(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類被験体の一領域中の有核細胞における細胞死をin  vivoで撮像する方法であって、
（ａ）前記被験体に、生体適合性のある放射性核種で標識したアネキシンを投与するステップと、
（ｂ）前記被験体を放射線検出装置の検出界内に配置するステップと、
（ｃ）前記放射線検出装置により、被験体内に局在化した前記放射性核種から出た放射線を測定することで、放射線の画像を構成するステップと
を含み、前記画像が、前記哺乳類被験体の前記有核細胞における細胞死の表現である、方法。
【請求項２】
ヒト被験体の一領域中の有核細胞におけるホスファチジルセリン露出をin  vivoで撮像する方法であって、
（ａ）前記ヒト被験体に、生体適合性のある放射性核種で標識したアネキシンを投与するステップと、
（ｂ）前記ヒト被験体を放射線検出装置の検出界内に配置するステップと、
（ｃ）前記放射線検出装置により、前記ヒト被験体内に局在化した前記放射性核種から出た放射線を測定することで、放射線の画像を構成するステップと
を含み、前記画像が、前記ヒト被験体の一領域中の前記有核細胞上のホスファチジルセリン露出の表現である、方法。
【請求項３】
ヒト被験体の一領域中の有核細胞におけるホスファチジルセリン露出をin  vivoで撮像する方法であって、
（ａ）前記ヒト被験体に、生体適合性のある放射性核種で標識したアネキシンを投与するステップと、
（ｂ）前記ヒト被験体内に局在化した前記放射性核種から出た放射線を測定することで、放射線の画像を構成するステップと
を含み、前記画像が、前記ヒト被験体の一領域中の前記有核細胞上のホスファチジルセリン露出の表現である、方法。
【請求項４】
前記画像を処理することで、前記標識されたアネキシンの非特異的局在化から生じた信号を減算するステップ、をさらに含む、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記非特異的局在化が腎臓内である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記放射性核種が、ヨウ素123、ヨウ素131、ガリウム67、インジウム111、フッ素18及びテクネチウム99m（Tc99m）のうちのいずれかから選択される、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記放射性核種がテクネチウム99m（Tc99m）である、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記Tc99mがアネキシンにヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）を介して結合される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Tc99m標識付アネキシンの投与される量が、５mCiから２０mCiの間の用量になる、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記放射線検出装置がガンマ線検出装置であり、前記放射線がガンマ線である、請求項１、２又は４乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ガンマ線検出装置がガンマ・シンチレーション・カメラである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記画像を構成するための前記ガンマ線の測定が、標識されたアネキシンの投与後５分から２時間の間に行なわれる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記画像を構成するための前記ガンマ線の測定が、標識されたアネキシンの投与後１時間に行なわれる、請求項１０乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
（ｂ）及び（ｃ）のステップを選択された間隔で反復するステップをさらに含み、
但しこの場合ステップ（ｂ）は前記ヒト被験体を放射線検出装置の検出界内に配置するステップを含み、そして
ステップ（ｃ）は、前記放射線検出装置により、前記ヒト被験体内に局在化した前記放射性核種から出た放射線を測定することで、放射線の画像を構成するステップを含み、そして
前記反復するステップが、前記領域からの放射線の強度変化を経時的に追跡するのに有効である、請求項１、２又は４乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
（ｂ）及び（ｃ）のステップを選択された間隔で反復するステップをさらに含み、
但しこの場合ステップ（ｂ）は前記ヒト被験体を放射線検出装置の検出界内に配置するステップを含み、そして
ステップ（ｃ）は、前記放射線検出装置により、前記ヒト被験体内に局在化した前記放射性核種から出た放射線を測定することで、放射線の画像を構成するステップを含み、そして
前記反復するステップが、前記領域からの放射線の局在変化を経時的に追跡するのに有効である、請求項１、２又は４乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記放射線検出装置が３次元撮像カメラである、請求項１、２又は４乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記放射線検出装置が陽電子放出検出装置である、請求項１、２又は４乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記アネキシンがアネキシンＶである、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
標識されたアネキシンの投与される量が３００μgたんぱく質／kg未満である、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
標識されたアネキシンの投与される量が１μgたんぱく質／kgから10μgたんぱく質／kgの間である、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
標識されたアネキシンが静脈内（i.v.）投与される、請求項１乃至２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
標識されたアネキシンが腹腔内（i.p.）投与される、請求項１乃至２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
標識されたアネキシンが鞘内投与される、請求項１乃至２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
標識されたアネキシンが胸膜内投与される、請求項１乃至２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
標識されたアネキシンがリンパ内投与される、請求項１乃至２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
