(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかの場合に陽性と判定する、ヒト型結核菌の検出方法
（１）フォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１７８塩基対の画分が確認された場合、
（２）フォワードプライマーとして配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１８２塩基対の画分が確認された場合、
（３）フォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１９３塩基対の画分が確認された場合。
【請求項２】
下記の何れかの場合に陽性と判定する、ヒト型結核菌の検出方法
（１）フォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、電気泳動を行い、得られた画分について配列番号６に記載の核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認された場合、
（２）フォワードプライマーとして配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、電気泳動を行い、得られた画分について配列番号７に記載の核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認された場合。
【請求項３】
下記の何れかの場合に陽性と判定する、ヒト型結核菌の検出方法
（１）フォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドを用い、配列番号６に記載の核酸配列の一部からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該標識プローブ由来の標識がリアルタイムＰＣＲ検出系により検出された場合、  
（２）フォワードプライマーとして配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、配列番号７に記載の核酸配列の一部からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該標識プローブ由来の標識がリアルタイムＰＣＲ検出系により検出された場合。
【請求項４】
下記を構成試薬として含んでなるヒト型結核菌検出用試薬キット
（１）配列番号１若しくは２に記載の核酸配列からなり、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー、
（２）配列番号３若しくは４に記載の核酸配列からなり、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅およびその検出系を利用した、臨床検査におけるヒト型結核菌マイコバクテリウム・ツベクローシス（Mycobacterium tuberculosis、以下ヒト型結核菌と記載する。）の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト型結核菌はヒトに結核を起こす病原体であり、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に分類される抗酸性の性質を持つグラム陽性桿菌である。結核は近年著しく減少してきたにもかかわらず、最近になって高齢者の罹患率が上がり、結核感染を経験していない若年層で集団感染を引き起こすなど、深刻な問題となっている。
【０００３】
一方、ヒト型結核菌の他にも、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Mycobacterium kansasii）などの非結核性抗酸菌がヒトに病原性を示すことが知られている。また、ＡＩＤＳウイルスに感染しているような免疫不全者において、非結核性抗酸菌が病気を引き起こす事が大きな問題となっている。これらの非結核性抗酸菌症の多くは抗結核薬に対して抵抗性を示す事から、治療方針を決定する上で、結核症と非結核性抗酸菌症との鑑別診断が重要となる。しかし、臨床症状、病理組織学的所見から結核症と鑑別することは極めて困難であるため、診断は菌の同定によってなされなければならない。
【０００４】
結核症か、又は非結核性抗酸菌症かを鑑別診断する場合、一般的には検体を小川培地上で分離培養し、種の同定のためにさらに生化学的試験を行う方法が行われる。しかしながら、一般にマイコバクテリウム属は発育が遅いので、培養にはかなりの時間を要する。そのため、従来の基本法である塗抹検査や培養検査を行った場合、結核症か否かの診断結果を得るためには菌の分離培養だけで３〜４週間を要し、その後種を同定するための各種試験でさらに２〜３週間を要する。
【０００５】
別にマイコバクテリウム属の抗原に対する抗体を用いた結核菌の検出法もあるが、マイコバクテリウム属種間の交差反応のために結核菌に対する特異性を欠き、感度も充分ではない。
【０００６】
近年、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等の核酸増幅技術を利用した診断技術が有用な手段として検討され、結核菌の診断に於いても利用されるべく検討されており、結核菌DNAゲノムの各種の領域が、PCRを利用した結核菌検出におけるターゲットとして利用できるか研究されてきた。
【０００７】
例えばマイコバクテリウム属の65キロダルトン抗原をコードする遺伝子領域を検出する方法が報告されている（例えば、非特許文献１，非特許文献２、非特許文献３，非特許文献４、非特許文献５参照）。しかしながら、65キロダルトン抗原遺伝子は、ヒト型結核菌の他にM. avium（トリ型結核菌），M. fortuitum, M. paratuberculosis，M. kansasii，M. malmoense，BCG 及びM. marinum等の同属菌も持っている事が知られている。特に、非結核性抗酸菌症の代表的な原因菌であるM. avium或いはM. kansasiiと交叉性が高いため、65キロダルトン抗原遺伝子を検出する方法は、ヒト型結核菌を特異的に検出する方法としては問題点が残る。
【０００８】
また、Mycobacterium bovis DNAより同定された配列であるＭＰＢ７０タンパク質をコードする遺伝子配列を用いて、M. tuberculosisの同定を行う試験方法が検討されている（例えば、非特許文献６参照）。しかしながら、Kulskiらは、FEMS Microbiol Lett. 1997 Mar 1;148（1）:43-48.（非特許文献７）でその結果を報告しているが、その中で行われたPCR検証の結果、ＭＰＢ７０タンパク質をターゲットとした場合では、M. kansasii のDNA中に存在する類似配列との交差反応が生じる事が判明し、この方法もヒト型結核菌検出を特異的に検出するには問題点が残る。
【０００９】
他に、タンパク抗原b(Pab)をコードする遺伝子配列をマーカーとしたM. tuberculosis/bovisの検出方法が報告され（例えば、非特許文献８参照）、このマーカーを、M. tuberculosis／bovis 検出目的で使用する事の有用性が確認された。しかしながら、Pab遺伝子は結核ゲノム中に1コピーのみしか存在しないので、核酸増幅ターゲット材料としてはあまり好ましくないと考えられた（これに対し、後述のIS6110配列は結核ゲノム中に10コピー存在する。）。
【００１０】
更に、IS6110をプローブとしたRFLP（Restriction fragment length polymerization）が結核菌の診断に利用できることが報告され（例えば、非特許文献９参照）、結核の疫学調査の重要なツールとして世界各国で用いられるようになった。IS6110は結核菌特有の挿入配列であり、染色体DNA上に複数個存在し、菌株ごとにその数、位置が異なり、この形質はある程度安定に遺伝していく。その結果、菌株の相違によって異なるRFLPパターンを示し、由来ごとのグループ分けも可能となる。これまでに、IS6110を用いた結核の検出方法に関して多数の報告があり、75%を越える感度および100%に近い特異性があることが報告されている。しかしながら、その一方で、IS6110を用いた検出方法では、偽陽性が生じる問題があるという研究結果も報告されている（非特許文献１０）。また、IS6110に特異的なプライマーを設計してPCRを行う検出方法もあるが（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３，特許文献４参照）、M. tuberculosis以外のマイコバクテリア属由来のIS6110に関係する配列も増幅するという問題がある。更にはIS6110様の配列が結核菌以外の他の微生物にも存在し、IS6110をターゲットとした検出方法では、これらの微生物も検出され得るという疑いが示唆された。従って、従来のIS6110を検出する方法は、いずれもヒト型結核菌を特異的に検出するという点においては不十分であり、問題があった。
【００１１】
以上のことから、新たなヒト型結核菌を特異的に検出する方法を確立することが望まれている現状にあった。
【００１２】
【特許文献１】
特表平5-507617号公報
【特許文献２】
特表平11-514522号公報
【特許文献３】
特許第2814422号公報
【特許文献４】
米国特許第5370998号明細書
【特許文献５】
特開昭60-500717号公報
【特許文献６】
特開昭60-281号公報
【特許文献７】
米国特許第5210015号明細書
【特許文献８】
米国特許第5538848号明細書
【特許文献９】
米国特許第5,801,155号明細書
【特許文献１０】
米国特許第5925517号明細書
【特許文献１１】
米国特許第6,492,121号明細書
【特許文献１２】
特許第2650159号公報
【特許文献１３】
特公平7-114718号公報
【特許文献１４】
特開昭58-40099号公報
【特許文献１５】
特開昭62-265999号公報
【非特許文献１】
Chia et al., J. Clin. Microbiol., 1990年, 第28巻, 第9号, p.1877-1880
【非特許文献２】
Brisson-Noelet al., Lancet, 1989年, 第334巻, p.1069-1071
【非特許文献３】
Hackel et al., Molecular and cellular Probes, 1990年, 第4巻, p.205-210
【非特許文献４】
Woods, Cole, FEMS Mycrobiology Letters, 1989年, 第65巻, p.305-310
【非特許文献５】
Hance et al., Molecular Microbioloby, 1989年, 第3巻，第7号, p.843-849
【非特許文献６】
Kulski et al., J. Clin.Microbiol., 1995年, 第33巻, p.668-674
【非特許文献７】
Kulski et al., FEMS Microbiol Lett. 1997年3月1日, 第148巻,第1号, p.43-48.
