(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるヒトＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸。
【請求項２】
配列番号：４で示されるアミノ酸配列からなるヒトＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
配列番号：８で示されるアミノ酸配列からなるヒトＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
配列番号：１０で示されるアミノ酸配列からなるヒトＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号：１に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２３〜１６７５によって表されるヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項６】
配列番号：３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１８５〜１５４９によって表されるヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項７】
配列番号：７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２６〜１２９７によって表されるヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項８】
配列番号：９に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２６〜１６８１によって表されるヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
請求項３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
請求項４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
請求項５に記載の核酸の相補鎖である核酸を含む、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する生物学的に活性なアンチセンス分子。
【請求項１８】
請求項６に記載の核酸の相補鎖である核酸を含む、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する生物学的に活性なアンチセンス分子。
【請求項１９】
請求項７に記載の核酸の相補鎖である核酸を含む、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する生物学的に活性なアンチセンス分子。
【請求項２０】
請求項８に記載の核酸の相補鎖である核酸を含む、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する生物学的に活性なアンチセンス分子。
【請求項２１】
請求項１７に記載のアンチセンス分子の生物学的に活性な類縁体であって、ペプチド核酸、ホスホン酸メチルおよび２−Ｏ−メチルリボ核酸からなる群より選択される、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する類縁体。
【請求項２２】
請求項１８に記載のアンチセンス分子の生物学的に活性な類縁体であって、ペプチド核酸、ホスホン酸メチルおよび２−Ｏ−メチルリボ核酸からなる群より選択される、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する類縁体。
【請求項２３】
請求項１９に記載のアンチセンス分子の生物学的に活性な類縁体であって、ペプチド核酸、ホスホン酸メチルおよび２−Ｏ−メチルリボ核酸からなる群より選択される、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する類縁体。
【請求項２４】
請求項２０に記載のアンチセンス分子の生物学的に活性な類縁体であって、ペプチド核酸、ホスホン酸メチルおよび２−Ｏ−メチルリボ核酸からなる群より選択される、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する類縁体。
【請求項２５】
請求項１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的に活性なホスホロチオエート類縁体であって、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する前記ホスホロチオエート類縁体。
【請求項２６】
請求項１８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的に活性なホスホロチオエート類縁体であって、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する前記ホスホロチオエート類縁体。
【請求項２７】
請求項１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的に活性なホスホロチオエート類縁体であって、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する前記ホスホロチオエート類縁体。
【請求項２８】
請求項２０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的に活性なホスホロチオエート類縁体であって、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する前記ホスホロチオエート類縁体。
【請求項２９】
細胞におけるヒトＭｕｓ８１タンパク質の発現または機能を阻害するための医薬調製物であって、前記細胞に入ること、および前記ヒトＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸分子に特異的に結合することが可能なアンチセンス核酸類縁体を含み、前記アンチセンス核酸が、医薬として許容される担体中に存在しかつ請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸に相補的なヌクレオチド配列を有する、医薬調製物。
【請求項３０】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：８、または配列番号：１０で示されるアミノ酸残基配列からなるタンパク質の群より選択される単離ヒトＭｕｓ８１タンパク質。
【請求項３１】
請求項３０に記載のタンパク質またはＣｄｓ１と相互作用する部分を含む融合タンパク質。
【請求項３２】
ＧＦＰに融合したヒトｍｕｓ８１（Ｈｍｕｓ８１−ＧＦＰ）として特定可能な請求項３１に記載のタンパク質。
【請求項３３】
請求項３０に記載のタンパク質の一部に特異的に結合する抗体。
【請求項３４】
ポリクローナル抗体である請求項３３に記載の抗体。
【請求項３５】
モノクローナル抗体である請求項３３に記載の抗体。
【請求項３６】
ヒトＭｕｓ８１細胞周期チェックポイント／修復経路タンパク質の発現の阻害物質または活性化物質としての化合物を特定する方法であって、前記経路においてタンパク質を発現する細胞を前記化合物と接触させることと、前記細胞のヒトＭｕｓ８１ヒト細胞周期チェックポイント／修復経路タンパク質の発現レベルを前記化合物と接触させていない細胞と比較することとを含み、前記ヒトＭｕｓ８１細胞周期チェックポイント／修復経路タンパク質が配列番号：２、４、８または１０で示されるアミノ酸配列からなる前記方法。
【請求項３７】
Ｍｕｓ８１依存性細胞周期経路を調節する化合物を特定する方法であって、試験する化合物をＭｕｓ８１タンパク質をコードする遺伝子を含む宿主細胞に投与することと、前記宿主細胞中のヒトＭｕｓ８１タンパク質のレベルを検出することと、検出されたレベルを正常な未処置細胞と比較することとを含み、前記ヒトＭｕｓ８１細胞周期チェックポイント／修復経路タンパク質が配列番号：２、４、８または１０で示されるアミノ酸配列からなる方法。
【請求項３８】
Ｍｕｓ８１依存性細胞周期経路を調節する化合物を特定する方法であって、試験する化合物をＭｕｓ８１タンパク質をコードする遺伝子を含む宿主細胞に投与することと、前記宿主細胞中のヒトＭｕｓ８１タンパク質コーディング核酸のレベルを検出することと、検出されたレベルを正常な未処置細胞と比較することとを含み、前記ヒトＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸が、請求項５〜８のいずれか一項記載の核酸である、前記方法。
【請求項３９】
配列番号：１２で示されるアミノ酸配列からなるマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸。
【請求項４０】
配列番号：１４で示されるアミノ酸配列からなるマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸。
【請求項４１】
配列番号：１６で示されるアミノ酸配列からなるマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸。
【請求項４２】
配列番号：１８で示されるアミノ酸配列からなるマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸。
【請求項４３】
配列番号：１１に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド４２〜１６９４によって表されるヌクレオチド配列からなる、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４４】
配列番号：１３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１５〜１３２３によって表されるヌクレオチド配列からなる、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４５】
配列番号：１５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド５２〜１６４４によって表されるヌクレオチド配列からなる、請求項４１に記載の核酸。
【請求項４６】
配列番号：１７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド５２〜１６１４によって表されるヌクレオチド配列からなる、請求項４２に記載の核酸。
【請求項４７】
請求項３９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４８】
請求項４７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項５０】
請求項４９記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５１】
請求項４１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項５２】
請求項５１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５３】
請求項４２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項５４】
請求項５３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５５】
請求項４３に記載の核酸の相補鎖である核酸を含む、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する生物学的に活性なアンチセンス分子。
【請求項５６】
請求項４４に記載の核酸の相補鎖である核酸を含む、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する生物学的に活性なアンチセンス分子。
【請求項５７】
請求項４５に記載の核酸の相補鎖である核酸を含む、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する生物学的に活性なアンチセンス分子。
【請求項５８】
請求項４６に記載の核酸の相補鎖である核酸を含む、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する生物学的に活性なアンチセンス分子。
【請求項５９】
請求項５５に記載のアンチセンス分子の生物学的に活性な類縁体であって、ペプチド核酸、ホスホン酸メチルおよび２−Ｏ−メチルリボ核酸からなる群より選択される、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する類縁体。
【請求項６０】
請求項５６に記載のアンチセンス分子の生物学的に活性な類縁体であって、ペプチド核酸、ホスホン酸メチルおよび２−Ｏ−メチルリボ核酸からなる群より選択される、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する類縁体。
【請求項６１】
請求項５７に記載のアンチセンス分子の生物学的に活性な類縁体であって、ペプチド核酸、ホスホン酸メチルおよび２−Ｏ−メチルリボ核酸からなる群より選択される、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する類縁体。
【請求項６２】
請求項５８に記載のアンチセンス分子の生物学的に活性な類縁体であって、ペプチド核酸、ホスホン酸メチルおよび２−Ｏ−メチルリボ核酸からなる群より選択される、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する類縁体。
【請求項６３】
請求項５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的に活性なホスホロチオエート類縁体であって、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する前記類縁体。
【請求項６４】
請求項５６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的に活性なホスホロチオエート類縁体であって、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する前記類縁体。
【請求項６５】
請求項５７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的に活性なホスホロチオエート類縁体であって、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する前記類縁体。
【請求項６６】
請求項５８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的に活性なホスホロチオエート類縁体であって、Ｍｕｓ８１タンパク質の発現に対する阻害活性を有する前記類縁体。
【請求項６７】
哺乳動物細胞におけるＭｕｓ８１タンパク質の発現または機能を阻害するための医薬調製物であって、前記細胞に入ること、および前記Ｍｕｓ８１タンパク質をコードする核酸分子に特異的に結合することが可能なアンチセンス核酸類縁体を含み、前記アンチセンス核酸が医薬として許容される担体中に存在し、かつ請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の核酸に相補的なヌクレオチド配列を有する、医薬調製物。
【請求項６８】
配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、または配列番号：１８で示されるアミノ酸残基配列からなるタンパク質の群より選択される単離マウスＭｕｓ８１タンパク質。
【請求項６９】
請求項６８に記載のタンパク質の一部に特異的に結合する抗体。
【請求項７０】
ポリクローナル抗体である請求項６９に記載の抗体。
【請求項７１】
モノクローナル抗体である請求項６９に記載の抗体。
【請求項７２】
哺乳動物Ｍｕｓ８１細胞周期チェックポイント／修復経路タンパク質の発現の阻害物質または活性化物質としての化合物を特定する方法であって、前記経路においてタンパク質を発現する細胞を前記化合物と接触させることと、前記細胞中の哺乳動物Ｍｕｓ８１細胞周期チェックポイント／修復経路タンパク質の発現レベルを検出することと、検出されたレベルを前記化合物と接触させていない細胞と比較することを含み、前記Ｍｕｓ８１細胞周知チェックポイント／修復経路タンパク質が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１２：、配列番号：１４、配列番号：１６または配列番号：１８で示されるアミノ酸配列からなる、前記方法。
【請求項７３】
