(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエートを産生するための方法であって、以下の工程：
ビシナルジオールデヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３−ホスファターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉを提供する工程；
該Ｅ．ｃｏｌｉによって発現される酵素によって、３−ヒドロキシプロピオネートモノマーまたは３−ヒドロキシバレレートモノマーに変換され得るジオールを提供する工程；および
３−ヒドロキシプロピオネートまたは３−ヒドロキシバレレートが、重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成する条件下で、該Ｅ．ｃｏｌｉを培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記Ｅ．ｃｏｌｉが、１つ以上の前記酵素をコードするプラスミドで遺伝子操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｅ．ｃｏｌｉが、前記酵素をコードする遺伝子を染色体へ組み込むために遺伝子操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ジオールが、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、およびグリセロールからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記デヒドラターゼが、グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を提供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７】
ポリヒドロキシアルカノエートを産生するための系であって、
ビシナルジオールデヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３−ホスファターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉを包含し、
ここで、該Ｅ．ｃｏｌｉが、重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成する、３−ヒドロキシプロピオネートモノマーまたは３−ヒドロキシバレレートモノマーに、ジオールを変換し得る、系。
【請求項８】
前記Ｅ．ｃｏｌｉが、１つ以上の前記酵素をコードするプラスミドで遺伝子操作される、請求項７に記載の系。
【請求項９】
前記Ｅ．ｃｏｌｉが、前記酵素をコードする遺伝子を染色体へ組み込むために遺伝子操作される、請求項７に記載の系。
【請求項１０】
補酵素Ｂ−１２をさらに包含する、請求項７に記載の系。
【請求項１１】
前記ビシナルジオールデヒドラターゼが、グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼからなる群より選択される、請求項７に記載の系。
【請求項１２】
酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項７に記載の系。
【請求項１３】
３−ヒドロキシプロピオン酸を産生するための方法であって、以下の工程：
３−ヒドロキシプロピオネートを産生するのに有効な、ビシナルジオールデヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３−ホスファターゼからなる群より選択される１以上の酵素を発現するように遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉを提供する工程；
該Ｅ．ｃｏｌｉによって発現される酵素によって、３−ヒドロキシプロピオネートに変換され得るポリオール基質を提供する工程；および
３−ヒドロキシプロピオネートが産生される条件下で該Ｅ．ｃｏｌｉを培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記基質が、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、グリセロール−３−ホスフェートおよびグリセロールからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ビシナルジオールデヒドラターゼが、グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
糖および糖代謝物の代謝中間体からなる群から選択される基質をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉが、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびビシナルジオールデヒドラターゼを発現する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
基質としてグリセロール−３−ホスフェートを提供することを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
３−ヒドロキシプロピオン酸を産生するための系であって、
ビシナルジオールデヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３−ホスファターゼからなる群より選択される１以上の酵素を発現するように遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉであって、基質を３−ヒドロキシプロピオネートに変換し得るＥ．ｃｏｌｉ、および
有効量のポリオール基質であって、３−ヒドロキシプロピオネートが産生される条件下で、３−ヒドロキシプロピオネートに変換されるポリオール基質、
を包含する系。
【請求項２０】
請求項１３に記載のプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡを産生するための方法であって、
３−ヒドロキシプロピオン酸を３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡに変換し得るＥ．ｃｏｌｉであって、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡシンセターゼまたは３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼの活性を有する酵素を含むＥ．ｃｏｌｉを提供する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡからポリヒドロキシアルカノエートを産生するための方法であって、
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼの活性を有する酵素を含むＥ．ｃｏｌｉを提供する工程を包含し、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡがポリヒドロキシアルカノエートシンターゼによってポリヒドロキシアルカノエートに組み込まれる、方法。
【請求項２２】
ポリヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシプロピオネートポリマーまたはコポリマーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｅ．ｃｏｌｉが、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−ホスファターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝子操作されており、それにより代謝中間体をグリセロールに変換し、該中間体がさらに３−ヒドロキシプロピオン酸に変換される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｅ．ｃｏｌｉがさらに、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼおよびポリヒドロキシアルカノエートシンターゼからなる群から選択される１以上の酵素を発現するよう遺伝子操作される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｅ．ｃｏｌｉがさらに、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼおよびポリヒドロキシアルカノエートシンターゼからなる群から選択される１以上の酵素を発現するよう遺伝子操作される、請求項１９に記載の系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般的に、細菌酵素の遺伝子操作によるポリヒドロキシアルカノエートの産生の分野にある。
【０００２】
多数の微生物は、ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノエート］（ＰＨＡ）ポリマーの細胞内リザーバーを蓄積する能力を有する。ＰＨＡは、広範な範囲の産業的適用および生物医学的適用を有する、生分解性かつ生体適合性の熱可塑性材料である（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、ＣＨＥＭＴＥＣＨ  ２６，３８−４４）。ＰＨＡは、多数の異なる発酵プロセスを使用して産生され得、そして広範な抽出技術を使用して回収され得る（Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１９９８、Ｊ．Ｂｏｉｔｅｃｈｎｏｌ．６５：１２７−１６１；ＣｈｏｉおよびＬｅｅ，１９９９に概説される）。植物作物はまた、植物油に沿った原価構造を提供するこれらのポリマーを産生するため、そして石油ベースのポリマーとの価格競合性を指向するために遺伝子操作されている（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、ＣＨＥＭＴＥＣＨ  ２６，３８−４４：Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｙ．１９９９、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８１−１８５頁）。ＰＨＡは、ＰＨＡシンターゼ酵素の作用によって形成される。ポリマー鎖が成長するにつれて、不溶性顆粒を形成する。次いで、ＰＨＡは回収され得、次いで、化学物質に変換される得か、または回収プロセスの間に化学物質に変換され得る（Ｍａｒｔｉｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９７／１５６８１）。それゆえ、それらのポリマーとしての能力に加えて、ＰＨＡは、微生物系および植物作物系の両方において、新たな化学を貯蔵するための独特の機構を示す。
【０００３】
