(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)に示すオリゴペプチド、または薬学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含有する、変異スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子を原因とする運動ニューロン疾患の治療及び/又は予防用医薬。
(a) Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(b) Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号１）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、変異スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子による神経細胞死抑制活性を有するオリゴペプチド
【請求項２】
以下の(a)又は(b)のオリゴペプチドをコードするDNAを有効成分として含有する、変異スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子を原因とする運動ニューロン疾患の治療及び/又は予防用医薬。
(a) Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(b) Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号１）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、変異スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子による神経細胞死抑制活性を有するオリゴペプチド
【請求項３】
運動ニューロン疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
運動ニューロン疾患の発症を遅延させ、運動ニューロン疾患患者の運動機能を改善させる効果を有する、請求項１又は２に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、運動ニューロン疾患、特には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療及び／又は予防用医薬に関する。
【背景技術】  筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）は、通常、中高年期に発症し、大脳、脳幹、脊髄の運動神経が選択的に侵される神経変性疾患である（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＤＷ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ＪＤ，２００１，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：８０６−８１９；Ｈａｎｄ  ＣＫ  ａｎｄ  Ｒｏｕｌｅａｕ  ＧＡ，２００２，Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ２５：１３５−１５９）。ＡＬＳは、外眼筋を除く全身の随意筋に筋萎縮、筋力低下を起こし最終的に呼吸不全に陥り、発症から通常３〜５年で死にいたる難病である。
リルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）は、これまで米国及び日本においてＡＬＳに対して認証された唯一の薬剤である。リルゾールはもともとグルタミン酸の放出を抑制する抗けいれん薬として開発されたが、幾つかの臨床試験ではＡＬＳ患者の延命にわずかな効果しか示さないと報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ  ＬＰ  ａｎｄ  Ｓｈｎｅｉｄｅｒ  ＮＡ，２００１，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４４，１６８８−１７００；Ｔｕｒｎｅｒ  ＭＲ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｏｎ  ＭＪ，２００１，Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２１：１６７−１７５）。また、繊毛性神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及びインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）を含む広範囲な因子が臨床試験で試されたが、成功には至っていない（Ｍｉｌｌｅｒ  ＲＧ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ３９：２５６−２６０）。従って、ＡＬＳに対して有効な治療薬が存在しないのが現状である。
ＡＬＳの約１０％は家族性（ＦＡＬＳ）で、この大部分は常染色体優性遺伝である。１９９３年、Ｒｏｓｅｎらは常染色体遺伝の家系の解析から、２１番染色体に存在するスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子を原因遺伝子として初めて特定した（Ｒｏｓｅｎ  ＤＲ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：５９−６２）。ＦＡＬＳの約２０％がＳＯＤ１遺伝子変異を原因としており、その変異の殆どはミスセンス点変異である。既に、ＳＯＤ１にはＦＡＬＳを引き起こす１００以上の変異が見い出されている（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＤＷ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ＬＤ，前掲）。また、複数のグループによって、ＦＡＬＳ関連変異ＳＯＤ１遺伝子が神経細胞死を誘引することが報告されている（Ｒａｂｉｚａｄｅｈ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：３０２４−３０２８；Ｄｕｒｈａｍ  ＨＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｎｅｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５６：５２３−５３０；Ｇｈａｄｇｅ  ＧＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｊ  Ｎｅｒｏｓｃｉ  １７：８７５６−８７６６等）。このように、変異ＳＯＤ１の過剰発現によって、インビトロで神経細胞死が誘導されることに加え、ＡＬＳ患者の脊髄でカスパーゼ３の活性化が観察されている。よって、神経細胞死抑制は、ＡＬＳに対する治療薬の開発における重要なターゲットとなる。
これまで、変異ＳＯＤ１の過剰発現による神経細胞死に対して抑制（拮抗）作用を示すものとして、先に述べたＣＮＴＦ、ＩＧＦ−Ｉ以外にＢｃｌ２、非特異的カスパーゼインヒビターｚＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｋｏｓｔｉｃ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５９−５６２；Ａｚｚｏｕｚ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９：８０３−８１１；Ｌｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：３３５−３３９）や新しく発見された劣性遺伝型ＦＡＬＳの原因遺伝子ＡＬＳ２の産物であるアリシン（ａｌｓｉｎ）等がある（Ｋａｎｅｋｕｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１９２４７−１９２５６）。
