(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦと以下の物性を有するゼラチンからなり、ゼラチンに対してＨＧＦが５倍量以下の重量比で含有される、ＨＧＦ安定化ゼラチン製剤：
（１）コラーゲンからのアルカリ処理によって得られる、酸性ゼラチンである、
（２）非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１０万〜２０万ダルトンである、
（３）等電点が５である、
（４）水溶液中のジータ電位が−１５〜−２０ｍＶである。
【請求項２】
以下の物性を有するゼラチンに対してＨＧＦが５倍量以下の重量比で形成されるＨＧＦゼラチン複合体：
（１）コラーゲンからのアルカリ処理によって得られる、酸性ゼラチンである、
（２）非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１０万〜２０万ダルトンである、
（３）等電点が５である、
（４）水溶液中のジータ電位が−１５〜−２０ｍＶである。
【請求項３】
請求項２記載のＨＧＦゼラチン複合体を含有してなるＨＧＦ安定化ゼラチン水溶液製剤。
【請求項４】
請求項１記載のＨＧＦ安定化ゼラチン製剤、請求項２記載のＨＧＦゼラチン複合体および請求項３記載のＨＧＦゼラチン安定化水溶液製剤からなる群より選択されるいずれかの製剤からなる血管新生促進剤。
【請求項５】
請求項１記載のＨＧＦ安定化ゼラチン製剤、請求項２記載のＨＧＦゼラチン複合体および請求項３記載のＨＧＦゼラチン安定化水溶液製剤からなる群より選択されるいずれかの製剤からなる動脈疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）と特定の物性を有するゼラチンヒドロゲルとの組み合わせにより得られるＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＨＧＦとゼラチンヒドロゲルとの複合体、ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲル製剤もしくはこれらを利用した血管新生促進剤、または動脈疾患治療剤などに関する。
背景技術
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）は成熟肝細胞に対する強力な増殖促進因子として発見され、その遺伝子クローニングがなされたタンパク質である（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１２２，１４５０（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８３，６４８９，（１９８６）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，２２，３１１（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８７，３２００（１９９０））。その後の研究により、ＨＧＦはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて肝再生因子として障害肝の修復再生に働くだけでなく、血管新生作用を有し、虚血性疾患や動脈疾患の治療または予防に大きな役割を果たしていることが明らかとなってきた（Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，４７ｃｅｌｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ，２２７−２３４（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０，１９３７−１９４１（１９９３），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９７，３８１−３９０（１９９８））。
このようにＨＧＦは血管新生因子の機能を始めとして種々の機能を持っており、医薬品として活用するため色々な試みがなされてきた。しかし、ここで問題となってきたのがＨＧＦの血中での半減期である。ＨＧＦの半減期は数分から１０分と短く、血中濃度を維持することが困難であり、また、患部へのＨＧＦの有効量の移行が問題となった。このように、タンパク質を溶液の形で注射するだけでは注射部位から急速に拡散排泄されることから、必ずしもＨＧＦの十分な生理活性を期待することは難しいと考えられた。
しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏの有効性を高める唯一考えられる方法は、ポリマー担体にＨＧＦを含浸させ、長時間にわたるＨＧＦの徐放を可能にすることである。近年、塩基性線維芽細胞増殖因子、骨誘導タンパク質および形質転換成長因子などいくつかの増殖因子が、種々の担体マトリックスと併用した場合にｉｎ  ｖｉｖｏで予測した生理活性を示すことがいくつかの試験で示された［Ｄｏｗｎｓ，Ｅ．Ｃ．ら１９９２年、Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｓ．ら１９９２年、Ｇｏｍｂｏｔｚ，Ｗ．Ｒ．ら１９９３年］。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＧＦの放出に関する報告は全くない。生理的に過剰な用量でＨＧＦ溶液を注射すると、予測した生理作用を誘導するという研究結果がいくつかあるのみである［Ｍａｔｓｕｄａ，Ｙ．ら１９９５年］。
すでに本発明者は、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＨＧＦは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のヘパラン硫酸またはヘパリンなどの酸性多糖類と相互作用して体内に蓄えられる［Ｔａｉｐａｌｅ，Ｊ．，Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊａ，Ｊ．１９９７年、Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ．ら１９９４年、Ａｒａｋａｋｉ，Ｎ．ら１９９２年、Ｓａｋａｔａ，Ｈ．ら１９９７年］との知見に基づき、これら増殖因子の徐放のために種々の検討を試みてきた。これまで、「塩基性」ｂＦＧＦおよびＴＧＦ−β１の場合には、イオン的に相互作用できる等電点５．０の「酸性」ゼラチンから生分解性ヒドロゲルを調製し、これにｂＦＧＦおよびＴＧＦ−β１を含浸させたヒドロゲルを作製した。これらの含浸ヒドロゲルは、生体内での分解によって生理活性の増殖因子を徐放することができ、放出された増殖因子はｉｎ  ｖｉｖｏの生理作用を示し、活性を保つ時間が増殖因子放出時間によく対応した［Ｔａｂａｔａ，Ｙ．，Ｉｋａｄａ，Ｙ．１９９９年］。
しかしながら、ＨＧＦに関しては、どのようなゼラチンヒドロゲルが好適な組み合わせであるのかが明確でなく、ＨＧＦについて具体的なゼラチンヒドロゲル製剤の作製が望まれている状況であった。
本発明は、ＨＧＦの徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤を提供することを目的とする。さらに詳しくは、本発明は、ＨＧＦとゼラチンあるいはゼラチンヒドロゲルとの複合体もしくはこれらを利用した血管新生促進剤、または動脈疾患治療剤などに関する。
