(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマ細胞株ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６により産生される、抗体。
【請求項２】
ウシ海綿状脳症またはクロイツフェルト・ヤコブ病またはクロイツフェルト・ヤコブ病の変異型形態またはＴＳＥ関連疾患を診断するための薬剤の調製のための、請求項１記載の抗体の使用。
【請求項３】
請求項１記載の抗体を含有する、ＢＳＥおよび／またはＣＪＤおよび／またはｖＣＪＤまたはＴＳＥ関連疾患を診断するためのキット。
【請求項４】
ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６である、ハイブリドーマ細胞株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、プリオンのＰｒＰScイソ型のＣ末端部分に対する新規な抗体に関する。詳細には、本発明は、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、クロイツフェルト・ヤコブ病の新しい異型形態（ｖＣＪＤ）、散発性ＣＪＤおよびスクレイピーの診断におけるそのような抗体の使用に関する。
【０００２】
１９８６年以降、慢性の変性疾患が英国で診断されている。この疾患に罹患した家畜は神経系の進行性の変性を受け、神経質または攻撃性、異常な姿勢、立ち上がりの協調不能および困難、低下した乳汁産生、または継続した食欲にもかかわらず体重の低下などの性質の変化を示している。
【０００３】
この疾患はウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）と名付けられたが、今では「狂牛病」と広く呼ばれている。その後の１０年間に、約１６００００例のこの新しく認識された家畜疾患が英国で確認されている、同時に、欧州諸国においても、そして海外（例えば、カナダ、フォークランド諸島およびオマーン王国）においてさえも、この疾患に罹っている動物が報告されている。
【０００４】
ＢＳＥは伝染性の病原体を伴っているが、その性質はまだ完全には理解されていない。この病原体は家畜の脳および脊髄を冒し、病巣は、顕微鏡によって視認され得るスポンジ様の変化を特徴としている。この病原体は非常に安定であり、凍結および乾燥に対してだけでなく、通常の調理温度への加熱に対して、そして低温殺菌、通常的な温度および時間での殺菌のために使用される温度などのさらにより高い温度への加熱に対して耐える。
【０００５】
ＢＳＥに自然感染した家畜において、ＢＳＥ病原体は、脳組織、脊髄および網膜にのみ見出されている。さらなる研究により、ＢＳＥ感染動物に由来する脳材料が与えられていた子ウシの遠位回腸、骨髄、後根神経節および三叉神経節におけるＢＳＥ感染性が確認されている。
【０００６】
ヒトでは、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）と名付けられている類似した変性症候群が知られている。ＣＪＤは、明かな機能不全、進行性痴呆および脳の空胞変性を伴う中枢神経系の遅い変性性のヒト疾患である。ＣＪＤは、１年に百万人あたり１人の割合で世界中で散発的に発生している。よりまれには、ゲルストマン−ストロイスラー症候群、クールー病および致死性家族性不眠症の関連するＴＳＥ（伝染性海綿様脳症）状態がある。
【０００７】
１９９６年に、英国海綿様脳症諮問委員会（ＳＥＡＣ）は、ＣＪＤの新しい異型形態（ｖＣＪＤ）が１０例確認されたと発表している。すべての患者は１９９４年または１９９５年に発症している。しかし、報告された１０例は、ＣＪＤの散発型形態とは非常に異なっている。罹患者は、従来のＣＪＤ患者よりもはるかに若い。典型的には、ＣＪＤ患者は６３歳を越えている。これに対して、異型ＣＪＤの発症に対する平均患者年齢は約２８歳である。ｖＣＪＤにおける疾患の経過は平均して１３ヶ月であるが、これは、平均して６ヶ月の継続期間である従来のＣＪＤ症例と異なる。異型症例では、脳における脳波計（ＥＥＧ）電気活性は散発性ＣＪＤの特徴を示していない。脳の病理学はＣＪＤとして識別可能である、そのパターンは散発性ＣＪＤとは異なり、プリオンタンパク質斑の大きい集塊を有している。
