(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２１２−３０８の位置から３７３４の位置までの配列番号１の断片の塩基配列からなるＤＮＡであって、トランスガラクトシラーゼ活性を有する酵素をコードする、ＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡにおいて１又は数個のヌクレオチド置換、付加、または欠失を含み、かつ、トランスガラクトシラーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを調製するための、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの使用。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のＤＮＡによってコードされる酵素。
【請求項５】
１−３３の位置から１１７４の位置までの配列番号２の断片のアミノ酸配列からなる、トランスガラクトシル化酵素であって、下記の特徴：
ａ）１００g/Lラクトースの溶液中、３７℃におけるトランスガラクトシル化活性のβ-ガラクトシダーゼ活性に対する比が、少なくとも１：１である、
ｂ）１００g/Lラクトースの溶液を用いる、３７℃でのバッチ反応において、少なくとも２５％のガラクト-オリゴ糖の産生を触媒する、
ｃ）１００g/Lラクトースの溶液を用いる、３７℃でのバッチ反応において、ガラクト-オリゴ糖の産生を触媒し、ここでガラクト-オリゴ糖の濃度が最高である反応時には、ラクトース由来のガラクトースの１５％未満が遊離形態で存在する、
の１つ以上を有する、酵素。
【請求項６】
請求項５に記載の酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１、２、又は６に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、または真菌細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、Bifidobacterium、Lactococcus、Lactobacillus、Streptococcus、 Leuconostoc、Escherichia、Bacillus、Streptomyces、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torula、Torulopsis、及びAspergillusからなる群より選択される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium bifidum、及びLactococcus lactisからなる群より選択される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、食事サプリメント、及び共生適合性製品からなる群から選択される製品の製造のための、請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項１３】
請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の細胞を含む乳製品。
【請求項１４】
請求項４又は５に記載のトランスガラクトシル化酵素または請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の細胞の、ガラクトオリゴ糖の製造のための使用。
【請求項１５】
請求項４又は５に記載のトランスガラクトシル化酵素または請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の細胞の、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、食事サプリメント、及び共生適合性製品からなる群から選択される製品の一部としてガラクトオリゴ糖を製造するための使用。
【請求項１６】
請求項４又は５に記載のトランスガラクトシル化酵素または請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の細胞の、ガラクトオリゴ糖を製造してBifidobacteriumの増殖を促進するための使用。
【請求項１７】
請求項４又は５に記載のトランスガラクトシル化酵素または請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の細胞の、ガラクトオリゴ糖を製造して混合培地発酵におけるBifidobacteriumの増殖を促進するための使用。
