(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を基板の表面に結合させる方法であって、以下の工程Ａ〜Ｂを備する方法：
金またはカルボキシル基を具備する表面を有する基板を準備する工程Ａ、および
前記タンパク質を前記表面上に供給する工程Ｂ
ここで、前記タンパク質は、プロテインＡ、または前記プロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなり、かつ
前記タンパク質は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって表されるアミノ酸配列により修飾されたＣ末端を具備する。
【請求項２】
前記表面は金を具備する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面はカルボキシル基を具備し、
以下の化学式（ＩＩＩ）により前記表面に前記タンパク質が結合している、請求項１に記載の方法。
【化３】
0004987165.tif 000012
（式中、ｎは自然数を示す。）
【請求項４】
前記工程Ａと前記工程Ｂとの間に、下記工程（Ｃ）〜（Ｄ）をこの順でさらに具備する、請求項１に記載の方法。
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩またはその等価物およびＮ−ヒドロキシサクシンイミドを含有する溶液を前記表面上に供給する工程（Ｃ）、および
下記式（ＩＶ）で表わされる化合物を前記表面上に供給する工程（Ｄ）、
【化４】
0004987165.tif 000013
（式中、ｍは自然数を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。）
【請求項５】
式（ＩＶ）中のｍが２以上２０以下の自然数である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
式（ＩＶ）中のｍが２である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質がプロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質がプロテインＡのＤドメインからなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質がプロテインＡからなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質が固定された表面を有する基板であって、
前記基板は、金またはアミド結合を具備し、
前記タンパク質は、プロテインＡ、または前記プロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなり、かつ
前記タンパク質は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって表されるアミノ酸配列により修飾されたＣ末端を具備する、基板。
【請求項１１】
前記タンパク質は、以下の化学式（ＩＩ）または化学式（ＩＩＩ）により基板に固定されている、請求項１０に記載の基板。
【化２】
0004987165.tif 000014
【化３】
0004987165.tif 000015
（式中、ｎは自然数を示す。）
【請求項１２】
前記タンパク質は、前記化学式（ＩＩ）により基板に固定されている、請求項１１に記載の基板。
【請求項１３】
前記タンパク質は、前記化学式（ＩＩＩ）により基板に固定されている、請求項１１に記載の基板。
【請求項１４】
前記タンパク質がプロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなる、請求項１０に記載の基板。
【請求項１５】
前記タンパク質がプロテインＡのＤドメインからなる、請求項１４に記載の基板。
【請求項１６】
前記タンパク質がプロテインＡからなる、請求項１４に記載の基板。
【請求項１７】
タンパク質を含有する水溶液であって、
前記タンパク質は、プロテインＡ、または前記プロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなり、
前記タンパク質は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって表されるアミノ酸配列により修飾されたＣ末端を具備する、水溶液。
【請求項１８】
タンパク質であって、
前記タンパク質は、プロテインＡ、または前記プロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなり、
前記タンパク質は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって表されるアミノ酸配列により修飾されたＣ末端を具備する、タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＡ、またはプロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなるタンパク質を基板の表面に結合させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分の５％を構成するタンパク質であり、「ＳｐＡ」と略記される。プロテインＡは、Ａ〜Ｅドメインの５つのドメインから構成され、システインを含有しない。
【０００３】
プロテインＡまたはプロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つからなるタンパク質（以下、「ＳｐＡタンパク質」）は抗体に結合する性質を有する。当該性質を利用して、基板に抗体を結合させるためにＳｐＡタンパク質が用いられる。
【０００４】
従来技術によれば、ＳｐＡタンパク質に含有されるリジンの残基が、アミンカップリング法を使用することにより基板上のカルボキシル基に結合する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１７０６１７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ８４，  １４７５−１４８３  （１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記公知の方法を使用して固定されたＳｐＡタンパク質は基板の表面上で低い密度を有する。なぜなら、ＳｐＡタンパク質は複数のリジン基を有するため、基板の表面上では配向性を有さないためである。