３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）（特にＰＨＢＶ）を含有するＰＨＡコポリマーは、広範に記載されている。多くの野生型微生物は、３ＨＶ含有ＰＨＡを産生し得る。ＰＨＢＶは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（以前は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を用いて、グルコースおよびプロピオネートから、ならびにグルコースおよびイソブチレートから、商業的に産生されている（Ｈｏｌｍｅｓらに対する米国特許第４，４７７，６５４号）。多数の他の微生物およびプロセスが、当業者に公知である（Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６５：１２７−１６１）。ポリ（３ＨＶ）ホモポリマーは、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍを用いて、バレレートから産生されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌら、１９９３、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：４４３−４４９）。３ＨＶ単位を含有するＰＨＡもまた、組換え微生物を使用して合成されている。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＡ生合成遺伝子を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを使用して、グルコースおよびプロピオネートまたはバレレートのいずれかから（Ｓｌａｔｅｒら、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：１０８９−１０９４）ならびにグルコースおよびバリンまたはトレオニンのいずれかから（Ｅｓｃｈｅｎｌａｕｅｒら、１９９６、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１９：１２１−１３０）、ＰＨＢＶが産生されている。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＡ生合成遺伝子を保有するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａを使用して、グルコースおよびプロピオネートからＰＨＢＶが産生されている（Ｚｈａｎｇら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−１２０５）。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅのＰＨＡ生合成遺伝子を保有するＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａを使用して、奇数の炭素数のアルカン酸からポリ（３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｐ）が産生された（Ｆｕｋｕｉら、１９９７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：１０９３−１０９７）。
【０００４】
３−ヒドロキシプロピオネート単位を含有するＰＨＡコポリマーもまた、記載されている。Ｈｏｌｍｅｓら（米国特許第４，４７７，６５４号）は、グルコースおよび３−クロロプロピオネートまたはアクリレートのいずれかからポリ（３ＨＰ−ｃｏ−３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を合成するために、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａを使用した。Ｄｏｉら（１９９０、Ｅ，Ａ，Ｄａｗｅｓ（編）、Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，３７−４８頁）は、３−ヒドロキシプロピオネート、１，５−ペンタンジオール、１，７−ヘプタンジオール、または１，９−ノナンジオールからポリ（３ＨＰ−ｃｏ−３ＨＢ）を合成するために、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａを使用した。ＨｉｒａｍｉｔｓｕおよびＤｏｉ（１９９３、Ｐｏｌｙｍｅｒ３４：４７８２−４７８６）は、スクロースおよび３−ヒドロキシプロピオネートからポリ（３ＨＰ−ｃｏ−３ＨＢ）を合成するために、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓを使用した。Ｓｈｉｍａｍｕｒａら（１９９４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２７：４４２９−４４３５）は、３−ヒドロキシプロピオネートおよび３−ヒドロキシブチレートまたはスクロースのいずれかからポリ（３ＨＰ−ｃｏ−３ＨＢ）を合成するために、Ａ．ｌａｔｕｓを使用した。これらのコポリマーに組み込まれた３−ヒドロキシプロピオネートの最高レベルは、８８モル％であった（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、１９９４、同書）。組換え３ＨＰ含有ＰＨＡプロデューサーは、当該分野では記載されていない。
【０００５】
トランスジェニック作物種においてこれらのポリマーを産生し得ることが、経済的に所望される。植物の産生のための方法は、以下に記載されている：米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；同第５，５０２，２７３号；同第５，５３４，４３２号；同第５，６０２，３２１号；同第５，６１０，０４１号；同第５，６５０，５５５号；同第５，６６３，０６３号；ＷＯ９１００９１７、ＷＯ９２１９７４７、ＷＯ９３０２１８７、ＷＯ９３０２１９４、およびＷＯ９４１２０１４、Ｐｏｉｒｉｅｒら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：５２０−５２３、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、Ｃｈｅｍｔｅｃｈ２６，３８−４４。この目的を達成するために、微生物由来のＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子または１つより多いサブユニットを有するＰＨＡポリメラーゼの場合には複数の遺伝子を、植物細胞に移入して、ＰＨＡポリメラーゼ酵素の適切なレベルの産生を得ることが必要である。さらに、さらなるＰＨＡ生合成遺伝子（例えば、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、またはＰＨＡポリメラーゼ酵素についての基質を合成するために必要な酵素をコードする他の遺伝子）を提供する必要性があり得る。多くの場合において、異なる植物組織またはオルガネラにおける発現を制御することが所望される。植物組織またはオルガネラにおける発現を制御するための方法は、当該分野で公知であるｓ（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ，１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４；１２９３−１２９９；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ，１９９５、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、および「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ：Ａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、１９９６、Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｊｈｏｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ）。
【０００６】
細菌発酵系における種々の異なるコポリマーの産生のための方法は公知であり、そして植物におけるＰＨＡの産生は達成されているが、細菌において可能な範囲のコポリマーは、植物において達成されていない。トランスジェニック植物において異なるコポリマーを産生し得ること、およびトランスジェニック植物によって利用される基質に関してさらなる選択肢を有することは利点である。
【０００７】
それゆえ、本発明の目的は、植物におけるＰＨＡの産生のための方法および試薬を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、単一の糖およびアルコールを基質として使用してＰＨＡを産生するための方法および試薬を提供することである。
【０００９】
本発明のなおさらなる目的は、ＰＨＢおよびＰＨＶＢとは異なるコポリマーの産生のための方法および試薬を提供することである。
【００１０】
（発明の要旨）
ＰＨＡの産生のために有用である、グリセロールデヒドラターゼ、ジオールデヒドラターゼアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、βケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＡシンターゼ、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３−ホスファターゼのような酵素を発現する生物が提供される。いくつかの場合において、１つ以上のこれらの遺伝子は、宿主生物に対してネイティブであり、そして残りは、導入遺伝子から提供される。これらの生物は、３−ヒドロキシプロピオネートモノマーまたは３−ヒドロキシバレレートモノマーを組み込むポリ（３−ヒドロキシポリアルカノエート）ホモポリマーまたはコポリマーを産生し、ここで、３−ヒドロキシプロピオネートおよび３−ヒドロキシバレレート単位は、ジオールの変換を触媒する酵素から誘導される。使用され得る適切なジオールとしては、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、およびグリセロールが挙げられる。正常な細胞代謝からグリセロールを得るための生化学経路もまた記載される。ＰＨＡポリマーは容易に回収され、そしてポリマーとして、または１，３−プロパンジオール、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、アクリル、マロン酸、エステルおよびアミンを含む化学中間体の範囲についての開始物質として産業的に有用である。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
新たな代謝経路は、１，２−プロパンジオールからの３−ヒドロキシバレレート単位を含むＰＨＡ、およｇび１，３−プロパンジオールまたはグリセロールからの３−ヒドロキシプロピオネート単位を含むＰＨＡの産生のために開発されてきた。グリセロールの場合、グリセロールは、微生物に摂食され得るか、または中心代謝中間体から産生され得るかのいずれかである。これらのモノマーおよびその重合をもたらすこれらの新規な代謝経路の鍵となる酵素成分は、図１に示される。
【００１２】
