(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ペプチド及び糖ペプチド、又は、ペプチド及び糖を含む解析すべき試料と、
３−アミノキノリンイオンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸イオンを含むイオン性液体３ＡＱ/ＣＨＣＡ、及び１，１，３，３−テトラメチルグアニジンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン性液体ＴＭＧ/ＣＡと、
メタノール、エタノール、アセトニトリル、及び、酢酸エチルからなる群から選ばれる有機溶媒及び水を含む溶媒と、
を含む混合液滴をターゲットプレート上に調製する混合液滴調製工程と；
（２）前記混合液滴から前記溶媒を除去することによって、前記解析すべき試料と、３ＡＱ/ＣＨＣＡと、ＴＭＧ/ＣＡとを含むスポットを前記ターゲットプレート上に得るスポット形成工程と；
（３）前記スポットの特定の箇所にレーザー光を照射し、前記糖ペプチドのイオン又は糖のイオンを得ること、及び
前記スポットの前記特定の箇所と異なる箇所にレーザー光を照射し、前記ペプチドのイオンを得ること、
を含む質量分析工程と；
を含む、混合液体マトリックスを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項２】
前記工程（１）において、前記溶媒中、水は１０〜９０体積％の割合で用いられる、請求項１に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項３】
前記解析すべき試料は、糖タンパク質を、ペプチド鎖の断片化処理及び／又は糖鎖の切り出し処理に供することによって得られたものである、請求項１又は２のいずれかに記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、混合液体マトリックスを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法に関する。本発明は、修飾ペプチドのＭＡＬＤＩ質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いて、タンパク質の翻訳後修飾解析やタンパク質結合化合物の解析がなされている。たとえば、糖ペプチドの解析法として非特許文献１（JMSSJ., 2004, 52, 323-338）に報告があり、当該文献においては、ＭＳ分析で得られたスペクトルから糖ペプチドの分子量関連イオンとしてプロトン付加体及びナトリウムイオン付加体をプリカーサイオンとして選択し、それぞれについて、ＭＳ２以上の多段階分析（ＭＳｎ分析）を行い、一台のＭＡＬＤＩ質量分析装置で糖鎖情報とペプチド配列情報との両方を得る方法が開示されている。
【０００３】
また、糖ペプチドなど特定の分子を優先的にイオン化させる液体マトリックスの開発が行われてきた。その一例として、非特許文献２（Anal Chem., 2008, 80, 2171-2179）に液体マトリックスについて報告がある。
【０００４】
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・ザ・マス・スペクトロメトリ・ソサイエティ・オブ・ジャパン（Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan）、２００４年、第５２巻、ｐ．３２３−３３８
【非特許文献２】アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistry）、２００８年、第８０巻、ｐ．２１７１−２１７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、測定すべき試料に複数の分子種（例えばペプチドと糖ペプチド、ペプチドと糖など）が含まれる場合、ＭＳ分析においては、イオン化されやすさの違いに起因するサプレッション効果の問題を常に抱えることとなる。サプレッション効果の問題とは、すなわち、測定すべき試料中の特定の分子種が使用マトリックスによって優先的にイオン化され、一方で、当該試料中の他の分子種（たとえばイオン化がよりされにくい分子や微量分子）のスペクトルが取得できないという問題である。
【０００６】
従って、糖タンパク質の構造解析を行うためには、糖タンパク質の酵素消化物をＨＰＬＣにより糖ペプチドとペプチドとに分画精製し、それぞれを質量分析に供する、ということを要する。
【０００７】
上記非特許文献２（Anal Chem., 2008, 80, 2171-2179）などに記載の液体マトリックスを使用する方法は、このことに鑑みてなされたものであるが、現在まで開発された液体マトリックスは、糖ペプチドなどの特定の分子種をイオン化する一方で、ペプチドのイオン化を抑制するものであるため、糖タンパク質などの修飾タンパク質の同定を行うことはやはり困難である。
【０００８】
すなわち、これまでの技術では、サプレッション効果により、ペプチドと糖鎖又は糖ペプチドとの混合物中から糖鎖又は糖ペプチドを検出することが困難である。そのため、レーザーを照射すべきスポット１個からペプチドと糖鎖又は糖ペプチドを識別し検出することが困難である。さらに、いずれかの分子種がイオン化されても検出感度が低く、ＭＳｎによる構造解析が困難である。
【０００９】
そこで本発明の目的は、サプレッション効果による特定の分子種のイオン化阻害を防ぐことにある。
また本発明の目的は、レーザーを照射すべきスポット１個からペプチドと糖鎖又は糖ペプチドとの両方を高感度に検出することにある。
さらに本発明の目的は、ＭＳ測定の段階において、特定の分子種のイオン化を選択的に行い、それによってＭＳｎ測定における構造解析を容易にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意検討の結果、レーザーを照射すべきスポットを、１組（２種）の液体マトリックスと複数の溶媒を用いて調製することによって、１個のスポットにおいて、解析すべき試料中の特定の分子種が特異的にイオン化されるエリアと、当該試料中の他の分子種が特異的にイオン化されるエリアとが出現することを発見した。そして、これらエリアのそれぞれに対してレーザー照射して質量分析を行うことによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、以下の発明を含む。
[１]
（１）ペプチド及び糖ペプチド、又は、ペプチド及び糖を含む解析すべき試料と、