【０００８】
ＳＥＡＣによれば、すべての犠牲者は過去１０年に牛肉または牛肉製品を食べていたことが報告されている。このことは、ｖＣＪＤとＢＳＥとの因果関係を示している。１９９７年に発表された２つの論文は、ＢＳＥ病原体がｖＣＪＤの原因である可能性が非常に高いことを確認している。この目的のために、１つの研究者グループは３群の同系交配マウスおよび１群の交雑マウスにＢＳＥ、ｖＣＪＤおよび散発性ＣＪＤをそれぞれ感染させた。中間結果は、ＢＳＥ接種マウスが、ｖＣＪＤ患者に由来する組織が接種されたマウスと同じパターンの潜在時間、臨床的徴候および脳病巣を示したことを示している。このことから、ＢＳＥおよびｖＣＪＤは同じ特性を有するか、または同じ「株」であると結論される。さらに、散発性ＣＪＤおよび知られているスクレイピー株はｖＣＪＤまたはＢＳＥと類似していない。これらの結果が他の研究者によって確認されたので、現在では、ＢＳＥはヒトに伝染して、ｖＣＪＤの発症をもたらし得ると考えられている。
【０００９】
感染した家畜に由来する製品を消費した結果、ＢＳＥがヒト集団に伝染し得る可能性に関する社会的および科学的な関心が増大しているために、ＢＳＥに罹っている家畜は畜殺すべきであり、そしてその畜殺体をヒトの食物連鎖の中に入れるべきではないと提案されている。しかし、ＢＳＥが、感染動物の行動の結果として発現するには典型的には５年以上要することを考えれば、そして畜殺した動物の脳を調べること以外に、特定のウシがＢＳＥに罹っているか否かの可能性を評価する迅速な方法がないため、採用すべき唯一の安全な方法で、そのうえ、牛肉製品を食べることの安全性に関する社会的な恐怖を静める方法は、畜殺を広げることであると提案されている。そのような処置は、ＢＳＥに感染していない何千頭もの家畜を畜殺することになることがほぼ避けられない。したがって、ＢＳＥの迅速な確認方法がこの分野では求められている。
【００１０】
組織中のＢＳＥ病原体の存在を確認する現在利用可能な１つの方法は、ＢＳＥに感染していると考えられる材料を動物（通常的にはマウス）に接種することである。しかし、マウス接種研究は７００日までの長い時間を要し、そして、組織中のＢＳＥを同定できないことは、病原体が本当に存在していないこと、またはこの方法の感度が単に限られていることのいずれかを示している。
【００１１】
ＢＳＥおよび他のＴＳＥ（ｖＣＪＤなど）の発症に関与する病原体は、知られている最小のウイルスよりも小さく、まだ完全に特徴付けられていない。病原体の正体については主に３つの説がある：（１）病原体は、異常な特徴を持ったウイルスである；（２）病原体は、感染後に部分的にプロテアーゼ耐性の形態に変化する、もっぱら宿主にコードされたタンパク質（「プリオン」）である；そして（３）病原体は、宿主由来の保護的なタンパク質と一緒にコートされている小さい非コードの調節性核酸である。ＢＳＥ病原体は、熱および通常の滅菌処理に対して極めて抵抗性である。ＢＳＥ病原体はまた、宿主動物において何らかの検出可能な免疫応答または炎症反応を誘起しない。
【００１２】
近年、この疾患に関与する病原体はウイルスと異なることが今や見出されている。この病原体は複数の分子形態で存在し得るが、ウイルスは、明確な超微細構造の形態を有する単一形態で存在する。さらに、これらの病原体は、何らかの免疫応答をほぼ常に引き起こすウイルスとは対照的に、非免疫原性である。さらには、感染性粒子内の必須核酸に対する証拠がない。これに対して、ウイルスは、子孫ウイルスを合成するためのテンプレートとして使用される核酸ゲノムを有している。したがって、最終的には、プリオンがこの変性疾患の原因であると結論されていた。その唯一知られている成分はプリオンであり、これは個体自身の染色体遺伝子によってコードされている。
【００１３】
