(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するか、あるいはそのアミノ酸配列に対して１個又は複数個の、アミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの3'位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターにより形質転換された大腸菌。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質。
【請求項５】
請求項３に記載の大腸菌を培養し、又は生育させ、そして当該大腸菌からアントシアニンの3'位に糖を転移する活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の遺伝子を用いてアントシアニンの3'位に糖を付加する方法。
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子を用いて花の色を変える方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子及びその利用方法に関するものである。
背景技術
花き産業においては顕花植物の新規なあるいは多様性に富んだ新品種の開発が重要である。なかでも、花きのもっとも重要な形質のひとつである花の色については、交配に頼った従来の育種により、さまざまな色の品種が育種されてきたが、交配可能な植物種の遺伝資源が限定されているため、単一の植物種がすべての色の品種を有することはまれである。
花の色の主な成分は、アントシアニンと総称される、フラボノイド類に属する一群の化合物である。植物には多様なアントシアニンが存在することは知られており、それらの多くの構造が既に決定されている。アントシアニンの色は主としてその構造に依存している（Ｈａｒｂｏｒｎｅ（１９８６）Ｔｈｅ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，ｐ５６５）。アントシアニンの生合成に関わる酵素やその遺伝子に関しても研究が進んでおり、分子生物学的手法と植物への遺伝子導入により、アントシアニンの構造を変換し、花の色を変えた例もある（Ｈｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７，ｐ．１０７１、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９．ｐ１１１９）。
アントシアニンの生合成経路において、アントシアニジン３−グルコシドに至るまではほとんどの顕花植物で共通である（例えば、Ｈｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７，ｐ１０７１）。その後アントシアニジン３−グルコシドは種・品種に特異的な多様な修飾を受け植物体中に存在する。この多様性が花色の多彩さの一因となっている。
アントシアニンは中性溶液中では不安定な化合物であるが、糖やアシル基により修飾されることにより安定性が向上することが知られている（Ｆｏｒｋｍａｎｎ（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１０６，ｐ１）。また、芳香族アシル基の付加により青くなることも知られている（Ｆｏｒｋｍａｎｎ（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１０６，ｐ１）。ここで注目すべき点は、アシル基はアントシアニジン骨格に直接結合するのではなく、アントシアニジンに付加している糖を介して結合する点である。つまりアシル基による安定化、色素の青色化のためには、その前提条件としてアントシアニジンに糖が付加していることが必要である。
青い花の代表的な品種であるリンドウ、サイネリア、チョウマメのアントシアニンは、Ｂ環の３’位がグルコースにより修飾されており、さらにこのグルコースが芳香族アシル基により修飾されている（それぞれ、Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８，ｐ４３１３，Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５，ｐ６０２１，Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｇｒｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０，ｐ１７）。リンドウの主要色素を用いた研究によって、Ｂ環の３’位のアシル基がアントシアニジンの安定化、青色化に寄与していることが示されたが（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４，ｐ８５）、このためには３’位に糖が付加していることが必要である。
フラボノイドの配糖化に関してはいくつかの報告がある。例えば、アントシアニジンの３位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する酵素の遺伝子は、キンギョソウ、リンドウ、シソ、オオムギ、トウモロコシなどからクローン化されている（例えば、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７，ｐ７１１）。また、アントシアニジンの３位の水酸基にガラクトースを転移する反応を触媒する酵素の遺伝子はケツルアズキ（Ｖｉｇｎａ  ｍｕｎｇｏ）とペチュニアからクローン化されている（Ｍａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，３９，ｐ１１４５，Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２７３，ｐ３４０１１）。
