(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）または（Ｂ）の２本鎖ＲＮＡを含む、がんを治療するための医薬組成物。（Ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を有する２本鎖ＲＮＡ。
（Ｂ）ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０〜３０塩基の２本鎖ＲＮＡであって、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡ。
【請求項２】
前記２本鎖ＲＮＡが２０〜２７塩基である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記２本鎖ＲＮＡが、１〜４塩基の３'突出末端をさらに有する２本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の２本鎖ＲＮＡをヒト細胞内で発現しうる塩基配列を有するベクターを含む、がんを治療するための医薬組成物。
【請求項５】
前記がんが、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）遺伝子の発現の上昇を伴うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願発明者らは、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）遺伝子を単離することに成功した（特許文献１参照）。また、本願発明者らは、この遺伝子の発現がヒト大腸がん（非特許文献１参照）、前立腺がん、頭頚部がん等を含む各種ヒトがん等でほとんど例外なく亢進していることを見出した。一方、この遺伝子を導入したトランスジェニックマウスには、糖尿病の発症が認められ（非特許文献２参照）、また、糖尿病患者のＮＥＵ３遺伝子に多型が見いだされ、２型糖尿病発症と深い関係があることがわかってきた。
このように、ヒト形質膜シアリダーゼの発現量の亢進が、細胞のがん化や糖尿病の発症に深く関与していることが示唆されている。このことを利用して、本発明者らは、ヒト形質膜シアリダーゼを特異的に認識する抗体を用いたがんの診断方法を提供している（特許文献２参照）。【０００３】
一方、近年、特定の遺伝子の発現を特異的に抑制させる手段として、その遺伝子に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡにより引き起こされるＲＮＡ干渉（RNAi: RNA interference）を利用した手段が注目を集めている。この手段のメカニズムは以下のようなものであると考えられている。
発現抑制の標的となる遺伝子に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡが細胞内に取り込まれると、その２本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡａｓｅIIIファミリーに属するＤｉｃｅｒ酵素により切断され、約２１〜２３塩基の短い２本鎖ＲＮＡ断片にプロセスされる。それらのＲＮＡ断片のアンチセンス鎖は、それぞれＲＮＡ分解酵素活性を有するタンパク質と結合してＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）と呼ばれる複合体が形成される。ＲＩＳＣに含まれるアンチセンス鎖が標的遺伝子のｍＲＮＡに結合すると、ｍＲＮＡが切断され、その結果として、標的遺伝子の発現が抑制されると考えられている（非特許文献３参照）。【０００４】
線虫、菌類、ショウジョウバエ、植物などの遺伝子の発現を抑制させる場合は、一般的に長鎖（数百塩基以上）の２本鎖ＲＮＡを用いた方が、発現抑制効果が高いことが知られていたが、哺乳動物細胞の系では、長鎖の２本鎖ＲＮＡを導入するとインターフェロンのシグナル経路が活性化することによって細胞毒性を示すため、哺乳動物への応用は困難だと考えられていた。
しかし、その後、初めから短い２本鎖ＲＮＡ（例えば約２１〜２３塩基）を導入することによって、インターフェロン応答を回避する方法が開発され、哺乳動物細胞への適用が可能となった（非特許文献４参照）。このような短い２本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）と呼ばれ、遺伝子の機能解析やウイルスを用いた遺伝子治療への応用に期待が寄せられている（例えば、非特許文献５参照）。
しかしながら、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは知られておらず、また、そのようなｓｉＲＮＡを用いた、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物も知られていなかった。
【特許文献１】特許３０８８６８１号
【特許文献２】特開２００３−５５３９９号
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci., 99, 10718-10723, 2002
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 278, 27896-27902, 2003
【非特許文献３】Molecular Medicine, 41(1), 10-29, 2004
【非特許文献４】Nature, 411, 494-498, 2001
【非特許文献５】ウイルス、第５３巻、第１号、ｐ．７−１４、２００３年
【発明の開示】
【０００５】
