(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的材料と、デキストランと、PEG、PVP、Tween80（登録商標）、プルロニックF-68（登録商標）およびフィコール（商標）からなる群より選択される少なくとも１の化合物とを含有する液体の一相系から微粒子を製造する方法であって、前記微粒子の形成は、前記一相系から水を蒸発させて、分散相および連続相への相分離をもたらすことにより達成され、
前記微粒子は、注射に適切な、静脈内、筋内または皮下投与に適切な、肺用のエアゾールまたはスプレーとしての投与に適切な、合成または天然物質を標的細胞に輸送するために適切な、細胞内に送達するために適切な、トランスフェクションのために適切な、または遺伝子治療のための媒体として適切な、または遺伝子ワクチンの製造のために適切な、固体粒子、微小カプセルまたはミクロスフェアであり、
当該生物学的材料が、ペプチド、タンパク質、酵素、組換えタンパク質、核酸、プラスミド、抗体およびその組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項２】
蒸発工程が0.1〜100時間の持続時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蒸発工程が0.1〜50時間の持続時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
蒸発工程を0℃〜100℃の温度で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
蒸発工程を0℃〜50℃の温度で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
蒸発工程を0.1〜760mmHg pの圧力下で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
蒸発工程を系内の水濃度が5〜80％のときに停止する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
蒸発工程を系内の水濃度が5〜75％のときに停止する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
リン酸カルシウム沈殿法が用いられる、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
リン酸カルシウム沈殿法が用いられる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
リン酸カルシウム沈殿法が用いられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を実施することにより形成される微粒子。
【請求項１３】
少なくとも75％のデキストランと、PEG、PVP、Tween80、プルロニックF-68およびフィコールからなる群より選択される少なくとも１の化合物と、並びに25％以下の生物学的材料で構成される、請求項１２に記載の微粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は生物学的材料、特に核酸の標的細胞への、および／または核への送達のための組成物および方法に関し、欧州特許出願99 113 251 5および欧州特許出願00 101 030 5の優先権を主張する（なお、これらの開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）。
【０００２】
生物学的材料の細胞への送達、特にDNAの送達は遺伝子および感染を起源とする疾病の双方を治療するための多数の有望な機会をもたらす。それは細胞代謝に影響を及ぼすか、または欠陥のある遺伝子のスイッチを切るために、欠陥のある遺伝子を完全な遺伝子と置き換えるために、またはこれらの細胞が予防もしくは治療作用を有するタンパク質を形成できるようにするために、ペプチド、タンパク質または核酸などの生物学的に活性な物質を生物の体細胞に送達することに基づいている。
【０００３】
遺伝子治療が有望なアプローチとなる遺伝的に引き起こされる疾病の例は多数ある。その他の可能性ある適用は免疫調節にあり、そこでは免疫化により、分泌タンパク質抗原または非分泌タンパク質抗原をコードする機能的核酸の投与により免疫が達成される。欠陥遺伝子をコードする核酸を、例えば、特定の必要量に個々に合わせた形態で投与できる遺伝的欠陥のその他の例としては、筋ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子）、嚢胞性線維症（CFTR遺伝子）、高コレステロール血症（LDL受容体遺伝子）が挙げられる。遺伝子治療法は毒性または免疫調節活性を有するホルモン、成長因子またはタンパク質が体内で合成される場合にも有用である可能性がある。
【０００４】
