(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＫ５０６及びシクロスポリンＡからなる群から選択される免疫抑制剤、および、脳梗塞後のヒト又は動物から採取した血清を添加して骨髄細胞を培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
【請求項２】
脳梗塞後のヒト又は動物から採取した骨髄細胞を、ＦＫ５０６及びシクロスポリンＡからなる群から選択される免疫抑制剤を添加して培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
【請求項３】
ＦＫ５０６及びシクロスポリンＡからなる群から選択される免疫抑制剤、および、CINC-1もしくはＴＮＦα（tumor necrosis factor-α：腫瘍壊死因子）を添加して骨髄細胞を培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
【請求項４】
サイトカインとして、ＴＮＦαを添加する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
神経幹細胞として、ニューロスフェア（neurosphere）またはニューロスフェア様細胞塊を調製する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により神経幹細胞を生産する方法。
【請求項７】
請求項６記載の神経幹細胞をさらに培養することにより分化誘導し、神経細胞を生産する方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、神経幹細胞の調製に用いる骨髄細胞および血清には、治療対象の患者から採取したものを使用する方法。
【請求項９】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法において、神経幹細胞の調製に用いる骨髄細胞には、治療対象の患者から採取したものを使用する方法。
【請求項１０】
免疫不全マウスの母系マウスにＦＫ５０６及びシクロスポリンＡからなる群から選択される免疫抑制剤を投与して免疫不全状態にした後結紮処理により作成した脳梗塞モデルマウスに結紮処理後もＦＫ５０６及びシクロスポリンＡからなる群から選択される免疫抑制剤を継続して投与し、その後採取した骨髄細胞を培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
【請求項１１】
免疫不全マウスが、C.B-17/IcrCrlBRマウスを母系とするＳＣＩＤマウスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
免疫不全マウスが、BALB/cAJclマウスを母系とするヌードマウスである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞の調製法に関し、より詳細には、骨髄から神経幹細胞を誘導・調製する方法と、神経再生治療への応用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞などの脳血管障害や神経変性疾患は、超高齢社会を迎えつつあるわが国にとって解決すべき最重要課題のひとつである。しかし、これまでの神経細胞死抑制などに焦点をあてた治療法開発の努力にもかかわらず、有効な治療法の開発に結びつく成果は未だ十分に得られていない。【０００３】
神経再生療法は、既に障害をうけている脳機能を再生神経により改善できる可能性があり、新たな神経疾患治療法として期待されている。既に米国では、パーキンソン病などの神経変性疾患において胎児脳より採取された神経幹細胞移植による神経再生治療が行われている。しかし、この治療法には倫理上の問題など解決すべき課題が少なくない。【０００４】
脳梗塞治療を目的としたＥＳ細胞由来の神経幹細胞移植も行われているが、ＥＳ細胞の機能解析が不十分で、かつその入手が倫理的にも制度的にも現状困難という問題がある。また、ＥＳ細胞の神経への分化誘導法は未だ確立しておらず、生体内で生着・機能するかどうかも不確かである。【０００５】
神経再生医療への利用が期待される神経幹細胞は、上述のように胎児脳やＥＳ細胞に由来するもののほか、成熟脳由来の脳室下帯組織（subventricular zone：ＳＶＺ）からも採取可能である。胎児脳由来の神経幹細胞は、神経細胞に分化する。一方、成熟脳ＳＶＺ由来の神経幹細胞は、グリア細胞に高率に分化し、通常の培養条件では神経細胞に分化しない。成熟脳ＳＶＺ由来の神経幹細胞を神経細胞に分化させるためには栄養因子の添加や、分化誘導因子（Ｎｏｔｃｈ１など）の遺伝子導入が必要である。【０００６】
神経再生医療において、このような培養神経幹細胞を移植する方法としては、直接細胞を脳内に注入・移植する方法が主に施行されている。しかし、この方法は手技が煩雑であり、移植法は未だ確立されたものとはいえない。一方、このように直接脳内に移植する方法以外に、脳梗塞急性期に骨髄単核球細胞を静脈内に投与する治療法が試みられている。もっとも、この治療法は神経幹細胞を投与するものではなく、未分化の骨髄細胞を静脈内投与するものであるので、神経再生の効果がどの細胞によって生じているのかなどメカニズムが不明で効果の予測・評価が困難である。【０００７】
骨髄間質細胞に遺伝子導入することによって、あるいは数種類の成長因子を添加しながら骨髄間質細胞を培養することによって、骨髄細胞から神経細胞を作り出すことができたとの報告がある。また最近になって、ヒトやマウスの骨髄細胞から神経幹細胞であるニューロスフェア（neurosphere）が得られたとの報告がある（下記の非特許文献１・２参照）。しかし、これらの方法は、（１）ニューロスフェアおよび分化可能な神経幹細胞を作成するまでの培養期間が２ヶ月から６ヶ月程度かかり、長期間を要する、（２）最終的に神経細胞あるいはグリア細胞に分化させるのにＢＤＮＦやＰＤＧＦなどの栄養因子による刺激が必要である、などの難点がある。【０００８】
また、本発明者らは、ヒト臍帯血由来の幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を脳梗塞モデルマウスに静脈内投与することで、脳内での血管再生、さらに神経再生が起こることを見出し、これを報告している（下記の非特許文献３参照）。【０００９】
【非特許文献１】Hermann A, Gastl R, Liebau S, Oana Popa M, Fiedler J, Boehm BO, Maisel M, Lerche H, Schwarz J, Brenner R, Storch A (2004) J Cell Sci 117:4411-4422.
【非特許文献２】Kabos P, Ehtesham M, Kabosova A, Black KL, Yu JS (2002) Generation of neural progenitor cells from whole adult bone marrow. Exp Neurol 178:288-293.
【非特許文献３】Taguchi, A., Soma, T., Tanaka, H., Kanda, T., Nishimura, H., Yoshikawa, H., Tsukamoto, Y., Iso, H., Fujimori, Y., Stern, D.M., Naritomi, H., Matsuyama, T. （2004） Administration of CD34+ cells post-stroke enhances angiogenesis and neurogenesis in a murine model. J. Clin. Invest., 114:330-338.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
脳梗塞などの脳血管障害やその後遺症、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患に対しては、神経機能を回復させる有効な治療法がない。神経機能の再生をめざした治療法確立のためには再生する神経細胞が提供されなければならない。神経再生治療への応用が期待される神経幹細胞は、上述したように現在まで、胎児脳由来の神経幹細胞、成体脳由来の神経幹細胞、ＥＳ細胞由来の神経幹細胞、骨髄成体多能性幹細胞（multipotent adult progenitor cell：ＭＡＰＣ）由来の神経幹細胞などが報告されている。しかし、その供給源や神経細胞への分化効率、さらに移植脳への生着性、機能発揮性など問題点が山積している。また、骨髄細胞に遺伝子を導入するなど、神経細胞を人為的に作成する手法なども考案されているが、発がん性や生着、機能性などに問題がある。【００１１】
理想的には、まず倫理的にも、また移植片対宿主病（graft-versus-host disease：ＧＶＨＤ）回避のためにも、神経再生治療に使用される神経幹細胞は、患者本人の細胞であること、つまり自家移植（Autograft）であることが望ましい。また、神経細胞に高率に分化し（Neurogenesis）、神経機能を保ち（Functional）、かつ必要な時期に（Timely）、簡単に（eaSY）、大量に（Amplify）、作成される幹細胞であること、即ち、これらの特徴をあわせもったいわば「FANTASY」であることが望ましい。【００１２】
ところで、生体には組織あるいは臓器障害時に際して様々な修復機能が備わっている。これらは主に消化管上皮や肝臓、血管内皮細胞など組織固有の細胞の分裂や増殖を介して行われているものであるが、最近種々の骨髄由来の幹細胞がこれに関与することが知られてきた。しかしながら、ほとんどの病態において骨髄が組織修復にどの程度関与するかの検討はなされていないのが実情である。神経幹細胞移植による神経再生治療法の開発に際して、このような生体内で通常起こっているホメオスターシス維持機構の一環としての修復機構のメカニズムを研究した上で、その機構に添った治療法を考案することが有効・適切と考えられる。【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、脳梗塞などの脳血管障害や神経変性疾患に対する新たな神経再生治療法を開発・確立すること、そのため、神経再生治療又はその治療法開発において好適に用いられ、簡便かつ短期間に調製可能であり、しかもその移植により良好に神経細胞を脳患部に生着、機能させることが期待できる神経幹細胞の調製法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、まず免疫不全のＳＣＩＤマウスを処置して脳梗塞モデルマウスを作出し、脳梗塞１週間後の当該マウスより採取した骨髄細胞を培養することで、骨髄細胞から神経幹細胞（ニューロスフェア）に分化誘導できることを明らかにした。さらに、後述するように再生と免疫に関する重要な知見が得られ、骨髄から短期間（２週間程度）に神経幹細胞を誘導・調製する技術を確立した。この方法によって、実際にヒトの正常骨髄から神経幹細胞を誘導・調製することにも成功した。この方法により、患者骨髄から神経幹細胞を調製し、これを自家移植として静脈内投与することによって、再生神経を良好に脳患部に生着、機能させる神経再生治療法が実現可能であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。【００１５】
即ち、本発明は、産業上および医学・医療上有用な発明として、下記（１）〜（４８）の発明を包含するものである。
（１）免疫抑制剤、および、脳梗塞その他脳障害後のヒト又は動物から採取した血清を添加して骨髄細胞を培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
ここで、脳障害とは、脳の血管の狭窄、閉塞、結紮又はその他の原因で脳の一部が虚血状態になっていること、すなわち脳虚血障害を意味する。
（２）脳梗塞その他脳障害後のヒト又は動物から採取した骨髄細胞を、免疫抑制剤を添加して培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
（３）免疫抑制剤、および、ケモカイン（もしくはその他のサイトカイン）を添加して骨髄細胞を培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
（４）ケモカインとして、インターロイキン−８（ＩＬ−８）ファミリーのケモカインを添加する、上記（３）記載の方法。
（５）サイトカインとして、ＴＮＦα（tumor necrosis factor-α：腫瘍壊死因子）を添加する、上記（３）記載の方法。
（６）ケモカイン（もしくはその他のサイトカイン）であり、骨髄細胞から神経幹細胞への分化を直接的又は間接的に誘導する分化誘導因子。
（７）上記（６）記載の分化誘導因子を用いて、培養細胞から神経幹細胞を調製する方法。
（８）上記（６）記載の分化誘導因子と免疫抑制剤とからなる神経幹細胞分化誘導剤。
（９）神経幹細胞として、ニューロスフェア（neurosphere）またはニューロスフェア様細胞塊を調製する、上記（１）〜（５）又は（７）のいずれかに記載の方法。
（１０）上記（１）〜（５）又は（７）のいずれかに記載の方法により神経幹細胞を生産する方法。
（１１）上記（１０）記載の神経幹細胞をさらに培養することにより分化誘導し、神経細胞を生産する方法。