標識されたアネキシンが筋肉内投与される、請求項１乃至２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記領域が被験体全体を含む、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記領域が頭部又はその一部を含む、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記領域が心臓又はその一部を含む、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記領域が前記被験体の肝臓又はその一部分中にある、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記領域が前記被験体の腫瘍又はその一部分中にある、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記領域が前記被験体の移植体又はその一部分中にある、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記領域が前記被験体の虚血部位中又は前記虚血部位の一部分中にある、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記領域が前記被験体の臓器中又は前記臓器の一部分中にある、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記領域が前記被験体の肺中又は前記肺の一部分中にある、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記領域が前記被験体の脾臓中又は前記脾臓の一部分中にある、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記領域が前記被検体の骨髄中又は前記骨髄の一部分中にある、請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞死がアポトーシスによって引き起こされる、請求項１又は請求項４乃至１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
この研究は一部NIH助成金HL-47151による援助を受けている。従って、米国政府はこの発明に対して特定の権利を有するものである。
発明の分野
本発明は細胞死をin vivoで撮像する方法に関する。特に、ガンマ線撮像法を用いて哺乳類の細胞死領域を撮像する際に放射性標識したアネキシンを利用することに関する。
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発明の背景
アポトーシス、即ちプログラムされた細胞死は、発生及び数多くのホメオスタシス及び疾患のプロセスにおいて重要な役割を果たす（Thompson, 1995）。従って、様々な疾患に対する新しい治療戦略は、アポトーシスによる細胞死を調節することで可能となるかも知れない。アポトーシスによる細胞死を促進又は阻害しようと新規な薬理学的物質の研究がなされてきたが、in vivoで細胞死を検出及び観察するための非観血的方法がないことが障害となっている。
脂質陽子核磁気共鳴スペクトロスコピー（1H NMRS）が、アポトーシスによる細胞死の過程にあるリンパ芽球及びその他の細胞系の細胞膜で起きる特定の組成及び／又は流動性変化を検出する上で有用であることが判明している（Blankenberg, et al., 1996）。脂質1H NMRS研究アポトーシスの臨床上の利用は、現在、多くの組織及び臓器に天然に見られる複雑な局部的磁気微小環境があるために限界がある。
発明の概要
ある一つの態様では、本発明は、哺乳類被験体の一領域における細胞死（例えばアポトーシス又はネクローシスによる細胞死）をin vivoで撮像する方法を含む。本方法は、（ａ）被験体に対し、生体適合性のある放射性核種で標識したアネキシンを投与するステップと、（ｂ）前記標識されたアネキシンが被験体内で局在化できるような時間の後に、被験体を放射線検出装置の検出界に配置するステップと、（ｃ）被験体で局在化した放射性核種から放射される放射線を前記放射線検出装置で測定して、放射線画像を構成するステップとを含み、前記の画像は哺乳類被験体の前記領域における細胞死の表現である。一実施例においては、本方法は、（ｄ）前記画像を処理することで、腎臓内での非特異的局在など、標識されたアネキシンの非特異的局在から生じた信号を減算するステップをさらに含む。
本方法で有用な放射性核種には、ヨウ素123、ヨウ素131、ガリウム67、インジウム111、フッ素18及びテクネチウム99m（Tc99m）が含まれる。フッ素18は陽電子射出体であり、従って陽電子射出断層撮影法（PET）で有用であることは理解されよう。ヨウ素123、ヨウ素131、ガリウム67、インジウム111、及びテクネチウム99mは標準的なガンマ線検出に利用することができる。Tc99mが、本発明の方法で用いるのに好適な放射性核種である。ある好適な実施例では、Tc99mをヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）を介してアネキシンに結合させる。Tc99mで標識されたアネキシンは、典型的には約5から約20mCiの間の用量で投与される。
本発明のある一つの一般的実施例では、放射線検出装置はガンマ線検出装置であり、測定される放射線はガンマ線である。別の一般的実施例では、本放射線検出装置は陽電子線検出装置であり、測定される放射線は陽電子線である。
さらに別の一般的実施例では、本方法はさらに、選択された間隔で（ｂ）及び（ｃ）のステップを反復することを含むが、この反復は、細胞死していく細胞の数の変化を反映した、当該領域からの放射線（例えばガンマ線又は陽電子線）強度の経時変化を追跡する上で有用である。
さらに別の一般的実施例には、選択された間隔で（ｂ）及び（ｃ）のステップを反復することを含むが、この反復は、細胞死していく細胞の位置の変化を反映した、当該領域におけるガンマ線局在の経時変化を追跡する上で有用である。
放射線検出装置は、例えばアンガー・ガンマシンチレーション・カメラ又は3次元撮影カメラでよい。
本発明で利用するのに好適なアネキシンはアネキシンVである。これは典型的には約300μgたんぱく／kg未満の用量で投与されるが、約1から10μg／たんぱく／kgの間で投与されることが好ましい。いくつかの投与経路が可能であり、その中には静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、鞘内、及び胸膜腔内投与がある。
画像を構成するためのガンマ線の測定は、典型的には、標識されたアネキシンの投与後、約5分間から約2時間の間に行なわれる。ある一つの実施例では、画像を構成するためのガンマ線の測定は、標識されたアネキシンの投与後、約１時間の時点で行なわれる。
被験体の異なる部分をここで開示した方法を用いて撮像してもよい。例えば、当該領域には概ね被験体の全身が含まれていても、又は、例えば頭部又はその一部分、心臓又はその一部分、肝臓又はその一部分、等々、被験体の一部分が含まれていてもよい。
本発明はさらに細胞死をin vivoで撮像するキットを提供するものである。本キットは、（i）例えば材料及び方法（A）の項で説くように調製されたHYNICで標識されたアネキシンを含有する密封されたバイアルと、（ii）例えば材料及び方法（B）の項で説くように調製され、N2下で保存されたSn-トリシン溶液を含有する密封されたバイアルと、（iii）Tc-99mで標識されたアネキシンを、（i）及び（ii）の構成要素とTc-99mとを用いて作製する際の指示書と、（iv）前記Tc-99mアネキシンを細胞死の撮像区域にin vivoで投与する際の指示書とを含む。ある一つの実施例では、本キットは−70℃で保存され、氷上で運搬される。別の実施例では、HYNIC標識されたアネキシンは凍結乾燥される。
本発明のこれらの及びその他の目的及び特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読まれることで、より完全に明白となることであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、Tc99m HYNIC-アネキシンVで検出したFasの伝達する劇症肝炎のアポトーシスを示した、コンピュータで作成した画像である。
図２は、Fasの伝達する劇症肝炎のアポトーシス中のTc99m HYNIC-オボアルブミンからの信号を示した、コンピュータで作成した画像である。
発明の詳細な説明
I．定義
