(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）カカオプロシアニジンモノマーおよび該モノマーより構成されるオリゴマーから選択されるカカオプロシアニジンと、（ii）ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤とを含む非チョコレート食品であって、前記カカオプロシアニジンモノマーが下記式で示され：
【化１】
0004970690.tif 000012
前記オリゴマーは、（４→６）および／または（４→８）のフラバン間結合を介して結合している２から１８のモノマー単位を有し、
該食品は、１００μｇ／ｇ以上のカカオプロシアニジンを含有し、該カカオプロシアニジンは、プロシアニジン含有カカオ抽出物、または少なくとも１つのプロシアニジンモノマーまたはオリゴマーを含むカカオ抽出物の画分の形態であることを特徴とする非チョコレート食品。
【請求項２】
大豆蛋白、可溶性繊維および／またはＬ−アルギニンをさらに含むことを特徴とする請求項１記載の食品。
【請求項３】
カルシウム、カリウム、マグネシウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、およびモノまたはポリ不飽和脂肪酸よりなる群から選択される成分を少なくとも１つさらに含むことを特徴とする請求項１記載の食品。
【請求項４】
飲料であることを特徴とする請求項１記載の食品。
【請求項５】
ペットフードであることを特徴とする請求項１記載の食品。
【請求項６】
（i）カカオプロシアニジンモノマーおよび該モノマーより構成されるオリゴマーから選択されるカカオプロシアニジンと、（ii）ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤とを含む、コレステロール降下チョコレートであって、前記カカオプロシアニジンモノマーが下記式で示され：
【化２】
0004970690.tif 000013
前記オリゴマーは、（４→６）および／または（４→８）のフラバン間結合を介して結合している２から１８のモノマー単位を有し、
該チョコレートは、その製品中の無脂肪カカオ固形物の全体量に基づいて、チョコレート１ｇ当り８，０００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有するブラックチョコレート、またはチョコレート１ｇ当り３，０００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有するミルクチョコレートであることを特徴とするチョコレート。
【請求項７】
大豆蛋白、可溶性繊維および／またはＬ−アルギニンをさらに含むことを特徴とする請求項６記載のチョコレート。
【請求項８】
カルシウム、カリウム、マグネシウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、あるいはモノまたはポリ不飽和脂肪酸よりなる群から選択される成分を少なくとも１つさらに含むことを特徴とする請求項６記載のチョコレート。
【請求項９】
前記カカオプロシアニジンが、カカオ原料、プロシアニジン含有カカオ抽出物、または少なくとも１つのカカオプロシアニジンモノマーまたはオリゴマーを含むカカオ抽出物画分の形態であることを特徴とする請求項６記載のチョコレート。
【請求項１０】
請求項１から５いずれか１項記載の食品または請求項６から９いずれか１項記載のチョコレート、ならびに心血管の健康状態を増進させおよび／または心疾患の危険性を減らすために該食品またはチョコレートを使用するためのラベルおよび／または使用説明書を含んでなるパッケージ。
【請求項１１】
（i）カカオプロシアニジンモノマーおよび該モノマーより構成されるオリゴマーから選択されるカカオプロシアニジンと、（ii）ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤とを含む、ヒトまたは家畜動物の血管の健康状態を増進させるのに使用するための医薬組成物であって、前記カカオプロシアニジンモノマーが下記式で示され：
【化３】
0004970690.tif 000014
前記オリゴマーは、（４→６）および／または（４→８）のフラバン間結合を介して結合している２から１８のモノマー単位を有し、
該組成物は、１００ｍｇ／日から９００ｍｇ／日のカカオプロシアニジンの用量、および１ｇ／日以上のステロールおよび／またはスタノールの用量を送達するように形成されていることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
１５０ｍｇ／日から９００ｍｇ／日のカカオプロシアニジンの用量を送達するように形成されていることを特徴とする請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
心血管または冠動脈の健康状態を増進させるために使用される請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
粥状動脈硬化症または心血管疾患を治療または予防するために使用される請求項１１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、少なくとも１つのコレステロール降下剤と共にポリフェノール（例えばプロシアニジンのようなカカオポリフェノール）を含む組成物、ならびに粥状動脈硬化症および心血管疾患を治療および予防することを含む血管の健康状態を改善する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
心血管疾患（ＣＶＤ）の主要な形態である冠動脈疾患は、今日、米国における主な死因である。脳血管疾患は３番目の死因である。冠動脈疾患および脳血管疾患の両方の病因は粥状動脈硬化症によるものと考えられている。その臨床兆候を介して、粥状動脈硬化症は、１００万件以上の心臓発作、毎年約４００，０００件の脳梗塞、ならびに非常に多くの血液循環の不具合の主な原因となっている。多くの患者が高血圧を煩っている。
【０００３】
実質的な一連の証拠が、高コレステロール血症と若年性粥状動脈硬化症との因果関係を確立している：血漿コレステロールレベルが上昇するにつれ、その結果生じる心臓発作の危険性が高まる（例えば、Steinberg, D., JAMA 264: 3047 (1990)を参照）。粥状動脈硬化症につながる一連の事象において、最初の事象は、頚動脈、冠動脈および大脳動脈、ならびに大動脈における「脂肪層」の形成である。それら病変は、脈管内膜層の平滑筋細胞およびマクロファージ内に主に認められる、コレステロールおよびコレステロールエステルを含有する脂肪沈着を含む。血管平滑筋の遊走および増殖は、最初の脂肪沈着の後の粥状動脈硬化症の病原性において重要な役割を果たす。
【０００４】
さらには、粥状動脈硬化症および心血管疾患の発症は、ＬＤＬ酸化、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性、リポオキシゲナーゼ（ＬＯＸ）活性、一酸化窒素（ＮＯ）産生、および一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）活性によって調節されおよび／またはそれらに関連している。それらに関連する様々な経路および過程が図１に表されており、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号（ＷＯ９７／３６４９７として公開）（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）に詳細に記載されている。簡単に説明すると、ＬＤＬ酸化は、マクロファージが酸化的修飾ＬＤＬを取り込んでいわゆる「泡沫細胞」に変化した時に生じる病変（アテローム病変）の開始における重要な工程である。酵素ＣＯＸおよびＬＯＸは、プロスタグランジンおよびトロンボキサンＡ２の産生につながるアラキドンサン経路に関連し、トロンボキサンＡ２は、血管収縮および血小板凝集、さらには粥状動脈硬化症の進行を生じさせることが知られている。一酸化窒素は、血小板凝集、単球接着／走化性、および血管平滑筋の増殖（それらの全てが粥状動脈硬化症の進行を担うと考えられている）を阻害することが知られている。カカオポリフェノールは、ＬＤＬ酸化を阻害し、ＮＯ／ＮＯＳ活性を増強し、さらにＣＯＸ／ＬＯＸ活性を阻害することによって、上記の過程に対する有益な効果を有することが分かっている。それら効果は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号（ＷＯ９７／３６４９７として公開）およびその出願で報告されている実施例に示されている。例えばアスピリン等の非ステロイド性抗炎症剤の投与によって効果があることが分かっている症状を治療または予防するために、カカオポリフェノールを用いることができる。
【０００５】
粥状動脈硬化症およびＣＨＤの誘導および進行に関連する多くの経路および症状に対するカカオポリフェノールの有益な効果にも関わらず、それら化合物は顕著なコレステロール降下効果を有していないことが見出された。従って、本発明者は、少なくとも１つのコレステロール降下剤と共にポリフェノールを含有する改善された組成物を調製した。その組成物は、ポリフェノールまたはコレステロール降下剤を含有する既に公知の組成物と比較して、哺乳類、特にヒトの血管の健康状態に増強された効果を有する。
【０００６】
発明の概要
本発明は、哺乳類、特にヒトまたは家畜動物における血管の健康状態を改善するための組成物および方法に関する。
【０００７】
１つの態様において、本発明は、例えばカカオポリフェノールとコレステロール降下剤とを含む食品、食品添加物、栄養補助食品、または薬剤等の組成物に関する。本組成物は、必要に応じて、Ｌ−アルギニンを含んでいて差し支えない。
【０００８】
別の実施形態において、本発明はコレステロール降下菓子、最も好ましくはコレステロール降下チョコレート（例えばブラックチョコレート）、およびコレステロール降下チョコレートを含有する菓子に関する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、カカオポリフェノール、およびコレステロール降下化合物、ならびに必要に応じてＬ−アルギニンを含有する組成物を投与することによって、例えばヒトまたは家畜動物のような哺乳類における粥状動脈硬化症および心血管疾患を予防または治療することを含む、血管の健康状態を改善する方法に関する。本発明の組成物および方法において、例えばステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤等のコレステロール降下剤と共に、カカオポリフェノールの特性に類似の特性を有する他の供給源からのポリフェノールを用いて差し支えない。
【００１０】
さらに別の実施形態において、本発明は、フィトステロールおよび／またはフィトスタノールと共に、ポリフェノールを哺乳類に投与することによって、例えばフラバノールまたはフラボノールのようなポリフェノールの吸収を高める方法に関する。本方法において用いるための組成物および製品も提供する。
【００１１】
詳細な説明
本出願において挙げられている全ての特許、特許出願、および引例が、参照によってこの中に組み込まれる。矛盾がある場合には、本開示が適用される。
【００１２】
本発明は、例えばステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤のようなコレステロール降下剤と共にカカオポリフェノールを含有する組成物に関するものであり、本組成物は、哺乳類における血管の健康状態を改善または増進させるのに有用である。本組成物は、必要に応じて、Ｌ−アルギニン、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、あるいはモノまたはポリ不飽和脂肪酸（例えばオメガ−３脂肪酸）を含んでいて差し支えない。また、本発明の組成物および方法において、例えばステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤のようなコレステロール降下剤と共に、カカオポリフェノールの特性と類似の特性を有する他の供給源からのポリフェノールを含有する組成物を用いて差し支えなく、それらも本願発明の範囲に包含される。