３−アミノキノリンイオンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸イオンを含むイオン性液体３ＡＱ/ＣＨＣＡ、及び１，１，３，３−テトラメチルグアニジンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン性液体ＴＭＧ/ＣＡと、
メタノール、エタノール、アセトニトリル、及び、酢酸エチルからなる群から選ばれる有機溶媒及び水を含む溶媒と、
を含む混合液滴をターゲットプレート上に調製する混合液滴調製工程と；
（２）前記混合液滴から前記溶媒を除去することによって、前記解析すべき試料と、３ＡＱ/ＣＨＣＡと、ＴＭＧ/ＣＡとを含むスポットを前記ターゲットプレート上に得るスポット形成工程と；
（３）前記スポットの特定の箇所にレーザー光を照射し、前記糖ペプチドのイオン又は糖のイオンを得ること、及び
前記スポットの前記特定の箇所と異なる箇所にレーザー光を照射し、前記ペプチドのイオンを得ること、
を含む質量分析工程と；
を含む、混合液体マトリックスを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法。
【００１２】
「イオン性液体」は、室温で液体の状態で存在し、その実体は塩である物質をいう。本明細書において、マトリックスとしての「イオン性液体」と、「液体マトリックス」とは、同じ意味で記載する。
【００１３】
「３−アミノキノリンイオンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸イオンを含むイオン性液体」は、３−アミノキノリンのイオンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のイオンとから構成される。「１，１，３，３−テトラメチルグアニジンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン性液体」は、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンのイオンとｐ−クマル酸のイオンとから構成される。
【００１４】
「糖」には、単糖、糖鎖、及びそのラベル化体が含まれる。ラベル化体には、ピリジルアミノ化糖が含まれる。
【００１６】
[２]
前記工程（１）において、前記溶媒中、水は１０〜９０体積％の割合で用いられる、[１]に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【００１７】
[３]
前記解析すべき試料は、糖タンパク質を、ペプチド鎖の断片化処理及び／又は糖鎖の切り出し処理に供することによって得られたものである、[１]又は[２]のいずれかに記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、ＭＡＬＤＩターゲットプレートウェル上の、レーザーを照射すべきスポットの調製の際に、イオン化ターゲットの異なる１組（２種）の液体マトリックスと複数の溶媒を用いることによって、複数の解析すべき試料混合物から調製した１個のスポット上において、当該試料混合物に含まれる特定の分子種が特異的に検出されるエリアと、当該試料混合物に含まれる他の分子種が特異的に検出されるエリアとを局在化させるものである。
【００１９】
すなわち、本発明によると、混合物中の分子種をそれぞれ独立して検出することが可能であるため、これまでの技術で問題となっていたサプレッション効果による特定の分子種のイオン化阻害を回避することができる。
このようなサプレッション効果によるイオン化阻害の回避により、混合物中の分子種のそれぞれ検出感度を上げることが可能であり、従って、レーザーを照射すべきスポット１個からペプチドと糖鎖又は糖ペプチドとの両方を高感度に検出することが可能になる。
さらに、混合物中の分子種の分離検出（すなわち混合物中の分子種をそれぞれ独立して検出すること）を高感度に行うことが可能であることから、ＭＳ測定の段階において、特定の分子種（すなわちペプチド、糖、又は糖ペプチド）の選択的なイオン化が可能になり、且つＭＳｎ測定による構造解析を容易にすることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法は、（１）２種の分子種を含む試料と、２種の液体マトリックスと、水及び有機溶媒とを含む混合液滴を調製する工程と、（２）当該混合液滴から溶媒を除去することによって、質量分析用スポットを形成する工程と、（３）当該質量分析用スポットの特定のエリアと、それ以外のエリアとに、それぞれレーザーを照射することによって、試料に含まれていた２種の分子種を別々に検出する工程とを含む。
【００２１】
［１．混合液滴調製工程］
混合液滴には、構造解析すべき分子を含む試料と、液体マトリックスと、有機溶媒及び水とが含まれる。
［１−１．構造解析すべき分子を含む試料］
本発明において構造解析すべき分子は、糖、糖ペプチド、ペプチドであり、試料は、これらの分子が混合されたものである。すなわち、本発明における解析すべき試料は、ペプチド及び糖ペプチドを含む混合物、又は、ペプチド及び糖を含む混合物である。
ここで、糖には、単糖、糖鎖、及びそのラベル化体が含まれる。糖のラベル化体としては、いかなる修飾を受けた糖であっても良いが、例えば、ピリジルアミノ化糖などが挙げられる。
【００２２】
ペプチド及び糖ペプチドを含む混合物としては、例えば、糖タンパク質をペプチド鎖の断片化処理に供することによって得られるものが挙げられる。ペプチド及び糖を含む混合物としては、糖タンパク質又は糖ペプチドを糖鎖の切り出し処理に供することによって得られるもの、或いは、糖タンパク質をペプチド鎖の断片化処理に供し、さらに糖鎖の切り出し処理に供することによって得られるものが挙げられる。
【００２３】
ここで、ペプチド鎖の断片化処理や糖鎖の切り出し処理は、当業者にとって適宜行われるものである。ペプチド鎖の断片化処理法として代表的なものに、タンパク質分解酵素による消化やブロモシアンなどの試薬による化学的分解を行う方法が挙げられるが、その他当業者に公知のいかなる方法も用いられうる。糖鎖の切り出し処理法として代表的なものに、ピリジルアミノ化法が挙げられるが、その他当業者に公知のいかなる方法も用いられうる。
【００２４】
［１−２．液体マトリックス］
本発明は、マトリックスとしてのイオン性液体を用いる。イオン性液体は、室温で液体の状態で存在し、その実態は塩である物質をいう。具体的には、アミンのイオンと酸性基含有物質のイオンとからなるものが挙げられる。
【００２５】
本発明で用いられるイオン性液体は、３−アミノキノリンイオンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸イオンを含むイオン性液体（３ＡＱ/ＣＨＣＡ）、及び、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン性液体（ＴＭＧ/ＣＡ）である。本発明においては、これらのイオン性液体の両方をマトリックス（混合液体マトリックスと記載する場合がある）として用いる。