【０００８】
ところで、公知の方法によれば、Ｒ−ＳＨ（Ｒは炭化水素基を示す。）が金基板の表面に吸着され、化学式Ａｕ−Ｓ−Ｒにより表される配向膜を形成する。当該方法によりＳｐＡタンパク質を金基板に結合するために、ＳｐＡタンパク質の末端にシステインを結合させることが考えられる。
【０００９】
しかし、ＳｐＡタンパク質のＣ末端がシステイン（ＮＨ2−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ2−ＳＨ）で修飾された場合、ＳｐＡタンパク質を含有する溶液中で、ＳｐＡタンパク質のダイマー化が引き起こされる。以下の化学式（Ｉ）に示されるように、ＳｐＡタンパク質に含有されるシステイン中のメルカプト基（−ＳＨ）が重合して、ジススルフィド結合が形成される。
【００１０】
【化１】
0004987165.tif 000002
（式中、ＳｐＡはＳａＡタンパク質を示す。）
【００１１】
当該ダイマー化は、ＳｐＡタンパク質が基板へ固定されることを阻害する。
【００１２】
本発明者らは、システインを含有する配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって修飾されたＣ末端を有するＳｐＡタンパク質が、上記ダイマー化を引き起こさず、かつ基板の表面上で高い配向性を有して固定される知見を得た。
【００１３】
本発明の目的は、ダイマー化を引き起こさず、かつＳｐＡタンパク質を基板の表面に高密度に固定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
以下の方法は、上記課題を解決する。
〔１〕：タンパク質を基板の表面に結合させる方法であって、以下の工程Ａ〜Ｂを備する方法：
金またはカルボキシル基を具備する表面を有する基板を準備する工程Ａ、および
前記タンパク質を前記表面上に供給する工程Ｂ
ここで、前記タンパク質は、プロテインＡ、または前記プロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなり、かつ
前記タンパク質は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって表されるアミノ酸配列により修飾されたＣ末端を具備する。
〔２〕：前記表面は金を具備する、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕：前記表面はカルボキシル基を具備し、
以下の化学式（ＩＩＩ）により前記表面に前記タンパク質が結合している、前記〔１〕に記載の方法。
【化３】
0004987165.tif 000003
（式中、ｎは自然数を示す。）
〔４〕：前記工程Ａと前記工程Ｂとの間に、下記工程（Ｃ）〜（Ｄ）をこの順でさらに具備する、前記項目１に記載の方法。
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩またはその等価物およびＮ−ヒドロキシサクシンイミドを含有する溶液を前記表面上に供給する工程（Ｃ）、および
下記式（ＩＶ）で表わされる化合物を前記表面上に供給する工程（Ｄ）、
【化４】
0004987165.tif 000004
（式中、ｍは自然数を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。）
〔５〕：式（ＩＶ）中のｍが２以上２０以下の自然数である、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕：式（ＩＶ）中のｍが２である、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕：前記タンパク質がプロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなる、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕：前記タンパク質がプロテインＡのＤドメインからなる、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕：前記タンパク質がプロテインＡからなる、前記〔７〕に記載の方法。
〔１０〕：タンパク質が固定された表面を有する基板であって、
前記基板は、金またはアミド結合を具備し、
前記タンパク質は、プロテインＡ、または前記プロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなり、かつ
前記タンパク質は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって表されるアミノ酸配列により修飾されたＣ末端を具備する、基板。
〔１１〕：前記タンパク質は、以下の化学式（ＩＩ）または化学式（ＩＩＩ）により基板に固定されている、前記〔１０〕に記載の基板。
【化２】
0004987165.tif 000005
【化３】
0004987165.tif 000006
（式中、ｎは自然数を示す。）
〔１２〕：前記タンパク質は、前記化学式（ＩＩ）により基板に固定されている、前記〔１１〕に記載の基板。
〔１３〕：前記タンパク質は、前記化学式（ＩＩＩ）により基板に固定されている、前記〔１１〕に記載の基板。
〔１４〕：前記タンパク質がプロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなる、前記〔１０〕に記載の基板。
〔１５〕：前記タンパク質がプロテインＡのＤドメインからなる、前記〔１４〕に記載の基板。
〔１６〕：前記タンパク質がプロテインＡからなる、前記〔１４〕に記載の基板。
〔１７〕：タンパク質を含有する水溶液であって、
前記タンパク質は、プロテインＡ、または前記プロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなり、
前記タンパク質は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって表されるアミノ酸配列により修飾されたＣ末端を具備する、水溶液。
〔１８〕：タンパク質であって、
前記タンパク質は、プロテインＡ、または前記プロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つのドメインからなり、