感染性プリオンは本質的には、ＰｒＰScと略記される、プリオンタンパク質の「スクレーピーイソ型」と呼ばれるタンパク質からなる。翻訳後修飾はまだ明らかにされていないが、これにより、ＰｒＰScが、明らかに、遍在する細胞プリオンタンパク質ＰｒＰCから生じている。両者（ＰｒＰScおよびＰｒＰC）は１コピーの染色体遺伝子によってコードされており、そして接種されたプリオンが正常な宿主ＰｒＰCポリペプチドからのＰｒＰScの産生を開始させることが示されている。細胞表面に主に見出される正常な形態とは対照的に、このイソ型は細胞内の小胞に蓄積する。イソ型はまた、正常な形態のＰｒＰCに対して、ＰｒＰScイソ型の増大したプロテアーゼ耐性の原因であり得る増大したβシート含有量によって示されるその立体配座構造が異なっている。
【００１４】
現在、この疾患を防止するために使用できる処置またはワクチンは何もない。これは、主に、ＰｒＰScイソ型の免疫原性が明らかに低く、このために、「正常」なイソ型のＰｒＰCとの交差反応性を同時に避けながら、ＰｒＰScイソ型を特異的に認識する抗体を製造することが妨げられているためであり得る。
【００１５】
さらに、生きている動物においてこの疾患を検出するための適切な試験もない。動物病理学者は、脳組織の死後顕微鏡検査によってＢＳＥを確認することができる。しかし、組織中のＢＳＥ病原体の存在を検出するときには、ＢＳＥ病原体の存在は、ＢＳＥに感染していると考えられる材料を動物（通常的にはマウス）に接種することによって明らかにされる。したがって、スクレイピーなどのようなＢＳＥ、ＣＪＤ、ｖＣＪＤまたはＴＳＥ関連疾患などの神経系の変性疾患の発症に関与する病原体を検出する手段を提供することがこの分野では求められている。
【００１６】
したがって、本発明の課題は、ＢＳＥ、ＣＪＤ、ｖＣＪＤおよび／またはＴＳＥ関連疾患を生じさせる病原体の存在を特異的に検出することを獣医師および／または医師ができるようにする手段を提供することにある。
【００１７】
本発明に至った広範な研究の過程で、本発明者らは、ＰｒＰCがＰｒＰScへのその変換の際に受ける立体配座変化の１つがＰｒＰCのＣ末端部分の三次構造の変化に存在することを見出している。
【００１８】
したがって、１つの態様により、本発明は、ＰｒＰScイソ型のＣ末端部分またはその一部に対する抗体、すなわち、「ミスフォールド」形態で示されるプリオンポリペプチドの該部分の三次元立体配座に対する抗体を提供する。ＰｒＰC形態は、ＰｒＰScとは明らかに異なる、プリオンポリペプチドのこの部分における三次元立体配座を示すので、本発明の抗体はＰｒＰScイソ型に対して選択的に結合することができるが、ＰｒＰC形態には結合しない。したがって、本発明の抗体はそのようなイソ型を区別することができる。本発明の抗体は、好ましくは、ＰｒＰScのアミノ酸番号１９０〜２１４によって含まれる領域もしくはその一部に対して、より好ましくはＰｒＰScのおよそ２０２位〜およそ２１４位の配列もしくはその一部に対して、またはＰｒＰScイソ型によって示されるような該領域の立体配座特徴が本質的に保持される条件のもとで１つ以上のアミノ酸を置換もしくは除去することによって得られる変化体に対するものである。好ましい態様により、アミノ酸配列は、
【００１９】
【表５】
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である。
【００２０】
配列番号１は、本発明において同定されるようにアミノ酸番号１８０〜２１９のウシプリオンポリペプチドのアミノ酸配列のＣ末端領域の一部を示している。
【００２１】
【表６】
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【００２２】
本発明においてここで規定される抗体は、ＰｒＰC形態には存在しない、ＰｒＰScイソ型のＣ末端部分によりもたらされる三次元立体配座に選択的に結合することによってＰｒＰScとＰｒＰCとを区別することができる。
【００２３】
抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得るが、交差反応性のために、モノクローナル抗体が好ましい。さらに、抗体のフラグメントもまた本発明の抗体の意味に含まれ、これには、特に、Ｆａｂ領域またはその一部分などの、標的に結合するそのようなフラグメントが挙げられる。それぞれの必要性に基づいて、当業者は対応するフラグメントを設計することができる。