【非特許文献８】
Sjobring et al., J. Clin. Microbiol., 1990年, 第28巻, 第10号, p.2200-2204
【非特許文献９】
Hermans PWM et al., J. Clin. Microbiol., 1990年, 第28巻, p.2051-2058
【非特許文献１０】
Lee et al., Neuro1ogical Sciences, 1994年, 第123巻, p.173-179
【非特許文献１１】
Thierry et al., Nucleic Acid Res., 1990年, 第18巻, 第1号, p.188
【非特許文献１２】
Nucleic Acids Res.,1986年, 第14巻, p.6115-6128
【非特許文献１３】
Kent PT, Kubica GP, Pubric Health Mycobacteriology, A Guide for the Level III Laboratory, U.S.Department of Health and Human Services, Public Health Service, Center for Disease Control, Atlanta, U.S.A., 1985年, p.31-55
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、診断上の偽陽性を排除した新規な結核菌検出用プライマー、及びこれを用いた簡便、迅速且つ精度の高いヒト型結核菌の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は上記課題を解決する目的でなされたもので、以下の構成よりなる。
（１）下記の何れかの場合に陽性と判定する、ヒト型結核菌の検出方法
（i）フォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１７８塩基対の画分が確認された場合、
（ii）フォワードプライマーとして配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１８２塩基対の画分が確認された場合、
（iii）フォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１９３塩基対の画分が確認された場合。
（２）下記の何れかの場合に陽性と判定する、ヒト型結核菌の検出方法
（i）フォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、電気泳動を行い、得られた画分について配列番号６に記載の核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認された場合、  
（ii）フォワードプライマーとして配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った後、電気泳動を行い、得られた画分について配列番号７に記載の核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認された場合。
（３）下記の何れかの場合に陽性と判定する、ヒト型結核菌の検出方法
（i）フォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドを用い、配列番号６に記載の核酸配列の一部からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該標識プローブ由来の標識がリアルタイムＰＣＲ検出系により検出された場合、  
（ii）フォワードプライマーとして配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、配列番号７に記載の核酸配列の一部からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該標識プローブ由来の標識がリアルタイムＰＣＲ検出系により検出された場合。  
（４）下記を構成試薬として含んでなるヒト型結核菌検出用試薬キット
（i）配列番号１若しくは２に記載の核酸配列からなり、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー、
（ii）配列番号３若しくは４に記載の核酸配列からなり、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー。
【００１５】
本発明者らは、現在までに決定されたヒト型結核菌とその他の生物の各種遺伝子について、各種間の各遺伝子配列の相同性の理論的検証と実験的検証を重ねた結果、ヒト型結核菌の挿入繰り返し配列であるIS6110配列の特定領域に特異的にハイブリダイズし、ヒト型結核菌の検出に有用となる塩基配列が存在することを見出した。
【００１６】
これらの知見をもとに更に鋭意研究の結果、ヒト型結核菌に特異的で、その検出に有用なオリゴヌクレオチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に記載の核酸配列）と、それらを利用したヒト型結核菌検出用核酸プライマー及び標識プローブを開発し、これらを用いたヒト型結核菌の検出方法を確立した。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係るヒト型結核菌の検出方法によれば、従来のIS6110をターゲットとした結核菌の検出法と比べて、診断上の偽陽性が排除可能となり、より特異性及び精度の高いヒト型結核菌の検出が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１において得られた電気泳動の結果である。  尚、各レーンの数字は、夫々以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。Ｍ４：分子量マーカー（マーカー４）、ａ：Escherichia coli （大腸菌）、ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）、ｃ：Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム・カンサシイ）、ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）、ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）、ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）、ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）、ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）、ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）、ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）、ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）、ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）、ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）、ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）、ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）、ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）、ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）、ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）、ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）。
【図２】実施例２において得られた電気泳動図である。  尚、各レーンの数字は、夫々以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。Ｍ１：分子量マーカー（マーカー１）、Ｍ４：分子量マーカー（マーカー４）、ａ：Escherichia coli （大腸菌）、ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）、ｃ：Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム・カンサシイ）、ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）、ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）、ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）、ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）、ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）、ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）、ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）、ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）、ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）、ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）、ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）、ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）、ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）、ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）、ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）、ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）。
【図３−１】比較例１において得られた電気泳動図である。  尚、各レーンの数字は、夫々以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。  また、Mycobacterium nonchromogenicum を試料とした場合（ｍ）のバンドを点線で丸く囲んで示した。また、Mycobacterium trivialeを試料とした場合（ｏ）のバンドを点線で丸く囲んで矢印で示した。Ｍ１：分子量マーカー（マーカー１）、Ｍ４：分子量マーカー（マーカー４）、ａ：Escherichia coli （大腸菌）、ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）、ｃ：Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム・カンサシイ）、ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）、ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）、ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）、ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）、ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）、ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）、ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）、ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）、ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）、ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）、ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）、ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）、ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）、ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）、ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）、ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）。
【図３−２】Mycobacterium triviale試料について上記電気泳動で得られた画分（ｏ）に於いて、ヒト型結核菌の陽性バンドと増幅断片のサイズが酷似していると判断された画分のPCR産物を精製、分析して得られた核酸配列表を示す。ここで、画分（ｂ）のヒト型結核菌由来PCR産物の配列を1st Nucleotide Sequence とし、配列表の上段に比較のために示した。また、画分（ｏ）より得られたMycobacterium triviale由来PCR産物の配列を2nd Nucleotide Sequenceとし、配列表の下段に示した。
【図４】実施例３で行ったリアルタイムPCR検出結果を示し、各PCR用DNA試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットした検量線である。
