(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血前及び後であって神経細胞アポトーシス前に、１ｇ〜２ｇの範囲の遊離CDP−コリンに相当する量の日用量で被験者に投与することによる、CDP−コリンまたはその製薬上許容できる塩を含む神経細胞アポトーシスの予防的治療用医薬組成物。
【請求項２】
CDP−コリンの製薬上許容できる塩が、無水形または水和形の、アルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩、または塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、乳酸、マロン酸、酒石酸、アクリル酸、メタクリル酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、サリチル酸、桂皮酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびニコチン酸からなる群から選択される鉱酸または有機酸との塩である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
急性虚血事態を被る危険のある被験者の治療のための、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
大手術を受ける被験者の治療のための、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
被験者がヒトの患者である、請求項１〜４のいずれか１項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
説明
【０００１】
本発明は、脳虚血の予防的治療のためのCDP−コリンの使用に関する。
【０００２】
局所虚血の脳虚血性二次障害の発生とその程度に関わる因子には、幾つかのものがある。これらの因子として次のものが挙げられる：神経伝達物質ホメオスタシスのエネルギー欠損および損失、並びにカチオン；血液脳関門機能を変化させ、そして白血球の浸潤に関与するサイトカインの動員のみならず、初期遺伝子の誘導および随時発現；梗塞中枢域における急速細胞死および末梢または周縁領域における遅延死―しばしばアポプトシスに関連する；並びに修復形成現象および血管形成を促進する栄養因子およびそれらの受容体の誘導および発現。
【０００３】
虚血事態後の細胞死の機構についての知識は、それら細胞死機構の制御がその外部治療能力を可能にするから、１つの基礎をなす面である。プログラムされた細胞死の遺伝的制御が、線虫カエノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）において主として調べられたが、それは遺伝子ced-3、ced-4およびced-9に関係がある。システイン依存性哺乳動物プロテアーゼの１種であるキャスパーゼ（caspases）はced-3遺伝子産生物のある種の等価物に相当するものであって、アポプトシスの発生に決定的に重要である。キャスパーゼは幾つかの細胞死モデルに差別的に関与するものであって、細胞生存のための異なる基礎基質に作用してそれら基質の崩壊をもたらす。キャスパーゼ１、２、３、６および８が、異なる中枢神経系の疾患に関係がある。T. E. Andreoli（Am. J. Med.、107、488−506、1999）およびB. C. Albensi（Drug News Perspect.、12（8）、453−457、1999）は、アポプトシスの現象およびキャスパーゼの役割について徹底的に再検討した。
【０００４】
現在、一過性の全虚血または局所虚血によって誘発された損傷の後のキャスパーゼの発現については、わずかな文献データしかない。現在の研究では、各キャスパーゼについて関与時間および細胞の種類に依存する可変性発現が示された。本出願人は、キャスパーゼは―ヒトの脳およびラットの局所虚血モデルの両者で―虚血症状発現に関与すること、およびキャスパーゼの発現は最初の梗塞日数以内に周縁領域で特に顕著であることが証明されることを見いだした。
【０００５】
