(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の検体に含まれるヒトＰＴＣＨ１遺伝子からの転写産物のうち、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換及び／又は挿入した塩基配列であって、対応する配列番号１に記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする活性を有する塩基配列、からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を、そのＲＮＡ配列に含む該転写産物を検出することを特徴とする、がん組織の検出方法。
【請求項２】
前記ヒト由来の検体が、ヒトから採取された生体試料である請求項１記載のがん組織の検出方法。
【請求項３】
前記ヒト由来の検体が、ヒト生体組織である請求項１又は２記載のがん組織の検出方法。
【請求項４】
前記ヒト由来の検体が、大腸、白血球、脳、肺からなる群から選択される１種から採取した検体である請求項１〜３のいずれか１つに記載のがん組織の検出方法。
【請求項５】
前記転写産物を検出する方法が、マイクロアレイ法、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの測定方法である請求項１〜４のいずれか１つに記載のがん組織の検出方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つに記載のがん組織の検出方法に用いるための検出試薬であって、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子からの転写産物のうち、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換及び／又は挿入した塩基配列であって、対応する配列番号１に記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする活性を有する塩基配列、からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を、そのＲＮＡ配列に含む該転写産物を検出する１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするがん組織の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来の検体の癌状態を判定する方法及びその方法に用いる遺伝子産物検出試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム解析により、ヒトゲノム中の総遺伝子数が約２２０００ということが推定され、この遺伝子数の５０〜６０％の遺伝子で選択的スプライシング機構が働いていると予測されている。選択的スプライシング機構とは、遺伝子産物であるＲＮＡ前駆体からイントロン領域を切り出し、その上流と下流にある2つのエクソン同士を連結するスプライシング反応の際に、イントロン除去の方法が複数あることによって、1つの遺伝子から局在性や性質の異なる複数のタンパク質を生成する合理的かつ効率的な遺伝子発現調節機構である。ヒト体内で発現している１０万以上ともいわれるタンパク質情報が、２２０００の遺伝情報にどのようにコードされているのか、このギャップを埋めているのが選択的スプライシングであると考えられている。【０００３】
一方、細胞の癌化は、遺伝子の変異や遺伝子発現調節異常をその原因とすることが明らかとされているが、細胞内の遺伝子産物である転写産物あるいはその翻訳産物の中に、選択的スプライシングの調節異常によって、そのスプライシング変異体が異常出現することが、細胞の癌化への要因の１つとなると考えられている。【０００４】
例えば、ヒト細胞接着分子（ヒアルロン酸レセプター）であるＣＤ４４には、２０種類ものスプライス変異転写産物が同定されており、そのスプライス変異転写産物の発現比は、少なくともがん性胸水、非がん性胸水、膀胱がん患者尿、非がん患者尿では有意差が認められている。そして、がん細胞と正常細胞の判別方法として臨床検査にも応用されている。【０００５】
細胞の癌化は複数の遺伝子の発現異常等をその原因とする現象であり、その機構は未だ完全に解明されておらず、またその由来組織や細胞の癌化の悪性度によってもそれらにかかわる遺伝子群の変異及び発現異常のパターンは様々であることが知られている。【０００６】
したがって、種々の癌に適したがん診断や、創薬のターゲットとして用いるために、上記ＣＤ４４以外にも新規癌マーカーが必要とされ、特に、癌疾患の原因となっている癌細胞の状態を適切且つ正確に把握することによって、種々異なる癌細胞の状態と癌疾患との相関関係を求めることに有用な癌マーカーの提供が期待されている。【０００７】
癌マーカーに関して、例えば、下記特許文献１に、ヒト単球系培養細胞株ＴＨＰ−１で発現している新規ＡＴＰａｓｅ様ポリペプチドおよびそのＤＮＡが記載され、そのポリペプチドは細胞膜内にＰ型ＡＴＰａｓｅ領域を３個有する１０回膜貫通型のタンパク質で、１１９２個のアミノ酸配列からなる新規ＡＴＰａｓｅ様ポリペプチドおよび細胞膜内の６３個のアミノ酸が欠損した１１２９個のアミノ酸配列からなる欠損変異体（スプライシングバリアント）であり、癌細胞、特に胃癌細胞での発現上昇が認められることから新規癌マーカーとして有用であることが開示されている。【０００８】
また、スプライシング変異体の医薬および疾患の診断への利用に関しては、選択的スプライシングの結果生じるＭＡＰキナーゼｐ３８αの新たなスプライシング変異体を同定し、その変異体をコードする遺伝子をクローニングし、その遺伝子の構造と機能を解明することが下記特許文献２に開示されている。【０００９】
一方、ＰＴＣＨ１遺伝子はHedgehogシグナル伝達遺伝子の一つであり、多細胞生物の発生過程、成体機能の維持に重要な役割を果たしていることが知られている。ヒトにおいては、ＰＴＣＨ１遺伝子は基底細胞母斑症候群などの先天奇形を伴う遺伝病の原因遺伝子であることが知られ、また、いわゆる癌抑制遺伝子として基底細胞腫、髄芽細胞腫などに関わることも報告されている。（下記非特許文献１、２参照）
【特許文献１】特開２００３−１６４２８８号公報
【特許文献２】特開２００３−１３５０７３号公報
【非特許文献１】Kappler R. et al. Oncogene. 2004 Nov 18 ; 23 (54) : p8785-95
【非特許文献２】Chang-Claude J. et al. Int. J. Cancer 2003 Mar 1 ; 103 (6) : p779-83