本発明者は、ＨＧＦの徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤について、鋭意検討を行った。すなわちまず、ＨＧＦとゼラチンヒドロゲルとの徐放効果について検討を行い、ある特定の物性を持ったゼラチンヒドロゲルとＨＧＦの組み合わせにおいてのみ、顕著な徐放性効果を示すことを明らかにした。
また、ＨＧＦとゼラチンヒドロゲルとの間である特定のモル比（ＨＧＦ：ヒドロゲルを構成するゼラチンが約７：１のモル比）で複合体を形成することが明らかとなった。さらに、同様にＨＧＦとゼラチンとの間でも複合体が形成され、複合体中のＨＧＦはトリプシン等のタンパク質分解酵素にも安定であることが分かった。
このＨＧＦゼラチン（ヒドロゲル）複合体は、溶液中のイオン強度の影響が少ないことから、静電相互作用だけでなく、疎水結合等の他の作用も大きく寄与している複合体であることが明らかとなった。例えば、ＨＧＦ以外のタンパク質であるｂＦＧＦの場合、同様にｂＦＧＦゼラチンヒドロゲル複合体を形成するが、この複合体はイオン強度の影響を大きく受け、溶液中のイオン強度の増大と共にゼラチンに対するｂＦＧＦの収着が抑制される。しかし、ＨＧＦの場合にはｂＦＧＦに比べてイオン強度の影響が少ないものとなっている。
また、本発明に適切なゼラチンを用いてグルタルアルデヒドの量を変えた化学的架橋性ゼラチンを作製し、種々の分解性の異なるヒドロゲルを調製し、その効果を検討した。例えば、１２５Ｉ標識ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルを作製してマウスの体内に埋植すると、グルタルアルデヒド濃度が高くなるにしたがって、ＨＧＦ放射能がマウス皮下組織に長く残存することが明らかとなった。このように各ゼラチンヒドロゲルに残存するＨＧＦの時間プロファイルは、ヒドロゲル分解の時間プロファイルによく一致しており、これはヒドロゲル生分解によるＨＧＦ放出を示すものであることが明らかとなった。
さらに、本発明に好適なゼラチンゲルを用いて、ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルを作製し、マウスに埋植すると、埋植したヒドロゲル周辺に血管新生による組織学的変化が誘導された。即ち、ＨＧＦとして５および１０μｇを含浸したゼラチンヒドロゲル製剤を埋植することによって、埋植部位周囲に新たに形成される毛細管の数が有意に増大することを見出した。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
発明の開示
即ち本発明の要旨は以下のとおりである。
１．以下の物性を有するゼラチンを架橋して得られるゼラチンヒドロゲルと肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなるＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤：
（１）コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンである、
（２）分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約１０万〜約２０万ダルトンである、
（３）等電点が約５である、
（４）水溶液中のジータ電位が約−１５〜約−２０ｍＶである。
２．ゼラチンヒドロゲルの含水率が約８０〜９９ｗ／ｗ％である上記１記載のＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤。
３．ゼラチンヒドロゲルを構成するゼラチン１モルに対してＨＧＦが約７モル以下の比で含有される上記１または２記載のＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤。
４．ＨＧＦと以下の物性を有するゼラチンからなる、ＨＧＦ安定化ゼラチン製剤：
（１）コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンである、
（２）分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約１０万〜約２０万ダルトンである、
（３）等電点が約５である、
（４）水溶液中のジータ電位が約−１５〜約−２０ｍＶである。
５．以下の物性を有するゼラチンに対してＨＧＦが約５倍量以下の重量比で形成されるＨＧＦゼラチン複合体：
（１）コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンである、
（２）分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約１０万〜約２０万ダルトンである、
（３）等電点が約５である、
（４）水溶液中のジータ電位が約−１５〜約−２０ｍＶである。
６．上記５記載のＨＧＦゼラチン複合体を含有してなるＨＧＦ安定化ゼラチン水溶液製剤。
７．上記１〜３のいずれかに記載のＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤、上記４記載のＨＧＦ安定化ゼラチン製剤、上記５記載のＨＧＦゼラチン複合体および上記６記載のＨＧＦゼラチン安定化水溶液製剤からなる群より選択されるいずれかの製剤からなる血管新生促進剤。
８．上記１〜３のいずれかに記載のＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤、上記４記載のＨＧＦ安定化ゼラチン製剤、上記５記載のＨＧＦゼラチン複合体および上記６記載のＨＧＦゼラチン安定化水溶液製剤からなる群より選択されるいずれかの製剤からなる動脈疾患治療剤。
発明の詳細な説明
本発明で使用されるゼラチンとは、以下の物性を有するゼラチンであり、市販のゼラチンとは異なるものである。
（１）コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンである、
（２）分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約１０万〜約２０万ダルトンである、
（３）等電点が約５である、
（４）水溶液中のジータ電位が約−１５〜約−２０ｍＶである。
市販のゼラチンとして、例えば、シグマ社製タイプＡゼラチン、和光社製ゼラチンがあるが、水溶液中のジータ電位が以下のように異なっている。
シグマ社製タイプＡゼラチン：  約０〜約５ｍＶ
和光社製ゼラチン          ：  約−５〜約−２ｍＶ
ジータ電位は物質（ゼラチン）の静電的な荷電の程度を表す尺度であり、本発明におけるＨＧＦと静電的複合体を形成するゼラチンの指標としては好適なものと考えられる。
本発明のゼラチンは牛を始めとする各種の動物種の皮膚・腱などの部分あるいはコラーゲンからアルカリ加水分解して得られるものである。好ましくは、ウシの骨由来のＩ型コラーゲンをアルカリ処理して調製した酸性ゼラチンであり、新田ゼラチン社の試料ＩＥＰ５．０として入手することもできる。なお、酸処理して調製した塩基性ゼラチンは同じく新田ゼラチン社の試料ＩＥＰ９．０として入手することができるが、ジータ電位は以下のように大きく相違する。
