(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的生産物の生産に関与する酵素をコードする外来遺伝子と、下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、構成的に発現可能なHAP４遺伝子とを導入し、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-結合性複合体のサブユニットを構成するHAP4タンパク質
ピルビン酸脱炭酸酵素及び/又はアルコール脱水素酵素の酵素活性が低下し、野性型と比較してアルコール生産性が低下した変異株である変異体酵母。
【請求項２】
上記ピルビン酸脱炭酸酵素は、PDC1遺伝子、PDC5遺伝子及びPDC6遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子によりコードされることを特徴とする請求項１記載の変異体酵母。
【請求項３】
上記アルコール脱水素酵素は、ADH1遺伝子によりコードされることを特徴とする請求項１記載の変異体酵母。
【請求項４】
Saccharomyces属に属することを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の変異体酵母。
【請求項５】
Saccharomyces cerevisiaeの菌株に属することを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の変異体酵母。
【請求項６】
上記外来遺伝子は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１乃至５いずれか一項記載の変異体酵母。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれか一項記載の変異体酵母を培養し、目的生産物を菌体内外に生成する工程と、
上記目的生産物を回収する工程とを含む、酵母を用いた物質生産方法。
【請求項８】
上記目的生産物が有機酸であることを特徴とする請求項７記載の物質生産方法。
【請求項９】
上記目的生産物が乳酸であることを特徴とする請求項７記載の物質生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野性型酵母に対して所定の遺伝子を構成的に発現させるように改変した変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）等を用いて目的生産物を生産する場合、当該目的生産物の生合成に関与する遺伝子を構成的に発現できるように導入した変異体酵母を作製し、適切な培養条件にて変異体酵母を培養し、目的生産物を菌体内或いは菌体外から回収する。また、エタノール以外の物質を目的生産物とする場合、大量に生産されるエタノールを減らすことが好ましい。これまでに、エタノール生産能を低減するため、エタノールの生産経路にあるピルビン酸脱炭酸酵素やアルコール脱水素酵素などの遺伝子破壊株が作製された。しかしながら、特にSaccharomyces cerevisiaeのようなクラブトリー効果のある菌においては、エタノール生産量は低減するものの、増殖や発酵能力が大幅に低下し、実用性が低いといった問題があった。（非特許文献１：Ishida, N. et al. (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem. 70, p1148-1153、非特許文献２：Flikweert, M.T. et al. (1996) Yeast 12, p247-257、非特許文献３：Eri, A. et al. (1998) J. Ferment. Bioeng. 86, p284-289、特許文献１：特表2003-500062号公報、特許文献２：特表2001-516584号公報、非特許文献４：Skory, C.D. （2003） J. Ind. Microbiol. Biotechnol 30, p22-27）。また、非特許文献１、非特許文献３及び非特許文献４によれば、エタノールの生産経路の遺伝子を破壊することで大幅にエタノールを低減することはできても、必ずしも低減分の大部分が目的生産物にはなるわけではない。
【０００３】
一方、エタノールの生産経路の遮断は一部に留め、目的生産物の代謝経路を増強することで、目的生産物収率を向上させる報告もあるが（非特許文献５：Saitoh, S (2005) Appl. Environ. Microbiol. 71, p2789-2792）、目的の生産物の収率は向上するものの、エタノール低減は不十分で、発酵速度もやや低下するといった問題がある。
【０００４】
【特許文献１】特表2003-500062号公報
【特許文献１】特表2001-516584号公報
【非特許文献１】Ishida, N. et al. (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem. 70, p1148-1153
【非特許文献２】Flikweert, M.T. et al. (1996) Yeast 12, p247-257
【非特許文献３】Eri, A. et al. (1998) J. Ferment. Bioeng. 86, p284-289
【非特許文献４】Skory, C.D. （2003） J. Ind. Microbiol. Biotechnol 30, p22-27
【非特許文献５】Saitoh, S (2005) Appl. Environ. Microbiol. 71, p2789-2792
