(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を有する、フェノール酸化活性を有する酵素。
【請求項２】
酵素がＳ．ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ，Ｓ．ｃｈａｒｔａｒｕｍ，Ｓ．ｋａｍｐａｌｅｎｓｉｓ，Ｓ．ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ，Ｓ．ｂｉｓｂｙｉ，Ｓ．ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ，Ｓ．ｄｉｃｈｒｏａ，Ｓ．ｏｅｎａｎｔｈｅｓ及びＳ．ｎｉｌａｇｅｒｉｃａを含むＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ属の株から得ることができる、請求項１記載のフェノール酸化酵素。
【請求項３】
配列番号：２に開示されたアミノ酸配列を有する、請求項１記載のフェノール酸化酵素。
【請求項４】
配列番号：２に示された配列を有するアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：１又は配列番号：３に開示された核酸配列に少なくとも９０％同一性を有する、請求項４記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号：１に開示された核酸配列を有する、請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号：３に開示された核酸配列を有する、請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
高いストリンジェンシー条件下で配列番号：１又は配列番号：３に示された配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる単離されたポリヌクレオチドであって、フェノール酸化酵素の活性を有する請求項１記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項４記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９、請求項１０又は請求項１１記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
繊維状の真菌である、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１４】
繊維状の真菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属及びＭｕｃｏｒ属を含む、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
酵母である、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１６】
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、及びＹａｒｒｏｗｉａ属を含む、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】
宿主が細菌である、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１８】
細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ属及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属を含む、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】
工程：
（ａ）フェノール酸化酵素の生産に適した条件下で配列番号：２に開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するフェノール酸化活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）生産されたフェノール酸化酵素を任意に回収すること
を含む、宿主中でフェノール酸化酵素を生産する方法。
【請求項２０】
フェノール酸化酵素がＳ．ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ，Ｓ．ｃｈａｒｔａｒｕｍ，Ｓ．ｋａｍｐａｌｅｎｓｉｓ，Ｓ．ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ，Ｓ．ｂｉｓｂｙｉ，Ｓ．ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ，Ｓ．ｄｉｃｈｒｏａ，Ｓ．ｏｅｎａｎｔｈｅｓ及びＳ．ｎｉｌａｇｅｒｉｃａを含むＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ属の株から得ることができる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
フェノール酸化酵素がＳ．ｃｈａｒｔａｒｕｍから得ることができ、そして配列番号：２に開示されたアミノ酸配列を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドが配列番号：１又は配列番号：３に示された配列を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞が繊維状真菌、酵母及び細菌を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、及びＹａｒｒｏｗｉａ属を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
繊維状の真菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属及びＭｕｃｏｒ属を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
繊維状の真菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
繊維状の真菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
繊維状の真菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属である、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
繊維状の真菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
工程：
（ａ）配列番号：２に開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を有するフェノール酸化活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドを得て；
（ｂ）上記ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入し；そして
（ｃ）上記フェノール酸化酵素の生産に適した条件下で上記宿主細胞を生育させること
を含む、フェノール酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞の生産方法。
【請求項３１】
宿主細胞が繊維状真菌、酵母及び細菌を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
繊維状の真菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属及びＭｕｃｏｒ属を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉである、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属である、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
上記ポリヌクレオチドが配列番号：１又は配列番号：３に示す核酸に少なくとも９０％同一性を有する、請求項３０記載の方法。
【請求項３８】
上記ポリヌクレオチドが配列番号：１又は配列番号：３に示す核酸配列を有する、請求項３０記載の方法。
【請求項３９】
上記ポリヌクレオチドが複製するプラスミド上に導入される、請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
上記ポリヌクレオチドが宿主細胞ゲノムに組み込まれる、請求項３０記載の方法。
【請求項４１】
請求項１記載のフェノール酸化酵素を含む酵素組成物。
【請求項４２】
配列番号：２に示す配列を有するフェノール酸化酵素を含む、請求項４１記載の酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規なフェノール酸化酵素、特に、これらの酵素を生産するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓの株及びＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ属の新規な株由来の新規なフェノール酸化酵素に関する。
発明の背景
フェノール酸化酵素は酸化還元反応、即ち電子の電子ドナー（通常はフェノール化合物）から、Ｈ2Ｏに還元される分子酸素（電子受容体として作用する）への変換を触媒することにより機能する。様々な異なるフェノール化合物を電子ドナーとして使用できるが、フェノール酸化酵素は電子受容体としての分子酸素に関して極めて特異的である。
【０００２】
フェノール酸化酵素は広く様々な応用のために利用可能であり、洗浄剤工業、製紙工業及びパルプ工業、織物工業及び食品工業を含む。洗浄剤工業においては、フェノール酸化酵素を洗浄剤洗浄の間に一つの織物から別の織物への溶液中の染料の移入を妨害するために使用されており、染料移入阻害と呼ばれる応用である。
【０００３】
ほとんどのフェノール酸化酵素は、酸性ｐＨ範囲においてｐＨ最適値を呈し、中性又はアルカリ性ｐＨにおいては不活性である。
【０００４】
フェノール酸化酵素は広い範囲の様々な真菌により生産されることが知られており、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ，Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ，Ｂｏｔｙｌｉｓ，Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ，Ｆｏｍｅｓ，Ｐｈｌｅｂｉａ，Ｔｒａｍｅｔｅｓ，Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ，Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ及びＬｅｎｔｉｎｕｓ属を含む。しかしながら、洗浄剤洗浄法及び組成物においてアルカリ範囲に最適ｐＨ値を示す、フェノール酸化酵素及びフェノール酸化酵素を天然において生産できる生物を同定及び単離する要求が満たされないままである。
発明の概要
本発明は、新規なフェノール酸化酵素に関する。好ましい態様において、本発明は、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓから得ることができるフェノール酸化酵素に関する。特に、本発明の酵素は、異なる化学構造を有する染料及び発色化合物に付随して、特に中性又はアルカリ性ｐＨにおいて発色を修飾することができる。それらの発色修飾能力に基づき、本発明のフェノール酸化酵素は、例えばパルプ及び紙の漂白のために、染色の色を漂白するため及び洗浄剤及び織物の応用において使用することができる。本発明の一つの側面において、上記フェノール酸化酵素は増強剤の不在下で染料又は発色化合物の色を修飾することができる。本発明の別の側面において、上記フェノール酸化酵素は増強剤の存在下で色を修飾することができる。
【０００５】
本発明は、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓから得ることができ、且つ、配列番号：２に示す演繹されたアミノ酸配列を有するフェノール酸化酵素をコードするゲノミック配列（配列番号：３）の同定及び特性決定に基づく。
【０００６】
従って、本発明は、染料又は発色化合物に付随する色を修飾できさえすれば、配列番号：２に開示されたアミノ酸配列を有するフェノール酸化酵素に、少なくとも６８％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６８％同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性及び少なくとも９５％同一性を有するフェノール酸化酵素を提供する。一つの態様において、上記フェノール酸化酵素はＭＵＣＬ加盟番号３８８９８を有するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍにおいて含まれるような、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する。
【０００７】
