(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポーター遺伝子を、タンデムに連結された複数のHIF-1結合ドメイン(HRE: hypoxia responsive element)を有する低酸素応答性プロモーターの制御下に組み込んでなり、かつＯＤＤドメイン(oxygen dependent degradation domain)をレポーター遺伝子とインフレームで連結してなる遺伝子構築物。
【請求項２】
低酸素応答性プロモーターが、ミニマムプロモーター(mp)を有する請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項１又は２に記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
核局在シグナル(NLS)をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
（タンデムに連結された複数のHIF-1結合ドメイン）−（mp）−（NLS）−（ODDドメイン）−（レポーター遺伝子）の構造を有する請求項４に記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子構築物を宿主細胞に導入してなる形質転換体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子構築物を非ヒト哺乳動物に組み込んでなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
非ヒト哺乳動物がマウスである請求項７に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
請求項７または８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と任意の病態の特徴を有する他の非ヒト哺乳動物を交配させてなる、前記病態の特徴をリアルタイムで解析可能なトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
病態をリアルタイムでモニターするための、請求項７〜９のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物の使用。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子構築物を利用して、レポーター遺伝子の発現または活性に影響を及ぼす候補化合物または遺伝子を評価する、候補化合物または遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物を利用して、病態に影響を及ぼす候補化合物または遺伝子を評価または探索する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子構築物に関し、詳しくは動物の病態の変化をリアルタイムで観察可能な遺伝子構築物に関する。【０００２】
また、本発明は、該遺伝子構築物を含む、発現ベクター、哺乳動物細胞、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、動物の病態の変化をリアルタイムで観察するための該非ヒト哺乳動物の使用、並びに薬物、遺伝子、タンパク質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
固形腫瘍内の酸素分圧は均一ではなく、腫瘍細胞はさまざまな酸素環境にさらされている。これは、血管から腫瘍組織へ酸素分子が拡散する距離が限られていることに起因する。【０００４】
HRE等の低酸素応答エンハンサーを利用することによって、治療用遺伝子やレポーター遺伝子等、目的の遺伝子の発現を低酸素環境下で誘導できることが知られていた。【０００５】
しかしながら、この遺伝子発現系には、有酸素条件化においても僅かながら遺伝子が発現してしまうという問題点があった。また、レポーター遺伝子の安定性に起因して、細胞が置かれた酸素環境にリアルタイムに応答することが困難であった。すなわち現行のシステムでは低酸素刺激を感知する事は可能であっても、その後の有酸素刺激（再酸素化）を短時間で感知するレポーターが存在しなかったため、細胞の置かれた酸素環境をリアルタイムに反映することが出来なかった。最後に、当該低酸素応答プロモーターは、低酸素環境のみでなく、低酸素環境に直接的または間接的に付随して起こる異常な状態にある細胞内で活性化されることが知られており、従って低酸素環境に直接的または間接的に付随して起こる様々な病態を感知することができると考えられ、病態に深く関与する環境に応答性の高い遺伝子発現系の開発が望まれていた。【０００６】
特許文献１と特許文献２は、レポーター遺伝子と低酸素誘導性プロモータ（HRE)の組み合わせを開示しているが、ODDについては記載していない。【０００７】
特許文献３は、レポーター遺伝子とNLS-ODDの組み合わせを開示しているが、低酸素誘導性プロモータ（HRE)についての記載はない。
【特許文献１】特表平１１−５０６３０２
【特許文献２】特表２００４−５０９６３５
【特許文献３】ＷＯ２００２／０９９１０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、動物の組織における病態を、動物を傷つけることなく、特にリアルタイムで観察する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の遺伝子構築物、該遺伝子構築物を含む発現ベクター、哺乳動物細胞、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、動物の病態の変化をリアルタイムで観察するための該非ヒト哺乳動物の使用、並びに候補化合物または遺伝子のスクリーニング方法に関する。
１．  レポーター遺伝子を低酸素応答性プロモーターの制御下に組み込んでなり、かつＯＤＤドメイン(oxygen dependent degradation domain)をレポーター遺伝子とインフレームで（codonが合って）連結してなる遺伝子構築物。
２．  低酸素応答性プロモーターが、HIF-1結合ドメイン(HRE: hypoxia responsive element)を有する項１に記載の遺伝子構築物。
３．  低酸素応答性プロモーターが、ミニマムプロモーター(mp)を有する項１に記載の遺伝子構築物。
４．  レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である項１〜３のいずれかに記載の遺伝子構築物。
５．  核局在シグナル(NLS)をさらに含む、項１〜４のいずれかに記載の遺伝子構築物。
６．  （HIF-1結合ドメイン）−（mp）−（NLS）−（ODDドメイン）−（レポーター遺伝子）の構造を有する項５に記載の遺伝子構築物。
７．  項１〜６のいずれかに記載の遺伝子構築物を宿主細胞に導入してなる形質転換体。
８．  項１〜６のいずれかに記載の遺伝子構築物を非ヒト哺乳動物に組み込んでなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
９．  非ヒト哺乳動物がマウスである項８に記載の非ヒト哺乳動物。