これらのイオン性液体のうち、３ＡＱ/ＣＨＣＡは、ペプチドを特異的にイオン化することができ、ＴＭＧ/ＣＡは、糖や糖ペプチドを特異的にイオン化することができる。
【００２６】
液体マトリックスの調製方法としては特に限定されるものではない。具体的な調製方法としては従来からのイオン性液体の調製法に準じることができる。
例えば、もっとも簡便な調製法の一つとしては、イオン性液体を構成するアミンイオンの由来元となるアミン類と、酸性基含有物質イオンの由来元となる酸物質とを混合して反応させる方法が挙げられる。
【００２７】
双方の物質を反応させるためには、酸物質をアミン類に加えても良いし、アミン類を酸物質に加えても良い。当該双方の物質の反応は、溶媒中で行うことができる。そのため、酸物質及びアミン類の少なくとも一方を予め溶液として調製して、酸物質をアミン類に加えても良いし、アミン類を酸物質に加えても良い。或いは、溶媒に酸物質及びアミン類を同時に加えても良い。
【００２８】
互いに反応させるべきアミン類と酸物質との比は、特に限定されることなく、当業者が適宜決定することができる。例えば、３ＡＱ/ＣＨＣＡの場合、３−アミノキノリン（３ＡＱ）とα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）との比を、モル基準で１０：１〜２：1、好ましくは７：１〜４：１と設定することができる。また、ＴＭＧ/ＣＡの場合、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）とクマル酸（ＣＡ）との比を、モル基準で１：０．１〜１：１０、好ましくは１：１〜１：４と設定することができる。溶媒中どのような濃度で双方の物質を反応させるかについては、当業者が適宜決定すればよい。
【００２９】
溶媒中で反応させた場合は、反応後、溶媒を除去することができる。溶媒の除去は、留去、好ましくは減圧下における留去によって行うことができる。溶媒の除去を行った後、液状の物質をイオン性液体として得ることができる。
一方、反応に用いた溶媒を、後述の溶媒としても用いる場合は、当該溶媒を除去せず、イオン性液体の溶液として得ても良い。
【００３０】
［１−３．溶媒］
混合液滴中には、溶媒として、有機溶媒及び水を含む。後述の本発明の質量分析用スポット（すなわち、試料中のペプチドを特異的にイオン化することができるエリアと、試料中の糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリアとを有するスポット）を生じるための溶媒は、試料の種類、溶媒の沸点、疎水性、粘性、その他の要因により異なりうる。従って有機溶媒は、特に限定されるものではない。
【００３１】
例えば、一つの傾向として、揮発性の高い有機溶媒は、本発明の質量分析用スポットを生じやすい傾向にある。このような有機溶媒としては、沸点が８５℃以下、好ましくは８１℃以下のものが挙げられる。有機溶媒の下限値としては特に限定されないが、例えば６０℃、好ましくは６５℃である。
【００３２】
或いは、他の一つの傾向として、低級アルコール、低級ニトリル、低級カルボン酸の低級エステル、低級ハロゲン化炭化水素は、本発明の質量分析用スポットを生じやすい傾向にある。これら低級の化合物は、炭素数が１又は２の炭化水素基を有するものであることが好ましい。
【００３３】
本発明で好ましく用いられる有機溶媒の具体例としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルムなどである。
本発明において、有機溶媒は、１種又は複数種を組み合わせて用いることができる。
【００３４】
［１−４．混合液滴の形成］
混合液滴をターゲットプレート上に形成する具体的方法としては特に限定されない。
すなわち、それぞれの液体マトリックス、それぞれの解析すべき分子、及びそれぞれの溶媒を任意の順番で（溶媒が乾燥しない間に）滴下しても良いし、予め適宜混合したのち、混合液を滴下しても良い。
【００３５】
例えば、解析すべき分子を含む試料を水溶液として得て、一方、液体マトリックスを無溶媒で、或いは、水及び／又は有機溶媒中に含む溶液として得て、それら溶液同士を混合したものをターゲットプレート上に滴下することができる。
【００３６】
［１−５．混合液滴中の液体マトリックス量］
ターゲットプレート上に形成される混合液滴１個に含まれる液体マトリックスの量（すなわちターゲットプレート上に形成される後述の質量分析用スポット１個あたりの液体マトリックスの量）としては、特に限定されるものではない。例えば、混合液滴１個あたりのイオン性液体の合計量を、１ｎｍｏｌ〜１０μｍｏｌ、さらに好ましくは１０ｎｍｏｌ〜1μｍｏｌとすることができる。また、これらの量における２種の液体マトリックスの組み合わせ比率も、特に限定されるものではない。
【００３７】
［１−６．混合液滴中の試料の量］
ターゲットプレート上に形成される混合液滴１個に含まれる構造解析すべき分子の合計量としては、特に限定されるものではない。例えば、液体マトリックス合計量２００ｎｍｏｌに対し、構造解析すべき分子の合計量は、１０ｐｍｏｌ〜数ｆｍｏｌの広い範囲で許容される。
【００３８】
［１−７．混合液滴中の溶媒の組み合わせ比率］
混合液中の水と有機溶媒との比率は、特に限定されるものではない。例えば、全溶媒に対する水の量を１０〜９０体積％、好ましくは３０〜８０体積％、更に好ましくは３３〜７５体積％とすることができる。
また、有機溶媒を複数種組み合わせて用いる場合も、その組み合わせ比率は任意である。
【００３９】
［１−８．混合液滴の体積］
１個の質量分析用スポットを形成する混合液滴の体積としては、特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。
ターゲットプレート上にウェルが設けられている場合、混合液滴は、ウェル内に形成することができる。この場合、混合液滴は、当該ウェル内に収まる程度の体積をもって形成される。具体的には、１０ｎＬ〜１０μｌ程度、例えば０．５μｌ程度の液滴を形成することができる。
【００４０】
［１−９．ターゲットプレート］
ターゲットプレートとしては、特に限定されない。通常ＭＡＬＤＩ質量分析に使用されるステンレス鋼ターゲットプレートなどや、化学的或いは物理的に表面処理がなされたターゲットプレートなど、さまざまなものを使用することができる。表面処理がなされたものとしては、ターゲットプレート表面の表面粗さを所望の程度にする処理がなされたものが挙げられる。そのような表面処理としては、例えば、研磨処理や鏡面仕上げ処理が挙げられる。
