(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）酵素の結晶、および
（ｂ）スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびメトキシポリエチレングリコールからなる群から選択される、少なくとも１つの賦形剤、
を含む処方物であって、ここで該処方物は、Ｔ1/2で測定した場合、４０〜５５℃の溶液中の該酵素の結晶の可溶性形態よりも、該処方物を４０〜５５℃で貯蔵した場合、少なくとも６０倍より長い有効期限を有する、処方物。
【請求項２】
請求項１に記載の処方物であって、前記酵素は、リパーゼであり、そして、該処方物は、Ｔ1/2で測定した場合、４０℃の溶液中の該酵素の結晶の可溶性形態よりも、該処方物を４０℃で貯蔵した場合、少なくとも６０倍より長い有効期限を有する、処方物。
【請求項３】
請求項１に記載の処方物であって、前記酵素は、ペニシリンアシラーゼであり、そして、該処方物は、Ｔ1/2で測定した場合、５５℃の溶液中の該酵素の結晶の可溶性形態よりも、該処方物を５５℃で貯蔵した場合、少なくとも６０倍より長い有効期限を有する、処方物。
【請求項４】
請求項１に記載の処方物であって、前記酵素は、グルコースオキシダーゼであり、そして、該処方物は、Ｔ1/2で測定した場合、５０℃の溶液中の該酵素の結晶の可溶性形態よりも、該処方物を５０℃で貯蔵した場合、少なくとも６０倍より長い有効期限を有する、処方物。
【請求項５】
酵素の放出のための組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の処方物；ならびに、
（ｂ）少なくとも１つのポリマーキャリア、
を含む組成物であって、ここで該処方物は、該ポリマーキャリアのマトリックス内にカプセル化される、組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、ここで前記ポリマーキャリアがポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）すなわちＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルソエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴサッカライド、グリカアミノグリカン、硫酸化ポリサッカライド、それらの混合物およびコポリマーからなる群の１つ以上から選択されるポリマーである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、タンパク質、ペプチド、および核酸のような生物学的に活性な高分子の安定化、貯蔵、および送達のための方法に関する。特に、本発明は、タンパク質または核酸の結晶、それらを含む処方物、および組成物に関する。タンパク質および核酸の結晶化のための方法、ならびに、乾燥処方物またはスラリー処方物中での使用のための安定化されたタンパク質結晶または核酸結晶の調製のための方法が提供される。本発明の結晶、結晶処方物、および結晶組成物は、生物学的に活性な高分子成分の非経口投与のための希釈剤とともに再構成され得る。
【０００２】
本発明の方法は、治療的タンパク質または免疫原性タンパク質をコードする、そして非経口的に投与され得る「裸の」ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列の結晶を調製するために有用である。引き続いて細胞によって取り込まれ、そして適切なグリコシル化パターンを有するタンパク質を発現するために使用される、溶解しているＤＮＡおよびＲＮＡ分子は、治療的または免疫原性のいずれかであり得る。あるいは、本発明は、ＲＮＡもしくはＤＮＡのセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドの結晶、結晶処方物、および結晶組成物を調製するために有用である。
【０００３】
本発明はさらに、タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、ホルモン、およびペプチドの結晶または結晶処方物を、ヒトおよび動物に対する生物学的送達のために組成物中にカプセル化することに関する。本発明に従って、タンパク質結晶または結晶処方物が、ポリマー性キャリアを含むマトリクス中にカプセル化され、組成物を形成する。この処方物および組成物は、タンパク質のネイティブな生物学的に活性な三次構造の保持を増強し、そして必要とされる場所および時点で、活性タンパク質をゆっくりと放出し得るリザーバーを作製する。このようなポリマー性キャリアは、生体適合性ポリマーおよび生物分解性ポリマーを含む。生物学的に活性なタンパク質は、引き続いて、特定のカプセル化技術、ポリマー形成、結晶形状、結晶溶解度、結晶架橋、および使用される処方条件によって決定されるように、長期にわたって制御された様式で放出される。タンパク質を結晶化するための方法、薬学的成分または賦形剤を使用して安定した処方物を調製し、そして必要に応じてそれらをポリマー性キャリア中にカプセル化して組成物を産生するための方法、および、生物医学的な適用（治療タンパク質およびワクチンの送達を含む）のためにこのようなタンパク質結晶の処方物および組成物を使用するための方法が提供される。本発明のこのタンパク質結晶の処方物および組成物についてのさらなる用途は、ヒトの食品、農業用飼料、獣医学的組成物、診断薬、化粧品、および個人医療組成物におけるタンパク質送達を含む。
【０００４】
（発明の背景）
タンパク質は、薬学、獣医学的産物、化粧品、および他の消費財、食品、飼料、診断薬、工業化学および浄化の分野で、広範な適用において使用されている。ときどき、このような使用は、タンパク質それ自体に固有の束縛によって制限されるか、またはそれらが使用される環境または媒体によって制約されてきた。このような束縛は、タンパク質の乏しい安定性、性能の変動、または高いコストを生じ得る。
【０００５】
個々のタンパク質分子がそれらの独特な機能を果たすことが必要とされる時点まで、タンパク質の高次の三次構造または四次構造が保存されるべきであることは不可避である。現在までのところ、タンパク質の使用についての限定要因（特に治療レジメにおいて）は、送達の間に遭遇する化学的および物理的変性に対するタンパク質構造の感度にある。
【０００６】
これらの障壁を克服するために、種々のアプローチが利用されてきた。しかし、これらのアプローチは、しばしばタンパク質活性の損失、またはタンパク質安定化キャリアもしくは処方物のさらなる出費のいずれかを被る。
【０００７】
タンパク質の広範囲に及ぶ使用に対する障壁を克服するための１つのアプローチは、架橋酵素結晶（「ＣＬＥＣ（登録商標）」）技術（Ｎ．Ｌ．Ｓｔ．ＣｌａｉｒおよびＭ．Ａ．Ｎａｖｉａ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４、４３１４−１６頁（１９９２））である。ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５４１５もまた参照のこと。架橋した酵素結晶は、通常、酵素機能と適合性でない環境でその活性を保持している。そのような環境は、プロテアーゼ、有機溶媒、高温、または極端なｐＨへの長時間の暴露を含む。このような環境において、架橋した酵素結晶は、不溶性、安定、かつ活性のままである。
【０００８】
一般的には、タンパク質技術の最近の進歩にもかかわらず、以下に議論する２つの問題が、産業および医学における生物学的高分子の使用を制限し続けている。第１の問題は、製造および貯蔵の間の化学的および物理的変性に対する高次の三次構造の分子的な安定性および感受性に関する。第２の問題は、治療用タンパク質の生物学的送達の分野は、提供されるビヒクルが、特定の患者または疾患プロセスの必要性と一致する割合で、ネイティブなタンパク質（例えば、タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、ホルモン、核酸、およびペプチド）を放出することを必要とすることである。
【０００９】
（高分子の安定性）
多数の因子が、生物学的高分子を、従来的な化学的な実体（例えば、そのサイズ、コンホメーション、および両親媒性特性のような）から区別する。高分子は、化学的分解に感受性であるだけではなく、物理的な分解にもまた、感受性である。これらは、種々の環境因子（例えば、温度、酸化剤、ｐＨ、凍結、振盪、および剪断ストレス）に感受性である（Ｃｈｏｌｅｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｌｕｃｋｅｌ，Ｂ．およびＨｏｒｎ，Ｈ．，Ａｃｔａ  Ｈｅｌｖ．７１，４０５（１９９６））。薬物開発のための高分子を考慮する上で、安定性因子は、産生プロセスを選択する場合に考慮されなければならない。
【００１０】
薬学的製品の開発および製造の間の生物学的活性の維持は、その高分子の固有の安定性ならびに利用される安定化技術に依存する。以下を含む種々のタンパク質の安定化技術が存在する：
ａ）タンパク質の水溶液または懸濁液への化学的「安定化剤」の添加。例えば、米国特許第４，２９７，３４４号は、選択されたアミノ酸の添加による、凝固因子ＩＩおよび凝固因子ＶＩＩＩ、抗トロンビンＩＩＩならびにプラスミノーゲンの熱に対する安定化を開示する。米国特許第４，７８３，４４１号は、界面活性物質の添加によってタンパク質を安定化するための方法を開示する。米国特許第４，８１２，５５７号は、ヒト血清アルブミンを使用して、インターロイキン−２を安定化するための方法を開示する。このような方法の欠点は、各々の処方物が目的のタンパク質に特異的であり、そして大きな開発労力を必要とすることである。
【００１１】
ｂ）調製物を凍結保護物質とともに混合し、そして極低温で保存する凍結／融解法。しかし、すべてのタンパク質が凍結／融解サイクルで生き残るわけではない。
【００１２】
ｃ）凍結保護付加物（通常、グリセロール）を伴う低温保存。
【００１３】
ｄ）米国特許第５，０９８，８９３号に記載されるようなガラス形態における保存。この場合、タンパク質は、アモルファスもしくはガラス状状態にある水溶性物質または水膨潤性物質中に溶解される。
【００１４】
ｅ）タンパク質の安定化のために最も広範に使用されている方法は、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ  ｏｒ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）である（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｐｉｃａｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｎｇ，Ｂ．Ｓ．およびＲａｎｄｏｌｐｈ，Ｔ．Ｗ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：（８）９６９（１９９７））。十分なタンパク質の安定性が水溶液中で達成され得ない場合には常に、凍結乾燥が最も実行可能な代替を提供する。凍結乾燥の１つの不利な点は、これが洗練された処理を必要とし、時間を消費し、そして高価であることである（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｐｉｃａｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｎｇ，Ｂ．Ｓ．およびＲａｎｄｏｌｐｈ，Ｔ．Ｗ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：（８）９６９（１９９７）およびそこに引用される文献）。さらに、凍結乾燥が注意深く実行されない場合、この技術の凍結工程および脱水工程によって大部分の調製物が少なくとも部分的に変性する。この結果は、頻繁に、タンパク質分子の部分の不可逆的な凝集であり、これは、処方物を非経口的投与のために受容不可能にする。
【００１５】
上記の技術によって産生されたタンパク質処方物の大部分は、低温保存（ときどき、−２０℃までの低温）を必要とする。出荷または貯蔵の間、温度の上昇にさらすことは、有意な活性の損失を生じ得る。従って、上昇した温度において、または環境温度においてでさえ、貯蔵は、多くのタンパク質にとって可能ではない。
【００１６】
タンパク質、ペプチド、および核酸は、薬品、診断、食品、化粧品、洗剤、および研究の産業においてますます利用されている。迅速、安価、かつ広範な生物学的高分子に適用可能な、代替的な安定化の手順についての大きな必要性が存在している。特に、これらの生物学的高分子の機能を妨害し得る、過剰な賦形剤の使用に依存しない安定化手順が必要とされている。
【００１７】
低分子結晶薬物の安定性は、処方プロセスの間に極度な力に抵抗性であり得るようなものである（米国特許第５，５１０，１１８号を参照のこと）。比較的不溶性の薬物の結晶物質のナノ粒子のミリング（ｍｉｌｌｉｎｇ）に付随する力は：剪断ストレス、乱流、高衝撃衝突、キャビテーション、および粉砕を含む。低分子結晶化合物は、対応するアモスファス固体よりも化学的分解に対してはるかにより安定であると理解されている（Ｐｉｃａｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｕｋｅｓ，Ａ．Ｌ．，Ｌａｎｇ，Ｊ．Ｅ．およびＧａｉｎｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６７，７６７（１９７８））。不運にも、タンパク質および核酸のような高分子の結晶は、低分子には付随しないさらなる問題および困難さを示す。
【００１８】
今世紀の大部分の間、科学および医学は、糖尿病に対して有用な形態でインスリンを提供する問題を解決するように試みてきた。このタンパク質の安定性の問題および生物学的送達の問題のいくつかを解決するための試みがなされてきた。例えば、米国特許第５，５０６，２０３号は、吸収エンハンサーと組み合わせたアモルファスインスリンの使用を記載する。固体状態インスリンは、偏光光学顕微鏡によって示されるように、独占的にアモルファス物質であった。
【００１９】
Ｊｅｎｓｅｎらは、インスリンの気道送達における使用のために吸収エンハンサーとともにインスリンを共沈殿させた（ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／４２３６８を参照のこと）。ここでは、吸収エンハンサーは、界面活性物質（例えば、脂肪酸の塩または胆汁酸塩）として記載された。直径１０マイクロメートル未満であり、かつ亜鉛を欠くインスリン結晶は、Ｓ．Ｈａｖｅｌｕｎｄによって作製された（ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／４２７４９を参照のこと）。同様に、結晶はまた、肺投与を増強するために界面活性剤の存在下で作製された。
ＣＡ−Ａ−１  １９６  ８６４は、インスリンの結晶および生分解性ポリマーの生分解性マトリックスを含む組成物に関する。この生分解性ポリマーは、有機溶媒に溶解しそれとのマトリックスの形成を可能にする任意の都合のよい生分解性ポリマーとしてさらに規定される。
【００２０】
今日まで、当業者は、低分子について観察される結晶状態の安定性の非常な増強は、生物学的な高分子に転化されないことを認識している（Ｐｉｃａｌ，Ｍ．Ｊ．およびＲｉｇｓｂｅｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：１３７９（１９９７））。例えば、結晶インスリンの水懸濁物は、対応するアモルファス相の懸濁物と比較して、わずかにより安定なのみである（係数２の程度まで）（Ｂｒａｎｇｅ，Ｊ．，Ｌａｎｇｋｊａｅｒ，Ｌ．，Ｈａｖｅｌｕｎｄ，Ｓ．，およびＶｏｌｕｎｄ，Ａ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，９：７１５（１９９２））。固体状態においては、凍結乾燥したアモルファスインスリンは、調べられたすべての条件下において、凍結乾燥した結晶インスリンよりもはるかにより安定である（Ｐｉｃａｌ，Ｍ．Ｊ．およびＲｉｇｓｂｅｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：１３７９（１９９７））。
【００２１】
分子量は、高分子のすべての特性（その高分子の体積、水和、粘度、拡散、移動度、および安定性を含む）に著しい効果を有する。（Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）。
ＷＯ９６／１８４１７は、結晶性タンパク質およびポリエチレングリコールまたは薬学的に受容可能な植物油を含む薬学的組成物に関する。この発明は、結晶性タンパク質がＰＥＧ溶液もしくはゲル、または植物油に懸濁される場合、得られる予期せぬ高制御放出特性として著者らにより記載されている。この著者らは、特に、以下からなる群から選択される結晶性タンパク質を含む組成物をクレームしている：結晶性エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、結晶性顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、結晶性インスリン、および結晶性性顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）。
ＷＯ−Ａ−９  ６４１  ８７３は、凍結保護化合物で安定化され、そして凍結乾燥されるポリヌクレオチド複合体の処方物に関する。次いで、この凍結乾燥された処方物は、ポリヌクレオチド複合体を送達するために用いられ得る乾燥粉末処方物へと粉末化されるかまたは篩にかけられる。
【００２２】
（発明の要旨）
本発明者らは、驚くべきことに、雰囲気温度または上昇した温度で溶液中に保持される場合に安定でない生物学的高分子が、それにもかかわらず、結晶形態でそのような温度で長期間にわたり首尾よく乾燥形態で保存され得ることを発見した。実際問題として、この発見の５つの局面が特に有利である。
【００２３】
第一に、保存される物質の結晶性が非常に重要である。なぜなら、大規模な結晶化は、臨床での製造プロセス（例えば、治療剤またはワクチンを製造するためのプロセス）において、最終の精製工程および／または濃縮工程として導入され得るからである。さらに、大規模結晶化は、製造プロセスにおける精製工程のいくつかにとって代わり得る。例えば、タンパク質結晶化は、タンパク質処方物の生産をストリームライン化して、その生産をより便利にし得る。
【００２４】
第二に、溶液中で生じる高分子の相互作用は、全ての反応速度のかなりの減少に起因して、結晶状態において防止されるか、または重度に減少される。従って、この結晶状態は、生物学的高分子の混合物の保存に独特に適している。
【００２５】
第三に、固体結晶調製物が容易に再構成されて、非常に高いタンパク質濃度を有する容易に使用される非経口処方物を生成し得る。そのようなタンパク質濃度は、その処方物が皮下投与について意図されている場合に特に有用であると考えられる（ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／０４８０１を参照のこと）。皮下投与について、１．５ｍｌ以下の注射容量は充分寛容される。従って、１週間に１回のベースで１ｍｇ／ｍｌで投与されるタンパク質について、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が必要とされ、そして１００〜２００ｍｇ／ｍｌが好ましい。これらの濃度は、凝集の問題に起因して、液体処方物において達成することは困難である。これらの濃度は、本発明の結晶処方物において容易に達成され得る。
【００２６】
第四に、タンパク質結晶はまた、薬学的投薬調製物のために特に有利な形態を構成する。この結晶は、インビボで徐放処方物のための基礎として使用され得る。当業者が理解するように、粒子径は、結晶の溶解および活性の放出のために重要である。放出速度は、その結晶が実質的に均一な粒子径を有し、そしてアモルファス沈澱を含まない場合にはより予測可能であることもまた公知である（欧州特許第０  ２６５  ２１４号を参照のこと）。従って、タンパク質結晶は、移植可能なデバイスにおいて有利に使用され得る（ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／４００４９を参照のこと）。移植物リザーバは、一般に、およそ２５〜２５０μｌである。この容量制限によって、高濃度の処方物（１０％を超える）および最小限量の懸濁物ビヒクルが好ましい。本発明のタンパク質結晶は、そのような高濃度での非水性の懸濁物中で容易に処方され得る。
【００２７】
第五に、結晶の別の利点は、特定の変数が、経時的に高分子の放出を調節するために操作され得ることである。例えば、結晶の大きさ、形状、溶解をもたらす賦形剤を用いる処方、架橋、ポリマーマトリクスへの架橋およびカプセル化のレベルはすべて、生物学的分子についての送達ビヒクルを産生するように操作され得る。
【００２８】
本発明は、活性なタンパク質の最も安定な形態、結晶形態を用いること、ならびに（１）乾燥した結晶を安定化することが必要な場合に成分または賦形剤を添加すること、あるいは（２）そのタンパク質結晶もしくは結晶処方物を、ポリマー性キャリアにカプセル化して、各結晶を含む組成物を生成し、続いて活性なタンパク質分子の放出を可能にすることのいずれかによって上記の障害を克服する。任意の形態のタンパク質（糖タンパク質、抗体、酵素、ホルモンまたはペプチドを含む）が本発明の方法に従って、結晶化され得、そして組成物中で安定化またはカプセル化され得る。さらに、そのようなタンパク質をコードする核酸が同様に処理され得る。
【００２９】
結晶は、異なるもしくは特定の環境への送達または特定の機能をもたらすに適切な独特の特性を有する種々のポリマー性キャリアを用いてカプセル化され得る。その組成物の溶解の速度およびそれゆえ活性タンパク質の送達は、結晶の大きさ、ポリマー組成、ポリマー架橋、結晶架橋、ポリマーの厚さ、ポリマーの疎水性、ポリマーの結晶性またはポリマーの溶解性を変動させることによって調節され得る。
【００３０】
本発明の結晶への成分もしくは賦形剤の添加またはタンパク質結晶もしくは結晶処方物のカプセル化は、タンパク質成分のさらなる安定化をもたらす。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載した本発明がより充分に理解され得るために、以下の詳細な説明を示す。この説明において、以下の用語が使用される。
【００３２】
アモルファス固体−タンパク質の非結晶固体形態。ときに、アモルファス沈澱と呼ばれる。これは、結晶の固体状態に特徴的である分子格子構造を有しない。
【００３３】
アンチセンスポリヌクレオチド−その発現の阻害が意図される遺伝子のｍＲＮＡに相補的であるＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡ。
【００３４】
水性有機溶媒混合物−ｎ％の有機溶媒（ここで、ｎは、１と９９との間である）およびｍ％水性溶媒（ここで、ｍは、１００−ｎである）を含む混合物。
【００３５】
生体適合性ポリマー−非抗原性（アジュバントとして使用されない場合）で、非発ガン性で、非毒性であり、そして他の様式でも生きている生物とは固有に不適合ではないポリマー。例としては以下が挙げられる：ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）（例えば、ポリ（乳酸）またはＰＬＡ）、ポリ（乳酸コグルコール酸）すなわちＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｒｙａｔｅ））、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、マレイン酸無水物−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴサッカリド、グリカミノグリカン、硫酸化ポリサッカリド、それらの混和物およびコポリマー。
【００３６】
生体分解性ポリマー−加水分解または可溶化によって分解するポリマー。分解は、不均一（主に、粒子表面で生じる）または均一（ポリマーマトリクス全体で均一に分解する）、またはそのようなプロセスの組合せであり得る。
【００３７】
生物学的高分子−タンパク質、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）のような生物学的ポリマー。本願の目的のために、生物学的高分子はまた、高分子といわれる。
【００３８】
化学組成における変化−タンパク質または核酸の結晶または結晶処方物を取り囲む環境の化学物質成分において、その結晶成分の安定性または溶解速度に影響を与える任意の変化。
【００３９】
剪断力における変化−使用条件下において、タンパク質または核酸の結晶または結晶処方物を取り囲む環境の因子における任意の変化（例えば、力学的圧力における変化（これは、正であっても負であってもよい）、回転攪拌、遠心分離、タンブリング、機械的振盪および濾過ポンプ）。
【００４０】
組成物−架橋されていないタンパク質結晶、架橋されている結晶、核酸結晶またはそれらを含む処方物のいずれか。これらは、ポリマー性キャリア内にカプセル化されてコーティングされた粒子を形成している。本明細書において使用される場合、組成物は常に、カプセル化結晶または処方物をいう。
【００４１】
制御溶解−以下からなる群より選択される因子によって制御されている、タンパク質または核酸の結晶または結晶処方物の溶解あるいはその処方物の結晶成分の放出：その結晶の表面積；その結晶の大きさ；その結晶の形状；賦形剤成分の濃度；賦形剤成分の数および性質；賦形剤成分の分子量ならびにそれらの組合せ。
【００４２】
コポリマー−１を超えるモノマー種を用いて作製されるポリマー。
【００４３】
結晶−第二の形態であるアモルファス固体状態とは異なる物質の固体状態の１つの形態。結晶は、格子構造、特徴的形状および光学的特性（例えば、屈折率）を含む特徴的な特性を示す。結晶は、三次元で周期的に反復するパターンで配置される原子からなる（Ｃ．Ｓ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｓ、第二版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９５２、１頁）。本発明の結晶は、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、抗体、治療的タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡであり得る。
【００４４】
（タンパク質結晶または核酸結晶の乾燥）Ｎ2、気体または不活性ガスでの乾燥、真空オーブン乾燥、凍結乾燥、揮発性有機溶媒での洗浄続いてこの溶媒のエバポレーション、またはフュームフード（ｆｕｍｅ  ｈｏｏｄ）におけるこの溶媒のエバポレーション含む手段による水、有機溶媒または液体ポリマーの除去。代表的には、乾燥は、この結晶が自由に流れる粉末になる場合に達成される。乾燥は、濡れた結晶に対してガスの流れを通過させることにより実行され得る。ガスは、窒素、アルゴン、ヘリウム、二酸化炭素、空気またはそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００４５】
（有効量）幾らかの期間にわたってそれらが投与される、被検体または領域を、処置、免疫化、ブースト、保護、修復または解毒化するために有効である、本発明のタンパク質結晶もしくは核酸結晶または結晶処方物あるいは結晶組成物の量。
【００４６】
（乳化剤）ポリマーコート化タンパク質結晶と溶液との間の界面張力を低下させる、表面活性剤。
【００４７】