「細胞死を検出する」又は「細胞死を局在定位する」という文章における「細胞死」という術語は、細胞膜の一体性を失った細胞や、哺乳類の細胞が死んでいくプロセスを言う。このようなプロセスには、アポトーシスや、アポトーシスが関与していると考えられるプロセス（例えば細胞老化）、並びにネクローシスが含まれる。「細胞死」とはここでは、有核細胞（例えばニューロン、筋細胞、肝細胞、等々）の死又は切迫死や、脱核細胞（例えば赤血球、血小板、等々）の死又は切迫死を言うべく用いられている。
「生体適合性のある放射性核種」又は「生体適合性のある放射性同位元素」とは、核医学用途で患者に注射するのに有用であるとして認識された同位元素である。生体適合性のある放射性核種の例には、ヨウ素123、ヨウ素131、ガリウム67、インジウム111、フッ素18及びテクネチウム99mが含まれる。
II．細胞死−アポトーシス及びネクローシス
アポトーシスとは、細胞が「細胞の自殺」プログラムを実行する「プログラムされた細胞死」を言う。今では、アポトーシスのプログラムは事実上すべての多細胞生物や、ある特定の生物のすべての細胞で進化上保存されていると考えられている。さらに、多くの場合、アポトーシスは、健康な生存細胞では能動的に阻害されるはずの「省略時」プログラムであるかも知れないと考えられている。
ある細胞がアポトーシスを行なおうという決定を行なうには、様々な調節的刺激及び環境因子が影響を与えている（Thompson, 1995）かも知れない。アポトーシスの生理学的賦活物質には、腫瘍壊死因子（TNF）、Fasリガンド、形質転換成長因子β、神経伝達物質グルタミン酸、ドーパミン、N-メチル-D-アスパラギン酸、成長因子の消退、マトリックス付着の喪失、カルシウム及び糖質コルチコイドがある。損傷に関連したアポトーシス誘発物質には熱ショック、ウィルス感染、細菌毒素、腫瘍遺伝子myc、rel及びEIA、腫瘍抑制遺伝子p53、細胞溶解性T-細胞、オキシダント、活性酸素、及び栄養欠乏（代謝拮抗物質）がある。治療に関連したアポトーシス誘発物質には、ガンマ線、紫外線や、シスプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキセート及びビンクリスチンを含めた様々な化学療法薬がある。毒素の関連するアポトーシス誘発物質には、エタノール及びβ-アミロイドペプチドがある。
アポトーシスは、通常では再生しないような細胞、例えばニューロン、で病理学的に起きた場合に、特に破壊的な結果をもたらすことがある。このような細胞は死んでも置き替えられることがないため、これらが消失することは罹病臓器の衰弱、そして時には致命的な機能不全につながることがある。このような機能不全は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎及び小脳変性を含めた、アポトーシス増加に関連があるとされた数多くの神経変性疾患に見られる。
望ましくないアポトーシスの結果も、例えば心筋梗塞、再潅流外傷及び脳卒中の場合に典型的に起きるものなど、虚血性の外傷を含め、その他の病理でも同様に破壊的になり得る。特に、軽度の局所性虚血後に大変遅れて梗塞が起きる場合には、アポトーシスが中心的な役割をしていると考えられている（Du et al., 1996）。アポトーシスの増加に関連がある疾患は他にも以下、AIDS、再生不良性貧血などの脊髄形成異常症候群、及び、過度のアルコール摂取が原因の損傷を含めた毒素誘発性肝疾患、があるが、これらに限らない。
ネクローシスは、アポトーシス以外（例えば細胞の本来の自殺プログラム実行以外）の原因による、細胞又は組織の限局性の死である。ネクローシスは外傷性損傷、細菌感染、急性の低酸素症、等々が原因で引き起こされる場合がある。ある種の刺激はネクローシス又はアポトーシスのいずれかを、又はある程度の両方を、その損傷の重篤度に応じて引き起こすことがあるため、二つの種類の細胞死の間にいくらかの重複がある。
III．生体膜の非対称性
生体膜は特定の膜リン脂質に対して非対称であると一般に考えられている。特に、真核生物の細胞膜の外側の小葉は主に、スフィンゴミエリン及びホスファチジルコリン（PC）などのコリンリン脂質で形成されているが、内側の小葉は主にホスファチジルセリン（PS）及びホスファチジルエタノールアミン（PE）などのアミノリン脂質を含有している。この非対称性は、二重層の小葉の間でPS及びPEを選択的に輸送するアデノシン三リン酸（ATP）依存性アミノリン脂質トランスロカーゼの活性により維持されていると考えられている（Seigneuret and Devaux, 1984）。小葉間のリン脂質輸送に関与していると考えられるその他の酵素には、ATP依存性フロッパーゼ（Connor, et al., 1992）及びリピドスクランブラーゼ（Zwaal, et al., 1993）がある。
非対称性は正常細胞の役割であるように見えるが、このような非対称性の喪失は特定の生理学的、かつ病原性のプロセスに関連がある。例えば、細胞膜の外側小葉にPSが現われる（「PS露出」）こととして検出される、膜の非対称性は、DNAの断片化、細胞膜の泡状突起形成、及び膜の一体性喪失に先立つ、アポトーシスの初期の発現の一つであると認識されている（Martin, et al., 1995; Fadok, et al., 1992）。
同様の再配向が、鎌状赤血球症（Lane, et al., 1994）、β-サラセミア（Borenstain-Ben Yashar, et al., 1993）、血小板活性化、及び、PS輸送に欠陥があるいくつかの変異腫瘍細胞系で観察されている。PSが外側小葉に次第に現われることは、老化しつつある赤血球でも起きることが観察されている（Tait and Gibson, 1994）。このような細胞上でのPSの露出が閾値を超えると、この細胞はマクロファージにより血流から除去される（Pak and Fidler, 1991）。上記の状態のすべてが近接しながら最高点に達すると、罹病細胞（即ち、PS露出が著しい細胞）の死が訪れる。
PSの露出がアポトーシス及びネクローシスの両方の構成要素であることは理解されよう。アポトーシスの初期の段階におけるその役割は上に要約されている。アポトーシス中の細胞がいったんアポトーシスの最終段階に達すると（即ち膜の一体性を失うと）、細胞膜の両方の小葉のPSが細胞外ミリューに「露出」することは理解されよう。同様の状況はネクローシスによる細胞死にもあり、このとき膜の一体性の喪失は開始因子であったり、又はネクローシスによる細胞死のプロセスの初期に起きたりする。従って、このようなネクローシス中の細胞もまた、両方の細胞膜小葉が「露出」するために、PSを「露出」させているのである。
IV．アネキシン
アネキシンファミリーのたんぱく質が、本発明の実施において有用である。アネキシンVは通常、胎盤、リンパ球、単核細胞、胆管及び腎臓（髄質）の管状上皮を含む数多くの細胞の細胞質中に高レベルで見られる。アネキシンの生理学的機能は十分には解明されていないが、それが持ついくつかの性質のために、アネキシンは診断薬及び／又は治療薬として有用である。特に、アネキシンはホスファチジルセリン（PS）を表面に露出させた膜小葉など、陰イオンリン脂質表面への親和性が大変高いことが発見されている。
V．実験結果の概観
本発明を裏付けようと行なわれた実験の結果、放射性標識をつけたアネキシンの投与を利用することで、細胞死をin vivoで撮像できることが実証された。例えば、実施例１での実験では、マウスにおける精製Jo2抗体の注射に応答したFas媒介肝細胞死（Ogasawara, et al., 1993）の撮像及び定量を説く。これらの実験の結果は（例えば図１を参照されたい）、Jo2抗体注射後のFas媒介肝細胞死が特に原因で、それぞれ１及び２時間後の時点で、放射性標識したアネキシンVの肝摂取率が2倍及び4倍増加したことを示していた。脾臓摂取率も処置後間もなく一時的に2倍に増加し、その後対照値まで落ちたことも観察された。脾臓からの信号のこのような減少は、処置後のFas媒介アポトーシスの突発に応答して、血流中及び脾臓中のリンパ球に急速なクリアランスが起きたことが原因であったかも知れない。
