(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インテグリン受容体に対する親和力を有する一般式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化１】
0005043271.tif 000033
式中、Ｇはグリシンであり、
Ｄはアスパラギン酸であり、
ｈは１又は２の正の整数であり、
Ｘ1は１又は２個のアミノ酸残基であって、該アミノ酸残基は各々独立して任意に、ｉ）リンカー（Ｌ）基、又はｉｉ）キレート剤、又はｉｉｉ）キレート剤に結合したリンカー（Ｌ）基を介してインヴィヴォ像形成に適した放射性核種リポーター（Ｒ）基と結合しており、
Ｘ2及びＸ4は独立にシステイン又はホモシステイン残基であり、
Ｘ3はアルギニン又はＮ−メチルアルギニンであり、
Ｘ5はチロシン、フェニルアラニン、３−ヨード−チロシン又はナフチルアラニン残基であ、
Ｘ6は−（ＣＨ2）h−Ｓ−基と一体でシステイン又はホモシステイン残基から選択されるチオール含有アミノ酸残基を表し、
Ｘ7は１個以上のエチレングリコール単位を含有するリンカー（Ｌ）基であり、
Ｘ8は放射性核種リポーター（Ｒ）基又は−ＮＨ2であるか、或いは存在せず、
Ｘ1及びＸ7におけるＬは独立に１個以上のエチレングリコール単位を含有するリンカー基である。
【請求項２】
Ｘ1がアスパラギン酸、チロシン、チロシン−アスパラギン酸、リジン、グルタミン酸、アセチル−リジン、アスパラギン、セリン、トレオニン又はグルタミンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ5がフェニルアラニン又は３−ヨード−チロシン残基である、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
以下のいずれかのキレート剤を含有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の化合物。
【化２】
0005043271.tif 000034
【請求項５】
キレート剤が放射性核種に結合することができる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
テクネチウム、ヨウ素又はＣｕの放射性同位体、又は18Ｆ同位体に結合することができる、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
アミノ酸残基のいずれかが独立して天然に存在するアミノ酸である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
アミノ酸残基のいずれかが独立してＤ又はＬ立体配座である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
以下のいずれかの式で規定される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の化合物。
【化３】
0005043271.tif 000035
【化４】
0005043271.tif 000036
【化５】
0005043271.tif 000037
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規なペプチド系化合物、並びに治療的に有効な処置および診断撮像技術におけるにおけるその使用に関する。より詳細に言えば、本発明は血管新生に関連した受容体、特にインテグリン受容体（例えばαｖβ３インテグリン受容体）に結合するターゲッティングベクターとして使用される、ペプチド系化合物の使用に関する。従って、このような造影剤は、例えば悪性疾患、心疾患、炎症関連疾患、リューマチ性関節炎およびカポシ肉腫の診断のために使用することができる。更に、このような薬剤は、これら疾患の治療にも使用することができる。
【０００２】
新たな血管は、二つの異なる機構、即ち、血管形成または血管新生によって形成され得る。血管新生は、既存の血管からの分岐による新たな血管の形成である。このプロセスのための主な刺激は、組織内細胞への不十分な栄養および酸素（低酸素症）の供給である。細胞は、血管新生因子を分泌することにより応答し、該因子には多くのものが含まれる。その一例は、屡々、血管内皮増殖因子（VEGF）と称されるものである。これらの因子は、基底膜のタンパク質を分解するタンパク質分解酵素、およびこれらの潜在的に有害な酵素の作用を制限する阻害因子の分泌を開始させる。血管新生因子の他の顕著な効果は、内皮細胞を転移および分割することである。内腔の反対側において、血管周囲の連続的なシートを形成する基底膜に結合する内皮細胞は有糸分裂を受けない。付着性の喪失および血管新生因子受容体からの信号の喪失の組合された効果により、内皮細胞は転移し、増殖し、再配列され、最終的には新たな血管の回りに基底膜を合成する。
【０００３】
血管新生は、創傷治癒および炎症プロセスを含む組織の成長および再建において顕著である。腫瘍は、その増殖速度を維持するために、それらがミリメータサイズに達したときには血管新生を開始させなければならない。血管新生は、内皮細胞およびその環境における特徴的な変化によって達成される。これら細胞の表面は、転移の準備のために再構築され、隠れた構造が、基底膜が分解する場所に露出され、加えてタンパク質分解に影響し且つこれを制御する種々のタンパク質に露出される。腫瘍の場合、通常は、得られる血管網は鋭いキンクおよび動静脈シャントの形成と共に無秩序化される。また、血管新生の阻害は、抗腫瘍療法のための有望な戦略であると思われる。また、血管新生を伴う変質は診断のためにも非常に有望であり、その明白な例は悪性疾患であるが、その概念は、アテローム硬化症を含む炎症および種々の炎症関連疾患にも有望であり、初期アテローム硬化病巣のマクロファージは血管新生因子の潜在的な供給源である。これらの因子はまた、心筋梗塞部位における血管再生にも関与し、これは短時間のうちに狭窄が解除されるときに生じる。
【０００４】
血管再生または血管新生、新たな血管の発生または増殖に関連した望ましくない症状の更なる例は、以下に示すとおりである。この点に関しては、WO98/47541も参照される。
【０００５】
血管新生に関連した疾患および兆候は、例えば、乳癌、皮膚癌、直腸結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、または卵巣癌のような、癌および転移の異なる形態である。他の疾患および兆候は、炎症（例えば慢性炎症）、アテローム硬化症、リューマチ性関節炎、および歯肉炎である。
【０００６】
血管新生に関連した更なる疾患および兆候は、動静脈奇形、星細胞腫、絨毛癌、グリア芽細胞腫、神経膠腫、血管腫（小児、毛細管）、肝細胞腫、子宮内膜肥厚、虚血性心筋症、カポシ肉腫、黄斑変性症、メラノーマ、神経芽細胞腫、閉塞性末梢動脈疾患、骨関節炎、乾癬、網膜症（糖尿病性、増殖性）、強皮症、および潰瘍性大腸炎である。
【０００７】
血管新生には、内皮細胞および周囲組織に特有の受容体が関与する。これらのマーカーは、VEGFおよびインテグリン科の受容体を含んでいる。免疫組織化学的研究により、種々のインテグリン類（おそらく最も重要なのはα型）が血管頂部表面に発現され［Conforti, G.., et al. (1992) Blood 80: 37-446］、循環するリガンドによるターゲッティングに利用可能であること［Pasqualini, R., et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 542-546］が示された。α5β1は、フィブロネクチンマトリックスの組立て促進、およびフィブロネクチンへの細胞付着の開始に重要なインテグリンである。それはまた、細胞転移［Bauer, J.S., (1992) J. Cell Biol. 116: 477-487］、並びに腫瘍の浸潤および転移［Gehlsen, K.R., (1988) J. Cell Biol. 106: 925-930］において重要な役割を果たす。
【０００８】
インテグリンαｖβ3は、血管新生に関連することが知られた受容体の一つである。αｖβ3インテグリン受容体の拮抗剤／リガンドの相互作用はアポトーシスを誘起し、血管増殖を阻害するから、刺激された内皮細胞はこの受容体に依存して、血管新生の厳しい期間を生き延びるものと思われる。
【０００９】
インテグリンはヘテロ二量体分子であり、そのαおよびβサブユニットが細胞膜の脂質二重層を貫通する。αサブユニットはその細胞害鎖上に四つのCa2+結合ドメインを有しており、βサブユニットはシステインに富む多くの細胞外ドメインを有している。
【００１０】
細胞付着に関与する多くのリガンド（例えばフィブロネクチン）は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のトリペプチド配列（ＲＧＤ）を含んでいる。このＲＧＤ配列は、該配列を提示するリガンドと細胞表面受容体との間の主要な認識部位として作用すると思われる。該リガンドおよび受容体の間の二次的相互作用は、この相互作用の特異性を向上することが一般に信じられている。これらの二次的相互作用は、リガンドと前記ＲＧＤ配列に直ぐ隣接した受容体との間、または前記ＲＧＤ配列から離れた部位で生じるであろう。
【００１１】
ＲＧＤペプチド類は、或る範囲のインテグリン受容体に結合し、臨床的条件における応用に重要な多くの細胞内事象を調節する能力を有している。（Ruoslahti, J. Clin. Invest., 87: 1-5 (1991)）。おそらく、ＲＧＤペプチドおよびその擬似物の最も広範に研究された効果は、それらが血小板インテグリンGpIIbIIIaをターゲッティングする場合の、抗血栓剤としてのそれらの使用に関するものである。
【００１２】
