(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の生物活性又は機能をコードする少なくとも１の親ポリヌクレオチド配列のランダム突然変異誘発又は天然の対立遺伝子変異により、前記親ポリヌクレオチドに対し１又は複数の改変を含む変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを糸状菌細胞内で作製し及び選択又はスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記糸状菌細胞をＤＮＡベクターの集団で形質転換し、ここで各々のベクターは、（ｉ）糸状菌選択マーカー及び糸状菌複製開始配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該マーカー及び複製開始配列が前記集団内で変化しないポリヌクレオチド配列；並びに（ｉｉ）前記ＤＮＡベクターの集団が前記変異ポリヌクレオチド配列の全種を含むように選択される、前記変異ポリヌクレオチド配列のうちの１種を含み；
（ｂ）前記細胞を選択圧下で培養し；
（ｃ）要求される特徴を発現する１又は複数の形質転換体について選択又はスクリーニングし；
（ｄ）問題の形質転換体を単離することを含む方法。
【請求項２】
前記親ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、ホルモン、酵素、レセプターもしくはその一部、抗体もしくはその一部、又は調節タンパク質である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記選択マーカーが、殺生物剤もしくはウイルス毒性に対する耐性、重金属毒性に対する耐性、又は独立栄養体に対する原栄養性を供する産物をコードする遺伝子の群から選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記原栄養性が、ヌクレオチド合成、コファクター合成、アミノ酸合成、アセトアミド代謝、プロリン代謝、スルフェート代謝、及びニトレート代謝からなる代謝経路の群から選択される酵素から得られる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記選択マーカーが、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｅｍＡ（５−アミノレブリネートシンターゼ）、ｈｅｍＢ（ポルホビリノーゲンシンターゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートレダクターゼ）、ｐｒｎ（プロリンパーミアーゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｐｙｒｏＡ，ｒｉｂｏＢ，ｓＣ（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）からなる群から選択される遺伝子である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記複製開始配列が、
（ａ）配列番号：１又は配列番号：２の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ複製を開始できる複製開始配列；及び
（ｂ）（ｉ）配列番号：１もしくは配列番号：２の核酸配列、又は（ｉｉ）その各々の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、かつ複製開始活性を有する配列
からなる群から選択される核酸配列である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸配列が、配列番号：１又は配列番号：２の核酸配列と、少なくとも９７％の同一性を有する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複製開始配列が、糸状菌細胞から得られる請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記糸状菌細胞がアスペルギルス（Aspergillus）の株である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アスペルギルスの株がＡ．ニジュランス（A. nidulans）の株から得られる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複製開始配列が、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載される核酸配列を有する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記親ポリヌクレオチド配列の改変が、突然変異誘発により、物理的もしくは化学的変異誘発剤の使用により、ドープ化（doped）オリゴヌクレオチドの使用により、ＤＮＡシャッフリングにより、もしくは前記核酸配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることにより、又はそれらのいずれかの組合せを用いることにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異ポリヌクレオチド配列がポリペプチドもしくは調節配列、又は両方のいずれかの組合せをコードする２又はそれ超の相同核酸配列間の生体内組換えにより得られる請求項１５に記載の方法であって、
（ａ）前記親ポリヌクレオチド配列間の少なくとも１の保存された領域を同定し；
（ｂ）前記親ポリヌクレオチド配列の各々のフラグメントであって、（ａ）の保存された領域を含むものを生成し；そして
（ｃ）１又は複数の相同結合点として前記保存された領域を用いることにより（ｂ）のフラグメントを組み換えることを含む方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡベクターの集団で形質転換される糸状菌細胞が、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、コプリヌス（Coprinus）、フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、ムコル（Mucor）、マイセリオフトラ（Myceliopthora）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）又はトリコデルマ（Trichoderma）の株の細胞である請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、又はトリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）細胞である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
目的の生物活性又は機能をコードする少なくとも１の親ポリヌクレオチド配列のランダム突然変異誘発又は天然の対立遺伝子変異により、前記親ポリヌクレオチドに対し１又は複数の改変を含む変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを糸状菌細胞内で作製し、及びスクリーニング又は選択する方法であって、
（ａ）請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡベクターの集団で、細菌又はイースト細胞の培養物を形質転換し、ここで該ベクターは、細菌又はイースト選択マーカー及び細菌又はイースト複製開始配列をコードする核酸配列を更に含み；
（ｂ）前記細菌又はイースト細胞を選択圧下で培養し；
（ｃ）（ｂ）の形質転換体からＤＮＡ構成物を単離し；
（ｄ）糸状菌細胞を（ｃ）のＤＮＡ構成物で形質転換し；
（ｅ）（ｄ）の糸状菌細胞を培養し；
（ｆ）要求される特徴を発現する１又は複数の糸状菌形質転換体について選択又はスクリーニングし、そして（ｇ）問題の糸状菌形質転換体を単離することを含む方法。
【請求項２０】
前記細菌又はイースト選択マーカーが、殺生物剤もしくはウイルス毒性に対する耐性、重金属毒性に対する耐性、又は独立栄養体に対する原栄養性を供する産物をコードする遺伝子の群から選択される請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、糸状菌細胞において問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーを作製及びスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
発明の背景
糸状菌細胞は、ポリペプチドの商業的生産のための宿主細胞として広く用いられている。しかしながら、特定の変化した特徴、例えば熱安定性、pH活性プロフィール、比活性、基質特異性、Ｋｍ，Ｖｍａｘ等のポリペプチドの変異体を生産することが要求される場合、変異体コーディング配列のライブラリーの作製及びスクリーニングは、一般に、中間体宿主、例えば細菌細胞又はイーストの使用を要求する。これは、独立して形質転換された糸状菌細胞の中での低い形質転換の頻度及びコピー数のバリエーションによる。
【０００３】
イーストにおいて問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーの作製のためのいくつかの方法があり、ここでは、イーストにおいてライブラリーをスクリーニングした後に、生産関連宿主、例えば糸状菌が、問題の潜在的な変異体ポリヌクレオチド配列で形質転換される。
しかしながら、しばしば、イースト又は細菌においてスクリーニングにより同定されるポリヌクレオチド配列は、生産関連糸状菌細胞に形質転換した時に発現されないか、又は低レベルでしか発現されない。これは、コドン用法、ｍＲＮＡレベルのレギュレーション、転移機構、翻訳後修飾機構（例えばシステイン架橋、グリコシル化及びアシル化パターン）等の差を含むいくつかの理由による。
【０００４】
第２に、問題のポリヌクレオチド配列が商業的に有用なレベルで生産宿主内で発現されるであろうか否かは必ずしも予測できない。例えば、ライブラリーをスクリーニングするのに用いる生物が例えば細菌又はイースト細胞であり、生産関連宿主細胞が糸状菌細胞であるなら、プロテアーゼプロフィールは異なる。これにより、イーストにおいて同定されている問題の１又は複数の特徴をコードする配列は、産物関連糸状菌宿主細胞において発現されたプロテアーゼにより分解され得る。更に、調節タンパク質又は調節配列の機能を変化させることにより発現される産物の最適な収率を得ることは、生産宿主の直接の操作を要求する。
【０００５】
A.Aleksenko 及びA.J.Clutterbuck (1997, Fungal Genetics and Biology 21: 373〜387 ）は、遺伝子クローニング及び発現研究のための、自己複製ベクター又は自己複製配列（ＡＲＳ）の使用を開示する。ＡＭＡ１（アスペルギルスにおける自己メンテナンス）は、議論されるプラスミドレプリケーター因子の１つである。それは、０．３kb中心スペーサーにより分離されたＭＡＴＥ１（移動性アスペルギルス形質転換エンハンサー）で示すゲノム反復の２つの逆方向コピーからなる。ＡＭＡ１は、再配置多重重合化又は染色体組込みなしにプラスミド複製を促進する。
【０００６】
発明の概要
ＡＭＡ−１ベースのプラスミドは、糸状菌における遺伝子クローニングにおいて２つの利点を供することが見い出された。第１は、受容体アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株を、連結混合物で直接、形質転換することができるように、潜在的なライブラリーサイズを増加させ、かつ中間体宿主、例えば大腸菌でのライブラリー増幅の必要性を排除し得る形質転換の高い頻度である。第２は、遺伝子発現のために安定で標準的な環境を供することにより、その形質転換体の特性が均一になるであろうことである。
【０００７】
本発明の目的は、独立して形質転換された細胞の中で、高い頻度の形質転換及び均一な高レベルの遺伝子発現を供するためのエピソーム複製ＤＮＡベクターの使用により、糸状菌細胞において問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーを作製及びスクリーニングするための改良された方法を供することである。独立して形質転換された細胞の中でのコピー数のバリエーションを最小にすることにより、問題の変異体ポリペプチドは、問題の特徴の発現に基づいて直接、同定することができる。
【０００８】
従って、第１の態様において、本発明は、糸状菌細胞内の問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーを作製し及び選択又はスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記糸状菌細胞をＤＮＡベクターの集団で形質転換し、ここで各々のベクターは、
（ｉ）真菌選択マーカー及び真菌複製開始配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該マーカー及び複製開始配列が前記集団内で変化しないポリヌクレオチド；並びに
（ii）問題のポリヌクレオチド配列であって、ＤＮＡベクターの集団が該ポリヌクレオチド配列の１超の変異体を含むポリヌクレオチド配列
を含み；
（ｂ）前記細胞を選択圧下で培養し；
（ｃ）要求される特徴を発現する１又は複数の形質転換体について選択又はスクリーニングし；
（ｄ）問題の形質転換体を単離すること
を含む方法に関する。
【０００９】
他の態様において、本発明は、問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーを作製するため及びこのようなポリヌクレオチド配列のライブラリーをスクリーニング又は選択するための真菌複製開始配列の使用に関する。
発明の詳細な記載
第１の実施形態において、本発明は、糸状菌細胞内の問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーを作製し及び選択又はスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記糸状菌細胞をＤＮＡベクターの集団で形質転換し、ここで各々のベクターは、（ｉ）真菌選択マーカー及び真菌複製開始配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該マーカー及び複製開始配列が前記集団内で変化しないポリヌクレオチド配列；並びに（ii）問題のポリヌクレオチド配列であって、ＤＮＡベクターの集団が該ポリヌクレオチド配列の１超の変異体を含むポリヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）前記細胞を選択圧下で培養し；
（ｃ）要求される特徴を発現する１又は複数の形質転換体について選択又はスクリーニングし、
（ｄ）問題の形質転換体を単離すること
を含む方法に関する。
【００１０】