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、癌疾患の治療若しくは予防的治療又はその維持療法的治療における癌の診断に有用ながん組織の検出方法及びその方法に用いるがん組織の検出試薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明者らは、Hedgehogシグナル伝達遺伝子群の１つであるＰＴＣＨ１の遺伝子産物であるスプライス変異転写産物を検索した結果、これまでに知られていなかった新規な４種のスプライス変異転写産物を発見し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明のがん組織の検出方法は、ヒト由来の検体に含まれるヒトＰＴＣＨ１遺伝子からの転写産物のうち、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換及び／又は挿入した塩基配列であって、対応する配列番号１に記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする活性を有する塩基配列、からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を、そのＲＮＡ配列に含む該転写産物を検出することを特徴とする。
【００１３】
本発明のがん組織の検出方法によれば、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子からの遺伝子産物のうち、選択的スプライシングの変調によってその発現が増減する転写産物の存在量を指標にして、がん組織を検出することができる。
【００１７】
本発明のがん組織の検出方法の好ましい態様においては、前記転写産物を検出する測定方法が、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換及び／又は挿入した塩基配列であって、対応する配列番号１に記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする活性を有する塩基配列、からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列について、該塩基配列の相補鎖に配列特異的に結合するプローブ又はその化学修飾体を用いて、前記転写産物を検出することを特徴とする測定方法であることが好ましい。
【００１８】
この場合、前記化学プローブ又はその化学修飾体として、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、それらの化学修飾体、又はそれらの塩基配列において核酸の相補鎖への配列特異的な結合性が損なわれない範囲で塩基の置換、挿入及び／又は欠失した塩基配列から選ばれた塩基配列を有するポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド又はそれらの化学修飾体を用いることができる。
【００１９】
上記態様によれば、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子からの転写産物のうち、選択的スプライシングの変調によってその発現が増減する転写産物の存在を簡便に且つ特異的に感度よく検出することができる。
【００２３】
本発明のがん組織の検出方法の好ましい態様においては、前記ヒト由来の検体と前記ヒト正常生体組織から採取された対照用検体が、同一人からの検体であることが好ましい。
【００２４】
また、本発明のがん組織の検出方法においては、前記ヒト由来の検体が、ヒトから採取された生体試料であることが好ましい。この場合、前記ヒト由来の検体はヒト生体組織であってもよい。
【００２５】
更に、本発明のがん組織の検出方法においては、前記ヒト由来の検体が、大腸、白血球、脳、肺からなる群から選択される１種から採取した検体であることが好ましい。
【００２６】
本発明のがん組織の検出方法においては、前記転写産物を検出する方法として、マイクロアレイ法、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの測定方法を用いることが好ましい。
【００２７】
一方、本発明のがん組織の検出試薬は、上記のがん組織の検出方法に用いるための検出試薬であって、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子からの転写産物のうち、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換及び／又は挿入した塩基配列であって、対応する配列番号１に記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする活性を有する塩基配列、からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を、そのＲＮＡ配列に含む該転写産物を検出する１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００３０】
本発明のがん組織の検出試薬によれば、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子からの遺伝子産物のうち、選択的スプライシングの変調によってその発現が増減する転写産物の存在を簡便に且つ特異的に感度よく検出することができる。
【００３４】
また、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドを用いるので、従来からの微量ＲＮＡ定量技術を利用することで、多数の検体を迅速に処理することができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子からの遺伝子産物のうち、選択的スプライシングの変調によってその発現が増減する転写産物を癌マーカーとすることで、簡便で且つ特異性の高いがん組織の検出方法及びその方法に用いるがん組織の検出試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明においてマーカー遺伝子として用いられるヒトＰＴＣＨ１遺伝子の遺伝子構造を示す模式図である。
【図２】ヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物の部分配列を増幅するためのＰＣＲプライマー設計部位を示す模式図である。
【図３】種々の癌由来培養細胞株から抽出されたＲＮＡを用いてヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物の部分配列をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した結果を示すアガロース電気泳動の写真である。
【図４】ヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物として同定されたＰＴＣＨ１スプライス変異転写産物１〜４の構造を示す模式図である。
