(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液から、有機溶媒に対する光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸の溶解度の差を利用する方法によって光学活性アミノ酸アミドを分離回収する方法において、
前記水溶液に含まれる陰イオンの当量数の総和（Ａ）に対する陽イオンの当量数の総和（Ｃ）の比率（Ｃ／Ａ）が下記数式（１）の範囲となる条件下で、前記有機溶媒と共沸蒸留することによって有機溶媒溶液に置換するか、または脱水濃縮した後に前記有機溶媒を加えることによって有機溶媒溶液に置換した後、得られた光学活性アミノ酸アミドを含む有機溶媒相と析出した光学活性アミノ酸を含む固形物相を固液分離することを特徴とする、光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
1−0.05Ｘ≦Ｃ／Ａ≦1＋0.05Ｘ （１）
（上記数式（１）において、前記水溶液が脱塩処理されていない場合、Ｘ＝１であり、前記水溶液が脱塩処理されている場合、Ｘ＝１０である。また、ＡとＣには、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸、水素イオンと水酸化物イオン、及び共沸蒸留又は脱水濃縮する際に留去されるイオン物質に基づく陰イオンと陽イオンの当量数は含ませない。）
【請求項２】
前記水溶液が脱塩処理されている場合、該水溶液に含まれる陰イオンの当量数の総和（Ａ）に対する陽イオンの当量数の総和（Ｃ）の比率（Ｃ／Ａ）が下記数式（１´）の範囲となる条件下で、有機溶媒溶液に置換することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
1−0.05Ｘ≦Ｃ／Ａ≦1＋0.05Ｘ （１´）
（上記数式（１´）において、Ｘ＝Ｂ／Ａで表される１０以下の数値であり、かつ、Ｂ／Ａ＞１であり、Ｂは前記水溶液中に含まれる光学活性アミノ酸アミドの当量数である。）
【請求項３】
前記水溶液は、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液をイオン交換膜で電気透析して脱塩したものである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
【請求項４】
前記水溶液は、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液にアンモニアを加えてイオン交換膜で電気透析して脱塩したものである、請求項３に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
【請求項５】
加えるアンモニア量が前記水溶液中に含まれる光学活性アミノ酸アミド量の０．０１〜１００倍モルである、請求項４に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
【請求項６】
光学活性アミノ酸アミドが下記一般式（１）で示されるＬ−アミノ酸アミドである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
【化１】
0005092743.tif 000006
（但し、一般式（１）の中のＲは、炭素数１〜４の低級アルキル基、フェニル基、又はベンジル基を示す。）
【請求項７】
光学活性アミノ酸が下記一般式（２）で示されるＤ−アミノ酸である、請求項１に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
【化２】
0005092743.tif 000007
（但し、一般式（２）の中のＲは、炭素数１〜４の低級アルキル基、フェニル基、又はベンジル基を示す。）
【請求項８】
前記一般式（１）で示されるＬ−アミノ酸アミドがＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドである、請求項６に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
【請求項９】
前記一般式（２）で示されるＤ−アミノ酸がＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸である、請求項７に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
【請求項１０】
有機溶媒がイソブチルアルコール、ｎ−ヘプチルアルコールおよび２−エチル−１−ヘキサノールからなる群より選ばれた一種以上である、請求項１に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
【請求項１１】