一方、ＡＤＮＦまたはＡＤＮＦ９（ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）は９個のアミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）からなる短いペプチドであり、もともとＧｏｚｅｓらによってＶＩＰで刺激したアストロサイトの培養培地から精製された（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ  ＤＥ  ａｎｄ  Ｇｏｚｅｓ  Ｉ，１９９６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９７：２２９９−２３０７；Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８５：６１９−６２７；Ｂｌｏｎｄｅｌ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０：８０１２−８０２０）。ＡＤＮＦはアミロイドβを含む幾つかの神経傷害による神経細胞死から神経細胞を保護することが示されている（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８５：６１９−６２７；Ｇｌａｚｎｅｒ  ＧＷ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７３：２３４１−２３４７）。ＡＤＮＦは、通常、低濃度、例えば、フェムトモル範囲で活性があり、ナノモル範囲以上でその保護効果が失われるというユニークな神経保護因子であるが、このユニークさがゆえ、抗アルツハイマー（ＡＤ）病薬として開発が断念されたという経緯がある。
従って、本発明は、ＡＬＳの病因となる神経細胞死を抑制し、筋萎縮性側索硬化症の治療に有効な医薬を提供することを課題とする。
【発明の開示】
本発明者らは、上記課題を解決すべき鋭意研究を重ねた結果、Ａｃｔｉｖｉｔｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ（以下、「ＡＤＮＦ」と称する）が、変異スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子によって誘導される神経細胞死を有意に抑制（拮抗）し、また、ＡＬＳのモデルマウスにおいて運動機能を改善し、ＡＬＳ発症を遅延させる作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）に示すオリゴペプチド、または薬学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含有する、運動ニューロン疾患の治療及び／又は予防用医薬。
（ａ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
（ｂ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、変異スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子による神経細胞死抑制活性を有するオリゴペプチド
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のオリゴペプチドの修飾オリゴペプチド
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴペプチドをコードするＤＮＡを有効成分として含有する、運動ニューロン疾患の治療及び／又は予防用医薬。
（ａ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
（ｂ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、変異スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子による神経細胞死抑制活性を有するオリゴペプチド
（３）運動ニューロン疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、（１）又は（２）に記載の医薬。
（４）運動ニューロン疾患の発症を遅延させ、運動ニューロン疾患患者の運動機能を改善させる効果を有する、（１）又は（２）に記載の医薬。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴペプチドと他のペプチドからなる融合ペプチド。
（ａ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
（ｂ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、変異スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子による神経細胞死抑制活性を有するオリゴペプチド
（６）他のペプチドが、細胞外分泌のためのシグナルペプチド及び／又は精製・検出用のタグペプチドである、（５）に記載の融合ペプチド。
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴペプチド、または（５）に記載の融合ペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
（ｂ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、変異スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子による神経細胞死抑制活性を有するオリゴペプチド
（８）（７）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（９）（８）に記載のＤＮＡにより形質転換された形質転換体。
（１０）（９）に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から発現させたオリゴペプチドを採取することを特徴とする、以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴペプチドの製造方法。
（ａ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
（ｂ）Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、変異スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子による神経細胞死抑制活性を有するオリゴペプチド
本発明はまた、上記の医薬製造のための上記（ａ）〜（ｃ）に示すオリゴペプチド、または薬学的に許容されるそれらの塩の使用；上記（ａ）〜（ｃ）に示すオリゴペプチド、または薬学的に許容されるそれらの塩の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む運動ニューロン疾患の治療方法も包含する。
【図面の簡単な説明】  図１（Ａ）は、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、野生型ＳＯＤ１遺伝子（ｗｔ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）の細胞死率を示す。図１（Ｂ）は、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、変異ＳＯＤ１遺伝子（Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）の細胞死率を示す。図１（Ｃ）は、ＡＤＮＦまたはＨＮＧの存在下または非存在下、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、野生型ＳＯＤ１遺伝子（ｗｔ−ＳＯＤ１）、変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，またはＧ９３Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）の細胞死率を示す。
