(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラケスレアトリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株と（−）株との混合培養での発酵によりリコペンを生産する方法において、
該ブラケスレアトリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）の（−）株は、ＶＫＰＭＦ−７４４（−）株をエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）及びＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）で連続して処理し、該処理後の株にトリスポリック酸を添加し、赤色のコロニーを選択することにより得られるＬＭ（−）変異株であり、
該ブラケスレアトリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株は、ＶＫＰＭ  Ｆ−８１６（＋）をエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）で処理し、該処理後の株をイミダゾールを補充した固形培地で増殖し、ブラケスレアトリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）の（＋）株を予め接種した培地に移し、該（＋）株のコロニーとの交差ゾーンでの呈色強度により選択することにより得られるＣＰ（＋）変異株である、生産方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法よるリコペンの生産後、
ｂ）前記混合培養で得られる培養培地バイオマスを、リコペンの溶解度は低いが、該バイオマス中の他の親油性物質を溶解し得るアルコールで処理して、湿潤、精製バイオマスを分離し；
ｃ）乾燥、及び粉砕若しくは破砕により、該湿潤、精製バイオマスの状態を調整し；
ｄ）該精製バイオマス中に含まれるリコペンを、食品級の有機溶媒により、固液抽出し；
ｅ）該富化リコペン抽出物を濃縮し；
ｆ）リコペンの溶解度は低いが、該バイオマス中の他の親油性物質を溶解し得るアルコールの添加により、該濃縮抽出物から該リコペンを沈殿／結晶化し；
ｇ）該結晶化を行った液体から、該結晶を濾過及び乾燥して、リコペンの結晶を生じさせ；
ｈ）該リコペンを調合する
ステップを連続して含む、リコペン調合物の製造方法。
【請求項３】
ステップｂ）で用いられるアルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）を、予め、前記バイオマスを培養培地から分離し、該バイオマスを、前記アルコール中に、アルコール／バイオマス比、１ｍｌ／ｇから１０ｍｌ／ｇで、再懸濁することによって行う、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）において、前記アルコールを、０℃からその沸点に対応する温度で使用することを特徴とする、請求項２〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アルコールを、１０〜５０℃で使用することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）を、前記バイオマスを予め分離すること無く、該バイオマスを含む発酵培養培地を、前記アルコール中に、１／０．５〜１／５の培地／アルコール比で、室温から混合物の沸点の間の温度で混合することにより直接行うことを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項８】
前記培地／アルコール比が、１／１〜１／３であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記温度が、室温から６０℃であることを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｄ）で用いる溶媒がエステルであることを特徴とする、請求項２〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記エステルが、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル又は酢酸イソブチルであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｄ）で加えられる溶媒の量が、ステップｃ）で生じたバイオマス１ｇ当たり、５〜３０ｍｌであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップｆ）で使用するアルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される、請求項２〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｂ）で用いるアルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択され、
ステップｄ）で用いる溶媒が、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル及び酢酸イソブチルからなる群から選択され、
ステップｆ）で用いるアルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される、請求項２、４〜１０及び１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｈ）が、冷水分散性（ＣＷＤ）のリコペンの調製を含み、該調製が、
Ｉ．ステップｇ）からのリコペンの結晶を、酸化防止剤化合物とともに有機溶媒中に再懸濁若しくは溶解し、温度／時間比を調整して、該最終ＣＷＤリコペン調合物中のｃｉｓ−リコペンの割合を制御し；
ＩＩ．ステップＩで得られたリコペンの溶解物を、修飾デンプン水溶液中で乳化又はマイクロカプセル化し；
ＩＩＩ．該溶媒と水の一部とを蒸発により除去し、液体調合物を得；
ＩＶ．乾燥及び仕上げをする
ステップを含むプロセスによる、請求項２〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップＩで用いる溶媒が塩化メチレンである場合、１から１５分間、前記温度を２０から３５℃とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップＩで用いる溶媒が酢酸イソブチルである場合、５分間、温度を１１４℃とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ステップＩにおいて、前記酸化防止剤の１種又は混合物を、前記リコペンの重量に対して１〜３０％の割合で用いることを特徴とする、請求項１５〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記酸化防止剤が、トコフェロール又はアスコルビン酸パルミテート型である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップＩで、さらに植物油を加えることを特徴とする、請求項１５〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップＩＩで用いる前記修飾デンプンが、エステルの形態である、請求項１５〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップＩＩで使用される前記修飾デンプンが、コハク酸オクテニルエステルの形態である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップＩＶにおいて実施される前記液状調合物の乾燥を、高温微粉化による噴霧、比較的低温での流動床微粉化による顆粒化又は凍結乾燥の方法によって行うことを特徴とする、請求項１５〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記高温微粉化による噴霧プロセスが、前記調合物に使用される修飾デンプン、又はマイクロカプセル化されたリコペンの流動床内での懸濁液の微粉化による噴霧生成物の凝塊化を含む、ことを特徴とする、請求項２３に記載に方法。
【請求項２５】
前記流動床での微粉化による顆粒化プロセスが、種材料に、マイクロカプセル化されたリコペン懸濁液を散布することを含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記種材料が不活性材料であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記種物質が、糖粒子または先に顆粒化された材料の微粉末であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
段階ＩＶにおいて実施される前記仕上げが、０．５〜１０％の糖又は修飾デンプンの水溶液で粒子を被覆することからなることを特徴とする、請求項１５〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップｈ）が、ステップｇ）で得られたリコペン結晶を、酸化防止剤及び油と適切な割合で予備混合し、次いで磨砕することにより、リコペンの微結晶懸濁液を調合することからなる、請求項２から１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
用いる油が、植物起源である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
脂質親和性の酸化防止剤を、混合物中でのリコペン重量に対して０．２〜１５％の割合で用いることを特徴とする請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
９５％以上の結晶純度を有し、他のカルテノイドが３％以下である、リコペン結晶。
【請求項３３】
他のカルテノイドを含まない、請求項３２記載のリコペン結晶。
【請求項３４】
更に、ｃｉｓ−リコペンの含有量が３％以下である、請求項３２又は３３に記載のリコペン結晶。
【請求項３５】
ｃｉｓ−リコペンを含まない、請求項３４に記載のリコペン結晶。
【請求項３６】
請求項３２又は３３に記載のリコペン結晶を含む、調合物。
【請求項３７】
請求項３４又は３５に記載のリコペン結晶を含む、調合物。
【請求項３８】
前記リコペン結晶を植物油中に含む、請求項３６又は３７に記載の調合物。
【請求項３９】
前記リコペン結晶が修飾デンプンでマイクロカプセル化されており、該マイクロカプセル化されているリコペンを有機溶媒中に含む、請求項３６又は３７に記載の調合物。
【請求項４０】
