(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i) 以下のものからなる群より選択される酵素と：
(a) ホスファチジルイノシトールを含む結合を切断する、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI-PLC)及びホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼD(PI-PLD)から選択される酵素、および
(b) マンナナーゼ
(ii) 該酵素の生理学的に許容できる担体と
を含んでなる組成物であって、経口投与に適した形態であり、かつ、該酵素がマンナナーゼを含む場合該マンナナーゼは該組成物中に存在する唯一の抗感染剤であり、かつ、該組成物は家禽もしくはブタから選択される肉生産動物のための飼料であることを特徴とする上記組成物。
【請求項２】
上記酵素は、上記組成物中に存在する唯一の抗感染剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記酵素が、結合を切断することにより、細胞表面タンパク質を放出させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記酵素が、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼD(PI-PLD)である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記酵素が、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI-PLC)である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
上記酵素が、マンナナーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
上記マンナナーゼが、ATCC 55045と称するバシラス・レンツス（Bacillus lentus）により生産されるエンド-1,4-β-D-マンナナーゼである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記酵素が、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）株から調製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
上記バシラス・セレウス株が、ATCC 7004またはATCC 6464である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
上記酵素が、宿主生物における組換えDNAの発現により得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
上記宿主生物が、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）株に由来する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
安定剤、炭水化物担体または防腐剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
上記安定剤が、バッファー、炭水化物またはグリコールである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
上記炭水化物担体が、キシロース、フルクトース、グルコース、ソルビトールおよびマルトトリオースからなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
上記防腐剤が、プロピルパラベン、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムおよびパルミチン酸アスコルビルからなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
上記動物飼料が、穀物材料、タンパク質源、ビタミン、アミノ酸、およびミネラルをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
上記穀物材料が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギまたはオート麦である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
上記タンパク質源が、インゲンマメまたはエンドウである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
上記酵素が飼料１kg当たり200 IU〜4000 IU存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
上記酵素が飼料１ポンドあたり３ U〜90 U存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
上記酵素が飼料１ポンドあたり３ U、10 U、30 U、または90 Uからなる群より選択される量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
消化管の感染を治療する、またはその危険性を改善するための経口投与剤形の医薬の製造における、(i) 以下のものからなる群より選択される酵素と：
(a) ホスファチジルイノシトールを含む結合を切断する、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI-PLC)及びホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼD(PI-PLD)から選択される酵素、および
(b) マンナナーゼ
(ii) 該酵素の生理学的に許容できる担体と
を含んでなる組成物の使用であって、該酵素がマンナナーゼを含む場合、該マンナナーゼは該医薬中に存在する唯一の抗感染剤である、上記使用。
【請求項２３】
上記医薬が、ウイルス、原生動物、細菌、酵母または真菌病原体によって引き起こされる感染を治療するためのものである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
上記医薬が、アイメリア（Eimeria）属の原生動物病原体によって引き起こされる感染を治療するためのものである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
上記医薬が、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）属の原生動物病原体によって引き起こされる感染を治療するためのものである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
上記医薬が、クロストリジウム（Clostridium）属の細菌病原体によって引き起こされる感染を治療するためのものである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
上記医薬が、抗菌有効量の唯一の抗感染剤として使用するためのものである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２８】
上記医薬が、固体製剤または液体製剤として提供される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２９】
上記医薬が、錠剤またはゼラチンカプセルシェル中に含まれる、請求項２２に記載の使用。
【請求項３０】
(i) 以下のものからなる群より選択される酵素と：
(a) ホスファチジルイノシトールを含む結合を切断する、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI-PLC)及びホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼD(PI-PLD)から選択される酵素、および
(b) マンナナーゼ
(ii) 該酵素の生理学的に許容できる担体と
を含んでなる組成物であって、経口投与に適した形態であり、かつ、該酵素がマンナナーゼを含む場合該マンナナーゼは該組成物中に存在する唯一の抗感染剤であり、かつ、該組成物が家禽もしくはブタから選択される肉生産動物のための飼料添加剤であることを特徴とする上記組成物。
【請求項３１】
上記酵素は、上記組成物中に存在する唯一の抗感染剤である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
上記酵素が、結合を切断することにより、細胞表面タンパク質を放出させる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
上記酵素が、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼD(PI-PLD)である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
上記酵素が、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI-PLC)である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
上記酵素が、マンナナーゼである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３６】
上記マンナナーゼが、ATCC 55045と称するバシラス・レンツス（Bacillus lentus）により生産されるエンド-1,4-β-D-マンナナーゼである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
上記酵素が、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）株から調製される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３８】
上記バシラス・セレウス株が、ATCC 7004またはATCC 6464である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
上記酵素が、宿主生物における組換えDNAの発現により得られる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４０】
上記宿主生物が、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）株に由来する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
安定剤、炭水化物担体または防腐剤をさらに含む、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
上記安定剤が、バッファー、炭水化物またはグリコールである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
上記炭水化物担体が、キシロース、フルクトース、グルコース、ソルビトールおよびマルトトリオースからなる群より選択される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
上記防腐剤が、プロピルパラベン、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムおよびパルミチン酸アスコルビルからなる群より選択される、請求項４１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、消化管感染の治療もしくはその危険性の低減を目的とした、抗感染剤として酵素を含む組成物、ならびに、該酵素を用いる方法に関する。
【０００２】
発明の背景
