(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め選択した基質核酸配列中の切断部位を規定するヌクレオチド配列に特異的な部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する触媒ＤＮＡ分子であって、
コア領域に隣接する第一及び第二の基質結合領域を有し、
該第一の基質結合領域は、該予め選択した基質核酸配列の第一の部分に相補的な配列を有し、
該第二の基質結合領域は、該予め選択した基質核酸配列の第二の部分に相補的な配列を有し、
該コア領域は下記式で示される配列：
（Ｉ．）  Ｔ（ステム）’ＡＧＣ（ステム）”Ｚ
（式中、（ステム）’及び（ステム）”は、それぞれ３つの連続ヌクレオチドであり、（ステム）’：（ステム）”としてハイブリダイズしたときに少なくとも２つのＧ：Ｃを含む３つの塩基対を形成し、Ｚ＝ＷＣＧＲ又はＷＣＧＡＡであり、Ｗ＝Ａ又はＴであり、Ｒ＝Ａ又はＧであり、但しＺがＴＣＧＡＡである場合は除く。）又は、
（ＩＩ．）  ＲＧＧＣＴＡＧＣＸＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号１２２）
（式中、Ｘ＝Ｔ、Ｃ又はＡでありＲ＝Ａ又はＧである。）
を有し、
前記第一又は第二の基質結合領域が５〜１３ヌクレオチドの長さであることを特徴とし、但し配列番号１８、５６、８１及び８５乃至８７のいずれかの配列から成る触媒ＤＮＡ分子は除く、前記分子。
【請求項２】
式Ｉが配列番号１２０を規定している、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
式ＩＩが配列番号１２１を規定している、請求項１に記載の分子。
【請求項４】
触媒ＤＮＡ分子が、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、修飾ＤＮＡ、ヌクレオチド類似体又はこれらの複合体を含んでいる、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項５】
基質核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、ヌクレオチド類似体又はこれらの複合体を含んでいる、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項６】
触媒ＤＮＡ分子が、５’及び３’末端を有する一本鎖デオキシリボ核酸を含んでおり、該末端がエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドで修飾されている、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項７】
エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドがヌクレオシドホスホロチオネートを含んでいる、請求項６に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項８】
第一又は第二の基質結合領域が、少なくとも２つのホスホロチオネートヌクレオシドを含んでいる、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項９】
コア領域が、コア内のジピリミジン上にホスホロチオネートヌクレオシド残基を含んでいる、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１０】
３’末端が逆方向（３’，３’−結合）ヌクレオチドを含んでいる、請求項６に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１１】
触媒ＤＮＡ分子が、２’Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含んでいる、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１２】
第一及び第二の基質結合領域が、配列番号１０２〜１１９からなる群より選ばれる配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいる、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１３】
分子が、０．０５〜１０００ナノモルのＫｍで反応を触媒する、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１４】
触媒ＤＮＡ分子が、１．０マイクロモル未満のＫｍで基質と結合する、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１５】
触媒ＤＮＡ分子が、０．１ナノモル未満のＫｍで基質と結合する、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１６】
分子が、０．００５〜０．１分−１の触媒反応代謝回転速度（ｋｃａｔ）を有する、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１７】
エンドヌクレアーゼ活性が二価カチオンの存在により増強される、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１８】
二価カチオンが、Ｐｂ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋からなる群より選ばれる、請求項１７に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項１９】
エンドヌクレアーゼ活性がＭｇ２＋の存在により増強される、請求項１７に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項２０】
エンドヌクレアーゼ活性が一価カチオンの存在により増強される、請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項２１】
一価カチオンがＮａ＋及びＫ＋からなる群より選ばれる、請求項２０に記載の触媒ＤＮＡ分子。
【請求項２２】
請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子の２以上の集団を含む組成物であって、触媒ＤＮＡ分子の各集団が、基質中の異なるヌクレオチド配列を切断することができることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子の２以上の集団を含む組成物であって、触媒ＤＮＡ分子の各集団が、異なる基質を認識することができることを特徴とする組成物。
【請求項２４】
標的核酸分子の生体外での切断方法であって、
ａ）請求項１に記載の触媒ＤＮＡ分子を、第一及び第二の基質結合領域に対して相補的な予め選択した基質核酸配列を有する標的核酸分子と混合し、反応混合物を形成する工程、及び、
ｂ）該混合物を予め決定した反応条件下で維持し、触媒ＤＮＡ分子が標的核酸分子を切断し、これにより基質生成物集団を生成する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
基質がＲＮＡを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
予め決定した反応条件が、一価のカチオン、二価のカチオン又はその両方の存在を含んでいる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
混合工程が、触媒ＤＮＡ分子を、標的核酸分子を含む細胞へ導入することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
標的核酸分子中の予め選択した基質核酸配列を切断する触媒ＤＮＡ分子の製造方法であって、
ａ）標的核酸分子中の長さ１０〜２６ヌクレオチドの基質核酸配列を選択する工程、及び、
ｂ）コア領域に隣接する第一及び第二の基質結合領域を含むデオキシリボ核酸分子を合成する工程
を含み、
該第一の基質結合領域は、該予め選択した基質核酸配列の第一の部分に相補的な配列を有し、
該第二の基質結合領域は、該予め選択した基質核酸配列の第二の部分に相補的な配列を有し、
該コア領域は下記式で示される配列：
（Ｉ．）  Ｔ（ステム）’ＡＧＣ（ステム）”Ｚ，
（式中、（ステム）’及び（ステム）”は、それぞれ３つの連続ヌクレオチドであり、（ステム）’：（ステム）”としてハイブリダイズしたときに少なくとも２つのＧ：Ｃを含む３つの塩基対を形成し、Ｚ＝ＷＣＧＲ又はＷＣＧＡＡであり、Ｗ＝Ａ又はＴであり、Ｒ＝Ａ又はＧであり、但しＺがＴＣＧＡＡである場合は除く。）又は、
（ＩＩ．）  ＲＧＧＣＴＡＧＣＸＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号１２２）
（式中、Ｘ＝Ｔ、Ｃ又はＡであり、Ｒ＝Ａ又はＧである。）
を有し、
前記第一又は第二の基質結合領域が５〜１３ヌクレオチドの長さであって、
但し当該触媒ＤＮＡ分子は配列番号１８、５６、８１及び８５乃至８７のいずれかの配列から成る分子ではないことを特徴とする、前記方法。
【請求項２９】
式Ｉが配列番号１２０を規定している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
式ＩＩが配列番号１２１を規定している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
触媒ＤＮＡ分子が、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、修飾ＤＮＡ、ヌクレオチド類似体又はこれらの複合体を含んでいる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
基質核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、ヌクレオチド類似体又はこれらの複合体を含んでいる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
触媒ＤＮＡ分子が、５’及び３’末端を有する一本鎖デオキシリボ核酸を含んでおり、該末端がエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドで修飾されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドがヌクレオシドホスホロチオネートを含んでいる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第一又は第二の基質結合領域が、少なくとも２つのホスホロチオネートヌクレオシドを含んでいる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
コア領域が、コア内のジピリミジン上にホスホロチオネートヌクレオシド残基を含んでいる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
３’末端が逆方向（３’，３’−結合）ヌクレオチドを含んでいる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
触媒ＤＮＡ分子が、２’Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含んでいる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
第一及び第二の基質結合領域が、配列番号１０２〜１１９からなる群より選ばれる配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいる、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
分子が、０．０５〜１０００ナノモルのＫｍで反応を触媒する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
分子が、０．００５〜０．１分−１の触媒反応代謝回転速度（ｋｃａｔ）を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
エンドヌクレアーゼ活性が二価カチオンの存在により増強される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
二価カチオンが、Ｐｂ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋からなる群より選ばれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
エンドヌクレアーゼ活性が一価カチオンの存在により増強される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
一価カチオンがＮａ＋及びＫ＋からなる群より選ばれる、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、他の核酸分子、特にＲＮＡを切断することができる核酸酵素又は触媒（酵素）ＤＮＡ分子に関する。本発明は、また、開示された酵素ＤＮＡ分子を含む組成物及びその酵素及び組成物を製造及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然の状況外で作用し、天然では示さない反応も触媒する触媒が求められたことにより“酵素工学”技術の開発がもたらされた。酵素工学に用いられた通常の経路は“合理的な設計”法であり、新しい酵素の構築を促進することを天然酵素の理解に頼ってきた。残念ながら、タンパク質の構造と化学の領域における熟達状態は新規な生物学的触媒の生成を日常的にするには不十分である。
【０００３】
最近、新規な触媒を開発する異なる方法が用いられた。その方法は、高分子の不均一なプールの構築及び所望の反応を触媒する該プールから分子を単離する試験管内選択法の適用を必要とする。高分子のプールから触媒を選択することは、構造特性や化学的性質の網羅的な理解に依存しない。従って、その方法は“不合理な設計”と呼ばれた（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５３８１−５３８３，１９９２）。
【０００４】
今までの酵素ＤＮＡ分子の合理的な設計に伴うほとんどの努力は触媒作用を基本的に新しくしたり改良した分子をもたらさなかった。しかしながら、天然での生物のダーウィン的進化後にパターン化される“特定分子生成”又は“試験管内生成”として我々が記載した方法による不合理な設計法を適用することにより、望ましい機能特性をもつＤＮＡ分子の生産がもたらされる可能性がある。
【０００５】
この手法は、溶液中のＲＮＡ分子（例えば、Ｍｉｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５８：８３，１９６７；Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３４７：４０６，１９９０；Ｃｈｏｗｒｉｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：３２０，１９９１；Ｊｏｙｃｅ，Ｇｅｎｅ，８２：８３，１９８９；Ｂｅａｕｄｒｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５−６４１，１９９２；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３４４：４６７，１９９０を参照されたい）、及び固体支持体に結合するリガンドに結合したＲＮＡ（Ｔｕｅｒｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５，１９９０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８，１９９０）にいろいろな程度の成功で適用されている。また、固体支持体に直接結合したぺプチド（Ｌａｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２，１９９１）；及びウイルスコートタンパク質内で発現したぺプチドエピトープ（Ｓｃｏｔｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：２４９，１９９０；Ｃｗｉｒｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８，１９９０）にも適用されている。
【０００６】
触媒ＲＮＡの発見から１０年が過ぎた（Ｋｒｕｇｅｒら，Ｃｅｌｌ，３１：１４７−１５７，１９８２；Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ，３５：８４９−８５７，１９８３）。既知の天然に存在するリボザイムのリストは増加し続けており（Ｃｅｃｈ，Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ，Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ  ＆  Ａｔｋｉｎｓ（ｅｄｓ．），ｐｐ．２３９−２６９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９３）；Ｐｙｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：７０９−７１４，１９９３；Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，４：３２２−３３０，１９９４を参照されたい）、最近では試験管内生成により得られた合成リボザイムが増加してきた（Ｊｏｙｃｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，４：３３１−３３６，１９９４；Ｂｒｅａｋｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：２６８−２７５，１９９４；Ｃｈａｍａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，４：６１８−６２２，１９９４を参照されたい）。
【０００７】
ＤＮＡも同様に触媒活性を有すると考えることは合理的なことであり、ほとんどがＲＮＡと同じ官能基を含むと考えられる。しかしながら、ある種のウイルスゲノムと複製中間体を除いて、生物体のＤＮＡのほとんど全部が完全な二重らせんとして存在し、二次及び三次複合構造をとることを防止している。従って、ＤＮＡ酵素が天然に見られないことは驚くべきことではない。
【０００８】
本発明の出現まで、ヌクレオチド切断能力を有する触媒ＤＮＡ分子の設計、合成及び使用は開示も証明もされていない。従って、本明細書に開示された発見や発明は、他の核酸、特にＲＮＡを切断する酵素ＤＮＡ分子を含む著しく効率のよい触媒分子を設計する手段として試験管内生成の可能性を強調する点で特に重要である。
【０００９】
発明の要約
本発明は、特定の切断部位において基質の核酸（ＮＡ）配列を切断することができる合成又は工学的（即ち、天然に存在しない）触媒ＤＮＡ分子（又は酵素ＤＮＡ分子）を記載する。本発明は、また、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素ＤＮＡ分子を企図する。
【００１０】
好ましい触媒ＤＮＡ分子は、予め選択された基質核酸配列において切断部位を限定しているヌクレオチド配列に特異的な部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する。該ＤＮＡ分子は、コア領域を隣接している第１及び第２基質結合領域を有し、該第１基質結合領域は予め選択された基質核酸配列の第１部分に相補的な配列を有し、該第２基質結合領域は予め選択された基質核酸配列の第２部分に相補的な配列を有する。コア領域は下記式の配列を有する。
（Ｉ．）    Ｔ（ステム）′ＡＧＣ（ステム）″Ｚ、
（式中、（ステム）′及び（ステム）″は各々３連続ヌクレアーゼであり、（ステム）′：（ステム）″対としてハイブリダイズした場合、少なくとも２つのＧ：Ｃ対を含む３つの塩基対を含み、Ｚ＝ＷＣＧＲ又はＷＣＧＡＡであり、Ｗ＝Ａ又はＴ及びＲ＝Ａ又はＧである。）好適実施態様においては、式Ｉは配列番号１２０（８−１７）を定義している。
【００１１】
また、下記式の配列を有するコア領域も企図する。
（ＩＩ．）    ＲＧＧＣＴＡＧＣＸＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号）
（式中、Ｘ＝Ｔ、Ｃ又はＡであり、Ｒ＝Ａ又はＧである。）好適実施態様においては、式Ｉは配列番号１２１（１０−２３）を定義している。
【００１２】
他の実施態様においては、エンドヌクレアーゼ活性は、基質核酸配列において一本鎖核酸を含む切断部位を限定しているヌクレオチド配列に特異的である。他の好適態様においては、切断部位は二本鎖核酸である。同様に、基質核酸配列は、一本鎖、二本鎖、部分的一本鎖又は二本鎖、ループ、又はその組合わせである。
【００１３】
企図した他の実施態様においては、基質核酸配列は１以上のヌクレオチド類似体が含まれている。態様においては、基質核酸配列は大きな分子の一部、又はそれに結合されている。
【００１４】
種々の実施態様においては、その大きな分子はＲＮＡ、修飾したＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾したＤＮＡ、ヌクレオチド類似体、又はその複合物からなる群より選ばれる。他の例においては、その大きな分子は核酸配列と非核酸配列の複合物を含んでいる。
【００１５】
他の実施態様においては、本発明は、基質核酸配列が１以上のヌクレオチド類似体を含むことを企図している。他の態様は、一本鎖核酸がＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾したＲＮＡ、修飾したＤＮＡ、１以上のヌクレオチド類似体、又はその複合物を含むことを企図している。開示された本発明の実施態様においては、エンドヌクレアーゼは、ホスホエステル結合を切断部位で加水分解的に切断することを含んでいる。
【００１６】
種々の好適実施態様においては、本発明の触媒ＤＮＡ分子は全部又は一部が一本鎖である。これらの触媒ＤＮＡ分子は、触媒活性と一致した種々の形をとることが好ましい。従って、態様においては、本発明の触媒ＤＮＡ分子は１以上のヘアピンループ構造が含まれている。他の態様においては、触媒ＤＮＡ分子は“ハンマーヘッド”リボザイムと同様の形をとるものである。他の実施態様においては、触媒ＤＮＡ分子はテトラヒメナ・テルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）リボザイム、例えば、グループＩイントロンから誘導されたものと同様のコンホメーションをとるものである。
【００１７】
同様に、本発明の好ましい触媒ＤＮＡ分子は、基質分子のもとの向きに無関係に部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を示すことができる。従って、好適実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は酵素ＤＮＡ分子から分離している基質核酸配列を切断することができる。即ち、ＤＮＡｚｙｍｅに結合されていない。他の実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子は結合した基質核酸配列を切断することができる。即ち、自己切断と同じ反応を行うことができる。
【００１８】
