(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において前立腺癌と良性前立腺肥大症の区別を支援する方法であって：
（ａ）少なくとも１つのプライマーを用いて個体からの被験サンプルで逆転写を実施しｃＤＮＡを産生するステップ；
（ｂ）個体からの被験サンプルを配列番号１のヌクレオチド６２９〜１２０１（両端含む）にわたる領域又はその完全な相補体に由来する少なくとも１つのＰＣＩＧＦ特異的ポリヌクレオチドと接触させるステップ；
（ｃ）被験サンプルにおいて該ＰＣＩＧＦ特異的ポリヌクレオチドに結合する標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドの存在を検出するステップ；及び
（ｄ）該サンプル中の標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドの存在から、個体における前立腺癌と良性前立腺肥大症を区別するステップを含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）又は（ｂ）を実施する前に前記標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドが固相に付着している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）又は（ｂ）を実施する前に前記ＰＣＩＧＦ特異的ポリヌクレオチドが固相に付着している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
個体において前立腺癌と良性前立腺肥大症の区別を支援する方法であって：
（ａ）少なくとも１つのプライマーを用いて個体からの被験サンプルで逆転写を実施しｃＤＮＡを産生するステップ；
（ｂ）ＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドをセンス及びアンチセンスプライマーとして使用してステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡを増幅し、ＰＣＩＧＦアンプリコンを得るステップ；
（ｃ）ＰＣＩＧＦアンプリコンの存在を検出するステップであって、ここでステップ（ａ）及び（ｂ）で用いられるＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドが配列番号１のヌクレオチド６２９〜１２０１（両端含む）にわたる領域又はその完全な相補体に由来するものであるステップ；及び
（ｄ）該サンプル中の標的ＰＣＩＧＦアンプリコンの存在から、個体における前立腺癌と良性前立腺肥大症を区別するステップを含む方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）を実施する前に前記被験サンプルを固相と反応させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記検出ステップが測定可能なシグナルを発生できる検出可能な標識を利用することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
個体において前立腺癌と良性前立腺肥大症の区別を支援する方法であって：
（ａ）少なくとも１つのプライマーを用いて個体からの被験サンプルで逆転写を実施しｃＤＮＡを産生するステップ；
（ｂ）個体からの被験サンプルを、センスプライマーとして少なくとも１つのＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドと、及びアンチセンスプライマーとして少なくとも１つのＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドと接触させ、増幅して第１段階の反応産物を得るステップ；
（ｃ）該第１段階の反応産物を、少なくとも１つの別のＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドと接触させて第２段階のステップ反応産物を得るステップであって、ただし、別のＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドはステップ（ｂ）で用いられるＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドの３’に位置し、該第１段階の反応産物に相補的であるステップ；及び
（ｄ）標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドの存在の指標として第２段階反応産物を検出するステップであって、ここでステップ（ｂ）及び（ｃ）で用いられるＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド６２９〜１２０１（両端含む）にわたる領域又はその完全な相補体に由来するステップ；及び
（ｅ）該サンプル中の第２段階反応産物の存在から、個体における前立腺癌と良性前立腺肥大症を区別するステップを含む方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の１つを実施する前に前記被験サンプルを固相と反応させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出ステップが測定可能なシグナルを発生できる検出可能な標識を利用することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能な標識を固相と反応させる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は概して前立腺疾患の検出に関する。さらに、本発明はまた、前立腺疾患を検出する試薬及び方法に関する。より特定的には本発明は、ポリヌクレオチド配列及びそれによりコードされるポリペプチドのような試薬、及び、これらの配列を使用する方法に関する。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、前立腺癌のような前立腺疾患又は状態の検出、診断、病期判定（ステージング）、経過追跡（モニタリング）、予後判定、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影、予防もしくは処置又は疾病素質の判定に有用である。
【０００２】
米国男性の癌で最も多い形態が前立腺癌であり、１９９８年には新規症例は１８４５００例、及び関連死亡数は３９２００例と報告されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）。前立腺癌はまた他の型の癌に比較して最大の発生増加率を示し、１９９２から１９９６年で１４２％増加している。
【０００３】
前立腺癌のような前立腺疾患又は状態の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影、予防もしくは処置又は疾病素質の判定に使用される方法は患者の運命に極めて重要である。例えば、局在性前立腺癌と診断された患者の５年生存率が９０％を上回るのに比べて、遠隔転移と診断された患者の生存率は２５〜３１％である（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）。従って、前立腺癌を早期に検出するための診断方法はこの疾患を特異的に検出し、症状が発現する前に前立腺癌の存在を検出すべきである。
【０００４】
このような診断方法はまた、侵入性が最も少ない方法によって得られる血液、血漿、血清又は尿のような被検サンプルにおける免疫学的方法による種々の疾病マーカーの出現に基づく免疫学的アッセイを含む。これらの診断方法は、患者の負担を少なくして前立腺疾患患者を医師が管理する支援情報を提供するであろう。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のようなマーカーが存在しており、前立腺癌の患者をスクリーニングするために臨床使用されている。血清中のＰＳＡタンパク質レベルの上昇は、無症状の男性の前立腺癌の早期検出に使用される。Ｇ．Ｅ．Ｈａｎｋｓら：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１０７３−１１１３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．１９９３。ＰＳＡは通常前立腺から高レベルで精液に分泌されるが、前立腺が正常である男性の血液中には極めて低レベルで存在する。しかしながら、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）及び前立腺アデノカルチノーマなどの前立腺疾患を有する患者では、ＰＳＡレベルは血液中で著明に高く、従って前立腺疾患の指標として有用である。しかしながらＰＳＡはＢＰＨ及び前立腺癌の間で区別できず、前立腺癌のマーカーとしての特異性は低い。Ｍ．Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．５３１−５４２，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．１９９３参照。このように前立腺癌により特異的な新規マーカーが本疾患の早期検出に有利であろう。
【０００５】
前立腺癌患者の管理における重大な工程は、癌の外科的手術前段階に最適治療を計画するための予後判定及び診断基準を提供することである。外科的手術の前に正確な前立腺癌の病期判定をするための方法を改善することが必要である。ある研究では現在の外科手術前の前立腺癌の病期判定方法は当時約５０％は不正確であった。Ｆ．Ｌａｂｒｉｅら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ４４（Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｉｓｓｕｅ）：２９−３７（１９９４）。前立腺癌管理はまた不適切な体内区画に見出される新規マーカーを利用することにより改善されるであろう。かかるマーカーは初期前立腺腫瘍を起源としているが血液、骨髄又はリンパ節中には存在しない細胞により発現されるｍＲＮＡ又はタンパク質マーカーであり、これらの遠位器官への転移に関する高感度指標であろう。例えば転移性前立腺癌患者では、ＰＳＡタンパク質は骨髄において免疫組織化学的技術により検出され、血液、リンパ節及び骨髄の細胞ではＰＳＡ  ｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲにより検出されている。Ｋ．Ｐａｎｔｅｌら，Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ  １８：３９４−４０１（１９９５）。
【０００６】
初期前立腺癌の生物学的挙動を予測し得る新規なマーカーは有意な価値を有するであろう。患者の生命を脅かしている又は脅かすであろう初期前立腺癌は、生命に脅威のない又は脅威にならない癌よりも臨床的に重要である。Ｇ．Ｅ．Ｈａｎｋｓ，前出。従って、臨床上重要な前立腺癌と重要でない前立腺癌を区別できる新規マーカーが存在する必要がある。かかるマーカーがあれば医師は、前立腺組織に局在する、治療しなければ転移し、患者を死に至らしめるであろう前立腺癌を正確に同定し、有効に治療し得るであろう。さらに、侵襲性癌に特徴的なかかるマーカーが存在しないことが示されたときは、患者が高価で無益な治療を受けなくても済む。
【０００７】
ＰＳＡよりもより鋭敏に前立腺癌の再発を検出し、アンドロゲンによる影響を受けない前立腺関連マーカーを見出すこともまた有利であろう。今日までに、ＰＳＡは疾患の再発を検出するのに最も鋭敏なマーカーであることが解っている。しかしながら、癌治療に使用されるホルモン治療のために、ＰＳＡの上昇を生じずに腫瘍が進行する場合もある。アンドロゲンの低下に付随してＰＳＡが低下し、必ずしも腫瘍転移の低下を反映しなくなる。この複雑さはアンドロゲン刺激によるＰＳＡ発現の結果によるものである。アンドロゲン除去後に観察されるＰＳＡの低下は一部、腫瘍細胞死によるものではなく、ＰＳＡ発現の減少によるものである。Ｇ．Ｅ．Ｈａｎｋｓ、前出。
【０００８】
従って、前立腺疾患又は状態の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影、予防もしくは処置、又は、疾病素質の判定を行うための特異的方法及び試薬を提供すること、又はこれらの状態に対する素因の可能性を示すことは有益であろう。このような方法は、癌などの前立腺疾患及び状態の際に過剰発現される遺伝子産物を被検サンプル中で検定するアッセイを含む。このような方法はまた前立腺疾患又は状態に関連する遺伝子変化の産物に関して被験サンプルを検定するアッセイを含む。このような方法はさらに、癌のような前立腺関連疾患又は状態によって体内の種々の組織及び区画における分布が変化した遺伝子産物を被検サンプル中で検定するアッセイを含む。有用な試薬は、生検組織、血液又はその他の被検サンプルから抽出されたｍＲＮＡの逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションアッセイのような診断方法で使用され得る（１つ又は複数の）ポリヌクレオチド、又はその（１つ又は複数の）フラグメント；又は、このようなｍＲＮＡの翻訳産物であるポリペプチドもしくはタンパク質；又は、これらのポリペプチドもしくはタンパク質に対する抗体である。前立腺疾患又は状態のための薬物治療又は遺伝子治療はこれらの同定された遺伝子配列又はその発現タンパク質を基盤にすることができ、いずれかの特定の治療の効果を経過追跡することができる。さらに初期段階の前立腺疾患例えば癌を検出でき、代替的に利用できる非外科的手術診断方法を得ることは有益であろう。
【０００９】
本発明は新規に同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びにこのようなポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に関する。さらにとりわけ本発明のポリペプチドは、以後しばしば「ＰＣＩＧＦ」と称される前立腺癌誘導成長因子である。
【００１０】
本発明は構造的及び機能的にＴＧＦ−βに関与するポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する。ペプチド成長因子の形質転換成長因子βファミリーには５つのメンバーが含まれ、ＴＧＦ−β１ないしＴＧＦ−β５と称し、これらは全ておよそ２５ｋＤのホモダイマーを形成する。ＴＧＦ−βファミリーはムエラーラン阻害物質（Ｃａｔｅ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ  ４５：６８５−６９８（１９８６））、デカペンタプレジック（Ｐａｄｇｅｔｔ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：８１−８４（１９８７））、骨形態形成因子（Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１５２８−１５３４（１９８８））、ｖｇ１（Ｗｅｅｋｓ，Ｄ．Ｌ．及びＭｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．、Ｃｅｌｌ  ５１：８６１−８６７（１９８７））、アクチビン（Ｖａｌｅ，Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７６−７７９（１９８６））、及びインヒビン（Ｍａｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：６５９−６６３（１９８５））を含むペプチドシグナル発生分子の、より大きな拡張されたスーパーファミリーに属する。これらの因子は構造全体においてＴＧＦ−βに類似するが、ＴＧＦ−βタンパク質と、及び互いにおよそ２５％しかアミノ酸の同一性を共有しない。これらの分子は全て成長、発達及び分化の変調に重要な役割を果たすと考えられている。本発明のタンパク質、ＰＣＩＧＦはＴＧＦ−βの活性ドメインであるＣ末端に保存された７個のシステイン残基を保持する。
【００１１】
マウスモデル系及び限定的なヒト免疫細胞学データを用いて、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６Ｈ：５４−６１（１９９２））は前立腺癌の発病原因におけるＴＧＦ−β１の役割を示唆している。診断用試験としてのこれの使用及び関連ペプチドに関するこのような利用を示唆してはいない。さらにその他の研究（ヒト良性前立腺肥大における基本的な繊維芽細胞成長因子及び形質転換成長因子β２の遺伝子発現の増加、Ｍｏｒｉ  Ｈ．；Ｍａｋｉ．Ｍ．；Ｏｉｓｈｉ，Ｋ．；Ｊａｙｅ，Ｍ．；Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｋ．；Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｏ．；Ｈａｔａｎａｋａ  Ｍ．、Ｐｒｏｓｔａｔｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）  １６（１）：７１−８０（１９９０））はＴＧＦ−β１転写は良性前立腺肥大において上昇することを示唆している。本発明の配列はＴＧＦ−β１と遠縁であるが、明確に実在し、前立腺癌において優先的に誘導されることが示される。
【００１２】
新規の４つのＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのタンパク質が最近公開された：
（１）ＰＣＴ特許出願＃ＷＯ９６／１８７３０、発明者Ｈｕｄｓｏｎら（公開日：１９９６年６月２０日）。
（２）日本特許出願番号平６−２４８８５、発明者Ｋａｔｏら（公開日：１９９５年１０月３日）；ジーンバンク登録ｇＩ１８１３３２６。
（３）Ｈｒｏｍａｓによるジーンバンク登録ｇＩ１８７２５５３。
（４）Ｐａｒａｌｋａｒらによるジーンバンク登録ｇＩ２２９０９７２。
【００１３】
４つのタンパク質配列は全て、全３０８残基のうち全一致ではない９個の位置で本質的に同一である。差異が多型性又はシークエンシングエラーを表すかどうかについては明らかではない。ジーンバンク登録ｇＩ２２９０９７２のペプチド配列が公開されているが、対応するポリヌクレオチド配列は公開されていない。
【００１４】
この遺伝子の発現については、胎盤に豊富に存在し、従って生殖において役割を果たす、又は前立腺分化因子として、又は前立腺特異的であり、従って良性前立腺肥大もしくは前立腺癌を検出するための診断用として有用であるなど様々に報告されている。これらの研究が全て本質的に同一の配列に基づいているという真実に関わらず、発現パターン又は有用性に関して全一致ではないことは明らかである。驚くべきことに、我々は前記日本特許出願番号平６−２４８８５、発明者Ｋａｔｏら（公開日１９９５年１０月３日）の１２０１ｂｐの配列の３’部分に対応するｍＲＮＡによりコードされるペプチド配列は前立腺腫瘍において選択的に発現されるが、正常前立腺においても、良性前立腺肥大においても発現されないことを見出した。Ｗｈｉｌｅ  Ｈｕｄｓｏｎらは前立腺癌診断の理論的な利用性において、この診断が癌特異的であり、その他の前立腺異常から区別され得ることは示唆していない。実際に、遺伝子が臓器特異的であり、癌特異的ではないと示唆しており、故にこの前立腺特異性に関する分類は特異的診断有用性を論破している。従って、当業者はこれから、前立腺癌診断の有用な方法であることを容易に推論できない。対照的に、本発明は非癌性前立腺における低レベル発現に基づく癌診断の有用性を教示する。
【００１５】
発明の要旨
本発明は本明細書で以後「ＰＣＩＧＦ」と称するＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質（日本特許出願番号平６−２４８８５、発明者Ｋａｔｏら（公開日１９９５年１０月３日））、ポリヌクレオチド配列（配列番号１）及びそれにコードされるポリペプチド配列（配列番号６）に関する。
【００１６】
本発明は被験サンプルにおける標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドを検出する方法であって、被験サンプルを少なくとも１つのＰＣＩＧＦ特異的ポリヌクレオチドと接触させ、被験サンプル中の標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドの存在を検出することからなる方法に関する。また、方法を実施する前にＰＣＩＧＦ特異的ポリヌクレオチドを固相に付着させてもよい。
【００１７】
本発明はまた被験サンプル中のＰＣＩＧＦ  ｍＲＮＡを検出する方法であって、少なくとも１つのプライマーで逆転写（ＲＴ）を実施してｃＤＮＡを産生し、ＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドをセンス及びアンチセンスプライマーとして用いて、そのようにして得られたｃＤＮＡを増幅し、ＰＣＩＧＦアンプリコンを得、及び被験サンプル中のＰＣＩＧＦアンプリコンの存在をＰＣＩＧＦの存在の指標として検出することからなる方法をも提供する。ポリメラーゼ連鎖反応により増幅を実施できる。また方法を実施する前、増幅する前、又は検出する前に、被験サンプルを固相と反応させることができる。この反応を直接的又は間接的反応にできる。さらに、検出工程は測定可能なシグナルを生じることができる検出可能な標識を利用することからなる。検出可能な標識を固相に付着させることができる。
【００１８】
本発明はさらに標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドの含有が疑われる被験サンプル中の標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）被験サンプルをセンスプライマーとして少なくとも１つのＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチド及びアンチセンスプライマーとして少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させ、同一物を増幅して第１段階反応産物を得ること；（ｂ）第１段階反応産物を少なくとも１つの「その他の」ＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドと接触させて第２段階反応産物を得、但し「その他の」ＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドは工程（ａ）で用いたＰＣＩＧＦオリゴヌクレオチドの３’に位置し第１段階反応産物に相補的である；並びに（ｃ）被験サンプル中の標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドの存在の指標として第２段階反応産物を検出することからなる方法を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応により増幅を実施できる。方法を実施する前、増幅する前、又は検出する前に被験サンプルを固相と直接的に又は間接的に反応させることができる。検出工程はまた測定可能なシグナルを生じることができる検出可能な標識を利用することからなり；さらに検出可能なシグナルを固相に付着させることができる。少なくとも１つのＰＣＩＧＦ特異的ポリヌクレオチドを収容する容器を含んでなる、被験サンプル中の標的ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドを検出するのに有用な検査キットもまた提供される。これらの検査キットはさらに被検サンプル（例えば、血液、尿、唾液及び糞便）の収集に使用されるツールの付いた容器を含む。このようなツールは、採血用ランセット及び血液を収集し、安定させる吸取り紙又は布；唾液を収集し、安定させるスワブ；尿又は糞便のサンプルを収集し、安定させるコップである。紙、布、スワブ、コップなどのような収集材料は、サンプルの変質又は不可逆的吸着を防止するために任意に処理し得る。収集材料はまた、標本の完全性を維持する補助剤となる保存剤、安定剤又は抗菌剤によって処理されてもよく、又はこれらを含有してもよい。
【００１９】
本発明はまたＰＣＩＧＦ遺伝子から誘導された精製されたポリヌクレオチド又はそのフラグメントをも提供する。精製されたポリヌクレオチドはＰＣＩＧＦ遺伝子の核酸又はその相補体に選択的にハイブリダイズできる。さらに、組換え及び／又は合成技術により精製されたポリヌクレオチドを産生できる。精製された組換えポリヌクレオチドは組換えベクター内に含有され得る。本発明はさらに組換えベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を包含する。
【００２０】
本発明はさらにＰＣＩＧＦから誘導されるオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列を含んでなる組換え発現系を提供する。核酸配列は望ましい宿主に適合する調節配列に機能的に連結される。またこの組換え発現系でトランスフェクトされた細胞をも提供する。
【００２１】
本発明はまたＰＣＩＧＦによりコードされるポリペプチドをも提供する。組換え技術により産生できる、又は合成技術により産生できるポリペプチドを精製された形態で提供する。ポリペプチドは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００２２】
また、少なくとも１つのＰＣＩＧＦエピトープに特異的に結合する抗体が提供される。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。エピトープは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択されたアミノ酸配列に由来する。被検サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原又は抗ＰＣＩＧＦ抗原の存在を判定するアッセイキットも含まれる。１つの実施態様では、アッセイキットは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択されたアミノ酸配列に少なくとも５０％の同一性を有する少なくとも１つのＰＣＩＧＦポリペプチドが収容された容器を含む。これらの検査キットはさらに、被検サンプル（例えば、血液、尿、唾液及び糞便）の収集に使用されるツールの付いた容器を含む。このようなツールには、採血用ランセット及び血液を収集し、安定させる吸取り紙又は布；唾液を収集し、安定させるスワブ；尿又は糞便のサンプルを収集し、安定させるコップなどがある。紙、布、スワブ、コップなどのような収集材料は、サンプルの変質又は不可逆的吸着を防止するために任意に処理し得る。これらの収集材料はまた、標本の完全性を維持する補助剤となる保存剤、安定剤又は抗菌剤によって処理されてもよく、又はこれらを含有してもよい。抗体を固相に付着させてもよい。
【００２３】
本発明の別の実施態様によれば、疾患又は状態の検出又は診断目的で患者の抗原の所在を検出又は造影するためにＰＣＩＧＦ抗原に対する抗体又はそのフラグメントを使用し得る。このような抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、又は、分子生物学の技術によって作製されてもよく、放射性同位体及び常磁性金属を非限定例とする種々の検出可能な標識によって標識され得る。さらに、抗体又はそのフラグメントは、モノクローナル、ポリクローナル、又は分子生物学の技術によって作製されたもののいずれであっても、ＰＣＩＧＦ抗原の発現を特徴とする疾患を治療する治療薬として使用できる。治療用途の場合、抗体を誘導体化しないで使用してもよく、又は、放射性同位体、酵素、毒素、薬物、プロドラッグなどのような細胞障害性物質で誘導体化してもよい。
【００２４】
被検サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原又は抗ＰＣＩＧＦ抗原の存在を判定する別のアッセイキットはＰＣＩＧＦ抗原に特異的に結合する抗体が収容された容器を含み、ここでＰＣＩＧＦ抗原は少なくとも１つのＰＣＩＧＦコード化エピトープを含んでなる。ＰＣＩＧＦ抗原は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択されたＰＣＩＧＦコード化抗原の配列に少なくとも約６０％の同一性を有する。これらの検査キットはさらに、被検サンプル（例えば、血液、尿、唾液及び糞便）の収集に使用されるツールの付いた容器を含む。このようなツールには、採血用ランセット及び血液を収集し、安定させる吸取り紙又は布；唾液を収集し、安定させるスワブ；尿又は糞便のサンプルを収集し、安定させるコップなどがある。紙、布、スワブ、コップなどのような収集材料は、サンプルの変質又は不可逆的吸着を防止するために任意に処理し得る。これらの収集材料はまた、標本の完全性を維持する補助剤となる保存剤、安定剤又は抗菌剤によって処理されてもよく、又はこれらを含有してもよい。抗体を固相に付着させてもよい。
【００２５】
発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートすることからなる、少なくとも１つのＰＣＩＧＦエピトープを含有するポリペプチドを産生する方法が提供される。このベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなり、ここでポリペプチドは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択されたＰＣＩＧＦアミノ酸配列に少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００２６】
ＰＣＩＧＦ抗原を含有する疑いのある被検サンプル中で該ＰＣＩＧＦ抗原の存在を検出する方法もまた提供される。該方法は、被検サンプルを、少なくとも１つのＰＣＩＧＦ抗原のエピトープに特異的に結合する抗体又はそのフラグメントに、抗体／抗原複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させること；及び被験サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原の存在の指標として抗体を含有するこのような複合体の存在を検出することからなる。抗体を固相に付着させることができ、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれでもよい。さらに抗体は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択された少なくとも１つのＰＣＩＧＦ抗原に特異的に結合する。
【００２７】
ＰＣＩＧＦ抗原に特異的に結合する抗体を含有する疑いのある被検サンプル中で該抗体の存在を検出する方法もまた提供される。該方法は、被検サンプルを、少なくとも１つのＰＣＩＧＦエピトープを含有するポリペプチドに接触させることからなり、ＰＣＩＧＦエピトープはＰＣＩＧＦポリヌクレオチド又はそのフラグメントによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸を含んでなる。接触は抗原／抗体複合体を形成するのに十分な条件下、十分な時間で実施する。ポリペプチドを固相に結合できる。さらにポリペプチドを配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択されたアミノ酸配列に少なくとも５０％の同一性を有する組換えタンパク質又は合成ペプチドにできる。
【００２８】
本発明は少なくとも１つのＰＣＩＧＦ抗原のエピトープ又はそのフラグメントをコードするＰＣＩＧＦ核酸配列でトランスフェクトした細胞を提供する。
【００２９】
ＰＣＩＧＦ抗原に対する抗体を産生する方法をも提供し、該方法は個体に単離された免疫原性ポリペプチド又はそのフラブメントを投与することからなり、ここで単離された免疫原性ポリペプチドは免疫応答を生じるのに十分な量の少なくとも１つのＰＣＩＧＦエピトープを含んでなる。単離された免疫原性ポリペプチドは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択されたアミノ酸配列を含んでなる。
【００３０】
ＰＣＩＧＦ抗原に特異的に結合する抗体を産生する方法を開示し、該方法は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択されたアミノ酸配列から誘導された少なくとも１つのＰＣＩＧＦエピトープをコードする核酸配列を含んでなるプラスミドを哺乳動物に投与することからなる。
【００３１】
また少なくとも１０〜１２個のヌクレオチドのＰＣＩＧＦポリペプチド及びそのフラグメント又は相補体を含んで成る組成物が提供される。ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドは少なくとも１つのＰＣＩＧＦエピトープを有するアミノ酸配列をコードする。本発明により提供される別の組成物は約８〜１０個のアミノ酸の少なくとも１つのＰＣＩＧＦエピトープを有するポリペプチドを含んでなる。ポリペプチドは配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択されたアミノ酸配列に少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。また配列番号６に少なくとも５０％の同一性を有するＰＣＩＧＦポリペプチドをコードする遺伝子又はそのフラグメント、及び配列番号１に少なくとも５０％の同一性を有するＤＮＡを含んでなる遺伝子又はそのフラグメントも提供される。
【００３２】
配列番号１のヌクレオチド６２９〜１２０１間のＰＣＩＧＦの３’部分に実質的に同一であるｃＤＮＡ配列は、前立腺癌において大きく上方制御されるという認識は本発明の目的の１つである。逆に、配列番号１の１〜５３８ヌクレオチド間でＰＣＩＧＦの５’部分と重複するｃＤＮＡ配列は前立腺癌においてほとんど上方制御を示さない。さらに、公開の及び専有されているデータベースの数千の配列発現タグ（ＥＳＴ）を検索することにより、ＰＣＩＧＦの５‘及び３’間に重複がないことが示された。このように、前記の４つの文献の遺伝子から派生した遺伝子が存在する可能性がある。遺伝子配列の３’部分が前立腺癌において差別的に発現されるというまた別の可能性がある。このように、本発明の配列が特異的癌診断に有用であるということは驚くべきことである。
【００３３】
本発明のある態様では、ペプチド並びに生物学的に活性な診断上及び治療上有用なフラグメント、その類似体及び誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒトに由来する。
【００３４】
