(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのヌクレオチド配列が少なくとも１つの位置Ａで核酸Ｑと異なっている核酸Ｑ’の存在を試料中で検出するための方法において、ａ）適切な量のヌクレオシド３リン酸、該ヌクレオシド３リン酸の重合のための重合剤、及び、ハイブリダイゼーション条件下で核酸Ｑ’の位置Ａにあるヌクレオチドに対しハイブリッド形成できるものの核酸Ｑの位置Ａにあるヌクレオチドにハイブリッド形成できないヌクレオチドを位置Ａに含みかつ少なくとも１つのＬＮＡ(ロック核酸)を含む少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドと、試料中に存在する核酸を組合せる工程、ｂ）伸展産物を形成するべく試料中に存在する核酸に対しハイブリッド形成する任意のオリゴヌクレオチドを伸展させる工程であって、前記核酸が鋳型として使用されている工程、ｃ）形成された伸展産物、ひいては、試料中の核酸Ｑ’の存在を検出する工程、を含有し、ここで、診断用オリゴヌクレオチドが、５’ＮｕａＡｅＮｕｆ−３’という一般構造式をもち、式中、Ａは、標的核酸の変異体核酸配列が互いに異なっている位置ＡにあるＬＮＡであり；Ｎｕは変異体核酸と特異的塩基対を形成する能力をもつＬＮＡ以外の任意のヌクレオチドから成る群の中から選択された単量体であり；ａ，ｅ，及びｆが整数であり；ａ＝１０〜３０、ｅ＝１〜４、及びｆ＝０〜８である、前記方法。
【請求項２】
更に、ｄ）伸展産物の形成後、鋳型から伸展産物を分離するべく変性条件下で反応混合物を処理する工程、ｅ）適切な量のヌクレオシド３リン酸及びヌクレオシド３リン酸重合用作用物質の存在下で、工程ｃ）の１本鎖核酸を、ハイブリダイゼーション条件下で核酸Ｑ’の位置Ａにあるヌクレオチドにはハイブリッド形成できるものの核酸Ｑの位置Ａにあるヌクレオチドに対してはハイブリッド形成できないヌクレオチドを位置Ａに含みかつ少なくとも１つのＬＮＡを含む少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程、ｆ）検出可能な量の伸展産物を結果としてもたらすのに充分な回数だけ前記工程ｄ）及びｅ）を反復する工程、を含有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
更に、前記工程ａ）が、少なくとも１つの下流側オリゴヌクレオチドと、核酸を組合せる工程、を含有する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ａ）が、少なくとも１つの位置Ａで互いと異なるヌクレオチド配列を有しかつ少なくとも１つのＬＮＡを含有する少なくとも１組の診断用オリゴヌクレオチドと核酸をハイブリダイゼーション条件下で組合わせる工程、を含有する、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
そのヌクレオチド配列が少なくとも１つの位置Ａで互いに異なっている標的核酸を検出するための方法において、ａ）適切な量のヌクレオシド３リン酸、少なくとも１つが診断用オリゴヌクレオチドである少なくとも２つのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの連結用作用物質と標的核酸をハイブリダイゼーション条件下で組合せる工程であって、該少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドが、検出すべき標的核酸の位置Ａで発見されたヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを位置Ａに含有しかつ少なくとも１つのＬＮＡ(ロック核酸)を含むオリゴヌクレオチドである工程、ｂ）連結産物を形成するべく隣接する位置で核酸に対しハイブリッド形成する任意のオリゴヌクレオチドを連結する工程であって、前記核酸が鋳型として用いられている工程、ｃ）形成された連結産物を検出する工程、を含有し、ここで、前記少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドが、５’ＮｕａＡｅＮｕｆ−３’という一般構造式をもち、式中、Ａは、標的核酸の変異体核酸配列が互いに異なっている位置ＡにあるＬＮＡであり；Ｎｕは変異体核酸と特異的塩基対を形成する能力をもつＬＮＡ以外の任意のヌクレオチドから成る群の中から選択された単量体であり；ａ，ｅ，及びｆが整数であり；ａ＝１０〜３０、ｅ＝１〜４、及びｆ＝０〜８である、前記方法。
【請求項６】
更に、ｃ）連結後に鋳型から連結産物を分離するべく変性条件下で反応混合物を処理する工程、ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で適切な量のヌクレオシド３リン酸及びオリゴヌクレオチドの連結用連結剤の存在下で、工程ｃ）からの１本鎖核酸を、工程ｂ）からの連結産物に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び（少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドが、検出すべき標的核酸の位置Ａに発見されたヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを位置Ａに含むオリゴヌクレオチドであり、かつ少なくとも１つのＬＡＮを含む）少なくとも２つの診断用オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程、ｅ）検出可能な量の連結産物を結果としてもたらすのに充分な回数だけ工程ｃ）及びｄ）を反復する工程、を含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
診断用オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つの位置Ａが検出すべき核酸配列の位置Ａに相補的であるもののその他の核酸配列の位置Ａとは相補的でない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｆ＝１である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｆ＝０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｅ＝１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ＝２４である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドが固体支持体に対し共有結合により付着されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
異なる診断用オリゴヌクレオチドが固体表面上で点在による配列形式で配置されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
異なる下流側オリゴヌクレオチドが固体表面上で点在による配列形式で配置されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
付着がアントラキノン光化学により実施される、請求項１２〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドが検出可能な基で標識付けされている、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの第１の診断用オリゴヌクレオチドセットが、検出可能な基で標識づけされており、前記検出可能な基が異なる診断用オリゴヌクレオチドについて異なるものである、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
各々のオリゴヌクレオチドセット内の個別のオリゴヌクレオチドが検出可能な基で標識づけされており、前記検出可能な基が各々個別の診断用オリゴヌクレオチドについて異なるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検出すべき前記標的核酸が細胞試料、組織試料又は組織抽出物に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が、原始、原核又は真核由来のものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞試料が、血液、血清、血漿、網状赤血球、リンパ球、尿、骨髄組織、脳脊髄液又は血液又はリンパから調製されたあらゆる産物から誘導される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
組織試料が、筋生検、肝生検、腎生検、膀胱生検、骨生検、軟骨生検、皮ふ生検、膵生検、腸管生検、胸腺生検、乳房生検、子宮生検、こう丸生検、眼生検又は脳生検材料に由来するものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出すべき標的核酸が、生体の特定の種に特異的な少なくとも１つの配列である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出すべき標的核酸が、生体の特定の種、亜種又は菌株に特異的な少なくとも１つの配列である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出すべき標的核酸が、微生物の特定の種に特異的な少なくとも１つの配列である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出すべき標的核酸が、微生物の特定の種，亜種又は菌株に特異的な少なくとも１つの配列である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出すべき標的核酸が、特定の病原菌に特異的な少なくとも１つの配列である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出すべき標的核酸が、病原菌の特定の種、亜種又は菌株に特異的な少なくとも１つの配列である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出すべき標的核酸が、遺伝性疾患に関与する特定のタンパク質についてコードする遺伝子に特異的な少なくとも１つの配列である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出すべき標的核酸が、生活習慣病に関係する遺伝子に特異的な少なくとも１つの配列である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出すべき標的核酸が、ガンに関係する特定の遺伝子に特異的な少なくとも１つの配列である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
生活習慣病が、肥満、家族性高コレステロール血症、アテローム硬化症及び糖尿病から成る群より選択されたものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
検出すべき前記標的核酸が対立遺伝子である、請求項１９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
重合用の重合剤が酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
重合用の重合剤が、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
重合用の重合剤が熱安定性のＤＮＡポリメラーゼである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＴaq，Ｐfu，Ｐwo及びＴthから成る群の中から選択されている、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
重合用の重合剤がＲＮＡポリメラーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
連結用の連結剤が酵素である、請求項５〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
連結用の連結剤がリガーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
そのヌクレオチド配列が少なくとも１つの位置Ａで核酸Ｑと異なっている核酸Ｑ’の存在を試料中に検出するためのキットにおいて、ａ）適切な量のヌクレオシド３リン酸、ｂ）ヌクレオシド３リン酸の重合用作用物質、ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で核酸Ｑ’の位置Ａにあるヌクレオチドに対しハイブリッド形成できるものの核酸Ｑの位置Ａにあるヌクレオチドにハイブリッド形成できないヌクレオチドを位置Ａに含みかつ少なくとも１つのＬＮＡ(ロック核酸)を含む少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチド、を含有し、ここで、前記診断用オリゴヌクレオチドが、５’ＮｕａＡｅＮｕｆ−３’という一般構造式をもち、式中、Ａは、標的核酸の変異体核酸配列が互いに異なっている位置ＡにあるＬＮＡであり；Ｎｕは変異体核酸と特異的塩基対を形成する能力をもつＬＮＡ以外の任意のヌクレオチドから成る群の中から選択された単量体であり；ａ，ｅ，及びｆが整数であり；ａ＝１０〜３０、ｅ＝１〜４、及びｆ＝０〜８である、前記キット。
【請求項４２】
更に、少なくとも１つの下流オリゴヌクレオチドを含有する、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
少なくとも１つの位置Ａで互いに異なり少なくとも１つのＬＮＡ(ロック核酸)を含むヌクレオチド配列を有する少なくとも１組の診断用オリゴヌクレオチド、を含有する、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
少なくとも１つの位置Ａで互いに異なり少なくとも１つのＬＮＡ(ロック核酸)を含むヌクレオチド配列を有する少なくとも１組の診断用オリゴヌクレオチド、を含有する、請求項４２に記載のキット。
【請求項４５】
そのヌクレオチド配列が少なくとも１つの位置Ａにおいて互いに異なっている標的核酸を検出するためのキットにおいて、ａ）ヌクレオシド３リン酸、ｂ）連結用連結剤、及びｃ）少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドが、検出すべき標的核酸の位置Ａで発見されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを位置Ａに含むオリゴヌクレオチドであり、かつ少なくとも１つのＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドである、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、を含有し、ここで、前記診断用オリゴヌクレオチドが、５’ＮｕａＡｅＮｕｆ−３’という一般構造式をもち、式中、Ａは、標的核酸の変異体核酸配列が互いに異なっている位置ＡにあるＬＮＡであり；Ｎｕは変異体核酸と特異的塩基対を形成する能力をもつＬＮＡ以外の任意のヌクレオチドから成る群の中から選択された単量体であり；ａ，ｅ，及びｆが整数であり；ａ＝１０〜３０、ｅ＝１〜４、及びｆ＝０〜８である、前記キット。
【請求項４６】
ｆ＝１である、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４７】
ｆ＝０である、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４８】
ｅ＝１である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
ａ＝２４である、請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、変異体核酸を検出するための方法、この目的に適した１組のオリゴヌクレオチド、本発明の方法を実施するための試薬キット、及び、特異的遺伝子配列を同定し疾病及び感染を診断する上での該方法のさまざまな用途及び応用分野に関する。
【０００２】
発明の背景
今日、核酸配列内のいくつかの核酸の存在に関する試料の試験は、増々重要性を帯びてきている。これは一部には、核酸のヌクレオチド配列が各生体の１つのユニークな特長であるという事実に起因している。まず第１に、数多くの疾病が、「正常な」遺伝子についてのヌクレオチド配列が何らかの形で変化しているという意味合いで、遺伝的なものである。かかる変化は１つの塩基をもう１つの塩基で置換することによって発生しうる。複数の塩基を含む変化も考えることができる。３つの塩基が単一のアミノ酸についてコードするとすると、１つの塩基内の変化（点突然変異）がそのアミノ酸内で１つの変化を結果としてもたらす可能性があり、この変化が今度は、１つの細胞内で不良なタンパク質が作られるという結果をもたらし得る。単一の遺伝子すなわちベーターグロビン遺伝子内の単一の塩基の変化（コドン６におけるＡ→Ｔトランスバージョン）によってひき起こされるこのような遺伝子欠陥の古典的な例として、鎌状細胞貧血がある。例えばＬＤＬレセプタ（アテローム硬化症（１９９２），９６；９１−１０７）又はアポリポタンパク−Ｂ−遺伝子（コドン３５００のＣＧＧ→ＣＡＧ突然変異（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(１９８９)８６；５８７−５９１））内にも重要な点突然変異を見い出すことができる。単一遺伝子の欠陥によってひき起こされる疾病のその他の例としては、第IX及び第VIII因子欠損症、乳ガン、嚢胞性繊維症、Ｖ因子ライデン遺伝子突然変異、脆弱Ｘ症候群、ハンチントン病、筋強直性筋ジストロフィー症、血友病Ａ、血友病Ｂ、経線維腫症１型、アデノシン・デアミナーゼ欠損症、プリンヌクレオチド・ホスホリラーゼ欠損症、オルニチン・トランスカルバミラーゼ欠損症、アルギニノコハク酸シンセターゼ欠損症、ベータサラセミア、アルファ１抗トリプシン欠損症、グルコセレブロシダーゼ欠損症、フェニルアラニン・ヒドロキシラーゼ欠損症及びヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボーシルトランスフェラーゼ欠損症が含まれる。
