(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン（collagen）、脱灰骨材（a demineralized bone material）、酸および水を含むパテ状材料であって、該パテ状材料のｐＨが3.0〜6.0であり、該酸は、該コラーゲン100mgあたり0.05mmol〜2.3mmol含有され、該コラーゲンが、該パテ状材料の水を含めない重量の１重量％〜１０重量％であることを特徴とするパテ状材料。
【請求項２】
コラーゲンと、骨誘導物質と、酸とを含み、さらに水を含有させてｐHが3.0〜6.0のパテ状材料とするための骨形成組成物であって、該酸を該コラーゲン１００mgあたり0.05mmol〜2.3mmol含有することを特徴とする骨形成組成物。
【請求項３】
コラーゲンと、酸と、活性成分と、脱灰骨材（demineralized bone material）と、水とを混合してパテ状材料を形成する工程を有し、該酸を、該コラーゲン100mgあたり0.05mmol〜2.3mmol添加し、該パテ状材料のｐＨが3.0〜6.0の間であることを特徴とするパテ状材料の製造方法。
【請求項４】
該コラーゲンが、原線維コラーゲン（fibrillar collagen）、アテロペプチドコラーゲン（atelopeptide collagen）、テロペプチドコラーゲン（telopeptide collagen）およびトロポコラーゲン（tropocollagen）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１のパテ状材料。
【請求項５】
該コラーゲンが、原線維コラーゲン（fibrillar collagen）、アテロペプチドコラーゲン（atelopeptide collagen）、テロペプチドコラーゲン（telopeptide collagen）およびトロポコラーゲン（tropocollagen）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項６】
該コラーゲンが、原線維コラーゲン（fibrillar collagen）、アテロペプチドコラーゲン（atelopeptide collagen）、テロペプチドコラーゲン（telopeptide collagen）およびトロポコラーゲン（tropocollagen）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。
【請求項７】
該コラーゲンが牛I型コラーゲン（bovine Type I collagen）であることを特徴とする請求項１のパテ状材料。
【請求項８】
該コラーゲンが牛I型コラーゲン（bovine Type I collagen）であることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項９】
該コラーゲンが牛I型コラーゲン（bovine Type I collagen）であることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。
【請求項１０】
該酸が、アスコルビン酸（ascorbic acid）、酢酸（acetic acid）、アセチルサリチル酸（acetyl salicylic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、サリチル酸（salicylic acid）および塩酸（hydrochloric acid）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１のパテ状材料。
【請求項１１】
該酸が、アスコルビン酸（ascorbic acid）、酢酸（acetic acid）、アセチルサリチル酸（acetyl salicylic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、サリチル酸（salicylic acid）および塩酸（hydrochloric acid）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項１２】
該酸が、アスコルビン酸（ascorbic acid）、酢酸（acetic acid）、アセチルサリチル酸（acetyl salicylic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、サリチル酸（salicylic acid）および塩酸（hydrochloric acid）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。
【請求項１３】
該酸が塩酸であることを特徴とする請求項１のパテ状材料。
【請求項１４】
該酸が塩酸であることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項１５】
該酸が塩酸であることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。
【請求項１６】
さらに活性成分を含有することを特徴とする請求項１のパテ状材料。
【請求項１７】
さらに活性成分を含有することを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項１８】
活性成分が、骨誘導物質、成長因子、軟骨誘導因子、血管新生因子、ホルモン、抗生物質および抗ウィルス性化合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１６のパテ状材料。
【請求項１９】
活性成分が、骨誘導物質、成長因子、軟骨誘導因子、血管新生因子、ホルモン、抗生物質および抗ウィルス性化合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１７の骨形成組成物。
【請求項２０】
活性成分が、骨誘導物質、成長因子、軟骨誘導因子、血管新生因子、ホルモン、抗生物質および抗ウィルス性化合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。
【請求項２１】
該活性成分が、骨誘導物質であることを特徴とする請求項１６のパテ状材料。
【請求項２２】