前記タンパク質は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって表されるアミノ酸配列により修飾されたＣ末端を具備する、タンパク質。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、ダイマー化を引き起こさず、かつＳｐＡタンパク質を基板の表面に高密度に固定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、チオールカップリング法を示す。
【図２】図２は、クローニングベクター２０１の模式図を示す。
【図３】図３は、ベクター３０１の模式図を示す。
【図４】図４（Ａ）は、Ｄドメインをコードする遺伝子のＣ末端に、配列番号１をコードする遺伝子を修飾する方法を示す。図４（Ｂ）は、Ｄドメインおよび配列番号１をコードする遺伝子をベクター３０１にライゲーションさせる方法を示す。
【図５】図５は、Ｎｄｅｌ・ＸｈｏＩ・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子が増幅されたことを示す電気泳動写真である。
【図６】図６は、コロニーＰＣＲの温度・時間のプロファイルを示す。
【図７】図７は、Ｎｄｅｌ・ＸｈｏＩ・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子が形質導入されたクローニングベクター２０１が増幅されていることを示す電気泳動写真である。
【図８】図８は、ＳＦ修飾Ｄドメインが増幅されていることを示す電気泳動写真である。
【図９】図９は、６×Ｈｉｓによって修飾されたＮ末端を有するＳＦ修飾Ｄドメインの模式図を示す。
【図１０】図１０は、６×Ｈｉｓによって修飾されたＮ末端を有するＣ修飾Ｄドメインの模式図を示す。
【図１１】図１１（ａ）は、還元状態および非還元状態のＣ修飾Ｄドメインの分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された際の電気泳動写真である。図１１（ｂ）は、還元状態および非還元状態のＳＦ修飾Ｄドメインの分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された際の電気泳動写真である。
【図１２】図１２は、センサーチップＣＭ５に固定されたＣ修飾Ｄドメインの様子を模式的に示す。
【図１３】図１３は、センサーチップＣＭ５に固定されたＳＦ修飾Ｄドメインの様子を模式的に示す。
【図１４】図１４は、Ｃ修飾ＤドメインおよびＳＦ修飾Ｄドメインの固定量の測定結果を示すグラフを示す。
【図１５】図１５は、Ｃ修飾ＤドメインおよびＳＦ修飾Ｄドメインの固定量の測定結果を示すグラフを示す。
【図１６】図１６は、全てのＡ〜Ｅドメインを有するプロテインＡを示す模式図を示す。
【図１７】図１７は、Ｃ修飾ＳｐＡおよびＳＦ修飾ＳｐＡの固定量の測定結果を示すグラフを示す。
【図１８】図１８は、Ｃ修飾ＳｐＡおよびＳＦ修飾ＳｐＡの固定量の測定結果を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（用語の定義）
本明細書において用いられる用語は以下の通り定義される。
用語「プロテインＡ」は、黄色ブドウ球菌(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ)の細胞壁成分の５%を構成するタンパク質であり、「ＳｐＡ」とも記述される。プロテインＡは、Ａ〜Ｅの５つのドメインから構成され、システインを含有しない。
用語「ＳｐＡタンパク質」は、プロテインＡまたはプロテインＡのＡ〜Ｅドメインの少なくとも１つからなるタンパク質を意味する。すなわち、用語「ＳｐＡタンパク質」は、プロテインＡ、プロテインＡのＡドメイン、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＡのＣドメイン、プロテインＡのＤドメイン、プロテインＡのＥドメイン、および当該Ａ〜Ｅドメインの２以上の組み合わせを意味する。
用語「ＳＦ修飾ＳｐＡタンパク質」は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって修飾されたＣ末端を有するＳｐＡタンパク質を意味する。
用語「ＳＦ修飾Ｄドメイン」は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって修飾されたＣ末端を有するＤドメインからなるタンパク質を意味する。
用語「ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子」は、プロテインＡのＤドメインをコードする遺伝子のＣ末端に、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）をコードする遺伝子が修飾された遺伝子を意味する。
用語「Ndel・XhoI・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子」は、制限酵素サイトNdel及びXhoIがそれぞれＮ末端およびＣ末端に修飾されたＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子を意味する。
用語「Ｃ修飾ドメイン」は、システインによって修飾されたＣ末端を有するＤドメインからなるタンパク質を意味する。
用語「ＳＦ修飾ＳｐＡ」は、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）によって修飾されたＣ末端を有するプロテインＡからなるタンパク質を意味する。
用語「Ｃ修飾ＳｐＡ」は、システインによって修飾されたＣ末端を有するプロテインＡからなるタンパク質を意味する。
【００１８】
（工程（Ａ））
工程（Ａ）では、金（Ａｕ）またはカルボキシル基を具備する表面を有する基板が準備される。
金を具備する表面を有する基板は、表面に金を具備する基板だけでなく、ＳｐＡタンパク質が固定される部分にのみ金を具備する基板も含む。具体的には、当該基板は、金からなる薄膜または金からなる微細な粒子をその表面に具備する。
【００１９】
カルボキシル基を具備する基板は、金の場合と同様、カルボキシル基を具備する薄膜が表面に形成された基板だけでなく、ＳｐＡタンパク質が固定される部分にのみカルボキシル基を具備する基板も含む。具体的には、当該基板は、カルボキシル基を具備する薄膜をその表面に有する。
【００２０】
（工程（Ｂ））
工程（Ｂ）では、ＳＦ修飾ＳｐＡタンパク質が、基板の表面に供給される。
基板が金を表面に具備する場合、以下の化学式（ＩＩ）に示すように、ＳＦ修飾ＳｐＡタンパク質は基板の表面に固定される。
【００２１】
【化２】
0004987165.tif 000007
【００２２】
基板がカルボキシル基を具備する場合、以下の化学式（ＩＩＩ）に示すように、チオールカップリングによりＳＦ修飾ＳｐＡタンパク質は基板の表面に固定される。