【０００３】
第２に、ガンの主要な原因は、細胞成長及び分化を直接又は間接的に制御する細胞遺伝子内の改変であると考えられている。ヒト腫瘍形成に関与するオンコ遺伝子と呼ばれる遺伝子の系統群は少なくとも３０種存在する。かかる系統群の１つであるras遺伝子系統群の成員は、往々にしてヒト腫瘍内で突然変異を受けていることがわかっている。その正常状態において、ras 遺伝子により産生されたタンパク質は、正常な細胞の成長及び成熟に関与すると考えられている。タンパク質産物内の３つの非常に重要な位置の１つにおいてアミノ酸改変をひき起こすras遺伝子の突然変異の結果、腫瘍形成に関与する形態への転換がもたらされる。かかる突然変異をもつ遺伝子は、「突然変異体」又は「活性化された」遺伝子と呼ばれる。突然変異を受けていないrasは「野生型」又は「正常な」rasと呼ばれる。rasの活性化を導くかかる点突然変異は発ガン物質又はその他の環境因子によって誘発され得ると考えられている。膵臓腺ガンの９０％以上、結腸の腺腫及び腺ガンの約５０％，肺腺ガン及び甲状腺がん腫の約５０％そして、急性骨髄性白血病、リンパ腫及び脊髄形成異常症候群といったような血液学的悪性腫瘍の大部分が、活性化されたrasオンコ遺伝子を含有することがわかっている。全体として、ヒトの腫瘍の約１０〜２０％が、３つのras遺伝子（Ｈ-ras，Ｋ-ras，又はＮ-ras）のうちの１つにおいて突然変異を有している。
【０００４】
ガンの発生にきわめて関与する遺伝子のもう１つの例としては、ＴＰ５３遺伝子がある。これは、ヒトの全てのガンの半分以上において、突然変異及び／又は欠失により改変されている。点突然変異は、２５０以上のコドン全体にわたり分散しており、大部分がミスセンス突然変異として発生する。この点において、ＴＰ５３遺伝子は、網膜芽細胞腫瘍サプレッサ遺伝子（Ｒｂ１）及び欠失又はナンセンス突然変異によって不活性化されることが最も多いｐ１６遺伝子といったようなその他の腫瘍サプレッサ遺伝子と異なっている。
【０００５】
大部分の悪性腫瘍は、ＴＰ５３遺伝子の両方の対立遺伝子に改変を示す。これには通常、１つの対立遺伝子の完全な欠失及びミスセンス突然変異によるその他の対立遺伝子の不活性化が関与する。その結果、ＴＰ５３タンパク質が完全に欠如するか又は改変されたタンパク質が発現されることになる。ＴＰ５３の保存度の高い領域におけるミスセンス突然変異も同様に、ＴＰ５３タンパク質の増大したレベルと結びつけられてきた。これは、タンパク質を安定化させその半減期を４時間から８時間まで延長する突然変異で誘発された立体配座の変化の結果もたらされると思われる。大部分のミスセンス突然変異は、タンパク質の中央コア内の４つの高い保存度のドメイン内にクラスタ化している。この領域は、配列特異的ＤＮＡ結合を担当し、従ってＴＰ５３の機能的無欠性にとってきわめて重要性をもつ。これらのドメイン内には、７つの突然変異ホットスポットが同定された。これらは、アミノ酸残基１７５、２１３、２４５、２４８、２４９、２７３及び２８２に位置づけられている。
【０００６】
第３に、感染症は、全て独自の核酸をもつ寄生虫、微生物及びウイルスによってひき起こされる。生物学的材料試料中のこれらの生体の存在は、往々にして、数多くの従来の方法（例えば培養）によって決定される。各生体は、その独自のゲノムを有しており、単一の種（関連する複数の種、属又はより高レベルの関係）に特異的である核酸の配列又は遺伝子が存在する場合、この配列は、例えばＨＩＶウイルスの逆転写酵素の遺伝子内でその生体（又は種など）のための「フィンガプリント」を提供することになる（コドン２１５内のＡ→Ｔ突然変異；Science(１９８９)２４６；１１５５−１１５８）。その他のウイルスの例としては、ＨＰＶ，ＥＢＶ，ＨＳＶ，Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎及びＣＭＶが含まれる。微生物の例としはバクテリアが含まれ、より特定的には、マイコプラズマ、レジオネラ、マイコバクテリア、クラミジア、カンジダ、淋菌、シゲラ属及びサルモネラの様々な菌株が含まれる。科学界が、さらに多くの生体に由来するゲノムについての情報を得るにつれて、本発明により同定され得る微生物のレパートリは増大することになる。一部の細菌菌株の核酸の中では、特に大きい類似性が、それらのリボソーム遺伝子及びそのｒＲＮＡの配列の中に見い出される。
【０００７】
異なるヌクレオチド配列についての試料の検査の分野における現在の試みは、核酸の弁別を行なうことができるようにするためにヌクレオチド配列内のわずか１つの単一の差異を使用することに焦点を置いている。かかる差異は、例えば点突然変異によってひき起こされるヌクレオチド変換又は微生物の場合であれば種間の差異の結果であり得る。このような密に関係する核酸の天然の例は、対立遺伝子すなわち、染色体上の限定された部位上における一定の与えられた遺伝子の配列の別々の変異体である。
【０００８】
上述の各々の例において、試料から核酸を分離し、１つの疾病又は生体に特異的である単数又は複数の配列を同定することにより、上述の配列のうちのいずれかすなわち「遺伝病」、ガン、感染症又は感染生体に特異的な配列を試料が含有しているか否かを決定することができる。しかしながら、ヌクレオチド配列内のこれらの差異又は変化を同定する場合の問題点は、試料中に存在する標的配列のコピー数が少ないようなケースにおいて容易にこの検出を適用できないということにある。このようなケースにおいては、ノイズとシグナルを区別するのは困難である。この問題をめぐる１つの道は、シグナルを増強させることにある。従って、試料中に存在する標的配列を増幅するために数多くの方法が記述されてきた。最も良く知られた及び広く用いられた増幅方法の１つは、ＵＳ４,６８３,１９５号、ＵＳ４,６８３,２０２号及びＵＳ４,８００,１５９号内に詳細に記述されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと呼ばれる）である。
【０００９】
ＰＣＲ技術に基づいて、配列変動の検出のための数多くの方法が記述されてきた。Oncogene Research １（１９８９），２３５〜２４１及びNucl, Acids Res,１７（１９８９），８０９３〜８０９９から、対立遺伝子変異体を含有していると推測される部域がまず最初に特別設計のプライマを用いてＰＣＲにおいて増幅され次に制限酵素で処理されるような方法が知られている。このとき、対立遺伝子は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を用いてひとたび分析された時点で診断され得る。このとき、サイズに従った分割産物の電気泳動分離が、対応する対立遺伝子がプローブ内に含まれていたかいなかったかを明らかにする。この手順の欠点は、それが特異的制限消化を必要とするという点にある。すでにＲＦＬＰを生成していない各突然変異についてこれがやっかいな手順であるという事実以外に、一定の与えられた部位で正確に分割する制限酵素での消化を可能にするはずであるプライマを点突然変異に隣接するように設計できることが必要である。このことは、前記刊行物中に列挙された理由のため困難でありうる。
【００１０】
ＥＰ−Ａ−０３３２４３５及びＵＳ５,６０５,７９４は、隣接する核酸とわずか１つのヌクレオチドしか違わない核酸を選択的に検出するための方法を記述している。
ここで利用される効果は、検出すべき核酸にハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドから、伸展方向の末端である１つのヌクレオチドが、検出すべき（１つの対立遺伝子の）核酸の対応する核酸と相補的であるようなオリゴヌクレオチドのみが酵素を用いて理論的に伸展されうる、という効果である。従って、該オリゴヌクレオチドは、それがテストすべき核酸に対してのみ相補的であるように選択される。かくして、その他の対立遺伝子に対しハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドは理論的に伸展されない。しかしながら、実際には、その他の対立遺伝子にハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドも、程度はわずかであるにすぎないものの、伸展される。これによって感度、特に方法の特異性は低下する。非特異的な伸展は、特にＴが３’末端のミス対合の一部であるとき、又はミス対合がＣ：Ａミス対合である場合に、容易に発生しうる（Kwok et al.(１９９０)．Nucleic Acids Research, １８：９９９−１００５）。特異性を増大させるため、ＥＰ−Ａ−０３３２４３５は、末端部域が２つの核酸の対応するヌクレオチドに対し相補的でないもう１つのヌクレオチドを含有するような形で、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を選択することを提案している。両方の対立遺伝子を検出するためには、１回の反応につき２つの対立遺伝子のうちの１つしか検出されないようにしながら、２回の反応を実施しなければならない。この手順は、２つの対立遺伝子特異的プライマ及び１つの相補鎖プライマの合成を必要とする。試料は、次の２つの反応において増幅される： すなわち、相補鎖のプライマ及び対立遺伝子特異的プライマのうちの一方を用いたＰＣＲで１回、そして、第２の並行反応つまりＰＣＲにおいては、相補鎖プライマ及び第２の対立遺伝子特異的プライマを用いて増幅される。選択された対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物が一方の反応において検出されない場合、それぞれの対立遺伝子が試料中に存在しないと仮定される。ホモ接合ＤＮＡ試料は２つの反応のうちの一方のみにおいて検出されうる２つの対立遺伝子のうちの一方のみを含むことから、全ての反応において同じ対照産物を産生する２つの付加的プライマを使用することが必要である。この対照産物は、その他の対立遺伝子のそれぞれのＰＣＲの効率を制御するためそしてそれぞれの対立遺伝子の不在を立証するために、特異的産物とは異なっている。対照産物がＰＣＲ産物内に存在するものの、対立遺伝子のいかなる特異的産物も発見されない場合、試料がその反応においてテスト対象である対立遺伝子を含有している確率は低い。この方法では、２つの対立遺伝子の存在又は不在は２つの別々の反応において立証されなくてはならず、各々個別のＰＣＲは対照ＰＣＲを含んでいなければならない。
【００１１】
Biochem. Biophys. Res. Commun.（１９８９），１６０；４４１−４４７は、ｄＮＴＰ濃度を低減させることにより選択性を増大させることを提案している。たとえこの付加的措置が講じられたにせよ、別々のバッチ内の対立遺伝子の検出が非特異的産物を生み出す可能性はある。
【００１２】
リガーゼ連鎖反応（ＷＯ８９／０９８３５）においては、２つの隣接するオリゴヌクレオチドを特異的にリンクするために熱安定性リガーゼが使用される。これは、これらのオリゴヌクレオチドが緊縮ハイブリダイゼーション温度で相補的標的に対しハイブリッド形成されている場合、及びリンケージ部位における塩基対が完全である場合に発生する。２つの対立遺伝子がリンケージ部位における突然変異の結果として互いに異なっている場合、完全な塩基対の前述の条件は、一方の対立遺伝子について満たされる。最初の２つのものに相補的な２つの付加的なオリゴヌクレオチドがこのとき、リガーゼ連鎖反応において連結産物を増幅するのに必要である。これまでのところ、２つの対立遺伝子の検出には、少なくとも６つのオリゴヌクレオチドを用いた２つの反応が必要であり、増幅産物は放射性標識を用いて検出される（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(１９９１），８８；１８９−１９３）。
【００１３】
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(１９８５)，８２；１５８５〜１５８８及びNew England Journal of Medicine(１９８７)，３１７；９８５から、検査中の対立遺伝子との「対立遺伝子特異的」オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の示差的ハイブリダイゼーションに基づくものである対立遺伝子検出方法が知られている。例えば、各々長さ２０ｂｐである２つのオリゴヌクレオチドが合成される。各々は２つの異なる対立遺伝子のうちの１つと対合するものの、オリゴヌクレオチド配列の中央にあるその他の対立遺伝子に対するミス対合を有する。このとき、標識づけされたオリゴヌクレオチドを用いた示差的ハイブリダイゼーションにより、対立遺伝子間の弁別が可能である。このことは、ヒトゲノミックＤＮＡ及びＰＣＲ産物の両方の分析にあてはまる。この方法では、ゲノミックＤＮＡの直接的かつ離散的分析も可能であるが、付加的な消化及び電気泳動が必要となる。
【００１４】
Nucleic Acids Research（１９８９），１７；２４３７−２４４８及びＥＰ−Ａ−０３３３４６５は、対立遺伝子特異的プライマ（競合オリゴヌクレオチドプライミング＝ＣＯＰ）の競合によりいくつかの付加的なＰＣＲサイクル内でさまざまな対立遺伝子の存在について予備増幅されたヒトゲノミックＤＮＡをテストする方法について記述している。上述のＡＳＯ技術は、その後ＰＣＲ技術へと変換されている。元々のＡＳＯ技術においては、対応する制御中のシグナル強度の比較から結果の明確な解釈が可能になることから、交差ハイブリダイゼーションによってひき起こされる５％の誤差率は許容可能である。しかしながらＰＣＲ反応においては、プライマが対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドである場合、対立遺伝子のうちの１つのみを含む試料についての誤差率は、両方の対立遺伝子が増幅される試薬混合物中でこの誤差が発生した場合、１０サイクル後に１２％に昇ることになる。実際、プライマの競合は選択性を増大させたものの、ゲノミックＤＮＡの問題の部域がまず最初にＰＣＲ内で増幅され、次に異なる対立遺伝子のための分析がその後の１０回のサイクルにおいて実施されるということを立証することができた。これらのサイクルでは、２つの対立遺伝子特異的プライマ及び相補鎖プライマが使用され、２つの反応においては、対立遺伝子特異的プライマのうちの１つが放射性標識づけされた。異なる対立遺伝子の選択的検出が長さ１２〜１６塩基のオリゴヌクレオチドについて立証されてきており、一方一定の与えられた条件下でより長いオリゴヌクレオチドも同様に非特異的産物を生み出した。
【００１５】
検出工程が最小限におさえられかくして最小のオペレータ技能で迅速、正確かつ容易に実施されうる方法を結果としてもたらす、ゲノミックＤＮＡといったような核酸を含有する試料の中の少なくとも１つの単一塩基差を直接検出するための単純でなおかつきわめて特異的な方法に対する必要性が存在する。
【００１６】
示差的ハイブリダイゼーションに基づく方法は、或る種の状況下でのみ適用でき、その上きわめて複雑で干渉を受けやすい。同様に、予備増幅は、好ましくは削除される例えばＣＯＰ中の１つの手続き上の工程である。
【００１７】
変異体核酸を検出するための上述の方法は全て、変異体核酸の検出における弁別用因子と同じ、修正されていないヌクレオチドに依存するという特長をもっている。
【００１８】
本発明は、制限酵素による消化を必要とせず、１つの試薬混合物中の核酸の増幅を可能にしかつその後の酵素反応に左右されない、変異体核酸の特異的検出のための単純な方法を提供する。本発明における非常に重要な構成要素は、新しいクラスのＤＮＡ類似体であるＬＮＡであり、これは、in vitroＤＮＡ診断を改善するための主要候補となるべくいくつかのすばらしい特長を有している。ＬＮＡ単量体は、構造的にＲＮＡ単量体に非常に類似した２環化合物である（構造式Ｉ参照）。ＬＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡの化学的物性の大部分を共有し、水溶性をもち、ゲル電気泳動法によって分離したり、エタノール沈降させることができる（Tetrahedron,５４，３６０７〜３６３０（１９９８））。しかしながらＤＮＡ又はＲＮＡオリゴへのＬＮＡ単量体の導入は、結果として、ワトソン・クリック型塩基対の法則に従いながら相補的ＤＮＡ又はＲＮＡとの２重鎖の先例のない高い熱安定性をもたらす。ＬＮＡオリゴマと形成された２重鎖のこの高い熱安定性は、３’にあるＬＮＡ（単複）を含むプライマが例えばＰＣＲ反応といった酵素伸展のための基質であるという事実と共に、本発明において、本出願で記述されているin vitro検定における変異体核酸の検出の特異性を著しく増大させるために使用されている。個々の対立遺伝子の増幅プロセスは、きわめて弁別的に発生し（交叉反応は目に見えない）、複数の反応が同じ容器内で発生しうる。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は少なくとも１つの位置Ａで互いに異なるヌクレオチド配列をもつ変異体核酸を検出する方法に関する。該方法は少なくとも２つの工程を含んで成る：
すなわち、
ａ）  ＬＮＡ（単複）が好ましくは位置Ａ又は位置Ａに隣接する位置、好ましくはオリゴヌクレオチドの３’末端にあるＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドである、伸展反応用プライマとしての少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドとの伸展反応を実施する工程、
ｂ）  例えば標準的なゲル電気泳動法、毛細管電気泳動法又はさまざまなハイブリダイゼーション検定により伸展産物を検出する工程。
【００２０】
本発明のその他の実施形態は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド，１組のオリゴヌクレオチド，異なるオリゴヌクレオチドセット、試薬キットを用いたさらなる伸展及び増幅及び前記方法のさまざまな利用分野及び用途である。
【００２１】
