(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共生Neisseria、またはその外膜調製物もしくはタンパク質画分を含む、ワクチン組成物であって、該共生Neisseriaが、N. lactamica、N. cinerea、N. elongata、N. flavescens、N. polysaccharea、N. sicca、およびN. subflavaからなる群より選択される、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記共生Neisseriaが死菌共生Neisseriaである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記死菌共生Neisseriaが、共生Neisseriaをチオメルサールおよびホルムアルデヒドの混合物に懸濁することによって得られる、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記共生Neisseriaが生きた共生Neisseriaである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記共生Neisseriaが、野生型種とは異なるように改変または弱毒化される、請求項１から４のいずれかの項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記外膜調製物が、外膜小胞を含む、請求項１から５のいずれかの項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記タンパク質画分が、デタージェントの存在下で共生Neisseria細胞を懸濁する工程および該懸濁液をインキュベートして該共生Neisseria細胞からタンパク質を抽出する工程によって得られる、請求項１から５のいずれかの項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記共生Neisseriaとは異種の遺伝子産物をさらに含む、請求項１から７のいずれかの項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記異種遺伝子産物が、前記共生Neisseria、外膜調製物またはタンパク質画分と物理的に結合されている、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記異種遺伝子産物が、N. meningitidisに由来する、請求項８または９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記異種遺伝子が、トランスフェリン結合タンパク質、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ、ＮｓｐＡ、ポリン、または外膜タンパク質から選択されるN. meningitidis由来のタンパク質をコードする、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１から１１のいずれかの項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のワクチン組成物を調製する方法であって、
ａ）前記共生Neisseria、外膜調製物またはタンパク質画分を得る工程；および
ｂ）該共生Neisseria、外膜調製物またはタンパク質画分を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせる工程、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記共生Neisseria、外膜調製物またはタンパク質画分を、異種遺伝子産物と組み合わせる工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
髄膜炎菌感染に対するワクチン接種のための医薬品の製造における、請求項１から１２のいずれかの項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれかの項に記載のワクチン組成物を含む、髄膜炎菌感染に対するワクチン接種のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ワクチン、および免疫応答を刺激するワクチンを調製するための方法に関する。特に、本発明は、微生物感染に対する広いスペクトルの防御免疫を与えるワクチンに関する。
【０００２】
病原性生物による感染は、慢性および急性疾患の主要な原因の１つである。特に、細菌、ウイルス、および原生生物のような微生物ソースから生じる感染は、世界中で数百万のヒトの命を奪いつづけている。微生物種は従来の抗生物質にますます耐性になるので、微生物感染に対して防御しそして戦う代替的なおよび好ましくは予防的な手段を提供することが望まれている。
【０００３】
髄膜炎菌性髄膜炎は、世界中の健康問題として特に重要であり、そして多くの国において感染の発生率は上昇している。Neisseria meningitidis（髄膜炎菌）は、この疾患を引き起こす生物であり、そして髄膜炎菌敗血症の原因でもあり、これは、速やかな発症および高い死亡率に関連し、約２２％の症例が死亡している。
【０００４】
現在、髄膜炎菌疾患に対する防御免疫を与えるワクチンは、N. meningitidisの多くの異なる株のため、限定された防御を提供するにすぎない。血清群抗原、莢膜多糖に基づくワクチンは、感染に対して短寿命の防御のみを提供し、そして北アメリカおよびヨーロッパで通常見られる多くの株に対して防御しない。これらのワクチンのさらなる欠点は、これらが、通常感染を受けやすい最も弱い群の１つである２歳以下の子供について、低レベルの防御しか提供しないことである。現在英国で使用されるより新しい複合ワクチンは、これらの問題のいくつかを示すが、髄膜炎菌のＣ血清群に対してのみ効果的である。
