(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光導波路表面に測定対象物質と等価的な性質を持つ第１物質を固定化する工程；
前記光導波路表面に被測定検体溶液および被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を同時にもしくは被測定検体溶液を先に滴下して微粒子の第２物質と被測定検体の測定対象物質とを特異的に反応させると共に、光導波路と未反応の微粒子との間で第１、第２の物質を特異的に反応させて前記光導波路表面に前記微粒子を固定化する工程；
前記光導波路に光を入射させ、前記光導波路表面に固定化された前記微粒子によって前記光を散乱および吸収させる工程；および
前記光の散乱および吸収による光強度の変化を検出し、この光強度の変化に基づいて前記測定対象物質の濃度を測定する工程；
を含むことを特徴とする物質の測定方法。
【請求項２】
光導波路表面に被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質を固定化する工程；
前記光導波路表面に被測定検体溶液および前記第１物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を滴下して光導波路の第１物質と被測定検体の測定対象物質とを特異的に反応させると共に、光導波路の第１物質と微粒子の第２物質とを特異的に反応させて前記光導波路表面に前記微粒子を固定化する工程；
前記光導波路に光を入射させ、前記光導波路表面に固定化された前記微粒子によって前記光を散乱および吸収させる工程；および
前記光の散乱および吸収による光強度の変化を検出し、この光強度の変化に基づいて前記測定対象物質の濃度を測定する工程；
を含むことを特徴とする物質の測定方法。
【請求項３】
光導波路表面に被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質を固定化する工程；
前記光導波路表面に被測定検体溶液を滴下して光導波路の第１物質と被測定検体の測定対象物質とを特異的に反応させる工程；
前記光導波路表面に前記第１物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を滴下して光導波路の第１物質と微粒子の第２物質とを特異的に反応させて前記光導波路表面に前記微粒子を固定化する工程；
前記光導波路に光を入射させ、前記光導波路表面に固定化された前記微粒子によって前記光を散乱および吸収させる工程；および
前記光の散乱および吸収による光強度の変化を検出し、この光強度の変化に基づいて前記測定対象物質の濃度を測定する工程；
を含むことを特徴とする物質の測定方法。
【請求項４】
前記測定対象物質が抗原で、前記光導波路表面および前記微粒子に固定化された前記抗原と特異的に反応する第１、第２物質が抗体であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の物質の測定方法。
【請求項５】
前記光導波路は、厚さ３〜３００μmの有機系樹脂であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の物質の測定方法。
【請求項６】
前記微粒子は、有機系樹脂ビーズであることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の物質の測定方法。
【請求項７】
前記微粒子は、貴金属コロイドであることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の物質の測定方法。
【請求項８】
前記微粒子は、前記光導波路に入射させる前記光の波長に基づいて前記光を吸収する色に着色されていることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗原抗体反応を利用した免疫測定システムにおいては、通常、被測定検体中のタンパク質等に対応する一次抗体をウエル状の基材表面に固定化し、そのウエル内に各々所定量の被測定検体溶液、二次抗体液、発色試薬、それぞれに対する所定の洗浄液を、測定者が秤量しつつ加え、かつ排出するという複雑な手順で行われている。この免疫測定システムにおいて、被測定検体の容量は５μＬ〜２５μＬ程度必要である。
【０００３】
一方、本出願人が出願した特許文献１には必要最小の被測定検体の量が１μＬである上、被測定検体の容量が不正確でも被測定検体の測定対象物質の濃度測定が可能な濃度測定方法、センサチップが開示されている。
【特許文献１】ＷＯ２００５／０２２１５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前述した特許文献１の発明をさらに改良し、より短時間で測定対象物質を定量測定することが可能な物質の測定方法を提供しようとするものである。
【０００５】
また本発明は、前述した特許文献１の発明をさらに改良し、より短時間で測定対象物質を定量測定することが可能な物質測定用キットを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１態様によると、光導波路表面に測定対象物質と等価的な性質を持つ第１物質を固定化する工程；