請求項３２〜３５の何れか１項に記載するリコペン結晶、又は請求項３６〜３９に記載する調合物の、食品、医薬、又は化粧品分野の製品の添加物としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明に記載されるＢ．トリスポラ（Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ）の選択された菌株による発酵方法は、現状で文献に記載のあるものより高いリコペン産生レベルを達成可能にする。その分離、精製及び調合方法は、リコペンの任意の自然源、特にブラケスレア（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）属、コウガイケカビ（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ）属、ヒゲカビ（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）属又はケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属といったケカビ菌類（ｍｕｃｏｒａｌ  ｆｕｎｇｉ）の液内培養物に適用可能である。その抽出方法は、回収プロセスを単純化し、従来記載された方法と比較して製品純度を高めることができる。その調合方法は、食品及び製薬の分野に直接適用できる、リコペンの安定した調製物を得ることを可能とし、高い付加価値を与える。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイド類は自然界に広く分布しており、ニンジン、胡椒、トマト、花又はある種の微生物（ある種のバクテリア、真菌類及び光合成有機体を含む）など多数の天然物に黄色から暗赤色までその特徴的な色を付与する。カロテノイド類は２つのタイプに分類できる。即ち、（ｉ）カロテンと呼ばれる純粋な炭化水素（β−カロテン、α−カロテン、γ−カロテン又はリコペンなどの化合物を含む）及び（ｉｉ）酸素を様々な形（水酸基、エポキシ基など）で含むキサントフィルと呼ばれる分子（アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カプサンシン、カンタキサンチン、ルテインなどを含む）である。これらの２群の化合物は、その物理化学的な特性及び有機溶媒への溶解度に関して異なる振る舞いを示す。これらの化合物はすべて、人間の食餌において重要な役割を果たしており、癌その他の人間の疾病を予防するための酸化防止剤及びビタミンＡ前駆体として、その特性が広範囲に研究されてきた。リコペンがＤＮＡに対するニトリロ酢酸第二鉄の有害な影響を阻害して、肝臓の壊死を防ぐことが、最近ラットにおいて実証された［Ｍａｔｏｓ  Ｈ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｖｏｌ．  ３９６］。さらに、カロテノイド類は、黄色から赤までその着色により、また、健康に対するその有益な影響及びその魅力的な色のため、着色剤及び食品添加剤として相当な商業的重要性を有する［Ｎｉｎｅｔ  Ｌ．  ａｎｄ  Ｒｅｎａｕｔ  Ｊ．  （１９７９）  Ｉｎ：  Ｐｅｐｐｌｅｒ  ＨＪ．，  Ｐｅｒｌｍａｎ  Ｄ．  （ｅｄｓ）．  微生物技術（第２版）第１巻（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．１）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  ｐｐ．  ５２９−５４４］。
【０００３】
リコペン（Ｃ４０Ｈ５６）は、β−カロテン及びキサントフィル類の生合成における中間体である。それは、５３６．８５の分子量と以下の分子式を有する：
【化１】
0004960982.tif 000002
【０００４】
リコペン
酸化防止剤の役割をするとともに、リコペンは心臓血管疾患及びいくつかのタイプの癌を防ぎ、成長制御活性がある［Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８７：  １７６７−１７７６；  Ｓｔａｈｌ  Ｗ．ａｎｄ  Ｓｉｅｓ，  Ｈ．  （１９９６）  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３３６：  １−９；Ｃｌｉｎｔｏｎ，  ＳＫ．  （１９９８）  Ｎｕｔｒ．  Ｒｅｖ．  ５６：  ３５−５１］。これは消費者の側からの需要増大をもたらした。高純度化合物としてのリコペンの生産は過去においては化学合成と結びついていた［米国特許第５２０８３８１号；米国特許第５１６６４４５号；米国特許第４１０５８５５号；米国特許第２８４２５９９号］。しかし、今では、自然起源のリコペン源及び特別な抽出プロセスに基づく代替ルートが存在する。
【０００５】
微生物の生合成によるカロテノイド類の生産は化学プロセスと生物プロセスの競争の典型的な例である。生物起源のリコペン調製物はトマトから［国際公開公報ＷＯ  ９７／４８２８７、欧州特許第６０８０２７号］又はヒゲカビ（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）属、ブラケスレア（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）属、コウガイケカビ（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ）属といったケカビ菌類による発酵によって得られる［英国特許第１００８４６９号、米国特許第３０９７１４６号、米国特許第３３６９９７４号、特公昭４８−１６１８９号、特公昭４８−１６１９０号、ロシア特許第２１０２４１６号、国際公開公報ＷＯ００／７７２３４］。Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａによってカロテノイド類の最大収量を達成するためには、（＋）株と（−）株をともに発酵させることが必要である［Ｃｉｅｇｌｅｒ，  Ａ．  （１９６５）応用微生物学の進展（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）７：  １−３４；  Ｐｌｅｍｐｅｌ，  Ｍ．  （１９６５）  Ｐｌａｎｔａ  ６５：  ２２５−２３１；  Ｓｕｔｔｅｒ，  ＲＰ．  ａｎｄ  Ｒａｆｅｌｓｏｎ，  ＭＥ．（１９６８）  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ９５：  ４２６−４３２］。混合培養物中のカロテノイド類の収量の増加は、因子ベータ又はトリスポリック酸と呼ばれる一群の酸性化合物の生成と関係がある［国際公開公報ＷＯ００／７７２３４，  Ｃａｇｌｉｏｔｉ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ７：  １７５−１８７］。トリスポリック酸の生合成のために、（＋）株と（−）株によって生産されたβ−カロテンは、両者によってレチナールに、次いで４−ジヒドロトリスポロールに代謝される。（＋）株は、ジヒドロトリスポリック酸及びそのメチルエステル（メチル−４−ジヒドロトリスポレート）を形成するための基質として４−ジヒドロトリスポロールを利用する。（−）株は４−ジヒドロトリスポロールをトリスポロールに代謝する。最終的に、メチル−４−ジヒドロトリスポレートは（−）株によってトリスポリック酸に変換される。また、トリスポロールは（＋）株によってトリスポリック酸に変換される。このプロセスにおいては多数の共同代謝物質が生成され、その中には（＋）株と（−）株の両者に共通のものもあるし、これらのうちの一方に特有のものもあるため、トリスポリック酸の生合成についてのこの記載は単純化したものである。これらの共同代謝物質の相対量は菌株に依存して変わる。
【０００６】
β−カロテンの生合成経路（スキーム１参照）は、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ及びＭｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓなどのＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａと系統発生的に関係のある菌類について記載されている［Ａｒｒａｃｈ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９８：  １６８７−１６９２；  Ｖｅｌａｙｏｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７：  ５５０９−５５１９］。前述の生合成には、少なくとも３種の酵素：（ｉ）フィトエン（ｐｈｙｔｏｅｎｅ）合成酵素（これはゲラニルゲラニルピロホスフェート２分子を連結してフィトエンを形成する）、（ｉｉ）フィトエン脱水素酵素（これはフィトエン分子に４つの二重結合を導入してリコペンを合成する）及び（ｉｉｉ）リコペン環化酵素（これは基質としてリコペンを使用し、β−カロテン分子の２端にある環を形成する）が必要である。Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの変異株の分析に基づいて、この真菌中におけるβ−カロテンの生合成経路はＰ．ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓについて記載されたそれに似ているとの結論が得られた［Ｍｅｔｈａ  Ｂ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｅｒｄａ−Ｏｌｍｅｄｏ  Ｅ．（１９９５）  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４２：  ８３６−８３８］。Ｐ．ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓの場合、その菌糸体の黄色い色は変異によって変化して、赤、白又は様々な色合いの黄色に着色した菌糸体を備えた菌株を生じさせることがある。赤い変異株はリコペンを蓄積するが、白い変異株は、カロテノイド類の生産を欠くかフィトエンを蓄積する。リコペンの生産のためには、リコペン環化酵素活性を欠くＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの菌株を有することが必要であり、さもなければ、前記酵素活性を阻害する化学薬品を発酵培地に添加しなければならない。
【０００７】
【化２】
0004960982.tif 000003
【０００８】
英国特許第１００８４６９号、米国特許第３０９７１４６号、米国特許第３３６９９７４号、特公昭４８−１６１８９号、特公昭４８−１６１９０号、ロシア特許第２１０２４１６号及び国際公開公報ＷＯ００／７７２３４は、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ及びＣｈｏａｎｅｐｈｏｒａのようなケカビ菌類の発酵によるリコペンの生産について記載している。英国特許第１００８４６９号及び米国特許第３０９７１４６号は、７．０と９．５の値の間のｐＨ制御に基づくＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの発酵方法について記載しており、７日間の発酵後にリコペン９９．７ｍｇ／ｌの収量を得ている。特公昭４８−１６１８９号及び特公昭４８−１６１９０号は、第三アミンの添加に基づくケカビ菌類によるリコペン産生方法について記載している。ロシア特許第２１０２４１６号は、リコペンの蓄積を引き起こすためにアミノメチルピリジン類とタバコ残渣を添加することについて記載している。前記特許に記載された物質と同様に、カロテノイド合成をリコペン段階でブロックするための他の含窒素複素環塩基の使用が刊行物に発表されている：ニコチン［特開平５−１３１６７号］、イミダゾール、ピリジン、モルホリン、キノリン及び何種類か置換誘導体［米国特許第３３６９９７４号；  Ｎｉｎｅｔ  Ｌ．，  Ｒｅｎａｕｔ  Ｊ．  （１９７９）  Ｉｎ：  Ｐｅｐｐｌｅｒ  ＨＪ，  Ｐｅｒｌｍａｎ  Ｄ  （ｅｄｓ）．微生物技術（第２版）第１巻（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．１）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  ｐｐ．  ５２９−５４４］。さらに、第三アミンの添加を必要とせずにリコペンを蓄積するＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの変異株が記載されている［Ｍｅｈｔａ  Ｂ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｅｒｄａ−Ｏｌｍｅｄｏ  Ｅ．  （１９９５）  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４２：  ８３６−８３８］。
