(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造よりなる金属測定用蛍光プローブであって、当該配位部位が非環状でありかつ８座以上の配位部位であり、当該スペーサーが「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−」である金属測定用蛍光プローブ。
【請求項２】
配位部位が非環状のポリアミノカルボン酸でありかつ８座以上の配位部位である、請求項１記載の金属測定用蛍光プローブ。
【請求項３】
２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸である、請求項１又は請求項２記載の金属測定用蛍光プローブ。
【請求項４】
Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ'''，Ｎ'''−五酢酸である、請求項１又は請求項２記載の金属測定用蛍光プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、試料中の金属の測定に用いることができる金属測定用蛍光プローブに関するものである。
本発明は、分析化学などの化学分野、又は臨床検査などの生命科学分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】  従来、試料中に微量に含まれる金属の測定には、原子吸光分析装置が繁用されてきたが、この原子吸光分析装置は大変高価であり、またその設置に広いスペースを必要とし、配管や換気装置が必要なものであった。
また、ＩＣＰ発光分析装置は、試料中の複数の金属を同時に測定することができるものであるが、これは非常に高価なものであり、そしてやはりその設置に広いスペースを必要とし、配管や換気装置が必要なものであった。【０００３】  更に、キャピラリー電気泳動により複数の金属を分離して、紫外吸収を測定すること等により試料中に含まれていた複数の金属を同時に測定する方法が知られている。
この方法は高価な装置を使用せずに測定を行える方法であるが、しかしこのキャピラリー電気泳動による方法においては、試料中の多くの共存化学物質もまた紫外光を吸収するため、多くの場合、測定を妨害することが知られている。
また、上記吸光検出法では、蛍光検出法に比べ感度が著しく低いことが一般に知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明の目的は、試料中に微量に含まれる金属を、高価な装置を使用することなく、簡便かつ正確に測定を行うことが出来るようにするための金属測定用蛍光プローブを提供することにあり、特に、複数の金属を同時に測定することが出来る金属測定用蛍光プローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の発明よりなる。
（１）  「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造よりなる金属測定用蛍光プローブであって、当該配位部位が非環状でありかつ８座以上の配位部位であり、当該スペーサーが「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−」である金属測定用蛍光プローブ。
（２）  配位部位が非環状のポリアミノカルボン酸でありかつ８座以上の配位部位である、前記（１）記載の金属測定用蛍光プローブ。
（３） ２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸である、前記（１）又は（２）記載の金属測定用蛍光プローブ。
（４） Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ'''，Ｎ'''−五酢酸である、前記（１）又は（２）記載の金属測定用蛍光プローブ。
【発明の効果】
【０００６】  本発明の金属測定用蛍光プローブにより、試料中に微量に含まれる金属を、高価な装置を使用することなく、簡便、正確かつ高感度に測定を行うことが出来るようになった。
そして、本発明の金属測定用蛍光プローブにより、試料中に含まれる複数の金属を同時に測定することも可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】１．金属
本発明の金属測定用蛍光プローブを用いて測定を行う金属は、試料中における存在の有無又はその濃度を測定しようとする金属である。
この金属としては、例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属又はその他の金属を挙げることができる。【０００８】  より具体的には、アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム又はフランシウムを挙げることができる。【０００９】  また、アルカリ土類金属としては、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム又はラジウムを挙げることができる。【００１０】  そして、遷移金属としては、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルビジウム、ラドン、パラジウム、銀、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金又は金等を挙げることができる。【００１１】  更に、その他の金属としては、例えば、アルミニウム、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、カドミウム、インジウム、スズ、アンチモン、テルル、水銀、タリウム、鉛、ビスマス又はポロニウム等を挙げることができる。【００１２】２．試料
本発明の金属測定用蛍光プローブを用いて金属の測定を行う試料は、前記の金属を含む可能性がある試料であって、これを測定しようとするものである。