遺伝子治療はまた、いわゆる「癌ワクチン」の投与による癌の治療にも有望と思われる。腫瘍細胞の免疫原性を高めるために、細胞は、それらの抗原性を高くするか、または特定のサイトカインを産生させるかのいずれかにより変更されて、免疫応答を誘発させられる。これはサイトカイン、例えば、IL-2、IL-4、IFNγ、TNFαおよびその他のものをコードするDNAを細胞にトランスフェクトすることにより達成される。今日まで、自己腫瘍細胞への遺伝子導入は、in vivoで特定の遺伝子（調節が解除された発癌伝子またはウイルス遺伝子など）の発現をブロックするための治療薬として、レトロウイルスベクターを介して達成されてきた。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸の強い負電荷の結果として細胞膜によるそれらの取り込みが制限されてそれらの細胞内濃度が低い場合でさえ、細胞に移入され、そこでそれらの阻害作用を発揮できるということがすでに示されている。
【０００５】
送達により生じ得る実質的な利点を考えれば、安全で、かつ、効率的な生物学的材料、主に核酸送達系が必要であることは明らかである。
【０００６】
in vitroでの哺乳類細胞への遺伝子導入については、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストランまたはリン酸カルシウム沈殿法によるDNAの導入など、種々の技術が知られている。カチオン性脂質がDNAを導入するために上手く用いられてきた。脂質などのカチオン性成分は溶液中でDNAをコンパクトにすることができる。この方法は相当に凝集したDNA複合体をもたらし、in vitroでDNAをトランスフェクトするために用いると（ありのままのDNAと比較して）遺伝子導入および発現効率が高まることが知られている。これらの複合体の形成はin vitroでの遺伝子導入を促進し得るが、in vivoでのかかる複合体の注入は長期間持続し、かつ、効率的な遺伝子導入をもたすわけではない。
【０００７】
現在のところ、ウイルスはin vitroおよびin vivo遺伝子送達のための最も一般的なベクターを構成している。これらのベクターは、それらの親ウイルスの効率的侵入メカニズムを用いることにより遺伝子の導入をもたらすよう開発されてきた。この方法は、in vitroおよびin vivoでの高効率遺伝子導入を達成するための、組換えレトロウイルスおよびアデノウイルスベクターの構築に用いられた。これらは効率的であるが、これらのベクターは導入されるDNAのサイズおよび構築の点で制限され、またウイルスコートタンパク質が受容者において免疫応答を誘発し得るという危険がある。さらに、これらの薬剤は元のウイルスの活性なウイルス遺伝子エレメントが同時に導入されるという点で安全上問題がある。従って、例えば、レトロウイルスの使用は少なくとも低いパーセンテージで、ウイルス感染（内生ウイルスでの組換えおよび可能性あるその後の病原性形態への変異による）または癌の形成などの副作用の危険を含むので問題がある。さらに、レトロウイルスにより達成されるような患者の体細胞の安定した形質転換は、例えば、副作用が生じた場合に、これにより治療を元に戻すのがより難しくなり得るだけであるので、各場合において望ましくない。
【０００８】
最近、合成ベクターがウイルスの代替物として提案され、遺伝子導入のための代替法が開発された。
【０００９】
この１つの例には、遺伝子の受容体媒介性エンドサイトーシスという極めて効率のよい経路を介した細胞への導入がある（参照文献1、2）。このアプローチはDNA結合ドメインと細胞表面受容体に特異性のあるドメインとを有する二官能性分子共役体を用いる。DNA結合部分は通常ポリ-L-リジン（PLL）である。正電荷を有するリジン残基と負電荷を有するDNA主鎖のリン酸塩との間の静電相互作用によりDNAとの複合体が形成される。受容体媒介性エンドサイトーシスにより達成される遺伝子発現効率は複合体の直径および用いる標的リガンドの種類をはじめとする種々の要因の影響を受ける。
【００１０】
in vivoでうまく適用するためには、DNA送達系は標的細胞に接近するのに十分小さくなくてはならないという一般概念がある。これは内皮を介する血管外遊走をともなうことが多く、腫瘍に関連する過透過性内皮には約70nmのサイズ制限がある（参照文献3）。さらに、誘発された膜透過のほとんどの形態はエンドソーム膜を介して作用し、続くエンドサイトーシスおよび食作用インターナリゼーションは通常直径100nm未満の物質に限定される。効率的な核輸送には表面変化ではなく核酸圧密が重要であることが示されている（参照文献4）。
【００１１】
遊離溶液中の大きなサイズの生体分子、特にDNA発現ベクターを考えれば、DNAは圧縮されていることが有利であり、DNAはポリリジン（PLL）などのポリカチオンの添加により単純に高分子電解質複合体に凝縮できることが知られている。高分子量（mw）PLLを含む共役体は明らかに平均して大きなサイズを有し、より低分子量のPLLを含むものよりも多分散性である。例えば、最も大きなPLL（224500Da）をベースとする共役体はサイズの広範な多分散性を示し、300nmという最大直径にまで及ぶが、最も小さいPLL（3970DA）をベースとする共役体は小型で、比較的均一な分布（20-30nmにわたる直径）を示す（参照文献5）。
