(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物組織を、親水性の単官能性ビニルモノマーと親水性の多官能性ビニルモノマーを６：４〜８：２の混合比で含むビニル系モノマーを１０〜４０vol%と、残余の溶媒とを含む混合溶液に24時間以上含浸させた後、生物組織の表面に付着しているモノマーを拭き取り、−78℃で凍結し、生物組織の凍結状態を維持したまま電離性放射線を２０〜１００kGy照射してビニル系モノマーを重合させることを特徴とする生物組織硬化体の製造方法。
【請求項２】
前記親水性の単官能性ビニルモノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、及び２−ヒドロキシエチルメタクリレートの群から選択されることを特徴とする請求項１記載の生物組織硬化体の製造方法。
【請求項３】
前記親水性の多官能性ビニルモノマーが、
【化１】
0004963086.tif 000007
で示されるポリエチレングリコール＃６００ジメタクリレート、及び
【化２】
0004963086.tif 000008
で示されるポリエチレングリコール＃１０００ジメタクリレートの群から選択されることを特徴とする請求項１または２記載の生物組織硬化体の製造方法。
【請求項４】
親水性の単官能性ビニルモノマーと親水性の多官能性ビニルモノマーの混合比が７：３〜４：１であり、混合溶液中のビニル系モノマー全体の含有量が１０〜２０vol%であり、電離性放射線の照射量が３０kGy〜１００kGyである、請求項１〜３のいずれかに記載の生物組織硬化体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物組織の水分や脂肪分などの液体部分を固体に置換して、収縮を伴わないで生きた状態に近い形で保存する生物組織硬化体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物組織の固定には、古くはホルマリンなどの溶液に生物組織を浸漬する方法が広く用いられていた。生物組織をホルマリンに漬けると、生物の体は多くの場合、浸漬時間とともに非常に硬くなり、また最大で十数％収縮する。しかし、ホルマリンの主な作用がたんぱく質の収縮なので、脂肪などの他の物質は、ホルマリンによる固定作用を受けず、流れ出してしまう。一方、ホルマリン自体は、有毒な刺激臭を有し、人体に対し有害であるため、その取り扱いには十分な注意が必要である。また、ホルマリン固定法の欠点として、生物組織の型くずれが起こり易い、脱色が起こる、素手で触れられない、さらに定期的な固定液の交換が必要である、などが知られている。
【０００３】
近年、ホルマリン固定に代わる生物組織の固定化法として、シリコン、エポキシ、ポリアクリル系などの樹脂を生物組織中にしみ込ませ、樹脂を重合させるプラスティネーションという手法が提案されている。このプラスティネーション法は、ドイツ・ハイデルベルグ大学のグンター・フォン・ハーゲンスにより、１９７８年に生み出された。その手法は以下の通りである（非特許文献１参照）。
【０００４】
（１）組織をホルマリンに浸漬し、固定する。
（２）−２５℃でアセトンに浸漬し、組織内の水分をアセトンに置換する。アセトンは1週間毎に３回交換する。
（３）標本は室温に戻す。シリコン混合液に浸漬し真空ポンプで陰圧をかけ、組織内にシリコンを充填する。充填が完了するまで８週間を要する。
（４）余分なシリコンを除去する。硬化剤に２日間暴露してシリコンを重合させる。
【０００５】
しかしながら、このように生物組織硬化体を作製するまで、約３ヶ月の時間を費やす。さらには、硬化体の変形も報告されている。
【０００６】
最近、細胞内に水分とラジカルソースを含む組織を利用し、高親水性高分子モノマーを重合させる生物組織硬化体の製造方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。この場合、重合開始は組織表層部等の初期置換部細胞内に存在するラジカルソースによるため、組織全体を均等に全量重合化反応させるために、組織全域の細胞内水分が高親水性モノマー溶液に置換されるまでの間、重合禁止剤で反応を抑制しなければならない。また、ラジカルソースや水分の量は組織により異なるので、対象となる組織毎に高親水性高分子モノマー／架橋剤／重合禁止剤の３成分比率を調整する必要がある。このような３成分比率の最適化は、生物組織内に上記モノマー類を含浸させながら重合を進行させる手法であるため、組織中心部まで均一に重合させるように厳密に行わなければならない。従って、この手法では、モノマー類の調整のための煩わしさと共に、硬化体の完成時における収縮などは避けられないと考えられる。