該活性成分が、骨誘導物質であることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。
【請求項２３】
該骨誘導物質に含まれる骨誘導因子が、骨成長蛋白、BMP 1-13、OP1とからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１８のパテ材料。
【請求項２４】
該骨誘道物質に含まれる骨誘導因子が、骨成長蛋白、BMP 1-13、OP1とからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項２５】
該骨誘導物質に含まれる骨誘導因子が、骨成長蛋白、BMP 1-13、OP1とからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２０のパテ状材料の製造方法。
【請求項２６】
該成長因子が、b-FGFおよびTGF-betaとからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１８のパテ状材料。
【請求項２７】
該成長因子が、b-FGFおよびTGF-betaとからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１９の骨形成組成物。
【請求項２８】
該成長因子が、b-FGFおよびTGF-betaとからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２０のパテ状材料の製造方法。
【請求項２９】
無菌であることを特徴とする請求項１のパテ状材料。
【請求項３０】
無菌であることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項３１】
エチレンオキサイドでの殺菌により製造されることを特徴とする請求項２９のパテ状材料。
【請求項３２】
エチレンオキサイドでの殺菌により製造されることを特徴とする請求項３０の骨形成組成物。
【請求項３３】
ガンマ放射線に曝露して殺菌することにより製造されることを特徴とする請求項２９のパテ状材料。
【請求項３４】
ガンマ放射線に曝露して殺菌することにより製造されることを特徴とする請求項３０の骨形成組成物。
【請求項３５】
乾燥していることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項３６】
ゲルであることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項３７】
さらに水を含有することを特徴とする請求項２の骨形成組成物。
【請求項３８】
骨誘導物質が脱灰骨材を含有することを特徴とする請求項２、３０、３５、３６、３７の骨形成組成物。
【請求項３９】
さらに、該パテ状材料を殺菌する工程を有することを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。
【請求項４０】
該殺菌工程で、該パテ状材料をガンマ放射線に曝露することを特徴とする請求項３９のパテ状材料の製造方法。
【請求項４１】
さらに、該パテ状材料がゲルを減圧凍結乾燥する工程を有することを特徴とする請求項３、３９のパテ状材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、活性化合物を患者に与えるための移植可能なパテ状材料に関するものである。
従来の技術
各種の移植材料が、患者に活性物質を付与するのに使われてきた。例えば、この種の材料は、骨の修復にも用いることができる。典型的には、これらの材料を所望の部位に移植して、骨の成長を促す。この種の材料は、移植部位に固着し、順応する性質を持ち、骨の成長を助長するのが理想である。
米国特許第５，３１４，４７６号及び第５，０７３，３７３号は、脱灰骨粒子及びグリセリンのようなポリヒドロキシ化合物、あるいはオリゴ糖を含む変形容易な形体維持性骨形成組成物を開示している。
米国特許第５，４０５，３９０号および第５，２３６，４５６号には、脱灰や熱により改質された骨組織由来の表面接着性骨形成組成物が示されている。この組成物は、粉末、粘稠な液体の形、あるいは直接注入により投与される。
米国特許第５，２４６，４５７号は、燐酸カルシウム塩と再構成された原線維アテロペプチドコラーゲンを含有する骨修復組成物を示している。この化合物には、如何なる生物学的活性成分も含まれていない。物理的および取り扱い特性は、熱、湿潤混合物の飽和、コラーゲンの特殊な架橋を含め、多くの硬化過程により改善されている。
米国特許第４，４４０，７５０号では、脱灰骨粉と天然のアテロペプタイドコラーゲン繊維を含む骨形成組成物を開示している。このコラーゲン繊維は、実質的に生理的ｐＨとイオン強度を有する連続水相で再構成されている。
米国特許第４，９７５，５２６号は、蛋白抽出脱灰骨粉と基質内の粒子間空隙を増加させる膨潤剤とを含有する基質材料を示している。
米国特許第４，３９４，３７０号では、骨欠損を治療する骨移植材料が示されている。この材料は、コラーゲンと脱灰骨粒子とを含有し、スポンジ状である。
上記を含め、現在知られている移植用材料は、粘着性、弾力性及び所望の形状への成形性といった組織特性において受け入れ難い。さらに、米国特許第５，３１４，４７６号や第５，０７３，３７３号で開示されているような、他のペースト状材料は、前記のようにグリセリンのごとき有機溶媒を必要とする。
したがって、改善された取り扱い特性を有し、かつ有機溶媒を必要としない骨誘導物質が必要である。
課題を解決するための手段
本発明のひとつの実施の形態は、コラーゲンと水とを含有するパテ状材料であって、パテ状材料が約3.0〜約6.0のｐＨを有する。本発明の材料は、優れた物理的性質と取り扱い特性を有する。パテ状材料のコラーゲンは、原線維コラーゲン（fibrillar collagen）、アテロペプチドコラーゲン（atelopeptide collagen）、テロペプチドコラーゲン（telopeptide collagen）、およびトロポコラーゲン（tropocollagen）からなる群から選択できる。このパテ状材料は、酸を加えて成形できる。酸は、アスコルビン酸（ascorbic acid）、酢酸（acetic acid）、アセチルサルチル酸（acetyl salicylic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、サルチル酸（salicylic acid）、および塩酸（hydrochloric acid）からなる群から選択する。また、このパテ状材料は活性成分を含むことができる。活性成分は、例えば骨誘導物質、成長因子、軟骨誘導因子、血管新生因子、ホルモン、抗生物質、および抗ウイルス性化合物からなる群から選択される。
