(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、開始試料においてTcRγδ+T細胞を増殖させる方法：
（1）T細胞マイトゲン、インターロイキン2、およびインターロイキン7を含む第一の培養培地において開始試料中の細胞を培養する段階；ならびに
（2）TcRγδ+T細胞を増殖させるために、インターロイキン2とインターロイキン7とを含む第二の培養培地において、段階（1）で得られた細胞を培養する段階。
【請求項２】
段階（1）の前に、開始試料中の細胞がT細胞に関して濃縮される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
段階（1）の前に、開始試料中の細胞がTcRγδ+T細胞に関して濃縮される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
段階（1）の前に、開始試料中の細胞からCD14+、CD16+、CD19+、CD33+、CD56+、およびグリコフォリンA+細胞が枯渇される、請求項1〜3のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
段階（1）の前に、開始試料中の細胞からTcRαβ+T細胞が枯渇される、請求項1〜4のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
段階（1）の前に、開始試料中の細胞から非TcRγδ+T細胞が枯渇される、請求項1〜5のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
開始試料が血液もしくは組織またはその画分である、請求項1〜6のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
開始試料が、末梢血、臍帯血、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、脾臓、癌組織、感染組織、リンパ節組織またはその画分から選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
開始試料がヒト末梢血またはその画分である、請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
開始試料が低密度単核球である、請求項1〜9のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
第一の培養培地において、T細胞マイトゲンが0.01〜100 μg/mlの量で存在し、第一および第二の培養培地において、インターロイキン2が0.1〜1000 ng/mlの量で存在し、インターロイキン7が0.1〜1000 ng/mlの量で存在する、請求項1〜10のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
第一の培養培地において、T細胞マイトゲンが0.1〜50 μg/mlの量で存在し、第一および第二の培養培地において、インターロイキン2が1〜100 ng/mlの量で存在し、インターロイキン7が1〜100 ng/mlの量で存在する、請求項1〜10のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
第一の培養培地において、T細胞マイトゲンが0.5〜10 μg/mlの量で存在し、第一および第二の培養培地において、インターロイキン2が2〜50 ng/mlの量で存在し、インターロイキン7が2〜50 ng/mlの量で存在する、請求項1〜10のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
第一の培養培地が1μg/mlのT細胞マイトゲンを含み、第一および第二の培養培地において、10 ng/mlのインターロイキン2および10 ng/mlのインターロイキン7を含む、請求項1〜13のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
上記の第一および第二の培養培地がさらに、第三の増殖因子を含む、請求項1〜14のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
上記の第三の増殖因子がIL-4もしくはIL-15である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
上記の第一および第二の培養培地がさらに第三および第四の増殖因子を含む、請求項1〜14のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
上記の第三および第四の増殖因子がIL-4およびIL-15である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
T細胞マイトゲンが植物レクチンである、請求項1〜18のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
植物レクチンがコンカナバリンAである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
T細胞マイトゲンが抗体またはその断片である、請求項1〜18のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
抗体がCD3またはその断片に結合する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
第一および第二の培養培地がさらに、血清または血漿を含む、請求項1〜22のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２４】
血清または血漿が容量で1〜25％の量で存在する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
血清または血漿が容量で2〜20％の量で存在する、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
血清または血漿が容量で2.5〜10％の量で存在する、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