また、アントシアニンの５位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する酵素の遺伝子は、シソ、バーベナ、トレニアなどからクローン化されている（ＷＯ９９／０５２８７）。アントシアニジン３−グルコシドにラムノースを転移する反応を触媒する酵素遺伝子はペチュニアからクローン化されている（Ｂｒｕｇｌｉｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，５，ｐ８１）。
フラボノイドの７位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する酵素の遺伝子は、オウゴン（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）からクローン化されており、これを大腸菌で発現させた蛋白質はフラボノイドの７位の水酸基にグルコースを転移する反応をも触媒することが報告されている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ，２１０，ｐ１００６）。ベタニジンの５位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する酵素の遺伝子がクローン化されており、これを大腸菌で発現させた蛋白質はフラボノイドの４’位と７位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒することが示されている（Ｖｏｇｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９：５０９−５１９）。
しかしながら、アントシアニンの３’位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する酵素に関する報告はなく、酵素の活性が測定されたことも、酵素が精製されたことも、遺伝子がクローン化されたこともない。糖転移酵素は上に述べたように複数の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する場合もあるが、植物体内で目的のアントシアニンを蓄積させるためには基質特性の高い酵素を利用する必要がある。
発明の開示
本発明は、アントシアニンの３’位水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、好ましくはアントシアニンの３’位の水酸基のみにグルコースを転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を提供しようとするものである。本発明で得られたアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を用いて、花色を変えたり安定化することができる。本発明で得られたアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、アントシアニンの安定化ならびにアントシアニンの３’位の糖−アシル基付加の制御による花色の改変に有効である。
前記のように、アントシアニンの３’位水酸基に糖を転移する活性を有する蛋白質を用いるとアントシアニンの修飾により花の色を変えることができることは明らかであったが、この酵素の性質は明らかではなく、酵素が精製されたり、その遺伝子がクローニングされたこともなかった。本発明においては、アントシアニンの３’位に糖を転移する酵素活性をリンドウの花弁から見出し、その活性を持つ蛋白質をリンドウの花弁から精製した。
その酵素の部分アミノ酸配列を決定することにより、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を推察し、合成した。そのヌクレオチドを基にリンドウの花弁ｃＤＮＡライブラリーからアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質の遺伝子をクローン化した。クローン化した遺伝子を酵母で発現させることにより、アントシアニンの３’位に糖を転移する酵素活性を確認し、クローン化した遺伝子がアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードすることを確認した。
本発明者はさらに、サイネリアの花弁及びチョウマメからＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを実施例４で得られたリンドウの３’位糖転移酵素のｃＤＮＡをプローブとして用いてスクリーニングし、得られたクローンが３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードすることを見出した。
本発明においてはさらに、３’位糖転移酵素をコードする遺伝子と５位糖転移酵素をコードする遺伝子とをペチュニアに導入してトランスジェニック植物を作製し、これらの遺伝子が機能していることを確認した。
従って本発明は、配列番号：２，１２又は１４に記載のアミノ酸配列を有し、アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードし、あるいはそれらのアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／または他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列をコードする遺伝子を提供する。
本発明はまた、配列番号：２，１２又は１４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の一部または全部に対して、５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズして得られる、アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はさらに、前記の遺伝子を含んでなるベクターを提供する。