本発明の他の実施形態は骨形成組成物で、コラーゲン、骨誘導物質、および酸を含有している。この骨形成組成物は、コラーゲン100mgあたり約0.05mmol〜約2.3mmolの酸を含有する。
また、本発明の他の実施形態は、牛腱Ｉ型コラーゲン、アスコルビン酸、水、骨成長蛋白、および脱灰骨材を含む骨形成組成物にある。
さらに、本発明の他の実施形態は、コラーゲンと酸と水とを混合してゲルを得、ゲルに脱灰骨材を加えて骨形成パテを得、骨形成パテのｐＨ値が約6.0以下である工程を含む方法で製造される組成物にある。
また、本発明の他の実施形態は、コラーゲンと、酸と、骨誘導物質と、水とを混合してゲルを形成し、ゲルを減圧凍結乾燥させる工程を有する乾燥骨誘導組成物の製造方法にある。
本発明の他の実施形態は、患者への活性化合物の投与方法にあり、この投与方法は、コラーゲンと酸とを混合して、ｐＨ値が約3.0〜約6.0である組成物を得ることにより担体を調製し、担体に活性物質を入れ、担体を患者の体内の所望の部位に移植するステップを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からのアスコルビン酸の揮発性を示す。
第２図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からのリンゴ酸の揮発性を示す。
第３図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からの酢酸の揮発性を示す。
第４図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からの乳酸の揮発性を示す。
第５図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からのグリコール酸の揮発性を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、コラーゲンと水とを含有する材料組成物に関する。本発明の材料は、パテ状粘稠物で、所望の形に成形できる。また、本発明は、骨の形成を誘起するといった生物学的反応または活動を刺激し、引き起すために、体内にこの材料を移植する方法に関する。特に、本発明の材料は、骨欠損がある人や動物に移植するのに適しており、欠損が治療するように骨組織の再生を誘導するためのものである。
本発明のコラーゲン成分としては、原線維コラーゲン、アテロペプチドコラーゲン、テロペプチドコラーゲン、またはトロポコラーゲンが好ましく、各種の哺乳動物から集めることができる。アテロペプチドコラーゲンとトロポコラーゲンを作る方法は、米国特許第４，４４０，７５０号（Glowacki et al）に記載されており、その全文をここに挿入する。このコラーゲンは、好ましくは哺乳類コラーゲンである。このコラーゲンは、さらに好ましくは、牛Ｉ型コラーゲンおよび豚牛Ｉ型コラーゲンからなる群から選ばれる。もっとも望ましいのは、精製された原線維牛腱Ｉ型コラーゲンである。本発明の材料または組成物におけるコラーゲンの望ましい量は、（水を加えない状態での）約1重量%〜約10重量%であり、さらに望ましくは約2重量%〜約8重量%であり、最も望ましいのは約3重量%〜約5重量%である。
本発明の材料及び組成物は、約3〜約6のｐＨを有し、望ましくは約3.5〜約5の間で、最も望ましいのは約3.8〜約4.6である。材料のｐＨは、「Orion Co.（Boston, MA）」から出されている「Ross平坦表面電極」を使用し、材料表面に平坦なｐＨ電極を置き測定する。材料のｐＨ値が上記値内にあれば、その材料は、弾力性があり練り生地状のパテ状粘稠性といった優れた物質的な特性を有していることが分かる。高いｐＨでは、材料は湿った砂のように脆くなる。パテ状の粘性は、高い接着性、取り扱い易さ、成形容易性といった多くの利点があるので望ましい。また本発明の材料は接着性であるので、接着性の低い材料に比べて、移植した部位に活性化合物を長く保持する利点を提供するものと考えられる。
本発明の材料の望ましいｐＨ値は、酸をコラーゲンに加え、材料を形成することによって達成される。本発明において使用される用語「酸」は、水より低いpKa値を有する化合物を言い、用語「酸性プロトン」とは、そのpKa値が水より低いプロトンを意味する。本発明に用いる好適な酸は、フェノール（phenols）類やカルボン酸（carboxylic acids）類といった有機酸、及び塩酸（hydrochloric acid）、燐酸（phosphoric acid）、硫酸（sulfuric acid）といった無機酸を含む。酸は、好ましくは有機酸、塩酸もしくは燐酸であり、酢酸（acetic acid）、アスコルビン酸（ascorbic acid）、アスパラギン酸（aspartic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、塩酸（hydrochloric acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、燐酸（phosphoric acid）、サルチル酸（salicylic acid）、および酒石酸（tartaric acid）からなる群から選択される。さらに望ましい酸としては、アスコルビン酸（すなわちビタミンC）、酢酸、アセチルサルチル酸、安息香酸塩、クエン酸、グルタミン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、サルチル酸、および塩酸からなる群から選択される。最も望ましい酸は、アスコルビン酸、クエン酸、リンゴ酸、および乳酸からなる群から選択される。