前記光導波路表面に被測定検体溶液および被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を同時にもしくは被測定検体溶液を先に滴下して微粒子の第２物質と被測定検体の測定対象物質とを特異的に反応させると共に、光導波路と未反応の微粒子との間で第１、第２の物質を特異的に反応させて前記光導波路表面に前記微粒子を固定化する工程；
前記光導波路に光を入射させ、前記光導波路表面に固定化された前記微粒子によって前記光を散乱および吸収させる工程；および
前記光の散乱および吸収による光強度の変化を検出し、この光強度の変化に基づいて前記測定対象物質の濃度を測定する工程；
を含むことを特徴とする物質の測定方法が提供される。
【０００７】
本発明の第２態様によると、光導波路表面に被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質を固定化する工程；
前記光導波路表面に被測定検体溶液および前記第１物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を滴下して光導波路の第１物質と被測定検体の測定対象物質とを特異的に反応させると共に、光導波路の第１物質と微粒子の第２物質とを特異的に反応させて前記光導波路表面に前記微粒子を固定化する工程；
前記光導波路に光を入射させ、前記光導波路表面に固定化された前記微粒子によって前記光を散乱および吸収させる工程；および
前記光の散乱および吸収による光強度の変化を検出し、この光強度の変化に基づいて前記測定対象物質の濃度を測定する工程；
を含むことを特徴とする物質の測定方法が提供される。
本発明の第３態様によると、光導波路表面に被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質を固定化する工程；
前記光導波路表面に被測定検体溶液を滴下して光導波路の第１物質と被測定検体の測定対象物質とを特異的に反応させる工程；
前記光導波路表面に前記第１物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を滴下して光導波路の第１物質と微粒子の第２物質とを特異的に反応させて前記光導波路表面に前記微粒子を固定化する工程；
前記光導波路に光を入射させ、前記光導波路表面に固定化された前記微粒子によって前記光を散乱および吸収させる工程；および
前記光の散乱および吸収による光強度の変化を検出し、この光強度の変化に基づいて前記測定対象物質の濃度を測定する工程；
を含むことを特徴とする物質の測定方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、より短時間で、測定対象物質を定量測定することが可能な物質の測定方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態に係る物質の測定方法および物質測定用キットを詳細に説明する。
【００１４】
（第１実施形態）
まず、光導波路の一例として平面光導波路を用い、この平面光導波路表面に被測定検体の測定対象物質と等価的な性質を持つ第１物質を固定化する。
【００１５】
ここで測定対象物質としては、例えば血液、血清、血漿、生体試料、食品等の中に含まれる蛋白質、ペプチド、遺伝子等が挙げられる。具体的には、例えば、インスリン、カゼイン、β―ラクトグロブリン、オボアルブミン、カルシトニン、Ｃ−ペプチド、レプチン、β−２−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク、α−１−ミクログロブリン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニン−Ｉ、クルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因子、上皮増殖因子、コルチゾール、トリヨードサイロニン、サイロキシン等のハプテンホルモン、ジゴキシン、テオフィリン等の薬物、細菌、ウイルス等の感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥの他、そばの主要タンパク質複合体、落花生のＡｒａｈ２を含む可溶性タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、以下の第２実施形態から第５実施形態における測定対象物質も同様なものが用いられる。
【００１６】
平面光導波路は、例えば、フェノール樹脂、エポキシ樹脂のような熱硬化性樹脂または無アルカリガラスから形成することができる。詳細には、ここで用いる材料とは、所定の光の透過性を有する材料であって、特に、ポリスチレンを主たる構造とするエポキシ樹脂等であることが好ましい。平面光導波路への被測定検体の測定対象物質と等価的な第１物質の固定化は、例えば平面光導波路の疎水性相互作用により固定化する。
【００１７】
なお、被測定検体の測定対象物質と等価的な第１物質は、前記測定対象物質と同一物質であってもよい。
【００１８】