（処方物すなわち（タンパク質結晶組成物もしくは核酸結晶組成物））本発明のタンパク質結晶または核酸結晶および１以上の成分または賦形剤（糖および生体適合性ポリマーを含む）の組合せ。賦形剤の例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔｉａｎにより共同で刊行された、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ中に記載されている。本出願の目的に関して、「処方物」は、「結晶処方物」を含む。さらに、「処方物」は、「タンパク質結晶処方物または核酸結晶処方物」を含む。
【００４８】
（除染のための処方物）以下の群より選択される処方物：化学廃棄物、除草剤、殺虫剤、農薬および環境災害の除染のための処方物。
【００４９】
（遺伝子治療）個体において欠損しているか、欠けているか、または不十分に発現されるタンパク質をコードするＤＮＡの処方物および／または組成物を使用する治療。この結晶は、ＤＮＡが細胞中に取り込まれる非増殖性組織中に注射され、そして１〜６ヶ月の期間にわたって発現される。発現したタンパク質は、内因性タンパク質を一時的に置換または補充するように働く。遺伝子治療はまた、プロモーターと比較して逆の遺伝子の配向でトランスジーンを提供し、その結果、アンチセンスｍＲＮＡは、インビボで産生されることによって、遺伝子発現を阻害するように働く。
【００５０】
（糖タンパク質）炭水化物に共有結合したタンパク質またはペプチド。この炭水化物は、単量体であり得るか、またはオリゴサッカリドから構成され得る。
【００５１】
（ホモポリマー）単一の単量体種で作製されたポリマー。
【００５２】
（免疫療法剤）腫瘍細胞、ウイルス、または細菌に対して保護的免疫を誘導するタンパク質活性を有する、上記の腫瘍細胞、ウイルスまたは細菌に由来するタンパク質。免疫療法剤は、（タンパク質として）直接的に、またはこのタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを注射することによって（間接的に）投与され得る。
【００５３】
免疫療法剤はまた、タンパク質もしくは糖タンパク質サイトカインまたは上記の腫瘍細胞、ウイルスまたは細菌を低下または排除する免疫系を刺激する免疫細胞同時刺激性分子であり得る。
【００５４】
（液体ポリマー）水性溶媒または有機溶媒の非存在下における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような、純粋な液相合成ポリマー。
【００５５】
（高分子）タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、治療用タンパク質、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子。
【００５６】
（投与の方法）タンパク質結晶または核酸結晶あるいは結晶処方物または結晶組成物は、種々の様式または投与に適切であり得る。これらは、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、肺投与、病変内投与、または局所投与を含み得る。あるいは、核酸結晶は、「ＤＮＡ銃」を用いる非増殖性組織（例えば、筋肉）への送達のために、金粒子、または他のキャリアビーズに共有結合的に付着され得る。
【００５７】
（裸のＤＮＡ）プロモーターに作動可能に連結され得、そして複製コンピテントなプラスミド中に挿入され得る、ワクチン抗原、治療用タンパク質、または免疫療法タンパク質をコードする非複製性の非組み込み性ポリヌクレオチド。このＤＮＡは、トランスフェクションを容易にするタンパク質、ウイルス粒子、リポソーム性処方物、脂質およびリン酸カルシウム沈澱剤との会合から自由である。
【００５８】
（裸のＤＮＡワクチン）ワクチン抗原をコードするＤＮＡまたはワクチン抗原の結晶および免疫療法剤。このワクチンは、このＤＮＡが細胞中に取り込まれる非増殖性組織中に注射され、そして１〜６ヶ月の期間にわたって発現される。この核酸結晶は、投与部位への送達を補助するために、金粒子に共有結合され得る。
【００５９】
（有機溶媒）液体ポリマーおよびそれらの混合物を含む、非水性起源の任意の溶媒。本発明に適切な有機溶媒は、アセトン、メチルアルコール、メチルイソブチルケトン、クロロホルム、１−プロパノール、イソプロパノール、２−プロパノール、アセトニトリル、１−ブタノール、２−ブタノール、エチルアルコール、シクロヘキサン、ジオキサン、エチルアセテート、ジメチルホルムアミド、ジクロロエタン、ヘキサン、イソオクタン、塩化メチレン、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、トルエン、４塩化炭素、またはそれらの組合せを含む。
【００６０】
（ペプチド）通常、３〜３５のアミノ酸残基、そして頻繁には（ただし、より大きいタンパク質のフラグメントを必ずしも示さない）小〜中程度の分子量のポリペプチド。
【００６１】
（薬学的に有効な量）幾らかの期間にわたって投与される、生きている生物における状態を処置するために効果的な、タンパク質結晶もしくは核酸結晶または結晶処方物もしくは結晶組成物の量。
【００６２】
（成分）薬学的な成分または薬学的賦形剤を含む、任意の賦形剤（単数または複数）。賦形剤は、例えば、以下を含む：
（酸性化剤）
酢酸、氷酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、希塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、希リン酸、硫酸、酒石酸。
【００６３】
（エアロゾル噴霧薬）
ブタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、イソブタン、プロパン、トリクロロモノフルオロメタン。
【００６４】
（空気の置き換え）
二酸化炭素、窒素。
【００６５】
（アルコール変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ））
安息香酸デナトニウム（ｄｅｎａｔｏｎｉｕｍ  ｂｅｎｚｏａｔｅ）、メチルイソブチルケトン、スクロースオクタアセテート（ｏｃｔａｃｅｔａｔｅ）。
【００６６】
（アルカリ化剤）
強アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トロラミン（ｔｒｏｌａｍｉｎｅ）。
【００６７】
（抗ケーキング剤：滑沢剤（ｇｌｉｄａｎｔ）の項を参照のこと）
（消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ））
ジメチコーン、シメチコーン（ｓｉｍｅｔｈｉｃｏｎｅ）。
【００６８】
（保存剤）
塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム溶液、塩化ベンゼルトニウム（ｂｅｎｚｅｌｔｈｏｎｉｕｍ）、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン（ｂｕｔｙｌｐａｒａｂｅｎ）、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール、チモール。
【００６９】
（抗酸化剤）
アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、トコフェロール、トコフェロール賦形剤。
【００７０】
（緩衝化剤）
酢酸、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、クエン酸、酪酸、亜リン酸、クエン酸カリウム、メタリン酸カリウム、リン酸カリウム一塩基、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム溶液、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム。
【００７１】
（カプセル剤滑沢剤）
錠剤およびカプセル剤滑沢剤を参照のこと。
【００７２】
（キレート剤）
エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸およびその塩、エデト酸。    （コーティング剤）
カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ゼラチン、薬学的うわぐすり、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアセテートフタレート、セラック、スクロース、二酸化チタン、カルナウバロウ、微結晶ワックス、ゼイン。
【００７３】
（着色料）
カラメル、赤色、黄色、黒色またはこれらのブレンド、酸化鉄。
【００７４】
（錯体化剤）
エチレンジアミンテトラ酢酸およびその塩（ＥＤＴＡ）、エデト酸、ゲンチシン酸エタノールメイド（ｇｅｎｔｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｔｈａｎｏｌｍａｉｄｅ）、オキシキノリンスルフェート。
【００７５】
（乾燥剤）
塩化カルシウム、硫酸カルシウム、二酸化ケイ素。
【００７６】
（乳化剤および／または可溶化剤）
アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン（隣接型（ａｄｊｕｎｃｔ））、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノ−およびジ−グリセリド、モノエタノールアミン（隣接型）、オレイン酸（隣接型）、オレイルアルコール（安定化剤）、ポロキサマー、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシ３５ヒマシ（ｃａｓｔｅｒ）油、ポリオキシ４０水素化ヒマシ油、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ポリオキシ２０セトステアリルエステル、ポリオキシ４０ステアレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロールアミン、乳化ロウ。
【００７７】
（ろ過助剤）
粉末化したセルロース、精製ケイ質土。
【００７８】
（矯臭剤および香料）
アネトール、ベンズアルデヒド、エチルバニリン、メントール、サリチル酸メチル、グルタミン酸一ナトリウム、橙花油、ペパーミント、ペパーミント油、ペパーミント精、ローズ油、より強力な（ｓｔｒｏｎｇｅｒ）ローズ水、チモール、トルバルサムチンキ、バニラ、バニラチンキ、バニリン。
【００７９】
（滑沢剤および／または抗ケーキング剤）
ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状ケイ素二酸化物、タルク。
【００８０】
（湿潤化剤）
グリセリン、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール。
【００８１】
（軟膏基剤）
ラノリン、無水ラノリン、親水性軟膏、白色軟膏、黄色軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ペトロラタム、親水性ペトロラタム、白色ペトロラタム、ローズ水軟膏、スクワラン。
【００８２】
（可塑化剤）
ヒマシ油、ジアセチル化モノグリセリド、ジエチルフタレート、グリセリン、モノ−およびジ−アセチル化モノグリセリド、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチン、トリエチルシトレート。
【００８３】
（ポリマー膜）
酢酸セルロース。
【００８４】
（溶媒）
アセトン、アルコール、希釈アルコール、アミレン水和物、安息香酸ベンジル、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチル、グリセリン、ヘキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルアルコール、メチルクロライド、メチレンイソブチルケトン、鉱油、ピーナッツ油、ポリエチレングリコール、炭酸プロピレン、プロピレングリコール、ゴマ油、注射用水、注射用滅菌水、洗浄用滅菌水、精製水。
【００８５】
（吸収剤）
粉末セルロース、木炭、精製ケイ質土。
【００８６】
（二酸化炭素吸収剤）
水酸化バリウム石灰、ソーダ石灰。
【００８７】
（硬化剤）
硬化ヒマシ油。セトステアリル（ｃｅｔｏｓｔｅａｒｙｌ）アルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、硬化脂肪（ｈａｒｄ  ｆａｔ）、パラフィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化ワックス、白蝋、黄蝋（ｙｅｌｌｏｗ  ｗａｘ）。
【００８８】
（坐剤基剤）
ココアバター、硬化脂肪、ポリエチレングリコール。
【００８９】
（懸濁剤および／または増粘剤）
アラビアゴム、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、精製ベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー（ｃａｒｂｏｍｅｒ）９３４ｐ、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム１２、カラゲーナン、微晶性およびカルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーゴム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、二酸化ケイ素コロイド、アルギン酸ナトリウム、トラガカントゴム、キサンタンガム。
【００９０】
（甘味剤）
アスパルターム、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）、デキストロース、賦形剤デキストロース、フルクトース、マンニトール、サッカリン、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ソルビトール、ソルビトール溶液、スクロース、圧縮糖、コーティング糖、シロップ。
【００９１】
（錠剤結合剤）
アラビアゴム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微晶性セルロース、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、ガーゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポビドン、アルファ化デンプン、シロップ。
【００９２】
（錠剤および／またはカプセル剤希釈剤）
炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（２塩基）、リン酸カルシウム（３塩基）、硫酸カルシウム、微晶性セルロース、粉末セルロース、デキストレート、デキストリン、デキストロース賦形剤、フルクトース、カオリン、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプン、スクロース、圧縮糖、コーティング糖。
【００９３】
（錠剤崩壊剤）
アルギン酸、微晶性セルロース、クロスカルメロース（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、クロスポビドン（ｃｏｒｓｅｐｏｖｉｄｏｎ）、ポラクリリンカリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、デンプン、アルファ化デンプン。
【００９４】
（錠剤および／またはカプセル剤潤滑剤）
ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリン、ステアリン酸マグネシウム、軽鉱油、ポリエチレングリコール、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、精製ステアリン酸、タルク、硬化植物油、ステアリン酸亜鉛。
【００９５】
（強壮剤）
デキストロース、グリセリン、マンニトール、塩化カリウム、塩化ナトリウム。
【００９６】
（ビヒクル：矯味矯臭化（ｆｌａｖｏｒｅｄ）および／または甘味化）
芳香性エリキシル、化合物ベンズアルデヒドエリキシル、イソアルコールエリキシル、ハッカ水、ソルビトール溶液、シロップ、トルーバルサムシロップ。
【００９７】
（ビヒクル：油性）
アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチル酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、軽鉱油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、ピーナッツ油、キョウニン油、ゴマ油、ダイズ油、スクアリン。
【００９８】
（ビヒクル：固体キャリア）
糖球
（ビヒクル：滅菌化）
注射用静菌水、注射用静菌塩化ナトリウム。
【００９９】
（増粘剤）（懸濁剤を参照のこと）。
【０１００】
（撥水剤）
シクロメチコン、ジメチコン、シメチコン。
【０１０１】
（湿潤剤および／または可溶化剤）
塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドクサートナトリウム、ノノキシノール９、ノノキシノール１０、オクトキシノール９、ポロキサマー、ポリオキシル３５、ヒマシ油、ポリオキシル４０、硬化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシル５０、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０、セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、チロキサポール。
【０１０２】
好ましい成分または賦形剤は、以下の塩を含む：１）アミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリン）、２）炭水化物（例えば、単糖類（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボース）、および３）二糖類（例えば、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロース）、および４）多糖類（例えば、マルトデキストリン、デキストラン、スターチ、グリコーゲン）、および５）アルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、ソルビトール）、６）グルクロン酸、ガラクツロン酸、７）シクロデキストリン（例えば、メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、８）無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ナトリウムおよびカリウムのリン酸塩、ホウ酸塩、炭酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム）、および９）有機塩（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩）、１０）以下のような、乳化剤または可溶化剤（アラビアゴム、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリン、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、および他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体）、１１）以下のような、増粘試薬（寒天、アルギン酸およびその塩、ガーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースおよびその誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、チロキサポール）。賦形剤または成分のさらに好ましい群は、以下を含む：スクロース、トレハロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、イノシトール、ナトリウム塩およびカリウム塩（例えば、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩）、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン。
【０１０３】
（ポリマー）−−  低分子の、単純な化学的単位の反復によって構築される高分子。反復単位は、直線化または分枝化され得、相互連結されたネットワークを形成し得る。反復単位は、通常、そのモノマーと等価であるか、ほぼ等価である。
【０１０４】
（ポリマーキャリア）−−  タンパク質の送達（生物学的送達を含む）のためにタンパク質結晶のカプセル化に使用されるポリマー。このようなポリマーは、生体適合性ポリマーおよび生分解性ポリマーを含む。ポリマーキャリアは、単一のポリマー型であり得るか、またはそれは、ポリマー型の混合体から構成され得る。ポリマーキャリアとして有用なポリマーとしては、例えば、以下が挙げられる：ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）（例えば、ポリ（乳酸）すなわちＰＬＡ、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）すなわちＰＬＧＡ、ポリ（Ｂ−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、およびポリ（ジオキサノン（ｄｉｏｘａｎｏｎ）））；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ（（オルガノ）ホスファゼン（ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ））、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、天然および合成ポリペプチド、アルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫化多糖類、またはタンパク質結晶をカプセル化する任意の従来の材料。
【０１０５】
（タンパク質）−−  炭素、水素、酸素、窒素および通常硫黄を含み、かつペプチド結合によって連結されるアミノ酸の鎖から構成される複合高分子ポリマー。本出願におけるタンパク質とは、糖タンパク質、抗体、非酵素タンパク質、酵素、ホルモンおよびペプチドをいう。タンパク質の分子量の範囲は、１０００ダルトンのペプチドから６００〜１０００キロダルトンの糖タンパク質を含む。低分子タンパク質（１０，０００ダルトン未満）は、非常に小さいために高度に組織化された３次構造によって特徴付けされないかもしれない。ここで、この３次構造は、疎水性のコアの周辺に組織化される。
【０１０６】
本発明の一つの実施態様において、このようなタンパク質は、１０，０００ダルトン以上の分子量を有する。代替的な実施態様に従って、この分子量は、２０，０００ダルトン以上である。別の代替的な実施態様に従って、この分子量は、３０，０００ダルトン以上である。さらに代替的な実施態様に従って、この分子量は、４０，０００ダルトン以上である。別の代替的な実施態様に従って、この分子量は、５０，０００ダルトン以上である。
【０１０７】
（タンパク質活性）−−  結合、触媒、シグナル伝達、トランスポート、またはタンパク質が使用される環境内での機能的応答（例えば、免疫応答、酵素活性、またはそれらの組み合わせ）を誘導する他の活性からなる群より選択される活性。
【０１０８】
（タンパク質活性の放出速度）−−  単位時間あたりに溶解されるタンパク質の量。
【０１０９】
（タンパク質結晶）−−  結晶格子中に整列されたタンパク質分子。タンパク質結晶は、３次元に周期的に繰り返される特異的タンパク質−タンパク質相互作用のパターンを含む。本発明のタンパク質結晶は、アモルファス固体形態またはタンパク質の沈殿物（例えば、タンパク質溶液の凍結乾燥によって得られるもの）を含まない。
【０１１０】
（タンパク質結晶処方物）−−  コートされた粒子を形成するためにポリマー性キャリア内にカプセル化されたタンパク質結晶の組み合わせ。タンパク質結晶処方物のコートされた粒子は、球状形態を有し得、そして直径５００マイクロメーターまでのマイクロスフェアであり得るか、またはそれらは、他の形態を有し得、そして微小粒子であり得る。本出願の目的のために、「タンパク質結晶処方物」は、用語「組成物」に含まれる。
【０１１１】
（タンパク質送達系）−−  １以上のタンパク質結晶処方物または組成物、処方物を作製するためのプロセス、あるいは処方物を生物学的実態に投与する方法またはそのための手段。
【０１１２】
タンパク質の充填量  −−  乾燥処方物の重量に関して、タンパク質の重量のパーセンテージと同じように計算されたマイクロスフェアのタンパク質含有量。タンパク質充填量の代表的な範囲は，１〜８０％である。
【０１１３】
タンパク質の放出  −−  ポリマーキャリアからの活性タンパク質の放出を，１つ以上の、以下の因子によって制御する：（１）ポリマーマトリクスの分解；（２）ポリマーマトリクス内の結晶融解の速度；（３）融解したタンパク質のポリマーマトリクスを通る拡散；（４）タンパク質の充填量；および（５）タンパク質結晶／ポリマーマトリクスへの生物学的媒体の拡散。
【０１１４】
予防的に有効な量  −−  いくらかの時間にわたって投与される、生存している生物における状態を予防するために有効な、タンパク質もしくは核酸の結晶あるいはタンパク質もしくは核酸の結晶処方物またはタンパク質もしくは核酸の結晶組成物の量。
【０１１５】
再構成  −−  適切な緩衝液または薬学的処方物中の、タンパク質もしくは核酸の結晶あるいはタンパク質もしくは核酸の結晶処方物またはタンパク質もしくは核酸の結晶組成物の融解。
【０１１６】
貯蔵安定性  −−  特定の状態の下でインキュベートされた時間に対する、ネイティブタンパク質からの比活性の損失および／または２次構造における変化。
【０１１７】
安定性  −−  特定の条件下の溶液中での時間に対するネイティブタンパク質からの比活性の損失および／または２次構造における変化。
【０１１８】
安定化  −−  賦形剤または成分を含むタンパク質結晶またはＤＮＡ結晶もしくはＲＮＡ結晶の処方物を調製することによる、ネイティブタンパク質からの比活性の損失および／または２次構造における変化を妨げるプロセス。
【０１１９】
治療用タンパク質  −−  上記のようなタンパク質であって、これは、処方物または組成物、あるいは薬学的処方物または薬学的組成物において生存している生物に投与される。治療用タンパク質は、本明細書中で記載されるタンパク質型の全てを含む。
【０１２０】
ワクチン抗原  −−  ウイルス、寄生生物、細菌または腫瘍細胞のような病原性因子由来のタンパク質。このようなワクチン抗原のタンパク質活性は、病原性因子または腫瘍に特異的な防御的免疫応答の誘導物である。
【０１２１】
（結晶性）