本発明は上記観点からなされたものであり、ヒト形質膜シアリダーゼ（NEU3）の遺伝子の発現を効率よく抑制するｓｉＲＮＡを含む、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物を提供することを目的としている。
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の配列を有するｓｉＲＮＡがヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）の遺伝子の発現を効率よく抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）下記の（Ａ）または（Ｂ）の２本鎖ＲＮＡを含む、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物。
（Ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を有する２本鎖ＲＮＡ。
（Ｂ）ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０〜３０塩基の２本鎖ＲＮＡであって、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡ。
（２）前記２本鎖ＲＮＡが２０〜２７塩基である、（１）に記載の医薬組成物。
（３）前記２本鎖ＲＮＡが、１〜４塩基の３’突出末端をさらに有する２本鎖ＲＮＡである、（１）に記載の医薬組成物。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の２本鎖ＲＮＡをヒト細胞内で発現しうる塩基配列を有するベクターを含む、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物。
（５）前記がんまたは糖尿病が、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）遺伝子の発現の上昇を伴うことを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。なお、本明細書において、百分率は特に断りのない限り質量による表示である。【０００９】
本発明のがんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物（以下、単に「本発明の医薬組成物」と記載することがある。）は、下記の（Ａ）または（Ｂ）の２本鎖ＲＮＡを含んでいる。
（Ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を有する２本鎖ＲＮＡ。
（Ｂ）ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０〜３０塩基の２本鎖ＲＮＡであって、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡ。【００１０】
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡは、上記のようなｓｉＲＮＡであり、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する。前記遺伝子の配列は、既に公知であり、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185として開示されている（特許３０８８６８１号参照）。【００１１】
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡとしては、（Ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を有する２本鎖ＲＮＡ、または、（Ｂ）ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０〜３０塩基の２本鎖ＲＮＡであって、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡが挙げられる。
ここで、遺伝子の一部の配列に対して「相同な配列を有する２本鎖ＲＮＡ」とは、前記遺伝子の一部の配列に相同な配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ（アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列を有するＲＮＡ（センス鎖）からなる２本鎖を意味する。なお、ＤＮＡの配列に「相同な」配列を有するＲＮＡとは、ＤＮＡの塩基配列におけるチミンをウラシルに置換した配列を有するＲＮＡを意味し、ＲＮＡ配列に「相同な」配列を有するＤＮＡとは、ＲＮＡの塩基配列におけるウラシルをチミンに置換した配列を有するＤＮＡを意味する。【００１２】
また、「ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０〜３０塩基の２本鎖ＲＮＡ」とは、ＮＥＵ３をコードする遺伝子のアンチセンス鎖に相同なＲＮＡまたはＤＮＡであって、配列番号２またはそれと相同な配列を含む２０〜３０塩基のＲＮＡまたはＤＮＡ（アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列を有するＲＮＡ（センス鎖）からなる２本鎖、あるいは、ＮＥＵ３をコードする遺伝子のアンチセンス鎖に相同なＲＮＡまたはＤＮＡであって、配列番号４またはそれと相同な配列を含む２０〜３０塩基のＲＮＡまたはＤＮＡ（アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列を有するＲＮＡ（センス鎖）からなる２本鎖、あるいは、ＮＥＵ３をコードする遺伝子のアンチセンス鎖に相同なＲＮＡまたはＤＮＡであって、配列番号８またはそれと相同な配列を含む２０〜３０塩基のＲＮＡまたはＤＮＡ（アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列を有するＲＮＡ（センス鎖）からなる２本鎖を意味する。