次いで、前記平面光導波路表面に被測定検体溶液および被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を同時にもしくは被測定検体溶液を先に滴下して微粒子の第２物質と被測定検体の測定対象物質とを特異的に反応させると共に、平面光導波路と未反応の微粒子との間で第１、第２の物質を特異的に反応させ、光導波路表面に固定化された微粒子によるエバネッセント光の変化を検出する。
【００１９】
微粒子は、例えばラテックスビーズのような樹脂ビーズもしくは金コロイドのような貴金属コロイド、または酸化チタン粒子のような無機酸化物粒子等を用いることができる。特に、ラテックスビーズ、貴金属コロイドが好ましい。ラテックスビーズ中で、後述する光導波路を伝播させる光が赤色レーザの場合、青色ラテックスビーズが好ましい。
【００２０】
微粒子は、５０ｎｍ〜１０μｍの径を有することが好ましい。
【００２１】
微粒子への被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質の固定化は、例えば物理吸着またはカルボキシル基、アミノ基を介した化学結合により行うことができる。
【００２２】
このような第１実施形態において、被検体溶液および微粒子の分散液を平面光導波路に滴下する際、被検体溶液に測定対象物質が含まれていないと、平面光導波路の第１物質に対して微粒子の第２物質が特異的に反応して微粒子が平面光導波路表面に固定化され、エバネッセント光の微粒子による吸収または散乱が大きくなり、結果として測定される光強度の低下率が大きくなる。
【００２３】
一方、被検体溶液および微粒子の分散液を平面光導波路に滴下する際、被検体溶液に測定対象物質が含まれていると、被検体溶液の測定対象物質と微粒子の第２物質とが特異的に反応し、平面光導波路の第１物質と特異的に反応する微粒子の第２物質の量が少なくなる。その結果、平面光導波路表面に固定化される微粒子の量が少なくなり、エバネッセント光の微粒子による吸収または散乱が被検体溶液に測定対象物質が含まれていない（またはその測定対象物質の量が少ない）場合に比べて小さくなり、測定される光強度の低下率が小さくなる。したがって、光強度の低下率に基づいて測定対象物質の濃度を測定することが可能になる。
【００２４】
次に、第１実施形態に係る物質の測定方法を図１に示す光導波路型センサチップおよび図２の（Ａ）〜（Ｃ）を参照して具体的に説明する。
【００２５】
図１において、例えば屈折率１．５２の無アルカリガラス基板１の主面の両端部には入射側グレーティング２ａおよび出射側グレーティング２ｂが設けられている。これらのグレーティング２ａ，２ｂは、例えば屈折率が２．２〜２．４である酸化チタンをスパッタリングにより厚さ５０ｎｍの酸化チタン膜を成膜し、リソグラフィーとドライエッチングにより形成することができる。グレーティング２ａ，２ｂは、酸化チタン（ＴｉＯ2）の他に、酸化錫（ＳｎＯ2）、酸化亜鉛、ニオブ酸リチウム、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、ポリイミド等から形成することができる。例えばエポキシ樹脂、またはフェノール樹脂のような熱硬化性樹脂からなる厚さが３０μｍで、屈折率は１．５６の平面光導波路３は、グレーティング２ａ，２ｂを含む基板１主面に形成されている。この平面光導波路３は、例えば熱硬化性樹脂をスピンコートおよび焼成により形成することができる。例えば市販されている旭硝子株式会社製のサイトップ（登録商標）のポリ（パーフルオロブテニルビニルエーテル）のような屈折率が１．３４の低屈折率樹脂膜４が、平面光導波路３上に被覆されている。低屈折率樹脂膜４には、グレーティング２ａ，２ｂ間に位置する平面光導波路３の一部が露出するよう開口して例えば矩形状の反応ホール５を形成している。このような反応ホール５を有する低屈折率樹脂膜４は、例えば低屈折率樹脂溶液を平面光導波路３上にスクリーン印刷し、乾燥することにより形成することができる。枠状のセル壁６は、平面光導波路３を露出させる反応ホール５を囲むように低屈折率樹脂膜４上に形成されている。なお、図１に示す光導波路型センサチップにおいて反応ホール５に露出する平面光導波路３でのエバネッセント光の変化を測定するために入射側グレーティング２ａに光を入射させるレーザ発振器（例えば赤色レーザダイオード）２１を設置し、出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する光電変換素子（フォトダイオード）２２を設置する。
【００２６】
また、赤色レーザダイオードから放射される波長６５５ｎｍのレーザ光を吸収する粒径２１０ｎｍの青色ラテックスビーズの表面に抗インスリン抗体を固定化し、水に分散して青色ラテックスビーズの分散液を調製した。
【００２７】
図１および図２の（Ａ）に示すように反応ホール５から露出する平面光導波路３表面に被測定検体の測定対象物質と等価的な性質を持つ第１物質（タンパク質であるラットインスリン）１１を疎水性相互作用により固定化する。
【００２８】
次いで、反応ホール５内の平面光導波路３表面に被測定検体溶液および予め調製した青色ラテックスビーズの分散液を滴下する。このとき、滴下した被測定検体溶液中にラテックスビーズの抗インスリン抗体と特異的に反応する測定対象物質（ラットインスリン）が存在しないと、図２の（Ｂ）に示すように反応ホール５内の溶液１２においてラテックスビーズ１３の抗インスリン抗体１４は平面光導波路３表面のラットインスリン１１と特異的な反応により結合する。