本発明は、また、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素ＤＮＡ分子（触媒ＤＮＡ分子、デオキシリボザイム又はＤＮＡｚｙｍｅ）を企図し、よってエンドヌクレアーゼ活性には２価の陽イオンの存在が必要である。種々の代替的好適実施態様においては、２価の陽イオンはＰｂ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、及びＣａ２＋からなる群より選ばれる。他の態様は、エンドヌクレアーゼ活性が１価の陽イオンの存在を必要とすることを企図する。その代替的実施態様においては、１価の陽イオンはＮａ＋及びＫ＋からなる群より選ばれることが好ましい。
【００１９】
本発明の種々の好適実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子は、配列番号３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含んでいる。他の好適実施態様においては、本発明の触媒ＤＮＡ分子は、配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；及び配列番号３９からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含んでいる。
【００２０】
他の好適実施態様は、本発明の触媒ＤＮＡ分子が配列番号５０及び配列番号５１からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含んでいる。他の好適実施態様においては、本発明の触媒ＤＮＡ分子は配列番号５２〜１０１からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含んでいる。本明細書に開示されるように、本明細書に開示されたものと実質的に同じ配列を有する触媒ＤＮＡ分子も企図される。従って、他の有効な種々の酵素ＤＮＡ分子を作成するために種々の置換、欠失、挿入、複製及び他の突然変異が本明細書中に記載された分子に行なわれる。前記分子が本明細書に開示された部位特異的切断活性を示す限り、本開示の境界の範囲内である。
【００２１】
本発明の態様においては、更に、本発明の酵素ＤＮＡ分子の基質結合親和性が約１μＭ以下であることが好ましい。他の実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は約０．１μＭ未満のＫＤで基質を結合する。
【００２２】
本発明は、また、有効な代謝回転速度を有する酵素ＤＮＡ分子を開示する。実施態様においては、代謝回転速度は５ｈｒ−１未満である。好適実施態様においては、代謝回転速度は約２ｈｒ−１未満である。更に好適な実施態様においては、代謝回転速度は約１ｈｒ−１未満である。なお更に好適な実施態様においては、代謝回転速度は約０．６ｈｒ−１未満である。
【００２３】
他の実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は有効な代謝回転速度を示し、ｋｏｂｓは１ｍｉｎ−１未満、好ましくは０．１ｍｉｎ−１未満、更に好ましくは０．０１ｍｉｎ−１未満、なお更に好ましくは０．００５ｍｉｎ−１未満である。態様においては、ｋｏｂｓ値は約０．００２ｍｉｎ−１以下である。
【００２４】
本発明は、また、開示されたＤＮＡ酵素の触媒速度が十分に最適化されている実施態様を企図する。従って、種々の好適実施態様においては、Ｍｇ２＋の存在によって高められた反応のＫｍは約０．５〜２０ｍＭ、好ましくは約１〜１０ｍＭ、更に好ましくは約２〜５ｍＭである。
【００２５】
本発明は、また、切断部位を限定しているヌクレオチド配列が少なくとも１のヌクレオチドを含む実施態様を企図する。他の種々の好適実施態様においては、本発明の触媒ＤＮＡ分子は２以上のヌクレオチドの切断部位を限定するヌクレオチド配列を認識及び切断することができる。
【００２６】
種々の好適実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、１以上の基質結合領域が隣接した保存コアを含んでいる。実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子には第１及び第２基質結合領域が含まれている。他の実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子には２以上の基質結合領域が含まれている。
【００２７】
上記のように、本発明の好ましい触媒ＤＮＡ分子にも保存コアが含まれる。好適実施態様においては、保存コアは１以上の保存領域を含んでいる。他の好適態様においては、１以上の保存領域にはＣＧ；ＣＧＡ；ＡＧＣＧ；ＡＧＣＣＧ；ＣＡＧＣＧＡＴ；ＣＴＴＧＴＴＴ；及びＣＴＴＡＴＴＴからなる群より選ばれたヌクレオチド配列が含まれている（例えば、図３を参照されたい）。
【００２８】
本発明の実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、更に、保存コア内の保存領域間に１以上の可変ヌクレオチド又はスペーサーヌクレオチドを含んでいる。他の実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、更に、保存コアと基質結合領域間に１以上の可変ヌクレオチド又はスペーサーヌクレオチドを含んでいる。
【００２９】
態様においては、第１基質結合領域はＣＡＴＣＴＣＴ；ＧＣＴＣＴ；ＴＴＧＣＴＴＴＴＴ；ＴＧＴＣＴＴＣＴＣ；ＴＴＧＣＴＧＣＴ；ＧＣＣＡＴＧＣＴＴＴ（配列番号４０）；ＣＴＣＴＡＴＴＴＣＴ（配列番号４１）；ＧＴＣＧＧＣＡ；ＣＡＴＣＴＣＴＴＣ；及びＡＣＴＴＣＴからなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含むことが好ましい。他の好適態様においては、第２基質結合領域にはＴＡＴＧＴＧＡＣＧＣＴＡ（配列番号４２）；ＴＡＴＡＧＴＣＧＴＡ（配列番号４３）；ＡＴＡＧＣＧＴＡＴＴＡ（配列番号４４）；ＡＴＡＧＴＴＡＣＧＴＣＡＴ（配列番号４５）；ＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴ（配列番号４６）；ＴＡＴＡＧＴＧＴＡ；ＡＴＡＧＴＣＧＧＴ；ＡＴＡＧＧＣＣＣＧＧＴ（配列番号４７）；ＡＡＴＡＧＴＧＡＧＧＣＴＴＧ（配列番号４８）；及びＡＴＧＮＴＧからなる群より選ばれたヌクレオチド配列が含まれている。
【００３０】
本発明の種々の実施態様においては、基質結合領域は長さが変化する。従って、例えば、基質結合領域は１のヌクレオチドから１２のヌクレオチドを含む。しかしながら、長さが約３〜２５ヌクレオチド、好ましくは約３−１５ヌクレオチド、更に好ましくは約３−１５ヌクレオチドの基質結合領域が特に好ましいことが理解される。種々の実施態様においては、基質結合領域内の個々のヌクレオチドは基質分子のヌクレオチドと相補的塩基対を結合することができる。他の実施態様においては、非相補的塩基対も形成されている。相補的及び非相補的塩基対合の混合物も本発明の開示された実施態様の範囲内に包含するものとして企図される。
【００３１】
他の好適実施態様においては、本発明の触媒ＤＮＡ分子は、更に、第３基質結合領域を含んでいる。いくつかの好適実施態様においては、該第３領域にはＴＧＴＴ；ＴＧＴＴＡ；及びＴＧＴＴＡＧからなる群より選ばれたヌクレオチド配列が含まれている。本発明の他の好適実施態様には、基質結合領域間に１以上の可変領域又は“スペーサー”領域を更に含む酵素ＤＮＡ分子が開示されている。
【００３２】
他の開示された実施態様においては、本発明は、他のＤＮＡ分子及びオリゴヌクレオチドから分離した、エンドヌクレアーゼ活性を有する精製した合成酵素ＤＮＡ分子を企図し、該エンドヌクレアーゼ活性は基質核酸配列内の一本鎖又は二本鎖核酸を含む切断部位を限定するヌクレオチド配列に特異的である。態様においては、エンドヌクレアーゼ活性を有する合成（工学的）酵素ＤＮＡ分子は基質核酸配列の実質的に一本鎖又は二本鎖領域を含む切断部位を限定しているヌクレオチド配列に特異的である。
【００３３】
他の実施態様においては、本発明は、核酸含有基質を加水分解して基質切断産物を得る触媒活性を有するデオキシリボヌクレオチドポリマーを含む酵素ＤＮＡ分子を企図している。態様においては、加水分解は部位特異的な方法で起こる。上記のように、ポリマーは一本鎖、二本鎖、又は双方の組合わせである。
【００３４】
本発明は、更に、核酸配列を含む基質を企図する。種々の実施態様においては、核酸配列は、ＲＮＡ、修飾したＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾したＤＮＡ、１以上のヌクレオチド類似体、又はその複合物を含んでいる。実施態様は、基質が一本鎖セグメントを含むことを企図する。他の実施態様は、基質が二本鎖であることを企図する。
【００３５】
本発明は、また、核酸含有基質を加水分解して切断産物を得る触媒活性を有するデオキシリボヌクレオチドポリマーを含む酵素ＤＮＡ分子を企図する。態様においては、酵素ＤＮＡ分子は基質に対して効果的な結合親和性を有し、切断産物に対して効果的な結合親和性を欠いている。
【００３６】
好適実施態様においては、本発明は、認識ドメイン、可変領域、及びスペーサー領域が隣接した保存コアを限定しているヌクレオチド配列を含む天然に存在しない酵素ＤＮＡ分子を開示している。従って、好適実施態様においては、ヌクレオチド配列は、分子の５′末端に近接又は隣接する第１可変領域、３′末端→第１可変領域に位置する第１認識ドメイン、３′末端→第１認識ドメインに位置する第１スペーサー領域、３′末端→第１スペーサー領域に位置する第１保存領域、３′末端→第１保存領域に位置する第２スペーサー領域、３′末端→第２スペーサー領域に位置する第２保存領域、３′末端→第２保存領域に位置する第２認識ドメイン、及び３′末端→第２認識ドメインに位置する第２可変領域を限定している。
【００３７】
他の実施態様においては、ヌクレオチド配列は、分子の５′末端に近接又は隣接する第１可変領域、３′末端→第１可変領域に位置する第１認識ドメイン、３′末端→第１認識ドメインに位置する第１スペーサー領域、３′末端→第１スペーサー領域に位置する第１保存領域、３′末端→第１保存領域に位置する第２スペーサー領域、３′末端→第２スペーサー領域に位置する第２保存領域、３′末端→第２保存領域に位置する第２認識ドメイン、３′末端→第２認識ドメインに位置する第２可変領域、及び３′末端→第２可変領域に位置する第３認識ドメインを限定している。
【００３８】
上記態様においては、分子には２つの基質結合ドメインが隣接した保存コア領域が含まれる。他の態様においては、保存コア領域は１以上の保存ドメインを含んでいる。他の好適実施態様においては、保存コア領域は１以上の可変ヌクレオチド又はスペーサーヌクレオチドを含んでいる。他の実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、更に、１以上のスペーサー領域を含んでいる。
【００３９】
本発明は、更に、種々の組成物を企図する。例えば、上記酵素ＤＮＡ分子を含む組成物が開示及び企図される。代替的実施態様においては、本発明の組成物は、２集団以上の上記酵素ＤＮＡ分子を含み、酵素ＤＮＡ分子の各集団は基質中の異なる配列を切断することができる。他の態様においては、組成物は、２集団以上の上記酵素ＤＮＡ分子を含み、酵素ＤＮＡ分子の各集団は異なる基質を認識することができる。種々の実施態様においては、組成物は１価又は２価の陽イオンを含むことが好ましい。
【００４０】
本発明は、更に、本発明の酵素ＤＮＡ分子を作成、選択、及び単離する方法を企図する。態様においては、核酸（例えば、ＲＮＡ）を特定部位で切断する酵素ＤＮＡ分子を選択する方法は、次の工程：（ａ）配列が天然に存在するか合成かの推定酵素ＤＮＡ分子、好ましくは一本鎖ＤＮＡ分子であるものの集団を得る工程；（ｂ）ヌクレオチド含有基質配列と上記ＤＮＡ分子の集団とを混合して混合物を形成する工程；（ｃ）該混合物を該集団内の該推定酵素ＤＮＡ分子が該基質配列を切断させるのに十分な時間及び所定の反応条件下で維持し、よって基質切断産物を得る工程；（ｄ）ＤＮＡ分子の該集団を該基質配列と基質切断産物から分離する工程；（ｅ）基質核酸配列（例えば、ＲＮＡ）を特異的部位で切断するＤＮＡ分子を該集団から単離する工程を含んでいる。
【００４１】
前記方法の態様においては、基質核酸配列を特異的部位で切断するＤＮＡ分子は固定化剤で標識される。例においては、該薬剤はビオチンを含んでいる。
【００４２】
上記方法の他の態様においては、切断したい配列−−例えば、予め決められた“標的”ヌクレオチド配列−−をそのために操作した酵素ＤＮＡ分子を用いて選択することにより開始する。従って、実施態様においては、予め選択された（又は予め決められた）“標的”配列を用いて特異的部位の基質核酸配列を１以上のランダムの配列又はセグメントを含むデオキシリボ核酸配列に結合する又は“標識する”ことにより基質核酸配列を特異的切断部位で切断することができるＤＮＡ分子の集団を作成する。態様においては、ランダムの配列は長さが約４０ヌクレオチドである。他の態様においては、ランダムの配列は長さが約５０ヌクレオチドである。長さが１〜４０、４０〜５０、及び５０〜１００ヌクレオチドであるランダムの配列が本発明によって企図される。
【００４３】
本発明の実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子の集団を作成するために用いられるヌクレオチド配列は配列番号４、２３、５０及び５１からなる群より選ばれる。他の実施態様においては、“標的”又は“基質”ヌクレオチド配列は１以上のリボヌクレオチドの配列を含んでいる−−例えば、配列番号４及び２３の関連する部分、及び配列番号４９を参照されたい。また、有効な“標的”又は“基質”ヌクレオチド配列はＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその複合物を含むことが本発明によって企図される。
【００４４】
本発明は、また、分離工程が標識したＤＮＡ分子をアビジンが結合した固体表面に暴露し、よって標識したＤＮＡ分子が固体表面に結合する工程を更に含む上記方法を企図する。前のように、基質はＲＮＡ、ＤＮＡ、双方の複合物、又はヌクレオチド配列を含む分子である。
【００４５】
本発明は、また、（ａ）基質核酸配列を特異的切断部位で切断することができる酵素ＤＮＡ分子を供給する工程；及び（ｂ）該酵素ＤＮＡ分子と該核酸配列とを接触させて該核酸配列を切断部位で特異的に切断させる工程を含む、基質核酸配列を特定の切断部位で特異的に切断する方法を企図する。態様においては、該酵素ＤＮＡ分子は天然に存在しない（又は合成）ＤＮＡ分子である。他の態様においては、該酵素ＤＮＡ分子は一本鎖である。
【００４６】
上記方法の他の態様においては、該基質は核酸を含んでいる。種々の実施態様においては、該基質核酸は、ＲＮＡ、修飾したＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾したＤＮＡ、１以上のヌクレオチド類似体、又はその複合物を含んでいる。他の実施態様においては、該特異的切断は、酵素ＤＮＡ分子のエンドヌクレアーゼ活性によって引き起こされる。反応条件の変更−−例えば、ｐＨ、温度、陽イオン％、酵素％、基質％、及び産物％の調整−−もその中に企図される。
【００４７】
本発明は、また、（ａ）基質核酸配列を特定の切断部位で切断することができる触媒ＤＮＡ分子とホスホエステル結合含有基質とを混合して反応混合物を形成する工程；及び（ｂ）該混合物を該酵素ＤＮＡ分子が該ホスホエステル結合を切断することを可能にする所定の反応条件下で維持し、よって基質産物の集団を得る工程を含む、ホスホエステル結合を切断する方法を企図する。実施態様においては、該酵素ＤＮＡ分子は部位特異的な方法でホスホエステル結合を切断することができる。他の実施態様においては、該方法は、更に、（ｃ）該産物を該触媒ＤＮＡ分子から分離する工程；及び（ｄ）追加の基質を該酵素ＤＮＡ分子に付加して新しい反応混合物を形成する工程を含んでいる。
【００４８】
本発明は、また、ホスホエステル結合を切断する酵素ＤＮＡ分子を操作する方法を企図する。具体的な方法は、次の工程：（ａ）一本鎖ＤＮＡ分子の集団を得る工程；（ｂ）遺伝子変化を該集団に導入して変異集団を得る工程；（ｃ）所定の選択基準に適合する該変異集団から個体を選択する工程；（ｄ）該選択した個体を該変異集団の残部から分離する工程；及び（ｅ）該選択した個体を増幅する工程を含んでいる。
【００４９】
詳細な説明
Ａ．定義
本明細書に用いられる“デオキシリボザイム”という用語は、酵素として機能することができるＤＮＡ含有核酸を記載するために用いられる。本開示においては、“デオキシリボザイム”という用語は、エンドリボヌクレアーゼ及びエンドデオキシリボヌクレアーゼを含むが、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するデオキシリボザイムが特に好ましい。デオキシリボザイムと同じ意味で用いられる他の用語は、“酵素ＤＮＡ分子”、“ＤＮＡｚｙｍｅ”、又は“触媒ＤＮＡ分子”であり、合成で製造されるとしても生物又は他の供給源から誘導されるとしても全てその酵素活性部分を含むことは理解されなければならない。
【００５０】
“酵素ＤＮＡ分子”という用語は、また、指定したオリゴヌクレオチド標的又は基質に対して基質結合領域に相補性を有するＤＮＡ分子が含まれる。その分子は、また、オリゴヌクレオチド基質を特異的に切断するのに活性である酵素活性を有する。他の方法で述べた酵素ＤＮＡ分子は、分子間でオリゴヌクレオチド基質を切断することができる。この相補性は、基質の分子間切断を起こさせる基質のオリゴヌクレオチドに対して酵素ＤＮＡ分子の十分なハイブリダイゼーションを可能にするように機能する。１００パーセント（１００％）相補性が好ましいが、７５〜１００％の範囲の相補性が有効であり、本発明によって企図される。
【００５１】
本発明の酵素ＤＮＡ分子は、ヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼ活性を有するものとして代替的に記載される。これらの用語は、本明細書中で同じ意味で用いられる。
【００５２】
本明細書に用いられる“酵素核酸”という用語は、酵素ＲＮＡ又はＤＮＡ分子、酵素ＲＮＡ−ＤＮＡポリマー、及びその酵素活性部分又は誘導体を包含するが、酵素ＤＮＡ分子は本発明の酵素活性分子の特に好ましい種類である。
【００５３】
本明細書に用いられる“エンドデオキシリボヌクレアーゼ”という用語は、主としてＤＮＡを含む基質を切断することができる酵素である。本明細書に用いられる“エンドリボヌクレアーゼ”という用語は、主としてＲＮＡを含む基質を切断することができる酵素である。
【００５４】
本明細書に用いられる“塩基対”（ｂｐ）という用語は、一般的にはアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）との関係、又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との関係を記載するために用いられるが、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ（及びＵ）の一般的でない類似体も塩基対合に関与するときがあることは理解されなければならない。ＤＮＡ又はＲＮＡが二本鎖構造をとる場合に普通対になるヌクレオチドは、“相補的塩基”も言われる。
【００５５】
“相補的ヌクレオチド配列”は、一般的には、結果としての水素結合で特異的にハイブリダイズする他のオリゴヌクレオチド単鎖上のものと十分に相補的である一本鎖分子又はＤＮＡ又はＲＮＡセグメント内のヌクレオチドの配列を意味する。
【００５６】
“ヌクレオチド”は、一般的には、糖部分（ペントース）、リン酸基、及び含窒素複素環塩基からなるＤＮＡ又はＲＮＡのモノマー単位を意味する。塩基は糖部分にグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介して結合し、その塩基と糖の組合わせは“ヌクレオシド”である。ヌクレオシドがペントースの３′又は５′位に結合したリン酸基を含む場合、ヌクレオチドと呼ばれる。操作上結合したヌクレオチド配列は典型的には“塩基配列”又は“ヌクレオチド配列”、及び文法上の相当語句と呼ばれ、特にことわらない限り、左→右の向きが５′末端→３′末端の慣用の向きである式で表される。
【００５７】
“ヌクレオチド類似体”は、一般的には、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵと構造的に異なるプリン又はピリミジンヌクレオチドを意味するが、核酸分子の通常のヌクレオチドを置き換えるのに十分に類似しているものである。本明細書に用いられる“ヌクレオチド類似体”という用語は、修飾塩基、異なる又は特異な糖（即ち、“通常”のペントース以外の糖）、又はその２つの組合わせを包含する。塩基が修飾された具体的な類似体の表を下記Ｃ項に示す。
【００５８】
“オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド”は、一般的には、一本鎖又は二本鎖ヌクレオチドのポリマーを意味する。本明細書に用いられる“オリゴヌクレオチド”及びその文法上の相当語句は完全な範囲の核酸を含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、線状鎖のリボヌクレオチドを含む核酸分子を意味する。正確なサイズは、当該技術において周知であるように、多くの要因に左右され、最後の使用条件にも左右される。
【００５９】
本明細書に用いられる“生理的条件”という用語は、哺乳動物生物、特にヒトに見られるものに匹敵する反応条件を示すことを意味する。温度、陽イオンの利用可能性、及びｐＨ範囲のような可変部分は下で詳述されるように変動するが、“生理的条件”は通常は約３５〜４０℃の温度、特に好ましくは３７℃、及び約７．０〜８．０のｐＨ、特に好ましくは７．５を含み、更に、陽イオン、好ましくは２価及び／又は１価の陽イオンの利用可能性、特に好ましくは約２〜１５ｍＭ  Ｍｇ２＋及び０〜１．０Ｍ  Ｎａ＋の濃度を含む。本明細書に用いられる“生理的条件”は、遊離のヌクレオシド補因子の存在が含まれてもよい。上述したように、好ましい条件は下で詳述される。
【００６０】
Ｂ．酵素ＤＮＡ分子
種々の実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、付加、欠失、及び置換を含む１以上の修飾又は突然変異を組合わせることができる。代替的実施態様においては、その突然変異又は修飾はランダム又は特定の突然変異又は修飾を生じる方法を用いて作成される。これらの突然変異は、例えば、ループ、スペーサー領域又は認識配列（又はドメイン）の長さを変え、ヌクレオチド配列を変える。触媒活性酵素ＤＮＡ分子内の１以上の突然変異は、第２触媒活性酵素ＤＮＡ分子内の突然変異と組合わせて両分子の突然変異を含む新しい酵素ＤＮＡ分子を得ることができる。
【００６１】
他の好適実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、当業者に周知の種々の方法を用いて導入されたランダム突然変異を有するものである。例えば、Ｃａｄｗｅｌｌら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２８−３３，１９９２によって記載された方法は、後記実施例に記載されるように変更したその中に開示された使用が特に好ましい。（Ｃａｄｗｅｌｌら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１３６−Ｓ１４０，１９９２４を参照も参照されたい。）この変更ＰＣＲ法によれば、ランダム点突然変異はクローン化遺伝子に導入される。
【００６２】
上記方法は、例えば、リボザイムをコードしている遺伝子を配列分析により求められた１位置あたり０．６６±０．１３％（９５％の信頼区間）の突然変異率で突然変異を誘発させるために用いられ、塩基置換の種類に対して強い選択は認められなかった。これにより、本発明の酵素ＤＮＡ分子内のいずれの位置にもランダム突然変異を導入することが可能である。
