(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式で表され、
【化１】
0004897991.tif 000006
（ただし、式中、ｎが１ないし１２の間で変化し、Ｒ1＝ＨまたはＳＯ3Ｎａ、Ｒ2＝ＳＯ3ＮａまたはＣＯＣＨ3であり、＊を付した炭素原子はＲ配置またはＳ配置の何れかの炭素原子である）
平均分子量（Ｍｗ）が２，０００ないし４，０００ダルトンの範囲にあり、分子量が２，０００ダルトン未満のオリゴ糖鎖を２５ないし６０％含んでおり、４０ないし７５％のオリゴ糖鎖の分子量が２，０００ないし６，０００ダルトンの範囲にあり、１５％未満のオリゴ糖鎖の分子量が６，０００ダルトンより大きく、
１０％未満のフラグメントのｎが１０ないし１２の範囲にあり、８０〜９０％のフラグメントのｎが１ないし６の範囲にあり、１５％未満のフラグメントのｎが７ないし９の範囲にあることを特徴とするヘパリン組成物。
【請求項２】
オリゴ糖鎖またはヘパリンフラグメントの混合物からなることを特徴とする請求項１記載のヘパリン組成物。
【請求項３】
抗Ｘａ活性が１００ないし１５０I.U.／ｍｇの範囲にあり、抗第IIａ因子活性が１０I.U.／ｍｇ以下であることを特徴とする請求項１または２記載のヘパリン組成物。
【請求項４】
抗血栓症剤として使用可能であることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載のヘパリン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、４−エノピラノシルウロネート（4-enopyranosyl uronate）基を非還元末端に有する、限定された数のヘパリンフラグメントからなる、新規の低分子量ヘパリン組成物（ＨＬＭＷ）に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリナ（Heparina）は動物由来のムコ多糖体硫酸塩であって、哺乳動物の腸あるいは肺（ウシ、子ヒツジ、ブタ）から抽出され、現在ではヒトの血栓塞栓症の予防や治療に利用されることがある。
【０００３】
このヘパリンの使用は、非常に重症の大出血（very upsetting haemorrhaging）作用を伴うとともに、その毎日の投薬において、３回の皮下注射または静脈注射を伴うことから、非常に重大な欠点を有することがよく知られている。
【０００４】
ここ数年間の推移では、以下に示すような、様々な化学的手法がヘパリンの解重合のために用いられている。
−酸性溶媒中での亜硝酸ナトリウムを用いた処理
−エステルのアルカリ処理
−酸素処理水（oxygenated water）の存在下で発生するフリーラジカルの利用
−β−脱離（a beta elimination）機構による、強塩基を用いた非水性溶媒中でのヘパリンの四級アンモニウム塩の処理。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これらの方法は、操作の手順や状況によって、平均分子量や抗凝固活性（anti-coagulant activity ）が変化するヘパリンフラグメントの混合物が得られるという、一定しない生産となってしまう。上記従来の技術で述べられているか、または商品化された低分子量ヘパリン（ＨＬＭＷ）は、様々な解重合手順によって得られている。これらの平均分子量（Ｍｗ）は、４，０００ないし６，０００ダルトンの範囲にある。
【０００６】
現在では、次のことが認められている。すなわち、ＨＬＭＷの抗血栓活性（anti-thrombic activity）は、主に、血漿タンパク質である抗トロンビンIII(anti-thrombin III)活性化作用、および活性化第Ｘ因子およびトロンビンの有力な阻害作用の能力によるものである。このようにして、ヘパリンの抗血栓活性は、上記各因子の阻害を特異的に調べるテストにより測定することができる。