Ｍｕｓ８１依存性細胞周期経路を調節する化合物を特定する方法であって、試験する化合物をＭｕｓ８１タンパク質をコードする遺伝子を含む宿主細胞に投与することと、前記宿主細胞中のマウスＭｕｓ８１タンパク質のレベルを検出することと、検出されたレベルを正常な未処置細胞と比較することを含み、前記Ｍｕｓ８１細胞周知チェックポイント／修復経路タンパク質が、配列番号１２：、配列番号：１４、配列番号：１６または配列番号：１８で示されるアミノ酸配列からなる、前記方法。
【請求項７４】
Ｍｕｓ８１依存性細胞周期経路を調節する化合物を特定する方法であって、試験する化合物をＭｕｓ８１タンパク質をコードする遺伝子を含む宿主細胞に投与することと、前記宿主細胞中のマウスＭｕｓ８１タンパク質コーディング核酸のレベルを検出することと、検出されたレベルを正常な未処置細胞と比較することを含み、前記マウスＭｕｓ８１タンパク質コーディング核酸が、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の核酸である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に医学分野に関し、特に、新規なタンパク質、これらのタンパク質の変異体、およびこれらをコードする核酸を用いて、組織の細胞形成を含む、細胞の増殖および死滅を調節するための方法および組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
分裂中の細胞にとって、ゲノムが完全であることは非常に重要である。ＤＮＡ損傷への応答において、真核細胞は細胞周期の進行を遅らせるための複雑な制御システムに頼っている。正常な真核細胞の細胞周期は、明確な細胞の形態と生化学的活性に相関する４期（順にＧ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍ）に分けられる。細胞周期から離脱した細胞はＧ０期、または周期進行停止状態にあると称する。細胞周期内の細胞が活発に複製しているとき、Ｓ期でＤＮＡの重複が起こり、Ｍ期で細胞の活発な分裂が起こる。一般にはＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、ＧＥＮＥＳ  ＶＩ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＧＢ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３６、１９９７）を参照されたい。ＤＮＡは真核細胞内で連続的により高度に構成され、染色体を形成することになる。非性染色体は通常は対で存在し、細胞分裂中に各染色体のＤＮＡが複製して、対のクロマチドを生じる。（一般にはＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、ＧＥＮＥＳ  ＶＩ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＧＢ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５、１９９７を参照されたい）。
【０００３】
真核細胞の細胞周期は、その様々な期を通して確実に順序に従って進行させる固有のメカニズムと、異常な構造または組立が不完全な構造が存在する場合に周期進行を防止する監視メカニズムとによって、厳密に調節されている。これらの負の調節監視メカニズムはチェックポイントと呼ばれている（Ｈａｒｔｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒｔ、１９８９、「Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ：ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈａｔ  ｅｎｓｕｒｅ  ｔｈｅ  ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｅｖｅｎｔｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：６２９−６３４）。有糸分裂チェックポイントは、すべての染色体が紡錘体に付着するまで細胞の有糸分裂を防止するが、ＤＮＡ構造チェックポイントは複製およびＤＮＡ損傷チェックポイントにさらに分けることができ、ＤＮＡ損傷または複製が不完全なＤＮＡが存在すると細胞周期における様々なポイントで進行停止が起こる（Ｅｌｌｅｄｇｅ、１９９６、「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ：ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ａｎ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｃｒｉｓｉｓ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１６６４−１６７２）。これらの停止は複製のための期間を完了させるか、またはＤＮＡ修復を起こすと考えられている。ＤＮＡ損傷、複製が不完全なＤＮＡ、または不適当な有糸分裂の組立がある場合に細胞周期が進行すると、腫瘍形成の初期段階であるゲノム不安定性を引き起こすことがある。欠損チェックポイントメカニズムはｐ５３、ＡＴＭ、およびＢｕｂ１チェックポイント遺伝子産物の不活化から生じ、いくつかのヒト癌に関係があるとされている。
【０００４】
チェックポイントの遅延は、Ｓ期の損傷ＤＮＡの複製前、およびＭ期のクロマチドの分離前に損傷ＤＮＡを修復する時間を提供する（Ｈａｒｔｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒｔ、１９８９、上記）。多くの場合、ＤＮＡ損傷応答経路はサイクリン依存性キナーゼの活性を阻害することによって停止を引き起こす（Ｅｌｌｅｄｇｅ、１９９７、上記）。ヒト細胞において、ＤＮＡ損傷誘導性のＧ２遅延はＣｄｃ２の抑制的リン酸化に大きく依存しており（Ｂｌａｓｉｎａ他、１９９７、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｄｃ２  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋ  ａｎｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８：１０１３−１０２３；Ｊｉｎ他、１９９７、「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｃｄｃ２  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｇ２  ａｒｒｅｓｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３４：９６３−９７０）、したがって、Ｃｄｃ２に作用する対抗キナーゼおよびホスファターゼ活性の変化が原因であると考えられる。しかし、これらの酵素の活性がＤＮＡ損傷に応答して実質的に変化したという証拠は得られていない（Ｐｏｏｎ他、１９９７、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｄｃ２  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７：５１６８−５１７８）。
【０００５】
３つの異なるＣｄｃ２５タンパク質がヒト細胞で発現される。Ｃｄｃ２５ＡはＧ１からＳへの移行に特に必要とされる（Ｈｏｆｆｍａｎｎ他、１９９４、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤＣ２５Ａ  ｂｙ  ａ  ｃｄｋ２−ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｇ−１／Ｓ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．」ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３：４３０２−４３１０；Ｊｉｎｎｏ他、１９９４、「Ｃｄｃ２５Ａ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ」ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３：１５４９−１５５６）が、Ｃｄｃ２５ＢおよびＣｄｃ２５ＣはＧ２からＭへの移行に必要とされる（Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ他、１９９６、「Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｄｃ２５Ｂ  ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｃｅｎｔｒｏｓｏｍａｌ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｍｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ」Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１０９（５）：１０８１−１０９３；Ｇａｌａｋｔｉｏｎｏｖ他、１９９１、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｄｃ２５  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｂｙ  Ｂ−ｔｙｐｅ  ｃｙｃｌｉｎｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｙｃｌｉｎｓ」Ｃｅｌｌ、６７：１１８１−１１９４；Ｍｉｌｌａｒ他、１９９１、「ｐ５５ＣＤＣ２５  ｉｓ  ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１０５００−１０５０４；Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ他、１９９７、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３８：１１０５−１１１６）。Ｃｄｃ２５ＢおよびＣｄｃ２５ＣのＭ期進行への厳密な寄与は不明である。
【０００６】
チェックポイント制御について発明者らが現在持っている知識の多くは、出芽（サッカロミセス−セレビジエ）および分裂（シゾサッカロミセス−ｐｏｍｂｅ）酵母を用いた研究から得ている。酵母と、それよりも高等な真核生物における細胞周期チェックポイントに関する発明者らの現在の理解について、いくつかの総説が最近発表された（Ｈａｅｒｗｅｌｌ  ＆  Ｋａｓｔａｎ、１９９４、「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：１８２１−１８２８；Ｍｕｒｒａｙ、１９９４、「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６：８７２−８７６；Ｅｌｌｅｄｇｅ、１９９６、上記；Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＆  Ｐａｕｌｅｓ、１９９６、「ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ」ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１０：２３８−２４７）。分裂酵母において、６つの遺伝子産物、ｒａｄ１＋、ｒａｄ３＋、ｒａｄ９＋、ｒａｄ１７＋、ｒａｄ２６＋、およびｈｕｓ１＋が、ＤＮＡ損傷依存性およびＤＮＡ複製依存性の両方のチェックポイント経路の成分として確認されている。加えて、酵母においてｃｄｓ１＋はＤＮＡ複製依存性チェックポイントで必要であると確認され、ｒａｄ２７＋／ｃｈｋ１＋はＤＮＡ損傷依存性チェックポイントで必要であると確認されている。
【０００７】
これらの遺伝子のいくつかは出芽酵母における構造上のホモログを有している。Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ｒａｄ３＋に関係する２つの遺伝子：ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異遺伝子）（Ｓａｖｉｔｓｋｙ他、１９９５、「Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＰＩ−３  ｋｉｎａｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７４９−１７５３）およびＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症およびｒａｄ３＋関連遺伝子）（Ｂｅｎｔｌｅｙ他、１９９６、「Ｔｈｅ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ｒａｄ３  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｇｅｎｅｓ」ＥＭＢＯ  Ｊ．、１５：６６４１−６６５１；Ｃｉｍｐｒｉｃｈ他、「ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：２８５０−２８５５）；ならびにＳ．ｐｏｍｂｅ  ｒａｄ９＋のヒトホモログであるＨｒａｄ９（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ他、１９９６、「Ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ｒａｄ９＋  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｅｎｅ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１３８９０−１３８９５）、Ｈｒａｄ１（Ｐａｒｋｅｒ他、１９９８、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ｒａｄ１７＋  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｇｅｎｅ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８３４０−１８３４６；Ｆｒｅｉｒｅ他、１９９８、「Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ｒａｄ１（＋）  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａ  ＲＡＤ１７：ｌｉｎｋａｇｅ  ｔｏ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｅｉｏｓｉｓ」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２５６０−２５７３；Ｕｄｅｌｌ他、１９９８、「Ｈｒａｄ１  ａｎｄ  Ｍｒａｄ１  ｅｎｃｏｄｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｓｉｏｎ  ｙｅａｓｔ  ｒａｄ１（＋）  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｅｎｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２９７１−３９７６）、Ｈｒａｄ１７（Ｐａｒｋｅｒ他、１９９８、上記）、Ｈｈｕｓ１（Ｋｏｓｔｒｕｂ他、１９９８、「Ｈｕｓ１ｐ，ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｆｉｓｓｉｏｎ  ｙｅａｓｔ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄ１ｐ  ａｎｄ  ｉｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ」ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：２０５５−２０６６）、Ｈｃｈｋ１（Ｓａｎｃｈｅｚ他、１９９７、「Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｋ１  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ：ｌｉｎｋａｇｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  Ｃｄｋ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒ���ｕｇｈ  Ｃｄｃ２５」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１４９７−１５０１）およびＨｃｄｓ１（Ｍａｔｓｕｏｋａ他、１９９８、「Ｌｉｎｋａｇｅ  ｏｆ  ＡＴＭ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃｈｋ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２（５３９５）：１８９３−１８９７；Ｂｌａｓｉｎａ他、１９９９、「Ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃｄｓ１  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｃｄｃ２５  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ」Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（１）：１−１０）を含む、Ｓ．ｐｏｍｂｅチェックポイント遺伝子のいくつかのヒトホモログのクローニングにより、真核細胞全体のさらなる保存が最近になって示唆されている。
