(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋の抗トロンビン−III(ＡＴ−III)またはそのイソ型を含む溶液の調製方法であって、強力な酸性陽イオン交換基が直鎖状ポリマー鎖を介しゲルマトリクスに結合している陽イオン交換ゲルの使用を含む当該方法。
【請求項２】
次のステップ
(i)主にＡＴ−IIIおよびヒスチジン−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)を含む溶液を調製すること、
(ii)当該溶液を陽イオン交換ゲルと接触させること、この場合、ＡＴ−IIIは低イオン強度の下、ゲルから溶出することができ、一方、ＨＲＧＰは低イオン強度の下、ゲルに結合する条件の下、強力な酸性陽イオン交換基が直鎖状ポリマー鎖を介しゲルマトリクスに結合しており、そして
(iii)低イオン強度条件下、溶出し、タンパク質画分を回収し、それにより、実質的に純粋のＡＴ−IIIを含む溶液を得ること、
を含む、実質的に純粋の抗トロンビン−III(ＡＴ−III)を含む溶液の調製のための請求項１の方法。
【請求項３】
陽イオン交換ステップをカラムクロマトグラフィーにより行う、請求項２の方法。
【請求項４】
ステップ(iii)が、低イオン強度条件下、ゲルから溶出する初期の２つの主要なタンパク質画分であるタンパク質画分を回収すること、それにより主にＡＴ−IIIαを含むタンパク質溶液を得ることを含む、請求項３の方法。
【請求項５】
ステップ(iii)が、低イオン強度条件下、ゲルから溶出する後期の２つの主要なタンパク質画分であるタンパク質画分を回収すること、それにより主にＡＴ−IIIβを含むタンパク質溶液を得ることを含む、請求項３の方法。
【請求項６】
ＡＴ−IIIが、室温において導電率０．１から６ｍＳ／ｃｍである緩衝液により陽イオン交換ゲルから溶出する、請求項２の方法。
【請求項７】
陽イオン交換ステップを、６．５から８のｐＨにおいて行う、請求項２の方法。
【請求項８】
ＡＴ−IIIおよびＨＲＧＰを主に含む当該溶液を、次のステップ：
(i)ヒト血漿からCohn FractionＩ上清を調製すること、
(ii)当該Cohn FractionＩ上清を、ＡＴ−IIIおよびＨＲＧＰを結合することができるアフィニティーゲルと接触させること；および
(iii)当該アフィニティーマトリクスに結合するタンパク質画分を溶出および回収すること、
を含む方法により調製する、請求項２の方法。
【請求項９】
当該アフィニティーゲルが、アフィニティーリガンドとしてヘパリンを含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
中または高イオン強度条件下、溶出し、請求項２に定義のステップ(ii)の間に陽イオン交換ゲルに結合するタンパク質画分を回収することを含む実質的に純粋のヒスチジン−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)を含む溶液の調製方法。
【請求項１１】
ＨＲＧＰが、室温において導電率１０から４５０ｍＳ／ｃｍである緩衝液により陽イオン交換ゲルから溶出する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
次のステップ
(i)実質的に純粋のＡＴ−IIIを含む溶液を調製すること、
(ii)当該タンパク質溶液を陽イオン交換ゲルと接触させること、この場合、ＡＴ−IIIαは低イオン強度の下、ゲルから溶出することができ、一方、ＡＴ−IIIβは低イオン強度条件下、ゲルに結合する条件の下、強力な酸性陽イオン交換基が直鎖状ポリマー鎖を介しゲルマトリクスに結合しており、そして
(iii)低イオン強度条件下、溶出し、タンパク質画分を回収し、それにより、実質的に純粋のＡＴ−IIIαを含む溶液を得ること、および／または
(iv)中または高イオン強度条件下、溶出し、タンパク質画分を回収し、それにより、ＡＴ−IIIβを含む溶液を得ること、
を含む、純粋のイソ型ＡＴ−IIIを含む溶液の調製方法。
【請求項１３】
実質的に純粋のＡＴ−IIIを含む当該溶液は、請求項１または２に定義する方法により調製する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ＡＴ−IIIαが、室温において導電率０．１から６ｍＳ／ｃｍである緩衝液により陽イオン交換ゲルから溶出する、請求項１２の方法。
【請求項１５】
ＡＴ−IIIβが、室温において導電率４から４５０ｍＳ／ｃｍである緩衝液により陽イオン交換ゲルから溶出する、請求項１２の方法。
【請求項１６】
陽イオン交換ステップを６．５から７．２５のｐＨで行う、請求項１２の方法。
【請求項１７】
次のステップ
(i)ＡＴ−IIIβを含む溶液を、請求項５および／または請求項１２により、調製すること、
(ii)当該溶液を陽イオン交換ゲルと接触させること、この場合、ＡＴ−IIIαは低または中イオン強度の下、ゲルから溶出することができ、一方、ＡＴ−IIIβは低または中イオン強度の下、ゲルに結合する条件の下、強力な酸性陽イオン交換基が直鎖状ポリマー鎖を介しゲルマトリクスに結合しており、そして
(iii)低または中イオン強度条件下、タンパク質画分を溶出し、
(iv)高イオン強度条件下、溶出し、タンパク質画分を回収し、それにより、ＡＴ−IIIβを含む溶液を得ること、
を含む、実質的に純粋のＡＴ−IIIβを含む溶液の調製方法。
【請求項１８】
ＡＴ−IIIβが、室温において導電率１０から４５０ｍＳ／ｃｍである緩衝液により陽イオン交換ゲルから溶出する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
陽イオン交換ステップを６．７５から７．２５のｐＨで行う、請求項１７の方法。
【請求項２０】
当該強力な酸性陽イオン交換体がその官能基としてスルホン基を有する、請求項１から１９のいずれか１つの方法。
【請求項２１】
当該直鎖状ポリマー鎖が、式
【化１】
0004897177.tif 000009
[式中、ｘは２から１００であり、
Ｒ１は、スルホニルで置換された分枝または非分枝Ｃ１−１０−アルキルである]
の繰り返し単位からなる、請求項２０の方法。
【請求項２２】