酸性ゼラチン（新田ゼラチン社試料ＩＥＰ５．０）  ：約−１５〜約−２０ｍＶ塩基性ゼラチン（新田ゼラチン社試料ＩＥＰ９．０）：約＋１２〜約＋１５ｍＶ  本発明で使用されるゼラチンヒドロゲルとは、上記ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤と縮合させて得られるヒドロゲルのことである。化学的架橋剤としては、例えばグルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホナート等の水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合物、ホルマリン等が好ましく、グルタルアルデヒド、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩が特に好ましい。
また、ゼラチンは熱処理又は紫外線照射によっても架橋化できる。
ゼラチンヒドロゲルの形状は特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などがある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、通常移植片として用いられることが多く、また、球状、粒子状のものは注射投与も可能である。
円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンヒドロゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の鋳型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいはｐＨ２．５以下の水溶液を添加する。得られたゼラチンヒドロゲルは、蒸留水、エタノール、２−プロパノール、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。
球状、粒子状のゼラチンヒドロゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ  ｍｉｎｉＤ．Ｃ．Ｓｔｉｒｒｅｒ等）とテフロン（登録商標）製攪拌用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ボルテックスミキサーＡｄｖａｔｅｃ  ＴＭＥ−２１、ホモジナイザーｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ１０−３５等を用いて）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンヒドロゲルを回収した後、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンヒドロゲル粒子は、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。
ゼラチンヒドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば超音波処理（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
尚、前乳化することによって、粒子サイズが２０μｍ以下の微粒子状のゼラチンヒドロゲルを得ることができる。
得られるゼラチンヒドロゲル粒子の平均粒径（通常の方法で、水で膨潤した粒子の顕微鏡写真から最低４００個以上の粒子の粒子径を測定して平均を算出することにより得られる値）は１〜１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。
球状、粒子状のゼラチンヒドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。
上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下してＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠心分離によりゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸エチル等、次いで２−プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＭグリシン水溶液又は０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ  ＨＣｌ等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンヒドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンヒドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。
架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、１〜４８時間で行うことができる。
本発明のゼラチンヒドロゲルは、その含水率がＨＧＦの徐放性に大きく影響することが明らかとなっており、好ましい徐放性効果を示す含水率としては約８０〜９９ｗ／ｗ％が挙げられる。さらに好ましいものとしては、約９５〜９８ｗ／ｗ％のものが挙げられる。
本発明のゼラチンヒドロゲルは適宜、適当な大きさに切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンヒドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上、又は−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行うことができる。
ゼラチンヒドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度は、所望の含水率に応じて適宜選択すればよいが、ゼラチン濃度は１〜２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度は０．００１〜１ｗ／ｗ％が挙げられる。
なお、市販のゼラチンとして例えば、シグマ社製タイプＡゼラチン、和光社製ゼラチンを用いてゼラチンヒドロゲルを作製した場合には、ＨＧＦを含浸させたヒドロゲルを用いても、ＨＧＦの徐放効果を得ることができなかった。このように、上記の本発明の酸性ゼラチンを使用し、上記のゼラチンヒドロゲルを調製した場合に、ＨＧＦの徐放効果を得ることができた。
本発明で使用されるＨＧＦは公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができ、また既に市販されている製品（例えば、東洋紡Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＨＧＦ−１０１等）を使用してもよい。ＨＧＦの製造法としては、例えば、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦを得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる（例えばＮａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）、特開平５−１１１３８３号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３，９６７（１９８９）など参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞などを用いることができる。このようにして得られたＨＧＦは、天然型ＨＧＦと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。