【００２４】
抗体とういう用語は、病原体に対する処置された個体の応答を低下させるように、定常領域がヒト起源に由来し、一方で、可変領域がマウスなどの動物起源に由来するヒト化抗体などのキメラ抗体をも含むことが意図される。二重特異性抗体もまた本発明の範囲内であると見なされる。二重特異性抗体は、２つのＦａｂフラグメントがそれぞれ異なる標的に指向している免疫グロブリンまたはそのフラグメントである。例えば、１つのＦａｂフラグメントはＰｒＰScのＣ末端部分に指向するが、もう一方のＦａｂフラグメントは、アッセイにおいて使用される標的などの任意の標的に指向し得る。
【００２５】
抗体は、放射能標識、蛍光標識または色素などの、標的の検出において一般に使用されるマーカーに結合することができる。好ましい態様において、抗体は、ブダペスト条約に従ってパスツール研究所（パリ、フランス）に２０００年５月１０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６により産生される抗体である。
【００２６】
上記の抗体は、抗体がＰｒＰScイソ型に選択的に結合するという点で、哺乳動物（例えば、有蹄動物またはヒトなど）におけるウシ海綿様脳症またはクロイツフェルト・ヤコブ病またはその変異型形態またはＴＳＥ関連疾患の診断および／または処置のために使用することができる。種々の種（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジなど）において本発明の抗体を使用することができるというこの特質は、本発明の抗体の新規かつ興味深い特徴であり、そしてすべてのそれぞれの個体を調べるために１つの抗体のみが必要であるように確認方法を楽にする。
【００２７】
個体が相当する疾患に罹患しているどうかを確認するために、組織（ホモジネートもしくは切片）または体液（例えば、血液、唾液、尿もしくは脳脊髄液）などの試料が、検査される個体から採取され、そして試料を抗体と適切な条件のもとで接触させることによってＰｒＰScイソ型の存在について試験される。
【００２８】
試料を抗体と接触させる方法は、何らかの特定の限定を受けず、利用可能な手段および試料自体に依存するだけである。したがって、抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ウエスタンブロット、免疫組織化学法などの方法で使用することができる。これらはすべて当業者が十分に精通している。
【００２９】
プリオン関連疾患の存在について個体を迅速に試験することを可能にするために、本発明はまた、本発明による抗体を少なくとも１つ含むキットを提供する。さらに、キットはまた、行われるそれぞれのアッセイに適合した緩衝液、支持体材料およびマーカー剤を含む。
【００３０】
さらに、本発明の抗体はまた、効果的な量の本発明の抗体を、選択的に適切な賦形剤およびキャリアとともに罹患した個体に投与することによって、プリオン関連疾患の治療において使用することができる。したがって、本発明はまた、本発明による抗体を少なくとも１つ含有する医薬組成物を含む。
【００３１】
さらに、本発明はまた、ＰｒＰScイソ型に対して個体を免疫化する方法を提供する。これに関して、正常な形態（ＰｒＰC）とは異なることが見出されているＣ末端部分のペプチドを、個体における免疫応答を誘発させるために使用することができる。そのようなペプチドは、好ましくは、アミノ酸番号１９０〜２１５のプリオン配列またはその一部に由来し、より好ましくはポリペプチドのおよそ２０２位〜およそ２１４位の配列またはその一部に由来し、あるいはＰｒＰScイソ型により示されるような該領域の立体配座的特徴が実質的に保持される条件のもとで１つ以上のアミノ酸を置換もしくは除去することによって得られる変異体に由来する。最も好ましい態様により、アミノ酸配列は、
【００３２】
【表７】
0005042430.tif 000004
である。
【００３３】