一つの態様において、上記フェノール酸化酵素は、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種から得ることができ、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ，Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ；Ｓ．ｋａｍｐａｌｅｎｓｉｓ；Ｓ．ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ；Ｓ．Ｂｉｓｂｙｉ，Ｓ．ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ，Ｓ．ｏｅｎａｎｔｈｅｓ及びＳ．ｎｉａｇｅｒｉｃａを含む。別の態様において、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓは、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  ＭＵＣＬ３８８９８及びＳ．ｃｈａｒｔａｒｕｍ  ＭＵＣＬ３０７８２を含む。
【０００８】
さらに別の態様において、本発明は、フェノール酸化酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、但し、上記ポリヌクレオチドは、染料又は発色化合物に付随する色を修飾できさえすれば、配列番号：１に、少なくとも６５％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６５％同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％及び少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む。本発明は、ポリヌクレオチドが染料又は発色化合物に付随する色を修飾できさえすれば、配列番号：１又は３に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を包含する。本発明は、配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドも包含する。一つの態様において、上記ポリヌクレオチドは、ＭＵＣＬ加盟番号３８８９８を有するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍにおいて含まれるような、配列番号：１又は３に示す核酸配列を有する。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び宿主細胞も提供する。本発明は、本発明のフェノール酸化酵素を生産するための方法にも関する。従って、本発明は、フェノール酸化酵素を生産する方法を提供するが、上記フェノール酸化酵素を生産するのに適切な条件下で、配列番号：２に開示されたアミノ酸配列を有するフェノール酸化酵素に少なくとも６８％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６８％同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性及び少なくとも９５％同一性を有する配列を有するフェノール酸化酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し；そして任意に生産されたフェノール酸化酵素を回収する工程を含む。一つの態様において、上記ポリヌクレオチドは配列番号：１に示す配列を含む。別の態様において、上記ポリヌクレオチドは配列番号：３に示す配列を含む。更なる態様において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号：１又は配列番号：３に示されたか又はＭＵＣＬ加盟番号３８８９８を有するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍにおいて含まれるような配列を有するポリヌクレオチドと高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。別の態様において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号：１又は配列番号：３に、少なくとも６５％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６５％同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％及び少なくとも９５％同一性を有する。本発明は、フェノール酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を生産する方法も提供するが、配列番号：３に、少なくとも６５％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６５％同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％及び少なくとも９５％同一性を有する、上記フェノール酸化酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドを得て；上記ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入し；そして上記フェノール酸化酵素を生産するのに適した条件下で上記宿主��胞を成長させる工程を含む。一つの態様において、上記ポリヌクレオチドは複製するプラスミドである。本発明は、配列番号：１又は配列番号：３に示すポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。一つの態様において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号：１又は配列番号：３に示されたか又はＭＵＣＬ加盟番号３８８９８を有するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍにおいて含まれるような核酸配列を有する。
【０００９】
本発明の一つの態様において、フェノール酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、繊維状真菌、酵母及び細菌を含む。別の態様において、上記宿細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種及びＭｕｃｏｒ種を含む繊維状真菌である。さらなる態様において、上記繊維状真菌宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉを含む。
【００１０】
本発明の別の態様において、上記宿主細胞は酵母であり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ及びＹａｒｒｏｗｉａ種を含む。さらに別の態様において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。さらなる態様において、上記宿主細胞はグラム陽性細菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ種、及びグラム院生細菌、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種を含む。
【００１１】
また、本明細書には、配列番号：２に開示されたアミノ酸配列を有するフェノール酸化酵素に少なくとも６８％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６８％同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性及び少なくとも９５％同一性を有する配列を有するアミノ酸を含む酵素組成物も提供される。そのような酵素組成物は、例えば、洗浄剤及び他の洗浄用組成物；パルプ及び製紙の応用及び織物の応用における使用のための組成物を製造するために使用することができる。
【００１２】
本発明は、染色においてサンプルに生じる染料又は発色化合物に付随する色を修飾するための方法も包含し、酵素が染料又は発色化合物に付随する色を修飾できさえすれば、配列番号：２に開示されたアミノ酸配列を有するフェノール酸化酵素に少なくとも６８％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６８％同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性及び少なくとも９５％同一性を有する配列を有するアミノ酸を含む組成物にサンプルを接触させる工程を含む。
【００１３】
上記方法の一つの側面において、ｐＨ最適値は５．０と１１．０の間であり、別の側面においてはｐＨ最適値は７と１０．５の間であり、そしてまた別の側面においてはｐＨ最適値は８．０と１０．０の間である。上記方法の更なる側面においては、アミノ酸が配列番号：２に示すアミノ酸である。
詳細な説明
定義
本明細書にて使用する、用語フェノール酸化酵素は、電子ドナーがフェノール化合物である酸化還元反応を触媒することができ、そして電子受容体として分子酸素又は過酸化水素に特異的な酵素を意味する。Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍから得ることができる本発明の一つの例示のフェノール酸化酵素を、配列番号：２に示す。本発明は、配列番号：２に開示されたアミノ酸配列を有するフェノール酸化酵素に少なくとも６８％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６８％同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性及び少なくとも９５％同一性を有する配列を有するフェノール酸化酵素を包含する。本明細書にて使用される、同一性は、ＧＣＧソフトウエアのＧＡＰプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により以下のパラメーター：Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ＝１２；Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ＝４；Ｇａｐ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝８；及びＧａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２を用いて測定する。
【００１４】
本明細書にて使用される、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓは、染料又は発色化合物に付随する色を変調できるフェノール酸化酵素を生産するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種を意味する。本発明は、誘導体が染料又は発色化合物に付随する色を変調できるフェノール酸化酵素を生産できる限り、子孫及び変異体を含むＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓの天然単離物の誘導体を包含する。
【００１５】
本明細書にて使用される、フェノール酸化酵素に言及する際、用語「得ることができる」は、陳述された特定の微生物株に由来するか又はそれにより天然に生産されるフェノール酸化酵素を意味する。例示すると、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓから得ることができるフェノール酸化酵素は、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓにより天然に生産されるそれらのフェノール酸化酵素を意味する。本発明は、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種により生産されるのと同一のフェノール酸化酵素であるが、上記フェノール酸化酵素をコードする遺伝子により形質転換された生物、例えば細菌、真菌又は酵母により遺伝子操作技術の使用を通して生産されるか、又はＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ由来のものに同一か、又はＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ由来のものに均等な生物、例えば子孫及び変異体により生産される。
【００１６】
本発明は、配列番号：１又は配列番号：３に示す配列を有するポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされたフェノール酸化酵素を包含する。本発明は、配列番号：１に開示された配列を有するポリヌクレオチドに、少なくとも６５％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６５％同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％及び少なくとも９５％同一性を有する、フェノール酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを包含する。核酸レベルの同一性は、ＧＣＧソフトウエアのＧＡＰプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により以下のパラメーター：Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ＝５０；Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ＝４；Ｇａｐ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５０；及びＧａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３を用いて測定する。本発明は、変異体、異型又は誘導体フェノール酸化酵素が天然に生じるフェノール酸化酵素の少なくとも一つの特徴的な活性を保持できる限り、本発明のフェノール酸化酵素の、部分を含む、変異体、異型、誘導体も包含する。
