(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィルム状の第１容器壁及び第２容器壁を対向させて周縁を密封した容器本体と、前記容器本体内の空間に連通する少なくとも１つのポートとを備えた細胞培養用トレイ状容器において、
前記容器本体内の収容物が、前記第１容器壁の延在方向に移動するのを抑制するとともに、平面状の底面を有する複数の凹部を前記第１容器壁に設け、
前記凹部を区画する区画壁の頂部は、前記第２容器壁と非接着であって、前記容器本体内の収容物は前記各凹部へ区分け可能であることを特徴とする細胞培養用トレイ状容器。
【請求項２】
フィルム状の第１容器壁及び第２容器壁を対向させて周縁を密封した容器本体と、
前記容器本体内の空間に連通する少なくとも１つのポートと、
前記第１容器壁に設けられ、前記容器本体内の収容物が前記第１容器壁の延在方向に移動するのを抑制するとともに、平面状の底面を有する複数の凹部とを備え、
前記凹部を区画する区画壁の頂部は、前記第２容器壁と非接着であって、前記容器本体内の収容物は前記各凹部へ区分け可能な細胞培養用トレイ状容器への収容物充填方法であって、
前記ポートから前記収容物を前記容器本体内に収容する工程と、
前記収容物の自重及び／又は前記容器本体へ付与する厚さ方向の押圧力によって、前記容器本体内の収容物を前記複数の凹部へ区分けする工程と、
前記ポートを塞ぐ工程と、
を備えたことを特徴とする細胞培養用トレイ状容器への収容物充填方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、患者から採取したリンパ球などの動物細胞を閉鎖系で無菌的に安全かつ効率的に培養するのに好適な細胞培養用トレイ状容器並びに同容器への収容物の充填方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者から採取した細胞を体外で培養し、その増殖した細胞を再び体内に戻す養子免疫治療が行われている。この細胞の培養，増殖には、フラスコやシャーレ、更には、対向する樹脂フィルムの周縁を密封し内部を収容空間としたバッグ状の容器が用いられている。
【０００３】
上述した容器を用いた細胞の培養では、細胞数と培地の容量（以下、「収容物」という。）に合わせたサイズの容器を選定し、適時に培養液を追加するとともに、その培養液を含む収容物を容量に合った別サイズの容器に移し替える必要がある。この作業は煩雑であるばかりでなく、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションを生じる危険性がある。
【０００４】
それに加えて、容器が傾斜して置かれた場合や、放置した際に生じるバッグ状容器でのフィルムの歪み、更には周囲環境やインキュベータ由来の僅かな振動等により、収容物中の細胞が容器の一部や周縁付近に集中し、細胞同士が物理的に衝突することによる損傷と液相の細胞密度が高くなることにより、細胞の増殖を低下させる誘引となっている。
【０００５】
また、バッグ状容器を用いた細胞培養では、バッグを構成するフィルムを介して細胞増殖に必要な酸素を確保しているが、細胞がバッグの一部や周縁等に集ると、フィルムの単位面積当たりの細胞数が非常に多くなり、細胞増殖に必要な酸素を確保できないこと、また、細胞が集中し過ぎることでアポトーシスを誘発し、細胞死に至ることから細胞の増殖率が低下を呈する。
【０００６】
上述した容器以外に、複数の凹部を底面に設けた略直方体の容器本体に蓋を被せたウエルプラスチックプレートが使用されているが、このプラスチックプレートでは、ピペット等の器具を用いて細胞や培地等を各凹部毎に注入し乃至は回収しなければならないため、手間の掛かる作業を要する。また、注入乃至回収作業は蓋を外した状態での作業となるので、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションを生じさせるおそれもある。