【０００５】
Goldら（Journal of Infectious Diseases, 137巻2号, 1978年2月, 112-121頁）は、N. lactamicaの運搬が、交差反応性抗体の誘導によってN. meningitidisに対する自然免疫の発生を援助し得ることを報告している。この結論は、N. lactamica感染に応答して生じる補体依存性殺菌活性を有する抗体と交差反応することの観察に基づいた。しかし、CannおよびRogers（J. Med. Microbiol., 30巻, 1989年, 23-30頁）は、病原性および共生のナイセリア種の共通抗原に対する抗体を検出したが、同じ抗原に対する抗体が、殺菌および非殺菌の血清の両方ともに存在することも観察した。したがって、交差反応性殺菌性抗体を同定することはできなかった。
【０００６】
髄膜炎菌疾患に対する弱毒化生ワクチンは、Tangら（Vaccine 17, 1999, 114-117頁）に示唆されており、そこでは、N. meningitidisの生きた弱毒化された株が経粘膜送達され得る。Tangはまた、病原性細菌による感染に対して防御するための共生細菌の使用についてコメントしているが、髄膜炎菌感染に対する防御を誘導する交差反応性エピトープが定義されておらず、したがってN. meningitidisの遺伝学的に改変された株の使用が好ましいと結論した。
【０００７】
N. meningitidisからの感染に対する防御免疫を与えるさらなるワクチンを提供することが所望される。幼児ならびに成人に対する防御免疫を与えそしてその防御が長期であるワクチンを提供することがさらに所望される。無症状感染、すなわち、髄膜炎菌感染の徴候がすぐには現れずそして感染した個体が病原体の保菌者の働きをし得ることに対して防御するワクチンを提供することも有益であり得る。N. meningitidis感染、顕著には淋病のすべてまたは広範な株に対して防御することは、さらに有益である。
【０００８】
WO-A-96/29412は、免疫学的に入手可能なN. meningitidis ２２ｋＤａ表面抗原の単離を記載している。この２２ｋＤａ抗原は、共生N. lactamicaを含む他のナイセリア種で保存されることが示されている。
【０００９】
Aounら（Annals de l'Institut Pasteur Microbiol. 139巻, 203-212頁 (1988)）は、７０ｋＤａ髄膜炎菌表面抗原に対するヒト患者における抗体の同定、およびワクチン成分としてのその価値に関する。ヒト保菌者からの回復期血清は、N. gonorrhoeaeの７０ｋＤａタンパク質にも結合することが示されている。しかし、非病原性のNeisseria種は、７０ｋＤａ抗原を有するが、子供において抗体応答をしばしば誘起しなかった。
【００１０】
Gomezら（Vaccine, 14巻, 1340-1346頁 (1996)）は、N. meningitidisからの３７ｋＤａ鉄応答性タンパク質（Ｆｂｐ）の精製を記載している。病原性NeisseriaからのＦｂｐに対して惹起されたマウス抗体は、共生生物のN. lactamicaおよびN. siccaからのＦｂｐに結合することが示されている。
【００１１】
免疫刺激成分を含む組成物およびそれに基づくワクチンを提供することが、本発明の目的であり、これは従来技術の欠点を満たすかまたは少なくとも緩和する。
【００１２】
本発明は、疾患に対するワクチンにおける共生Neisseriaを使用することに基づく。したがって、N. lactamicaのようなNeisseriaの共生種は、生ワクチンまたは死菌全細胞ワクチンとして、あるいはN. lactamicaの画分を含むワクチンに使用され得る。驚くべきことに、本発明に従ってN. lactamica死菌全細胞および外膜調製物で免疫したマウスが、致死的な腹腔内髄膜炎菌チャレンジから防御されること、およびN. lactamica細胞のデタージェント抽出物またはプレパラティブ電気泳動によって分離されたこの画分を含むワクチンもまた、致死的な髄膜炎菌チャレンジからマウスを防御することが証明されている。これらの結果は、マウスを使用して得られており、そして使用したマウスモデルは、ヒトにおける対応する免疫原性およびワクチン接種効果の予測とみなされる。
【００１３】
したがって、本発明の第１の局面は、免疫原性組成物を提供することであり、これは、共生Neisseria、またはその免疫原性成分、抽出物、もしくは誘導体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００１４】
本発明の組成物は、動物の感染に対するワクチン接種に特に適する。本明細書で使用される用語「感染」とは、宿主生物の組織内および／または上での病原性生物の増殖を含むことを意図する。このような病原性生物としては、代表的には、細菌、ウイルス、菌類、および原生生物が挙げられるが、生物の組織内および／または上でのいずれの微生物の増殖も、用語「感染」に含まれると考えられる。
【００１５】
共生微生物は、病気の兆候なしに宿主生物にコロニー形成し得る微生物である。多くの異なる共生Neisseriaが本発明での使用に適切であり、そしてこれらの共生Neisseriaは、N. lactamica、N. cinerea、N. elongata、N. flavescens、N. polysaccharea、N. sicca、およびN. subflavaからなる群より選択され得る。これらの共生生物の異なる種は、口内または鼻の領域あるいは他の粘膜表面にコロニー形成することが知られており、したがってそれぞれの種は、体の公知の領域に従って投与され得、正常にコロニー形成する。したがってまた、本発明の組成物の使用は、新たに防御抗体の産生の刺激を生じ得、または個体が既にある程度までコロニー形成されているならば天然に存在する抗体の増強を生じ得る。