【００１７】
本明細書にて使用される、用語「発色化合物」は、染色の外観上の出現をもたらす織物又は物質に色を付加する物質を意味する。Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｆｉｂｅｒ  ａｎｄ  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈｏｅｓｔ  Ｃｅｌａｎｅｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９０）ＰＯ  Ｂｏｘ３２４１４，Ｃｈａｒｉｏｔｔｅ  ＮＣ  ２８２３２にて定義されるとおり、化学反応、吸着、又は分散により繊維に取り込まれる発色化合物である。染料の例は、直接ブルー染料、酸性ブルー染料、直接レッド染料、反応性ブルー染料及び反応性ブラック染料を含む。通常使用される織物染料のカタログは、Ｃｏｌｏｕｒ  Ｉｎｄｅｘ  第３版第１−８巻に見いだされる。染色の視覚上の出現をもたらす物質の例は、ポリフェノール、カロテノイド、アントシアニン、タンニン、マイラード（Ｍｉｌｌａｒｄ）反応産物等である。
【００１８】
本明細書にて使用される句「染料又は発色化合物に付随した色を修飾する」又は「発色化合物の修飾」は、色が修飾されて出現するように、即ち色が視覚上退色するか（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）、薄くなるか（ｌｅｓｓｅｎｅｄ）、脱色するか、漂白されるか、又は消える（ｒｅｍｏｖｅｄ）ようにか、あるいは色は影響されないが、染料の再沈着が阻害されるように化合物が修飾されるように、直接又は間接の何れかにて酸化を通して染料又は化合物が変化することを意味する。本発明は、あらゆる意味においての色の修飾を包含し、例えばあらゆる意味においての織物の染色からの発色化合物の完全な除去並びに色の強度の低下又は化合物の色の変化を含む。
【００１９】
本明細書にて使用される、用語「変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）及び異型（ｖａｒｉａｎｔｓ）」は、フェノール酸化酵素に関連させる場合、天然に生じるアミノ酸配列及び／又はその構造の変化、例えば構造遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列の変化及び／又はフェノール酸化酵素のアミノ酸配列及び／又は構造の変化により得られるフェノール酸化酵素を意味する。本明細書にて使用される用語フェノール酸化酵素「誘導体」は、天然に生じるフェノール酸化酵素の少なくとも一つの活性を保持する完全長の天然か又は異型のフェノール酸化酵素のアミノ酸配列の一部又は断片を意味する。本明細書にて使用される、用語「変異体及び異型」は、微生物株に関連させる場合、例えばフェノール酸化酵素をコードする構造遺伝子の変化したＤＮＡヌクレオチド配列を例えば有するいくつかの形態の天然単離物から変化した細胞；フェノール酸化酵素生産を増強するための天然単離物に対する変化；又はフェノール酸化酵素発現に影響する他の変化を意味する。
【００２０】
用語「増強剤」又は「媒介剤」は、染料に付随した色を修飾することができるあらゆる化合物、フェノール酸化酵素に関連した発色化合物又はフェノール酸化酵素の酸化活性を増加させる化合物を意味する。増強剤は典型的には有機化合物である。
フェノール酸化酵素
本発明のフェノール酸化酵素は、フェノール酸化酵素は酸化還元反応、即ち電子の電子ドナー（通常はフェノール化合物）から、水に還元される分子酸素（電子受容体として作用する）への変換を触媒することにより機能する。そのような酵素の例は、ラッカーゼ（ＥＣ  １．１０．３．２）、ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．５）、フェノールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１４．１８．１）、カテコールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１０．３．１）である。
フェノール酸化酵素をコードする核酸
本発明は、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種から得ることができるフェノール酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを提供するが、但し、上記ポリヌクレオチドは、染料又は発色化合物に付随する色を修飾できさえすれば、配列番号：３に開示されたポリヌクレオチド配列に、少なくとも６５％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６５％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性及び少なくとも９５％同一性からなる。一つの態様のにおいて、上記フェノール酸化酵素は、配列番号：１又は配列番号：３に示すポリヌクレオチド配列を有するか又はＭＵＣＬ加盟番号３８８９８を有するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍにおいて含まれるようなポリヌクレオチド配列を有する。当業者には理解されることになるが、遺伝コードの縮重のために、様々なポリヌクレオチドが配列番号：２に開示されたフェノール酸化酵素をコードし得る。本発明は、そのようなポリヌクレオチド全てを包含する。
【００２１】
フェノール酸化酵素をコードする核酸は、化学合成によるか、ｃＤＮＡクローニングによるか、ＰＣＲによるか、又は所望の細胞、例えばＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種から精製されたゲノミックＤＮＡ又はその断片のクローニングにより、例えばクローン化されたＤＮＡ（例えば。ＤＮＡライブラリー）から、当業界にて知られる標準手法により得てよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編纂），１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ．を参照）。ゲノミックＤＮＡに由来する核酸配列は、コード領域に加えて制御領域を含んでよい。源が何であれ、本発明のフェノール酸化酵素をコードする単離された核酸は、遺伝子の増殖のために適切なベクターに分子学上クローン化するべきである。
【００２２】
ゲノミックＤＮＡからの上記遺伝子の分子クローニングにおいては、ＤＮＡ断片を生じさせるが、そのいくつかが所望の遺伝子をコードすることになる。上記ＤＮＡは様々な制限酵素を用いて特定の位置において分断してよい。あるいは、上記ＤＮＡを断片化するためにマンガンの存在下でＤＮＡｓｅを使用してよく、あるいは上記ＤＮＡを例えば音波処理により物理的に剪断することができる。直鎖状化されたＤＮＡは、次に、限定ではないがアガロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びカラムクロマトグラフィーを含む技術によりサイズに従い分離することができる。
【００２３】
核酸断片が生成したなら、フェノール酸化酵素をコードする特定のＤＮＡ断片の同定は多数の様式において達成してよい。例えば、本発明のフェノール酸化酵素コード遺伝子又はその特定のＲＮＡ又はその断片、例えばプローブ又はプライマーを単離し、標識し、そして次にハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することにより、生成した遺伝子を検出してよい（Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｒ．１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｍ  Ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：３９６１）。上記プローブに対して実質上同じ配列類似性を共有するそれらのＤＮＡ断片に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることになる。
【００２４】
本発明は、配列番号：１又は配列番号：３をプローブ又はプライマーとして使用し、そしてゲノミック又はｃＤＮＡオリジンの何れかの核酸をスクリーニングする核酸ハイブリダイゼーション技術を通して同定されるＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種から得ることができるフェノール酸化酵素を包含する。Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種から得ることができるフェノール酸化酵素をコードし、且つ配列番号：１又は配列番号：３に６５％同一性を有する核酸配列は、配列番号：１又は配列番号：３のプローブ、一部又は断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション又は増幅により検出することができる。従って、本発明は、本発明により包含されるフェノール酸化酵素をコードする核酸の検出方法を提供し、配列番号：１又は配列番号：３の一部又は全核酸配列に、ゲノミック又はｃＤＮＡオリジンのＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ核酸をハイブリダイズすることを含む。
【００２５】
従って、本発明の範囲には、高いストリンジェンシー下にて配列番号：３に開示された核酸配列にハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体の溶融温度（Ｔｍ）を基礎とし、引用により本明細書に取り込まれるＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されるとおりであり、定義された「ストリンジェンシー」を参照しており、以下に説明されるとおりである。
【００２６】
「最大のストリンジェンシー」は典型的には約Ｔｍ−５℃にて起こる（プローブのＴｍから５℃下）；「高いストリンジェンシー」は約５℃から１０℃下において；「中間のストリンジェンシー」は約１０℃から２０℃下において；そして「低いストリンジェンシー」は約２０℃から２５℃下においてである。例えば、本発明においては、以下が高いストリンジェンシーの条件である：ハイブリダイゼーションを、５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ，０．５％のＳＤＳ及び５０ｕｇ／ｍｌの剪断ニシンＤＮＡを含むバッファー中で３７℃において行った。洗浄は、６５℃において３０分間１ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳの存在下で１回、６５℃において３０分間０．５ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳの存在下で１回及び６５℃において３０分間０．１ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳの存在下で１回実施した；以下は、中間のストリンジェンシーの条件である：ハイブリダイゼーションを、２５％のホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ，０．５％のＳＤＳ及び５０ｕｇ／ｍｌの剪断ニシンＤＮＡを含むバッファー中で３７℃において行った。洗浄は、５０℃において３０分間１ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳの存在下で１回、５０℃において３０分間０．５ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳの存在下で１回実施した；以下は、低いストリンジェンシーの条件である：ハイブリダイゼーションを、２５％のホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ，０．５％のＳＤＳ及び５０ｕｇ／ｍｌの剪断ニシンＤＮＡを含むバッファー中で３７℃において行った。洗浄は、３７℃において３０分間１ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳの存在下で１回、３７℃において３０分間０．５ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳの存在下で１回実施した。高いストリンジェンシー条件下で核酸プローブにハイブリダイズできる核酸はプローブに対して約８０％から１００％の同一性を有することになる；中間のストリンジェンシー条件下で核酸プローブにハイブリダイズできる核酸はプローブに対して約５０％から８０％の同一性を有することになる。本明細書にて使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の一つの鎖が塩基対を通して相補鎖と対合するプロセス」を含むだろう（Ｃｏｏｍｂｓ  Ｊ（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ）。