【図５】実施例４で得られた電気泳動の結果である。尚、各レーンの数字は、それぞれ以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。Ｍ：分子量マーカー、(１)試料なし、(２)ヒト型結核菌＋M.avium＋M.intracellulare＋M.kansasii、(３)ヒト型結核菌、(４)M.avium＋M.intracellulare＋M.kansasii、(５)ヒト型結核菌(10コピー)＋M.avium＋M.intracellulare＋M.kansasii、(６)M.avium、(７)ヒト型結核菌＋M.intracellulare＋M.kansasii。  また、電気泳動パターンの左に電気泳動方向を矢印で示し、各増幅産物の画分の現れる順番を示した。「TB」はM.tuberculosis、「avium」はM.avium、「intra」はM.intracellulare、「kansasii」はM.kansasiiを夫々示す。
【図６】実施例５で行ったリアルタイムPCR検出結果を示し、各PCR用DNA試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットした検量線である。
【００１９】
本発明に係るヒト型結核菌のIS6110遺伝子は、全長８８５塩基対の塩基配列から成り、例えばパスツール研による報告「Nucleic Acid Res 1990, No.18（1）,p.188」（非特許文献１１）にその全塩基配列が記載されている。
【００２０】
本発明に係るオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる（以下、本発明のオリゴヌクレオチドと略記する。）。
【００２１】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、更に好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部または全部を含有し、且つ連続する１０塩基以上、好ましくは２０塩基以上からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００２２】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部若しくは全部に対する相補配列の、一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００２３】
上記の、本発明に係る本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の一部若しくは全部を有するオリゴヌクレオチドとは、具体的には、本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００２４】
尚、ここでいう「ハイストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば50%ホルムアミド中で42〜70℃で、好ましくは60〜70℃でのハイブリダイゼーション、その後の0.2〜2×SSC、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）中で25〜70℃での洗浄という条件である。
【００２５】
また、「ストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜70℃の温度の条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で洗浄という条件である。
【００２６】
本発明に係るヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとは、前記したヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。そのハイストリンジェントな条件及びストリンジェントな条件は、前記したとおりである。
【００２７】
尚、本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（DNA）でもリボ核酸（RNA）でもよい。リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリジン残基を含むDNAであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴに変えたチミジン残基を含むRNAであってもよい。また、１若しくは複数のヌクレオチドが欠失、挿入或いは置換されていたり、イノシン（I）のような修飾ヌクレオチドがあってもよい。
【００２８】
本発明のオリゴヌクレオチドを得るには、自体公知の化学合成法により調製したものを用いればよい。そのため、クローン化したオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに比べ、容易、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能である。
【００２９】
例えば、DNAの合成に通常行われている、DNAシンセサイザーを用い、通常のホスホアミダイト法にてオリゴヌクレオチドを合成し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる常法により精製すれば、目的とする本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
【００３０】
本発明に係るヒト型結核菌検出用プライマーとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、ヒト型結核菌検出用プライマーが挙げられる（以下、本発明のプライマーと記載する。）。
【００３１】
本発明のプライマーに用いられる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの具体例は、前記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明に於いて記載したとおりである。
【００３２】
また、本発明のプライマーは、例えば、目的とする核酸ハイブリダイゼーション条件に合わせて、配列番号１〜５に記載の核酸配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドの中から、解離温度（Ｔｍ値）などを考慮して、適当な領域の適当な長さで使用すればよい。好ましくはプライマー配列としての特異性を維持するために必要な塩基数と考えられている、１０塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上の長さを有しているものがよい。
【００３３】
本発明のプライマーをPCR等に使用する場合のプライマーとしては、例えば、フォワードプライマーが配列番号１又は２に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーが配列番号３又は４に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００３４】
中でも、フォワードプライマーが配列番号１又は２に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーが配列番号３又は４に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００３５】
特に好ましいプライマーの組合せとしては、(ａ)フォワードプライマーが配列番号１に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号３に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドである組合せ、又は(ｂ)フォワードプライマーが配列番号２に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号４に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドである組合せが挙げられる。
【００３６】
本発明のプライマーを得る方法は、前記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。
【００３７】
本発明のプライマーは、標識物質で標識化されていてもよい。
【００３８】
本発明のプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。
【００３９】
例えば、放射性同位体としては32P，33P，35S等、酵素としてはアルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等、蛍光物質としてはCyanine Dye系のCy3，Cy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、フルオレセイン等、発光物質としてはAcridinium Esterを含む化学発光試薬等が挙げられる。
【００４０】
本発明のプライマーを放射性同位体により標識する場合は、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般によく用いられているランダムプライマー法、ニックトランスレーション法、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼによる5'−末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた3'−末端標識法、RNAラベリング法等が挙げられる。
【００４１】
本発明のプライマーを酵素で標識する場合は、アルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の、この分野に於ける常法である直接標識法を用いればよい。
【００４２】
蛍光物質により標識する場合は、例えばフルオレセイン標識したヌクレオチドをこの分野に於ける常法の標識手法によりプライマーに取り込ませればよい。また、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチドの一員として置換する方法（例えば、非特許文献１２参照）でもヌクレオチドを蛍光物質で標識することができる。その場合、５位にリンカーアームを有するウリジンを特開昭60-500717 号公報（特許文献５）に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリゴヌクレオチド鎖に蛍光物質を導入する方法もある。
【００４３】
発光物質で標識する方法及びビオチンで標識する方法は、通常この分野で行われているヌクレオチドを発光標識又はビオチン標識する常法に従って行えばよい。
【００４４】
本発明に係るヒト型結核菌検出用プローブとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）を含有するプローブが挙げられる（以下、本発明のプローブと記載する。）。
【００４５】
本発明のプローブに用いられる、本発明のオリゴヌクレオチドの具体例は、前記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明に於いて記載したしたとおりである。
【００４６】
本発明のプローブは、例えば、目的とする核酸ハイブリダイゼーション条件に合わせて、配列番号１〜８に記載の核酸配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドから、解離温度（Ｔｍ値）などを計算し、適当な領域を適当な長さで使用すればよい。しかし、プローブに十分な特異性を持たせたいのならば、プローブ配列としての特異性を維持するために必要な塩基数と考えられている１０塩基以上、さらに望ましくは２０塩基以上の長さを有しているものが好ましい。
【００４７】
尚、配列番号６，配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列は、本発明のプライマーを用いたPCRにより増幅される核酸配列である。例えば、配列番号６に記載の核酸配列は、配列番号１に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号３に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いたPCRにより増幅される配列であり、配列番号７に記載の核酸配列は、配列番号２に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号４に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いたPCRにより増幅される配列であり、配列番号８に記載の核酸配列は、配列番号４に記載の核酸配列の相補鎖配列であるオリゴヌクレオチド（配列番号１４）をフォワードプライマーとし、配列番号５に記載の核酸配列のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いたPCRにより増幅される配列である。
【００４８】
本発明のプローブを得る方法は、前記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。
【００４９】
本発明のプローブは、標識物質で標識化されていてもよい。
【００５０】
本発明のプローブを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。
【００５１】
本発明のプローブを標識する標識物質の具体例及び標識化方法は、本発明のプライマーの標識方法の説明に於いて記載したとおりである。
【００５２】
また、後述するリアルタイムPCR検出法に於いて用いられる標識プローブとしては、本発明のプローブを、リアルタイム検出法において通常用いられている標識物質で標識化したものが挙げられる。例えば、5'末端がレポーター蛍光物質（カルボキシフルオレセイン（FAM）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、テトラクロロフルオレセイン(TET)等）で標識化され、3'末端がクエンチャー色素[例えばカルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）等の蛍光物質、Black Hole Quencher色素（BHQ），4-((4-(dimethylamino) phenyl)azo)benzoic acid (DABCYL)等の非蛍光物質]で標識化された本発明のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５３】