【０００７】
近年、様々な著作者による研究結果から次のことが分かっている。すなわち、４，８００ダルトン未満（＜4,800 Daltons ）の中程度の分子量の短鎖からなるヘパリンのオリゴ糖鎖のフラグメントは、活性化第Ｘ因子への選択的な作用を有する一方、ファルマコペア（farmacopea）の手法を用いて測定される全体的な凝固にはほとんど影響を及ぼさないということである。
【０００８】
さらに、以下のことも見い出されている。すなわち、超低分子量のフラグメントが強い抗Ｘａ活性を有することが要求される場合には、米国特許4,981,955 号に記載しているように、抗トロンビンIII に結合する部位を攻撃する危険を冒さない、非水性溶媒中での選択的な解重合技術を用いることが好ましい。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上述した背景技術および従来技術に鑑みてなされたものであって、非水性溶媒中での手順を用いた、制御されたヘパリンの解重合を提供するものであり、このヘパリンの解重合は、高い抗Ｘａ活性および低い抗IIａ活性を有する低分子量オリゴ糖鎖が豊富なＨＬＭＷの新たな種類（family）を得るものであって、該ＨＬＭＷは、以下の一般式にて示される。
【００１０】
【化２】
0004897991.tif 000002
【００１１】
（ただし、式中、ｎが１ないし１２の間で変化し、Ｒ1＝ＨまたはＳＯ3Ｎａ、Ｒ2＝ＳＯ3ＮａまたはＣＯＣＨ3であり、＊を付した炭素原子はＲ配置またはＳ配置の何れかの炭素原子である）上記のような超低分子量ヘパリンは、β−脱離の手順によって、非水性溶媒中でヘパリンを選択的に解重合させることによって得られる。
【００１２】
本発明にかかる超低分子量ヘパリン組成物は、分子量が２，０００ないし４，０００ダルトンの範囲にあり、抗第Ｘａ因子活性が少なくとも１００I.U.／ｍｇに等しく、６量体糖鎖（hexasaccharide, ｎ＝１）から１２量体糖鎖（dodecasaccharide，ｎ＝４）までに及ぶ低重合度のオリゴ糖鎖の割合が大きく、７５％にも達しているということを特徴としている。
【００１３】
このような組成物は、静脈及び動脈の血栓症の予防や治療において有用であって、抗血栓症剤として用いることができる。
【００１４】
従来知られている、または市販で利用されているＨＬＭＷは、低分子量（low molecular mass）オリゴ糖鎖、特に、６量体糖鎖から１２量体糖鎖までに及ぶ重合度のオリゴ糖鎖の割合が小さいものであった。
【００１５】
本発明の成果であるヘパリン組成物の主な特徴は、そのようなオリゴ糖鎖の割合が大きく、７５％にも達しているということである。さらに、このようなオリゴ糖鎖は、高い抗Ｘａ活性（≧１００I.U.／ｍｇ）を有し、長い持続性と、高い抗血栓活性が得られる。
【００１６】
上記のヘパリン組成物は、抗Ｘａ活性が１００ないし１５０I.U.／ｍｇの範囲にあり、抗第IIａ因子活性が１０I.U.／ｍｇ以下である。
【００１７】
本発明のヘパリン組成物の平均分子量は２，０００ないし４，０００ダルトンの範囲にあり、その組成は以下の通りである。
−分子量が２，０００ダルトン未満のオリゴ糖鎖を２５〜６０％含んでおり；
−分子量が２，０００ないし６，０００ダルトンのオリゴ糖鎖を４０〜７５％含んでおり；
−分子量が６，０００ダルトンを超えるオリゴ糖鎖を１５％未満含んでいる。
【００１８】
本発明のヘパリン組成物は、オリゴ糖鎖、すなわちヘパリンフラグメントの混合物からなっている。本発明の一部を形成するフラグメントのパーセンテージは以下の通りである。
−ｎが１０ないし１２の範囲にあるフラグメントを１０％未満含んでおり；
−ｎが１ないし６の範囲にあるフラグメントを８０〜９０％含んでおり；
−ｎが７ないし９の範囲にあるフラグメントを１５％未満含んでいる。
【００１９】
【実施例】