【０００９】
前述のケカビ菌類に加えて、リコペンの生産は、藻類によるもの［特開平５−１３１６７号及び特開２０００−１５２７７８］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ  ｖａｒ．  ｒｕｂｅｓｃｅｎｓの発酵によるもの［米国特許第３４６７５７９号］及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｒ１５３４のカロテノイドの生合成経路の修正によるもの［米国特許第６１２４１１３号］が記載されている。
【００１０】
リコペンは、トマト、ニンジン、胡椒、植物油などの植物産物から得ることができる。そこで、国際公開公報ＷＯ９７／４８２８７は、トマトからのリコペンに富む含油樹脂（ｏｌｅｏｒｅｓｉｎ）の製造方法について記載している。これは、トマトをパルプが得られるまで圧搾し、有機溶媒によるパルプからのリコペンを抽出し引き続いて溶媒を蒸発によって除去することにより、リコペン含有量２〜１０％の範囲の含油樹脂を生じさせることによる。植物及び油から、一般にカロテノイド類特にリコペンの豊富な含油樹脂を得る方法が、様々な特許に記載されており、例えば、米国特許第５２４５０９５号及びＥＰ５８０７４５には、カルシウム塩類による沈殿によるもの、米国特許第５０１９６６８号には、油とのエステル交換後蒸留する方法を用いるもの、国際公開公報ＷＯ９５／１６３６３には、カロテノイド類が豊富な含油樹脂を含む様々な画分の中へのトマトの分留について記載しており、また、国際公開公報ＷＯ９０／０８５８４は臨界超過状態の流体を使用することによるリコペン抽出について記載しているが、得られた抽出物は様々なカロテノイド類の混合物であり、それらの低溶解度のため抽出収量は非常に低い。
【００１１】
これらのすべての場合において、これらの天然産物中のリコペン濃度が低いこと、及びこの化合物の細胞内での所在は葉緑体又は有色体のようなある種の細胞器官中であることにより、得られた製品の抽出収量及び純度は低く、リコペンが豊富な含油樹脂又は脱水された粗製品は、様々な量の他のカロテノイド又は非カロテノイド化合物とともに得られる。ほとんどの場合、記載された抽出方法は、溶媒抽出を容易にし、またしたがってリコペンに富む細胞内含有物を放出させるために、粉砕又は圧搾による果物調製物を必要とする。また最後に、これらの特許に記載されたほとんどの方法は、有機溶媒の使用を必要とし、その有機溶媒が得られた含油樹脂中に痕跡量存在する。さらに、イタリア特許第１０７９９９号は、リコペンに非常に富んだ含油樹脂のトマトパルプからの調製について記載しているが、上に述べたものと同様に、得られる製品は、高純度のリコペン結晶からなるものではなく、リコペンに富む脂質の濃縮物である。
【００１２】
他方、国際公開公報ＷＯ９７／１５５５４は、葉緑体及び有色体を分離し、続けて、ペクチン類などのタンパク質の加水分解酵素及び／又はプロテアーゼ類によって前述の細胞器官を消化することによって、様々な構造タンパク質に結合したリコペンを放出させることを可能にする、ニンジン及びトマト（これらはリコペンを含む）からの植物起源のカロテノイド類の抽出について記載している。続いて、アルカリの処理及び低分子量アルコール混合物による抽出によって、含油樹脂より豊富かつ高純度のリコペン抽出物を得ることが可能となるが、得られるのはリコペンの精製結晶ではなく、リコペンに富む粗出物である。同様に、欧州特許公開ＥＰ６０８０２７Ａ２では、リコペンが結晶の形式で存在しているトマト有色体の分離によってリコペンの濃縮抽出物を得ている。リコペンに富むトマト有色体からのこれらの抽出物は、後にリコペン結晶を抽出することなく着色剤として直接使用するもので、抽出時におけるリコペンの色変化を回避し、また、有機溶媒の使用を不要にする。この特許に記載された方法に従って、食品又は医薬組成物で使用するのに適した純粋な結晶状リコペンを得ることは可能ではなく、脱水、凍結乾燥又は凍結された形で食物着色剤として得られるだけである。
【００１３】
ドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）タイプのカロテノイド類に富むある種の微細藻類は別の重要なリコペン源である。これらの有機体からカロテノイド類、特にリコペンを抽出する様々な方法があり、有機溶媒（クロロカーボン類、炭化水素など）又は食用油（ドイツ特許第４３４２７９８号）による抽出によるものが米国特許第５３７８３６９号、米国特許第４７１３３９８号及び米国特許第４６８０３１４号に反映されている。別の方法が国際公開公報ＷＯ９８／０８５８４に記載されており、超臨界状態にあるＣＯ２を使用してリコペン抽出物を得ているが、このようにして得られた抽出物は、リコペンに関する純度は低い。
【００１４】
リコペンはブラケスレア（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、コウガイケカビ（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ）、ヒゲカビ（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）又はケカビ（Ｍｕｃｏｒ）などのケカビ菌類の液体培地中での発酵によっても得ることができる。この場合、植物産物又は藻類からのリコペン産生に優る特徴として、この化合物の濃度が増加し、場合によっては、乾燥バイオマス量に対して５重量％以上となり（これは最良の植物種から得た値より大きい）、古典的な変異生成技術によって又はこれらの微生物の遺伝子操作を可能にする分子生物学上の新技術の適用によって、これらの微生物の過剰産生種を生物工学的に開発し得る（これにより、構造上関連するカロテノイド類の生産をなくしてリコペンの濃度及び収量を増加させる）可能性がある。
【００１５】
既に述べた通り、自然源からの高純度の結晶リコペンの調製は、例えば、米国特許第３３６９９７４号、欧州特許第８１８２５５号及び欧州特許第２４２１４８号に記載されているように、一般に有機溶媒又は超臨界状態の流体による抽出段階、次にクロマトグラフィー、吸着及び溶出プロセス、及び沈殿又は結晶化の段階など、様々な追加的精製段階を必要とする。これらの後続的精製段階を使用せず、溶解度が克服されるまで溶媒を蒸発することによって抽出物から直接結晶化を行う事例では、ほとんどの場合、得られる生成物の純度は非常に低く、したがって、得られたリコペンの再結晶プロセスを行う必要があり、生成物の溶解度が低いことから再結晶段階を達成するために大量の溶媒を使用することが必要となり、これは低収量につながる（オランダ特許第６４１１１８４号、米国特許第４４３９６２９号）というさらなる問題を生じる。
【００１６】
国際公開公報ＷＯ９６／１３１７８は、粉砕によって液体媒体中に懸濁させたリコペン微結晶（１〜３ミクロン）を得る、エチレングリコール、エタノール又はグリセリンなどリコペンが不溶な食品適合性液体媒体中に安定化させた結晶リコペン濃縮物を調製物について記載している。さらに、国際公開公報ＷＯ９８／４３６２０は、高温での様々なトリグリセリド類及びホスホネート類のけん化によって含油樹脂からリコペン結晶を分離し、次いで水で希釈することによる、７５％と９５％の間の純度のリコペン結晶を得る方法について記載している。同様の方法が、最近、国際公開公報ＷＯ９８／０３４８０において、水、低分子量アルコール又はアセトンで洗浄することによる高純度β−カロテン結晶の調製について記載されている（但し、これを高純度のリコペン結晶を得るために適用することは記載されていない）。
【００１７】
結晶状態でのカロテノイド類の不安定はよく知られており、それらを安定させる１つの方法は油性分散液の調製である。さらに、油中に分散したカロテノイド類は、身体により容易に吸収されると信じられている。不安定な化合物を安定化させるための別の方法は、デンプンマトリックス中でのそれらのマイクロカプセル化である。このため、米国特許第２８７６１６０号、米国特許第２８２７４５２号、米国特許第４２７６３１２号及び米国特許第５９７６５７５号は、デンプンマトリックス中にそれらをカプセル化することによりカロテノイドを含む様々な化合物の安定性が相当に増加すると記載している。
【００１８】
着色剤の分野でカロテノイド類を使用する際の主要な困難の１つは、それが水に全く溶けない点である。というのも、それらの適用の多くが水性媒体中で起こるからである。この溶解度の問題は、米国特許第３９９８７５３号といった文書で言及され、ハロゲン化炭化水素などの揮発性有機溶媒中でカロテノイド溶液を調製しラウリル硫酸ナトリウム水溶液でそれらを乳化することにより解決された。
【００１９】
米国特許第５３６４５６３号は、粉末状のカロテノイド類調製物の製造方法について記載しており、それは高沸点を有する油中にカロテノイド懸濁液を形成することを含む。カロテノイドの油溶液を形成するために、この懸濁液を最大３０秒間の蒸気で加熱する。次に、この溶液をコロイド水溶液上で乳化し、次いで、乳剤を噴霧乾燥する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、真菌類Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａによるリコペンを高収量で得る一連の方法、並びにその回収及び調合方法を記載する。本発明は、（ｉ）リコペンの過剰産生株（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｅｒ）であるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ変異株の取得選択方法の設計、（ｉｉ）改善された発酵条件の開発、（ｉｉｉ）菌糸体からのリコペン回収方法の確立及び（ｉｖ）従来技術に存在していた様々な媒体中での安定性及び溶解度の問題を克服する調合物の達成からなる。Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａは、リコペンの生物工学的生産のために産業上大きな重要性を有する真菌類である。実際、前記方法は、現在産業上使用されている合成プロセスに見合うものであることがわかる。
【００２１】
リコペンの過剰産生株である菌株を得る目的で、まず第１に、変異誘発物質であるエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）及びＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）により、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）及び（−）菌株について突然変異を起こす方法を開発した。ＹｐＳｓ培地による斜面培地（ｓｌａｎｔ）から変異のための胞子懸濁液を得た。各斜面培地０．１％でトリトンＸ−１００溶液１０ｍｌを加えることにより胞子を再懸濁させた。孔径２０μｍのナイロンフィルターを用いた濾過によって菌糸体残滓を除去し懸濁液中での胞子濃度を１０６胞子／ｍｌに調節した。ＥＭＳによる変異方法は、１０６胞子／ｍｌを３％ＥＭＳ溶液（０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー中（ｐＨ  ７．０））中、室温で６０分間インキュベートすることからなり、約９９％の死亡率を達成した。変異した胞子を、０．１％トリトンＸ−１００で３回洗浄し、１５℃で２分間３０００ｒｐｍにて遠心分離した。ＮＴＧによる変異方法は、１０６胞子／ｍｌを、ＮＴＧ  ２５０  μｇ／ｍｌ及び０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ５．０）を含む溶液中、室温で３０分間インキュベートすることからなり、約９５％の死亡率を達成した。変異した胞子は、０．１％トリトンＸ−１００で３回洗浄し、１５℃で２分間３０００ｒｐｍにて遠心分離した。０．１％トリトンＸ−１００を補ったサッター（Ｓｕｔｔｅｒ）ＩＶ固体培地を含むペトリ皿に、変異した胞子を播種し、２５℃で４日間インキュベートし、分離されたコロニーを得た。