高分子の結晶性は、インビボにおいて、これらの貯蔵および送達のために、大いに重要である。しかし、母液の外側で安定である、このような結晶性高分子を大量に調製するための技術は、ほとんど存在しない。タンパク質または核酸の結晶は、非常に脆く、そして高い比率の溶媒を含むので、これらは、相当の注意を伴って取り扱わなければならない。Ｘ線結晶学において、高分子結晶からの回折パターンが空気中での脱水の際に迅速に変性することは周知である。通常、結晶は，その母液から注意深く分離され，そしてキャピラリーチューブへ挿入される。このチューブを，少量の母液の内側に沿って、デンタルワックス（ｄｅｎｔａｌ  ｗａｘ）またはシリコングリースを用いて空気から密封し、水和を維持する［ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｋｒｉｅｑｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｍａｌａｂａｒ、２１４頁（１９６９）］。別の技術は、低温において高分子結晶からデータを収集することである。この結晶を調製し、次いで、急速に冷却して水性媒体における氷格子形成を防止する。氷の、堅いガラス形態の代わりに、損傷がほとんどない結晶を容器に入れる。次いで、結晶を、１００ケルビンで維持して，結晶の崩壊を防止する［（Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｄ．Ｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｃａｒｔｅｒ，Ｃ．Ｗ．およびＳｗｅｅｔ，Ｒ．Ｍ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第２７６巻、１８３頁（１９９７）］。この技術は，これらの母液の外側の結晶を維持させることを可能にするが，一方、１００ケルビンより高い温度においては使用され得ない。
【０１２２】
原則的に、乾燥した結晶は，凍結乾燥によって調製され得る。しかし、この技術は，材料の急速な冷却を包含し、そして安定な生成物を凍結するためにのみ適用され得る。この水溶液は、まず、−４０℃と−５０℃との間で凍結される。次いで、この氷は真空下で取り除かれる。この氷形成は、通常、タンパク質結晶格子に対して破壊的であり、結晶性および非晶性沈殿物の混合物を生じる。
【０１２３】
結晶性状態において，周囲温度における貯蔵条件下で純粋かつ安定である高分子を生成することが望ましい。このような結晶は、治療剤およびワクチンの投薬調製物にために、タンパク質または核酸の特に有利な形態を構成する。本発明は、固体粒子かまたは非水性溶媒中に分散されるかのいずれかとして、結晶性高分子の貯蔵のための処方物および組成物を提供する。さらに、本発明は，単一の生物学的高分子または互いに相互作用しない高分子の混合物の貯蔵に対して適用され得る。
【０１２４】
別の実施態様において、本発明は、母液を非水性溶媒と置換することを包含する、生物学的高分子を懸濁液中の貯蔵に適切にするための方法を提供する。さらに別の実施態様において，結晶性スラリーは、第１の溶媒を遠心分離で除去（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｔ）し、そして水を除去するために第２の有機溶媒を使用して残存する結晶性固体を洗浄し、次いで非水性溶媒をエバポレーションすることによって固体にされ得る。
【０１２５】
結晶性治療用タンパク質の非水性スラリーは、皮下送達のために特に有用であり、一方，固体処方物は、理想的には肺投与に適している。肺送達は，他の経路または投与によって送達することが困難な生物学的高分子のために、特に有用である（例えば，ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／３２１５２、ＷＯ９５／２４１８３およびＷＯ９７／４１８３３を参照のこと）。
【０１２６】
以下で言及されるタンパク質は、それら自体のタンパク質結晶、または細胞のの取り込みに際してそれらのタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを含む核酸結晶を含む。
【０１２７】
本発明は，タンパク質または核酸の結晶の組成物および処方物を有利に提供する。
【０１２８】
（カプセル化した結晶の安定性）
当業者は、タンパク質の安定性が、タンパク質の放出を制御するポリマー微粒子送達系の首尾のよい処方物に対する最も重要な障害の１つであることを理解している。ポリマーキャリア中にカプセル化したタンパク質の安定性は、３つの別個の段階（タンパク質結晶組成物の製造、得られた組成物からのタンパク質の放出、およびタンパク質の放出後のインビボ安定性）で調査され得る。可溶性タンパク質または非晶性タンパク質を含む微粒子またはマイクロスフェアの調製の間、有機溶媒および凍結乾燥の使用は、タンパク質の安定性に対して特に不利益である。続いて、放出されたタンパク質は、水分誘導性の（ｍｏｉｓｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ）凝集を受けやすく、従って永続的な不活化を生じる。
【０１２９】
タンパク質の高い安定性を、本発明に従うタンパク質処方物およびタンパク質組成物の調製の間に達成するために、個々のタンパク質分子の可動度を制限する必要がある（結晶性固体状態において達成される最善の結果）。この適用の目的のために、固体状態は、２つのカテゴリー（非晶性および結晶性）に分類される。結晶性材料中に通常存在する、三次元的に広い範囲の規則性（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｏｒｄｅｒ）は、非晶性状態中に存在しない。さらに、互いに関連する分子の位置は、高度な規則性の結晶状態に関して、非晶性状態または液体状態において、よりランダムである。従って、非晶性タンパク質は、それらの結晶性対照物よりも、より低い安定性であり得る。
【０１３０】
図１は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ（「ＣＲＬ」）の以下の分子状態の相対的な安定性を示す：２０％有機溶媒中での架橋した非晶性、液体、結晶性、２０％有機溶媒中での架橋した結晶性、有機溶媒なしで架橋した結晶性。図１は、結晶性ＣＲＬが、２０％有機溶媒中で、１７５時間を越えて、８０％の活性を保持することを示す。対照的に、酵素の非晶形態および可溶性形態の両方は、数時間以内に完全に不活化される。本発明は、それらの優れた安定性の特徴に起因して、タンパク質の結晶性形態を有利に利用する。
【０１３１】
（結晶性の維持）
本発明に従ってタンパク質処方物およびタンパク質組成物を調製するためのタンパク質供給源としてタンパク質結晶を使用するために、結晶化溶液（母液）の外側のタンパク質結晶の融解の問題が克服されなければならない。タンパク質の結晶性、そしてそれ故安定性を維持するために、本発明のタンパク質結晶処方物およびタンパク質結晶組成物の生成において、いくつかのアプローチが使用され得る：
１．結晶は、ポリマーキャリアでカプセル化されたタンパク質結晶を生成する過程において母液中に残存する。タンパク質結晶化において使用される多くの化合物（例えば、塩、ＰＥＧ、および有機溶媒）は、ポリマーを処理する条件と適合性である。
２．融解の速度論。母液の外側の結晶融解の速度は、ｐＨ、温度、金属イオン（例えば、Ｚｎ、ＣｕおよびＣａ）の存在、ならびに沈殿剤の濃度のような条件に依存する。これらの条件を変化させることによって、数時間の間、結晶の融解を減速し得る。同時に、微粒子形成の処理は、非常に速く、そして通常は、完了までに数秒から数分が必要である。
３．乾燥したタンパク質結晶。母液は、濾過によって除去され得、そして残存する結晶ペーストは、風乾によって、真空下で、水混和性有機溶媒を用いる洗浄によって、および／または凍結乾燥によって、乾燥され得る。
４．タンパク質結晶は、非融解性結晶または緩徐な融解性結晶を形成するために、化学的に架橋され得る。
５．結晶サイズおよび形状は、結晶化の過程で操作および制御され得る。従って、非晶性タンパク質と比較して、異なる融解速度および続く異なる徐放プロフィールを各々有する結晶形態の範囲が、利用可能である。
【０１３２】
（タンパク質の構成）
本発明の処方物および組成物のタンパク質の構成は、天然にまたは合成的に改変される構成であり得る。それらは、糖タンパク質、リンタンパク質、イオウタンパク質、ヨウ素タンパク質、メチル化タンパク質、非改変化タンパク質または他の改変を含むタンパク質であり得る。このようなタンパク質の構成は、例えば、治療用タンパク質、予防用タンパク質（抗体を含む）、洗浄剤タンパク質（界面活性剤タンパク質を含む）、個人医療タンパク質（化粧用タンパク質を含む）、獣医用タンパク質、食品タンパク質、飼料タンパク質、診断用タンパク質および浄化タンパク質を含む、任意のタンパク質であり得る。
【０１３３】
本発明の１つの実施態様において、このようなタンパク質は、１０，０００ダルトン以上の分子量を有する。代替の実施態様に従って、その分子量は、２０，０００ダルトン以上の分子量である。別の代替の実施態様に従って、その分子量は、３０，０００ダルトン以上である。さらなる代替の実施態様に従って、その分子量は、４０，０００ダルトン以上であり得る。別の代替の実施態様に従って、その分子量は、５０，０００ダルトン以上である。
【０１３４】
このようなタンパク質に含まれるものは、例えば、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、アデニレートシクラーゼ、トランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼのような酵素である。ヒドロラーゼの例としては、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ（ｎｉｔｒｉｌａｓｅ）、アミラーゼ、ペクチナーゼ、ヒダントイナーゼ（ｈｙｄａｎｔｏｉｎａｓｅ）、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、サブチリシン、サーモライシンおよび他のプロテアーゼならびにリゾチームが挙げられる。リアーゼの例としては、アルドラーゼおよびヒドロキシニトリルリアーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｎｉｔｒｉｌｅ  ｌｙａｓｅ）が挙げられる。オキシドレダクターゼの例としては、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび他のデヒドロゲナーゼが挙げられる。他の酵素としては、セルラーゼおよびオキシダーゼが挙げられる。
【０１３５】
治療用タンパク質または予防用タンパク質の例としては、ホルモン（例えば、インスリン、グルカゴン（ｇｌｕｃｏｇｏｎ）様ペプチド１および副甲状腺ホルモン）、抗体、インヒビター、増殖因子、ｐｏｓｔｒｉｄｉｃａｌホルモン、神経成長ホルモン、血液凝固（ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ）因子、接着分子、骨形態発生タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびレクチン栄養因子）、サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、α−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γ−ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リンホトキシン、ＩＬ−５、遊走阻止因子、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−３、単球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、多剤耐性タンパク質、他のリンホカイン、トキソイド、エリトロポイエチン、第ＶＩＩＩ因子、アミリン、ＴＰＡ、ドルナーゼ−α、α−１−抗トリプシン、ヒト成長ホルモン、神経成長ホルモン、骨形態発生タンパク質、ウレアーゼ、トキソイド、受胎ホルモン（ＦＳＨおよびＬＳＨ）が挙げられる。
【０１３６】
以下のような治療用タンパク質もまた含まれる：
白血球マーカー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＥ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７およびそのリガンド、ＣＤ２８およびそのリガンド、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７．３、ＣＤ２９およびそのリガンド、ＣＤ３０およびそのリガンド、ＣＤ４０およびそのリガンドｇｐ３９、ＣＤ４４、ＣＤ４５およびアイソフォーム、Ｃｄｗ５２（Ｃａｍｐａｔｈ抗原）、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＴＬＡ−４、ＬＦＡ−１ならびにＴＣＲ）、
組織適合性抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原またはＭＨＣクラスＩＩ抗原、ルイスＹ抗原、ＳＬｅｘ、ＳＬｅｙ、ＳＬｅａおよびＳＬｅｂ）；
インテグリン（例えば、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６およびＬＦＡ−１）；
接着分子（例えば、Ｍａｃ−１およびｐ１５０、９５）；
セレクチン（例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンならびにそれらの対応するレセプターＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＬＦＡ−３）；
インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５）；
インターロイキンレセプター（例えば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１４ＲおよびＩＬ−１５Ｒ）；
ケモカイン（例えば、ＰＦ４、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＣＰ１、ＮＡＰ−２、Ｇｒｏα、ＧｒｏβおよびＩＬ−８）；
増殖因子（例えば、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＴＳＨ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＰＴＨｒＰ、ＥＧＦファミリー、ＥＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、エンドセリンおよびガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ））；
増殖因子レセプター（例えば、ＴＮＦαＲ、ＲＧＦβＲ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ／ＶＰＦＲ、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＴＨｒＰＲ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＥＰＯ−Ｒ；ＧＣＳＦ−Ｒおよび他の造血レセプター；
インターフェロンレセプター（例えば、ＩＦＮαＲ、ＩＦＮβＲおよびＩＦＮγＲ）；
Ｉｇおよびそれらのレセプター（例えば、ＩｇＥ、ＦｃｅＲＩおよびＦｃｅＲＩＩ）；
血液因子（例えば、補体Ｃ３ｂ、補体Ｃ５ａ、補体Ｃ５ｂ−９、Ｒｈ因子、フィブロネクチン、フィブリンおよびミエリン関連増殖インヒビター）。
【０１３７】
本発明の処方物および組成物のタンパク質成分は、任意の天然タンパク質抗原、合成タンパク質抗原または組換えタンパク質抗原であり得、例えば、破傷風毒素、ジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、ウイルス表面タンパク質（例えば、ＣＭＶ糖タンパク質Ｂ、ＨおよびｇＣＩＩＩ、ＨＴＶ−１エンベロープ糖タンパク質、ＲＳＶエンベロープ糖タンパク質、ＨＳＶエンベロープ糖タンパク質、ＥＢＶエンベロープ糖タンパク質、ＶＺＶエンベロープ糖タンパク質、ＨＰＶエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザウイルス糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原）、ウイルス性構造タンパク質、ウイルス性酵素、寄生生物性タンパク質、寄生生物性糖タンパク質、寄生生物性酵素ならびに細菌性タンパク質を含む。
【０１３８】
腫瘍抗原（例えば、ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ムチン、ＣＥＡおよびエンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ））もまた含まれる。アレルゲン（例えば、ハウスダストダニ抗原、ｌｏｌ  ｐ１（草）抗原およびウルシオール）が含まれる。
【０１３９】
毒素（例えば、シュードモナスエンドトキシンおよびオステオポンチン／ウロポンチン（ｕｒｏｐｏｎｔｉｎ）、ヘビ毒液およびハチ毒液）が含まれる。
【０１４０】
糖タンパク質腫瘍関連抗原（例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒトムチン、ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよび前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）［Ｒ．Ａ．ＨｅｎｄｅｒｓｏｎおよびＯ．Ｊ．Ｆｉｎｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６２、２１７−５６頁（１９９６）］）も含まれる。
【０１４１】
（投与および生物学的送達）
これまでに、治療用タンパク質は、それらのごくわずかな経口生物利用能および血漿中での短い生存という特徴のために、一般に、頻繁な注射により投与されていた。本発明のタンパク質結晶処方物および組成物は、タンパク質薬物についての微粒子ベースの徐放系を含み、患者のコンプライアンスおよびコンビニエンスの改善、より安定した血液レベルおよび可能用量の減少を有利に許容する。本発明の緩やかでかつ一定した放出能力は、投薬量を有利に減少させ得る。これは、活性タンパク質のより効率的な送達に起因する。有意なコストの節約は、本明細書中に記載のタンパク質処方物および組成物を用いて達成され得る。
【０１４２】
本発明に従うポリマー送達キャリア中にタンパク質結晶を含む処方物および組成物はまた、ワクチン、医薬品、個人医療処方物および組成物、獣医学的処方物、または経口酵素補充において使用される、任意の慣習的なキャリアまたはアジュバントを含み得る。これらのキャリアおよびアジュバントとしては、例えば、フロイントアジュバント、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、緩衝物質（ホスフェート）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素ニナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、マグネシウム、トリケイ酸塩、セルロースベースの物質およびポリエチレングリコールが挙げられる。局所形態またはゲルベース形態のためのアジュバントとしては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび樹木のワックスアルコールが挙げられる。
【０１４３】
本発明の１つの実施態様に従って、タンパク質結晶は、制御放出投与（医薬品制御放出投与を含む）に使用される任意の従来の材料と組合わせられ得る。このような材料としては、例えば、コーティング、殻およびフィルム（例えば、腸溶性コーティングならびにポリマーコーティングおよびフィルム）が挙げられる。
【０１４４】
本発明に従うポリマー送達キャリアおよび組成物（組成物）におけるタンパク質処方物は、移植可能なデバイスのようなデバイスであり得、そして微粒子タンパク質送達系であり得る。
【０１４５】
本発明の１つの実施態様において、高分子結晶は、約０．０１μｍと約５００μとの間、あるいは約０．１μｍと約１００μｍとの間の最も長い寸法を有する。最も好ましい実施態様は、タンパク質結晶処方物成分のタンパク質結晶は、それらの最も長い寸法において約５０μｍと約１００μｍとの間であることである。このような結晶は、球状、針状、棒状、プレート状（例えば、五角形および正方形）、菱形、立方形、二錘形（ｂｉｐｙｒａｍｉｄｓ）および柱形からなる群より選択される形状を有し得る。
【０１４６】
本発明に従って、組成物を作製するための、ポリマーキャリア中のタンパク質結晶またはタンパク質結晶処方物のカプセル化は、架橋されたまたは非架橋のタンパク質結晶について実行され得る。このようなタンパク質結晶は、市販されているかまたは本明細書中に例示されるように生成され得る。
【０１４７】
本発明に従うタンパク質または核酸結晶もしくは結晶処方物および組成物は、化粧品（例えば、クリーム、ローション剤、乳液、泡、洗剤、コンパクト、ジェル、ムース、スラリー、粉末、スプレー、ペースト、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、香膏、ドロップ、シャンプーおよび日焼け止め剤）を含む個人医療用組成物における成分として使用され得る。例えば、局所用クリームおよびローション剤において、それらは、湿潤剤としてか、または皮膚の保護、軟化、脱色、洗浄、除タンパク質剤、脂質除去、湿潤、漂白、着色または解毒するために使用され得る。それらはまた、化粧品中の抗酸化剤として使用され得る。
【０１４８】
本発明に従って、任意の個体（ヒト、動物および植物を含む）は、それらがある期間にわたって投与された個体における状態を処置するのに十分な期間、薬学的に有効な量のタンパク質もしくは核酸結晶物または結晶処方物または結晶組成物を用いて、薬学的に受容可能な様式で処置され得る。あるいは、個体は、それらがある期間にわたって投与される個体における状態を予防するのに有効である、本発明のタンパク質あるいは核酸結晶もしくは結晶処方物または組成物の予防的有効量を受容され得る。
【０１４９】
タンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物は、単独で、またはアジュバントを伴うもしくは伴わない薬学的調製物、個人医療用調製物または獣医学的調製物の一部としてか、あるいは予防用調製物（例えば、ワクチン）の一部として、投与され得る。それらは、非経口経路かまたは経口経路により投与され得る。例えば、それらは、経口、肺、鼻、耳、肛門、皮膚、眼、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜、舌下、皮下、または頭蓋内経路により投与され得る。薬学的、個人治療的または獣医学的適用のいずれかにおいて、タンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物は、任意の上皮表面に局所的に投与され得る。このような上皮表面としては、口、眼、耳、肛門および鼻表面が挙げられ、これらは、タンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物の適用により処置、保護、修復または解毒され得る。
【０１５０】
本発明に従うタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物を含む薬学的、個人治療用、獣医学的または予防的処方物および組成物はまた、錠剤、リポソーム、顆粒、球、微粒子、マイクロスフェアおよびカプセルからなる群より選択され得る。
【０１５１】
このような使用、および本発明に従う他の使用について、タンパク質あるいは核酸結晶もしくは結晶処方物および組成物は、錠剤中に処方され得る。このような錠剤は、扱いが容易でかつ活性または能力の受容可能なレベルを保持するタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物の貯蔵のための、液体なし、ホコリなしの形態で構成される。
【０１５２】
あるいは、タンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物は、反応組成物を提供する投与のために使用される種々の都合良い貯蔵物形態であり得る。これらは、例えば、固体、半固体および液体形態（例えば、液体溶液または懸濁液、スリラー、ジェル、クリーム、香膏、乳液、ローション、粉末、スプレー、泡、ペースト、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、香膏およびドロップ）を含む。
【０１５３】
本発明に従うタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物はまた、薬学的組成物、個人医療用組成物または獣医学的処方物において使用される任意の従来のキャリアまたはアジュバントを含み得る。これらのキャリアはおよびアジュバントには、例えば、フロイントアジュバント、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、緩衝物質（ホスフェート）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、マグネシウム、トリケイ酸塩、セルロースベースの物質およびポリエチレングリコールが挙げられる。局所的またはゲルベース形態のためアジュバントは、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび樹木ワックスアルコールを含み得る。
【０１５４】
本発明のタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物の最も有効な投与形態および投薬レジメは、所望の効果、以前の治療（もしあれば）、個人の健康状態または症状自体の状態、ならびにタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物に対する応答、ならびに処置する医師または臨床医の判断に依存する。このタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物は、ある時点かまたは一連の処置にわたる、薬学的、ワクチン接種、遺伝子治療、免疫治療、個人医療用組成物または獣医学的処方物に受容可能な任意の投薬形態において処方され得る。
【０１５５】
単回投薬を提供するタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物の量は、投与、処方、投薬レベルまたは投薬頻度の特定の様式に依存して変化する。代表的な調製物は、約０．０１％と約９９％との間、好ましくは約１％と約５０％との間の、タンパク質結晶または核酸結晶（Ｗ／Ｗ）を含む。あるいは調製物は、約０．０１％と約８０％との間のタンパク質結晶、好ましくは約１％と約５０％との間のタンパク質結晶（Ｗ／Ｗ）を含む。あるいは、調製物は、約０．０１％と約８０％との間のタンパク質結晶処方物、好ましくは約１％と約５０％との間のタンパク質結晶処方物（Ｗ／Ｗ）を含む。
【０１５６】
個体の状態の改善の際、タンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物の維持用量が、必要ならば投与され得る。続いて、投与の投薬量または頻度、あるいはその両方は、改善された状態が維持されるレベルまで、症状の関数として減少され得る。症状が所望のレベルまで緩和された場合、処置は、止めるべきである。しかし、個体は、それらの状態または症状のいずれの再発に基づき、長期において、断続的な処置を必要とし得る。
【０１５７】
（結晶、結晶処方物、および結晶組成物の産生）