本発明の別の態様により、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ並びに類似体及び生物学的に活性な、及び診断上又は治療上有用なそのフラグメント及び誘導体などの単離された核酸分子が提供される。
【００３５】
さらに本発明のさらなる態様では、ヒトＰＣＩＧＦ核酸配列を含有する組換え原核及び／又は真核宿主細胞を、該タンパク質の発現及びそれに続く該タンパク質の収集を促進する条件下で培養することからなる、組換え技術によるこのようなポリペプチドを産生する方法が提供される。
【００３６】
さらに本発明のさらなる態様では、治療目的で、例えば前立腺癌を阻止するためにこのようなポリペプチド、又はこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法が提供される。
【００３７】
さらに本発明のさらなる態様では、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。またＰＣＩＧＦポリペプチド（配列番号６）の種々ドメインに特異的なこのような抗体を誘導するために用いることができる特異的ペプチド配列もまた提供される。
【００３８】
本発明のさらに別の態様では、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、該アンタゴニストを用いて、例えば腫瘍の処置においてこのようなポリペプチドの作用を阻止できる。
【００３９】
さらに本発明のさらなる態様では、ヒトＰＣＩＧＦポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブが提供される。
【００４０】
本発明のさらに別の態様では、ＰＣＩＧＦポリペプチド（配列番号６）の過少発現及び過剰発現並びにこのようなポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関連する疾患を検出するための診断用アッセイが提供される。
【００４１】
さらに本発明のさらなる態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡの化学的研究、合成及びＤＮＡベクターの製造に関連する目的で、このようなポリペプチド、又はこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法が提供される。
【００４２】
これらの及びその他の態様は本明細書の教示から当業者に明白である。
【００４３】
図面の簡単な説明
以下の図面は本発明の実施態様を説明し、請求の範囲により包含される本発明の範囲を制限することを意味するものではない。
【００４４】
図１及び２はＰＳＡタンパク質又はＰＣＩＧＦ合成ペプチド（配列番号９）の何れかに対する抗血清でプローブされた組織タンパク質抽出物のパネルにおいて実施されたウェスタンブロットの結果を示す。
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前立腺腫瘍からのｃＤＮＡライブラリーに見出すことができるが、いくつかのその他の正常及び腫瘍組織、例えば副腎、結腸、膀胱、肺、膵臓島細胞、胎盤及び子宮にも見出すことができる。しかしながら、最も頻繁に見出されるのは前立腺腫瘍ライブラリーである。
【００４６】
本発明はＰＣＩＧＦポリペプチド（配列番号６）をコードする塩基１〜１２０１（配列番号１）間の遺伝子フラグメントを提供する。本発明はまたＰＣＩＧＦ合成ペプチド配列番号７、配列番号８及び配列番号９をも提供する。ＰＣＩＧＦ合成ペプチド配列番号６はＰＣＴ特許出願＃ＷＯ９６／１８７３０、発明者Ｈｕｄｓｏｎら（公開日：１９９６年６月２０日）にて同定されたポリペプチドの各々の部分と同一であり、日本特許出願番号平６−２４８８５、発明者Ｋａｔｏら、（公開日：１９９５年１０月３日）；ジーンバンク登録ｇＩ１８１３３２６にて同定されたポリペプチドの各々の部分からの１個のアミノ酸残基が異なる。
【００４７】
本発明はまた、ＰＣＩＧＦと称する前立腺組織遺伝子の産物に関して被検サンプルを検定するアッセイ方法を提供し、該方法は、被験サンプル中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、ＰＣＩＧＦの存在の指標としてｃＤＮＡを検出することからなる。該方法は増幅工程を含み、該工程では遺伝子又はそのフラグメントに対応するＰＣＩＧＦからのｍＲＮＡの１つ又はそれ以上の部分が増幅される。ＰＣＩＧＦの翻訳産物を検定するための方法もまた提供される。本発明にて提供される方法により検定され得る被験サンプルは組織、細胞、体液及び分泌物である。本発明はまたこれらの方法を実施するのに有用な試薬例えばオリゴヌクレオチドプライマー及びポリペプチドをも提供する。
【００４８】
本明細書に開示する核酸配列の部分は、ＲＮＡの逆転写のため、もしくはｃＤＮＡの増幅のためのプライマーとして；又は被験サンプル中の特定のｍＲＮＡ配列の存在を決定するためのプローブとして有用である。また診断用イムノアッセイの標準又は試薬としても、医薬スクリーニングアッセイの標的としても、及び／又は、種々の治療のための成分もしくは標的部位としても有用である。これらのポリペプチドに含まれている少なくとも１つのエピトープに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、ＰＣＩＧＦに関連する疾患又は状態、特に前立腺癌の治療薬のデリバリー物質として有用であり、また、診断試験及びスクリーニングに有用である。目的の遺伝子のその他の部分の配列の単離は核酸配列により誘導されるプローブ又はＰＣＲプライマーを利用することにより達成できる。これにより目的のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの別のプローブ及び対応するコード化ポリペプチド配列を確立できる。これらの別の分子は、本明細書に開示するようなＰＣＩＧＦに特徴づけられる、前立腺癌のような前立腺疾患又は状態の検出、診断、病期判定（ステージング）、経過追跡（モニタリング）、予後判定、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影、予防もしくは処置又は疾病素質の判定に有用である。
【００４９】
アミノ酸配列の「類似性」を決定する技術は当業界で公知である。一般に、「類似性」は、２つ又はそれ以上のポリペプチドの適当な位置の正確なアミノ酸対アミノ酸比較において、アミノ酸が等しいか又は類似の化学的及び／又は物理的特性例えば電荷もしくは疎水性を有していることを意味する。いわゆる「類似性パーセント」は、比較されたポリペプチド配列間で決定され得る。核酸及びアミノ酸配列の同一性を決定する技術も当業界で公知であり、その遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列（通常ｃＤＮＡ媒介による）を決定し、それによりコードされるアミノ酸配列を第二のアミノ酸配列に比較することから成る。一般に、「同一性」なる用語は、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの各々正確な、ヌクレオチド対ヌクレオチド、又はアミノ酸対アミノ酸対応を意味する。２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較し得る。２つ以上のアミノ酸配列も同様に、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較し得る。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）で利用できるプログラム、例えばＧＡＰプログラムは２つの配列、例えば各々２つのポリヌクレオチド間の同一性及び２つのポリペプチド配列間の同一性及び類似性の両方を算出できる。配列間の同一性又は類似性パーセントを計算する別のプログラムは当業界で公知である。
【００５０】
本明細書に記載の組成物及び方法によって前立腺組織の疾患又は状態の指標となる幾つかのマーカーを同定することが可能であろう。そこから得られた情報は、ＰＣＩＧＦに関連する疾患又は状態、特に前立腺癌の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影、予防もしくは処置又は判定に役立つ。試験方法としては例えば、本発明で提供される配列を利用し、またポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）及びハイブリダイゼーションのごとき核酸増幅反応を利用することもできるプローブアッセイなどがある。加えて、本発明により提供されるヌクレオチド配列は免疫原性エピトープが見出されるオープン・リーディング・フレームを含有する。このエピトープはＰＣＩＧＦに関連する疾患又は状態に固有であると考えられている。またＰＣＩＧＦ遺伝子によりコードされるポリヌクレオチド又はポリペプチド及びタンパク質もまたマーカーとして有用であると考えられる。このマーカーは前立腺癌のごとき疾患において上昇するか、又は前立腺癌のごとき疾患において変化するか、又は正常なタンパク質として存在するが、不適切な体内区画において現れる。このエピトープの固有性を（ｉ）ＰＣＩＧＦ遺伝子によってコードされたタンパク質及びポリペプチドを対象とする抗体に対する該エピトープの免疫反応性及び特異性、及び（ｉｉ）他の任意の組織マーカーとの交差反応性の欠如、により判定できる。免疫反応性の判定方法は公知であり、その非限定例は例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムリンクトイムノアブソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、血球凝集反応（ＨＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）などである。適当な方法の幾つかの例が本文中に記載されている。
【００５１】
特記しない限り、以下の用語は以下の意味で使用されている。
【００５２】
特定の配列に「由来する」又は「特異的な」ポリヌクレオチドは、特定のヌクレオチド配列の領域に対応する、すなわち同一であるか、又は相補的である、おおよそで少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１５〜２０個のヌクレオチドの隣接配列を含んでなるポリヌクレオチド配列を意味する。配列は、当該分野で公知の技術により決定される特定のポリヌクレオチド配列に固有である配列に相補的又は同一でよい。例えば、データバンクでの配列比較を特定の配列の固有性を判定する方法として用いることができる。配列が由来する領域には、その非限定例としては特異的エピトープをコードする領域、並びに非翻訳及び／又は非転写領域などがある。
【００５３】
誘導されるポリヌクレオチドは試験中の目的のヌクレオチド配列から物理学的に誘導される必要はないが、非限定例としては化学合成、複製、逆転写又は転写などのいずれかの方法により作製でき、該方法はポリヌクレオチドが誘導される領域の塩基配列により提供される情報に基づく。このように、誘導されるポリヌクレオチドは元来のポリヌクレオチドのセンス又はアンチセンスのいずれかの配向を表し得る。加えて特定の配列の誘導ポリヌクレオチドに対応する領域の組み合わせを当該分野で公知の方法により修飾して使用目的に合致させることができる。
【００５４】
特定のポリヌクレオチドの「フラグメント」は、特定のヌクレオチド配列の領域に対応する、すなわち同一であるか、又は相補的である、おおよそで少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１５〜２０個のヌクレオチドの隣接配列を含んでなるポリヌクレオチド配列を意味する。
【００５５】
「プライマー」なる用語は標的ヌクレオチド配列に相補的であり、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするために用いられる特異的オリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素のいずれかにより触媒されるヌクレオチド重合の開始点として提供される。
【００５６】
「プローブ」なる用語は相補的配列を担持する被験サンプル中に存在する特異的ポリヌクレオチドを同定するために用いることができる規定の核酸セグメント（又はヌクレオチド類似体セグメント、例えば以後ＰＮＡとして定義するもの）を意味する。
【００５７】
「によってコードされた」という用語は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ここでポリペプチド配列又はその一部分は、核酸配列によってコードされたポリペプチドの少なくとも３〜５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５〜２０個のアミノ酸を含む。従って、「ポリペプチド」、「タンパク質」又は「アミノ酸」配列は、ＰＣＩＧＦアミノ酸配列に少なくとも約５０％の同一性、好ましくは約６０％の同一性、より好ましくは約７５〜８５％の同一性、最も好ましくは約９０〜９５％以上の同一性を有している。さらに、ＰＣＩＧＦ「ポリペプチド」、「タンパク質」又は「アミノ酸」配列は、ＰＣＩＧＦのポリペプチド又はアミノ酸配列に少なくとも約６０％の類似性、好ましくは少なくとも約７５％の類似性、より好ましくは約８５％の類似性、最も好ましくは約９５％以上の類似性を有し得る。このアミノ酸配列を配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントからなる群から選択できる。
【００５８】
“組換えポリペプチド”、“組換えタンパク質”又は“組換え技術によって産生されたポリペプチド”なる用語は本文中で互換的に使用されており、その起原又は操作が原因で、天然に結合するポリペプチドの全部又は一部に結合していないか及び／又は天然に結合するポリペプチド以外のポリペプチドに結合しているポリペプチドを意味する。組換えられた又はコードされたポリペプチド又はタンパク質は必ずしも指定の核酸配列から翻訳されない。また、化学合成又は組換え発現系の発現を含む任意の手段で作製され得る。
【００５９】
本文中で使用された“合成ペプチド”なる用語は、当業者に公知の方法によって化学的に合成され得る任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味する。これらの合成ペプチドは種々の用途に有用である。
【００６０】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」なる用語はいずれかの長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの重合形態を意味する。この用語は分子の１次構造のみを意味する。従って、この用語は二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖ＲＮＡを包含する。また、ポリヌクレオチドの修飾、例えばメチル化又はキャッピング及び非修飾形態をも包含する。本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」及び「オリゴ」なる用語は互換的に用いられる。
【００６１】
「ｃＤＮＡ」に対応する配列とは特定のＤＮＡにおける配列と同一であるか又は相補的であるポリヌクレオチド配列を含有する配列を意味する。ｃＤＮＡに対する同一性又は相補性の程度（又は「パーセント」）はおよそ５０％以上、好ましくは少なくとも約７０％以上、及びさらに好ましくは少なくとも約９０％以上である。同定されたｃＤＮＡに対応する配列は少なくとも約５０ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチドの長さ、及びより好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチドの長さである。目的の遺伝子又は遺伝子フラグメント及びｃＤＮＡ間の対応を公知の方法により決定でき、該方法には例えば記載したｃＤＮＡとシークエンシングした物質との直接比較、又はハイブリダイゼーション及び一本鎖ヌクレアーゼでの消化、続いて消化したフラグメントの大きさの決定などがある。
【００６２】
「精製されたポリヌクレオチド」とは本質的に遊離の、例えば、ポリヌクレオチドが天然に結合するタンパク質の約５０％未満、好ましくは約７０％未満、及びより好ましくは約９０％未満を含有する目的のポリヌクレオチド又はそのフラグメントを意味する。目的のポリヌクレオチドを精製するための技術は当該分野で公知であり、例えばカオトロピック剤によるポリヌクレオチドを含む細胞の破壊、及びイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度に従う沈殿に準じた分離などがある。
【００６３】
“精製ポリペプチド”又は“精製タンパク質”は、問題のポリペプチドが天然に結合する細胞成分を本質的に含まないか又は約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満で含むポリペプチドまたそのフラグメントを意味する。問題のポリペプチドの精製方法は当業界で公知である。
【００６４】
“単離された”という用語は、物質が本来の環境（例えば、天然産生物質の場合には自然環境）から取出されることを意味する。例えば、生存動物体内に存在する天然産生ポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然の系に共存する物質の幾つか又は全部から分離されている同じポリヌクレオチド又はＤＮＡ又はポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部でもよく、及び／又は、このようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部でもよく、ベクター又は組成物が天然環境の一部でないときは、やはり単離されている。
【００６５】
本明細書において「ポリペプチド」及び「タンパク質」は互換的に用いられ、共有結合及び／又は非共有結合により連結された少なくとも１個のアミノ酸分子鎖を示す。該用語は産物の特異的な長さに言及するものではない。このようにペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質はポリペプチドの定義に含まれる。該用語はポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。加えて、タンパク質フラグメント、類似体、変異又は変異タンパク質、融合タンパク質等はポリペプチドの意味に含まれる。
【００６６】
特定ポリペプチドの“フラグメント”は、特定ポリペプチドに由来する少なくとも約３−５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８−１０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約１５−２０個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を意味する。
【００６７】
“組換え宿主細胞”、“宿主細胞”、“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”、及び、その他の単細胞統一体として培養された微生物又はより高等な真核細胞系を表す同様の用語は、組換えベクター又はその他の転移されたＤＮＡのレシピエントとして使用され得る又は使用された細胞を意味しており、トランスフェクトされた起原的細胞の起原的後代を包含する。
【００６８】
本文中で使用された“レプリコン”は、細胞中の自律的ポリヌクレオチド複製単位として挙動するプラスミド、染色体又はウイルスのような遺伝子要素を意味する。
【００６９】
“ベクター”は、別のポリヌクレオチドセグメントが結合されており、結合セグメントの複製及び／又は発現を生じさせるようなレプリコンを意味する。
【００７０】
“コントロール配列”なる用語は、該配列に結合しているコーディング配列の発現を実行させるために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。このようなコントロール配列の特性は宿主生物次第で異なる。原核生物では、このようなコントロール配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む。真核生物では、このようなコントロール配列は一般に、プロモーター、ターミネーターを含み、幾つかの場合にはエンハンサーを含む。従って、“コントロール配列”なる用語は最小でも、その存在が発現に必要なすべての構成要素を含み、更に、その存在が有利であるような追加の構成要素、例えばリーダー配列を含み得る。
【００７１】
「機能的に連結した」とは記載された成分が意図された様式で成分を機能させることができる関係にある状況を意味する。このように、例えばコーディング配列に「機能的に連結された」調節配列は、調節配列に適合する条件下でコーディング配列の発現を達成するような様式でライゲートされる。
【００７２】
“読取り枠”又は“ＯＲＦ”なる用語は、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の領域を意味する。この領域がコーディング配列の一部分を表してもよく、またコーディング配列の全部を表してもよい。
【００７３】
“コーディング配列”は、適正な調節配列のコントロール下に配置されたときにｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列を意味する。コーディング配列の境界は５’−末端の翻訳開始コドンと３’−末端の翻訳終止コドンとによって決定される。コーディング配列の非限定例は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び組換えポリヌクレオチド配列である。
【００７４】
“によって／として免疫学的に同定可能”という用語は、指定された（１つ又は複数の）ポリペプチド中に存在する該ポリペプチドに固有の（１つ又は複数の）エピトープ及び（１つ又は複数の）ポリペプチドの存在を意味する。免疫学的一致は抗体結合及び／又は結合競合によって決定され得る。これらの技術は当業者に公知であり、本文中にも記載されている。また、エピトープの固有性は、ＧｅｎＢａｎｋのような既知のデータバンクのコンピュータサーチによってエピトープをコードするポリヌクレオチド配列を探し出し、既知の別のタンパク質とのアミノ酸配列比較によって決定できる。
【００７５】
本文中で使用された“エピトープ”は、ポリペプチド又はタンパク質の抗原決定基を意味する。エピトープは３つのアミノ酸をエピトープに固有の空間コンホメーションで含むと考えられる。一般に、１つのエピトープは少なくとも５個のこのようなアミノ酸から成り、より多くの場合には少なくとも８−１０個のアミノ酸から成る。空間コンホメーションの試験方法は当業界で公知であり、例えば、Ｘ−線結晶学及び二次元核磁気共鳴がある。
【００７６】
“コンホメーショナルエピトープ”は、免疫学的に認識可能な構造の特定アミノ酸配置から成るエピトープである。このようなアミノ酸は同じポリペプチドに連続順序もしくは不連続順序で存在するか又は異なるポリペプチドに存在する。
【００７７】
ポリペプチドは、該ポリペプチドに含まれている特異的エピトープの抗体認識によって抗体に結合するときは抗体に“免疫反応性”である。免疫反応性は、抗体結合によって、より特定的には抗体結合の動力学によって、及び／又は、抗体の対象であるエピトープを含む既知の（１つ又は複数の）ポリペプチドを（１つ又は複数の）競合物質として使用する結合の競合によって測定し得る。ポリペプチドが抗体に免疫反応性であるか否かを判定する方法は当業界で公知である。
【００７８】
本文中で使用された“問題のエピトープを含有する免疫原性ポリペプチド”という用語は、天然に産生する問題のポリペプチド又はそのフラグメント、及び、別の手段、例えば化学合成もしくは組換え生物中のポリペプチドの発現のような手段によって調製されたポリペプチドを意味する。
【００７９】
“トランスフェクション”なる用語は、原核性又は真核性の宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを導入することを意味する。導入に使用される方法は問わない。“トランスフェクション”なる用語は、ポリヌクレオチドの安定な導入及び一過性の導入の双方を意味しており、ポリヌクレオチドの直接取込み、形質転換、形質導入及びｆ−交配を包含する。宿主細胞にいったん導入された外因性ポリヌクレオチドは非組込みレプリコン、例えばプラスミドとして維持されてもよく、あるいは、宿主ゲノムに組込まれてもよい。
【００８０】
“処置”は予防及び／又は治療を意味する。
【００８１】
本文中で使用された“個体”なる用語は、脊椎動物、特に哺乳類の動物を意味しており、非限定例は、飼育動物、競走用動物、霊長類及びヒトである。より特定的にはこの用語はヒトを指す。
【００８２】
本明細書で用いられる「センス鎖」又は「プラス鎖」（又は「＋」）なる用語はポリペプチドをコードする配列を含む核酸を意味する。「アンチセンス鎖」又は「マイナス鎖」（又は「−」）なる用語は「プラス」鎖の配列に相補的である配列を含む核酸を意味する。
【００８３】
“被検サンプル”なる用語は、分析物（例えば問題の抗原又は問題の抗体）のソースである個人の身体の成分を意味する。これらの成分は当業界で公知である。被検サンプルは典型的には、ターゲット配列を含有する疑いのある任意のサンプルである。被検サンプルは例えば、個体から標本を採取し、必要ならば標本に含まれている任意の細胞を破壊し、これによってターゲット核酸を遊離させる当業界で公知の方法を用いて調製できる。これらの被検サンプルとしては、本文中に記載の本発明の方法によって試験され得る生物サンプルがあり、例えば全血、血清、血漿、脳脊髄液、気管支洗浄液、気管支吸引液、尿、リンパ液のようなヒト及び動物の体液、並びに、呼吸器、腸管及び尿生殖器の種々の外分泌物、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫など；細胞培養上清のような生物流体；固定され得る組織標本；及び、固定され得る細胞標本がある。
【００８４】
“精製された産生物”は、常態で産生物と会合している細胞成分及び問題のサンプル中に存在し得る別の種類の細胞から産生物を単離することによって得られた調製物を意味する。
【００８５】
「ＰＮＡ」は標的の存在を決定するための本明細書に記載するアッセイのごとき方法に利用できる「ペプチド核酸類似体」を意味する。「ＭＡ」は標的の存在を決定するための本明細書に記載するアッセイのごとき方法に利用できる「モルフォリノ類似体」を意味する。例えば、米国特許第５３７８８４１号を参照（出展明示により本明細書の一部とする）。ＰＮＡはＲＮＡ標的又はＤＮＡを対象とすることができる荷電していない部分である。例えば本発明のＤＮＡプローブの代わりにアッセイにおいて用いることができるＰＮＡプローブは、ＤＮＡプローブを用いた場合に達成できない利点を提供する。これらの利点には製造業性、大容量標識、再現性、安定性、イオン強度における変化に対する無反応性及びＤＮＡ又はＲＮＡを利用する方法に存在する酵素分解に対する抵抗性などがある。これらのＰＮＡを蛍光、放射性ヌクレオチド、化学ルミネサンス化合物等のようなシグナル発生化合物で標識（「結合」）できる。ＰＮＡ又は、ＭＡのごときその他の核酸類似体をアッセイにおいてＤＮＡ又はＲＮＡの代わりに用いることができる。ＤＮＡプローブを用いるアッセイを本明細書に記載するが、アッセイにおいて必要とされれば、及び必要とされるとき、ＰＮＡ又はＭＡを適当な変化を伴うＲＮＡ又はＤＮＡと置換できることは通常の技術者の範囲内である。
【００８６】
本文中に使用された“分析物”なる用語は、被検サンプル中に存在し得る検出すべき物質を意味する。分析物は、天然の特異的結合要素（例えば抗体）が存在するか又は特異的結合要素の調製が可能な任意の物質でよい。従って、分析物は、アッセイ中に１つ又は複数の特異的結合要素に結合できる物質である。“分析物”はまた、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体及びその組合せを包含する。分析物を特異的結合対の一方の要素となるので、天然の特異的結合パートナー（対）を利用して分析物を検出できる。例えば、ビタミンＢ１２の検出には特異的結合対の要素として内因子タンパク質を使用し、葉酸の検出には葉酸塩結合タンパク質を使用し、糖質の検出には特異的結合対の一方の要素としてレクチンを使用し得る。分析物としては、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ヌクレオチドターゲットなどがある。分析物は、血液、血漿又は血清、尿などの体液に可溶性でもよい。分析物は、組織中に存在してもよく、細胞表面又は細胞内部に存在してもよい。分析物は、血液、尿、乳組織吸引液のような体液中に分散した細胞上もしくは細胞内に存在してもよく、又は生検サンプルとして得られてもよい。
【００８７】
本明細書で用いられる「前立腺の疾患」又は「前立腺疾患」又は「前立腺の状態」とは、非限定例として良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺炎、前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）及び癌などのいずれかの前立腺疾患又は状態を意味する。
【００８８】
本明細書で用いる「前立腺癌」とは、非限定例としてアデノカルチノーマ、小型細胞未分化カルチノーマ及び粘液性（コロイド性）癌などの前立腺のいずれかの悪性疾患を意味する。
【００８９】
“発現配列タグ”又は“ＥＳＴ”は、組織から抽出され、次いでベクターに挿入され、ｍＲＮＡの逆転写によって作製されたｃＤＮＡインサートの部分配列を意味する。
【００９０】
“転写物イメージ”は、ライブラリー中のＥＳＴの定量的分布を示す表又はリストを意味しており、ライブラリーの作製に用いた組織中で活性の遺伝子を表す。
【００９１】
本発明は特異的結合要素を利用するアッセイを提供する。本文中で使用された“特異的結合要素”なる用語は、特異的結合対の１つの要素を意味する。即ち、一方の分子が化学的又は物理的手段を介して第二の分子に特異的に結合する異なる２つの分子のうちの１つの要素を意味する。従って、常用のイムノアッセイの抗原及び抗体から成る特異的結合対に加えて、ビオチンとアビジン、糖質とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素インヒビターと酵素、などのような特異的結合対がある。更に、特異的結合対としては、原型の特異的結合要素の類似体である要素、例えば分析物−類似体がある。免疫反応性特異的結合要素としては、抗原、抗原フラグメント、モノクローナル及びポリクローナルの双方の抗体及び抗体フラグメント、その複合体があり、組換えＤＮＡ分子によって形成されるものも含む。
【００９２】
本文中で使用された“ハプテン”なる用語は、部分的抗原を意味するか、又は、抗体結合能力を有しているがキャリアータンパク質に結合しないと抗体形成を誘発できない非タンパク質結合要素を意味する。
【００９３】
本文中で使用された“捕獲試薬”なる用語は、サンドイッチアッセイでは分析物に特異的であり、競合アッセイでは指示薬もしくは分析物に特異的であり、間接アッセイではそれ自体が分析物に特異的な補助特異的結合要素に特異的であるような未標識の特異的結合要素を意味する。捕獲試薬は、アッセイ処理前又はアッセイ処理中に直接又は間接に固相物質に結合でき、これによって、固定された複合体を被検サンプルから分離し得る。
【００９４】
“指示薬”は、シグナル発生能を有しており特異的結合要素にコンジュゲートされた（“付着された”）外的手段によって検出され得る測定可能なシグナルを発生する“シグナル発生化合物”（“ラベル”）から成る。特異的結合対の抗体要素であることに加えて、指示薬はまた、ハプテン−抗−ハプテン系のような任意の特異的結合対の一方の要素、例えば、ビオチン又は抗ビオチン、アビジン又はビオチン、糖質又はレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター又はレセプター分子、酵素補因子と酵素、酵素インヒビター又は酵素、などでもよい。免疫反応性特異的結合要素は、サンドイッチアッセイで問題のポリペプチドに結合でき、競合アッセイで捕獲試薬に結合でき、間接アッセイで補助特異的結合要素に結合できる抗体、抗原、又は、抗体／抗原複合体である。プローブ及びプローブアッセイについて記述するときは、“リポーター分子”なる用語を使用し得る。リポーター分子は、カルバゾール又はアダマンタンなどの特異的結合対の特異的結合要素にコンジュゲートした上記のようなシグナル発生化合物から成る。
【００９５】
考えられる種々の“シグナル発生化合物”（ラベル）としては、色原体、酵素のような触媒、フルオレセイン及びローダミンのような発光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム及びルミノールのような化学発光化合物、放射性元素並びに直接可視ラベルがある。酵素の例は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼなどである。特定ラベルの選択は決定要因ではない。しかしながらラベルは、単独でシグナルを発生するか又は１つもしくは複数の付加物質とのコンジャンクションによってシグナルを発生する能力を有していなければならない。
【００９６】
“固相”（“固体支持体”）は当業者に公知であり、反応トレーのウェル壁、試験管壁、ポリスチレンビーズ、磁性又は非磁性のビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子のようなマイクロ粒子、ヒツジ（又は他の動物）の赤血球、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）（ピルビン酸アルデヒド及びホルムアルデヒドによって“固定された”赤血球、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）などがある。“固相”は決定要因ではなく、当業者が選択できる。従って、ラテックス粒子、マイクロ粒子、磁性又は非磁性のビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラス又はシリコンチップ、ヒツジ（又は他の動物の）赤血球及びＤｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）はすべて好適例である。固相をペプチドに固定する適当な方法は、イオン性、疎水性又は共有結合性相互作用などである。本文中で使用された“固相”なる用語は、不溶性であるか又はその後の反応によって不溶化し得る任意の材料を意味する。固相は、捕獲試薬を吸引し固定し得る固有能力に基づいて選択され得る。あるいは固相が、捕獲試薬を吸引し固定する能力を有している付加的レセプターを保持し得る。付加的レセプターは、捕獲試薬自体又は捕獲試薬にコンジュゲートされた荷電物質に反対の電荷をもつ荷電物質でもよい。あるいはまた、レセプター分子が、固相に固定（付着）されており特異的結合反応を介して捕獲試薬を固定化する能力を有している任意の特異的結合要素でもよい。レセプター分子は、アッセイ処理前又はアッセイ処理中に捕獲試薬を固相材料に間接に結合させ得る。従って固相は、プラスチック、誘導プラスチック、磁性又は非磁性の金属、試験管のガラス又はシリコン表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、マイクロ粒子、チップ、ヒツジ（又は他の動物）の赤血球、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）及び平均的な当業者に公知の他の形状でよい。