【請求項１８】
請求項４又は５に記載のトランスガラクトシル化酵素の製造方法であって、前記酵素を発現させる条件下で、適当な培地中において請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程、及び前記培地から生成した酵素を回収する工程を含む方法。
【請求項１９】
請求項４又は５に記載の酵素または請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の細胞を、ラクトースの溶液と接触させる工程を含む、ガラクト-オリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵乳製品の改善に関する。特に本発明は、トランスガラクトシル化活性を有するβ-ガラクトシダーゼに関する。とりわけ、本発明は、Bifidobacterium bifidumから単離されたβ-ガラクトシダーゼに関し、ここではタンパク質のＣ末端が欠失しており、生じた切り詰め酵素は加水分解酵素活性よりも高いトランスガラクトシル化活性を有している。ラクトースが基質として用いられる場合は、ガラクトオリゴ糖がトランスガラクトシラーゼ活性の生成物である。ガラクトオリゴ糖は、乳業における多数の応用において利用しうる、健康増進性Bifidobacteriumの成長を促進する。
【０００２】
【従来の技術】
Bifidobacterium属は、様々な乳製品の発酵のために、乳業において最も一般的に使用されるタイプの細菌培養菌である。Bifidobacterium含有生成物の摂取は、更に健康増進効果を有する。この効果は、腸内容物の低いｐＨによって達成されるのみならず、その腸微生物叢が例えば抗生物質の摂取によって乱された個体において、腸内微生物叢を再生させるBifidobacteriumの性能によっても達成される。Bifidobacteriumはさらに、有害でありうる腸内微生物を打ち負かす（outcompeting）可能性を有する。
【０００３】
ガラクトオリゴ糖は、Bifidobacteriumの成長を促進することが知られている。この効果はおそらく、ガラクトオリゴ糖を炭素源として利用するBifidobacteriumの独自の能力によって達成される。ガラクトオリゴ糖の食事サプリメントは、更に、多くの長期的疾患保護効果を有すると考えられている。例えば、ガラクトオリゴ糖摂取は、ラットにおける直腸結腸癌の発生に対する保護性が高いことが示されている（Wijnands, et al., 1999）。したがって、食事サプリメント及び乳製品の改善のための該産業における使用のための、ガラクトオリゴ糖の安価且つ有効な製造方法を開発することには、多大な興味が寄せられている。
【０００４】
酵素β-ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）は、通常はラクトースを単糖類Ｄ-グルコース及びＤ-ガラクトースに加水分解する。β-ガラクトシダーゼ類の正常な酵素反応においては、前記酵素はラクトースを加水分解し、ガラクトース単糖を一時的にガラクトース−酵素錯体中に結合させるが、該錯体はガラクトースを水のヒドロキシル基に移動させ、結果としてＤ-ガラクトース及びＤ-グルコースが遊離する。しかしながら、高いラクトース濃度においては、β-ガラクトシダーゼのなかには、トランスガラクトシル化と呼称される行程においてガラクトースをＤ-ガラクトースまたはＤ-グルコースのヒドロキシル基に移動させることのできるものがあり、これによればガラクトオリゴ糖が産生する。
【０００５】
トランスガラクトシル化を行うことのできる酵素は、細菌及び酵母を含む、広範な微生物から単離されている。ガラクトオリゴ糖が健康増進性Bifidobacteriumの成長を増進することが観察されたため、Bifidobacterium及びこれらのβ-ガラクトシダーゼ酵素類についての研究が活気付いてきた。B. breve及びB. longum  β-ガラクトシダーゼの２つのＤＮＡ配列が、Genebankに寄託されている（それぞれ受託番号Ｅ５０４０及びＡＪ２４２５９６）。Dumortierら（1994）は、B. bifidum DSM20215が３つのβ-ガラクトシダーゼ類を含み、これらの酵素の１つがトランスガラクトシル化特性を有する旨を報告している。しかしながら、この活性を有する酵素、または前記酵素の如何なる配列、またはB. bifidum DSM20215由来の対応する遺伝子のアイデンティフィケーションは、全く公開されていない。
【０００６】