【０００７】
さらに、ウェル構造細胞培養容器に着目すると、従来、容器本体が略直方体でなり、断面Ｕ字状の凹部を容器本体の一面に複数設けたフラスコタイプの容器が提案されている。この培養容器は、神経幹細胞等の凝集塊を形成できる細胞の浮遊培養のために提案されている。（特許文献１）
【特許文献１】特開２００６−０５５０６９
【０００８】
この容器は、細胞密度にかかわらず、細胞の凝集塊を意図的に形成するために、凹部の開口部面積よりも底面積が小さくなる縮径構造となっているが、凝集塊の内部に位置する細胞やフラスコ底面側の細胞は、増殖させるために必要な酸素を確保することが困難である。さらに、一般的なフラスコと同様に、注入乃至回収作業において、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションを生じさせるおそれもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、容器底面の細胞培養領域において、容器底面の延在方向への細胞の移動を抑制することにより、細胞が容器の周縁若しくは一部に集中することなく、細胞を増殖するに好適な細胞培養用トレイ状容器を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明は、複数の凹部を底面に設けたウェル構造のプラスチック容器を用いた場合に必要となる、収容物を凹部毎に注入し乃至は回収するといった手間の掛かる作業を省け、また、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションを低減できる細胞培養用トレイ状容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願の請求項１は、フィルム状の第１容器壁及び第２容器壁を対向させて周縁を密封した容器本体と、前記容器本体内の空間に連通する少なくとも１つのポートとを備えた細胞培養用トレイ状容器において、
前記容器本体内の収容物が、前記第１容器壁の延在方向に移動するのを抑制するとともに、平面状の底面を有する複数の凹部を前記第１容器壁に設け、
前記凹部を区画する区画壁の頂部は、前記第２容器壁と非接着であって、前記容器本体内の収容物は前記各凹部へ区分け可能であることを特徴とする複数の凹部を前記第１容器壁に設けたことを特徴とする。
【００１２】
尚、本発明において、ポートとは、他の接続部材が容易に接続可能な形状を有する短尺状の管状体のみならず、容器本体に融着等により一体化された軟質のチューブ等を含むものであり、容器本体内への収容物の充填や容器本体内からの収容物の排出が可能な構成を有する小径の開口部をいう。
【００１３】
また、容器本体内の収容物のすべてが複数の凹部へ区分けされて収容される場合のみならず、収容物の体積が複数の凹部の全容積を超える場合には、収容物の一部は凹部に収容しきれずに凹部の上方に貯留されることになるが、これも本発明に含まれるものである。
【００１４】
本願の請求項２は、フィルム状の第１容器壁及び第２容器壁を対向させて周縁を密封した容器本体と、
前記容器本体内の空間に連通する少なくとも１つのポートと、
前記第１容器壁に設けられ、前記容器本体内の収容物が前記第１容器壁の延在方向に移動するのを抑制するとともに、平面状の底面を有する複数の凹部とを備え、
前記凹部を区画する区画壁の頂部は、前記第２容器壁と非接着であって、前記容器本体内の収容物は前記各凹部へ区分け可能な細胞培養用トレイ状容器への収容物充填方法であって、
前記ポートから前記収容物を前記容器本体内に収容する工程と、