CDP−コリン（シチジン二リン酸−コリン、シチコリン）は、膜ホスファチジルコリン合成の鍵となる前駆体である。実験モデルでは、CDP−コリンの外因性投与は、ホスファチジルコリン合成の増加および遊離脂肪酸レベルの低下を誘発することによって細胞膜の破壊を低下させる。CDP−コリンによる治療は、幾つかの虚血または低酸素症動物モデルで有益であることがわかった。CDP−コリンの抗アポプトシス性、神経保護性および抗健忘症性の効果が、X. A. Alvarez等によってラットで実験的に調べられた（Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology：21（8）、535−540、1999）。CDP−コリンの神経保護機構は十分な程度には知られていない。今のところ、この効果は、遊離脂肪酸の低下、フリーラジカルの生成、神経細胞膜の安定化、グルタメート誘発毒性の減少、および神経細胞生存の増加に関係があると考えられている。虚血症状発現におけるCDP−コリンの有益な効果が局所虚血後周縁領域におけるアポプトシスによる細胞死の低下に関係があるかどうかは、まだ解明されていない。
【０００６】
驚くべきことに、脳虚血症状発現前のCDP−コリンの投与が、後遺症の激烈さを防ぐに当たって、CDP−コリンを後遺症の発症後に投与する場合よりも大きい有益な効果を生むことが見いだされた。
【０００７】
本発明は、脳虚血の予防的治療用医薬品製造のための、CDP−コリンまたはその製薬上許容できる塩の使用に関する。
【０００８】
予防的治療とは、CDP−コリンまたはその製薬上許容できる塩を虚血症状発現の最後の発症前に投与することを意味する。虚血症状発現が起こる場合、この治療を続けることが好ましい。次いで、治療の態様を患者の必要性に適合させることができる。
【０００９】
もう１つの面から見ると、本発明は神経保護治療に関する。神経保護とは、脳組織を損傷から、特に脳梗塞から保護することを意味する。
【００１０】
もう１つの面によれば、本発明は、脳組織の損傷が広がるのを防ぐための、CDP−コリンまたはその製薬上許容できる塩の使用に関する。
【００１１】
本発明は、１つの特定の態様によれば、脳組織の損傷、特に脳梗塞が脳虚血に関連がある場合の上記使用に関する。
【００１２】
脳虚血は脳の虚血事態を含む。虚血事態は、組織に対する血液供給の低下と定義することができる。脳虚血は、脳に送る動脈からの血液供給の低下によって、またはその中断によってさえも引き起こされ得る。
【００１３】
CDP−コリンはキャスパーゼ鎖の活性化に対して抑制効果を有し、そして周縁領域における神経細胞のアポプトシスを低下させる。
【００１４】
かくして、本発明は、もう１つの面から見ると、キャスパーゼ鎖の活性化を抑制するための、CDP−コリンまたはその製薬上許容できる塩の使用に関する。この効果は、予備治療を受けた被験者でより高かったから、CDP−コリンは脳虚血事態において予防的神経保護効果を発揮すると結論される。要するに、CDP−コリンが虚血前に投与されるときにより有効であるということは、虚血合併症の厳しさに対する予防作用を示唆しているのである。最後に、本発明の予防的方法は、有利なことに、後天的な従来の治療よりも有効である。
【００１５】
本発明による使用は、脳虚血の予防的治療を必要とする被験者に、有効量のCDP−コリンまたはその製薬上許容できる塩を投与することを含む脳虚血の予防的治療方法を包含する。
【００１６】
CDP−コリンまたはその製薬上許容できる塩、或いはそれらの混合物は、これらを必要とする被験者に、通常はヒトの患者に、製薬上許容できる形で、例えば製薬キャリアーおよび／または賦形剤と都合よく混合された形で、有効量で、好ましくは遊離CDP−コリンの０．５〜４ｇ、より好ましくは遊離CDP−コリンの１〜２ｇの範囲の日用量で、患者の状態に依存して経口および非経口の両ルートで投与することもできるし、或いは、場合によっては、さらなる治療剤に続いて、またはその治療剤と同時に共投与することができる。
【００１７】
CDP−コリンの製薬上許容できる塩を挙げると、その塩基付加塩、特にそのナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩のようなアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩、または塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、乳酸、マロン酸、酒石酸、アクリル酸、メタクリル酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、サリチル酸、桂皮酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびニコチン酸のような鉱酸若しくは有機酸とのその酸付加塩がある。