金属は単体、イオン及び化合物等の種々の形態を取り、また遊離又はキャリアー（担体）に結合した状態等で存在し、そして様々な物に含まれて存在しているが、本発明の金属測定用蛍光プローブを用いて測定を行う試料中の金属は特に限定されるものではなく、直接又は処理を行うことにより測定することが可能なものであれば対象となる。【００１３】  本発明の金属測定用蛍光プローブは、金属を簡便、正確、かつ高感度に測定できることを特徴とするものであるので、生体試料、食肉、野菜、穀物、果物、水産物、加工食品、飲料、飲料水、井戸水、河川水、湖沼水、海水、土壌、空気、又は医薬品等の微量の金属が含まれる可能性がある試料に含まれる金属の測定に特に有効なものである。【００１４】  例えば、生体試料としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、脳等の臓器、毛髪や皮膚や爪や筋肉若しくは神経等の組織及び細胞等を挙げることができる。【００１５】  本発明の金属測定用蛍光プローブを用いて行う試料中の金属の測定においては、金属測定用蛍光プローブと混合し、接触させる試料は液体であることが好ましい。
もし、金属を含む試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を公知の方法に従って行ない、金属を液体中に含有させるようにしてもよい。【００１６】３．金属測定用蛍光プローブ
本発明の金属測定用蛍光プローブは、「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造よりなる金属測定用蛍光プローブであって、当該配位部位が非環状でありかつ８座以上の配位部位であるものである。
なお、この金属測定用蛍光プローブにおける配位部位は、測定しようとする試料中の金属と接触することにより、この金属と配位結合し、錯体を形成することができるものであって、そして当該配位部位が非環状でありかつ８座以上の配位部位であれば、特に制限なく用いることができる。【００１７】  この配位部位は、８座以上であることにより、８座未満のものよりも、より広い範囲の金属の測定を行うことができたり、８座未満のものでは測定することが出来ない金属を測定することが出来る。【００１８】  例えば、配位部位が非環状でありかつ６座の配位部位である金属測定用蛍光プローブである、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ〕（構造式を［化１］に示す）を、後述のようにゲル電気泳動法に適用して、銅、亜鉛、マンガン、ニッケル、コバルト、鉛、又はカドミウムの各イオンをそれぞれ含む各々の試料の中の金属を測定しようとした場合、これらの７種類のいずれの金属においても、この金属測定用蛍光プローブＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡと前記金属イオンとの錯体のバンドは得られなかった。【００１９】
【化１】
0005055595.tif 000002
【００２０】  これは、６座の配位部位よりなるＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡでは、金属との錯体の安定性が小さく安定ではなく、ゲル電気泳動法に適用した場合、前記錯体が解離してしまい、錯体のバンドが検出されなかったものと推測される。【００２１】  また、この配位部位は、その構造が非環状であることにより、環状のものよりも、やはり、より広い範囲の金属の測定を行うことができたり、環状のものでは測定することが出来ない金属を測定することが出来る。【００２２】  例えば、後述のように、配位部位が非環状でありかつ８座の配位部位である金属測定用蛍光プローブである、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕を、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）に適用して、種々の金属イオンを含む試料中の金属を測定しようとした場合、配位部位が環状でありかつ８座の配位部位である金属測定用蛍光プローブである、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ〕（構造式を［化２］に示す）では測定することが出来なかった、カドミウム、及び鉛を測定することが出来た。【００２３】
【化２】
0005055595.tif 000003
【００２４】  なお、本発明の金属測定用蛍光プローブの配位部位、すなわち配位部位が非環状でありかつ８座以上の配位部位であるものとしては、例えば、非環状のポリアミノカルボン酸でありかつ８座以上の配位部位よりなるもの等を挙げることができる。【００２５】  より具体的には、この非環状のポリアミノカルボン酸でありかつ８座以上の配位部位よりなるものとしては、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸、ジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）、又はＮ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′′，Ｎ′′′−五酢酸等を挙げることができる。
なお、これらの配位部位は、いずれも、５つのカルボキシル基の酸素原子及び３つの窒素原子により８座のものである。【００２６】  この配位部位としては、特に、ジエチレントリアミン五酢酸、又はＮ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′′，Ｎ′′′−五酢酸が好ましい。【００２７】  本発明の金属測定用蛍光プローブは、その蛍光団により、蛍光を測定することができる。
なお、この金属測定用蛍光プローブにおける蛍光団は、可視部又は紫外部の励起光を照射することにより、蛍光を放出するものであれば、特に制限なく用いることができる。
この蛍光団としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナトなどのフルオレセイン類縁体、キニーネ、ローダミンＢ、アクリジンオレンジ、クマリン、又はＰＯＰＯＰ等を挙げることができる。
