(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素の存在下で、式（Ｉ）：
【化１】
0004877227.tif 000022
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよい。Ｒ1で表される前記基は、無置換であるか、あるいはハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、およびヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）から選ばれる１種または２種の置換基を有する）
に示されるＬ−α−アミノ酸と、下記式（ＩＩ）：
【化２】
0004877227.tif 000023
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよい。Ｒ1で表される前記基は、無置換であるか、あるいはハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、およびヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）から選ばれる１種または２種の置換基を有する）
に示されるアルデヒドとを反応させる、式（ＩＩＩ）：
【化３】
0004877227.tif 000024
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
に示されるＬ−セリン誘導体の製造方法であって、
前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｌ）からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質である、Ｌ−セリン誘導体の製造方法。
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記酵素が、ラルストニア（Ralstonia）属、バリオボラックス（Variovorax）属、ボセア（Bosea）属およびシリシバクター（Silicibacter）属からなる群より選ばれるいずれかの属に属する微生物に由来する、請求項１に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
【請求項３】
Ｒ1が、炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ2が、水素、または炭素数１〜６のアルキル基である、請求項１または２に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
【請求項４】
式（Ｉ）で示されるアミノ酸が、Ｌ−α−アラニンであり、式（ＩＩＩ）で示されるＬ−セリン誘導体がα−メチル−Ｌ−セリンである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
【請求項５】
式（Ｉ）で示されるアミノ酸が、Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸であり、式（ＩＩＩ）で示されるＬ−セリン誘導体がα−エチル−Ｌ−セリンである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
【請求項６】
式（Ｉ）で示されるアミノ酸が、Ｌ−α−アラニンであり、式（ＩＩＩ）で示されるＬ−セリン誘導体がα−メチル−Ｌ−スレオニンである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
【請求項７】
式（Ｉ）：
【化４】
0004877227.tif 000025
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよい。Ｒ1で表される前記基は、無置換であるか、あるいはハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、およびヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）から選ばれる１種または２種の置換基を有する）
に示されるＬ−α−アミノ酸と、下記式（ＩＩ）：
【化５】
0004877227.tif 000026
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよい。Ｒ1で表される前記基は、無置換であるか、あるいはハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、およびヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）から選ばれる１種または２種の置換基を有する）
に示されるアルデヒドとから、下記式（ＩＩＩ）：
【化６】
0004877227.tif 000027
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有する、下記（Ａ）〜（Ｌ）のいずれかのタンパク質。
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
【請求項８】
ラルストニア（Ralstonia）属、バリオボラックス（Variovorax）属、ボセア（Bosea）属およびシリシバクター（Silicibacter）属からなる群より選ばれるいずれかの属に属する微生物に由来する、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項７または８に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
下記（ａ）から（ｌ）よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号２２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号２２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号２９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号２９に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（上記（ａ）から（ｌ）において、ストリンジェントな条件は、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。）
【化７】
0004877227.tif 000028
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよい。Ｒ1で表される前記基は、無置換であるか、あるいはハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、およびヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）から選ばれる１種または２種の置換基を有する）
【化８】
0004877227.tif 000029
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよい。Ｒ1で表される前記基は、無置換であるか、あるいはハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、およびヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）から選ばれる１種または２種の置換基を有する）
【化９】
0004877227.tif 000030
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β（ｂｅｔａ）−ヒドロキシ−α−Ｌ−アミノ酸の製造方法に関し、より詳しくは、新規な酵素を用いたＬ−セリン誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリン誘導体、α位に光学活性を有するアミノ酸などのアミノ酸は、医薬品の中間体などとしての利用が期待される物質である。α位に異なる２つの置換基を有する光学活性アミノ酸誘導体である光学活性α−アルキルセリン誘導体およびその塩の製造方法としては、例えば以下の方法が知られている。
１）光学活性セリン誘導体とピバルアルデヒドより得られる光学活性オキサゾリジン化合物への不斉アルキル化による方法（非特許文献１）
２）光学活性金属触媒を用いるα−イソシアノカルボン酸エステルとパラホルムアルデヒドの不斉アルドール反応による方法（非特許文献２）
３）光学活性オキサゾリジンクロムカルベン錯体とオキサジン化合物から得られる光学活性β−ラクタム化合物への不斉アルキル化による方法（非特許文献３）
４）光学活性アジリジン化合物の不斉開環反応（非特許文献４）
５）光学活性バリン誘導体と光学活性アラニン誘導体から得られる光学活性ピラジノン化合物への不斉アルキル化による方法（非特許文献５）
６）２−メチル−２−プロペン酸誘導体にシャープレス不斉ジヒドロキシル化を行い、得られる光学活性ジオール化合物を光学活性アジド化合物に導き還元する方法（非特許文献６）【０００３】
また、医薬品の中間体として有望視される物質の一つとして、例えばα−メチル−Ｌ−セリンがある。α−メチル−Ｌ−セリンを酵素反応を利用して製造する方法としては、例えば、Ｄ−アラニンと５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸を原料とし、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．２．７）の利用する方法が知られている（非特許文献７）。【０００４】
【非特許文献１】Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，１９８７，７０，１１９４−１２１６
【非特許文献２】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８８，２９，２３５−２３８
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，５８，５９１８−５９２４
【非特許文献４】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９５，３６，３６３９−３６４２
【非特許文献５】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，２８０９−２８２０
【非特許文献６】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，２００１，１２，９４９−９５７
【非特許文献７】Ｗｉｌｓｏｎら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２３７  ３１７１−３１７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように光学活性アミノ酸の製法については様々な手法が研究されている。しかし、光学活性アミノ酸やセリン誘導体の種類は多く、より簡便な手法、またはより効率よく、様々な光学活性アミノ酸やセリン誘導体を生成する方法が求められている。本発明は、簡便な手法によるセリン誘導体およびその光学活性体を生成する新たな方法およびこれに用いられる酵素等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等はセリン誘導体の新たな製法について鋭意研究したところ、Ｌ−アミノ酸と所定のアルデヒドとを反応させる系において、その反応を触媒する新たなタンパク質を見出した。さらに、このタンパク質を用いることにより、簡便にセリン誘導体を生成でき、しかも生成物が光学活性を生じ得るアミノ酸である場合には、Ｌ−セリン誘導体を選択的に生成し得ることが見出された。また、具体的な一形態として、アミノ酸とホルムアルデヒドとを、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸を介さずに直接的に反応させるという従来にない反応系を構築したものである。本発明は係る知見に基づくものであり、下記Ｌ−セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素などを提供するものである。【０００７】
〔１〕酵素の存在下で、式（Ｉ）：
【化１】
0004877227.tif 000002
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるＬ−α−アミノ酸と、下記式（ＩＩ）：
【化２】
0004877227.tif 000003
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとを反応させる、式（ＩＩＩ）：
【化３】
0004877227.tif 000004
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
に示されるＬ−セリン誘導体の製造方法。
〔２〕前記酵素が、ラルストニア（Ralstonia）属、バリオボラックス（Variovorax）属、ボセア（Bosea）属およびシリシバクター（Silicibacter）属からなる群より選ばれるいずれかの属に属する微生物に由来する、上記〔１〕に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