αｖβ3またはαｖベータ5拮抗剤の投与による組織での血管新生の阻害は、例えば抗体またはＲＧＤ含有ペプチドを使用したWO 97/06791およびWO 95/25543に記載されている。EP 578083は、一連の単環状ＲＧＤ含有ペプチドを記載しており、またWO 90/140103はＲＧＤ抗体を特許請求の範囲に記載している。Haubner et al.は、J. Mucl. Med. (1999); 40: 1061-1071において、単環状ＲＧＤ含有ペプチドに基づく腫瘍ターゲッティングのための新規な分類のトレーサを記載している。しかし、全身オートラジオグラフィー撮像を用いた生体内分布の研究によって、「123Ｉ-標識したペプチドは、非常に迅速な血液クリアランス速度および主に肝胆排泄ルートを有し、高いバックグラウンドを生じることが明らかになった。
【００１３】
また、複数の架橋を含む環状ＲＧＤペプチド類が、WO 98/54347およびWO 95/14714に記載されている。インビボ・バイオパンニング（WO 97/10507）から誘導されたペプチドは、種々のターゲッティング適用のために使用されてきた。配列ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（ＲＧＤ-４Ｃ）は、その架橋位置が特定されていないが、ドキシルビシン（WO 98/10795）のような薬物、核酸およびアデノウイルスを細胞にターゲッティングするために使用されてきた（WO 99/40214、WO 99/39743、WO 98/54347、WO 98/54346、US 5846782参照）。しかし、複数のシステイン残基を含むペプチドは、複数のジスルフィド異性体を生じ得る欠点を有している。ＲＧＤ-４Ｃのような四つのシステイン残基をもったペプチドは、三つの異なるジスルフィド折り畳み形態を形成する可能性を有する。これらの異性体は、ＲＧＤファルマコフォアが三つの異なるコンホメーションを取るので、インテグリン受容体について種々の親和性を有するであろう。
【００１４】
従って、血管新生に関連したインテグリン受容体のインビボでの効率的なターゲッティングおよび撮像は、化学的に頑丈で安定な、選択的高親和性ＲＧＤ系ベクターを必要とする。更に、バックグラウンドに関する問題を低減するためには、排泄ルートは撮像剤を設計するときの重要な因子である。これらの厳格な条件は、本発明に記載した二環系構造によって満たされる。
【００１５】
一つの側面において、本発明は、式Ｉによって定義される新規なペプチド系化合物を提供する。これらの化合物は、インテグリン受容体に対する親和性、例えばインテグリンαｖβ3に対する親和性をもったベクターとしての有用性を有する。
【００１６】
式Ｉの化合物は少なくとも二つの架橋を有し、一方の架橋はジスルフィド結合を形成し、他方の架橋はチオエーテル（スルフィド）結合を形成し、これら架橋は「入れ子状態の」（nested）配置中にベクター部を含む。
【００１７】
従って、本発明の化合物は、ベクター部当たり最大一つのジスルフィド架橋を有する。本発明により規定される化合物は、驚くべきことに、インヴィヴォにおいてラベル付けの間、例えばテクネチウムを用いたラベル付けの間に使用される状況下において安定である。
【００１８】
これらの新規化合物は、像を造る目的と同様、治療学的に有効な処置において使用され得る。
【００１９】
Ｒ１およびＸ１−８の定義により、式Ｉは、任意にＬ部および／またはＲ部を伴う（Ｖ）ｋ部を有する化合物を含有する。
【００２０】
Ｖは二環式ベクターであり、Ｌはリンカー（linker）部であり、Ｒは検出可能な部（リポーター（reporter））、例えば像形成処置において検出可能、であり、例えば、ヒト又は血管化のヒト以外の動物体（例えば、哺乳類、鳥類又は爬虫類体）のインヴィヴォにおいて像を造る（Ｖ）ｋＬＲ構成のような造影剤として、あるいは治療薬として使用される。
【００２１】
本発明により提供される新規なペプチドベースの化合物は式Ｉにより規定される化合物、およびその薬学的に許容されるすべての塩である。
【００２２】
【化６】
0005043271.tif 000002
式中、Ｇはグリシンを表し、
Ｄはアスパラギン酸を表し、
Ｒ1は−（ＣＨ2）n−又は−（ＣＨ2）n−Ｃ6Ｈ4−、好ましくは−（ＣＨ2）n−を表し（式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０を表す。）、
ｈは１又は２の正の整数を表し、
Ｘ1は結合又は１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸残基、好ましくは１又は２個のアミノ酸残基を表すものであって、該アミノ酸残基は各々独立して任意に前記薬剤の薬物動態もしくは血液クリアランス速度を適切に変更する官能基側鎖（例えば炭水化物基）で誘導されていてもよく、前記側鎖は好ましくは、血清アルブミンに対する親和力を有するＣ1-22−アルキル又はＣ1-22パーフルオロアルキル鎖、ポリエチレングリコールポリマー及び／又は疎水性基であり、該アミノ酸残基は各々独立して任意に、ｉ）リンカー（Ｌ）基、又はｉｉ）キレート剤、又はｉｉｉ）キレート剤に結合したリンカー（Ｌ）基を介してインヴィヴォ像形成に適したリポーター（Ｒ）基と結合していてもよい。
【００２３】
Ｘ１は、好ましくはアスパラギン酸、チロシン、チロシン−アスパラギン酸、リジン、グルタミン酸、アセチル−リジン、アスパラギン、セリン、トレオニン、またはグルタミン、もしくはこれらの誘導体である。
【００２４】
Ｘ２およびＸ４は独立に、ジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸残基を表し、好ましくはシステイン又はホモシステイン残基である。
【００２５】
Ｘ3はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、好ましくはアルギニン又はＮ−メチルアルギニン残基である。
【００２６】
Ｘ５は疎水性アミノ酸又はその誘導体を表し、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、３−ヨード−チロシン、またはナフチルアラニン残基であり、より好ましくはフェニルアラニン又は３−ヨード−チロシン残基である。
【００２７】
Ｘ６はチオール含有アミノ酸残基を表し、好ましくはシステイン又はホモシステイン残基である。
【００２８】
ｋは正の整数１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０を表し、好ましくは正の整数１、２、３又は４であり、より好ましくは正の整数１である。
【００２９】
Ｘ7はリンカー（Ｌ）基又は１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸残基（任意にリンカー（Ｌ）部の一部であってもよい。）を表し、好ましくはＸ7は１個のアミノ酸残基であって、
該アミノ酸残基は各々独立して任意に前記薬剤の薬物動態もしくは血液クリアランス速度を適切に変更する官能基側鎖（例えば炭水化物基）で誘導されていてもよく、前記側鎖は好ましくは、血清アルブミンに対する親和力を有するＣ1-22−アルキル又はＣ1-22パーフルオロアルキル鎖、ポリエチレングリコールポリマー及び／又は疎水性基であり、該アミノ酸残基は各々独立して任意に、ｉ）リンカー（Ｌ）基、又はｉｉ）キレート剤、又はｉｉｉ）キレート剤に結合したリンカー（Ｌ）基を介してインヴィヴォ像形成に適したリポーター（Ｒ）基と結合していてもよく、或いはＸ7は存在しない。
【００３０】
好ましくは、少なくとも１のリンカー（Ｌ）部は１又は２以上のエチレングリコールユニットを含有し、および／または、好ましくはＸ７は、グリシン残基を含有するか、あるいは存在しない。
【００３１】
Ｘ８はリポーター（Ｒ）部または−NH2を表し、もしくは存在しない。
【００３２】
特に好ましいキレート試薬は、以下に示す式ａ、ｂ、ｃおよびｄにより規定されるが、式Ｉにおいて規定される化合物は、表１に規定されるキレート試薬もまた含有し得る。
【００３３】
【化７】
0005043271.tif 000003
好ましいキレート試薬およびリンカーユニットの例は式ｅおよびｆとして示される。
【００３４】
【化８】
0005043271.tif 000004
本発明のある側面において、キレートは放射性核種に結合する、あるいは結合することが可能な官能基部分である。ヌクレオチドの錯形成反応において好ましく規定されるキレート試薬（好ましくは９９ｍテクネチウム）を以下の表１に列挙する。
【００３５】
【表１−１】
0005043271.tif 000005
【００３６】
【表１−２】
0005043271.tif 000006
【００３７】
【表１−３】
0005043271.tif 000007
本発明のある側面において、キレートは、求核性置換または求電子付加反応のいずれかにより、あるいはキレート試薬の使用により１８Ｆの同位体、又はＣｕの同位体に結合する、あるいは結合することが可能な官能基部分である。従って、生成する化合物は、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）イメージングにおいて使用され得る。
【００３８】
本明細書において記載されたベクター共役のベクター構成要素は、好ましくは遊離アミノ又は遊離カルボキシル末端を有さない。これによりこれらの化合物に、酵素の分解に対する抵抗に有意な増加がもたらされ、結果として多くの公知の遊離ペプチドと比較してインヴィヴォにおける安定性が増加する。
【００３９】
リポーターＲは、Ｘ１および／またはＸ７を介してＶ（Ｌを介して）に連結し得る。好ましくは、連結点は、ターゲットに対するＶの生物学的活性又はＶの結合親和力が実質的にあるいは有意に減少しないよう選択される（ＲなしのＶと比較した場合におけるＶの生物学的活性又は結合親和力に関して）。最も好ましくは、ＲはＶに連結される。
【００４０】
本明細書において使用する「アミノ酸」なる用語は、最も広い意味に用いられ、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、化学修飾されたアミノ酸、Ｎ−メチル、Ｃα−メチル及びアミノ酸側鎖模倣体、及びナフチルアラニン等の天然には存在しないアミノ酸を言い、好ましくは、天然に存在するアミノ酸又は天然アミノ酸の模倣体である。
【００４１】
式Ｉの化合物の好ましい態様を、以下に化合物ＩＩ〜ＩＸにより例示する。
【００４２】
【化９】
0005043271.tif 000008