【００２９】
被測定検体溶液およびラテックスビーズ１３の分散液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、ラテックスビーズ１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、ラテックスビーズ１３がエバネッセント光領域に存在することになる。すなわち、ラテックスビーズ１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度の減衰が起きる。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化されたラテックスビーズ１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。
【００３０】
一方、滴下した被測定検体溶液中にラットインスリンが存在すると、図２の（Ｃ）に示すようにラットインスリン１５は同時に滴下した分散液中のラテックスビーズ１３の抗インスリン抗体１４と特異的に反応して結合する。すなわち、ラテックスビーズ１３はその抗インスリン抗体１４が被測定検体溶液中のラットインスリン１５と特異的に反応するため、平面光導波路３表面のラットインスリン１１との特異的な反応、結合の割合が減少し、平面光導波路３表面に対して固定化されるラテックスビーズ１３の量が低下する。
【００３１】
被測定検体溶液およびラテックスビーズ１３の分散液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、ラテックスビーズ１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、前述したように出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化された微粒子１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。ただし、平面光導波路３表面に対して固定化されるラテックスビーズ１３の量は被測定検体溶液中にラットインスリンが存在しない場合に比べて少なくなるため、レーザ光強度の低下率が小さくなる。
【００３２】
このようにフォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、平面光導波路３表面に対して固定化されるラテックスビーズ１３の量に比例するものの、固定化されるラテックスビーズ１３の量はラテックスビーズ１３の抗インスリン抗体との反応に関与する被測定検体溶液中のラットインスリン濃度に反比例する。
【００３３】
したがって、ラットインスリン濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、ラットインスリン濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中のラットインスリン濃度を測定できる。
【００３４】
以上、第１実施形態によれば洗浄作業を必要とせず、平面光導波路表面に被測定検体の測定対象物質と等価的な性質を持つ第１物質を固定化する操作、被測定検体溶液の滴下、微粒子の分散液の滴下の３回の操作、つまり短時間かつ迅速な操作で被測定検体の測定対象物質の濃度を定量することが可能な被測定検体の測定対象物質の測定方法を提供することができる。
【００３５】
なお、第１実施形態において被測定検体溶液を先に平面光導波路に滴下し、この後微粒子の分散液を平面光導波路に滴下しても同様に測定対象物の濃度測定を行うことができる。
【００３６】
（第２実施形態）
まず、光導波路の一例として平面光導波路を用い、この平面光導波路表面に被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質を固定化する。
【００３７】
次いで、前記平面光導波路表面に被測定検体溶液および前記第１物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を滴下して平面光導波路の第１物質と被測定検体の測定対象物質とを特異的に反応させると共に、平面光導波路の第１物質と微粒子の第２物質とを特異的に反応させ、光導波路表面に固定化された微粒子によるエバネッセント光の変化を検出する。
【００３８】
平面光導波路、微粒子は、前記第１実施形態と同様なものを用いることができる。
【００３９】
このような第２実施形態において、被検体溶液および微粒子の分散液を平面光導波路に滴下する際、被検体溶液に測定対象物質が含まれていないと、平面光導波路の第１物質に対して微粒子の第２物質が特異的に反応して微粒子が平面光導波路表面に固定化され、エバネッセント光の微粒子による吸収または散乱が大きくなり、結果として測定される光強度の低下率が大きくなる。
【００４０】