【００１２】
ポリカチオンはある範囲の非特異的毒性作用を及ぼすことが知られており、高分子電解質凝縮によりもたらされる帯電の濃縮により極めて高い電荷密度を有し、かつ、おそらくは毒性さえも高まった粒子が生じ得る。高分子量PLLを用いて形成した共役体は最も低分子量のポリカチオンを用いて形成したものよりも相当高い細胞傷害性を示す（参照文献5）。
【００１３】
DNA-PLL複合体では、PLLの機能はDNAをコンパクトな構造に凝縮することである。最も有効なDNA凝縮剤の１つにスペルミン、テトラアミンがある。スペルミンのペプチド類似体を合成して短い合成ペプチドが実際にPLLと同様またはそれ以上に機能し得るという仮定を調べた。ペプチドK8（参照文献6）は高分子量PLLの優れた代替物である。可能性ある細胞障害性をPLLのものと比較した。K8はHepG2細胞に関してPLLよりも少なくとも1000倍毒性が低い。同様の結果がその他の細胞系統においても得られた。
【００１４】
DNA-PLL複合体に関するこれまでの研究により高効率遺伝子導入にはエンドソーム溶解剤が必要であるということが証明されている。複製に欠陥のあるアデノウイルスが、同一の外来遺伝子を含有する組換えアデノウイルスに匹敵する発現レベルを達成するために用いられることが多かった。アデノウイルスに対する宿主免疫応答が単独投与のためのその使用を制限するということはよく知られている。エンドソーム溶解剤としてのアデノウイルスを置換するために、ウイルスタンパク質の融合ペプチドが用いられてきた。新規なる両親媒性ペプチド、JTS-1が作製されている（参照文献6）。種々の細胞系統において高レベルの遺伝子発現が達成され、このことはDNA K8/JTS-1複合体はin vitroでの遺伝子送達に高度に有用であるということを示すものである。
【００１５】
データは培養細胞への高効率遺伝子送達を示す単純なDNAペプチド複合体を構築することが実現可能であるということを証明している。これらの複合体は3種の構成要素；DNA、凝縮性ペプチド、および溶解性ペプチドのみを含み、それらのすべては分子的に規定され、かつ、活性なDNA送達系に容易に自己組織化する。これらの複合体の今後の開発によりウイルスベクターの置換が期待できるが、in vivo適用はいまだ知られてはいない。
【００１６】
最近（最小文献7）、カチオン性ポリマーポリエチレンイミン（PEI）が種々の細胞への効率的な遺伝子導入をいずれの細胞結合性リガンドまたはエンドソーム溶解性部分も加えないで媒介することが示された。この化合物はPLLとは対照的に、DNA結合および凝縮活性と高pH緩衝能とを兼ね備えている。PEI主鎖の3つ目ごとの原子がプロトン付加可能なアミノ窒素原子であり、ポリマーを効率的な「プロトンスポンジ」にする。エンドソームおよびリソソーム緩衝はDNAを分解から保護し酸性小胞からの放出を促進すると考えられている。これらの特性からPEIは細胞結合性ドメインおよびその他の細胞侵入機能を含むより精巧なベクターのための極めて魅力的なDNA結合性コアである。リガンド-PEI共役体は受容体リガンド依存法での培養腫瘍細胞の効率的なトランスフェクションを媒介できることが示された。この発見はリガンドが共役したPEIは受容体特異的遺伝子送達のための有望なベクターであり得るということを示す（参照文献8）。
【００１７】
DNAリン酸塩に対して種々の割合のPEI窒素（N/P比）を含むPEI-DNA複合体を調製して種々のin vivoモデルにおいて調べた。分枝した25kDaのPEIを用いて実施した初期の実験はこのポリマーは毒性があり、低N/P比で用いてさえ数分内に死をもたらすということを示す。平均分子量が22kDAの直鎖ポリマー（Exgene500）を用いればより良好な結果が得られる。レポーター遺伝子（pCMW-Luc）をExgene500と3ないし5（N/P）の比で複合体化した場合には、トランスジーン発現が24時間後に肺、心臓、脾臓、肝臓、腎臓および脳で認められた（参照文献9）。しかしながら、毒性および免疫原性特性はPEIの使用ではおそらく克服できないであろう。
【００１８】
エレクトロポレーションはもう１つの非ウイルス性送達系であるが、これは米国特許第4,849,355号および米国特許第5,232,856号に記載のように電界を適用することで生物学的材料を標的細胞に送達するために用いる。生物学的材料を細胞に送達するためには、例えば、細胞懸濁液の標的細胞に電気パルスを適用する。懸濁液中の生物学的材料は電気パルスの適用により細胞膜に形成される小胞を通って細胞内に拡散し得る。
【００１９】
高効率送達を達成するために、生物学的材料をリポソームに封入し、リポソームを標的とされる細胞と電気融合により融合するために、リポソーム技術がエレクトロポレーション技術と組み合わされた。しかしながら、リポソームは電界において少量でしか含まれず、標的細胞と十分には融合しない。
【００２０】