【００１６】
「抽出物」または「成分」は、共生Neisseriaの抽出物または成分に対して惹起した抗体が病原性Neisseria、特にN. meningitidisと交差反応するような、免疫原性である抽出物または成分である。
【００１７】
用語「誘導体」は、野生型種とは異なるようにいくつかの方法で改変または弱毒化される共生Neisseriaのタイプおよび種を記載するために使用され；例えば、抗生物質化合物のあるタイプに耐性を示す組換え共生Neisseriaを含むワクチン組成物であり、これは、感染の処置にこのような抗生物質と組み合わせて有利に利用され得る。
【００１８】
ナイセリア疾患に対するワクチン接種が、Neisseriaの非病原性種を使用してこのように達成され得、ワクチン接種がより安全な手順になることが、本発明の利点である。さらに、驚くべきことに、与えられた防御は、髄膜炎菌の特異的血清型、サブタイプ、または血清群に限定され得ないが、一般的防御効力がある。
【００１９】
本発明の主題である共生Neisseriaが、毒性タイプに戻り得ないことは、本発明のさらなる利点である。ワクチン接種の分野において、生きた弱毒化された病原体を使用することが知られており、そしてこの使用は、弱毒化した生物が毒性に戻り得るという危険性を有する。この危険性は本発明によって回避される。さらに、N. meningitidisは、病原性における正確な役割が未知である多くの毒性因子を有しており、そして従来認識されていなかった毒性因子を有し得る。したがって、本発明のさらなる利点は、本発明の組成物が、安全性のレベルに確信をもって使用され得ることである。
【００２０】
本発明の方法は、好ましくはナイセリア感染だけでなく、種々の感染に対するワクチン接種への適用である。本発明の特定の実施態様では、髄膜炎菌疾患に対する防御が証明されている。本発明はまた、淋病感染を含むナイセリア感染に対するワクチン接種に一般的に、および他の病原性微生物からの感染にも、適用がある。本発明は、さらに、免疫系を刺激するかまたは脱感作するかのいずれかに関するワクチン接種を提供する。
【００２１】
組成物は、詳細には、死菌共生Neisseriaを含み、これは、例えば、加熱によって、またはチオメルサールおよびホルムアルデヒドのような殺菌剤の混合物に共生Neisseriaを懸濁することによって得られ得る。
【００２２】
組成物はまた、生きた共生Neisseriaを含み得る。上述のように、任意であるが、これらの生物は無毒性なので、通常は弱毒化共生Neisseriaを使用する必要はない。
【００２３】
本発明の１つの実施態様では、共生Neisseriaの免疫原性成分または抽出物は、外膜小胞調製物、外膜調製物、リポオリゴ糖、およびタンパク質画分から選択される。
【００２４】
N. lactamicaの外膜調製物およびタンパク質画分は、例えば、鉄の存在下または不在下で培養されたN. lactamicaから得られ得る。N. lactamicaのタンパク質画分は、便利には、デタージェントの存在下でN. lactamica細胞または膜を懸濁する工程、および懸濁液をインキュベートしてN. lactamicaからタンパク質を抽出する工程によって得られる。
【００２５】
あるいは、細胞調製物からの、タンパク質画分、リポオリゴ糖、およびリポ多糖のような外膜成分の抽出について、多くの他の技法が知られており、そして本発明の共生Neisseria免疫原性成分または抽出物を得るために適切である。この目的のための従来の技法の例としては、塩濃度の変更、カオトロピック剤、ｐＨの変更（高いまたは低い）、酵素消化、および機械的破壊の使用が挙げられる。
【００２６】
多くの異なる画分が、髄膜炎菌疾患に対するワクチン接種における使用に適切である。特に適切な画分は、５０ｋＤａ以下の分子量の画分、４０ｋＤａ以上および７０ｋＤａ以下の分子量の画分、および６０ｋＤａ以上の分子量の画分である。
【００２７】
本発明のより特定の実施態様では、免疫応答を誘起するための、そしてナイセリア感染、より詳細には、髄膜炎菌疾患に対して個体にワクチン接種することにおける使用に適切である組成物が提供され、これは以下の特性を有する１つまたは複数の抗原性成分を含む：
（ａ）５０ｋＤａ以下の分子量；
（ｂ）N. lactamicaから得られ得る；および
（ｃ）N. lactamicaから得られる成分に対する抗体が、N. meningitidisと交差反応する。
【００２８】
デタージェントを用いて抽出されたこのような成分を含む組成物の使用において、この成分で処置したすべてのマウスは、２×１０７ＣＦＵのN. meningitidisのチャレンジした用量で生存し、そして５匹のマウスのうちの３匹が、６×１０８ＣＦＵのより高いチャレンジ用量で生存した。
【００２９】
本発明の他の特定の実施態様は、免疫応答を誘起するための組成物であり、そしてナイセリア感染、より詳細には髄膜炎菌疾患に対して個体にワクチン接種することにおける使用に適切である組成物であり、これは以下の特性を有する１つまたは複数の抗原性成分を含む：
（ａ）少なくとも４０ｋＤａおよび７０ｋＤａまでの分子量；
（ｂ）N. lactamicaから得られ得る；および
（ｃ）N. lactamicaから得られる成分に対する抗体が、N. meningitidisと交差反応する。
【００３０】