【００２３】
【化３】
0004987165.tif 000008
（式中、ｎは自然数を示す。）
【００２４】
図１は、チオールカップリング方法を示す。カルボキシル基を具備する表面に、ＥＤＣ／ＮＨＳの混合液が供給される。ＥＤＣは、Ｎ−エチルＮ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩またはその等価物である。その等価物としては、フッ化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、臭化水素酸塩等のハロゲン酸塩が例示される。ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドの略名である。
次に、ＰＤＥＡが供給される。ＰＤＥＡは、２−（２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｄｉｔｈｉｏ）  ｅｔｈａｎｅａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅの略名である。最後に、メルカプト基（−ＳＨ）を有するリガンドが供給される。
本発明においては、リガンドとしてＳＦ修飾ＳｐＡタンパク質が供給される。
【００２５】
ＰＤＥＡに代えて、下記式（ＩＶ）であらわされる化合物を使用することもできる。
【００２６】
【化４】
0004987165.tif 000009
（式中、ｍは自然数を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。）
【００２７】
好ましくは、自然数ｍは２〜２０の範囲から選択される。
【００２８】
固定されたＳＦ修飾ＳｐＡタンパク質は高い配向性を有するため、ＳＦ修飾ＳｐＡタンパク質は基板の表面上で高い密度を有する。
【００２９】
（実施例１）
（遺伝子配列（ベクター）の作製）
（ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子の形成を確認するためのベクターおよびＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子を発現するためのベクターの調製）
図２および図３は、それぞれ、ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子の形成を確認するためのクローニングベクター２０１および大腸菌を用いてＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子を発現するためのベクター３０１を示す。
【００３０】
いずれのベクター２０１、３０１も環状である。クローニングベクター２０１およびベクター３０１は、いずれも、ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子が導入され得るマルチクローニングサイト（以下、「ＭＣＳ」）を有する。
【００３１】
ＭＣＳは制限酵素サイトを有する。制限酵素を用いて、ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子がＭＣＳに導入され得る。クローニングベクター２０１およびベクター３０１の例は、それぞれ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）  （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）である。ｐＢｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩは、ＭＣＳに導入されたＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子の確認および増殖のために用いられる。ｐＥＴ１５ｂは、ＳＦ修飾Ｄドメインを産生するために用いられる。
【００３２】
具体的な手順は以下の通りである。
【００３３】
（アミノ酸配列ＳＦＮＲＮＥＣを有するＳｐＡのＤドメイン遺伝子の設計および作製）
ＳＦ修飾Ｄドメインとして、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＰｒｏｔｅｉｎ  ＡのＤドメインが用いられた。
【００３４】
Ｄドメインをコードする遺伝子のＣ末端に、配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）をコードする遺伝子配列が図４（Ａ）に示すように付加された。
Ｄドメインをコードする遺伝子配列は、以下の通りである。
【００３５】
gctgatgcgcaacaaaataacttcaacaaagatcaacaaagcgccttctatgaaatcttgaacatgcctaacttaaacgaagcgcaacgtaacggcttcattcaaagtcttaaagacgacccaagccaaagcactaacgttttaggtgaagctaaaaaattaaacgaatctcaagcaccgaaa（以下、配列番号２）
【００３６】
配列番号１（ＳＦＮＲＮＥＣ）をコードする遺伝子配列は、
agcttcaaccgtaacgaatgc（以下、配列番号３）であった。
【００３７】
図４（Ａ）に示されるように、制限酵素サイトＮｄｅｌをコードする遺伝子がＮ末端に修飾されたプライマーＰ１（配列番号４）および配列番号２−停止コドン−制限酵素サイトXhoIをコードするプライマーＰ２（配列番号５）を用いてＰＣＲが行なわれ、制限酵素サイトＮｄｅｌおよびXhoIがそれぞれＮ末端およびＣ末端に修飾されたＮｄｅｌ・XhoI・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子を得た。以下の表１はＰＣＲにおける温度および時間のプロファイルを示す。
【００３８】
【表１】
0004987165.tif 000010
【００３９】
ＰＣＲの後、増幅されたクローニングベクター２０１を含有する溶液が２．０％アガロースゲルによる電気泳動に供された。
【００４０】
図５は電気泳動の結果の写真である。図５に示されるように、約４００ｂｐを指し示すＡにバンドが見出された。これは、Ｎｄｅｌ・XhoI・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子が増幅されたことを示す。
【００４１】
（Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換および遺伝子配列の確認）