本発明はまた、前記のベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はまた、前記の遺伝子によってコードされる蛋白質を提供する。
本発明はまた、前記の宿主を培養し、又は生育させ、そして当該宿主からアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法を提供する。
本発明はさらに、前記の遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫またはそれらの組織を提供する。
本発明はまた、前記の植物又はこれと同じ性質を有するその子孫の切り花を提供する。
本発明はまた、前記の遺伝子を用いてアントシアニンの３’位に糖を付加する方法を提供する。
本発明はまた、前記の遺伝子を用いて花の色を変える方法を提供する。
発明の実施の形態
本発明の遺伝子としては、例えば配列番号：２，１２又は１４に記載するアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質も、もとの蛋白質と同様の酵素活性を維持することが知られている。従って本発明は、アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を維持している蛋白質である限り、配列番号：２，１２又は１４に記載のアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸配列の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有する蛋白質および当該蛋白質をコードする遺伝子も本発明に属する。
本発明はまた、配列番号：１，１１又は１３に記載の塩基配列もしくは配列番号：２，１２又は１４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、またはそれらの塩基配列の一部分、例えば糖転移酵素間でよく保存されている領域の６個以上のアミノ酸をコードする塩基配列に対して、例えば５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関するものである。なお、適切なハイブリダイゼーション温度は塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えばアミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとした場合には５０℃以下の温度が好ましい。
このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば植物由来のもの、例えば、サイネリアやチョウマメ、ロベリア、カリフォルニアライラック由来の遺伝子が挙げられるが、植物以外の由来であってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。
本発明はさらに配列番号：２，１２又は１４に記載のアミノ酸配列に対して約２０％以上、好ましくは５０％以上、例えば６０％または７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の花色変換への利用に関するものである。
生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に具体的に示すように、例えばｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法を実施し、所望の修飾を導入したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
また、得られた遺伝子を大腸菌および酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られた遺伝子がアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードすることを確認することができる。さらに、当該遺伝子を発現させることにより、遺伝子産物であるアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質を得ることができる。あるいはまた、配列番号：２，１２又は１４に記載のアミノ酸配列に対する抗体を用いても、アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質を得ることができ、抗体を用いて他の生物由来のアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子をクローン化することもできる。
従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス．スブシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母または糸状菌が使用できる。
酵母としては例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えばサッカロミセス．セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばアスペルギルス．オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス．ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えばｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーター等が使用される。
また動物細胞宿主用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーター等が使用される。発現ベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うことができる。