β-ガラクトシダーゼ類の使用によるガラクトオリゴ糖の製造は、数本の論文において報告されている。例えば、E. Coli由来のβ-ガラクトシダーゼは、高ラクトース濃度（０．５Mまたはおよそ２０％のラクトース；Huber et al. 1976）にてオリゴ糖を産生することが示されている。多様な好熱微生物が、高温及び高ラクトース濃度にてオリゴ糖を産生することが示されており、例えばSterigmatomyces elviaeは６０℃にて２０％ラクトースから３９％のオリゴ糖を産生可能であり（Onishi & Tanaka, 1995）、Saccharopolyspora rectivirgulaは７０℃にて１．７５Mラクトース中において４１％のオリゴ糖を合成可能である（Nako et al., 1994）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述の酵素はいずれも、著しいトランスガラクトシラーゼ活性を示すためには高温または高ラクトース濃度を、あるいは両方を必要とするという欠点を有する。したがって、当該産業における使用のための、ガラクトオリゴ糖のより安価且つより有効な製造方法の開発が必要とされている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Bifidobacterium bifidum由来の新規なβ-ガラクトシダーゼを開示する。驚くべきことに、該酵素の切り詰めバージョンが高いトランスガラクトシル化活性を有することが示された。切り詰め酵素、または組換え切り詰め酵素を発現する宿主細胞を適当な条件下でラクトースと共にインキュベートした場合、ガラクトオリゴ糖が高効率で産生する。乳製品または他の食料品中におけるガラクトオリゴ糖の存在は、前記食品中または該食品摂取後の消費者の腸内微生物叢中、あるいはこれら両方における健康増進性Bifidobacteriumの成長を改善するという利点を有する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の態様は、単離され、特徴付けされたBifidobacterium bifidum由来の新規なβ-ガラクトシダーゼ、ＯＬＧＡ５（配列番号１及び配列番号２）である。E. Coli細胞は、B. bifidum由来のPstＩ消化された染色体ＤＮＡからなる挿入物を含むプラスミドを用いて形質転換した。β-ガラクトシダーゼ活性を有するクローンを、発色性β-ガラクトシダーゼ基質を含むプレート上で選択した。正のコロニーの１つがおよそ２０kbの挿入物を有するプラスミド、ｐＯＬＧＡ５（配列番号１）を含んでいた。ＤＮＡ配列のシークエンシングにより、ＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼ（配列番号２）の演繹的アミノ酸配列は、現在知られているβ-ガラクトシダーゼ類のおよそ２倍長いことが明らかになり、さらに既知のβ-ガラクトシダーゼ類との配列相同性の程度が驚くほど低いことが示される。E. Coliにおける組換えＯＬＧＡ５の発現は、酵素が、ラクトース加水分解活性に加えて、トランスガラクトシル化活性も示すことを明らかにした。ＯＬＧＡ５酵素のＣ末端部分は、既知のβ-ガラクトシダーゼとは全く相同性を示さなかった。引き続きＯＬＧＡ５の様々なＣ末端欠失ミュータントを構成し、生成した酵素を、加水分解活性及びトランスガラクトシル化活性について調査した。
【００１０】
本発明の第二の態様は、ＯＬＧＡ５の欠失ミュータント、例えばＯＬＧＡ３４７である。幾つかのＣ末端欠失ミュータントの中で、５７８アミノ酸Ｃ末端欠失を有するＯＬＧＡ３４７が、ラクトースと共にインキュベートした場合に、比較的に低いラクトース濃度においてさえも、産生するオリゴ糖のレベルに最も著しい増加を示した。該酵素は、実際上全てのガラクトース分子をガラクトース又はグルコース上に転移させたようである。ＯＬＧＡ５のＣ末端の欠失のゆえに、前記酵素は、加水分解性ＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼからトランスガラクトシル化ＯＬＧＡ３４７-トランスガラクトシダーゼに変換した。天然のＯＬＧＡ５酵素を含む、他のトランスガラクトシル化β-ガラクトシダーゼとは異なり、切り詰めβ-ガラクトシダーゼＯＬＧＡ３４７は、ガラクトースを、試験したラクトース濃度全てにおいて高頻度で受容体糖分子上に転移させる。
【００１１】