〔３〕前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｌ）からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質である、上記〔１〕に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
〔４〕式（Ｉ）で示されるアミノ酸が、Ｌ−α−アラニンであり、式（ＩＩＩ）で示されるＬ−セリン誘導体がα−メチル−Ｌ−セリンである、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
〔５〕式（Ｉ）で示されるアミノ酸が、Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸*1であり、式（ＩＩＩ）で示されるＬ−セリン誘導体がα−エチル−Ｌ−セリンである、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
〔６〕式（Ｉ）で示されるアミノ酸が、Ｌ−α−アラニンであり、式（ＩＩＩ）で示されるＬ−セリン誘導体がα−メチル−Ｌ−スレオニンである、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のＬ−セリン誘導体の製造方法。
〔７〕ラルストニア（Ralstonia）属、バリオボラックス（Variovorax）属、ボセア（Bosea）属およびシリシバクター（Silicibacter）属からなる群より選ばれるいずれかの属に属する微生物に由来し、式（Ｉ）：
【化４】
0004877227.tif 000005
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるＬ−α−アミノ酸と、下記式（ＩＩ）：
【化５】
0004877227.tif 000006
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとから、下記式（ＩＩＩ）：
【化６】
0004877227.tif 000007
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
〔８〕式（Ｉ）：
【化７】
0004877227.tif 000008
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるＬ−α−アミノ酸と、下記式（ＩＩ）：
【化８】
0004877227.tif 000009
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとから、下記式（ＩＩＩ）：
【化９】
0004877227.tif 000010
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有する、下記（Ａ）〜（Ｌ）のいずれかのタンパク質。
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
〔９〕上記〔８〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１０〕下記（ａ）から（ｌ）よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号２２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号２２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号２９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号２９に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【化１０】
0004877227.tif 000011
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
【化１１】
0004877227.tif 000012
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
【化１２】
0004877227.tif 000013
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
〔１１〕上記〔９〕または〔１０〕に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
〔１２〕上記〔１１〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、簡便な手法でＬ−セリン誘導体を生成することができる。
また、本発明は、光学活性を有するＬ−セリン誘導体を生成する場合、Ｌ−型のアミノ酸を選択的に生成することができるため、Ｌ−アミノ酸の製法として効率がよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の一実施形態における反応系を示す概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態についてその最良の形態と共に説明する。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（１９９９）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。本明細書においては、特に断らない限り、配列番号は配列表中の配列番号を示す。また、本明細書において、酵素とは化学反応を触媒する活性を有するタンパク質のことをいう。【００１１】
本発明のＬ−セリン誘導体の製造方法においては、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と、式（ＩＩ）で示されるアルデヒドとを反応させる。【００１２】
式（Ｉ）におけるＲ1をより具体的に示すと以下の通りである。
Ｒ1が炭素数１〜６のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、ｎプロピル基、イソプロピル基、ｎブチル基、イソブチル基、ｓｅｃブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ｎペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎヘキシル基、イソヘキシル基などが例示される。【００１３】
また、Ｒ1が炭素数６〜１４のアリール基である場合とは、具体例を示すと、フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニリル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基などが例示される。【００１４】
Ｒ1が炭素数３〜１０のシクロアルキル基である場合とは、具体例を示すと、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプタニル基、シクロオクタニル基、シクロノナニル基、シクロデカニル基などが例示される。【００１５】
Ｒ1が炭素数７〜１９のアラルキル基である場合とは、具体例を示すと、ベンジル基、ベンズヒドリル基、フェネチル基、トリチル基などのフェニルアルキル基、シンナミル基、スチリル基、ナフチルアルキル基などが例示される。【００１６】
Ｒ1が炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基である場合とは、具体例を示すと、炭素数１〜１０のアルキル基に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、フェノキシ基、ヘプトキシ基、オクトキシ基、ノナノキシ基、デカノキシ基、およびウンデコキシ基から選ばれる基が置換されたものが例示される。【００１７】
Ｒ1は、上記炭化水素の炭素骨格中にヘテロ原子を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、酸素、窒素、硫黄などが挙げられる。
Ｒ1が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭化水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が例示される。【００１８】
また、Ｒ1は、上記に示す基において炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む炭化水素基であってもよい。
さらに、上記Ｒ1は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、Ｒ1は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）等から選ばれる１種または２種以上が置換・付加されたものであってもよい。【００１９】
式（Ｉ）に示されるＬ−α−アミノ酸としては、例えば、それぞれＬ−α−型の、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、２−アミノ−ｎ−酪酸などが挙げられ、好ましくは、アラニン、２−アミノ−ｎ−酪酸、より好ましくはアラニンが例示される。【００２０】
式（ＩＩ）におけるＲ2をより具体的に示すと次の通りである。【００２１】
Ｒ2は水素であってもよい。
Ｒ2が炭素数１〜６のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、ｎプロピル基、イソプロピル基、ｎブチル基、イソブチル基、ｓｅｃブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ｎペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎヘキシル基、イソヘキシル基などが挙げられる。【００２２】
また、Ｒ2が炭素数６〜１４のアリール基である場合とは、具体例を示すと、フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニリル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基などが挙げられる。【００２３】
Ｒ2が炭素数３〜１０のシクロアルキル基である場合とは、具体例を示すと、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプタニル基、シクロオクタニル基、シクロノナニル基、シクロデカニル基などが挙げられる。【００２４】
Ｒ2が炭素数７〜１９のアラルキル基である場合とは、具体例を示すと、ベンジル基、ベンズヒドリル基、フェネチル基、トリチル基などのフェニルアルキル基、シンナミル基、スチリル基、並びにナフチルアルキル基などが挙げられる。【００２５】
Ｒ2が炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基である場合とは、具体例を示すと、炭素数１〜１０のアルキル基に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、フェノキシ基、ヘプトキシ基、オクトキシ基、ノナノキシ基、デカノキシ基、およびウンデコキシ基から選ばれる基が置換されたものなどが挙げられる。【００２６】
Ｒ2は、上記炭化水素の炭素骨格中にヘテロ原子を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、酸素、窒素、硫黄などが挙げられる。
Ｒ2が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭素水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が含まれる。【００２７】
また、Ｒ2は、上記に示す基において炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む炭化水素基であってもよい。
さらに、上記Ｒ2は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、Ｒ2は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）等から選ばれる１種または２種以上が置換・付加されたものであってもよい。【００２８】
式（ＩＩ）で示される化合物としては、好ましくはホルムアルデヒド及びアセトアルデヒドが例示される。【００２９】
式（ＩＩＩ）におけるＲ1およびＲ2はそれぞれ式（Ｉ）および式（ＩＩ）におけるそれらと同じである。なお、Ｒ1およびＲ2との具体的な組み合わせによっては、生成物が光学不活性な立体異性体（メソ体）となる場合があり得るが、本発明の方法は光学活性を有するアミノ酸の製造方法に係るものであり、メソ体を生成するようなＲ1およびＲ2の組み合わせは含まない。例えば、α−ヒドロキシメチル−セリンはＬ−セリン誘導体には該当しないので、式（Ｉ）の化合物がセリンであって式（ＩＩ）の化合物がホルムアルデヒドという組み合わせは本発明のＬ−セリン誘導体の製造方法には含まれない。【００３０】
本発明のＬ−セリン誘導体の製造方法は、酵素を用いた反応によりＬ体のセリン誘導体を優先的に生成させる方法である。ここで「Ｌ体を優先的に生成」とは、生成されるセリン誘導体に占めるＬ体の比率が、Ｄ体よりも高いことを意味し、好ましくはＬ体の比率が７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。この場合のセリン誘導体に占めるＬ体の比率は[Ｌ体]／（［Ｄ体］＋[Ｌ体]）＊１００で算出される。【００３１】