当該Ｃ１−１０−アルキルがイソブチルである、請求項２１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、血漿グリコプロテイン抗トロンビン-III(ＡＴ−III)の精製方法に関係する。特に本発明の態様には、抗トロンビンイソ型ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβの分離方法、ならびにヒスチジン−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)からＡＴ−IIIイソ型を分離する方法が含まれる。
【０００２】
背景技術
抗トロンビンIII(ＡＴ−III)は、凝固カスケードにおいてセリンプロテアーゼを阻害する血漿グリコプロテインであり、そのため、血液凝固の制御において主要な役割をする。抗トロンビンIIIは、ファクターＩＸａ、Ｘａ、ＸＩ、ＸIIａ、およびトロンビンのインヒビターである。そのため、ＡＴ−IIIは、凝固カスケードの異なる段階で凝固形成を制御する。血液中のＡＴ−III含有の僅かな減少により、血栓塞栓症の危険性は高くなる。ＡＴ−III濃縮は、獲得性または遺伝性抗トロンビン欠損の患者における血栓塞栓症異常の予防および処置に使用される。更に、ＡＴ−IIIは、多くの他の生物学的応答、例えば、脈管形成および炎症応答に含まれると報告されている。これら機構におけるＡＴ−IIIの機能はまだ完全に理解されていない。
【０００３】
固相結合リガンドとしてヘパリンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによるＡＴ−III精製は、本分野に既知である。Miller-Andersson et al.(Thrombosis Research 5, 439-452, 1974)は、ヒトＡＴ−IIIを精製するヘパリン−セファロースの使用を開示する。イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを含む全手順は、３４％収率である。
【０００４】
ヒト血漿において、抗トロンビンIIIは、アミノ酸組成物では相同ではあるが、炭化水素含有率およびヘパリン結合の挙動が異なる、少なくとも２つの分子実在物として存在する。ＡＴ−IIIβとして名付けられた抗トロンビン変異体は、高イオン強度でヘパリン−セファロースマトリクスに強固に結合する効果により、優勢抗トロンビン種(ＡＴ−IIIαとして名付けられた)から独立してヒト血漿から単離された(Peterson, C.B. & Blackburn, M.N. (1985) J. Biol. Chem. 260, 610-615)。
【０００５】
決定された分子量は、ヒトＡＴ−IIIαおよびヒトＡＴ−IIIβ、それぞれ５９，８００および５６，９００であった。２つの抗トロンビンの分子量の相違により、ＡＴ−IIIα亜種(subspecies)の炭化水素含有率を比較すると、ＡＴ−IIIβのシアル酸、中性糖(neutral sugar)、およびアミノ糖含有率において約２５−３０％の減少が生じた(Peterson & Blackburn, 上記)。ＡＴ−IIIβは、４つのオリゴサッカライド側鎖のうちの１つ、すなわち、アスパラギン１３５の側鎖を欠いていることが示された(Brennan, S.O. et al.,(1987) FEBS Letters 219, 431-436)。ＡＴ−IIIα形成物は、ＡＴ−IIIβよりも陰性電荷である：ＡＴ−IIIαとＡＴ−IIIβでは、ｐＩ：ｓはそれぞれ４．９と５．１であると説明されている(Frebelius, S. et al. (1996) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 16: 1292-1297)。
【０００６】
精製ＡＴ−IIIβが得られることが望ましく、この型は、脈管壁における凝固に特に効果を有する。バルーン創傷(balloon injury)後のウサギの大動脈における再狭窄をＡＴ−IIIβが防止することができることが示された(Swedenborg (1998) Blood Coagulation and Fibrinolysis 9 (suppl. 3): S7-S10)。それゆえ、ＡＴ−IIIβは、大動脈のバルーン拡張(balloon dilatation)を行うとき、再狭窄の防止の、ヒト用の強力な薬物として考えられ得る。
【０００７】
ヒスチジン−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)は、１９７２年に原材料から単離された単一鎖血漿タンパク質である。ＨＲＧＰの正確な生理学的機能はまだ知られていない。ヘパリン、フィブリノーゲンおよびフィブリン、プラスミノーゲンおよび活性化血小板との相互作用のために、ＨＲＧＰは、凝固とフィブリン溶解のモジュレーターであると考えられる(Koide, T. In: Fibrinolysis: Current Prospects. Gaffney, PJ (Ed.), John Libbey & Co., London 1988, p.55-63)。ポリペプチド鎖は、５０７アミノ酸残基からなり、他の血漿タンパク質、例えば、抗トロンビン-IIIとの相同性を有する(Koide, T. et al. (1986) Biochemistry 25, 2220-2225)。
【０００８】
上記のように、体内における２つのＡＴ−IIIイソ型およびＨＲＧＰの完全な改善はまだ完全には理解されていない。従って、インビボおよびインビトロでの研究を促進する、精製型のタンパク質を産生するための効率的な精製方法を提供することが望ましい。
【０００９】
置換クロマトグラフィーの手段による、ヒドロキシアパタイトの使用は、抗トロンビンIIIの精製で開示されている(Freitag & Breier (1995) J. Chromatography A, 691, 101-112)。しかし、別々のイソ型ＡＴ−IIIの精製は、従来、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーでは達成されていない。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１
本発明の方法(実施例１)または比較の方法(実施例２)の間において回収されたタンパク質サンプルの等電点電気泳動。
【００１１】
ゲルＡ
１  濃縮ＵＦ１(実施例１、ステップ２)
２  画分Ａ１(実施例１、ステップ２)
３  画分Ｂ１(実施例１、ステップ２)
４  −
５  画分Ａ２(実施例１、ステップ３)
６  Ａ２とＢ２との間の洗浄画分(実施例１、ステップ３)
７  画分Ｂ２(実施例１、ステップ３)
８  １Ｍ ＮａＣｌでゲルから溶出する物質(実施例１、ステップ３)