１つの実施態様において、ＯＬＧＡ５、ＯＬＧＡ３４２、ＯＬＧＡ３４５、ＯＬＧＡ３４７、ＯＬＧＡ３４４、または他のあらゆるＯＬＧＡ５変異体をコードする挿入物を有する発現ベクターが使用される。この発現ベクターは、Bifidobacterium、Lactococcus、Lactobacillus、Streptococcus、Leuconostoc、Escherichia、Bacillus、Streptomyces、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torula、Torulopsis、及びAspergillusを含む群より選択される宿主細胞に形質転換可能である。Bifidobacterium属の細胞は、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium bifidum、及びLactococcus lactisからなる群より選択される。その後前記細胞は、ＯＬＧＡ５またはＯＬＧＡ３４７変異体を発現させるような条件下において適当な培地中で培養され、その後生成する酵素は前記培地より回収される。
【００１２】
本発明の別の実施態様においては、ＯＬＧＡ変異体は、発現ベクターの一部であるが、これは上述の宿主細胞のいずれにも形質転換することができる。該細胞は、その後、ＯＬＧＡ５変異体を発現させるような条件下において適当な培地中で培養され、その後生成する酵素は前記培地より回収される。該ＯＬＧＡ５変異体は、いかなるランダムミューテーションまたは従来の分子生物学的技術によって発生するいかなるミューテーションを含んでいても良い。ミューテーションした、またはワイルドタイプのＯＬＧＡ５ＤＮＡ分子のいかなる断片も、発現ベクターに挿入することができる。前記断片は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって、または配列中に存在するあらゆる制限部位を利用して、あるいは両方の組み合わせによって、発生させることができる。ＯＬＧＡ５変異体を発生させるための処理操作は、当業者には良く知られている。よって、本発明にとっては、どの方法で変異体を得るかは重要ではない。本願において開示される変異体は、配列中に存在する制限部位の使用によるサブクローニングによって得られる。
【００１３】
本発明の別の態様は、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、食事サプリメント、及び共生適合性製品からなる群から選択される製品の製造のための、上述の細胞タイプの１つ以上の使用に関する。この態様においては、Bifidobacteriumの成長改善の技術的効果が、工業製品の品質の改善のために使用される。ガラクトオリゴ糖の添加により、健康増進性Bifidobacteriumの成長を促進する。したがって、ＯＬＧＡ３４７によって生産されるガラクトオリゴ糖は、オリゴ糖の製造のために天然のβ-ガラクトシダーゼ類を使用することに比べて、ずっと安価で且つ容易に得られる。
【００１４】
本発明の更に別の態様は、オリゴ糖の製造のための、ＯＬＧＡ５、ＯＬＧＡ３４２、ＯＬＧＡ３４５、ＯＬＧＡ３４７、ＯＬＧＡ３４４、または別のあらゆるＯＬＧＡ５変異体の使用、または上述のあらゆる細胞タイプの１つ以上の使用に関する。該オリゴ糖は、以下に限定されるものではないが、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、ラクトスクロース、キシロオリゴ糖を含む。
【００１５】
本発明の１つの実施態様においては、前記オリゴ糖は、例えばラクツロース、トレハロース、ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトース、またはセロビオースなどの二糖基質を含む培地中において、ＯＬＧＡ５変異体を発現する細胞をインキュベートすることによって製造される。前記インキュベートは、オリゴ糖が産生する条件下でにおいて行われる。前記細胞は、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、食事サプリメント、及び共生適合性製品からなる群より選択される製品の一部であって良い。あるいはまた、前記オリゴ糖を回収し、続いて興味ある製品にその製造の前または後に添加することができる。オリゴ糖の添加は、Bifidobacterium単独の、または混合培地中におけるBifidobacteriumの、成長を促進する。
【００１６】