世界人口推定および予測1998年改訂版で、国際連合経済社会局人口部門（United Nations Department of Economic and Social Affairs Population Division）は、1999年に世界の人口が60億人に達すると予測した。また、この報告書では、人口が10億人から20億人に達するまでに123年を要したのに対し、50億人から60億人に増加するまでにわずか12年しかかからなかったことについても述べている。21世紀中頃までに、人口は、73〜107億人に達することが予測されている。過去10年の著しい人口増加は、部分的には、技術の応用および集中的な食料生産の実施による効率的な食料生産の増大に起因する。将来の人口増加に備え、遅れをとらないためには、さらに効率的な食料生産の増大が求められるであろう。
【０００３】
食肉生産をさらに効率的にした一手法は、動物の飼料に、抗菌剤および抗生物質を広く使用するものであった。大規模な飼育場では、密集した生産条件下で、感染の広がりが非常に速い。従って、これらの物質の予防的および治療的使用により、疾病の蔓延を抑制する。例えば、コクシジウム感染を抑制するために動物の飼料に化学物質（例えば、サリノマイシン、モネンシン、ロキサルソン（3-ニトロ）、ハルキノール、カルバドックスおよびオラキンドックス）ならびに、抗菌抗生物質（例えば、バシトラシン、バージニアマイシン、チロシン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、ペニシリン、オレアンドマイシン、ノボビオシン、リンコマイシン、バンベルマイシン、アプラマイシン、スピラマイシン、エリスロマイシン、ネオマイシンなど）を添加するのは一般的に実施されている。この実施は、成長を促進し、飼料変換を高めることがよく知られている。
【０００４】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）およびヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のようなヒト病原体に多重抗生物質耐性が発生し、飼育場の動物に含まれる微生物で表われた抗生物質耐性が、転移性薬剤耐性因子を介して、ヒト病原体へと移動し得るという恐れが生じてきた。抗生物質を与えた動物は、転移性耐性因子を有する細菌源となることが証明されている。Hooge, Feedstuffs 71(20):59, 1999を参照のこと。動物とヒトでは用いられる抗生物質は一般に異なるが、作用機構には類似点があり、これによって、交差耐性が生じる可能性がある。一例として、フルロキノロンは、いくつかの動物で大腸菌感染（大腸菌症）を抑制することが認められており、ヒトの医薬でも用いられている。Hooge（前掲）。近年、FDA/CVMは、フルオロキノロン耐性キャンピロバクターの発生およびヒトへの転移により、家禽に対するフルロキノロンエンロフロキサシンの使用の承認を取り消すことを申し出た。Murhead, S. Feedstuffs 72(45):1-4, 2000。
【０００５】
また、食肉生産業では、飼料への抗生物質および抗菌剤の使用が禁止されれば、収率損失や、動物疾病の復活が起こるのではないかという懸念もある。1986年に、例えば、スエーデンが、飼料抗生物質の使用を禁止したところ、動物の疾病が増加した。これにより、治療用の抗生物質の使用が増加したため、抗生物質の使用の全体的増加および食肉用動物生産コストの増加を招いた。Smith, Feedstuffs 71(13):1, 1999を参照。1998年12月には、EU閣僚会議（Council of Ministers）は、以前、飼料用成長促進剤の中でも処方箋を免除されるものとして承認されていた６種の抗菌剤の使用を中止することを決定した（Official Journal of the European Communities 29.12.98、指令70/524に関する会議規則No. 2821/98号）。また、２種のキノキサリンに基づく添加剤も、食肉中の残留物に関する懸念から、1999年８月に禁止された。このような措置の実行により、以前抑制されていた下記を含む症状の有病率が増加した：ブロイラーの壊死性腸炎；子ブタにおけるウェルチ菌（Clostridium perfringens）による腸炎；ブタにおける赤痢およびスピロヘータ性下痢；ならびに、大腸菌に関連する下痢。Miller, United States Animal Health Association, 1999 Proceedings “Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective”を参照。
【０００６】
耐性病原体の院内感染により年間30,000人のヒトが死亡しているが、食品発生病原体による死亡はこれよりはるかに少ない。食品発生病原体による死亡のいずれも、抗生物質耐性と関連づけられたことはなかった（Smith、前掲参照）。従って、食肉生産業による抗生物質の使用が、ヒトにおける院内感染の薬剤耐性病原体問題に寄与しているかどうかについては不明である。別の懸念は、耐性病原体による感染を治療するための新しい抗生物質がないことである。Henry, C.M., Chemical and Engineering News, March 6, 2000, pp 41-58を参照。つまり、有意な抗生物質耐性病原体が発生すると、その感染を治療するのに使用できる新しい抗生物質が存在しない可能性があるということである。抗生物質開発の難しさ、市場規模、および規制問題などにより、大手製薬会社の研究開発の焦点を、特に、動物用途の抗生物質開発から遠ざけてしまったようだ。動物用薬物を登録するための、新たに提案された規則は、あまりに難しく、開発がストップしている状態である。Smith（前掲）参照。しかし、新しい抗生物質の開発に関わっている中小企業もいくつかある（Henry、前掲参照）。
【０００７】
特定の動物集団では、感染がすでに流行している。例えば、鳥類コクシジウム症は、対処することはできるが、実際には制御されていない疾病である。ほぼすべての群れが感染しており、抗コクシジウム症薬は、一般に飼料中に循環され、これによって、損傷を抑制すると同時に、耐性株の発生を制限している。コクシジウム症により、家禽生産者は、損失、ならびに、サリノマイシンのような抗生物質の医療費に年間３億５千万ドルの費用を要する。Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News、1997年10月28日を参照。1999年までには、米国のコクシジウム抑制薬に関して、年間約１億千四百万ドルが使われるであろうと推定されている。Frost & Sullivan, U.S. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report 5245-54, 1995を参照。
【０００８】
明らかに、集中的飼育の実施により飼育される動物の消化管における感染を抑制する、新規で、かつ、これまでより効果的な方法をみいだす必要がある。この必要性は、急速に増加する世界人口に遅れをとらないために、より高い生産効率を獲得する要求に基づくものである。腸感染の抑制を改善することにより、成長速度の増加と共に、給餌効率の改善が保証される。さらに、ヒト病原体に抗生物質耐性が発生し得るという懸念に対処するために、動物生産における抗生物質使用の代替策も求められる。
【０００９】
あらゆる抗生物質とは違った様式で作用する、酵素に基づく治療を用いれば、ヒトの健康に問題を起こす耐性病原微生物の発生を刺激する危険性がない。酵素はタンパク質であるため、ある種の抗生物質や抗コクシジウム薬で起こるように、危険な化学薬品残留物が食肉製品に組み込まれる可能性がない。American Feed Control Officials Inc., Official Publication, 1999, “Drugs and Feed Additives, Section 30.0 Enzymes”, pp.206-217, ISBN 1-878341-10-3を参照。
【００１０】
発明の概要
従って、本発明の目的は、消化管感染の影響を軽減する、酵素による治療を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、病原体と消化管の細胞との結合を妨害することにより、消化管感染の影響を軽減する作用機構を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、感染または壊死性腸炎を引き起こす病原体に感染した動物に関して、体重増加および飼料変換を高める手法を提供することである。
【００１３】
さらに、本発明の目的は、微生物病原体に感染した、もしくは感染する恐れがある被験者の状態を改善するのに有効な経口投与に適した投薬形態を提供することである。
【００１４】
これらの、および他の目的を達成するため、本発明の一実施形態によれば、
（i）結合を切断することにより、細胞表面タンパク質または炭水化物を放出させる酵素であって、エンド-1,4- -D-マンナナーゼ以外である酵素と、
(ii) 該酵素の生理学的に許容できる担体と
を含んでなる組成物であって、経口投与に適した形態をしており、該酵素以外の抗感染剤を含まないことを特徴とする組成物が提供される。一実施形態では、上記酵素は、結合を切断することにより、細胞表面タンパク質を放出させる。
【００１５】
好ましい実施形態では、組成物に含まれる酵素は、スフィンゴミエリナーゼまたはホスホリパーゼであり、特に、ホスホリパーゼCまたはDである。別の好ましい実施形態では、上記酵素は、結合を切断することにより、細胞表面タンパク質または炭水化物を放出させる、エステラーゼ、セレブロシダーゼ、およびカルボヒドラーゼからなる群より選択される。別の実施形態では、上記酵素は、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）株、好ましくは、ATCC 7004またはATCC 6464から調製される。あるいは、上記酵素は、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）において、上記酵素をコードする組換えDNAを発現することにより得られる。別の実施形態では、上記酵素は、ゼラチンカプセルシェル中に含まれ、飼料１Kg当たり、200 IU〜4000 IUで組成物中に存在する。
【００１６】
本発明の別の実施形態によれば、前記成分（i）および（ii）を含む組成物であって、上記生理学的に許容できる担体が、上記酵素が組み込まれる食品である組成物が提供される。従って、この組成物は、該酵素以外の抗感染剤を含まない動物飼料となり得る。本発明の動物飼料組成物は、さらに、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギまたはオートムギのような穀物材料、インゲンマメもしくはエンドウのようなタンパク質源、ならびに、ビタミン、アミノ酸、およびミネラルを含む。
【００１７】
さらに別の実施形態によれば、本発明は、固体または液体投与形態である、前述の組成物を提供する。
【００１８】
さらに、消化管感染を治療するか、またはその危険性を改善する方法であって、感染した、または感染する恐れがある被験者に、結合を切断することにより、細胞表面タンパク質または炭水化物を放出させる有効量のエンド-1,4- -D-マンナナーゼ以外の酵素を経口投与することを含んでなる、上記方法が提供される。さらには、上記方法は、酵素以外の抗感染剤を投与することを含まない。この感染は、アイメリア属およびクリプトスポリジウム属のような原生動物、クロストリジウム属のような細菌、真菌または酵母病原体によって起こるものであり得る。
【００１９】
さらに、（i）結合を切断することにより、細胞表面タンパク質または炭水化物を放出させる酵素と、
(ii) 該酵素の生理学的に許容できる担体と
を含んでなる組成物であって、経口投与に適した形態をしており、該酵素以外の抗感染剤を含まない組成物も提供される。
【００２０】
また、消化管感染を治療するか、またはその危険性を改善する方法であって、感染した、または感染する恐れがある被験者に、結合を切断することにより、細胞表面タンパク質または炭水化物を放出させる有効量の酵素を経口投与することを含んでなり、該酵素と一緒に、抗菌有効量の別の抗感染剤を投与することを含まない、上記方法が提供される。
【００２１】