引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第5,789,213号には、生物学的材料を標的細胞とともに濃縮し、含まれる標的細胞と生物学的材料の双方を二相のうちの一相に濃縮することにより電気パルスの適用の間およびその後にこの材料を標的細胞に導入できるような二相ポリマー系の使用に関するエレクトロポレーション系が記載されている。
【００２１】
二相ポリマー法は細胞、タンパク質および無機物を分離または分配できる（米国特許第4,181,589号；およびPartitioning in Aqueous Two-Phase Systems, 1985, H. Walter, D. BrooksおよびD. Fisher編, Academic  Press 出版（ここではポリマー濃度は特に断りのない限り重量％である）に記載される）。異なるポリマー相への粒子の分配は粒子およびポリマー溶液の界面エネルギーに左右される。ポリマーおよび塩濃度に左右される界面エネルギーを変更することにより、選択された粒子（細胞、高分子）を所定の相に動かすことができ、このようにしてポリマーの組合せの使用により分離または分配するという目的を達成する。
【００２２】
米国特許第5,789,213号によれば、標的細胞と生物学的材料の双方を単一相に濃縮するよう機能し、かつ、浸透圧制御によりこの相の体積を減少するよう機能し、その結果エレクトロポレーションの際に細胞および生物学的材料がこの単一相に濃縮形態で封入されている組成物が用いられている。次いで、エレクトロポレーションの際に生物学的材料を標的細胞に入れ、次いで、エレクトロポレーション後の細胞のコロイド状浸透性膨潤が制限され、その結果高含有率が得られる。例えば、ポリエチレングリコール（PEG；分子量（m.w.）8,000（ダルトンで））およびデキストラン（dx；m.w.9,000および71,000および249,000）の3種の製剤のうちの1種を用いる二相ポリマー系が記載されている。
【００２３】
しかしながら、エレクトロポレーションはその他の不利な点以上に、特別な装置を必要とし、in vitroでの使用に限られる。
【００２４】
核酸などの生理活性分子の送達は、生理活性分子を、上記のように標的とされる領域への分子の移動を促進するポリマー微粒子中に固定化することにより有意に高めることができる。しかしながら、ポリマーは好ましくは非毒性の単量体を含み、かつ、非毒性成分に分解する非毒性であり、生体適合性であり、送達される物質と化学的に適合性でなければならない。合成および天然ポリマーから微粒子を作製するために、いくつかの異なる技術が開発されている。
【００２５】
引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第5,849,884号には、高分子微粒子および製造方法および使用が記載されている。この方法は三次または四次構造を有する高分子を崩壊させ、基礎構造要素を形成することに基づいている。微粒子はエネルギー供給源の存在下で粒子を形成するのに十分な時間の間、溶液または液相中の高分子を溶液または液相中のポリマーまたはポリマーの混合物と混合することで製造する。溶液は好ましくは水溶液である。高分子溶液をポリマーに加えるか、ポリマー溶液を高分子溶液に加えるかのいずれかで高分子から水を除去するか、または脱水する。この工程はまた当業者から「体積排除」とも呼ばれている。
【００２６】
微粒子を形成する高分子の種類としてはタンパク質、ペプチド、炭化水素、共役体、核酸、ウイルスまたはこれらの混合物が挙げられる。高分子は微粒子内に要素を形成する主要な構造であるので、好適な高分子は三次または四次構造を有するか、または有し得る必要がある。好ましいポリマーにはポリビニルピロリドン（PVP）、ポリエチレングリコール（PEG）、デキストラン（Dx）、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体（PPC）、ポリビニルアルコール（PVA）またはその混合物がある。
【００２７】
各微粒子は少なくとも40重量％の高分子と30重量％以下のポリマー分子からなり、これらは微粒子中で絡み合いまたは散らばり、かつ、通常均一に分布している。
【００２８】
微粒子形成性高分子の崩壊を誘導するためには、高分子-ポリマー溶液をエネルギー供給源の存在下で所定の時間の間インキュベートする。好ましいエネルギー供給源は熱である。しかしながら、可能性あるエネルギー供給源としては、単独での、または超音波処理、ボルテックス処理、混合または攪拌と組み合わせた、熱、放射線およびイオン化が挙げられる。好ましくは、高分子-ポリマー溶液混合物は水浴中で37℃以上90℃以下の温度にて約5分間から2時間の間インキュベートする。最も好ましくは、混合物は5-30分間50から90℃の温度にてインキュベートする。
【００２９】
この方法は高分子-ポリマー溶液がポリマーと高分子との混合前、混合後または混合の際のいずれかで特定のpH範囲、高分子の等電点（pI）付近のpH、好ましくは高分子のpIの３ないし４pH単位内、最も好ましくは高分子のpIの1.5ないし2pH単位内に調節されることを必要とする。
【００３０】
