(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１，２−フコース転移酵素の基質として作用する下記の一般式（１）：
Ｇａｌβ（１−３又は４ＧｌｃＮＡｃβ）n−Ｒ （１）
〔式中、ＲはＣ1-10アルキル基、アリル基、ベンジル基又はニトロ基を有することのあるフェニル基を示し、ｎは０又は１を示す。〕
からなるプライマーを有効成分として含有する大腸癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
一般式（１）において、ｎが０であるときＲはメチル基又はニトロ基を有することのあるフェニル基であり、ｎが１であるときＲはオクチル基、アリル基又はベンジル基である請求項１記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項３】
プライマーが、Ｇａｌβ−フェニル、Ｇａｌβ−ｏ−ニトロフェニル、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−オクチル、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−アリルおよびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ベンジルから選択される請求項１記載の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大腸癌の予防及び／又は治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞表面糖鎖の癌性変化については、種々の癌細胞で報告があり、このうちヒト大腸癌細胞ではフコシル糖鎖関連抗原として、ＳＬＸやＣＡ１９−９等のシアリル化を伴う癌関連抗原の発現がよく知られている。
【０００３】
本発明者も、フコシル糖鎖抗原に対するモノクローナル抗体を用いて、Ｙ抗原（Fucα1,2Galβ1,4[Fucα1,3]GlcNAcβR）の他、正常血液型Ｌｅb抗原（Fucα1,2Galβ1,3[Fucα1,4]GlcNAcβR）の異所的発現を大腸癌細胞に特異なフコシル糖鎖の癌性変化であることを明らかにしている(Jpn. J. Cancer Res., 84：641-648, 1993)。
【０００４】
即ち、正常大腸、特に遠位大腸粘膜ではタイプＩ鎖のＬｅa抗原（Galβ1,3[Fucα1,4]GlcNAcβR）が高発現していてＬｅb抗原は殆ど発現していないのに対して、大腸癌では、タイプＩ鎖やタイプII鎖のＨ抗原（Fucα1,2Galβ1,4GlcNAcβR）、Ｘ抗原（Galβ1,4[Fucα1,3]GlcNAcβR）、Ｙ抗原の発現が顕著となり、そのため、これらＹ、Ｌｅb及びＨタイプII鎖の３抗原を同時に認識するＹＢ−２抗体の免疫組織学的特異性は非常に高い（Jpn. J. Surg., 24:382-384,1994）。
【０００５】
また、フコシル糖鎖の発現が認められないマウス大腸癌細胞に、ヒトα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子及びα−１，３（４）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入すると、これらの糖鎖抗原の発現が確認され、遺伝子導入細胞における足場非依存性増殖が増加し、アポトーシスに対する抵抗性を示し、更に当該細胞の抗癌剤に対する抵抗性が増加することが確認されている(第20回日本分子腫瘍マーカー研究会抄録誌, 70頁, 2000年10月3日)。
【０００６】
このように、大腸細胞表面に特定のフコシル糖鎖が発現すると、細胞の癌化が促進され、また癌細胞の抗癌剤に対する抵抗性も増加することから、斯かる特定のフコシル糖鎖の発現を抑えることができれば、大腸癌の発生及び進行を抑制できると考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大腸細胞における特定のフコシル糖鎖の発現を効果的に抑制し、大腸癌の予防及び／又は治療に有用な薬剤を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み鋭意検討した結果、α−１，２−フコース転移酵素の特定の基質が、大腸癌細胞におけるある種のフコシル糖鎖の発現を効果的に抑制すると共に、抑制された癌細胞においては抗癌剤に対する抵抗性を著しく減少させ、大腸癌の予防及び／又は治療に有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、α−１，２−フコース転移酵素の基質として作用するβガラクトース又は非還元末端にβガラクトース基を有するオリゴ糖と疎水性有機化合物との結合体からなるプライマーを有効成分として含有する大腸癌の予防及び／又は治療剤を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本明細書において、以下、ＹＢ−２抗体（特開平６−９３）で認識されるＹ、Ｌｅb及びＨタイプII鎖の３抗原からなるフコシル糖鎖抗原を「ＹＢ−２抗原」と表記する。