【００４１】
［２．質量分析用スポット形成工程］
［２−１．質量分析用スポットの形成］
質量分析用スポットは、混合液滴から溶媒が除去されることによって得られる。溶媒の除去の方法としては、いかなる方法も許容され、操作性の観点からは自然蒸発を行うことが好ましい。溶媒の除去により、試料中のペプチドを特異的にイオン化することができるエリアと、試料中の糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリアとを有する質量分析用スポットを生じる。
【００４２】
これは、本発明で用いた２種の液体マトリックス、すなわちペプチドを特異的にイオン化する３ＡＱ/ＣＨＣＡと、糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化するＴＭＧ/ＣＡとが、複数種の異なる溶媒が除去されるに伴って、分離して局在化する（separated and localized）ためであると考えられる。
【００４３】
この観点から考えられる質量分析用スポット形成の過程のモデル例を、図２９に示す。図２９の例においては、３ＡＱ/ＣＨＣＡとＴＭＧ/ＣＡとを含む溶液、３ＡＱ/ＣＨＣＡ、及びＴＭＧ/ＣＡのみを模式的に示しており、試料については表示を省略している。図２９の例が示すように、ターゲットプレート上に調製された混合液滴（i）から溶媒が除去され、（ii）〜（iv）に示すように混合液滴の体積の縮小とともに無溶媒の液体マトリックスが現れる。
【００４４】
ここで比較のため、液体マトリックスとしてＴＭＧ/ＣＡを含み３ＡＱ/ＣＨＣＡを含まない溶液について、同様の質量分析用スポット形成の過程のモデル例を図３０に示す。図３０が示すように、ＴＭＧ/ＣＡは濃縮されない傾向にあるため、ターゲットプレート上に調製された混合液滴（i）から溶媒が除去され、（ii）〜（iii）に示すように、体積が縮小する混合液滴の周囲に無溶媒のＴＭＧ/ＣＡが現れてくる。その結果、（iv）に示すように、無溶媒のＴＭＧ/ＣＡがターゲットプレート上にリング状に残留する。
【００４５】
３ＡＱ/ＣＨＣＡとＴＭＧ/ＣＡとを含む溶液に関する図２９の例においても、混合液滴中に含まれる液体マトリックスのうちのＴＭＧ/ＣＡは濃縮されない傾向にあることから、図３０の例と同じ過程を経ることによって、無溶媒のＴＭＧ/ＣＡがリング状に現れる。一方、３ＡＱ/ＣＨＣＡについては濃縮される傾向にあるため、例えば図２９（iii）や（iv）に示すように、リング状に現れてくる無溶媒のＴＭＧ/ＣＡの内側に、無溶媒の３ＡＱ/ＣＨＣＡが現れる。
【００４６】
［２−２．質量分析用スポットの態様］
本発明の質量分析用スポットは、上記のように、おそらくペプチドを特異的にイオン化する３ＡＱ/ＣＨＣＡと、糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化するＴＭＧ/ＣＡとがそれぞれ局在しているために、試料中のペプチドを特異的にイオン化することができるエリアと、試料中の糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリアとを有する。それぞれのエリアの生じる場所は、ある程度決まった傾向が見られる。
【００４７】
すなわち、糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリアは、スポットの周辺により近いエリアに位置する傾向にある。すなわち、極めて極端な場合でいえば、糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリアは、凡そ、スポットの略直径とほぼ同じ略外径を有する中空のリング状の形状を形成しうる。当該リング状エリアの肉厚寸法は、試料の種類、有機溶媒の種類、３ＡＱ/ＣＨＣＡとＴＭＧ/ＣＡとの混合比、その他の要因により異なりうるため、特に限定されるものではない。例えば、糖ペプチドとペプチドとの混合比、又は糖とペプチドとの混合比が１：１（モル基準）、３ＡＱ/ＣＨＣＡとＴＭＧ/ＣＡとの混合比が、１：１（体積基準）である場合、当該肉厚寸法の一例としては、当該スポットの略半径の５〜３０％、好ましくは１０〜２０％となりうる。
【００４８】
糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリアは、主としてこのようなリング状のエリア内に位置することが好ましい。しかしながら、これに加えて、一部、当該エリアを逸脱して位置する場合もある。
【００４９】
一方、ペプチドを特異的にイオン化することができるエリアは、上記の糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリアとは異なるエリア、すなわち上記のエリアよりスポットの中心により近いエリアに位置する傾向がある。すなわち、極めて極端な場合でいえば、ペプチドを特異的にイオン化することができるエリアは、凡そ、上記のリング状のエリアの内側に位置する。
【００５０】
ペプチドを特異的にイオン化することができるエリアは、主として上記リング状エリアの内側の、よりスポットの中心近くに集中して位置することが好ましい。しかしながら、これに加えて、一部、当該エリアを逸脱して位置する場合もある。さらに、上記リング状エリアの内側に位置するものの、中心部を欠いた状態で（すなわち当該リング状エリアの内側に位置する、より小さい略外径を有するリング状エリアを形成して）位置する場合もある。
質量分析用スポットのこの態様は、室温下及び真空下でも維持される。
【００５１】
［３．質量分析工程］
質量分析工程においては、上記のようにして得られた質量分析用スポットにレーザーを照射し、このレーザー照射位置によって、異なるイオンを検出する。
【００５２】
すでに述べたように、レーザーを照射すべきスポットにおいて、ペプチドを特異的にイオン化する３ＡＱ/ＣＨＣＡと、糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化するＴＭＧ/ＣＡとが、溶媒の除去により分離して局在化していると考えられる。おそらくこのために、試料中のペプチドを特異的にイオン化することができるエリア（例えばスポットの中心部により近いエリア）と、試料中の糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリア（例えばスポットの周辺により近いエリア）とが生じるものと考えられる。
【００５３】
［３−１．サプレッション効果の抑制、イオンの高感度検出、及びイオンの選択的検出］