本発明の１つの実施態様に従って、結晶、結晶処方物、および結晶組成物が、以下の工程によって調製される：最初に、タンパク質または核酸が結晶化される。次に、糖、糖アルコール、粘度増加剤、湿潤剤もしくは可溶化剤、緩衝塩、乳化剤、抗菌剤、抗酸化剤、および被覆剤から選択される賦形剤または成分が、母液に直接的に添加される。あるいは、結晶は、母液が除去された後に最少で１時間から最大で２４時間までの間、賦形剤溶液中に懸濁される。賦形剤濃度は、代表的には、約０．０１〜３０％重量／重量である。最も好ましくは、約０．１〜１０％である。成分濃度は、約０．０１〜９０％である。結晶濃度は、約０．０１〜９５％である。次いで、濾過によるかまたは遠心分離によるかのいずれかによって、結晶スラリーから母液を取り除く。引き続いて、必要に応じて５０〜１００％の１つ以上の有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、または酢酸エチルのような）の溶液を用いて、室温または−２０℃〜２５℃の温度のいずれかにて、結晶を洗浄する。結晶を、その結晶上に窒素流、空気流、不活性ガス流のいずれかを通すことによって、乾燥させる。あるいは、風乾によって、または凍結乾燥法によって、または真空乾燥によって、結晶を乾燥させる。この乾燥は、洗浄後に最少で１時間から最大で７２時間までの間、最終産物の水分含有率が１０％重量未満、最も好ましくは５％未満になるまで実施される。最終的に、必要であれば、結晶の微粉化が実施され得る。
【０１５８】
本発明の１つの実施態様に従って、タンパク質結晶、タンパク質結晶処方物またはタンパク質結晶組成物を調製する場合、エンハンサー（例えば、界面活性剤）は、結晶化の間には添加されない。賦形剤または成分は、約１〜１０％重量／重量の濃度で、あるいは約０．１〜２５％重量／重量の濃度で、あるいは約０．１〜５０％重量／重量の濃度で、結晶化の後に母液に添加される。賦形剤または成分は、結晶と共に母液中において、約０．１〜３時間インキュベートされる。あるいは、このインキュベーションは、０．１〜１２時間実施される。あるいは、このインキュベーションは、０．１〜２４時間実施される。
【０１５９】
本発明の別の実施態様において、成分または賦形剤は母液以外の溶液中に溶解され、そしてタンパク質結晶は、母液から取り出されて、そしてこの賦形剤溶液または成分溶液中に懸濁される。成分または賦形剤の濃度およびインキュベーション時間は、上記の濃度および時間と同じである。
【０１６０】
（徐放形態および徐放ワクチン）
本発明の別の実施態様において、ポリマーキャリア中でのリパーゼのカプセル化は、腸リパーゼ欠損に罹患している患者を処置するために有用な組成物を提供する。そのような患者としては、膵性脂肪便を有する患者が挙げられる。これは、進行型の膵性機能不全が、経口的なリパーゼ補充を必要とするためである。不幸なことに、現在の治療方法は、胃腸管を通して移動する間に活性なリパーゼを保護し、そして小腸内でこの酵素活性が臨床的に必要とされる箇所でこの酵素活性を放出するのに十分な程に順応的ではあり得ない（Ｌ．Ｇｕａｒｎｅｒら、「Ｆａｔｅ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」、Ｇｕｔ、第３４巻、第７０８〜７１２頁（１９９３）を参照のこと）。緩徐に有効な活性リパーゼを調製する際の本発明の順応性は、リパーゼ補充としばしば関連する現在の問題点を解決する。本発明の１つの実施態様に従って、カプセル化リパーゼ結晶（組成物）と、非カプセル化架橋リパーゼ結晶または非カプセル化架橋リパーゼ処方物との組合わせは、薬物療法レジメンを提供する。この薬物療法レジメンにおいて、酵素活性は、早くから、非カプセル化架橋リパーゼから利用可能である。この物質がタンパク質分解性の分解を受けるにつれて、カプセル化酵素（組成物）は、より遠位の腸内へと酵素活性を放出し始める。類似のストラテジーが、他の酵素または治療用タンパク質の補充の問題を解決するために使用され得る。
【０１６１】
本発明はまた、他の徐放方法論（例えば、ホルモン、抗体もしくは酵素、またはそれらを含有する組成物を含むカプセル化タンパク質結晶で予め負荷されている、シリコンベースの環（ｒｉｎｇ）または桿（ｒｏｄ））を利用し得る。本発明の技術の目的は、数週間または数ヶ月の期間にわたって、血流に一定レベルのタンパク質を提供することである。そのようなインプラントは、皮内に挿入され得、そして必要とされる場合に、安全に置換および除去され得る。
【０１６２】
本発明に従う他の処方物および組成物としては、タンパク質（抗原）結晶、アジュバント、およびカプセル化ポリマーを含むワクチン処方物およびワクチン組成物が挙げられる。タンパク質抗原は、ウイルス性糖タンパク質、ウイルス性構造タンパク質、ウイルス性酵素、細菌性タンパク質、またはウイルス性もしくは細菌性タンパク質の幾分操作されたホモログ、あるいは任意の免疫増強タンパク質（例えば、サイトカイン）であり得る。そのような処方物または組成物の１つの実施態様としては、３つ以上の異なる放出プロフィールを有するマイクロスフェアを含有する単回ワクチン注射が挙げられる。この様式において、抗原処方物または抗原組成物は、永続する免疫性を生成するのに十分な持続期間にわたって、放出され得る。この処方物または組成物によって、複数の抗原ブーストは、一回単位の形態であり得る。より早い分解調製物（組成物）は、免疫応答を増強するために免疫原アジュバントを含み得る。そのような系の１つの利点は、タンパク質結晶を用いることによって、このエピトープのネイティブの三次元構造が維持され、そしてそれらのネイティブ形態で免疫系に提示されるということである。
【０１６３】
一旦、免疫系が初回抗原刺激を受けると、アジュバント効果に対する必要性は少なくなり得る。従って、より緩徐に分解される接種においては、より少ない抗原性アジュバントが含められ得、そしてこの処方物および組成物の最も緩徐に分解されるマイクロスフェアにおいては、おそらくアジュバントは全く必要とされ得ない。この様式において、遠隔地にある患者集団は、感染疾患に対する防御を提供するために、複数回処置される必要がない。タンパク質の生物学的送達についての当業者は、このテーマに対して多くの改変が可能であることを認識する。従って、本明細書中に提供される実施例は、本発明を制限することを意図しない。
【０１６４】
本発明の別の実施態様においては、混合ワクチンが産生され得、それによって一回の注射で複数の疾患に対する免疫が誘導される。上記のように、異なる放出プロフィールを有するマイクロスフェアは、単独で、または処方物および組成物において組合わせられ得る。そしてこれには、混合ワクチン（処方物および組成物）を産生するための複数の病原菌由来の抗原を含むマイクロスフェアが挙げられ得る。例えば、複数の放出プロフィールを有し、そして麻疹、おたふくかぜ、風疹、ポリオ、およびＢ型肝炎の因子の抗原結晶を含有するマイクロスフェアが合わせられ得、そして小児に投与され得る。あるいは、複数の放出プロフィールを有し、そしてＨＩＶ  ｇｐ１２０の異なる分離菌の結晶を含有するマイクロスフェアが、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のためのワクチンを産生するために合わせられ得る。
【０１６５】
本発明の別の利点は、ポリマーキャリア内にカプセル化され、そしてマイクロスフェアを含有する組成物を形成しているタンパク質結晶が、凍結乾燥法によって乾燥され得るということである。凍結乾燥法（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（すなわち、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））は、組成物から水分を分離させる。タンパク質結晶組成物は、最初に凍結され、次いで高真空下に置かれる。真空下で、結晶のＨ2Ｏは昇華し、わずかな結合水のみを含むタンパク質結晶組成物が残される。そのような工程は、この組成物をさらに安定化させ、そして代表的に遭遇する周囲温度でのより簡便な貯蔵および輸送を可能にする。
【０１６６】
この特徴は、特に、処方物または組成物における、単回用量の滅菌容器（「アンプル」）、あるいはスラリーのような単回用量の任意の所望増分に調剤され得る治療用タンパク質およびワクチンについて望ましい。次いで、調剤されたスラリー、処方物または組成物を含むアンプルは、滅菌条件下で、キャップされ得、バッチ凍結（ｂａｔｃｈ  ｆｒｏｚｅｎ）され得、そして凍結乾燥され得る。そのような滅菌容器は、世界中にわたって輸送され得、そして周囲温度で貯蔵され得る。そのような系は、遠隔地および世界の未開地域へと滅菌ワクチンおよび治療用タンパク質を提供するために有用である。使用の時点で、このアンプルは、選択された滅菌溶媒または滅菌緩衝液を用いて再水和され、そして投薬される。このシナリオの下では、最小限の冷凍が必要とされるか、または冷凍は全く必要とされない。
【０１６７】
（タンパク質結晶化）
タンパク質結晶は、水溶液、または有機溶媒を含む水溶液からの制御されたタンパク質結晶化によって発生する。制御され得る溶液の条件としては、例えば、溶媒、有機溶媒のエバポレーション速度、適切な共存溶質および緩衝液の存在、ｐＨならびに温度が挙げられる。タンパク質の結晶化に作用する種々の因子についての包括的な概説は、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１４、第１１２〜２０頁（１９８５）によって公表されている。
【０１６８】
ＭｃＰｈｅｒｓｏｎおよびＧｉｌｌｉｌａｎｄ、Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ、９０、第５１〜５９頁（１９８８）によって、結晶化されたタンパク質および核酸、ならびにそれらが結晶化された条件の、包括的リストが編集されている。結晶および結晶化処方の大要、ならびに解明されたタンパク質構造および核酸構造の座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）の収集所は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｂｎｌ．ｇｏｖ；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２、第５３５〜４２頁（１９７７））によって維持される。これらの参照は、適切なタンパク質結晶の形成に対する前置きとして、タンパク質の結晶化に必要とされる条件を決定するために使用され得、そして他のタンパク質についての結晶化ストラテジーを導き得る。あるいは、多くの場合は、多くのタンパク質について受容可能なレベルの純度が達成され得るという条件で、知的な試行錯誤の研究ストラテジーによって、それらの適切な結晶化条件が作り出され得る（例えば、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊｒ．およびＣ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４、第１２２１９〜２３頁（１９７９）を参照のこと）。
【０１６９】
一般的に、結晶は、結晶化されるべきタンパク質を、適切な水性溶媒または適切な結晶化因子（例えば、塩または有機溶媒）を含有する水性溶媒と組合わせることによって産生される。溶媒は、タンパク質と組合わせられ、そして結晶化の誘導に適切であり、かつタンパク質の活性および安定性の維持のために受容可能であることが実験的に決定された温度での攪拌に供され得る。この溶媒は、必要に応じて、共存溶質（例えば、二価のカチオン、補因子、またはカオトロープ）、ならびにｐＨを制御するための緩衝液種を含み得る。共存溶質の必要性およびそれらの濃度は、結晶化を促進させるために実験的に決定される。
【０１７０】
非晶質沈殿物と結晶性物質との間を識別することが重要である。結晶性物質は、物質の固体状態の形態であり、これは非晶質の固体状態とは異なる。結晶は、格子構造、特徴的形状、および光学的特徴（例えば、屈折率および複屈折）を含む特徴的な特性を示す。結晶は、三次元において周期的に繰り返されるパターンで配置される原子からなる。対照的に、非晶質物質は、物質の非結晶性固体状態であり、時として非晶質沈殿物といわれる。そのような沈殿物は、結晶性固体状態に特徴的な分子格子構造を全く有さず、そして複屈折、または物質の結晶性形態に代表的な他の分光学的特徴を示さない。
【０１７１】
産業的スケールの工程においては、結晶化へと導く制御された沈殿析出は、バッチプロセスにおけるタンパク質、沈殿剤、共存溶質、および必要に応じて緩衝液を単純に組合わせることによって、最良に実施され得る。別の選択肢として、タンパク質は、出発物質としてタンパク質沈殿物を使用することによって結晶化され得る。この場合、タンパク質沈殿物を結晶化溶液に添加し、そして結晶形成までインキュベートする。代替的な研究室での結晶化方法（例えば、透析または拡散蒸着）もまた、採択され得る。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（前出）およびＧｉｌｌｉｌａｎｄ（前出）は、結晶化の文献についてのそれらの概説において、適切な条件の包括的リストを包含する。
【０１７２】
時折、結晶化タンパク質が架橋されるべき場合において、意図される架橋剤と結晶化媒質との間の不適合性は、結晶をより適切な溶媒系に交換することを必要とし得る。
【０１７３】
結晶化条件がすでに記載されている多くのタンパク質が、本発明に従ってタンパク質結晶を調製するために使用され得る。しかし、上記に引用された参考文献の大半において報告された条件は、多くの場合、わずかに大きな、回折の質の結晶（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｒｙｓｔａｌ）を産生するように最適化されていることに留意すべきである。従って、本発明のタンパク質結晶を作製する際に使用される、より少ない結晶の大規模産生のための高収量工程を提供するために、これらの条件を幾分調整することが必要とされ得るということが当業者によって認識される。
【０１７４】
（タンパク質結晶の架橋）
本発明の１つの実施態様によると、例えば、ポリマーキャリア（組成物）からのタンパク質の放出速度は、ゆっくりであり得、そしてクロスリンカー（例えば、生体適合性のクロスリンカーのような）を使用して化学的に架橋したタンパク質結晶の使用により制御され得る。従って、一旦タンパク質結晶が、好適な培地中で増殖されると、クロスリンカーされ得る。
【０１７５】
架橋は、可逆性のクロスリンカー（並行にまたは順に）を使用して実行され得る。得られた架橋タンパク質結晶は、反応性の多機能性（ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーにより特徴付けられる。トリガーは、別の基として取り込まれる。反応性官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）は、タンパク質の反応性アミノ酸側鎖をともに結合させることに関与し、そしてトリガーは、周囲の環境の１つ以上の条件（例えば、ｐＨ、温度、または熱力学的な水の活性）を変化させることにより破壊され得る結合からなる。これは以下のように例示される：
Ｘ−Ｙ−Ｚ  ＋  ２ＡＡ残基  −−＞ＡＡ1−Ｘ−Ｙ−Ｚ−ＡＡ2
環境の変化                  −−＞ＡＡ1−Ｘ  ＋  Ｙ−Ｚ−ＡＡ2
−−ここで、ＸおよびＺは、反応性官能基を有する基であり、
−−ここで、Ｙは、トリガーであり、
−−ここで、ＡＡ1およびＡＡ2は、同じタンパク質上かまたは２つの異なるタンパク質上の反応性アミノ酸残基を示す。架橋剤とタンパク質との間の結合は、共有結合、イオン結合、または水素結合であり得る。周囲の環境の変化は、トリガー結合の切断およびタンパク質の解離を生じる。従って、このような可逆性の架橋剤と架橋したタンパク質結晶内の架橋が切断した場合、タンパク質結晶の解離を生じ、従って、活性を失う。
【０１７６】
あるいは、クロスリンカーのおよびトリガーの反応性官能基は、以下のように同じであり得る：
Ｘ−Ｚ  ＋  ２ＡＡ残基  −−＞ＡＡ1−Ｘ−Ｚ−ＡＡ2
環境の変化              −−＞ＡＡ1  ＋  Ｘ−Ｚ−ＡＡ2。
【０１７７】
クロスリンカーは、同種官能基（Ｘ＝Ｙ）または異種官能基（Ｘは、Ｙと同じではない）であり得る。反応性官能基ＸおよびＹは、以下の官能基であり得るがそれらに限定されない（ここで、Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’”は、アルキル基、アリール基または水素基であり得る）：
Ｉ．反応性アシル供与体は、以下により例示される：カルボキシレートエステルＲＣＯＯＲ’、アミドＲＣＯＮＨＲ’、アシルアジドＲＣＯＮ3、カルボジイミドＲ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’、Ｎ−ヒドロキシイミドエステルＲＣＯ−Ｏ−ＮＲ’、イミドエステルＲ−Ｃ＝ＮＨ２’（ＯＲ’）、無水物ＲＣＯ−Ｏ−ＣＯＲ’、カルボネートＲＯ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’、ウレタンＲＮＨＣＯＮＨＲ’、酸性ハロゲン化物ＲＣＯＨａｌ（ここで、Ｈａｌは、１つのハロゲンである）、アシルヒドラジドＲＣＯＮＮＲ’Ｒ”、Ｏ−アシリスキュアー（ａｃｙｌｉｓｃｕｒｅａ）ＲＣＯ−Ｏ−Ｃ＝ＮＲ’（−ＮＲ”Ｒ’”）。
【０１７８】
ＩＩ．反応性カルボニル基は、以下により例示される：アルデヒドＲＣＨＯ、およびケトンＲＣＯＲ’、アセタールＲＣＯ（Ｈ2）Ｒ’、ケタールＲＲ’ＣＯ2Ｒ’Ｒ”。タンパク質の固定化および架橋の当業者に公知の官能基を含む反応性カルボニルは、以下の文献に記載される［Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９９４）；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９１）］。
【０１７９】
ＩＩＩ．アルキルまたはアリール供与体は、以下により例示される：アルキルハロゲン化物またはアリールハロゲン化物Ｒ−Ｈａｌ、アジドＲ−Ｎ3、硫酸エステルＲＳＯ3Ｒ’、リン酸エステルＲＰＯ（ＯＲ’3）、アルキルオキソニウム塩Ｒ3Ｏ＋、スルホニウムＲ3Ｓ＋、硝酸エステルＲＯＮＯ2、ＭｉｃｈａｅｌアクセプターＲＣＲ’＝ＣＲ’”ＣＯＲ”、フッ化アリールＡｒＦ、イソニトリル
【０１８０】
【化１】
0004965022.tif 000002
ハロアミン（ｈａｌｏａｍｉｎｅ）Ｒ2Ｎ−Ｈａｌ、アルケンおよびアルキン。
【０１８１】
ＩＶ．硫黄含有基は、以下により例示される：ジスルフィドＲＳＳＲ’、スルフヒドリルＲＳＨ、エポキシド
【０１８２】
【化２】
0004965022.tif 000003
Ｖ．塩は以下により例示される；アルキルアンモニウム塩またはアリールアンモニウム塩Ｒ4Ｎ＋、カルボキシレートＲＣＯＯ−、スルフェートＲＯＳＯ3−、ホスフェートＲＯＰＯ3”およびアミンＲ3Ｎ。
【０１８３】
以下の表１は、放出機構により体系付けられるトリガーの例を挙げる。表１において、Ｒ＝は、多機能架橋剤であり、これは、アルキル、アリール、または架橋すべきタンパク質と反応し得る活性基を有する他の鎖であり得る。これらの反応基は、任意の種々の基（例えば、求核置換、フリーラジカル置換、または求電子置換に感受性の基（特に、ハロゲン化物、アルデヒド、カルボネート、ウレタン、キサンタン、エポキシドを含む））であり得る。
【０１８４】
【表１】
0004965022.tif 000004
可逆性クロスリンカーのさらなる例は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（編）（１９８１）に記載される。可逆性保護基に使用するための任意の種々のストラテジーは、可逆性の制御された可溶化が可能な、架橋されたタンパク質結晶の生成に好適なクロスリンカー中に導入され得る。種々のアプローチが、この主題のＷａｌｄｍａｎｎの総説（Ａｎｇｅｗａｎｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５、２０５６頁（１９９６））に列挙される。
【０１８５】
可逆性クロスリンカーの他の型は、ジスフィルド結合含有クロスリンカーである。このようなクロスリンカーにより形成されたトリガー破損架橋は、還元剤（例えば、システイン）の架橋したタンパク質結晶環境への添加である。
【０１８６】
ジスフィルドクロスリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９４−１９９５）に記載され、そしてより最近には、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによる「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、（１９９６）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、５２５  Ｂ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｓｕｉｔｅ  １９９０、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１０１−４４９５に記載される。
このようなクロスリンカーの例は、以下を含む：
（同種二官能性（対称性））
（ＤＳＳ）−  ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、Ｌｏｍａｎｔ剤としても知られる
（ＤＴＳＳＰ）−３−３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、ＤＳＰの水溶性版
（ＤＴＢＰ）−  ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・ＨＣｌ。
（ＢＡＳＥＤ）−  ビス−（β−［４−アジドサリチルアミノ］エチル）ジスルフィド
（ＤＰＤＰＢ）−  １，４−ジ−（３’−［２’−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ブタン
（異種二官能性（非対称性））
（ＳＰＤＰ）−  Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（ＬＣ−ＳＰＤＰ）−  スクシンイミジル−６−（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）ヘキサノエート
（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）−  スルホスクシンイミジル−６−（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）ヘキサノエート、ＬＣ−ＳＰＤＰの水溶性版
（ＡＰＤＰ）−  Ｎ−（４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチル）−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド
（ＳＡＤＰ）−  Ｎ−スクシンイミジル（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート
（スルホ−ＳＡＤＰ）−  スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート、ＳＡＤＰの水溶性版
（ＳＡＥＤ）−  スルホスクシンイミジル−２−（７−アジド−４−メチルクマリン（ｍｅｔｈｙｃｏｕｍａｒｉｎ）−３−アセトアミド）エチル−１，３’ジチオプロピオネート
（ＳＡＮＤ）−  スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート
（ＳＡＳＤ）−  スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート
（ＳＭＰＲ）−  スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート
（スルホ−ＳＭＰＲ）−  スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート
（ＳＭＰＴ）−  ４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン
（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）−  スルホスクシンイミジル−６−（α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルアミド）ヘキサノエート。
【０１８７】
詳細には、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、（１９９６）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、５２５  Ｂ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｓｕｉｔｅ  １９００、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１０１−４４９５による「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」の、Ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ、Ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓのＩＩ部、３−５章を参照のこと。
【０１８８】
本発明のタンパク質の形成に有用な架橋タンパク質結晶はまた、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５４１５に示される方法に従って調製され得る。
【０１８９】
（ポリマーキャリアにおけるタンパク質結晶のカプセル化）
本発明の１つの実施態様によると、組成物は、タンパク質結晶が少なくとも１つのポリマーキャリアにおいて、カプセル化によりマイクロスフェア形態になるように、ポリマーキャリアのマトリックスとともにカプセル化される場合、それらのネイティブな三次構造および生物学的に活性な三次構造を保存するように生成される。結晶は、異なる生物学的環境への送達または特定の機能に効果を及ぼすために好適な独特の特性を有する、種々の生体適合性および／または生分解性ポリマーを使用してカプセル化され得る。従って、活性なタンパク質の溶解速度および送達速度は、特定のカプセル化技術、ポリマー組成物、ポリマー架橋、ポリマーの厚さ、ポリマー溶解度、タンパク質結晶の相対位置および程度、ならびにもしあれば、タンパク質結晶架橋の相対位置および程度により決定される。
【０１９０】
カプセル化されるタンパク質の結晶または処方物は、有機溶媒に溶解したポリマーキャリアに懸濁される。ポリマー溶液は、溶液に添加された後、タンパク質の結晶または処方物を完全に被膜するに十分な濃度に濃縮されなければならない。このような量は、約０．０２と約２０との間、好ましくは、約０．１と約２との間のポリマーに対するタンパク質結晶の重量比を提供する量である。タンパク質結晶は、約０．５分と約３０分の間、好ましくは約１分と約３分との間の時間の間、溶液中のポリマーと接触される。結晶は、懸濁されたままであるべきであるべきであり、そしてポリマーと接触させることにより結晶は被膜されるので、凝集し得ない。
【０１９１】
その接触後、結晶は被膜され、そして新生マイクロスフェアと呼ばれる。新生マイクロスフェアは、被膜化が起こっている間大きさが増加する。本発明の好ましい実施態様において、ポリマーキャリアおよび有機溶媒とともに懸濁された被膜化結晶または新生ミクロスエフェアは、乳化剤として公知の界面活性剤を含む大量の水溶液に移される。この水溶液において、懸濁された新生マイクロスフェアは、水相に浸漬され、ここで、有機溶媒は、エバポレートするか、またはポリマーから拡散させる。最終的に、ポリマーは、もはや可溶性ではなく、そしてタンパク質結晶または処方物をカプセル化して組成物を形成した沈殿相を形成する点に達する。このプロセスのこの局面は、ポリマーキャリアまたはポリマーの硬化といわれる。乳化剤は、硬化相プロセスの間の系での物質の種々の相間の界面の表面張力を低減するのを助ける。あるいは、被膜ポリマーが、いくらかの固有の界面活性を有する場合、別の界面活性剤を添加する必要はない。
【０１９２】