前記収容物の自重及び／又は前記容器本体へ付与する厚さ方向の押圧力によって、前記容器本体内の収容物を前記複数の凹部へ区分けする工程と、
前記ポートを塞ぐ工程と、
を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
以下、本発明の効果を説明する。
本願の請求項１に係る細胞培養トレイ状容器によれば、容器本体内の培養中の細胞は、複数の凹部へ区分けされて各凹部の底面へ沈降して第１容器壁の延在方向への移動が抑制される。このため、トレイ状容器が多少傾斜して置かれた場合や、あるいは第１容器壁に歪があっても、培地中の細胞が容器本体内の周縁若しくは一部に集中することがなく、アポトーシスによる細胞の増殖率の低下を招くことなく細胞を増殖することが可能となる。
【００１６】
また、複数の凹部を有する容器本体内は周縁が密封されており、また、容器本体内の空間に連通する少なくとも１つのポートを備えているため、ポートから細胞を含む培地を容器本体内へ充填し、例えば、トレイ状容器を長さ方向や幅方向に多少傾斜させることによって細胞を含む培地を複数の凹部へ容易に区分けすることができる。
【００１７】
また、増殖した細胞の回収時には、例えば、トレイ状容器を反転させて傾斜させることにより、容易にポートからの排出ができるため、ウェル構造のプラスチック容器を用いた場合のような、ピペットを用いて、細胞を凹部毎に注入し乃至は回収するといった手間の掛かる作業を省くことができる。さらに、閉鎖系を維持した状態で細胞の充填や増殖した細胞の回収ができるため、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションを低減することができる。
【００１８】
それに加えて、凹部は平面状の底面を有するため、各凹部内においても、培地中の細胞が一箇所に片寄って集中するのを防止することができる。
【００１９】
本願の請求項２に係る細胞培養用トレイ状容器への収容物の充填方法によれば、フィルム状の第１容器壁及び第２容器壁を対向させて周縁を密封した容器本体と、
前記容器本体内の空間に連通する少なくとも１つのポートと、
前記第１容器壁に設けられ、前記容器本体内の収容物が前記第１容器壁の延在方向に移動するのを抑制するとともに、平面状の底面を有する複数の凹部とを備え、
前記凹部を区画する区画壁の頂部は、前記第２容器壁と非接着であって、前記容器本体内の収容物は前記各凹部へ区分け可能な細胞培養用トレイ状容器への収容物充填方法であって、
ポートから収容物を容器本体内に収容する工程と、
収容物の自重及び／又は容器本体へ付与する厚さ方向の押圧力によって、容器本体内の収容物を複数の凹部へ区分けする工程と、
ポートを塞ぐ工程と、
を備えたため、ウェル構造のプラスチック容器を用いた場合のような、細胞を凹部毎に注入するといった手間の掛かる作業を省くことができる。
【００２０】
以下、本願の請求項１に係る細胞培養用トレイ状容器に技術的な限定等を加えた場合の効果について説明する。
本発明に係る細菌培養用トレイ状容器にあっては、凹部は夫々の底面積及び深さが略等しいのが好ましい。この細菌培養用トレイ状容器であれば、夫々の凹部は底面積及び深さが略等しいため、各凹部毎に略均一な細胞密度とすることができる。
【００２１】
第２容器壁は平面状であって、凹部を区画する区画壁の頂部に接触可能であってもよい。この細胞培養用トレイ状容器であれば、第２容器壁を第１容器壁側へ押圧することにより、細胞を含む培地を各凹部へ容易に区分けできる。
【００２２】
第２容器壁は平面状であって、前記凹部を区画する区画壁の頂部と非接触状態を維持してもよい。この細胞培養用トレイ状容器は、細胞を含む培地の体積が複数の凹部の全容積を超える場合に好適である。
【００２３】
第２容器壁は、凹部に陥入可能な凸部を有していてもよい。この細胞培養用トレイ状容器にあっては、細胞を含む培地が複数の凹部の全容積に満たない場合であっても、凸部を凹部に陥入させることにより、細胞を含む培地を各凹部に略均一量に区分けすることができる。