酸は、望ましい物理的特性を持つ材料を製造するのに、適度な量で加えるべきである。材料中に存在する酸の好ましい量は、コラーゲン１００ｍｇ当たり、約0.05ミリモル当量（以後「eq. mmol」という）から約2.30eq. mmolであり、さらに好ましくはコラーゲン１００ｍｇ当たり約0.1eq. mmolから約1.5eq. mmolであり、最も望ましくは、コラーゲン１００ｍｇ当たり約0.2eq. mmolから約1.5eq. mmolである。ここで用語「ミリモル当量」とは、酸一分子中にある酸性プロトンの数で除したmmolでの酸の量を言う。例えば、リンゴ酸などのいくつかの酸は、一分子あたり二つの等価の酸性プロトンを有している。従って、一分子当たり二つの酸性プロトンを有するリンゴ酸、その他の酸の好ましい量は、一分子あたり一つの酸性プロトンを有する酸の半分の量となる。例えば、リンゴ酸は2つの酸性プロトンを有しているのに対して酢酸はたった一つしか酸性プロトンを持たないことから、５mmolのリンゴ酸と１０mmolの酢酸とは、両方とも１０eq. mmolの酸と表すことができる。
材料中に存在する酸の量を決める他の方法は、コラーゲンコラーゲン１００ｍｇあたりの酸の量である。かくして、例えばアスコルビン酸を含有する材料組成物にあっては、約100mgのコラーゲンに対して約20mgから約200mgまでのアスコルビン酸を添加するのが望ましく、さらに望ましくは約100mgのコラーゲンあたり約26mgから約131mgまでのアスコルビン酸であって、最も望ましいのは約100mgのコラーゲンあたり約65mgから約131mgまでのアスコルビン酸である。酸の量は、その分子量によって変わることを考慮すべきである。材料が減圧凍結乾燥される場合には凍結乾燥中に酸が蒸発し、乾燥固体が水で再構成される際、ｐＨと材料の粘稠性に影響を及ぼす。例えば、アスコルビン酸やリンゴ酸を含む材料は、処理中にこれらの酸の揮発量が少ないため、減圧凍結乾燥に特に適している。減圧凍結乾燥工程中の酸揮発量は、約30%以下が望ましく、さらに望ましくは約15%以下であり、最も望ましいのは約5%以下である。
既述のように、本発明の材料と組成物は、移植後の接着性や形体保持性のごとき、優れた物理的特性を有している。このような物理的特性のひとつの尺度は、本発明の材料及び組成物が少なくとも約10グラム（g）、望ましくは少なくとも約20g、さらに望ましくは少なくとも約30gのピーク対抗力を持つことである。ここで用いる「ピーク対抗力（ピーク力）」とは、Texture Technologies Corp.（Scarsdale, New York）製のTA.XT2 Texture Analyzer装置またはこれと同等の装置を使用し、破断点まで引っ張った時に材料によって与えられた力の最大値を言う。試験片は「SMS/Kieffer molding form and press（TA-105a Texture Technologies）」または同等の装置により、長さ53mm、高さ4mm、一辺の幅4mm、他辺の幅2.5mmの台形柱形状に製作する。
この種の物理的特性の他の尺度は、本発明の材料及び組成物が好ましくは約2mmから約25mm、さらに好ましくは約3mmから約25mm、最も望ましいのは約5mmから約25mmの伸張長を持つことである。ここで用いる「伸張長（extensibility）」は、ピーク対抗力テストと同一装置及び同一試験片サイズを用いて、材料が破断するまで、材料を引っ張るプルーブが移動した距離を言う。
また、本発明の材料は活性成分の有効量を含むことができる。「活性成分」とは、生物活性を有する如何なる化合物または化合物の混合の混合物をも意味する。代表的な活性成分は、骨誘導物質、成長因子、ホルモン、抗生物質、および抗ウイルス性化合物を含む。骨誘導物質の詳細は後述する。成長因子としては、線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor：以下「bFGF」）と変換成長因子ベータ（transforming growth factor beta：以下「TGF-beta」）とをあげることができる（「Cuevas et al., Basic Fibroblast Growth Factor（FGF）Promotes Cartilage Repair In Vivo, Biochem Biophys Res Commun 156:611-618, 1988」参照）。これらの成長因子は、軟骨刺激及び血管形成剤とも言われている。例えば、bFGFは、骨芽細胞の再生速度を促進するが、一方で同時にそれらの活性を抑制することも知られている。（「Frenkel S, Singh IJ; The effects of fibroblast growth factor on osteogenesis in the chick embryo. In: Fundamentals of bone growth: Methodology and applications. Ed. AD Dixon, BG Sarnat, D. Hoyte, CRC Press, Boca Raton, FL, USA, pp. 245-259, 1990」）この作用は投与量に依存しており、投与量が多すぎても少なすぎても活性は低下し、その中間域が活性を刺激する（「Aspenberg P, Thorngren KG, Lohmander LS; Dose-dependent stimulation of bone induction by basic fibroblast growth factor in rats. Acta Orthop Scand 62:481-484, 1991」）
「効果量」なる用語は、望ましくない副作用を起こすことなく、望ましい作用を発揮させるに十分な活性成分の量を言う。ある場合には、望ましい作用を得ることと、望ましくない作用の強さを抑えることのバランスをとる必要もある。使用された活性成分の量は、活性成分のタイプと本発明組成物の使用目的によって変わることも認識しておく必要がある。本発明の材料が骨形成材料を含む場合にあっては、骨誘導物質の量はパテ状材料組成物の総重量に対し、望ましくは約0.1重量%から約10重量%であり、さらに望ましくは約0.25重量%から約4重量%であり、最も望ましいのは約0.35重量%から約1.6重量%である。