【００２２】
Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａのリコペン過剰産生性（−）株を選択するのに使用した方法は、以下の通りであった：（ｉ）トリスポリック酸の使用及び（ｉｉ）コロニーの色強度。トリスポリック酸の添加によるリコペン産生変異株の選択は、変異した胞子から得られたコロニー上にトリスポリック酸をしみ込ませたフィルターを置くことからなるものであった。トリスポリック酸は、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）と（−）の菌株の混合培養物から得られた。フィルターとコロニーを２５℃でインキュベートし、橙色に着色したβ−カロテン産生体とは対照的に、リコペン産生変異株が深赤色を呈することを観察した。ＣＭＡ３（−）株を用いてこの方法を適用し、ＬＭＡ１（−）株を選択した（スキーム２）。コロニーの色強度の関数とするリコペン産生変異株の選択は、次の方法で行った：ＣＭＡ１（−）株（β−カロテン産生体；スキーム２）を変異させ、変異した胞子をＹＥＰＤＡ固体培地プレート上で成長させた。次に、ＣＭＡ１（−）親菌株より深い黄橙色を有するコロニーを選択した。このようにして、深い黄橙色を有する２つのコロニーを分離した（ＣＭＢ１（−）及びＣＭＢ２（−）という）。
【００２３】
【化３】
0004960982.tif 000004
【００２４】
Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）のリコペン過剰産生変異株の選択は、０．１％イミダゾールを補ったサッター（Ｓｕｔｔｅｒ）ＩＶ固体培地を含むペトリ皿中で変異胞子を成長させることにより行った。次に、各コロニーの一部を、予めＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）を播種したＰＤＡ皿上に移した。固体培地中でのリコペン産生レベルは、（−）株コロニーと（＋）株コロニーの交差ゾーンでの呈色の強度の関数として決定した。このようにして、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）株を選択したところ（スキーム３）、一連の（−）菌株との混合固体培養物中のリコペンより高い収量を生じた。次いで、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）株の産生レベルを、液体培地中の混合培養物中で分析した。
【００２５】
選択した菌株を指定するのに使用した符号システムは以下の通りである：
ＣＭ：カロテン  マイナス（−）
ＬＭ：リコペン  マイナス（−）
ＣＰ：カロテン  プラス（＋）
ＬＰ：リコペン  プラス（＋）。
【００２６】
親世代の関係はアルファベットの順番に従う。すなわち、ＡはＢの親であり、ＢはＣの親である（以下同様）。文字の後の数字は変異株の数に相当する。例えば、ＣＭＡ１（−）という表示は、それがカロテン産生菌株（Ｃ）であり、マイナス（Ｍ）、ＣＭＢの親で変異株番号１であることを示す。同様に、ＣＭＡ１（−）、ＣＭＡ２（−）、ＣＭＡ３（−）及びＣＭＡ４（−）は、同じ世代の変異株１、２、３及び４に相当する。
【００２７】
【化４】
0004960982.tif 000005
【００２８】
固体培地中で選択されたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）及び（−）菌株を、液体培地及び混合培養物中のリコペンの生産量を決定するため、フラスコ中で発酵した。このために、個別の接種原フラスコに菌株Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）及びＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＭＢ２（−）を播種し、次いで、フラスコ中で両方の菌株の混合発酵を行った。発酵開始時（０〜５０時間）に、リコペン段階で生合成経路をブロックする目的で、酵素リコペン環化酵素の阻害剤を加えた（例えば、０．７〜０．８ｇ／ｌの濃度のイミダゾール）。発酵終了時（約６日）に、ボルテックス撹拌によってＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの菌糸体を溶菌させ、有機溶媒（例えば、アセトン）でリコペンを抽出し、その濃度及び純度をＨＰＬＣによって決定した。得られた収量は３．０ｇ／ｌであった。リコペン環化酵素の阻害剤を加えることが必要でなかったこと以外は同じタイプの発酵を、菌株Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）及びＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＬＭＡ１（−）を用いて実行した。混合培養物中、これらの菌株によって得られた収量は１．２ｇ／ｌであった。
【００２９】
リコペン収量を決定するため、ＣＰＡ１（＋）とＣＭＢ２（−）株を半商用発酵槽中で培養した。この目的のため、それらをフラスコ中で別々に増殖し、別々に中間増殖槽に移し、最後に一緒にして発酵させた。発酵２５時間と３５時間の間、リコペン環化酵素の阻害剤としてイミダゾールを加えた。発酵は１００〜１４０時間インキュベートした。ＣＰＡ１（＋）及びＣＭＢ２（−）株の一連の様々な発酵で得られたリコペン収量の平均値は、３．４ｇ／ｌであった。
【００３０】
酵素リコペン環化酵素の阻害剤添加なしでのリコペン収量を決定するため、ＣＰＡ１（＋）とＬＭＡ１（−）株を半商用発酵槽中で培養した。ＣＰＡ１（＋）及びＣＭＢ２（−）株について上に示したのと同様に、但しイミダゾールは加えずに発酵を実行した。ＣＰＡ１（＋）及びＬＭＡ１（−）株の一連の様々な発酵で得られたリコペン収量の平均値は、１．６ｇ／ｌであった。
【００３１】
この発酵段階では、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ菌株の栄養増殖期（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｓｔａｇｅ）の時間齢（ａｇｅ）を制御することによってより高収量が得られる。したがって、接種原として使用する培養物は、（＋）と（−）の両者について３０〜６０時間、好ましくは４８時間の時間齢を有するが、播種した胞子数はそれぞれ８００〜１０００胞子／ｍｌ及び４０  ０００〜６０  ０００胞子／ｍｌとする。インキュベーションは、一次培養物相中に播種された各接種原０．１％ｖ／ｖを用いて約２５℃で実行する。前記一次培養物の時間齢は３０〜６０時間、好ましくは３６〜４８時間の範囲で変化し、温度は２６〜２８℃の範囲である。次いで、この（＋）／（−）一次相を１／１０ｖ／ｖの比で混合し、発酵槽に前記相混合物を１０〜２０％ｖ／ｖで播種する。
【００３２】
発酵中に生合成されたカロテノイド成分の細胞内在性を考慮すると、通常の方法で言うように調製された培養培地からの回収方法の第１段階は、培地からのバイオマスの分離である。この分離は、フィルター（ベルトフィルター、ロータリーフィルター、プレスフィルター等のいずれでもよい）による通常技術を使用し、確立された濾過方法（濾布からなる障壁がバイオマスを分離し、バイオマスを含まない液相は通過させる）によって達成できるし、あるいは遠心分離（培養培地とバイオマス（通常高密度）の間の密度差の利用によって、遠心分離機又はデカンターなどが使用され、その中で重い相は濃縮され、液相（これはバイオマスを最小限度でしか含まない）から分離する。この段階の目的のうちの１つは、損失を低減し、各相の特性を最適化し、バイオマスについて乾燥残留物の最も高い含有量を達成して、活性物質を最少量しか含まない発酵培地の大部分を除去することである。
【００３３】
生じた湿潤菌糸体は、発酵中に産生されたカロテノイド類の９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上含む。したがって、水相中のカロテノイド類の含有量は５％未満、好ましくは３％未満、より好ましく１％未満である。この湿潤菌糸体により、後の段階によってそれはリコペンを分離することも可能であろう。しかし、発酵に関して言えば、この菌糸体は、脂質親和性の強い成分を比較的大きな割合（１５〜２０％（脂肪酸及び油））で依然として有しており、これは後の段階で精製の問題を引き起こすことが判明した。したがって、この時点でバイオマスの精製の段階を導入することが必要となる。精製段階は、脂質成分の最大の精製を達成するのに十分な程度まで、バイオマスをアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール又はリコペンの溶解度が非常に低い他のアルコール）中に再懸濁することを含む。したがって、湿潤菌糸体を、湿潤菌糸体の１ｍｌ／ｇから１０ｍｌ／ｇの範囲の量のアルコールで再懸濁する。再懸濁液の温度は、０℃とアルコールの沸点の間、好ましくは１０と５０℃の間で変わる。接触時間は、５分から２４時間までの範囲である。このように調製したアルコールの再懸濁液を、濾液又は清浄化された液体中の固形分は実際上０となるように濾過又は遠心分離する。生じる湿潤菌糸体（それは様々な比で水とアルコールを含むであろう）は、発酵物中で生産されたカロテノイド類の９３％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上を含む。
【００３４】
培地とアルコールの残渣を含む上清又は濾液中では、カロテノイド類含有量は初期の培地に比べて２％未満、好ましくは１％未満である。アルコールによるこの処理は、多数のアルコール可溶の脂質親和性の強い物質を除去することを可能にし（使用される培地の特性に依存するその量は変わる）、高純度の結晶である最終生産物を得ることを可能にする予備精製を達成する。さらに、初期の湿気菌糸体から様々な比の水を取り除くことによって、後の乾燥プロセスが非常に容易になる。アルコールと培地を直接混合し最小の接触時間を維持することによって、以前に記載されたそれと等しい精製効果が達成され、その結果、そのプロセスは固液分離の１つの操作の除去によって単純化される。培地／アルコール比率は１／０．５〜１／５まで変えることができ、好ましく１／１と１／３の間である。混合物の温度は、室温と混合物の沸点の間、好ましくは室温と６０℃の間で変わる。
【００３５】
脱水又は精製された菌糸体は乾燥させる。乾燥は通常のバッチ法又は連続法によって実行できる。乾燥温度は、室温と１５０℃の間で変わるが、好ましくは、６０℃を超過してはならず、より好ましくはそれは５０℃未満とすべきである。乾燥時間は、用いる温度に依存し１時間と７２時間の間で変わる。大気中酸素による酸化によってこれらのカロテノイド類は分解し得るため、この乾燥操作は、酸素不在下、窒素雰囲気下又は少なくとも真空下で行うのが最良である。カロテノイド生成物が細胞内にあるという事実は、精製したバイオマスの処理（バイオマスの乾燥プラス粉砕によるか、乾燥プラス分解又は分解による。これらは、溶媒による混合を促進し、溶媒抽出を容易にする）が必要であるということを意味する。溶媒が抽出されるカロテノイドによく接触するように、事前に菌糸体の破壊操作を行って接触面積を最大限にすることが必要である。乾燥され破壊された菌糸体の最適の粒子サイズは、３ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満であり、より好ましくは０．５ｍｍ未満でなければならない。
