(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中にポリヌクレオチドをトランスフェクトするためのトランスフェクション組成物の製造のための、
（i）少なくとも1つのポリヌクレオチド；
（ii）カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせ；および
（iii）シクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる可溶化コレステロール調製物；
の使用であって、ここで、前記細胞が前記ポリヌクレオチドでトランスフェクトされるように、前記トランスフェクション組成物が前記細胞に適用される、前記使用。
【請求項２】
前記シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンである、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
（ii）が１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）であるカチオン脂質である、請求項1に記載の使用。
【請求項５】
（ii）がスーパーフェクト（Superfect）であるポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマーである、請求項1に記載の使用。
【請求項６】
（ii）がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、［２，３−ビス（オレオイル）プロピル］トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジオクタデシルジアンモニウムブロミド（DODAB）、ジオクタデシルジアンモニウムクロライド（DODAC）、２，３−ジオレオイルオキシ−N−［スペルミンカルボキシアミノエチル］−N,N-ジメチル−１−プロパンアミニウム（DOSPA）、３β［Ｎ-ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ジオレオイル（DC−Chol）、１−［２−（オレオイルオキシ）−エチル］−２−オレオイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（DOIC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、ポリアミドアミン（PAMAM）、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ（4−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド）、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項1に記載の使用。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドがプラスミドDNAである、請求項1に記載の使用。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドがウイルスDNA、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項1に記載の使用。
【請求項９】
前記細胞が真核細胞である、請求項1に記載の使用。
【請求項１０】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記細胞が尿路上皮（urothelial）細胞である、請求項1０に記載の使用。
【請求項１２】
前記トランスフェクション組成物が培養中の細胞に適用される、請求項1に記載の使用。
【請求項１３】
前記トランスフェクション組成物がin  vivoにおいて細胞に適用される、請求項1に記載の使用。
【請求項１４】
前記トランスフェクション組成物が被検体の膀胱への膀胱内デリバリーによりin  vivoにおいて尿路上皮細胞に適用される、請求項11に記載の使用。
【請求項１５】
カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーの可溶化コレステロールに対する比の範囲が、２：１〜１：３（重量/重量）である、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドをカチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーと複合化し、細胞に適用する、細胞の中にポリヌクレオチドをトランスフェクトするインビトロの方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチドおよびカチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーを可溶化コレステロール調製物で処方することを含んでなり、さらにここで、前記可溶化コレステロール調製物がシクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
前記シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記カチオン脂質が１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）である、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
前記デンドリマーがスーパーフェクトであるポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマーである、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
前記カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、［２，３−ビス（オレオイル）プロピル］トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジオクタデシルジアンモニウムブロミド（DODAB）、ジオクタデシルジアンモニウムクロライド（DODAC）、２，３−ジオレオイルオキシ−N−［スペルミンカルボキシアミノエチル］−N,N-ジメチル−１−プロパンアミニウム（DOSPA）、３β［Ｎ-ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ジオレオイル（DC−Chol）、１−［２−（オレオイルオキシ）−エチル］−２−オレオイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（DOIC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、ポリアミドアミン（PAMAM）、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ（4−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド）、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドがプラスミドDNAである、請求項16に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドがウイルスDNA、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が真核細胞である、請求項16に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が尿路上皮細胞である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが培養中の細胞に適用される、請求項16に記載の方法。
【請求項２８】
ポリヌクレオチドを被検体の尿路上皮細胞中に送出すための医薬組成物の製造のための、
（i）少なくとも1つのポリヌクレオチド；
（ii）カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせ；および
（iii）可溶化コレステロール調製物；
の使用であって、ここで、前記ポリヌクレオチドが被検体の尿路上皮細胞の中に送出されるように、前記医薬組成物が膀胱内的に被検体の膀胱の中に送出されて、さらにここで、前記コレステロールがシクロデキストリンで可溶化されている、前記使用。
【請求項２９】
前記シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンである、請求項28に記載の使用。
【請求項３０】
前記シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項28に記載の使用。
【請求項３１】
（ii）が１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）であるカチオン脂質である28に記載の使用。
【請求項３２】
（ii）がスーパーフェクトであるポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマーである、請求項28に記載の使用。
【請求項３３】