【００１２】
ゲルＢ
１  プールした画分Ｂ１およびＢ２(実施例１、ステップ４)
２  低イオン強度で溶出する物質(実施例１、ステップ４)
３  画分Ｂ３(溶出ピークの最初の部分)(実施例１、ステップ４)
４  画分Ｂ３(溶出ピークの最後の部分)(実施例１、ステップ４)
５  画分Ａ２(実施例１、ステップ３)
６  画分Ｂ３(実施例１、ステップ４)
７  画分Ｄ(実施例２)
８  画分Ｅ(実施例２)
【００１３】
図２
(Ａ)本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーによるＡＴ−IIIαの精製(画分Ａ２)；および(Ｂ)既知方法のヘパリン−セファロースクロマトグラフィーによるＡＴ−IIIαの精製(画分Ｄ)から得られたクロマトグラムの比較。
【００１４】
本発明の開示
「触手」陽イオン交換ゲル(陽イオン交換体基が直鎖状ポリマー鎖を介しゲルマトリクスに結合している)が、抗トロンビンイソ型ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβの分離に、ならびに抗トロンビンからのヒスチジン−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)の分離に有利に使用され得ることが驚くべきことに示された。その陽イオン交換ゲルは、例えば、カラムクロマトグラフィーにより、ＡＴ−III、ＡＴ−IIIα、ＡＴ−IIIβおよび／またはＨＲＧＰの精製に通常使用され得る。
【００１５】
従って、第一の態様において、本発明は、実質的に純粋の抗トロンビン−III(ＡＴ−III)またはそのイソ型を含む溶液の調製方法であって、陽イオン交換体基が直鎖状ポリマー鎖を介しゲルマトリクスに結合している陽イオン交換ゲルの使用を含む当該方法を提供する。
【００１６】
好ましい態様では、本発明は、次のステップ
(i)主にＡＴ−IIIおよびヒスチジン−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)を含む溶液を調製すること、
(ii)当該溶液を陽イオン交換ゲルと接触させること、この場合、ＡＴ−IIIは低イオン強度の下、ゲルから溶出することができ、一方、ＨＲＧＰは低イオン強度の下、ゲルに結合する条件の下、陽イオン交換体基が直鎖状ポリマー鎖を介しゲルマトリクスに結合しており、そして
(iii)低イオン強度条件下、溶出し、タンパク質画分を回収し、それにより、実質的に純粋のＡＴ−IIIを含む溶液を得ること、
を含む、実質的に純粋の抗トロンビン−III(ＡＴ−III)を含む溶液の調製方法を提供する。
【００１７】
主にＡＴ−IIIおよびヒスチジン−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)を含む当該溶液は、通常、当分野に既知の方法により調製され得る。適当な方法には、例えば、次のステップ：
(i)既知の方法でヒト血漿からCohn FractionＩ上清を調製すること(例えば、Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68, 459-475参照)、
(ii)当該Cohn FractionＩ上清を、ＡＴ−IIIおよびＨＲＧＰを結合することができるアフィニティーゲルと接触させること(例えば、Koide, T. et al. (1985) J. Biochem. 98, 1191-1200参照)；および
(iii)当該アフィニティーマトリクスに結合するタンパク質画分を溶出および回収すること、
が含まれる。
【００１８】
当該アフィニティーゲルは、アフィニティーリガンドとしてヘパリンを好ましくは含む。適当なアフィニティーゲルには、ヘパリン−セファロース(商標)(Amersham Pharmacia)；HeparinHyperD(Biosepra)、Fractogel TSK AF-Heparin 650 (Merck)、Heparin-Agarose(Sigma)、TSKgel Heparin (Tosohaas)、Heparin-Agarose 6XL (ACL)が含まれる。
【００１９】
当該陽イオン交換ステップは、吸着クロマトグラフィー、好ましくはカラムクロマトグラフィーにより行われる。イオン交換クロマトグラフィーでは、電荷物質は、逆電荷を有するカラム物質で分離される(例えば、Scopes, R.K. Protein Purification, Principles and Practice, Third edition, Springer-Verlag 1993)。交換体カラムのイオン基は、通常、ゲルマトリクスに結合しており、緩衝液中に存在する僅かな(small)濃度の対イオンで補われる。サンプルをカラムに加えるとき、弱く結合する対イオンとの交換が生ずる。
【００２０】
当業者に既知のように、クロマトグラフィーは、タンパク質が多価陰イオンまたは陽イオンであるという事実を用いる。タンパク質のすべての電荷(見かけの電荷)により、塩濃度を低く維持する限り、それらを電荷安定相に結合する。塩勾配は、イオン交換体からタンパク質を溶出する最も一般的な手段である。過度の高塩濃度は、タンパク質表面の電荷のシールディングの要因となり、交換体への有効な結合はもはや起こり得ない。その後、結合タンパク質は、増加する塩勾配により置き換えられるため、電荷で変化するタンパク質を分離し得る。塩の作用は、２つの方法のうちの１つと考えられる。塩は、直接、タンパク質を置き換えることができる；イオンは電荷部位を占め、タンパク質の再結合を妨げる。あるいは、当該システムは、より強力に結合するタンパク質は幾らか時間を要して吸着されなくなる平衡とみなされ得る：非結合タンパク質と吸着剤との間の塩イオンの存在は、その２つの間の引力を弱める。いずれの場合でも、吸着タンパク質は、対イオンにより置き換えられる。タンパク質の溶出は、段階的に塩濃度を高くすることによるか、または直線状または非直線状塩勾配により行われ得る。
【００２１】
上記のように、本発明により使用される陽イオン交換ゲルは、支持体表面に結合され、官能性イオン基を、クロマトグラフィー中にタンパク質との相互作用を最適化する配置とし得るスペーサーまたは「触手」としての役割をする直鎖状ポリマー鎖を含む。その「触手」イオン交換体は、例えば、Mueller, W. (1990) J. Cromatography 510, 133-140; Ditz, R. et al. (1991) Australian J. Biotechnol. 5, 101-102; and Donovan, J. et al. (1991) Am. Biotechnol. Lab. 9, 20-22に記載されている。