（１２）上記（１０）記載の神経幹細胞もしくは上記（１１）記載の神経細胞を、脳梗塞治療または他の神経再生治療に使用する方法。
（１３）上記（１０）記載の神経幹細胞もしくは上記（１１）記載の神経細胞を、静脈内投与などの方法により投与する、脳梗塞治療法または他の神経再生治療法。
（１４）上記（１）記載の方法において、神経幹細胞の調製に用いる骨髄細胞および血清には、治療対象の患者から採取したものを使用する方法。
（１５）上記（２）〜（５）又は（７）のいずれかに記載の方法において、神経幹細胞の調製に用いる骨髄細胞には、治療対象の患者から採取したものを使用する方法。
（１６）上記（１）〜（５）又は（７）のいずれかに記載の方法において、神経幹細胞の調製に用いる免疫抑制剤に、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリン、抗ＣＤ２８抗体および抗ＩＣＯＳ抗体などのＴ細胞機能を抑制する免疫抑制剤を使用する方法。
ここで、抗ＣＤ２８抗体および抗ＩＣＯＳ抗体とは、それぞれＣＤ２８、ＩＣＯＳの作用を阻害し、Ｔ細胞機能を抑制するブロッキング抗体を意味し、Ｔ細胞を刺激し活性化するものではない。
（１７）上記（１３）記載の神経再生治療法において、神経（幹）細胞の投与と同時または異時に、免疫抑制剤を投与する方法。
（１８）上記（１３）記載の神経再生治療法において、神経（幹）細胞の投与と同時または異時に、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）などの血管形成能を有する細胞を投与する方法。
（１９）上記（１０）記載の神経幹細胞もしくは上記（１１）記載の神経細胞を含む脳梗塞治療剤。
（２０）上記（１０）記載の神経幹細胞もしくは上記（１１）記載の神経細胞を含む神経再生治療剤。
（２１）免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスを含む）、その母系マウス、又はこれらのマウスから作成した脳梗塞モデルマウスの骨髄細胞を培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
（２２）免疫不全マウスの骨髄細胞を、脳梗塞モデルマウスから採取した血清、又はケモカイン（もしくはその他のサイトカイン）を添加して培養する、上記（２１）記載の方法。
（２３）免疫不全マウスの母系マウスの骨髄細胞を、脳梗塞モデルマウスから採取した血清（又は、ケモカインもしくはその他のサイトカイン）と免疫抑制剤とを添加して培養する、上記（２１）記載の方法。
（２４）免疫不全マウスの母系マウスから作成した脳梗塞モデルマウスの骨髄細胞を、免疫抑制剤を添加して培養する、上記（２１）記載の方法。
（２５）免疫不全マウスから作成した脳梗塞モデルマウスの骨髄細胞を培養することにより神経幹細胞を調製する、上記（２１）記載の方法。
（２６）免疫不全マウスの母系マウスに免疫抑制剤を投与して免疫不全状態にした後作成した脳梗塞モデルマウスの骨髄細胞を培養することにより神経幹細胞を調製する、上記（２１）記載の方法。
（２７）免疫不全マウスが、C.B-17/IcrCrlBRマウスを母系とするＳＣＩＤマウスである、上記（２１）〜（２６）のいずれかに記載の方法。
（２８）免疫不全マウスが、BALB/cAJclマウスを母系とするヌードマウスである、上記（２１）〜（２６）のいずれかに記載の方法。
（２９）上記（２１）〜（２８）のいずれかに記載の方法により調製された神経幹細胞。
（３０）ＳＣＩＤマウスの母系マウスの脳の血管を結紮してなる脳梗塞モデル動物。
（３１）ＳＣＩＤマウスの母系マウスの脳の血管が、中大脳動脈である上記（３０）記載の脳梗塞モデル動物。
（３２）ＳＣＩＤマウスの母系マウスが、C.B-17/IcrCrlBRマウスである上記（３０）又は（３１）記載の脳梗塞モデル動物。
（３３）ヌードマウス又はその母系マウスの脳の血管を結紮してなる脳梗塞モデル動物。
（３４）ヌードマウス又はその母系マウスの脳の血管が、中大脳動脈である上記（３３）記載の脳梗塞モデル動物。
（３５）ヌードマウスの母系マウスが、BALB/cAJclマウスである上記（３３）又は（３４）記載の脳梗塞モデル動物。
（３６）上記（３０）〜（３５）のいずれかに記載の脳梗塞モデル動物に、被検薬物を投与して、当該被検薬物の脳梗塞に対する有効性をスクリーニングする方法。
（３７）上記（３０）〜（３５）のいずれかに記載の脳梗塞モデル動物に、神経（幹）細胞又は他の細胞を移植して、当該移植治療の脳梗塞に対する有効性をスクリーニングする方法。
（３８）免疫抑制作用を有する物質を有効成分とする神経再生治療剤。
（３９）免疫抑制作用を有する物質が、Ｔ細胞機能を抑制する物質である、上記（３８）記載の神経再生治療剤。
（４０）免疫抑制作用を有する物質が、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリン、抗ＣＤ２８抗体および抗ＩＣＯＳ抗体のいずれかである、上記（３９）記載の神経再生治療剤。
（４１）ケモカインその他のサイトカイン、又はこれらの骨髄細胞から神経幹細胞への分化を誘導する作用を促進する物質を有効成分とする神経再生治療剤。
（４２）ケモカインが、インターロイキン−８（ＩＬ−８）ファミリーのケモカインである、上記（４１）記載の神経再生治療剤。
（４３）サイトカインが、ＴＮＦα（tumor necrosis factor-α：腫瘍壊死因子）である、上記（４１）記載の神経再生治療剤。
（４４）脳梗塞又は他の神経疾患の治療に用いられる、上記（３８）〜（４３）のいずれかに記載の神経再生治療剤。
（４５）脳梗塞又は他の神経疾患の治療に用いられる神経再生治療剤のスクリーニング方法であって、骨髄細胞から神経幹細胞への分化を誘導し、又はその分化を促進する作用を有するかどうかを指標に、候補物質を探索することを特徴とする神経再生治療剤のスクリーニング方法。
（４６）ヒト又は動物から採取した骨髄細胞の培地に被検物質を投与し、当該被検物質が、骨髄細胞から神経幹細胞への分化を誘導し、又はその分化を促進する作用を有するかどうかを調べることを特徴とする上記（４５）記載の神経再生治療剤のスクリーニング方法。
（４７）免疫抑制作用を有する物質群の中から、候補物質を探索することを特徴とする上記（４５）又は（４６）記載の神経再生治療剤のスクリーニング方法。
（４８）ケモカインその他のサイトカイン、又はこれらの活性もしくは産生を調節する作用を有する物質群の中から、候補物質を探索することを特徴とする上記（４５）又は（４６）記載の神経再生治療剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の神経幹細胞調製法は、簡易かつ短期間に、骨髄細胞から神経幹細胞を調製することができる。得られた神経幹細胞は、神経細胞に高効率に分化可能であり、生体への移植により脳患部において良好に神経細胞を生着、機能発揮させることが期待できるので、神経再生治療、あるいは脳梗塞モデルマウス等を用いた治療法開発の目的に使用できる。また、材料となる骨髄細胞は生体からの採取が比較的容易であるので、例えば脳梗塞後の患者から骨髄を採取し、免疫抑制剤の存在下に培養を行って神経幹細胞を調製し、これを静脈内投与などで患者に移植する自家移植治療に本発明を利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】胎生期マウス脳由来のニューロスフェアおよび神経細胞等（Ａ，Ｂ，Ｃ）と、脳梗塞ＳＣＩＤマウス骨髄由来のニューロスフェア様細胞塊および神経細胞等（Ｄ，Ｅ，Ｆ）を比較して示す図面に代わる写真である。原図のＣ・Ｆでは、ＭＡＰ２陽性の神経細胞は赤で、ＧＦＡＰ陽性のグリア細胞は緑で表示される。
【図２】脳梗塞ＳＣＩＤマウス骨髄由来のニューロスフェア様細胞塊形成に関して、脳梗塞後骨髄を採取するまでの期間や骨髄細胞の培養期間が、細胞塊形成にどのように影響するか等を検討した結果を示すグラフである。
【図３】骨髄由来のニューロスフェア様細胞塊から神経細胞、グリア細胞への分化を免疫染色により検討した結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】骨髄由来のニューロスフェア様細胞塊の神経細胞への分化能、分化効率を検討した結果を示すグラフである。
【図５】偽手術ＳＣＩＤマウスの骨髄に脳梗塞ＳＣＩＤマウス（ＭＣＯ１Ｗ）の血清を添加するとニューロスフェア様細胞塊ができ（Ａ・Ｂ）、さらに神経細胞にも分化した（Ｃ・Ｄ）ことを示す図面に代わる写真である。
【図６】ＳＣＩＤマウスとＣ．Ｂ１７マウスにおける中大脳動脈結紮後１６日目に摘出した脳を比較して示す図面に代わる写真である。
【図７】ＳＣＩＤマウスとＣ．Ｂ１７マウスにおける中大脳動脈結紮後１日目に摘出した脳切片のＴＴＣ染色の結果を比較して示す図面に代わる写真である。脳梗塞領域が白く示される。
【図８】脳梗塞ＳＣＩＤマウスおよび脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスの脳梗塞後における脳（皮質）再生の有無を、ＣＩ値をもとに検討した結果を示すグラフである。
【図９】脳梗塞ＳＣＩＤマウスの梗塞下組織ではＮｅｕＮ陽性の神経前駆細胞が多数観察されたが（Ａ）、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスの梗塞下組織ではほとんど観察されなかった（Ｂ）ことを示す図面に代わる写真である。
【図１０】脳梗塞ＳＣＩＤマウスの骨髄からはニューロスフェア様細胞塊が形成され（Ａ・Ｂ）、一方、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスの骨髄からは培養開始７日目までにわずかにニューロスフェア様細胞塊が形成された（Ｃ・Ｄ）ことを示す図面に代わる写真である。
【図１１】脳梗塞ＳＣＩＤマウス（Ａ）および脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウス（Ｂ）の骨髄由来ニューロスフェア様細胞塊におけるアポトーシスを検討した結果を示す図面に代わる写真である。原図では、ネクローシス細胞が赤で、アポトーシス細胞が緑で表示される。
【図１２】脳梗塞ＳＣＩＤマウスと脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスの脳梗塞下組織からの神経幹細胞の形成を検討した結果を示すグラフである。
【図１３】Ｃ．Ｂ１７マウスの脳梗塞作成前３日間と後７日間にＦＫ５０６を連日腹腔内投与し、その後、骨髄と脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）を採取して培養したところ、骨髄（Ａ・Ｂ）および脳梗塞瘢痕部位（Ｃ）からニューロスフェア様細胞塊が形成されたことを示す図面に代わる写真である。
【図１４】脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスの骨髄を、ＦＫ５０６を添加して培養したところ、ニューロスフェア様細胞塊（Ａ・Ｂ）が形成されたことを示す図面に代わる写真である。
【図１５】脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄由来のニューロスフェア様細胞塊の形成に対するＦＫ５０６の影響を検討した結果を示すグラフである。
【図１６】脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウスの骨髄を、脳梗塞ＳＣＩＤマウスの血清およびＦＫ５０６を添加して培養したしたところ、ニューロスフェア様細胞塊が形成され（Ｂ・Ｃ）、脳梗塞ＳＣＩＤマウスの血清のみ添加して培養した場合は一旦ニューロスフェア様細胞塊が形成されるが（Ａ）、すぐに排除されたことを示す図面に代わる写真である。
【図１７】上記方法によりＦＫ５０６を添加してニューロスフェア様細胞塊を形成させ、さらに培養後７日目に、ＮｅｓｔｉｎとＭＡＰ２に対する免疫組織化学（二重染色間接蛍光抗体法）を行った結果を示す図面に代わる写真である。
【図１８】脳梗塞後ＳＣＩＤマウスにおいて、骨髄由来の神経幹細胞が脳組織へ生着し、分化したことを示す図面に代わる写真である。骨髄由来のＧＦＰ陽性細胞（原図では緑）は脳梗塞下組織に広く認められ、同時にＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性（原図では赤）で、神経前駆細胞であった（Merge）。
【図１９】脳梗塞患者の血清とＦＫ５０６存在下で培養した正常ヒト骨髄細胞から得られたニューロスフェア様細胞塊（Ａ）、およびさらに培養して得られた神経細胞（Ｂ）を示す図面に代わる写真である。
【図２０】脳梗塞ＳＣＩＤマウスの骨髄由来の神経幹細胞を、別の脳梗塞ＳＣＩＤマウスに移植した場合の脳再生に与える影響、脳梗塞治療効果について検討した結果を示す図面に代わる写真である。「ＢＭ−ＮＳＣ」は骨髄由来の神経幹細胞を投与した結果、「ＰＢＳ」はコントロールでＰＢＳを投与した結果、である。
【図２１】Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄由来のニューロスフェア様細胞塊の形成における抗ＣＤ２８抗体、抗ＩＣＯＳ抗体の影響を検討した結果を示す図面に代わる写真である。脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウスの骨髄を、脳梗塞後１週間目のＳＣＩＤマウスの血清を添加して培養した。これにさらに、ＦＫ５０６（Ａ）、あるいは、抗ＣＤ２８抗体（Ｂ）又は抗ＩＣＯＳ抗体（Ｃ）を各々添加した。培養９日目にはＦＫ５０６、抗ＣＤ２８抗体、抗ＩＣＯＳ抗体を添加して培養した骨髄細胞からニューロスフェア様細胞塊が形成され、血清のみを添加して培養した場合（Ｄ）はニューロスフェア様細胞塊は形成されなかった。