【化１０】
0005043271.tif 000009
【化１１】
0005043271.tif 000010
【化１２】
0005043271.tif 000011
【化１３】
0005043271.tif 000012
ここで、化合物Ｖおよび化合物ＶＩはテクネチウムのラベル付けに好適であり、化合物ＩＩはヨードの放射性同位体をラベル付けされ得、化合物ＩＩＩはヨードの放射性同位体のラベル付けに好適なチロシン残基を有する。化合物ＶＩＩは、アルギニンおよびフェニルアラニン残基が各々、ベクター構成要素の酵素安定性を増加させるＮ−メチルアルギニンおよびナフチルアラニンで置換されるベクター−キレート共役を含む。化合物ＩＶは、ヨードの放射性ラベル付けに、フェニルアラニンの代わりにチロシンを含み、Ｃ−末端グリシンは除去され、カルボキシペプチダーゼによるベクターの分解を減少させるためにアミド結合により酸官能基が置換されている。
【００４３】
規定される式Ｉは１又は複数のベクター（Ｖ）を含む。
【００４４】
ここで、Ｘ１は結合、または１、２、３、４又は５のアミノ酸残基を表し、ここでアミノ酸残基は各々独立して任意に前記薬剤の薬物動態もしくは血液クリアランス速度を適切に変更する官能基側鎖で誘導され、
Ｘ２−６は式Ｉにおいて規定した通りであり、
Ｘ７は１、２、３，４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸残基を表し、もしくは存在せず、
Ｘ８は存在しない。
【００４５】
多くの場合において、ベクターＶにおけるアミノ酸はＬ−形態であることが好ましい。しかしながら、本発明におけるいくつかの態様においては、ベクターＶにおける１、２、３又はそれ以上のアミノ酸は好ましくはＤ−形態である。かかるＤ−形態アミノ酸の包含は、ベクターの血清安定性に関して重大な影響を有し得る。Ｘ１の位置にＤ−チロシンを有するベクターに関して特に参照される。
【００４６】
本発明によると、式Ｉに規定されるアミノ酸残基のいずれかは、好ましくは天然に存在するアミノ酸を表し、独立にＤ又はＬ立体配座である。
【００４７】
化合物ＩＩ〜ＶＩＩは、好ましくは以下に示すような立体特異性配座を有する。
【００４８】
【化１４】
0005043271.tif 000013
【化１５】
0005043271.tif 000014
【化１６】
0005043271.tif 000015
本発明の化合物のいくつかは、高親和性ＲＧＤベースのベクターである。本明細書において用いる用語「高親和性ＲＧＤベースのベクター」とは、αｖβ3インテグリンに関する競合結合測定法において、１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満、最も好ましくは５ｎＭ未満のＫｉを有する化合物を言い、そこでＫｉ値は公知の高親和性リガンドエチスタチン（echistatin）との競合により決定された。このような競合測定の実行は、当該分野において周知である。
【００４９】
本発明はまた、１又は２以上の薬学的に許容される補助薬、賦形剤又は希釈剤と共に、一般式（Ｉ）の化合物またはその塩を有効量（例えば、インヴィヴォで像をつくる際に像コントラストを増強するために有効な量）含有する医薬組成物を提供する。
【００５０】
本発明は更に、１又は２以上の薬学的に許容される補助薬、賦形剤又は希釈剤と共に、一般式（Ｉ）の化合物、又はその酸添加塩を有効量含有する、疾患の治療のための医薬組成物を提供する。
【００５１】
上述した通り、式Ｉの化合物はベクター、リンカーおよびリポーター部を有し得る。リンカー部は１つのベクターを１つのリポーターに結合する役割を果たし得、あるいは１より多くのベクターおよび／または１より多くのリポーターを一緒に結合する役割を果たし得る。同様に、リポーター又はベクターは１より多くのリンカーに結合され得る。この方法における複数のリポーター（例えば１ベクターに連結した数個のリンカー−リポーター部）の使用は、造影剤の検出性を増加させることを可能とし得（例えばその放射性不透明度、エコー発生性、リラキシビティ（relaxivity）を増加させることによる）、あるいは１より多くの像形成モダリティにおいて検出されることを可能とし得る。この方法における複数のベクターの使用は、例えば、造影剤のターゲット効率を増加させ得、あるいは造影剤／治療薬が１よりも多くのサイト（例えば異種受容体を有する薬剤につき異なった受容体）をターゲットとすることを可能とし得る。
【００５２】
生物分解性リンカーおよび生物ポリマーを含む、幅広いリンカーを使用し得る。
【００５３】
造影剤のリンカー構成要素は、最も単純なところにおいて、ベクターおよびリポーター部間の結合である。しかしながら、より一般的にはリンカーは、１又は２以上のベクターと１又は２以上のリポーターとを電子対を共有して、あるいは電子対を共有せず結合しているモノ−又はマルチ分子骨格構造（例えば、直線状、環状、枝分かれ状又は網状の分子構造）であって、電子対を共有して、あるいは電子対を共有せず結合している（例えば、同等に結合している）、もしくはかかる部分をカプセルに入れ、とらえ、あるいはしっかり固定して内部に組み込まれた、又は付属性基を有する分子構造を提供し得る。本発明の一つの好ましい態様において、式中、１又は複数のアミノ酸が個々のリンカー構成要素の一部である式Ｉの化合物が提供される。
【００５４】
このように、リポーターユニットと所望のベクターとの結合は、電子対を共有した、あるいは電子対を共有せず結合する手段により達成され得、通常、リポーターおよび／またはベクターに位置する１又はそれ以上の官能基を有する相互作用を含む。本目的のために使用され得る化学的反応性官能基の例としては、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト基、カルボキシル、およびカルボニル基と共に、炭水化物基、ビシナルジオール、チオエーテル、２−アミノアルコール、２−アミノチオール、グアニジニル、イミダゾリルおよびフェノール基が含まれる。
【００５５】
リポーターおよびベクターの電子対を共有するカップリングは、故に係る官能基と反応することが可能な反応性部分を含む結合剤（linking agent）の使用に影響され得る。
【００５６】
リポーターおよび／またはベクター中の官能基が所望により反応に先立ち他の官能基に変換され得ることは理解され得る。
【００５７】
膜挿入の媒介となり得る構成要素を含むペプチド、リポ−オリゴ糖類又はリポペプチドリンカーにカップリングされるベクターもまた有用となり得る。
【００５８】
追加の結合物質を添加することなく直接的な電子対を共有する二つの反応性化学性基の結合を引き起こす（例えば、カルボジイミドを用いて、あるいは酵素的に引き起こされたアミド結合の形成）、いわゆるゼロ長（zero-length）結合剤は、所望により本発明において使用され得、該結合剤は、例えば電子対を共有しないリポーター−ベクター結合を引き起こすビオチン／アビジン系のような試薬であり得、また静電気的相互作用を引き起こす試薬であり得る。
【００５９】
しかしながら、最も一般的には、該結合剤はスペーサー構成要素により接続された２又はそれ以上の反応性部（例えば、上述したような）を含有し得る。かかるスペーサーの存在により、二官能リンカーが特定の官能基と一分子内でもしくは異なる二つの分子間で反応することを可能とし、これによりこれら二つの構成要素間における結合が生成し、リポーター−ベクター共役への外因性リンカー誘導物質がもたらされる。結合剤における反応性部は同じであってもよいし（ホモ二官能試薬）、異なっていてもよく（ヘテロ二官能試薬又は、ヘテロ多官能試薬（いくつかの異なる反応性部が存在する。））、分子内又は分子間のいずれかにおいて、いくつかの化学種間における電子対を共有する結合をもたらし得る多様性のあるポテンシャル試薬を提供する。
【００６０】
結合剤によりもたらされる外因物質の性状は、ターゲット能および最終生成物の一般的安定性に重大な関係を有し得る。従って、化学結合を起こしやすい結合を導入することが好ましく、例えば生物分解性又は化学的感度のよい、もしくは酵素による結合開裂サイトを包含するスペーサーアームを含むことができる。あるいは、該スペーサーはポリマー成分を含有し得、該ポリマー成分は、例えば界面活性剤として作用し試薬の安定性を強化するものであることができる。スペーサーはまた反応性部分（例えば上述したような表面架橋結合を強化するもの）を含むことができる。スペーサー構成要素はまた、デキストラン、好ましくはポリ（エチレングリコール）（一般的にＰＥＧと言われる）等の高分子構造を含有し得る。スペーサー構成要素に加えて、ＰＥＧはまた、ベクターのインヴィヴォにおける特性を修正するために用いられ得る。
【００６１】
他の典型的スペーサー構成要素は、酵素による結合開裂サイトを含み得、又は含まない、構造多糖類、貯蔵多糖類、ポリアミノ酸とそのメチル並びにエチルエステル、ポリペプチド、オリゴ糖類およびオリゴヌクレオチドを含む。
【００６２】
好ましい結合基は、以下から選択される（但し、これらは限定するものではない。）ベクター反応性基から誘導される。
【００６３】
ベクターにおいて、カルボキシル、アルデヒド、アミン（ＮＨＲ）、アルコール、メルカプト基、活性メチレン等と直接的に反応し得る基、例えば活性ハロゲン含有基、
ベクター反応性基を含む修飾されたベクター分子、すなわち、例えばベクターを酸化してアルデヒド又はカルボン酸にするなど、反応性基を含むように修飾された反応性基を含むベクターと容易に反応し得る基、および
架橋剤を使用することにより、反応性基を含むベクターに、あるいは上記のように修飾されたベクターに結合され得る基、である。
【００６４】
好ましい有用な結合剤は、ピース・ケミカル・カンパニー・イミューノテクノロジー・カタログ−プロテイン・モディフィケーション・セクション（Pierce Chemical Company Immunotechnology Catalog−Protein Modification Section）, 1995および1996に挙げられているような、様々なヘテロ二官能架橋剤から誘導される。
【００６５】
