(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面と外層を有する金属性のインプラントを含む、コーティングされた金属性インプラントであって、
前記外層は、前記金属性のインプラントの表面に付着され、リン酸カルシウム相で鉱化されたコラーゲンマトリックスを含む骨に類似のコーティングを含み、
前記鉱化されたコラーゲンマトリックスは層の形で構成され、
前記鉱化されたコラーゲンマトリックスは、鉱化されたコラーゲンフィブリル、無定形のリン酸カルシウム、及び結晶のヒドロキシアパタイトの複合体を含む、コーティングされた金属性インプラント。
【請求項２】
前記リン酸カルシウム相が追加のイオンでドープされることを特徴とする請求項１に記載のコーティングされた金属性インプラント。
【請求項３】
前記追加のイオンがフッ化物、銀、マグネシウムおよび炭酸塩から選ばれることを特徴とする請求項２に記載のコーティングされた金属性インプラント。
【請求項４】
前記コラーゲンがI型のコラーゲンからなることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載のコーティングされた金属性インプラント。
【請求項５】
前記コラーゲンがI―III型コラーゲンの混合物であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載のコーティングされた金属性インプラント。
【請求項６】
前記コラーゲンにゼラチンを加えることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載のコーティングされた金属性インプラント。
【請求項７】
前記コーティングが生物活性物質を含み、該生物活性物質が成長因子、ペプチド連鎖、ホルモン、及び抗生物質から選ばれることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載のコーティングされた金属性インプラント。
【請求項８】
前記金属性のインプラントがチタン又はチタン合金からなることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載のコーティングされた金属性インプラント。
【請求項９】
以下のa）及びb）の工程を含むことを特徴とする、鉱化されたコラーゲンマトリックスによる、金属性インプラント物質の電気化学的コーティング方法：
a)pHが８未満、温度が４―４０℃のコラーゲン溶液中に浸漬することにより金属性インプラント物質をコーティングする、
b)カルシウムイオン及びリン酸塩イオンを含む電解質溶液中で、陰極分極による電気化学的に支援された方法で、前記金属性インプラント物質をリン酸カルシウム相でコーティングする、
工程a)と工程b)は同時に又は続けて実施される。
【請求項１０】
追加の工程b)を工程a)の前に置くことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程a)とb)が交互に多数回進行することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
工程a)とb)とが１つの工程に組合わされ、コーティングしようとする金属性インプラント物質がカルシウムイオンとリン酸塩イオンを含むコラーゲン溶液中で電気化学的に陰極分極されていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
工程b)における陰極分極中−０.５から−３０mA／cm2の陰極電流が流れることを特徴とする請求項９ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
鉱化したコラーゲンマトリックスの構造が層にされていることを特徴とする請求項９ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記コラーゲンにゼラチンを加えることを特徴とする請求項９ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面の形態が如何なる形態であってもよい金属性のインプラント(implant）材用の有機と無機の主成分からなる生体を模倣してつくられた骨類似のコーティング、ならびにこのコーティングの製造方法に関する。
【０００２】
このコーティングの必須の成分は骨の有機及び無機主成分を形成するコラーゲンとリン酸カルシウムの相である。本発明にしたがうコーティングは、成長因子、粘着蛋白質又は薬理活性化合物などの他の誘導物質を含有させるためのマトリックスとして特に適している。
【０００３】
【従来の技術】