カプセル化タンパク質結晶を本発明に従って調製するために有用な乳化剤としては、ポリマー被覆タンパク質結晶もしくはポリマー被覆結晶処方物と溶液との間の表面張力を減少し得る、本明細書に例示されるようなポリ（ビニルアルコール）、界面活性剤および他の表面活性剤が挙げられる。
【０１９３】
本発明のマイクロスフェアを調製するために有用な有機溶媒としては、塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルムおよび他の非毒性溶媒が挙げられ、これらはポリマーの特性に依存する。ポリマーを溶解しそして究極的には非毒性である溶媒が、選択されるべきである。
【０１９４】
本発明の好ましい実施態様は、タンパク質結晶の結晶性が、カプセル化過程の間維持されることである。結晶性は、被覆過程の間、有機溶媒を使用して維持される（ここにおいては、結晶は可溶性ではない）。続いて、一旦被覆された結晶が水性溶媒に移されると、先の工程でのポリマーキャリアの迅速な硬化および結晶の十分な被覆が、溶解から結晶性材料を保護する。他の実施態様において、架橋されたタンパク質結晶の使用は、水性溶媒および有機溶媒の両方において、結晶性の維持を容易にする。
【０１９５】
タンパク質結晶を被覆するために、ポリマーキャリアとして使用されるポリマーは、ホモポリマーまたはコポリマーのいずれかであり得る。マイクロスフェアの加水分解速度は、大部分は、個々のポリマー種の加水分解速度によって決定される。一般的に、加水分解速度は、以下のように減少する：ポリカーボネート＞ポリエステル＞ポリウレタン＞ポリオルトエステル＞ポリアミド。生分解性ポリマーおよび生体適合性ポリマーの総説については、Ｗ．Ｒ．ＧｏｍｂｏｔｚおよびＤ．Ｋ．Ｐｅｔｔｉｔ、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６巻、３３２〜３５１頁（１９９５）を参照のこと。
【０１９６】
好ましい実施態様において、ポリマーキャリアは、ＰＬＧＡのような単一のポリマー型からなる。次の好ましい実施態様において、ポリマーキャリアは、５０％  ＰＬＧＡおよび５０％アルブミンのようなポリマーの混合物であり得る。
【０１９７】
本発明に従うカプセル化タンパク質結晶を調製するための、ポリマーキャリアとして有用な他のポリマーは、以下からなる群から選択される、生体適合性／生分解性ポリマーを含む：ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）（例えば、ポリ（乳酸）もしくはＰＬＡ）、ポリ（ｂ−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン（ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸アルキルビニルエーテルコポリマー、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、アルブミン、アルギン酸、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴサッカリド、グリカミノグリカン（ｇｌｙｃａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、硫酸化ポリサッカリド、それらの混合物ならびにコポリマー。他の有用なポリマーは、Ｊ．ＨｅｌｌｅｒおよびＲ．Ｗ．Ｂａｌａｒ、「Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、（１９８０）；Ｋ．Ｃ．Ｒ．ＬｅｈｍａｎおよびＤ．Ｋ．Ｄｒｅｈｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第３巻、５−  頁（１９７９）；Ｅ．Ｍ．Ｒａｍａｄａｎ，Ａ．Ｅｌ−ＨｅｌｗおよびＹ．Ｅｌ−Ｓａｉｄ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｉｏｎ、第５巻、１２５頁（１９８８）に記載される。好ましいポリマーは、使用されるタンパク質結晶の特定のタンパク質成分、およびカプセル化結晶（処方物および組成物）の意図される使用に依存する。あるいは、タンパク質結晶をカプセル化するために、溶媒エバポレーション技術が使用され得る（Ｄ．Ｂａｂａｙ，Ａ．ＨｏｆｆｍａｎｎおよびＳ．Ｂｅｎｉｔａ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  第９巻、４８２−４８８頁（１９８８）を参照のこと）。
【０１９８】
本発明の好ましい実施態様において、タンパク質結晶は、二重エマルジョン法（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（本明細書中に例証される）を使用して、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸のようなポリマーを用いて、少なくとも１つのポリマーキャリア中にカプセル化される。本発明の最も好ましい実施態様において、ポリマーは、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（「ＰＬＧＡ」）である。ＰＬＧＡは、乳酸（「Ｌ」）とグリコール酸（「Ｇ」）とでの重縮合反応により調製されるコポリマーである。ＰＬＧＡポリマーの結晶性および疎水性を調節するために、種々の割合のＬおよびＧが使用され得る。ポリマーのより高度な結晶性は、結果としてより緩徐な溶解をもたらす。２０〜７０％のＧ含有量を有するＰＬＧＡポリマーは、非結晶性固体である傾向があるが、ＧまたはＬいずれかの高いレベルは、優れたポリマー結晶性をもたらす。ＰＬＧＡの調製についてのさらなる情報は、Ｄ．Ｋ．ＧｉｌｄｉｎｇおよびＡ．Ｍ．Ｒｅｅｄ、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｓｕｒｇｅｒｙ−ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｏｌｉｃ）／ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）  ｈｏｍｏ  ａｎｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：１」Ｐｏｌｙｍｅｒ  第２０巻、１４５９−１４６４頁（１９８１）を参照のこと。ＰＬＧＡは、水への曝露後、エステル結合の加水分解により分解されて、非毒性の乳酸およびグリコール酸のモノマーを生成する。
【０１９９】
別の実施態様において、二重層（ｄｏｕｂｌｅ−ｗａｌｌｅｄ）ポリマー被覆されたマイクロスフェアは、有益であり得る。二重層ポリマー被覆されたマイクロスフェアは、２つの別々のポリマー溶液を、塩化メチレンまたはポリマーを溶解し得る他の溶媒中に調製することによって生成され得る。タンパク質結晶をこの溶液の一方に添加し、そして分散させる。ここで、このタンパク質結晶は、第１のポリマーで被覆される。次いで、この第１のポリマーで被覆されたタンパク質結晶を含む溶液を、第２のポリマー溶液と混合する。（Ｐｅｋａｒｅｋ，Ｋ．Ｊ．；Ｊａｃｏｂ，Ｊ．Ｓ．およびＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ，Ｅ．  Ｄｏｕｂｌｅ−ｗａｌｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３６７，２５８−２６０を参照のこと）。今度は、第２のポリマーが、タンパク質結晶をカプセル化している第１のポリマーをカプセル化する。理想的には、次いで、この溶液を、表面活性剤もしくは乳化剤を含む、より大きな容積の水溶液中に滴下する。水溶液において、この溶媒は、２つのポリマー溶液からエバポレートされそしてポリマーを沈殿させる。
【０２００】
上記の工程は、タンパク質結晶、ＤＮＡ結晶またはＲＮＡ結晶のいずれかをこれらのいずれかの処方物中から使用して行われ、組成物を生成し得る。
【０２０１】
本発明に従う処方物は、タンパク質結晶および少なくとも１つの成分を含む。このような処方物は、５０℃で貯蔵された場合、５０℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも、少なくとも６０倍のより長い有効期限によって特徴付けられる（Ｔ1/2によって測定した場合）。あるいは、このような処方物は、４０℃および７５％の湿度で貯蔵された場合、４０℃および７５％の湿度で貯蔵されたこのタンパク質結晶の非処方物形態よりも、少なくとも５９倍のより長い有効期限によって特徴付けられる（Ｔ1/2によって測定した場合）。あるいは、このような処方物は、５０℃で貯蔵された場合、５０℃で貯蔵されたこのタンパク質結晶の非処方物形態よりも、少なくとも６０％のより長い有効期限によって特徴付けられる（Ｔ1/2によって測定した場合）。あるいは、このような処方物は、５０℃で４日間貯蔵された後のタンパク質のα−へリックス構造含有量の２０％未満の損失によって特徴付けられ、ここで、このタンパク質の可溶性形態は、５０℃で６時間貯蔵された後に、このタンパク質のα−へリックス構造含有量を５０％を超えて損失する（ＦＴＩＲによって測定した場合）。あるいは、このような処方物は、５０℃で４日間貯蔵された後のこのタンパク質のα−へリックス構造含有量の２０％未満の損失によって特徴付けれら、ここで、このタンパク質の可溶性形態は、５０℃で６時間貯蔵された後に、このタンパク質のα−へリックス構造含有量を５０％を超えて損失し（ＦＴＩＲによって測定した場合）、そしてここで、このような処方物は、５０℃で貯蔵される場合に、５０℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも、少なくとも６０倍のより長い有効期限によって特徴付けられる（Ｔ1/2によって測定した場合）。
【０２０２】
本発明に従う組成物は、上記のタンパク質結晶処方物のうちの１つ、および少なくとも１つのポリマーキャリアを含み、ここで、この処方物は、このポリマーキャリアのマトリックス中にカプセル化されている。
【０２０３】
あるいは、本発明に従う組成物は、タンパク質結晶および少なくとも１つの成分の処方物を含む。このような組成物は、５０℃で貯蔵された場合、５０℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも、少なくとも６０倍のより長い有効期限によって特徴付けられ得る（Ｔ1/2によって測定した場合）。あるいは、このような組成物は、４０℃および７５％の湿度で貯蔵された場合、４０℃および７５％の湿度で貯蔵されたこのタンパク質結晶の非処方物形態よりも、少なくとも５９倍のより長い有効期限によって特徴付けられる（Ｔ1/2によって測定した場合）。あるいは、このような組成物は、５０℃で貯蔵された場合、５０℃で貯蔵されたこのタンパク質結晶の非処方物形態よりも、少なくとも６０％のより長い有効期限によって特徴付けられる（Ｔ1/2によって測定した場合）。あるいは、このような組成物は、５０℃で４日間貯蔵された後のタンパク質のα−へリックス構造含有量の２０％未満の損失によって特徴付けられ、ここで、このタンパク質の可溶性形態は、５０℃で６時間貯蔵された後に、このタンパク質のα−へリックス構造含有量を５０％を超えて損失する（ＦＴＩＲによって測定した場合）。あるいは、このような組成物は、５０℃で４日間貯蔵された後のこのタンパク質のα−へリックス構造含有量の２０％未満の損失によって特徴付けれら、ここで、このタンパク質の可溶性形態は、５０℃で６時間貯蔵された後に、このタンパク質のα−へリックス構造含有量を５０％を超えて損失し（ＦＴＩＲによって測定した場合）、そしてここで、この処方物は、５０℃で貯蔵される場合に、５０℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも、少なくとも６０倍のより長い有効期限によって特徴付けられる（Ｔ1/2によって測定した場合）。
【０２０４】
本発明がより理解され得るように、以下に実施例を示す。これらの実施例は、例示のみの目的のためであり、いかなる様式によっても本発明の範囲を限定するように解釈され得ない。
【０２０５】
（実施例）
（実施例１  リパーゼ）
（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａのリパーゼの結晶化）
材料：
Ａ−Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａのリパーゼの粉末
Ｂ−セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）粉末（珪藻土）
Ｃ−ＭＰＤ（２−メチル−２，４−ペンタジオール）
Ｄ−５ｍＭ  Ｃａアセテート緩衝液ｐＨ４．６
Ｅ−脱イオン水。
【０２０６】
（手順）
１ｋｇのリパーゼの粉末のアリコートを１ｋｇのセライトとよく混合し、次いで、２２Ｌの蒸留水を加えた。この混合物を攪拌してリパーゼの粉末を溶解させた。溶解が完了した後、酢酸を使用してｐＨを４．８に調整した。次に、この溶液を濾過して、セライトおよび溶解していない物質を除去した。次いで、この濾過物を３０Ｋカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）中空繊維を使用してポンピング（ｐｕｍｐｉｎｇ）し、３０ｋＤ未満の分子量のタンパク質を全て除いた。蒸留水を加え、そしてリパーゼ濾過物を、残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の伝導率が蒸留水の伝導率と等しくなるまで中空繊維によりポンピングした。この時点で、蒸留水の添加を止め、そして５ｍＭのＣａ−アセテート緩衝液を加えた。次に、Ｃａ−アセテート緩衝液を、残留物の伝導率がＣａ−アセテート緩衝液の伝導率と等しくなるまで中空繊維によるポンピングにより送達した。その時点で、緩衝液の添加を止めた。このリパーゼ溶液を、３０ｍｇ／ｍｌ溶液にまで濃縮した。この結晶化を、ＭＰＤを攪拌しながらこのリパーゼ溶液に緩やかにポンピングすることによって開始させた。ＭＰＤが２０％容積／容積に達するまで、ＭＰＤの添加を続けた。この混合液を２４時間またはタンパク質の９０％が結晶化するまで攪拌した。得られた結晶を結晶化緩衝液で洗浄して、この結晶から可溶性物質を全て除去した。次いで、この結晶を新鮮な結晶化緩衝液中に懸濁して、４２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を達成した。
【０２０７】
（実施例２）
（賦形剤としてショ糖を使用するリパーゼ結晶の処方）
リパーゼ結晶の乾燥工程および貯蔵の間の安定性を増強するために、この結晶を賦形剤と共に処方した。この実施例において、リパーゼ結晶は、乾燥工程の前に、母液の存在下でスラリー形態で処方された。ショ糖（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、母液中のリパーゼ結晶に賦形剤として加えた。十分なショ糖を、母液（１０ｍＭ塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．８）中２０ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度のリパーゼ結晶に、最終濃度が１０％に達するまで加えた。得られた懸濁物を室温で３時間反転させた。ショ糖での処置の後、この結晶を、この液体から、遠心分離（実施例６、方法４または５に記載される）により分離した。
【０２０８】
（実施例３）
（トレハロースを賦形剤として使用するリパーゼ結晶の処方）
リパーゼ結晶を、実施例２において、スクロースの代わりにトレハロース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加することにより処方し、母液中の最終濃度１０％にした。得られた懸濁物を、室温で３時間転倒混和（ｔｕｍｂｌｅ）し、そしてその結晶を、実施例６の方法４または５に記載のように、遠心分離により液体から分離した。
【０２０９】
（実施例４）
ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を賦形剤として使用するリパーゼ結晶の処方）
リパーゼ結晶を、以下のように水中０．１％のポリエチレンオキシドを使用して処方した。この結晶（母液中２０ｍｇ／ｍｌ）を、スイングバケットローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ卓上遠心機において１０００ｒｐｍの遠心分離により母液から分離した。次いで、この結晶を、０．１％ポリエチレンオキシド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で３時間懸濁し、次いで、実施例６の方法４または５に記載のように、遠心分離により分離した。
【０２１０】
（実施例５）
（メトキシポリエチレングリコール（ＭＯＰＥＧ）を賦形剤として使用するリパーゼ結晶の処方）
リパーゼ結晶を、実施例２にように、スクロースの代わりに母液中１０％のメトキシポリエチレングリコール（最終濃度）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、そして実施例６の方法４または５のように、３時間後に遠心分離により分離することにより処方した。
【０２１１】
（実施例６）
（結晶処方物を乾燥する方法）
（方法１．室温でのＮ2ガス乾燥）
実施例１、１０、１４、および２１のように調製した結晶を、スイングバケットローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ卓上遠心機において１０００ｒｐｍの遠心分離により、５０ｍｌ  ＦｉｓｃｈｅｒブランドＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ遠心管（ポリプロピレン）中で、賦形剤を含む母液から分離した。次いで、この結晶を、約１０ｐｓｉ圧の窒素の気流をこの管に一晩通すことによって乾燥した。
【０２１２】
（方法２．真空オーブン乾燥）
実施例１、１０、１４、および２１のように調製した結晶を、まず、スイングバケットローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ卓上遠心機において１０００ｒｐｍの遠心分離を使用して、５０ｍｌ  ＦｉｓｃｈｅｒブランドＤｉｓｐｏｓａｂｌｅポリプロピレン遠心管中で、母液／賦形剤溶液から分離した。次いで、湿った結晶を、室温にて２５  ｉｎ  Ｈｇで真空オーブン（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中に配置し、そして少なくとも１２時間乾燥した。
【０２１３】
（方法３．凍結乾燥）
実施例１、１０、１４、および２１のように調製した結晶を、まず、スイングバケットローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ卓上遠心機において１０００ｒｐｍの遠心分離を使用して、５０ｍｌ  ＦｉｓｃｈｅｒブランドＤｉｓｐｏｓａｂｌｅポリプロピレン遠心管中で、母液／賦形剤溶液から分離した。次いで、この湿った結晶を、Ｖｉｒｔｉｓ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ２４を使用して、半分閉めたバイアル中で凍結乾燥した。貯蔵温度（ｓｈｅｌｆ  ｔｅｍｐｅｒｔｕｒｅ）を、凍結工程の間ゆっくりと−４０℃へと低減した。この温度を１６時間保った。次いで、２次乾燥を、さらに８時間実行した。
【０２１４】
（方法４．有機溶媒および風乾）
実施例１、１０、１４、および２１のように調製した結晶を、まず、スイングバケットローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ卓上遠心機において１０００ｒｐｍの遠心分離を使用して、５０ｍｌ  ＦｉｓｃｈｅｒブランドＤｉｓｐｏｓａｂｌｅポリプロピレン遠心管中で、母液／賦形剤溶液から分離した。次いで、この結晶を、有機溶媒（エタノールまたはイソプロパノールまたは酢酸エチルあるいは他の適切な溶媒のような）中に懸濁し、遠心分離し、その上清をデカントし、そして換気フード中で２日間室温で風乾した。
【０２１５】
（方法５．室温での風乾）
実施例１、１０、１４、および２１のように調製した結晶を、スイングバケットローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ卓上遠心機において１０００ｒｐｍの遠心分離により、５０ｍｌ  ＦｉｓｃｈｅｒブランドＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ遠心管（ポリプロピレン）中で、賦形剤を含む母液から分離した。続いて、結晶を、換気フード中で２日間風乾させた。
【０２１６】
（実施例７）
（可溶性リパーゼサンプル調製）
比較のために、可溶性リパーゼのサンプルを、リパーゼ結晶をリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）に、２０ｍｇ／ｍｌに溶解することにより調製した。
【０２１７】
図２は、可溶性リパーゼについての安定性を示す。比活性は、時間とともに非常に迅速に減少する。２〜３時間以内、比活性は、約６６０マイクロモル／分／ｍｇタンパク質から約１００マイクロモル／分／ｍｇタンパク質に減少する（すなわち約８５％減少）。可溶性リパーゼについてのＴ1/2を算出すると１．１２時間であった。
【０２１８】
（実施例８）
（リパーゼ活性を測定するためのオリーブオイルアッセイ）
実施例１〜７からのリパーゼ結晶を、ｐＨ７．７緩衝液中のオリーブオイルに対する活性について評価した。このアッセイを、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ−Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｒ．ＲｕｙｓｓｅｎおよびＡ．Ｌａｕｗｅｒｓ（編）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ（１９７８）に記載される手順に対するわずかな改変形を使用して、滴定により実行した。
【０２１９】
（試薬）
１．オリーブオイルエマルジョン：
アラビアゴム（Ｓｉｇｍａ）１６．５ｇを、水１８０ｍｌ、オリーブオイル（Ｓｉｇｍａ）２０ｍｌに溶解し、そしてＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐミキサーを３分間使用して乳化した
２．滴定液：０．０５Ｍ  ＮａＯＨ
３．溶液Ａ：３．０Ｍ  ＮａＣｌ
４．溶液Ｂ：７５ｍＭ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ
５．混合物：溶液Ａ４０ｍｌを、溶液Ｂ２０ｍｌおよび水１００ｍｌと混合した
６．０．５％アルブミン：
７．リパーゼ基質溶液（溶液７）を、オリーブオイルエマルジョン（溶液１）５０ｍｌを混合物（溶液５）４０ｍｌおよび０．５％アルブミン（溶液６）１０ｍｌに添加することにより調製した。
【０２２０】
（アッセイ手順）
リパーセ基質溶液（溶液７）を、水浴中で３７℃に温めた。まず、基質２０ｍｌを、反応容器に加え、そしてそのｐＨを、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ（溶液２）を使用して７．７に調整し、そしてかき混ぜながら３７℃に平衡化した。反応を、酵素を添加することにより開始した。反応の進行を、酵素と基質の混合物を０．０５Ｍ  ＮａＯＨで滴定することによりそのｐＨを７．７に維持しながら、モニターした。
【０２２１】
比活性（マイクロモル／分／ｍｇタンパク質）は、（初速×１０００×滴定液の濃度）／（酵素の量）に等しかった。ゼロ点は、酵素を伴わない反応を実行すること（すなわち、反応混合物中で酵素の代わりに緩衝液を使用すること）により決定した。
【０２２２】
（実施例９）
（活性）
実施例１〜５からの乾燥結晶の貯蔵活性を、実施例８に記載のようなオリーブオイルアッセイを使用して測定した。乾燥結晶（５ｍｇ）を、リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）（ｐＨ７．４）１ｍｌに溶解し、そしてその活性を、オリーブオイルを基質として使用して測定した。
【０２２３】
（貯蔵安定性（ｓｈｅｌｆ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ））
実施例２〜５からの乾燥結晶リパーゼ処方物の貯蔵安定性を、相対湿度７５％および温度４０℃に制御された湿潤チャンバー（ＨＯＴＰＡＣＫ）中で実行した。この結晶の活性を、乾燥サンプル５ｍｇをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、オリーブオイルアッセイにおける活性を測定し、次いで最初の結果と比較することにより測定した。
【０２２４】
（方法５により乾燥した結晶処方物）
図３は、スクロース、トレハロース、およびＰＥＯを用いて処方されたリパーゼ結晶の貯蔵安定性プロフィールを示す。方法５により乾燥した場合、ＰＥＯが最も保護的な賦形剤であり、次にスクロース次いでトレハロースであった。
【０２２５】
（方法４により乾燥した結晶処方物）
図４は、スクロース、トレハロース、ＰＥＯ、およびＭＯＰＥＧを用いて処方されたリパーゼ結晶の貯蔵安定性プロフィールを示す。方法４により乾燥した場合、賦形剤ＰＥＯ、スクロースおよびＭＯＰＥＧは、Ｔ1/2に対するそれらの効果により測定した場合に、酵素活性を保存するそれらの能力は同様であった。トレハロースは、他の賦形剤よりもリパーゼ活性の保護が劣った。
【０２２６】
（貯蔵安定性）
酵素の比活性が５０％減少するのに要する時間は、Ｔ1/2として既知である。表２は、乾燥リパーゼ結晶の処方物についての比活性のＴ1/2に対する効果を示す。リパーゼについて、スクロースが最も保護的な賦形剤であり、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、メトキシポリエチレングリコール（ＭＯＰＥＧ）、そして最後にトレハロースと続いた。スクロースは、比活性のＴ1/2に対するその効果により測定した場合は、１０倍を超えてより保護的であった。
【０２２７】
【表２】
0004965022.tif 000005
Ｔ1/2を、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔプログラムを使用する非線形回帰分析により有効期限データから算出した。表２は、リパーゼ処方物が、ＰＥＯを賦形剤として使用した場合に可溶性よりも１，９２３倍安定であったことを示す。さらに、リパーゼ処方物は、スクロースを賦形剤として使用した場合に、可溶性リパーゼよりも２３，３００倍安定であった（表２）。ＭＯＰＥＧおよびＰＥＯを賦形剤として使用したリパーゼ結晶の処方物は、可溶性リパーゼよりも９，２７０倍および１７，８００倍安定であった（表２）。
【０２２８】
表２に示されるように、非処方結晶と比較して、処方された結晶の安定性は大きく増強されていた。表２に示されるように、例えば、トレハロースを用いて処方された結晶は、賦形剤を用いずに生成された非処方リパーゼ結晶よりも４０℃で５９倍安定であった。同様に、表２に示されるように、ＭＯＰＥＧを用いて処方された結晶は、非処方結晶よりも２８６倍安定であり、そしてＰＥＯを用いて処方された結晶は、賦形剤を用いずに生成された非処方リパーゼ結晶よりも４０℃で５４９倍安定であった。最後に、表２に示されるように、スクロースを用いて処方された結晶は、賦形剤を用いずに生成された非処方リパーゼ結晶よりも４０℃で７１８倍安定であった。
【０２２９】
（水分含量）
水分含量を、ＶＡ−０６  Ｖａｐｏｒｉｚｅｒを装備するＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＣＡ−０６  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｍｅｔｅｒ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、製造業者の指示に従って、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ法によって決定した。