【００９７】
また本発明の範囲内で、検出抗体がアクセスできる十分な多孔度を有しておりかつ抗原に結合する適当な表面親和性を有している任意の適当な多孔質材料を固相に使用することも考えられる。一般には微孔質構造が好ましいが、水和状態でゲル構造をもつ材料も使用できる。このような有用な固体支持体の非限定例は、ニトロセルロース及びナイロンである。本文中に記載のこのような多孔質固体支持体として、好ましくは約０．０１−０．５ｍｍ、特に好ましくは約０．１ｍｍの厚みのシートの形態が考えられる。細孔サイズは広い範囲内で変更でき、好ましくは約０．０２５−１５ミクロン、特に約０．１５−１５ミクロンである。このような支持体の表面は、抗原又は抗体を支持体に共有結合させる化学的プロセスによって活性化され得る。しかしながら一般には、十分には解明されていない疎水性の力によって抗原又は抗体が多孔質材料に吸着されることによって抗原又は抗体が不可逆的に結合する。その他の適当な固体支持体は当業界で公知である。
【００９８】
試薬
本発明は、目的の前立腺組織に由来し、ＰＣＩＧＦと称するポリヌクレオチド配列、それによりコードされるポリペプチド及びこれらのポリペプチドに特異的な抗体のような試薬を提供する。本発明はまた開示したポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチド及びこれらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列などの試薬をも提供する。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は抗体を、前立腺癌のような前立腺疾患及び状態の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影、予防もしくは処置、又は疾病素質の判定、などを可能にする情報を提供するために使用できる。本明細書に開示する配列はアッセイにおいて、又は遺伝子転写活性の特異的プロフィールを作製するために用いることができる固有のポリヌクレオチドを表す。このようなアッセイは欧州特許第０３７３２０３Ｂ１及び国際公開番号ＷＯ９５／１１９９５に開示されており、これらは出展明示により本明細書の一部とする
選択されたＰＣＩＧＦ由来のポリヌクレオチドを本明細書に記載する正常又は変化した遺伝子発現を検出する方法に用いることができる。このような方法ではＰＣＩＧＦポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、そのフラグメントもしくは誘導体、又はそれに相補的な核酸配列を用いることができる。
【００９９】
本明細書に開示するポリヌクレオチド、その相補的配列又はいずれかのフラグメントをアッセイに用いて前立腺組織疾患及びそれに関連する状態に関係する遺伝子、核酸、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの検出、増幅又は定量をすることができる。またこれらを用いてＰＣＩＧＦポリペプチドのコーディング配列全体を又は部分的に同定することもできる。さらにこれらをアッセイ用のキットの形態で個々の容器に収容して提供するか、又は個々の組成物として提供することができる。アッセイ用のキットとして提供される場合、その他の適当な試薬、例えばバッファー、コンジュゲート等を含むことができる。
【０１００】
ポリヌクレオチドをＲＮＡ又はＤＮＡの形態にできる。ＤＮＡの形態のポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体及び合成ＤＮＡは本発明の範囲内である。ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖の形態でよく、一本鎖の場合、コーディング（センス）鎖又は非コーディング（アンチセンス）鎖でよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列は本発明にて提供するコーディング配列と同一であるか、又は異なるコーディング配列でよく、遺伝コードの冗長性又は縮重の結果、コーディング配列は本発明にて提供されるＤＮＡと同一のポリペプチドをコードする。
【０１０１】
このポリヌクレオチドはポリペプチドのコーディング配列のみ、又はポリペプチドのコーディング配列及びリーダーもしくは分泌配列もしくはプロタンパク質配列のような別のコーディング配列、又はポリペプチドのコーディング配列（及び所望により別のコーディング配列）及びポリペプチドのコーディング配列の非コーディング５‘及び／又は３’配列のような非コーディング配列を含み得る。
【０１０２】
加えて、本発明はポリヌクレオチド欠失、置換又は付加のような修飾を含むポリヌクレオチド変異；及びポリヌクレオチド配列変異から得られるいずれかのポリクローナル抗体ペプチド修飾体を含む。本発明のポリヌクレオチドはまた本発明にて提供されるコーディング配列の天然対立遺伝子変異であるコーディング配列をも有する。
【０１０３】
加えて、ポリヌクレオチドのコーディング配列を同一の読み枠で、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を補助するポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリペプチドの輸送を調節する分泌配列として機能するリーダー配列に融合できる。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、宿主細胞により切断され、ポリペプチドを形成するリーダー配列を有することができる。ポリヌクレオチドはまたタンパク質に５‘アミノ酸残基が付け加えられているプロタンパク質をもコードできる。プロ配列を有するタンパク質はプロタンパク質であり、プロタンパク質はタンパク質の不活性形態である場合もある。プロ配列を一度切断すると、活性タンパク質が残る。このように本発明のポリヌクレオチドはタンパク質を、又はプロ配列を有するタンパク質を、又はプレ配列（リーダー配列）及びプロ配列の両方を有するタンパク質をコードできる。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドはまた本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にフレーム内融合したコーディング配列をも有することができる。マーカー配列は、細菌宿主の場合マーカーに融合されたポリペプチドを精製するためにｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグでよく、又は、例えば哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７セルラインを用いる場合、マーカー配列は赤血球凝集素（ＨＡ）タグでよい。ＨＡタグはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。例えば、Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）参照。
【０１０５】
ポリヌクレオチド及び配列間で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、及びより好ましくは少なくとも９０％の同一性がある場合、ポリヌクレオチドは本発明にて提供される配列にハイブリダイズすると考えると企図する。
【０１０６】
本発明はまた、ポリペプチドの少なくとも一部が、本発明で提供されるポリヌクレオチドから選択されたＰＣＩＧＦポリヌクレオチドによりコードされる、精製されたＰＣＩＧＦポリペプチドを用いて産生された抗体をも提供する。本発明にて提供される方法でこれらの抗体を用いて被験サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原を検出できる。被験サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原の存在は前立腺疾患又は状態の存在の指標である。また抗体を治療目的で用いて発現変化又は状態に関連するＰＣＩＧＦポリペプチドの活性を中和させることができる。
【０１０７】
本発明は、本発明にて提供されたような推定アミノ酸配列及びこのようなポリペプチドのフラグメント、類似体及び誘導体のようなＰＣＩＧＦポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、組換えによって産生されてもよく、天然ソースから精製されてもよく、又は、合成されてもよい。ＰＣＩＧＦポリペプチドのフラグメント、誘導体又は類似体は、いずれかの構成ポリペプチド鎖の１つ又は複数のアミノ酸残基が保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）によって置換され、このような置換アミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされているかコードされていないポリペプチドであってもよく；１つ又は複数のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドであってもよく；ポリペプチドがポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えばポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合したポリペプチドであってもよく；又は、付加アミノ酸がポリペプチド、例えばリーダー配列もしくは分泌配列又はポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列に融合しているポリペプチドであってもよい。このようなフラグメント、誘導体及び類似体は本発明の範囲内に包含される。本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは好ましくは単離形態で提供され、好ましくは精製されている。
【０１０８】
従って、本発明のポリペプチドは、天然ポリペプチドのアミノ酸配列に同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、１つ又は複数のアミノ酸置換に起因する小変異をもつアミノ酸配列を有し得る。変異は、置換アミノ酸が類似の構造的又は化学的特性を有するような「保存性変化」、例えばイソロイシンによるロイシンの置換又はセリンによるトレオニンの置換でもよい。対照的に、変異が非保存性変化、例えばトリプトファンによるグリシンの置換でもよい。同様の小変異はまた、アミノ酸の欠失又は挿入又はその双方でもよい。生物学的又は免疫学的な活性を変化させることなく置換、挿入又は欠失し得るアミノ酸の種類及び個数を決定する指針は、当業界で公知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用することによって見出される。
【０１０９】
本発明のポリヌクレオチド配列により構築されたプローブを種々のアッセイ法において用いて種々の型の分析を提供できる。例えば、このようなプローブを蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術において用いて染色体分析を実施し、染色体における癌特異的構造変化、例えば染色体スプレッドから可視化できるか又はＰＣＲにより生じた、及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ、対立遺伝子特異的増幅を用いて、又は直接シークエンシングにより検出できる欠失又は転移を同定できる。またプローブを放射性同位元素で直接的もしくは間接的に検出可能なハプテン、又は蛍光分子で標識でき、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究に用いて組織標本又は細胞のポリヌクレオチドを含んでなる遺伝子のｍＲＮＡ発現を評価できる。
【０１１０】
本発明はまた、本発明で提供されるポリペプチドの産生に関する教示を提供する。
【０１１１】
プローブアッセイ
本発明にて提供される配列を用いて、被験サンプル中の核酸を検出するためのアッセイにおいて用いることができるプローブを作製できる。目的のポリヌクレオチドの保存ヌクレオチド領域から、又は目的のポリヌクレオチドの非保存ヌクレオチド領域からプローブを設計できる。アッセイを最適化するためのこのようなプローブの設計は通常の技術者の技術範囲内である。一般に、特異性が最大であるのが望ましい場合、核酸プローブを非保存又は固有の領域から開発し、例えば多重遺伝子族の異なるメンバーに非常に関連性のあるヌクレオチド領域又はマウス及びヒトのような関連性のある種にあるヌクレオチド領域を検定する場合、保存領域から核酸プローブを開発する。
【０１１２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は核酸及びそれの混合物に含まれる望ましい核酸配列（標的）を増幅する技術である。ＰＣＲではプライマー対を過剰に用いて標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする。各々鋳型として標的核酸を用いてポリメラーゼによりプライマーを伸長する。伸長産物はそれ自体標的配列になり、その後元来の標的鎖から解離される。次いで新規のプライマーをハイブリダイズし、ポリメラーゼにより伸長し、サイクルを繰り返して標的配列分子数を幾何級数的に増加させる。ＰＣＲは米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号に開示されており、これは出展明示により本明細書の一部とする。
【０１１３】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は核酸増幅のための代替法である。ＬＣＲでは、２個の１次（第１及び第２）及び２個の２次（第３及び第４）プローブを含むプローブ対を用い、該プローブは全て標的に対して過剰のモル濃度で用いられる。第１プローブは標的鎖の第１セグメントにハイブリダイズし、第２プローブは標的鎖の第２セグメントにハイブリダイズし、第１及び第２セグメントは近接して、１次プローブが５‘リン酸−３’ヒドロキシルの関係で互いに隣接し、リガーゼが２個のプローブを融合産物に共有結合により融合又はライゲートできる。加えて、類似の隣接様式で、第３（２次）プローブは第１プローブの部分にハイブリダイズでき、第４（２次）プローブは第２プローブの部分にハイブリダイズできる。もちろん、標的が最初二本鎖である場合、２次プローブはまず第１に標的相補体にハイブリダイズする。一度１次プローブのライゲートされた鎖が標的鎖から分離すると、ライゲートされて相補体、２次ライゲート産物を形成できる第３及び第４プローブにハイブリダイズする。ライゲート産物が標的又はその相補体のいずれかと機能的に等価であるということを認識することが重要である。ハイブリダイズ及びライゲーションのサイクルを繰り返すことにより、標的配列を増幅することができる。この技術はＫ．Ｂａｃｋｍａｎに対して１９８９年６月１６日に公開されたＥＰ−Ａ−３２０３０８及びＫ．Ｂａｃｋｍａｎらに対して１９９１年７月３１日に公開されたＥＰ−Ａ−４３９１８２においてさらに完全に記載されており、双方共に出展明示により本明細書の一部とする。
【０１１４】
ｍＲＮＡの増幅に関しては、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いてポリメラーゼ連鎖反応を行うこと（ＲＴ−ＰＣＲ）；又は米国特許第５３２２７７０号（出展明示により本明細書の一部とする）に記載されているような双方の工程のための単一の酵素を用いること；又はＲ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ４：８０−８４（１９９４）（出展明示により本明細書の一部とする）に記載されているような、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて非対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を行うことは本発明の範囲内である。
【０１１５】
本発明にて利用できるその他の公知の増幅方法には、非限定例として、Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８（１９９０）により記載され、またＪ．Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０（６３１３）：９１−９２（１９９１）により記載されている、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」又は「３ＳＲ」技術；公開欧州特許出願（ＥＰＡ）番号４５４４６１０にて記載されているようなＱベータ増幅；鎖置換増幅（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：９−１３（１９９６）に記載されている）及び欧州特許出願番号６８４３１５；並びに国際特許出願番号ＷＯ９３／２２４６１に記載されているような標的媒介増幅などがある。
【０１１６】
現在当該分野で公知のこれらの検出法などのいずれかの適当な検出方法及び後に案出し得る検出計画を用いてＰＣＩＧＦを検出できる。前記した現在公知の検出法の実例は出展明示により本明細書の一部とする。例えばＣａｓｋｅｙら、米国特許第５５８２９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５２１００１５号を参照。このような検出法の例としては標的増幅法及びシグナル増幅技術などがある。現在知られている検出法の例としてはＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＲＣＡ及びＴＭＡと称する核酸増幅技術などがある。例えば、Ｃａｓｋｅｙら、米国特許第５５８２９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５２１００１５号を参照。前記は全て出展明示により本明細書の一部とする。Ｓｎｉｔｍａｎら、米国特許第５２７３８８２号に開示されるもののようなシグナル増幅を用いて検出を達成することもできる。今のところ標的又はシグナルの増幅が好ましいが、増幅を必要としない超鋭敏検出法を本発明において使用できることは企図するところであり、本発明の範囲内である。
【０１１７】
種々の同種及び異種検出様式を用いて増幅する及び増幅しない検出を（組み合わせて）実施できる。異種性検出様式の実例はＳｎｉｔｍａｎら、米国特許第５２７３８８２号、Ａｌｂａｒｅｌｌａら、ＥＰ８４１１４４４１．９、Ｕｒｄｅａら、米国特許第５１２４２４６号、Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第５１８５２４３号及びＫｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４５８１３３３号に開示されている。前記の全てを出展明示により本明細書の一部とする。同種検出様式の実例はＣａｓｋｅｙら、米国特許第５５８２９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５２１００１５号に開示されており、これらを出展明示により本明細書の一部とする。ハイブリダイゼーションアッセイにおける複数のプローブの使用は意図されるところであり、本発明の範囲内であり、それを使用することによりＰＣＩＧＦシグナルの感受性及び増幅が改善される。例えばＣａｓｋｅｙら、米国特許第５５８２９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５２１００１５号（出展明示により本明細書の一部とする）を参照。
【０１１８】
１つの実施態様において、本発明は概して標的ポリヌクレオチドを含有することが疑われる被験サンプルを増幅プライマー及びアンプリコン配列の内部領域とハイブリダイズできる検出プローブを含んでなる増幅反応試薬と接触させる工程を含む。本発明にて提供される方法により用いられるプローブ及びプライマーを捕捉及び検出標識で標識し、この場合プローブはある型の標識で標識され、プライマーは別の型の標識で標識される。さらにプローブ配列がプライマー配列よりも溶融温度が低くなるようにプライマー及びプローブを選択する。増幅試薬、検出試薬及び被験サンプルを増幅条件下におき、それにより標的配列の存在下、標的配列のコピー（アンプリコン）を作製する。通常の場合、プライマーが提供されて標的配列及びその相補鎖を増幅するので、アンプリコンは二本鎖である。次いで二本鎖アンプリコンを熱変成し一本鎖アンプリコンメンバーを産生する。一本鎖アンプリコンの形成時、混合物を冷却してプローブ及び一本鎖アンプリコンメンバー間で複合体形成させる。
【０１１９】
一本鎖アンプリコン配列及びプローブ配列を冷却したとき、プローブ配列は一本鎖アンプリコンメンバーに優先的に結合する。予想に反して、一般にプローブ配列がプライマー配列よりも短くなるようにプローブ配列が選択されるという知見が得られる。従って、プライマーにより産生されたアンプリコンの溶融温度はまたプローブの溶融温度よりも高い。このように、混合物を冷却したとき、二本鎖アンプリコンの再形成が予測されよう。しかしながら、前記するように、この場合はしない。プローブは一本鎖アンプリコンメンバーに優先的に結合することが見出される。さらにプライマー配列を過剰のプローブに加える場合でも、このプローブ／一本鎖アンプリコン結合の偏好性が存在する。
【０１２０】
プローブ／一本鎖アンプリコンメンバーハイブリッドが形成された後、これが検出される。標準的な異種アッセイ様式はプライマー及びプローブに存在する検出標識及び捕捉標識を用いてハイブリッドを検出するのに適している。ハイブリッドを捕捉標識により固相に結合でき、検出標識により検出できる。検出標識を直接検出できる場合、必要であれば標識に検出可能なシグナルを生じさせ、そしてシグナルを検出することにより固相上でのハイブリッドの存在を検出できる。標識を直接検出できない場合、捕捉ハイブリッドを、通常直接検出可能な標識に結合した結合メンバーを含んでなるコンジュゲートに接触させることができる。コンジュゲートは複合体に結合できるようになり、複合体でのコンジュゲートの存在を直接検出可能な標識で検出する。このように、固相試薬でハイブリッドの存在を決定できる。当業者は洗浄工程を用いてハイブリダイズされていないアンプリコン又はプローブ及び結合していないコンジュゲート洗去できる。
【０１２１】
標的配列は一本鎖であると記載されているが、標的配列が実際は二本鎖であり、増幅プライマー配列とハイブリダイズする前にその相補体から分離されているだけである場合を含むことを意図している。この方法でＰＣＲを用いる場合、標的配列の末端は通常既知である。ＬＣＲ又はその修飾法を好ましい方法で用いる場合、通常全標的配列が既知である。典型的には、標的配列は例えばＲＮＡ又はＤＮＡのような核酸である。
【０１２２】
本発明にて提供される方法を熱サイクル反応混合物を含む公知の増幅反応、とりわけＰＣＲ及びギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）において使用することができる。増幅反応は典型的にはプライマーを用いて標的核酸配列のコピーを作製し、該標的配列は通常さらに大きな核酸配列の小領域である。プライマーはそれ自体標的配列の領域に相補的である核酸配列である。増幅条件下でこれらのプライマーが標的配列の相補的領域にハイブリダイズ又は結合する。標的配列のコピーは典型的にはポリメラーゼ又はリガーゼ活性を有する酵素を用いて別個に又は組み合わせて、ヌクレオチドをハイブリダイズされたプライマーに添加し、及び／又は隣接するプローブ対にライゲートするプライマー伸長及び／又はライゲーション方法により作製される。プライマー又はプローブに添加されたヌクレオチドもまた単量体、又は用いられたオリゴマーとして標的配列に対して相補的である。一度プライマー又はプローブが十分に伸長及び／又はライゲートされると、例えば反応混合物を相補的核酸鎖が解離する「溶融温度」まで加熱することにより、標的配列から分離される。このように標的配列に相補的な配列が形成される。
【０１２３】
次いで新たな増幅サイクルが起こり得、いずれかの二本鎖を分離することにより標的配列数をさらに増幅し、プライマー又はプローブがその各々の標的にハイブリダイズすることが可能になり、ハイブリダイズされたプライマー又はプローブを伸長及び／又はライゲートし、再分離する。増幅サイクルにより作製された相補配列を鋳型として提供してプライマー伸長又は２個のプローブのギャップを充填し、標的配列数をさらに増幅する。典型的には反応混合物は２０から１００回循環し、さらに典型的には、反応混合物は２５から５０回循環する。サイクル数は通常の技術者により決定できる。この方法では、標的配列の複数のコピー及びその相補配列が作製される。このようにプライマーは増幅条件下にある場合、標的配列の増幅を開始する。
【０１２４】
一般に、標的鎖の部分に相補的である２個のプライマー及びその相補体をＰＣＲに使用する。ＬＣＲでは、４個のプローブのうち２個は標的配列に相補的であり、２個は標的の相補体に対して同様に相補性であるその４個のプローブを一般に使用する。プライマーセット及び前記の酵素に加えて、核酸増幅反応混合物はまた公知である別の試薬を含んでなってよく、非限定例としてはマンガン；マグネシウム；塩；ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）；並びにデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸及びデオキシチミン三リン酸などがある。
【０１２５】
増幅プライマーは標的配列の増幅を開始するが、一方検出（ハイブリダイゼーション）プローブは増幅に関与しない。一般に検出プローブは例えば国際特許出願番号ＷＯ９２／２０７０２に開示されたペプチド核酸；米国特許第５１８５４４４号、第５０３４５０６号及び第５１４２０４７号に開示されるモルフォリノ類似体；等のような核酸配列又は荷電していない核酸類似体である。プローブが担持する標識の型に依存して、プローブを用いる増幅反応により作製されたアンプリコンを捕捉又は検出する。プローブは標的配列の増幅に関与せず、従って付加ｄＮＴＰをプローブに付加できないので、「伸長不可能」にならざるを得ない。本来は及び自然には、類似体は通常伸長不可能であり、プローブの３’末端をヒドロキシル基がもはや伸長できないように修飾することにより核酸プローブを伸長不可能にすることができる。例えば、捕捉又は検出標識によりヒドロキキシル基を消費するか又はそうでなければ遮断する該捕捉又は検出標識でプローブの３’末端を機能的にできる。また別に、３’ヒドロキシル基を簡単に切断、置換又は修飾できる。１９９３年４月１９日出願の米国特許出願番号０７／０４９０６１を用いてプローブを伸長不可能にでき、これは出展明示により本明細書の一部とする。
【０１２６】
プローブに対するプライマーの比率は重要ではない。従って、プローブ又はプライマーを反応混合物に過剰に加え、それにより一方の濃度を他方の濃度よりも大きくする。また別にプライマーとプローブを等濃度で用いることができる。しかしながら、好ましくはプライマーをプローブが過剰にある反応混合物に加える。従って、プローブに対するプライマーの比率を例えば５：１及び２０：１にするのが好ましい。
【０１２７】
プライマー及びプローブの長さは変化するが、プローブ配列を、溶融温度がプライマー配列よりも低くなるように選択する。このように一般にプライマー配列はプローブ配列よりも長い。典型的には、プライマー配列は２０から５０ヌクレオチドの長さの範囲であり、より典型的には２０から３０ヌクレオチドの長さの範囲である。典型的なプローブは１０から２５ヌクレオチドの長さの範囲である。
【０１２８】
プライマー及びプローブを合成するための種々の方法は当該分野で公知である。同様に、標識をプローブに付着させる方法もまた当該分野で公知である。例えば、慣用的なヌクレオチドホスホラミダイト化学及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｄｕｐｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）より入手可能な器具を用いて望ましい核酸プライマー又はプローブを合成するのは慣例的なことである。本発明のプライマー又はプローブのようなオリゴヌクレオチドを標識するたもの多くの方法が報告されている。Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の双方が報告されており、プローブ標識技術が市販されている。例えば、３’−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ  ＣＰＧ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて１級アミンを３’オリゴ末端に付着させることができる。同様に、Ａｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ  ＩＩ（登録商標）（クロンテック）を用いて１級アミンを５’オリゴ末端に付着させることができる。加えて、１９９０年１２月１１日出願の係属出願米国第６２５５６６及び１９９０年１２月２０日出願の第６３０９０８号は各々５‘及び３’末端でプローブを標識する方法を教示しており、各々出展明示により本明細書の一部とする。１９９２年６月２５日公開の国際公開番号９２／１０５０５及び１９９２年７月９日公開のＷＯ９２／１１３８８は各々５‘及び３’末端でプローブを標識する方法を教示している。オリゴヌクレオチドを標識するためのある既知の方法によれば、標識ホスホラミダイト試薬を調製し、これを用いてその合成中にオリゴヌクレオチドに標識を加える。例えば、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９（４６）：５９０５−５９０８（１９９８）；又はＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎら、公開米国特許出願第０７／２４６６８８号（ＮＴＩＳ  ＯＲＤＥＲ  Ｎｏ．ＰＡＴ−ＡＰＰＬ−７−２４６６８８）（１９８９）を参照。好ましくはプローブをその３’及び５’末端で標識する。
【０１２９】
捕捉標識をプライマー又はプローブに付着させることができ、固相試薬の特異的結合メンバーと結合対を形成する特異的結合メンバーにできる。プライマー又はプローブをそれ自体を捕捉標識として提供できることは理解されよう。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合、それがプライマー又はプローブの相補部分に結合し、それによりプライマー又はプローブを固相に固定できるように選択し得る。プローブ自体が結合メンバーとして提供される場合、プローブが一本鎖アンプリコンメンバーに相補的でない配列又は「テイル」を含有することを当業者には理解されよう。プライマー配列に十分に相補的ではないようにプローブが選択されるので、プライマー自体が捕捉標識として提供される場合、少なくともプライマーの一部は固相上の核酸と自由にハイブリダイズするであろう。
【０１３０】
一般に、異種イムノアッセイを実施するのに通常用いられる技術を用いて、プローブ／一本鎖アンプリコンメンバー複合体を検出できる。好ましくは、この実施態様では、市販により袖手可能なＡｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ（商標）インストルメンテーション（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）により用いられるプロトコルに従って検出を実施する。
【０１３１】
本発明にて開示されるプライマー及びプローブは典型的なＰＣＲアッセイにおいて有用であり、この場合被験サンプルをプライマー対と接触させ、増幅を実施し、ハイブリダイゼーションプローブを加え、検出を実行する。
【０１３２】
本発明により提供される別の方法は被験サンプルを複数のポリヌクレオチドと接触させること（この場合、少なくとも１つのポリヌクレオチドは本明細書に記載するＰＣＩＧＦ分子である）、被験サンプルを複数のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせること、及びハイブリダイゼーション複合体を検出することからなる。ハイブリダイゼーション複合体を同定し、測定して前立腺組織疾患、例えば前立腺癌の指標であるプロフィールを集める。逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当該分野で公知の方法によるＤＮＡ産物の増幅により発現されたＲＮＡ配列をさらに検出できる。
【０１３３】
薬剤スクリーニング及び遺伝子治療
本発明はまた、分子例えば本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来するアンチセンスＰＣＩＧＦを、前立腺組織疾患又は状態とりわけ前立腺癌に関連するポリヌクレオチドの異常発現に関係する症状を有する患者に導入する遺伝子治療方法の使用をも包含する。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡフラグメント及びリボザイムなどのこれらの分子をＰＣＩＧＦ  ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計し、ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドの発現変化又は異常に関連する症状の処置において治療的に使用することができる。
【０１３４】