【００１８】
CDP−コリンまたはその塩は、無水形で、または溶媒和した、特に水和した形で使用することができる。
【００１９】
投与は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、カシュ剤、トローチ剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、ゲル等の形で経口的に行うこともできるし；或いは静脈注射または筋肉注射のための溶液、懸濁液、エマルジョン等の形で非経口的に行うこともできる。
【００２０】
本発明による治療を必要とする被験者は、特に次の患者である：
【００２１】
−大手術を受ける患者、即ち出血、血管整復、または誘導性および持続性低血圧（脳神経外科、心臓血管外科、臓器移植、整形外科プロテーゼのインプラント等）が起こりそうな、そして特に起きてしまった、外科手術を受けることになっている、受けつつある、そして特に受けた患者。これらの場合、治療を、外科手術の２４〜４８時間前に、例えば１〜２ｇ／日の有効経口用量で開始することが好ましい。薬物投与は、外科手術中に、麻酔を誘発させる時点においては静脈ルートで、例えば１〜２ｇの有効用量で、次いで、例えば１〜２ｇ／日の有効用量で１週間、患者の状態に依存して経口または静脈ルートで続けられる。
【００２２】
−既往一過性虚血症状発現、動脈性高血圧症、高コレステロール血症、喫煙、心房性細動または他の塞栓性心臓病の既往症のような、幾つかの既知の危険因子に因る発作のような急性虚血事態を被る高い危険のある患者。この場合、患者は、仮想発作に罹ってからでも、経口ルートで、例えば１〜２ｇ／日の有効用量を用いて治療されるべきである。
【００２３】
実施例
本発明の方法の適用に適した活性成分の調合物が、次の実施例で例示説明される。この技術分野の当業者であれば、本発明の特定の態様を変えず、従って本発明をこれら実施例の特定の細部に限定しないという条件で、任意の変更をなすことができるであろう。
【００２４】
実施例１：５００ｍｇの錠剤
CDP−コリン、ナトリウム塩 ……………………………５２２．５ｍｇ
タルク…………………………………………………………３０．９ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム……………………………………３．０ｍｇ
二酸化ケイ素……………………………………………………２．５ｍｇ
クロスカルメロース（croscarmellose）ナトリウム……２０．０ｍｇ
コーンスターチ………………………………………………２０．０ｍｇ
微結晶性セルロースｓ．ｑ．……………………………７８０．０ｍｇ
【００２５】
実施例２：２５％経口投与用溶液
CDP−コリン、ナトリウム塩 ……………………………２６．１２ｇ
７０％ソルビトール………………………………………２０．００ｇ
ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル……………………………０．１６ｇ
ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル…………………………０．０４ｇ
クエン酸二ナトリウム………………………………………０．６０ｇ
サッカリンナトリウム………………………………………０．０２ｇ
ストロベリー精油……………………………………………０．０４ｇ
レッド・プンゾ（Red Punzo）４Ｒ ………………………０．５０ｇ
無水クエン酸…………………………………………………０．０５ｇ
純水ｓ．ｑ．……………………………………………１００．００ｍＬ
【００２６】
実施例３：静脈注射用溶液
CDP−コリン、ナトリウム塩 …………………………５２２．５０ｍｇ
塩酸、ｐＨ６．０−６．５、ｑ．ｓ．
水ｑ．ｓ．……………………………………………………４．００ｍＬ
【００２７】
実施例４：神経保護作用
遅延神経細胞死（アポプトシス）に対するCDP−コリンの効果を、次の実験プロトコルに従ってラットの皮質性脳虚血モデルで評価した：
【００２８】
１）−動物：
全ての脳梗塞形成試験を体重２２０〜２７０ｇの雄のSprague-Dawleyラットで行った。動物を、１２／１２時間の明暗サイクルを持つ温度および湿度調節済みの部屋に、餌と水に自由に近づけるようにして入れた。
【００２９】
２）−中大脳動脈閉塞のモデル：
