(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の生体分子を含む試料を用意する工程と、
前記試料中の前記生体分子を、抗体が結合した担体、又は抗体と特異的に結合することができる分子が結合した担体を用いて免疫沈降させることにより濃縮する工程と、
前記生体分子の免疫沈降物を、アンモニア水及びアンモニウム塩水溶液からなる群から選ばれる、電荷中和剤を含む水溶液を洗浄液として用いて洗浄する工程と、
洗浄された前記免疫沈降物を質量分析に供することによって、前記生体分子を検出する工程と、
を含む、免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【請求項２】
前記目的の生体分子を含む試料が、血液、尿、脳脊髄液、及び体分泌液からなる群から選ばれる体液に前記目的の生体分子が含まれるものである、請求項１に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【請求項３】
前記目的の生体分子を含む試料が、臨床試料である、請求項１又は２に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【請求項４】
前記生体分子が、バイオマーカー、バイオマーカー候補生体分子、及び、前記バイオマーカー又は前記候補生体分子からスプライシングにより生成した断片からなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【請求項５】
前記バイオマーカー及び前記バイオマーカー候補生体分子は、癌、脳疾患、免疫疾患、肝疾患、腎疾患、及び眼病からなる群から選ばれる疾患に応答するものである、請求項４に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【請求項６】
前記担体が、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、フッ素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、及び磁性体からなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【請求項７】
前記質量分析において、多段階タンデム質量分析を行う、請求項１〜６項のいずれか１項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【請求項８】
前記質量分析において、前記洗浄された免疫沈降物を内部標準物質の存在下で測定することによって、前記生体分子の定量を行う、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【請求項９】
前記質量分析において、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型質量分析装置を用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の生体試料の質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、応用化学、基礎生物学、構造生物学、臨床診断学などの分野に関する。具体的には、本発明は、免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法（Method for Mass Spectrometry of Biological Sample Using Immunoprecipitaion）に関する。特に本発明は、臨床サンプルから、バイオマーカー分子の検出を目的とした質量分析法に関する。
【０００２】
【背景技術】
チップ表面に抗体などの官能基を固定化し、官能基特異的な結合によって特定の分子を捕捉し、余分な成分を水やバッファで洗浄除去した後、レーザーを照射し、捕捉された特定の分子を質量分析する方法（ＳＥＬＤＩプロテインチップ(R)システム）がサイフャージェン社により開発されている（例えば国際公開第１９９６／０３６７３２号パンフレット（特許文献１）参照）。実際には、１つのチップですべての分子を捕捉することはできないため、疎水性チップ、イオン交換性チップ、金属イオンアフィニティーチップなどの数種類のチップを用いてそれぞれに同じサンプルを添加し、チップごとに発現解析を行う。
【０００３】
一方、Journal of Neurochemistry, 2003, 84, 602-609（非特許文献１）には、Protein G-セファロースを用いてアミロイドβについて免疫沈降を行い、得られた抗体−セファローススラリーをＰＢＳ及びＨＥＰＥＳを用いて洗浄し、洗浄された抗体−セファローススラリーを直接ＭＡＬＤＩターゲットプレートにアプライし、測定を行ったことが記載されている。
【０００４】
さらに一方、N. Leigh Anderson and Norman G. Anderson, Mol. Cell. Proteomics, Nov 2002; 1: 845-867（非特許文献２）には、組織漏出タンパク質は、わずかな組織量であっても重大な症状が検出されること、スパイクテストの結果、その血中レベルはng/mlオーダーであることが記載されている。
【０００５】
また、臨床診断において、アミロイドペプチドの存在比、特に(1-40)/(1-42)比が非常に重要であることが、NATURE NEUROSCIENCE 7(9), 954-960, 2004（非特許文献３）、HUMAN MUTATION 27(7), 686-695, 2006（非特許文献４）、Dement Geriatr Cogn Disord 2007;23:316-320（非特許文献５）などに示唆されている。
具体的には、上記非特許文献３には、Aβが、遺伝性アミロイド症脳出血のマウスモデルの脈管構造をターゲットとすることが記載されており、上記非特許文献４には、プレセニリン変異による家族性アルツハイマー病の発症年齢の平均が、Ab42の増加とAb40の減少との両方と相関することが記載されており、上記非特許文献５には、軽度認識障害の患者における脳脊髄液のA42/A40比を使用するアルツハイマー病の予測について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第１９９６／０３６７３２号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】
「ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（Journal of Neurochemistry）」、２００３年、第８４巻、ｐ．６０２−６０９
【非特許文献２】
Ｎ・レイ・アンダーソン（N. Leigh Anderson）及びノーマン・Ｇ・アンダーソン（Norman G. Anderson）著、「モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Molecular & Cellular PROTEOMICS）」２００２年１１月、第１巻、ｐ．８４５−８６７
【非特許文献３】
「ネイチャー・ニューロサイエンス（NATURE NEUROSCIENCE）」、２００４年、第７巻、第９号、ｐ．９５４−９６０
【非特許文献４】
「ヒューマン・ミューテーション（HUMAN MUTATION）」、２００６年、第２７巻、第７号、ｐ．６８６−６９５
【非特許文献５】
「ディメンシャ・アンド・ジェリアトリック・コグニティブ・ディスオーダーズ（Dementia and Geriatric Cognitive Disorders）」、２００７年、第２３巻、ｐ．３１６−３２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の目的
ＳＥＬＤＩ法では、官能基に捕捉される分子の同定を行うための決定的な手段がない。つまり、ＳＥＬＤＩ法で分子に変動があった場合（例えばイオン交換性チップで捕捉された分子が変動した場合）、その変動の原因を調べることができない。すなわち、分子の変動を追うことはできても、本方法では分子の同定を行うことができないため、変動の根本原因、特に分子の形まで調べることはできない。
【０００９】
Journal of Neurochemistry, 2003, 84, 602-609の方法では、免疫沈降により得られた抗体−セファロースの洗浄を、通常のバッファを用いて行っている。しかしながら、通常のバッファを用いることによる洗浄効果は、質量分析による目的分子の検出を行うという目的においては不十分である。このため、後の質量分析において目的分子の検出感度は低い。
【００１０】
上述のように、アミロイドペプチドの存在比、特に(1-40)/(1-42)比が非常に重要であることがいくつかの文献に示唆されている。アミロイド（1-40）及びアミロイド（1-42）の検出は、一般的に使用されているELISA法によって同一抗体を用いることによって可能である。しかしながら、ELISA法ではそれらを互いに区別することはできない。つまり、ELISA法を用いる場合、アミロイド（1-40）及びアミロイド（1-42）を互いに区別するためには、それぞれに対する特異的抗体が必要となる。
【００１１】
本発明の目的は、臨床的に意義のある分子及びそれからスプライシングなどにより生じた断片を検出対象とすることを目的とした生体試料の解析法を提供することにある。
また、本発明では、SELDI法の根本的解決を目的の１つとして、検出すべき生体分子の絞り込みを行うことに着目した。また、本発明では、従来の免疫沈降法で用いられる免疫沈降物の洗浄において、洗浄操作を厳格に行うことに着目した。従って、本発明の目的は、臨床現場に応用することができる程度のシンプルな系であり、且つ、質量分析におけるイオン化を阻害する分子をキャップすることができる、臨床的意義を有する生体試料の解析法を提供することにある。
本発明の目的は、シンプルな実験系とすることにより、臨床でも使用可能で、疾患に応答するさまざまなバイオマーカー検定への広い応用範囲を有する生体試料の解析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明者らは、鋭意検討の結果、免疫沈降によって検出すべき目的の生体分子の濃縮を行い、さらに、質量分析を助ける洗浄液を用いて当該免疫沈降物を洗浄することによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  目的の生体分子を含む試料を用意する工程と、
前記試料中の前記生体分子を、抗体が結合した担体、又は抗体と特異的に結合することができる分子が結合した担体を用いて免疫沈降させることにより濃縮する工程と、
前記生体分子の免疫沈降物を、アンモニア水及びアンモニウム塩水溶液からなる群から選ばれる、電荷中和剤を含む水溶液を洗浄液として用いて洗浄する工程と、
洗浄された前記免疫沈降物を質量分析に供することによって、前記生体分子を検出する工程と、
を含む、免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【００１４】
電荷中和剤を用いることによる効果としては、質量分析におけるイオン化を阻害する分子をキャップすることができるということが挙げられる。洗浄工程においては、濃縮工程において生成した免疫沈降物の形態を保持する（すなわち免疫沈降物中の抗原抗体結合力の弱まることによる目的の生体分子の遊離が起こっていない状態を保持する）程度の適切なｐＨに保つ。
上記のような電荷中和剤を用いることによる効果として、電荷を中和することや適切なｐＨを保持することができることに加え、適当な濃度であれば質量分析においてバックグラウンドとしての支障となることがないことなどが挙げられる。
【００１５】
（２）  前記目的の生体分子を含む試料が、血液、尿、脳脊髄液、及び体分泌液からなる群から選ばれる体液中に前記目的の生体分子が含まれるものである、（１）に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【００１６】
（３）  前記目的の生体分子を含む試料が、臨床試料である、（１）又は（２）に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【００１７】
（４）  前記生体分子が、バイオマーカー、バイオマーカー候補生体分子、及び、前記バイオマーカー又は前記候補生体分子からスプライシングにより生成した断片からなる群から選ばれる、（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【００１８】
（５）  前記バイオマーカー及び前記バイオマーカー候補生体分子は、癌、脳疾患、免疫疾患、肝疾患、腎疾患、及び眼病からなる群から選ばれる疾患に応答するものである、（４）に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【００１９】
下記（６）は、濃縮工程において使用される免疫沈降用担体に関する。