N. lactamicaのデタージェント抽出物を用いて得られる本発明のこのような成分の使用において、この成分で処置した５匹のマウスのうちの４匹が２×１０７ＣＦＵのN. meningitidisのチャレンジ用量で生存し、そして６×１０８ＣＦＵのより高いチャレンジ用量を投与されたマウスはコントロール群よりも長く生存した。
【００３１】
本発明のなおさらなる実施態様は、免疫応答を誘起するための、そしてナイセリア感染、より詳細には髄膜炎菌疾患に対して個体にワクチン接種することにおける使用に適切である組成物であり、これは以下の特性を有する１つまたは複数の抗原性成分を含む：
（ａ）少なくとも６０ｋＤａの分子量；
（ｂ）N. lactamicaから得られ得る；および
（ｃ）N. lactamicaから得られる成分に対する抗体が、N. meningitidisと交差反応する。
【００３２】
デタージェント抽出物を用いて得られるこのような成分の使用において、５匹のマウスのうちの１匹が２×１０７ＣＦＵのN. meningitidisのチャレンジ用量で生存したが、６×１０８ＣＦＵのより高いチャレンジ用量に対してはすべてのマウスが死亡し、その生存時間は、この成分を投与されていないコントロール群よりも長かった。
【００３３】
以下でより詳細に記載する本発明の使用例では、共生Neisseriaから抽出された２５〜３５ｋＤａおよび３５〜４３ｋＤａのサイズ範囲のタンパク質は、ワクチン成分としてマウスに投与される場合、顕著なレベルの免疫防御を与えた。
【００３４】
本発明の抗原性成分を抽出する方法の例として、抽出方法は、以下の工程を含む：
（ｉ）デタージェントの水溶液中にN. lactamica細胞を懸濁する工程；
（ｉｉ）上記懸濁液をインキュベートしてこのN. lactamicaから抗原性成分を抽出する工程；
（ｉｉｉ）上記懸濁液を遠心分離して上記懸濁液を上清とペレットとに分離する工程；および
（ｉｖ）上記上清から抗原性成分を分画する工程。
【００３５】
この特定の方法は、ユーザーによって選択される抽出プロトコルに従って、例えば、最初の工程（ｉ）において高い塩濃度を使用することによって、改変され得る。本発明のさらなる実施態様では、抗原性成分は、組換え技術を用いて、E.coliのような適切な宿主でのN. lactamica配列の発現によって得られる。
【００３６】
本発明の第２の局面では、共生Neisseria、またはその免疫原性成分、抽出物、もしくは誘導体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ナイセリア感染に対するワクチン接種のための組成物が提供され、この共生Neisseriaは、病原性Neisseria由来の遺伝子を含みそして発現する。
【００３７】
本発明のこの局面は、病原性Neisseria由来の抗原をレシピエントに送達および／または提示するための共生生物の使用の有益性を提供する。この遺伝子は、必要に応じて、表面抗原または分泌されるタンパク質をコードし、そして例えば、N. meningitidisまたはN. gonorrhoeae由来の抗原をコードし得る。共生Neisseriaは、生きているかまたは死菌であり得る。
【００３８】
本発明の第２の局面の実施態様では、共生Neisseriaおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、髄膜炎菌疾患に対するワクチン接種のための組成物が提供され、この共生Neisseriaは、N. meningitidis遺伝子を含みそして発現する。
【００３９】
N. meningitidis遺伝子は、例えば、トランスフェリン結合タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）（例えば、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）、ナイセリア表面タンパク質Ａ（「ＮｓｐＡ」）、ポリン、または他の外膜タンパク質をコードし得る。これらの抗原の大部分についての遺伝子配列は、文献で知られている。Krollら, Microbiology 141(Pt 9), 2271-2279 (1995)は、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤの配列を記載する。Martinら, J Exp Med, 1997, 4月7日, 185(7), 1173-1183頁は、N. meningitidis由来のＮｓｐＡの配列を記載する。
【００４０】
本発明はまた、本発明の第１または第２の局面の組成物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を提供する。
【００４１】
第３の局面では、本発明は、本発明の第１および第２の局面の組成物の有効量を投与する工程を含む、ナイセリア感染に対するワクチン接種の方法を提供する。
【００４２】
以下の例に記載される本発明の実施態様の使用において、本発明の第１および第２の局面の組成物の有効量を投与する工程を含む、髄膜炎菌疾患に対するワクチン接種の方法が提供される。
【００４３】
本発明の第４の局面では、病原性Neisseria由来の遺伝子を発現するように遺伝学的に改変された、N. lactamicaのような共生Neisseriaの株が提供される。N. meningitidis遺伝子は、例えば、トランスフェリン結合タンパク質、ＳＯＤ（例えば、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）、ＮｓｐＡ、ポリン、または他の外膜タンパク質から選択されるタンパク質をコードし得る。
【００４４】
本発明はさらに、第５の局面において、髄膜炎菌疾患に対するワクチン接種に適切な組成物に組み込むためのタンパク質を抽出する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む：