用語“問題のポリヌクレオチド配列のライブラリー”とは、問題の同じ機能又は活性をコードし又はそれを有するポリヌクレオチド配列のコレクションをいう。ライブラリーは、変異体のコレクションとして本明細書で定義される“問題のポリヌクレオチド配列の変異体のライブラリー”であり得る。ここでその変異体は、前記親ポリヌクレオチド配列の１又は複数の改変を含むことにより親ポリヌクレオチド配列と異なる。便利には、ポリヌクレオチド配列又は変異体は、突然変異誘発、好ましくはランダム変異誘発により問題の少くとも１の親ポリヌクレオチド配列から生成され、最小数で４、好ましくは最小で２５の異なるポリヌクレオチド配列をそのコレクション内に生ずる。親ポリヌクレオチド配列を変異誘発するために役立つ種々の方法が“ランダム変異誘発”及び“局所的ランダム変異誘発”との標題の下のセクションに記載される。用語“改変”は、その変異体のものと比べて、配列中の１又は複数のヌクレオチドの置換、挿入及び／又は削除を示すことを意図し、２又はそれ超の異なる親ポリヌクレオチドのハイブリッドを含み得る。
【００１１】
ポリヌクレオチド配列又は変異体は、親ポリヌクレオチド配列の天然の対立遺伝子バリエーションからも生じ得る。対立遺伝子変異体は、同じ染色体座を占有する遺伝子の２又はそれ超の別の型のいずれかをいう。対立遺伝子変異は、突然変異を介して生じ、集団内で表現型多型性を引きおこし得る。遺伝子変異は、サイレント（即ちコードされるポリペプチドに変化なし）であっても、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。更に、１又は複数の親ヌクレオチド配列から生成されるよりむしろ、ライブラリーのポリヌクレオチド配列は異なるソースから得ることができ、異なるが同じ活性又は機能を有する高度に関連したポリペプチドをコードし得る。本文脈において、“高度に関連”は、ポリペプチドが同じ活性又は機能を有し、そして更に、“ＤＮＡシャッフリング”の標題の更に下のセクションに記載されるような共有する保存された領域を有するポリヌクレオチド配列によりコードされることを示すことを意図する。
【００１２】
用語“〜から得られる（由来）”は、ポリヌクレオチド配列が特定のソース、例えば微生物から単離されることを示すことを意図する。ポリヌクレオチド配列は、非培養性生物から作られたものであってよい。ポリヌクレオチド配列は、問題の生物活性又は機能を有し又はそれをコードし、変異体ヌクレオチド配列の生産を許容するために少くとも６ヌクレオチドのサブ配列を含むいずれのポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００１３】
ライブラリーに含まれるポリヌクレオチド配列について用いられる用語“同じ活性又は機能”は、ポリヌクレオチド配列が（定量的に測定して）同じ又は類似した生物活性もしくは機能を有するポリペプチドをコードするか、ポリヌクレオチド配列自体が同じ（定量的）活性又は機能を有することを示すことを意図する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、プロモーター活性を有し得、即ち転写を促進することができるか、又は同じ定量的活性もしくは機能、例えば同じ酵素活性もしくは機能、例えばプロテアーゼ、リパーゼ又はアミラーゼ活性のポリペプチドをコードし得る。
【００１４】
用語“ＤＮＡベクター”は、自律的に複製する能力を有し、問題の配列を含み得るポリヌクレオチド配列である。これにより、ＤＮＡベクターは、複製開始配列、例えば起点（例えばＣｏｌＥ１起点、Ｆ１起点、Ｍ１３起点、２μ起点（イースト）、ｏｒｉＰ（ＥＢウイルス）（ｐｉ））を含む。ＤＮＡベクターは、例えばプラスミドであり得る。
【００１５】
用語“ＤＮＡベクターの集団がポリヌクレオチド配列の１超の変異体を含む”とは、ＤＮＡベクターの集団が問題の生物機能又は活性をコードし又は有する異なるポリヌクレオチド配列を含むことを示すことを意図する。
好ましい実施形態において、問題のポリヌクレオチド配列はポリペプチドコーディング配列である。用語“ポリペプチド”は、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含し、それゆえ特定の長さのコードされた産物に限られない。ポリペプチドは宿主細胞に対してネイティブであっても、異種ポリペプチドであってもよい。用語“異種ポリペプチド”は、宿主細胞に対してネイティブでないポリペプチドとして定義される。ポリペプチドは、ポリペプチドの生産に関連する核酸配列に対して外来性の１又は複数の調節配列を含む核酸配列によりコードされる細胞に対してネイティブであるポリペプチドである組換えポリペプチドであってもよい。ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下に記載のようにいくつかの様式で操作され得る。ポリペプチドは、野生型ポリペプチドであってもその変異体であってもよく、本発明の方法にかけることができる。ポリペプチドは、１又は複数のポリペプチドが細胞に対して異種であり得る少くとも２の異なるポリペプチドから得られた部分的又は完全なポリペプチドの組合せを含むハイブリッドポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、更に、天然の対立遺伝子及び上述のポリペプチドの操作された変異体を含む。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、問題のポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドコーディング配列と通常、関連した調節配列である。調節配列はポリペプチドをコードする核酸又はポリペプチドの生産に関連する他のものに作用可能に結合した全ての成分を含む。このような調節配列は、これらに限らないが、本明細書に記載される。プロモーター、シグナル配列、プロペプチド配列、転写ターミネーター、リーダー、プロモーター認識配列、エンハンサー配列及びポリアデニル化配列を含む。なお更なる実施形態において問題のポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドコーディング配列（又はその配列の一部）と、ａ）調節配列（その調節配列の一部）又はｂ）２もしくはそれ超の調節配列（又はその配列の一部）との組合せである。調節配列の各々は、コーディング配列に対してネイティブであっても外来性であってもよい。
【００１７】
好ましい実施形態において、問題のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドは、抗体もしくはその部分、抗原、凝固因子、酵素、ホルモンもしくはホルモン変異体、レセプターもしくはその部分、調節タンパク質、構造タンパク質、リポーター、又は輸送タンパク質である。
より好ましい実施形態において、酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。
【００１８】
更により好ましい実施形態において、酵素は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである。リパーゼの特定の例は、サーモマイセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）由来のリパーゼ又はそのリパーゼの変異体、例えば、ＷＯ９７／０４０７９に開示されるようにＮ末端伸長部が成熟リパーゼ酵素に付加されている変異体である。
【００１９】
別の実施形態において、ポリペプチドはヒトインスリンもしくはそのアナログ、ヒト成長ホルモン、エリトロポイエチン、又はインスリノトロピンである。
更に好ましい実施形態において、調節配列はプロモーター配列、好ましくは真菌プロモーター、例えばアスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、ＮＡ２−ｔｐｉ（Ａ．ニゲル中性α−アミラーゼ及びＡ．オリザエトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）及びアスペルギルス・ニゲル又はアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーターである。
【００２０】
別の好ましい実施形態において調節配列はプロモーター認識配列、例えばａｍｙＲ認識配列（ＷＯ９８／０１４７０）、ｃｒｅＡ（ＷＯ９４／１３８２０）及びａｒｅＡ（ＷＯ９５／３５３８５）である。
更なる本発明に関連する問題の調節配列の例は、“ＤＮＡベクター及び調節配列”の標題のセクションに更に下に列記される。
【００２１】
糸状菌選択マーカー
用語“選択圧”は有効量の好適な選択剤の存在下又はそれの欠如下で、真菌選択マーカー遺伝子及び問題のポリヌクレオチド配列を含む、糸状菌細胞を培養することとして本明細書で定義される。選択剤の有効量は、選択マーカーを含まない細胞からの選択マーカーを含む細胞の選択を許容するために十分な量として本明細書で定義される。
【００２２】
好ましい実施形態において、真菌選択マーカーは、殺生物剤もしくはウイルス毒性に対する耐性、重金属毒性に対する耐性、又は栄養要求体に対する原栄養性を供することができる産物をコードする遺伝子の群から選択される。
より好ましい実施形態において、原栄養性は、ヌクレオチド合成、コファクター合成、アミノ酸合成、アセトアミド代謝、プロリン代謝、スルフェート代謝、及びニトレート代謝からなる代謝経路の群から選択される酵素から得られる。
【００２３】
更により好ましい、実施形態において、真菌選択マーカーは、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｅｍＡ（５−アミノレブリネートシンターゼ）、ｈｅｍＢ（ホルホビリノーゲンシンターゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートレダクターゼ）、ｐｒｎ（プロリンパーミアーゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｐｙｒｏＡ，ｒｉｂｏＢ，ｓＣ（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）から選択される遺伝子である。
【００２４】
真菌細胞は、要求される特徴を有し又はそれをコードする問題の変異体ポリヌクレオチド配列を有する形質転換体についてスクリーニング又は選択するための好適な培地及び好適な条件下で培養される。培養は、ポリヌクレオチド配列ライブラリーのスクリーニングのための当業界で公知の方法に従って行うことができる。
【００２５】
複製開始配列
本明細書に用いる場合、用語“真菌複製開始配列”は、通常、ＤＮＡベクターの構造的再配置又は宿主細胞ゲノムへの組込みなしに、真菌細胞内で、絶体外分子、例えばＤＮＡベクター、例えばプラスミドの自律的複製を支持することができる核酸配列として定義される。複製開始配列は、それが真菌細胞内で複製開始活性を媒介することができる限り、いずれの起源のものであってもよい。例えば、複製開始配列はアスペルギルスにおいて複製するプラスミド能力を与えるヒト起源のテロマーであってよい（Alek Senko and Ivanova, Mo.Gen.Genet. 260 (1998) 159〜164)。好ましくは、複製開始配列は、糸状菌細胞、より好ましくはアスペルギルス、フサリウム又はアルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）の株、更により好ましくはＡ．ニジュランス、Ａ．オリザエ、Ａ．ニゲル、Ｆ．オキシスポルム又はアルテルナリア・アルテナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｎａｒａ）の株から得られる。
【００２６】
真菌複製開始配列は、当業界で公知の方法により同定することができる。例えば、その配列は、問題の生物由来のゲノムフラグメントの中で、糸状菌細胞内での自律的複製の能力を示す、イーストにおいて自律的複製を維持することができる配列として同定することができる。所定の配列の真菌中の複製開始活性は、真菌を、考えられるプラスミドレプリケーターで形質転換し、そして後にプラスミド上で見い出される遺伝子について選択する時に選択培地上で増殖の欠如を導くであろうセクターのプラスミドの喪失を示す、不規則な形態を有するコロニーについて選択することによっても決定することができる（Gemsら、Gene, 98 (1991) 61〜67）、ＡＭＡ１は、この方法で単離された、複製開始配列を単離するためのかわりの方法は、（例えばアルテルナラ・アテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｔｅｒｎａｔａ）についてTsuge ら、Genetics 146 (1997) 111〜120に開示されるような）天然のプラスミドを単離することである。
【００２７】
真菌複製開始配列の例には、これらに限らないが、Cullen, D.ら（1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163 〜9175）及びGems, D.ら（1991, Gene 98: 61 〜67）により各々記載されるような、アスペルギルス・ニジュランスのＡＮＳ１及びＡＭＡ１がある。
用語“複製開始活性”は、本明細書においてその慣用的な意味で、その配列が、染色体外分子、例えば真菌細胞におれるプラスミド又はＤＮＡベクターの自律的複製を支持することができることを示す。
【００２８】
用語“プラスミドの構造的再配置なし”とは、プラスミドの部分が削除もしくはプラスミドの別の部分に挿入されることがなく、またいずれの宿主ゲノムＤＮＡもプラスミドに挿入されることがないことを意味するとして本明細書で用いる。
好ましくは、本発明の方法に用いるべき複製開始配列は、
（ａ）配列番号：１又は配列番号：２の核酸配列と少くとも５０％の同一性を有し、かつ真菌中で複製を開始できるヌクレオチド配列；
（ｂ）（ｉ）配列番号：１もしくは配列番号：２の核酸配列、又は（ii）その各々の相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする複製を開始することができるヌクレオチド配列であって、該低ストリンジェンシー条件が、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％  ＳＤＳ、２００mg／mLせん断変性サケ精子ＤＮＡ、及び２５％ホルムアミド中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件が、５０℃で、３０分、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中として定義されるヌクレオチド配列；及び
（ｃ）真菌中で複製を開始することができる（ａ）又は（ｂ）のサブ配列からなる群から選択される核酸配列である。
【００２９】