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、酵母を用いて目的生産物を生産するに際して、目的生産物の生産性を大幅に向上させるとともに優れた生育速度及び発酵速度を維持することができる変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、目的生産物の生産に関与する遺伝子を導入するとともに、HAP4遺伝子を構成的に発現させることで、生育速度及び発酵速度を維持しつつ当該目的生産物の生産性が大幅に向上することを見いだし、本発明を完成するにいたった。
【０００７】
本発明は以下を包含する。
（１）目的生産物の生産に関与する酵素をコードする外来遺伝子と、構成的に発現可能なHAP４遺伝子又はその相同遺伝子とを導入した変異体酵母。
【０００８】
上記（１）の変異体酵母としては、野性型と比較してアルコール生産性が低下した変異株であることが好ましい。例えば、アルコール合成に関与する酵素の酵素活性を低下させることでアルコール生産性を低下させることができる。ここで、アルコール合成に関与する酵素としては、ピルビン酸脱炭酸酵素及び/又はアルコール脱水素酵素を挙げることができる。上記ピルビン酸脱炭酸酵素としては、PDC1遺伝子、PDC5遺伝子及びPDC6遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子によりコードされる酵素を挙げることができる。上記アルコール脱水素酵素としては、ADH1遺伝子によりコードされる酵素を挙げることができる。また、上記（１）の変異体酵母としては、Saccharomyces属に属する酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeの菌株に属する酵母を使用することが好ましい。また、上記外来遺伝子は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。
【０００９】
（２）上述した本発明に係る変異体酵母を培養し、目的生産物を菌体内外に生成する工程と、上記目的生産物を回収する工程とを含む、酵母を用いた物質生産方法。
【００１０】
上記（２）の物質生産方法において、目的生産物としては有機酸とすることができる。また、特に目的生産物としては乳酸とすることが好ましい。なお、目的生産物としてはエタノール以外のアルコールとすることもできる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れた生育速度及び発酵速度を維持しながらも、目的生産物の生産性に優れた変異体酵母を提供することができる、本発明に係る変異体酵母を用いることによって、目的生産物を低コストに生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る変異体酵母は、目的生産物の生産に関与する酵素をコードする外来遺伝子と、構成的に発現可能なHAP４遺伝子又はその相同遺伝子とを導入したものである。ここで、HAP4遺伝子とは、ヘミ活性化、グルコース抑制されるHap2p/3p/4p/5p CCAAT-結合性複合体のサブユニットを構成するHAP4タンパク質をコードしている。当該複合体は、種々の遺伝子の転写促進活性を有していることが知られている。特に、HAP４タンパク質及び上記複合体については、Gancedo JM  (1998) Yeast carbon catabolite repression. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(2), p334-61に詳述されている。
【００１３】
HAP4遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列及びHAP４タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。なお、構成的に発現するように導入するHAP4遺伝子としては、配列番号２に示したアミノ酸配列を含むタンパク質に限定されず、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記複合体を形成して転写促進活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、同一性とは、blastアルゴリズムを実装したコンピュータプログラム及び遺伝子配列情報を格納したデータベースを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００１４】
また、HAP4遺伝子としては、配列番号２に示したアミノ酸配列において１又は複数個（例えば２〜６０個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜４０個、さらに好ましくは２〜３０個、最も好ましくは、２〜１５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、上記複合体を形成して転写促進活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００１５】
さらに、HAP4遺伝子としては、配列番号１に示した塩基配列を含む遺伝子に限定されず、配列番号１に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は連続する一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記複合体を形成して転写促進活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、45℃、6×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の50〜65℃、0.2〜1×SSC、0.1％SDSでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、65〜70℃、1×SSCでのハイブリダイゼーション、その後の65〜70℃、0.3×SSCでの洗浄を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