核酸からなる微粒子はまず核酸をウシ血清アルブミンなどのタンパク質と混合するか、または核酸は陰イオンであるのでポリ-L-リジン（PLL）などの陽イオンを加えるのいずれかにより調製しなければならず、これが微粒子の形成を著しく助ける。
【００３１】
この組成物に関しては、この方法が特定のpH範囲の高分子ポリマー溶液に限定されるということが不利な点である。さらに、攪拌、ボルテックス処理または混合と組み合わせてエネルギー、例えば熱を加えながら溶液をインキュベートするために特別な装置を必要とする。
【００３２】
さらに、三次または四次構造を有するか、有し得る高分子に限定される。
【００３３】
とりわけ、この方法は遺伝子の生物の細胞への導入に関する問題を解決するものではない。特に、生物学的材料、特に核酸の細胞およびその核への透過に関する問題が解決されていない。
【００３４】
従って、本発明の目的は生物学的材料、特に、ポリヌクレオチドの効率的なin vitroおよびin vivo送達系を提供することである。
【００３５】
本発明は特定の条件下では水性ポリマー溶液が自然に二相ポリマー系に分離するという発見に基づいている。この工程の際に電荷をもたないポリマー分子間に水素結合が形成され得る。水素結合形成はまた、高分子が電荷を有する場合にも起こり得る。同時に、相の一方において生物学的材料およびポリマー濃度の自然増が生じ、次いで、それが高いトランスフェクション能を有する微粒子の形成をもたらし、これをin vivoでのいくつかの器官への遺伝子の導入に用いることができる。
【００３６】
本発明の方法により形成される微粒子は少なくとも75％のポリマー分子と25％以下の生物学的材料からなってよい。ポリマー分子が主要な構造形成要素であり得る。
【００３７】
これらの微粒子はすべての細胞種および核に透過し、このことは蛍光顕微鏡観察により証明できる。
【００３８】
以下の好ましい実施形態および実施例の記載から（図１も参照）、本発明の特徴がより理解されよう。
【００３９】
二相ポリマー法は細胞、タンパク質および無機物を分離または分配できる（米国特許第4,181,689号に記載される）。説明されるような異なるポリマー相への粒子の分配は粒子およびポリマー溶液の界面エネルギーに左右される。ポリマーおよび塩濃度に左右される界面エネルギーを変更することにより、選択された粒子（細胞、高分子）を所定の相に動かすことができ、このようにしてポリマーの組合せの使用により分離または分配するという目的を達成する（参照文献10）。
【００４０】
自然な相分離は水を一相、ポリマー1（P1）-ポリマー2（P2）-高分子（例えば、核酸またはタンパク質）水系から部分蒸発させ、水中水混合物（W1/W2；W1-分散相、W2-連続相）の形態で二水性相が形成されると達成される。この工程は温度を低下させることにより促進される。約0℃の温度でさえ実施できる。
【００４１】
第1相は水および主にP1からなり、第2相は水および主にP2からなる。高分子の分配係数は常にもっぱら二相のうちの一相に動くように調節できる。高分子が核酸である場合には、一相Dx-PEG-核酸-水系が好ましい。核酸がDx相に濃縮されると高いトランスフェクション能を有する微粒子が形成される。
【００４２】
W1相が形成されている際（蒸発工程の際）に、不連続相の粒子中に高濃度の炭化水素および生物学的材料が生じ、またポリマー分子間の水素結合形成は主に微粒子構造の安定化現象として作用する（参照文献11）。
【００４３】
デキストランは微粒子形成のための最良のポリマーであるが、これはこのポリマーが生分解性であり、かつ、長い間血漿増量剤として使用されてきたからである。さらに、いくつかの徐法および薬剤ターゲッティングのための処方はデキストランまたはその誘導体または類似体の利用に基づいている（参照文献11）。
【００４４】
デキストランの他にも、好適なポリマーとしてはメチルセルロールなどのその他の炭化水素ベースのポリマー、キチンまたはデンプンが挙げられる。また、ポリエチレンオキシドおよびその誘導体、例えばポリエチレングリコール（PEG）またはPEG-アシレートなどの多価脂肪族アルコールおよびポリ（ビニル）アルコールなどのポリ（ビニル）ポリマーおよびその誘導体も好適であり得る。また、ポリリジンなどのポリアミノ酸も使用できる。さらに、発明の組成物はゼイン、プルランまたはキトサンまたはその誘導体などの天然ポリマーを水性ポリマー系の構成要素として含み得る。
【００４５】
本発明の組成物に含まれる生物学的材料としては天然または合成起源のすべての物質が挙げられる。好ましくは、これらの物質は標的細胞内または標的細胞で生物学的活性を示す。生物学的材料は三次または四次構造を有する高分子に限定されないことが有利である。
【００４６】
従って、組成物により形成される微粒子はペプチド、タンパク質、酵素、組換えタンパク質、核酸、ホルモン、成長因子、炭化水素、脂質およびその誘導体を含み得る。また、微粒子を形成するために、ウイルス、ウイルス粒子またはプラスミドも上記のようにポリマーと混合できる。ハプテンなどの小分子は、ポリマー溶液に加える前に、高分子、例えば、タンパク質に共役させればよい。有機または無機医薬化合物または薬剤は、薬剤をタンパク質などの高分子に結合させることで微粒子に組み込むことができる。次いで、高分子-薬剤複合体または共役体を用いて微粒子を形成すればよい。