図２Ａは、変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，またはＧ９３Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）に誘導された細胞死に対するＡＤＮＦの濃度依存的抑制効果を示す。また同図下は、免疫ブロットによるＳＯＤ１タンパクの発現量を示す。
図２Ｂは、変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，またはＧ９３Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（ＮＳＣ３４細胞）に誘導された細胞死に対するＡＤＮＦの濃度依存的抑制効果を示す。また同図下は、免疫ブロットによるＳＯＤ１タンパクの発現量を示す。
図３Ａは、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、１００ｎＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下で変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）に誘導された細胞死に対する、ウオートマニン（Ｗ）、ジェニスティン（Ｇ）、ＰＤ９８０５９（ＰＤ）、ＳＢ２０３５８０（ＳＢ）、ＡＧ４９０（ＡＧ）、ＫＮ９３（ＫＮ）、またはＨＡ１００４（ＨＡ）の影響を示す。また同図下は、免疫ブロットによるＳＯＤ１タンパクの発現量を示す。
図３Ｂは、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、１００ｎＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下で変異ＳＯＤ１遺伝子（Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）に誘導された細胞死に対する、ウオートマニン（Ｗ）、ジェニスティン（Ｇ）、ＰＤ９８０５９（ＰＤ）、ＳＢ２０３５８０（ＳＢ）、ＡＧ４９０（ＡＧ）、ＫＮ９３（ＫＮ）、またはＨＡ１００４（ＨＡ）の影響を示す。また同図下は、免疫ブロットによるＳＯＤ１タンパクの発現量を示す。
図３Ｃは、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、１００ｎＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下で変異ＳＯＤ１遺伝子（Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）に誘導された細胞死に対する、ウオートマニン（Ｗ）、ジェニスティン（Ｇ）、ＰＤ９８０５９（ＰＤ）、ＳＢ２０３５８０（ＳＢ）、ＡＧ４９０（ＡＧ）、ＫＮ９３（ＫＮ）、またはＨＡ１００４（ＨＡ）の影響を示す。また同図下は、免疫ブロットによるＳＯＤ１タンパクの発現量を示す。
図４Ａは、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、１００ｆＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下で変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）に誘導された細胞死に対するＫＮ９３またはＫＮ９２の影響を示す。また同図下は、免疫ブロットによるＳＯＤ１タンパクの発現量を示す。
図４Ｂは、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、１００ｆＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下で変異ＳＯＤ１遺伝子（Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）に誘導された細胞死に対するＫＮ９３またはＫＮ９２の影響を示す。また同図下は、免疫ブロットによるＳＯＤ１タンパクの発現量を示す。
図４Ｃは、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、１００ｆＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下で変異ＳＯＤ１遺伝子（Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）に誘導された細胞死に対するＫＮ９３またはＫＮ９２の影響を示す。また同図下は、免疫ブロットによるＳＯＤ１タンパクの発現量を示す。
図４Ｄは、１００ｎＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下で変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，またはＧ９３Ｒ−ＳＯＤ１）とキナーゼ不活型ＣａＭＫＩＩまたはキナーゼ不活型ＣａＭＫＩＶをＦ１１細胞に二重導入したときの細胞死を示す。
図５Ａは、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、１００ｆＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下で変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，またはＧ９３Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）に誘導された細胞死に対するＩＰＡＬペプチド（ＩＰＡＬＤＳＬＫＰＡＮＥＤＱＫＩＧＩＥＩ）の影響を示す。
図５Ｂは、コントロールベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｖｅｃｔｏｒ）、種々の濃度のＡＤＮＦ（ＳＡＬＬＲＳＩＰＡ）またはＡＤＮＦ８（ＡＬＬＲＳＩＰＡ）の存在下で変異ＳＯＤ１遺伝子（Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１）を導入した神経細胞株（Ｆ１１細胞）の細胞死率を示す。
図６は、Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１トランスジェニックマウスの運動機能に対するＡＤＮＦ  ｉｃｖ注入の影響を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年４月８日に出願された米国仮出願６０／５６０，２５４号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
１．本発明の医薬
本発明の医薬の有効成分であるオリゴペプチドは、Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである。
上記オリゴペプチドは、変異スーパーオキシドジスムターゼ１（以下、「変異ＳＯＤ１」と記載する）遺伝子による神経細胞死抑制活性を有する限りにおいて、上記のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加された変異オリゴペプチドをも含む。上記の「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸を意味する。
他のアミノ酸への置換としては、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ）、親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）間の置換などが含まれうる。但し、これらは置換の好ましい具体例を例示したものにすぎず、変異ＳＯＤ１遺伝子による神経細胞死抑制活性を維持する限りは他のアミノ酸で置換することも可能である。
また、上記の変異ＳＯＤ１遺伝子とは、野生型ヒトＳＯＤ１のアミノ酸配列（配列番号５）において、開始コドン（Ｍｅｔ）の次のＡｌａを１位として数えて４位（配列番号５では５位）のＡｌａがＴｈｒに置換したＳＯＤ１、８５位（配列番号５では８６位）のＧｌｙがＡｒｇに置換したＳＯＤ１、９３位（配列番号５では９４位）のＧｌｙがＡｒｇに置換したＳＯＤ１をそれぞれコードする遺伝子をいう。