１０．  項８または９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と任意の病態の特徴を有する他の非ヒト哺乳動物を交配させてなる、前記病態の特徴をリアルタイムで解析可能なトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
１１．  病態をリアルタイムでモニターするための、項８〜１０のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物の使用。
１２．  項１〜６のいずれかに記載の遺伝子構築物を利用して、レポーター遺伝子の発現または活性に影響を及ぼす候補化合物または遺伝子を評価する、候補化合物または遺伝子のスクリーニング方法。
１３．  項８〜１０のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物を利用して、病態に影響を及ぼす候補化合物または遺伝子を評価または探索する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の遺伝子構築物は、動物細胞に導入することにより、酸素濃度のみならず、病態を初期の段階から重症に至るまでの過程をその重篤度に応じてリアルタイムで観察することができる。例えば、図１１では、1.0×10４個のルシフェラーゼ発光腫瘍細胞が検出可能であることを明らかにした。実際の腫瘍サイズでは、１mmの腫瘍に最小でも4×10５個の腫瘍細胞があることを考えると、本発明により1mmよりもかなり小さい腫瘍までin vivoで観察可能であることが明らかである。したがって、本発明の遺伝子構築物を導入することにより得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物に固形がんが形成された場合、癌の病態イメージングを的確に行うことができる。また、この癌の動物モデルに抗癌剤の候補となる化合物を投与して癌の状態を観察することにより、癌に対する有効性を判定することが出来、薬物のスクリーニング系や物理的治療法（例えば、手術、放射線療法、温熱療法）の評価系としても有用である。【００１１】
本発明は、放射線治療や抗癌剤に耐性を示す腫瘍内低酸素環境の基礎研究、腫瘍内の酸素環境に影響を及ぼす薬剤の薬効評価を好適に行うことができる。【００１２】
例えば、本発明は、虚血性疾患の病態イメージングおよび治療法の開発、自然発生癌のモデルマウスでの病態イメージングに特に有用である。
また、癌以外に、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病の合併症の末梢循環障害或いは糖尿病性腎症、動脈硬化に関連する疾患、血管の結紮或いは組織の圧迫などによる人工的な虚血或いは血流の低下などの虚血に関与する病態のイメージングが可能である。また、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、呼吸器系の慢性炎症モデル（例えば、タバコ或いはディーゼル、ガソリンの排気ガスの強制吸入により引き起こすことができる）、或いは各種臓器、組織に対し起炎物質を投与することによる炎症性の病態、外傷などの広範な病態のイメージングができる可能性もあると考えられる。【００１３】
本発明の遺伝子構築物を組み込むことで、臓器ないし組織の病態の変化を、動物に侵襲を与えることなく評価できる。従って、本発明は複数の薬物の投与スケジュールなどを含めた種々の治療法の開発に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】酵素依存的タンパク質安定性制御に必須な領域の同定  ODDドメインの融合による酸素依存的タンパク質分解の効率に違いがあるか否かを検証する目的で、以下の実験を行った。
【００１５】
pGL3 プロモーターベクターをBglII消化後、T4 DNA ポリメラーゼで処理し、さらにDNA リガーゼで処理することによって、pGL3プロモーターベクターのBglII認識配列に変異を導入したプラスミドpGL3ΔBglを構築した。【００１６】
pCH/3-0プラスミド（Harada et al. 2002. Cancer Res.）を鋳型とし、NLS-Nco-sense primer; 5’-AAC CAT GGC GXX TAA GAA GAA GAG GAA G-3’、およびODD-Nco-anti primer; 5’-AAC CAT GGT CTG CTG GAA TAC TGT AAC TG-3’を用いてNLS-ODD3-0のDNA断片（NLS-ODD548-603をコードするDNA断片）をPCR法で増幅した。このDNA断片をNcoI消化後pGL3ΔBglのNcoI部位に挿入し、pGL3ΔBgl/3-0を構築した。【００１７】
pGL3ΔBgl/3-0が発現するNLS-ODD-Luciferase融合遺伝子の5’端に存在するNcoI認識部位に変異を導入したプラスミドpGL3ΔbglΔNco/3-0を、site-directed mutagenesis法によって構築した。以降、このプラスミドをpGL3/3-0と記述する。【００１８】
ヒト子宮頸癌由来細胞株HeLaのtotal RNAを、ISOGENE（ニッポンジーン）を用いて抽出した。これを鋳型としAMV reverse transcriptase XLを用いて逆転写反応を行うことによってヒトHIF-1α遺伝子のcDNAを獲得した。このcDNAを鋳型とし、表１に示す10種のプライマー（ODD-Bgl-F0, -F1, -F2, -F3,-F4、およびODD-Nco-R0, -R1, -R2, -R3, -R4）の-Fと-Rを組み合わせてPCRを行い、系統的に欠失させたODD領域をコードするDNA断片を獲得した。【００１９】
これらのDNA 断片をBglII及びNcoIで消化することによって5’末端および3’末端をそれぞれBglII及びNcoI消化末端にし、pGL3/3-0をBglII及びNcoI処理して調製したプラスミドベクターに組込んだ。本遺伝子組換えによって、ODD領域の各種欠失DNA断片（0-0、0-1、0-2、0-3、0-4、1-0、1-2、1-3、1-4、2-0、2-3、2-4、3-0、3-4、4-0）と、NLS、及びルシフェラーゼが融合した遺伝子を発現するプラスミド（それぞれpGL3/0-0、pGL3/0-1、pGL3/0-2、pGL3/0-3、pGL3/0-4、pGL3/1-0、pGL3/1-2、pGL3/1-3、pGL3/1-4、pGL3/2-0、pGL3/2-3、pGL3/2-4、pGL3/3-0、pGL3/3-4、pGL3/4-0）を構築した。【００２０】
24穴培養ディッシュにHeLa細胞をまき（10000 cells/well）、16時間培養した後に上記プラズミド(0.4μg/well)をそれぞれPolyfect Transfection Reagent (QIAGEN)にて導入した。この時ウミシイタケルシフェラーゼを恒常的に発現するプラスミドpRL/CMV (Promega)もインターナルコントロールとして同時に導入した (0.04μg/well)。遺伝子導入から24時間後に培地を交換し、その後さらに18時間にわたって有酸素、または低酸素条件化（酸素濃度<0.02%）にて培養した。培地を吸引後、100 mlのPassive Lysis Buffer (Promega)にて細胞抽出液を収集し、付属の説明書に従ってデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。【００２１】