【００６３】
特定又はランダム突然変異を導入するのに有効な他の方法は、Ｊｏｙｃｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：７１１−７２２，１９８９に開示されている。この後者の方法は、二本鎖ＤＮＡの鋳型（コード）鎖の切り出し、突然変異原オリゴヌクレオチドの取込みによる鋳型鎖の再構築、及び続いての部分的ミスマッチの鋳型の転写を必要とする。これにより、選択した位置に既知の又はランダムヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むことにより分子内のいずれの位置にも特定又はランダム突然変異を導入することが可能である。
【００６４】
本発明の酵素ＤＮＡ分子は、分子の種類や機能によって適するように種々の長さや折りたたみパターンを有するものである。例えば、酵素ＤＮＡ分子は、酵素ＤＮＡ分子は長さが約１５〜約４００以上のヌクレオチドであるが、約２５０以下の長さが大きすぎることにより又は不恰好にすることにより分子の治療有用性を制限することを避けるために好ましい。種々の好適実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は長さが少なくとも約２０ヌクレオチドであり、有効な分子は長さが少なくとも約２０ヌクレオチドであるが、好ましい分子は長さが通常は約１００ヌクレオチド以下である。
【００６５】
種々の治療適用においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子はデオキシリボザイムの酵素活性部分を含んでいる。種々の実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は好ましくは約２００以下のヌクレオチドを含んでいる。他の実施態様においては、本発明のデオキシリボザイムは約１００以下のヌクレオチドを含んでいる。他の好適実施態様においては、本発明のデオキシリボザイムは、長さが約２０〜７５ヌクレオチド、好ましくは約２０〜６５ヌクレオチドである。他の好ましい酵素ＤＮＡヌクレオチドは、長さが約１０〜５０ヌクレオチドである。
【００６６】
他の適用においては、酵素ＤＮＡ分子は、“ハンマーヘッド”リボザイムと同様の構造をとるものである。その酵素ＤＮＡ分子は、長さが好ましくは約７５〜１００ヌクレオチド以下であり、約２０〜５０ヌクレオチドの長さが特に好ましい。
【００６７】
一般的には、本明細書に開示されたように使用する分子を合成するものである場合には、酵素核酸分子が大きくなるほど合成が難しくなる。当業者は、これらの設計束縛を確かに理解する。しかし、その大きな分子は依然として本発明の範囲内にある。
【００６８】
また、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、デオキシリボザイムの酵素活性部分を含み、１以上の突然変異、例えば、欠失、付加又は修飾が酵素として行うための分子の能力に逆に影響しない限り、存在しないか又は修飾した１以上の塩基対形成配列又はスペーサーと共にデオキシリボザイムも含む。
【００６９】
本発明の酵素ＤＮＡ分子の認識ドメインは、典型的には触媒ドメインに隣接している２つのヌクレオチド配列を含み、基質核酸内の塩基の相補的配列に対してハブリダイズすることができ酵素ＤＮＡ分子に高配列特異性を与える典型的には少なくとも約３〜約３０塩基、好ましくは約６〜約１５塩基の配列を有する。周知の方法による認識部位の修飾又は突然変異により、酵素核酸分子の配列特異性を変えることが可能である。（Ｊｏｙｃｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：７１１−７１２，１９８９を参照されたい。）
本発明の酵素核酸分子は、認識部位又はドメインが修飾されたものが含まれる。種々の実施態様においては、これらの修飾認識ドメインは、その認識ドメインを含む酵素核酸分子にユニークな配列特異性を与える。認識ドメイン内に存在する正確な塩基は、切断が生じる塩基配列を決定する。基質核酸の切断は、認識ドメイン内で生じる。この切断により、基質切断配列上の２′、３′、又は２′，３′−環状リン酸基及びもとの基質では最初すぐに３′の基質切断配列であったヌクレオチド上の５′ヒドロキシルが脱離する。切断は、認識配列（内部ガイド配列）内に存在する塩基を変えることにより選択部位に再特定される。Ｍｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２１８−９２２２，１９８９を参照されたい。
【００７０】
更に、酵素ＤＮＡ分子とその基質間の認識と結合を促進するポリアミンを添加することが有効である。有効なポリアミンの例としては、スペルミジン、プトレッシン又はスペルミンが挙げられる。約１ｍＭのスペルミジン濃度が具体的な実施態様において効果的であり、約０．１〜約１０ｍＭの範囲の濃度も有効である。
【００７１】
種々の代替的実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、核酸基質、特にＲＮＡ基質を切断する能力が強化又は最適化される。当業者が理解するように、酵素触媒反応速度は基質や酵素の濃度によって変動し、通常は高基質又は酵素濃度で横ばいになる。その作用を考慮すると、酵素触媒反応速度論は反応を定義する次の条件で記載される。
【００７２】
ＲＮＡ基質を切断する本発明の酵素ＤＮＡ分子の能力の強化又は最適化は、酵素ＤＮＡ分子の存在下に種々の量の標識ＲＮＡ基質との切断反応で求められる。基質を切断する能力は、一般的には触媒速度（ｋｃａｔ）をミカエリス定数（ＫＭ）で割ることにより定義される。記号ｋｃａｔは、基質が飽和値に達したときの酵素反応の最大速度を表す。ＫＭは、反応速度が最大の１／２である基質濃度を表す。
【００７３】
例えば、ＫＭ値とｋｃａｔ値は、本発明においては基質濃度［Ｓ］が酵素ＤＮＡ分子濃度［Ｅ］より過剰である実験により求められる。基質濃度の範囲について反応（ｖ０）の初速度は、初期直線相、通常は反応の最初の５％以下から算出される。データ点を式：ｖ＝−ＫＭ（ｖ０／［Ｓ］）＋Ｖｍａｘで示される理論系に最小自乗法によりあてはめる。従って、ｋｃａｔとＫＭは、反応の初速度、ｖ０、及び基質濃度［Ｓ］により求められる。
【００７４】
種々の代替的実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、核酸基質、好ましくはＲＮＡ基質を切断する能力が強化又は最適化される。好適実施態様においては、ＲＮＡ基質を切断する酵素ＤＮＡ分子の能力の強化又は最適化は、非触媒速度より約１０〜１０９倍改善される。更に好適な実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、“前駆体”種より約１０３〜１０７倍改善された速度でＲＮＡ基質を切断することができる。更に好適な実施態様においては、ＲＮＡ基質を切断する能力の強化又は最適化は、前駆体種より１０４〜１０６倍の改善として示される。当業者は、本発明の試験管内生成法で適用される選択束縛によって変動することを理解する。
【００７５】
本発明のデオキシリボザイム及び他の酵素ＤＮＡ分子及びヌクレアーゼを修飾する種々の好ましい方法を下記の実施例１〜３に記載する。
【００７６】
Ｃ．ヌクレアーゼ類似体
上記のように、本明細書に用いられる“ヌクレアーゼ類似体”という用語は、一般的にはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵと構造的に異なるプリン又はピリミジンヌクレオチドを意味するが、核酸分子内のその“通常の”ヌクレオチドを置き換えるのに十分類似しているものである。本明細書に用いられる“ヌクレオチド類似体”という用語は、修飾塩基、異なる（又は特異な）糖、修飾リン酸骨格、又はそれらの修飾の組合わせを包含する。本発明に有効なヌクレオチド類似体の例は、次の表に示されたものが挙げられ、たいていは３７  ＣＦＲ§１．８２２（本願明細書に含まれるものとする）の修飾塩基の認可された表に見られる。
【００７７】
【表１】
0005066016.tif 000002
0005066016.tif 000003
0005066016.tif 000004
【００７８】
他の有効な類似体としては、公開された国際出願第ＷＯ９２／２０８２３号（この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする）に記載されたもの、又はその中に開示された方法で製造された類似体が含まれる。ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：２２６−２２９，１９９４；ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｓｙｎｌｅｔｔ  ７３３−７３６（Ｏｃｔ．１９９３）；Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００，１９９１；及びＩｄｚｉａｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３４：５４１７−５４２０，１９９３に記載された類似体も開示された発明に有効であり、前記文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【００７９】
Ｄ．酵素ＤＮＡ分子の操作方法
本発明は、また、所定の活性を有する核酸分子の製造方法を企図する。好適実施態様においては、核酸分子は酵素ＤＮＡ分子である。他の態様においては、所望の活性は触媒活性である。
【００８０】
実施態様においては、本発明は、酵素ＤＮＡ分子を合成する方法を企図し、特定の又は所定の反応を触媒するために“操作される”。酵素ＤＮＡ分子を調製する方法は本明細書に記載される。例えば、下記の実施例１〜３を参照されたい。他の実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のような小分子又はリガンドを結合するために操作される。（Ｓａｓｓａｎｆａｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３６４：５５０−５５３，１９９３を参照されたい。）
他の実施態様においては、本発明は、酵素ＤＮＡ分子の集団が変異酵素ＤＮＡ分子（又は“デオキシリボザイム”又は“ＤＮＡｚｙｍｅ”と呼ばれる）の異種集団を得る突然変異を誘発させる条件に供することを企図する。その後、所望の特性を有する酵素ＤＮＡ分子は、その集団から選択及び／又は分離され、続いて増幅される。
【００８１】
また、酵素ＤＮＡ分子の認識ドメインの長さを変えることにより酵素ＤＮＡ分子に突然変異が導入される。酵素ＤＮＡ分子の認識ドメインは、基質核酸配列内の塩基の相補的配列と関連がある。認識ドメインの長さを変える方法は、当該技術において既知であり、例えば、ＰＣＲが含まれる。有効な手法は下記の実施例に記載されている。
【００８２】
酵素ＤＮＡ分子の認識ドメインの長さの変化は、酵素ＤＮＡ分子の結合特異性に対して所望の効果を与えることができる。例えば、認識ドメインの長さの増加は酵素ＤＮＡ分子と基質のオリゴヌクレオチドの相補的塩基配列間の結合特異性を増大し、ハイブリッド基質における具体的な配列の認識も高められる。更に、認識ドメインの長さの増加は基質に結合する親和性を増大させる。種々の実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子内の修飾認識ドメインは、酵素ＤＮＡ分子とその基質間の結合特異性や親和性の増大を与える。
【００８３】
最近、ある種のオリゴヌクレオチドが相補的配列を有するオリゴヌクレオチド以外の分子を認識及び結合することができることが言及された。そのオリゴヌクレオチドは、“アプタマー”という名前もよく示されている。例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎらには種々の有機色素を結合することができるＲＮＡ分子が記載されており（Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８−８２２，１９９０）、Ｂｏｃｋらにはヒトトロンビンを結合するｓｓＤＮＡ分子が記載されている（Ｎａｔｕｒｅ，３５５：５６４−５６６，１９９２）。同様に、Ｊｅｌｌｉｎｅｋらには塩基性線維芽細胞成長因子に対するＲＮＡリガンドが記載されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１１２２７−１１２３１，１９９３）。従って、本発明の触媒活性ＤＮＡ酵素が典型的にはアプタマーと関連がある種々の性能を示すために本明細書に記載された方法に従って操作されることが本明細書において企図される。
【００８４】
従って、当業者は、本発明の酵素ＤＮＡ分子がＰＣＲや３ＳＲ（自己配列複製−−下記実施例１を参照されたい）を含む本明細書に開示される種々の方法により認識ドメインのようなヌクレオチド配列で修飾されることを理解しなければならない。例えば、追加のヌクレオチドはプライマーに追加のヌクレオチドを含めることにより酵素ＤＮＡ分子の５′端に付加される。
【００８５】
本発明の酵素ＤＮＡ分子は、また、部位特定突然変異誘発の使用によりランダムでない方式で調製又は操作される。例えば、部位特定突然変異誘発は、実質的にＭｏｒｉｎａｇａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：６３６，１９８４に記載されるようにデオキシリボザイムに適用するために本明細書に記載されるように変更して行なわれる。酵素ＤＮＡ分子を操作する有効な方法は、更に下記の実施例に記載されている。
【００８６】
開示された実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、２つの基質結合（又は認識）ドメイン又は塩基対合相互作用により基質と相互作用する配列が隣接した保存コアを含んでいる。種々の実施態様においては、保存コアは１以上の保存ドメイン又は配列を含んでいる。他の態様においては、酵素ＤＮＡ分子は、塩基対合に関係する領域（又は配列）間に“スペーサー”領域（又は配列）を含んでいる。他の態様においては、更に、保存コアは１以上の保存されない可変ヌクレオチド又は“スペーサー”ヌクレオチドにより種々の間隔で“中断されている”。
【００８７】
種々の実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子の集団は、少なくとも２種類の異なるデオキシリボザイム分子でつくられている。例えば、態様においては、その分子は異なる配列を有する。他の態様においては、デオキシリボザイムは、ヌクレオチド配列の５′末端に近接又は隣接している認識ドメインを限定している核酸配列を有する核酸分子である。種々の代替的実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、更に、３′末端→認識ドメインに位置する１以上のスペーサー領域、３′末端→認識ドメインに位置する１以上のループ及び／又はスペーサー領域を含んでいる。他の態様においては、本発明のデオキシリボザイムは、同じ分子の他の領域に対してハイブリダイズすることができる１以上の領域を含んでいる。開示された方法に従って得られた酵素ＤＮＡ分子の他の特性は他で記載される。
【００８８】
他の実施態様においては、突然変異誘発条件としては酵素ＤＮＡ分子内に特定又はランダムヌクレオチド置換を導入する条件が含まれる。典型的な突然変異誘発条件の例は、本明細書の他の部分及びＪｏｙｃｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：７１１−７２２，１９８９；Ｊｏｙｃｅ，Ｇｅｎｅ，８２：８３−８７，１９８９；及びＢｅａｕｄｒｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５−４１，１９９２に記載された方法に開示されている。
【００８９】
他の実施態様においては、本発明の変異酵素核酸分子の異種集団は、正確に同じヌクレオチド配列をもたない少なくとも２種の核酸分子を含むものである。他の態様においては、その異種集団から所定の活性を有する酵素ＤＮＡ分子又は他の酵素核酸が所定の活性を行う能力に基づいて選択される。種々の態様においては、所定の活性は、高触媒活性、低ＫＭ、高基質結合能、修飾基質特異性等を含むが限定されない。
【００９０】
酵素性能の態様とみなされる他のパラメーターとしては、触媒活性又は能力、基質結合能、酵素代謝回転速度、フィードバック機序に対する酵素感受性等が含まれる。ある態様においては、基質特異性は、特に酵素が２以上の相対する基質を認識及び結合することができ、その各々が他の基質に対して酵素の性能に影響する状態においては酵素性能の態様とみなされている。
【００９１】
本明細書に用いられる基質特異性は、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ、又はその双方の複合物のような具体的な基質に対する本明細書に記載される酵素核酸分子の特異性を意味する。基質分子は、また、ヌクレオチド類似体を含む。種々の実施態様においては、本発明の酵素核酸分子は、ハイブリッド又は非ハイブリッド基質の具体的な領域に優先的に結合するものである。
【００９２】
“基質特異性”として本明細書に同定された用語又はパラメーターは、配列特異性が含まれる。即ち、本発明の酵素核酸分子は、具体的な核酸配列を有する核酸基質を“認識”し、それに結合する。例えば、本発明の酵素核酸分子の基質認識ドメインが単に一連の１又は２のリボヌクレオチド（例えば、ｒＡ）を有する基質分子に一列に結合する場合には、酵素核酸分子はその配列を欠く核酸基質分子を認識又は結合しない傾向がある。
【００９３】
選択工程について、種々の実施態様においては、選択は所定の活性を有する変異酵素核酸を変異酵素核酸の異種集団から物理的に分離する手段が含まれる。たいてい、選択はサイズ、触媒活性の存在、又は変異核酸を他の核酸、ぺプチド、又は溶液中であるか又は固体マトリックスに結合した他の分子に対してハイブリダイズすることによる分離を含んでいる。
【００９４】
種々の実施態様においては、所定の活性は、所定の活性を有する変異酵素核酸がある様式で活性によって標識されるようになるものである。例えば、所定の活性は酵素ＤＮＡ分子活性であり、よって基質上の変異酵素核酸の活性が変異酵素核酸を共有結合するようにさせる。次に、変異酵素核酸は、共有結合によって選択される。
【００９５】
他の実施態様においては、所定の活性を有する変異酵素核酸を選択することは変異酵素核酸の増幅が含まれる（Ｊｏｙｃｅ，Ｇｅｎｅ，８２：８３−８７，１９８９；Ｂｅａｕｄｒｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５−４１，１９９２）。所定の特性又は活性を有する酵素核酸分子を選択する他の方法は、実施例の項に記載されている。
【００９６】
Ｅ．組成物
本発明は、また、本発明の酵素ＤＮＡ分子の１以上の種類又は集団を含む組成物を企図する。例えば、異なる種類又は集団は異なるヌクレオチド配列を認識及び切断することができる。組成物は、更に、リボ核酸含有基質が含まれる。本発明の組成物は、更に、本明細書に記載されたように鉛イオン、マグネシウムイオン、又は他の２価又は１価の陽イオンを含むものである。
【００９７】
酵素ＤＮＡ分子は、好ましくは約０．０５〜約２μＭの濃度で存在する。酵素ＤＮＡ分子は、基質に対する酵素ＤＮＡ分子の濃度比が典型的には約１：５〜約１：５０で存在する。酵素ＤＮＡ分子は、更に好ましくは約０．１〜約１μＭの濃度で組成物中に存在する。組成物は、更に好ましくは約０．１〜約０．５μＭの濃度で酵素ＤＮＡ分子を含む。基質は、好ましくは約０．５〜約１０００μＭの濃度で組成物中に存在する。
【００９８】
当業者は、天然に存在する供給源及び合成供給源を含む多くの核酸含有基質源があることを理解する。適切な基質源としては、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉ、及びＨＴＬＶ−ＩＩを含む種々のウイルスやレトロウイルスの病原体が含まれるが限定されない。
【００９９】
他の適切な基質としては、ピコルナウイルス、ヘパドナビリデ（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、ガンマヘルペスビリネ（例えば、ＥＢＶ）、リンホクリプトウイルス、白血病ウイルス（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ）、フラビウイルス、トガウイルス、ヘルペスウイルス（アルファヘルペスウイルス及びベータヘルペスウイルスを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス、及び免疫不全疾患及び症候群に寄与するウイルス及びレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）を含む又はそれらによって生産されたものを含むウイルス及びレトロウイルスが含まれるが限定されない。更に、適切な基質としては、非ヒト霊長類及びサル及びネコの免疫不全ウイルス及びウシ白血病ウイルスを含むが限定されない他の動物に感染するウイルスやレトロウイルスの病原体が挙げられる。
【０１００】
上記のように、マグネシウムイオン、鉛イオン、又は他の適切な１価又は２価陽イオンが組成物中に約１〜１００ｍＭの範囲の濃度で存在させることができる。予め選択されたイオンは、好ましくは約２〜約５０ｍＭの濃度で組成物中に存在させ、約５ｍＭの濃度が特に好ましい。当業者は、イオン濃度が水溶液中その供給源（例えば、マグネシウム）の溶解度の限度及び活性コンホメーションで同じ組成物中に存在する酵素ＤＮＡ分子をもつことを必要とすることによってのみ束縛されることを理解する。
【０１０１】
本発明は、また、本発明の酵素ＤＮＡ分子、ハイブリッドデオキシリボヌクレオチド−リボヌクレオチド分子、及び上記濃度のマグネシウム又は鉛イオンを含む組成物を企図する。上記のように、マグネシウムの代わりに他の１価又は２価イオン（例えば、Ｃａ２＋）も用いられる。
【０１０２】
本発明は、また、本発明の酵素ＤＮＡ分子、核酸含有基質（例えば、ＲＮＡ）、及び約１ミリモルより大きい濃度の予め選択されたイオンを含む組成物を企図し、前記基質は、該酵素ＤＮＡ分子に存在する認識ドメインより長さが大きい。
【０１０３】
態様においては、組成物は酵素ＤＮＡ分子−基質複合体であり、酵素ＤＮＡ分子とその基質間の塩基対合は近接している。他の実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子とその基質間の塩基対合は１以上の非相補的対で中断されている。種々の代替的実施態様においては、本発明の組成物は、更に、１価の陽イオン、２価の陽イオン、又は双方を含むものである。
【０１０４】
他の態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、２価陽イオンの存在下又は不在下で効率よく機能することができる。態様においては、２価陽イオンが存在し、Ｐｂ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、又はＣａ２＋を含む。また、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、１価陽イオンの存在下又は不在下に効率よく機能することができる。Ｐｂ２＋又はＭｇ２＋について本明細書に記載されたものと同じ１価又は２価陽イオン濃度が本明細書に開示されたように有効であることは予想される。
【０１０５】
任意により、１価陽イオンは、２価陽イオンのほかに、又は“代替物”として存在させてもよい。例えば、ナトリウム（Ｎａ＋）又はカリウム（Ｋ＋）のような１価陽イオンは、解離イオンとしてか又はＮａＣｌ又はＫＣｌのような解離性化合物として存在する。
【０１０６】