本発明に係るヒト型結核菌の検出に用いられる試料としては、ヒトの喀痰、血液、経気管支採取物等の各種臨床材料が挙げられる。また、検体から単離、培養された培養菌体、これらより単離、精製された核酸、又は核酸増幅検出系等で増幅された核酸でもよい。
【００５４】
上記試料からDNAを抽出・精製するには、検体からの抗酸菌（結核菌）DNA抽出に用いられる常法に従って行えばよい。
【００５５】
例えば菌体を試料とする場合には、例えばSDS等の界面活性剤や、グアニジンチオシアネート（GTC）等の蛋白変性剤で菌体を処理して結核菌の膜構造を破壊する方法、菌体をガラスビーズ等によって物理的に破砕する方法等が挙げられる。
【００５６】
喀痰を試料とする場合には、前処理として、米国疾病管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention、略称CDC）で推奨しているNALC （N-acetyl-L-cysteine） -NaOH法（非特許文献１３）による検体の均質化を行えばよい。
【００５７】
その後、一般的なDNAの調整法（フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿法等  Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin. Microbiol., 1990, Mar;28（3）, 495-503, Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J）によりDNAの抽出及び精製を行えばよい。
【００５８】
検体から単離、培養された培養菌体を、ヒト型結核菌を検出する試料として用いる場合を例にとって示すと、例えば小川培地上のコロニーを採取し、滅菌蒸留水に懸濁、遠心分離して菌体を集めた後、蒸留水に再懸濁し、オートクレーブ処理した後、菌体の粉砕処理（ガラスビーズによる物理的破砕等）を経て、さらに遠心分離して上清を回収する。得られた上清からDNAを抽出精製すればよい。DNAの抽出精製には、そのための様々なキットが市販されているので、それを用いてもよいし、この分野に於ける常法（例えば、フェノール・クロロホルム抽出法、エタノールやイソプロパノール等を用いて沈殿させる方法等）に従って行ってもよい。例えば（株）キアゲン製イオン交換樹脂タイプ  DNA抽出精製キットGenomic-tip等を用いてDNAの抽出、精製を行えばよい。
【００５９】
本発明に係るヒト型結核菌の検出方法としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして用いる方法（本発明のプライマー及び／又はプローブを用いる方法）が挙げられる。
【００６０】
例えば、本発明のプライマーを用いて、これを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、DNAポリメラーゼ等による核酸増幅（例えばPCR；特許文献６）を行ってプライマー伸長させることにより、ヒト型結核菌についてIS6110核酸配列の特定の領域の配列を増幅させることができるので、得られたプライマー伸長物を測定することにより、ヒト型結核菌を検出することができる。
【００６１】
本発明に係る、本発明のプライマーを用いるヒト型結核菌の検出方法の具体例としては、
「下記工程
（i）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）として用い、試料中の核酸を鋳型としてPCRを行う、
（ii）上記(i)で得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、その結果からヒト型結核菌の有無を判定する、
を包含することを特徴とするヒト型結核菌の検出方法」が挙げられる。
【００６２】
上記方法に於いて用いられる本発明のプライマーの具体例は、前記したとおりである。
【００６３】
好ましくは、フォワードプライマーとしては配列番号１又は２に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーとしては配列番号３又は４に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６４】
上記プライマーを用いたPCR、及び続いて行う電気泳動法の条件、操作法等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。
【００６５】
電気泳動を行い、その結果からヒト型結核菌の有無を判定する方法としては、例えば（ａ）目的とする塩基対数のプライマー伸長物画分を確認することにより判定する方法、（ｂ）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより判定する方法等が挙げられる。
【００６６】
（ａ）の目的とする塩基対数のプライマー伸長物画分を確認することにより判定する方法としては、
例えばフォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１７８塩基対の画分が確認されたものを陽性と判定する方法が挙げられる。
【００６７】
また、例えばフォワードプライマーとして配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１８２塩基対の画分が確認されたものを陽性と判定する方法でも良い。
【００６８】
また、例えばフォワードプライマーとして配列番号１４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、３２４塩基対の画分が確認されたものを陽性と判定する方法でも良い。
【００６９】
（ｂ）の標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより判定する方法としては、例えば電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、本発明のヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在の有無を、該標識プローブの標識を検出することによって確認したものを陽性と判定する方法が挙げられる。
【００７０】
例えば、フォワードプライマーとして配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った場合を例に取ると、PCR後、電気泳動を行い、得られた画分について、配列番号６に記載の核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在の有無を、該標識プローブの標識を検出することによって確認したものを陽性と判定する方法が挙げられる。
【００７１】
また、フォワードプライマーとして配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った場合には、PCR後、電気泳動を行い、得られた画分について配列番号７に記載の核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在の有無を、該標識プローブの標識を検出することによって確認したものを陽性と判定すればよい。
【００７２】
また、フォワードプライマーとして配列番号１４に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った場合には、PCR後、電気泳動を行い、得られた画分について配列番号８に記載の核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在の有無を、該標識プローブの標識を検出することによって確認したものを陽性と判定すればよい。
【００７３】
本発明に係るヒト型結核菌の検出方法の詳細を、例えばフォワードプライマーとして配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを用いたPCR、及び電気泳動を行った後、目的とする塩基対数のプライマー伸長物画分を確認する方法によって検出する場合を例に挙げて説明すると、以下の通りである。
【００７４】
まず、前記した方法に従い、ヒト型結核菌を検出すべき試料中から精製DNA試料を得る。別に、前記した方法で、本発明に係るヌクレオチドから、DNAシンセサイザーを用いてホスホアミダイト法にて、配列番号２に示される配列（以下、IS_F6と記載する。）及び配列番号４に示される配列（以下、IS_R6と記載する。）のオリゴヌクレオチドを合成する。
【００７５】
各0.2〜2.0μM のIS_F6及びIS_R6、1.0〜4.0mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.005〜0.2% Triton X-100（トリトンX-100、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社商品名）、夫々0.1〜0.6mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよび10〜80単位/mLのTaq DNA ポリメラーゼを含有する10mM Tris-HCl（pH8.9）緩衝液を調製し、PCR用反応液とする。
【００７６】
PCR用反応液に精製DNA試料１ngを添加したものをPCR用試料として用い、DNAサーマルサイクラーにて、20- 40回PCRを行う。得られたPCR後の反応液５μLを、１.５％アガロースゲル電気泳動する。次いでエチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出する。また、分子量マーカーも反応液と同時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたDNA断片の長さを算出する。フォワードプライマーとしてIS_F6、及びリバースプライマーとしてIS_R6を用いたPCRでは、IS6110の核酸配列中の182塩基対のDNA断片（配列番号７）が複製されると予測される。そこで、182塩基対の蛍光バンドが確認されたものを陽性と判定すればよい。
【００７７】
本発明に係るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるヒト型結核菌の検出方法の別の実施態様としては、本発明のプライマーを前記した方法で標識化した標識プライマーを用いて試料中の核酸を鋳型としたPCRを行い、得られたプライマー伸長物の標識を測定することによって、標識を検出できた場合には、ヒト型結核菌陽性と判定する方法が挙げられる。
【００７８】
上記方法の場合、PCRを行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長物の標識を測定し、標識を検出できた場合に、ヒト型結核菌陽性と判定すればよい。
【００７９】
遊離の標識プライマーを除く方法としては、PCR反応を行って得られた反応物中のプライマー伸長物を、核酸を沈殿させる常法（エタノール沈殿法、イソプロパノールを用いた沈殿法等）により沈殿させた後、沈殿しなかった遊離の標識プライマーを含有する上清を除去する方法が挙げられる。
【００８０】
また、PCR反応を行って得られた反応物を適当な条件下、ゲルクロマトグラフィーで処理して、プライマー伸長物と遊離の標識プライマーを分離する方法、電気泳動法により分離する方法等も挙げられる。
【００８１】
本発明のヒト型結核菌の検出方法には、リアルタイム増幅検出系（例えば特許文献７、特許文献８の記載参照）も用いることができる。
【００８２】
リアルタイム増幅検出系による検出系の例として、例えばリアルタイムPCR検出系が挙げられる。
【００８３】
例えば、TaqManTMリアルタイムPCR法（例えば特許文献８の記載参照）、MGB Eclipse Probe System法（例えば特許文献９の記載参照）、Molecular Beacons Probe Technology法（例えば特許文献１０の記載参照）、LUX Fluorogenic Primer法（Invitrogen Corporation）、Quenching probe-PCR（QP）法（例えば特許文献１１の記載参照）など、様々なリアルタイムPCR検出法が本発明のヒト型結核菌の検出方法に用いることができる。
【００８４】
より具体的には、5'末端をFAMで、3'末端をTAMRAで標識したプローブを用いたTaqManTMリアルタイムPCR法（例えば特許文献８の記載参照）により、目的の微量なDNAを高感度かつ定量的に検出できる。
【００８５】
即ち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして（本発明のプライマー）用い、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部若しくは全部又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の5'末端がレポーター蛍光色素で標識化され、3'末端がクエンチャー色素で標識化されたものを標識プローブとして用いて、試料中の核酸を鋳型としてPCRを行い、該標識プローブから遊離された標識物質を検出することにより行う方法である。
【００８６】
上記のTaqManTMリアルタイムPCR法の原理は以下の通りである。5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャー色素によってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光標識プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からTaq DNAポリメラーゼを用いてPCRを行う。Taq DNAポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光標識プローブが5'端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムPCR法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型DNAの初期量を正確に定量することができる。
【００８７】