【００２４】
上述した細胞培養用トレイ状容器においては、凹部を区画する区画壁の頂部に、隣接する凹部と連通可能な凹陥部を設けるようにできる。この細胞培養用トレイ状容器では、各凹部に区分けされる細胞を含む培地を、凹陥部を介して隣接する凹部に流出できるため、細胞を含む培地を容易に各凹部へ略均等に分散することができる。
【００２５】
上述した細胞培養用トレイ状容器においては、第１容器壁又は第２容器壁の少なくとも一方が酸素透過性を有するとよく、細胞の増殖に要する酸素を確実に確保することができる。
【００２６】
上述した細胞培養用トレイ状容器においては、第１容器壁又は第２容器壁の少なくとも一方から容器本体内が透視可能であるとよく、容器本体内の細胞を取り出さなくても、随時、容器本体の外部から目視あるいは顕微鏡で細胞を観察することができる。
【００２７】
上述した凹部は、０．７ｍｍ以上２０ｍｍ以下の深さを有し、より好ましくは２ｍｍ以上１５ｍｍ以下の深さがよい。この細胞培養用トレイ状容器では、静置した状態で沈降した細胞の移動を抑制でき、また、第１容器壁の凹部を成形する際の偏肉を軽減できる。また、凹部を２ｍｍ以上の深さとすれば、容器を移動させる場合や、培養中に振動等が生じた場合でも、沈降した細胞を凹部内へ抑制する事ができ、１５ｍｍ以下の深さとすることで、凹部成形時に生じる偏肉を許容範囲内に抑えることができ、安定した成形ができる。
【００２８】
上述した凹部の底面は、０．３ｃｍ２以上２０ｃｍ２以下の面積とすれば、細胞の集中し過ぎによるアポトーシスの誘発を抑えることができる。
【００２９】
容器本体内の収容物は、動物内に注入または埋設する、或いは、損傷部に貼付する細胞を含む。その容器本体内の収容物では、閉鎖系のシステム化を図ることにより、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションを生じさせる危険性も減少させることができ、動物内に注入または埋設し、或いは、損傷部に貼付する細胞の培養をより好適に行うことができる。
【００３０】
容器本体内には、第１容器壁と当接し、容器本体内の収容物が第１容器壁の延在方向に移動するのを抑制する複数の区画を形成する隔壁を設けるようにできる。その細胞培養用トレイ状容器によっても、本願の請求項１に係るトレイ状容器と略同様の効果を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明に係るトレイ状容器を細胞培養容器として用いるものであり、以下に当該図示実施の形態に基づいて説明する。なお、本発明に係るトレイ状容器は、細胞培養容器のみならず、他の用途に使用することもできるのは勿論である。
【００３２】
本実施の形態に係るトレイ状容器は、図１，図２で示すように、可撓性のフィルム状の第１容器壁１ａ，第２容器壁１ｂを対向させて周縁１ｃを密封した容器本体１と、容器本体１に溶着された２つのポート１ｆ，１ｇとを備えて構成されている。この他、容器本体１にはバッグとして吊るす懸垂孔１ｄ，１ｅが上端側の左右に設けられている。
【００３３】
まず、容器本体１に溶着されたポート１ｆ，１ｇを説明すると、ポート１ｆ，１ｇは、細胞や培地等を容器本体１の内部に注入するための流路であるとともに、ポート１ｆは、細胞や培地等を注入したり、他の培養液容器と連結するための充填チューブ２１を接続するために設けられており、また、ポート１ｇは、容器本体1内の収容物のサンプリングを行うためのサンプリングポート３を接続するために設けられている。
【００３４】
各ポート１ｆ，１ｇは、ポリエチレン，ポリプロピレン、塩化ビニル等の熱可塑性樹脂から形成された管状体の成形物や、チューブでも良い。好ましくは容器壁１ａまたは１ｂと同じ材質の樹脂から形成したものを備えるとよい。