別の実施態様においては、オリゴ糖は、例えばラクツロース、トレハロース、ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトース、またはセロビオースなどの二糖基質を含む培地中において、ＯＬＧＡ５変異体をインキュベートすることによって製造される。前記インキュベートはオリゴ糖が産生する条件下でにおいて行われる。ＯＬＧＡ５変異体及びラクトースを含む培地は、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、食事サプリメント、及び共生適合性製品からなる群より選択される製品の一部であって良い。あるいはまた、オリゴ糖を回収し、続いて興味ある製品にその製造の前または後に添加することができる。オリゴ糖の添加は、Bifidobacterium単独の、または混合培地中におけるBifidobacteriumの、成長を促進する。
【００１７】
（定義）
「β-ガラクトシダーゼまたはその断片」。β-ガラクトシダーゼは、ラクトースを単糖類Ｄ-グルコースとＤ-ガラクトースとに加水分解することのできる酵素として定義される。β-ガラクトシダーゼの断片は、５−９８％、好ましくは４０−９５％、最も好ましくは５５−７５％のタンパク質を含み、欠失は好ましくはＣ末端に関する。
【００１８】
「宿主細胞」は、真菌、酵母、及び原核生物からなる群より選択される。前記微生物は、より好ましくは原核生物であり、最も好ましくはBifidobacterium属またはE. Coli種の細菌である。
【００１９】
「オリゴ糖」は、少なくとも３つの糖分子からなるオリゴ糖を意味する。オリゴ糖の例は、以下に限定されるものではないが、ガラクトオリゴ糖である。オリゴ糖の糖残基間の結合には、以下に限定されるものではないが、１−４及び１−６結合が含まれる。
【００２０】
β-ガラクトシダーゼのラクトースとのインキュベートは、０．５−６０％のラクトース、好ましくは２−３０％のラクトース、最も好ましくは２−１５％のラクトースの存在下において起こる。
【００２１】
β-ガラクトシダーゼのラクトースとのインキュベートの条件は、５乃至７５℃、好ましくは１５−４５℃、最も好ましくは３７℃の温度でインキュベートを行うことによって定義される。インキュベートに必要な時間は、１−５０時間、好ましくは５−４０時間、最も好ましくは１５−２５時間である。
【００２２】
「適合性製品」には、食品、飲料、錠剤、及び粉末などの摂取を企図する製品が含まれる。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）
B. bifidumからのトランスガラクトシル化β-ガラクトシダーゼの単離及び特徴付け。B. bifidum DSM 20215由来のPstＩ消化染色体ＤＮＡを、標準操作を用いてｐＫＳプラスミド（Stratagene）にライゲートした。ライゲーション混合物を、LacZ及びβ-ガラクトシダーゼ中においてE. Coli株ＭＴ１０２欠損中に形質転換した。β-ガラクトシダーゼ産生クローンが、発色性β-ガラクトシダーゼ基質Ｘ-galを含むプレート上において青色コロニーとして同定された。
【００２４】
青色コロニーの１つは、およそ２０kbの挿入物を有するプラスミド、ｐＯＬＧＡ５を含んでいた。前記挿入物を、さらにサブクローニングし、部分的に配列決定し、推定されるβ-ガラクトシダーゼ（ＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼ）をコードするオープンリーディングフレームを同定した（図１）。ＢＬＡＳＴ探索により、ＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼは、Streptomyces coelicolorβ-ガラクトシダーゼ（ＡＬ１３３１７１）及びThermoanaerobacterethamolicus（ＹＯ８５５７）との相同性が、それぞれ３８％及び３０％の同一性をもって、最も高度であることを示した。図３には、ＯＬＧＡ５及び関連するアミノ酸配列の「同一性樹形図」が示される。
【００２５】
ＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼのアミノ酸配列の詳細な分析により、該酵素がそのＮ末端に推定されるシグナル配列を含むこと及び、該オープンリーディングフレームが、現在知られているあらゆるβ-ガラクトシダーゼのおよそ２倍大きな、１８５ｋＤａのポリペプチドをコードすることが明らかになった。E. Coli中において製造された組換えＯＬＧＡ５酵素を精製し、Ｎ末端アミノ酸配列決定により、シグナル配列がE. Coli中における発現の間に開裂したことを確認した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、ＯＬＧＡ５ポリペプチドの分子量を確認した。