前記カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、［２，３−ビス（オレオイル）プロピル］トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジオクタデシルジアンモニウムブロミド（DODAB）、ジオクタデシルジアンモニウムクロライド（DODAC）、２，３−ジオレオイルオキシ−N−［スペルミンカルボキシアミノエチル］−N,N-ジメチル−１−プロパンアミニウム（DOSPA）、３β［Ｎ-ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ジオレオイル（DC−Chol）、１−［２−（オレオイルオキシ）−エチル］−２−オレオイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（DOIC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、ポリアミドアミン（PAMAM）、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ（4−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド）、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項28に記載の使用。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドがプラスミドDNAである、請求項28に記載の使用。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドがウイルスDNA、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項28に記載の使用。
【請求項３６】
被検体における膀胱癌を治療するための医薬組成物の製造のための、
（i）少なくとも1つのポリヌクレオチド；
（ii）カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせ；および
（iii）可溶化コレステロール調製物；
の使用であって、
ここで、前記ポリヌクレオチドが膀胱癌細胞に対する抗癌活性を有し、そして、前記被検体の膀胱癌細胞が前記ポリヌクレオチドで治療されるように、前記医薬組成物が膀胱内的に前記被検体の膀胱の中に送出されて、さらにここで、前記コレステロールがシクロデキストリンで可溶化されている、前記使用。
【請求項３７】
前記シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンである、請求項36に記載の使用。
【請求項３８】
前記シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項36に記載の使用。
【請求項３９】
（ii）が１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）であるカチオン脂質である、請求項36に記載の使用。
【請求項４０】
（ii）がスーパーフェクトであるポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマーである、請求項36に記載の使用。
【請求項４１】
カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、［２，３−ビス（オレオイル）プロピル］トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジオクタデシルジアンモニウムブロミド（DODAB）、ジオクタデシルジアンモニウムクロライド（DODAC）、２，３−ジオレオイルオキシ−N−［スペルミンカルボキシアミノエチル］−N,N-ジメチル−１−プロパンアミニウム（DOSPA）、３β［Ｎ-ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ジオレオイル（DC−Chol）、１−［２−（オレオイルオキシ）−エチル］−２−オレオイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（DOIC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、ポリアミドアミン（PAMAM）、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ（4−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド）、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項36に記載の使用。
【請求項４２】
前記ポリヌクレオチドがインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、抗血管形成因子、抗転移因子、膜レセプターおよび腫瘍抑制因子から成る群から選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの発現ベクターを含んでなる、請求項36に記載の使用。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドがインターロイキン−1（IL−1）、インターロイキン−2（IL−2）、インターロイキン−6（IL−6）、インターロイキン−9（IL−9）、インターロイキン−11（IL−11）、インターロイキン−12（IL−12）、インターロイキン−13（IL−13）、インターロイキン−18（IL−18）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、マクロファージコロニー刺激因子（MCSF）、熱ショックタンパク質（HSP）、p53、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）のアンタゴニスト、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（TIMP）、およびフィブロネクチンレセプターから成る群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも1つの発現ベクターを含んでなる、請求項36に記載の使用。
【請求項４４】
前記ポリヌクレオチドがインターロイキン−2（IL−2）をコードする発現ベクターを含んでなる、請求項36に記載の使用。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）をコードする発現ベクターを含んでなる、請求項36に記載の使用。
【請求項４６】
前記ポリヌクレオチドがインターフェロン−γをコードする発現ベクターを含んでなる、請求項36に記載の使用。
【請求項４７】
前記ポリヌクレオチドがインターロイキン−2（IL−2）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）およびインターフェロン−γの2またはそれ以上をコードする少なくとも1つの発現ベクターを含んでなる、請求項36に記載の使用。
【請求項４８】
前記被検体に追加の抗膀胱癌治療が実行される、請求項36に記載の使用。
【請求項４９】
前記追加の抗膀胱癌治療がカルメット−ゲラン杆菌（BCG）療法を含んでなる、請求項48に記載の使用。
【請求項５０】
（i）ポリヌクレオチド；
（ii）カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせ；および
（iii）可溶化コレステロール調製物；
を含んでなるトランスフェクション組成物であって、ここで、前記可溶化コレステロール調製物がシクロデキストリンで可溶化されたコレステロールを含んでなる、前記トランスフェクション組成物。
【請求項５１】
前記シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリンである、請求項50に記載のトランスフェクション組成物。
【請求項５２】
前記シクロデキストリンがアルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項50に記載のトランスフェクション組成物。
【請求項５３】
（ii）が１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）であるカチオン脂質である、請求項50に記載のトランスフェクション組成物。
【請求項５４】
（ii）がスーパーフェクトであるポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマーである、請求項50に記載のトランスフェクション組成物。
【請求項５５】
カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、［２，３−ビス（オレオイル）プロピル］トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジオクタデシルジアンモニウムブロミド（DODAB）、ジオクタデシルジアンモニウムクロライド（DODAC）、２，３−ジオレオイルオキシ−N−［スペルミンカルボキシアミノエチル］−N,N-ジメチル−１−プロパンアミニウム（DOSPA）、３β［Ｎ-ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ジオレオイル（DC−Chol）、１−［２−（オレオイルオキシ）−エチル］−２−オレオイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（DOIC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、ポリアミドアミン（PAMAM）、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ（4−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド）、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項50に記載のトランスフェクション組成物。
【請求項５６】
前記ポリヌクレオチドがプラスミドDNAである、請求項50に記載のトランスフェクション組成物。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチドがウイルスDNA、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項50に記載のトランスフェクション組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、in  vitroまたはin  vivoにおける、細胞の中への製剤のデリバリー、特に非ウイルス法による細胞の中へのポリヌクレオチドのデリバリーに関する。本発明は、さらに、癌の治療、特に膀胱癌の治療用製剤のデリバリーに関する。