また、「配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を有する２本鎖ＲＮＡ」とは、配列番号２またはそれと相同な１９塩基の配列からなるＲＮＡまたはＤＮＡ（アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列からなるＲＮＡ（センス鎖）により構成される２本鎖、あるいは、配列番号４またはそれと相同な１９塩基の配列からなるＲＮＡまたはＤＮＡ（アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列からなるＲＮＡ（センス鎖）により構成される２本鎖、あるいは、配列番号８またはそれと相同な２５塩基の配列からなるＲＮＡまたはＤＮＡ（アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列からなるＲＮＡ（センス鎖）により構成される２本鎖を意味する。【００１３】
なお、配列番号２は、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の７０４〜７２２番目の塩基配列からなるＤＮＡに相同なＲＮＡ配列を示しており、配列番号４は、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の１００９〜１０２７番目の塩基配列からなるＤＮＡに相同なＲＮＡ配列を示しており、配列番号８は、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の８３３〜８５７の塩基配列からなるＤＮＡに相同なＲＮＡ配列を示している。
なお、「相補的」または「相同」は、必ずしも完全に相補的または相同であることを意味するものではなく、２本鎖ＲＮＡが取り込まれたＲＩＳＣ複合体によって、標的遺伝子のｍＲＮＡの切断が起こり得る限り、１、２または３塩基のミスマッチがあってもよい。
２本鎖ＲＮＡのセンス鎖側の配列は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよいが、ＲＮＡであることが好ましい。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドによる遺伝子発現阻害については、特開２００３−２１９８９３に記載されている。本明細書においては、２本鎖ＲＮＡの配列は、アンチセンス鎖のＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列として示す。【００１４】
また、本発明でいう「ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する」とは、本発明の２本鎖ＲＮＡをヒトの細胞に導入した場合に、その２本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖が取り込まれたＲＩＳＣ複合体が形成され、そのＲＩＳＣ複合体がヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子のｍＲＮＡを切断することを意味する。ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現が抑制されているかどうかは、例えば、本発明の２本鎖ＲＮＡを導入すること以外は同様の条件で本発明の２本鎖ＲＮＡを導入した細胞と導入しなかった細胞を作製し、それらの両細胞において、前記遺伝子の全長のｍＲＮＡ量、前記遺伝子産物であるヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）のタンパク量またはシアリダーゼ活性の値等を測定し、本発明の２本鎖ＲＮＡを導入しなかった細胞に比べて、本発明の２本鎖ＲＮＡを導入した細胞で前述のｍＲＮＡ量、タンパク量またはシアリダーゼ活性が減少していることを確認することによって確かめることができる。前述のｍＲＮＡ量の測定は、ノーザンブロット法や、後述の実施例にも記載されているようなＲＴ−ＰＣＲ法等の公知の手段を用いて測定することができる。また、前述のタンパク量は、ＲＩＡ法やＥＬＩＳＡ法等の公知の手段を用いて測定することができる。また、シアリダーゼ活性についても、後述の実施例に記載されているように、ガングリオシドを基質として用いた試験を行うことにより測定することができる。【００１５】
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡとしては、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を有する２本鎖ＲＮＡが好ましいが、それらの２本鎖ＲＮＡと同様に、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する効果を有している限り、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０〜３０塩基の２本鎖ＲＮＡであって、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡも用いることができる。