【００２７】
ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）において実施される増幅のプロセスは、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＣＷ  ａｎｄ  ＧＳ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  ＮＹ）に記載される。配列番号：３からの少なくとも約１０ヌクレオチド及び多くて約６０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１２から３０ヌクレオチド、そしてより好ましくは約２５ヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【００２８】
ｃＤＮＡ又はゲノミックライブラリーから本発明の核酸構築物を単離するための好ましい方法は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列を基にして製造される縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いたポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）の使用による。例えば、ＰＣＲは米国特許第４，６８３，２０２号に記載された技術を用いて実施してよい。
発現系
本発明は、微生物、例えば真菌、酵母及び細菌におけるフェノール酸化酵素の生産のための宿主、発現方法及び発現系を提供する。本発明のフェノール酸化酵素をコードする核酸が得られたなら、該核酸を含む組換え宿主細胞を当業界でよく知られた技術を用いて構築してよい。分子生物学の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に開示される。以下のパラメーター：Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ＝５０；Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ＝４；Ｇａｐ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５０；及びＧａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３を用いて、ＧＣＧソフトウエアのＧＡＰプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により測定された、配列番号：１又は配列番号：３の核酸に、少なくとも６５％から１００％の間の同一性、即ち少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％及び少なくとも９５％同一性を有するフェノール酸化酵素をコードする核酸を得て、適当なベクターを用いて形質転換する。真菌、酵母及び細菌におけるクローニング、形質転換及び発現に適した様々なベクター及び形質転換及び発現のためのカセットが当業者には知られている。
【００２９】
典型的には、上記ベクター又はカセットは、核酸の転写及び翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー及び自律複製又は染色体組み込みを可能にする配列を含む。適当なベクターは、転写開始コントロールを有する遺伝子の５’領域及び転写の終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。これらの制御領域は、選択された制御領域が宿主細胞中で機能できる限り、宿主に対して同種又は異種の遺伝子に由来してよい。
【００３０】
開始制御領域又はプロモーターは、宿主細胞におけるフェノール酸化酵素の発現を操縦するのに有用であり、当業者には知られている。理想的には、これらのフェノール酸化酵素を操縦できるあらゆるプロモーターが本発明に適している。フェノール酸化酵素をコードする核酸は、作動可能なように、酸化酵素又は還元酵素の効果的な発現のために選択された発現制御領域に開始コドンを介して連結する。適当なカセットが構築されたなら、それを使用して宿主細胞を形質転換する。
【００３１】
一般的な形質転換の手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第１巻、Ａｕｓｂｅｌらにより編纂、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８７，第９章）に教示されており、リン酸カルシウム法、ＰＥＧを用いた形質転換及びエレクトロポレーションを含む。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａに関しては、ＰＥＧ及びカルシウム媒介プロトプラスト形質転換を使用することができる（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，ＤＢ  １９９２  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ＆  Ｂｉｌｌにより編纂）１１３−１５６）。プロトプラストのエレクトロポレーションは、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，ＤＢ  １９９２  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ＆  Ｂｉｌｌにより編纂）１１３−１５６に開示される。分生子に対するマイクロインジェクションの砲撃は、Ｆｕｎｇａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｏｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｉｎｉｄｉａ．ＦＥＢＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２５  ２９３−２９８に記載される。Ａｇｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにより媒介される形質転換は、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６  ８３９−８４２に開示される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの形質転換に関しては、酢酸リチウム媒介形質転換及びＰＥＧ及びカルシウム媒介プロトプラスト形質転換並びにエレクトロポレーション技術が当業者には知られている。
【００３２】
本発明のフェノール酸化酵素のコード配列を含み、そして該蛋白質を発現する宿主細胞は、当業者に知られている様々な手法により同定してよい。これらの手法は、限定ではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び核酸又は蛋白質の検出及び／又は同定のための、膜に基づくか、溶液に基づくか又はチップに基づく技術を含むプロテインアッセイ又はイムノアッセイ技術を含む。
【００３３】
本明細書にて使用される、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ（ＭＵＣＬ３８８９８）から得ることができるフェノール酸化酵素をコードする核酸（配列番号：３）を単離して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉにおいて発現した。
フェノール酸化酵素の活性
本発明のフェノール酸化酵素は電子ドナーとして広く様々な異なるフェノール化合物を使用でき、電子受容体として分子酸素又は過酸化水素に極めて特異的である。
【００３４】
特定の基質及び反応条件、例えば温度、増強剤の在否等に依存して、各フェノール酸化酵素の酸化反応は最適なｐＨを有することになる。
ポリフェノール酸化酵素の応用
前記のとおり、本発明のＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓのフェノール酸化酵素は、酸素又は過酸化水素を電子受容体として用いて異なる化学構造を有する広く様々な染料又は発色化合物を酸化することができる。従って、本発明のフェノール酸化酵素は、例えばクリーニングにおいて織物上の食物による汚れを除去するため；及び織物のため；及び製紙及びパルプの応用のために染料又は発色化合物に付随した色を修飾することが望まれる応用において使用される。
発色化合物
本発明においては、様々な発色化合物が、本発明のフェノール酸化酵素による酸化のための標的となり得た。例えば、界面活性剤の応用においては、織物上の汚れとして生じるかもしれない発色化合物が標的となり得る。いくつかの種類又はクラスの発色物質が、汚れ、例えばプルフィリン由来の構造、例えば血液の汚れのヘム又は植物のクロロフィル；お茶の汚れにおいて生じるタンニン及びポリフェノール（Ｐ．Ｒｉｂｅｒｅａｕ−Ｇａｙｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ，Ｅｄ．Ｏｌｉｖｅｒ  ＆  Ｂｏｙｄ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１９７２，ｐｐ．１６９−１９８）、ワインの汚れ、バナナの汚れ、ピーチの汚れ、カロテノイド、トマトにおいて生じる発色した物質（リコピン、赤色）、マンゴ（カロテン、橙黄色）（Ｇ．Ｅ．Ｂａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９５），Ｖｏｌ  ７，１０２７−１０３８）；アントシアニン、多くの果物及び花において生じる発色性の高い分子（Ｐ．Ｒｉｂｅｒｅａｕ−Ｇａｙｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ，Ｅｄ．Ｏｌｉｖｅｒ  ＆  Ｂｏｙｄ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１９７２，ｐｐ．１３５−１６９）；及びメイラード反応産物、蛋白質／ペプチド構造存在下で糖質分子の加熱に際して出現するクッキングオイル中に見いだされるような黄色／褐色の物質として出現するかもしれない。
増強剤
本発明のフェノール酸化酵素は、染料又は発色化合物に付随した色を、増強剤の存在又は不在下で、該化合物の特性に依存して修飾するように作用する。化合物はフェノール酸化酵素のための直接の基質として作用することができるなら、該フェノール酸化酵素は増強剤の不在下で染料又は発色化合物に付随した色を修飾することになるが、増強剤は最適なフェノール酸化酵素活性に関して好ましいままであってよい。フェノール酸化酵素の直接の基質として作用できないか又はフェノール酸化酵素に直接接近できない他の発色化合物に関して、増強剤は最適なフェノール酸化酵素活性及び色の修飾に必要である。
【００３５】
増強剤は、例えば、１９９５年１月１２日に公開されたＷＯ９５／０１４２６；１９９６年３月７日に公開されたＷＯ９６／０６９３０；及び１９９７年３月２７日に公開されたＷＯ９７／１１２１７に記載される。増強剤は、限定されないが、フェノールチアジン−１０−プロピオン酸（ＰＴＰ），１０−メチルフェノチアジン（ＭＰＴ）、フェノキサジン−１０−プロピオン酸（ＰＰＯ）、１０−メチルフェノキサジン（ＭＰＯ）、１０−エチルフェノチアジン−４−カルボキシル酸（ＥＰＣ）アセトシリンゴン、シリングアルデヒド、メチルシリンゲート、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォネート（ＡＢＴＳ）を含む。
培養
本発明は、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ株及び天然単離物、及びそのような株の誘導体及び単離物、例えば種Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｐａｒｖｉｓｐｏｒａの株、特に、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ  ｖａｒ．ｈｕｇｈｅｓ  ＭＵＣＬ３８９９６；種Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍの株、特にＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  ＭＵＣＬ３８８９８；Ｓ．ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ  ＭＵＣＬ９４８５；Ｓ．ｃｈａｒｔａｒｕｍ  ＭＵＣＬ３０７８２；Ｓ．ｋａｍｐａｌｅｎｓｉｓ  ＭＵＣＬ３９０９０；Ｓ．ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ  ＭＵＣＬ３９２９３；及び本発明のフェノール酸化酵素を生産するＳ．ｂｉｓｂｙｉ，Ｓ．ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ，Ｓ．ｄｉｃｈｒｏａ，Ｓ．ｏｅｎａｎｔｈｅｓ及びＳ．ｎｉｌａｇｅｒｉｃａの株を包含する。
【００３６】
本発明は、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ属の新規な株の生物学上実質純粋な培養物、及び、特にフェノール酸化酵素が生成できる株Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ  ＭＵＣＬ３８９９６及びＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  ＭＵＣＬ３８８９８の生物学上実質純粋な培養物を提供する。