【００４７】
生物学的材料とは上記の物質の組合せも包含すると理解される。この用語はまた生物学的に活性な材料、ならびに生物学的起源の材料を含んでなる。
【００４８】
核酸微粒子は同様にクロロキンなどの医薬物質を含むことができ、これにより核酸が細胞質コンパートメントから細胞質に出ることができ、その結果細胞により転写および翻訳されるのがより容易になり得る。
【００４９】
癌治療に対応するために、微粒子形成性組成物はインターロイキンまたはインターフェロンなどの成長調節因子を含み得る。
【００５０】
さらに微粒子を、微粒子の細胞特異的ターゲッティングを支援または提供するために、翻訳効率を高める物質で被覆してもよいし、またはTweenのような界面活性剤などの物質で被覆してもよい。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明の組成物はポリリジンまたはポリエチレンイミン（PEI）などの核酸結合剤を含んでなる。凝縮活性を有する結合剤、例えば、スペルミンなどのテトラミンの使用は有利であり得る。凝縮剤は1種以上のさらなるベクターまたはリガンドに結合できる。
【００５２】
さらに、有利なことに、遺伝子導入効率を向上させるために凝縮剤を溶解剤、例えば、溶解性ペプチドと組み合わせることができる。溶解剤としては複製に欠陥のあるアデノウイルスまたはウイルスタンパク質の融合ペプチドが使用できる。
【００５３】
本発明は、組成物がDNAまたはRNAなどの核酸を含んでなる場合には、遺伝子治療または「遺伝子ワクチン」の製造のための媒体を形成するのに使用できる。核酸を含む微粒子は標的細胞、例えば、哺乳類の細胞に裸のDNAが送達される場合と同様に送達され得る。例えば、組織培養物の一部である細胞へのin vitro送達も可能である。
【００５４】
本発明の送達系は種々の生物種の標的細胞に適用できる。好ましくはin vitroおよびin vivoで哺乳類の標的細胞、特にヒト細胞に用いる。しかしながら、両生類または爬虫類などの下等動物の細胞も標的とされ得る。さらに、本方法を適用することにより生物学的材料を植物細胞のプロトプラストまたは微生物に送達できる。
【００５５】
in vivoでの哺乳類標的細胞、特にヒトに関しては、微粒子を患者に静脈内、筋内または皮下投与してもよいし、または肺用のエアゾールまたはスプレーまたは開口部の直接洗浄をはじめとする所望の治療効果に適当なその他の公知の方法で投与してもよい。微粒子は凍結乾燥し、次いで、使用のためにマイクログラム/mLないし100mg/mLの範囲で水性懸濁液に処方してもよい。それらは一度に投与してもよいし、所望の用量次第で変動する時間間隔で投与されるいくつかの小用量に分割してもよい。
【００５６】
定義：
送達系とは一般に合成または天然物質を標的細胞に輸送するのを可能にする媒体およびメカニズムを指す。送達系は種々の組成および起源を有し得る。十分公知な例としてはリポソーム、ポリマー、共役体およびウイルスがある。生物学的に活性な物質を標的細胞および標的細胞内に送達するのに用いることが多い。
【００５７】
標的細胞とは送達系により輸送される物質の目的地である細胞、組織、生物、器官またはオルガネラを指す。それらは生存生物自身、生存生物内の細胞、組織、器官もしくはオルガネラまたは細胞培養物のいずれかに相当するか、またはその一部を形成する。生物学的材料は上記に定義される生物学的材料により構成されるリガンドに結合できる。
【００５８】
生物学的材料とは、好ましくは標的細胞内または標的細胞で生物学的活性を示す天然または合成起源の物質を指す。生物学的材料としてはペプチド、タンパク質、酵素、組換えタンパク質、核酸、ホルモン、成長因子、炭化水素、脂質、ウイルスまたはウイルス粒子、プラスミド、抗体またはその誘導体、組合せもしくは重合体が挙げられる。
【００５９】
微粒子とは、合成ポリマー、タンパク質および多糖をはじめとする種々の材料から形成され得る、直径が好ましくは1ミリメートル未満、より特には100マイクロメートル未満の固体または半固体粒子を指す。微粒子はまた微小カプセルおよびミクロスフェアも指す。
【００６０】
核酸結合剤とは核酸または匹敵する材料と複合体を形成する天然または合成物質を指す。好ましくは、それらはそれらの正電荷を有する残基と負電荷を有する核酸のリン酸塩主鎖との間の静電相互作用を構成するポリカチオンを含んでなる。それらはさらに凝縮および／または緩衝活性を提供し得る。
【００６１】
界面活性剤とは、微粒子形成性組成物に統合されるか、または微粒子を被覆する天然または合成起源の物質を指す。好ましくは、それらは親水性および親油性物質を含んでなる。
【００６２】
以下、好ましい実施形態の例により本発明をさらに説明する。
【００６３】
実施例１
1.1  フルオレセイン標識タンパク質
フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を用いてタンパク質をフルオレセイン標識した。遊離フルオレセインの痕跡を除去するために、フルオレセイン標識タンパク質をエタノール沈殿させ、遠心分離してペレットとし、次いで、PBSに溶解した。
【００６４】
1.2  フルオレセイン標識ポリマー
FD-20S、FD-70S、FD-500S（FITC標識デキストラン）はSigma Chemical Company（St. Louis MO, USA）から入手し、細胞内微粒子局在の検出に用いた。
【００６５】
1.3  デキストラン誘導体
DNA結合性であり、かつ、生物学的に活性なタンパク質とペプチドのデキストランへの結合手順は詳細に記載され、当業者には十分に公知である（例えば、Roger L. Lundblad, 「Techniques in Protein Modefication」, 1995を参照）。
【００６６】
1.4  細胞
細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC, Rockville, MO, USA）から入手できる。細胞は文献の推奨に従って培養する。一般に、それらは10-20％のウシ胎児血清、ペニシリン（100U/mL）、ストレプトマイシン（100.mu.g/mL）および2mmのL-グルタミン（GIBCO, Gaithersburg, MD, USA）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）で維持する。
【００６７】
1.5  ポリマー
デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよびその他の共重合体は「Sigma」（米国）、「Serva」（ドイツ）、「Fluka」（スイス）などの化学薬品供給業者から市販されている。
【００６８】
1.6  微粒子の製造
デキストラン（P1,20-500kDa；Serva）およびPEG（P2,1.5-35kDa；Serva）またはPVP（P2,10-360kDa, Fluka）またはTween80（P2；Serva）またはプルロニックF-68（P2；Serva）またはフィコール（P2；Serva）を含有する一相水溶液を製造する。次いで、FITC標識Dx（FD-20、70、500S, Sigma Chemical Company, St. Luis, MO, USA）またはFITC標識タンパク質を加えて蒸発工程を開始する。5-10時間後、蒸発工程を停止する。次いで、当業者に公知の方法に従ってP2を除去できる。微粒子を保存のために凍結乾燥する。微粒子の平均直径は0.03から3ミクロンの間で多様であり、粒径はW1/W2エマルションのP1相/P2相体積比、ポリマー分子量、それらの性質、温度および蒸発速度により異なる。
【００６９】
細胞内送達に好適な微粒子のサイズは光相関分光法により決定した（Zeta sizer 1, AZ 110, 90度,波長633）。サイズは
水性一相溶液中のP1/P2（W/W）比（R1）；R1=0.01-1.0；
蒸発工程時間（D,時間）；D=5-10；
温度（T,℃）；T=25,37；
を変更することにより200-300nmに調節する。
【００７０】
1.7  in vitro実験
ヒト肝臓癌細胞（HepG2細胞：ATCC HB-8065, ATCC, Rockville, MA, USA）は10％の熱不活化血清を含有するダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）中で培養する。培地およびウシ胎児血清（FBS）はGIBCO-BRL（Galthersburg, MD, USA）製のものである。培養培地には2mMのL-グルタミンおよび抗生物質（100単位/mLペニシリンおよび0.1mg/mLストレプトマイシン；GIBCO）を添加する。
【００７１】
HepG2細胞をトランスフェクションの前日に24ウェルプレートにプレーティングする。細胞をウェル当たり最終容量0.75mLの微粒子2mgを含有する培養培地中でトランスフェクトする。微粒子のサイズは0.2-0.3ミクロンである。微粒子はDx（20、70、500kDa）およびDx（FD-70S、500S；2.mu.g）またはFITC標識HSA（ヒト血清アルブミン；2.mu.g）からなる。37℃にて6または24時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を除去して細胞をBSAを含有するPBS中で洗浄して-20℃にてメタノール中の5％の酢酸中で30分間固定する。
【００７２】
実験は3T3繊維芽細胞およびまたHeLa細胞を用いて数回実施する。一連の中で、実験は二連で実施する。無処置の細胞を対照として用いた。
【００７３】
次いで、蛍光顕微鏡が用いたすべての細胞種において微粒子の核内および細胞内局在を示す。
【００７４】
実施例2
2.1  トランスフェクション用微粒子の製造