実施態様においては、組成物中に存在する１価陽イオンの濃度は０〜１．０Ｍの範囲である。他の実施態様においては、１価陽イオンは、約０〜２００ｍＭの範囲の濃度で存在する。他の実施態様においては、１価陽イオンは、約１〜１００ｍＭの範囲の濃度で存在する。また、１価陽イオンの濃度は約２〜５０ｍＭの範囲である。他の実施態様においては、濃度は約２〜２５ｍＭの範囲である。
【０１０７】
Ｆ．酵素ＤＮＡ分子を用いる方法
本明細書に開示される酵素ＤＮＡ分子を用いる方法は、従来技術の酵素及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドについて当該技術において周知である多くの異なる用途を包含する。上記のように、隣接する核酸を連結する結合（例えば、ホスホエステル結合）を切断することができる分子は、種々の適用を含む多くの使用がある。例えば、本明細書に開示された性能、構造、及び／又は機能を有する酵素ＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡのような標的核酸配列を試験管内及び生体内で不活性化する医薬品や医療用品（例えば、創傷デブリードマン、凝血溶解用等）、及び家庭用品（例えば、洗剤、口腔衛生用品、肉の柔化剤）に有効である。本明細書に開示された化合物、組成物及び方法の産業的用途も企図され、十分に本発明の範囲内である。
【０１０８】
本発明は、また、一本鎖核酸、ループ核酸、部分的又は完全な二本鎖核酸を切断する有効な方法を記載する。これらの方法の大部分は、本発明の新規な酵素活性核酸分子を用いる。種々の実施態様においては、基質の一本鎖核酸セグメント又は部分（又は基質全体）は、ＤＮＡ、修飾したＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾したＲＮＡ、又はその複合物を含んでいる。好ましくは、核酸基質は基質切断配列が又はその近傍が一本鎖であることだけを必要とするので本発明の酵素核酸分子は酵素認識配列によって基質切断配列に対してハイブリダイズすることができる。
【０１０９】
本発明の方法によって切断される核酸基質は、化学的に合成又は酵素的に生産されるか又はファージ、ウイルス、原核細胞、又は真核細胞、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母細胞及び細菌細胞のような種々の供給原から分離される。化学的に合成された一本鎖及び二本鎖核酸は、リサーチジェネティクス（アラバマ州ハンツビル）を含むが限定されない多くの製造業者から市販されている。
【０１１０】
ＲＮＡ基質は、アプライドバイオシステムズ（カリフォルニア州フォスターシティ）オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて製造業者の説明書に従って合成される。一本鎖ファージも核酸基質源である。（Ｍｅｓｓｉｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：３６４２−３６４６，１９７７，Ｙｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，Ｇｅｎｅ，３３：１０３−１１９，１９８５を参照されたい。）一本鎖ファージを含む細菌細胞は、すぐに使える適切な一本鎖核酸基質源である。
【０１１１】
本発明の方法によって切断できる一本鎖ＲＮＡは、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、コロナウイルス、アレナウイルス又はレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスによって供給される。上記のように、種々の原核細胞及び真核細胞が適切な核酸基質の優れた供給源である。
【０１１２】
本発明の方法は、原核細胞、真核細胞、植物、動物、酵母又は細菌細胞を含む細胞の内部に存在する一本鎖核酸又はループ核酸又は二本鎖核酸の一本鎖部分に用いられる。これらの条件下、本発明の酵素核酸分子（例えば、酵素ＤＮＡ分子又はデオキシリボザイム）は抗ウイルス剤又は遺伝子発現の調節剤として作用する。本発明の酵素ＤＮＡ分子のその使用の例は後述される。
【０１１３】
本発明の方法の大部分においては、一本鎖核酸の切断は予め決められた塩基配列の３′末端で起こる。その予め決められた塩基配列又は基質切断配列は、典型的には１〜約１０ヌクレオチドを含む。他の好適実施態様においては、本発明の酵素ＤＮＡ分子は、切断部位の上流、又は上流と下流のヌクレオチドを認識することができる。種々の実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子は、切断部位の上流の約２〜１０ヌクレオチドを認識することができる。他の実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子は、切断部位の上流の約２〜１０ヌクレオチドと下流の約２〜１０ヌクレオチドを認識することができる。他の好適実施態様は、長さが約３０ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を認識することができる酵素ＤＮＡ分子を企図し、約２０ヌクレオチドまでの長さが更に好ましい。
【０１１４】
本明細書に開示された方法は、酵素ＤＮＡ分子の認識ドメインのヌクレオチド配列を変えることによりいずれのヌクレオチド配列でも切断することができる。これにより、制限エンドヌクレアーゼ部位を存在させずに選択された位置で一本鎖核酸を切断することが可能である。
【０１１５】
本発明の酵素ＤＮＡ分子は、適切な切断部位での部位特異的加水分解により酵素ＤＮＡ分子に依然として結合している一本鎖核酸基質のいずれの部分からも分離される。酵素ＤＮＡ分子を基質から分離すること（又は“切断産物”）により酵素ＤＮＡ分子が他の切断反応を行うことを可能にする。
【０１１６】
一般的には適切な核酸切断条件−−好ましくは生理的条件下−−核酸基質を本発明の酵素ＤＮＡ分子の有効な量で処理する。核酸基質がＤＮＡを含む場合には、切断条件は２価の陽イオンの存在を約２〜１０ｍＭの濃度で含む。
【０１１７】
酵素ＤＮＡ分子の有効量は、一本鎖核酸内に存在する予め決められた塩基配列を切断するために要する量である。酵素ＤＮＡ分子は、好ましくは１：２０の基質切断部位に対するＤＮＡ分子のモル比で存在する。この比は、用いられる具体的な核酸切断条件下に具体的な酵素ＤＮＡ分子の処理の長さ及び効率によって変動するものである。
【０１１８】
従って、好適実施態様においては、処理は、典型的には、水溶液中でＲＮＡ含有基質と酵素を混合して切断混合物を形成する工程、次にそのようにして形成した混合物をＲＮＡ切断条件下に酵素ＤＮＡ分子がＲＮＡ内に存在する予め決められたヌクレオチド配列でＲＮＡ基質を切断する十分な時間維持する工程を含んでいる。種々の実施態様においては、イオン源−−即ち、１価又は２価陽イオン、又は双方が供給される。
【０１１９】
本発明の実施態様においては、酵素ＤＮＡ分子が一本鎖核酸を切断するのに必要な時間が予め決められた。時間は、約１分〜約２４時間であり、反応成分の濃度及び反応の温度によって変動する。その時間は、酵素ＤＮＡ分子が存在する予め決められたヌクレオチド配列で一本鎖核酸を切断するような通常は約１０分〜約２時間である。
【０１２０】
本発明は、更に、核酸切断条件が約２〜１００ｍＭの濃度で２価の陽イオン源（例えば、ＰｂＯＡｃ）の存在を含むことを企図する。核酸切断条件としては、２価陽イオンを典型的には約２〜約１０ｍＭの濃度で含み、約５ｍＭの濃度が特に好ましい。
【０１２１】
核酸切断条件に含む最適陽イオン濃度は、一定のカチオン濃度で切断した一本鎖核酸量を求めることにより容易に求められる。当業者は、最適濃度が用いられる具体的な酵素ＤＮＡ分子によって変動することを理解する。
【０１２２】
本発明は、更に、核酸切断条件がｐＨ約６．０〜約９．０を含むことを企図する。好適実施態様においては、ｐＨは、ｐＨ約６．５〜８．０の範囲である。他の実施態様においては、ｐＨは生理的条件に匹敵する。即ち、ｐＨは約７．０〜７．８であり、ｐＨ約７．５が特に好ましい。
【０１２３】
当業者は、酵素ＤＮＡ分子が依然として活性コンホメーションであるようなｐＨが核酸切断に用いられる限り本発明の方法が広範囲のｐＨで作用することを理解する。活性コンホメーションの酵素ＤＮＡ分子は、一本鎖核酸を予め決められたヌクレオチド配列で切断する能力により容易に検出される。
【０１２４】
種々の実施態様においては、核酸切断条件は種々の温度範囲が含まれている。上記のように、生理的条件と一致した温度範囲が特に好ましいが、商業的適用と一致した温度範囲も本明細書に企図される。実施態様においては、温度は約１５〜約６０℃の範囲である。他の態様においては、核酸切断条件は約３０〜約５６℃の範囲である温度が含まれる。他の態様においては、核酸切断条件は、約３５〜約５０℃の温度が含まれる。好適実施態様においては、核酸切断条件は、約３７〜約４２℃の温度範囲を含んでいる。核酸切断条件と一致した温度範囲は、所望の切断速度及び具体的な温度での具体的な酵素ＤＮＡ分子の安定性によってのみ束縛される。
【０１２５】
種々の方法においては、本発明は、ポリアミンの存在を含む核酸切断条件を企図している。本発明を行うのに有効なポリアミンとしては、スペルミジン、プトレッシン、スペルミン等が挙げられる。態様においては、ポリアミンは、約０．０１〜約１０ｍＭの濃度で存在する。他の態様においては、ポリアミンは、約１〜約１０ｍＭの濃度で存在する。核酸切断条件は、約２〜約５ｍＭの濃度でポリアミンの存在を含むものである。種々の実施態様においては、ポリアミンはスペルミジンである。
【０１２６】
Ｇ．ベクター
本発明は、また、好ましくは標的細胞（例えば、植物又は動物）内の酵素ＤＮＡ分子の発現を可能にする方法で、ベクター内に位置する本発明の酵素ＤＮＡ分子をコードしている核酸セグメントを含む発現ベクターを特徴とする。
【０１２７】
従って、一般的には、本発明のベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、又はファージベクターが含まれることが好ましい。適切なベクターは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）−−例えば、環状ファージミドｓｓＤＮＡを含むことが好ましい。本発明の有効なベクターは、環状である必要がないことも理解されなければならない。
【０１２８】
態様においては、追加の酵素ＤＮＡ分子をコードしている配列の各々を隣接しているヌクレオチド配列が供給されることが好ましく、その配列は第１酵素ＤＮＡ分子によって認識される。介在又は隣接配列は、好ましくは少なくとも１ヌクレオチドを含んでいる。介在又は隣接配列は、長さが更に好ましくは約２〜２０ヌクレオチドであり、長さが約５〜１０ヌクレオチドの配列が特に好ましい。
【０１２９】
ポリヌクレオチドの尾部の付加は、本発明の酵素ＤＮＡ分子の３′端を保護するのに有効である。酵素末端トランスフェラーゼを用いることによりポリマー配列を結合して与えられる。
【０１３０】
本発明のベクターは、２以上の酵素ＤＮＡ分子が含まれる。実施態様においては、第１酵素ＤＮＡ分子は、分子内切断活性を有し、他の酵素ＤＮＡ配列を放出するためにヌクレオチド配列を認識及び切断することができる。即ち、ベクターから他の酵素ＤＮＡ分子を“放出”するために機能することができる。例えば、ベクターは第１酵素ＤＮＡ分子が発現される場合にその第１分子が第２酵素ＤＮＡ分子、第３酵素ＤＮＡ分子等をコードしている追加のヌクレオチド配列を隣接しているヌクレオチド配列を切断することができるように構築されることが好ましい。前記第１酵素ＤＮＡ分子（即ち、“放出する”分子）が分子内にオリゴヌクレオチド配列を切断することができると考えると、追加（例えば、第２、第３等）の酵素ＤＮＡ分子（即ち、“放出される”分子）は“放出する”分子と同じ特性をもつことを必要としない。例えば、実施態様においては、“放出される”（即ち、第２、第３等）酵素ＤＮＡ分子は特定のＲＮＡはを切断することができ、第１（“放出する”）酵素ＤＮＡ分子は“放出された”分子を遊離することを可能にするヌクレアーゼ活性を有する。他の実施態様においては、“放出される”酵素ＤＮＡ分子はアミド結合切断活性をもち、第１（“放出する”）酵素ＤＮＡ分子はヌクレアーゼ活性をもっている。
【０１３１】
また、第１酵素ＤＮＡ分子は、第２（及び第３、第４等）酵素ＤＮＡ分子と別のベクター上でコードされ、分子内切断活性を有する。本発明に記載されたように、第１酵素ＤＮＡ分子は自己切断酵素ＤＮＡ分子（例えば、デオキシリボザイム）であり、第２酵素ＤＮＡ分子は所望のタイプの酵素ＤＮＡ分子である。ベクターがこれらの核酸配列からＤＮＡを発現させる場合、そのＤＮＡは隣接領域の各々を切断する適切な条件下で能力を有し、よって１コピー以上の第２酵素ＤＮＡ分子を放出する。所望される場合には、数種の異なる第２酵素ＤＮＡ分子が同じ細胞又は担体内に置かれ異なるデオキシリボザイムが作製される。１以上のベクターは、１以上のリボザイム又はデオキシリボザイムを“放出する”と“放出される”酵素核酸分子の組合わせで含むこともその組合せが所望の結果：予め決められた核酸配列を切断することができる酵素核酸分子の放出を得る限り企図される。
【０１３２】
本発明の酵素ＤＮＡ分子を分離及び精製する方法も企図される。本明細書に記載される方法のほかに、種々の精製法（例えば、ＨＰＬＣを用いるもの）及びクロマトグラフィー分離法が当該技術において利用できる。例えば、公開された国際出願第ＷＯ  ９３／２３５６９号に記載された方法を参照されたい。その明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【０１３３】
本明細書に記載された実施態様の種々の組合わせは本発明の範囲内に含まれるものであることは理解されなければならない。本発明の他の特徴及び利点は、上記説明、下記実施例、及び請求の範囲から明らかである。
【実施例】
【０１３４】
以下の実施例は本発明を説明するものであり、本発明を限定するものではない。
【０１３５】
１．酵素ＤＮＡ分子のインビトロ進化：概要
インビトロ選択及びインビトロ進化技術は、新規触媒組成物又は構造の経験的知識なしに新規触媒を単離することを許容する。これらの方法を使用して、新規な触媒特性を有するＲＮＡ酵素を得ていた。例えば、鉛カチオンで自己分解性切断するリボザイムは、ｔＲＮＡＰｈｅ分子のランダム化されたプールに由来している（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：３８８７−３８９５，１９９２）。ＤＮＡを切断することができる（Ｂｅａｕｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５−６４１，１９９２）又は改変された金属依存性を有する（Ｌｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６１：１８２−１８５，１９９３）グループＩリボザイム変異体が単離されている。
【０１３６】
ランダムＲＮＡ配列から出発して、ポリメラーゼ様反応を触媒する分子が得られている（Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：１４１１−１４１８（１９９３））。本実施例では、インビトロ進化手順中の選択条件を変化させることにより進化した酵素の特異的触媒特性の精錬について述べる。
【０１３７】
ダーウィン型進化は以下の３工程の反復実施を必要とする：（ａ）遺伝的変異の導入；（ｂ）いくつかの適合基準に基づく個体の選択；および（ｃ）選択した個体の増幅。これらの工程の各々はインビトロで実現することができる（Ｊｏｙｃｅ，Ｇｅｎｅ，８２：８３，１９８９）。遺伝子は、化学的修飾、ランダム化変異誘発オリゴヌクレオチドの取込み、またはポリメラーゼによる不正確なコピー生成によって変異を誘発できる（Ｃａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２：２８−３３，１９９２；Ｃａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１３６−Ｓ１４０，１９９４；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９８：１６８，１９７９；Ｓｈｏｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１００：４５７，１９８３；Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：２４２，１９８５；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１：３１１３，１９８３；Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５，１９８５；ＭｃＮｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３５４５，１９８５；Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１０，１９８６；Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４６：１４５，１９８６；Ｚａｋｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９５：７０８，１９８２；Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，２：６３，１９８８；Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１，１９８９；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：６０５２，１９９１を参照のこと）。
【０１３８】
遺伝子生成物は、例えばリガンドと結合する能力または化学的反応を遂行する能力によって選択することができる（例えば、Ｊｏｙｃｅ，上掲書，１９８９；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４：４６７，１９９０；Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５，１９９０を参照のこと）。選択される遺伝子生成物に対応する遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような互変プライマー法（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）によって増幅できる（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−５４，１９８５；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１，１９８８を参照のこと）。
【０１３９】
代替として、核酸増幅を、自家内配列複製（３ＳＲ）を用いて実施してもよい（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４，１９９０を参照のこと（この文献は参照することにより本明細書に組み込まれる））。３ＳＲ法にしたがえ、標的核酸配列を、レトロウイルスに必須の以下の３つの酵素活性：（１）逆転写酵素、（２）ＲＮアーゼＨ、および（３）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いることによって等温条件下でインビトロで指数関数的に増幅（複製）させることができる。ｃＤＮＡ中間体を用いたレトロウイルスのＲＮＡ複製を模倣することによって、この反応は最初の標的のｃＤＮＡおよびＲＮＡコピーを蓄積させる。
【０１４０】
要約すると、酵素ＤＮＡ分子集団の進化を企図する場合、ｃＤＮＡ中間体を用いた逆転写と転写反応の連続的シリーズよってＲＮＡ標的配列を複製する。このデザインに必須の要素は以下のとおりである：（ａ）オリゴヌクレオチドプライマーが標的に特異的であり、かつ、得られたｃＤＮＡが転写鋳型として適性なようにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ結合部位をコードする５’伸長部を含むこと；（ｂ）ＲＮアーゼＨによる中間体ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中の鋳型ＲＮＡの分解により両方の鎖の完成までｃＤＮＡ合成が進行することができること；及び（ｃ）反応生成物（ｃＤＮＡ及びＲＮＡ）は次工程のための鋳型として機能し、指数関数的複製を可能にすること。
【０１４１】
酵素ＤＮＡ分子を進化させる場合、本実施例に開示されるように、このデザインの種々の重大な要素は幾分異なる。例えば、（１）オリゴヌクレオチドプライマーは標的に特異的であり、かつ好ましくは或る様式、例えば、ビオチン化により「マーク」又は標識されており、得られた適性な鋳型鎖を容易に同定できること、及び（２）使用するインビトロ選択手順が、好ましくは最も好ましい放出（ｒｅｌｅａｓｅ）メカニズムの同定に依存していること。
【０１４２】
インビトロのダーウィン型進化の実現における主要な障害は、変異と増幅（これはともに遺伝子型に関係する）を選択（これは表現型に関連する）を一体化する必要性である。その遺伝子型と表現型とが同一分子内で統合されている核酸酵素の場合、作業は単純化される。
【０１４３】
Ａ．酵素ＤＮＡ分子の設計
一本鎖ＤＮＡは興味深い３次構造を呈することは周知である。例えば「ｔＤＮＡ」の構造は、対応のｔＲＮＡと非常に似ている（Ｐａｑｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９：２５９−２６５，１９９０を参照のこと）。更に、少なくとも或る触媒活性を維持しながら、ハンマーヘッド型リボザイム内の３５リボヌクレオチドの内３１程を置換することができる（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４：５６５−５６７，１９９０；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９１８−９２１，１９９２；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：５００５−５００９，１９９２を参照のこと）。
【０１４４】
インビトロ選択技術を巨大なランダム配列ＤＮＡへ適用し、標的リガンドへ高親和性で結合する特異的ＤＮＡ「アプタマー」を回収する（Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５５：５６４−５６６，１９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５５：８５０−８５２，１９９２；Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１３５６−１３６０，１９９４）。最近になって、２つのグループが、アプタマー（Ｇ−四分子構造を形成し、かつタンパク質トロンビンに高親和性で結合する１５量体ＤＮＡである）の最初のＮＭＲ構造決定を達成した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：１８９９−１９０４，１９９３；Ｍａｃａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：３７４５−３７４９，１９９３）。これらの知見は、Ｘ線結晶学的分析により実証された（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１７６５１−１７６５４，１９９３）。
【０１４５】