（ｉ）デタージェントの存在下で共生Neisseria、例えば、N. lactamicaの細胞を懸濁する工程；および
（ｉｉ）上記懸濁液をインキュベートしてこの細胞からタンパク質画分を抽出する工程。
【００４５】
このタンパク質画分は、適切には、５０ｋＤａ以下の分子量、少なくとも４０ｋＤａおよび９０ｋＤａまでの分子量、または少なくとも８０ｋＤａの分子量であり得る。
【００４６】
この組成物は、薬学的に受容可能なキャリア−経口、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、または任意の他の投与経路に適切な任意のキャリアであり得るが、例えば、アジュバントアルム−と組み合わされて、髄膜炎菌疾患の処置のための薬学的組成物を生成し得る。口内コロニー形成菌である共生Neisseriaは、口内洗浄剤で、そして鼻内コロニー形成菌では鼻内スプレーで投与され得る。
【００４７】
トランスフェリン結合タンパク質は、N. meningitidisのような多くのグラム陰性細菌の外膜上に位置することが知られている。本発明の組成物と従来のキャリアまたはアジュバントとの、および必要に応じてさらにNeisseria種由来の（必要に応じて組換え産生された）１つ以上の抗原、例えば、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ、２２ｋＤａ ＮｓｐＡ、ポリン、淋病抗原、またはトランスフェリン結合タンパク質が補充された処方物は、これらの細菌による感染の処置のための組成物を提供する。
【００４８】
本発明において、用語「トランスフェリン結合タンパク質」または「Ｔｂｐ」とは、単独でトランスフェリンに結合するかまたはトランスフェリンに結合するタンパク質の複合体の一部であり得るかのいずれかのタンパク質をいう。この用語はまた、フラグメント、改変体、または誘導体に対して惹起された抗体がタンパク質に結合するならば、このようなタンパク質のフラグメント、改変体、および誘導体を含む。したがって、解離したまたは会合して複合体となったいずれかのＴｂｐＡおよびＴｂｐＢは、Ｔｂｐであると考えられる。さらに、共通の抗原同一性を有するＴｂｐＡもしくはＢまたはＴｂｐＡ＋Ｂ複合体の他の誘導体のいずれかの変異体、融合タンパク質、またはフラグメントも、本発明における用語Ｔｂｐで表されると考えられる。
【００４９】
本発明の生ワクチンは、非経口的にまたは粘膜に、例えば、鼻内または経口接種によって投与され得る。死菌またはサブユニットワクチンはまた、この経路によって投与され得るか、あるいは経口送達用に処方され得る。サブユニットワクチンは、便利には、非経口経路によって投与される。本発明の特定の実施態様においてテストされた株からの種々の共生Neisseriaおよび種々の株のN. lactamicaが存在し、そして本発明は、他の株にも適用される。
【００５０】
本発明の第６の局面は、抗体を含む組成物を提供し、この抗体は、本発明の第１または第２の局面の共生Neisseriaまたはその免疫原性成分もしくは抽出物に結合する。抗体は、薬学的組成物に処方され得、髄膜炎菌疾患のようなナイセリア感染、または他のNeisseriaによって引き起こされる感染の処置に使用され得る。
【００５１】
本発明のこの局面の抗体は、標準的な技法に従って、例えば、共生Neisseriaまたはその免疫原性成分もしくは抽出物を動物に接種し、その後その共生Neisseriaまたはその免疫原性成分もしくは抽出物に結合する抗体を単離することによって、得られ得る。
【００５２】
本発明のさらなる局面は、共生Neisseria、またはその免疫原性成分、抽出物、もしくは誘導体を含む組成物を提供し、このNeisseriaは、異種遺伝子産物を含む。
【００５３】
本発明の異種遺伝子産物としては、代表的には、この共生Neisseriaには本来ない遺伝子配列によってコードされるペプチド、タンパク質、およびアンチセンス配列が挙げられる。本発明の代表的な異種遺伝子産物としては、例えば、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、または表面ペプチド、その抗原および抗体およびフラグメントが挙げられる。本発明の異種遺伝子産物はまた、病原性生物で見られる任意の抗原であり得る。
【００５４】
本発明の実施態様では、組成物は、異種遺伝子産物をコードする遺伝子配列を含む発現ベクターで形質転換されている共生Neisseriaを含む。本発明での使用に適切な特定のタンパク質としては、代表的には、以下のものが挙げられる：
ウイルスタンパク質−例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原；狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ；単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ；エプスタイン−バーウイルス糖タンパク質；インフルエンザウイルス糖タンパク質；水疱性口内炎ウイルス核タンパク質；ヒト呼吸合包体ウイルス糖タンパク質Ｇ；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ；ロタウイルスサブユニット；麻疹ウイルスサブユニット；およびワクシニアウイルスサブユニット：
細菌タンパク質−例えば、Bordetella pertussis線毛サブユニット；Bordetella pertussis表面タンパク質；Bacillus anthracisサブユニット；Escherichia coliサブユニット；およびYersinia pestisサブユニット：