好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号：１又は配列番号：２に記載の核酸配列と、少くとも約５０％、より好ましくは約６０％、更により好ましくは７０％、更により好ましくは約８０％、更により好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約９７％の同一性の程度を有する（以後、“相同ポリヌクレオチド”）。相同ポリヌクレオチドは、真菌細胞内で複製開始活性を有する配列番号：１又は配列番号：２のサブ配列も包含する。本発明の目的のため、同一性の程度は、好適には、当業界で知られたコンピュータープログラム、例えば、ポリヌクレオチド配列比較のための次のセッティング：５．０のＧＡＰ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ及び０．３のＧＡＰ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙでＧＡＰを用いて、ＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45 ）に供されるＧＡＰにより決定することができる。
【００３０】
ハイブリダイゼーションは、標準的サザン・ブロッティング手順の方法により、複製開始配列が、低〜高ストリンジェンシー条件（即ち４２℃で５×ＳＳＰＥ、０．３％  ＳＤＳ、２００μｇ／mLせん断変性サケ精子ＤＮＡ、並びに低、中及び高ストリンジェンシーについて各々、２５，３５又は５０％のホルムアミドでのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション）下で、配列番号：１又は配列番号：２に記載の核酸配列から得られるオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることを示す。配列番号：１又は配列番号：２と相同であるクローン又はＤＮＡを同定するために、ハイブリダイゼーション反応は、各々、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳを用いて、好ましくは少くとも５０℃、より好ましくは少くとも５５℃、より好ましくは少くとも６０℃、より好ましくは少くとも６５℃、更により好ましくは少くとも７０℃、そして最も好ましくは少くとも７５℃で、３０分、３回、洗浄される。
【００３１】
オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号：１もしくは配列番号：２の核酸配列であっても、その各々のサブ配列であってもよい。より詳しくは、オリゴヌクレオチドプローブは、全体の配列よりかなり短くてもよいが、少くとも１５、好ましくは少くとも２５、そしてより好ましくは少くとも４０ヌクレオチド長である。ＤＮＡ及びＲＮＡの両方のプローブを用いることができる。
【００３２】
プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために（例えば32Ｐ， 3Ｈ，35Ｓ、ビオチン、又はアビジンで）標識される。例えば、32Ｐ−， 3Ｈ−、又は35Ｓ−標識化オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを用いることにより検出することができる。
本発明に用いるための複製開始配列を単離する場合、その配列を有すると予想される先に定義されるような生物から調製されたゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ又はコンビナトリアル化学ライブラリーは、複製開始活性を有する上述のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡについてスクリーニングされる。このような他の生物からのゲノム又は他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技術によって分離することができる。ライブラリーからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の好適な担体材料に移し、そしてそれ上に固定することができる。配列番号：１又は配列番号：２と相同であるクローン又はＤＮＡは、次に、以下の標準的サザンブロッティング手順に従って同定することができる。
【００３３】
複製開始活性を有する核酸配列を単離又はクローン化するために用いる技術は当業界で知られており、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからの単離を含む。このようなＤＮＡからのクローニングは、例えば共有する構造的特徴でクローン化ＤＮＡフラグメントを検出するためにポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を用いることにより、行うことができる（例えばInnis ら、1990, PCR: A Guide to Method and Application, Academic Press, New York）。他の核酸増幅手順、例えばリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）を用いることができる。
【００３４】
好ましい実施形態において、複製開始配列は、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載の核酸配列、又はそれらの各々の機能的サブ配列を有する。例えば、配列番号：１の機能的サブ配列は、５′及び／又は３′端からの１又は複数のヌクレオチドが削除されていることを除いて配列番号：１又は配列番号：２により包含される核酸配列である。好ましくは、サブ配列は、少くとも１００ヌクレオチド、より好ましくは少くとも１０００ヌクレオチド、そして最も好ましくは少くとも２０００ヌクレオチドを含む。より好ましい実施形態において、配列番号：１のサブ配列は、少くとも配列番号：２に示す核酸配列を含む。
【００３５】
ＤＮＡベクター及び調節配列
真菌選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列、真菌複製開始配列及び問題のポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターにおいて、そのポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードし得る。この場合、そのコーディング配列の発現を指示する１又は複数の調節配列に作用可能に結合する。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、調節配列であり、この場合、問題の調節配列に依存して、それは、通常、調節配列の活性を評価することができるためにポリペプチドコーディング配列に作用可能に連結する（これにより、要求される特性を有する親調節配列の変異体を選択することができる）。
【００３６】
ＤＮＡベクターの要素を連結するために用いる手順は当業者に公知である（例えばSambrookら、1989、前掲を参照のこと）。
用語“作用可能に連結”は、調節配列がポリペプチドの発現を指示し、又はポリペプチドの生産に関連するように、調節配列がポリペプチドコーディング配列に関連する位置に適切に配置されるコンフィグレーションとして本明細書で定義される。
【００３７】
以下に、異なる調節配列が更に詳細に議論される。調節配列は、問題のポリヌクレオチド配列に作用可能に結合したもの（問題のポリヌクレオチド配列はポリペプチドをコードする）、及び問題のポリヌクレオチド配列を構成するもの（ポリヌクレオチド配列が調節配列である場合）をコードする。問題のポリヌクレオチド配列として（ライブラリーが調節配列のライブラリーである場合）又は問題のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの生産に関連した調節配列として（ライブラリーがポリペプチドをコードする問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーである場合）１つ及び同じ調節配列を用いることができ、そして以下の開示が両方のタイプの調節配列の使用をカバーすることが理解されよう。
【００３８】
調節配列は、ポリペプチドコーディング配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列である好適なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、変異体、トランケート化、及びハイブリッドプロモーターを含む選択された宿主細胞内で転写活性を示すいずれの核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００３９】
糸状菌宿主細胞内でポリペプチドコーディングヌクレオチド配列の転写を指示するための好適なプロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラチックプロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（米国特許４，２８８，６２７）並びにその変異体、トランケート化、及びハイブリッドプロモーターをコードする遺伝子から得られるプロモーターである。糸状菌宿主細胞に用いるための特に好ましいプロモーターは、ＴＡＫＡアミラーゼ、ＮＡ２−ｔｐｉ（アスペルギルス・ニゲル中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼからのプロモーターのハイブリッド）、及びｇｌａＡプロモーターである。
【００４０】
調節配列は、転写を終了させるために糸状菌細胞により認識される配列である好適な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列はポリペプチドコーディングヌクレオチド配列の３′末端に作用可能に結合される、糸状菌細胞内で機能的であるいずれのターミネーターも本発明に用いることができる。
好ましいターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニレートシンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼ、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００４１】
調節配列は糸状菌細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である好適なリーダー配列であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドコーディングヌクレオチド配列の５′末端に作用可能に結合される。糸状菌細胞内で機能的であるいずれのリーダー配列も本発明に用いることができる。
好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニジュランストリオースホスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００４２】
調節配列は、転写された時に、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残量を加えるためのシグナルとして糸状菌細胞により認識されるポリペプチドコーディングヌクレオチド配列の３′末端に作用可能に結合された配列であるポリアデニル化配列であってもよい。糸状菌細胞内で機能的であるいずれのポリアデニル化配列も本発明に用いることができる。
【００４３】
好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスアントラニレートシンターゼ、及びアスペルギルス・ニゲルα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
調節配列は、細胞の分泌経路にコードされたポリペプチドを向かわせることができるポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコーディング領域であってもよい。ポリペプチドコーディングヌクレオチド配列の５′端は、固有に、分泌されるポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントに翻訳読み枠内で天然で連結したシグナルペプチドコーディング領域を含んでもよい。あるいは、コーディング配列の５′端は、そのコーディング配列に対して外来性であるシグナルペプチドコーディング領域を含み得る。コーディング配列がシグナルペプチドコーディング領域を通常、含まない場合に、外来シグナルペプチドコーディング領域が必要とされ得る。あるいは、外来シグナルペプチドコーディング領域はそのポリペプチドの分泌を増強させるために、天然のシグナルペプチド領域に単に置きかわることができる。シグナルペプチドコーディング領域は、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、又はリゾムコル種からのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子から得ることができる。しかしながら、発現されたポリペプチドを糸状菌細胞の分泌経路に向かわせるいずれのシグナルペプチドコーディング領域も本発明に用いることができる。
【００４４】
有効なシグナルペプチドコーディング領域は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニゲル中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパラチックプロテイナーゼ遺伝子、又はヒュミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である。
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置したアミノ酸配列をコードするプロペプチドコーディング領域であってもよい。得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は特定の場合、チモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、そのプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的開裂により成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコーディング領域は、リゾムコル・ミエヘイアスパラチックプロテイナーゼ遺伝子又はマイセリオフトラ・サーモフィララッカーゼ遺伝子から得られる（ＷＯ９５／３３８３６）。
【００４５】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、シグナルペプチド領域はそのプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