図５に示されるバンドを、ＷｉｚａｒｄＳＶ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて切り出した。
【００４２】
当該バンドに含有されるＮｄｅｌ・XhoI・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子の末端が、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ（株）社製）を用いて、３７℃にて２時間かけてリン酸化された。
【００４３】
リン酸化されたＮｄｅｌ・XhoI・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子は、クローニングベクター２０１が有する制限酵素サイトＥｃｏＲＶ（ＭＣＳ）にライゲーションされ、Ｎｄｅｌ・XhoI・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）のＭＣＳに導入した。当該クローニングベクター２０１は、ＥｃｏＲＶで消化後に脱リン酸化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）であった。
当該ライゲーションは、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ  ＣＯ．，  ＬＴＤ．）を用いて、１６℃にて３０分かけて行われた。
【００４４】
得られたクローニングベクター２０１を、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を用いたエレクトロポレーション法（品名：Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｌｓｅｒ、ＢｉｏＲａｄ社製、プログラム：Ｅｃｏ１）によって形質転換した。当該エレクトロポレーション法では、およそ０．２μｇのクローニングベクター２０１および大腸菌ＤＨ１０Ｂ株４２μＬが混合され、１ｍｍＧａｐのキュベットが用いられた。
【００４５】
ＬＢプレート培地（１００ｕｇ／ｍＬアンピシリン）上にて大腸菌コロニーが育成された。ブルーホワイトセレクションが実施された。コロニーＰＣＲにより確認することによって、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）が形質導入されたコロニーのみが抽出された。
【００４６】
図６および図７は、それぞれ、コロニーＰＣＲの温度および時間のプロファイルおよび電気泳動の結果を示す。図７に示されるように、約４００ｂｐを示す「Ａ」にバンドが見出された。これは、Ｎｄｅｌ・XhoI・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子が形質導入されたクローニングベクター２０１が増幅されていることを意味する。
【００４７】
形質導入されたコロニーがピペットの先端部分を用いて回収された。当該形質導入されたコロニーは、およそ５〜１０ｍＬのＬＢ培地（１００ｕｇ／ｍＬアンピシリン）中に添加された。その後、揺動（３７℃、２３０ｒｐｍ）しながら、一晩かけて大腸菌が増殖された。増殖した大腸菌を遠心分離により回収した。回収された大腸菌はｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ（株）社製）によって精製され、Ｎｄｅｌ・XhoI・ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子を具備するプラスミドベクター２０１を得た。さらに、得られたプラスミドベクター２０１のシークエンスが読まれ、導入した遺伝子配列を確認した。
【００４８】
（タンパク質の産生）
（タンパク質発現用Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換）
得られたプラスミドベクター２０１から、ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子を切り出し、そしてベクター３０１のＭＣＳに導入した。
【００４９】
具体的には、制限酵素であるＮｄｅＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．製）およびＸｈｏＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．製）を用い、得られたプラスミドベクター２０１はＨ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）中にて３７度２時間インキュベーションされて、ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子を切り出した。１０μｇのプラスミドベクター２０１に対して２μＬの制限酵素を用いた。
【００５０】
次に、ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株からなるベクター３０１に形質導入され、大腸菌コロニーを得た。クローニングベクター２０１の形質導入と実質的に同一の形質導入が行われた。
【００５１】
具体的にはまず、およそ０．２μｇのＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子および４２μＬのベクター３０１が混合された。次いで２ｍｍＧａｐのキュベットを用いて、エレクトロポレーション法（品名：Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｌｓｅｒ、ＢｉｏＲａｄ社製、プログラム：Ｅｃｏ１）を使用して形質導入が行われた。このようにして、ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子を具備するベクター３０１が得られた。
【００５２】
次に、得られたベクター３０１をＬＢプレート培地（１００ｕｇ／ｍＬアンピシリン、２５ｕｇ／ｍＬクロランフェニコール）に添加し、当該ＬＢプレート培地上にて大腸菌コロニーを育成した。
【００５３】
得られた大腸菌コロニーが５０ｍｌの２ＹＴ培地（アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ、クロランフェニコール２５ｕｇ／ｍｌ）に添加された。その後、３７oＣで揺動しながら、一晩かけて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株が増幅された。
【００５４】