後述の実施例において、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する効果が、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を有する２本鎖ＲＮＡについて実際に確認されているが、それらの２本鎖ＲＮＡと同様に、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する効果を有している限り、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０〜３０塩基の２本鎖ＲＮＡであって、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡも用いることができる。２本鎖ＲＮＡは、２７塩基程度まではあまり活性が変わらない場合があることが報告されており（J. Biol. Chem., 278,15991-15997, 2003参照）、後述の実施例でも２５塩基の２本鎖ＲＮＡでも前記効果が確認されているので、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０〜３０塩基程度の２本鎖ＲＮＡについても同様の効果が認められると推定される。【００１６】
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡは１９〜３０塩基であるが、好ましくは１９〜２７塩基、より好ましくは１９〜２５塩基、さらに好ましくは１９〜２３塩基であり、最も好ましいのは１９〜２１塩基である。なお、ここで述べている塩基数は、２本鎖になっている部分の塩基数であり、後述の３’突出末端の塩基数はここでいう塩基数には含まれない。【００１７】
また、本発明に用いる２本鎖ＲＮＡは、センス鎖の配列とアンチセンス鎖の配列の長さが同一であってもよいが、両配列のいずれかまたは両方に１〜４塩基の３’突出末端（オーバーハング）をさらに有していてもよい。このような３’突出末端をさらに有することにより、本発明の２本鎖ＲＮＡがより安定する場合があるからである。また、このような３’突出末端は、４塩基までは標的遺伝子の発現抑制効果に影響がないことが知られている（Nat. Biotechnol., 20, 497-500, 2002参照）。【００１８】
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡは、例えば、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子またはその一部に相同な配列を有する２本鎖ＲＮＡを調製し、これをＤｉｃｅｒ酵素で切断することによって得ることができる。Ｄｉｃｅｒ酵素は、市販されているものを使用することができる。前記２本鎖ＲＮＡは、例えば、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０〜３０塩基の２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡポリメラーゼ反応や、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列に相同な２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡポリメラーゼ反応によって調製することができる。そのような２本鎖ＤＮＡは、前記遺伝子の配列に基づいて設計されたプライマーにより増幅することによって、調製することができる。【００１９】
上記のようにして得られる２本鎖ＲＮＡをＤｉｃｅｒ酵素で切断することによって、本発明に用いる２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が得られる。こうして得られるｓｉＲＮＡは、本発明に用いるｓｉＲＮＡを含む、複数種のＲＮＡ分子の混合物である。本発明に用いる２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、このような混合物であってもよいし、この混合物から精製された均一なＲＮＡ分子であってもよい。【００２０】
また、本発明に用いる２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、化学合成によっても製造することができる。すなわち、標的配列に相当するセンス鎖とアンチセンス鎖を合成し、それらをアニールさせることによって、本発明に用いる２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が得られる。さらに、標的遺伝子配列に応じて設計した合成ＤＮＡを、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクターに挿入し、適当な宿主で発現させることによっても、本発明に用いる２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を得ることができる。
また、本発明の医薬組成物には、標的細胞内の内在性Ｄｉｃｅｒ酵素によって目的の２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が生成するような２本鎖ＲＮＡを用いることもできる。【００２１】
また、本発明の医薬組成物の別の実施態様として、本発明の医薬組成物は、前述の２本鎖ＲＮＡの代わりに、前述の２本鎖ＲＮＡを、標的であるヒト細胞内で発現しうる塩基配列を有するベクターを含んでいてもよい。そのようなベクターとして、例えば、タンデム型のｓｉＲＮＡ発現ベクター、および、ヘアピン型のｓｉＲＮＡ発現ベクターが挙げられる。これらに用いるベクターは、ヒト細胞で発現しうるベクターであれば特に制限はなく、市販のものを使用することができる。【００２２】