本発明の他の目的、特徴、利点は、以下に挙げる詳細な説明から明らかになるだろう。以下の詳細な説明および特定の実施例は、好ましい実施形態を示すものではあるが、例示のために与えるにすぎない。何故なら、本発明の精神および範囲内で、様々な改変および変更は、当業者には、この詳細な説明から明らかとなるからである。さらに、以下の実施例は、本発明の原理を示すものであり、当業者には明らかに有用であると思われる、あらゆる感染例に対する本発明の用途を特に説明するものではない。
【００２２】
詳細な説明
結合を切断することにより、細胞表面タンパク質または炭水化物を放出させる能力を特徴とする特定クラスの酵素が、例えば消化管感染の治療に有効な有意な抗生物質活性を、経口投与によって呈示することがみいだされた。この酵素クラスとして、限定するものではないが、スフィンゴミエリナーゼおよびホスホリパーゼCまたはD、ならびに、同様の切断特異性を有する酵素が挙げられる。すなわち、このクラスの典型的な例は、結合を介してホスファチジルイノシトールに膜固定した糖タンパク質または炭水化物を切断し、これを放出させる酵素である。従って、PI-PLCの略語または1-ホスファチジルイノシトール・ホスホジエステラーゼとしても知られる、酵素ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（E.C.3.1.4.10）は、このクラスのメンバーである。別の例は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼD、すなわち、GPI-PLDである。LowおよびPrasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:980-984, 1988である。
【００２３】
GPI-PLDおよびPI-PLC酵素は、真核生物由来のものが記載されている。MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRANE PROTEINS中の、Lowによる「特異的ホスホリパーゼによるグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーの分解(Degradation of glycosyl-phosphatidylinositol anchors by specific phospholipases)」、第２章、pp 35-63；GLYCOLIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS, A.J. Turner (ed.), Ellis Horwood, New York, 1990；Low and Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:980-984, 1988；Essenら、Nature 380:595-602, 1996；およびEssenら、Biochemistry 36:2753-2762, 1997を参照されたい。PI-PLCは、原核生物由来のものが記載されており、細菌による細胞外生産によるものなどがある。PI-PLC の公知の細菌供給源としては、バシラス・セレウス（SteinおよびLogan, J. Bacteriol. 85:369-381, 1963；SteinおよびLogan, J. Bacteriol. 90:69-81, 1965；Ikezawaら、Biochimica et Biophysica Acta 450: 154-164, 1976；Griffithら、Methods in Enzymology 197: 493-502, 1991；Volwerkら、J. Cell. Biochem. 39:315-325, 1989；およびKuppeら、J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989）、バシラス・チュリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)（IkezawaおよびTaguchi, Methods in Enzymology 71:731-741, 1981；日本国特許JP55034039）、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)（LowおよびFinean, Biochem J. 162:235-240, 1977）およびノーヴィ菌(Clostridium novyi)（TaguchiおよびIkezawa, Arch. Biochem. Biophys. 186:196-201, 1978）がある。
【００２４】
PI-PLC酵素に対する改良された酵素アッセイ法で、蛍光基質に基づくものが考案されている。Hendricksonら、Biochemistry 31:12169-12172, 1992；Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8, 1994；Hendricksonら、Bioorg. Med. Chem. Letters. 1:619-622, 1991を参照。
【００２５】
特定の理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、PI-PLC酵素が、細胞表面タンパク質のホスファチジルイノシトール糖脂質アンカーおよび他のグリコシルホスファチジルイノシトールを切断する能力を有することに着目している。Low（前掲）；LowおよびSaltiel, Science 239:268-275, 1988を参照。例えば、変異型表面糖タンパク質やその他の表面タンパク質、ならびに、数種の原生動物寄生体の炭水化物は、グリコシルホスファチジルイノシトール脂質（GPIアンカー）によって固定されており、PI-PLC消化および放出に対して感受性が高い。例として挙げられる種は、住血吸虫属(Schistosoma)、トキソプラズマ属(Toxoplasma)、プラズモディウム属(Plasmodium)、トリパノソーマ属(Trypanosoma)、およびリーシュマニア属(Leishmania)（Low、前掲）、ならびに、アイメリア属(Eimeria)、バベシア属(Babesia)、タイレリア属(Theileria)、ジアルジア属(Giardia)、レプトモナス属(Leptomonas)およびエントアメーバ属(Entamoeba)に属する。McConvilleおよびFerguson, Biochemical J. 294:305-324, 1993；PearceおよびSher, J. Immunol. 142:979-984, 1989；Saumaら、Mol. Med. Biochem. Parasitol. 46:73-80, 1991；HawnおよびStrand, Mol. Med. Biochem. Parasitol. 59:73-82, 1993を参照。
【００２６】
この細胞表面成分の固定機構は、酵母から哺乳動物に至るまでの真核細胞に普遍的なようである。極めて原始的な真核生物と考えられる、ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)におけるGPIアンカーの存在は、この種のアンカーが真核生物において初期に進化したことを示唆している。この知見は、古細菌において、進化を経たさらに複雑な真核生物性GPIアンカー構造の主成分として、新規のホスホグリセロ脂質であるGlcNal-6-myo-イノシトール-P-ジアルキルグリセロールが発見されたこと（Nishiharaら、J. Biol. Chem. 267:12432-12435, 1992）とも合う。原生動物では、これより高等の真核生物と比較して、GPI固定系が多頻度に用いられており、またGPI固定構造が、昆虫および哺乳動物宿主における寄生体生存に重要であるという証拠が存在する（McConvilleおよびFerguson、前掲）。例えば、変異型表面糖タンパク質の頻繁な脱皮は、免疫系の攻撃を回避するための機構であると思われる。
【００２７】
原生動物アイメリア・テネラ(Eimeria tenella)は、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)の糖タンパク質／糖脂質に類似したホスファチジルイノシトール固定構造を含んでいる。これらは、膜結合と、それに続く感染に重要であると考えられている。Gurnettら、Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41:177-186, 1990を参照。アイメリア属の構造は、トリパノソームリパーゼおよびバシラス・チュリンギエンシスのPI-PLC（Gurnett、前掲）により切断される。PI-PLC を用いた寄生体のin vivo処理が、もし実施可能であると証明されればだが、宿主の免疫系を助け、かつ消化管に侵入する病原体による結合および感染を妨害するであろう。アイメリア属の種は、養鶏業に共通する費用のかさむ問題である。別の原生動物寄生体であるクリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum)は広範囲に広がっており、ヒトや多くの動物に急性下痢症状を引き起こす。スポロゾイトタンパク質、GP15/45/60は、DNA配列に基づいてGPI連結タンパク質であると推定され、このスポロゾイトタンパク質に対するモノクローナル抗体は感染を阻害する（Strong, W.B.ら、Infection and Immunity 68:4117-4134, 2000；Cevallos, A.M.ら、Infection and Immunity 68:4108-4116, 2000）。従って、C.パルブム(C. Parvum)は、PI-PLCで治療可能であり得るもう１つの病原体である。
【００２８】
原核細菌は、ホスファチジルイノシトールにより固定された表面糖タンパク質および炭水化物を含んでいない（McConvilleおよびFerguson、前掲）が、それでもPI-PLCは、結合過程を妨害することにより、細菌の感染を低減することができた。病原性大腸菌(E.coli)や、その他多数のよく知られた病原性腸内細菌(Enterobacteriaceae)は、線毛の遠位端に存在する細菌アドヘシンFimHという29 kDのマンノース結合レクチンを発現する。Abrahamら、Nature 336:682-684, 1988。このアドヘシンは、マスト細胞のCD48、GPI-固定分子に結合することがわかっている。Malaviyaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8110-8115, 1999を参照。PI-PLCを用いたin vitro消化は、マウスNIH3T3細胞への突然変異体GPI-固定ジフテリア毒素（ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)由来）の結合を低減した。Lanzreinら、EMBO J. 15:725-734, 1996を参照。さらに、悪性水腫菌(Clostridium septicun)α毒素およびエアロモナス・ヒドロフィア（Aeromonas hydrophia）エアロリジンは、両方とも、C末端GPI-アンカーを介して細胞表面に結合するが、これらは、PI-PLCを用いた処理により細胞表面から除去され得る。Gordonら、J. Biol. Chem. 274:27274-27280, 1999を参照のこと。
【００２９】
細菌感染の作用を低減するPI-PLCの機構は、宿主マスト細胞からのCD48結合部位の解放に関連する。また、マスト細胞とFimHの結合は、炎症応答を引き起こす。従って、本発明によれば、炎症応答は腫瘍壊死因子αの放出を伴なう（Malaviya、前掲）ことから、結合部位の低減はまた、過度になると腸の健康自体を損なう恐れのあるような炎症を低減させるに相違ない。従って、炎症を低減し、腫瘍壊死因子の分泌を引き起こすこの機構により、本発明によるホスホリパーゼ治療は、過敏性腸症候群、大腸炎、およびクローン病のような状態を特徴とする症状を緩和するはずである。van Deventer参照。S. J. Ann. Rheum. Dis. 58(1):I114-I120（1999年11月）。