さらに、抗体そのものは、免疫付けのために使用され得る抗イディオタイプ抗体を作製するために使用することができる。免疫付けのために、当業者は、追加抗原投与工程間の適切な期間を選び、そして必要と考えられる場合には適正なアジュバントを選択することが理解される。
【００３４】
本発明の抗体はまた、抗イディオタイプ抗体（すなわち、本発明の抗体の結合領域に対する抗体）を惹起させるために使用することができる。このような抗イディオタイプ抗体は本発明の抗体の鏡像を表し、上記に述べられた疾患を防止および治療するために使用することができる。したがって、抗イディオタイプ抗体もまた本発明の範囲内であり、当技術分野で十分に知られている方法に従って、すなわち、例えば、本発明の抗体の超可変領域で動物を免疫化し、そしてそれに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生させることによって産生させることができる。次の工程において、得られた抗体は、該抗イディオタイプ抗体に対する本発明の抗体の結合に従って選択される。
【００３５】
本発明の抗体を得るための方法は、動物（例えば、マウスまたはウサギなど）を、プリオンポリペプチドのＣ末端部分のアミノ酸を含むペプチドの免疫付け量で、好ましくは、下記の配列を有するペプチドの免疫化量で免疫化する工程を含む：
【００３６】
【表８】
0005042430.tif 000005
【００３７】
より好ましくは、免疫化工程のためには、下記のアミノ酸配列を得るために、プリオンポリペプチドの２０７位のＧｌｎ残基をＧｌｕにより置換することによって上記配列から得られたペプチドが使用される：
【００３８】
【表９】
0005042430.tif 000006
【００３９】
この配列は、驚くべくことに、ＰｒＰScに対して特異的に抗体を容易に惹起させることができる十分に強い免疫応答を誘発することが証明されている。何らかの理論にとらわれることなく、このペプチドを用いて得られたこの驚くべき結果は、天然のＧｌｎ残基は水素結合を形成することができ、その結果、エピトープの一部であるときには所望されないペプチドの不溶性を生じさせ得るということにあると考えられる。一方、ヒトＰｒＰの配列に存在するＧｌｕは、これに対してＧｌｎがウシＰｒＰの一次構造における同じ位置に存在しているが、見たところでは、そのような関連を形成していないようである。
【００４０】
免疫化工程のために上記ペプチドのいずれかを使用することは、完全なプリオンポリペプチドを使用するときなど、ノックアウトマウスを事前に調製する必要がないという利点を有している。免疫化のために、好ましくは、ペプチドがそのＮ末端を介してキャリアに結合されているペプチドとキャリアとの結合体を使用する。この方法は、ペプチドをＣ末端を介してキャリアに結合することと比較して、より良好な免疫応答を明らかにもたらすことが示され得る。
【００４１】
動物を抗原で免疫化した後、脾細胞が単離され、当技術分野で十分に知られている方法および技術に従ってミエローマ細胞と融合させられる。融合した細胞の選択は、非融合細胞の増殖を支持しない適切な培地（ＨＡＴ培地など）を使用して行われる。選択培地で増殖する融合したミエローマ細胞は、免疫化工程のために使用されたペプチドに結合し得る抗体の産生についてスクリーニングされる。
【００４２】
本発明はまた、本発明の抗体を産生することができ、かつ上記の方法に従って得ることができるハイブリドーマ細胞株に関する。得られた細胞株は、約８時間の倍加時間で極めて早く増殖することが見出されている。抗体の分泌もまた、通常のハイブリドーマ抗体分泌と比較して非常に大きいことが見出された。好ましい態様により、ハイブリドーマはＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６であり、これは、ブダペスト条約に従ってパスツール研究所（パリ、フランス）に２０００年５月１０日に寄託されている。
【００４３】
別の態様により、本発明は、下記のアミノ酸配列によって示されるペプチド配列：
【００４４】
【表１０】
0005042430.tif 000007
【００４５】
または三次元立体配座構造が実質的に維持されるという条件のもとで１つ以上のアミノ酸を置換もしくは除去することによってこれらの配列に由来するペプチドに関する。