【００１３】
この中で用いられている「カカオポリフェノール」（ＣＰ）の用語は、プロアントシアニジン、より詳細には、カカオ豆中に存在しまたはカカオ豆またはカカオ原料から抽出されたプロシアニジンを含む、ポリフェノール物質(polyphenolic substance)を称する。「プロシアニジン」の用語は、カテキンおよびエピカテキンのモノマー（単量体）およびオリゴマーの両方を含む。この中でのカカオポリフェノールへの言及は、カカオプロシアニジンにも適用されることを理解すべきである。「カカオ原料」の用語は、例えばチョコレート液、および部分または完全脱脂カカオ固形物（例えばケーキまたは粉末）のような、殻を含まないカカオニブに由来するカカオ固形物含有物質を称する。「コレステロール降下剤」の用語は、効果量で投与した場合に哺乳類においてコレステロールレベルを低下させる特性を有する、天然のまたは加工された、任意の化合物、化合物の配合物、抽出物または植物成分を意味する。そのようなコレステロール降下剤が、ステロールまたはスタノール型の化合物または化合物の配合物（すなわち誘導体および異性体を含む）である場合、そのコレステロール降下剤は、「ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤」と称される。例えば「コレステロール降下ブラックチョコレート」のような組成物に関してその用語が用いられる場合、その組成物がコレステロール降下特性を有することを意味する。当業者がこの中での使用から理解するように、「血管」の用語は、全血管系を称し、すなわち、その用語は心臓を含み、さらに「血管の健康状態」の用語は、心血管の健康状態および／または冠動脈の健康状態を含む。「血管の健康状態を増進させる」は、この中に記載の有益な健康的効果を達成することを称する。
【００１４】
カカオポリフェノールは、天然由来のもの、すなわちカカオ豆由来のものであっても、あるいは合成によって調製されたものであっても差し支えない。当業者は、可用性およびコストに応じて、天然または合成カカオポリフェノールを選択して差し支えない。カカオポリフェノールは、例えばチョコレート中のチョコレート液のようなカカオポリフェノール含有カカオ原料として組成物中に含まれていて差し支えなく、あるいは例えば抽出物、抽出画分、プールした抽出画分のようなカカオ原料、または合成によって調製された化合物として、カカオ原料とは無関係に添加されても差し支えない。カカオポリフェノールは、エピカテキンおよびカテキンのモノマーおよび／またはオリゴマーであるカカオプロシアニジンを含む。
【００１５】
プロシアニジンモノマーは、(＋)カテキン、(−)エピカテキン、ならびにそれらの対応するエピマー（例えば(−)カテキンおよび(＋)エピカテキン）を含み、以下の構造を有する：
【化１】
0004970690.tif 000002
プロシアニジンオリゴマーは、２から約１８、好ましくは２から約１２、さらに最も好ましくは２から約１０のモノマー単位を有する。例えば、オリゴマーは、ダイマー（二量体）、トリマー（三量体）、テトラマー（四量体）、ペンタマー（五量体）、ヘキサマー（六量体）、ヘプタマー（七量体）、オクタマー（八量体）、ノナマー（九量体）、およびデカマー（十量体）であって差し支えない。オリゴマーでは、モノマーが（４→６）および／または（４→８）のフラバン間結合を介して結合している。もっぱら（４→８）結合のみを有するオリゴマーは直鎖であり；一方、1つ以上の（４→６）結合が存在すると分枝オリゴマーとなる。
【００１６】
カカオ豆、カカオニブ、あるいは例えばチョコレート液、部分脱脂カカオ固形物および／または完全脱脂カカオ固形物からの抽出によって、カカオポリフェノールを調製することができる。好ましくは、完全または部分脱脂カカオ粉末から抽出物を調製する。テオブロマ、ヘラニア(Herrania)、またはそれらの種内および種間の交配物の任意の種類の豆を用いて差し支えない。発酵した、発酵途中の、または未発酵の豆から抽出物を調製して差し支えなく、発酵豆が最も少ない量のカカオポリフェノールを有し、未発酵豆が最も多い量のカカオポリフェノールを有する。豆の発酵因子に基づいて豆の選択を行うことができ、例えば、２７５以下の発酵因子を有する豆から抽出が行われる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１５８９３号（ＷＯ９８／０９５３３号として公開）（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）に記載のように、発酵の程度を操作することによって、カカオ原料またはその抽出物中のポリフェノールレベルを最適化することができる。
【００１７】
従来のカカオ加工法（例えば、Industrial Chocolate Manufacture and Use, ed. Beckett, S.T., Blackie Acad. & Professional, New York, 1997例えば1、５および６章に記載）、あるいは米国特許第６,０１５,９１３号(Kealey et al)に記載の改善された加工法（従来の方法に比べて、カカオ原料中のポリフェノールが、その破壊を防止することによって保存される）を用いて加工されたカカオ原料から、カカオポリフェノールを抽出する。改善された加工法は、従来の焙煎工程を省略する。以下の工程によってカカオ原料が得られる：（ａ）カカオニブを焙煎することなくカカオ殻を軟らかくするのにちょうど十分な時間および温度でカカオ豆を加熱する工程；（ｂ）カカオ殻からカカオニブをふるい分ける工程；（ｃ）カカオニブを回転圧搾する工程、および（ｄ）保存レベルのカカオポリフェノールを含有するカカオバターおよび部分脱脂カカオ固形物を回収する工程。本方法は、従来の方法よりも非常に高レベルの高プロシアニジンオリゴマーを保持する。本方法によって作成されたカカオ固形物は、無脂肪固形物１ｇ当り20,000μｇを超える量の全プロシアニジンを含有し；好ましくは25,000μｇ／ｇを超える量、より好ましくは28,000μｇ／ｇを超える量、さらに最も好ましくは30,000μｇ／ｇを超える量の全プロシアニジンを含有する。本願発明の目的において、全プロシアニジン量は実施例３に記載のように特定される。
【００１８】
ポリフェノールを溶解させる溶媒を用いて上記のような供給源からカカオポリフェノールを抽出する。適切な溶媒として、水、あるいは例えばメタノール、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコールおよび酢酸エチルのような有機溶媒が挙げられる。溶媒混合物を用いても差し支えない。溶媒として水を用いる場合、例えば酢酸でわずかに酸性化したものが好ましい。好ましい溶媒は、水と、例えば水性メタノール、エタノールまたはアセトン等の有機溶媒との混合物である。水性有機溶媒は、例えば約５０％から約９５％の有機溶媒を含有する。従って、水中の５０％、６０％、７０％、８０％、および９０％有機溶媒を用いて差し支えない。また、溶媒は、少量（例えば約０．５％から約１．０％の量）の例えば酢酸を含んでいて差し支えない。抽出物の組成、すなわち表示（すなわちオリゴマープロフィール）、およびプロシアニジンオリゴマーの量は、溶媒の選択に依存するであろう。例えば、水抽出物は主にモノマーを含有し、酢酸エチル抽出物はモノマーおよび低オリゴマー（主にダイマーおよびトリマー）を含有し、さらに水性メタノール、エタノールまたは酢酸抽出物はモノマーおよび一連の高オリゴマーを含有する。モノマーならびに高プロシアニジンオリゴマーの抽出に好ましい溶媒の１つは、７０％アセトンである。しかしながら、いずれのポリフェノール含有抽出物も本発明において有用である。カカオフェノール抽出方法は当業界で公知であり、例えば米国特許第５，５５４，６４５号（Romanczyk et al.）および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号（ＷＯ９７／３６４９７として公開）に記載されている。従って、１つの実施形態では、カカオ豆をカカオ粉末に粉砕し、その粉末を脱脂し、カカオポリフェノールを抽出し、さらにその抽出物を精製することによって、カカオ抽出物を調製する。カカオ豆およびパルプを凍結乾燥し、凍結乾燥カカオ豆を脱パルプ化しまたは外皮を剥ぎ、外皮を剥いだカカオ粉末を粉砕することによってカカオ粉末を調製して差し支えない。
【００１９】
例えば、カフェインおよび／またはテオブロミンの除去によって抽出物を精製し、さらにその後、ゲル浸透クロマトグラフィーおよび／または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する。ゲル浸透クロマトグラフィー（例えばセファデックスＬＨ−２０）を用いて、高プロシアニジンオリゴマーに関して抽出物の質を高めた。例えば、選択したオリゴマーがカラムから溶出を始めるまで、モノマーおよび低オリゴマーを含有する溶出物を集めない。そのような抽出の例は当業界で公知であり、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号（ＷＯ９７／３６４９７として公開）（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）の実施例５に記載されている。例えば順相ＨＰＬＣのような予備ＨＰＬＣを用いることによって、例えば５０重量％以上のモノマーまたは特定オリゴマーを含有するモノマー画分およびオリゴマー画分に、抽出物を分画することができる。その画分がモノマーおよび低オリゴマー（テトラマーまで）を含む場合、その画分は約９０から９５重量％の特定オリゴマー画分を含む。分離後、所望の画分をプールし、例えばオリゴマー３−１０または５−１０を含有するように選択したオリゴマーの混合物を得ることができる。本願明細書におけるガイダンスおよび当業界における一般知識（例えば米国特許第５，５５４，６４５号（Romanczyk et al.）および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号（ＷＯ９７／３６４９７として公開）に記載の技術）を鑑みて、当業者はクロマトグラフィー条件を操作して、所望のプロシアニジンプロフィールを達成することができる。
【００２０】
ポリフェノールを含有するカカオ原料を加えることによって、あるいはチョコレート（ミルクチョコレート、スウィートチョコレートおよびセミスウィートチョコレートであって差し支えなく、好ましくはブラックチョコレートおよび低脂肪チョコレートである）を加えることによって、本発明の組成物中にカカオポリフェノールを含めて差し支えない。従来のカカオ加工法を用いてカカオ原料を調製して差し支えないが、好ましくは、米国特許第６，０１５，９１３号(Kealey et al)に記載の方法を用いて調製する。あるいは、カカオポリフェノールレベルを高めるために、２７５以下の発酵因子を有するカカオ豆から調製したチョコレート液およびカカオ固形物を用いる。それら原料は、従来のカカオ加工法（例えば焙煎工程を含む）および完全発酵豆を用いて得られるよりも高いカカオポリフェノール含有量を有する。従来技術を用いて上記の原料から、あるいは国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５４１４号（ＷＯ９９／４５７８８として公開）（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）に記載のように、チョコレート製造においてカカオポリフェノールを保護するために改善された方法を用いて、チョコレートを調製することができる。少なくとも１つの以下の非従来的方法によって調製されたチョコレートは、この中で、「保存量のカカオポリフェノールを有するチョコレート」と称される：（ｉ）発酵途中または未発酵のカカオ豆からカカオ原料を調製する；(ii)カカオ原料製造においてカカオポリフェノールを保護する；および(iii)チョコレート製造工程においてカカオポリフェノールを保護する。