共沸蒸留又は脱水濃縮する際に留去されるイオン物質がアンモニアである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液から、光学活性アミノ酸アミドを効率良く分離回収する方法に関する。詳しくは、例えば、原料のラセミ体のアミノ酸アミドを含む水溶液に、そのうちの一方の光学活性体のアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素を作用させた後、該水溶液を所望により脱塩し、得られた光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液から、有機溶媒に対する光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸の溶解度の差を利用した方法によって、化学純度及び光学純度がともに優れた光学活性アミノ酸アミドを高収率かつ簡便に分離回収する方法に関する。光学活性アミノ酸アミドは、各種工業薬品、農薬、及び医薬品の製造中間体として大変重要な物質である。
【背景技術】
【０００２】
従来の光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法としては、例えば、ラセミ体のアミノ酸アミドを酵素的に不斉加水分解して光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液となした後、得られた酵素反応終了液又はこの濃縮物に、光学活性アミノ酸アミドに対して富溶媒となりかつ光学活性アミノ酸に対して貧溶媒となる有機溶媒を加えて光学活性アミノ酸を析出させ、有機溶媒相に含まれる光学活性アミノ酸アミドと分離する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
しかしながら、この方法は、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸の他に、原料のアミノ酸アミド或いは触媒として使用した微生物菌体や酵素を含む水溶液に由来する酸、塩基、塩を含む水溶液を対象とした場合、得られた酵素反応終了液又はこの濃縮物に光学活性アミノ酸アミドに対して富溶媒かつ光学活性アミノ酸に対して貧溶媒となる有機溶媒を加えても、可溶であるべき光学活性アミノ酸アミドと不溶であるべき光学活性アミノ酸の荷電状態が適正でないため、有機溶媒相に含まれる光学活性アミノ酸アミド量の減少や光学活性アミノ酸の混入が起こり、光学活性アミノ酸アミドの収率や化学純度が低下してしまう問題点を有していた。【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１１０３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、従来技術における上記のような課題を解決し、例えばラセミ体からなるアミノ酸アミドの水溶液に、Ｄ，Ｌ何れか一方の光学活性アミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する微生物の菌体又は酵素等の生体触媒で処理した水溶液から、高純度の光学活性アミノ酸アミドを高収率かつ簡便に分離回収できる方法を確立し提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、有機溶媒相に移行する遊離体の光学活性アミノ酸アミド量が最も多くなるように、水溶液のｐＨを光学活性アミノ酸アミドの酸塩基解離平衡定数から予測される等電点ｐＨに調整した後、それより得られる濃縮物に光学活性アミノ酸アミドに対して富溶媒となり光学活性アミノ酸に対して貧溶媒となる有機溶媒を加えて、光学活性アミノ酸アミドを取得する試みを行った。しかしながら、等電点ｐＨに調整するだけでは、原料アミノ酸アミドの不斉加水分解によって生じたアンモニアやアルキルアミン類等の揮発性のイオン物質が系外に留去されるため、有機溶媒相への光学活性アミノ酸アミドの移行が不十分となり、得られる光学活性アミノ酸アミドの収率が大幅に低下し、課題の解決には至らないことが判明した。【０００７】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するべくさらに鋭意検討を重ねた結果、微生物の菌体又は酵素等の生体触媒で処理した水溶液に含まれているイオン濃度分析を行った後、その中に含まれる陰イオンの当量数の総和（Ａ）に対する陽イオンの当量数の総和（Ｃ）の比率（Ｃ／Ａ）が特定の範囲になるように、必要に応じ不足したイオンのカウンターイオンを加え、これを共沸蒸留又は脱水濃縮することによって脱水し、光学活性アミノ酸アミドは溶解するが光学活性アミノ酸や無機塩類は溶解しない有機溶媒溶液へと置換した後、得られた光学活性アミノ酸アミドを含む有機溶媒相と析出した光学活性アミノ酸を含む固形物相とを分離することによって、光学活性アミノ酸や夾雑塩類の混入量が極めて少ない高純度の光学活性アミノ酸アミドを高収率かつ簡便に取得できるようになることを見出した。【０００８】
また、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸以外に、酸、塩基、塩が酵素等で処理した水溶液に存在すると、酸、又は塩基の影響によって有機溶媒に対する光学活性アミノ酸アミドの溶解性が低下したり、光学活性アミノ酸の溶解性が増したりする他、固形物として析出した塩に付着する光学活性アミノ酸アミド量が増加するため、得られる光学活性アミノ酸アミドの純度及び収率が低下してしまうことが明らかとなった。【０００９】