血清または血漿が容量で5％の量で存在する、請求項23記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、TcRγδ+T細胞をエキソビボで増殖させる、新規かつ改善された方法に関する。
【０００２】
発明の背景
TcRγδ+T細胞は、古典的なクラスIまたはクラスII主要組織適合複合体（MHC）拘束要素の意味において、外来ペプチド抗原を微細な特異性で認識する従来のTcRαβ+T細胞とは異なる、循環中の（circulating）Tリンパ球の小さいサブセットである。対照的に、TcRγδ+T細胞は、外来微生物またはウイルス感染もしくは形質転換のようなストレスによって誘導された内因性細胞産物のいずれかに由来する可能性があるペプチドおよび非ペプチド抗原の双方を認識することができる。その上、TcRαβ+T細胞による抗原認識とは異なり、TcRγδ+T細胞による抗原認識はMHCによる拘束を受けない。
【０００３】
TcRαβ+T細胞およびTcRγδ+T細胞のT細胞受容体は、それらをコードする異なる遺伝的要素によって区別される。TcRγδ+T細胞の大部分は、そのδ鎖をコードする遺伝子に基づいて、2つの主なサブセット、すなわちVδ1+およびVδ2+に分類される。ヒト末梢血におけるTcRγδ+T細胞の主なサブセットは、Vγ9と共にVδ2を発現するが、残りのほとんどがVγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、またはVγ8と共にVδ1を発現する（セラーノ＆ディエリ（Selerno, A. and Dieli, F.）、1998）。
【０００４】
TcRγδ+T細胞は、TcRαβ+T細胞の微細な特異性特徴を欠損しているため、それらは感染症および腫瘍に対して第一線の監視機能を提供するより原始的な免疫メカニズムを表すと提唱されている（ボアスメニュ（Boismenu, R.）ら、1997）。いくつかの研究によって、TcRγδ+T細胞の様々な起源の腫瘍細胞溶解の媒介能と共に（ゾッキ（Zocchi, M.R.）ら、1990；キタヤマ（Kitayama, J.）ら、1993；チョウダリー（Choudhary, A.）ら、1995）、様々なウイルス、細菌、および寄生虫に対するTcRγδ+T細胞の応答（ブコウスキ（Bukowski, J.F.）ら、1994；ワラス（Wallace, M.）ら、1995；ラング（Lang, F.）ら、1995；エロソ（Elloso, M.M.）ら、1996）が報告されている。Vγ1.1導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスは、注入したT細胞白血病に対する自然発生抵抗性を示し、そしてこれらのマウスに由来するTcRγδ+T細胞ハイブリドーマは非造血腫瘍細胞と比較して造血悪性細胞に対して選択的に応答することから、造血細胞の腫瘍はTcRγδ+T細胞の溶解作用に対して特に感受性が高い可能性がある（ペニンガー（Penninger, J.）ら、1995）。その上、患者の末梢血および骨髄に由来するヒトTcRγδ+T細胞クローンはそれぞれ、急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄性白血病において自己白血病細胞を溶解することが示されている（ベンスッサン（Bensussan, A.）ら、1989；ヤーン（Jahn, B.）ら、1995）。さらに、同種異系骨髄移植後の白血病患者における無病生存率の改善は、末梢血中のTcRγδ+T細胞の数および割合の増加に関連していることが示されている（ラム（Lamb, L.S.）ら、1996）。ひとまとめにすると、これらの結果は、TcRγδ+T細胞が癌および感染症の治療において治療に役立つ可能性があるかも知れないことを示唆している。
【０００５】
TcRγδ+T細胞のエキソビボ増殖を記述する公表された方法の多くが、抗原の存在を必要とする。ウイルスを感染させた、もしくは形質転換した細胞または細胞株、細菌および寄生虫は、確立された腫瘍細胞株と同様に、エキソビボでTcRγδ+T細胞の増殖を刺激することが知られている。例えば、Vδ2+細胞の増殖を刺激する場合には、単純ヘルペスウイルス（HSV）感染細胞を用い（ブコウスキー（Bukowski, J.F.）ら、1994）、一方、Vδ1+細胞の増殖を刺激する場合には、エプスタイン-バーウイルス（EBV）形質転換Bリンパ芽球様細胞株を用いた（オルシニ（Orsini, D.L.M.）ら、1993）。結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抽出物および血液段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）マラリア抗原は、TcRγδ+T細胞の増殖を刺激することが示されている（コンスタント（Constant, P.）ら、1994；エロソ（Elloso, M.M.）ら、1996）。不死化ヒトバーキットリンパ腫細胞株であるDaudiも同様に、TcRγδ+T細胞の増殖を刺激することができる（カウア（Kaur, I.）ら、1993）。さらに、例えばイソペンテニルピロホスフェートなどのプレニルホスフェートファミリーの十分に特徴付けのなされた非ペプチド抗原は、TcRγδ+T細胞のエキソビボ増殖を刺激することが示されている（ガルシア（Garcia, V.E.）ら、1998）。これらの系のいくつかでは、TcRγδ+T細胞の抗原刺激培養物にサイトカインを添加した。
【０００６】
TcRγδ+T細胞はまた、IL-2（ゾッキ（Zocchi, M.R.）ら、1990）と共に、または固定した抗CD3抗体（キタヤマ（Kitayama, J.）ら、1993）もしくは抗TcRγδ抗体（ユ（Yu, S.）ら、1999）とIL-2とを組み合わせて培養することによって、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）集団からもエキソビボで増殖している。これらの系において、腫瘍抗原によるTcRγδ+T細胞の選択的刺激は、癌組織からT細胞を単離する前にインビボで起こっていると想定される。
【０００７】
