(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトプラストの液体培養の際、細胞壁合成阻害剤を用いることなく、プロトプラストが破壊されず、かつ該プロトプラスト表層への細胞壁構成成分の沈着を防止できる範囲で培養液を動かすことにより、該プロトプラストの状態を維持しながら培養液中へ細胞壁構成成分を連続産生させるプロトプラスト培養方法。
【請求項２】
前記プロトプラストを包膜又は固定化することを特徴とする請求項１記載のプロトプラスト培養方法。
【請求項３】
前記包膜又は固定化に用いる材料は、培養液を透過し、かつ前記細胞壁構成成分を透過しない性質の材料であって、該包膜あるいは固定化素材内に存在する培養液中へ前記細胞壁構成成分を連続的に産生させることを特徴とする請求項２記載のプロトプラスト培養方法。
【請求項４】
前記包膜又は固定化に用いる材料は、前記細胞壁構成成分を透過する性質の材料であって、該包膜あるいは固定化素材外に存在する培養液中へ前記細胞壁構成成分を連続的に産生させることを特徴とする請求項２記載のプロトプラスト培養方法。
【請求項５】
前記プロトプラストは、細菌、酵母、カビ、キノコ、藻類、植物のいずれかから選択される細胞から生成されたものであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項記載のプロトプラスト培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞壁構成成分を連続産生するプロトプラストの培養技術に関する。より詳しくは、プロトプラストの細胞壁再生を抑制しながら、細胞壁構成成分を連続的に産生させる培養方法および培養システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロトプラスト（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）は、細菌、菌類、カビ、藻類、植物細胞などの細胞壁を、等張溶液中で酵素処理（例えば、リゾチーム処理）することによって細胞壁を除去することで得られる原形質体である。このプロトプラストは、細胞膜と細胞質成分のみからなり、適当な浸透圧条件下では、細胞と同様の活性を維持するので、これまで、細胞融合や遺伝子導入の素材として用いられてきた。【０００３】
また、このプロトプラストは、物質移動の悪いゲルなどに包埋して培養すると、細胞壁構成成分を産生し、プロトプラスト表層に細胞壁構成成分が蓄積、沈着することによって、細胞壁の再生が完了して細胞に戻り、増殖を開始するという性質を有する。【０００４】
現在、前記細胞壁構成成分には医薬品や食品に適用できる有用成分（例えば、β−Ｄグルカンなどの多糖体）が含まれていることが明らかになってきているため、該細胞壁構成成分を効率的かつ大量に産生させるための技術が関連産業界から望まれている。【０００５】
ここで、特許文献１には、酵母の細胞壁を除去して得られるプロトプラストを培養液中で培養し、該培養液中に細胞表層物質を産生させる技術、特に、プロトプラストを包括法によって固定化し、これにより得られた固定化プロトプラストを、細胞壁合成阻害剤（抗真菌剤・アクレアシンＡ）を添加した培養液で培養し、前記細胞表層物質を連続的に培養液中に産出させる技術が開示されている。この技術は、本来的に細胞壁構成成分を産生させるのではなく、細胞壁や細胞壁と細胞膜の間に存在する酵素タンパク群からなる細胞表層物質を産生させることを目的としている。このため、この発明では、細胞壁合成阻害剤を用いて、強制的に細胞壁構成成分を産生させないシステムが採用されている。【０００６】
特許文献２には、細胞膜を疎水化された多糖で被覆することによって、カルシウムの流入に対する耐性などを有する安定なプロトプラストを提供する技術が開示されている。
【特許文献１】特開平８−１０３２７１号公報。
【特許文献２】特開平８−５６６５４号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞から細胞壁構成成分を産生する従来の技術は、細胞を過酷な条件（高温、高圧、酸、アルカリ、薬剤処理など）の下で抽出処理するため、工程が煩雑で、かつ環境への負荷も問題となっていた。また、従来の抽出処理では細胞壁成分の変性も著しかった。【０００８】
