(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは非ヒト動物患者における細菌または寄生虫因子の予防的または治療的抑制用の医薬組成物であって、多数のアミノ末端基を持ちそれらアミノ末端基の少なくとも一つがそれに結合または連結された陰イオンまたは陽イオン含有部分
［陰イオンまたは陽イオン含有部分は、
【化１】
0004979848.tif 000013
から選択され、式中Ｒは4-([1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン]メチル)であり、また陰イオンまたは陽イオン含有部分は、アミドまたはチオ尿素連結並びに適宜含まれるスペーサー基{アルキル鎖、アルコキシ鎖、ポリアルコキシ鎖、アルキルチオ鎖、ポリアルキルチオ鎖、アルケニル鎖、多価アルケニル（multiple alkenyl）鎖、アルキニル鎖、多価アルキニル（multiple alkynyl）鎖または-(CH2)ｍ-Z-(CH2)ｍ-の基であって、Zは-CH2-、-CH＝CH-、-C≡C-、-O-または-S-から選択され、ｍは1〜15の整数である}を介してアミノ末端基と結合または連結している］
を有するポリアミドアミンまたはポリリジンデンドリマーを医薬的に許容できる担体又は希釈剤と共に含む医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物が少なくとも２つの樹状分岐に共有結合した多価コアを含み、少なくとも二世代にわたって広がっているデンドリマーである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記デンドリマーがアンモニアコアに基づくポリアミドアミンデンドリマーである請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記デンドリマーがエチレンジアミンコアに基づくポリアミドアミンデンドリマーである請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記デンドリマーがベンズヒドリルアミンコアに基づくポリリジンデンドリマーである請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記化合物が一般式Ｉ：
【化２】
0004979848.tif 000014
［式中、
Ｉは開始コア、
Ｚは内部分岐アミドアミンまたはリジン単位、
ｎはそのデンドリマーの世代数を表わす整数、
Ａはアミドまたはチオ尿素連結並びに随意の連結基Ｘ{アルキル鎖、アルコキシ鎖、ポリアルコキシ鎖、アルキルチオ鎖、ポリアルキルチオ鎖、アルケニル鎖、多価アルケニル（multiple alkenyl）鎖、アルキニル鎖、多価アルキニル（multiple alkynyl）鎖または-(CH2)ｍ-Z-(CH2)ｍ-の基であって、Zは-CH2-、-CH＝CH-、-C≡C-、-O-または-S-から選択され、ｍは1〜15の整数である}を介して内部分岐単位Ｚに連結されてもよい陰イオンまたは陽イオン含有部分であり、そのような陰イオンまたは陽イオン含有部分は
【化３】
0004979848.tif 000015
から選択され、式中Ｒは4-([1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン]メチル)である］
のポリイオン性デンドリマーである請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記の予防的または治療的抑制が細菌または寄生虫因子の抑制を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ヒトまたは非ヒト動物患者における細菌または寄生虫因子の予防的または治療的抑制用医薬の製造における請求項１〜７のいずれか一項に記載の陰イオン性または陽イオン性デンドリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は微生物因子および寄生虫因子の抑制に関し、具体的には細菌、真菌または寄生虫などの病原体によるヒトおよび非ヒト動物患者の感染の抑制剤としてのデンドリマーの使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
デンドリマーは多数の表面末端基を特徴とする低多分散性の三次元ポリマー物質である。また、これらの物質を製造する方法により、大きさ、形状および表面基の数とタイプの厳密な制御が可能である。樹状物質は治療用物質としての使用に役立ついくつかの特徴、すなわち、生物学的表面および受容体との相互作用に使用される大きくて明確な表面を呈する固定された形状、および生物学的標的との多重的な相互作用を可能にする多数の末端基を有する。
【０００３】
国際特許出願番号PCT/AU95/00350（WO95/34595）およびPCT/AU97/00447（WO98/03573）には、多数の末端基を持ちそれら末端基の少なくとも一つがそこに結合または連結された陰イオンまたは陽イオン含有部分を有する、ポリアミドアミンデンドリマーまたはポリリジンデンドリマーなどのデンドリマーが開示されている。これらの国際特許出願公開の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
本発明は細菌および真菌病原体を含む微生物因子および寄生虫因子の抑制に樹状高分子を使用するものである。
【０００５】
（発明の要約）
本発明によれば、ヒトまたは非ヒト動物患者における微生物因子または寄生虫因子の予防的または治療的抑制法であって、多数の末端基を持ちそれら末端基の少なくとも一つがそれに結合または連結された陰イオンまたは陽イオン含有部分を有するデンドリマーの有効量を前記患者に投与することからなる方法が提供される。
【０００６】
本発明の方法での使用に特に好ましい化合物は、その末端基に連結されたスルホン酸含有部分、カルボン酸含有部分、リン酸もしくはホスホン酸含有部分、ボロン酸含有部分、ノイラミン酸もしくはシアル酸含有部分またはノイラミン酸もしくはシアル酸を含有する部分、1級、2級、3級または4級アミノ含有部分、ピリジニウム含有部分、グアニジウム含有部分、アミジニウム含有部分、フェノール含有部分、酸性または塩基性水素を有する複素環、両性イオン含有部分、または上述した部分の混合物を有するデンドリマーである。
【０００７】
本発明の方法で使用される化合物を、ここではポリイオン性デンドリマーと呼び、この用語は、本明細書の全体を通して、デンドリマーそのものだけではなく、医薬的または獣医学的に許容できるそれらの塩（例えばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩）および医薬的に許容できる陰イオン（例えばフッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、クエン酸イオン、酢酸イオン、p-トルエンスルホン酸イオンなど）も包含する用語として使用される。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明に従って使用される好ましい化合物には、一般式Ｉ：
【化５】
0004979848.tif 000002
［式中、
Ｉは開始コア、
Ｚは内部分岐単位、
ｎはそのデンドリマーの世代数を表わす整数、
Ａは随意の連結基Ｘを介して内部分岐単位Ｚに連結されてもよい陰イオンまたは陽イオン含有部分である］
のポリイオン性デンドリマーが包含される。
【０００９】
デンドリマーは、最初のコア分子から始まって「世代」ごとに連続的な層または段（stage）が付加されて三次元的な高度に規則正しいポリマー化合物を構築する一連の反復反応によって形成される高度に分岐した高分子化合物である。デンドリマーは、i）開始コア（I）（これは1または複数の反応部位を持ちうるもので、点状であってもよいし、デンドリマーの最終的トポロジーが達成されるように有意な大きさであってもよい）、ii）開始コアに結合した分岐反復単位（Ｚ）の層、iii）デンドリマーの表面に結合（随意に連結基（連結基Ｘなど）を介した結合であってもよい）した官能性末端基（Ａ部分など）を特徴とする。本発明では樹状構造をイオン部分結合用の骨組みとして使用する。本発明はここに詳述する球状デンドリマーに限定されるわけではなく、任意の樹状構造に基づくことができる。形状と構造の両面でデンドリマーの多様性は当業者によく知られている。
【００１０】
デンドリマーの製造法はよく知られており、例えば米国特許第4289872号および第4410688号（リジン単位の層に基くデンドリマーが記載されている）や、米国特許第4,507,466号、第4,558,120号、第4,568,737号および第4,587,329号（ポリアミドアミンを含む他の単位に基くデンドリマーまたはPAMAMデンドリマーが記載されている）などに記載されている。これらの米国特許に開示されているデンドリマーは、表面修飾剤、金属キレート剤、解乳化剤または油/水エマルジョン、製紙における湿潤紙力増強剤、および塗料などの水性配合物での粘度調節剤などとしての使用に適すると記載されている。また米国特許第4,289,872号と同第4,410,688号には、リジン単位に基くデンドリマーを医薬製造用の基剤として使用できることが示唆されている。
【００１１】
国際特許公開番号WO 88/01178、WO 88/01179およびWO 88/01180には、デンドリマーがもう1つの物質（例えば担持された医薬用または農業用物質）と結合または会合している複合体が開示されている。また国際特許公開番号WO 95/24221には、生物学的反応修飾物質になりうる担体物質と会合した少なくとも一つのデンドリマーからなり、随意に標的指向因子を含んでもよい樹状ポリマー複合体が開示されている。これらの特許公開公報は上記の米国特許と共に様々なデンドリマーとその製造法を広く開示しており、これら各刊行物の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００１２】
本明細書で使用する「デンドリマー」という用語は最も広義に解釈されるべきものであり、特許公開番号WO 88/01178、WO 88/01179およびWO 88/01180に開示されるようなこれらデンドリマーの全ての形態および組成物が、その範囲に包含されるべきである。またこの用語は、これらの特許公開公報に開示されるような連結または架橋型デンドリマーも包含する。
【００１３】
本発明の好ましいデンドリマーは、少なくとも2つの樹状分岐に共有結合した多価コアを含み、好ましくは少なくとも二世代にわたって広がっているものである。とりわけ好ましいデンドリマーはポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマー、PAMAM(EDA)デンドリマー、ポリ(プロピレンイミン)（PPI）デンドリマーおよびポリリジンデンドリマーである。
【００１４】
本発明では、デンドリマーの表面にある末端基のうち少なくとも一つ、好ましくは相当数が、それに共有結合した陰イオンまたは陽イオン含有部分を有する。デンドリマーの分岐は、後に陰イオンまたは陽イオン部分と反応させることができるアミノ基または他の官能性反応基（例えばOH、SHなど）を末端に持ちうる。デンドリマーの末端基がアミン基である場合、陰イオンまたは陽イオン含有部分はアミド結合およびチオウレア結合などの様々な官能基によってデンドリマーに連結できる。デンドリマーの末端基に結合させうる好ましい陰イオンまたは陽イオン含有部分としては、スルホン酸含有部分、カルボン酸含有部分（ノイラミン酸およびシアル酸含有部分、修飾ノイラミン酸およびシアル酸含有部分を含む）、ボロン酸含有部分、リン酸およびホスホン酸含有部分（エステル化されたリン酸およびホスホン酸含有部分を含む）および1級、2級、3級または4級アミノ含有部分、ピリジニウム含有部分、グアニジウム含有部分、アミジニウム含有部分、フェノール含有部分、酸性または塩基性水素を有する複素環、両性イオン含有部分、または上記部分の混合物が挙げられる。
【００１５】
アミノ基または他の末端基に結合または連結できる好適な陰イオンおよび陽イオン含有部分としては、例えば次の基が挙げられる（式中、nはゼロまたは正の整数、より具体的にはnはゼロまたは1〜20の整数である）：
-NH(CH2)ｎS03−、-(CH2)ｎSO3−、-Ar(S03−)ｎ、-CH2CH(S03−)COOH、-CH(S03−)CH2COOH、-ArX(CH2)ｎSO3−  ［X＝O、S、NH］、-(CH2)ｎN＋Me3、-Ar(N＋Me3)ｎ、-Ar(CH2N＋Me3)ｎ、
【化６】
0004979848.tif 000003
-ArXP(＝0)(OR)2  ［X＝0、CH2、CHF、CF2；R＝アルキル、アリール、H、Na］、-ArXP(＝O)(OR1)(NR2R3)  ［X＝0、CH2、CHF、CF2；R1＝アルキル、アリール、H、Na；R2，R3＝アルキル、アリール］、-Ar[P(＝0)(OR)2]ｎ  ［R＝アルキル、アリール、H、Na；n＝1〜3］、-Ar[B(OH)2]ｎ  ［n＝1〜3］、-Ar[COOH]ｎ  ［n＝1〜3］、
【化７】
0004979848.tif 000004
【化８】
0004979848.tif 000005
［R＝アルキルまたはアリールアルキル；R1，R2，R3（これらは同一でも異なってもよい）＝アルキルまたはアリールアルキル］。
【００１６】
上記の部分の他に、様々なノイラミン酸もしくはシアル酸含有部分または修飾ノイラミン酸もしくはシアル酸含有部分も、本発明に従ってデンドリマーに結合または連結することができる。これらの部分としては、ノイラミン酸の様々なN-およびO-置換誘導体、特にN-アセチル、O-アセチルおよびN-グリコリル誘導体などのN-およびO-アシル誘導体ならびにノイラミン酸基が修飾されてなる部分などがある。好適な修飾ノイラミン酸基としては、4位がアミノ、アミド、シアノ、アジドまたはグアニジノ基で置換されている基および不飽和ノイラミン酸基が挙げられる。これらの部分は2-、7-、9-または5-NAc位を介してデンドリマーに連結できる。
【００１７】
一般式Ｉのポリイオン性デンドリマーでは、nが1〜20または20より大きい整数であることが好ましく、1〜10の整数であることがより好ましい。また、デンドリマーが少なくとも3つまたはそれ以上の末端基を含むことも好ましい。
【００１８】