【００３０】
ウイルス感染に対しても同様に、本発明は、ウイルス粒子と、ウイルスがin vivoで感染する細胞との結合を破壊することにより、有効であると考えられる。本発明者らの本明細書に記載した経口投与の効力の発見において、ホスホリパーゼCを用いたインフルエンザウイルスの前処理は、約50％のウイルスリン脂質の放出を引き起こし、ニワトリ胚における感染力の有意な低下が達成されたことは興味深い。Mizutaniら、Nature 204:781-782, 1964を参照。逆に、ウェルチ菌(Clostridium perfringens)から単離したホスホリパーゼCで培養ニワトリ胚繊維芽細胞を前処理することにより、セムリキ森林ウイルス(Semliki Forest Virus)によるその後の細胞感染が顕著に阻害された。FriedmanおよびPastan, Proc, Natl. Acad. sci. USA 59:1371-1378, 1968参照。後から考えると、従来技術ではこれらの現象における治療上の有意性は理解されていなかったものの、これらは、本発明の基本をなすと考えられる１つの機構、すなわち、感染に必要な相互作用を破壊する、病原体−表面リガンドおよび／またはそのコグネイト細胞−膜受容体が切断されることと矛盾しない。
【００３１】
ウイルス感染を防止する上で本発明が有効であると考えられる別の方法は、ウイルス性GPI固定タンパク質と感受性細胞との結合を破壊することによるものである。PI-PLC消化に対して感受性を示すウイルス性GPI固定タンパク質の一例は、デング熱ウイルス(Dengue Virus)NS1（非構造タンパク質１）である。Jacobsら、FASEB J 14:1603-1610, 2000を参照。ウイルスの結合部位である宿主細胞GPI固定タンパク質にはいくつかの例がある。このような例として、GPI固定CD55（崩壊促進因子、DAF）に結合する、ヒトエコウイルス(Echovirus)６、７、12および21、ならびに、エンテロウイルス(Enterovirus)70が挙げられる。Clarksonら、J. Virology 69:5497-5501, 1995；Bergelsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6245-6248, 1994；ならびに、Karnauchowら、J. Virology 70:5143-5152, 1996を参照。イヌパルボウイルス(Canine Parvovirus)（CPV）感染は、PI-PLCを用いたネコ細胞の前処理により、in vitroで阻止することができる。BarbisおよびParrish, Brazilian J. Med. Biol. Res. 27:401-407, 1994を参照。
【００３２】
感染を初期設定するのに重要であると推定されるいくつかの細胞表面受容体は、GPIアンカー以外の機構により、膜に結合する。これらには、コレステロールエステル（RostandおよびEsko, J. Biol. Chem. 268:24053-24059, 1993）、非リン酸化スフィンゴ糖脂質（Karlsson, Ann Rev. Biochem 58:309-350, 1989）およびホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセレンのようなその他のリン脂質などの構造がある。Sylvester, Infect. Immun. 64:4060-4066, 1996を参照。
【００３３】
従って以上述べた理由により、細胞表面からこれらの構造を放出する活性を有する好適なエステラーゼ、セレブロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、およびホスホリパーゼを用いて、該構造をターゲッティングすることは、本発明に従う経口投与により、消化管感染を治療する上で有益な効果をもたらすに違いない。
【００３４】
真核生物においてはホスファチジルイノシトール結合表面タンパク質および炭水化物は普遍的性質のものであることから、酵素を投与することにより、このような細胞表面タンパク質および／または炭水化物の固定的結合を、直ちにまたは予防的に切断する本発明の治療方法は、消化管の原生動物、細菌、真菌およびウイルス感染に対処する上で、広範な用途を有するであろう。この目的のために、本発明の重要な態様は、前記酵素が、細菌表面成分を切断する活性を有するだけではなく、抗感染剤として経口投与が可能であり、しかもin vivoで有効であることの証明である。特に、代表的な好適酵素であるPI-PLCは、1960年代から入手可能であったが、この手法はこれまで提示されていなかった。
【００３５】
本発明の別の態様では、動物の飼料調製物中の有効な抗感染剤として、前記と同様、酵素を使用し、これが、飼料を消費する動物の消化管感染を治療またはその危険性を軽減する。エンド-1,4- -D-マンナナーゼを含む飼料調製物は知られており、マンナナーゼの抗真菌活性を提示する報告もある。WO 00/21381（PCT/EP99/07835）およびKudoら、Experentia 48:227-281, 1992を参照。これらの事例では、マンナナーゼを承認された抗生物質と組み合わせるが、抗生物質を含まない飼料に酵素を使用する可能性については広く議論がなされている。Adams, Feed Mix（Special 2000）16〜18ページ。
【００３６】
その態様の１つでは、従って、本発明は、前記の切断活性を特徴とし、かつ、マンナナーゼ以外、さらに具体的には、エンド-1,4- -D-マンナナーゼ以外の酵素を含有する飼料組成物を含む、組成物に関する。すなわち該酵素は、例えば、ENZYME NOMENCLATURE 1992（Academic Press）（見出し項目3.2.1.77、3.2.1.78、3.2.1.101、3.2.1.106、3.2.1.130および3.2.1.137を参照）に記載されている、異なる切断特異性を有するマンナン指向酵素とは区別されるものである。さらに、本発明では、マンナナーゼなどの酵素を含むがそれ以外の抗感染剤は含まない組成物も考えられる。
【００３７】
従って、本発明によれば、バシラス・セレウスから得られ、PI-PLC含有量に応じて標準化した細胞外酵素調製物を用いて、感染の存在下で、体重増加および飼料転換に非常に有意な改善をもたらすことができる。この結果は、B.セレウス(B.cereus)が、一般に、飼料性胃腸炎およびB.セレウス眼内炎を引き起こす日和見性病原体であることから、予想外なものであった。
【００３８】
初期の研究によれば、ウサギに細胞外炭疽菌(B. anthracis)またはB.セレウス酵素を注射すると、リン酸塩血症を引き起こし、さらには死に到らしめる。例えば、SteinおよびLogan, J. Bacteriol. 85:369-381, 1963を参照。従って、胃腸炎を引き起こす病原体からの細胞外酵素が、本発明に従い、細胞感染による疾病に関して治療効果を有するのは、驚くべきことである。
【００３９】
バシラス・セレウスは、様々な細胞外膜活性酵素および細胞溶解毒素、例えばホスホリパーゼCとスフィンゴミエリナーゼとから構成される、PI-PLCおよびセレオリジンABなどを生成する。Gilmore, J. Bacteriol. 171:744-753, 1989を参照。前記の酵素調製物においては、B.セレウスにより産生される、細胞外ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC［E.C.3.1.4.10］が、活性成分であると考えられている。本発明の酵素治療は、コクシジウム抑制薬(coccidiostat)および抗生物質として有効に働いた。従って、この酵素は消化管感染の治療に有効であり、かつ（現在用いられている物質が禁止される場合には特に）商業的に適切な手法である。
【００４０】
コーティングされていない場合には、酵素は、胃液による不可逆の不活性化され得る。米国特許第4,079,125号には、酵素欠損哺乳動物による摂取用の改良された腸コーティング酵素含有組成物が記載されている。驚くべきことに、コーティングせずに動物飼料にPI-PLCを添加すると、病原体感染の有効な治療が達成される。
【００４１】
本発明に従う酵素組成物は、好ましくは、乾燥した、固体または液体の経口組成物として調製される。このような組成物は、一般に、バッファー、炭水化物および／またはグリコールのような安定剤を含む。本発明に従い、例えば、錠剤もしくはカプセルへの組込みに好適である、乾燥した保存上安定な酵素製剤は、凍結乾燥、不活性担体または炭水化物担体を用いた流動床乾燥機での噴霧乾燥により、あるいは、ガラス形成安定剤と共に用いる蒸発法を用いて、調製することができる。Franksら、Biopharm. 4:38-55, 1991を参照。別の手法として塩沈殿法があり、例えば、粉末形成にアセトンを用いるのと同様にして、硫酸アンモニウム沈殿物または溶剤沈殿物を得た後、それを乾燥させ、担体とブレンドする。
【００４２】
ある種の炭水化物、特に、単糖、二糖、および低級オリゴ糖は、重要なガラス形成炭水化物である。担体として用いられる炭水化物の典型的例としては、中でも、Franks（前掲）が記載するような、キシロース、フルクトース、グルコース、ソルビトールおよびマルトトリオースなどが挙げられる。炭水化物担体の選択は、酵素との適合性、低湿度傾向、ならびに、好ましいガラス転移曲線に基づいて行う。安定剤であるトレハロースは、特に、周囲温度安定性の生物製剤を製造するのに適している。米国特許第4,891,319号；Roser, Biopharm. 4(8)：47-53, 1991；Colacoら、Bio/Technology 10:1007-1011, 1992；Aldridge, Genetic Engineering News, March 15, 1995, pp10-11を参照のこと。
【００４３】
本発明で使用する酵素は、液体として製剤化することができ、例えば、水活性を低下させ、かつタンパク質を安定化するソルビトールまたはグリセロールを含むシロップでもよい。このような溶液は、通常、医薬として使用する前に滅菌ろ過する。
【００４４】
すでに記載したように、本発明は、一態様において、飼料または食品の成分として酵素を送達することに関する。飼料は、主として、穀物材料、タンパク質源、ビタミン、アミノ酸およびミネラルから構成される。穀物材料は、通常、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、オート麦などを含む。タンパク質源としては、例えば、インゲンマメまたはエンドウがある。ミネラル、アミノ酸およびビタミンの典型例としては、B12、Ａ、パントテン酸、ニアシン、リボフラビン、Ｋ、ＤＬ-メチオニン、Ｌ-リシン、塩化コリン、葉酸、リン酸二カルシウム、スルホン酸マグネシウム、硫酸カリウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、酸化第一マンガン、ヨウ素酸カルシウム、酸化銅、酸化亜鉛、およびＤ-活性化動物ステロールが挙げられる。
【００４５】
飼料に用いる場合には、水活性を低下させ、濃縮した製品中での細菌増殖を防ぐため、塩水（例えば、NaCl、15〜18％ w/w）またはシロップと共に、液体酵素製剤を調製することができる。これ以外にも、安息香酸ナトリウム、プロピルパラベン、ソルビン酸ナトリウムまたはソルビン酸カリウム、およびパルミチン酸アスコルビルなどの飼料用の他の防腐剤が、製品中の細胞増殖によって起こり得る腐敗を防止するのに用いることができる認可化学防腐剤の例として挙げられる。米国飼料管理局協会（Association of American Feed Control Officials, Inc.）、Official Publication 2000、第18部、”Chemical Preservatives”pp215-217, ISBN 1-878341-11-1を参照のこと。これらの防腐剤は、ペレット化の後、自動噴霧法による大規模稀釈によって、飼料に適用することができる。Fodgeら、Feedstuffs, 1997年9月29日を参照。このような液体調製物に、適合性であれば、ソルビトールまたはグリセロールのような安定化炭水化物を含有させてもよい。効力を高めるために、上記以外の熱不安定性の酵素またはビタミンなどであって、飼料の望ましい成分である材料を添加してもよい。