実験の結果、ODD/3-0ドメイン配列を融合した時に、最大の酸素濃度依存的タンパク質分解効率が得られることがわかった。
【図２】5HREプロモーター活性の低酸素応答性制御  低酸素特異的なプロモーターを用いることで、図１０に示したようなODDを介した分解系の限界を十分解決することができる。
【００２２】
5HRE-Lucを導入した細胞をグラフ（上）に示した時間有酸素（□）または低酸素（■）で培養した後、細胞内で発現したルシフェラーゼの活性を測定した。データは３回の実験の結果を平均とＳＤで示した。下の図は、上述の低酸素で培養した細胞内でのHIF-1αのタンパク質をウエスタンブロット法で調べた結果である。ODDを介する分解機構が、western blotで示したHIF-1αのタンパク質と同様に起こるということを考えると、５ＨＲＥを用いることにより、有酸素状態の組織でのレポーター遺伝子の発現をかなり押さえることができると考えられる。更に、低酸素状態の組織での発現誘導は、時間が長くなるにつれて（慢性化することにより）100倍以上に増加し、イメージングもそれにつれて増強されていくことが期待される（実際in vivoイメージングで増強されている図が図６）。 
【図３】既存レポーターとの比較（ルシフェラーゼ活性の低酸素／有酸素比とバックグラウンド）  5HREプロモーターだけを用いた時と5HREにODDを組み合わせた時のレポーター遺伝子の発現を比較した。特に誘導比（低酸素/有酸素）（上グラフ）と有酸素での発現（バックグラウンド）（下グラフ）の比較を行った。その結果、5HREにODDを組み合わせたレポーターの方が、バックグラウンドが小さくなり、その結果誘導比が著しく向上する事がわかった。上段；pGL3/5HRE-LucもしくはpGL3/5HREp-NLS-ODD-Luciferase (pGL3/5HRE-ODD-Luc)を、pRL-CMVとともにHeLa細胞に導入し、低酸素/有酸素条件化で培養した後に、デュアルルシフェラーゼアッセイを行った。低酸素条件化および有酸素条件化における「ウミシイタケルシフェラーゼの活性に対する蛍ルシフェラーゼの活性の比」をそれぞれ算出し、次に有酸素条件化における比に対する低酸素条件化での比を算出し、Induction Ratioとした。下段；上記処理後の有酸素条件化におけるホタルルシフェラーゼの活性（実測値）をグラフにした。細胞抽出液の代わりにPassive Lysis Bufferを用いてルシフェラーゼアッセイを実施し、Backgroundを測定した。
【図４】低酸素処理後の再酸素化によるルシフェラーゼ活性の推移  5HREプロモーターだけを用いた時と5HREにODDを組み合わせた時のレポーター遺伝子の発現を比較した。低酸素状態から有酸素状態に環境が変化したときのレポーターの変化を調べた。
【００２３】
24穴培養ディッシュにHeLa/5HRE-Luc、およびHeLa/5HRE-ODD-Luc細胞を播種（1×104 cells/well）し16時間培養した後、18時間にわたって低酸素処理を行った。細胞を低酸素チャンバーから取り出した直後にシクロヘキサミド含有培地に培地交換し、0、10、30、60分間にわたって5% CO2インキュベーターで培養をすることによって再酸素処理をした。その後培地を吸引し、Passive Lysis Buffer (Promega Co.)を100 μl/well添加して-80 ℃にて凍結した後、融解することによって細胞抽出液を収集した。20μlの細胞抽出液を用いルシフェラーゼアッセイ(Promega)を行った。【００２４】
再酸素化から0、10、30、60分後にルシフェラーゼ活性を測定し、0分におけるルシフェラーゼ活性に対する各測定時間におけるルシフェラーゼ活性の比を算出してRelative Luciferase Activity とした。その結果、5HREにODDを組み合わせた時の方が、レポーターの減少が速やかで、よりリアルタイムに環境の変化を捕らえることができることがわかった。
【図５】固形腫瘍内低酸素がん細胞のモニタリング（移植）  低酸素環境下におかれた細胞をどれくらい感度良くモニターすることができるかを調べる目的で、5HRE-mp-NLS-ODD-Luciferase遺伝子構築物を安定に組み込んだヒトがん細胞をヌードマウスの下腿部の皮下に移植してルシフェラーゼによる発行をモニターした。1×106ヒトがん細胞をヌードマウスの右足（circle）に皮下移植した。移植直後は有酸素環境下にあるため見えない（左図）。次の日には既にイメージが見えており、３日後には腫瘍としては観察されないものの、イメージは非常にはっきり観察される。固形腫瘍内の低酸素がん細胞内のルシフェラーゼ発光を捕らえている（右図）
【図６】虚血処理によるルシフェラーゼ発光の増強  低酸素によるレポーター遺伝子の発現誘導を比較する目的で、5HREプロモーターだけのレポーター遺伝子を組み込んだ細胞で作った腫瘍と、5HREにODDを組み合わせたレポーター遺伝子を組み込んだ細胞で作った腫瘍で、結紮により血流を悪くして低酸素状態を作ったときの発現誘導を比較した。
【００２５】
HeLa/EF−Lucを左下腿部皮下に、HeLa/5HRE-Luc（上段a-d）またはHeLa/5HRE-ODD-Luc（下段e-h）を右下退部皮下に移植した。右下腿を結紮後、0、2、4、8時間後にルシフェラーゼ発光量を測定した。その結果、レポーター遺伝子の発現誘導にはいずれの遺伝子構築物でも発現誘導の早さに大きな差が無いことがわかった。また、両足に腫瘍細胞を移植し、右足だけの血流を悪くすると、縛った方だけイメージの増強がみられた。
【図７】虚血処理後再酸素化のルシフェラーゼ発光の推移  次に再酸素化によるレポーターの発現変化を比較する目的で、図６と同様に結紮により血流を悪くして低酸素状態を作った腫瘍の結紮を解き、血流を回復した後のレポーターの発現変化を比較した。
【００２６】
左下腿にHeLa/EF-Luc (internal control)、右下腿にHeLa/5HRE-Luc（右上段）またはHeLa/5HRE-ODD-Luc（右下段）の細胞を移植した。右下腿を18時間にわたって結紮した後ルシフェリンをiv投与した。麻酔後に結紮を解き、その0、5、15、25、35分後にルシフェラーゼ発光量を測定した。【００２７】
各測定時間における左下腿のルシフェラーゼの発光量に対する右下腿の発光量の比を算出し、さらに0分の値に対する各測定時間の値の比を算出してRelative Luciferase Activityとした。その結果、培養細胞を用いた実験（図４）と同様に、ODDが無い場合は、再酸素化されてもイメージは変わらないが、in vivoでも5HREにODDを組み合わせた時の方が、レポーターの減少が速やかで、よりリアルタイムに環境の変化を捕らえることができることがわかった。
【図８】トランスジェニックマウス  図７では、5HRE-mp-NLS-ODD-Luciferaseを安定に組み込んだ細胞を用いて実験を行ったが、上記遺伝子構築物を全身の細胞に安定に組み込んだトランスジェニックマウスでも、同様な現象が観察されるか否かを調べる目的で、トランスジェニックマウスを用いた実験を行った。
【００２８】