本発明に従った「標的核酸」は、試料中に含有されている可能性があり、その存在が問題となっている核酸であり、標的核酸（Ｑ’及びＱ）のヌクレオチド配列は、実質的に同一であるが、核酸Ｑ’はそのヌクレオチド配列の少なくとも１つの位置において核酸Ｑのヌクレオチド配列と異なっている。ヌクレオチド配列中の差異の位置は、「位置Ａ」と呼ばれる。位置Ａは、多形部位とも呼ばれ、ＡＣ中の位置Ａの存在は遺伝子多型現象と呼ばれる。変異体ヌクレオチド配列が複数の異なる核酸（Ｑ'１，Ｑ'２，‥‥Ｑ'ｅ）を含む場合、差異の位置はＡ１，Ａ２‥‥Ａｅと呼ばれることになる。かかる差異は例えば、点突然変異の結果として発生することもあれば、単数又は複数の塩基の欠失又は挿入によってひき起こされることもある。検出すべき核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであってよく。特に細菌ｒＲＮＡの診断においては特に適したものであることが立証されている。
【００２２】
「診断用オリゴヌクレオチド」という語は、位置Ａにおいて、検出すべき標的核酸の位置Ａに見られるヌクレオチドに対し相補的なヌクレオチドを有し、かつ一定の与えられた条件下で異なる標的核酸配列（Ｑ，Ｑ'１，Ｑ'２，‥‥Ｑ'ｅ）を弁別する能力をもち、診断用オリゴヌクレオチドの位置Ａのヌクレオチドに対し相補的であるヌクレオチドを位置Ａに含有する標的核酸配列の伸展のみを開始させるオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２３】
「産物標的」という語は、もとの標的核酸の伸展産物であるようなヌクレオチドを意味する。産物標的は同様に、標的核酸としても使用でき、通常はもとの標的よりも小さい。
【００２４】
「位置」という語は、核酸上の限定された部位を意味する。かかる位置は、例えばヌクレオチドによって占有され得る。
【００２５】
「対立遺伝子」という語は、相同な染色体上の同じ遺伝子座で発生するものの塩基配列が異なっている同じ遺伝子のいずれかの形態を意味する。
【００２６】
ヌクレオチドは、規則的なワトソン・クリック型塩基対が確保された場合（例えばＧ−Ｃ，Ａ−Ｔ又はＡ−Ｕ）に相補的であるものと言われる。この相補的塩基対は、対合を導くが、一方非相補的塩基対はミス対合を導く。このような塩基対を作り出すあらゆる核塩基（例えば７−deaza-ｄＧＴＰ，ｄＩＴＰ，ＬＮＡ塩基類似体など）が、同様に相補的であると呼ばれる。
【００２７】
本発明の方法を実施するためには、検出すべき核酸は、in vitro反応に適した形で存在しなければならない。検査対象の試料、例えば組織試料、組織抽出物、個々の細胞又は細胞含有流体は、核酸を放出させるべく細胞壁を壊すため既知の要領（例えば熱、酵素又は化学的分解又はそれらの組合せ）で消化される。
【００２８】
試料は、次に本発明の診断用オリゴヌクレオチドと接触させられる。選択される条件は、本発明のオリゴヌクレオチドが、検出すべき核酸の対応する部域をハイブリッド形成するような条件である。このハイブリダイゼーションは一般にアニーリングとして知られている。関連性のない核酸すなわち検出対象でない核酸とのハイブリダイゼーションは、適切なヌクレオチド配列，ヌクレオチド長、ハイブリダイゼーション温度、アジュバントなどを選択することによって回避される（Ausubelらの「分子生物学における現行プロトコル」，pub. John Wiley & Sons（１９９８）及び例中の詳細を参照のこと）。
【００２９】
本発明の異なる診断用オリゴヌクレオチドの数は、少なくとも検出すべき異なる標的核酸の数に対応する。従って２つの異なる突然変異の検出には、標的核酸のＡ位置に存在しうるヌクレオチドのうちの１つのみに対し相補的であるヌクレオチドを各々含有する少なくとも２つの異なる診断用オリゴヌクレオチドが必要である。使用される診断用オリゴヌクレオチドは、５０未満のヌクレオチド，好ましくは５〜４０，より好ましくは５〜３０，さらに好ましくは５〜２５のヌクレオチドの範囲内、例えば、６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４又は２５個のヌクレオチドという好ましい長さを有する。診断用オリゴヌクレオチドの各々は、位置Ａに隣接する部域との関係においてきわめて相補的であるためこのオリゴヌクレオチドが検出すべき核酸とハイブリッド形成できるようなヌクレオチド配列を有する。
【００３０】
本発明の方法は、競合プライミング又はミス対合プライミング法及び関連する方法の原理に基づくプロセスに対する改良である。しかしながら、適用される変形形態の方法の如何に関わらず、標的核酸の検出において使用される各々の診断用オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡを含む。このＬＮＡは好ましくは、検出すべき標的核酸の位置Ａに見られるヌクレオチドに対応し、これに対し相補的である。そして、好ましくは、当該診断用オリゴヌクレオチドは、５’ＮｕａＡｅＮｕｆ−３’という一般構造式をもち、式中、Ａは、標的核酸の変異体核酸配列が互いに異なっている位置ＡにあるＬＮＡであり；Ｎｕは変異体核酸と特異的塩基対を形成する能力をもつＬＮＡ以外の任意のヌクレオチドから成る群の中から選択された単量体であり；ａ，ｅ，及びｆは整数であり；ａ＝１０〜３０、ｅ＝１〜４、及びｆ＝０〜８である。
【００３１】
本発明の１実施形態は、そのヌクレオチド配列が少なくとも１つの位置Ａで核酸Ｑと異なっている標的核酸Ｑ’の存在を試料中で検出するための方法において、
ａ）  適切な量のヌクレオシド３リン酸、該ヌクレオシド３リン酸の重合のための重合剤及び、ハイブリダイゼーション条件下で核酸Ｑ’の位置Ａにあるヌクレオチドに対しハイブリッド形成できるものの核酸Ｑの位置Ａにあるヌクレオチドにハイブリッド形成できないヌクレオチドを位置Ａに含みかつ少なくとも１つのＬＮＡを含む少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドと、試料中に存在する核酸を組合せる工程、
ｂ）  伸展産物を形成するべく試料中に存在する核酸に対しハイブリッド形成する任意のオリゴヌクレオチドを伸展させる工程であって、前記核酸が鋳型として使用されている工程、
ｃ）  工程ｂ）において形成された任意の核酸、ひいては、試料中の核酸Ｑ’の存在を検出する工程、
を含有する方法である。
【００３２】
この方法は、例えばｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写及びその他の第１鎖合成の利用分野に適用することができる。該方法は、さらに、工程ｃ）の代わりに以下の工程を付加することにより伸展反応を循環させることによってより効率を高めることができる。
ｃ１）  伸展産物の形成後、鋳型から伸展産物を分離するべく変性条件下で反応混合物を処理する工程、
ｄ１）  適切な量のヌクレオシド３リン酸及びヌクレオシド３リン酸重合用作用物質の存在下で、工程ｃ１）の１本鎖核酸を、ハイブリダイゼーション条件下で核酸Ｑ’の位置Ａにあるヌクレオチドにはハイブリッド形成できるものの核酸Ｑの位置Ａにあるヌクレオチドに対してはハイブリッド形成できないヌクレオチドを位置Ａに含みかつ少なくとも１つのＬＮＡを含む少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程、
ｅ１）  検出可能な量の伸展産物を結果としてもたらすのに充分な回数だけ工程ｃ１）及びｄ１）を反復する工程、
ｆ１）  形成された伸展産物を検出する工程。
【００３３】
本発明は、線形増幅を結果としてもらすことになり、ＰＣＲタイプの対数増幅を可能にするため、標的核酸内の反対側のストランドの伸展産物の合成のためのプライマとして作用する「下流側オリゴヌクレオチド」を内含する再増幅工程を内含するようにさらに伸展され得る。そのヌクレオチド配列が少なくとも１つの位置Ａで核酸Ｑと異なっている標的核酸Ｑ’の存在を試料中で検出するための方法は、このとき次の工程を含むことになる：
ａ）  適切な量のヌクレオシド３リン酸、該ヌクレオシド３リン酸の重合のための重合剤、少なくとも１つの下流側オリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーション条件下で核酸Ｑ’の位置Ａにあるヌクレオチドに対しハイブリッド形成できるものの核酸Ｑの位置Ａにあるヌクレオチドにハイブリッド形成できないヌクレオチドを位置Ａに含みかつ少なくとも１つのＬＮＡを含む少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドと、核酸を組合せる工程、
ｂ）  伸展産物を形成するべく核酸に対しハイブリッド形成する任意のオリゴヌクレオチドを伸展させる工程であって、前記核酸が鋳型として使用されている工程、
ｃ）  伸展産物の形成後、鋳型から伸展産物を分離するべく変性条件下で反応混合物を処理する工程、
ｄ）  適切な量のヌクレオシド３リン酸及びヌクレオシド３リン酸重合用作用物質の存在下で、工程（ｃ）からの１本鎖核酸を、ハイブリダイゼーション条件下で少なくとも１つの下流側Ｃヌクレオチド及び核酸Ｑ’の位置Ａにあるヌクレオチドにはハイブリッド形成できるものの核酸Ｑの位置Ａにあるヌクレオチドに対してはハイブリッド形成できないヌクレオチドを位置Ａに含みかつ少なくとも１つのＬＮＡを含む少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程、
ｅ）  検出可能な量の伸展産物を結果としてもたらすのに充分な回数だけ工程ｃ）及びｄ）を反復する工程、
ｆ）  形成された伸展産物を検出する工程。
【００３４】
本発明に従った方法のどの変形形態が選択されるかに応じて、ＬＮＡヌクレオチド（単複）は、診断用オリゴヌクレオチドの一定の与えられた部位、好ましくは位置Ａ，例えば診断用オリゴヌクレオチドの内部位置で又は好ましくは診断用オリゴヌクレオチドの３’末端に位置設定される。
【００３５】
ここで記述されている発明は、多重分析のために特に適している。数多くの状況において、異なる部位に一定数の異なる突然変異を含みうる遺伝子１例えば数多くのコドン内に突然変異をもつＴＰ５３遺伝子が分析される。各々が特定の突然変異に向けられ各々が特徴的にサイズ決定されたフラグメント又は特徴的に標識づけされたフラグメントを結果としてもたらしうる一定数の入念に対合されたＬＮＡ−オリゴ／ＤＮＡ−オリゴ対を内含することにより、産生されたフラグメントをサイズ分画化するか又はフラグメントの標識を検出して一定数の異なる突然変異を弁別することが可能である。そのヌクレオチド配列が少なくとも１つの位置Ａで互いに異なっている標的核酸を検出するための方法はこの場合、上述のものに類似しているが、ここでは診断用オリゴヌクレオチドは複数の配列から成り、該方法は、かくして以下の工程を含む：
ａ）  適切な量のヌクレオシド３リン酸、ヌクレオシド３リン酸重合用作用物質及び、少なくとも１つの位置Ａで互いと異なるヌクレオチド配列をもちかつ少なくとも１つのＬＮＡを含有する少なくとも１組の診断用オリゴヌクレオチドと核酸をハイブリダイゼーション条件下で組合わせる工程、
ｂ）  伸展産物を形成するべく核酸に対しハイブリッド形成する任意のオリゴヌクレオチドを伸展させる工程であって、前記核酸が鋳型として使用されている工程、
ｃ）  工程ｂ）において形成された核酸を検出する工程。
【００３６】
これは、例えば異なる核酸配列の配列特異的な第１鎖合成として使用でき、かつ例えばＲＮＡの配列特異的逆転写として使用可能な１つの方法を構成する。以上でも同様に記述されているように、そのヌクレオチド配列が少なくとも１つの位置Ａで互いに異なっている標的核酸を検出するための方法は、工程ｃ）に代って以下の工程の付加により説明できるように一定の回数だけ伸展反応を反復することによって、より効率の良いものとなることができる：
ｃ１）  伸展産物の形成後、鋳型から伸展産物を分離するべく変性条件下で反応混合物を処理する工程。
ｄ１）  適切な量のヌクレオシド３リン酸及びヌクレオシド３リン酸重合用作用物質の存在下で、工程ｃ１）からの１本鎖核酸を、少なくとも１つの位置で互いに異なるヌクレオチド配列をもつ少なくとも１組の診断用オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程、
ｅ１）  検出可能な量の伸展産物を結果としてもたらすのに充分な回数だけ工程ｃ１）及びｄ１）を反復する工程、
ｆ１）  形成された伸展産物を検出する工程。
【００３７】
この方法は、使用されたオリゴヌクレオチドに対応する異なる核酸の線形増殖を結果としてもたらし、ＰＣＲタイプの対数増幅を可能にする標的核酸内の反対側のストランドの合成のためのプライマとして作用する単数又は複数の下流側オリゴヌクレオチドを内含する再増幅工程を内含するよう、さらに伸展され得る。このとき、そのヌクレオチド配列が少なくとも１つの位置Ａで互いに異なっている標的核酸を検出するための方法は以下の工程を含むことになる：
ａ）  適切な量のヌクレオシド３リン酸、ヌクレオシド３リン酸重合用作用物質、少なくとも１つの下流側オリゴヌクレオチド及び、少なくとも１つの位置Ａで互いと異なるヌクレオチド配列をもちかつ少なくとも１つのＬＮＡを含有する少なくとも１組の診断用オリゴヌクレオチドと核酸をハイブリダイゼーション条件下で組合わせる工程、
ｂ）  伸展産物を形成するべく核酸に対しハイブリッド形成する任意のオリゴヌクレオチドを伸展させる工程であって、前記核酸が鋳型として使用されている工程、
ｃ）  伸展産物の形成後、鋳型から伸展産物を分離するべく変性条件下で反応混合物を処理する工程。
ｄ）  適切な量のヌクレオシド３リン酸及びヌクレオシド３リン酸重合用作用物質の存在下で、工程ｃ）からの１本鎖核酸を、さらなる伸展産物を合成するべく少なくとも１つの位置Ａで互いに異なるヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチドである少なくとも１組の診断用オリゴヌクレオチドと少なくとも１つの下流側オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程、
ｅ）  検出可能な量の伸展産物を結果としてもたらすのに充分な回数だけ工程ｃ）及びｄ）を反復する工程、
ｆ）  形成された伸展産物を検出する工程。
【００３８】
同様に、該方法のこれらの変形形態においては、診断用オリゴヌクレオチドの好ましくは３’末端ＬＮＡ−ヌクレオチドが突然変異の位置（標的核酸の位置Ａ）に対応することが好まれるが、これは、これらの条件下でハイブリダイゼーションがさらに高い選択性及び特異性を有するからである。
【００３９】
上述の方法全てにおける重合用作用物質は、酵素、例えばＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴaq，Ｐfu，Ｐwo又はＴthである。
【００４０】
変異体核酸の検出の原理は、以下の例を用いて示すことができる。１つの単一反応容器は、１つの遺伝子の２つの対立遺伝子の同時検出のためのＰＣＲ用の試薬混合物を内含する。これらの対立遺伝子は、１つの塩基位置において異なっている（対立遺伝子Ｑ’の位置Ａ（突然変異体）及び対立遺伝子Ｑの位置Ａ（正常））。両方の対立遺伝子に見られる１つの配列に相補的な１つの包括的プライマ及び各々２つの対立遺伝子のうちの１方のみについて選択的な２つのプライマという計３つのプライマが、反応の中で使用される。プライマ選択性は、１つの選択的プライマの３’末端にある塩基がＱ’の位置Ａに相補的であり、もう１つのプライマの塩基がＱの位置Ａに相補的であるということによってもたらされている。両方のプライマ共に、位置Ａに対応する３’位置においてＬＮＡを含んでいる。その上、結果として得られたＰＣＲ産物を容易に区別するためには、例えば、異なる長さをもつか又は異なる標識を伴うＰＣＲ産物が産生され例えばゲル電気泳動、毛細管電気泳動又は当該技術分野において既知のさまざまなハイブリダイゼーション技術によって適切に検出されるような形で対立遺伝子特異的プライマを選択することが可能である。
【００４１】
単一塩基におけるヌクレオチド配列の差異の検出に向けてのハイブリダイゼーションの感度は、リガーゼ反応を使用することによって増強させることができる。一般的考察（Nature３２７，２９３−２９７（１９８７）及びNature３２７，２９８−３０３（１９８７））は、一定の与えられたオリゴヌクレオチドの長さが短かくなればなるほど、単一塩基の差異に向けての弁別は良好となるというものである。しかしながら、短いＤＮＡ−オリゴは非常に低いＴmをもち、かくしてＤＮＡ−オリゴの長さに対しより低い限界を設定する。一方、ＬＮＡ修飾は、Ｔmの非常に有意な増大を結果としてもたらし（修飾１回につき３〜８℃），従って、標準的なＰＣＲ及びＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）条件と相容性ある条件で標的核酸に対し４〜２５ヌクレオチドの短いプライマでさえもハイブリッド形成でき、さらに単一塩基差異に向かっての弁別の改善を伴ってそれを行なう。ＬＣＲは、ＰＣＲと同様、ターゲティングされた多数のＤＮＡの配列を増幅するために、変温多重サイクルを使用する。しかしながら、ＬＣＲは、鋳型伸展のため個々のヌクレオチドを使用せず、その代り標的領域の両方のストランドに相補的である余剰のオリゴヌクレオチドに依存している。２本鎖鋳型ＤＮＡの変性の後、ＬＣＲ手順は、標的ストランドの１つの上の隣接する領域に対し相補的な２つ（又はそれ以上の）オリゴヌクレオチドプライマの連結から始まる。いずれかのストランドに相補的なオリゴヌクレオチドを接合することができる。連結及び第２の変性工程の後、もとの鋳型ストランド及び２つ（又はそれ以上の）新たに接合された産物は、ターゲティングされた配列の対数増幅を提供するべく付加的な連結のための鋳型として役立つ。この方法については、本書に参考として内含されているGenomics，４：５６０〜５６９（１９８９）内に詳述されている。本発明においては、好ましくは４〜２５個、より好ましくは５〜２０個、さらに好ましくは６〜１５個、例えば６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５個のヌクレオチドを含む少なくとも１つのＬＮＡを含有する１つの短いオリゴヌクレオチドを内含することが提案されている。このオリゴヌクレオチドは、「ＬＣＲ」手順において遺伝子−多形現象に対し向けられている。多数の変温サイクルの後、ターゲティングされた多数の配列は増幅されており、ゲル電気泳動、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション又は当該技術分野における言及された数多くの方法によって検出できる。これについては以下の工程によって記述される：