【図２２】脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄にＣＩＮＣ−１とＦＫ５０６を添加して培養すると、培養５日目に細胞塊が形成され（Ａ・Ｂ）、培養７日目にはニューロスフェア様細胞塊が形成された（Ｃ・Ｄ）ことを示す図面に代わる写真である。ＢはＡの、ＤはＣの拡大像である。
【図２３】ＣＩＮＣ−１により刺激誘導されたニューロスフェア様細胞塊形成におけるＦＫ５０６の影響を検討した結果を示す図面に代わる写真である。脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄にＣＩＮＣ−１を添加、あるいはＣＩＮＣ−１とＦＫ５０６を添加して培養した。ＣＩＮＣ−１とＦＫ５０６を添加すると培養５日目以内にすでに細胞塊が形成され、７日目以降にはニューロスフェア様細胞塊が形成された（Ａ）。一方、ＦＫ５０６を添加しない場合は、細胞塊は形成されるが、排除されるか、あるいは細胞塊の状態で止まっており（Ｂ）、ニューロスフェア様にはならなかった。Ａ・Ｂはいずれも培養９日目の像である。
【図２４】Ｃ．Ｂ１７マウスの骨髄（ａ）および脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）（ｂ）由来ニューロスフェア形成における免疫抑制剤（ＦＫ５０６とシクロスポリンＡ）の影響を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、１dishあたりの培養９日目のnestin陽性ニューロスフェア数を示す（各群4匹ずつ）。＊Ｐ＜0.001, student t test
【図２５】ヌードマウスの骨髄由来および脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）由来ニューロスフェア形成能を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、培養９日目の骨髄（ａ）と脳梗塞下組織（ｂ）から形成されたnestin陽性ニューロスフェア数を示す（各群4匹ずつ）。培養１dishあたりのニューロスフェア数はヌードマウスではそれぞれ13±4個、42±5個であったのに対し、コントロールでは1.5±1.5個、2.0±1.5で、有意にヌードマウスで多かった。＊Ｐ＜0.001, student t test
【図２６】サイトカイン（ＣＩＮＣ−１とＴＮＦα）の骨髄由来ニューロスフェア形成に及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、１dishあたりの培養９日目に形成されたnestin陽性ニューロスフェア数を示す（各群4匹ずつ）。＊Ｐ＜0.001, student t test
【図２７】Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄由来のニューロスフェア様細胞塊の形成における抗ＣＤ２８抗体、抗ＩＣＯＳ抗体の影響を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、培養１dishあたりのnestin陽性ニューロスフェアの数を示す（各群４匹ずつ）。＊Ｐ＜0.001, student t test
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について説明する。
［１］骨髄からの新たな神経幹細胞調製法の開発
本発明者らは最近、良好な再現性を示し、しかも長期間生存可能な脳梗塞モデルマウスを開発した（特願２００４−１０８５００号）。この脳梗塞モデルマウスは、後述するように、免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウスの中大脳動脈を結紮することにより、中大脳動脈の皮質枝の血流を選択的に途絶させ、再現性のよい均一な脳梗塞を作成したものである。興味深いことに、この脳梗塞ＳＣＩＤマウスでは、虚血後の脳梗塞の進展（delayed infarct expansion）は脳梗塞後３日で終了し、その後は脳萎縮の進展ではなく、脳形態上はむしろ回復する。免疫組織化学による検討の結果、このマウスの脳梗塞下組織（脳梗塞周囲の瘢痕部位）において脳梗塞後多数の神経幹細胞の出現が観察され、これが正常神経組織に生着して脳再生、脳機能改善に貢献していること、さらに、この神経幹細胞は骨髄に由来するものであることを明らかにした。【００１９】
そこで、上記脳梗塞ＳＣＩＤマウスから脳梗塞１週間後に採取した骨髄細胞を培養したところ、上述のように、神経幹細胞（ニューロスフェア）に分化誘導することができた（図１Ｄ）。またその後も培養を続けると、神経幹細胞は分裂・増殖し、神経細胞に分化誘導された（同図Ｅ）。さらに、神経再生と免疫に関する下記（１）〜（６）の重要な知見が得られた（なお、各実験の詳細については後述する）。【００２０】
（１）  脳梗塞を起こしていない正常ＳＣＩＤマウスの骨髄を培養しても神経幹細胞は誘導されないが、この骨髄に脳梗塞モデルマウスの血清を添加すると神経幹細胞が誘導され（図２、図５Ａ・Ｂ）、神経幹細胞は神経細胞にも分化した（図５Ｃ・Ｄ）。このことより、脳梗塞後の血清中に、骨髄細胞を神経幹細胞に分化誘導させる刺激因子（differentiation factor）が存在し、生体ではこの刺激因子が血流を介して骨髄に伝えられ、神経幹細胞が産生されると考えられる。
さらに解析の結果、この刺激因子、換言すれば神経幹細胞への分化誘導因子のひとつは、インターロイキン−８（ＩＬ−８）ファミリーのケモカインである、ＣＩＮＣ−１／ＧＲＯ（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1／growth-related oncogene）であることを明らかにした（図２２、２３）。【００２１】
（２）  ＳＣＩＤマウスの母系である免疫機能が正常なC.B-17/IcrCrlBRマウスの中大脳動脈を結紮して脳梗塞モデルを作成した後、その骨髄を採取して培養すると、神経幹細胞が一旦形成されるが（図１０Ｃ・Ｄ）、これらは２週間以内にすべて消失してしまう（図１５）。【００２２】
（３）  一方、上記C.B-17/IcrCrlBRマウスに対して、免疫抑制剤ＦＫ５０６（タクロリムス）を投与して免疫不全状態にし、脳梗塞を起こさせた後も免疫抑制剤の投与を続け、その後当該マウスから採取した骨髄細胞を培養したところ、神経幹細胞に分化誘導させることができた（図１３）。他の免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）を投与した場合も同様の結果が得られた（図２４）。また、C.B-17/IcrCrlBRマウスを脳梗塞後、その骨髄を採取し、免疫抑制剤ＦＫ５０６を添加して培養すると、神経幹細胞が形成された（図１４、図１５）。【００２３】
（４）  脳梗塞を起こしていない正常C.B-17/IcrCrlBRマウスの骨髄細胞を異なる条件下で培養したところ、免疫抑制剤ＦＫ５０６および脳梗塞モデルマウスの血清を添加した場合にのみ、神経幹細胞が形成された（図１６）。ＦＫ５０６の代わりに、Ｔ細胞機能を抑制する抗体（抗Ｔ細胞抗体）を添加しても同様に神経幹細胞が形成された（図２１、図２７）。【００２４】
（５）  さらに、ヒトの正常骨髄細胞を、免疫抑制剤ＦＫ５０６および脳梗塞患者の血清を添加して培養したところ、神経幹細胞に分化誘導させることができた（図１９Ａ）。これをさらに培養すると、神経細胞に分化した（同図Ｂ）。【００２５】
（６）  脳梗塞ＳＣＩＤマウスの骨髄から調製された神経幹細胞を、別の脳梗塞ＳＣＩＤマウスに静脈内投与してその脳梗塞治療効果を調べたところ、脳形態上の回復が観察され、神経再生の促進効果が認められた（図２０）。【００２６】
本発明は、これらの知見に基づき、（１）正常骨髄細胞を神経幹細胞へ分化させるためには、脳梗塞後の血清中に存在する刺激因子と、骨髄培養液中の免疫反応を抑制させる免疫抑制剤の添加が重要であり、（２）脳梗塞後の患者又は免疫正常なモデル動物から採取した骨髄細胞を神経幹細胞へ分化させるためには、免疫抑制剤の添加が重要であること、および、（３）上記の刺激因子（分化誘導因子）のひとつは、ＩＬ−８ファミリーのケモカインＣＩＮＣ−１／ＧＲＯであることを見出し、以下の第１〜第３の神経幹細胞調製法を提供するものである。【００２７】
第１の神経幹細胞調製法：免疫抑制剤、および、脳梗塞その他脳障害後のヒト又は動物から採取した血清を添加して骨髄細胞を培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
第２の神経幹細胞調製法：脳梗塞その他脳障害後のヒト又は動物から採取した骨髄細胞を、免疫抑制剤を添加して培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。
第３の神経幹細胞調製法：免疫抑制剤、および、ケモカイン（好ましくは、ＩＬ−８ファミリーのケモカイン）を添加して骨髄細胞を培養することにより分化誘導し、神経幹細胞を調製する方法。【００２８】
第１（および第３）の調製法において、常法にしたがってヒト又は動物から採取した骨髄は、免疫抑制剤および脳障害後の血清（又は、当該血清の代わりにケモカイン）を添加する以外、従来の神経幹細胞の培養方法と同様の方法により培養可能である。また、第２の調製法においても、免疫抑制剤を添加する以外、従来の神経幹細胞の培養方法と同様の方法により培養可能である。従来の培養方法としては、ニューロスフェア（neurosphere）法、低密度単層培養法、高密度単層培養法などが例示され、このうち好ましい培養法としては、ニューロスフェア法が挙げられる。後述の実施例においては、このニューロスフェア法を用いて、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ，５０μｇ／ｍｌ）および上皮成長因子（ＥＧＦ，２０μｇ／ｍｌ）存在下骨髄細胞を培養し、神経幹細胞を調製した。【００２９】
以下、本発明の調製法において使用する免疫抑制剤、血清および分化誘導因子であるケモカインについて説明する。
［1-A］免疫抑制剤
培養液に添加する免疫抑制剤は、実施例で用いたＦＫ５０６（タクロリムス）およびシクロスポリンを使用することができるが、そのほかに、バシリキシマブ、アザチオプリン、ムロモナブＣＤ３、ミゾリビン、ミコフェノール酸モフェチル、など公知の免疫抑制剤の使用が考えられる。免疫抑制剤は、Ｔ細胞機能など細胞性免疫を抑制する作用・性質を有するものが好ましく、免疫抑制機能を有する限りにおいて、抗体（例えば抗ＣＤ２８抗体、抗ＩＣＯＳ抗体）などの物質も広く本発明の「免疫抑制剤」に含まれる。
培養液への免疫抑制剤の添加量は、特に限定されないが、０．０１μｇ／ｍｌ〜１．０μｇ／ｍｌ程度の濃度で添加することが好ましい。後述の実施例では、０．１μｇ／ｍｌの濃度でＦＫ５０６を培養液に添加した。【００３０】
［1-B］血清
第１の調製法において、培養液へ添加する血清の量も特に限定されるものではないが、５μｌ／ｍｌ〜２５μｌ／ｍｌ程度の濃度で添加することが好ましい。上述のように、脳梗塞後の血清中には、骨髄細胞を神経幹細胞に分化誘導させる分化誘導因子が存在し、この分化誘導因子は、虚血侵襲や他の原因により脳神経細胞が一部障害を受けることによって、生体の有する修復機構の一環として産生されるものと考えられる。したがって、脳梗塞後の血清に限らず、事故等により脳組織が一部障害を受けた後の血清中にもこの分化誘導因子は出現し、当該血清を添加して骨髄細胞を培養することで同様の効果が得られると考えられる。
また、例えば脳梗塞後の血清を使用して調製した本発明の神経幹細胞を、脳梗塞の治療に限らず、他の神経疾患の再生治療に利用してもよい。
「動物」から採取した血清を使用して、治療法の開発用などに神経幹細胞を調製する場合、当該動物としてはマウスやラットのほか、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が例示される。マウスは、ＳＣＩＤマウス以外のものを使用してもよい。
なお、後述の実施例に示すように、ヒトおよびマウスの場合、脳梗塞後１週間目に採取した血清を使用することで良好に神経幹細胞を調製できたので、本発明の第１の調製法においては、脳梗塞後（または他の脳障害後）５日〜１０日の血清を使用することが好ましい。【００３１】
［1-C］分化誘導因子
第３の調製法は、免疫抑制剤とともに、分化誘導因子としてケモカインを添加して骨髄細胞を培養する方法である。
上述のように、脳梗塞後の血清中には、骨髄細胞を神経幹細胞へ分化させる何らかの分化誘導因子が存在し、この分化誘導因子が血流を介して骨髄に伝えられ、神経幹細胞が産生されると考えられる。本発明者は、この分化誘導因子の探索に際して、ＳＣＩＤマウスの免疫反応の特徴に注目した。すなわち、ＳＣＩＤマウスはＴ細胞が欠落しているがＮＫ細胞は十分存在しているため、ＳＣＩＤマウスがＣ．Ｂ１７マウスより骨髄での神経幹細胞産生に適した条件を備えているとすると、ＮＫ細胞にその原因を求めるのが妥当と考えた。さらに、骨髄細胞の分化に関与し、かつ虚血などの生体への侵襲刺激に際して血中に放出される因子を探索した。【００３２】