本発明では、スポット上の特定のエリア（例えばスポットの中心部により近いエリア）においては、糖ペプチド又は糖によるイオン化抑制効果を低減させることができ、その結果、ペプチドを効率的にイオン化することができる。その一方、スポット上の前記特定のエリアと異なるエリア（例えばスポットの周辺により近いエリア）においては、ペプチドによるイオン化抑制効果を低減させることができ、その結果、糖ペプチド又は糖を効率的にイオン化することができる。
従って、本発明の方法は、サプレッション効果による特定の分子種のイオン化阻害を防ぐことを可能にする。
【００５４】
また、２種の異なる分子種（すなわちペプチドと糖鎖又はペプチドと糖ペプチド）のイオンを生じさせることができる２種の異なる２つのエリアを、１つのスポット上に形成することができるため、それぞれの分子種を別々に検出することができる。さらに、それら分子種のイオン化においては、上述のように、サプレッション効果によるイオン化阻害を回避することができるため、それらの分子種の一方が、従来の方法ではイオン化効率が低いものであっても、高感度に検出することが可能になる。
従って、本発明の方法は、レーザーを照射すべきスポット１個からペプチドと糖鎖又は糖ペプチドとの両方を高感度に検出することを可能にする。
【００５５】
さらに、これらのことから、混合物中の分子種を分離検出する（detected separately）こと、すなわち混合物中の分子種をそれぞれ独立して検出することを高感度に行うことが可能であるため、本発明の方法は、ＭＳ測定の段階において、特定の分子種（すなわちペプチド、糖、又は糖ペプチド）の選択的なイオン化を可能にし、且つＭＳｎ測定による構造解析を容易にすることを可能にする。
【００５６】
［３−２．レーザー照射部位及び検出される分子種］
レーザーを照射すべきスポットは、上記２−２で述べたような態様を有する。以下において、質量分析スポットの好ましい態様、すなわち、試料中のペプチドを特異的にイオン化することができるエリアが、スポットの中心部により近いエリアに位置し、試料中の糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリアが、スポットの周辺により近いエリアに位置する態様を有する場合を想定して説明する。
【００５７】
当該スポットの特定の箇所、例えばスポットの中心部により近いエリア内のいずれかの箇所にレーザーを照射することによって、試料中に含まれるペプチド分子のイオンを優位に検出することができる。このエリアにおいては、試料に含まれる糖又は糖ペプチド分子は、イオン化効率が相対的に低いか、或いはイオンとして検出されない。
【００５８】
一方、前記と同じスポットの当該特定の箇所以外の箇所、例えばスポットのより周辺部に近いリング状エリア内のいずれかの箇所にレーザーを照射することによって、試料中に含まれる糖又は糖ペプチドのイオンを検出することができる。このエリアにおいては、試料に含まれるペプチド分子は、イオン化効率が相対的に低いか、或いはイオンとして検出されない。
【００５９】
［３−３．試料の解析］
以下においても、質量分析スポットの好ましい態様、すなわち、試料中のペプチドを特異的にイオン化することができるエリアが、スポットの中心部により近いエリアに位置し、試料中の糖ペプチド又は糖を特異的にイオン化することができるエリアが、スポットの周辺により近いエリアに位置する態様を有する場合を想定して説明する。
【００６０】
例えば、試料に、構造解析すべき分子としてペプチドと糖とが含まれる場合、ペプチドはスポットの中心部により近いエリアから検出され、糖はスポットの周辺により近いエリアから検出される。
試料がペプチドと糖とを含む場合、当該試料は糖タンパク質の糖鎖切り出し処理物などである場合があり、そのような場合、通常、糖タンパク質の構造解析を行うことを目的とする。スポットの中心部により近いエリアからペプチドのイオンを検出することによって、糖タンパク質のタンパク質部分の一次構造の特定を行うための情報を得ることができ、一方、スポットの周辺により近いエリアから糖のイオンを検出することによって、糖タンパク質の糖鎖部分の一次構造の特定を行うための情報を得ることができる。
【００６１】
また例えば、試料に、構造解析すべき分子としてペプチドと糖ペプチドとが含まれる場合、ペプチドはスポットの中心部により近いエリアから検出され、糖ペプチドはスポットの周辺により近いエリアから検出される。
なお、糖ペプチドは、糖−アミノ酸結合が維持された糖ペプチドイオンとして得られる。すなわち、本発明で用いる液体マトリックスＴＭＧ/ＣＡにより、糖ペプチドから、糖鎖とペプチドとの間の結合の開裂が起こることなくイオンを生じさせることができる。
【００６２】
試料がペプチドと糖ペプチドとを含む場合、当該試料は糖タンパク質のプロテアーゼ酵素消化物などである場合が多く、そのような場合、通常、糖タンパク質の構造解析を行うことを目的とする。糖タンパク質の構造解析においては、タンパク質部分の一次構造の特定、糖鎖部分の一次構造の特定、及び糖鎖結合部位の特定を行うことが必要である。
糖ペプチドイオンの検出は、糖タンパク質の構造解析を行うために必要な情報の１つである、糖鎖結合部位の特定を行うための情報を得るという点で重要である。また、糖タンパク質の構造解析を行うために必要なそれ以外の情報である、タンパク質部分の一次構造の特定を行うための情報、及び糖鎖部分の一次構造の特定を行うための情報も、当該糖ペプチドイオンから得ることができる。
【００６３】
一方、糖タンパク質に由来する、ペプチドイオンや、糖鎖部分のみのイオンからは、タンパク質部分の一次構造の特定を行うための情報、及び糖鎖部分の一次構造の特定を行うための情報を得ることができる。しかしながら、上記のような糖鎖結合部位の特定を行うための情報を得ることは、例えば糖鎖結合部位となるアミノ酸に化学的にタグを付加するなどのさらなる工程を行わない限り、不可能である。
【００６４】
糖タンパク質の構造解析においては、具体的には、例えば、糖ペプチドイオンをプリカーサイオンとして選択し、ＭＳｎ分析を行うことで、糖タンパク質の構造解析を行うことができる。
【００６５】
さらに具体的には、糖ペプチドとして、ペプチドに付加しやすいプラスチャージイオンが付加したイオンと、糖に付加しやすいプラスチャージイオンが付加したイオンとを検出し、それぞれをプリカーサイオンとして選択しＭＳｎ分析を行うことで、前者のイオンからはタンパク質部分の一次構造、糖鎖結合部位及び糖鎖の一次構造を、後者のイオンからは前者のイオンの場合とは異なる糖鎖の一次構造を特定することができる。さらにこの場合、ペプチドに付加しやすいプラスチャージイオンとしてはプロトンが挙げられ、糖鎖に付加しやすいプラスチャージイオンとしては金属イオンが挙げられる。それぞれのイオンをプリカーサイオンとしたＭＳｎ分析によって、それぞれに異なる構造情報が得られる。すなわち、多くの構造情報が得られる。このため、正確な構造解析が可能になる。