タンデム型のｓｉＲＮＡ発現ベクターの場合は、目的のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖が細胞内のＲＮＡポリメラーゼによって別々に転写された後、両方の鎖がアニーリングすることにより目的のｓｉＲＮＡが細胞内で作られる。一方、ヘアピン型のｓｉＲＮＡ発現ベクターの場合は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによって、目的のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を含むＲＮＡが一体となって転写された後、センス鎖とアンチセンス鎖の間の領域で折れ曲がって両鎖がアニーリングしてヘアピン型の前駆体ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；short hairpin RNA）となり、アニーリングしていない一本鎖の領域が細胞内のＲＮＡａｓｅにより除去されることにより、目的のｓｉＲＮＡが細胞内で作られる。その具体的な方法は、例えば特開２００４−２６１００２や「改訂 ＲＮＡｉ実験プロトコール、羊土社、２００４年１０月１日発行」等に記載されている。本明細書において、「本発明に用いる２本鎖ＲＮＡ」には、上述のような本発明の２本鎖ＲＮＡをヒト細胞内で発現しうる塩基配列を有するベクターが導入されたヒト細胞内で、前述のベクターから発現したＲＮＡによって生成した２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む場合がある。【００２３】
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡは、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する作用を有する。当該作用の定義および測定法は、前記の通りである。【００２４】
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡは、さらに、がん細胞の増殖を抑制し、がん細胞のアポトーシスを誘導するという効果を有する。がん細胞の増殖を抑制する程度は、例えば、細胞数、総ＤＮＡ量、総タンパク質量等を測定したり、ＭＴＴアッセイなどの公知の方法で測定することができる。ここでいう「がん細胞の増殖を抑制する効果を有する」とは、本発明の２本鎖ＲＮＡを導入すること以外は同様の条件で本発明の２本鎖ＲＮＡを導入した細胞と導入しなかった細胞を培養した場合において、本発明の２本鎖ＲＮＡを導入しなかった細胞に比べて、本発明の２本鎖ＲＮＡを導入した細胞の方が、がん細胞の増殖の程度が低い、または、がん細胞の減少の程度が高いことを意味する。【００２５】
アポトーシスの誘導する程度は、例えば、ＴＵＮＥＬ法、ＤＮＡ断片化検出法、ＦＡＣＳ解析法、Ａｎｎｅｘｉｎ法、ｃａｓｐａｓｅ活性測定法等の公知の測定法で測定することができる。
ここでいう「アポトーシスを誘導する効果を有する」とは、本発明の２本鎖ＲＮＡを導入すること以外は同様の条件で本発明の２本鎖ＲＮＡを導入した細胞と導入しなかった細胞を用いてアポトーシスの程度を測定した場合に、本発明の２本鎖ＲＮＡを導入しなかった細胞に比べて、本発明の２本鎖ＲＮＡを導入した細胞の方がアポトーシスの程度が高いことを意味する。【００２６】
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡは、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物の有効成分とすることができる。同医薬組成物は、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する。【００２７】
本発明の医薬組成物に含まれる２本鎖ＲＮＡがヒトの細胞に導入されると、がんや糖尿病への関与が強く示唆されているヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）の遺伝子の発現を効率良く抑制する。また、本発明の医薬組成物に含まれる２本鎖ＲＮＡは、前記遺伝子の発現を抑制する結果、がん細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する。このことから、本発明の医薬組成物は、がんや糖尿病の遺伝子治療に有効であると考えられる。【００２８】
ここでいう「がんまたは糖尿病」とは、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）遺伝子の発現の上昇を伴うものであれば特に制限はないが、例えば、大腸がん、前立腺がん、頭頚部がん等が含まれる。【００２９】
すなわち、本発明の一態様は、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物の製造における、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡの使用である。また、本発明の他の態様は、本発明の医薬組成物をヒトに投与することを含む、がんまたは糖尿病を治療する方法である。【００３０】
本発明の医薬組成物は、通常は、製剤学的に許容される製剤担体と組み合わせて、経口的または非経口的にヒトに投与することができる。本発明の医薬組成物の製剤形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示することができる。製剤化にあたっては、製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。【００３１】
本発明の医薬組成物に含まれる２本鎖ＲＮＡの量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、ｓｉＲＮＡの場合は、組成物中に５０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌとするのがよい。