一方、被検体溶液および微粒子の分散液を平面光導波路に滴下する際、被検体溶液に測定対象物質が含まれていると、平面光導波路の第１物質と被検体溶液の測定対象物質とが特異的に反応し、微粒子に固定化された第２物質は平面光導波路の第１物質に特異的に反応する量が抑えられ、微粒子の平面光導波路に固定化される量が被検体溶液に測定対象物質が含まれていない（または測定対象物質の量が少ない場合）に比べて低下する。すなわち、平面光導波路表面に固定化される微粒子の量が少なくなり、エバネッセント光の微粒子による吸収または散乱が被検体溶液に測定対象物質が含まれていない（またはその測定対象物質の量が少ない）場合に比べて小さくなり、測定される光強度の低下率が小さくなる。したがって、光強度の低下率に基づいて測定対象物質の濃度を測定することが可能になる。
【００４１】
次に、第２実施形態に係る被測定検体の測定対象物質の測定方法を図３に示す光導波路型センサチップおよび図４の（Ａ）〜（Ｃ）を参照して具体的に説明する。なお、図３に示す光導波路型センサチップ構造は第１実施形態で説明した図１のセンサチップと同様で、反応ホール５に露出する平面光導波路３でのエバネッセント光の変化を測定するために入射側グレーティング２ａに光を入射させるレーザ発振器（例えば赤色レーザダイオード）２１を設置し、出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する光電変換素子（フォトダイオード）２２を設置する。また、赤色レーザダイオードから放射される波長６５５ｎｍのレーザ光を吸収する粒径２１０ｎｍの青色ラテックスビーズの表面に、抗インスリン抗体の抗体である第２物質（抗ＩｇＧ抗体）を固定化し、水に分散して青色ラテックスビーズの分散液を調製した。
【００４２】
まず、図３および図４の（Ａ）に示すように反応ホール５から露出する平面光導波路３表面に被測定検体の測定対象物質（例えば、ラットインスリン）の抗体である第１物質（抗インスリン抗体）１６を疎水性相互作用により固定化する。
【００４３】
次いで、反応ホール５内の平面光導波路３表面に被測定検体溶液および予め調製した抗ＩｇＧ抗体が固定化された青色ラテックスビーズの分散液を滴下する。このとき、滴下した被測定検体溶液中に測定対象物質（例：ラットインスリン）が存在しないと、図４の（Ｂ）に示すように反応ホール５内の溶液１２においてラテックスビーズ１３の抗ＩｇＧ抗体１７は平面光導波路３表面の抗インスリン抗体１６と特異的な反応により結合する。
【００４４】
被測定検体溶液およびラテックスビーズ１３の分散液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、ラテックスビーズ１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、ラテックスビーズ１３がエバネッセント光領域に存在することになる。すなわち、ラテックスビーズ１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度の減衰が起きる。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化されたラテックスビーズ１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。
【００４５】
一方、滴下した被測定検体溶液中にラットインスリンが存在すると、図４の（Ｃ）に示すようにラットインスリン１５は表面光導波路３に固定された抗インスリン抗体１６と特異的な反応により結合する。その結果、ラテックスビーズ１３の抗ＩｇＧ抗体１７と平面光導波路３表面の抗インスリン抗体１６との特異的な反応、結合の割合が減少し、平面光導波路３表面に対して固定化されるラテックスビーズ１３の量が低下する。
【００４６】
被測定検体溶液およびラテックスビーズ１３の分散液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、ラテックスビーズ１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、前述したように出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化された微粒子１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。ただし、平面光導波路３表面に対して固定化されるラテックスビーズ１３の量は被測定検体溶液中にラットインスリンが存在しない場合に比べて少なくなるため、レーザ光強度の低下率が小さくなる。
【００４７】
このようにフォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、平面光導波路３表面に対して固定化されるラテックスビーズ１３の量に比例するものの、固定化されるラテックスビーズ１３の量は平面光導波路３の抗インスリン抗体１６との特異的な反応に関与する被測定検体溶液中のラットインスリン濃度に反比例する。
【００４８】
したがって、ラットインスリン濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、ラットインスリン濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中のラットインスリン濃度を測定できる。
【００４９】