【実施例】
【００６６】
［実験例１：混合液体マトリックス３ＡＱ/ＣＨＣＡ＋ＴＭＧ/ＣＡを用いたＭＡＬＤＩ質量分析１］
１）混合液体マトリックス３ＡＱ/ＣＨＣＡ＋ＴＭＧ/ＣＡ溶液の調製
３ＡＱ/ＣＨＣＡは、Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996, 10, 923-926に記載のKumarらの手法により合成した。具体的には、３５ｍｇの３−アミノキノリン（３ＡＱ）に、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）の飽和メタノール溶液を１５０μｌ添加して混合し、３ＡＱ/ＣＨＣＡのメタノール溶液として調製した。さらに、得られた３ＡＱ/ＣＨＣＡのメタノール溶液を５０％（ｖ/ｖ）有機溶媒水溶液で１０倍（体積基準）稀釈することにより、３ＡＱ/ＣＨＣＡのメタノール−有機溶媒−水溶液を調製した。
【００６７】
ＴＭＧ/ＣＡは、Anal Chem. 2008, 80, 2171-2179 に記載のFukuyamaらの手法により合成した。具体的には、０．０５ｍｍｏｌ（８．２ｍｇ）のｐ−クマル酸（ＣＡ)をメタノール５００μｌに溶解し、得られた溶液に０．１５ｍｍｏｌ（１８．７５μｌ）の１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）を加えて、手動及び自動振動器で混合した。得られた混合溶液に対し、スピードバックを用いて２時間減圧乾燥を行った。さらに、真空下で一晩減圧乾燥を行った。得られたＴＭＧ/ＣＡを、９ｍｇ/０．１ｍｌの濃度となるようにメタノールに溶かし、さらにメタノールで１０倍（体積基準）稀釈することにより、ＴＭＧ/ＣＡのメタノール溶液を調製した。
【００６８】
３ＡＱ/ＣＨＣＡのメタノール−有機溶媒−水溶液とＴＭＧ/ＣＡのメタノール溶液とを１：１（ｖ/ｖ）の割合で混合し、混合液体マトリックス３ＡＱ/ＣＨＣＡ＋ＴＭＧ/ＣＡの溶液を得た。
【００６９】
実験例１で用いられた有機溶媒を以下に挙げる。
１−Ａ．アセトニトリル
１−Ｂ．酢酸エチル
１−Ｃ．メタノール
１−Ｄ．エタノール
１−Ｅ．ｎ−プロパノール
１−Ｆ．ｎ−ブタノール
１−Ｇ．ｎ−ペンタノール
１−Ｈ．ｎ−ヘキサノール
１−Ｉ．ｎ−ヘプタノール
１−Ｊ．ｎ−オクタノール
【００７０】
２）糖タンパク質消化物の調製
モデル糖タンパク質RibonucleaseB (RNaseB)をリジルエンドペプチダーゼ（Lys C）で消化することにより、糖タンパク質消化物の水溶液（1pmol/μｌ）を得た。
【００７１】
３）混合液体マトリックスによる糖タンパク消化物の測定
上記１）で得られた混合液体マトリックスの溶液と、上記２）で得られた糖タンパク質消化物の溶液とを、１：１（ｖ/ｖ）の割合で混合し、最終的に、糖タンパク質消化物と混合マトリックスとを、メタノール−有機溶媒−水混合溶媒中に含むサンプル溶液を調製した。このサンプル溶液１μｌをサンプルターゲット（Axima-QITミラープレート、島津製作所製）上に滴下した。蒸発により液滴の溶媒を除去した後、MALDI-QIT-TOF質量分析装置（島津製作所製）のポジティブモードで測定を行った。
【００７２】
測定は、溶媒除去後の液滴（質量分析用スポット）における１００箇所で行った。図１に、ウェル上に調製されたスポット及び１００箇所のレーザー照射位置（ａ〜ｊ）×（１〜１０）を示す。なお、ウェルの内径はφ２．８ｍｍである。
【００７３】
有機溶媒としてアセトニトリルを用いた場合（１−Ａ）について、図２（i）に、図１に示すｂ−４の位置における測定によって得られたスペクトルを示し、図２（ii）に、図１に示すｉ−６の位置における測定によって得られたスペクトルを示す。図２（i）のスペクトルにおいては、糖ペプチドイオンに相当する（ｍ/ｚ）１９３６のピークが検出され、その一方、図２（ii）のスペクトルにおいては、ペプチドイオンに相当する（ｍ/ｚ）２２２５のピークが検出された。
【００７４】
より詳細な結果として、図３（i）に、ウェル上のスポットにおける（ｍ/ｚ）１９３６の糖ペプチドイオンの分布を、測定された当該（ｍ/ｚ）１９３６のピークの強度によって色分けして示す。同様に、図３（ii）に、ウェル上のスポットにおける（ｍ/ｚ）２２２５のペプチドイオンの分布を、測定された当該（ｍ/ｚ）２２２５のピークの強度によって色分けして示す。以下、これらのような図３のような種類の図をヒートマップと呼称する。
【００７５】
さらに、図３（iii）に、１００箇所のレーザー照射箇所における（ｍ/ｚ）１９３６の糖ペプチドイオンの分布を三次元棒グラフで示す。同様に、図３（iv）に、１００箇所のレーザー照射箇所における（ｍ/ｚ）２２２５の糖ペプチドイオンの分布を三次元棒グラフで示す。図３（iii）及び（iv）においては、スポットが形成されたサンプルプレート平面をｘ−ｙ座標平面とし、当該ｘ−ｙ座標平面上の（ａ〜ｊ）×（１〜１０）の１００箇所のレーザー照射位置それぞれにおける検出ピークの強度をｚ軸として表す。
【００７６】
図３（i）及び（iii）が示すように、糖ペプチドが優先的にイオン化されるエリアと、図３（ii）及び（iv）が示すように、ペプチドが優先的にイオン化されるエリアとが、別々に出現したことがわかった。具体的には、スポットの周辺により近いエリアに糖ペプチドが優先的にイオン化されるエリア、それ以外のエリアにペプチドが優先的にイオン化されるエリアが生じたことがわかった。すなわち、糖ペプチドとペプチドとの混合物から、糖ペプチドとペプチドとを１つのスポット上で分離検出（detected separately）できたことが示された。
【００７７】
その他の有機溶媒を用いた場合、すなわち１−Ｂ〜１−Ｊの場合についても、同様に図４〜１２に示す。
以上の図２〜１２に示す結果より、実験例１の条件下においては、有機溶媒としてアセトニトリルを用いた場合（１−Ａ）、酢酸エチルを用いた場合（１−Ｂ）、メタノールを用いた場合（１−Ｃ）、及びエタノールを用いた場合（１−Ｄ）に、糖ペプチドが優先的にイオン化されるエリア（具体的には、スポットの周辺により近いエリア）と質量分析用スポットの周辺により近いエリアに糖ペプチドを優位に検出することができるエリア、それ以外のエリアにペプチドを優位に検出することができるエリアを生じさせることができた。これにより、糖ペプチドとペプチドとを１つのスポット上で分離検出できたことが示された。
【００７８】
［実験例２：混合液体マトリックス３ＡＱ/ＣＨＣＡ＋ＴＭＧ/ＣＡを用いたＭＡＬＤＩ質量分析２］
