(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性の担体に親水性の分子量２，０００以上の仲介物質が結合し、仲介物質にプローブおよび２個以上の分子量１０，０００以下の検出マーカーが結合したプローブ複合体。
【請求項２】
検出マーカーがビオチンである請求項１に記載のプローブ複合体。
【請求項３】
検出マーカーがハプテンである請求項１に記載のプローブ複合体。
【請求項４】
検出マーカーが蛍光物質または発光物質である請求項１に記載のプローブ複合体。
【請求項５】
検出マーカーが放射性同位体を有するものである請求項１に記載のプローブ複合体。
【請求項６】
検出マーカーが抗体との結合能を有する物質である請求項１に記載のプローブ複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体に仲介物質を介してプローブおよびハプテンまたは低分子ペプチドなどの検出マーカーが結合したプローブ複合体作製の技術に関するものであり、作製されたプローブ複合体は酵素免疫測定法や免疫組織化学などの免疫反応を利用する免疫測定に広く用いられる。
【背景技術】
【０００２】
免疫組織化学法や免疫測定法は抗原と抗体の免疫反応を利用して、生体内の自己の抗原あるいは外来抗原を検出する方法として用いられている。これらの方法は特異性と感度が高いため、生体内に存在する微量な物質を単離することなく、検出することができる。【０００３】
免疫組織化学法は抗原と抗体の特異的な反応を用いて、目的とする抗原の細胞内の局在や組織内での局在を検出する手法である。一般に広く使用されているＡＢＣ法による免疫組織化学法は次のような工程で行う。凍結組織やパラフィン固定した組織から組織切片を作製する。次に非特異的な結合を抑えるため、牛血清アルブミンなどでブロッキングを行う。これに目的の抗原に結合する抗体とビオチンを結合させたビオチン化抗体を反応させ、抗原とビオチン化抗体の免疫複合体が形成される。この免疫複合体に西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素が結合したアビジンを添加しビオチン−アビジン酵素コンプレックスを形成させ、酵素の発色基質や発光基質により目的の抗原を検出する。アビジンにフルオレッセインなどの蛍光物質やアクリジニウムエステルなどの発光物質を導入して目的の抗原を検出することもできる。【０００４】
また血清などの生体試料中の抗原を検出する免疫測定法は次のような工程で行う。まずマイクロプレート等の担体に、測定する抗原と結合する捕捉抗体を固相化する。その後、抗体や担体への非特異的な吸着を防ぐために、牛血清アルブミンなどでブロッキングを行う。これに測定する抗原が含まれる試料を加え、捕捉抗体と目的の抗原を結合させる。さらに抗原を認識する抗体などのプローブとビオチンなどのハプテンが結合したプローブ複合体を添加し、捕捉された抗原とプローブ複合体を結合させる。これにより、捕捉抗体−抗原−プローブ複合体の免疫複合体がマイクロプレートなどの担体上に形成される。この免疫複合体のビオチンとＨＲＰ標識アビジンを結合させ、ＨＲＰの発色基質や発光基質を加え、目的の抗原を測定する。【０００５】
上記のように免疫組織化学法や免疫測定法では、抗体などのプローブとビオチンの結合したプローブ複合体が用いられている。（例えば非特許文献１参照）このビオチンの代わりにジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ＦＩＴＣなどのハプテンを抗体と結合させプローブ複合体とし、これらのハプテンを認識する抗体に酵素を結合させ、検出する方法も開発されている。【０００６】
酵素を用いず、ビオチンの代わりにフルオレッセインなどの蛍光基質やアクリジニウムエステルなどの発光基質と抗体を結合させプローブ複合体とし、蛍光や発光により検出する免疫測定法も開発されている。【０００７】
これらの免疫組織化学法や免疫測定法は感度と特異性の高い検出法であるが、生体内には通常の方法では検出することが困難な微量物質も数多く存在する。例えば、ヒトガストリン放出ペプチド前駆体（ｐｒｏＧＲＰ）の正常人の血清濃度は１４ｐｇ／ｍｌ程度であり、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）やα−フェトプロテインの正常人の血清中濃度である５〜２０ｎｇ／ｍｌと比較すると１０００倍ほどの感度が必要である。また外来抗原であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、血中に存在するウイルス量が非常に少ないため、１００−１０００コピーのウイルスＲＮＡを検出する感度が必要で、蛋白質の濃度ではおよそ０．０３−０．３ｐｇ／ｍｌの抗原を検出する感度が必要である。【０００８】
生体内の微量物質の検出のため、免疫組織化学法や免疫測定法の感度を上昇させるための改良が行われてきている。免疫組織化学法や免疫測定法の感度の上昇には、様々な要素が関係しているが、上記の抗原と結合する抗体などのプローブとビオチンなどの結合したプローブ複合体の機能を改良することも１つの要素である。例えば、一分子の抗体に結合させるビオチンの分子数を増加させることにより、そのビオチンに結合するアビジン、アビジンに結合した酵素などの分子数が増加し、発色や発光のシグナルが上昇し感度が上昇する。【０００９】