【００２１】
合成プロシアニジンを用いても差し支えなく、それらは、当業界で公知の方法、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１３９２号（ＷＯ９９／１９３１９として公開）（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）の実施例に記載の方法によって調製できる。カカオポリフェノール誘導体も有用である。それらは、没食子酸モノマーおよびオリゴマー、グリコシル化モノマーおよびオリゴマー、ならびにそれらの混合物；例えば硫酸化、グルクロン酸化、およびメチル化形態のようなプロシアニジンモノマーおよびオリゴマーの代謝物；ならびに大腸微小植物代謝または体内哺乳類代謝によるプロシアニジンの酵素切断産物を含む。それら誘導体は、天然由来であっても合成によって調製されたものであっても差し支えない。
【００２２】
本組成物は、コレステロール降下剤をさらに含む。その作用の態様に関わらず任意のコレステロール降下剤を用いて差し支えない。適切な物質は、哺乳類の胆汁におけるコレステロール吸収を減らすことによって、あるいはコレステロール合成を減らすことによって作用する。適切な物質の例として、フィトステロール、フィトスタノール、ならびにそれらの誘導体および異性体；大豆蛋白；例えばカラスムギ、オオバコ、木の実、糠油由来のβ−グルカン等の可溶性繊維（それらの各々は食品、栄養補助食品、食品添加物組成物における使用に特に適している）；が挙げられる。公知のコレステロール低下薬も用いて差し支えないが、それらは食品および食品添加物組成物における使用にはあまり好ましくなく、薬剤において使用される。当業者にとって、コレステロール降下剤の選択が、意図された運搬手段（例えば食品、栄養補助食品、薬剤）ならびに投与形態に依存することは明白である。従って、胆汁におけるコレステロールの吸収を減らす物質は、静脈投与に適さないであろう。同様に、運搬手段が食品である場合には、薬の強い味または臭いを有するコレステロール降下剤は望ましくない。
【００２３】
フィトステロールは水に溶けない植物ステロールであり、コレステロールに類似の分子量および構造を有する。フィトステロールは、それ自体吸収されることなく、胆汁におけるコレステロール吸収（内因性コレステロールおよび食事性コレステロールの両方）、ならびに血清コレステロールレベル（全コレステロールおよびＬＤＬ）を低下させる。４０を超える植物ステロールが同定されているが、β−シトステロール、カンペステロールおよびスチグマステロールが最も豊富にある。有用なステロールの他の例として、ブラシカステロール(brassicasterol)、デスモステロール(demosterol)、カリノステロール(chalinosterol)、ポリフェラステロール(poriferasterol)、クリオナステロール(clionasterol)が挙げられる。個々のステロールまたはステロール混合物、天然供給源から単離したものまたは合成したもの、ならびにそれらの異性体および誘導体を用いることができる。特に有用なものは、スタノールとして知られている、環における全ての炭素−炭素結合が飽和であるステロールの飽和誘導体である。適切なスタノールは２８または２９炭素原子を有し、β−シトスタノール、クリオナスタノール、２２、２３−ジヒドロブラシカスタノール、およびカンペステノールを含む。フィトステロールは、固体形状（例えば粉末、顆粒）であっても液体形状（例えば油）であっても差し支えない。
【００２４】
ステロールおよびスタノールは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２３４４号中の実施例に記載のように、いくつかの植物材料中に見出されている。ステロール／スタノールの例示的供給源は、松の樹皮、大豆油、トール油、タケノコ抽出物（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２５５６号(ＷＯ９８／５７５４５号として公開)に記載）、カカオ殻および脂、ならびに米糠油である。パルプおよび製紙業の副生成物であるトール油は、スタノール、すなわちβ−スタノールの優れた供給源である。
【００２５】
例えば植物性油、植物性油スラッジ(sludge)、植物性油蒸留物のような天然供給源、あるいは例えばトール油のような他の植物油供給源から、比較的簡単で安価な手段によって、植物ステロールを得ることができる。例えば、メタノールのような溶媒を用いることによる植物性油スラッジからのステロールの調製は、米国特許第４,４２０,４２７号(Hamunen)に記載されている。スタノールは、天然では少量でのみ認められているが、当業者に公知のいくつかの任意の方法によって水素化することによってステロールから容易に調製できる。ステロール開始物質が植物材料から調製される場合、それはいくつかの様々なステロールの混合物を含んでおり、従って、水素化の後得られるスタノールも様々なスタノールの混合物であろう。その混合物は本発明における使用に適している。しかしながら、純粋な特定ステロール調製物を同様に水素化して純粋なスタノールを作成することができ、それも利用可能である。
【００２６】
カカオ殻から抽出されたカカオ脂はフィトステロールの優れた供給源である。カカオフィトステロールは、フィトステロールの約９０％までの遊離ステロールを含む遊離および結合ステロールの混合物である。フィトステロールは、カンペステロール、β−シトステロール、スティグマステロール、シクロアルテノイル、２４−メチレンシクロアルテノイル、ならびに少量の他のフィトステロールを含む。結合フィトステロールは、フィトステロールの脂肪酸エステルまたはフェルラ酸誘導体(ferulate derivatives)を含む。また、カカオ脂はトコフェノール（抗酸化特性を有する）およびトコトリエノール（コレステロール降下活性を有する）を含むトコール(tocols)を含有する。以下の工程によってカカオ脂を調製する：(i)カカオ殻を挽く工程；(ii)フィトステロールに関して、挽いたカカオ殻を溶媒で抽出する工程；(iii)溶媒を除去する工程；(iv)カカオ脂を回収する工程。カカオ豆焙煎の副生成物であるカカオ殻は，乾燥発酵カカオ豆、微粉カカオ豆、焙煎カカオ豆、および好ましくは、より高い全ステロール含有量を含む乾燥未発酵豆に由来するものである。好ましいカカオ豆はテオブロマカカオ由来である。好ましい溶媒は石油エーテル、ヘキサン、ペンタン、およびエチルエーテルである。溶媒は減圧蒸留によって回収して差し支えない。１つの実施形態において、凍結乾燥殻をＴＥＫＭＡＲミル(Cincinatti, OH)で微粉末に挽き、次いで、Soxtec装置(Fisher Scientific, Springfield, NJ)において、再蒸留石油エーテル(b.p. 38-39.6℃)を用いて挽いた塊を１晩抽出する。次の朝、窒素流の下、ゆっくり蒸留することによって溶媒を注意深く除去し、得られた抽出物を−４０℃で保存する。さらに、予備ＨＰＬＣまたはカラムクロマトグラフィーによってフィトステロールを精製しても差し支えない。
【００２７】
ステロールおよびスタノールの両方のエステル形態を用いても差し支えない。エステル化は、ステロール／スタノールを脂肪および脂により溶け易くし、そのことは、ある場合には、食品または他の運搬手段にそれらを組み込むのを助ける。例えば、ステロールを脂肪酸エステルとエステル結合させて差し支えない。そのようなエステル化ステロールの例として、酢酸シトステロール、オレイン酸シトステロールおよびオレイン酸スティグマステロールが挙げられる。当業界で公知の方法および例えば米国特許第６，０３１，１１８号(van Amerongen et al.)、米国特許第５，８９２，０６８号(Higgins)、米国特許第５，５０２，０４５号(Mietienen et al.)、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ９９／００６５５号（ＷＯ００／０４８８７として公開）に記載の方法のように、スタノールエステルを調製することができる。１つの実施形態では、米国特許第５，９５８，９１３号(Miettenen et al.)に記載のように、少なくとも１つのステロールを、Ｃ２からＣ２２脂肪酸エステルとエステル結合させることによって有用なスタノールエステルを調製する。当業界で公知の他の方法を用いて、哺乳類に投与した際のステロール／スタノールの安定性を高めることができる。そのような方法の１つは、米国特許第５，９３２，５６２号(Ostlund)に記載されており、そこでは、ステロール／スタノールをレシチンと混合して水溶性の粉末が得られる。
【００２８】
他の材料と混合することによって、粉末形態の組成物にステロール／スタノールを添加しても差し支えない。食品組成物の場合、スタノール／ステロール、ならびに他のコレステロール降下剤を混合工程にタイミング良く添加する。コレステロール降下チョコレートの調製の間に、糖、融けたバター；製粉前のニブ；
または融けたチョコレートを含有する乾燥混合物に、例えばステロール／スタノールを添加しても差し支えないが、あまり好ましくはない。混合を容易にするため、例えば脂肪、植物性油、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、トコフェノールおよびそれらの混合物のような溶媒に、ステロール／スタノールをまず溶解させても差し支えない。ステロール／スタノールの懸濁液およびエマルジョンを作るのに効果的な担体は、水、アルコール、ポリオール、ステロール／スタノールが少なくとも部分的に溶解する食用化合物（例えばチョコレート液）、およびそれらの混合物である。
【００２９】
例えば、大豆蛋白単離物、大豆蛋白濃縮物、加工大豆蛋白、または大豆粉、フレークおよび粗挽き大豆のような、任意の公知の形態で大豆蛋白を組成物に添加して差し支えない。例えば実施例５に記載のように、大豆全体またはその一部を用いても差し支えない。様々な形態の大豆蛋白が当業界で公知であり、かつ市販されている。その特性およびそれを得る方法は、例えば、Soy Protein and Human Nutrition, Wilcke et al., eds., Acad. Press, NY, 1979に記載されている。任意のステロール／スタノールベースのコレステロール降下剤と併用して大豆蛋白を用いて差し支えない。
【００３０】
例えばβ−グルカンのような適切な植物繊維は、血漿コレステロールを低下させることができる。本発明において使用するための繊維は、当業界で公知の方法に基づいて調製し、さらに組成物に添加することができる。それら繊維は、例えば食品および栄養補助食品のような経口輸送組成物に特に適している。任意のステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤と併用して、β−グルカンおよび他の可溶性植物繊維を用いて差し支えない。また、本発明の組成物はＬ−アルギニンを含んでいて差し支えなく、それは、例えば精製化合物、Ｌ−アルギニン含有植物からの抽出物、または種／木の実原料（例えば木の実粉末もしくは全体の種／木の実）の形態等の様々な形態で、本発明の組成物中に提供される。合成のまたは天然の、任意のＬ−アルギニン供給源を用いて差し支えない。好ましいＬ−アルギニン供給源は、大豆および木の実の仁（例えばピーナッツ、クルミ、アーモンド、およびヘーゼルナッツ(hezelnuts)）である。脱脂および部分脱脂した木の実の仁を用いても差し支えない。それらを挽いたものを木の実粉末と称する。
【００３１】
本組成物は、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、あるいはモノまたはポリ不飽和脂肪酸（例えばオメガ−３脂肪酸）を含んでいて差し支えなく、それらは当業界で公知の方法に基づいて得られる。オリーブ油、魚油、または木の実の形態で、モノまたはポリ不飽和脂肪酸を用いて差し支えない。そのような使用に適した木の実の例として、ピーナッツ、アーモンド、およびクルミが挙げられる。
【００３２】