ａ）  適切な量のヌクレオシド３リン酸、少なくとも１つが診断用オリゴヌクレオチドである少なくとも２つのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの連結用作用物質と標的核酸をハイブリダイゼーション条件下で組合せる工程であって、該少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドが、検出すべき標的核酸の位置Ａで発見されたヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを位置Ａに含有しかつ少なくとも１つのＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドである工程、
ｂ）  連結産物を形成するべく隣接する位置で核酸に対しハイブリッド形成する任意のオリゴヌクレオチドを連結する工程であって、前記核酸が鋳型として用いられている工程、
ｃ）  連結後に鋳型から連結産物を分離するべく変性条件下で反応混合物を処理する工程、
ｄ）  ハイブリダイゼーション条件下で適切な量のヌクレオシド３リン酸及びオリゴヌクレオチドの連結用作用物質の存在下で、工程ｃ）からの１本鎖核酸を、工程ｂ）からの連結産物に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び（検出すべき標的核酸の位置Ａに発見されたヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを位置Ａに含むオリゴヌクレオチドであり、かつ少なくとも１つのＬＡＮを含む）少なくとも１つの診断用オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程、
ｅ）  検出可能な量の連結産物を結果としてもたらすのに充分な回数だけ工程ｃ）及びｄ）を反復する工程、
ｆ）  形成された連結産物を検出する工程。
【００４２】
該方法は当然のことながら、工程ｂ）の後停止でき、直ちに視覚化されうる。
【００４３】
好ましい連結用作用物質は、酵素、例えばリガーゼ、好ましくはＤＮＡ−リガーゼ、例えばＴ４−ＤＡＮリガーゼ、より好ましくは熱安定性リガーゼ、例えばＴaqＤＮＡリガーゼである。
【００４４】
既存の方法のもう１つの改良は、ＬＣＲ及びＰＣＲの組合せ型の使用に関する。従って、１つの上流側プライマの代りに鋳型に対し２つ（又はそれ以上）の短い（例えは８ｂｐ）上流側ＬＮＡプライマをハイブリッド形成することが提案される。２つ（又はそれ以上の）短いＬＮＡプライマが互いに隣合せにハイブリッド形成している場合、これらは連結反応により１つに接合され得る。このように、この接合は充分特殊性を発揮している。連結後、連結されたプライマを伸展することが可能である。熱安定性リガーゼ及びポリメラーゼの両方が記述されてきたため、ターゲティングされた多数のＤＮＡ配列を増幅させるために多数の変温サイクルを使用することが示唆される。２本鎖鋳型のＤＮＡの変性後、手順は、標的ストランドのうちの１つの上の隣接する領域に相補的な２つ（又はそれ以上の）オリゴヌクレオチドプライマの連結で始まる。接合された／連結されたオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼにより伸展される１つの上流側「プライマ」を形成する。第２の変性工程の後、もとの鋳型ストランド及び新たに形成された産物は、ターゲティングされた配列の対数増幅を提供するべく付加的な連結及び伸展のための鋳型として役立つ。多数の変性温度サイクルの後、ターゲティングされた多数の配列が増幅された。
【００４５】
上述の方法全ての診断用オリゴヌクレオチドは、
ａ）  ５’−Ｎｕａ（ＮｕｂＬＮＡｃ）ｍＮｕｄＡｅＮｕｆ−３’
という一般構造式をもち、式中、Ａは、標的核酸の変異体核酸配列が互いに異なっている位置ＡにあるＬＮＡであり、ＬＮＡはＬＮＡであり、Ｎｕは変異体核酸と特異的塩基対を形成する能力をもつＬＮＡ以外の任意のヌクレオチドから成る群の中から選択された単量体であり、ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，及びｆの合計が少なくとも５であることを条件としてａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，及びｆは０〜３０の整数であり、ｍは１〜８の整数であり、ｅは１〜６の整数である。
【００４６】
このことは、すなわち、診断用オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つの位置Ａが、検出すべき標的核酸配列の位置Ａに対し相補的であるものの、もう１つの標的核酸配列の位置Ａに対しては相補的でないことが好ましいということを意味している。さらに、診断用オリゴヌクレオチド内の少なくとも１つの位置ＡがＬＮＡであることが好ましい。
【００４７】
試料中の検出すべき核酸の存在又は数量についての尺度である伸展産物の特異的検出は、例えば、使用されるオリゴヌクレオチドが１つの付加的な特長によって弁別されるという事実を使用することによっても可能である。区別となるかかる特質は、例えば、１つのセットのオリゴヌクレオチドの変動する長さであると考えられる。このとき異なる診断用オリゴヌクレオチドの伸展は、異なる長さの伸展産物を産生する。診断用オリゴヌクレオチドは同様に、異なる標識を有することによっても区別できる。かかる標識は、例えば、検出可能な基を用いてその後の反応の中で検出されうるカラー又は螢光分子又は化学基である。この種の化学基には、例えばジブキシン及びジブキシゲニンといったハプテンが含まれる。ハプテンに対する標識づけされた抗体と反応させることによってハプテンを検出することができ、このとき標識は検出される。もう１つのハプテンは、例えば、異なる形で標識づけされた抗体又はストレプトアビジンを使用することで検出可能であるビオチンであり得る。
【００４８】
ここでは、「標識」という語は、単独でか又は検出系列の一部として検出可能である基を意味している。リポータ基の官能部分の例としては、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基（例えば一定波長の光線、Ｘ線などの電磁放射線を吸収でき、かつその後吸収エネルギーをより波長の長い放射線として再放射することのできる基、具体例としては、ダンシル（５−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニルがある）、ＤＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−４，４−ジメチルオキサゾリジン）、ＰＲＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピオリジン）、ＴＥＭＰＯ（Ｎ−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン）、ジニトロフェニル、アクリジン、クマリン、Ｃｙ３及びＣｙ５（Biological Detection Systems, Incの商標）、エリスロシン、クマリン酸、アンベリフェロン、テキサスレッド、ローダミン、テトラメチル・ローダミン、Ｒｏｘ、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤ）、ピレン、フルオレセイン、ユーロピウム、ルテニウム、サマリウム、及びその他の希土類金属）、ラジオアイソトープ標識、化学発光標識（化学反応中の発光を介して検知可能な標識）、スピン標識（電子スピン共鳴分光法を利用することで検知可能な生物分子に結合された遊離基（例えば置換された有機ニトロキシド）又はその他の常磁性プローブ（例えば、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋）、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びグリコースオキシダーゼなど）、抗原、抗体、ハプテン（ペプチドやステロイドホルモンなどといった、抗体と結び付くことはできるがそれ自身では免疫応答を開始させることのできない基）、脂肪酸残基、ステロイド半分（コレステリン）、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、特定レセプタ用の葉酸ペプチド、エンドサイトーシス調節するための基、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ブラジキニン、及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）といった細胞膜浸透用担体系がある。特に有利な例は、ビオチン、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ルテニウム、ユーロピウム、Ｃｙ５、Ｃｙ３などである。
【００４９】
検出すべき核酸の数量及び存在についての尺度であるさまざまな伸展産物は、さまざまな形で検出可能である。これらは、試薬混合物を分離した後別々に検出することもできるし、ひとたび試薬混合物が得られた場合には逐次的に、或いは、適切な標識が使用されていることを条件として既知の方法に従って同時に検出することもできる。好ましくは、各々のオリゴヌクレオチドセット内の個々のオリゴヌクレオチドは、各々個別の診断オリゴヌクレオチドについて異なるものである検出可能な基で標識づけされる。
【００５０】
ＥＰ−Ａ−０３２４,４７４号に記述されている方法は、マーカーとしてステロイドホルモンを使用するための好ましい方法であることが立証されてきた。オリゴヌクレオチドは、直接標識づけされてもよいし、そうでなければ、化学基に対する抗体に例えば対応する螢光標識を備えることもできる。異なるオリゴヌクレオチドプライマの数に対応する複数のチャネル内の螢光を同時に測定することにより、さまざまな対立遺伝子産物を検出することができる。同様に、産物の一部分を螢光標識で標識づけすることができる一方で、同じ試薬混合物からのその他の産物のために酵素を使用することもできる。原則的に、既知の任意の標識づけ及び検出方法を利用することが可能である。
【００５１】
逐次的又は同時検出において、２つの異なる化学基、好ましくは異なる抗体によって検出されるハプテンを、例えば２つのオリゴヌクレオチドを標識づけするのに使用することができる。かかるハプテンには、ジゴキシゲニン、ビオチン及びフルオレセインが内含される。好ましくは、フルオレセインに対する抗体及びジゴキシゲニンに対する抗体はこのとき、標識として異なる酵素をもつ。このとき、核酸は、検出可能な酵素特異的基質と逐次的に又は同時に接触させることによって検出される。
【００５２】
共通の伸展反応の混合物は同様に、固定化されているか又は１つの基（例えばビオチン）を介して固定化されうる固相に対して１本鎖伸展産物を結合させるべく捕捉プローブを用いて、結果として変性反応に付される可能性もある。代替的には、捕捉プローブを、例えばアントラキノン光化学によって予め固相に永久的に結合させることができる（ＷＯ９６／３１５５７）。これらの手順においては、反応の伸展産物は、検出すべき全ての核酸と共に固定化される。捕捉プローブの特異性に起因して、核酸は（洗浄工程により分離されて）逐次的に検出されうる。検出すべきシグナルを１つの容器内で同時に生成し検出できる場合、かかる洗浄工程を省略することも可能である。
【００５３】
１変形形態においては、伸展反応が発生した後、２つ（又は検出に２つ以上の対立遺伝子が関与する場合及び２セット以上の特異的プライマが使用される場合にはそれに応じて３つ以上）の充分な液体のアリコートが試薬混合物から取られ、各アリコートが、伸展産物についてテストされる。アリコートは多重反応から取られ、オリゴヌクレオチドについて使用される異なる標識に応じて、対応する数の増幅産物を各アリコート内に検出することができる。
【００５４】
本発明の方法は、さまざまな応用分野において利用可能である。例えば、１つの単一のテスト対象から検出されるべき標的核酸（個々の診断）を、或る種の疾病、例えば代謝障害、生活習慣病、ガン又は遺伝病に関係づけることが可能である。生活習慣病の例としては、肥満、家族性高コレステロール血症、アテローム硬化症及び糖尿病がある。
【００５５】
検出すべき核酸を含有する試料は、標準的には原始、原核又は真核動物由来の細胞、組織試料又は組織抽出物であろう。試料が例えば哺乳動物又はヒトといった動物に由来する場合、試料は血液、血清、血漿、網状赤血球、リンパ球、尿、骨髄組織、脳脊髄液又は血液又はリンパから調製されたあらゆる製品又はあらゆるタイプの組織生検材料、例えば筋生検、肝生検、腎生検、膀胱生検、骨生検、軟骨生検、皮ふ生検、膵生検、腸管生検、胸腺生検、乳房生検、子宮生検、こう丸生検、眼生検又は脳生検材料でありうる。
【００５６】
その上、その優れた特異性のため、該方法は同様に、プローブがプールスクリーニングを受けるような検定に適している。この原則に従うと、異なるテスト対象の個別のプローブが多数混合される。apo Ｂ３５００遺伝子内の欠陥、例えば糖尿病、家族性高コレステロール血症、アテローム硬化症又は肥満に関連した欠陥を診断するとき、１つのプール内で６４のプローブを組合わせるのが適切であることが立証された。本発明の方法を用いると、プール内に含まれたプローブ中のこの欠陥の存在又は不在を見極めることが可能である。本発明の方法に従って陽性結果の出たプール由来の複数の部分的プールを連続して数回テストする場合、欠陥をもつ遺伝子を検出するのに少ない（先行技術と比べて）回数の決定で充分である。
【００５７】
本発明の方法においては、その遺伝子が存在することを条件として欠陥をもたない遺伝子を同時に検出することが特に有利であることが立証されている。プールをスクリーニングするときには、代替的に突然変異産物を検出することが可能であり、又そうでなければ、いかなる突然変異対立遺伝子も存在しない場合には正常な産物を検出することが可能である。そのままの状態での反応のための対照としてのその機能に加えて、両方の対立遺伝子の検出は、検出すべき核酸を数量化する手段でもある。
【００５８】
プールスクリーニング方法において使用される試料は患者特異的でなく匿名であることから、これらの方法は、例えばエイズウイルスの汚染率又は例えば高コレステロールレベル、高血圧又は糖尿病の頻度（マススクリーニング）といったような、特に疫学的な関連性をもつ疾病の試験において使用できる。これらの方法は、対立遺伝子の頻度を決定するのに役立つ。
【００５９】
同じことが、生体、微生物の特定の種、亜種又は菌株又は病原菌、細菌そして一部のケースではウイルスの特定の種、亜種又は菌株の検出又は診断にもあてはまる。特に問題となる分野では、密に関連する病原性／非病原性の種又は菌株の同時検出に焦点があてられている。さらに、本発明の方法は同様に、大腸菌のさまざまなストランドを識別する既知のＡＴ配列を介して例えば（遺伝子技術の法則に従って評価された）E.coli Ｋ１２を高い信頼性で検出するのにも適している。従って本発明は同様に、環境条件の分析においても利用可能である。
【００６０】
本発明の１つの重要な内容は、例えばアレイフォーマットでのアントラキノン光化学（ＷＯ９６／３１５５７）（Nature Genetics, suppl. 第２１巻、１９９９年１月、１〜６０）により固体表面に共有結合で付着された少なくとも１つのＬＮＡを含有する診断オリゴヌクレオチドの使用にある。異なる標的核酸配列に対し向けられた少なくとも１つのＬＮＡを含有する、異なる診断オリゴヌクレオチドをアレイ内に点在させ、固体表面に永久的に付着させることができる。かかるアレイを次に伸展反応又はＰＣＲに付すことができる。適切な顕微鏡スライド、例えば表面処理されたガラス又はポリカーボネートスライドに対し診断オリゴヌクレオチドを付着させる場合、市販のin situ ＰＣＲサーモサイクラの１つの中で伸展反応又はＰＣＲ反応を実施することができる。ＰＣＲの後、（特異的突然変異を表わす）陽性スポットを適切な標識によって検出することができる。かかる手順の結果は、異なる多数の標的核酸の半定量的評定となる。
【００６１】
本発明の主な利点は、関連性ある２次反応が事実上全くない状態で１つの単一容器内に収納された混合物内の対立遺伝子化合物を同時に検出することができるという点にある。制限酵素での消化又はその後のハイブリダイゼーションは必要とされない。この目的は、ＬＮＡオリゴマがワトソン−クリック型塩基対法則に従い、ＤＮＡ：ＤＮＡにより形成される類似の２重鎖よりもはるかに安定した２重鎖を形成すること及び３’にあるＬＮＡ（単複）を含むプライマがＰＣＲ反応のための基質であることにより達成される。個々の対立遺伝子の増幅プロセスはきわめて弁別的に発生し（交叉反応は見えない）、複数の反応が同じ容器内で起こり得る。
【００６２】
本発明のもう１つの内容は、核酸検出用の試薬キットである。このキットは、本発明に従った１組のオリゴヌクレオチド、そして必要とあらば付加的なオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの伸展に必要なアジュバントを含んで成る。さらに試薬キットは、例えば相補鎖プライマといったような付加的なオリゴヌクレオチドを含むことができる。好ましくは、キットは酵素及びオリゴヌクレオチド及びその他の試薬を別々のコンテナに収納された状態で提供する。
【００６３】
ここで使用される「ＬＮＡ」又は「ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド」という語は、
【００６４】
【化１】
0005095888.tif 000002
【００６５】
という一般構造式Ｉの少なくとも１つのヌクレオシド類似体を含むオリゴマ及びその塩基性塩及び酸性付加塩を意味する。なお式中：
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ*）−、−ＣＲ６（Ｒ６*）− の中から選択される；
Ｂは、核塩基から選択される。
Ｐは、後続単量体に対するヌクレオシド間リンケージ又は５’末端基のためのラジカル位置を表わし、かかるヌクレオシド間リンケージ又は５’末端基は任意には置換基Ｒ５を内含する。
Ｒ３又はＲ３*は、先行単量体に対するヌクレオシド間リンケージ又は３’末端基を表わすＰ*である。
Ｒ４*及びＲ２*は、合わせてＣ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、及び＞Ｃ＝Ｚ、から選択された１〜４個の基／原子から成るバイラジカルを表わす。なおここで、