基質分子と高い親和性かつ特異性で結合する能力は、良好な酵素の必要条件である。更に酵素は、当該酵素内又は補因子内で十分に位置づけられた官能基を利用し、特定の化学変換を促進しなければならない。更に酵素は、反応過程の間未変化のままで、触媒代謝回転で動作することができなければならない。或るものでは、情報高分子であることという要件を追加する。情報高分子は、触媒活性の責任を負う特定の命令（ｏｒｄｅｒｉｎｇ）を有するサブユニットを含んでいる。これらの基準を、意味論上及び化学的理由上の双方において論議することが快く受け入れられ、これらの基準は、単純な溶媒効果から基質拡散の限界時における生物学的な酵素の動作への影響に及ぶ化学的速度の増強現象を区別するのに役立つ。
【０１４６】
以下に詳述するように、本発明者等は、ランダム配列から出発して、ＤＮＡ触媒及びＤＮＡ酵素を迅速に得る一般的方法の開発しようと努力した。最初の標的として、本発明者等は、ＤＮＡの能力範囲内にあると感じた反応、すなわち二価の金属補因子によって補助されるＲＮＡホスホジエステルの加水開裂を選択した。この反応は、ハンマーヘッド型及びヘアピン型モチーフを含む種々の天然ＲＮＡ酵素によって行われる反応と同一である（例えば、Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４９：２１１−２２０，１９８７；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：５９６−６００，１９８７；Ｈａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：４９２９−４９３３，１９８９を参照のこと）。
【０１４７】
ｔＲＮＡ分子のランダム化ライブラリーを用いて開始して、中性ｐＨ下でＰｂ２＋依存性、部位特異的ＲＮＡホスホエステラーゼ活性を有するリボザイムを得ることができたことが示された（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：３８８７−３８９５，１９９２；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５８：５６０−５６３，１９９２）。これは、酵母ｔＲＮＡＰｈｅの偶然の自己切断反応に類似している（Ｄｉｒｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，５４：１２７−１４４，１９７２）。この反応は、ｔＲＮＡ内の規定された部位におけるＰｂ２＋イオンの特定の配位に依存する（Ｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．，１：６３９−６４６，１９８３；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４：４７８５−４８０１，１９８５を参照のこと）。
【０１４８】
本明細書に記載されるように、本発明者等のゴールには、最初はＤＮＡの５’末端に付着した短いリーダー配列内に存在し、最終的には迅速な代謝回転で分子間様式で切断することができる別々の分子内に位置するＤＮＡ特定のＲＮＡホスホエステルのＰｂ２＋依存性切断を実行することができるＤＮＡの開発が含まれる。
【０１４９】
ＤＮＡが標的ホスホエステル及び周辺ヌクレオチドとどのように相互作用するかということについての仮説は立てられていなかった。約１０１４のランダム５０量体配列のプールを用いて開始し、インビトロ選択の実行を許容した。５日間かけて５ラウンドの選択を行った後、集団は全体として、１ｍＭ  Ｐｂ２＋の存在下、約０．２分−１の速度で標的ホスホエステルを切断する能力を獲得した。これは、同一の反応条件下における自発的切断速度と比較して、約１０５倍増加したことになる。
【０１５０】
集団から固体を単離し、配列決定し、触媒活性についてアッセイした。この情報に基づいて、反応を分子間フォーマットへ転換し、単純化することにより、１ｍＭ  ＰｂＯＡｃの存在下、２３℃、ｐＨ７．０における１分−１の代謝回転速度で進行する反応において、３８量体ＤＮＡ酵素による１９量体基質の部位特異的切断を許容した。
【０１５１】
Ｂ．インビトロ選択スキーム
約１０１４一本鎖ＤＮＡ分子の出発プールを生成した。これは全て５’ビオチン部分、連続的に単一リボヌクレオチドを含む固定化ドメイン、５０のランダムデオキシリボヌクレオチドからなる潜在的触媒ドメイン、及び、３’末端に位置する第二の固定化ドメインを含んでいる（図１）。
【０１５２】
プライマー結合部位が隣接する５０のランダムヌクレオチドを含む合成ＤＮＡを用いて開始したｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術によりプールを構築した。ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲプライマーは３’−アデノシンリボヌクレオチドを有する５’−ビオチン化合成オリゴデオキシヌクレオチドであった。リボヌクレオチド末端化オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲという面において鋳型特異的の伸長を効率的にプライム（ｐｒｉｍｅ）した。この場合において、単一の包埋されたリボヌクレオチドを含む伸長生成物が生じた。
【０１５３】
図１は、標的ＲＮＡホスホエステルを切断するＤＮＡを単離するための選択的増幅スキームを示している。５０のランダムヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む二本鎖ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。この増幅は、３’末端がアデノシンリボヌクレオチドで末端化されている（これは、記号「Ｎ」又は「ｒＡ」により示され、「Ｎ」及び「ｒＡ」は共にアデノシンリボヌクレオチドを表す）５’−ビオチン化ＤＮＡプライマー（例えば、プライマー３−−３ａ又は３ｂ）を用いて行った。プライマーはＴａｑポリメラーゼにより伸長し、単一の包埋されたリボヌクレオチドを含むＤＮＡ生成物をえた。得られた二本鎖ＤＮＡをストレプトアビジンマトリックス上に固定化し、非ビオチン化ＤＮＡ鎖を０．２Ｎ  ＮａＯＨを用いた洗浄により除去した。緩衝液でカラムを再平衡化した後、カラムを、１ｍＭＰｂＯＡｃを添加した同一溶液で洗浄した。Ｐｂ２＋依存性自己切断を起こしたＤＮＡをカラムから遊離させ、溶離液中に集め、ＰＣＲにより増幅した。次いでＰＣＲ産物を使用して次ラウンドの選択的増幅を開始した。
【０１５４】
ＰＣＲ生成物をストレプトアビジンアフィニティーマトリックスを通過させ、二本鎖ＤＮＡの５’−ビオチン化鎖の非共有付着物を得た。非ビオチン化鎖を、０．２Ｎ  ＮａＯＨを用いた簡素な洗浄により除去した。結合鎖を、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）（２３℃）を含む緩衝液中で平衡化した。次に、同一の緩衝液中に１ｍＭ  ＰｂＯＡｃを添加して、標的ホスホエステルにおいてＰＢ２＋依存性切断の発生を許容し、これによりＤＮＡのサブセットをストレプトアビジンマトリックスから遊離させた。原則としては、個々のＤＮＡは、種々の方法、例えばビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用の破壊又はデオキシリボヌクレオチド結合の切断等により、ＤＮＡ自体の遊離を促進するだろう。リボヌクレオシド３’−Ｏ−Ｐ結合の切断は、この結合の相対的不安定性に基づくと、最も有望な遊離メカニズムであり、かつＰＢ２＋依存性加水切断を最も迅速に遊離を引き起こすと考える。しかしながら、原則としては、インビトロ選択手順は、このメカニズムを最良に実行することができる個体だけでなく、最も有望な遊離メカニズムを同定するかもしれない。
【０１５５】
Ｐｂ２＋添加時にマトリックスから遊離したＤＮＡ分子を溶離液中に集め、エタノール沈殿により濃縮し、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ増幅に付した。分子の出発プール構築において、第一ＰＣＲ増幅は、ランダム領域に隣接するプライマー（プライマー１及び２）を利用し、第二のＰＣＲ増幅は、３’末端リボアデニレートを有する５’ビオチン化プライマー（プライマー３ｂ）を利用し、これにより標的ＲＮＡホスホエステルを再導入した。全選択的増幅手順は実行に３〜４時間を要求した。
【０１５６】
この手順の各ラウンドの間、分子を３つの方法で精製した。第一の方法は、ＰＣＲ増幅に続き、フエノールで２回、クロロホルム／イソアミルアルコールで１回洗浄し、次いでエタノール沈殿する方法である。第二の方法は、ＤＮＡのストレプトアビジンへの付着に続き、強力な変性条件下で全ての非ビオチン化分子を洗い流す方法である。第三の方法は、Ｐｂ２＋での溶離後、エタノール沈殿する方法である。ゲル電気泳動精製は行わない。したがって、分子を特定の長さに束縛する選択圧は存在しない。
【０１５７】
Ｃ．触媒ＤＮＡの選択
インビトロ選択を連続的に５ラウンド行った。進行的にＰｂ２＋の添加にしたがい反応時間を減少させ、進行的に選択の厳密性を増加させた。１〜３ラウンドの間、反応時間は１時間であった。４ラウンドでは２０分間であった。５ラウンドでは１分間であった。選択の各ラウンド後に得られた分子集団を有する一本鎖ＤＮＡの出発プールを、インビトロ選択の間使用したものと同一の条件下で、自己切断活性についてアッセイした。（図２）。
【０１５８】
このアッセイのために、５’−ビオチン部分ではなく５’−３２Ｐを用いて分子を調製した。これは出発材料及び５’切断生成物両方の検出を許容した。５分間のインキュベート後、最初のプール（Ｇ０）又は第一及び第二ラウンドの選択後に得られた集団においては検出可能な活性は存在しなかった。第三ラウンド（Ｇ３）後に得られたＤＮＡは、低レベルの活性を示した。この活性は、第五ラウンド（Ｇ５）の選択後に得られたＤＮＡについての自己切断活性の約５０％に達し、着実に増加した。長いインキュベート後であっても、切断は標的ホスホエステルにおいてのみ検出された。Ｐｂ２＋を反応混合物から除外したとき、この活性は失われた。
【０１５９】
図２は、ＤＮＡの出発プール（Ｇ０）及び１〜５ラウンドの選択後に得られた集団（Ｇ１〜Ｇ５）の自己切断活性を示している。反応混合物は５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０（２３℃））及び３ｎＭ［５’−３２Ｐ］−標識ＤＮＡを含んでいた。
【０１６０】
これを、１ｍＭ  ＰｂＯＡｃの存在下又は非存在下、２３℃で５分間インキュベートした。
【０１６１】
記号「Ｐｒｅ」は１０８−ヌクレオチド前駆体ＤＮＡ（配列番号４）を表し、「Ｃｌｖ」は２８−ヌクレオチド５’−切断生成物（配列番号５）を表し、「Ｍ」は５’−切断生成物に対応するプライマー３ａ（配列番号６）を表している。
【０１６２】
示された２８−ヌクレオチド５’−切断生成物（Ｃｌｖ）は、好ましくは配列５’−ＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＮ−３’（「Ｎ」は、３’末端に追加の２’，３’−環状ホスフェートを有するアデノシンリボヌクレオチド（配列番号５）を表す。）を有している。代替の態様においては、「Ｎ」は、分子の３’末端に追加の２’又は３’ホスフェートを有するアデノシンリボヌクレオチドを表す。
【０１６３】
図２において、「Ｇ０」レーンの「Ｐｒｅ」バンドは、１０８−ヌクレオチド前駆体ＤＮＡ（各ＤＮＡは５０のランダムヌクレオチドを含んでいる）を含んでいる。それゆえ、与えられた全ての「Ｐｒｅ」サンプリングは、広範囲の前駆体ＤＮＡを含んでいるだろう。また、各サンプリングは、その前後のサンプリングで異なると考えられる。「Ｇ１」〜「Ｇ５」レーンは「Ｐｒｅ」バンドを含んでいる。このバンドでは触媒ＤＮＡ分子が次第に濃縮されていくが、異なるＤＮＡ分子（すなわち、５０ヌクレオチドランダム化ドメインが異なっている。）を多数含んでいる。「Ｇ５  Ｐｒｅ」ＤＮＡ由来の異なる配列サンプルを図３に示す。
【０１６４】
ショットガンクローニング技術を使用して、Ｇ５集団から個体を単離した。サブクローンの中から２０の完全ヌクレオチド配列を決定した（図３）。（Ｃａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２８−３３，１９９２及びＣａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１３６−Ｓ１４０，１９９４）を参照のこと。２０の配列のうち、５つは唯一のものであり、２つは２倍生じ、１つは３倍生じ、１つは８倍生じた。個々の変異体の全てが、ＤＮＡの出発プールにおいてランダム化された５０ヌクレオチド領域内に共通配列要素を共有している。これらは全て２つの椎定鋳型領域を含んでいる。１つは、切断部位のちようど上流に位置するヌクレオチドのストレッチに相補的な領域であり、他方は、少なくとも４ヌクレオチド下流に位置するヌクレオチドに相補的な領域である。これら２つの椎定鋳型配列の間に、１〜１１ヌクレオチドの可変ドメイン、続いて固定配列５’−ＡＧＣＧ−３’、更に３〜８ヌクレオチドの第二の可変ドメイン、最後に固定配列５’−ＣＧ−３’又は５’−ＣＧＡ−３’が存在する。２つの推定鋳型配列外存在するヌクレオチドは、配列及び長さにおいて高度に可変性であった。配列決定した全てのサブクローンにおいて、最初にランダム化した５０ヌクレオチドに対応する領域は、全５０ヌクレオチドの長さを残していた。
【０１６５】
図３は、５ラウンドの選択後の集団から単離した個々の変異体の配列の整列化を示している。固定基質ドメイン：（５’−ＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴｒＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＣ−３’又は、５’−ＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＮＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＣ−３’、Ｎはアデノシンリボヌクレオチドを表す）（配列番号１３）を、逆三角形で同定される標的リボアデニレートと共に上端に示す。推定される塩基対相互作用に一般的に関連する基質ヌクレオチドを垂直の棒で示す。５０の初期ランダム化ヌクレオチドに対応する配列を、基質ドメインに逆平行に整列化した。全ての変異体は、固定配列５’−ＣＧＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣ−３’（配列番号１）（「プライマー部位」、表示せず）により３’末端化されていた。基質ドメインと塩基対を形成ずることが推定される初期ランダム化領域内のヌクレオチドを図の右側及び左側に示す。酵素ＤＮＡ分子の推定される塩基対形成（又は基質結合）領域を、各配列において個別に囲んだ。推定触媒ドメイン内の高度に保存されたヌクレオチドを２つの囲んだカラム内に示す。
【０１６６】
追加データが、触媒ドメインの有意な二次構造モデルの構築に有用であることが予想されるが、ハンマーヘッド型及びヘアピン型リボザイムと同様に、本発明の酵素ＤＮＡ分子の触媒ドメインは、塩基対形成相互作用を通して基質と相互作用する２つの基質結合領域（又は認識ドメイン）によって隣接される保存されたコアを含んでいると考えられることに注目している。ハンマーヘッド型及びヘアピン型リボザイムと同様に、触媒ＤＮＡは、塩基対形成に関連する２つの領域間の不対合基質ヌクレオチドの短いストレッチ、この場合においては５’−ＧＧＡ−３’を要求すると考えられる。
【０１６７】
９つの別個の変異体のそれぞれが、基質ドメインとの推定相補性について異なるパターンを示すことに注目することも興味深い。或る場合においては、塩基対形成は隣接していた。他方では、１以上のモノ相補的対により妨害された。一般的には、切断部位の上流に位置するヌクレオチドは、下流に位置するヌクレオチドよりもより強固な相互作用を形成する傾向にある。結合の研究及び部位特異的変異誘発分析により、更なる見識を得、この推定を更に実証することができるだろう。
【０１６８】
触媒機能についての配列要件についての更なる見識を得るために、９つの変異体のうちの６つについての自己切断活性を、本明細書に記載した選択条件下で試験し、評価した（図３）。驚くべきことではないが、２０のサブクローンの内の８つで生じた配列が、最も反応性が高いことが証明された（一次反応速度定数＝１．４分−１）。研究した全ての変異体は、自己切断アッセイにおいて活性であり、標的ＲＮＡホスホエステルにおける切断に対応する単一の５’標識生成物を生じた。
【０１６９】
優勢なサブクローンを、種々の反応条件下で更に分析した。自己切断活性はＰＢ２＋依存性であったが、Ｍｇ２＋を反応混合物から取り除いた場合でも影響を受けなかった。更に、Ｎａ＋又はＫ＋が適合する一価のカチオンについての要求性が存在した。０〜１．０Ｍの範囲の一価カチオンの濃度の上昇につれて、反応速度も直線的に増加した（ｒ＝０．９９８）。反応に影響するであろうその他の変数、例えばｐＨ、温度及びその他の二価金属の存在は、更なる評価が進行中である。
【０１７０】
２．材料及び方法
Ａ．オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体
合成ＤＮＡ及びＤＮＡ類似体は、オペロン・テクロノジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）より購入した。１９ヌクレオチド基質５’−ｐＴＣＡＣＴＡＴｒＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３’（又は５’−ｐＴＣＡＣＴＡＴＮＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３’、「Ｎ」はアデノシンリボヌクレオチドを表す。）（配列番号７）は、鋳型として５’−ＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡ−３’（配列番号９）を使用し、既報（Ｂｒｅａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１１９８０−１１９８６，１９９４）にしたがい、５’−ｐＴＣＡＣＴＡＴｒＡ−３’（又は５’−ｐＴＣＡＣＴＡＴＮ−３’、「Ｎ」はアデノシンリボヌクレオチドを表す。）（配列番号８）を逆転写酵素伸長することにより調製した。プライマー３、すなわち５’−ＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴｒＡ−３’（又は５’−ＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＮ−３’、式中、「Ｎ」はアデノシンリボヌクレオチドを表す。）（配列番号６）を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（プライマー３ａ）で５’−標識するか、又は、［γ−Ｓ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’−チオリン酸化し、次いＮ−ヨードアセチル−Ｎ’−ビオチニルヘキシレンジアミンでビオチン化した（プライマー３ｂ）。
【０１７１】
Ｂ．ＤＮＡプールの調製
ＤＮＡの出発プールは、合成オリゴマー５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧ−Ｎ５０−ＧＴＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号４）（「Ｎ」はＧ、Ａ、Ｔ及びＣの等モル混合物を表す）を使用したＰＣＲにより調製した。５００ｐｍｏｌのランダム化オリゴマー、１０００ｐｍｏｌのプライマー１（５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧ−３’、配列番号１０）、５００ｐｍｏｌｅｓのプライマー２（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＣ−３’、配列番号１１）、５００ｐｍｏｌｅのプライマー３ｂ、１０μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ及び０．２Ｕμｌ−１  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む２ｍｌのＰＣＲを、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３（２３℃））、０．０１％ゼラチン及び各０．２ｍＭのｄＮＴＰの存在下、９２℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間インキュベートし、次いで９２℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で１分間のサイクルを５回行った。得られた混合物をフェノールで２回、クロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを単離した。
【０１７２】
Ｃ．インビトロ選択
ＤＮＡの出発プールを、５００μＬの緩衝液Ａ（１Ｍ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０（２３℃））中に再懸濁し、ストレプトアビジンカラム（ＡｆｆｉｎｉＴｉｐ  Ｓｔｒｅｐ  ２０、ゲノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）、ウッドランド（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ）、テキサス）を繰り返し通過させた。カラムを、容積１００−μｌの緩衝液Ａで５回、続いて容積１００−μｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨで５回洗浄し、次いで容積１００−μｌの緩衝液Ｂ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０（２３℃））で５回平衡化した。固定化一本鎖ＤＮＡを、容積２０−μｌの緩衝液Ｂ（１ｍＭ  ＰｂＯＡｃを添加）を３回用い、１時間かけて溶離した。全ての固定化及び溶離工程は２３℃下で行った。溶離液を等容積の緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０（２３℃）及び８０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に集め、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。
【０１７３】
得られたＤＮＡを、２０ｐｍｏｌｅプライマー１、２０ｐｍｏｌｅプライマー２、０．０５Ｕμｌ−１Ｔａｑポリメラーゼ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３（２３℃））、０．０１％ゼラチン及び各０．２ｍＭのｄＮＴＰを含む１００−μＬＰＣＲ中、９２℃で１０秒間、５０℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間の３０サイクルで増幅した。反応生成物をフェノールで２回、クロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿により回収した。約４ｐｍｏｌの増幅ＤＮＡを、１００ｐｍｏｌｅのプライマー１、１００ｐｍｏｌｅのプライマー３ｂ、２０μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ及び０．１Ｕμｌ−１  Ｔａｑポリメラーゼを含む第二のｎｅｓｔｅｄＰＣＲ（総容積２００μＬ）に添加し、９２℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で１分間のサイクルを１０回行い増幅した。ＰＣＲ生成物をもう一度抽出し、沈殿させた。得られたＤＮＡを５０μＬの緩衝液Ａ中に再懸濁した。これを使用して次ラウンドの選択を開始した。