もう一つの系において、固相の固定された抗CD3抗体をIL-2と共に用い、その後IL-2単独で培養することによって、神経膠芽細胞腫患者の末梢血からTcRγδ+T細胞を増殖させた（ヤマグチ（Yamaguchi, T.）ら、1997）。これらの著者は、その後精製したTcRγδ+ T細胞がIL-2単独の存在下では1週間以上増殖せず、したがって、彼らはこの方法が短期間の試験に限って適用可能であろうと結論した。彼らはさらに、この方法によってTcRαβ+T細胞とTcRγδ+T細胞の双方の増殖と濃縮が得られ、TcRγδ+T細胞の純度は28％の次数に達したことを示した。その後の報告において、同じ著者らは、この方法がVδ2+ サブセットを選択的に増殖させることを示した（スズキ（Suzuki, Y.）ら、1999）。もう一つの報告において、このグループは、抗CD3およびIL-2を用いて培養した後にIL-2単独を用いて培養して増殖させ、その後増殖した集団から精製したTcRγδ+T細胞が、IL-15を添加すると、3H-チミジン取り込みアッセイにおいてより良好に増殖したことを示した（ヤマグチ（Yamaguchi, T.）ら、1997）。
【０００８】
このように、TcRγδ+T細胞のエキソビボ培養および増殖のための既存の方法には、細胞増殖および／または抗原刺激の要件に制限がある。上記を考慮すると、インビトロで実質的に純粋なTcRγδ+T細胞を選択的に大量培養する方法が当技術分野において必要である。
【０００９】
発明の概要
本発明は、外来抗原の非存在下でTcRγδ+T細胞を培養して増殖させる新しい方法を提供する。特に、本発明者らは、T細胞マイトゲン、インターロイキン2、およびインターロイキン7を含む第一の培地において細胞を培養すること、次に、マイトゲンの非存在下でインターロイキン2およびインターロイキン7を含む第二の培養培地において細胞を二次培養することによって、TcRγδ+T細胞を増殖させうることを示した。したがって、本発明は、以下を含む、開始試料中のTcRγδ+T細胞を増殖させる方法を提供する：
（1）（a）T細胞マイトゲン、（b）インターロイキン2様活性を有する増殖因子、および（c）インターロイキン7様活性を有する増殖因子、を含む第一の培養培地において開始試料中の細胞を培養する段階；ならびに
（2）TcRγδ+T細胞を増殖させるために、（i）インターロイキン2様活性を有する増殖因子および（ii）インターロイキン7様活性を有する増殖因子を含む第二の培養培地において、段階（1）において得られた細胞を培養する段階。
【００１０】
「インターロイキン2様活性を有する増殖因子」という用語は、培養中のTcRγδ+T細胞の増殖能に関してIL-2と同じ活性を有する如何なる化合物も意味し、IL-2およびIL-2模倣体、またはIL-2の如何なる機能的同等物も含まれるがこれらに限定されない。
【００１１】
「インターロイキン7様活性を有する増殖因子」という用語は、培養中のTcRγδ+T細胞の増殖能に関してIL-7と同じ活性を有する如何なる化合物も意味し、IL-7、IL-7模倣体、またはIL-7の如何なる機能的同等物も含まれるがこれらに限定されない。
【００１２】
本発明の方法によって、増殖したTcRγδ+T細胞集団が得られる。「増殖した」とは、最終調製物中の所望のまたは標的細胞タイプ（すなわち、TcRγδ+T細胞）の数が、初回または開始細胞集団における数より高いことを意味する。
【００１３】
好ましい態様において、第一の培養培地において細胞を培養する前に、細胞から非TcRγδ+T細胞を枯渇する。第一および第二の培養培地はまた、TcRγδ+T細胞の増殖を増強しうる他の増殖因子（IL-2およびIL-7の他に）を含んでもよい。そのような増殖因子の例にはIL-4およびIL-15が含まれる。
【００１４】
本発明の方法によって得られたTcRγδ+T細胞は、多様な実験的、治療的、および商業的応用において用いることができる。
【００１５】
本発明の他の特徴および長所は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内での様々な変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかとなるであろうため、本発明の好ましい態様を示している詳細な説明および特定の実施例は説明するために限って示される。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、培養においてTcRγδ+T細胞を選択的に増殖させる新規方法を提供する。方法は、未分画の開始試料またはT細胞に関して濃縮されている開始試料のいずれかを用いることができる。都合のよいことに、本発明の方法は、ほとんどの他の技法において必要である抗原刺激を用いる必要がない。
【００１７】
したがって、本発明は、以下を含む、開始試料中のTcRγδ+T細胞を増殖させる方法を提供する：
（1）T細胞マイトゲンと少なくとも2つの増殖因子とを含む第一の培養培地において、開始試料中の細胞を培養する段階；および
（2）TcRγδ+T細胞を増殖させるために、少なくとも2つの増殖因子を含む第二の培養培地において段階（1）で得られた細胞を培養する段階。
【００１８】
2つの増殖因子は、IL-2およびIL-7のような、培養においてTcRγδ+T細胞を増殖させることができる如何なる増殖因子、またはIL-2またはIL-7と同じ活性を有して培養においてTcRγδ+T細胞を増殖させることができる増殖因子ともなりうる。
【００１９】
一つの局面において、本発明は、以下を含む、開始試料中のTcRγδ+T細胞を増殖させる方法を提供する：
（1）（a）T細胞マイトゲン、（b）インターロイキン2様活性を有する増殖因子、および（c）インターロイキン7様活性を有する増殖因子、を含む第一の培養培地において開始試料中の細胞を培養する段階；ならびに
（2）TcRγδ+T細胞を増殖させるために、（i）インターロイキン2様活性を有する増殖因子および（ii）インターロイキン7様活性を有する増殖因子を含む第二の培養培地において段階（1）で得られた細胞を培養する段階。
【００２０】
「インターロイキン2様活性を有する増殖因子」という用語は、培養中のTcRγδ+T細胞の増殖能に関してIL-2と同じ活性を有する如何なる化合物も意味し、IL-2およびIL-2模倣体、またはIL-2の如何なる機能的同等物も含まれるがこれらに限定されない。