そこで、本発明者らは、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸が良好に分離し、しかも固形物として得られる光学活性アミノ酸への塩類混入量が低減できる製造方法を確立すべく鋭意検討を重ねた。その結果、微生物の菌体又は酵素等の生体触媒で処理した水溶液を必要に応じ中和した後、アンモニア添加下にイオン交換膜による電気透析を行うことによって脱塩し、さらに得られた水溶液に含まれているイオン濃度分析を行った後、その中に含まれる陰イオンの当量数の総和（Ａ）に対する陽イオンの当量数の総和（Ｃ）の比率（Ｃ／Ａ）が特定の範囲になるように、必要に応じ不足したイオンのカウンターイオンを加え、これを共沸蒸留又は脱水濃縮することによって脱水し、光学活性アミノ酸アミドは溶解するが光学活性アミノ酸は溶解しない有機溶媒へと置換した後、得られた光学活性アミノ酸アミドを含む有機溶媒相と析出した光学活性アミノ酸からなる固形物相とを分離することによって、光学活性アミノ酸アミドを高純度かつ高収率に取得できるようになることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
即ち、本発明の方法は、
光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液から、有機溶媒に対する光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸の溶解度の差を利用する方法によって光学活性アミノ酸アミドを分離回収する方法において、
前記水溶液に含まれる陰イオンの当量数の総和（Ａ）に対する陽イオンの当量数の総和（Ｃ）の比率（Ｃ／Ａ）が下記数式（１）の範囲となる条件下で、前記有機溶媒と共沸蒸留することによって有機溶媒溶液に置換するか、または脱水濃縮した後に前記有機溶媒を加えることによって有機溶媒溶液に置換した後、得られた光学活性アミノ酸アミドを含む有機溶媒相と析出した光学活性アミノ酸を含む固形物相を固液分離することを特徴とする、光学活性アミノ酸アミドの分離回収方法を提供する。
1−0.05Ｘ≦Ｃ／Ａ≦1＋0.05Ｘ          （１）
（上記数式（１）において、前記水溶液が脱塩処理されていない場合、Ｘ＝１であり、前記水溶液が脱塩処理されている場合、Ｘ＝１０である。また、ＡとＣには、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸、水素イオンと水酸化物イオン、及び共沸蒸留又は脱水濃縮する際に留去されるイオン物質に基づく陰イオンと陽イオンの当量数は含ませない。）【００１１】
前記水溶液が脱塩処理されている本発明の態様において、該水溶液に含まれる陰イオンの当量数の総和（Ａ）に対する陽イオンの当量数の総和（Ｃ）の比率（Ｃ／Ａ）が下記数式（１´）の範囲となる条件下で、有機溶媒溶液に置換することが好ましい。
1−0.05Ｘ≦Ｃ／Ａ≦1＋0.05Ｘ          （１´）
（上記数式（１´）において、Ｘ＝Ｂ／Ａで表される１０以下の数値であり、かつ、Ｂ／Ａ＞１であり、Ｂは前記水溶液中に含まれる光学活性アミノ酸アミドの当量数である。）【００１２】
前記水溶液が脱塩処理されている本発明の態様において、前記水溶液は、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液をイオン交換膜で電気透析して脱塩したものであることが好ましい。また、前記水溶液は、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液にアンモニアを加えてイオン交換膜で電気透析して脱塩したものであることがより好ましい。ここで、加えるアンモニア量は前記水溶液中に含まれる光学活性アミノ酸アミド量の０．０１〜１００倍モルであることが好ましい。【００１３】
本発明は、光学活性アミノ酸アミドが下記一般式（１）で示されるＬ−アミノ酸アミドである場合に好適である。
【化３】
0005092743.tif 000002
（但し、一般式（１）の中のＲは、炭素数１〜４の低級アルキル基、フェニル基、又はベンジル基を示す。）
また、本発明は、光学活性アミノ酸が下記一般式（２）で示されるＤ−アミノ酸である場合に好適である。
【化４】
0005092743.tif 000003
（但し、一般式（２）の中のＲは、炭素数１〜４の低級アルキル基、フェニル基、又はベンジル基を示す。）【００１４】
上記一般式（１）で示されるＬ−アミノ酸アミドとしては、代表的には、Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドが挙げられ、上記一般式（２）で示されるＤ−アミノ酸としては、代表的には、Ｄ−２−アミノ−ｎ−酪酸が挙げられる。【００１５】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記有機溶媒として、イソブチルアルコール、ｎ−ヘプチルアルコールおよび２−エチル−１−ヘキサノールからなる群より選ばれた一種以上が用いられる。
