進化系統樹を図３に示す。この結果、新規mfCYP2C（CYP2C76）は、全てのヒトCYP2C及び他のカニクイザルCYP2Cから、離れたクレードに属することがわかった。
〔他の霊長類における新規mfCYP2Cに対応するcDNAのクローニング〕
そこで、新規mfCYP2Cが、サルに特異的に存在する遺伝子なのか、従来ヒトのホモログが見出されていないだけなのかを確認するため、いくつかの遺伝子特異的プライマーを用いてRT-PCRを行い、他の霊長類における、新規mfCYP2Cのorthologus遺伝子の有無を調べた。
他種のサルからの新規mfCYP2Cホモログは、肝（アカゲザル、コモン・マーモセット、オランウータンおよびチンパンジー）またはCOS1細胞（アフリカミドリザル）由来のRNAサンプルを用いて、RT-PCRにより同定した。RT反応は、M-MLV reverse transcriptase（Toyobo社）を用い、1μgの全RNAとオリゴ（dT）プライマーまたはランダムプライマーを使用して、37℃で1時間行った。得られたRT産物は、25倍に希釈してPCRに供した。ヒトについては、市販の肝RT産物（BD Biosciences社）を使用した。いくつかのプライマーペアを試したところ、アカゲザル、ミドリザルおよびコモン・マーモセットのCYP2CホモログのcDNAは、それぞれ以下の塩基配列を有するプライマーペアにより増幅することができた。
アカゲザル
FW: mfCYP2C (5rt2) 5'-CCCAGCAATGGATCTCTTCA-3'  （配列番号：１０）
RV: mfCYP2C (3polyA2a) 5'-TGCCTAGACAGGTAGATAGGAGTG-3'  （配列番号：１１）
アフリカミドリザル
FW: mfCYP2C (5rt2) 5'-CCCAGCAATGGATCTCTTCA-3'  （配列番号：１０）
RV: mfCYP2C (3ex4b) 5'-GAAAAGTGGGATCACAGGGA-3'  （配列番号：１２）
コモン・マーモセット
FW: mfCYP2C (5ex2a) 5'-GTATTTTCTGGCCGAGGGAG-3'  （配列番号：１３）
RV: mfCYP2C (3ex4a) 5'-ACAGGGAACACAACCCAGAA-3'  （配列番号：１４）
増幅は、KOD Plus DNA polymerase（Toyobo社）を使用してMJ Research thermal cycler（MJ Research社）によって行い、最初の変性を95℃2分で行った後、95℃20秒、55℃20秒、72℃2分のサイクルを30回繰り返し、最終伸長を72℃10分とした。
3'A-overhangを付加した後、PCR産物を、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社）を用いてベクターにクローニングした。続いて、ABI Prism BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）を用いて、インサートの塩基配列解析を行い、ABI PRISM 3730 DNA Analyzer（Applied Biosystems社）により電気泳動を行った。
この結果、増幅産物は、旧世界ザル（カニクイザル、アカゲザル、アフリカミドリザル）および新世界ザル（コモン・マーモセット）には見られ、これらのサルが新規mfCYP2Cのホモログを有しており、互いに99％以上の相同性を有することが確認された。この結果は、これらのサルが進化系統的に近い種であることを示している。
結果を図４〜６に示す。図４および５はそれぞれ新規mfCYP2CのcDNAの塩基配列を示し、上段から、カニクイザル（配列番号：１５）、アカゲザル（配列番号：１６）、アフリカミドリザル（配列番号：１７）およびコモン・マーモセット（配列番号：１８）である。図６は新規mfCYP2Cタンパク質のアミノ酸配列を示し、上段から、カニクイザル（配列番号：２）、アカゲザル（配列番号：１９）、アフリカミドリザル（配列番号：２０）およびコモン・マーモセット（配列番号：２１）である。
一方、ヒトや、チンパンジーおよびオランウータン等の大型類人猿由来のサンプルからは検出可能なバンドが得られなかった（data not shown）。さらに、Blastによるヒトおよびチンパンジーのゲノム・データベース検索でも、新規mfCYP2Cに90％以上の相同性を有する遺伝子が発見されないことから、新規mfCYP2Cは、サル特異的であることが示された。
〔新規mfCYP2Cの遺伝子構造〕
エクソンとイントロンの構造を決定するため、4種類のmfCYP2C（mfCYP2C9v1、mfCYP2C9v3、CYP2C20および新規mfCYP2C)のcDNAの塩基配列を比較して、遺伝子特異的プライマーを各エクソン上に設計し、すべてのイントロンをlong PCRによって増幅した。PCRは、LA Taq PCR kit（Takara社）を使用し、5p moleのフォワードおよびリバースプライマー（表２）、0.5mMのdNTP、2mMのMgCl2、1単位のLA Taq polymerase（Takara株式会社）を用いて全量20μlとして行った。【００１５】