また、上記のオリゴペプチド、その改変オリゴペプチドは、化学的修飾及び生物学的修飾されていてもよい。修飾の例としては、例えば、アルキル化、エステル化、ハロゲン化、又はアミノ化などの官能基導入、酸化、還元、付加、又は脱離などによる官能基変換、糖化合物（単糖、二糖、オリゴ糖、若しくは多糖）又は脂質化合物などの導入、リン酸化、あるいはビオチン化などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
上記の改変オリゴペプチド又は修飾オリゴペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むオリゴペプチドと同等の変異ＳＯＤ１遺伝子による細胞死抑制活性を有することは、本明細書の実施例に詳細かつ具体的に記載した試験方法によって、又は上記試験方法に適宜の改変や修飾を加えることにより、当業者が容易に確認することができる。
上記の各種オリゴペプチド（以下、オリゴペプチドには改変オリゴペプチドや修飾オリゴペプチドも含むものとする）は遊離形態であってもよいが、酸付加塩又は塩基付加塩であってもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの鉱酸塩；クエン酸塩、シュウ酸酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩；アンモニウム塩；メチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩などの有機アンモニウム塩を挙げることができる。
さらに、これらのオリゴペプチド又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合がある。
上記オリゴペプチドは、公知のペプチド合成の常法に従って合成できる。例えば「ザ．ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」第１巻（１９６６年）［Ｓｃｈｒｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｈｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．］、あるいは「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）］の記載に従い、具体的には、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（Ｐ−ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法など）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アディティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法など、各種の方法により合成することができる。これらの方法は、固相合成及び液相合成のいずれにも適用できる。
固相法では市販の各種ペプチド合成装置を利用することができる。必要に応じて、官能基の保護及び脱保護を行うことにより効率的に合成を行うことができる。保護基の導入及び脱離方法については、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（１９８１年）などを参照することができる。
得られたオリゴペプチドは、通常の方法に従い脱塩、精製することができる。例えば、ＤＥＡＥ−セルロースなどのイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０、セファデックスＧ−２５などの分配クロマトグラフィー、シリカゲルなどの順相クロマトグラフィー、ＯＤＳ−シリカゲルなどの逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。
上記オリゴペプチドは、変異ＳＯＤ１遺伝子による神経細胞死を抑制し、神経細胞保護作用を有する。また、上記オリゴペプチドの神経保護作用は、ＩＰＡＬペプチドにより阻害されないこと（後記実施例５）、また、該オリゴペプチドのＮ末のアミノ酸の１個を欠失させてもその作用が示されたこと（後記実施例６）から、従来報告されるアミロイドβ傷害による神経細胞死に対する拮抗作用とは異なる機序（新しい機序）によるものである。
従って、該オリゴペプチドは変異ＳＯＤ１遺伝子による神経細胞死に起因して運動ニューロン機構が破綻する疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に対して用いると、神経細胞死を抑制することによって、該疾患の治療を行うことができる。本明細書において、「運動ニューロン疾患」とは、運動を制御する身体の上位および下位運動ニューロンに進行性、退行性障害をきたす神経変性疾患をいう。代表的には筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられ、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ：ウェルデニッヒ・ホフマン病、ケーベルベルク・ウェランダー病）、球脊髄性筋萎縮症（ＢＳＭＡ：ケネディ・オルター・スン症候群）などが含まれるが、これらに限定はされない。本発明の医薬は上記運動ニューロン疾患の発症を防止または遅延する予防剤としての作用、及び／又は運動ニューロン疾患を正常な状態に回復させる治療剤としての作用を有している。本発明の医薬はまた、運動ニューロン疾患に起因する病態の改善に有効である。病態の改善とは、例えば、筋萎縮、筋力低下、球麻痺（顔面・咽頭、舌の筋萎縮、筋力低下、それによる言語障害、嚥下障害）、筋肉の線維束性収縮、呼吸障害の改善をいう。
本発明の医薬は、上記オリゴペプチドの精製標品を、公知の種々の方法にて各種製剤形態に調製し、医薬組成物として提供することができる。本発明の医薬を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤などに製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。また、医薬組成物中、有効成分であるオリゴペプチドの含有量は、例えば０．１〜１０重量％程度とすればよい。
本発明の医薬は、前述の疾患の予防治療薬剤として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して非経口的にまたは経口的に安全に投与することができる。本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により適宜変更しうる。例えば、オリゴペプチドの有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組み合わせとして投与される量は、例えば、１日につき体重１ｋｇあたり１〜５００μｇの範囲内である。
また、本発明の医薬の有効成分は上記オリゴペプチドをコードするＤＮＡ（遺伝子）であってもよい。上記オリゴペプチドをコードする遺伝子を上記疾患に対する遺伝子治療剤として使用する場合は、該遺伝子を注射により直接投与する方法のほか、該遺伝子が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、上記遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を用いてもよい。
遺伝子治療剤の投与形態としては、大腿四頭筋、大臀筋等への局所投与、あるいは、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のいずれでもよいが、局所投与が好ましい。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態を採用することもできる。
２．オリゴペプチドをコードするＤＮＡの発現系