本発明におけるＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤とは、上記の酸性ゼラチンヒドロゲルにＨＧＦを含浸させて得られる製剤である。また、本発明のＨＧＦ安定化ゼラチン製剤は、ＨＧＦと上記の酸性ゼラチンからなる製剤である。ＨＧＦは塩基性タンパク質であるため、溶液中で酸性ゼラチン（ヒドロゲル）と複合体を形成するが、前述の溶液中のイオン強度変化に対するＨＧＦの収着抑制効果を考慮すると、このＨＧＦゼラチン（ヒドロゲル）複合体は静電的相互作用だけでなく、疎水結合等の他の相互作用が大きく寄与している。この複合体の解離定数（Ｋｄ）およびゼラチンに対するＨＧＦの結合モル比はスキャッチャード結合モデル［Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ．１９４９年］にしたがって得られた。ゼラチンに対するＨＧＦの結合モル比として、およそＨＧＦ分子７個が酸性ゼラチン分子１個に結合していることが示された。なお、同様の複合体を形成するｂＦＧＦの場合と比較すると、ｂＦＧＦゼラチン複合体は１：１のモル比であり、ＨＧＦとは大きく相違している。
また、３７℃の酸性ゼラチンのＫｄ値は５．５×１０−７Ｍで、これは２０℃の硫酸ヘパリンのＫｄ値１×１０−９〜２．０×１０−１０Ｍよりも約２〜３次数大きい［Ｒａｈｍｏｕｎｅ  Ｈら１９９８年］。これはＨＧＦゼラチン複合体の結合性がＨＧＦヘパリン硫酸ほど強固でなく、緩やかであることを示している。
ゼラチンに対してＨＧＦのモル比を約１：７以上に上げた場合には、ＨＧＦの遊離が起きやすく活性的にはほとんど遊離のＨＧＦと同様の挙動を示す。しかし、ＨＧＦのモル比を約１：７以下に下げた場合には、ＨＧＦが吸着され解離するものが少なくなるため、ＨＧＦの見かけの活性は低下するように見える。
従って、ＨＧＦとゼラチンあるいはゼラチンヒドロゲルとの複合体として、ＨＧＦとゼラチンのモル比が種々の変化したものが作り得るが、初期バーストを回避するためには、好適なものとして、ゼラチン（またはゼラチンヒドロゲルを構成するゼラチン）１モルに対してＨＧＦが約７モル以下のモル比の複合体が挙げられる。
なお、ゼラチンに対しては、ＨＧＦの重量比が約５倍量以下のものが好適である。さらに好適なものとしては、ゼラチンに対してＨＧＦが約５〜約１／１０４倍量の重量比のものが望ましい。
本発明のＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤は、ＨＧＦの徐放性効果とＨＧＦの安定化効果を持つため、ＨＧＦの機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、ＨＧＦの本来的機能である血管新生の作用を効果的に発揮するので、本発明のＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤は、哺乳動物（例えば、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトなど）の血管新生促進剤、あるいは動脈疾患（例えば、動脈硬化症、虚血再潅流障害、心筋梗塞、狭心症、難治性動脈疾患、バージャー病、移植後動脈硬化症等）の治療剤として有効に使用できる。
本発明のＨＧＦ安定化ゼラチン製剤は、ゼラチンヒドロゲル製剤と同様にＨＧＦゼラチンの静電的複合体に基づくゼラチンのＨＧＦ保護効果を有しており、トリプシン等のタンパク質分解酵素に対しても安定に存在する。この安定化効果に基づき、また水溶液として利用しやすい等の点から、注射用製剤として、非経口的に使用することができる。例えば、皮下、筋肉内、静脈内、体腔内あるいは障害臓器等に投与することができる。したがって、本発明のＨＧＦ安定化ゼラチン製剤は、哺乳動物（例えば、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトなど）の血管新生促進剤、動脈疾患治療剤、臓器障害治療剤として有効に使用できる。
水溶液の形態であるＨＧＦ安定化ゼラチン製剤（ＨＧＦ安定化ゼラチン水溶液製剤）は、注射用水、各種緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等）中に上記ＨＧＦゼラチン複合体（好ましくはゼラチンに対してＨＧＦの重量比が約５倍量以下のもの）を含有するものである。当該製剤中のＨＧＦゼラチン複合体の濃度は特に制限されず、治療目的の疾患、患者の年齢、体重、投与量等に応じて適宜調整することができる。例えば、成人患者に対して当該製剤を約１〜約１０ｍｌ投与する場合、当該製剤中のＨＧＦゼラチン複合体の濃度は、ＨＧＦの濃度として、通常約０．００１〜約５００μｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約０．１〜約２００μｇ／ｍｌの範囲とすることができる。
本発明のＨＧＦ徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤あるいは複合体は、それぞれの用途に応じて適宜剤型を工夫することができる。例えば、シート状、スティック状、粒子状、ロッド状、ペースト状の剤型にして投与することができる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与などが考えられる。
本発明の製剤は、必要に応じて製剤上許容し得る一般的な添加剤（安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）を含めることができる。これらは公知のものが使用できる。さらに、徐放効果を調節する各種添加剤（アミノ酸、アミノ基あるいはリン酸基、硫酸基、ＳＨ基、カルボキシル基などを持つ糖、脂質などの低分子物質あるいは高分子物質など）やＨＧＦの効果を高める作用やＨＧＦの分解・失活を抑制する作用などを有する他の活性成分も含ませることができる。このような他の活性成分としては、当該作用を有する限り特に制限されず、多糖、脂質、糖脂質、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、薬物として利用できる各種低分子化合物または高分子化合物などのいかなる低分子物質あるいは高分子物質でもよい。
本発明の製剤の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、ＨＧＦとして、通常成人患者当たり約０．０１〜約５００μｇの範囲、好ましくは約１〜約２００μｇの範囲から投与量が選択され、これを患部またはその周辺部位に注入することができる。また１回の投与で効果が不十分であった場合は、該投与を複数回行うことも可能である。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲル製剤の調製