ＣＩＮＣ−１／ＧＲＯ（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1／growth-related oncogene）は、インターロイキン−８（ＩＬ−８）ファミリーのケモカインであり、コルヒチン刺激などのnoxious stimulationにより脳の視床下部神経で産生亢進され、下垂体後葉を経て血中に放出される（Neurosci. Res. (1997) 27:181-184.）。ＣＩＮＣ−１は、ＮＫ細胞からも産生されて子宮の脱落膜を介した受精卵の免疫反応に関与し（Biochem. Biophys. Res. Commun. (1994) 200:378-383.）、また骨髄間質（stroma）細胞からも産生される（Exp. Cell Res. (2004) 299:383-392.）。さらに、本発明者は独自に、脳虚血負荷に際しても視床下部や下垂体後葉においてＣＩＮＣ−１産生が亢進するという調査結果を得ていた。
そこで、ＣＩＮＣ−１が神経幹細胞への分化誘導因子である可能性を検討した。その結果、脳梗塞を起こしていない正常C.B-17/IcrCrlBRマウスから採取した骨髄に、免疫抑制剤ＦＫ５０６およびＣＩＮＣ−１を添加して培養すると、骨髄から神経幹細胞へ分化誘導させることができた（図２２、２３）。この結果から、ＣＩＮＣ−１が分化誘導因子のひとつであることが示された。また、ＣＩＮＣ−１は、培養中の骨髄細胞を凝集させる作用を有しており（図２３Ｂ）、この凝集した細胞塊が核となってニューロスフェアが形成されると考えられる。したがって、このような凝集作用を有する他のケモカインもＣＩＮＣ−１と同様に分化誘導因子として作用すると考えられる。このようなケモカインの作用が骨髄中の幹細胞に直接作用しているのか、あるいは間質細胞などを介して間接的に作用しているのかは今後更なる解析を必要とするが、いずれにせよ、ケモカインを免疫抑制剤とともに培養骨髄中に添加することで、神経幹細胞への分化誘導が可能である。【００３３】
ケモカインはＩＬ−８ファミリーのケモカインの使用が好ましく、ヒト、ラット又はマウス由来のＩＬ−８ファミリーのケモカイン、あるいは他の哺乳動物のカウンターパートから選ばれるケモカインを添加する方法が挙げられる。ヒト由来ＩＬ−８ファミリーのケモカインとしては、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β及びＧＲＯ−γなどが例示され、ラット由来は、ＣＩＮＣ−１、ＣＩＮＣ−２α、ＣＩＮＣ−２β、ＣＩＮＣ−３、マウス由来は、ＫＣ、ＭＩＰ−２などが例示される。その他のＣＸＣケモカインの使用も考えられる。【００３４】
培養液へのケモカインの添加量は、特に限定されないが、０．１μｇ／ｍｌ〜１．０μｇ／ｍｌ程度の濃度で添加することが好ましい。後述の実施例では、１０-5Ｍの濃度でＣＩＮＣ−１を培養液に添加した。
上述のように、ケモカインは、免疫抑制剤とともに培養骨髄中に添加することによって、神経幹細胞への分化誘導が可能であるので、ケモカインと免疫抑制剤とを組み合わせ、神経幹細胞分化誘導剤として提供できる。また、免疫抑制剤の添加は培養下のＴ細胞機能を抑制するためであるから、あらかじめＴ細胞を除去するなどして他の方法でＴ細胞機能を抑制することができれば、免疫抑制剤を添加せずにケモカインのみで培養細胞から神経幹細胞を調製することも可能と考えられる。【００３５】
さらに後述するように、本発明者らによる探索の結果、上記ケモカイン以外に、サイトカインであるＴＮＦα（tumor necrosis factor-α）が、骨髄細胞から神経幹細胞への分化誘導作用を有することを明らかにした（図２６）。従って、本発明の上記第３の調製法において、ケモカインの代わりに、ＴＮＦα又はＩＬ１８などその他のサイトカインを分化誘導因子として使用してもよい。ＴＮＦαなどのサイトカインを分化誘導因子として使用する場合も、上記ケモカインと同様の方法・条件で使用可能であり、骨髄細胞から神経幹細胞への調製に利用することができる。【００３６】
本発明の神経幹細胞調製法は、次のような利点・特徴を有する。
（１）  簡便かつ短期間に、神経幹細胞の誘導・調製が可能である。後述の実施例に示すように、実際に骨髄から短期間（２週間程度）で神経幹細胞を誘導・調製することができ、得られた神経幹細胞はその後分裂・増殖して、神経細胞に高効率に分化した。
神経再生治療に応用する場合、治療開始は２週間以内（即ち、幹細胞の産生および生着に最も適した時期である急性期）が好ましく、従来この期間内に大量の幹細胞を準備・調製することは困難であった。短期間に幹細胞の調製可能な本発明の方法は、神経再生治療の臨床応用に最も適した方法といえる。【００３７】
（２）  脳患部において良好に神経細胞を生着、機能発揮させることが期待できる。実際に、本方法により調製された神経幹細胞を移植（静脈内投与）したところ、脳形態上の回復が観察され、幹細胞移植により神経細胞が脳組織に生着したものと考えられる。
上述のように、本発明者らは、脳梗塞ＳＣＩＤマウスにおいて、脳梗塞後多数の神経幹細胞の出現が観察され、これが正常神経組織に生着して脳再生、脳機能改善に貢献していること、および、この神経幹細胞は骨髄に由来するものであることを明らかにした。本発明は、このように脳梗塞修復時に特異的に産生され、神経を再生する骨髄由来の神経幹細胞を調製するものであり、生体が要求する細胞を大量に提供することができ、生体機構に沿った移植治療が可能になると考えられる。【００３８】
（３）  骨髄細胞は比較的採取が容易であるので、例えば脳梗塞後の患者から骨髄を採取し、免疫抑制剤の存在下に培養を行って神経幹細胞を調製し、これを静脈内投与などで患者に移植する自家移植も十分実現可能である。
細胞移植は、基本的に自家移植が倫理的にも医学的にも最良の方法と考えられる。本発明は、生体への生着性と機能発揮性の点で最良ともいえる患者自身の骨髄由来神経幹細胞を提供することができ、再生医療に適している。ただし、本発明は、自家移植への利用のみに限定されるものではなく、他家移植用に他者由来の骨髄から神経幹細胞を調製する方法にも利用可能である。【００３９】
（４）  分化誘導因子であるケモカイン（もしくはその他のサイトカイン）の使用によって、より簡便かつ安全性を向上できる。また、慢性期などの患者で骨髄又は血清中に分化誘導因子としてのケモカインやサイトカインがまったく或いは殆ど存在しない場合に、ケモカインなどのサイトカインを添加して神経幹細胞を調製する方法は極めて効果的である。そのほか、他家移植用に他者由来の骨髄から神経幹細胞を調製する方法においても、血清の代わりにケモカインやサイトカインを使用することは、安全性の面から非常に望ましい方法である。【００４０】
（５）  本発明は、脳梗塞の治療に限らず、その他の脳血管障害、脳虚血性疾患、神経変性疾患に対する神経移植治療にも利用可能であり、神経再生治療に広く利用可能性を有する。【００４１】
（６）  本発明は、神経再生治療へ直接利用可能であるほか、治療法開発においても利用可能であり、例えば本発明により得られた神経幹細胞を様々な条件下、脳梗塞モデルマウスに移植してその治療効果を確認することで、更なる治療法開発・研究進展が期待できる。【００４２】
また、本発明により調製した神経（幹）細胞を神経再生治療剤として患者に移植・投与する方法としては、例えば、静注、点滴静注などによって投与する。このような注射剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に生理食塩水、細胞培養液などを用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えてもよい。これら製剤中の神経（幹）細胞の配合量は特に限定されるものではなく、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて決定すればよい。また、本発明の神経（幹）細胞を、数回にわたり患者に投与してもよいし、１回当たりの投与量、投与間隔などを診断結果に応じて決定してもよい。【００４３】
神経（幹）細胞に対する患者の免疫応答を抑制するため、神経（幹）細胞の投与と同時またはその投与前（もしくは投与後）に、免疫抑制剤を投与することが望ましい。投与方法は、神経（幹）細胞の投与と異なる方法であってもよい。【００４４】
また、脳内での血管再生、神経再生を向上させるため、神経（幹）細胞の投与と同時またはその投与前（もしくは投与後）に、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞（J.Clin.Invest. 114:330-338（2004）参照）、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）などの血管形成能を有する細胞を投与する方法は、好ましい方法である。【００４５】
以上のように、神経（幹）細胞を神経再生治療剤として用いることができるが、これ以外に、後述の実施例の結果から、in vitroにおいて、またin vivoにおいても、骨髄由来神経幹細胞の形成を維持・促進し、神経再生治療を実現するためには、免疫機能を抑制すること、特にＴ細胞機能を抑制することが重要であることが示されたので、免疫抑制物質（特にＴ細胞機能を抑制する物質）を神経再生治療剤として用いることが可能である。【００４６】
例えば、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリン、抗ＣＤ２８抗体および抗ＩＣＯＳ抗体など、Ｔ細胞の活性を抑制する物質を神経再生治療剤として用いることができる。【００４７】
そのほか、前述のように、骨髄細胞から神経幹細胞への分化誘導作用を有するＣＩＮＣ−１、ＴＮＦαといったケモカイン、サイトカインについても、これらの分化誘導因子を投与することによって、in vitro と同様に、in vivoでの骨髄由来神経幹細胞の形成が促進されると考えられるので、神経再生治療剤としての応用が可能である。【００４８】
さらに、これらケモカイン、サイトカインの分化誘導作用を促進する物質（これらケモカイン、サイトカインの産生を促進する物質を含む）も神経再生治療剤としての応用が可能である。このような物質は、例えば後述する本発明のスクリーニング系を利用して探索することができる。【００４９】
本発明のこれら免疫抑制物質、ケモカイン、サイトカイン等を有効成分とする神経再生治療剤は、経口剤でもよいし、注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤でもよい。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、トレハロース、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の有効成分の配合量は特に制限されるものではなく適宜設定できる。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。【００５０】
非経口剤の場合は、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などによって投与する。この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用いることができる。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えてもよい。これら製剤中の有効成分の配合量は特に制限されるものではなく、前述の神経（幹）細胞を投与する場合と同様に、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて決定すればよい。また、本発明の神経再生治療剤を、数回にわたり患者に投与してもよいし、１回当たりの投与量、投与間隔などを診断結果に応じて決定してもよい。【００５１】
［２］脳梗塞モデル動物の開発
上述した本発明の神経幹細胞調製法の開発に伴い、免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）の母系マウスの脳の血管を結紮してなる新たな脳梗塞モデル動物を開発した。この脳梗塞モデル動物は、ＳＣＩＤマウスの代わりに、その母系マウスを使用すること以外、特願２００４−１０８５００号記載の方法と同様に作製可能である。【００５２】
ＳＣＩＤマウスの母系マウスとしては、現在市販されている（例えば、FOX Chase Cancer Centerなど参照のこと）ＳＣＩＤマウス、または、この改良型のマウスの母系マウスであればよい。結紮する脳の血管としては、脳内の脳梗塞を発症させることができる血管であれば、いずれの血管であっても特に制限はないが、発症例の多い血管や、また実験の行いやすい表皮側の血管が好ましい。好ましい血管としては、中大脳動脈、内頚動脈、椎骨脳底動脈などが例示される。【００５３】
また、結紮する部位としても特に制限はないが、結紮部位によっては、虚血領域の選択性が悪くなることもあることから、選択性を確保できる部位を設定することも必要である。例えば、結紮部位として、中大脳動脈が嗅索を通過した直後、すなわち遠位側Ｍ１部位（distal M1 portion）を選択することにより、中大脳動脈の皮質枝の血流を選択的に途絶させることが可能である。【００５４】