原生生物タンパク質−例えば、Plasmodium falciparumタンパク質；トリパノソーマタンパク質；およびCryptosporidiumタンパク質。
【００５５】
さらなる実施態様において、本発明の組成物は、非感染性疾患、例えば、アレルギーおよび癌の処置のための免疫刺激性である異種遺伝子産物を発現する共生Neisseriaを提供する。本発明の使用例では、ピーナッツ抗原を発現する共生Neisseriaが、急性ピーナッツアレルギーの患者を脱感作するために使用される。
【００５６】
以下でより詳細に記載される本発明のさらなる使用例では、発現ベクターpJSK422が、共生N. cinereaにおいてgroES/ELプロモーターの制御下で、グリーン蛍光タンパク質を発現するために使用される。
【００５７】
本発明は、さらに、異種遺伝子産物をナイセリア細胞の外膜に向かわせるシグナル配列を含む発現ベクターで形質転換される共生Neisseriaを提供する。分泌シグナルまたは細胞サブコンパートメント局在化シグナル、例えば、ペリプラズム局在化シグナルのような、他のシグナル配列もまた、本発明における使用に適切である。
【００５８】
本発明のさらなる局面は、組成物を調製する方法を提供する。このような方法は、動物に投与される場合、微生物感染に対する防御免疫を誘起するワクチン粗生物を調製するために適切である。
【００５９】
以下でより詳細に記載される本発明の使用例は、以下の工程を含む、組成物を調製する方法を提供する：
ａ）異種遺伝子産物をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入する工程；
ｂ）上記異種遺伝子産物がNeisseriaで発現されるように、上記発現ベクターを共生Neisseriaに形質転換する工程；および
ｃ）上記（ｂ）のNeisseriaを薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせる工程。
【００６０】
本発明のさらなる例は、以下の工程を含む、組成物を調製する方法を提供する：
ａ）異種遺伝子産物をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入する工程；
ｂ）上記異種遺伝子産物がNeisseriaで発現されるように、上記発現ベクターを共生Neisseriaに形質転換する工程；
ｃ）上記（ｂ）のNeisseriaから免疫原性成分または抽出物を得る工程；および
ｄ）上記（ｃ）の免疫原性成分または抽出物を薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせる工程。
【００６１】
本発明のなおさらなる使用例では、以下の工程を含む、組成物を調製する方法を提供する：
ａ）共生Neisseriaから免疫原性成分または抽出物を得る工程；および
ｂ）上記（ａ）の免疫原性成分または抽出物を異種遺伝子産物および薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせる工程。
【００６２】
したがって、本発明は、（ａ）異種遺伝子産物を発現する共生Neisseriaから抽出物を取り出す、方法および組成物、ならびに（ｂ）抽出物が共生Neisseriaから得られそして別のところで（他の生物で）発現された異種遺伝子産物がこの後者の抽出物と組み合わされる、方法および組成物を提供する。
【００６３】
本発明のさらなる局面は、ナイセリア感染の処置のための医薬品の製造における、共生Neisseriaの使用、ならびに動物における感染の処置または免疫刺激のための医薬品の製造における、共生Neisseria、またはその免疫原性成分、抽出物、もしくは誘導体の使用を提供し、このNeisseriaは異種遺伝子産物を含む。
【００６４】
本発明の特定の実施態様は、以下に記載の実施例によってより詳細に議論される。実施例に記載の結果は、添付の図面によって説明される。
【００６５】
実施例１
死菌全細胞を含むワクチンの調製
Neisseria lactamica株Y92-1009を、５μg/mlのエチレンジアミン-ジ(o-ヒドロキシフェニル酢酸)（EDDHA）を含むMueller Hintonブロス（MHB）中で増殖し、37℃にて振盪（140rpm）しながら約６時間インキュベートした。
【００６６】
次いで、細菌を遠心分離によって集め、そして１％(v/v)ホルムアルデヒドおよび0.1％(w/v)チオメルサールを含むリン酸緩衝化生理食塩液（PBS）に再懸濁し、そして２〜８℃にて一晩放置した。次いで、死菌細胞を、1.0のＯＤ650（２×１０９ＣＦＵ/mlに等価）になるようにPBSに再懸濁し、そしてアルヒドロゲル（alhydrogel）を25％(V/V)になるまで加え、皮下投与に適切な生成物を得た。
【００６７】
この方法は、N. cinerea、N. elongata、N. flavescens、N. polysaccharea、N. sicca、およびN. subflavaにも適切である。
【００６８】
実施例２
N. lactamica外膜（ＯＭ）調製物を含むワクチンの調製
N. lactamica株Y92-1009を、５μg/mlのEDDHAを添加したおよび添加しないMHB中で37℃にて振盪しながら一晩増殖させた。次いで、鉄制限した（EDDHAを含む）および鉄補充した細胞を、別々に処理した。1.5リットルから遠心分離によって細菌を集め、そして20mlの200mM酢酸リチウム、５mM EDTA、pH 6.0に再懸濁し、そして37℃にて振盪しながら3時間インキュベートした。次いで、細菌を21ゲージ針を７回通過させ、そして10分間の8000gによってペレットにした。
【００６９】