また、本発明の他の好ましい実施形態によれば、共沸蒸留又は脱水濃縮する際に留去されるイオン物質はアンモニア又はアルキルアミン類である。
【発明の効果】
【００１６】
光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液を、そのまま、または、必要に応じ中和し脱塩した後、該水溶液中の陰イオン及び陽イオンの濃度分析を行い、水溶液に含まれる陰イオンに対する陽イオンの濃度比率が特定範囲となる条件下で水を留去することにより、溶媒を水から光学活性アミノ酸アミドに対して富溶媒かつ光学活性アミノ酸に対して貧溶媒となる有機溶媒に置換した後、光学活性アミノ酸アミドを含む有機溶媒と光学活性アミノ酸を含むスラリー状の沈殿物を濾過等の方法によって固液分離し、さらに得られた有機溶媒相を濃縮するとともに固形物相を乾燥することによって、高純度の光学活性アミノ酸アミドを高い収率で得ることが可能になる。【００１７】
本発明において、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液を、脱塩せずにそのまま使用する態様では、酵素等の生体触媒を用いて処理した酸、塩基、塩等の夾雑物を含む水溶液から、これらの不純物をあらかじめ除去することなく高純度の光学活性アミノ酸アミドを分離回収することが可能となり、工程が簡略化できるという工業上のメリットが得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施態様を詳しく説明する。本発明で使用する光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸の種類に特に制限はなく、天然型又は非天然型の何れの光学活性アミノ酸アミド及び光学活性アミノ酸でもよい。例えば２−アミノ−ｎ−酪酸アミドと２−アミノ−ｎ−酪酸、ｔ−ロイシンアミドとｔ−ロイシン、バリンアミドとバリンなどが挙げられるが、これらの例以外の光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸、或いはアミノ酸部分の構造が異なる光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸からなるものであってよい。【００１９】
光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液は、例えば、ラセミ体のアミノ酸アミドの水溶液を、Ｄ，Ｌ何れかのアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する微生物の菌体又は該菌体処理物から得られる酵素等の生体触媒を作用させることによって得られる。微生物としては特に制限がなく、例えば、ロドコッカス属、シュードモナス属、オクトバクトラム属及びセラチア属等に属する微生物、具体的にはロドコッカス  エリスロポリス  ＮＲ２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−８９３８）、シュードモナス  フローレッセンス  ＩＦＯ１２０５５、オクロバクトラム  アンスロピ  ＡＴＣＣ４９２３７、セラチア  マルセッセンス  ＩＡＭ１２１４３等が挙げられる。また、これら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、又は細胞融合若しくは遺伝子組み替え等の遺伝学的手法により誘導される組換え株等の何れの株であってもよく、アミノ酸アミドのアミド結合を不斉加水分解する能力を有するものであれば使用可能である。また、これら微生物は、菌体又は菌体の処理物、例えば乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物、粗若しくは精製酵素、又はこれらの担体固定物として使用される。【００２０】
酵素等の生体触媒反応を利用した上記光学分割法は、例えば、原料基質としてラセミ体のアミノ酸アミドを溶解させた水溶液に、上記菌体又は菌体処理物を接触させることによって行われる。通常、基質となるアミノ酸アミドの濃度は０．０１ｗｔ％〜飽和濃度、好ましくは１〜２５ｗｔ％とするのが操作性や生産効率の面で好ましい。触媒として使用する菌体又は菌体処理物の濃度はその比活性または活性量によっても異なるが、通常は原料のアミノ酸アミド重量に対し１／１０００〜１／１０倍量とするのが好ましく、１／５００〜１／２０倍量とするのがより好ましい。反応液のpHは４〜１１が好ましく、６〜１０とするのがより好ましい。反応温度は１０〜６０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。反応は、例えばラセミ体のアミノ酸アミド中に含まれるＤ、Ｌ何れかの光学活性アミノ酸アミドが対応する光学活性アミノ酸に変換されるまで行えばよい。反応終了後、反応液からの菌体又は菌体処理物を遠心分離、濾過などの公知の方法を用いて除去することにより、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含む水溶液が得られる。【００２１】