【００２６】
ｐＯＬＧＡ５を含む組換えE. Coli ＭＴ１０２の細胞抽出物を調製し、トランスガラクトシル化活性について分析した。図４は、ＯＬＧＡ５が、ラクトース加水分解活性に加えてトランスガラクトシル化活性を呈したことを示す。
【００２７】
（実施例２）
高度なトランスガラクトシラーゼ活性を有する切り詰めＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼの構成。他のβ-ガラクトシダーゼに相同のＯＬＧＡ５の領域を、タンパク質のＮ末端に位置する。Ｃ末端半分は、いかなる既知のβ-ガラクトシダーゼにも相同性を示さなかった。しかしながら、シアリダーゼ様ガラクトース結合領域が、Ｃ末端部分中に観察された。該ＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼのこのＣ末端部分の役割を、切り詰め欠失ミュータントの構成によって調査した。生成する組換えβ-ガラクトシダーゼの加水分解活性及びトランスガラクトシル化活性を分析した。図５は、ＯＬＧＡ５酵素のほぼ３分の一を欠失させて、依然加水分解活性を維持できることを示す。
【００２８】
トランスガラクトシル化活性を分析したところ、プラスミドｐＯＬＧＡ５、ｐＯＬＧＡ３４２、及びｐＯＬＧＡ３４５を含むE. Coliからの抽出物を用いても同様の結果が得られた。しかしながら、ｐＯＬＧＡ３４７を有する細胞の抽出物は、産生したオリゴ糖のレベルが増加し、ガラクトースがほとんど無いことを示した。図５に示されるように、切り詰めＯＬＧＡ３４７  β-ガラクトシダーゼを含む抽出物は、確かにラクトースを加水分解したが、ガラクトースを水中のヒドロキシル基上に移動させる変わりに、前記酵素は実際上全てのガラクトース分子をガラクトースまたはグルコース上に移動させた（またはグリセリン上に移動させた；ＴＬＣ上でグルコースよりも僅かに遅く移動するスポットは、ＮＭＲによりガラクト-グリセリンと判明した−データ表示無し）。結論として、ＯＬＧＡ３４７は、真の「トランスガラクトシラーゼ」である。
【００２９】
（実施例３）
ＯＬＧＡ３４７のトランスガラクトシル化活性の特徴付け。ＯＬＧＡ３４７  β-ガラクトシダーゼのトランスガラクトシル化活性を定量するために２つの方法を用いた：放射性標識ラクトースを含む反応混合物のＴＬＣ分析、及び未標識ラクトースの酵素変換後のＨＰＬＣ分析。
【００３０】
放射能を用いる実験を、グルコースのＣ−１位置に14Ｃ標識を含むラクトースを用いて行った。前記標識が該二糖のグルコース部分にあるため、グルコースを含む反応生成物のみが欠失した。図７には、１５％ラクトース及び様々な量のＯＬＧＡ３４７酵素を用いたトランスガラクトシル化実験の結果が示される。ＴＬＣによる反応混合物の分離後、該プレートをスキャンして放射性スポットをホスホイメージャーで計量した。低酵素濃度（抽出物０乃至０．２μl）では、グルコースレベルとオリゴ糖レベルとがほぼ同一であり、全てのグルコース分子がトランスガラクトシル化反応において基質として利用されたことを示している。「遊離の」加水分解グルコースは、高酵素濃度においてのみ現れた。
【００３１】
未標識ラクトースを用いた実験では、様々な基質及び酵素濃度を試験した。図８には、酵素反応における基質として１０％、２０％、及び４０％のラクトースを、様々な濃度のＯＬＧＡ３４７酵素と共に使用した実験が示される。反応混合物をＨＰＬＣで分析し、ラクトース、グルコース、ガラクトース、及びガラクト-オリゴ糖の濃度を算出した。図８には、酵素濃度の増加につれてラクトース濃度は低下し、グルコース濃度は増加するが実際上「遊離の」ガラクトースは全く生産されないことが示され、これはラクトース中のほぼ全てのガラクトース分子が別の糖に転移していることを示す。低酵素濃度での反応において測定された炭水化物濃度の計算により、グルコースとガラクトースとの間の比率がおよそ０．１であることが示されたが、これは、遊離のガラクトースとグルコースとに加水分解された全てのラクトース分子について、トランスガラクトシル化において９つのラクトース分子が使用されたことを意味する。図８に見られるように、トランスガラクトシル化反応は、１０乃至４０％ラクトースの範囲において、ラクトース濃度に依存しない。１０％、２０％または４０％ラクトースを基質として用いたトランスガラクトシル化反応において産生した、ガラクト-オリゴ糖の最大収量は、それぞれ３９％、４４％、及び３７％であった（添加したラクトース１mgあたりに産生したオリゴ糖（mg）。）
【００３２】
【参考文献】