この蛍光団としては、特に、フルオレセイン、又はフルオレセイン類縁体が好ましい。【００２８】  従来、配位部位と蛍光団を結合させた「配位部位−蛍光団」は、この蛍光プローブが金属と錯体を形成しても、常磁性消光又は重原子効果等の理由により消光してしまうという問題があった。【００２９】  しかしながら、本発明の金属測定用蛍光プローブは、配位部位と蛍光団をスペーサーを介して結合させ、「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造としたものであるが、このように配位部位と蛍光団との間にスペーサーを存在させることにより、この金属測定用蛍光プローブが試料中に含まれる金属と蛍光性金属錯体を形成したときに消光してしまうのを抑制することができ、高いレベルの蛍光を安定して得ることができる。【００３０】  このスペーサーとしては、例えば、「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−」、「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−」、「−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−」、アルキル基やフェニル基などの炭化水素基、又はこれらの誘導体等を挙げることができる。
このスペーサーとしては、特に、「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−」が好ましい。【００３１】  本発明の金属測定用蛍光プローブとしては、特に、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕（構造式を［化３］に示す）、又はＮ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，Ｎ′′′，Ｎ′′′−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕（構造式を［化４］に示す）が好ましい。【００３２】
【化３】
0005055595.tif 000004
【００３３】
【化４】
0005055595.tif 000005
【００３４】４．金属測定用蛍光プローブの調製方法
本発明の金属測定用蛍光プローブは、前記の「配位部位」、「スペーサー」及び「蛍光団」を、「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造となるように結合させて調製すれば良い。【００３５】  この調製の方法は、特に制限はなく、公知の方法等により行えば良い。
例えば、前記のＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡの調製方法としては、２−（４−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸溶液にマレイン酸、フルオレセインイソチオシアナート  アイソマーＩ溶液、及び超純水を加え、暗所で放置した後、１−ブタノールで抽出し、さらに１−ペンタノールで抽出し、そして塩酸で再結晶し、乾燥することによりＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを取得する方法等を挙げることができる。【００３６】  また、前記のＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡの調製方法としては、［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−五酢酸溶液にマレイン酸、５−アミノフルオレセイン、及び超純水を加え、暗所で放置することによりＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡを取得する方法等を挙げることができる。【００３７】５．金属測定用蛍光プローブを用いた試料中の金属の測定
本発明の金属測定用蛍光プローブを使用することにより、試料中に含まれる金属を、簡便、正確かつ高感度に測定することができる。また、試料中に含まれる複数の金属を同時に測定することもできる。【００３８】  この試料中の金属の測定は、試料と本発明の金属測定用蛍光プローブを混合し、接触させることにより、試料に含まれる金属と金属測定用蛍光プローブとの蛍光性金属錯体を形成させ、そして、この蛍光性金属錯体と遊離の金属測定用蛍光プローブ、及び／又は複数種類の金属よりなる蛍光性金属錯体同士を区別できるようにするか又は分離等して、更に、この蛍光性金属錯体の蛍光を測定することによって、試料中の金属の有無、更にはそれらの濃度について測定を行うことができる。【００３９】  前記の蛍光性金属錯体と遊離の金属測定用蛍光プローブ、及び／又は複数種類の金属よりなる蛍光団金属錯体同士を区別できるようにするか又は分離等する方法は、特に制限はない。【００４０】  前記の区別できるようにするか又は分離等する方法としては、例えば、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、又はキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）等を挙げることができる。【００４１】  以下、ゲル電気泳動法を例に取り、前記の区別できるようにするか又は分離等する方法について、詳細に説明する。
このゲル電気泳動法としては、支持体としてゲルを使用する電気泳動法であれば、特に制限なく用いることができる。
このゲル電気泳動法におけるゲルとしては、例えば、ポリアクリルアミドゲル、又はアガロースゲル等を挙げることができるが、特に、ポリアクリルアミドゲルを用いることが好ましい。
また、このゲル電気泳動法としては、スラブ型（垂直型）、ディスク型、又は水平型等のいずれの種類のゲル電気泳動法をも用いることができる。
そして、このゲル電気泳動法としては、通常のゲル電気泳動法、又はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法のいずれをも用いることができる。
更に、このゲル電気泳動法としては、一次元電気泳動法、又は二次元電気泳動法のいずれをも用いることができる。
なお、このゲル電気泳動法は、濃縮ゲル及び分離ゲルよりなる非連続系ゲルを用いるゲル電気泳動法であっても良い。【００４２】  本発明の金属測定用蛍光プローブを用い、そしてゲル電気泳動法により、試料中の金属の測定を行う方法としては、例えば、下記の（ａ）〜（ｃ）の工程よりなる方法を挙げることができる。
（ａ）試料と、本発明の金属測定用蛍光プローブとを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる金属と前記金属測定用蛍光プローブとの蛍光性金属錯体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液をゲル電気泳動法に適用する工程。