【図５】ＰＣＲプライマー４（配列番号８）を用いてＰＴＣＨ１スプライス変異転写産物１を検出した結果を示すアガロース電気泳動の写真である。
【図６】種々の正常組織から抽出されたＲＮＡについてＰＣＲプライマー４（配列番号８）を用いてＰＴＣＨ１スプライス変異転写産物１を検出した結果を示すアガロース電気泳動の写真である。
【図７】大腸がん患者の大腸組織から抽出されたＲＮＡについてＰＣＲプライマー４（配列番号８）を用いてＰＴＣＨ１スプライス変異転写産物１を検出した結果を示すアガロース電気泳動の写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本明細書において「癌状態」とは、一般に当該分野において理解される意味であって、具体的には、例えば、検体が細胞である場合には細胞のがん悪性度を意味し、また、例えば、検体が転移性のがん細胞であれば、その転移性を意味し、例えば、検体が細胞の集合である場合にはその細胞集合における癌細胞の存在比等を意味している。
【００３８】
本明細書において、「ヒト由来の検体」とは、特に制限はないが、血液、血清、血漿、髄液、尿、精子などの液性生体試料、心臓、脳、すい臓、肺、肝臓、骨、腎臓、膀胱、脾臓、甲状腺、睾丸、子宮、小腸、大腸などの臓器組織片試料又はこれらから調製された試料、例えば遺伝子産物、転写産物、又はその翻訳産物を測定しやすいように各種の方法で前処理した試料等が使用される。このような前処理としては、例えばＲＮＡ抽出、タンパク精製などの処理等が挙げられ、公知の方法に準じて行うことができる。
【００３９】
本明細書において、「ヒト正常生体組織から採取された対照用検体」とは、癌状態を判定するための基準とすることができる検体であれば特に制限はないが、例えば、ヒト生体組織から採取された組織片であって、その組織片から採取した細胞が公知の判定方法に準じた細胞検査によって正常細胞と判定されるものを対照用検体として用いることができる。
【００４０】
本明細書において、「転写産物」とは、一般に当該分野において理解される意味であって、具体的には、例えば、細胞内でゲノム上の遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼによって合成されるＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ、及びその修飾体等である。
【００４３】
本明細書において、「選択的スプライシングの変調」とは、一般に当該分野において理解される意味であって、具体的には、例えば、細胞の選択的スプライシング機構に異常をきたし、転写産物中における選択的スプライシング転写産物の発現比に正常細胞との差異があるような状態を引き起こすことである。
【００４４】
本明細書における「転写産物について、ヒト由来の検体中における存在量を測定する工程」においては、転写産物の存在量をその対照と対比できる程度に測定できれば特に制限はなく、定量を目的とする測定である必要はない。測定法として、マイクロアレイ法、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法等の公知の核酸解析方法（「新遺伝子工学ハンドブック」；羊土社、２００３年１０月発刊、「ここまでできるＰＣＲ最新活用マニュアル」；羊土社、２００３年１０月発刊参照）を利用することができ、定量的測定法であればより好ましい。
【００４６】
また、本明細書において、「検体の癌状態を判定する」ためには、測定された遺伝子産物、転写産物、翻訳産物の該検体中における存在量を、同一産物の存在量の差異として評価することができ、また、異種産物の存在量との関係における相対的ないし統計的評価とすることもできる。
【００４７】
具体的には、例えば、検体及びその対照用検体からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ等の公知の方法を用いて本発明の遺伝子マーカーであるヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物についてｃＤＮＡを増幅合成し、アガロースゲル電気泳動に展開後、エチジムブロマイド等の色素あるいはSYBR Green I等の蛍光色素によりゲル染色して得られる染色像を、目視観察による比較あるいは画像情報処理によって数値化された値を比較することによって存在量の差異を評価することができる。また、公知のリアルタイムＰＣＲ法によって前記ｃＤＮＡを半定量的に増幅合成することで、アガロースゲル電気泳動、染色像の解析を介さずに比較することもできる。【００４８】
また、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法によって同時に多数の産物についてその存在量が測定され、異種産物の存在量が各産物の存在量との関係においてパターン化され、評価される場合には、本発明の遺伝子マーカーであるヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物をその評価に供せられるものとせしめ、その相対的ないし統計的評価を求めることができる。【００５０】
上記存在量を評価する際には、予め基準となる値を設定しておき、その基準値に対する検体中の存在量を評価してもよく、また、対照となる検体を逐一設定し、検体中の存在量を対照用検体中の存在量と比較・評価することもできる。この場合、「予め基準となる値」は、例えば、健常人からの生体試料、正常組織、又は正常細胞についての、複数検体中の存在量の統計値などを用いることができる。
【００５１】
上記存在量を評価する際には、種々の癌に逐一最適化された上記基準又は対照をそれぞれに設定することができる。
【００５２】
上述のとおり、ヒト由来の検体又はその対照用検体の由来に特に制限はないが、特に大腸、白血球、脳又は肺から採取した検体においては、ヒトＰＴＣＨ１転写産物の下記スプライス変異転写産物１の存在量の増加と細胞の癌化との間に良好な相関が認められるため、それらを好ましく用いることができる。
【００５３】
ヒトＰＴＣＨ１遺伝子に関する塩基配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース等の遺伝子情報データベース機関等を利用して得ることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースの登録番号Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ１６１７２９には１８９６４３塩基長のヒトゲノムＤＮＡ断片が記載されており、そのうち塩基番号５２３０３〜１１６７４５に示されるＰＴＣＨ１遺伝子が、６４４４３塩基長のＤＮＡから構成されることが記載されている。
【００５４】