本発明の医薬に使用する上記オリゴペプチドはまた、通常の遺伝子工学的手法に従って生産することもできる。すなわち、上記オリゴペプチドをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを作製し、該ベクターにより形質転換された微生物（形質転換体）を調製し、該形質転換体を培養した培養物から所望のオリゴペプチドを分離・精製することができる。
かかる遺伝子工学的手法によるオリゴペプチド生産にあたり、上記オリゴペプチドのＮ末端に細胞外分泌のためのシグナルペプチドを付加した融合ペプチドの形で発現させることにより、該オリゴペチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。さらに、該シグナルペプチドとオリゴペプチドの間、またはオリゴペプチドのＣ末端に、精製・検出用のタグを付加することもできる。
融合タンパク質を作製する方法は、上記オリゴペプチドをコードするＤＮＡと他のペプチドをコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、すでに公知の手法を用いることができる。
シグナルペプチドとしては、宿主細胞の種類に応じて公知の任意の分泌タンパク質のシグナルペプチドを用いることができるが、例えば、動物細胞を用いる場合、各種サイトカインなどの増殖分化因子やそのレセプターなどのＮ末端に存在するシグナルペプチドなどが挙げられる。
また、精製・検出用のタグとしては、当該分野において公知のものを用いることができ、例えば、ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ＶＳＶ−ＧＰの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ等が挙げられる。
これらペプチド配列をコードするＤＮＡを挿入物として含有するベクター各宿主（大腸菌、酵母、動物細胞）は市販されている。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに上記オリゴペプチドをコードする遺伝子を連結することにより得ることができる。該遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに上記遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
上記オリゴペプチドをコードするＤＮＡは、そのＤＮＡの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、上記ＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的とするＤＮＡが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、前記遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属に属する細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母；サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ヒトＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等の動物細胞が挙げられる。
組換えベクターの宿主の導入方法としては、宿主の種類に応じて、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、酢酸リチウム法、リポフェクション法、ウイルス法等が挙げられる。また、上記の各宿主細胞への遺伝子導入は、組換えベクターによらない方法、例えばパーティクルガン法なども用いることができる。
オリゴペプチドは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養後、オリゴペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより該オリゴペプチドを抽出する。また、オリゴペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的とするオリゴペプチドを単離精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
なお、以下の実施例において記載する神経細胞株を用いたすべての実験は、独立した導入と処理を少なくとも３回繰り返したもので、各々基本的に同じ結果を得た。統計解析は一方向ＡＮＯＶＡとそれにつづくＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔにて実施され、ｐ＜０．０５を有意と評価した。
また、動物実験については、北米神経学会の動物及びヒト使用法則（Ｐｏｌｉｃｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、慶應大学動物実験委員会の実験動物の使用と飼育ガイドライン（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ＫＥＩＯ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に従って実施した。すべての実験手順については慶應大学実験動物委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｔ  ＫＥＩＯ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の許可を得た。
【実施例１】変異ＳＯＤ１遺伝子により誘導される神経細胞死のＡＤＮＦによる抑制
（１）試験材料
野生型ＳＯＤ１のｃＤＮＡ（配列番号４）、変異ＳＯＤ１（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１、Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１、Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１）のｃＤＮＡは東京大学医学部辻省次博士から譲与された。キナーゼ不活型ＣａＭＫＩＩとＣａＭＫＩＶ  ｃＤＮＡはＵＳスタンフォード大学のハワード、シュルマン博士から譲与された。ＡＤＮＦ（ＳＡＬＬＲＳＩＰＡ：配列番号１）、ＡＤＮＦ８（ＡＬＬＲＳＩＰＡ：配列番号２）は合成した（Ｇｌａｚｎｅｒ  ＧＷ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７３：２３４１−２３４７）。ＩＰＡＬペプチド（ＩＰＡＬＤＳＬＫＰＡＮＥＤＱＫＩＧＩＥＩ：配列番号３），Ｚａｍｏｓｔｉａｎｏ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２６４：９−１２）はペプチド研（大阪）から購入した。抗ＳＯＤ１抗体はＭＢＬ（名古屋）から購入した。ＰＤ９８０５９，ＳＢ２０３８０，ＡＧ４９０，ＫＮ９３，ＫＮ９２，ＨＡ１００４はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳＡ）から購入した。
ラット胎児１３日（Ｅ１３）の初代培養神経細胞とマウス神経芽腫細胞ＮＴＧ１８のハイブリッド細胞であるＦ１１細胞は、１８％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）と既報の抗生物質（Ｐｌａｔｉｋａ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：３４９９−３５０３；Ｙａｍａｔｓｕｊｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１３４９−１３５２；Ｈｕａｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６：１０６９−１０７８；Ｎｉｉｋｕｒａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２１：１９０２−１９１０）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で培養した。