以上、第２実施形態によれば洗浄作業を必要とせず、平面光導波路表面に被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質を固定化する操作、被測定検体溶液および微粒子の分散液の滴下の２回の操作、つまり短時間かつ迅速な操作で被測定検体の測定対象物質の濃度を定量することが可能な被測定検体の測定対象物質の測定方法を提供することができる。
【００５０】
なお、第２実施形態において被測定検体溶液を先に平面光導波路に滴下しして平面光導波路の第１物質と被測定検体の測定対象物質とを特異的に反応させ、この後微粒子の分散液を平面光導波路に滴下して測定対象物と特異的に反応されない平面光導波路の第１物質と微粒子の第２物質とを特異的に反応させて微粒子を平面光導波路に固定してもよい。この方法によれば、被測定検体溶液および微粒子の分散液を同時に滴下する方法に比べてより正確な測定対象物質の濃度定量が可能になる。
【００５１】
（第３実施形態）
第３実施形態に係る被測定検体の測定対象物質測定用キットは光導波路型センサチップと被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定された微粒子の分散液を収容した包装体とを組み合わせた構成を有する。光導波路型センサチップには、光導波路の一例として平面光導波路が用いられており、この平面光導波路に所望のギャップをあけて対向して配置され、被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質がその対向面に固定化された構造体とを備える。
【００５２】
平面光導波路、微粒子は、前記第１実施形態と同様なものを用いることができる。
【００５３】
次に、前記被測定検体の測定対象物質測定用キット使用による被測定検体の測定対象物質の測定方法を説明する。
【００５４】
平面光導波路と構造体の間のギャップで形成された測定域に被検体溶液および包装体内の微粒子の分散液を供給し、構造体の第１物質と微粒子の第２物質とを被検体溶液の測定対象物質を介して特異的に反応させると共に、この反応に関与しない残りの微粒子を平面光導波路表面に吸着させ、光導波路表面の微粒子によるエバネッセント光の変化を検出する。
【００５５】
このような方法において、被検体溶液および微粒子の分散液を平面光導波路と構造体の間の測定域に供給する際、被検体溶液に測定対象物質が含まれていないと、平面光導波路に供給した微粒子が物理的に吸着され、エバネッセント光の微粒子による吸収または散乱が大きくなり、結果として測定される光強度の低下率が大きくなる。
【００５６】
一方、被検体溶液および微粒子の分散液を平面光導波路と構造体の間の測定域に供給する際、被検体溶液に測定対象物質が含まれていると、構造体の第１物質と微粒子の第２物質とを被検体溶液の測定対象物質を介して特異的に反応し、平面光導波路と物理的に吸着する微粒子の量が少なくなる。すなわち、平面光導波路表面に吸着される微粒子は前記測定対象物質との特異的な反応で構造体側に固定された微粒子量に相当する量低下し、エバネッセント光の微粒子による吸収または散乱が被検体溶液に測定対象物質が含まれていない（またはその測定対象物質の量が少ない）場合に比べて小さくなり、測定される光強度の低下率が小さくなる。したがって、光強度の低下率に基づいて測定対象物質の濃度を測定することが可能になる。
【００５７】
なお、第３実施形態において被測定検体溶液を先に平面光導波路に滴下し、この後微粒子の分散液を平面光導波路に滴下しても同様に測定対象物の濃度測定を行うことができる。
【００５８】
次に、第３実施形態に係る被測定検体の測定対象物質測定用キットを図５を参照して具体的に説明する。
【００５９】
図５に示す光導波路型センサチップは、第１実施形態で説明したセンサチップと同様にガラス基板１、入射側、出射側のグレーティング２ａ，２ｂ、平面光導波路３、反応ホール５を有する低屈折率樹脂膜４および枠状のセル壁６を備える。例えば有機系樹脂からなる構造体７は、枠状のセル壁６に固定されている。構造体７は、反応ホール５と対向する面（下面）に凹凸８が形成されている。なお、露出する平面光導波路３と構造体７の間のギャップには、前記反応ホール５を含む測定域９が形成される。被測定検体溶液および微粒子の分散液を導入・排出するための穴（図示せず）がその上面から枠状のセル壁６の内面近傍の測定域９に向かって穿設されている。被測定検体の測定対象物質（例えばラットインスリン）と特異的に反応する第１物質（例えば抗インスリン抗体）１８は、構造体７の凹凸８面に固定化されている。
【００６０】
被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質（抗インスリン抗体）が固定化された微粒子（例えば青色ラテックスビーズ）の分散液を収容した例えばポリエチレン製の包装体（図示せず）は、前記光導波路型センサチップと組み合わされてキットを構成している。
【００６１】
次に、前述したキットを使用して被測定検体の測定対象物質の測定方法を図６の（Ａ）〜（Ｃ）を参照して説明する。なお、図５に示す光導波路型センサチップにおいて測定域に露出する平面光導波路でのエバネッセント光の変化を測定するために入射側グレーティング２ａに光を入射させるレーザ発振器（例えば赤色レーザダイオード）２１を設置し、出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する光電変換素子（フォトダイオード）２２を設置する。