血管緊張低下の誘導；ＣＯＸ活性の阻害；ＬＯＸ活性の阻害；ＬＤＬ酸化の阻害；ＮＯＳ活性の強化；ＮＯレベルの上昇；血小板凝集、単球接着、および血管平滑筋増殖の阻害；血圧の降下；血栓の軽減；および酸化的ストレスの調節；よりなる群から選択される特性の少なくとも１つを有するポリフェノールと、コレステロール降下剤とを含む組成物も本発明の範囲に含まれる。例えばステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤のような任意のコレステロール降下剤を用いて差し支えない。そのような組成物において、ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤は、ポリフェノールの生体利用率を高める。そのようなポリフェノールの例として、フラバノール（例えばカテキン、エピカテキン、およびそれらの没食酸誘導体）、フラボノール（例えば、ケルセチン、ケンプセロール(kaempserol)、ミリセチン、およびそれらのグリコシル化誘導体）、ならびにプロシアニジン（例えばカカオ由来のプロシアニジンダイマー）が挙げられる。
【００３３】
本発明の組成物は、食品、食品添加物、栄養補助食品、または薬剤として有用である。本組成物は、担体、希釈剤、または賦形剤を含んでいて差し支えない。意図された用途に応じて、ヒトまたは家畜での使用、食品、食品添加物、栄養補助食品、または薬剤における使用に適するように、担体、希釈剤、または賦形剤が選択される。
【００３４】
この中で用いられている「食品」は、成長、修復および生活過程を維持し、かつエネルギーを供給するために生物の体内で用いられる、タンパク質、炭水化物および／または脂肪から実質的に成る物質である。食品は、例えばミネラル、ビタミン、および調味料のような補助的物質も含んでいて差し支えない。Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary, 10th Edition, 1993を参照。食品の用語は、ヒトまたは動物が摂取するのに適合させた飲料を含む。この中で用いられている「食品添加物」は、ＦＤＡ(21 C.F.R. 170.3(e)(1))によって定義されており、直接的および間接的添加物を含む。この中で用いられている「薬剤」は医薬である。Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary, 10th Edition, 1993を参照。薬剤は医薬品とも称される。この中で用いられている「栄養補助食品」は、食事を補足することが意図された、以下の食物原料の１つ以上を有するまたは含有する製品（タバコ以外）である：ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、全１日摂取量を増やすことによって食事を補足するために男性に用いられる栄養物質、あるいはそれら原料の濃縮物、代謝物、構成成分、抽出物または配合物。
【００３５】
例えばカカオポリフェノールのようなポリフェノールまたはその誘導体と共に、さらに必要に応じてＬ−アルギニン、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、あるいはモノまたはポリ不飽和脂肪酸（例えばオメガ−３脂肪酸）と共に、コレステロール降下剤によって改良された任意の飲料を含む、任意の従来の食品も本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
カカオポリフェノールの場合、(i)カカオポリフェノールを含有しない食品にカカオポリフェノールまたはその誘導体を添加することによって、あるいは(ii)食品が従来から例えばチョコレートのようなポリフェノールを含有する場合には、従来の食品中に含まれるレベルを越えてポリフェノールレベルを強化することによって、改良を行う。例えば抽出物の形態の追加のカカオポリフェノールを添加することによって；原料を含む別のポリフェノール（例えば木の実の表皮）と共にカカオポリフェノールを添加することによって；食品の製造に用いられるカカオ原料中のカカオポリフェノールを保存するように、上記のようにカカオ原料加工およびカカオ豆選択を操作することによって；あるいは、上記のようにチョコレート製造工程を操作することによって；強化を行うことができる。従って、それら食品（飲料を含む）は、匹敵する従来の食品（飲料を含む）と比較して、「高められたレベルのポリフェノール」（カカオプロシアニジンを含む）。高められたレベルのポリフェノールを有するチョコレートの例は、チョコレート製造業者が、既に市販されている製品に、カカオポリフェノール含有カカオ抽出物を添加した場合に生じる。そのような食品は、「高カカオポリフェノール食品」とも称され、すなわち、それら食品は従来の対応物よりも高レベルのポリフェノールを含有する。
【００３７】
カカオポリフェノール、および少なくとも１つのコレステロール降下剤（例えばステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤）、さらに必要に応じてＬ−アルギニン、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、あるいはモノまたはポリ不飽和脂肪酸（例えばオメガ−３脂肪酸）を含む食品を、ヒトまたは家畜における使用（ペットフードを含む）に適合させて差し支えない。その食品は菓子以外であっても差し支えないが、好ましいコレステロール降下食品は、例えばミルクチョコレート、スウィートチョコレート、およびセミスウィートチョコレート（ブラックチョコレート、低脂肪チョコレート、およびチョコレートでキャンディーを覆ったようなキャンディーを含む）のような、同一性規格(standard of identity)(ＳＯＩ)または非ＳＯＩチョコレートのような菓子類である。他の例として、焼き製品（例えばチョコレートケーキ、焼きスナック、クッキー、ビスケット等）、調味料、グラノーラバー(granola bar)、キャラメル(toffee chew)、食事代用バー(meal replacement bar)、スプレッド(spread)、シロップ、粉末飲料混合物、カカオまたはチョコレート風味飲料、プディング、もち、米混合物(rice mix)、風味の良いソース等が挙げられる。望ましい場合には、食品はチョコレートまたはカカオ風味である。カカオポリフェノールおよびコレステロール降下剤に加えて、Ｌ−アルギニンを含有する食品は、好ましくは、チョコレート、または例えば、木の実（例えばピーナッツ、クルミ、アーモンド、およびヘーゼルナッツ等）を含有するグラノーラバーのようなキャンディーバーである。例えばピーナッツの表皮は約１７％のプロシアニジンを含有し、さらにアーモンドの表皮は約３０％のプロシアニジンを含有するため、この中に記載の食品に、表皮を有する木の実を加えると、全ポリフェノール含有量が高められることに注意すべきである。１つの実施形態では、コレステロール降下剤を含有するチョコレートキャンディーのヌガー(nougat)に、木の実の表皮を添加する。
【００３８】
好ましい実施形態において、コレステロール降下剤を含有する非チョコレート食品は、約５μｇ／ｇ以上から約１０ｍｇ／ｇ（例えば５μｇ／ｇ以上、好ましくは１０μｇ／ｇ以上、より好ましくは１００μｇ／ｇ以上）のカカオプロシアニジンを含有する。望ましい場合には、非チョコレート食品は、以下に記載のチョコレート食品中に含まれるレベルよりもさらに高レベルのカカオプロシアニジンを含んでいて差し支えない。
【００３９】
特に好ましい食品は、コレステロール降下チョコレート菓子であり、最も好ましいのはブラックチョコレートである。ある実施形態では、チョコレートは、その製品中の無脂肪カカオ固形物の全体量に基づいて、チョコレート１ｇ当り、３，６００μｇ以上、好ましくは４，０００μｇ以上、より好ましくは４，５００μｇ以上、さらに好ましくは５，０００μｇ以上、最も好ましくは５，５００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有する。他の実施形態では、チョコレートは、その製品中の無脂肪カカオ固形物の全体量に基づいて、チョコレート１ｇ当り、６，０００μｇ以上、好ましくは６，５００μｇ以上、より好ましくは７，０００μｇ以上、最も好ましくは８，０００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有し、さらにより好ましくは１０，０００μｇ含有する。
【００４０】
コレステロール降下ミルクチョコレート菓子は、そのミルクチョコレート製品中の無脂肪カカオ固形物の全体量に基づいて、チョコレート１ｇ当り、１，０００μｇ以上、好ましくは１，２５０μｇ以上、より好ましくは１，５００μｇ以上、最も好ましくは２，０００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有する。より好ましい実施形態では、ミルクチョコレート菓子は、そのミルクチョコレート製品中の無脂肪カカオ固形物の全体量に基づいて、チョコレート１ｇ当り、２，５００μｇ以上、好ましくは３，０００μｇ以上、より好ましくは４，０００μｇ以上、最も好ましくは５，０００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有する。
【００４１】
食品中のＬ−アルギニンの量は変化して差し支えない。通常、カカオは、１００ｇの部分脱脂カカオ固形物１００ｇ当り、１から１．１ｇのＬ−アルギニンを含有する。それはカカオ１００ｇ当り０．８から１．５ｇの範囲に亘るであろう。本発明のチョコレート食品は、カカオ原料中に天然で生じる量よりも多い量で、Ｌ−アルギニンを含有する。食品中で用いられるカカオ原料およびＬ−アルギニンの量が分かれば、当業者は容易に最終製品中のＬ−アルギニンの全体量を特定できるであろう。食品は、通常、食品１ｇ当り、５μｇ／ｇ以上、好ましくは３０μｇ／ｇ以上あるいは６０μｇ／ｇ以上、さらに好ましくは２００μｇ／ｇ以上でＬ−アルギニンを含むであろう。
【００４２】
食品中のコレステロール降下剤の量は、用いられる薬剤のタイプに依存し、本明細書、特に以下に提供する１日用量、ならびに当業技術に基づいて、当業者はその量を特定することができる。例えば、食品組成物は、４５ｇの１人前分量当り約０．５から約１０ｇ、好ましくは４５ｇの１人前分量当り約１．５から約５ｇ、最も好ましくは、４５ｇの１人前分量当り約２ｇから約４．５ｇのステロール／スタノールを含有する。大豆蛋白、およびカラスムギ由来の可溶性繊維に関して、ＦＤＡは、健康促進効能表示を行うことができる食品１人前当りの最少量を提供している。ＦＤＡによると、β−グルカン含有食品１人前は、０．７５ｇ以上含む必要があり、さらに大豆蛋白含有食品１人前は、６．２５ｇ大豆蛋白を含む必要がある。それらの値は、食品中のコレステロール降下剤の量を特定するためのガイドとしても用いることができる。
【００４３】
好ましい実施形態の１つにおいて、コレステロール降下剤およびカカオポリフェノールの１日効果量を単一の１人前量で提供する。従って、コレステロール降下菓子（例えばチョコレート）は、１人前当り、１．５ｇ以上（例えば１．５−４．５ｇ）のステロール／スタノール、ならびに１人前当り約１００ｍｇ以上（例えば１５０−２００ｍｇ、または２００−４００ｍｇ）のカカオプロシアニジンを含有する。
【００４４】