（６）  前記担体が、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、フッ素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、及び磁性体からなる群から選ばれる、（１）〜（５）のいずれかに記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
【００２０】
下記（７）〜（９）は、質量分析工程に関する。
（７）  前記質量分析において、多段階タンデム質量分析を行う、（１）〜（６）のいずれかに記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
多段階タンデム質量分析によって、生体分子の同定を行うことや、スプライシング情報、翻訳後修飾情報を知るなどができる。
（８）  前記質量分析において、前記洗浄された免疫沈降物を内部標準物質の存在下で測定することによって、前記生体分子の定量を行う、（１）〜（７）のいずれかに記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
（９）  前記質量分析において、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型質量分析装置を用いる、（１）〜（８）のいずれかに記載の生体試料の質量分析法。
【００２１】
下記（１０）及び（１１）は、界面活性剤の使用に関する。
（１０）前記質量分析工程の前に、非イオン性界面活性剤を、前記生体分子を含む試料又は前記生体分子の免疫沈降物を洗浄するための洗浄液に含ませることをさらに含む、上記の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
（１１）上記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である、上記の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
上記界面活性剤は、親水性基として糖鎖を有することが好ましい。
上記界面活性剤は、界面活性基として炭素数８〜１２の直鎖アルキル基を有することが好ましい。
上記（１０）及び（１１）の方法において界面活性剤を用いることにより、例えば、免疫沈降物への非特異吸着分子を低減することや、溶液の均一性や安定化、目的物の回収を効率的にすることによって免疫沈降の条件を穏和なものにすることなどが可能になる。
【００２２】
下記（１２）は、複数の生体分子の混合試料の解析に関する。
（１２）前記生体分子は、同一の抗体と結合することができる複数の異なる生体分子を含み；前記濃縮する工程において、前記抗体は１種の抗体であり；前記質量分析工程において、前記複数の異なる生体分子を区別して検出する、前記の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。
上記（１２）の方法により、臨床診断において非常に重要な微量タンパク質の混合比を、非常に簡便な方法で、かつ同一試料、同時分析において見出すことが可能になる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によると、臨床的に意義のある分子及びそれからスプライシングなどにより生じた断片を検出対象とすることを目的とした生体試料の解析を行うことができる。本発明によると、臨床現場に応用することができる程度のシンプルな系であり、且つ、質量分析におけるイオン化を阻害する分子をキャップすることができる、臨床的意義を有する生体試料の解析を行うことができる。本発明によると、シンプルな実験系とすることにより、臨床でも使用可能で、疾患に応答するさまざまなバイオマーカー検定への広い応用範囲を有する生体試料の解析を行うことができる。
【００２４】
具体的に、例えば、従来のＳＥＬＤＩ法と比較すると、本発明では以下のような効果が得られる。例えば、ＳＥＬＤＩ法では、専用のＳＥＬＤＩチップが必要であるが、本発明の方法では、一般的なＩＰビーズ等をもちいることができ、汎用性に優れている。また、ＳＥＬＤＩ法では、分析に際し、ＳＥＬＤＩスキャナーが必要であるが、本発明の方法では、すべてのＭＡＬＤＩ型質量分析によって分析が可能であり、汎用性に優れている。さらに、ＳＥＬＤＩ法では、ＳＥＬＤＩ周辺機器が必要となるが、本発明の方法では、さまざまな研究室及び検査室で行うことが可能な免疫沈降法をベースに実験系が組まれているため、手法が簡素であり、汎用性に優れている。
【００２５】
また、例えば、従来の抗体を使用するＥＬＩＳＡやエンザイムイムノアッセイ等の方法と比較すると、本発明の方法は、そのような従来法では検出できないようなレベルの分子の検出を検出でき、感度の点で優れている。具体的には、目的の生体分子が数ng/mlオーダー、例えば１〜５ng/mlオーダーの低レベルの濃度であっても、検出が可能である。このオーダーは、当該生体分子によって特定の疾患等の症状が現れはじめる際の、当該生体分子の血中濃度に相当する。従って、本発明は、バイオマーカーとして必要である濃度に十分耐えうる感度を持った方法であるといえる。
【００２６】
さらに、本発明の方法では、免疫沈降物として目的の生体分子を測定するため、目的の生体分子とともに免疫沈降する分子を検出することができる。すなわち、目的の生体分子との相互作用を調べることも可能である。
【００２７】
そして、本発明の方法では、微量スケールのペプチド混合物を、質量分析によって質量差を有するイオンピークとして検出すること可能にするため、例えば、アミロイド(1-40)/(1-42)比のような、臨床診断において非常に重要な微量タンパク質の混合比を、非常に簡便な方法で見出すことを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、実施例１において、アミロイドペプチド１０ｐｍｏｌをバッファ中に含む試料についてIP-MSを行って得られた免疫沈降物からのマススペクトル（IP）を、アミロイド（1-38）コントロールからのマススペクトル（Aβ）、抗体混合直後の溶液からのマススペクトル（Before IP）、及び免疫沈降後の上清からのマススペクトル（IP sup.）とともに示したものである。
【図２】図２は、実施例２において、アミロイドペプチド１００ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、及び１ｆｍｏｌをバッファ中に含むそれぞれの試料についてIP-MSを行って得られたマススペクトルを、実施例１で得られたマススペクトル（試料中のアミロイドペプチド（1-38）の量：１０ｐｍｏｌ）とともに示したものである。