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐａｐｅｒｓ  １４８（２），２３７−２３８，２００４
【特許文献１】特開２００６−３６９５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年、医療資源のより効率的な運用を図るために、看護師、パラメディカル（理学療法士、作業療法士等）、救命救急士などに対し、従来のものに比較してより充実した解剖教育をしようとする動きがある。また、画像診断と疾患の治療技術の進歩に伴い、３次元的な臓器の位置関係がより重視される傾向にある。このように、従来の解剖学教育に比較して今後その対象や要求が多様化することが予想されるが、従来の解剖実習で対応していくには教育資源に制限がある。対応策のひとつは、組織内の水分を樹脂に置換した永久標本の導入である。しかし、従来のシリコンを用いた方法は工程が煩雑で時間がかかり、また、組織によって細かいノウハウを使い分けねばならず、１９７０年代に実用化されながら現在に至るまで一般に普及していない。特に、脳は脂質に富んだ実質臓器で、さらに形状が複雑であり、脳組織内の水を他の溶液に置換することがその他の組織に比較して困難である。例えば、３０％まで段階的に濃度を上げたスクロース溶液への浸漬処理は、凍結切片を作製するための前処理として汎用されるが、ヒトに比べて単純なつくりのラット脳でも他の組織に比較して処理に時間がかかる。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、短時間で、かつ収縮を伴わないで生きた状態に近い形で保存が可能な生物組織硬化体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の生物組織硬化体の製造方法は、生物組織を、親水性の単官能性ビニルモノマー、親水性の多官能性ビニルモノマー、及び溶媒を組合せた混合溶液に含浸させた後、γ線、電子線、Ｘ線などに代表させる透過性の高い電離性放射線を照射することで重合させることを特徴とする。
【００１１】
前記親水性の単官能性ビニルモノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、及び２−ヒドロキシエチルメタクリレートの群から選択されることが好ましい。
【００１２】
また、前記親水性の多官能性ビニルモノマーが、
【化１】
0004963086.tif 000002
で示されるポリエチレングリコール♯６００ジメタクリレート、及び
【化２】
0004963086.tif 000003
で示されるポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレートの群から選択されることが好ましい。
【００１３】
前記混合溶液において、前記単官能性ビニルモノマー及び前記多官能性ビニルモノマーの合計のモノマー濃度が、１０〜４０ｖｏｌ％であることが好ましく、前記単官能性ビニルモノマーと前記多官能性ビニルモノマーの比率が、６：４〜８：２であることが好ましい。
【００１４】
前記電離性放射線の照射量が２０〜１００ｋＧｙであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって作製された生物組織硬化体は、従来のシリコン包埋体に比べてかなり軽くなり、扱い易く、さらには、収縮を伴わず優れた寸法安定性に加えて生きた状態に近い形で保存ができる。このため、今後予想される多彩な解剖学講義や実習への要望に応えることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
図１に、本発明に係る生物組織硬化体の製造方法の一実施形態について、フローシートを示す。
【００１７】
本実施形態では、生物組織をビニルモノマーに７日以内含浸して−７８℃で凍結もしくは液体状態とした後、γ線照射により生物組織をポリマー化して１日以内凍結乾燥し、生物組織硬化体とする。
【００１８】
（モノマー含浸）