１，２−プロパンジオールおよびグリセロールは、高濃度でさえ多くの微生物に対して毒性ではない安価な基質である。１，３−プロパンジオールは、再生可能資源から産生され得る（Ａｎｔｏｎ，Ｄ．「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３−ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ」、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＩ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｅｌｍａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９８年１０月２７日）にて提示された）。１，２−プロパンジオールは、プロピレングリコールの産生からの産業廃棄物の流れに存在する。グリセロールもまた、多数の微生物および植物作物における代謝から得られ得る。多くの場合、これらは、一般的に多くの微生物に対して低濃度で毒性になる有機酸と比較して、発酵のための優れた供給材料である。３−ヒドロキシプロピオン酸は化学的に安定ではなく、それゆえ、商業的に利用可能ではない。
【００１３】
（操作される微生物）
１つの実施態様において、図１に例示される全体の経路のための遺伝子は、産生生物に導入される。天然にはＰＨＡを産生しない微生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が使用され得る。多数の組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＰＨＢ産生系が記載されている（ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ，１９９９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３）。ビシナルジオールデヒドラターゼ（天然に、グリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換し得る生物（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来）をコードする遺伝子は、この宿主に導入される。１，２−プロパンジオールの場合、ビシナルジオールデヒドラターゼは、基質をプロピオンアルデヒドに変換し、これは、必要に応じて、外因性アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル−ＣｏＡシンセターゼの補助を伴って、微生物の内因性代謝によってプロピオニル−ＣｏＡに変換され得る。プロピオンアルデヒドに対する増加した耐性を有する株を変異誘発しそして選択することは有用であり得る。次いで、プロピオニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡとの縮合において、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼによって受容され、従って、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡが形成され得る。ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼはまた、アセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させ、よれによって、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを形成する。３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの両方は、組換え宿主において発現されるような様々なＰＨＡシンターゼによって受容され、それゆえ、ＰＨＢＶは、組換え宿主によって合成される。
【００１４】
上記の宿主はまた、増殖中または別々の増殖期の後のいずれかに、１，３−プロパンジオールまたはグリセロールを摂食し得、そして３ＨＰポリマーが、その細胞内に蓄積される。Ｅ．ｃｏｌｉは、補酵素Ｂ−１２を新たに合成せず、それゆえ、補酵素Ｂ−１２たはＥ．ｃｏｌｉが補酵素Ｂ−１２に変換し得る前駆体（例えば、ビタミンＢ−１２）もまた、摂食されるはずである。グリセロールの場合、ビシナルジオールデヒドラターゼは、基質を、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換し、これは、必要に応じて、外因性アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル−ＣｏＡシンセターゼの補助を伴って、微生物の内因性代謝によって３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡに変換され得る。次いで、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡは、ＰＨＡシンターゼによってＰ３ＨＰに重合され得る。３ＨＰに加えてヒドロキシアシル−ＣｏＡモノマー単位もまた、ポリマーに組み込まれ得る。例えば、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼおよびレダクターゼが発現される場合、３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシプロピオネートのコポリマーが形成され得る。
【００１５】
炭水化物供給材料から直接３ＨＰポリマーを産生するために、Ｅ．ｃｏｌｉはさらに、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−ホスファターゼを発現するように操作される。このような組換えＥ．ｃｏｌｉ株およびその構築のための方法は、当該分野で公知である（Ａｎｔｏｎ，Ｄ．「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３−ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ」、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＩ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｅｌｍａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９８年１０月２７日）で提示；ＰＣＴ  ＷＯ９８／２１３３９）。
【００１６】
別の実施態様において、ビシナルジオールデヒドラターゼを天然に含む組換え微生物が使用され得る。このような微生物の１つの例は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａであるが、上記のようにいくつかの他の微生物が存在する。この実施態様において、外因性ビシナルジオールデヒドラターゼが、別の生物から移入される必要はない。しかし、この微生物を変異誘発し、そいて好気性増殖中にこのデヒドラターゼを発現する変異体を選択することもまた有用であり得るか、または好気性条件下でその遺伝子を発現するように遺伝子操作され得る。一般的には、１つ以上の補酵素Ｂ−１２依存性ビシナルジオールデヒドラターゼを含む生物が補酵素Ｂ−１２を新たに合成し得る場合であり、そして補酵素Ｂ−１２またはその密接に関連する前駆体を培養の任意の部分に添加する必要がない場合である。この場合では、ＰＨＡシンターゼまたは全体のＰＨＢ生合成経路および必要に応じて外因性アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＣｏＡシンセターゼが、この微生物に導入される。これを行うための技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６４：１７７−１８６）。炭水化物供給物から直接３ＨＰポリマーを産生するために、この株はさらに、上記のように、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−ホスファターゼを発現するように操作される。
【００１７】
別の実施態様において、ＰＨＡを天然に産生する生物が使用され得る。このような生物の例としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｌｃａｌｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓおよびＡｚｏｔｏｂａｃｔｏｒが挙げられるが、当業者には多くの他の生物が周知である（Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１９９８、Ｊｏｕｎｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６５：１２７−１６１）。ジオールデヒドラターゼの導入は、ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ（１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６４、５２９８−１５３０３）によって記載されるような標準的な技術を用いて達成される。これらの場合、生物を変異させ、そして３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに対する増加した耐性について選択することが有用であり得る。ＰＨＡを産生する生物は、補酵素Ｂ−１２を新たに合成する能力において変化し、それゆえ補酵素Ｂ−１２またはその生物が補酵素Ｂ−１２に変換し得る前駆体が適切に添加される。次いで、ＰＨＢＶは、１，２−プロパンジオールおよび少なくとも１つの他の供給材料を摂食することによって産生される。ＰＨＢＰは、１，３−プロパンジオールまたはグリセロールおよび１つの他の供給材料（例えば、グリセロール）を摂食することによって産生される。炭水化物供給材料から直接３ＨＰポリマーを産生するために、この株はさらに、上記のように、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−ホスファターゼを発現するように操作される。これらの生物におけるＰ３ＨＰホモポリマーの産生についての利点である変異を利用することは有用であり得る。特異的変異としては、β−ケトチオラーゼ遺伝子および／またはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を不活性化することが挙げられる。これらの遺伝子は一般的に周知であり、そして利用可能または単離可能であるので、遺伝子破壊は、例えば、Ｓｌａｔｅｒら、１９９８（Ｊ．Ｂｉｃｔｅｒｉｏｌ．）によって記載されるように、容易に行われ得る。
【００１８】
ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）およびそのコポリマーの産生の実行はまた実施例に記載されるような細菌に限定されない。同じ遺伝子が真核生物細胞（酵母および植物を含むがこれらに限定されない）に導入され得、これはまた、細菌のように、ジヒドロキシアセトンホスフェートのような解糖中間体を産生し、そこから、グリセロールおよび最終的にはポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）が誘導され得る。
【００１９】
（基質の利用のための遺伝子）