増幅した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（５ｍｌ）が５００ｍｌの２ＹＴ培地（アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ）に添加された。その後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株は３７oＣで１．５時間かけて振動しながら培養された。最後に、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ-Ｄ-１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加え、さらに６時間かけて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株が十分に増幅された。
【００５５】
（ＳＦ修飾Ｄドメインの精製および確認）
遠心分離法により、増幅したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株が回収された。回収したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株が、最終濃度５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）（４０ｍｌ）にもう一度懸濁された。次いでソニケーションにより菌体が超音波破砕に供された。
【００５６】
遠心分離法により不溶分画を除き、さらに０．２２μｍのフィルターに残液が通された。０．５ｍｌのベッドボリュームのＮｉビーズ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムに残液が２回通された後、ソニケーションバッファーで５回洗浄された。最終濃度３００ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、各１ｍｌの４分画が溶出された。Ｏ．Ｄ．２８０の吸光度からタンパク質溶出分画が同定された。
【００５７】
Ｏ．Ｄ．２８０の吸光度、タンパク質の分子量、及びＴｒｐ／Ｔｙｒの個数から算出したモル分子吸光係数から、１０ｍｇのＳＦ修飾Ｄドメインが得られたことが確認された。当該ＳＦ修飾ＤドメインのＮ末端は、ヒスチジン六量体（以下、「６×Ｈｉｓ」と称する。）を具備していた。
【００５８】
さらにタンパク質の精製度合いを検証するために、１６％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図８の参照番号８０３が示すように、タンパク質は高純度に精製された。
【００５９】
図８において、参照番号８０１は、それぞれが異なる分子量を有する複数のマーカーが形成するバンドを指し示す。参照番号８０３は、ＳＦ修飾Ｄドメインのバンドを指し示す。参照番号８０２は、ＳＦ修飾に代えて、図１０に示されるように、１分子のシステインがＣ末端に修飾されたこと以外は上記と同様のプロセスに従って得られたＤドメイン（以下、「Ｃ修飾Ｄドメイン」のバンドを指し示す。
【００６０】
図８から理解されるように、バンド８０２とバンド８０３との間には差がある。バンド８０３は、ＳＦ修飾Ｄドメインが得られたことを意味する。
【００６１】
このようにして、図９に示すような、６ｘＨｉｓによって修飾されたＮ末端およびアミノ酸配列ＳＦＮＲＮＥＣによって修飾されたＣ末端を具備するＳＦ修飾Ｄドメイン９０１が得られた。以下、説明を簡略化するため、必要とされない限り、用語「６×Ｈｉｓ」は割愛される。従って、用語「ＳＦ修飾Ｄドメイン」は、図９に示されるＳＦ修飾Ｄドメイン９０１を意味する。同様に用語「Ｃ修飾Ｄドメイン」は、図１０に示されるＣ修飾ドメイン９０２を意味する。
【００６２】
（配列番号１によるジスルフィド結合形成の抑制効果の確認）
図１１（ａ）は、還元状態および非還元状態のＣ修飾Ｄドメインの分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して測定された電気泳動写真を示す。
図１１（ｂ）は、還元状態および非還元状態のＳＦ修飾Ｄドメインの分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して測定された電気泳動写真を示す。
【００６３】
還元状態とは、ジスルフィド結合の還元が促進され、メルカプト基となる状態である。すなわち、還元状態では、二量化が抑制される。
非還元状態とは、メルカプト基の酸化が抑制されていない状態である。すなわち、非還元状態では、二量化が促進される。
【００６４】
還元状態および非還元状態は以下のプロセスにより得られた。
【００６５】
５μｇのＳＦ修飾ＤドメインがＰＢＳバッファー（ｐＨ：７．４）に添加され、非還元状態の溶液を得た。
【００６６】
次に、還元状態を得た方法が以下に記述される。まず、最終濃度が５ｍＭになるようにジチオスレイトール（以下、「ＤＴＴ」）が当該溶液に添加された。その後、溶液は４℃で一晩かけてゆっくり攪拌された。さらに、ＰＤ−１０（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、ＰＢＳバッファを１ｍＭでＥＤＴＡを含むＰＢＳに置換し、還元状態を得た。ＥＤＴＡは、ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄの略名であり、メタロプロテアーゼの活性を阻害する。Ｃ修飾Ｄドメインにも、上記と同様のプロセスが用いられる。
【００６７】
図１１（ａ）において、参照番号１１２は、還元状態におけるＣ修飾Ｄドメインのバンドを指し示す。参照番号１１３は非還元状態におけるＣ修飾Ｄドメインのバンドを指し示す。参照番号１１０１は異なる分子量を有する複数のマーカーによって形成されたバンドを指し示す。
図１１（ａ）から理解されるように、非還元状態では、２つのシステインの間にジスルフィド結合が形成され、２つのＣ修飾Ｄドメインが結合する。これは、いうまでもなく、ダイマー化が引き起こされたことを意味する。
【００６８】
図１１（ｂ）において、参照番号１１４は還元状態におけるＳＦ修飾Ｄドメインのバンドを指し示す。参照番号１１５は非還元状態におけるＳＦ修飾Ｄドメインのバンドを指し示す。
【００６９】
図１１（ｂ）の中の非還元状態列には、バンド１１５(i)及びバンド１１５(ii)が確認される。バンド１１５(i)は、ＳＦ修飾Ｄドメインを指し示す。このＳＦ修飾Ｄドメインにおいて、システインが有する硫黄原子は互いにジスルフィド結合を形成していない。バンド１１５(ii)は二量化したＳＦ−修飾Ｄドメインを指し示す。バンド１１５(i)はバンド１１５(ii)よりも非常に強い。