そこで、本発明は、マイルドな培養条件下でのプロトプラストの培養を実現し、プロトプラストから細胞に戻すことなく、自然のままの細胞壁構成成分を連続的に産生させる事を可能とする技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、まず、プロトプラストの表層に細胞壁成分が蓄積してプロトプラストが細胞に戻るのを防ぐため、プロトプラストを液体培養して細胞壁成分を培養液中に拡散させることによって、プロトプラストから培養液中へ細胞壁構成成分を連続産生させるプロトプラスト培養方法を提供する。この方法は、有用な細胞壁構成成分を大量生産するための方法として好適である。なお、本発明における「プロトプラスト」は、「スフェロプラスト」を含む概念として定義する。【００１０】
この方法において、プロトプラストが破壊されない程度で、かつプロトプラスト表層への細胞壁構成成分の沈着を防止できる範囲で培養液を動かすようにすれば、プロトプラストの細胞壁再生をより確実に阻止しながら、プロトプラストから培養液中へ細胞壁構成成分を効率的に産生させることが可能となる。なお、前記範囲内において、培養液の流動の度合いを少なくすると、細胞壁構成成分をシート状の形態で回収することが可能となり、培養液の流動の度合いを大きくすると細胞構成成分の産生量を増大させることが可能になる。【００１１】
なお、本発明に係るプロトプラストは、例えば、細菌、酵母、カビ、キノコ、藻類、植物のいずれかから選択される細胞から作製されたものを、いずれも採用できる。即ち、本発明は、細菌、酵母、カビ、キノコ、藻類、植物の有用な細胞壁構成成分の生産技術として活用できる。【００１２】
「細胞壁構成成分」は、細菌では、ペプチドグリカン、テイコ酸、キチン、β−Ｄグルカン、マンナン、リポタンパク質、リポ多糖類（特にグラム陰性菌）、各種酵素などであり、酵母では、β−１，３−グルカン、マンナン、各種酵素など、藻類では、種類によって異なるが、例えば、セルロース、キシラン、マンナンフィブリル、アルギン酸、フコイジン、ラミナラン、寒天質、各種酵素などであり、植物の場合は、セルロース、ヘミセルロース（キシラン、マンナン、ガラクタン、グルカンなど）、グリコペプチド、ペクチン（ペクチンオリゴ糖）、セロオリゴ糖、リグニン、各種酵素、薬用成分などである。【００１３】
次に、本発明では、プロトプラストを包膜又は固定化することによって、物理的衝撃に弱い性質を有するプロトプラストを保護する。特に、培養液を動かしたときの外力からプロトプラストを保護する。本発明において、「包膜」とは、薄い膜でプロトプラストが被われ、該膜中の溶液内にプロトプラストが懸濁した状態となっていることを意味し、「固定化」は、ゲルなどで個々のプロトプラストが個別に固定された状態となっていることを意味する。【００１４】
さらに、プロトプラストを包膜又は固定化を、培養液を透過し、かつ前記細胞壁構成成分を透過しない性質の材料を用いて行うことによって、該包膜又は固定化素材内の培養液中へ、前記細胞壁構成成分を連続的に蓄積させるという方法を達成できる。この方法によれば、包膜内あるいは固定化素材中に保持されている培養液内へ細胞壁構成成分を蓄積させていくことができるため、有用な細胞壁構成成分の回収、抽出作業が容易になる。【００１５】
培養液を透過し、かつ前記細胞壁構成成分を透過しない性質の包膜あるいは固定化に用いる素材としては、例えば、アルギン酸、ペクチン、キトサン、寒天、アガロース、ゲランガム、ゼラチン、コラーゲン、κ−カラギーナン、ポリビニルアルコール、光架橋性樹脂、感光性樹脂やこれらの成分の一部を含む複合体などを挙げることができる。【００１６】
また、本発明では、前記包膜又は固定化に用いる材料として、前記細胞壁構成成分を透過する性質の材料を採用することにより、該包膜あるいは固定化素材の外側に存在する培養液中へ前記細胞壁構成成分を連続的に産生させる方法を提供する。【００１７】
この方法によれば、包膜あるいは固定化素材によってプロトプラストを物理的に保護しながら、包膜あるいは固定化素材外に存在する培養液中へ細胞壁構成成分を放出させ続けることができる。従って、この方法では、包膜あるいは固定化素材内部の狭小な培養液領域へ細胞壁構成成分を蓄積させていく方法に比べて、より大量の細胞壁構成成分を連続産生させることが可能となる。【００１８】