発明の背景
遺伝子治療法における多数の最近の進歩にかかわらず、種々の細胞タイプの中への遺伝子の有効な療法的デリバリー、特にin  vivoデリバリーは、治療を必要とする患者の特定細胞中にこのような遺伝子を治療的に有効な量で送達するために利用不可能であるので、簡単に達成されてきていない。治療的に十分な量の遺伝子、および治療用分子の有効なデリバリーは、例えば、細胞膜が選択的に透過性のバリヤーを表すので、不可能でないにしても、困難であることが証明された。さらに、遺伝子または他の生物学的に活性な分子が首尾よくターゲット細胞の中に入ったときでさえ、それらは分解され、不適切に輸送されるか、あるいは遺伝子の場合において、適切に転写されないことがある。
【０００２】
特に遺伝子治療のための、有効なデリバリー法を欠如するターゲット細胞のタイプの1例は、膀胱の尿路上皮（urothelial）細胞である。このような方法は膀胱癌の治療において特に有効であろう。内視鏡および膀胱内化学療法の進歩にかかわらず、表在性膀胱癌はなお高い再発性および進行速度を有する（Nseyo  UO、Lamm  DL（1996）Semin.  Oncol.  5：598−604）。現在、最も有望な治療は毎週「生」カルメット−ゲラン杆菌（BCG）を膀胱の中に2時間点滴注入することを包含する（Morales、A.  他（1976）、J.  Urol.、116：180−183；Brosman、S.  A.（1992）Urol.  Clin.  North  Am.、19：557−564）。有効であるが、60〜70％の日常的応答速度で、副作用、例えば、排尿困難、血尿、脈拍数および膀胱炎は普通であり、時には苛酷である（Lamm  DL（1992）Urol.  Clin.  North  Am.、19：565−572）。その上、有意な数の患者はBCG治療に対して応答せず、毒性は普通である。免疫応答のBCG活性化メカニズムの探査において、腫瘍に対する細胞障害性応答の促進において重要な役割を演ずるサイトカイン、共刺激分子および接着分子が同定された（Taniguchi、K.  他（1999）Clin.  Exp.  Immunol.、115：131−5、1999；Patard、J.  J.  他（1998）Urol.  Res.、26：155−9；Kurisu、K.  他（1994）Cancer  Imunol.  Immunother.、39：249−53；Sander、B.  他（1996）J.  Urology、156：536−41；Chow、N.  H.  他（1998）Urology、52：1015−9；Jackson、A.  M.  他（1995）Clin.  Exp.  Immunol.、99：369−75）。
【０００３】
表在性膀胱癌は、in  vivo遺伝子治療、すなわち、腫瘍を定位し、療法用遺伝子を簡単な膀胱内投与により腫瘍と直接接触させて配置することができる治療、のために特に魅力的とする、いくつかの特徴を有する。さらに、治療に対する腫瘍の応答は膀胱鏡検査および尿細胞学により容易に測定することができる。トランジション細胞上皮の首尾よいトランスフェクションの主要な障害の1つは、DNA複合体の吸収に対する有意なバリヤーとして作用することがある、グリコサミノグリカン層の存在である（Ruponen、M.  他（1999）Biochim.  Biophys.  Acta、1415：331−41）。
【０００４】
ウイルス発現ベクターは、特異的遺伝子を膀胱の中に局所的に導入するために使用されてきている（Sutton、M.  A.  他（1997）Urology、49：173−80；Lee、S.  S.  他（1994）Cancer  Res.、54：3325−8）。しかしながら、ウイルスベクターは臨床的設定、例えば、免疫原性および安全性において多数の制限を有する。Li他による最近の研究において、膀胱癌のためのアデノウイルスに基づく遺伝子治療の有効性は、ヒト膀胱癌細胞系統において観測されたウイルスレセプターレベルの差のために問題とされた（Li、Y.  他（1999）Cancer  Res.、59：325−30）。
【０００５】
遺伝子治療の別法は、細胞の中へのリポソーム仲介デリバリーを包含する。非ウイルス系の利点は、それがレセプター依存性でなく、したがってすべての腫瘍に適用可能であるということである。Brigham他は、カチオンリポソームを使用する組織の中へのDNAのデリバリーを最初に報告した（Brigham、K.  L.  他（1989）Am.  J.  Med.  Sci.、298：278−81）。それ以来カチオン脂質は、in  vivoにおける組織への局在化、系統的デリバリーのための効率よいキャリヤーであることが示された（Plautz、G.  E.  他（1993）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、90：4645−9；Nabel，G.  J.  他（1993）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、90：11307−11；Zhu  N.  他（1993）Science、261：209−11）。カチオンリポソームは、臨床的設定においてウイルス遺伝子デリバリーを超えた、多数の重要な利点を有する。これらは簡単なプラスミドから染色体フラグメントの範囲を使用する能力、およびより少ない安全性の問題を包含する。しかしながら、それらの主要な欠点は、ウイルス技術と比較したとき、トランスフェクション効率が比較的低いことである。
【０００６】
したがって、特に尿路上皮細胞の、トランスフェクション効率を増加する方法、ならびに製剤を膀胱に送達する一般的方法は、なお必要とされている。
発明の要約
本発明は、製剤、特にポリヌクレオチドを細胞、特に尿路上皮細胞の中に送達する改良された方法を提供する。また、可溶化コレステロールをカチオン脂質として使用すると、カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーと複合化したDNAのトランスフェクション効率を増強できることが今回発見された。好ましくは、シクロデキストリン、好ましくはメチル−β−シクロデキストリンを使用してコレステロールを可溶化する。in  vitroまたはin  vivoにおいて尿路上皮細胞をトランスフェクトすることが特に好ましいが、本発明のトランスフェクション法は種々の他の細胞タイプのトランスフェクションに適用することができる。その上、カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーで複合化したDNAの尿路上皮細胞の中へのエントリーに対する可溶化コレステロールの作用を増強することは、in  vitroまたはin  vivoにおいて膀胱内デリバリーによる、他のタイプの製剤デリバリーに適用することができる。
【０００７】
したがって、1つの面において、本発明は、（i）少なくとも1つのポリヌクレオチドを（ii）カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせ、および（iii）可溶化コレステロール調製物を組合わせてトランスフェクション組成物を形成し；そしてトランスフェクション組成物を細胞に適用し、こうして細胞を1またはそれ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることを包含する。好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる。好ましくは、シクロデキストリンはメチル−β−シクロデキストリンである。他のシクロデキストリンは、アルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを包含する。好ましいカチオン脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはスーパーフェクト（Superfect）である。他の適当なカチオン脂質およびデンドリマーは、DOPE、DOTMA、DOGS、DODAB、DODAC、DOSPA、DC−Chol、DOIC、DOPC、DMRIE、PAMAM、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ（4−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド）、またはそれらの組合わせを包含する。この方法を使用して種々のポリヌクレオチド、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせをトランスフェクトするために使用することができる。
【０００８】
本発明のトランスフェクション法は、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、なお最も好ましくは尿路上皮細胞とともに使用される。トランスフェクション法は、in  vitroで、例えば、トランスフェクション組成物を培養中の細胞に適用するとき、実行することができる。選択的に、この方法は、トランスフェクション組成物をin  vivoにおいて細胞に適用することによって、in  vivoにおいて実行することができる。他の好ましい態様において、本発明のトランスフェクション組成物を被検体の膀胱への膀胱内デリバリーによりin  vivoにおいて尿路上皮細胞に適用する。
【０００９】
他の面において、本発明は、製剤を被検体の尿路上皮細胞の中に送達する方法を提供する。この方法は、製剤を可溶化コレステロール調製物と組合わせて医薬組成物を形成し、医薬組成物を膀胱内的に被検体の膀胱の中に送達し、こうして製剤を被検体の尿路上皮細胞の中に送達させることを包含する。好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる。好ましくは、シクロデキストリンはメチル−β−シクロデキストリンである。他の適当なシクロデキストリンは、アルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを包含する。他の好ましい態様において、製剤は、（i）少なくとも1つのポリヌクレオチドおよび（ii）カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせを含んでなる。