【００１６】
なお、上述したような、所定の同一性を有するアミノ酸配列や、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列等は、配列番号２に示したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号１に示す塩基配列）を有するポリヌクレオチドを、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。また、配列番号１に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は連続する一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについても、同様に、配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）を用いて変異が導入される。また、変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良いし、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。
【００１７】
また、あるタンパク質が、上記複合体を形成して転写促進活性を有するか否かは、例えば、David S. McNabbら、Eukaryotic Cell, November 2005, p. 1829-1839, Vol. 4, No. 11に開示された実験系を利用して確認することができる。すなわち、この文献には、Hap2p/Hap3p/Hap5pヘテロトリマーを構築した後にHap4タンパク質を作用させることで、上記複合体を形成するとともに上記転写促進活性を示すことが記載されている。よって、当該文献に記載された実験系を利用して、あるタンパク質がHAP4タンパク質と同等の機能を有するか否かを容易に検討することができる。
【００１８】
ところで、上述したHAP4遺伝子は、従来公知の手法によりSaccharomyces cerevisiaeから単離して使用することができる。なお、本発明においては、上述したHAP4遺伝子の代わりにHAP4遺伝子の相同遺伝子を使用しても良い。HAP4遺伝子の相同遺伝子としては、Kluyveromyces lactis由来のHAP4相同遺伝子（Bourgarel, D. et al., 1999. Mol. Microbiol. 31:1205-1215参照)及びHansenula polymorpha由来のHAP4相同遺伝子（Sybirna, K. et al., 2005. Curr. Genet. 47:172-181参照）を挙げることができる。これらHAP4相同遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子によりコードされるHAP4相同タンパク質のアミノ酸配列は、Genbank等の公知のデータベースより入手することができる。
【００１９】
以上で説明したHAP4遺伝子又はその相同遺伝子を、宿主内で構成的に発現させるには、例えば、構成的発現プロモーターを利用する方法が挙げられる。すなわち、構成的発現プロモーターの制御下にHAP4遺伝子又はその相同遺伝子を配置した発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを用いて宿主を形質転換する方法を採用することができる。ここで構成的発現プロモーターとは、宿主細胞の生育条件とは無関係に下流の遺伝子を発現させる機能を有するプロモーターである。構成的発現プロモーターは、特に限定しないで使用できるが、宿主細胞の種類に応じてまた制御する遺伝子の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエにおける構成的発現プロモーターとしては、ＡＤＨ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＣＹＣ３プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター及びＨＯＲ７プロモーター等が挙げられる。
【００２０】
なお、上述した構成的発現プロモーターとHAP4遺伝子又はその相同遺伝子とを含む発現ベクターは、宿主に導入された際にHAP4遺伝子又はその相同遺伝子の発現を調製するその他の配列、具体的には、オペレーター、エンハンサー、サイレンサー、リボソーム結合配列、ターミネーター等を有していてもよい。
【００２１】
ここで、HAP4遺伝子又はその相同遺伝子を構成的に発現するように導入するための宿主としては、酵母であれば特に限定されない。宿主として使用可能な酵母としては、例えば、子嚢菌類（Ascomycota）の子嚢菌酵母、担子菌類（Basidiomycota）の担子菌酵母、又は不完全菌類（Fungi Imperfecti）の不完全菌酵母を挙げることができる。好ましくは、子嚢菌酵母、特に出芽酵母であるサッカロマイセス・セレビシアエ、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)又はピキア・パストリス(Pichia pastris)等、分裂酵母であるシゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)等が用いられる。また、宿主としては、Kluyveromyces lactis及びHansenula polymorphaを使用することができる。
【００２２】