【００７０】
図１１（ｂ）から理解されるように、非還元状態であっても、ジスルフィド結合によって結合した２つのＤドメインのダイマーの量よりも、ジスルフィド結合を形成していない単量体のＤドメインの量の方が多い。これは、配列番号１によって表されるアミノ酸配列がジスルフィド結合によるダイマー化を抑制することを意味する。
【００７１】
（Ｄドメインを基板の表面に固定する方法）
Ｄドメインを基板の表面に固定する方法では、センサーチップＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）が用いられた。センサーチップＣＭ５は、高密度のカルボキシル基が付加されたデキストランを固定された表面を有する金基板であった。当該センサーチップＣＭ５に固定されたＤドメインの量が、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定された。
【００７２】
（比較例１：アミンカップリング法）
まず、０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」）および０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＳ」）を含有する混合液を調製した。当該混合液はセンサーチップＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面に２分間かけて５μＬ／ｍｉｎの流速で添加された。このようにして、カルボキシル基をＮＨＳエステルに置換した。
【００７３】
さらに、ｐＨ４．５の条件下でＣ修飾Ｄドメインが添加された。ＮＨＳエステルはＤドメインに含有されるリジン残基が有する−ＮＨ2基(ε‐アミノ基）に置換され、Ｄドメインがアミド結合により固定された。本手順は、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により固定量がモニタリングされながら、目的の固定量が得られるまで行なわれた。
【００７４】
最後に、エタノールアミンが流速５μＬ／分で、４分間添加された。このようにして、未反応のカルボキシル基が不活性化された。
【００７５】
図１２はセンサーチップＣＭ５に固定されたＣ修飾Ｄドメインの様子を模式的に示す。
【００７６】
図１４の点線は、基板上に固定されたＣ修飾Ｄドメインに８８０ＲＵ（およそ８８０ｎｍ／ｍｍ2）の抗体マウスＩｇＧ１（２００ｎｍ）が結合した後に、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって測定されたＣ修飾Ｄドメインの固定量の測定結果を示す。
【００７７】
図１５の点線は、基板上に固定されたＣ修飾Ｄドメインに８８０ＲＵ（およそ８８０ｎｍ／ｍｍ2）の抗体マウスＩｇＧ２ａ（２００ｎｍ）を結合させた後に、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって測定されたＣ修飾Ｄドメインの固定量の測定結果を示す。
【００７８】
（実施例１：チオールカップリング法）
比較例１と同様に、０．０５Ｍ  ＮＨＳおよび０．２Ｍ  ＥＤＣを含有する混合液がセンサーチップＣＭ５の表面に添加された。このようにして、カルボキシル基がＮＨＳエステルに置換された。
【００７９】
次に、図１に示されるように、ｐＨ８．５  ８０ｍＭ  ＰＤＥＡ（２−（２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｄｉｔｈｉｏ）  ｅｔｈａｎｅａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が流速５μＬ／分で、４分間添加された。このようにして、ＮＨＳエステルをジスルフィドに置換した。
【００８０】
さらに、ｐＨ４．５の条件下においてＳＦ修飾Ｄドメインが添加された。このようにして、以下の化学式（III）によって表されるように、基板の表面にＳＦ修飾Ｄドメインが固定された。
【００８１】
【化３】
0004987165.tif 000011
【００８２】
本手順は、比較例１と同様、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して固定される量をモニタリングしながら、目的の固定量が得られるまで行なわれた。
【００８３】
最後に、ｐＨ４．３  ５０ｍＭシスタミン／１Ｍ  ＮａＣｌを、流速５μＬ／分で４分間添加した。これにより、未反応のカルボキシル基を不活性化した。
【００８４】
図１３はセンサーチップＣＭ５上に固定されたＳＦ修飾Ｄドメインの様子を模式的に示す。
【００８５】
図１４の実線は、基板上に固定されたＳＦ修飾Ｄドメインに９６０ＲＵ（およそ９６０ｎｍ／ｍｍ2）の抗体マウスＩｇＧ１（２００ｎｍ）を結合させた後に、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定されたＳＦ修飾Ｄドメインの固定量の測定結果を示す。
【００８６】
図１５の実線は、基板上に固定されたＳＦ修飾Ｄドメインに９６０ＲＵ（およそ９６０ｎｍ／ｍｍ2）の抗体マウスＩｇＧ２ａ（２００ｎｍ）を結合させた後に、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定されたＳＦ修飾Ｄドメインの固定量の測定結果を示す。
【００８７】
図１４および図１５のいずれもが、アミンカップリング法によって固定されたＤドメインの量（点線）よりも、チオールカップリング法を使用して固定されたＤドメインの量（実線）の方が多いことを示している。これは、図１２および図１３に示されるように、アミンカップリング法を使用するとＤドメインは均一に配向しない一方で、ＳＦ修飾Ｄドメインはチオールカップリング法を使用することにより均一に配向するためと考えられる。
【００８８】
（実施例２）
実施例２では、図１６に示されるように、全てのＡ〜Ｅドメインを有するプロテインＡのＣ末端に配列番号１のアミノ酸配列が修飾された。当該プロテインＡのＮ末端は、６×Ｈｉｓによって修飾された。
【００８９】
Ｄドメインをコードする遺伝子（配列番号２）に代えて、全てのＡ〜Ｅドメインを有するプロテインＡをコードする以下の遺伝子（配列番号６）が用いられたこと以外は、実施例１および比較例１と同様の実験を行った。
【００９０】