アネキシンの結合はさらに腎臓でも観察された。しかしながら、この結合はアポトーシス誘発性刺激の不在下でも存在し、実際には肝細胞信号が増加するにつれて減少していた。抗Fas Ab投与後、同じ時間帯にに肝摂取率が増加しながらも腎活性が進行的に減少したことは、アポトーシスに関係していない腎臓のアネキシンVに対する親和性は、アポトーシス組織のそれよりも低いことを意味している。注射されたアネキシンVの腎皮質結合は、部分的に、腎管状リン脂質とのアネキシンの交差反応性によるものかも知れない。
標識されたアネキシンの腎排泄がほとんどなかったことに気付かれようが、このことは放射性標識（この場合はTc99m）が実験の間中アネキシンに結合したままであったことを示唆している。さらに、注射されたTc99m標識付アネキシンは血流から急速に浄化され、その血清半減期は約３から７分であった。これらの因子から、放射性薬剤信号の撮像を、その投与から１から２時間で行なうことができた。
上記の特徴により、連続して毎日（又は二日に一度）の撮像研究を行なうことができ、その研究のそれぞれで、放射性標識されたアネキシンVの注射時に、標的の組織又は臓器のアポトーシス活性を撮影したスナップ写真を得ることができる。
VI．in vivoにおける細胞死の撮像
ある一つの態様では、本発明は、哺乳類被験体の一領域の（例えばアポトーシス又はネクローシスが原因の）細胞死をin vivoで撮像する方法を含む。本方法においては、放射性標識したアネキシン（例えばテクネチウム99mで標識したアネキシンV）が被験体に投与される。この結合体が被験体で局在化できる時間の後に、被験体をガンマ線検出装置の検出界に配置する。テクネチウム99mからのガンマ線をこのガンマ線検出装置を用いて測定する間、被験体を概ね固定した状態に維持する。測定段階に続き、ガンマ線の画像を構成する。次に、このようにして構成された画像を用いて、この哺乳類被験体における細胞死の区域、又は分析しようとする哺乳類被験体の当該領域における細胞死区域、のマップ又は局在定位を担当医に提供する。
上述の方法を用いて得られた画像の解釈を容易にするため、画像をデジタル処理してバックグラウンド、ノイズ、及び／又は、アネキシン／Tc99m結合体の非特異的局在化（例えば腎臓への局在化）を、以下に詳述するようにフィルタ除去してもよい。
上記の方法の利点は、ガンマ線を測定し、かつ選択された間隔で画像を形成することにより、細胞死の過程にある細胞数の変化を反映した、被験体からのガンマ線の強度変化を経時的に追跡するために本発明を用いることができるという点である。さらにこのようなアプローチを用いて、細胞死の過程にある細胞の分布変化を反映した、被験体からのガンマ線の局在変化を経時的に追跡してもよい。
A．放射性標識したアネキシンの合成
本発明は精製された天然の、組換え、又は合成により調製されたアネキシンを用いて実施することができる。例えばアネキシンVはヒト胎盤から容易に精製することができる（Funakoshi, et al., 1987）。しかしながら、組換えアネキシンには、調製が容易で経済効率が良いなど、いくつかの長所がある。数多くの様々なアネキシンが、ヒト及びその他の生物からクローンされている。それらの配列は、GenBankを含めた配列データベースから入手可能である。
本発明はいくつかの理由からアネキシンVを用いて実施されることが好ましい。第一に、アネキシンVは最も豊富にあるアネキシンの一つであり、（ii）天然又は組換え源から容易に作製することができ、そして（iii）リン脂質の膜に対する親和性が高い（Tait et al., 1988）。ヒトアネキシンVの分子量は36kdであり、ホスファチジルセリン（PS）に対して高い親和性を有する（kd＝7nmol／L）。ヒトアネキシンVの配列は、GenBankから受け入れ番号U5760-U05770で得ることができる。
本発明で使用するためのアネキシンを作製するのに適した発現系の例を材料及び方法の項で述べる。これはE. coliのpET12a発現ベクタ（ウィスコンシン州マジソン、Novagen社製）を利用している。
その他の細菌発現ベクタも利用することができる。その中には、例えばプラスミドpGEX（Smith, et al., 1988）、及びその由来株（例えばニュージャージー州ピスカタウェイ、Pharmacia Biotech社製のpGEXシリーズ）がある。これらのベクタは、グルタチオン−S−トランスフェラーゼとフレーム内で融合された、クローンされたインサートのポリペプチド配列を発現するものである。組換えpGEXプラスミドを適切なE. coli株に形質転換させることができ、融合たんぱく質の生成をIPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を添加することにより誘発することができる。こうして、標準的な方法に従ったグルタチオンアガロース・アフィニティクロマトグラフィを用いて、誘発された培養株の細胞溶解産物から、可溶化した組換え融合たんぱく質を精製することができる（Ausubel, et al.）。その他の市販の発現系には、Invitrogen（カリフォルニア州サンディエゴ）社のPichia発現キットなどの酵母発現系、バキュロウィルス発現系（Reilly, et al.: Beames, et al.: カリフォルニア州パロアルト、Clontech社製）、及び哺乳類細胞発現系（カリフォルニア州パロアルト、Clontech社；メリーランド州ガイザーズバーグ、Gibco-BRL社製）がある。
発現した配列の培養媒質中への分泌を促進するリーダー配列など、数多くの特徴をこの発現ベクタ内に操作により組み込むことができる。組換えにより生成されたポリペプチドは、典型的には溶解した細胞又は培養媒質から単離される。
上述したように生成された、単離された組換えポリペプチドは、沈殿較差法、分子ふるいクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、等電点電気泳動法、ゲル電気泳動法及びアフィニティ・クロマトグラフィを含めた標準的なたんぱく質精製法により精製してよい。たんぱく質のプレパラートを、さらに、例えばろ過（マサチューセッツ州ダンバー、Amicon社）などにより濃縮することもできる。
次に、上述のように作製されたアネキシンを選択された放射性核種で標識する。選択される特定の同位元素は、請求の範囲の方法の特定の用途に応じることであろう。
本発明は、現在入手可能な様々な放射性各種のいずれを用いて実施してもよい。適した放射性核種を選択する際には、実施者は典型的には本発明の特定の用途を、一般の核画像法に共通のファクタと併せて考慮することとなろう。このようなファクタには、（i）粒子放射の最小値、（ii）約50から500kEvの間の一次光子エネルギ、（iii）投与用の材料を調製するのに必要な時間よりも長い物理的半減期、（iv）その放射性核種で標識されたアネキシンの、試験時間よりも長い実効半減期、適した化学的形状及び反応性、低毒性、及び安定性又は近安定性がある。
放射性核種の一例は、半減期が約6時間であり、アネキシンを高特異活性を持つように標識することのできるTc99mである。これは上記の基準のほとんどを満たし、また80%を超える核医学的撮像法で用いられている。利用可能なその他の同位元素には、ヨウ素123（半減期は〜13.2時間）、ヨウ素131（半減期は〜8日）、ガリウム67（半減期は〜78時間）、及びインジウム111（半減期は〜2.8日）がある。
同位元素のアネキシンへの結合は公知の技術を用いて行なってよい。例えば、Tc99mはアネキシンに、以下、材料及び方法の項に説明するように、例えばカナダ、ブリティッシュ・コロンビア州、ラングレー、AnorMED社から得られるヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）群を利用することで結合させることができる。ガリウム67及びインジウム111を用いると、ここに参考文献として編入することとするHnatowich, et al., 1983の説明した方法などを用いてたんぱく質を放射性標識することができる。