トランスジェニックマウスの右下腿を16時間に渡って結紮した。ルシフェリン投与後11分経過した時点からイソフルランガスにて麻酔し、13分の時点で撮像した（-2 min）。ルシフェリン投与後15分で結紮を解き、右下腿を再酸素化（reoxygenation）した。再酸素化した時点を基準（0 min）として、以降2、5、8、10、12、15分で撮像した。その後直ちにルシフェリンを追加投与し、さらに17、20、23、26、30分の時点で撮像した。その結果、縛った足でのみルシフェリンの発光が観察され、発光は結紮を解除後、経時的に速やかに消失し、その後のルシフェリンの再投与でも発光は観察されなかった。トランスジェニックで低酸素状態がモニターできた事を示している。
【図９】トランスジェニックマウスによる病態イメージングの好ましい実施形態の１つを示す。
【図１０】細胞内に導入されたタンパク質量とＯＤＤドメインを介した酸素濃度依存的タンパク質分解効率の関連を調べる目的で、NLS-ODD3-0-β-galactosidaseタンパク質に細胞膜を通過して細胞内に自由に蛋白を入れることが出来る膜透過ドメイン(PTD)を融合させたタンパク質を濃度を変えて細胞培養液に表示しているユニット数に相当するβ-galactosidase活性をもつタンパク質を培地に添加して、有酸素状態（２０％）と低酸素状態（１％）で２４時間培養した。その後、細胞をホルマリン固定し、ＰＢＳで３回洗い、β-galactosidaseの基質を含んだ溶液に細胞を反応させることで、β-galactosidaseタンパク質の活性（つまりβ-galactosidaseタンパク質の細胞内残存量）を有酸素と低酸素状態で比較した。1.25 unit/mlまでのタンパク質を添加した時は、明らかに低酸素状態の細胞でのみ安定化したタンパク質が確認できるが、それ以上濃度があがると有酸素状態でもタンパク質の安定化がみられ、ある一定量以上のタンパク質が細胞内に存在するとＯＤＤを介した分解機構の限界を超えて、もはやタンパク質を分解することが出来ないことを示している。このことは、恒常的なプロモーター-NLS-ODD-レポーターという遺伝子構築物を使っても、レポーター遺伝子が沢山発現する組織ではレポーターが残存して低酸素に起因する病態イメージングを正確に行えないことを示唆している。
【図１１】A：図に示した数のHeLa/EF-Luc細胞を含む細胞懸濁液100μlと、50μlのルシフェリン溶液（0.1mg/ml）とを各ウェルにて混合した。その後直ちにIVIS-200システム（Xenogen）に化学発光をイメージングした。その結果、103個オーダーのルシフェラーゼ発現細胞を可視化できることが明らかになった。B ：(A)の実験結果を元に、各ウェルの化学発光量をIgor Pro 4.09A（Xenogen）を用いて定量した。その結果、7.8×102個の細胞から生じる化学発光量が3.9×102個の細胞からの化学発光量と比較して有意に大きいことが明らかになった（p<0.05）。この結果はIVIS-200システムによって10２個オーダーの細胞が生じるルシフェラーゼの発光を検出できることを示している。（平均±SD ;n=2）C：ヌードマウス背部皮下に1.0×10５個（左）、1.0×10４個（右）のHeLa/EF-Luc細胞を移植し、翌日にIVIS-200システムを用いて化学発光を検出した。In vivoにおいて、少なくとも1.0×10４個のルシフェラーゼ発光細胞を検出できることが明らかになった。
【図１２】ヒト子宮頸癌由来細胞株HeLaのtotal RNAを鋳型としAMV reverse transcriptase XLを用いて逆転写反応を行うことによってヒトHIF-1α遺伝子のcDNAを獲得した。このcDNAを鋳型とし、表１に示すプライマーをODD-Bgl-F3とA588-Nco-anti、ODD-Bgl-F3とA593-Nco-anti、ODD-Bgl-F3とT598-Nco-anti、Q553-Bgl-senseとA588-Nco-anti、L557-Bgl-senseとA588-Nco-antiの組み合わせでPCRを行い、これらのDNA 断片をBglII及びNcoIで消化することによって5’末端および3’末端をそれぞれBglII及びNcoI消化末端にし、pGL3/3-0をBglII及びNcoI処理して調製したプラスミドベクターに組込んだ。本遺伝子組み換えによって、ODD領域の各種欠失DNA断片（HIF-1αのアミノ酸番号で548-588、548-593、548-598、553-588、557-588）と、NLS、及びルシフェラーゼが融合した遺伝子を発現するプラスミド（それぞれpGL3/548-588、pGL3/548-593、pGL3/548-598、pGL3/553-588、pGL3/557-588）を構築した。これらのプラスミドを用いて、図１と同じアッセイ法でルシフェラーゼ活性を測定した。使用したプラスミドDNAは、pGL3プロモーターベクター、pGL3/3-0、pGL3/3-4、pGL3/548-588、pGL3/548-593、pGL3/548-598、pGL3/553-588、pGL3/557-588であり、図中ではそれぞれpGL3、548-603 (3-0)、548-583 (3-4)、548-588、548-593、548-598、553-588、557-588と表記した。結果として、ODDをルシフェラーゼと融合させた本図中の全ての融合タンパク質は酸素濃度依存的な安定性制御を受けることが明らかになった。中でも、ODD553-588の領域をルシフェラーゼと融合させることによって、ODD3-0(548-603)を融合させた場合と同等の強い酸素濃度依存性を獲得出来ることが明らかになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の特徴は、低酸素或いは病態組織を非常に初期の段階でイメージングすることができ、病態の解明或いは病気の治療薬を非常に効率的にスクリーニングできる点にある。【００３０】
例えば図５は、僅か１×１０６個のガン細胞をヌードマウスに移植後１日で癌をイメージングすることができ、３日後の腫瘍の観察が不可能な段階において非常に鮮明なイメージングを行えることを示している。同様に図１１は僅か１×１０４個のガン細胞を検出することが出来ることを示している。
また、本発明の遺伝子構築物を使用すると、病態の重症度（例えば酸素濃度、ガン細胞の数）に応じて適切なイメージングが行われる（図６〜８）。【００３１】
さらに、病態モデル動物と交配させた本発明のトランスジェニックマウスは、当該病態のイメージングを行うことができ、発症時期の特定、発症部位の特定、病変部位の経時的観察、治療方法の開発、治療効果の経時的観察などに威力を発揮する。【００３２】
本発明の図９に示されるように、本発明のトランスジェニックマウスを他の病態マウス（例えば癌発症改変マウスあるいは虚血性疾患発症マウス）と交配させるか、虚血性処置もしくは発ガン刺激を行うことにより、病態のイメージングを行うことができる。【００３３】
本明細書及び特許請求の範囲において、特に断らない限り、ＯＤＤドメイン(oxygen dependent degradation domain)、HIF-1結合ドメイン(HRE: hypoxia responsive element)、ミニマムプロモーター(mp)、核局在シグナル(NLS)は、各々これらをコードするポリヌクレオチドの意味で使用される。【００３４】