また別に、前記したオリゴヌクレオチドを当該分野で公知の方法によりアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで発現され、前記の方法でＰＣＩＧＦポリペプチドの産生を阻止するように細胞に分配できる。従ってＰＣＩＧＦポリヌクレオチドに対するアンチセンス構築物はＰＣＩＧＦ転写物の作用を逆転し、該アンチセンス構築物を前立腺組織疾患状態、例えば前立腺癌に使用できる。またこれらのアンチセンス構築物を腫瘍転移の処置に使用できる。
【０１３５】
本発明は、ＰＣＩＧＦポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１つの化合物を同定するために、複数の化合物をＰＣＩＧＦポリペプチド又はその任意のフラグメントに対する特異的結合に基づいてスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、少なくとも１つの化合物を提供する工程と、ＰＣＩＧＦポリペプチドを各化合物に混合し、結合に適した条件下で結合に十分な時間維持する工程と、各化合物に対するＰＣＩＧＦポリペプチドの結合を検出する工程とから成る。
【０１３６】
このような試験に使用されるポリペプチド又はペプチドフラグメントは、溶液中で遊離状態でもよく、固体支持体に固定されていてもよく、細胞表面に担持されていてもよく、又は、細胞内に配置されていてもよい。１つのスクリーニング方法では、ポリペプチド又はペプチドフラグメントを発現し得る組換え核酸を安定にトランスフェクトした真核性又は原核性の宿主細胞を使用する。薬剤、化合物又は他の任意の物質はこのようなトランスフェクト細胞に対する競合結合アッセイによってスクリーニングされ得る。例えば、ポリペプチドと被検物質との間の複合体の形成を生存細胞又は固定細胞中で測定し得る。
【０１３７】
従って本発明は、ＰＣＩＧＦに関連する疾患を治療するために使用できる薬剤、化合物又は他の任意の物質のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、物質をポリペプチド複合体、ポリペプチド又はそのフラグメントに接触させ、物質とポリペプチドとの複合体の存在、又はポリペプチドと細胞との複合体の存在を検定する段階から成る。競合結合アッセイでは一般にポリペプチドを標識する。適当なインキュベーション後、遊離（即ち非複合）ポリペプチド又はそのフラグメントを結合形態で存在するポリペプチド又はそのフラグメントから分離し、遊離即ち複合体非形成ラベルの量を、特定物質のポリペプチド結合能力又はポリペプチド／細胞複合体妨害能力の尺度とする。
【０１３８】
本発明はまた、ポリペプチドに特異的に結合し得る中和抗体がポリペプチド又はそのフラグメントに対する結合に関して被検物質と競合するような競合スクリーニングアッセイの使用を包含する。このように、本発明で提供されるＰＣＩＧＦポリペプチドに共通の１つ又は複数の抗原決定基を有している被検サンプル中の任意のポリペプチドの存在を検出するために抗体を使用できる。
【０１３９】
別のスクリーニング技術は、本発明で開示されたＰＣＩＧＦの少なくとも１つのポリペプチドに適当な結合親和性を有している化合物を高処理量でスクリーニングし得る。簡単に説明すると、プラスチックピン又は他の任意の表面のような固相上で多数の異なる小ペプチドから成る被検化合物を合成する。被検ペプチド化合物をポリペプチドと反応させて洗浄する。このようにして固相に結合したポリペプチドを当業界で公知の方法によって検出する。また、本文中に記載のスクリーニング技術に使用するために精製ポリペプチドをプレートに直接コートしてもよい。更に、ポリペプチドを捕獲し固体支持体に固定させるために非中和抗体を使用してもよい。例えば、１９８４年９月１３日公開の欧州特許ＥＰ８４／０３５６４参照。該特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０１４０】
合理的な薬剤設計の目的は、考察中の生物活性ポリペプチド又は該ポリペプチドと相互作用するアゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビターのような小分子の構造的類似体を産生することである。このような構造的類似体は、より活性の形態もしくはより安定な形態のポリペプチドから成る薬剤又はポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ機能を増進もしくは妨害する薬剤を設計するために使用できる。Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１９−２１（１９９１）参照。該文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０１４１】
例えば１つの方法では、ポリペプチド又はポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューターモデリング、又は、最も典型的には双方の併用によって決定する。分子の構造を解明し分子の（１つ又は複数の）活性部位を決定するためには、ポリペプチドの形態及び電荷を確認しなければならない。使用される機会は少ないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報はまた相同タンパク質の構造に基づくモデリングによって得られる。双方の場合に、類似のポリペプチド様分子を設計するため又は効率的なインヒビターを同定するために適当な構造情報が使用される。
【０１４２】
合理的な薬剤設計の有用な例は、Ｓ．Ｂｒａｘｔｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：７７９６−７８０１（１９９２）に示されたような改良された活性もしくは安定性をもつ分子、又は、Ｓ．Ｂ．Ｐ．Ａｔｈａｕｄａら，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１３（６）：７４２−７４６（１９９３）によって示されたような天然型ペプチドのインヒビター、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する分子である。これらの引用文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０１４３】
また、上記のようなアッセイによって選択されたターゲット特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を決定することも可能である。原則としてこの方法は、以後の薬剤設計の基礎となるファーマコホア（薬作用発生団）を産生する。更に、薬理学的に活性の機能性抗体に対する抗−イディオタイプ抗体（“ａｎｔｉ−ｉｄ”）を産生させることによってタンパク質結晶学を完全に無視することも可能である。鏡像の鏡像なのでａｎｔｉ−ｉｄの結合部位は起原レセプターの類似体である。次に、ａｎｔｉ−ｉｄを使用して、化学的又は生物学的に産生されたペプチドバンクからペプチドを同定及び単離し得る。単離されたペプチドはファーマコホア（即ち、原型医薬）として作用し得る。
【０１４４】
本発明の組換えポリペプチド複合体は、Ｘ線結晶学のような分析的研究を行うために十分な量で提供される。更に、核酸配列から誘導され得るポリペプチドのアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代替又は付加してコンピユーターモデリング技術を使用する技術者に指針を提供するであろう。
【０１４５】
ＰＣＩＧＦに特異的な抗体（例えば抗−ＰＣＩＧＦ抗体）は更に、ポリペプチド複合体に結合することによってポリペプチド複合体の生物作用を阻害するために使用され得る。このような場合、抗体を例えば前立腺癌及びその転移のような前立腺組織疾患を治療する治療方法で使用し得る。
【０１４６】
更に、このような抗体は被検サンプル中のＰＣＩＧＦポリペプチドの有無を検出でき、従って、前立腺組織の疾患又は状態、特に前立腺癌を診断する診断用マーカーとして有用である。このような抗体はまた、前立腺癌のような前立腺組織疾患状態の診断用マーカーとして機能し得る。
【０１４７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト及びインヒビターを目的とする。アンタゴニスト及びインヒビターは、ポリペプチド複合体の機能を阻害又は排除する因子である。従って例えば、アンタゴニストは本発明のポリペプチドに結合し、該ポリペプチドの機能を阻害又は排除し得る。アンタゴニストは例えば、ＰＣＩＧＦポリペプチドに結合することによってＰＣＩＧＦポリペプチドの活性を除去する抗ポリペプチド抗体でもよく、又は、幾つかの場合にはアンタゴニストがオリゴヌクレオチドでもよい。小分子インヒビターの非限定例は、小ペプチド又はペプチド様分子である。
【０１４８】
アンタゴニスト及びインヒビターは、生理的食塩水、緩衝生理的食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びその混用を非限定例とする医薬として許容される担体に組合せた組成物として使用され得る。ＰＣＩＧＦポリペプチドインヒビターは全身性投与で使用されるのが好ましい。本発明はまた、このようなポリペプチド複合体の作用を阻害する抗体を提供する。
【０１４９】
アンチセンス技術を用いて三重らせん形成又はアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより遺伝子発現を低減でき、その双方の方法はＤＮＡ又はＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づいている。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５‘コーディング部分を用いて１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補的であり、それによりＰＣＩＧＦポリペプチドの転写及び産生を防御するように設計される。三重らせんに関しては、例えばＬｅｅら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；及びＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１）を参照。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはｉｎ  ｖｉｖｏでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＰＣＩＧＦポリペプチドへの翻訳を遮断する。アンチセンスに関しては、例えばＯｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；及び「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ（１９８８）を参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、分子にヌクレオチド溶解性の切断に対する抵抗性を付与する人工的なヌクレオチド内結合を含むように修飾した場合、非常に効率よく作用する。このような人工的なヌクレオチド内結合には、非限定例としてはメチルホスホネート、ホスホロチオレート及びホスホロアミデートヌクレオチド内結合などがある。
【０１５０】
組換え技術
本発明は、本発明のＰＣＩＧＦポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞及び発現ベクターを提供し、並びにこれらによってコードされるポリペプチドの産生方法を提供する。このような方法は、ＰＣＩＧＦポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物からＰＣＩＧＦポリペプチドを回収することから成る。
【０１５１】
本発明はまた、本発明のＰＣＩＧＦポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターによって遺伝子操作された宿主細胞、並びに組換え技術による本発明のポリペプチドの産生を提供する。
【０１５２】
クローニングベクター又は発現ベクターから成るベクターによって宿主細胞を遺伝子操作（トランスフェクト、形質導入又は形質転換）する。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態でよい。操作した宿主細胞を、プロモーターを活性化し、トランスフェクト細胞を選択するか又はＰＣＩＧＦ遺伝子を増幅するように適宜改質した慣用の栄養培地で培養し得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、選択された発現用宿主細胞に従来から使用されている培養条件であり、平均的な当業者に明らかであろう。
【０１５３】
組換え技術によってポリペプチドを産生させるためにポリヌクレオチドを使用し得る。従って、ポリペプチドを発現させる多様な発現ビヒクル、特にベクター又はプラスミドのいずれかにポリヌクレオチド配列を含ませるとよい。このようなベクターとしては、染色体ＤＮＡ配列、染色体性ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡ、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び偽狂犬病ウイルスのようなウイルスＤＮＡとの組合せに由来するベクターがある。しかしながら、宿主体内で複製可能であり生存可能であるならば他の任意のプラスミド又はベクターを使用し得る。
【０１５４】
適当なＤＮＡ配列を多様な手順によってベクターに挿入し得る。一般に、当業者に公知の手順によってＤＮＡ配列を適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。このような手順及びその他の手順は当業者の知識の範囲内にあると考えてよい。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令する（１つ又は複数の）適当な発現コントロール配列（プロモーター）に機能的に連結されている。このようなプロモーターの非限定的代表例は、ＬＲＴ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐ、ラムダファージＰ  ｓｕｂ  Ｌプロモーター、並びに、原核細胞もしくは真核細胞もしくはそれらのウイルス中で遺伝子発現をコントロールすることが判明している他のプロモーターである。発現ベクターはまた、翻訳開始用リボソーム結合部位と転写ターミネーターとを含む。ベクターはまた、適当な発現増幅配列を含む。加えて発現ベクターは好ましくは、真核細胞培養物のジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性又は大腸菌のテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性のようなトランスフェクトされた宿主細胞を選択するための表現形質を与える遺伝子を含有する。
【０１５５】
上記のような適当なＤＮＡ配列と適当なプロモーター又はコントロール配列とを含有するベクターを適当な宿主にトランスフェクトし、宿主にタンパク質を発現させるために使用し得る。適当な宿主の代表例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｍｕｒｉｕｍ）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）のような細菌細胞；酵母のような菌類細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びＳｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ又はＢｏｗｅｓメラノーマのような動物細胞；植物細胞、などがある。適当な宿主の選択は本文中の教示から当業者が想到し得ると考えられる。
【０１５６】
より特定的には本発明はまた、上記に広義に定義された１つ又は複数の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、本発明の配列が順方向又は逆方向に挿入されたプラスミド又はウイルスベクターのようなベクターから成る。この実施態様の好ましい特徴は、構築物が更に、配列に作動的に連結された調節配列例えばプロモーターを含むことである。多数の適当なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり市販されている。以下のようなベクターを例示し得る。細菌性ベクター：ｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ），ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核性ベクター：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主体内で複製可能及び生存可能である限り、他の任意のプラスミド又はベクターを使用し得る。
【０１５７】
プラスミドｐＩＮＣＹは、ポリリンカー（多重クローニング部位）に２つの修飾を有している以外はプラスミドｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にほぼ一致する。これらの修飾は、（１）ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が欠失している、（２）ＥｃｏＲＩ制限部位が異なる位置に存在する、ことである。ｐＩＮＣＹは、ｐＳＰＯＲＴ１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで開裂し、ポリリンカーの切除フラグメントを合成ＤＮＡフラグメント（配列番号２−３）で置換することによってｐＳＰＯＲＴ１から作製される。この置換は平均的な当業者に公知の任意の方法で行われる。例えば、５’末端ホスフェートをもつ２つのヌクレオチド配列、即ち、配列２−３を合成的に作製し、一緒に混合し、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断されたｐＳＰＯＲＴ１プラスミドに、付着末端の結合が生じる標準条件下で結合させる。次に、適当な宿主細胞（例えば大腸菌ＤＨ５μ細胞）に結合ＤＮＡをトランスフェクトし、組換えクローンをアンピシリン耐性に基づいて選択する。次に、プラスミドＤＮＡを個々のクローンから調製し、制限酵素分析又はＤＮＡ配列決定を行って、適正方向の挿入配列の存在を確認する。平均的な当業者に公知の別のクローニング戦略も使用し得る。
【０１５８】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択可能マーカーをもつ他のベクターを使用して所望の任意の遺伝子から選択できる。２つの適当なベクターは、ｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７である。特定の名称の細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、ＳＰ６、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ  ｓｕｂ  Ｒ、Ｐ  ｓｕｂ  Ｌ及びｔｒｐである。真核性プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーター、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス及びマウスメタロチオネイン−Ｉに由来のＬＴＲがある。適当なベクター及びプロモーターの選択は平均的な当業者のレベルの十分に範囲内である。
【０１５９】
別の実施態様において本発明は、上記の構築物を含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、哺乳類細胞のような高等真核細胞でもよく、又は、酵母細胞のような下等真核細胞でもよく、あるいは、細菌細胞のような原核細胞でもよい。宿主細胞に構築物を導入するためには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション又は電気穿孔を使用し得る〔Ｌ．Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ，Ｐａｒａｍｏｕｎｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔ  Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）〕。
【０１６０】
宿主細胞中の構築物は組換え配列によってコードされた遺伝子産物を産生するために慣用の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは慣用のペプチドシンセサイザーによって合成的に製造し得る。
【０１６１】
組換えタンパク質は哺乳類細胞、酵母、細菌又はその他の細胞中で適正なプロモーターのコントロール下で発現され得る。また、ＤＮＡ構築物に由来のＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を産生させるために無細胞翻訳系を使用できる。原核性及び真核性の宿主と共に使用できる適当なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載されている。該文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０１６２】
高等真核細胞による（１つ又は複数の）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増進される。エンハンサーは、通常は約１０−３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素であり、転写を増進するようにプロモーターに作用する。その例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーがある。
【０１６３】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点と、宿主細胞にトランスフェクションさせ得る選択可能マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、酵母菌（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＲＰ１遺伝子と、高度に発現された遺伝子に由来し下流の構造配列の転写を指令するプロモーターとを含む。このようなプロモーターは特に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、アルファ因子、酸ホスファターゼ又は熱ショックタンパク質のような解糖酵素をコードするオペロンに由来し得る。ヘテロロガスな構造配列を翻訳開始配列、終止配列、及び、好ましくは翻訳されたタンパク質を細胞周辺腔又は細胞外培地に分泌するように指令し得るリーダー配列に適正フェーズで組立てる。ヘテロロガス配列は任意に、発現された組換え産物の安定化又は精製容易化のような所望の特性を与えるＮ−末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【０１６４】
細菌に使用し得る発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適当な翻訳開始シグナル及び終止シグナルと共に機能性プロモーターに対して作動可能な読取りフェーズで挿入することによって構築される。ベクターは１つ又は複数の表現型選択可能マーカーとベクターの維持を確保し所望の場合には宿主体内で増幅させる複製起点とを含むであろう。トランスフェクションに適当な原核性宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、及び、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属に含まれる様々な種であり、また、使用可能なその他の宿主も常法で選択できよう。
【０１６５】
細菌に使用される有用な発現ベクターは、選択可能マーカーと、公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子要素を含むプラスミドに由来の細菌複製起点とを含む。その他のベクターの非限定例は、ＰＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）である。これらのｐＢＲ３２２の“主鎖”セクションを適正プロモーター及び発現させるべき構造配列に組合せる。
【０１６６】
適当な宿主をトランスフェクションし宿主を適正な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば温度シフト又は化学的誘発）によって抑制解除し、細胞を追加期間培養する。細胞を、典型的には遠心によって収集し、物理的又は化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を取出して更に精製する。タンパク質の発現に使用された微生物細胞を、凍結−解凍の繰返し、音波処理、機械的破壊のような慣用の方法又は細胞溶解剤の使用によって破壊し得る。このような方法は平均的な当業者に公知である。
【０１６７】
種々の哺乳類細胞培養物もまた組換えタンパク質を発現させるために使用できる。哺乳類発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１）に記載されたサル腎臓線維芽細胞系ＣＯＳ−７、並びに、Ｃ１２７、ＨＥＫ−２９３、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系のような相溶性ベクターを発現し得るその他の細胞系である。哺乳類発現ベクターは、複製起点と適当なプロモーター及びエンハンサーとを含み、また必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスのドナー及びアクセプター部位、転写終了配列及び５’フランキング非転写配列を任意に含むであろう。例えばＳＶ４０ウイルスゲノム、例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位に由来のＤＮＡ配列を、必要な非翻訳遺伝子要素を提供するために使用し得る。有用なベクターの代表はｐＲｃ／ＣＭＶ及びｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）である。
【０１６８】
ポリペプチドを、アフィニティクロマトグラフィー、硫安アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又はレクチンクロマトグラフィーなどの公知の方法で組換え細胞培養物から回収し精製し得る。精製中に低濃度（約０．１−５ｍＭ）のカルシウムイオンを存在させるのが好ましい〔Ｐｒｉｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：９１７（１９６９）〕。ポリペプチドの配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を完成するために必要に応じてタンパク質の再生段階を使用し得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製段階として使用し得る。
【０１６９】
従って、本発明のポリペプチドは高発現細胞系から発現された天然精製産物でもよく、又は化学合成手順の生成物でもよく、又は原核性もしくは真核性の宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞の培養物）から組換え技術によって産生されてもよい。組換え産生手順に使用される宿主次第で、本発明のポリペプチドは哺乳類もしくはその他の真核生物の糖質によってグリコシル化されていてもよく又は非グリコシル化でもよい。本発明のポリペプチドはまた、開始アミノ酸としてメチオニン残基を含んでもよい。
【０１７０】
出発プラスミドは周知の手順に従い、有用なプラスミドから構築できる。さらに、ここに記載の同等のプラスミドは当分野で既知であり、当分野の通常の技術者には明らかである。
【０１７１】
以下はｃＤＮＡクローンを単離及び分析するための一般的な方法である。本発明に開示する特定の実施態様では、ｍＲＮＡを前立腺組織から単離し、ｃＤＮＡライブラリーの作製に使用する。外科的切除により患者から前立腺組織を入手し、病理学者により腫瘍又は非腫瘍組織として分類する。
【０１７２】
前立腺組織ライブラリーからランダムに単離したｃＤＮＡインサートを部分的にシークエンシングし、実施例に記載するように詳細に分析する。
【０１７３】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当該分野で公知である。慣用的な酵素法ではＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメント、セクエナーゼ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）又はＴａｑポリメラーゼを用いて目的のＤＮＡ鋳型にアニーリングしたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡ鎖を伸長する。一本鎖及び二本鎖の双方を使用するように方法を開発した。鎖終止反応産物を尿素／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、オートラジオグラフィー（放射性核標識前駆体に関して）又は蛍光（蛍光標識前駆体に関して）のいずれかにより検出できる。最近改善された、蛍光検出法を用いる機械化反応調製、シークエンシング及び分析では、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７７ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような機械を用いて１日あたりに判定できる配列数が拡大された。
【０１７４】
ヌクレオチド配列の読み枠を数種の分析により確認できる。第１に、コーディング配列内に含まれる読み枠を出発コドンＡＴＧ及び停止コドンＴＧＡ、ＴＡＡ又はＴＡＧの存在に関して分析できる。典型的には１つの読み枠がｃＤＮＡ配列の主要な部分に渡って続くが、別の読み枠は多数の停止コドンを含む傾向がある。このような場合、さらなる分析が必要とされる。
【０１７５】
各々の推定コドントリプレットにて個々のヌクレオチド塩基の存在を分析するためにアルゴリズムが作製された。例えば、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１０：５３０３（１９８２）を参照。特定の生物（最近、植物及び動物）のコーディング配列は特定のトリプレット周期内に特定のヌクレオチドを含む傾向があり、例えば第３コドン位置ではピリミジンに対する偏好性が著明である。これらの偏好性は、規定のＤＮＡ伸長のコーディングの可能性（及びフレーム）を判定するのに用いることができる広く入手可能なソフトウェアに組み込まれている。出発／停止コドン情報と組み合わせたアルゴリズム誘導情報を用いて、高い確実性で適切なフレームを判定できる。今度はこれにより正確な読み枠で適当な発現ベクターに配列をクローニングすることが可能になる。
【０１７６】
十分に確立されたＤＮＡ組換え技術により、本発明で開示された核酸配列を種々のその他のポリヌクレオチド配列及び目的のベクターに結合できる。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照。目的のベクターはクローニングベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ誘導体、ファゲミド、並びにシークエンシング、複製及び発現ベクター等がある。一般にこのようなベクターは少なくとも１つの生物において機能する複製起点、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ消化部位及び特定の宿主細胞に適した選別可能なマーカーを含む。当業者に公知の種々手段により、次いで望ましいＤＮＡ、ＲＮＡ又はポリペプチドを産生する適切な宿主細胞にベクターを移すことができる。
【０１７７】
時折シークエンシング又はランダム逆転写エラーが適切なオープン・リーディング・フレーム又は制御エレメントの存在を遮蔽する。このような場合、ポリペプチドの発現を試み、標準的なペプチドマッピング及びシークエンシング技術によりアミノ酸配列を決定することにより、正確な読み枠を決定することが可能である。Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）を参照。さらに、規定のヌクレオチド配列の実際の読み枠を３つの可能な読み枠すべてを含有するベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることにより決定できる。正確な読み枠でヌクレオチド配列を有するこれらの細胞のみが予想される長さのペプチドを産生する。
【０１７８】
本発明にて提供されるヌクレオチド配列は現在の最先端技術の自動化法により調製され、このように未同定ヌクレオチドを含み得る。これらは本発明を実行することを希望する当業者にとって問題ではない。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）に報告された標準的な組換え技術又はそれを定期的に更新した技術を用いるいくつかの方法を使用して喪失された配列情報を完全にできる。本明細書に記載される、全長配列を得るために用いられる同一の技術を用いてヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１７９】
ｃＤＮＡを適当な発現ベクターにサブクローニングし、このベクターを適当な発現宿主にトランスフェクトすることにより特定のｃＤＮＡを発現させることができる。前立腺組織ｃＤＮＡライブラリーを作製するために用いられるクローニングベクターを用いて特定のｃＤＮＡのｍＲＮＡを転写でき、該ベクターはβガラクトシダーゼのプロモーター、アミノ末端Ｍｅｔ及びそれに続くβガラクトシダーゼの７個のアミノ酸残基を含有する。これらにすぐ続く８個の残基が人工的なプライミング及び転写に有用な操作されたバクテリオファージプロモーター、並びにＥｃｏＲＩなどのクローニングのための多数の固有の制限部位である。ベクターを適当な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の宿主株にトランスフェクトできる。
【０１８０】