【図３】図３は、実施例３において、アミロイドペプチド１００ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、及び１ｆｍｏｌを血清中に含むそれぞれの試料についてIP-MSを行って得られたマススペクトルである。
【図４】図４は、実施例４において、アミロイドペプチド１ｐｍｏｌを、界面活性剤（n-Octyl-β-D-thioglycoside及びn-Octyl-β-D-glycoside）をそれぞれ添加した血清中に含む試料について、IP-MSを行って得られたマススペクトルを、界面活性剤を添加しなかったコントロールから得られたマススペクトル（None）とともに示したものである。
【図５】図５は、実施例５において、（ａ）：アミロイドペプチド混合物（アミロイドペプチド（1-42）５００ｆｍｏｌ、アミロイドペプチド（1-40）５００ｆｍｏｌ及びアミロイドペプチド（1-40）５００ｆｍｏｌの混合物）（Mixture）のマススペクトルを、（ｂ）：アミロイドペプチド（1-42）５００ｆｍｏｌのマススペクトル、（ｃ）：アミロイドペプチド（1-40）５００ｆｍｏｌのマススペクトル、及び（ｄ）：アミロイドペプチド（1-38）５００ｆｍｏｌのマススペクトルと共に示したものである。
【図６】図６は、実施例６において、（ａ）：細胞溶解液中のアミロイド５００ｆｍｏｌのマススペクトル、（ｂ）：血漿中のアミロイド５００ｆｍｏｌのマススペクトル、（ｃ）：血清中のアミロイド５００ｆｍｏｌのマススペクトルを示したものである。
【図７】図７は、実施例７において、アミロイドペプチド１ｐｍｏｌを、界面活性剤（（ａ）：スクロースモノカプレート（SMC）、（ｂ）：スクロースモノラウリレート（SML）、（ｃ）：n-オクチル−β−Ｄ−マルトシド（OM）、（ｄ）：n-ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（DDM）、（ｅ）：デオキシBIGCHAP（BIGCHAP）、及び（ｆ）：n-オクチル−β−Ｄ−チオグリコシド（OTG））をそれぞれ添加した血清中に含む試料について、IP-MSを行って得られたマススペクトルを示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法では、目的の生体分子を含む試料を用意する工程と；前記試料中の前記生体分子を、抗体が結合した担体、又は抗体と特異的に結合することができる分子が結合した担体を用いて免疫沈降させることにより濃縮する工程と；前記生体分子の免疫沈降物を、電荷中和剤を含む水溶液を洗浄液として用いて洗浄する工程と；洗浄された前記免疫沈降物を質量分析に供することによって、前記生体分子を検出する工程と、を含む。
【００３０】
［１．目的の生体分子を含む試料を用意する工程］
本発明においては、目的の生体分子を含む試料は、通常、体液中に目的の生体分子を含むものである。体液としては特に限定されないが、血液、尿、脳脊髄液、体分泌液などが挙げられる。また、体液には、当業者によって適宜、粗精製等の前処理や培養が行われて得られた処理済液や培養液等も許容される。血液としては、全血、血漿、血清が挙げられる。特に本発明では、目的の生体分子を含む試料が、臨床試料である場合に有用である。
【００３１】
生体分子としては、バイオマーカー、バイオマーカー候補生体分子や、それらからスプライシングなどにより生成した断片などが挙げられる。バイオマーカー及びバイオマーカー候補生体分子としては特に限定されず、本発明では広くさまざまなバイオマーカーを検出対象とする。たとえば、癌、脳疾患（アルツハイマーなど）、免疫疾患、肝疾患（肝硬変など）、腎疾患、眼病などの疾患に応答する生体分子が挙げられる。生体分子は、主としてタンパク質である。
【００３２】
［２．目的の生体分子を濃縮する工程］
この工程においては、当該生体分子を濃縮する目的で、免疫化学的手法により目的の生体分子を沈降させる。免疫化学的手法により目的の生体分子を沈降できる方法であれば、どのような方法でも許容される。本発明は、たいていの研究室、検査室で行うことが可能な免疫化学的手法を用いることができるため、操作が簡便でコスト性が良く、非常に汎用性の高い方法である点で優れている。
【００３３】
具体的には、免疫複合体が形成しうる条件下で、試料と、目的の生体分子に対する抗体と、沈降用の担体とを接触させる。これにより、目的の生体分子と、当該目的の生体分子に対する抗体とを反応させるとともに、沈降用の担体の共存により免疫沈降物を得る。沈降用の担体は、目的の生体分子に対する上記抗体が結合したものであっても良いし、目的の生体分子に対する上記抗体に対し免疫特異的結合能を有する分子（例えば抗IgG抗体、Protein A、Protein G等）が結合したものであっても良い。以下において、上記抗体や上記免疫特異的結合能を有する分子を、「抗体等」と記載する場合がある。また、抗体等の担体への「結合」を、抗体等の「固定化」或いは「担持」と記載する場合がある。
【００３４】
また、「反応」とは、免疫学的反応のことをいい、免疫学的分野において認識されうる免疫学的な反応、主に抗原抗体反応をいう。この反応により、担体に担持された抗体等と目的の生体分子とを少なくとも含む免疫複合体を免疫沈降物として得る。
【００３５】
沈降用の担体として、目的の生体分子に対する抗体に対し免疫特異的結合能を有する分子が結合したものを用いる場合、より具体的には、免疫複合体が形成しうる条件下で、試料と、目的の生体分子に対する抗体Ｘとを接触させ、さらにこの抗体に対する二次抗体Ｙを担持した沈降用の担体を接触させることができる。これにより、目的の生体分子と、抗体Ｘと、二次抗体Ｙとを反応させるとともに、目的の生体分子と、抗体Ｘと、二次抗体Ｙを固定した担体との複合体を、免疫沈降物として得る。
【００３６】
以下、試料と、目的の生体分子に対する抗体Ｘと、この抗体に対する二次抗体Ｙを担持した担体とを用いる形態を挙げて、さらに説明する。
抗体Ｘとしては、目的の生体分子に免疫特異的に結合する分子であればどのようなものでも用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び、分子生物学的技術により調製した抗体を含む。また抗体は、広く免疫特異的に結合する物質であればよく、抗体フラグメント等も用いられてよい。いずれの場合も、抗体の調製は、当業者に良く知られた方法によって行われる。本発明は、ポリクローナル抗体の使用でも本発明の効果を良好に得ることができる点で好ましい。