本明細書及び特許請求の範囲において、「病態」とは、疾患の状態だけでなく、それに至る初期の不都合な状態を広く含む。例えば癌の病態としては、本発明によりイメージングが可能なガン細胞が数十個程度の集団で存在する場合を包含し、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血再灌流障害などの虚血性の「病態」では、血管が詰まった状態のみならず、動脈硬化あるいは血管内皮細胞の肥厚などにより全身的或いは局所的に血流が低下した状態も広く「病態」に含まれる。【００３５】
本発明において、レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子（青色、赤色、橙色、緑色など）、（グリーン、イエロー、シアン、レッド、ブルー）蛍光タンパク質遺伝子(GFP,YFP,CFP, BFP, DsRed, DsRed2)、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられ、ルシフェラーゼが感度の点で特に好ましい。ルシフェラーゼは、橙色或いは赤色のような波長の長い発光を有するルシフェラーゼが、深部の発光を確認しやすいので好ましい。ルシフェラーゼの由来としては、例えばホタル、ヒカリコメツキなどの発光昆虫、発光ミミズ、ラチア、ヒオドシエビ、イリオモテホタル、ウミボタル、ウミシイタケ、鉄道虫、渦鞭毛藻、オワンクラゲ（エクオリン）などの発光生物が挙げられる。【００３６】
低酸素応答性プロモーターとは、低酸素時に発現が誘導されるエレメント（エンハンサー）とＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を促進するエレメントの両方を含むものである。【００３７】
低酸素時に転写活性を誘導するエレメントとしては、特に限定されないが、例えばHIF1応答性エレメント（エンハンサー）が挙げられる。具体的には、HIF1結合ドメインを有するHRE (hypoxia responsive element )が好ましく例示される。HREはタンデムに複数のHREを連結して使用するのが好ましい。タンデムに連結されるHREの数としては、例えば２〜５個が挙げられる。【００３８】
例えば、HREを５個タンデムに連結したエレメント(5HRE)において低酸素誘導すると、２時間以降（特に４時間以降）に発現が急速に増加することが図２に示されている。【００３９】
ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を促進するエレメントとしては、公知のエレメントが広く使用され、例えばCMVmp（サイトメガロウイルス最小プロモーター）が例示される。【００４０】
ＯＤＤドメイン(oxygen dependent degradation domain)としては、配列番号１のヒトＨＩＦ−１αのアミノ酸配列の４０１〜６０３番目の領域をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。ODDドメインの必須の部分を解明するために、種々の長さのODDドメインについてルシフェラーゼ活性を測定した結果を図1及び図１２に示す。【００４１】
但し、ＯＤＤドメインにおいて：
(i) ５５７〜５７４番目の領域をコードするポリヌクレオチドが特に望ましく、
(ii) ５５３〜５５６番目及び５７５〜５８８番目の領域をコードするポリヌクレオチドは含まれるのがより好ましく、
(iii) ５４８〜５５２番目及び５８９〜６０３番目の領域をコードするポリヌクレオチドは含まれていてもよく、
(iv) ４０１〜５４７番目の領域をコードするポリヌクレオチドは含まれていてもよいが、含まれない方が望ましい。【００４２】
また、配列番号１のヒトHIF-1αに由来するODDドメインの他、ヒトHIF-2αやHIF-3α等またマウスやラット等、ヒト以外の生物のHIF-1αのホモログに由来するODDドメインを利用することも出来る。また、有酸素条件下において積極的に分解され、逆に低酸素条件下において安定化する制御を受けるポリペプチドであれば、HIF-1αに由来するODDの代わりに利用することができる。【００４３】
本発明において、ODDドメインと低酸素誘導性プロモーターを組み合わせることは非常に重要である。【００４４】
図３に示されるように、単に低酸素誘導性プロモーター（例えば５×HREとサイトメガロウイスルミニマムプロモーター（CMPmp）を組み合わせたプロモーター）だけであると、有酸素時にもわずかながら遺伝子発現があるため、低酸素時の発現量を有酸素時の発現量で割った誘導比は３００倍程度となる。一方、これにODDドメイン（好ましくはさらにNLS）をさらに組み合わせることで、発現したレポータータンパク質が数分以内に速やかに分解されるため、有酸素時にはレポーター遺伝子がほとんど発現されない（バックグラウンドと同レベル）遺伝子構築物を得ることができる。そのため、約１２００倍近い誘導比を得ることができる。これにより、低酸素部位に対する特異性を高めることが出来、低酸素に起因する病態部位を明確に（例えばイメージングにより）モニターすることができる。【００４５】
ＯＤＤドメインのポリペプチドをもたないレポータータンパク質が、有酸素条件でも安定に存在し続けるのに対し、ODDドメインのポリペプチド（好ましくはさらにNLSのポリペプチド）をさらに組み合わたレポータータンパク質は、有酸素状態に移された後数分以内に速やかに分解される。この現象は、細胞レベル（図４）でも個体レベル（図７）でも観察される。【００４６】
図３によると、ODDがない場合、低酸素時の発現量を有酸素時の発現量で割った誘導比は１２００倍から３００倍程度にまで減少し、病態部位のイメージングの鮮明さが大きく低下する。特許文献１と２は、レポーター遺伝子産物と低酸素誘導性プロモータ（HRE)の組み合わせを開示する。低酸素状態を確認する場合、HREとレポーター遺伝子を組み合わせて低酸素時の発現量をできるだけ高くすることが従来行われてきた。ここにODDを組み合わせると、レポーター遺伝子が一部分解して発現量が低下するが、誘導比が大きくなるため、結果として鮮明な病態部位のイメージングが可能になることを本発明者は見出した。低酸素時において、レポーター遺伝子の発現量を増加させるエレメントである低酸素誘導性プロモータ（例えばHRE）とレポーター遺伝子の発現量を低下させるODDを組み合わせて、病態部位のイメージング効率を向上させ得ることは、本発明で初めて明らかにされた。【００４７】
本発明の遺伝子構築物は核局在シグナル(NLS)をさらに含むのが好ましい。
ＮＬＳは、細胞内に核膜構造を持つ真核細胞でタンパク質が核に局在するために必要なアミノ酸配列を指し、タンパク質を核に局在させる活性を有する限り特に限定されないが、例えば、SV40 large-T antigenに由来するNLS (large-T antigenの126〜132番目のアミノ酸の領域をコードするポリヌクレオチド；Proc.Natl.Acad.Sci.(1989)86:9327-9331)、ＨＩＦ−１αのＮＬＳなどを好ましく例示できる。【００４８】
本発明の遺伝子構築物は、好ましくは以下の構造を有する：
（HIF-1結合ドメイン）-(mp)-(NLS)-(ODDドメイン)-(レポーター遺伝子)
なお、HIF-1結合ドメイン、mp、NLS、ODDドメイン、レポーター遺伝子の各々のポリヌクレオチド間は直接結合されても良く、適当なヌクレオチド配列を介して連結されても良い。【００４９】