脳の血管を結紮する手法としては、脳梗塞が発症できる結紮方法であれば特に制限はなく、例えば、クリップ法、血管の凝固・切断法、血管内栓子法などの各種の手法を使用することができる。虚血を一過性にするか、永久的にするかにより、結紮方法を選定することも必要である。例えば、凝固用ピンセットにて電気凝固後に切断する永久結紮法、動脈瑠結紮用クリップを用いた一過性結紮法などが挙げられる。【００５５】
具体的な結紮方法としては、例えば、ハロセンなどでマウスを麻酔し、マウスの左頬骨を切除し、頭蓋底を露出させ、中大脳動脈走行部位に直径１〜５ｍｍ程度の骨窓を歯科用ドリルで作成し、硬膜、クモ膜を剥離し、中大脳動脈を分離して結紮を行うことができる。【００５６】
上記方法にしたがって、実際にＳＣＩＤマウスの母系マウスであるC.B-17/IcrCrlBRマウスの脳の血管を結紮することにより、良好な再現性を示し、しかも長期間生存可能な脳梗塞モデルマウスを作製することができた（後述の実施例２参照）。【００５７】
さらに、上記脳梗塞モデルマウスの作製方法と同様に、無胸腺マウスであるヌードマウス（BALB/cAJcl-nu）およびその母系マウスの左中大脳動脈をそれぞれ結紮することにより、良好な再現性で脳梗塞モデルマウスを作製することができた（後述の実施例７参照）。【００５８】
ＳＣＩＤマウスと同様に、ヌードマウスは、そのＴ細胞機能が抑制された免疫不全マウスであり、上記方法でヌードマウスから脳梗塞モデルを作製後、その骨髄および脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）から採取した細胞をそれぞれ培養したところ、nestin陽性のニューロスフェアが多数形成された（図２５）。対照的に、その母系マウス（コントロール）から脳梗塞モデルを作製後、その骨髄および脳梗塞下組織から採取した細胞をそれぞれ培養したところ、nestin陽性のニューロスフェアは殆ど形成されなかった。この結果からも、Ｔ細胞が骨髄あるいは脳梗塞下組織におけるニューロスフェア形成に抑制的機能を果たしていることがわかる。【００５９】
従って、（１）Ｔ細胞機能を抑制する免疫抑制剤を利用することによって、ＳＣＩＤマウスの母系マウスの骨髄細胞から神経幹細胞を調製したのと同様の方法で、ヌードマウスの母系マウスの骨髄細胞から神経幹細胞を調製することができると考えられる。さらに、（２）ＳＣＩＤマウスおよびヌードマウス以外のＴ細胞機能不全マウスの骨髄からも、ＳＣＩＤマウス等からと同様の方法で、神経幹細胞を調製することができると考えられる。【００６０】
また、本発明は、（１）本発明の脳梗塞モデル動物に、被検薬物を投与して、当該被検薬物の脳梗塞に対する有効性をスクリーニングする方法、および、（２）本発明の脳梗塞モデル動物に、神経（幹）細胞又は他の細胞を移植して、当該移植治療の脳梗塞に対する有効性をスクリーニングする方法、を提供するものである。【００６１】
本発明のスクリーニング方法としては、例えば、本発明の脳梗塞モデル動物に、被検薬物を投与、あるいは神経幹細胞等を移植して、カーボンブラック灌流法、脳の大きさの測定、ＭＲＩなどによる機器分析などにより脳梗塞の病巣部の大きさや容積の変化、形態学的検討（左右大脳皮質幅の比、ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシスの程度、ＢｒｄＵ標識による再生神経や再生血管内皮細胞数）、行動テスト（オープンフィールドテストや驚愕反射、迷路学習、回避学習）などを測定し、これを対照群と比較して脳梗塞病巣部の拡大の阻止、脳機能の回復などの程度を評価する方法が挙げられる。【００６２】
さらに、本発明は、脳梗塞などの脳虚血性疾患、又はその他の神経疾患の治療に用いられる神経再生治療剤のスクリーニング方法として、骨髄細胞から神経幹細胞への分化を誘導し、又はその分化を促進する作用を有するかどうかを指標に、候補物質を探索するスクリーニング方法を提供するものである。【００６３】
例えば、後述の実施例記載の培養系において、ヒト又は動物から採取した骨髄細胞の培地に被検物質を投与し、当該被検物質が、骨髄細胞から神経幹細胞への分化を誘導し、又はその分化を促進する作用を有するかどうかを調べることによって、候補物質を探索する。培養条件は、使用する骨髄細胞の起源などに応じて、（１）免疫抑制剤を添加したもの、（２）分化誘導因子（又は脳障害後に採取した血清）を添加したもの、（３）免疫抑制剤と分化誘導因子（又は脳障害後血清）の両者を添加したもの、（４）両者とも添加しないもの、など種々の条件の中から適切な条件を設定すればよい。【００６４】
実際に、後述の実施例記載の培養系を用いて、骨髄細胞から神経幹細胞への分化を誘導する物質を探索したところ、サイトカインであるＴＮＦαがこのような分化誘導作用をもつことを見出すことができ、本発明のスクリーニング方法の有効性が認められた。【００６５】
本発明のスクリーニング方法において、免疫抑制作用を有する物質群の中から、神経再生に有用な候補物質の探索を行ってもよいし、ケモカインなどのサイトカイン、あるいはこれらの活性や産生を調節する物質群の中から、神経再生に有用な候補物質の探索を行ってもよい。【００６６】
また、本発明のスクリーニング方法は、後述の実施例記載の培養系を用いたスクリーニング系に制限されるものではなく、その他のスクリーニング系を用いても勿論よい。例えば、分化誘導因子として同定されたＣＩＮＣ−１やＴＮＦαなどの物質を標的分子として、これらの分子の活性や産生を調節する物質を既存の様々な系で調べることができ、これにより、骨髄細胞から神経幹細胞への分化を促進し、神経再生治療に有効な候補物質を探索することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
〔実施例１：脳梗塞ＳＣＩＤマウス骨髄由来の神経幹細胞の調製〕
［1-1］脳梗塞ＳＣＩＤマウスの作成
特願２００４−１０８５００号の明細書記載の方法にしたがって、免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウス（５週齢）の中大脳動脈を結紮し、脳梗塞モデルマウスを作成した。
具体的には、３％ハロセン麻酔下にマウス左頬骨を切除し、頭蓋底を露出した。中大脳動脈走行部位に直径１．５ｍｍの骨窓を歯科用ドリルで作成した。硬膜、クモ膜を剥離し、中大脳動脈を分離して結紮準備とした。中大脳動脈結紮法としては、凝固用ピンセットにて電気凝固後に切断する永久結紮法、動脈瑠結紮用クリップを用いた一過性結紮法などが可能である。結紮部位は、動脈が嗅索を通過した直後、すなわちdistal M1 portionである。この部位を結紮することにより、中大脳動脈の皮質枝の血流を選択的に途絶させることが可能である。【００６８】
このような中大脳動脈結紮法により、ＳＣＩＤマウス左中大脳動脈のdistal M1 portionを結紮して作成した脳梗塞モデルマウス（脳梗塞ＳＣＩＤマウス）の脳梗塞領域を、実際に２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（2,3,5-triphenyltetrazolium（ＴＴＣ））染色法にて検討した。ＴＴＣ染色法は、中大脳動脈結紮後（ＭＣＯ）１，３，７日目にそれぞれマウス脳を摘出し、brain slicerにて作成した冠状脳スライスを用いて施行した。図７左には、この染色法によって、結紮後（ＭＣＯ）１日目に摘出した脳の染色結果が示される。この方法により、左中大脳動脈皮質枝領域に選択的に梗塞（白い部分）が観察され、再現性のよい均一な脳梗塞を作成することができる（特願２００４−１０８５００号参照）。なお脳梗塞は、上記方法による結紮後（ＭＣＯ）３日でほぼ完成する。【００６９】
［1-2］ニューロスフェア（neurosphere）様細胞塊の形成
上記方法により作成した脳梗塞ＳＣＩＤマウスを結紮後７日目にクリーンベンチ内で断頭し、大腿骨から骨髄を採取した。その後、ＤＭＥＭとＮ−２の基本培養液内（２５０μｌ）で単細胞になるまでピペッティングし、１０ｍｌの培養液を加えて６００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を３ｍｌの培養液にて再浮遊させ、ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）存在下にlow cell bindingプレート上で１０−２８日間培養を行った。その結果、図１Ｄに示すように、７日目以降にはニューロスフェア（neurosphere）様細胞塊が細胞顕微鏡下で観察された。【００７０】
比較のため、胎生２週目のＣ５７Ｂ／６マウスから採取した線条体細胞をlow cell binding プレート上で１０日間培養を行ったところ、図１Ａに示すように、ニューロスフェアが形成された。これをhigh bindingプレート上でさらに培養すると３日後には分化し（同図Ｂ）、発現蛋白を免疫組織化学法（二重染色間接蛍光抗体法）にて検討すると、ＭＡＰ２陽性の神経細胞と、ＧＦＡＰ陽性のグリア細胞に分化していた（同図Ｃ参照）。【００７１】
一方、脳梗塞ＳＣＩＤマウスから採取した骨髄細胞をlow cell binding プレート上で１０日間培養すると、上述のように、胎生期マウス脳（線条体）由来のニューロスフェアとよく似たニューロスフェア様細胞塊が形成された（同図Ｄ）。これをhigh bindingプレート上でさらに培養すると３日後には突起を持った細胞に分化し（同図Ｅ）、一部はＭＡＰ２陽性の神経細胞と、ＧＦＡＰ陽性のグリア細胞に分化していた（同図Ｆ参照）。【００７２】
さらに、ＳＣＩＤマウスに対して偽手術（骨窓まで開き、結紮はしない処置）を施行した脳梗塞を生じさせていない偽手術ＳＣＩＤマウス（sham SCIDマウス）から骨髄を採取し、同様の条件で培養を行ったが、ニューロスフェア様細胞塊はほとんど形成されなかった。【００７３】
［1-3］ニューロスフェア様細胞塊の形成効率
脳梗塞ＳＣＩＤマウス骨髄由来のニューロスフェア様細胞塊形成に関して、脳梗塞後（結紮後）骨髄を採取するまでの期間や骨髄細胞の培養期間が、細胞塊形成にどのように影響するかを検討した。【００７４】
脳梗塞作成後（結紮後）１，２，３週目のＳＣＩＤマウスから採取した骨髄をそれぞれ２８日間培養し、新たに形成されるニューロスフェア様細胞塊数を数えた。その結果、図２に示すように、脳梗塞後１週目（ＭＣＯ１Ｗ）に採取した骨髄が最も多くのニューロスフェア様細胞塊を形成し、培養後１０−１３日目に形成能がピークとなることが明らかになった。【００７５】
一方、偽手術ＳＣＩＤマウスの培養骨髄からは、ニューロスフェア様細胞塊は培養１ヶ月を経過してもほとんど形成されなかった（Sham control）。しかし、偽手術ＳＣＩＤマウスの骨髄に脳梗塞ＳＣＩＤマウス（ＭＣＯ１Ｗ）から採取した血清を添加して培養すると、ニューロスフェア様細胞塊が形成された（Sham control + Serum）。【００７６】
［1-4］神経幹細胞・神経細胞への分化能
脳梗塞ＳＣＩＤマウス（ＭＣＯ１Ｗ）の骨髄を培養し、１０日目に培養液に浮遊しているニューロスフェア様細胞塊を採取してhigh bindingプレート上でさらに培養した。３−７日後に分化した細胞をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定して免疫染色を行い、発現蛋白の検討を行った。その結果、細胞塊の中心にはＮｅｓｔｉｎ陽性の神経幹細胞が高率に観察された（図３左）。また、周囲には分化したＭＡＰ２陽性の神経細胞（同図中央）、ＧＦＡＰ陽性のグリア細胞（同図右）が観察された。【００７７】
次に、骨髄由来のニューロスフェア様細胞塊の神経細胞への分化能、分化効率を検討した。その結果、図４に示すように、脳梗塞ＳＣＩＤマウス（ＭＣＯ１Ｗ）の骨髄を培養して得られたニューロスフェア様細胞塊の約６０％がＮｅｓｔｉｎ陽性の神経幹細胞であり、そのうち６７％（全体のニューロスフェア様細胞塊の約４０％）がＭＡＰ２陽性、ＮｅｕＮ陽性の神経細胞に分化した。また、ＭＡＰ２陽性の神経細胞を産生した細胞塊には、ほぼ１００％の確率で同時にＧＦＡＰ陽性のグリア細胞が観察された。【００７８】
［1-5］神経幹細胞へ分化誘導させる刺激因子の存在
上述のように、脳梗塞ＳＣＩＤマウスの骨髄を培養することで、神経幹細胞が産生された。このように脳梗塞ＳＣＩＤマウスの骨髄から神経幹細胞が分化誘導されるメカニズムを検討する目的で、脳梗塞を起こしていない偽手術ＳＣＩＤマウスの培養骨髄液に別のマウスの血清（３０μｌ）を添加した。【００７９】
その結果、偽手術ＳＣＩＤマウスの骨髄に別の偽手術ＳＣＩＤマウスの血清を添加してもニューロスフェア様細胞塊はまったく形成されなかったが、偽手術ＳＣＩＤマウスの骨髄に脳梗塞ＳＣＩＤマウス（ＭＣＯ１Ｗ）の血清を添加するとニューロスフェア様細胞塊ができ（図５Ａ・Ｂ、図２）、これは神経細胞にも分化した（図５Ｃ・Ｄ）。以上の結果から、脳梗塞を起こした後の血清には、骨髄細胞を神経幹細胞へ分化させる何らかの刺激因子（differentiation factor）が存在し、この刺激因子が血流を介して骨髄に伝えられ、神経幹細胞が産生されると考えられる。【００８０】
［1-6］本実施例の結果と考察
以上のように、免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウスの中大脳動脈を結紮して脳梗塞モデルマウスを作成し、脳梗塞発症後（結紮後）に骨髄細胞を採取、培養することで、神経幹細胞塊（ニューロスフェア）を誘導・調製することができた。また、このニューロスフェアが神経細胞に分化することを明らかにした。【００８１】