細胞壁構成成分を透過する性質の材料としては、例えば、高分子物質の電気泳動に用いられている、物質移動能が高い（ゲルの編み目が大きい）アガロースゲルや、アルギン酸、ペクチン、キトサン、寒天、ゲランガム、ゼラチン、コラーゲン、κ−カラギーナン、ポリビニルアルコール、光架橋性樹脂、感光性樹脂などのゲルやこれらの成分の一部を含む複合体を、任意の方法で処理、加工することによって、編み目を大きくした材料を挙げることができる。【００１９】
次に、本発明は、プロトプラストを液体培養するシステムであり、培養液を収容する培養液収容部と、プロトプラストが破壊されず、かつ該プロトプラスト表層への細胞壁構成成分の沈着を防止できる範囲の強さで前記培養液を動かす手段と、該培養液中に産生された細胞壁構成成分を回収する手段と、を少なくとも備えるプロトプラスト培養システムを提供する。【００２０】
培養液を動かす手段は、プロトプラストから産生される細胞壁構成成分がプロトプラストの表層に蓄積及び沈着して細胞壁が再生されてしまうことを有効に阻止し、かつプロトプラストを破壊しない程度の範囲で、培養液を流動、振動、攪拌等して動かすことができる手段であれば、特に限定されない。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、環境負荷の少ないマイルドな培養条件下で、プロトプラストを液体培養して細胞壁成分を培養液中に拡散させることで、プロトプラストの状態を維持して培養し続けることができる。即ち、プロトプラストの表層に細胞壁成分が蓄積してプロトプラストが細胞に戻るのを有効に防ぎながら、培養過程で、有用な細胞壁構成成分を培養液中に連続的に産生させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、図１から図３に基づいて、本発明に係る方法の好適な実施形態により、本発明の基本的な概念を説明する。【００２３】
図１には、符号Ｐで示されたプロトプラストを液体培養するために調製された培養液１が、培養容器２に収容されている状態が示されている。この培養液１は、当該プロトプラストに適する等張液条件に調整されている。なお、培養容器２は、例えば、シャーレやシャーレ状を呈する容器を採用できるが、容器形状は、特に限定されず、目的に応じて自由に選択できる。【００２４】
プロトプラストＰを前記培養容器２内で静置液体培養した場合は、培養容器２の底部に、細胞壁構成成分Ｗが集積するので、該細胞壁構成成分Ｗをシート状の形態で回収することが可能となる。【００２５】
また、プロトプラストＰが破壊されない程度の強さで、培養容器２を振とうすることで、培養液１を緩やかに動かすようにしてもよい。例えば、培養容器２を振とう台の上に設置したり、マグネットスターラーで攪拌したりすることで、培養液１を動かすようにする。【００２６】
このプロトプラストＰは、通常、細胞壁構成成分Ｗを生産し、プロトプラストＰの表層に該細胞壁構成成分Ｗが蓄積及び沈着することで、細胞壁が再生して細胞に戻り、細胞増殖を開始するという性質を有する。しかし、本発明では、プロトプラストＰ周辺の培養液１を適度に動かすことによって、該プロトプラストＰから産生される細胞壁構成成分ＷがプロトプラストＰの表層に蓄積及び沈着してしまうことを有効に防止できる。この結果、プロトプラストＰの表面での細胞壁の再生をより確実に阻止できる。【００２７】
この結果、培養液１中では、細胞壁再生が起こることなく、プロトプラストＰが細胞壁構成成分Ｗを産生し続けるため、該培養液１中へ細胞壁構成成分Ｗが蓄積する。従って、この細胞壁構成成分Ｗ濃度の高い培養液１を回収し、この培養液１中から細胞壁構成成分Ｗを抽出すれば、有用な細胞壁構成成分Ｗを容易に大量生産することができる。例えば、β−Ｄグルカンなどの多糖体を大量生産することができる。【００２８】
図２は、本発明の他の実施形態の概念を示す図である。この形態では、プロトプラストＰの周囲に培養液１ａを内包した状態でカプセル状の包膜（又は固定化膜）Ｍが形成され、さらに該包膜Ｍの外側に培養液１ｂが存在している。【００２９】
包膜Ｍは、培養液１を透過し、かつ前記細胞壁構成成分Ｗを透過しない性質の材料で形成されているため、プロトプラストＰから産生される細胞壁構成成分Ｗを、包膜Ｍの内部に蓄積させる機能を発揮する。【００３０】
なお、包膜Ｍの物質透過性を適宜設計することによって、包膜Ｍ内に蓄積させたい物質と包膜Ｍ外へ排出させたい物質を選別することができる。なお、包膜Ｍの材料としては、例えば、アルギン酸ナトリウムを採用することができる。【００３１】