デンドリマーと部分Ａの間にスペーサーとして存在してもよい随意の連結基Ｘは、アルキル鎖（置換アルキル鎖または分岐アルキル鎖であってもよい）、アルコキシ、ポリアルコキシ、アルキルチオまたはポリアルキルチオ鎖（置換されていてもよい）またはアルケニル、多価アルケニル（multiple alkenyl）、アルキニル、多価アルキニル（multiple alkynyl）鎖（置換されていてもよい）からなりうる。好適なスペーサー鎖には、式-(CH2)ｍ-Z-(CH2)ｍ-の基［式中、Zは-CH2-、-CH＝CH-、-C≡C-、-O-または-S-、ｍは1〜15の整数である］が含まれる。
【００１９】
本発明の陰イオンまたは陽イオンデンドリマーは、当業者によく知られている標準的な化学的方法によって製造できる。好適な方法を下記の実施例に例示する。
【００２０】
先に述べたように本発明の陰イオン性または陽イオン性デンドリマーは、微生物因子および寄生虫因子を抑制することが見出された。本明細書で使用する「微生物因子」という用語は細菌因子および酵母または真菌因子を指し、特に細菌病原体および酵母または真菌病原体を指す。したがってこの用語は、大腸菌、ネズミチフス菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、赤痢菌、シュードモナス、クロストリジウム、ナイセリアおよび肺炎球菌属を包含するが、これらに限るわけではない。またこの用語はカンジダなどの酵母病原体およびアスペルギルス-フミガーツス（Aspergillus fumigatus）などの真菌病原体も包含する。
【００２１】
「寄生虫因子」という用語は、ここでは特に寄生虫病原体を指すために使用され、プラスモジウム、トリパノソーマおよびリーシュマニア（Leischmania）属、トキソプラズマ-ゴンヂ（Toxoplasma gondii）およびクリプトスポリジウム-パルブム（Criptosporidium parvum）などの寄生虫因子を包含するが、これらに限るわけではない。
【００２２】
「抑制」という用語は、ここでは最も広い意味で、微生物病原体または寄生虫病原体によるヒトまたは非ヒト動物患者の感染の完全なまたは部分的な抑制または抑止、または微生物病原体または寄生虫病原体による上記患者の感染の病原的効果の完全なまたは部分的な抑制または抑止を包含するものとして使用される。またこの用語は予防的処置と治療的処置の両方を包含するものとして使用される。
【００２３】
したがって本発明はもう一つの側面として、上に概論したデンドリマーを、少なくとも1つの医薬的または獣医学的に許容できる担体または希釈剤と共に含有する、ヒトまたは非ヒト動物患者における微生物因子または寄生虫因子の予防的または治療的抑制用の医薬組成物または獣医用組成物を提供する。
【００２４】
このような組成物の処方は当業者にはよく知られている。好適な医薬的に許容できる担体および/または希釈剤には、従来のあらゆる溶媒、分散媒、充填剤、固形担体、水溶液、剤皮、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが包含される。医薬活性物質用のこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野ではよく知られており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences（第18版、Mack Publishing Company、米国ペンシルヴァニア州）などに記載されている。従来のどの媒体または薬剤もその活性成分とは不適合である場合を除き、本発明の医薬組成物にはそれらの使用が考えられる。補助的な活性成分を本組成物に組み込むこともできる。
【００２５】
投与を容易にし投与量を均一にするには、組成物を投与単位剤として製剤化することがとりわけ有利である。本明細書にいう投与単位剤とは、処置されるヒト対象への1回投与量として適当な物理的に分離した単位を指し、各単位は所望の治療効果を生むように計算された所定の活性成分量を必要な医薬担体および／または希釈剤と共に含有する。本発明の新規投与単位剤の仕様は（a）その活性成分に特有の特徴と、達成しようとする治療効果、および（b）その活性成分をその特定の処置のために調合する技術に固有の制限事項によって決定され、それらに直接依存する。
【００２６】
さらにもう一つの側面として本発明は、微生物因子または寄生虫因子の抑制によるヒトまたは非ヒト動物患者の予防的または治療的処置に、またはそのような予防的または治療的処置用の医薬の製造に、上に概論したデンドリマーの有効量を使用するものである。
【００２７】
様々な投与経路を利用できる。選択される方法は、当然、治療される状態と治療効果に必要な投与量とに依存するだろう。本発明の方法は、一般的には、医学的に許容できる任意の投与法、すなわち臨床上許容できない有害作用を引き起こすことなく治療レベルの本発明活性成分をもたらす任意の方法を使って実施することができる。そのような投与法には、経口、直腸、局所、経鼻、吸入、経皮または非経口（例えば皮下、筋肉内および静脈内）経路が含まれる。経口投与用製剤にはカプセル剤、錠剤、ロゼンジなどの独立した単位剤が含まれる。他の経路としては、髄液への直接的な髄腔内投与、当業者によく知られている種々のカテーテルおよびバルーン血管形成装置などによる直接導入、および標的領域への実質内注射が挙げられる。
【００２８】
本組成物は単位用量剤として提供すると好都合であり、製薬技術分野でよく知られる任意の方法で製造できる。そのような方法には、活性成分を1または複数の補助成分を構成する担体と混合する段階が含まれる。一般に本組成物は、活性成分を液状担体、固形担体微粒子またはその両方と均一かつ完全に混合した後、必要であればその生成物を成形することによって製造される。
【００２９】
経口投与に適した本発明の組成物は、各々所定量の活性成分を含有するカプセル剤、カシェ剤、錠剤またはロゼンジなどの独立した単位として、またはリポソームに封入して、またはシロップ剤、エリキシル剤またはエマルジョンなどの水性もしくは非水性液体中の懸濁液として提供できる。
【００３０】
非経口投与に適した組成物は、活性成分の滅菌水性製剤（好ましくは受容者の血液と等張性のもの）からなることが好都合である。この水性製剤は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用し、既知の方法に従って製剤できる。滅菌注射用製剤は、例えばポリエチレングリコール溶液などの無毒性で非経口的に許容できる希釈剤または溶剤を使った滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用可能な許容できる賦形剤および溶剤には、水、リンゲル液、等張食塩溶液などがある。また滅菌固定油も溶剤または懸濁媒として便利である。この目的には、合成モノグリセリドや合成ジグリセリドを含めて任意の無刺激固定油を使用できる。またオレイン酸などの脂肪酸も注射剤の製造に利用できる。
【００３１】
活性成分が鼻腔内にまたは吸入によって、例えば活性成分を含有する微細分散エアロゾルなどとして投与される系での送達が可能なように、活性成分を調剤することもできる。
【００３２】
他の送達系には徐放送達系がある。好ましい徐放送達系は、徐放性ペレットまたは徐放性カプセル中の本発明の活性成分の放出に備えうる系である。様々なタイプの徐放送達系を利用できる。それらには（a）活性成分がマトリックスに含まれている浸食系および（b）活性成分が制御された速度でポリマーを通して浸透する拡散系などがあるが、これらに限るわけではない。またポンプ型ハードウェア送達系も使用でき、それらには植込みに適するものもある。
【００３３】
活性成分は予防的または治療的に有効な量で投与される。予防的または治療的に有効な量とは、所望の効果を少なくとも部分的に達成するのに必要な量、または処置される状態の発生を遅らせ、その進行を抑制し、またはその発生もしくは進行を完全に停止させるのに必要な量を意味する。そのような量は当然、処置される状態、その状態の重症度、および年齢、体調、大きさ、体重および併用される処置を含む個々の患者のパラメーターに依存するだろう。これらの因子は当業者にはよく知られており、日常的な実験だけで対処することができる。一般的には最大量（すなわち妥当な医学的判断による最高安全量）を使用することが好ましい。しかし医学的理由、心理学的理由または他の事実上任意の理由から、より低い用量または許容量を投与できることは、当業者には理解されるだろう。
【００３４】
活性成分の経口一日量は一般的には約0.01mg/kg/日〜1000mg/kg/日になるだろう。最初は少量（0.01〜1mg）を投与し、その後、最大約1000mg/kg/日まで用量を増やすことができる。対象の反応がそれらの用量では不十分である場合は、患者の耐性が許す範囲で、さらに高い用量（またはより限局的な別の送達経路によるより高い有効量）を使用してもよい。化合物の全身レベルを適切な値にするために、一日あたり複数回の投与を行なうことが考えられる。
【００３５】
本発明の活性成分は、例えば当技術分野の従来の方法によって製造できる獣医用組成物の形でも提供できる。そのような獣医用組成物の例としては、
（a）例えば水薬（例：水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤または巨丸剤、飼料添加用の散剤、顆粒剤またはペレット、舌塗布用のペーストなどの経口投与、外用に適したもの、
（b）例えば滅菌溶液または懸濁液としての皮下、筋肉内または静脈内注射などによる非経口投与、または（しかるべき場合は）乳房内注射（この場合、懸濁液または溶液を乳頭から乳房中に導入する）による非経口投与に適したもの、
（c）例えば皮膚に適用されるクリーム剤、軟膏もしくは噴霧剤などといった局所外用に適したもの、または
（d）例えば膣坐薬、クリーム剤またはフォームなどの腟内投与に適したもの
が挙げられる。
【００３６】
本明細書と本願特許請求の範囲では、文脈上別段の必要がない限り、「含む（含有する、からなる）」という用語とその活用形（「含んでいる」など）は、明記した事物（integer）または事物の群の包含を意味するが、その他の事物または事物の群の除外を意味するわけではないと理解される。
【００３７】
本発明のさらなる特徴は下記の実施例から明らかになるだろう。これらの実施例は発明の限定ではなく例示のために記載するものである。下記の実施例においてPAMAMデンドリマーとは米国特許第4,507,466号、第4,558,120号、第4,568,737号および第4,587,329号に詳述されているようなアンモニアコアに基くポリアミドアミンデンドリマーを指し、PAMAM(EDA)デンドリマーとはエチレンジアミンコアに基くポリアミドアミンデンドリマーを指し、またBHAlysｘlysｙlysｚデンドリマーとは米国特許第4,289,872号と第4,410,688号に記載されているようなベンズヒドリルアミンコアとリジン分岐単位に基くポリリジン非対称デンドリマーを指す。ポリアミドアミンデンドリマーPAMAM1.0、PAMAM2.0、PAMAM3.0、PAMAM4.0、PAMAM5.0またはそれ以上の世代、PAMAM4.0(EDA)、およびポリリジンデンドリマーBHAlyslys2、BHAlyslys2lys4、BHAlyslys2lys4lys8およびBHAlyslys2lys4lys8lys16、BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32、BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32lys64またはそれ以上の世代は、上記米国特許第4289872号、第4410688号、第4507466号、第4558120号、第4568737号および第4578239号ならびに国際特許公開番号WO 88/01178、WO 88/01179、WO 88/01180およびWO 95/24221に記述されているように製造される。
【００３８】
（実施例）
実施例１
スルホン酸末端デンドリマーを与える樹状ポリマーと2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸との反応
Ａ．PAMAM1.0
2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸（0.41g、2.0mmol）の水（3ml）溶液を撹拌したものに、炭酸ナトリウム固体（0.13g、1.0mmol）をゆっくり加えた。気体の発生が停止した後の溶液のpHは8.0だった。次にその溶液にPAMAM1.0（0.12g、0.33mmol）の水（1ml）溶液を添加し、続いて水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムの40％水溶液を4滴加えた。次にその溶液を窒素下に60°で3日間加熱した後、濃縮した。残渣をゲルろ過（セファデックスG10、水）で精製した後、凍結乾燥したところ、スルホン化PAMAM1.0デンドリマーが灰白色固体（0.51g）として得られた。1Hおよび13C NMRスペクトルによりジアルキル化およびモノアルキル化PAMAM1.0デンドリマーの混合物（約70：30）が確認された。13C nmr（D2O）：δ31.0、31.1、37.1、37.7、41.3、48.6、51.5、53.1、53.4、55.6、56.2、61.2、61.5、178.3、179.0、179.8。
【００３９】
Ｂ．PAMAM2.0
上記と同様にしてPAMAM2.0を2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸と反応させた。粗生成物をゲル濾過（セファデックスG10、水）で精製した後、凍結乾燥したところ、灰白色固体を得た。1Hおよび13C NMRスペクトルによりジアルキル化およびモノアルキル化PAMAM2.0デンドリマーの混合物（約65：35）が確認された。13C nmr（D2O）：δ31.0、31.1、37.1、37.7、41.3、48.7、51.5、53.4、55.6、56.2、61.2、61.5、178.4、179.0、179.1、179.6。
水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムを省いて上記の反応を繰返したところ、同様の結果が得られた。
【００４０】
Ｃ．PAMAM3.0  BRI2783
わずかに過剰の炭酸ナトリウムを使用した点と水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムを省いた点以外は上記と同様にして、PAMAM3.0を2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸と反応させた。1Hおよび13C NMRスペクトルによりジアルキル化およびモノアルキル化PAMAM3.0デンドリマーの混合物（約50：50）が確認された。13C nmr（D2O）：δ31.0、31.1、36.9、37.4、41.1、48.6、51.5、53.4、55.7、56.2、61.1、61.5、178.2、178.9、179.0、179.8。