ＮＳＣ３４細胞は運動神経系のマウス胎児脊髄初代培養細胞とマウス神経芽腫細胞ＮＴＧ１８のハイブリッド細胞で、１０％ＦＢＳと抗生物質（Ｃａｓｈｍａｎ  ＮＲ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  １９４：２０９−２２１；Ｄｕｒｈａｍ  ＨＤ，ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １４：３８７−３９５）を含むＤＭＥＭ培地で培養した。
（２）試験方法
（２−１）神経細胞死試験
上記Ｆ１１細胞（７ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，６−ｗｅｌｌプレート，Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（１８％ＦＢＳ）培地で１２−１６時間培養）に野生型ＳＯＤ１遺伝子または変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ，Ｇ８５Ｒ，Ｇ９３Ｒ）をリポフェクション（ＳＯＤ１遺伝子  ０．５μｇ；ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  １μｌ；ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ，２μｌ）で無血清下３時間の条件で導入し、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（１８％ＦＢＳ）で２時間培養した。培地をＡＤＮＦ存在下または非存在下のＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２（１０％ＦＢＳ）に交換し、導入から７２時間後、細胞死率を既報のトリパンブルー排除法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：９２３５−９２４５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６３３６−６３４１）で測定することよって得た。
また、上記ＮＳＣ３４細胞（７ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，６−ｗｅｌｌプレート，ＦＢＳ１０％  ＤＭＥＭ培地で１２−１６時間培養）に野生型ＳＯＤ１遺伝子または変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ，Ｇ８５Ｒ，Ｇ９３Ｒ）をリポフェクション（ＳＯＤ１遺伝子０．５μｇ；ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  １μｌ；ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ，２μｌ）で無血清下３時間の条件で導入し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）で２１時間培養し、さらに４８時間後、Ｎ２サプリメント（インヴィトロジェン）を加えたＤＭＥＤで培養した。導入から７２時間後、細胞死率を同様にトリパンブルー排除法で測定することによって得た。
（２−２）免疫ブロット解析
免疫ブロット解析を、既報に従い（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，前掲２報）、実施した。野生型ＳＯＤ１遺伝子または変異ＳＯＤ１遺伝子のタンパク発現を調べるため、各ＳＯＤ１遺伝子導入細胞の溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（２０μｇ／ｌａｎｅ）。ＰＶＤＦシートに電気的にブロットした後、通常の方法でブロッキングし、抗ＳＯＤ１抗体と反応させ、１：５０００希釈でホースラディッシュ−パーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）と反応させた。抗体と反応したバンドをＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で検出した。
（３）結果
（３−１）Ｆ１１細胞への変異ＳＯＤ１遺伝子導入による神経細胞死誘導の確認
Ｆ１１細胞に、０．２５μｇ，０．５μｇ，または１．０μｇの野生型ＳＯＤ１（ｗｔ  ＳＯＤ１）ｃＤＮＡ、または変異ＳＯＤ１（Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１）ｃＤＮＡを導入し、７２時間後、細胞死率をトリパンブルー排除法により測定した。コントロールとしてベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ｖｅｃｔｏｒ）を用いた。０．２５μｇまたは０．５μｇ野生型ＳＯＤ１  ｃＤＮＡの導入による細胞死率は約１０％であり、コントロールベクターを導入したものと同様であったが、１μｇ導入により、細胞死率は４５％となり、たとえ野生型であっても過剰発現させると細胞死が起こることがわかった（図１（Ａ））。一方、０．２５μｇ  Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１  ｃＤＮＡの導入による細胞死率は１７％で、ややコントロールベクター導入より高く、０．５μｇ、１．０μｇのＧ８５Ｒ−ＳＯＤ１  ｃＤＮＡ導入による細胞死率は、各々５０、６０％という値であった（図１（Ｂ））。以上の結果に基づいて、Ｆ１１細胞の細胞死を誘導するための３種の変異ＳＯＤ１遺伝子導入ｃＤＮＡ量は、０．５μｇと決めた。
（３−２）変異ＳＯＤ１遺伝子により誘導された神経細胞死に対するＡＤＮＦの効果
変異ＳＯＤ１遺伝子により誘導された神経細胞死に対するＡＤＮＦの効果を試験した。また、比較として、Ｓ１４Ｇ  Ｈｕｍａｎｉｎ（ＨＮＧ）を用いた。Ｓ１４Ｇ−ＨＮ（ＨＮＧ）は複数のアルツハイマー病関連傷害による神経細胞死を防ぐが、変異ＳＯＤ１遺伝子による神経細胞死を防ぐことができなかったと報告されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，前掲２報）。
Ｆ１１細胞に、１００ｆＭ  ＡＤＮＦまたは１０ｎＭ  ＨＮＧの存在下または非存在下で、野生型ＳＯＤ１遺伝子、変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１、Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１、Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１）（０．５μｇ）を導入し、７２時間後、細胞死率をトリパンブルー排除法により測定した。コントロールとしてベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ｖｅｃｔｏｒ）を用いた。
変異ＳＯＤ１遺伝子の導入により、４０〜５０％の細胞死が起こった（図１（Ｃ））。一方、コントロールベクターの導入によってはわずか１０％の細胞死が起こるのみであった。１００ｆＭのＡＤＮＦを加えると、これら変異ＳＯＤ１遺伝子による細胞死はコントロールレベルまで下がった。これに対して、１０ｎＭ  ＨＮＧは、変異ＳＯＤ１遺伝子による細胞死を低下させることはできなかった（図１（Ｃ））。
【実施例２】ＡＤＮＦによる神経細胞死抑制の濃度依存的効果
Ｆ１１細胞またはＮＳＣ３４細胞を用いて、変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１、Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１、Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１）の導入により誘導される神経細胞死に対するＡＤＮＦの濃度依存的効果を確かめた。