【００１１】
本発明プライマーは、非還元末端のβガラクトース基にα−１，２結合でフコース（Ｆｕｃ）を転移することによりＨ抗原糖鎖を合成するα−１，２−フコース転移酵素の基質として作用する。而して、本発明プライマーは、生細胞におけるＨ抗原糖鎖の生合成において、プライマーとして作用することによりその生合成を阻害する。従って、本発明プライマーの利用によれば、大腸細胞におけるＹＢ-２抗原の発現を効果的に抑制することができ、当該プライマーを有効成分として含有する本発明の予防及び／又は治療剤は、大腸癌の予防及び／又は治療として有用である。
【００１２】
本発明プライマーにおいて非還元末端にβガラクトース基を有するオリゴ糖としては、α−１，２−フコース転移酵素の基質として作用する限りにおいて、その構成する糖の種類や個数等には特に限定はなく、また分枝鎖オリゴ糖であることができる。一般には、約１０個程度の糖からなるオリゴ糖を例示することができ、特にＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−が好ましい。
【００１３】
また、本発明プライマーは、疎水性有機化合物に由来する疎水性有機残基を有するが、該疎水性有機残基としては本発明プライマーの糖（鎖）構造によって規定されるα−１，２−フコース転移酵素の基質として作用する機能に悪影響を与えないものである限り特に限定はなく、一般に当該プライマーが生細胞に取り込まれる上で有利に作用することの知られている任意の疎水性の有機残基、例えば各種の飽和／不飽和の炭化水素基、アリール基又はアラルキル基を挙げることができる。当該疎水性有機残基は、生細胞環境下において酵素的分解を受けにくいものであることが好ましい。
【００１４】
前記一般式（１）で表されるプライマーは、本発明プライマーのより好ましい具体例であり、特にＲとして、アルキル基、アルケニル基及び置換基を有することのあるフェニル基又はフェニルアルキル基を好ましく例示することができる。
【００１５】
上記アルキル基としては、炭素数１〜２０（Ｃ1-20）のアルキル基、特にはＣ1-10アルキル基を、アルケニル基としては、Ｃ2-20のアルケニル基、特にはＣ2-10アルケニル基を、フェニルアルキル基としては、フェニルＣ1-10アルキル基を好ましく例示することができ、また、フェニル基又はフェニルアルキル基のフェニル環上にはニトロ基等の任意の置換基を有することができる。
【００１６】
本発明プライマーとしては、細胞表面のフコシル糖鎖抗原の中でも大腸癌で特異的に発現されるＹＢ−２抗原の発現を効果的に抑制できることにより、メチル−β−ガラクトシド、オクチル−β−ガラクトシド、アリル−β−ガラクトシド、フェニル−β−ガラクトシド、ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシド、ベンジル−β−ガラクトシド及びそれらの二糖体を特に好ましいものとして例示することができる。
【００１７】
斯かる本発明プライマーは、一般の糖鎖合成や糖鎖遺伝子の活性測定、特にＨ酵素の活性測定系の基質として広く使用されているものから選択して使用することができ（例えば、European Journal of Biochemistry, 69:583-592,1976等参照）、或いは一般の化学合成法に従い容易に製造することもできる。
【００１８】
例えば、本発明プライマーは、水酸基等の反応性官能基を持つ疎水性有機化合物と本発明にかかる糖（オリゴ糖）とを、常法に従い縮合させることにより得ることができ、また、所望のオリゴ糖の合成も慣用方法に従い行い得る。これら反応において、反応に関与しない糖（オリゴ糖）上の官能基は、常法に従い、慣用の保護基で保護され、反応終了後に脱離される。これら合成方法や目的化合物の精製手法等も、いずれも慣用の常法に従い行うことができる（例えば、糖鎖工学、産業調査会バイオテクノロジー情報センター、1992年等参照）。