【００２１】
「インターロイキン7様活性を有する増殖因子」という用語は、培養中のTcRγδ+T細胞の増殖能に関してIL-7と同じ活性を有する如何なる化合物も意味し、IL-7、IL-7模倣体、またはIL-7の如何なる機能的同等物も含まれるがこれらに限定されない。
【００２２】
開始試料は、血液、骨髄、リンパ様組織、上皮、胸腺、肝臓、脾臓、癌組織、リンパ節組織、感染組織、胎児組織、およびその画分または濃縮部分を含むがこれらに限定されない、TcRγδ+T細胞またはその前駆細胞を含む如何なる試料ともなりうる。開始試料は、好ましくは末梢血もしくは臍帯血、またはバフィーコート細胞、単核球、および低密度単核球（LDMNC）を含むその画分を含む血液である。細胞は、密度勾配遠心のような当技術分野で既知の技術を用いて血液の開始試料から得てもよい。例えば、全血を等量のフィコール-ハイパック（登録商標）の上に重ねた後、400×g、室温で30分間遠心してもよい。界面の材料は低密度単核球を含み、これを回収して、培養培地において洗浄し、100×g、室温で10分間遠心することができる。TcRγδ+T細胞に関して培養する前に、AIM-V（登録商標）、RPMI 1640、またはIMDMのような適した哺乳類の培養培地において細胞を維持することができる。
【００２３】
開始試料またはその画分（LDMNCのような）を第一の培養培地において培養する前に、試料またはその画分を、特定の細胞タイプに関して濃縮してもよく、および／または他の細胞タイプを枯渇してもよい。特に、開始試料またはその画分は、TcRαβ+T細胞を枯渇すると共にT細胞に関して濃縮してもよい。試料は当技術分野で既知の技術を用いて特定の細胞タイプを濃縮または枯渇してもよい。一つの態様において、特定の表現型の細胞は、開始試料またはその画分を、枯渇すべき細胞上のマーカーに対して特異的な抗体を含む抗体カクテルと共に培養することによって枯渇してもよい。好ましくは、カクテル中の抗体は、ランスドープ（Lansdorp）の米国特許第4,868,109号において記載された四量体抗体複合体である。
【００２４】
開始試料中の細胞を分画して濃縮した後、望ましければ、細胞をT細胞マイトゲンと少なくとも2つの増殖因子、好ましくはインターロイキン2様活性を有する増殖因子とインターロイキン7様活性を有する増殖因子とを含む第一の培養培地において培養する。好ましくはT細胞マイトゲンは、約0.01〜約100 μg/mlの量で存在する；インターロイキン2様活性を有する増殖因子は、約0.1〜約1000 ng/mlの量で存在する；インターロイキン7様活性を有する増殖因子は、約0.1〜約1000 ng/mlの量で存在する。より好ましくはT細胞マイトゲンは、約0.1〜約50 μg/mlの量で存在する；インターロイキン2様活性を有する増殖因子は、約1〜約100 ng/mlの量で存在する；インターロイキン7様活性を有する増殖因子は、約1〜約100 ng/mlの量で存在する。最も好ましくは、培地は、1μg/mlのT細胞マイトゲン；10 ng/mlのインターロイキン2様活性を有する増殖因子、および10 ng/mlのインターロイキン7様活性を有する増殖因子を含む。
【００２５】
細胞は、好ましくは、第一の培養培地において約3日〜約21日間の範囲で培養する。より好ましくは、約5日〜約14日間培養する。
【００２６】
T細胞マイトゲンは、植物および非植物起源のレクチン、T細胞を活性化する抗体、および他の非レクチン／非抗体マイトゲンを含むがこれらに限定されない、T細胞を刺激することができる如何なる物質ともなりうる。好ましい植物レクチンは、コンカナバリンA（ConA）であるが、フィトヘムアグルチニン（PHA）のような他の植物レクチンも用いてもよい。好ましい抗体には、OKT3のような抗CD3抗体、OKT11のような抗CD2抗体、または抗CD28抗体が含まれる。本発明の意味において、抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、FabおよびF(ab')2）、一本鎖抗体、一本鎖可変領域断片（ScFv）、および組み換えによって産生された結合パートナーが含まれると理解される。その他のマイトゲンには、ホルボル-12-ミリステート-13-アセテート（TPA）およびメゼレインのようなその関連化合物、またはブドウ球菌エンテロトキシンA（SEA）および連鎖球菌プロテインAのような細菌化合物が含まれる。T細胞マイトゲンは、可溶性であっても、固定していてもよく、一つ以上のT細胞マイトゲンを本発明の方法において用いてもよい。
【００２７】
第一の培養培地において培養した後、細胞を遠心によって洗浄し、少なくとも2つの増殖因子、好ましくはインターロイキン2様活性を有する増殖因子とインターロイキン7様活性を有する増殖因子とを含む第二の培養培地において二次培養する。細胞をIL-2のみで二次培養すると、増殖は数日間持続するがその後急速に減少する。このように、マイトゲンを除去後も細胞増殖が持続するためには、IL-2とIL-7様活性の双方を有する増殖因子が第二の培養培地に必要である。
【００２８】
二次培養段階（すなわち、T細胞マイトゲンの除去）は、特に開始試料またはLDMNCを第一の培養培地での培養前に分画していない場合、本発明の方法によるTcRγδ+T細胞の増殖にとって重要である。LDMNCを分画すれば、二次培養段階は選択的であってもよい。逆に、マイトゲンを第一の培養培地から除去すれば、細胞の増殖はほとんど／または全く起こらない。残留マイトゲンを患者に投与することは望ましくないため、二次培養によってマイトゲンを除去することは、TcRγδ+T細胞が治療的使用にとってより適するようになるというさらなる長所を有する。TcRγδ+T細胞を実験、診断、または他の非治療に使用する場合には、二次培養段階でT細胞マイトゲンを除去する必要はないかも知れない。
【００２９】
好ましくは第二の培養培地において、二つの増殖因子は、第一の培養培地に関して先に記述した濃度と同じ濃度で存在する。
【００３０】
細胞は、好ましくは約3日〜約21日の範囲の期間、第二の培養培地において培養する。より好ましくは、約9日〜約13日間培養する。
【００３１】