【０００８】
酵母および哺乳動物細胞におけるチェックポイントタンパク質の遺伝学および生化学的分析により、チェックポイント応答は通常のシグナルトランスダクション経路を通じて伝達されることが示唆される。Ｈｒａｄ１、Ｈｒａｄ９、Ｈｒａｄ１７、およびＨｈｕｓ１は損傷ＤＮＡまたは複製が不完全なＤＮＡから発しているシグナルを中心キナーゼＡＴＭおよびＡＴＲに伝達し、これが次いで下流のキナーゼＣｈｋ１およびＣｄｓ１を活性化する。ＤＮＡ構造チェックポイント応答は最終的に、Ｃｈｋ１またはＣｄｓ１による有糸分裂誘導性ホスファターゼＣｄｃ２５のリン酸化を引き起こす。このリン酸化事象は、核から細胞質への輸送のためにＣｄｃ２５を標的とするタンパク質１４−３−３の結合部位を作出し、したがってサイクリン依存性キナーゼＣｄｃ２からの抑制的リン酸化物の除去を防止する。この抑制的リン酸化物の除去は、すべての細胞周期におけるＧ２から有糸分裂への通過のために必要とされる。ＤＮＡ構造チェックポイント応答はこの除去が起こることを防止し、Ｇ２／Ｍ停止を引き起こす。
【０００９】
Ｓ．ｐｏｍｂｅにおいてＣｈｋ１タンパク質がＧ２／ＭのＤＮＡ損傷チェックポイントで必要とされることが明らかにされているが、複製チェックポイントにはＣｄｓ１とＣｈｋ１の両方の活性が必要である。リボヌクレオチド還元酵素阻害物質のヒドロキシ尿素（ＨＵ）処理によって複製が阻止されると、野生型細胞は有糸分裂前に停止する。ｃｄｓ１ｃｈｋ１二重突然変異体はＨＵ存在下で停止しないが、単一の突然変異体はいずれも正常に停止する（Ｒｕｓｓｅｌｌ、１９９８、「Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ｍｉｔｏｓｉｓ」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２３（１０）：３９９−４０２）。Ｓ．ｐｏｍｂｅ  Ｃｈｋ１およびＣｄｓ１はいずれもＣｄｃ２５をリン酸化し、１４−３−３タンパク質による結合のためにこれを標的とすることができる。Ｓ．ｐｏｍｂｅ  Ｃｄｓ１タンパク質キナーゼのＨＵによる活性化も、Ｗｅｅ１への結合とそのリン酸化、ならびにＭｉｋ１の蓄積を活性化することになる。これら２つのタンパク質キナーゼは、細胞が有糸分裂に入るのを防止するＣｄｃ２の抑制的リン酸化に必要であり、チェックポイント仲介性細胞周期停止のためのＣｄｃ２５Ｃリン酸化の代わりになることが示唆される。最近、Ｃｄｓ１もＳ期におけるＤＮＡ損傷チェックポイントにとって必要であることが明らかにされている（Ｒｈｉｎｄ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、１９９８、「Ｔｈｅ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  Ｓ−ｐｈａｓｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ＤＮａ  ｄａｍａｇｅ」Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４９（４）：１７２９−１７３７；Ｌｉｎｄｓａｙ他、１９９８、「Ｓ−ｐｈａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｄｓ１  ｋｉｎａｓｅ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｓｕｂｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２（３）：３８２−３９５）。ＡＴＭ依存性の様式でＤＮＡ損傷およびＨＵによって活性化され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣｄｃ２５Ｃをリン酸化することが可能な、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  Ｃｄｓ１のヒトホモログが最近同定された（Ｍａｔｓｕｏｋａ他、１９９８、上記；Ｂｌａｓｉｎａ他、１９９９、上記）。ヒトｃＤＮＡは、そのＳ．ｐｏｍｂｅホモログと同様にキナーゼドメインのＮ末端にフォークヘッド随伴（ＦＨＡ）ドメインを含む５４３アミノ酸のタンパク質をコードする。ＦＨＡドメインはＳ．セレビジエＣｄｓ１オルソログＲａｄ５３を含むいくつかの他のタンパク質で見いだされている。Ｒａｄ５３は２つのＦＨＡドメインを含み、その１つはＤＮＡ損傷存在下でＤＮＡ損傷チェックポイントタンパク質Ｒａｄ９と相互作用するために必要である（Ｓｕｎ他、１９９８、「Ｒａｄ５３  ＦＨＡ  ｄｏｍａｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒａｄ９  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（５３７４）：２７２−２７４）。
【００１０】
加齢や癌などの疾患の影響を改善するための、新しく、より有効な処置および治療法を開発するために、哺乳動物、特にヒトのチェックポイントタンパク質を同定し、特徴付けること、ならびにそれらの活性のメディエイタを同定することが重要である。本発明は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  Ｃｄｓ１  ＦＨＡドメインと相互作用するＳ．ｐｏｍｂｅ  Ｍｕｓ８１タンパク質と著しい相同性を有するヒトＭｕｓ８１（Ｈｍｕｓ８１）およびマウスＭｕｓ８１（Ｍｍｕｓ８１）タンパク質をコードするヒトおよびマウス核酸の同定および特徴付けを教示する。Ｓ．セレビジのエオルソログは減数分裂およびＤＮＡ修復に関与していると報告されている。
【００１１】
以下に記載するとおり、Ｈｍｕｓ８１遺伝子はチェックポイント／修復遺伝子としてはたらき、ＤＮＡ修復に関与している。チェックポイント／修復の遅延はＳ期の損傷ＤＮＡの複製前、およびＭ期のクロマチドの分離前に損傷ＤＮＡを修復する時間を提供し、Ｈｍｕｓ８１は他の知られているチェックポイント／修復遺伝子と同様に、両方の局面で作用するようである。多くの場合、ＤＮＡ損傷応答経路は停止を引き起こし、細胞は分裂できなくなる。しかし、機能的ＤＮＡ修復メカニズムは、損傷を修正し、結果として細胞分裂を起こさせることになる。
【００１２】
ヒトにおいては、除去修復は２つの主な発癌要因である日光およびタバコの煙に対する重要な防御メカニズムである。除去修復が欠如している個人は高い癌発生率を示すことが明らかにされている。（Ｓａｎｃａｒ，Ａ、１９９６、「ＤＮＡ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｐａｉｒ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：４３−８１参照）。ＤＮＡ複製の誤りを修正し、異なるＤＮＡ間の組換え事象を阻止することにより細胞ゲノムを安定化するミスマッチ修復などの他のメカニズムも、同様の様式でＤＮＡを修復する。これらの活性をコードする遺伝子を不活化すると、自然突然変異性および腫瘍発生の素因が大幅に増大することになる。（Ｍｏｄｒｉｃｈ  ＆  Ｌａｈｕｅ、１９９６、「Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１０１−３３参照）。ＤＮＡにおいて忠実度を維持することの重要性は、修復と、修復不能な場合には細胞分裂停止の多くのメカニズムによって十分に示されている。（Ｗｏｏｄ、ＲＤ、１９９６、「ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１３５−６７参照）。
【００１３】
標的となる悪性細胞のＤＮＡを破壊するか、そうでなければ損傷を引き起こすための多くの化学療法剤が設計されている。アルキル化剤、代謝拮抗剤、ならびに他の化学類縁体および物質などの抗新生物薬は、典型的にはヌクレオチド生合成もしくはタンパク質合成を阻害する、ＤＮＡを架橋する、またはＤＮＡに挿入して複製もしくは遺伝子発現を阻害することにより作用する。例えばブレオマイシンおよびエトポシドは、ＤＮＡを特異的に損傷し、修復を妨害する。
【００１４】
Ｈｍｕｓ８１遺伝子またはタンパク質活性の阻害は抗新生物薬の活性を増強し、化学療法剤としてのそれらの使用の有効性を増大させる。この増大は、標的細胞に対してより徹底的に作用するだけでなく、有効性の増大に比例して用いる用量削減を可能にすることにより、有害な副作用を低減させる上で有益である。Ｈｍｕｓ８１またはＭｍｕｓ８１遺伝子活性のアンチセンス核酸医薬による阻害は、本発明の核酸をアンチセンス核酸構築の鋳型として用いることにより行うことができる。アンチセンス結合と、したがって阻害のために核酸のアミノ末端を標的とすることは、ｍＲＮＡの翻訳を低減するため、好ましい。Ｈｍｕｓ８１タンパク質活性の阻害は、Ｈｍｕｓ８１またはＭｍｕｓ８１タンパク質の改変体または断片を用いて損傷ＤＮＡの修復を引き起こす生化学的カスケードを競合阻害するか、または細胞停止を引き起こすことによって行うことができる。
【００１５】
疾患は不完全なＤＮＡ修復メカニズムによっても発生することがあり、遺伝性非ポリープ大腸癌（ミスマッチ修復の欠損）、ナイメーヘン染色体不安定症候群（２本鎖切断修復の欠損）、色素性乾皮症、コケーン症候群、およびトロコチオジストロフィー（核除去修復の欠損）が含まれる。（例えば、Ｌｅｎｇａｕｅｒ他、１９９８、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ」Ｎａｔｕｒｅ  ３９６（６７１２）：６４３−６４９；Ｋａｎａａｒ他、１９９８、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｒｅｐａｉｒ」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８（１２）：４８３−４８９参照）。
【００１６】
加齢または疾患に起因する細胞挙動のよりよい処置を行うために、Ｈｍｕｓ８１遺伝子またはタンパク質活性の一時的阻害で十分でありうることがさらに考えられる。例えば、ＤＮＡチェックポイント／ＤＮＡ損傷による細胞分裂停止の一時的阻害により、癌などの疾患の治療において標的となる細胞により大きい損傷を与えるための低用量化学療法剤の組み合わせ使用が可能になると考えられる。
【００１７】
発明の概要
新規遺伝子およびそれがコードするタンパク質は、細胞の増殖、分裂および死滅を調節するために有用である。本発明の１つの態様は、新規な哺乳動物、例えばヒトまたはマウスのチェックポイント／修復タンパク質、そのタンパク質およびそのタンパク質変異体をコードする核酸、核酸構築物、ならびに哺乳動物Ｍｕｓ８１コーディング遺伝子およびタンパク質の産生法および使用法である。本明細書における「チェックポイント遺伝子」とは、細胞分裂のチェックポイント／修復調節において作用するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。そのようなタンパク質は複製およびＤＮＡ損傷チェックポイント活性の両方を行うことができる、すなわちチェックポイント／修復活性を有している。哺乳動物Ｍｕｓ８１タンパク質コーディング核酸およびそれらの細胞周期調節における役割の具体的な特徴付けにより、哺乳動物細胞周期を標的細胞において調節するための新規で有用な化合物が提供される。
【００１８】
本明細書における「ヒトＭｕｓ８１遺伝子」、「Ｈｍｕｓ８１コーディング遺伝子」および「Ｈｍｕｓ８１遺伝子」なる用語は、ヒト個体群で出現する遺伝子の対立遺伝子変異体であるが、同じタンパク質をコードする変異体、その遺伝子のスプライス変異体、ならびにそのようなゲノム遺伝子からの転写物、その転写物をコードするｃＤＮＡ、およびＨｍｕｓ８１タンパク質をコードする他の核酸を含む、ヒトＭｕｓ８１をコードする遺伝子を含む。本明細書における「ヒトＭｕｓ８１タンパク質」、「Ｈｍｕｓ８１」および「Ｈｍｕｓ８１タンパク質」なる用語は一般に、Ｈｍｕｓ８１コーディング核酸から発現されるタンパク質を意味し、Ｈｍｕｓ８１コーディング遺伝子によってコードされるタンパク質の翻訳およびプロセッシングにより生成されるタンパク質のスプライス変異体およびグリコシル化変異体を含み、特に配列番号：２、４、８、および１０で示されるアミノ酸配列に対応する配列を有するヒトＭｕｓ８１タンパク質を意味する。好ましい実施形態において、本発明の単離核酸はヒトＭｕｓ８１タンパク質をコードするｃＤＮＡに対応する。本発明のいかなる特定の単離核酸も、ヒトＭｕｓ８１タンパク質の１つの型だけをコードすることが好ましい。
【００１９】
以下に詳述するとおり、本発明のヒトＭｕｓ８１コーディング核酸は、本明細書において開示されるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、ヒトＭｕｓ８１１（「Ｈｍｕｓ８１（１）」；配列番号：１）、ヒトＭｕｓ８１２（「Ｈｍｕｓ８１（２）」；配列番号：３）、ヒトＭｕｓ８１３（「Ｈｍｕｓ８１（３）」；配列番号：７）、およびヒトＭｕｓ８１４（「Ｈｍｕｓ８１（４）」；配列番号：９）として具体的に特定される単離核酸を含む。前述の核酸はすべて、ヒトＭｕｓ８１タンパク質およびその等価物をコードする。したがって、本発明はヒトＭｕｓ８１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含み、具体的には配列番号：１、３、７、９および２５で示される配列のコーディングドメインセグメントに対応するヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明は、配列番号：２５で示される配列に対応するヌクレオチド配列を有するＨｍｕｓ８１タンパク質の２つの型をコードする核酸も含む。この核酸は、配列番号：４で示されるアミノ酸残基配列を有するＨｍｕｓ８１タンパク質をコードするが、ただし停止コドンを含む配列番号：２５の配列の１２７４位から１４７４位までの２０１ヌクレオチドが欠失しており、したがって、ＤＮＡのより長いコーディングドメインセグメント配列の翻訳が可能である。配列番号：２５で示される配列に対応するヌクレオチド配列を有する核酸は、イントロンを正しい位置に残して、より短いコーディングドメインセグメントから、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するより短いＨｍｕｓ８１タンパク質もコードする。
【００２１】
したがって、好ましい実施形態において、本発明はヒトＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸、および特に配列番号：１で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２３〜１６７５によって表される配列；配列番号：３で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１８５〜１５４９によって表される配列；配列番号：７で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２６〜１２９７によって表される配列；配列番号：９で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２６〜１６８１によって表される配列；または配列番号：２５において特定される配列に対応するコーディングドメインセグメント配列を有する核酸を含む。
【００２２】
「マウスＭｕｓ８１遺伝子」および「Ｍｍｕｓ８１遺伝子」なる用語は、本明細書において新規なマウスＭｕｓ８１コーディング遺伝子を意味するために用いられる。「マウスＭｕｓ８１タンパク質」、「Ｍｍｕｓ８１」および「Ｍｍｕｓ８１タンパク質」なる用語は一般に、Ｍｍｕｓ８１遺伝子のタンパク質産物を意味し、特に配列番号：１２、１４、１６、および１８で示される配列に対応するアミノ酸残基配列を有するマウスＭｕｓ８１タンパク質を意味する。
【００２３】
「マウスＭｕｓ８１遺伝子」、「Ｍｍｕｓ８１遺伝子」および「Ｍｍｕｓ８１コーディング遺伝子」なる用語はＭｍｕｓ８１遺伝子を含み、特に本明細書において開示されるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、マウスＭｕｓ８１１（「Ｍｍｕｓ８１（１）」；配列番号：１１）、マウスＭｕｓ８１２（「Ｍｍｕｓ８１（２）」；配列番号：１３）、マウスＭｕｓ８１３（「Ｍｍｕｓ８１（３）」；配列番号：１５）、マウスＭｕｓ８１４（「Ｍｍｕｓ８１（４）」；配列番号：１７）、およびそれにおいてコードされるタンパク質コーディングドメインセグメントとして特定される単離核酸を含む。好ましい実施形態において、本発明の単離核酸はマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードするｃＤＮＡに対応する。本発明のいかなる特定の単離核酸も、マウスＭｕｓ８１タンパク質の１つの型だけをコードすることが好ましい。