生物適合性や生物官能性を最適化する目的でインプラント表面の物理化学的及び生物化学的性質の周囲組織に対する適合性を改善させる問題に関して、色々な方法がとられている。
【０００４】
エッチング又はサンドブラスチングなどによるインプラント表面の形の単なる変更の他に、現在はリン酸カルシウム相（calcium phosphate phases: CPP)によるコーティングが重要な役割を演じている。使用に最も広く進歩したものは、骨と接触するインプラントのヒドロキシアパタイトによるコーティングであり、さらにより易溶のリン酸カルシウム相でのコーティングが増加している[Yang et   al., J. Mater Sci., Mater. in Med. 6, 258-65 (1995); Remer, P., Schwerpunkt proguramm Gradientenwerkstoffe, 3rd Ed. Darmstadt 31. 3. 1998; Floquet et al., Rev. Stomatol. Chir. Maxillofac. 98, 47-9 (1997)]。骨の無機主成分及びそれから誘導された化合物によるインプラントのコーティングのためのこれらの方法は、局部的に増加したカルシウム及びリン酸塩イオンの供給によってインプラントがより速やかに確立することを特に目的としている。CPPによるインプラント表面のコーティングは、現在は主としてプラズマスプレー法で行われている。この方法の工程条件の故に、これらの層は骨の鉱物相とは結晶化度や溶液挙動において著しく異なる性質を有し、さらに層の厚さが厚いため、層の機械的な欠陥を招く可能性がある［Filiaggi et al., J. Biomed. Mat. Res. 27 (2), 191-8 (1993); Gross et al., Int. J. Oral Maxillofac. Implants 12 (5), 589-97 (1997); Posner et al., Phosphate Minerals, Springer Verlag, Berlin/Heidelberg (1984)］。
【０００５】
電気化学的に支援された方法［Shirkhamzadeh, J. Mater. Sci.: Mater. in Med. 9, 76-72 (1998); Szmukler-Moncler et al., Biological Mech. of Tooth Eruption, Resorption and Replacement by implants (Eds. Z. Davidovitch and J. Mah), 481-85 Harvard Society for the Advancement of Orthodontics, Boston, USA (1998)]が層の厚さの薄いCPPを生成させる可能性を提供する。CPPの析出はCa2+／HxPO4(3-x)-含有溶液中でインプラントの陰極分極によって実現される。インプラントの分極が表面近くの電解液のアルカリ化を招き（2H2O＋2e-→H2＋2OH-)、これによりサンプル（インプラント）表面の前面で析出反応が誘発され、生成した析出生成物が金属性のインプラント表面に堆積する。
【０００６】
インプラント物質の表面改質分野への、別のアプローチ（方法）は、周囲の組織中に生成する有機化合物を表面改質用に利用してインプラント表面の生物化（biologization)を達成することにある。この点については、一方では固定化した状態で作用を及ぼす固定化した蛋白質及び蛋白質連鎖が用いられ（コラーゲン、粘着蛋白質、RGD連鎖）、又は他方では一定期間に亘って放出される蛋白質が使用される。固定化した物質によっては、インプラント表面のバイオ適合性（コラーゲン、一定の粘着性蛋白質）又は一定の細胞型の粘着性について主として実用的な作用が図られている（拡大したRGD連鎖）［Schaffner et al., J. of Mat. Sci.: Mat. in Med. 10, 837-39 (1999)]。
【０００７】
前述の先行技術は、金属性のインプラントコーティング用の骨の無機及び有機成分から形成する骨類似のコンポジット相の製造目標を設定した方法は今まで知られていなかったことを示している。ヒドロキシアパタイトとコラーゲンの両方を含む方法は、単に成分の混合物に限定されているだけであり、さらにキャリヤ物質として別の外生物質を割当てる必要がある。
【０００８】
WO９９／３０６７２（Uni. Tbingen)は、表面にヒドロキシアパタイト又はコラーゲンを含むことのできる有機ポリマー物質の補綴用コーティングを記載している。ここでこのポリマー物質は接着促進剤であるに過ぎない；骨に類似のコラーゲンとリン酸カルシウム相とのコンポジット（複合物）のことに言及しているはずがない。