精製
本発明のフェノール酸化酵素は、フェノール酸化酵素生産Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ株（例えば、Ｓ．ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ  ＭＵＣＬ３８９９６，Ｓ．ｃｈａｒｔａｒｕｍ  ＭＵＣＬ３８８９８）の他の必須の栄養と共に同化できる炭素及び窒素を含む栄養培地中で好気性条件下での培養により、生産してよい。上記培地は当業界にてよく知られた原理に従い構成され得る。
【００３７】
培養の間、上記フェノール酸化酵素生産株はフェノール酸化酵素を細胞外に分泌する。これは、フェノール酸化酵素の単離及び精製（回収）が、例えば培養ブロスからの細胞塊の分離（例えば、濾過又は遠心分離）により達成されることを許容する。その結果の細胞を含まない培養ブロスを、所望であれば、最初に濃縮するように（例えば、蒸発又は超遠心分離）使用することができる。所望であれば、フェノール酸化酵素は次に上記の細胞を含まないブロスから分離して、慣用の方法、例えばカラムクロマトグラフィーにより所望の程度に精製することができる。
【００３８】
本発明のフェノール酸化酵素は、宿主培養物の上清の濃縮により細胞外に分泌される培養ブロスから単離及び精製し、そして硫酸アンモニウム分画及びゲル透過クロマトグラフィーをしてよい。
【００３９】
本発明のフェノール酸化酵素は、それらの意図された応用に従い、製剤化及び利用してよい。この点で、洗浄剤組成物中で使用されるなら、フェノール酸化酵素は、発酵ブロスから直接、コートされた固形として米国特許第４，６８９，２９７号に記載された手法を使用して製剤化してよい。さらに、所望であれば、フェノール酸化酵素を適切な担体と共に流体の形態にて製剤化してよい。フェノール酸化酵素は所望であれば固定化してもよい。
【００４０】
本発明は、本発明のＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓのフェノール酸化酵素を含む発現ベクター及び組換え宿主細胞及び組換え宿主細胞からのフェノール酸化酵素ののちの精製も包含する。
酵素組成物
本発明のフェノール酸化酵素は、例えば、洗浄剤又はクリーニング組成物における使用のための酵素組成物を生産するために使用してよい；織物については、繊維の処理、加工、仕上げ、磨き又は生産；紙又はパルプの生産において；及び澱粉の加工の応用においてである。酵素組成物は追加の成分を、例えば、製剤化のため又は性能増強剤として含んでもよい。
【００４１】
例えば、洗浄剤組成物は、フェノール酸化酵素に加えて、慣用の洗浄剤成分、例えば、界面活性剤、結合剤及び別の酵素、例えばプロテアーゼ類、アミラーゼ類、リパーゼ類、クチナーゼ類、セルラーゼ類又はパーオキシダーゼ類を含んでよい。他の成分は、増強剤、安定剤、殺菌剤、光学増白剤及び香料を含む。上記酵素組成物は、あらゆる適切な物理形態をとってよく、例えば粉末、水性又は非水性流体、ペースト又はゲルである。
【００４２】
本発明のフェノール酸化酵素をこのように記載してきたが、以下の実施例は例示の目的に今提示されるのであり、限定として解釈されるべきではない。本明細書においてパーセンテージにて表現される希釈、量等は、特に別に示さない限り、パーセント質量／体積（ｗ／ｖ）のパーセンテージである。本明細書にて使用される、％（ｖ／ｖ）にて表現される希釈、量等は、体積／体積のパーセンテージを意味する。温度は、摂氏の温度（Ｃ）にて示される。本発明を実施する様式及び方法は、以下の実施例を参照することにより当業者に、より完全に理解されることになり、実施例は以下なる様式においても、本発明又は請求の範囲の範囲を限定することを意図しない。本明細書にて引用された全ての文献及び特許刊行物は引用により取り込まれる。
実施例１
精製
この実施例は図２に示されたアミノ酸配列を有するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍのフェノール酸化酵素の精製を例示する。
【００４３】
Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍはＰＤＡプレート（Ｄｉｆｃｏ）上で約５−１０日間生育させた。プレート培養物の一部を使用して５００ｍｌ振盪フラスコ中の１００ｍｌのＰＤＢ（ポテトデキストロースブロス）を接種した。フラスコを２６−２８℃にて、１５０ｒｐｍにて、３−５日間、良好な生育が得られるまで、インキュベートした。
【００４４】
上記ブロス培養物を２．８Ｌの振盪フラスコ中の１ＬのＰＤＢに接種した。フラスコは、２６−２８℃にて、１５０ｒｐｍにて、２−４日間、良好な生育が得られるまで、インキュベートした。
【００４５】
生産培地を含む１０Ｌの発酵器を用意した（グラム／リットルにて、以下を含んだ：グルコース１５；レシチン１  ５１；ｔ−アコニチン酸  １．７３；ＫＨ2ＰＯ4  ３；ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ０．８；ＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏ  ０．１；酒石酸カルシウム  １．２；ダイズペプトン  ５；Ｓｔａｌｅｙ  ７３５９；ベンジルアルコール  １：ツイーン２０  １；ニトリロトリ酢酸  ０．１５；ＭｎＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ０．０５；ＮａＣｌ  ０．１；ＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ０．０１；ＣｏＳＯ4  ０．０１；ＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏ  ０．０１；ＺｎＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ０．０１；ＣｕＳＯ4  ０．００１；ＡＬＫ（ＳＯ4）２．１２Ｈ2Ｏ  ０．００１；Ｈ3ＢＯ3  ０．００１；ＮａＭｏＯ4．２Ｈ2Ｏ  ０．００１）。発酵器は次に１Ｌブロス培養物で接種し、そして発酵を２８Ｃにて６０時間、５．０リットル／分の一定空気流下及び１２０  ＲＰＭの一定撹拌において実施した。ｐＨは６．０に維持した。
【００４６】
１リットルのブロスからの細胞を発酵ブロスから遠心分離により除去し、そして上清をさらにＤＥフィルターを通して濾過することにより透明にした。低分子量の塩を、ｐＨ７．０に調節した２０ｍＭ  ＭＯＰＳを含む４容量のバッファーに対してＡｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜を用いて透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により除去した。
【００４７】
２０ｍｌのＰｏｒｏｓ  ＨＱ−２０樹脂を含むイオン交換カラムを使用して、上記酵素を精製した。上記カラムは最初に５カラム容量（１２５ｍｌ）の２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０により平衡化した。全蛋白質５−１０ｍｇを含むサンプル５ｍｌをカラムに負荷した。カラムは次に３容量のＭＯＰＳバッファーで洗浄し、次に２５０ｍｌの容量の０−０．５Ｍの硫酸アンモニウムの勾配を用いて溶出した。流速は１０ｍｌ／分であった。画分を５ｍｌ容量で回収した。各画分は、ＡＢＴＳ法を用いてフェノール酸化酵素活性をアッセイした。ＡＢＴＳ活性を含んだ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動に供した。ＡＢＴＳ活性に対応したゲル上のバンドを切り出して、アミノ酸配列を決定した。
【００４８】
以下に示すデータは別の精製の作業からであり、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上のＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓオキシダーゼのＢバンドの存在を示す。この精製においては、発酵からの粗精製物質をＨＱ２０を用いたイオン交換カラム上で精製した。画分を４−２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲルの初期非変性（天然）ゲル電気泳動に供した。サンプルをトラッキング染料で希釈して、ランニングバッファーはＬａｅｍｍｌｉバッファーであった。精製度を見るこの初期のゲルは興味のある溶出ピークの全ての画分に実施し、その結果のゲルを銀染色した。活性蛋白質を確認するための第２のゲルは同じピークの他の各画分について実施し、ｐＨ７及びｐＨ１０にてＡＢＴＳで重層した。ＡＢＴＳ重層については、４．５ｍＭのＡＢＴＳをｐＨ７及びｐＨ１０にて用意した（５０ｍＭ酢酸ナトリウムによるｐＨ７及び５０ｍＭ硼酸ナトリウムによるｐＨ１０）。ゲルは重層のために２部に分割した；レーン１−５はｐＨ７で重層、そしてレーン６−１０はｐＨ１０で重層。ＡＢＴＳに関して陽性のバンドを切り出して、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー及びＢＭＥを含むトラッキング染料によりホモジェナイズした。サンプルは、次に、１００℃にて５分間おき、Ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲルに負荷した。ランニングバッファーは２０％ＳＤＳを伴うＬａｅｍｍｌｉバッファーであった。ゲルを次に銀染色した。
【００４９】
初期変性ゲル、ＡＢＴＳ重層ゲル及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を図８、９及び１０にそれぞれ示す。
実施例２
Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍフェノール酸化酵素のアミノ酸配列分析
実施例１に開示されたとおりに調製されたＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍフェノール酸化酵素をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そして単離した。単離された画分を尿素及びヨードアセトアミドで処理し、そして酵素ｅｎｄｏＬｙｓＣいより消化した。ｅｎｄｏＬｙｓＣ消化による断片をＨＰＬＣ（逆相単孔Ｃ１８カラム、ＣＨ３ＣＮ勾配）を用いて分離し、そしてマルチタータープレートを用いて回収した。画分は質量測定のためにＭＡＬＤＩにより分析し、そしてエドマン分解により配列決定した。以下のアミノ酸配列が決定され、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって示される。以下のアミノ酸配列が決定され、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって示される。
Ｎ’  ＦＶＮＳＧＥＮＴＳＰＮＳＶＨＬＨＧＳＦＳＲ  Ｃ’
Ｎ’  ＧＶＥＰＹＥＡＡＧＬＫＤＶＶＷＬＡＲ  Ｃ’
実施例３
ゲノミック核酸のクローニング
２つの縮重プライマーを実施例２に供給されたペプチド配列を基にしてデザインした。プライマー１は以下の配列：ＧＴＣＡＡＣＡＧＴＧＧＮＧＡＲＡＡＹＡＣを含み、そしてプライマー２は以下の配列：ＧＣＧＧＣＣＴＣＡＴＡＮＧＧＣＴＣＮＡＣを含んだが、式中、Ｎは４つ全てのヌクレオチド（Ａ，Ｔ，Ｃ又はＧ）の混合を含み、ＲはＡ及びＧの混合を示し、そしてＹはＴ及びＣの混合を示す。
【００５０】
フェノール酸化酵素をコードするゲノミックＤＮＡの単離のため、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ（ＭＵＣＬ  ＃３８８９８）から得られたＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として使用した。該ＤＮＡをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーを用いて１００倍希釈して、８８ｎｇ／ｕｌの最終濃度にした。１０マイクロリットルの希釈されたＤＮＡを、０．２ｍＭの各ヌクレオチド（Ａ，Ｇ，Ｃ及びＴ）、１ｘ反応バッファー、０．５４２マイクログラムのプライマー１及び０．６２マイクログラムのプライマー２を全量１００マイクロリットルの反応物にてエッペンドルフチューブ中に含んだ反応混合物に加えた。該混合物を１００℃において５分間加熱することにより、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを反応混合物に加えた。ＰＣＲ反応は９５℃１分間実施し、プライマーを鋳型に５０℃を１分間アニールさせ、そして伸長合成を７２℃において１分間行った。この循環を３０回、及び６８℃にて７分間の追加の伸長合成の追加の循環を伴った。アガロースゲルにより検出されたＰＣＲ断片は約１．３ｋｂの断片を含み、次に該断片をプラスミドベクターｐＣＲ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。該１．３ｋｂの断片は次に核酸配列決定に供した。配列データはそれがＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍのフェノールオキシダーゼＢであることを明らかにしたが、何故ならば、演繹されたアミノ酸配列がエドマン分解により実施例２に記載されたペプチドの配列と適合したからである。５’遺伝子及び３’遺伝子を含むＰＣＲ断片を次に上記１．３ｋｂのＰＣＲ断片からの配列データを基にして演繹された４つのプライマーを用いて逆ＰＣＲ法を用いて単離した。図３は、プロモーター及びターミネーター配列を含むＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓのフェノールオキシダーゼＢ遺伝子（ｓｐｏＢ）の完全長のゲノミック配列（配列番号：３）を提供する。