【００４１】
Ｄ．PAMAM4.0  BRI2784
PAMAM3.0について記述したように、PAMAM4.0を2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸と反応させた。1Hおよび13C nmrスペクトルによりジアルキル化およびモノアルキル化PAMAM4.0デンドリマーの混合物（約35：65）が確認された。13C nmr（D2O）：δ31.0、31.1、36.9、37.3、41.1、48.5、51.5、53.5、55.7、56.2、61.1、61.5、178.1、178.9、179.0、179.8。
【００４２】
実施例２
スルホアセトアミドナトリウム末端デンドリマーの製造
Ａ．PAMAM1.0
PAMAM1.0（0.18g、0.5mmol）のDMF（3ml）溶液を撹拌したものに、ブロモ酢酸4-ニトロフェニル（0.40g、1.5mmol）の乾燥DMF（1ml）溶液を加えた。得られた黄色溶液を室温で20時間撹拌してからニンヒドリン試験を行なったところ、結果は陰性だった。その溶液を濃縮（30°/0.1mmHg）したところ黄色油状物を得た。この油状物を水とクロロホルムに分配し、その水層を分離し、クロロホルムで洗浄（2回）し、最後に酢酸エチルで洗浄した。その水溶液を濃縮（35°/25mmHg）したところ、ブロモアセチル化されたPAMAM1.0デンドリマーが黄色油状物（0.36g、100％）として得られた。13C nmr（D2O）：δ32.8、33.3、43.0、43.5、54.4、174.5、176.4。
【００４３】
上記ブロモアセチル化PAMAM1.0デンドリマー（0.36g、0.5mmol）の水（5ml）溶液に亜硫酸ナトリウム（0.2g、1.6mmol）の水（1ml）溶液を加え、その溶液を室温で11日間放置した。その黄色溶液を濃縮したところ帯黄色固体（0.60g）を得た。13C nmr（D2O）：δ34.4、43.1、43.4、54.0、61.7、171.3、177.2。
【００４４】
上記の一連の反応は、ブロモアセチル化デンドリマーを単離することなく、単に第一反応で得た粗製水性抽出物に亜硫酸ナトリウム溶液を添加することによっても行なうことができるだろう。
【００４５】
Ｂ．PAMAM2.0
方法１：
PAMAM2.0（0.10g、0.1mmol）のDMF（3ml）溶液を撹拌したものに、ブロモ酢酸4-ニトロフェニル（0.18g、0.7mmol）の乾燥DMF（1ml）溶液を加えた。得られた黄色溶液を室温で20時間撹拌してからニンヒドリン試験を行なったところ、結果は陰性だった。次にその溶液をかき混ぜながら水（150ml）に加え、その混合物をクロロホルム（3回）と酢酸エチルで抽出した。その粗製ブロモアセチル化デンドリマー溶液に亜硫酸ナトリウム（0.1g、0.8mmol）の水（1ml）溶液を加え、その混合物を室温で3日間放置した。次にその黄色溶液を濃縮したところ黄色の固体残渣が得られ、それをゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、スルホアセトアミドナトリウム末端PAMAM2.0デンドリマー（103mg）を得た。13C nmr（D2O）：δ33.0、35.7、36.0、37.7、40.3、43.0、43.2、53.4、53.7、56.0、61.6、171.2、174.6、178.5。
【００４６】
方法２：
アセチルチオ酢酸スクシンイミジル固体（67mg、0.33mmol）をPAMAM2.0（52mg、0.05mmol）の乾燥DMF（2ml）溶液に加え、得られた溶液を室温で2日間撹拌した。次にその混合物を濃縮（30°/10−3mmHg）して油状残渣を得た。その残渣を水とクロロホルムに分配し、水層を分離して濃縮したところ粘稠な油状物（117mg）を得た。1Hおよび13C nmrにより、その油状物はアシル化デンドリマーとN-ヒドロキシスクシンイミドの混合物であることがわかった。ゲルろ過（セファデックスG10、水）によってアセチルチオアセトアミド末端PAMAM2.0デンドリマーの純粋な試料（29mg）を得た。13C nmr（D2O）：δ34.0、34.2、37.3、43.0、43.1、43.3、53.5、54.0、56.3、175.4、177.2、177.5。
【００４７】
次に、40％ギ酸水溶液（7ml）に溶解した上記官能化デンドリマーを、ギ酸（2ml）中に新たに調製した過ギ酸（1.6ml）の氷冷溶液に加えた。その混合物を0°で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。次に過剰の過酸を分解するために少量の活性炭を加え、その混合物を30分間撹拌した後、濾過し濃縮して粘稠な油状物を得た。
【００４８】
その粗生成物を水に溶解し、重炭酸ナトリウム水溶液でpHを9.0に調節し、それをセファデックスG10のカラムに通すことによって脱塩した。凍結乾燥によって得た白色固体（20mg）は、分光光学的に、方法１で得た物質と本質的に同じものだった。13C nmr（D2O）：δ33.0、38.7、42.9、43.0、43.1、53.9、54.3、56.5、61.6、171.2、176.4、177.0。
【００４９】
実施例３
スルホスクシンアミド酸ナトリウム末端デンドリマーの製造
Ａ．PAMAM1.0
PAMAM1.0（0.12g、0.33mmol）の乾燥DMF（3ml）溶液を撹拌したものに、無水マレイン酸固体（0.11g、1.1mmol）を加えた。この混合物は無水物が溶解するにつれて少し温かくなり褐色を帯びた。得られた溶液を室温で終夜撹拌した。次にその溶液を濃縮（30°/10−4mmHg）したところ粘稠な油状物を得た。1Hおよび13C nmr（D2O）によりPAMAM1.0のトリスアミドへの完全な変換が若干量のマレイン酸と共に確認された。13C nmr（D2O）：δ33.1、42.8、43.1、54.3、135.0、137.1、169.1、171.9、173.3。
【００５０】
次にその粗製トリスアミドを水（4ml）に溶解し、亜硫酸ナトリウム固体（0.20g、1.6mmol）を加えた。得られた溶液を室温で4日間放置した後、濃縮した。1Hおよび13C nmr（D2O）により、位置異性スルホスクシンアミド酸ナトリウム末端PAMAM1.0デンドリマーの1：1混合物が、若干量のスルホコハク酸と共に確認された。この粗生成物をゲルろ過（セファデックスG10、水）で精製してスルホスクシンアミド酸ナトリウム末端PAMAM1.0デンドリマーの試料（107mg）を得た。13C nmr（D2O）：δ33.3、39.6、40.0、42.9、43.1、54.0、67.9、69.4、173.8、176.3、177.6、181.8。
【００５１】
Ｂ．PAMAM 2.0
位置異性スルホスクシンアミド酸ナトリウム末端PAMAM2.0デンドリマーの混合物を上記のように製造した。13C nmr PAMAM2.0マレインアミド酸誘導体（D2O）：δ32.8、33.0、38.7、42.9、53.8、54.3、56.5、135.2、136.8、169.2、171.9、173.5、174.6。13C nmr PAMAM2.0スルホスクシンアミド酸ナトリウム誘導体（D2O）：δ37.0、40.1、41.1、43.0、43.2、43.9、53.0、53.3、55.5、68.0、69.4、173.8、177.6、179.1、179.5、179.8、182.3。
【００５２】
Ｃ．PAMAM4.0  BRI6038
PAMAM4.0（51mg、0.01mmol）の乾燥DMF（2ml）溶液を撹拌したものに無水マレイン酸固体（60mg、0.6mmol）を加えた。その混合物はまず濁ったが、すぐに透明な溶液になった。その透明溶液を室温で終夜撹拌した。次にその溶液を濃縮（35°/10−4mmHg）したところ粘稠な油状物を得た。1Hおよび13C nmr（D2O）により、PAMAM4.0のポリアミドへの完全な変換が、若干量のマレイン酸と共に確認された。次にその粗製ポリアミドを水（2ml）に溶解し、亜硫酸ナトリウム（126mg、1.0mmol）の水（2ml）溶液を加えた。得られた溶液を室温で2日間放置した後、濃縮した。1Hおよび13C nmr（D2O）により、位置異性スルホスクシンアミド酸ナトリウム末端PAMAM4.0デンドリマーの混合物と、若干量のスルホコハク酸が確認された。その粗生成物をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、24個の位置異性スルホスクシンアミド酸基を末端に持つPAMAM4.0（90mg）の試料を得た。1H nmr（D2O）：δ2.4-2.6、2.7-3.1、3.2-3.4、3.9-4.0。13C nmr（D2O）：δ36.2、39.8、40.5、43.0、43.2、53.5、55.8、68.1、69.5、173.8、177.4、178.7、182.3。
【００５３】
実施例４
N-(2-スルホエチル)スクシンアミドナトリウム末端デンドリマーの製造
a）N-(2-スルホエチル)スクシンアミド酸テトラブチルアンモニウムの製造
2-アミノエチルスルホン酸テトラブチルアンモニウム（1.83g、5.0mmol）の乾燥ジクロロメタン（30ml）溶液を撹拌したものに無水コハク酸固体（0.5g、5.0mmol）を加えた。無水コハク酸はゆっくり溶解し、生成した混濁液を室温で終夜撹拌した。その混合物を濾過し、濾液を濃縮したところ粘稠な油状物（2.41g）を得た。13C nmrにより、所望のモノアミドへの完全な変換が、少量のコハク酸と共に確認された。大過剰のジエチルエーテルへのジクロロメタン溶液の滴下による生成物の沈殿を繰返すことにより、N-(2-スルホエチル)スクシンアミド酸テトラブチルアンモニウムを白色固体（1.763g、76％）として得た。融点125〜127℃。1H nmr（CDCl3）：δ0.86（t，12H，4×CH3）、1.28（m，8H，4×CH2）、1.50（m，8H，4×CH2）、2.33（m，2H，CH2COOH）、2.44（m，2H，CH2CONH）、2.76（m，2H，CH2NHCO）、3.12（m，8H，4×CH2N）、3.50（m，2H，CH2SO3−）、7.53（br t，1H，NH）。13C nmr（CDCl3）：δ13.5、19.5、23.8、30.1、30.9、35.6、50.0、58.5、172.0、174.1。
【００５４】
b）N-(2-スルホエチル)スクシンアミド酸4-ニトロフェニルエステルテトラブチルアンモニウムの製造
N-(2-スルホエチル)スクシンアミド酸テトラブチルアンモニウムのジクロロメタン（2ml）溶液を撹拌したものに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（45mg、0.22mmol）の乾燥ジクロロメタン（1ml）溶液を加え、その混合物を室温で終夜撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、濾液を濃縮することによって粗製活性エステルを得て、それをさらに精製することなく使用した。
【００５５】
Ａ．N-(2-スルホエチル)スクシンアミドナトリウム末端PAMAMデンドリマーの製造
PAMAM4.0  BRI2786
50％DMF水溶液（3ml）に溶解したPAMAM4.0（51.5mg、0.01mmol）の溶液を撹拌したものに、粗製N-(2-スルホエチル)スクシンアミド酸4-ニトロフェニルエステルテトラブチルアンモニウム（0.30mmol）の乾燥DMF（1ml）溶液を加え、得られた黄色溶液を室温で終夜撹拌した。次にその混合物を濃縮（35°/10−5mmHg）し、その黄色残渣を水とクロロホルムに分配した。水層を分離し、クロロホルム（2回）と酢酸エチルで洗浄した後、濃縮したところ黄色油状物（134mg）を得た。その粗生成物をアンバーライトIR120（Na）のカラムに通すことによってナトリウム塩に変換し、85mgの生成物を得た。この物質をさらにゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、N-(2-スルホエチル)スクシンアミドナトリウム末端PAMAM4.0デンドリマー（45mg）を得た。13C nmr（D2O）：δ33.2、33.6、35.5、39.0、39.5、42.8、43.2、53.8、54.1、54.4、56.6、176.5、176.9、177.2、178.9、179.4。
【００５６】
N-(2-スルホエチル)スクシンアミドナトリウム基を末端に持つ類似のPAMAM1.0デンドリマーとPAMAM3.0（BRI2785）デンドリマーも同様に製造した。
13C nmr PAMAM3.0誘導体（D2O）：δ33.4、35.5、39.0、39.5、42.9、42.3、53.8、54.1、54.3、56.5、176.4、176.9、177.4、178.9、179.4。
13C nmr PAMAM1.0誘導体（D2O）：δ34.9、35.5、39.5、42.9、43.1、53.7、54.1、179.0、179.1、179.3。
【００５７】
Ｂ．N-(2-スルホエチル)スクシンアミドナトリウム末端ポリリジンデンドリマーの製造
BHAlyslys2lys4lys8lys16  BRI2789
乾燥ジクロロメタン（1ml）に懸濁したBHAlyslys2lys4lys8DBL16（36.5mg、5.0μmol）にトリフルオロ酢酸（1ml）を加え、得られた溶液を窒素下に室温で2時間撹拌した後、濃縮した。残渣を乾燥DMSO（2ml）に溶解し、トリエチルアミンでpHを8.5に調節した。次に、粗製N-(2-スルホエチル)スクシンアミド酸4-ニトロフェニルエステルテトラブチルアンモニウム（約0.2mmol）のDMSO（1ml）溶液を滴下し、その混合物を室温で終夜撹拌した。次にその黄色溶液を濃縮（50°/10−5mmHg）し、その黄色残渣を水とクロロホルムに分配した。水層を分離し、クロロホルム（3回）と酢酸エチルで洗浄した後、濃縮したところ油状物（99mg）を得た。その粗生成物をアンバーライトIR120（Na）のカラムに通すことによってナトリウム塩に変換し、81mgの物質を得た。この物質をゲルろ過（セファデックスLH20、水）でさらに精製して、N-(2-スルホエチル)スクシンアミドナトリウム末端BHAlyslys2lys4lys8lys16デンドリマー（39mg）を得た。13C nmr（D2O）：δ27.0、32.3、35.2、35.3、35.6、35.7、39.5、43.5、54.1、58.5、131.5、132.0、133.3、145.1、177.8、178.0、178.4、178.8、178.9、179.2、179.7、179.8。