【０００９】
硬蛋白質とリン酸カルシウムを含有させるための別の可能性がドイツ特許DE１９８１１９００（Feinchemie)に示されている。無機のゲルと生物活性成分（コラーゲン、エラスチン、フィブリン）からなる生物適合性コンポジット物質が記載されている。さらに、リン酸カルシウム又はその前駆物質が溶解状態で存在し得る。このコンポジット物質はしたがって骨の主成分の混合物に過ぎず、さらに無機のゲルにキャリヤの役をさせる必要がある。
【００１０】
WO９２／１３９８４（Queen's University of Kingston)に、リン酸カルシウム化合物からセラミックコーティングの電気化学的製造方法が記載されている。ここでは電解液がコラーゲンなどの生物学的に無毒性の化合物又は不純物をも含んでいることは除外していない。コーティングは連合した非方向性の微結晶でつくられた均一なミクロ細孔のセラミック物質である。この層はまた析出生成物として生物活性化合物を含むこともできる。セラミックリン酸カルシウムコーティングとして、記載のコーティングはしたがって鉱化したコラーゲン／リン酸カルシウムマトリックスとは著しく異なる。
【００１１】
あご骨の部分又は接合部の取替えに使用するインプラントは、機械的な要求に応じるため金属性の材料で製造するのが好ましい。ここで、性質が基部の物質とは大きく異なり得る、じかに接する表面がしばしば無視されている。しかしながら、表面の性質が特にインプラントと周囲の組織の間の相互作用にとって極めて重要であることは知られている。したがって、吸着した蛋白質の組織の変化が繊維の中間層生成に大きく影響し、そしてこれがインプラントの不十分な安定性を招く可能性がある。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の教示は、インプラントの移植後、高品質の骨の組織の生成により速やかな骨の完成を達成するため、特に生化学情報（知識）によってインプラント表面を改質する目的から出発している。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この目的は、表面がどんな形でもよい金属のインプラント物質用の有機及び無機主成分からなる、骨類似のコーティング、コーティングされたインプラント物質およびコーティング方法により達成され、このコーティングは本質的にリン酸カルシウムで鉱化されたコラーゲンマトリックスからなっている。
【００１４】
解決手段は次のようである。
１．  リン酸カルシウムで鉱化されたコラーゲンマトリックスから実質的になることを特徴とする、有機及び無機の主成分からなる、任意希望の表面形態を有する金属インプラント物質のための骨に類似のコーティング。
２．  前記鉱化されたコラーゲンマトリックスの構造が層にされていることを特徴とする上記１に記載のコーティング。
３．  前記リン酸カルシウム相が無定形のリン酸カルシウム（Ca9(PO4)6・nH2O)、ヒドロキシアパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2)、リン酸オクタカルシウム(Ca8H2(PO4)6・5H2O)又はブラッシュ石(CaHPO4・2H2O)からなることを特徴とする上記１または２に記載のコーティング。
４．  前記リン酸カルシウム相がフッ化物、銀、マグネシウム又は炭酸塩などの追加のイオンでドープされることを特徴とする上記１ないし３のいずれか一つ記載のコーティング。
５．  前記コラーゲンがI型のコラーゲンからなることを特徴とする上記１ないし４のいずれか一つに記載のコーティング。
６．  前記コラーゲンがI―III型コラーゲンの混合物であることを特徴とする上記１ないし４のいずれか一つに記載のコーティング。
７．  前記コラーゲンにゼラチンを加えることを特徴とする上記１ないし６のいずれか一つに記載のコーティング。
８．  成長因子、ペプチド連鎖、ホルモン、抗生物質又は鉱化に影響を及ぼす物質などの生物活性物質を含むことを特徴とする上記１ないし７のいずれか一つに記載のコーティング。
９．  外側の層が上記１ないし８のいずれか一つに記載のコーティングからなることを特徴とする、親物質（被コーティング物質）とこれにより担持される外側の層（コーティング層）とからなる金属性のインプラント。
１０．  親物質がチタン又はチタン合金からなることを特徴とする上記９に記載の金属性のインプラント。
１１．  以下のa）及びb）の工程を特徴とする、コラーゲンとリン酸カルシウム相（CPP）による、任意希望の表面形態を有する金属インプラント物質の電気化学的コーティング方法：