実施例４
Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍのフェノール酸化酵素Ｂと他の酸化酵素の比較
翻訳された蛋白質配列（図２に示すとおり）（配列番号：２）を質問として、ＤＮＡ及び蛋白質のデータベースを検索した。ＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓオキシダーゼＢが蛋白質配列べれるにおいてビリルビンオキシダーゼと６７％同一性を共有したことが示された。図４は、ＧＣＧソフトウエアのＧＡＰプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により以下のパラメーター：Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ＝１２；Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ＝４；Ｇａｐ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝８；及びＧａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２を用いた、２つの蛋白質の配列アラインメントを示す。
実施例５
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ中のＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓオキシダーゼＢの発現
２つの新たに導入された制限酵素部位（ＢａｍＨＩとＡｇｅＩ）を周囲に有するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ酸化酵素Ｂをコードする核酸を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより単離した。このＰＣＲ断片を最初にプラスミドベクターｐＣＲ−ＩＩにクローン化し、そして核酸配列決定に供することにより遺伝子配列を確かめた（図１）。このＤＮＡ断片は、次に、ベクター（ｐＧＡＰＴ２）のＢｇｌＩＩからＡｇｅＩ部位にクローン化することにより、図５に示すプラスミドｐＧＡＰＴ２−ｓｐｏＢを創製した。該発現プラスミドはｐＧＡＰＴ２−ｓｐｏＢと命名され（図５）、宿主ゲノムに組み込まれることができる。２つの新規に導入された制限酵素部位（ＢａｍＨＩとＡｇｅＩ）を周囲に有するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓの酸化酵素をコードする核酸を含むＤＮＡ断片も、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのゲノミックＤＮＡ断片ＡＭＡ１配列の５２５９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９６  １９：５６５−５７４）が挿入された以外はプラスミドｐＧＡＰＴ２と同一のプラスミドベクターｐＲＡＸ１にクローン化した。ｐＲＡＸ１−ｓｐｏＢと命名された該発現ベクター（図６）は、複製するプラスミドとして保持されることができ、次に、標準ＰＥＧ法によりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ株ＧＣＡＰ４（ｇｅｎｅ  １９９０，８６：１５３−１６２）を形質転換した。形質転換体はウリジンを用いずにプレート上で選択した。３つの形質転換体をウリジンプレート上で３日間生育させた。形質転換体からの胞子を、０．０１％のツイーン８０を含む水に懸濁した。胞子（１００、１、０００又は１０，０００）１６０ｕｌのＰＲＯＣ培地を含む９６ウエルのマイクロタイタープレートに加えた。３０℃において５日間生育させた後に、これらのサンプルはＡＢＴＳ活性を有することを示した。一千の胞子が２５０ｍｌ振盪フラスコ中の５０ｍｌのＰＲＯＣ培地に加えられ、そして３０℃における３日間の生育後に、ＡＢＴＳ活性は０．３３ユニット／ｍｌであった。３０℃において４日間の生育後に、ＡＢＴＳ活性は４．８ユニット／ｍｌであった。約百二十万の胞子も、２．８リットル振盪フラスコ中の１リットルのＰＲＯＣ培地に加えた。ＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓのフェノールオキシダーゼＢ蛋白質の生産は、３日目に１ユニット／ｍｌに、そして４日目に４ユニット／ｍｌに達し、そして活性がＡＢＴＳアッセイにおいて検出された。
実施例６
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉにおけるフェノール酸化酵素の発現
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉを形質転換することにおける使用のための発現ベクターを以下のとおりに構築した。Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓフェノール酸化酵素Ｂをコードする遺伝子を含む図５に示したＢａｍＨＩからＡｇｅＩの断片の末端をＴ４のＤＮＡポリメラーゼにより平滑にし、そしてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの発現ベクターのＰｍｅＩ制限部位に挿入したが、該ベクターは本明細書に引用により取り込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９６／２３９２８に開示されたｐＴＥＸの修飾バージョンであり、そして遺伝子発現のためのＣＢＨＩプロモーターとターミネーター及び形質転換のための選択マーカーを含む。ＣＢＨ１プロモーター、フェノール酸化酵素遺伝子（ｓｐｏＢ）、ＣＢＨ１ターミネーター及び選択マーカーｐｙｒ４のみを含む直鎖状ＤＮＡ断片をゲルから単離し、そして４つの主要なセルラーゼ遺伝子を欠損したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのウリジン栄養要求株（米国特許第５，４７２，８６４号を参照）を形質転換するために用いた。安定な形質転換体がウリジンを含まないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ最少培地上で単離された。該形質転換体を振盪フラスコ中のＰｒｏｆｌｏ培地５０ｍｌ上で４日間２８℃から３０℃において生育させ、そしてフェノール酸化酵素Ｂの発現を実施例８において記載されたとおりにＡＢＴＳによりアッセイした。Ｐｒｏｆｌｏ培地は、（ｇ／ｌ）Ｐｒｏｆｌｏ  ２２．５；ラクトース  ３０．０；（ＮＨ4）2ＳＯ4  ６．５；ＫＨ2ＳＯ4  ２．０；ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ０．３；ＣａＣｌ2  ０．２；ＣａＣＯ3  ０．７２；痕跡金属ストック溶液  １．０ｍｌ／ｌ及び１０％ツイーン８０  ２．０ｍｌ／ｌからなる。使用された痕跡金属ストック溶液は（ｇ／ｌ）ＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ５．０；ＭｎＳＯ4．Ｈ2Ｏ  １．６；ＺｎＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  １．４；ＣｏＣｌ2．６Ｈ2Ｏ  ２．８を有した。
実施例７
ＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓフェノールオキシダーゼＢの精製
実施例５に記載されたとおりに得られたＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓフェノールオキシダーゼＢ培養ブロスを振盪フラスコから回収し、４℃に冷やし、そしてＳｏｒｖａｌ遠心分離機にて１５分間１０，５００ｒｐｍにてＧＳＡローターを用いて遠心分離した。結果の上清を次に沈殿物から分離して、ＴＦＦホルダー及びカートリッジＵＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（６ｆｔ∧２  ＰＴＧＣ  １０Ｋポリエーテルスルフォンカタログ番号ＣＤＵＦ００６ＴＧ）を使用した超遠心分離により６−１０倍に濃縮した。濃縮物を４容量のＤｉ水で透析濾過により洗浄したところ、４０−８０％の間の回収量をもたらした。上記物質を次に再び遠心分離することにより固形物を除去し、そして０．４５μフィルターを用いて濾過した。酵素を含む濾過物は、次に、さらにアニオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。この点において、Ｑ−セファロースアニオン交換カラムは５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．９により平衡化した。濃縮物（上記の酵素混合物）を１部対４部（全部で５部）にて２０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．９で希釈し、そして１２０ｍＬ／分にてカラムに負荷した。汚染物の大多数は、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．９により溶出された。次に、上記カラムを５００ｍＭのＮａＣｌを含む上記バッファーを用いて１２０ｍｌ／分の流速で溶出した。各々の画分を次に得た。もっとも高いフェノール酸化酵素を含む各々の画分を一緒にプールし、濃縮し、そしてＹＭ１０膜を用いたＡｍｉｃｏｎ濃縮機を用いたミリＱに対して透析濾過した。
【００５１】
フェノール酸化酵素の活性を、次に、実施例８に記載されたとおりのＡＢＴＳの酸化に基づいて、標準アッセイ手法を用いて測定した。測定された酵素活性はｐＨ５において６１．４  Ｕ／ｍｌ及びｐＨ９において６．１  Ｕ／ｍｌであった。
実施例８
ＡＢＴＳアッセイ
以下の実施例はフェノール酸化活性の測定のために使用されるＡＢＴＳアッセイを記載する。ＡＢＴＳアッセイは分光光学活性のアッセイであり、以下の試薬を使用する：アッセイバッファー＝５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０；５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０；５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０。ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス３エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）は蒸留水中の４．５ｍＭ溶液であった。０．７５ｍｌのアッセイバッファーと０．１ｍｌ濃縮機ＡＢＴＳ基質溶液を化合し、混合し、そしてキュベットに加えた。バッファー−ＡＢＴＳ溶液を含むキュベットをブランクの対照として使用した。０．０５ｍｌの酵素サンプルを加え、素早く混合し、そしてバッファー−ＡＢＴＳ溶液を含むキュベット中に入れた。４２０ｎｍにおける吸光の変化の範囲、ΔＯＤ  ４２０／分、を、１５秒間（又は＜０．１の活性率を有するサンプルに関してはより長く）３０℃において測定した。高い率の活性を有する酵素サンプルを、アッセイバッファーを用いて０．１と１の間のレベルに希釈した。
実施例９
トマトの着色の脱色
この実施例は、トマトの着色に付随する色を修飾することにおける、図２に示した配列を有するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓフェノール酸化酵素の使用を例示する。
【００５２】
実験は、１５ｍｌの洗浄溶液が加えられた２５０ｍｌのコンテナ中で実施した（表に示された）。洗浄溶液のｐＨはｐＨ９に設定した。Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ由来の精製されたフェノールオキシダーゼを６ｍｇ／ｌにて洗浄溶液に加えた。増強剤としてフェノチアジン−１０−プロピオネート（ＰＴＰ）を２５０ｍＭの用量にて使用した。以下の製剤を洗浄溶液として使用した（２ｇｒ／リットル）：
洗浄剤組成：
ＬＡＳ          ２４％
ＳＴＰ          １４．５％
ソーダアッシュ  １７．５％
珪酸塩          ８．０％
ＳＣＭＣ        ０．３７％
青色色素        ０．０２％
湿気／塩        ３４．６％
布きれを３０分間３０℃において洗浄した。洗浄後に、上記布きれを回転乾燥し、そして反射率範囲をＭｉｎｏｌｔａ分光計により測定した。洗浄前と後の布切れの間の発色の相異のデータがＣＩＥＬＡＢ  Ｌ*ａ*ｂ*発色スペースとして表現された。この発色スペースにおいて、Ｌ*は明度を示し、そしてａ*とｂ*は色彩の等級を示す。２つの布きれの間の発色の相異はΔＥとして表現され、以下の等式から計算される。
【００５３】
【数１】
0004995389.tif 000002
【００５４】
ΔＥ値としての結果を以下の表１に示す。
【００５５】
【表１】
脱色系なしの洗浄          脱色系を用いた洗浄
ΔＥ＝６．８              ΔＥ＝１２．２
ΔＥ値から観察できるとおり、トマトの着色の脱色が酵素／増強剤系の存在下で改良される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Genencor International, Inc.