この水溶液を脱塩する場合、脱塩する方法に特に制限はないが、例えば、イオン交換膜による電気透析で行うと効率良く脱塩が行われる。また、脱塩透析を電気透析で行う場合、脱塩する前の光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含んだ水溶液を必要に応じ中和した後、光学活性アミノ酸アミド量の０．０１〜１００倍モル、好ましくは３〜１０倍モルのアンモニアを加えてから電気透析を行うと、光学活性アミノ酸アミドのロスを抑えることができる。
また、脱塩後の脱塩率は、脱塩後の水溶液の電気伝導度（Ｃ１）と脱塩前の初期電気伝導度（Ｃ２）及び完全に脱塩が進行し平衡に達したときの電気伝導度（Ｃ３）より数式（２）を用いて近似的に求めることができる。【００２２】
Y＝｛（Ｃ２−Ｃ１）／（Ｃ２−Ｃ３）｝×１００          （２）
（但し、脱塩率（Y）は、脱塩前の水溶液中に存在する塩分を構成するイオン種の総モル数に対する、脱塩後に除去された塩分を構成するイオン種の総モル数の割合と定義する。）
脱塩は塩を構成するイオン種が完全に除去されるまで行う必要はないが、脱塩率が５０〜９０％の範囲以内で行うことが好ましい。脱塩率を５０％未満とした場合、イオン比率調整に使用する酸及び塩基の量が増加し生成塩が多くなる。一方、９０％を超えるまで脱塩率を高めると、イオン比率調整に使用する酸及び塩基の量は減少するが、脱塩に長時間を要し透析膜の使用効率が低下するため運転コストが上昇する。また、脱塩透析後の光学活性アミノ酸アミドの捕集率が低下する原因ともなる。
つまり、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸以外に酸、塩基、塩を含む酵素処理した水溶液を対象とする場合、イオン交換膜を使用した電気透析による脱塩と、水溶液に含まれるイオン濃度比率の調整を組み合わせて行うことにより、電気透析による脱塩が非常に速やかに進行し、かつ光学活性アミノ酸アミドの捕集率が低下しない、比較的早い段階で脱塩操作を終了することが可能となる。一方、脱塩処理を併用することにより、イオン濃度比率の選択幅が比較的広い状態で比率調整を行うことができるという相乗効果が得られることになる。【００２３】
このようにして得られた光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸を含み、脱塩されないかまたは脱塩された水溶液中の陰イオン及び陽イオンの濃度をイオンクロマトグラフィーやＩＣＰ発光分析等のイオン濃度分析法を用いて測定する。次に、その中に含まれる陰イオンの当量数の総和（Ａ）に対する陽イオンの当量数の総和（Ｃ）の比率（Ｃ／Ａ）を、上記数式（１）の範囲となるように、必要に応じてカウンターのイオン物質を加え両イオン量の比率を調整する。
すなわち、前記水溶液が脱塩処理されていない場合、上記数式（１）においてＸ＝１であり、上記比率（Ｃ／Ａ）が０．９５≦Ｃ／Ａ≦１．０５の範囲、より好ましくは０．９７５≦Ｃ／Ａ≦１．０２５の範囲となるように調整する。Ｃ／Ａが０．９５を下回る場合には、光学活性アミノ酸アミドが陰イオンと塩を形成する割合が増加するため、有機溶媒に対する光学活性アミノ酸アミドの溶解性が減少し、光学活性アミノ酸アミドの収率が著しく低下する。一方、Ｃ／Ａが１．０５を上回る場合には、有機溶媒に対する光学活性アミノ酸アミドの溶解性は減少しないが、光学活性アミノ酸が陽イオンと塩を形成する割合が増加するため、有機溶媒に対する光学アミノ酸の溶解性が増すので、光学活性アミノ酸を多く含む純度の低い光学活性アミノ酸アミドしか得られないことになる。
また、前記水溶液が脱塩処理されている場合、上記数式（１）においてＸ＝１０であり、上記比率（Ｃ／Ａ）は０．５≦Ｃ／Ａ≦１．５の範囲となるように調整するが、好ましくは、脱塩の程度に応じて下記数式（１´）に従う範囲となるように調整する。
1−0.05Ｘ≦Ｃ／Ａ≦1＋0.05Ｘ          （１´）
（上記数式（１´）において、Ｘ＝Ｂ／Ａで表される１０以下の数値であり、かつ、Ｂ／Ａ＞１であり、Ｂは前記水溶液中に含まれる光学活性アミノ酸アミドの当量数である。）
脱塩率が５０％であるとき（またはＢ／Ａ＝２であるとき）は、上記比率（Ｃ／Ａ）は０．９≦Ｃ／Ａ≦１．１の範囲に調整することが好ましく、脱塩率が９０％であるとき（またはＢ／Ａ＝１０であるとき）は、０．５≦Ｃ／Ａ≦１．５の範囲に調整することが好ましい。