【００４６】
これらのペプチドは、ＰｒＰScイソ型によりもっぱら示されるが、ＰｒＰC形態には由来しない三次元立体配座を明らかにもたらしている。したがって、上記に述べているように、このペプチドは、免疫付けされた個体がプリオンポリペプチドの「ミスフォールド型形態」に対する免疫応答を生じさせ得るようにヒトまたは動物を免疫付けするために、そしてそのような免疫応答を天然の方法では身体からなくすために同様に使用することができる。さらに、該ポリペプチドはまた、上記のプリオン関連疾患に対する薬物を製造するために使用することができる。
【００４７】
下記の実施例は本発明を例示しているが、本発明は実施例に限定されない。
【００４８】
実施例１
合成ペプチドの調製
免疫付けのために、ヒトＰｒＰ（ヒトプリオンタンパク質）の一次構造から、長さが１３アミノ酸のペプチドが選ばれた。このペプチドは、アミノ酸２０２〜２１４のプリオンタンパク質のＣ末端部分に近いところに位置する。このペプチドは、下記のアミノ酸配列にするために、２０７位のＧｌｎ残基をＧｌｕ残基により交換することによって改変された：
【００４９】
【表１１】
0005042430.tif 000008
【００５０】
このペプチドは、そのＮ末端部分を介してキャリアタンパク質のＫＬＨ（keyhole limpet homocyanin）に結合され、ペプチドは通常的にはＣ末端を介してキャリアに連結されるので、これは、潜在的に免疫原性のペプチドをキャリアに連結するという新規な特徴を表している。
【００５１】
実施例２
動物の免疫化
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１個体あたり０．２mgのＫＬＨ−ペプチド結合体（実施例１に従って調製したもの）を用いてフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（２００μl／マウス）で皮下に免疫付けした。１４日後、マウスを、再び、１個体あたり０．１mgのＫＬＨ−ペプチドを用いてフロインド不完全アジュバント（ＩＦＡ）（２００μl／マウス）で腹腔内に免疫付けした。２週間後、マウスには、１個体あたり０．２mgのＫＬＨ−ペプチドが、もう一度、フロインド不完全アジュバントで腹腔内に接種された。血液を、最後の接種を行った１０日後に尾から採取して、結合体に対する抗体の存在を間接ＥＬＩＳＡによって測定した。プレートをＫＬＨ、ＫＬＨ−ペプチドおよび遊離ペプチドでコーティングした。マウス抗体の結合を、ＨＲＰと結合させたヤギ抗マウス抗体によって検出した。驚くべきことに、すべてのマウスの免疫応答は非常に高かった。
【００５２】
最終的な追加抗原を生理的食塩水溶液で静脈内注射した（０．１mg／マウスを１００μl）。
【００５３】
実施例３
ハイブリドーマの作製
追加抗原注射の４日後にマウスを犠牲に付し、その脾臓を取り出した。脾細胞を単離し、そして標準的な技術（Liddel,J.E.、Cryer,A.、A practical guide to monoclonal antibodies、John Wiley&Sons、ニューヨーク、1991）に従って、５０％ＰＥＧを使用して、３分間、マウスのミエローマ細胞ＮＳ１と（１０：４の比で）融合させた。細胞を洗浄し、９６ウエルマイクロタイタープレート内に、１３％ＦＣＳ（HyClone、米国）を補充したＤＭＥＭ（これは下記では単にＤＭＥＭと呼ばれる）にマウスの胸腺細胞のフィーダー層とともに再懸濁した。翌日、ＨＡＴ  ＤＭＥＭをすべてのウエルに加えた。上清を、１０日後〜１４日後に、間接ＥＬＩＳＡによって、特異的な抗体の存在について調べた。このために、マイクロタイタープレート（Nunc、デンマーク）を、５０mM炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（pH９．６）中、＋４℃で一晩、５μg/mlのペプチドまたはＫＬＨ−ペプチド結合体またはＫＬＨ単独（Bachem、スイス）でコーティングした。