標準的な方法を用いて単離された細菌の株をイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、βガラクトシダーゼの第１の７個の残基、リンカーの約１５個の残基及びｃＤＮＡ内でコードされたペプチドを含有する融合タンパク質を産生する。ｃＤＮＡクローンインサートを本質的にランダムな方法により作製するので、含まれるｃＤＮＡが適切に翻訳されるために正確な枠内に位置するチャンスは３回に１回である。ＤＮＡが適切なリーディングフレームにない場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発、エクソヌクレアーゼＩＩＩもしくは緑豆ヌクレアーゼによる消化又はオリゴヌクレオチドリンカーの包含などの公知の方法により、適当な数の塩基を欠失又は挿入することにより正確な枠を得ることができる。
【０１８１】
ｃＤＮＡを特定宿主体内でタンパク質を発現させるために有用な別の既知のベクターにシャトルさせてもよい。ターゲットｃＤＮＡの両端の直鎖（ｓｔｒｅｔｃｈ）にハイブリダイズする十分なクローニング部位とＤＮＡセグメントとを含むオリゴヌクレオチドプライマーは標準方法で化学合成できる。次にこれらのプライマーを使用して所望の遺伝子セグメントをＰＣＲ増幅させる。得られた新しい遺伝子セグメントを標準条件下で適正な制限酵素で消化し、ゲル電気泳動で単離する。あるいは、同様の遺伝子セグメントを産生するために、ｃＤＮＡを適正な制限酵素で消化し、欠失した遺伝子セグメントを化学合成オリゴヌクレオチドで充填してもよい。２つ以上の遺伝子に由来のコーディング配列のセグメントを互いに結合し、組換え配列を最適に発現できる適正なベクターにクローニングし得る。
【０１８２】
このようなキメラ分子に適した発現宿主の非限定例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞のような哺乳類細胞、Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞、大腸菌のような細菌である。これらの細胞系の各々に対して有用な発現ベクターも、細菌中の増殖を可能にする複製起点と、細菌中の選択を可能にするベータ−ラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子のような選択可能マーカーとを含むであろう。更にベクターは、トランスフェクトされた真核宿主細胞中の選択を可能にするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような第二の選択可能マーカーを含み得る。問題の配列にポリＡが欠失しているときは、真核発現宿主に使用するベクターに３’ポリＡテールを付加することが必要であろう。
【０１８３】
ベクターは更に、遺伝子発現を増進させるプロモーター又はエンハンサーを含有し得る。このようなプロモーターは宿主特異的であり、その非限定例は、ＣＨＯ細胞用のＭＭＴＶ、ＳＶ４０又はメタロチオニンプロモーター；細菌宿主用のｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ又はＴ７プロモーター；酵母用のアルファ因子、アルコールオキシダーゼ又はＰＧＨプロモーターである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを任意に有するアデノウイルスベクターは哺乳類細胞系のおけるタンパク質発現を誘発するために使用され得る。組換え細胞の均質培養物が得られると、大量の組換え産生タンパク質をならし培地から回収し、当業界で公知のクロマトグラフィー方法を用いて分析する。大量の分泌タンパク質を産生させる代替方法では、哺乳動物胚をトランスフェクションし、トランスジェニック雌牛、ヤギ、ヒツジなどの産乳から組換えタンパク質を回収する。ポリペプチド及び近縁分子はタンパク質を容易に精製できるような方法で組換え発現され得る。１つの方法では、ヒトのポリペプチドに天然には存在しない１つ又は複数の追加のポリペプチドドメインを含むキメラタンパク質を発現させる。精製を容易にするこのようなドメインの非限定例は、固定金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンドメインのような金属キレート化ペプチド、固定免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）に使用されるドメインである。Ｆａｃｔｏｒ  ＸＡ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のエンテロキナーゼのような開裂可能なリンカー配列をポリペプチド配列と精製ドメインとの間に混在させることもポリペプチドの回収に役立つであろう。
【０１８４】
イムノアッセイ：
そのフラグメント、誘導体、類似体を含むＰＣＩＧＦポリペプチド又は、そのようなポリペプチドを発現する細胞などは種々のアッセイに使用し得る。前立腺組織に対する抗体を検出するための多くのアッセイが本文中に記載されている。これらのポリペプチドはまた、抗体を産生させるために免疫原として使用できる。これらの抗体は例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、又は、Ｆａｂ発現ライブラリーの産物である。当業界で公知の種々の手順をこのような抗体及びフラグメントの産生に使用し得る。
【０１８５】
例えば本発明の配列を含んでなるポリペプチドに対して産生される抗体は、ポリペプチドをマウス、ウサギ、ヤギ又はヒトのような動物に直接注入するか又はポリペプチドを動物に投与することによって得ることができる。マウス、ウサギ又はヤギが好ましい。ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択される。このように得られた抗体はポリペプチド自体に結合する。このように、ポリペプチドのフラグメントだけをコードする配列を使用して、天然型（ｎａｔｉｖｅ）ポリペプチドに結合する抗体を産生させ得る。このような抗体を次に、該多量体ポリペプチドを含むと疑われる組織のような被検サンプルからポリペプチドを単離するために使用できる。モノクローナル抗体を調製する場合には、連続細胞系培養物によって産生される抗体を供給する任意の技術を使用できる。例としては、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）により記載されるようなハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８８３）により記載されるようなヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術、Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．７７−９６（１９８５）により記載されるようなヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある。一本鎖抗体を産生するために記載された技術を、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する一本鎖抗体の産生に応用できる。例えば、米国特許第４９４６７７８号参照。該特許の記載内容は出展明示により本明細書の一部とする。
【０１８６】
「サンドイッチ」イムノアッセイ及びプローブアッセイなどの種々のアッセイフォーマットで本発明の抗体を使用し得る。例えば、被検サンプル中にＰＣＩＧＦ抗原が存在するならば該抗原の存在を判定し得る種々のアッセイ系で本発明の抗体又はそのフラグメントを使用し得る。例えば、第１のアッセイフォーマットでは、固相にコーティングしておいたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体もしくはそのフラグメント又はこれらの抗体の組合せを被検サンプルに接触させて第１混合物を形成する。この第１混合物を抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートする。次いで、シグナル発生化合物を付着させたモノクローナルもしくはポリクローナル抗体もしくはそのフラグメント又はこれらの抗体の組合せから成る指示薬を抗原／抗体複合体に接触させて第２混合物を形成する。この第２混合物を次に、抗体／抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートする。被検サンプル中に固相に捕獲されたＰＣＩＧＦ抗原が存在するならば、シグナル発生化合物によって発生された測定可能なシグナルを検出することによって該抗原の存在が判定される。被検サンプル中に存在するＰＣＩＧＦ抗原の量は発生シグナルに比例する。
【０１８７】
代替的アッセイフォーマットにおいては、（１）ＰＣＩＧＦ抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、又は、固体支持体に結合したこのような抗体の組合せと；（２）被検サンプルと；及び（３）シグナル発生化合物を付着させた異なるＰＣＩＧＦ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はそのフラグメント（又はこれらの抗体の組み合わせ）から成る指示薬と；を接触させることにより混合物を形成する。この混合物を抗体／抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートする。被検サンプル中に存在し固相に捕獲されたＰＣＩＧＦ抗原が存在するならば、その存在をシグナル発生化合物によって発生された測定可能なシグナルを検出することによって判定する。被検サンプル中に存在するＰＣＩＧＦ抗原の量は発生シグナルに比例する。
【０１８８】
別のアッセイフォーマットでは、本明細書の少なくとも２つのモノクローナル抗体の１つ又は組み合わせをＰＣＩＧＦ抗原に対する抗体を検出するための競合プローブとして用いることができる。例えば本発明に開示する組換え抗原のようなＰＣＩＧＦポリペプチドを単独で、又は組み合わせて固相をコーティングする。次いでＰＣＩＧＦ抗原に対する抗体を含有する疑いのある被験サンプルをシグナル発生化合物を含んでなる指示薬及び少なくとも１つの本発明の抗体と、被験サンプル及び固相に結合した指示薬又は固相に結合した指示薬のいずれかの抗原／抗体複合体を形成するのに十分な条件下で十分な時間インキュベートする。固相に対するモノクローナル抗体の結合の低下を定量的に測定できる。
【０１８９】
また別の検出方法では、本発明のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の各々を、免疫組織化学分析によって組織切片中及び細胞中のＰＣＩＧＦ抗原を検出するために使用し得る。組織切片を組織の凍結サンプル又は化学的に固定したサンプルから作製する。細胞内の抗原を検出する場合には、細胞を血液、尿、前立腺組織吸引液又はその他の体液から単離し得る。細胞は外科的又は穿刺による生検から得られる。本発明の抗体で染色すべき細胞の特定画分を富化するために磁気粒子又はフェロ流体で標識した後で、細胞を遠心又は磁気吸引によって単離し得る。疾患の組織病理学を追跡するためにこれらの抗体を直接標識するか（例えば、フルオレセイン、コロイド金、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどによって標識）、又は、第２の標識抗−種抗体（本文中に例示の種々の標識）を使用して標識する細胞化学分析も本発明の範囲に包含される。
【０１９０】
さらに、これらのモノクローナル抗体をＣＮＢｒ−活性化セファロースに類似のマトリックスに結合させると、例えば組換えタンパク質及び天然型タンパク質を精製するなどの目的で細胞培養物又は生物組織から特異的ＰＣＩＧＦポリペプチドをアフィニティ精製するために使用できる。
【０１９１】
本発明のモノクローナル抗体はまた、治療目的又は他の同様の用途のキメラ抗体の製造に使用され得る。
【０１９２】
モノクローナル抗体又はそのフラグメントはＰＣＩＧＦ抗原を検出するために個別に提供され得る。本発明で提供されるモノクローナル抗体（及びそのフラグメント）は、本発明の少なくとも１つのＰＣＩＧＦ抗体が別のＰＣＩＧＦ領域に特異的に結合する抗体と共に存在し、各抗体が異なる結合特異性を有しているような混合物即ち「カクテル」の成分として組合せ使用してもよい。従ってこのカクテルは、本明細書に開示されたＰＣＩＧＦポリペプチドに指向する本発明のモノクローナル抗体、及び、ＰＣＩＧＦ抗原又は別の近縁タンパク質の別の抗原決定基に特異的な別のモノクローナル抗体を含むであろう。
【０１９３】
アッセイフォーマットに使用できるポリクローナル抗体又はそのフラグメントは、アッセイに付加的に使用されるＰＣＩＧＦポリペプチド又はその他のＰＣＩＧＦポリペプチドに特異的に結合しなければならない。使用されるポリクローナル抗体は好ましくは、ＰＣＩＧＦポリペプチドに結合するヒト、ヤギ、ウサギ又はヒツジのポリクローナル抗体のような哺乳類起原の抗体である。最も好ましくは、ポリクローナル抗体はウサギ起原の抗体である。アッセイに使用されるポリクローナル抗体は単独で使用されてもよく、又は、ポリクローナル抗体のカクテルとして使用されてもよい。アッセイフォーマットに使用されるカクテルはＰＣＩＧＦポリペプチドに対して異なる結合特異性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれかから成るので、これらのカクテルは、前立腺癌のような前立腺疾患又は状態の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影、予防もしくは処置、又は疾病素質の決定に有用である。
【０１９４】
また、組換え抗原を使用するアッセイ、及びＰＣＩＧＦのアミノ酸配列を含む合成ペプチド又は精製ペプチドを使用するアッセイで、ＰＣＩＧＦ抗原を検出することも本発明の範囲内で考えられる。このようなポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそのフラグメントから成る群から選択される。本発明の範囲内ではまた、ＰＣＩＧＦの種々のエピトープを認識する種々の合成ペプチド、組換えペプチド又は精製ペプチドの組合せを、前立腺癌のような前立腺疾患及び状態の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影、予防もしくは処置、又は疾病素質の判定を行うアッセイに使用できる。この場合、これらのペプチドの全部を１つの固相にコーティングしてもよいか；あるいは、個別のペプチドの各々を微粒子のような個別の固相にコーティングし、次いで組合せてペプチドの混合物を形成し、その後のアッセイに使用してもよい。さらに、種々の抗原のエピトープを規定する多数のペプチドを、前立腺癌のような前立腺疾患及び状態の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影、予防、もしくは処置、又は疾病素質の判定に使用できると考えられる。固相にコーティングされたか又は検出可能な標識で標識されたペプチドを限定量の抗体に対して患者サンプル中に存在する（かもしれない）ペプチドと競合させる。（１つ又は複数の）抗体に対する合成ペプチド、組換えペプチド又は精製ペプチドの結合の減少が患者サンプル中の多量体ポリペプチド抗原の存在の指標となる。ＰＣＩＧＦ抗原の存在は患者体内の前立腺組織疾患、特に前立腺癌の存在の指標となる。アッセイフォーマットの変形は平均的な当業者に公知であり、その多くを以下に記載する。
【０１９５】
別のアッセイフォーマットでは、抗−ＰＣＩＧＦ抗体及び／又は多量体ポリペプチド抗原の存在を以下のような同時アッセイで検出できる。被検サンプルを第一分析物の捕獲試薬と第二分析物の捕獲試薬とに同時に接触させて混合物を形成する。第一分析物の捕獲試薬は、固相に付着させた第一分析物に特異的な第一結合要素を含み、第二分析物の捕獲試薬は第二固相に付着させた第二分析物に対する第一結合要素を含む。この混合物を、捕獲試薬／第一分析物及び捕獲試薬／第二分析物の複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートする。このようにして形成された複合体を、シグナル発生化合物で標識した第一分析物に特異的な結合対の１つの要素を含む指示薬と、シグナル発生化合物で標識した第二分析物に特異的な結合対の１つの要素を含む指示薬とに接触させて、第二混合物を形成する。この第二混合物を、捕獲試薬／第一分析物／指示薬複合体及び捕獲試薬／第二分析物／指示薬複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートする。一方又は双方の固相に形成された複合体に関して発生されたシグナルを検出することによって１種又は複数の分析物の存在を判定し、被検サンプル中の１種又は複数の分析物の存在の指標とする。このアッセイフォーマットでは、本発明で開示された発現系に由来する組換え抗原を使用でき、また、本発明で開示された発現系に由来のタンパク質から産生されたモノクローナル抗体を使用できる。例えばこのアッセイ系では多量体ポリペプチド抗原が第一分析物である。このようなアッセイ系は欧州特許公開０４７３０６５により詳細に記載されている。
【０１９６】
また別のアッセイフォーマットでは、本発明で開示されたポリペプチドを、被検サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原に対する抗体の存在を検出するために使用し得る。例えば、被検サンプルを、組換えタンパク質又は合成ペプチドのような少なくとも１つのポリペプチドを付着させておいた固相と共にインキュベートする。ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びそれらのフラグメントから成る群から選択される。これらを抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間反応させる。インキュベーション後、抗原／抗体複合体を検出する。選択したアッセイ系次第で、検出を容易にする指示薬も使用し得る。別のアッセイフォーマットでは、被検サンプルを、本発明に記載のごとく産生させた組換えタンパク質を付着させた固相に接触させ、また、好ましくは指示薬で標識しておいたタンパク質特異的モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体に接触させる。抗体／抗原複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベーション後、固相を遊離相から分離し、固相中又は遊離相中のラベルを検出して、多量体ポリペプチド抗原に対する抗体の存在の指標とする。本発明で開示された組換え抗原を使用する別のアッセイフォーマットも考えられる。これらのアッセイフォーマットは、被検サンプルを、第一ソースに由来の少なくとも１つの抗原を付着させた固相に接触させ、固相と被検サンプルとを抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートし、次いで第一ソースとは異なる第二ソースに由来の標識抗原に固相を接触させる。例えば、大腸菌のような第一ソースに由来の組換えタンパク質を固相上の捕獲抗原として使用し、このように調製した固相に被検サンプルを添加し、望ましい又は必要な標準インキュベーション及び洗浄段階後に、異なるソース（即ち、非大腸菌）に由来の組換えタンパク質を、後で検出される指示薬の一部として使用する。同様に、固相上の組換え抗原と指示薬相中の合成ペプチドとの組合せも可能である。第一ソースから産生また誘導されるＰＣＩＧＦに特異的な抗原を捕獲抗原として使用し、かつ、異なる第二ソースに由来のＰＣＩＧＦに特異的な抗原を使用するアッセイフォーマットも考えられる。従って、組換え抗原の種々の組合せ、合成ペプチド、精製タンパク質の使用、などは本発明の範囲内である。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、共有米国特許第５，２５４，４５８号に記載されている。該特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０１９７】
その他の種々の固相を使用する別の実施態様も考えられ、本発明の範囲に包含される。例えば、固定化可能な反応複合体を負荷電ポリマーで固定化するイオン捕獲手順（欧州特許公開ＥＰ０３２６１００及びＥＰ０４０６４７３に記載）を本発明に従って使用し、高速溶液相免疫化学反応を惹起し得る。負荷電ポリマー／免疫複合体と予め処理した正荷電多孔質マトリックスとの間のイオン相互作用によって、固定化可能な免疫複合体を反応混合物の残りから分離し、先行文献に記載された種々のシグナル発生系を使用することによって検出する。このような系として例えば、公開されたＥＰＯ出願であるＥＰ０２７３１１５に記載のような化学発光シグナル測定に記載された系がある。
【０１９８】
本発明方法はまた、マイクロ粒子（磁性又は非磁性）を固相とする全自動又は半自動の系を含むマイクロ粒子技術を使用する系に応用できる。このような系は、例えば、ＥＰＯ出願公開ＥＰ０４２５６３３及びＥＰ０４２４６３４に記載されている。
【０１９９】
イムノアッセイ用走査型プロープ顕微鏡法（ＳＰＭ）の使用も本発明のモノクローナル抗体を容易に応用できる技術である。走査型プロープ顕微鏡法、特に原子力顕微鏡法では、捕獲相、例えば本発明のモノクローナル抗体の少なくとも１つを固相に付着させ、走査型プロープ顕微鏡を使用して、固相の表面に存在するならば抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネリング顕微鏡法を使用するならば、多くのイムノアッセイ系が抗原／抗体複合体を検出するために通常は必要とするラベルの使用が不要になる。特異的結合反応をモニターするためにＳＰＭを種々の方法で使用し得る。１つの実施態様では、特異的結合パートナーの一方の要素（本発明のモノクローナル抗体である分析物特異的物質）を走査に適した表面に付着させる。分析物特異的物質の付着は、平均的な当業者に公知の方法に従って、プラスチック又は金属表面の固相から成る試験ピースに吸着させることによって行う。又は、誘導プラスチック、金属、シリコンまたガラスの固相から成る試験ピースに特異的結合パートナー（分析物特異的物質）を共有結合によって付着させる方法を使用してもよい。共有結合による付着方法は当業者に公知であり、特異的結合パートナーを試験ピースに不可逆的に結合させる多様な手段が存在する。試験ピースがシリコン又はガラスの場合、特異的結合パートナーを付着させる前に表面を活性化しなければならない。また、技術及び化学を使用することによって試験ピースの表面に特異的結合パートナーを固定化するために高分子電解質相互作用を使用してもよい。好ましい付着方法は共有結合である。特異的結合要素を付着させた後、非特異的結合を最小に抑制するために表面を血清、タンパク質又はその他のブロッキング剤のような物質で更に処理してもよい。また、アッセイ目的に対する適性を確認するために製造現場又は使用時点で表面を走査してもよい。走査プロセスが試験ピースの特異的結合特性を変質させるとは考えられない。
【０２００】
本発明は固相の使用が好ましいことを開示したが、本発明の抗体、タンパク質及びペプチドのような試薬は非固相のアッセイ系にも使用し得る。これらのアッセイ系は当業者に公知であり、本発明の範囲に包含される。
【０２０１】
アッセイに使用される試薬を、バイアル又は瓶のような１つ又は複数の容器を含む検査キットの形態で提供することも考えられる。各容器が、アッセイに使用されるプローブ、プライマー、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体カクテル又はポリペプチド（例えば、組換え的に、合成的に産生又は精製されたもの）のような個別の試薬を収容している。ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらのフラグメントから成る群から選択される。バッファ、対照、などのような平均的な当業者に公知の他の成分をこのような検査キットに含ませてもよい。また、採取可能な体液又は老廃物、例えば血液、尿、唾液及び糞便のような被検サンプルを採取する手段を含む検査キットを提供することも考えられる。このような採取用ツール（“採取材料”）としては、血液を採取し安定させるランセット及び吸取り紙又は布；唾液を採取し安定させるスワブ；尿又は糞便サンプルを採取し安定させるコップがある。採取材料、紙、布、スワブ、コップなどはサンプルを変質させたり又は不可逆的に吸着したりしないように任意に処理してもよい。また、標本の完全性を維持する助けになるように、保存剤、安定剤又は抗菌剤で採取材料を処理するか又はこれらを採取材料に含有させてもよい。手術又は針生検によって得られた被検標本を収集、安定化及び保存するように設計された検査キットも有用である。全部のキットを、別々に提供され得る２つの部品から構成し、一方の部品が標本の採取及び運搬、他方の部品が標本の分析に使用されるようにしてもよい。例えば、採取用部品は一般ユーザーに市販され、分析用部品は分析物の有無又は量を判定する試験所の技師のような一般ユーザー以外に提供される。更に、素人が使用するように設計された被検標本の採取、安定化及び保存用キットが在宅使用向けに市販され、在宅使用後に被検サンプル分析研究所に送付されてもよい。
【０２０２】
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用
本発明の抗体はｉｎ  ｖｉｖｏで使用できる。即ち、前立腺疾患が疑われるか又は前立腺疾患に罹患した患者の体内に診断目的又は治療目的で注入され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ診断のために抗体を使用することは当業界で公知である。Ｓｕｍｅｒｄｏｎら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ  １７：２４７−２５４（１９９０）は、インジウム−ＩＩＩをラベルとして使用して癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現している腫瘍のラジオイムノシンチグラフィック造影に最適な抗体−キレート剤を記載している。Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃ  ９：６３１−６４０（１９９１）は、再発結腸直腸癌が疑われる患者の腫瘍を検出するためにこの薬剤を使用することを記載している。磁気共鳴造影用ラベルとして常磁性イオンと共に同様の薬剤を使用することは当業界で公知である（Ｒ．Ｂ．Ｌａｕｆｆｅｒ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２：３３９−３４２（１９９１）。ＰＣＩＧＦ抗原に対する抗体は、患者の病状診断また病期判定の目的で前立腺癌のような前立腺疾患の疑いのある患者に注入できると期待できる。使用されるラベルは選択された造影方法に依存する。平面走査又は単一光子放出演算トモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）にはインジウム−ＩＩＩ、テクネチウム−９９ｍ、又はヨウ素−１３１のような放射性ラベルを使用できる。また、フッ素−１９のようなポジトロン放出ラベルはポジトロン放出トモグラフィー（ＰＥＴ）に使用できる。ＭＲＩには、ガドリニウム（ＩＩＩ）又はマンガン（ＩＩ）のような常磁性イオンを使用できる。前立腺内又は前立腺外のラベルの所在から、疾患の拡がりを判断できる。前立腺内のラベルの量から前立腺癌の有無を判断できる。
【０２０３】
前立腺疾患に罹っていることが判明している患者の場合、ＰＣＩＧＦ抗原に対する抗体の注入は治療効果を有するであろう。抗体は組織又は器官の上又は中で発現されたＰＣＩＧＦ抗原に結合することによって付着物質を使用しないで効果を発揮し得る。あるいは、治療効果を増強するために抗体を薬物、毒素又は放射性核種のような細胞障害性物質に結合させてもよい。Ｇａｒｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４６：２４０７−２４１２（１９８６）は、薬物−モノクローナル抗体コンジュゲートの調製を記載した。Ｐａｓｔａｎら，Ｃｅｌｌ  ４７：６４１−６４８（１９８６）は、種々の癌を治療するためにモノクローナル抗体にコンジュゲートされた毒素の使用を記載した。Ｇｏｏｄｗｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ８０：２６７５−２６８０（１９９７）は、正常組織の毒性を抑制しながら腫瘍に対する投与量を最大にする種々の戦略でイットリウム−９０標識モノクローナル抗体を使用することを記載した。その他の公知の細胞障害性放射性核種は、銅−６７、ヨウ素−１３１及びレニウム−１８６である。これらはすべて、前立腺癌治療用ＰＣＩＧＦ抗原に対するモノクローナル抗体を標識するために使用できる。
【０２０４】
本発明の実施例を以下に示す。これらの実施例は本発明の範囲を代表するが本発明の範囲を限定しない。
【０２０５】
実施例
実施例１：前立腺組織ライブラリーＰＣＩＧＦ遺伝子特異的クローンの同定
発現配列タグ（ＥＳＴ）又は転写造影のライブラリー比較
ｃＤＮＡクローンインサートの部分配列、いわゆる“発現配列タグ”（ＥＳＴ）を、前立腺腫瘍組織、前立腺非腫瘍組織並びに腫瘍及び非腫瘍の多数の別の組織から作製されたｃＤＮＡライブラリーから入手し、データベース（ＬＩＦＥＳＥＱＴＭデータベース、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に遺伝子転写物イメージとして入力した。国際公開ＷＯ９５／２０６８１参照。（転写物イメージは、所与の組織ライブラリーに示されている遺伝子の各々に関するＥＳＴの番号表である。相互配列オーバーラップのＥＳＴ共有領域をクラスターに分類する。代表５’ＥＳＴからクラスターにクローン番号を割当てる。しばしば、考察中のクラスターのコンセンサス配列を全自動クラスター化基準に適合しなかった別のＥＳＴの配列に比較することによって該クラスターを延長し得る。得られたクラスターの全部と単独ＥＳＴとを位置合せすることによって、コンセンサス配列のもとになるｃｏｎｔｉｇが得られる。）次いで、転写物イメージを評価して、乳組織ライブラリーの主要な代表ＥＳＴ配列を同定した。これらのターゲットクローンを次に、ターゲットライブラリー中の数度（出現数）及びバックグラウンドライブラリー中の非存在に従ってランク付けした。クローンのバックグラウンド出現数が少なく数度が高いほど、高い研究優先度をクローンに与えた。ヌクレオチド１〜５３８間のＰＣＩＧＦの５‘領域（配列番号１、又はそのフラグメント）に対応するＥＳＴが前立腺癌ライブラリーの５３．８％（１７のうち１０）に、及び前立腺非癌組織ライブラリー（正常及び良性前立腺肥大）の４０％（２０のうち８）に見出された。対称的に、ヌクレオチド６２９〜１２０１間のＰＣＩＧＦの３’領域（配列番号１、又はそのフラグメント）に対応するＥＳＴが前立腺癌の４１．１％（１７のうち７）に、及び前立腺非癌組織ライブラリー（正常及び良性前立腺肥大）の１０％（２０のうち２）に見出された。
【０２０６】
実施例２：ＰＣＩＧＦ  ＥＳＴ特異的クローンのシークエンシング
公知の方法に従って、色素ターミネーターを用いるジデオキシ終止シークエンシングを用いて、ＰＣＩＧＦ遺伝子コンティグの最上流及び最下流のＥＳＴを含んでなるクローンのＤＮＡ配列を決定する（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ７４：５４６３（１９７７））。
【０２０７】
ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及びｐＩＮＣＹ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡより入手可能）のようなベクターはインサートの３’及び５’ライゲーション接合部にちょうど隣接してユニバーサルプライミング部位を含むので、ユニバーサルプライマー、配列番号４及び配列番号５（各々、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ．）を用いて両方向にインサートをシークエンシングする。シークエンシング反応物をポリアクリルアミド変成ゲルに流し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ．より入手可能）又はその他のシークエンシング装置により配列を決定する。
【０２０８】
実施例３：核酸
Ａ．組織からのＲＮＡ抽出
前立腺組織及び前立腺以外の組織から全ＲＮＡを単離する。非限定例としてはＫａｔｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：２１８２−２１９１（１９８７））により報告されている塩化リチウム／尿素技術及びＴＲＩｚｏｌ（商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）などの種々の方法を利用する。
【０２０９】
簡単には、組織を滅菌コニカルチューブ中氷上に置き、３Ｍ  ＬｉＣｌ  １０〜１５容量、６Ｍ  尿素、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  β−メルカプトエタノール、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加える。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を用いて氷上で３０〜５０秒間組織をホモジナイズする。溶液を１５ｍｌプラスティック遠心管に移し、−２０℃で一晩放置する。チューブを０〜４℃、９０００ｘｇで９０分間遠心し、上澄を即座にデカンテーションする。３Ｍ  ＬｉＣｌ  １０ｍｌを加え、チューブを５秒間振盪する。チューブを０〜４℃、１１０００ｘｇで４５分間遠心する。デカンテーション、ＬｉＣｌ中に再懸濁及び遠心を繰り返し、最終的なペレットを空気乾燥し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）  ２ｍｌ中に懸濁する。プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）  ２０μｌを加え、溶液を時々混和しながら３７℃で３０分間インキュベートする。３Ｍ  ＮａＣｌの１／１０容量を加え、溶液を振盪した後フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）  ２ｍｌを収容する別のチューブに移す。チューブを１〜３秒間振盪し、１０℃、３０００ｘｇで２０分間遠心する。ＰＣＩ抽出を繰り返し、続いてクロロホルム／イソアミルアルコール（ＣＩ）２回類似の抽出を行う。最終的な水溶液を予め冷却した、無水エタノール６ｍｌを収容する１５ｍｌ  コレックスガラスチューブに移し、チューブをパラフィンで覆い、−２０℃で一晩放置する。チューブを０〜４℃、１００００ｘｇで３０分間遠心し、即座にエタノール上澄をデカンテーションする。ＲＮＡペレットを７５％  氷冷エタノール  １０ｍｌで４回洗浄し、室温で１５分間空気乾燥する。ＲＮＡを１０ｍＭ  ＴＥ（ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）０．５ｍｌに懸濁し、分光測光によりその濃度を決定する。ＲＮＡサンプルを等分し、エタノール沈殿として−７０℃で保存する。