このように、脱塩率が５０％であるときにはＣ／Ａが０．９を下回らないように、また、脱塩率が９０％であるときにはＣ／Ａが０．５を下回ないようにすることが好ましい。このようにすることによって、有機溶媒に対する光学活性アミノ酸アミドの溶解度の低下を抑えることができる。さらに、脱塩率が５０％であるときにはＣ／Ａが１．１を上回らないように、また、脱塩率が９０％であるときにＣ／Ａが１．５を上回らないようにすることが好ましい。この場合は、有機溶媒に対する光学活性アミノ酸アミドの溶解性には影響しないが、形成される光学活性アミノ酸の陽イオン塩が減るので、有機溶媒に対する光学活性アミノ酸の混入が抑えられることになる。他の脱塩率の場合でも、上記式（１´）の上限及び下限のそれぞれは、上記と同様の意義を有する。【００２４】
なお、イオンの当量数の総和に加算するイオン物質は、水溶液から有機溶媒溶液へと置換した後も系内に残存する不揮発性のイオン物質であり、例えば濃縮操作中に遊離して留去されてしまう揮発性のイオン物質は除外する。例えば、水溶液に含まれる光学活性アミノ酸アミドやイオン濃度の比率調整のために使用される塩基よりも塩基性が低いアンモニアやアルキルアミン類は系外に留去されるため、陽イオンの加算対象には入れない。
また、反応液内に存在する水などに由来する水素イオンと水酸化物イオンもイオン種としては除外する。さらに、光学活性アミノ酸アミドと光学活性アミノ酸そのものも、中性荷電の遊離した状態とすることが目的であるので、加算するイオン物質には加えない。【００２５】
イオンの濃度比Ｃ／Ａを調整するために使用するカウンターのイオン物質としては、例えば、陰イオンが不足している場合にはＨＣｌ、ＨＮＯ３、Ｈ２ＳＯ４等の鉱酸やＨ３ＰＯ４等の酸を、陽イオンが不足している場合にはＫＯＨ、ＮａＯＨ等のアルカリ金属の水酸化物を添加することによってイオンの濃度比Ｃ／Ａを調整すればよい。なお、イオン濃度比の調整は、光学活性アミノ酸アミドに対して富溶媒かつ光学活性アミノ酸に対して貧溶媒となる有機溶媒へ置換する前段、或いは途中の何れの段階で行ってもよい。【００２６】
次に光学活性アミノ酸アミドを溶解し光学活性アミノ酸を溶解し難い、光学活性アミノ酸アミドに対し富溶媒かつ光学活性アミノ酸に対し貧溶媒となる有機溶媒を用いて有機溶媒溶液へと置換する。光学活性アミノ酸アミドに対し富溶媒かつ光学活性アミノ酸に対し貧溶媒となる有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノール、ｎ−ヘプタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、２−エチル−１−ヘキサノールなどが挙げられる。【００２７】
水溶液から有機溶媒溶液への置換は、水溶液を常圧下若しくは光学活性アミノ酸アミドの温度安定性を考慮した減圧下における濃縮や乾燥の操作を行うことにより水を取り除き、光学活性アミノ酸アミドに対し富溶媒かつ光学活性アミノ酸に対し貧溶媒となる有機溶媒を添加する方法などを用いて行えばよい。
さらに、光学活性アミノ酸アミドに対し富溶媒かつ光学活性アミノ酸に対し貧溶媒となる有機溶媒が水と共沸する性質を併せ持つ溶媒であることが好ましい。例えば、上記溶媒中のエタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノール、ｎ−ヘプタノール、イソブチルアルコール、２−エチル−１−ヘキサノール等が挙げられ、特にイソブチルアルコール、ｎ−ヘプチルアルコール、２−エチル−1−ヘキサノールがより好ましい有機溶媒として挙げることができる。なお、エタノールから２−エチル−１−ヘキサノールまでのそれぞれの常圧下における有機溶媒の水との共沸温度は７８℃、８８℃、９３℃、９６℃、９８℃、９９℃、９０℃、９９℃である。【００２８】
共沸蒸留を行う際の有機溶媒の供給方法としては、あらかじめ必要量の溶媒を仕込んで置く方法や、蒸留を実施しながら溶媒を添加していく方法が挙げられる。なお、後者の方法では、常に新鮮溶媒を供給するワンパス蒸留の形で行ってもよいし、蒸留トラップした水と有機溶媒からなる回収液から、デカンターを用いて水を除いた後、上層の有機溶媒を還流再使用する何れの方法を用いてもよい。これらの溶媒置換操作によって、溶媒可溶の光学活性アミノ酸アミドは有機溶媒相に溶解した状態となり、溶媒不溶の光学活性アミノ酸や塩類はスラリー状の固形物相として析出する。【００２９】
この水溶液から有機溶媒溶液への置換は、有機溶媒相と固形物相からなる全体量に含まれる水分濃度が好ましくは０．５ｗｔ％以下、より好ましくは０．１ｗｔ％以下となる状態まで行うことが望ましい。水分濃度が０．５％を超える場合には、不溶物である光学活性アミノ酸や塩類の析出が不十分となり、結果的に有機溶媒液相に含まれる光学活性アミノ酸アミドの純度が低下する。【００３０】
このようにして水溶液から有機溶媒溶液へと置換した後、光学活性アミノ酸アミドを含む有機溶媒相と光学活性アミノ酸や塩類からなるスラリー状の固形物相を、遠心分離や濾過等の手段を用いて固液分離する。さらに、有機溶媒を用いて固形物を洗浄し、得られた有機溶媒溶液を濃縮、冷却することによって、高純度の光学活性アミノ酸アミドを、高収率で得ることが可能となる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明の内容を実施例及び比較例を以て具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって制限されるものではない。