（ｃ）前記ゲル電気泳動法により泳動された前記蛍光性金属錯体を測定する工程。【００４３】  ところで、前記の工程（ｂ）においては、前記の工程（ａ）における試料と金属測定用蛍光プローブとの混合液をゲル電気泳動法に適用する。
これは、この混合液をゲルに添加、接触させ、次に通電して、前記の蛍光性金属錯体を泳動させることにより行う。【００４４】  また、前記の工程（ｃ）においては、前記の工程（ｃ）のゲル電気泳動法で泳動された前記蛍光性金属錯体を測定する。
これは、前記のゲル電気泳動法のゲルに、用いた金属測定用蛍光プローブの蛍光団に適した波長の励起光を照射し、これに対して放出された蛍光を測定することにより行う。
この蛍光の測定は、目視によりゲルの泳動パターン（バンド）の確認を行い定性的に金属を測定しても良いし、又はデンシトメーター若しくは蛍光光度計等により各バンドの蛍光強度を測定して、定量的に金属を測定しても良い。
また、ゲルの泳動パターン（バンド）を、デジタルカメラやスキャナー等により取り込んで、コンピュータで解析しても良い。【００４５】  そして、既知の金属、又は既知の濃度の金属を前記の測定方法で測定した際のゲルの泳動パターン（バンド）、更にはその蛍光強度と比較することにより、試料中に含まれていた複数種類の金属について、その有無、更にはそれらの濃度についての測定結果を得ることができる。
【実施例】
【実施例１】
【００４６】〔金属測定用蛍光プローブ（２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕）の調製〕【００４７】  本発明の金属測定用蛍光プローブとして、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕を調製した。【００４８】合成法）
１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３の２−（４−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸溶液２５ｍｌに１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３のマレイン酸（ｐＨ６．０）を５ｍｌ、１０−２ｍｏｌ  ｄｍ−３のフルオレセインイソチオシアナート  アイソマーＩ溶液を２．５ｍｌ、さらに超純水を１７．５ｍｌ加えた。
その後、暗所で６時間放置し、その後、１−ブタノールで抽出し、さらに１−ペンタノールで抽出し、塩酸で再結晶し、乾燥し、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕の粉末を得た。【００４９】元素分析値）
測定値：Ｃ，５３．３０；Ｈ，５．２５；Ｎ，７．０５％．
計算値：Ｃ，５３．３１；Ｈ，４．５４；Ｎ，７．４０％（測定値と計算値の誤差０．７１％）
【参考例１】
【００５０】〔本発明の金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）を用いてのゲル電気泳動法による試料中の金属イオンの測定〕
本発明の金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）を用いて、ゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った。
【００５１】１．試料
下記の１３種類の試料をそれぞれ調製した。
（１）カルシウム含有試料
１ｍＭのカルシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（２）マグネシウム含有試料
１ｍＭのマグネシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（３）アルミニウム含有試料
１ｍＭのアルミニウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（４）鉄含有試料
１ｍＭの鉄イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（５）銅含有試料
１ｍＭの銅イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（６）亜鉛含有試料
１ｍＭの亜鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（７）ニッケル含有試料
１ｍＭのニッケルイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（８）コバルト含有試料
１ｍＭのコバルトイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（９）マンガン含有試料
１ｍＭのマンガンイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１０）カドミウム含有試料
１ｍＭのカドミウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１１）水銀含有試料
１ｍＭの水銀イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１２）鉛含有試料
１ｍＭの鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１３）陰性対照試料
超純水を陰性対照試料とした。
【００５２】２．蛍光プローブ含有溶液
実施例１にて調製した２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕を、金属測定用蛍光プローブとして用いた。
【００５３】  １ｍＭのＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを含む水溶液を調製し、蛍光プローブ含有溶液とした。
【００５４】３．ゲル電気泳動用のゲル及び泳動液
（１）濃縮ゲル
ゲル濃度が１６．５％Ｔ（１．４６％Ｃ）であり、０．０９３８Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）を含むポリアクリルアミドゲルを調製し、濃縮ゲルとした。
【００５５】（２）分離ゲル