しかし、従来の抗体などのプローブとビオチンやハプテンなどが結合したプローブ複合体は、抗体に直接ハプテンを結合させるものである。例えば、抗体にビオチンを結合させる１つの方法は、抗体のアミノ基とビオチンに導入したＮＨＳエステルを反応させ、共有結合により作製するものである。この場合、反応条件の検討により一分子の抗体に結合するビオチンの分子数を増加させることができる。しかし抗体のアミノ基の数は限られており、結合するビオチンの分子数も限界がある。また抗体の抗原決定基の近傍のアミノ基にビオチンが結合した場合は、逆に立体障害などにより抗体と抗原の結合を阻害することも考えられる。【００１０】
さらに結合させるハプテンが疎水性の物質である場合は、抗体に多数の疎水性のハプテンが結合すると、プローブ複合体全体としての疎水性が強まる。免疫組織化学法や免疫測定法において、プローブ複合体の疎水性が強いと、組織やプレートへの疎水結合による非特異的な結合が起こり、バックグラウンドの上昇につながり十分な感度を得ることができなくなる。
【非特許文献１】Harlow, E.およびLane, D.著,「Antibodies: A LABORATORY MANUAL」（米国）,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988年,p. 340-341.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は高感度の免疫測定法に用いることのできる高機能のプローブ複合体を提供することであり、かつ可溶性の感度の高いプローブ複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは上記の課題を解決するため、担体に親水性の仲介物質を結合させ、その仲介物質に抗体及びビオチン、ハプテン、放射性同位体または低分子量のペプチドなどの検出マーカーを結合させることにより、高感度なプローブ複合体を作製できることを見出し、本願発明を完成させたものである。担体に親水性の仲介物質を結合させることにより、多くの前述した検出マーカーを結合させ、且つプローブ複合体全体として親水性が増加するため、非特異的な反応を起こしにくく、高機能なプローブ複合体を完成させた。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のプローブ複合体は生体内に存在する抗原、蛋白質を検出するためにプローブ複合体を改良したものである。このプローブ複合体を用いることにより、従来測定不可能であった抗原や蛋白質が免疫組織化学法や免疫測定法により測定可能となる。【００１４】
さらに仲介物質が親水性であるため、ハプテン、ビオチン、放射性同位体、低分子量ペプチドなどの検出マーカーが疎水性であってもプローブ複合体の親水性が増加し、全体として疎水性が弱まる。そのため免疫反応における疎水結合による非特異反応を軽減させる効果も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は担体に仲介物質として親水性の物質を結合させ、さらに親水性の物質にプローブとビオチン、ハプテン、放射性同位体、低分子量ペプチド、レクチンなどの検出マーカーを直接結合させるものである。この検出マーカ−とは本願発明のプローブ複合体を免疫反応に利用するための標識物である。【００１６】
本発明でいう担体とは、分子量２０，０００〜４，０００，０００のものであれば特別な制限はない。しかしながら、感度をより向上させるためには、多数の抗体などのプローブやハプテンなどが結合できるように、ある程度以上の分子量をもったものが望ましい。担体の例としては、多糖類や高分子量蛋白質やペプチドポリマーが挙げられ、それらの分子量が２０，０００〜２０，０００，０００、好ましくは２０，０００〜４，０００，０００、さらに好ましくは７０，０００〜２，０００，０００のものが適している。また、多糖類やペプチドポリマーを使用する場合、同じ分子量でも側鎖に富んだもののほうが、より多くの仲介物質を結合させることができる。【００１７】
本発明における多糖類の担体としては、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール、デキストリン、アガロース、各種セルロース、キチン、水溶性キトサン、可溶性でんぷんなどが例示される。また、本発明における高分子量蛋白質の担体としては、β―ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニンなどが例示される。また、本発明におけるペプチドポリマーの担体としては、ポリリジンのほか各種ペプチドポリマーが使用できる。【００１８】
本発明における仲介物質としては、水溶性の分子量２０００以上の物質であれば様々なものを使用することができる。例えば、牛血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、リボヌクレアーゼ、カゼイン、ヘモグロビン、オボアルブミン、アビジンなどの蛋白質や、水溶性キトサンなどが挙げられる。またポリリジンのようなペプチドポリマーも利用可能である。【００１９】
プローブとしては、抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂｃ’）、Ｆａｂｃ’など）、各種レセプターなどで、測定しようとする物質結合する蛋白質であればよい。また各種アビジン（アビジンＤ、ストレプトアビジンなど）、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、各種レクチン（コンカナバリンＡ、レンチルレクチン、インゲンマメレクチンなど）、各被分析核酸結合プローブなども使用できる。【００２０】