また、特に、宿主として使用する酵母は、アルコール生産性が低下した変異株を使用することが好ましい。ここで、アルコール生産性が低下したとは、野性型酵母と比較して、アルコール生産性が有意に低下したことを意味する。例えば、アルコール合成に関与する酵素の酵素活性が低下するように変異を野性型酵母に対して導入することによって、アルコール生産性を低下させることができる。アルコール合成に関与する酵素としては、ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素を挙げることができる。これらピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素のうち、一方又は両方の酵素活性を低下させることでアルコール生産性を低下させることができる。サッカロマイセス・セレビシアエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子としては、PDC1遺伝子、PDC5遺伝子及びPDC6遺伝子を挙げることができる。サッカロマイセス・セレビシアエ由来のアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子としては、ADH1遺伝子を挙げることができる。
【００２３】
これら遺伝子のうち１又は複数の遺伝子を欠損させることによって、アルコール生産性を低下させることができる。なお、遺伝子の欠損方法としては、特に限定されないが、当該遺伝子を欠失させる方法、当該遺伝子に変異を導入して不活性型の酵素を発現させる方法、当該遺伝子の発現調節領域（例えばプロモーター）を欠失又は変異させる方法を挙げることができる。また、遺伝子の欠損方法には、当該遺伝子に対するsiRNA (small interfering RNA)、アンチセンスRNA、リボザイムを宿主細胞内において発現させる方法も含まれる。
【００２４】
また、本発明に係る変異体酵母は、目的生産物の生産に関与する酵素をコードする外来遺伝子しており、当該目的生産物を生産するために使用することができる。目的生産物としては、酵母で生合成できる物質であれば特に限定されないが、例えば乳酸、アクリル酸、酢酸、ピルビン酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、レブリン酸、アジピン酸、アスコルビン酸及びクエン酸等の有機酸並びに1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、イソブタノール、2-メチル-1-ブタノール及び3-メチル-1-ブタノール等のアルコールを挙げることができる。
【００２５】
なかでも、乳酸を目的生産物とする場合、外来遺伝子としては、乳酸の合成に関与する乳酸脱水素酵素（LDH）遺伝子を挙げることができる。換言すれば、外来遺伝子としてLDH遺伝子を導入することによって、変異体酵母には乳酸生産能が付与されることとなる。LDHとしては、生物の種類に応じてあるいは生体内において各種同族体が存在する。本発明において使用するLDHとしては天然由来のLDHの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたLDHも包含している。LDHとしては、好ましくは、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・カゼイ、クルベルマイセス・サーモトレランス、トルラスポラ・デルブルッキ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、リゾプス・オリゼなどの原核生物もしくはカビなどの真核生物由来であり,より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来である。例えば、ウシ由来のLDH（L-LDH）を使用することが好ましい。これら遺伝子を、上述した酵母に導入することによって、当該微生物に乳酸生成能を付与することができる。
【００２６】
また、上述した外来遺伝子は、構成的発現プロモーターの制御下に導入されても良いし、発現誘導型プロモーターの制御下に導入されても良い。なお、上述した外来遺伝子は、Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-結合性複合体が認識して結合するCCAATコンセンサス配列を含むプロモーターの制御下に導入される必要はない。
【００２７】
本発明に係る変異体酵母によれば、HAP4遺伝子又はその相同遺伝子を構成的に発現するため、目的生産物の生産性が大幅に向上することとなる。特に、アルコール生産性が低減した変異体酵母においては、HAP4遺伝子又はその相同遺伝子を構成的に発現させることで生育速度及び発酵速度の低下を来すことなく、目的生産物の生産性を向上させることができる。このように、本発明に係る変異体酵母を利用することで、目的生産物の収率を大幅に向上させることができ、目的生産物の生産コストを著しく削減することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２９】
〔実施例１〕
LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片の作製
先ず、宿主となる酵母に対して外来遺伝子として乳酸脱水素酵素（LDH）遺伝子を導入するとともに、アルコール合成に関与するピルビン酸合成酵素遺伝子（PDC1遺伝子）を破壊するためのDNA断片を作製した。
【００３０】
具体的には、特開2003-259878号公報に開示されたプラスミドpBTrp-PDC1-LDHKCBを鋳型として、PDC1プロモーター、LDH遺伝子及びTDH3ターミネーターが融合したDNA断片をPCRで増幅した。このPCRではプライマーとしてTB215（5'-GAAACAGCTATGACCATGATTACG-3'：配列番号３）とTB1497（5'-AAGCTCTTAAAACGGGAATTCCCCTAAGAAACCAT-3'：配列番号４）を使用した（図１参照）。
【００３１】
一方、プラスミドｐRS403（ATCCから入手可能）を鋳型として、HIS3遺伝子を増幅した。このPCRではプライマーとしてTB1421（5'-ATGGTTTCTTAGGGGAATTCCCGTTTTAAGAGCTT-3'：配列番号５）とTB422（5'-GACCAAGTTAGCTGGTCGAGTTCAAGAGAAAAAAAAAG-3'：配列番号６）を使用した。