本発明における好ましい一形態としては、例えば図１に示すように、Ｌ−α−アラニンとホルムアルデヒドとを反応させて、α−メチル−Ｌ−セリンを生成する系が含まれる。ホルムアルデヒドを、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸などを介さずに、直接的にＬ−アミノ酸と反応させてＬ−セリン誘導体を生成する反応系は従来においてまったく知られていなかった。このように、本発明によって、よりシンプルな反応系でＬ−セリン誘導体を得ることができる。また、ホルムアルデヒドを用いる場合、少量のホルムアルデヒドを逐次的に反応系に添加していくことが好ましい。ホルムアルデヒドを逐次添加することにより、副産物等の生成を抑制し得る。【００３２】
本発明における好ましい別の形態としては、例えば、Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸とホルムアルデヒドとを反応させてα−エチル−Ｌ−セリンを生成する系、及びＬ−α−アラニンとアセトアルデヒドとを反応させてα−メチル−Ｌ−スレオニンを生成する系が挙げられる。【００３３】
反応温度は、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。また、反応系のｐＨは、好ましくは４〜１０であり、より好ましくは６〜８である。【００３４】
上記反応終了後の酵素反応液からは、例えば、以下の様にしてL−セリン誘導体の単離を行うことが出来る。
酵素反応液のpHを下げ、加熱殺菌と共に、溶存タンパクの凝集を行った後、遠心分離、ろ過、ＵＦ（ウルトラフィルトレーション：限外ろ過）等の手段により、除菌・除タンパクを行う。この液中には、無機塩類が含まれるため、晶析時に、これらの析出を回避する為、脱塩を行う。方法は、ＮＦ（ナノフィルトレーション：ナノろ過）、電気透析、イオン交換樹脂等何れの方法を用いても構わない。【００３５】
必要に応じ上記の脱塩処理を行った後、反応液を濃縮していくとL−セリン誘導体の結晶が析出してくるが、性状は微細であり、結晶分離に際し、溶解度が高い故、高回収率が得られない上に、粘性も大きく取り扱いが困難であることが多い。その為、液を必要に応じてある程度予備的に濃縮した後に貧溶媒添加晶析を行うのが好ましい。予備的濃縮は、例えば結晶が析出し始めるまで行うことができる。ここで添加する貧溶媒としては、水溶性である低級アルコールやアセトンが好適である。貧溶媒晶析の後に、冷却晶析を組み合わせて、晶析率を上げることも可能である。このスラリーを分離し、湿ケーキを乾燥することにより、L−セリン誘導体の結晶を得ることができる。【００３６】
本発明において、式（ＩＩ）のアルデヒドと、Ｌ−α−アミノ酸との反応は所定の酵素の存在下において行われる。この反応を触媒し得る酵素としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属、ボセア（Ｂｏｓｅａ）属およびシリシバクター（Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ）属からなる群のいずれかに属する微生物から得ることができる。微生物についてのより具体的な例としては、ラルストニア・エスピー（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.）、バリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、ボセア・エスピー（Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．）、シリシバクター・ポメロイ（Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ）などが挙げられ、より好ましくは、ラルストニア・エスピー  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０７株、バリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０８株、バリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＮＢＲＣ１５１４９株、バリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＮＢＲＣ１５１５０株、ボセア・エスピー（Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．）ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０９株、シリシバクター・ポメロイ（Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ）ＤＳＭ１５１７１株などが例示される。【００３７】
なお、ＦＥＲＭ番号またはＮＢＲＣ番号が付与された菌株は下記の通り寄託された菌株であり、各番号を参照の上、所定の手続により分譲を受けることができる。【００３８】
（１）名称：ラルストニア・エスピー（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.）Ａ１１株（または別名：ＡＪ１１０４０５株）
寄託番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０７
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６
寄託された日：２００５年３月８日【００３９】
（２）名称；バリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）Ｂ２−Ｂ２株（別名：ＡＪ１１０４０６株）
寄託番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０８
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６
寄託された日：２００５年３月８日【００４０】
（３）バリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＡＪ１１０４０８株
寄託番号：ＮＢＲＣ１５１４９
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）バイオテクノロジー本部（ＤＯＢ）生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）
寄託機関住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８【００４１】
（４）バリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＡＪ１１０４０９株
寄託番号：ＮＢＲＣ１５１５０
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）バイオテクノロジー本部（ＤＯＢ）生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）
寄託機関住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８【００４２】
（５）名称：ボセア・エスピー（Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．）Ｂ２−Ｒ１株（別名：ＡＪ１１０４０７株）
寄託番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０９
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６
寄託された日：２００５年３月８日【００４３】
この他、シリシバクター・ポメロイ（Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ）ＤＳＭ１５１７１株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（住所：Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＧＥＲＭＡＮＹ）から、本願優先日当時から公衆が入手可能である他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（連絡先：Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１０８、Ｕ．Ｓ．Ａ．）からも、ＡＴＣＣ  ７００８０８株として本願優先日当時から公衆が入手可能である。【００４４】
表１−１および表１−２に、ラルストニア・エスピー（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.）Ａ１１株（または別名：ＡＪ１１０４０５株、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０７）の菌学的性質について示す。【００４５】
【表１−１】
0004877227.tif 000014
【００４６】
【表１−２】
0004877227.tif 000015
【００４７】
表２−１および表２−２に、バリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）Ｂ２−Ｂ２株（別名：ＡＪ１１０４０６株、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０８）の菌学的性質について示す。【００４８】
【表２−１】
0004877227.tif 000016
【００４９】
【表２−２】
0004877227.tif 000017
【００５０】
表３−１および表３−２に、ボセア・エスピー（Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．）Ｂ２−Ｒ１株（別名：ＡＪ１１０４０７株、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０９）の菌学的性質について示す。【００５１】
【表３−１】
0004877227.tif 000018
【００５２】
【表３−２】
0004877227.tif 000019
【００５３】
参考文献および使用キット
１）ＢＡＲＲＯＷ，（Ｇ．Ｉ．）ａｎｄ  ＦＥＬＴＨＡＭ，（Ｒ．Ｋ．Ａ）：Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  ３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ．１９９３，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．
２）坂崎利一・吉崎悦郎・三木寛二：新細菌培地学講座・下〈第二版〉．１９８８，近大出版，東京．
３）細菌同定キットＡＰＩ２０，ＮＥ，
（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ．ｆｒ／ｈｏｍｅ＿ｅｎ．ｈｔｍ）．【００５４】
本発明においてＬ−セリン誘導体を生成する反応に用いられる酵素としては、より具体的には下記のタンパク質が例示される。
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質【００５５】
上記のタンパク質を用いることにより、Ｌ−セリン誘導体を簡便に生成することができる。特に、Ｌ−α−アラニンとホルムアルデヒドとを反応させる系においては、実質的にα−メチル−Ｌ−セリンのみを生成可能であり、効率よく光学活性アミノ酸を得ることができる。【００５６】
配列番号５に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ａ）は、ラルストニア・エスピー  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０７株から単離し得る。配列番号９に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ｃ）は、バリオボラックス・パラドキサス  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０８株から単離し得る。配列番号１５に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ｅ）は、バリオボラックス・パラドキサス  ＮＢＲＣ１５１４９株から単離し得る。配列番号１９に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ｇ）は、バリオボラックス・パラドキサス  ＮＢＲＣ１５１５０株から単離し得る。配列番号２３に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ｉ）は、ボセア・エスピー  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０９株から単離し得る。配列番号３０に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ｋ）は、シリシバクター・ポメロイＤＳＭ１５１７１株から単離し得る。【００５７】