【００３５】
充填チューブ２１は、二本に分岐した接続口２０を備え、容器本体１のポート１ｆまたは１ｇと嵌合するようにできる。充填チューブ２１の一方のチューブ２１ｄには、培養液等を容器本体１の内部に注入するための注入口２１ａが設けられ、注入口２１ａには、注入口キャップ２１ｂ，注入口カバー２１ｃが備えられている。また、他方のチューブ２２ｄには、培養液を封入した他のバックと連結するための連結口２２ａが設けられ、連結口２２ａには連結口キャップ２２ｂ，連結口カバー２２ｃが備えられている。
【００３６】
ここで、注入口２１ａと連結口２２ａは、細胞を含む培地や培養液等の収容物を出し入れするための開口部があれば特に限定されないが、ルアー形状となっているものがより好ましく、部材としては輸液，血液バッグ等で使用されるものがより好ましい。
【００３７】
サンプリングポート３は、ポート１ｆまたは１ｇと接続するための接続口３ａと注射針を刺通するためのゴム栓３ｃとを備えた封止栓であり、ゴム栓３ｃの注射針刺通部は封止キャップ３ｂで覆われている。
【００３８】
第１容器壁１ａは、フィルム状の部材を凹凸状に追加工することから形成されている。第１容器壁１ａには、容器本体１内の細胞を含む培地等の収容物、特に、容器本体１を水平に保ったときに、第１容器壁１ａの内面に沈降した細胞が第１容器壁１ａの延在方向に移動するのを抑制するための凹部１０，１１…が長さ方向及び幅方向にわたって複数（図１においては４９個）設けられている。また、各凹部１０，１１…の底面積及び深さは、略同一となっている。尚、図３乃至図５において、符号１０ａは凹部１０の底面を示している。
【００３９】
そして、第１容器壁１ａの凹部１０，１１…と第２容器壁１ｂとから収容物を区分け可能な複数の収容室（符号、「凹部」と同じ）が形成されており、第２容器壁１ｂは、第１容器壁１ｂの凹部１０，１１…を覆う平面状のフィルム材で形成されている。
【００４０】
第１容器壁１ａ及び第２容器壁１ｂを構成するフィルム素材としては、低密度ポリエチレン，直鎖状低密度ポリエチレン，ポリプロピレン，エチレン酢酸ビニル共重合体，環状ポリオレフィン，メチルペンタン樹脂，ポリブタジエン樹脂，スチレンブタジエンスチレンブロック共重合体，塩化ビニル等の熱可塑性樹脂よりなるものが挙げられる。このフィルムは単層に限らず、内面側をシーラント層として軟質樹脂で、外面側を結晶化樹脂で形成する等の複層のものであってもよい。
【００４１】
第１容器壁１ａ，第２容器壁１ｂの少なくとも一方は、酸素透過性フィルムで形成されている。例えば、第２容器壁１ｂを酸素透過性フィルムで形成し、第１容器壁１ａを酸素透過性フィルムまたは非透過性フィルムのいずれかで形成する。
【００４２】
ここで言う酸素透過性フィルムとは、２５℃の環境下で気体を酸素とし、ＪＩＳＫ７１２６「プラスチックフィルム及びシートの気体透過度試験」に準拠した試験方法で試験した場合、酸素透過量が１０００ｃｃ／ｍ２／２４ｈ／ａｔｍ以上であるものを指し、酸素透過量が２０００ｃｃ／ｍ２／２４ｈ／ａｔｍ以上がより好ましい。これにより、細胞の増殖に必要となる酸素を確実に確保することができる。
【００４３】
また、第１容器壁，第２容器壁の少なくとも一方は、内部の透視可能な透明又は半透明のフィルムで形成されている。これにより、容器本体１内の細胞を採取することなく、容器本体１の外部から目視又は顕微鏡で、随時、細胞の増殖状況等を観察することができる。
【００４４】
第１容器壁１ａの凹部１０，１１…は、０．２ｍｍ以上２０ｍｍ以下の深さ、好ましくは、０．７ｍｍ以上２０ｍｍ以下の深さを有すれば、静置した状態で沈降した細胞の移動を抑制でき、また、第１容器壁の凹部を成形する際の偏肉を軽減できる。尚、凹部が２ｍｍ以上１５ｍｍ以下の深さを有する事がより好ましく、凹部を２ｍｍ以上とする事で、容器を移動させる場合や、培養中に振動等が生じた場合でも、沈降した細胞を凹部内へ抑制する事ができ、また、１５ｍｍ以下とすることで、凹部成形時に生じる偏肉を許容範囲内に抑えることができ、安定した成形ができる。