前記の発現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培または生育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により回収、精製し、目的とする蛋白質を得ることができる。
本明細書においてはリンドウ、サイネリア及びチョウマメ由来のアントシアニンの３’位に糖を転移する酵素の遺伝子について述べているが、本発明はこれら由来の遺伝子に限定されるものではなく、アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の起源としては、植物でも動物でも微生物であってもよく、アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有していれば同様に花色変換へ利用できる。
さらに本発明は、アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を導入することにより得られる、色合いが調節された植物もしくはその子孫又はこれらの組織に関するものであり、その形態は切り花であってもよい。本発明により得られるアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を用いると、アントシアニンの３’位を配糖化したり、あるいはアントシアニンの３’位の配糖化を抑制することができ、結果として花の色を変換することができる。この際３’位のグルコースにアシル基を転移する酵素遺伝子と併せて利用することもできる。
現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることが可能であり、またアンチセンス法やコサプレッション法などによって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。
形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワーなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。
実施例
以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、ＷＯ９６／２５５００号公報に記載されている方法に依った。
実施例１．リンドウ花弁でのアントシアニンの３’位に糖を転移する酵素活性測定
既に報告されている方法（植物細胞工学シリーズ  ９（１９９８）ｐ９９，藤原  秀潤社）に従い、リンドウの花弁から粗酵素液を抽出した。
２０μｌの粗抽出液、１０μｌの０．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８．５）、１０μｌの５ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース、１０μｌのデルフィニジン３，５−ジグルコシド（１．５ｍｇ／ｍｌ）を混合し、３０度で１０分間保持した。その後、藤原らの方法（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９８）Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．）に従い、反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーにて分析した。その結果、デルフィニジン３，３’，５−トリグルコシドのピークが検出された。従って、リンドウの花弁にはアントシアニンの３’位に糖を転移する酵素があることが明らかとなった。
実施例２．アントシアニンの３’位に糖を転移する酵素の精製
酵素の精製方法は、断らない限り、既に報告されている方法（植物細胞工学シリーズ  ９（１９９８）ｐ９９，藤原  秀潤社）に依った。約５００ｇのリンドウの花弁から粗抽出液を得、硫安塩析により飽和度４０−７０％の画分を得た。これを緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、１０μＭ  ｐ−アミジノフェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＡＰＭＳＦ）、０．１％ベータメルカプトエタノール）に溶解した後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア社）により脱塩した。脱塩した画分を緩衝液Ａで平衡化したＱ−セファロース（ファルマシア社）に吸着させ、緩衝液Ａと５００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａとの直線濃度勾配により溶出した。
活性のある画分を緩衝液Ａで平衡化したＢｌｕｅ  Ａ（アミコン社）に吸着させ、緩衝液Ａと１．５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａとの直線濃度勾配により溶出した。活性のある画分を緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１０％グリセロール、１０μＭ  ｐ−アミジノフェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＡＰＭＳＦ）、０．１％ベータメルカプトエタノール）に透析後、緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社）に吸着させ、緩衝液Ｂと５００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ｂとの直線濃度勾配により溶出した。活性のある画分をマイクロコン−３０（アミコン社）により濃縮脱塩し、溶媒を０．５ｍｌの緩衝液Ｂに置換した後、緩衝液Ｂで平衡化したスーパーロース１２（ファルマシア社）を用いて精製した。以上の方法により、約７．５μｇの精製標品を得ることができた。