a)  pHが８未満、温度が４―４０℃のコラーゲン溶液中に数分間浸漬することにより金属性のインプラント物質をコーティングする。
b)  カルシウムイオン及びリン酸塩イオンを含む電解質溶液中で、正確に規定した電流密度と温度の下で、ガルバノスタット分極による電気化学的に支援された方法で、前記コラーゲンをコーティングしたサンプルをCPPでコーティングする。
１２．  追加の工程b)を工程a)の前に置くことを特徴とする上記１１に記載の方法。
１３．  工程a)とb)が交互に多数回進行することを特徴とする上記１１に記載の方法。
１４．  工程a)とb)とが１つの工程に組合わされ、コーティングしようとする金属性インプラントがカルシウムイオンとリン酸塩イオンを含むコラーゲン溶液中で電気化学的に陰極分極されることを特徴とする上記１１に記載の方法。
１５．  工程b)におけるガルバノスタット分極中―０.５から―３０mA／cm2の陰極電流が約３０分間流れることを特徴とする上記１１ないし１４のいずれか一つに記載の方法。
１６．  鉱化したコラーゲンマトリックスの構造が層にされていることを特徴とする上記１１ないし１５のいずれか一つに記載の方法。
１７．  前記コラーゲンにゼラチンを加えることを特徴とする上記１１ないし１６のいずれか一つに記載の方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
好適な金属のインプラント材料は、一般に歯科技術又は内部補綴や外傷の分野で使用されるすべての金属である。チタン及びTiAl6V4などのチタン合金が特に好ましい。
【００１６】
本発明によるコーティングは有機成分の含有を可能にする条件の下で生成される。それ故、骨に類似のマトリックスを生体模倣技術で生成させるために、本発明は電気化学的に支援された方法を利用する。この方法は殆ど生理的なpHと温度条件の下で行うことができ、したがってバイオ分子を含有させることが可能となる。
【００１７】
これは電解質溶液中又はインプラント表面に固定化した形で存在し得る。その主要成分は、骨の有機と無機の主要成分であるコラーゲン及びヒドロキシアパタイトからなる。本発明の課題によって、生体内でつくられた骨の構造に類似の浸透性の構造を、試験管内でその本質的な特徴においてはじめて理解することができ、さらに金属のインプラント表面に良好な接着性でこの構造を製造することが可能である。
【００１８】
鉱化されたコラーゲンマトリックスは層の形で構成される。これは、この手段によってコラーゲンマトリックスの色々な硬化度のグレード別の層をつくることも可能であるという利点を有する。
【００１９】
無機の主成分すなわちリン酸カルシウム相（CPP）は、無定形のリン酸カルシウム（CA9(PO4)6・nH2O)、ヒドロキシアパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2)、リン酸オクタカルシウム(Ca8H2(PO4)6・H2O)またはブラッシュ石(CaHPO4・2H2O)からなることが好ましい。しかしながら、前述の相の混合物でもよい。
【００２０】
このリン酸カルシウム相はさらにフッ化物、銀、マグネシウム又は炭酸塩などのイオンでドープすることができる。
【００２１】
骨の弾性の原因であり、かつ鉱化状態でヒドロキシアパタイト微結晶とともに高強度の骨をもたらすI型コラーゲンの使用が好ましい。さらに、コラーゲンはI型からIII型の混合物からなっていてもよい。I ―III型はフィブリル形成コラーゲンのグループに属する。コラーゲンにさらにゼラチンを加えることもできる。遺伝子組替生産で誘導もできるコラーゲンの他に、別のマトリックス蛋白質を含有させることも可能である。
【００２２】
本発明のさらなる利点は、前述の層を骨に特有の蛋白質（BMP, TGFβなど）用のマトリックスとして利用する可能性にある。成長因子や細胞に特有の接着ペプチドに加えて、抗生物質などの薬理活性化合物の含有も可能である。
【００２３】
本発明はさらに親物質とこれによって担持される外側層とでつくられた金属性のインプラントに関し、この外側層は、前記解決手段の１ないし８のいずれか一つに記載の本発明のコーティングからなっている。
【００２４】
本発明はまた、任意希望の表面を有する金属のインプラント物質の、前記解決手段１１記載のコラーゲン及びCPPによる、電気化学的に支援されたコーティング方法にも関する。
【００２５】