本発明の医薬組成物の投与形態は特に限定されず、製剤形態、患者の疾患の部位、患者の性別、年齢、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて適宜決定される。
本発明の医薬組成物中の２本鎖ＲＮＡの投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。また、本発明の医薬組成物中の２本鎖ＲＮＡは、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。【００３２】
本発明の医薬組成物は、がんまたは糖尿病の治療に有効であると考えられる。本発明の医薬組成物は、公知のがんまたは糖尿病の予防・治療剤と一緒に、または前後に別々に使用することも可能である。このように使用することによって、前記がんまたは糖尿病の予防・治療効果を高めることができる。さらに、前記がんまたは糖尿病の予防・治療剤を、本発明の医薬組成物中に有効成分として含有させても良いし、本発明の医薬組成物中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化し、使用時に組み合わせても良い。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
ヒト形質膜シアリダーゼ遺伝子の配列（GenBank/DDBJ accession NO. AB008185参照）に基づいて、前記遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡの候補となる１９塩基の５つの配列を選択した。
これらの配列は、ＧＣ含有量が５０％前後で、最も２次構造の影響が少なく、ヒトの全遺伝子に対するＢＬＡＳＴサーチの結果、ヒト形質膜シアリダーゼ遺伝子以外の全遺伝子に対して１７塩基以上一致することがない配列である。
上記の５つの配列に相同な配列を有するＲＮＡ配列（アンチセンス鎖）を、それぞれ配列番号１〜５、及び８に示す。【００３４】
配列番号１は、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の２１８〜２３６番目の塩基配列からなるＤＮＡに相同なＲＮＡ配列を示しており、配列番号２は、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の７０４〜７２２番目の塩基配列からなるＤＮＡに相同なＲＮＡ配列を示しており、配列番号３は、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の９４９〜９６７番目の塩基配列からなるＤＮＡに相同なＲＮＡ配列を示しており、配列番号４は、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の１００９〜１０２７番目の塩基配列からなるＤＮＡに相同なＲＮＡ配列を示しており、配列番号５は、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の１３２１〜１３３９番目の塩基配列からなるＤＮＡに相同なＲＮＡ配列を示しており、配列番号８は、GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の８３３〜８５７の塩基配列からなるＤＮＡに相同なＲＮＡ配列を示している。【００３５】
［実施例２］
本発明の医薬組成物に含まれる２本鎖ＲＮＡを製造した。
すなわち、上記の５つの配列を有する２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、Silencer siRNA Construction kit（Ambion社製）を用いて作製した。作製方法は、そのキットに添付されたマニュアルに記載された方法に従った。具体的には、以下の通りである。
まず、目的のｓｉＲＮＡの配列とリーダー配列を含むオリゴヌクレオチドを、センス鎖用とアンチセンス鎖用に２種類合成した。これらの両オリゴヌクレオチドと、T7 promoter primer（T7 RNA プロモーター配列とリーダー配列に相同な配列）とをそれぞれハイブリダイズさせた。Exo-KlenowDNA polymerase により、ｓｉＲＮＡの転写用のテンプレートＤＮＡを合成した。T7 RNA polymerase で in vitro 転写反応を行い、センス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ合成した。この両鎖をハイブリダイズさせ、二本鎖ＲＮＡを作製した。一本鎖特異的ＲＮａｓｅ処理で、ハイブリダイズしなかった８塩基のリーダー配列を分解した。ＤＮａｓｅ処理を行い、テンプレートのＤＮＡを分解した。その後、ｓｉＲＮＡを精製した。【００３６】
このようなin vitro 転写反応による生合成により、配列番号１〜５の配列を有するｓｉＲＮＡをそれぞれ製造し、順にそれぞれ試験試料１〜５とした。試験試料１〜５のｓｉＲＮＡの濃度は、それぞれ７５μＭ、６３μＭ、６１μＭ、６５μＭ、７４μＭであった。
また、Dharmacon社に委託して、同様のｓｉＲＮＡを５種類、化学合成により作製した。
さらに、コントロールとして、配列番号１の塩基配列をランダムに入れ替えて標的部位を認識できないようにしたスクランブルコントロール配列を化学合成により製造し、試験試料６とした。また、配列番号２〜５の塩基配列に対しても、同様にスクランブルコントロール配列を化学合成によりそれぞれ製造し、それぞれ試験試料７〜１０とした。【００３７】
［実施例３］
前記試験試料１〜１０について、それぞれの細胞導入用試料を調製した。具体的には以下のような手順で行った。