実施例I−１〜I−３、及び比較例I−１〜I−３【００３２】
１．酵素反応用の菌体処理液の調製
光学活性脂肪族アミノ酸アミドの製造法に関する公開特許、特開２００２−２５３２９４号公報記載の方法に従い、培養分離したオクトバクトラム  アンスロピ  ＡＴＣＣ４９２３７株の菌体から酵素反応用の菌体処理液を調製した。
２．酵素処理したアミノ酸アミド水溶液の調製
Ｄ，Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミド塩酸塩３５３ｇ（２．５５ｍｏｌ）を水１０００ｇに溶解した後、４８ｗｔ％のＮａＯＨ水溶液で酵素反応の至適ｐＨである７に調整し、さらに水を加えて全量を２０００ｇとなした。このＤ，Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミド塩酸塩の水溶液２０００ｇに対して、乾菌重量２．６ｇに相当する菌体処理液を加え４０℃で２２時間反応させた。反応終了後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去し、酵素処理したアミノ酸アミドの水溶液を得た。
この酵素反応終了液をＨＰＬＣにて分析したところ、原料中のＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドのみがほぼ１００％の収率でＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸に定量的に変換されていた。なお、脱アミド化したＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸及び未反応のＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドの水溶液中の濃度は何れも６．３ｗｔ％であり、立体選択的に反応が進行していた。
３．酵素反応終了液中のイオン種及びイオン濃度の分析
酵素反応によって得られたＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドとＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸を含む水溶液中に共存するイオン種及びイオン濃度をイオンクロマトグラフィーで分析した。陰イオンとしてはＣｌ−が、陽イオンとしてはＮａ＋が各イオン種のほぼ全量を占めており、Ｃｌ−イオンは７．０３ｗｔ％（溶液１００ｇあたり０．１９８ｍｏｌ）、Ｎａ＋イオンは０．６１ｗｔ％（溶液１００ｇあたり０．０２７ｍｏｌ）となっていた。この結果より、Ｃｌ−イオンに対するＮａ＋イオンの濃度比が０．１３６と、酵素反応後の水溶液中に含まれる両イオンの濃度比が陰イオン過剰の状態に偏っていることが確認された。
４．イオンの濃度比と光学活性アミノ酸アミドの分離性との関係
実施例I−１〜I−３、及び比較例I−１〜I−３として酵素反応終了液を１００ｍＬずつ分取し、Ｎａ＋／Ｃｌ−の濃度比が未調整のままの０．１４に、一方、４８ｗｔ％のＮａＯＨ水溶液を用いることによって０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５になるように調整した後、ロータリーエバポレータで濃縮した。濃縮後、Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドに対して富溶媒、Ｄ−２−アミノ−ｎ−酪酸に対して貧溶媒となるイソブチルアルコール１００ｍＬを加え、ロータリーエバポレータにより共沸脱水濃縮した。乾固後、再びイソブチルアルコール１００ｍＬを加えてスラリー状の白色結晶を含む有機溶媒溶液になし、この白色結晶を含む有機溶媒溶液をよく攪拌した後にサンプリングし、その中に含まれている水分濃度が０．５ｗｔ％以下になっていることを確認した。次いで、スラリー状の白色結晶を吸引濾過によって分離し、さらに、３０ｍＬのイソブチルアルコールを加えて付着母液を洗浄回収した。この濾液をロータリーエバポレータにて濃縮した後、４０℃にて真空乾燥することにより、Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドの針状結晶を得た。調整したイオンの濃度比と得られたＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドの回収率及び純度との関係を表１に示す。イオンの濃度比が０．９５〜１．０５の範囲で、得られた光学活性アミノ酸アミドの回収率と化学純度が共に最適となる結果を得た。【００３３】
【表１】
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【００３４】
比較例I−４