シリシバクター・ポメロイＤＳＭ１５１７１はゲノム配列が公開されており、配列番号３０の一部はセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＡＡＶ９６７５４．１）として登録されていた。このセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＡＡＶ９６７５４．１）の登録配列をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにて発現させた結果、目的のタンパク質は検出されず２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性も示さなかった。しかしながら、発明者らの検討の結果、登録配列にさらに上流の９アミノ酸残基が２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性に必須であることを見出した。配列３０は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＡＡＶ９６７５４．１）の登録配列に上流の９アミノ酸残基が加わっているものである。この配列をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに導入し発現させた結果、目的のタンパク質が検出され２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性が確認された。【００５８】
上記のように、本発明においては、（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）、（Ｉ）および（Ｋ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質も用い得る。まず（Ａ）のタンパク質を例とすると、上記（Ａ）に示すタンパク質と実質的に同じタンパク質として（Ｂ）に示すタンパク質が提供される。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。ただし、（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個の置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ７−８の条件下で、（Ａ）のタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。【００５９】
上記（Ｂ）に示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加などされるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列を有するポリヌクレオチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、（Ａ）をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び（Ａ）をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。【００６０】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および逆位等の変異には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、（Ａ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。【００６１】
（Ａ）のタンパク質と（Ｂ）のタンパク質の関係と同様に、（Ｃ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質として（Ｄ）のタンパク質が、（Ｅ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質として（Ｆ）のタンパク質が、（Ｇ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質として（Ｈ）が、（Ｉ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質として（Ｊ）が、（Ｋ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質として（Ｌ）が、それぞれ例示される。【００６２】
また、（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）、（Ｉ）および（Ｋ）のタンパク質とそれぞれ実質的に同一のタンパク質として、アミノ酸配列による相同性が、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列を有するタンパク質が例示される。なお、本明細書において、アミノ酸配列の相同性の計算は、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド鎖全長をもちいて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＭａｒｃｈｉｎｇ  ｃｏｕｎｔをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値またはこれと同等の計算手法による数値である。【００６３】
本発明は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本発明のポリヌクレオチドとして、上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）、（Ｋ）および（Ｌ）に示されるタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。【００６４】
また、本発明のポリヌクレオチドとして具体的には、下記（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）に示すポリヌクレオチドが例示される。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号２２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号２９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド【００６５】
上記（ａ）のポリヌクレオチドは、（Ａ）のタンパク質をコードしており、ラルストニア・エスピー  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０７株から単離し得る。（ｃ）のポリヌクレオチドは、（Ｃ）のタンパク質をコードしており、バリオボラックス・パラドキサス  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０８株から単離し得る。（ｅ）のポリヌクレオチドは（Ｅ）のタンパク質をコードしており、バリオボラックス・パラドキサス  ＮＢＲＣ１５１４９株から単離し得る。（ｇ）のポリヌクレオチドは（Ｇ）のタンパク質をコードしており、バリオボラックス・パラドキサス  ＮＢＲＣ１５１５０株から単離し得る。（ｉ）のポリヌクレオチドは（Ｉ）のタンパク質をコードしており、ボセア・エスピー  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６０９株から単離し得る。（ｋ）のポリヌクレオチドは（Ｋ）のタンパク質をコードしており、シリシバクター・ポメロイ  ＤＳＭ１５１７１株から単離し得る。【００６６】
単離の方法について（ａ）のポリヌクレオチドの場合を例に説明する。配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡは、ラルストニア・エスピーの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）参照）またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、例えば本発明の方法における反応を触媒する活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、配列番号４に記載された塩基配列に基づいてプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、あるいはプローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、コード領域を挟むように、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーの組み合わせを用いると、本タンパク質のコード領域全長を増幅することができる。【００６７】
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機  ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などを用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。【００６８】
また、上記（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）および（ｋ）と実質的に同一のポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。（ａ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記（ｂ）のポリヌクレオチドが、また（ｃ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記（ｄ）のポリヌクレオチドが、また（ｅ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記（ｆ）のポリヌクレオチドが、（ｇ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記（ｈ）のポリヌクレオチドが、（ｉ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記（ｊ）のポリヌクレオチドが、（ｋ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記（ｌ）のポリヌクレオチドがそれぞれ例示される。【００６９】
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号２２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号２９に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＬ−α−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるＬ−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド【００７０】
ハイブリダイズさせるポリヌクレオチドとしては、例えばプローブを用い得る。それぞれの場合において、プローブは、配列番号４、８、１４、１８、２２および２９に記載の各塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブは、プラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。また、一旦、上記のような実質的に同一のポリヌクレオチドが検出された後は、ＰＣＲ等によって増幅することも定法により可能である。【００７１】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。なお、塩基配列についての相同性（％）の計算は各遺伝子のORF全体（終止コドンを含む）をもちいて、株式会社ゼネティックスのソフトウェアGENETYX  Ver7.0.9を使用し、Unit  Size  to  Compare  =  6、pick  up  location  =  1の設定でpercentage計算させた数値として表示する。また、他の例として、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。【００７２】
なお、上記のように上記（ｂ）のポリヌクレオチドの場合には、それぞれ３０℃、ｐＨ８の条件下で、上記配列番号４の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ａ）の半分程度以上の活性、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の触媒活性を保持していることが望ましい。上記（ｄ）のポリヌクレオチドの場合については（Ｃ）のタンパク質と対比して同様である。上記（ｆ）のポリヌクレオチドの場合については（Ｅ）のタンパク質と対比して同様である。上記（ｈ）のポリヌクレオチドの場合については（Ｇ）のタンパク質と対比して同様である。上記（ｊ）のポリヌクレオチドの場合については（Ｉ）のタンパク質と対比して同様である。上記（ｌ）のポリヌクレオチドの場合については（Ｋ）のタンパク質と対比して同様である。【００７３】
本発明において用いられる酵素は、上記のような反応を触媒し得る状態で反応系内に存在すれば、その形態に特に限定はない。具体的形態としては、酵素を生産する微生物の培養物、その培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗精製タンパク質、さらに精製した精製タンパク質なども含まれる。精製処理されたタンパク質としては、各種精製法によって得られる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化タンパク質を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。【００７４】
次に本発明のタンパク質の製造方法、並びにこれに用いられる組換え体および形質転換体の作製方法について、上記（Ａ）のタンパク質を一例として説明する。他のタンパク質についても同様に実施可能である。【００７５】