【表２】
0005063117.tif 000003
PCRは、95℃2分で変性させてから、95℃20秒、55℃30秒、72℃5分のサイクルを35回繰り返し、最終伸長を72℃20分として行った。0.8％アガロースゲル上で電気泳動した後、PCR産物はゲル精製し、TOPO TAまたはXL cloning kit（Invitrogen社）を使用して、製品の指示書に従ってベクターにクローニングし、配列解析した。
配列解析は上述の方法に従って行い、initial sequencingには、以下のM13フォワードおよびリバースプライマーを用いた。
プライマー
FW: M13FW 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'  （配列番号：３８）
RV: M13RV 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' （配列番号：３９）
すべてのイントロンの塩基配列はプライマーウォーキング法により完全に決定され、当該配列は、DNASIS Pro（Hitachi Software社）により、各イントロンの全長に統合された。
この結果、新規mfCYP2Cは約19.6kbにおよび（配列番号：３）、すべてのヒトCYP2Cと同様に9つのエクソンを有する遺伝子であることが確認された（図７）。エクソンおよびイントロンのサイズは、それぞれ142-693bp、937-4307bpであった。表３に示すように、エクソン（小文字）−イントロン（大文字）の境界のほとんどは、GU-AC則に従っていたが（太字）、イントロン8の5'スプライス部位はGUがGCに置換されていた。【００１６】
【表３】
0005063117.tif 000004
〔サルCYP2C遺伝子座のゲノム構造〕
新規mfCYP2Cの種特異性を確認するために、サルのCYP2C BACクローンを用いて、ゲノムにおける新規mfCYP2C遺伝子座を解析した。カニクイザルのBACライブラリーは入手不可能であったため、代わりにアカゲザルのBACライブラリーを使用した。
アカゲザルBACライブラリー（BACPAC）を、CYP2C9v3及び新規mfCYP2CのcDNAをプローブとしてスクリーニングし、CYP2Cを含むBACクローンを単離した。ライブラリー・フィルターとのハイブリダイゼーションは、BACPACの指示書に従って行い、プローブは、［α］32P-dCTP（Amersham Biosciences社）の存在下で、RadPrime DNA labeling system（Invitrogen社）を用いて合成した。同定されたBACクローンをBACPAC社より入手し、BAC DNAをDNA PhasePrepTM BAC DNA Kit（Sigma-Aldrich社）により精製した。各BAC DNAに含まれるCYP2C遺伝子を同定するため、精製されたDNAをテンプレートとして、AmpliTaq Gold DNA polymerase（Applied Biosystems社）及び各遺伝子の5'及び3'末端に特異的なプライマーを用いて、PCRを行った。
プライマーペアは、各遺伝子のエクソン1及び9で設計し、位置は、macaqueのcDNAとヒトのCYP2C遺伝子とを比較して決定した。相同性の高いCYP2C9v1及びCYP2C9v3では、設計したプライマーは遺伝子特異的な増幅パターンを示さなかった。そこで、macaqueゲノムデータを検索してこれらの遺伝子の遺伝子特異的indelを同定し、それらのindel（insertion/deletion）を認識するプライマーを設計した。
使用したプライマーを表４に示す。Grayらの方法（Gray IC et al., Genomics, (1995) 28:328-332）に従い、増幅パターンを用いてゲノムにおけるCYP2C遺伝子のアレンジメントを決定した。同様の目的で、BACPACの指示書に従い、DNAは、BAC end sequencing及びBamHIまたはEcoRIによる制限酵素マッピングにも用いた。
【表４】
0005063117.tif 000005
この実験の過程で、アカゲザルのゲノムの一部の配列が明らかにされ、ヒトCYP2C18遺伝子の塩基配列と非常に相同性が高い遺伝子が存在することがわかった。そこで、このCYP2C18様遺伝子に特異的なプライマーを設計して、BACクローンの増幅に使用した。
各遺伝子の増幅パターンから、5つのCYP2C遺伝子は、サルゲノムでは一つのクラスタ内に存在することがわかった（図８）。さらに、BAC end sequencing及び制限酵素マッピングにより、新規mfCYP2C（図中CYP2C76で表される）がそのクラスタの末端、即ち、ヒトゲノムにおけるCYP2Cクラスタとそれに隣接する遺伝子の間の領域に位置することが確認された。この結果は、新規mfCYP2C遺伝子が種特異的に存在することを強く裏付けるものである。
〔遺伝子発現の組織分布解析〕
新規mfCYP2C、CYP2C20、CYP2C9v1、及びCYP2C9v3の遺伝子発現の組織分布を決定するため、脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、空腸、精巣、卵巣及び子宮由来のRNAを用いて、リアルタイムRT-PCRを行った。