試験試料１〜１０のそれぞれについてＡ液（LipofectamineＴＭ 2000（Invitrogen社製）：１０μｌとOpti-MEM I（登録商標、GIBCO社製）２５０μｌとの混合溶液）とＢ液（試験試料４μｇとOpti-MEM I（GIBCO社製）２５０μｌとの混合溶液）を調製した。Ａ液およびＢ液それぞれを室温で５分間放置した後、Ａ液とＢ液を混合して室温で２０分間放置して、試験試料１〜６のそれぞれについて、細胞導入用試験試料１〜１０を調製した。【００３８】
［実施例４］
前記細胞導入用試験試料１〜１０をヒト子宮頸部がんHeLa細胞および大腸がんDLD-1細胞に一過性導入した。具体的には以下のような方法で行った。
ヒト子宮頸部がんHeLa細胞および大腸がんDLD-1細胞を、ＤＭＥＭ培地で懸濁し、７０〜８０％の細胞密度になるまでプレートで培養した。前記細胞導入用試験試料１〜１０を、それぞれ前記細胞の培養液に添加し、トランスフェクションを行った。【００３９】
［実施例５］
実施例４でトランスフェクションを行った細胞を用いて、前記ｓｉＲＮＡによる形質膜シアリダーゼ遺伝子の発現への影響を、その遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量することにより検討した。
細胞導入用試験試料１〜１０をそれぞれトランスフェクションしたヒト子宮頸部がんHeLa細胞（トランスフェクション後４８時間培養）から、totalＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてそのｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、形質膜シアリダーゼ遺伝子のｍＲＮＡレベルの定量を試みた。目的のｍＲＮＡの検出は、目的遺伝子の配列に基づいて作製したプライマーを用いて行った。プライマーの配列を、配列番号６および７に示す。
サンプル間の調製差を補正するために、ハウスキーピング遺伝子であるporphobilinogen deaminase（ＰＢＧＤ）のｍＲＮＡレベルの定量も同様に行った。【００４０】
以上の試験の結果、試験試料１〜５のｓｉＲＮＡは、それぞれのスクランブルコントロールである試験試料６〜１０に比べて、形質膜シアリダーゼ遺伝子に対してそれぞれ以下のような発現阻害を示した。
試験試料４：９４％の発現阻害
試験試料２：４５％の発現阻害
試験試料１、３、５：０〜１５％の発現阻害
このように、試験試料２および４は発現阻害を示したが、試験試料１、３および５は、明確な発現阻害を示さなかった。
また、上述のin vitro 転写反応による生合成により製造したｓｉＲＮＡの代わりに、化学合成により製造したｓｉＲＮＡを用いた場合も、ほぼ同様の結果が得られた。また、ヒト子宮頸部がんHeLa細胞に代えて、大腸がんDLD-1細胞を用いた同様の実験でも、ほぼ同様の結果が得られた。【００４１】
［実施例６］
実施例４でトランスフェクションを行った細胞を用いて、前記ｓｉＲＮＡによる形質膜シアリダーゼ遺伝子の発現への影響を、シアリダーゼ活性を測定することにより検討した。
シアリダーゼ活性の測定は以下のように行った。
前記細胞導入用試験試料３および４でトランスフェクションしたヒト子宮頸部がんHeLa細胞を、ＤＭＥＭ培地で４８時間培養を行った。細胞を集めて氷冷生理食塩水で洗った後、１０秒間超音波処理し、細胞粗抽出液とした。
上記のようにして得られた細胞粗抽出液についてシアリダーゼ活性を、ガングリオシドを基質として測定した。反応系は、１０μｌの０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、５μｌの１％トリトンＸ−１００、１０ｎｍｏｌのガングリオシド、１０μｌの細胞粗抽出液を含み、蒸留水を加えて全量５０μｌとした。その５０μｌの溶液を、３７℃で３０〜６０分間インキュベートを行った後、その溶液１０μｌを用いて、遊離シアル酸をＤＭＢ（1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzen）により蛍光標識し、高速液体クロマトグラフィーで分析定量した。遊離シアル酸の分析は、J. Chromatogr. 377, 111-119 (1986)に従った。【００４２】
また、コントロールとして、トランスフェクションしていない細胞の粗抽出液についてもシアリダーゼ活性を測定した。
その結果、実施例５で形質膜シアリダーゼ遺伝子のｍＲＮＡの発現抑制効果がほとんど見られなかった、前記細胞導入用試験試料３でトランスフェクションした細胞のシアリダーゼ活性は、コントロールと同程度の比活性（５．６ユニット／ｍｇ・タンパク）であった。一方、実施例５で、形質膜シアリダーゼ遺伝子のｍＲＮＡの発現に対して９４％もの発現阻害を示した、前記細胞導入用試験試料４でトランスフェクションした細胞では、シアリダーゼの比活性は１．０ユニット／ｍｇ・タンパクにまで抑制されていた。
このことから、配列番号４の配列を有するｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルで示したのと同様に、タンパクレベルでも形質膜シアリダーゼ遺伝子の発現の抑制効果を示すこと分かった。また、この結果から、配列番号２の配列を有するｓｉＲＮＡも、ｍＲＮＡレベルで示したのと同様に、タンパクレベルでも形質膜シアリダーゼ遺伝子の発現の抑制効果を示すであろうと予測された。
なお、ヒト子宮頸部がんHeLa細胞に代えて、大腸がんDLD-1細胞を用いた同様の実験でも、ほぼ同様の結果が得られた。【００４３】
［実施例７］
本発明に用いるｓｉＲＮＡによる形質膜シアリダーゼ遺伝子の発現の阻害が、がん細胞の細胞増殖にどのような影響を与えるかを調べるために、Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara)を用いて、ＭＴＴアッセイを行った。