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｎ（Ｒａ）−の中から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々水素、任意に置換されたＣ１−12−アルキル、任意に置換されたＣ２−12−アルケニル、任意に置換されたＣ２−12−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−12−アルコキシ、Ｃ２−12−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−12−アルコキシカルボニル、Ｃ１−12−アルキルカルボニル、Ｃ１−12−アルキルカルボニル、ホルミル、アリル、アリルオキシ−カルボニル、アリルオキシ、アリルカルボニル、ヘテロアリル、ヘテロアリルオキシ−カルボニル、ヘテロアリルオキシ、ヘテロアリルカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−16−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルフォノ、Ｃ１−６−アルキルスルフォニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンドの中から独立して選択されており、ここでアリル及びヘテロアリルは任意に置換されていて良く、２つのジェミナル置換基Ｒａ及びＲｂは一緒に、任意に置換されたメチレン（アリルの任意の置換基として定義づけされたとおりの置換基で１回又は２回任意に置換された＝ＣＨ２）を表わすことができる。そして存在しかつＰ又はＰ*に関与していない置換基Ｒ１*，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ３*，Ｒ５，Ｒ５*，Ｒ６及びＲ６*の各々は、水素、任意に置換されたＣ１−12−アルキル、任意に置換されたＣ２−12−アルケニル、任意に置換されたＣ２−12−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−12−アルコキシ、Ｃ２−12−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−12−アルコキシカルボニル、Ｃ１−12−アルキルカルボニル、Ｃ１−12−アルキルカルボニル、ホルミル、アリル、アリルオキシ−カルボニル、アリルオキシ、アリルカルボニル、ヘテロアリル、ヘテロアリルオキシ−カルボニル、ヘテロアリルオキシ、ヘテロアリルカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−16−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルフォノ、Ｃ１−６−アルキルスルフォニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンドの中から独立して選択されており、（ここで後者の基は置換基Ｂについて定義されているようなスペーサを内含し得る）ここでアリル及びヘテロアリルは任意に置換され得、２つのジェミナル置換基は一緒に、オキソ、チオキソ、イミノ又は任意に置換されたメチレンを表わすか又は一緒に、ＲＮか水素及びＣ１−４−アルキルから選択されるものとして−Ｏ−，−Ｓ−，及び−（ＮＲ���）−の中から選択された単数又は複数のヘテロ原子１基により任意に中断及び／又は終結された１〜５個の炭素原子アルキレン鎖から成るスピロバイラジカルを形成でき、かつここで２つの隣接する非ジェミナル置換基は、２重結合を結果としてもたらす１つの付加的な結合を表わすことができ、ＲＮ*は、存在しているか又はバイラジカル内に関与していないとき水素及びＣ１−４−アルキルから選択される。
ここで「ＬＮＡ」（Locked Nucleoside Analogues)という語は、オリゴマ（一般構造式Ｉ）の中に取り込まれた２環ヌクレオシド類似体を意味する。
【００６６】
ここでは、「核塩基」という語は、天然に発生する核塩基ならびに非天然に発生する核塩基を網羅する。当業者にとっては、以前「非天然に発生する」とみなされてきたさまざまな核塩基がその後天然に発見された、ということは明白であるはずである。かくして「核塩基」は、既知のプリン及びピリミジン複素環を内含するだけでなく、その複素環類似体及び互変異性体をも内含する。核塩基の例としてはアデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、及びBennerらの米国特許第５,４３２,２７２号内で記述されている「非天然発生の」核塩基がある。「核塩基」という語は、これらの例の各々全てならびにその類似体及び互変異性体を網羅することが意図されている。特に有利な核塩基は、人間における治療及び診断の応用分野に関係して天然に発生する核塩基とみなされているアデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシルである。
【００６７】
ここで使用されている「ＤＮＡインターカレータ」という語は、ＤＮＡ又はＤＮＡらせん、２重鎖又は３重鎖内にインタカレートできる基を意味している。ＤＮＳインターカレータの官能部分の例としては、アクリジン、アントラセン、アントラキノンといったキノン、インドール、キノリン、イソキノリン、ジヒドロキノン、アントラサイクリン、テトラサイクリン、メチレンブルー、アントラサイクリノン、プソラレン、クマリン、エチジウムハロゲン化物、ダイネミシン、１，１０−フェナンスロリン−銅といった金属錯塩、カルケアミシン、ポルフィリン、ディスタマイシン、ネトロプシン、ビオロゲン、ダウノマイシンといったトリス（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナスロリン）ルテニウム−コバルト−エネジインがある。特に有利な例は、アクリジン、アントラキノンといったキノン、メチレンブルー、プソラレン、クマリン及びエチジウムハロゲン化物である。
【００６８】
ここで、「光化学活性基」という語は、光の照射時点で化学反応を起こすことのできる化合物を網羅している。その官能基の一例としては、キノン、特に６−メチル−１，４−ナフトキノン、アントラキノン、ナフトキノン及び１，４−ジメチル−アントラキノン、ジアジリン、芳香族アジド、ベンゾフェノン、ソラシン、ジアゾ化合物及びジアジリノ化合物がある。
【００６９】
ここで、「熱化学的反応性基」という語は、その他の基と熱化学的に誘発された共有結合形成を起こすことのできる官能基として定義づけされる。熱化学反応性基の官能部分の具体例としては、カルボン酸、活性エステルといったカルボン酸エステル、酸フッ化物、酸塩化物、酸臭化物、酸ヨウ化物といったカルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸アジド、カルボン酸ヒドラジド、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルホン酸ハロゲン化物、セミカルバジド、チオセミカルバジド、アルデヒド、ケトン、第１級アルコール、第２級アルコール、第３級アルコール、フェノール、アルキルハロゲン化物、チオール、ジスルフィド、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、ヒドラジン、エポキシド、マレイミド及びボロン酸誘導体がある。
【００７０】
ここで、「キレート化基」という語は、複数の結合部位を含み、同時に複数の結合部位を通してもう１つの分子、原子又はイオンに結合することの多い分子を意味する。キレート化基の官能部分の例としては、イミノジ酢酸、ニトリロトリ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、アミノホスホン酸などがある。
【００７１】
ここでは、「リガンド」というのは、結合を行なう何らかのものを意味する。リガンドは、芳香族基（ベンゼン、ピリジン、ナフタレン、アントラセン及びフェナンテレンなど）、複素環芳香族基（チオフェン、フラン、テトラヒドロフラン、ピリジン、ジオクサン及びピリミジンなど）、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸アジド、カルボン酸ヒドラジド、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルホン酸ハロゲン化物、セミカルバジド、チオセミカルバジド、アルデヒド、ケトン、第１級アルコール、第２級アルコール、第３級アルコール、フェノール、アルキルハロゲン化物、チオール、ジスルフィド、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、ヒドラジン、エポキシド、マレイミド、任意には酸素原子、窒素原子及び／又は硫黄原子といた単数又は複数のヘテロ原子で中断又は終結され、任意には芳香族又はモノ／ポリ不飽和炭化水素、ポリエチレングリコールといったポリオキシエチレン、ポリ−β−アラニンといったオリゴ／ポリアミド、ポリグリシン、ポリリシン、ペプチド、オリゴ／多糖類、オリゴ／ポリリン酸塩、毒素、抗生物質、細胞毒及びステロイドといったような官能基と同様に「親和性リガンド」すなわち特定のタンパク質、抗体、多糖体又はオリゴ糖及びその他の生体分子上の部位に対する特異的親和性をもつ官能基又は生体分子を含むことができる。
【００７２】
当業者にとっては、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学的活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンドの下で上述された特定的な例が、問題の基の「活性／機能」部分に対応するということは明白であろう。さらに、当業者にとっては、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンドが標準的にＭ−Ｋ−という形で表わされる（なおここでＭは問題の基の「活性／官能」部分であり、Ｋは、それを通して「活性／官能」部分が５又は６成員環に付着されている）ということも明白である。かくして、ＢがＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学的活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンドの中から選択される場合、Ｂ基がＭ−Ｋ−の形態を有すること（ここで、ＭはそれぞれＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンドの「活性／機能」部分であり、Ｋは、５又は６成員環と「活性／機能」部分の間に１〜５０個好ましくは１〜３０個、特に１〜１５個の原子を含む任意のスペーサである）を理解すべきである。
【００７３】
ここでは、「スペーサ」という語は、熱化学的及び光化学的に不活性な間隔形成基を意味し、上述のタイプの２つ以上の異なる半分を接合するために使用される。スペーサは、その疎水性、親水性、分子柔軟性及び長さを含めたさまざまな特徴に基づいて選択される。（例えば、Hermanson et al.,「固定化親和性リガンド技術」、Academic Press, San Diego, California (１９９２)，ｐ１３７−ｆｆを参照のこと）。一般に、スペーサの長さは、４００Å未満又は約４００Åであり、一部の応用分野では好ましくは１００Å未満である。かくして、スペーサは、酸素原子、窒素原子及び／又は硫黄原子といったような単数又は複数のヘテロ原子で任意に中断又は終結された炭素原子鎖を含んで成る。かくして、スペーサＫは、単数又は複数のアミド、エステル、アミノ、エーテル及び／又は、チオエーテル官能基、そして任意には、芳香族又はモノ／ポリ不飽和炭化水素、ポリエチレングリコールといったようなポリオキシエチレン、オリゴ／ポリアミド例えばポリ−β−アラニン、ポリグリシン、ポリリシン、及びペプチド全般、オリゴ糖、オリゴ／ポリホスフェートを含むと考えられる。その上、スペーサはその組合わされた単位で構成されていてよい。スペーサの長さは、５〜６成員環との関係における問題の基の「活性／機能」部分の所望の又は必要な位置づけ及び空間的配位を考慮に入れて、変動可能である。特に有利な実施形態においては、スペーサは、化学的に分割可能な基を内含する。このような化学的に分割可能な基の例としては、還元性条件下で分割可能なジスルフィド基、ペプチターゼにより分割可能なペプチドフラグメントなどが含まれる。
【００７４】
１つの変形形態においては、Ｋは、問題の基の「活性／機能」部分が５又は６成員環に直接付着されるような単一結合を表わしている。
【００７５】
好ましい実施形態においては、一般構造式Ｉ及びIIの中の置換基は好ましくは核塩基、特にアデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシルの中から選択される。
【００７６】
オリゴマ（構造式Ｉ）においては、Ｐは、後続単量体に対するヌクレオシド間リンケージ又は５’末端基のためのラジカル位置を表わす。第１の可能性は、問題のＬＮＡが５’末端「単量体」でないときにあてはまり、一方後者の可能性は、問題のＬＮＡが５’末端「単量体」である場合にあてはまる。（以下のヌクレオシド内リンケージ及び５’末端基の定義からも明らかとなるように）、かかるヌクレオシド内リンケージ又は５’末端基が置換基Ｒ５（又は同等に適用可能であるのは置換基Ｒ５＊）を内含でき、かくして基Ｐに対する２重結合を形成するということを理解すべきである（５’末端は、ヌクレオシド内のリボース半分の５’炭素原子に対応する位置を意味する）。
【００７７】
一方、先行する単量体又は３’末端基（Ｐ*）に対するヌクレオシド間リンケージは、好ましくは置換基Ｒ３*によって定義された位置から、置換基Ｒ３又はＲ３*の１つによって規定された位置に由来することができる。（３’末端は、ヌクレオシド内のリボース半分の３’炭素原子に対応する位置を意味する）。
【００７８】
Ｒ３*（「正常な」形態）又はＲ３（キシロ形態）のいずれかとしてのＰ*基の配向が、２つの同等に有利な可能性を表わしていることを理解すべきである。「正常な」ＬＮＡ単量体及びヌクレオチド（２−デオキシヌクレオチド及び／又はヌクレオチド）の組合せを伴うオリゴマ及び全「正常」（Ｒ３*＝Ｐ*）オリゴマは、ＤＮＡ，ＲＮＡ及びその他のＬＮＡオリゴマに対して強力に（増大する親和力を伴って）ハイブリッド形成するということがわかっている。現在、全−キシロＬＮＡオリゴマ及びキシロＬＮＡ（Ｒ３＝Ｐ*）単量体を伴うオリゴマを例えば、キシロヌクレオチド（ヌクレオチド及び／又はコーデオキシヌクレオチド）の組合せは、比較可能なハイブリダイゼーション特性を発生させることになると考えられている。「正常な」形態（Ｒ３*＝Ｐ*）をもつオリゴマが、ＤＮＡ，ＲＮＡ又はもう１つのＬＮＡオリゴマのいずれかに対し（増大する親和性を伴って）ハイブリッド形成された時点で１つのＬＮＡオリゴマの逆平行配向を発生させることになるということが示されてきた。かくして、キシロ形態（Ｒ３＝Ｐ*）をもつオリゴマが、ＤＮＡ，ＲＮＡ又はもう１つのＬＮＡにハイブリッド形成された時点で平行配向を発生させることになると考えられる。
【００７９】
以上のことからみて、１つのオリゴマ内での「正常な」ＬＮＡとキシロＬＮＡの組合せは、異なるタイプのこれらの単量体がドメイン内にあるかぎりにおいて、すなわち５個以上、例えば１０個以上といった単量体（例えばキシロ−ＬＮＡ，キシロ−ヌクレオチドなどの単量体）の中断されないドメインの後にその他のタイプの５個以上例えば１０個以上の単量体（例えば「正常な」ＬＮＡ，「正常な」ヌクレオチドなど）の中断されていないドメインが続くような形で、有利な特性を発生させることができると考えられている。このようなキメラタイプのオリゴマは、例えば核酸を捕捉するために使用することができる。
【００８０】
ここでは、「単量体」という語は、天然に発生するヌクレオシド，非天然に発生するヌクレオシド，ＰＮＡなどならびにＬＮＡに関するものである。従って、「後続単量体」という語は、５’末端方向に隣接する単量体」に関係し、「先行単量体」は、３’末端方向に隣接する単量体と関係する。ＬＮＡ単量体の位置から見たこのような後続及び先行単量体は、天然に発生するヌクレオシド又は非天然に発生するヌクレオシド，さらにはＬＮＡ単量体であり得る。
【００８１】
その結果、（以上の定義から導くことができるように、ここでは、「オリゴマ」という語は、単数又は複数のＬＮＡの取込みによって修飾されたオリゴヌクレオチドを意味する。
【００８２】
ここでは、バイラジカル（Ｒ2*−Ｒ４*）の配位は、左側が最小の番号をもつ置換基を表わし右側が最大の番号をもつ置換基を表わすようなものであり、かくしてＲ２*及びＲ４*が一緒にバイラジカル「−Ｏ−ＣＨ２」を表わす場合、酸素原子がＲ２*を表わしかくして酸素原子が例えばＲ２*の位置に付着され、メチレン基がＲ４*を表わすことがわかる。
【００８３】
オリゴマの中に取込まれたＬＮＡ（単複）内のバイラジカル（Ｒ２*−Ｒ４*）の構造についての数多くの有利な可能性を考慮すると、バイラジカルは好ましくは、−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ−Ｙ−（ＣＲ*Ｒ*）ｓ−、−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ−Ｙ−（ＣＲ*Ｒ*）ｓ−Ｙ−、−Ｙ−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｙ−、−Ｙ−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ−Ｙ−（ＣＲ*Ｒ*）ｓ−、−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−、−Ｙ−、−Ｙ−Ｙ−、の中から選択され、ここで各々のＹは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｉ（Ｒ*）２−、−Ｎ（Ｒ*）−、＞Ｃ＝０、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ*）−、及び−Ｎ（Ｒ*）−Ｃ（＝Ｏ）−、から独立して選択され、各々のＲ*は、水素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、モノ又はジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、任意に置換されたＣ１−６−アルコキシ、任意に置換されたＣ１−６−アルキル、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基、及びリガンドの中から選択され、かつ／又は２つの隣接する非ジェミナルＲ*は一緒に１つの２重結合を表わし、ｒ及びｓの各々は、ｒ＋ｓの和が１〜４であることを条件として０〜４である。特に有利な状況は、バイラジカルが−Ｙ−，−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−，−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ−Ｙ−（ＣＲ*Ｒ*）ｓ−，及び−Ｙ−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｙ−，から選択され、ｒ及びｓの各々がｒ＋ｓの和が１〜４であることを条件として０〜３であるような状況である。