抗体は、目的とする抗原あるいは被分析物と結合するものであればよい。抗体はペプシンやパパインといったプロテアーゼを用いて、Ｆ（ａｂ’）２やＦａｂといった断片を得ることができる。一般的に抗体の重鎖（Ｈ鎖）は、Ｓ−Ｓ結合により重鎖同士が結合しており、その結合は還元剤にて切断される。還元剤としては、システアミンやメルカプトエタノールなどがあげられ、Ｆ（ａｂ’）２もこのような還元剤でＦａｂ’に切断されチオール（ＳＨ）基が新たに生じる。本発明には、抗体のこれらの断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂｃ’）、Ｆａｂｃ’など）も使用することができる。【００２１】
本発明の仲介物質には検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの免疫反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させることができる。検出マーカーとはプローブ複合体を免疫測定に利用するための標識物である。このような検出マーカーとしては、ビオチンまたはハプテンが考えられる。パプテンにはジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ＦＩＴＣなどが含まれる。例えばビオチンをプローブ複合体に結合させた場合、ビオチンに親和性のあるアビジンにＨＲＰのような酵素、フルオレッセインのような蛍光物質又はアクリジニウムエステルのような発光物質を標識し、プローブ複合体と反応させ発色、蛍光、発光などによりシグナルを検出することができる。【００２２】
またハプテンとしてフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やアクリニジウムエステルなどの蛍光物質や発光物質を直接仲介物質に結合させることもできる。この場合も蛍光や発光でシグナルを検出できる。【００２３】
また、放射性同位体を直接仲介物質に結合させたり、放射性同位体でラベルされたハプテンを仲介物質に結合することもでき、この場合その放射活性でシグナルを検出することができる。【００２４】
さらにハプテンとしてＤＩＧやＤＮＰを結合させることができる。これらの場合は、ＤＩＧやＤＮＰに結合する抗体を酵素、蛍光物質、発光物質などで標識したものを反応させシグナルとして検出する。この場合はハプテンに対する抗体が取得できるものであれば、どのような物質でも免疫測定系の検出マーカーとして使用可能である。【００２５】
検出マーカーとしてはハプテン以外に低分子量のペプチドなども利用可能である。プローブ複合体の仲介物質に低分子量のペプチドを結合させ、このペプチドに対する抗体に酵素、蛍光物質、発光物質を標識しシグナルを検出することができる。これらのペプチドは糖鎖や脂質を含んでいるものでもかまわない。【００２６】
検出マーカーに対する抗体を用いて免疫反応のシグナルを検出する場合は、検出マーカーは抗体の取得できる抗原性のある物質であり、仲介物質と結合できるものであればハプテンや低分子量ペプチド以外の物質も利用可能である。【００２７】
さらに発光、発色酵素の基質も仲介物質に結合させ検出マーカ−として利用できる。基質に対する酵素を反応させることにより、シグナルを検出することができるからである。【００２８】
本願発明のプローブ複合体に結合させる検出マーカーは分子量１万以下のものが望ましい。高分子量のものは仲介物質に結合できる分子数が制限され免疫測定法の感度の上昇に寄与できないことが考えられるからである。【００２９】
さらに各種レクチン（コンカナバリンＡ、レンチルレクチン、インゲンマメレクチンなど）なども検出マーカーとして利用可能である。【００３０】
以下に非限定的にプローブ複合体の製造方法を概説する。【００３１】
本願発明は、まず担体と仲介物質が結合した複合体を作製する。例えば担体として糖鎖を有するデキストランやフィコールなどと、仲介物質としてＢＳＡやカゼインなどの蛋白質を結合させる場合、まずデキストランやフィコールに過ヨウ素酸ナトリウムを反応させることにより、アルデヒド基が生成される。このアルデヒド基とＢＳＡなどの蛋白質のアミノ基が反応し、担体と仲介物質の複合体が形成される。【００３２】
この複合体は担体単独のものに比べて、親水性が増しており、またプローブおよびハプテン等の結合できる領域も増加している。【００３３】
次に仲介物質にプローブと検出マーカーとしてハプテンを結合させる。プローブとハプテンの結合量をコントロールするため、それぞれの結合に用いる官能基は異なるものを用いることが望ましい。例えば仲介物質ＢＳＡにハプテンとしてビオチンを、プローブとしてＦａｂ’を結合させる場合は、次のような方法が考えられる。【００３４】
ＢＳＡのアミノ基には、ビオチンにＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）エステルを導入したＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＢｉｏｔｉｎのＮＨＳエステルを結合させる。一方、Ｆａｂ’とＢＳＡを結合させるため、ＢＳＡにリンカーを導入する。ＢＳＡ内部のＳ−Ｓ結合をシステアミン塩酸やＤＴＴなどで還元し、チオール基を生成させる。このチオール基にリンカーとして１．２−ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｅなどを反応させ、マレイミド基を導入する。このマレイミド基と抗体のＦａｂのチオール基を反応させ、担体、仲介物質、検出マーカー、プローブのプローブ複合体を作製することができる。【００３５】
検出マーカーとしては各種ハプテン、放射性同位体やペプチドなどがある。ペプチドを仲介物質に結合させる場合、例えばペプチドの末端にシステインを導入し、このチオール基と仲介物質のＢＳＡなどのアミノ基を利用して結合させることができる。またリンカーを用い、仲介物質にスクシミジル基などを導入し、ペプチドのアミノ基と反応させることもできる。【００３６】