【００３６】
粉砕は、乾燥生成物に対して回転又は固定部品（ハンマーやスクリーンなど）による機械的なシステムによって、互いに圧縮し合う（圧縮又は押し出し）回転シリンダを通すことなどによって実行することができる。ジェットミル中でのフラッシュ（瞬間）乾燥システム（ここで湿潤生成物は、滞留時間が液体成分の含有物を気化する最小限であるように高温の再循環ガス流に供給され、生成物は密度変化に伴いサイクロンに輸送され、そこで回収される）によって１段階で乾燥と粉砕を行うことも可能である。乾燥時間の間及び乾燥経路では、粒子が壁に衝突するため、均質化効果もある。
【００３７】
前記のように条件調整した菌糸体からリコペンを抽出するために、様々な有機溶媒が使用できる。本発明は、アシルエステル（好ましくは、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル又は酢酸イソブチル）などの、天然とみなされ得る食品級溶媒の使用に言及するものであり、これは、カロテノイド成分に対するかなり高い溶解性とＩＣＨのクラスＩＩＩのグループに含まれる溶媒としての適合性とを併せ持つ。これらの溶媒は、各国レベル及び共同体レベルのいずれでも、また、医薬及び食品分野（ＲＤＬ１２／０４／９０とＲＤＬ１６／１０／９６）において許容され得る。ＩＣＨにおいて要求されるように、溶媒残留量は、各場合とも液体混合物中の乾燥物質量に基づいて５０００ｐｐｍ未満、好ましくは１０００ｐｐｍ未満、より好ましくは１００ｐｐｍ未満でなければならない。抽出温度は、室温と溶媒の沸点の間、好ましくは５０℃と８０℃の間で変わる。抽出時間は、分離を達成するのに必要な最小限であり、１秒と１時間の間、好ましくは１分と１５分の間となるであろう。使用される溶媒の量は、温度及び菌糸体のカロテノイド含有量に依存して、バイオマスの５ｍｌ／ｇと３０ｍｌ／ｇの間で変わる。抽出回数は、１〜３回と変動する。抽出されるカロテノイドの量は８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
【００３８】
一度得られた、カロテノイドに富んだ抽出物は所定の体積に濃縮しなければならない。濃縮後の溶媒中のカロテノイドの最終濃度は好ましくは１０〜５０ｇ／ｌである。濃縮温度は、８０℃以下、好ましくは７０℃以下、より好ましくは５０℃以下でなければならない。抽出物が、一旦所定の体積に濃縮されたならば、カロテノイドの不溶化剤、特にアルコール、より具体的にはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール又はリコペンの溶解度が非常に低く、その結果、結晶リコペンの収量を著しく増加させる他の任意のアルコールを添加する必要がある。アルコールの添加は精製効果もある。結晶時間は、１５分と２４時間の間、好ましくは１時間と１２時間の間、好ましくは３〜８時間の間で変わる。結晶温度は、５℃以下、好ましくは２５℃以下でなければならない。
【００３９】
結晶用アルコール溶媒からの結晶の分離は、濾過又は遠心分離によって達成することができ、結晶が浸漬されていた結晶用アルコール溶媒を不溶化のために用いるのと同じアルコールで洗うことにより置き換える。得られた結晶を室温で真空下、残留溶媒含有量が前述した法令により定められた仕様（リコペンの場合、乾燥で０．５％未満の損失を規定する）を満たすまで少なくとも１時間乾燥させる。
【００４０】
得られた結晶の純度は、結晶のｎ−ヘキサン（Ｅ１％１ｃｍ＝３４５０）溶液について４７２ｎｍの吸収を読みとることによる分光測光法によって決定され、９５％以上の滴定濃度に相当し、他のカロテノイド類含有量は３％以下である。ｃｉｓリコペンの含有量は３％以下である。
【００４１】
本発明の方法は、微生物源、好ましくは藻類、真菌類、酵母、より好ましくはケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ  ｏｒｄｅｒ）の真菌類、より好ましくは、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａからの結晶リコペンの回収に特に適している。本発明の方法論によって得られる結晶について達成された例外的な純度及び自然とみなされる溶媒の使用は、これらの結晶が、食品、医薬又は化粧品産業において使用できるということを意味する。
【００４２】
本発明に記載された方法論によって得られる結晶生成物は、生成物の光劣化を防ぐ不透明な容器中、酸化を防ぐために酸素不在下（不活性雰囲気又は真空）、０と５℃の間の温度で梱包できる。適切に梱包された生成物は「そのまま」取り扱い市場に出荷可能である。しかし、後の調合又は最終段階での安定性を増加させることが好ましく、これには、適切に梱包された時には６か月を超える貯蔵寿命を備えた完成品を得ることを可能にする酸化防止剤の添加が含まれる。
【００４３】
本発明の別の本質的な目的は、リコペンの製造方法であり、これは、リコペンが使用されることになっている適用態様の特性に応じた様々なかたちでのその調合を含む。植物油中のリコペンの微晶質の懸濁液と呼ばれる最初の適用態様は、前述の結晶リコペンを可変量の植物油と前もって混合することからなる。植物油のタイプは様々に変えることができ、最も一般的なもの（唯一のものではない）としては、ヒマワリ油、オリーブオイル、トウモロコシ油、大豆油、綿実油などである。リコペンの投薬量は、要求される最終強さの関数であり、最も一般的な値は、５〜６０％、好ましくは１０〜３０％の間のリコペン含有量の懸濁液になるであろう。混合物の安定性を増すために、天然トコフェロール、好ましくはＤ，Ｌ−アルファ−トコフェロールなどの通常の脂溶性酸化防止剤を添加する。この化合物の割合は、リコペンの重量に対して０．２〜１５％、好ましくは０．５〜５％の範囲で変わる。満足な生理学活性を有するリコペン含有調合物とするためには、リコペン結晶の大きさを小さくすることが必要である。これは、液体混合物に適した通常の粉砕システムを用いて達成される。本発明の特別の目的は、１０ミクロン以下、好ましくは５ミクロン以下、さらに好ましくは２ミクロン以下まで結晶サイズの低減を可能にするボールミルである（０．５〜０．７５ｍｍの間の直径の微粒子を使用する）。もっとも、結晶サイズは懸濁液の具体的適用態様での必要に応じて変わり得るものであり、各場合で適当な球体及び粉砕条件を使用する。この結晶サイズは、混合物の流動学的特性（特にその粘性）を決定するが、これもまた必要に応じて調節できる。油中のリコペンのこれらの微晶質懸濁液は、脂質親和性の強い環境でのリコペンの適用態様（マーガリン、バター、クリームなど）に適している。
【００４４】
第２の適用態様は、冷水分散性（ＣＷＤ）リコペン調合と呼ばれ、有機溶媒中へのリコペンの溶解、次いで修飾デンプン中へのマイクロカプセル化に基づく。この溶解を達成するのに最も適した溶媒は、この分子が高い溶解度を示すことから、クロロホルム、ベンゼン、トルエンなどである。塩化メチレンは特に適している。しかし、これにはハロゲン化物性があることから、アシルエステル（好ましくは、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル又は酢酸イソブチル）などの、天然とみなされ得る食品級溶媒の使用が可能であり、これは、カロテノイド成分に対するそのかなり高い溶解度とＩＣＨのクラスＩＩＩのグループに含まれる溶媒としての適合性とを併せ持つ。有機溶媒中のリコペンの濃度は、１〜５０ｇ／ｌ、好ましくは１０〜３０ｇ／ｌの間で変えることができる。分解温度は、室温と溶媒沸点の間、好ましくは２０と１３０℃の間で変えることができる。ｃｉｓリコペンのパーセンテージは、有機溶媒中へのリコペンの溶解操作における温度／時間比の関数であるという事実は、この異性体の含有量の低い製品を得たければ、低い溶解温度が使用され、さもなければ非常に短い溶解時間が用いられることを意味する。したがって、低ｃｉｓレベルを達成するためには、使用される溶媒が塩化メチレンである場合は、溶解を１〜１５分の時間をかけて２０〜３５℃で実行すればよい。他方、溶媒が酢酸イソブチルである場合、溶解は、数秒間、７０と１３０℃の間で好ましくは達成されるであろう。しかし、ｃｉｓ異性体のレベルが関係ない場合、溶解は、使用する溶媒中にリコペンを分子レベルですべて溶解させる溶解度を達成する点以外、その条件に対する制限なしで実行できる。最終調合物の安定性を増加させるために、リコペンとともに有機溶媒中に１又は複数の酸化防止剤の混合物を溶解させる。これらの酸化防止剤は好ましくはトコフェロール、アスコルビン酸パルミテートなどであり、各々、リコペン重量に対して１〜３０％、好ましくは１０〜２０％の間の割合である。さらに、リコペンの溶解を促進し、調製物にさらなる安定性を付与する目的で、混合物に植物油（ヒマワリ油、オリーブオイル、トウモロコシ油、大豆油、綿実油など）を組み入れることも可能である。リコペン／油比率は１０／１と１／１０の間で変えることができる。
【００４５】
このようにして得られたリコペン溶液を、乳化剤、例えば、修飾デンプン、より具体的にはデンプンに由来するエステル、好ましくは様々な分子量のデンプンに由来するコハク酸オクテニル、特に（但し、これらに限定されない）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ製Ｐｕｒｉｔｙ  Ｇｕｍ  ２０００（登録商標）又はＲｏｑｕｅｔｔｅ  製Ｃｌｅａｒｇｕｍ  ＣＯ０１（登録商標）、及びマイクロカプセル化剤、例えば修飾デンプン、より具体的には、デンプンに由来するエステル、好ましくは様々な分子量のデンプンに由来するコハク酸オクテニル、特に（但し、これらに限定されない）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ製ＨｉＣａｐ  １００（登録商標）又はＣａｐｓｕｌ（登録商標）を含む水溶液と混合して乳化する。乳化剤及びマイクロカプセル化剤が混合される割合は、５／９５〜９５／５の間、好ましくは２５／７５〜７５／２５の間、より好ましくは４０／６０〜６０／４０の間で変えることができる。乳化剤とマイクロカプセル化剤の混合物の各成分の含水率は可変で、１〜３０％の間、好ましくは５〜２０％の間、より好ましくは１０％とすることができる。水相と有機相の混合物は乳化され、得られた乳液は、一般に使用されるＭａｎｔｏｎ  Ｇａｕｌｉｎ又はＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒタイプの差圧均質化システムを使用して、好ましくは接線摩擦による（例えばＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘタイプの乳化機を用いて）均質化によって、１０ミクロン未満、好ましくは２ミクロン未満、より好ましくは０．１〜１ミクロンの間の平均ミセル径を得る目的で、装置により供給されるエネルギー及び乳化される混合物の体積の関数として変化する時間の間、均質化する。
【００４６】
乳剤を形成した後、５０℃以下の温度で好ましくは真空蒸留によって有機溶媒の蒸発を行う。溶媒の蒸発が進むにつれて、デンプンマトリックス中でリコペンの微結晶化が起こる。溶媒が蒸発した後も、残留溶媒含有量が法令によって定められた最大濃度に関する仕様に適合するまで水を引き続き加えて蒸発を継続し、この液体混合物に適用すべき乾燥タイプに適した乾燥残留物を得る。マイクロカプセル化されたリコペンの懸濁液中での適切な乾燥含量値は、１〜３０％の間、好ましくは１０〜２０％の間である。