【００５８】
N-(2-スルホエチル)スクシンアミドナトリウム基を末端に持つ類似のBHAlyslys2、BHAlyslys2lys4（BRI2787）およびBHAlyslys2lys4lys8（BRI2788）も同様に製造した。
13C nmr BHAlyslys2lys4lys8誘導体（D2O）：δ26.9、32.3、35.1、35.6、35.7、39.5、43.5、54.1、58.5、131.6、131.9、132.2、132.3、133.2、133.3、145.0、145.2、177.2、177.8、177.9、178.0、178.2、178.3、178.6、178.7、178.8、178.9、179.2、179.3、179.7、179.8。
13C nmr BHAlyslys2lys4誘導体（D2O）：δ26.9、32.3、35.1、35.4、35.7、35.8、39.5、43.5、54.1、58.5、61.8、131.7、132.0、132.2、132.3、133.2、133.3、145.0、145.1、177.3、178.0、178.3、178.4、178.7、178.9、179.0、179.3、179.7、179.8。
13C nmr BHAlyslys2誘導体（D2O）：δ26.9、27.1、32.2、32.3、34.7、34.8、35.1、35.3、35.6、35.7、39.5、43.4、54.1、58.6、61.8、131.7、131.9、132.2、132.3、133.3、144.9、145.0、177.7、178.4、178.8、179.0、179.3、180.0。
【００５９】
実施例５
4-スルホフェニルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
Ａ．PAMAM4.0  BRI2791
PAMAM4.0（300mg、0.0582mmol）の水（10ml）溶液に固体の4-スルホフェニルイソチオシアネートナトリウム一水和物（500mg、1.96mmol）を加え、得られた溶液を窒素下に53°で2時間加熱した後、冷却した。その溶液を濃縮し、その黄色固体残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥したところ、4-スルホフェニルチオ尿素ナトリウム末端PAMAM4.0デンドリマーが綿毛様白色固体（370mg）として得られた。1H nmr（D2O）：δ2.28、2.52、2.69、3.15、3.27、3.60、7.32（d，J＝9Hz）、7.72（d，J＝9Hz）。13C nmr（D2O）：δ36.9、41.1、43.1、48.3、53.6、55.8、129.0、131.1、144.4、178.5、179.1、184.4。
【００６０】
それぞれ3、6、12および48個の4-スルホフェニルチオ尿素ナトリウム基を末端に持つ類似のPAMAM1.0、PAMAM2.0（BRI2790）、PAMAM3.0およびPAMAM5.0（BRI2991）デンドリマーも同様に製造した。
【００６１】
Ｂ．PAMAM4.0(EDA)  BRI6045
PAMAM4.0(EDA)（69mg、0.01mmol）の水（4ml）溶液に固体の4-スルホフェニルイソチオシアネートナトリウム一水和物（130mg、0.5mmol）を加え、得られた溶液を窒素下に53°で2時間加熱した後、冷却した。その溶液を濃縮し、その固体残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥したところ、32個の4-スルホフェニルチオ尿素ナトリウム基を末端に持つPAMAM4.0が綿毛状白色固体（136mg）として得られた。1H nmr（D2O）：δ2.30、2.50、2.70、3.18、3.62、7.35（d，J＝9Hz）、7.72（d，J＝9Hz）。13C nmr（D2O）：δ36.8、41.0、43.1、48.4、53.6、55.7、128.9、131.0、144.3、178.5、179.0、184.5。
【００６２】
Ｃ．BHAlyslys2lys4lys8lys16  BRI2792
窒素下で乾燥ジクロロメタン（4ml）に懸濁したBHAlyslys2lys4lys8DBL16（0.73g、0.1mmol）にトリフルオロ酢酸（4ml）を加えた。激しい気体の発生が短時間観察された。得られた溶液を室温で2時間撹拌した後、濃縮した。シロップ状の残渣を水（5ml）に溶解し、その溶液をアンバーライトIRA-401（OH）のカラムに通し、濾液を濃縮したところ、BHAlyslys2lys4lys8lys16が粘稠な油状物（0.49g）として得られた。その油状物を水（5ml）に再溶解し、N,N-ジメチル-N-アリルアミン緩衝液（pH9.5、3ml）を加えた。次に固体の4-スルホフェニルイソチオシアネートナトリウム一水和物（1.30g、5.1mmol）を加え、得られた溶液を窒素下に53°で2時間加熱した後、冷却した。その溶液を濃縮し、その帯褐色固体残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した。純粋な画分を合わせ、アンバーライトIR120（Na）のカラムに通し、凍結乾燥したところ、4-スルホフェニルチオ尿素ナトリウム末端BHAlyslys2lys4lys8lys16デンドリマーが綿毛状白色固体（374mg）として得られた。1H nmr（D2O）：δ1.40、1.72、3.08、3.42、4.24、4.60、7.30、7.40（d，J＝9Hz）、7.78（d，J＝9Hz）。13C nmr（D2O）：δ27.3、32.5、35.9、43.7、48.9、58.6、63.3、128.8、131.0、143.7、144.7、145.1、177.7、178.1、183.8、185.2。
【００６３】
それぞれ16、64および128個の4-スルホフェニルチオ尿素ナトリウム基を末端に持つ類似のBHAlyslys2lys4lys8、BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32（BRI2992）およびBHAlyslys2lys4lys8lys16lys32lys64（BRI2993）デンドリマーも同様に製造した。
【００６４】
実施例６
3,6-ジスルホナフチルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
Ａ．PAMAM4.0  BRI2923
PAMAM4.0（51mg、0.01mmol）の水（3ml）溶液に固体の3,6-ジスルホナフチルイソチオシアネートナトリウム（160mg、0.41mmol）を加え、得られた溶液を窒素下に53℃で2時間加熱した後、冷却した。その溶液を濃縮し、その褐色固体残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した。純粋な画分を合わせて濃縮したところ、3,6-ジスルホナフチルチオ尿素ナトリウム末端PAMAM4.0デンドリマーが帯褐色固体（73mg）として得られた。1H nmr（D2O）：δ2.30、2.60、2.74、3.20、3.57、7.75、7.86、8.28。13C nmr（D2O）：δ35.0、39.9、43.1、48.1、53.8、56.1、128.4、128.6、129.3、131.0、131.3、136.0、136.8、138.2、145.5、146.0、177.2、177.8、185.5。
【００６５】
3,6-ジスルホナフチルチオ尿素ナトリウム基を末端に持つ類似のPAMAM2.0デンドリマーも同様に製造した。
【００６６】
Ｂ．PAMAM4.0(EDA)  BRI6046
PAMAM4.0(EDA)（74mg、0.01mmol）の水（4ml）溶液に固体の3,6-ジスルホナフチルイソチオシアネートナトリウム（220mg、0.57mmol）を加え、得られた溶液を窒素下に53°で2時間加熱した後、冷却した。その溶液を濃縮し、その帯褐色固体残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した。純粋な画分を合わせて濃縮したところ、32個の3,6-ジスルホナフチルチオ尿素ナトリウム基を末端に持つPAMAM4.0が黄褐色固体（148mg）として得られた。1H nmr（D2O）：δ2.30、2.80、3.20、3.54、7.74、7.85、8.25。13C nmr（D2O）：δ36.0、40.8、43.1、48.3、53.6、55.9、128.5、129.4、131.0、131.3、136.0、136.8、138.3、145.5、146.0、178.2、185.6。
【００６７】
Ｃ．BHAlyslys2lys4lys8lys16  BRI2999
窒素下で乾燥ジクロロメタン（2ml）に懸濁したBHAlyslys2lys4lys8DBL16（73mg、0.01mmol）にトリフルオロ酢酸（2ml）を加えた。激しい気体の発生が短時間観察された。得られた溶液を室温で2時間撹拌した後、濃縮した。シロップ状の残渣を水（5ml）に溶解し、その溶液をアンバーライトIRA-401（OH）のカラムに通し、その濾液を濃縮したところ、BHAlyslys2lys4lys8lys16が粘稠な油状物として得られた。その油状物を水（5ml）に再溶解し、N,N-ジメチル-N-アリルアミン緩衝液（pH9.5、3ml）を加えた。次に固体の3,6-ジスルホナフチルイソシアネートナトリウム（234mg、0.60mmol）を加え、得られた溶液を窒素下に53°で2時間加熱した後、冷却した。その溶液を濃縮し、その帯褐色固体残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）によって精製した。純粋な画分を合わせ、アンバーライトIR120（Na）のカラムに通し、凍結乾燥したところ、32個の3,6-ジスルホナフチルチオ尿素ナトリウム基を末端に持つBHAlyslys2lys4lys8lys16が綿毛状灰白色固体（119mg）として得られた。1H nmr（D2O）：δ1.0-2.0、3.18、3.43、4.31、7.22、7.80、7.89、8.25。13C nmr（D2O）：δ27.2、32.4、35.3、43.7、49.0、58.5、63.6、128.4、129.1、131.4、136.1、136.6、138.6、139.0、145.1、145.6、178.4、184.8、186.7。
【００６８】
実施例７
4-スルホナフチルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0  BRI2997
PAMAM4.0（51mg、0.01mmol）の水（5ml）溶液に固体の4-スルホナフチルイソチオシアネートナトリウム（180mg、0.5mmol）を加え、その混合物を窒素下に53°で2時間加熱した後、冷却した。得られた懸濁液から水を減圧下に蒸留し、その灰白色固体残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥したところ、4-スルホナフチルチオ尿素ナトリウム末端PAMAM4.0デンドリマーが綿毛状白色固体（60mg）として得られた。1H nmr（D2O）：δ2.20、2.60、3.14、3.48、7.23、7.47、7.56、7.77、7.93（d，J＝6Hz）、8.56（d，J＝6Hz）。13C nmr（D2O）：δ35.8、40.5、43.1、48.4、53.6、55.9、127.6、128.6、130.3、131.9、132.5、133.5、134.7、140.5、142.7、177.8、178.0、185.4。
【００６９】
実施例８
3,5-ジスルホフェニルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0  BRI6039
PAMAM4.0（63mg、0.012mmol）の水（3ml）溶液に固体の3,5-ジスルホフェニルイソチオシアネートナトリウム（110mg、0.32mmol）を加え、得られた溶液を窒素下に53°で2時間加熱した後、冷却した。その溶液を濃縮し、その帯褐色固体残渣をゲルろ過（セファデックスG25、水）で精製した。純粋な画分を合わせて濃縮したところ、24個の3,5-ジスルホフェニルチオ尿素ナトリウム基を末端に持つPAMAM4.0が灰白色固体（110mg）として得られた。1H nmr（D2O）：δ2.53、3.08、3.36、3.66、7.90、7.95。13C nmr（D2O）：δ34.8、41.0、43.1、48.0、53.7、56.2、124.1、128.6、143.5、148.8、177.6、185.0。
【００７０】
実施例９
3,6,8-トリスルホナフチルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0  BRI2998
水（2ml）に溶解したPAMAM4.0（51mg、0.01mmol）とN,N-ジメチル-N-アリルアミン緩衝液（pH9.5、1ml）に、固体の3,6,8-トリスルホナフチルイソチオシアネートナトリウム（250mg、0.5mmol）を加え、その混合物を窒素下に53°で2時間加熱した後、冷却した。その混合物を減圧下に濃縮したところ橙色の固体が得られた。その残留固体を水（2ml）に溶解し、短いアンバーライトIR-120（Na）カラムに通した。次に濾液を濃縮して、その残渣をゲル濾過（セファデックスLH20、水）で精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥したところ、3,6,8-トリスルホナフチルチオ尿素ナトリウム末端PAMAM4.0デンドリマーが灰白色固体（102mg）として得られた。1H nmr（D2O）：δ2.65、3.02、3.30、3.66、8.05、8.42、8.59、8.67。13C nmr（D2O）：δ33.2、38.7、43.2、43.7、47.8、54.0、54.3、56.7、131.0、131.3、131.9、135.9、138.0、139.6、143.8、144.1、145.6、176.2、176.5、186.0。
【００７１】
同様にして、対応する3,6,8-トリスルホナフチルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーBHAlyslys2lys4lys8lys16 BRI7011を製造した。
【００７２】
実施例１０