【００１９】
本発明プライマーは、後記実施例に示すように、大腸癌細胞におけるＹＢ−２抗原の発現を強く抑制し、抗癌剤処理や紫外線照射処理に対する効果を顕著に亢進する。而して、本発明プライマーの少なくとも１種を含有する医薬製剤は、大腸癌の発生及び進行を抑制でき、大腸癌の予防／又は治療剤として有用である。
また、当該医薬製剤は、癌細胞の抗癌剤や放射線照射に対する抵抗性を減少させることから、これを癌の化学療法剤として知られている各種の制癌剤や放射線療法と併用すれば、それらの制癌効果を一層助長することができ、また、それら副作用の軽減を図ることができる。斯かる化学療法剤としては、例えば５−フルオロウラシル（５ＦＵ、協和発酵工業株式会社製）、マイトマイシン（Mitomycin-C、同上社製）、フトラフール（ＦＴ−２０７、大鵬薬品工業株式会社製）、エンドキサン（Endoxan、塩野義製薬株式会社製）、トヨマイシン（Toyomicin、武田薬品工業株式会社製）等を制限なく挙げられる。
【００２０】
尚、当該本発明の医薬製剤に含まれる１種又は２種以上の本発明プライマーは任意に選択することができるが、所望によりタイプＩ鎖又はタイプII鎖からなるプライマーから選択することにより、タイプＩ鎖又はタイプII鎖のＹＢ−２抗原を選択的に発現抑制することもでき、或いは所望によりそれら両者タイプの抗原を発現抑制するように混合使用することもできる。
【００２１】
本発明大腸癌の予防及び／又は治療剤の成人に対する一日当たりの投与量は、広範囲に適宜選択されるが、有効成分のプライマーとして、通常一日当たり１００mg／body〜１０００mg／body程度であり、好ましくは、一日当たり２００mg／body〜５００mg／body程度とするのが望ましい。
【００２２】
本発明の大腸癌の予防及び／又は治療剤は、その使用目的に応じ、医薬製剤としてこの分野で慣用されている各種の投与形態で使用される。
斯かる製剤は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤或いは賦形剤を無毒性薬理担体として用いて調製される。剤形は、治療目的に応じて各種の形態が選択でき、この代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。
【００２３】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン糖の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が例示できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００２４】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知なるものを広く使用でき、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナランカンテン等の崩壊剤等が例示できる。
【００２５】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。
【００２６】
注射剤として調製される場合には、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものを全て使用でき、例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。尚、この場合等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００２７】
更に本発明大腸癌の予防及び／又は治療剤中には必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよい。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。
【００２９】
実施例１
（１）本発明プライマー（合成基質）によるヒト大腸癌細胞の変化
ヒト大腸癌細胞(colo201)を２４時間前培養後（培地：ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）、トリプシン／ＥＤＴＡを含むＰＢＳで接着細胞をはがし、細胞数を計測した。
表１に示す合成基質（いずれもＳｉｇｍａ社、終濃度０．５mM）を含む及び含まない培地で調製した細胞（１×１０4Cells/５０μL／well）を９６ウエルマイクロタイタープレートに播き、３７℃で一晩培養した。