プレートをＰＢＳ／Tween ２０（Sigma、米国）で３回洗浄して、１％ＢＳＡ（Sigma、米国）で３０分間ブロッキングした。ＰＢＳ／Tween ２０で洗浄した後、上清をウエルに加え、３７℃で２時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳ／Tween ２０で３回洗浄して、ＨＲＰと結合させたヤギ抗マウス免疫グロブリン（Sigma、米国）を、１％ＢＳＡで１：５０００希釈してウエルに加えた。３７℃で２時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ／Tween ２０で洗浄して、基質をウエルに加えた（ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２；Sigma、米国）。プレートの読み取りを４１０nmで行った。すべての容量は５０μlであった。
【００５４】
陽性のウエルに由来するハイブリドーマをＨＴ  ＤＭＥＭ培地においてより大きい容量（２４ウエルプレート）に移した。特異的な抗体の存在を間接ＥＬＩＳＡによって再び測定して、選択された系統をＤＭＥＭにおいて組織培養フラスコに移した。最後に、選択されたハイブリドーマを限界希釈法によって２回クローン化して、液体窒素で凍結した。
【００５５】
選択された系統は、ＤＭＥＭにおいて、すなわち、ＨＴを必要とすることなく、約８時間の倍加時間で極めて早く増殖した。また、抗体の分泌が非常に大きいことが見出された。得られたクローンの１つをパスツール研究所に寄託して、寄託番号第ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６を受け取った。
【００５６】
実施例４
抗体の試験
モノクローナル抗体とＰｒＰとの反応性を、保存されたクローンの上清を使用して調べた。モノクローナル抗体を、ＣＪＤ患者、ｖＣＪＤ患者に由来する脳組織、ならびにＢＳＥ陽性家畜の脳、およびヒツジのスクレイピー感染脳に対する免疫組織化学によって調べた。対照には、正常なヒト、ウシおよびヒツジの脳を使用した。スクリーニングはまたウエスタンブロットおよびドットブロットによっても行われた。
【００５７】
組織化学のためのサンプル調製：
種々の源（ヒト、ウシおよびヤギ）に由来する脳組織のパラフィン切片を、標準的な技術を使用して調製した（装置：Ventana）。この場合、厚さが６〜８μmの切片が得られた。サンプルをＨＣＯＯＨで処理し（図１、５、６）、または全く前処理しなかった（図２〜４）。続いて、内因性のペルオキシダーゼを、（Ventana、米国）によって提供されたキットを使用してブロッキングし、そして抗体をDako S-2022（Dako、米国）で希釈して４μg/mlの濃度で加え、４２℃で２０分間インキュベーションした。
【００５８】
続いて、ビオチン化ヤギ抗マウス＋ウサギ（Ventana、米国）を加え、４２℃で２０分間インキュベーションし、その後、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ventana）と４２℃で２０分間インキュベーションし、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）をＣｕとともに４分間インキュベーションした。
【００５９】
結果：
免疫組織化学反応のパターンは、ｍＡｂのＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６が、異なる種（ヒト、ウシ、ヒツジ）に由来するすべての知られているＴＳＥ形態と反応し、そして病理学的タンパク質とのみ反応していることを示している。健康な個体およびアルツハイマー病患者の脳組織に対しては反応していない。
【００６０】
脳ホモジネートの調製：
脳組織（視床または延髄または脊髄）を、１０％スクロース、２０mMのＨＥＰＥＳ（pH７．５）、２％サルコシルおよび５mMのＥＤＴＡにおいて、ホモジナイザー（Potter）でホモジネートした（５回、１mlに０．１ｇ）。ホモジネートを＋４℃および１４０００rpmで４５分間遠心分離した。上清を−２０℃で凍結し、これに対してペレットは１MのＮａＯＨで溶解した。サンプル中のタンパク質濃度を、２８０および２６０nmにおける吸光度を測定することによって求めた。