本明細書中に記載されるような使用に適切な組換えＰＨＡ手順を開発するための遺伝子および技術は、一般的に、当業者に公知である（ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ，１９９１、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３；ＰＣＴ  ＷＯ９９／１４３１３）。中心代謝中間体からグリセロールを介してポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）の産生を実行する必要がある遺伝子の全てはクローニングされており、そして遺伝子操作可能な形態で利用可能であるので、プラスミドにより運ばれた遺伝子および組み込まれた遺伝子の任意の組み合わせが使用され得、それゆえ、この経路の実行は、本明細書中に概説されるスキームに制限されない。多くの異なる実行は、当業者に明らかである。
【００２０】
グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３０）およびジオールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８）は、細菌のいくつかの種に見出される個別の補酵素Ｂ−１２要求性酵素である。しばしば、グリセロールデヒドラターゼは、グリセロールにおける嫌気性増殖の間に誘導され、そしてジオールデヒドラターゼは、グリセロールまたは１，２−プロパンジオールのいずれかにおける嫌気性増殖の間に誘導される（ＦｏｒａｇｅおよびＦｏｓｔｅｒ，１９７９、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ５６９：２４９−２５８）。これらのデヒドラターゼは、グリセロールから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの形成、および１，２−プロパンジオールからプロピオンアルデヒドの形成を触媒する。これらのアルデヒドは、通常、デヒドロゲナーゼによって対応するアルコールに変換される。１つまたは両方のデヒドラターゼを含む生物は、代表的には、グリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドまたは１，３−プロパンジオールに変換し得る。この能力で有名な細菌種としては、以下が挙げられる：Ｋｌｅｂｉｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｅｋｓｔｒａら、１９８７、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：２６８−２７５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ（Ｈｏｍａｎｎら、１９９０、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：１２１−１２６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ（Ｈｏｍａｎｎら、１９９０、同書）、およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ（Ｂｏｅｎｉｇｋら、１９９３、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４５３−４５７）。しかし、多くの他の例が一般的に公知である。両方のデヒドラターゼは、３つのサブユニットから形成され、その各々は、他の酵素のその対応物に相同である。
【００２１】
グリセロールおよびジオールデヒドラターゼ（これはまた、一般的に、この点から、「ビシナルジオールデヒドラターゼ」と称される）の基質範囲はグリセロールおよびおよび１，２−プロパンジオールに限定されない。Ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎら（１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１６：１０８２−１０９２）は、例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ酵素によって受容される基質としては、以下が挙げられることを実証した：グリセロール、（Ｒ）−１，２−プロパンジオール、（Ｓ）−１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、チオグリセロール、３−クロロ−１，２−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、イソブチレングリコール、および３，３，３−トリフルオロ−１，２−プロパンジオール。全ての場合において、この反応の産物は、基質の水分子の効果的除去によって形成されるアルデヒドまたはケトンである。
【００２２】
ホスホグリセレートを通して糖からグリセロールを天然に産生する生物としては、以下が挙げられる：
【００２３】
【数１】
0005042407.tif 000002
これらの生物の多くにおいて、グリセロールは、ジヒドロキシアセトンホスフェート（グリセロール経路の中間体）から誘導されることが公知である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、通常、ほとんどの糖で増殖させた場合には、有意な量ではグリセロールを合成しない（ＢａｌｄｏｍａおよびＡｇｕｉｌａｒ，Ｊ．Ｂｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：４１６、１９８８）。しかし、グルコースのような一般的な糖からグリセロールを形成し得るトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株が、例えば、ＰＣＴ  ＷＯ９７／２０２９２に記載されている。
【００２４】
糖からグリセロールの産生（ＷＯ９８／２１３３９）、グリセロールから１，３−プロパンジオールの産生（ＷＯ９６／３５７９６、ＷＯ９８／２１３３９）、および糖から１，３−プロパンジオールの産生のための遺伝子操作された系が記載されている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＡＲ１（ジヒドロキシアセトンホスフェートデヒドロゲナーゼ）遺伝子およびＧＰＰ２（ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェートホスファターゼ）遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉは、グルコースで増殖させた場合に、培地中に高濃度のグリセロールを蓄積することが示された（Ａｎｔｏｎ，Ｄ．「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３−ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ」、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＩ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｅｌｍａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９８年１０月２７日）に提示）。
【００２５】
（発現の調節）
前述の実施態様のいずれかにおいて、ビシナルジオールデヒドラターゼの発現を制御することによって、または補酵素Ｂ−１２の利用能を制御することによって、産生されるポリマーの組成を制御することが可能である。デヒドラターゼ活性が高くなるにつれて、基質利用能またはデヒドラターゼの下流の酵素活性のような別の要因が限定される点まで、より活性化されたモノマーが、その活性の結果として誘導される。様々な生物における遺伝子発現（および、従って、酵素活性）の調節のための方法は、当業者に周知である。ビシナルジオールデヒドラターゼ活性の制御のためのさらなる方法は、微生物に対する補酵素Ｂ−１２の利用能の調節である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの多くの株は、例えば、補酵素Ｂ−１２を新たに合成できず、それゆえ、活性について補酵素Ｂ−１２に依存する組換えビシナルジオールデヒドラターゼは、補酵素Ｂ−１２またはビタミンＢ−１２のような適切な前駆体が培地に付加される限りは、これらの株において活性ではない。ＰＨＡ合成遺伝子およびビシナルジオールデヒドラターゼを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株において、補酵素Ｂ−１２を添加しないと、例えば１，２−プロパンジオールが培地中に存在してもＰＨＢのみが合成されることが見出されている。同じ培地における同じ株の培養への１μＭの補酵素Ｂ−１２の添加は、実施例で議論されるように、ＰＨＢＶの形成をもたらす。Ｓｋａｌｙら（１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８−１０５）は、増加した濃度の補酵素Ｂ−１２が約２０ｎＭの濃度まで培地中に提供され、その後１，２−プロパンジオールの収量が増加しなかったので、トランスジェニックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが、グリセロールから増加したレベルの１，３−プロパンジオールを合成したことを見出した。それゆえ、０〜２０ｎＭの濃度の補酵素Ｂ−１２は、１，２−プロパンジオールを含有する培地中で培養された、ＰＨＡ合成遺伝子およびビシナルジオールデヒドラターゼ遺伝子を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＶ組成を制御するために、使用され得る。同じ基本的な前提は、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）がグリセロールから誘導されることについて真実である。この細胞は、ビシナルジオールデヒドラターゼが存在しない場合に、コモノマーの存在下でＰＨＡ（例えば、ＰＨＢ）を生成し得る。ポリマー組成を制御するための補酵素Ｂ−１２の使用は、補酵素Ｂ−１２を新たに合成できない任意の微生物で達成され得る。このような生物としては、この能力を天然に欠く生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびこの能力を天然に保有するが化学変異誘発の使用によってかまたはトランスポゾン変異誘発のようなこの能力を失わせる遺伝的方法によって変異されている生物（例えば、Ｋｌｅｂｉｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられる。
【００２６】
いくつかの生物の場合において、いくつかの遺伝子は、宿主染色体に取り込まれ得、他の遺伝子は、プラスミドに提供され得る。いくつかの場合において、適合可能なプラスミド系は、例えば、１つのプラスミドによってコードされる経路のいくつかの工程および第２のプラスミドによってコードされる他の工程とともに使用され得る。この２つのアプローチの組み合わせもまた使用され得る。
【００２７】
（基質）
上記で議論したように、ＰＨＡを生成するために使用され得る基質としては、グリセロールおよびグルコースが挙げられる。多数の他の基質は、グリセロールまたはグルコースに加えて、首尾よく使用され得る。他の基質の例としては、デンプン、スクロース、ラクトース、フルクトース、キシロース、ガラクトース、コーン油、ダイズ油、獣脂、トール油、脂肪酸またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２８】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される。