【０２３０】
【表３】
0004965022.tif 000006
（結晶化度）
処方物の結晶強度を、定量的顕微鏡観察によって測定した。結晶が、乾燥後にその形状を維持するか否かを可視化するために、乾燥した結晶を、Ｉｍａｇｅ  ＰｒｏＰｌｕｓソフトウェアとともにＣａｍｅｒａ  ＡｄａｐｔｅｒとＤＸＣ−９７０ＭＤ  ３ＣＣＤ  Ｃｏｌｏｒ  Ｖｉｄｅｏ  Ｃａｍｅｒａを装着したＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０顕微鏡の下で検査した。乾燥させた結晶のサンプルを、ガラスカバーストリップで覆い、取り付け、そしてＯｌｙｍｐｕｓ  ＵＰＬＡＮ  Ｆ１対物レンズ  １０×／０．３０  ＰＨ１を備えたＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡（位相差）使用して、１０倍の拡大率で検査した。
【０２３１】
この分析において、スクロース、トレハロース、ＰＥＯおよびＭＯＰＥＧでもともと処方された結晶は、４０℃および７５％湿度にて１２９日後に容易に可視化された。図５は、ＰＥＯで処方された結晶が、最初の時点で存在したことを示す。１２９日後に得られそして図６に示した類似の顕微鏡観察は、結晶化度が、期間全体にわたって維持されたことを実証する。類似のデータを、スクロース、ＭＯＰＥＧおよびトレハロースで処方した結晶について得た（データは示さず）。
【０２３２】
（ＦＴＩＲによる二次構造の特徴づけ）
フーリエ変換赤外分光法（「ＦＴＩＲ」）スペクトルを、Ｄｏｎｇらに記載されるように、Ｎｉｃｏｌｅｔモデル５５０Ｍａｇｎａシリーズ分光計で収集した（Ｄｏｎｇ，Ａ．，Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｂ．，Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｗ．Ｓ．，Ｂｈａｔ，Ｋ．Ｓ．およびＣｏｅ，Ｊ．Ｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２；３１：９３６４−９３７０；Ｄｏｎｇ，Ａ．Ｐｒｅｓｔｒｅｌｓｋｉ，Ｓ．Ｊ．，Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．およびＣａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９５；８４；４１５−４２４）。固体サンプルについて、１〜２ｍｇのタンパク質を、３５０ｍｇのＫＢｒ粉末で軽く施し、そして乱反射部品を用いて小さなカップを満たした。スペクトルを収集し、次いで、第２の誘導体を用いる二次構造の個々の成分の相対領域の決定のためのＧａｌａｃｔｉｃソフトウェアからのＧｒａｍｓ  ３２、およびアミドＩ領域（１６００〜１７００ｃｍ-1）の下でカーブフィッティングプログラムを用いて、処理した。
【０２３３】
比較のために、可溶性リパーゼサンプルを、リン酸緩衝化生理食塩水中にリパーゼ結晶を溶解することによって調製し、そして安定性についてＦＴＩＲによって分析した。
【０２３４】
二次構造を、以下のように決定した：ＦＴＩＲスペクトルを、Ｎｉｃｏｌｅｔモデル５５０  Ｍａｇｎａシリーズ分光計で収集した。可溶性リパーゼの１ｍｌのサンプルを、ＡＲＫ  ＥＳＰのセレン化亜鉛結晶上に置いた。スペクトルを、最初の時点（０）およびほとんどの活性が損失したまたはほぼ０の活性になった後に収集した。次いで、獲得したデータを、第２の誘導体を用いる二次構造の個々の成分の相対領域の決定のためのＧａｌａｃｔｉｃソフトウェアからのＧｒａｍｓ  ３２ソフトウェア、およびアミドＩ領域（１６００〜１７００ｃｍ-1）の下でカーブフィッティングプログラムを用いて、処理した。
【０２３５】
【表４】
0004965022.tif 000007
（結論）
表４は、可溶性リパーゼについて、約５０％および７５％のα−ヘリックスおよびβ−シート構造含量が、３日間にわたって損失したことを示す。ランダム構造の含量において対応する増加が存在した。
【０２３６】
対照的に、図４は、処方し乾燥した結晶が、可溶性酵素より非常に安定であることを示す。このような結晶は、４０℃および７５％湿度にて６６日後に、６．１％〜２１．１％の範囲のα−ヘリックス構造の損失を示した。この時点で、溶液中ランダムコイルは、３日間にわたって７〜５０％増加し、一方、結晶化度は、６６日後でさえ最小のランダムコイル含量を示した。
【０２３７】
ＦＴＩＲを用いて二次構造における変化をモニタリングすることで得られた表４のデータは、図４に示す活性データと相関した。詳細には、スクロース、ＰＥＯおよびＭＯＰＥＧで処方されたリパーゼは、トレハロースで処方した結晶（２１％のα−ヘリックス構造の損失を示し、そして最も低い活性プロフィールを有した）よりも、α−ヘリックス構造の有意により少ない損失を示し、かつ上昇した温度および湿度にて６６日間にわたって、より高い比活性を維持した。
【０２３８】
（実施例１０：ヒト血清アルブミン）
（ヒト血清アルブミンの結晶化）
１０グラムの粉末化したヒト血清アルブミンを、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）（４℃）の７５ｍｌの攪拌した溶液に添加した。最終タンパク質濃度は１２０ｍｇ／ｍｌであった（溶液のＯＤ280値から推定した）。最初に、硫酸アンモニウム溶液（７６７ｇ／ｌ）（脱イオン水で調製した）を、最終濃度が３５０ｇ／ｌまたは５０％飽和まで、このタンパク質溶液に添加した。次に、結晶化溶液を、５０％硫酸アンモニウム（ｐＨ５．５）中の５０ｍｇ／ｍｌアルブミン結晶１ｍｌを用いて「播種（ｓｅｅｄ）」した。種結晶（ｓｅｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌ）を、１００ｍＭリン酸緩衝液中５０％飽和の硫酸アンモニウム（ｐＨ５．５）の溶液との沈殿物を含まない結晶のサンプルを洗浄することによって調製した。播種した結晶化溶液を、４℃にて一晩、強力に回転するプラットフォーム上でインキュベートした。棒（ｒｏｄ）の形状の結晶（２０μｍ）は、約１６時間後の一晩の溶液中に出現した。
【０２３９】
（実施例１１）
（賦形剤としてゼラチンを用いるＨＳＡ結晶の処方）
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結晶の乾燥および保存の間の安定性を増強するために、この結晶を賦形剤とともに処方した。この実施例において、ＨＳＡ結晶を、乾燥前の母液の存在下でスラリー形態で処方した。ゼラチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、賦形剤としての母液中のリパーゼ結晶に添加した。十分なゼラチンを、母液（１００ｍＭリン酸緩衝液中２．５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ５．５））中のリパーゼ結晶に、タンパク質濃度２０ｍｇｓ／ｍｌにて、１０％の最終濃度に達するまで、添加した。得られた懸濁物を、室温にて３時間回転させた。ゼラチンでの処理の後、結晶を、実施例６の方法１に記載の遠心分離によって液体から分離した。
【０２４０】
（ＨＳＡ結晶の乾燥）
次いで、ＨＳＡ結晶を実施例６に記載の４つの方法によって乾燥させた。この結晶を、方法４の有機溶媒として冷エタノール（４℃）中に懸濁させた。
【０２４１】
（実施例１２）
（可溶性ヒト血清アルブミン調製）
比較のために、可溶性ＨＳＡサンプルを、水中２０ｍｇ／ｍｌでＨＳＡを溶解させることによって調製した。
【０２４２】
（実施例１３）
（貯蔵安定性（ｓｈｅｌｆ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ））
ＨＳＡの乾燥した結晶処方物の貯蔵安定性を、５０℃の温度の水浴中で行った。この結晶の安定性を、ＦＴＩＲ分析により以下の構造崩壊によってモニタリングした。
【０２４３】
（水分含量）
水分含量を、ＶＡ−０６  Ｖａｐｏｒｉｚｅｒを装備するＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＣＡ−０６  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｍｅｔｅｒ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、製造業者の指示に従って、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ法によって決定した。
【０２４４】
【表５】
0004965022.tif 000008
（結晶化度）
処方物の結晶強度を、実施例９に記載のように、定量的顕微鏡観察によって測定した。図７は、ＨＳＡ結晶が、ゼラチンで処方物を調製した直後に、容易に可視化されたことを示す。図８は、結晶化度が、５０℃にて４日間後に維持されたことを示す。
【０２４５】
（ＦＴＩＲによる二次構造の特徴付け）
ＦＴＩＲスペクトルを、Ｄｏｎｇらに記載されるように、Ｎｉｃｏｌｅｔモデル５５０Ｍａｇｎａシリーズ分光計で収集した（Ｄｏｎｇ，Ａ．，Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｂ．，Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｗ．Ｓ．，Ｂｈａｔ，Ｋ．Ｓ．およびＣｏｅ，Ｊ．Ｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２；３１：９３６４−９３７０；Ｄｏｎｇ，Ａ．Ｐｒｅｓｔｒｅｌｓｋｉ，Ｓ．Ｊ．，Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．およびＣａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９５；８４；４１５−４２４）。固体サンプルについて、１〜２ｍｇのタンパク質を、３５０ｍｇのＫＢｒ粉末で軽く施し、そして乱反射部品を用いて小さなカップを満たした。スペクトルを収集し、次いで、第２の誘導体を用いる二次構造の個々の成分の相対領域の決定のためのＧａｌａｃｔｉｃソフトウェアからのＧｒａｍｓ  ３２、およびアミドＩ領域（１６００〜１７００ｃｍ-1）の下でカーブフィッティングプログラムを用いて、処理した。
【０２４６】
比較のために、可溶性ＨＳＡサンプルを、水中にＨＳＡ結晶を溶解することによって調製し、そして安定性についてＦＴＩＲによって試験した。二次構造を、実施例９に記載のように決定した。
【０２４７】
【表６】
0004965022.tif 000009
（結論）
可溶性ＨＳＡは、溶液中で１時間後に７８％のα−ヘリックス含量の急速な減少、およびランダムコイル構造の対応する増加を示した。
【０２４８】
乾燥処方した結晶は、約１６％のα−ヘリックス含量の減少、β−シート含量の大幅な減少を示し、そしてランダム構造の含量の増加は示さなかった。
【０２４９】
（実施例１４：ペニシリンアシラーゼ）
（ペニシリンアシラーゼの結晶化）
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍからのペニシリンアシラーゼの硫酸アンモニウム懸濁物が、粗材料であった。ペニシリンアシラーゼの懸濁物を、脱イオン水を用いて１：３希釈した。この溶液を、３０Ｋメンブレンを用いるダイアフィルトレーションによって、Ａ280nm／ｍｌで２００ＯＤの最終濃度まで濃縮した。次いで、この酵素溶液を、４Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏを用いてＡ280nm／ｍｌで１５０ＯＤｍまで希釈した。
【０２５０】
１．９Ｍ  ＮａＰＯ4の最終溶液濃度となる４Ｍおよび１Ｍの十分なＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏの二相性溶液を、調製した。この場合、２８０ｍｌの１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏを、５４９ｍｌの４Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏの頂部に注意深く重層した。この酵素溶液を、容器の側面に穏やかに注ぎ、１Ｍ層の上に層を形成した。船舶用インペラーと共にオーバーヘッド攪拌機を設定した。アジテーターを、その刃を４Ｍ／１Ｍ界面のすぐ下にして容器中に置いた。速度を、８．０の設定、すなわち６００ｒｐｍに調整した。このアジテーターのスイッチを入れ、１０分後に停止させた。インペラーを容器からはずした。種結晶の容積を、０．５容積％と０．１容積％との間で目盛り付きピペットを用いて測定し、そして２０Ｌの滅菌ポリカーボネート容器中に添加した。この種を、添加前に１０秒間よりも長く静置しなかった。この溶液を、フラットブレードインペラーを用いて約１分間、手動で攪拌した。この結晶化混合物を、２４時間静置させた。
【０２５１】
２４時間後、この容器を開け、そして溶液を３０秒間、手動で混合した。この溶液を、さらに２４時間沈澱させた。計４８時間後、上清のうちの１０ｍｌのサンプルを採取した。このサンプルを、０．２ミクロンＡｃｒｏｄｉｓｃを用いて濾過した。上清のＡ280nmを測定した。上清のＡ280nmが１．０ｍｇ／ｍｌよりも大きい場合、結晶化をさらに２４時間継続させた。上清の濃度が１．０ｍｇ／ｍｌ未満になった場合、結晶スラリーおよび上清のＡ280nmを直接決定した。
【０２５２】
（実施例１５：ＰＡ結晶についてのペニシリンＧアッセイ）
ペニシリンアシラーゼについての活性アッセイの基礎は、この酵素によるベンジルペニシリンの酵素的加水分解を測定する滴定アッセイを含む。この酵素は、ペニシリンＧからのフェニルアセチル基の切断を触媒し、これによりｐＨの減少を引き起こす。この活性は、反応１分間に（２８℃にてｐＨ８を維持するために）必要な５０ｍＭ  ＮａＯＨの容積の測定による。このアッセイは、塩化カリウムおよびＴｒｉｓを用いて作製された基質緩衝液を使用する。そしてこのアッセイを、Ｕ／ｍｇで報告した。
【０２５３】
（ペニシリンアシラーゼアッセイ）：
（このアッセイにおいて用いられる化学物質および溶液）：
１．  ペニシリン−Ｇ、Ｓｉｇｍａ、カリウム塩
２．  ０．０５Ｎ  水酸化ナトリウム
３．  １．０Ｍ  ＫＣ１、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０
４．  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2緩衝液、ｐＨ８．０
５．  ０．０１Ｍ  ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．５
（基質溶液の調製）
１ｇのペニシリン−Ｇを、１０ｍｌの１．０Ｍ  ＫＣ１、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０および約７０ｍｌのＤＩ水、１ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2溶液中に添加した。次いで、この溶液のｐＨを、０．０５Ｎ  ＮａＯＨを用いて８．０に調整した。次いで、最終溶液容積を、１００ｍｌに調整した。この溶液を、各使用の前に新たに調製し、そして調製から５時間以内に使用した。
【０２５４】
（ＰＡサンプル溶液の調製）
ペニシリンアシラーゼのサンプルを、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解させた。代表的には、２ｍｇ〜４ｍｇ（乾燥重量）のタンパク質を、各アッセイに用いた。
【０２５５】
（ペニシリンＧの加水分解についてのアッセイ）
２０ｍｌのペニシリンアシラーゼ基質溶液を、滴定容器中に添加し、そして２８℃に平衡化させた。この酵素溶液をこの反応容器に添加した後、ｐＨを８．０に維持するために０．０５Ｎ  ＮａＯＨを用いて反応混合物を滴定することにより、ペニシリン−Ｇの加水分解をモニタリングした。
【０２５６】
（実施例１６：ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）を賦形剤として用いるＰＡ結晶の処方）：
乾燥および保存の間のＰＡ結晶の安定性を増強するために、この結晶を、賦形剤と共に処方した。本実施例では、ＰＡ結晶を、乾燥前に母液の存在下でスラリー形態で処方した。ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、賦形剤として母液中のＰＡ結晶に添加した。十分なＨＰＣＤを、母液（１．９Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．６）中２０ｍｇ／ｍのタンパク質濃度でリパーゼ結晶に添加して、１０％という最終濃度に到達させた。得られた懸濁物を、室温にて３時間転動（ｔｕｍｂｌｅｄ）させた。ＨＰＣＤを用いる処理後、この結晶を、実施例６の方法１に記載のように遠心分離によって液体から分離した。
【０２５７】
（実施例１７：母液自体を賦形剤として用いるＰＡ結晶の処方）：
ＰＡ結晶を、母液（１．９Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．６）を用いて処方した。この結晶を、実施例１６においてのように、遠心分離によって分離した。
【０２５８】
（実施例１８：ＰＡの乾燥）
次いで、実施例１５〜１７からのＰＡ結晶を、実施例６の方法１、３または４に従って乾燥させた。実施例６の方法４について用いた有機溶媒は、酢酸エチルであった。
【０２５９】
（実施例１９：可溶性ＰＡ調製物）：
比較標準として、可溶性ＰＡのサンプルを、２０ｍｇ／ｍｌで水中にＰＡ結晶を溶解させることによって調製した。
【０２６０】
可溶性ＰＡの安定性を、経時的に測定した。そして時間に対する５５℃でのプロット比活性を図９に示す。溶液中のＰＡ酵素活性は、迅速に減衰し、そして約２０時間後に検出できなかった。
【０２６１】
（実施例２０：乾燥結晶の活性）：
実施例１８からの乾燥結晶の活性を、実施例１５に記載される通りにＰｅｎ  Ｇアッセイにおいて試験した。乾燥した結晶（５ｍｇ）を、１ｍｌの水中に溶解させ、そしてその活性を、基質としてＰｅｎ  Ｇを用いて測定した。
【０２６２】
（貯蔵安定性）：
ＰＡ乾燥結晶処方物の貯蔵安定性を、ＰｉｅｒｃｅによるＲｅａｃｔｉｖｅ−Ｔｈｅｒｍ  ＩＩＩ−Ｈｅａｔｉｎｇ／Ｓｔｉｒｒｉｎｇモジュールを５５℃の温度で用いて決定した。活性を、５ｍｇの乾燥サンプルを水中に溶解し、そして実施例１５に記載のＰｅｎ  Ｇアッセイにおいて酵素活性を測定することにより測定し、そして最初の結果と比較した。図１０は、賦形剤を含むＰＡ結晶および賦形剤を含まないＰＡ結晶の貯蔵安定性プロフィールを示す。図１０はまた、窒素（方法１）または風乾（方法４）を用いて乾燥したＰＡ結晶処方物の貯蔵安定性プロフィールを示す。
【０２６３】
【表７】
0004965022.tif 000010
Ｔ1/2を、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔプログラムを用いる非線形回帰分析による有効期限データから算出した。処方された結晶の安定性は、処方されていない結晶に比較して、表７に示すように、増強された。例えば、ＨＰＣＤを用いて処方された結晶は、５５℃にて可溶性ＰＡより４１８倍安定であった（表７）。ＨＰＣＤを用いて処方された結晶は表７に示すように、賦形剤なしで作製された、処方されていないＰＡ結晶よりも、５５℃にて３．５倍安定であった。
【０２６４】
（水分含量）：
水分含量を、ＶＡ−０６  Ｖａｐｏｒｉｚｅｒ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を備えたＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＣＡ−０６  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｍｅｔｅｒを用いて製造業者の使用説明書に従ってＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ方法によって決定した。
【０２６５】
【表８】
0004965022.tif 000011
（結晶性）：
処方物の結晶の完全性を、実施例９に記載される通りに定量的顕微鏡観察によって測定した。結晶によって示される通り、結晶性は、プロセスの間中維持され（データは示さず）、これは容易に可視可能であった。
【０２６６】
（ＦＴＩＲによる二次構造の特徴付け）：
安定性を、乾燥され、そして処方されたＰＡ結晶の二次構造含量を、実施例９に記載される通りにＦＴＩＲによって定量することによって評価した。可溶性ＰＡを、比較の目的のために用いた。
【０２６７】
【表９】
0004965022.tif 000012
（結論）：
α−ヘリックス含量の減少は、可溶性ペニシリンアシラーゼについては１日後に７６％であった。対照的に、ＨＰＣＤを賦形剤として用い、そして処方物を実施例６の方法１によって乾燥した場合、５５℃の温度で４３日後にほんの３１％のα−ヘリックス含量が失われただけであった。
【０２６８】
（実施例２１：グルコースオキシダーゼ）
（グルコースオキシダーゼ結晶の調製）
本発明者らは、グルコースオキシダーゼの結晶を以下の通りに調製した。最初に、糖タンパク質を、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製し、次いで結晶化パラメーターを最適化した（データは示さず）。
【０２６９】
これらの研究の結果として、本発明者らは、グルコースオキシダーゼの結晶化条件が、一般に、７％〜１７％のＰＥＧ  ４０００またはＰＥＧ  ６０００、８％〜２０％の２−プロパノールまたはエタノール、および３と６との間のｐＨに調整する緩衝液の範囲に入ることを見出した。しかし、この範囲内およびこの範囲付近の多くのセットの実験条件が、グルコースオキシダーゼおよび他の糖タンパク質の結晶化について満足な結果を生じ得ることを理解すべきである。当業者は、所望の大きさおよび品質の結晶を効率的に生じる正確な条件が、実験条件の差異（例えば、タンパク質および試薬の純度、攪拌速度、剪断力の効果、ならびに炭水化物含量）に起因して変化することを理解する。
【０２７０】
（グルコースオキシダーゼの大規模結晶化）
本発明者らは、グルコースオキシダーゼの予備的規模の結晶化に好ましい条件を決定した。予備的規模の結晶化は一般に、１００ｍｌ〜９００ｍｌの糖タンパク質を含む。
【０２７１】
（Ａ．種を用いない、一定ｐＨでの結晶化）
グルコースオキシダーゼを、水中でダイアフィルトレーションし、そして５と１５との間のＡ280まで濃縮した。グルコースオキシダーゼ濃縮物を、ｐＨ５．０にて０．２Ｍ酢酸Ｎａ中に１８％  ＰＥＧ  ６０００、３２％  ２−プロパノールを含有する１容積の結晶化試薬と混合した（１：１）。混合後、この溶液を６℃まで冷却した。グルコースオキシダーゼ結晶化溶液を、プロペラスターラーを用いて１００ｒｐｍにて２４時間攪拌した。この時間の間に、この結晶が徐々に形成された。
【０２７２】
（実施例２２：賦形剤としてトレハロースを使用するグルコースオキシダーゼの処方）
乾燥および貯蔵の間のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）結晶の安定性を増強するために、この結晶を、賦形剤とともに処方した。この実施例において、ＧＯＤ結晶を、乾燥の前に、母液の存在下でスラリー形態に処方した。トレハロース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、賦形剤として母液中のＧＯＤ結晶に添加した。十分なトレハロースを、母液（３２％  イソプロパノールおよび９％  ＰＥＧ  ６０００を含む１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５））中の、タンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍｌのＧＯＤ結晶に、終濃度が１０％に達するまで添加した。得られた懸濁物を、３時間室温で転倒混和した。トレハロースでの処理後、実施例６の方法１に記載のように遠心分離によって、結晶と液体とを分離した。
【０２７３】
（実施例２３：賦形剤としてラクチトール（ｌａｃｔｉｔｏｌ）を使用するグルコースオキシダーゼ結晶の処方）
母液に対して終濃度１０％になるまで（トレハロースの代わりに）ラクチトール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することによって、グルコースオキシダーゼ結晶を実施例２２と同様に処方した。３時間の遠心分離後に、この結晶と母液／ラクチトール溶液とを分離した。
【０２７４】
（実施例２４：賦形剤としてヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）を使用するグルコースオキシダーゼ結晶の処方）
母液に対して終濃度１０％になるまで（トレハロースの代わりに）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することによって、グルコースオキシダーゼ結晶をＨＰＣＤ使用して、実施例２２と同様に処方し、そして３時間インキュベートした。次いで、実施例６の方法１に記載のように、３時間の遠心分離後に、この結晶と母液／ＨＰＣＤ溶液とを分離した。
【０２７５】
（実施例２５：賦形剤としてゼラチンを使用するグルコースオキシダーゼ結晶の処方）
母液に対して終濃度１０％になるまで（トレハロースの代わりに）ゼラチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することによって、グルコースオキシダーゼ結晶を実施例２２と同様に処方した。３時間の遠心分離後に、この結晶と母液／ゼラチン溶液とを分離した。
【０２７６】
（実施例２６：賦形剤としてメトキシポリエチレングリコールを使用するグルコースオキシダーゼ結晶の処方）
母液に対して終濃度１０％になるまで、メトキシポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することによって、グルコースオキシダーゼ結晶を実施例２２と同様に処方した。３時間の遠心分離後に、実施例６の方法１に記載のように、この結晶と母液／メトキシポリエチレングリコール溶液とを分離した。
【０２７７】
（実施例２７：賦形剤としてスクロースを使用するグルコースオキシダーゼ結晶の処方）
母液に対して終濃度１０％になるまでスクロース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することによって、グルコースオキシダーゼ結晶を実施例２２と同様に処方した。３時間の遠心分離後に、この結晶と母液／スクロース溶液とを分離した。
【０２７８】
（実施例２８：グルコースオキシダーゼ処方物の乾燥）
上記のグルコースオキシダーゼ結晶処方物を、実施例６に記載の方法に従って乾燥させた。方法４は、有機溶媒として冷イソプロパノール（４℃）を使用した。
【０２７９】
（実施例２９：可溶性グルコースオキシダーゼの調製）
比較のために、可溶性グルコースオキシダーゼサンプルを、５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、２０ｍｇ／ｍｌでグルコースオキシダーゼ結晶を溶解することによって調製した。
【０２８０】
図１１は、５０℃での可溶性グルコースオキシダーゼの安定性を経時的に示す。比活性は時間がたつにつれて急速に減少する。２４時間後、比活性は、９０％を超えて減少する。可溶性グルコースオキシダーゼのＴ1/2は、０．９１時間と算出された。