実施例３．アントシアニンの３’位に糖を転移する酵素の部分アミノ酸配列の決定
実施例２で得た精製標品を用い、藤原らの方法（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９８）Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．）に従い、その部分アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列は以下に記載の通りである。
0004982782.tif 000002
という配列に基づきオリゴヌクレオチドＧ３’ＧＴ２を作製した。
0004982782.tif 000003
実施例４．アントシアニンの３’位に糖を転移する酵素をコードする遺伝子のクローニング
リンドウ花弁ｃＤＮＡライブラリーファージ溶液３μｌを鋳型にし、Ｇ３’ＧＴ２とＸｈｏＩ−Ｔをそれぞれ５０ｐｍｏｌｅをプライマーとし、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いて製造者の推奨する方法により計５０μｌでＰＣＲ反応を行った。９５度で２分間保持した後、９５度１分、４２度２分、７２度３分のサイクルを２５サイクル繰り返した後、７２度で１０分間保持した。
反応液をアガロースゲル電気泳動で分離し、約７００ｂｐのバンドを回収し、ｐＣＲＩＩベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。得られたプラスミドの塩基配列を決定したところ、ＧＴ１５、ＧＴ２５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドが得られた。このＤＮＡをプローブとしてリンドウのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、完全長のｃＤＮＡを含むクローンを得た。そのうち１クローン（ｐＧ３’ＧＴ７）の全塩基配列を決定し、配列番号：１に示す。また、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
実施例５．アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の酵母での発現
ｐＧ３’ＧＴ７をＸｈｏＩで消化し得られた約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡとｐＹＥ２２ｍをＳａｌＩで消化して得られるＤＮＡ断片をライゲーションし、得られたプラスミドのうち、開始コドンがｐＹＥ２２ｍ上のプロモーターに近い方向のものをｐＹＧ３’ＧＴ７とした。なお、ｐＹＥ２２ｍは、特開平４−２２８０７８号公報記載の方法に従って作製した。このプラスミドを酵母に導入し、形質転換酵母を取得した。この酵母を培養し、グラスビーズで破砕後、デルフィニジン３，５−ジグルコシドを基質として実施例１と同様にして酵素活性を測定したところ、デルフィニジン３，５−ジグルコシドの３’位に糖を付加する活性が認められた。
プラスミドを導入していない酵母には活性は検出されなかった。また、シアニジン３，５−ジグルコシドを基質とした際には新しいピークは生じなかった。従って、Ｂ環に水酸基を３つ有するデルフィニジン３，５−ジグルコシドには反応するが、水酸基が２つのシアニジン３，５−ジグルコシドには糖を付加することができなかったことから、本酵素は基質のＢ環の構造に対する特異性が高く、Ｂ環の３つめの水酸基に特異的に糖を付加する活性をもつものと考えられる。
実施例６．アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の大腸菌における発現
ＰＣＲによってｐＧ３’ＧＴ７の開始メチオニンコドン部位に重なるようにＮｃｏＩサイトを導入し、ｐＧ３’ＧＴ７の開始メチオニンからポリＡに至る領域を大腸菌発現ベクターｐＱＥ６１（ＱＩＡＧＥＮ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩサイトに挿入した。得られた大腸菌発現ベクターをｐＧ３’Ｑ１とした。ｐＧ３’Ｑ１を大腸菌ＪＭ１０５株に導入し、３７℃で一晩前培養した後、前培養液の一部を８Ｌの本培養液に植菌し、２７℃でＯＤ６００＝０．６になるまで培養した。３’ＧＴ遺伝子の発現誘導のため、最終濃度０．４ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、さらに２７℃で一晩培養した。集菌、洗浄後、菌体を４００ｍｌの破砕用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％β−メルカプトエタノール）に懸濁後、超音波処理によって菌体を破壊した。遠心後、得られた上清をＤＥ５２にかけた後、さらに４０−７０％硫安沈殿画分を回収した。脱塩後の粗蛋白質液を、予め緩衝液Ｃ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５％β−メルカプトエタノール）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー株式会社）にかけ、０−０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで溶出した。活性画分を回収し、緩衝液Ｃで平衡化したＢｌｕｅＡ（アミコン社）に吸着させ、緩衝液Ｃと２Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃの直線濃度勾配により溶出した。得られた活性画分を３’ＧＴ部分精製標品として以下で述べる反応に用いた。
実施例７．糖付加位置の確認