本発明の遺伝子構築物は哺乳類細胞に導入されて、形質転換細胞を得ることができる。動物細胞、特に哺乳類細胞への本発明の遺伝子構築物の導入は、例えばリン酸カルシウム法（Chen and Okayama法：Mol Cell Biol. 1987 Aug;7(8):2745-52.）などにより行うことができる。【００５０】
本発明の遺伝子構築物が導入される宿主としては、哺乳動物（ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、昆虫、鳥類（ニワトリなど）、爬虫類（例えばカエルなど）、魚類などの動物細胞、酵母などの真核細胞が例示され、哺乳動物細胞が好ましい。【００５１】
本発明の形質転換体は、細胞内の低酸素状態をイメージングすることができ、低酸素に対する保護効果を有する薬物候補化合物のスクリーニングに有用である。
なお、本明細書において、「候補化合物」としては、低分子化合物の他に、タンパク質、ヌクレオチド（オリゴマー及びポリマー）、ペプチド（オリゴマー及びポリマー）、糖類（単糖、二糖、多糖など）、糖脂質、糖蛋白などの天然或いは合成の物質（モノマー、オリゴマー及びポリマーを広く含む）を広く包含する。【００５２】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような常法（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年を参照）に従って作製することができる。例えばトランスジェニックマウスの場合には、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を、本発明の遺伝子構築物を含む発現ベクターで形質転換する。該形質転換ＥＳ細胞を別のマウスから取得した受精卵（肺盤胞）にマイクロインジェクションしてファウンダーマウスを得、これを他のマウス（例えばBALB/ｃが挙げられるがこれに限定されない）と２回戻し交配させ、本発明のトランスジェニックマウス（ヘテロ型、すなわち一方のみの染色体に本発明の遺伝子構築物を有するマウス）を得ることができる。このヘテロ型のトランスジェニックマウス同士をさらに交配させれば、ホモトランスジェニックマウスを得ることもできる。【００５３】
なお、(5×HRE )-(CMVmp)-(NLS)-( 548〜603番目のODDドメイン)-(ホタルルシフェラーゼ遺伝子)の遺伝子構築物を組み込んだトランスジェニックマウスは、２００５年３月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに「受託番号FERM P-20451」で国内寄託され、その後、２００６年２月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに「受領番号FERM ABP-10537」で国際寄託された。【００５４】
トランスジェニックマウスを作製する過程で使用した他のマウスとして正常マウスを用いれば、低酸素部位及び機能障害を有する部位がリアルタイムに検出可能なトランスジェニックマウスを得ることができる。【００５５】
また、トランスジェニックマウスを作製する過程で使用した他のマウス、或いはヘテロもしくはホモトランスジェニックマウスと病態モデルマウスや遺伝子改変マウス（他のトランスジェニックマウス、ノックアウトマウス；例えば虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、虚血性動脈硬化症、固形がんなどの病態を自然発症するマウス）を交配させることで、該病態をリアルタイムに観察可能なマウスを得ることができる。【００５６】
上記では、トランスジェニックマウスの作製法を例示したが、マウス以外の他の非ヒト哺乳動物においてもマウスと同様にして本発明の非ヒト哺乳動物を得ることができる。【００５７】
本発明のレポーター遺伝子としてルシフェラーゼを使用した場合、非ヒト哺乳動物にルシフェリンを投与することで、低酸素或いは病態の部位における発光を確認することができる。ルシフェリンは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下などの注射により好適に投与することができ、ドラッグデリバリーシステムによりルシフェリンを持続的に放出させることもできる。【００５８】
ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の特有の波長を検出できるようなボックスに、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を有する本発明の非ヒト哺乳動物を収容し、発光を観察することで、低酸素ないし病態部位を確認することができる。GFP, YFP, CFP, BFP, DsRed, DsRed2などの蛍光蛋白質もルシフェラーゼと同様にして確認できる。【００５９】
このようなボックスとしては、具体的には、IVIS-100, IVIS-200システム（Xenogen Co.）、フォトイメージャー(BIOSPACE社)などを使用できる。【００６０】
アルカリホスファターゼの場合は、基質のリン酸化による蛍光波長の変化、西洋ワサビペルオキシダーゼの場合はルミノール反応による蛍光、その他の酵素（β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）は基質となるタンパク質に発光標識をつけて、各々の酵素反応を受ける（たとえば基質が切断される等の変化を受ける）と蛍光波長が変化する様に修飾する事により酵素反応を発光という現象でイメージングすることが可能になる。【００６１】
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼが、イメージングの感度の点で特に好ましい。【００６２】
本発明のスクリーニング方法は、本発明の形質転換細胞（形質転換体）或いはトランスジェニック非ヒト哺乳動物に種々の化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現の変化を観察することで実施することができる。
例えば病態を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に化合物、特に薬物候補化合物を投与し、その病態がどのように変化するのかを、好ましくはリアルタイムで観察することで、該化合物の効果を精密に調べることができる。【００６３】
投与される化合物は、タンパク質（ホルモン、抗体、酵素、受容体などを広く含む）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）或いはこれらと作用する物質や生理活性物質を広く含む（低分子量及び高分子量の化合物を包含する）ものであり、毒物の効果を確認することも包含される、【００６４】
なお、レポーター遺伝子は、１種のみを組み込んでも良く、２種、３種、４種或いはそれ以上の遺伝子を同時に組み込むこともできる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
(1)  組み換えDNA (5HRE-mp-NLS-ODD-Luciferase)の構築