ATGCTGACTTTACAAATACATACAGGGGGTATTAATTTGAAAAAGAAAAACATTTATTCAATTCGTAAACTAGGTGTAGGTATTGCATCTGTAACTTTAGGTACATTACTTATATCTGGTGGCGTAACACCTGCTGCAAATGCTGCGCAACACGATGAAGCTCAACAAAATGCTTTTTATCAAGTCTTAAATATGCCTAACTTAAATGCTGATCAACGCAATGGTTTTATCCAAAGCCTTAAAGATGATCCAAGCCAAAGTGCTAACGTTTTAGGTGAAGCTCAAAAACTTAATGACTCTCAAGCTCCAAAAGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATCTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGTAACGGCTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGACCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGCGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCCTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAAGCACCAAAAGCTGACAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGGAAGACAATAACAAGCCTGGCAAAGAAGACAATAACAAGCCTGGCAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGCAAAGAAGACAATAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGATGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGCAAAGAAGATGGCAACAAACCTGGTAAAGAAGATGGTAACGGAGTACATGTCGTTAAACCTGGTGATACAGTAAATGACATTGCAAAAGCAAACGGCACTACTGCTGACAAAATTGCTGCAGATAACAAATTAGCTGATAAAAACATGATCAAACCTGGTCAAGAACTTGTTGTTGATAAGAAGCAACCAGCAAACCATGCAGATGCTAACAAAGCTCAAGCATTACCAGAAACTGGTGAAGAAAATCCATTCATCGGTACAACTGTATTTGGTGGATTATCATTAGCCTTAGGTGCAGCGTTATTAGCTGGACGTCGTCGCGAACTATAA
【００９１】
図１７の点線は、基板上に固定されたＣ修飾ＳｐＡに８８０ＲＵ（およそ８８０ｎｍ／ｍｍ2）の抗体マウスＩｇＧ１（２００ｎｍ）を結合させた後に、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定されたＣ修飾ＳｐＡの固定量の測定結果を示す。
【００９２】
図１８の点線は、基板上に固定されたＣ修飾ＳｐＡに８８０ＲＵ（およそ８８０ｎｍ／ｍｍ2）の抗体マウスＩｇＧ２ａ（２００ｎｍ）を結合させた後に、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって測定されたＣ修飾ＳｐＡの固定量の測定結果を示す。
【００９３】
図１７の実線は、基板上に固定されたＳＦ修飾ＳｐＡに９６０ＲＵ（およそ９６０ｎｍ／ｍｍ2）の抗体マウスＩｇＧ１（２００ｎｍ）を結合させた後に、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定されたＳＦ修飾ＳｐＡの固定量の測定結果を示す。
【００９４】
図１８の実線は、基板上に固定されたＳＦ修飾ＳｐＡに９６０ＲＵ（およそ９６０ｎｍ／ｍｍ2）の抗体マウスＩｇＧ２ａ（２００ｎｍ）を結合させた後に、ＢｉａＣＯＲＥ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって測定されたＳＦ修飾ＳｐＡの固定量の測定結果を示す。
【００９５】
図１７および図１８のいずれもが、アミンカップリング法によって固定されたＳｐＡの量（点線）よりも、チオールカップリング法を使用して固定されたＳｐＡの量（実線）の方が多いことを示している。これは、実施例１と同様、アミンカップリング法を使用するとＳｐＡは均一に配向しない一方で、ＳＦ修飾ＳｐＡはチオールカップリング法を使用することにより均一に配向するためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は当該タンパク質を表面に有するセンサを製造するために用いられ得る。
【符号の説明】
【００９７】
２０１：ＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子の形成を確認するためのクローニングベクター
３０１：大腸菌を用いてＳＦ修飾Ｄドメイン遺伝子を発現するためのベクター
８０１：異なる分子量を有する複数のマーカーが形成するバンド
８０２：Ｃ修飾Ｄドメインのバンド
８０３：ＳＦ修飾Ｄドメインのバンド
１１２：還元状態におけるＣ修飾Ｄドメインのバンド
１１３：非還元状態におけるＣ修飾Ｄドメインのバンド
１１０１：異なる分子量を有する複数のマーカーが形成するバンド
１１４：還元状態におけるＳＦ修飾Ｄドメインのバンド
１１５：非還元状態におけるＳＦ修飾Ｄドメインのバンド
【図１】
0004987165.tif 000016
【図２】
0004987165.tif 000017
【図３】
0004987165.tif 000018
【図４】
0004987165.tif 000019
【図５】
0004987165.tif 000020
【図６】
0004987165.tif 000021
【図７】
0004987165.tif 000022
【図８】
0004987165.tif 000023
【図９】
0004987165.tif 000024
【図１０】
0004987165.tif 000025
【図１１】
0004987165.tif 000026
【図１２】
0004987165.tif 000027
【図１３】
0004987165.tif 000028
【図１４】
0004987165.tif 000029
【図１５】
0004987165.tif 000030
【図１６】
0004987165.tif 000031
【図１７】
0004987165.tif 000032
【図１８】
0004987165.tif 000033