【００３７】
担体の形状としては、特に限定されない。例えば、球体、顆粒、破砕体などの粒子（ビーズ）状のものが挙げられる。粒子（ビーズ）状の担体は、操作性、例えば免疫沈降物の回収作業や洗浄作業の簡便性、という観点から特に好ましい。
担体の材質としては、二次抗体Ｙを結合させることができるものであれば特に限定されない。例えば、アガロース、セファロースなどの多糖類や、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、フッ素樹脂、金属錯体樹脂などのポリマーといった高分子化合物が挙げられる。さらに、ガラス、金属、磁性体等も挙げられる。これらの素材は、単独で又は組み合わせられて使用されうる。
【００３８】
担体に担持させるべき二次抗体Ｙとしては、目的の生体分子に免疫特異的に結合する前記の抗体Ｘに、免疫特異的に結合する分子であれば特に限定されない。このような分子としては、抗IgG抗体、Protein A、Protein G等が挙げられる。
【００３９】
本発明においては、アガロースビーズ（セファロース）、磁性ビーズ等は、汎用性という観点から特に好ましい。すなわちこれらの担体は、各メーカーから市販されているものを使用することができる。しかも、これら市販品の多くは、既にセファロース、アガロース、磁性ビーズ等の担体に、Protein AやProtein G等が結合した状態で提供されている。
【００４０】
一方、二次抗体Ｙを担体に担持させる作業を行う場合は、公知の担持法を用い、当業者によって適宜行われて良い。担持法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等が挙げられ、これらの方法は、単独で又は組み合わせて行うことができる。
【００４１】
以上、試料と、目的の生体分子に対する抗体Ｘと、この抗体に対する二次抗体Ｙを担持した担体とを用いる形態を挙げて説明したが、既に述べたように、本発明は上記の形態に限定されることなく、当業者が適宜選択した方法によって他のさまざまな形態で行われて良い。
【００４２】
免疫学的反応の反応条件としては、当業者が適宜決定することができる。例えば、反応時間としては１時間程度〜終夜行うことができる。反応温度としては、例えば、４〜１０℃程度とすることができる。本発明における標準的なプロトコルを挙げると、反応条件は、４℃で２時間程度である。
【００４３】
［３．免疫沈降物の洗浄工程］
上記工程で得られた免疫沈降物は、本工程において、適宜回収され、下記の洗浄液で洗浄される。回収方法は、当業者によって適宜選択される。
本工程で用いられる洗浄液は、電荷中和剤を含む水溶液である。上記工程で得られた免疫沈降物と共存する塩や分子等に由来するイオンの中には、後の質量分析工程において残存した場合に、質量分析のイオン化を阻害するものがある。そこで、電荷中和剤を用いて免疫沈降物を洗浄することにより、このような質量分析におけるイオン化を阻害するイオンをキャップし、中性化することができると考えられる。
【００４４】
また、電荷中和剤は、免疫沈降物の形態を保持することができる程度の適切なｐＨに保つものを用いる。免疫沈降物の形態が保持された状態とは、免疫沈降物中の抗原抗体結合力の弱まることによる目的の生体分子の遊離が起こっていない状態をいう。このために適切なｐＨとしては、通常、ｐＨが過度に酸性側によっていなければ特に限定されないが、好ましくは７以上、例えば７〜９、さらには７〜８或いは８〜９である。
【００４５】
さらに、電荷中和剤は、後の質量分析工程においてバックグラウンドとして解析に支障を与えないようなものを用いることが好ましい。
本発明において用いられる電荷中和剤は、洗浄液（水溶液）中でアンモニウムイオンを発生するものである。アンモニウムイオンは、例えば脂肪酸、塩類などの電荷を弱くキャップする性質があると考えられている。従って電荷中和剤を含む水溶液としては、希アンモニア水やアンモニウム塩水溶液が挙げられる。アンモニウム塩のカウンターアニオンとしては、当業者によって適宜決定することができる。本発明において好ましいアンモニウム塩の具体的な例としては、例えば炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどが挙げられる。
上記電荷中和剤は、単独で又は組み合わせられて用いられる。
【００４６】
電荷中和剤の洗浄液中の濃度としては、当業者によって適宜決定することができるが、例えば０．１〜１０ｍＭ、例えば０．１ｍＭ程度とすることができる。
本工程では、上記電荷中和剤を含む水溶液を洗浄液として用いるとともに、バッファを洗浄液として併用することができる。バッファとしては特に限定されず、当業者によって適宜選択されて良い。後の質量分析工程への影響を考え、できるだけ塩が残りにくいものを選択することが好ましい。このような観点から、特に好ましいバッファとしては、ＴＢＳ、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ−ｓａｌｉｎｅなどが挙げられる。
【００４７】
一般的に、抗原抗体の結合、タンパク質間相互作用はある程度の塩濃度存在下によって最適化されることが知られている。この場合、この抗原抗体結合をはがすことなく洗浄することを目的とするため、最適な塩の存在下、バッファを用いて洗浄することができる。当該最適な塩及びその濃度は、当業者によって適宜決定される。例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌとすることができる。本発明の方法は、さらに引き続き、電荷中和剤水溶液を用いて洗浄するため、効率よく電荷を中和し、かつ抗体との結合状態を保ったまま質量分析のステップへと移行できるメリットがある。
【００４８】
洗浄液の量や洗浄回数などの具体的な条件は、当業者によって適宜決定される。一般的には担体容量の約5倍量の洗浄液を用いて洗浄操作を行うことが基本である。本発明では、担体容量5μLに対し、100μLバッファを用いた洗浄操作を3回、100μL電荷中和剤水溶液を用いた洗浄操作を1回行うことで分析を行い、支障のないことを確認している。
【００４９】
電荷中和剤溶液での洗浄は出来る限り手早くすると良い。また溶液交換の際、応用例として、膜直径の細かいスピンカラムを作成し、このフィルター上にて洗浄操作を行うことができる。また磁性ビーズの使用も効果的である。これにより、樹脂そのものを吸い出してしまう危険性を回避することができ、洗浄効率、回収効率ともに向上が期待できる。