【００３２】
また、上記pBTrp-PDC1-LDHKCBを鋳型として、PDC1遺伝子の下流領域DNA断片をPCRで増幅した。このPCRではプライマーとして、TB1147（5'-CCAGCTAACTTGGTCGACTTG-3'：配列番号７）とTB019（5'-GCGCGTAATACGACTCACTAT-3'：配列番号８）を使用した。
【００３３】
以上のように増幅した3種類のPCR産物を鋳型として、Shevchuk, N.A.らの方法（Shevchuk, N. A. et al.（2004）Construction of long DNA molecules using long PCR-based fusion of several fragments simultaneously. Nucleic Acids Research 32(2) e19）により、3種類のPCR産物を結合した。このPCRではプライマーとしてTB151（5'-CCTATCTCTAAACTTCAACACC-3'：配列番号９）とTB152（5'-TCAGCAATAGTGGTCAACAACT-3'：配列番号１０）を使用した。なお、得られたDNA断片は、PDC1プロモーター、LDH遺伝子及びTDH3ターミネーターがこの順で融合した領域と、選択マーカーとしてのLEU2遺伝子と、組み換え用領域としてのPDC1遺伝子の下流領域とが含まれている。以下、このDNA断片を「LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片」と称する。
【００３４】
PDC5遺伝子破壊用DNA断片の作製
また、本実施例では、PDC5遺伝子を破壊するためのDNA断片を作製した。具体的には、Saccharomyces cerevisiae BY4742株（Invitrogen社）のゲノムDNAを鋳型として、PDC5遺伝子の5'上流非翻訳領域DNA断片と3'下流非翻訳領域DNA断片をそれぞれPCRで増幅した（図２参照）。使用したPCR用プライマーは前者がTB604（5'-TTCGCATCTAAGGGGTGGTG-3'：配列番号１１）とTB607（5'-GCGTGTACGCATGTAACTTTGTTCTTCTTGTTATT-3'：配列番号１２）、後者がTB599（5'-CTAACATTCAACGCTAGACGGTTCTCTACAATTGA-3'：配列番号１３）とTB501（5'-TAAGAAGGCATGTTGGCCTCTGT-3'：配列番号１４）である。
【００３５】
また、特開2003-259878号公報で開示されたプラスミドpBHPH-PTを鋳型として、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットをPCRで増幅した。使用したPCR用プライマーはTB606（5'-AATAACAAGAAGAACAAAGTTACATGCGTACACGC-3'：配列番号１５）とTB598（5'-TCAATTGTAGAGAACCGTCTAGCGTTGAATGTTAG-3'：配列番号１６）である。
【００３６】
以上のように増幅した3種類のPCR産物を鋳型として、上述したShevchuk, N.A.らの方法により、3種類のPCR産物を結合した。このPCRではプライマーとしてTB070（5'-GGAGACCCACTGTACAAC-3'：配列番号１７）とTB210（5'-GCAGCTGAAAGATAATAAGGTATG-3'：配列番号１８）を使用した。以下、このDNA断片を「PDC5遺伝子破壊用DNA断片」と称する。
【００３７】
HAP4遺伝子過剰発現用DNA断片の作製
また、本実施例では、Saccharomyces cerevisiae由来のHAP4遺伝子を過剰発現させるためDNA断片を作製した。具体的には、Saccharomyces cerevisiae BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、PDC6遺伝子の一部とその5'上流非翻訳領域を含むDNA断片、HAP4遺伝子とそのターミネーター領域を含むDNA断片、TDH2プロモーター領域を含むDNA断片、CTT1遺伝子の5'上流非翻訳領域を含むDNA断片をPCRで増幅した（図３参照）。使用したPCR用プライマーはそれぞれTB1021（5'-CCTTGATGCGTGCGTAACC-3'：配列番号１９）とTB910（5'-AAACGCGTGTACGCATGTAATCTCATAAACCTATGCACTG-3'：配列番号２０）、TB911（5'-TCATATTCGACGATGTCGTCCGAACTACAGTTATCGCCTC-3'：配列番号２１）とTB679（5'-CACACAAACAAACAAAACAAAATGACCGCAAAGACTTTTCTAC-3'：配列番号２２）、TB680（5'-GTAGAAAAGTCTTTGCGGTCATTTTGTTTTGTTTGTTTGTGTG-3'：配列番号２３）とTB900（5'-ATATATCTGCAGGGATCCCTTGACGGGTATTCTGA-3'：配列番号２４）、TB899（5'-TCAGAATACCCGTCAAGGGATCCCTGCAGATATAT-3'：配列番号２５）とTB349（5'-CCATATTTTCGTTAGGTCATTT-3'：配列番号２６）である。
【００３８】
また、特開2003-259878号公報で開示されたプラスミドpBble-LDHKCBを鋳型として、フレオマイシン発現カセットをPCRで増幅した。使用したPCR用プライマーはTB909（5'-CAGTGCATAGGTTTATGAGATTACATGCGTACACGCGTTT-3'：配列番号２７）とTB912（5'-GAGGCGATAACTGTAGTTCGGACGACATCGTCGAATATGA-3'：配列番号２８）である。