生物組織中へのビニルモノマー類の含浸は、通常、低温（冷蔵庫中）で行う。含浸時間は、生物組織体の大きさにもよるが、１〜７日間で十分である。
【００１９】
即ち、生物組織中の水あるいはホルマリンと、後述する親水性の単官能性ビニルモノマーと多官能性ビニルモノマーおよび親水性溶媒の混合溶液とを置換し、低温（たとえば、ドライアイス温度）で生物組織とその中に注入されたモノマー類を凍結（モノマー：過冷却状態、水：結晶化状態）、もしくは低温状態（モノマー、溶媒：液体状態）にする。
【００２０】
（ビニルモノマー）
生物組織中に重合するビニルモノマーは、Ａ群の単官能性ビニルモノマー、Ｂ群の多官能性ビニルモノマーからなる群から選択される１種又は２種以上の混合物を使用することができる。
【００２１】
（１）Ａ群：
アクリル酸、メタクリル酸、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、及び２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどの群から選択される親水性の単官能性ビニルモノマーなどを挙げることができるが、電離性放射線で重合するものであれば種類は問わない。
（２）Ｂ群:
【化３】
0004963086.tif 000004
で示されるポリエチレングリコール♯６００ジメタクリレート、及び
【化４】
0004963086.tif 000005
で示されるポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレートなどの群から選択される親水性の多官能性ビニルモノマーなどを挙げることができるが、電離性放射線で重合するものであれば種類は問わない。
【００２２】
電離性放射線を利用して重合を行う場合、（１）〜（２）のモノマーは、水やエタノール、アセトンなどで希釈したものを用いてもよい。モノマー濃度が高い場合、モノマーが生物組織内部まで浸透するのに時間がかかるとともに、重合後の硬化体が堅固なものになることが予想される。したがって、モノマー濃度は水やアセトンなどに対し、１０〜４０ｖｏｌ％が好ましい。多官能性ビニルモノマーは、放射線照射とともに重合し、網目構造が付与されるために、生物組織硬化体に適当な強度を与え、かつ保存時の吸湿における膨潤を抑える効果が期待できる。しかし、多量の多官能性ビニルモノマーの使用は、生物組織を堅固なものにしてしまう。
【００２３】
Ａ群は単官能モノマーで、組織の中に入った状態で放射線照射をすることにより重合させるが、単官能モノマーのため重合体は柔らかく、膨潤してしまう。この膨潤を抑える役目としてＢ群のモノマーが必要となる。Ｂ群は多官能モノマーで、架橋剤モノマーと呼ばれている。結果的には、モノマー組成分中のＡ群モノマーが高いと得られた硬化体は柔らかすぎてしまい、逆にＢ群モノマーが高いと硬化体は堅くなってしまう。Ａ群：Ｂ群の比率の好ましい範囲は、６：４〜８：２である。
【００２４】
（重合）
生物組織中での上記ビニルモノマーの重合は、６０Ｃｏ、γ線を、ドライアイス温度（−７８℃）で２０〜１００ｋＧｙ照射する。照射後、凍結乾燥処理を施すことにより、生物組織硬化体が得られる。
【００２５】
例えば、１ｃｍ 角の立方体に裁断したブタ肝臓を２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／水（１４／６／８０ｖｏｌ％）の混合溶液に浸漬し、６０Ｃｏ線源からのγ線を−７８℃の低温で３０ｋＧｙ（線量率１０ｋＧｙ／ｈ）照射することにより、適当な強度を有し、収縮を伴わないで生きた状態に近い形で保存が可能な生物組織硬化体を得ることができる。
【００２６】
（対象となる生物組織）
本発明において対象となる生物組織は、ホルマリン等で固定処理をした人体及び各種動物の各種管腔臓器、実質臓器、筋組織などである。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
（実験例１〜６）