（１）ゼラチンヒドロゲルの調製
ウシの骨由来のＩ型コラーゲンをアルカリ処理して調製して得られたゼラチン（新田ゼラチン社製試料ＩＥＰ  ５．０）を用いて、５ｗｔ％のゼラチン水溶液５０ｍｌを調製し、グルタルアルデヒド水溶液（２５ｗｔ％）４０，５０および７０μｌと混合し、それぞれ最終濃度が５．００，６．２５および８．７５ｍＭとした。混合溶液をプラスチック製の型（８×８ｃｍ２、６ｍｍ厚）に注ぎ、ゼラチンを架橋させるために４℃で１８時間放置した。その後、得られたゼラチンヒドロゲルシートを１００ｍＭグリシン水溶液に３７℃で１時間浸し、グルタルアルデヒドのアルデヒド残基をブロックした。架橋性ヒドロゲルシートを約１０ｍｇのディスク（直径６ｍｍ）に切断した後、このヒドロゲルディスクを３７℃の再蒸留水（ＤＤＷ）で３回洗浄し、凍結乾燥した。表１にゼラチンヒドロゲルの調製条件およびその含水量をまとめた。ＤＤＷ中で３７℃、２４時間膨潤させた前後のヒドロゲル重量を計測し、湿ったヒドロゲルに対するヒドロゲル中の水の重量比である含水量を計算した。グルタルアルデヒド濃度が高いほど、このヒドロゲル含水量は減少した。凍結乾燥したヒドロゲルをエチレンオキシドガスによって滅菌した。凍結乾燥および滅菌過程の前後でヒドロゲルの形状に変化はなかった。
0004878730.tif 000002
（２）ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルの調製
ＨＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ．Ｌｔｄ．製、Ｌｏｎｄｏｎ  ＵＫ）の１、５および１０μｇを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて、凍結乾燥したディスク状のゼラチンヒドロゲルにＨＧＦを含浸させた。ＨＧＦを含浸せず、他に何も含まないヒドロゲルの調製は、ＨＧＦを含まないＰＢＳを用いたことを除けば、同じ方法であった。簡潔に記載すると、ＨＧＦを含むＰＢＳまたはＨＧＦを含まないＰＢＳ  ２０μｌを凍結乾燥したゼラチンヒドロゲル上に滴下し、４℃で一晩放置すると、ヒドロゲルの種類には関係なく、ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルを得た。この溶液量が理論的に各ヒドロゲルに含浸される量よりもかなり少なかったために、膨潤工程で凍結乾燥したゼラチンヒドロゲルにＨＧＦ水溶液を完全に収着した。同じく、１２５Ｉ標識ＨＧＦの水溶液を凍結乾燥したゼラチンヒドロゲルディスクに収着し、１２５Ｉ標識ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルを調製した。１２５Ｉ標識ＨＧＦの調製はこれまでに報告されているクロラミンＴ法にしたがって行った［Ｌｙｏｎ，Ｍ．ら１９９４年］。調製したそれぞれのヒドロゲルディスクは、ヒドロゲルの種類および放射性標識に関係なく、外観（形状および大きさ）は同じであった。
実施例２
ＨＧＦ安定化ゼラチン製剤の調製
（１）ＨＧＦとゼラチンの複合体（約７：１のモル比）の調製
実施例１記載のゼラチンを使用し、７４μｇ／ｍｌ溶液を調製した。ＨＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）の１４．７μｇ／ｍｌ溶液を調製し、５μｌを分取し、５μｌのゼラチン水溶液に添加攪拌後、３７℃、２４時間静置し作製した。
（２）約７：１のモル比以外のＨＧＦとゼラチンの静電複合体の調製
前項のゼラチン水溶液とＨＧＦ水溶液とを異なる比率で混合し所望のモル比となるように調製し、３７℃、２４時間静置し作製した。
参考例１
ゼラチンの物性測定
（１）等電点測定
酸性ゼラチン（新田ゼラチン社試料ＩＥＰ５．０）の１ｗ／ｗ％水溶液を調製し、この水溶液を陽イオンカラム、陰イオンカラムで濾過処理し、濾取された水溶液のｐＨを測定する。測定値として、ｐＨ約４．９〜５．０の値が得られた。この値をゼラチンの等電点として表す。
（２）ジータ電位測定
ゼラチンをミリキュー処理の水に溶解し、０．１ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製した。この水溶液をＥＬＳ（ＥＬＳ−７０００ＡＳ、大塚電子社製）を用いて測定した。測定温度は２５〜２７℃であり、ＥＬＳ標準セルを用いて行った。
その結果を以下に示す。
［ゼラチン試料］                                  ［ジータ電位］
酸性ゼラチン（新田ゼラチン社試料ＩＥＰ５．０）  ：約−１５〜約−２０ｍＶ
塩基性ゼラチン（新田ゼラチン社試料ＩＥＰ９．０）：約＋１２〜約＋１５ｍＶ
シグマ社製タイプＡゼラチン                      ：約０〜約５ｍＶ
和光社製ゼラチン                                ：約−５〜約−２ｍＶ
参考例２
ゼラチンヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｖｏ分解プロフィール
（１）ゼラチンヒドロゲルの放射性標識
１２５Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いて、実施例１記載のゼラチンヒドロゲルを放射性ヨウ素標識した［Ｂｏｌｔｏｎ，Ａ．Ｅ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｗ．Ｍ．１９６３年］。ベンゼンが完全に蒸発するまで、乾燥窒素ガスを１２５Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬の無水ベンゼン溶液１００μｌに吹き付け、ベンゼンを蒸発させた。次に、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液１２５μｌ（ｐＨ８．５）をこの乾燥試薬に加え、１２５Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬の水溶液を調製した。ディスクひとつにつき２０μｌの調製済み水溶液を凍結乾燥したディスク状のゼラチンヒドロゲルに含浸させた。この結果膨潤したヒドロゲルを４℃で３時間維持し、１２５Ｉ残基をゼラチンのアミノ基に導入した。４℃で４日間定期的にＤＤＷを交換することによって、結合していない遊離した１２５Ｉ標識試薬を１２５Ｉ標識ゼラチンヒドロゲルから除いた。定期的に測定すると、ＤＤＷの放射能は３日間洗浄した後、バックグラウンド値に戻った。ヒドロゲル調製条件に関わらず、放射性標識およびその後の洗浄工程中に、膨潤ヒドロゲルディスクの形状変化は観察されなかった。最終的に得られた膨潤ヒドロゲルを凍結乾燥した。
（２）ゼラチンヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｖｏ分解の評価