ここで、「骨誘導物質」とは、体内に移植された際、骨の形成を誘導することができる如何なる物質（すなわち、骨形成特性を持っている物質）を意味し、脱灰骨基質や骨誘導因子を含む。「骨誘導因子」とは、骨の形成を誘導することができる天然の蛋白、（遺伝子）組換えもしくは合成蛋白、さらには蛋白混合物をいう。例えば、この骨誘導因子なる語は、米国特許第５，５６３，１２４号（「Damien et al.」）で骨成長因子として説明されている物質を意味する。本発明がもっとも意図する用途は、人体への使用に係わり、同様に本発明の製品および方法は動物にも働くことに注目すべきである。骨形成の誘導は、骨芽細胞、破骨細胞や類骨基質を伴う新たな骨の形成を示す組織学的評価によって測定可能である。例えば、骨誘導因子の骨誘導能は、テストする物質を沈着させた基質を用いる試験により示すことができる。物質沈着基質は実験動物の皮下に移植する。次いで、移植片を取り出し、骨芽細胞、破骨細胞や類骨基質の存在を含めて、骨形成の有無を顕微鏡観察する。この好適な手順は、米国特許第５，２９０，７６３号の実施例５で説明されている。
骨形成能の程度を評価する一般的に認められた基準はないものの、ある種のファクターは、骨形成を示すものとして広く知られている。そのようなファクターとしては米国特許第５，５６３，１２４号の実施例1の表3で示されているスケール0-8がある。このスケールの0-4部分は、米国特許第５，２９０，７６３号で述べられている採点システムと一致するが、スコア0-4に限定される。スケールの残りの部分、スコア5-8は、骨形成熟度の付加的レベルを示している。拡張されたスケールは、米国特許第５，２９０，７６３号には述べられてないが、コラーゲンの再吸収を考慮したファクターをも含んでいる。
本発明の好適な骨誘導因子は、骨から自然に生成する蛋白の精製またはDNAの組み換えにより製造することができる。ここで使われている用語「組み換え製造骨誘導因子（recombinantly produced osteoinductive factors）」は、DNA組み換え技術で用いた骨誘導因子の製造を意味する。例えば、骨形成能を有する蛋白をコード化する核酸は、蛋白に結合して抗体を生み出すことにより同定できる。この抗体は、親和性クロマトグラフィー（affinity chromatography）を使って、生成された特定の骨形成蛋白の集団を分画するのに使用できる。アミノ酸の配列は、精製された蛋白を配列することにより同定できる。DNAオリゴヌクレオチド（oligonucleotides）は、既知のアミノ酸鎖から合成することができる。オリゴヌクレオチドは、骨形成蛋白をコード化する核酸を同定するために、例えば牛属のDNAから作られたゲノムDNA（genomic DNA）および／またはcDNAライブラリのいずれかを選別するのに使用できる。正当なオリゴヌクレオチドは、適切なｃDNAにハイブリッド化し、それによって骨形成蛋白コード化遺伝子をコードするcDNAを同定する。
骨形成蛋白に結合した抗体は、またcDNA発現ライブラリを選別するのに直接利用できる。例えば、骨形成蛋白をコード化する真核細胞のｃDNA（eukaryotic cDNA）鎖は、細菌発現ベクター内に組み込むことができる。発現ベクターは「E.coli」といった細菌内に形質転換でき、転換発現ベクターを発現し、骨形成蛋白を産生する。この形質転換された細菌は、細菌を溶解し、放射能でラベルされた抗体に細菌を接触させることにより、骨形成蛋白を発現させるために選別することができる。
組換え骨誘導因子は、核酸を細胞に入れる種々の方法を用いて、前記方法により同定された遺伝子を細胞に導入させることにより製造できる。導入後、細胞は、導入された核酸の発現により、組換え骨誘導因子を製造する。得られた骨誘導因子は、細胞から回収できる。
多くの骨から自然に生成する蛋白または組換え骨誘導因子は文献に記述されており、本発明にも適している。組換え技術により作られた骨誘導因子は、いろいろなところで製造されてきた。「Creative Biomolecules of Hopkinton（Massachusetts, USA）」では「Osteogenic Protein 1」または「OP1」と称する骨誘導因子を製造している。「Genetics Institute of Cambridge（Massachusetts, USA）」では、「Bone Morphogenetic Proteins骨形成因子1-13（i.e., BMP 1-13）」と称する一連の骨誘導因子を製造しており、このうちいくつかは、米国特許第５，１０６，７４８号、第５，６５８，８８２号またはPCT国際公開ＷＯ９６／３９１７０に記載されている。精製された骨誘導因子も、各社で開発されてきた。「Collagen Corporation of Palo Alto（California, USA）」は、骨形成能を有すると考えられる精製蛋白混合物を開発、米国特許第４，７７４，２２８号、第４，７７４，３２２号、第４，８１０，６９１号、および第４，８４３，０６３号に記載されている。「Marshall Urist of the University of California」は、骨形成能があると考えられる精製蛋白混合物を開発、これは米国特許第４，４５５，２５６号、第４，６１９，９８９号、第４，７６１，４７１号、第４，７９５，８０４号に記載されている。「International Genetic Engineering（Inc. of Santa Monica, California, USA）」は、骨形成能があると考えられる精製蛋白混合物を開発、米国特許第４，８０４，７４４号に記載されている。前記すべての特許は、参考までにここに挙げた。
本発明の望ましい骨誘導因子およびその製法は、関連米国特許第５，２９０，７６３号に詳述されている。この骨誘導因子は、高い骨形成能を有し、かつ精製された骨誘導因子であることから、特に望ましい。米国特許第５，２９０，７６３号の骨誘導因子は、適当な担体上に付着させ、ラットの皮下に移植すると、約３マイクログラムで骨誘導活性を示す。ひとつの実施例では、骨誘導因子は、米国特許第５，５６３，１２４号の図1に示されたゲル分離プロフィールをもつ蛋白の骨誘導活性混合物である。このゲル分離プロフィールは、SDS-PAGEを使って得られたものである。最初の欄は、既知の分子量の標準値についてSDS-PAGEを行うことによって得られた分子量目盛である。第２欄は、２−メルカプトメタノール（2-mercaptoethanol）によって希釈した本発明による蛋白混合物についてのSDS-PAGEプロフィールを示す。第３欄は、本発明における希釈しない蛋白混合物についてのSDS-PAGEプロフィールを示している。ここに示されたSDS-PAGEプロフィールを備えた蛋白混合物は高い骨誘導活性を持つことがわかっておるが、ここに示されたものからわずかに異なるSDS-PAGEプロフィールを持つ蛋白混合物もまた有効あると予測される。例えば、効果のある蛋白混合物は、ここに示されたものからプラスマイナス5KDまで分子量の異なる蛋白を含むことができ、示したものより多くのあるいは少ない蛋白を含むことができる。したがって、この中の希釈または非希釈SDS-PAGEプロフィールで検出されたすべての蛋白のバンドを実質的に含むプロフィールをもつ蛋白混合物も、本発明の範囲に含まれるものと見なされる。