実験例１の１）において、３ＡＱ/ＣＨＣＡのメタノール溶液を５０％（ｖ/ｖ）有機溶媒水溶液で１０倍（体積基準）稀釈する代わりに、有機溶媒で１０倍（体積基準）稀釈し、且つ、ＴＭＧ/ＣＡを、９ｍｇ/０．１ｍｌの濃度となるようにメタノールに溶かしたものをさらにメタノールで１０倍（体積基準）稀釈する代わりに、水で１０倍（体積基準）稀釈したことを除いては、実験例１と同様の操作を行った。
【００７９】
実験例２で用いられた有機溶媒を以下に挙げる。
２−Ａ．アセトニトリル
２−Ｂ．酢酸エチル
２−Ｃ．メタノール
２−Ｄ．エタノール
２−Ｅ．ｎ−プロパノール
２−Ｆ．ｎ−ブタノール
２−Ｇ．ｎ−ペンタノール
２−Ｈ．ｎ−ヘキサノール
２−Ｉ．ｎ−ヘプタノール
２−Ｊ．ｎ−オクタノール
【００８０】
実験例１と同様に、得られた結果を図１３〜図２２に示す。
以上の図１３〜２２に示す結果より、実験例２の条件下においては、有機溶媒としてアセトニトリルを用いた場合（２−Ａ）、酢酸エチルを用いた場合（２−Ｂ）、メタノールを用いた場合（２−Ｃ）、及びエタノールを用いた場合（２−Ｄ）に、質量分析用スポットの周辺により近いエリアに糖ペプチドを優位に検出することができるエリア、それ以外のエリアにペプチドを優位に検出することができるエリアを生じさせることができた。これにより、糖ペプチドとペプチドとを１つのスポット上で分離検出できたことが示された。
【００８１】
［比較例１：単独個体マトリックスＤＨＢを用いたＭＡＬＤＩ質量分析］
実験例１の１）において、混合液体マトリックス３ＡＱ/ＣＨＣＡ＋ＴＭＧ/ＣＡの溶液を得る代わりに、固体マトリックスＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシベンゼン）を、５０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）−水混合溶媒（ｖ/ｖ/ｖ）に１０ｍｇ/ｍｌの濃度で含む溶液を得たことを除いては、実験例１と同様の操作を行った。
【００８２】
図２３に、図１に示すｉ−６の位置における測定によって得られたスペクトルを示す。図２３のスペクトルにおいては、ペプチドイオンに相当する（ｍ/ｚ）２２２５のピークが検出された。その他の位置においても、スポットの大部分を占めるエリアで図２３と同様のスペクトルが得られ、当該エリアの部分ではほとんどピークが検出されなかった（あるいは検出されても微量であった）。
【００８３】
より詳細な結果として、図２４（i）に、ウェル上のスポットにおける（ｍ/ｚ）１９３６の糖ペプチドイオンについてのヒートマップを示す。同様に、図２４（ii）に、ウェル上のスポットにおける（ｍ/ｚ）２２２５のペプチドイオンついてのヒートマップを示す。
【００８４】
さらに、図２４（iii）に、１００箇所のレーザー照射箇所における（ｍ/ｚ）１９３６の糖ペプチドイオンの分布を三次元棒グラフで示す。同様に、図２４（iv）に、１００箇所のレーザー照射箇所における（ｍ/ｚ）２２２５の糖ペプチドイオンの分布を三次元棒グラフで示す。
【００８５】
図２４（i）及び（iii）が示すように、糖ペプチドはほとんど検出されておらず（あるいは検出されても微量であり）、図２４（ii）及び（iv）が示すように、主としてペプチドが検出されたことがわかった。
【００８６】
以上の結果より、比較例１の方法では、糖ペプチドとペプチドとの混合物から、主としてペプチドのみが検出されたため、糖ペプチドとペプチドとをスポット上で分離検出できなかったことが示された。
【００８７】
［比較例２：単独液体マトリックス３ＡＱ/ＣＨＣＡを用いたＭＡＬＤＩ質量分析］
実験例１の１）において、混合液体マトリックス３ＡＱ/ＣＨＣＡ＋ＴＭＧ/ＣＡの溶液を得る代わりに、３ＡＱ/ＣＨＣＡの溶液を得たことを除いては、実験例１と同様の操作を行った。
【００８８】
３ＡＱ/ＣＨＣＡの溶液は、以下のようにして調製した。
３ＡＱ/ＣＨＣＡは、実験例１で合成されたものと同じものと用いた。すなわち、３５ｍｇの３−アミノキノリン（３ＡＱ）に、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）の飽和メタノール溶液を１５０μｌ添加して混合し、３ＡＱ/ＣＨＣＡのメタノール溶液として調製した。
さらに、得られた３ＡＱ/ＣＨＣＡのメタノール溶液を、５０％アセトニトリル水溶液（ｖ/ｖ）で１/１０（ｖ/ｖ）の濃度に稀釈し、３ＡＱ/ＣＨＣＡをメタノール−アセトニトリル−水混合溶媒中に含む溶液を得た。
【００８９】
図２５に、図１に示すｂ−４の位置における測定によって得られたスペクトルを示す。図２５のスペクトルにおいては、糖ペプチドイオンに相当する（ｍ/ｚ）１９３６のピークと、ペプチドイオンに相当する（ｍ/ｚ）２２５５のピークとが検出された。その他の位置においても、図２５と同様のスペクトルが得られた。
【００９０】
より詳細な結果として、図２６（i）に、ウェル上のスポットにおける（ｍ/ｚ）１９３６の糖ペプチドイオンについてのヒートマップを示す。同様に、図２６（ii）に、ウェル上のスポットにおける（ｍ/ｚ）２２２５のペプチドイオンについてのヒートマップを示す。
【００９１】
さらに、図２６（iii）に、１００箇所のレーザー照射箇所における（ｍ/ｚ）１９３６の糖ペプチドイオンの分布を三次元棒グラフで示す。同様に、図２６（iv）に、１００箇所のレーザー照射箇所における（ｍ/ｚ）２２２５の糖ペプチドイオンの分布を三次元棒グラフで示す。
【００９２】
図２６（i）〜（iv）が示すように、糖ペプチドとペプチドとの両方が同じ位置から検出されていることがわかった。
以上の結果より、比較例２の方法では、糖ペプチドとペプチドとの混合物から、両方の分子が同時に検出されたため、糖ペプチドとペプチドとをスポット上で分離検出できなかったことが示された。
【００９３】
［比較例３：単独液体マトリックスＴＭＧ/ＣＡを用いたＭＡＬＤＩ質量分析］
実験例１の１）において、混合液体マトリックス３ＡＱ/ＣＨＣＡ＋ＴＭＧ/ＣＡの溶液を得る代わりに、ＴＭＧ/ＣＡの溶液を得たことを除いては、実験例１と同様の操作を行った。
【００９４】
ＴＭＧ/ＣＡの溶液は、以下のようにして調製した。
ＴＭＧ/ＣＡは、実施例１で合成されたものと同じものと用いた。すなわち、０．０５ｍｍｏｌ（８．２ｍｇ）のｐ−クマル酸（ＣＡ)をメタノール５００μｌに溶解し、得られた溶液に０．１５ｍｍｏｌ（１８．７５μｌ）の１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）を加えて、手動及び自動振動器で混合した。得られた混合溶液に対し、スピードバックを用いて２時間減圧乾燥を行った。さらに、真空下で一晩減圧乾燥を行った。得られたＴＭＧ/ＣＡを、９ｍｇ／０．１ｍｌの濃度となるようにメタノールに溶かし、さらにメタノールで１/１０（ｖ/ｖ）の濃度に稀釈することにより、ＴＭＧ/ＣＡのメタノール溶液を調製した。