ポリペプチドコーディングヌクレオチド配列は、ポリペプチドの発現を指示するために有利な１又は複数の因子、例えば転写アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、及びプロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列に作用可能に結合させることもできる。糸状菌細胞において機能的であるいずれの因子も本発明に用いることができる。これらの因子を１又は複数、コードする核酸は、ポリペプチドコーディングヌクレオチド配列と必ずしもタンデムである必要はない。
【００４６】
アクティベーターは、ポリペプチドコーディングヌクレオチド配列の転写を活性化するタンパク質である（Kudla ら、1990, EMBO, Journal 9: 1355 〜1364: Jarai及びBuxton, 1994, Currene Genetics 26: 2238〜244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271〜297 ）。アクティベーターをコードする核酸配列はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅヘムアクティベータープロテイン１（ｈａｐ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトース代謝プロテイン４（ｇａｌ４）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアンモニア調節タンパク質（ａｒｅＡ）、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  α−アミラーゼアクティベーター（ａｍｙＲ）をコードする遺伝子から得られる。更なる例について、Verdier, 1990, supra and MacKenzie et al., 1993, Journal of General Microbiology 139: 2295-2307を参照のこと。
【００４７】
シャペロンは、別のポリペプチドが正確にホールディングするのを目かけるタンパク質である（Hartl et al., 1994, TIBS 19: 20-25; Bergeron et al., 1994, TIBS 19: 124-128; Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnology 32: 179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething and Sambrook, 1992, Nature 355; 33-45; Puig and Gilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 7764-7771; Wang and Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515-11157; Robinson et al., 1994, Bio/Technology 1: 381-384; Jacobs et al., 1993, Molecular Microbiology 8: 957-966）。シャペロンをコードする核酸配列は、アスペルギルス・オリザエタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はサッカロマイセス・セレビシアエカルネキシン、サッカロマイセス・セレビシアエＢｉＰ／ＧＲＰ７８、及びサッカロマイセス・セレビシアエＨｓｐ７０から得ることができる。更なる例について、Gething 及びSambrook, 1992、前掲、及びHartl ら、1994、前掲を参照のこと。
【００４８】
プロセッシングプロテアーゼは、成熟した生化学的に活性なポリペプチドを作り出すためにプロペプチドを開裂するプロテアーゼである。（Enderlin and Ogrydziak, 1994, Yeast 10: 67-79; Fuller et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Julius et al., 1984, Cell 37: 1075-1089; Julius et al., 1983, Cell 32: 839-852; 米国特許５，７０２，９３４）。プロセッシングプロテアーゼをコードする核酸配列はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅジペプチジルアミノペプチダーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋｅｘ２、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ塩基性プロセッシングエンドプロテアーゼ（ｘｐｒ６）、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ｐ４５遺伝子）から得られる。
【００４９】
糸状菌細胞の増殖に関連するポリペプチドの発現の調節を許容する調節配列を加えることも要求され得る。調節システムの例は、調節化合物の存在を含む、化学的又は物理的刺激に対する応答において遺伝子の発現をターン・オン又はオフするものである。ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエグルコアミラーゼプロモーターを調節配列として用いることができる。他の調節配列の例は、遺伝子増幅を許容するもの、例えば重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子である。これらの場合、ポリペプチドコーディングヌクレオチド配列は、調節配列に作用可能に結合するであろう。
【００５０】
ＤＮＡベクターの糸状菌細胞への導入は、それ自体、知られた様式で、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生からなる方法に関連し得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための好適な手順は、ＥＰ  ２３８０２３及びYeltonら、1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470〜1474に記載される。フサリウム種を形質転換する好適な方法は、Malardier ら、1989, Gene 78: 147〜156 又はＷＯ９６／００７８７に記載される。
【００５１】
真菌細胞
ＤＮＡベクターの集団で形質転換すべき真菌細胞は糸状菌細胞である。
“糸状菌”は（Hawksworthら、1995、前掲に定義される）亜門真菌類及び卵菌類の全ての糸状菌型を含む。糸状菌は、キチン、セルラーゼ、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合ポリサッカライドから構成される菌糸壁を特徴とする。栄養生長は、菌糸伸長により、炭素異化作用は絶対好気性である。対照的に、サッカロマイセスセレビシアエのようなイーストによる栄養生長は、単細胞葉状体により、炭素異化作用は発酵的であり得る。好ましい実施形態において、糸状菌細胞はこれらに限られないが、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ，Ｍｕｃｏｒ，Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ，Ｔｈｉｅｌａｖｉａ，Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの種の細胞である。
【００５２】
本発明に用いるべき糸状菌細胞は、通常、問題のポリヌクレオチド配列に基づき選択される。例えば、問題のポリヌクレオチドがアスペルギルス細胞に用いることを意図した調節配列であるなら、糸状菌細胞は通常、アスペルギルス細胞である。本発明に用いる糸状菌細胞の例には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ細胞、Ｆｕｓａｒｉｕｍ細胞、Ｈｕｍｉｃｏｌａ細胞、Ｍｕｃｏｒ細胞、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ細胞、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ細胞、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ細胞、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ細胞、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ細胞がある。
【００５３】
より詳しくは、糸状菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ細胞；
ａ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｉｏｉｄｅｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ細胞又はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ細胞（Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ  ｓｐ．ｎｏｖ；Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ  ｃｅｌｌ又はＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ細胞；，Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ細胞；Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ細胞；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ細胞；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ細胞；Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ細胞；又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ細胞である。
【００５４】
問題の形質転換体についてのライブラリーの選択又はスクリーニング
本発明の方法の選択又はスクリーニングステップｃ）を行うために用いるべき方法は、問題のポリヌクレオチド配列に依存するであろう。ステップｃ）に用いる“要求される特徴を発現する１又は複数の形質転換体についての選択又はスクリーニング”とは、要求される活性又は機能を有し、任意に、以下に例示されるような更なる特徴を有する（培養ステップｂの間に問題のポリヌクレオチド配列に基づいて生成されている）問題の改変されたポリヌクレオチド配列を含む形質転換体を同定するために、スクリーニング又は選択を行うことを示すことを意図する。これにより、問題のポリヌクレオチド配列が特定の活性又は機能を有するポリペプチドをコードするなら、その選択は、要求される活性又は機能を有するポリペプチドを発現する形質転換体が増殖するのを許容するだけであろう。これにより、問題のポリヌクレオチド配列が特定の活性又は機能を有するポリペプチドをコードするなら、その要求される活性又は機能を有するポリペプチドを発現する形質転換体を同定するためにスクリーニングが行われよう。例えば、問題のポリヌクレオチド配列が酵素、例えばリパーゼをコードするなら、選択又はスクリーニングステップｃ）は、リパーゼ活性を発現する形質転換体を同定するために行われよう。リパーゼを、特定の特徴、例えば高い熱安定性として同定すべきであることが要求されるなら、スクリーニングは、要求される高い熱安定性を有するリパーゼを同定することができる条件（典型的な温度）下で行われるべきである。
【００５５】
同様に、問題のポリヌクレオチド配列が調節配列、例えばプロモーター配列であるなら、選択又はスクリーニングステップｃ）は、プロモーター活性を評価することができる条件下で行われる。典型的には、ライブラリーにおいて、問題のプロモーターポリヌクレオチド配列は、そのプロモーター活性が第２の配列の転写を引用してアッセイすることができるように、転写されるべき第２の配列（例えばポリペプチドコーディング配列）に作用可能に結合される。
【００５６】
細菌又はイースト宿主におけるライブラリー作製
本発明は、糸状菌細胞において問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーを作製し、及びスクリーニング又は選択する方法であって、
（ａ）細菌又はイースト細胞の培養物を、ＤＮＡベクターの集団で形質転換し、ここで各々のベクターは、
（ｉ）糸状菌選択マーカー、糸状菌複製開始配列、細菌又はイースト選択マーカー及び細菌又はイースト複製開始配列（各々は、ＤＮＡベクターの集団内で実質的に変化がない）をコードするポリヌクレオチド配列、及び
（ii）問題のポリヌクレオチド配列であって、そのポリヌクレオチド配列の１超の変異体がＤＮＡベクターの集団内に含まれるもの
を含み；
（ｂ）細菌又はイースト細胞を選択圧下で培養し；
（ｃ）（ｂ）の形質転換体からＤＮＡベクターを単離し；
（ｄ）糸状菌細胞を（ｃ）のＤＮＡベクターで形質転換し；
（ｅ）（ｄ）の糸状菌細胞を選択圧下で培養し；
（ｆ）要求される特徴を発現する１又は複数の糸状菌形質転換体について選択又はスクリーニングし；そして
（ｇ）問題の糸状菌形質転換体を単離すること
を含む方法にも関する。
【００５７】
中間体宿主としてイースト又は細菌を用いる利点は、形質転換頻度がアスペルギルスのような糸状菌細胞についてのものより１００〜１０００倍高く、最初に、操作され任意に連結されたＤＮＡベクターをイースト又は細菌に形質転換し、次にその単離されたスーパーコイルベクターを糸状菌細胞に形質転換する場合により大きなライブラリーを作り出すことである。
【００５８】
好ましい実施形態において、問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーは、上述の問題の生物機能を有し又はそれをコードする少くとも１の親ポリヌクレオチド配列のランダム変異誘発又は天然の対立遺伝子変異体によって調製される。
別の好ましい実施形態において、細菌細胞は大腸菌の株である。
別の好ましい実施形態において、イースト細胞は、サッカロマイセス種の株、特にサッカロマイセス・セレビシアエ又はサッカロマイセス・クルイベリ又はスキゾサッカロマイセス種の株である。好適なイースト細胞の更なる例は、クルイベロマイセス、例えばＫ．ラクチス、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、例えばＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株である。
【００５９】