たんぱく質を放射性核種で標識するその他の方法は公知である。例えば、1996年9月3日発行の米国特許第5,552,525号（Dean）は、テクネチウム-99m（Tc-99m）で標識されたペプチドの作製を教示している。ペプチド及びポリペプチドをTc-99mで標識する方法はさらに米国特許第5,443,815号及び第5,508,020号に開示されている。Lind, et al.,（1990）はTc-99mで標識されたモノクローナル抗体を教示している。LaMuraglia, et al.,（1989）は111Inで標識された非特異的ヒト免疫グロブリンを教示しており、Fischman, et al.,（1991）は化学走性ホルミルペプチド（fMLF）−111Inで標識されたDTPA結合体を教示している。
Ｂ．  放射性標識されたアネキシンの投与
放射性標識されたアネキシンは、放射性標識された化合物の投与のための標準的プロトコルを用いて投与されてよい。用量は二つの主要な考慮点に依る。（i）注射される放射性核種の量および種類、及び（ii）注射されるアネキシンたんぱくの量、である。
テクネチウム99mは、成人のヒトに対し、最大約20mCiまでの用量、投与することができる。一回のTc99m投与に好適な用量は約5から20mCiの間である。
アネキシンVは約300μg／kgよりも大きな用量で薬理学的効果（抗血液凝固効果）を持ち始める。従って、（標識されたアネキシンの薬理学的効果を避けることを狙いとした）本発明の診断方法は、好ましくは、300μg／kg未満の用量、典型的には約50μg／kg未満の用量で実施されるとよい。このようなトレーサの用量（例えば10μg／kgから50μg／kg）では、動物又はヒトの被験体において薬理学的又は毒性の副作用を持つものとして報告されたことはない。
放射性標識されたアネキシンは、典型的には例えば無菌の生理食塩水などの適した搬送伝播体中に懸濁される。この伝播体には、当業において認識されているように、さらに安定化剤、担体、賦形剤、安定剤、乳化剤、等々を含めてもよい。
放射性標識されたアネキシンは、核医学画像法のために放射性標識されたたんぱく質の投与するのに有効であるとして公知である経路のいずれを用いても投与が可能である。投与の好適な方法は静脈内（i.v.）注射である。これは、良く血管化した内部臓器、例えば心臓、肝臓、脾臓、等々、の撮像に特に適している。放射性薬剤のi.v.注射の方法は公知である。例えば、放射性標識された薬剤は、典型的にはオルデンドルフ／ターニケット法又は静脈内プッシュ法のいずれかを用いた大量注射として投与されていることが認識されている（例えばMettler and Guierbteau, 1985, Appendix Dを参照されたい）。
脳を撮像するには、標識されたアネキシンを鞘内投与することができる。鞘内投与により、化合物は脳脊髄液（CSF）を含有するクモ膜下腔に直接送られる。脊髄領域への送達は、さらにくも膜外側の脊髄領域に硬膜外注射することによっても達成することができる。
その他の投与形態には腹腔内（例えば腎臓透析中の患者に）及び胸膜腔内投与がある。特定の用途のためには、本発明は、筋肉内注射、皮下、リンパ内、吸入、及び経口、経膣及び／又は直腸投与を含めた更なる送達形態を考察するものである。
上記の投与形態を実施する方法は当業において公知である。
Ｃ．  放射性標識したアネキシンの局在化
標識したアネキシンを投与後、それを標的の組織又は臓器に局在化させる。本文中での局在化とは、被験体内において「結合して」局在化した標識付アネキシンと、結合しないまま「遊離した」標識付アネキシンとの間に、平衡状態又は偽性の安定状態関係のいずれかが達成された状態を言う。このような局在化に要する時間は典型的には数分から数十分の間である。それは、標識されたアネキシンの血清半減期から推定することができる。i.v.注射されたTc99m標識付アネキシンVの場合、血清半減期は約3から7分の間である。局在化時間はさらに、標識されたアネキシンにとっての標的の組織への到達可能性の程度にも依存する。これはひいては、当業において認識されるように、投与形態に依存する。
撮像は、好ましくは標識されたアネキシンの大半がその標的に局在化した後に開始されるとよい。i.v.注射されたTc99m-標識付アネキシンVの場合、これはいくつかの半減期の後になる。約１０種類の半減期の時間（アネキシン／Tc99m結合体の場合約3から70分間）があれば、概ね完全な局在化を達成するには充分であると考えられる。しかしながら、当業者であれば、上記の〜10半減期の時点未満又はそれを越える時点で撮像を行なうのが好ましいであろうことは理解されよう。例えば、血管の損傷が原因の細胞死を撮像する際には、標的組織の到達可能性は大変高いため、特に低用量の標識付アネキシンを次第に投与して循環する標識からの信号を抑える場合には、僅かに数分で標的部位から強い信号を得ることができる。
上記のすべての場合において、局在化を達成するための時間は当業者であれば合理的に推測できよう。さらに時間の関数である局在化状態を、本発明の方法に基づき、標識されたアネキシンからのガンマ線信号を撮像することにより追跡してもよい。
D．ガンマ線検出装置
ガンマ線撮像装置は、被験体から放出されるガンマ線から生じた信号をある時間にわたって蓄積することにより機能する。ガンマ線検出で最も広く用いられている方法の一つはアンガー・ガンマ・シンチレーション・カメラ（Mettler and Guiberteau, 1985）である。これは、放射性核種から放出されるガンマ線を（通常NaI（TI）結晶体を用いて）光子に変換することで作動するが、この光子は次に光電子増倍管（PMT）で増幅され、電圧信号に変換され、画像を構成するために用いられる。アンガー・シンチレーション・カメラの構成要素には、典型的にはコリメータ、シンチレーション結晶体、PMTのアレイ、パルス高分析器、陰極線管（CRT）、及び制御コンソールが含まれる。このカメラシステムにはさらにコンピュータが含まれている場合が多い。PMTとディスプレイ（例えばCRT）との間の処理はアナログであったりデジタルであったりする。アンガー・ガンマシンチレーション・カメラの理論及び作動の詳細な説明は、数多くの批評及び又は核医学のテキストのいずれにも見ることができる（例えばここに参考文献として編入することとするMettler and Guiberteau, 1985を参照されたい）。
よりたくさんの情報を含んだ画像は、3次元画像を生成する放射型コンピュータ断層撮影法（ECT）を用いると得られよう。二つの主な種類のECTは、Tc-99mなどの同位元素を用いる単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（SPECT）、及び、高度に正確な局在化を提供するために高エネルギ（511-keV）の消滅光子に依拠する陽電子射出断層撮影法（PET）である。PETの欠点は、短命のサイクロトロンが生成する同位元素、例えば11C、13N、及び18F、と共に用いられる点である。一方SPECTは、ここで説明するような種類の放射性薬剤（例えばTc-99m）と共に利用することができる。
SPECTシステムには、典型的には患者の周りを円形又は楕円形の軌道上を回転することのできる、一つ又は二つのコンピュータ制御されたアンガー・ガンマシンチレーション・カメラ・ヘッドが含まれる。このようなSPECTカメラは、数多くのメーカから入手が可能である。例えばSiemens社（イリノイ州デス・プレインズ）は、「E−CAM」、「ORBITER」、「ECAT」、「MULTISPECT3」、「MULTISPECT2」及び「DIACAM」を含め、このようなカメラをいくつか販売している。
上に説明したようなカメラには現在、典型的にはバックグラウンドを減算したり、模擬色を足したり、等々のためにデジタルファイルとして画像を操作できる一体型画像処理装置が含まれている。画像をデジタルファイルにしさえすれば、それらをIBM互換機PC又はアップル・マッキントッシュ（カリフォルニア州クペルティノ、Apple Computer社製）で多種の画像処理プログラム（例えばカリフォルニア州マウントビュー、Adobe Systems, Adobe Systems社製「ADOBE PHOTOSHOP」など）により操作し、印刷することができる。