0005042431.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＯＬＧＡ５配列である。Bifidobacterium bifidum由来のＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼのＤＮＡ及びタンパク質配列。シグナル配列は太字で示され、ＯＬＧＡ３４７において欠失したＯＬＧＡ５遺伝子の一部はイタリック体で示される。欠失を起こすために使用されたBglII部位には、ハイライトがかかっている。
【図２】  図２は、β-ガラクトシダーゼ活性部位領域の比較を示す。E. Coli由来の触媒Glu461残基（ハイライトがかかっている）の周囲の領域の整列。該配列は、これらのデータベース受託番号によって同定される。６-ホスホ-β-ガラクトシダーゼ配列には、（Ｐ）印が付けてある。
【図３】  図３は、図１の直線の近隣連結分析を示すが、ここではSulfolubus配列を外群として使用した。ブートストラップ分析（ｎ＝１００）の結果を、８０より大きな値の接合部について示す。
【図４】  図４は、ＯＬＧＡ５トランスガラクトシラーゼ活性を示す。プラスミド中のＯＬＧＡ５遺伝子を有するE. Coli細胞の全細胞溶解産物を、０．４Mのラクトースと共に３７℃において２０時間に亘りインキュベートした。５０μlの全反応体積には、全細胞溶解産物の表示量が含まれていた。反応試料を、シリカゲルＴＬＣプレート上で分析した。前記プレートに、オルシノール試薬をスプレーして糖類を画像化した。
【図５】  図５は、ＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼのＣ末端欠失を示す図である。１７５２アミノ酸オープンリーディングフレームは、ＯＬＧＡ５  β-ガラクトシダーゼをコードするが、ここでは開始３２アミノ酸がおそらくシグナルペプチド（白四角）を表す。ＯＬＧＡ５の欠失ミュータントを、指示された制限部位を使用して構成した。一晩成長させた細菌培養物から調製した溶解産物を、β-ガラクトシダーゼ活性の測定のために使用し、相対結果をそれぞれの構成物の右に示した。使用した制限酵素の記号：BglＩＩ（Ｂ）、EcoＲＩ（Ｅ）、EcoＲＶ（Ｖ）、HindＩＩＩ（Ｈ）、KpnＩ（Ｋ）、NruＩ（Ｎ）、PstＩ（Ｐ）。
【図６】  図６は、トランスガラクトシラーゼ活性のＴＬＣ分析を示す。試験した２つの欠失ミュータント、ＯＬＧＡ３４７及びＯＬＧＡ３４５についての全細胞溶解産物を、指示量で使用し、５０μlの全体積中において０．４Mのラクトースと反応させた。反応物を３７℃にて２０時間に亘ってインキュベートした。試料を、シリカゲルＴＬＣプレート上で分析した。前記プレートには、オルシノール試薬をスプレーして糖類を画像化した。
【図７】  図７は、ＯＬＧＡ３４７によって産生されるオリゴ糖を示す。指示量のＯＬＧＡ３４７全細胞溶解物を、１５％のラクトースと共にμlの全体積中において、２１時間に亘り３７℃にてインキュベートした。グルコースＣ−１位において14Ｃで標識した放射性ラクトースを使用した。試料をＴＬＣプレート上で分離させ、ホスホイメージャーを使用して計量した。Ａ：ラクトース、グルコース、及びガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）スポットからの14Ｃシグナルの測定に使用した画像。Ｂ：バックグラウンド（計器レーン）を差し引いた後の14Ｃ測定シグナル。
【図８】  図８は、ＯＬＧＡ３４７酵素反応性生物のＨＰＬＣ測定を示す。１０％、２０％、及び４０％のラクトース中における反応を、指示量のＯＬＧＡ３４７全細胞溶解物を使用して行った。２００μlの全体積を使用し、反応物を３７℃にて２０時間に亘ってインキュベートした。希釈した試料を、ＨＰＬＣ分析にかけ、標準曲線を使用して、観察されたピーク領域を濃度（mg/ml）に変換した。Ａ：１０％ラクトースを用いたＯＬＧＡ３４７反応後に得られた糖（mg/ml）。Ｂ：２０％ラクトースを用いたＯＬＧＡ３４７反応後に得られた糖（mg/ml）。Ｃ：４０％ラクトースを用いたＯＬＧＡ３４７反応後に得られた糖（mg/ml）。Ｄ：１０％反応から得られた結果のプロットである。ガラクトオリゴ糖の生成量は、グルコースまたはガラクトースとして回収されなかったラクトースの量として算出される（「ＧＯＳ」）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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