一方、脳梗塞を起こしていない偽手術ＳＣＩＤマウスの骨髄からはニューロスフェアは形成されなかったが、これに脳梗塞モデルマウスの血清を添加して培養することでニューロスフェア形成がみられたことから、ニューロスフェア形成には脳梗塞が誘因となって産生される刺激因子が必要と考えられる。【００８２】
〔実施例２：脳梗塞後骨髄からの神経幹細胞産生と免疫不全との関連性検討〕
［2-1］免疫正常マウスからの脳梗塞モデルの作成
上述のように、免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウスの脳梗塞モデルから採取した骨髄を培養することで、多くの神経幹細胞（ニューロスフェア）が形成された。そこで、この現象がマウスの免疫不全と関係があるかどうかを検討する目的で、ＳＣＩＤマウスの母系マウスである免疫正常なC.B-17/IcrCrlBRマウス（以下、「Ｃ．Ｂ１７マウス」という。）に対して、同様の方法で脳梗塞モデルを作成して脳梗塞ＳＣＩＤマウスと比較し、その骨髄から神経幹細胞が分化誘導されるか等について検討した。【００８３】
Ｃ．Ｂ１７マウスからの脳梗塞モデルの作成は、上述の脳梗塞ＳＣＩＤマウスの作成方法と同様である。すなわち、３％ハロセン麻酔下にマウス左頬骨を切除し、頭蓋底を露出した。中大脳動脈走行部位に直径１．５ｍｍの骨窓を歯科用ドリルで作成した。硬膜、クモ膜を剥離し、中大脳動脈を分離して結紮準備とした。中大脳動脈結紮法としては、凝固用ピンセットにて電気凝固後に切断する永久結紮法、動脈瑠結紮用クリップを用いた一過性結紮法などが可能である。結紮部位は、動脈が嗅索を通過した直後、すなわちdistal M1 portionである。この部位を結紮することにより、中大脳動脈の皮質枝の血流を選択的に途絶させることが可能である。【００８４】
このような中大脳動脈結紮法により、Ｃ．Ｂ１７マウス左中大脳動脈のdistal M1 portionを結紮して作成した脳梗塞モデルマウス（脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウス）の脳梗塞領域を、実際にＴＴＣ染色法にて検討した。ＴＴＣ染色法は、結紮後（ＭＣＯ）１，３，７日目にそれぞれマウス脳を摘出し、brain slicerにて作成した冠状脳スライスを用いて施行した。その結果、各群４匹、計１２匹はすべて左中大脳動脈皮質枝領域に選択的に梗塞が作成され、脳梗塞部位は極めて均一であった。図７には、結紮後（ＭＣＯ）１日目に摘出した脳の染色結果が、脳梗塞ＳＣＩＤマウスのものと対比して示される（白い部分が梗塞部位）。【００８５】
Ｃ．Ｂ１７マウス、およびＳＣＩＤマウスにおける中大脳動脈閉塞後の脳梗塞の様子を摘出脳で観察した。マウス左中大脳動脈のdistal M1 portionを結紮し、３，７，１６，２８日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出した。その結果、摘出脳は全例中大脳動脈領域の欠損が観察され（図６には、結紮後１６日目のものが示される）、ＳＣＩＤマウスの母系であるＣ．Ｂ１７マウスを用いた場合も、ＳＣＩＤマウスと同様に再現性のよい均一な脳梗塞モデルを作成できることが明らかになった。【００８６】
ところで、ＳＣＩＤマウスから作成した脳梗塞モデルマウスでは、虚血後の脳梗塞の進展（delayed infarct expansion）は脳梗塞後３日で終了し、その後は脳萎縮の進展ではなく、脳形態上はむしろ回復することが認められている（特願２００４−１０８５００号参照）。このことは、脳梗塞ＳＣＩＤマウスが脳梗塞モデルマウスとしてのみならず、脳再生モデルとしても適していることを示している。【００８７】
そこで次に、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスにおいても、このような脳形態上の回復が認められるか検討した。上述のように、Ｃ．Ｂ１７マウスおよびＳＣＩＤマウスの左中大脳動脈のdistal M1 portionを結紮し、３，７，１４，２８日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、残存大脳皮質の大きさを定量化することで、脳欠損の程度、回復・再生の有無を観察した。具体的には、梗塞側大脳皮質の大脳裂から梗塞部位までの幅（ａ）を正常側（ｂ）と比較し、その比（ａ／ｂ）をcortical width index（ＣＩ値）として算出した（図２０参照）。その結果、図８に示すように、脳梗塞ＳＣＩＤマウス、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスともＣＩ値は３日目から７日目までは０．３４とほぼ一定であった。しかし、ＳＣＩＤマウスでは２８日目に０．３７と増加し、回復・再生が認められたのに対し、Ｃ．Ｂ１７マウスでは２８日目でも０．３４と一定であった。この結果から、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスでは、脳梗塞ＳＣＩＤマウスとは異なり、脳形態上の回復は認められず、脳再生モデルとはいえなかった。【００８８】
［2-2］脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスにおける神経幹細胞等の発現検討
脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスは、ＣＩ値では脳再生が認められなかったが、梗塞後のマウス脳に神経幹細胞等が形成されているかどうかを、神経幹細胞や神経細胞、グリア細胞の各種マーカーを用いた免疫組織化学で検討した。【００８９】
具体的には、神経幹細胞に対しては抗ムサシ１（Musashi1）抗体を用い、未熟神経細胞の同定にはDoublecortin（ＤＣＸ）を用いた。オリゴデンドロサイト前駆細胞はPlatelet-derived Growth Factor Receptorα（ＰＤＧＦＲα）とＮＧ２をマーカーとし、前および未熟オリゴデンドロサイトに対してはＯ４とMyelin-associated Glycoprotein（ＭＡＧ）を用いた。アストロサイトは抗ＧＦＡＰ抗体で同定した。さらに、未熟神経細胞や軸索伸長過程にある神経のマーカーとしてＰＳＡ−ＮＣＡＭを用いた。ＰＳＡ−ＮＣＡＭは，培養神経幹細胞の細胞膜に発現することが確認されている。また、Ｎカドヘリン（N-cadherin）もニューロスフェアに発現することが確認されている。これらは、ニューロスフェアの分化誘導シグナル調節に深く関与している。【００９０】
上述の各種マーカーを用いて、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスの脳室下帯組織（subventricular zone：ＳＶＺ）、および脳梗塞下の組織における神経幹細胞等の産生について検討した。なお、脳梗塞下の組織とは、梗塞組織（脳梗塞瘢痕部位）および梗塞組織と白質（脳梁）とが接する脳梗塞周囲の部位のことである。この脳梗塞下の組織は、脳室下帯組織（ＳＶＺ）とともに、脳梗塞ＳＣＩＤマウスにおいて多数の神経幹細胞の出現（即ち、脳再生）が観察された部位である（特願２００４−１０８５００号参照）。また、この脳梗塞下の組織における神経幹細胞は、骨髄に由来するものであった。【００９１】
［2-3］脳室下帯組織（ＳＶＺ）における神経幹細胞等の発現
脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウス作成後１，７，１４，３５日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成し、その後、免疫組織化学を行った。【００９２】
梗塞後１日目には、ＳＶＺの各種マーカー発現はすべて正常側と差はなかった。７日目になると、Musashi1陽性、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性の細胞が、ＳＶＺに増殖するようになった。１４日目になると、これらの神経幹細胞は脳室膨大部から白質内に侵入するようにみられた。３５日目には、ＳＶＺでの発現細胞は減少しコントロールレベルとなったが、脳室下の白質には多数のMusashi1陽性、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性の細胞が認められた。同部位には、ＤＣＸ陽性の未熟神経細胞や、小型のＮｅｕＮ陽性細胞もみられた。また、梗塞後７日目よりＳＶＺにはＮＧ２陽性、ＰＤＧＦＲα陽性のオリゴデンドロサイト前駆細胞も発現するようになった。これらは成熟オリゴデンドロサイトマーカーを有しておらず、１４日目までみられたが、３５日目には減少した。【００９３】
このように、ＳＶＺでは梗塞後７日目以降、１４日目をピークに神経幹細胞の増殖がみられ、以後減少する。神経幹細胞としては脳室下の白質に３５日目までは存在するが、以後は成熟して神経となるか、あるいは死滅してしまうと考えられる。ＳＶＺには梗塞後７日目にはＮｏｔｃｈ１陽性細胞がみられたが、それ以降はみられなかったことから、ＳＶＺ細胞の分化増殖シグナルは、梗塞後１週間程度で終了すると考えられた。【００９４】
［2-4］Ｃ．Ｂ１７マウス梗塞下組織における神経幹細胞の発現抑制
Ｃ．Ｂ１７マウスおよびＳＣＩＤマウスに対して脳梗塞作成後２１日目のマウス脳のビブラトーム切片を用いて、ＮｅｕＮに対する免疫組織化学を施行した。その結果を図９に示す。脳梗塞ＳＣＩＤマウスの梗塞下組織（白質領域）には多数の小型ＮｅｕＮ陽性細胞（神経前駆細胞）が観察されたが（同図Ａ）、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスの梗塞下組織は、ほとんどマクロファージで占拠されており、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性の神経幹細胞や小型のＮｅｕＮ陽性細胞は梗塞後３５日目までほとんど認められなかった（同図Ｂ）。このことは、Ｃ．Ｂ１７マウスの正常な免疫反応が、梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位を含む）における神経幹細胞発現・神経再生に抑制的に作用していることを示唆するものである。【００９５】
次に、脳梗塞下組織から採取した細胞を培養して神経幹細胞が形成されるかどうか検討した。結紮後７日目の脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスおよび脳梗塞ＳＣＩＤマウスの梗塞下組織を採取し、その後、ＤＭＥＭとＮ−２の基本培養液内（２５０μｌ）で単細胞になるまでピペッティングし、１０ｍｌの培養液を加えて６００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を３ｍｌの培養液にて再浮遊させ、ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）存在下にlow cell bindingプレート上で２９日間培養を行い、新たに形成されるニューロスフェア様細胞塊数を数えた。その結果、図１２に示すように、脳梗塞ＳＣＩＤマウスの梗塞下組織からは培養５日目以降にニューロスフェア様細胞塊の形成が観察されたが、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスの梗塞下組織からはニューロスフェア様細胞塊は全く形成されなかった。【００９６】
［2-5］Ｃ．Ｂ１７マウスにおける骨髄由来ニューロスフェア様細胞塊の形成
脳梗塞作成後７日目のＳＣＩＤマウスとＣ．Ｂ１７マウスの骨髄を２８日間培養し、ニューロスフェア様細胞塊が形成されるかどうかを観察した。その結果、ＳＣＩＤマウスの骨髄からは培養２週間目までにニューロスフェア様細胞塊が形成された（図１０Ａ・Ｂ）。一方、Ｃ．Ｂ１７マウスの骨髄からは培養開始７日目までにわずかにニューロスフェア様細胞塊が形成されたが（同図Ｃ・Ｄ）、これらは２週間以内にすべて消失した。【００９７】
そこで、ニューロスフェア様細胞塊における細胞死のメカニズムを探る目的で、培養後同時期のＳＣＩＤマウス由来とＣ．Ｂ１７マウス由来のニューロスフェア様細胞塊をＡｎｅｘｉｎＶで標識してアポトーシスを検討した。その結果、ＳＣＩＤマウス由来のニューロスフェア様細胞塊では、細胞中心部が少しネクローシスに陥っているのみであったが（図１１Ａ参照）、Ｃ．Ｂ１７マウス由来のニューロスフェア様細胞塊では、内側の細胞はほとんどがネクローシスで、外側の細胞はすべてアポトーシスに陥っていた（同図Ｂ参照）。この結果から、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウス由来のニューロスフェア様細胞塊は、アポトーシスで消滅することが示された。【００９８】
また、脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウスの骨髄からは、ニューロスフェア様細胞塊は全く形成されなかった。さらに、偽手術Ｃ．Ｂ１７マウスから採取した骨髄を、脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウスの血清を添加して培養すると、ニューロスフェア様細胞塊が一旦形成されるがすぐに排除され、ニューロスフェア様細胞塊を得ることはできなかった。【００９９】
［2-6］本実施例の結果と考察