各遺伝子に特異的なプライマー及びTaqMan（登録商標）MGBプローブは、Primer Express sftware（Applied Biosystems社）を用いて設計し、Applied Biosystems社で合成された。各プライマー及びプローブの塩基配列を表５に示す。
【表５】
0005063117.tif 000006
プローブは、5'末端をFAM fluorescence reporter dyeにより標識した。RT反応は、ランダムプライマーを用いて行い、得られた反応産物を25倍に希釈してPCRに供した。PCRは、全量25μlとしてTaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用い、ABI Prism 7700 sequence detection system（Applied Biosystems社）により行った。各プライマーの最終濃度は、CYP2C20、及びCYP2C9v1は0.3μM、CYP2C9v3は0.9μM、新規mfCYP2Cは0.1μMとした。全CYP2Cに対し、プローブの最終濃度は0.25μMとした。サーマルサイクラーの条件は、50℃で2分、95℃で10分の後、95℃15秒、60℃1分を40サイクルとした。
すべてのCYP2C遺伝子に対し、アッセイの特異性の確認は、予想されたサイズの目的PCR産物が単一のバンドとしてゲル上にあらわれること、及び、標的遺伝子のcDNAプラスミドが、他のCYP2C遺伝子に対し少なくとも500倍増幅されることを確かめることにより、行った。各遺伝子の相対的な発現レベルは、Applied Byiosystems社製のキットにより、18SリボソームRNAレベルを測定することにより標準化した。各遺伝子について、少なくとも3回の増幅を行った。
結果を図９に示す。新規mfCYP2C（図中CYP2C76で表される）、肝臓における発現が圧倒的に多かったが、他の組織でも発現が見られた。また、追加の解析により、心臓、筋肉、脳等、通常P450が発現しない種々の組織においても新規mfCYP2Cの発現が見られ、また雄と雌では約2倍の発現量の差があることが認められた（図１０）。
〔新規mfCYP2C遺伝子のためのレポーター・プラスミドの構築および配列解析〕
Inverse PCRにより、5'フランキング領域を同定した。以下に、方法を説明する。まず、各カニクイザル由来のゲノムDNAの1μgをPstI存在下、37℃で一晩消化した。この生成物を、フェノール：クロロホルム（1：1）の溶媒で抽出精製した後、エタノール沈殿を行った。得られたDNAをLigation high（Toyobo社）を用いて16℃でセルフライゲーションさせた後、同様の方法で精製した。精製したDNAは、KOD plus DNA polymerase（Toyobo社）および新規mfCYP2C cDNA配列の5'末端をもとに設計した以下に示す2つのプライマーと共に、PCRに供した。
プライマー
FW: mfCYP2C (5inv3) 5'-TCCTCTCCCCGTTATTGGAA-3'  （配列番号：８８）
RV: mfCYP2C (3inv2) 5'-CACCAGGATGATGAAGAGATCC-3'  （配列番号：８９）
増幅したDNAを1％アガロースゲルでゲル精製した後、mfCYP2C（5inv3）を用いてシーケンスを行い、5'フランキング領域の最末端の塩基配列を決定した。この配列に基づき、2つのプライマーをさらに設計した。
プライマー
FW: mfCYP2C (5flk1aK) 5'-CGGGGTACCGCAGGCCAACATTCAAATTC-3'（配列番号：９０）
RV: mfCYP2C (3flk1aH) 5'-CCCAAGCTTGCTGGGCTCTTTGAAAAC-3'（配列番号：９１）
PCRは上述の方法で行い、PCR産物はpGL3-basicベクター（Promega社）にクローニングした。インサートの全長の塩基配列を決定した後、決定した配列では、TRANSFACを使用した調節エレメント探索を行い、構築物は、レポーターアッセイに用いた。
TRANSFACプログラムによる解析では、主要な肝臓の転写因子の結合部位が見出された（threshold score≧75.0）（図１１）。各結合部位の位置（location）は、転写開始部位をゼロとして示されている。
〔新規mfCYP2C遺伝子の5'フランキング領域のレポーターアッセイ〕
HepG2細胞を独立行政法人理化学研究所から購入し、Dulbecco's modified Eagle's Medium（日水製薬株式会社）に、10％のウシ胎児血清（Cambrex Bioscience Walkersville社）、非必須アミノ酸（ICN社）および1mMのピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）を添加した培地で、37℃5％CO2供給下で培養した。12ウェルのプレートに、2×105個/ウェルとなるように移した後、24時間インキュベートした。
