(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取した試料中のヒトライノウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列に基づいて遺伝子系統解析を行い、ヒトライノウイルスの血清型または遺伝子型を同定することを特徴とするヒトライノウイルスの血清型または遺伝子型の同定法。
【請求項２】
試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４全領域を含むウイルス遺伝子を増幅し、前記ＶＰ４全領域の塩基配列を得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲが、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとを用いるものであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトライノウイルスは、ピコルナウイルス科（family picornaviridae）ライノウイルス属（genus rhinovirus）に含まれるプラス一本鎖RNAをゲノムに持つ小型ウイルスであり、鼻を意味するギリシャ語rhinにその名が由来するように、鼻かぜ、いわゆる感冒の原因ウイルスである。至適増殖温度が33℃と低いため、ヒトライノウイルスによる炎症は上気道に起こることが多い。細菌等による二次感染が起こった場合、気管支炎、副鼻腔炎、中耳炎などを引き起こすこともある。ヒトライノウイルスによる感冒は、集中的に流行するインフルエンザウイルス等によるものと異なり通年みられるが、春と秋に多いとされている。１つの地域に複数の血清型のヒトライノウイルスが存在すること、及び、感染した血清型のヒトライノウイルスに対する免疫を獲得しても血清型が１００以上も存在するために、他の血清型のヒトライノウイルスに感染することから、ライノウイルス感染の早期診断には迅速なウイルスの検出と同定が必須である。
【０００３】
ヒトライノウイルスは、培養細胞での増殖が遅くウイルス分離が困難なこと、及び、血清型が１００以上も存在するため、型特異的抗血清を用いた型同定が困難かつ煩雑なことから、ライノウイルスの流行の実態はいまだ明らかでない。ライノウイルスは他の多くのRNAウイルスと同様、ウイルスの遺伝子自体がコードするRNA依存性RNAポリメラーゼによって複製される。しかしながら、この酵素は校正(proofreading)機能を持たないために、RNA合成の過程で生じた塩基変異が子孫ウイルスの遺伝子に蓄積され易い。従って、アミノ酸変異を伴う塩基変異がウイルス構造蛋白質コード領域に生じた場合、いわゆる難中和性ウイルスが生じる可能性がある。これは、表現型（phenotype）を指標にした中和試験に固有の問題である。
【０００４】
分子系統分析を行うことによりウイルスの血清型を同定する方法がエンテロウイルスについて報告されている（特開平11-346799）。この報告には、エンテロウイルスのＰＣＲによる検出において、ライノウイルスも検出され得ることが記載されているが、ライノウイルスの血清型または遺伝子型の同定については記載がない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の様な問題点のないヒトライノウイルスの迅速かつ簡易な血清型または遺伝子型の同定法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトライノウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を解析したところ、この塩基配列の遺伝子系統解析により血清型が同定できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００７】
かくして、本発明は、ヒトライノウイルスのＶＰ４領域の塩基配列に基づいて遺伝子系統解析を行い、ヒトライノウイルスの血清型を同定することを特徴とするヒトライノウイルスの血清型または遺伝子型の同定法（以下、本発明同定法ともいう）を提供する。
【０００８】
本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基配列は、試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域を含むウイルス遺伝子を増幅することにより得ることができる。
【０００９】
ＰＣＲに使用されるプライマーとしては、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明同定法は、ヒトライノウイルスの血清型または遺伝子型を同定するために、ヒトライノウイルスのＶＰ４領域の塩基配列に基づいて遺伝子系統解析を行うことを特徴とする。