【０１７４】
第三ラウンドの最後にｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを容積１００μｌで行ったことを除いて、第二及び第三ラウンドを前記と同様にして行った。第四ラウンドの間、Ｐｂ２＋添加後の溶離時間を２０分間（溶離容積２０μｌを２回）に減少させ、回収したＤＮＡの半分のみを第一のＰＣＲに使用した。これは、１５回の温度サイクルを含んでいた。第五ラウンドの間、溶離時間を１分間（溶離容積２０μｌを２回）に減少させ、回収したＤＮＡの４分の１のみを第一のＰＣＲに使用した。これは１５回の温度サイクルを含んでいた。５ラウンドの選択後に得られたＤＮＡを、既報（Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：５９６６−５９７３，１９９４）と同様にしてサブクローニングし、配列決定した。
【０１７５】
Ｄ．触媒ＤＮＡの動力学的分析
ＤＮＡ及び種々のサブクローニング化個体の集団は、５’−３２Ｐ標識を用いて、非対称性ＰＣＲにより、１０ｐｍｏｌｅのプライマー３ａ、０．５ｐｍｏｌｅのインプット（ｉｎｐｕｔ）ＤＮＡ及び０．１Ｕμｌ−１  Ｔａｑポリメラーゼを含む２５−μｌ反応混合物中、前記と同一の条件下で、９２℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で１分間のサイクルを１０回行うことにより調製した。得られた［５’−３２Ｐ］−増幅生成物を、１０％ポリアクリルアミド／８Ｍゲル中の電気泳動により精製した。
【０１７６】
自己切断アッセイは、緩衝液Ｂ中で１０分間のＤＮＡプレインキュベーション後に行った。ＰｂＯＡｃを終濃度１ｍＭになるまで添加することにより反応を開始させた。等量の緩衝液Ｃの添加により反応を終了させた。反応生成物を、１０％ポリアクリルアミド／８Ｍゲル中の電気泳動により分離した。多代謝回転条件下における動力学的アッセイを緩衝液Ｂ中で行った。この緩衝液は５０μｇ  ｍｌ−１  ＢＳＡを含んでおり、材料の容器壁への付着を防止した。基質及び酵素分子を、Ｐｂ２＋を含まない反応緩衝液中で５分間別々にプレインキュベートし、その後に組み合わせ、ＰｂＯＡｃを終濃度１ｍＭになるまで添加することにより反応を開始させた。
【０１７７】
３．分子間切断をするデオキシリボザイムの進化
Ａ．分子間フォーマットへの転換
研究した変異体の触媒及び基質ドメイン間の推定される塩基対形成相互作用の種々のパターンに基づくと、ＤＮＡ触媒反応を分子間フォーマットへ転換することは道理上簡単であると考えられる。その実行において、本発明者等は、触媒の２つの基質結合領域を単純化し、それぞれが基質どの７〜８塩基対の連続ストレッチを形成することを望んだ。更に、本発明者等は、２つの塩基対形成領域及び介在配列５’−ＧＧＡ−３’に限定される最小基質を提供することを望んだ（図４Ａ）。
【０１７８】
図４Ａ及び４Ｂは、触媒代謝回転で進行する分子間反応におけるＲＮＡホスホエステルのＤＮＡ触媒切断を示している。図４Ａは、１９量体基質と３８量体ＤＮＡ酵素との間に形成された複合体を図示したものである。基質は単一のアデノシンリボヌクレオチド（「ｒＡ」又は「Ｎ」（矢印に隣接する）これはデオキシリボヌクレオチドに隣接している。）を含んでいる。合成ＤＮＡ酵素は、図３示す最も頻繁に出現した変異体の３８ヌクレオチド部分である。推定触媒ドメイン内に位置する高度に保存されたヌクレオチドを「四角」で囲んだ。図示されるように、１つの保存された配列は「ＡＧＣＧ」であり、もう一方は「ＣＧ」（５’→３’方向に読む）であった。
【０１７９】
図４は、インビトロ選択の間に使用したものと同一の条件下における、［５’−３２Ｐ］−標識基質のＤＮＡ触媒切断についてのＫｍ（負の勾配）及びＶｍａｘ（ｙ切片）を決定するために使用したイーディー−ホフスティー（Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ）プロットを示している。切断の初速度を、５ｎＭのＤＮＡ酵素及び０．１２５、０．５、１、２又は４μＭのいずれかの基質を含む反応について測定した。
【０１８０】
触媒ドメインの設計において、本発明者等は、最も反応性の高い変異体組成物（５’末端における２つのヌクレオチド及び３’末端における１１のヌクレオチドが切断されている。）に強く依存した。２つの鋳型領域の間に存在する１５ヌクレオチドは未変化のままであり、３’鋳型領域に単一のヌクレオチドが挿入され、基質と塩基対を形成することができるヌクレオチドの連続的ストレッチを形成した。基質を、配列５’−ＴＣＡＣＴＡＴｒＡ  ●  ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３’（又は５’−ＴＣＡＣＴＡＴＮ  ●  ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３’）（「Ｎ」はアデノシンリボヌクレオチドを表す）（配列番号１２）（下線を引いたヌクレオチドは、触媒ＤＮＡ分子との塩基対形成に関連する２つの領域に対応する）に単純化した。
【０１８１】
デオキシリボヌクレオチドの全体を含む３８量体触媒ＤＮＡ分子（触媒）及びその他の全ＤＮＡ配列内に包埋された単一リボヌクレオチドを含む１９量体基質を使用した単純化された反応系は、迅速な代謝回転での効率的ＤＮＡ触媒ホスホエステル切断を許容した。０．０１μＭの触媒及び１μＭの基質の存在下での９０分間のインキュベートの間、基質の４６％が切断された。これは触媒の４６回の代謝回転に相当する。この反応の予備的動力学的分析を行い、多代謝回転条件下で評価した。ＤＮＡ触媒は、ミカエリス−メンテン動力学を示した。ｋｃａｔ及びＫｍはそれぞれ１分−１及び２μＭであった（図４Ｂ参照）。Ｋｍの値は、ワトソン−クリック相互作用に基づく触媒と基質との間の予想される解離常数よりもかなり大きかった。基質を同一反応条件下（但し、触媒の非存在下）でインキュベートしたところ、４×１０−６分−１のｋｕｎｃｕｔ値を得た。これは、０．５ｍＭ  Ｐｂ２＋の存在下、ｐＨ７．０及び３７℃でのより不安定な１−ニトロフェニル−１，２−プロパンジオールの加水分解についての既報（Ｂｒｅｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４０８０−４０８３，１９９１）．の値５×１０−３分−１と一致した。
【０１８２】
ホスホエステル切断反応は、隣接ホスフェート上のリボヌクレオシド２’−ヒドロキシルによる攻撃を含む加水分解メカニズムにより進行し、末端２’（３’）環状ホスフェートを有する５’生成物及び末端５’−ヒドロキシルを有する３’生成物を生成すると考えられる。このメカニズムのサポートにおいて、３’−切断生成物は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて効率的にリン酸化された。
【０１８３】
これは、遊離５’−ヒドロキシルの利用可能性と一致する。
【０１８４】
Ｂ．考察
５ラウンドのインビトロ選択後、標的ＲＮＡホスホエステルのＰｂ２＋依存性切断を効率的に触媒する一本鎖ＤＮＡ分子集団を得た。この集団から単離した代表的な個体の共通の特徴に基づき、触媒及び基質ドメインの単純化バージョンを構築し、分子間関係における迅速な触媒代謝回転の実証を誘導した。したがって、３８量体触媒ドメインはＤＮＡ酵素、又は「デオキシリボザイム」と呼ばれるものの例を提供する。
【０１８５】
この分子が、迅速な代謝回転で進行し、かつ、ミカエリス−メンテン動力学にしたがう反応において化学的変換を促進することができる情報性高分子であるという事実に基づく、この分子の酵素としての言及は、酵素を構築するものについて全ての人が認める概念を満足させないだろう。ある者は、酵素は本質的にポリペプチドでなければならないと主張するかもしれない。しかしながら、ＲＮＡ酵素の概念を認めるならば、ＤＮＡ酵素に関する同様の見解を採用することは妥当であると考える。本発明者等がランダム配列ＤＮＡのプールからこの分子の生成を極めて迅速に行うことができたということを考慮すると、合成ＤＮＡ酵素の多数の例が近い将来に現れることを予想している。
【０１８６】
ＲＮＡホスホエステルのＰｂ２＋依存性切断を、ＤＮＡ触媒の最初の標的として選択した。なぜなら、この反応は、切断部位に隣接して存在する２’ヒドロキシルの脱保護を促進する配位Ｐｂ２＋−ヒドロキシルの適切な位置のみを要求する単純な反応だからである（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ，Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ  ＆  Ａｔｋｉｎｓ（ｅｄｓ．），ｐｐ．２７１−３０２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９３）を参照のこと）。Ｐｂ２＋は、プリンのＮ７部位に配位し、グアニンの０６部位に配位し、ウラシルの０４部位に配位し、シトシンのＮ３部位に配位することが知られている（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３０３：５４３−５４６，１９９３）。したがって、ＲＮＡと比較した糖組成及びＤＮＡの立体配座の差異は、ＤＮＡが十分に規定されたＰｂ２＋−結合ポケットを形成することを妨げそうにはない。
【０１８７】
その他の全ＤＮＡ配列内に単一のリボヌクレオチドを含む基質を選択した。なぜなら、切断に対する唯一の許された部位が提供されており、得られた全ての触媒活性が唯−ＤＮＡに起因することを保証するからである。基質認識は、触媒及び基質間で塩基対形成相互作用する２つの領域に依存すると考えられる。しかしながら、２つの領域間に存在する対を形成しない基質ヌクレオチド５’−ＧＧＡ−３’は、基質認識、金属の配位又は触媒機能のその他の側面において重要な役割を果たすだろう。
【０１８８】
全ＲＮＡ分子、その他のＲＮＡ−ＤＮＡ複合体及び１以上のヌクレオチド類似体を含む分子は許容される基質であろう。本明細書に記載するように、本明細書に記載されるインビトロ進化手順を首尾よく使用して、所望の特異性を有する酵素ＤＮＡ分子を生成してもよい。この系についての更なる分析も進行中である。
【０１８９】
更に、酵素及び基質間の推定塩基対形成相互作用が、配列に関して一般化されるか否かを決定する研究が、本明細書に記載される方法を使用して進行中である。本明細書に記載されるＰｂ２＋−依存性デオキシリボザイムを、ＤＮＡの構造的及び酵素特性を探索するためのモデル化合物として考慮してもよいだろう。
【０１９０】
ＤＮＡ触媒の迅速な開発のために本明細書の開示において使用される方法はかなり一般的なものであるので、本発明者等がその他の補因子を使用して、潜在的な触媒ドメインに付着する標的結合の切断の引き金を引くことを許容するだろう。
【０１９１】
この点に関して、その他のカチオンの存在下において機能するＤＮＡ酵素の開発（実施例４）と同様に、生理的条件下において標的ＲＮＡを特異的に切断するＭｇ２＋依存性ＤＮＡ酵素の開発が興味の対象となる。そのような分子は、標的ｍＲＮＡの特異的な不活性化に対する伝統的なアンチセンス及びリボザイムアプローチの代替物を提供するだろう。
【０１９２】
したがって、酵素活性を示すことができる生物学的巨大分子のリストにおいて、ＤＮＡは、ＲＮＡ及びタンパク質に加わる。ＤＮＡの触媒能力の全範囲は探索中であるが、これらの探索は、本研究において使用する方法等のインビトロ選択法に基づいて急速に進行するだろう。
【０１９３】
ＤＮＡ酵素は、その他の巨大分子触媒と比較していくつかの重要な利点を提供する。第一は、ほとんどの研究所が自動化ＤＮＡ合成機にアクセスし、ＤＮＡホスホラミダイトのコストが極めて適切なものとなった時代において、容易に調製されることである。第二に、ＤＮＡ酵素は、特にＲＮＡと比較して極めて安定な化合物であるので、生物物理学的研究における使用を促進することができることである。第三は、現在、ＲＮＡ切断活性を欠くアンチセンスＤＮＡを利用している治療学的応用へ適用することができることが期待されていることである。インビトロ選択は、ＤＮＡ類似体を用いて実行することができるだろう。このＤＮＡ類似体は、ヌクレアーゼ耐性、例えばホスホロチオネート含有ＤＮＡである。これらのＤＮＡ類似体はデオキシヌクレオシド５’−トリホスフェートの形態で調製することができる限り、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼによって基質として許容される。最後に、ＤＮＡ酵素は、触媒機能の巨大分子的基礎の理解についての新規な窓を提供する。例えば、同一の化学的変換を触媒するタンパク質基礎酵素、ＲＮＡ基礎酵素及びＤＮＡ基礎酵素の比較分析を行うことは興味深いだろう。
【０１９４】
４．触媒ＤＮＡのその他のファミリー
ＤＮＡの出発プールを、ＤＮＡ出発プールが４０ランダムヌクレオチドを含んでいたことを除いて前記実施例２Ｂと本質的に同様にしてＰＣＲにより調製した。したがって、本実施例に記載するＤＮＡ出発プールは、合成オリゴマー５’ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ｒＡ  ＧＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  Ｎ４０ＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＡＣ３’（配列番号２３）、（ＮはＧ、Ａ、Ｔ及びＣの等モル混合物である。）を使用したＰＣＲにより調製した。ＤＮＡ分子を、標的ｒＡへ続くホスホエステルを切断する能力について選択した（図６Ａも参照のこと）。
【０１９５】
選択的増幅を、Ｐｂ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋又はＭｇ２＋のいずれかの存在下で行い、少なくとも４つの触媒ＤＮＡ分子の「ファミリー」を生成した。図５に示されるように、特異的活性を示す触媒ＤＮＡ分子が種々のカチオンの存在下で生成した。
【０１９６】
図５は、選択した触媒ＤＮＡの４つのファミリーの特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を示すポリアクリルアミドゲルの写真表示である。分子中のＰｂ２＋依存性ファミリーの選択を、対照として平行して繰り返した。３つのレーンの各グループにおいて、第一のレーンは、金属カチオン非存在下における選択した集団の活性の欠如を示している。第二のレーンは、金属カチオンの存在下において観察された活性を示している。第三のレーンは出発プール（Ｇ０）の活性の欠如を示している。現在、反応性の順番は、Ｐｂ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｍｎ２＋＞Ｍｇ２＋であることが観察された。これは、対応の金属水酸化物のｐＫａを反映している。
【０１９７】
予め選択した二価カチオンの存在下における各５ラウンド（Ｇ５）又は６ラウンド（Ｇ６）の選択的増幅の後、所望のエンドヌクレアーゼ活性を得た。以下に示すＭｇ２＋の存在下における選択的増幅についての説明は、例示であることを意図する。
【０１９８】
使用した二価金属が１ｍＭ  Ｐｂ２＋ではなく１ｍＭ  Ｍｇ２＋であったことを除いて、本明細書の実施例２に記載の方法にしたがい、６ラウンドのインビトロ選択増幅を行った（Ｂｒｅａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｌ．，１：２２３−２２９，１９９４（この文献は本質的に同一の手順を記載しており、参照することにより本明細書に組み込まれる。）も参照のこと）。
【０１９９】
６ラウンド後に、個々のクローンを単離し、これらのクローンのうちの２４のヌクレオチド配列を決定した。全ての配列は、５’ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ｒＡ  ＧＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＣＧＡ  ＣＡ（配列番号２３の部位１〜４４）で始まり、ＣＧＧ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ３’（配列番号２３の部位９３〜１０７）で終わっていた。
【０２００】
出発プールのＴＣＴＣ  Ｎ４０  ＧＴＧＡ（配列番号２３の部位４５〜９２）に対応する中間のセグメントは下記の通り変動した。
【０２０１】
【化１】
0005066016.tif 000005
括弧内の最初の数字は、特定の配列を有するクローンの数を示している。ある変異（太字で強調）は、最初にランダム化したヌクレオチド部位以外の部位で起こったことに注目すべきである。
【０２０２】
前記に列挙した第二の配列（すなわち、配列番号２５）は、２４のクローンのうち５つで生じ、これを更なる研究のためのリード化合物（すなわち、主化合物）として選択した。切断活性を、濃度１ｍＭの種々の二価金属イオン及び１Ｍ  ＮａＣｌの存在下、ｐＨ７．０、２３℃で測定した。
【０２０３】
【表２】
0005066016.tif 000006
【０２０４】
リード化合物を、Ｍｇ２＋の存在下における活性について選択したけれども、４つ全ての二価金属の存在下で活性であった。逆に、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋又はＰｂ２＋の存在下における活性について選択したＤＮＡ分子は、Ｍｇ２＋の存在下において活性を全く示さなかつた。
【０２０５】
更に、Ｍｇ２＋の存在下における６ラウンドのインビトロ選択後に得たＤＮＡ集団は、全てをホスホロチオネート含有ＤＮＡ類似体として調製したとき、〜１０−３分−１の観察された速度でＭｇ２＋依存性切断活性を示した。各立体中心にＲＰ配置を有するようにホスホロチオネート含有類似体を酵素に調製した。そのような化合物は、非修飾ＤＮＡと比較して、細胞ヌクレアーゼによる分解に比較的耐性を有した。
【０２０６】
リード化合物を４０ヌクレオチド部位（下線部）で再ランダム化し、１５％の頻度（３つの可能性のある塩基置換のそれぞれが５％の可能性）で変異を導入した。再ランダム化集団を追加の７ラウンドのインビトロ選択に付した。最後の４ラウンドの間、１ｍＭ  Ｐｂ２＋の存在下で反応性の分子を集団から取り除き、残りを１ｍＭ  Ｍｇ２＋の存在下における反応に挑戦させた。７回目のラウンド後、個々のクローンを単離し、これらのクローンのうち１４のヌクレオチド配列を決定した。全ての配列は、５’ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ｒＡ  ＧＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  （配列番号２３の部位１〜４８）で始まり、ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＧＴＡ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  Ｃ３’（配列番号２３の部位８９〜１０７）で終わっていた。
【０２０７】
４０の部分的にランダム化した部位（Ｎ４０、配列番号２３の部位４９〜８８）に対応する中間のセグメントは下記の通り変動した。
【０２０８】
【化２】
0005066016.tif 000007
【０２０９】
括弧内の数字は、特定の配列を有するクローンの数を示している。太字で示すヌクレオチドは、リード化合物とは異なるヌクレオチドである。
【０２１０】
これらのクローンの切断活性についての正式な分析が進行中である。集団は全体として、〜１０−２分−１の観察された速度でのＭｇ２＋依存切断活性を示した。これは、Ｐｂ２＋の存在下における活性と比較可能なレベルであった。
【０２１１】
図６Ａ及び６Ｂは、それぞれ本明細書に記載する選択的増幅方法により得た「前駆体」触媒ＤＮＡ分子及びいくつかの触媒ＤＮＡ分子のうちの１つの二次元図を示している。図６Ａは出発プールの１つの例示分子であり、これは、配列番号２３に現される分子の全体的な配置を示している。図示されるように、種々の相補的ヌクレオチドがランダム（Ｎ４０）領域に隣接している。
【０２１２】
図６Ｂは、本明細書に記載の手順により生成したＭｇ２＋依存性触媒ＤＮＡ分子（又は「ＤＮＡｚｙｍｅ」）の１つの略図である。基質核酸内のリボヌクレオチドの位置は矢印で示される（図示した分子は、配列番号２３の「最初」及び「最後」の配列だけでなく、配列番号２５に同定される配列を含んでいる）。
【０２１３】
本明細書に開示されるように、エンドヌクレアーゼ活性は、インビトロ進化を経て前記の各「ファミリー」において増強を続けた。そのため、本明細書に開示されるガイドラインを使用して、更に望ましい特異性を有する酵素ＤＮＡ分子を生成してもよい。
【０２１４】
５．大きなＲＮＡ配列の切断
前記の拡張と同様にして、前記に示したその他の全ＤＮＡ基質内に包埋した単一のリボヌクレオチドよりも全ＲＮＡ基質を切断するＤＮＡ酵素を開発した（Ｂｒｅａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｌ．，１：２２３−２２９，１９９４、Ｂｒｅａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｌ．，２：６５５−６６０，１９９５を参照のこと）。標的配列として、配列５’ＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵ３’（配列番号４９）を有する、ＨＩＶ−１  ＲＮＡのＵ５ＬＴＲ領域内の１２の高度に保存されたヌクレオチドのストレッチを選択した。
【０２１５】
前記実施例に記載の方法にしたがい、以下に示す組成を有する１０１４ＤＮＡ分子のプールを生成した。
【０２１６】
【化３】
0005066016.tif 000008
【０２１７】
ＮはデオキシリボヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ及びＣの等モル混合物であり、「ｒ（ＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵ）」として同定される配列は、リボヌクレオチドから構成される（適宜、追加のｄＡ残基を、５’末端のリボヌクレオチド部分に先行する配列へ添加して、最初の５’ヌクレオチド配列を改変し、「ＧＧＡＡＡＡＡ」を読む最初の配列を生じさせ、長さ９９残基である配列番号５０で示される配列を生じさせてもよい。明らかなことに、これは本明細書に詳細に記載される様に特定の酵素ＤＮＡ分子を操作するためになされてもよい修飾の単なる１例である。
【０２１８】