【００５０】
［４．質量分析工程］
上記工程で洗浄された免疫沈降物は、目的の生体分子を抗体より遊離させることなく複合体のまま直接質量分析する。本発明においては、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）型質量分析装置を用いることができる。免疫沈降物は、例えばマトリックス溶液と混合してから、質量分析サンプルプレートにスポットすることができる。マトリックスは、目的の生体分子に応じ、当業者が適宜決定することができる。
【００５１】
目的の生体分子の同定を行う場合は、少なくともＭＳの２乗の多段階タンデム質量分析が可能な装置を用いる。このような装置の例としては、AXIMA-QIT（島津製作所製）が挙げられる。
【００５２】
目的の生体分子の定量を行う場合は、目的の生体分子を内部標準とともに測定し、それぞれに由来するピークの積分比に基づいて定量を行うことができる。内部標準としては特に限定されることなく、当業者によって適宜選択されたものを目的の生体分子にさらに加えて用いることができる。また、濃縮工程において用いられた抗体が他の無関係な分子にクロスすることで非特異的吸着を伴った免疫沈降物が得られた場合には、上記のように内部標準をさらに加えること以外に、当該非特異吸着分子を内部標準として有効活用しても良い。
【００５３】
一方で、当該非特異吸着分子を低減するための操作が、当業者によって適宜行われてもよい。この操作は任意に行われて良い。この操作を行う場合、具体的には、界面活性剤を用いることができるが、一般的に免疫沈降にて使用されるNP-40は質量分析を阻害することが知られており、できるだけ後の質量分析において支障とならないものを適宜選択する。
例えば、界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。具体的には、n−オクチル−β−Ｄ−グリコシド（n−オクチル−β−Ｄ−グリコピラノシド）、n−オクチル−β−Ｄ−チオグリコシド（n−オクチル−β−Ｄ−チオグリコピラノシド）、デオキシBIGCHAP、n-ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、n-オクチル−β−Ｄ−マルトシド、スクロースモノラウリレート、スクロースモノカプレート（全て同仁化学社より入手可能）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
本発明で用いられる非イオン性界面活性剤としては、親水性基として糖鎖を有する界面活性剤が好ましく、また、界面活性基として直鎖アルキル基を有する界面活性剤が好ましい。当該直鎖アルキル基の長さとしては、炭素数８〜１２程度とすることができる。全般的に、糖鎖−C8界面活性剤（すなわち親水性基として糖鎖を有し且つ界面活性基として炭素数8の直鎖アルキル基を有する界面活性剤）は、非常に良い効果を奏する。そのなかでも特に、n−オクチル−β−Ｄ−チオグリコシドやn−オクチル−β−Ｄ−マルトシドが好ましい。
【００５５】
界面活性剤は、例えば、免疫沈降による濃縮工程の前に試料中に加えたり、洗浄工程において洗浄液に加えたりすることができる。界面活性剤を使用する場合、その使用量は、当業者が適宜決定することができる。免疫沈降による濃縮工程の前に試料中に加える場合は、例えば０．１〜２w/v％程度、特に１w/v％程度を目安に用いることができる。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。また、本発明によって行われる、免疫沈降物の質量分析をIP-MS（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry）と記載することがある。
【００５７】
＜実施例１：アミロイドペプチドを用いたIP-MS基礎実験＞
アミロイドペプチド（1-38）（Anaspec製）１０ｐｍｏｌをTBSバッファ中に含む試料液（50μL）と、アミロイドペプチド抗体（Anti-amyloid b(1-17)、品番NE1003, 6E10、Calbiochem製）0.5μLをTBSバッファ中に含む抗体液50μLを調製し、両者を混合した。抗体に関しては、アルツハイマー病などで診断にも用いられる、最も信頼性のあるモノクローナル抗体である6E10クローンを解析に用いた。
得られた混合液を、４℃で２時間インキュベートした。
さらに、混合液に、Protein G agarose plus（ピアス社製）を（TBSバッファ中５０v/v％スラリー、5μL）加え、４℃で２時間インキュベートした。
【００５８】
得られた免疫沈降物を遠心分離によって回収し、TBSおよび０．１ｍＭ炭酸アンモニウム水溶液を用いて、回収した免疫沈降物を洗浄した。洗浄操作としては、１００μｌのTBSによる洗浄を３回、１００μｌの０．１ｍＭ炭酸アンモニウム水溶液による洗浄を１回行った。
【００５９】
洗浄した免疫沈降物と、マトリックス溶液（０．１v/v％トリフルオロ酢酸−５０v/v％アセトニトリル水溶液を溶媒とし、２０ｍｇ／ｍｌのシナピン酸（和光純薬製）をマトリックスとして含む溶液）とを、同体積混合し、質量分析用サンプルとした。
調整された質量分析用サンプルを、ＭＡＬＤＩターゲットプレートに直接スポッティングした。
質量分析装置（Axima CFR plus、島津製作所製）を用いて、linear positive modeで測定を行うことによってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを行った。
【００６０】
図１に、上記操作によって得られたマススペクトル（横軸：質量／電荷(Mass/ Charge)、縦軸：相対イオン強度(%Int.)）を示す。図１では、免疫沈降物からのマススペクトル（IP）を、アミロイド（1-38）コントロールからのマススペクトル（Aβ）、抗体混合直後の溶液からのマススペクトル（Before IP）、及び免疫沈降後の上清からのマススペクトル（IP sup.）とともに示す。
【００６１】
図１が示すように、コントロールのデータ（Aβ）及び抗体混合直後の溶液のデータ（Before IP）からは、アミロイドペプチド由来のシグナルを観測できている一方、免疫沈降後の上清のデータ（IP sup.）では当該シグナルが検出されていない。さらに、免疫沈降物のデータ（IP）からは、コントロールのデータ（Aβ）における場合と同等のシグナルが検出できている。これらのことから、本発明の実験系はうまく働いていることが示されている。