さらに、得られたＴＭＧ/ＣＡのメタノール溶液を、５０％アセトニトリル水溶液（ｖ/ｖ）で１/１０（ｖ/ｖ）の濃度に稀釈し、ＴＭＧ/ＣＡをメタノール−アセトニトリル−水混合溶媒中に含む溶液を得た。
【００９５】
図２７に、図１に示すｂ−４の位置における測定によって得られたスペクトルを示す。図２７のスペクトルにおいては、糖ペプチドイオンに相当する（ｍ/ｚ）１９３６のピークが検出された。その他の位置においても、スポットの特定のエリアで図２７と同様のスペクトルが得られ、当該エリア以外の部分ではほとんど全くピークが検出されなかった。
【００９６】
より詳細な結果として、図２８（i）に、ウェル上のスポットにおける（ｍ/ｚ）１９３６の糖ペプチドイオンについてのヒートマップを示す。同様に、図２８（ii）に、ウェル上のスポットにおける（ｍ/ｚ）２２２５のペプチドイオンについてのヒートマップを示す。
【００９７】
さらに、図２８（iii）に、１００箇所のレーザー照射箇所における（ｍ/ｚ）１９３６の糖ペプチドイオンの分布を三次元棒グラフで示す。同様に、図２８（iv）に、１００箇所のレーザー照射箇所における（ｍ/ｚ）２２２５の糖ペプチドイオンの分布を三次元棒グラフで示す。
【００９８】
図２８（ii）及び図２８（iv）が示すようにペプチドはほとんどまったく検出されておらず、  図２８（i）及び図２８（iii）が示すように、糖ペプチドが特異的に検出されたことがわかった。なお、糖ペプチドが検出された場所が特徴的なリング状を形成していることから、本比較例３において質量分析用スポットは、図３０に模式的に示すような過程を経て形成されたものと考えられる。
以上の結果より、比較例３の方法では、糖ペプチドとペプチドとの混合物から、糖ペプチドが特異的に検出されたため、糖ペプチドとペプチドとをスポット上で分離検出できないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ウェル上に調製されたスポット及び１００箇所のレーザー照射位置（ａ〜ｊ）×（１〜１０）を示す。
【図２】実験例１の１−Ａにおいて、図１に示すｂ−４の位置における測定によって得られたスペクトル（i）、及び図１に示すｉ−６の位置における測定によって得られたスペクトル（ii）を示す。
【図３】実験例１の１−Ａにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図４】実験例１の１−Ｂにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図５】実験例１の１−Ｃにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図６】実験例１の１−Ｄにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図７】実験例１の１−Ｅにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図８】実験例１の１−Ｆにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図９】実験例１の１−Ｇにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１０】実験例１の１−Ｈにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１１】実験例１の１−Ｉにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１２】実験例１の１−Ｊにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１３】実験例２の２−Ａにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１４】実験例２の２−Ｂにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１５】実験例２の２−Ｃにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１６】実験例２の２−Ｄにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１７】実験例２の２−Ｅにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１８】実験例２の２−Ｆにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図１９】実験例２の２−Ｇにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図２０】実験例２の２−Ｈにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図２１】実験例２の２−Ｉにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図２２】実験例２の２−Ｊにおいて、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図２３】比較例１において、図１に示すｉ−６の位置における測定によって得られたスペクトルを示す。
【図２４】比較例１において、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図２５】比較例２において、図１に示すｂ−４の位置における測定によって得られたスペクトルを示す。
【図２６】比較例２において、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図２７】比較例３において、図１に示すｂ−４の位置における測定によって得られたスペクトルを示す。
【図２８】比較例３において、糖ペプチドイオンについてのヒートマップ（i）、ペプチドイオンについてのヒートマップ（ii）、糖ペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフ（iii）、及びペプチドイオンの分布についての三次元棒グラフを示す。
【図２９】３ＡＱ/ＣＨＣＡとＴＭＧ/ＣＡとを含む混合液滴から質量分析用スポットが形成される過程を示したモデル例である。
【図３０】ＴＭＧ/ＣＡを含む混合液滴から質量分析用スポットが形成される過程を示したモデル例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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