第一および第二の培養培地はさらに、TcRγδ+T細胞の増殖および細胞数増加を補助しうる他の成分を含んでもよい。加えてもよい他の成分の例には、血漿または血清、IL-4およびIL-15のようなサイトカイン、腫瘍壊死因子（TNFs）、およびインターフェロン（IFNs）を含むさらなる増殖因子、アルブミンのような精製蛋白質、低密度リポ蛋白質（LDL）のような脂質源、ビタミン、アミノ酸、ステロイド、ならびに増殖および／または生存を支持または促進する他の補助物質が含まれるがこれらに限定されない。
【００３２】
好ましい態様において、第一および第二の培養培地はさらに、IL-4もしくはIL-15のような他の増殖因子、またはその模倣体もしくは機能的同等物が含まれる。本発明者らは、第三の増殖因子を第一および第二の増殖培地に加えると、二つの増殖因子を用いた場合に得られた増殖と比較して、TcRγδ+T細胞の増殖を増強することを発見した。
【００３３】
したがって、本発明は、以下を含む、開始試料中のTcRγδ+T細胞を増殖させる方法を提供する：
（1）T細胞マイトゲンと少なくとも三つの増殖因子とを含む第一の培養培地において開始試料中の細胞を培養する段階；および
（2）TcRγδ+T細胞を増殖させるために、少なくとも三つの増殖因子を含む第二の培養培地において段階（1）で得られた細胞を培養する段階。
【００３４】
好ましい態様において、三つの増殖因子は、IL-2、IL-4、IL-7およびIL-15の組み合わせから選択される。組み合わせの例には、IL-2、IL-4およびIL-15；IL-2、IL-4およびIL-7；ならびにIL-2、IL-7、およびIL-15が含まれる。第三の増殖因子は、先に記述した二つの増殖因子と類似の量で存在しうる。
【００３５】
本発明者らは、第一および第二の培地に第四の増殖因子を加えると、二つまたは三つの増殖因子を用いて得られた増殖と比較して、TcRγδ+T細胞の増殖を増強することも同様に発見した。
【００３６】
したがって、本発明は、以下を含む、開始試料中のTcRγδ+T細胞を増殖させる方法を提供する：
（1）T細胞マイトゲンと少なくとも四つの増殖因子とを含む第一の培養培地において開始試料中の細胞を培養する段階；および
（2）TcRγδ+T細胞を増殖させるために、少なくとも四つの増殖因子を含む第二の培養培地において段階（1）で得られた細胞を培養する段階。
【００３７】
好ましい態様において、第四の増殖因子は、IL-2、IL-4、IL-7、およびIL-15である。
【００３８】
好ましくは、第一および第二の培養培地の双方に血清または血漿（P）を加える。第一および第二の培養培地におけるPの量は、好ましくは約1％〜約25％である。より好ましくは、第一および第二の培養培地におけるPの量は、約2％〜約20％である。さらにより好ましくは、第一および第二の培養培地におけるPの量は約2.5％〜約10％である。最も好ましくは、第一および第二の培養培地におけるPの量は5％である。血清または血漿（P）は、ヒト末梢血、臍帯血、または別の哺乳類種に由来する血液を含むがこれらに限定しない如何なる起源からも得ることができる。血漿は、単一のドナーに由来してもよく、複数のドナーからプールしてもよい。自己TcRγδ+T細胞を臨床的に用いる場合、すなわち当初の開始試料が得られた同じ患者に再注入する場合、外因性の物質（例えば、ウイルス）がその患者に導入されないように、自己P（すなわち、同じ患者からの）を同様に用いることが好ましい。TcRγδ+T細胞を同種異系（すなわち、当初の開始試料が得られた人以外の人に注入する）で用いる場合、外因性の産物の患者への導入を最小限にするために、当人またはもう一人の人からの血清を用いることが好ましい；動物物質が患者に投与されないようにするために、最低でも、血清はヒト由来でなければならない。
【００３９】
本発明の方法によって、TcRγδ+T細胞の増殖した細胞集団が得られる。「増殖した」とは、最終調製物中の所望または標的細胞タイプ（すなわち、TcRγδ+T細胞）の数が初回または開始細胞集団の数より多いことを意味する。
【００４０】
本発明の方法に従って得られたTcRγδ+T細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング、免疫磁気分離、アフィニティカラムクロマトグラフィー、密度勾配遠心、および細胞パンニングを含む、当技術分野で既知の技術を用いて、最終培養物に存在する可能性がある他の細胞から分離することができる。
【００４１】
本発明には、本発明の方法によって得られたTcRγδ+T細胞が含まれる。したがって、本発明は、TcRγδ+T細胞の細胞調製物を提供する。好ましくは、TcRγδ+T細胞は、濃縮集団において全細胞（total cells）の60％以上、より好ましくは80％以上、および最も好ましくは90％以上を含む。
【００４２】
本発明にはまた、本発明の方法によって得られたTcRγδ+T細胞を如何なる適用にも、および全ての適用に用いることが含まれる。TcRγδ+T細胞は感染病原体に対する最も重要な防御であるように思われる。さらに、TcRγδ+T細胞は、B細胞リンパ腫、肉腫、および癌を含む様々な起源の形質転換細胞に対して固有の細胞溶解活性を有する。その結果、本発明の方法に従ってエキソビボで得られ、培養されたTcRγδ+T細胞は、感染症、癌、または免疫抑制が原因で起こる疾患を治療または予防するために患者に移入することができる。都合のよいことに、本発明のTcRγδ+T細胞は、マイトゲンまたはウシ胎児血清を含まないため、それらはヒトの治療応用にとって有用である。したがって、本発明は、本発明の方法に従って調製されたTcRγδ+T細胞の有効量を、それを必要とする動物に投与することを含む、免疫応答を調節する方法を提供する。
【００４３】
本明細書において用いられる「有効量」という用語は、所望の結果を得るために必要な用量および期間での有効な量を意味する。
【００４４】
本明細書において用いられる「動物」という用語には、動物世界の全てのメンバーが含まれる。好ましくは、動物は哺乳類であり、より好ましくはヒトである。
【００４５】
一つの態様において、本発明は、本発明の方法に従って調製したTcRγδ+T細胞の有効量を、それを必要とする動物に投与することを含む、感染症を治療する方法を提供する。
【００４６】