この実施形態では、プロトプラストＰそれ自体は、その周囲に形成された包膜Ｍによって外力から保護されているため、培養液１（１ａ，１ｂ）を動かす工程を採用した場合であっても、プロトプラストＰが破壊させることなく、包膜Ｍ内に細胞壁構成成分Ｗを産生させ続けることができる。【００３２】
また、この実施形態では、プロトプラストＰから産生された細胞壁構成成分Ｗは、培養液１ｂへ広く拡散することなく、包膜Ｍの培養液１ａ内に滞留し、蓄積する。従って、細胞壁構成成分Ｗを回収する作業が容易となる。【００３３】
次に、図３は、プロトプラストＰを包膜又は固定化する構成の変形実施形態の概念を説明するための図である。【００３４】
この実施形態では、包膜Ｍが、プロトプラストＰから産生された細胞壁構成成分Ｗを透過可能な材料で形成されていることが特徴である。従って、この実施形態では、プロトプラストＰから産生された細胞壁構成成分Ｗは、包膜Ｍ内の培養液１ａや固定化用のゲルなどから、包膜Ｍを通り抜けて、包膜Ｍ外の培養液１ｂへ放出されていく。【００３５】
包膜Ｍ外の培養液１ｂの体積は、包膜Ｍ内の培養液１ａの体積よりも大きいので、細胞壁構成成分Ｗの収容能力が大きい。このため、本実施形態では、図２に示す実施形態と比較して、より長時間にわたり、プロトプラストＰから細胞壁構成成分Ｗを連続的に産生させることができるという利点がある。【００３６】
以上の方法は、図４に示すような基本構成のプロトプラスト培養システムＳによって実施できる。【００３７】
このシステムＳは、プロトプラストＰを液体培養可能な培養液１を収容する培養液収容部Ｓ１（例えば、培養容器２）と、プロトプラストＰが破壊されることなく、かつ該プロトプラストＰの表層への細胞壁構成成分Ｗの沈着を防止できる範囲で前記培養液１を動かすことができる手段Ｓ２と、培養液１中に産生された細胞壁構成成分Ｗを回収する手段Ｓ３と、を少なくとも備えており、回収された培養液１から細胞壁構成成分Ｗを抽出する。【００３８】
培養液１を動かすことができる手段Ｓ２は、振とう装置、マグネットスターラー装置、攪拌装置、あるいはこれらを大型化した装置などを適宜採用でき、特に限定されない。この手段は、培養液１を動かさずに、静置液体培養を実施する場合では、該手段Ｓ２を駆動させないようにすればよい。【００３９】
なお、本発明においては、培養に用いるプロトプラストの濃度を適切な範囲に設定することが重要である。一例を挙げると、酵母プロトプラストの場合では、１×１０６〜１×１０７cells／ｍＬが最適である。この範囲以外の濃度であると良好に細胞壁成分が生産できない。
【００４０】
また、プロトプラストの濃度に加え、培養温度、栄養源、浸透圧および振とう速度の制御、酸素の供給や疎外物質の除去などを適切に行うことが重要である。
【実施例１】
【００４１】
＜酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いた培養試験＞。【００４２】
ＹＰＤ培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ｐＨ５．７）を２００ｍｌ入れた５００ｍｌ三角フラスコを用いて、３０℃、２００ｒｐｍ、１４時間の条件で酵母細胞を増殖させた。【００４３】
培養して得られた酵母細胞を集め、細胞壁溶解酵素液（溶菌酵素：Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ  ２０Ｔ（生化学工業社製））を３０Ｕ／ｍＬ、促進剤：２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを１００ｍＭ、浸透圧調整剤：０．９Ｍマンニトール、緩衝液：ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を作用させ、３０℃条件で、マイルドシェーカーにより１．５時間ゆっくりと振とうし、プロトプラストを作製した。【００４４】
これにより得られたプロトプラストを液体培地（ＹＰＭＰ培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、マンニトール０．８５Ｍ、ｐＨ５．７）が入ったシャーレに入れ、３０℃条件で液体培養を行った。また、マイルドシェーカーにより培養液をゆっくりと振とうした場合についても、同様の実験を行った。【００４５】