次に、これらの細胞を、レポーター構築物（0.45μg）、pRL-SV40（0.05μg；Promega社；内部標準）により形質転換した（FuGENE6（Roche Diagnostics社）を使用）。アッセイの際、必要に応じて、肝臓の主要な転写因子であるHNF1α、HNF3βおよびHNF4αのoverexpression vectorを加えた。
48時間後、これらの細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、製品の指示書に従ってdual-luciferase assay（Promega社）に供した。
結果を図２２に示す。
すべての転写因子が新規mfCYP2Cの発現を著しく亢進させ、中でもHNF1αによる効果が最も大きかった。これらの結果は、新規mfCYP2C遺伝子の発現調節にこれらの転写因子が重要な機能を果たすことを示す。また、新規mfCYP2Cが、RT-PCRで解析した組織の中で、肝臓において高く発現していた結果と一致する。
〔E.Coliにおける4つのサルCYP2Cタンパク質の発現〕
新規mfCYP2C、mfCYP2C9v1、mfCYP2c9v3およびCYP2C20のcDNAを用いて、Iwataらの方法（Iwata, H. et al., Biochem Pharmacol (1998) 55:1315-1325）に従って各タンパク質を発現させた。タンパク質の発現レベルを上昇させるために、各cDNAのオープン・リーディング・フレーム（ORF）を、表６に示すプライマーとKOD Plus DNA polymerase（Toyobo績社）を用いて増幅することにより、N末端の8残基を、ウシCYP17のN末端の8残基であるMALLLAVFに置換した（Barnes, HJ et al., Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88:5597-5601）。【００１７】
【表６】
0005063117.tif 000007
NdeI認識部位とXbaI認識部位をそれぞれ含むフォワードおよびリバースプライマーを用いることにより、PCR産物を、Iwataらが、ヒト・レダクターゼcDNAと共発現させるようにpCWベクター（Barnes, HJ., Methods Enzymol (1996) 272:3-14）をもとに作製したベクターに直接クローニングした。本発明者らは、この構築物をそれぞれのcDNAの由来に因んで、pCW-CYP2C20/OR、pCW-mfCYP2C9v1/OR、pCW-mfCYP2C9v2/ORおよびpCW-新規mfCYP2C/ORと名付けた。
DH5α competent cells（Invitrogen社）を形質転換した後、インサートの塩基配列と配向性をシーケンシングにより確認した。バクテリアは、100μg/mlのアンピシリンを含むLuria-bertani broth中で一晩培養した後、Iwataらの方法（1998）に従って調整した。Terrific Brothで100倍に希釈し、200μg/mlのアンピシリン存在下、30℃で6時間から12時間、OD600が約0.6〜0.8になるまで培養した。
続いてイソプロピル-B-D-チオガラクトシド(IPTG)を最終濃度が1.5mMとなるように培養液に添加した。16時間から20時間後、公知の方法（Omura, T. et al., J Biol Chem (1964) 239:2379-2385）に従い、U-3000 spectrophotometer（Shimdzu社）を使用して、培養物のP450スペクトルを求めた。結果を図１３に示す。
P450の発現を確認した後、培養した細胞を採取し、細胞膜画分を調製した。そして、Iwataらの方法（1998）に従って、P450およびNAPDH-P450レダクターゼの濃度を測定した。
〔4つのサルCYP2Cの代謝活性〕
すべて組換えCYP2Cタンパク質を用いて、4つの基質、taxol、tolbutamide、S-mephenytoinおよびtestosteroneに対する新規mfCYP2C、CYP2C20、CYP2C9v1、及びCYP2C9v3の代謝活性を解析した。
反応混合物は、以下のように調製した。まず、14C-taxol (6μM)、14C-tolbutamide (100μM)、14C-testosterone (50μM)、14C-S-mephenytoin (50μM)と、サル肝ミクロゾーム若しくは精製した組換えCYP2Cとを、チューブに用意し、37℃で5分、インキュベートした。続いて、代謝反応を開始させるため、1.3mMのNADP+、3.3mMのグルコース-6-リン酸、0.4U/mlのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、および3.3mMの塩化マグネシウを溶解させた100mMリン酸ナトリウム緩衝液を含むNADPH再生系を添加した。最終濃度は、1mg protein/mL、または200pmol P450/mLであった。