【００４６】
飼料を、ペレット化せずにすり潰した状態（例えば、非加熱処理の）で用いる場合には、本発明の酵素は、飼料ミキサーに加えるために、乾燥濃縮物として提供することができる。このような乾燥酵素濃縮物は、まず、10 Kd NMWCまたはその他の適した限外ろ過を用いて、液体酵素調製物を濃縮して酵素含有率を高め、次いでトウモロコシ粗粒、ダイズ粗粒などの非常に乾燥した担体、あるいは、飼料への使用が認可されている不活性材料または不溶性塩と、ブレンドすることにより調製する。Official Publication, American Feed Control Officials（前掲）、第582部、”Substances generally regarded as safe in animal feeds”を参照。
【００４７】
低温において、消化管で機能するのに十分な活性を保持しながら、飼料微粉砕機でのペレット化工程に耐えるだけの十分安定した酵素を生産するために利用可能な多数の技法がある。主にコードDNA配列の改変により、または二次的には化学的修飾により、タンパク質構造を改変することによって、酵素を不活性化に対してさらに安定化できることはよく知られている。これに関する一例は、酵素結晶の化学的架橋の使用である。Collinsら、Organic Process Research and Development 2(6):400-406, 1998を参照。本発明の酵素の安定性を高める別の手法は、目的とする酵素をコードする遺伝子の突然変異誘発により、アミノ酸を改変するか、または、シャッフリングのために遺伝子もしくは遺伝子の部分を取得することを含む。Crameriら、Nature 391:288-291, 1998；Arnold, Nature Biotechnol. 16:617-618, 1998b；Zhaoら、Nature Biotechnol. 16:258-235, 1998；ZhaoおよびArnold, Protein Eng. 12:47-53, 1999を参照。所望の特性を備えた酵素の「指向進化」のための突然変異および選択も実施可能である。例えば、Giverら、Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:12809-12813, 1998；Liaoら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:576-580, 1986；Cherryら、Nature Biotechnol. 17:379-384, 1999を参照。
【００４８】
またグリコシル化、PEG化およびスクシニル化などの、特定のタンパク質修飾により、本発明で用いられる酵素について最適化されるように、安定性を増強させたり最適pHや特性を変化させたりすることもできる。従って、これに関して、公知のプロトコルを用いることにより、実施例に従って、試験用の修飾酵素を作製し、本発明の治療方法において適切化することができる。
【００４９】
PI-PLCを生産するための効果的方法は、B.セレウス遺伝子のB.メガテリウム（B. megaterium）中へのクローニングにより達成された。この発現系（RygusおよびHillen, Appl. Microbiol. Bacteriol. 35:594-599, 1991）は、バシラス・メガテリウムのキシロースレギュロン由来のエレメント（Rygusら、Arch. Microbiol. 155:535-542, 1991）を利用するが、これは、BIO 101 Corp.（カリフォルニア州ビスタ）から市販されていた。テトラサイクリン耐性で固定化され、かつ、キシロース応答性リプレッサーにより調節されるプラスミド中へ、PI-PLC遺伝子リーダーコード配列と、B.メガテリウムのxylA遺伝子の最初の３つのアミノ酸との融合物を作製した。このタイプの系統は、増幅させて発現させることにより商業的に有用な量のPI-PLCを生産して本発明の動物飼料に組み込む上で、適した手段を提供する。
【００５０】
バシラス・セレウスの単離株には、ツニカマイシンのような抗生物質を産生するものがある。Kamogashiraら、Argic. Biol. Chem. 52:859-861, 1988を参照。また植物の立ち枯れ病や根腐れ病を予防するための生態的防除剤として、バシラス・セレウスの別の単離株（ATCC 53522）が米国特許第4,877,738号および第5,049,379号に記載されている。この株の効果は、２種の抗生物質、すなわち、「ツイッターマイシン（Zwittermicin）」と呼ばれる396ダルトンの線状アミノポリオールと「抗生物質B」と呼ばれるアミノグリコシドの作用によるものと考えられている。以下に詳細に説明する実施例では、酵素調製物から存在し得る低分子量抗生物質を除去することにより、上記２つの抗生物質を含む可能性を排除した。
【００５１】
特に、細胞を含まない培養液を、10 Kd分子量カットオフの膜により濃縮した。10 Kdより大きいタンパク質を含む濃縮物を用いて、さらに処理を行った。Handelsman（前掲）により記載されたもののような小分子量抗生物質はこのフィルターを通過したであろう。さらに、硫酸アンモニウム沈殿により、溶液中に低分子量物質を残し、高分子量タンパク質を沈殿させた。硫酸アンモニウム沈殿物を再溶解させた後、得られた酵素溶液をバッファーに対して透析するさらなる処理により、低分子量抗生物質を除去した。最後に、やはり硫酸アンモニウムで、上記タンパク質を再度沈殿させて、溶液に残るすべての低分子量化合物を排除した。
【００５２】
これら４回の処理を組み合わせて用いることによって、観察される抗生作用が、ATCC 6464またはATCC 7004により生産される低分子量抗生物質に起因する可能性を徹底的に排除する。また、大腸菌試験株を用いて培養液も試験し、抗生物質の存在について調べたが、抗生物質活性は検出されなかった。
【００５３】
以下の実施例を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。
【００５４】
実施例１  バシラス・セレウスATCC 6464およびATCC 7004の凍結保存株の調製
ATCCからの凍結乾燥化細胞を入れたバイアルを開封し、pH 7.0のAmberferm 4015（Red Star）10 g/L、Amberex 695（Red Star）５g/L、および塩化ナトリウム５g/Lから構成される種培地に接種し、30℃で増殖させた。初期培養物をLB Broth寒天プレートにストリークし、得られた単一コロニーを250 mLバッフルフラスコ（Bellco）中の20 mLの種培地に戻し接種し、30℃で振盪しながら増殖させた。培養密度が、OD600読取り値で1.5に達したら、滅菌グリセロールを約10％ v/vまで添加し、1.8 mLの培養物を入れたバイアルを−80℃で凍結した。
【００５５】
実施例２  ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC生産のためのバシラス・セレウスのATCC 6464およびATCC 7004単離株の増殖
２つのBiostat C発酵槽（各々30リットル）に、水道水中の下記組成物の培地を計量して入れた：25 g/Lの栄養ブロス（Nutrient Broth）No. 2（Oxoid）、10 g/LのTryptone（Difco）、10 g/Lの酵母抽出物（Difco）、および0.1 mL/LのMazu DP10P Mod11消泡剤（BASF）。初期バッチ量は9.5 Lであり、上記ブロスは、121℃で40分滅菌した。滅菌後、初期pHをアンモニアガスで7.0に調整した。
【００５６】
接種用コネクター付きシリコーン製チューブを取り付けたアスピレーター接続部（Bellco）を備える、４リットルバッフル振盪フラスコ中に入れた500 mLの同じ培地で種培養物を用意した。これらのフラスコをオートクレーブにおいて、121℃で50分滅菌した後、ATTC発送品から調製した1.8 mLの凍結保存株（実施例１）を接種した。制御環境インキュベーター振盪機（NBSモデルG-25）において、この種フラスコ培養物を200 RPMで振盪しながら、30℃で5.5時間増殖させた。接種前に、ATCC 7004培養物は、OD600が1.53、pHが6.58であった。また、ATCC 6464培養物は、OD600が1.28、pHが6.79であった。
【００５７】
500 mLの種培養物を30 L発酵槽に接種し、下記の条件で操作した：温度 30℃、混合 RPM 600、空気流量 10リットル／分、および圧力 0.5バール。初期培養物のOD600は、0.81であった。６時間後、発酵を停止したところ、最終OD600が22.1（ATCC 7004）および24.2（ATCC 6464）であった。発酵は、pH調整を行わずに実施し、最終pHは、8.17（ATCC 7004）および8.13（ATCC 6464）であった。上記ブロスを発酵槽から取り出し、次の処理に付す前に８℃まで冷却した。
【００５８】
バシラス・セレウスの両ATCC単離株についてほぼ同じ手順を用いて、上記発酵槽を再度運転した。この場合には、種培養物を６時間用いて、OD600を2.86（ATCC 7004）および1.98（ATCC 6464）、また、pHを6.69（ATCC 7004）および6.65（ATCC 6464）とした。主発酵を6.5時間実施し、最終OD600は、35.9（ATCC 7004）および33.6（ATCC 6464）であった。冷却時の最終pHは、8.38（ATCC 7004）および8.47（ATCC 6464）であった。
【００５９】
実施例３  PI-PLC酵素のろ過および濃縮による細胞の除去
両端を接続した、２つのA/G Technology（UFP-500-K-6A）３mm中空ファイバー500,000分子量カットオフ（500 Kd NMWC）フィルターを用いて、実施例２に記載した４つの発酵槽バッチの各々から細胞を回収し、洗浄した。毎分約２リットルの蠕動ポンプで、フィルターを通して冷却ブロスをくみ上げ、貯蔵タンクに再循環させた。酵素を含む透過物を氷上で冷却したタンクに回収した。最初の細胞を含有する約９リットルのブロスを約２リットルまで濃縮した。この時点で、10 mM トリスHCl（pH 8.5）を用いて、透析ろ過を開始した。合計量が約14リットルの透過物を回収した後、細胞の洗浄を終了した。
【００６０】
両端を接続した、２つのA/G Technology（UFP-10-C-4XTCA）0.5 mm中空ファイバー10,000分子量カットオフフィルター（10 Kd）を用いて、500 Kd透過物（各発酵槽から約14リットル）を濃縮した。透過物を廃棄する以外は、濃縮物を再循環させる同じポンプくみ上げ方法を用いた。各発酵槽から約500 mLの量の最終濃縮物を、次の処理工程のために取っておいた。
【００６１】
実施例４  PI-PLC酵素のさらなる精製および濃縮
各バシラス・セレウス発酵から得られた10 Kdの限外ろ過濃縮物（実施例３）を、硫酸アンモニウムを用いて80％飽和まで調整した後、氷上で60分間混合した。
【００６２】
上記溶液を、Sorvall GSAローターにより、6000 RPMで15分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿物を最小量の10 mM Tris-HCl、0.2 mM EDTA（pH 7.5）に溶解させ、同じバッファーに対して、常温で透析した。
【００６３】
色素結合アッセイ（BioRad）を用いて各濃縮物中のタンパク質を測定し、HPLCに基づく検出方法および蛍光基質（Molecular Probes, Inc. P-3764, 1-ピレンブチルミオ-イノシトール-1-リン酸塩、リチウム塩）を用いて、PI-PLCレベルを測定した（Hendricksonら、Bioorg. Med. Chem. Letters 1:619-622, 1991）。以下の表１は、アッセイデータをまとめ、４つの調製物の各々について得られた純粋基材に基づく、近似純度および酵素合計量を推定したものである。酵素調製物は、次の処理まで、−20℃で保存した。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