本発明を、以下の各実施例によって説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２０】
分子量（Ｍｗ）、分子分布（molecular distribution）、同じく抗第Ｘａ因子活性は、モノグラフ第８２８号、『低分子量ヘパリン（“Heparin of low molecular weight ”）』第３版  ファルマコペア・エウロペア（Farmacopea Europea）に記載の手法によって決定した。
【００２１】
〔実施例１〕
１ｋｇの未分別ヘパリンナトリウムを７Ｌ（リットル：litres) の精製水に溶解した後、５０重量（質量）／体積％（％ w/v）の塩化ベンザルコニウム水溶液４．４Ｌを該ヘパリン溶液へ攪拌しながら添加した。
水を加えて体積を３０Ｌにして、デカンテーション（傾瀉）した。
【００２２】
次に、上澄液を取り除き、水を加えて体積を３０Ｌにして、デカンテーション状態とした。
デカンテーション終了後、上澄液を取り除き、沈澱物を凍結乾燥（liophilised)した。
約２．７ｋｇのヘパリンのベンザルコニウム塩（生成物Ａ）が得られた。
【００２３】
１００ｇの生成物Ａを３００ｍｌのジクロロメタンに溶解した後、トリトンＢを以下の３ロットに分けて添加した。
−２５ｍｌのトリトンＢを添加し、混合物を２５℃で８時間放置した。
−２５ｍｌのトリトンＢを添加し、混合物を２５℃で１６時間放置した。
−２５ｍｌのトリトンＢを添加し、混合物を２５℃で８時間放置した。
【００２４】
上記溶液を、１０重量／体積％の酢酸ナトリウムのメタノール溶液６００ｍｌで沈澱させ、沈殿物をメタノールで洗浄しながらの遠心分離によって回収した。
【００２５】
該生成物を５００ｍｌの水に溶解し、０．１mol ／Ｌ（０．１Ｎ）のＨＣｌで中和し、塩化ナトリウムを１０重量／体積％の濃度に到達するまで添加した。沈殿は１．２５Ｌのメタノールの添加によりもたらされた。
【００２６】
次に、メタノールで洗浄しながらの濾過、および３５℃での真空乾燥により沈澱物を回収したところ、３３ｇの生成物Ｂが得られ、該生成物Ｂを１０重量／体積％で水に溶解した。
【００２７】
温度を２５℃に設定し、塩化ナトリウムを添加して濃度を１０重量／体積％にした。沈殿は２．５倍のメタノールの添加によってもたらされた。それから、メタノールで洗浄しながらの濾過、および３５℃での真空乾燥により沈澱物を回収したところ、２６ｇの精製された生成物が得られた。該生成物を５重量／体積％で水に溶解した。
【００２８】
０．１mol ／Ｌ（０．１Ｎ）のＨＣｌによりｐＨを６．６に調整し、塩化ナトリウムを添加して濃度を５重量／体積％とした。
沈殿は０．８倍のメタノールの添加によりもたらされた。
沈澱物を、メタノールで洗浄しながらの濾過により回収し、生成物を３５℃で真空乾燥させた。
【００２９】
上澄液を１．６倍のメタノールで沈澱させた。
メタノールで洗浄しながらの濾過、および３５℃で真空乾燥により沈澱物を回収した。
上記プロセスの終了で、２２ｇの生成物が得られた。
【００３０】
〔実施例２〕
実施例１における生成物Ｂを得る方法を繰り返した。
２０ｇの生成物Ｂを１５０ｍｌの水に溶解し、５０重量／体積％の塩化ベンザルコニウム水溶液１００ｍｌを添加した。
【００３１】
次に、水を加えて該混合物の体積を５００ｍｌにした。該混合物をデカンテーション状態とした。
デカンテーション終了後、上澄液を取り除き、水を加えて体積を５００ｍｌにして、該混合物をデカンテーション状態とした。
【００３２】
上澄液を取り除いた後、沈澱物を凍結乾燥させたところ、５０ｇのベンザルコニウム塩が得られた。
得られた上記塩２０ｇを６０ｍｌのジクロロメタンに溶解した。
５ｍｌのトリトンＢを添加し、該混合物を３５℃で８時間放置した。
【００３３】
次に、上記溶液を、１０重量／体積％の酢酸ナトリウムのメタノール溶液１２０ｍｌで沈澱させ、沈澱物をメタノールで洗浄しながらの遠心分離により回収した。