実施例I−１の方法によって得られたＬ−２−アミノ−n−酪酸アミドとＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸を含む酵素反応終了液５００ｇを、遊離のＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドが最も多くなるｐＨ８．５に４８ｗｔ％のＮａＯＨ水溶液を用いることによって調整した。なお、このときのイオンの濃度比Ｎａ＋／Ｃｌ−は０．５６であった。この水溶液を、イオンの濃度比以外は上記の実施例I−１〜I−３及び比較例I−１〜I−３と同様に処理したところ、得られたＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドの回収率は０．７６％、純度は６０．４％と何れも不十分な値であった。【００３５】
実施例II−1〜II−４、比較例II−１，II−２
１．酵素反応用の菌体処理液の調製
上記実施例I−１〜I−３、及び比較例I−１〜I−３と同様に行った。
２．酵素処理したアミノ酸アミド水溶液の調製
上記実施例I−１〜I−３、及び比較例I−１〜I−３と同様に行った。
この酵素反応終了液をＨＰＬＣにて分析したところ、原料中のＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドのみがほぼ１００％の収率でＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸に定量的に変換されていた。なお、脱アミド化したＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸及び未反応のＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドの水溶液中の濃度は何れも６．３ｗｔ％であり、立体選択的に反応が進行していた。
３．酵素反応終了液の脱塩
酵素反応によって得られたＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドとＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸を含む水溶液１２００ｇに２５％アンモニア水を２４５ｇ加え、これを電気透析前の塩の濃度に対して残存する塩の濃度が１０％となるまで脱塩を行った。脱塩後の水溶液は１０９５ｇとなり、Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドとＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸は共に7ｗｔ％、Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドとＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸の回収率は共に９７％であった。
４．脱塩した水溶液中のイオン種及びイオン濃度の分析
脱塩したＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドとＤ−２−アミノ−ｎ−酪酸を含む水溶液中に存在するイオン種及びイオン濃度をイオンクロマトグラフィーで分析した。陰イオンとしてはＣｌ−が、陽イオンとしてはＮａ＋が各イオン種のほぼ全量を占めており、Ｃｌ−は０．７７６ｗｔ%（水溶液１００ｇあたり０．０２１６ｍｏｌ）、Ｎａ＋は０．１７８％(水溶液１００ｇあたり０．００７７４ｍｏｌ)となり、イオンの濃度比率Ｎａ＋／Ｃｌ−は０．３５８であり陰イオンが陽イオンに比べて過剰であることが確認された。
５．イオンの濃度比と光学活性アミノ酸アミドの分離性との関係
そこで、実施例II−１〜II−４、及び比較例II−１，II−２として各５０ｇの脱塩した上記水溶液を取り、イオンの濃度比率Ｎａ＋／Ｃｌ−を０．３６、０．５０、０．８０、１．０、１．５、２．０になるように４８ｗｔ％ＮａＯＨ水溶液を添加して、ロータリーエバポレータで濃縮した。濃縮後５０ｍＬイソブチルアルコールを加えてロータリーエバポレータにより共沸脱水濃縮を行い、再びイソブチルアルコール５０ｍＬを加えてスラリー状の白色結晶を含む有機溶媒溶液となし、この白色結晶を含む有機溶媒溶液をよく攪拌した後にサンプリングし、その中に含まれている水分濃度が０．５ｗｔ％以下となっていることを確認した。次いで、スラリー状の白色結晶を吸引濾過によって分離し、さらに、２０ｍＬのイソブチルアルコールを加えて付着母液を洗浄回収した。この濾液をロータリーエバポレータにて濃縮した後、濃縮物を４０℃にて真空乾燥することによりＬ−２−アミノ−ｎ−酪酸アミドの針状結晶を得た。調整したイオンの濃度比と得られたこのときの回収率および純度を表２に示す。脱塩率を９０％で脱塩を実施した場合にはイオンの濃度比が０．５〜１．５の範囲で、得られた光学活性アミノ酸アミドの回収率と化学純度が共に最適となる結果を得た。【００３６】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、化学純度及び光学純度に優れた光学活性アミノ酸アミドを、高収率かつ簡便に分離回収する方法であり、各種工業薬品、農薬、及び医薬品の製造中間体として大変重要な物質である光学活性アミノ酸アミドの製造に有用である。