また、上記のようにゲノム上にコードされているＰＴＣＨ１遺伝子の塩基配列情報に基づいて転写されスプライシングを受けて生体細胞中に存在する成熟ｍＲＮＡをＧｅｎＢａｎｋデータベースの登録番号Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ０００２６４には、その生体細胞中に存在する成熟ｍＲＮＡを鋳型として実験的に求められた全長６８２５塩基長のｃＤＮＡの塩基配列が記載され、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子が１４４７アミノ酸長のポリペプチドをコードする構造遺伝子であることが記載されている。【００５５】
したがって、これら情報から、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子から転写される転写産物の構造として、図１に模式的示されるような、２４のエクソンからなるエクソン−イントロン構造の存在を知ることができる。なお、前記登録番号Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ０００２６４に記載されるｃＤＮＡは exon 1B タイプのエクソン１によって構成されているが、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子から転写される転写産物のとして、exon 1 及びexon 1Ａ タイプのエクソン１によって構成され、それぞれその開始コドン位置を異にするアイソフォームも報告されている（登録番号Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ４３１４８、Ｎｏ．ＡＢ１８９４４０参照）。【００５６】
利用されるヒトＰＴＣＨ１遺伝子には、上記の公知の塩基配列を有する遺伝子のほか、その塩基配列に、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換及び／又は付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
【００５８】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする活性を有する塩基配列」とは、一般に当該分野において理解される意味であって、ＤＮＡプローブを用いて、サザンブロットハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法等のハイブリダイゼーション法を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、フィルターに固定化したＤＮＡを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（１×ＳＳＣ；１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーション法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）．）などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５９】
具体的には、配列番号１〜４に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換及び／又は挿入した塩基配列であって、少なくとも６５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは、８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、更に好ましくは、９０％以上の相同性を有する塩基配列を挙げることができる。【００６０】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡクロ−ニング、ＤＮＡシークエンス等の分子生物学的手法、又は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等の免疫化学的手法は、通常当業者によって用いられる方法に準じてなすことができる。
【００６１】
ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチドは公知の方法に準じて化学合成することができる（「新遺伝子工学ハンドブック」；羊土社、２００３年１０月発刊参照）。
【００６２】
プローブの化学修飾体のための化学修飾に特に制限はなく、通常当業者によって微量物質検出のために用いられる蛍光物質、放射性同位体、酵素等によって行うことができる。
【実施例】
【００６３】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。【００６４】
下記実施例１、２においては、種々の癌由来培養細胞株を用いて、Hedgehogシグナル伝達遺伝子群の１つであるヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物の探索を行った。すなわち、細胞内に発現しているヒトＰＴＣＨ１遺伝子由来の転写産物について、その主要な転写産物以外に発現しているスプライス変異転写産物の発現スクリーニングを行った。ここで、発現スクリーニングに用いられた癌由来培養細胞株は、白血病血球細胞由来のHL60RG、NB4、Raji、Daudi、U937、K562、脳腫瘍細胞由来のON776、TE671、D283、Daoy、Uw228、PFSK、胃がん細胞由来のMKN1、MKN7、MKN28、MKN45、MKN74、NEDATE、KATOIII、HSC64、大腸がん細胞由来のSW1116、C-1、肺がん細胞由来のLu65、皮膚がん細胞由来のA431、膵臓がん細胞由来のPSN1、YPK1、YPK2、S2-013、Aspc1、MIApaca2、Bxpc3、H48N、KP2、KP3、KP4、KP1NL、KP1N、QGP1、PANC1である。【００６５】
＜実施例１＞  
（ＲＮＡ抽出、ＤＮａｓe処理）
培養細胞からの全ＲＮＡの抽出は、上述のとおり、分子生物学的手法として通常用いられる方法に準じて行うことができるが、本実施例１においては、ＲＮＡ抽出用試薬（商品名「ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ」；株式会社ニッポンジーン製）を用いて、種々の癌由来培養細胞株の培養細胞浮遊液０．２５ｍｌから細胞内全ＲＮＡを抽出した。【００６６】