【００３０】
５−ＦＵ処理：５−ＦＵ（Ｓｉｇｍａ、終濃度２μｇ／mL）を含む培地５０μLを加え、更に２日間３７℃で培養した。５−ＦＵ無添加の対照をおいた。
ＵＶ処理：トランシルルミネーター（中波）を用いてＵＶ照射３０秒後、培地を５０μLを加え、更に２日間３７℃で培養した。ＵＶ非照射の対照をおいた。
【００３１】
上記各処理後の生細胞数を測定し、(Cell counting kit;Dojin)、細胞増殖抑制率（％）を算出した。
細胞増殖抑制率（％）＝（１−（処理群生細胞数／対照生細胞数））×１００
尚、各種合成基質を終濃度１mMにて添加した培地にて上記前培養を行い、細胞表面のＹＢ−２抗原の発現変化をＹＢ−２抗体を用いたＦＡＣＳ分析で調べた。
結果を表１に示す。表１において、ＹＢ−２抗原の発現率（ＦＡＣＳ分析（％））は、合成基質無添加の場合の発現を１００％として表示されている。
【００３２】
【表１】
0004963533.tif 000002
【００３３】
本発明のプライマーである各種合成基質の添加による前培養で、大腸癌細胞のＹＢ−２抗原の発現は抑制され、比較例とした対応するα−Ｇａｌ糖鎖ではその抑制は認められなかった。特にフェニル−β−Ｇａｌとｏ−ニトロフェニル−β−Ｇａｌでの抑制が顕著であった。
これらＹＢ−２抗原の発現抑制が認められる細胞においては、５−ＦＵ処理及びＵＶ照射に対する感受性がいずれも増加した。
【００３４】
以上より、ヒト大腸癌細胞の癌特異フコシル糖鎖抗原（ＹＢ−２抗原）の合成の鍵酵素であるＨ酵素の基質は、細胞によるプライミングによって、本来のＹＢ−２抗原の生合成を抑制し、あわせて抗腫瘍効果を亢進することが見込まれた。
尚、上記ＹＢ−２抗原の発現抑制は、Ｙ、Ｌｅb及びＨタイプ２のそれぞれに反応特異性を有する抗体を用いたＦＡＣＳ分析により、タイプII鎖のＹ及びＨの発現が抑制されており、タイプＩ鎖のＬｅb抗原の発現は変化していないことが確認された。
【００３５】
また、上記同様にして、タイプＩ鎖及びII鎖構造のオリゴ糖からなる下記プライマーを用いて、同様にしてＹＢ−２抗原の発現抑制を試験した。
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−オクチル
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−アリル
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−ベンジル
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ベンジル
尚、上記各プライマーは常法に従い合成した（European Journal of Biochemistry, 69:583-592,1976）。
即ち、２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノースの１位に、例えばオクチルアルコール（他同様）を縮合させ、３、４、６位のアセチル基を除去後、４、６位をベンジリデンアセタール化した。遊離の３位水酸基に、２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミドを縮合させ、ベンジリデン及び全てのＯ−アセチル基を除去して目的のプライマーを得た。
【００３６】
結果、ＹＢ−２抗原の発現率は、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−アリルを用いた場合６７．９％、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−オクチルを用いた場合７３．６％、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−ベンジルを用いた場合で８７．２％、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ベンジルを用いた場合で６９．０％といずれも所望の発現抑制が確認された。また、ＹＢ−２抗原の発現抑制に応じて、前記の細胞増殖抑制が確認された。
尚、前記したＹ、Ｌｅb及びＨタイプ２反応特異性の抗体を用いたＦＡＣＳ分析により、採用したプライマーに応じて、タイプＩ鎖のＬｅb抗原又はタイプII鎖のＹ及びＨの発現が特異的に抑制されていることが確認された。
【００３７】