【００８４】
特に有利なオリゴマは、オリゴマ内の少なくとも１つのＬＮＡ中のＲ２*及びＲ４*が一緒に−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ*）−、−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ＋１−、−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ−Ｏ−（ＣＲ*Ｒ*）ｓ−、−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ−Ｓ−（ＣＲ*Ｒ*）ｓ−、−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ−Ｎ（Ｒ*）−（ＣＲ*Ｒ*）ｓ−、−Ｏ−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ*）−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ*）−、−Ｓ−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｓ−、Ｎ（Ｒ*）−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ*）−、−Ｎ（Ｒ*）−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｓ−、及び−Ｓ−（ＣＲ*Ｒ*）ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ*）−の中から選択されたバイラジカルを表わしているようなオリゴマである。
【００８５】
さらに、１つのＲ*が、水素、ヒドロキシ、任意に置換されたＣ１−６−アルコキシ、任意に置換されたＣ１−６−アルキル、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンドの中から選択され、いずれかの残りの置換基Ｒ*が水素であることが好ましい。
【００８６】
１つの好ましい変形形態においては、少なくとも１つのＬＮＡのバイラジカル内の１つのＲ*基は、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンドの中から選択される（ここで後者の基には、置換基Ｂについて定義されているようなスペーサが内含されていてよい）。
【００８７】
好ましくは、存在しかつＰ又はＰ*に関与しないＬＮＡ（単複）の置換基Ｒ１*、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ３*、Ｒ５、Ｒ５*、Ｒ６及びＲ６*の各々は、水素、任意に置換されたＣ１−６−アルキル、任意に置換されたＣ２−６−アルケニル、ヒドロキシ、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、アジド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルフォノ、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンド及びハロゲンの中から独立して選択され、ここで２つのジェミナル置換基はオキソを表わすことができ、ＲＮ*は、それが存在しバイラジカルに関与していない場合、水素及びＣ１−４アルキルの中から選択される。
【００８８】
ＬＮＡの好ましい変形形態においては、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＲＮ*−特に−Ｏ−の中から選択され、存在しかつＰ又はＰ*に関与しないＬＮＡ（単複）の置換基Ｒ１*、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ３*、Ｒ５、Ｒ５*、Ｒ６及びＲ６*の各々は、水素を表わす。
【００８９】
さらに好ましい変形形態においては、ＸはＯであり、Ｒ２は水素、ヒドロキシ及び任意に置換されたＣ１−６−アルコキシの中から選択され、Ｒ３及びＲ３*のうちの１つのＰ*であり、もう１方は水素であり、Ｒ１*、Ｒ５及びＲ５*は水素を表わし、より特定的には、バイラジカル（Ｒ２*−Ｒ４*）は、−Ｏ−、−（ＣＨ２）０−１−Ｏ−（ＣＨ２）１−３−、−（ＣＨ２）０−１−Ｓ−（ＣＨ２）１−３−、−（ＣＨ２）０−１−Ｎ（ＲＮ）−（ＣＨ２）１−３−、及び−（ＣＨ２）２−が、特にＯ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、及び−ＮＲＨ−ＣＨ２−の中から選択される。一般に、これまでに得られた結果を正当に考慮すると、Ｒ２*及びＲ４*を構成するバイラジカルが２つの炭素原子架橋を形成することすなわち、バイラジカルが、フラノース環（Ｘ＝Ｏ）と５成員環を形成することが好ましい。特に有利であるのは、同様に、構造式Ｉの組込まれたＬＮＡのＲ２*及びＲ４*が一緒に−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−及び−ＮＲＨ−ＣＨ２−の中から選ばれたバイラジカルを表わし、ＸがＯであり、Ｂがアデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシルの中から選ばれた１つの核塩基を表わし、Ｒ２が水素であり、Ｒ３又はＲ３*の１つがＰ*を表わし、もう１方が水素であり、Ｒ１*、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５*が水素を表わすようなオリゴマである。
【００９０】
これらの実施形態においては、オリゴマ内に取込まれた少なくとも１つのＬＮＡが、アデニン及びグアニンの中から選択された核塩基（置換基Ｂ）を内含することがさらに好ましい。特に、オリゴマが共にチミン、ウラシル及びシトシンの中から選択された少なくとも１つの核塩基及びアデニン及びグアニンから選択された少なくとも１つの核塩基を内含するＬＮＡを中に取込んでいることが好ましい。ＬＮＡ単量体については、核塩基がアデニン及びグアニンから選択されていることが特に好ましい。
【００９１】
これらの有利な実施形態の１変形形態においては、オリゴヌクレオチドの全ての単量体はＬＮＡ単量体である。
【００９２】
一般構造式Ｉ（１つのオリゴマ内のＬＮＡ（単複））及びそれに付随する定義から明白であるように、置換基及び考えられるバイラジカルの性質に応じて、オリゴマ内には単数又は複数の非対象な炭素原子が存在しうる。以下を参照のこと。
【００９３】
１変形形態においては、Ｒ３＋はＰ*を表わす。もう１つの変形形態では、Ｒ３はＰ*を表わし、第３の変形形態では、一部のＲ３*はいくつかのＬＮＡ内のＰ*を表わし、Ｒ３は、１つのオリゴマ内のその他のＬＮＡ内のＰ*を表わす。
【００９４】
オリゴマは標準的に、一般構造式Ｉの１〜１００００のＬＮＡ（単複）及び、天然に発生するヌクレオシド及びヌクレオシド類似体から選択された０〜１００００のヌクレオシドを含んで成る。ヌクレオシドの数とＬＮＡ（単複）の数の合計は少なくとも２、好ましくは少なくとも３、特に少なくとも５、特に少なくとも７、例えば２〜１５０００の範囲内、好ましくは２〜１００例えば３〜１００の範囲内、特に２〜５０の範囲内、例えば３〜５０又は５〜５０又は７〜５０の範囲内にある。
【００９５】
ここでは、「ヌクレオシド」という語は、複素環塩基のグリコシドを意味する。「ヌクレオシド」という語は広義には、非天然発生のヌクレオシド、天然発生のヌクレオシドならびにその他のヌクレオシド類似体を内含するものとして使用されている。ヌクレオシドの例としては、リボース半分を含むリボヌクレオシドならびにデオキシリボース半分を含むデオキシリボヌクレオシドがある。かかるヌクレオシドの塩基に関しては、これは、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルといったような天然に発生する塩基のいずれかならびにそのいずれかの修飾された変異体及び考えられるあらゆる非天然塩基でありうるということを理解すべきである。
【００９６】
定義及び既知のヌクレオシド（天然発生及び非天然発生）及びヌクレオシド類似体（既知の２環及び３環類似体）を考慮すると、オリゴマが（置換基の選択及びバイラジカルの選択の両方に関して同一であるか又は異なるものであり得る）単数又は複数のＬＮＡ（単複）及び単数又は複数のヌクレオシド及び／又はヌクレオシド類似体を含むことができるということは明白である。ここでは、「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間リンケージを介して結合された連続するヌクレオシド鎖を意味するが、１つのオリゴマ（オリゴヌクレオチド）内の単数又は複数のヌクレオチド単位（単量体）の中の核塩基が以上で定義されたような置換基Ｂで修飾された可能性があるということを理解すべきである。
【００９７】
上述のように、オリゴマのＬＮＡ（単複）は、ヌクレオシド間リンケージを介してその他の単量体と結合されている。ここでは、「ヌクレオシド間リンケージ」という語は、ＲＨが水素及びＣ１−４−アルキルから選択されＲ"がＣ１−６−アルキル及びフェニルから選択されるものとして−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ"）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ")−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、及び−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−の中から選ばれた２〜４個好ましくは３個の基／原子から成るリンケージを意味する。かかるヌクレオシド間リンケージの例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続単量体に対するリンケージとして用いられる場合Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（後続単量体に対するリンケージとして用いられる場合Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続単量体に対するリンケージとして用いられる場合、Ｒ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ"）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｓｉ���Ｒ"）２−Ｏ−があり、このうち、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ"）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、及び−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、（ここでＲＨは水素及びＣ１−４アルキルの中から選ばれ、Ｒ"はＣ１−６アルキル及びフェニルの中から選ばれる）が特に好ましい。さらなる例は、Mesmaeker et al.、構造生物学における今日的見解１９９５、５、３４３−３５５の中で示されている。ヌクレオシド間リンケージの左側は置換基Ｐ*として５成員環に結合されており、一方右側は先行単量体の５’位置に結合されている。
【００９８】
上述のことから同様に、問題のＬＮＡが５’末端単量体である場合に、Ｐ基が５’末端基をも表わし得るということは明白である。かかる５’末端基の例としては、水素、ヒドロキシ、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６−アルコキシ、任意に置換されたＣ１−６−アルキルカルボニルオキシ、任意に置換されたアリルオキシ、１リン酸、２リン酸、３リン酸及び−Ｗ−Ａ’〔ここでＷは−Ｏ−、−Ｓ−、及び−Ｎ（ＲＨ）（ここでＲＨは水素及びＣ１−６−アルキルの中から選ばれる）の中から選ばれ、Ａ’は、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンドの中から選択される（ここで後者の基には、置換基Ｂについて定義されているようなスペーサが内含されていてよい）の中から選択される〕がある。
【００９９】
当該明細書及びクレームの中では、「１リン酸」、「２リン酸」及び「３リン酸」という語はそれぞれ−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ、及び−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏという構造式をもつ基を意味している。
【０１００】
特に有利な実施形態においてＰ基は、１リン酸、２リン酸及び３リン酸から選択された５’末端基を表わす。特に、３リン酸変形形態は、核酸ポリメラーゼのための基質として有利である。
【０１０１】
同様にして、Ｐ*基は、問題のＬＮＡが３’末端単量体である場合に３’末端基を表わすことができる。かかる３’末端基の例としては、水素、ヒドロキシ、任意に置換されたＣ１−６アルコキシ、任意に置換されたＣ１−６アルキルカルボニルオキシ、任意に置換されたアリルオキシ及び−Ｗ−Ａ'〔ここでＷは−Ｏ−、−Ｓ−、及び−Ｎ（ＲＨ）（ここでＲＨは水素及びＣ１−６−アルキルの中から選ばれる）の中から選ばれ、Ａ’は、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート化基、リポータ基及びリガンド（ここで後者の基には、置換基Ｂについて定義されているようなスペーサが内含されていてよい）の中から選択される〕がある。
【０１０２】
ＬＮＡの好ましい変形形態においては、オリゴマは、
Ｇ−[Ｎｕ−Ｌ]ｎ（０）−{[ＬＮＡ−Ｌ]ｍ（ｑ）−[Ｎｕ−Ｌ]ｎ（ｑ）}ｑ−Ｇ＊
という構造式を有し、式中
ｑは１〜５０であり；
ｎ（０）、……、ｎ（ｑ）及びｍ（１）、…ｍ（ｑ）の和が２〜１５０００であることを条件として、
ｎ（０）、……、ｎ（ｑ）の各々は独立して０〜１００００であり；
ｍ（１）、……  ｍ（ｑ）の各々は独立して１〜１００００であり；
Ｇは５’末端基を表わし、
各々のＮｕは独立して、天然に発生するヌクレオシド及びヌクレオシド類似体から選択したヌクレオシドを表わし、
各々のＬＮＡは独立してヌクレオシド類似体を表わし、各々のＬは独立して、Ｎｕ及びＬＮＡの中から選択された２つの基の間のヌクレオシド間リンケージを表わし、又ＬはＧ*と共に３’末端基を表わし、各々のＬＮＡ−Ｌは独立して上述のような一般構造式Ｉのヌクレオシド類似体を表わしている。
【０１０３】
この変形形態の範囲内でならびに一般的に言って、ＬＮＡは好ましくは異なる核塩基、特にチミン、シトシン及びウラシルの中から選択された核塩基並びにアデニン及びグアニンの中から選択された核塩基の両方を内含する。
【０１０４】
オリゴマは同様に、キメラオリゴマも網羅することが意図されている。「キメラオリゴマ」というのは、直接又はスペーサを用いて接合された異なる起源の単量体を伴う２つ以上のオリゴマを意味する。組合せることのできるかかるオリゴマの例としてはペプチド、ＰＮＡ−オリゴマ、ＬＮＡを含むオリゴマ、及びオリゴヌクレオチドオリゴマがある。キシロ−ＬＮＡ（Ｒ３＝Ｐ*）ドメイン（単複）及び「正常な」ＬＮＡ（Ｒ３*＝Ｐ*）ドメイン（単複）をもつオリゴマの組合せは、さまざまなドメインが異なる親和性及び特異性プロフィールを有する可能性があることから、キメラオリゴマの一例とみなすことができる。
【０１０５】
一般に、オリゴマは、親和性及び特異性に関して驚くほど優れたハイブリダイゼーション特性を有する。かくして、オリゴマは、いかなるヌクレオシド類似体も含まない対応する未修飾の基準オリゴヌクレオチドのものに比べて少なくとも２.５℃高い、好ましくは少なくとも３.５℃高い、特に少なくとも４.０℃高い、特に少なくとも５.０℃高い相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドでのＴｍをオリゴマに付与する少なくとも１つのヌクレオシド類似体を含む。特にオリゴマのＴｍは、Ｎをヌクレオシド類似体の数として、少なくとも２.５×Ｎ℃、好ましくは３.５×Ｎ℃、特に少なくとも４.０×Ｎ℃、特に少なくとも５.０×Ｎ℃高いものである。
【０１０６】
相補的ＲＮＡオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、少なくとも１つのヌクレオシド類似体は、いかなるヌクレオシド類似体も含まない対応する未修飾の基準オリゴヌクレオチドのものに比べて少なくとも４.０℃高い、好ましくは少なくとも５.０℃高い、特に少なくとも６.０℃高い、特に少なくとも７.０℃高い相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドでのＴｍをオリゴマに付与する。特にオリゴマのＴｍは、Ｎをヌクレオシド類似体の数として、少なくとも４.０×Ｎ℃、好ましくは５.０×Ｎ℃、特に少なくとも６.０×Ｎ℃、特に少なくとも７.０×Ｎ℃高いものである。
【０１０７】
「対応する未修飾の基準オリゴヌクレオチド」という語は、同じ絶対的順序で（かつ同じ配向で）同じ核塩基を表わす天然に発生するヌクレオチドだけから成るオリゴヌクレオチドを意味することが意図されている。
【０１０８】
Ｔｍは、