ゲル濃度が３０％Ｔ（０．８％Ｃ）であり、０．１６６Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．３）、０．０８５３Ｍグリシンを含むポリアクリルアミドゲルを、分離ゲルとした。
【００５６】（３）泳動液
４８ｍＭグリシンを含む６．２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．３）を調製し、これを泳動液とした。
【００５７】４．試料中の金属の測定
（１）  前記１の１３種類の試料各々と、前記２の蛍光プローブ含有溶液と、５０ｗｔ％グリセロール水溶液と、７５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．８）と、純水とを、それぞれ１：１：０．５：１：６．５で混合し、これにより試料と金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）とを接触させ、室温にて２０分間放置し、この混合液中において前記１の各試料中の金属と金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）との蛍光性金属錯体を形成させた。
【００５８】（２）  前記（１）の計１３種類の混合液のそれぞれをポリアクリルアミドゲル電気泳動法に適用して、泳動を行った。
なお、このポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、一次元・スラブ型であり、濃縮ゲルの下に分離ゲルを配置した非連続系のものである。
この濃縮ゲルとしては前記３の（１）の濃縮ゲルを用い、また、分離ゲルとしては前記３の（２）の分離ゲルを用い、そして、泳動液としては前記３の（３）の泳動液を用いた。
【００５９】  具体的には、まず前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽にセットした。
次に、計１３種類の前記（１）の混合液のそれぞれの０．５μＬを、前記の濃縮ゲルに添加し、接触させた。
そして、電流２０ｍＡ（一定）、電圧６８０−１１５０Ｖで、１８０分間通電した。
この通電により、前記の蛍光性金属錯体は濃縮ゲル中で濃縮され、その後分離ゲルに移動し、分離ゲル中を泳動した。
【００６０】（３）  前記（２）の通電を終了した後、前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽から取り外した。
次に、この濃縮ゲル及び分離ゲルを乾燥させた。
【００６１】  乾燥後、この濃縮ゲル及び分離ゲルを、紫外線照射装置の上に置き、波長４７０ｎｍの励起光を照射した。
これにより放出された蛍光による濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、デジタルカメラで撮影した。
この濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、図１に示した。
なお、この図１の泳動パターン（バンド）において、「Ｂｌａｎｋ」は前記の陰性対照試料のバンドを示す。
また、「Ｃａ」は前記のカルシウム含有試料のバンドを示し、同様に、「Ｍｇ」は前記のマグネシウム含有試料の、「Ａｌ」は前記のアルミニウム含有試料の、「Ｆｅ」は前記の鉄含有試料の、「Ｃｕ」は前記の銅含有試料の、「Ｚｎ」は前記の亜鉛含有試料の、「Ｎｉ」は前記のニッケル含有試料の、「Ｃｏ」は前記のコバルト含有試料の、「Ｍｎ」は前記のマンガン含有試料の、「Ｃｄ」は前記のカドミウム含有試料の、「Ｈｇ」は前記の水銀含有試料の、そして「Ｐｂ」は前記の鉛含有試料のバンドを示す。
【００６２】５．測定結果
図１の濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）から、本発明の金属測定用蛍光プローブを用いることにより、試料中に含まれる金属に応じたバンドが得られることが分かる。
このことより、本発明の金属測定用蛍光プローブを用いることによって、試料中に微量に含まれる金属を、簡便、正確かつ高感度に測定できることが確かめられた。
【実施例２】
【００６３】〔金属測定用蛍光プローブ（Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，Ｎ′′′，Ｎ′′′−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕）の調製〕【００６４】  本発明の金属測定用蛍光プローブとして、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，Ｎ′′′，Ｎ′′′−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕を調製した。【００６５】合成法）
１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３の［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−五酢酸溶液２５ｍｌに１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３のマレイン酸（ｐＨ６．０）を５ｍｌ、１０−２ｍｏｌ  ｄｍ−３の５−アミノフルオレセイン溶液を２．５ｍｌ、さらに超純水を１７．５ｍｌ加えた。
その後、暗所で６時間放置し、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，Ｎ′′′，Ｎ′′′−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕を得た。
【参考例２】
【００６６】〔本発明の金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ）を用いてのゲル電気泳動法による試料中の金属イオンの測定〕
本発明の金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ）を用いて、ゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った。
【００６７】１．試料
下記の１４種類の試料をそれぞれ調製した。
（１）鉛含有試料
１ｍＭの鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（２）水銀含有試料