また、上記試験において採用されたｃｏｌｏ２０１以外の大腸癌細胞、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＳ１８０、ＨＴ−２９及びＤＬＤ−１を用いて同様に試験しており、同様の糖鎖の改変（ＹＢ−２抗原の発現抑制）及び細胞特性の変化（細胞増殖抑制）を確認している。
尚、上記した合成基質の効果は添加濃度に依存しており、基質としてフェニル−β−Ｇａｌを用いた場合の結果を図１及び図２に示す。両図において、横軸は基質添加濃度（mM）を、図１の縦軸は前記したＹＢ−２抗原の発現率を、Ｂの縦軸はＵＶ照射又は５−ＦＵ処理における細胞増殖抑制率をそれぞれ示す。
【００３８】
（２）ＦＵＴ遺伝子導入細胞の合成基質添加による変化
ＹＢ-２抗原の発現がみられないマウス大腸癌細胞(colon26)にヒトＦＵＴ１及びＦＵＴ３遺伝子を導入してＹＢ-２抗原を発現する細胞を得、これを用いて、ＹＢ-２抗原の発現抑制が抗腫瘍に効果のあることを確認した。
【００３９】
即ち、ヒトＦＵＴ１及びＦＵＴ３遺伝子を別々のベクターに挿入し、ｃｏｌｏｎ２６細胞に導入してＹＢ−２抗原を安定発現する細胞を既知方法により得た（第２０回日本分子腫瘍マーカー研究会抄録誌、７０頁、２０００年１０月３日）。対照として各ベクターのみを導入した細胞を用いた。合成基質としてフェニル−β−Ｇａｌを用い、前記試験例に従い細胞の糖鎖改変と特性変化を調べた。
結果を表２に示す。表２において、「colon26wild」は、未処置のｃｏｌｏｎ２６細胞における結果を、「colon26/FUT1/FUT3」は、ヒトＦＵＴ１及びＦＵＴ３遺伝子を導入したｃｏｌｏｎ２６細胞における結果を、「colon26/vect1/vect2」は、上記ベクターのみを導入したｃｏｌｏｎ２６細胞における結果をそれぞれ示す。
【００４０】
【表２】
0004963533.tif 000003
【００４１】
ＦＵ６１及びＦＵＴ３遺伝子導入によりＹＢ-２抗原の発現が認められた。Ｈ酵素基質のフェニル−β−Ｇａｌ添加（＋ｐＧａｌ）による前培養により、この獲得したＹＢ−２抗原の発現が抑制された。
ＹＢ−２抗原の発現により獲得されたＵＶ照射及び５−ＦＵ処理に対する耐性は、基質添加によるＹＢ−２抗原の発現抑制により再び減弱した。
ヒト大腸癌細胞では、ほとんどの細胞でＹＢ−２抗原が発現しているが、元々ＹＢ−２抗原の欠損しているｃｏｌｏｎ２６細胞に遺伝子導入によってＹＢ−２抗原を発現させた後、更に発現抑制を行うことで同抗原の抗腫瘍効果などにおける役割が確認された。
【００４２】
（３）大腸癌細胞の糖鎖変化による腫瘍形成への影響
Ｈ酵素の基質を添加してＹＢ−２抗原の発現を抑制したヒト大腸癌細胞ｃｏｌｏ２０１をヌードマウスの皮下に接種し、糖鎖変化による腫瘍形成への影響を試験した。
即ち、基質処理（５mMのフェニル−β−Ｇａｌ添加にて２４時間培養）及び未処理（対照）のｃｏｌｏ２０１細胞の２×１０5細胞／１００μLをヌードマウス各８匹の皮下に接種し、経時的腫瘍サイズ（縦×横mm）を測定した。
結果を図３に示す。同図において、縦軸は、腫瘍サイズを、横軸は経時（日）を示す。また、上欄の矢印は測定可能な腫瘍形成が始まった日からの腫瘍サイズ測定日を示し、図中の太い横線は平均腫瘍サイズを示す。
【００４３】
接種後２６日までの腫瘍形成を試験群と対照群で比較すると、後者では全例腫瘍の形成が認められたが、前者では２例で腫瘍形成が認められなかった。また、それぞれの平均腫瘍サイズでの比較から、試験群ではおおよそ腫瘍形成の半減が観察された。
以上より、大腸癌細胞のＹＢ−２抗原の発現抑制は、インビボにおいて腫瘍形成に拘わることが考えられた。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の大腸癌の予防及び／又は治療剤を用いることにより、大腸細胞の癌性変化を抑制でき、大腸癌の発生及び進行を抑制することができる。また、他の制癌剤や放射線療法と併用することにより当該制癌効果を一層助長することができ、副作用の少ない抗癌療法が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】フェニル−β−ＧａｌによるＹＢ−２抗原の発現抑制効果を示す図である。
【図２】フェニル−β−Ｇａｌによる細胞増殖抑制効果を示す図である。
【図３】フェニル−β−Ｇａｌの腫瘍形成に対する影響を示す図である。
【図１】
0004963533.tif 000004
【図２】
0004963533.tif 000005
【図３】
0004963533.tif 000006