【００６２】
まず、図５および図６の（Ａ）に示すように構造体７の凹凸８の面に被測定検体の測定対象物質（例えばラットインスリン）と特異的に反応する例えば抗インスリン抗体１８を固定化した光導波路型センサチップを用意する。
【００６３】
次いで、被測定検体溶液および包装体中の青色ラテックスビーズの分散液を構造体７の穴（図示せず）を通して測定域９内に供給する。このとき、供給した被測定検体溶液中に構造体７の凹凸８面の抗インスリン抗体１８と特異的に反応する測定対象物質（ラットインスリン）が存在しないと、図６の（Ｂ）に示すように測定域９内の溶液において抗インスリン抗体１４が固定化されたラテックスビーズ１３は平面光導波路３表面に物理的に吸着する。
【００６４】
被測定検体溶液およびラテックスビーズ１３の分散液の供給直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、ラテックスビーズ１３が平面光導波路３表面に吸着されているため、ラテックスビーズ１３がエバネッセント光領域に存在することになる。すなわち、ラテックスビーズ１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度の減衰が起きる。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化されたラテックスビーズ１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。
【００６５】
一方、供給した被測定検体溶液中にラットインスリンが存在すると、図６の（Ｃ）に示すように構造体７の凹凸８面の抗インスリン抗体１８とラテックスビーズ１３の抗インスリン抗体１４とがラットインスリン１５を介して特異的に反応して結合する。すなわち、ラテックスビーズ１３はその抗インスリン抗体１４が被測定検体溶液中のラットインスリン１５を介して構造体７の凹凸８面の抗インスリン抗体１８と特異的に反応、固定化されるため、平面光導波路３表面に物理的に吸着する量が低下する。
【００６６】
被測定検体溶液およびラテックスビーズ１３の分散液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、ラテックスビーズ１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、前述したように出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化されたラテックスビーズ１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。ただし、平面光導波路３表面に吸着されるラテックスビーズ１３の量は被測定検体溶液中にラットインスリンが存在しない場合に比べて少なくなるため、レーザ光強度の低下率が小さくなる。
【００６７】
このようにフォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、平面光導波路３表面に吸着されるラテックスビーズ１３の量に比例するものの、吸着されるラテックスビーズ１３の量はラテックスビーズ１３の抗インスリン抗体１４と構造体７の凹凸８面の抗インスリン抗体１８との間の反応に関与する被測定検体溶液中のラットインスリン濃度に反比例する。
【００６８】
したがって、ラットインスリン濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、ラットインスリン濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中のラットインスリン濃度を測定できる。
【００６９】
以上、第３実施形態の被測定検体の測定対象物質測定用キットおよびこのキットの使用による測定対象物質の測定方法によれば、洗浄作業を必要とせず、平面光導波路表面が露出する測定域への被測定検体溶液の虚球および微粒子の分散液の供給の最大２回の操作、つまり短時間かつ迅速な操作で被測定検体の測定対象物質の濃度を定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】第１実施形態における物質の測定に用いられる光導波路型センサチップを示す断面図。
【図２】第１実施形態における物質の測定工程を示す概略図。
【図３】第２実施形態における物質の測定に用いられる光導波路型センサチップを示す断面図。
【図４】第２実施形態における物質の測定工程を示す概略図。
【図５】第３実施形態の物質測定用キットの光導波路型センサチップを示す断面図。
【図６】第３実施形態における物質の測定工程を示す概略図。
【符号の説明】
【００７１】
１…ガラス基板、２ａ，２ｂ…グレーティング、３…平面光導波路、５…反応ホール、７…構造体、９…測定域、１１…ラットインスリン、１３…青色ラテックスビーズ、１４，１７，１８…抗ＩｇＧ抗体、１５…測定対象物質（例：ラットインスリン）、１６…抗インスリン抗体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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