taxolとtestosteroneについては37℃で15分、S-mephenytoinについては45分、tolbutamideについては60分インキュベートした後、等量のメタノールを加えて反応を停止させた。組換えmfCYP2Cタンパク質の場合は、いずれの化合物についてもインキュベーションは30分とした。反応終了後、サンプルは、遠心分離され、各アリコットは、乾燥するまで上清を蒸発させ、残渣を15μlのメタノールに溶解させた。
6α-hydroxytaxolと3-hydroxytaxolの分析は、藤野らの方法（Fujino, H. et al., J Chromatogr B Biomed Sci Appl (2001) 757:143-150）に従って行った。各上清2μlずつを、TLCプレート(Silicagel 60F254, 20x20 cm, Merck)にスポットし、展開溶媒（トルエン‐アセトン‐ギ酸(60:39:1,v/v/v)）と共に、溶媒蒸気で飽和させた水平なTLC展開槽に12cm展開した。
6β-hydroxytestosteroneの場合は、展開溶媒をジクロロメタン−アセトン（4:1,v/v）とし、16cm展開した。
4-hydroxytolbutamideは、Ludwigらの方法（Ludwig, E. et al., J Chromatogr B Biomed Sci Appl (1998) 707:347-350）に従って、展開溶媒をトルエン−アセトン−ギ酸(60:39:1,v/v/v)とし、10cm展開した。
S-mephenytoin 4-hydroxylase活性は、Shimadaらの方法（Shimada, T. et al., Anal Biochem (1985) 147:174-179）に従って測定し、展開溶媒をクロロホルム−メタノール−28％アンモニア(90:10:1,v/v/v)とし12cm展開した。
TLCプレートを乾燥し、phosphor imaging plate (IP)に接触させて12時間静置した。化合物と代謝産物の量の変化は、BAS-2500（富士フイルム社）を使用して測定した。放射性を示す代謝産物のRf値が、標識なしの標準に比較して明確に識別された。
結果を図１４に示す。レーン1はサルの肝ミクロゾーム、レーン2はCYP2C20、レーン3はCYP2C9v1、レーン4はCYP2C9v3、レーン5は新規mfCYP2Cである。
新規mfCYP2Cは、4つの基質のうち、tolbutamideとtestosteroneを代謝することが確認された。
これに対し、mfCYP2C20は、taxolを代謝したが、他の化合物に対しては代謝活性を有しなかった。また、mfCYP2C9v3はtolbutamide、S-mephenytoin、testosteroneを、mfCYP2C9v1は、S-mephenytoinとtestosteroneを代謝することが確認された。
新規mfCYP2C、mfCYP2C9v1、mfCYP2C9v3は、いずれもtestosteroneを基質とした代謝活性を示したが、代謝産物は同一ではなかった。
以上から、サル特異的な新規mfCYP2Cタンパク質が、ある種の薬物に対して代謝活性を示すことが確認された。このことは、新規mfCYP2Cがサルとそれ以外の霊長類における代謝パターンの相違の一因となっていることを示唆するものである。
〔抗新規mfCYP2C抗体の作製及びイムノブロッティング〕
新規mfCYP2Cに対するポリクローナル抗体は、このタンパク質の特異的なアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、このペプチドでウサギを免疫することによって、NeoMPS社（SanDiego,CA）で産生された。まず、4つのmfCYP2Cの配列を比較することによって選択した特異的なアミノ酸配列をもとに以下の2つのペプチドを合成した。
（A） H-CQLNTKNISKSISMLA-NH2  （配列番号：９８）
（B） H-CLYNAFPHLRVL-NH2  （配列番号：９９）
合成したペプチドは精製し、C末端のシステイン残基のチオール基を介してKeyhole Limpet Hemocyanin（キャリアタンパク質）に結合させ、New Zealand White Rabbitを免疫し、ウサギ抗新規mfCYP2C抗体を得た（図１５）。
遺伝子組換えP450タンパク質として、サルCYP2CからCYP2C20、CYP2C9v1、CYP2C9v3、及び新規mfCYP2C、またヒトCYP2CからCYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、及びCYP2C19（各1.0pmol）を10％SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Hybond-P filter（Amersham Biosciences社）上に移行した。このフィルターを用いて、ウサギ抗新規mfCYP2C抗体（1:250）、及びホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたロバ抗ウサギIgG抗体（SantaCruz Biotechnology社）を用いたイムノブロッティングを行った。製品の指示書に従い、ECL Western Blotting detection reagent（Amersham Biosciences社）により可視化したところ、抗体（Ａ）を使用した場合のみ、新規mfCYP2C（CYP2C76）に相当するバンドが1つのみ得られ、免疫特異性が確認された（図１６（Ａ））。