E．被験体をガンマ線検出装置の界に配置する
1．装置の検出界  装置の検出界は、ガンマ線の一致した、かつ信頼性ある測定値が得られる区域として定義される。画像生成のためにECTを用いている場合は、装置の検出はガンマ線を確実に測定できる空間全体か、又はスキャンに含めるようECTシステムがプログラムされているこのような空間の一部分である。子の空間は、典型的には、単一のECTでないカメラの検出界よりもかなり大きい場合が多い。
動物又は被験体全体が必ずしもガンマ線検出装置の検出界内にある必要はないことは理解されよう。例えばある特定の臓器からの信号を分析することに関心があれば、所望の情報を得るには、当該臓器を含む領域からの信号のみと、それを取り巻く充分な「暗」域を測定すればよい。
2．被験体の配置：固定  画像を生成するのに用いる信号を採集するには、画像を構成するのに用いることとなるガンマ線が測定されている間、光検出装置の検出界に被験体を配置する。この信号が充分に強く、測定されるガンマ線から約20ミリ秒未満で画像を構成できる場合、及び／又は、画像を大きく損なう程度に被験体が撮像平面に対して動かない場合、典型的には特に固定の配慮は必要でない。必要なのは、測定時間の間中、被験体が検出装置の界内に位置していることである。
他方で、もしガンマ線の測定に約20ミリ秒よりも長くかかって被験体が動揺するのであれば、被験体の動揺の程度に応じ、ガンマ線測定の間、被験体が確実に固定されているようにする配慮をして、構成された画像の空間情報を保たなければ成らない。例えば、被験体がヒトであり、光子放射測定時間が数秒の桁であれば、被験体にガンマ線測定（撮像）の間できるだけ静止してもらうように頼むだけでよいであろう。他方、被験体がマウスなどの動物である場合、この被験体を例えば麻酔又は機械的な拘束装置を用いて固定することができる。
多種の拘束装置を構成してよい。例えば、マウスを数十秒から数分間固定するのに効果的な拘束装置は、発泡クッション上にガンマ線が透過するシートを緊締することにより作成されよう。このクッションは動物の頭部用の凹みを一端に有する。動物をこのシートの下に配置し、頭部がその凹み上に来るようにして、呼吸は自由に出来るが、体幹部の動きは発泡クッションで拘束されるようにする。
撮像される領域は、被験体の概ね全体か、又は、細胞死について診断又は観察する必要がある被験体の一部分のみを含むことは理解されよう。例えば、当該領域には、一本の外肢のみ又はこのような外肢の一部、頭部、中枢神経系、又は、胸郭又は腹腔などの内腔を含めてよい。具体的な実施例では、子の領域には選択された臓器のみ又はその一部のみが含まれていてもよい。例えば、本方法は、中枢神経系、脳、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、又は前述のいずれかの一部のみにおける細胞死の分析に応用可能である。さらに、例えば腫瘍の細胞死を引き起こすようデザインされた治療を受けている癌患者など、分析される当該領域を腫瘍に制限してもよい。
F．ガンマ線画像の構成：画像処理
最も適したカメラでは、ガンマ線を測定すると電圧信号が生成されるが、この信号をCRTで表示しても、保存しても、及び／又は、数列としてコンピュータで分析してもよい。これらの数を用いて標準的撮像法により画像が生成される。例えば、この画像は典型的には、（固定された、予め選択された数値に、又はいずれかのピクセルで検出された最大値に）ガンマ線の計数を標準化し、この標準化された計数を、モニタに表示される輝度（グレースケール）又は色彩（偽色）に変換することにより分析される。偽色表現の場合、典型的な色彩の指定は以下の通りである。計数ゼロのピクセルは黒と指定され、計数の低いものは青、そして計数が増すにつれて色の波長を高くし、ガンマ線計数の数値が最も高いものを最大の赤とする。モニタ上の色の位置は、ガンマ線の分布、従って細胞死の区域の位置を表すこととなる。
例えばこの細胞死の分布及び／又は局在化に対する治療の効果を記録するなどのために、この局在化及び／又は信号を経時的に追跡したい場合、ガンマ線の測定、又は撮像を所定の時間間隔で繰り返して一連の画像を構成することができる。この間隔は数分と短いものでも、又は数日、数週、数ヶ月又は数年と長くてもよい。
本発明の方法により生成される画像は、多種の方法で分析してよい。それらは簡単な視覚検査、精神的評価及び／又はハードコピーの印刷から、高度なデジタル画像分析まで様々である。
VII．用途
放射性標識されたアネキシンVの主要な用途には、例えば狼瘡などの免疫異常など、そこで起きてはならないはずの個所での疾患状態、移植片拒絶反応、又は重い虚血にさらされた細胞で起きる、好ましくないアポトーシスの検出、及び、例えば腫瘍やウィルス感染した細胞など、起きるべきアポトーシスが不充分である場合のその検出、が含まれる。
ここで説明する結果は、例えば、しかしこれらに限定されることなく、臓器又は骨髄移植の拒絶反応又は損傷、感染及び非感染性炎症性疾患、自己免疫疾患、脳及び心筋梗塞並びに虚血、心筋症、アテローム性動脈硬化症、神経及び神経筋変性疾患、鎌状赤血球症、β−サラセミア、癌治療、AIDS、脊髄異形成症候群、及び毒素誘発性肝疾患、等々など、アポトーシス及び／又はネクローシスによる細胞死を観察する必要のある多種の臨床の場で、放射性標識したアネキシンを利用可能であることを示唆している。さらに放射性標識したアネキシンは、正常な免疫系、発生学上の発生、及び免疫寛容及びアレルギーを研究するための臨床研究用ツールとしても有用であろう。
放射性標識されたアネキシンVは、例えば正常及び治療中の悪性の組織におけるアポトーシスによる細胞死を撮像及び定量するために用いることができる。放射性標識したアネキシンVを用いた連続撮像研究でのアポトーシス観察は、新薬の迅速な検査及び開発や、多種の疾患の治療に利用することができる。加えて、本方法は、治療の進行を観察したり、疾患の進行を観察したり、又はその両方を行なうのに利用してもよい。さらに、特定の疾患を早期検出する助けとしても利用できるであろう。
以下の実施例は実例を挙げたものであり、本発明を制限するものとしては決して意図されていない。
材料及び方法
A．HYNIC標識したアネキシンVの調製
ヒトアネキシンVを、pET12a-PAP1プラスミドからE. coliで発現させて作製し、前に説かれたように（ここに参考文献として編入することとするWood, et al., 1996）精製した。ヒドラジノニコチンアミド（HYNIC；カナダ、ブリティッシュ・コロンビア州、ラングレー、AnorMED社製；ここに参考文献として編入することとするBabich, et al., 1993）のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル保存溶液（「HYNICエステル保存液」）30mMを、220μgのスクシンイミジル6-ヒドラジノニコチン酸ヒドロクロリド（SHNH）を18.5μLのN,N-ジメチルホルムアミドに懸濁させることにより調製した。893μLの緩衝液A（20mMのHEPES、pH7.4、100mMのNaCl）に溶解させた5mgのアネキシンVを、ここに参考文献として編入することとするSchwartz, et al., 1991が説明した方法に基づき、室温で遮光して優しく攪拌しながらHYNICエステル保存液に3時間反応させた。この反応を500μLの500mMのグリシンpH5.3で停止させた後、20mMのクエン酸ナトリウム、pH5.2、100mMのNaClで4℃で透析した。1500×gで10分間遠心分離して沈降物を取り除いた。100μL（100μg）アリクォートのHYNIC-アネキシンVを-70℃で保管した。
B．HYNIC-アネキシンVの放射性標識付け