体内埋植した１２５Ｉ標識ゼラチンヒドロゲルの放射能の減衰からゼラチンヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｖｏ分解を評価した。ｄｄＹマウスの背の皮下組織に種々の１２５Ｉ標識ゼラチンヒドロゲルを体内埋植した（３匹／群、６〜７週齢、Ｓｈｉｚｕｏｋａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、静岡県）。ヒドロゲル埋植の１，３，５，７，１０，１４および２１日目に、ガンマ計数器（ＡＲＣ−３０１Ｂ、アロカ、東京都）を用いて、埋植ヒドロゲルの放射能を計測した。次に、マウスの背のヒドロゲル埋植部位周囲の皮膚を、３×５ｃｍ２の小片に切除し、この筋膜部位を濾紙で徹底的に拭き取り、溶出した１２５Ｉ標識ゼラチンを吸収した。皮膚小片および濾紙の放射能を測定し、埋植ヒドロゲル周囲組織の残存放射線を評価した。最初に埋植したヒドロゲルの放射能に対する総放射線量の比は、ヒドロゲル分解のために残存する活性比率を示すものであった。それぞれの実験群には２１匹のマウスを用い、特に記載がない限り、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のための各評価時に３匹ずつ屠殺した。すべての動物実験は、動物実験に関する京都大学の学内ガイダンスにしたがって行った。
この結果を図１に示す。図１には、１２５Ｉ標識ゼラチンヒドロゲルをマウスの背に皮下埋植した後に残存するゼラチン放射能の時間経過を示す。ヒドロゲル調製に用いるグルタルアルデヒド濃度が高くなるにつれて、放射能が長期間残存するが、すべてのヒドロゲルで残存放射能は時間とともに減衰した。たとえば、最も、含水率の高いゼラチンヒドロゲルは体内埋植後７日以内に分解されたが、最も含水率が低いヒドロゲルは２１日にわたり体内に維持された。
以上のように、グルタルアルデヒド濃度が高くなるにしたがって、ゼラチンヒドロゲルが遅く分解された。一般に、ヒドロゲル調製に用いられるグルタルアルデヒド濃度が高くなれば、それだけヒドロゲルの架橋程度が高くなる。このため、ヒドロゲルの架橋程度は立体化学的にゼラチン鎖に対するプロテアーゼの加水分解アプローチを小さくし、その結果、タンパク質加水分解に対する感受性が小さくなると思われる。
実施例３
ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルからのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＨＧＦ放出の評価
１２５Ｉ標識ＨＧＦを含浸する種々のゼラチンヒドロゲルをマウスの背の皮下組織に埋植した。１２５Ｉ標識ＨＧＦ（１００μｌ／部位）の水溶液をマウスの背部皮下に注射した。異なる時間間隔で埋植ヒドロゲルまたは注射部位を含むマウスの皮膚を取り出し、上記と同じ方法で濾紙を用いてその筋膜部位を徹底的に拭き取った。残りのゼラチンヒドロゲル、皮膚小片および濾紙の放射能をガンマ計数器で測定し、使用前のＨＧＦに対するこの放射線の比率をｉｎ  ｖｉｖｏ  ＨＧＦ放出のために残存する活性比率として示した。
この結果を図２に示す。図２には、１２５Ｉ標識ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルをマウスの背に皮下埋植した後のＨＧＦ放射能の減衰パターンを示す。ＨＧＦの残存放射能は経時的に漸減し、ヒドロゲルの種類には関係なかった。放射能の減衰パターンはヒドロゲルの種類に大きく依存した。架橋性ヒドロゲルのグルタルアルデヒド濃度が高くなるにしたがって、放射能が長く維持された。その一方、１２５Ｉ標識した遊離ＨＧＦの注射後の放射能は、注射部位から１日以内に消失した。
図３には、ヒドロゲルの残存放射能の相関的要素として、ＨＧＦの放射能残存量を示す。ヒドロゲルの種類に関わりなく、ふたつの残存放射能間に良好な相関が認められ、傾きは約１であった。
以上のように、図１と図２を比較すると、ＨＧＦ放射能は分解が早いヒドロゲルで急速に減衰した。ＨＧＦヒドロゲル放射能間の減衰パターンに良好な相関が認められる（図３）ということは、ヒドロゲルの生分解にともない体内のゼラチンヒドロゲルからＨＧＦが放出されたことを意味する。吸着実験ではＨＧＦが酸性ゼラチンに相互作用することを示している。いったん酸性ゼラチンと相互作用すると、ヒドロゲル分解によって水溶性ゼラチン断片が生成されない限り、ヒドロゲルからＨＧＦ分子を放出できなくなると考えられる。
実施例４
ゼラチンヒドロゲルに収着したＨＧＦの定量
ヒドロゲルに対するＨＧＦ吸着の等温式を作製するため、種々の量の１２５Ｉ標識ＨＧＦを含む水溶液（０．５ｍｌ）を、ＤＤＷ  １ｍｌにあらかじめ膨潤しておいたヒドロゲルに添加した。３７℃で４８時間かけてＨＧＦ吸着が進み、ＨＧＦ濃度に関係なく、平衡化したＨＧＦ吸着にはこれで十分であることがわかった。放射線を測定することによって、溶液中の遊離ＨＧＦの平衡濃度（Ｃｆ）を算定した。ＨＧＦおよびゼラチンのモル重量を９０，０００および１００，０００として、ゼラチンに吸着したＨＧＦのモル比（ｒ）を計算した。スキャッチャード結合モデル［Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ．１９４９年］にしたがって、ｒ／Ｃｆをプロットした。ｒ／Ｃｆ−ｒ直線でｒ＝０のときの傾きおよび切片から、解離定数（Ｋｄ）およびゼラチンに対するＨＧＦの結合モル比を得た。
このゼラチンへのＨＧＦ吸着に対する結果を以下に示す。
ゼラチンヒドロゲルに対するＨＧＦの吸着等温式は、ラングミュアの吸着等温式とした（データ示さず）ために、吸着パラメータはスキャッチャード解析法に基づいて計算した。３７℃の酸性ゼラチンのＫｄ値は５．５×１０−７Ｍで、これは２０℃の硫酸ヘパリンのＫｄ値１×１０−９〜２．０×１０−１０Ｍよりも約２〜３次数大きい［Ｒａｈｍｏｕｎｅ  Ｈら１９９８年］。これはゼラチンに対するＨＧＦの親和性がきわめて低いことを示している。およそＨＧＦ分子７個が酸性ゼラチン分子１個に結合した。
実施例５
ＨＧＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイ
Ｍｖ１Ｌｕ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を促すＨＧＦまたはゼラチンと複合体形成したＨＧＦの作用に関して、その生理活性を評価した［Ｔａｊｉｍａ，Ｈ．ら１９９２年］。培養培地にはイーグル培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯカタログ番号１５１４０−１２２）を含有するＮｉｓｓｕｉ）を用いた。まず、培養培地１００μｌを９６ウェルマルチウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｓｔｅｒ）に入れ、５％ＣＯ２−９５％空気雰囲気下、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ＨＧＦ水溶液５０ｍｌまたはＨＧＦ濃度１．２５μｇ／ｍｌで調製したＨＧＦ−ゼラチン複合体をウェルに加え、各ＨＧＦ試料を含む培地５０μｌ（１５０μｌ）を順次隣のウェルに移していき、３倍段階希釈によって、１１のウェルを調製した。ゼラチンとＨＧＦの混合物をＤＤＷ中で３７℃にした。簡潔に記載すると、ＨＧＦ／ゼラチン混合比率を１４．２／１および７．１／１として、種々の濃度の水溶液を１および１２時間放置し、種々のＨＧＦ−ゼラチン複合体を調製した。各ＨＧＦ試料のために、ＨＧＦ濃度ごとに３つのウェルを用いた。最後に、細胞懸濁液１００μｌ（１×１０４細胞／ｍｌ）を各ウェルに播種した。７２時間インキュベーションした後、細胞数計測キット−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて、細胞増殖を検定した。各ウェルにキット−８溶液（１０μｌ）を添加し、この細胞を３７℃で４時間インキュベートした。ＵＶ  ｍａｘ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェルの収着度を測定した。試料ウェルの収着度を後者に対するＨＧＦを含まない対照の収着度と比較した（％細胞増殖）。各ＨＧＦ試料に対して最大細胞増殖の５０％を誘導できるＨＧＦ濃度をＧＣ５０と表現した。