本発明に係るリアルタイムPCR検出系に用いられる5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識したプローブに用いられるプローブとしては、前記した本発明のプローブの他、該プローブの配列から設計されたものであっても良い。例えば配列番号６から設計された配列番号１１で示される配列が挙げられる。また、5'末端を標識するレポーター蛍光物質としてはFAM、HEX、TET等が挙げられるが、中でもFAMが好ましい。3'末端を標識するクエンチャー色素としては、TAMRA等の蛍光物質、BHQ，DABCYL等の非蛍光物質が挙げられるが、中でもTAMRAが好ましい。
【００８８】
本発明に係るリアルタイムPCR検出系に用いられるフォワードプライマーの好ましい例としては、配列番号１又は２に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられ、リバースプライマーの好ましい例としては、配列番号３又は４に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００８９】
リアルタイムPCR検出系に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、DNAポリメラーゼ等の試薬は、通常のリアルタイムPCRで用いられているものを用いればよく、リアルタイムPCRの手法は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、リアルタイムPCRの一般的なプロトコルに従って行えばよい。
【００９０】
本発明に係るリアルタイムPCR検出系（TaqManTMリアルタイムPCR法）によるヒト型結核菌の検出方法の一例を説明すると、以下の通りである。
【００９１】
まず、前記した方法に従い、ヒト型結核菌を検出すべき試料中から精製DNA試料を得る。別に、DNAシンセサイザーを用いて  ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される配列（IS_F5）、配列番号３に示される配列（IS_R5）のオリゴヌクレオチドを合成する。
【００９２】
また、IS_F5およびIS_R5をプライマーとして用いたPCRで増幅される配列番号６のオリゴヌクレオチド配列から、プローブとして利用するための配列（配列番号１１）を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成する。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素FAMを、3’末端にレポーター消光体のTAMRAを常法により結合し、蛍光標識プローブを得る。
【００９３】
上記で調製したIS_F5をフォワードプライマーとして、IS_R5をリバースプライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムPCRを行う。
【００９４】
即ち、各１μMのプライマーIS_F5、及びプライマーIS_R5、100〜1000nMの蛍光標識プローブ、1.0〜4.0mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%TritonX-100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位/mLのTaq DNA ポリメラーゼを含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、反応液とする。反応液20μLに精製DNA試料1ngを加えたものをPCR用試料とし、これを９６穴反応プレートのウェルに入れ、TaqMan TM  PCR 専用リアルタイムPCR検出装置等を用いてリアルタイムPCRを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定する。
【００９５】
ヒト型結核菌の判定においては、レポーター色素の発光量が測定された場合に、ヒト型結核菌陽性と判定すればよい。
【００９６】
また、リアルタイムPCR法では、検量線を作成することができるので、試料中のヒト型結核菌のゲノムDNAの数（コピー数）を得ることがでる。また、その数はヒト型結核菌の数に比例するので、試料中のヒト型結核菌の数も得ることができる。検量線の作成方法は、リアルタイムPCR法において通常行われている常法に従えばよい。例えば、標準としてコピー数既知のヒト型結核菌のゲノムDNA試料を用い、希釈系列の濃度（コピー数）のPCR用DNA試料を調製する。次いで各希釈系列のPCR用DNA試料を用いて上記方法に従いリアルタイムPCRを行い、レポーター色素の発光量を測定する。各希釈系列のPCR用DNA試料毎に、PCRの各サイクル数（ｘ軸）に対する、測定した発光量の測定値(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成する。次いで、発光量が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引く。Thと各PCR用DNA試料の増幅曲線が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とする。次いで用いた各PCR用DNA試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。
【００９７】
試料中のヒト型結核菌のゲノムDNAの数（コピー数）を定量するには、先ずヒト型結核菌を検出すべき試料中からDNAを分離精製した後、得られたDNA試料についてリアルタイムPCRを行い、同様に増幅曲線を作成する。検量線を作成したときのThと得られた増幅曲線が交差したCt値を得る。そのCt値を検量線に当てはめることにより、試料中のヒト型結核菌のゲノムDNA量（コピー数）を得ることができる。
【００９８】
また本発明は、核酸増幅工程において、RNA転写産物を利用した検出法を適用する事ができる。例えば、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）法（特許文献１２）、３ＳＲ（self-sustained sequence replication）法（特許文献１３）などが挙げられるが、中でも逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの協奏的作用（逆転写酵素およびRNAポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させ）を利用する一定温度核酸増幅法が測定系の自動化には適する。
【００９９】
更に、本発明のヒト型結核菌の検出方法として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）を標識物質で標識化したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出する方法が挙げられる。
【０１００】
具体的には、例えば（ａ）本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に結合して、捕捉プローブとして用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、試料中のヒト型結核菌由来の核酸を固相上に固定化させる検出法、（例えば、特許文献１５の記載参照）（ｂ）(a)の捕捉プローブと、本発明の標識プローブを用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、固相担体上に補足プローブとヒト型結核菌由来の核酸と標識プローブの複合体を形成させて、標識プローブの標識を測定するサンドイッチアッセイ（例えば、特許文献１４の記載参照）を行う方法、等が挙げられる。また（ｃ）ビオチンで標識した本発明の標識プローブを用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーション後、試料中のヒト型結核菌由来の核酸をアビジン結合担体で捕捉する方法も用いることができる。
【０１０１】
尚、本発明のヒト型結核菌の検出方法に用いられる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、PCRやハイブリダイゼーション反応を阻害しないものを用いることが出来る。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【０１０２】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のPCRやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。
【０１０３】
また、必要に応じて核酸合成酵素（DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などが用いられる。
【０１０４】
本発明に係るヒト型結核菌検出用試薬キットとしては、「配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に記載の核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）として含んでなるヒト型結核菌検出用試薬キット。」が挙げられる。プライマーは標識物質で標識化されたものであってもよい。
【０１０５】
上記キットは、更に、本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識化したものを標識プローブとして含んでいてもよい。
【０１０６】
また、「（１）配列番号１又は２に記載の核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー
（２）配列番号３又は４に記載の核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つヒト型結核菌のIS6110遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの」が挙げられる。
【０１０７】
上記キットは、更に、本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識化したものを標識プローブとして含んでいてもよい。
【０１０８】
更に、「本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして含んでなるヒト型結核菌検出用試薬キット。」が挙げられる。該プローブは標識物質で標識化されたものであってもよい。
【０１０９】
これらのキットを構成する構成試薬の好ましい態様及び具体例は前記したとおりである。
【０１１０】
尚、本発明のヒト型結核菌の検出用試薬キットには、例えば緩衝剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、PCRやハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【０１１１】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のPCRやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。
また、必要に応じて核酸合成酵素（DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などを含んでいてもよい。
【０１１２】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【実施例】
【０１１３】
実施例１
（１）結核菌検出用PCRプライマーの合成
ＡＢＩ社DNAシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号２に示される配列（ACCTCACCTATGTGTCGACC、以下、IS_F6と記載する）及び配列番号４に示される配列（AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG、以下、IS_R6と記載する）のオリゴヌクレオチドを合成した。合成手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液を５５℃で一夜加熱することにより実施した。次いでファルマシア社製ＦＰＬＣを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、合成オリゴヌクレオチドを精製した。
（２）試料の調製
以下に示す細菌を用い、下記の方法でDNAを抽出・精製し、DNA試料を得た。細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。
まず、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌については、小川培地上のコロニーを精製水に懸濁し、オートクレーブ処理（１２０℃・２気圧、２０分）した後、菌体の粉砕処理（直径2mmガラスビーズによる物理的破砕）を経て、遠心分離し、上清を得た。得られた上清から、(株)キアゲン製のイオン交換樹脂タイプ  DNA抽出精製キットGenomic-tipを用いてDNAの抽出、精製を行った。また、大腸菌については、大腸菌のDNA抽出方法の常法に従い、DNAを抽出、精製した。
【０１１４】
得られた精製DNAを、最終１ng／μL（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、DNA試料とした。
ａ：Escherichia coli （大腸菌）
ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）
ｃ：Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム・カンサシイ）
ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）
ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）
ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）
ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）
ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）
ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）
ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）
ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）
ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）
ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）
ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）
ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）
ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）
ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）
ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）
ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）
【０１１５】
（３）PCR
上記（1）で調製したIS_F6をフォワードプライマーとして、IS_R6をリバースプライマーとして用い、下記の通りPCRを行った。
まず、各１μMのプライマーIS_F6及びプライマーIS_R6、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% Triton X-100（トリトンX-100、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社商品名）、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/mL を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、PCR用反応液とした。
PCR用反応液20μLにDNA試料１ngを添加したものをPCR用試料として用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）にて、下記の反応条件で30サイクル PCRを行った。
PCR反応条件：
熱変性： ９４℃、０．５分
アニーリング：５５℃、１分
重合反応： ７５℃、０．５分。
【０１１６】
（４）検出
上記（3）で得られたPCR後の反応液５μLを、１.５％アガロースゲル電気泳動した。電気泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、３０分行った。操作方法並びに他の条件はバイオ実験イラストレイテッド2巻, p53-63（秀潤社、中山広樹 著）に記載の一般的に用いられる方法に従った。次いでエチジウムブロマイド染色した後、ＵＶサンプル撮影装置FAS-IIIシステム（東洋紡績(株)製）を用いて紫外線での蛍光を検出した。また、分子量マーカーも反応液と同時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたDNA断片の長さを算出した。尚、分子量マーカーは、Ｘ１７４／HaeIII digest（マーカー４、(株)ニッポン・ジーン製）を使用した。
【０１１７】
（５）結果
得られた電気泳動の結果を図１に示す。
図１に於いて、各レーンの数字は、夫々以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。
Ｍ４：分子量マーカー（マーカー４）
ａ：Escherichia coli （大腸菌）
ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）
ｃ：Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム・カンサシイ）
ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）
ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）
ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）
ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）
ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）
ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）
ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）
ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）
ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）
ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）
ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）
ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）
ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）
ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）
ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）
ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）
【０１１８】
フォワードプライマーIS_F6、及びリバースプライマーIS_R6を用いたPCRにより、IS6110の核酸配列中の182塩基対のDNA断片（配列番号７）が複製されると予測される。そこで、182塩基対の蛍光バンドが確認されたものを陽性と判定した。
【０１１９】
図１の結果から明らかな如く、本発明のプライマーIS_F6、及びプライマーIS_R6を用いてPCRを行った結果、Mycobacterium tuberculosis を試料とした場合（ｂ）のみに182塩基対の蛍光バンドが確認でき、陽性と判定できた。これに対し、その他のマイコバクテリウム属細菌や他の属の細菌である大腸菌の試料を試料とした場合（ａおよびｃ〜ｓ）には、該当する蛍光バンドが確認できず、すべて陰性と判定できた。
【０１２０】
以上のことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRに用いることにより、ヒト型結核菌を特異的に検出することが出来ることが判った。また、PCRなどの核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、細菌を単離する必要がなく、臨床材料をそのまま検出に用いることが可能であるため、従来の細菌を培養してから検出する方法では培養に数週間かかっていたヒト型結核菌の検出を、長くても１日以内に終わらせることができる。
【０１２１】
実施例２
（１）結核菌検出用PCRプライマーの合成
実施例１（1）と同じ機器を用い、同様の操作で、配列番号１に示される配列（TGGGTAGCAGACCTCACCTAT、以下、IS_F5と記載する）、及び配列番号３に示される配列（CGAGTACGCTTTCTTGTTGG、以下、IS_R5と記載する）のオリゴヌクレオチドを合成した。
（２）試料の調製
実施例１（2）で得られたDNA試料を使用した。
（３）PCR
上記（1）で調製したIS_F5をフォワードプライマー、IS_R5をリバースプライマーとして用い、下記の通りPCRを行った。
まず、各１μMのプライマーIS_F5及びプライマーIS_R5、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX-100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/mLを含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、PCR用反応液とした。
PCR用反応液20μLにDNA試料１ngを添加したものをPCR用試料として用い、実施例１(3)に用いたと同じ機器を用い、同様の反応条件でPCRを行った。
【０１２２】
（４）検出
実施例１（4）と同様の方法で１.５％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色、紫外線での蛍光を検出した。
【０１２３】
（５）結果
得られた電気泳動の結果を図２に示す。
図２に於いて、各レーンの数字は、夫々以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。
【０１２４】
Ｍ４：分子量マーカー（マーカー４）
ａ：Escherichia coli （大腸菌）
ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）
ｃ：Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム・カンサシイ）
ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）
ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）
ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）
ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）
ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）
ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）
ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）
ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）
ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）
ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）
ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）
ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）
ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）
ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）
ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）
ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）
【０１２５】
尚、フォワードプライマーIS_F5、及びリバースプライマーIS_R5を用いたPCRにより、IS6110の核酸配列中の178塩基対のDNA断片（配列番号６）が複製されると予測される。そこで、178塩基対の蛍光バンドが確認されたものを陽性と判定した。
【０１２６】
比較例１
公知のIS6110配列に基づいて作製されたプライマー配列を用いた検出法（特表平11-514522号公報：特許文献11）によりヒト型結核菌の検出を行った。
（１）結核菌検出用PCRプライマーの合成
特表平11-514522に開示されたプライマー配列のうち、「TTCGGACCACCAGCACCTAACC」（配列番号９、以下IS_F2と記載する）、及び「CCTTCTTGTTGGCGGGTCCAG」（配列番号１０、以下、IS_R2と記載する）のオリゴヌクレオチドを合成した。
合成には実施例１（1）と同様の機器を用い、同様の操作で行った。
（２）試料の調製
実施例１（2）で得られたDNA試料を使用した。
【０１２７】
（３）PCR
上記（1）で調製したIS_F2をフォワードプライマーとして、IS_R2をリバースプライマーとして用い、下記の通りPCRを行った。
まず、各１μMのプライマーIS_F2及びプライマーIS_R2、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX-100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/mLを含有する10mM Tris-HCl 緩衝液（pH8.9）を調製し、PCR用反応液とした。
PCR用反応液20μLにDNA試料１ngを添加したものをPCR用試料として用い、実施例１(3)に用いたと同じ機器を用い、同様の反応条件でPCRを行った。
（４）検出
実施例１(4)と同様の方法で１.５％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色、紫外線での蛍光を検出した。尚、分子量マーカーは、λ／Hind III digest（マーカー１）（レーンＭ１）もしくは、Ｘ１７４／HaeIII digest（マーカー４）を使用した（何れも(株)ニッポン・ジーン製）。
（５）結果
得られた電気泳動の結果を図３−１に示す。
図３−１に於いて、尚、各レーンの数字は、夫々以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。
【０１２８】
Ｍ１：分子量マーカー（マーカー１）
Ｍ４：分子量マーカー（マーカー４）
ａ：Escherichia coli （大腸菌）
ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）
ｃ：Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム・カンサシイ）
ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）
ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）
ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）
ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）
ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）
ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）
ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）
ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）
ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）
ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）
ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）
ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）
ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）
ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）
ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）
ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）
【０１２９】
尚、フォワードプライマーIS_F2、及びリバースプライマーIS_R2を用いたPCRにより複製されるのは、IS6110の核酸配列中の197塩基対のDNA断片であると予測される。そこで、197塩基対の蛍光バンドが確認されたものを陽性と判定した。
実施例２で得られた図２の結果から明らかな如く、本発明のプライマーIS_F5・プライマーIS_R5を用いた場合、ヒト型結核菌（ｂ）を試料とした場合のみに178塩基対の蛍光バンドが確認でき、陽性と判定できた。これに対し、その他のマイコバクテリウム属細菌や他の属の細菌である大腸菌を試料とした場合（ａ、およびｃ〜ｓ）には、該当する蛍光バンドがみられず、すべて陰性と判断できた。
【０１３０】
一方、比較例１で得られた図３−１の結果から明らかな如く、公知のプライマーIS_F2・プライマーIS_R2を用いてPCRを行った場合には、ヒト型結核菌を試料とした場合には陽性と判定できたが、それ以外に、Mycobacterium nonchromogenicum を試料とした場合（ｍ）、および Mycobacterium triviale を試料とした場合（ｏ）でも顕著なバンドが確認され、偽陽性と判定された。図３−１に、Mycobacterium nonchromogenicum を試料とした場合（ｍ）のバンドを点線で丸く囲んで示した。また、Mycobacterium trivialeを試料とした場合（ｏ）のバンドを点線で丸く囲んで矢印で示した。
即ち、比較例１の方法では、ヒト型結核菌を特異的に検出することが困難であることが判った、
【０１３１】
そこで、比較例１の電気泳動の結果から、特にヒト型結核菌の陽性バンドと増幅断片のサイズが酷似していると判断されたMycobacterium trivialeの試料（ｏ）に注目した。図３−１では矢印で、特にそのバンドを示した。そして、このPCR産物について更に分析すべく、泳動画分のPCR産物を切り出しDNAの精製を行った後、ABI社  シーケンス・キットを用いたPCR-ダイレクト・シーケンス法によって、配列の解析を行った。
【０１３２】
得られた配列を図３−２に示す。図３−２に示した配列のうち、画分（ｂ）のヒト型結核菌由来PCR産物の配列を1st Nucleotide Sequence とし、配列表の上段に示した（配列番号１２）。また、画分（ｏ）より得られたMycobacterium triviale由来PCR産物の配列を2nd Nucleotide Sequenceとし、配列表の下段に示した（配列番号１３）。
【０１３３】
DNA断片の配列解析の結果、これはMycobacterium triviale由来の核酸配列であり、ヒト型結核菌に特有のIS6110の核酸配列とは、比較例１で用いたプライマーIS_F2及びプライマーIS_R2の配列部位のみが一致することが確認された。従って、この公知のプライマーIS_F2・プライマーIS_R2を用いてPCRを行った場合、ヒト型結核菌以外の核酸配列も増幅させてしまうことがわかり、プライマーのデザインに明らかな欠点があることが確認された。
【０１３４】
以上のことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、PCRによるヒト型結核菌の検出を行えば、従来のプライマーを用いた結核菌の検出法と比べて、偽陽性の判定が排除可能となり、ヒト型結核菌を特異的に且つ高精度に検出できる点に於いて、従来のプライマー及びそれを用いたヒト型結核菌の検出法と比較して、極めて優れていることが判った。
【０１３５】
実施例３
リアルタイムPCR増幅系による結核菌の検出
（１）結核菌検出用PCRプライマーの合成
実施例１（1）と同じ機器を用い、同様の操作でIS_F5、及びIS_R5のオリゴヌクレオチドを合成した。
（２）結核菌検出用プローブの作製
IS_F5およびIS_R5をプライマーとして用いたPCRで増幅される配列番号６のオリゴヌクレオチド配列から、プローブとして利用するための配列「ACCGACGCCTACGCTCGCAG」を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した（以下、IS_F5R5_FAMTAMと記載する。配列番号１１）。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素FAMを、3'末端にレポーター消光体のTAMRAを結合し、標識オリゴヌクレオチドプローブ（TaqManTMフルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を得た。
（３）PCR用DNA試料の調製
実施例１（2）で調製したマイコバクテリウム・ツベクローシス試料から得られた、DNA試料について、吸光度を測定して試料中のDNA量を測定した。得られたDNA量を、既知のマイコバクテリウム・ツベルクローシスのゲノムDNA量と比較することにより、試料中のゲノムDNA量（ゲノムコピー数）を決定した。10８コピー／μLのゲノムDNAが得られた。
次いで10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9を用いてDNA試料を105, 104, 103, 102, 10, 5, 2コピー／μLの希釈系列に希釈したものを調製し、PCR用DNA試料とした。
【０１３６】
（４）リアルタイムPCR
上記（1）で調製したIS_F5をフォワードプライマーとして、IS_R5をリバースプライマーとして用い、下記の通りリアルタイムPCRを行った。
即ち、各１μMのプライマーIS_F5、及びプライマーIS_R5、195nMの上記（1）で調製した蛍光標識プローブIS_F5R5_FAMTAM、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/mL を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、反応液とした。
反応液20μLに各希釈系列のDNA試料１μLを加えたものをPCR用試料とし、これを９６穴反応プレート（ マイクロアンプ・オプチカル・９６ ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、TaqManTM  PCR 専用サーマルサイクラー・検出器（ABI7000、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いてリアルタイムPCRを行った。反応は、95℃ で10分間保温の後、95℃で15秒間、6 0℃で１分間の反応を50サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定した。尚、発光量は、測定に用いたサーマルサイクラーの、測定に供した９６穴反応プレート１プレート毎に相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。
【０１３７】
（５）結果と解析
リアルタイムPCR法において行われている常法に従って、検量線を作成した。
即ち、各PCR用DNA試料毎に、PCRのサイクル数（ｘ軸）に対するレポーター色素の発光量(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成した。次いで、発光量が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引いた。Thと各PCR用DNA試料の発光量が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とした。次いで用いた各PCR用DNA試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ct値に対して得られた近似曲線を検量線とした。得られた検量線を図４に示す。
ｙ＝−３.５５5ｘ＋３９.１３
Ｒ２＝０.９９６
以上のことより、リアルタイムPCRで発光が検出されたことから、本発明によるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRに用い、その増幅領域となる配列から標識プローブを設計し、リアルタイムPCRを行う事でヒト型結核菌が検出できることが判った。
【０１３８】
また、検量線が作成できたことより、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムPCR法によれば、ヒト型結核菌の定量が可能であることが判った。更に、図４より、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムPCR法では、ヒト型結核菌のゲノムDNAが初期量として２コピー存在する条件でもヒト型結核菌の検出が可能である事がわかる。
更に、リアルタイムPCR法を利用した場合では、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングするので、鋳型DNAの初期量を正確に定量することができ、ヒト型結核菌の検出に有効である。
【０１３９】
実施例４
複数のプライマーペアを使用して１本のチューブ中で複数の断片を同時に増幅するmultiplex PCR反応を利用して、ヒト型結核菌およびMycobacterium avium（M.avium）、Mycobacterium intracellulare（M.intracellulare）、Mycobacterium kansasii（M.kansasii）を対象とした結核症と非結核性抗酸菌症（non-tuberculosis Mycobacteriosis, NTM症）の同時診断（識別診断）の試みを行った。
【０１４０】
（１）プライマーの合成
（ｉ）結核菌検出用PCRプライマーの合成
実施例１(1)と同様の操作でIS_F5（配列番号１）、及びIS_R6（配列番号４）を調製し、夫々フォワードプライマー、リバースプライマーとした。
（ii）M.avium検出用PCRプライマーの合成
実施例１(1)と同様の操作で、特開平11-69999号公報請求項５に記載の「アビウム19キロダルトン蛋白質遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー」であるMAV19K F1（CGGCTGTTCGAGTGGCAACAAGTC、本明細書で配列番号１５に示す。以下「M.avium検出用プライマーFw」と記載する。）、及びMAV19K R1（CCGTCGATGATGACCTTGGTCCC、本明細書で配列番号１６に示す。以下「M.avium検出用プライマーRv」と記載する。）を調製し、夫々フォワードプライマー及びリバースプライマーとした。
（iii）M.intracellulare検出用PCRプライマーの合成
実施例１(1)と同様の操作で、特開平11-69999号公報請求項６に記載の「イントラセルラーレリボソーム蛋白質ｓ１遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー」であるrps1 F1（CGGGACAAGGTCGCCAAGGTCAAGA、本明細書で配列番号１７に示す。以下「M.intracellulare検出用プライマーFw」と記載する。）、及びrps1 R1（GGGATGTAGGCCGTCACCTCAAC、本明細書で配列番号１８に示す。以下、「M.intracellulare検出用プライマーRv」と記載する。）を調製し、夫々フォワードプライマー及びリバースプライマーとした。
（iv）M.kansasii検出用PCRプライマーの合成
実施例１(1)と同様の操作で、特開平11-155589号に記載された、M.kansasiiのKATS2配列から設計されたプライマーである図１に記載のPrimer15の、１塩基分が5'方向にシフトしている配列（GTCCCTGGCTGCTCTTGA、本明細書で配列番号１９に示す。以下「M.kansasii検出用プライマーFw」と記載する。）、
及びPrimer E3（GCTGGTGGAGATGGAGATGTT、本明細書で配列番号２０に示す。以下、「M.kansasii検出用プライマーRv」と記載する。）を調製し、夫々フォワードプライマー及びリバースプライマーとした。
（２）試料の調製
実施例1(2)で得られたヒト型結核菌、M.avium、M.intracellulare、M.kansasiiのDNA試料を使用した。
【０１４１】
（３）PCR
上記(1)で合成した各フォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ最終濃度１μM、10mM Tris-HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100 、それぞれ0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびTaq DNA ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）40単位/mL含有する溶液を調製し、PCR反応用溶液とした。