【００４５】
また、凹部１０，１１…の底面を平面状に形成し、０．３ｃｍ２以上２０ｃｍ２以下の面積とすることにより、細胞が集中し過ぎて生じるアポトーシスの誘発を抑えることができる。ここで、夫々の細胞に増殖に必要な酸素を供給することができ、かつ、細胞が集中し過ぎることによって生じるアポトーシスの発生も防ぐためには、一つの凹部１０の容積は、０．５〜２０ｃｃ程度が好ましく、１〜８ｃｃ程度がより好ましい。
【００４６】
第１容器壁１ａの凹部１０，１１…の底面は、図示実施の形態では平面視正方形を呈するよう形成されている。但し、凹部１０，１１…の底面の平面視形状は正方形に限定されず、菱形，六角形，八角形，円形等を呈するような形状であってもよい。
【００４７】
第２容器壁１ｂは、図３で示すように第１容器壁１ａの凹部１０…を覆う平面状のフィルム面で構成されており、第１容器壁１ａに設けられた隣接する凹部１０，１１間に形成される区画壁１０ｂの頂面１０ｃに接触可能に構成されている。これにより、収容室に区分けした細胞を含む培地を平面状のフィルム面で覆うことができるため、培養中でも単位面積当たりの細胞密度を均等に保つことができる。
【００４８】
尚、第２容器壁１ｂを平面状のフィルム面で構成するが、区画壁１０ｂの頂面１０ｃには第２容器壁１ｂが接触することがないように構成してもよい。
【００４９】
以上の構成の下に、図示実施の形態を更に具体的に説明すると、第１容器壁１ａは３５０μｍ厚のポリエチレンフィルムで形成されている。凹部１０，１１…を備えた第１容器壁１ａは、一つの底面積が１．４４ｃｍ２の平面視正方形で、高さが７ｍｍの直方体が４９個設けられた金型で真空成形した凹凸状の形状を有するフィルムを用いて形成されている。
【００５０】
第２容器壁１ｂは、酸素透過量が２０００ｃｃ／ｍ２／２４ｈ／ａｔｍで、１００μ厚のポリエチレンフィルムを用いて形成されており、これにより、細胞の培養に必要な酸素を確保可能となっている。
【００５１】
このように構成するトレイ状容器では、細胞を含む培地が凹部（収容室）１０，１１…に区分けされて収容されるため、沈降した細胞が容器本体１内の一部や周縁等に集中するのを防止することができ、単位面積当たりの細胞密度を略均等に保つことができる。
【００５２】
このため、夫々の細胞に増殖に必要な酸素を供給することができるとともに、細胞が集中し過ぎることによって生じるアポトーシスの発生も防ぐことができ、細胞の増殖率の低下を招くことなく、細胞の増殖を継続させることができる。また、容器として閉鎖系であるため、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションの危険性も減少させることができる。
【００５３】
細胞を増殖する過程においては細胞相互の距離が重要であるが、細胞の増殖に適した細胞の距離間を保てるため、細胞同士の刺激し合うことで増殖性を高められる。これは、細胞の集中による細胞密度が高すぎることから生ずるアポトーシスを防ぎ、また、細胞密度が低いと、細胞増殖のシグナルの伝達が起こらず、増殖が進まないことを回避すると考えられる。更には、細胞密度を調整できることから培地やサイトカインの最適使用量での培養が可能となり、ロスをなくすばかりでなく、細胞が増殖する範囲で細胞密度を上げることにより、培養液やサイトカインの使用量を減らすことができ、かつ、容器の小型化が可能となるため、省スペース化の効果も得られる。
【００５４】
さらに、本実施の形態のトレイ状容器は、立体構造をしているが、基本素材がフィルムよりなるため、一般に使用されている硬質容器と異なり、容易に潰れるため、廃棄時の減容積の効果も得られる。