具体的には、予め１×ＰＢＳ緩衝液に懸濁した細胞数０．５〜５．０×１０５を含む培養細胞浮遊液０．２５ｍｌにＲＮＡ抽出用試薬（商品名「ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ」；株式会社ニッポンジーン製）を０．７５ｍｌ添加し５分間室温に放置した後、０．２ｍｌのクロロホルムを添加し、約１５秒間激しくボルテックスした。その溶液を２〜３分室温に放置した後、１２，０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心操作により、下層の有機相、中間相及び上層の水相に液相分離した溶液のうちＲＮＡの含まれる水相を注意深く採取した。その水相溶液に等量のイソプロパノ−ルを添加、混合し、１２，０００×ｇ、４℃、１５分間の遠心操作により、ＲＮＡを沈殿させ、７５％エタノール１ｍｌでそのＲＮＡ沈殿物を洗浄した。上清を除き、風乾した後、ＴＥ緩衝液（10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH8.0）を５０μｌで溶解し、得られたＲＮＡを分光光度計（商品名「Gene Quant pro “S”」；アマシャム バイオサイエンス株式会社製）で２６０ｎｍの吸光度（ＯＤ２６０）を測定し、１ＯＤ２６０をＲＮＡ４０μｇと換算してその濃度を定量した。【００６７】
この方法によって、各々の培養細胞株又は実験条件によっても異なるが、上記細胞数０．５〜５．０×１０５を含む培養細胞浮遊液０．２５ｍｌからの収量として５．０μｇ〜３０μｇのＲＮＡを得ることができた。【００６８】
このようにして得られたＲＮＡ溶液は、ＤＮＡやタンパク等の細胞由来の夾雑物は相当程度に除かれている溶液となっているが、微量に残存するＤＮＡの影響を排除するために、ＤＮａｓe処理用キット（商品名「RQ1 RNase-Free DNase kit」；プロメガ株式会社製）を用いてＤＮａｓe処理をおこなった。具体的には、定量したＲＮＡ溶液からＲＮＡ３μｇ相当量をNuclease-freeチューブに分注し、キットに添付の試薬溶液である１０×反応液及びＤＮａｓe溶液（１ユニット／μｌ）をそれぞれ３μｌずつ加え、ＲＮＡ溶液と合わせて総液量３０μｌになるようNuclease-free Ｈ２Ｏを加えて反応混合液とした。この反応混合液中で３７℃で３０分間インキュベートしてＤＮａｓe酵素反応を行い、その後キットに添付の反応停止溶液を３μｌ加えて反応を停止した後、６５℃で１０分間インキュベートしてＤＮａｓeを不活性化した。【００６９】
＜実施例２＞  
（ＲＴ−ＰＣＲ、アガロース電気泳動）
培養細胞等から抽出された全ＲＮＡから特定の配列を有するＤＮＡ断片を特異的に増幅合成する方法は、上述のとおり、公知のＲＴ−ＰＣＲ法に準じて行うことができるが、本実施例２においては、ｃＤＮＡ合成用としてＲＴ−ＰＣＲ用キット（商品名「ReverTra Ace-α-kit」；東洋紡績株式会社製）、ｃＤＮＡ合成後のＰＣＲ反応試薬としてＰＣＲ用熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ（商品名「Ampli Taq Gold」；米国Applied Biosystems社製）及びその反応用試薬（商品名「10×PCR Gold buffer」；米国Applied Biosystems社製）を用いて行った。【００７０】
ＰＣＲプライマーとしては、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子上のエクソン１Ｂ及びエクソン８に存在する塩基配列を基にして、図２（ａ）に示すようなプライマー設計部位においてＰＣＲプライマー１（配列番号５）とＰＣＲプライマー２（配列番号６）とを設計した。そして、このプライマーセットを用いた逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、培養細胞から抽出された全ＲＮＡに含まれるヒトＰＴＣＨ１遺伝子由来の転写産物について、その９５２塩基長部分の塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅合成することとした。【００７１】
具体的には、上記ＤＮａｓe処理されたＲＮＡ溶液のＲＮＡ１μｇ相当量（１μｇ／μｌに濃度調整したもの）とＲＴ−ＰＣＲ用キットに添付の試薬溶液を下記に示す液量で混合し、総液量３０μｌになるようNuclease-free Ｈ２Ｏを加えて逆転写反応混合液とし、(30℃、10分)→(42℃、20分)→(99℃、5分)→(4℃、5分)の条件で逆転写酵素反応による１ｓｔ鎖ｃＤＮＡ合成を行った。なおここで、上記ランダムプライマーは 5’-(dN)9-3’、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅは、ｃＤＮＡ合成能を有する逆転写酵素であり、ランダムプラーマーからの逆転写産物としてＲＮＡに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ（１ｓｔ鎖ｃＤＮＡ）が、その混合物として合成される。
(逆転写反応試薬溶液)
5×RT Buffer 4 μl
dNTP Mixture(10 mM) 2 μl
RNase Inhibitor(10 U/μl) 1 μl
Random Primer(25 pmol/μl) 1 μl
ReverTra Ace   1 μl
次に、上記の逆転写酵素反応において得られた反応溶液の１μｌとＰＣＲ反応試薬溶液を下記に示す液量で混合し、総液量２６μｌになるようNuclease-free Ｈ２Ｏを加えてＰＣＲ反応混合液とし、(94℃、10分)→変性(94℃、1分)→アニーリング(60℃、1分)→伸長(72℃、1分30秒)→(72℃、7分)→(4℃) の条件でＰＣＲ反応を行った。なお、その変性、アニーリング、伸長反応のＰＣＲサイクルは４０サイクルとした。
(ＰＣＲ反応試薬溶液)
10×PCR Gold buffer 2.5 μl
MgCl2(25 mM) 1.5 μl
2mM dNTP mixture 2.5 μl
ＰＣＲプライマー１（10 pmol/μl）0.625 μl
ＰＣＲプライマー２（10 pmol/μl）0.625 μl
Ampli Taq Gold (5U/μl) 0.15 μl
ＤＮＡ配列：
ＰＣＲプライマー１（配列番号５）
ＰＣＲプライマー２（配列番号６）
ＰＣＲ反応後の溶液の一部を、１．５％アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液：４０ｍＭＴｒｉｓ、１９ｍＭ 酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ）中に電気泳動し、得られたゲルを染色０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド水溶液で染色した。図３にＵＶ照射時の写真像を示す。図３では、Ｍのレーンは核酸分子量マーカーであり、また、その他のレーンは、発現スクリーニングに用いられた各種癌由来培養細胞株の培養細胞のそれぞれから抽出された全ＲＮＡから、ＰＣＲプライマー１（配列番号５）、ＰＣＲプライマー２（配列番号６）のＰＣＲプライマーセットによって増幅合成されたＤＮＡ断片を電気泳動した結果である。【００７２】