実施例６で得られた３’ＧＴ部分精製標品を用い、デルフィニジン３，５−ジグルコシドを基質として実施例１で述べた反応を１００倍にスケールアップして行った。３０℃、１５分の反応の後、１Ｍ  ＨＣｌを最終濃度０．１６Ｍとなるように添加し、反応を停止した。反応液をＳｅｐｐａｋ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ（株）製）に負荷し水洗にて脱塩、除タンパクした後、５０％アセトニトリル０．１％ＴＦＡ溶液で色素画分を溶出し減圧濃縮した。この色素画分を分取ＨＰＬＣで精製した。分取ＨＰＬＣは、カラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｄ−ＯＤＳ−５（ＹＭＣ社製）２ｃｍφ＊２５ｃｍ、移動相はＡ：水、Ｂ：５０％アセトニトリル０．５％ＴＦＡ、６ｍｌ／ｍｉｎ．、Ｂ２０％→Ｂ５０％のリニアグラジエント（６０ｍｉｎ）、検出はＡ５２０ｎｍ−ＡＵＦＳ：０．３２で行った。２０〜２２分に溶出した生成物を集め減圧濃縮後、凍結乾燥した。ＭＳはサーモクエスト社ＬＣ−Ｑを用いＥＳＩ、ｐｏｓｉｔｉｖｅで測定した。その結果、分子イオン７８９（Ｍ＋）のピークを与え、このことから反応生成物はデルフィニジン３，５’−ジグルコシドにグルコースが１個付加した物であることが確認された。
また、凍結乾燥後の化合物２．５ｍｇをＮＭＲに供した。測定溶媒は０．６ｍｌの１０％ＴＦＡ−ｄ／ＣＤ３０ＤでＢｒｕｋｅｒ  ＤＭＸ−５００で１Ｈ  ＮＭＲとＲＯＥＳＹ、（１３Ｃ  ＮＭＲ）の測定を行った。ＲＯＥＳＹの結果、Ｂ環の２’位の８．１２ｐｐｍのピークとグルコースの１位の５．０３ｐｐｍのピークの間にＲＯＥが観察された。このことから、３個のグルコースの結合位置はそれぞれデルフィニジンの３位、５位及び３’位である事が明らかになり、酵素反応生成物は目的のデルフィニジン３，５，３’−トリグルコシドであることが確認された。
実施例８．基質特異性の解析
実施例６で得られた３’ＧＴ部分精製標品を用い、３’ＧＴの基質特異性を解析した。実施例５で確認されたのと同様に、Ｂ環に水酸基を３つ有するデルフィニジン３，５−ジグルコシドには反応するが、水酸基が２つのシアニジン３，５−ジグルコシドには反応しない。デルフィニジン３−グルコシル−５−カフェオイルグルコシドに対しても反応し、デルフィニジン３，５−ジグルコシドに対する活性を１００％とすれば、デルフィニジン３−グルコシル−５−カフェオイルグルコシドに対する活性は約５０％程度であった。デルフィニジンやデルフィニジン３−ジグルコシドを基質とした場合も数％（１％以下）の反応精製物が確認された。本生成物はＨＰＬＣのＲＴならびに吸収スペクトルから基質の３’位に１分子の糖が付加したものと考えられる。
実施例９．アントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のペチュニアにおける発現
ペチュニア（Ｓｋｒ４  Ｘ  Ｄａ系統）は、アントシアニン３−ラムノシル転移酵素遺伝子の変異のため３位のグルコースにラムノースを付加することができず、花弁の主要アントシアニン色素としてデルフィニジン３−グルコシドを蓄積する。そこでリンドウのアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ  ｐＧ３’ＧＴ７とトレニア由来のアントシアニンの５位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ  ｐＴＧＴ５（ＷＯ９９／０５２８７）を共に発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ１１１２を構築し、本ペチュニアに導入した。
ｐＳＰＢ１１１２作製は下記のように行った。まずカリフラワーモザイウイルス３５Ｓプロモーター上流にエンハンサー配列を２回繰り返してもつＥ１２  ３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐ４９）とリンドウのｐＧ３’ＧＴ７  ｃＤＮＡならびにＮＯＳターミネーターからなる発現カセットをプラスミドベクターｐＵＣ１９上のＨｉｎｄＩＩＩサイトを５’端、ＥｃｏＲＩサイトを３’端として作製した。これをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切り出し、植物導入用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，ｐ２８８）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した（ｐＳＰＢ１１１０）。続いて、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトの両端にＡｓｃＩを挿入したプラスミドベクターｐＵＣＡＡを作製し、ｐＵＣＡＡ上でＭＡＣｌプロモーター（Ｃｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，ｐ３７３）とトレニアｐＴＧＴ５  ｃＤＮＡ、マンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるトレニアのｐＴＧＴ５の発現カセットをベクターのＨｉｎｄＩＩＩサイトを５’端、ＥｃｏＲＩサイトを３’端として作製した。このｐＴＧＴ５発現カセット全体をＡｓｃＩ切断によってｐＵＣＡＡベクターから切り出し、前述のｐＳＰＢ１１１０のＡｓｃＩ切断部位にリンドウのｐＧ３’ＧＴ７発現カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ１１１２とした。