【００１０】
本発明のなお他の面は、被検体における膀胱癌を治療する方法に関する。この方法は、製剤を可溶化コレステロール調製物と組合わせて医薬組成物を形成し、ここで製剤は膀胱癌細胞に対する抗癌活性を有し、そして医薬組成物を膀胱内的に被検体の膀胱の中に送出して、被検体の膀胱癌細胞を製剤で治療することを含んでなる。好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる。好ましくは、シクロデキストリンはメチル−β−シクロデキストリンである。他の適当なシクロデキストリンは、アルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを包含する。
【００１１】
膀胱癌を治療する好ましい製剤は、少なくとも1つのポリヌクレオチドと、カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせとを含んでなる。例えば、1またはそれ以上のポリヌクレオチドは、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、抗血管形成因子、抗転移因子、膜レセプターおよび腫瘍抑制因子から成る群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも1つの発現ベクターを含んでなることができる。好ましいタンパク質は、インターロイキン−1（IL−1）、インターロイキン−2（IL−2）、インターロイキン−6（IL−6）、インターロイキン−9（IL−9）、インターロイキン−11（IL−11）、インターロイキン−12（IL−12）、インターロイキン−13（IL−13）、インターロイキン−18（IL−18）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、マクロファージコロニー刺激因子（MCSF）、熱ショックタンパク質（HSP）、p53、抗血管形成因子、例えば、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）のアンタゴニスト、例えば、アンチセンス分子、抗転移因子、例えば、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（TIMP）、およびBCG活性を増加する因子、例えば、フィブロネクチンレセプターを包含する。特に好ましいタンパク質は、インターロイキン−2（IL−2）、GMCSFおよびインターフェロン−γ、およびそれらの組合わせを包含する。
【００１２】
膀胱癌を治療する本発明の方法は、被検体に対する追加の抗膀胱癌治療を実行することをさらに含むことができる。例えば、本発明の治療方法と組合わせることができる、好ましい追加の抗膀胱癌治療は、カルメット−ゲラン杆菌（BCG）療法である。
【００１３】
本発明のなお他の面は、トランスフェクション組成物に関する。本発明は、少なくとも1つのポリヌクレオチド；カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせ；および可溶化コレステロール調製物を含んでなる。好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる。好ましくは、シクロデキストリンはメチル−β−シクロデキストリンである。他の適当なシクロデキストリンは、アルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを包含する。好ましいカチオン脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはスーパーフェクトである。他の適当なカチオンおよびデンドリマーは、DOPE、DOTMA、DOGS、DODAB、DODAC、DOSPA、DC−Chol、DOIC、DOPC、DMRIE、PAMAM、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ（4−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド）、またはそれらの組合わせを包含する。トランスフェクション組成物は、1またはそれ以上の種々のポリヌクレオチド、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせを含んでなることができる。
発明の詳細な説明
この開示を通じて、種々の刊行物、特許および公開された特許出願は識別引用により参照される。本発明が関係する技術水準をいっそう完全に記載するために、これらの刊行物、特許および公開された特許出願の開示は引用することによってこの開示の中に組込まれる。
【００１４】
本発明がいっそう容易に理解されるように、ある種の用語を最初に定義する。
【００１５】
本明細書において使用するとき、用語「トランスフェト」（例えば、「トランスフェクトする」または「トランスフェトした」）の種々の形態は、ポリヌクレオチド分子を外部の位置から細胞の内部の中に導入するプロセスを意味することを意図する。
【００１６】
本明細書において使用するとき、用語「ポリヌクレオチド分子」はデオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）分子を包含する、2またはそれ以上の共有結合したヌクレオチド塩基から構成された分子を包含する。ポリヌクレオチド分子を形成するヌクレオチドは典型的にはホスホジエステル結合により互いに結合されているが、用語「ポリヌクレオチド分子」はまた他の結合、例えば、ホスホロチオエート結合により結合されたヌクレオチドを包含することを意図する。ポリヌクレオチド分子の非限定的例は、プラスミドDNA、ウイルスDNA、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイムを包含する。
【００１７】
本明細書において使用するとき、用語「カチオン脂質」は、少なくとも1つ、最も典型的には2つの、脂肪酸鎖および正に帯電した極性ヘッド基から構成された分子を意味することを意図する。典型的なカチオン脂質は、ドデシル（C12）またはヘキサデシル（セチル、C16）脂肪酸鎖を有するが、用語「カチオン脂質」はまた他の長さの脂肪酸鎖を有する脂質を包含することを意図する。カチオン脂質の非限定的例は、次の通りである：
DOTAP（1，2−ジアシル−3−トリメチルアンモニウムプロパン）、
DOPE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、
DOTMA（［2，3−ビス（オレオイル）プロピル］トリメチルアンモニウムクロライド）、
DOGS（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、
DODAB（ジオクタデシルジアンモニウムブロミド）、
DODAC（ジオクタデシルジアンモニウムクロライド）、
DOSPA（2,3−ジオレオイルオキシ−N−［スペルミンカルボキシアミノエチル］−N，N−ジメチル−1−プロパンアミニウム）、
DC−Chol（3β［N−n'，N'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ジオレオイル）、
DOIC（1−［2−（オレオイルオキシ）−エチル］−2−オレオイル−3−（2−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド）、
DOPC（ジオレオイルホスファチジルコリン）、
DMRIE（ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）。
【００１８】
本明細書において使用するとき、用語「カチオンポリマー」は核酸を縮合する能力を有する正に帯電したポリマー（例えば、DNA）である。カチオンポリマーはポリ電解質およびカチオンポリペプチドを包含する。カチオンポリマーの非限定的例は、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン（PEI）、ポリ（4−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）およびポリ（4−ビニル−N−アルキルピリジニウムハライド）である。
【００１９】
本明細書において使用するとき、用語「デンドリマー」はカチオンスターバーストポリマーを意味することを意図する。これらは層中の球形成長によりアンモニウムコアから派生する球形ポリマーである。デンドリマーの非限定的例は、スーパーフェクト（Superfect）およびPAMAMである。
【００２０】
本明細書において使用するとき、用語「コレステロール」は、4つの融合環を有する天然に存在するステロイドアルコール（ステロール）、ならびに長鎖脂肪酸とのそのエステル、および膜流動性をモジュレートする能力を保持するそれらのアナローグを意味することを意図する。コレステロールおよびコレステロールエステルは、血漿リポタンパク質および動物細胞の外側細胞数の成分であり、そして膜流動性をモジュレートする能力を有する。膜流動性をモジュレートするコレステロールアナローグはこの分野において知られており（例えば、Gimpl、G.、他（1997）Biochemistry  36：10959−10974参照）そして、例えば、5−コレステン、5−プレグネン−3β−オール−20−オン、4−コレステン−3−オンおよび5−コレステン−3−オンを包含する。
【００２１】