上述の方法に従って、ＤＮＡベクターは、形質転換された細菌又はイースト細胞の容易な選択を許容する選択マーカーを含む。細菌選択マーカーの例には、これらに限らないが、抗生物質、耐性例えばアンピシリン、カナマイシン、エリトロマイシン、クロランフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与えるマーカーがある。更に、選択は、例えばＷＯ９１／０９１２９に記載されるように、同時形質転換によって行うことができる。ここでは、選択マーカーは別個のベクター上にある。
【００６０】
イースト宿主細胞のための好適なマーカーは、ＡＤＥ２，ＨＩＳ３，ＬＥＶ２，ＬＹＳ２，ＭＥＴ３，ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。
好ましい実施形態において、細菌又はイースト選択マーカーは、殺生物剤に対する耐性を与え、ここで殺生物剤は、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロランフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン及びメトトレキセートからなる群から選択される。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、細菌又はイースト選択マーカーは、殺生物剤もしくはウイルス毒性に対する耐性、重金属毒性に対する耐性又は栄養要求体に対する原栄養性を供する産物をコードする遺伝子の群から選択される。
別の好ましい実施形態において、原栄養性は、ヌクレオチド合成、コファクター合成、アミノ酸合成、アセトアミド代謝、プロリン代謝、スルフェート代謝、及びニトレート代謝からなる代謝経路からなる群から選択される酵素から得られる。
【００６２】
自律的複製のために、ベクターは、そのベクターが問題の細菌又はイースト細胞内で自律的に複製することを可能による複製の起点を更に含み得る。複製の細菌の起点の例は、大腸菌内で複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４の複製の起点である。
イースト宿主細胞に用いるための複製の起点の例は、複素の２ミクロン起点、ＡＲＳ１，ＡＲＳ４，ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。
【００６３】
細菌又はイースト細胞の形質転換は、例えば、コンピテント細胞を用いることにより、エレクトロポレーションにより、又は細菌細胞のコンジュゲーションにより、行うことができる（例えばJ.Sambrook, E.F.Fritsch 、及びT.Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと）。これらの細胞の選択圧下での培養は、当業界で知られた方法に従って行うことができる。
【００６４】
糸状菌選択マーカー、真菌複製開始配列及び問題のポリヌクレオチド配列は、好ましくは本明細書、例えば“糸状菌選択マーカー”及び“複製開始配列”の標題のセクションに記載される通りである。
問題の形質転換体の選択又はスクリーニングは、“形質転換体の選択及びスクリーニング”の標識のセクションに上述されるように行うことができる。
【００６５】
問題のポリヌクレオチド配列
本発明は、いずれの型の問題のポリヌクレオチドのライブラリーをスクリーニング又は選択するためにも有用であろう。より詳しくは、本発明の方法に用いるべき問題のポリヌクレオチド配列は、問題の生物活性又は機能を有し又はそれをコードする親ポリヌクレオチド配列から生成することができる。例えば、問題のポリヌクレオチド配列は、遺伝子のランダム変異誘発により問題のポリペプチドをコードする遺伝子から生成される。あるいは、問題のポリヌクレオチド配列は、先に定義されるような調節配列、例えばプロモーター配列である。また、更に上述されるように、問題のポリヌクレオチド配列は、異なるソース、例えば異なる天然のソース、例えば微生物から得ることができる。問題のポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドコーディング配列及び調節配列の組合せであり得る。
【００６６】
好ましい実施形態において、親ポリヌクレオチド配列の改変は、物理的もしくは化学的変異誘発剤の使用、ドープ化（ｄｏｐｅｄ）オリゴヌクレオチドの使用、ＤＮＡシャッフリングにより、核酸配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることにより、又はそれらのいずれかの組合せにより行われる。
あるいは、問題のポリヌクレオチド配列は、誤りがちなポリメラーゼ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）又はエラーの形成を促進するために最適以下の条件下で作用するポリメラーゼを用いることにより、即ち、エラー・プローンＰＣＲにより、ヌクレオチド塩基の誤った組込みにより、配列を変異誘発にかけることにより得ることができる、エラー・プローンＤＮＡ合成は、例えば種々のミューテーター株の使用により、試験管内又は生体内で行うことができる。
【００６７】
ランダム変異誘発
改変タンパク質及び酵素をコードする変異体ポリヌクレオチド配列を生成するための一般的なアプローチは、例えばＵＳ  ４，８９４，３３１及びＷＯ９３／０１２８５に開示されるような、ランダム変異誘発に基づいている。このアプローチは、本発明とあわせて用いることもできる。例えば、ランダム変異誘発は、好適な物理的もしくは化学的変異誘発剤の使用により、好適なオリゴヌクレオチドの使用により、又はポリヌクレオチド配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることにより行うことができる。更に、ランダム変異誘発は、これらの変異誘発剤のいずれかの組合せの使用により行うことができる。変異誘発剤は、例えば、転位、トランスバージョン、逆位、スクランブリング、削除及び／又は挿入を誘導するものであってよい。
【００６８】
本目的に適した物理的又は化学的変異誘発剤の例には、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロングアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、重硫酸ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチドアナログがある。このような剤を用いる場合、変異誘発は、典型的には、問題のポリヌクレオチド配列を、選択された変異誘発剤の存在下で、変異誘発がおこるために適した条件下でインキュベートすることにより行われる。
【００６９】
変異誘発をオリゴヌクレオチドの使用により行う場合、オリゴヌクレオチドは、変化すべき位置でオリゴヌクレオチドの合成の間、３つの非親ヌクレオチドでドープ又はスパイクすることができる。ドーピング又はスパイキングは、不要なアミノ酸のためのコドンが回避されるように行うことができる。ドープ化又はスパイク化オリゴヌクレオチドは、いずれかの公開された技術により、例えばＰＣＲ，ＬＣＲ又は好適と思われるいずれかのＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼにより問題のポリヌクレオチドに組込むことができる。
【００７０】
好ましくは、ドーピングは、各々の位置での野生型及び変異の割合が予め規定されている“コンスタントランダムドーピング”を用いて行われる。更に、ドーピングは、特定のヌクレオチドの導入のための選択、それにより１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入についての選択に対して行うことができる。ドーピングは、例えば各々の位置での９０％野生型及び１０％変異の導入を許容するように、行うことができる。ドーピングスキームの選択における更なる考慮は、遺伝子及びタンパク質構造束縛に基づく。ドーピングスキームは、とりわけ終止コドンの導入を避けるＤＯＰＥプログラム（例えば、Tomardl, Dら、1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11: 29〜38; Jensen, LJ, Andersen KV, Svendsen, A., 及びKretzschmar, T., 1998, Nucleic Acids Reseach 26: 697〜702）を用いることによって行うことができる。
【００７１】
ＰＣＲ生成変異誘発を用いる場合、化学的に処理した又は非処理の問題の親ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチドの誤った組込みを増加させる条件下でＰＣＲにかけられる（Deshler, J.O., 1992, Genetic Analysis, Techniques and Arrlications 9: 103 〜106; Leungら、1989, Technique 1: 11 〜15）。
大腸菌（Foulerら、1974, Molec.Gen.Genet. 133: 179〜191）、Ｓ．セレビシアエ又はいずれかの他の微生物のミューテーター株は、問題のポリヌクレオチド配列のランダム変異誘発のために、例えば親ポリヌクレオチド配列を含むプラスミドをミューテーター株に形質転換し、そのミューテーター株をプラスミドと共に増殖させそしてそのミューテーター株から変異したプラスミドを単離することにより用いることができる。変異したプラスミドは、次に、発現生物に形質転換することができる。
【００７２】
変異誘発すべきポリヌクレオチド配列は、便利には、その配列を有する生物から調製されたゲノム又はｃＤＮＡライブラリー中に存在し得る。あるいは、その配列は、それ自体、変異誘発剤と共にインキュベートすることができ、又はそれに露出することができるプラスミド又はバクテリオファージのような好適なベクター上に存在し得る。変異誘発すべきポリヌクレオチド配列は、単離された形態であってよい。ランダム変異誘発にかけるべきポリヌクレオチド配列は、好ましくはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列であることが理解されよう。その変異誘発されたＤＮＡ配列は、変異されたＤＮＡ配列の発現を許容する機能をコードするＤＮＡ配列を更に含み得る。
【００７３】
ＤＮＡシャッフリング
本発明による問題のポリヌクレオチド配列の変異体の迅速な調製のための別の方法には、生体内又は試験管内ＤＮＡシャッフリングの方法がある。ここで、ＤＮＡシャッフリングは、２又はそれ超の相同ポリヌクレオチド間のヌクレオチド配列フラグメントの生体内又は試験管内の組換えとして定義され、インプットポリヌクレオチド（即ちシャッフリングにかけられるポリヌクレオチド）と比べて、いくつかの変化したヌクレオチドフラグメントを含むアウトプットポリヌクレオチド（即ちシャッフリングサイクルにかけられたポリヌクレオチド）を生ずる。シャッフリングは、その例が以下に列記される当業界で知られた方法により、細胞内での組換えにより試験管内又は生体内で行うことができる。
【００７４】
例えば、H.Weher 及びWeissmanu, C. (1983. Nucleic Acids Research 11: 5661〜5669）は、２つの相同遺伝子間の生体内組換えにより遺伝子を改変するための方法を記載する。ここでは、組換え体は、耐性マーカーを用いて同定され、単離される。
Pomponら（1989, Gene 83: 15 〜24）は、サッカロマイセス・セレビシアエを、フィル・イン端を有する直鎖化プラスミド、及びそのプラスミドの端と部分的に相同であるＤＮＡフラグメントで形質転換することにより、サッカロマイセス・セレビシアエにおける部分的に相同な配列の生体内組換えによる哺乳動物シトクロムＰ−４５０の遺伝子ドメインをシャッフリングするための方法を記載する。
【００７５】
ＷＯ９７／０７２０５においては、ポリペプチド変異体が、テンプレートとしてプラスミドＤＮＡを用いる生体内組換えにより、相同なＤＮＡ配列の異なるヌクレオチド配列をシャッフリングすることにより調製される方法が記述される。
米国特許第５，０９３，２５７号（Genencor International, Inc.）は、生体内組換えによりハイブリッドポリペプチドを生産するための方法を開示する。
【００７６】
好ましい実施形態において、問題の変異体ポリヌクレオチド配列は、問題の２又はそれ超の相同な核酸配列間の生体内組換えによって得られ、
（ａ）問題のポリヌクレオチド配列間の少くとも１の保存された領域を同定し；
（ｂ）問題のポリヌクレオチド配列の各々のフラグメントであって、（ａ）の保存された領域を含むフラグメントを生成し；
（ｃ）１又は複数の相同なリンク点として保存された領域を用いることにより（ｂ）のフラグメントを組換えることを含む。
【００７７】
好ましくは、問題のポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドもしくはその一部をコードするか、又は先に定義されるような調節配列もしくは両方のいずれかの組合せである。
用語“保存（された）領域”とは、２又はそれ超の配列が共有する好ましくは少くとも１０bpのサブ配列をいい、少くとも約５０％、より好ましくは少くとも約６０％、更により好ましくは少くとも約７０％、更により好ましくは少くとも約８０％、更により好ましくは少くとも約９０％、そして最も好ましくは少くとも約９７％のサブ配列間の同一性の程度がある。
【００７８】
保存された領域を２つの配列間の“結合（連結、リンク）点”として用いるために、保存された領域内の配列間の同一性の程度は、配列間の例えば上述の条件下で、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に高く、それにより保存された領域はリンク点として機能する。
試験管内の相同ＤＮＡ配列のシャッフリングのための１つの方法は、Stemmer (Stemmer, 1994. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 91: 10747-10751; Stemmer, 1994. Nature 370: 389-391; Crameri, A., et al., 1997. Nature Biotechnology 15: 436-438 ）により記載されている。その方法は、試験管内ＰＣＲ技術を用いることにより相関ＤＮＡ配列をシャッフリングすることに関する。シャッフ化ＤＮＡ配列を含む陽性細胞組換え遺伝子は、発現されたタンパク質の改良された機能に基づきＤＮＡライブラリーから選択される。
【００７９】
上述の方法は、相同ＤＮＡ配列をシャッフリングするための方法に関連してＷＯ９５／２２６２５にも記載される。その方法における重要なステップは、相同なテンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを、要求されるサイズのランダムフラグメントに開裂し、次にそれらフラグメントを全長遺伝子に相同的に再アセンブルすることである。
【００８０】