本発明のトランスジェニックマウスが有する組み換えＤＮＡを含む発現ベクターは、次のような手順で構築された。pCH/3-0プラスミド（Harada et al. 2002. Cancer Res.）を鋳型とし、NLS-Nco-sense primer; 5’-AAC CAT GGC GCC TAA GAA GAA GAG GAA G-3’、およびODD-Nco-anti primer; 5’-AAC CAT GGT CTG CTG GAA TAC TGT AAC TG-3’を用いてNLS-ODDのDNA断片（NLS-ODD548-603をコードするDNA断片）をPCR法で増幅した。これをNcoIで消化後、5HRE-hCMVmp-Lucプラスミド (Shibata et al. 2000. Gene Ther.；以降pGL3/5HRE-Luc)のNcoI部位に挿入することによって、5HREプロモーターの制御下でNLS-ODD-Luciferase融合タンパク質を発現するプラスミドpGL3/5HREp-NLS-ODD-Luciferaseを構築した。このプラスミドおよびpGL3/5HRE-LucプラスミドのKpnI-XbaI断片を、pEF/myc cyto（Invitrogen）のKpnI-XbaI部位に挿入することによってそれぞれpEF/5HREp-ODD-Luc、pEF/5HRE-Lucを構築した。【００６６】
恒常的にルシフェラーゼタンパク質を発現するプラスミドベクターは、次のような手順で構築された。Luc-Bam-sense primer 5’-AAG GAT CCA CCA TGG AAG ACG CCA AA -3’、およびLuc-RV-anti primer 5’-TTG ATA TCT TAC ACG GCG ATC TTT CC-3’ を用い、pGL3プロモーターベクターを鋳型としてPCRを行うことによって、ルシフェラーゼ遺伝子のcDNAを獲得した。これをBamHIおよびEcoRVで消化後、pEF6/Myc-His B（Invitrogen）プラスミドのBamHI-EcoRV部位に挿入し、恒常的にルシフェラーゼを発現するプラスミドpEF/Lucを構築した。
(2) 細胞培養
ヒト子宮頚癌由来HeLa細胞をATCCより入手し、ペニシリン100 unit/ml，ストレプトマイシン100 μg/ml，及び10％ Fetal Bovin Serumを添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium：D-MEMで培養した。
(3) レポーター遺伝子導入細胞の単離
リン酸カルシウム変法によってHeLa細胞にpEF/Luc、pEF/5HRE-LucおよびpEF/5HRE-ODD-Lucを導入した。各プラスミドがゲノムDNAに安定に組み込まれた細胞株を獲得する目的で、遺伝子導入翌日から10日間に渡って400 mg/mlのG418を含む選択培地で培養し、形成したコロニーを単離した。pEF/Lucを導入して単離したクローンのうち恒常的にルシフェラーゼを発現するクローン（HeLa/EF-Luc）を実験で使用した。一方、HeLa細胞にpEF/5HRE-LucまたはpEF/5HRE-ODD-Lucを導入して得たそれぞれのクローンのうち、低酸素処理によるルシフェラーゼの誘導能が高いクローン（HeLa/5HRE-Luc、および HeLa/5HRE-ODD-Luc）を実験で使用した。
(4) ルシフェラーゼ活性の測定
5HREを含むHIF-1依存性プロモーターの低酸素応答性を確認するために以下のような実験を行った。24穴培養ディッシュにHeLa/5HRE-Luc細胞を播種し（1×104 cells/well）16時間培養した。その後有酸素条件（20%O2）または低酸素条件（1%O2以下）で 0, 1, 2, 4, 8 および16時間培養した。その後、細胞をPhosphate Buffered Saline (PBS)で洗浄後、100 μl Passive Lysis Buffer (Promega, Madison, Wisconsin) で溶解し、 10μlのルシフェラーゼ活性をluciferase assay kit (Promega)で測定し、net countを図２のグラフに示した。各々の細胞内で発現しているHIF-1αの蛋白を western blot 法で確認した（図２の下）。具体的には、上述した方法で調整した細胞を低酸素条件で培養し、0, 1, 2, 4, 8 および 16 時間後、細胞を低酸素チャンバー内で直接 100μl の 1 × loading buffer に溶解し、そのうち20μl を 7.5% SDS-polyacrylamide gel を用いて電気泳動法で展開し、PVDF 膜 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)に転写し、膜上の HIF-1a タンパク質を monoclonal anti-HIF-1a antibody (BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA) とanti mouse IgG horseradish peroxidase linked whole antibody (Amersham Bioscience)を用いて標識し、ECL-PLUS system (Amersham Bioscience)を用いて標識タンパク質を確認した。結果は、図２に示した。【００６７】
レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼのみの時と、NLS-ODDを融合させたホタルルシフェラーゼの低酸素応答性を比較する目的で以下の実験を行った。24穴培養ディッシュにHeLa細胞をまき（10000 cells/well）、16時間培養した後にpGL3、pGL3/5HRE-Luc、またはpGL3/5HREp-NLS-ODD-Luciferase (0.4μg/well)をPolyfect Transfection Reagent (QIAGEN)にて導入した。この時ウミシイタケルシフェラーゼを恒常的に発現するプラスミドpRL/CMV (Promega)もインターナルコントロールとして同時に導入した (0.04μg/well)。遺伝子導入から24時間後に培地を交換し、その後さらに18時間にわたって有酸素、または低酸素条件化（酸素濃度<0.02%）にて培養した。培地を吸引後、100 mlのPassive Lysis Buffer (Promega)にて細胞抽出液を収集し、付属の説明書に従ってデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。結果は、図３に示した。【００６８】
プロメガのデュアルアッセイシステムは、図１，３の実験のみ使用した。これは、各々の構築物をコードする遺伝子を一時的に発現させるために、遺伝子の導入効率による差を補正するためにウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子を一定量同時に導入し、両方のルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼ）活性を測定して、その比で活性を評価するためである。【００６９】
その他の実験では、単にホタルルシフェラーゼ（Firefly Luciferase）の発現量を活性で測定して評価した。【００７０】