また、ヒト、チンパンジー、オランウータン、カニクイザル、及びアカゲザルの5種類の霊長類から調製した肝ミクロソームを使用した抗新規mfCYP2C（CYP2C76）抗体によるイムノブロッティングも行った。期待されたサイズのバンドが、カニクイザル及びアカゲザルのサンプルにおいてのみ確認され、新規mfCYP2C遺伝子の発現パターンと一致した結果が得られた（図１６（Ｂ））。
〔免疫組織化学〕
カニクイザルの肝臓の切片を用いて、標準的方法に従い、抗新規mfCYP2C抗体による免疫組織化学染色を行った。一次抗体は50倍に希釈し、切片に接触させて4℃で一晩放置した。結合した抗体を、EnVision+System及びliquid diaminobenzidine（いずれもDakoCytomation社）を用い、製品の指示書に従って検出した。スライドを、harris hematoxylinにより対照染色した。ネガティブ・コントロールとして、ウサギのpreimmune血清を一次抗体の代わりに使用した。免疫組織化学特異性を検証するために、抗体は、過剰量の新規mfCYP2C特異的ペプチド（0.05mg/ml）と共に4℃で一晩プレインキュベートし、一次抗体の代わりに使用した。この結果、肝細胞は強く染色されたが、胆管や血管の細胞は染色されなかった。ブロッキングペプチドまたは免疫前血清の存在下では、染色は見られず（図１７）、染色が新規mfCYP2Cに特異的であることが示唆された。
【実施例２】
【００１８】
〔DNAサンプルの調製〕
ゲノムDNAは、全血サンプルから、DNA Blood Kit（Gentra社）を使用して製品の指示書に従って調製した。血液は、雄25匹、雌48匹の計73匹のカニクイザルから採取した。これらのサルのうち、雄15匹、雌24匹はインドシナ半島に由来し、雄10匹、雌24匹はインドネシア由来であった。
〔多型の検出〕
新規mfCYP2C遺伝子の各エクソンを、表１に示す示される新規mfCYP2C遺伝子特異的なプライマーを使用して、イントロン−エクソンの境界と共にPCRで増幅した。表７に使用したプライマーを示す（配列番号：１０２〜１１９）。
【表７】
0005063117.tif 000008
インドシナ半島由来10匹、インドネシア由来4匹、を含む14個体から抽出したゲノムDNAをテンプレートとした。PCRは、1ngのゲノムDNA、5pmolのフォワードおよびリバースプライマー、並びに1unitのAmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems社)を含む計20μLの反応液中で行った。増幅にはMJ Research thermal cycler (MJ Research社)を使用し、最初の変性を95℃で10分行った後、95℃20秒、55℃30秒、72℃1分を30サイクル行い、最終伸長工程を72℃で10分とした。シーケンシングは、ABI Prism BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社)を使用してPCRを行った後、ABI PRISM 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems社)による電気泳動に供した。配列のデータは、DNASIS Pro (Hitachi Software社)により解析した。
14個体サンプルのダイレクト・シーケンスにより、カニクイザルの新規mfCYP2C遺伝子のエクソンに、アミノ酸置換を伴う SNPを含む45個のSNPが同定された。表８に17個のアミノ酸置換を伴うSNPを示す。
【表８】
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これらのnon-synonymous SNPの中に、基質認識部位（SRS）と推定される領域に位置するものが6つ（SRS1に4455G>A、4456C>T、SRS3に9771A>T、SRS5に12129T>C、12138A>G、および12140G>T）見出された。
また、6033TG>Aは、フレームシフトを引き起こすnull alleleであり、エクソン3内に終止コドンを生じさせる。これにより、欠失する領域は、ヘム結合領域、およびSRS1を除くすべての基質認識部位を含むタンパク質の全長の約4分の3にのぼり、このタンパク質は仮に翻訳されたとしても機能しないものと考えられる。6033TG>AのcDNAの塩基配列を配列番号：１００に示す。また、図１８に6033TG>Aによる変異のイメージを示す。グアニンの欠失によりフレームシフトが起こり、タンパク質合成は、155番目のアミノ酸部位で停止するものと考えられる。このアミノ酸配列を配列番号：１０１に示す。
〔新規mfCYP2C遺伝子における6033TG>Aの特性〕