１ｍＭの水銀イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（３）カドミウム含有試料
１ｍＭのカドミウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（４）マンガン含有試料
１ｍＭのマンガンイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（５）コバルト含有試料
１ｍＭのコバルトイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（６）ニッケル含有試料
１ｍＭのニッケルイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（７）亜鉛含有試料
１ｍＭの亜鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（８）銅含有試料
１ｍＭの銅イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（９）鉄含有試料
１ｍＭの鉄イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１０）アルミニウム含有試料
１ｍＭのアルミニウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１１）マグネシウム含有試料
１ｍＭのマグネシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１２）カルシウム含有試料
１ｍＭのカルシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１３）１２種類の金属含有試料
０．１ｍＭの鉛イオン、０．１ｍＭの水銀イオン、０．１ｍＭのカドミウムイオン、０．１ｍＭのマンガンイオン、０．１ｍＭのコバルトイオン、０．１ｍＭのニッケルイオン、０．１ｍＭの亜鉛イオン、０．１ｍＭの銅イオン、０．１ｍＭの鉄イオン、０．１ｍＭのアルミニウムイオン、０．１ｍＭのマグネシウムイオン、及び０．１ｍＭのカルシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１４）陰性対照試料
超純水を陰性対照試料とした。
【００６８】２．蛍光プローブ含有溶液
実施例２にて調製したＮ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，Ｎ′′′，Ｎ′′′−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕を、金属測定用蛍光プローブとして用いた。
【００６９】  １ｍＭのＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡを含む水溶液を調製し、蛍光プローブ含有溶液とした。
【００７０】３．ゲル電気泳動用のゲル及び泳動液
（１）濃縮ゲル
ゲル濃度が１６．５％Ｔ（１．４６％Ｃ）であり、０．０９３８Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）を含むポリアクリルアミドゲルを調製し、濃縮ゲルとした。
【００７１】（２）分離ゲル
ゲル濃度が３０％Ｔ（０．８％Ｃ）であり、０．１６６Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．３）、０．０８５３Ｍグリシンを含むポリアクリルアミドゲルを、分離ゲルとした。
【００７２】（３）泳動液
４８ｍＭグリシンを含む６．２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．３）を調製し、これを泳動液とした。
【００７３】４．試料中の金属の測定
（１）  前記１の１４種類の試料各々と、前記２の蛍光プローブ含有溶液と、５０ｗｔ％グリセロール水溶液と、７５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．８）と、純水とを、それぞれ１：１：０．５：１：６．５で混合し、これにより試料と金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ）とを接触させ、室温にて２０分間放置し、この混合液中において前記１の各試料中の金属と金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ）との蛍光性金属錯体を形成させた。
【００７４】（２）  前記（１）の計１４種類の混合液のそれぞれをポリアクリルアミドゲル電気泳動法に適用して、泳動を行った。
なお、このポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、一次元・スラブ型であり、濃縮ゲルの下に分離ゲルを配置した非連続系のものである。
この濃縮ゲルとしては前記３の（１）の濃縮ゲルを用い、また、分離ゲルとしては前記３の（２）の分離ゲルを用い、そして、泳動液としては前記３の（３）の泳動液を用いた。
【００７５】  具体的には、まず前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽にセットした。
次に、計１４種類の前記（１）の混合液のそれぞれの０．５μＬを、前記の濃縮ゲルに添加し、接触させた。
そして、電流２０ｍＡ（一定）、電圧６８０−１１５０Ｖで、１８０分間通電した。
この通電により、前記の蛍光性金属錯体は濃縮ゲル中で濃縮され、その後分離ゲルに移動し、分離ゲル中を泳動した。
【００７６】（３）  前記（２）の通電を終了した後、前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽から取り外した。
次に、この濃縮ゲル及び分離ゲルを乾燥させた。
【００７７】  乾燥後、この濃縮ゲル及び分離ゲルを、紫外線照射装置の上に置き、波長４７０ｎｍの励起光を照射した。
これにより放出された蛍光による濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、デジタルカメラで撮影した。
この濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、図２に示した。
なお、この図２の泳動パターン（バンド）において、「Ｌ」は前記の陰性対照試料のバンドを示す。