【００２２】
適当な「直鎖状ポリマー鎖」には、特に、ＵＳ５,４５３,１８６(Mueller et al.)に開示の分離物質中に含まれるものが含まれる。当該特許は、少なくとも１つの共有結合性ポリマーで被覆した一次または二次脂肪族ヒドロキシル基含有支持体を含む分離物質を開示し、この場合、
(１)共有結合ポリマーは、ヒドロキシル基のα−炭素原子を介してのグラフト重合によって支持体に結合し、そして
(２)当該ポリマーは、式
【化２】
0004897177.tif 000002
[式中、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり、
Ｙは
【化３】
0004897177.tif 000003
または
【化４】
0004897177.tif 000004
であり、
Ｒ'およびＲ''は、各々独立してＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ２およびＲ３は各々独立して
(ａ)Ｃ１−１０−アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ１−１０−アルキル、シクロアルキル、Ｃ１−１０−アルキル−シクロアルキルまたはＣ１−１０−アルキルフェニル、
(ｂ)アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、カルボキシル、またはスルホニルのそれぞれにより、単置換されるかまたは多置換された(ａ)における上記基のうちの１つ、
(ｃ)５−１０Ｃ原子を有する環式または二環式のラジカル、この場合、１つまたはそれ以上のＣＨまたはＣＨ２基が(i)ＮまたはＮＨ、(ii)ＮまたはＮＨおよびＳ、または(iii)ＮまたはＮＨおよびＯで置換され、または
(ｄ)Ｒ２またはＲ３の１つはＨであり、
この場合、Ｒ２およびＲ３は、両方のラジカルのいずれかが酸性または塩基性となるか、またはそのラジカルのうちの１つが中性となり、１つが酸性または塩基性となるように、互いに配位結合させ、
ｘは２から１００であり、
およびＲ４はそれぞれカルボキシルまたはスルホニルで単置換されるかまたは多置換されたＣ１−１０−アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ１−１０−アルキル、シクロアルキルまたはＣ１−１０−アルキル−シクロアルキル、またはＣ１−１０−シクロフェニルである。]
の同一または異なる繰り返し単位を含む。
【００２３】
本発明の目的のため、特に好ましい分離物質は、ＵＳ５,４５３,１８６に記載されたものが含まれ、この場合、Ｒ'およびＲ''はＨであり、Ｒ１はＨであり、そしてＹは
【化５】
0004897177.tif 000005
[式中、Ｒ２はＨであり、Ｒ３は官能基、例えばスルホニルで置換されたＣ１−１０−アルキル、例えばイソブチルである。]
である。従って、当該直鎖状ポリマー鎖は、好ましくは、式
【化６】
0004897177.tif 000006
[式中、ｘは２から１００であり、およびＲ１は分枝または非分枝Ｃ１−１０−アルキル、例えばイソブチルであり、当該アルキルはスルホニルのような強力な酸性イオン交換基で置換されている。]
の繰り返し単位からなる。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様では、当該陽イオン交換体は、官能基として例えばスルホン基を有する、強力な酸性陽イオン交換体である。他の可能な官能基には、カルボキシメチル(ＣＭ)を含む。好ましい陽イオン交換ゲルは、Fractogel(商標)EMD SO3-650(M)(Merck, Darmstadt, Germany)であり、この場合、官能性スルホン基は、スルホイソブチルアクリルアミド単位を含む疎水性「触手」スペーサーアームを介しゲルマトリクスに結合する。ポリマー鎖の媒体の長さは、１５から５０モノマー単位であり、同数の側鎖リガンドを有する。
【００２５】
以下の実施例１、ステップ２に示すように、ＡＴ−IIIは、通常、ＨＲＧＰから分離され得、そのため、上記定義の方法により精製され得る。更なる態様では、この方法は、ＡＴ−IIIイソ型ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβの分離および精製を含む。ＡＴ−IIIαを主に含むタンパク質溶液は、低イオン強度条件下、ゲルから溶出する初期の２つの主要なタンパク質画分であるタンパク質画分を回収することにより得られ得る。ＡＴ−IIIβを主に含むタンパク質溶液は、低イオン強度条件下、ゲルから溶出する後期の２つの主要なタンパク質画分であるタンパク質画分を回収することにより得られ得る。以下の実施例では、ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβのそれぞれの維持時間８および１０４分間を示した。しかし、当業者であれば、維持時間は、溶出緩衝液のｐＨおよびイオン強度、温度、カラムの大きさ、タンパク質負荷および流速のような多数の要因に依存することを理解する。種々のパラメーターの効果における一般情報は、Scopesによる１つ(上記)のようなタンパク質精製の教科書において見ることができる。
【００２６】
本明細書では、「低イオン強度条件」なる用語は、室温において導電率が約０．１から約６ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約１から４ｍＳ／ｃｍ、およびより好ましくは約２．６ｍＳ／ｃｍのような約２から約３ｍＳ／ｃｍである溶出緩衝液を用いることを意味する。適当な緩衝液は、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリム、リン酸ナトリウム、Tris(base)またはリン酸カリウムを、単独で、または濃度約１０ｍＭのような約１から約２０ｍＭで塩化ナトリウムのような他の塩と組合せて含み得る。陽イオン交換ステップは、好ましくは、中性ｐＨ、より特に約６．５から約８のｐＨ、好ましくは約７．５で行う。
【００２７】
更なる態様では、本発明は、中または高イオン強度条件下、溶出し、上記のようなステップ(ii)の間に陽イオン交換ゲルに結合するタンパク質画分を回収することを含む実質的に純粋のヒスチジン−リッチグリコプロテイン(ＨＲＧＰ)を含む溶液の調製方法を提供する。ＨＲＧＰの溶出は、好ましくは、ＡＴ−IIIの溶出の間に用いるのと同じｐＨで行う。