上記に加えて結合剤はまた、全部または一部において、ヌクレオチド及びヌクレオチド残基の相補的構造を含有し又は誘導され得、天然に存在するもの及び修飾されたもの双方であり、好ましくは異物に結合したオリゴヌクレオチド構造である。
【００６６】
本発明において使用される結合剤は、通常、ベクターとリポーター、又はリポーターとリポーターとの、ある程度の特異性を有する結合をもたらし得、また治療学的に活性な１又は２以上の活性剤を結合するためにもまた使用され得る。
【００６７】
本願の内容において用いられ得るリンカーの更なる例は、WO98/47541の第３２頁〜第５４頁に記載されており、参照によりこれらの開示のすべてを取り込む。その結果、上記該当頁に開示された各々かつすべてのリンカーあるいはその部分は、本明細書に開示された発明の一部であるとみなされる。
【００６８】
本発明の造影剤におけるリポーター部は、インヴィヴォにおける診断的像形成処置において直接的に、または間接的に検出することが可能なすべての部分であり得る。好ましくは、造影剤は、一つのリポーターを含む。好適な部分は、検出可能な放射線を発する、または該放射線の発生を引き起こし得る部分（例えば、放射性減衰、蛍光性励起、スピン共鳴励起等による）、局部的な電磁界に作用する部分（例えば、常磁性体、超超磁性体、フェリ磁性体又は強磁性体）、放射線エネルギー（例えば、発色団又は発蛍光団）を吸収し又は発散する部分、粒子（気胞を含有する液体を含む）、重元素並びにその化合物、検出可能な物質を発生する部分である。
【００６９】
診断的像形成様式により検出可能な極めて広範囲の物質が当該分野において知られており、リポーターは用いられる造形性様式に従い選択されうる。従って、例えば、超音波像形成においては、音波発生物質又は音波発生物質を発生することが可能な物質が通常は選択され得る。ベクターは、ガスが充填された微少な泡に取り込まれるために、リンカーを介して好適な脂質リポーター／キャリアーに連結され得る。このような微少な泡は、超音波造形性をターゲットとするために用いられ得る。Ｘ線像形成において、リポーターは概して重原子（例えば、原子量３８以上）であるか、または重原子を含み得、ＭＲ像形成において、リポーターはゼロでない核スピン同位体（例えば１９Ｆ）か、あるいは不対電子を有する物質であり得、故に常磁性、超超磁性、フェリ磁性又は強磁性特性を有し得、光像形成において、リポーターは光散乱体（例えば、彩色された、又は彩色されていない粒子）、光吸収体、又は光発生体であり得、磁気測定像形成において、リポーターは検出可能な磁気特性を有し得、電気的インピーダンス像形成において、リポーターは電気的インピーダンスに影響し得、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ等において、リポーターは放射性核種であり得る。
【００７０】
好適なリポーターの例は、診断的像形成論文から広く知られており、例えば磁性を帯びた鉄酸化物粒子、気胞を含有するＸ線造影剤、キレート化された常磁性金属（例えばＧｄ、Ｄｙ、Ｍｎ、Ｆｅ等）等である。
【００７１】
一般的に述べられているように、リポーターは（１）キレート化可能な金属又は多原子からなる金属含有イオン（すなわち、ＴｃＯ等）であって、前記金属は高原子番号金属（例えば、原子番号が３７より大きい）である；常磁性体（例えば、遷移金属又はランタニド）；又は放射性同位体である、（２）電子対を共有して結合した非金属種であって、不対電子サイトである（例えば、遊離基中の酸素又は炭素）；高原子番号の非金属；又は放射性同位体、（３）高原子番号の原子を含有する、又は協同磁性作用を示す（例えば超常磁性体、フェリ磁性体、又は強磁性体）、又は放射性核種を含有する、多原子クラスター又は結晶、（４）発色団（該発色団に蛍光性又は燐光性である種が含まれる）、例えば無機又は有機構造、特に複合金属イオン又は広範囲に非局在化された電子系を有する有機基、又は（５）例えば広範囲に非局在化された電子系により、特性を変化させる電気的インピーダンスを有する構造又は基、である。
【００７２】
特に好ましいリピーター基の例を以下においてより詳細に記載する。
【００７３】
キレート化された金属リピーターは、好ましくは、金属放射性核種、常磁性金属イオン、蛍光性金属イオン、重金属イオン及びクラスターの群から選択される。
【００７４】
好ましい金属放射性核種には、９０Ｙ、９９mＴｃ、１１１Ｉｎ、４７Ｓｃ、６７Ｇａ、５１Ｃｒ、１７７ｍＳｎ、６７Ｃｕ、１６７Ｔｍ、９７Ｒｕ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ及び１４１Ｃｅが含まれる。
【００７５】
好ましい常磁性金属イオンには、遷移金属及びランタニド金属のイオンが含まれ（例えば原子番号６〜９、２１〜２９、４２、４３、４４、又は５７〜７１）、特にはＣｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ及びＬｕであり、より好ましくはＭｎ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｇｄ及びＤｙであり、特に好ましくはＧｄである。
【００７６】
金属イオンは、望ましくはリンカー基上又は粒子内もしくは粒子上（例えば気胞もしくは、気孔又は気孔を有しない無機もしくは有機固体）のキレート基によりキレート化され、該キレート基として、特には直線状、大環状、テルピリジン（terpyridine）及びＮ２Ｓ２キレートであり、例えばＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＥＤＴＡ、Ｄ０３Ａ及びＴＭＴがある。好適なキレート基の更なる例が、US-A-4647447, WO89/00557, US-A-5367080, US-A-5364613等に記載されている。
【００７７】
リンカー基又は粒子はそのようなキレート基を１又は２以上含み得、所望により１以上の金属種により金属付加される（例えば異なる像形成様式において検出可能なリポーターを提供するために）。
【００７８】
キレート試薬を金属付加する方法は当業者が通常行う程度の技術である。３つの一般的な方法のいずれかにより金属をキレート部に含ませることができる：直接的な取り込み、テンプレート合成および／または金属交換反応であり、直接的な取り込みが好ましい。
【００７９】
従って、金属イオンは、例えば、単にさらすのみにより、あるいは
キレート試薬を含む部分の水溶液を、好ましくはｐＨが約４〜約１１の範囲である水溶液中に含有される金属塩と混合することにより、容易にキレート試薬と複合化され得ることが好ましい。前記塩はいずれの塩でもよいが、例えばハロゲン塩のような金属の水可溶性塩であり、より好ましくは、金属イオンがキレート試薬と結合するのを妨げない塩から選択される。キレート試薬含有部分は、好ましくはｐＨが約５〜約９の間である水溶液中にあり、より好ましくはｐＨが約６〜約８である。最適なｐＨを得るために、キレート試薬含有部分はクエン酸塩、アセテート、リン酸塩及びホウ酸塩等のバッファー塩と共に混合され得る。好ましくは、バッファー塩は、その後に起こる金属イオンとキレート試薬との結合を妨げないよう選択される。
【００８０】
診断的像形成において、ベクター−リンカー−リポーター（Ｖ）ｋＬＲ構造は、好ましくは、キレート試薬に対して金属放射性核種イオンを、診断的像形成の適用において有効な比率で含有する。好ましい態様において、キレート試薬１モル当たりの金属イオンのモル比は約１：１０００〜約１：１である。
【００８１】
放射線療法への適用において、（Ｖ）ｋＬＲは、好ましくは、キレート試薬に対して金属放射性核種イオンを、治療上の適用において有効な比率で含有する。好ましい態様において、キレート試薬１モル当たりの金属イオンのモル比は約１：１００〜約１：１である。例えば、放射性核種はＳｃ、Ｆｅ、Ｐｂ、Ｇａ、Ｙ、Ｂｉ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｇｅ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｓｎ、Ｓｒ、Ｓｍ、Ｌｕ、Ｓｂ、Ｗ、Ｒｅ、Ｐｏ、Ｔａ及びＴｌの放射性同位体から選択され得る。
【００８２】
好ましい放射性核種には、４４Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、６８Ｇａ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅが含まれる。これらのなかで、９０Ｙが特に好ましい。これらの放射性同位体は原子でもよいが、好ましくはイオンである。
【００８３】
以下の同位体、又は対になっている同位体は、放射性同位体を識別するための方法論あるいはキレート化剤を変更することなく、像形成と治療の双方において使用することができる：４７Ｓｃ２１；１４１Ｃｅ５８；１８８Ｒｅ７５；１７７Ｌｕ７１；１９９Ａｕ７９；４７Ｓｃ２１；１３１Ｉ５３；６７Ｃｕ２９；１３１Ｉ５３及び１２３Ｉ５３；１８８Ｒｅ７５及び９９ｍＴｃ４３；９０Ｙ３９及び８７Ｙ３９；４７Ｓｃ２１及び４４Ｓｃ２１；９０Ｙ３９及び１２３Ｉ５３；１４６Ｓｍ６２及び１５３Ｓｍ６２；および９０Ｙ３９及び１１１Ｉｎ４９。
【００８４】
キレート部はキレートの根幹となる官能基を介して、あるいはキレートの１又はそれ以上の金属が配位結合している基の利用により、又は酸キレートとアミン、もしくはヒドロキシルを有するリンカー根幹との間のエーテル結合の形成により、連結され得、例えばPCT/ EP 96/ 00565の、ポリリジン−ポリＤＴＰＡ、ポリリジン−ポリＤＯＴＡ及びいわゆる拡大ポリキレート（magnifier polychelant）である。かかる部分は１又は２以上のベクター基と直接的に（例えば、ポリキレートリンカーにおけるアミン、酸又はヒドロキシル基を利用する）、またはおいてモノキレートリンカーについて上記したような二官能リンカー化合物を介して共役され得る。
【００８５】
粒状（あるいは分子アグリゲート、例えば小胞）のリンカーによりキレート化された種において、キレートは例えば連結していないモノ、又は粒子内に包含されるポリキレート（Ｇｄ  ＤＴＰＡ−ＢＭＡ又はＧｄ  ＨＰ−ＤＯ３Ａ等）であり得、または電子対を共有した結合により、もしくは小胞の膜を有するモノ／ポリキレート上のアンカー基（例えば、脂肪親和性基）の相互作用のいずれかにより、粒子と共役したモノ又はポリキレートであり得る。（PCT /GB 95/02378 の実施例を参照のこと。）