１０％ホルマリン/リン酸緩衝液に１週間以上浸漬固定した食用のブタ肝臓を１ｃｍ角の立方体に裁断し、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯６００ジメタクリレート／水の組成比が１００／０／０ｖｏｌ％（実験例１）、０／１００／０ｖｏｌ％（実験例２）、３０／２０／５０ｖｏｌ％（実験例３）、２０／３０／５０ｖｏｌ％（実験例４）、１４／６／８０ｖｏｌ％（実験例５）、７／３／９０ｖｏｌ％（実験例６）の混合溶液に満たされているガラス容器に入れ、冷蔵庫内において、４８時間浸漬した後、ブタ肝臓を取り出し、表面に付着しているモノマーを拭き取り、６０Ｃｏ線源からのγ線を−７８℃の低温、線量率１０ｋＧｙ／ｈの条件下で３０ｋＧｙ照射した。次に、照射したブタ肝臓を凍結乾燥処理し硬化体とした。得られたブタ肝臓硬化体の収縮性、およびカッターを用いて半分にカットした切断面の硬化度、均一度を観察した。
なお、収縮性は、湿潤状態の生物組織に対する硬化体の寸法変化で評価し、小：２％未満、中：２〜５％未満、大：５％以上の３段階評価とした。また、硬化度は、生物組織硬化体中に含浸されたポリマーの硬さの度合いで評価し、適、不適の２段階評価とした。更に、均一度は、生物組織硬化体内部のポリマー分散性で評価し、良、不良の２段階評価とした。その結果を表１に示す。
表１の結果より、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯６００ジメタクリレート／水の組成比が１４／６／８０ｖｏｌ％（実験例５）、７／３／９０ｖｏｌ％（実験例６）の混合溶液を用いた場合は、総合評価が合格となったが、それ以外の組成比の混合溶液を用いた場合は、総合評価が不合格であった。
【００２９】
（実験例７）
１０％ホルマリン/リン酸緩衝液に１週間以上浸漬固定した食用のブタ肝臓を１ｃｍ角の立方体に裁断し、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／水の組成比が、１４／６／８０ｖｏｌ％の混合溶液に満たされているガラス容器に入れ、冷蔵庫内において、４８時間浸漬した後、ブタ肝臓を取り出し、表面に付着しているモノマーを拭き取り、６０Ｃｏ線源からのγ線を−７８℃の低温、線量率１０ｋＧｙ／ｈの条件下で３０ｋＧｙ照射した。次に、照射したブタ肝臓を凍結乾燥処理し硬化体とした。得られたブタ肝臓硬化体の収縮性、およびカッターを用いて半分にカットした切断面の硬化度、均一度を観察した。その結果を表１に示す。
表１の結果より、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／水の組成比が１４／６／８０ｖｏｌ％の混合溶液を用いた場合は、総合評価が合格となった。
【００３０】
（実験例８〜１１）
１０％ホルマリン／リン酸緩衝液に１週間以上浸漬固定した食用のブタ肝臓を１ｃｍ角の立方体に裁断し、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／水の組成比が１４／６／８０ｖｏｌ％の混合溶液に満たされているガラス容器に入れ、冷蔵庫内において、４８時間浸漬した後、ブタ肝臓を取り出し、表面に付着しているモノマーを拭き取り、６０Ｃｏ線源からのγ線を−７８℃の低温、線量率１０ｋＧｙ／ｈの条件下で１ｋＧｙ（実験例８）、５ｋＧｙ（実験例９）、１０ｋＧｙ（実験例１０）、３０ｋＧｙ（実験例７）、６０ｋＧｙ（実験例１１）照射した。次に、照射したブタ肝臓を凍結乾燥処理し硬化体とした。得られたブタ肝臓硬化体の収縮性およびカッターを用いて半分にカットした切断面の硬化度、均一度を観察した。その結果を表１に示す。
表１の結果より、照射量が１〜１０ｋＧｙでは、総合評価は不合格であったが、３０ｋＧｙ以上照射することにより総合評価は合格となった。
【００３１】
（実験例１２〜１５）
１０％ホルマリン／リン酸緩衝液に１週間以上浸漬固定した食用のブタ肝臓を１ｃｍ角の立方体に裁断し、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／水の組成比が１４／６／８０ｖｏｌ％の混合溶液に満たされているガラス容器に入れ、冷蔵庫内において、１時間（実験例１２）、５時間（実験例１３）、１０時間（実験例１４）、２４時間（実験例１５）、４８時間(実験例７)浸漬した後、ブタ肝臓を取り出し、表面に付着しているモノマーを拭き取り、６０Ｃｏ線源からのγ線を−７８℃の低温、線量率１０ｋＧｙ／ｈの条件下で３０ｋＧｙ照射した。次に、照射したブタ肝臓を凍結乾燥処理し硬化体とした。得られたブタ肝臓硬化体の収縮性、およびカッターを用いて半分にカットした切断面の硬化度、均一度を観察した。その結果を表１に示す。