【００２９】
（実施例１．グルコースおよび１，２−プロパンジオールからのＰＨＢＶ産生）
プラスミドｐＦＳ４４Ｃを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＭＢＸ７６９（Ｈｕｉｓｍａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９９／１４３１３）（これは、Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡ合成遺伝子（アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＡシンターゼ）を発現する）を使用して、グルコースおよび１，２−プロパンジオールからＰＨＢＶを合成した。プラスミドｐＦＳ４４ｃ（図２に模式的に示される）は、ｐＴＣ５３から単離された、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子（ｄｈａＢ）（Ｓｋｒａｌｙら、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８〜１０５）、およびｐＣＫ３から単離された、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｈｂｃＴ）（ＳｅｕｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１〜８８０）（両方とも、ｔｒｃプロモーターの制御下の１つのオペロン内）を含む。ｐＦＳ４４Ｃはまた、ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、および複製起点（ＯＲＩ）（全てベクターｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ）に由来する）を含む。
【００３０】
これらの細胞を、２５ｇ／ｍＬのＬＢブロス粉末（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む、１００ｍＬの培地中で予め培養した。これらを、この培地から遠心分離（２０００×ｇ、１０分）によって取り出し、そして１００ｍＬの培地（１リットル当たり：５ｇ  ＬＢブロス粉末；５０ｍｍｏｌリン酸カリウム、ｐＨ７；１０ｇ  １，２−プロパンジオール；２ｇ  グルコース；１μｍｏｌ  補酵素Ｂ−１２；１００μｇ  アンピシリン；および０．１ｍｍｏｌ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む）中に再懸濁した。これらの細胞を、２２５ｒｐｍにて３０℃で４８時間振盪しながら、この培地中でインキュベートした。次いで、これらを、上記のように遠心分離によって取り出し、水で１回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【００３１】
補酵素Ｂ−１２を添加しなかったことを除いて、同じ実験を並行して行った。各フラスコからの約２５ｍｇの凍結乾燥した細胞塊を、２ｍＬの混合液（内部標準物として添加された２ｍｇ／ｍＬの安息香酸とともに、（容量で）９０％  １−ブタノールおよび１０％  濃塩酸を含む）中での１１０℃で３０時間の同時の抽出およびブタノール溶解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）に供した。得られた混合液の水溶性成分を、３ｍＬの水での抽出によって除去した。有機層（２ｍＬ／分の全体的な流速にて１：５０分割比での１μＬ）を、以下の温度プロフィール（８０℃で２分；１分で１０℃から２５０℃；２５０℃で２分）を用いて、ＳＰＢ−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍ  ＩＤ；０．２５μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ．）上にて分析した。ポリマー中の３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシバレレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）単位の存在について試験するために使用される標準物は、ＰＨＢＶ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）であった。添加された補酵素Ｂ−１２を用いる実験におけるポリマーは、６０．９％の乾燥細胞重量を示し、そしてこれは、９７．４％の３−ヒドロキシブチレート単位および２．６％の３−ヒドロキシバレレート単位から構成された。
【００３２】
この実験から得られた上清は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって０．４１ｇ／Ｌのプロパノールを含むことが見出され、このことは、グリセロールデヒドラターゼが機能的であったことを示す。補酵素Ｂ−１２を添加していない実験におけるポリマーは、５６．７％の乾燥細胞重量を示し、そしてこれは、ＰＨＢホモポリマーであった。この実験から得られた上清は、プロパノールを含まなかった。ＨＰＬＣ分析を、０．６ｍＬ／分の流速および５０℃のカラム温度で、移動相として硫酸（ｐＨ２）を用いたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを使用して実行した。検出は、屈折率および紫外線吸収の両方によってであった。
【００３３】
（実施例２．唯一の炭素源としての１，２−プロパンジオールからのＰＨＢＶおよび増殖）
ＭＢＸ１８４は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３２７を生成するために、１，２−ＰＤでの増殖について選択した。ＭＢＸ１３２７を、ＭＢＸ１１６４由来のＰＨＢ遺伝子ＡＢＣ５ＫＡＮを用いて形質導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３２９を生成した。ＭＢＸ１１６４は、ＭＢＸ２４７：：ＡＢＣ５ＫＡＮである。ＭＢＸ２４７は、標準的な手順（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）によって、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）で変異誘発され、かつ唯一の炭素源として１，２−プロパンジオールを用いて増殖する能力についてスクリーニングされたＬＪ５２１８（ＪｅｎｋｉｎｓおよびＮｕｎｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１９８４  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ  ｃｅｎｔｅｒ  ＣＧＳＣ  ６９６６）である。この能力を有するＥ．ｃｏｌｉ株およびこのような株を作製するための方法は、以前に記載されている（Ｓｒｉｄｈａｒａら、１９６９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：８７）。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３２９は、唯一の炭素源として１，２−プロパンジオールを用いて増殖する能力およびアセチル−ＣｏＡを生成する炭素源からＰＨＢを合成する能力の両方を有する。
【００３４】
プラスミドｐＦＳ４４Ｃを保有するＭＢＸ１３２９（図２に示される）を、培地（１リットル当たり：６．２５ｇ  ＬＢブロス粉末；３．５ｇ  リン酸アンモニウムナトリウム；７．５ｇ  二塩基性リン酸カリウム・３水和物；３．７ｇ  一塩基性リン酸カリウム；０．１２ｇ  硫酸マグネシウム；２．７８ｍｇ  硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物；１．９８ｍｇ  塩化マンガン（ＩＩ）・四水和物；２．８１ｍｇ  硫酸コバルト（ＩＩ）・７水和物；１．４７ｍｇ  塩化カルシウム・２水和物；０．１７ｍｇ  塩化銅（ＩＩ）・２水和物；０．２９ｍｇ  塩化亜鉛（ＩＩ）・７水和物；１０ｍｇ  チミン；１０ｇ  １，２−プロパンジオール；５０ｎｍｏｌ  補酵素Ｂ−１２；１００μｇ  アンピシリン；および０．０５ｍｍｏｌ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む）中にて増殖させた。総容量は、２５０ｍＬエルレンマイアーフラスコにおいて５０ｍＬであった；接種物は、２５ｇ／Ｌ  ＬＢブロス粉末および１００μｇ／ｍＬアンピシリンにおける０．５ｍＬの一晩の培養物であった。これらの細胞を、この培地中で、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で３日間インキュベートした。これらを、この培地から遠心分離（２０００×ｇ、１０分）によって取り出し、水で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。
【００３５】
細胞内ポリマー含量を、実施例１のようにブタノール溶解によって分析した。これらの細胞は、９．８の光学密度（６００ｎｍにて）まで増殖し、そして乾燥細胞重量の６％のＰＨＢＶを含んだ。このポリマー自体は、２．５％の３−ヒドロキシバレレート単位および９７．５％の３−ヒドロキシブチレート単位から構成された。
【００３６】
（実施例３．１，３−プロパンジオールからのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）およびグリセロールからの１，３−プロパンジオール）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１８４（これは、ｆａｄＲ遺伝子を欠損し、かつ構成的にａｔｏＣ遺伝子を発現する）を使用して、グリセロールから１，３−プロパンジオールを、および１，３−プロパンジオールからポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を合成した。両方の例において、これらの細胞は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅグリセロールデヒドラターゼ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子（全て、ｔｒｃプロモーターの制御下の１つのオペロン内）を含むプラスミドｐＦＳ４５（図３に模式的に示される）を保有した。グリセロールが１，２−プロパンジオールの代わりに存在したことを除いて、これらの細胞を、実施例１に記載されるように培養した。
【００３７】
ＨＰＬＣ分析は、補酵素Ｂ１２含有培地中の細胞が、１．３ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールを合成したが、補酵素Ｂ−１２を含まない培地中の細胞が１，３−プロパンジオールを全く合成しないことを示した。１，３−プロパンジオールが１，２−プロパンジオールの代わりに存在し、かつ補酵素Ｂ−１２が添加されないことを除いて、実施例１の方法を使用して、この同じ株もまた培養した。
【００３８】