【００２４】
もう１つの好ましい実施形態において、本発明はマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸、および特に配列番号：１１で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド４２〜１６９４によって表される配列；配列番号：１３で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１５〜１３２３によって表される配列；配列番号：１５で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド５２〜１６４４によって表される配列；または配列番号：１７で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド５２〜１６１４によって表される配列に対応するコーディングドメインセグメント配列を有する核酸を含む。
【００２５】
本発明は、ヒトＭｕｓ８１またはマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸構築物、ベクター、プラスミド、コスミド、レトロウイルス、またはウイルス構築物なども含む。特に、本発明は配列番号：１、３、７、９または２５で示される核酸のＨｍｕｓ８１コーディングドメインセグメントのヌクレオチド配列を含み、タンパク質として発現可能な核酸ベクター構築物を提供する。本発明は、配列番号：１１、１３、１５、または１７で示される核酸のＭｍｕｓ８１コーディングドメインセグメントを含むベクター構築物も提供する。
【００２６】
本明細書における「発現可能な導入遺伝子」なる用語は、Ｈｍｕｓ８１またはＭｍｕｓ８１タンパク質と同じ機能および／または同じもしくは類似の生物活性を有する、そのようなタンパク質の発現を引き起こす適当なヌクレオチド配列を意味する。導入遺伝子は、例えば、ゲノムに統合されたＤＮＡまたは染色体外状態のＤＮＡを含む、哺乳動物細胞（例えばヒトまたはマウス）から単離されたゲノム核酸または合成核酸を含みうる。導入遺伝子は本明細書に記載のとおり本発明によるタンパク質、または前記タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。生物学的に活性なタンパク質は、Ｍｕｓ８１タンパク質全体としてのタンパク質活性のすべてではないとしてもその一部を有する、Ｍｕｓ８１タンパク質の融合産物、断片、消化断片、セグメント、ドメインなどを意味すると解釈されるべきであるが、これらに限定されることはない。生物学的に活性なタンパク質はしたがって、哺乳動物Ｍｕｓ８１タンパク質の生化学的機能を有する、そのタンパク質の生物学的機能部分を含む。
【００２７】
本発明は、真核細胞または原核細胞に関わらず、ウイルスベクターへの取り込みに適した、またはｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質発現に適した、宿主細胞の形質転換に適した核酸ベクターを含む。タンパク質の原核細胞発現のために特に好ましい宿主細胞には、大腸菌などの細菌細胞が含まれるが、これらに限定されることはない。タンパク質の真核細胞発現に適した宿主細胞には、ヒトもしくはマウス由来の哺乳動物細胞など、または酵母細胞が含まれるが、これらに限定されることはない。好ましい実施形態において、以下に記載するとおり、タンパク質の発現は固定化ヒト細胞のウイルスベクターによる形質転換によって達成される。
【００２８】
本発明はさらに、ヒトＭｕｓ８１またはマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、融合タンパク質産物の生成のための他の核酸と直列に、またはそうではなく共に含む。ヒトＭｕｓ８１融合タンパク質は、配列番号：１、３、７、および９として記載のヌクレオチド配列中に示されるコーディングドメインセグメントとして示される核酸によってコードされるタンパク質の少なくとも１つのセグメントを含むことになる。同様に、マウスＭｕｓ８１融合タンパク質は、配列番号：１１、１３、１５、および１７で示される核酸のコーディングドメインセグメントによってコードされるタンパク質の少なくとも１つのセグメントを含むことになる。
【００２９】
本発明は、標的細胞における取り込みおよび発現のための裸のＤＮＡ形質転換体ベクターとして使用するために構成された、核酸セグメントを含む単離核酸または核酸ベクター構築物も含む。同様に、アンチセンスＤＮＡ、三重らせん核酸、二重らせんＲＮＡなどのヒトＭｕｓ８１またはマウスＭｕｓ８１コーディング核酸転写物の阻害物質も提供される。生物学的に活性なアンチセンスＤＮＡ分子調合物は、標的となるヌクレオチド配列の隣接部分に相補的であるか、または非連続部分に相補的であるかに関わらず、ヒトＭｕｓ８１もしくはマウスＭｕｓ８１コーディング遺伝子またはその断片のヌクレオチド配列の相補鎖であって、細胞におけるヒトＭｕｓ８１またはマウスＭｕｓ８１タンパク質発現の阻害物質である調合物である。そのような阻害物質および阻害は、細胞周期チェックポイント経路のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析、阻害または強化化合物の検出および／または評価、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ療法を含む多くの目的のために有用であるが、目的はこれらに限定されることはない。
【００３０】
本発明は、ヒトＭｕｓ８１もしくはマウスＭｕｓ８１コーディング遺伝子、またはその断片のヌクレオチド配列をコードする改変ヌクレオチドあるいは置換主鎖成分を組み込む組成物も提供する。
【００３１】
本発明は、ヒトＭｕｓ８１またはマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸の少なくとも一部の相補鎖である核酸を含むアンチセンス核酸の使用を含む。ペプチド核酸、ホスホン酸メチルおよび２−Ｏ−メチルリボ核酸からなる群より選択されるこのアンチセンス分子の生物学的に活性な類縁体も考えられる。本発明のアンチセンス分子は、ホスホロチオエート類縁体であってもよい。
【００３２】
同様に、細胞におけるＨｍｕｓ８１タンパク質の発現または機能を阻害するための医薬調製物であって、前記細胞に入ること、およびＨｍｕｓ８１タンパク質をコードする核酸分子に特異的に結合することが可能なアンチセンス核酸類縁体を含む調製物も含まれる。アンチセンス核酸は医薬として許容される担体中に存在し、配列番号：１、３、７、９または２５の核酸の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を有する。この医薬調製物は少なくとも配列番号：２、４、８、または１０のアミノ酸残基配列のアミノ酸残基１〜５０をコードするヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸を含みうることも考えられる。好ましい実施形態において、医薬調製物は配列番号：１、３、７、９または２５で示されるヌクレオチド配列におけるコーディングドメインセグメントの少なくともヌクレオチド１〜２０に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を含む。最も好ましい実施形態において、アンチセンス核酸は配列番号：１、３、７、９または２５で示されるヌクレオチド配列におけるコーディングドメインセグメントの少なくともヌクレオチド１〜１０に相補的な配列を有する核酸を含む。
【００３３】
本発明は、トリプレットコドンの知識を考慮して同義語コドン置換に基づく配列番号：２、４、８または１０で示されるアミノ酸配列を有するＨｍｕｓ８１タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、配列番号：１、３、７、９、または２５で示されるヌクレオチド配列のコーディングドメインセグメントに基づき、それらがコードするアミノ酸も含む。特定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするいかなるヌクレオチド配列をも生成するための、等価の同義語核酸コードは当業者には知られており、予測することができる。
【００３４】
好ましい実施形態において、核酸が配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７または２５で示されるヌクレオチド配列のタンパク質コーディングドメインセグメントを含むように改変されている場合であって、標的宿主細胞において最も好ましくないコドンが最も好ましいコドンで置換されている場合などに、コドン使用頻度を最適化して標的宿主細胞にとって望まれるようにタンパク質の発現を増大させる。ヒト標的宿主細胞の場合、最も好ましくないコドンはｇｇｇ、ａｔｔ、ｃｔｃ、ｔｃｃ、およびｇｔｃである。
【００３５】
本発明は、ヒトＭｕｓ８１もしくはマウスＭｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質、またはその断片を、組換えＤＮＡ技術およびヒトＭｕｓ８１またはマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードする適当な核酸を用いることによって生成する方法も提供する。本発明は、適当なヌクレオチド配列を適当な発現ベクターに組み込むこと、誘導性または構成性のいずれかで発現されたリボソーム結合部位、プロモーター、および／またはエンハンサーなどの適当な制御因子の組込みも提供する。本発明は、発現ベクターの、少なくとも１つの他の選択可能なマーカーまたは発現可能タンパク質を伴う、または伴わない使用を提供する。本発明は、適当に構築された発現ベクターが適当な宿主細胞中に形質転換、あるいは導入されており、タンパク質がそのような宿主細胞によって発現される方法を提供する。本発明は、ヒトＭｕｓ８１もしくはマウスＭｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質、またはその断片を産生することができる、形質転換された宿主細胞も提供する。本発明による前記核酸を含む発現ベクターは、例えば遺伝子療法などのｉｎ  ｖｉｖｏで有利に用いることができる。
【００３６】
本発明は、組換えＤＮＡ技術によって産生され、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現された、哺乳動物、例えばヒトまたはマウスＭｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質、およびその生物学的に活性な部分を含む。タンパク質の生物学的に活性な部分は、同様の条件下で比較した時に、哺乳動物Ｍｕｓ８１タンパク質全体の酵素活性または少なくともそのいくらかの酵素活性を有するタンパク質セグメントまたは断片である。例えば、前記核酸によってコードされるタンパク質配列に影響をおよぼさないか、または本発明による生物学的に活性な機能性タンパク質をコードする、ヌクレオチドの置換または欠失を通常の技法を用いて導入しうることを、当業者であれば容易に理解するであろう。酵素による消化、またはタンパク質をコードする核酸の改変により断片を生成するためのタンパク質の操作によって、哺乳動物Ｍｕｓ８１タンパク質の生物学的に活性な部分を同様に得ることができる。
【００３７】
哺乳動物Ｍｕｓ８１タンパク質の完全タンパク質、融合タンパク質およびその生物学的に活性な部分は、治療用調合物、診断検査、および例えばそれに対する抗体を生成するための免疫原として有用である。したがって本発明は、小規模または大規模製造で形質転換された宿主細胞によって産生された、Ｈｍｕｓ８１およびＭｍｕｓ８１タンパク質を含む。本発明は、真核または原核細胞のいずれかによって産生された完全Ｈｍｕｓ８１およびＭｍｕｓ８１タンパク質を、グリコシル化または非グリコシル化のいずれかの型で含む。本発明は、当技術分野において知られているとおり、適当な形質転換ベクターを用いて、哺乳動物、昆虫、植物、細菌、真菌、または任意の他の適当な宿主細胞から発現されたＨｍｕｓ８１およびＭｕｓ８１タンパク質を提供する。本発明は、固体支持体に結合された融合タンパク質産物として産生されたＨｍｕｓ８１およびＭｕｓ８１タンパク質、または任意の化学、放射性、蛍光、化学発光もしくは他の検出可能なマーカーで標識されたＨｍｕｓ８１およびＭｍｕｓ８１タンパク質を含む。
【００３８】
本発明は、天然供給源から単離され、天然で見られるものよりも純度が高い、Ｈｍｕｓ８１およびＭｕｓ８１タンパク質も提供する。同様に、Ｈｍｕｓ８１およびＭｍｕｓ８１タンパク質の医薬調合物ならびに医薬として許容される担体または賦形剤中のＨｍｕｓ８１およびＭｍｕｓ８１タンパク質の調合物も提供される。
【００３９】
本発明は、配列番号：２、４、８、もしくは１０で示されるアミノ酸残基配列、またはアミノ酸残基配列の免疫原性断片を有するヒトＭｕｓ８１タンパク質、あるいは配列番号：１２、１４、１６もしくは１８で示されるアミノ酸残基配列を有するマウスＭｕｓ８１タンパク質による哺乳動物の免疫化によって生成されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかとして、ヒトＭｕｓ８１もしくはマウスＭｕｓ８１タンパク質、または両方に特異的に結合する特異抗体を生成するための、ヒトＭｕｓ８１もしくはマウスＭｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質、またはその生物学的に活性な断片の使用も含む。免疫原性断片は、免疫原性条件下で免疫適格宿主に注入されるとき、免疫応答を誘発し、その免疫原生断片に特異的な抗体を生じるものである。
【００４０】
本発明は、ヒトＭｕｓ８１タンパク質（配列番号：２、４、８、１０）またはマウスＭｕｓ８１タンパク質（配列番号：１２、１４、１６、１８）をコードするアミノ酸配列において示されるアミノ酸残基のアミノ酸置換がなされている等価のタンパク質も含む。そのようなアミノ酸置換には、等価であると合理的に予測できる類似アミノ酸残基の保存的置換、または溶解性、グリコシル化、もしくはタンパク質発現に対する合理的に予測可能な影響を有する半保存的置換が含まれる。例えば、非極性（疎水性側鎖）アミノ酸であるアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；非荷電極性アミノ酸であるグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；荷電極性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性アミノ酸であるリシン、アルギニン、およびヒスチジンは、置換されたときに機能的に予測可能な影響を有することが、当業者には理解されるであろう。アミノ酸置換は、改変アミノ酸残基または化学的に変更された置換体によるアミノ酸残基の置換も含む。
【００４１】
本発明は、そのような等価タンパク質をコードする核酸、およびヒトＭｕｓ８１タンパク質またはマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードするその実施形態も含む。特定の改変は、改変された核酸がまだヒトＭｕｓ８１またはマウスＭｕｓ８１タンパク質をコードする一方で、標的宿主細胞にとって好ましいコドンを利用するように、本発明のヒトＭｕｓ８１またはマウスＭｕｓ８１コーディング遺伝子に対応する核酸で用いられるコドンにより行うこともできる。これは、標的宿主細胞によって用いられる、あまり好ましくないコドンの数を減少させる、および／または好ましいコドンの数を増加させる保存的同義語コドン置換によって達成することができる。本発明は、例えばヌクレオチド間結合の改変、塩基の改変、糖の改変、非放射性標識、核酸の架橋、およびＰＮＡ（ポリペプチド核酸）を含む主鎖の変更を組み込む、改変された核酸も含む。
【００４２】
Ｈｍｕｓ８１がチェックポイント／修復タンパク質としてはたらき、ＤＮＡ修復に関与している見込みが高いという知見により、異常なＤＮＡ損傷チェックポイント／修復機能に関与するか、または標的細胞におけるＤＮＡ修復を有利に阻害する、疾患の治療において本発明の化合物を用いることが可能になる。本発明は、癌の治療薬としての本発明の化合物の使用をさらに提供する。１つの実施形態において、本発明の正常なタンパク質および／または遺伝子の機能を阻害する阻害物質または薬剤は、化学療法剤、放射線、ＤＮＡ損傷物質、または複製阻害物質による治療に対して細胞を増感するために有用であると考えられる。
【００４３】