この結果、培養に伴い、培養液中に細胞壁構成成分が大量かつ継続的に分泌され、細胞壁構成成分がシート状に蓄積されることが確認できた。また、マイルドシェーカーによりゆっくりと振とうしながらプロトプラストを培養した場合、粉体状の細胞壁構成成分が培養液中に大量かつ継続的に分泌産生された。
【実施例２】
【００４６】
＜細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３０）を用いた液体培養試験＞。【００４７】
トリプトソイブイヨン培地を２００ｍＬ入れた５００ｍＬ三角フラスコを用いて、３７℃、１００ｒｐｍ、１０−１２時間の条件で、Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞を増殖させた。【００４８】
培養して得られたＥｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞を集め、細胞壁溶解酵素液(溶菌酵素：Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（鶏卵白由来）１ｍｇ／Ｌ、外膜破壊剤：ＥＤＴＡ５ｍＭ、浸透圧調整剤：マンニトール０．９Ｍ、緩衝液：Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）)を作用させ、３０℃条件で、マイルドシェーカーによって１．５時間ゆっくりと振とうし、プロトプラストを作製した。【００４９】
得られたプロトプラストを液体培地（０．９Ｍマンニトールを含むトリプトソイブイヨン培地）が入ったシャーレを用いて、３７℃条件で、液体培養を行った。。また、マイルドシェーカーにより培養液をゆっくりと振とうした場合についても、同様の実験を行った。【００５０】
その結果、培養に伴い、培養液中に細胞壁構成成分が大量かつ継続的に分泌し、細胞壁構成成分がシート状に蓄積されることが確認できた。また、マイルドシェーカーによりゆっくりと振とうしながらプロトプラストを培養した場合、粉体状の細胞壁構成成分が培養液中に大量かつ継続的に分泌産生された。
【実施例３】
【００５１】
＜植物（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ  Ｌ．）を用いた液体培養試験＞。【００５２】
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地を１００ｍＬ入れた５００ｍＬ三角フラスコを用いて、２５℃、１２０ｒｐｍ、7日間の条件で、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ  Ｌ．細胞を増殖させた。【００５３】
培養して得られたＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ  Ｌ．細胞を集め、細胞壁溶解酵素液(溶菌酵素：ペクトリアーゼＹ２３（生化学工業社製）１．０ｇ／Ｌ、セルラーゼオノズカRS（ヤクルト薬品工業社製）１０．０ｇ／Ｌ、細胞膜保護剤：Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ５．０ｇ／Ｌ、緩衝液：ＭＥＳ０．２ｇ／Ｌ（ｐＨ５．５）)を作用させ、２５℃条件下、マイルドシェーカーで１時間ゆっくりと振とうし、プロトプラストを作製した。【００５４】
得られたプロトプラストを液体培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地成分、グルコース３０ｇ／Ｌ、２，４−Ｄ０．５ｍｇ／Ｌ、マンニトール１００ｇ／Ｌ、ｐＨ６．２）が入ったシャーレを用いて、２５℃条件下で液体培養を行った。。また、マイルドシェーカーにより培養液をゆっくりと振とうした場合についても、同様の実験を行った。【００５５】
その結果、培養に伴い、培養液中に細胞壁構成成分が大量かつ継続的に分泌し、細胞壁構成成分がシート状に蓄積されることが確認できた。また、マイルドシェーカーによりゆっくりと振とうしながらプロトプラストを培養した場合、粉体状の細胞壁構成成分が培養液中に大量かつ継続的に分泌産生された。
【実施例４】
【００５６】
＜カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＦＯ５２３９）を用いた液体培養試験＞。【００５７】