Ｆ１１細胞またはＮＳＣ３４細胞に、ｐＥＦ−ＢＯＳ，Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１またはＧ９３Ｒ−ＳＯＤ１  ｃＤＮＡを導入し、ＡＤＮＦの濃度を（１０ａＭ，１ｆＭ，１００ｆＭ，１０ｐＭ，１ｎＭ，１００ｎＭ）増加させ、７２時間後、細胞死率をトリパンブルー排除法により測定した。
１０ａＭのＡＤＮＦでは細胞死抑制がほとんどなかったが、１００ｆＭのＡＤＮＦは完全にこれら３種類の変異ＳＯＤ１遺伝子による細胞死率をコントロールレベルまで減少させた（図２Ａ）。このとき、変異ＳＯＤ１遺伝子による細胞死に対するＡＤＮＦの完全な保護作用は、１０ｎＭ以上でも認められた。これらの結果から、変異ＳＯＤ１遺伝子による神経細胞死に対するＡＤＮＦの抑制活性は、濃度依存的であることがわかった。
また、ＮＳＣ３４細胞を用いた実験でも、同様に１００ｆＭ  ＡＤＮＦで３種類の変異ＳＯＤ１遺伝子による神経細胞死を完全に抑制できることがわかった（図２Ｂ）。Ｆ１１細胞の場合と同様に、神経細胞死に対するＡＤＮＦの抑制活性は濃度依存的であり、その効果は１０ｎＭ以上でも減少することはなかった。
さらに、いずれの細胞を用いた試験においても、ＳＯＤ１遺伝子の発現レベルは、ＡＤＮＦ処理によって影響されないことを確認した。
ＡＤＮＦは１０ｎＭ以上でその神経細胞保護作用が消失することが報告されている（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９７：２２９９−２３０７．；Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８５：６１９−６２７）。この結果と一致して、本発明者らもＡＤＮＦがアミロイドβ傷害や変異ＡＰＰ遺伝子などのアルツハイマー病関連傷害に対する神経細胞死に対しては、ｎＭ濃度以上でその細胞死抑制活性が低減することを確認している（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６３３６−６３４１）。
従って、本試験で確認された、変異ＳＯＤ１による神経細胞死に対するＡＤＮＦの濃度依存的な神経細胞保護効果は、アミロイドβ神経毒性に対するものとは異なると考えられた。
【実施例３】ＡＤＮＦの神経保護作用に関する解析
ＡＤＮＦによる細胞内シグナル伝達を調べた。Ｆ１１細胞に、ｐＥＦ−ＢＯＳ、または変異ＳＯＤ１（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１）ｃＤＮＡを導入し、１００ｎＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下で、１０ｎＭのウオートマニン（ＰＩ３キナーゼ阻害剤）、１００μＭジェネスティン（タイロシンキナーゼ阻害剤）、５０μＭ  ＰＤ９８０５９（ＭＥＫ阻害剤）、２０μＭ  ＳＢ２０３５８０（ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤）、１μＭ  ＡＧ４９０（ＪＡＫキナーゼ阻害剤）、５μＭ  ＫＮ９３（カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ阻害剤）、または１０μＭ  ＨＡ１００４（プロテインキナーゼＡ阻害剤）を反応させた。導入から７２時間後、細胞死率をトリパンブルー排除法により測定した
Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１における結果をそれぞれ図３Ａ〜Ｃに示す。
ＡＤＮＦによる神経保護作用はウオートマニン（Ｗ）、ＰＤ９８０５９（ＰＤ），ＳＢ２０３５８０（ＳＢ），ＡＧ４９０（ＡＧ），ＨＡ１００４（ＨＡ）に影響されなかったが、ジェネスティン（Ｇ）、ＫＮ９３（ＫＮ）によって抑制された（図３Ａ〜Ｃ）。このことは、ＡＤＮＦは何らかのチロシンキナーとカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ（ＣａＭＫ）を介して神経保護作用を発揮し、ＰＩ３キナーゼ、ＭＥＫ，ｐ３８ＭＡＰＫ，ＪＡＫ２、ＰＫＡを活性化してその神経保護作用を発揮しないことを示唆した。
【実施例４】ＡＤＮＦシグナル経路下流におけるＣａＭＫＩＶの介在
ＡＤＮＦの神経保護作用に対するＫＮ９３の影響を調べた。Ｆ１１細胞に、ｐＥＦ−ＢＯＳ、または変異ＳＯＤ１（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１）ｃＤＮＡを導入し、１００ｆＭ  ＡＤＮＦ存在下または非存在下、ＫＮ９３（１０ｎＭ，５０ｎＭ，１００ｎＭ，５００ｎＭ，１μＭ，または５μＭ）またはＫＮ９３の不活型物質であるＫＮ９２（５μＭ）を反応させた。導入から７２時間後、細胞死率をトリパンブルー排除法により測定した
Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１における結果をそれぞれ図４Ａ〜Ｃに示す。
ＡＤＮＦによる神経保護作用は５０ｎＭのＫＮ９３によって部分的に抑制され、１μＭでほぼ完全に抑制された。また、ＫＮ９３はいずれの濃度においてもコントロールレベルの細胞死率に影響を与えなかった。予想どおり、不活型のＫＮ９２は５μＭですら、ＡＤＮＦの活性に影響を与えなかった。免疫ブロットで検出した変異ＳＯＤ１のタンパクの発現も、ＫＮ９３またはＫＮ９２により影響を受けなかった。このＫＮ９３の濃度依存的阻害はＡ４Ｔ−ＳＯＤ１、Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１、Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１のいずれの導入細胞にも同様に観察された（図４Ａ〜Ｃ）。
次に、ＡＤＮＦの神経保護作用に対するキナーゼ不活型ＣａＭＫＩＩまたはキナーゼ不活型ＣａＭＫＩＶの影響を調べた。
ＮＳＣ３４細胞に、ｐＳＲ−ａｌｐｈａ，Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１またはＧ９３Ｒ−ＳＯＤ１  ｃＤＮＡとｐＳＲ−ａｌｐｈａ，キナーゼ不活型ＣａＭＫＩＩ，またはキナーゼ不活型ＣａＭＫＩＶを導入し、この細胞をさらに１００ｎＭのＡＤＮＦの存在下又は非存在下で培養した。導入から７２時間後、細胞死率を測定した。
コントロールベクターもキナーゼ不活型ＣａＭＫＩＩもＡＤＮＦの神経保護作用に影響を与えなかった。これに対して、キナーゼ不活型ＣａＭＫＩＶはＡＤＮＦの神経保護作用を抑制した（図４Ｄ）。これにより、ＣａＭＫＩＩではなくＣａＭＫＩＶがＡＤＮＦシグナル経路の下流に存在していることが示唆された。また、キナーゼ不活型ＣａＭＫＩＩもキナーゼ不活型ＣａＭＫＩＶもコントロールレベルの細胞死率には影響を与えなかった。
【実施例５】ＦＡＬＳ関連傷害に対するＡＤＮＦ神経保護作用と、アミロイドβ傷害に対する保護作用との相違
ＩＰＡＬペプチド（ＩＰＡＬＤＳＬＫＰＡＮＥＤＱＫＩＧＩＥＩ：配列番号３）はアミロイドβによる細胞死に対するＡＤＮＦの保護作用を阻害することが報告されている（Ｚａｍｏｓｔｉａｎｏ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２６４：９−１２）。そこで、変異ＳＯＤ１遺伝子による細胞死に対するＡＤＮＦの保護作用にＩＰＡＬペプチドがどのように影響するかを確かめた。
Ｆ１１細胞に、ｐＥＦ−ＢＯＳ、または変異ＳＯＤ１遺伝子（Ａ４Ｔ−ＳＯＤ１，Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１，Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１）ｃＤＮＡを導入し、１０μＭのＩＰＡＬペプチド存在下で１００ｆＭ  ＡＤＮＦを反応させ、導入から７２時間後、細胞死率を測定した。ＩＰＡＬペプチドは３つの変異ＳＯＤ１遺伝子による細胞死に対するＡＤＮＦの抑制活性を阻害せず、また、変異ＳＯＤ１遺伝子による細胞死に影響を与えなかった（図５Ａ）。また。この時、ＩＰＡＬペプチド自体は、コントロールレベルの細胞死に影響を与えなかった。
【実施例６】ＡＤＮＦのＮ末欠失体の効果