ＷＯ９８／４１６５３は、組換えた相同ポリヌクレオチドのライブラリーが試験管内ＤＮＡ合成の間に誘導されたテンプレートシフトによりいくつかの異なるインプットＤＮＡテンプレート及びプライマーから作製される。
局所化ランダム変異誘発
ランダム変異誘発は、問題の親ポリヌクレオチド配列の一部に有利に局在化させることができる。改変すべき配列は例えば、遺伝子産物の活性のために本質的である遺伝子のコーディング領域もしくはその一部、又は先に定義される調節配列もしくはその一部であり得る。このような調節配列の好ましい例は、プロモーター配列又はその機能的部分、即ち核酸配列の発現を行うために十分である部分である。
【００８１】
局所化ランダム変異誘発は、例えば、問題のポリヌクレオチド配列の特定の領域が特に重要であると同定されている場合に有利であり得る。例えば、問題のポリヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする場合、その重要な領域は、そのポリペプチドの所定の特性のために本質的なものであり得、その領域の改変はこの特性が改変されている変異体を生ずると予想される。このような領域は、通常、親ポリペプチドの三次構造が解明されてその機能と関連づけられている場合に同定することができる。同様に、問題のポリヌクレオチド配列が、調節配列、例えばプロモーターである場合、問題の領域は、プロモーター活性に本質的であるか又はそれに関連すると予想されるものであり得る。
【００８２】
局在化、又は領域特異的ランダム変異誘発は、便利には、上述のようなＰＣＲ生成変異誘発技術又は当業界で知られたいずれかの他の好適な技術の使用により行われる。あるいは、改変すべきポリヌクレオチド配列の部分をコードするヌクレオチド配列は、例えば好適なベクターへの挿入により単離することができ、その部分は、次に、先に議論した変異誘発法のいずれかの使用により変異誘発にかけることができる。
【００８３】
真菌複製開始配列の使用
更なる態様において、本発明は、糸状菌細胞において問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーを作製し、選択又はスクリーニングするための本明細書に定義される真菌複製開始配列の使用に関する。好ましくは、ライブラリーは、本発明の第１又は第２の態様に従う方法によって作製される。好ましい実施形態において、真菌複製開始配列は、
（ａ）配列番号：１もしくは配列番号：２の核酸配列と少くとも５０％の同一性を有し、複製を開始することができる複製開始配列；
（ｂ）（ｉ）配列番号：１もしくは配列番号：２の核酸配列、又は（ii）それら各々の相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする複製開始配列であって、その低ストリンジェンシー条件は、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％  ＳＤＳ、２００mg／mLせん断変性サケ精子ＤＮＡ、及び２５％ホルムアミド中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより規定され、洗浄条件が５０℃で３０分、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中として規定される複製開始配列；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のサブ配列であって複製開始活性を有するもの
からなる群から選択される。
【００８４】
好ましくは、複製開始配列は、糸状菌細胞から、特にアスペルギルス、例えばＡ．ニジュランスの株から得られる。最も好ましい実施形態において、複製開始配列は、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載の核酸配列を有するか、又はそれらの各々の機能的サブ配列である。この態様に従って用いるべき複製開始配列は、“複製開始配列”の標題の上述のセクションに記載され得る通りである。
【００８５】
問題のポリヌクレオチド配列のライブラリー
更なる態様において、本発明は、ＤＮＡベクターの集団で形質転換された糸状菌細胞を含む問題のポリヌクレオチド配列のライブラリーであって、各々のベクターが、
（ｉ）真菌選択マーカー及び真菌複製開始配列をコードする遺伝子であって、該マーカー及び複製開始配列が前記集団内で変化していない遺伝子；及び
（ii）問題のポリヌクレオチド配列であって、ＤＮＡベクターの集団がポリヌクレオチド配列の１超の変異体を含むポリヌクレオチド配列を含むライブラリーに関する。
【００８６】
好ましい実施形態において、そのベクターは細菌又はイースト選択マーカー及び細菌又はイースト複製開始配列をコードする核酸を更に含む。好ましくは、ライブラリーは、本発明の第１又は第２の態様に従う方法によって調製される。好ましくは、ライブラリーの要素、例えばＤＮＡベクター及びその言及される構成物は明細書に記載される。
【００８７】
本発明は、以下の例により更に記述されるが、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。
実施例
材料
緩衝液及び基質として用いる化学物質は少くとも試薬グレードの商用製品であった。
【００８８】
プラスミド
ｐＭＴ１５０５  ：実施例１に後述の通り作製
ｐＨｅｌｐ１    ：Gems, D., ら（1991, Gene 98: 61〜67 ）に記載されるよう
に選択マーカーとしてＡ．オリザエからのｐｙｒＧ遺伝子及
びＡ．ニジュランスにおける自己複製を可能にするＡＭＡ１
配列を含む。
ｐＴｏＣ６８    ：ＥＰＯ  ５３１３７２（Novo Nordisk A/S）に記載
ｐＡＨＬ        ：ＷＯ９２／０５２４９に記載、リパーゼコーディング配列を
含む
ｐＳＯ２        ：ＷＯ９６／２９３９１に記載、アスペルギルス・オリザエｐ
ｙｒＧ遺伝子を含む
ｐＥＮＩ１１２７：実施例１に後述の通り作製
ｐＥＮＩ１２４５：実施例１に後述の通り作製
ｐＥＮＩ１２４６：実施例１に後述の通り作製
ｐＥＮＩ１２９８：実施例１に後述の通り作製
ｐＥＮＩ１２９９：実施例１に後述の通り作製
株
ＪａＬ２５０：ＷＯ９８／０１４７０に記載される通り、ｐｙｒＧが不活性化さ
れているアスペルギルス・オリザエＡ１５６０の誘導体
ＤＨ５ａ    ：GIBCO BRL から購入した大腸菌宿主細胞（Life Technologies,
Inc., Rockville MD）
ＤＬＭ１５  ：以下の実施例５に記載されるようなフサリウム・ベネナトウム（
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の誘導体
実施例１：ｐＥＮＩ１２９８及びｐＥＮＩ１２９９の作製
ｐＭＴ１４６６を、ｐＨｅｌｐ１からのＳｐｈＩ／ＮａｒＩフラグメントをｐＴｐＣ６８に挿入することにより作製した。ｐＭＴ１４８９を、ｐＭＴ１４６６をＳｐｈＩ及びＳｔｕＩで消化し、次に再連結することにより作製した。ｐＭＴ１５００を、ｐＭＴ１４８９をＡａｔII及びＮｕｒＩで消化し、リンカーを連結することにより作製した。ｐＭＴ１５０４を、ｐＭＴ１５００をＮｈｅＩで消化し、再連結することにより作製した。ｐＭＴ１５０５を、Ａ．ニジュランスゲノムＤＮＡからのａｍｄＳコーディング遺伝子を含む２．７kb  ＸｂａＩフラグメント（Corrick, C.M. ら、1987, Gene 53: 63 〜71）を、ＮｈｅＩで切断されたｐＭＴ１５０４に挿入することにより作製した。ｐＥＮＩ１１２７を、ＳａｌＩで消化したｐＭＴ１５０５から作製し、ＡＭＡ１反復のうちの１つ及び中心スペーサー領域を除去した。
【００８９】
ｐＥＮＩ１１２７及びｐＭＴ１５０５を、各々ＨｉｎｄIII で切断し、各々２４０３bp及び５２５３bpのフラグメントを作り、それらを１％アガロースのゲルから精製し、リパーゼコーディング配列を含むベクターｐＡＨＬ内のＨｉｎｄIII 部位にクローン化した。得られたプラスミドを各々ｐＥＮ１２４５及びｐＥＮ１２４６と呼んだ。
【００９０】
ｐｙｒＧ遺伝子を含む３５２７bp  ＳｔｕＩ／ＢｂｕＩフラグメントをｐＳＯ２から切り出し、ｐＥＮＩ１２４５及びｐＥＮＩ１２４６の両方のＳｔｕＩ／ＢｂｕＩ部位に挿入した。得られたプラスミドを各々ｐＥＮ１２９８及びｐＥＮ１２９９と呼んだ。ｐＥＮＩ１２９８についての制限地図を図１に、ｐＥＮＩ１２９９を図２に示す。
【００９１】
実施例２：独立して増殖させたアスペルギルス・オリザエ形質転換体におけるリパーゼの発現レベル
ＪａＬ２５０を、例えばＷＯ９８／０１４７０に記載される標準的手順を用いて、ｐＥＮＩ１２９８及びｐＥＮＩ１２９９で形質転換した。次にその細胞を３７℃でＣｏｖｅプレート上で培養した。
【００９２】
形質転換体は、１０4 〜１０5 ／μｇ  ＤＮＡの形質転換頻度で、３日のインキュベーション後に現れた。それは、ＡＭＡ１配列の欠如下での形質転換頻度の１００〜１０，０００倍の増加であった。
ｐＥＮＩ１２９８及びｐＥＮＩ１２９９形質転換体からの３０の独立した形質転換体を、Ｃｏｖｅプレート上で単離し、同時に、各々のウェル中に１* ｖｏｇｅｌ、２％マルトースの２００μＬ最小培地（例えばMethods in Enzymology, Vol.17 p.84）を含む９６ウェルマイクロタイター皿に接種した。
【００９３】
３４℃で３日のインキュベーションの後、そのマイクロタイター皿内の培養物からの培地を、リパーゼ活性についてアッセイした。各々のウェルからの培地の１０μＬアリコートを、０．０１８％  ｐ−ニトロフェニルブチレートのリパーゼ基質２００μＬ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０mM  ＣａＣｌ2 、５０mM  Ｔｒｉｓ  pH７．５を含むマイクロタイターウェルに加えた。活性を、標準的酵素学プロトコル（例えばEnzyme Kinetics, Paul C.Engel, ed, 1981, Chapman and Hall Ltd.）を用いて、カイネティックマイクロタイターリーダー（Molecular Device Corp., Sunnyvale CA）を用いて５分間にわたり、１５秒間隔で分光光度測定によりアッセイした、要約すると、産物形成は、基質ターンオーバーの最初の比率の間、測定し、５分間、１５秒毎に４０５mmでの吸光度から計算した曲線の傾きとして規定した。任意リパーゼ活性単位を、最も高いリパーゼ活性を示す形質転換体に対して標準化した。３０の形質転換体の各々のグループについて平均値及び標準偏差を計算した。
【００９４】
同時に、３７℃で３日間、Ｃｏｖｅプレート上で培養した形質転換体を第２のＣｏｖｅプレート上に再び単離し、前述のようにマイクロタイターウェルに再接種した。更に３日間、培養した後に、もう１回、アッセイ、再単離及び再接種の手順をくり返した。
以下の表１に要約した結果は、形質転換後６日にｐＥＮＩ１２９８形質転換体により生産される量に対する、生産されたリパーゼの量を示す。標準偏差の低い値により示されるように、３０の独立して増殖させた形質転換体の中でリパーゼ発現レベルにほとんど変化はない。通常、糸状菌の形質転換を行う場合、ベクターのゲノムへのランダム組込み及び組み込まれたベクターの数の両方により、かなり大きい相対的な標準偏差が見られる（７０％〜１００％）。最も悪い及び最も優れた生産性真菌形質転換体間で発現レベルで１００〜１０００倍の差となり得る。
【００９５】
【表１】
0005043254.tif 000002
【００９６】
表１．形質転換後６日の、ｐＥＮＩ１２９８に対する３０の独立して増殖させた形質転換体からのリパーゼの平均発現レベル及び各々についての標準誤差
実施例３：プラスミドの再配置についてのテスト
ｐＥＮＩ１２９８又はｐＥＮＩ１２９９のいずれかを含むＪａｌ２５０の形質転換体をＹＰＤ培地中で一晩、増殖させた。
【００９７】
製造元により供される手順が改変されているＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（QIAGEN, Venlo, The Netherlands）を用いて形質転換体の各々からＤＮＡを調製した。要約すると、各々の株を３日間、５mL  ＹＰＤ中で増殖させた。その菌糸体を、ろ過により収集し、２００mLの水で洗い、次に２mLマイクロフュージチューブに移し、６０℃で３時間、真空下で遠心により凍結乾燥した。その乾燥した菌糸体を次に、粉砕し、１mLの溶解緩衝液（１００mM  ＥＤＴＡ、１０mM  Ｔｒｉｓ  pH８．０、１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５００mMグアニジン−ＨＣｌ、２００mM  ＮａＣｌ）に再度懸濁し、次に全体を混合した。２０mgのＲＮＡｓｅを各々のチューブに加え、次にそれを１０分、３７℃でインキュベートした。１００μｇのプロテイナーゼＫを加え、その反応を３０分、５０℃でインキョベートした。次に各々のチューブを、標準的トップ・マイクロフュージ中でトップヒスピードで１５分、遠心した。その上清をＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンカラムに適用し、次に遠心してろ液を捨てた。そのカラムを次に、そのキットに供される０．５mL  ＰＢ中で洗い、１分間、再び遠心した。ろ液を捨てた後、そのカラムをキットに供される０．７５mL  ＰＥ中で洗い、次にもう１回、１分、遠心した。そのカラムを空気乾燥させ、そのＤＮＡを１００μＬのＴＥ緩衝液を加えることにより溶出し、最後に１分、回転させた。
【００９８】
ＤＮＡを大腸菌ＤＨ５ａに形質転換した場合に形質転換体を得て、プラスミドがＡ．オリザエ内のエピソームに維持した。プラスミドＤＮＡを製造元の説明に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いて細菌細胞から精製した。
次にその精製したプラスミドＤＮＡをＳｃａＩで消化し、その制限パターンを、標準的アガロースゲル分画技術により分析した。
【００９９】
もとのプラスミドの制限パターンと比べた時、結果は、５のｐＥＮＩ１２９９ＪａＬ２５０形質転換体に再配置は１つもなく、８のｐＥＮＩ１２９８ＪａＬ２５０形質転換体のうち１つのみが再配置を示し、プラスミド再配置がまれであることを示した。
実施例４：ライブラリーのスクリーニング
変異体ポリペプチドを、親ポリペプチドに相当するレベルで発現される改良された機能的特徴で同定するために、変異体ポリペプチドのライブラリーを作製し、アスペルギルス・オリザエにおいてスクリーニングした。テンプレートとしてｐＥＮＩ１２９８並びに以下に記載のような各々のプライマー２pmol／mL：１つのプライマーとしてｏｌｉｇｏ１９６７０、第２のプライマーとしてドープ化ｏｌｉｇｏ２３７０１，２３７０２又は２３７０３を用いるポリメラーゼ鎖反応を以下の条件下で行った；９４℃、５分；３０サイクルの（９４℃、３０秒；５０℃、３０秒；７５℃、１分）、及び７２℃、５分。商用Ｔａｑポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑを、供給元（Perkin-Elmer Corp., Branchburg NJ, USA）により推奨される通り用いた。
【０１００】
１９６７０：配列番号：３
２３７０１：配列番号：４