表１の結果より、浸漬時間が１〜１０時間までは総合評価は不合格であったが、２４時間以上で総合評価は合格となった。
【００３２】
（実験例１６〜１９）
１０％ホルマリン／リン酸緩衝液に１週間以上浸漬固定した食用のブタ肝臓を半分に裁断し、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／水の組成比が１０／１０／８０ｖｏｌ％（実験例１６）、１４／６／８０ｖｏｌ％（実験例１７）、１６／４／８０ｖｏｌ％（実験例１８）、１８／２／８０ｖｏｌ％（実験例１９）の混合溶液が満たされているガラス容器に入れ、冷蔵庫内において、７日浸漬した後、ブタ肝臓を取り出し、表面に付着しているモノマーを拭き取り、６０Ｃｏ線源からのγ線を−７８℃の低温、線量率１０ｋＧｙ／ｈの条件下で３０ｋＧｙ照射した。次に、照射したブタ肝臓を凍結乾燥処理し硬化体とした。得られたブタ肝臓硬化体の収縮性およびカッターを用いて半分にカットした切断面の硬化度、均一度を観察した。その結果を表１に示す。
表１の結果より、２−ヒドロキシエチルメタクリレート：ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレートの割合が１４／６〜１６／４の範囲では、総合評価は合格であったが、上記割合が１０／１０や１８／２の場合は、総合評価が不合格であった。
【００３３】
（実験例２０）
１０％ホルマリン／リン酸緩衝液に浸漬固定した脳を、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／水の組成比が１４／６／８０ｖｏｌ％の混合溶液が満たされているガラス容器に入れ、冷蔵庫内において、７日浸漬した後、脳を取り出し、表面に付着しているモノマーを拭き取り、６０Ｃｏ線源からのγ線を−７８℃の低温、線量率１０ｋＧｙ／ｈの条件下で３０ｋＧｙ照射した。次に、照射した脳を凍結乾燥処理し硬化体とした。得られた脳硬化体の収縮性、およびカッターを用いて半分にカットした切断面の硬化度、均一度の結果を表１に示す。また、図２及び図３にそれぞれ脳硬化体の外観、切断面の写真を示す。
表１の結果より、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／水の組成比が１４／６／８０ｖｏｌ％の混合溶液を用いた本実験例は、総合評価が合格となった。
【００３４】
（実験例２１）
１０％ホルマリン／リン酸緩衝液に浸漬固定した脳を、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／エタノールの組成比が１４／６／８０ｖｏｌ％の混合溶液が満たされているガラス容器に入れ、冷蔵庫内において、７日浸漬した後、脳を取り出し、表面に付着しているモノマーを拭き取り、６０Ｃｏ線源からのγ線を−７８℃の低温、線量率１０ｋＧｙ／ｈの条件下で３０ｋＧｙ照射した。次に、照射した脳を凍結乾燥処理し硬化体とした。得られた脳硬化体の収縮性、およびカッターを用いて半分にカットした切断面の硬化度、均一度を観察した。その結果を表１に示す。
表１の結果より、２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリエチレングリコール♯１０００ジメタクリレート／エタノールの組成比が１４／６／８０ｖｏｌ％の混合溶液を用いた本実験例は、総合評価が合格となった。
【表１】
0004963086.tif 000006
【産業上の利用の可能性】
【００３５】
本発明によって作製された生物組織硬化体は、全工程にかかる時間が短く、また、単一のプロトコルで脳を含めた全ての組織に対応でき、従来のシリコン包埋体に比べて簡便に作製できる。さらに、従来のものに比較して軽く、硬化後の加工が容易であることも利点である。このように、本発明で提唱する方法は、従来のものに比較して一般に普及させやすく、今後予想される多彩な解剖学講義や実習への要望に応えることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明に係る生物組織硬化体の製造方法の一実施形態を示すフローシートである。
【図２】実施例で得られた脳硬化体の外観写真である。
【図３】実施例で得られた脳硬化体の切断面写真である。
【図１】
0004963086.tif 000009
【図２】
0004963086.tif 000010
【図３】
0004963086.tif 000011