図３矢印１によって指し示されるように、培養細胞株Ｋ５６２の細胞抽出ＲＮＡからは、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子由来の転写産物についてのＲＴ−ＰＣＲによって、その完全長の転写産物から予想される９５２塩基長部分のＤＮＡ断片とともに、核酸分子量マーカーの移動度（レーンM）を指標にして７６０塩基長付近の位置にＤＮＡ断片が検出された。この７６０塩基長付近のＤＮＡ断片は、培養細胞株TE671、MKN28、S2-013、Aspc1、H48N、KP3、KP1NLのＲＮＡからも検出された。【００７３】
また、図３矢印２によって指し示されるように、培養細胞株Ｄ２８３の細胞抽出ＲＮＡからは、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子由来の転写産物についてのＲＴ−ＰＣＲによって、その完全長の転写産物から予想される９５２塩基長部分のＤＮＡ断片とともに、核酸分子量マーカーの移動度（レーンM）を指標にして５５０塩基長付近の位置にＤＮＡ断片が検出された。この５５０塩基長付近のＤＮＡ断片は、培養細胞株TE671、MKN1のＲＮＡからも検出された。【００７４】
更に、図３矢印３〜５によって指し示されるように、培養細胞株Ｕ９３７、ＨＬ６０ＲＧ、ＴＨ６７１の細胞抽出ＲＮＡからは、それぞれ３８０、２５０、１５０塩基長付近の位置にＤＮＡ断片が検出された。また、培養細胞株KP4の細胞抽出ＲＮＡからは、３８０、１５０塩基長付近の位置にＤＮＡ断片が検出され、培養細胞株TE671の細胞抽出ＲＮＡからは、上記ＤＮＡ断片の他に更に２５０塩基長付近の位置にもＤＮＡ断片が検出された。【００７５】
これらのＤＮＡ断片は、培養細胞等から抽出された全ＲＮＡに含まれるヒトＰＴＣＨ１遺伝子由来の転写産物から、ＰＣＲプライマー１（配列番号５）とＰＣＲプライマー２（配列番号６）のプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲによって配列特異的に増幅合成されたものであることから、上記７６０、５５０、３８０、２５０、１５０塩基長付近の位置に検出されたＤＮＡ断片に対応するヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物の存在を示唆するものであった。【００７６】
＜実施例３＞  
（スプライス変異転写産物の同定）
上記７６０、５５０、３８０、２５０塩基長付近の位置に検出された４種のＤＮＡ断片について、それらがヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物からの増幅合成物であるか否かを確認し、その塩基配列を決定するために、図３矢印１〜４で示すバンドを切り出して、クローニングし、ＤＮＡシークエンスでその塩基配列を確認した。具体的には下記の方法でおこなった。【００７７】
すなわち、まず、１．５％アガロースゲル中に電気泳動によって展開された４種のサイズのＤＮＡバンドについて、それを切り出して、ゲルバンド抽出用キット（商品名「MinElute Gel Extraction kit」；株式会社キアゲン製）を用いて、そのゲルからＤＮＡを抽出した。【００７８】
具体的には、切り出したゲルスライス（０．１〜０．３ｍｇ）を１．５ｍｌチューブに入れ、ゲルスライスに対して約３倍量(例：100 mgに対しては300 μl)のキットに添付のBuffer QGを添加した。５０℃で１０分間インキュベートし、ゲルを溶解後、ゲルと同量のイソプロパノールを添加し、チューブを反転して溶液を混合した。２ｍｌコレクションチューブにキットに添付のMinEluteカラムをのせ、サンプルをアプライして１０，０００×ｇ、１分間の遠心操作によりフロースルー液を捨て、ＤＮＡをカラムに吸着させた。洗浄のため７５０μｌのキットに添付のBuffer PEをカラムに添加し、５分間放置後、１０，０００×ｇ、１分間の遠心操作によりフロースルー液を捨て、カラムをさらに１０，０００×ｇ、１分間の遠心操作によりBuffer PE由来のエタノールを完全に取り除いた。新しい１．５ｍｌチューブにカラムをのせ、キットに添付のBuffer EB１０μｌをカラムメンブレンの中央に添加し、１分間放置後、１０，０００×ｇ、１分間の遠心操作によりＤＮＡを溶出した。その平均的な溶出量は約９μlであった。【００７９】
アガロースゲルから抽出されたＤＮＡのＤＮＡベクターへのクローニングは、上述のとおり、分子生物学的手法として通常用いられる方法に準じて行うことができるが、本実施例３においては、ＤＮＡクローニング用キット（商品名「TOPO cloning Reaction」；インビトロジェン株式会社製）を用いた。【００８０】
具体的には、ゲルから切り出して抽出した上記ＤＮＡ溶出液の２μｌに、キットに添付の試薬溶液、Salt Solution 1 μl、TOPO vector 1μl、滅菌水２μｌを混合し、５分間室温に放置した。混合液を氷上に移し、その２μｌを大腸菌コンピテントセル（商品名「One Shot Chemically Competent E.coli」；インビトロジェン株式会社製）５０μｌに加え、穏やかに懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、４２℃で３０秒間インキュベートした。ただちに氷上に移し、S.O.C.mediumを２５０μl添加後、２００ｒｐｍ、３７℃で６０分間振とうした。その菌液を、予め５０ｍｇ／ｍｌＸ−ｇａｌ(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) ３２μl、０．１ＭＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）５０μlを表面に塗布し、浸透させておいたＬＢアガープレート(１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有)に塗布した。その後、３７℃で１２時間培養し、白いコロニーをピックアップしてLB medium ２ｍｌでさらに１６時間培養した。【００８１】
このように単離された大腸菌から、常法に従い、アルカリ-SDS法で大腸菌プラスミドベクターを抽出し、上記TOPO vectorの外来遺伝子挿入部位にインサートＤＮＡが挿入されているか否かを確認した。すなわち、外来遺伝子挿入部位近傍の配列に基づくＰＣＲ用プライマーセットM13-20 Forward（配列番号１０）及びM13-20 Reverse（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲ用プライマーセット以外は実施例２と同様の条件でＰＣＲ反応を行い、そのＰＣＲ産物を電気泳動で１．５％アガロースゲルに展開して予想される塩基長のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。【００８２】
ＤＮＡベクターにクローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、上述のとおり、分子生物学的手法として通常用いられる方法に準じて行うことができるが、本実施例３においては、ＰＣＲ産物シークエンス用キット（商品名「PCR Product Pre-Seqencing kit」；米国ＵＳＢ社製）を用いてＰＣＲ産物からＤＮＡシークエンス用ＤＮＡサンプルを調製し、サーマルサイクルシークエンスキット（商品名「BigDye Terminator Cycle Sequencing kit」；米国Applied Biosystems社製）を用いてシークエンス反応を行った。【００８３】
具体的には、大腸菌プラスミドベクターであるTOPO vectorにクローニングされたＤＮＡ断片について、ＰＣＲ用プライマーセットM13-20 Forward（配列番号１０）及びM13-20 Reverse（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲ用プライマーセット以外は実施例２と同様の条件でＰＣＲ反応を行い、そのＰＣＲ産物の５μｌに上記ＰＣＲ産物シークエンス用キットに添付の試薬溶液、Exonuclease I（１０Ｕ／μｌ）1μl、Shrimp Alkaline Phosphatase（２Ｕ／μｌ）1μlを混合し、前シークエンス反応液とした。その前シークエンス反応液（７μｌ）を(37℃、15分)→(80℃、15分)でインキュベートし、Primerを酵素分解除去した。プライマー除去したサンプル３μｌに、シークエンス用プライマー（1 pmol/μl）３μｌ、滅菌水６μｌ及び上記サーマルサイクルシークエンスキットに添付の試薬溶液Terminator プレミックス８μｌをＰＣＲチューブに分注し、シークエンス反応液とした。そのシークエンス反応液（２０μｌ）を変性(96℃、10秒)→アニーリング(50℃、5秒)→伸長(60℃、4分)→(4℃)でインキュベートした。なお、シークエンス用プライマーには上記ＰＣＲプライマー１（配列番号５）又はＰＣＲプライマー２（配列番号６）を用いて、それぞれ５’側又は３’側からのシークエンス反応に供した。その変性、アニーリング、伸長反応のサーマルサイクルは２５サイクルとし、反応後の溶液に、３Ｍ酢酸ナトリウム(pH 4.6) 3 μl、９５％エタノール 62.5 μl、滅菌水 14.5 μlを混合し、室温に１５分間放置後、１４，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心操作によりＤＮＡを沈殿させ、７５％エタノール０．２５ｍｌでそのＤＮＡ沈殿物を洗浄した。上清を除き、風乾した後、上記サーマルサイクルシークエンスキットに添付の試薬溶液ＨｉＤｉを２５μｌ加えて９５℃、2分間インキュベートした。インキュベート後、約３０分間氷水で冷却し、ＤＮＡシークエンス装置（商品名「310 Genetic Analyzer」；米国Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を決定した。【００８４】
その結果、７６０、５５０、３８０、２５０塩基長付近の位置に検出された上記４種のＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号１３〜１６に示す塩基配列を有するそれぞれ７５９、５５７、３９４、２３９塩基長のＤＮＡ断片であることが明らかとなった。図４にはそれらの構造を模式的に示した。なお、選択的スプライシングを受けないStandard配列を有する転写産物からのｃＤＮＡの対応部分（９５２塩基長）は配列番号１２に示す塩基配列を有する。【００８５】
図４に示すように、これらのＤＮＡ断片は、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物からエクソンが一部抜け落ちた構造を有しており、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物のエクソン２部分（１９３ｂｐ）が欠失したスプライス変異転写産物１、エクソン４の途中からエクソン７の途中までが欠失したスプライス変異転写産物２、エクソン２の途中からエクソン６の途中までが欠失したスプライス変異転写産物３、エクソン２の途中からエクソン７の途中までが欠失したスプライス変異転写産物４の存在がそれぞれ確認された。【００８６】
＜実施例４＞  
上記実施例３において新規に同定されたヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物１〜４のうちスプライス変異転写産物１について、それを特異的且つ高感度に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。すなわち、図２（ｃ）に示すように、スプライス変異転写産物１の選択的スプライシング連結部分の塩基配列に基づいて、エクソン１Ｂとエクソン３が連結した構造に配列特異的に結合性を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ＰＣＲプライマー４（配列番号８）を設計した。【００８７】
上記オリゴヌクレオチドプライマー、ＰＣＲプライマー４（配列番号８）の有用性を確認するために、ＰＣＲプライマー５（配列番号９）とのプライマーセットとして、このＰＣＲ用プライマーセット以外は実施例２と同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行い、上記発現スクリーニングに用いられた癌由来培養細胞株及び膵臓がん細胞由来のKP1Nについて、そのスプライス変異転写産物１の発現を調べた。なお、配列番号１７のＰＣＲプライマーと配列番号１８のＰＣＲプライマーとのプライマーセットを用いてβ−アクチンの転写産物の部分配列を同様にＲＴ−ＰＣＲ増幅合成し、検出条件のコントロールとした。【００８８】
その結果、図５に示すように、全ての癌由来培養細胞株についてスプライス変異転写産物１が検出され、ヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物１を特異的且つ高感度に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーとして、ＰＣＲプライマー４（配列番号８）が有用であることが明らかとなった。なお、図２（ｂ）に示すＰＣＲプライマー１（配列番号５）とＰＣＲプライマー３（配列番号７）とのプライマーセットを用いて、選択的スプライシングを受けないStandard配列を有する転写産物についても、全ての癌由来培養細胞株にその発現を確認した。【００８９】
＜実施例５＞  
上記実施例３において新規に同定されたヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物１〜４のうちスプライス変異転写産物１について、がん細胞と正常細胞とを判別するため癌マーカーとしての有用性を検討した。【００９０】