ＣＺＡＰＥＫ−Ｄｏｘ培地＋０．５％カザミノ酸培地を、１００ｍＬ入れた５００ｍＬ三角フラスコを用いて、３０℃条件下で数日間静置培養し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ細胞を増殖させた。【００５８】
培養して得られたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ細胞を集め、細胞壁溶解酵素液(溶菌酵素：ＦＵＮＣＥＬＡＳＥ（ヤクルト薬品工業社製）２％、Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ社製）１％、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ  ２０Ｔ０．２％、浸透圧調整剤：０．８Ｍ  ＮａＣＬ、緩衝液：１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０）を作用させ、３０℃条件下、マイルドシェーカーで３時間ゆっくりと振とうし、プロトプラストを作製した。【００５９】
得られたプロトプラストを液体培地（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地＋０．５％カザミノ酸培地＋０．８Ｍ  ＮａＣｌ）が入ったシャーレを用いて、２５℃条件下で静置液体培養を行った。。また、マイルドシェーカーにより培養液をゆっくりと振とうした場合についても、同様の実験を行った。【００６０】
この結果、培養に伴い、培養液中に細胞壁構成成分が大量かつ継続的に分泌し、細胞壁構成成分がシート状に蓄積されることが確認できた。また、マイルドシェーカーによりゆっくりと振とうしながらプロトプラストを培養した場合、粉体状の細胞壁構成成分が培養液中に大量かつ継続的に分泌産生された。
【実施例５】
【００６１】
＜プロトプラストの包膜方法＞。【００６２】
各種の細胞から得られた任意の濃度のプロトプラストを２％（ｗ／ｗ）ＣａＣｌ２、４０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６０００（ａｖ．  ＭＷ＝７５００、和光純薬株式会社製）に懸濁し、包膜内部の芯液とした。包膜の部分（膜液）は、１．９２％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム（３００−４００ｃＰ、和光純薬株式会社製）、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を用いた。
【００６３】
包膜の作製方法は下記の通りである。１）スターラーで攪拌している膜液へ芯液を滴下し、そのまま１０分間攪拌を続けて包膜を形成させる。２）浸透圧を調整した緩衝液で液全体を２倍希釈し、メッシュで包膜を回収して同じ緩衝液で包膜を洗浄する。３）包膜を１％（ｗ／ｖ）  ＣａＣｌ２液中で、３０分間攪拌し、該包膜を強化する。４）ＣａＣｌ２液を除去し、包膜を培地で洗浄する。５）０．２５％（ｗ／ｖ）  ＣａＣｌ２を含む培地に包膜を移し、培養を開始する。【００６４】
培養の結果、培養に伴って包膜内（内部は液状）に多量の細胞壁構成成分が継続的に生産され、蓄積することを確認した。
【実施例６】
【００６５】
＜ゲルビーズとゲルブロックの固定化法＞。【００６６】
アルギン酸ストロンチウムゲルビーズへの固定化法。まず、次の溶液１、２と培地を用意する。溶液１：任意の濃度の各種の細胞から作製したプロトプラスト、２％アルギン酸ナトリウム（G-rich、BDH社）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．７）、浸透圧調整剤：１Ｍマンニトール。溶液２：０．１Ｍ ＳｒＣｌ２、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．７）、０．７Ｍマンニトール。培地：０．８５Ｍマンニトールを含むYPD培地（ＹＰＭＰ培地）。【００６７】
次に、前記溶液１を前記溶液２に滴下し、６０分静置してゲルビーズを形成させた。溶液２の容量は、溶液１の４−５倍とする。そして溶液２を除去した後、上記培地を加えて１５分間静置する。培地を入れ替えて、振とうを加えながら、培養を行う。
【実施例７】
【００６８】
＜アガロースゲルブロックへの固定化法（酵母の場合）＞。【００６９】