本明細書において使用するとき、用語「可溶化コレステロール調製物」は、コレステロールの水溶性を増加させる可溶化剤を使用してコレステロールが水可溶化されている（すなわち、可溶化コレステロール調製物の水溶性はコレステロール単独の水溶性よりも高い）調製物を意味することを意図する。典型的には、可溶化剤は親油性分子をパッケージすることができるキャビティを有する水溶性化合物である。好ましい可溶化剤はシクロデキストリンである。コレステロールの可溶化（例えば、可溶化剤、例えば、シクロデキストリンの中への組込み）は、コレステロール、例えば、［1，2，6，7−3H（N）］コレステロール（Dupont／New  England  Nuclearから商業的に入手可能である）の放射能標識化によりモニターすることができる、例えば、下記の文献を参照のこと：Pang、L.  他（1999）Biochemistry  38：12003−12011）。用語「可溶化コレステロール調製物」は、リポソームの2層の中に組込まれたコレステロールを意味することを意図しない。
【００２２】
本明細書において使用するとき、用語「シクロデキストリン」は親水性外側表面および疎水性中心キャビティを有する、オリゴ糖の環状トルス形分子を意味することを意図し、この疎水性中心キャビティは親油性物質（例えば、コレステロール）を担持することができる。「シクロデキストリン」は6、7または8つのグリコピラノース単位を有する分子（それぞれ、アルファ−、ベータ−およびガンマ−シクロデキストリン）、ならびにより大きい環を有する分子（9〜13のグリコピラノース単位を有するシクロデキストリンが単離された）を包含するが、ベータ−シクロデキストリンは本発明において使用するために好ましい。用語「シクロデキストリン」はまたアルファ−、ベータ−およびガンマ−シクロデキストリン（またはさらになおより大きい環）の誘導体を包含することを意図し、それらの非限定的例は硫酸化ベータ−シクロデキストリン、第三級アミンベータ−シクロデキストリン、第四級アミンベータ−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、2，6−ジ−O−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−ベータ−シクロデキストリン、6−デオキシ−6−S−ベータ−D−ガラクトピラノシル−6−チオ−シクロマルト−ヘプタオース、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−ベータ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−エチル−ベータ−シクロデキストリン、ジエチル−ベータ−シクロデキストリン、ジメチル−ベータ−シクロデキストリン、ランダムメチルベータ−シクロデキストリン、グルコシル−ベータ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ベータ−シクロデキストリンを包含する。本発明において使用するために好ましいシクロデキストリンは、メチル−β−シクロデキストリンである。シクロデキストリンの構造および薬学上の応用は下記の文献において概観されている：Szejtli、Ｊ．（1994）Med.  Res.  Reviews  14：353−386およびRajewski、R.  A.  およびStella、V.  J.（1996）J.  Pharm.  Sci.  85：1142−1169。
【００２３】
本明細書において使用するとき、用語「トランスフェクション組成物」は、ポリヌクレオチドと、カチオン脂質またはデンドリマーと、可溶化コレステロール調製物とから生ずる組成物を意味する。
【００２４】
本明細書において使用するとき、用語「製剤」は薬学的活性を有する化合物を包含することを意図し、それらの非限定的例はポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、化学療法剤、抗生物質およびその他を包含する。
【００２５】
本明細書において使用するとき、用語「治療組成物」は少なくとも1種の製剤と可溶化コレステロール調製物とを組合わせることによって形成した組成物を意味することを意図するが、治療組成物は追加の成分（例えば、追加の製剤、カチオン脂質、デンドリマーまたは治療組成物のデリバリーまたは治療活性を増強する1またはそれ以上の他の成分）を含有することができる。
【００２６】
本明細書において使用するとき、用語「被検体」製剤を使用する治療を必要とする、例えば、膀胱癌のような癌の治療を必要とする、生きている生物を意味することを意図する。好ましい被検体は哺乳動物である。被検体の例は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、雌牛、ウマ、ヤギおよびヒツジである。また、被検体は他の脊椎動物、例えば、魚類および鳥類（例えば、ニワトリ）を包含する。
【００２７】
本明細書において使用するとき、用語「抗癌活性」は、製剤が癌細胞の増殖、生活能力または転移を、直接的に（すなわち、癌細胞に対して直接的に作用することによって、例えば、癌細胞に対して毒性である化学療法剤）あるいは間接的に（例えば、癌細胞に対する免疫応答を刺激することによって）阻害する能力を有することを意味する。
【００２８】
本明細書において使用するとき、用語「治療」は治療する疾患の1またはそれ以上の症状の軽減を意味することを意図する。
【００２９】
本明細書において使用するとき、用語「治療的に有効な量」は治療する疾患の治療を達成するために十分な量（例えば、製剤の）を意味することを意図する。
【００３０】
本明細書において使用するとき、用語「カルメット−ゲラン杆菌（BCG）療法」は、BCGを膀胱の中に膀胱内的に投与する、膀胱癌の治療養生法を意味することを意図する。
【００３１】
本発明は、少なくとも一部分、可溶化コレステロールを添加剤として使用して細胞のトランスフェクション効率を改善することができるという発見に基づく。コレステロールの好ましい可溶化剤はシクロデキストリン、例えば、メチル−β−シクロデキストリンである。実験において、メチル−β−シクロデキストリンを含有するコレステロールはそれ自体裸DNAのトランスフェクションを改良せず、カチオン脂質（DOTAP）と組み合わせて、それはトランスフェクションを増強することを示した。in  vitroにおいて、この添加はカチオン脂質（DOTAP）単独に比較してトランスフェトした3.8倍の増加を生ずる（実施例1参照）。in  vivoにおいて、管腔に面する膀胱上皮細胞は、カチオン脂質単独を使用して達成できない程度に、首尾よくトランスフェクトされた（実施例6参照）。使用するカチオン脂質がDOTAPであるとき、2.7：1（重量：重量）のDOTAP／DNA比および6：1（重量：重量）のDOTAP／コレステロール比を使用して最適なトランスフェクションが得られた。Crook他はDOTAPとの混合物を使用して、1：1（重量：重量）のDOTAP／コレステロール比を使用したとき、トランスフェクションは最適であることを発見した（Crook、K.  他（1998）Gene  Ther.  5：137−43）。コレステロールを増加させると、血清の存在下にトランスフェクション効率が増加することを彼らのデータは示した。しかしながら、DOTAP：コレステロールのこの組合わせを使用すると、ネズミ尿路上皮細胞系統MB49の非常にわずかのトランスフェクションが存在したが、COS−7細胞は効率よくトランスフェトされた。
【００３２】
メチル−β−シクロデキストリン／コレステロール（MBC）複合体は、コレステロールを細胞膜に付加することができる。メカニズムにより制限されることを意図しないが、コレステロールの付加は細胞膜の流動性／剛性および透過性に影響を与えるであろう。膜中のコレステロールレベルはエンドソーム中のGPIアンカードタンパク質のソーティングに影響を与えることが示され、消耗はエンドソームを介してこれらのタンパク質の再循環を増加した（Rodal、S.  K.  他（1999）Mol.  Biol.  Cell  10：961−74）。また、DOTAP／メチル−β−シクロデキストリン／コレステロール（DMBC）複合体はコレステロールをDOTAP分子に付加して、形成するDOTAP：DNA複合体の構造に影響を与えることができる。ベータ−シクロデキストリンは腸細胞によるアデノウイルスの内在化を改良することが示された（Croyle、M.  A.  他（1998）Pharm.  Res.  15：1348−1355）。改良された吸収は細胞膜を崩壊するシクロデキストリンの能力に帰属される。その研究において使用されたシクロデキストリンのいずれもコレステロールを担持していなかった。メチル−β−シクロデキストリンそれ自体のみをDOTAPおよびDNAと組み合わせて使用するとき、ネズミ膀胱上皮細胞のトランスフェクションは存在せず、本発明により提供されるトランスフェクション効率の増加のためにシクロデキストリンの中にパッケージされたコレステロールが重要であることが示された。
【００３３】
最近の研究において、Zabnerおよび共同研究者らは、カチオン脂質により仲介される遺伝子デリバリーのメカニズムを解析し、首尾よい遺伝子転移のための制限因子として、細胞質から核へのプラスミドDNAの運動を同定した（Zabner、J.  他（1995）J.  Biol.  Chem.  270：18997−9007）。本発明において、コレステロールの添加はトランスフェクション効率を増強したが、細胞によるプラスミドDNAの吸収に対して作用をほとんどもたないことが見出された。しかしながら、DMBCを使用すると、プラスミドDNAは核の中に見出されることが発見され（実施例4参照）、DMBCの添加はエンドソームからのDNAの逃散においてある役割を演ずることができ、多分リソソーム中の分解を回避する。
【００３４】
本発明の系において、尿路上皮細胞中でトランスフェクトされた遺伝子の発現はトランスフェクション事象後1月まで観測することができる。これはin  vivoにおける尿路上皮細胞のより遅い代謝回転に関係づけることができる。なぜなら、複数の細胞複製後に遺伝子発現はin  vitroにおいて低下したからである。Morris、B.  D.  他（J.  Urol.（1994）152：506−509）は、アデノウイルスを使用して膀胱をトランスフェクトし、遺伝子発現は少なくとも7日間明らかであることが示された。Harimoto他（Br.  J.  Urol.（1998）81：870−874）は、遺伝子発現がHVJ−リポソームを使用して10日まで観測され、単一パーティクルガン衝撃で2週まで観測されることを示した。こうして本発明のDMBCトランスフェクション系は、それほどでないにしても、in  vivo膀胱トランスフェクションの現在好ましい技術よりも耐久性がある。