上記（Ａ）のタンパク質を発現する形質転換体は、上記のいずれかの塩基配列を有するポリヌクレオチドを組み込んだ組換えポリヌクレオチドを作製し、これを用いて作製することができる。例えば、配列番号４に示される塩基配列を有するＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡを作製して適切な宿主に導入することにより、（Ａ）のタンパク質を発現する形質転換体を得ることができる。配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。培養等の取り扱いが簡便で、高価な成分を要せずとも培養できる宿主を用いることにより、Ｌ−セリン誘導体の大量生産をより簡便に、また安価に行うことができる。【００７６】
配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡを宿主に導入するために用いる組換えＤＮＡは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、これらのＤＮＡを、ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。タンパク質を発現させるためのプロモータとしては、ラルストニア・エスピー、バリオボラックス・パラドキサス、ボセア・エスピーなどに由来する上記酵素をコードする遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には、そのプロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを、配列番号４などのＤＮＡに連結し、そのプロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。【００７７】
組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８，  ３２６  （１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。【００７８】
目的のタンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、そのタンパク質を生産する形質転換体内でそのタンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。【００７９】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。【００８０】
形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ  （２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。【００８１】
本発明で用いられる触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＱＥ３０およびその誘導体等を用いることができる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。【００８２】
本発明で用いられるタンパク質を融合タンパク質封入体として生産させるためには、そのタンパク質の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。【００８３】
これらの遺伝子とタンパク質をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。【００８４】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。【００８５】
触媒活性を有するタンパク質またはその融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。【００８６】
また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。【００８７】
プロモータ、所定の活性を有する目的タンパク質またはその目的タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。【００８８】
得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、所定のタンパク質またはその融合タンパク質が発現生産される。【００８９】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、目的タンパク質内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いて目的タンパク質を切り出せるようにしてもよい。【００９０】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。【００９１】
目的のタンパク質またはこれを含む融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。目的タンパク質あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により、目的タンパク質あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、目的タンパク質あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化し、変性剤を透析等により除去して目的タンパク質を得ることができる。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明について実施例を示しより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。【００９３】
実施例１：２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性の検出
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社）で、表４に示した微生物をそれぞれ３０℃、２４時間培養した。得られた各微生物の菌体を３ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ液体培地に１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で２４時間培養した。得られた培養液０．１５ｍｌを０．２％α−メチル−ＤＬ−セリンを含む３ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ液体培地に接種し、３０℃、１２０往復／分で２４時間培養した。【００９４】
培養後、菌体を遠心分離し、培養液と等量の０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で菌体を２回洗浄した。０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、全量０．３ｍｌの菌体懸濁液を調製し、４℃にて超音波破砕処理をした。遠心分離（１６，０００ｇ、１０分）で得られる上清を０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し、無細胞抽出液とした。【００９５】
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭα−メチル−ＤＬ−セリン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１ｍＭ硫酸マグネシウムの組成を有する反応液−１に、０．０５ｍｌの無細胞抽出液を添加して、全量０．１ｍｌで３０℃、１０分間反応させた。ホルムアルデヒドキット−テスト  ワコー（和光純薬工業）内のアルカリ試液（５Ｎ−水酸化カリウム）を０．１ｍｌ混和させることで反応を停止した。以降、キット付帯のマニュアルに従い、ホルムアルデヒドの検出反応を行い、５５０ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ１１）。なお、対照として前記反応液−１においてα−メチル−ＤＬ−セリンの代わりに水を添加したもので行った反応によって得られる反応液の吸光度（Ｅ１０）を同様に測定し、α−メチル−ＤＬ−セリン特異的な吸光度変化（ＥΔ１＝Ｅ１１−Ｅ１０）を算出し、表４に示した。以上の結果より、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性が確認された。【００９６】
【表４】
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【００９７】
実施例２：Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.  Ａ１１株（ＡＪ１１０４０５）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの精製
（１）無細胞抽出液の調製
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社）で３０℃、２５．５時間培養したラルストニア・スピーシーズの菌体を５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ液体培地に接種し、３０℃、１２０往復／分で２１時間培養した。得られた培養液を０．２％  α−メチル−ＤＬ−セリン、０．１７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ（ｐＨ７．０）液体培地２Ｌに接種し、５００ｍｌ容の坂口フラスコに１００ｍｌずつ分注し、３０℃、１２０往復／分で２４時間培養した。得られた菌体を遠心分離（８，０００ｇ、１０分）により集菌し、０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄し、５０ｍｌの菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理により菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分）で得られる上清を超遠心分離（２００，０００ｇ、３０分）を行い、同緩衝液を用いて透析し、無細胞抽出液を得た。【００９８】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
上記（１）にて得られた無細胞抽出液を予め０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム（アマシャムバイオサイエンス製）にアプライし、０−１Ｍ塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出した。なお、この操作は無細胞抽出液を１／３づつ３回に分けて行った。【００９９】
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー
上記（２）で得られた酵素の活性画分を０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、緩衝液Ｉとする）に透析し、等量の２Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｉと混和し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｉと平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし１−０Ｍ硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により、酵素を溶出した。【０１００】
（４）ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
上記（３）で得られた酵素の活性画分を０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む２．５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、予め同緩衝液で平衡化されたＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅＨＡｐカラム（生化学工業製）にアプライした。２．５−５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて酵素を溶出させた。
このようにして得られた酵素の活性画分は、比活性０．７２Ｕ／ｍｇであり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、クーマシーブリリアントブルー染色液でゲルを染色させたところ、分子量約４７，０００の位置に均一なバンドが検出された。【０１０１】
実施例３：Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.  Ａ１１株（ＡＪ１１０４０５）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列およびコードする塩基配列の決定
実施例２で調製した精製酵素１００ｐｍｏｌ相当をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、プロテインシーケンサーに供し、３０アミノ酸を決定した（配列番号１）。【０１０２】