コレステロール降下剤、および必要に応じてＬ−アルギニンと共に、この中に挙げられた特性を有するポリフェノール（例えばカカオポリフェノールまたはその誘導体）を含む薬剤を、例えば経口、口腔内、経鼻、直腸、静脈内、非経口、および局所等の様々な経路で投与して差し支えない。当業者は、投与形態に応じて、適切なコレステロール降下剤を特定することができる。従って、各投与形態に適合させた剤形も本発明の範囲に含まれ、例えば錠剤、カプセル剤、ゼラチンカプセル剤（ゲルカップ）、バルクまたは単位量の粉末または顆粒、エマルジョン、懸濁液、ペースト、クリーム、ゲル、フォームまたはゼリー等の固形剤形、液体剤形、および半固形剤形が挙げられる。徐放性剤形も本発明の範囲に含まれ、米国特許第５，０２４，８４３号；第５，０９１，１９０号；第５，０８２，６６８号；第４，６１２，００８号；および第４，３２７，７２５号（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）に記載のように調製することができる。適切な薬剤的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤は、当業界で周知であり、当業者は容易にそれらを特定できる。例えば錠剤は、効果量のポリフェノール含有組成物、ならびに例えばソルビトール、ラクトース、セルロースまたはリン酸２カルシウムのような担体を含む。カカオポリフェノール、少なくとも１つのコレステロール降下剤、および必要に応じてＬ−アルギニンを含有する栄養補助食品を、当業界で公知の方法を用いて調製することができ、例えば、リン酸２カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、硝酸カルシウム、ビタミン、およびミネラルのような栄養素を含んでいて差し支えない。
【００４５】
さらに、食品、栄養補助食品または薬剤、ならびに(i)ポリフェノールおよび／またはその誘導体の存在、またはそれらの増強された含有量；および(ii)コレステテロール降下剤の存在；を指示するラベルを含むパッケージも本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
必要に応じて、そのラベルは、Ｌ−アルギニン含有量、ポリフェノール、コレステロール降下剤および必要に応じてＬ−アルギニンを併用することの有益な特性、ならびに使用説明を指示していて差し支えない。この中に用いられる有益な特性とは、血漿コレステロール（全コレステロールおよびＬＤＬ）の降下、ＣＯＸ活性（ＣＯＸ−１活性を含む）の阻害、ＬＯＸ活性の阻害、一酸化窒素産生の増大、アテロゲニック因子(atherogenic factors)（すなわち産生されるエイコサノイドおよびエンドセリン）に対するアテロスタティック因子(atherostatic factors)の比の上昇、さらにＬＤＬ酸化の阻害を含み、それらは、個々でまたは組み合わさって、血管収縮および血小板凝集を減らし、単球接着を阻害し、血管平滑筋の過剰な増殖を阻害し、血栓を減らし、血圧を低下させ、さらに例えば粥状動脈硬化症および心血管疾患のような血管および心血管の疾患に関連する危険性を減らす。
【００４７】
(i) 血管緊張低下の誘導；ＣＯＸ活性の阻害；ＬＯＸ活性の阻害；ＬＤＬ酸化の阻害；ＮＯＳ活性の強化；ＮＯレベルの上昇；血小板凝集、単球接着、および血管平滑筋増殖の阻害；血圧の降下；血栓の軽減；および酸化的ストレスの調節；よりなる群から選択される特性の少なくとも１つを有するポリフェノールと、コレステロール降下剤（例えばステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤）とを含む組成物；ならびに(ii) 血管の健康状態（心血管の健康状態の用語を用いても差し支えない）を増進させおよび／または心疾患の危険性を減らすための組成物のラベルおよび／または使用説明書；を含むパッケージも本発明の範囲に含まれる。ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤が用いられる場合、ラベルおよび／または使用説明書は、その組成物がポリフェノールの吸収を増進または増強することを述べて差し支えない。ラベルおよび／または使用説明書は、上述した他の有益な特性も指示して差し支えない。それらの有益な特性とは、血漿コレステロール（全コレステロールおよびＬＤＬ）の降下、ＣＯＸ活性の阻害、ＬＯＸ活性の阻害、一酸化窒素産生の増大、アテロゲニック因子（すなわち産生されるエイコサノイドおよびエンドセリン）に対するアテロスタティック因子の比の上昇、ならびにＬＤＬ酸化の阻害を含み、それらは、個々でまたは組み合わさって、血管収縮および血小板凝集を減らし、単球接着を阻害し、血管平滑筋の過剰な増殖を阻害し、血栓を減らし、血圧を低下させ、さらに例えば粥状動脈硬化症および心血管疾患のような血管および心血管の疾患に関連する危険性を減らす。
【００４８】
ＣＯＸ活性、ＬＯＸ活性、ＮＯ産生、ＮＯＳ活性、ＬＤＬの酸化、ならびに血漿の全コレステロールおよびＬＤＬコレステロールの上昇に関連し、またはそれらによって調節される疾患および／または症状を治療および／または予防する方法も本発明の範囲に含まれる。この中で用いられている「治療」は、疾患の病状またはそれに関連する症状に影響を及ぼすことによって、例えば高血圧または粥状動脈硬化症のような現在の病状を改善することを意味する。「予防する」の用語は、疾患の兆候を減らすことを含む、疾患を発症することに関連する危険性を減らすことを意味する。予防は、疾患を発症する危険性が高いことが分かっている個体、あるいは例えば血管の健康状態を維持する等、良好な健康状態を維持するために広い個体群において用いられるであろう。本方法は、ヒト、または例えばイヌ、ネコ、ウマ等の家畜動物において用いることができる。
【００４９】
ＣＯＸ活性、ＬＯＸ活性、ＮＯ産生、ＮＯＳ活性、ＬＤＬの酸化および／または高コレステロールに関連し、またはそれらによって調節される疾患および／または症状として、粥状動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）、脳血管疾患、心臓発作、脳梗塞、抹消血管疾患、および腎不全が挙げられる。また、高コレステロール血症（軽い高コレステロール血症も含む）を治療または予防し、血管緊張低下を誘導し、ＣＯＸ（ＣＯＸ１を含む）およびＬＯＸ活性を阻害し、ＬＤＬの酸化を阻害し、ＮＯＳ活性を強化し、ＮＯレベルを高め、血小板凝集、単球接着、および血管平滑筋増殖を阻害し、血圧を降下させ、血栓を減らし、さらに酸化的ストレスを調節する方法も含まれる。
【００５０】
本方法は、コレステロール降下に加えて、１つ以上の上記の有益な効果を達成するのに効果的な量の、例えばカカオポリフェノールのようなポリフェノールおよびコレステロール降下剤、さらに必要に応じてＬ−アルギニンを含む組成物を、哺乳類、好ましくはヒトまたは家畜動物に投与することを含む。本方法は、例えば血漿コレステロールレベルを特定することによって、治療の効果を特定することをさらに含んでいて差し支えない。
【００５１】
予防目的で健康な哺乳類に、あるいは治療を必要とするまたは１つ以上の関連する危険因子を有する哺乳類に、本組成物を投与して差し支えない。高いコレステロールレベルの家族性の病歴を有する任意の個体、更年期あたりまたは更年期後の女性、心筋の虚血後の障害を有する閉経後の女性、外科的にまたは化学的に誘発されたエストロゲン欠乏の女性、高血糖、糖尿病、高血圧、および肥満症を有する老人、ならびに紙巻タバコ喫煙者は、全てこの中に記載の治療を必要とする感受性のある個体である。血管の健康状態の問題を発症しやすい他の哺乳類の集団も当業者に明白であろう。
【００５２】
本方法は、レステノシス(restenosis)を治療または予防するのに特に有用である。米国で毎年約３３０，０００人もの患者が、正常な血流を回復するために、アテローム斑によって塞がれた例えば冠動脈のような血管を開通させるように設計された方法である、冠動脈および／または抹消血管形成術を受ける（Marx, 265 Science 320, 1994）。しかしながら、それら患者のほぼ３３％はレステノシスを発症し、すなわち処置された動脈が直ぐに再び塞がる。それら患者は、症状が全く良くならず、しばしば血管形成術前の症状よりも悪化する。血管壁における平滑筋細胞（ＳＭＣｓ）の過剰な増殖がレステノシスに寄与する。従って、カカオポリフェノールおよびコレステロール降下剤（さらに必要に応じてＬ−アルギニン）を含有する組成物を、血管形成術の前、あるいは熟練した医師が定めるようにその後直ぐに投与して差し支えない。
【００５３】
例えばイヌ、ネコ、およびウマのような家畜動物に上記の組成物を投与して、心不全、心臓弁膜症、および慢性腎不全を治療または予防することができる。例えば、本発明の組成物をイヌに投与して、以下の症状に対処できる：慢性心臓弁膜症（心内膜症または房室弁の粘液腫性変性）、拡張型心筋症、心膜疾患、心内膜炎、突発性不整脈、および糸状虫疾患。
【００５４】
ヒトまたは家畜動物（例えばペット）の血液へのポリフェノールの吸収を増強させる方法も提供する。本質的に、ヒトまたは動物の健康に有益であるポリフェノールの生体利用率を高める本方法は、ヒトまたは家畜動物に、以下の(i)および(ii)を併用して投与することを含む：
(i)血管緊張低下の誘導；ＣＯＸ活性の阻害；ＬＯＸ活性の阻害；ＬＤＬ酸化の阻害；ＮＯＳ活性の強化；ＮＯレベルの上昇；血小板凝集、単球接着、および血管平滑筋増殖の阻害；血圧の降下；血栓の軽減；および酸化的ストレスの調節；よりなる群から選択される特性の少なくとも１つを有するポリフェノール；
(ii)ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤。
ポリフェノールは、例えばフラバノールまたはフラボノール等であって差し支えなく、それらの例は上記で挙げられている。
【００５５】
本方法は、同じ組成物中の成分として、あるいは別々に、ポリフェノールおよびステロール／スタノールを投与することによって実施できる。
【００５６】
効果量は、この中に記載のガイダンスおよび当業界の一般知識を用いて等業者が特定できる。例えば、ステロール／スタノールを用いてコレステロール降下効果を得るためには、非菜食主義者の平均的食事に一般的に含まれる量よりも多い量を投与すべきである。一般的な北アメリカの食事に基づく人は、約２００−４００ｍｇ／日の量で摂取する。従って、例えばシトステロールのようなフィトステロールを用いてコレステロールレベルを下げる場合、約１ｇ／日以上、好ましくは約３ｇ／日以上を投与すべきである。好ましくは、約１ｇ／日以上、より好ましくは約４．５ｇ／日以上から、約２０ｇ／日までの量を用いる。しかしながら、その量は、フィトステロールのコレステロール降下効力によって変化し、例えばより強力なシトスタノールが用いられる場合、効果量は約１から３ｇ／日程度になるであろう。その量は、Roger et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 70(30) 1993およびCarpenter, et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 71(8) 1994に記載の解析方法を用いて特定される。例えば、約２５ｇ／日以上の量で大豆蛋白を投与する。さらに、Recommended Daily Allowances, 9th ed., National Res. Council/national Acad. sci., Washington, D.C.にガイダンスを見つけることができる。例えば３ｇ／日以上の量で可溶性繊維を投与する。カカオポリフェノールは、約５０ｍｇ／日から約１０００ｍｇ／日、好ましくは約１００−１５０ｍｇ／日から約９００ｍｇ／日、さらにもっとも好ましくは約３００ｍｇ／日から約５００ｍｇ／日で投与する。しかしながら、ポリフェノールが食品中に天然に含まれ、さらに非毒性である場合には、上述した量より多くの量を用いて差し支えない。Ｌ−アルギニンは、約２ｇ／日から約５０ｇ／日、好ましくは約３ｇ／日から約１０ｇ／日、さらにもっとも好ましくは約６ｇ／日から約８ｇ／日で投与する。この場合にも、Ｌ−アルギニンが食品中に天然に含まれる場合には、上述された量よりも多くの量を用いて差し支えない。ポリフェノールは、通常、当業界で公知の量で投与される。効果量を特定する際に、ステロール／スタノールの存在下での増強された吸収も考慮することができる。
【００５７】
必要な回数に関して熟練した医者によって特定されたように、例えば毎日、１ヶ月に１回、２ヵ月に１回、半年に１回、１年に１回といった投薬計画、あるいは他の投薬計画に従って、治療／予防的投与を継続して差し支えない。好ましくは、毎日組成物を投与し、最も好ましくは、哺乳類の体内の効果的な化合物レベルを維持するために、例えば朝と夜というように、１日２回または３回組成物を投与する。最も有益な結果を得るために、少なくとも約３０日から約６０日間組成物を投与する。そのような投薬計画を定期的に繰り返して差し支えない。