実施例５  動物飼料への使用前の酵素調製物のプールおよび濃縮
酵素調製物１、２、３および４をプールし、合計量は675 mLであった。硫酸アンモニウム（492ｇ）をゆっくりと添加し、溶液を氷上で数分間混合した。この溶液を遠心分離することにより、沈殿物を回収した。ペレット画分を最小量の20 mM リン酸バッファー（pH 7.0）中に溶解させた。
【００６６】
得られた溶液は70.9 mLで、密度は1.057ｇ／ccであった。タンパク質濃度を測定したところ、約25.5 mg／mLであった。測定したPI-PLC活性は、約1.13 U／mgであり、PI-PLCの推定純度は、1.88％であった。溶液をそのまま−20℃で凍結し、解凍した後用いることにより、200ポンドのニワトリ用飼料を均質に処理した。
【００６７】
実施例６  バシラス・メガテリウムにおけるバシラス・セレウスPI-PLC遺伝子のクローニングおよび発現
ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）をコードする遺伝子を配列決定した。Kuppeら、J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989を参照。PCR法を用いて、PI-PLC遺伝子をバシラス・セレウス（ATCC 6464）染色体DNAからクローニングした。バシラス・メガテリウム用の発現ベクター、pMEGA（BIO 101、カリフォルニア州ビスタ）を用いた。プライマー-1のSpeI部位と、プライマー-2のBamHI部位を用いて、２つのPCRプライマー、すなわち、5’-GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3’（プライマー１）と5’-CGGGATCCATATTGTTGGTTATTGG-3’（プライマー２）を設計した。
【００６８】
PCR増幅PI-PLC遺伝子をpMEGA SpeI-BamHI部位に結合した後、プラスミドpCG682を得た。PI-PLCタンパク質を、発現ベクターにおけるSpeI部位でxylA遺伝子産物の最初の３つのアミノ酸と融合した。PI-PLC遺伝子の発現は、xylAプロモーターの制御下で実施した。フラスコ振盪発酵を用いて、バシラス・メガテリウムにおけるホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC生産を評価した。10μg／mLテトラサイクリン（20 mL）を含むLB培養液に0.2 mLの種培養物を接種し、37℃の振盪機において250rpmでインキュベートした。約0.5のOD600で、５ｇ／ＬのD-(+)-キシロースを添加することにより、xylAプロモーターを誘導した。３時間後、遠心分離により上清を回収した。蛍光基質方法（Hendricksonら、Biochemistry 31:12169-12172, 1992；Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8, 1994）に従い、1-ピレンブチル-ミオ-イノシトール-1-リン酸塩基質（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いると同時に、HPLC検出により、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC活性を測定した。
【００６９】
【表２】
0004871473.tif 000003
【００７０】
これらのデータから、大部分のPI-PLCは細胞外であり、発現が、D(+)キシロース添加後初めて起こることがわかる（表２）。この組換え株は、実施例２で生育したような平均的野生株の少なくとも15倍の生産性（mg/L/OD）を有すると推定される。
【００７１】
実施例７  PI-PLC生産のためのバシラス・メガテリウムの発酵
実施例６に記載したバシラス・メガテリウム／pCG682を用いて、発酵により、PI-PLCを生産した。種および発酵段階の培地（PM）は、20g/LのAmberferm 4015（Universal Flavors Bionutrients、インディアナ州インディアナポリス）、10 g/LのAmberex 695酵母抽出物（Universal Flavors Bionutrients、インディアナ州インディアナポリス）、10 g/LのNZ Case Plus（Quest International、イリノイ州ホフマンエステーツ）、2.0 g/LのK2HPO4、0.1 g/LのMgSO4・7H2O、2.0 g/Lのグルコース、および、12.5 mg/Lのテトラサイクリンを含んでいた。PHを7.5に調整した。
【００７２】
種段階（2.8-Lバッフルフラスコ中500 mL）を凍結種バイアルからの接種により開始し、30℃にて250 RPMで振盪した。LB寒天プレート上で増殖させた単コロニーを、250 mL振盪フラスコ中の20 mL PMに添加することにより、種バイアルを調製した。30℃で約1.0のOD600まで増殖させた後、５mLの50％滅菌グリセロールを添加し、混合して、得られた溶液を２mLのプラスチック製滅菌バイアルに移し、−60℃で凍結した。
【００７３】
９時間の振盪により、約1.2〜1.8 OD600まで増殖させた後、500 mLの種フラスコを用いた。２つのフラスコを用いて、50 Lの同じ蒸気滅菌培地で充填した60-L発酵槽に接種した。テトラサイクリンは、40％エタノール中の１％溶液として滅菌ろ過（0.2ミクロンフィルター）し、滅菌後添加して、30℃まで冷却した。発酵槽には、初期バッチ中に0.1 mL/LのMazu DF10PMOD11消泡剤（BASF、イリノイ州ガーニー）も添加し、必要に応じて添加することにより、発酵中の気泡を抑制する。最初の発酵槽段階の操作条件は、次の通りである：圧力0.5〜2.5 psig；温度30℃±0.5℃、攪拌200〜450 RPM；エアスパージ25〜50 SLPM；溶存酸素≧25％。pHは、21.25 ％H3PO4または5N NaOHを用いて、6.9〜8.1に制御した。OD600が、８〜10 まで達したら、上記内容物を用いて、425 Lの同じ培地の入った600-L 発酵槽に接種した。
【００７４】
600-L 生産発酵槽の操作条件は次の通りである：圧力0.5〜2.5 psig；温度30℃±0.5℃、攪拌100〜300 RPM；エアスパージ250〜500 SLPM；溶存酸素≧25％。pHは、21.25％H3PO4または5N NaOHを用いて、6.9〜8.1に制御した。５時間後、初期グルコースが消費され、OD600が、約17に達したら、キシロース供給（オートクレーブにより、121℃で20分予備滅菌してあり、10 kgのD-(+)-キシロースと10リットルの水とから構成される）を開始した。D-キシロースは、Varsal Instruments（ニュージャージー州）から入手した。この供給は、初め25 mL／分で開始し、1.5時間維持した後、43 mL／分まで加速した。第２速度は、22.5リットルのキシロース供給が消費されるまで維持した。50 SLPMの増分により、スパージ空気を500 SLPMまで増加することによって、溶存酸素を維持した。気流が500 SLPMになった時点で、RPMを増加した。発酵を20時間後に停止した。17時間後までには、7440 U/L（単位は、実施例４に定義する通り）が蓄積した。
【００７５】
Pall Filtron C10 Skidと、４つのCellFlo Microgonモジュール（膜細孔0.2μm、直径1mm、面積3.3ｍ2のファイバー）を用いて、発酵培養液を回収した。AG/テクノロジーサイズ85 10K限外ろ過膜を備えたLT100 Pall Filtron Skid を用いて、0.2μm膜透過物を濃縮した。最終濃縮物の量は10リットルであり、これを−20℃で凍結した。
【００７６】
実施例８  バシラス・セレウス発酵培養液は、抗生物質活性を含まなかった
初期量を20リットルに増やす以外は実施例２に記載した方法と同様にして、バシラス・セレウス（ATCC 7004）による発酵を実施した。実施例３〜５に記載した方法に従って調製した最終発酵培養液または部分的に精製したPI-PLCと共に、試験株として大腸菌MG1655を用いて、抗生物質の存在を調べる試験を実施した。試験は、円筒板アッセイとして実施した。Brantner, Pharmazie 52(1):34-40, 1997を参照。酵素サンプルを含む円筒周辺に、抗生物質活性を示す除菌領域は認められなかった。
【００７７】
実施例９  マイクロタイタープレート蛍光検定によるPI-PLCアッセイ
実施例４で用いたHendricksonら（前掲）の方法に対し、PI-PLCについて改良された生化学試験を開発した。基質4-メチルウンベリフェリル-ミオ-イノシトール1-リン酸塩、N-メチル-モルホリン塩は、Biosynth（イリノイ州ナパービル）から入手した。反応は、MTX Lab Systems（バージニア州ビエナ）から取得したFlouroscan II蛍光マイクロタイタープレート読取り装置でモニターした。発酵培養液または酵素濃縮物のアッセイのために、10 mMのTris-Cl、0.16％デオキシコール酸塩、0.8 mMの4-メチルウンベリフェリル-ミオ-イノシトール-1-リン酸塩、N-メチル-モルホリン塩、およびpH 8.0で希釈した酵素から構成されるブラックプラスチックマイクロタイタープレートで、200μLの反応を実施した。必要に応じて、酵素希釈物を0.1％BSA水溶液で作製する。次に、反応を37℃で30分間実施し、２分間隔で、350 nmでの励起および450 nmでの放射により、基質からのメチルウンベリフェロンの放出を観察した。
【００７８】
メチルウンベリフェロンのミクロモルと蛍光単位の相関を用いて、添加した酵素溶液の量に対し形成された単位（ミクロモル／分）を計算する。pH 8.0での反応は、酵素の至適pHと、メチルウンベリフェロンの最大蛍光のpH（pH 10）との妥協点である。また、pH 9.0以上では、酵素によらないメチルウンベリフェロンの放出率が有意となる。このアッセイ条件下で、比活性（単位／mg）は、Hendricksonら（前掲）の方法を用いた場合と比較して、約39.3倍高い。動物給餌実験で効力を試験することを目的として、このアッセイを用いて測定した単位を、同等のHendrickson単位に換算することにより、このアッセイを実施する前の最初の試験との比較を容易にした。
【００７９】
実施例10  動物飼料に有効量添加したPI-PLCのアッセイ
動物飼料に添加した後の酵素を測定するため、4-メチルウンベリフェリル-ミオ-イノシトール-1-リン酸塩、N-メチル-モルホリン塩に基づくPI-PLCのアッセイ（実施例９）のさらに感度の高い改変版が考案されたが、これは、アッセイのためのpHと、蛍光を測定するための別のpHとを含む。４ｇの飼料を計量し、これを、20 mLの10 mM Tris-Cl（pH 7.5）（0.1％デオキシコール酸塩を含む）に添加して、20 g/L飼料を作製することにより、上記酵素を飼料試験材料から抽出した。得られたスラリーを、NBS G-25振盪機（New Brunswick Scientific）により、250 RPMで、室温で１時間振盪した。1.5 mLマイクロ遠心分離管を備えたIEC Micromaxマイクロ遠心分離機により、13,000 RPMで上記スラリーを遠心分離した。0.1％ BSA（ウシ血清アルブミン）で、上記抽出物の適当な稀釈物を作製した。10 U/lbの適用を有する飼料から抽出したサンプルは希釈しなかった。
【００８０】
第１反応段階−試験管を下記のようにセットした。0.12 U/mL PI-PLC（単位は実施例４に定義した通り）の1:100または1:200希釈の標準サンプル、および、ブランクも含めるものとする。サンプル反応物は、ホイルで覆い、光から基質を保護しなければならない。
【００８１】
20μLのTris-HCl、0.10 M、pH 6.0
40μLのデオキシコール酸塩（0.8％）
40μLのPI-PLC基質（４mM）
100μLの酵素
200μL／管  25℃での合計反応
２つの時点（30分および60分）で、0.10 mLの各反応物を採取した。アリコートを65℃で15分加熱することにより、酵素の反応を停止し、氷上で冷却した。最後に、マイクロ遠心分離機により、サンプルを12,000 RPMで５分遠心分離した。