この結果を表２に示す。表２には、ＨＧＦおよびＨＧＦ−ゼラチン複合体のＧＣ５０値をまとめた。ＧＣ５０値の範囲はＨＧＦ／ゼラチン混合比および混合時間にほとんど依存しないものの、ＧＣ５０値はゼラチン複合体形成によって増加する。３７℃でゼラチンと複合体形成すると、ＨＧＦの用量−反応曲線が高用量の向きに、もとのＨＧＦの用量−反応曲線に平行になるようにシフトする。ゼラチン自体は細胞増殖を促進するような作用を持たない（データ示さず）。
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以上のように、表２には酸性ゼラチンと複合体形成した場合でも、ＨＧＦが生理活性を示すことを示した。ＨＧＦの活性が小さくなることはゼラチンの複合体形成から説明することができる。ＨＧＦはゼラチンと複合体形成するため、細胞表面受容体へのＨＧＦの作用は遊離のＨＧＦよりも小さいと考えられる。
実施例６
ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルによって誘導される血管新生のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
ＨＧＦ  １、５および１０μｇを含浸するゼラチンヒドロゲル、ＨＧＦを含浸せず、何も含まないゼラチンヒドロゲルのいずれかをマウスの背の皮下組織に体内埋植した。対照として、ＨＧＦ  １０μｇを含むＰＢＳまたは含まないＰＢＳをマウスの背に皮下注射した。各実験群は実験ポイントにつき６匹であった。体内埋植または注射から７日後にマウスを屠殺し、背の皮下組織にみられるＨＧＦ誘導性血管新生作用を評価した。ＨＧＦの血管新生は組織の性状、組織学的検査および生化学的検査をもとに評価した。まず、ＨＧＦの埋植部位または注射部位周囲の皮下組織の写真を撮影し、肉眼的所見で血管新生作用を評価した。次に、６匹のマウスから３匹を無作為選択し、埋植ヒドロゲルまたは注射部位を含む皮膚標本を１０ｗｔ％中和ホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィンに包理して、切片（５μｍ厚）を作製した。作製した切片をヘマトキシリン−エオジン染色し、光学顕微鏡で組織学的に観察した。各実験群につき３匹のマウスから得た３つの組織学的切片を用いて、ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルまたはＨＧＦを含まないゼラチンヒドロゲルの埋植部位のほか、ＨＧＦおよびＰＢＳの注射部位の周囲に新たに形成された毛細管の数を評価した。簡潔に記載すると、埋植部位または注射部位（３ヵ所／切片）周囲の固定領域を無作為に観察し、毛細管の数を数えた。
残りの３匹はＨＧＦ誘導性血管新生の生化学的検査に用いた。ヒドロゲル埋植部位または注射部位周囲の皮膚小片（２×２ｃｍ２）を鋏で小さく切断し、０．１Ｍトリス−ＨＣｌおよび０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１ｍｌで４℃、２４時間処理するすることでタンパク質成分を抽出した。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した後、得られた上清の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の濃度をＥＬＩＳＡ法で明らかにした。
ＨＧＦによって活性化された細胞がＶＥＧＦを分泌し、このＶＥＧＦがＨＧＦの血管新生作用に介在することが報告されている［Ｗｏｊｔａ，Ｊ．ら、１９９９年］。
この結果を図４と表３に示す。図４は、異なる用量のＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルの埋植またはＨＧＦを含むＰＢＳ溶液の注射後の背側の皮膚の組織性状を示したものである。血管新生による変化がＨＧＦ  ５および１０μｇを含浸するゼラチンヒドロゲルの埋植部位周囲に認められ、高用量であっても遊離ＨＧＦの注射部位とはまったく対照的であるように思われた。溶液の形でのＨＧＦ注射は、皮下組織の血管分布にまったく影響せず、注射部位の組織所見はＨＧＦを含まないＰＢＳ注射マウスの所見に類似していた。ＨＧＦを含まないゼラチンヒドロゲル単独では血管新生による変化は誘導されなかった。図５にはこの組織切片を示す。ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルを埋植した場合、新たな血管が埋植部位周囲に形成され、ＨＧＦの用量が増すにつれて、その範囲が大きくなった。ＨＧＦを含浸しないゼラチンヒドロゲルも最高用量の遊離ＨＧＦもいずれも無効であった。ＨＧＦを含浸する埋植ヒドロゲルまたはＨＧＦを含浸しない埋植ヒドロゲルに対する有害反応および重篤な炎症反応は、観察されなかった。
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表３は、ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルの埋植部位周囲に新たに形成された毛細管の数を示す。この毛細管の数は、ほかの実験群に比して、ＨＧＦ  ５および１０μｇを含浸するゼラチンヒドロゲルによって有意に上昇した。遊離ＨＧＦ  １０μｇでは血管新生を誘導せず、毛細管の数はＨＧＦを含まないＰＢＳおよび何も含まないゼラチンヒドロゲルと同じであった。
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表４には、ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルの埋植後および遊離ＨＧＦの注射後、マウスの皮下組織にみるＶＥＧＦ濃度を示す。注射から７日目、ＰＢＳ溶液中のＨＧＦ１０μｇが注射部位のＶＥＧＦを誘導せず、ＨＧＦを含まないＰＢＳ注射または未治療の正常マウスとほぼ同じであった。しかし、ＨＧＦ  ５および１０μｇを含浸するゼラチンヒドロゲルによって、埋植後７日でヒドロゲル周囲のＶＥＧＦ濃度が上昇し、何も含まれていないゼラチンヒドロゲルとは対照的であった。