【０２８１】
（実施例３０：グルコースオキシダーゼ活性アッセイ）
以下のプロトコルを使用して、乾燥したグルコースオキシダーゼ結晶および結晶処方物の活性を決定した。
【０２８２】
化学薬品および溶液：
１．リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．３）、ＮａＣｌ（０．１Ｍ）溶液
２．２１ｍＭ  Ｏ−ジアニシジンジヒドロクロリドストック溶液。使用前に、作業溶液として０．２１ｍＭまで希釈
３．２Ｍ  グルコース溶液
４．ペルオキシド溶液（２ｍｇ／ｍｌ）
５．５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）。
【０２８３】
サンプル調製：
１．２ｍｇのグルコースオキシダーゼを１ｍｌの５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に添加し、そして約２分間、十分にボルテックスする。この溶液を、室温で１時間転倒混和して、再構成した
２．上記の酵素溶液０．１ｍｌと４．９ｍｌの同じクエン酸緩衝液とを混合することによって希釈酵素溶液を調製する。
【０２８４】
酵素活性測定のためのアッセイ手順：
１．ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計によってこのアッセイをモニターした。速度モードを使用し、そして４６０ｎｍの波長および２５℃の温度を設定する
２．２５℃の水浴中でＯ−ジアニシジン／ホスフェート作業溶液を温め、そして使用の少なくとも２０分前に酸素でこの溶液を泡立てる
３．酵素溶液を添加せずに試薬溶液を使用してブランクを測定する
４．２．４ｍｌの酸素化したＯ−ジアニシジン／ホスフェート作業溶液、０．４ｍｌの２Ｍ  グルコース溶液、および０．１ｍｌのペルオキシダーゼを、使い捨てキュベットにピペットで入れる
５．キュベット壁上に１０ｍｌの酵素サンプルを添加し（この工程でサンプルと試薬とが混合しないように、キュベットを傾ける）、そしてパラフィルム片で覆う。キュベットを２回反転させて素早く混合し、分光光度計のセル区画にキュベットを挿入し、そしてデータを収集し始める。
酵素比活性を以下の式を使用して算出する：
比活性＝Ａ＊Ｂ＊Ｃ／Ｄ＊Ｅ＊Ｆ
ここで、Ａ＝１分間あたりの４６０ｎｍでの吸光度単位の変化
Ｂ＝反応混合物容積（ｍｌ）
Ｃ＝希釈倍率
Ｄ＝１１．３（定数）
Ｅ＝使用した酵素の重量（ｍｇ）
Ｆ＝サンプル容積（ｍｌ）。
【０２８５】
（実施例３１：乾燥した結晶の活性）
グルコースオキシダーゼの乾燥した結晶処方物の活性を、実施例３０に記載のように測定した。
【０２８６】
（貯蔵（ｓｈｅｌｆ）安定性）
グルコースオキシダーゼ結晶処方物の貯蔵安定性の研究を行った。この場合、この処方物を、実施例６の方法４を用いて乾燥させ、そして２ｍｌのスクリューキャップ付きエッペンドルフチューブ中で１３日間、５０℃の温度にて水浴中に貯蔵した。特定の時点での活性を、５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に２ｍｇの乾燥したサンプルを溶解して、次いで、実施例３０に従って活性を測定することにより得た。
【０２８７】
５０℃で貯蔵した種々のグルコースオキシダーゼ処方物の貯蔵安定性を決定した。このデータを図１２に示す。ラクチトールは、上昇した温度において期間にわたり、グルコースオキシダーゼ比活性を保存するに最も有効な賦形剤であった。
【０２８８】
【表１０】
0004965022.tif 000013
Ｔ1/2を、Ｓｉｇｍａプロットプログラムを使用する非線形回帰分析により有効期限データから算出した。表１０は、トレハロースが賦形剤として使用された場合、グルコースオキシダーゼ処方物が可溶性グルコースオキシダーゼより、９５倍より安定であったことを示す。さらに、グルコースオキシダーゼ処方物は、賦形剤としてラクチトールが使用された場合、可溶性グルコースオキシダーゼより１２１倍より安定であった（表１０）。ＨＰＣＤまたはＭＯＰＥＧを賦形剤として使用するグルコースオキシダーゼ結晶処方物は、可溶性グルコースオキシダーゼより、それぞれ、６０倍および３２５倍より安定であった（表１０）。最後に、ゼラチンまたはスクロースを賦形剤として使用するグルコースオキシダーゼ結晶処方物は、可溶性グルコースオキシダーゼより、それぞれ、９９倍および８２倍より安定であった（表１０）。
【０２８９】
賦形剤としてトレハロース、ラクチトール、ＨＰＣＤ、ＭＯＰＥＧ、ゼラチンまたはスクロースのいずれかを用いて作製されたグルコースオキシダーゼ結晶処方物は、表１０に示されるように、Ｔ1/2により測定した場合、賦形剤を用いずに作製されたグルコースオキシダーゼ結晶より、５０℃において２．５倍、３．２倍、１．６倍、８．６倍、２．６倍、または２．２倍、より安定であった。
【０２９０】
（水分含量）
水分含量を、ＶＡ−０６  Ｖａｐｏｒｉｚｅｒ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を備えたＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＣＡ−０６  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｍｅｔｅｒを使用して、製造業者の説明書に従ってＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ法により決定した。
【０２９１】
【表１１】
0004965022.tif 000014
（結晶化度）
ＧＯＤ処方物の結晶完全性を、実施例９に記載のように定量的顕微鏡観察によって測定した。この実施例において、結晶は容易に結晶化された。このことにより、結晶化度は、プロセスの間中維持されたことを示す。
【０２９２】
図１３は、グルコースオキシダーゼ結晶がラクチトール処方物の調製直後に容易に視覚化されたことを示す。図１４は、結晶化度が５０℃で１３日間の後に維持されたことを実証する。結晶材料もまた、図１５に示すように、トレハロースでのグルコースオキシダーゼの処方後に容易に視覚化された。同様に、残った結晶材料も、図１６に示されるように、５０℃で１３日間の後に容易に視覚化された。
【０２９３】
（ＦＴＩＲによる二次構造の特徴）
実施例９に記載のように、乾燥したＧＯＤ結晶および処方したＧＯＤ結晶の二次構造量をＦＴＩＲにより定量することにより、安定性を評価した。比較のために、可溶性グルコースオキシダーゼサンプルを、５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中にグルコースオキシダーゼ結晶を溶解し、そしてＡＲＫ  ＥＳＰのセレン化亜鉛結晶上で約１ｍｌを配置することにより調製し、次いで、これを、ＦＴＩＲにより安定性について分析した。
【０２９４】
【表１２】
0004965022.tif 000015
（結論）
可溶性グルコースオキシダーゼは、５０℃でわずか６時間以内で、そのα−ヘリックス含量の７５％を損失した。
【０２９５】
糖ラクチトール、スクロース、およびトレハロースは、高温での貯蔵の際のα−ヘリックス含量の損失を防止するのに、最も有効な賦形剤であった。ラクチトール、スクロース、およびトレハロース中で処方され、そして方法４によって乾燥されたグルコースオキシダーゼ結晶は、５０℃で４日後に、α−ヘリックス構造含量の１８．１〜１９．４％のみの損失を示した。
【０２９６】
（実施例３２：Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ結晶の乾燥）
材料：
Ａ−Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ（実施例１）
Ｂ−ポリ（エチレングリコール）、１００％、ＰＥＧ２００、３００、４００、または６００
Ｃ−アセトン
手順：
結晶懸濁液（１４０ｍｇ）の４ｍｌアリコートを、４つの１５ｍｌ管に添加する。次に、この懸濁液を、１０００ＲＰＭ〜３０００ＲＰＭの間で、１〜５分間の間、または結晶化緩衝液が除去されるまで遠心分離する。次いで、４ｍｌの液体ポリマー（２００と６００との間のいかなるＰＥＧも適切である）を各管に添加し、そしてこの内容物を均一になるまで混合する。この懸濁液を１０００ＲＰＭ〜３０００ＲＰＭの間で、１〜５分間の間、または液体ポリマーが除去されるまで、遠心分離する。次に、４ｍｌのアセトン（イソプロパノール、ブタノール、および他の溶媒もまた適切である）を各管に入れ、そして十分に混合する。結晶／有機溶媒懸濁液を、０．８ｃｍ×４ｃｍ  ＢＩＯ−ＲＡＤポリ分取クロマトグラフィーカラム（スピンカラム）に移す。カラムを、有機溶媒を除去するために、１０００ＲＰＭで、１〜５分間の間、遠心分離する。最後に、窒素ガスをカラムに通し、自由流動粉末が生じるまで、結晶を乾燥させる。
【０２９７】
（実施例３３：Ｐｕｒａｆｅｃｔ（プロテアーゼ）４０００Ｌ結晶化）
材料：
Ａ−粗製ｐｕｒａｆｅｃｔ  ４０００Ｌ
Ｂ−１５％  ＮａＳＯ4溶液
手順：
１容量の粗製ｐｕｒａｆｅｃｔ酵素溶液を、２容量の１５％Ｎａ2ＳＯ4溶液と混合する。混合物を、室温で２４時間、または結晶化が完了するまで、攪拌する。結晶を１５％  Ｎａ2ＳＯ4溶液で洗浄し、可溶性酵素を除去する。結晶を新鮮な１５％  Ｎａ2ＳＯ4溶液中に懸濁し、２７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得る。
【０２９８】
（実施例３４：Ｐｕｒａｆｅｃｔ結晶の乾燥）
材料：
Ａ−ｐｕｒａｆｅｃｔ結晶懸濁液
Ｂ−ポリ（エチレングリコール）、１００％  ＰＥＧ
２００、３００、４００、または６００
Ｃ−有機溶媒
手順：
結晶懸濁液（１４０ｍｇ）の４ｍｌアリコートを、４つの１５ｍｌ管に添加する。次に、この懸濁液を、１０００ＲＰＭ〜３０００ＲＰＭの間で、１〜５分間の間、または結晶化緩衝液が除去されるまで、遠心分離する。次いで、４ｍｌの液体ポリマー（２００と６００との間のいかなるＰＥＧも適切である）を各管に添加し、そしてこの内容物を均一になるまで混合する。この懸濁液を１０００ＲＰＭ〜３０００ＲＰＭの間で、１〜５分間の間、または液体ポリマーが除去されるまで、遠心分離する。次に、４ｍｌのアセトン（イソプロパノール、ブタノール、および他の溶媒もまた適切である）を各管に入れ、そして十分に混合する。結晶／有機溶媒懸濁液を、０．８ｃｍ×４ｃｍ  ＢＩＯ−ＲＡＤポリ分取クロマトグラフィーカラム（スピンカラム）に移す。カラムを、有機溶媒を除去するために、１０００ＲＰＭで１〜５分間、遠心分離する。最後に、窒素ガスをカラムに通し、自由流動粉末が生じるまで、結晶を乾燥させる。
【０２９９】
（実施例３５：結晶化のためのＤＮＡの生成）
ｐＵＣプラスミド由来のプラスミド（例えば、ｐＳＰ６４）は、結晶化用のＤＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかを産生するために使用され得る。本実施例において、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能）を用いて結晶化用のＤＮＡを生成させる。目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、マルチプルクローニング部位で利用可能な多数の制限部位のいずれかに挿入する。次いで、組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を形質転換するために使用する。次に、大量のプラスミドを、アンピシリン含有培地中の細菌の増殖により得る。組換えプラスミドを生産し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、そして細菌増殖およびプラスミドＤＮＡ調製のための技術は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版」（１９８９）Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓにおいて詳細に記載される。
【０３００】
続いて、プラスミドＤＮＡを、細胞をまず溶解し、次いでゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、および他の細胞材料からプラスミドＤＮＡをＣｓＣｌ勾配を用いて分離することにより、細菌培養物から精製する。これらの技術は、当該分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋらで詳細に議論されている。勾配精製ＤＮＡを、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液飽和Ｎ−ブタノールで抽出し、そして最後にエタノールで抽出する。次に、プラスミドＤＮＡを、ＲＮＡ結晶化のためにｍＲＮＡの生成（実施例３６）、またはＤＮＡ結晶化のために目的の遺伝子の切り出し（実施例３７）に使用される、プラスミドのいずれかの線状化に供する。
【０３０１】
（実施例３６：結晶化のためのｍＲＮＡの生成）
ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼと組み合わせたＳＰ６４プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能）を、５’キャップ化ＲＮＡ転写物のミリグラム量の生成のために使用する。実施例３５で調製したプラスミドを、遺伝子の切り出しの前に、ポリＡテールの下流の制限酵素で線状化する。この線状化したプラスミドを、２回のフェノール／クロロホルム抽出および２回のクロロホルム抽出によって精製する。次に、ＤＮＡを、ＮａＯＡｃ（０．３Ｍ）および２容量のＥｔＯＨで沈殿させる。次に、ペレットを、ＤＥＰＣ処理した蒸留した脱イオン水中におよそ１ｍｇ／ｍｌで再懸濁する。
【０３０２】
転写を、４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＤＴＴ、および４０ｍＭスペルミジンで構成される緩衝液中で実施する。続く試薬を、室温で１容量のＤＥＰＣ処理水に対して以下の順に添加する：１容量のＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ転写緩衝液；ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、およびｒＵＴＰ（１ｍＭ濃度まで）；ｒＧＴＰ（０．５ｍＭ濃度まで）；７ｍｅＣ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．、０１９５１）（０．５ｍＭ濃度まで）；上記で調製した線状化ＤＮＡテンプレート（０．５ｍｇ／ｍｌ濃度まで）；ＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）（２０００Ｕ／ｍｌ濃度まで）；およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）（３０００Ｕ／ｍｌ濃度まで）。転写混合物を、３７℃で１時間インキュベートする。
【０３０３】
次いで、ＤＮＡテンプレートを、使用した１μｇのＤＮＡテンプレート当たり２ＵのＲＱ１  ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することにより消化する。消化反応を、１５分間実施する。転写ＲＮＡを、クロロホルム／フェノールで２回、およびクロロホルムで２回抽出する。上清溶液を、２容量のＥｔＯＨ中０．３Ｍ  ＮａＯＡｃで沈殿させ、そしてこのペレットを、５００ｍｌ転写産物当たり１００ｍｌ  ＤＥＰＣ処理脱イオン水で再懸濁する。最後に、上清溶液を、ＲＮＡｓｅ非含有Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＃  １００  ４１１）に通す。得られるｍＲＮＡは、結晶化に用いられるのに十分に純粋である。
【０３０４】
（実施例３７：ＤＮＡ結晶化）
材料：
Ａ−精製プラスミドＤＮＡ（実施例３５）
Ｂ−スペルミン
Ｃ−ＭＰＤ（２−メチル−２，４−ペンタンジオール）
Ｄ−５ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）
Ｅ−脱イオン水
手順：
増幅されたＤＮＡ（実施例３５）を、制限消化によってプラスミドから除去する。挿入された遺伝子を、適切な分子量のゲルバンドからの目的遺伝子のアガロースゲル電気泳動および抽出によって、プラスミドビヒクルから精製する。
【０３０５】
ハンギングドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）技術を使用して、５ｍＭ酢酸ナトリウム／２０％  ＭＰＤ／１ｍＭスペリミン緩衝液（ｐＨ７．０）中５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを、９０％のＤＮＡが結晶化されるまで、室温でインキュベートする。得られる結晶を、結晶化緩衝液で洗浄し、全ての可溶性材料を結晶から除去する。次いで、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度を達成するまで、結晶を新鮮な結晶化緩衝液中に再懸濁する。
【０３０６】
（実施例３８：ＲＮＡ結晶化）
材料：
Ａ−精製ｍＲＮＡ（実施例３６）
Ｂ−スペルミン
Ｃ−ＭＰＤ（２−メチル−２，４−ペンタンジオール）
Ｄ−５ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）
Ｅ−脱イオン水
手順：
ハンギングドロップ技術を使用して、５ｍＭ酢酸カルシウム／２０％  ＭＰＤ／１ｍＭスペリミン緩衝液（ｐＨ７．０）中５ｍｇ／ｍｌのＲＮＡ（実施例３６）を、９０％のＲＮＡが結晶化されるまで、室温でインキュベートする。得られる結晶を、結晶化緩衝液で洗浄し、全ての可溶性材料を結晶から除去する。次いで、５ｍｇ／ｍｌのＲＮＡ濃度を達成するまで、結晶を新鮮な結晶化緩衝液中に再懸濁する。
【０３０７】
（実施例３９：ＤＮＡ結晶を用いるＨＩＶ  ｇｐ１２０に対する免疫応答の誘発）
ＨＩＶ  ｇｐ１６０をコードするＤＮＡを、実施例３６および３７の方法に従って調製する。次いで、ＨＩＶ  ｇｐ１６０の結晶を、マウスの免疫化のために使用する。広範な中和免疫を誘発するワクチンを設計するために、ＨＩＶの初代分離株および実験分離株の両方の多くの遺伝的クローンは、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ  ２０８５２から入手可能である。
【０３０８】
ＤＮＡ結晶を、結晶化緩衝液中で維持し、そして２００μｌ／マウスを後脚に注射する。ｇｐ１２０に対する免疫応答の発達を、１ヶ月の基準でＥＬＩＳＡにおいて対応するＶ３ループペプチドに対する血清抗体を測定することにより決定する。
【０３０９】
（実施例４０：ｍＲＮＡ結晶を用いるＨＩＶ  ｇｐ１２０に対する免疫応答の誘発）
ＨＩＶ  ｇｐ１６０をコードするＲＮＡを、実施例３５、３６および３８の方法に従って調製する。次いで、ＨＩＶ  ｇｐ１６０  ｍＲＮＡの結晶を、マウスの免疫化のために使用する。広範な中和免疫を誘発するワクチンを設計するために、ＨＩＶの種々の初代分離株および実験分離株は、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ  ２０８５２から入手可能である。
【０３１０】
ＲＮＡ結晶を、結晶化緩衝液中で維持し、そして２００μｌ／マウスを後脚に注射する。ｇｐ１２０に対する免疫応答の発達を、１ヶ月の基準でＥＬＩＳＡにおいて対応するＶ３ループペプチドに対する血清抗体を測定することにより決定する。
【０３１１】
（実施例４１  オリゴＤＮＡ結晶化）
材料：
Ａ−合成オリゴＤＮＡ
Ｂ−スペルミン
Ｃ−ＭＰＤ（２−メチル−２，４−ペンタンジオール）
Ｄ−５ｍＭ  酢酸Ｃａ緩衝液  ｐＨ７．０
Ｅ−脱イオン水
手順：
ハンギングドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）技術を用いて、５ｍＭ酢酸Ｍｇ／３０％  ＭＰＤ／１ｍＭスペルミン緩衝液（ｐＨ７．０）中５ｍｇ／ｍｌの合成オリゴＤＮＡを、このＤＮＡの９０％が結晶化するまで室温にてインキュベートする。得られた結晶を結晶化緩衝液で洗浄し、この結晶からすべての可溶性物質を除去する。次いで、この結晶を、新しい結晶化緩衝液中に再懸濁し、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度を達成する。
【０３１２】
（実施例４２  遺伝子発現の阻害のためのアンチセンスＤＮＡ投与）
抑制されるべきｍＲＮＡ種のセンス鎖に相補的であるＤＮＡ配列をコードするオリゴＤＮＡ結晶を、実施例４１に記載するように生成する。次に、この結晶またはこの結晶を含む処方物を、遺伝子発現の阻害が意図される部位に投与する。引き続いて、細胞が、このＤＮＡ結晶または溶解されたＤＮＡを取り込み、そしてこのオリゴＤＮＡおよび宿主ｍＲＮＡが、相補的な塩基対を形成し、そして遺伝子発現が一定の時間阻害される。
【０３１３】
（カプセル化されたタンパク質結晶）
（実施例４３  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼの大規模結晶化）
１５ｋｇの粗製Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼ（ＰＳ３０リパーゼ−Ａｍａｎｏ）（「ＬＰＳ」）のスラリーを、１００Ｌの蒸留した脱イオン水中に溶解し、そしてさらなる蒸留した脱イオン水を用いて容量を２００Ｌにした。この懸濁液を、Ａｉｒ  Ｄｒｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇミキサー中で室温にて２時間混合し、次いで０．５μｍフィルターを通して濾過し、セリット（ｃｅｌｉｔｅ）を除去した。次いで、この混合物を、３Ｋ中空ファイバーフィルター膜カートリッジを使用して限外濾過し、そして１０Ｌ（１２１．４ｇ）に濃縮した。固体の酢酸カルシウムを、２０ｍＭ  Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2の濃度にまで添加した。必要に応じて、ｐＨを、濃酢酸を用いて５．５に調整した。この混合物を加熱し、そして３０℃の温度に維持した。硫酸マグネシウムを、０．２Ｍの濃度にまで添加し、続いてグルコポン（ｇｌｕｃｏｐｏｎ）を１％の濃度にまで添加した。次いで、イソプロパノールを２３％の最終濃度にまで添加した。得られた溶液を、３０℃にて３０分間混合し、次いで３０℃から１２℃にまで２時間にわたって冷却した。次いで、結晶化を１６時間進行させた。
【０３１４】
この結晶を沈殿させ、そして可溶性タンパク質を、末端に１０ｍｌのピペットを有するタイゴン管を備えた蠕動ポンプを用いて除去した。新しい結晶化溶液（２３％イソプロピルアルコール、０．２Ｍ  ＭｇＳＯ4、１％グルコポン、２０ｍＭ  Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2、ｐＨ５．５）を添加し、タンパク質の濃度を３０ｍｇ／ｍｌにした（１ｍｇ／ｍｌ溶液のＯ．Ｄ．２８０＝１．０、分光光度計を波長２８０で用いて測定した場合）。結晶の収量は、約１２０グラムであった。
【０３１５】
（架橋されたＬＰＳ結晶）
架橋されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼ結晶（ＣｈｉｒｏＣＬＥＣ−ＰＣTMという名称で販売されており、Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手可能である）を用いて、実施例４８によって処方物を生成した。あるいは、上記のように調製したリパーゼ結晶は、任意の従来方法を用いて架橋され得る。
【０３１６】
（実施例４４  グルコースオキシダーゼ結晶の架橋）
次いで、本発明者らは、実施例２１において調製されたグルコースオキシダーゼ結晶を下記のように架橋した。この架橋手順は、グルタルアルデヒド、またはＴｒｉｓ緩衝液（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）、リジン、もしくはジアミノオクタンのいずれかを用いて前処理されたグルタルアルデヒドを含んだ。
【０３１７】
この架橋を、６０ｍｇのタンパク質を用いて行った。Ｔｒｉｓ前処理グルタルアルデヒド（４８ｍｇ  Ｔｒｉｓ塩／１ｇグルタルアルデヒド）を、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中に懸濁した１ｇのＧＯ結晶あたり０．２ｇおよび０．６ｇの濃度にまで添加した。反応を、室温にて２時間進行させた。２時間後、この結晶をガラスファイバー紙を通して濾過および洗浄した。
【０３１８】
この架橋した結晶を、実施例４８に記載のようにカプセル化した。様々に架橋された結晶の間で、カプセル化プロセスにおいて差異はなかった。代表的なサンプルを、図２１に示す。
【０３１９】
（実施例４５  架橋されたＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ結晶）
架橋したＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ結晶（ＣｈｉｒｏＣＬＥＣ−ＣＲTMという名称で販売されており、Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手可能である）を用いて、実施例４８によって処方物を生成した。あるいは、上記で調製したリパーゼ結晶は、任意の従来方法を用いて架橋され得る。
【０３２０】
（実施例４６  ヒト血清アルブミン結晶の架橋）
実施例１０において調製されたヒト血清アルブミン結晶に対して架橋を行った。この架橋反応を、５０％の飽和硫酸アンモニウムを含む母液中の攪拌された結晶溶液中で、４℃にて行った。ホウ酸塩で前処理したグルタルアルデヒドでの架橋の前には、この結晶を洗浄しなかった。
【０３２１】
前処理したグルタルアルデヒドを、１容量の５０％グルタルアルデヒド（「ＧＡ」）を、等量の３００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）に添加することによって調製した。次いで、このグルタルアルデヒド溶液を、６０℃にて１時間インキュベートした。この溶液を、室温まで冷却し、そして濃ＨＣｌを用いてｐＨを５．５に調整した。次に、この溶液を、氷上で迅速に４℃にまで冷却した。
【０３２２】
前処理したグルタルアルデヒド（２５％）を、段階様式で、１５分間隔で０．０５％の増分（総濃度）を用いて、２％の濃度にまで結晶化溶液に添加した。使用された結晶化溶液のアリコートは、１ｍｌ〜５００ｍｌの容量の範囲に及んだ。次いで、この結晶を、５％ＧＡにし、そして４℃にて４時間インキュベートして架橋させた。最終的に、アルブミン架橋した結晶を、低速の遠心分離によって回収し、そしてｐＨ７．５、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌを用いて繰り返し洗浄した。この架橋された結晶が、凝集することなく高速で遠心分離され得るときに、洗浄を停止した。
【０３２３】
（実施例４７  ペニシリンアシラーゼの架橋）
前処理したグルタルアルデヒドを、実施例４６の方法によって調製した。
【０３２４】
前処理したグルタルアルデヒド（２５％）を、段階様式で、１５分間隔で０．０５％の増分（総濃度）を用いて、１．５％の濃度にまで結晶化溶液に添加した。使用された結晶化溶液のアリコートは、１ｍｌ〜５００ｍｌの容量の範囲に及んだ。最終的に、架橋した結晶を、低速の遠心分離によって回収し、そしてｐＨ７．５、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌを用いて繰り返し洗浄した。この架橋された結晶が、凝集することなく高速で遠心分離され得るときに、洗浄を停止した。
【０３２５】