【００３５】
DMBC／DNA複合体に対して細胞を2時間暴露すると、細胞増殖に対する作用は示されなかった（実施例5参照）。MBCそれ自体は24時間後に細胞増殖の減少を引き起こさなかったが、DOTAPは減少させた。しかしながら、これは統計的に有意でなかった。延長した暴露の抗増殖作用は、治療用遺伝子が仲介する腫瘍細胞の殺しを増強する働きをするので、好都合であることがある。研究において、メチル−β−シクロデキストリンそれ自体を使用したとき、それは無胸腺ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片に対して抗腫瘍作用を有することが示された（Grosse、P.  Y.  他（1998）Br.  J.  Cancer  78：1165−9）。この作用は細胞からのコレステロールの流出に関係するように思われる。
【００３６】
DMBC／DNA複合体のちょうど2時間の膀胱内点滴注入は、リポソーム／DNA複合体に対するウロセリウムの暴露を最大にしかつ効率よいトランスフェクションを保証する（実施例7参照）。リポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）の発現は膀胱に制限された。Morris，B.  D.  他（J.  Urol.（1994）152：506−509）は、アデノウイルスを使用して膀胱をトランスフェクトし、この制限が多分膀胱の構築の結果であり、使用したデリバリー系のためでないことを示す、同様な観測を行った。
【００３７】
また、本発明のトランスフェクション系は、腫瘍の根絶のためにサイトカイン遺伝子をin  vivo送達するとき有効であることが示された（実施例9参照）。
【００３８】
前述した事柄にかんがみて、本発明の1つの面は少なくとも1つのポリヌクレオチドを細胞の中にトランスフェクトする方法に関する。実施例においてさらに記載するように、可溶化コレステロールを使用すると、カチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーのような因子で複合化されたポリヌクレオチドのトランスフェクション効率が増強される。したがって、1つの面において、本発明は、工程：
（i）少なくとも1つのポリヌクレオチド；
（ii）カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせ；および
（iii）可溶化コレステロール調製物；
を組合わせてトランスフェクション組成物を形成し；そして
トランスフェクション組成物を細胞に適用し、こうして細胞をポリヌクレオチドでトランスフェクトする；
を含んでなる、ポリヌクレオチドを細胞の中にトランスフェクトする方法を提供する。
【００３９】
好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリン、最も好ましくはメチル−β−シクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる。他の適当なシクロデキストリンは上に列挙したものを包含する。好ましいカチオン脂質はDOTAPである。好ましいデンドリマーはスーパーフェクトである。他の適当なカチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは上に列挙したものを包含する。カチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは商業的に入手可能な源から入手することができる。トランスフェクション組成物は、試薬（ii）の1つのタイプ、すなわち、カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーを包含することができるか、あるいは、選択的に、試薬（ii）は組合わせ、例えば、カチオン脂質およびカチオンポリマーの両方、またはカチオン脂質の2つの異なるタイプ、またはカチオンポリマーの2つの異なるタイプの組合わせであることができる。試薬（i）、（ii）および（iii）を組合わせるとき、好ましくは1またはそれ以上のポリヌクレオチドの添加の直前に可溶化コレステロール調製物をカチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーと混合し、次いでこの混合物を室温においてある時間、例えば、15分間インキュベートして、トランスフェクション組成物を形成する。
【００４０】
各試薬の使用量は、条件、例えば、選択する特定の試薬およびトランスフェクトすべき細胞のタイプに依存して変化させることができる。しかしながら、最適なトランスフェクション条件は標準法により、例えば、実施例に記載するトランスフェクション系を使用して決定することができる。例えば、カチオン脂質（またはカチオンポリマーまたはデンドリマー）／可溶化コレステロールの最適比は異なる細胞タイプについて異なることがあるが、1：2（DOTAP：MBC）の比はin  vitroにおいて尿路上皮細胞について最適であることが見出された。カチオン脂質（またはカチオンポリマーまたはデンドリマー）／可溶化コレステロールの比の非限定的範囲は2：1〜1：3（重量／重量）である。可溶化コレステロール調製物（例えば、メチル−β−シクロデキストリン／コレステロール、またはMBC）を調製するとき、コレステロール／シクロデキストリンの好ましい比率は50mgのコレステロール／600gのシクロデキストリン（メチル−β−シクロデキストリン）（すなわち、1：12重量／重量のコレステロール：シクロデキストリン）であるが、再びこの比率は使用する特定の試薬および関係する条件に依存して最適化することができる。コレステロール／シクロデキストリンの比の非限定的範囲は1：1〜1：20である。また、ポリヌクレオチドの使用量は、使用する試薬およびトランスフェクトすべき宿主細胞に依存して変化させることができる。ポリヌクレオチド（例えば、DNA）の使用量の非限定的範囲は0.1〜100μg、より好ましくは1〜50μgである。カチオン脂質の使用量の非限定的範囲は1〜200μg、好ましくは10〜50μgである。デンドリマー（例えば、スーパーフェクト）の使用量の非限定的範囲は1〜300μg、好ましくは5〜25μgである。in  vivo適用のために、各試薬の量は前述の好ましい量から増加させることが必要であろう。
【００４１】
DOTAPを使用するとき、好ましい量の非限定的例は次の通りである：7.5μgのDNA＋20μgのDOTAP＋40μgのメチル−β−シクロデキストリン可溶化コレステロール。スーパーフェクトを使用するとき、好ましい量の非限定的例は次の通りである：2μgのDNA＋22.5μgのスーパーフェクト＋10μgのメチル−β−シクロデキストリン可溶化コレステロール。
【００４２】
本発明のトランスフェクション法を使用して、種々の異なるポリヌクレオチド、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA、染色体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、RNA分子およびリボザイム、またはそれらの組合わせをトランスフェクトすることができる。遺伝子治療の目的で、1またはそれ以上のポリヌクレオチドは典型的には療法的利益を提供するためのタンパク質をコードする発現ベクター（下記においてさらに詳細に説明する）である。真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞をトランスフェクトするために、トランスフェクション法を使用する。トランスフェクション法は、多数の他のタイプのトランスフェクション法に対して耐性に止まる、尿路上皮細胞をトランスフェクトするとき特に有効である。トランスフェクション法は、in  vitroにおいて、例えば、トランスフェクション組成物を培養中の細胞に適用することによって、実施することができる。トランスフェクション組成物を培養中の細胞と接触させる時間は、標準法により最適化することができる。in  vitroトランスフェクション時間の非限定的例は48時間であり、次いで細胞を洗浄（例えば、リン酸塩緩衝液で）する。選択的に、トランスフェクション法はin  vivoにおいて、例えば、トランスフェクション組成物を細胞にin  vivo適用することによって実施することができる。好ましい態様において、トランスフェクション組成物を被検体の膀胱への膀胱内デリバリー（例えば、カテーテルを介して）によりin  vivoにおいて尿路上皮細胞に適用する。in  vivoトランスフェクションのための他のターゲット組織は、例えば、胃、筋肉、肺、上皮細胞、結腸、子宮、腸、心臓、腎臓、前立腺、皮膚、眼、脳、陰茎組織および鼻組織を包含する。
【００４３】
他の面において、本発明は、尿路上皮細胞による物質の吸収を増強する可溶化コレステロールの能力に基づいて、製剤を膀胱の尿路上皮細胞の中に送達する方法を提供する。したがって、本発明は、工程：
製剤を可溶化コレステロール調製物と組合わせて医薬組成物を形成し；そして
医薬組成物を膀胱内的に被検体の膀胱の中に送出して、製剤を被検体の尿路上皮細胞の中に送出す；
を含んでなる、被検体の尿路上皮細胞の中に製剤を送出す方法を提供する。
【００４４】
好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリン、最も好ましくはメチル−β−シクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる。他の適当なシクロデキストリンは上に列挙したものを包含する。製剤は、例えば、少なくとも1つのポリヌクレオチドと、カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーとであることができる。選択的に、製剤は、例えば、化学療法剤、抗生物質、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、抗血管形成因子、抗転移因子、膜レセプターまたは療法的活性を有する他の因子であることができる。製剤がポリヌクレオチドであるとき、好ましいカチオン脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはスーパーフェクトである。他の適当なカチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは上に列挙したものを包含する。