80μLのSnCl2（0.1NのHCl中N2ガスで2時間パージした50mg／ml）を50mlの20mMのトリシン溶液（pH7.1、N2ガスで1時間パージしたもの；トリシン＝N-［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）に加えた。200μLのSn-トリシン溶液を、Larson, et al., 1995が説明した方法に基づき、（上述したように調製された）100μLアリクォートのアネキシンVに混合した100μLのTc99m（4-8mCi放射能）に加えた。
放射性標識されたアネキシンの比放射能は20-200μCi／μgたんぱく質（所望の放射能に依存する）であり、生理食塩水を溶剤として用いた瞬間薄層クロマトグラフィ（ITLC）で判定した放射性純度は92%から97%であった。HYNIC−アネキシンV及び崩壊したTc99mHYNICアネキシンVの膜結合活性を、5nMのFITC-アネキシンVをI125アネキシンVに置換した改良競合アッセイ（Wood, et al., 1996）で判定した。室温で15分後、この試料を遠心分離し、ペレットになった細胞に結合したFITC-アネキシンVをEDTAで遊離させ、この遊離したFITC-アネキシンVを蛍光光度法で測定した。このアッセイ系では、修飾されなかったアネキシン、HYNICアネキシン、及びTc99mHYNICアネキシンVはそれぞれ8nM、10.5nM、及び12.3nMの競合阻害（FITC-アネキシンVの結合の50%濃度）があった。アネキシンVへのHYNICの取りこみは1モルのアネキシンV当り0.9モルであることが判明した。
C．撮像及び生体分布の研究
ITLC生理食塩水を溶剤として用い、遊離対結合したTc99mを判定した後に、50から150μCiのTc99m-HYNICアネキシン（0.125−0.25μgのたんぱく質）をマウスに注射した。放射性薬剤を注射後1から2時間の時点でマウスを腹位で撮像した。高感度パラレル・ホール・コリメータ及び128×128撮像マトリックス（イリノイ州デス・プレインズ、Siemens社製）を付けたLow Energy Mobile（LEM）シンチレーションカメラを用いて15分間、画像を得た。同じプロトコルを、処置前及び処置後のすべてのスキャンに用いた。
頚部リンパ節／唾液腺、脳、胸腺、心臓、肺臓、肝臓、脾臓、胃、胃腸管、腎臓、骨格筋、脂肪、血液、及び死体のその他の部分から標本を採集した後、生体分布研究を行なった。試料をPackard Cobra IIオートガンマ・シンチレーション・カウンタ（イリノイ州ダウナーズグローブ、Packard Instrument社製）で計数し、放射性同位元素の崩壊及びバックグラウンドの放射能について分当りで補正された計数として表した。
D．結合したヒトアネキシンV及びアポトーシス中の核の免疫染色
ホルマリン固定しパラフィンに埋め込んだ組織を、ヘマトキシリン／エオシン又はその他の技術で染色するために5μmの切片にした。結合したヒトアネキシンVの免疫染色は、ヒト胎盤アネキシンVに対して生じさせ、Affi-Gel（Bio-Rad社製）に結合させた組換えアネキシンVでアフィニティ精製したウサギ抗血清で行なった。次に、ビオチン標識したヤギ抗ウサギ抗体及びアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Jackson Immuno Research社製）と一緒に順次インキュベートし、その後Bindl及びWarnke（ここに参考文献として編入することとするBindl, J.M. & Warnke, R.A., 1986）が説明したように3,3’-ジアミノベンジジンと反応させることにより、免疫組織化学的検出を完了した。
アポトーシス中の核を検出するために、Gavrieli et al.（ここに参考文献として編入することとするGavrieli, Y., et al., 1992）が説いた末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介UTP端標識法（TUNEL）の改良版を用いて切片を染色した。内生のペルオキシダーゼを阻害した後、脱パラフィンした切片をプロテナーゼK（20μg／ml）で15分間、室温で消化した。次に切片をλエキソヌクレアーゼ（メリーランド州ガイザーズバーグ、Life Technologies社製）と一緒に、5単位／mlで30分間、37℃でインキュベートし、その後、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応緩衝液（0.2Mのカコジル酸カリウム、25mMのTris・HCl、0.25mg／mlのBSA、1.5mMのCaCl2、20mg／mlのポリビニルピロリドン、及び20mg／mlのフィコール）及び5μMのdATPで平衡させた。次に、この末端標識反応を、さらに最終濃度75単位／mlの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及び100μMの1,N-6-エテノール-dATP（Sigma社製）を含有する末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応緩衝液中で行なわせた。37℃で60分間インキュベートした後、1×SSC（標準的クエン酸生理食塩水）ですすいでこの反応を停止させた。その後、切片を、エテノアデニン成分を認識する（ここに参考文献として編入することとするYoung, T.L. & Santella, R.M., 1988）マウス1G4mAb（コロンビア大学、Regina Santellaから贈呈）と一緒にインキュベートした。次の免疫組織化学的検出は上に説明した通りであり、ビオチン標識したヤギ抗マウス抗体を用いた。
実施例1
Fas媒介アポトーシスのin vivo撮像
マウスの肝臓のアポトーシスを、1から2時間で広範な肝臓のアポトーシスを起こし、処置された動物の90%がその後3時間の時点で死亡する抗Fas抗体を注射して誘発した（Ogasawara）。
生後5から6週の18-24グラムのメスのBaih/cマウスに、精製されたハムスターモノクローナル抗Fas抗体（Jo2、動物一匹当り10μg、カリフォルニア州サンディエゴ、Pharmingen社製）を静脈（i.v.）注射した。この抗Fas抗体注射後、動物に約90μCiのテクネチウム99m（Tc99m）ヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）で標識したアネキシンVを、抗体投与後0、1、及び2時間の時点で三つの別々の実験にして静脈注射した。結果を図1に示す。
放射性標識されたアネキシンVの肝摂取率が著しく次第に増加することが、1及び2時間の時点で観察され、図１に示した関心領域（ROI）画像分析で判定したときにそれぞれ対象値の148%及び372%に相当していた。脾臓の摂取率は、処理後1時間の時点で一時的に対象値の140％にまで上昇し、その後2時間で110%に下降していた。腎臓の摂取率は処置後1及び2時間の時点で40%下降していた。
別の群のマウス（対照）には、90μCiのTc99mHYNICオボアルブミン（MW＝43kd;2μgのたんぱく質）を、Jo2抗体処置後0、1、及び2時間の時点で注射した。図２に示されるように、これらの動物は抗Fas抗体処置後1時間の時点で最初の肝摂取率の増加（127%）を示し、これは2時間の時点では変化しなかった（131%）。放射性標識されたオボアルブミンの脾臓摂取率は処置後、対照値から変化がないままであった。放射性標識されたオボアルブミンの腎臓摂取率は、処置後1時間の時点で対照値の138%に増加し、二時間の時点で131%で横ばいになった。
三番目の群のマウスも上述のように処置され、三つの別々の実験にしてTc99mで標識したアネキシンV及びI125で標識したヒト血清アルブミン（HSA）を0、1及び2時間の時点で同時注射した。別々の実験の動物は各対応する時点後に実験死させ、生体分布研究を行なった。組織1グラム当りの注射用量（%ID／gm）のパーセントで表したその結果を、下記の表１に示す。このデータは、放射性標識されたアネキシンV及びHSAの両方についてROI画像分析により得られたものに比例していた。