【００１１】
本明細書において、ＶＰ４領域とは、ヒトライノウイルスのキャプシドを形成するタンパク質の一つであるＶＰ４タンパク質（通常、６９アミノ酸）をコードする領域（通常、２０７ｂｐ）を意味する。
【００１２】
ＶＰ４領域の塩基配列を得る方法は特に限定されないが、血清型の未同定のヒトライノウイルスを含む試料からＶＰ４領域の塩基配列を得る場合には、以下の方法によることが好ましい。すなわち、試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域を含むウイルス遺伝子を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配列解析を行う方法である。
【００１３】
試料は、ヒトライノウイルスを含むかまたは含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例としては、鼻腔又は咽頭拭い液、鼻腔洗浄液などの臨床材料、または、これらの臨床材料より分離されたウイルス培養液などを挙げることができる。これらの試料からのＲＮＡの抽出は公知の方法により行うことができる。また、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成方法も公知である。ＰＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４領域を含むウイルス遺伝子を増幅できるように選択されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、公知のＰＣＲの方法に従って行うことができる。また、ＲＮＡから逆転写(RT)-PCRにより同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの増幅を行うこともできる。RT-PCRによれば、高感度かつ迅速な増幅が可能になる。
【００１４】
増幅産物の取得は、アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公知の方法で行うことができる。通常には、ヒトライノウイルスの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列とから予測できる長さの増幅産物を取得する。
【００１５】
ＶＰ４領域の全領域を含む塩基配列を増幅できるように選択されたオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１６】
ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよく、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第２回目のＰＣＲを行うことができる。２段階の増幅を行うことによって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅することが可能になる。
【００１７】
増幅産物の塩基配列の決定は公知の方法によって行うことができる。決定された塩基配列の内、ＶＰ４領域の塩基配列を系統解析に用いる。
【００１８】
本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基配列に基づく系統解析は、公知の系統解析法によって行うことができる。このような方法としては、Higgins法、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法及びN-J法などが挙げられ、また、これらの方法により系統解析を行うためのソフトウェアが市販されている（DNASIS(日立ソフトウェアエンジニアリング)、SINCA(富士通)など）。
【００１９】
血清型は、系統解析においてそれぞれの血清型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、または、一定値以上の確率で他の血清型のクラスターと区別されるか否かによって決定できる。一定値とは、系統解析により得られた系統樹において各血清型に属する株がそれぞれ単一のクラスターを形成するような値であればよい。
【００２０】
より具体的には、ホモロジーで８０％以上、ブーツストラップ法で他のクラスターから区別される確率が７０％以上という値があげられる。例えば、ライノウイルス標準株１００血清型の系統解析によると、血清型は９８．６％以上のホモロジーで区別され、分離株を加えたブーツストラップでは、８６％の確率で他の血清型と区別された。
【００２１】
ヒトライノウイルスのＶＰ４領域の塩基配列に基づく遺伝子系統解析では、血清型によく対応した分類が得られるため、すなわち、血清型とＶＰ４領域の遺伝子型が十分に一致するため、血清型に対応する遺伝子型として型の同定を行ってもよい。従って、本発明により血清型または遺伝子型の同定方法が提供される。