【００５８】
以下の非限定的な実施例において本発明をさらに説明する。
【００５９】
実施例
実施例１：リポキシゲナーゼ活性に対するカカオプロシアニジンの効果
米国特許第５，５５４，６４５号（Romanczyk et al.）の実施例１−５および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号（ＷＯ９７／３６４９７号として公開）の実施例５に記載のように、フェノール画分（モノマーからヘキサマー）および抽出物（粗アセトンおよび濃縮されたペンタマー）を調製した。大豆からのＩ−Ｂ型リポキシゲナーゼ、リノール酸（約９９％）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウリン酸）、および対照フェノール（ノルジヒドログアヤレト酸(Nordihydroguaiaretic acid)(NDGA)、(+)−カテキンおよび(-)−エピカテキンは、Sigma Chemicalから購入した。
【００６０】
Grossman ＆ Zakut(Methods Biochem. Anal. 25: 303-329, 1979)に基づいて、乳化剤Ｔｗｅｅｎ２０を用いてリノール酸を可溶化させた。ＰＢＳ（ｐＨ８．６）中にリポキシゲナーゼを５０００Ｕ／ｍＬで溶解させた。カカオフェノールを純水に溶解させ、以下のストック溶液から希釈した。モノマーからヘキサマーを１ｍＭで溶解させ、抽出物を１ｍｇ／ｍＬで溶解させた（１ｇの粗アセトン抽出物／Ｌ〜３．０ｍＭモノマー、１ｇのペンタマー濃縮抽出物／Ｌ〜３．４ｍＭ）。
【００６１】
以下の式に基づいて、６つの反応キュベット（１つの水が入った対照キュベットと、５つの水に溶かしたフェノールが入った実験キュベット）の各試料セットに関して阻害を計算した：％阻害＝（Δ吸光度（対照）−Δ吸光度（実験）／Δ吸光度（対照））ｘ１００。反応混合物は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）±水中の試験フェノール中に、溶解したリノール酸（１００μＭ）を含有する。最終濃度１００Ｕ／ｍＬまでリポキシゲナーゼを添加することによって反応を開始させた。リノール酸のヒドロペルオキシド形成の共役ジエン測定を、ベックマンＤＵ−６００ＵＶ分光光度計（３７℃、２３７ｎｍでの吸光度）で、５または１０分間に亘り、動的スキャンを記録することによって行った。
【００６２】
カカオ成分の高いＵＶ吸光度は、実際の濃度でのＩＣ５０の測定を不可能にした。その理由で、試験物質によってリポキシゲナーゼ活性の５０％阻害が達成される濃度まで、対数回帰曲線（フェノール濃度の対数に対する％阻害）を外挿することによってＩＣ５０を計算した。外挿ＩＣ５０値は、カカオポリフェノール抽出物のリポキシゲナーゼ阻害活性の概算をもたらす。ＮＤＧＡは、大豆および哺乳類のリポキシゲナーゼの確立された阻害剤である（Kemal et al., Biochemistry 26: 7064-7072, 1987）。それは、脂肪および油における抗酸化剤として市販されている。２ｘ１０−６ＭのＩＣ５０値は他の試験フェノールでは達成されないため、ＮＤＧＡは陽性対照として働く。(＋)−カテキンおよび(-)−エピカテキンは構造的にカカオポリフェノールに類似していると想定されている。
【００６３】
フェノールをモルベースで比較した。(＋)−カテキンによるリポキシゲナーゼ阻害（３ｘ１０−３Ｍ）は、(−)−エピカテキンによるリポキシゲナーゼ阻害（３ｘ１０−１Ｍ）よりも２桁強く、＋カカオモノマー（５ｘ１０−３Ｍ）、ダイマー（２ｘ１０−３Ｍ）、およびトリマー（２ｘ１０−３Ｍ）による阻害に非常に類似する。高オリゴマーによるリポキシゲナーゼ阻害は、モル濃度の対数とあまり相関しない。０．３から２５μＭまでの最終濃度で、テトラマー、ペンタマー、およびヘキサマーは、５−３０％リポキシゲナーゼ活性を阻害した。しかしながら、フェノール濃度と阻害は有意に相関しなかった。粗アセトン抽出物は、モノマーからトリマー画分よりも約３桁弱い、濃度依存的なリポキシゲナーゼ阻害を示した（モノマーベースで、ＩＣ５０＝５μＭ）。ペンタマー濃縮抽出物は、意味のあるレベルでリポキシゲナーゼ活性を阻害しなかった（ＩＣ５０＝５９Ｍ）。
【００６４】
カカオフェノール抽出物の大豆リポキシゲナーゼ阻害活性は、(＋)−カテキンの阻害活性に類似していた。モルベースで比較した場合、モノマーからトリマーまでの活性にほとんど差は無く、酵素の立体阻害を示唆する。テトラマーからヘキサマー成分は著しく低いリポキシゲナーゼ阻害活性を示し、さらにペンタマー濃縮抽出物は、より多くのモノマーからトリマーまでのオリゴマー画分を含有する粗抽出物よりも阻害が少ないため、阻害は低分子量成分（モノマーからトリマー）に特異的であろう。従って、補欠分子の鉄イオンをキレート化することによって、あるいは、酸化反応において、フェノールの水酸基を介してフリーラジカル（フリーラジカル中間体を含む）を除去することによって、カカオポリフェノールは大豆リポキシゲナーゼを阻害する。より大きなオリゴマー（テトラマーからヘキサマー）は立体的に妨げられ、従って酵素の触媒部位を読み取ることができない。
【００６５】
実施例２：プロスタノイドおよび全エンドセリン（ＥＴ）の基底内皮細胞による遊離に対する、カカオプロシアニジン抽出物およびカカオプロシアニジンオリゴマー画分の効果
ウシおよびヒトの培養内皮細胞における、プロスタノイドであるプロスタサイクリン、プロスタグランジン（ＰＧＥ２）およびトロンボキサン、ならびに全エンドセリンの遊離に対する、カカオポリフェノール抽出物由来の精製プロシアニジンモノマーおよびペンタマーの効果について調べた。
【００６６】
インドメタシンはCayman(Ann Arbor, MI USA)から購入した。米国特許第５，５５４，６４５号（１９９６年９月１０日に発行）の実施例１−５に記載されている方法によって、プロシアニジンモノマーおよびペンタマー画分をプロシアニジン豊富なカカオ豆（米国特許第６，０１５，９１３号(２０００年１月１８日発行)に記載の方法に基づいて加工された）から精製した。
【００６７】
Hammerstone らの方法(J. Agric. Food Chem., 47:2:490-496, 1999)によって試料を分析した。分子量の純度を質量分析によって確認した。
【００６８】
Schrammら (J. Nutr. Biochem. 8: 647-651, 1997;J.Agric. and Food. Chem. 46(5): 1900-1905, 1998) によって以前報告されているように、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）およびヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）をイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中において培養した。
【００６９】
２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／Ｌのペニシリン、０．１ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、および０．２５ｐｇ／Ｌのアンフォテリシンを含有するＥＭＥＭと共にＥＣｓ（継代＜１１）を２４穴プレートに蒔いた。処理化合物を含有する（該当する場合には）、フェノールレッドを含まないＥＭＥＭ（２５０ｍｌ）中においてコンフルエント細胞を処理した。プロシアニジン画分（１０、２０、および３０ｐｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに０および２０分間ＥＣｓと共にインキュベートした後、ＥＣｓと共にインキュベートした培地を分析した。下記のような免疫測定法で分析を行うまで、培地を−７０℃で保存した。Bioadjieras et al., Methods in Lab. Invest. 50: 239-246, 1984に記載のように、ＥＣの完全な状態をトリパンブルー排除法によってモニターした。
【００７０】
Westcott et al., Prostaglandins 32:857-873, 1986; Yakota et al., Adv. Prostgl. Thrombox. Leukot. Res. 15:33-34, 1985; Schramm et al., 1997; 1998; 1999に記載されているように、免疫測定法を実施した。培地の全ＥＴ（ＥＴ-1＋ＥＴ−２＋ＥＴ−３）は、Cayman免疫測定法#583151を用いて測定した。プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）代謝物である６−ケトプロスタグラニジンＦ１−αはCayman酵素免疫測定法＃515211を用いて測定し、トロンボキサン（ＴＸＡ２）代謝物であるＴＸＢ２はCayman酵素免疫測定法519031を用いて測定し、さらにＰＧＥ２はCayman免疫測定法＃514016を用いて特定した。
【００７１】
それら確立された測定条件は、質量＜３０００ダルトンを有するワイン画分が、ＥＣプロスタノイド合成に対して、質量＞３０００を有するワイン画分とは異なる効果を誘導することを示すために以前用いられた条件(Schramm et al., J. Agric. and Food. Chem, 46(5): 1900-1905, 1998)を模倣する。基底細胞の機能に対する効果を調べた。細胞の生存性および細胞の形態は何れもカカオプロシアニジン処理によって影響を受けなかった。ＢＡＥＧｓと共に２０分間インキュベートした１ｍＬの対照培地は、７３．５±０．０４４ｎｇのＴＸＢ２、および２９４±６．３ｐｇのＰＧＥ２を含有していた。
【００７２】
図２に示すように、ＢＡＥＣｓと共にインキュベートした培地へのカカオプロシアニジンモノマーまたはペンタマーの添加は、対照培地単独と比較した場合に、培地のプロスタノイドおよびＥＴ濃度を変化させた。プロシアニジンモノマー（Ａ１）またはプロシアニジンペンタマー（Ａ２）のいずれかを含有する培地は、対照培地よりも多くの６−ケト−ＰＧＦ１−αを含有していた。培地のＰＧＥ２は、モノマー画分（Ｂ１）によって用量依存的に減少し、さらに３０μＭでのペンタマー画分（Ｂ２）によって減少した。何れのカカオプロシアニジン画分も培地のＴＸＢ（Ｃ１−２）に対して有意な効果を示さなかった。カカオプロシアニジンのモノマー画分とペンタマー画分は、培地の６−ケト−ＰＧＦ１−αおよびＰＧＥ２に対して類似の効果を有していたが、培地のＥＴに対しては逆の効果を示し、モノマー画分（Ｄ１）は３０μＭで培地中のＥＴ濃度を高めたのに対して、ペンタマー画分（Ｄ２）は用量依存的に培地のＥＴ濃度を低下させた。
【００７３】
図３Ａ−Ｂのデータは、カカオプロシアニジンのモノマーとペンタマーが、ウシ大動脈ＥＣｓ（ＢＡＥＣ）およびヒト大動脈ＥＣｓ（ＨＡＥＣ）に効果を及ぼしている、類似の態様を示す。
【００７４】
上記のデータは、カカオプロシアニジンが、血管を弛緩させ、血小板凝集／血栓形成を減らすエイコサノイドおよびエンドセリン効果、すなわち、プロスタサイクリンの誘導ならびにエンドセリンおよびプロスタグランジンの阻害を誘導することを示す。
【００７５】
実施例３：血小板活性に対する、プロシアニジン−豊富なカカオ飲料の摂取の効果
血小板活性化および初期の止血の調節に対するカカオ飲料の摂取の効果について調べた。
【００７６】
心疾患または止血障害の病歴が無い、喫煙者でない健康な３０名の大人を以下の３つの処置群に分けた：（ａ）カカオ飲料を摂取する１０名の被験者（男性４、女性６、年齢２４−４９歳）；（ｂ）対照としてカフェイン飲料を摂取する１０名の被験者（男性４、女性６、年齢２６−５０歳）；（ｃ）対照として水を摂取する１０名の被験者（男性４、女性６、年齢２４−５０歳）。全ての女性が閉経前であり、エストロゲンを服用していない。参加者は、非ステロイド性抗炎症剤を少なくとも試験前４日間、アルコール飲料を少なくとも試験前２日間、さらにカフェイン−またはテオブロミン−含有食品を少なくとも試験前２４時間、ならびに試験期間中控えるように指示された。