【００４５】
他の面において、本発明は、工程：
製剤を可溶化コレステロール調製物と組合わせて医薬組成物を形成し、ここで製剤は膀胱癌細胞に対する抗癌活性を有し；そして
医薬組成物を膀胱内的に被検体の膀胱の中に送出して、被検体の膀胱癌細胞を製剤で治療する；
を含んでなる、被検体における膀胱癌を治療する方法を提供する。
【００４６】
好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリン、最も好ましくはメチル−β−シクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる。他の適当なシクロデキストリンは上に列挙したものを包含する。製剤は、例えば、少なくとも1つのポリヌクレオチドと、カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマーとであることができる。好ましくは、製剤は治療的に有効な量で送出される。製剤が1またはそれ以上のポリヌクレオチドであるとき、好ましいカチオン脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはスーパーフェクトである。他の適当なカチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは上に列挙したものを包含する。
【００４７】
ポリヌクレオチドは、膀胱癌の治療において療法的利益を有する1またはそれ以上のタンパク質をコードする少なくとも1つの発現ベクターを含んでなることが好ましい。発現ベクターはトランスフェクトすべき細胞中のポリヌクレオチド発現に適当な形態のポリヌクレオチドを含んでなり、これは組換え発現ベクターが1またはそれ以上の調節配列を含み、これらの調節配列が通常トランスフェクトすべき細胞のタイプに基づいて選択され、発現すべきポリヌクレオチドに作用可能に連鎖されていることを意味する。組換え発現ベクター内において、「作用可能に連鎖された」はポリヌクレオチド発現（例えば、ベクターが宿主細胞の中に導入されるとき、宿主細胞中の転写／翻訳）を可能とする方法で問題のポリヌクレオチドが1またはそれ以上の調節配列連鎖されていることを意味することを意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現コントロール因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含することを意図する。このような調節配列はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、下記の文献に記載されている：Goeddel；Gene  Expression  Technology：Methods  in  Enzymology  185、Academic  Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）。調節配列は、多数のタイプの宿主細胞中のポリヌクレオチドの連続的発現を指令する配列およびある種の宿主細胞中のポリヌクレオチド発現のみを指令する配列（例えば、組織特異的調節配列）を包含する。当業者は理解されるように、発現ベクターの設計は、因子、例えば、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、およびその他に依存するであろう。
【００４８】
哺乳動物発現ベクターの例は、pMex−NeoI、pCDM8（Seed、B.（1987）Nature  329：840）およびpMT2PC（Kaufman  他（1987）EMBO  J.  6：187−195）。哺乳動物細胞において使用するとき、発現ベクターのコントロール機能はしばしばウイルス調節因子により提供される。例えば、普通に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来される。選択的に、特定細胞タイプにおいてポリヌクレオチド発現を優先的に指令することができる哺乳動物発現ベクター（すなわち、組織特異的調節因子を含んでなる発現ベクター）を使用することができ、そしてこの分野においてよく知られている。
【００４９】
膀胱癌の治療において膀胱中で発現ベクターにより発現するために適当なタンパク質の例は、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、抗血管形成因子、抗転移因子、膜レセプターおよび腫瘍抑制因子である。好ましいタンパク質は、インターロイキン−1（IL−1）、インターロイキン−2（IL−2）、インターロイキン−6（IL−6）、インターロイキン−9（IL−9）、インターロイキン−11（IL−11）、インターロイキン−12（IL−12）、インターロイキン−13（IL−13）、インターロイキン−18（IL−18）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、マクロファージコロニー刺激因子（MCSF）、熱ショックタンパク質（HSP）、p53、抗血管形成因子、例えば、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）のアンタゴニスト、アンチセンス分子、抗転移因子、例えば、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（TIMP）、およびBCG活性を増加する因子、例えば、フィブロネクチンレセプター、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子および腫瘍サプレッサーを包含する。発現すべき好ましいタンパク質は、IL−2、GMCSFおよびインターフェロン−γ、およびそれらの組合わせ（例えば、IL−2、GMCSFおよびインターフェロン−γの少なくとも2つ）を包含する。
【００５０】
選択的に、製剤は、例えば、化学療法剤、抗生物質、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または療法的活性を有する他の因子であることができる。
【００５１】
膀胱癌を治療する本発明の方法は、1またはそれ以上の追加の抗膀胱癌治療法と組合わせることができる。好ましい追加の治療法はBCG治療である。追加の癌治療の他の例は、化学療法および放射線治療を包含する。
【００５２】
他の面において、本発明は、また、トランスフェクション組成物を提供する。本発明のトランスフェクション組成物は、
（i）ポリヌクレオチド；
（ii）カチオン脂質、カチオンポリマーまたはデンドリマー、またはそれらの組合わせ；および
（iii）可溶化コレステロール調製物；
を含んでなる。
【００５３】
好ましくは、可溶化コレステロール調製物はシクロデキストリン、最も好ましくはメチル−β−シクロデキストリンで可溶化されているコレステロールを含んでなる。他の適当なシクロデキストリンは上に列挙したものを包含する。好ましいカチオン脂質はDOTAPであるが、好ましいデンドリマーはスーパーフェクトである。他の適当なカチオン脂質、カチオンポリマーおよびデンドリマーは上に列挙したものを包含する。本発明のトランスフェクション組成物は、包装処方物、例えば、各成分試薬が容器手段の中に提供される包装処方物として提供することができる。さらに、包装処方物は、細胞をトランスフェクトするためにトランスフェクション組成物を使用するための使用説明書を含むことができる。
【００５４】
下記の実施例により本発明のさらに説明するが、これらの実施例は限定的に解釈すべきではない。
【００５５】
下記の実施例において使用した特定の材料および方法を後述する：
材料および方法
pCMVlacZはクロンテク（Clontech）（アメリカ合衆国カリフォルニア州パロアルト）から入手した。マウストランジション細胞癌腫細胞系統は、アイオワ大学のTimothy  Ratliff博士から入手した。エンドフリー・プラスミド・クイアゲン（Endofree  plasmid  Qiagen）キット（Qiagen  GmbH、ドイツ国）を使用して、プラスミドDNAを調製した。フジーン（Fugene）はロシェ・ダイアグノスティクス（Roche  Diagnostics、ドイツ国マンハイム）から購入し、スーパーフェクト（Superfect）はクイアゲン（Qiagen  GmbH、ドイツ国）から購入し、DEAEデキストランはプロメガ（Promega、アメリカ合衆国マディソン）から購入し、そしてリン酸カルシウムはメルク（Merck、ドイツ国フランクフルト）から購入した。
DMBCトランスフェクション効率についてのin  vitroアッセイ
6ウェルの組織培養プレート中において10％のPBS（Biosciences、オーストラリア国）、2mMのL−グルタミン、50U／mlのペニシリンおよび0.05mg／mlのストレプトマイシン（Sigma  Chemical  Co.、アメリカ合衆国ミゾリー州セントルイス）を補充したRPMI  1640中でオーバースリップ上に2×105細胞をプレートした。細胞を1×PBSで2回洗浄し、20μgのDOTAP（Roche  Diagnostics、ドイツ国マンハイム）および40μgのメチル−β−シクロデキストリン可溶化コレステロール（Sigma）で複合化したpCMVlacZの7.5μgでトランスフェクトした。DNAおよびDMBCを20mMのHepes緩衝液（Gibco  BRL、アメリカ合衆国マリイランド州ロックビレ）で165μlに構成し、15分間混合することによって、複合体を形成した。これをRPMI  1640培地で1mlとし、ウェルに適当な時間の間添加し、次いで洗浄し、3mlのRPMI  1640培地で置換した。48時間後、下記の文献に記載されているように、細胞をPBSで洗浄し、固定し、染色した：Weiss、D.  J.  他（1997）Hum.