本発明は、真核細胞のＭｕｓ８１仲介性チェックポイント／修復機能を作用させる際の有効性に関する、試験化合物のスクリーニング法も含む。これらの方法は、試験化合物を真核細胞に接触させることと、哺乳動物Ｍｕｓ８１の発現または機能に変化があればそれを検出することとを含む。同様に、化合物を投与し、Ｈｍｕｓ８１またはＭｍｕｓ８１遺伝子の発現または機能における変化の検出を、Ｈｍｕｓ８１もしくはＭｍｕｓ８１  ｍＲＮＡ産生をアッセイすること、またはＨｍｕｓ８１もしくはＭｍｕｓ８１タンパク質発現をアッセイすることによって達成するスクリーニング法も含まれる。特定の遺伝子の発現レベルの変化を検出する方法は、当技術分野において知られている。特に、本発明は、哺乳動物Ｍｕｓ８１タンパク質のヌクレアーゼ、リン酸化もしくはキナーゼ活性における変化があればそれをスクリーニングすることにより、哺乳動物Ｍｕｓ８１仲介性ＤＮＡ損傷チェックポイント／修復またはＤＮＡ修復機能を改変する際の有効性に関する候補物質のスクリーニングを可能にする。本発明のアッセイによって特定された化合物もしくは物質、またはそのような化合物もしくは物質に対応する化合物を、治療用医薬の製造のために用いることができる。
【００４４】
Ｍｕｓ８１依存性細胞周期経路を調節する化合物の特定法も同様に提供される。そのような方法は、試験する化合物を宿主細胞に投与することと、前記細胞中の哺乳動物Ｍｕｓ８１タンパク質の量を検出することと、検出された量を正常な未処置細胞と比較することとを含む。Ｍｕｓ８１依存性細胞周期経路を調節する化合物を特定する方法であって、試験する化合物をＨｍｕｓ８１タンパク質および適当な基質の生化学混合物に投与することと、前記混合物中のＨｍｕｓ８１タンパク質活性のレベルを検出することと、検出された活性を正常な未処置のＨｍｕｓ８１タンパク質の生化学混合物と比較することとを含む方法もさらに提供される。下記の実施例に示すとおり、単離Ｈｍｕｓ８１タンパク質および適当な基質は単離化学反応において測定することができる。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明は、Ｈｍｕｓ８１タンパク質、Ｈｍｕｓ８１核酸、またはＨｍｕｓ８１アンチセンス核酸を含む医薬組成物も提供する。治療用Ｈｍｕｓ８１タンパク質は通常、タンパク質に望まれる特徴に応じてグリコシル化、改変、または脱グリコシル化することができる。同様に、Ｈｍｕｓ８１タンパク質は長いもしくは短い完全タンパク質、融合産物、またはその機能性もしくは免疫原性断片を含む。Ｈｍｕｓ８１核酸は長いもしくは短いタンパク質全体、タンパク質の一部、融合タンパク質産物、およびその断片をコードするものを含む。同様に、置換塩基類縁体、改変塩基、ＰＮＡを組み込むもの、および好ましいコドン使用頻度を組み込むものを含む核酸の改変型も含まれる。アンチセンス核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその類縁化合物でありうる相補的核酸の完全、部分もしくは不連続セグメントを有する、標的核酸に特異的に結合することができる相補的核酸を含む。もう１つの実施形態において、本発明は、本発明のアッセイによって医薬調合物における治療薬としての使用に適していると特定された化合物または物質を提供する。これらの医薬組成物は、癌の治療において用いる化学療法剤をさらに含むか、または他の抗癌療法の投与と協調した治療法において投与することができる。本発明は、１つの実施形態において、Ｈｍｕｓ８１由来医薬を独立に、および他の化学療法剤との組み合わせで、かつ第２の実施形態において、単回用量投与のための他の抗癌治療薬との混加物として用いる併用化学療法のための方法を含む。
【００４６】
同様に、マウスＭｕｓ８１タンパク質、またはタンパク質をコードする核酸を用いて、マウスまたはマウス以外の哺乳動物細胞の細胞周期を調節することができる。マウスＭｕｓ８１タンパク質をコードする核酸を用いて、ヒトＭｕｓ８１タンパク質と同様の様式で、医薬検出法およびキット、ならびにアッセイシステムにおいて用いるために、組換え手段によってマウスＭｕｓ８１タンパク質を産生することができる。
【００４７】
本発明は、図１Ａ（配列番号：２）、図１Ｂ（配列番号：４）、図１Ｃ（配列番号：８）、図１Ｄ（配列番号：１０）に示されるアミノ酸配列を含む、ヒトＭｕｓ８１タンパク質、もしくは図２Ａ（配列番号：１２）、図２Ｂ（配列番号：１４）、図２Ｃ（配列番号：１６）、図２Ｄ（配列番号：１８）に示されるアミノ酸配列を含む、マウスＭｕｓ８１タンパク質、あるいはその生物学的に活性な機能等価物もしくは生物前駆体または生物学的に活性な断片を発現することが可能な導入遺伝子を含む、トランスジェニック細胞、形質転換細胞、組織または生物を提供する。また、そのような形質転換宿主細胞によって産生される単離タンパク質を提供する。
【００４８】
図面の簡単な説明
具体的な実施形態の詳細な記述、および本明細書に示す特許請求の範囲と組み合わせて、１つまたは複数の以下の図面を参照することによって、本発明をさらに良く理解することができる。
【００４９】
図１は、ヒトＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその翻訳産物のアミノ酸配列を示す。図１Ａは、５５１個のアミノ酸タンパク質Ｈｍｕｓ８１（１）（配列番号１および２）をエンコードしている小脳のｃＤＮＡライブラリーからの、ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を示す。図１Ｂは、４５５個のアミノ酸タンパク質Ｈｍｕｓ８１（２）（配列番号３および４）をエンコードしているＩＭＡＧＥ１２８３４９のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。図１Ｃは、４２４個のアミノ酸タンパク質Ｈｍｕｓ８１（３）（配列番号７および８）をエンコードしている小脳のｃＤＮＡライブラリーからの、ＰＣＲ産物の配列を示す。図１Ｄは、５５２個のアミノ酸タンパク質Ｈｍｕｓ８１（４）（配列番号９および１０）をエンコードしている小脳のｃＤＮＡライブラリーからの、ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を示す。
【００５０】
図２は、マウスＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその翻訳産物のアミノ酸配列を示す。図２Ａは、Ｍｍｕｓ８１（１）および５５１個のアミノ酸の長さの翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１および１２）をエンコードしている核酸を示す。図２Ｂは、Ｍｍｕｓ８１（２）および４２４個のアミノ酸の長さの翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３および１４）をエンコードしている核酸を示す。図２Ｃは、Ｍｍｕｓ８１（３）および５３１個のアミノ酸の長さの翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５および１６）をエンコードしている核酸を示す。図２Ｄは、Ｍｍｕｓ８１（４）および５２１個のアミノ酸の長さの翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７および１８）をエンコードしている核酸を示す。
【００５１】
図３は、マウス（Ｍｍ）（Ｍｍｕｓ８１；配列番号１２）、ヒト（Ｈｓ）（Ｍｍｕｓ８１；配列番号１０）、Ｓ．ｐｏｍｂｅ（Ｓｐ）（Ｓｐｍｕｓ８１；配列番号６）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃ）Ｍｕｓ８１（Ｓｃｍｕｓ８１；配列番号５）のアミノ酸配列のアラインメントを図式的に示す。すべてのタンパク質中に保存されているアミノ酸を黒色で際だたせ、２つ以上のタンパク質に保存されているアミノ酸をグレーで際だたせる。赤色で下線を引いた配列は、エンドヌクレアーゼのＸＰＦファミリーの保存触媒ドメインに対応する。
【００５２】
図４。ヒトＭｕｓ８１のゲノム構造およびスプライシング変異。太線はゲノム配列を示し、ボックスはエクソンの位置を示す。エクソンおよびイントロンのサイズ（ｂｐ）は、それぞれゲノム断片の上および下に示す。エクソン１３および１４の周辺で起こり、Ｍｕｓ８１１、Ｍｕｓ８１４、およびＭｕｓ８１３に対応する選択的スプライシングを細線によって示す。Ｍｕｓ８１２は同定されているエクソンすべてを使用している。
【００５３】
図５。ＦＩＳＨ分析によるヒトＭｕｓ８１の染色体局在部位決定。（Ａ）蛍光Ｍｕｓ８１ｃＤＮＡプローブで標識した染色体の中期拡散体（左のパネル）および対応するＤＡＰＩ染色（右のパネル）。（Ｂ）１０個の代表的な中期拡散体からのハイブリダイゼーションシグナルの位置に関する染色体１１の染色体図。
【００５４】
図６。ヒトＭｕｓ８１のノーザンブロット分析。ヒト組織（Ｈ１およびＨ２）およびガン細胞株（Ｃ）。
【００５５】
図７。Ｍｕｓ８１−ＧＦＰ（ＧＦＰ：たとえばＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色の蛍光タンパク質）融合タンパク質の細胞内局在部位決定。Ａ５４９細胞は導入後３日目に、Ｈｍｕｓ８１−ＧＦＰ融合体を発現しているレトロウイルスにより感染させた。
【００５６】
図８。ヒトＭｕｓ８１およびＣｄｓ１の共免疫沈降。タグ付けＭｕｓ８１およびＣｄｓ１を別々にまたは一緒に発現している細胞からの溶解物（Ｌ）および免疫沈降物（ＩＰ）のウエスタンブロット。Ｍｕｓ８１およびＣｄｓ１に対応するバンドは矢印で示す。ＨＡ抗体と交差反応するタンパク質に対応するバンドは、上部パネルにおいて星印によって示す。免疫グロブリン重鎖は下側パネルにおいて矢印で示す。
【００５７】
発明の詳細な説明
本発明は一態様において、ヒトＭｕｓ８１タンパク質およびネズミＭｕｓ８１タンパク質などの、新規な哺乳動物の細胞周期チェックポイント／修復タンパク質をエンコードしている単離した核酸を提供する。本発明の核酸は、組換えＤＮＡ技法を使用してヒトＭｕｓ８１およびネズミＭｕｓ８１タンパク質を生成させるため、裸の核酸ベクターとして標的宿主細胞を形質転換するため、またはプロモーター、エンハンサー、またはサプレッサーなどの核酸調節要素と組み合わせて発現ベクター構築体として構築されるときに有用である。有利には、ガンおよび他の増殖性疾患の治療のために、本発明による核酸分子を医薬として、または標的細胞の細胞周期チェックポイント／修復機能を調整するための医薬の調製において使用することができる。
【００５８】
本発明は単離した／組換えによって生成したヒトおよびネズミＭｕｓ８１タンパク質、およびタンパク質アナログも提供する。組換えによって生成した本発明のヒトＭｕｓ８１またはネズミＭｕｓ８１タンパク質を、標的宿主細胞の細胞周期および／またはチェックポイント／修復経路を調整するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで有利に使用することができる。本発明の単離したヒトＭｕｓ８１またはネズミＭｕｓ８１タンパク質を使用して、ヒトＭｕｓ８１タンパク質および／またはネズミＭｕｓ８１タンパク質に特異的に結合する抗体を生成することができ、この場合このような抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであってもよい。有利には、ガンおよび他の増殖性疾患の治療のために、本発明によるタンパク質分子を医薬として、または標的細胞の細胞周期チェックポイント／修復機能を調整するための医薬の調製において使用することができる。
【００５９】
単離した（組換えによって生成した）ヒトおよび／またはネズミＭｕｓ８１は、ヒトＭｕｓ８１またはネズミＭｕｓ８１タンパク質と関係がある細胞周期チェックポイント／修復機構を調整するための能力に関して化学的またはタンパク質化合物を試験および／または評価するために、他のタンパク質と組み合わせてｉｎ  ｖｉｔｒｏの生化学システムとして使用することもできる。ヒトＭｕｓ８１またはネズミＭｕｓ８１タンパク質の生化学的混合物は、単離した酵素、適切なイオンおよび／または補因子、および適切な基質を含むはずである。好ましい生化学的混合物は、たとえばエネルギー、または蛍光光線を放出すること、または放出される光線の波長を変えることによって、または特定の形のＭｕｓ８１タンパク質に特異的な抗体分子による結合を変えることによって、Ｍｕｓ８１タンパク質の酵素活性が基質に加えられるときに、検出可能に変化する（または状態の変化をシグナルする）適切な基質を含もう。
【００６０】
本発明の単離した核酸、それらがエンコードするヌクレオチド配列は、単離したＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ヌクレオチドアナログ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで核酸中に同じ（または非常に関係のある）ヌクレオチド配列を含む核酸を模倣し、これに相補的に結合し、および／またはそうでなければ標識することができる標識された核酸構築体を提供する。本発明の核酸は修飾ヌクレオチドおよび核酸塩基アナログを取り込むことができることが考えられ、このことは当分野で知られている（たとえばＶｅｒｍａ他の１９９８、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４を参照のこと）。本発明の単離した核酸は生物学的に活性があるアンチセンス分子である可能性があり、これは核酸の相補的な結合によって標的核酸にハイブリダイズし、これによって標的核酸の発現を調整することができる。
【００６１】
有利には、ガンおよび他の増殖性疾患の治療のために、本発明によるアンチセンス分子を医薬として、または標的細胞の細胞周期チェックポイント／修復機能を調整するための医薬の調製において使用することができる。適切な生物学的に活性があるアンチセンス核酸は、このような核酸の安定性または（２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−ＭＯＥ））などのヌクレアーゼへの耐性、オリゴヌクレオチドの修飾を改善するための修飾ヌクレオチド塩基などを含む（ＭｃＫａｙ他、１９９９、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＰＫＣ−ａｌｐｈａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７１５−１７２２）。好ましいアンチセンス核酸分子は少なくとも１０残基の長さ、好ましくは２０残基の長さであり、遺伝子転写物からの機能的タンパク質の翻訳を結果として阻害する遺伝子転写物の一部分を対象とする。
【００６２】
本発明は有利には、本発明による核酸の隣接部分と相補的である少なくとも約１５個のヌクレオチドのヌクレオチド配列も提供する。これらの相補的配列をプローブまたはプライマーとして使用して、複製を開始させること、本発明のヌクレオチド配列を有する核酸の存在を検出すること、またはサンプルから所望の核酸のセグメントを特異的に増幅させることことができる。たとえば組換えまたは合成手段などによる当分野でよく知られている技法に従って、このような相補的ヌクレオチド配列を生成することができる。サンプル中の標的核酸の一部分を特異的に増幅するために適切に調整し作製したプライマーは、本発明による核酸の存在を検出するために、診断キットなどにおいて使用することができる。一般にこれらの試験は、ハイブリダイズ条件下でプローブとサンプルを接触させること、プローブとサンプル中の任意の核酸の間の任意のデュプレックスまたはトリプレックス形成の存在を検出することを含む。
【００６３】
有利には、組換えまたは合成手段を使用して、たとえばＰＣＲクローニング機構などを使用して、本発明を具体化するヌクレオチド配列を生成することができる。一般にＰＣＲクローニング機構は１対のプライマー（クローン化を望む遺伝子の領域への約１５〜５０個のヌクレオチド）を作成すること、そのプライマーをヒト細胞からのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うこと（必要な場合、最初に逆の転写ステップを行う）、増幅した領域または断片を単離し、増幅したＤＮＡを回収することを含む。有利には、たとえば一定範囲の個体、たとえば異なる個体群からゲノムＤＮＡライブラリーを探索すること、および他の遺伝子型決定技法によって、本発明による核酸のヒト対立遺伝子変異体を得ることができる。さらに、本発明による核酸およびプローブを使用して、患者からのゲノムＤＮＡを配列決定することができる。これはたとえば、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ鎖停止法などの当分野でよく知られている技法を使用し、この方法は有利には患者の任意の素質を確認して増殖性障害を確認することができる。
【００６４】
配列番号１、３、７および９に対応する核酸において使用されるコドンの特異的な修飾は、修飾核酸がＭｍｕｓ８１タンパク質をエンコードしながら、標的宿主細胞によって好まれるコドンを使用するようなものであってよい。同様に本発明は、配列番号１１、１３、１５および１７に対応する核酸において使用されるコドンの特異的な修飾を含み、修飾核酸がＭｍｕｓ８１タンパク質をエンコードしながら、標的宿主細胞によって好まれるコドンを使用する。本発明は修飾核酸も含み、これはたとえば内部ヌクレオチド結合修飾体、塩基修飾体、糖修飾体、非放射性標識、核酸の交差結合、ＰＮＡ（ポリペプチド核酸）を含む変化したバックボーン、およびコドン置換体を取り込み、あまり好ましくないコドンの数を減少させ、および／または標的宿主細胞によって使用される好ましいコドンの数を増大させる（Ｚｈａｎｇ他の１９９１、「Ｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  １４９０  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｇｅｎｅ１０５（１）：６１−７２、Ｚｈａｎｇ他の１９９３、「Ｌｏｗ−ｕｓａｇｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｙｅａｓｔ、ｆｒｕｉｔ  ｆｌｙ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｔｅｓ」Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２（３）：３２９−３３５を参照のこと）。