ＡＤＮＦ８（ＡＬＬＲＳＩＰＡ：配列番号２）はＡＤＮＦのＮ末端アミノ酸が１残基欠除したものであるが、アミロイドβまたはＴＴＸによる神経細胞死に対して、何の抑制効果もないと報告されている（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８５：６１９−６２７）。そこで、Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１が起こす細胞死に対するＡＤＮＦ８の効果を確かめた。
Ｆ１１細胞に、ｐＥＦ−ＢＯＳまたはＧ９３Ａ−ＳＯＤ１  ｃＤＮＡを導入し、ＡＤＮＦ（ＳＡＬＬＲＳＩＰＡ）またはＡＤＮＦ８（ＡＬＬＲＳＩＰＡ）を種々の濃度で反応させ、導入から７２時間後、細胞死率を測定した。ＡＤＮＦ８は、Ｇ９３Ｒ−ＳＯＤ１による細胞死を１０ｐＭで完全に抑制し、変異ＳＯＤ１遺伝子による神経細胞死抑制に効果があったが、その効果はＡＤＮＦに比べると１００倍低いことがわかった（図５Ｂ）。
【実施例７】ＡＬＳモデル動物による運動能力試験
（１）使用動物
９３位にＧｌｙからＡｌａへの変異（Ｇ９３Ａ）を有する、ヒトＦＡＬＳ関連変異ＳＯＤ１遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（Ｔｇ）マウス（以下、「Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１  Ｔｇマウス」と称する）はＡＬＳのモデルマウスとして最も確立されたものである（Ｇｕｒｎｅｙ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１７７２−１７７５；Ｇｕｒｎｅｙ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １５２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ６７−７３）。Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１  Ｔｇマウスは、正常に生まれた後、全例ヒトＡＬＳと極めて似た症状を発症し、急速に死に至る。Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１  ＴｇマウスはヒトＡＬＳに臨床的にも病理学的にも似ている運動神経細胞退行を発症し、これまで世界的にもＡＬＳの最も優れたモデルとされており、ＡＬＳ患者のための有効な候補薬を同定するために使用されている。
（２）試験方法
上記モデルマウスを使って、Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１による神経毒性に対するＡＤＮＦの効果をｉｎ  ｖｉｖｏで確かめた。
Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１  ＴｇマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１  Ｔｇマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．）との交配によりヘミ接合体マウスとして維持した。マウスはＳＰＦ室（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ  ａｎｉｍａｌ  ｆａｃｉｌｉｔｙ；２３±１℃、５５±５％湿度）で１２時間  明／暗サイクル（７：００ＡＭ−７：００ＰＭ）で飼育した。ガンマー線照射したＰｉｃｏｌａｂ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ２０（ＰＭＩ  Ｆｅｅｄｓ  Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と次亜硫酸ナトリウム（５ｐｐｍ）入り無菌脱イオン蒸留水を自由に与えた。
Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１  Ｔｇマウスを生後１０週間目に腹腔内注射により１０％ネブタール（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  ６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、定位装置手術台上でマウス用Ｃ３１５ＧＳ−４カニューラシステム（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｒｏａｎｏｋｅ，ＶＡ）を無菌下でマウス左脳室に頭蓋骨にドリルで穴をつくることにより移植した。カニューラを手術用接着剤と歯科用セメントにより固定した。生後８０日目にマウスを無作為に生理食塩水（コントロール）投与群（ｎ＝８）とＡＤＮＦ投与群（ｎ＝１１）に分け、前者には生理食塩水３μｌを、後者には３μｌの３０ｎｍｏｌ  ＡＤＮＦを各日実験終了時まで脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入した。注入は、カニューラチューブ（Ｃ２３２，ＰＥ５０／Ｔｈｉｎ  ｗａｌｌ，Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｏｎｅ）によってハミルトンシリンジに繋いだＣ３１５ＩＳ−４内カニューラ（ハミルトンシリンジ）によって行った。
運動機能（モーターパーフォーマンス）は毎週ローターロッド（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．）により評価した。カニューラの移植後、マウスを２日間ローターロッドに慣れさせた。マウスを５ｒｐｍで回転する枝に載せ、留まることのできる時間を自動的に検出した。マウスが７分間ロッド上に留まれば、スコア７分としてテストを終えるプロトコールとした（Ｌｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：３３５−３３９；Ｋａｓｐａｒ  ＢＫ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：８３９−８４２）。病気発症の定義として、マウスがローターロッドに７分間留まれなくなった１日目を病気発症とした。
また、死亡の定義として、マウスを仰向けにして３０秒以内に元に戻れない時を死亡とした（Ｌｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，前掲）。
（３）結果
ＡＤＮＦ処理したＡＬＳマウスは１６週目で有意にコントロールマウスよりモーターパフォーマンスが良く、ＡＤＮＦで処理したマウスは運動機能の低下を起こさず維持したことを示唆している（図６）。しかしながら、このコントロールマウスとＡＤＮＦ処理マウスの差は、後に１８〜２０週で消失した。
また、生理食塩水投与群とＡＤＮＦ投与群における発症日数と生存日数は、下記表１を示す。
【表１】
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生理食塩水投与群とＡＤＮＦ投与群では、病気発症についての有意差は得られなかったものの、遅れる傾向にあった。ＡＬＳコントロールマウスの平均生存日数およびＡＤＮＦ処理群の平均生存日数は各々、１５６．８±３．５日、１５５．３±３．７日であり、生存率には違いのないことが確認された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、変異スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子によって誘導される神経細胞死を有意に抑制（拮抗）し、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）をはじめとする運動ニューロン疾患の発症を遅延させ、運動ニューロン疾患患者の運動機能を改善させる効果を有する医薬が提供される。従って、本発明の医薬は、運動ニューロン疾患を治療及び／又は予防に有用である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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