【００８２】
蛍光光度計の読取り−120μLの0.10 M トリスバッファー（pH 8.0）をブラックプラスチックプレート中のマイクロタイターウェルに添加し、次に、80μLの反応サンプルを添加した後、実施例７に記載した読取りを実施する。バックグラウンドコントロールレベルは差し引いた。毎分の蛍光単位生成速度を計算した。蛍光単位を反応産物のミクロモルに換算し、元の飼料１ポンド当たり抽出された酵素単位を計算した。
【００８３】
実施例11  病原体攻撃によるニワトリ給餌試験
Ｉ．ブロイラーニワトリ給餌試験Ｉ
生後１日の雄ブロイラーニワトリを用いて開始する第１の給餌試験を実施した。国内調査審議会の家禽栄養要件（第９版、1994）を満たす、またはこれを超えるように、設計された「出発飼料」である典型的な均質ニワトリ飼料を調製し、すり潰した状態で与えた。ニワトリは、４つの処理グループに分けてケージ（床面積12インチ×24インチ）に入れ、各処理グループは、４回の重複試験を受け、１回のケージ重複試験につき、６羽を用いる（表３）。21日の試験期間を通して、水と飼料を無制限に与えた。ランダム化ブロック設計を用いて、ニワトリをケージに割り当てると同時に、ケージを処理グループに割り当てた。ケージ、給餌機および給水機はすべて、試験開始前に消毒した。照明は、白熱灯を用いて、連続的に（毎日24時間）行った。第１日および第21日に体重を測定した。飼料消費は、第21日に計量した。
【００８４】
第５日に、経口胃管栄養法により、１羽当たり、200,000個のEimeria acervulina接合子嚢で、すべてのニワトリを感染させた。第７日に、給水により、500,000個のウェルチ菌で、すべてのニワトリをさらに感染させた。陰性対照（T1）では、感染の処理は行わなかった。陽性対照（T2）では、コクシジウム抑制薬と抗生物質を飼料に添加した。これは、抗コクシジウム症治療薬サコックス（Sacox）（60ｇ／tのサリノマイシン）と、抗生物質BMD-50（50ｇ／t）であった。処置グループT3およびT4については、野生型PI-PLC酵素処理飼料（純粋基材に基づき、約0.34グラムのPI-PLC）を使用するが、この使用は、Eimeria acervulinaの経口胃管栄養法を実施した第５日から開始した。飼料はすべて、均質なバッチで調製した後、分割して、抗生物質（試験グループT2）または酵素（試験グループT3およびT4）を添加した。ニワトリの体重分析の結果を表４に示し、飼料／体重増加の計算値を表５に示す。
【００８５】
【表３】
0004871473.tif 000004
【００８６】
【表４】
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【００８７】
【表５】
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【００８８】
前記２つの表では、共通の文字のない横行の平均値は、ダンカンの有意性試験に従い、有意に異なる（P＜0.05）。
【００８９】
II．ブロイラーニワトリ給餌試験II
生後１日の雄ブロイラーニワトリを用いて開始する第２の給餌試験を実施した。基礎食は、国内調査審議会の家禽栄養要件（第９版、1994）を超えるように、設計し、均質性を確実にするため、すり潰した状態で調製した。実験は、ブラインド方式に基づき、ランダム化した１組のケージ内で行い、生後21日までの雄ブロイラー飼育に対する、天然源のバシラス・セレウス（野生型PI-PLC）、もしくは組換えバシラス・メガテリウムから作製したPI-PLCの作用を試験した。天然源は、他の細胞外酵素も含むが、バシラス・メガテリウムから調製したPI-PLCは、高度に精製した上、30-Kd NMWC膜を用いた限外ろ過によりさらに精製した。生後８日に、鳥類コクシジウム（飲用水を介し、１羽当たり200,000個のE. acervulina接合子嚢）で、また、生後10日には、ウェルチ菌（飲用水を介し、１羽当たり100,000個）で、チャレンジした。９種の処理（表６）の各々は、10の重複試験またはケージからなる。各ケージは、６羽のワクチン注射した（Newcastle-Bronchitis, Mareks）Cobb x Cobb雄ブロイラーを収容し、１羽当たり0.40 ft2のスペースを与えた。死んだニワトリがあっても、第８日以降は取り替えなかった。全試験期間を通して（第０日〜第21日まで）、飼料は、すり潰した状態で、無制限に与えた。
【００９０】
抗生物質を含まない共通の非処理基礎食をすり潰した状態で全ニワトリに第０日〜第８日まで与えた。その後、生後８〜21日に、９種の処理食をすり潰した状態で与えた。基礎食は、ME（代謝可能なエネルギー内容物）が1400 kcal/lbの、22％の粗タンパク質を含む典型的なブロイラー出発飼料であった。
【００９１】
【表６】
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【００９２】
【表７】
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【００９３】
飲用水を介して細菌感染を実施した第１試験（実施例11-I）で、すべての基準により、バシラス・セレウスにより生産された野生型PI-PLCは、サリノマイシン＋BMD処理（表４〜５）と同様か、それより良好に作用した。組換えPI-PLCを用いて実施した後の試験（実施例11-II、表７）では、濃度を変えて添加したPI-PLCは、腸病変点数および飼料変換の低下（T3〜T6）と、体重増加に、用量依存作用を示した。さらに、サリノマイシン＋BMD処理の不在下で、90 U/lbの組換えPI-PLCを用いた処理により、腸病変点数が低下し、飼料変換および体重増加に正の作用がみられた。この試験では、バシラス・セレウス由来の野生型PI-PLCは、同じ濃度（10 U/lb）の組換え体ほど有効に作用しなかった。
【００９４】
III．酵素、すなわち、PI-PLCおよびエンド-1,4- -D-マンナナーゼを用いたブロイラーニワトリ給餌試験III
生後21日までの雄ブロイラー飼育に関する、PI-PLCおよびエンド-1,4- -D-マンナナーゼ（米国特許第5,429,828号）の作用を試験した。生後８日に、鳥類コクシジウム（経口胃管栄養法により、１羽当たり750,000個のE. acervulina接合子嚢と1,250個のE. maxima接合子嚢）で、また、生後11、12および13日には、ウェルチ菌（経口胃管栄養法により、１日当たり108 cfu/mLを含む１mLの新鮮な培養液）で、チャレンジした。各処理（表８）は、８の重複試験またはケージからなり、各ケージは、14羽のMareksワクチン注射したCobb x Cobb雄ブロイラーを収容し（第14日には、４羽のニワトリが、各ケージから取り出され、病変点数を記録されたため、10羽に減った）、１羽当たり0.36 ft2のスペースを与えた。死んだニワトリがみつかれば、ケージから取り出したが、取替えはしなかった。全試験期間を通して（第０日〜第21日まで）、飼料は、すり潰した状態で、無制限に与えた。
【００９５】
生後０〜21日まで、飼料は、すり潰した状態で与えた。基礎食は、MEが1400 kcal/lbの、22％の粗タンパク質を含む典型的なブロイラー出発飼料であった。
【００９６】
【表８】
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【００９７】
飼料変換は、各種処理を比較する目的のために、鳥の平均的体重の差異に合わせて調節した。感染により、AF/G（体重調節飼料変換）が約23％（0.147 AF/G単位）悪化した。サリノマイシンおよびBMDの使用により、AF/Gは、完全に正常レベルに回復したが、これら２種の化学薬品は、感染により発生した腸病変の低下については、-マンナナーゼとPI-PLCの組合せほど優れてはいなかった。感染した対照におけるAF/G低下の65％〜70％の改善（T3対T1を参照）により証明されるように、１トン当たり１億（100 MU）単位の-マンナナーゼは、単独で、あるいは、PI-PLCと組み合わせて、感染による有害な影響を部分的に解消した。-マンナナーゼは、アイメリア・マキシマ(E. maxima)よりも、アイメリア・アセルブリナ(E. acervulina)によって発生する腸病変スコアを低下させることがわかった。AF/Gの部分的回復は、飼料中のPI-PLCで治療した感染した鳥において達成されたが、悪化の33〜41％しか改善されなかった。しかし、両クラスのPI-PLCとも、いずれかのアメリア種により発生した腸病変スコアを低下させた。アイメリア・マキシマの場合、病変低下は、統計的に有意である。結果を表９に示す。
【００９８】
【表９】
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【００９９】
IV．ブロイラーニワトリの給餌試験IV
この研究は、無作為化されたPetersime養鶏用ケージ(battery cage)において行われ、生後21日までの雄ブロイラー飼育に対する、PI-PLC、マンナナーゼ（米国特許第5,429,828号）および真菌マンナナーゼ酵素の作用を試験した。生後８日に、コクシジウム（経口胃管栄養法により、１羽当たり750,000個のアイメリア・アセルブリナ接合子嚢と1,250個のアイメリア・マキシマ接合子嚢）で、また、生後11、12および13日には、ウェルチ菌（経口胃管栄養法により、１日当たり108 cfu/mLを含む新鮮なブロース培養物）で、鳥にチャレンジした。各処理は、８の重複試験またはケージからなる。各ケージは、初め、14羽のMareksワクチン接種したCobb x Cobb雄ブロイラーを収容し（第14日には、４羽の鳥が、病変スコアリングのために各ケージから取り出されたため、10羽に減った）、１羽当たり0.36 ft2のスペースを与えた。鳥の取替えはしなかった。全試験期間を通して（第０日〜第21日まで）、飼料および水は無制限に与えた。生後０〜21日まで、飼料は、すり潰した状態で与えた。処理１〜16のための基礎食は、MEが1400 kcal/lbの、22％の粗タンパク質を含む典型的なトウモロコシ／ダイズブロイラー出発飼料であった。
【０１００】
以下の表10にまとめた結果は、鳥類コクシジウムおよびウェルチ菌の２種に感染させたブロイラーニワトリの飼料にPI-PLCまたはマンナナーゼのいずれかを添加することにより、体重増加および飼料変換のいずれも改善され、再現可能な便益をもたらすことを示す。重要なことは、この実験からわかるように、PI-PLCまたはマンナナーゼのいずれかを、抗生物質BMD（試験６および５）なしに、サリノマイシンと組み合わせると、基本的に非感染試験（第１および２）のレベルまで性能が回復することである。これは、抗菌機能を証明するものである。この場合、PI-PLC／サリノマイシンは、マンナナーゼよりいくらか良好に作用し、また、現在米国で実施されている、感染した群れに対するBMDおよびサリノマイシンの組合せの添加（試験４）より優れている。
【０１０１】
【表１０】
0004871473.tif 000011
【０１０２】
実施例１２  in vitroでのアイメリア・アセルブリナおよびアイメリア・テネラスポロゾイトによる生存能力および細胞侵入に対する酵素の作用の測定
アイメリア・アセルブリナスポロゾイトまたはアイメリア・テネラスポロゾイトおよび培養した乳児ハムスター腎（BHK）細胞を公開された方法で用意した。Augustine, Avian and Poultry Biology Reviews 11:113-122, 2000を参照。細胞の前処理のため、表11に記載した酵素の希釈物を、細胞培養物に塗布し、塗布から５〜45分後の形態的変化を調べた。45分後、単層培養物を２回洗浄し、次に、非処理アイメリア・アセルブリナまたはアイメリア・テネラスポロゾイトを接種した。感染の間中適用するために、スポロゾイトを酵素の適当な希釈物中に懸濁させ、細胞培養物に直接接種した。45分のインキュベーションの後、培養物を固定、染色し、侵入を定量化した。
【０１０３】
酵素処理によるスポロゾイトまたは細胞の総体的な形態的変化を検出するための観察を行った。これらの実験で用いた酵素レベルでは、形態的変化は認められなかった。組織染色および顕微鏡法により、２種の酵素処理方法の実施後、ならびに、酵素処理していないものについても、培養細胞のスポロゾイト侵入を測定した。