6033TG>Aで表される多型を含む新規mfCYP2C遺伝子を、上述した〔E.Coliにおける4つのサルCYP2Cタンパク質の発現〕と同様の方法で発現させ、細胞膜画分を調製し、P450を測定した。結果を図１９に示す。図示されるように、ワイルドタイプでは450nmのピークが観察されたが、6033TG>Aで表される多型を含む新規mfCYP2C遺伝子を発現させた細胞ではこのピークが観察されず、新規mfCYP2Cタンパク質が機能的なP450としては発現していないことが示された。
さらに、インドシナ半島およびインドネシア由来の69個体からゲノムサンプルを調製し、スクリーニングを行ったところ、インドネシア由来の雄14匹、雌20匹のうちさらに1個体、6033TG>Aで表される多型を含むものが見出された。その結果、インドネシア由来のサルにおけるアレル頻度は0.0294と計算された。
一方、インドシナ半島由来の雄15匹、雌24匹の中に6033TG>Aで表される多型を含むものは発見されなかった。
上述のように、サル特異的に存在する新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質は、薬物代謝活性を有しており、この遺伝子が機能することによって、サルとヒトとの代謝パターンに種差が生じると考えられる。従って、このタンパク質の発現および／または機能が欠如または抑制されている個体は、ヒトの代謝パターンにより近い代謝パターンを示すことが予想され、モデル動物に適していることが解る。
このような変異をヘテロ接合体またはホモ接合体で有する動物を選択し、これらの動物同士、または野生型のサルと交配させることによって、本発明に係るモデル動物を作出することができる。交配は、自然交配であっても、人工授精等人為的な交配であってもよい。特にサルの場合は環境要因等により自然交配が困難な場合があり、かかる場合には人工授精を行う。人工授精は公知の方法に従って行うことができる。
こうして得られたモデル動物においては、サル特異的な新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子の機能が欠失または限りなく抑制されており、よりヒトに近い代謝パターンを有するモデルとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１上段は、新規mfCYP2CのcDNAの塩基配列（配列番号：１）を、下段は新規mfCYP2Cタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。枠で囲まれているのは、ヘム結合領域と推定される領域である。Alternative polyadenylationにより長い3'非翻訳領域をもつtranscript variantにおける延長部分（281塩基）には下線が引かれている。破線の引かれたアミノ酸配列は、抗新規mfCYP2C抗体を産生する際に用いたペプチドの配列である。cDNAは1666塩基長からなり、489アミノ酸残基のオープン・リーディング・フレームを含んでいる。
【図２】4種のサルCYP2Cタンパク質のアミノ酸配列のマルチプル・アライメントである。上段から、CYP2C20（配列番号：１１）、mfCYP2C9v1（配列番号：１２）、mfCYP2C9v3（配列番号：１３）、新規mfCYP2C（配列番号：１４）のアミノ酸配列を示す。新規mfCYP2Cは489アミノ酸残基を有し、他のサルCYP2Cタンパク質およびヒトCYP2Cタンパク質より1残基短い。
【図３】ニワトリ(c)、ヒト(h)、ブタ(pig)、イヌ(dog)、ウサギ(rab)、マウス(m)、カニクイザル（mf）、ラット(r)、のCYP2Cのアミノ酸配列を使用して描いた分子進化系統樹である。新規mfCYP2Cの配列は、ヒトよりも他の動物種のものに、より類似することが示された。
【図４】他のサルにおける新規mfCYP2CホモログのcDNAのマルチプル・アライメントである。上段から、カニクイザル（配列番号：１の一部）、アカゲザル（配列番号：１５）、アフリカミドリザル（配列番号：１６）、コモン・マーモセット（配列番号：１７）のcDNAの塩基配列を示す。配列の種差により、コード領域を完全に増幅できたのはアカゲザルだけであり、アフリカミドリザルおよびコモン・マーモセットについては、それぞれエクソン1-4およびエクソン2-4が増幅された。種間において、数個の残基が異なるのみであり、100％に近い相同性が見られた。
【図５】図１５の続きであり、他のサルにおける新規mfCYP2CホモログのcDNAのマルチプル・アライメントを示す。
【図６】他のサルにおける新規mfCYP2Cホモログのタンパク質のアミノ酸配列のマルチプル・アライメントである。上段から、カニクイザル（配列番号：２）、アカゲザル（配列番号：１８）、アフリカミドリザル（配列番号：１９）、コモン・マーモセット（配列番号：２０）の新規mfCYP2Cタンパク質ホモログのアミノ酸配列を示す。
【図７】各エクソン上で設計された遺伝子特異的プライマーを使用してlong-distance PCRを行い、全イントロンの配列を解析することにより決定した、新規mfCYP2Cのエクソン−イントロン構造である。新規mfCYP2C遺伝子は、ヒトCYP2C遺伝子と同様に、9つのエクソンを含んでいることが確認された。