ＹＰＭＰ培地を用いて１．５％アガロースＳ−ＬＭ−３（コスモ・バイオ社製）溶液を調製し、オートクレーブ滅菌する。その後、４５℃のウオーターバスで保温した。ＹＰＭＰ培地に懸濁した任意の濃度の酵母から作製したプロトプラストをアガロース溶液に加えて穏やかに混合した後、冷却してゲル化させた。次に、固まったゲルをメスで切断し、５ｍｍ程度のブロックを作製する。培地に添加し、振とうを加えながら、培養を行った。【００７０】
この結果、振とう培養を行ってもプロトプラストは破壊される事なく、培養に伴って多量の細胞壁構成成分が培養液中に効率的に分泌産生された。また、一部の細胞壁成分はゲルブロック内にも蓄積した。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、細胞壁構成成分には医薬品や食品に適用できる有用成分（例えば、β−Ｄグルカンなどの多糖体）が含まれていることを踏まえ、該細胞壁構成成分を効率的かつ大量に生産させるための技術として利用できる。【００７２】
例えば、細菌では、ペプチドグリカン、テイコ酸、キチン、β−Ｄグルカン、マンナン、リポタンパク質、リポ多糖類（特にグラム陰性菌）、各種酵素など、酵母の場合は、β-1,3-グルカン、マンナン、各種酵素など、藻類では、種類によって異なるが、例えば、セルロース、キシラン、マンナンフィブリル、アルギン酸、フコイジン、ラミナラン、寒天質、各種酵素など、植物の場合は、セルロース、ヘミセルロース（キシラン、マンナン、ガラクタン、グルカンなど）、グリコペプチド、ペクチン（ペクチンオリゴ糖）、セロオリゴ糖、リグニン、各種酵素、薬用成分などの大量生産技術として利用できる。【００７３】
近年注目されているカビ（例えば、コウジカビ、アオカビ、ケカビ、クモノスカビ、ツチアオカビなど）やキノコ（例えば、ヒメマツタケ、霊芝、ハナビラタケ、マイタケ、シイタケなど）の有用な細胞壁構成成分の大量生産技術としても利用できる。【００７４】
加えて、本発明は、微量な細胞壁構成成分の検出などに応用できる可能性がある。細胞壁構成成分には、種々の糖質や糖タンパク質などが含まれている。それらの成分の中には、温度、浸透圧、病原菌の認識センサー等として、重要な役割を果たしているものもある。一方、本発明により、それらの成分を、比較的遊離した状態のまま、簡易かつ大量に取得できる。そこで、例えば、レクチン（糖結合性タンパク質）等を電極に固定し、特定の細胞壁構成成分とレクチン等とを結合させ、その結合を電気抵抗の変化などにより検出することにより、特定の微細な細胞壁構成成分を高精度に検出できる可能性がある。なお、例えば、特定の細胞壁構成成分とレクチンとが結合した場合の電気抵抗の変化を予め取得しておくことにより、その成分の定量的な検出ができる可能性がある。【００７５】
その他、本発明は、電子回路用部品等の組立プロセス等にも応用できる可能性がある。細胞壁成分は、例えば、電場を付加することにより、比較的容易に、電極などに付着させることができる。一方、細胞壁成分は、同種生物の細胞壁間などで特異的に相互吸着する性質を有する。そこで、接合したい部品のそれぞれに細胞壁成分を付着させ、両細胞壁を吸着させることにより、目的の態様に部品を組み立てることができる可能性がある。なお、この方法には、細胞壁間の特異的な相互吸着性を利用することにより、複雑で微細な部品の組立てを精密に行うことができ、かつ、その組立てを複雑な装置・工程を用いずに行うことができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明に係る細胞壁構成成分を連続的に産生するプロトプラスト連続培養方法の基本概念を説明するための図である。
【図２】包膜されたプロトプラスト（Ｐ）の構成を模式的に示す図である。
【図３】プロトプラストＰを包膜又は固定化する構成の他の実施形態の概念を説明するための図である。
【図４】本発明に係る細胞壁構成成分を連続的に産生するプロトプラスト連続培養システム（Ｓ）の基本構成を示す図である。
【符号の説明】
【００７７】
１  培養液
２  培養容器
Ｐ  プロトプラスト
Ｍ  包膜又は固定化材料
Ｗ  細胞壁構成成分
【図１】
0004982749.tif 000002
【図２】
0004982749.tif 000003
【図３】
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【図４】
0004982749.tif 000005