脳虚血を電気凝固法を用いる中大脳動脈の永久近位閉塞によって誘発させた。深い麻酔の下で、ラットの頭を刈り、そして左耳と左目との間を切開した。次いで、側頭筋を切り出すことによって頭蓋を露出させた。鱗状裂溝の後ろで１〜２ｍｍのドリルを用いて開頭を行った。永久的に凝固された中大脳動脈アームを露出させるために硬膜に穴をあけた。
【００３０】
３）−治療：
ラットをランダムに３つのグループに分けた：
【００３１】
（ａ）虚血３０分後に、このグループの動物を、腹腔内投与される０．９％滅菌生理食塩水（０．１ｍＬ）中CDP−コリン（５００ｍｇ／ｋｇ）で治療した。このグループは図１〜５に「後」として示されている。
【００３２】
（ｂ）虚血前２４時間以後ずっと、そして虚血３０分後に、このグループの動物はグループ（ａ）と同じ治療を受けた。このグループは図１〜５に「前」として示されている。
【００３３】
（ｃ）このグループの動物は対照として用いられた。虚血後、それら動物を腹腔内投与される０．９％生理食塩ビヒクル（０．１ｍＬ）で治療した。このグループは図１〜５に「対照」として示されている。
【００３４】
４）−形態学的研究、フラグメント化DNA標識付けおよびキャスパーゼ免疫組織化学のための試料の調製：
上記動物を異なる時間（３０分、並びに１、４、８、１２、２４および４８時間）に覚醒させ、その後にエチルエーテルで神経終末麻酔をかけた。次いで、脳に、直ちに、心臓（左心室）に挿入されたカニューレを用いることによって４℃のPBSを、続いて４％パラホルムアルデヒドを潅流させた。脳を速やかに取り出し、そして同じ固定液中に４℃で２４時間浸漬することによって固定した。脳を、３０％サッカロースを用いて耐冷却保護（cryoprotection）を施した後、液体窒素で冷却されたイソペンタン中で凍結させ、続いて−７０℃で保存した。低温槽を用いて脳を切り出して５０μｍのスライスにした。これらの脳スライスを耐冷却保護装置を用いて−７０℃で保存した。これらの切片標本を、後に、アポプトシス細胞の免疫組織化学、形態学およびインシチュー（in situ）標識付けのための試料として用いた。梗塞の形態構造を、梗塞の開始と終わりを含む一連の切片標本において、ヘマトキシリン−エオジン染色法およびニッスル染色法（クレシルバイオレット）を用いることによって調べた。アポプトシス細胞を、フラグメント化DNAインシチュー標識付け法の変法で標識した。キャスパーゼ発現の免疫組織化学を、Santa Cruz Biotechnology社から入手したキャスパーゼ１、２、３、６および８に特異性の一次抗体を用いるアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法を使用して行った。
【００３５】
５）−ゲル電気泳動およびウェスタンブロット分析：
グループと時間に関する試料の調製は、項目４）の調製と同様である。麻酔を深くかけられた動物を断頭し、そしてそれらの脳を新鮮な状態で取り出した。各々の場合に、次の区域を解剖した：ａ）梗塞領域の灰白質；ｂ）梗塞領域の白質；ｃ）周縁領域の灰白質；およびｄ）周縁領域の白質。各々の場合に、試料は同じ側および反対側から得た。これらの試料を、続いて、それらの虚血損傷後に起こり得る分解を知るために、抗キャスパーゼ抗体、および異なるキャスパーゼ基質に対する抗体のウェスタンブロット分析に用いた。
【００３６】
６）−結果：
治療効果の評価のために、アポプトシス過程のマーカーとしてのキャスパーゼ１、２、３、６および８の発現を、梗塞形成誘発１２時間後に測定した。それらの結果は、それぞれ図１、２、３、４および５に示される。本出願人は、これらマーカーの発現に関する限り、治療動物と対照動物との間に有意差が存在することを観察した。加えて、そしてもっと重要なことであるが、これらの差は虚血後に治療を受けた動物よりも虚血前に治療を受けた動物においてより著しい。これら全ての実験は、CDP−コリンは、梗塞形成誘発の前後に投与されたとき、キャスパーゼレベルを梗塞形成誘発後にのみ投与されたときよりもより有意に減少させることを明らかにしている。
【００３７】
７）−図面の説明：
図１、２、３、４および５は、免疫蛍光検査装置におけるキャスパーゼ１、２、３、６および８それぞれの測定の平均値の棒グラフを示す。信頼区間は９５％であり、また対照に対する統計的有意性は*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０２５、***ｐ＜０．０１である。