以上のように、表３から、ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルが同量の遊離ＨＧＦよりも著明な範囲で血管新生を誘導することが明らかである。ＨＧＦによって活性化された細胞がＶＥＧＦを分泌し、このＶＥＧＦがＨＧＦの血管新生作用に介在すると報告されている［Ｗｏｊｔａ  Ｊ．ら１９９９年］。ＨＧＦ  ５および１０μｇを含浸するゼラチンヒドロゲルの埋植から７日後でも、ＶＥＧＦ誘導が観察された（表４）。１μｇの量は長時間にわたり、誘導性ＶＥＧＦ濃度を維持するほど十分な用量ではなかった。総合すると本データは、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境に曝露されていても、ゼラチンヒドロゲルに含浸されるＨＧＦがその生理活性を維持することを示している。分解によってヒドロゲルから放出されたＨＧＦがｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生を誘導すると考えられる。
実施例７
ＨＧＦゼラチン製剤のトリプシンに対する安定性
実施例２記載のＨＧＦゼラチン製剤にトリプシン水溶液（２．３μｇ／ｍｌ）を５μｌ加え、よく攪拌した後、３７℃、３時間静置した。さらにトリプシンインヒビター水溶液（３．５μｇ／ｍｌ）を５μｌ加え（よく攪拌した後、３７℃、１時間静置した。これを１０％アクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（２０ｍＡ、９０分）。コントロールとして、ゼラチン水溶液のみ、ＨＧＦ水溶液のみ、トリプシンおよびトリプシンインヒビターを加えなかったもの、ＨＧＦ溶液にトリプシンおよびトリプシンインヒビターを加えたものを共に電気泳動した。その結果を図６に示す。本発明のＨＧＦゼラチン製剤は、トリプシン処理によってもＨＧＦはほとんど分解されなかった（レーン４および６）。
実施例８
ＨＧＦゼラチン製剤の生物活性
実施例２記載のＨＧＦゼラチン製剤を用いて、ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液に加えた。その混合溶液中でＭｖ１Ｌｕ細胞（ミンク肺上皮細胞株）を培養した。コントロールとして、ＨＧＦ水溶液、ゼラチン水溶液を使用した。
ＨＧＦ濃度の異なる培養液中で、３日間培養した後の増殖細胞数をセル・カウイテイング・キット（同仁化学研究所製）により計測し、ＨＧＦの無添加培養時の増殖細胞数に対する百分率として細胞増殖率を算出した。細胞増殖率をＨＧＦ濃度に対してプロットした場合の、最大細胞増殖率の１／２となるＨＧＦ濃度をＩＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）とした。この値あるいは細胞増殖率からＨＧＦの生物活性を評価した。ゼラチンと混合した、ＨＧＦあるいはＨＧＦをトリプシンを用いて酵素消化した。その後、同様にしてＨＧＦの細胞増殖率を評価することによって、ゼラチンとの混合によるＨＧＦの酵素消化抵抗性を調べた。なお、データはすべてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較法によって解析し、Ｐ＜０．０５で統計的有意性を認めた。実験結果は平均±平均の標準偏差（ＳＤ）で表した。結果を図７に示す。
図７Ａは、遊離ＨＧＦ、ゼラチン、酸性ゼラチンと混合したＨＧＦの細胞増殖活性を示す。ゼラチンとの混合の有無に関係なく、ＨＧＦ濃度の増加とともに細胞増殖効率は増加したが、その程度はゼラチンと混合することにより若干低下した。ゼラチン自身には細胞増殖の促進作用は見られなかった。図７Ｂは、ゼラチンと混合したＨＧＦの細胞増殖促進活性に与えるＨＧＦ／ゼラチンの混合比の影響である。混合比が７／１以下では、ＨＧＦの細胞増殖促進活性が低下した。これは、ゼラチンとの相互作用により、ＨＧＦの細胞表面レセプターへの親和性が低下したことが原因であると考えられる。図７Ｃは、トリプシン処理がＨＧＦの細胞増殖促進活性に与える影響を示す。ゼラチンと混合することによってＨＧＦのトリプシン消化抵抗性の向上が認められた。ＨＧＦがゼラチンによりカバーされ、ＨＧＦ分子がトリプシンにより攻撃されにくくなったためであると考えられる。
産業上の利用可能性
本発明により、ＨＧＦのゼラチン徐放性製剤が提供でき、さらには、この製剤を用いて血管新生促進剤または動脈疾患治療剤などが提供される。本発明の血管新生促進剤または動脈疾患治療剤は、多くの患者に適用可能であり、さらに、ＨＧＦの有効な治療製剤としての有用性が期待される。
本出願は、日本で出願された特願２００１−２１８８７０号を基礎としており、その内容は本明細書中に全て包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、１２５Ｉ標識ヒドロゲルのゲル１（○）、ゲル２（●）およびゲル３（△）をマウスの背に皮下埋植した後の残存放射能の時間経過を示す。この線は最小２乗法による。
図２は、１２５Ｉ標識ＨＧＦを含浸するゲル１（○）、ゲル２（●）およびゲル３（△）をマウスの背に皮下埋植した後、あるいはマウスの背に溶液の形で１２５Ｉ標識ＨＧＦを皮下注射（▲）した後の残存放射能の時間経過を示す。この線は最小２乗法による。
図３は、マウスの背に皮下埋植した後の１２５Ｉ標識ＨＧＦ含浸ゼラチンヒドロゲルと１２５Ｉ標識ゼラチンヒドロゲルとの残存放射能の関係を示す。ヒドロゲルはゲル１（○）、ゲル２（●）およびゲル３（△）から調製した。
図４は、ＨＧＦを含まないＰＢＳ（Ａ）および遊離ＨＧＦ１０μｇ（Ｂ）の注射後、またはＨＧＦを含浸せず、他に何も含まないゲル２ヒドロゲル（Ｃ）およびＨＧＦ  １μｇ（Ｄ）、５μｇ（Ｅ）および１０μｇ（Ｆ）含浸ゲル２ヒドロゲルを埋植後、７日目の各マウスの皮下組織性状を示す。
図５は、ＨＧＦを含まないＰＢＳ（Ａ）および遊離ＨＧＦ１０μｇ（Ｂ）の注射後、またはＨＧＦを含まず、他に何も含まないゲル２ヒドロゲル（Ｃ）およびＨＧＦ  １μｇ（Ｄ）、５μｇ（Ｅ）および１０μｇ（Ｆ）含浸ゲル２ヒドロゲルを埋植後、７日目の各マウスの組織学的切片を示す。矢印は新たに形成された血管を示す。
図６は、ゼラチンとの複合体形成によるＨＧＦのトリプシンに対する安定化効果を示すゲル電気泳動の結果である。レーン１、９、１０は標準タンパク質、レーン２はゼラチン（新田ゼラチン；等電点９．０）、レーン３はＨＧＦ＋ゼラチン（新田ゼラチン；等電点９．０）、レーン４は３７℃、２４時間インキュベーション後のＨＧＦ＋ゼラチン（新田ゼラチン；等電点９．０）、レーン５はＨＧＦ単独、レーン６は３７℃、２４時間インキュベーション後のＨＧＦ＋ゼラチン（新田ゼラチン；等電点５．０）、レーン７はＨＧＦ＋ゼラチン（新田ゼラチン；等電点５．０）、レーン８はゼラチン（新田ゼラチン；等電点５．０）、レーン１１はゼラチン（シグマ社，タイプＡ）、レーン１２はゼラチン（和光純薬社製）、レーン１３はゼラチン（新田ゼラチン；等電点９．０）、レーン１４はゼラチン（新田ゼラチン；等電点５．０）である。
図７（Ａ、ＢおよびＣ）は、ＨＧＦの細胞増殖促進活性に及ぼすゼラチンとの混合の影響を示す。図７Ａは、遊離ＨＧＦ（●），ゼラチン（○）、酸性ゼラチンと混合したＨＧＦ（△）の細胞増殖活性のＨＧＦ濃度との関係を示す。図７Ｂは、ゼラチンと混合したＨＧＦの細胞増殖促進活性に与えるＨＧＦ／ゼラチンの混合比の影響を示す。図７Ｃは、トリプシンで処理した（●）もしくは処理していないＨＧＦ（○）およびトリプシンで処理した（▲）もしくは処理していないＨＧＦ＋ゼラチン（△）における細胞増殖率とＨＧＦ濃度との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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