上記の担体と仲介物質の結合、仲介物質と検出マーカーの結合および仲介物質とプローブの結合には共有結合が利用できる。共有結合には様々な官能基を利用できる。例えば、アルデヒド基とアミノ基、ヒドラジン基とアルデヒド基、マレイミド基とチオール基、スクシミジル基とアミノ基、ビニル基とヒドロキシ基、ビニル基とチオール基の共有結合などがあるが、これらの官能基の結合に限られるものではない。また担体、仲介物質、検出マーカー、プローブに結合のための適当な官能基が存在しない場合は、官能基を有するリンカー分子を導入することによって、結合させることができる。【００３７】
リンカーは２種以上の官能基を有しているものであればよいが、２種以上の官能基は異なる官能基でも、同じ官能基でも構わない。【００３８】
作製した担体、仲介物質、プローブおよび検出マーカーとしてハプテンまたは低分子量のペプチドのプローブ複合体は免疫組織化学や免疫測定法などの免疫反応に利用できる。例えば、ビオチンを用いた場合は、目的の抗原とプローブ複合体を結合させた後、アビジン−ＨＲＰを反応させ、発色基質または発光基質などを加えて検出することができる。ＨＲＰの代わりにアルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素が結合したアビジンを利用し検出することもできる。【００３９】
またアクリジニウムエステルやその誘導体をプローブ複合体に結合させることもできる。アクリジニウムエステルはＮＨＳエステルを有しているため、ＢＳＡなどのアミノ基と反応し結合する。アクリジニウムエステルは化学発光免疫測定に利用可能であり、高感度な測定系として利用できる。【００４０】
また検出マーカーとしてＤＮＰ、ＤＩＧ、ＦＩＴＣなどを用いた場合や低分子量のペプチドは共有結合で仲介物質に結合させることができる。そして、これらの物質特異的に結合する抗体にＨＲＰなどの酵素を結合させ、発色や発光で検出することも可能である。【００４１】
本発明をさらに詳しくかつ非限定的に説明するために、以下に酵素プローブ複合体の製造方法およびそれらの性能について実施例を挙げる。
【実施例１】
【００４２】
担体としてＦｉｃｏｌｌ４００を用いたビオチン−抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体の調製
Ｆｉｃｏｌｌ４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ）４４ｍｇを秤量し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍＬに溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム溶液を０．４ｍＬ添加混合した。室温で２時間反応させた後、ゲルろ過（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ）により余剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液を添加して、室温で３時間反応させ、ＦｉｃｏｌｌにＢＳＡを導入した。反応産物の安定化のため、Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  Ｂｏｒａｔｅ（ＤＭＡＢ；生化学工業株式会社）を添加混合して室温で１時間反応させた後、Ｆｉｃｏｌｌ上の未反応のアルデヒド基をブロックするためにＴｒｉｓ溶液を添加した。室温で１晩反応させた後、ゲルろ過（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００，１．６＊３０）により反応産物を精製し、２８０ｎｍの吸光度を測定して担体ＢＳＡ結合物の濃度を算出した。この担体ＢＳＡ結合物１ｍｇをシステアミン塩酸塩で還元し、ゲルろ過（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ）により余剰のシステアミン塩酸塩を除去し、Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｌｍａｍｉｄｅに溶解した１，２−ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｅおよびＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１３３５）水溶液を添加混合し、室温で１．５時間反応させ、担体ＢＳＡ結合物にマレイミド基およびビオチンを導入した。余剰の１，２−ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｅとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎはゲルろ過（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ）により除去した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中の抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体のＦ（ａｂ）’２溶液（Ｃ１１−１４Ｆ（ａｂ）’２とＣ１１−９Ｆ（ａｂ）’２を等量混合）に、０．１５Ｍシステアミン塩酸塩を１／１０容量添加し、３７℃で１．５時間インキュベーションを行い、ゲルろ過（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ）により余剰のシステアミン塩酸塩を除去し、抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体Ｆａｂ’を得た。