【００７７】
午前８時から１０時の間に、各被験者から血液を採取した。０．５ｍｌの３．２％緩衝クエン酸ナトリウム溶液を含む２本の５ｍｌ真空チューブ(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)に試料を採取した。その後、試験被験者は、１８．７５ｇのプロシアニジン豊富なカカオ粉末（約９６０ｍｇの全プロシアニジン、１７ｍｇのカフェイン、および２８５ｍｇのテオブロミンを供給する）ならびに１２．５ｇのスクロースを蒸留水と混合して含む３００ｍｌの黒っぽい飲料を飲んだ（Adamson, G.E.et al., J.Ag.Food Chem.; 1999; 47(10) 4184-4188を参照）。対照被験者は、１７ｍｇのカフェインおよび１２．５ｇのスクロースを含有する飲料、あるいは純水の何れかを飲んだ。それら飲料を摂取した２および６時間後にさらに血液試料を採取した。１名の女性被験者は、カカオ摂取の６時間後の血液採取を行わなかった。
【００７８】
以下のようにプロシアニジンを定量化した：市販されている（−）−エピカテキン、ならびに以下の方法によって精製状態で得られたダイマーからデカマーを用いて複合標準を作成した：Hammerstone, J.F. et al., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47(10)490-496, Lazarus, S.A.et al., J.Ag. Food Chem.; 1999; 47(9); 3693-3701、Adamson, G.E. et al., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47(10) 4184-4188。励起波長２７６ｎｍおよび発光波長３１６ｎｍでの蛍光検出を利用して、以前挙げられたAdamson引例に記載の順相ＨＰＬＣ法を用いて、それら化合物を使用した標準ストック溶液を分析した。ピークを集め、任意の１つのオリゴマー類内の全ての異性体が含まれるようにその面積を合計し、さらに２次フィット (quadratic fit)を用いて校正曲線を作成した。モノマーおよび小さなオリゴマーはほとんど直線プロットを有しており、それはモノマーおよびダイマーに基づく校正曲線を作成するために直線回帰を事前に行ったものと一致していた。
【００７９】
それら校正曲線を用いて、以下のように調製した試料中のプロシアニジンレベルを計算した：最初に、ヘキサン（各４５ｍＬ）を用いて、カカオまたはチョコレート試料（約８ｇ）を３回脱脂処理した。次に、５ｍＬのアセトン／水／酢酸混合物（７０：２８．５：０．５ ｖ／ｖ）を用いて１ｇの脱脂材料を抽出した。次に、試料のＨＰＬＣデータを、上記のように得られた校正曲線（精製オリゴマーを用いた）と比較することによって、脱脂材料中のプロシアニジンの量を特定した。Association of Official Analytical Chemists(AOAC Official Method 920.177)による標準化方法を用いて、試料（チョコレートに関して１ｇの試料を用い、または液体に関して０．５ｇの試料を用いた）の脂肪の割合（％）を特定した。さらに、元の試料（脂肪を含む）中の全プロシアニジンの量を計算した。カラム間の変動を防ぐため、各試料について実施する前に校正を行った。
【００８０】
採血の１０分内に、ペプチドArg-Gly-Asp-Ser(Sigma, St. Louis, MO)の存在下または不在下、１０μｍ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４、未刺激対照）、２０または１００μＭ ＡＤＰ、あるいは２０μＭエピネフリン(BioData, Horsham, PA)と共に、ポリスチレンチューブ中において全血を室温で５分間インキュベートした。５分後、試料を１ｍｌ ＨＥＰＥＳバッファー中に懸濁させ、１００ｍｌの試料を、飽和濃度（２０μL）の下記の蛍光標識モノクロナール抗体の各々を含むチューブに移した：ＰＡＣ１−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、抗−ＣＤ６２Ｐ−ピコエリスリン（ＰＥ）、および抗ＣＤ４２ａ−ＰｅｒＣＰ。ＰＡＣ１は、フィブリノーゲン結合受容体ＧＰIIｂ−IIIａの活性化形態を認識し、抗ＣＤ６２Ｐは、活性化血小板の表面に存在するＰ−セレクチンを認識する。抗ＣＤ４２ａは、活性化および休止血小板の両方の表面に存在するＧＰ１ｂ−１Ｘを認識する。マウスＩｇＧ、ＦＩＴＣおよびマウスＩｇＧ、ＰＥをアイソタイプ対照として用いた。Arg-Gly-Asp-Serペプチドを用いて血小板に対するＰＡＣ１抗体の結合をブロックし、それによってフローサイトメトリーにおける陰性対象マーカーを設定した。抗体およびアイソタイプ対照はBecton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc., San Jose, CAから購入した。
【００８１】
アゴニストＡＤＰおよびエピネフリンの存在下または不在下において、モノクロナール抗体またはアイソタイプ対照と共に、全血試料を２０分間暗がりにおいて室温でインキュベートした。その後、濾過した１％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．２）中において試料を固定し、暗がりにおいて２−８℃で保存した。４８時間以内に、ＬＹＳＹＳ IIソフトウェアを用いたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで全ての試料を分析した。１、２および１０μｍキャリブレーションビーズ(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc., San Jose, CA and Flow Cytometry Systems, Research Triangle Park, NC)を用いてフローサイトメトリーの性能を確認した。対数コードにおける全ての光散乱および蛍光パラメーターを用いたリストモードにおいて、20,000イベントを収集した。光散乱およびＣＤ４２ａ発現に基づいて血小板を限定した。活性化血小板は、活性化形態のＧＰIIｂ−IIIａまたはＰ−セレクチンを共発現するＣＤ４２ａ陽性イベントの割合（％）と定義した。血小板微粒子は、２μｍ未満のサイズのＣＤ４２ａ陽性イベントの割合（％）と定義した。
【００８２】
使用説明書に基づいて血小板機能分析機（PFA-100（登録商標）Dade Behring International, Miami, Fl.）を用いて、３つの各試験時点において採取した血液試料を４時間以内に分析した（Mammen et al., Sem．Thromb．Hemostas．24：195-202, 1998およびFressinaud et al., Blood 91: 1325-31, 1998を参照）。試験カートリッジ膜中の孔を血液が塞ぐのに必要な時間として定義された閉鎖時間（病）として機能を測定した。
【００８３】
差に関して、ランクに基づくフリードマン累次尺度(Friedman’s repeated measures) ＡＮＯＶＡ(SigmaStat for Windows（登録商標）, SPSS, Richmond, CA)を用いて各処置群または対照群のデータ−を解析した。基線と、摂取の２時間後および６時間後の結果の間の差を特定するために、Dtudent-Newman-Keuls 多重比較法を用いた。Ｐ値が０．０５未満である場合に差が有意と考えられた。
【００８４】
カカオの摂取は、摂取の２および６時間後において、未刺激活性化ＧＰIIｂ／IIIａ発現(P=0.035、図４Ａ)ならびにex vivoエピネフリン誘導活性化ＧＰIIｂ／IIIａ発現（p=0.008、図４Ｂ）を抑制した。摂取の０、２、および６時間後の活性化ＧＰIIｂ／IIIａを発現する血小板の割合（％）の平均は、未刺激でそれぞれ０．９％、０．５％、および０．３％であり、エピネフリン刺激でそれぞれ９．６％、６．８％、および３．３％であった。一方、カフェイン飲料を飲んだ対照群では、エピネフリン刺激活性化ＧＰIIｂ／IIIａ発現が増加した（P=0.048、摂取の０、２、および６時間後において、平均はそれぞれ５．３％、６．５％、および７．５％）。水を飲んだ対照群では全く変化が無かった。
【００８５】
カカオは、摂取の２および６時間後において、血小板での２０μＭ ＡＤＰ誘導活性化ＧＰIIｂ／IIIａ発現を減少させた（P<0.001、図４Ｃ、摂取の０、２、および６時間後において、平均はそれぞれ５８．５％、４４．２％、および３８．８％）。その傾向は、１００ｐｍ ＡＤＰによって活性化が誘導される場合に、カカオ摂取後において血小板での活性化ＧＰIIｂ／IIIａ発現が減少することを示唆する（P=0.067、摂取の０、２、および６時間後において、平均はそれぞれ７６．５％、６８．７％、および５７．６％）。カフェイン飲料および水を摂取した対照群では、ＡＤＰ誘導活性化ＧＰIIｂ／IIIａ発現に全く変化は無かった。
【００８６】
カカオ摂取後に、Ｐ−セレクチン発現が減少する有意でない傾向が認められた（P=0.053、図５Ａ）。カカオ摂取は、摂取の２および６時間後において、２０μＭ ＡＤＰ誘導Ｐ−セレクチン発現を減少させ（P=0007、図５Ｃ）、摂取の０、２、および６時間後において、１００μＭ ＡＤＰ誘導Ｐ−セレクチン発現はそれぞれ５６．１％、５４．７％、および４１．７％であった。
【００８７】
カフェイン含有飲料または水を摂取した対照群では、血小板刺激または阻害の証拠は全く無かった。
【００８８】
カカオ飲料の摂取後におけるフローサイトメトリーで検出された血小板微粒子の数は、２時間後に基線より減少し、６時間後にさらに減少した（表１参照）。一方、血小板微粒子の数は、水の摂取の２および６時間後、ならびにカフェイン含有飲料の摂取の６時間後に増加した。血小板微粒子は止血活性を有し、生理的血小板活性化の間に形成されるリン脂質豊富な微小小胞である。
【００８９】
【表１】
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カカオ飲料の摂取６時間後、コラーゲン−エピネフリン誘導閉鎖時間は延びた（表２を参照）。このことは、カカオ摂取によって血小板関連初期止血が遅延することを示唆する。コラーゲン−ＡＤＰ誘導後の閉鎖時間が延びる傾向が観察された（P=0.097）；カフェイン対照群では閉鎖時間は変化しなかった。
【００９０】
【表２】
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結果は、チョコレート飲料の摂取が、ヒトにおける血小板機能を変化させることを示した。第1に、in vitroでの弱いアゴニストに応答した血小板活性化マーカー発現によって測定した血小板活性化が、カカオ摂取後に低下した。第２に、カカオ摂取後、血小板微粒子形成が減少した。第３に、カカオ摂取は、血小板関連初期止血によって測定した血小板機能に対して、アスピリン様効果を生じさせた。カフェイン飲料対照が、エピネフリン誘導活性化ＧＰIIｂ−IIIａ発現および微粒子形成の増加を生じさせたという事実は、カカオ飲料中に存在するカカオプロシアニジンが血小板の活性化および機能の阻害を担うことを意味する。
【００９１】
実施例４：コレステロールによる血管内皮依存性弛緩（ＥＤＲ）の阻害に対する、カカオの経口摂取の効果
フラボノイドを含有するいくつかの植物は、ウサギの大動脈においてin vitroでＥＤＲを誘導することが分かっている。ＥＤＲに対する、長期に亘るカカオの経口投与の効果、ならびにコレステロール供給によって生じるＥＤＲの喪失に対するその防御活性について検討した。ニュージーランドホワイトウサギに以下の４種類の食事を７週間与えた：（１）食事；（２）食事＋２００ｍｇカカオ／日；（３）２％コレステロールを３週間、その後食事を４週間；（４）２％コレステロールを３週間、その後食事＋２００ｍｇカカオ／日を４週間。臓器浴(organ bath)中に懸濁させた大動脈環でＥＤＲを測定した。ノルエピネフリン（ＮＥ）（１０−５Ｍ）で環を予備収縮させた。アセチルコリン（Ａｃｈ）およびカカオペンタマー抽出物（１０−７−１０−５Ｍ）に対するＥＤＲを、ＮＥに対する％弛緩として測定した。