次いで、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.  ＡＪ１１０４０５のゲノムＤＮＡ５μｇをＳａｌＩ（７５Ｕ）にて切断した後、ＴａＫａＲａＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔのマニュアル記載の方法に従って、ＳａｌＩカセットとライゲートした。ライゲートミックスを鋳型として、カセットプライマーＣ１とプライマーＡＬＤ＿ＲＶ＿Ｓ１（配列番号２）の組み合わせによってＰＣＲ（９４℃：３０秒、４７℃：２分、７２℃：１分、３０サイクル）を行った。次いでこのＰＣＲ反応液を鋳型として２回目のＰＣＲ（９４℃：３０秒、５５℃：２分、７２℃：１分、３０サイクル）をカセットプライマーＣ２とプライマーＡＬＤ＿ＲＶ＿Ｓ２（配列番号３）を用いて行った。増幅が確認された約０．７ｋｂ長の断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（プロメガ社）にライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。約０．７ｋｂの断片について塩基配列を決定したところ目的タンパク質のＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。このプラスミドをＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ処理して得られる約０．３ｋｂ長の遺伝子断片をプローブとして、染色体ＤＮＡを各種制限酵素処理後、サザン解析したところ、ＳｐｈＩ処理した場合に約２．４ｋｂにポジティブシグナルを確認した。【０１０３】
次いで、染色体ＤＮＡをＳｐｈＩ処理後、アガロース電気泳動し、約２．５ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１８のＳｐｈＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＳＫＡ０４０９８として、挿入配列について塩基配列を決定したところ、４３８アミノ酸をコードするＯＲＦが存在した（配列番号４）。【０１０４】
実施例４：Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.  Ａ１１株（ＡＪ１１０４０５）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる発現
ｐＳＫＡ０４０９８を鋳型として、プライマーＲａｌ＿Ｅｃｏ（配列番号６）、およびプライマーＲａｌ＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号７）をもちいてＰＣＲにより２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子のＯＲＦ領域１．３ｋｂを増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理した後、予めＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理したｐＵＣ１８とライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミド（ｐＲａｌ２）を有する形質転換体を得た。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＲａｌ２と命名した。【０１０５】
ＪＭ１０９／ｐＲａｌ２を１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。０．１５ｍｌの前培養液を３ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で培養を行った。培養１時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液０．３ｍＬを用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、０．０３Ｕ／ｍｇであった。なお、ｐＵＣ１８をＪＭ１０９に導入した形質転換体；ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８を用い上記の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は検出限界以下であった。【０１０６】
実施例５：Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.  Ａ１１株（ＡＪ１１０４０５）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによるα−メチル−Ｌ−セリン生成反応
１００ｍＭホルムアルデヒド、１００ｍＭＬ−アラニン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液に実施例２で調製した精製酵素溶液を５０μｌ添加し、３０℃で２０時間反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物５０μｌに１ｍＭ硫酸銅水溶液を１００μｌ、水５０μｌ加え、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−６１００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：０．５ｍＭ硫酸銅水溶液、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２１５ｎｍ）。その結果２７．５ｍＭのα−メチル−Ｌ−セリンの生成が確認され、α−メチル−Ｄ−セリンは検出限界以下であった。なお、標準品としては、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ社製のα−メチル−Ｌ−セリン［コード番号：２９００１−２５００］α−メチル−Ｄ−セリン［コード番号：２９００２−２５００］を用いた。【０１０７】
実施例６：Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.  Ａ１１株（ＡＪ１１０４０５）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによるα−メチル−Ｌ−セリン生成
ＪＭ１０９／ｐＲａｌ２を１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３０℃、２４時間前培養した後、アンピシリン１００ｍｇ／ｌ及びＩＰＴＧ０．５ｍＭを含むＬＢ培地４００ｍｌで３４℃、１６時間前培養した。培養液４００ｍｌから得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む１００ｍＭ  燐酸緩衝液（pH７．４）を用いて洗菌した。得られた菌体を１００ｍｌの反応液（３００ｍＭＬ−アラニン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））に懸濁した。この反応液に３０℃にて６００ｍＭホルムアルデヒド水溶液５０．５ｍｌを撹拌しながら２４時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。添加終了後、反応混合物５０μｌに１ｍＭ硫酸銅水溶液を５０μｌ、水１００μｌ加え、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−６１００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：０．５ｍＭ硫酸銅水溶液、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２１５ｎｍ）。その結果２７．０ｍｍｏｌのα−メチル−Ｌ−セリンの生成が確認され、α−メチル−Ｄ−セリンは検出限界以下であった。【０１０８】
実施例７：Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  Ｂ２−Ｂ２株（ＡＪ１１０４０６）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．ＡＪ１１０４０５株由来ＯＲＦ領域を実施例３と同様の方法により、ＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物をプローブとして、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  Ｂ２−Ｂ２株のゲノムＤＮＡをＰｓｔＩによって処理した後、サザン解析を行ったところ、約２ｋｂ長にポジティブシグナルが得られた。【０１０９】
次いで、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  Ｂ２−Ｂ２株のゲノムＤＮＡをＰｓｔＩ処理後、アガロース電気泳動し、約２ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＵＣＢ２−Ｂ２として、挿入配列について塩基配列を決定したところ、４４１アミノ酸からなるＯＲＦ（配列番号８）が存在するのを確認した。【０１１０】
次に、ｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ製）を鋳型として、プライマーｐＴＶ１１８Ｎ＿Ｎｄｅ（配列番号１０）、及びｐＴＶ１１８Ｎ＿Ｎｄｅc（配列番号１１）を使用してＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（プロメガ製）を用いて、ｐＴＶ１１８Ｎｄを得た。ｐＵＣＢ２−Ｂ２を鋳型として、プライマーＢ２−Ｂ２＿Ｎｄｅ（配列番号１２）、及びＢ２−Ｂ２＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号１３）によりＰＣＲ反応により、得られた１．２ｋｂの増幅断片をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ処理し、ｐＴＶ１１８ＮｄのＮｄｅＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＴＶＶＨＭＴ０１とした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴＶＶＨＭＴ０１と命名した。【０１１１】
ＪＭ１０９／ｐＴＶＶＨＭＴ０１を１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  燐酸緩衝液（pH７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定した。反応液組成５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１０ｍＭα−メチル−Ｌ−セリン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸にて、反応温度３０℃の条件で遊離するホルムアルデヒドの定量を行ったところ、９ｍＵ／ｍｇであった。なお、ｐＴＶ１１８ＮｄをＪＭ１０９に導入した形質転換体；ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎｄより上記の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は検出限界以下であった。【０１１２】
実施例８：Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  ＮＢＲＣ１５１４９由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．ＡＪ１１０４０５株由来ＯＲＦ領域を実施例３と同様の方法により、ＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物をプローブとして、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  ＮＢＲＣ１５１４９のゲノムＤＮＡをＰｓｔＩによって処理した後、サザン解析を行ったところ、２ｋｂ長にポジティブシグナルが得られた。【０１１３】
次いで、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  ＮＢＲＣ  １５１４９のゲノムＤＮＡをＰｓｔＩ処理後、アガロース電気泳動し、約２ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＵＣ１５１４９として、挿入配列について塩基配列を決定したところ、４４０アミノ酸からなるＯＲＦ（配列番号１４）が存在するのを確認した。ｐＵＣ１５１４９を鋳型として、プライマー１５１４９＿Ｎｄｅ（配列番号１６）、及び１５１４９＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号１７）によりＰＣＲ反応により、得られた１．２ｋｂの増幅断片をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ処理し、ｐＴＶ１１８ＮｄのＮｄｅＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＴＶＶＨＭＴ０２とした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴＶＶＨＭＴ０２と命名した。【０１１４】
ＪＭ１０９／ｐＴＶＶＨＭＴ０２を１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、１３ｍＵ／ｍｇであった。【０１１５】