凍結乾燥した細胞塊を、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を定量するためのβ−プロピオラクトンのさらなる標準物とともに、実施例１のようにＧＣによって分析した。これらの細胞は、ＧＣ分析によって、７．８％の乾燥細胞重量でポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）ホモポリマーを含むことが示された。グリセロールからのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）の合成は、多くの微生物に非常に有毒である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの蓄積のために生じなかったようであった（Ｄｏｂｒｏｇｏｓｚら、１９８９、Ｗｅｎｎｅｒ−Ｇｒｅｎ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．５２：２８３〜２９２）。この毒性は、少なくとも２つの様式において、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの蓄積を阻止することによって扱われ得る：１）１．３−プロパンジオール産生生物（例えば、上記の生物）由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼもまた、発現され得る、そして２）グリセロールデヒドラターゼが存在する場合に、１，３−プロパンジオールの観察された形成を担うＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の未同定の内因性デヒドロゲナーゼの活性は、グリセロールおよび補酵素Ｂ−１２の両方の存在下で十分に増殖する、グリセロールデヒドラターゼを発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞をスクリーニングすることによって増大され得る。第２のアプローチは、例えば、変異誘発されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを、ｐＦＳ４５のようなプラスミドを用いて形質転換することによって達成され得、その結果、この変異誘発は、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子、続いてグリセロールおよび補酵素Ｂ−１２を含有する培地の富化に影響しなかった。
【００３９】
（実施例４．グリセロールからのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート））
実施例３における２つの経路（グリセロールから１，３−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールからポリ（３−ヒドロキシプロピオネート））を、同じ組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて活性化した。Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡ生合成遺伝子ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、およびｐｈａＣを安定に発現するＥ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ８２０を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼならびにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のグリセロールデヒドラターゼおよび１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（ｔｒｃプロモーター制御下）を含むプラスミドｐＦＳ４７Ａ（図４に模式的に示される）を用いて形質転換した。ＰＦＳ４７Ａを、プラスミドｐＦＳ１６（ｐＦＳ４７Ａの前駆体）から以下の通りに構築した：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ｏｒｆＺ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プラスミドｐＣＫ３（ＳｅｕｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１〜８８０）からＰＣＲによって増幅した：
【００４０】
【化１】
0005042407.tif 000003
ｏｒｆＺ  ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩ（これは、ＡｖｒＩＩと適合性である）およびＳａｌＩで消化されているｐＴｒｃＮにライゲーションした。
【００４１】
これらの細胞を、２５ｇ／ＬのＬＢブロス粉末（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．）および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む、１００ｍＬの培地中にて予め培養した。これらを、遠心分離（２０００×ｇ、１０分）によりこの培地から取り出し、そして１００ｍＬの培地（１リットル当たり：２．５ｇ  ＬＢブロス粉末；５０ｍｍｏｌ  リン酸カリウム、ｐＨ７；５ｇの基質（グリセロール；１，２−プロパンジオール；または１，３−プロパンジオール）；２ｇ  グルコース；５ｎｍｏｌ  補酵素Ｂ−１２；１００μｇ  アンピシリン；および０．１ｍｍｏｌ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む）中に再懸濁した。これらの細胞を、２２５ｒｐｍにて３０℃で４８時間振盪しながら、この培地中でインキュベートした。次いで、これらを、上記のように遠心分離によって取り出し、水で１回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【００４２】
凍結乾燥した細胞塊を、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を定量するためのβ−プロピオラクトンのさらなる標準物とともに、実施例１のようにＧＣ分析によって分析した。グリセロールおよび１，３−プロパンジオール中で培養された細胞は、両方とも、３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシプロピオネート単位のコポリマーを含み、そして１，２−プロパンジオール中で培養された細胞は、３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシバレレート単位のコポリマーを含んだ。乾燥細胞重量の百分率としてのポリマーの組成および量を、表１に示す。グリセロールで培養された細胞は、１，３−プロパンジオールで培養された細胞よりもポリマーを合成したが、３−ヒドロキシプロピオネート単位の百分率は、グリセロールで培養された細胞においてよりも小さかった。これらの差異は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドが有毒であり、かつこれがグリセロールデヒドラターゼによってグリセロールから生じるよりも１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼによって１，３−プロパンジオールからより迅速におそらく生じるという事実によって説明され得る。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの毒性は、細胞の調子（従って、全体的なポリマー含量）に負の影響を与えるが、グリセロールからのその形成は、必要な中間体が３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドまたは１，３−プロパンジオールであるかに関わらず、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ形成に必要である。
【００４３】
（表１．種々の基質において培養されたＭＢＸ８２０/ｐＦＳ４７Ａによって産生されたポリマー）
【００４４】
【表１】
0005042407.tif 000004
（実施例５．補酵素Ｂ−１２のバリエーションによるポリマー組成の制御）
（濃度）
ビシナルジオールデヒドラターゼは、活性が補酵素Ｂ−１２に依存するので、そしてグリセロールからの３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡまたは１，２−プロパンジオールからのプロピオニル−ＣｏＡの形成は、デヒドラターゼ活性に依存するので、いずれかの場合におけるこのコポリマーの組成は、デヒドラターゼに対する補酵素Ｂ−１２の利用能のバリエーションによって制御され得る。この例において、このことを、プラスミドｐＦＳ４７Ａを保有するＥ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ８２０がＰＨＡを産生していた培地に添加された補酵素Ｂ−１２濃度のバリエーションによって達成した。
【００４５】
これらの細胞を、２５ｇ／ＬのＬＢブロス粉末（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．）および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む、１００ｍＬの培地中にて予め培養した。これらを、遠心分離（２０００×ｇ、１０分）によりこの培地から取り出し、そして１００ｍＬの培地（１リットル当たり：２．５ｇ  ＬＢブロス粉末；５０ｍｍｏｌ  リン酸カリウム、ｐＨ７；１０ｇの基質（グリセロールまたは１，２−プロパンジオール）；２ｇ  グルコース；１００μｇ  アンピシリン；０．１ｍｍｏｌ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）；および０、５、２０、または５０ｎｍｏｌ  補酵素Ｂ−１２を含む）中に再懸濁した。これらの細胞を、２２５ｒｐｍにて３０℃で７２時間振盪しながら、この培地中でインキュベートした。次いで、これらを、上記のように遠心分離によって取り出し、水で１回洗浄し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥された細胞塊を、実施例４の通りに、ＧＣ分析によって分析した。
【００４６】
表２は、この様式において産生されたＰＨＡの量および組成を示す。補酵素Ｂ−１２の非存在は、基質がグリセロールまたは１，２−プロパンジオールであるかに関わらず、ＰＨＢのみの合成を生じた。グリセロールは、最終の光学密度およびポリマー含量によって示される通り、デヒドラターゼ活性の非存在下でＰＨＡ形成により適していた。これは、おそらくＥ．ｃｏｌｉが好気性条件下で炭素源およびエネルギー源としてグリセロールを利用し得るからであるが（Ｌｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：５３５、１９７６）、一般にこのことは、１，２−プロパンジオールに関しては当てはまらない（ＢａｌｄｏｍａおよびＡｇｕｉｌａｒ、同書）。補酵素Ｂ−１２がグリセロールで培養された細胞に漸増量で添加される場合、ポリマー中の３−ヒドロキシプロピオネート単位の百分率は、増加し、一方、全体的なポリマー含量は、減少する。この減少は、おそらく、細胞の調子の減少を生じる３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの毒性に起因する。補酵素Ｂ−１２が、１，２−プロパンジオールで培養された細胞に漸増量で添加される場合、３−ヒドロキシバレレート単位は、ポリマー中に取り込まれるが、ポリマー中の３−ヒドロキシバレレートの百分率は、グリセロール実験において３−ヒドロキシプロピオネート単位の百分率が増加したのと同程度に増加しない。このことは、補酵素Ｂ−１２の濃度が数ナノモル濃度にさえ達した場合に、補酵素Ｂ−１２の濃度が、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ合成に対して律速ではないこと、および他のいくつかの因子が律速となることを示す。