２３７０２：配列番号：５
２３７０３：配列番号：６
得られた産物をマイクロフュージスピンカラムＳ３００（Pharmacia-LKB, Uppsala SE ）を用いて精製した。ｐＥＮＩ１２９８  ＤＮＡを含むその精製された産物を以下の条件下で２回目のＰＣＲ増幅にかけた：９４℃、５分；３０サイクルの（９４℃、１分；５０℃、１０分；７２℃、２分）；及び７２℃７分。以下のプライマーを用いた。
【０１０１】
１９６７１：配列番号：７
次にその産物をテンプレートＤＮＡを除去するためＤｐｎ１消化にかけ、次に９４℃で３０分、インキュベートしてＤｐｎ１酵素を不活性化した。
ＪａＬ２５０を、ＢａｌＩ及びＳｇｒＡＩ消化してリパーゼコーディング配列のほとんどを除去した２μｇのｐＥＮＩ１２９８、並びに２３７０１，２３７０２又は２３７０３ドープ化オリゴ反応起源のＰＣＲフラグメントのうちの１つ５μｇを用いて形質転換した。そのベクター及びＰＣＲフラグメントをＷＯ９７／０７２０５に記載のように生体内で組み換えた。ＪａＬ２５０細胞は、消化したｐＥＮＩ１２９８又はＰＣＲ産物各々のみでも形質転換した。細胞をベクターのみで形質転換した場合に１つの形質転換体を得て、ＰＣＲフラグメントのみの形質転換からは形質転換体は得られなかった。
【０１０２】
２３７０１，２３７０２及び２３７０３ライブラリー各々からの１５，１２及び２６の形質転換体を１．１* ｖｏｇｅｌ、２％グルコース培地２００μＬを含むマイクロタイタープレートに接種し、７２時間、インキュベートした。ｐＥＮＩ１２９８のＪａＬ２５０形質転換体もコントロールとして接種した。次にその培養物をＣｏｖｅプレート上にストリーキングした。マイクロタイター培養物中のリパーゼ活性を先の実施例２に記載されるように、及びマイクロタイターウェル中商用洗濯用界面活性剤を用いて調製した２００μＬのリパーゼ基質に１０μＬのマイクロタイター培養物を加える界面活性剤含有アッセイでアッセイした。活性は、分光光度測定により４０５nmで測定し、先の実施例２に記載されるように計算した。
【０１０３】
界面活性剤含有アッセイにおいて活性を示した形質転換体の各々をＣｏｖｅプレート上に再単離した。７２時間、３７℃でインキュベートしたＣｏｖｅプレート各々から、上述の通り、１０のｐＥＮＩ１２９８形質転換体と共に、２つのコロニーをマイクロタイター皿に接種し、次に７２時間、３４℃で培養した。全てのクローンが界面活性剤アッセイで活性を示したが、ｐＥＮＩ１２９８形質転換体は示さなかった。更に、独立して重複した培養物として増殖させた形質転換体は、相対的に小さいレベルの活性しか示さなかった。結果を以下の表２に要約する。
【０１０４】
【表２】
0005043254.tif 000003
【０１０５】
表２  ｐｎｐ−ブチレート及び商用洗濯用界面活性剤でのリパーゼ活性
クローン２３７０１．１がｐｎｐ−ブチレート及び界面活性剤アッセイの両方において優れた発現及び能力を示したので、そのポリペプチドの縮重したＮ末端配列を決定するためにＤＮＡを単離し、それはＳＰＰＲＲＰＰであると決定された。天然のＮ末端配列はＳＰＩＲＲＥであり、それはｋｅｘ２様プロテアーゼにより切断除去されるプロペプチドをコードする。他の形質転換体のいくつかからのＤＮＡを配列決定し、それは次の縮重Ｎ末端配列を生じた：２３７０１．２（ＳＰＰＲＲＲＲ），２３７０２．１（ＳＰＰＲＰＲＲＲ），２３７０２．７（ＳＰＰＲＰＲＲＰ），２３７０３．１（ＳＰＰＲＲＲＲＲＰ）、及び２３７０３．４（ＳＰＰＲＲＰＲＲＲ）。これにより、親ポリペプチドに相当するレベルで発現することができる改良された機能的特徴を有する変異体ポリペプチドが生産宿主において同定された。
【０１０６】
本明細書に記載され及びクレームされる本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態にその範囲が限定されるべきでない。なぜならこれらの実施形態は本発明のいくつかの態様を説明する目的だからである。いずれの等価な実施形態も本発明の範囲内にあることを意図する。実際、本明細書に示され、記述されるものに加えて、本発明の種々の改変が先の記載から当業者に明らかになるであろう。このような改変も添付の請求の範囲の範囲内にあることを意図する。
【０１０７】
本明細書に言及される全ての出版物は、その出版物が言及する特定の情報を記載し及び開示する目的のために引用により本明細書に組み込まれる。上述の出版物は本願の出願日前、それらの開示のためのみに供される。本発明者らが先の発明によるこのような開示に先立つ権利がないとの承認として解釈すべきものはない。
【０１０８】
本発明は、記述される特定の方法及び組成物に限定されず、もちろん、変化し得ることが理解されるはずである。本明細書に用いる用語は、特定の実施形態を記述する目的のためだけであり、限定を意図したものではない。なぜなら本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるであろうからである。
特に示さない限り、本明細書に用いる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと類似した又は等価のいずれの材料又は方法も本発明の実施又はテストに用いることができるが、その好ましい方法及び材料が記載される。
【０１０９】
実施例５：フサリウム・ベネナトウム株ＤＬＭ１５株の作製
現在、フサリウム・ベネナトウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）として再分類されるフサリウム株Ａ３１５（Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80; O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67）を、Dr. Anthony Trinci, University of Manchester, Manchester, England から又はAmerican Type Culture Collection, Manassas, VAからＦｕｓａｒｉｕｍ株ＡＴＣＣ  ２０３３４として得た。ＣＣｌ−３と呼ぶフサリウム・ベネナトウムＡ３１５の形態変異体（Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555-562; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 95: 1284-1288; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 96: 555-562）は高度に枝分れしたコロニー状変異体である。この実験で用いた株ＭＬＹ３は、フサリウム・ベネナトウムＡ３１５形態転換体ＣＣｌ−３から得た。それはＣＣｌ−３と同一の補足特性を有する。
【０１１０】
培地及び溶液
最小培地は、１リッター当り、６ｇのＮａＮＯ3 、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１mlのＣＯＶＥ微量金属溶液、１ｇのグルコース、５００mgのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３４２．３ｇのスクロース、及び２０ｇの不活性寒天（pH６．５）から構成される。
【０１１１】
ＲＡ発芽培地は、１リッター当り５０ｇのコハク酸、１２．１ｇのＮａＮＯ3 、１ｇのグルコース、２０mlの５０×Ｖｏｇｅｌｓ、及び０．５mlの１０mg／ml  ＮａＭｏＯ4 保存溶液、（pH６．０）から構成される。
ＹＥＰＧ培地は、１リッター当り１０ｇのイーストエキス、２０ｇのペプトン、及び２０ｇのグルコースから構成される。
【０１１２】
ＳＴＣは、０．８Ｍソルビトール、２５mM  Ｔｒｉｓ  pH８、２５mM  ＣａＣｌ2 から構成される。
ＳＰＴＣは、４０％  ＰＥＧ  ４０００、０．８Ｍソルビトール、２５mM  Ｔｒｉｓ  pH８、２５mM  ＣａＣｌ2 から構成される。
ＣＯＶＥ微量金属溶液は、１リッター当り０．０４ｇのＮａＢ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、０．８ｇのＮａ2 ＭｏＯ2 ・２Ｈ2 Ｏ、及び１０ｇのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏから構成される。
【０１１３】
５０×ＣＯＶＥ塩溶液は、１リッター当り２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、７６ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、及び５０mlのＣＯＶＥ微量金属から構成される。
ＣＯＶＥトップアガロースは、１リッター当り、２０mLの５０×ＣＯＶＥ塩、０．８Ｍスクロース、１．５mMセシウムクロライド、１．０mMアセトアミド、及び１０ｇの低融点アガロース（pH６．０）から構成される。
【０１１４】
ＣＯＶＥ培地は、１リッター当り、３４２．３ｇのスクロース、２０mLの５０×ＣＯＶＥ塩溶液、１０mLの１Ｍアセトアミド、１０mLの１．５Ｍ  ＣｓＣｌ2 、及び２５ｇのＮｏｂｌｅ寒天から構成される。
５０×Ｖｏｇｅｌｓ培地は、１リッター当り１５０ｇのクエン酸ナトリウム、２５０ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１０gのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１０ｇのＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、２．５mLのビオチン保存溶液、及び５．０mLのＡＭＧ微量金属溶液から構成される。
【０１１５】
Ｖｏｇｅｌ’ｓ／アセトアミド寒天は、１リッター当り、３０ｇのスクロース、１×Ｖｏｇｅｌ’ｓ塩、１０mMアセトアミド、１５mM  ＣｓＣｌ、及び２５ｇのＮｏｂｌｅ寒天から構成される。
フルオロアセトアミド培地は、１リッター当り、１２ｇの酢酸ナトリウム、２ｇの塩化ナトリウム、０．５ｇのＭｇＳＯ4 、３ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、０．３ｇの尿素、２ｇのフルオロアセトアミド、１mLの５０×Ｖｏｇｅｌｓ塩、及び１５ｇのＡｇａｒｏｓｅ  Ｉ（Amresco; Solon, Ohio ）、pH６．１から構成される。
【０１１６】
フサリウム・ベネナトウムＭＬＹ３におけるｐｙｒＧ遺伝子の削除
フサリウム・ベネナトウム発現宿主ＭＬＹ３のゲノム内の非マーク化ｐｙｒＧ削除を、最初にｐｙｒＧ遺伝子を削除しそしてそれを、アスペルギルス・オリザエｐｙｒＧ遺伝子の上流領域から単離された反復ＤＮＡ配列に隣接したアスペルギルス・ニジュランスａｍｄＳ遺伝子で置きかけることにより形成した。次に、ａｍｄＳ遺伝子から処理した単離物を、フルオロアセトアミドを含むプレート上での増殖により選択した。
【０１１７】
プラスミドｐＤＭ１５６．２を、フサリウム・ベネナトウム株ＡＴＣＣ  ２０３３４からクローン化した３．９kbゲルＥｃｏＲＩ  ｐｙｒＧフラグメントをｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって作製した。そのｐｙｒＧフラグメントは、全コーディング領域＋１．３kbのプロモーター及び１．５kbのターミネーターを含んだ（図３）。フサリウム・ベネナトウムＭＬＹ３のネイティブｐｙｒＧ遺伝子を相同的組換えにより、ｐｙｒＧの全オープンリーディングフレームが削除されている４．４kbフラグメントにより相同的組換えを介して置換し、そして図３に示す通り２３０bp反復配列に隣接するａｍｄＳ遺伝子で置換した。
【０１１８】
ｐＪＲｏｙ４７は、最初に、ＰａｌＩ及びＸｂａＩ部位がＳｗａＩ部位で置換されているｐＮＥＢ１９３（New Englard Biolabs ）から構成されるｐＪＲｏｙ４３を作製することにより作製した。これを達成するために、５′端にＢａｍＨＩ部位、中間にＳｗａＩ部位、及び３′端にＳａｌＩ部位を含むリンカーを、次の２つのオリゴを一緒にアニーリングすることにより作った。
【０１１９】
プライマー１：配列番号：８
プライマー２：配列番号：９
得られたリンカーをｐＮＥＢ１９３に連結し、それをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、ｐＪＲｏｙ４３を作った。
次に、アスペルギルス・オリザエｐｙｒＧ遺伝子の上流２３０bp領域をフサリウム・ベネナトウム中の反復配列として選択した。この領域を以下の２つのプライマー対、プライマー３と４及びプライマー５と６を用いて、アスペルギルス・オリザエｐｙｒＧプラスミドｐＪａＬ３３５（ＷＯ９８／１２３００）からの２つの異なる産物として増幅した：
プライマー３：配列番号：１０
プライマー４：配列番号：１１
プライマー５：配列番号：１２
プライマー６：配列番号：１３
増幅反応物（５０μＬ）を、テンプレートとしてＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて調製したゲノムＤＮＡ約４０〜５０μｇを用いて調製した。各々の反応は次の成分を含んだ：４０〜５０μｇのゲノムＤＮＡ、各々５０pmolのプライマー３及び４又はプライマー５及び６、各々２００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、及び２．５UnitのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。その反応物を次の通りプログラムしたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４８０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ中でインキュベートした：９４℃で２．５分及び７２℃で２．５分のサイクル１；各々９４℃で４５秒、５０℃で４５秒、及び７２℃で２分のサイクル２〜２６；並びに９４℃で４５秒、５０℃で４５秒、及び７２℃で１０分のサイクル２７。
【０１２０】
その反応産物を１％アガロースゲル上で単離し、ここでは約２３０bpのフラグメントが単離された。最初のＰＣＲ産物（約２３０bpフラグメント）はその５′端にＳｗａＩ部位及び３′端にＥｃｏＲＶ部位を含むが、２回目のＰＣＲ産物（約２３０bpフラグメント）は５′端にＥｃｏＲＶ部位及び３′端にＰｍｅＩ部位を含んだ。それら２つの精製した反復フラグメントを最初にＥｃｏＲＶで消化し、一緒に連結した。精製（フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿）後、その連結産物を次にＰｍｅＩ及びＳｗａＩで消化して約５００bpのフラグメントを作り出し、それをアガロースゲル電気泳動及びアガロース処理により精製した。
【０１２１】
得られたフラグメントを、ＰｍｅＩ及びＳｗａＩで消化したｐＪＲｏｙ４３にクローン化してｐＪＲｏｙ４４を作り出した（図４）。このベクターは、ＥｃｏＲＶ部位により分離され、ＳｗａＩ及びＰｍｅＩ部位に隣接した２つの２３０bp反復を含む。