以上のように、免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウスの脳梗塞モデルから採取した脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）や骨髄からは、大量のニューロスフェアが形成された。これに対して、その母系マウスである免疫正常なＣ．Ｂ１７マウスの脳梗塞モデルから採取した脳梗塞瘢痕部位や骨髄からは、ニューロスフェアはほとんど形成されなかった。これらの結果から、正常な免疫反応が骨髄および脳梗塞瘢痕部位における神経幹細胞（ニューロスフェア）の発現に抑制的に作用していると考えられる。【０１００】
〔実施例３：免疫抑制剤を用いた骨髄・脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）からの神経幹細胞調製法〕
上述のように、脳梗塞後の神経再生（神経幹細胞の発現・形成）に免疫の関与が考えられたので、この推論を確かめるため、脳梗塞後の骨髄・脳梗塞瘢痕部位からの神経幹細胞の形成に対する免疫抑制の効果をin vivoとin vitro双方で検討した。【０１０１】
［3-1］免疫抑制剤を投与したＣ．Ｂ１７マウス骨髄・脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）からのニューロスフェア形成
Ｃ．Ｂ１７マウスに免疫抑制剤ＦＫ５０６（１．０ｍｇ／ｋｇ）を前投与すなわち３日間連日腹腔内投与し、その後、左中大脳動脈閉塞による脳梗塞を作成した。脳梗塞後（結紮後）もＦＫ５０６（１．０ｍｇ／ｋｇ）投与を継続し、脳梗塞後７日目に骨髄と脳梗塞瘢痕部位とを採取してＤＭＥＭとＮ−２の基本培養液内（２５０μｌ）で単細胞になるまでピペッティングし、１０ｍｌの培養液を加えて６００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を３ｍｌの培養液にて再浮遊させ、ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）存在下にlow cell bindingプレート上で１０−２８日間培養を行った。図１３に示すように、培養７日目以降には骨髄（Ａ・Ｂ）と脳梗塞瘢痕部位（Ｃ）からニューロスフェア様細胞塊が細胞顕微鏡下で観察された。
一方、偽手術Ｃ．Ｂ１７マウスにＦＫ５０６（１．０ｍｇ／ｋｇ）を１０日間連日腹腔内投与しただけの培養骨髄からはニューロスフェア様細胞塊はほとんど形成されなかった。【０１０２】
［3-2］脳梗塞Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄に免疫抑制剤を添加した場合のニューロスフェア形成
次に、脳梗塞作成後７日目のＣ．Ｂ１７マウス骨髄を培養する際に免疫抑制剤ＦＫ５０６（０．１μｇ／ｍｌ）を培養液に添加してニューロスフェア様細胞塊が形成されるかどうかを観察した。すなわち、骨髄細胞をＤＭＥＭとＮ−２の基本培養液内（２５０μｌ）で単細胞になるまでピペッティングし、１０ｍｌの培養液を加えて６００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞をＦＫ５０６（０．１μｇ／ｍｌ）を含む３ｍｌの培養液にて再浮遊させ、low cell bindingプレート上で１０−２８日間培養を行った。すると、培養４日目以降にニューロスフェア様細胞塊が細胞顕微鏡下で観察された（図１４Ａ・Ｂ）。【０１０３】
即ち図１５に示すように、脳梗塞作成後７日目のＣ．Ｂ１７マウス骨髄を培養しても、ほとんどニューロスフェア様細胞塊は形成されなかったが（C.B (MCO1W)）、上述のように、ＦＫ５０６（０．１μｇ／ｍｌ）を培養液に添加するとニューロスフェア様細胞塊が形成された（C.B (MCO1W) + FK506）。これは培養４日目以降に観察され、ＳＣＩＤマウスの脳梗塞後における形成（SCID (MCO1W)）よりも早期に見られた。【０１０４】
一方、脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄に対しては、
（１）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）のみ、
（２）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）＋脳梗塞後１週間目のＳＣＩＤマウスの血清（５０μｌ）、
（３）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）＋脳梗塞後１週間目のＳＣＩＤマウスの血清（５０μｌ）＋ＦＫ５０６（０．１μｇ／ｍｌ）、
の３種類の培養液を用意した。【０１０５】
すると、培養４日目以降に上記（３）の培養液中にのみニューロスフェア様細胞塊が細胞顕微鏡下で観察された（図１６Ｂ・Ｃ）。一方、上記（２）の培養液からはニューロスフェア様細胞塊が一旦形成されるが、すぐに排除されニューロスフェアは得られなかった。これらのことから、骨髄におけるニューロスフェア形成に抑制的に作用している免疫反応を排除することにより神経幹細胞が形成されること、骨髄から異所性に神経幹細胞が形成されるためにはＴ細胞機能など細胞性免疫が抑制されなければならないことが明らかになった。【０１０６】
［3-3］Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄に抗Ｔ細胞抗体を添加した場合のニューロスフェア形成
ＣＤ２８およびＩＣＯＳ（inducible costimulatory molecule）は、多くのＴ細胞依存性免疫反応における受容体であり、そのブロッキング抗体である抗ＣＤ２８抗体および抗ＩＣＯＳ抗体は、Ｔ細胞機能を抑制することが知られている（Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1997) 16:335-342.；J. Immunol. (2000) 165:5035-5040.等）。そこで、ＦＫ５０６以外に、このようなＴ細胞機能を抑制する抗体（抗Ｔ細胞抗体）を添加した場合も、ＦＫ５０６を添加した場合と同様に神経幹細胞が形成されるかどうかを検討した。【０１０７】
脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄に対して、
（１）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）＋脳梗塞後１週間目のＳＣＩＤマウスの血清（５０μｌ）＋ＦＫ５０６（０．１μｇ／ｍｌ）、
（２）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）＋脳梗塞後１週間目のＳＣＩＤマウスの血清（５０μｌ）＋抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ，BD Biosciences）、
（３）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）＋脳梗塞後１週間目のＳＣＩＤマウスの血清（５０μｌ）＋抗ＩＣＯＳ抗体（４μｇ／ｍｌ，BD Biosciences）、
および、コントロールとして、
（４）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）＋脳梗塞後１週間目のＳＣＩＤマウスの血清（５０μｌ）＋生理食塩水（saline）、
の４種類の培養液を用意した。【０１０８】
すると、培養４日目以降に上記（４）以外の培養液中にニューロスフェア様細胞塊が細胞顕微鏡下で観察された（図２１）。さらに、浮遊しているニューロスフェア様細胞塊を採取してhigh bindingプレート上で更に培養した。７日後に分化した細胞をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定し、nestin陽性のニューロスフェア数を計測したところ、１dishあたりのnestin陽性ニューロスフェア数は、上記（４）のsaline群に比しＦＫ５０６添加群（１）や抗ＣＤ２８抗体添加群（２）、抗ＩＣＯＳ抗体添加群（３）で有意に多かった（図２７）。
以上の結果から、Ｔ細胞機能を抑制する抗Ｔ細胞抗体を添加することにより、ＦＫ５０６を添加した場合と同様に神経幹細胞が形成されること、および、骨髄から神経幹細胞が形成されるためにはＴ細胞機能を抑制することが重要であることが明らかになった。【０１０９】
［3-4］Ｃ．Ｂ１７マウスから調製されたニューロスフェア様細胞塊の神経細胞への分化能
脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄にＦＫ５０６と血清を添加して培養し、１０日目に浮遊しているニューロスフェア様細胞塊を採取してhigh bindingプレート上でさらに培養した。３−７日後に分化した細胞をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定して、ＮｅｓｔｉｎとＭＡＰ２に対する免疫組織化学（二重染色間接蛍光抗体法）を行った。その結果、これらの中にはＮｅｓｔｉｎ陽性の神経幹細胞が高率に観察された（図１７）。同図に示すように、細胞塊の中心はＮｅｓｔｉｎ陽性（明灰色）で神経幹細胞であり、周囲にはより分化したＭＡＰ２陽性の神経細胞（暗灰色）が観察された。また、上記ニューロスフェア様細胞塊について神経への分化能を検討した結果、骨髄培養から得られたニューロスフェア様細胞塊の約６０％がＮｅｓｔｉｎ陽性の神経幹細胞で、そのうち６７％がＭＡＰ２陽性の神経細胞に分化した。【０１１０】
［3-5］Ｃ．Ｂ１７マウスの骨髄と脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）から形成されるニューロスフェアの相違
上述のように、Ｃ．Ｂ１７マウスの脳梗塞後の骨髄からはニューロスフェア様の細胞塊が一旦は形成されるが、脳梗塞瘢痕部位からはニューロスフェア様細胞塊の痕跡すら認められなかった。このことは、骨髄では脳梗塞後に血清中の刺激因子を介して神経幹細胞産生への誘導が生じるものの、正常なＴ細胞機能があるとその影響により幹細胞が排除され、脳に到達できないものと考えられる（図１２）。【０１１１】
［3-6］本実施例の結果と考察
以上のように、Ｃ．Ｂ１７マウスに免疫抑制剤であるＦＫ５０６を前投与し、Ｔ細胞機能を十分抑制してから脳梗塞を作成すると、骨髄および脳梗塞瘢痕部位からニューロスフェアが形成された。また、脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウスの骨髄に脳梗塞後１週間目のＳＣＩＤマウスの血清とＦＫ５０６を添加して培養するとニューロスフェアが形成された。さらに、Ｔ細胞機能抑制の目的でＦＫ５０６の代わりに抗ＣＤ２８抗体あるいは抗ＩＣＯＳ抗体を添加して培養すると、同様に骨髄からニューロスフェアが形成された。【０１１２】
このことより、骨髄から異所性に神経幹細胞が形成されるためにはＴ細胞機能など細胞性免疫が抑制されなければならないこと、正常マウスでも免疫を調節（抑制）すれば骨髄で神経再生が生じ、アポトーシスによる細胞死を回避して、脳梗塞瘢痕部位に移行生着し、そこで分化して神経になることが示唆された。【０１１３】
〔実施例４：脳梗塞ＳＣＩＤマウス骨髄由来の神経幹細胞の移植と脳組織への生着・分化〕
脳梗塞ＳＣＩＤマウスの骨髄由来の神経幹細胞が生理的に脳梗塞巣に侵入して脳組織へ生着、分化するかどうかを確認するため、以下の実験を行った。【０１１４】
即ち、骨髄由来の神経幹細胞がＳＣＩＤマウスの脳梗塞後に生じる神経再生に関与するかどうかを、緑色蛍光タンパク質（green fluorescence protein：ＧＦＰ）を発現するＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄を移植したＳＣＩＤマウス脳梗塞モデルで検討した。【０１１５】
まず、ＳＣＩＤマウスに２００ｒａｄの放射線照射による骨髄抑制を施した後にＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄細胞（１０万個）を移植した。移植後２週間目に脳梗塞を作成し、さらに脳梗塞後１６日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定した。脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。その後脳切片をＧＦＰとＰＳＡ−ＮＣＡＭに対する二重染色免疫組織化学に供した。【０１１６】
具体的には、脳切片をラットモノクローナル抗ＧＦＰ抗体とマウスモノクローナル抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体を含むリン酸緩衝液（２０００倍希釈）にて１２時間反応させ（第一反応）、洗浄後ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ラットＩｇＧとビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（第二反応）、次いでアビジン標識Ｃｙ３と反応させた。ＧＦＰとＰＳＡ−ＮＣＡＭの可視化は共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した。ＧＦＰ陽性細胞は脳梗塞下組織に広く認められ、一部はＰＳＡ−ＮＣＡＭ陰性でミクログリアの形態を示していたが（図１８Ｂ参照）、梗塞下の白質外側および大脳皮質断面（本発明者らがステムロード（Stem Road）と称する部位）に沿って広く認められたＧＦＰ陽性細胞群は、同時にＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性で神経前駆細胞と考えられる（同図Ｃ参照）。ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性部位は他に脳室周囲組織にもみられたが、ここはＧＦＰ陰性であった。【０１１７】