治療してもよい感染症の例には、マイコバクテリア（Mycobacteria）（例えば、結核菌（M. tuberculosis））によって引き起こされる感染症、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、または肝炎ウイルスによって引き起こされるウイルス感染症、およびプラスモジウム（Plasmodium）（例えば、マラリア）によって引き起こされる寄生虫感染症が含まれるがこれらに限定されない。
【００４７】
もう一つの態様において、本発明は、本発明の方法に従って調製したTcRγδ+T細胞の有効量を、それを必要とする動物に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【００４８】
本発明に従って治療してもよい癌の例には、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、およびT細胞およびB細胞白血病を含む白血病、リンパ腫（ホジキンスおよび非ホジキンス）、リンパ増殖障害、プラズマ細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、肉腫、固形組織の癌、低酸素性腫瘍、扁平上皮癌、子宮頚癌および膀胱癌のような尿生殖器癌、造血癌、頭頚部癌、ならびに神経系の癌が含まれるがこれらに限定されない。
【００４９】
好ましい態様において、本発明は、本発明の方法に従って調製したTcRγδ+T細胞の有効量を、それを必要とする動物に投与することを含む、慢性骨髄性白血病を治療する方法を提供する。そのような態様において、LDMNCは、慢性骨髄性白血病（CML）患者から得ることができる。TcRγδ+T細胞を培養して増殖させた後、増殖した細胞は癌様CML細胞を含まず、そのため、患者に再注入するために適している。
【００５０】
本発明にはまた、免疫応答を調節するため、感染症を治療するため、または上記のような癌を治療するために、本発明の方法によって得られたTcRγδ+T細胞を用いることが含まれる。本発明はさらに、先に記述したように、免疫応答を調節するため、感染症を治療するため、または癌を治療するための薬剤または薬学的組成物を調製するために本発明の方法に従って得られたTcRγδ+T細胞を用いることが含まれる。
【００５１】
本発明に従って得られたTcRγδ+T細胞はまた、例えば細胞の機能をさらに調べて解明するために、実験モデルにおいて用いることができる。さらに、これらの細胞は、TcRγδ+T細胞によって認識される抗原／エピトープを同定することをねらいとする研究、ならびにワクチンをデザインおよび開発するための研究に用いてもよい。
【００５２】
本発明に従って得られたTcRγδ+T細胞は、上記の治療的、実験的、または商業的応用において直ちに用いてもよく、または後に用いるために細胞を凍結保存してもよい。
【００５３】
以下の非制限的な実施例は、本発明を説明する：
【００５４】
実施例
実施例1
低密度単核球（LDMNC）を、フィコール-ハイパック（登録商標）（密度＝1.077 g/ml）を用いる密度勾配遠心によって成人末梢血から単離した。全血100 ml容量を10〜15 mlずつに分けて、50 ml組織培養用遠心管においてフィコール-ハイパック（登録商標）の等量に重層した後、400×g、室温で30分間遠心した。単核球を含む界面の材料を回収して、細胞を100×g、室温で10分間遠心することによって、培養培地（20単位/mlのヘパリンおよび50 μMの2-メルカプトエタノールを含むAIM-V（登録商標）；HCBM-2）において2回洗浄した。細胞を、10％自己血漿を含むHCBM-2において希釈し、ポリスチレン組織培養フラスコにおいて37℃、5％CO2で一晩インキュベートした。翌朝、細胞を遠心して、2％自己血漿を含む燐酸緩衝生理食塩液（PBS）中に再浮遊させた。細胞浮遊液の試料を2％酢酸によって20倍希釈して、有核細胞の総数を血球計算盤を用いて決定した。
【００５５】
TcRγδ+T細胞は、系列特異的抗体カクテルおよび免疫磁気アフィニティクロマトグラフィー（ステムセプ（登録商標）、ステムセルテクノロジーズ、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州）を用いる陰性選択によってLDMNCから濃縮した。2％自己血漿を含むPBS 1.25 mlに全体でLDMNC細胞8.2×107個を再浮遊させて、系列特異的モノクローナル抗体の混合物を加えた。混合物は、CD14（単球）、CD16（NK細胞）、CD19（B細胞）、CD33（骨髄前駆細胞）、CD56（NK細胞）、グリコフォリンA（赤血球細胞）、およびTcRαβ（TcRαβ+T細胞）に対して特異的な抗体を含んだ。これらは系列特異的マーカーに対する一つの抗原特異性とデキストランに対するもう一つの抗原特異性とを有する二重機能抗体であった。LDMNCを双特異的抗体と共に氷中で30分インキュベートした後、鉄デキストランコロイドを加えて、インキュベーションをさらに30分継続した。次に、浮遊液に免疫磁気クロマトグラフィーを行い、この技法により、二重特異性抗体によって鉄デキストラン粒子にクロスリンクされている細胞が除去される。このように、回収された細胞は、抗体または鉄デキストランに結合していないTcRγδ+T細胞の濃縮集団であった。得られた濃縮されたTcRγδ+T細胞の収量は2.65×105個であった。
【００５６】
濃縮したTcRγδ+T細胞を、5％自己血漿（P）を含むHCBM-2において1×105個/mlの密度で様々な条件（下記参照）で組織培養に播種して、培養物を37℃、5％CO2でインキュベートした。様々な時点で、各培養物の小さい試料中の細胞を血球計算盤で計数することによって細胞の増殖をモニターした。生細胞（非染色）が非生細胞（染色）と区別できるように、試料を0.4％トリパンブルーの等量によって希釈してから計数した。
【００５７】