好ましい非金属原子のリポーターには、１２３Ｉ、１３１Ｉ及び１８Ｆ等の放射性同位体のほか、ゼロでない核スピン原子（例えば１９Ｆ）、並びに重原子（例えばＩ）が含まれる。
【００８６】
かかるリポーター（好ましくは、複数のリポーターであり、例えば２〜２００）は、リンカーの根幹と、従来の化学合成技術を用いて直接的に、もしくは支持基（例えばトリヨードフェニル基）を介し、電子対を共有して結合され得る。
【００８７】
本発明の一態様において、ヨウ素又はフッ素の放射性同位体の使用が具体的に検討された。例えば、仮にベクター又はリンカーが、反応を形成する電子対共有結合においてヨウ素又はフッ素により化学的に置換され得る置換基（例えば、ヒドロキシフェニル又はｐ−ニトロベンゾイルを含む置換基）を含有する場合に、かかる置換基はヨウ素又はフッ素各々の放射性同位体を用いて当業者に周知の方法によりラベル付けされ得る。これらの種は、治療においても、また診断的像形成における適用においても使用され得る。同時に、同じベクター−リンカー上のキレート試薬に連結された金属もまた、治療においても、また診断的像形成における適用においても使用され得る。
【００８８】
上述した金属キレートに関し、かかる金属原子リポーターはリンカーに連結され得、あるいは粒状リンカー内又は粒状リンカー上（例えば、小胞内）におかれ得る（WO 95/ 26205 及び GB 9624918.0参照）。
【００８９】
金属リポーターに連結した上記タイプのリンカーは、非金属原子リポーターのために、非金属原子リポーター又はキレート基の一部又は全部に代わるリポーターを有する基と共に使用され得る。
【００９０】
本発明において好ましい（Ｖ）ｋＬＲ試薬はリポーターに直接的に又は間接的に、例えば、電子対を共有して結合されたヨード放射性同位体を用いて、直接的に又は有機リンカー基を介して連結された、もしくは粒状リポーター又はリンカー−リポーターに連結された金属キレートと共に、連結した受容体ターゲットベクターを有し得る。例えば、超常磁性結晶（例えば、PCT/ GB97/ 00067に開示されているように、任意にコートされている。）、又は小胞。ミセル又はリポソームを含有するヨー化物造影剤。
【００９１】
本発明の好ましい態様は、一般式（Ｉ）の放射性同位体を用いてラベル付けされた試薬に係わり、特には腫瘍の像形成における使用に関するものである。
【００９２】
本発明の診断的試薬は特別な像形成技術を用いて記載されたコントラストを生ずるのに充分な量をもって像を形成するために患者に投与され得る。リポーターが金属の場合においては、通常、患者の体重１キログラム当たりキレート化された像形成金属イオン０．００１〜５．０ｍｍｏｌが一回分の投与量として適切なコントラスト増強を達成するために効果的である。リポーターが放射性核種の場合においては、通常、０．０１〜１００ｍＣｉの投与量が、体重７０ｋｇに対して充分であり得る。
【００９３】
治療に使用するための本発明の化合物の投与量は、治療状況に依存するが、一般的には、１pmol/kg 〜１mmol/kg体重のオーダーであり得る。
【００９４】
従って、本発明による化合物は、投与のために、生理的に許容されるキャリアー又は賦形剤を用い、当該分野における技術レベルの方法において充分に調製されうる。例えば、本発明の化合物は、任意に薬学的に許容される賦形剤と共に、水溶性媒体に懸濁され、あるいは溶解され得、次いで得られた溶液又は懸濁液は撹拌される。
【００９５】
式Ｉの化合物は、疾患の治療において治療学的に効果的であり、同様にインヴィヴォにおいて像を形成する際に検出可能であり得る。従って、例えば、リポーター部上のベクターは、治療上の効果（例えば放射性核種リポーターの放射線療法効果の効き目による）、発色団（又は発蛍光団）リポーターの光力学的治療における効果、あるいはベクター部の化学療法効果を有し得る。
【００９６】
治療学的組成物の製造における、並びに、ヒト又はヒト以外の動物の身体における治療又は予防的治療、好ましくは癌の治療方法における式Ｉの化合物の使用は、本発明の更なる側面を表すものと考えられる。
【００９７】
本発明の内容において使用され得るリポーターの更なる例としては、WO 98/ 47541の63〜66頁、70〜86頁に開示があり、この開示のすべては本明細書において参照により取り込まれる。その結果、上記該当頁に開示された各々かつすべてのリンカーあるいはその部分は、本明細書に開示された発明の一部であるとみなされる。
【００９８】
更なる側面から見ると、本発明は、前記造影剤の生体対象への投与と、少なくとも前記対象の一部における像の発生を含む診断方法において使用するための造影剤の製造における式Ｉの化合物の使用を提供する。
【００９９】
更に別の側面から見ると、本発明は、生きたヒトまたは非ヒト動物（好ましくは哺乳類または鳥類）対象の画像を生成する方法であって、造影剤を前記対象に投与する（例えば血管系の中に）ことと、例えば、Ｘ線、ＭＲ、超音波、シンチグラフィー、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、電気的インピーダンス、光、または磁気撮像施設により、前記造影剤が分布された前記対象の少なくとも一部の画像を生成させることとを含み、前記造影剤として式Ｉの薬剤が使用される方法を提供する。
【０１００】
更に別の側面から見ると、本発明は、式Ｉで定義した化合物を含む造影剤組成物を策に投与されたヒトまたは非ヒト動物対象の、向上した画像を生成する方法であって、前記対象の少なくとも一部の画像を生成することを含む方法を提供する。
【０１０１】
更なる側面から見たとき、本発明は、癌、好ましくは血管新生に関連する症状と戦う薬物を用いたヒトまたは非ヒト対象の治療効果をモニターする方法であって、前記対象に、式Ｉで定義された薬剤を投与すること、細胞受容体、好ましくは内皮細胞受容体、特にαｖβ3受容体による前記薬剤の取り込みを検出することとを含み、前記投与および検出は、任意に且つ好ましくは、前記薬物での治療の前、最中および後に繰り返し行われる方法を提供する。
【０１０２】
更なる側面から見たとき、本発明は、式Ｉの薬剤を調製するための方法であって、ベクターＶを、診断撮像法において検出可能な化合物またはキレート剤に接合することと、もし必要であれば、得られた接合体中に存在するキレート基を、診断撮像法において検出可能な金属イオンで金属化することとを含む方法を提供する。
【０１０３】
本発明の化合物は、全て既知の化学合成法を使用して合成することができるが、特に有用なのは、自動ペプチド合成機を用いたMerrifieldの固相法（J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1964)）である。複数の架橋を含むベクターは、ベクターの最終折り畳み形態に関して曖昧さが存在しないように、示差的システイン保護基を使用して合成される。このペプチド類およびペプチドキレート類は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して精製してもよく、またインビトロでのスクリーニングで試験する前に、質量スペクトル分析および分析的HPLCによって特徴付けしてもよい。
【０１０４】
【実施例】
以下に示す実施例（これらは本発明を限定するものではない）により本発明を更に詳細に説明する。
【０１０５】
例１：化合物V1aの合成
１ ａ）ClCH2CONH−Asp−Cys (MBzl)−Arg−Gly−Asp−Cys(MBzl)−Phe−Cys−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2の合成
【化１７】
0005043271.tif 000016
ペプチドを、Ｏ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂を出発物質として０．２５mmolスケールにつき、１mmolのアミノ酸とクロル酢酸カートリッジを用い、ＡＢＩ ４３３Ａ自動ペプチドシンセサイザーで合成した。アミノ酸とクロル酢酸をカップリング前にＨＢＴＵを用いて予め活性化した。ＴＩＳ（５％）、Ｈ２Ｏ（５％）、及びフェノール（２．５％）を含むＴＦＡ中で、２時間２０分かけて樹脂からペプチド及び側鎖保護基（MBzLを除く）を同時に除去した。
【０１０６】
作業後、２５０mgの粗ペプチドを得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、２０分間５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、VYDAC C18218TP54；検出、UV 214nm；生成物保持時間、２０．５５分）。更に生成物の特性を、MALDI質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1389、実測値：1392。
【０１０７】
１ ｂ）シクロ[−CH2CONH−Asp−Cys (MBzl)−Arg−Gly−Asp−Cys (MBzl)−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2の合成
【化１８】
0005043271.tif 000017
２５０mgのClCH2CONH−Asp−Cys (MBzl)−Arg−Gly−Asp−Cys (MBzl) −Phe−Cys−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2を水／アセトニトリル中に溶解した。アンモニア溶液を用いて混合溶液をｐＨ８に調整し、２０時間撹拌した。凍結乾燥後、２４０mgの粗ペプチドを得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、２０分間５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、VYDAC C18218TP54；検出、UV 214nm；生成物保持時間、１９．４５分）。更に生成物の特性を、MALDI質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1353、実測値：1358。