ａ）  １０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７.０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ；
ｂ）  １０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７.０、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ；又は
ｃ）  ３Ｍのテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７.０、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ；
という条件のうちの１つの条件下、好ましくは、条件ａ）の下で、等モル量（標準的には１.０μＭ）のオリゴマ及び相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドで測定される。
【０１０９】
オリゴマは、好ましくは上述のとおりのものであり、ここで少なくとも１つのヌクレオシドはＢが核塩基であるものとして構造式Ｉを有する。特に有利な実施形態においては少なくとも１つのヌクレオシド類似体は、アデニン及びグアニンの中から選択された核塩基を内含する。
【０１１０】
さらに、特異性及び親和性に関しては、オリゴマは、このオリゴマと単数又は複数のミス対合を有する部分的に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド又は部分的に相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成された時点で、ヌクレオシド類似体を全く含まない対応する未修飾の基準オリゴヌクレオチドで観察される減少以上のＴｍ減少を前記ミス対合の結果として示すはずである。同様にオリゴマは、対応する未修飾の基準オリゴヌクレオチドのものと実質的に同じハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度に対するＴｍ感度を有するはずである。
【０１１１】
ここで定義されているオリゴマは、標準的に少なくとも１％，例えば少なくとも２％，例えば３％，４％，５％，６％，７％，８％又は９％，少なくとも１０％，例えば少なくとも１１％，例えば１２％，１３％，１４％，又は１５％，少なくとも２０％，例えば少なくとも３０％，少なくとも５０％，例えば７０％修飾されており、一部の有利な応用分野においては１００％修飾されている。
【０１１２】
オリゴマは、好ましくは、対応する未修飾基準オリゴヌクレオチドよりも実質的に高い３’−ヌクレオチド鎖分解安定性を有する。
【０１１３】
（ＬＮＡが中に取込まれている）オリゴマ及びそのままの状態のオリゴマが、関連性をもちうる薬学的に受容可能な塩を含むそれらの考えられる塩を内含するということを理解されたい。塩には酸性付加塩と塩基性塩がある。酸性付加塩の例は、塩酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩などである。塩基性塩の例としては、（残りの）対立イオンが、ナトリウム及びカリウムといったようなアルカリ金属、カルシウムといったようなアルカリ土類金属、及びアンモニウムイオン（Ｒｇ及びＲｈの各々が独立して、任意に置換されたＣ１−６−アルキル、任意に置換されたＣ２−６−アルケニル、任意に置換されたアリル又は任意に置換されたヘテロアリルを表わすものとして、＋Ｎ（Ｒｇ）３Ｒｈ）の中から選択されているような塩がある。薬学的に受容可能な塩は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,１７，Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.) Mack Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., １９８５及びそれ以降の版、及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology の中で記述されているものである。従って、ここで使用されている「酸性付加塩又はその塩基性塩」という語はこのような塩を含むものであることが意図されている。さらに、オリゴマ及びＬＮＡならびにそのためのあらゆる中間体又は出発物質は同様に水化物の形で存在する可能性がある。
【０１１４】
【実施例】
実施例１
ＬＮＡプライマでの配列特異的増幅
プライマの合成と分析：
ＬＮＡアミダイトのためのカップリング時間が標準の２分から５分まで延長されたという点を除いてＤＮＡ−合成装置（Pharmacia Gene Assembler Special（登録商標）, Pharmacia AB, Uppsala, Sweden）のプロトコル（０.２μmolのスケール）に従った標準的なカップリング条件が使用された。工程的カップリング収量は約９９％であった。一般に標準的な２'−デオキシヌクレオシドＣＰＧ又はポリスチレン固体支持体が使用された。望ましい配列の完成後、３２％のアンモニア水（５又は１０時間５５℃）を用いて、固体支持体の分割及び保護基の除去が達成された。０.０５Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液ｐＨ７.０中の一定のアセトニトリル濃度勾配で逆相ＨＰＬＣ（Delta Pak Ｃ−１８，３００Ａ，カラム寸法０.４×３０cm）により、５'−Ｏ−ＤＭＴ−ＯＮモードで合成したＬＮＡを精製した（流速１.５cm／分）。５'−Ｏ−ＤＭＴ−ＯＮ ＬＮＡ（保持時間３０〜３５分）を含有する分画を蒸発させ、８０％の酢酸中で脱トリチル化した（１cm，室温，１時間）。蒸発後、上述のとおりの（単一ピークとして溶出する）逆相ＨＰＬＣにより、ＬＮＡを再度精製した。
【０１１５】
試料調製
哺乳動物の血液用のＤＮＡ分離キット（Roche Molecular Systems cat. no.１６６７３２７．Roche Molecular Biochemicals, Hvidorre, Denmark）を用い、かつメーカーの推奨事項を厳密に守って、５ｍＬの全血からヒトゲノミックＤＮＡを分離した。
【０１１６】
ＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」を、ＡpoＢ３５００遺伝子座を含む野生型ヒトＡpoＢ遺伝子の一部分をＰＣＲ増幅することによって生成した（Ludwig et al.(１９８７)ＤＮＡ６；３６３−３７２；受入れ番号Ｍ１９８２８号、配列番号４）。ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Cloning（登録商標） Kit (Invitrogen, cat. no. Ｋ４５００−０１，Invitrogen Corporation, Carisbad CA USA)を用いてＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＣＲ（登録商標）２.１−ＴＯＰＯ内にクローニングした。QUIAGEN（登録商標） Plasmid Kits (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)を用いて細菌培養からプラスミドＤＮＡを精製した。インサートのＤＮＡ配列を、ALFexpress II ＤＮＡ分析システム（Amersham Pharmacia Biotech) を用い、メーカーの推奨事項を厳密に守ってＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１１７】
ＰＣＲ増幅
Hybaid PCR Expressサーモサイクラ（Hybaid, Middlesex, UK）を用いて、０.５ｍＬの薄壁管の中でＰＣＲ反応を実施した。ｄＮＴＰは、Amersham Pharmacia Biotech AB., Uppsala, Sweden からのものであった。最終試薬混合物は、以下のように構成されていた。
ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，各々２００μＭ
ＭｇＣｌ２  １.５ｍＭ
１０×GeneAmp ＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer Corporaiton, Norwalk, CT, USA),５μＬ
プライマＥＱ３０５３，配列番号１  １μＭ
プライマＥＱ３０５４，配列番号２  １μＭ
AmpliTaq Gold（登録商標）ポリメラーゼ（Perkin Elmer cat. no. Ｎ８０８−０２４０，Perkin-Elmer Corporaiton, Norwalk, CT, UAS），１単位
系列希釈状態のＤＮＡ鋳型  ２μＬ，図１参照
【０１１８】
合計体積５０μＬのサーモサイクリング
変性：  ９５℃，１５分
サイクリング：  ３５回（９４℃で３０秒；６３℃で３０秒；７２℃で３０秒）
最終伸展：  ７２℃，１０分
４℃まで冷却
【０１１９】
伸展産物の検出
１０μＬのＰＣＲ産物をその後２μＬの施用緩衝液（４０％のスクロース、０.２５％のブロモフェノールブルー、０.２５％のキシレンシアノール、０.１ＭのＥＤＴＡ ｐＨ８.０）と混合し、アガロースゲル内での電気泳動に付した。ゲルは、１×ＴＡＥ，０.５μｇ／ｍＬの臭化エチジウム（Sigma-Aldrich cat. no.Ｅ７６３７，Sigma-Aldrich Denmark A/S, Vallensbaek Strand, Denmark） 中の１％のSeaKem（登録商標）, Agarose (FMC Bio-Products, Philadelphia, PA, USA) （５０×ＴＡＥ＝２４２ｇ Tris Base, ５７.１mL 氷酢酸, １００mL 0.５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０）で構成されていた。ゲルを、約５Ｖ／cmで０.５〜１時間走らせた。Image-Master VDS装置（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden） を用いて、螢光を写真撮影した。標準的な実験は図１に示されている。
【０１２０】
ＬＮＡ単量体を伴うＰＣＲプライマ中の３’末端置換が対立遺伝子特異的増幅をもたらすことができるか否かを立証するため、鋳型ＤＮＡを２セットのプライマＥＱ３０５３／ＡpoＢＲ２及びＥＱ３０５４／ＡpoＢＲ２を用いて増幅させた。プライマセットＥＱ３０５３／ＡpoＢＲ２（配列番号１，配列番号３）は、ＡpoＢ遺伝子（配列番号４）が鋳型として使用されていることを条件として６６７ｂｐのＰＣＲ産物を産生し、一方、ＥＱ３０５３／ＡpoＢＲ２プライマセットは、鋳型として３０.４ng以下のＡpoＢ遺伝子「Ａ−対立遺伝子」（配列番号５）が用いられる場合、いかなる特異的ＰＣＲ産物も産生しない。結果は図１に示されている。
【０１２１】
ＥＱ３０５３（配列番号１）：５’−ＣＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡ
ＧＣＡＣＡＣＧＬＮＡ−３’
ＥＱ３０５４（配列番号２）：５’−ＣＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡ
ＧＣＡＣＡＣＡＬＮＡ−３’
ＡpoＢＲ２  （配列番号３）：５’−ＴＴＴＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＧＴＴＴＣ
ＡＧＣＣＣ−３’
【０１２２】
ＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」（配列番号４）：
５’−ＣＴＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＴ−３’
【０１２３】
ＡpoＢ遺伝子の「Ａ−対立遺伝子」（配列番号５）：
５’−ＣＴＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＴ−３’
【０１２４】
実施例２
ＬＮＡプライマを用いた対立遺伝子特異的ＰＣＲによるＡpoＢ Ｒ３５００Ｑの検出
アポリポタンパクＢ（ＡpoＢ）は、ＬＤＬ−レセプタにより認識される低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）複合体の交換不可能なタンパク質である。家族性ＡpoＢ１００欠損症は、アミノ酸３５００（arg→gln）における塩基遷移（Ｇ→Ａの突然変異）（ＡpoＢ  Ｒ３５００Ｑ  突然変異）によってひき起こされる常染色体優性疾患である。突然変異は、ＬＤＬレセプタのためのＬＤＬ複合体の親和性を低減させ、血漿中のＬＤＬコレステロールのレベルを上昇させる結果となる。突然変異の罹患率は、正常な母集団の中でヘテロ接合体について １：５００，ホモ接合体については１：１,０００,０００である（Fauci. A.S.らによるHarrisonの内科学原理、第１４版、（編集）マグローヒル）である。
【０１２５】
ＬＮＡプライマを用いたＰＣＲの可変性を立証するため、ＡpoＢ Ｒ３５００Ｑ多型現象の「Ｇ−対立遺伝子」及び「Ａ−対立遺伝子」の両方の正の同定を可能にする２つの対立遺伝子特異的ＰＣＲがセットアップされた。
【０１２６】
プライマの合成と分析
基本的に例１に記述されているようにＬＮＡプライマの合成及び分析を行なった。商業的供給源（ＤＮＡ Technology, Aarhus, Denmark）からＨＰＬＣ精製されたオリゴとして下流側ＤＮＡプライマを得た。
【０１２７】
試料の調製
例１に記述されているようにＡpoＢ３５００遺伝子座を含む野生型ヒトＡpoＢ遺伝子の一部分をＰＣＲ増幅することにより、ＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」を生成した。「Ｇ−対立遺伝子」プラスミドを用いて、ＡpoＢ３５００遺伝子座（配列番号４）を含む野生型ヒトＡpoＢ遺伝子の一部分のＰＣＲ増幅中のアミノ酸３５００においてオリゴヌクレオチド誘導型単一塩基突然変異（Ｇ→Ａ突然変異）を作り上げることによって、ＡpoＢ遺伝子の「Ａ−対立遺伝子」を生成した。オリゴヌクレオチド誘導型単一塩基突然変異は、突然変異させるべき部位を網羅する１つのオリゴと２つの増幅オリゴの計３つのＤＮＡオリゴをＰＣＲ反応に取り込むことによって得られ、このオリゴは、突然変異が生成された１つのミス対合を含んでいた。原理は図２に例示されている。ＰＣＲ増幅の後、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Cloning（登録商標）Kit (Invitrogen, cat. no.Ｋ４５００−０１，Invitrogen Corporation, Carlsbad CA USA）を用いて、フラグメントをプラスミドＰＣＲ（登録商標）２.１−ＴＯＰＯ内にクローニングさせた。QUIAGEN（登録商標）Plasmid Kits (QIAGNE GmbH, Hilden, Germany）を用いて、クローニングされた細菌培養からプラスミドＤＮＡを精製した。次に、ALFexpress II DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)を用いメーカーの推奨事項を厳密に守ってＤＮＡ配列決定を行なうことによって、予測された突然変異の存在についてプラスミド調製物をスクリーニングした。
【０１２８】
ＰＣＲ増幅
Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Germany）を用いて、０.５ｍＬの薄壁管の中で、ＰＣＲ反応を実施した。ｄＮＴＰはAmersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala Sweden からのものであった。最終的試薬混合物は、以下のように構成されていた：
【０１２９】
ヒトＡpoＢ３５００遺伝子座の野生型（Ｇ−対立遺伝子）の検出のための手順。
ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ：  各々２００μＭ
ＭｇＣｌ２  １.５ｍＭ
１０×GeneAmp ＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT, USA),５μＬ
プライマ  ＥＱ３０５３，配列番号１  １μＭ
プライマ  ＥＱ３２１３，配列番号６  １μＭ
AmpliTaq Gold（登録商標）ポリメラーゼ（Perkin Elmer cat. no.N８０８−０２４０，Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT, USA），１単位
ＤＮＡ鋳型２μＬ（約５０ngのプラスミド／１μｌ）
合計体積  ５０μＬ
【０１３０】
ＰＣＲ増幅により生成されプラスミドＰＣＲ（登録商標）２.1 −ＴＯＰＯ内にクローニングされたヒトＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」及び「Ａ−対立遺伝子」の両方を使用した。
【０１３１】
サーモサイクリング
未変性：  ９５℃，１５分
サイクリング：  ３５回（９４℃で３０秒；５５℃で３０秒；７２℃で３０秒）
最終伸展：  ７２℃，１０分
４℃まで冷却。
【０１３２】
検出
その後、標準的なアガロースゲル電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分析した（例１参照）。唯一の差異は２％のアガロースにあり、これらの産物は、ゲル内に１：３０,０００で希釈されたGel Star（登録商標） （FMC Bio Products, Rockland, Maine, U.S.A）を内含することによって染色された。永久的記録として、適切なＵＶトランスイルミネータ（ＴＭ−２０Ｅ型 UV Products, Upland, CA, USA) 及びフィルタ（Kodak Wratten ＃９ Eastman Kodak Co.,Rochester, NY. USA)を用いて、標準的ポラロイド（Polaroid LTD, St. Albans, UK）写真撮影術によりゲルを撮影した。
【０１３３】
ヒトＡpoＢ３５００遺伝子座の突然変異型（Ａ−対立遺伝子）の検出のための手順
ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ：  各々２００μＭ