【０１０４】
表11に示すデータから、アイメリア・アセルブリナおよびアイメリア・テネラスポロゾイト侵入の両方で、スポロゾイト侵入に有意な低下が認められる。バシラス・セレウス細胞外ブロースからの比較的不純なPI-PLC酵素調製物と、組換えバシラス・メガテリウムブロースにおいて産生された高純度の組換えPI-PLCの両者ともに、ほとんどの実験で、侵入に統計的に有利な低下がみられた。バシラス・セレウス野生型PI-PLC調製物の約半分の用量でも、組換えPI-PLC調製物は依然として活性であった。従って、酵素を用いた細胞の前処理および該酵素の洗浄は、感染の際、同時に酵素を添加するのと同じくらい効果的であった。しかし、飼料から酵素を抽出する経験から、２段階の洗浄では、酵素をすべて除去するわけではないようである。
【０１０５】
エンド-1,4- -D-マンナナーゼを用いた酵素調製物も、感染前に細胞を酵素で前処理した２つの実験で、統計的に有意な侵入の低下をもたらした。これら正の結果には、各種病原体を用いた一実験が含まれた。従って、マンナナーゼも、バシラス・セレウス PI-PLC調製物と同様に良好に作用し、in vitroでのスポロゾイト侵入を低下させた。
【０１０６】
【表１１】
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【０１０７】
実施例１３  クリプトスポリジウム感染に対するPI-PLCのin vitro評価
酵素PI-PLCを、0.01〜30 U/mlの濃度で抗クリプトスポリジウム活性および毒性について評価した。この実験は、生後４日のMadin-Darbyイヌ腎（MDCK）細胞を用いて実施した。酵素単位は、実施例４の方法によるものと同様に定義されるが、実施例９と同様に測定した。用いる酵素の調製物は、組換えバシラス・メガテリウムから得た。処理は、感染から３時間後に開始し、48時間継続した。
【０１０８】
化学発光イムノアッセイ
感染の前に、接合子嚢を洗浄した後、0.75％タウロコール酸ナトリウムを含むDMEM塩基中に再懸濁し、37℃で10分インキュベートした（Youら、FEMS Microbiol. Letters 136:251-156, 1996；Youら、J.Antimicrobial.Chemother.41:293-296, 1998）。脱嚢混合物をUltraculture培地で希釈し、100％集密のMDCK細胞を含むプレート中にすばやく分散させた後、Ultraculture培地中に４日維持した。接種材料を細胞と一緒に３時間インキュベートした後、PBSで洗浄し、試験酵素を含む、または含まない新鮮なUltraculture培地に取り替えた。５％CO2空気雰囲気中で、プレートを37℃で48時間インキュベートした。培養物をPBSで洗浄し、ブイン（Bouin）溶液で固定した。
【０１０９】
固定プレートを、TBSTバッファー（20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.05％Tween-20）で洗浄し、１％BSA-TBST（１％のウシ血清アルブミンを含むTBSTバッファー）を用いて、穏やかに振盪しながら、25℃で30分ブロッキングした。ウサギ抗クリプトスポリジウム・パルブム血清（１：200希釈）をプレートに適用し、１時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgGおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（作用希釈、１：1000、KPL Inc.、メリーランド州ゲーターズバーグ）と一緒に、サンプルを連続的にインキュベートした。増強したルミノール（4-ヨードフェノールおよび過酸化水素、Aldrich Chemical Co. Inc.、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を基質として用いた。ML3000照度計（Dynatech Lab.、バージニア州シャンティ）で読み取り、相対光単位（RLU）を決定した。４つの重複ウェルからRLUの平均値を算出し、すべての実験を少なくとも２回繰り返した。
【０１１０】
毒性アッセイ
市販のテトラゾリウム染料還元アッセイ（CellTiter96；Promega Corp.、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて、上記酵素を試験した。簡潔に言えば、以下に示す各濃度の酵素を、集密MDCK細胞単層を含む96-ウェルプレートに導入した。各希釈物を３回繰り返して評価した。37℃の５％CO2において、酵素を単層上でインキュベートした。48時間後、プレートを１時間展開させ、490nmのELISAプレート読取装置で読み取った。結果を記録および分析した。酵素を含む平均ODから、酵素を含まない培地対照の平均ODを差し引いた後、培地のODで割り、100を掛けることにより、毒性％を算出した。以下の表に示すように、細胞毒性スコアを割り当てた。
毒性％ スコア
０〜５％            ０
６〜25％            １
26〜50％            ２
51〜75％            ３
76〜100％           ４
【０１１１】
酵素の濃度が３U/mL以上で、有意な毒性が認められた。酵素が、0.1〜１U/mLの範囲内にあれば、有意な毒性は認められなかった（表12）。従って、この濃度範囲（1.0 U/mL以下）で、１セットの実験を行うことにより、酵素の活性および酵素の特異性を決定した。第１の実験では、MDCK細胞を脱嚢スポロゾイトで感染させた。３時間のインキュベーション後、細胞単層を洗浄し、様々な濃度で、酵素を48時間にわたり添加した。表13に示すように、上記酵素は、in vitroで0.01〜１U/mLの範囲で、抗クリプトスポリジウム活性を示した。0.1U/mLのの濃度で、約50％阻害が達成された（図１）。
【０１１２】
【表１２】
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【０１１３】
【表１３】
0004871473.tif 000014
【０１１４】
第２セットの実験を実施し、酵素の特異性を評価した。スポロゾイトを様々な濃度の酵素で45分処理した後、簡単に洗浄した。次に、処理済のスポロゾイトを未処理の宿主細胞に感染させ、48時間発生および繁殖させた。別の実験では、宿主細胞を様々な濃度の酵素と一緒にインキュベートし、洗浄後、未処理のスポロゾイトに感染させた。以下の表（表14）に示すように、スポロゾイトまたは宿主細胞のいずれかを酵素で処理した場合、部分的な阻害が生じた。この濃度範囲では、用量依存的阻害は認められなかった。これは、宿主または寄生細胞と酵素の短いインキュベーション時間（45分）、あるいは、宿主／寄生受容体の部分的もしくは不完全な切断によるものと思われる。また、恐らく、その他の宿主／寄生受容体も感染に関与していると考えられ、宿主細胞で観察された増殖を説明している。
【０１１５】
【表１４】
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【０１１６】
実施例１４  クリプトスポリジウム感染に対するPI-PLCのin vivo評価
免疫不全SCIDマウスモデルを用いて、酵素の抗クリプトスポリジウム効力を評価した。簡潔に言えば、0.1％BSA、PBS（pH 7.2）で、精製接合子嚢（６ヶ月未満の保存）を洗浄して、重クロム酸カリウムを除去することにより、接合子嚢接種材料を調製した。SCIDマウス（4〜5週齢）を106個の接合子嚢（IOWA株）に感染させ、以下に示すように処理した。マウスから糞サンプルを回収し、不連続的スクロースで精製した後、すでに記載されているように、フローサイトメトリーにより寄生体負荷を評価した。Arrowwoodら、J. Parasitol. 81:404-409, 1995を参照。
【０１１７】
【表１５】
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【０１１８】
顆粒状のマウス固形飼料を、PBS中の30もしくは90 U/lbのPI-PLC、またはPBSでコーティングした。すべてのマウスに無制限に給餌した。マウスを感染後、直ちに給餌した。糞サンプルおよび体重を毎週２回回収した。飼料の消費を毎日測定した。マウスは、各々0.2 ccの100 mg/mlケタミン、100 mg/mlキシラジンおよび0.9％NaClを注射して安楽死させた。
【０１１９】
マウス１匹当たりが1日当たりに消費した平均飼料およびマウスの平均体重を表16に示す。３週間にわたり、飼料の消費および体重に統計的に有意な差異は認められなかった。
【０１２０】
【表１６】
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【０１２１】
感染から３週間後の効力
表17に示すように、処理したおよび対照群のSCIDマウスから、感染から３、４および4.5週間後に糞サンプルを回収し、100マイクロリットルのサンプル中のクリプトスポリジウムを計数した。表に示すように、酵素で処理したマウスは、寄生体負荷の低下を示した。処理した群において寄生体負荷が認められた（34〜54％）。これらの低下のいくつかは、ANOVA統計分析（以下に符号をつけて示す）を用いて評価すると、統計的に有意であった。酵素は、抗クリプトスポリジウム治療薬として有望であることを示す。酵素の用量をより高くするか、酵素の感染部位への送達をより良好にすることにより、その効能を増強する可能性があり、将来の実験で言及されるであろう。
【０１２２】
【表１７】
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【０１２３】
実施例１５  増殖試験に用いた飼料中酵素の確認
上記動物実験で用いる飼料から抽出したPI-PLCのアッセイを実施例10に記載したように実施した。結果を表18〜19にまとめる。
【０１２４】
【表１８】
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【０１２５】
飼料からの抽出効率は、飼料の種類に応じて有意に違っていた。マウス飼料からの抽出は、73.4〜76％の効率を示した（表18）。３つの異なる場所で作製されたニワトリ飼料の３種の異なる調製物に注意深く45または180 U/lbの組換えPI-PLCをローディングした後、直ちに抽出し、ローディングレベルが、実施例９の連続的アッセイ方法の範囲にあることから、実施例９のアッセイ方法を用いてアッセイした（表19）。
【０１２６】
【表１９】
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【０１２７】
コーンミールからの抽出効率は、マウス飼料からの抽出と類似していることがわかる。しかし、幾つかのニワトリ飼料サンプルの抽出は、この実験、また他の実験でも乏しかった。
【０１２８】
表20に示す試験では、抽出可能な酵素は、理論上のPI-PLCの約30〜45％であるのに対し、β-マンナナーゼは容易に抽出が可能で、収率は約100％であった。約45％の抽出が、前記抽出試験で、この飼料について得られた最高レベルの抽出であった。従って、表20の試験の飼料について抽出されたU/lb.のアッセイ結果は、使用したローディングに予測される範囲にある。
【０１２９】
【表２０】
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【０１３０】
本発明を説明する目的で、特定の代表的実施形態および詳細を示してきたが、当業者には、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更および改変が本発明で行われることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  バシラス・メガテリウム株により生産される組換えPI-PLC酵素の抗クリプトスポリジウム活性を示す図である。
【図１】
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