【００４７】
本発明によれば、得られたリコペンの水性懸濁液を乾燥させるのには、高温微粉化（噴霧）による乾燥方法と流動床微粉化（顆粒化）法の両方が適することがわかった。別の選択肢としては凍結乾燥があろう。噴霧による乾燥方法において求められるように、乾燥空気の適切な入口温度は１００と２００℃の間であり、出口温度は６０と１２０℃の間であろう。噴霧された生成物は、１０〜１００ミクロン間の粒径を有する。粒径を増加させて有効面積を低減させ、これにより生成物の耐酸化性を増加させる目的で、前記噴霧生成物の流動床内で、調合に使用する修飾デンプン溶液又はマイクロカプセル化されたリコペン自体の懸濁液のうち１つから微粉化することによって噴霧生成物を凝塊化させることもできる（これにより、５０〜５００ミクロン、好ましくは、２００〜３００ミクロンの範囲の粒径に到達できる）。
【００４８】
顆粒化方法は、流動床造粒機の使用を含み、そこに、種物質（典型的には、糖粒子などの不活性材料あるいは前の顆粒化プロセス又は噴霧乾燥プロセスで得た、乾燥させようとする実際の物質の微粉末）を装入する。空気によって粒子を運動状態に維持し、床温度を３０と９０℃の間、好ましくは５０と８０℃の間に維持する。マイクロカプセル化されたリコペンの懸濁液は、流動床内において２０〜１４０℃の間の温度に予熱した空気によって、被覆される粒子が確実に、過度に湿潤となることなく塊を形成しない割合で散布する。顆粒化された生成物は、１００〜２０００ミクロン間、好ましくは１００〜８００ミクロン、より好ましくは１００〜３００ミクロンの間の粒径を有する。何らかの方法により微粉化が完了した後、粒子を被覆してもよい。この被覆は、本発明の目的である調合物を構成する様々な糖又は１又は複数のデンプンの混合物の水溶液（乾燥重量でおよそ０．５〜１０％）によって行うことができる。
【００４９】
（ブダペスト条約に従う微生物の寄託）
Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａの菌株は、ブダペスト条約の規定に従って、以下の番号及び日付により、モスクワ１１３５４５（ロシア）、Ｄｏｒｏｚｈｎｙ  Ｐｒｏｅｚｄ  １、ＧＮ１１  Ｇｅｎｅｔｉｋａロシア国立産業微生物コレクション（ＶＫＰＭ）に寄託された：
ＶＫＰＭ  Ｆ−１１７（１２．２１．１９７９）、ＶＫＰＭ  Ｆ−２０８（１２．２０．１９７９）、ＶＫＰＭ  Ｆ−５５１（１１．１９．１９９２）、ＶＫＰＭ  Ｆ−６７４（１１．１９．１９９２）、ＶＫＰＭ  Ｆ−７２６（０１．２１．１９９７）、ＶＫＰＭ  Ｆ−７２７（０１．２１．１９９７）、ＶＫＰＭ  Ｆ−７３６（１０．０７．１９９７）、ＶＫＰＭ  Ｆ−７４１（０１．２８．１９９８）、ＶＫＰＭ  Ｆ−７４４（０１．２８．１９９８）及びＶＫＰＭ  Ｆ−８１６（１２．１３．２０００）。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）菌株のフラスコ中、次の各Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）菌株（Ｌ２５、ＣＭＡ１、ＣＭＡ２、ＣＭＡ３、ＣＭＡ４、ＣＭＢ１、ＣＭＢ２及びＬＭＡ１）との混合発酵によるリコペンの生産を示すグラフである（ＣＰＡ１（＋）／ＬＭＡ１（−）混合発酵以外においては、リコペン環化酵素の阻害剤としてイミダゾールを加えた。縦座標：対照菌株Ｌ２５（−）（ＶＫＰＭ  Ｆ−７４４）に対する生産率（％））。
【図２】Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）菌株の発酵槽中、次の各Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）菌株（Ｌ２５、ＣＭＡ１、ＣＭＡ２、ＣＭＡ３、ＣＭＡ４、ＣＭＢ１、ＣＭＢ２及びＬＭＡ１）との混合発酵によるリコペンの生産を示すグラフである（ＣＰＡ１（＋）／ＬＭＡ１（−）混合発酵以外においては、リコペン環化酵素の阻害剤としてイミダゾールを加えた。縦座標：対照菌株Ｌ２５（−）（ＶＫＰＭ  Ｆ−７４４）に対する生産率（％））。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下の例は本発明を詳細かつ非限定的に説明するものである。
【実施例１】
【００５２】
Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）及び（−）菌株の変異方法
初めに、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）及び（−）菌株について変異誘導方法を開発し、下記の点を分析した：（ｉ）様々なタイプの変異誘導剤、（ｉｉ）変異原濃度、（ｉｉｉ）胞子の濃度、（ｉｖ）インキュベーションｐＨ及び（ｖ）処理時間。このようにして、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）及びＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）が変異誘導剤として選択された。
【００５３】
変異胞子の懸濁液をＹｐＳｓ培地（これは以下の組成を有する：酵母エキス４ｇ／ｌ、溶解度デンプン１５ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ／ｌ及び寒天１５ｇ／ｌ。最終ｐＨ５．８）による斜面培地から得た。胞子は、各斜面培地にトリトンＸ−１００の０．１％溶液を１０ｍｌ加えることにより再懸濁させた。菌糸体残留物は、孔径２０μｍのナイロンフィルターを通す濾過によって除去した。懸濁液中の胞子濃度は約１０６胞子／ｍｌであった。
【００５４】
ＥＭＳによる変異方法は、ＥＭＳの３％溶液（０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ７．０））中、室温で６０分間、１０６胞子／ｍｌをインキュベートすることにより行い、約９９％の死亡率を達成した。変異胞子を０．１％トリトンＸ−１００で３回洗浄し、１５℃で２分間３０００ｒｐｍにて遠心分離した。
【００５５】
ＮＴＧによる変異方法は、２５０μｇ／ｍｌのＮＴＧ及び０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ５．０）を含む溶液中、室温で３０分間、１０６胞子／ｍｌをインキュベートすることにより行い、約９５％の死亡率を達成した。変異胞子を０．１％トリトンＸ−１００で３回洗浄し、１５℃で２分間３０００ｒｐｍにて遠心分離した。
【００５６】
変異胞子を用い、０．１％トリトンＸ−１００を補ったサッターＩＶ固体培地を含むペトリ皿に播種した。サッター（Ｓｕｔｔｅｒ）ＩＶ培地１リットル当たりの組成は以下の通りである：グルコース４０ｇ、Ｌ−アスパラギン４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１０ｇ、５０倍希釈微量元素溶液４０ｍｌ及び寒天３０ｇ。５０倍希釈微量元素溶液は以下のものから構成される：ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２５ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １．８２ｇ／ｌ、チアミン０．０５ｇ／ｌ、クエン酸０．１ｇ／ｌ、Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ  ０．０７５ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．１７ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０２５ｇ／ｌ及びＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０２５ｇ／ｌ。播種した皿は、分離されたコロニーを得るために２５℃で４日間インキュベートした。
【実施例２】
【００５７】
過剰産生株であるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）の変異株を選択するための方法
この例は、（ｉ）トリスポリック酸の使用及び（ｉｉ）コロニーの色強度に基づいて、リコペン過剰産生株であるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）菌株を選択するための方法について記載する。図１は、本発明で用いたＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）菌株の系統発生を示す。
【００５８】
トリスポリック酸添加によるリコペン産生変異株の選択は、変異胞子から得られたコロニー上に、トリスポリック酸をしみ込ませた直径約０．６ｍｍの無菌フィルターを置くことにより行った。トリスポリック酸は、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）と（−）の菌株の混合培養物から、試料をｐＨ２まで酸性化した後、クロロホルム１体積によって上清を抽出することによって得た。有機画分を４％重炭酸ナトリウム溶液１体積によって抽出し、水相を回収し、これを酸性化した後、クロロホルムで再び抽出した。次に、クロロホルムは蒸発して乾燥させ、トリスポリック酸に豊む残渣をエタノールに溶解した。トリスポリック酸の量は、３２５ｎｍで吸光度を測定し、７０ｍｌ×ｍｇ−１×ｃｍ−１の吸光係数を想定して決定した（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｒ．Ｐ．，  Ｃａｐａｇｅ  Ｄ．Ａ．，  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｔ．Ｌ．，  Ｋｅｅｎ  Ｗ．Ａ．１９７３．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １１４：１０７４−１０８２）。
【００５９】
１．２ｍｇ／ｍｌトリスポリック酸エタノール溶液中で無菌フィルターをインキュベートし、次に、無菌状態で室温において乾燥させた。次に、フィルターを、予め２５℃で４日間増殖させた変異株コロニー上に置いた。この皿をさらに３日間２５℃でインキュベートし、リコペン産生変異株が、β−カロテン産生体（その色は橙色だった）とは対照的に深赤色になるのを観察した。
【００６０】
ＣＭＡ３（−）菌株にこの方法を適用して変異株ＬＭＡ１（−）を得た（図１）。これは、リコペン環化酵素をコードするｃａＲＰ遺伝子に変異を有する可能性があり、したがって、β−カロテンを生産する代わりに、カロテノイドの発酵プロセス中に中間体であるリコペンを蓄積するはずである。したがって、ＬＭＡ１菌株は、リコペン環化酵素活性の特異的阻害剤を加える必要なくリコペンを生産できる（実施例５）。
【００６１】
コロニーの色強度に関してのリコペン産生変異株の選択を以下のようにして行った。ＣＭＡ１菌株（β−カロテン産生体；図１参照）を実施例１に記載するのと同様にして変異させた。ＹＥＰＤＡ固体培地（バクト−ペプトン２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ及び寒天２０ｇ／ｌ。最終ｐＨ６．０）の皿の上に変異胞子を播種し、２５℃で２４時間、次いで２０℃で４８〜７２時間インキュベートした。最後に、ＣＭＡ１（−）親菌株より深い黄橙色のコロニーを選択した。このようにして、深い黄橙色の２つのコロニーを分離した（ＣＭＢ１（−）及びＣＭＢ２（−）という）。ＣＭＢ１菌株とＣＭＢ２菌株は、リコペン環化酵素活性の特異的阻害剤（例えば、イミダゾール；実施例４）を添加した混合発酵で、コペン過剰産生株となる可能性がある。