【００２２】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】
（１）ヒトライノウイルスＶＰ４全領域の塩基配列解析
１）ウイルスRNAの抽出とcDNA合成
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に登録されている100血清型（HRV1〜100）のヒトライノウイルスのうち、GenBankにその遺伝子の全塩基配列が登録されている７株（HRV1B、HRV2、HRV9、HRV14、HRV16、HRV85、HRV89）を除いた９３株をATCCから入手した。
【００２４】
それぞれの試料から、スマイテストＲキット（ゲノムサイエンス研究所）を用いてRNAを抽出し、乾固させた。このRNAに、リボヌクレアーゼフリー蒸留水８μl、リボヌクレアーゼインヒビター（40 U/μl、promega）１μl、及び、50μM下流プライマー（OL68-1: 5'GGTAA(C/T)TTCCACCACCA(A/G/C/T)CC3'(配列番号１)、20mer）１μlを加えてRNAを溶解させた。100℃で１分間加熱変性後、氷中にて急冷した。これに、10×Taq緩衝液（100 M Tris-HCl pH 8.3、500 mM KCl、15 mM MgCl2、0.01%(w/v)ゼラチン） 2μl、10 mM dNTPs 2μl、M-MLV由来逆転写酵素（200 U/μl、GIBCO BRL)）0.6μl、及び、リボヌクレアーゼフリー蒸留水4.4μlを加え、37℃で60分間の反応条件でcDNAを合成した。
【００２５】
２）PCR
ウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を増幅するため、ヒトライノウイルス及びエンテロウイルスに共通な配列と思われるウイルス遺伝子の5'非翻訳領域及びVP2領域に設定したプライマーを用いてPCRを行った。第１回(1st)PCRは、上記で得られた反応液10μlに、10×Taq緩衝液 4.5μl、50μM 上流プライマー（EVP2: 5'CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT3'(配列番号２)、25mer）0.5μl、蒸留水34.75μl及びAmpli Taq DNAポリメラーゼ(5 U/μl)(Roche Diagnostics)0.25μlを加え、ミネラルオイルを重層し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)を用いて、95℃30秒で変性、55℃30秒でアニーリング及び72℃１分間で伸長のサイクルを40サイクルの条件で行った。第２回(2nd)PCRは、1st PCRで得られた反応液５μlに、10×Taq緩衝液4.5μl、10 mM dNTPs １μl、50μM上流プライマー(EVP4: 5'CTACTTTGGGTGTCCGTGTT3'(配列番号３)、20mer) 0.5μl、50μM 下流プライマー(OL68-1) 0.5μl、蒸留水38.25μl及びAmpli Taq DNAポリメラーゼ0.25μlを加え、1st PCRと同じ条件で行った。PCR産物は、３％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線で検出した。
【００２６】
この条件でのPCRでは、1st PCRで約630 bp、2nd PCRで約530 bp（5'非翻訳領域の一部、ＶＰ４全領域及びＶＰ２領域のＮ末端側約１／３を含む）が増幅される。この条件では、全ヒトエンテロウイルスの同領域の増幅も可能であるが、ヒトエンテロウイルスの場合の増幅領域は1st PCRで約750 bp、2nd PCRで約650 bpである（特開平11-346799参照）。ヒトライノウイルスは、ヒトエンテロウイルスと比較した場合、5'非翻訳領域の3'末端に約120 bpの欠損があり、ヒトエンテロウイルスとはアガロースゲル電気泳動で容易に鑑別可能であった。また、今回用いた全てのヒトライノウイルス標準株及び分離ウイルス株において増幅が確認できたことから、上記プライマーの塩基配列は、ヒトエンテロウイルスのみならず、ヒトライノウイルスの全血清型に保存されていることが明らかとなった。
【００２７】
３）塩基配列の解析
上記のようにして得られた、ＶＰ４全領域を含むPCR産物の塩基配列を解析した。PCR産物は、QIAquick PCR purificationキット(QIAGEN)を用いて、未反応のプライマーとdNTPsを除去し、DNA濃度が5 ng/μl以上になるように蒸留水に溶解した。塩基配列解析用に、ＶＰ４領域上流の、ヒトライノウイルス及びエンテロウイルスに共通な配列と思われる塩基配列の上記プライマーEVP4を用いた。塩基配列の解析は、ダイターミネーター(dye terminator)法を用いたサイクルシークエンスキット(BECMAN COULTER)を用いて、96℃20秒、50℃20秒及び60℃４分のサイクルを40サイクルの条件で反応を行い、マルチキャピラリーDNA解析システム(BECMAN COULTER)で塩基配列を決定した。