上清を回収し、そして４℃にて100,000gでの１時間の遠心分離によって、膜をペレットにした。次いで、膜を、0.1％(v/v)10mM PMSFを含む10mM HEPES、pH 7.4に再懸濁し、ＯＭ含有ワクチン接種調製物を得た。ＯＭワクチン調製物のタンパク質含量を、ビシンコニン酸アッセイ（Sigma, UK）を使用して決定した。ＯＭを、滅菌脱イオン水で希釈して、100μg/mlのタンパク質濃度にした。次いで、これを等容量のフロイントアジュバントと混合して、50μg/mlの最終タンパク質濃度にし、そして全体を乳濁させた。初回投与にはフロイント完全アジュバントを用い、そしてその後のブーストにはフロイント不完全アジュバントを用いた。
【００７０】
実施例３
リポオリゴ糖（ＬＯＳ）を含むワクチンの調製
ＬＯＳの精製を、Gu, X-XおよびTsai, C.M. (1991) Anal Biochem. 196; 311-318の方法を用いて、N. lactamica株Y92-1009から行った。ワクチンを、10μg/mlの最終濃度でＬＯＳを用いて、上記と同様にフロイントアジュバントを使用して調製した。
【００７１】
実施例４
ワクチン接種およびチャレンジスケジュール
５匹のマウスの群に、以下のように各調製物をワクチン接種した：
初回免疫：−          ０日目
第１回ブースト：−    ２１日目
第２回ブースト：−    ２８日目。
【００７２】
実施例１の死菌細胞をワクチン接種したマウスには、１×１０９ＣＦＵに等価の死菌全細胞である0.5mlを皮下投与した。実施例２のＯＭおよび実施例３のＬＯＳをワクチン接種したマウスには、10μgのタンパク質および２μgのＬＯＳに等価である0.2mlを皮下投与した。
【００７３】
３５日目に、20mg/mlの最終濃度でトランスフェリンを含むＭＨＢ中で作成した約１０８ＣＦＵのN. meningitidis K454を、腹腔内注射によってマウスにチャレンジした。次いで、マウスを検査し、そして生存数を記録し、そして結果を図１に示す。４日後、全細胞およびＯＭＰ（鉄を含まない）をワクチン接種した群において５匹のすべてのマウスが生存し、そしてＯＭＰ（鉄含有）をワクチン接種した群においては３匹が生存していた。５日後には、コントロール群およびＬＯＳ（図ではＬＰＳと示す）をワクチン接種した群のすべてのメンバーが死亡した。
【００７４】
実施例５
N. lactamica画分を含むワクチンの調製
脳心臓注入寒天プレートに、50μlのN. lactamica株Y92-1009を接種し、そして５％ＣＯ２下で37℃にて一晩インキュベートした。これを用いて、100ml ＭＨＢスターター培地に接種して、37℃にて振盪しながら６時間インキュベートした。スターター培養物（15ml）を、６×500ml容量のＭＨＢのそれぞれに添加した。次いで、これらを37℃にて一晩振盪しながらインキュベートし、そして条件を、５μg/ml EDDHAの添加によって鉄制限にした。細胞を遠心分離によって集め、そして上清を捨てた。細胞を100ml PBSで洗浄し、次いで遠心分離によってペレットにした。細胞ペレットを、PBS＋0.3％(v/v)Elugent（Calbiochem、２ml/g湿重量）に再懸濁し、そして37℃にて20分間振盪しながらインキュベートした。次いで、細胞を遠心分離によって除去し、そしてペレットを捨てた。次いで、EDTAおよびN-ラウロイルサルコシンを、それぞれ10mMおよび0.5％(w/v)になるように上清に加えた。
【００７５】
次いで、BioRad（登録商標）Prep Cell, model 491を用いて、デタージェント抽出物に含まれるタンパク質を分離した。４cm、７％アクリルアミド天然分析ゲルを、２cmスタッキングゲルとともにキャストした。天然の試料緩衝液中の12mgのタンパク質を、0.1％(w/v) SDS、0.025M Tris、および0.192Mグリシンを含むランニング緩衝液を用いて、染料前部がゲルの下部に達するまで、40mAおよび400Vで電気泳動した。次いで、溶出したタンパク質の３mlの複数の画分を収集した。画分を収集するとすぐに、これらを、約４０ｋＤａ以下、４０と６７ｋＤａとの間、および６７ｋＤａ以上の分子量のタンパク質からなる群にプールした。プールしたタンパク質を硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮し、そしてPBSに対して透析した。これらを100μg/mlのタンパク質濃度になるようにPBSで希釈し、そしてフロイント完全アジュバントを１：１(v/v)の比で添加し、あるいはブースター投与にはフロイント不完全アジュバントを添加した。
【００７６】
実施例６
ワクチン接種およびチャレンジスケジュール
５匹のマウスの群に、以下のように各調製物をワクチン接種した：
初回免疫：−          ０日目
第１回ブースト：−    ２１日目
第２回ブースト：−    ２８日目。
【００７７】
マウスに、ワクチンなし（すなわち、コントロール群）、Elugent（「登録商標」）抽出物、または高、中、もしくは低分子量画分をワクチン接種した。タンパク質画分を投与するマウスの群に、10μgのタンパク質に等価である0.2mlを皮下投与した。
【００７８】
３５日目に、20mg/mlの最終濃度のトランスフェリンを含むＭＨＢ中で作成した約２×１０７または６×１０８ＣＦＵのいずれかのN. meningitidis K454を、腹腔内注射によってマウスにチャレンジした。次いで、マウスを４日間検査し、そして生存数を記録し、そして結果を図２に示す−上の図は、２×１０７のチャレンジおよび下の図は、６×１０８のチャレンジである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを流した後の高、中、および低分子量画分の成分を、図３に示す。
【００７９】
実施例７