【００６５】
本発明の一態様によれば、配列番号２、４、８または１０で示されるアミノ酸残基配列を有するＨｍｕｓ８１タンパク質をエンコードしているか、あるいは機能的に均等な断片、または前記タンパク質の生前駆体をエンコードしている核酸が提供される。本発明の他の態様によれば、配列番号１２、１４、１６または１８で示されるアミノ酸残基配列を有するＨｍｕｓ８１タンパク質をエンコードしているか、あるいは機能的に均等な断片、または前記タンパク質の生前駆体をエンコードしている核酸が提供される。
【００６６】
核酸はゲノムＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子であることが好ましく、ｃＤＮＡ分子であることがさらに好ましい。しかしながら、それはＲＮＡであってもよい。当業者によく知られているように、トリプレットコドンの遺伝コードの縮重のために、本発明のヌクレオチド配列は、その中に依然として同じアミノ酸残基配列をエンコードしている置換体を含む可能性がある。
【００６７】
本明細書で定義するヌクレオチド配列は、ストリンジェンシーの低い条件下で本発明の核酸から誘導されるヌクレオチド配列とハイブリダイズして、そこからのホモログを同定することができる（または他の種からのヌクレオチド配列を代替的に同定することができる）。
【００６８】
本発明の核酸を発現ベクターに取り込ませて、その後適切な宿主細胞を形質転換、トランスフェクトまたは感染させるために使用することができる。このような発現ベクターでは、本発明による核酸は適切なプロモーターなどのコントロール配列に動作可能に結合しており、適切な宿主細胞中での本発明によるタンパク質の発現を確かなものにする。発現ベクターはプラスミド、コスミド、ウイルスまたは他の適切なベクターであってよい。発現ベクター、およびベクターによってトランスフェクト、形質転換または感染させられる宿主細胞も、本発明の一部を形成する。宿主細胞は真核細胞または細菌細胞であることが好ましく、哺乳動物細胞または昆虫細胞であることがさらに好ましい。哺乳動物の宿主細胞が非常に有利である。なぜなら、これらは本発明に従って発現したタンパク質に必要な翻訳後修飾を提供するからであり（たとえばグリシジル化など）、この修飾によって前記タンパク質の最適な生物学的活性が与えられ、タンパク質を単離して診断キットなどにおいて有利に使用することができる。
【００６９】
本発明の組換えベクターは一般に、プロモーターからの下流に動作可能に位置するＨｍｕｓ８１遺伝子またはＨｍｕｓ８１を含む。このプロモーターは哺乳動物、たとえばヒト細胞中に核酸をエンコードしているヒトＭｕｓ８１またはネズミＭｕｓ８１の発現を指示することができる。したがってこのようなプロモーターは、哺乳動物細胞、たとえばヒト細胞中で「動作可能」である。
【００７０】
本発明を具体化する発現ベクターおよびプラスミドは、ウイルスプロモーターまたは一般に転写を促進する際に活性がある哺乳動物遺伝子からのプロモーターなどの、１つまたは複数の構成的プロモーターを含む。構成的ウイルスプロモーターの例にはＨＳＶ、ＴＫ、ＲＳＶ、ＳＶ４０およびＣＭＶプロモーターがあり、この中ではＣＭＶプロモーターが現在好まれている一例である。構成的哺乳動物プロモーターの例には、β−アクチンプロモーターによって例示されるような、さまざまなハウスキーピング遺伝子のプロモーターがある。
【００７１】
本発明の発現ベクターと共に使用するための、誘導的プロモーターおよび／または調節要素も企図される。適切な誘導的プロモーターの例にはシトクロムＰ４５０遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ホルモン誘導遺伝子（エストロゲン遺伝子プロモーターなど）などの遺伝子からのプロモーターがある。ｆｏｓ、ｊｕｎおよびｅｒｇ−１などのイオン化放射線への暴露に反応して活性化するプロモーターも企図される。テトラシクリンに反応するｔｅｔＶＰ１６プロモーターが現在好まれている一例である。
【００７２】
組織特異的プロモーターおよび／または調節要素は、ある実施形態において有用である。本発明の発現ベクターと共に使用することができるこのようなプロモーターの例には、結腸上皮細胞に特異的な肝臓脂肪酸結合（ＦＡＢ）タンパク質遺伝子、すい臓細胞に特異的なインシュリン遺伝子、肝臓細胞に特異的なトランスフィレチン、α．１−アンチトリプシン、プラスミノゲン活性阻害剤タイプ１（ＰＡＩ−１）、アポリポタンパク質ＡＩおよびＬＤＬのレセプター遺伝子、希突起こう細胞に特異的なミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、グリア細胞に特異的なグリア微小繊維状酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子、目を標的とするのに特異的なＯＰＳＩＮからのプロモーター、および神経細胞に特異的な神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターがある。
【００７３】
発現ベクターおよびプラスミドの構築および使用は、当業者によく知られている。したがって、本明細書で開示する遺伝子に関して、ほぼすべての哺乳動物細胞の発現ベクターを使用することができる。
【００７４】
少なくとも１つの多重クローニングサイトを有する好ましいベクターおよびプラスミドを構築する。ある実施形態では発現ベクターが、プロモーターと遺伝子配列をエンコードしているヒトＭｕｓ８１またはネズミＭｕｓ８１の間に動作可能に位置する１つの多重クローニングサイトを含む。他の実施形態での使用に加えて、第２のタンパク質エンコード型ＤＮＡセグメントをそれがヌクレオチド配列をエンコードしている哺乳動物のＭｕｓ８１に隣接しインフレームになるように多重クローニングサイトにクローニングすることによって、このようなベクターを使用してＮ末端またはＣ末端融合タンパク質を作製することができる。
【００７５】
他の実施形態では発現ベクターが、配列をエンコードしている発現可能なヒトＭｕｓ８１またはネズミＭｕｓ８１からの下流に動作可能に位置する１つの多重クローニングサイトを含む。これらのベクターは（その使用に加えて）第２のタンパク質エンコード型ＤＮＡセグメントをそれがヌクレオチド配列をエンコードしている哺乳動物のＭｕｓ８１に隣接しインフレームになるように多重クローニングサイトにクローニングすることによって、Ｃ末端融合タンパク質を作製する際に有用である。
【００７６】
その中に追加的なタンパク質またはＲＮＡエンコード型核酸セグメントも存在するベクターおよびプラスミドも、核酸セグメント自体の性質に関係なく、当然ながら本発明によって含まれる。
【００７７】
第２のレポーター遺伝子が、本発明の発現ベクター内に含まれていてもよい。第２のレポーター遺伝子が、第２の転写単位中に含まれる可能性もある。適切な第２のレポーター遺伝子には、ネオマイシン、ヒグロマイシン、ピュロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸、ヒスチジノールおよびメトトレキセートなどの作用物質に耐性を与える遺伝子がある。
【００７８】
発現ベクターはＩＲＥＳ要素などの他のヌクレオチド配列、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナー／スプライス受容シグナルなども含むことができる。
【００７９】
適切な発現ベクターの具体例は、組換えアデノウイルス、組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）または組換えレトロウイルスシステムを使用して発現するようになされた発現ベクターである。特にワクチンウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、サイトメガロウイルスおよび不完全Ｂ型肝炎ウイルスも使用することができる。
【００８０】
１つの具体的な実施形態では本発明は、新規な哺乳動物の細胞周期チェックポイント／修復タンパク質をエンコードしている単離した核酸を含む。他の具体的な実施形態では本発明は、Ｈｍｕｓ８１（ヒトＭｕｓ８１）と呼ばれるヒトのソースおよびＭｍｕｓ８１（ネズミＭｕｓ８１）と呼ばれるネズミのソースから単離した核酸から誘導される、新規な哺乳動物の細胞周期チェックポイント／修復タンパク質を含む。
【００８１】
配列番号２、４、８または１０で示されるアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列、または機能的に均等な融合タンパク質産物のアミノ酸配列を有する単離したタンパク質、前記タンパク質の断片または生前駆体が、本発明によってさらに提供される。配列番号１２、１４、１６または１８で示されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、または機能的に均等な融合タンパク質産物のアミノ酸残基配列を有する単離したタンパク質、生物学的に活性がある前記タンパク質の断片または生前駆体も、本発明によって提供される。これらのタンパク質のアミノ酸配列またはその断片に特異的に結合する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を生成させるための、このようなタンパク質の使用も考えられる。当業者によく知られているように、本発明によるタンパク質は保存型または半保存型置換体、欠失体、挿入体を含むことができ、このタンパク質は図１および図２中に開示するアミノ酸とは異なるアミノ酸を含む。
【００８２】
本発明のタンパク質は実質的に精製された形であってよく、この場合このタンパク質は一般に調製物中にポリペプチドを含むはずであり、この調製物中の９０％を超える、たとえば９５％、９８％、または９９％のポリペプチドが本発明のポリペプチドである。たとえばヒスチジン残基を加えることによってその精製を手助けするよう、シグナル配列を加えることによって細胞からのその分泌を助長するよう、本発明のタンパク質を修飾することができる。配列番号２、４、８または１０で示されるポリペプチドタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性、たとえば９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するタンパク質は、配列番号２、４、８または１０で示されるタンパク質のアミノ酸配列変異体、対立遺伝子、誘導体、または突然変異体であるタンパク質であり得、これらも本発明によって提供される。同様に、配列番号１２、１４、１６または１８で示されるポリペプチドタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性、たとえば９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するタンパク質は、配列番号１２、１４、１６または１８で示されるタンパク質のアミノ酸配列変異体、対立遺伝子、誘導体、または突然変異体であるタンパク質であり得、これらも本発明によって提供される。
【００８３】
参照配列（すなわち配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８）と問題の配列を比較する市販のアルゴリズムを使用することによって、タンパク質のアミノ酸残基配列の同一性のパーセンテージを計算することができる。デフォルトパラメータと共に使用することができる以下のプログラム：ＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮおよびｐｓｉ−ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩによって提供される）を使用して、相同性を判定することができる。本明細書で「相同性」または「相同的な」という語のいずれかを使用することは、比較する配列間のいかなる必要な進化関係も示さず、２つのヌクレオチド配列が適切な条件下で組換えられるほど充分に同等であることを単に必要とする「相同的な組換え」という語の標準的な使用と調和する。
【００８４】
ヌクレオチド配列（またはその一部分）と問題の配列の間の、最良の全体的な整合性を判定するための他の方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ他（１９９０、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈｅｓ」Ｃｏｍｐｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用することである。このプログラムは、グローバルな配列アラインメントを提供する。このようなグローバルな配列アラインメントの結果は、同一性のパーセントとして表される。同一性の程度を計算するための、ヌクレオチド配列のＦＡＳＴＤＢサーチにおいて使用するのに適したパラメータは知られている。
【００８５】
問題の配列が配列番号２、４、８または１０の配列と少なくとも９０％の同一性を有すると判定される場合、前記配列はＨｍｕｓ８１と同じ活性を保持するタンパク質の配列であり、このような配列は本発明に含まれる。同様に、問題の配列が配列番号１２、１４、１６または１８の配列と少なくとも９０％の同一性を有すると判定される場合、前記配列はＨｍｕｓ８１と同じ活性を保持するタンパク質の配列であり、このような配列は本発明に含まれる。
【００８６】
好ましい断片は、本発明によるタンパク質のエピトープを含む断片である。たとえば当分野において記載されるようなペプチドスキャニング技法（Ｇｅｙｓｅｎ他の１９８６、「Ａ  ｐｒｉｏｒｉ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｈｉｃｈ  ｍｉｍｉｃｓ  ａ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ」Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３；７０９−７１５を参照のこと）を使用して、このエピトープを判定することができる。
【００８７】
当業者に知られる技法（たとえば、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｏｕｎｄ、Ｊ．Ｄ．ｅｄ．、１９９８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．８０、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．）に従って、本発明によるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成することができる。たとえば、マウス、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ハムスター、ラットなどの宿主動物に本発明によるタンパク質またはエピトープを接種させ、その免疫血清を回収することによって、ポリクローナル抗体を生成することができる。本発明は、たとえばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片などのその結合活性を維持している抗体全体の断片、および単鎖の抗体も含む。
【００８８】
本発明による核酸および／またはタンパク質は、医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に医薬組成物中に含まれてもよい。本発明による前記核酸を含む医薬組成物は、たとえば遺伝子治療において使用することができる。本発明によるこのような核酸は裸の状態、またはタンパク質カプセル、脂質カプセル、リポソーム、膜ベースのカプセル、ウイルスタンパク質、ウイルス全体、細胞ベクター、細菌性細胞宿主、変化した哺乳動物細胞宿主、または投与するのに適した手段にパッケージして投与することができる。
【００８９】
生物学的サンプル中の本発明による核酸の存在（または不在）を検出するための方法が、本発明によってさらに提供され、この方法は以下のことを含む。（ａ）ハイブリダイズ条件下で前記サンプルを核酸を含むプローブまたは本発明によるプローブに接触させること、（ｂ）たとえば前記プローブと前記サンプル中に存在する任意の核酸の間の任意のデュプレックスまたはトリプレックス形成の存在によって、ハイブリダイゼーションの存在を検出すること。本発明によるタンパク質は以下のことによっても検出することができる。（ａ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、本発明によるタンパク質のエピトープに対する抗体と前記サンプルを接触させること、（ｂ）任意の抗原−抗体複合体の存在を監視すること。