【図８】CYP2C BACクローンのPCR増幅パターン、制限酵素マッピング、end-sequencingにより決定されたサルCYP2C遺伝子の構造を示す。尚、CYP2C9v1及びCYP2C9v3（図中それぞれCYP2C43及びCYP2C75と表される）は相互に相同性が高く、ゲノム上の位置が決定できなかったため、仮の順序で描かれている。サル特異的な新規mfCYP2C（図中CYP2C76と表される）は、CYP2Cクラスタの末端に位置するが、この位置は、ヒトのゲノムの対応する領域においては遺伝子と遺伝子の間の領域である。破線は明確な増幅が起こらなかったBACクローンを示す。
【図９】サルCYP2C遺伝子発現の組織分布を示す。10種類の組織サンプルから得た全RNAを使用して、リアルタイムRT-PCRを行った。すべてのCYP2Cについて肝臓での発現がもっとも高く、新規mfCYP2C（CYP2C76）の発現がもっとも顕著であった。
【図１０】雄と雌における新規mfCYP2Cの発現量の差を測定した結果である。雄の発現量は、雌の約2倍であった。
【図１１】TRNASFACプログラムによって同定された（threshold score≧75.0）、主な肝臓特異的転写因子（HNF1α、HNF3β、HNF4α）に対するDNA結合エレメントである。各エレメントの位置は、転写開始点をゼロとして計算されている。
【図１２】約1kbの5'フランキング領域をルシフェラーゼアッセイにより分析した。アッセイは、HepG2細胞中のpGL-1kb構築物を使用して行い、必要に応じて転写因子を加えた。全ての因子、特にHNF1αは、新規mfCYP2Cの発現を著しく亢進させた。
【図１３】大腸菌における組換え新規mfCYP2Cタンパク質の発現を確認するCO-difference spectraである。P450タンパク質に特有のピーク(450nm)が確認できる。
【図１４】E.Coli中で発現させたサルCYP2Cの代謝活性を示す。レーン1〜5は、それぞれサル肝ミクロゾーム、CYP2C20、CYP2C9v1、CYP2C9v3、及び新規mfCYP2Cを示す。
【図１５】図１に示されるアミノ酸配列を有する合成ペプチドでウサギを免疫して作製した抗体である。図２５Ａは、ペプチドH-CQLNTKNISKSISMLA-NH2（配列番号：２９）を抗原として、同図Ｂは、ペプチドH-CLYNAFPHLRVL-NH2（配列番号：３０）を抗原として得られた抗体である。
【図１６】Ａ．抗新規mfCYP2C抗体を使用したイムノブロッティングの結果を示す。サル及びヒトの8種類のP450を電気泳動後PVDFフィルターに移行させ、抗新規mfCYP2C抗体を結合させた。新規mfCYP2C（CYP2C76）のバンドのみが検出できた。Ｂ．Ａと同様の方法で、複数の動物の肝ミクロゾームにおける新規mfCYP2Cのホモログを探索した。コントロールとしてのPDIタンパク質は、全てのサンプルにおいて検出されたが、新規mfCYP2Cタンパク質は、カニクイザルとアカゲザルのみでしか検出されなかった。
【図１７】肝における新規mfCYP2Cタンパク質の免疫組織化学染色の結果を示す。（Ａ）は、抗新規mfCYP2C抗体による免疫染色、（Ｂ）は、ペプチドブロッキングによる前処理を行った場合、（Ｃ）は、免疫前染色を行った場合の結果を示す。肝細胞における強い染色が確認されたが、胆管（矢印）及び静脈（三角）の上皮細胞では確認されなかった。（Ｂ）および（Ｃ）ではほとんど染色されなかった。実線のスケールは100μmを示す。
【図１８】6033TG>Aで表される多型のイメージを示す。6085番目のTと6086番目のGがA1塩基になるため、1塩基分の欠失が生じてフレームシフトが起こる結果、約150アミノ酸からなるペプチドしか合成されず、薬物代謝酵素として機能するために必要なヘム結合領域は合成されない。
【図１９】E.Coliを用いてカニクイザルのワイルドタイプの新規mfCYP2C遺伝子（Ａ）、およびを含む新規mfCYP2C遺伝子（Ｂ）を発現させ、450nmの吸収極大を測定した結果を示す。（Ｂ）では、450nmの吸収極大が観察されず、P450タンパク質が発現していないことが示された。
【図２０】6033>TGで表される多型を含むcDNAの塩基配列（下段）とワイルドタイプのcDNAの塩基配列との比較を示す。エクソン３において下向きの黒三角で示される位置に1塩基の欠失が存在する。
【図２１】図２０の続きであり、6033TG>AのcDNAの塩基配列（下段、配列番号１００）とワイルドタイプのcDNAの塩基配列（上段、配列番号：１の1番目-1666番目まで）との比較を示す。エクソン３において下向きの黒三角で示される位置に1塩基の欠失が存在する。
【図２２】多型のアミノ酸配列（配列番号：１０１）を示す。151番目の残基でフレームシフトが生じる結果、タンパク質が合成されたとしても、機能を有するヘム結合領域が欠失したものとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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