ＭｇＣｌ２  １.５ｍＭ
１０×GeneAmp ＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT, USA）,５μＬ
プライマ  ＥＱ３１５７，配列番号７  １μＭ
プライマ  ＥＱ３１７６，配列番号６  １μＭ
AmpliTaq Gold（登録商標）ポリメラーゼ（Perkin Elmer cat. no.N８０８−０２４０，Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT, USA），１単位
ＤＮＡ鋳型２μＬ（約５０ngのプラスミド／１μｌ）
合計体積  ５０μＬ
【０１３４】
ＰＣＲ増幅により生成されプラスミドＰＣＲ（登録商標）２.1 −ＴＯＰＯ内にクローニングされたヒトＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」及び「Ａ−対立遺伝子」の両方を使用した。
【０１３５】
サーモサイクリング
変性：  ９５℃，１５分
サイクリング：  ３５回（９４℃で３０秒；６７℃で３０秒；７２℃で３０秒）
最終伸展：  ７２℃，１０分
４℃まで冷却。
【０１３６】
検出
その後、標準的なアガロースゲル電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分析した（実施例１参照）。唯一の差異は２％のアガロースにあり、これらの産物はゲル内に１：３０,０００で希釈されたGel Star（登録商標）（FMC Bio Products, Rockland, Maine, U.S.A）を内含することによって染色された。永久的記録として、適切なＵＶトランスイルミネータ（ＴＭ−２０Ｅ型 UV Products, Upland, CA, USA) 及びフィルタ（Kodak Wratten ＃９ Eastman Kodak Co.,Rochester, NY. USA)を用いて、標準的ポラロイド（Polaroid LTD, St. Albans, UK）写真撮影術によりゲルを撮影した。
【０１３７】
結果
ＬＮＡ単量体を用いたＰＣＲプライマ内での３’末端置換が対立遺伝子特異的増幅をもたらすことができるということを示すため、ヒトＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」及び「Ａ−対立遺伝子」の両方を含有する鋳型ＤＮＡを２セットのプライマＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３及びＥＱ３１５７／ＥＱ３１７６を用いて増幅させた。
【０１３８】
ＥＱ３０５３（配列番号１）：５’−ＣＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡ
ＧＣＡＣＡＣＧＬＮＡ−３’
ＥＱ３２１３（配列番号６）：５’−ＧＴＴＴＴＴＣＧＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣ
ＣＣＡＧＡＧ−３’
ＥＱ３１５７（配列番号７）：５’−ＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＡ
ＧＡＣＴＬＮＡ−３’
ＥＱ３１７６（配列番号８）：５’−ＣＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＣＣＡＴ
ＴＧＡＧＴ−３’
【０１３９】
ＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」（配列番号４）：
５’−ＣＴＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＴ−３’
【０１４０】
ＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」（配列番号５）：
５’−ＣＴＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＴ−３’
【０１４１】
プライマセットＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３（配列番号１，配列番号６）は、鋳型としてＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」（配列番号４）が使用されたことを条件として、１５３ｂｐのＰＣＲ産物を産生し、一方ＡpoＢ遺伝子「Ａ−対立遺伝子」（配列番号５）が鋳型として使用された場合、このプライマセットはいかなる特異的ＰＣＲ産物も産生しない−図３参照のこと。
【０１４２】
プライマセットＥＱ３１５７／ＥＱ３１７６（配列番号７，配列番号８）は、ＡpoＢ遺伝子の「突然変異体」又は「Ａ−対立遺伝子」（配列番号５）が鋳型として使用されたことを条件として、１４５ｂｐのＰＣＲ産物を産生し、一方ＡpoＢ遺伝子の「野生型」又は「Ｇ−対立遺伝子」（配列番号４）が鋳型として使用された場合、このプライマセットはいかなる特異的ＰＣＲ産物も産生しない−図３参照。ここで２つのプライマセットＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３及びＥＱ３１５７／ＥＱ３１７６が鋳型分子の異なるストランドに向けられているという点に留意されたい。
【０１４３】
実施例３
ＤＮＡプライマは、野生型及び突然変異型の間の弁別を行なうことができない。
ＬＮＡ及びＤＮＡプライマ間の差異を評価するべく、２つのＰＣＲ反応をセットアップした。
【０１４４】
１つの反応は、ＬＮＡプライマＥＱ３０５３を用いたヒトＡpoＢ３５００遺伝子座の野生型（Ｇ−対立遺伝子）の検出のための例２で記述された反応であった。
【０１４５】
もう１つの反応は、類似のものであったがＬＮＡプライマＥＱ３０５３を用いる代りにＥＱ３０５３と類似の配列をもつＤＮＡプライマが用いられた。
【０１４６】
プライマの合成と分析
基本的に例１に記述されているようにＬＮＡプライマの合成及び分析を行なった。商業的供給源（ＤＮＡ Technology, Aarhus, Denmark）からＨＰＬＣ精製されたオリゴとしてＤＮＡプライマを得た。
【０１４７】
ＰＣＲ増幅
Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Germany）を用いて、０.５ｍＬの薄壁管の中で、ＰＣＲ反応を実施した。ｄＮＴＰは、Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala Sweden からのものであった。最終的試薬混合物は、以下のように構成されていた：
【０１４８】
ＬＮＡ−プライマとの反応には、１μＭのプライマＥＱ３０５３（配列番号１）及び１μＭのプライマＥＱ３２１３（配列番号６）が含まれていた。
【０１４９】
ＤＮＡ−プライマとの反応には、１μＭのプライマＥＱ３６４７（配列番号９）及び１μＭのプライマＥＱ３２１３（配列番号６）が含まれていた。
【０１５０】
その他全ての点で、ＬＮＡ及びＤＮＡを用いた反応は、以下の通り同一であった：
ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ：  各々２００μＭ
ＭｇＣｌ２  １.５ｍＭ
１０×GeneAmp ＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT, USA),５μＬ
AmpliTaq Gold（登録商標）ポリメラーゼ（Perkin Elmer cat. no.N８０８−０２４０，Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT, USA），１単位
ＤＮＡ鋳型２μＬ（約５０ngのプラスミド／μＬ）
合計体積  ５０μＬ
【０１５１】
ヒトＡpoＢ遺伝子の両方の「Ｇ−対立遺伝子」及び「Ａ−対立遺伝子」鋳型は、例２に記述されているプラスミドであった。
【０１５２】
サーモサイクリング
変性：  ９５℃，１５分
サイクリング：  ３５回（９４℃で３０秒；５５℃で３０秒；７２℃で３０秒）
最終伸展：  ７２℃，１０分
４℃まで冷却。
【０１５３】
検出
その後、２％のアガロース中の標準的なアガロースゲル電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分析し、例２で記述された通り、Gel Star（登録商標）（FMC Bio Products, Rockland, Maine, U.S.A）で染色した。最終的に、ゲルを例２で記述されている通りに写真撮影した。
【０１５４】
結果
図４を見ればわかるように、プライマセットＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３（配列番号１，配列番号６）は、ＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」が鋳型として使用された場合に１５３ｂｐのＰＣＲ産物を産生し、一方このプライマセットは、ＡpoＢ遺伝子「Ａ−遺伝子（配列番号５）が鋳型として使用された場合いかなる特異的ＰＣＲ産物も生成しなかった−図４参照。
【０１５５】
ＥＱ３０５３（配列番号１）：５’−ＣＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡ
ＧＣＡＣＡＣＧＬＮＡ−３’
ＥＱ３２１３（配列番号６）：５’−ＧＴＴＴＴＴＣＧＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣ
ＣＣＡＧＡＧ−３’
【０１５６】
ＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」（配列番号４）：
５’−ＣＴＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＴ−３’
【０１５７】
ＡpoＢ遺伝子の「Ａ−対立遺伝子」（配列番号５）：
５’−ＣＴＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＴ−３’
【０１５８】
しかしながら、全てのＤＮＡプライマセットＥＱ３６４７／ＥＱ３２１３（配列番号９，配列番号６）は、両方の「Ｇ−対立遺伝子」又は「Ａ−対立遺伝子」が鋳型として使用された場合、１５３ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。図４参照。
【０１５９】
ＥＱ３６４７（配列番号９）：５’−ＣＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡ
ＧＣＡＣＡＣＧ−３’
ＥＱ３２１３（配列番号６）：５’−ＧＴＴＴＴＴＣＧＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣ
ＣＣＡＧＡＧ−３’
【０１６０】
我々は、ＬＮＡプライマは、ＡpoＢ Ｒ３５００Ｑ 突然変異の単一の塩基差異を検出できるものの、類似のＤＮＡプライマはこれができない、という結論を出している。
【０１６１】
実施例４
Roche Lightcycler 上で適用されたＬＮＡプライマを用いた配列特異的増幅
ＬＮＡプライマを用いたＰＣＲの柔軟性を例示するため、Light Cycler (Roche Diagnostics GmbH, Mamheim, Germany) 上で対立遺伝子特異的ＰＣＲをセットアップした。LightCycler 計器は、産生されたＰＣＲ産物のＴｍ測定による増幅及び同定を１つの作業で可能にする装置である。
【０１６２】
ヒトＡpoＢ Ｒ３５００Ｑ 多型現象の「Ｇ−対立遺伝子」の正の同定を可能にする反応は、以下のとおりであった。
【０１６３】
プライマの合成と分析
基本的に実施例１に記述されているようにＬＮＡプライマの合成及び分析を行なった。商業的供給源（ＤＮＡ Technology, Aarhus, Denmark) からＨＰＬＣ精製されたオリゴとしてＤＮＡプライマを得た。
【０１６４】
ＰＣＲ増幅
計器と共に提供されたほうケイ酸ガラス製の毛細管の中で、メーカーの推奨事項を厳守してＰＣＲ反応を実施した。
【０１６５】
各反応には、以下のものが含まれていた：
合計体積２０μＬ中
・  LightCycler−DNA Master SyBR Green 1 mix (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) ２μＬ。マスターミックスは、核酸，ＰＣＲ緩衝液、ＳｙＢＲ Green及びTaq ポリメラーゼを含有する。
・  ＤＮＡ鋳型１μＬ（約５０ｎｇのプラスミド／μＬ），
・  プライマＥＱ３０５３（配列番号１）１μＭ及びプライマＥＱ３２１３（配列番号６）１μＭ，
・  ＭｇＣｌ２３ｍＭ。
【０１６６】
鋳型として「Ｇ−対立遺伝子」又は「Ａ−対立遺伝子」プラスミドのいずれかを添加した。ヒトＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」及び「Ａ−対立遺伝子」鋳型は両方共、例２で論述したプラスミドであった。
【０１６７】
サーモサイクリング
変性：  ９５℃  ２分，  ２０℃／秒
サイクリング：  ４４回（設定、９５℃で０秒、５５℃で５秒、７２℃で７秒）
【０１６８】
Ｔｍ測定
セグメント１：  ９５℃，０秒，設定
セグメント２：  ６５℃，１０秒
セグメント３：  ９５℃，０秒設定、０.１℃／秒、連続的測定。
冷却：  ４０℃，３０秒
【０１６９】
結果
プライマセットＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３（配列番号１，配列番号６）は、「Ｇ−対立遺伝子」を明らかに増幅し、一方「Ａ−対立遺伝子」が鋳型として使用された場合には非常にわずかなＰＣＲ産物しか観察されなかった。
−  図５参照
【０１７０】
図６を見ればわかるように、プライマセットＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３は、８２℃という明確なＴｍでＰＣＲ産物を産生した。
【０１７１】
我々は、ＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３プライマセットをLight Cycler内での対立遺伝子特異的増幅のために使用できるという結論を下している。
【０１７２】
【配列表】
0005095888.tif 000003
0005095888.tif 000004
0005095888.tif 000005
0005095888.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】  対合する３’末端を伴うＬＮＡのみがＰＣＲ内でプライマとして役立つということを例示している。
【図２】  ＰＣＲ反応に３つのＤＮＡオリゴを取込むことによって得られたオリゴヌクレオチド誘導型単一塩基突然変異。
Ａ）  ３つのオリゴヌクレオチド２本鎖ＰＣＲプライマ及び１つの突然変異オリゴから出発して、ミス対合塩基がＸで表わされている。
Ｂ）  ２回のＰＣＲサイクルの後、４つの１本鎖ＰＣＲ産物が生成される。
Ｃ）  産物１及び４は、数回の付加的ＰＣＲサイクルの後、予想された突然変異を含む２本鎖ＰＣＲ産物を生成する。
【図３】  ＬＮＡプライマを用いた対立遺伝子特異的ＰＣＲ。左側の図版は、プライマセットＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３を用いた結果、「野生型」反応を示している。「Ｇ」は、ＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」が鋳型として使用されたことを意味し、「Ａ」は、ＡpoＢ遺伝子の「Ａ−対立遺伝子」が使用されたことを意味する。右側図版は、プライマセットＥＱ３１５７／ＥＱ３１７６での結果、「突然変異体型の」反応を示す。プライマが非コーディングストランドに向けられていることに留意されたい。「Ｃ」は、ＡpoＢ遺伝子の野生型「Ｇ−対立遺伝子」が鋳型として使用されたことを意味し、「Ｔ」は、ＡpoＢ遺伝子の突然変異体「Ａ−対立遺伝子」が用いられたことを意味する。マーカーは、Low DNA MassＴＭ（Gibco BRL cat.no. １００６８、０１３，Life Technologies Inc., Rockville, MD.USA) である。
【図４】  ＬＮＡ及びＤＮＡプライマの比較。左側図版は、ＬＮＡ／ＤＮＡプライマセットＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３での結果を示す。右側図版は、全ＤＮＡプライマセットＥＱ３６４７／ＥＱ３２１３での結果を示す。「Ｇ」は、ＡpoＢ遺伝子の「Ｇ−対立遺伝子」が鋳型として使用されたことを意味し、「Ａ」は、ＡpoＢ遺伝子の「Ａ−対立遺伝子」が使用されたことを意味し、「Ｈ２Ｏ」は、ＰＣＲ反応内にいかなる鋳型も内含されないことを意味している。マーカーは、Low ＤＮＡＴＭ（Gibco BRL cat.no. １００６８−０１３，Life Technologies Inc. Rockvile. MD. U.S.A) である。
【図５】  増幅プロセスのサイクル毎の監視。ＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３プライマセット及び「Ａ−対立遺伝子」プラスミド又は「Ｇ−対立遺伝子」プラスミドのいずれかを鋳型として用いた、「Ｇ−対立遺伝子」（上の曲線、Ｇ）及び「Ａ−対立遺伝子」（下の曲線、Ａ）の増幅中の螢光増加。
【図６】  ＥＱ３０５３／ＥＱ３２１３プライマセット及び「Ａ−対立遺伝子」鋳型（下の曲線Ａ）又は「Ｇ−対立遺伝子」鋳型（上の曲線Ｇ）のいずれかを用いて生成されたＰＣＲフラグメントの融解曲線分析。上の図版は、２本鎖アンプリコンに結合されたＳｙＢＲ GreenＩ染料の螢光を示す。下の図版は、上の図版内の融解曲線の第１の負の導関数（−ｄＦ／ｄＴ）を示す。Ｔｍは−ｄＦ／ｄＴプロッティング上ではピークとして見える。
【図１】
0005095888.tif 000007
【図２】
0005095888.tif 000008
【図３】
0005095888.tif 000009
【図４】
0005095888.tif 000010
【図５】
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【図６】
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