【００４７】
この例は、補酵素Ｂ−１２依存性デヒドラターゼの使用に由来するＰＨＡの組成が、デヒドラターゼに利用可能に作製された補酵素Ｂ−１２の濃度を変動させることによって制御され得ることを実証する。制御が実行され得る程度は、使用されるジオール基質に依存する。このことは、他の基質を超える特定の基質についてのビシナルジオールの好ましさに起因し得、そしてＰＨＡ形成に対して活性化されたモノマーとして働くジオールから誘導されたアルデヒドをアセチルＣｏＡに導く宿主代謝の休止に依存し得る
（表２．種々の補酵素Ｂ−１２の濃度を有する培地において、ＭＢＸ８２０／ｐＦＳ４７Ａによってグリセロールおよび１，２−プロパンジオールから産生されるポリマーの組成）
【００４８】
【表２】
0005042407.tif 000005
a光学密度
b３−ヒドロキシブチレート単位
c３−ヒドロキシバレレート単位
d３−ヒドロキシプロピオネート単位
e乾燥細胞重量の百分率。
【００４９】
（実施例６．中心代謝中間体からのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）の産生）
実施例１〜５は、グリセロールからポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を得ることが可能であること、ならびに上記のように、トランスジェニック生物および非トランスジェニック生物の両方において、中心代謝中間体からグリセロールを産生することが可能であることを実証する。従って、２つの経路の組合せは、中心代謝中間体からのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）の合成を可能にする。これらの経路は、上記の実施例に記載されるように、グリセロール産生宿主中にポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）合成遺伝子を導入することによってか、あるいはグリセロールからポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を既に合成し得る宿主中にグリセロール合成遺伝子を導入することによってのいずれかと組み合わされ得る。
【００５０】
前者の場合、ビシナルジオールデヒドラターゼ、ＰＨＡシンターゼ、ならびに必要に応じて、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、中心代謝中間体からグリセロールを産生し得る宿主中に発現させる。このような宿主の例は、上記のような、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＡＲ１（ジヒドロオキシアセトンホスフェートデヒドロゲナーゼ）遺伝子およびＧＰＰ２（ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェートホスファターゼ）遺伝子（Ａｎｔｏｎ，Ｄ．「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ」、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＩ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｅｌｍａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９８年１０月２７日；ＰＣＴ  ＷＯ  ９８／２１３３９）を発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉの多くの株は、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼおよびアルデヒドデヒトロゲナーゼ酵素活性を天然に発現するが、それらのレベルは、必要に応じて、これらの機能を行う酵素の変異誘発または望ましい過剰発現によって増強され得る。必要なさらなる遺伝子は、ｔｒｃプロモーターの制御下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡシンターゼ；ならびにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のグリセロールデヒドラターゼおよび１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含む、ｐＦＳ４８Ｂのようなプラスミドに導入され得る。これらの遺伝子のうちのいずれかまたは全てはまた、当業者に周知の標準的な技術を使用して、染色体中への組み込みによって導入され得る。
【００５１】
同様に、ＤＡＲ１およびＧＰＰ遺伝子は、上記のポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を既に合成し得る宿主（例えば、ＭＢＸ８２０／ｐＦＳ４７Ａ）中に導入され得る。ＤＡＲ１およびＧＰＰ２遺伝子は、ｐＦＳ４７Ａと適合性のプラスミド（ｐＦＳ４７Ａとともに同時に維持され得るプラスミド）に導入され得るか、またはそれらは、染色体中に組み込まれ得る。ＭＢＸ８２０は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＡシンターゼを安定に発現し、それによってポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート）を合成し得る。ホモポリマーのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）が所望される場合、３つの全てのＰＨＢ生合成遺伝子ではなくＰＨＡシンターゼのみを発現する株が、使用され得る。
【００５２】
グルコースからのＰＨＰの生合成の経路を実証するために、プラスミドｐＭＳ１５（図６に模式的に示される）を、ｔｒｃプロモーターからのオペロンとして以下の遺伝子を発現するように構築した：Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来のＰＨＢシンターゼ、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ由来のグリセロールデヒドラターゼ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のＤＡＲ１遺伝子、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のＧＰＰ２およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の１，３−プロパノールオキシドレダクターゼ。
【００５３】
プラスミドｐＦＳ５５１を、ＤＡＲ１およびＧＰＰ２のＰＣＲ産物をｐＴｒｃＮに一度にライゲーションすることによって構築した。ＤＡＲ１遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した：
【００５４】
【化２】
0005042407.tif 000006
ＧＰＰ２遺伝子を、同じ様式で以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した：
【００５５】
【化３】
0005042407.tif 000007
各遺伝子に対するＰＣＲを、以下を含む５０μＬの反応容量において、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて実行した：１０ユニットのｐｆｕポリメラーゼ、製造業者により提供される１×反応緩衝液、５０ｐｍｏｌの各プライマー、約２００ｎｇのＳ．ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅゲノムＤＮＡ、および２００μＭの各ｄＮＴＰ。この反応の温度プロフィールは、以下の通りであった：（９４℃で１分；５５℃で２分；７２℃で３分）を２７サイクル、次いで７２℃で２分。反応混合液が９４℃に達するまで、Ｐｆｕポリメラーゼを添加しなかった。
【００５６】
ＰＣＲ産物を、１％の低融点アガロースゲルから精製し、そして対応する部位がプライマーの５’末端に含まれている制限酵素（ＤＡＲ１についてはＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ、ＧＰＰ２についてはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ）で消化した。ベクターｐＴｒｃＮは、ＮｃｏＩ部位を欠くように改変されたｐＴｒｃ９９ａのバージョンである（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｌａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。ｐＴｒｃＮを、ＤＡＲ１の挿入のために、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、および仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）で切断し、ＧＰＰ２の挿入のためにＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、およびＣＩＡＰで切断した。ライゲーションを、製造業者により提供される使用説明書に従って、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）で実行した。このライゲーションの産物は、ｐＦＳ４９（ＤＡＲ１）およびｐＦＳ５０（ＧＰＰ２）であった。１つのプラスミドに両方の遺伝子を構築するために、ｐＦＳ４９をＭｌｕＩおよびＮｏｔＩで切断し、そしてｔｒｃプロモーターおよびＤＡＲ１を含む２．３−ｋｂフラグメントを、同じ２つの酵素およびＣＩＡＰで消化されているｐＦＳ５０にライゲーションした。得られたプラスミドは、ｔｒｃプロモーターの制御下のオペロンＤＡＲ１−ＧＰＰ２を含み、ｐＦＳ５１と命名した。
【００５７】
プラスミドｐＭＳ１５を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１８４（図６に模式的に示される）を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンもまた含む５０ｍＬのＬＢ培地中で３７℃にて、２００ｍＬの四角のボトル中で一晩増殖させた。これらの細胞を、２０００×ｇの１０分間の遠心分離によってこの培養物から取り出し、そしてこれらの細胞を、５０ｍＬのグルコース培地中に再懸濁し、そして２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で７２時間インキュベートした。グルコース培地は、１リットル当たり：６．２５ｇ  ＬＢ粉末；１００μｇ  アンピシリン；２０ｇ  グルコース；５０ｍｍｏｌ  リン酸カリウム、ｐＨ７；１０μｍｏｌ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）；および０、１０、または１００ｎｍｏｌ  補酵素Ｂ−１２を含んだ。インキュベーションの後に、これらの細胞を、２０００×ｇでの１０分間の遠心分離により培地から取り出し、水で１回洗浄し、そして再度、遠心分離し、次いで凍結乾燥した。