このＦａｂ’とマレイミドおよびビオチンを導入した担体ＢＳＡ結合物を混合し、４℃で１晩反応させた後、ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００，１．６ｘ３０）を行い、遊離のＦａｂ’を除去した。このとき、本発明の担体ＢＳＡ−Ｆａｂ’複合体は、ボイド分画近傍に出現し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００の排除限界は分子量１５０万であることから、数十万以上の分子量であることが推測された。このようにして調製された担体ＢＳＡ−Ｆａｂ’複合体の２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光度とみなして濃度を算出した。
【実施例２】
【００４３】
既存の方法を用いたビオチン化抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体の調製
Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１３３５）の添付文書に記載の方法に従って行った。ＰＢＳ中の抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（Ｃ１１−１４  ＩｇＧとＣ１１−９  ＩｇＧを等量混合）にＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを混合し、室温で１時間反応させた後、余剰のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎをゲルろ過（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ）により除去した。調製したビオチン化抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体の２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体濃度を算出した。
【実施例３】
【００４４】
実施例１で調製したビオチン−抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体と実施例２で既存の方法により調製したビオチン化抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体との比較
抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体を０．１Ｍ酢酸・０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．８）で４μｇ／ｍｌに調整し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに２５０μｌずつ加え、４℃で１晩インキュベーションを行った。ＰＢＳで洗浄後、０．５％カゼインを各ウェルに３５０μｌずつ加え、室温で３時間インキュベーションを行った。組み換え体ＨＣＶコア抗原（ｃ１１）を０ｆｍｏｌ／Ｌ，１４８ｆｍｏｌ／Ｌ，４４４ｆｍｏｌ／Ｌ，１３３３ｆｍｏｌ／Ｌ，４０００ｆｍｏｌ／Ｌ，１２０００ｆｍｏｌ／Ｌ，３６０００ｆｍｏｌ／Ｌの濃度に調製したものをサンプルとして添加し、攪拌しながら室温で１時間インキュベーションを行った。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３（洗浄液）で６回洗浄後、２次抗体として、実施例１で調製したビオチン−抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体および実施例２で既存の方法により調製したビオチン化抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体を１μｇ／ｍｌの濃度に希釈して２００μｌ加え、室温で１時間インキュベーションを行った。洗浄液で６回洗浄し、ＨＲＰ結合アビジンを５０００倍希釈液２００μをｌ加え、室温で３０分間インキュベーションを行った。さらに洗浄液で６回洗浄し、基質溶液（オルトフェニレンジアミン・過酸化水素混合液）を２００μｌ加え、室温で３０分間インキュベーションを行い、５Ｎ硫酸を５０μｌずつ加えて反応を停止させた。４９２ｎｍの吸光度（リファレンス波長６００ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲＡ４ｉ，ＴＯＳＯＨ）で測定した。各濃度の組換え体ＨＣＶコア抗原（ｃ１１）を加えたウェルの吸光度から０ｆｍｏｌ／Ｌの吸光度の値を差し引いた値を表１に示した。【００４５】
【表１】
0004920415.tif 000002
【００４６】
表１より、既存法によりビオチン化した抗体を用いた場合、４４４ｆｍｏｌ／Ｌのコア抗原量では、０ｆｍｏｌ／Ｌとの差を確認できないが、実施例１で調製した本発明によるビオチン−抗体複合体を用いることにより、４４４ｆｍｏｌ／Ｌおよびさらに３倍希釈された１４８ｆｍｏｌ／Ｌのコア抗原量を充分に検出できることは明らかであった。また、吸光度を比較すると、１３３３ｆｍｏｌ／Ｌで約５倍、４４４ｆｍｏｌ／Ｌで約６倍ほど本発明のビオチン−抗体複合体が既存の方法よりも高い値を示した。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明のプローブ複合体の模式図。
【図１】
0004920415.tif 000003