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実施例2
心臓同種移植片拒絶反応のin vivo撮像
99mTc HYNIC-アネキシンVを概ね上に記載したように調製した。撮像及び生体分布研究も、特に明記する場合を除き上述したように行なった。
成体オスのACIラット（250−350g）を、Ono及びLindseyの技術の改良版（ここに参考文献として編入することとするWoodley, et al., 1993）に基づき、ホストの腹部大動脈及び下大静脈に、PVGドナー（Harlan-Sprague-Dawleyから得た）の心臓同種移植片を吻合異所移植した。ACIドナーから得た同系の心臓同系移植片もホストACIラットの腹部に移植した。上のモデルを用いたACIレシピエントのPVG心臓同種移植片は、動悸に対する拍動の減少で評価したときに、移植後4及び5日の間に拒絶反応を起こし始める。移植後5日でこれら動物のすべてに700−900μCiの99mTc HYNIC-アネキシンV（10−20μgたんぱく質／kg）を尾の静脈から注射し、1時間後に撮像した。次に動物を殺し、天然の及び移植した心臓に対してシンチレーション計数及び組織病理学的研究を行なった。
PVG心臓同種移植片のすべて（n＝4）に、移植後5日で99mTc HYNIC-アネキシンVが容易に見られた。ACI同系心臓同系移植片（n＝3）は99mTc HYNIC-アネキシンの注射後では可視の放射能は全くなく、シンチレーション・ウェル計数法で確認した放射性薬剤の摂取率は天然の心臓放射能と同一であった。PVG同種移植片の全身放射能に対するパーセンテージは、ROI画像分析で調べるとACI同系移植片の放射能の213%上であった（P・0.005；ツーテイルド・スチューデンツT検定（原語：two-tailed Student’s T-test）を用いた）。シンチレーション・ウェル計数アッセイの結果、天然の心臓放射能に比較して、PVG同種移植片の99mTc HYNIC-アネキシンV摂取率が11倍を超える増加をみせていたことが判明した。
移植後5日目のPVG心臓同種移植片の切片を見ると、すべての動物において著しい単核炎症性細胞が浸潤していたが、同系又は天然の心臓では浸潤はまったく観察されなかった。浸潤は心筋障害の区域を取り囲んでおり、心筋血管の血栓症を伴っていた。これらの区域の中心では、ヘモキシリンによる染色のない明らかなネクローシスがあったが、周辺ではTUNEL染色で確認したときにアポトーシス変化のある核があった。99mTc HYNIC-アネキシンVの免疫染色が、炎症を起こし、かつネクローシスの過程にある区域の接合部の心筋細胞に顆粒状に広がっていることが観察され、これらの細胞の核はそれでもヘマトキシリンで染色されていることから、これらがネクローシスではなくアポトーシスによるものであることがさらに示唆された。抗アネキシンV染色は、TUNELに比較すると陽性の筋細胞数及び強度という観点でさらにずっと広範であった。抗アネキシン染色は、予測されたように明らかにネクローシスの区域では強く、また凝集していたが特異的であり、同系の又は天然の心臓、あるいは一次抗体を省略した同種移植心臓の染色においては染色は観察されなかった。
別々に、しかし同様の組の実験で、ACIラット（各群でn＝6）にPVGドナーから心臓を異所同種移植した。ACIドナーからの同系の心臓同系移植片（各群でn＝3）をホストのACIラットに移植した。いずれの群にも移植拒絶反応のための処置を行なわなかった。
レシピエントのラット群に、移植後1、2、3、4、5、6、及び7日目の時点で核スキャンニングを行なった。1.0mCiの99mTc HYNIC-アネキシンVを核スキャンニングの前1時間に注射した。
PVGの心臓同種移植片は、移植後4日で99mTc HYNIC-アネキシンVがあることが容易に見られた。ACI同系の心臓同系移植片は、99mTc HYNIC-アネキシンの注射後、可視の放射能はなかった。
関心領域分析を用いて99mTc HYNIC-アネキシンVの摂取率を定量した。移植された心臓による摂取率を、全身の摂取率に対するパーセンテージで計算した。その結果を図３に示す。
核スキャンニングの直後、動物を安楽死させた。移植された心臓を分析に向けて取り出した。急性の拒絶反応の組織学的等級付けを、標準的なヘマトキシリン及びエオシンで染色された切片に対して行なった。この等級付けスキームを下記の表2に示す。
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アポトーシスの核は、市販のペルオキシダーゼ・キット（メリーランド州ガイザーズバーグ、オンコール、APOPTAG▲Ｒ▼社製）を用い、核DNA割線のTUNEL染色により組織切片で識別した。表３のデータが示すように、アポトーシスは心臓同種移植片の拒絶反応の間に筋細胞及び炎症性細胞で起きるように思われる。
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下の表4のデータ、及び図４のグラフに見られるように、99mTc HYNIC-アネキシンVの摂取率は急性拒絶反応の組織学的等級と相関している。
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実施例3
処置されたマウスリンパ腫のin vivoでの撮像
99mTc HYNIC-アネキシンVを概ね上に説明したように調製した。撮像及び成体分析研究は、特に明記した場合を除き、上述のように行なった。
38C13マウスB細胞リンパ腫（Maloney, et al., 1985）を、200μlのRPMI媒質1640（血清なし）に懸濁させた400の腫瘍細胞を左側腹部にs.c.注射したC3H.HeNマウス（インディアナポリス州、Harlan Breeders社製）で成長させた。移植後14日目にマウスに100mg／kgのシクロホスホアミドのi.p.注射処置を施した。シクロホスホアミド投与後20時間の時点でマウスに25−50μg／kgの99mTc HYNIC-アネキシンV（100−150μCi／動物）をi.v.注射した。その後、放射性薬剤の注射後、シンチレーション計数及び組織病理学的研究のための腫瘍を取り除いた1時間後に動物を撮像し、死なせた。
未処置の側腹部腫瘍移植片（n＝8）はシンチレーション・カメラ撮像で容易に観察でき、そのアネキシンV摂取率は、ROI画像分析で示されるように、正常な軟質組織放射能より365%高かった。処置された側腹部腫瘍（n＝6）では、全身放射能に対する腫瘍1グラム当りで表したときに対象値より78%高い99mTc HYNIC-アネキシンV放射能の増加があったことを簡単に視覚認識することができた（有効数字にツーテイルド・スチューデンツT検定（原語：two-tailed Student’s T-test）を用いるとP<0.05）。この結果はシンチレーション・ウェル計数でも確認され、この計数では、処置された腫瘍が、対照に比較して腫瘍1グラム当りの注射された用量のパーセントで表したときのアネキシンVの摂取率が132%増加しており（P<0.05）重量で58%減少（P<0.05）していたことが実証された。ROI画像分析で見たときの腫瘍1グラム当りの全身放射能は、生体分布研究で判定された腫瘍1グラム当りの注射用量のパーセンテージに線形に相関していた（r2＝0.831）。組織学的分析の結果、処置された腫瘍ではリンパ芽球のすべてにほぼ完全な（95%を超える）アポトーシスがあり、対照ではアポトーシス中の細胞が5%未満であることが実証された。
以上、本発明を特定の方法及び実施例を参照しながら説明してきたが、本発明から逸脱することなく様々な改良および変更が可能であろうと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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