【０１０８】
１ ｃ）［Cys2-6］シクロ[−CH2CONH−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2の合成
【化１９】
0005043271.tif 000018
１００mgのシクロ[−CH2CONH−Asp−Cys (MBzl)−Arg−Gly−Asp−Cys (MBzl)−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2をＴＨＡ（１０ml）中に溶解し、次いでこれをアニソール（２００μl）、ＤＭＳＯ（５ml）及びＴＦＡ（９０ml）の予め加熱された溶液に加えた。混合物を６０℃で６０分間撹拌し、次いでＴＦＡを真空中で除去し、ジエチルエーテルを添加してペプチドを沈澱させた。
【０１０９】
ＨＰＬＣ（VYDAC C18 218TP1022 カラム）による予備的な精製を行った（流速９ｍＬ／minにおいて４０分間、０〜３０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）。凍結乾燥後、２６mgの純物質を得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、０〜３５％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、VYDAC C18218TP54；検出、UV 214nm；生成物保持時間、１４．３３分）。更に生成物の特性を、MALDI質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1143、実測値：1148。
【０１１０】
１ ｄ）[Cys 2-6］シクロ[CH2CONH−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2とN3S−アジパートキレートとの共役  −  化合物Ｖ１a：
【化２０】
0005043271.tif 000019
アセトニトリル（５ml）に溶解している６．５mgのN3S −アジパートキレート化活性エステルを、ＤＰＢＳ（５ml、ｐＨ７．４）に溶解してる５．１mgの［Cys 2-6］シクロ[CH2CONH−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2に加えた。混合物を３日間撹拌した。
【０１１１】
ＨＰＬＣ（VYDAC C18 218TP1022 カラム）による予備的な精製を行った（流速９ｍＬ／minにおいて４０分間、５〜３０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）。凍結乾燥後、４．３mgの純物質を得た（ＨＰＬＣ分析：１０分、勾配、５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 mm；検出、UV 214nm；生成物保持時間、６．５５分）。更に生成物の特性を、MALDI質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1150、実測値：1546。
【０１１２】
１ ｅ）化合物Ｖ１aのテクネチウムラベル付け
窒素が充填された容器（vial）中に、水（５０μg）に溶解した化合物V1a（５０μg）、１５０μＬのグルコン酸ナトリウム溶液（６mLＨ２Ｏに２５mg）、１００μLの酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０、５０mM）、１mLのＴｃＯ４溶液（５００MBq）及び５０μＬのＳｎＣｌ２溶液（１００mLＨ２Ｏに２０mg）を加えた。ＩＴＬＣ及びＨＰＬＣによる分析前に混合物を７５℃において２０分間加熱した。
【０１１３】
例２：［Cys 2-6］シクロ[CH2CONH−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2とPn216キレートとの共役（化合物Ｖａ）
２ ａ）Pn216キレートの合成
クロロ−ニトロソ中間体（3−クロロ−3−メチル−2−ニトロソブタン）
2−メチル−２−ブテン（１８．５mL）と硝酸イソアミル（１９．５mL）との混合物を撹拌し、−１０℃に冷却し、温度を０℃以下に注意深く維持しながら塩酸（１７．５mL）を加えて濃縮した。反応物を当該温度で３０分間撹拌した。生成した沈殿物を濾過して収集し、５mＬのエタノール（−２０℃）で４回洗浄し、真空中で乾燥することにより、白色固体のクロロ−3−メチル−2−ニトロソブタンを得た。
【０１１４】
２ ｂ）Pn216−(3 ,3, 11, 11−テトラメチル−7−アミノエチル−4, 7, 10, トリアザトリデカン−2, 12−ジオンジオキシム)
tris−(2−アミノエチル)アミンのアセトニトリル溶液（２０mL）に、重炭酸ナトリウム（２．２ｇ、２６mmol）を加えた。3−クロロ−3−メチル−2−ニトロソブタン（１．８ｇ、１３mmol）の乾燥アセトニトリル溶液を０℃においてゆっくり加えた。反応混合物を室温において４時間撹拌したままにし、次いで濾過した。濾液をアセトニトリルで洗浄し、該濾液を蒸発した。粗生成物をアセトニトリルに溶解し、ＨＰＬＣにより精製し、Pn216を得た。収率  ０．８８ｇ、１９％。
【０１１５】
２ ｃ）Pn216−琥珀酸中間体の合成
【化２１】
0005043271.tif 000020
琥珀酸無水物  （１００）
Ｐｎ２１６  （３５８）
テトラフルオロチオフェノール  （１８２）
ＤＣＣＩ  （２０６）
Pn216（０．５ｇ、１．４mmol）をＤＭＦ（５mL）に溶解し、攪拌しながらＤＭＦ（１０mL）中の琥珀酸無水物（０．０１５ｇ、１．５mmol）を分けて加えた。反応物をそのまま16時間攪拌し続け、所望の生成物への完全な変換を得た。続くＨＰＬＣクロマトグラフィーにおいて高収率で純酸を得た。
【０１１６】
２ ｄ）Pn216−琥珀酸のテトラフルオロチオフェノールエステル誘導体の合成
【化２２】
0005043271.tif 000021
ＨＡＴＵ（８．３mg、０．０２２mmol）およびＮＭＭ（０．００７mL、０．０６６mmol）をDMF（１．０ｍL）中のPn216酸（１０mg、０．０２２mmol）に添加した。混合物を5分間攪拌し、次いでＴＦＴＰ（０．０２２mmol、４mg）を添加した。該溶液を30分間攪拌し、次いで反応混合物を２０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（３ｍL）で希釈し、生成物を逆相クロマトグラフィーにより精製し、続く凍結乾燥により所望の生成物６mgを得た。
【０１１７】
２ ｅ）ペプチドの合成については、例１のａ）〜ｃ）を参照することができる。
【０１１８】
２ ｆ）ペプチドとPn216キレートとの共役
【化２３】
0005043271.tif 000022
５mgのPn216キレート活性エステル、２μlのN−メチルモルホリンおよび６mgの[Cys 2-6]シクロ[CH2CONH−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe - Cys]−Gly−NH (CH2CH2O)2CH2CH2NH2をN, N−ジメチルホルムアミド（０．５ml）に溶解した。混合物を２４時間攪拌した。
【０１１９】
反応混合物のＨＰＬＣ（Phenomenex Luna 5u C18 (2) 250 x21.20 mm カラム）による予備的な精製を行った（流速１０mL／minで10分間、５〜５０％B、A＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）。凍結乾燥後、３．５mgの純物質を得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、１０分間、５〜５０％Ｂ、A＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 mm；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、4.47分）。更に生成物の特性を、質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1569.7、実測値：1569.7。
【０１２０】
２ ｇ）化合物は上記１ ｅ）において述べた方法と類似の方法においてテクニチウム（99mTc）でラベル付けされ得る。
【０１２１】
例３：Pn216キレートで脂肪酸修飾されたベクター
３ ａ）Dde−Lys−Cys (tBu)−Arg (Pmc)−Gly−Asp (OtBu)−Cys (tBu)−Phe−Cys (Trt)−Gly−(O−ビス−(アミノエチル)エチレングリコールトリチル)樹脂のアセンブリー  （ｉ）
保護ペプチドを、Ｏ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂を出発物質として０．３mmolスケールにつき、１mmolのアミノ酸カートリッジを用い、ＡＢＩ ４３３Ａ自動ペプチドシンセサイザーでアセンブルした。アミノ酸をカップリング前にＨＢＴＵを用いて予め活性化した。
【０１２２】
３ ｂ）ClCH2CO−Lys(ヘキサノイル)−Cys (tBu)−Arg−Gly−Asp−Cys (tBu)−Phe−Cys−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2（ｉｉ） の合成
０．１mmolの樹脂（ｉ）をヘキサン酸無水物のＤＭＦ溶液で１７時間処理した。樹脂からのDde保護基の除去を、ヒドラジン一水和物の２％ＤＭＦ溶液を用い、３分間で４回行った。次いで前記樹脂をクロル酢酸無水物のＤＭＦ溶液を用いて６０分間処理した。
【０１２３】
ＴＩＳ（５％）、Ｈ２Ｏ（５％）、及びフェノール（２．５％）を含むＴＦＡ中で、２時間かけて樹脂からペプチド及び側鎖保護基（MBzLを除く）を同時に除去した。
【０１２４】