（実施例４８  ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）中のタンパク質結晶のマイクロカプセル化）
Ａ．糖タンパク質、タンパク質、酵素、ホルモン、抗体およびペプチド
Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ由来のリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼ、ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のペニシリンアシラーゼの非架橋結晶を用いて、マイクロカプセル化を行った。さらに、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼ、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のペニシリンアシラーゼの架橋された酵素結晶を用いて、マイクロカプセル化を行った。表１３は、この実施例によって生成されたマイクロスフェアのサンプルのおよその平均直径を示す。さらに、生成されたヒト血清アルブミンまたは任意の他のタンパク質結晶またはタンパク質結晶処方物は、この技術によってカプセル化され得る。
【０３２６】
【表１３】
0004965022.tif 000016
Ｂ．乾燥結晶の調製：
実施例６によって乾燥された結晶または結晶処方物を、各々用いて、本発明のマイクロスフェアを生成し得る。本発明における使用のためのタンパク質結晶を乾燥させるための１つのプロセスは、空気乾燥を含む。
【０３２７】
実施例１からのＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ結晶（非架橋および架橋）、実施例２１および４４からのグルコースオキシダーゼ（非架橋および架橋）、ならびに実施例１４および４７からのペニシリンアシラーゼ（非架橋および架橋）の各々約５００ｍｇを、空気乾燥させた。最初に、母液を、３０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって除去した。次に、結晶を、２５℃にて２日間、換気フード中に置いた。
【０３２８】
（Ｃ．ポリマーおよび溶媒）
タンパク質結晶をカプセル化するのに使用したポリマーは、ＰＬＧＡであった。ＰＬＧＡは、５０／５０ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）として、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．からロット番号Ｄ９７１８８から購入した。このロットは、ＨＦＩＰ中３０℃で、０．４４ｄｌ／ｇの固有の粘度を有していた。
【０３２９】
塩化メチレンは、分光学的グレードであり、そしてＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから購入した。ポリビニルアルコールを、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから購入した。
【０３３０】
（Ｄ．ＰＬＧＡにおける結晶のカプセル化）
結晶を、二重エマルジョン法を使用してＰＬＧＡ中にカプセル化した。一般的なプロセスは、以下の通りであった。乾燥タンパク質結晶またはタンパク質結晶のスラリーのいずれかを、まず、塩化メチレン中のポリマー溶液に添加した。その結晶をポリマーでコートし、そして新生マイクロスフェアとなった。次いで、有機溶媒溶液中のそのポリマーを、界面活性剤を含有するより大きな容量の水溶液へと移した。結果として、その有機溶媒は、蒸発し始め、そしてそのポリマーは硬化した。この実施例では、漸減濃度の乳化剤の２つの連続的な水溶液を、そのポリマーコートを硬化するために使用し、マイクロスフェアを形成した。以下の手順は、この一般的なプロセスの１つの例示であった。ポリマーサイエンスの当業者は、その手順の多くの改変が利用され得ること、および以下の実施例は本発明を限定することを意図されたものではないことを理解する。
【０３３１】
（１．０  乾燥タンパク質結晶の使用）
実施例１に従って製造された架橋された、および架橋されていないＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼの乾燥結晶、実施例２１および４５に従って製造された架橋された、および架橋されていないグルコースオキシダーゼ、実施例１４および４７に従って製造された架橋された、および架橋されていないペニシリンアシラーゼを、１５０ｍｇサンプルへと計量した。次いで、計量したタンパク質結晶を、２ｍｌの塩化メチレンおよび０．６ｇＰＬＧＡ／１ｍｌ溶媒のＰＬＧＡを含有する１５ｍｌのポリプロピレン遠心分離チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直接添加した。その結晶を、溶媒の表面へ直接添加した。次いで、そのチューブを、２分間室温でボルテックスすることによって十分に混合し、ＰＬＧＡを含む溶媒中でタンパク質結晶を完全に分散させた。その結晶を、ポリマーで完全にコートした。新生マイクロスフェアを懸濁された状態に維持するために、さらにボルテックスまたは攪拌をして、さらなるコーティングを許容し得る。そのポリマーは、３．０節に記載されるように硬化され得る。
【０３３２】
（２．０  タンパク質結晶スラリーの使用）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼの結晶スラリーを、２００μｌの母液当たり約５０ｍｇの結晶を使用して作製した。結晶スラリーを、塩化メチレンおよび０．６ｇのＰＬＧＡ／１ｍｌ溶媒のポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の２ｍｌの溶液とともに、１５ｍｌポリプロピレン遠心分離チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へ迅速に注入した。そのニードルを溶媒の表面下に挿入し、そして溶液中に注入した。この場合、１５０ｍｇの総タンパク質、または６００μｌの水溶液を注入した。プラスチックシリンジＬｅｕｒ−ｌｏｋ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して、２２ゲージ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｏｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ）のステンレススチールニードルを介して注入した。次いで、タンパク質結晶ＰＬＧＡスラリーを、２分間室温でボルテックスすることによって完全に混合した。その結晶をポリマーで完全にコートした。新生マイクロスフェアを懸濁した状態で維持し、さらにコーティングするために、必要に応じて、さらにボルテックスまたは攪拌した。
【０３３３】
（３．０  ポリマーコーティングの硬化）
液体ポリマーコートから塩化メチレンを除去することを容易にし、そしてそのポリマーをタンパク質結晶上で硬化させるために、２工程プロセスを利用した。工程間の差異は、乳化剤の濃度が第１の溶液においてずっと高く、そして第１の溶液の容量が、第２の溶液よりもずっと小さいことである。
【０３３４】
第１の工程において、ポリマーでコートされた結晶および塩化メチレン懸濁液を、室温で、０．５％塩化メチレンを含む水中１８０ｍｌの６％ポリビニルアルコール（本明細書中以下で「ＰＶＡ」）の攪拌したフラスコに滴下して加えた。この溶液を、１分間迅速に混合した。
【０３３５】
工程２において、新生マイクロスフェアを含有する第１のＰＶＡ溶液を、２．４リットルの冷（４℃）蒸留水中に迅速に注いだ。この最終浴を、４℃で１時間、溶液の表面を窒素下でおいて、穏やかに混合した。１時間後、マイクロスフェアを、０．２２μｍのフィルターを使用して濾過し、そして凝集を減少させるために０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する３リットルの蒸留水で洗浄した。
【０３３６】
（実施例４９）
（カプセル化した結晶の作製）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼのカプセル化マイクロスフェアを、相分離技術によって調製する。実施例４３において調製された結晶ＬＰＳを、二重エマルジョン法を使用して、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（「ＰＬＧＡ」）中にカプセル化する。タンパク質結晶の７００ｍｇのアリコートを、ＰＬＧＡを含有する塩化メチレン（０．６ｇ  ＰＬＧＡ／１ｍｌ溶媒；１０ｍｌ）中に注入する。その混合物を、マイクロファインチップを供えたホモジナイザーを使用して、３０秒間、３，０００ｒｐｍでホモジナイスする。得られる懸濁液を、６％ポリ（ビニルアルコール）（「ＰＶＡ」）および塩化メチレン（４．５ｍｌ）を含有する攪拌しているタンク（９００ｍｌ）に移す。その溶液を、１，０００ｒｐｍで１分間混合する。ＰＶＡ溶液中のマイクロスフェアを、蒸留水中に浸漬させることによって沈殿させ、洗浄し、そして濾過する。次いで、そのマイクロスフェアを、凝集を減少させるために０．１％のＴｗｅｅｎを含有する蒸留水で洗浄し、そして２日間、４℃で窒素で乾燥させる。
【０３３７】
（実施例５０）
（Ａ．マイクロスフェアのタンパク質濃度）
実施例４８で調製したマイクロスフェアの総タンパク質含量を測定した。２５ｍｇのＰＬＧＡ／ＰＶＡマイクロスフェアの３連のサンプルを、１Ｎの水酸化ナトリウム中で４８時間混合させながらインキュベートした。次いで、タンパク質含量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．７２、２４８〜２５４頁（１９７６））およびＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）からの市販のキットを使用して見積もった。タンパク質を含有するマイクロスフェアを、結晶を含まないＰＬＧＡマイクロスフェアと比較した。これを表１４に示す。
【０３３８】
【表１４】
0004965022.tif 000017
表１４から選択されたサンプルのミリグラム当たりの活性または比活性を決定した。これを表１５に示す。
【０３３９】
【表１５】
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（実施例５１）
（マイクロスフェアからのタンパク質の放出）
実施例４８で調製されたＰＬＧＡマイクロスフェアからのタンパク質の放出を、０．２２μｍのフィルターを含有する微少遠心分離濾過チューブ中に５０ｍｇのタンパク質カプセル化ＰＬＧＡマイクロスフェアを配置することによって測定した。次に、６００μｌの放出緩衝液（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４）を、フィルターの保持側のマイクロスフェアに添加した。そのチューブを３７℃でインキュベートし、溶解させる。経時的に放出させたタンパク質の量を測定するために、サンプルを異なる時間間隔で採取した。そのチューブを３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そしてその濾過物をタンパク質活性および総タンパク質測定について取り出した。次いで、マイクロスフェアをさらなる６００μｌの放出緩衝液で再懸濁した。
【０３４０】
（Ａ．マイクロスフェアから放出された総タンパク質）
表１６は、ほぼ９０％のインプットしたタンパク質が全ての場合において回収されたことを示す。さらに、マイクロカプセル化したタンパク質結晶から放出された総Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼのパーセントは、約５．７日間、またはインプットしたタンパク質の８０％を超えるものが、１５．８％／日の速度で放出されるまで、比較的定常であった。この長い迅速放出の後は、１日当たりわずか０．６％の放出のみが８日間続いた
対照的に、表１６は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ結晶が、まず最初ゆっくりとした放出を示し、続いて迅速な放出相が続いた反対のプロフィールを示したことをさらに示す。最初の３日間において、約１０％のタンパク質が２．４％／日の緩やかな勾配を伴って放出された。４日から１４日まで、さらにタンパク質の８０％が、直線的に、７．５％／日の勾配で、放出された。表１６に示した放出したプロフィールは、３７℃、ｐＨ７．４で得られた。
【０３４１】
これらのデータは、本発明のカプセル化したタンパク質が治療用タンパク質の生物学的送達に適していることを示す。送達の種々の速度は、タンパク質結晶、結晶の選択、結晶の架橋、カプセル化するポリマーの疎水性および親水性の特徴、カプセル化の数、マイクロスフェアの用量、および他の簡単に制御可能な変数の選択を操作することによって選択され得る。
【０３４２】
【表１６】
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（Ｂ．マイクロスフェアから放出されたタンパク質の活性）
経時的に放出されたタンパク質の生物学的活性を、リパーゼマイクロスフェアについてのオリーブ油アッセイを用いて測定した。これらの結果を表１７に示す。
【０３４３】
表１７に示すように、放出されたタンパク質の生物学的活性は、マイクロスフェアが、活性タンパク質を保護および放出することを実証する。タンパク質の投入量に基づいて計算した放出された活性の累積率は、放出されたタンパク質の総量と密接な相関関係にあった（表１６と表１７とを比較のこと）。二つの異なる結晶リパーゼは、本質的に１００％活性なタンパク質を放出した。３７℃での液浸の７日後でさえ、マイクロスフェアから放出されたタンパク質は、完全に活性であった。
【０３４４】
【表１７】
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上記に示す活性測定を、実施例８に記載したオリーブオイルアッセイを用いて行った。
【０３４５】
（実施例５２）
（ＰＬＧＡマイクロスフェアの顕微鏡検査）
結晶が、カプセル化後にインタクトであったか否かを可視化するために、実施例４８に従って調製したＰＬＧＡマイクロスフェアを、ＤＸＣ−９７０ＭＤ  ３ＣＣＤカラービデオカメラ、カメラアダプター（ＣＭＡ  Ｄ２）、Ｉｍａｇｅ  ＰｒｏＰｌｕｓソフトウェアを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０マイクロスコープの下で検査した。乾燥マイクロスフェアのサンプルを、ガラスカバーガラスで覆い、マウントし、そしてＯｌｙｍｐｕｓ  ＵＰＬＡＮ  Ｅ１対物レンズ１０×０．３０  ＰＨ１（位相差）を備えるＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を用いて１０×の拡大率の下で検査して、結晶を容易に可視化し、そして結晶サイズを決定した。マイクロスフェアサイズおよび結晶サイズを、ＯｌｙｍｐｕｓからのＩｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェアおよび製造業者によって提供される０．５〜１５０μｍサイジングビーズを用いて決定した。ＰＬＧＡマイクロスフェアの外側のサイズを決定し、結晶についても同様に決定した。
【０３４６】
図１７は、実施例４８の方法によってカプセル化されたＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼの架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、約２５μｍであり、そしてマイクロスフェアは、約９０μｍであった。拡大率は、２５０×であった。
【０３４７】
図１８は、実施例４８の方法によってカプセル化されたＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼの非架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、約２５μｍであり、そしてマイクロスフェアは、約１２０μｍであった。拡大率は、２５０×であった。
【０３４８】
図１９は、実施例４８の方法によってカプセル化されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のペニシリンアシラーゼの架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、約２５μｍであり、そしてマイクロスフェアは、約７０μｍであった。拡大率は、２５０×であった。
【０３４９】
図２０は、実施例４８の方法によってカプセル化されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のペニシリンアシラーゼの非架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、約５０μｍであり、そしてマイクロスフェアは、約９０μｍであった。拡大率は、２５０×であった。
【０３５０】
図２１は、実施例４８の方法によってカプセル化されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼの架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、０．５〜１μｍの範囲であり、そしてマイクロスフェアは、約５０μｍであった。拡大率は、５００×であった。
【０３５１】
図２２は、実施例４８の方法によってカプセル化されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼの非架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、０．５〜１μｍの範囲であり、そしてマイクロスフェアは、約５０μｍであった。拡大率は、５００×であった。
【０３５２】
図２３は、実施例４８の方法によって母液中にスラリーとしてカプセル化されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ由来のリパーゼの非架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、約２．５μｍであり、そしてマイクロスフェアは、約６０μｍであった。拡大率は、５００×であった。
【０３５３】
図２４は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ由来のリパーゼの非架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、約２．５μｍであった。拡大率は、１０００×であった。
【０３５４】
（実施例５３）
（タンパク質放出）
ＰＬＧＡマイクロスフェアからのタンパク質の放出を、０．２２μｍフィルターを含むマイクロ遠心濾過チューブ中に５０ｍｇのＰＬＧＡマイクロスフェアを置くことによって測定する。放出緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ、０．０２％アジド）の６００μｌのアリコートを、フィルターの保持側面（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ  ｓｉｄｅ）上のマイクロスフェアへ添加して懸濁する。チューブを、３ｃｃバイアル栓で密閉し、パラフィルムを覆う。次いで、マイクロスフェアを、３７℃でインキュベートする。サンプルを、チューブの遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１分）によって経時的に得る。濾液を取り出し、そしてマイクロスフェアを、６００μｌの放出緩衝液を用いて再懸濁する。放出されたタンパク質の品質を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよび酵素活性によってアッセイする。
【０３５５】
タンパク質結晶の形およびサイズを、本発明のタンパク質結晶処方物の溶解の割合か、または他の特性を調整するために選択し得る。
【０３５６】
（実施例５４）
（生物学的ポリマーを用いるリパーゼ結晶のカプセル化）
生物学的ポリマーはまた、タンパク質結晶のカプセル化に有用である。本実施例は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ結晶の架橋結晶および非架橋結晶のカプセル化を実証する。非架橋結晶および架橋結晶を、実施例１および実施例４５に記載のように調製した。抗体および化学薬品を、Ｓｉｇｍａから購入した。
【０３５７】
（１．０  被覆結晶の調製）
１０ｍｇ／ｍｌにて１．５ｍｌのウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）の溶液を、ｐＨ７に調整した５ｍＭリン酸緩衝液中で調製した。次いで、１５ｍｌのＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ結晶の１０ｍｇ／ｍｌ懸濁液を、５ｍＭ  Ｋ／Ｎａリン酸緩衝液、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７（「緩衝液」）中で調製した。ＢＳＡ溶液を結晶溶液へ添加し、そして二つの溶液を、十分に混合した。結晶を、オービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）を使用してＢＳＡ中で３０分間ゆっくりと混合しながらインキュベートした。ＢＳＡとのインキュベーションに続いて、結晶を、真空ろ過によって一晩乾燥した。乾燥させた結晶をアルブミンを有さない緩衝液中に再懸濁した。結晶を、２８０ｎｍの吸光度で測定した洗浄液中にタンパク質を検出出来なくなるまでか、またはＡ280nmが０．０１未満になるまで、緩衝液を用いて洗浄した。この結晶を、低速遠心分離によって回収した。
【０３５８】
（２．０  アルブミン被膜の検出）
被覆結晶を、ウェスタンブロットによって評価して、アルブミン層の存在を確認した。洗浄に続いて、被覆タンパク質結晶を、１００ｍＭ  ＮａＯＨ中で一晩インキュベートして、マイクロスフェアを成分タンパク質へと溶解した。サンプルを、中和し、ろ過し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロットによって分析した。
【０３５９】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｒａｇｏｓａリパーゼのアルブミン被覆架橋結晶マイクロスフェアおよびアルブミン被覆非架橋結晶マイクロスフェアの両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロットの結果は、アルブミンと同じ分子量を有する単一の免疫反応種を示した。
【０３６０】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｒａｇｏｓａリパーゼのアルブミン被覆架橋結晶マイクロスフェアおよびアルブミン被覆非架橋結晶マイクロスフェアのサンプルを、ウシ血清アルブミンを特異的に認識しかつ結合する蛍光標識抗ＢＳＡ抗体と共にインキュベートした。次いで、過剰な抗体を、リン酸緩衝液を用いて洗浄することで取り除いた。蛍光顕微鏡下での、これらの蛍光性標識アルブミン被覆結晶マイクロスフェアの顕微鏡検査は、マイクロスフェアの特異的蛍光標識を示した。非被覆リパーゼ結晶をコントロールとして用い、そしてこれらは抗体の特異的結合を示さなかった。
【０３６１】
本発明者らは、上に本発明の多くの実施態様を記載したが、本発明者らの基礎的な構築物を変化させて、本発明のプロセスおよび組成物を利用する他の実施態様を提供し得ることは明白である。従って、本発明の範囲は、例示の目的で上に示した特定の実施態様によってよりはむしろ、ここに添付される特許請求の範囲によって定義されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼの以下の分子状態の相対的な安定性を示す：架橋アモルファス、液体、２０％有機溶媒における結晶、２０％有機溶媒における架橋結晶、有機溶媒を伴わない架橋結晶（「Ｘｌｉｎｋｅ  ｐｐｔ」は、架橋沈殿物を示す）。
【図２】  図２は、４０℃での可溶性リパーゼの比活性を経時的に示す。
【図３】  図３は、４０℃および湿度７５％で方法１によって乾燥させたリパーゼ結晶処方物の貯蔵安定性を示す。
【図４】  図４は、４０℃および湿度７５％で方法４によって乾燥させたリパーゼ結晶処方物の貯蔵安定性を示す。
【図５】  図５は、初期時間０においてポリエチレンオキシドを用いて処方したリパーゼ結晶を示す。
【図６】  図６は、４０℃および湿度７５％で、１２９日間インキュベーションした後に、ポリエチレンオキシドを用いて処方したリパーゼ結晶を示す。
【図７】  図７は、初期時間０においてゼラチンを用いて処方したヒト血清アルブミン結晶を示す。
【図８】  図８は、５０℃にて４日間インキュベーションした後にゼラチンを用いて処方したヒト血清アルブミン結晶を示す。
【図９】  図９は、５５℃での可溶性ペニシニンアシラーゼの比活性を経時的に示す。
【図１０】  図１０は、５５℃での種々の乾燥ペニシリンアシラーゼ結晶処方物の貯蔵安定性を示す。
【図１１】  図１１は、可溶性グルコースオキシダーゼの比活性を経時的に示す。
【図１２】  図１２は、５０℃での種々の乾燥グルコースオキシダーゼ結晶処方物の貯蔵安定性を示す。
【図１３】  図１３は、初期時間０にてラクチトールを用いて処方したグルコースオキシダーゼ結晶を示す。
【図１４】  図１４は、５０℃にて１３日間インキュベーションした後にラクチトールを用いて処方したグルコースオキシダーゼ結晶を示す。
【図１５】  図１５は、初期時間０にてトレハロースを用いて処方したグルコースオキシダーゼ結晶を示す。
【図１６】  図１６は、５０℃にて１３日間のインキュベーション後にトレハロースを用いて処方したグルコースオキシダーゼ結晶を示す。
【図１７】  図１７は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼのカプセル化し架橋した酵素結晶を示す。
【図１８】  図１８は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼのカプセル化し架橋していない酵素結晶を示す。
【図１９】  図１９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のペニシリンアシラーゼのカプセル化し架橋した酵素結晶を示す。
【図２０】  図２０は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のペニシリンアシラーゼのカプセル化し架橋していない酵素結晶を示す。
【図２１】  図２１は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼのカプセル化し架橋した酵素結晶を示す。
【図２２】  図２２は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼのカプセル化し架橋していない酵素結晶を示す。
【図２３】  図２３は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ由来のリパーゼの架橋されていない酵素結晶のカプセル化した水性スラリーを示す。
【図２４】  図２４は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ由来のリパーゼの架橋されていない酵素結晶を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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