コーティングは、金属インプラントが陰極分極する電解槽中で行われる。層の堆積は生理的pH及び温度条件近くで起る。電解液はCa2+／HxPO4(3-x)-含有溶液からなり、さらにコラーゲン又は他の物質（成長因子、抗生物質）を含むことができる。インプラント表面は、任意希望の形態（構造；粗面、磨面、エッチング面）、化学的変性（官能基の発生）、リン酸カルシウム層、蛋白質層及び国際特許出願WO９８／１７８４４又はドイツ特許DE―１９５０４３８６（TU Dresden)又はこれらの組み合わせによって製造した層とすることができる。同時に行われる、リン酸カルシウム堆積工程及び生理的なpHと温度条件でのコラーゲンの固定化により、チタン表面上に鉱化したコラーゲン層をつくることができる。鉱化の程度、すなわちCPPの本来の性質とコーティングの程度は、ここでは電気化学のパラメータによって明細に記述される。この方法は鉱化に影響を及ぼす物質群を加えることによって手助けできる（例えばbone sialoprotein, osteopontin)。
【００２６】
コーティングが前記解決手段の１２に記載のようにされるのがさらに望ましい：この方法では、まず電気化学的方法でCPPによるサンプルのコーティングが、カルシウムイオン及びリン酸塩イオンを含む電解質溶液中において正確な規定電流密度及び温度でガルバノスタット分極により行われ、次いでpHが８未満で温度が４―４０℃のコラーゲン溶液中にCPPで被覆したサンプルを数分間浸漬してコーティングが行われ、引き続いて新しい電気化学工程で正確に規定した電流密度と温度下にガルバノスタット分極によってコラーゲン／CPPでコーティングしたサンプルをさらにCPPでコーティングする。
【００２７】
前述の方法工程は、好ましくは、交互の条件で多数回、すなわち解決手段１１記載の工程a)及びb)の順序をa―b―a―b―a―bなどの構成にしたがって進行させることもできる。
【００２８】
工程a)及びb)が一工程に組合わされ、コーティングしようとする金属性のインプラント物質がカルシウムイオンとリン酸塩イオンを含むコラーゲン溶液中で電気化学的に陰極分極されている、前記解決手段１４に記載の方法も望ましい。
【００２９】
工程b)でのガルバノスタット分極中、―０.５から―３０mA／cm2の陰極電流が約３０分間流れる方法がさらに望ましい。
【００３０】
本発明による鉱化した骨類似のコラーゲンマトリックスの利点は細胞テストで印象的に示すことができる。生物模倣技術でつくったヒドロキシアパタイトでは骨芽細胞に対する細胞接着は１時間後もなお比較的良い値を示すが、本発明の層での細胞増殖が明らかに好ましい。ここで、細胞数の増加は時間的に非常に早い時点で起り、そして細胞数の最大値は純粋なヒドロキシアパタイト層に対してよりも極めて速やかに達成される。図１にMC 3T3マウスの骨芽細胞による１７日間にわたる増殖テストの測定曲線を示す。縦軸の吸収は細胞数に比例する（ＷＴＳ−１テスト）。
【００３１】
【実施例】
以下に図１を参照しながら典型的な実施態様によって本発明を詳細に説明する。
【００３２】
実施例１：
シーリング用TiO2艶出し剤を使用してTiAl6V4のシリンダー（高さ２mm、φ１０mm)を金相学的に製造した。次いでこのシリンダーを超音波浴中でアセトン及びエタノールで洗浄しさらに蒸留水ですすぎ洗いした。
【００３３】
次いでこのサンプルを次の方法で調製するコラーゲン溶液中に浸漬する：酸に可溶な凍結乾燥した子牛の皮膚コラーゲンI型を０.０１M酢酸に溶解し、４℃で０.１mg／mlの濃度に調節する。コラーゲン分子は２工程で再構成される；２倍に濃縮されたリン酸塩緩衝液を用いる７.４へのpH調節及び３６℃への温度上昇。３時間後、溶液は自然に再構成されたフィブリルからなっている。サンプルはこの溶液中に１０分間留まり、次いで脱イオン水ですすぎ洗いされる。コラーゲンで被覆されたサンプルを、温度調節した電解槽中に参照電極としての飽和カロメル電極及びカウンター電極としてのプラチナ板からなる３電極式配置の作業電極として組入れる。使用した電解液は次の方法で調製されるストック溶液である；それぞれの濃度が３３mM及び２.０mMのCaCl2とNH4H2PO4の各１０mlのストック溶液を稀釈混合して２００mlとする；１.６７mMカルシウムイオン及び１.０mMリン酸塩イオン。pHは稀薄NH4OH溶液を使用して６.４に調節する。
【００３４】
ポテンシオスタットに接続後、―１mA／cm2での陰極電流の下でガルバノスタット分極によりリン酸カルシウム相(CPP)での鉱化／コーティングを行う。３０分後、陰極分極が終了し、サンプルを電解溶液から取り出して脱イオン水ですすぎ洗いする。析出層は白っぽく見える。電子顕微鏡試験により層はコラーゲンのネットワークと球状CPの房からなることがわかる。IR―スペクトル検査は、鉱物相が無定形のリン酸カルシウムからなることを確認する。
【００３５】
実施例２：
実施例１と同様、TiAl6V4のシリンダーを作製する。電解槽の構造とリン酸カルシウム析出用電解液は実施例１のそれらと同じである。