また、「Ｍｅｔａｌ＊１２」は前記の１２種類の金属含有試料のバンドを示す。
そして、「Ｐｂ」は前記の鉛含有試料のバンドを示し、同様に、「Ｈｇ」は前記の水銀含有試料の、「Ｃｄ」は前記のカドミウム含有試料の、「Ｍｎ」は前記のマンガン含有試料の、「Ｃｏ」は前記のコバルト含有試料の、「Ｎｉ」は前記のニッケル含有試料の、「Ｚｎ」は前記の亜鉛含有試料の、「Ｃｕ」は前記の銅含有試料の、「Ｆｅ」は前記の鉄含有試料の、「Ａｌ」は前記のアルミニウム含有試料の、「Ｍｇ」は前記のマグネシウム含有試料の、そして「Ｃａ」は前記のカルシウム含有試料のバンドを示す。
【００７８】５．測定結果
図２の濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）から、本発明の金属測定用蛍光プローブを用いることにより、試料中に含まれる金属に応じたバンドが得られることが分かる。
このことからも、本発明の金属測定用蛍光プローブを用いることによって、試料中に微量に含まれる金属を、簡便、正確かつ高感度に測定できることが確かめられた。
【参考例３】
【００７９】〔本発明の金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）、従来の金属測定用蛍光フローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ）を用いてのキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法による試料中の金属イオンの測定〕
本発明の金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）、又は従来の金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ）を用いて、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属の測定を行った。
【００８０】１．試料
下記の１３種類の試料をそれぞれ調製した。
（１）マグネシウム含有試料
１ｍＭのマグネシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（２）アルミニウム含有試料
１ｍＭのアルミニウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（３）カルシウム含有試料
１ｍＭのカルシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（４）マンガン含有試料
１ｍＭのマンガンイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（５）鉄含有試料
１ｍＭの鉄イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（６）コバルト含有試料
１ｍＭのコバルトイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（７）ニッケル含有試料
１ｍＭのニッケルイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（８）銅含有試料
１ｍＭの銅イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（９）亜鉛含有試料
１ｍＭの亜鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１０）カドミウム含有試料
１ｍＭのカドミウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１１）水銀含有試料
１ｍＭの水銀イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１２）鉛含有試料
１ｍＭの鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１３）陰性対照試料
超純水を陰性対照試料とした。
【００８１】２．蛍光プローブ含有溶液
（１）ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ含有溶液
実施例１にて調製した２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕を、金属測定用蛍光プローブとして用いた。
【００８２】  １ｍＭのＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを含む水溶液を調製し、ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ含有溶液とした。
【００８３】（２）ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ含有溶液
２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ〕を、金属測定用蛍光プローブとして用いた。
【００８４】  １ｍＭのＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを含む水溶液を調製し、ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ含有溶液とした。
【００８５】３．キャピラリー電気泳動用の泳動液
０．０５ｗｔ％のポリブレン、及び１ｍＭの１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）を含む５０ｍＭリン酸−ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０９）を調製し、これを泳動液とした。
【００８６】４．試料中の金属の測定
（１）  前記１の１３種類の試料各々と、前記２の（１）のＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ含有溶液と、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）と、純水とを、それぞれ０．００１：０．０５：２：８で混合し、これにより試料と金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）とを接触させ、室温にて２０分間放置し、この混合液中において前記１の各試料中の金属と金属測定用蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）との蛍光性金属錯体を形成させた。