実施例９：Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  ＮＢＲＣ１５１５０由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．ＡＪ１１０４０５株由来ＯＲＦ領域を実施例３と同様の方法により、ＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物をプローブとして、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  ＮＢＲＣ１５１５０のゲノムＤＮＡをＰｓｔＩによって処理した後、サザン解析を行ったところ、２ｋｂ長にポジティブシグナルが得られた。【０１１６】
次いで、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  ＮＢＲＣ  １５１５０のゲノムＤＮＡをＰｓｔＩ処理後、アガロース電気泳動し、約２ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＵＣ１５１５０として、挿入配列について塩基配列を決定したところ、４４０アミノ酸からなるＯＲＦ（配列番号１８）が存在するのを確認した。ｐＵＣ１５１５０を鋳型として、プライマー１５１５０＿Ｎｄｅ（配列番号２０）、及び１５１５０＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号２１）によりＰＣＲ反応により、得られた１．２ｋｂの増幅断片をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ処理し、ｐＴＶ１１８ＮｄのＮｄｅＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＴＶＶＨＭＴ０３とした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴＶＶＨＭＴ０３と命名した。【０１１７】
ＪＭ１０９／ｐＴＶＶＨＭＴ０３を１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、３６ｍＵ／ｍｇであった。【０１１８】
実施例１０：Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．  Ｂ２−Ｒ１株（ＡＪ１１０４０７株）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．ＡＪ１１０４０５株由来ＯＲＦ領域を実施例３と同様の方法により、ＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物をプローブとして、Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．  Ｂ２−Ｒ１株  ゲノムＤＮＡをＰｓｔＩによって処理した後、サザン解析を行ったところ、５ｋｂ長にポジティブシグナルが得られた。【０１１９】
次いで、Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．  Ｂ２−Ｒ１株のゲノムＤＮＡをＰｓｔＩ処理後、アガロース電気泳動し、約５ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブを用いてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＵＣＢ２−Ｒ１として、挿入配列について塩基配列を決定したところ、４４０アミノ酸からなるＯＲＦ（配列番号２２）が存在するのを確認した。ｐＵＣＢ２−Ｒ１を鋳型として、プライマーＢ２−Ｒ１＿Ｐｓｈ（配列番号２４）、及びＢ２−Ｒ１＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号２５）によりＰＣＲ反応により、得られた１．２ｋｂの増幅断片をＰｓｈＢＩ／ＰｓｔＩ処理し、ｐＴＶ１１８のＮｄｅＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＴＶＢＨＭＴとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴＶＢＨＭＴと命名した。ｐＵＣＢ２−Ｒ１を鋳型として、プライマーＢ２−Ｒ１＿Ｅｃｏ（配列番号２６）、及びＢ２−Ｒ１＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号２５）によりＰＣＲ反応により、得られた１．２ｋｂの増幅断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＵＣＢＨＭＴとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＵＣＢＨＭＴと命名した。【０１２０】
ＪＭ１０９／ｐＴＶＢＨＭＴを１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、９５ｍＵ／ｍｇであった。ＪＭ１０９／ｐＵＣＢＨＭＴを１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、３１８ｍＵ／ｍｇであった。
なお、ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８より上記の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は検出限界以下であった。【０１２１】
実施例１１：Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＭ１５１７１由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＭ１５１７１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＳｉｌｉｃｉ  ＡＴＧ  ＥｃｏＲＩ（配列番号２７）、及びＳｉｌｉｃｉ＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号２８）によりＰＣＲ反応を行い１．３ｋｂの配列番号２９を含む増幅断片を得た。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＵＣ１８ＳＨＭＴとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＵＣＳＨＭＴと命名した。【０１２２】
ＪＭ１０９／ｐＵＣＳＨＭＴを１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定した。反応液組成５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭα−メチル−Ｌ−セリン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸にて、反応温度３０℃の条件で遊離するホルムアルデヒドの定量を行ったところ、１９０ｍＵ／ｍｇであった。【０１２３】
次いで、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＭ１５１７１染色体ＤＮＡを鋳型としてプライマーＳｉｌｉｃｉ  ＡＴＧ  ｐＱＥ３０  ＢａｍＨＩ  （配列番号３４）、Ｓｉｌｉｃｉ＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号２８）により配列番号２９を含む約１．３  ｋｂ長のＰＣＲ産物を得た。次いで、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩにて消化することにより得られるＤＮＡ断片をｐＱＥ３０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩサイトに挿入した。これにより５´末端に６×Ｈｉｓが融合した２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを生成することのできるプラスミドが得られ、これをｐＱＥ３０ＳＨＭＴと命名した。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＱＥ３０ＳＨＭＴと命名した。【０１２４】
得られた形質転換体を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地（ＬＢ＋ａｍｐ）で３０℃にて１４ｈｒ培養し、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加しさらに３ｈｒ培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液をＱＩＡｅｘｐｒｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い添付プロトコールに従って精製した。得られたタンパク質をＨｉｓ融合ＳＨＭＴとした。【０１２５】
得られたＨｉｓ融合ＳＨＭＴを用いて、１０ｍＭホルムアルデヒド、１００ｍＭ  Ｌ−アラニン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなる１００μＬの溶液にて、３０℃で１０分間反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物１００μｌに１ｍＭ硫酸銅水溶液を２００μｌ加え、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−６１００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：０．５ｍＭ硫酸銅水溶液、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２１５ｎｍ）。その結果、０．３６７ｍＭのα―メチル−Ｌ−セリンの生成が確認され、α―メチル−Ｄ−セリンは検出限界以下であった。【０１２６】
実施例１２：Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによるα−メチル−Ｌ−セリン生成
上記の実施例の方法で作製したＪＭ１０９／ｐＴＶＶＨＭＴ０１、ＪＭ１０９／ｐＴＶＶＨＭＴ０２、ＪＭ１０９／ｐＴＶＶＨＭＴ０３をそれぞれ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、及び０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。培養液１００ｍｌから得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む１００ｍＭ  燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌した。
【０１２７】
得られた各菌体を１００ｍｌの反応液（１５０ｍＭＬ−アラニン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））に懸濁した。この反応液に３０℃にて３００ｍＭホルムアルデヒド水溶液５０．５ｍｌを撹拌しながら２４時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。添加終了後、反応混合物５０μｌに１ｍＭ硫酸銅水溶液を５０μｌ、水１００μｌ加え、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−６１００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：０．５ｍＭ硫酸銅水溶液、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２１５ｎｍ）。その結果、表５に示すα−メチル−Ｌ−セリンの生成が確認され、α−メチル−Ｄ−セリンはいずれの場合も検出限界以下であった。【０１２８】
【表５】
0004877227.tif 000021
【０１２９】
実施例１３：Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．  Ｂ２−Ｒ１株（ＡＪ１１０４０７株）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ発現株の作成
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモータ領域を、配列番号３１、配列番号３２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより０．３ｋｂの断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ―Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質