PCR用反応液20μLに各DNA試料１μL(0〜1000コピー)を下記表１の通り添加したPCR用試料(1)〜(7)を調製し、夫々について、実施例１(3)に用いたと同じ機器を用い、同様の反応条件でPCRを行った。尚、表１に於いて、aviumはM.aviumを、intracellulareはM.intracellulareを、kansasiiはM.kansasiiを、夫々示す。また、×はDNA試料を加えなかった場合を、○はDNA試料を加えた場合を夫々示し、○の下の(  )内の数字は、加えたDNA試料の濃度（コピー数）を示す。
【０１４２】
【表１】
0004905130.tif 000002
【０１４３】
（４）検出
実施例１（4）と同様の方法で１.５％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色、紫外線での蛍光を検出した。
【０１４４】
（５）結果
得られた電気泳動の結果を図５に示す。
図５に於いて、各レーンの数字は、夫々前記表１に於ける７種類のDNA試料(1)〜(7)を用いた場合の結果を夫々示す。
また、DNA試料中にヒト型結核菌のDNA試料がある場合、IS_F5プライマーとIS_R6プライマーを用いたPCRで193bpの増幅産物が得られると予想される。M.aviumのDNA試料がある場合、M.avium検出用プライマーFwとM.avium検出用プライマーRvを用いたPCRで106bpの増幅産物が得られると予想される。また、M.intracellulareのDNA試料がある場合、M.intracellulare検出用プライマーFwとM.intracellulare検出用プライマーRvを用いたPCRで160bpの増幅産物が得られると予想される。M.kansasiiのDNA試料がある場合、M.kansasii検出用プライマーFwとM.kansasii検出用プライマーRvを用いたPCRで、235bpの増幅産物が得られると予想される。そこで、図５の電気泳動パターンの横に、電気泳動方向と併せて、各増幅産物の画分の現れる順番を示した。それぞれ「kansasii」はM.kansasiiを、「TB」はヒト型結核菌を、「intra」はM.intracellulareを、「avium」はM.aviumを夫々示す。
【０１４５】
図５から明らかな如く、ヒト型結核菌、M.avium、M.intracellulare、M.kansasiiのDNA試料全てを同一チューブ内に加え、一度にPCRを行った場合、夫々の菌体が存在する場合に増幅されると予測される各増幅産物の４本の蛍光バンドすべてが確認できた（レーン(２)、(５)）。また、レーン(5)でヒト型結核菌のバンドが確認できたことから、DNA試料の濃度がレーン(2)の場合の1/100であっても、高感度に結核菌の検出が行えることが判った。
ヒト型結核菌のDNA試料のみを用いてPCRを行った場合には、M.avium、M.intracellulare、M.kansasii検出用のプライマーが存在していても、本発明に係るヒト型結核菌検出用プライマーIS_F5及びIS_R6を用いたPCR反応に由来する193bpの蛍光バンドのみが確認できた（レーン(３)）。
一方、ヒト型結核菌のDNA試料を含まない試料を用いてPCRを行った場合（レーン(４)、(６)）には、M.avium検出用プライマーFw/Rvを用いたPCR反応に由来する106bpの蛍光バンド、M.intracellulare検出用プライマーFw/Rvを用いたPCR反応に由来する160bpの蛍光バンド及びM.kansasii検出用プライマーFw/Rvを用いたPCR反応に由来する235bpの蛍光バンドが、夫々のDNA試料を用いてPCRを行った場合にそれぞれ確認できたが、ヒト型結核菌がある場合に確認できるはずの193bpの蛍光バンドは検出されなかった。
【０１４６】
以上のことから、本発明のプライマーを用いれば、複数のDNA試料が同一チューブ内に存在していても、特異的にヒト型結核菌の検出が可能であることがわかった。また、１チューブ反応にてPCRを行うことにより、ヒト型結核菌と、非結核性抗酸菌症の起因菌であるMAC群（M.avium、M.intracellulare）、さらにはM.kansasiiの各々４つの起因菌由来ゲノムDNAの検出を一度に行うことが可能となった。
【０１４７】
実施例５
リアルタイムPCR増幅系における蛍光標識プローブを用いたmultiplex PCRを行って、ヒト型結核菌およびMycobacterium avium（M.avium）Mycobacterium intracellulare（M.intracellulare）、Mycobacterium kansasii（M.kansasii）を対象とした結核症と非結核性抗酸菌症（non-tuberculosis Mycobacteriosis, NTM症）の同時診断（識別診断）を試みた。
【０１４８】
（１）PCR用プライマー
（i）結核菌検出用PCRプライマー
実施例１（１）と同様の操作でIS_F5（配列番号１）、及びIS_R5（配列番号３）を調製し、夫々フォワードプライマー、リバースプライマーとした。
（ii）M.avium検出用PCRプライマーは、実施例４(1)(ii)と同じものを用いた。
（iii）M.intracellulare検出用PCRプライマーは、実施例４(1)(iii)と同じものを用いた。
（iv）M.kansasii検出用PCRプライマーは、実施例４(1)(iv)と同じものを用いた。
【０１４９】
（２）プローブの調製
（i）結核菌検出用プローブの作製
IS_F5およびIS_R5をプライマーとして用いたPCRで増幅される配列番号６のオリゴヌクレオチド配列から、プローブとして利用するための配列「ACCGACGCCTACGCTCGCAG」を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した（以下、IS_F5R5_FAMTAMと記載する。配列番号１１）。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素FAMを、3'末端にレポーター消光体のTAMRAを結合し、標識オリゴヌクレオチドプローブ（TaqManTMフルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を得た。
（ii）Mycobacterium avium検出用プローブの作製
PCRプライマーとして用いるM.avium検出用プライマーFwおよびM.avium検出用プライマーRvにより増幅されるオリゴヌクレオチド配列から、プローブとして利用するための配列「CAGCTCGAGCACCAGTGCGTCGG」を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した（以下、Mab_F1R1m2_Cy5BHQと記載する。配列番号２１）。この5’末端にレポーター色素Cy5を、3’ 末端にレポーター消光体のBHQ２を結合し、標識オリゴヌクレオチドプローブ（リアルタイムPCR用両末端修飾プローブ、SIGMA GENOSYS社製）を得た。
（iii）M.intracellulare検出用プローブの作製
PCRプライマーとして用いるM.intracellulare検出用プライマーFwおよびM.intracellulare検出用プライマーRvにより増幅されるオリゴヌクレオチド配列から、プローブとして利用するための配列「CTGGCTCGTCAGCTTCACGCG」を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した（以下、Int_F1R1m_VICMGBと記載する。配列番号２２）。この5'末端にレポーター色素VICを、3'末端にレポーター消光体のMGBを結合し、標識オリゴヌクレオチド（TaqManTMフルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を得た。
（iv）M.kansasii検出用プローブの作製
PCRプライマーとして用いるM.kansasii検出用プライマーFwおよびM.kansasii検出用プライマーRvにより増幅されるオリゴヌクレオチド配列から、プローブとして利用するための配列「ATCGTATCCACCATCCTCGACAGCGT」を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した（以下、KATS2_TAMBHQ2と記載する。配列番号２３）。この5'末端にレポーター色素TAMRAを、3'末端にレポーター消光体のBHQ2を結合し、標識オリゴヌクレオチドを得た（リアルタイムPCR用両末端修飾プローブ、SIGMA GENOSYS社製）。
【０１５０】
（３）試料の調製
実施例1(2)で得られたヒト型結核菌、M.avium、M.intracellulare、M.kansasiiのDNA試料について、吸光度を測定して試料中のDNA量を測定した。得られたDNA量を、既知のマイコバクテリウム・ツベルクローシスのゲノムDNA量と比較することにより、試料中のゲノムDNA量（ゲノムコピー数）を決定した。10８コピー／μLのゲノムDNAが得られた。
次いで10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9を用いてDNA試料を105, 104, 103, 102, 10, 5, 2コピー／μLの希釈系列に希釈したものを調製し、PCR用DNA試料とした。
【０１５１】
（４）リアルタイムPCR検出
上記(1)で合成した各フォワードプライマー及びリバースプライマーを、それぞれ最終濃度１μM、各蛍光標識プローブを、それぞれ最終濃度195nM、10mM Tris-HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-10 100 、それぞれ0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびTaq DNA ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）40単位/mL となるように含有する溶液を調製し、反応液とした。
反応液20μLに、各希釈系列のDNA試料１μLを加えたものをPCR用試料とし、これを９６ 穴反応プレート（ マイクロアンプ・オプチカル・９ ６ ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製） のウェルに入れ、TaqManTM  PCR 専用サーマルサイクラー・検出器（ A B I 7 5 0 0、アプライドバイオシステムズジャパン社製） を用いてリアルタイムPCRを行った。反応は、95℃ で10分間保温の後、95℃ で15秒間、60℃ で１分間の反応を50サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定した。
尚、発光量は、測定に用いたサーマルサイクラーの、測定に供した９６穴反応プレート１プレート毎に相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。
【０１５２】
（５）結果と解析
各菌体検出用プライマーのレポーター色素が夫々異なるので、各サイクル毎のレポーター色素由来の異なる蛍光４波長の発光量をモニタリングすれば、ヒト型結核菌由来のゲノム配列をターゲットとしたＤＮＡ断片の増幅、および非結核性抗酸菌症の起因菌であるMAC群（M.avium、M.intracellulare）、さらにはM.kansasiiの各々４つの起因菌由来ゲノムDNAの増幅が確認できる。
そこで、各レポーター色素の発光量を測定し、実施例３(5)と同様の方法で、各菌由来ゲノムDNAの希釈系列と各レポーター色素の発光量の関係を示す増幅曲線を作成した。得られた増幅曲線から、実施例３(5)と同様の方法でゲノムのコピー数（x軸、対数表示）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ct値に対して得られた近似曲線を検量線とした。
結果を図６に示す。
【０１５３】
図６の結核菌（M.tuberculosis）DNAについての結果(検量線)から明らかな如く、ヒト型結核菌検出用プライマーのレポーター色素の発光を検出することができたことから、本発明に係るオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRに用い、その増幅領域となる配列から標識プローブを設計し、リアルタイムPCRを行うことで、同一チューブ内にヒト型結核菌以外の複数の菌体由来のDNAが存在していても、ヒト型結核菌が検出できることが判った。
また、検量線が作成できたことより、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムPCR法によれば、ヒト型結核菌の定量が可能であることが判った。更に、図６より、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムPCR法では、ヒト型結核菌のゲノムDNAが初期量として２コピー存在する条件（２コピー/reaction）でもヒト型結核菌の検出が可能である事がわかる。
【０１５４】
更に、リアルタイムPCR法を利用した場合では、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型DNAの初期量を正確に定量することができ、ヒト型結核菌の検出に有効である。
更にまた、非結核性抗酸菌症の起因菌であるMAC群（M.avium、M.intracellulare）、およびM.kansasiiの各々由来ゲノムDNAが混在（同時感染）している場合でも、互いの増幅反応が干渉し合う事なく夫々の検量線の直線性を維持しており、各々４つの起因菌由来ゲノムDNAを1チューブ反応でモニタリングする事が可能となる。この場合の検出感度はいずれの菌種に対しても、2コピー/reactionを提示できている。即ち、複数の菌体が混在している検体について、リアルタイムPCRを行うことにより、ヒト型結核菌の検出と、非結核性抗酸菌の同定が一度に行えることが判る。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明に係るヒト型結核菌の検出方法によれば、従来のIS6110をターゲットとした結核菌の検出法と比べて、診断上の偽陽性が排除可能となり、より特異性及び精度の高いヒト型結核菌の検出が可能となる。
また、本発明に係るプライマー及びプローブを用い、リアルタイムPCR法によって、ヒト型結核菌の検出を行えば、ヒト型結核菌に特異的なため、一つの試料について、ヒト型結核菌の検出と、非結核性抗酸菌の同時診断（識別診断）が行える。
【図１】
0004905130.tif 000003
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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