作業後、１００mgの粗ペプチドを得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、１０分間５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 ｍｍ；流速、２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、7.81分）。更に生成物の特性を、質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1404.7、実測値：1404.6。
【０１２５】
３  ｃ）シクロ[CH2CO−Lys (ヘキサノイル)−Cys (tBu)−Arg−Gly−Asp−Cys (tBu)−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2（ｉｉｉ）の合成
【化２４】
0005043271.tif 000023
１００mgの化合物（ｉｉ）を水／アセトニトリル中に溶解した。混合物をアンモニア溶液を用いてpＨ８に調整し、２０時間攪拌した。作業後、１０４mgの粗ペプチドを得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、１０分間５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 ｍｍ；流速、２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、7.67分）。更に生成物の特性を、質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1368.7、実測値：1368.7。
【０１２６】
３  ｄ）[Cys 2-6]シクロ[CH2CO−Lys (ヘキサノイル)−Cys - Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2（ｉｖ）の合成
【化２５】
0005043271.tif 000024
５０mgの化合物（ｉｉｉ）を、アニソール（１００μm）、ＤＭＳＯ（１ml）およびＴＦＡ（５０ml）溶液を用いて室温において３０分間処理し、次いでＴＦＡを真空中において除去し、ジエチルエーテルを添加してペプチドを沈殿させた。
【０１２７】
粗物質のＨＰＬＣ（Phenomenex Luna 5u C18 (2) 250 x21.20 mm カラム）による予備的な精製を行った（流速１０mL／minで10分間、５〜５０％B、A＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）。凍結乾燥後、９mgの純物質を得た（ＨＰＬＣ分析：１０分間、勾配、５〜５０％Ｂ、A＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 mm；流速２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、5.38分）。更に生成物の特性を、質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1254.5、実測値：1254.6。
【０１２８】
３  ｅ）[Cys 2-6]シクロ[CH2CO−Lys (ヘキサノイル)−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe - Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH−Pn216（ｖ）の合成
【化２６】
0005043271.tif 000025
９mgの化合物（ｉｖ）、１１mgのPn216キレート活性エステルおよび８μlのN−メチルモルホリンをＤＭＦ（１ml）中に溶解した。混合物を３．５時間攪拌した。
【０１２９】
反応混合物のＨＰＬＣ（Phenomenex Luna 5u C18 (2) 250 x21.20 mm カラム）による予備的な精製を行った（流速１０mL／分で４０分間、５〜５０％B、A＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）。凍結乾燥後、５．２mgの純物質を得た（ＨＰＬＣ分析：１０分間、勾配、５〜５０％Ｂ、A＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 mm；流速２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、5.83分）。更に生成物の特性を、質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1680.8、実測値：1680.7。
【０１３０】
例４：Pn216キレートを用いたPEG修飾ベクター
４ ａ）ClCH2CO−Lys (PEG2000)−Cys (tBu)−Arg−Gly−Asp−Cys (tBu)−Phe−Cys−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2（ｖｉ）の合成
【化２７】
0005043271.tif 000026
０．１mmolの樹脂（ｉ）を、CH3O−PEG−NHCOCH2CH2COOH(ＨＡＴＵを用いて予め活性化されている)を用いて１６時間処理した。樹脂からのDde保護基の除去を、ヒドラジン一水和物の２％ＤＭＦ溶液を用い、３分間で４回行った。次いで前記樹脂をクロル酢酸無水物のＤＭＦ溶液を用いて６０分間処理した。
【０１３１】
ＴＩＳ（５％）、Ｈ２Ｏ（５％）、及びフェノール（２．５％）を含むＴＦＡ中で、２時間かけて樹脂からペプチド及び側鎖保護基（tBuを除く）を同時に除去した。
【０１３２】
作業後、１００mgの粗ペプチドを得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、１０分間５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 ｍｍ；流速、２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、５〜９分から多重ピーク）。更に生成物の特性を、MALDI質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、3313、実測値：2785。
【０１３３】
４ ｂ）シクロ[CH2CO−Lys (PEG2000)−Cys (tBu)−Arg−Gly−Asp−Cys (tBu)−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2（ｖｉｉ）の合成
【化２８】
0005043271.tif 000027
１１０ｍｇの化合物（ｖｉ）を水／アセトニトリルに溶解した。混合物をアンモニア溶液を用いてｐＨ８に調整し、２０時間撹拌した。作業後、９０ｍｇの粗ペプチドを得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、１０分間５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 ｍｍ；流速、２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、５〜９分から多重ピーク）。更に生成物の特性を、MALDI質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、3277、実測値：2627。
【０１３４】
４ ｃ）[Cys2-6] シクロ [CH2CO−Lys (PEG2000)−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2（ｖｉｉｉ）の合成
６０mgの化合物（ｖｉｉ）を、室温においてアニソール（２００μl）、ＤＭＳＯ（２ml）およびＴＦＡ（１００ml）の溶液を用いて３０分間処理し、次いで真空中においてＴＦＡを除去し、ジエチルエーテルの添加によりペプチドを沈澱させた。
【０１３５】
粗物質のＨＰＬＣ（Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250 x 21.20 ｍｍ カラム）による予備的な精製を行った（流速１０mL／分において４０分、５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）。凍結乾燥後、３０mgの純物質を得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、１０分間５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 ｍｍ；流速、２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、５分においてブロードピーク）。
【０１３６】
４ ｄ）[Cys2-6] シクロ [CH2CO−Lys (PEG2000)−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2とPn216キレートとの共役（ｉｘ）
【化２９】
0005043271.tif 000028
２０mgの化合物（ｖｉｉｉ）、１１mgのPn216キレート活性エステルおよび８μlのＮＭＭをＤＭＦ（１ml）に溶解した。混合物を２４時間撹拌した。
【０１３７】
反応混合物のＨＰＬＣ（Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250 x 21.20 ｍｍ カラム）による予備的な精製を行った（流速１０mL／分において４０分、５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）。凍結乾燥後、１０．７mgの純物質を得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、１０分間５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 ｍｍ；流速、２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、５〜８分からブロードピーク）。更に生成物の特性を、質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、3589、実測値：3270。