4-(スルホメチル)ベンズアミドナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0  BRI6040
PAMAM4.0（70mg、0.014mmol）の乾燥DMSO（4ml）溶液に4-(クロロメチル)安息香酸4-ニトロフェニル固体（200mg、0.68mmol）を加え、得られた黄色溶液を室温で2時間撹拌した。次にその溶液を濃縮（10−4mmHg、40°）し、残渣を水とジクロロメタンの混合物（1：1）で抽出した。残った固体物質をDMSO（5ml）に溶解し、亜硫酸ナトリウム（130mg、1mmol）の水（3ml）溶液を加えた。その結果生成したわずかに濁った混合物を4日間放置した後、さらに水（2ml）を加えたところ、透明で均一な黄色溶液が得られた。次にその溶液をまず40°/25mmHgで濃縮し、次いで50°/10−4mmHgで濃縮することにより、粗生成物を得た。その粗生成物をゲルろ過（セファデックスG25、水）で精製したところ、24個の4-(スルホメチル)ベンズアミドナトリウム基を末端に持つPAMAM4.0（24mg）が得られた。1H nmr（D2O）：δ2.25、2.66、3.08、3.20、3.33、3.38、4.01、7.40（br d）、7.62（br d）。13C nmr（D2O）：δ36.7、40.9、43.0、43.6、53.5、55.5、61.0、131.6、135.0、137.2、140.4、174.5、178.6、179.2。
【００７３】
実施例１１
4-スルホベンズアミド末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0（EDA）  BRI6116
0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.5、5ml）に溶解したPAMAM4.0(EDA)（35mg、0.005mmol）に固体の4-スルホ安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルナトリウム（100mg、0.3mmol）を加え、その溶液を室温で2時間撹拌した。得られた乳状の溶液はこの段階でpHが4.5だった。次に1M炭酸ナトリウム溶液（1ml）を加えて透明な溶液とし、それを濃縮することにより、粗生成物を白色固体として得た。その粗生成物をゲルろ過（セファデックスG25、水）で精製して、32個の4-スルホベンズアミドナトリウム基を末端に持つPAMAM4.0(EDA)を得た（47mg）。1H nmr（D2O）：δ2.25、2.42、2.63、3.05、3.18、3.31、3.38、7.72（d，J＝8Hz）、7.78（d，J＝8Hz）。13C nmr（D2O）：δ36.0、40.4、43.0、43.7、53.7、55.8、130.2、132.2、140.4、150.1、173.6、178.0、178.5。
【００７４】
実施例１２
N-(4-スルホフェニル)プロパンアミドナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)  BRI6117
PAMAM4.0(EDA)（78mg、0.011mmol）の水（4ml）溶液を撹拌したものに、固体のN-(4-スルホフェニル)アクリルアミドナトリウム（250mg、1mmol）および炭酸ナトリウム固体（106mg、1mmol）を順次加えた。得られた溶液を窒素下で4日間撹拌した後、凍結乾燥したところ、綿毛状の白色固体が得られた。その粗生成物をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、64個のN-(4-スルホフェニル)プロパンアミドナトリウム基を末端に持つPAMAM4.0(EDA)を得た（206mg）。13C nmrにより、極微量のモノアルキル化末端アミノ基と思われるものが認められた。1H nmr（D2O）：δ2.10、2.48、2.58、2.79、3.20、7.42（d，J＝7Hz）、7.65（d，J＝7Hz）。13C nmr（D2O）：δ36.5、37.9、41.1、53.4、55.6、124.8、130.9、143.0、144.2、177.4、178.5。
【００７５】
実施例１３
4-スルホフェニル尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)  BRI6115
スルファニル酸ナトリウム（195mg、1mmol）の乾燥DMSO（3ml）溶液を炭酸N,N'-ジスクシンイミジル（530mg、2mmol）の乾燥DMSO（4ml）溶液に滴下し、得られた帯褐色溶液を室温で20時間撹拌した。乾燥DMSO（1ml）に溶解したPAMAM4.0(EDA)（75mg、0.011mmol）を加え、その溶液をさらに18時間撹拌した。次にその溶液を高真空下（10−5mmHg、35°）で濃縮して、帯黄色の半固体を得た。その粗生成物をDMSO（4ml）に溶解し、その溶液をよく撹拌した酢酸エチル200mlに加えた。沈殿した白色固体を濾過によって集め、酢酸エチル（2回）とエーテル（2回）で洗浄した後、乾燥することによって白色粉末（275mg）を得た。この物質をさらにゲル濾過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、32個の4-スルホフェニル尿素ナトリウム基を末端に持つPAMAM4.0(EDA)を得た（106mg）。1H nmr（D2O）：δ2.31、2.55、2.75、3.19、7.32（d，J＝9Hz）、7.63（d，J＝9Hz）。13C nmr（D2O）：δ36.3、40.7、43.3、43.8、53.7、55.7、123.3、130.9、140.9、146.0、161.4、178.2、178.6。
【００７６】
実施例１４
塩化N,N,N-トリメチルグリシンアミド末端デンドリマーの製造
BHAlyslys2lys4lys8lys16  BRI2922
乾燥ジクロロメタン（2ml）に懸濁したBHAlyslys2lys4lys8DBL16（220mg、30μmol）にトリフルオロ酢酸（4ml）を加え、得られた溶液を窒素下に室温で2時間撹拌した後、濃縮した。その残渣を乾燥DMSO（5ml）に溶解し、トリエチルアミンでpHを8.5に調節した。次に塩化N,N,N-トリメチルグリシン4-ニトロフェニル固体（0.50g、1.8mmol）を加え、その混合物を室温で終夜撹拌した。次にその混濁液を濃縮（50°/10−5mmHg）し、残渣を水とジクロロメタンに分配した。水層を分離し、ジクロロメタン（3回）と酢酸エチルで洗浄した後、濃縮して油状物（1.128g）を得た。その粗生成物をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、N,N,N-トリメチルグリシンアミド末端BHAlyslys2lys4lys8lys16デンドリマー（116mg）を得た。13C nmr（D2O）：δ25.5、30.5、30.8、33.4、42.1、56.5、57.1、67.5、68.1、166.7、167.0、167.1、176.0、176.2。
【００７７】
実施例１５
4-トリメチルアンモニウムベンズアミド末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0  BRI6043
ヨウ化4-トリメチルアンモニウム安息香酸（154mg、0.5mmol）の乾燥DMF（4ml）溶液に1,1'-カルボニルジイミダゾール（85mg、0.52mmol）を加え、その混合物をアルゴン下に室温で2時間撹拌した。この間に白色固体が溶液から分離した。次にPAMAM4.0（58mg、0.011mmol）の乾燥DMF（2ml）溶液を加え、その混合物を室温で終夜撹拌した。これを終えた時点で沈殿物の大半が溶解しており、その溶液のニンヒドリン試験は陰性だった。その混合物を濃縮（10−4mmHg、30°）して白色固体残渣を得た。その粗生成物をゲル濾過（セファデックスLH20、10％AcOH）で精製することにより、24個の4-トリメチルアンモニウムベンズアミド基を末端に持つPAMAM4.0を酢酸塩（89mg）として得た。1H nmr（D2O）：δ1.96、2.65-2.85、3.25-3.55、3.64、7.92。13C nmr（D2O）：δ25.8、33.1、33.5、38.7、43.1、43.5、53.5、54.1、56.4、61.2、124.8、133.6、139.9、153.2、173.2、176.3、176.8、182.6。
【００７８】
同様にして、6個の4-トリメチルアンモニウムベンズアミド基を末端に持つ類似のPAMAM2.0デンドリマーを製造した。
【００７９】
実施例１６
4-(トリメチルアンモニウムメチル)ベンズアミド末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0  BRI6044
PAMAM4.0（52mg、0.01mmol）の乾燥DMSO（3ml）溶液を撹拌したものに4-(クロロメチル)安息香酸4-ニトロフェニル固体（150mg、0.5mmol）を加えた。得られた黄色溶液を室温で20時間撹拌してニンヒドリン試験を行なったところ、結果は陰性だった（pH約8.5）。次にその溶液を濃縮（10−5mmHg、40°）し、水とジクロロメタンの混合物（1：1）と共に残渣を振盪した。不溶性のゲル様物質を濾過によって集め、水（2回）およびジクロロメタン（2回）で洗浄した後、風乾した。この粗製4-(クロロメチル)ベンズアミド末端デンドリマーを25％トリメチルアミン水溶液（20ml）に溶解し、その黄色溶液を終夜放置した。次にその溶液を濃縮し、残渣を水（5ml）に溶解し、その溶液をアンバーライトIRA-401（OH）のカラムに通した。無色の濾液を濃縮したところ粘稠な油状物が得られ、それをゲル濾過（セファデックスG10、10％AcOH）で精製することにより、24個の4-(トリメチルアンモニウムメチル)ベンズアミド基を末端に持つPAMAM4.0（90mg）を得た。1H nmr（D2O）：δ1.88、2.65-2.80、2.98、3.10-3.60、7.52（br d，J＝9Hz）、7.72（br d，J＝9Hz）。13C nmr（D2O）：δ26.6、33.4、38.8、43.2、43.5、53.6、54.1、56.8、62.8、73.0、132.1、135.3、137.5、140.0、176.9、183.6。
【００８０】
実施例１７
N-(2-アセトキシエチル)-N,N-(ジメチルアンモニウム)メチルカルボキサミド末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0
臭化N-(2-アセトキシエチル)-N-(カルボキシメチル)-N,N-ジメチルアンモニウム（135mg、0.5mmol）の乾燥DMF（3ml）溶液に1,1'-カルボニルジイミダゾール固体（85mg、0.52mmol）を加え、得られた溶液を窒素下に2時間撹拌した。次にPAMAM4.0（60mg、0.012mmol）のDMF（2ml）溶液を加えたところ、直ちに凝集性の沈殿が生成し、それはゆっくりと再溶解した。その混合物を2日間撹拌した後、濃縮（10−4mmHg、40°）したところ、粘稠な油状物が得られた。その粗生成物をゲルろ過（セファデックスG10、10％AcOH）で精製することにより、24個のN-(2-アセトキシエチル)-N,N-(ジメチルアンモニウム)メチルカルボキサミド基を末端に持つPAMAM4.0（64mg）を得た。1H nmr（D2O）：δ1.93、2.05、2.70、3.10-3.60、3.28、3.93（m）、4.14、4.48（m）。13C nmr（D2O）：δ24.6、26.2、33.2、38.7、42.8、42.9、53.9、57.4、62.6、67.3、67.5、168.9、176.4、176.8、177.3、183.2。
【００８１】
実施例１８
グアニジノ末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0  BRI6042
PAMAM4.0（63mg、0.012mmol）と硫酸メチルチオプソイド尿素（170mg、0.61mmol）の水（5ml）溶液（pH10.5）を窒素下に80°で2時間加熱した。次にその溶液を濃縮し、残渣をゲル濾過（セファデックスG10、10％AcOH）で精製することにより、24個のグアニジノ基を末端に持つPAMAM4.0を酢酸塩（107mg）として得た。1H nmr（D2O）：δ2.00、2.80（br t）、3.09（br t）、3.32、3.45（br t）、3.60（br t）。13C nmr（D2O）：δ25.2、33.2、33.4、38.7、41.2、42.6、43.4、44.7、53.5、54.0、56.3、176.5、176.7、176.9、181.6。
【００８２】
同様にして、6個のグアニジノ基を末端に持つ類似のPAMAM2.0デンドリマーを製造した。
【００８３】
実施例１９
4-([1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン]メチル)ベンズアミド末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0  BRI6041
pH7のリン酸緩衝液（10ml）に溶解した1-(4-カルボキシフェニル)メチル-1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン四塩酸塩（120mg、0.25mmol）、N-ヒドロキシスクシンイミド（60mg、0.52mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（250mg、1.3mmol）を室温で1時間放置した後、pH7のリン酸緩衝液（10ml）に溶解したPAMAM4.0（32mg、0.006mmol）を加えた。その混合物を2日間放置した後、濃縮した。残渣をゲル濾過（セファデックスLH20、10％AcOH）で精製したところ、1H nmrと13C nmrから判断して約12個の4-([1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン]メチル)ベンズアミド基を末端に持つPAMAM4.0（80mg）が得られた。次にその生成物を水に溶解し、アンバーライトIRA-401（Cl）樹脂のカラムに通した後、濃縮した。その残渣を水（1ml）に溶解し、濃塩酸（1ml）を加え、その溶液をエタノール（30ml）で希釈することによって白色固体を沈殿させた。その固体を濾過によって集めた（68mg）。1Hおよび13C nmrにより、末端アミノ基はやはり約50％官能化されていることが確認された。1H nmr（D2O）：δ2.17、2.36、2.50、2.78、2.85、3.25、3.40、3.50、3.60、3.62、4.49、7.63（br d）、7.78（br d）。13C nmr（D2O）：δ22.7、23.1、33.2、38.8、39.9、40.2、40.3、41.0、41.2、42.0、42.9、43.2、43.6、45.5、46.1、49.1、52.2、53.9、54.3、56.6、62.7、132.5、135.7、137.1、139.7、174.3、176.2、176.3、176.7、177.0、178.2、178.5。