髄膜炎菌疾患後のヒト血清の試料を研究し、そしてこれらは、ある範囲のN. lactamicaタンパク質と反応する抗体を産生することを示した。イムノブロットの結果を図４に示す。
【００８０】
実施例８
実施例６（図２を参照のこと）において低分子量プールによって示される防御のレベルに基づいて、これらのタンパク質のさらなる分離を、実施例５の方法に従って行い、防御の原因となる成分をさらに特徴付けた。タンパク質を、＜２５ｋＤａ（ｇ１）、２５〜３５ｋＤａ（ｇ２）、および３５〜４３ｋＤａ（ｇ３）（図５に示される）からなる３つの群にプールした。リポ多糖（ＬＰＳ）のレベルの測定は、画分ｇ１において高レベルのＬＰＳ［２６５８０エンドトキシン単位/ml（EU/ml）］を示し、そして残りの画分ではかなり低レベルであった（ｇ２では９１４９EU/mlおよびｇ３では９３４８EU/ml）。
【００８１】
これまでの実施例におけるように、５匹のマウスの群に、３回投与スケジュールを用いて、上記のタンパク質の３つの群、＞４３ｋＤａタンパク質、N. lactamicaの死菌全細胞のデタージェント抽出物、およびN. lactamicaの死菌全細胞のうちの１つを免疫した。動物に、N. meningitidis血清群Ｂの株K454を、５×１０６または１×１０８ＣＦＵの用量で、非免疫コントロールとともにチャレンジした。チャレンジ後の各日における生存数を、図６に示す。
【００８２】
コントロール群およびｇ３群の１匹のマウスは別として、すべてのマウスは、低チャレンジ用量で生存したが；高チャレンジ用量では、ｇ２およびｇ３タンパク質群（それぞれ２５〜３５ｋＤａおよび３５〜４３ｋＤａ）が最も良好な防御を示した。
【００８３】
実施例９
組換えタンパク質発現のためのベヒクルとしての共生Neisseria
麻疹ウイルスヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子を、pMGC18.1シャトルベクターにクローニングし（Webbら, 1998, 第11回 International Pathogenic Neisseria Conference, Niceでのポスター）、そしてE.coli DH5αに形質転換した。麻疹ウイルスヌクレオカプシドタンパク質の発現を、特異的抗血清でプロ−ブしたウエスタンブロッティングによって確認した。次いで、この構築物を用いて、接合によってN. lactamicaを形質転換した。麻疹ウイルスヌクレオカプシドタンパク質の発現を、ナイセリアfrpCプロモーターの制御下に配置し、そして細菌を鉄制限した増殖条件下で増殖した場合に、高レベルでの発現が見られた。
【００８４】
実施例１０
共生N. cinereaにおけるＧＦＰの発現
Aequorea victoriaのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を、標準的なクローニング技法を用いてpJSK422プラスミドに挿入した。ＧＦＰは、groES/ELプロモーターの制御下にあった。ネガティブコントロールとして、ＧＦＰ遺伝子を、pJSK422プラスミドのgroES/ELプロモータを欠いているpJSK411プラスミドにも挿入した。
【００８５】
N. cinereaを、pJSK422またはpJSK411（ネガティブコントロール）のＧＦＰ含有プラスミドのいずれかとの接合（実施例９を参照のこと）によって形質転換した。形質転換した細胞を、適切な条件下で培養した。N. cinereaのpJSK422で形質転換した培養物の蛍光を、pJSK411で形質転換した培養物の蛍光と比較した。比較の結果を図７に示す。ヒストグラムは、Ｘ軸にＧＦＰ蛍光の強度およびＹ軸に蛍光を発している細胞数を示す。蛍光のレベルが、pSK422で形質転換したN. cinereaにおいてpJSK411で形質転換したものよりも高いことが明らかであり、これは、ピークが右にシフトしていることによって示される。これは、共生N. cinereaにおけるＧＦＰ遺伝子の異種発現を示す。
【００８６】
したがって、本発明は、疾患に対して防御することに使用するための免疫原性組成物およびワクチンを提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  N. lactamica全細胞および外膜画分の使用によるN. meningitidis株K454での腹腔内（「ＩＰ」）感染に対するマウスの防御を示す図である。
【図２】  デタージェントならびにN. lactamica細胞の高、中、および低分子量抽出物の使用による、N. meningitidis株K454でのＩＰ感染に対するマウスの防御を示す図である−上の図＝２×１０７ＣＦＵによるチャレンジ、下の図＝６×１０８ＣＦＵによるチャレンジ。
【図３】  図２の高、中、および低分子量画分の成分を示す図である。
【図４】  髄膜炎菌疾患患者からの血清中の抗体とN. lactamica株Y92-1009由来のタンパク質との交差反応を示すイムノブロットを示す図である。
【図５】  低分子量外膜タンパク質抽出物のサブ画分を流したゲルの写真である。
【図６】  低分子量サブ画分で免疫した場合のN. meningitidis株K454でのＩＰ感染に対するマウスの防御を示す図である−上の図＝５×１０６ＣＦＵによるチャレンジ、下の図＝１×１０８ＣＦＵによるチャレンジ。
【図７】  pJSK411（プロモーターのないGFP）を含むN. cinerea NRL 32165の蛍光とpJSK422（groEL/ESプロモーターを有するpJSK411）のものとを比較するヒストグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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