【００８７】（２）  前記（１）の計１３種類の混合液のそれぞれを、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）に適用して、泳動及び測定を行った。
なお、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）における高電圧電源は松定プレシジョンのＨＣＺＥ−３０Ｐを、レーザー装置はＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社製ＡｒレーザーシステムＭｏｄｅｌ２６３Ｄを、レーザー誘起蛍光検出器はＰｉｃｏｍｅｔｒｉｃｓ社製ＺＥＴＡＬＩＦを使用した。
Ａｒレーザー（励起波長４８８ｎｍ）の出力は８．０ｍＷとした。
また、キャピラリー電気泳動の印加電圧は２０ｋＶ一定とした。
キャピラリーチューブは、ジーエルサイエンス社製の内径０．０５ｍｍ、全長６０ｃｍ、及び有効長４７ｃｍの溶融シリカキャピラリーを使用した。
【００８８】（３）  このＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属を測定した結果を、図３に示した。
なお、この図において、「Ｌ２」は前記の陰性対照試料のバンドを示す。
また、「Ｃｄ」は前記のカドミウム含有試料のピークを示し、同様に、「Ｍｎ」は前記のマンガン含有試料の、「Ｐｂ」は前記の鉛含有試料の、「Ｚｎ」は前記の亜鉛含有試料の、「Ｎｉ」は前記のニッケル含有試料の、「Ｃｏ」は前記のコバルト含有試料のピークを示す。
そして、この図において、横軸は移動時間（分）を表し、縦軸は測定により得られた蛍光強度を表す。
【００８９】（４）  また、蛍光プローブ含有溶液として前記２の（１）のＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡに代えて、前記２の（２）のＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ含有溶液を用いる他は、前記（１）及び（２）の通りに泳動及び測定を行った。
このＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属を測定した結果を、図４に示した。
なお、この図において、「Ｌ３」は前記の陰性対照試料のバンドを示す。
また、「Ｃａ２＋」は前記のカルシウム含有試料のピークを示し、同様に、「Ｍｎ２＋」は前記のマンガン含有試料の、「Ｍｇ２＋」は前記のマグネシウム含有試料の、「Ｚｎ２＋」は前記の亜鉛含有試料の、「Ｃｏ２＋」は前記のコバルト含有試料の、「Ｃｕ２＋」は前記の銅含有試料の、「Ｎｉ２＋」は前記のニッケル含有試料のピークを示す。
そして、「■」は未確定なピークを示す。
なお、この図において、横軸は移動時間（分）を表し、縦軸は測定により得られた蛍光強度を表す。
【００９０】５．測定結果
図３より、金属測定用蛍光プローブとして、本発明の金属測定用蛍光プローブであるＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属を測定した場合には、試料中のカドミウム、鉛、マンガン、亜鉛、ニッケル及びコバルトの各イオンを測定することが出来たことが分かる。
【００９１】  このことより、本発明の金属測定用蛍光プローブを用いることによって、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）においても、試料中に微量に含まれる金属を、簡便、正確かつ高感度に測定できることが確かめられた。
【００９２】  なお、図４より金属測定用蛍光プローブとして、従来の金属測定用蛍光プローブであるＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属を測定した場合には、試料中のカルシウム、マグネシウム、銅、マンガン、亜鉛、コバルト及びニッケルの各イオンを測定することが出来たことが分かる。
【００９３】  このことから、本発明の金属測定用蛍光プローブであるＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属を測定した場合には、従来の金属測定用蛍光プローブであるＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを用いた場合には測定することが出来なかった、試料中のカドミウムイオン、及び鉛イオンをそれぞれ測定できることが確かめられた。
【００９４】  なお、カドミウムイオン、及び鉛イオンそれぞれの測定は、生体における中毒等の診断や治療のために重要であり、このことからも本発明の金属測定用蛍光プローブの有用性が確かめられた。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の金属測定用蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った際の泳動を行った濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を示した図である。
【図２】本発明の金属測定用蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った際の泳動を行った濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を示した図である。
【図３】本発明の金属測定用蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属の測定を行った際の結果を示した図である。
【図４】金属測定用蛍光プローブとして従来のＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属の測定を行った際の結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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