【００２８】
本詳細の説明の目的では、「中イオン強度条件」なる用語は、室温において約４から約１６ｍＳ／ｃｍの導電率を有する溶出緩衝液を用いることを意味する。「高イオン強度条件」なる用語は、室温において約１０から約４５０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する溶出緩衝液を用いることを意味する。両方の場合において、適当な緩衝液は、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリム、リン酸ナトリウム、Tris(base)またはリン酸カリウムを、単独で、または濃度約１ｍＭから約２Ｍで塩化ナトリウムのような他の塩と組合せて含み得る。
【００２９】
そのため、ＨＲＧＰを含むタンパク質画分の場合、「中または高イオン強度条件」なる用語は、室温において導電率が約４から約４５０ｍＳ／ｃｍ、または約１０から約４５０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約５０から１５０ｍＳ／ｃｍ、およびより好ましくは約１０６ｍＳ／ｃｍのような約８０から約１１０ｍＳ／ｃｍである溶出緩衝液を用いることを意味する。以下の実施例１、ステップ２に示されるように、ＨＲＧＰは、１０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出し得る。
【００３０】
また他の態様では、本発明は、次のステップ
(i)純粋または実質的に純粋のＡＴ−IIIを含む溶液を調製すること、
(ii)当該タンパク質溶液を陽イオン交換ゲルと接触させること、この場合、ＡＴ−IIIαは低イオン強度の下、ゲルから溶出することができ、一方、ＡＴ−IIIβは低イオン強度条件下、ゲルに結合する条件の下、当該陽イオン交換体基が直鎖状ポリマー鎖を介しゲルマトリクスに結合しており、そして
(iii)低イオン強度条件下、溶出し、タンパク質画分を回収し、それにより、実質的に純粋のＡＴ−IIIαを含む溶液を得ること、および／または
(iv)中または高イオン強度条件下、溶出し、タンパク質画分を回収し、それにより、ＡＴ−IIIβを含む溶液を得ること、
を含む、純粋のイソ型ＡＴ−IIIを含む溶液の調製方法を提供する。
【００３１】
出発物質、すなわち、精製ＡＴ−IIIを含む溶液は、有利には、上記のような本発明により調製した実質的に純粋のＡＴ−IIIを含む溶液であり得る。陽イオン交換ステップは、好ましくは、約６．５から約７．２５、より好ましくは約６．７５のｐＨで行う。
【００３２】
「低イオン強度条件」、「中イオン強度条件」および「高イオン強度条件」なる用語は、上記のように定義する。そのため、ＡＴ−IIIβを含むタンパク質画分を溶出する場合、「中または高イオン強度条件」なる用語は、室温において導電率が約４から約４５０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約４から約３０ｍＳ／ｃｍ、およびより好ましくは約４から約１６ｍＳ／ｃｍ；または約１３ｍＳ／ｃｍのような約１０から約１６ｍＳ／ｃｍである溶出緩衝液を用いることを意味する。以下の実施例１、ステップ３に示すように、ＡＴ−IIIβは、１０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出し得る。
【００３３】
また更なる態様では、本発明は、次のステップ
(i)上記のような本発明の方法のうちいずれか１つ(単独または組合せて)により、ＡＴ−IIIβを含む溶液を調製すること、
(ii)当該溶液を陽イオン交換ゲルと接触させること、この場合、ＡＴ−IIIαは低または中イオン強度の下、ゲルから溶出することができ、一方、ＡＴ−IIIβは低または中イオン強度の下、ゲルに結合する条件の下、当該陽イオン交換体基が直鎖状ポリマー鎖を介しゲルマトリクスに結合しており、そして
(iii)低および／または中イオン強度条件下、タンパク質画分を溶出し、それにより、カラムからＡＴ−IIIαを溶出すること、
(iv)高イオン強度条件下、溶出し、タンパク質画分を回収し、それにより、ＡＴ−IIIβを含む溶液を得ること、
を含む、実質的に純粋のＡＴ−IIIβを含む溶液の調製方法を提供する。
【００３４】
陽イオン交換ステップは、好ましくは、約６．７５から約７．２５、より好ましくは約７．０のｐＨで行う。
【００３５】
当業者であれば、出発溶液は、当該溶液を陽イオン交換ゲルと接触させる前に適当な方法で処置しなければならないことを理解する。適用されるタンパク質混合物は、カラムの平衡化に用いられたものと同一の緩衝液に溶かされているのが普通である。更に、ｐＨおよびイオン強度は、カラム緩衝液と類似または同一である。正確な緩衝組成物、透析またはゲル濾過を達成する２つの通常の方法が存在する(例えば、Scopes, R.K. Protein Purification, Principles and Practice, Third edition, Springer-Verlang 1993参照)。他に、適当な導電率は、以下の実施例１、ステップ４のような蒸留水による希釈により達成され得る。適当なｐＨ値は、水酸化ナトリウムのような塩基またはクエン酸のような酸の添加により得ることができる。
【００３６】
「低イオン強度条件」、「中イオン強度条件」および「高イオン強度条件」なる用語は、上記のように定義する。ＡＴ−IIIαを含むタンパク質画分を溶出する場合、「中イオン強度条件」なる用語は、室温において導電率が約４から約１６ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約７ｍＳ／ｃｍのような約５から約１０ｍＳ／ｃｍである溶出緩衝液を用いることを意味する。以下の実施例１、ステップ４に示すように、追跡量のＡＴ−IIIαは、後で純粋のＡＴ−IIIβを得るため、１０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび所望により０．０８Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出し得る。
【００３７】