カナマイシンを含む選択培地でシュートを形成し、発根が見られた個体を馴化した。それぞれの形質転換体の花弁からアントシアニン色素を抽出し、ＨＰＬＣにて分析した結果、分析に用いたすべての形質転換体において０．５〜６．８％（全アントシアニンに対する割合）のデルフィニジン３，５’，３’−トリグルコシドが検出された。一方、元株の花弁抽出物中にはデルフィニジン３，５’，３’−トリグルコシドは全く存在せず、デルフィニジン３−グルコシドが大部分であった。このことから、形質転換体において、導入したリンドウの３’位糖転移酵素遺伝子とトレニアの５位糖転移酵素遺伝子が機能し、デルフィニジン３−グルコシドを基質としてデルフィニジン３，５’，３’−トリグルコシドが生成したことが明らかとなった。
実施例１０．サイネリア由来の３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
サイネリア花弁はシネラリン（デルフィニジン３−マロニル−グルコシド、７−カフェオイル−グルコシル−カフェオイル−グルコシド、３’−カフェオイル−グルコシド）を主要アントシアニン色素として含有する。よってサイネリアはアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を有することが期待される。そこで、塩酸グアニジンバッファー−超遠心による方法（ＷＯ９６／２５５００）で、サイネリアの花弁よりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ＤＩＧ標識および検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）推奨の方法に従い、ＰＣＲ法でラベルしたリンドウのｐＧ３’ＧＴ７  ｃＤＮＡをプローブとして、サイネリア花弁のｃＤＮＡライブラリー約３０万のファージクローンをスクリーニングした。なお、スクリーニングは上記キット製造元推奨の方法にしたがったが、ハイブリダイゼーションバッファーのホルムアミド濃度は３０％、ハイブリダイゼーション温度は３７℃、洗浄は１％ＳＤＳを含む５  ｘ  ＳＳＣ中、５５℃で行った。得られた１５個の陽性クローンの塩基配列を決定した結果、リンドウの３’ＧＴと高い相同性を示すアミノ酸配列をコードする１クローンｐＳＰＢ１０９０を得た。ｐＳＰＢ１０９０の全塩基配列を配列番号：１１に示し、該配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：１２に示す。
ｐＳＰＢ１０９０  ｃＤＮＡにコードされる蛋白質はリンドウのｐＧ３’ＧＴ７にコードされる３’位糖転移酵素とアミノ酸レベルで３９％の同一性を示した。一方、ｐＳＰＢ１０９０にコードされる蛋白質の他の糖転移酵素に対する同一性は、例えばシソのアントシアニン５位糖転移酵素、キンギョソウやリンドウのアントシアニジン３位糖転移酵素に対していずれも２４％であった。従って、リンドウの３’位糖転移酵素に対して有意に高い同一性を示すことから、得られたサイネリアのｐＳＰＢ１０９０  ｃＤＮＡにコードされる糖転移酵素はアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有すると言える。
実施例１１．チョウマメ由来の３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
チョウマメ花弁はテルナチン（デルフィニジン３−マロニル−グルコシド、３’−グルコシル−クマロイル−グルコシル−クマロイル−グルコシド、５’−グルコシル−クマロイル−グルコシル−クマロイル−グルコシド）を主要アントシアニン色素として含有する。よってチョウマメはアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を有することが期待される。実施例１０と同様にして、チョウマメ花弁より抽出したＲＮＡをもとにｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＤＩＧ標識したリンドウのｐＧ３’ＧＴ７  ｃＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを得た。得られた５１個の陽性クローンの塩基配列を決定した結果、リンドウの３’ＧＴと高い相同性を示す１種類のクローンを得た。完全長と考えられるｃＤＮＡ  ｐＳＰＢ１０８７の全塩基配列を配列番号：１３に示し、該配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：１４に示す。
ｐＳＰＢ１０８７  ｃＤＮＡにコードされる蛋白質はリンドウの３’位糖転移酵素とアミノ酸レベルで５３％の同一性を示し、これは、他の糖転移酵素に対する同一性、例えばシソのアントシアニン５位糖転移酵素に対する同一性２８％、リンドウのアントシアニジン３位糖転移酵素に対する同一性２５％に比べて有意に高い値である。またサイネリアのｐＳＰＢ１０９０とチョウマメのｐＳＰＢ１０８７にコードされる蛋白質相互の同一性は４４％であった。
Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ解析で得られる進化系統樹（西村、大野  タンパク質実験プロトコール２構造解析編、１９９７、秀潤社）でも、サイネリアのｐＳＰＢ１０９０とチョウマメのｐＳＰＢ１０８７  ｃＤＮＡにコードされる蛋白質は、リンドウの３’位糖転移酵素ともっとも近い位置に置かれる。
これらのことから、実施例１０で得られたサイネリアのｐＳＰＢ１０９０と本実施例で得られたチョウマメのｐＳＰＢ１０８７ｃＤＮＡは共にアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードすると言える。
産業上の利用可能性
本発明により、アントシアニンの生合成に関わっているアントシアニンの３’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が初めてクローン化できた。本発明の蛋白質をコードする遺伝子を花弁で発現させたり、発現を抑制することにより、アントシアニンの構造と花色を変えることができる。
【配列表】
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