また、本発明の望ましい骨誘導因子の別な実施例は、加水分解すると、約20.7〜約26.1mol％の酸性アミノ酸（acidic amino acids）、約11.3.約15.7mol％のヒドロキシアミノ酸（hydroxy amino acids）、約37.6〜約42.4mol％の脂肪族アミノ酸（aliphatic amino acids）、約5.8〜約7.9mol％の芳香族アミノ酸（aromatic amino acids）および約13.3〜約19.9mol％の塩基性アミノ酸（basic amino acids）持つ骨誘導活性蛋白混合物を含んでいる。より詳細には、好ましい骨誘導因子は、約20.7〜約26.1（望ましくは約23.4）mol％のＡＳＰ（＋ＡＳＮ）およびＧＬＵ（＋ＧＬＮ）；約11.3〜約15.7（望ましくは約13.5）mol％のＳＥＲおよびＴＨＲ；約37.6〜約42.4（望ましくは約40.0）mol％のＡＬＡ、ＧＬＹ、ＰＲＯ、ＶＡＬ、ＭＥＴ、ＩＬＥ、およびＬＥＵ；約5.8〜約7.9（望ましくは約6.8）mol％のＴＹＲおよびＰＨＥ；ならびに約13.3〜約19.9（望ましくは約16.6）mol％のＨＩＳ、ＡＲＧおよびＬＹＳのアミノ酸組成物を有する。望ましい骨誘導因子の更なる実施例は、表1に示すものに近いアミノ酸組成物を有する蛋白混合物である。
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さらに別の望ましい骨誘導因子の実施例としては、米国特許第５，２９０，７６３号所載の精製工程のどれかによって得られた蛋白混合物である。
本発明の材料は、典型的にはコラーゲンと水と酸とを混合することにより誘導される。上述したように、本材料は、活性成分といった他の物質もまた含有することができる。本材料は、透析、照射（例えばガンマ放射線の使用）、濾過、化学的処理（例えばエチレンオキサイドを使用）または既知の殺菌方法により殺菌することができる。また、ゲルでもよい材料は、殺菌する前に乾燥固体に減圧凍結乾燥する。化学的処理により殺菌するに際にも、殺菌する前に組成物を減圧凍結乾燥して固体とするのが望ましい。減圧凍結乾燥では水を除去し、殺菌に使用される薬品（例えばエチレンオキサイド）と水との間で起こり得る如何なる化学的反応をも防止する。本発明の他の方法は、無菌環境下で本発明の材料を製造するにあり、それによって別の殺菌工程を必要としない。
本発明の材料は、また脱灰骨材を含むこともできる。微粒子状の脱灰骨材を製造する方法は、米国特許第４，４４０，７５０号（Glowacki et al.）に記載されている。別な脱灰骨材は、骨を摩粉し、0.6M（Mol）のHCl溶液により脱灰し、リン酸塩緩衝液（phosphate buffered solution）で洗浄し、エタノールで洗浄し、これを乾燥する。また、脱灰骨材は例えば「AlloSource（Denver, CO）」といった民間の骨組織バンクから入手することもできる。
本発明の材料は、本材料の成分を入れたキットの一部とすることもできる。このようなキットは、使用の直前に、本発明の材料や組成物を調合するヘルスケアの専門家にとって特に有用である。このようなキットは、本発明の種々の材料や組成物の成分を入れてあるのに加えて、オプションとしてステアラーのような混合器を付けて、成分原料混合用容器を入れておく。さらに、この種のキットは、予め計量され、シールされたパッケージでもって、成分原料を収納することができる。このシールされたパッケージは、無菌的にシールし、成分量は、このどこかで述べた割合であらかじめ計量しておくこともできる。
本発明の他の面としては、広く上記した材料及び組成物を体内に移植する方法を含む。上述したように、本発明の大部分の使用は、人体への適用に関する。この方法は、しかしながら、広く他の動物、特に哺乳類に適用できる。本発明で使用されているように「移植（implanting）」という用語は、本発明の材料及び組成物を活性成分の作用を発揮させたい部位に配置することを言う。本発明のこの実施例では、材料は、活性成分用担体（delivery vehicle）として機能する。このような移植方法は、外科的処置または、注射器の使用を含めて、既知の方法のどれかを使用し、本製品の注入を含むことができる。
骨形成組成物を含む本発明の製品に関しては、本材料または方法は、骨の形成が必要な場合は、どのような用途にも使用できる。このような用途としては、人工股関節置換術、人工膝関節置換術、脊椎固定術、歯根欠損部の修復、骨粗鬆症の治療、骨腫瘍による欠損部の修復、頭蓋顎顔面欠損部の修復、骨折の修復などにおける骨形成の誘導がある。
人工股関節置換術にあっては、人の股関節が適切に機能しない場合、股関節が置換される。大腿骨近位端の骨頭の部分を外科的に切除して球関節を置換する。人工骨頭の部分は、本来の骨頭の部分が切除された大腿骨近位端に挿入するスパイクとは反対側に機能的ボール端を有している。スパイクには、スパイクの周りの骨成長が大腿骨内でスパイクを固定できるようにポーラスコーティーングされた表面がある。本発明の材料は、スパイクと、スパイクが挿入される大腿骨の空隙との間にコーティーングしたり埋め込んだりされる。関節のソケット部分は、人工的ソケット部分を本来の臼蓋に挿入することにより置換される。
人工ソケット部分は人工骨頭にサイズが合うように設けられている。本来のソケット部分が接する人工ソケット部分の表面に、ポーラスコーティーングされた表面を設けることができる。本発明の材料は、人工ソケット部分を置換することにより、人工と本来の部分の間に材料があるように、本来のソケット部分の空隙内へ挿入される。この方法により、骨が形成され、人工ソケット部分が本来の臼蓋部分に固定される。