図３上段：有酸素条件化、および低酸素条件化における「ウミシイタケルシフェラーゼの活性に対するホタルルシフェラーゼの活性の比」を求めた。さらに有酸素条件化における算出値に対する低酸素条件化における算出値の比を求め、これを低酸素誘導能（Induction Ratio:Hypo/Aero）とした。【００７１】
図３下段：有酸素条件化におけるホタルルシフェラーゼの活性を有酸素でのバックグラウンド（Net Count under Aero）とした。【００７２】
pGL3/5HRE-LucまたはpGL3/5HREp-NLS-ODD-Luciferaseを安定に保有するヒトがん細胞株HeLa/5HRE-Luc、およびHeLa/5HRE-ODD-Luc細胞を用いて、レポーター遺伝子であるホタルルシフェラーゼの活性が酸素濃度の変化（低酸素から有酸素になる）に応じてどう変化するかを調べた。【００７３】
24穴培養ディッシュにHeLa/5HRE-Luc、およびHeLa/5HRE-ODD-Luc細胞を播種（1×104 cells/well）し16時間培養した後、18時間にわたって低酸素処理を行った。細胞を低酸素チャンバーから取り出した直後にシクロヘキサミド含有培地に培地交換し、0、10、30、60分間にわたって5% CO2インキュベーターで培養をすることによって再酸素処理をした。その後培地を吸引し、Passive Lysis Buffer (Promega Co.)を100 μl/well添加して-80 ℃にて凍結した後、融解することによって細胞抽出液を収集した。20 μlの細胞抽出液を用いホタルルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイキット(Promega)で調べた。0分におけるルシフェラーゼ活性に対する、各測定時間におけるルシフェラーゼ活性の比を算出し、Relative Luciferase Activityとした。【００７４】
結果を図４に示す。
(5) 腫瘍モデルの作成
細胞をトリプシン処理後、冷PBSで洗浄し、PBSにより（1×106  cells/100μl）の濃度に懸濁した。この細胞懸濁液を６週齢、雌のBALB/c nu/nuマウスの下腿皮下に移植した。【００７５】
得られたモデルマウスのイメージングの結果を図５に示す。
(6) in vivo imaging
HeLa/EF-Lucを左下腿部、HeLa/5HRE-LucまたはHeLa/5HRE-ODD-Lucを右下腿部に皮下移植した。移植10日後に右下腿を結紮し、その直後にイソフルランガスを充填した麻酔装置（Xenogen Co）にマウスを入れた。麻酔から0、2、4、8時間後にルシフェリンを50 mg/kg ivにて投与しIVIS-100システム（Xenogen Co.）を用いてルシフェラーゼによる化学発光を検出した。得られた画像をIGOR Pro,V4.0.6.1(Wavemetrics, LakeOswego,OR)を用いて解析した。【００７６】
結果を図６に示す。【００７７】
右下腿部を結紮してから18時間後にルシフェリンを50 mg/kg ivにて投与した。投与から12分経過した時点でイソフルランガスを充填した麻酔装置（Xenogen Co）にマウスを入れた。その3分後に結紮を解き、以後0、5、15、25、35分の時点で化学発光を検出した。【００７８】
結果を図７に示す。【００７９】
5HRE-mp-NLS-ODD-Luciferaseのトランスジェニックマウスを用いたin vivo imagingに関しては以下の様に実施した。【００８０】
まずトランスジェニックマウスの右下腿を16時間に渡って結紮した。ルシフェリン投与後11分経過した時点からイソフルランガスにて麻酔し、13分の時点で撮像した。ルシフェリン投与後15分で結紮を解き、右下腿を再酸素化（reoxygenation）した。再酸素化した時点を基準（0 min）として、以降2、5、8、10、12、15分で撮像した。レポータータンパク質の発光は経時的に小さくなり消失した。その後これまでに観察されたイメージが出血等による擬陽性のイメージで無いことを確認するために、直ちにルシフェリンを追加投与し、さらに17、20、23、26、30分の時点で撮像した。一度再酸素化されて消えてしまったレポータータンパク質は再度確認することができなかった。【００８１】
結果を図８に示す。
(7) 遺伝子操作動物作製
遺伝子改変動物作製には、雌B6C3F1×雄B6C3F1の自然交配によって得られた受精卵B6C3F2を使用した。当該遺伝子断片（pGL3/5HREp-NLS-ODD-Luciferase のXhoI-SalI断片、約1.7 kbp；5HRE-CMVmp-NLS-ODD(548-603)-(Firefly Luciferase gene)）を電気泳動後に0.6％アガロースゲルでから回収・精製後にトリス10mM、EDTA0.1mM（T10E0.1）溶液に500copy/pl濃度で溶解した。マウス前核期受精卵１個当たり1000コピー相当量をマイクロインジェクション法（参考図書Methods in Enzymolizy  Vol. 225  Guode to Techniques in Mouse Development）で注入し、生存の確認できた受精卵を偽妊娠0.5dpcのICR系統仮腹親の卵管に移植後19日に、帝王切開で産仔（ファウンダートランスジェニック）を得た。得られた産仔のPCR遺伝子解析の結果、当該遺伝子が陽性であった。該遺伝子陽性の個体を基にライン化して、本発明のトランスジェニックマウスを樹立した。【００８２】
ファウンダートランスジェニック（B6C3F2）にBALB/ｃを掛け合わせ得られたトランスジーンがヘテロの交雑種N1雄個体とワイルド（C57BL/6J）の雌を用いて体外受精により受精卵を作製した。得られた受精卵の融解・移植後に得られる個体は、トランスジーン（導入遺伝子）保有と非保有が１：１になる。得られたトランスジェニックマウス(HOL-A)の受精卵は、２００５年３月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに「受託番号FERM P-20451」で国内寄託され、その後、２００６年２月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに「受領番号FERM ABP-10537」で国際寄託された。【００８３】
参考文献
・  Shibata T, Giaccia AJ, Brown JM (2002). Hypoxia-inducible regulation of a prodrug-activating enzyme for tumor-specific gene therapy. Neoplasia. 4:40-48.
・  Harada H, Hiraoka M, Kizaka-Kondoh S (2002). Antitumor effect of TAT-oxygen-dependent degradation-caspase-3 fusion protein specifically stabilized and activated in hypoxic tumor cells. Cancer Res. 62:2013-2018.【００８４】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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