【００９０】
核酸およびタンパク質を検出するためのキットも、本発明によって提供される。生物学的サンプル中の本発明による核酸の存在を検出するためのキットは、（ａ）サンプルを核酸を含むプローブまたは本発明によるプローブに接触させるための手段、および前記プローブと前記サンプル中に存在する任意の核酸の間の任意のデュプレックスまたはトリプレックス形成の存在を検出するための手段を含むことができる。
【００９１】
同様に、生物学的サンプル中の本発明によるタンパク質の存在を検出するためのキットは、（ａ）抗体−タンパク質複合体の形成を可能にする条件下で、本発明によるタンパク質のエピトープに対する抗体と前記サンプルを接触させるための手段、（ｂ）任意のタンパク質−抗体複合体の存在に関して前記サンプルを監視するための手段を含むことができる。
【００９２】
本発明の他の態様は、ある化合物が哺乳動物の細胞周期および／またはチェックポイント／修復経路のタンパク質の発現または活性の、阻害剤または活性剤であるかどうかを判定する方法を提供する。この方法は、タンパク質を発現している細胞を前記経路において前記化合物と接触させること、前記細胞のチェックポイント／修復経路の任意のタンパク質の発現レベルを前記化合物と接触していない細胞と比較することを含む。したがって、ガンまたは増殖性障害を治療するために、同定される任意の化合物を医薬としてあるいは医薬の調製において有利に使用することができる。代替的に、化合物は医薬として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と共に医薬組成物中に含まれてもよい。同定される任意の化合物、または細胞のチェックポイント／修復経路の阻害剤として同定される化合物に対応する任意の化合物は、ＤＮＡ損傷化学療法剤などの細胞毒剤、医薬として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と共に本発明による医薬組成物中に含まれてもよい。したがって、細胞のチェックポイント／修復阻害剤は、たとえば抗ガン治療において使用される細胞毒剤の化学療法効果を高めることができる。
【００９３】
抗ガン治療用の候補物質をスクリーニングするための方法も本発明によって提供され、この方法は以下のことを含む。（ａ）キナーゼが基質に作用する条件下において、キナーゼ活性を示す本発明によるタンパク質および前記タンパク質用の基質を提供すること、（ｂ）タンパク質および基質を候補物質と接触させること、（ｃ）タンパク質のキナーゼ活性のいかなる増加（または低下）の度合いも測定すること、（ｄ）活性の増加（または低下）を与える候補物質を選択すること。ガンまたは他の増殖性細胞障害を治療するために、このような候補物質を医薬としてあるいは医薬の調製において使用することもできる。
【００９４】
本発明は、以下のものを含む治療用組成物を特に提供する。（ｉ）Ｈｍｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質産物、または生物学的に活性があるこれらの断片、（ｉｉ）Ｈｍｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質またはその断片をエンコードしている核酸、（ｉｉｉ）Ｈｍｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質またはその断片をエンコードしている発現可能な核酸を有する発現ベクター構築体、（ｉｖ）Ｈｍｕｓ８１タンパク質をエンコードしている核酸の相補体に対応するアンチセンス核酸、（ｖ）修飾Ｈｍｕｓ８１タンパク質、（ｖｉ）Ｈｍｕｓ８１タンパク質の一部分に特異的に結合する抗体、（ｖｉｉ）Ｈｍｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質またはその断片を発現することができる形質転換型宿主細胞、および（ｖｉｉｉ）Ｈｍｕｓ８１タンパク質に結合するおよび／または影響を与える能力に関するスクリーニングによって同定した治療剤。
【００９５】
本発明は、以下のものを含む治療用組成物も提供する。（ｉ）Ｍｍｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質産物、または生物学的に活性があるこれらの断片、（ｉｉ）Ｍｍｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質またはその断片をエンコードしている核酸、（ｉｉｉ）Ｍｍｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質またはその断片をエンコードしている発現可能な核酸を有する発現ベクター構築体、（ｉｖ）Ｍｍｕｓ８１タンパク質をエンコードしている核酸の相補体に対応するアンチセンス核酸、（ｖ）修飾Ｍｍｕｓ８１タンパク質、（ｖｉ）Ｍｍｕｓ８１タンパク質の一部分に特異的に結合する抗体、（ｖｉｉ）Ｍｍｕｓ８１タンパク質、融合タンパク質またはその断片を発現することができる形質転換型宿主細胞、および（ｖｉｉｉ）Ｍｍｕｓ８１タンパク質に結合するおよび／または影響を与える能力に関するスクリーニングによって同定した治療剤。
【００９６】
本発明の治療用組成物を、２種類以上のＭｕｓ８１タンパク質の混合物、このようなタンパク質をエンコードしている核酸、このようなタンパク質に対する抗体、またはこのようなタンパク質の核酸転写物の阻害剤と組み合わせることができる。
【００９７】
Ｈｍｕｓ８１の活性によって仲介されるＤＮＡのチェックポイント／修復の調節が必要な個体を治療するために、本発明の治療用組成物を使用して医薬組成物を作成することができる。本発明の他の態様は、抗腫瘍治療が必要な個体を治療するための医薬調合物の調合において、本発明の治療用組成物を使用することである。抗腫瘍治療が必要な個体を治療するために、少なくとも１つの他の抗腫瘍剤と組み合わせた本発明の治療用組成物は、医薬調合物の調合において有用であることがさらに考えられる。
【００９８】
治療用組成物、またはこのような治療用組成物を含む医薬調合物を使用して、標的細胞のＨｍｕｓ８１仲介型活性に関する治療が必要な個体を治療することができる。抗腫瘍性の病状に関する治療が例示的であり、これはこのような治療が必要な個体の細胞を少なくとも１つの本発明の治療用組成物と接触させることを含む。抗腫瘍性の病状を治療するために、このような治療法は１つまたは複数の治療用組成物を順次に、同時に、あるいは他の治療剤と組み合わせて投与することを含む可能性もある。
【００９９】
当業者によって理解されるように、本発明の組成物の多くの変更形態および均等物は容易に得られ、本発明の教示を使用し当分野で知られる一般的な方法を適用することによって生み出される。
【０１００】
以下の実施例に記載するような、基本的な分子生物学の操作を行うための多くの方法および材料は当分野で知られており、以下の参照文献中で見ることができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ他、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、（１９８７）；Ｄａｖｉｓ他、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、（１９８６）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２ｎｄ  ｅｄ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、（１９９１）；Ｇｕｔｈｒｉｅ他、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１９４、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、（１９９１）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ他、ＰＣＲ  Ｖｏｌｕｍｅ１、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９１）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ他、ＰＣＲ  Ｖｏｌｕｍｅ２、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９５）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ．Ｄ．ｅｄ．、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．３９、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、（１９９５）。
【０１０１】
以下の実施例を参照しながら、いくつかの態様において本発明をより容易に理解することができる。
【０１０２】
実施例１  ヒトＭｕｓ８１（Ｈｍｕｓ８１）のクローニング
推定のヒトＭｕｓ８１ＯＲＦの５’（ＡＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＣＣＧ）（配列番号１９）および３’（ＣＴＡＣＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＣＣＴＧＡ）（配列番号２０）端に対応する、オリゴヌクレオチドプライマーＨｍｕｓ８１ＦＷ（ＧＡＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＣＣＧ）（配列番号２１）およびＨｍｕｓ８１ＲＥＶ（ＧＡＣＴＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＧＧＣＣＧＴＡＧ）（配列番号２２）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡ産物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）を増幅した。Ｐｆｕポリメラーゼを用いて以下の条件９５℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃１〜３０秒（３５ｘ）でＰＣＲを行った。結果として生じたＤＮＡ産物を製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）に勧められるようにｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドにクローン化し、そのＤＮＡを配列決定した。
【０１０３】
同定した酵母配列を使用して構築した、推定ＯＲＦからのＨｍｕｓ８１の５’および３’端に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーからの配列を増幅した。５５１個のアミノ酸タンパク質（配列番号２）をエンコードし、酵母Ｍｕｓ８１配列（配列番号５）と非常に類似性があるヌクレオチドが１６５３個の配列を得た。ヌクレオチドが１８５７個のより長い配列は、４５５個のアミノ酸タンパク質（配列番号４）であるＨｍｕｓ８１のより短い変異体をエンコードしている。このことは、ヌクレオチド配列（配列番号２５）の位置１２７４〜１４７４からのＤＮＡ挿入体中のストップコドンの存在に起因する。
【０１０４】
実施例２  マウスＭｕｓ８１のクローニング
推定のマウスＭｕｓ８１ＯＲＦの５’および３’端の側面に位置する配列に対応する、オリゴヌクレオチドプライマーＲＪＨ０３０（ＧＡＧＡＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧ）（配列番号２３）およびＲＪＨ０３１（ＧＣＴＡＡＡＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＣ）（配列番号２４）を使用して、ＰＣＲによってＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙマウス脳ｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡ産物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を増幅した。以下の条件９５℃６０秒、６０℃６０秒、７２℃２分３０秒（３５ｘ）を使用した。生じたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、そのＤＮＡを配列決定した。
【０１０５】
公開データベースにおいて、ヒトのｃＤＮＡ配列を使用して相同なマウスの配列を探した。ヒトの配列の５’および３’端と非常に相同性があるいくつかのＥＳＴを同定した。これによって、アミノ酸が４２４〜５５１個の（図２）タンパク質をエンコードしているいくつかの配列が増幅される結果となった（変異体のスプライシングを示す可能性がある）。
【０１０６】
ヒトおよびマウスｃＤＮＡの翻訳産物は、酵母Ｍｕｓ８１アミノ酸配列とかなりの類似性を有する。最も長いヒト（Ｈｍｕｓ８１４）およびマウス（Ｈｍｕｓ８１１）の翻訳産物は、酵母のタンパク質と１７〜２０％同一、３０〜４０％類似であった。他の哺乳動物のタンパク質は酵母のタンパク質との類似性が高くなく、これが最も近いホモログに同定されたことを示す。マウスの配列は、ヒトのタンパク質と８１％同一、８７％類似である。哺乳動物および酵母のタンパク質のアラインメントによって、タンパク質の中央のより高度に保存された領域およびＣ末端領域について、全体的に類似性があることが示される（図３）。保存されている中央の領域はエンドヌクレアーゼのＸＰＦファミリーにおいて見られ、その触媒部位に対応する（Ａｒａｖｉｎｄ他、「Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２７（５）：１２２３−１２４２、１９９９）。
【０１０７】
実施例３  ノーザンブロットハイブリダイゼーション
ヒトの多数の組織およびガン細胞株ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって記載されているようにしてＱｕｉｃｋＨｙｂ法を使用して、ヒトＭｕｓ８１ｃＤＮＡに対応する１．７ｋｂのプローブとハイブリダイズさせた。これらのブロットを高ストリンジェンシー（０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、２×２０分）で洗浄し、オートラジオグラフィによってシグナルを検出した。
【０１０８】
ヒトＭｕｓ８１ｃＤＮＡをプローブとして使用するノーザンブロット分析によって、大部分のヒト組織中に約２．５〜３．０ｋｂの特異的な転写物が存在し、肺、肝臓および腎臓においてレベルが低いことが示された（図６）。
【０１０９】
実施例４  Ｃｄｓ１  ＦＨＡドメイン結合タンパク質の同定
Ｓ．ｐｏｍｂｅのＣｄｓ１  ＦＨＡドメインを釣り針として、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｃＤＮＡライブラリーを獲物として使用し、酵母２−ハイブリッドスクリーンを行った。釣り針と獲物タンパク質の間の相互作用の選択条件で生育した形質転換体を単離し、二次スクリーンにおいて相互作用の特異性について試験した。このスクリーンから単離した形質転換体の１つは、アミノ酸が５７２個の仮タンパク質（ＰＩＤｇ２２１３５４８）をエンコードしているｃＤＮＡ配列を含んでいた。Ｓ．ｐｏｍｂｅのＯＲＦ  ＳＰＣＣ４Ｇ３．０５ｃ（Ｓｐｍｕｓ８１）（配列番号６）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＲＦ  ＹＤＲ３８６Ｗ（ＳｃＭｕｓ８１）（配列番号５）によってエンコードされるアミノ酸配列と比較し、アミノ酸配列を比較するために、酵母およびヒト配列の翻訳産物のアラインメントを、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて行った。
【０１１０】
このＳ．ｐｏｍｂｅのＯＲＦ（ｍｕｓ８１＋）の翻訳産物は、ＯＲＦ  ＹＤＲ３８６ｗによってエンコードされているＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの仮タンパク質と有意に相同性があることが分かった（同一性２５％、類似性４２％）。このタンパク質は、サッカロミセスゲノムデータベース中のＭｕｓ８１と注釈付けされ、ＤＮＡ修復タンパク質Ｒａｄ５４を有する複合体中に存在しているとされている。あるヌル突然変異体は、生きてはいるが減数分裂せず、ＤＮＡ損傷剤ＭＭＳおよび紫外線に対して感受性であると報告されている。ヘモインフルエンザＨＡエピトープの３つのタンデムコピーを有するＳ．ｐｏｍｂｅ  ｍｕｓ８１＋のゲノムコピーを、位置指定組換えによって３’端でタグ付けした。
【０１１１】
ＨＡエピトープに対する抗体によって、約６５〜７０ｋＤａの移動度によりＳＤＳ−ＰＡＧＥにて移動するポリペプチドを非同調培養物から検出した。計算した予想分子量は約６５ｋＤａであった。
【０１１２】