【００８４】
実施例２０
4-カルボキシ-3-ヒドロキシベンジルアミン末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)  BRI6119
水（4ml）中のPAMAM4.0(EDA)（69mg、0.01mmol）、4-ホルミル-2-ヒドロキシ安息香酸（83mg、0.5mmol）および炭酸水素ナトリウム（42mg、0.5mmol）の混合物にシアノホウ水素化ナトリウム（32mg、0.5mmol）を加えた。その不均一な橙色の混合物を室温で4時間撹拌したところ均一になった。次にその橙色溶液を濃縮し、残渣をゲル濾過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、約32個の4-カルボキシ-3-ヒドロキシベンジルアミン基を末端に持つPAMAM4.0(EDA)を得た（91mg）。1Hおよび13C nmr（D2O）はほとんどの末端アミノ基がモノアルキル化されていることを示すが、ジアルキル化の信号も若干認められ、どちらのスペクトルも幅広いピークを示す。13C nmr（D2O）：δ37.0、41.1、50.9、53.4、55.5、55.8、61.5、120.9、122.2、122.4、132.3、132.7、135.0、135.8、163.5、163.7、169.0、178.6、179.3。1H nmr（D2O）：δ2.20、2.35、2.60、3.15、3.30、3.55、4.25、6.68、7.12、7.55。
【００８５】
実施例２１
4-カルボキシフェニルアミド末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)
PAMAM4.0(EDA)（69mg、0.01mmol）の水（20ml）溶液に4-カルボキシフェニルイソチオシアネート固体（86mg、0.48mmol）を加えた。生成した混濁液のpHをNaHCO3飽和溶液で9に調節し、室温で24時間撹拌放置した。次にその反応混合物を濾過し、濾液を濃縮することによって白色固体残渣を得て、それをゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した後、凍結乾燥することにより、生成物を白色の綿毛状固体（68mg）として得た。
【００８６】
実施例２２
3,5-ジカルボキシフェニルアミド末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)
PAMAM4.0(EDA)（70mg、0.01mmol）の水（5ml）溶液に、3,5-ジカルボキシフェニルイソチオシアネート固体（112mg、0.5mmol）を加えた。生成した混濁液のpHを1M Na2CO3溶液で10に調節し、窒素下に53°で2時間加熱した。次にその反応混合物を濾過し、濾液を濃縮したところ帯褐色固体残渣が得られ、それをゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した後、凍結乾燥することにより、生成物を淡褐色固体（112mg）として得た。
【００８７】
実施例２３
4-ホスホノオキシフェニルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)
PAMAM4.0(EDA)（69mg、0.01mmol）の水（20ml）溶液に固体の4-ホスホノオキシフェニルイソチオシアネートナトリウム（251mg）を加えた。得られた溶液（pH9）を窒素下に室温で24時間撹拌した。次にその反応混合物を濃縮したところ白色固体残渣が得られ、それをゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した後、凍結乾燥することにより、生成物を綿毛状白色固体（86mg）として得た。
【００８８】
実施例２４
4-(ホスホノメチル)フェニルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)
PAMAM4.0(EDA)（69mg、0.01mmol）の水（30ml）溶液に固体の4-(ホスホノメチル)フェニルイソチオシアネートナトリウム（97mg）を加えた。NaHCO3飽和溶液を断続的に添加することによってpHを8に維持しながら、得られた溶液を窒素下に室温で3時間撹拌した。次にその反応混合物を濃縮したところ白色固体残渣が得られ、それをゲルろ過（セファデックスLH20、水）によって精製した後、凍結乾燥することにより、生成物を綿毛状白色固体（102mg）として得た。
【００８９】
実施例２５
4-(ホスホノメチル)フェニルチオ尿素エチルエステルナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)
PAMAM4.0(EDA)（69mg、0.01mmol）のDMF（30ml）溶液に固体の4-(ホスホノメチル)フェニルイソチオシアネートエチルエステルナトリウム（109mg）を加えた。NaHCO3飽和溶液を断続的に添加することによってpHを8に維持しながら、得られた溶液を窒素下に室温で17時間撹拌した。次にその反応混合物を濃縮したところ白色固体残渣が得られ、それをゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製した後、凍結乾燥することにより、生成物を綿毛状白色固体（30mg）として得た。
【００９０】
実施例２６
Cn-アルキル連結2-チオシアロシド末端デンドリマーの製造
[(8-オクタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチルを、以下の方法で製造した。
【００９１】
5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-2-S-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラソン酸メチル（Hasegawaら、1986）（100mg）の乾燥ジメチルホルムアミド（1ml）溶液に、8-ブロモオクタン酸（41mg）とジエチルアミン（280mg）を加え、その溶液を20℃で17時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を酢酸エチルと氷冷5％塩化水素酸に分配した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去して残渣（130mg）を得た。これを酢酸エチル（5ml）に溶解し、N-ヒドロキシスクシンイミド（26mg）とジシクロヘキシルカルボジイミド（46mg）を加えた。その混合物を20℃で17時間撹拌した後、白色の沈殿を濾去した。濾液を濃縮し、酢酸エチルを溶離液とするシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物含有画分を合わせて溶媒を留去することにより、白色の泡状物97mgを得た。71％。
【００９２】
同様にして、以下の化合物を製造した。
[(11-ウンデカン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル、
[(酢酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル)5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル、
[(4-ブタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル、
[(4-メチル安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル。
【００９３】
Ａ．PAPAM[EDA]4.0[(8-オクタンアミド)-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32  BRI6112
不活性雰囲気下にあるPAMAM[EDA]4.0（50mg）の乾燥ジメチルスルホキシド（4ml）溶液に、[(8-オクタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル（300mg）を加え、その溶液を20℃で60時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をメタノール（2ml）に溶解した。この溶液を、メタノールを溶離液とするセファデックスLH20でのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。溶媒を留去したところ、生成物PAMAM[EDA]4.0[[(8-オクタンアミド)5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル]32が白色粉末として得られた。182mg。93％。
【００９４】
これを以下の方法で遊離のシアロシドに変換した。20℃で窒素下にあるPAMAM[EDA]4.0[[(8-オクタンアミド)5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル]32（182mg）の乾燥メタノール（3ml）溶液に、新たに調製したナトリウムメトキシドの0.19Mメタノール溶液（7ml）を加え、その混合物を2.5時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水（10ml）に溶解し、3時間撹拌した。この溶液を、水を溶離液とするセファデックスLH20でのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。凍結乾燥したところ、PAPAM[EDA]4.0[(8-オクタンアミド)-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32が淡いレモン色の粉末として得られた。110mg。77％。
【００９５】
同様の方法で以下の化合物の製造した。
PAMAM[EDA]4.0[(11-ウンデカンアミド)-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32  BRI6147、
PAMAM[EDA]4.0[(アセトアミド)-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32  BRI6121、
PAMAM[EDA]4.0[(4-メチルベンズアミド)-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32  BRI6120。
【００９６】
Ｂ．BHAlyslys2lys4lys8lys16[(8-オクタンアミド)-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32  BRI6169
トリフルオロ酢酸（2ml）とジクロロメタン（2ml）の混合物に溶解したBHAlyslys2lys4lys8lys16(t-Boc)32（20.3mg）を20℃で2時間撹拌した後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をジメチルスルホキシド（1ml）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（25mg）と[(8-オクタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)5-アセトアミド-4,7,8,9-テトラ-O-アセチル-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル（78mg）を加えた。その混合物をアルゴン下に20℃で60時間撹拌した後、溶媒を減圧下に除去した。残渣を、新たに調製したナトリウムメトキシドの0.1Mメタノール溶液（2.5ml）に溶解し、その混合物をアルゴン下に20℃で3時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水（1ml）に溶解して、17時間撹拌した。その溶液を、水を溶離液とするセファデックスLH20でのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。凍結乾燥により、生成物BHAlyslys2lys4lys8lys16[(8-オクタンアミド)-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32が白色粉末として得られた。44mg。86％。
【００９７】
実施例２７
シアル酸の4位が修飾されている樹状シアロシドの製造
4-アジド-5-アセトアミド-7,8,9-トリ-O-アセチル-2-S-アセチル-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノソン酸メチルを、以下の方法で製造した。4-アジド-5-アセトアミド-7,8,9-トリ-O-アセチル-2-クロロ-3,4,5-トリデオキシ-D-グリセロ-β-D-ガラクト-2-ノヌロピラノソン酸メチル（Sabesan、1994）（5g）の乾燥ジクロロメタン（150ml）溶液に、チオール酢酸カリウム微粉末（5.8g）を加え、その懸濁液を20℃で48時間激しく撹拌した。その混合物を濾過し、溶媒を留去して淡褐色泡状物（5.2g）を得た。必要な生成物を分取用逆相HPLC［C18、30％アセトニトリル/水］によって白色泡状物（3.9g、72％）として単離した。
【００９８】
[(8-オクタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)4-アジド-5-アセトアミド-7,8,9-トリ-O-アセチル-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチルを以下の方法で製造した。
【００９９】