【００６２】
＜実施例２：IP-MS感度のテスト＞
実施例１における、試料中のアミロイドペプチド（1-38）の量を、１００ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、及び１ｆｍｏｌに変更し、それぞれの量のアミロイドペプチド（1-38）を有する試料について、実施例１と同様の操作を行った。得られたマススペクトルを、実施例１で得られたマススペクトル（試料中のアミロイドペプチド（1-38）の量：１０ｐｍｏｌ）とともに図２に示す。図２が示すように、試料中のアミロイドペプチド（1-38）量が１ｆｍｏｌの場合でも良好なシグナルを得ることができた。
【００６３】
＜実施例３：IP-MSの血清中での感度テスト＞
バッファのかわりに、Ig分子を除去した血清を用いたこと以外は、実施例１及び実施例２と同様の操作を行った。すなわち、１００ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、及び１ｆｍｏｌのそれぞれの量のアミロイドペプチド（1-38）を、Ig分子を除去した血清中に含む試料を調製し、それぞれの試料について、IP-MSを行った。
【００６４】
血清中Ig分子の除去は、免疫沈降においては非常に重要である。なぜなら、Ig分子の除去を行わずにProtein Gにてプルダウンする場合、既存のIgが結合することでその免疫沈降効率が下がることや、また大過剰の抗体、Protein G agarose樹脂を必要とすることなどが原因し、分析系の感度を著しく下げる虞があるためである。
Ig分子が除去された血清は、５０μｌの血清をTBSで５倍に希釈し、これにProtein G agarose plus（ピアス社製）を加えて、４℃で２時間振盪し、その後、遠心分離を行い、上清を回収することによって調製した。
【００６５】
得られたマススペクトルを図３に示す。図３が示すように、血清試料中のアミロイドペプチドの量が１ｆｍｏｌの場合でも良好なシグナルを得ることができた。血液試料中１ｆｍｏｌの量の分子の検出が可能ということは、濃度に換算して数ng/mlの分子の検出が可能ということであり、バイオマーカーとして意義を有するために必要な濃度の検出に十分耐えうる精度を有していると考えられる。
【００６６】
また、図３が示すように、アミロイドペプチド抗体に特異的にクロスし非特異的結合する分子（Antibody-crossed non-specific binding component）と思われるものが検出されている。このような非特異的結合に対するアプローチとしては、当該非特異結合を低減する手法をとることと、当該非特異結合を利用する手法をとることとが可能となる。
【００６７】
非特異結合を低減する手法としては特に限定されず、当業者によって適宜行われて良い。通常の免疫沈降では、ＮＰ−４０が用いられる。しかしながら、ＮＰ−４０は質量分析を強く阻害し、分析計に大きな影響を与える傾向がある。この観点から、複数の界面活性剤を検討したところ、特に、親水性基として糖鎖と、界面活性基として炭素数8の直鎖アルキル基とを有する非イオン性界面活性剤が非常に有効であることが本発明者らによって見出された（下記実施例４及び実施例７）。具体的には、例えば上記実施例において、IP-MS前（すなわち免疫沈降による濃縮工程の前）の血清中に界面活性剤を例えば０．１〜２w/v％程度、特に１w/v％程度添加する操作をさらに加えることができる。
【００６８】
一方、非特異結合を利用する手法として、当該Antibody-crossed non-specific binding componentを内部標準として利用しても良い。これは、図３が示すように、アミロイドペプチドの濃度を１００ｐｍｏｌ〜１ｆｍｏｌという広い範囲にわたって濃度を振っているにもかかわらず、当該Antibody-crossed non-specific binding componentのピーク強度がほとんど変わっていないという事実に基づく。
【００６９】
＜実施例４：IP-MSにおける非特異的結合低減のための界面活性剤選定＞
本実施例では、実施例３で用いたIg分子を除去した血清中に、界面活性剤を添加して実験を行った。界面活性剤としては、n-オクチル−β−Ｄ−グリコシド（n-オクチル−β−Ｄ−グリコピラノシド）及びn-オクチル−β−Ｄ−チオグリコシド（n-オクチル−β−Ｄ−チオグリコピラノシド）をそれぞれ検討した。具体的には、Ig分子を除去した血清50μLに、界面活性剤を終濃度が1w/v%となるように加え、室温で15分振盪した。実施例３におけるIg分子を除去した血清のかわりに、このようにして得られた界面活性剤含有血清を用いた以外は、実施例３と同様の操作を行った。なお、試料中のアミロイドペプチド（1-38）の量は1pmolとした。
【００７０】
得られたマススペクトルを図４に示す。1w/v% n-オクチル−β−Ｄ−チオグリコシドを添加した場合のアミロイドペプチドのシグナル強度が最も強く得られた。血清中に界面活性剤を入れなかったコントロールのスペクトル（None）と比較すると、アミロイドペプチドのシグナル強度、およびシグナル/ノイズ比の顕著な改善が見られた。
【００７１】
＜実施例５：IP-MSによるアミロイドペプチド混合物の測定＞
臨床診断において、アミロイドペプチドの存在比、特に(1-40)/(1-42)比は非常に重要である。
そこで、本実施例では、アミロイドペプチドの微量混合物をIP-MSに供した。
具体的には、実施例４における、試料液中のアミロイドペプチド（1-38）１ｐｍｏｌを、アミロイド（1-38）、アミロイド（1-40）及びアミロイド（1-42）の各々５００ｆｍｏｌの混合物とし、n−オクチル−β−Ｄ−チオグリコシドを１％含む溶液条件として使用した以外は、実施例１と同じ操作を行い、マススペクトルを得た。
【００７２】
図５に、（ａ）：アミロイドペプチド混合物（Mixture）のマススペクトルを、（ｂ）：アミロイドペプチド（1-42）５００ｆｍｏｌのマススペクトル、（ｃ）：アミロイドペプチド（1-40）５００ｆｍｏｌのマススペクトル、及び（ｄ）：アミロイドペプチド（1-38）５００ｆｍｏｌのマススペクトルと共に示す（横軸：質量／電荷(Mass/ Charge)、縦軸：相対イオン強度(%Int.)）。
【００７３】
図５の結果は、IP-MSをプラットフォームとして用いたことにより、同一の抗体にて上記混合物が同時に測定できたことを示している。ここで、各ペプチドのイオン化効率は固有であるため、そのピーク強度が異なる。そこで、当業者に知られる方法でピーク強度の補正（例えば図５（ｂ）〜（ｄ）のような外部標準を用いることによる補正）を適宜行うことで、その存在比の定量が可能となる。