【００９２】
【表３】
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実施例５：カカオプロシアニジン、フィトステロール、およびそれらの組み合わせの経口摂取の効果
本実験の結果は、（１）酸化的ストレスおよび損傷の指標に対する、および（２）コレステロールレベルに対する、トール油から利用可能な非エステル化フィトステロールおよびフィトスタノール（「フィトステロール」）と、約７０ｍｇ／ｇの全カカオプロシアニジンを含有するカカオ粉末（ＣＰｄ）との組み合わせの供給の効果、ならびにフィトステロールとカカオプロシアニジンの併用投与の相乗効果を示す。
【００９３】
精製卵殻食(purified egg shell diet)にフィトステロール（２ｗｔ％）および／またはＣＰｄ（０、０．５、１、２ｗｔ％）を補足し、２週間オスラットの給餌に用いた。そのラットを８つの群（各群３匹のラット）に分け、以下に従って対照食および試験食を２０−２５ｇ／日与えた：
【表４】
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自由に水を供給し、残り物／食事カップの底に集められたこぼれた食事を量ることによって消費量を特定した。食事摂取量を毎日測り、さらにラット体重を１日おきに測定した。
【００９４】
酸化的損傷／ストレスのパラメーター、コレステロールレベル、および血漿へのエピカテキン吸収を測定した。
【００９５】
Yagi(Biochem Med 15: 212-6, 1976)に記載の方法を改変させた方法を用いて血漿ＴＢＡＲＳを測定した。１００μＬの全血を１ｍＬの生理食塩水に加えて、１７００ｇで１５分間遠心分離した。上清を回収し、分析するまで−７０℃で凍結した。リンタングステン酸／硫酸系を用いて脂質を沈殿させて、脂質を単離した。脂質画分をチオバルビツール酸と反応させ、標準として1,1’,3,3’−テトラエトキシプロパンを用いて、得られた付加生成物を蛍光的に測定した。結果は、血漿１ｍＬ当りのＭＤＡ（ナノモル）として、および血漿ポリ不飽和脂肪酸の濃度関数として表された。
【００９６】
８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８ＯＨ２’ｄＧ）を以下のように測定した。WAKO DNA Extractor WBキット(Wako Chemical USA, Inc., Richmond, VA)を用いて核ＤＮＡを単離した。キット溶解バッファー中において組織（１００−２５０ｍｇ）または細胞（１０６細胞）をホモジナイズし、さらに４℃において１０,０００ｇで２０秒間遠心分離した。ペレットを溶解バッファーで処理し、得られたペレットをキット酵素反応溶液に溶解させた。ＲＮａｓｅを最終濃度２０μｇ／ｍｌまで添加し、さらに５０℃で１０分間試料をインキュベートした。キットプロテイナーゼ溶液を添加し、５０℃でのインキュベーションをさらに１時間継続した。室温において１０，０００ｇで５分間試料を遠心分離し、キットＮａＩ溶液およびイソプロパノールで上清を処理して、ＤＮＡを精製した。室温において１０，０００ｇで１０分間遠心分離して沈殿を回収し、さらにキット溶液ＡおよびＢで洗浄した。最終ペレットを簡単に空気乾燥させ、さらに０．１ｍＭデスフェリル／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）２００μｌ中に再懸濁させた。Shigenagaらの方法(Methods Enzymol 234: 16-33, 1994)に基づいて、ＤＮＡ消化および分析を実施した。簡単に説明すると、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌでヌクレアーゼＰ１と共に６５℃で１５分間インキュベートすることによって、ＤＮＡをヌクレオチド５’−モノリン酸に消化した。１Ｍ Tris-HCl（ｐＨ８．５）でｐＨを調整し、仔牛の腸のアルカリホスファターゼを用いて同じ試料をヌクレオチドにさらに消化した（３７℃、１時間）。３Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ５．１）を用いて試料のｐＨを調整し、さらに０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭデスフェリルを添加して、金属媒介酸化を防止した。３０，０００ＭＷカットオフスピンフィルターに試料を通し、ＨＰＬＣ注入バイアルに入れた。人為的な影響を防ぐために、調製の４８時間内に試料を分析した。分析のために、電気化学検出器(ESA, Coulochem II)を備えたHewlett Packard 1100 HPLCに試料を注入した。Supelcosil LC-18-DBカラム(150x4.6mm, ３μｍ粒子サイズ)、および５％メタノールを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）の移動相を用い、定組成で、流速１．０ｍｌ／分において分離を行った。電気化学検出器を用いて４５０ｍＶでＯＨ８ｄＧを検出し、さらにＵＶ検出器を用いて２４８ｎｍで２’−デオキシグアノシン（ｄＧ）を検出した。ＯＨ８ｄＧのレベルを、試料中のｄＧの量に対して表した。
【００９７】
Rein et al., J. of Nutr., 2000, 130 (8S), 2109S-2114Sに記載のように、エピカテキン吸収を測定した。
【００９８】
結果
結果は、フィトステロールとポリフェノールの併用投与の予想外の利益を確立した。
【００９９】
図６を参照すると、吸収されたエピカテキンの量は用量依存的に増加した。驚くべきことに、フィトステロールの投与はエピカテキンの吸収を増強させ、例えば２ｗｔ％ＣＰｄ食において、フィトステロールを含まない対応食と比較して、エピカテキン血漿レベルが約３０％高められた。従って、フィトステロールはエピカテキンの生体利用率を増大させた。
【０１００】
図７を参照すると、ＣＰｄは用量依存的にＤＮＡに対する酸化的損傷を阻害した。驚くべきことに、高用量のＣＰｄ（２ｗｔ％）で、ＤＮＡに対する酸化的損傷の予想外の減少が観察され、ＤＮＡに対する酸化的損傷の予防におけるフィトステロールとＣＰｄとの相乗効果を示唆する。
【０１０１】
図８を参照すると、フィトステロール含有食を与えると、驚くべきことに、対照食よりも高い酸化的ストレスを生じさせ、すなわち、本出願の出願日前の当業界で推奨されていた食事と共にフィトステロールを摂取することは、酸化的ストレスを悪化させた。カカオプロシアニジンを与えると、フィトステロールのそのようなネガティブ効果を逆転させまたは鈍くさせた。
【０１０２】
全血漿コレステロールも測定し、以下の表３にその結果を示す。
【０１０３】
【表５】
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表３を参照すると、予想通り、フィトステロールはコレステロールレベルを低下させた。しかしながら、驚くべきことに、フィトステロールをＣＰｄと共に投与した場合、コレステロールレベルは用量依存的にさらに低下した。例えば、フィトステロール含有食を与えられた３匹のラットの平均全コレステロールレベルは８４ｍｇ／ｄｌであった。その食事に２ｗｔ％ＣＰｄを補足すると、結果的に８０ｍｇ／ｄｌまで全コレステロールがさらに低下し、それら２つの化合物の相乗効果を示唆した。対照食を与えられたラットは、８８．３ｍｇ／ｄｌの平均コレステロールレベルを有する。
【０１０４】
実施例６：カカオプロシアニジン含有カカオまたはチョコレートと共にコレステロール降下剤を含む組成物
コレステロール降下剤を含有するブラックチョコレート、キャラメル、およびグラノーラバーを調製した。
【０１０５】
キャラメルは、砂糖とカカオを事前に混合し、それをキャラメルと混ぜ合わせることによって、表４に示す材料から調製された。遊離フィトステロール（粉砕されたものとして）を糖とカカオとの混合物に添加した。
【０１０６】
【表６】
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遊離ステロールを含有するブラックチョコレートは、市販されているブラックチョコレート（マーズから市販されているDOVE Dark）を用いて調製された。融けたチョコレートとの混合を容易にするため、およびチョコレートのきめに対する不都合な影響を避けるため、顆粒形態の植物ステロール／スタノールを、IKAによって製造されているUniversal Muche M20で３０−６０秒間挽き、混合し、さらに粒子径がチョコレートの粒子径に匹敵するようになるまでさらに３０秒間挽いた。ブラックチョコレートを融かし、ゆっくり混合しながらステロールを添加して、ステロール粒子を確実に均一に分布させた。得られた組成を表５に示す。
【０１０７】
【表７】
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コレステロール降下カラスムギ繊維を含有するグラノーラバーは、表６および表７に挙げられた材料から調製された。ヤシ仁油(palm kernel oil)を４５℃で融かすことによってシロップ結合剤を調製し、使える状態になるまでその温度で維持した。コーンシロップ、グリセリン、カカオ粉末、黒砂糖、塩、レクチン、および没食子酸プロピルを混合し、ヤシ仁油を加えた。その混合物を保温した。グラノーラを調製するため、カラスムギまたは大豆パフ(soy puffs)(Sovex Food, Collegedale, TNから市販されている)をチョコレート片と共に混合し、上記のように調製した暖かいシロップ結合剤をその混合物中に軽く混ぜ入れる。その後、グラノーラ混合物を板状にし、１０Ｘ糖（６２％）、カカオ粉末（３３％）、およびシナモン（５％）の混合物をまぶし、さらにいくつかに切り分けた。混合物中において用いられるカカオ粉末は、米国特許第５,０１５,９１３号(Kealeyら)の方法に基づいて調製された。
【０１０８】
【表８】
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【表９】
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【０１０９】
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）の進行に寄与する主要な因子を表し、さらにその疾患の進行の予防にカカオポリフェノールがどのように寄与するかを示すチャートである
【０１１１】
【図２】図２は、ＢＡＥＣＳにおけるプロスタノイドおよびエンドセリンの基底内皮細胞での合成に対する植物化学物質の効果を示す（*＝p<0.05での対照からの有意差）
【０１１２】
【図３】図３は、プロスタサイクリンおよびエンドセリンのＥＣ遊離におけるプロシアニジン誘導変化に対する細胞種の効果を示す
【０１１３】
【図４】図４は、弱いアゴニストでの刺激後および刺激無しでの活性化ＧＰIIｂ-IIIａの血小板表面発現に対する、カカオ飲料摂取の効果を示す
【０１１４】
【図５】図５は、弱いアゴニストでの刺激後および刺激無しでの活性化Ｐ−セレクチンの血小板表面発現に対する、カカオ飲料摂取の効果を示す
【０１１５】
【図６】図６は、血漿へのエピカテキンの吸収に対する、フィトステロール、カカオプロシアニジン、およびそれらの併用の効果を示す
【０１１６】
【図７】図７は、ＤＮＡに対する酸化的損傷への、フィトステロール、カカオプロシアニジン、およびそれらの併用の効果を示す
【０１１７】
【図８】図８は、脂質に対する酸化的損傷への、フィトステロール、カカオプロシアニジン、およびそれらの併用の効果を示す
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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