【００５５】
また、第１容器壁１ａと第２容器壁１ｂの周縁が密封されているため、トレイ状容器が閉鎖系であり、閉鎖系のシステム化が容易となる。また、容器として閉鎖系であるため、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションの危険性も減少させることができ、動物内に注入又は埋設し、或いは、損傷部に貼付する細胞の培養に用いる容器として好適である。
【００５６】
上述した実施の形態では、第２容器壁１ｂを平面状のフィルム面で形成する場合に基づいて説明したが、図４で示すように第２容器壁１ｂが第１容器壁１ａの凹部１０…に陥入可能な凸部１２を有するよう形成することができる。これにより、容器本体１内の細胞を含む培地が第１容器壁１ａの凹部１０，１１……の全容積に満たない場合に、第２容器壁１ｂの凸部１２で凹部１０，１１……の減容積が可能となり、容器本体１内の細胞を含む培地が比較的少量であっても、かかる培地を凹部１０，１１……に略均等に区分けすることができる。
【００５７】
その他に、図５で示すように第１容器壁１ａの凹部１０…が隣接相互の凹部に連通する凹陥部１３を区画壁１ｂの頂面１ｃに有するよう形成することもできる。これにより、各収容室の細胞を含む培地を凹陥部１３で隣接相互の凹部に流出させて容易に区分けし、かつ、分散することができる。
【００５８】
上述した酸素透過性に関連し、一般的に酸素透過性を持たせるにはフィルム厚みを１００〜１５０μ厚まで薄く形成する方法が採られるが、例えば、この薄膜フィルムを用いて第１容器壁１ａを形成した場合は、図６，図７で示すように、第１容器壁１ａを別に成形した保持用トレイ４に収容するようにして、第１容器壁１ａを立体形に保持することが可能となる。
【００５９】
保持用トレイ４は、容器本体１の周縁１ｃを載置可能なフランジ部４ａを有し、第１容器壁１ａの凹部１０…を収容可能な周側壁１ｂ，底面１ｃを有するよう形成されている。また、保持用トレイ４は、第１容器壁１ａの各凹部１０…に合わせた複数の凹部とすることも可能である。
【００６０】
さらに、酸素透過性を確保するべく、少なくとも一つの通気孔４ｄを底面１ｃに設け、或いは、少なくとも一つの通気孔４ｄを底面１ｃに設けた後、微細な網目状シートを保持用トレイ４の底面と凹部１０…の底面との間に敷き込むことから、第１容器壁１ａの凹部１０…を平らに保つとともに、第１容器壁の凹部全体から容器本体１内へ酸素を透過させる事も可能である。
【００６１】
次に、そのトレイ状容器を用いて、次の手順で収容物（一例として、細胞を含む培地）を容器本体1の内部に充填することができる。まず、図８で示すように、充填チューブ２１の一方のチューブ２１ｄの注入口２１ａから注入口カバー２１ｃ，注入キャップ２１ｂを取り外し、シリンジの外筒５を注入口２１ａに差し込み、ポート１ｆより収容物を容器本体１の内部に注入する。
【００６２】
収容物の注入後は、図９で示すように、シリンジの外筒５を注入口２１ａから取り外した後、容器本体１を横臥状態に保つ。この後に、容器本体１を揺らし、あるいは、長さ方向や幅方向に容器本体１を傾斜させ、収容物を分散させて複数の凹部１０，１１…に区分けする。そして、第２容器壁１ｂを厚さ方向に押圧して容器本体１の内部空気を注入口２１ａから排出し、最後に注入口２１ａを注入キャップ２１ｂで封止して閉鎖系バッグとすればよい。
【００６３】
このトレイ状容器を用いることにより、複数の凹部を底面に設けたウェル構造のプラスチック容器のように、ピペットを用いて、収容物を各凹部毎に注入し乃至は回収するといった手間の掛かる作業を省くことができる。また、閉鎖系容器として用いることができるため、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションを生じさせる危険性も減少させることができる。