4-アジド-5-アセトアミド-7,8,9-トリ-O-アセチル-2-S-アセチル-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノソン酸メチル（300mg）の乾燥ジメチルホルムアミド（3.5ml）溶液に、8-ブロモオクタン酸（155mg）とジエチルアミン（1.26ml）を加え、その溶液を20℃で17時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を酢酸エチルと氷冷10％塩化水素酸に分配した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去して黄色泡状物（385mg）を得た。これを酢酸エチル（20ml）に溶解し、N-ヒドロキシスクシンイミド（95mg）とジシクロヘキシルカルボジイミド（175mg）を加えた。その混合物を20℃で17時間撹拌した後、白色沈殿物を濾去した。濾液を濃縮し、分取用逆相HPLC［C18、30％アセトニトリル/水］で精製することにより、白色の泡状物（340mg，83％）を得た。
【０１００】
Ａ．PAMAM[EDA]4.0[(8-オクタンアミド)-4-アジド-5-アセトアミド-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32  BRI6146
不活性雰囲気下にあるPAMAM[EDA]4.0（72mg）の乾燥ジメチルスルホキシド（5ml）溶液に、[(8-オクタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)4-アジド-5-アセトアミド-7,8,9-トリ-O-アセチル-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル（318mg）を加え、その溶液を20℃で60時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をメタノール（2ml）に溶解した。この溶液を、メタノールを溶離液とするセファデックスLH20でのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。溶媒の留去により、生成物PAMAM[EDA]4.0[[(8-オクタンアミド)4-アジド-5-アセトアミド-7,8,9-トリ-O-アセチル-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル]32を白色の泡状物（225mg、81％）として得た。
【０１０１】
遊離のシアロシドは次の方法で得た。アルゴン下20℃にあるPMAM[EDA]4.0[[(8-オクタンアミド)4-アジド-5-アセトアミド-7,8,9-トリ-O-アセチル-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド]オン酸メチル]32（215mg）の乾燥メタノール（1ml）溶液に、新たに調製したナトリウムメトキシドの1Mメタノール溶液（1ml）を加え、その混合物を3時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水（2ml）に溶解し、17時間撹拌した。その溶液を、水を溶離液とするセファデックスLH20でのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。凍結乾燥により、生成物PAMAM[EDA]4.0[(8-オクタンアミド)-4-アジド-5-アセトアミド-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32を綿毛状の白色粉末（160mg、90％）として得た。
【０１０２】
Ｂ．PAMAM[EDA]4.0[(8-オクタンアミド)-4-アミノ-5-アセトアミド-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32  BRI6149
ピリジン（40ml）と水（20ml）の混合液に溶解したPAMAM[EDA]4.0[(8-オクタンアミド)-4-アジド-5-アセトアミド-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32（25mg）に、20℃で5日間にわたって遅い硫化水素ガスの気流を通過させた。次にその溶液中に窒素を2時間吹込んで過剰の硫化水素を除去した。その溶液を蒸発乾固し、残渣を水（5ml）に取り出し、0.45μm膜フィルターに通すことによって硫黄を除去した。凍結乾燥により、生成物PAMAM[EDA]4.0[(8-オクタンアミド)-4-アミノ-5-アセトアミド-3,4,5-トリデオキシ-2-チオ-D-グリセロ-α-D-ガラクト-2-ノヌロピラノシド酸]32が綿毛状の白色粉末（23mg、96％）として得られた。
【０１０３】
実施例２８
ボロン酸末端デンドリマーの製造
4-カルボキシフェニルボロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
4-カルボキシフェニルボロン酸（500mg）の乾燥ジメチルホルムアミド（5ml）溶液にN-ヒドロスクシンイミド（380mg）とジシクロヘキシルカルボジイミド（680mg）を加えた。その混合物を20℃で64時間撹拌した後、白色沈殿物を濾去した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を酢酸エチル（100ml）に溶解した。その溶液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去したところ白色固体が得られ、これをアセトニトリル/水から細かい針状物として結晶化した。730mg。92％。
【０１０４】
PAMAM[EDA]4.0[4-ベンズアミドボロン酸]32  BRI6160
不活性雰囲気下にあるPAMAM[EDA]4.0（69mg）の乾燥ジメチルスルホキシド（5ml）溶液に4-カルボキシフェニルボロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（130mg）を加え、その溶液を20℃で65時間撹拌した。その濃厚なスラリーに1M炭酸ナトリウム溶液（1ml）を加え、その透明な溶液をさらに24時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を10％アンモニア溶液（5ml）に溶解した。その溶液を、10％アンモニア溶液を溶離液とするセファデックスLH20でのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。溶媒の留去により、生成物PAMAM[EDA]4.0[4-ベンズアミドボロン酸]32が白色の綿毛状固体として得られた。110mg。94％。
【０１０５】
実施例２９
3,6-ジスルホナフチルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32
BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32（147mg）の乾燥ジクロロメタン（2ml）懸濁液を撹拌したものにトリフルオロ酢酸（2ml）を加え、得られた溶液を窒素下に室温で2時間撹拌した後、濃縮した。残渣をN,N-ジメチル-N-アリルアミン緩衝液（pH9.5、5ml）に溶解した後、3,6-ジスルホナフチルイソチオシアネート固体（400mg）を加えた。次にその混合物のpHを1M炭酸ナトリウムの添加によって9.5に調節し、その溶液を窒素下に53℃で3時間加熱した。その反応混合物を濃縮し、残渣を水に再溶解し、その溶液をアンバーライトIR120（Na）のカラムに通した。濾液を濃縮して得た粗生成物をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、64個の3,6-ジスルホナフチル尿素ナトリウム基を持つBHAlyslys2lys4lys8lys16lys32が白色の綿毛状固体（175mg）として得られた。
【０１０６】
実施例３０
3,5-ジスルホフェニルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32
BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32（300mg、0.02mmol）の乾燥ジクロロメタン（3ml）懸濁液を撹拌したものにトリフルオロ酢酸（3ml）を加え、得られた溶液を窒素下に室温で2時間撹拌した後、濃縮した。残渣を水に溶解し、その溶液をアンバーライトIRA401（OH）のカラムに通し、濾液を濃縮したところ粘稠な油状物（187mg）が得られた。その油状物をピリジン/水の1：1混合液（8ml）に溶解し、3,5-ジスルホフェニルイソチオシアネートナトリウム固体（680mg、2mmol）を加えた。得られた溶液を窒素下に53℃で3時間加熱した。次にその溶液を濃縮して白色固体残渣を得た。その粗生成物をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、64個の3,5-ジスルホフェニル尿素ナトリウム基を持つBHAlyslys2lys4lys8lys16lys32が白色の綿毛状固体として得られた。
【０１０７】
実施例３１
3,5-ジカルボキシフェニルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 BRI6741
BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32（300mg、0.02mmol）の乾燥ジクロロメタン（3ml）懸濁液を撹拌したものにトリフルオロ酢酸（3ml）を加え、得られた溶液を窒素下に室温で2時間撹拌した後、濃縮した。残渣を水に溶解し、その溶液をアンバーライトIRA401（OH）のカラムに通し、濾液を濃縮したところ粘稠な油状物（186mg）が得られた。その油状物をピリジン/水の1：1混合液（8ml）に溶解し、3,5-ジカルボキシフェニルイソチオシアネートナトリウム（450mg、2mmol）を加えた。得られた溶液を窒素下に53℃で13時間加熱した。次にその溶液を濃縮して白色固体残渣を得た。その粗生成物をゲル濾過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、64個の3,6-ジカルボキシフェニル尿素ナトリウム基を持つBHAlyslys2lys4lys8lys16lys32が白色の綿毛状固体として得られた。
【０１０８】
同様にして、対応する3,5-ジカルボキシフェニルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーPAMAM4.0(EDA) BRI6195を製造した。
【０１０９】
実施例３２
4-ホスホノオキシフェニルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 BRI6181
BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32（147mg、0.01mmol）の乾燥ジクロロメタン（2ml）懸濁液を撹拌したものにトリフルオロ酢酸（2ml）を加え、得られた溶液を窒素下に室温で2時間撹拌した後、濃縮したところ粘稠な油状物を得た。その油状物をN,N-ジメチル-N-アリルアミン緩衝液（pH9.5、5ml）に溶解し、4-ホスホノオキシフェニルイソチオシアネート固体（250mg）を加えた。得られた溶液のpHを1M炭酸ナトリウムで10に調節し、その混合物を窒素下に53℃で3時間加熱した。次にその溶液を濃縮したところ白色固体残渣を得た。その残渣を水に再溶解し、その溶液をアンバーライトIR120（Na）のカラムに通し、濾液を濃縮した。次に、その残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製することにより、64個の4-ホスホノオキシフェニル尿素ナトリウム基を持つBHAlyslys2lys4lys8lys16lys32を白色の綿毛状固体（150mg）として得た。
【０１１０】
実施例３３
4-ホスホノフェニルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32
BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32（147mg、0.01mmol）の乾燥ジクロロメタン（2ml）懸濁液を撹拌したものにトリフルオロ酢酸（2ml）を加え、得られた溶液を窒素下に室温で2時間撹拌した後、濃縮したところ、粘稠な油状物を得た。その油状物をN,N-ジメチル-N-アリルアミン緩衝液（pH9.5、5ml）に溶解し、4-ホスホノフェニルイソチオシアネート固体（250mg）を加えた。得られた溶液のpHを炭酸水素ナトリウム飽和溶液で9に調節し、その混合物を窒素下に53℃で3時間加熱した。次にその溶液を濃縮したところ白色固体残渣を得た。その残渣を水に再溶解し、その溶液をアンバーライトIR120（Na）のカラムに通し、濾液を濃縮した。次に残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製して、凍結乾燥することにより、64個の4-ホスホノフェニル尿素ナトリウム基を持つBHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 BRI6196を白色の綿毛状固体（152mg）として得た。
【０１１１】
実施例３４
4,6-ジホスホノナフチルチオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0
4,6-ジホスホノナフチルイソチオシアネート（165mg）の水（2ml）溶液を、PAMAM4.0（51mg、0.01mmol）の水（2ml）溶液に加えた。その混合物のpHを炭酸水素ナトリウム飽和溶液で9.5に調節し、その混合物を室温で1時間激しく撹拌した後、窒素下に53℃で3時間加熱した。次にその混合物を濾過し、濾液を濃縮したところ褐色の固体残渣を得た。その粗生成物をゲル濾過（セファデックスG25、水）で精製し、凍結乾燥することにより、24個の4,6-ジホスホノナフチルチオ尿素ナトリウム基を末端に持つPAMAM4.0を褐色固体（81mg）として得た。
【０１１２】
実施例３５
フルオレセインチオ尿素末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)
PAMAM4.0(EDA)（74mg、0.01mmol）の水（3ml）溶液にフルオレセインイソシアネート固体（188mg）を加えた。炭酸水素ナトリウム飽和溶液を加えてpHを9に調節し、得られた均一溶液を室温で終夜撹拌してから濃縮した。その橙色の残渣をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製し、凍結乾燥することにより、21個のフルオレセインチオ尿素基を末端に持つPAMAM4.0（EDA）を綿毛状の橙色固体（193mg）として得た。