【０２１０】
アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡの品質を決定し（実施例５、ノーザンブロット分析を参照）、０．５μｇ／ｍｌ  臭化エチジウムで１時間染色する。完全なｒＲＮＡを含有しないＲＮＡサンプルを該実験より排除する。
【０２１１】
また別に、ＲＴ−ＰＣＲ分析に関しては、ウルトラスペックＲＮＡ試薬  １ｍｌを２．０ｍｌポリプロピレンマイクロフュッジ管に収容された微粉状組織１２０ｍｇを加え、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を用いて５０秒間ホモジナイズし、氷上で５分間放置する。次いでクロロホルム０．２ｍｌを各サンプルに加え、続いて１５秒間振盪する。サンプルをさらに５分間氷上に放置し、続いて４℃、１２０００ｘｇで１５分間遠心する。上層を回収し、別のＲＮアーゼ不含の２．０ｍｌマイクロフュッジ管に移す。等容量のイソプロパノールを各サンプルに加え、溶液を氷上で１０分間放置する。サンプルを４℃、１２０００ｘｇで１０分間遠心し、上澄をデカンデーションする。残りのペレットを冷７５％エタノールで２回洗浄し、振盪して再懸濁し、次いで再懸濁した物質を４℃、７５００ｘｇで５分間遠心してペレット状にする。最終的に、ＲＮＡペレットをＳｐｅｅｄｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）中５分間乾燥し、ＲＮアーゼ不含水中で再構成する。
【０２１２】
Ｂ．血液単核細胞からのＲＮＡ抽出
以下のようにＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用いて、遠心により患者の血液サンプルから単核細胞を単離する。全血１０ｍｌ容量を等容量のＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）と混合する。次いでこの混合物をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）１０ｍｌの下に積層し、２００ｘｇで３０分間遠心する。単核細胞を含むバッフィーコートを取り出し、ダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で５０ｍｌに希釈し、混合物を２００ｘｇで１０分間遠心する。２回洗浄した後、得られたペレットをダルベッコＰＢＳに再懸濁し、最終容量を１ｍｌにする。
【０２１３】
Ｎ．Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：２１８２−２１９１（１９８７）により報告されるように、単離された単核細胞からＲＮＡをを調製する。簡単には、ペレット状の単核細胞を最終容量１ｍｌにし、ＰＢＳ  ２５０μｌに再懸濁し、３Ｍ  ＬｉＣｌ、６Ｍ  尿素、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２．５ｍｌと混合する。得られた混合物をホモジナイズし、−２０℃で一晩インキュベートする。ホモジネートをＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１Ｍローター中０〜４℃、１００００ｒｐｍで４５分間遠心する。次いで再懸濁工程及びペレット形成工程を繰り返す。ペレットを１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５）２ｍｌに再懸濁し、プロテイナーゼＫ  ４００μｇと共に振盪し、次いで攪拌しながら３７℃で３０分間インキュベートする。次いで３Ｍ  ＮａＣｌの１／１０容量を加え、混合物を振盪する。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）で２サイクル抽出し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコール（ＣＩ）で１回抽出してタンパク質を除去する。無水エタノール６ｍｌを添加することによりＲＮＡを沈殿させ、続いて−２０℃で一晩インキュベートする。沈殿したＲＮＡを遠心により回収した後、７５％  エタノールで４回ペレットを洗浄する。次いでペレット状にしたＲＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する溶液に溶解する。
【０２１４】
前立腺以外の組織を陰性対照として用いる。ポリアデニル化ＲＮＡを単離するために、オリゴｄＴセルローススピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎのＲｅｄｉＣｏｌ（商標））のような市販のキットを用いて、全ＲＮＡからｍＲＮＡをさらに単離できる。リボヌクレアーゼ保護アッセイにおいて分析するために、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを溶解バッファー（５Ｍ  グアニジンチオシアネート、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に溶解できる。
【０２１５】
Ｃ．ポリソームからのＲＮＡ抽出
組織を４℃で生理食塩水中細かく刻み、６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有するＴＫ１５０Ｍ（１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４）溶液中０．８Ｍ  スクロースの２．５容量と混合する。Ｂ．Ｍｅｃｈｌｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２：２４１−２４８（１９８７）に記載されるように、テフロンガラスＰｏｔｔｅｒホモジナイザー中１００〜２００ｒｐｍで５ストローク、続いてＤｏｕｎｃｅホモジナイザー中６ストロークで組織をホモジナイズする。次いでホモジネートを４℃、１２０００ｘｇで１５分間遠心し、核を沈殿させる。上澄をＴＫ１５０Ｍ中０．８Ｍ  スクロース６ｍｌと混合し、この混合物を３８ｍｌポリアロマーチューブにおいてＴＫ１５０Ｍ中２．５Ｍ  スクロース４ｍｌ上に積層し、ポリソームを単離する。抽出分画上にさらにスクロースＴＫ１５０Ｍ溶液を連続的に積層し、第１層２．０５Ｍスクロース１３ｍｌの次ぎに第２層１．３Ｍスクロース６ｍｌがくる。４℃、９００００ｘｇで５時間、グラジエントを遠心してポリソームを単離する。次いでシリコン処理したピペットで１．３Ｍスクロース／２．０５Ｍスクロースの境界面から分画を採り、等容量のＴＥ（１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で希釈する。等容量の９０℃のＳＤＳバッファー（１％  ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４）を加え、沸騰浴中２分間インキュベートする。次ぎにプロテイナーゼＫ消化（５０ｍｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１５分間タンパク質を消化する。３容量のフェノール・クロロホルム抽出物で精製し、続いて２Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）０．１容量及び１００％  エタノール２容量で−２０℃で一晩沈殿させる。沈殿させたＲＮＡを４℃、１２０００ｘｇで１０分間遠心して回収する。ＲＮＡを乾燥し、ＴＥ（ｐＨ７．４）又は蒸留水に再懸濁する。次いで再懸濁したＲＮＡをＰＣＩＧＦ  ｍＲＮＡの存在に関してスロットブロット又はドットブロットハイブリダイゼーションアッセイに用いることができる（実施例６を参照）。
【０２１６】
核酸及びタンパク質の品質は用いた調製法に依存する。標的分子の単離効率を最大にするために、各サンプルには異なる調製技術が必要であろう。これらの調製技術は通常の当業者の技術範囲内である。
【０２１７】
実施例４：リボヌクレアーゼ保護アッセイ
Ａ．標識された相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブ及び未標識センス鎖の合成
標識アンチセンス及び未標識センスリボプローブをＳＰ６又はＴ７のような５‘ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するＰＣＩＧＦ遺伝子ｃＤＮＡ配列から転写する。配列は適当なＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡインサートを含有するベクターに由来するか、又は５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を組み込んだＰＣＲプライマーを用いたインサートのＰＣＲ産生物に由来してよい。例えば、ＰＣＩＧＦ遺伝子ｃＤＮＡ配列を含有し、対するＳＰ６及びＴ７又はその他のＲＮＡポリメラーゼプロモーターでフランキングされるｐＩＮＣＹ又はｐＳＰＯＲＴ１プラスミドをＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製する。次いでプラスミドＤＮＡ１０μｇをＤｄｅＩのような適当な制限酵素で、３７℃で１時間切断して直線化する。直線化したプラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製し、供給者の指示書に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で、標識として（アルファ３２Ｐ）ＣＴＰ（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）又はビオチン化ＣＴＰのいずれかを組み込んだＲｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）を用いて適当なプロモーターからのアンチセンス転写物の合成に使用する。センス鎖を作製するために、精製プラスミドＤＮＡ  １０μｇをＸｂａ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉのような制限酵素で切断し、前記のように適当なプロモーターから転写する。スピンカラムクロマトグラフィーによりセンス鎖及びアンチセンス鎖の双方を単離する。２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収により未標識センス鎖を測定する。
【０２１８】
Ｂ．標的に対する標識プローブのハイブリダイゼーション
液体窒素下、凍結組織を微粉状にし、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔ（商標）ｌｙｓａｔｅ  ＲＮａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｖ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）の構成成分として利用できる溶解バッファー１ｍｌに溶解する。さらに組織ホモジナイザーを用いて分解することができる。加えて、陽性対照として使用するために、マウス肝臓ライゼートのセンス鎖の既知量の一連の希釈物を作製する。最終的に、可溶化組織又は希釈したセンス鎖４５μｌを；１）放射性標識プローブ１ｘ１０５ｃｐｍ、又は２）溶解バッファー５μｌ中非同位元素標識プローブ２５０ｐｇ；のいずれかと直接混合する。３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを進行させる。Ｔ．Ｋａａｂａｃｈｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：２２５−２３０（１９９５）を参照。
【０２１９】
Ｃ．ＲＮアーゼ消化
ＲＮアーゼＡ及びＲＮアーゼＴ１の溶液を用いてＤｉｒｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔ（商標）により、３７℃で３０分間プローブにハイブリダイズしないＲＮＡを反応物から除去し、続いてサルコシルナトリウムの存在下プロテイナーゼＫ消化により除去する。次いで等容量のイソプロパノールを添加することにより、消化から保護されたハイブリダイズされたフラグメントを沈殿させ、−７０℃で３時間放置する。１２０００ｘｇで２０分間遠心することにより沈殿物を収集する。
【０２２０】
Ｄ．フラグメント分析
沈殿物を色素負荷変成ゲル（８０％  ホルムアミド、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１ｍｇ／ｍｌ  キシレンシアノール、１ｍｇ／ｍｌ  ブロモフェノールブルー）に溶解し、熱変成し、６％  ポリアクリルアミド  ＴＢＥ、８Ｍ  尿素変成ゲルで電気泳動にかける。ゲルを造影し、ＳＴＯＲＭ（商標）保存蛍光オートラジオグラフィーシステム（Ｍｏｌｅｃｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて分析する。被験サンプルから得られたピーク面積を陽性対照センス鎖の既知希釈物から得られたピーク面積と比較することにより、フェムトグラム（ｆｇ）で現れる保護フラグメントバンドを定量する（セクションＢ参照、前出）。結果をＰＣＩＧＦ  ＲＮＡ分子／細胞で、及び造影評点として表す。非同位元素標識を用いる場合、ブロッティングによりハイブリッドをゲルから膜（ナイロン又はニトロセルロース）に移し、次いでストレプトアビジンホスファターゼコンジュゲート及び化学ルミネサンス又は化学蛍光試薬を使用する検出系を用いて分析する。
【０２２１】
配列番号１及びそのフラグメント又は相補体の配列を含んでなる産生物の検出はＰＣＩＧＦ  ｍＲＮＡの存在の指標であり、これは前立腺疾患又は状態、例えば前立腺癌の診断を示唆している。
【０２２２】
実施例５：ノーザンブロッティング
ノーザンブロット技術を用い、ゲル電気泳動及び核酸ハイブリダイゼーションを用いてＲＮＡの複合集団から特異的な大きさのＲＮＡフラグメントを同定する。ノーザンブロッティングは当該分野で公知の技術である。簡単には、全ＲＮＡ５〜１０μｇ（実施例３参照）を４０ｍＭ  モルフィリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．２Ｍ  ホルムアルデヒド、５０容量／容量％  ホルムアミドを含有する溶液１５μｌ中６５℃で１５分間インキュベートする。変成ＲＮＡを負荷バッファー（５０％  グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４％  ブロモフェノールブルー、０．４％  キシレンシアノール）２μｌと混合し、４０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２．２Ｍ  ホルムアルデヒドを含有する変成１．０％  アガロースゲルに負荷する。６０Ｖで１．５時間電気泳動し、ＲＮアーゼ不含水ですすぐ。アルカリ性キャピラリー下方移動法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１：１３４−１３９（１９９２））を用いて、ＲＮＡをゲルからナイロン膜（Ｂｒｉｇｈｔｓｔａｒ−Ｐｌｕｓ，Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に１．５時間移す。１Ｘ  ＳＳＣでフィルターをすすぎ、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｌｏｌｌａ，ＣＡ）を自動架橋モードで用いてＲＮＡをフィルターに架橋し、１５分間乾燥する。次いで膜を、予め加熱したハイブリダイゼーション溶液（５Ｘ  ＳＳＣ、５０％  ホルムアミド、５Ｘ  デンハーツ溶液、１００μｇ／ｍｌ変成サケ精子ＤＮＡ）２０ｍｌを含有するハイブリダイゼーションチューブに入れ、４２℃のハイブリダイゼーションオーブン中で少なくとも３時間インキュベートする。ブロットをプレハイブリダイズするが、製造者の指示書に従ってＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ＰＣＩＧＦインサートフラグメント（ｐＳＰＯＴＲ又はｐＩＮＣＹクローン又は別の適合するクローンをＸｂａＩＸｂａＩ及びＮｏｔＩで消化することにより得られる）を用いて３２Ｐ標識ランダムプライミングされたプローブを作製する。プローブの半分を１０分間煮沸し、即座に氷上で冷却し、ハイブリダイゼーションチューブに加える。４２℃で少なくとも１２時間ハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーション溶液を捨て，フィルターを３Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ  ３０ｍｌで４２℃で１５分間、続いて３Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ  ３０ｍｌで４２℃で１５分間洗浄する。フィルターをサランラップで包み、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ−Ｏｍａｔフィルムに８〜９６時間暴露し、フィルムを分析用に現像する。配列番号１、及びそのフラグメント又は相補体から選択される配列に対応するｍＲＮＡの高レベル発現はＰＣＩＧＦ  ｍＲＮＡの存在の指標であり、これは前立腺組織疾患又は状態、例えば前立腺癌の診断を示唆している。
【０２２３】
実施例６：ドットブロット／スロットブロット
ドット及びスロットブロットアッセイは核酸の複合混合物中の特異的核酸配列の存在を評価するための迅速な方法である。このようなアッセイを実施するために、ＲＮＡ  ５０μｇまでを５０％  ホルムアミド、７％  ホルムアルデヒド、１Ｘ  ＳＳＣ  ５０μｌに混合し、６８℃で１５分間インキュベートし、次いで氷上で冷却する。次いで、２０Ｘ  ＳＳＣ  １００μｌをＲＮＡ混合物に加え、真空下、調製ニトロセルロース又はナイロン膜を有するマニホルド装置に負荷する。膜を水、２０Ｘ  ＳＳＣに１時間浸し、２０Ｘ  ＳＳＣで予め湿らせたワットマン＃３濾紙２枚の上に載せ、スロットブロット又はドットブロット真空マニホルド装置に負荷する。実施例４、前出に記載されているように調製及び標識されたプローブでスロットブロットを分析する。配列番号１及びそのフラグメント又は相補体から選択される配列に対応するｍＲＮＡの検出はＰＣＩＧＦの存在の指標であり、前立腺疾患又は状態、例えば癌の診断を示唆する。
【０２２４】
実施例５及び６で記載される方法に利用できるその他の方法及びバッファーは、本明細書にて特記しない場合、当該分野で公知であり、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出（これは出展明示により本明細書の一部とする）に記載されている。
【０２２５】
実施例７：ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション
この方法は、検出可能な核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて細胞における特異的標的核酸配列を直接検出するのに有用である。
【０２２６】
パラホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドのような架橋により固定可能な物質で、細胞のＲＮＡ保有を最大にするように組織を調製する。Ｌ．Ａｎｇｅｒｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３５：３７−７１（１９９１）参照。簡単には、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中１％  グルタルアルデヒド５容量以上の中に、組織を４℃で３０分間置く。溶液を新鮮なグルタルアルデヒド溶液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム中１％  グルタルアルデヒド、ｐＨ７．５）と交換し、さらに３０分間固定する。固定溶液はおよそ０．３７５％  ＮａＣｌのオスモル濃度を有していなければならない。組織を等張ＮａＣｌで１回洗浄し、リン酸塩を除去する。
【０２２７】
次いで固定した組織を一連の漸増濃度のエタノールで各１５分間脱水する：５０％（２回）、７０％（２回）、８５％、９０％次いで１００％（２回）。次に、キシレンを２回交換して組織を室温で各２０分間浸す。次いで組織をキシレン及びパラフィン１：１混合物を２回交換して各６０℃で２０分間；次いでパラフィンを最終３回交換して各１５分間、組織を浸す。
【０２２８】
次に、標準的なミクロトームを用いて組織を５μｍに切断し、予め３−アミノプロピルトリエトキシシランのような組織付着剤で処理したスライドに載せる。
【０２２９】
１０分間キシレン浸漬、及び一連の漸減濃度のエタノール：９９％２回、９５％、８５％、７０％、５０％、３０％、次いで蒸留水２回で再度脱水することにより、パラフィンを組織から除去する。切片を０．２Ｍ  ＨＣｌで１０分間予め処理し、２μｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫで、３７℃で１５分間浸透できるようにする。
【０２３０】
ＰＣＩＧＦ遺伝子プラスミドから転写した標識リボプローブ（実施例４参照）を調製した切片にハイブリダイズし、３Ｘ標準生理食塩水抽出物及び５０％  ホルムアミド中５６℃で一晩インキュベートする。２Ｘ標準生理食塩水クエン酸塩及び５０％  ホルムアミドで洗浄して過剰なプローブを除去し、続いて１００μｇ／ｍｌ  ＲＮアーゼＡを用いて３７℃で３０分間消化する。顕微鏡下紫外（ＵＶ）光の照明で蛍光ブローブを可視化する。細胞質の蛍光はＰＣＩＧＦ  ｍＲＮＡの指標である。また別に、切片をオートラジオグラフィーにより可視化できる。
【０２３１】
実施例：８逆転写ＰＣＲ
Ａ．１工程ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
公知の方法を用いる逆転写ＰＣＲにより標的特異性プライマーを前記の標的配列を検出するように設計する。１工程ＲＴ−ＰＣＲを１回の反応混合物のＲＴ及びＰＣＲの双方を実施する一連の方法である。５０ｍＭ（Ｎ，Ｎ，−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ｐＨ８．１５、８１．７ｍＭ  ＫＯＡｃ、３３．３３ｍＭ  ＫＯＨ、０．００１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、０．０２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＮ３、８重量／容量％  グリセロール、１５０μＭ  各ｄＮＴＰ、０．２５μＭ  各プライマー、５単位ｒＴｔｈポリメラーゼ、３．２５ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２及び標的ＲＮＡ（実施例３参照）５μｌを含有する反応混合物２００μｌ中で該方法を実施する。ＲＮＡ及びｒＴｔｈポリメラーゼ酵素はＭｎ（ＯＡｃ）２の存在下では不安定であるので、Ｍｎ（ＯＡｃ）２は標的を添加する直前に添加すべきである。ｃＤＮＡ合成及び熱循環の最適条件は当業者に容易に決定できる。反応物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０中でインキュベートする。有用であることが解っている条件には、６０℃〜７０℃で１５〜４５分間、及び９４℃で３０〜４５増幅サイクル、１分；５５〜７０℃、１分；７２℃、２分でのｃＤＮＡ合成などがある。１工程ＲＴ−ＰＣＲはまたＴａｑポリメラーゼ及び逆転写酵素を用いる二重酵素法、例えばＭＭＬＶ（モロニーネズミ白血球ウイルス）又はＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）ＲＴ（逆転写）酵素を用いて実施することもできる。
【０２３２】
Ｂ．従来のＲＴ−ＰＣＲ
また別に、以下のようにＫ．Ｑ．ＨｕらＢｉｒｏｌｏｇｙ  １８１：７２１−７２６（１９９１）に記載される従来の２工程ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施する１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００μＭ  ｄＮＴＰ、２０単位  ＲＮアシン、１μＭ  アニチセンスプライマープライマープライマー及び２５単位  ＡＭＶ又はＭＭＬＶ逆転写酵素を含有する反応混合物２５μｌ中。抽出されたｍＲＮＡを転写する。逆転写は３７〜４５℃で３０〜６０分、続いて９５℃で５分さらにインキュベートしてＲＴを不活性化する。１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ  ＫＣｌ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭ  各プライマー及び２．５単位  Ｔａｑポリメラーゼを含有する最終ＰＣＲ反応物５０μｌ中ｃＤＮＡ１０μｌを用いてＰＣＲを実施する。ｃＤＮＡ合成及び熱循環の最適条件は当業者に容易に決定できる。反応物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０又はその他の適合する装置中でインキュベートする。有用であることが解っている条件には、３０〜４５増幅サイクル（９４℃、１分；５５〜７０℃、１分；７２℃、２分）、最終伸長（７２℃、１０分）、及び４℃で浸漬などがある。
【０２３３】
Ｃ．ＰＣＲフラグメント分析
次いでＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いるゲル電気泳動を使用して大きさを決定することにより正確な産生物を確認でき、ＳＴＯＲＭ造影系を使用して造影できるか、又はＰＣＲ産生物の内部配列に対する標識プローブを使用してサザンドットもしくはスロットブロット分析により確認することもできる。プローブはまたモルフォリノ又はペプチド核酸類似体（ＰＮＡ）のようなポリヌクレオチド類似体でもよい。配列番号１及びそのフラグメント又は相補体から選択される配列を含んでなる産生物の検出はＰＣＩＧＦ  ｍＲＮＡの存在の指標であり、これは前立腺組織疾患又は状態、例えば前立腺癌の診断を示唆している。
【０２３４】
実施例９：ＯＨ−ＰＣＲ
Ａ．プローブ選別及び標識
標的特異的プライマー及びプローブを、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲにより前記の標識配列を検出するように設計する。１９９２年６月２５日公開の国際公開番号ＷＯ９２／１０５０５及び１９９２年７月９日公開のＷＯ９２／１１３８８は各々５‘及び３’末端でオリゴヌクレオチドを標識する方法を教示している。オリゴヌクレオチドを標識するためのある公知の方法によれば、標識ホスホラミダイト試薬を調製し、これを用いて合成中に標識にオリゴヌクレオチドを添加する。例えばＮ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９（４６）：５９０５−５９０８（１９８８）；又はＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎら、公開米国特許出願０７／２４６６８８（ＮＴＩＳ  ＯＲＤＥＲ  Ｎｏ．ＰＡＴ−ＡＰＰＬ−７−２４６６８８）（１９８９）を参照。好ましくは、プローブをその３’末端で標識し、ＰＣＲへの関与及び望ましくない伸長産物の形成を防御する。１工程ＲＴ−ＰＣＲでは、プローブはプライマーのＴＭ以下で少なくとも１５℃のＴＭを有するべきである。プライマー及びプローブを、検出標識を有しても、有さなくても、標準的なホスホラミダイト化学及び／又は当業者に公知の合成後標識法を用いて特異的結合メンバーとして利用する。
【０２３５】
Ｂ．１工程オリゴハイブリダイゼーションＰＣＲ
５０ｍＭ（Ｎ，Ｎ，−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ｐＨ８．１５、８１．７ｍＭ  ＫＯＡｃ、３３．３３ｍＭ  ＫＯＨ、０．０１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、０．０２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＮ３、８重量／容量％  グリセロール、１５０μＭ  各ｄＮＴＰ、０．２５μＭ  各プライマー。３．７５ｎＭ  プローブ、５単位  ｒＴｔｈポリメラーゼ、３．２５ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２及び５μｌ  標的物質の血液等価物を含有する反応物２００μｌでＯＨ−ＰＣＲを実施する。ＲＮＡ及びｒＴｔｈポリメラーゼ酵素はＭｎ（ＯＡｃ）２存在下では不安定なので、Ｍｎ（ＯＡｃ）２は標的物質を添加する直前に添加すべきである。反応物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０中でインキュベートする。ｃＤＮＡ合成及び熱循環に最適な条件は、当業者に容易に決定できる。有用であることが解っている条件には、ｃＤＮＡ合成（６０℃、３０分）、３０〜４５増幅サイクル（９４℃、４０秒；５５〜７０℃、６０秒；５５〜７０℃、６０秒）、オリゴハイブリダイゼーション（９７℃、５分；１５℃、５分；１５℃浸漬）などがある。適当な反応産生物は少なくとも１つのＰＣＲ産物の鎖及び内部でハイブリダイズされたプローブを含有する。
【０２３６】
Ｃ．ＯＨ−ＰＣＲ産物分析
増幅反応産物をＬＣｘ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒシステム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可能）で検出する。簡単には、適切な反応産物をＰＣＲ産生鎖又はハイブリダイゼーションプローブのいずれかの捕捉部位で抗体標識微粒子により捕捉され、複合体はプローブ又はＰＣＲ鎖のいずれかの検出可能部位にコンジュゲートする検出可能な抗体の結合により検出する。内部プローブにハイブリダイズするＰＣＲ鎖を含有する複合体のみを検出する。そしてこの複合体の検出はＰＣＩＧＦ  ｍＲＮＡの存在の指標であり、前立腺疾患又は状態、例えば前立腺癌の診断を示唆する。
【０２３７】
増幅された、又は増幅されていないＰＣＩＧＦ由来の核酸配列の存在を検出するための当業者に使用できる、及び／又は修飾できる多くのその他の検出様式には、非限定例としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）；Ｑベータレプリカーゼ（Ｇｅｎｅ−Ｔａｒｋ（商標）、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、分岐鎖反応（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）及び鎖置換アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）がある。
【０２３８】
実施例１０：合成ペプチド産生
合成ペプチドを設計し、次いでＰＣＩＧＦペプチド配列［配列番号６（実施例１を参照）］の予想アミノ酸配列に基づいて調製する。とりわけ、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のペプチドなどの配列番号６に由来する多くのＰＣＩＧＦペプチドを調製する。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡより入手可能）又はＦＭＯＣ化学、標準サイクル及びｉｎ−ｓｉｔｕ  ＨＢＴＵ活性化を用いる同様の装置で全てのペプチドを合成する。切断及び脱保護条件は以下のとおりである：切断試薬（７７．５容量／容量％  トリフルオロ酢酸、１５容量／容量％  エタンジチオール、２．５容量／容量％  水、５容量／容量％  チオアニソール、１−２重量／容量％  フェノール）２．５ｍｌ容量を樹脂に加え、室温で２〜４時間攪拌する。次いでロ液を除去し、切断試薬から冷ジエチルエーテルでペプチドを沈殿させる。各ペプチドを濾過し、水／アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡグラジエントを用いて逆相調製用ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥する。質量分析（実施例１２参照）により産生物を確認する。
【０２３９】
以下のような自己酸化条件を用いてジスルフィド結合形成を実施する：ペプチドを最低容量（およそ１０ｍｌ）のＤＭＳＯに溶解した後０．３〜０．８ｍｇ／ｍｌの濃度までバッファー（０．１Ｍ  トリスＨＣｌ、ｐＨ６．２）を加える。ジスルフィド結合の形成が完了するまでＨＰＬＣにより反応を経過観察し、続いて水／アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡグラジエントを用いる逆相調製用ＨＰＬＣに供し、凍結乾燥する。次いで質量分析（実施例１２参照）により産生物をを確認する。
【０２４０】
精製されたペプチドをＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ又はその他の免疫反応性分子をグルタルアルデヒドと共にアジュバントと混合したものにコンジュゲートし、動物に注入する。
【０２４１】
実施例１１ａ：プラスミド５７７細胞系におけるタンパク質の発現
Ａ．ＰＣＩＧＦ発現プラスミドの構築
１９９５年６月７日出願の米国特許出願番号０８／４７８０７３（出展明示により本明細書の一部とする）に記載されるプラスミド５７７を永久細胞系において分泌抗原を発現するように構築した。このプラスミドは以下のＤＮＡセグメントを含有する：（ａ）細菌性ベータラクタマーゼ及びＤＮＡ複製起点を含有するｐＢＲ３２２；（ｂ）ＨＳＶ−１チミジンキナーゼプロモーター及びポリＡ付加シグナルの調節下ネオマイシン抵抗性遺伝子の発現を指示する１．８ｋｂのカセット；（ｃ）シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター及びポリＡ付加シグナルの調節下ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子の発現を指示する１．９ｋｂのカセット；（ｄ）シミアンウイルス４０Ｔ−Ａｇプロモーター及び転写エンハンサー、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）エンハンサーＩ続いてポリＡ付加シグナルを提供する単純疱疹ウイルスＩ（ＨＳＶ−１）ゲノムの調節下修飾Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２タンパク質に融合するウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列の発現を指示する３．５ｋｂのカセット；（ｅ）このプラスミドにおいて機能しないＳＶ４０ゲノム後期領域の残りの０．７ｋｂフラグメント。分子生物学の当業者に公知の標準的な方法によりベクターの全てのセグメントを組み立てた。