【００２８】
この結果、プライマーEVP4を用いて全ての型のヒトライノウイルスの塩基配列が決定された。このことから、プライマーEVP4は、ヒトエンテロウイルスのみならず、ヒトライノウイルスの全血清型に保存されていることが明らかとなった。塩基配列を決定した結果、ヒトライノウイルスの標準株、及び、分離ウイルス株のいずれの株についても、塩基配列に挿入や欠失は認められず、ＶＰ４領域の長さはは207 bpと一様であった。
【００２９】
ＶＰ４全領域の塩基配列の解析を行った標準株93血清型とGenBankに登録されている標準株７血清型とを合わせた100種のヒトライノウイルス血清型標準株のVP4領域のホモロジーは50.2〜98.6％であった（シンプルホモロジー法(DINASIS)により算出）。
【００３０】
（２）系統解析
新たに塩基配列を解析した標準株93株、ならびに、GenBankに登録されているHRV1B、HRV2、HRV9、HRV14、HRV16、HRV85及びHRV89（７血清型）のＶＰ４領域の塩基配列を用いた。系統樹は、２−パラメーター法を用いたUPGMA法及びN-J法(SINCA、富士通)により作成し、作成された系統樹の確かさは、ブーツストラップ法(SINCA)を用いて統計的評価を行った。
【００３１】
臨床分離株の塩基配列を標準株と共に系統解析を行って得られた系統樹の枝分かれとブーツストラップ解析より血清型同定を行った。
【００３２】
先ず、標準株のＶＰ４領域の全領域の塩基配列による系統樹を作成した結果、ヒトライノウイルスの遺伝子型は、HRV87を除いて、大きく２つのグループに分類された。すなわち、HRV1〜2、7〜13、15〜16、18〜25、36、38〜41、43〜47、49〜51、53〜68、71、73〜78、80〜82、85、88〜90、94〜96、98及び100の第１群と、HRV3〜6、14、17、26〜27、37、42、48、52、69〜70、72、79、83〜84、86、91〜93、97及び99の第２群の２グループである。これは、UPGMA法及びN-J法のいずれも同様の結果となった。
【００３３】
ヒトライノウイルスは分子生物学的特徴からこれまで、ヒトライノウイルスＡ(Human Rhinovirus A)、ヒトライノウイルスＢ(Human Rhinovirus B)及びテンタティブ種(tentative species)に分類されている。上記の分類結果では、これまでにヒトライノウイルスＡ及びヒトライノウイルスＢに分類されているヒトライノウイルスは、それぞれ、第１群及び第２群へ分類され、ヒトライノウイルスＡ及びヒトライノウイルスＢの分類は第１群及び第２群の分類と１００％一致した。従って、第１群がヒトライノウイルスＡ、第２群がヒトライノウイルスＢに相当することが判明した。さらにこれまでテンタティブ種に分類されている78種類（HRV87を除く）のヒトライノウイルスは、56種類のヒトライノウイルスＡ及び22種類のヒトライノウイルスＢに分類された。系統樹の一例を図１及び２に示す。
【００３４】
（３）血清型同定
ヒトエンテロウイルスRT-PCR（臨床とウイルス、第27巻、第４号、P283〜P293）で、ヒトライノウイルスとして検出された臨床分離株９株について、上記と同様に塩基配列決定を行い、標準株の塩基配列とともに系統解析を行ったところ、標準株と同様に２グループに分類された（ヒトライノウイルスＡが７株、ヒトライノウイルスＢが２株）。さらに一部（８株）の臨床分離株は、標準株とともにブートストラップ値86%以上でクラスターを形成し、それぞれ、HRV1、HRV3、HRV38、HRV49、HRV53及びHRV60と血清型が同定された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によって、ヒトライノウイルスの血清型または遺伝子型を、ウイルスの分離培養を要することなく、塩基配列の遺伝子系統解析により決定することが可能になる。また、非中和サイトの蛋白質をコードする遺伝子を利用するため、表現型に影響を受けず、難中和性ウイルスに関わる問題の解決にも寄与する。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  標準株のＶＰ４領域に基づいて、2-パラメーター法を用いたUPGMA法により作成された系統樹。
【図２】  図１の続き。
【図１】
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【図２】
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