【００３４】
得られた上記生成物を１００ｍｌの水に溶解し、０．１mol ／Ｌ（０．１Ｎ）のＨＣｌで中和して、塩化ナトリウムを１０重量／体積％の濃度に到達するまで添加した。沈殿は２５０ｍｌのメタノールの添加によりもたらされた。
【００３５】
メタノールで洗浄しながらの濾過、および３５℃での真空乾燥により沈澱物を回収した。
上記プロセスの終了で、６．３ｇの生成物が得られた。
【００３６】
〔実施例３〕
まず、実施例２で得られた生成物５ｇを、５重量／体積％の濃度となるように水に溶解した。
【００３７】
０．１mol ／Ｌ（０．１Ｎ）のＨＣｌでｐＨを６．６に調整し、塩化ナトリウムを５重量／体積％の濃度に到達するまで添加した。
沈殿は１．５倍のメタノールの添加によりもたらされた。
【００３８】
次に、メタノールで洗浄しながらの濾過、および３５℃での真空乾燥により沈澱物を回収した。
上記プロセスの終了で、３ｇの生成物が得られた。
【００３９】
〔実施例４〕
実施例１における生成物Ｂを得る方法を繰り返した。
【００４０】
２０ｇの生成物Ｂを１５０ｍｌの水に溶解し、５０重量／体積％の塩化ベンザルコニウム水溶液１００ｍｌを添加した。
それから、水を加えて該混合物の体積を約５００ｍｌにした。
【００４１】
その後、上澄液を取り除いて、水を加えて体積を５００ｍｌにして、該混合物をデカンテーション状態とした。
上澄液を取り除いて、水を加えて容量を５００ｍｌにして、該混合物をデカンテーション状態とした。
【００４２】
その後、上記により得られた上記塩２０ｇを６０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリトンＢを以下の２ロットに分けて添加した。
−５ｍｌのトリトンＢを添加し、３５℃で８時間放置。
−５ｍｌのトリトンＢを添加し、３５℃で１６時間放置。
【００４３】
上記の溶液を、１０重量／体積％の酢酸ナトリウムのメタノール溶液１２０ｍｌで沈澱させ、沈澱物をメタノールで洗浄しながらの遠心分離により回収した。
【００４４】
得られた上記生成物を１００ｍｌの水に溶解し、０．１mol ／Ｌ（０．１Ｎ）のＨＣｌで中和し、塩化ナトリウムを１０重量／体積％の濃度に到達するまで添加した。２５０ｍｌのメタノールを添加して沈澱させた。
【００４５】
メタノールで洗浄しながらの濾過、および３５℃での真空乾燥により沈澱物を回収した。
上記プロセスの終了で、８．７ｇの生成物が得られた。
【００４６】
〔実施例５〕
まず、実施例４で得られた生成物５ｇを５重量／体積％となるように水に溶解した。
【００４７】
０．１mol ／Ｌ（０．１Ｎ）のＨＣｌでｐＨを６．６に調整し、塩化ナトリウムを５重量／体積％の濃度に到達するまで添加した。
次に、沈殿は０．９３倍のメタノールの添加によりもたらされた。
【００４８】
その後、メタノールで洗浄しながらの濾過により沈澱物を回収し、３５℃で真空乾燥させた。
上澄液を２倍のメタノールで沈澱させた。
【００４９】
メタノールで洗浄しながらの濾過、および３５℃での真空乾燥により沈澱物を回収した。
その結果、４ｇの生成物が得られた。
【００５０】
【表１】
0004897991.tif 000003
【００５１】
【表２】
0004897991.tif 000004
【００５２】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかるヘパリン組成物は、以下の一般式で表され、
【００５３】
【化３】
0004897991.tif 000005
【００５４】
（ただし、式中、ｎが１ないし１２の間で変化し、Ｒ1がＨまたはＳＯ3Ｎａであり、Ｒ2がＳＯ3ＮａまたはＣＯＣＨ3であり、＊を付した炭素原子はＲ配置またはＳ配置の何れかの炭素原子である）非常に分子量の低いものである。
【００５５】
それゆえ、このような組成物は、静脈及び動脈の血栓症の予防や治療において有用であって、抗血栓症剤として用いることができる。