【００５８】
凍結乾燥された細胞塊のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析は、以下を示した：１０ｎＭの補酵素Ｂ−１２を用いた実験において、ポリ（３ＨＰ）は、乾燥細胞重量の０．１１％であり；１００ｎＭの補酵素Ｂ−１２を用いた実験において、ポリ（３ＨＰ）は、乾燥細胞重量の０．１３％であり；そして補酵素Ｂ−１２を用いない実験において、ポリ（３ＨＰ）は、検出されなかった。３ＨＰ以外のポリマー成分は、いずれの場合も見出されなかった。ＧＣ分析を、以下の通りに実施した：１５〜２０ｍｇの凍結乾燥された細胞塊を、内部標準物として添加された２ｍｇ／ｍＬの安息香酸とともに、（容量で）５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％の濃縮した塩酸を含む、２ｍＬの混合液中で、１００℃にて３時間、同時に抽出およびプロパノール溶解に供した。得られた混合液の水溶性成分を、３ｍＬの水を用いる抽出によって除去した。有機層（２ｍＬ／分の全体的な流速にて１：５０分割比での１μＬ）を、以下の温度プロフィール（８０℃で２分；１分で１０℃から２５０℃；２５０℃で２分）を用いて、ＳＰＢ−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍ  ＩＤ；０．２５μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ．）上にて分析した。３ＨＰ残基の存在について試験するために使用された標準物は、β−プロピオラクトンであった。ポリ（３ＨＰ）およびβ−プロピオラクトンの両方は、プロパノール溶解に供した場合に、３−ヒドロキシプロピオネートの１−プロピルエステルを生じた。
【００５９】
（実施例７．中心代謝中間体からのＰＨＢＶ）
上記のように、他の炭素源（例えば、グルコース）を必要に応じて添加して、１，２−プロパンジオールからＰＨＢＶを得ることが可能であり、そしてトランスジェニック生物および非トランスジェニック生物の両方において、中心代謝中間体から１，２−プロパンジオールを産生することが可能である（Ｃａｍｅｒｏｎら、１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４  １１６〜１２５）。従って、２つの経路の組合せは、中心代謝中間体からのＰＨＢＶの合成を可能にする。これらの経路は、上記の実施例に記載されるように、１，２−プロパンジオール産生宿主中にＰＨＢＶ合成遺伝子を導入することによってか、または１，２−プロパンジオールからＰＨＢＶを既に合成し得る宿主中に１，２−プロパンジオール合成遺伝子を導入することによってのいずれかで組み合わされ得る。
【００６０】
前者の場合、ビシナルジオールデヒドラターゼ、ＰＨＡシンターゼ、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼおよび３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼ、ならびに必要に応じて、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、１−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、中心代謝中間体から１，２−プロパンジオールを産生し得る宿主中に発現させる。このような宿主の例は、上記のような、ラットレンズ（ｌｅｎｓ）アルドースレダクターゼを発現するか、またはＥ．ｃｏｌｉグリセロールデヒドロゲナーゼを過剰発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉの多数の株は、１−プロパノールオキシドレダクターゼ酵素活性、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素活性、およびプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素活性を天然に発現するが、それらのレベルは、必要に応じて、これらの機能を行う酵素の変異誘発または所望の過剰発現によって増強され得る。必要なさらなる遺伝子は、プラスミドにより運ばれた（ｐｒａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）遺伝子として導入され得るか、または染色体中に組み込まれ得るか、あるいはこれらの２つのアプローチの組合せが使用され得る。例えば、ｐＦＳ４８Ｂのようなプラスミドは、ｔｃｒプロモーターの制御下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡシンターゼならびにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のグリセロールデヒドラターゼおよび１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含み、当業者に周知の標準的な技術を使用して、染色体中中へのＰＨＢ合成遺伝子の組み込みと組み合せて使用され得る。
【００６１】
同様に、ラットレンズアルドースレダクターゼまたはＥ．ｃｏｌｉグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、上記の、ＰＨＢＶ合成が既に可能な宿主（例えば、ＭＢＸ７６９／ｐＦＳ４４Ｃ）中に導入され得る。さらなる改善は、Ｃａｍｅｒｏｎら、１９９８（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４  １１６〜１２５）により示唆されるような、メチルグリオキサール合成遺伝子の過剰発現から生じ得る。ラットレンズアルドースレダクターゼまたはＥ．ｃｏｌｉグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ｐＦＳ４４Ｃと適合性のプラスミド（ｐＦＳ４４Ｃと同時に維持され得るプラスミド）上に導入され得るか、または、それらは、染色体中に組み込まれ得る。
【００６２】
（実施例８．３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の同定）
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｌｄＨ遺伝子配列は、ＧＥＮＢＡＮＫから入手可能である。この遺伝子を、実施例６に記載されるアプローチおよび以下のプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅の後にクローニングベクターｐＳＥ３８０のＡｃｃ６５ＩおよびＮｏｔＩ部位中にクローニングした：
【００６３】
【化４】
0005042407.tif 000008
得られた組換えプラスミドｐＡＬＤＨを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α中に導入し、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中にて３７℃で増殖させた。翌日に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌを、１００μｌの一晩の培養物に接種し、そして６００ｎｍの吸光度が０．５に達するまで増殖させた。６００ｎｍの吸光度が０．５に達した時点で、ｔｒｃプロモーターを、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、そして３７℃でさらに３時間インキュベートした。これらの細胞を回収し、洗浄し、そして０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ８．０中に再懸濁し、そして超音波処理により溶解した。これらの細胞溶解物を、補因子としてＮＡＤおよびＮＡＤＰの両方を用いて３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを使用して、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。アッセイを、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄダイオードアレイ分光光度計を使用して実行した。酵素反応を、１．５ｍｌのＵＶキュベットで、以下を含む溶液中で実行した：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、６ｍＭ  ジチオスレイトールおよび最終容量１ｍｌまでの粗細胞抽出物。混合液を、１ｍＭ  ３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを添加することによって反応を開始する前に２０秒インキュベートし、そして反応を３４０ｎｍでモニターした。この溶解物は、ベクターのみを使用して調製されたコントロールサンプル中に存在しないＮＡＤが補因子である場合に、有意な３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を示した（１．３５μモル／分／ｍｇタンパク質）。従って、ａｌｄＨ遺伝子は、先の実施例に記載される株における３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を増大させるために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、グリセロール−３−Ｐからの３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡの産生のフローチャートである。
【図２】  図２は、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈｂｃＴ）をコードするプラスミド構築物ｐＦＳ４４Ｃの模式図である。
【図３】  図３は、ｄｈａＢ、ｈｂｃＴおよびｐｈａＣをコードするプラスミド構築物ｐＦＳ４５の模式図である。
【図４】  図４は、ｄｈａＴ、ｄｈａＢおよびｈｂｃＴをコードするプラスミド構築物ｐＦＳ４７Ａの模式図である。
【図５】  図５は、ｄｈａＴ、ｄｈａＢ、ｈｂｃＴおよびｐｈａＣをコードするプラスミド構築物ｐＦＳ４８Ｂの模式図である。
【図６】  図６は、ｄｈａＴ、ＤＡＲ１−ＧＰＰ２（ＤＡＲ１、ジヒドロキシアセトンホスフェートデヒドロゲナーゼ；およびＧＰＰ２、ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェートホスファターゼ）、ｄｈａＢ、ｈｂｃＴおよびｐｈａＣをコードするプラスミド構築物ｐＭＳ１５の模式図である。
【図７】  図７は、ＧＰＰ２およびＤＡＲ１をコードするプラスミド構築物ｐＦＳ５１の模式図である。
【図１】
0005042407.tif 000009
【図２】
0005042407.tif 000010
【図３】
0005042407.tif 000011
【図４】
0005042407.tif 000012
【図５】
0005042407.tif 000013
【図６】
0005042407.tif 000014
【図７】
0005042407.tif 000015