初期ライブラリーを、１０Ｕｕｌ−１  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（ＲＴ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＊ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び各０．２ｍＭのｄＮＴＰを含む反応混合物５０−ｕｌ中、１００ｐｍｏｌｓの５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧ−Ｎ５０−ＧＴＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣ−３’（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ）についての５０ｐｍｏｌｓの５’−ビオチン−ｄ（ＧＧＡＡＡＡＡ）ｒ（ＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵ）ｄ（ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＣ）−３’の鋳型特異的伸長により生成した。極微量の［５’−３２Ｐ］−標識プライマーが反応混合物中に含まれており、伸長効率をモニターすることを許容した。ＲＴを除く全ての成分を組み合わせ、６５℃で５分間インキュベートし、４５℃で１０分間冷却した。ＲＴを添加し、混合物を４５℃で４５分間インキュベートし、Ｎａ２  ＥＤＴＡの添加によりクエンチした。ＮａＣｌを終濃度１Ｍになるまで添加し、伸長生成物を４つのストレプトアビジンアフィニティーカラム（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を繰り返して通過させることにより固定化した。カラムを、３７℃下、容量１００−ｕｌの洗浄緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＊ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）で５回、続いて容積１００−ｕｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨで５回、容積１００−ｕｌの洗浄緩衝液で５回洗浄し、反応緩衝液（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＊ＨＣｌ（ｐＨ７．５））の３×２０−ｕｌアリコートを用いて、３７℃下で１時間かけて溶離した。溶離した分子を回収し、プライマー５’−ビオチン−ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＣ−３’及び５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧ−３’を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＰＣＲ生成物を、前記のようにしてストレプトアビジンカラム中に固定化し、容積１００−ｕｌの洗浄緩衝液で５回洗浄し４０ｕｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨを用いて溶離し、非ビオチン化鎖を得た。単離したＤＮＡをエタノール沈殿し、プライマー伸長反応における鋳型として使用し、次ラウンドを開始した。２〜１０ラウンドは、反応スケールを伸長の間は５倍減少させ、ＰＣＲの間は２倍減少させたことを除いて前記と同様にして行った。
【０２１９】
生成した酵素ＤＮＡ分子を、包埋したＲＮＡ標的配列内に位置するホスホエステルを切断する能力について選択した。ｐＨ７．５、３７℃における１０ｍＭ  Ｍｇ２＋存在下における酵素ＤＮＡ分子活性に基づいて、１０ラウンドのインビトロ選択増幅を行った。選択工程の間、「好ましい」切断部位及びその好ましい部位で切断する「最良の」触媒についての競争が存在した。最も効率的な切断能力を有する２つの部位及び２つの触媒ファミリーが出現した（図７）。
【０２２０】
図７は、基本的に本明細書に記載されるようにして行った１０ラウンドのインビトロ選択的増幅のある結果を示している。示されるように、２つの部位及び触媒の２つのファミリーが、最も効率的な標的配列切断を示すものとして出現した。
【０２２１】
切断条件は図７に示されるものと本質的に同一であった。すなわち、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、ｐＨ７．５、３７℃であった。反応２時間後に集めたデータを示す。切断（％）を、世代数（０〜１０）に対してプロットした。基質中の示された部位で標的配列を切断することができる触媒ＤＮＡ分子の数／普及率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を、Ｇ↓ＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵで切断したものを縞模様の垂直棒で、ＧＵＡＡＣＵＡ↓ＧＡＧＡＵで切断したものを開かれた垂直棒（僅かに陰影）で示した。図７において、矢印（↓）は、切断が起こる２つの隣接ヌクレオチド間の部位を示している。
【０２２２】
８及び１０ラウンド目の選択的増幅後に得た集団に由来する種々の個体をクローニングした。第８ラウンド由来の２９個体及び第１０ラウンド由来の３２個体のヌクレオチド配列を決定した（それぞれ、表２及び３を参照のこと）。
【０２２３】
表２及び３の上部の「ヌクレオチド配列」の下に、出発プールにおいてランダム化された５０ヌクレオチド（すなわちＮ５０）に対応する同定された各クローン部分を示す。したがって、与えられたクローンの全体のヌクレオチド配列は通常、「Ｎ５０」に先行、「Ｎ５０」に続く及び「Ｎ５０」を含むヌクレオチド配列を含んでいる。基質配列は付着しており、自己切断は起こっていないと椎定する。例えば、（非自己切断）クローンの全体配列は通常、配列番号５０の残基番号１〜３３、続くランダム化Ｎ５０領域を現す領域、、続く配列番号５０の残基番号８４〜９８又は配列番号５１の残基番号１〜３４、続くランダム化Ｎ５０領域を現す残基、続く配列番号５１の残基番号８５〜９９を含んでいる。しかしながら、各クローンのＮ５０（又はＮ４０）領域又はその一部は、特定の酵素ＤＮＡ分子の特異性及び／又は活性の決定において特に重要である。このことは、基質及びＤＮＡｚｙｍｅが別の分子である反応においては特に明確である（例えば、図８及び９を参照のこと）。
【０２２４】
クローン番号は、第８ラウンド及び第１０ラウンド後に得られた個体についてそれぞれ８−ｘ及び１０−ｘと名付けた。配列番号を列挙し、各クローンの「Ｎ５０」領域と対応させた。
【０２２５】
【表３】
0005066016.tif 000009
0005066016.tif 000010
0005066016.tif 000011
１．１０−４、１０−４０と同一。
２．８−２０、８−３２、８−３８、１０−１、１０−３４と同一。１０−１１に対して１つの変異。１０−２９に対して３つの変異。
【０２２６】
【表４】
0005066016.tif 000012
0005066016.tif 000013
0005066016.tif 000014
３．１０−５に対して１つの変異。
４．１０−３０に対して１つの変異。
【０２２７】
続いて種々のクローンの自己切断活性を測定した。クローン８−５、８−１７及び１０−３は部位５’  ＧＵＡＡＣＵ↓ＡＧＡＧＡＵ  ３’で効率的に切断することを見いだした。一方、クローン１０−１４、１０−１９及び１０−２７は部位５’  Ｇ↓ＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵ  ３’で効率的に切断することを見いだした。分子のＲＮＡ部分を配列５’  ＧＧＡＡＡＡＡＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵＧＧＡＡＧ  ３’（配列番号５１の残基番号１−２４）に伸長したとき、クローン８−１７、１０−１４及び１０−２７は完全な活性を保持したが、クローン８−５、１０−３及び１０−１９では活性が低下した。続いて、クローン１０−２３は、伸長したＲＮＡドメインを含む自己切断反応において高レベルの活性を示すことを見いだした。
【０２２８】
当業者が同様のことを理解しない場合、本明細書の開示にしたがい操作したポリヌクレオチド分子の「Ｎ５０」領域に先行又は続くヌクレオチド配列、すなわち「Ｎ５０」領域に隣接する基質結合領域を、例えば長さ、ヌクレオチド配列、核酸の種類等について種々の方法で改変し、特定の特異性を有する酵素ＤＮＡ分子を生成してもよいことに注意すべきである。例えば、配列番号５１の残基番号１−２４がＲＮＡヌクレオチドとして記載されているが、これらは代替としてＤＮＡ、ＲＮＡ又はその複合物を含んでいてもよい。すなわち、例えば配列番号５１を、核酸残基番号１−７がＤＮＡを含み、残基番号８−１９がＲＮＡを含み、残基番号２０−９９がＤＮＡを含むことができるだろう。同様に、「Ｎ５０」に続くヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ又はその複合物を含んでいてもよい。「Ｎ５０」（又は「Ｎ４０」。実施例４を参照のこと）領域に先行又は続く領域の長さは、本明細書に記載されるように変化してもよい。更に、Ｎ５０又はＮ４０領域に先行及び／又は配列を短縮、拡張又は全体として削除してもよい。
【０２２９】
更に、前記のように、本実施例に記載する方法における標的配列としてＨＩＶ−１ＲＮＡの特定の領域を選択した。そのような配列は、標的として使用する唯一のものではない。明らかに、当業者は、本明細書に記載される教示にしたがい、その他の標的配列に特異性を有する酵素ＤＮＡ分子を操作し、設計するだろう。本明細書に記載されるように、そのような標的配列を構築し、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は配列番号５０及び５１に記載されるその複合物を含む大きな配列へ挿入してもよい。
【０２３０】
酵素及び基質ドメインを別分子に分割することにより、自己切断反応は分子間反応へ容易に転換した。クローン８−１７及び１０−２３をプロトタイプ分子として選択した。両方とも、多代謝回転で進行する反応における別個の全ＲＮＡ基質の切断においてＤＮＡ酵素として作用することが示された（図８）。続いて、基質結合アームを、切断部位を画する未対合のヌクレオチドの各側における７塩基対へ縮小した（図９）。
【０２３１】
図８は、本発明の２つの触媒ＤＮＡ分子であるクローン８−１７及び１０−２３のヌクレオチド配列、切断部位及び代謝回転速度を現している。反応条件は示したとおりである。すなわち、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、ｐＨ７．５及び３７℃であった。クローン８−１７として同定されたＤＮＡｚｙｍｅを左に示す。ＲＮＡ基質の切断部位は矢印によって示される。この基質配列（５’−ＧＧＡＡＡＡＡＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵＧＧＡＡＧ−３’）は、ＤＮＡｚｙｍｅから単離したもの（すなわち中間切断物が示される）であり、それ自体が標識されていた。同様に、本明細書において１０−２３として同定されたＤＮＡｚｙｍｅを右に示す。ＲＮＡ基質の切断部位を矢印で示す。更に基質配列を示す。８−１７酵素について、代謝回転速度は約０．６時間−１であった。１０−２３酵素について、代謝回転速度は約１時間−１であった。
【０２３２】
図８に示すように、別の基質分子を切断することができる触媒ＤＮＡ分子であるクローン８−１７のヌクレオチド配列は以下の通りである。５’−ＣＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴＡＣＴＴＴＴＴ−３’（配列番号５６の残基番号１−３４）。同図において、別の基質分子を切断することができる触媒ＤＮＡ分子であるクローン１０−２３のヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０２３３】
【化４】
0005066016.tif 000015
【０２３４】
更に、図９は本発明の２つの触媒ＤＮＡ分子であるクローン８−１７及び１０−２３のヌクレオチド配列、切断部位及び代謝回転速度を現している。反応条件は示したとおりである。すなわち、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、ｐＨ７．５及び３７℃であった。図８に示されるように、クローン８−１７として同定されたＤＮＡｚｙｍｅを左に示す。ＲＮＡ基質の切断部位は矢印によって示される。この基質配列（５’−ＧＧＡＡＡＡＡＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵＧＧＡＡＧ−３’）は、ＤＮＡｚｙｍｅから単離したもの（すなわち中間切断物が示される）であり、それ自体が標識されていた。同様に、本明細書において１０−２３として同定されたＤＮＡｚｙｍｅを右に示す。ＲＮＡ基質の切断部位を矢印で示す。更に基質配列を示す。８−１７酵素について、Ｋｏｂｓは約０．００２分−１であった。１０−２３酵素について、ｋｏｂｓ値は約０．０１分−１であった。
【０２３５】
図９に示すように、別の基質分子を切断することができる触媒ＤＮＡ分子であるクローン８−１７のヌクレオチド配列は以下の通りである。５’−ＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴＡＣＴ−３’（配列番号５６の残基番号４−３０）。同図において、別の基質分子を切断することができる触媒ＤＮＡ分子であるクローン１０−２３のヌクレオチド配列は以下の通りである。５’−ＣＴＡＧＴＴＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＴＴＴＴＣＣ−３’（配列番号８５の残基番号５−３３、５’末端において「ＴＴＧ」が「ＣＴＡ」で置換されている）。
【０２３６】
ＲＮＡ切断ＤＮＡ酵素の触媒速度は、今は十分に最適化されていない。前記及び過去の研究報告の通り、本発明者等は、プロトタイプ分子を部分的にランダム化し、選択的増幅の追加のラウンドを行うことにより触媒速度を改善することができた。しかしながら、本発明者等は、８−１７及び１０−２３のＭｇ２＋に対するＫｍが、それぞれ約５ｍＭ及び２ｍＭ（ｐＨ７．５、３７℃で測定）であることを見いだした。これは細胞内条件と確かに適合するものである。
【０２３７】
６．普遍的な基質酵素の調製
前記は、予め選択した配列を有する標的核酸を触媒的に切断する能力を有する本発明の酵素を示したものである。更に、全ＤＮＡである核酸、デオキシリボヌクレオチド（すなわちＤＮＡ）配列内に包埋されたリボヌクレオチド（すなわちＲＮＡ成分）を有する核酸又は全体がＤＮＡである核酸を切断する酵素が示される。更に、改変することができる基質及びその基質を切断することができる酵素を調製する。
【０２３８】
本発明によって、全ての標的となる基質、すなわち約１０〜３０ヌクレオチドの長さの予め選択したヌクレオチド配列を含むものを、生理的条件下において効率的かつ特異的な動力学的態様で切断することができる酵素が提供される。この酵素は容易に製造することができかつ安価である。更に、ＲＮＡ構造の探索及び組換えＲＮＡ、例えば配列特異的エンドリボヌクレアーゼ等の操作をするための、標的ＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の不活性化に有用である。
【０２３９】
ＲＮＡの不活性化について、この酵素は標的細胞ＲＮＡの不活性化に有用であり、、例えば「アンチセンス」オリゴデオキシヌクレオチドを使用してｍＲＮＡ機能をブロックすることができる。しかしながら、本発明の酵素は、アンチセンス試薬よりも優れている。なぜなら、本発明の酵素は、標的の認識及び切断を提供し、触媒代謝回転で機能することができるからである。一方、アンチセンス分子は等モルの様式（すなわち、非触媒的）での認識を提供するのみであり、ＲＮＡ不活性化反応についてはその他の細胞性酵素に依存しなければならない。
【０２４０】
以下に示すセクションは、前記「１０−２３」及び「８−１７」モチーフに基づく改良酵素の調製について記載している。これらの改良酵素は、予め選択した標的配列をすべて切断することができる一般的酵素である。また、本明細書において詳述するように、標的特異性は、酵素の基質結合領域の配列にのみ依存する。
【０２４１】
前記実施例５に記載するように、「１０−２３」及び「８−１７」と命名した２つのモチーフを、選択的増幅の連続的ラウンドの間に同定した。これらを分子間切断反応について作り直したところ、この態様で効率的な遂行を示した。
【０２４２】
シミュレートした生理的条件下（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．５、３７℃、ｋｃａｔ＝約０．０１分−１の速度）における、図９に示される別々の基質分子の部位特異的触媒切断を提供する反応（すなわち、分子間切断）を使用して、更なる研究を行った。
【０２４３】
切断は、酵素に相補的なオリゴヌクレオチドが隣接する基質の未対合プリンヌクレオチドにしたがい起こった。５’及び３’切断生成物は、それぞれ２’（３’）ホスフェート及び５’ヒドロキシルを有して（ｂｏｒｅ）いた。これは隣接ホスフェートの２┤  ヒドロキシルによる攻撃を含む反応メカニズムを示している。「８−１７」及び「１０−２３」モチーフ酵素の両方においては、基質配列を、酵素の基質結合アームが相補的な様式で改変される限り、触媒活性の喪失なしに改変することができる。８−１７酵素は、切断部位の直ぐ下流に位置するｒＧ−ｄＴ「ゆらぎ」対について特別の要求を有する。この部位におけるワトソン−クリック対の置換は触媒活性を除去した。１０−２３酵素の基質結合アームは、標準ワトソン−クリック塩基対形成により基質全体と相互作用した。８−１７及び１０−２３モチーフ酵素の触媒コアは、それぞれ１３及び１５のデオキシヌクレオチドを含む２つの基質結合アームの間に位置していた。
【０２４４】
触媒コアの配列要求性をより正確に定義するために、各モチーフの１０１４の変異体からなるライブラリーを生成し、次いでコアのいたるところにヌクレオチド部位あたり２５％の頻度でランダム変異を導入した各ライブラリーを６つの異なるインビトロ選択プロトコルに付した。このプロトコルは全５２ラウンドの選択的増幅を含んでいた。この選択方法及び戦略を変更して、２つのプロトタイプ分子に関連する配列の徹底的な試験を行った。選択した集団由来の個体をクローニングし、配列決定し、触媒活性について試験した。この手順を以下に示すようにして行った。
【０２４５】
８−１７及び１０−２３分子に基づく再選択は、各モチーフについて６つの異なる系列を含んでいた。各系列は５〜２１ラウンドのインビトロ選択を伴い、選択プロトコル及び反応時間に関しては異なっていた。全ての切断反応は、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＊ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、３７℃で行った。反応時間は、初期のラウンドでの６０分間から後期のラウンドにおける１分間へと変化した。鋳型の各出発プールは、プロトタイプに相補的な配列に基づいており、それぞれ７つのヌクレオチドの固定化結合アーム及び各ヌクレオチド部位が２５％の縮重でランダム化された触媒コアを有していた。８−１７及び１０−２３モチーフについて、鋳型はそれぞれ以下の配列を有していた（小文字はＰＣＲプライマー部位。基質結合アームに下線、ランダム化部位をイタリックにした）。
【０２４６】
【化５】
0005066016.tif 000016
【０２４７】
鋳型特異的伸長に使用するプライマーは、配列５’−ビオチン−ｒ（ＧＧＡＡＡＡＡ−ＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵＧＧ）ｄ（ＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＣ）−３’を有していた。８−１７を基本とする選択用のＰＣＲプライマーは５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧＡＧＴＡＡＣＴ−３’及び、５’−ｄ（ＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＡＣＣ−ＣＡＴＣ）ｒＵであった。１０−２３を基本とした選択用ＰＣＲプライマーは５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧＧＧＡＡＡＡＡ−３’及び５’−ｄ（ＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＡＣＣＴＡＧＴＴ）ｒＡであった。ＰＣＲプライマーは結合アームを包含しており、したがって、これらの配列を固定していた。各セットのＰＣＲプライマーの１つは３’末端リボヌクレオチドを含んでおり、これが非鋳型鎖のアルカリ加水分解による二本鎖ＰＣＲ生成物からの鋳型鎖の単離、続くポリアクリルアミドケル電気泳動による精製を許容した。ケルを基礎とする選択スキームをいくつかの系列に使用した。ＰＣＲプライマーは、５’−ビオチン−ＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧ−３’及び、５’−ＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＴＡＧ−ＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＡＣＣ−３’でであった。伸長反応を固体担体中、プライマー５’−ｒ（ＧＧＡＡＡＡＡＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵＧＧＡＡＧ）−３’を使用して行った。極微量の［α−３２Ｐ］−ｄＡＴＰを混合物中に含めて伸長生成物を標識し、アルカリを用いて溶離し、変性ポリアクリルアミドケル精製により精製し、エレクロトエルーション（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）により回収した。次いで分子を反応させ、切断を起こした分子をゲル電気泳動により単離した。
【０２４８】
初期選択の８回目と１０回目のラウンド後に、前記と同様にして個々の分子をクローニングし、配列決定した。第８ラウンドの１７番目のクローン（８−１７）及び第１０ラウンドの２３番目のクローン（１０−２３）は、それぞれ配列５’−ｃａｃｇｇｔｔｃｇａ−ａｔｇｇｃＧＴＴＡＴＧＣＡＴＣＡＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣｃａｇｃｇｇｔａｇ−ａｇａａｇｇ−３’及び、５’−ｃａｃｇｇｔｔｃｇａａｔｇｇｃＡＴＧＴＴＡＡＧＴＴＣＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＧＣＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＧＧＡＴＴ−ＧＧＴＴＴＣＣＣｃａｇｃｇｇｔａｇａｇａａｇｇ−３’を有していた（小文字はＰＣＲプライマー部位。基質結合アームに下線、ランダム化部位をイタリックにした）。分子間反応のために、合成オリゴデオキシヌクレオチドを、基質結合アームの外側領域を欠くクローン化配列を基礎として調製した。これらを使用して、初期ライブラリーの構築に使用したプライマー（前記参照）と同一の配列を有する全ＲＮＡ基質を切断した。続いて、ＤＮＡ酵素の基質結合アームをそれぞれ７ヌクレオチドに縮小し、ＲＮＡ基質に完全に相補的にした。
【０２４９】
８−１７酵素の場合において、クローン化個体間の配列の変動は、触媒コアが短い内部ステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）、続く未対合の４〜５ヌクレオチド領域から構成されることを示唆している（図１０）。ステムは通常、３つの塩基対を含んでおり、このうち少なくとも２つはＧ−Ｃであった。ループは不変であり、配列５’−ＡＧＣ−３’を含んでいた。ステムを伸ばすか又はループを改変した配列合成構築物は触媒活性を示さなかった。下流基質結合ドメインに対するステムの３’半分部分に結合する未対合領域は、配列５’−ＷＣＧＲ−３’又は５’−ＷＣＧＡＡ−３’（Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｒ＝Ａ又はＧ）を含んでいた。この領域に配列５’−ＴＣＧＡＡ−３’を有する変異体は最高レベルの触媒活性を示したが、８−１７酵素に関する増強はその他の基質配列に対して一般化されなかった。
【０２５０】
１０−２３酵素モチーフの触媒コアの８番目のヌクレオチド部位は、Ｔ、Ｃ又はＡのいずれかの変異を許容した。しかし、この部位のＴ（プロトタイプと同じ）が最高レベルの活性を提供した。ＲＮＡ基質と基質結合ドメインの対応の相補的ＤＮＡ酵素との多数の異なる組み合わせは、１０−２３モチーフが全ての基質配列に関して一般的であることを明らかにした。
【０２５１】