【０１１３】
実施例３６
(フェニル-3-ボロン酸)チオ尿素ナトリウム末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0(EDA)
PAMAM4.0(EDA)（69mg、0.01mmol）の水（5ml）溶液に(フェニル-3-ボロン酸)イソチオシアネート固体（100mg、0.5mmol）を加えた。1M炭酸ナトリウムを加えて上記イソチオシアネートを溶解した（pH約10）。次にその混合物を窒素下に53℃で2時間加熱した後、濾過し、濾液を濃縮したところ帯褐色固体残渣を得た。その粗生成物をゲルろ過（セファデックスLH20、水）で精製し、凍結乾燥することにより、32個の(フェニル-3-ボロン酸)チオ尿素基を末端に持つPAMAM4.0(EDA)を白色の綿毛状固体（87mg）として得た。
【０１１４】
実施例３７
ピリジニウムドデシルカルボキサミド末端デンドリマーの製造
PAMAM2.0デンドリマー  BRI-6807
PAMAM2.0世代コア（0.0479mmol、50mg）を0.5mlのMeOH溶液からエバポレートし、10mlの水に再溶解した。その溶液に、臭化1-N-ピリジニウム12-ドデカン酸（0.14g、0.384mmol）、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物［HOBT］（52mg、0.384mmol）、トリエチルアミン（53μl、0.384mmol）および1-(3-ジエチルアミノプロピル-3-エチル)カルボジイミド塩酸塩［EDC］（74mg、0.384mmol）を加えた。その反応混合物を室温で終夜撹拌した。減圧下で体積を三分の一に減らし、その溶液を、水を溶離液とするLH20カラムでのクロマトグラフィーにかけた。生成物を含有する画分を集め、凍結乾燥により、臭化ピリジニウムドデシルカルボキサミドPAMAM2.0を綿毛状白色固体として単離した。1H nmr（D2O）：δ 1.15、1.45、1.9、2.15、2.75、2.8、3.15、3.35、3.5、4.55、8.05、8.5、8.8。
【０１１５】
PAMAM4.0デンドリマー  BRI-6809
PAMAM4.0世代コア（0.05mmol、69mg）を1.0mlのMeOH溶液からエバポレートし、水15mlに再溶解した。その溶液に、臭化1-N-ピリジニウム12-ドデカン酸（0.143g、0.4mmol）、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物［HOBT］（77mg、0.4mmol）、トリエチルアミン（56μl、0.4mmol）および1-(3-ジエチルアミノプロピル-3-エチル)カルボジイミド塩酸塩［EDC］（77mg、0.4mmol）を加えた。その反応混合物を室温で終夜撹拌した。減圧下で体積を三分の一に減らし、その溶液を、1％トリエチルアミン水溶液を溶離液とするLH20カラムでのクロマトグラフィーにかけた。生成物を含有する画分を集め、凍結乾燥により、臭化ピリジニウムドデシルカルボキサミドPAMAM4.0を綿毛状白色固体として単離した。少量の生成物を無水酢酸と反応させて、デンドリマーコアのNH2末端基が完全にキャッピングされていることを確認した。1H nmr（D2O）：δ 1.10、1.45、1.9、2.1、2.30、2.5、2.7、3.2、4.5、8.00、8.45、8.80。
【０１１６】
実施例３８
サッカリン末端デンドリマーの製造
PAMAM4.0デンドリマー BRI-6157
エチレンジアミンコアPAMAM4.0デンドリマーコア（275mg、39.8μM）の乾燥ジメチルホルムアミド（25ml）溶液に6-(ベンゾスルフィミド)イソチオシアネート（400mg、1.67mM）を加え、その混合物を室温で24時間撹拌した。炭酸ナトリウムでpHを10〜10.5に調節することによって、その混濁液を透明にした。この溶液をさらに24時間撹拌し、揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去した。その溶液を大きいセファデックスLH20カラムでのクロマトグラフィーにかけて、前端画分を集めた。残りの画分を集め、小さいカラムでの再クロマトグラフィーにかけた。合わせた前端画分をエバポレートし凍結乾燥することにより、サッカリン末端デンドリマー生成物（450mg、78％）を綿毛状白色固体として得た。1H nmr（D2O）：δ 2.20、2.50、3.23、3.46、3.63、7.52、7.87。
【０１１７】
同様にして、対応するサッカリン末端BHA.Lys.Lys2Lys4.Lys8.Lys16.Lys32...デンドリマーBRI-6189を製造した。
【０１１８】
実施例３９
インビトロ抗寄生虫アッセイ
I：トリパノソーマの抑制について試験するためのインビトロアッセイとして以下のアッセイを行なった。
【０１１９】
Ａ．材料と方法
・培地：「Balz-MEM」＋10％熱非働化ウマ血清。
・トリパノソーマ株：
STIB900（STIB704からクローン化されたT.b.rhodesiense）
STIB920（STIB348からクローン化されたT.b.brucei）
STIB930（STIB754からクローン化されたT.b.gambiense）。
・基準薬：メラルソプロール（Arsobal、Specia、フランス）、ペンタミジン（Pentacarinat、Phone-Poulenc）、スラミン（Germanin、Bayer、ドイツ）。
・培養条件：湿潤雰囲気下5％CO2、37℃で72時間。
・試験系：96ウェルマイクロタイタープレート、100μl/ウェル、200〜1000トリパノソーマ/ウェル（株に依存）、2つの終点測定値で評価。
・評価：
ａ）顕微鏡によるMICの決定
ｂ）BCECF/AM添加後の蛍光測定値またはコールターカウンターまたはCASYによる細胞の計数。
・調剤：10％溶媒（DMSO、エタノールなど）中に10mMの原液、最も高い薬物濃度は50μMである。
【０１２０】
試験手順の詳細：
試験はLILIT＝Low Inoculum Long Incubation test（低接種量長時間培養テスト、BrunおよびLun、Vet.Par.52(1994)37-46）に基づいて行なう。
１．96ウェルの横列B〜H、縦列＃2〜10のウェルに完全培地50μlを加える（印付きウェル）。
２．試験する予定の最も高い薬物濃度の2倍を含有する培地75μlを縦列＃11のB〜D（D1）およびF〜H（D2）ウェルに加える。
３．マルチピペットを使って＃11のウェルから＃10のウェルに25μlを移すことによって段階希釈液を調製し、培地の吸引と排出を最低10回行なうことによって混合する。
４．＃5のウェルをから＃4のウェルに25μlを移すまで右から左に向かって希釈を続ける。混合後、残りの25μlを捨てる。各横列の＃2と＃3のウェルは薬物を含まない対照とする。
５．プレートの＃2〜11のB、CおよびF、Gのウェルに、トリパノソーマ懸濁液50μlを4×103/mlの接種密度で加える（200/ウェルにする）。蛍光アッセイ用のバックグラウンド対照としてトリパノソーマを含まないBaltz培地50μlを横列DおよびEの＃2〜11のウェルに加える。
６．37℃、5％CO2で72時間プレートをインキュベートする。
７．倒立顕微鏡でプレートを観察して、MIC（最小発育阻止濃度）、すなわち対照ウェルと比較して正常な形態と運動性を持つトリパノソーマを認めることができなくなる最も低い薬物濃度またはトリパノソーマが生存できなくなる濃度を顕微鏡で決定する。
８．この試験は、BCECF/AMを添加した後の蛍光測定値によって、またはコールターカウンターによる発育阻止評価によって、さらに評価できる。
【０１２１】
Ｂ．結果
以下のデンドリマーを試験した。
【表１】
0004979848.tif 000006
【０１２２】
（i）72時間蛍光アッセイでT.b.rhodesiense（STIB 900）に対して試験した4化合物のインビトロ活性。いずれの化合物も蒸留水に4mg/mlの濃度で溶解した後、完全培養培地に所望の濃度に希釈した。
【表２】
0004979848.tif 000007
MIC＝最小発育阻止濃度（生リパノソーマなし）
MTC＝最大許容濃度（薬物効果なし）。
【０１２３】
（ii）72時間蛍光アッセイでT.b.rhodesiense（STIB 900）に対して試験した5化合物のインビトロ活性。全ての化合物を蒸留水に20μg/mlの濃度で溶解した後、完全培養培地（BMEM＋10％熱非働化ウマ血清）に1：10希釈した。
【表３】
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【０１２４】
II  トリパノソーマ属（T）およびプラスモジウム属（P）の抑制について試験するインビトロアッセイで、以下の測定結果を得た。以下の化合物を試験した。
【表４】
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試験は以下の株を使って行なった。
【表５】
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【０１２５】
結果：（値は全てμg/ml）
【表６】
0004979848.tif 000011
【０１２６】
実施例４０
抗細菌活性の決定
このアッセイに使用した細菌は、
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 29213）
エンテロコッカス-フェカリス（Enterococcus faecalis）（ATCC29212）
大腸菌（Escherichia coli）（ATCC 25922）
である。最小発育阻止濃度（MIC）と最小殺菌濃度（MBC）は、2〜5×104cfu（対数増殖期）の種菌と35℃で24時間および48時間の好気培養とを用いた陽イオン調節ミュラー-ヒントンブロス（pH7）でのマイクロブロスダイルーション法（NCCLS-M7A3 1993）によって決定した。MBCは3logの種菌数減少を示す力価とする。結果を次の表に示す（単位は全てμg/ml）。
【表７】
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MIC＝最小発育阻止濃度
（MBC）＝最小殺菌濃度。
【０１２７】
実施例４１
インビトロのヒト赤血球におけるヒトマラリア寄生虫Plasmodium falciparum（熱帯熱マラリア原虫）の侵入と発育に対するデンドリマーの効果の定量
方法
マラリア原虫：3D7は詳細に特徴づけられたP.falciparumのインビトロ培養適応株である。この寄生虫はヒト赤血球内で発育と複製のサイクルを繰り返す。各サイクルの持続時間は48時間であり、若い環状期寄生虫から始まって、（生活環の最初の24時間で）有色の栄養体を通って分節した分裂前体に成熟し、これが破裂して感染性分裂小体を放出し、それが新たな赤血球にすばやく侵入する。新たに侵入した分裂小体は環状になり、この生活環が繰返される。
【０１２８】
寄生虫培養と発育アッセイ：P.falciparum（3D7株）寄生虫は、確立された方法により、新鮮ヒト赤血球中のインビトロ培養で同期させて維持した。侵入アッセイのために、成熟した有色栄養体を含有する赤血球をゼラチン浮遊法によって精製した後、200赤血球毎にほぼ1つの寄生虫が寄生するように、新しいヒト赤血球に再懸濁した（0.5％寄生虫血）。次に新しい培養培地を加えて、最終赤血球濃度を2×108赤血球/mlにした。
【０１２９】
この赤血球懸濁液の一部（それぞれ95μl）を96ウェルプレートに1対ずつ分注した。試験化合物（BRI2999、BRI6741、BRI2998、BRI7011、BRI6181）またはPBS（対照）を含有する寄生虫培養培地5μlを適切なウェルに加え、そのプレートを37℃、1％O2でインキュベートした。各ウェルから直ちに（時刻＝0）、また培養24時間、48時間および72時間後に、薄層塗沫標本を作成した。各塗沫寄生虫血から、pH7.2でのギムザ染色後の塗沫標本の顕微鏡検査によって、寄生虫成熟段階を定量した。これにより、侵入、寄生虫発育およびその後の再侵入を定量することができた。各試料採取時点で、残りのウェルの培養培地（化合物を含むものまたは含まないもの）を完全に置換した。
【０１３０】
試験化合物はまず滅菌等張リン酸緩衝食塩水（pH7.2）に20mg/mlの濃度に溶解した後、それをさらに希釈して1mg/ml〜200μg/mlの範囲の濃縮原液を作った。原液はアッセイの期間中常に4℃に保存し、必要な時に寄生虫培養培地に適宜希釈した。
【０１３１】
結果
各化合物について独立した侵入/発育実験を行なった。その結果をグラフにして図1〜5に示す。各化合物の効果は10、25および50μg/mlの最終濃度で試験した。上記5種類の化合物は寄生虫の侵入、発育および複製に対してどの濃度でもそれぞれ濃度依存的な抑制効果を示し、抑制の絶対レベルは化合物間で相違した。試験した全ての濃度（最高50μg/mlまで）で、上記5種類の化合物はいずれも、赤血球の形態に明らかに好ましくない影響は与えなかった。BRI7011およびBRI6081を試験した実験（図4および5）では、72時間での対照ウェルにおける寄生虫の再侵入のレベルが通常観察されるレべルより低かった。これは、培養48時間後に寄生虫の発育が明らかに遅延したため、72時間の時点で分裂前体の大部分はまだ破裂して侵入性分裂小体を放出していなかったからである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  インビトロのヒト赤血球におけるP. falciparumの発育に対するBRI2999の効果を表す図。
【図２】  インビトロのヒト赤血球におけるP. falciparumの発育に対するBRI6741の効果を表す図。
【図３】  インビトロのヒト赤血球におけるP. falciparumの発育に対するBRI2998の効果を表す図。
【図４】  インビトロのヒト赤血球におけるP. falciparumの発育に対するBRI7011の効果を表す図。
【図５】  インビトロのヒト赤血球におけるP. falciparumの発育に対するBRI6181の効果を表す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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