多数のポリペプチドが存在することから、タンパク質は翻訳後に（おそらくリン酸化によって）修飾される可能性があることが示された。ヒドロキシウレア、細胞周期をＳ期で止めるリボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤で、細胞を処理することによって、移動が遅いポリペプチドの非同調培養における比率を増大させた。これは、当該翻訳後修飾は細胞周期により調節されていて、チェックポイント依存であり得ることを示唆している。Ｍｕｓ８１の修飾の増大はＣｄｓ１およびＲａｄ３チェックポイント突然変異株においては観察されなかったが、ｒａｄ５４突然変異株において起こった。Ｃｄｓ１とＭｕｓ８１の間のこの物質的な相互作用は２つのタンパク質の共免疫沈降によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで確認された。
【０１１３】
Ｍｕｓ８１の不活性化は、分裂期酵母を紫外線照射に対してより敏感にする。このことは、紫外線誘導損傷（ヌクレオチド除去修復および紫外線除去修復）のすべての検出可能な修復を担う、２つの修復経路が欠けている酵母株においても観察される。このことは、Ｍｕｓ８１が紫外線による損傷の寛容のために必要であることを示唆している。
【０１１４】
この遺伝子によってエンコードされている生成物がチェックポイント／修飾応答に関係があるかどうかを判定するために、ｍｕｓ８１のＯＲＦ全体が除去されているＳ．ｐｏｍｂｅ株を位置指定組換えによって生成させた。この突然変異株は紫外線照射に対する感受性が増大していたが、ＤＮＡ損傷が存在するときは無傷のチェックポイント／修飾応答を有するようであった。
【０１１５】
実施例５  ヒトＭｕｓ８１とＣｄｓ１の間の相互作用
Ｈｍｕｓ８１１のＯＲＦを、哺乳動物の一過性発現ベクターｐＹＣ１ＨＡ（Ｆｕ他、「ＴＮＩＫ、ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｈａｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｔｏｎ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４３）：３０７２９−３０７３７、１９９９）中、ＨＡエピトープタグのすぐ下流にて、このエピトープタグとインフレームでクローン化した。同様に、ヒトＣｄｓ１のＯＲＦを、ＦＬＡＧエピトープのすぐ下流にて、このエピトープタグとインフレームで、ｐＹＣ１ＦＬＡＧ（Ｆｕ他、上記１９９９）発現ベクター中にクローン化した。プラスミドＤＮＡを使用し、製造者（Ｑｉａｇｅｎ）によって記載されているようにして、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬を使用してＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。２４時間後、細胞を製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって勧められるようにして、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）ＳＣおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を補った溶解バッファー（１％ＮＰ４０、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中に回収した。１００００ｇで１５分間（４℃）の遠心分離によって、溶解液中デブリスを取り除いた。
【０１１６】
エピトープタグ付けタンパク質を一過性発現している細胞からの上清を、ＨＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＦＬＡＧ（ＯｃｔＡ−ｐｒｏｂｅ（登録商標）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）エピトープに対するアガロースビーズ結合抗体と共に４℃で数時間インキュベートした。次いでアガロースビーズを溶解バッファーで３度洗浄し、ＳＤＳ変性バッファー中に再懸濁し９５℃で５分間インキュベートした。上清と免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。５％スキムミルクを含むＴＴＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、この膜をブロックした。ＨＡタグ付けＭｕｓ８１タンパク質を検出するために、０．１％ミルクを含むＴＴＢＳ中で１：１０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシターゼ結合抗−ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に、ブロットを室温で２時間インキュベートした。ＦＬＡＧタグ付けＣｄｓ１を検出するために、ＴＴＢＳ中で１：３０００に希釈した抗−ＦＬＡＧ（商標）Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に、ブロットをインキュベートした。ＴＴＢＳを用いてブロットを洗浄し、次いでＴＴＢＳ中で１：３０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシターゼ結合抗−マウスＩｇ抗体と共に室温で１時間インキュベートした。最後に、ＴＴＢＳを用いてブロットを洗浄し、製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって記載されているようにして、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ化学発光検出システムを使用してシグナルを検出した。
【０１１７】
ヒトＭｕｓ８１とＣｄｓ１が相互作用することができるかどうかを判定するために、タンパク質をそれぞれＨＡおよびＦＬＡＧエピトープでタグ付けし、哺乳動物細胞中で単独で（または組み合わせて）一過性発現させた。トランスフェクトした細胞から細胞溶解液を調製し、エピトープタグに対する抗体について免疫沈降を行った。その結果生じた免疫沈降物を、相当抗体と共にウエスタンブロット分析にかけた。Ｍｕｓ８１構築体を用いてトランスフェクトした細胞からの溶解液においてのみ、ＨＡ抗体が６５ｋＤａ（ヒトＭｕｓ８１のタグ付けバージョンに関して予期されたサイズ）のタンパク質を認識した。同様に、Ｃｄｓ１−ＦＬＡＧを発現している細胞からの溶解液においてのみ、ＦＬＡＧ抗体はタグ付けＣｄｓ１に対応する６５ｋＤａのタンパク質を認識した（図８）。Ｃｄｓ１およびＭｕｓ８１の両方を用いてトランスフェクトした細胞の溶解液からＦＬＡＧ抗体を用いて得た沈殿物においても、Ｍｕｓ８１を検出した。しかしながら、Ｍｕｓ８１またはＣｄｓ１を発現している細胞からの沈殿物中には、Ｍｕｓ８１は存在しなかった。逆に、両方のタグ付けタンパク質を発現している細胞からＨＡ抗体を用いて得た沈殿物においてのみ、Ｃｄｓ１を検出した。これらの結果は、ヒトＭｕｓ８１およびＣｄｓ１タンパク質は、哺乳動物細胞中で相互作用できることを示す。これによって、Ｍｕｓ８１タンパク質が紫外線によるＤＮＡ損傷の修復に関係があることが示唆される。
【０１１８】
本発明は、紫外線損傷耐性に関係があり分裂酵母Ｃｄｓ１のＦＨＡドメインと相互作用する酵母Ｍｕｓ８１タンパク質のヒトおよびマウスホモログを特定する。ヒトＭｕｓ８１はさまざまなスプライシングイソ形として存在し、大部分のヒト組織およびガン細胞株において発現される。Ｍｕｓ８１−ＧＦＰ融合タンパク質の分析は、その大部分が核由来であることを示唆する一方、タグ付けヒトＭｕｓ８１およびＣｄｓ１の共免疫沈降は、これらが哺乳動物細胞中で複合体を形成することを示す。
【０１１９】
実施例６  ヒトＭｕｓ８１のゲノム構造および染色体の局在部位
公開データベースにおいて、ヒトのｃＤＮＡを使用してＭｕｓ８１を含む連続ゲノム配列を同定した。ゲノム配列を比較することによって、異なるスプライス変異体に対応するさまざまなｃＤＮＡ形を確認した。これらの結果を評価することによって、５．８ｋｂのゲノム領域内にＭｕｓ８１配列をエンコードしている１８個のエクソンを同定した（図４）。同定したｃＤＮＡのスプライシングの違いは、エクソン１３および１４を含む領域で起こった。ヒトＭｕｓ８１２（配列番号３）をエンコードしている核酸は、同定したすべてのエクソンから構成されていた。ヒトＭｕｓ８１１（配列番号１）をエンコードしている核酸はエクソン１３を含んでおらず、ヒトＭｕｓ８１３（配列番号７）をエンコードしている核酸はエクソン１３および１４が欠けていた。ヒトＭｕｓ８１４（配列番号９）をエンコードしている核酸のスプライシングは、選択的スプライス受容部位を使用したためにそれがエクソン１４の５’端に３つの追加的なヌクレオチド（ＣＡＧ）を含んでいたこと以外は、ヒトＭｕｓ８１１（配列番号１）をエンコードしている核酸において見られたスプライシングと同一であった。使用したすべてのイントロンのスプライシングは、同一のドナーおよび受容部位を使用した。
【０１２０】
標準的な手順を使用して、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を行った。簡潔には、０．１８ｍｇ／ｍｌ  ＢｒｄＵの存在下で培養することによって血液から単離したヒトリンパ細胞を同調培養した。ＢｒｄＵを洗い流してブロックを遊離させ、細胞を６時間培養して、収集および同定した。。ビオチン化ｄＡＴＰで標識したＭｕｓ８１  ｃＤＮＡプローブを用いて、ＦＩＳＨ検出を行った。ＤＡＰＩバンドパターンとＦＩＳＨシグナルを比較することによって、染色体局在部位を判定した。
【０１２１】
ヒトＭｕｓ８１  ｃＤＮＡをプローブとして使用するＦＩＳＨ分析は、１１ｑ１３における１対の染色体の１００個の分裂拡散体のうちの７０個を染色する結果となった（図５）。公開ＥＳＴ（ＷＩ−１８４８４）を前もって割り当てることによってこの局在部位を確認し、これはＭｕｓ８１配列の一部、ＷＩＣＧＲ放射ハイブリッドマップ上の染色体１１と同一である。
【０１２２】
実施例７  ヒトＭｕｓ８１の発現および細胞内局在部位
ヒトＭｕｓ８１４ｃＤＮＡを、レトロウイルス発現ベクター中のオープンリーディングフレーム遺伝子（ＯＲＦ）をエンコードしている緑色蛍光タンパク質（ＧＥＰ）と、下流にて読取り枠内でクローン化した。レトロウイルス発現ベクターを選択して当該のタンパク質の調節された発現を可能にし、好ましい実施形態では（発現を視覚化するために）当該のタンパク質のＧＥＰまたは修飾ＧＥＰへの融合を可能にする。Ｍｕｓ８１タンパク質とＧＥＰタンパク質の両方を、同じ発現ベクターからの別個のタンパク質として発現させることも可能である。
【０１２３】
Ｍｕｓ８１タンパク質を発現するのに適した市販のベクターには、たとえばｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）レトロウイルス発現ベクター（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ、Ｈ．、１９９２、「Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：５５４７−５５５１）、またはＧＥＰ融合タンパク質を発現するレトロウイルス発現ベクターｐＬＥＧＦＰ−Ｎ１およびｐＬＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から誘導されるｐＲｅｖＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）あるが、これらだけには限られない。
【０１２４】
融合タンパク質の調節された発現のために、ヒトＭｕｓ８１−ＧＦＰを発現するレトロウイルスベクターを使用して、ｔＴＡトランス活性化剤が組み込まれたコピーを含むＡ５４９肺ガン細胞を感染させた。細胞を成長させて融合タンパク質の発現を可能にし、感染から３日後に蛍光顕微鏡によって視覚化した。
【０１２５】
ヒトＭｕｓ８１は、Ａ５４９細胞中のＧＥＰタンパク質に関する融合体として発現した。これらの細胞の核内において、主に蛍光が検出された（図７）。Ｈｍｕｓ８１の核配置は、ＤＮＡ修復関連機能のその役割と一致する。
【０１２６】
本明細書でその多くの態様において詳細に記載し特許請求している本発明は、本明細書における教示に従う当業者による過度の実験なしに作成し実施することができる。本発明の組成物および方法を前述の例によって記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、多くの変形形態および変更形態を本明細書に記載の組成物および方法に加えることができることは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  ヒトＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその翻訳産物のアミノ酸配列を示し、５５１個のアミノ酸タンパク質Ｈｍｕｓ８１（１）（配列番号１および２）をエンコードしている小脳のｃＤＮＡライブラリーからの、ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１Ｂ】  ヒトＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその翻訳産物のアミノ酸配列を示し、４５５個のアミノ酸タンパク質Ｈｍｕｓ８１（２）（配列番号３および４）をエンコードしているＩＭＡＧＥ１２８３４９のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。
【図１Ｃ】  ヒトＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその翻訳産物のアミノ酸配列を示し、４２４個のアミノ酸タンパク質Ｈｍｕｓ８１（３）（配列番号７および８）をエンコードしている小脳のｃＤＮＡライブラリーからの、ＰＣＲ産物の配列を示す図である。
【図１Ｄ】  ヒトＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその翻訳産物のアミノ酸配列を示し、５５２個のアミノ酸タンパク質Ｈｍｕｓ８１（４）（配列番号９および１０）をエンコードしている小脳のｃＤＮＡライブラリーからの、ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２Ａ】  マウスＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその転写産物のアミノ酸配列を示し、Ｍｍｕｓ８１（１）および５５１個のアミノ酸の長さの翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１および１２）をエンコードしている核酸を示す図である。
【図２Ｂ】  マウスＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその転写産物のアミノ酸配列を示し、Ｍｍｕｓ８１（２）および４２４個のアミノ酸の長さの翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３および１４）をエンコードしている核酸を示す図である。
【図２Ｃ】  マウスＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその転写産物のアミノ酸配列を示し、Ｍｍｕｓ８１（３）をエンコードしている核酸および５３１個のアミノ酸の長さの翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５および１６）を示す図である。
【図２Ｄ】  マウスＭｕｓ８１のｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、およびその転写産物のアミノ酸配列を示し、Ｍｍｕｓ８１（４）をエンコードしている核酸および５２１個のアミノ酸の長さの翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７および１８）を示す図である。
【図３】  マウス（Ｍｍ）（Ｍｍｕｓ８１；配列番号１２）、ヒト（Ｈｓ）（Ｍｍｕｓ８１；配列番号１０）、Ｓ．ｐｏｍｂｅ（Ｓｐ）（Ｓｐｍｕｓ８１；配列番号６）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃ）Ｍｕｓ８１（Ｓｃｍｕｓ８１；配列番号５）のアミノ酸配列のアラインメントを図式的に示す図である。
【図４】  ヒトＭｕｓ８１のゲノム構造およびスプライシング変異体を示す図である。
【図５】  ＦＩＳＨ分析によるヒトＭｕｓ８１の染色体局在部位を示す図である。
【図６】  ヒトＭｕｓ８１のノーザンブロット分析を示す図である。
【図７】  Ｍｕｓ８１−ＧＦＰ（ＧＦＰ：たとえばＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色の蛍光タンパク質）融合タンパク質の細胞内局在部位を示す図である。
【図８】  ヒトＭｕｓ８１およびＣｄｓ１の共同免疫沈降を示す図である。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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