<120> Novel Phenol Oxidizing Enzymes
<130> GC584-PCT
<141> PCT/US00/24751
<142> 2000-11-09
<150> US 09/401,476
<151> 1999-09-22
<160> 8
<170> FastSEQ for Windows Version 3.0
<210> 1
<211> 1958
<212> DNA
<213> Stachybotrys chartarum
<400> 1
ggatccatca acatgatcag ccaagctatc ggagccgtgg ctctgggcct tgctgtgatc      60
ggcggcagct ctgtcgatgc cagatccgtt gctggtcgat cgacagacat gccttccggt     120
ctcaccaaga ggcagacgca gctgagtcct cccctggcct tgtacgaagt gcctctgccg     180
atccctcctc tgaaggcgcc caagtagtaa gtacattcta taggctagca gagccaacgt     240
tgctaatcat tgcagtaccg tccccaaccc caacactgga gaggacatct tgtactacga     300
gatggagatt aggcccttct cccaccagat ctaccctgat ctggagccgg ccaacatggt     360
tggatacgat ggcatgtccc caggacctac catcatcgtt cctcgtggca ctgagagtgt     420
tgtccgcttc gtgaacagcg gagagaacac ctctcccaac agcgtccact tgcacggctc     480
tttctctcga gctccctttg atggttgggc tgaggacact acccagcctg gcgagtacaa     540
ggattactac taccccaaca ggcaggctgc ccgcatgctt tggtaccatg accatgccat     600
gtccatcacc gccgagaacg cctacatggg tcaggctggt gtctacatga tccaggaccc     660
ggctgaggat gccctgaacc tccccagcgg ctacggcgag tttgatatcc ccttggttct     720
gactgccaag cgatacaacg cagacggcac tctcttctcc accaatggag aggtttccag     780
cttctggggt gacgttattc aagtggtaag ttgagcccat tgagatgctt cagatcctag     840
aagtatcgat gtatgaaatt gtgcatgctc taaccagtgc tatcacagaa cggtcagcct     900
tggcctatgc tcaacgtgca gccgcgcaag taccgcttcc gcttcctcaa cgctgccgtc     960
tcacgctctt tcgctctgta tcttgctacc tctgaggatt cagagaccag acttcccttc    1020
caggtcattg ccgctgacgg tggtctgctt gagggccctg ttgacactga cactctgtac    1080
atctctatgg ccgagcgctg ggaggttgtt atcgacttct ccaccttcgc tggccagtcc    1140
atcgatatcc gcaaccttcc tggtgctgac ggtctcggtg ttgagcctga gtttgataac    1200
actgacaagg tcatgcgatt cgtcgttgat gaagtccttg agtcgcccga cacttctgag    1260
gtgcctgcca acctccgaga tgttcctttc cccgagggcg gcaactggga ccccgcaaac    1320
cccactgatg acgagacttt caccttcggc cgtgctaatg gacagtggac aatcaacgga    1380
gttaccttct cggatgtcga gaaccgtctg ctccgcaatg tgccccgcga cactgttgag    1440
atctggcgac ttgagaacaa ctccaacggt tggactcacc ctgttcacat tcacctcgtt    1500
gacttccgag tcctttctcg ttccactgcc cgtggagtcg agccttatga ggctgctggt    1560
ctcaaggatg ttgtctggct ggctcgtcgt gaggttgtct atgttgaggc ccactacgct    1620
cctttcccgt aagttctcgc cttttaccta actggttttc actcatgcta acatctacaa    1680
gtggtgtcta catgttgcac tgccacaacc tgatccacga ggaccacgac atgatggctg    1740
ctttcaatgt cactgttctc ggtgactatg gctacaacta caccgagttc attgacccca    1800
tggagcctct ctggaggccc cgccccttcc tcctcggaga gttcgagaat ggctcgggtg    1860
acttcagcga gcttgccatc actgaccgca ttcaggagat ggctagcttc aacccctacg    1920
cccaggctga tgatgatgcc gctgaggagt agaccggt                            1958
<210> 2
<211> 583
<212> PRT
<213> Stachybotrys chartarum
<400> 2
Met Ile Ser Gln Ala Ile Gly Ala Val Ala Leu Gly Leu Ala Val Ile
1               5                  10                  15
Gly Gly Ser Ser Val Asp Ala Arg Ser Val Ala Gly Arg Ser Thr Asp
20                  25                  30
Met Pro Ser Gly Leu Thr Lys Arg Gln Thr Gln Leu Ser Pro Pro Leu
35                  40                  45
Ala Leu Tyr Glu Val Pro Leu Pro Ile Pro Pro Leu Lys Ala Pro Asn
50                  55                  60
Thr Val Pro Asn Pro Asn Thr Gly Glu Asp Ile Leu Tyr Tyr Glu Met
65                  70                  75                  80
Glu Ile Arg Pro Phe Ser His Gln Ile Tyr Pro Asp Leu Glu Pro Ala
85                  90                  95
Asn Met Val Gly Tyr Asp Gly Met Ser Pro Gly Pro Thr Ile Ile Val
100                 105                 110
Pro Arg Gly Thr Glu Ser Val Val Arg Phe Val Asn Ser Gly Glu Asn
115                 120                 125
Thr Ser Pro Asn Ser Val His Leu His Gly Ser Phe Ser Arg Ala Pro
130                 135                 140
Phe Asp Gly Trp Ala Glu Asp Thr Thr Gln Pro Gly Glu Tyr Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Tyr Pro Asn Arg Gln Ala Ala Arg Met Leu Trp Tyr His Asp
165                 170                 175
His Ala Met Ser Ile Thr Ala Glu Asn Ala Tyr Met Gly Gln Ala Gly
180                 185                 190
Val Tyr Met Ile Gln Asp Pro Ala Glu Asp Ala Leu Asn Leu Pro Ser
195                 200                 205
Gly Tyr Gly Glu Phe Asp Ile Pro Leu Val Leu Thr Ala Lys Arg Tyr
210                 215                 220
Asn Ala Asp Gly Thr Leu Phe Ser Thr Asn Gly Glu Val Ser Ser Phe
225                 230                 235                 240
Trp Gly Asp Val Ile Gln Val Asn Gly Gln Pro Trp Pro Met Leu Asn
245                 250                 255
Val Gln Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Phe Leu Asn Ala Ala Val Ser
260                 265                 270
Arg Ser Phe Ala Leu Tyr Leu Ala Thr Ser Glu Asp Ser Glu Thr Arg
275                 280                 285
Leu Pro Phe Gln Val Ile Ala Ala Asp Gly Gly Leu Leu Glu Gly Pro
290                 295                 300
Val Asp Thr Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Met Ala Glu Arg Trp Glu Val
305                 310                 315                 320
Val Ile Asp Phe Ser Thr Phe Ala Gly Gln Ser Ile Asp Ile Arg Asn
325                 330                 335
Leu Pro Gly Ala Asp Gly Leu Gly Val Glu Pro Glu Phe Asp Asn Thr
340                 345                 350
Asp Lys Val Met Arg Phe Val Val Asp Glu Val Leu Glu Ser Pro Asp
355                 360                 365
Thr Ser Glu Val Pro Ala Asn Leu Arg Asp Val Pro Phe Pro Glu Gly
370                 375                 380
Gly Asn Trp Asp Pro Ala Asn Pro Thr Asp Asp Glu Thr Phe Thr Phe
385                 390                 395                 400
Gly Arg Ala Asn Gly Gln Trp Thr Ile Asn Gly Val Thr Phe Ser Asp
405                 410                 415
Val Glu Asn Arg Leu Leu Arg Asn Val Pro Arg Asp Thr Val Glu Ile
420                 425                 430
Trp Arg Leu Glu Asn Asn Ser Asn Gly Trp Thr His Pro Val His Ile
435                 440                 445
His Leu Val Asp Phe Arg Val Leu Ser Arg Ser Thr Ala Arg Gly Val
450                 455                 460
Glu Pro Tyr Glu Ala Ala Gly Leu Lys Asp Val Val Trp Leu Ala Arg
465                 470                 475                 480
Arg Glu Val Val Tyr Val Glu Ala His Tyr Ala Pro Phe Pro Gly Val
485                 490                 495
Tyr Met Leu His Cys His Asn Leu Ile His Glu Asp His Asp Met Met
500                 505                 510
Ala Ala Phe Asn Val Thr Val Leu Gly Asp Tyr Gly Tyr Asn Tyr Thr
515                 520                 525
Glu Phe Ile Asp Pro Met Glu Pro Leu Trp Arg Pro Arg Pro Phe Leu
530                 535                 540
Leu Gly Glu Phe Glu Asn Gly Ser Gly Asp Phe Ser Glu Leu Ala Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Arg Ile Gln Glu Met Ala Ser Phe Asn Pro Tyr Ala Gln Ala
565                 570                 575
Asp Asp Asp Ala Ala Glu Glu
580
<210> 3
<211> 2095
<212> DNA
<213> Stachybotrys chartarum
<400> 3
cagctcggtc tactactctc gcttctcttt gacaaatcaa atctaccaat cgttccttca      60
atttcaaacg atcaacatga tcagccaagc tatcggagcc gtggctctgg gccttgctgt     120
gatcggcggc agctctgtcg atgccagatc cgttgctggt cgatcgacag acatgccttc     180
cggtctcacc aagaggcaga cgcagctgag tcctcccctg gccttgtacg aagtgcctct     240
gccgatccct cctctgaagg cgcccaagta gtaagtacat tctataggct agcagagcca     300
acgttgctaa tcattgcagt accgtcccca accccaacac tggagaggac atcttgtact     360
acgagatgga gattaggccc ttctcccacc agatctaccc tgatctggag ccggccaaca     420
tggttggata cgatggcatg tccccaggac ctaccatcat cgttcctcgt ggcactgaga     480
gtgttgtccg cttcgtgaac agcggagaga acacctctcc caacagcgtc cacttgcacg     540
gctctttctc tcgagctccc tttgatggtt gggctgagga cactacccag cctggcgagt     600
acaaggatta ctactacccc aacaggcagg ctgcccgcat gctttggtac catgaccatg     660
ccatgtccat caccgccgag aacgcctaca tgggtcaggc tggtgtctac atgatccagg     720
acccggctga ggatgccctg aacctcccca gcggctacgg cgagtttgat atccccttgg     780
ttctgactgc caagcgatac aacgcagacg gcactctctt ctccaccaat ggagaggttt     840
ccagcttctg gggtgacgtt attcaagtgg taagttgagc ccattgagat gcttcagatc     900
ctagaagtat cgatgtatga aattgtgcat gctctaacca gtgctatcac agaacggtca     960
gccttggcct atgctcaacg tgcagccgcg caagtaccgc ttccgcttcc tcaacgctgc    1020
cgtctcacgc tctttcgctc tgtatcttgc tacctctgag gattcagaga ccagacttcc    1080
cttccaggtc attgccgctg acggtggtct gcttgagggc cctgttgaca ctgacactct    1140