まず、細胞を2つの異なる条件（条件1および条件6）で培養し、その後条件1の細胞を異なる5つの条件（条件1〜5）で二次培養した。当初、条件1において、濃縮したTcRγδ+T細胞1.3×105個に、マイトゲンとサイトカインの組み合わせを以下のように加えた：1μg/mlコンカナバリンA（ConA）、10 ng/ml IL-2および10 ng/ml IL-4。細胞をこの条件で7日間培養すると、細胞は3.5倍増殖して生細胞の総数は4.5×105個となった。この時点で、5％自己血漿を含む新しい培養培地を培養物に加えて、細胞を1×105個/mlの密度に希釈して（総容量＝4.5 ml）、1μg/mlコンカナバリンA、10 ng/ml IL-2、および10 ng/ml IL-4を加えた。培養をさらに2日間継続すると、細胞は増殖して、全体で生細胞が2.0×106個となった。この時点で、細胞を以下のように二次培養した：細胞を100×g、室温で10分間遠心して沈降させ、HCBM-2によって1回洗浄して、2％自己血漿を含むHCBM-2に1.0×105個/mlで再浮遊させた。再浮遊させた細胞を4.0×105個ずつ5個の等量に分けて、以下の条件で培養した：
0004982645.tif 000002
【００５８】
12日目に、各培養物中の細胞を計数して、2％自己血漿を含む新鮮な培養培地をそれぞれに加えて、細胞を1×105個/mlに希釈した。新鮮なマイトゲンとサイトカインとを加えて、上記の条件を維持した。培養をさらに4日間（16日まで）継続して、その時点で各条件での細胞を計数し、フローサイトメトリーによって分析してTcRγδ+T細胞の割合を決定した。
【００５９】
第6の培養条件において、この条件では細胞をマイトゲンによって刺激せず、自己血漿を含むHCBM-2において10 ng/ml IL-2および10 ng/ml IL-4の存在下で維持したことを除き、濃縮したTcRγδ+T細胞を上記の通りに培養物に播種した。
条件の要約：
培養条件  →  二次培養条件
0004982645.tif 000003
【００６０】
本実験の結果を図1に示し、各培養条件における生細胞の総数を時間の関数としてプロットする。図の矢印は細胞を二次培養した時点を示す。細胞数の数値を、培養期間終了時の増殖集団におけるTcRγδ+T細胞の割合と共に、グラフに添付の表に示す。
【００６１】
これらのデータは、本発明の方法によるTcRγδ+T細胞の増殖を示している、すなわち
マイトゲン（例えば、ConA）＋IL-2＋IL-4
→  IL-2＋IL-4
【００６２】
データはまた、IL-4を用いた場合では用いなかった場合より、TcRγδ+T細胞の増殖が大きいこと、すなわち総増殖量（total expansion）は条件3と比較して条件2では高かったことを証明している。
【００６３】
データはさらに、TcRγδ+T細胞の有意な増殖が起こるためには培養の開始時にマイトゲンが必要であること、すなわち、総増殖量は条件6と比較して条件2ではかなり高かったことを示している。
【００６４】
データはさらに、二次培養段階（すなわち、培養物からマイトゲンを除去する）によって、TcRγδ+T細胞のより良好な増殖が得られたこと、すなわち条件1と比較して条件2では総増殖量が高かったことを示している。
【００６５】
データはまた、本発明の方法によって、増殖した細胞集団をさらに精製する必要がなく、非常に純粋なTcRγδ+T細胞（99％）が得られることを示している。
【００６６】
実施例2
TcRγδ+T細胞を、実施例1に記載のように成人末梢血LDMNCから濃縮した。濃縮したTcRγδ+T細胞を組織培養に播種して、実施例1の条件2に記載した方法と類似の方法で増殖させた。特に、培養は、（1）1μg/mlコンカナバリンAおよび10 ng/ml IL-2、または（2）1μg/mlコンカナバリンA、10 ng/ml IL-2、および10 ng/ml IL-4、または（3）1μg/mlコンカナバリンA、10 ng/ml IL-2および10 ng/ml IL-7、によって開始した。10日目に、各条件の細胞を二次培養する、すなわち、マイトゲンを除去して、細胞を（1）IL-2、（2）IL-2とIL-4、または（3）IL-2とIL-7においてさらに増殖させた。17日目、培養を終了して、最終細胞数を決定し、フローサイトメトリーによってTcRγδ+T細胞の純度を評価した。
条件の要約
培養条件  →  二次培養条件
0004982645.tif 000004
【００６７】
この実験の結果を図2に示し、各培養条件における生細胞の総数を時間の関数としてプロットする。図の矢印は細胞を二次培養した（すなわち、マイトゲンを除去した）時点を示す。細胞数の数値を、培養期間終了時の増殖集団におけるTcRγδ+T細胞の割合と共に、グラフに添付の表に示す。
【００６８】
これらのデータは、本発明の方法によるTcRγδ+T細胞の増殖を示している、すなわち
マイトゲン（例えば、ConA）＋IL-2＋IL-4またはIL-7
→  IL-2＋IL-4またはIL-7
【００６９】
データはまた、IL-4またはIL-7を用いた場合では用いなかった場合より、TcRγδ+T細胞の増殖が大きいこと、すなわち総増殖量は条件1と比較して条件2および3では高かったことを証明している。
【００７０】
データはまた、本発明の方法によって、増殖した細胞集団をさらに精製することなく、非常に純粋なTcRγδ+T細胞（＞95％）が得られることを示している。
【００７１】
実施例3
TcRγδ+T細胞は実施例1に記載のように成人末梢血LDMNCから濃縮した。濃縮したTcRγδ+T細胞を組織培養に播種して、用いたマイトゲンがコンカナバリンAの代わりに固定したモノクローナル抗体であったことを除き、実施例1の条件2に記載した方法と類似の方法で増殖させた。モノクローナル抗CD3抗体であるOKT3を、組織培養プレートのウェルに10 μg/ml PBS溶液の濃度で4℃で一晩コーティングした。ウェルを空にしてPBSで5回洗浄してから使用した。陰性対照として、無関係な抗原特異性を有するアイソタイプをマッチさせた免疫グロブリン（IgG2a）を同様に用いた。培養は、（1）固定OKT3および10 ng/ml IL-2、（2）固定OKT3、10 ng/ml IL-2および10 ng/ml IL-4、または（3）固定IgG2a、10 ng/ml IL-2および10 ng/ml IL-4、によって開始した。8日目に、各条件における細胞を二次培養した、すなわちマイトゲンを除去した。これは、細胞を再浮遊させて、細胞浮遊液をコーティングしたウェルから採取して、遠心によって細胞を沈降させて洗浄し、コーティングしていない培養ウェルに細胞を加えることによって行った。培養物は、（1）IL-2、（2）IL-2とIL-4、または（3）IL-2とIL-4においてさらに増殖させた。20日目に、培養を終了して、最終細胞数を決定し、TcRγδ+T細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した。