【実施例３】
【００６２】
リコペン過剰産生変異株であるＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）を選択するための方法
Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）のリコペン過剰産生変異株の選択を、実施例１に記載した変異胞子を使用して行った。これらの胞子を、０．１％のイミダゾールを補ったサッター（Ｓｕｔｔｅｒ）ＩＶ固体培地を含むペトリ皿上に播種し、分離されたコロニーを得るために２５℃で７日間インキュベートした。次に、各コロニーからの一部を予めＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（−）を播種したＰＤＡ皿に移した。（＋）と（−）の菌株の播種点の間の距離は、およそ２ｃｍでなければならない。固体培地中のリコペン産生レベルは、（−）菌株のコロニーと（＋）菌株のコロニーの交差ゾーンでの着色強度から評価した。このようにして、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ菌株ＣＰＡ１（＋）を選択し、これは一連の（−）菌株との混合固体培養でリコペンのより高い収量を生じた。次いで、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ菌株ＣＰＡ１（＋）からの産生レベルを、実施例４及び５に記載するように、液培地中の混合培養物中で分析した。本発明の中で使用するＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）菌株の系統発生をスキーム３に示す。
【実施例４】
【００６３】
リコペン環化酵素の阻害剤添加による、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）菌株と（−）菌株の混合培養によるフラスコ中でのリコペン産生方法
実施例１、２及び３に記載するように選択したＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）菌株と（−）菌株を、液体培地及び混合培養中でリコペン産生レベルを決定するため、フラスコ中で発酵させた。このために、接種原培地を１リットル当たり以下の組成で調製した：大豆粉２３ｇ、トウモロコシ粉４７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、チアミン塩酸塩０．００２ｇ。また、ｐＨは６．３に調節した。Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＰＡ１（＋）菌株を、６７ｍｌの培地を含む５００ｍｌフラスコ中、１ｍｌ当たり１０３胞子の割合で播種した。Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＭＢ２（−）菌株を、１００ｍｌの培地を含む５００ｍｌフラスコ中、１ｍｌ当たり１０４胞子の割合で播種した。両方のタイプの接種原を２５℃で４４時間２５０ｒｐｍにてインキュベートした。
【００６４】
インキュベーションが完了したら、（＋）菌株と（−）菌株の種菌を１／１０（ｖ／ｖ）の比率で混合し、混合物を、発酵培地を２０ｍｌ含む２５０ｍｌフラスコに１個のフラスコ当たり菌株混合物４ｍｌの割合で接種するために使用した。これらのフラスコを２５℃で５〜６日間２５０ｒｐｍにてインキュベートした。使用する発酵培地は、１リットル当たり次の組成を有するものとした。大豆粉４４ｇ、トウモロコシ粉１９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４５．５ｇ、チアミン塩酸塩０．００２ｇ、植物油１００ｍｌ。また、ｐＨは７．５に調節した。培地を２５０ｍｌのフラスコ中に分配し、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａの（＋）菌株と（−）菌株の混合物２０％で接種した。生合成経路をリコペン段階でブロックする目的で、発酵０時間目と３６時間目の間にリコペン環化酵素の阻害剤（例えば、イミダゾール０．７５μｇ／ｍｌ）を加えた。フラスコを２５℃で６日間２５０ｒｐｍにてインキュベートした。発酵終了時点で、発酵培地、ガラスビーズ及び塩化メチレン／メタノール（１／１）混合物を調製した。ボルテックス撹拌によりＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ菌糸体を溶菌させ、細胞内のリコペンを放出させた。塩化メチレン／メタノール混合物（比率１：１）で抽出したリコペンをアセトン中で希釈した。リコペンの濃度及び純度を逆相ＨＰＬＣを使用して決定した。
【００６５】
菌株Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）及びＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＭＢ２（−）の混合発酵で得られた収量は、イミダゾール存在下でリコペン３ｇ／ｌであった（図１）。
【実施例５】
【００６６】
リコペン環化酵素阻害剤を添加しない、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）とＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＬＭＡ１（−）菌株との混合培養によるフラスコ中でのリコペン産生方法
実施例１、２及び３に記載するように選択したＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＬＭＡ１（−）菌株及びＣＰＡ１（＋）菌株を、液体培地及び混合培養中でリコペン産生レベルを決定するため、フラスコ中で発酵させた。このために、（＋）菌株及び（−）菌株から種菌を調製し、実施例４に記載したのと同様にしてフラスコ中で発酵を行った。違いは、この場合、リコペン環化酵素活性の化学的阻害剤を添加しなかった点である。発酵終了時点で、実施例４に記載したのと同様にしてリコペン産生を評価した。
【００６７】
菌株Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）とＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＬＭＡ１（−）の混合発酵によって得られた収量は、イミダゾールがない状態でリコペン１．２ｇ／ｌであった（図２）。
【実施例６】
【００６８】
リコペン環化酵素の阻害剤添加による、Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ（＋）菌株と（−）菌株の混合培養による半商用発酵槽中でのリコペン産生方法
実施例２及び３に記載したのと同様にして選択したＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＰＡ１（＋）菌株及びＣＭＢ２（−）菌株を、リコペン収量を決定するため、半商用発酵槽中で培養した。このために、接種原培地を１リットル当たり以下の組成で調製した（大豆粉２３ｇ、トウモロコシ粉４７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、チアミン塩酸塩０．００２ｇ。また、ｐＨは６．３に調節した）。培地を５００ｍｌ含む２０００ｍｌフラスコ中、（＋）菌株と（−）菌株を別々に播種し、２５℃で４４〜４８時間、２５０ｒｐｍにてインキュベートした。
【００６９】
１リットル当たり以下の組成を有する培地を含む中間増殖槽に各菌株を移した（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ２９ｇ、トウモロコシ粉４７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ；チアミン塩酸塩０．００２ｇ及び消泡剤１ｇ。また、ｐＨは６．０に調節した）。３６〜４８時間インキュベートした後、（＋）菌株と（−）菌株を１／１０の比率で混合し、混合物の２０％を発酵基礎培地（これは１リットル当たり次の組成を有するものとした：大豆粉４４ｇ、トウモロコシ粉１９．２５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４３．３６ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４０．１８４ｇ、チアミン塩酸塩０．００２２ｇ、植物油１００ｇ及び消泡剤０．１７５ｇ。また、その初期ｐＨは７．５に調節した）に播種するために使用した。１〜１．５ｖ／ｖ／ｍで通気し１５０〜２５０ｒｐｍの範囲で撹拌しながら、発酵液を２５〜２８℃の温度で１００〜１４０時間インキュベートした。発酵２５時間目と３５時間目の間に、滅菌イミダゾールを０．７５ｇ／ｌの最終濃度で加えた。
【００７０】
実施例４に記載したのと同様にして、発酵終了時点でリコペンの濃度及び純度の評価を行った。ＣＰＡ１（＋）及びＣＭＢ２（−）菌株の一連の様々な発酵液中で得られたリコペン収量の平均値は、３．４ｇ／ｌであった（図２）。
【実施例７】
【００７１】
リコペン環化酵素阻害剤を添加しない、菌株Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＣＰＡ１（＋）とＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａ  ＬＭＡ１（−）の混合培養による半商用発酵槽中でのリコペン産生方法
実施例２及び３に記載する方法で選択したＢ．ｔｒｉｓｐｏｒａのＣＰＡ１（＋）菌株及びＬＭＡ１（−）菌株を、リコペン環化酵素の阻害剤を加えずに、リコペン産生レベルを決定するため半商用発酵槽中で培養した。このために、接種原培地を１リットル当たり以下の組成で調製した（大豆粉２３ｇ、トウモロコシ粉４７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、チアミン塩酸塩０．００２ｇ。また、ｐＨは６．３に調節した）。培地を５００ｍｌ含む２０００ｍｌフラスコ中、（＋）菌株と（−）菌株を別々に播種し、２５℃で４４〜４８時間、２５０ｒｐｍにてインキュベートした。
【００７２】
１リットル当たり以下の組成を有する培地を含む中間増殖槽に各菌株を移した（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ２９ｇ、トウモロコシ粉４７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ；チアミン塩酸塩０．００２ｇ及び消泡剤１ｇ。また、ｐＨは６．０に調節した）。３６〜４８時間インキュベートした後、（＋）菌株と（−）菌株を１／１０の比率で混合し、混合物の２０％を発酵基礎培地（それは１リットル当たり次の組成を有するものとした：大豆粉４４ｇ、トウモロコシ粉１９．２５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４３．３６ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４０．１８４ｇ、チアミン塩酸塩０．００２２ｇ、植物油１００ｇ及び消泡剤０．１７５ｇ。また、その初期ｐＨは７．５に調節した）に播種するために使用した。１〜１．５ｖ／ｖ／ｍで通気し１５０〜２５０ｒｐｍの範囲で撹拌しながら、発酵液を２５〜２８℃の温度で１００〜１４０時間インキュベートした。
【００７３】