以上の結果から、上記ステムロードには骨髄細胞由来の神経幹細胞が梗塞後に発現して脳実質内に侵入すること、すなわち、骨髄由来の神経幹細胞が脳梗塞下の組織へ生着し、神経に分化することが示された。【０１１８】
〔実施例５：ヒトへの応用と神経幹細胞移植による脳梗塞治療効果〕
［5-1］ヒトの骨髄由来神経幹細胞調製法
以上の知見をヒトに応用し、ヒト骨髄由来の神経幹細胞の調製が可能かどうかを検討した。
脳梗塞を起こしていない正常ヒト骨髄を採取し、その後、ＤＭＥＭとＮ−２の基本培養液内（２５０μｌ）で単細胞になるまでピペッティングし、１０ｍｌの培養液を加えて６００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を３ｍｌの培養液にて再浮遊させ、low cell bindingプレート上で１０−２８日間培養を行った。培養液は、
（１）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）のみ、
（２）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）＋脳梗塞後１週間目の患者の血清（５０μｌ）、
（３）ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）＋脳梗塞後１週間目の患者の血清（５０μｌ）＋ＦＫ５０６（０．１μｇ／ｍｌ）
の３種類を用意した。【０１１９】
すると、培養７日目以降に上記（３）の培養液中にのみニューロスフェア様細胞塊が細胞顕微鏡下で観察された。培養１０日目に形成されたニューロスフェア様細胞塊（図１９Ａ）をhigh bindingプレート上でさらに５日間培養すると、神経細胞に分化した（同図Ｂ）。【０１２０】
［5-2］脳梗塞ＳＣＩＤマウス骨髄由来の神経幹細胞の移植
脳梗塞ＳＣＩＤマウスから得られた骨髄由来の神経幹細胞を、別の脳梗塞ＳＣＩＤマウスに移植した場合の脳再生に与える影響、脳梗塞治療効果について検討した。【０１２１】
即ち、脳梗塞ＳＣＩＤマウスの骨髄から調製されたニューロスフェア様細胞塊を単細胞に分離して、その１０万個を別の脳梗塞ＳＣＩＤマウス（脳梗塞後２日目）に静脈内投与した。そして、その脳梗塞後１６日目に当該マウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出した。摘出脳は、全例中大脳動脈領域の欠損が観察された。【０１２２】
梗塞側大脳皮質の大脳裂から梗塞部位までの幅（ａ）を正常側（ｂ）と比較し、その比（ａ／ｂ）をcortical width index（ＣＩ値）として算出すると、ＣＩ値は、骨髄由来神経幹細胞（ＢＭ−ＮＳＣ）投与マウスでは０．４８で、ＰＢＳを投与したコントロールマウスでは０．３６であった（図２０）。このように、神経幹細胞を移植されたマウスの脳は、コントロールマウスの脳より残存大脳皮質が拡大していた。【０１２３】
上述のように、ＳＣＩＤマウスから作成した脳梗塞モデルマウスでは、虚血後の脳梗塞の進展（delayed infarct expansion）は脳梗塞後３日で終了し、その後は脳萎縮の進展ではなく、脳形態上はむしろ回復するが、神経幹細胞を移植するとさらに回復が進むことを示している。このことは、本神経幹細胞の移植が脳梗塞後の神経再生を促進することを示している。【０１２４】
〔実施例６：分化誘導因子の発見とこれを用いた骨髄由来神経幹細胞の調製〕
ＣＩＮＣ−１が神経幹細胞への分化誘導因子である可能性が考えられたので、以下の実験によりＣＩＮＣ−１が骨髄細胞分化に及ぼす影響を検討した。【０１２５】
脳梗塞を起こしていない偽手術Ｃ．Ｂ１７マウス骨髄にＣＩＮＣ−１（１０-5Ｍ：ペプチド研究所）とＦＫ５０６（０．１μｇ／ｍｌ）を添加して培養した。すると培養５日目以内にすでに多くの細胞塊が形成された（図２２Ａ・Ｂ）。これらはまだ細胞密度が低い細胞凝集塊であり、ニューロスフェアとは異なっていたが、培養７日目以降になると、ニューロスフェア様細胞塊が形成された（図２２Ｃ・Ｄ）。【０１２６】
また、ＦＫ５０６の影響を検討した結果、ＣＩＮＣ−１（１０-5Ｍ）とＦＫ５０６（０．１μｇ／ｍｌ）を添加して培養した場合には、上述のように、培養７日目以降にニューロスフェア様細胞塊が形成された（図２３Ａ）のに対して、ＣＩＮＣ−１（１０-5Ｍ）のみを添加し、ＦＫ５０６を添加しない場合は、細胞塊は形成されるが、殆どが排除されてしまうか、あるいは細胞塊の状態で止まっており（図２３Ｂ）、ニューロスフェア形成は認められなかった。【０１２７】
以上の結果は、脳虚血刺激で産生亢進し、ＮＫ細胞でも作られるＣＩＮＣ−１が骨髄細胞の神経幹細胞への分化誘導因子のひとつであることを示すと同時に、Ｔ細胞機能の抑制もその形成維持には重要であることを示している。【０１２８】
〔実施例７：神経幹細胞の形成における免疫抑制の重要性と免疫抑制物質の神経再生治療への応用〕
これまでの実験結果から、in vitroにおいて、またin vivoにおいても、骨髄由来神経幹細胞の形成を維持・促進し、神経再生治療を実現するためには、免疫機能を抑制すること、特にＴ細胞機能を抑制することが重要であると考えられた。このことをさらに確かめるため、以下の実験を行った。【０１２９】
［7-1］ＦＫ５０６以外の免疫抑制剤を用いたニューロスフェアの形成
Ｃ．Ｂ１７マウスにＦＫ５０６（tacrolimus hydrate: 1.0 mg/kg/day）あるいはＦＫ５０６と同じくＴ細胞機能を抑制する免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ: 10mg/kg/day）を３日間連日腹腔内投与し、左中大脳動脈閉塞による脳梗塞を作成した（３匹ずつ）。その後もＦＫ５０６（1.0 mg/kg）あるいはＣｓＡ（10mg/kg/day）投与を継続し、脳梗塞後７日目に骨髄と脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）を採取してＤＭＥＭとＮ−２の基本培養液内（２５０μｌ）で単細胞になるまでピペッティングし、１０ｍｌの培養液を加えて６００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を３ｍｌの培養液にて再浮遊させ、ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）存在下にlow cell bindingプレート上で１０−２８日間培養を行った。７日目以降にはＦＫ５０６とＣｓＡ投与群の骨髄（ＢＭ）と脳梗塞下組織からニューロスフェア様細胞塊が細胞顕微鏡下で観察された。一方、生理食塩水（saline）を１０日間連日腹腔内投与しただけの培養骨髄からはニューロスフェア様細胞塊はほとんど形成されなかった。浮遊しているニューロスフェア様細胞塊を採取してhigh bindingプレート上でさらに培養した。７日後に分化した細胞をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定し、nestin陽性のニューロスフェア数を計測したところ、ＦＫ５０６およびＣｓＡ投与群ではコントロールに比し、有意にnestin陽性ニューロスフェアが多かった（図２４）。
以上のことより、Ｔ細胞機能を抑制する免疫抑制剤を投与することで脳梗塞後に骨髄で神経再生が生じ、アポトーシスによる細胞死を回避して、脳梗塞部位に移行生着し、そこで分化して神経になることが示唆された。【０１３０】
［7-2］Ｔ細胞機能欠如マウス（ヌードマウス）のニューロスフェア形成
無胸腺マウスであるヌードマウス（BALB/cAJcl-nu）とその母系マウス（コントロール）の左中大脳動脈閉塞による脳梗塞作成後、７日目に骨髄細胞と脳梗塞下組織（脳梗塞瘢痕部位）を採取、培養して神経幹細胞塊（ニューロスフェア）を作成した。すなわち、マウスをクリーンベンチ内で断頭し、大腿骨から骨髄細胞を、脳梗塞瘢痕部より細胞を採取した。その後、ＤＭＥＭとＮ−２の基本培養液内（２５０μｌ）で単細胞になるまでピペッティングし、１０ｍｌの培養液を加えて６００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を３ｍｌの培養液にて再浮遊させ、ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）存在下にlow cell bindingプレート上で１０−２８日間培養を行った。７日目以降にはニューロスフェア様細胞塊が細胞顕微鏡下で観察されたが、Ｔ細胞が正常なコントロールマウスの培養骨髄と脳梗塞瘢痕部からはニューロスフェア様細胞塊はほとんど形成されなかった。浮遊しているニューロスフェア様細胞塊を採取してhigh bindingプレート上でさらに培養した。７日後に分化した細胞をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定し、nestin陽性のニューロスフェア数を計測したところ、ヌードマウスではコントロールに比し、有意にnestin陽性ニューロスフェアが多かった（図２５）。
以上のことより、Ｔ細胞の存在がなければ、脳梗塞後に骨髄で神経再生が生じ、アポトーシスによる細胞死を回避して、脳梗塞部位に移行生着し、そこで分化して神経になることが示唆された。【０１３１】
本実施例の結果から、Ｔ細胞が骨髄あるいは脳梗塞瘢痕部におけるニューロスフェア形成に抑制的機能を果たしていること、換言すれば、ニューロスフェアの形成を維持・促進するためにはＴ細胞機能を抑制することが重要であることが示された。すなわち、in vivoでのＦＫ５０６やＣｓＡなどの免疫抑制剤の効果、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウスの効果などは、免疫抑制が神経幹細胞作成に重要であることを示すものであると同時に、in vivoで免疫抑制が脳梗塞治療効果に結びつくことを明らかとしている点で、免疫抑制物質が脳梗塞治療など神経再生治療に有効であることを示すものといえる。【０１３２】
〔実施例８：新たな分化誘導因子の発見と本スクリーニングの有効性〕
実施例６で分化誘導因子のひとつとして見出されたＣＩＮＣ−１は、ケモカインに分類されるサイトカインであるが、分化誘導因子として作用する分子が他のサイトカインにも存在する可能性が考えられたので、前記と同様の培養系を用いたスクリーニングによって他の分化誘導因子を探索した結果、以下のように、サイトカインのＴＮＦαが、骨髄細胞から神経幹細胞への分化誘導作用を有することを見出した。【０１３３】
脳梗塞を起こしていない偽手術ＳＣＩＤマウス骨髄にＣＩＮＣ−１（10-5Ｍ）を添加、あるいはＴＮＦα(0.1 ng/ml)を添加して培養した。ＣＩＮＣ−１、ＴＮＦαを添加すると培養5日目以内にすでに細胞塊が形成され７日目以降にはニューロスフェア様細胞塊が形成されたが、これらを添加していないもの（saline添加）はほとんど細胞塊形成がみられなかった。浮遊しているニューロスフェア様細胞塊を採取してhigh bindingプレート上でさらに培養した。７日後に分化した細胞をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定し、nestin陽性のニューロスフェア数を計測したところ、ＣＩＮＣ−１のみならずＴＮＦα添加群でもコントロールに比し、有意にnestin陽性ニューロスフェアが多かった（図２６）。【０１３４】
以上のことから、ＴＮＦαで骨髄が刺激されると、骨髄で神経再生が生じることが示され、ＴＮＦαも骨髄細胞から神経幹細胞への分化誘導因子のひとつであること、および、神経幹細胞培養系を用いた本スクリーニング法が、神経幹細胞の誘導物質のスクリーニング、さらには当該物質を用いた神経再生治療剤の開発に有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
以上のように、本発明は、骨髄から簡易かつ短期間に神経幹細胞を調製する方法等を提供するものであり、細胞移植による脳梗塞発症後の速やかな脳機能の回復、脳梗塞以外の脳血管障害、神経変性疾患に対する神経再生治療、またはそのための治療法開発など神経再生医療の分野において広く利用可能性を有し、再生医療などに取り組む各種の医療関連産業において有用である。
【図２】
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【図４】
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【図８】
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【図１２】
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【図１５】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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