まず、種々の正常組織での発現比較を行った。そのために市販のパネル正常組織ｃＤＮＡ（BD Biosciences 社製）を用い、ヒト正常組織Heart、Brain、Placenta、Lung、Liver、Skeletal、Kidney、Pancreas、Spleen、Thymus、Prostate、Testis、Ovary、Small intestine、Colon、Leukocyteについて、実施例４と同様のプライマーセットを用いて、スプライス変異転写産物１を検出した。【００９１】
その結果、図６（ａ）のゲル染色写真及び図６（ｂ）のバンド染色度合の相対比較に示されるように、ヒト正常組織Heart、Brain、Placenta、Lung、Skeletal、Thymus、Prostate、Ovary、Small intestine、Colon、Leukocyteにおいては、スプライス変異転写産物１が検出されないか又はその発現が非常に弱いものであり、それらの組織においては、スプライス変異遺伝子産物１の存在量を指標としてがん組織を検出できる可能性が示唆された。
【００９２】
特に、図６のBrain、Placenta、Lung、Prostate、Ovary、Small intestine、Colonでは、選択的スプライシングを受けないStandard配列を有する転写産物の発現量と、スプライス変異遺伝子産物１の発現量に差異が認められ、更にその中でも、Prostate、Ovary、Small intestine、Colonにおいてはその差が顕著であり、それらの組織におけるがん組織の検出においては、スプライス変異遺伝子産物１の存在量を指標とするだけでなく、その存在量と選択的スプライシングを受けないStandard配列を有する転写産物の発現量との差異を指標とすることもできることが示唆された。
【００９３】
一方、図５に示されるがん細胞についての結果と図６に示される正常細胞についての結果の比較から明らかなように、少なくとも大腸、白血球、脳、肺、においては、スプライス変異遺伝子産物１の存在量が正常細胞とがん細胞との間で顕著な差異が認められることから、それらの組織に由来する癌の癌マーカーとしての有用性が明らかとなった。【００９４】
次に、大腸がん患者からの大腸組織片の正常組織（Ｎ）２５検体、及びがん組織（Ｔ）２５検体からグアニジン・酸性フェノール法で抽出したＲＮＡについて、実施例４と同様にして、スプライス変異転写産物１の発現を検討した。そのゲル染色写真の結果の一部をを図７に、又、全検体についてのバンド染色度合の相対比較を下記表１に示す。なお、同一患者からの大腸組織片からの結果を同一の数字記号で表記した。【００９５】
【表１】
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図７に示すように、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１５の患者からの正常組織（Ｎ）とがん組織（Ｔ）のスプライス変異転写産物１の発現に顕著な差異がみられ、また、図に写真としては示さないが、２３、８６、１０２、１２８、１９０の患者においても同様の結果が得られ、がん組織を検出することができた。
【００９６】
また、上記表１に示すように、正常組織（Ｎ）においては２５検体中５検体（２０％）でスプライス変異転写産物１の発現を認めたのに対し、がん組織（Ｔ）では２５検体中１８検体（７２％）と高頻度に発現しており、癌状態を判定するために有用であることが示唆された。【００９７】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：ヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物１の選択的スプライシング連結部分の塩基配列。【００９８】
配列番号２：ヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物２の選択的スプライシング連結部分の塩基配列。【００９９】
配列番号３：ヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物３の選択的スプライシング連結部分の塩基配列。【０１００】
配列番号４：ヒトＰＴＣＨ１遺伝子のスプライス変異転写産物４の選択的スプライシング連結部分の塩基配列。【０１０１】
配列番号５：ヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物の部分配列を増幅するためのＰＣＲプライマー１。【０１０２】
配列番号６：ヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物の部分配列を増幅するためのＰＣＲプライマー２。【０１０３】
配列番号７：ヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物の部分配列を増幅するためのＰＣＲプライマー３。【０１０４】
配列番号８：ヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物の部分配列を増幅するためのＰＣＲプライマー４。【０１０５】
配列番号９：ヒトＰＴＣＨ１遺伝子の転写産物の部分配列を増幅するためのＰＣＲプライマー５。【０１０６】
配列番号１０：プラスミドTOPO vector上にクローニングされたＤＡＮ断片を増幅するためのＰＣＲ用ＤＮＡforwardプライマー。【０１０７】
配列番号１１：プラスミドTOPO vector上にクローニングされたＤＡＮ断片を増幅するためのＰＣＲ用ＤＮＡreverseプライマー。【０１０８】
配列番号１２：ＰＴＣＨ１転写産物のｃＤＮＡ部分配列。【０１０９】
配列番号１３：ＰＴＣＨ１スプライス変異転写産物１のｃＤＮＡ部分配列。【０１１０】
配列番号１４：ＰＴＣＨ１スプライス変異転写産物２のｃＤＮＡ部分配列。【０１１１】
配列番号１５：ＰＴＣＨ１スプライス変異転写産物３のｃＤＮＡ部分配列。【０１１２】
配列番号１６：ＰＴＣＨ１スプライス変異転写産物４のｃＤＮＡ部分配列。【０１１３】
配列番号１７：ヒトβ−アクチン遺伝子の転写産物の部分配列を増幅するためのＰＣＲ用ＤＮＡforwardプライマー。【０１１４】
配列番号１８：ヒトβ−アクチン遺伝子の転写産物の部分配列を増幅するためのＰＣＲ用ＤＮＡreverseプライマー。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によれば、がん細胞と正常細胞とを判別するための簡便で特異性の高いがん組織の検出方法及びその方法に用いるがん組織の検出試薬を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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