ａｍｄＳ遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラグメント及び調節領域をｐ３ＳＲ２（Kelly 及びHynes, 1985, EMBO Journal 4: 475〜479 ）から単離し、クレノウフラグメントで平滑化し、そしてＥｃｏＲＶで消化したｐＪＲｏｙ４４に連結してｐＪＲｏｙ４７を作った（図３）。
【０１２２】
２３０bp反復配列に隣接したａｍｄＳ遺伝子をＳｗａＩ／ＰｍｅＩフラグメントとしてｐＪＲｏｙ４７から得て、ＥｃｏＲＶ／ＳｔｕＩで消化したｐＤＭ１５６．２に挿入してｐＤＭ２２２．Ａを作った（図３）。ｐＤＭ２２２．ＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐｙｒＧ削除カセットを含む４．４kb  ＥｃｏＲＩフラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen, Chatsworth, CA）を用いてゲル精製した後、形質転換した。
【０１２３】
フサリウム・ベネナトウムＭＬＹ３の胞子を、５００mLのＲＡ胞子形成培地を含むフラスコに、最小培地プレートからの３つの１cm2 菌子体プラグを接種し、そして２８℃、１５０rpm で２〜３日、インキュベートすることにより形成した。胞子をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Calbiochem, San Diego, CA ）を介して収集し、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂセントリフュージ（E.I.DuPont De Nemours and Co., Wilmington, DE ）中の７０００rpm で２０分、遠心した。ペレット化胞子を滅菌蒸留水で２回、洗い、少量の水に再度懸濁し、そして次にヘモサイトメーターを用いてカウントした。
【０１２４】
プロトプラストを、１００mLのＹＥＰＧ培地に４×１０7 のフサリウム・ベネナトウムＭＬＹ３の胞子を接種し、そして１６時間、２４℃で１５０rpm でインキュベートすることにより調製した。その培養物を７分、３５００rpm でＳｏｒｖａｌｌ  ＲＴ  ６０００Ｄ（E.I.DuPont De Nemours and Co., Wilmington, DE ）中で遠心した。ペレットを３０mLの１Ｍ  ＭｇＳＯ4 で２回、洗い、１Ｍ  ＭｇＳＯ4 中５mg／mlのＮＯＶＯＺＹＭＥ  ２３４TM（batch PPM 4356, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）１５mLに再度懸濁した。培養物を２４℃、１５０rpm で、プロトプラストが形成されるまでインキュベートした。３５mLの容量の２Ｍソルビトールをプロトプラスト消化物に加え、その混合物を２５００rpm で１０分、遠心した。そのペレットを再度懸濁し、ＳＴＣで２回、洗い、そして２０００rpm で１０分、遠心してプロトプラストをペレット化した。プロトプラストをヘモサイトメーターでカウントし、ＳＴＣ：ＳＰＴＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液中に１．２５×１０7 プロトプラスト／mLの最終濃度まで再度懸濁した。そのプロトプラストを、Nalgene Cryo 1℃ Fretzing Container (VWR Scientific, Inc., San Francisco, CA）中で速度制御凍結した後、−８０℃に保存した。
【０１２５】
フサリウム・ベネナトウムＭＬＹ３の凍結したプロトプラストを氷上で解凍した。上述のｐＤＭ２２２．Ａからの４．４kb  ＥｃｏＲＩフラグメント１μｇ及びヘパリン５μＬ（ＳＴＳ  １mL当り５mg）を５０mL滅菌ポリプロピレンチューブに加えた。１００μＬのプロトプラストを加え、静かに混合し、そして３０分、氷上でインキュベートした。１mLのＳＰＴＬを加え、２０分、室温でインキュベートした。２５mLの４０℃  ＣＯＶＥトップアグロース＋１０mMウリジンを加えた後、その混合物を、ａｍｄＳ遺伝子の組込みについて選択するためにＣＯＶＥ寒天を含む１５０mm径プレートに注いだ。
【０１２６】
フサリウム・ベネナトウムＭＬＹ３のｐｙｒＧ遺伝子のネイティブ３．９kb  ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐｙｒＧ隣接配列、及び２３０bp反復配列に隣接するａｍｄＳ遺伝子を含む４．４kbフラグメントによる相同的組換えを介して置換した。これは、全ｐｙｒＧコーディング領域＋０．７８kbの５′非翻訳及び０．８kbの３′非翻訳領域を削除した。その削除カセットでのネイティブｐｙｒＧ遺伝子の置換を、サザン・ハイブリダイゼーションにより確認した。サザンハイブリダイゼーションは、製造元により供されるＡｍｅｒｓｈａｍ（Arlington, IL）Ｖｉｓｔａ  ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｈｙｂプロトコル又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍプロトコルを用いて行った。推定上の削除体の真菌ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen Chatworth, CA）を用いて調製し、ＥｃｏＲＩで消化した。サザンブロットを、Ｍａｇｎａｇｒａｐｈ膜（Micron Separations, Inc; Westborough, MA）及び標準的分子生物学技術を用いて行った。膜は、製造元の説明に従って展開し、フルオレセイン標識化プローブのためにＳＴＯＲＭ８６０（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA ）を用いてスキャンするか、又はＤＩＧ標識化プローブのためにフィルムに露出した。３．２kb  ｐｙｒＧプローブは、全ｐｙｒＧコーディング領域、０．６４kb  ５′領域、及び１．４２kb  ３′非翻訳領域を含んだ。
【０１２７】
削除体株を、ＲＡ培地＋１０mMウリジン中で、約３日間、２８℃、１５０rpm で胞子形成させ、マイクロマニュピレーターを用いて単一の胞子を単離した。胞子単離物を、Ｖｏｇｅｌ’ｓ／アセトアミド寒天＋１０mMウリジン上で増殖させた。１つの胞子単離物をＲＡ培地＋１０mMウリジン中で胞子形成させた。その胞子培養物をＭｉｒａｃｌｏｔｈを介してろ過して菌糸体を除いた。確認されたｐｙｒＧ削除体の約９．５×１０5 胞子を、フロオロアセトアミド培地＋１０mMウリジンを含む５つの１５０mmプレートの各々に広げることによりａｍｄＳマーカーの損失についての選択を行った。これらのプレートを室温で２週間までインキュベートした。得られたコロニーをＣＯＶＥプレート及びフロオロアセトアミドプレート＋１０mMウリジンにサブクローン化した。フロオロアセトアミドで十分に生長し、ＣＯＶＥ上でほとんど又は全く生長しなかったコロニーを更に分析した。これらの株のうちの３つからの胞子単離物をサザンブロット分析にかけた。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、上述のｐｙｒＧプローブでプロービングした。胞子単離物のいくつかは１．４kbハイブリダイズバンドを形成し、ａｍｄＳ“ループアウト”を示した。１つの胞子単離物を選択し、フサリウム・ベネナトウムＤＬＭ１５と呼んだ。
【０１２８】
実施例６：独立して増殖させたフサリウム・ベネナトウムＤＬＭ１５形質転換体におけるリパーゼの発現レベル
実施例５に記載されるｐｙｒＧマイナスフサリウム・ベネナトウム株ＤＬＭ１５を、アセトアミドを硝酸ナトリウム（２５mM）で置きかえるRoyer ら1995, Biotech, 13, 1479 〜1483に記載される通り、標準的手順を用いて、（実施例２に記載される）ｐＥＮＩ１２９８で形質転換した。形質転換体は、２週間のインキュベーション後、５０〜１００／μｇ  ＤＮＡの形質転換頻度で現れ、それはＡＭＡ１配列の欠如下の形質転換頻度の１０〜１００倍の増加であった。２０の形質転換体を最小培地プレート上に単離し、更に２週間、室温で増殖させた。その形質転換体を２０mMウリジンを補給した又はウリジンのない（実施例２のような）２００μＬ  ｖｏｇｅｌ培地中マイクロタイター皿中でインキュベートし、室温で増殖させた。ウリジンを補給した形質転換体は十分に増殖したが、ウリジンなしの最小培地プレート上で単離した場合、増殖することができず、このことは、ｐｙｒＧ遺伝子を含むプラスミドが失われており、これによりそのプラスミドが自律的に複製することを示す。ウリジン補給培地中で増殖した形質転換体からリパーゼ活性は検出することができなかった。リパーゼ活性は、ウリジンを補給しなかった最小培地中で増殖する形質転換体からの培地中で検出することができなかった。平均任意活性は、独立して増殖させたフサリウム形質転換体と比べた場合、１５％の相対標準偏差で３４．８であった。これにより、このプラスミドは、フサリウム種におけるライブラリーの作製のために潜在的に用いることができる。
【０１２９】
実施例７：ＰＣＲフラグメントの同時形質転換についてのテスト
以下の実験を、多重ＰＣＲフラグメントが同じ細胞内で（実施例４のような）切断ベクターで生体内で組み換わり、そして同じクローンからの多重酵素の発現を保持するであろうか否かを評価するために行った。２つのＰＣＲフラグメントを、標準的ＰＣＲ条件（９４℃、５分；（９４℃、３０秒；５０℃、３０秒；７２℃、１分）の３０サイクル；及び７２℃、５分）、ｏｌｉｇｏ１１５１２０（配列番号：１４）、ｏｌｉｇｏ１３４５３２（配列番号：１５）及びテンプレートとしてｐＡＨＬ誘導体（ｐＡＨＬのリパーゼ変異体）又はｐＥＮＩ１５４３誘導体（ＡＭＧ変異体）を用いて、リパーゼ遺伝子又はＡＭＧ遺伝子（プロモーター及びターミネーターを含む）ように作った。ｐＥＮＩ１５４３を、ＢａｌII及びＳａｌＩで切断し、それをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断したｐＡＨＬにクローン化したｏｌｉｇｏ１３９１２３（配列番号：１６）及び１３９１２４（配列番号：１７）を用いてアスペルギルス・ニゲルからのグルコアミラーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むＰＣＲフラグメント（ＥＭＢＬ：ＡＣ：Ｘ００５４８、テンプレートとして）を形成することにより作製した。
【０１３０】
約１μｇの各々のＰＣＲフラグメントを、ＢａｌII及びＳｇｒＡＩで切断しウシ腸ホスファターゼで処理したｐＥＮＩ１２９９（１μｇ）と共に（実施例４に記載のような）Ｊａｌ２５０に形質転換した。２０の形質転換体を単離し、（実施例４に記載の通り）最小培地に接種した。７２時間のインキュベーションの後、その培養培地をリパーゼ（ｐｎｐ−ブチレート活性）及びグルコアミラーゼ（ｐｎｐ−グルコピラノシド活性）の存在についてアッセイした。リパーゼ及びグルコアミラーゼ活性の両方を示す形質転換体はなく、これにより、同じ細胞内での多重変異体の同時形質転換及び発現は極めて頻度の低い事象であり、これにより糸状菌ライブラリーのスクリーニングに問題とならないことを示す。
【０１３１】
実施例８：ｐＪｅｒＳ２８０１及びｐＨＰＯＤ１の作製
３断片連結を、ｐＥＮＩ１２９８からの５．８kb  ＢａｌII／ＳｐｈＩフラグメント、ｐＥＮＩ１２９８からの４．０kb  ＢｓｓＨII／ＳｐｈＩフラグメント、及びｐＢＡＮｅ６（ＴＡＫＡ／ＮＡ２／ＴＰＩプロモーター／ＡＭＧターミネーター；ＷＯ９８／１２０３に記載）からの０．７５kb  ＢｓｓＨＩ／ＢａｌIIフラグメントを用いて行い、これによりｐＪｅｒｓ２８０１を作った。クルバリア・ベルルクロサ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）からのハロペルオキシダーゼを含むＰＣＲフラグメント（特許ＷＯ９７４１０２−Ａ１）を、ｏｌｉｇｏ  １０２９ｆｕｐ（配列番号：１８）及び１０２９ｒｅｖ（配列番号：１９）を用いて形成した。そのＰＣＲフラグメントをＳｗａＩ及びＮｏｔＩで切断し、同じ制限酵素で切断したｐＪｅｒｓ２８０１にクローン化し、これによりｐＨＰＯＤ１を形成した。
【０１３２】
実施例９：独立して増殖させた形質転換体におけるハロペルオキシダーゼの発現レベル
ｐＨＰＯＤ１を実施例２に記載されるようにＪａｌ２５０に形質転換した。ｐＥＮｉ１２９８（実施例２）についてのとほぼ同じ形質転換頻度を得た。１０の独立したアスペルギルス形質転換体を各々のウェル内に２００μＬのＧ２−ｇｌｙ−培地を含む９６ウェルマイクロタイタープレートに接種し、７２時間、増殖させた。ハロペルオキシダーゼ活性は、本質的にDe Boer らにより記載されるように１０の形質転換体の各々について決定した［1987; Vanadium containing bromoperoxidase: An example of an oxidoreductase with a high operationel stability in aqueous and organic media, Biotechnol. Bioeng. 30: 607-610］。平均発現レベルは８２．５±９．１（ア−ビトラリーユニット）であった。独立した形質転換体間の発現レベルの相対的な標準偏差は約１１％であり、それは驚くほど低い。これにより、本発明はリパーゼに適用できるばかりでなく、更に他の酵素にも適用できる。
【０１３３】
実施例１０：２つの異なる酵素をコードする２つのプラスミドのＪａｌ２５０への同時形質転換
２つの異なる酵素を形質転換し、増殖の間、同じ細胞内に保持され、これにより１超のプラスミドがコードする酵素の細胞外同時発現を導き得るか否かを評価するために以下の実験を行った。
【０１３４】
Ｊａｌ２５０を０．１μｇ  ｐＥＮＩ１２９９及び０．１μｇ  ｐＨＰＯＤ１（実施例２に記載）の両方で同時形質転換した。４０の独立した形質転換体を単離し、（実施例４に記載される通り）最小培地に接種した。７２時間のインキュベーションの後、その培養培地を（実施例４に記載されるように）リパーゼ及び（実施例８に記載されるように）ハロペルオキシダーゼ活性の存在についてアッセイした。リパーゼ及びハロペルオキシダーゼ活性の両方を示す形質転換体はなく、このことは、同じ細胞内の多重変異体の同時形質転換及び同時発現は極めて頻度の低い出来事であり、糸状菌ライブラリーのスクリーニングに問題はないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  その作製が実施例１に記載されるプラスミドｐＥＮＩ１２９８の制限地図である。
【図２】  その作製が実施例１に記載されるプラスミドｐＥＮＩ１２９９の制限地図である。
【図３】  実施例５に記載されるプラスミドｐＤＭ１５６．２，ｐＪＲｏｙ４７及びｐＤＭ２２２．Ａの制限地図である。
【図４】  実施例５に記載されるプラスミドｐＪＲｏｙ４４の制限地図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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