【００３６】
ポテンシオスタットに接続後、―１０mA／cm2での陰極電流の下でガルバノスタット分極によりCPPのコーティングを行う。３０分後、陰極分極をストップさせ、サンプルを電解液から取り出して脱イオン水ですすぎ洗いする。結晶性のCPP、ヒドロキシアパタイトは今やTiAl6V4表面に存在する。このサンプルを実施例１と同じコラーゲン溶液に浸漬させる。ヒドロキシアパタイトでコーティングされたサンプルを１０分間この溶液中に残留させ、次いで脱イオン水ですすぎ、再度電解槽に組入れる。ポテンシオスタットに接続後、―１０mA／cm2の陰極電流の下でガルバノスタット分極によりヒドロキシアパタイトの析出が再び起る。２０分後、サンプルを取り出して脱イオン水ですすぎ洗いする。析出した層は白っぽく見える。電子顕微鏡試験は小さな針状結晶の凝集体からなる密集層を示している。鉱化したコラーゲンフィブリルのネットワークがこの層の上に在る。IR―スペクトル及びX線回折検査により、鉱物相がヒドロキシアパタイトからなることが確認される。IRスペクトル中の特徴的なアミドバンドはさらにコラーゲンが変性した形で存在するのではなく、それどころか鉱化層と本来の骨のスペクトル間に良好な一致が存在することを示している。
【００３７】
実施例３：
TiAl6V4のシリンダーを実施例１に同じく作製する。電解槽の構造は実施例１のそれと同じである。本来の集合コラーゲンフィブリルを含むコラーゲン溶液を実施例１と同様に調製する。この溶液を５０００g、４℃で１５分間遠心分離にかけ、ペレットを脱イオン水で取り出して振盪により分散させる。次いでこの溶液を再度５０００g、４℃で１５分間遠心分離する。遠心分離で得られたペレットを実施例１に記載のリン酸カルシウム析出用の電解液中に取り入れ、分散器によってホモジナイズ（均質化）する。この溶液がコラーゲンの析出と鉱化のための同時遂行工程のための電解液として用いられる。ポテンシオスタットに接続後、―１０mA／cm2の陰極電流でガルバノスタチック分極により鉱化を行う。３０分後、陰極分極が完了するので、サンプルを電解液から取り出して脱イオン水ですすぐ。析出した層は白っぽく見える。電子顕微鏡検査はコラーゲンのフィブリルとCPPのコンポジットを示している。IR―スペクトル及びX線回折試験により、フィブリルの鉱化が主として結晶相ヒドロキシアパタイトにより起ることが確認される。さらに容易に可溶な無定形のリン酸カルシウム相が部分的に見出される。IRスペクトル中の特徴的なアミドバンドはさらにコラーゲンが変性した形で存在するのではなく、それどころか鉱化層と本来の層のスペクトルとの間に良好な一致が存在することを示している。
【００３８】
実施例４：
TiAl6V4のシリンダーを実施例１のようにして作製する。電解槽の構造とリン酸カルシウム析出用の電解液は実施例１のそれらと同じである。ポテンシオスタットに接続後、陰極電流―１０mA／cm2でガルバノスタチック分極によりCPPでのコーティングを行う。３０分後、陰極分極を中止し、サンプルを電解質溶液から取り出して脱イオン水ですすぐ。結晶性のCPP、ヒドロキシアパタイトが今やTiAl6V4の表面にある。このサンプルを実施例１のそれと同じコラーゲン溶液中に浸漬する。ヒドロキシアパタイトでコーティングされたサンプルをこの溶液中に１０分間残留させ、次いで脱イオン水ですすいで再度電解槽中に組入れる。ポテンシオスタットに接続後、―１０mA／cm2の陰極電流で１５分間コラーゲンの部分的鉱化を行う。最後に、サンプルを脱イオン水ですすぐ。析出した層は白っぽく見える。
【００３９】
第２の工程段階で、固定化したコラーゲン層への、インテグリンに特異な細胞を選択できるペプチド配列の結合が行われる。この結合は、チオールアンカー及びSMPB（sulfosuccinimidyl 4 ―（p―maleimidophenyl) butyrate)によりコラーゲンのリン酸塩基に対して共有的に行われる。
【００４０】
電子顕微鏡試験はヒドロキシアパタイト針状結晶の均質な層を示しており、その上にコラーゲンフィブリルの部分的に鉱化したネットワークが存在する。RGD配列の活性はMC3T3―E1細胞を使用する接着及び増殖実験から明らかである。
【００４１】
比較に値する純粋のコラーゲン層と比較して、RGD―被覆表面は、細胞接着性と短時間後に始まる細胞増殖の増加を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  TiAl6V4基体上のヒドロキシアパタイト及び骨類似コラーゲン／ヒドロキシアパタイトマトリックスでのMC3T3マウス骨芽細胞の細胞増殖を示すグラフである。
【図１】
0004970665.tif 000002