【００３９】
以上のように増幅したPDC6遺伝子の一部とその5'上流非翻訳領域を含むPCR産物、フレオマイシン発現カセットを鋳型として、上述したShevchuk, N.A.らの方法により、PCRで結合した。使用したPCR用プライマーはTB315（5'-ACCAGCCCATCTCAATCCATCT-3'：配列番号２９）とTB912である。また、以上のように増幅したHAP4遺伝子とそのターミネーター領域を含むPCR産物、TDH2プロモーター領域を含むPCR産物及びCTT1遺伝子の5'上流非翻訳領域を含むPCR産物を鋳型として、同様にPCRで結合した。使用したPCR用プライマーはTB911とTB316（5'-AGCGTATGGGTGATGAGAGTAC-3'：配列番号３０）である。
【００４０】
そして、上述のように結合した2つの断片をさらにDNAを鋳型として、同様にPCRで結合した。このPCRではプライマーとしてTB948（5'-GTTGAAGTCGCCTGGTAGCC-3'：配列番号３１）とTB734（5'-TGTCCAGGCTACGTCGAATC-3'：配列番号３２）を使用した。最終的に得られたDNA断片を「HAP4遺伝子過剰発現用DNA断片」と称する。
【００４１】
LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株の作製
Frozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH社製）を用いて、上述したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片をBY4742株に導入して刑資転換を行った。この形質転換はキット添付のプロトコールに従った。形質転換後、ロイシン選択培地（SD-Leu）のプレートにまいて、30℃で3日間培養し、形質転換体を選抜した。形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によって、LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片が染色体に組み込まれていることを確認した。このPCRではLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片の外側に位置するプライマーとして、TB324（5'-CTCATACATGTTTCATGAGGGT-3'：配列番号３３）とTB304（5'-ACACCCAATCTTTCACCCATCA-3'：配列番号３４）を使用した。その結果、BY4742株におけるPDC１遺伝子を破壊して、LDH遺伝子が染色体に組込まれていることを確認した。以下、この形質転換酵母を「LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株」と称する。
【００４２】
LDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株の作製
次に、PDC5遺伝子破壊用DNA断片を用いて、LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株を形質転換した。なお、形質転換方法は上記と同様である。形質転換後、200μg/mlのハイグロマイシンを含むYPD培地のプレートにまいて、30℃で３日間培養し、形質転換体を選抜した。形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によりPDC5遺伝子破壊用DNA断片が染色体に組み込まれていることを確認した。このPCRではPDC5遺伝子破壊用DNA断片の外側に位置するプライマーとしてTB077（5'-GGAACCCATAGATGAAGAGG-3'：配列番号３５）とPDC5遺伝子破壊用DNA断片内部に位置するプライマーとしてTB434（5'-ATCCGCTCTAACCGAAAAGG-3'：配列番号３６）を使用した。その結果、LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株におけるPDC5遺伝子が破壊されていることを確認した。以下、この形質転換酵母を「LDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株」と称する。
【００４３】
HAP4遺伝子導入株の作製
次に、上述したHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片を用いて、上記LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株及びLDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株を形質転換した。なお、形質転換方法は上記と同様である。形質転換後、100μg/mlのフレオマイシンを含むYPD培地のプレートにまいて、30℃で３-5日間培養し、形質転換体を選抜した。形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によりHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片が染色体に組み込まれていることを確認した。このPCRではHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片の外側に位置するプライマーであるTB315とHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片内部に位置するプライマーであるTB1020（5'-TCCTGCGCCTGATACAGAAC-3'：配列番号３７）を使用した。その結果、LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株及びLDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株の染色体中にHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片が導入されていることを確認した。