ＡＴ−IIIβを含むタンパク質画分を溶出するため、「高イオン強度条件」なる用語は、室温において導電率が約１０から約４５０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約５０から１５０ｍＳ／ｃｍ、およびより好ましくは約１０６ｍＳ／ｃｍのような約８０から約１１０ｍＳ／ｃｍである溶出緩衝液を用いることを意味する。以下の実施例１、ステップ４に示すように、ＡＴ−IIIβは、１０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出し得る。
【００３８】
本発明により産生する抗トロンビン調製物は、医薬組成物および組合せにおける医薬的有効成分として適当である。医薬組成物は、所望により、ヒルジンまたはヘパリンのような抗凝固薬、プラスミノーゲンアクチベーターまたはヘメンチン(hementin)のような血栓溶解薬などの更なる活性成分を含み得る。本発明により産生された抗トロンビン調製物は、任意の非毒性、有機性酸または無機性酸を伴う医薬的に許容される塩を形成し得る。
【００３９】
本発明により産生された抗トロンビン調製物は、通常の非毒性の医薬的に許容される担体、希釈剤、非経口投与に典型的なアジュバントおよびビヒクルを含む単位用量として投与し得る。本明細書で用いるとき、「医薬的に許容される担体」なる用語は、活性化合物または患者と好ましくない反応をしない、不活性、非毒性固体または液体フィルター、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。適当に、好ましくは液体担体は当分野に既知であり、滅菌水、生理食塩水、水性デキストラン、糖溶液、エタノール、グリコールおよび石油、動物、野菜、または合成起源のようなもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油および鉱油を含むオイルなどである。
【００４０】
「非経口」なる用語には、本明細書では、皮下、静脈、動脈および気管内注射および注入技術を含む。経口投与および局所適用のような他の投与もまた適当である。非経口組成物および組合せは、最も好ましくは、ボラス型でまたは既知手順の定常量点滴、いずれかで静脈に投与される。経口投与用の錠剤およびカプセルには、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化剤(tableting agent)、滑沢剤、崩壊剤、および湿潤剤のような通常の賦形剤が含まれる。当該錠剤は、当分野に既知の方法で被覆され得る。
【００４１】
経口液体調製物は、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの型であり得るか、または使用前に水または他の適当なビヒクルで再構成する乾燥産物として存在し得る。その液体調製物には、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存剤のような通常の添加剤を含み得る。典型的な適用は、水性または油性懸濁、溶液、エマルジョン、ゼリーまたは好ましくはエマルジョン軟膏の型であり得る。
【００４２】
本発明の単位用量には、毎日必要な量の本発明のタンパク質であるか、または所望用量の分割量(sub-multiples)を含み得る。所定患者(ヒトを含む哺乳類)用の、最適の治療的に許容される用量および用量率は、用いられる特異活性物質の活性化、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与の時間および経路、クリアランス率のような種々の要因に依存する。処置の目的、すなわち、治療または予防および処置すべき血栓症疾患、抗血小板または抗凝固活性の性質。
【００４３】
処置患者(インビボ)において抗凝固薬として有用な組成物および組合せにおいて、医薬的に有効な一日用量の本発明のペプチドは、約０．０１と１００ｍｇ／ｋｇ体重の間、好ましくは０．１と１０ｍｇ／ｋｇ体重の間である。
【００４４】
実験方法
ＡＴ−IIIの生物学的活性(IU/ml)は、ヘパリンおよびＡＴ−III存在中のトロンビンによる色素生産性基質H-D-Phe-Pip-Arg-pNA・2HCl(Chromogenix, Sweden)の切断をモニターすることにより、ヘパリン補因子活性として測定された。Frantzen Handeland et al. (Scand. J. Haematol. 31, 427-436, 1983)およびvan Voorhuizen et al. (Thromb. Haemostas. 52(3), 350-353, 1984)。
【００４５】
総タンパク質濃度は、２８０ｎｍ(Ａ２８０)での吸収測定値により決定した。ＡＴ−III溶液の濃度(mg/ml)は、6.4 IU/ml係数を用い算出した。ＡＴ−IIIの特異活性(ＳＡ)は、IU/mlとして算出されるヘパリン補因子活性とＡ２８０との間の割合として定義される。
【００４６】
ＨＲＧＰは、ロケット電気泳動技術を用いて定量した。この場合、「ロケット」の高さは、抗原濃度に比例する(Laurell, C-B, (1966) Analyt. Biochem. vol. 15, p. 45;およびLaurell, C-B (1972) J. Clin. Lab. Invest. vol. 29, suppl. 124, p.21)。ＨＲＧＰウサギ抗体(Behringerwerke)を１％アガロースＡゲル(Amersham Pharmacia Biotech)中に含めた。ＨＲＧＰサンプル(５μｌ)をゲルに適用し、それを一夜作動させた(１５０Ｖ、１Ｖ／ｍ)。得られた抗体−抗原複合体を染色し、標準と比較した(ヒト血清)。
【００４７】
等電点電気泳動は、Phastマニュアル分離技術ファイルNo. 100により、事前に形成したゲルによるｐＩ３−９のPhastSystem(Amersham Pharmacia Biotech)を用い、行った。
【００４８】
強力な酸性陽イオン交換ゲルFractogel(商標)EMD SO3-650(Ｍ)をMerck, Darmstadt, Germany(カタログNo. 1.16882)から購入した。当該ゲルの官能性スルホン基、ＳＯ３−を疎水性「触手」スペーサーアームを介しゲルマトリクスに結合する。当該リガンドのモノマー構造(組合せにおける官能基およびスペーサーアーム)は、より特にスルホイソブチルアクリルアミドである。
【００４９】