【００６４】
本発明のトレイ状容器の有効性を確認するべく、本発明のトレイ状容器と共に、複数の凹部がなく平面状の底面を有するトレイ状容器を比較例として用い、次の通りの実験を行った。
【００６５】
健常者より採取した活性化リンパ球（１．５×１０７ＣＥＬＬＳ）を自己血清５％含有したＲＰＭＩ培地（ＩＬ−２含有）：５０ｍＬに加えた収容物を、注入口２１ａから容器本体１の内部に注入した後に、注入キャップ２１ｂを閉じ、容器本体１を水平に保って収容物をゆっくり混和した。
【００６６】
次に、再度、注入キャップ２１ｂを取り外した後、ゆっくり第２容器壁を厚さ方向に押圧しながら、容器本体１の内部の空気を抜き取ることにより、第２容器壁を凹部１０，１１…を区画する区画壁1ｂの頂面１ｃに近接させて各凹部１０，１１…内に収容物を略均一に収容して各凹部１０，１１…内の細胞密度を略均一にし、凹部１０，１１…を第２容器壁で覆った。
【００６７】
これに対し、複数の凹部がなく平面状の底面を有するトレイ状容器には通常通り、健常者より採取した活性化リンパ球（１．５×１０７ＣＥＬＬＳ）を自己血清５％含有したＲＰＭＩ培地（ＩＬ−２含有）：５０ｍＬに加えた培養細胞を充填した。
【００６８】
各容器をインキュベータに入れ、培養細胞を３７℃飽和湿度下、５％炭酸ガス環境の下で３日間培養した。次に、先の３日間培養した各容器の内部に、培養液ＲＰＭＩを５０ｍＬ添加し、各容器内の収容量を１００ｃｃとした後、インキュベータに再度入れて３日間培養した。
【００６９】
その結果、各容器の最終細胞数と培養面積１ｃｍ２あたりの細胞数は、本発明のトレイ状容器で、３．０×１０８（培養面積１ｃｍ２あたり５.１×１０６）ＣＥＬＬＳであった。比較例である複数の凹部がなく平面状の底面を有するトレイ状容器では、１．９×１０８（培養面積１ｃｍ２あたり３．２×１０6）ＣＥＬＬＳであった。
【００７０】
上記の実施の形態においては、第１容器壁１ａに凹部１０，１１…を設けたものを例示したが、第１容器壁１ａ及び第２容器壁１ｂを平面状に構成し、第１容器壁１ａ及び第２容器壁１ｂとの間に形成される容器本体１内に、第１容器壁１ａの内面と当接し、容器本体１内の収容物が第１容器壁１ａの延在方向に移動するのを抑制する複数の区画を形成する、例えば格子状の隔壁を配置し、この格子状の隔壁を周面とし、第１容器壁１ａを底面とすることで、複数の凹部を形成するようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明に係る細胞培養用トレイ状容器の実施の形態を示す平面図である。
【図２】図１のトレイ状容器を示す側面図である。
【図３】図１のトレイ状容器を示す部分側断面図である。
【図４】図１のトレイ状容器と別の実施の形態を示す部分側断面図である。
【図５】図１のトレイ状容器の区画壁に凹陥部を設けた実施の形態を示す部分斜視図である。
【図６】図１のトレイ状容器に保持トレイを備えた実施の形態を示す平面図である。
【図７】図６のトレイ状容器に保持トレイを備えた実施の形態を示す部分側断面図である。
【図８】図１のトレイ状容器による収容物の充填工程を示す説明図である。
【図９】図８のトレイ状容器による収容物の充填工程に引き続く収容工程を示す説明図である。
【符号の説明】
【００７２】
１              容器本体
１ａ            第１容器壁
１０，１１      凹部（収容室）
１ｂ            第２容器壁
１ｆ，１ｇ      ポート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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