【００４４】
増殖試験
上述したように作製したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株（本項ではHAP4非導入株）及びHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片を導入したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株（本項ではHAP4導入株）について比増殖速度を算出した。具体的には、YPD（イーストエキストラクト 1%、ペプトン 2%及びグルコース2%）液体培地を100ml分注した500ml容バッフル付きフラスコに供試株を植菌し、30℃、120rpm（振幅35mm）で15〜20時間振盪培養後、菌体濃度0.7〜1.0％の状態で集菌した。再度、同条件にて供試株を菌体濃度0.01%の濃度で植菌し、増殖開始後約2時間毎にサンプリングを行い、菌体濃度を測定した。比増殖速度は増殖開始2〜10時間の間、対数増殖期であることを確認し、下記式に従って算出した。
【００４５】
【数１】
0004963488.tif 000002
【００４６】
増殖試験の結果を表１に示す。表１に示すように、HAP4導入株は、HAP4非導入株と比較して、ほぼ同等の増殖速度であった。
【００４７】
【表１】
0004963488.tif 000003
【００４８】
発酵試験１
上述したように作製したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株（本項ではHAP4非導入株）及びHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片を導入したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株（本項ではHAP4導入株）について発酵試験を行った。具体的には、供試株をYPD培地（イーストエキストラクト 1%、ペプトン 2%及びグルコース2%）に植菌し、30℃で24時間培養を行った。培養終了後、遠心分離（2000ｇ、3分）により菌体を回収した。
【００４９】
次に、発酵培地（グルコース11%、イーストエキス1%及び炭酸カルシウム4%）25mlを50ml容のフラスコに入れ、菌体濃度が0.5%になるように接種し、80rpm/分（震とう幅40mm）で34℃2〜3日間発酵を行った。発酵終了後、乳酸とエタノールの生産量を検討した。なお、乳酸収率は下記式で計算した。
【００５０】
乳酸収率(%)=乳酸最高濃度(%)/仕込み糖濃度(%)
発酵試験の結果を図４に示した。図４から判るように、HAP4導入株は、HAP4非導入株と比較して、乳酸収率が62％から70％に向上し、エタノール最高濃度が2.2％から1.4％に低下した。なお、発酵速度は同程度であった。
【００５１】
この結果から、HAP4遺伝子を構成的に発現した酵母においては、外来遺伝子として導入したLDH遺伝子による乳酸生産能が大幅に向上することが明らかとなった。
【００５２】
発酵試験２
上述したように作製したLDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株（本項ではHAP4非導入株）及びHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片を導入したLDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株（本項ではHAP4導入株）について発酵試験を行った。本発酵試験では、YPD培地に代えてYPE培地（イーストエキストラクト 1%、ペプトン 2%及びエタノール1%）を使用した以外は、上記発酵試験１と同様にして行った。
【００５３】
発酵試験の結果を図５に示した。図５から判るように、HAP4導入株は、HAP4非導入株と比較して、乳酸収率が77％から90％に向上し、エタノール最高濃度が0.09％から0.03％に低下した。なお、発酵速度は同程度であった。
【００５４】
この結果から、HAP4遺伝子を構成的に発現した酵母においては、外来遺伝子として導入したLDH遺伝子による乳酸生産能が大幅に向上することが明らかとなった。また、発酵試験１の結果（図４）と比較すると、HAP4遺伝子を構成的に発現した酵母であってアルコール生産性がより低下した酵母においては、外来遺伝子として導入したLDH遺伝子による乳酸生産能がより大幅に向上することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片を構築するフローを示す模式図である。
【図２】PDC5遺伝子破壊用DNA断片を構築するフローを示す模式図である。
【図３】HAP4遺伝子過剰発現用DNA断片を構築するフローを示す模式図である。
【図４】LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株に対するHAP4導入株及びHAP4非導入株について発酵試験の結果を示す特性図である。
【図５】LDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株に対するHAP4導入株及びHAP4非導入株について発酵試験の結果を示す特性図である。
【図１】
0004963488.tif 000004
【図２】
0004963488.tif 000005
【図３】
0004963488.tif 000006
【図４】
0004963488.tif 000007
【図５】
0004963488.tif 000008
【配列表】
0004963488000001.app