条件の要約：
培養条件  →  二次培養条件
0004982645.tif 000005
【００７２】
本実験の結果を図3に示し、各培養条件における生細胞の総数を時間の関数としてプロットする。図の矢印は細胞を二次培養した時点を示す。細胞数の数値を、培養期間終了時の増殖集団におけるTcRγδ+T細胞の割合と共に、グラフに添付の表に示す。
【００７３】
これらのデータは、本発明の方法によるTcRγδ+T細胞の増殖を示している、すなわち
マイトゲン（例えば、OKT3）＋IL-2＋IL-4
→  IL-2＋IL-4
【００７４】
データはまた、IL-4を用いた場合では用いなかった場合より、TcRγδ+T細胞の増殖が大きいこと、すなわち総増殖量は条件1と比較して条件2では高かったことを証明している。
【００７５】
データはまた、マイトゲンがモノクローナル抗体となりうること、そして総増殖量は条件3と比較して条件2ではかなり高かったことから、モノクローナル抗体の特異性が重要であることを示している。
【００７６】
データはまた、本発明の方法によって、増殖した細胞集団をさらに精製することなく非常に純粋なTcRγδ+T細胞（94％）が得られたことを示している。その上、TcRγδ+T細胞の純度は、IL-4を用いた場合（94％）では用いなかった場合（73％）より高い。
【００７７】
実施例4
TcRγδ+T細胞は、実施例1に記載のように成人末梢血LDMNCから濃縮した。濃縮したTcRγδ+T細胞を組織培養に播種して、実施例3に記載の方法と類似の方法で増殖させた。培養は、（1）固定OKT3および10 ng/ml IL-2、（2）固定OKT3、10 ng/ml IL-2および10 ng/ml IL-4、または（3）固定OKT3、10 ng/ml IL-2および10 ng/ml IL-7、によって開始した。6日目に、各条件における細胞を二次培養した、すなわちマイトゲンを除去した。培養物は、（1）IL-2、（2）IL-2とIL-4、または（3）IL-2とIL-7においてさらに増殖させた。21日目に、培養を終了して、最終細胞数を決定した。
条件の要約：
培養条件  →  二次培養条件
0004982645.tif 000006
【００７８】
本実験の結果を図4に示し、各培養条件における生細胞の総数を時間の関数としてプロットする。図の矢印は細胞を二次培養した時点を示す。細胞数の数値を、培養期間終了時の増殖集団におけるTcRγδ+T細胞の割合と共に、グラフに添付の表に示す。
【００７９】
これらのデータは、本発明の方法によるTcRγδ+T細胞の増殖を示している、すなわち
マイトゲン（例えば、OKT3）＋IL-2＋IL-4またはIL-7
→  IL-2＋IL-4またはIL-7
【００８０】
データはまた、IL-4またはIL-7を用いた場合では用いなかった場合より、TcRγδ+T細胞の増殖が大きいこと、すなわち総増殖量は条件1と比較して条件2および3では高かったことを証明している。
【００８１】
実施例5
TcRγδ+T細胞は、実施例1に記載のように成人末梢血LDMNCから濃縮した。濃縮したTcRγδ+T細胞を組織培養に播種して、実施例2に記載の方法と類似の方法で増殖させた。特に、培養は1μg/mlコンカナバリンAとサイトカインの組み合わせ（下記参照）によって開始し、そのそれぞれは10 μg/mlで用いた。8日目、各条件における細胞を二次培養した、すなわちマイトゲンを除去して、細胞をサイトカイン単独のそれぞれの組み合わせを用いてさらに増殖させた。
条件の要約：
培養条件  →  二次培養条件
0004982645.tif 000007
【００８２】
この実験の結果を図5に示し、各培養条件の生細胞の総数を時間の関数としてプロットする。図の矢印は細胞を二次培養した（すなわちマイトゲンを除いた）時点を示す。細胞数の数値をグラフに添付の表に示す。
【００８３】
これらのデータは、第三の増殖因子を加えると、一つまたは二つの増殖因子を用いた場合に得られる増殖と比較してTcRγδ+T細胞の増殖を増強すること、すなわち増殖は条件1および2と比較して条件3、4および5では高かったことを示している。
【００８４】
これらのデータはさらに、第四の増殖因子を加えると、一つ、二つ、または三つの増殖因子を用いた場合に得られる増殖と比較してTcRγδ+T細胞の増殖を増強すること、すなわち増殖は条件1〜5と比較して条件6では高かったことを示している。
【００８５】
本発明は、好ましい実施例であると現在考えられることを参照して説明してきたが、本発明は開示の実施例に制限されないと理解されるべきである。逆に、本発明は、添付の請求の範囲の精神および範囲内に含まれる様々な改変、同等の組み合わせも包含すると解釈される。
【００８６】
出版物、特許および特許出願は全て、本明細書において、それぞれの個々の出版物、特許、または特許出願が特におよび個々にその全体が参照として組み入れられることが示されるのと同じ程度に、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【００８７】
明細書中で参照される参考文献の全引用例
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0004982645.tif 000009
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【図面の簡単な説明】
本発明は以下の図面を参照して説明する。
【図１】  様々な培養条件での時間に対する総生細胞を示すグラフである。
【図２】  様々な培養条件での時間に対する総生細胞を示すグラフである。
【図３】  様々な培養条件での時間に対する総生細胞を示すグラフである。
【図４】  様々な培養条件での時間に対する総生細胞を示すグラフである。
【図５】  様々な培養条件での時間に対する総生細胞を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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