【０２４２】
以下のように、プラスミド５７７のＣ型肝炎Ｅ２タンパク質コーディング配列を配列番号１及びそのフラグメント又は相補体から選択されるＰＣＩＧＦのポリヌクレオチドのコーディング配列と置換することにより分泌可能なＰＣＩＧＦポリペプチドを発現するためのプラスミドを構築する。プラスミド５７７をＸｂａＩで消化してＣ型肝炎Ｅ２遺伝子フラグメントを遊離する。得られたプラスミドバックボーンにより、発現されたタンパク質を細胞の分泌経路に指向させるウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列の下流にＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡの挿入が可能になる。ＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡフラグメントは標準的な方法を用いるＰＣＲにより作製される。センスＰＣＲプライマー配列にコード化されるのはＸｂａＩ部位であり、すぐ後に培養液中のシグナルプロテアーゼプロセシング、効果的な分泌及び最終産物の安定を促進するアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（「ＳＮＥＬ」）をコードする１２ヌクレオチド配列が続く。この１２ヌクレオチド配列のすぐ後に、プライマーはＰＣＩＧＦ遺伝子のアミノ酸をコードする鋳型配列に相補的なヌクレオチドを含有する。アンチセンスプライマーは停止コドンの直前に以下の８個のアミノ酸：Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１０）をコードする配列を組み込む。この配列内にＰＣＩＧＦポリペプチド産生物を分析及び精製を補助する認識部位が組み込まれる。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）と称する市販により入手可能なモノクローナル抗体により認識される認識部位（「ＦＬＡＧ」と称する）、並びにその他の適合配列及びその対応する抗体を利用できる。例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓより入手したＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）試薬を用いて供給者の指示書によりＰＣＲを実施する。ＰＣＲプライマーを最終濃度０．５μＭで使用する。反応物１００μｌ中ＰＣＩＧＦプラスミド鋳型で、３５サイクル（９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、９０秒）、続いて７２℃、１０分の伸長サイクルでＰＣＲを実施する。
【０２４３】
Ｂ．ジヒドロ葉酸リダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞のトランスフェクション
前出のプラスミドをＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞にトランスフェクトする（ＤＸＢ−１１１、Ｕｒｉａｃｉｏら、ＰＮＡＳ  ７７：４４５１−４４６６（１９８０））。これらの細胞は受け入れ番号ＣＲＬ  ９０９６で、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８２５より入手できる。Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）に記載されるカチオン性リポソーム媒介法を用いてトランスフェクションを実施する。とりわけ、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞を１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）を含有するＨａｍのＦ−１２培地で培養し、フラスコあたり５〜８×１０５セルの密度でフラスコに新たに播種する。トランスフェクションのために細胞を６０から８０％の単層集密度まで成長させる。プラスミドＤＮＡ２０μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地１．５ｍｌに加え、リポフェクチン試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）１００μｌを別のＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地１．５ｍｌに加える。２つの溶液を混合し、室温で２０分間インキュベートする。細胞から培養培地を除去した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地５ｍｌで３回細胞をすすぐ。次いでＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ−リポフェクチン−プラスミドＤＮＡ溶液を細胞に積層する。細胞を３７℃で３時間インキュベートし、その後選別前にさらに２４時間、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ−リポフェクチン−ＤＮＡ溶液を培養培地と交換する。
【０２４４】
Ｃ．選別及び増幅
トランスフェクションに１日後、細胞を１：３継代培養し、ｄｈｆｒ／Ｇ４１８選別培地（以後「Ｆ−１２マイナスメジウムＧ」と称する）でインキュベートする。選別培地はＬ−グルタミン含有、ヒポキサンチン、チミジン及びグリシン不含ＨａｍのＦ−１２（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ）及びＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）ｍｌあたり３００μｇである。２５ｃｍ２あたり５ｍｌの培地容積対表面面積比を維持する。およそ２週間後、ＤＨＦＲ／Ｇ４１８細胞を広げて継代培養し、続けてＦ−１２マイナスメジウムＧ中に保持する。
【０２４５】
メソトレキセートを用いるＤＨＦＲ＋、Ｇ４１８＋細胞の段階的選別により（Ｒ．Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｃｅｌｌ  ３７：７０５−７１３（１９８４）参照）、トランスフェクトされたＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡ配列の各々を増幅する。１５０ｎＭ  メソトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するＦ−１２マイナスメジウムＧと共に、抵抗性コロニーが出現するまでおよそ２週間、細胞をインキュベートする。さらに５μＭ  ＭＴＸで１５０ｎＭの適用細胞を選別することにより遺伝子増幅を達成する。
【０２４６】
Ｄ．抗原産生
５μＭ  ＭＴＸを補充したＦ−１２マイナスメジウムＧを５％  ＣＯ２中３７℃で１２〜２４時間、ちょうど全面成長した単層に積層する。成長培地を除去し、細胞をダルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（カルシウム及びマグネシウムを含む）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で３回すすぎ、存在し得る残留培地／血清を除去する。次いで細胞をＶＡＳカスタム培地（Ｌ−グルタミン含有、ＨＥＰＥＳ含有、フェノールレッド不含のＶＡＳカスタム処方、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより入手可能；Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，製品番号５２−０８６７８Ｐ）と共に５％  ＣＯ２中３７℃で１時間インキュベートする。次いで産生するためにＴフラスコあたり５ｍｌで細胞をＶＡＳに積層する。インキュベーションの７日後培地を除去し、保持し、次いで回収２、３及び４で精製するまで凍結する。７日以後に回収する３つでは単層をＶＡＳで積層する。
【０２４７】
Ｅ．前立腺組織遺伝子ＰＣＩＧＦ抗原発現の分析
ＰＣＩＧＦポリペプチド構築物を発現する細胞からのＶＡＳ上澄を当該分野で公知の標準的な方法及び試薬（ラエムリ不連続ゲル）を用いるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）か、又は質量分析のいずれかにより分析する。
【０２４８】
Ｆ．精製
ヒドラジン結合によりアガロースに共有結合により付着した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体を含んでなるアフィニティーマトリックス（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＬＡＧ配列を含有するＰＣＩＧＦポリペプチドの精製を行う。アフィニティー精製を行う前に、プールしたローラーボトルからのＶＡＳ培地回収物のタンパク質をＳｅｈｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムを用いて５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー中に交換する。このバッファー中のタンパク質を抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体アフィニティーカラムに適用する。５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファーを用いてカラムを洗浄し、非結合タンパク質を溶出する。５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中過剰のＦＬＡＧペプチドを用いて結合タンパク質を溶出する。ゲル電気泳動又はＨＰＬＣにより精製されたＰＣＩＧＦポリペプチドから過剰のＦＬＡＧペプチドを除去できる。
【０２４９】
プラスミド５７７をこの実施例で使用するが、その他の適合する発現系、例えばＣＭＶに試薬及び／又は技術に適当な修飾を加えて本発明で使用できることは当業者に周知であり、通常の技術者の技術範囲内である。
【０２５０】
ＰＣＩＧＦ遺伝子のコーディング領域を含有する最大のクローンインサートを、次に（ｉ）例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及び／又はタンパク質発現及び検出を補助するタンパク質可融性配列を含有し得る真核性発現ベクター又はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）又はタンパク質配列を発現するためのその他のタンパク質融合遺伝子を含有する細菌性発現ベクター（ｉｉ）のいずれかにサブクローニングする。ＳＯＤの融合配列を含有するポリペプチドの産生に有用な方法及びベクターは１９８６年１０月１日公開のＥＰＯ０１９６０５６に記載されており、これは出展明示により本明細書の一部とし、ＣＫＳの融合配列を含有するポリペプチドは１９８８９年９月１３日公開のＥＰＯ公開番号０３３２９６１に記載されており、これもまた出展明示により本明細書の一部とする。このように精製したタンパク質を、非限定例としては動物免疫実験、固相イムノアッセイ等の種々の技術に用いることができる。
【０２５１】
実施例１１ｂ：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを用いる細胞系におけるタンパク質の発現
Ａ．ＰＣＩＧＦ発現プラスミドの構築
従来たいていの哺乳動物細胞系による分泌抗原の発現に用いられたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｃａｔ．＃Ｖ８５５−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）を構築した。発現されたタンパク質インサートをｍｙｃ−ｈｉｓペプチドタグに融合する。ｍｙｃ−ｈｉｓタグ（配列番号１１）は抗ｍｙｃ又は抗ｈｉｓアフィニティーカラム又はメタロタンパク質結合タンパク質のいずれかを用いることにより発現された融合タンパク質を精製するのに有用であるｃ−ｍｙｃ腫瘍性タンパク質エピトープ及びポリヒスチジン配列を含んでなる。
【０２５２】
分泌可能なＰＣＩＧＦタンパク質を発現するためのプラスミドを、配列番号１及びそのフラグメント又は相補体から選択されるＰＣＩＧＦポリヌクレオチド配列を挿入することにより構築する。ＰＣＩＧＦ発現プラスミドを構築する前に、最初に以下のようにＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡをｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングする：
標準的な方法を用いてＰＣＲによりＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡフラグメントを作製する。例えば、製造者に指示されるように、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標），Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の方法及び試薬によりＰＣＲを実施する。ＰＣＲプライマーは最終濃度０．５μＭで使用する。５０μｌ反応物中、ＰＣＩＧＦプラスミド鋳型（実施例２参照）で、ｐｆｕポリメラーゼ５単位を用いるＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を３０サイクル（９４℃、１分；６５℃、１．５分；７２℃、３分）、続いて７２℃で８分の伸長サイクルを実施する。（センスＰＣＲプライマー配列はＰＣＩＧＦ遺伝子インサートのすぐ上流のｐＩＮＣＹベクターに相補的であるか、又は５‘ＥｃｏＲＩ制限部位を組み込むヌクレオチド、下流に隣接するタンパク質翻訳コンセンサスイニシエーター、及びＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡインサートのたいていの５’末端と同一のセンスである３’核酸配列を含んでなる。アンチセンスＰＣＲプライマーは５’ＮｏｔＩ制限配列及び３’のたいていの、フレーム内停止コドンのすぐ上流のＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡインサートの３’末端に相補的である配列を組み込む。）得られたブラント末端ＰＣＲ産生物５μｌを直線化ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）２５ｎｇにライゲートし、ベクターの致死ｃｃｄＢ遺伝子を妨害する。Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、製造者の指示書に従って、得られたライゲートされたベクターをＴＯＰ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換する。形質転換した細胞をＬＢ−Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ  カナマイシン）選別プレート上３７℃で成長させる。妨害されたｃｃｄＢ遺伝子を有するプラスミドを含有する細胞のみが形質転換後成長する（Ｇｒａｔ，Ｓ．Ｇ．Ｎ．、ＰＮＡＳ  ８７：４６４５−４６４９（１９９０））。形質転換されたコロニーを採り、ＬＢ−Ｋａｎブロス３ｍｌ中３７℃で成長させる。ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）法を用いて製造者に指示されるようにプラスミドＤＮＡを単離する。ＥｃｏＲＩ又はＳｎａＢＩ、及びＮｏｔＩ制限酵素でＤＮＡを切断し、ＰＣＩＧＦインサートフラグメントを遊離する。フラグメントを１％  Ｓｅａｋｅｎ（登録商標）ＬＥアガロース／０．５μｇ／ｍｌ  臭化エチジウム／ＴＥゲルに流し、ＵＶ照射により可視化し、切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を用いて供給者の指示書に指示されるように精製する。
【０２５３】
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ又はＳｎａＢＩ及びプラスミドＤＮＡのポリリンカー領域のＮｏｔＩで消化することにより直線化する。得られたプラスミドＤＮＡバックボーンにより、哺乳動物細胞においてタンパク質の発現を指示するＣＭＶプロモーターの下流でＰＣＩＧＦ精製ｃＤＮＡフラグメント（前出）の挿入が可能になる。ライゲートされたプラスミドを製造者に指示されるように、ＤＨ５  アルファ（商標）細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に形質転換する。簡単には、ＰＣＩＧＦインサートを含有するｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ１０ｎｇをコンピテントＤＨ５  アルファ細胞５０μｌに加え、内容物を穏やかに混合する。混合物を氷上で３０分間インキュベートし、３７℃で２０秒間熱ショックを与え、さらに２分間氷上に置く。ＬＢ培地０．９５ｍｌを添加したとき、混合物を２２５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。次いで形質転換した細胞を１００ｍｍ  ＬＢ／Ａｍｐ（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン）プレートに載せ、３７℃で成長させる。コロニーを採り、ＬＢ／Ａｍｐブロスで成長させる。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを精製する。インサートの存在を、非限定例としては制限消化及びゲル分析などの当業者に公知の方法を用いて確認する。（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出。）
Ｂ．ヒト胚性腎細胞２９３細胞のトランスフェクション
セクションＡ（前出）に記載したＰＣＩＧＦ発現プラスミドでＤＨ５アルファ細胞を再び形質転換し、ＬＢ／アンピシリン寒天で平板培養し、前記するように１０ｍｌのＬＢ／アンピシリンブロス中で増殖させる。プラスミドを、ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ（商標）  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して精製し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７））。これらの細胞はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２から受け入れ番号ＣＲＬ１５７３で入手できる。トランスフェクションは、Ｐ．Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら，Ｆｏｃｕｓ  １５．７３（１９９３）に記載されたカチオン性リポフェクタミン介在法で行う。より詳細には、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を補充した１０ｍｌのＤＭＥＭ培地で培養し、１００ｍｍの培養皿に１培養皿あたり９×１０６セルの密度で新たに播種する。トランスフェクション用細胞を３７℃で７０％〜８０％の単層集密度まで増殖させた。プラスミドＤＮＡ８μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）８００μｌに添加し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）４８〜９６μｌを別のＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地８００μｌに添加する。２つの溶液を混合し、室温で１５〜３０分間インキュベートする。細胞から培養培地を除去した後、血清不含ＤＭＥＭ１０ｍｌで１回細胞を洗浄する。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−プラスミドＤＮＡ溶液を血清不含ＤＭＥＭ６．４ｍｌで希釈し、次いで細胞に積層する。細胞を３７℃で５時間インキュベートし、その後さらに２０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ８ｍｌを添加する。１８〜２４時間後、古い培地を吸引し、５％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭ５ｍｌを細胞に積層する。トランスフェクションの７２時間後、ＰＣＩＧＦ遺伝子活性に関して上澄及び細胞抽出物を分析する。
【０２５４】
Ｃ．前立腺組織遺伝子ＰＣＩＧＦ抗原発現の分析
培養上澄（前出）をサイトチューブに移し、氷上で保持する。ダルベッコＰＢＳ１０ｍｌで２回洗浄してＨＥＫ２９３細胞を回収し、ＣＡＴ溶解バッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）１．５ｍｌを添加して溶解し、続いて室温で３０分間インキュベートする。ライゼートを１．７ｍｌポリプロピレンマイクロフュッジ管に移し、１０００ｘｇで１０分間遠心する。上澄を新たなサイトチューブに移し、氷上で保存する。細胞からの上澄のアリコート及びＰＣＩＧＦポリペプチド構築物を発現する細胞のライゼートをＰＣＩＧＦ組換えタンパク質の存在に関して分析する。当該分野で公知の標準的な方法及び試薬を用いて、アリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけることができる。（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）次いでこれらのゲルを固体培地、例えばニトロセルロース、ニトラン等にブロッティングし、抗ｍｙｃエピトープもしくは抗ヒスチジンモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）又は抗ＰＣＩＧＦポリクローナル血清を用いるウェスタンブロッティング技術を使用してＰＣＩＧＦポリペプチドバンドを可視化できる（実施例４参照）。また別に、発現したＰＣＩＧＦ組換えタンパク質を質量分析により分析できる（実施例１２参照）。
【０２５５】
Ｄ．精製
ポリヒスチジン残基に特異的に結合するニッケル荷電アガロース樹脂を含有するＸｐｒｅｓｓ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてｍｙｃ−ｈｉｓ配列を含有するＰＣＩＧＦ組換えポリペプチドの精製を行う。前出で記載されるように調製した１０ｘ１００ｍｍプレートからの上澄をプールし、ニッケル荷電カラムを通す。５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファーでカラムを洗浄して非結合性タンパク質を溶出し、ｍｙｓ−ｈｉｓ融合タンパク質のみを残す。次いで過剰のイミダゾール又はヒスチジン、又は低ｐＨバッファーのいずれかを用いてカラムから結合ＰＣＩＧＦ組換えポリペプチドを溶出する。また別に、ｍｙｓ−ｈｉｓ配列でヒドラジド又はその他の結合を介してアガロース樹脂にコンジュゲートした抗ｍｙｓ又は抗ヒスチジンモノクローナル抗体からなるアフィニティーカラムに結合し、各々過剰のｍｙｃペプチド又はヒスチジンで溶出することにより組換えタンパク質を精製することもできる。
【０２５６】
精製された組換えタンパク質を次いで、供給者の指示書に指示されるように、固相、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド活性化セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に共有結合により架橋できる。次いで共有結合したＰＣＩＧＦ組換えタンパク質を含有するこれらのカラムを用いてウサギ又はマウス血清から抗ＰＣＩＧＦ抗体を精製することができる（実施例１３及び１４参照）。
【０２５７】
Ｅ．ＰＣＩＧＦ発現タンパク質でのマイクロタイタープレートのコーティング
前出で記載されるように１００ｍｍプレートからの上澄を適当な容量のＰＢＳで希釈する。次いで得られた混合物１００μｌをＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）金属キレートマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の各ウェルに配置し、振盪しながら室温でインキュベートし、続いて０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有ＰＢＳ各２００μｌで３回洗浄する。次いで調製したマイクロタイタープレートを用いてＰＣＩＧＦ抗体の存在に関してポリクローナル抗血清をスクリーニングできる（実施例１７参照）。
【０２５８】
この実施例ではｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを使用するが、その他の適合する発現系の試薬及び／又は技術に適当な修飾を加えて本発明にて使用できることは当業者に周知であり、当該分野の通常の技術範囲内である。ＰＣＩＧＦ遺伝子のコーディング領域を含有する最大のクローン化インサートを（ｉ）例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及び／もしくはタンパク質の発現及び検出を助ける融合可能なタンパク質配列を含有し得る真核細胞発現系、又は（ｉｉ）スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）もしくはタンパク質配列を発現するためのその他のタンパク質融合配列を含有する細菌性発現ベクターのいずれかにサブクローニングする。ＳＯＤの融合配列を含有するポリペプチドの産生に有用な方法及びベクターは１９８６年１０月１日公開の公開ＥＰＯ出願番号ＥＰ０１９６０５６（出展明示により本明細書の一部とする）に記載されており、ＣＫＳの融合配列を含有するベクターは１９８９年９月１３日公開の公開ＥＰＯ出願番号ＥＰ０３３１９６１（出展明示により本明細書の一部とする）に記載されている。精製されたタンパク質を、非限定例としては動物免疫研究、固相イムノアッセイ等の種々の技術に使用できる。
【０２５９】
実施例１２：前立腺組織タンパク質の化学分析
Ａ．ＭＳを用いるトリプシン消化ペプチドフラグメントの分析
標準的な方法を用い、クーマシーブルーで染色する、ポリアクリルアミドゲルに前立腺疾患、例えば前立腺癌の患者の血清、前立腺疾患でない患者の血清、前立腺疾患、例えば前立腺癌の患者の前立腺組織又は細胞の抽出物、前立腺疾患でない患者の前立腺組織又は細胞の抽出物、及び患者のその他の疾患でない、又は疾患の器官の組織又は細胞の抽出物を流す。未知のポリペプチドの含有が疑われるゲル区画を切除し、ゲル中還元、アセトアミド化及びトリプシン消化に供する。Ｐ．Ｊｅｎｏら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．２２４：４５１−４５５（１９９５）及びＪ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．２０３：１７３−１７９（１９９２）。ゲル区画を１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３及びアセトニトリルで洗浄する。収縮したゲル切片を消化バッファー（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１２．５μｇ／ｍｌ  トリプシン）中４℃で４５分間膨張させる。上澄を吸引し、トリプシン不含の消化バファー５〜１０μｌと置換し、３７℃で一晩インキュベートする。ペプチドを５％  ギ酸及びアセトニトリルで３回交換して抽出し、蒸発乾固する。ペプチドを５％  ギ酸１０μｌに溶解し、それをガスクロマトグラフィーの吸入キャピラリーに通すことにより、該キャピラリーチューブのチップにトラップしたＰＯＲＯＳ  Ｒ２ソルベント（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）およそ０．１μｌに吸着させる。吸着されたペプチドを水で洗浄し、６０％  メタノール中５％  ギ酸で溶出する。ナノエレクトロスプレイ質量分析で分析するために、溶出剤をＡＰＩ  ＩＩＩ質量分析器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ，Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）のスプレイキャピラリーに直接通す。Ｍ．Ｗｉｌｍら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  １３６：１６７−１８０（１９９４）及びＭ．Ｗｉｌｍら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ６６：１−８（１９９４）。最初の４極子から得られた質量スペクトルからトリプシン消化したペプチドの質量を決定する。予想されるペプチドに対応する質量をＭＳ／ＭＳモードでさらに分析し、ペプチドのアミノ酸を得ることができる。
【０２６０】
Ｂ．ＬＣ／ＭＳを用いるペプチドフラグメント分析
過形成疾患組織で見出されるｍＲＮＡから予想されるポリペプチドの存在を液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて確認することもできる。Ｄ．Ｈｅｓｓら、ＭＥＴＨＯＤＳ，Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６：２２７−２３８（１９９４）。患者の血清標本又は腫瘍抽出物をＳＤＳで変成し、ジチオスレイトール（１．５ｍｇ／ｍｌ）で９０℃で３０分間還元し、続いてヨードアセタミド（４ｍｇ／ｍｌ）で２５℃で１５分間アルキル化する。アクリルアミド電気泳動の後、ポリペプチドをカチオン性膜にエレクトロブロッティングし、クーマシーブルーで染色する。染色後、膜を洗浄し、満ちポリペプチドが含まれると考えられる区画を切除し、小片に切断する。膜を５００μｌマイクロ遠心管に配置し、タンパク質溶解性消化バッファー（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％  アセトニトリル、２ｍＭ  ＣａＣｌ２及び５μｇ／ｍｌ  トリプシンを含有する１００ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．２）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１０〜２０μｌに浸す。３７℃で１５時間後、飽和尿素３μｌ及び１００μｇ／ｍｌ  トリプシン１μｌを加え、さらに３７℃で５時間インキュベートする。消化混合物を１０％  トリフルオロ酢酸３μｌで酸性にし、遠心して膜から上澄を分離する。上澄を逆相ＨＰＬＣカラムのマイクロボアに直接注入し、０．０５％  トリフルオロ酢酸中アセトニトリルの直線グラジエントで溶出する。物質の容量を調整する必要がある場合、分流器（ｓｔｒｅａｍ  ｓｐｌｉｔｔｅｒ）を通した後、溶出液をエレクトロスプレイ質量分析器に直接供給する。実施例１２、セクションＡで示す方法に従って、データを分析する。
【０２６１】
実施例１３：遺伝子免疫プロトコル
Ａ．ｉｎ  ｖｉｖｏ抗原発現
遺伝子免疫は適当な発現ベクターを接種した後、抗原をｉｎ  ｖｉｖｏで直接発現することにより、タンパク質精製工程を回避する。また、タンパク質を哺乳動物組織において産生するので、この方法によって抗原を産生することにより正確なタンパク質フォールディング及びグリコシル化が可能になる。該方法はＣＭＶプロモーターを含有するプラスミドへの遺伝子配列の挿入、プラスミドの伸長及び精製、並びに動物の筋肉組織へのプラスミドＤＮＡの注入を利用する。好ましい動物にはマウス及びウサギなどがある。例えば、Ｈ．Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１８４７−１８５１（１９９３）参照。１又は２回のブースター投与後、次に動物を出血させ、腹水を収集することができ、又は動物の脾臓を回収してハイブリドーマを産生させることができる。
【０２６２】
Ｂ．プラスミド調製及び精製
実施例１１に記載される方法に従って、適切な５‘制限部位を含有する適当なＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡ含有ベクターからＰＣＩＧＦ  ｃＤＮＡ配列を作製する。適当な制限酵素でＰＣＲ産物を切断し、ＣＭＶプロモーター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡのｐＲｃ／ＣＭＶ又はｐｃＤＮＡ３ベクター）を含有するベクターに挿入する。次いでこのプラスミドを適当な細菌株中で伸長し、ＣｓＣｌグラジエント又はＱｉａｇｅｎプラスミドＤＮＡ精製カラムを用いて細胞ライゼートから精製する。これらの技術は全て分子生物学の通常の技術者に周知である。
【０２６３】
Ｃ．免疫プロトコル
ＰＢＳで希釈した精製プラスミド０．１〜１００μｇ又はその他のＤＮＡ取り込みエンハンサー（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ、２５％  スクロース）を筋肉内投与することにより麻酔動物を免疫する。例えば、Ｈ．Ｄａｂｉｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：７３３−７４０（１９９３）；及びＰ．Ｗ．Ｗｏｌｆｆら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：４７４−４８５（１９９１）参照。月間隔で１又は２回のブースター注射を行う。
【０２６４】
Ｄ．抗血清の試験及び使用
動物を出血させ、当該分野で公知の技術、例えばウェスタンブロッティング又はＥＩＡ技術を用いて、既知遺伝子配列から合成したペプチド（実施例１６参照）を用いて抗体に関して得られた血清を試験する。この方法により産生した抗血清を用いて患者の組織又は細胞抽出物における抗原の存在を検出でき、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロッティング技術、例えば実施例１５〜１８に記載される技術により患者血清中の抗原の存在を検出できる。
【０２６５】
実施例１４：ＰＣＩＧＦに対する抗体の産生
Ａ．ポリクローナル抗血清の産生