Dx（P1；20、70、500kDa；Serva）、PEG（P2；6kDa；Serva）またはPVP（P2；40kDa；Fluka）またはフィコール（P2；Serva）またはプルロニックF68またはTween80およびCMVプロモーター（Clonetech, Palo Alto, CA, USA）の下にβ-ガラクトシダーゼ（LacZ）のコード配列を含むプラスミドの形態のポリヌクレオチドを含有する一相水溶液を調整し、次いで蒸発工程を実施する（実施例1参照）。
【００７５】
粒径はR1、DおよびTを変更することにより100-200nmに調節する。含有等級はアガロースゲル電気泳動（1％アガロースゲル、TAEバッファー、pH7.4、90V、3時間）により分かる。非含有プラスミドはエチジウムブロマイド挿入により検出する。P1/pDNA、w/w、比が25よりも大きい場合には、PLLなどのDNA結合剤を用いずに0.95というプラスミドDNA含有等級を達成できる。その他の場合には、PLLなどのポリカチオン、ペプチドまたはDNA結合剤で置換したデキストランを用いる。
【００７６】
2.2  in vitroトランスフェクション
実験の24時間前に細胞を24ウェル組織培養プレートにプレーティングしてトランスフェクトする（実施例1参照）。37℃にて24時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を除去し、細胞をBSAを含有するPBS中で洗浄して-20℃にてメタノール中の５％酢酸中で30分間固定し、37℃にてX-gal溶液に一晩曝す。染色後、用いたすべての細胞種（HeLa、3T3、HepG2）においてLacZ発現が認められる。
【００７７】
2.3  in vitroトランスフェクション
マウスに尾の静脈から0.1mLの150mMのNaCl生理食塩溶液中の微粒子（動物当たりDx/pCMV LacZ2.5mg/0.025mg）を注射する。注射の2週間後にマウスを屠殺し、次いで生理食塩水中の5mg/lのヘパリン、PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび標準β-ガラクトシダーゼ提示溶液（1mg/mLのX-gal；Sigma）を潅流させる。還流後、すべての器官を解剖して30℃にてX-gal溶液に浸漬することによりβ-ガラクトシダーゼの判定を48時間続けた。染色後、器官を組織化学用パラフィンに包埋した。トランスジーン（LacZ）発現は肺、心臓、筋肉、肝臓および脳において認められた。
【００７８】
実施例3
3.1  生物学的材料：
生物学的材料としてヒトサイトメガロウイルスプロモーターにより働くβ-ガラクトシダーゼを含有するpCMVLacZまたはpNTβGal（核局在化シグナルで改変されたより小さい構築物）を組成物に含める。
【００７９】
3.2  微粒子の製造
実施例１および２に詳細に記載のように微粒子を製造する。
【００８０】
3.3  微粒子の特性決定
微粒子のサイズ分布は電子顕微鏡を用いることにより決定する。すべての粒子の直径は約1ミクロンである。
【００８１】
3.4  in vivoトランスフェクション
マウスで遺伝子導入を実施する。微粒子の投与には、筋内（大腿四頭筋）および静脈内（尾の静脈）経路を用いる。各注射につき、微粒子中に25または50μgのプラスミドDNAが含まれる。対照動物を同量のありのままのプラスミドDNAでトランスフェクトする。
【００８２】
3.5  動物の乱切法
投与の14日後に動物の乱切を実施した。
【００８３】
3.6  β-Gal発現分析
筋内投与の場合には、注射された筋肉、肝臓または肺の組織サンプルを採取する。静脈投与の場合には、肝臓または肺から組織サンプルを採取する。この組織サンプルのうち組織変性の兆候を示すものはない。
【００８４】
3.7  トランスジーン発現実験
乱切後、組織サンプルを液体窒素中で瞬間凍結し、その後のクリオスタット切片または器官サンプル全体での定性的細胞化学マーカー遺伝子発現実験のために処理する。
【００８５】
全細胞数（核）に対するβ-Gal陽性細胞（核）の割合をトランスフェクション効率の平均値として定量する。
【００８６】
筋内注射後、陽性細胞の割合は筋組織で0.01-0.07および肝臓および肺組織では0.01-0.03であった。
【００８７】
静脈注射後、陽性細胞の割合は双方、すなわち、肝臓および肺で0.01-0.05であった。
【００８８】
本発明を詳細に説明したが、実施例は例として挙げたものである。当業者には明らかな本発明の改変は本特許の請求の範囲内にあるものとする。
【００８９】
引用により、以下の文書はそのまま本明細書の一部とされる。
【００９０】
参照文献：
【００９１】
【参照文献１】
0004988114.tif 000002
別の微小カプセル化技術に関する参照文献：
【００９２】
【参照文献２】
0004988114.tif 000003
非毒性デキストランに関する参照文献：
【００９３】
【参照文献３】
0004988114.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明による微粒子の製造方法を概略的に示す説明図である。
【図１】
0004988114.tif 000005