タンパク質サンプルを、１０ｍｌ Fractogel(商標)EMD SO3-650(Ｍ)カラムを用い、ＡＴ−IIIα、ＡＴ−IIIβおよびＨＲＧＰについて特性解析した。当該ゲルを１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化し、タンパク質サンプル(５０μｌ)をゲルに適用し、当該カラムを３倍体積の平衡緩衝液(１ｍｌ／ｍｉｎ)で洗浄した。当該カラムに吸着するタンパク質を１Ｍ塩化ナトリウム／１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で溶出した。タンパク質ピークを２８０ｎｍで検出した。
【００５０】
実施例
実施例１：本発明によるＡＴ−IIIα、ＡＴ−IIIβおよびＨＲＧＰの分離
ステップ１
血漿(1200kg)を０℃で融解し、得られた寒冷沈降物(cryoprecipitate)(例えば、ファクターＶIIIおよびフィブロネクチンを含む)を遠心分離により取り出した。得られた寒冷上清(cryosupernatant)を陰イオン交換カラム(７０リッターＤＥＡＥ−セファロースＦＦ、Amersham Pharmacia Biotech)で処理しビタミンＫ依存タンパク質(ファクターＩＸ、ファクターＸ、ファクターII、プロテインＣ、プロテインＳなど)を結合した。当該緩衝液は、０．１４Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含んでいた。当該カラムに結合しなかったタンパク質画分は、更に、最終濃度８％(ｖ／ｖ)のエタノールを添加することにより処理した。得られたCohn Fraction１沈殿物(例えばフィブリノーゲンおよびリポタンパク質を含む。Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68, 459-475参照)を、遠心分離により取除いた。
【００５１】
Cohn Fraction１上清(1400kg)をアフィニティークロマトグラフィーカラム(１２０リッターヘパリン−セファロースＦＦ、Amersham Pharmacia Biotech)を通して処理し、それにより、抗トロンビンおよびＨＲＧＰ(ヒスチジン−リッチグリコプロテイン)が結合し、その一方、主要部分の他の血漿タンパク質がカラムを通過する。当該カラムを６００ｋｇ緩衝液(０．４Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８)で洗浄し、抗トロンビン／ＨＲＧＰ画分を５００ｋｇ緩衝液(２．３Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８)で溶出した。得られた抗トロンビン−リッチ溶出液を濃縮し、限外濾過膜(Biomax-10、Millipore)を用い、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に対しダイアフィルトレート(diafiltrate)した。得られたダイアフィルトレート濃縮物をＵＦ１と名付けた。
【００５２】
ステップ２
ステップ２からステップ４は室温で行った(＋２２℃)。濃縮ＵＦ１(Ａ２８０＝２３．６；図１Ａ、レーン１)を蒸留水で１＋３希釈した。希釈溶液(２０５０ｇ、導電率２．６ｍＳ／ｃｍ)を、Fractogel(商標)EMD SO3-650(M)陽イオン交換クロマトグラフィー媒体(１．７ｌ)で満たし１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、２．６ｍＳ／ｃｍで平衡化したカラム(Pharmacia Biotech Bioprocess Column、15cm直径)を通して処理した。流速は９ｌ／ｈであった。タンパク質溶液を当該カラムに負荷したとき、当該カラムを７倍体積の平衡緩衝液で洗浄した。カラムに吸着しなかった物質(「画分Ａ１」と名付けた；図１Ａ、レーン２)を回収し(維持時間８分間；２．３ｋｇ)、以下のステップ３で更に処理した。イオン交換体により妨げられ洗浄を通して回収される物質(「画分Ｂ１」として名付けた；図１Ａ、レーン３)を回収し(維持時間１０４分間；１３．３ｋｇ)、更に以下のステップ４で処理した。
【００５３】
更に強力な吸着タンパク質を１．９ｋｇ緩衝液(１Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、導電率１０６ｍＳ／ｃｍ)でカラムから溶出させた。溶出液(１．９ｋｇ)を濃縮し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム／１％サッカロース、ｐＨ７．０に対しダイアフィルトレートした。得られた「画分Ｃ」は本質的に純粋のＨＲＧＰ(表Ｉ)を含んだ。
【００５４】
ステップ３
ステップ２で得られた画分Ａ１を１Ｍクエン酸でｐＨ６．７５に調節した。溶液(２．３ｌ、導電率２．６ｍＳ／ｃｍ)をステップ２(１．７リッターFractogel(商標)EMD SO3-650(M))と同じカラムを通して処理した。当該ゲルを１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２．６ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ６．７５で平衡化した。流速は９l／ｈであった。タンパク質溶液(２．３ｌ)をカラムでポンプした後、当該カラムを３倍体積の平衡緩衝液で洗浄した。カラムに吸着しなかったタンパク質を回収し(２．５ｌ)、濃縮し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム／１％サッカロース、ｐＨ７．０に対しダイアフィルトレートした。得られた「画分Ａ２」は本質的に純粋のＡＴ−IIIα(表Ｉ；図１Ａ、レーン５；図１Ｂ、レーン５；および図２Ａ)を含んだ。平衡緩衝液でカラムから溶出した第２の画分(図１Ａ、レーン６)は、ＡＴ−IIIα画分中の汚染を最小にするため、捨てた。
【００５５】
カラムによってより強力に吸着するタンパク質を、「中」イオン強度の下、３倍体積の０．１５Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液(導電率約１３ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ６．７５)で洗浄し、回収し(５ｌ、「画分Ｂ２」；図１Ａ、レーン７)、更にステップ４で処理した。
【００５６】
ステップ４