転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモータの方向がｌａｃプロモータと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモータを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩにて処理して得られるＤＮＡ断片と、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたＴｒｒｎＢターミネータを含む０．７ｋｂのＤＮＡ断片とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐｔｒｐ２とした。このｐｔｒｐ２を鋳型として、プライマー（配列番号３１、配列番号３３）を用いてｔｒｐプロモータ領域を含む０．３ｋｂの断片を増幅した。このＰＣＲ産物とｐｔｒｐ２のプロモータ領域を置換することを目的に、ＰＣＲ産物をＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩ消化によって得られる断片をｐｔｒｐ２のＥｃｏＲＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションしＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このプラスミドをｐｔｒｐ４とした。さらに、ｐＴＷＶ２２８（ＴａＫａＲａ製）をＮｄｅＩで処理した後に末端の平滑化処理を行い、次いでＡａｔＩＩで処理し１．９ｋｂの断片を得た。この断片に、ｐｔｒｐ４をＡａｔＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理した０．４ｋｂの断片とｐＫＫ２２３−３をＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理した０．７ｋｂの断片とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択しこのプラスミドをｐｔｒｐ１３とした。【０１３０】
Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．Ｂ２−Ｒ１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＢ２−Ｒ１＿Ｐｓｈ（配列番号２４）、及びＢ２−Ｒ１＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号２５）によりＰＣＲ反応により、得られた１．２ｋｂの増幅断片をＰｓｈＢＩ／ＰｓｔＩ処理し、ｐｔｒｐ１３のＮｄｅＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐｔｒｐ１３ＢＨＭＴとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐｔｒｐ１３ＢＨＭＴと命名した。【０１３１】
上記で得られたＪＭ１０９／ｐｔｒｐ１３ＢＨＭＴをアンピシリン（１００μｇ／ｍl）を含むＬＢ寒天倍地（ペプトン１０ｇ／l、酵母エキス５ｇ／l、ＮａＣｌ１０ｇ／l）上で３０℃、２４時間培養した。次に１／８プレート分の細胞を５０ｍＬのＬＢ培地（ペプトン１０ｇ／l、酵母エキス５ｇ／l、ＮａＣｌ１０ｇ／l）に移した。シェーカー（１２０ｒｐｍ）を用いて３０℃、１６時間培養した培養液１ｍｌ分を以下に示す組成の培地３００ｍlに植菌し、１．０ｌの容量の実験室用ファーメンター内で７００ｒｐｍの回転数で攪拌通気（１／１ｖｖｍ）しながらバッチ培養を行った。糖切れ後の培養液１５ｍｌ分を同じ組成の培地３００ｍlに植菌し、同様のファーメンターによる攪拌通気（１／１ｖｖｍ）、３５℃で糖フィード培養を行った。ｐＨは気体アンモニアで自動的に７．０に調整した。【０１３２】
培地の組成（ｇ／ｌ）
Ｇｌｕｃｏｓｅ  ２５．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4  ５．０
Ｈ3ＰＯ4  ３．５
ＦｅＳＯ4  ７ａｑ  ０．０５
ＭｎＳＯ4  ７ａｑ  ０．０５Ｔｈｉａｍｉｎｅ  ＨＣｌ  ０．００１
Ｐｙｒｉｄｏｘｙｎｅ  ＨＣｌ  ０．０１
ＧＤ１１３  ０．１
アンピシリン  ０．１
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。他の組成分のｐＨはＫＯＨで５．０に調整した。
フィード糖液の組成（ｇ／l）
Ｇｌｕｃｏｓｅ  ５００．０
ｐＨ  無調【０１３３】
実施例１４：Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．  Ｂ２−Ｒ１株（ＡＪ１１０４０７株）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによるα―メチル−Ｌ−セリンの生成
上記の実施例１３で作製したＪＭ１０９／ｐｔｒｐ１３ＢＨＭＴの培養液３０ｍｌを用いてα―メチル−Ｌ−セリン生成反応を行った。３００ｍｌの反応液（１２００ｍＭＬ−アラニン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ１３ＢＨＭＴの培養液１０％）に３０℃にて２４００ｍＭホルムアルデヒド水溶液１５０ｍｌを撹拌しながら４８時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。添加終了後、反応混合物５０μｌに１ｍＭ硫酸銅水溶液を９５０μｌ加え、水で５倍希釈してＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−６１００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：０．５ｍＭ硫酸銅水溶液、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２１５ｎｍ）。その結果、３２７．３ｍｍｏｌのα―メチル−Ｌ−セリンの生成が確認され、α―メチル−Ｄ−セリンはいずれの場合も検出限界以下であった。【０１３４】
実施例１５：α―メチル−Ｌ−セリンの精製
実施例１４で作成した反応溶液から遠心分離により簡単に除菌を行った。得られた反応溶液４５１g（α―メチル−Ｌ−セリン：９．０８％）に硫酸３．３gを加え、ｐHを３に調整し、５０℃にて１時間、溶存タンパクの加熱凝集を行った。これを０．２μｍのＭＦにて、ろ過を行い、残渣洗浄水を含め、４８２ｇの溶液（α―メチル−Ｌ−セリン：８．４５％、Ｄ−アラニン：０．１３％、Ｌ−アラニン：０．０８％）を得た。この溶液の内１６５ｇを採り、５％のα―メチル−Ｌ−セリン濃度となる様、水で希釈した後、Ｈ型の強酸性カチオン交換樹脂（バイエル製  レバチットＳ−１４６８）１２０ｍｌを充填した樹脂塔にフィードし、α―メチル−Ｌ−セリンを吸着させた。樹脂量の２倍量の水を貫流して洗浄した後、１Ｍのアンモニア水を用いて溶離を行い、３５２ｇ（α―メチル―L−セリン含量：約３．８％）の水溶液を得た。【０１３５】
この溶液を、減圧下、濃縮を行い、アンモニアを概ね留去した。この時の溶液のｐＨは約８．２であり、残るカチオン類を除去する為、この溶液をＨ型の弱酸性カチオン交換樹脂（ＩＯＮＡＣ  Ａ−３６５）２０ｍｌを充填した樹脂塔に貫流させ、洗浄液も含め、ｐＨ５．２の２０４ｇの貫流液を得た。続けて、この貫流液を濃縮し、結晶が析出し始めた段階で濃縮を止めた。この時の溶液重量は、３５．５５ｇ（α―メチル−Ｌ−セリン：３７．２％）であり、ここに室温下、６７ｇのメタノールを添加することにより、貧溶媒添加晶析を行った。この後、撹拌下１０℃にて１時間熟成した後、結晶分離を行い、７５％メタノール水溶液１２ｇを用いて結晶を洗浄した。得られた湿結晶を、４０℃で２時間減圧乾燥し、１２．１３ｇの乾燥結晶を得た。α―メチル−Ｌ−セリン含量は、市販試薬を標品として１００．７％であり、不純物としては、Ｄ−アラニン：０．０６％、Ｌ−アラニン：０．０５％を含有していた。【０１３６】
実施例１６：Ｂｏｓｅａ  ｓｐ．  由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによるα―エチル−Ｌ−セリン生成
ＪＭ１０９／ｐＵＣＢＨＭＴを酵素菌体として１００ｍｌの反応液（１５０ｍＭ  Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））に懸濁した。この反応液に３０℃にて３００ｍＭホルムアルデヒド水溶液５０．５ｍｌを撹拌しながら２４時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。菌体分離（８，０００ｇ、１０ｍｉｎ）を行った反応液（５０ｍｌ  ：  a−エチル−セリンとして６３２ｍｇ、４．７５ｍｍｏｌ含有）を、予め５０ｍｌのメタノールでの活性化、及び１００ｍｌのＨ2Ｏでの平衡化を行ったＭｅｇａ  Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＳＣＸ  （１０Ｇ）  （Ｖａｒｉａｎ，  Ｉｎｃ）にアプライした。１００ｍｌの水で洗浄した後、５０ｍｌの０．５Ｎ−ＨＣｌで溶出し、２．５ｍｌずつ分取した。各分取画分をＨＰＬＣ分析によってa−エチル−セリン／（a−エチル−セリン  ＋  Ｌ−２−アミノ−ｎ−酪酸）の存在比を確認し、存在比＞９９％である画分を分離画分とした。非分離画分については濃縮乾固した後、１０ｍｌ程度の水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨ７．０付近に調整し、再び上記の条件で分離を行った。この操作を２回繰り返し、分離画分を集めて、濃縮乾固した。１００ｍｌ程度の水に溶解し、陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，  ｗｈａｔｍａｎ）を添加して、ｐＨを６．０付近に調整した。その後、樹脂をろ過によって取り除き、ろ液に対してアセトンを滴下し、結晶を析出させ、乾燥し、白色の結晶を得た（３４８ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）。ＮＭＲスペクトルとＥＳＩ−ＭＳ分析によって、構造を確認後、日本分光製旋光度計（ＤＩＰ−３７０）により旋光度を測定した（［ａ］D20＝−３．４±０．４  （ｃ＝１，  ５Ｎ−ＨＣｌ）、［ａ］D20＝−４．５±０．０４  （ｃ＝１０，  ５Ｎ−ＨＣｌ））。文献記載値と比較することにより、酵素反応の主生成物は（−）体、すなわち（Ｓ）体であることが確認された（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００１，  ７，  ６１９−６２５及びＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １９８８，  ２９，  ２３５−２３８）。【０１３７】
また菌体分離（８，０００ｇ、１０ｍｉｎ）を行った反応液（２５ｍｌ  ：  a−エチル−セリンとして３１６ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ含有）に５ｍｍｏｌのＮａＨＣＯ3を添加し、氷冷下でｐＨ９．５に調整した。１０ｍｌのアセトンに溶解させた２．３８ｍｍｏｌのベンゾイルクロリドを１ｈｒかけて、ｐＨを９−１０に保ちながら、滴下した。その後、室温で３ｈｒ反応させた後、ＨＣｌを加えることでｐＨ２．０に調整させた。ＥｔＯＡｃ（１０ｍｌ  ｘ  ３）抽出、ＭｇＳＯ4による脱水処理後、濃縮乾固させた。ＨＰＬＣ分析によって安息香酸が大量に含まれていたことからメタノールに溶解させ、ＴＬＣ（ＰＬＣ  ｐｌａｔｅ  ２０  ｘ  ２０ｃｍ，  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ254，  ２ｍｍ  （Ｍｅｒｃｋ）、展開溶媒：ＥｔＯＡｃ  ／  ＡｃＯＨ  ＝  ２０  ／  １）によって分離し、ＵＶ照射による確認を行って、シリカゲルをプレートから掻き取り、メタノール（１００ｍｌ）で抽出し、濃縮乾固し、白色の結晶を得た。少量の水を加え、ＮａＯＨでｐＨ８．０付近に調整することで溶解させ、次いでＨＣｌを滴下して、ｐＨ２．０付近に調整することで再結晶させた。結晶をろ過分離し、乾燥させた後、少量の２−プロパノールに溶解させ、ヘキサンを滴下することで再結晶させ、１１０ｍｇの標品を得た（０．４６ｍｍｏｌ）。ＨＰＬＣ分析は９９％  ａｒｅａであり、ＮＭＲスペクトルとＥＳＩ−ＭＳ分析によって構造の確認を行い、旋光度測定を行った（［ａ］D20＝−１１．４±０．２  （ｃ＝１，  メタノール））。文献記載値と比較することにより酵素反応の主生成物は（−）体、すなわち（Ｓ）体であることが確認された（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００１，  ７，  ６１９−６２５）。【０１３８】
実施例１７：Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ.  Ａ１１株（ＡＪ１１０４０５）由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによるα―メチルスレオニン生成
５１ｍＭアセトアルデヒド、５０ｍＭＬ−アラニン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液に実施例２で調製した精製酵素溶液を５０μｌ添加し、３０℃で１７．５時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α―メチルスレオニンの分子イオンピークが観測された。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明はアミノ酸の製法に係る産業において有用である。本発明は、各種のセリン誘導体、光学活性アミノ酸の製造に寄与し、例えば医薬中間体などの製法として利用されることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１４０】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号２０：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２４：プライマー
配列番号２５：プライマー
配列番号２６：プライマー
配列番号２７：プライマー
配列番号２８：プライマー
配列番号３１：プライマー
配列番号３２：プライマー
配列番号３３：プライマー
配列番号３４：プライマー
【図１】
0004877227.tif 000031
【配列表】
0004877227000001.app