ＭＴＴアッセイは、テトラゾリウム塩の一種であるＭＴＴが、生存細胞のミトコンドリアに存在するコハク酸塩テトラゾリウム還元酵素によってホルマザン色素に分解されることを利用したアッセイである。ホルマザン色素により染色されたサンプル溶液の吸光度を比較することにより、サンプル中の生存細胞の量を比較することができる。
前記細胞導入用試験試料２、３、４、９でトランスフェクションした細胞を、１ウェル当たり１×１０４〜７×１０４個で、９６ウェルプレートでそれぞれ培養し、培養を始めてから１２時間後、２４時間後、４８時間後にサンプリングした。それぞれのサンプルにテトラゾリウム塩と電子結合試薬を含む溶液１０μｌを加えて３０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでホルマザン産物を吸光度４５０ｎｍで測定した。
その結果を以下の図１に示す。
図１に示されている通り、前記細胞導入用試験試料２でトランスフェクションした細胞および前記細胞導入用試験試料４でトランスフェクションした細胞は、前記細胞導入用試験試料９でトランスフェクションした細胞（コントロール）に比べて、細胞増殖の抑制効果を示した。特に、前記細胞導入用試験試料４でトランスフェクションした細胞は、細胞増殖の抑制効果が最も優れていた。また、前記細胞導入用試験試料３でトランスフェクションした細胞は、コントロールとほぼ同様に増殖しており、細胞増殖抑制効果はほとんど見られなかった。【００４４】
これらの結果から、配列番号２または４の配列を有するｓｉＲＮＡは、コントロール（配列番号４のスクランブルコントロール配列）と比較して、ヒト子宮頸部がんHeLa細胞の増殖を抑制する効果を有していることが示された。特に、配列番号４の配列を有するｓｉＲＮＡは、優れた細胞増殖抑制効果を示した。また、ｍＲＮＡレベル、タンパクレベルで
形質膜シアリダーゼ遺伝子の発現抑制が見られなかった配列番号３の配列を有するｓｉＲＮＡは、がん細胞の増殖抑制効果も見られなかった。
なお、ヒト子宮頸部がんHeLa細胞に代えて、大腸がんDLD-1細胞を用いた同様の実験でも、ほぼ同様の結果が得られた。【００４５】
［実施例８］
本発明に用いるｓｉＲＮＡによる形質膜シアリダーゼ遺伝子の発現の阻害が、がん細胞のアポトーシスにどのような影響を与えるかを調べるために、アポトーシスの程度をIn Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche社製)を用いたＴＵＮＥＬ法により測定した。具体的には前記 Kit のマニュアルにしたがって、以下のような方法で行った。
まず、前記細胞導入用試験試料４でトランスフェクションした細胞（１×１０６個）を、パラホルムアルデヒドで３０分間室温で固定した。そのサンプルを蒸留水で洗浄後、氷上で冷やしながら、２分間浸透化液で膜透過処理した。次いで、再びサンプルを洗浄した後、酵素およびラベルを含むTUNEL reaction mixture（ＴｄＴおよびdUTPを含む）を加えて３７℃で６０分間インキュベートした。
また、前記細胞導入用試験試料４でトランスフェクションした細胞に代えて、前記細胞導入用試験試料３でトランスフェクションした細胞を用いて同様の処理を行った。
その後、両サンプルにおける、ＴｄＴ（terminal deoxynucleotidyltransferase）によってＤＮＡ断片に結合したdUTPの蛍光色素（FITC）の数を、フローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて検出した。この際、４８８nmの波長の励起光を使って、ＦＬ１（530nm±15nm）の波長の蛍光を検出した。
その結果を図２に示す。
図２の結果から、前記細胞導入用試験試料４でトランスフェクションした細胞では、９１．３％の細胞がアポトーシスを起こしていることが分かった。すなわち、本発明の２本鎖ＲＮＡ（配列番号４の配列を有するｓｉＲＮＡ）は、がん細胞のアポトーシスを誘導することが示された。
なお、ヒト子宮頸部がんHeLa細胞に代えて、大腸がんDLD-1細胞を用いた同様の実験でも、ほぼ同様の結果が得られた。【００４６】
［実施例９］
配列番号８に示す塩基配列を有するｓｉＲＮＡの合成を、iGENE Therapeutics社に依頼した。
実施例３、４と同様にして、上記ｓｉＲＮＡをHeLa細胞に一過性導入した。そして、実施例５と同様にしてＮＥＵ３ ｍＲＮＡレベルを定量した。また、実施例８と同様にしてＴＵＮＥＬ法にアポトーシスの程度を測定した。尚、スクランブルコントロールとして、配列番号９に示す塩基配列を有する２本鎖ＲＮＡを用いた。
その結果、ＮＥＵ３ ｍＲＮＡについては９４％の発現阻害を示した。また、８５％の細胞がアポトーシスを起こしていた。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の医薬組成物に含まれる２本鎖ＲＮＡは、がんや糖尿病への関与が強く示唆されているヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）の遺伝子の発現を効率良く抑制する。また、本発明の医薬組成物に含まれる２本鎖ＲＮＡは、前記遺伝子の発現を抑制する結果、がん細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する。このことから、本発明の医薬組成物は、がんや糖尿病の遺伝子治療に有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ｓｉＲＮＡ導入によるがん細胞増殖の抑制効果を示す図。
【図２】ｓｉＲＮＡの細胞死に対する影響を示す図。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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