実施例４に記載したのと同様にして、発酵終了時点でリコペンの濃度及び純度の評価を行った。ＣＰＡ１（＋）及びＬＭＡ１（−）菌株の一連の様々な発酵液中でイミダゾールがない状態で得られたリコペン収量の平均値は、１．６ｇ／ｌであった（図２）。
【実施例８】
【００７４】
アルコール中のバイオマスの再懸濁によるリコペン回収方法
生合成経路をリコペン段階で中断した生合成プロセスに対応する、３リットルの発酵培地を収穫した。培地の滴定濃度は１リットル当たりリコペン３ｇであった。この培地のバイオマスをブフナー漏斗（濾過シートの役割をする円形の紙又はカードを支える磁器フィルター漏斗）による濾過によって回収し、湿潤バイオマス７５０ｇを得た。湿潤バイオマスを５．２ｌの共沸イソプロピルアルコール（８５／１５）に再懸濁し、４５±５℃で３０分間撹拌した。ブフナー漏斗を使用して精製バイオマスの回収を繰り返した。このバイオマスを真空下、残留溶媒／水含有量が８％未満となるまで４５±５℃以下の温度のレンジ中で１８時間乾燥させた。乾燥した精製バイオマス１５０ｇが得られ、リコペン含有量は５．５％の分析値と等しかった。乾燥バイオマスをボールミル中及び１ｍｍスクリーンを用いて磨砕し、同じパーセンテージ含有量の固体を得た（溶媒抽出を可能にするようにこれを条件調整した）。
【００７５】
磨砕したバイオマス１５０ｇを酢酸イソブチル２５００ｍｌと７０±５℃で混合し、５分間撹拌を続けることで抽出を行った。抽出済みバイオマスは、フィルタープレート上で濾過することによりリコペンに富む溶媒から分離した。抽出済みバイオマスを同じフィルター上、熱酢酸イソブチル３００ｍｌで洗浄し、洗浄溶媒と濾液を合わせた。これらのリコペンに富む酢酸イソブチルをすべて、体積が３００ｍｌに減少するまで、４５±５℃以下の温度を維持して、真空下で濃縮した。これにより直ちに、リコペンのうちの幾分かが結晶化した。結晶化を完了させ、より純粋なリコペンを得るために、イソプロピルアルコール９００ｍｌを加えた。混合物の撹拌を、窒素下で３時間、０〜５℃の温度範囲で継続した。これをブフナー漏斗で濾過し、ブフナー漏斗上、イソプロピルアルコール２５ｍｌで結晶を洗った。結晶を回収し、次いで真空下で乾燥させ、９５％の分光分析純度を有するリコペン結晶６．５ｇを得た。他のカロテノイド及びｃｉｓリコペンのいずれもＨＰＬＣによって検出されなかった。
【実施例９】
【００７６】
油性懸濁液中へのリコペン調合方法
Ｎｅｔｚｓｃｈ製Ｍｉｎｉｚｅｔａ  ００３タイプの実験室ボールミルに、以下の順で下記のものを装入した。０．５〜０．７５ｍｍの直径の微粒子、ヒマワリ油（Ｋｏｉｐｅ）２３．５ｇ、Ｄ，Ｌ−アルファトコフェロール（Ｍｅｒｃｋ）０．０６５ｇ及び実施例８に記載するように得た結晶リコペン６．５ｇ。混合物を５分間３０００ｒｐｍにて磨砕し、深い赤みがかった紫色の粘着性液体２５ｇを得た。油性懸濁液の分光分析から、リコペン含有量は２１％であることが明らかになった。他のカロテノイド類もリコペンのｃｉｓ異性体もＨＰＬＣでは存在が検出されなかった。結晶は１０ミクロン未満であった。
【実施例１０】
【００７７】
アルコールによるリコペン発酵培地の直接処理によるリコペンの回収方法
１５００ｌのリコペン発酵培地（リコペン濃度２．３ｇ／ｌ）を、４５００リットルのイソプロピルアルコール／水（８５／１５）共沸混合物と直接混合した。４５±５℃で３０分間撹拌した後、バイオマスを遠心デカンターを使用して液体から分離した。湿潤精製バイオマス約２５０ｋｇを回収した。
【００７８】
このバイオマスを水とイソプロピルアルコールに浸漬し、残留溶媒／水含有量が８％以下となるまで真空下、回転式ドライヤー中で乾燥させた。乾燥温度は４５±５℃であり、ドライヤー中の平均滞留時間は１４時間であった。比濃度３．７５％に等しいリコペン含有量の乾燥バイオマス８５ｋｇを得た。
【００７９】
乾燥バイオマスを圧粉機（ＢＥＰＥＸ製ＨｕｔｔＣｏｍｐａｃｋｔｏｒ）で押し出し、同じ比濃度の固体を得た（これを溶媒抽出が可能なように条件調整した）。
【００８０】
抽出は酢酸イソブチル１６５０１と磨砕した固体８５ｋｇを混合することにより行った。混合物を、およそ２分の平均接触時期の間６０±５℃、インラインで加熱した。また、抽出済みバイオマスは、遠心デカンターを使用して、リコペンに富む溶媒から分離した。リコペンに富む酢酸イソブチル全体を体積が１００ｌに減るまで４５±５℃以下の温度に維持して真空下で濃縮した。これにより直ちに、多くのリコペンが結晶化した。リコペンの結晶化を完成するため、イソプロピルアルコール３００ｌを加えた。混合物を０〜５℃で３時間撹拌した。これをブフナー漏斗上で濾過し、リコペン結晶を回収し、真空下に室温で乾燥させた。分光分析純度９６％の生成物２ｋｇを得た。他のカロテノイド類もｃｉｓ異性体もＨＰＬＣでは存在が検出されなかった。
【実施例１１】
【００８１】
酢酸イソブチルを溶媒として用いた水分散性リコペンの調合方法
実施例１０に記載するようにして得たリコペン３．５ｇを酢酸イソブチル４１０ｍｌに再懸濁させ、Ｄ，Ｌ−アルファトコフェロール（Ｍｅｒｃｋ）０．３５ｇを加えた。混合物を沸騰（１１４℃）するまで５分間加熱してリコペンが確実に完全に溶解するようにした。同時に、１２ｇのＨｉ−Ｃａｐ  １００（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ）及び１２ｇのＰｕｒｉｔｙ  Ｇｕｍ  ２０００（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ）を脱塩水３２５ｍｌに溶解した。熱い有機相を、ＩＫＡ製Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ乳化剤を用いて水相上、１段階で５分間かけて乳化し、１．２ミクロンの平均ミセル径（コールターＬＳ２３０アナライザーで測定）を達成した。乳液を真空蒸留システムに移し、水６００ｍｌ加え、酢酸イソブチル４１０ｍｌを水およそ７００ｍｌとともに蒸発させた。リコペン含有量１．２５％（乾燥質量に基づいて９．８％）の２０３ｇの液体調合物（乾燥分１２．７５％）が得られた。ＨＰＬＣを使用して含有量２３．３％のｃｉｓリコペンが検出されたが、他のカロテノイド類は検出されなかった。この液体調合物を、Ｂｕｃｈｉ  １９０実験室用噴霧器（入口１９０℃、出口９０℃のガス温度を使用）によって噴霧し、リコペン含有量８．４％、含水量６．５％の深赤色粉末を得た。ＨＰＬＣを使用して含有量２３％のｃｉｓリコペンが検出されたが、他のカロテノイド類は検出されなかった。
【実施例１２】
【００８２】
酢酸イソブチルを溶媒として用いた水分散性リコペンの調合方法
実施例１０に記載するようにして得たリコペン３．５ｇを酢酸イソブチル４１０ｍｌに再懸濁させ、Ｄ，Ｌ−アルファトコフェロール（Ｍｅｒｃｋ）０．３５ｇ、アスコルビン酸パルミテート（Ｍｅｒｃｋ）０．７ｇ及びヒマワリ油（Ｋｏｉｐｅ）３．５ｇを加えた。混合物を沸騰（１１４℃）するまで５分間加熱してリコペンが確実に完全に溶解するようにした。同時に、１０ｇのＨｉ−Ｃａｐ  １００（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ）及び１０ｇのＰｕｒｉｔｙ  Ｇｕｍ  ２０００（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ）を脱塩水３２５ｍｌに溶解した。熱い有機相を、ＩＫＡ製Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ乳化剤を用いて水相上、１段階で５分間かけて乳化し、１．４  ミクロンの平均ミセル径（コールターＬＳ２３０アナライザーで測定）を達成した。乳液を真空蒸留システムに移し、水６００ｍｌ加え、酢酸イソブチル４１０ｍｌを水およそ７００ｍｌとともに蒸発させた。リコペン含有量１．３％（乾燥質量に基づいて９．８％）の１９５ｇの液体調合物（乾燥分１３．２５％）が得られた。ＨＰＬＣを使用して含有量２５％のｃｉｓリコペンが検出されたが、他のカロテノイド類は検出されなかった。この液体調合物を、Ｂｕｃｈｉ  １９０実験室用噴霧器（入口１９０℃、出口９０℃のガス温度を使用）によって噴霧し、リコペン含有量８．５％、含水量６．０％の深赤色粉末を得た。ＨＰＬＣを使用して含有量２４．５％のｃｉｓリコペンが検出されたが、他のカロテノイド類は検出されなかった。
【実施例１３】
【００８３】
ジクロロメタンを溶媒として用いた水分散性リコペンの調合方法
実施例１０に記載するようにして得た結晶リコペン７．５ｇをジクロロメタン５００ｍｌに再懸濁させ、Ｄ，Ｌ−アルファトコフェロール（Ｍｅｒｃｋ）０．７５ｇを加え、混合物を３５℃で５分間加熱した。同時に、２７ｇのＨｉ−Ｃａｐ  １００（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ）及び２７ｇのＰｕｒｉｔｙ  Ｇｕｍ  ２０００（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ）を蒸留水４００ｍｌに溶解した。有機相を、ＩＫＡ製Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ乳化剤を用いて水相上、１段階で１５分間かけて乳化し、０．４ミクロンの平均ミセル径（コールターＬＳ２３０アナライザーで測定）を達成した。乳液を真空蒸留システムに移し、水６００ｍｌ加え、ジクロロメタン５００ｍｌを水およそ６００ｍｌとともに蒸発させた。リコペン含有量１．５％（乾燥質量に基づいて１１．５％）の４００ｇの液体調合物（乾燥分１３．１％）が得られた。ＨＰＬＣを使用して含有量６．５％のｃｉｓリコペンが検出されたが、他のカロテノイド類は検出されなかった。この液体調合物を、Ｂｕｃｈｉ  １９０実験室用噴霧器（入口１９０℃、出口９０℃のガス温度を使用）によって噴霧し、リコペン含有量１０．６％、含水量５．３％の深赤色粉末を得た。ＨＰＬＣを使用して含有量６．４％のｃｉｓリコペンが検出されたが、他のカロテノイド類は検出されなかった。
【実施例１４】
【００８４】
ジクロロメタンを溶媒として用いた水分散性リコペンの調合方法
実施例１０に記載するようにして得た結晶リコペン７．５ｇをジクロロメタン５００ｍｌに再懸濁させ、Ｄ，Ｌ−アルファトコフェロール（Ｍｅｒｃｋ）０．７５ｇを加え、混合物を３５℃で５分間加熱した。同時に、２７ｇのＨｉ−Ｃａｐ  １００（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ）及び２７ｇのＰｕｒｉｔｙ  Ｇｕｍ  ２０００（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ）を蒸留水４００ｍｌに溶解した。有機相を、ＩＫＡ製Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ乳化剤を用いて水相上、１段階で６０分間かけて乳化し、０．２３ミクロンの平均ミセル径（コールターＬＳ２３０アナライザーで測定）を達成した。乳液を真空蒸留システムに移し、水６００ｍｌ加え、ジクロロメタン５００ｍｌを水およそ６５０ｍｌとともに蒸発させた。リコペン含有量１．６％（乾燥質量に基づいて１１．４％）の３５０ｇの液体調合物（乾燥分１４．４％）が得られた。ＨＰＬＣを使用して含有量２０％のｃｉｓリコペンが検出されたが、他のカロテノイド類は検出されなかった。この実験室ユニット中で凍結乾燥し、リコペン含有量１０．７％、含水量７．４％の綿毛状深赤色粉末を得た。ＨＰＬＣを使用して含有量１５％のｃｉｓリコペンが検出されたが、他のカロテノイド類は検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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