本発明の材料は、人工膝関節置換術における使用にも適している。人工膝関節には、大腿骨と、大腿骨の遠位端および外科的に設けられた脛骨端とへ挿入される脛骨コンポーネントとからそれぞれ構成されている。本発明の材料は、大腿骨および／または人工の脛骨コンポーネントとの間、および大腿骨と脛骨との間にコーティーングまたは埋め込む。この方法により、人工物と骨との間に骨を形成し、人工物が固定される。
本発明の材料は、実質的に二つの椎体を互いに固定する脊椎固定術における使用にも適している。この材料は、例えば、隣接した棘突起と横突起との間に、組成物に沿って骨が形成されることにより、この隣接した棘突起と横突起とがそれぞれ固定され、この固定により隣接した二つの椎体が連結されるように適用される。
本発明の材料は、メタルケージまたはそれに匹敵するインプラントを使用して、実質的に二つの椎体を互いに固定する脊椎固定術における使用にも適している。このような場合、ケージは二つの椎体の間の椎間板内で置換され、本発明の材料はこのケージ周りに詰め込まれ、ケージ内外に骨形成されることにより二つの椎体が固定して、脊椎が安定するようにする。
実施例
本実施例においては、他に述べる場合を除き、以下に示す一般的手順が使われる。
牛脱灰骨材は、牛の骨を約125μm〜約850μmの粒度になるまで磨砕して調製した。これは、0.6MのHCl溶液で脱灰し、リン酸塩緩衝溶液により洗浄し、さらにエタノールで漱ぎ乾燥した。
パテ状材料は、次の試験仕様を有する「TA-XT2 Texture Analyzer」を使用して試験した。
pre-test speed＝2.0mm/sec
test speed＝3.3mm/sec
post test speed＝10.0mm/s
distance＝30mm
trigger force＝3g
パテ状物質のｐＨは、Boston, Orion Co.（Boston, MA）.製のロス平面表面電極（Ross flat surface electrode）を用いて測定した。
実施例１
本実施例は、コラーゲンと脱灰骨材とを組み合わせて製造された材料の粘度に及ぼす酸の影響を示す。
各酸およびそのモル濃度をテストするにあたり、精製された牛腱Ｉ型コラーゲン100mgと7.4のmLの酸水溶液とを混合してゲルを調製した。ゲルは減圧凍結乾燥し、次いで水と約2.1gから約2.4gの脱灰骨材とに混合した。得られた組成物は、接着力、弾性、成形性といった特性マニュアル試験により、その物理的特性について定性的に評価した。各ゲルは、許容可能な物理的特性を有するものと、そうでないものに分けた。アスコルビン酸や安息香酸塩のごときいくつかの酸は、許容できる物理的特性を有する組成物の製造において有用な濃度範囲が広かったが、酢酸や乳酸のごとき他の酸では、パテ状の粘稠さをもつ組成物の製造に好適な量の範囲は狭かった。ゲルが最初から許容できる物理的特性を持つことが分かっている場合には、先にエチレンオキサイドにより殺菌処理してから再評価した。表２は、試験した組成物の定性的評価を要約したものである。
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「N/R」は「記録せず」、「N/A」は「不適（テスト不能）」、「Y/N」は「許容すれすれ」
実施例２
本実施例は、組成物を減圧凍結乾燥する間の酸の消失量と、エチレンオキサイドによる殺菌の前後における得られた材料の物理的特性を示す。
水100mLでテストされた1M溶液の酸の500μLからなる対照溶液を、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で滴定した。減圧凍結乾燥間における酸損失量を試験するために、試料は実施例１の手順を用いて調製した。但し、凍結後脱灰骨材は添加しなかった。得られた材料を（100mLにつき1gの減圧凍結乾燥された組成物となる比率で）水に溶かし、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で滴定した。酢酸で作られた一つを除き、本材料は引き続きイソプロピルアルコール（2-propanol）で処理し、以下のとおり滴定した。コラーゲンと酸の混合物からなる減圧凍結乾燥試料は、イソプロピルアルコール中で細断し、再減圧凍結乾燥して、酸の大部分を取り除いた。すなわち、この酸は、処理後に試料を滴定した結果から明らかなように、2度目の減圧凍結乾燥により除かれている。アスコルビン酸、リンゴ酸、酢酸、乳酸およびグリコール酸で作られた材料の滴定結果の曲線は、第１図〜第５図においてそれぞれ示す。試料中の酸の消失量と酸の残存量は、表３に示す。
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これらの結果は、アスコルビン酸、クエン酸、およびリンゴ酸は、比較的低い揮発性を示し、酢酸が最も揮発性が高かった。
実施例３
本実施例は、種々の酸を含有する移植材料の生物学的活性を示す。
100mgのコラーゲンと、所定のモル濃度の酸水溶液7.4mLと、米国特許第５，２９０，７６３号に記載された所定の量の骨成長蛋白（BGP）を混合してゲルを得た。ゲルは減圧凍結乾燥され、減圧凍結乾燥されたゲルのいくらかはエチレンオキサイドと接触させて殺菌した。約15mgの減圧凍結乾燥されたゲルは、1.14mLの水および173mgのラット脱灰骨材と混合した。得られた材料は、金型に入れて、直径7mm、厚さ2mmのディスクを12枚から15枚成形した。ディスクを冷凍し、夜通し減圧凍結乾燥し、ラットの皮下に移植した。28日後にラットを殺し、組織スライドは移植後の組織で作られた。マゼンダ（Acid fuchsin）およびSanderson’s Rapid Bone Stainまたはトルイジンブルー（toluidine blue）を使用して、移植後組織スライドを着色し、骨および軟骨形成の観察に供した。被験酸の型と濃度、BGPの添加量、ゲルのエチレンオキサイド曝露の有無は、表4に示した。