gtacatctct atggccgagc gctgggaggt tgttatcgac ttctccacct tcgctggcca    1200
gtccatcgat atccgcaacc ttcctggtgc tgacggtctc ggtgttgagc ctgagtttga    1260
taacactgac aaggtcatgc gattcgtcgt tgatgaagtc cttgagtcgc ccgacacttc    1320
tgaggtgcct gccaacctcc gagatgttcc tttccccgag ggcggcaact gggaccccgc    1380
aaaccccact gatgacgaga ctttcacctt cggccgtgct aatggacagt ggacaatcaa    1440
cggagttacc ttctcggatg tcgagaaccg tctgctccgc aatgtgcccc gcgacactgt    1500
tgagatctgg cgacttgaga acaactccaa cggttggact caccctgttc acattcacct    1560
cgttgacttc cgagtccttt ctcgttccac tgcccgtgga gtcgagcctt atgaggctgc    1620
tggtctcaag gatgttgtct ggctggctcg tcgtgaggtt gtctatgttg aggcccacta    1680
cgctcctttc ccgtaagttc tcgcctttta cctaactggt tttcactcat gctaacatct    1740
acaagtggtg tctacatgtt gcactgccac aacctgatcc acgaggacca cgacatgatg    1800
gctgctttca atgtcactgt tctcggtgac tatggctaca actacaccga gttcattgac    1860
cccatggagc ctctctggag gccccgcccc ttcctcctcg gagagttcga gaatggctcg    1920
ggtgacttca gcgagcttgc catcactgac cgcattcagg agatggctag cttcaacccc    1980
tacgcccagg ctgatgatga tgccgctgag gagtaaatat gatgatcgtc gaatgattta    2040
tggacagcag tatatagcta ttttaggaaa tacttgaata agttgtggtg cttaa         2095
<210> 4
<211> 572
<212> PRT
<213> Stachybotrys chartarum
<400> 4
Met Phe Lys His Thr Leu Gly Ala Ala Ala Leu Ser Leu Leu Phe Asn
1               5                  10                  15
Ser Asn Ala Val Gln Ala Ser Pro Val Pro Glu Thr Ser Pro Ala Thr
20                  25                  30
Gly His Leu Phe Lys Arg Val Ala Gln Ile Ser Pro Gln Tyr Pro Met
35                  40                  45
Phe Thr Val Pro Leu Pro Ile Pro Pro Val Lys Gln Pro Arg Leu Thr
50                  55                  60
Val Thr Asn Pro Val Asn Gly Gln Glu Ile Trp Tyr Tyr Glu Val Glu
65                  70                  75                  80
Ile Lys Pro Phe Thr His Gln Val Tyr Pro Asp Leu Gly Ser Ala Asp
85                  90                  95
Leu Val Gly Tyr Asp Gly Met Ser Pro Gly Pro Thr Phe Gln Val Pro
100                 105                 110
Arg Gly Val Glu Thr Val Val Arg Phe Ile Asn Asn Ala Glu Ala Pro
115                 120                 125
Asn Ser Val His Leu His Gly Ser Phe Ser Arg Ala Ala Phe Asp Gly
130                 135                 140
Trp Ala Glu Asp Ile Thr Glu Pro Gly Ser Phe Lys Asp Tyr Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Asn Arg Gln Ser Ala Arg Thr Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met
165                 170                 175
His Ile Thr Ala Glu Asn Ala Tyr Arg Gly Gln Ala Gly Leu Tyr Met
180                 185                 190
Leu Thr Asp Pro Ala Glu Asp Ala Leu Asn Leu Pro Ser Gly Tyr Gly
195                 200                 205
Glu Phe Asp Ile Pro Met Ile Leu Thr Ser Lys Gln Tyr Thr Ala Asn
210                 215                 220
Gly Asn Leu Val Thr Thr Asn Gly Glu Leu Asn Ser Phe Trp Gly Asp
225                 230                 235                 240
Val Ile His Val Asn Gly Gln Pro Trp Pro Phe Lys Asn Val Glu Pro
245                 250                 255
Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Phe Leu Asp Ala Ala Val Ser Arg Ser Phe
260                 265                 270
Gly Leu Tyr Phe Ala Asp Thr Asp Ala Ile Asp Thr Arg Leu Pro Phe
275                 280                 285
Lys Val Ile Ala Ser Asp Ser Gly Leu Leu Glu His Pro Ala Asp Thr
290                 295                 300
Ser Leu Leu Tyr Ile Ser Met Ala Glu Arg Tyr Glu Val Val Phe Asp
305                 310                 315                 320
Phe Ser Asp Tyr Ala Gly Lys Thr Ile Glu Leu Arg Asn Leu Gly Gly
325                 330                 335
Ser Ile Gly Gly Ile Gly Thr Asp Thr Asp Tyr Asp Asn Thr Asp Lys
340                 345                 350
Val Met Arg Phe Val Val Ala Asp Asp Thr Thr Gln Pro Asp Thr Ser
355                 360                 365
Val Val Pro Ala Asn Leu Arg Asp Val Pro Phe Pro Ser Pro Thr Thr
370                 375                 380
Asn Thr Pro Arg Gln Phe Arg Phe Gly Arg Thr Gly Pro Thr Trp Thr
385                 390                 395                 400
Ile Asn Gly Val Ala Phe Ala Asp Val Gln Asn Arg Leu Leu Ala Asn
405                 410                 415
Val Pro Val Gly Thr Val Glu Arg Trp Glu Leu Ile Asn Ala Gly Asn
420                 425                 430
Gly Trp Thr His Pro Ile His Ile His Leu Val Asp Phe Lys Val Ile
435                 440                 445
Ser Arg Thr Ser Gly Asn Asn Ala Arg Thr Val Met Pro Tyr Glu Ser
450                 455                 460
Gly Leu Lys Asp Val Val Trp Leu Gly Arg Arg Glu Thr Val Val Val
465                 470                 475                 480
Glu Ala His Tyr Ala Pro Phe Pro Gly Val Tyr Met Phe His Cys His
485                 490                 495
Asn Leu Ile His Glu Asp His Asp Met Met Ala Ala Phe Asn Ala Thr
500                 505                 510
Val Leu Pro Asp Tyr Gly Tyr Asn Ala Thr Val Phe Val Asp Pro Met
515                 520                 525
Glu Glu Leu Trp Gln Ala Arg Pro Tyr Glu Leu Gly Glu Phe Gln Ala
530                 535                 540
Gln Ser Gly Gln Phe Ser Val Gln Ala Val Thr Glu Arg Ile Gln Thr
545                 550                 555                 560
Met Ala Glu Tyr Arg Pro Tyr Ala Ala Ala Asp Glu
565                 570
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> Stachybotrys chartarum
<400> 5
Phe Val Asn Ser Gly Glu Asn Thr Ser Pro Asn Ser Val His Leu His
1               5                  10                  15
Gly Ser Phe Ser Arg
20
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> Stachybotrys chartarum
<400> 6
Gly Val Glu Pro Tyr Glu Ala Ala Gly Leu Lys Asp Val Val Trp Leu
1               5                  10                  15
Ala Arg
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n = A,T,C or G
<400> 7
gtcaacagtg gngaraayac                                                  20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Stachybotrys chartarum
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n = A,T,C or G
<400> 8
gcggcctcat anggctcnac                                                  20
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、実施例５に記載されたとおり、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍからＰＣＲにより得ることができるフェノール酸化酵素の核酸配列（配列番号：１）を提供する。
【図２】  図２は、ＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓのオキシダーゼＢ遺伝子と本明細書にて命名されたアミノ酸のアミノ酸配列（配列番号：２）を提供する。
【図３】  図３は、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍから得ることができるフェノール酸化酵素のゲノミック配列（配列番号：３）を示す。この核酸配列は、ＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓのオキシダーゼＢ遺伝子と本明細書では呼ばれる。
【図４】  図４は、ＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓフェノールオキシダーゼＢ酵素の配列番号：２（底のライン）及びＢｉｌｉｒｕｂｉｎオキシダーゼ（配列番号：４）のアミノ酸アラインメントである。
【図５】  図５は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ中のＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓフェノール酸化酵素の発現に使用したベクターｐＧＡＰＴ２−ｓｐｏＢの描写を提供する。塩基１から１１３４がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ遺伝子プロモーターを含む。塩基３０９８から３３５６及び４９５０から４９７１はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼターミネーターを含む。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのｐｙｒＧ遺伝子を真菌形質転換のマーカーとして３３５７から４９４９に挿入した。配列番号：１のＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓフェノール酸化酵素をコードする核酸をＢｇｌＩＩ及びＡｇｅＩ制限ブイに挿入した。
【図６】  図６は、複製プラスミド中のＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓオキシダーゼＢ蛋白質の発現の描写である。Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓオキシダーゼの発現はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓグルコアミラーゼプロモーター及びターミネーターの制御下である。形質転換マーカーｐｙｒＧ遺伝子及びＡＭＡ１配列はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来である。
【図７】  図７は、基質２，６ＤＭＰに対するＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓオキシダーゼＢのｐＨプロフィールを示す。
【図８】  図８は、実施例１に記載されたとおりのイオン交換カラムからのＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ画分の非変性（天然）ゲル電気泳動を示す（銀染色）。
【図９】  実施例１に記載されたとおりのＡＢＴＳオーバーレイを伴う画分の非変性電気泳動を示す。
【図１０】  図１０は、図９に示すゲルのＡＢＴＳオーバーレイから同定されて単離されたバンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍオキシダーゼＢはオーバーレイ２と標記されたレーンの中に示される。オーバーレイ２のレーンは、記載された条件下でのＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍオキシダーゼＢの観察されたバンドパターンを示す。
【図１】
0004995389.tif 000003
【図２】
0004995389.tif 000004
【図３】
0004995389.tif 000005
【図４】
0004995389.tif 000006
【図５】
0004995389.tif 000007
【図６】
0004995389.tif 000008
【図７】
0004995389.tif 000009
【図８】
0004995389.tif 000010
【図９】
0004995389.tif 000011
【図１０】
0004995389.tif 000012