【０１３８】
例５：Pn44を用いたベクター
５ ａ）1, 1, 1,−トリ（フェニルスルホニルオキシメチル）エタンの調製
1, 1, 1,−tris トリヒドロキシメチル（１２０g、１．０mol）を、ジクロロメタン（１０００mL）およびピリジン（２３７g、１mol）に溶解し、氷／メタノール浴で−５℃において、温度が１０℃を上回らないような速度で、フェニルスルフォニルクロリド（５２８ｇ、３mol）を少しずつ滴下して処理した。次いで反応物を室温まで暖めて一晩おいた。次いで反応物を５Ｎ塩酸を用いて振り動かし、有機相を分離し、ジクロロメタンを用いて水相を再抽出し、有機抽出物を合わせた。ジクロロエタン溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空中でこれを濃縮し、ゴム質の1, 1, 1,−トリ（フェニルスルホニルオキシメチル）エタン（５４０ｇ、１mol）を得た。
【０１３９】
５ ｂ）1, 1, 1,−トリ（アジドメチル）エタンの調製
ジメチルホルムアミド（３００ml）中の1, 1, 1,−トリ（フェニルスルホニルオキシメチル）エタン（２５ｇ、７００mmol）を、５００ml RBフラスコ中でアジ化ナトリウム（４１ｇ、６３０mmol、９eq）を用いて処理し、混合物を撹拌しながら７時間１２０℃において加熱した。次いで反応物を室温まで冷却し、５０％飽和ブライン溶液（２５０ml）およびジエチルエーテル（２５０ml）を加えた。有機層を５０％飽和ブライン溶液（２５０ml）を用い洗浄して分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥しこれを濃縮し、粘性のある黄色液体の1, 1, 1,−トリ（アジドメチル）エタンを得た（５．５１ｇ、２８．２mmol、収率４０％）。
【０１４０】
NMR H1 (CDCl3), 1.0 (3H, s, CH3), 3.3 (6H, s, CH3)。
【０１４１】
５ ｃ）1, 1, 1,−トリ（アミノメチル）エタンの調製
エタノール（１４０ml）中の1, 1, 1,−トリ（アジドメチル）エタン（５．５１ｇ、２８．２mmol）を、遊離した窒素を除去するために水素の流動下、大気圧下において炭（２ｇ）に担持された１０％パラジウムを用いて処理し、１５時間これを水素化した。反応物をセライトパッドを用いて濾過して触媒を除去し、真空下においてこれを濃縮し、黄色液体の1, 1, 1,−トリ（アジドメチル）エタン（２．５３ｇ、２１．６mmol、収率７６％）を得た。
【０１４２】
NMR H1 (CDCl3), 0.8 (3H, s, CH3), 1.18 (6H, s, 3xNH2), 2.6 (6H, s, 3xNH2)。
【０１４３】
NMR C13 (CDCl3), 20.1 CH3, 31.7 C, 48.8 CH２。
【０１４４】
５ ｄ）Pn44の調製
乾燥メタノール（１０ml）中の1, 1, 1,−トリ（アミノメチル）エタン（１０ｇ、８５．３mmol）溶液を、０℃の窒素下において、乾燥メタノール（５０ml）中の３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタン（２３．１４ｇ、１７０６mmol、２eq）懸濁液に徐々に加えた。混合物を０℃において４０分間撹拌し、室温まで暖め、次いで６０℃で３時間加熱した。次いで反応混合物を室温まで冷却し、５日間撹拌した。最終的に混合物を３時間還流温度において加熱し、その後、真空下において溶媒を除去した。残渣を２Ｍ ＨＣｌ（１５０ml）に溶解し、エーテルで抽出した（３ｘ１００ml）。次いで水層を６Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ１０に塩基性化し、これをジクロロメタンを用いて抽出した（３ｘ１００ml）。合わされた有機層を室温に放置することにより、白色固体が沈澱した。この固体を濾過により取り除き、ＮＭＲにより３付加化合物（tri-adduct）であることがわかった。濾液を１／３までに濃縮し、冷却装置内に放置した。別の白色固体がこの溶液から沈澱した。これを濾過して分離し、１Ｈ−ＮＭＲによりPn44であることがわかった。濾液を再度濃縮し、更にPn44の一部を溶液から結晶化させた。（全収率：６．９８１ｇ、２６％）
NMR H1 (CDCl3), 0.9 (3H, s, CH3), 1.25 (6H, d, 4xCH3), 1.8 (6H, s, 2xCH3), 2.4 (2H, d, 2xCH), 2.54 (2H, d, 2xCH), 2.95 (2H, s, CH2), 4.95 (6H, s, OH)．
MS C15H33N5O2 M+H=316 実測値 316。
【０１４５】
５ ｅ）PN44−コハク酸中間体の合成
例２ｃに記載した通りである。
【０１４６】
５ ｆ）PN44のテトラフルオロチオフェノールエステル誘導体−コハク酸の合成
例２ｄに記載した通りである。
【０１４７】
５ ｇ）［Cys 2-6］シクロ[−CH2CONH−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2の合成
例１ａ−１ｃを参照することができる。
【０１４８】
５ ｈ）［Cys 2-6］シクロ[−CH2CONH−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2−Pn44の合成
【化３０】
0005043271.tif 000029
７mgのPn44キレート活性エステル、５μlのＮＭＭおよび１０mgの［Cys 2-6］シクロ[−CH2CONH−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys]−Gly−NH−(CH2CH2O)2CH2CH2NH2をＮＭＰ（１ml）に溶解した。混合物を３時間撹拌した。
【０１４９】
反応混合物のＨＰＬＣ（Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250 x 21.20 ｍｍ カラム）による予備的な精製を行った（流速１０mL／分において４０分、５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）。凍結乾燥後、９．８mgの純物質を得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、１０分間５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 ｍｍ；流速、２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、４．３８分）。更に生成物の特性を、質量分析法を用いて調べた。計算値：M+H、1540.7、実測値：1540.6。
【０１５０】
例６：ビス−[Cys 2-6], シクロ[−CH2CONH−Asp−Cys2−Arg−Gly−Asp−Cys6−Phe−Cys]−Ahx−Lys −(シクロ[−CH2CONH−Asp−Cys2−Arg−Gly−Asp−Cys6−Phe−Cys]−Ahx)−NH (CH2CH2O)2CH2CH2NH−Pn216の合成
【化３１】
0005043271.tif 000030
二量体ペプチドを、Ｏ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂を出発物質として０．１mmolスケールにつき、１mmolのアミノ酸カートリッジを用い、ＡＢＩ ４３３Ａ自動ペプチドシンセサイザーでアセンブルした。アミノ酸をカップリング前にＨＢＴＵを用いて、Fmoc−Lys (Fmoc)−OH, Fmoc−Ahx−OH (Ahx = アミノヘキサン酸), Fmoc−Cys (Trt) −OH, Fmoc−Phe−OH, Fmoc−Cys (tBu)−OH, Fmoc−Asp (O−tBu)−OH, Fmoc−Gly−OH, Fmoc−Arg (Pmc)−OH, Fmoc−Cys (tBu)−OH, Fmoc−Asp (O−tBu)−OH, クロロ酢酸無水物の順で、予め活性化した。次いで半保護ペプチドをＴＩＳ（５％）、フェノール（５％）およびＨ２Ｏ（５％）を含むＴＦＡ中で、固体支持体からとった。次いで、Vydac C18 カラムにおけるＨＰＬＣ精製後、粗クロロ−ペプチドを２０％アセトニトリル／水（ｐＨ８）で環化し、単環式ｔ−ブチル保護中間体（以下に示す）を生じた。
【０１５１】
【化３２】
0005043271.tif 000031
純中間体に、０．１mLのアニソールを含む１０％ＤＭＳＯ／ＴＦＡ溶液を加えた。ペプチド混合物を１時間撹拌し、過剰ＴＦＡ蒸発させた後に、ジエチルエーテルを添加して生成物（以下に示す）を沈澱させた。
【０１５２】
【化３３】
0005043271.tif 000032
次いでこの生成物（５mg）を、２％ＮＭＭを含有する１mLのＤＭＦに溶解し、例１から５ｍｇのPn216活性エステル５mgを加えた。共役反応はＨＰＬＣにより追随され、１６時間後完全になったことがわかった。次いでペプチド溶液を、水を用いてトータルで８mLになるまで希釈し、Phenomenex Luna 5u C18 (2) 250 x 10 mm カラムに充填した（流速、５ml／分において３０分、５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）。凍結乾燥後、所望の目的生成物２mgを得た（ＨＰＬＣ分析：勾配、１０分間、５〜５０％Ｂ、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；カラム、Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 4.6 ｍｍ；流速、２ml／分；検出、UV 214 nm；生成物保持時間、９．８分）。更に生成物の特性を、ＥＳ−ＭＳを用いて調べた。計算値：M+H、1805、実測値：1805。