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50mMおよび100mMの乳酸、並びに10mM、20mM、30mM、50mM及び100mMのアスコルビン酸により得られた材料は、良好で完全な小骨形成を示した。骨は、移植後組織全体にわたって認められた。全般的に骨の成熟した縁と、柔軟組織内にポケットがあった。50mMのリンゴ酸、50mMのグリコール酸、50mMのクエン酸および25mMの安息香酸で作られた材料の結果は、まばらな島から完全な小骨まで変化していた。50mMのアスコルビン酸によるものではBGP投与に対する骨誘導反応の感受性は、５０ｍＭのアスコルビン酸で評価した。結果は、BGP０μgでは骨形成が認められず、35μgにおいて、顕著な量の骨成長が起こっていた。この結果は、またエチレンオキサイド曝露後骨誘導反応が、酸のモル濃度とは逆相関して現れることを示している。３０ｍＭと５０ｍＭのアスコルビン酸をコラーゲンとＢＧＰの混合物に加えて、エチレンオキサイドに曝露しない場合、アスコルビン酸自体は別にエチレンオキサイドに曝露していても、良好な骨の形成が観察された。エチレンオキサイドへの曝露の如何に関わらず、10mMおよび20mMアスコルビン酸を使って作られたサンプルでは、良好な骨形成が認められた。
実施例４
本実施例は、脱灰骨基質の添加直前に、減圧凍結乾燥されたコラーゲン材に対する酸性緩衝液の添加効果を示す。
実施例１で述べたように、酸性溶液でコラーゲンを調製し、この材料を減圧凍結乾燥する代わりに、コラーゲン試料を希釈された揮発性酸（例えば酢酸）で調製し、減圧凍結乾燥した。この材料は、水でもどすと、再構成主観的には取扱い難い性質になるが、以下の実施例に述べるような方法を使って客観的にテストすることができなかった。同じ組成物でも水の代わりに酸性緩衝液を添加してもどすと、得られた材料はパテ状となり、主観的にも十分であるが、以下の実施例に述べる実験方法を用いて試験可能であった。20、30、50、および100mMのアスコルビン酸、50mMのクエン酸、50mMのリンゴ酸および50mMの乳酸を含めて、各種の酸性緩衝液は、減圧凍結乾燥されたコラーゲンをもどす酸性緩衝液として使用し、望ましい物理的特性を持つ材料をうることができる。
実施例５
本実施例は、材料の伸張長及びピーク対抗力（peak force）に対する異なった酸の効果を示す。
ゲルは、実施例4の手順を用いて調製及び減圧凍結乾燥された。減圧凍結乾燥ゲルは、使用まで冷凍保存した。
物理的特性テストするための試料は、減圧凍結乾燥されたゲルに6mLの水を付加することによって調製した。粒度約125μmから約850μmの牛脱灰骨材約1.75gを添加して、混合し、特記しないかぎり約5分間放置した。次いで、このパテを「SMS/Kieffer成形金型（TA-105a Texture Technologies）」に入れ、プレスした。これにより長さ53mm、高さ4mm、一辺の幅4mm、他辺の幅2.5mmの台形柱の試験片を作成した。表５は、種々の酸溶液を有するパテ状材料についてのピーク力とピーク力にいたる距離を示す。測定には、「TA-XT2 texture analyzer」を使用した。テスト速度（すなわち検知器の移動速度）は2.0mm／sec、引っ張り強度は5.0gであった。
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理論的に拘束されるものではないが、50mMの酢酸試料の低い値は、減圧凍結乾燥プロセスの間に約85%が失われる、酢酸の揮発性に起因するものと考えられる。
実施例６
本実施例は、パテ状材料の物理的特性に及ぼす異なった酸濃度の影響を示す。
種々の濃度のアスコルビン酸およびクエン酸溶液を用いて試料を調製し、実施例５の手順にしたがってテストした。結果を表６に示す。一般的には、酸の濃度が増すと、パテ状材料の伸張長も長く。
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実施例７
本実施例は、ｐＨに対する調製時間の影響並びにパテ状材料のピーク力までの距離とピーク力を示す。
50mMのアスコルビン酸、50mMのクエン酸酸、および100mMのクエン酸溶液を使った試料を調製し、実施例5の手順を用いテストした。パテ状材料の放置時間は2、5、10、および20分とした。結果を表7に示す。
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放置時間を2、5、および10分のパテ状材料については、ピーク力までの距離は略同等であった。重要なのは、パテ状物質の組成物のｐＨが、表８に示すように放置時間によりわずかに変化したことである。
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実施例８
本実施例は、パテ状材料の物理的特性に対し、エチレンオキサイド殺菌が及ぼす影響を示す。
20mMおよび50mMのアスコルビン酸、50mMおよび100mMのクエン酸溶液を使った試料は、実施例５の手順により調製、「MMC（Erie, PA）」によりエチレンオキサイドで殺菌した。ピーク力までの比較距離およびピーク力を表９に示す。
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実施例９
本実施例は、ガンマ放射線に曝露して殺菌したために生じるパテ状材料の物理的特性の変化を示す。
20mM、50mMおよび100mMのアスコルビン酸溶液を使った試料を、実施例５の手順で調製し、「Sterigenics（Charlotte, NC）」により1.0Mradのガンマ放射線で照射した。ピーク力までの比較距離とピーク力を表１０に示す。
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50mMまたは100mMのアスコルビン酸で調製された試料は、ガンマ放射線に曝露された後でもパテ状の風合いをとどめていた。
当該技術分野の通常の知識を有する者であれば、多くの変更や修正が本発明の望ましい態様に対して加えられ、かかる変更や修正が本発明の精神から外れることなしには、なされ得ないことを了解するだろう。したがって、添付された請求項は、本発明の真の精神と範囲にあるようなすべてのこのような均等な変更を包含するつもりである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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