１０−２３及び８−１７モチーフ変異体についての触媒活性を、多代謝回転反応を使用して測定したところ、異日に行った同一の実験について通常＜２０％の変動を示した。単一及び多代謝回転実験で得られた動力学的値は類似していた。合成ＲＮＡ基質を用いて得た値は、インビトロ転写基質を用いて得た値よりも都合よく僅かに低かった。報告されているｋｃａｔ及びＫｍ値は、ｋｏｂｓ対ｋｏｂｓ／［Ｓ］の改変イーディー−ホフスティープロットの最良適合線のそれぞれｙ切片及び負の勾配から決定した。各プロットは、Ｋｍをまたぐ［Ｓ］範囲（［Ｅ］の１０倍をこえる［Ｓ］）について１０のデータポイントから構成されていた。ｋｏｂｓ値は通常最初の１０％の反応について得られた５つのデータポイントに基づいていた。基質及び酵素分子を別々に反応緩衝液中で１０分間プレインキュベートし、次いで組み合わせて反応を開始した。
【０２５２】
全ての反応は、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で行い、材料の容器壁への付着を防いだ。５０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−プロパンスルホン酸の添加によりｐＨを維持した。動力学的値は緩衝液の同一性により影響を受けなかった。反応生成物を、変性２０％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により分離し、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用して定量化した。
切断は、単一の未対合ヌクレオチドの３’側、好ましくはプリン、続くピリミジンにおいて起こった。Ａ及びＵに囲まれている標的部位は、シミュレートした生理的条件下において約０．１分−１の触媒速度で最も効率的に切断された。
【０２５３】
Ａ＊Ｕ部位においてＲＮＡを切断するＤＮＡ酵素を使用して、全てのｍＲＮＡ開始コドン（Ａ＊ＵＧ）を標的とすることができる。テストケースとして、ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌｍＲＮＡ（５’−ＧＧＡＧＡＧＡＧＡ＊ＵＧＧＧＵＧＣＧ−３’）の翻訳開始部位に対応する１７量体のＲＮＡの合成及びインビトロ転写バージョンを調製した。両方の基質バージョンとも、シミュレートした生理的条件下、対応の１０−２３ＤＮＡ酵素により、０．１５分−１のｋｃａｔ及び０．４７ｎＭのＫｍ値で進行する反応で、予想される部位で切断された（触媒効率、ｋｃａｔ／Ｋｍ＝３．２ｘ１０８Ｍ−１分−１）（図１１）。触媒速度は、１〜２５０ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２濃度の増加に伴い上昇した（Ｍｇ２＋に対する見かけのＫｍは１８０ｍＭ、ｐＨ７．５、３７℃）。触媒速度は、７．０〜８．５の範囲のｐＨ上昇につれておおよそ対数直線的に上昇した。これは、切断されたホスホエステルに隣接する２’−ヒドロキシルの脱保護を含む反応メカニズムと一致していた。５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ８．０、３７℃）の存在下において、ＲＮＡの実験室操作に有用な条件は、ｋｃａｔが３．４分−１であり、Ｋｍが０．７６ｎＭであった。生理的条件下及び実験室条件下における１０−２３ＤＮＡ酵素の触媒効率を、既知のＲＮＡ切断ＲＮＡの値と都合よく比較した。タンパク質酵素リボヌクレアーゼと比較したとき、ＤＮＡ酵素は〜１０４倍低いｋｃａｔを有したが、Ｋｍは〜１０５倍以上であった。
【０２５４】
１０−２３酵素を使用して、生物学的に関連する種々のＲＮＡを切断することができる。本発明者等は、ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖＰｒ、ｔａｔ、ｎｅｆ  ＩＧＦ−Ｒ及びＥ１００リガーゼｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む１５〜１７ヌクレオチドに対応する合成ＲＮＡ基質を調製した。各基質は、各７〜１２ヌクレオチド基質結合アームが隣接する１０−２３触媒コアを含む合成ＤＮＡ酵素により、予想される部位で切断された（表４）。全ての場合について、シミュレートした生理的条件下における触媒速度は約０．１分−１であった。しかしながら、Ｋｍ値は基質のヌクレオチド組成により変動した。グアノシンに富むｇａｇ／ｐｏｌ基質については、７−又は８−ヌクレオチド基質結合アームを使用したとき、Ｋｍ＜１ｎＭであった。ｅｎｖ及びｖｐｒ基質は、７−ヌクレオチド結合アームを使用したとき、都合よく非常に低いＫｍで切断された。しかし、アームを８ヌクレオチドに増加したとき、Ｋｍは実質的に改善された。
【０２５５】
【表５】
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0005066016.tif 000018
【０２５６】
測定し、表４に示す動力学的値は、多代謝回転条件下、合成ＤＮＡ酵素の＞１０倍をこえる合成ＲＮＡ基質を用いて得た。反応条件は、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、３７℃であった。２５ｍＭ  ＮａＣｌ２で得た。
【０２５７】
本発明のＤＮＡ酵素がサポートする基質結合領域（アーム）についての変異の更なる証明として、アームの長さを、表４に示されるＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子開始コドン標的ヌクレオチド配列を使用して４〜１３ヌクレオチド残基に系統的に変化させた。反応は、図１３に示すようにアームの長さを変化させたことを除いて、前記と同様にして調製した各ＤＮＡ酵素構築物について別々に行った。触媒ＤＮＡ酵素の動力学的特性を、２ｍＭ  Ｍｇ２＋、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、３７℃の条件下、前記通りに測定し、酵素の多代謝回転を測定した。ＨＩＶ−１  ｇａｇ造伝子に対して相補的に結合するように修飾した１０−２３モチーフを使用して、ｋｃａｔ（分−１）及びＫｍ（ｎＭ）を測定した。図１３に示す。
【０２５８】
結果は、５〜１３ヌクレオチド／アーム／基質結合領域の全範囲において有用な触媒速度が観察され、好ましい範囲７〜１０ヌクレオチドでは特に効率的であったことを示している。更に結果は、最大触媒の半分の有効酵素濃度（Ｋｍ）は５〜１３ヌクレオチドの長さでは１００〜０．０５ナノモル（ｎＭ）であり、７〜１３の長さが特に好ましいことを示している。
【０２５９】
種々の修飾を１０−２３ＤＮＡ酵素に取り込み、１０％ウシ胎仔血清中における安定性について試験した（図１３）。これらの修飾には、１）ＤＮＡの３’末端における「逆方向」（３’、３’−結合）チミジレート、２）両基質結合アームの遠位末端における５つの２’−Ｏ−メチル残基、３）両基質結合アームの全ての部位における２’−Ｏ−メチル残基、４）触媒コア内の５つのピリミジン−ピリミジン部位におけるホスホロチオネート残基、５）両基質結合アームの遠位末端における３つのホスホロチオネート残基が含まれる。最高の保護は、逆方向のチミジレート（ｔ１／２＞６０分）により提供された。その他の全ての修飾は、未修飾のＤＮＡと比較して増強された血清安定性を示した。ただし、コア内のＰ＝Ｓ置換は例外であった。全ての修飾ＤＮＡ酵素は触媒活性を保持した。
【０２６０】
したがって、本発明は、予め選択した全ての基質核酸配列を切断するように設計することができる、部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する触媒ＤＮＡ分子を記載している。ＤＮＡ分子（酵素）は第一及び第二の基質結合領域（アーム）を有し、これはコア領域に隣接している。各アームは標的基質核酸配列の一部に相補的な配列を有しており、第一及び第二のアームは一緒になって切断される基質核酸配列を規定している。相補性とは、基質結合領域が共有結合性ワトソン−クリック塩基対形成を用いて標的配列に結合することを意味する。
【０２６１】
アームの種々の長さをとることができる。しかしながら、長さが酵素の触媒速度（ｋｃａｔ）及び有効濃度（Ｋｍ）に影響することが観察されたので、好ましいアームの長さは各相補性の５〜１３ヌクレオチド、好ましくは約６〜１１ヌクレオチド、より好ましくは約７〜１０ヌクレオチドである。
【０２６２】
コア領域は以下の式に基づく種々の配列を有することができる。
【０２６３】
（Ｉ．）  Ｔ（ステム）’ＡＧＣ（ステム）“Ｚ（式中、（ステム）’及び（ステム）”は、それぞれ３つの連続ヌクレオチドであり、（ステム）’：（ステム）“対としてハイブリダイズするときは少なくとも２つのＧ：Ｃ対を含む３つの塩基対を含み、Ｚ＝ＷＣＧＲ又はＷＣＧＡＡであり、Ｗ＝Ａ又はＴであり、Ｒ＝Ａ又はＧである。）このステム構造を図１０に示す。図１０は、３つの相補的ヌクレオチド対を示している。特に好ましいのは、モチーフ８−１７のコア領域のプロトタイプ構造“ＴＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＣＧＡ”（配列番号１２０）であり、これは図１０に示される。
【０２６４】
別の態様においては、コア領域は以下の式で示される配列を有することができる。
【０２６５】
（ＩＩ．）  ＲＧＧＣＴＡＧＣＸＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号１２２）
（式中、Ｘ＝Ｔ、Ｃ又はＡであり、Ｒ＝Ａ又はＧである。）特に好ましいのは、モチーフ１０−２３のコア領域のプロトタイプ構造“ＲＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ”（配列番号１２１）であり、これは図１０に示される。
【０２６６】
前記デザインを有するＤＮＡ酵素は、図１２に示されるように、アームの長さに依存した有用な触媒速度範囲及び有効触媒濃度を示すことができる。８−１７又は１０−２３モチーフの本発明のＤＮＡ酵素は、通常生理的条件下で、約０．００５〜０．１分−１、好ましくは約０．０１〜０．１分−１、より好ましくは約０．０３〜０．１分−１の触媒代謝回転速度（ｋｃａｔ）を有する。特に好ましい酵素は、約０．１分−１の速度を有する。８−１７又は１０−２３モチーフの本発明のＤＮＡ酵素は、通常生理的条件下で、約０．０５〜１０００ナノモル（ｎＭ）、好ましくは約０．７〜９００ｎＭ、より好ましくは約１．０マイクロモル（ｕＭ）未満、特に好ましくは約０．１（ｕＭ）の触媒の最大有効濃度の半分濃度（Ｋｍ）を有する。
【０２６７】
前述の記載は、更に、好ましいＤＮＡ酵素が、生理的条件下における使用のためにＤＮＡ酵素を安定化するヌクレオチド修飾を有していることを示している。種々の修飾のすべてを、酵素が本明細書において定義され、測定される酵素活性を維持する限り利用することができ、それゆえ、本発明は特定の安定化修飾に限定されない。好ましい修飾は、主題となるＤＮＡ分子のエキソ又はエンド型核分解性（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）消化に対する感受性を低下させる。１つの態様においては、修飾は、１以上のヌクレオシドホスホロチオネート残基の組み込みを含んでいる。これはＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５０：５４５−５５６（１９９５）ｏｒ  ｂｙ  Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：１４７−１４９（１９９６）に記載されている。ホスホロチオネート残基はアーム又はコアに存在することができ、ある態様においてはコア内のジピリミジン上に残基を含んでいる。別の修飾は、糖ヌクレオチドのリボース又はデオキシリボース成分の２’部位へＯ−メチル基を置換し、２’Ｏ−メチルリボヌクレオチドを形成することを含んでいる。これも周知であり、前記Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。更なる修飾は、逆方向の末端ヌクレオチドをＤＮＡ分子の３’末端へ付着させ、３’末端をブロックし、遊離の５’末端を現すことである。この構造は３’エンドヌクレアーゼをブロックし、３’末端における３’−３’結合ヌクレオチドの形成（すなわち逆方向のヌクレオチド）により生成する。３’末端における３’逆方向ヌクレオチドの調製は周知であり、オリゴヌクレオチド合成中、出発材料として末端３’残基逆位を有する修飾固体担体を使用して調製する。この目的に好ましい固体担体材料はｄＴ−５’−ＣＰＧ５００（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）、ＶＡ））であり、これは修飾された残基を有する制御された有孔ガラス樹脂である。
【０２６８】
特定の態様及び実施例を含む前記の明細書は、本発明の説明を意図するものであり、本発明を限定するものとして解釈するべきではない。その他多数の変形及び修飾を、本発明の真の精神及び範囲を離れることなく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】標的ＲＮＡホスホエステルを切断するＤＮＡを分離する選択的増幅を示すスキームである。図示されたように、５０のランダムヌクレオチドの伸長物を含む二本鎖ＤＮＡ（その上に示された“Ｎ５０”を有する分子）をＰＣＲで増幅し、５′ビオチニル化ＤＮＡを用い、アデノシンリボヌクレオチド（ｒＡ）により３′端で終結する。（ビオチンラベルを丸で囲んだ文字“Ｂ”で示す。）このプライマーをＴａｑポリメラーゼで伸長して埋め込まれた１つのリボヌクレオチドを含むＤＮＡ産物を得る。得られた二本鎖ＤＮＡをストレプトアビジンマトリックス上に固定化し、０．２Ｎ  ＮａＯＨで洗浄することにより非ビオチニル化ＤＮＡ鎖を除去する。カラムを緩衝化溶液で再平衡化した後、１ｍＭ  ＰｂＯＡｃを加えた同じ溶液でカラムを洗浄する。Ｐｂ２＋依存性自己切断を受けるＤＮＡをカラムから放出させ、溶離液に集め、ＰＣＲで増幅する。次に、ＰＣＲ産物を用いて次のラウンドの選択的増幅を開始する。
【図２】ＤＮＡの出発プール（Ｇ０）と鉛陽イオン（Ｐｂ２＋）の存在下に第１〜第５ラウンドの選択（Ｇ１〜Ｇ５）後の集団の自己切断活性を示す写真である。記号Ｐｒｅは１０８−ヌクレオチド前駆ＤＮＡ（配列番号４）；Ｃｌｖは２８−ヌクレオチド５′切断産物（配列番号５）；及びＭはプライマー３ａ（配列番号６）を表し、長さが５′切断産物に対応する。
【図３】５ラウンドの選択後の集団から分離した個々の変異体を示す配列アラインメントである。上部に所定の基質ドメインを示し、標的リボアデニル酸塩を逆三角形により同定した。推定した塩基対合相互作用に一般に関係する基質ヌクレオチドを縦のバーで示す。５０のはじめがランダムのヌクレオチドに対応する配列を基質ドメインと逆平行に並べる。変異体の全てを所定の配列５′−ＣＧＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣ−３′（図示されていない；配列番号１）で３′終結する。基質ドメインと塩基対を形成すると考えられるはじめがランダムの領域内のヌクレオチドを図面の左右に示す。酵素ＤＮＡ分子の推定塩基対形成領域は、図示された各配列において個別に四角に囲まれている。保存領域は、中央に位置した２つの大きなボックスで示されている。
【図４Ａ】触媒の代謝回転で進行する分子間反応におけるＲＮＡホスホエステルのＤＮＡ触媒切断を示す図である。図４Ａは、１９量体基質（３′−ＴＣＡＣＴＡＴｒＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−５′、配列番号２）と３８量体ＤＮＡ酵素（５′−ＡＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＴＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＡＴＡＧＴＧＡＣＧＣＴＡ−３′、配列番号３）間に形成された複合体を示す線図である。基質は、デオキシリボヌクレオチドが隣接した１つのアデノシンリボヌクレオチド（“ｒＡ”、矢印の隣り）を有する。合成ＤＮＡ酵素は、図３に示された最も高い頻度で生じる変異体の３８−ヌクレオチド部分である。推定触媒ドメイン内に位置する高度に保存されたヌクレオチドは“四角に囲まれている”。示されたように、一方の保存配列は“ＡＧＣＧ”であり、もう一方は“ＣＧ”である（５′→３′の方向に読取り）。
【図４Ｂ】触媒の代謝回転で進行する分子間反応におけるＲＮＡホスホエステルのＤＮＡ触媒切断を示す図である。図４Ｂは、試験管内選択で用いられるものと同じ条件下で［５’−３２Ｐ］標識基質をＤＮＡ触媒切断するＫｍ（負のスロープ）とＶｍａｘ（ｙ切片）を求めるために用いたイーディー・ホフステープロットを示すグラフである。切断の初速度は、５ｎＭ  ＤＮＡ酵素及び０．１２５、０．５、１、２、又は４μＭ基質を含む反応について求めた。
【図５】ポリアクリルアミドゲルを示す写真であり、選択した触媒ＤＮＡの４ファミリーの特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を示す。対照としてＰｂ２＋依存性ファミリーの分子の選択を平行方式で繰り返した（第１グループ）。第２グループでは、陽イオンとしてＺｎ２＋を用い、第３グループでは陽イオンはＭｎ２＋であり、第４グループでは陽イオンはＭｇ２＋である。ゲル上の第５の位置はマーカーとして切断産物のみからなる。わかるように、上記４グループの各々には３レーンがある。３レーンの各グループにおいては、第１レーンは金属陽イオンの存在しないときの選択した集団の活性がないことを示し、第２レーンは金属陽イオンの存在するときの活性が見られたことを示し、第３レーンは出発プールの活性のないことを示す（Ｇ０）。
【図６Ａ】各々“前駆体”の触媒ＤＮＡ分子と本明細書に開示された選択的増幅法により得られた数種の触媒ＤＮＡ分子の１つを示す二次元図である。図６Ａは、出発プールからの具体的な分子を示す図であり、配列番号２３で示される分子の全体の配置を示す。示されたように、種々の相補的ヌクレオチドはランダム（Ｎ４０）領域を隣接する。
【図６Ｂ】各々“前駆体”の触媒ＤＮＡ分子と本明細書に開示された選択的増幅法により得られた数種の触媒ＤＮＡ分子の１つを示す二次元図である。図６Ｂは、本明細書に記載された方法で作成したＭｇ２＋依存性触媒ＤＮＡ分子（又は“ＤＮＡｚｙｍｅｓ”）の１つを示す図である。基質核酸内のリボヌクレオチドの位置を図６Ａ及び図６Ｂ共に矢印で示す。
【図７】実質的に実施例５のように行なわれた１０ラウンドの試験管内選択的増幅の結果のいくつかを示すグラフである。示されたように、触媒の２つの位置と２つのファミリーが標的配列の最も効率のよい切断を示すものとして現れた。切断条件は実質的に図７に示された通り、即ち、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、ｐＨ７．５、及び３７℃とした。反応を２時間行った後に集めたデータを示す。世代数（ここでは０〜１０）に対してプロットした切断（％）を示す。基質の指示された部位で標的配列を切断することができる触媒ＤＮＡ分子の数／有効を縦のバーで示し、Ｇ↓ＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵでの切断は斜線バーで示され、ＧＵＡＡＣＵＡ↓ＧＡＧＡＵでの切断は白い（陰のない）バーで示されている。
【図８】本発明の２つの触媒ＤＮＡ分子、クローン８〜１７及び１０〜２３のヌクレオチド配列、切断部位、及び代謝回転速度を示す図である。反応条件は、示された通り、即ち、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、ｐＨ７．５、及び３７℃とした。クローン８〜１７として同定したＤＮＡｚｙｍｅを左に示し、ＲＮＡ基質の切断部位は矢印で示されている。基質配列（５′−ＧＧＡＡＡＡＡＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵＧＧＡＡＧ−３′）−−ＤＮＡｚｙｍｅから分離している（即ち、分子内切断を示す）−−はそのままで標識される。同様に、１０〜２３として同定したＤＮＡｚｙｍｅを右に示し、ＲＮＡ基質の切断部位は矢印で示されている。また、基質配列を示す。８〜１７酵素については、代謝回転速度は約０．６ｈｒ−１であり、１０〜２３酵素については、代謝回転速度は約１ｈｒ−１であった。非相補的対合を黒い丸（●）で示し、相補的対合を縦の線（｜）で示す。
【図９】本発明の２つの触媒ＤＮＡ分子、クローン８〜１７及び１０〜２３のヌクレオチド配列、切断部位、及び代謝回転速度を示す図である。反応条件は、示された通り、即ち、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、ｐＨ７．５、及び３７℃とした。図８のように、クローン８〜１７として同定したＤＮＡｚｙｍｅを左に示し、ＲＮＡ基質の切断部位は矢印で示されている。基質配列（５′−ＧＧＡＡＡＡＡＧＵＡＡＣＵＡＧＡＧＡＵＧＧＡＡＧ−３′）−−ＤＮＡｚｙｍｅから分離している（即ち、分子内切断を示す）−−はそのままで標識される。同様に、１０〜２３として同定したＤＮＡｚｙｍｅを右に示し、ＲＮＡ基質の切断部位は矢印で示されている。また、基質配列を示す。８〜１７酵素については、ｋｏｂｓは約０．００２ｍｉｎ−１であった。１０〜２３酵素については、ｋｏｂｓ値は約０．０１ｍｉｎ−１であった。非相補的対合を黒い丸（●）で示し、相補的対合を縦の線（｜）で示す。
【図１０】８〜１７及び１０〜２３触媒モチーフの組成を示す略図である。ＤＮＡ酵素（下の鎖）は、指定されていない相補的ヌクレオチド（横の線）間でワトソン・クリックの相補的対合（縦の線）によりＲＮＡ基質（上の鎖）を結合する。切断は、矢印で示された位置で起こる。ここで、Ｒ＝Ａ又はＧ及びＹ＝Ｕ又はＣである。
【図１１】実施例６に記載された多代謝回転条件下の１０〜２３ＤＮＡ酵素の触媒活性を示すグラフである。反応の最初の１０％について初速度を測定し、一定の酵素濃度（０．００４ｎＭ）及び種々の濃度の基質（０．０２〜４ｎＭ）を用いた。ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌ  ｍＲＮＡの出発コドン領域に対応する１７量体ＲＮＡ基質を試験管内転写により調製した。反応条件：２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、３７℃。２つの独立した実験からのデータを示し、ミカエリス・メンテンの式：ｖ＝ｋｃａｔ［Ｅ］／（Ｋｍ＋［Ｓ］）にあてはめる。
【図１２Ａ】実施例６に記載された本発明のＤＮＡ酵素の基質結合領域の長さの変化の影響を示す２つのパネルである。わかるように、相補的基質結合領域の長さは第１及び第２基質結合領域（アーム）の各々について４〜１３ヌクレオチドの長さ（ｎ）で変化し、触媒活性を測定し、ｋｃａｔ（ｍｉｎ−１）及びＫｍ（ナノモル［ｎＭ］）として示した。
【図１２Ｂ】実施例６に記載された本発明のＤＮＡ酵素の基質結合領域の長さの変化の影響を示す２つのパネルである。わかるように、相補的基質結合領域の長さは第１及び第２基質結合領域（アーム）の各々について４〜１３ヌクレオチドの長さ（ｎ）で変化し、触媒活性を測定し、ｋｃａｔ（ｍｉｎ−１）及びＫｍ（ナノモル［ｎＭ］）として示した。
【図１３】実施例６に記載されるＤＮＡ酵素のヌクレオチド残基に対する修飾の影響を示すグラフである。ＤＮＡ酵素をＲＰＭＩ−１６４０培養液中１０％加熱不活性化ウシ胎児血清中３７℃でインキュベートし、未修飾ＤＮＡ（白い丸）、逆方向チミジル酸塩（黒い丸）、各アーム内に５つの２′−Ｏ−Ｍｅ残基（白い四角）、コア内に５つのＰ＝Ｓ残基（白い三角）、及び各アーム内に３つのＰ＝Ｓ残基（黒い三角）を比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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