ウサギにＰＣＩＧＦヌクレオチド配列（配列番号１）のアミノ酸配列に由来する配列を有するペプチドを注射してＰＣＩＧＦに対する抗血清を調製した。ペプチド（配列番号７、配列番号８及び配列番号９）の合成については実施例１０に記載されている。免疫原として用いられるペプチドはキャリヤー、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、ＫＬＨにコンジュゲートしていない免疫原として使用した（すなわちこれらはコンジュゲートされていなかった）。
【０２６６】
動物免疫  体重２ｋｇ以上の雌のニュージーランド白ウサギをポリクローナル抗血清の感作に使用する。１匹の動物をコンジュゲートされていないペプチド（配列番号７、配列番号８及び配列番号９）で免疫した。初回免疫の１週前に５〜１０ｍｌの血液を動物から採取し、非免疫プレブリードサンプルとして使用した。
【０２６７】
コンジュゲートされていないペプチド配列番号７、配列番号８及び配列番号９を用いて、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）０．５ｍｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２ｍｇ／ｍｌの濃度のペプチド０．５ｍｌを乳化することによって一次免疫原を調製した。免疫原を、皮下、腹腔内及び／又は筋肉内の投与経路で動物の複数の部位に注入する。初回免疫の４週後にブースター免疫を投与する。ブースター免疫の投与に使用する免疫原は、ペプチドを不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）０．５ｍｌで１ｍｇ／ｍｌに希釈する以外は初回免疫に使用したのと同じコンジュゲートされていないペプチド０．５ｍｌを乳化することによって調製した。ブースターの場合にも、ブースター用量を皮下、腹腔内及び筋肉内注入の経路で複数の部位に投与した。ブースター免疫の２週後に動物から採血（５ｍｌ）し、以下に記載の方法でペプチドに対する血清の免疫反応性を試験した。適当な抗体価が得られるまでブースター及び採血のスケジュールを４週毎に繰り返した。抗血清の力価又は濃度を以下の実施例１７に記載するようにマイクロタイターＥＩＡで、コンジュゲートされていないペプチドを用いて測定した。１：５００以上の抗体価を以後の使用及び試験に好適な適正抗体価と判定した。
【０２６８】
表１．ウサギ抗ＰＣＩＧＦペプチド抗血清のタイター（１１週）
ペプチド免疫原            タイター
ＰＣＩＧＦ．１              ４３，０００
ＰＣＩＧＦ．２              ５８，０００
ＰＣＩＧＦ．３              ＞６２，５００
Ｂ．モノクローナル抗体の産生
１．免疫プロトコル
マウス体内でモノクローナル抗体を産生させるために使用したコンジュゲートされていない、又はコンジュゲートされたペプチドの量をウサギ体内でポリクローナル抗血清を産生させるために使用した量の１／１０にする以外は、キャリヤー例えばＫＬＨにコンジュゲートされていてもよい（以下のように調製されるか、又はコンジュゲートされていない（すなわちキャリヤー例えばＫＬＨにコンジュゲートされていない））ペプチドを用いてマウスを免疫する。即ち、一次免疫原は０．１ｍｌのＣＦＡ中のコンジュゲートされているか又はコンジュゲートされていないペプチド１００μｇのエマルジョンから成り、一方ブースター免疫に使用した免疫原はＩＦＡ０．１ｍｌ中コンジュゲートされているか又はコンジュゲートされていないペプチド５０μｇから成る。モノクローナル抗体産生用のハイブリドーマを標準技術で調製しスクリーニングする。モノクローナル抗体産生に使用した方法は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９４（１９７５）に詳細に記載され、Ｊ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ，ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）に概説されているような当業界で公知の方法に従う。Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法に基づく別のモノクローナル抗体産生方法は、Ｌ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：６０４−６１９（１９９０）（これは出展明示により本明細書の一部とする）の方法である。
【０２６９】
（マウスあたりの）免疫感作計画は、１回の初回免疫と複数の追加ブースター免疫とから成る。初回免疫に使用した一次免疫原は、５０μｌのＣＦＡで予め乳化した５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の１００μｇの非コンジュゲート又はコンジュゲートペプチドから成る。初回免疫のほぼ２週後及び４週後に行うブースター免疫は５０μｌのＩＦＡで乳化した５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の５０μｇの非コンジュゲート又はコンジュゲートペプチドから成る。合計１００μｌのこの免疫原を各マウスの腹腔内及び皮下に接種する。３回目の免疫感作のほぼ４週後に実施例３に記載のようなマイクロタイタープレートエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）によって個々のマウスを免疫応答に基づいてスクリーニングする。３回目の免疫感作のほぼ１５週後にＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の５０μｇの非コンジュゲート又はコンジュゲートペプチドをマウスの静脈内、脾臓内又は腹腔内に接種する。
【０２７０】
この静脈内ブーストの３日後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を使用して脾細胞を例えばＳｐ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に融合させる。１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と１％のヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を含有するダルベッコの改質イスコフ培地（ＤＭＥＭ）で融合物を培養する。バルク培養物を実施例１７のプロトコルに従ってマイクロタイタープレートＥＩＡによってスクリーニングした。免疫原として使用したペプチドに反応性でその他のペプチドに反応性でないクローンを最終膨張用に選択する。このように選択したクローンを膨張させ、アリコートに分け、１０％ＦＣＳと１０％ジメチルスルホキシドとを含有するＤＭＥＭ中で凍結させる。
【０２７１】
２．ペプチドコンジュゲーション
ペプチドをマレイミド活性化ＫＬＨ（ＩｍｊｅｃｔＡＥとして市販されており、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬより入手可能）にコンジュゲートさせる。ＩｍｊｅｃｔＡＥはヘモシアニンのモルあたり約２５０モルの反応性マレイミド基を含有する。活性化ＫＬＨをリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ８．４）に約７．７ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解する。ペプチド配列中に生じるシステインを介して、又は付着点を提供するために合成したペプチドに予め付加したシステインにペプチドをコンジュゲートする。ペプチドをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶解し、ＫＬＨに付着した反応性マレイミドのモルあたりペプチド約１．５モルのモル比で活性化ＫＬＨと反応させる。ペプチドをコンジュゲートする方法は以下に提示する。このような方法の量、時間及び条件をペプチドコンジュゲートを最適化するために変化させることができるのは通常の業者に周知である。
【０２７２】
以下に記載するコンジュゲーション反応は反応性マレイミド基約０．７７マイクロモルを含有するＫＬＨペプチドコンジュゲート（ｉｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｉ）３ｍｇを得ることに基づいている。このペプチドコンジュゲートの量はウサギにおいてポリクローナル抗血清を産生するための初回注射及び４回のブースター注射に十分である。簡単には、ペプチドをＤＭＳＯ１００μｌあたり１．１６マイクロモルの濃度でペプチドをＤＭＳＯに溶解する。ＤＭＳＯ溶液１００μｌを前記のように調製した活性化ＫＬＨ溶液３８０μｌに加え、ＰＢＳ（ｐＨ８．４）２０μｌを加えて５００μｌの容量にする。反応物を攪拌しながら室温で一晩インキュベートする。反応混合物中の未反応チオールの量を測定することにより反応の程度を判定する。チオールの出発濃度及び最終濃度の差は活性化ＫＬＨにカップリングしたペプチドの濃度であると考えられる。残留チオールの量をエルマン試薬（５，５‘−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて測定する。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）１０ｍｌ中システインＨＣｌ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）３５ｍｇを溶解し、保存溶液を望ましい濃度に希釈することにより、０、０．１、０．５、２、５及び２０ｍＭの濃度でシステイン標準を作製する。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＡＥマイクロウェルプレート（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各ウェルにＰＢＳ（ｐＨ８．４）２００μｌを入れることにより、チオール濃度の光度測定による判定を行う。次に、標準又は反応混合物１０μｌを各ウェルに加える。最終的に、エルマン試薬２０μｌをＰＢＳ（ｐＨ８．４）中１ｍｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに加える。ウェルを室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダー（例えばＢｉｏＲａｄ  ３５５０モデル、ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて全ウェルの吸収を４１５ｎｍで計測する。標準の吸収を用いて標準曲線を構築し、標準曲線から反応混合物のチオール濃度を決定する。遊離チオールの濃度の減少はコンジュゲート反応の成功の指標である。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して室温で６時間透析することにより未反応ペプチドを除去する。直ぐに使用する場合はコンジュゲートを２〜８℃で保存し；そうでない場合は−２０℃未満で保存する。
【０２７３】
３．モノクローナル抗体を含有する腹水の産生。上記のごとく調製した凍結ハイブリドーマ細胞を解凍し、膨張培養した。生存ハイブリドーマ細胞をプリスタン処理マウスの腹腔内に接種した。マウスから腹水を採取し、プールし、０．２μフィルターで濾過し、免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）分析を行って、精製に必要なプロテインＡカラムの容量を決定した。
【０２７４】
４．腹水又は細胞培養上清からのモノクローナル抗体の精製。プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬカラムクロマトグラフィー又は沈降のような様々な方法を使用して腹水又は細胞培養上清からモノクローナル抗体を精製し得る。Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（Ｇ）ＩｇＧ精製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してモノクローナル抗体Ｈ８５Ｃ２１を精製した。２９μｇ／ｍＬのＩｇＧを含有していた４７ｍｌのＨ８５Ｃ２１培養上清を、１００ｍＬの結合バッファ（０．０２Ｍのリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）（Ｐｉｅｒｃｅ）と混合した。１４５ｍｌの混合物を、結合バッファで平衡させたプロテインＧカラムに通した。次にカラムを溶出バッファ（０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．７）（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶出させた。１ｍｌの画分を中和用の１００μＬの１Ｍの炭酸水素ナトリウムを入れた試験管に集めた。画分の２８０ｎｍの吸光度をモニターした。適正な画分をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に２−８℃で一夜透析した。２８０ｎｍの吸光度は、プロテインＧカラムから１．５１ｍｇのＩｇＧが回収されたことを示した。このようにして調製し特性決定した精製モノクローナル抗体を−８０℃で長期保存した。
【０２７５】
５．モノクローナル抗体のさらなる特徴づけ
前記のように産生されたモノクローナル抗体のイソタイプ及びサブタイプを市販のキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて決定できる。モノクローナル抗体のアリコートを２〜８℃で継続保存し、規定の時間中光学密度（ＯＤ）の読みを評価することにより、モノクローナル抗体に関して安定性試験を実施することもできる。
【０２７６】
Ｃ．免疫原としての組換えタンパク質の使用
前記のように作製された組換えタンパク質を、当業者に公知の試薬及び技術に対応する変更を加えて、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の産生において免疫原として使用できることは本発明の範囲内である。
【０２７７】
実施例１５：ＰＣＩＧＦペプチドに特異的に結合する血清抗体の精製
実施例１０に記載されるように調製された固定合成ペプチド、又は実施例１１に記載されるように調製された組換えタンパク質を用いて、前記の実施例１３及び／又は１４に記載されるように得られた免疫血清をアフィニティー精製する。希釈された粗製抗血清をプロテインＡカラム（Ａｆｆｉ−ＧｅｌプロテインＡ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に通すことにより抗血清のＩｇＧ分画が得られる。バッファー（バインディングバッファー、製造者により供給）での溶出により免疫グロブリンでない全てのタンパク質を実質的に除去する。０．１Ｍ  緩衝グリシン（ｐＨ３）で溶出することによりアルブミン及びその他の血清タンパク質を実質的に含まない免疫グロブリン調製物が得られる。
【０２７８】
特異的抗原結合抗体を高い割合で含む調製物を得るためにイムノアフィニティクロマトグラフィーを実施する。抗血清を感作するために使用したペプチドをクロマトグラフィー樹脂に固定し、そのエピトープに特異的な抗体を樹脂に吸着させる。未結合の成分を洗浄によって除去し、特異的抗体を０．１Ｍのグリシンバッファ，ｐＨ２．３で溶出させる。免疫反応性を保存するために抗体画分を１．０Ｍのトリスバッファ（ｐＨ８．０）で直ちに中和する。選択されるクロマトグラフィー樹脂は、ポリペプチド中に存在する反応性基に依存する。ペプチドがアミノ基を有するとき、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０又はＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  １５のような樹脂を使用する（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。ペプチドのカルボキシ基によるカップリングを望むならば、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０２を使用し得る（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。ペプチドが遊離スルフヒドリル基を有しているならば、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  ５０１のような有機水銀性樹脂を使用し得る（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
【０２７９】
あるいは、脾臓を摘出し、モノクローナル抗体製造用ハイブリドーマを作製するために前述のような当業界に公知の常法に従って使用できる。
【０２８０】
実施例１６：組織サンプルのウェスタンブロッティング
０．１Ｍ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５重量／容量％  グリセロール、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０ｍＭ  １，４−ジチオスレイトール、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン及び１．０ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルフォニル中組織サンプルをホモジナイズしてタンパク質抽出物を調製した（Ｓ．Ｒ．Ｋａｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：９８２（１９９４））。ホモジナイズの後ホモジネートを４℃で５分間遠心し、粉砕片から上澄を分離する。タンパク質を定量するために、上澄３〜１０μｌをビシンコニン酸試薬（Ｓｉｂｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１．５ｍｌに加えて得られる５６２ｎｍにおける吸収を測定した。
【０２８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、サンプルをＴｒｉｃｉｎｅバッファー（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で望ましいタンパク質濃度に調整し、２Ｘ  Ｔｒｉｃｉｎｅサンプルバッファー（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等量と混合し、サーマルサイクラー中１００℃で５分間加熱した。次いでサンプルを電気泳動用のＮｏｖｅｘ１０〜２０％  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｔｒｉｃｉｎｅゲルに適用する。電気泳動の後、サンプルをゲルからＮｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒバッファーのニトロセルロース膜に移した。次いでＷｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｓ  Ｐｌｕｓ又はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｓ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）化学ルミネサンス検出キットで提供される試薬及び方法を用いて膜を特異的抗ペプチド抗体でプローブした。
【０２８２】
色素産生性基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドニルホスフェート（ＢＣＩＰ）の添加し、顕色することにより、バンドを膜上で直接可視化した。この色素産生性溶液は０．０１６％  ＢＣＩＰ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１００ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ９．５を含有する。フィルターを溶液中室温で望ましい強度にバンドが顕色されるまでインキュベートした。予め染色した分子量標準（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びビオチン化分子量標準（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の可動性に基づいて分子量を決定した。
【０２８３】
図１及び２は各々ＰＳＡ及びＰＣＩＧＦペプチド（配列番号９）に対する抗血清を用いて組織抽出物のパネルで実施したウェスタンブロットの結果を示す。図１及び２の各々のレーンは異なる組織タンパク質抽出物（１〜６、乳癌；７〜１０、ＢＰＨ；１１〜１３、前立腺癌；１４、マーカー）を表す。図１では、ＢＰＨサンプルの４個全て及び前立腺癌の３個のうち２個のサンプルで３１ｋＤに強いバンドが認められるが、前立腺癌の１個では弱いバンドが認められる。乳癌サンプルでは３１ｋＤにバンドが認められない。
【０２８４】
図２では、３個の前立腺癌サンプルのうち２個に６．５ｋＤ及び１４ｋＤの間にバンドが認められるが、その他のいずれの組織でもバンドは認められない。
【０２８５】
以下の例外以外は前記と類似の方法で競合実験を実施した：１次抗体（抗ペプチドポリクローナル抗血清）をペプチド免疫原の濃度を変化させて４℃で一晩プレインキュベートし、その後ニトロセルロースフィルターに暴露した。ウェスタンブロットの顕色を前記のように続けた。６．５ｋＤでバンドに結合する抗体はＰＣＩＧＦ合成ペプチド（配列番号８）３．６μＭの濃度で阻止された
実施例１７：ＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイ
好ましくは実施例１４で記載するようにウサギから得られた抗血清の免疫反応性を以下のようにマイクロタイタープレートＥＩＡにより判定した。簡単には、実施例１０で記載される世に調製された合成ペプチド、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を炭酸塩バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ９．６）に溶解し、最終濃度２μｇ／ｍｌにした。次にペプチド又はタンパク質溶液１００μｌをＩｍｍｕｌｏｎ  ２ＡＥマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各ウェルに入れた。プレートを室温で一晩インキュベートし、次いで脱イオン水で４回洗浄した。適当なタンパク質遮断剤例えばＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋＡＥ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）１２５μｌを各ウェルに添加してウェルを遮断し、次いで即座に溶液を捨てた。この遮断方法を３回行った。前記するように調製した免疫ウサギ又はマウスから得られた抗血清を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０ＡＥ（モノラウレート・ポリオキシエチレンエーテル）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び０．０５％  アジドナトリウムを含有するＰＢＳ中１：１００、１：５００、１：２５００、１：１２５００及び１：６２５００の希釈でタンパク質遮断剤（例えば３％  ＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋＡＥ溶液）で希釈し、コーティングされたマイクロタイタープレートの各ウェルに配置した。次いでウェルを室温で３時間インキュベートした。各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０ＡＥ及び０．０５％  アジドナトリウムを含有するリン酸塩緩衝生理食塩水中１：２０００に希釈した３％  ＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋＡＥ溶液アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート・ヤギ抗ウサギＩｇＧ又はヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＢ）１００μｌを各ウェルに加えた。ウェルを室温で２時間インキュベートした。次に各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。次いでパラニトロフェニルホスフェイト基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）１００μｌを各ウェルに加えた。ウェルを室温で３０分間インキュベートした。各ウェルで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。４０５ｎｍにおける吸光度が試験ウェルにおいて非免疫血清による吸光度（陰性対照）よりも増加している場合、陽性と決定する。陽性反応は検出可能な抗ＰＣＩＧＦ抗体の存在の指標であった。抗ペプチド抗血清の力価を前記した抗血清の希釈から算出し、算出希釈として決定し、ここでＡ４０５ｎｍ＝０．ＯＤである。
【０２８６】
実施例１８：固相粒子のコーティング
Ａ．ＰＣＩＧＦ抗原に特異的に結合する抗体での微粒子のコーティング
ＰＣＩＧＦポリペプチド（実施例１５参照）に特異的に結合するアフィニティー精製した抗体をポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、ポリメチルアクリレート又は半径約０．１〜２０μｍの範囲の類似の粒子にコーティングする。微粒子を受動的又は能動的のいずれかでコーティングできる。あるコーティング法はＥＤＡＣ（塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））活性化カルボキシル化ラテックス粒子をＰＣＩＧＦポリペプチドに特異的に結合する抗体で以下のようにコーティングすることがからなる。簡単には、適当な容器中で最終濃度０．３７５％の樹脂の固体懸濁液洗浄カルボキシル化ラテックス粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ，Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ又はＳｅｒｏｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー、ｐＨ４．０及び１５０ｍｇ／ｌ  アフィニティー精製した抗ＯＣＩＧＦ抗体（実施例１４参照）を含有する溶液中２５分間混合する。ＥＤＡＣカップリング試薬を混合物に加えて最終濃度５．５μｇ／ｍｌにし、室温で２．５時間混合する。
【０２８７】
次いで０．２μｍ  Ｍｉｄｒｏｇｏｎ濾過モジュールを用いて接線方向のフロー・フィルトレーションにより、微粒子を８容量のＴｅｒｒｎ２０（登録商標）／リン酸ナトリウム洗浄バッファー（ｐＨ７．２）で洗浄する。洗浄した微粒子を、通常は溶解界面活性剤及びタンパク質を遮断剤として含む適当なバッファー中で保存する。
【０２８８】
Ｂ．１／４インチビーズのコーティング
当該分野の常法により、ＰＣＩＧＦ抗原に特異的に結合する抗体で１／４インチビーズポリスチレンビーズすることもでき（Ｓｎｉｔｍａｎら、米国特許第５２７３８８２号、出展明示により本明細書の一部とする）、競合結合又はＥＩＡサンドウィッチアッセイに使用できる。
【０２８９】
最初にポリスチレンビーズを１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３バッファー中、ｐＨ８．０で約１５秒間超音波処理して清浄する。次いで全ての微細物質を除去するまでビーズを脱イオン水で洗浄する。次いでビーズを１０ｍＭ  炭酸塩バッファー（ｐＨ８〜９．５）の抗体溶液に浸す。高アフィニティーモノクローナル抗体の場合、抗体溶液を１μｇ／ｍｌに希釈するか、又はアフィニティー精製しなかったポリクローナル抗体では約５００μｇ／ｍｌの濃度にする。ビーズを室温で少なくとも１２時間コーティングし、次いで脱イオン水で洗浄する。ビーズを空気乾燥するか又は湿らせて（ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）保存することができる。これらをまたタンパク質安定剤（例えばスクロース）又は非特異的結合遮断剤として用いられるタンパク質遮断剤（例えば無関係なタンパク質、Ｃａｒｎａｔｉｏｎスキムミルク、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）、等）で保護コーティングできる。
【０２９０】
実施例１９：微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）
標準的な抗原競合ＥＩＡ又は抗体サンドウィッチＥＩＡを実施することにより、又は固相例えば微粒子（ＭＥＩＡ）を利用することにより患者の被験サンプル中のＰＣＩＧＦを検出する。自動分析器、例えばＩＭｘ（登録商標）アナライザー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ，Ｐａｒｋ，ＩＬ）でアッセイを実施できる。
【０２９１】
Ａ．抗体サンドウィッチアッセイ
簡単には、ＰＣＩＧＦ抗原の含有が疑われるサンプルを抗ＰＣＩＧＦ抗体コーティング微粒子（実施例１７に記載のように調製）の存在下インキュベートし、抗原／抗体複合体を形成する。次いで微粒子を洗浄し、シグナル発生化合物にコンジュゲートした抗体を含んでなるインジケーター試薬（すなわち酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）を抗原／抗体複合体又は微粒子に加え、インキュベートする。微粒子を洗浄し、シグナルアッセイ化合物と反応して測定可能なシグナルを生じる基質（例えば各々４−メチルアンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）又はＯＰＤ／ペルオキサイド）を添加して結合抗体／抗原／抗体複合体を検出する。被験サンプル中で上昇したシグナルを陰性対照により生じたシグナルと比較し、ＰＣＩＧＦ抗原の存在を検出する。被験サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原の存在は前立腺疾患又は状態、例えば前立腺癌の診断の指標である。
【０２９２】
Ｂ．競合結合アッセイ
競合結合アッセイでは、標識ペプチドが微粒子をコーティングする抗ペプチド抗体に接触した場合に測定可能なシグナルを生じるペプチド又はタンパク質を使用する。このアッセイをＩＭｘ（登録商標）アナライザー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で実施できる。ＰＣＩＧＦ抗原の含有が疑われる被験サンプルの存在下、標識されたペプチドをＰＣＩＧＦ抗体コーティング微粒子（実施例１７で記載のように調製）に添加し、標識ＰＣＩＧＦペプチド（又は標識タンパク質）／結合抗体複合体及び／又は患者ＰＣＩＧＦ抗原／結合抗体複合体を形成するのに十分な条件下、十分な時間インキュベートする。被験サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原は微粒子上の結合部位を標識ＰＣＩＧＦペプチド（又はＰＣＩＧＦポリペプチド）と競合する。アッセイでは被験サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原が標識ペプチド及び微粒子上にコーティングされた抗体の結合を低下させ、ＰＣＩＧＦペプチド又はＰＣＩＧＦポリペプチドが抗体結合部位に関して競合する。シグナルの低下（対照と比較）は被験サンプル中のＰＣＩＧＦ抗原の存在を示す。ＰＣＩＧＦ抗原の存在は前立腺疾患又は状態、例えば前立腺癌の診断を示唆する。
【０２９３】
前記で提示され、記載されたＰＣＩＧＦポリヌクレオチド及びそれによりコードされるタンパク質は前立腺組織疾患、とりわけ前立腺癌のマーカーとして有用である。被験サンプル、例えば血液、血漿又は血清中のこのマーカーの出現に基づく試験は、医師が癌の診断をし、治療プロトコルを選択するのを助け、又は選択した治療の成功を経過観察するのを補助する、安価で非侵襲性の診断情報を提供できる。このマーカーは免疫学的方法により検出される疾患組織に由来する抗原として入手しやすい体液例えば血液、尿又は糞便中に現れる。このマーカーは疾患状態で上昇し、疾患状態で変化するか、又は不適切な体内区画において出現する正常前立腺タンパク質であり得る。
【０２９４】
実施例２０：ＰＣＩＧＦタンパク質の免疫組織化学的検出
前記の実施例１４に記載するＰＣＩＧＦポリペプチド配列に由来するＰＣＩＧＦ合成ペプチド（配列番号７、配列番号８及び配列番号９）に対する抗血清を用いて、標準的な方法を用いて種々の正常及び疾患組織を免疫組織化学的に染色する。簡単には、組織の凍結塊を６ミクロンの切片に切断し、顕微鏡スライドに載せる。冷アセトンで固定し、切片を室温で乾燥し、次いでリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、遮断する。スライドをＰＣＩＧＦタンパク質配列（配列番号６）に由来する合成ペプチドに対する抗血清を１：５００に希釈したものと共にインキュベートし、洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートし、再度洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したアビジンと共にインキュベートする。最後の洗浄の後、スライドを赤色に染色する３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質と共にインキュベートする。スライドをヘマトキシリンと共に対比染色、マウントし、病理学者が顕微鏡下で試験する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＰＳＡタンパク質又はＰＣＩＧＦ合成ペプチド（配列番号９）の何れかに対する抗血清でプローブされた組織タンパク質抽出物のパネルにおいて実施されたウェスタンブロットの結果を示す。
【図２】  ＰＳＡタンパク質又はＰＣＩＧＦ合成ペプチド（配列番号９）の何れかに対する抗血清でプローブされた組織タンパク質抽出物のパネルにおいて実施されたウェスタンブロットの結果を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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