【００７４】
既に述べたように、一般的に使用されているELISA法でも同一抗体にてアミロイド（1-40）及びアミロイド（1-42）を検出できるが、それらを互いに区別することはできない。つまり、ELISA法を用いる場合、アミロイド（1-40）及びアミロイド（1-42）を互いに区別するためには、それぞれに対する特異的抗体が必要となる。
【００７５】
本発明のIP-MS法は、上記のような微量スケールのペプチド混合物を、質量分析によって質量差を有するイオンピークとして検出することを初めて可能した、非常に画期的な方法である。また、本発明のIP-MS法は、上記アミロイド(1-40)/(1-42)比のような、臨床診断において非常に重要な微量タンパク質の混合比を、非常に簡便な方法で見出すことを可能にするものである。
【００７６】
＜実施例６：IP-MSによる血漿中及び細胞溶解液中のアミドロイドペプチドの測定＞
本実施例では、血清中、血漿中、及び、培養が行われて得られた処理済液としての細胞溶解液中のアミロイドペプチドの測定を行った。
【００７７】
血清としては、実施例３と同じものを用いた。
血漿としては、コスモバイオ社（カタログ番号  １２２５０１１０）より購入したものを用いた。
細胞溶解液としては、次のようにして得られたものを用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ（４．５w/v％高グルコース）＋１０v/v％ＦＢＳ中、１５ｃｍディッシュにて３日間培養した。培養した細胞をリン酸緩衝液にて洗浄し、その後回収した。回収した培養細胞を１ｍｌのトリス緩衝液中（プロテアーゼ阻害剤および１w/v％ n−オクチル−β−Ｄ−チオグリコシドを含む）に懸濁し、１ｍｍ径ジルコニアビーズを用いて冷却槽中５０００ｒｐｍで１２０秒混和することで破砕した。その後、４℃、２００００ｇで３０分の遠心を行い、上清を細胞溶解液として得た。
【００７８】
上記血清５０μＬ、上記血漿５０μＬ、及び上記細胞溶解液５０μＬについて、それぞれ以下の工程を行った。２００μＬのトリス緩衝液（０．５w/v％ n−オクチル−β−Ｄ−チオグリコシドを含む）中に希釈し、得られた希釈液に、Protein G agaroseビーズ（ピアス社製）を加え、４℃で２時間攪拌した。その後、遠心を行って上清を回収した。
【００７９】
アミロイドペプチド５００ｆｍｏｌ及び抗体０．５μＬを、回収した上清に加え、４℃で２時間、穏やかに攪拌を行った。撹拌後、さらにProtein G agaroseビーズを５μＬ加え、４℃で２時間攪拌し、アミロイドペプチドを免疫沈降した。トリス緩衝液および０．１ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液を用いてビーズ（免疫沈降物）を洗浄し、上清を除去した。残余のビーズ（免疫沈降物）を、実施例１で用いられたマトリックス溶液と同じ２０ｍｇ/ｍＬのシナピン酸溶液５μＬと混合し、ビーズ懸濁液を得た。ビーズ懸濁液を直接ＭＡＬＤＩプレートにスポットし、乾燥後、質量分析に供した。
【００８０】
図６に、（ａ）：細胞溶解液中のアミロイドのマススペクトル、（ｂ）：血漿中のアミロイドのマススペクトル、（ｃ）：血清中のアミロイドのマススペクトルを示す（横軸：質量／電荷(Mass/ Charge)、縦軸：相対イオン強度(%Int.)）。図６が示すように、血清中、血漿中、及び細胞溶解液中のいずれにおいても、感度よくアミロイドの検出が可能であった。
【００８１】
＜実施例７：IP-MSにおける非特異的結合低減のための界面活性剤のスクリーニング＞
本実施例では、実施例４で用いた界面活性剤以外の界面活性剤の評価も行った。
具体的には、界面活性剤として、n-オクチル−β−Ｄ−チオグリコシド（OTG）、デオキシBIGCHAP（BIGCHAP）、n-ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（DDM）、n-オクチル−β−Ｄ−マルトシド（OM）、スクロースモノラウリレート（SML）、及びスクロースモノカプレート（SMC）（全て同仁化学社製）のそれぞれを用いた。実施例４における界面活性剤を、上記のそれぞれの界面活性剤に置き換えた以外は、実施例４と同じ操作を行い、マススペクトルを得た。
【００８２】
得られたマススペクトルを図７に示す（横軸：質量／電荷(Mass/ Charge)、縦軸：相対イオン強度(%Int.)）。具体的には、（ａ）：スクロースモノカプレート（SMC）、（ｂ）：スクロースモノラウリレート（SML）、（ｃ）：n-オクチル−β−Ｄ−マルトシド（OM）、（ｄ）：n-ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（DDM）、（ｅ）：デオキシBIGCHAP（BIGCHAP）、及び（ｆ）：n-オクチル−β−Ｄ−チオグリコシド（OTG）をそれぞれ界面活性剤として使用した場合に、IP-MSを行うことによって得られたマススペクトルを示す。それぞれのスペクトルは、m/z 300-2000の範囲とm/z 2000-10000の範囲とで分けて示される。m/z 300-2000の範囲においては界面活性剤のピークを、m/z 2000-10000の範囲においてはアミロイドペプチドのピークを見るために、適宜、ピークの相対強度を最適化して表示した。
【００８３】
図７が示すように、全般的に、親水性基として糖鎖と、界面活性基として炭素数8の直鎖アルキル基とをもつ非イオン性界面活性剤が、非常に良い結果を示した。この中でも、例えば、OTGは、非特異的吸着ピークの少ない界面活性剤として好ましく選択することができ、OMは、非特異的吸着は多いものの目的物を効率よく回収できる、つまり穏和な条件にてIP-MSを可能とする界面活性剤として好ましく選択することができることが示された。
【００８４】
上記実施例においては、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他のいろいろな形態で実施することができる。このため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、請求の範囲の均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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