Ｂ１およびＢ２と名付けた画分をプールし(図１Ｂ、レーン１)、ｐＨを７．０に調節した。蒸留水を、導電率２．６ｍＳ／ｃｍに到達するまで、添加した。次いで、当該溶液(４０．６ｌ)を、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２．６ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．０で平衡化したステップ２および３(１．７リッターFractogel(商標)EMD SO3-650(M))と同じカラムを通して処理した。流速は２ｌ／ｈであった。追跡量のＡＴ−IIIαを取除くため、当該カラムを１倍体積の平衡緩衝液(２．６ｍＳ／ｃｍ)(図１Ｂ、レーン２参照)で洗浄し、その後、１倍体積の８０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液(７ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．０)で洗浄した。次いで、ＡＴ−IIIβ画分を３倍体積の１Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１０６ｍＳ／ｃｍで溶出した(維持時間５２分間)。当該溶出物質(２リッター)を濃縮し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム／１％サッカロース、ｐＨ７．０に対しダイアフィルトレートした。得られた「画分Ｂ３」(図１Ｂ、レーン４および６)は本質的に純粋のＡＴ−IIIβ(表Ｉ)を含んだ。
【００５７】
【表１】
表Ｉ
本発明によるＡＴ−IIIα、ＡＴ−IIIβおよびＨＲＧＰ画分の分離
0004897177.tif 000007
【００５８】
表ＩおよびIIにおいて、カラム「ＡＴ−III(％)」は、総タンパク質含有のパーセント中のＡＴ−III(ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβ)の純度の算出であり、その一方、「ＡＴ−IIIα(％)」は総ＡＴ−III含有のパーセント中のＡＴ−IIIαの純度の算出である。その両方の場合、当該値は、等電点電気泳動および分析陽イオン交換クロマトグラフィーからの観察から算出する。
【００５９】
他の型の陽イオン交換体(CM-Sepharose(商標)、SP-Sepharose(商標)、Fractogel(商標)CM-650(M)；この場合、CMはカルボキシメチルを示し、SPはスルホプロピル示す)を用いる同様の実験では、ＡＴ−IIIα、ＡＴ−IIIβおよびＨＲＧＰの重要な分離が達成されなかった。「触手」スペーサーアームで供される、より高い交換容量の媒体がＡＴ−IIIα、ＡＴ−IIIβおよびＨＲＧＰの効果的な分離に必要である。
【００６０】
実施例２：ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーを用いる既知方法のＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβの分離
ヘパリン−セファロースＦＦゲル(１３ｌ)をカラム(ｄ＝３２ｃｍ)に注ぎ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で平衡化した。ＵＦ１と名付けた当該濃縮液(実施例１、ステップ１参照)(7075g; ヘパリン補因子活性78 IU/ml)を当該ゲルに適用した。流れは５０ｌ／ｈであった。当該カラムを、３倍体積の平衡緩衝液で洗浄し、溶出は０．１５から１．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で開始した(１０カラム体積)。タンパク質溶出は、フロースルースペクトロフォトメーター(２８０ｎｍ)を用い追跡した。最初のタンパク質ピーク、約６０リッターを回収し、限外濾過システム(PLGC 10kd, Millipore)で濃縮した。得られた「画分Ｄ」は主にＡＴ−IIIαを含んだ(表II；および図１Ｂ、レーン７)。第２のピーク、約１００リッターを回収し、限外濾過システム(PLGC 10kd, Millipore)で濃縮した。得られた「画分Ｅ」は、ＡＴ−IIIβを含んだ(表II；および図１Ｂ、レーン８)。
【表２】
表II
既知方法によるＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβ画分の分離
0004897177.tif 000008
【００６１】
表ＩとIIとの比較により、本発明の方法(実施例１)が、ＡＴ−IIIαおよびＡＴ−IIIβの精製の場合より優れていることが示される。実施例１のＡＴ−IIIα画分(Ａ２)は５％未満のＡＴ−IIIβおよび５未満のＨＲＧＰを含み、その一方、実施例２のＡＴ−IIIα画分(Ｄ)は、１／３を超えるＨＲＧＰならびにより高量のＡＴ−IIIβを含んだ。実施例１のＡＴ−IIIβ画分(Ｂ３)は５％未満のＡＴ−IIIαおよび５％未満のＨＲＧＰを含み、実施例２のＡＴ−IIIβ画分(Ｅ)はＨＲＧＰ(約２０％)およびＡＴ−IIIα(１０−３０％)で汚染されていた。
【００６２】
等電点電気泳動により得られた結果(図１)により、本発明の方法は既知の方法よりも優れていることを確認した。図１Ｂ中のレーン５および６は、本発明により得られたそれぞれの画分Ａ２およびＢ３を示す。図１Ｂ中のレーン７および８は、実施例２の既知方法により得られた画分ＤおよびＥを示す。ＡＴ−IIIα(レーン５)とＡＴ−IIIβ(レーン６)のそれぞれの２つの明瞭なバンドが見られる。対照的に、レーン７および８は、２つのＡＴ−IIIイソ型の交差汚染(cross-contamination)を示す。同量タンパク質をレーン５から８に適用した。
【００６３】
実施例１および実施例２による方法の相違がまた図２で示される。本発明により精製されたＡＴ−IIIαのサンプル(画分Ａ２、図２Ａ)は単一ピークで示され、その一方、画分Ｄ(図２Ｂ)のピークは他のタンパク質によるの汚染を示す。同様の結果が画分Ｂ３とＥとの間の比較で得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の方法(実施例１)または比較の方法(実施例２)の間において回収されたタンパク質サンプルの等電点電気泳動を示す。
【図２】  図２は、(Ａ)本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーによるＡＴ−IIIαの精製(画分Ａ２)；および(Ｂ)既知方法のヘパリン−セファロースクロマトグラフィーによるＡＴ−IIIαの精製(画分Ｄ)から得られたクロマトグラムの比較を示す。
【図１】
0004897177.tif 000010
【図２】
0004897177.tif 000011