【００６１】
ドットブロット：
１０倍希釈した上清およびペレットをサンプルとして使用した。サンプルはそのまま使用したか、またはプロテイナーゼＫ（１０μg/mlおよび１００μg/ml）で消化して使用した。電気泳動を、２５mM  Tris、０．３２Mグリシン、０．１６％ＳＤＳ（w/v）pH８．３を用いてBioRadセルで行った。転写を、２５mM  Tris、１９２mMグリシン、２０％メタノール（v/v）pH８．３を用いて、０．２mmのＰＶＤＦメンブレンに対して行った。転写を１００Ｖで５０分間行った。その後、メンブレンを５％ミルクでブロッキングし、そしてモノクローナル抗体（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６の場合には４０μg/ml）を含む１％ミルク中で１〜２時間（穏やかに振とうしながら）インキュベーションした。メンブレンを洗浄した後、メンブレンを、１％ミルクで１：５０００希釈されたＨＲＰ結合二次抗体（ヤギ抗マウス、Sigma、米国）と（１〜２時間、穏やかに振とうしながら）インキュベーションした。メンブレンを洗浄して、免疫反応を、化学発光キット（ＥＣＬ、Amersham、米国）を使用して検出した。
【００６２】
結果：
正常な脳のサンプルと抗体Ｖ５Ｂ２（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６）との反応は生じなかった。陽性の対照として、ＫＬＨ−ペプチドを使用した。
【００６３】
本発明によって提供されるモノクローナル抗体はＰｒＰScに対して大きい特異性を示している。認識させるために、ＰｒＰCのプロテイナーゼＫ消化をスクリーニング法に先立って使用することは必要ではなかった、正常な脳組織とｍＡｂとの反応は同じ条件のもとでは存在しなかった。このことは、産生された抗体が非常に特異的であり、ＰｒＰScのみを認識していることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、抗体ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６で処理された、散発性ＣＪＤ罹患者に由来するヒト脳組織サンプルの写真（１０倍の拡大）を示す。
【図２】  図２は、抗体ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６で処理された、散発性ＣＪＤ罹患者に由来するヒト脳組織サンプルの写真（６０倍の拡大）を示す。
【図３】  図３は、抗体ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６で処理された、新しい異型ＣＪＤ罹患者に由来するヒト脳組織サンプルの写真（６０倍の拡大）を示す。
【図４】  図４は、抗体ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６で処理された、新しい異型ＣＪＤ罹患者に由来するヒト脳組織サンプルの写真（２０倍の拡大）を示す。
【図５】  図５は、抗体ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６で処理された、ＢＳＥの徴候を示す動物に由来するウシ脳組織サンプルの写真（２０倍の拡大）を示す。
【図６】  図６は、抗体ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６で処理された、スクレイピー罹患ヤギに由来する脳組織サンプルの写真（１０倍の拡大）を示す。
【図７】  図７は、正常な脳組織の様々なサンプルが抗体ＣＮＣＭ  Ｉ−２４７６にさらされたドットブロット実験の結果を示す。対照として、配列番号２のペプチドおよび該ペプチトとＫＬＨとの結合体を使用した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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