Gene  Ther. 8:1545−54。100×の倍率で4回の四分円中の細胞の総数に関して、青色コロニーの平均数を使用して、トランスフェクション効率を決定した。トランスフェクションを二重反復実験により実行し、2回反復した。
増殖アッセイ
［14C］−チミジンの組込みを測定することによって、増殖をアッセイした。96ウェルの平底組織培養プレート（Nunc、デンマーク国ロスクライド）中で1×104細胞／ウェルをプレートし、前述の最適条件下に適当な時間の間（2時間および24時間の暴露）トランスフェクトし、洗浄し、新鮮なRPMI  1640と37℃においてインキュベートした。32時間後、上清を除去し、細胞を1×PBSでリンスした。トリプリケートウェルを0.2μCi／mlの［14C］−チミジン（比活性56.5mCi／mmol；Du  Pont、アメリカ合衆国デラウェア州ウィルミントン）と16時間インキュベートした。試料を下記の文献に記載されているように収集した：Zhang、Y.  他（1997）Int.  J.  Cancer  71：851−7。［14C］−チミジンの組込みを非トランスフェクション細胞から成る対照細胞中の組込みの百分率として表した。非パラメトリックマン−ウィトネイ（non−parametric  Mann−Whitney）U試験を使用して、統計的有意性を計算した。p＜0.05の確率値を統計的に有意であると考えた。
DNA−DMBCの膀胱内デリバリー後のリポーター遺伝子のin  vivo発現の検出
5〜7週齢の雌C57BL6マウスを麻酔した；マウスの膀胱に24G血管内カテーテルを挿入し、1×PBSでフラッシュした。DMBCおよびDNA複合体を前述したように15分間混合した。点滴注入が容易であるように最終混合物を1×PBSで465μlに構成し、膀胱内に導入した。15分、1時間または2時間のトランスフェクション暴露時間を評価した。異なる時点後、膀胱を1×PBSでフラッシュしてDNA／DMBC複合体を除去した。処置後48時間に、マウスを殺した。二重反復実験を実施した。
組織化学
膀胱、肺、腎臓、心臓、肝臓および脾臓を取出し、液体窒素中で凍結させた（Werthman、P.  E.  他（1996）J.  Urol.  55：53−6）。厚さ6μmのクリオスタット切片を4℃において1.25％のグルタルアルデヒド中で10分間固定し、次いで37℃においてX−galと4時間インキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。
器官に対するPCRの実行
トランスフェクトしたプラスミドの存在を検出するために、lacZ遺伝子に対してユニークなPCRプライマーを使用した。使用した上流プライマーは5'−GCCGACCGCACGCCGCATCCAGC−3'（配列番号1）であり、そして下流調製は5'−CGCCGCGCCACTGGTGT−3'（配列番号2）であった。100ngのゲノムDNA、2μl（2.5Mm）のdNTP（New  England  Biolabs、アメリカ合衆国ベバーリイ）、2.5μl（10×）の反応緩衝液、1μlの各プライマー（10μM）および1μl（2U）のTaqポリメラーゼ（Finnzymes、フィンランド）を含有する総体積25μl中でPCRを実施した。PCRプログラムは次の通りであった：94℃において40秒間、次いで60℃において30秒間および72℃において30秒間の40サイクル。GADPHをPCR分析の対照として使用した。GADPHのプライマー配列は上流プライマー5'−CTGCGACTTCAACAG−3'（配列番号3）および下流プライマー5'−CACCCTGTTGCTGTAG−3'（配列番号4）であった。PCRプログラムは次の通りであった：94℃において30秒間、58℃において30秒間および72℃において30秒間の40サイクル。増幅されたDNAを1％アガロースゲル上の電気泳動により分析し、紫外線下に臭化エチジウムで可視化した。イメージマスターVDSソフトウェアを使用してデンシトメトリー走査を実施し、分析用イメージングシステムソフトウェア（Imaging  Research  Inc.、カナダ国オンタリオ）を使用してバンドを分析した。
トランスフェクションのONPGアッセイ
トランスフェトした細胞を1×PBSで2回洗浄し、次いで150μlの溶解緩衝液で溶解した。標準としてウシ血清アルブミンを使用するマイクロBCAタンパク質アッセイ（Pierce、アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォード）により、ライゼイトのタンパク質含量を測定した。4mg／mlのONPGを含有する反応混合物中で、ゲルタンパク質ライゼイトをアッセイし、37℃において1時間インキュベートした。500μlの1M  Na2CO3の添加により、反応を停止させ、420nmにおける吸収を測定した。
PCRによる核および細胞質の分析
TNE緩衝液（10mM  Tris、pH（pH8）、1mM  EDTA、100mM  NaCl、1％Igepecal）を使用するおだやかな溶解により、トランスフェクトした細胞の核および細胞質の分画を実施し、氷上に10分間放置し、次いで4℃においてマイクロフージ中で7Kで5分間遠心した。そのように形成した上清を細胞質抽出物と標識し、新鮮な管に移した。ペレット化した物質をプロテイナーゼK消化（100mM  NaCl、10mM  Tris、pH8、0.5％SDS、25mM  EDTAおよび0.1mg／ml  プロテイナーゼK）で50℃において一夜処理することによって、核抽出物を調製した。核DNAをフェノール／クロロホルムで2回抽出し、次いでエタノール沈殿させた。前述したように、PCR分析を実施した。
細胞系統およびサイトカイン遺伝子
ネズミトランジション細胞癌腫細胞系統MB49およびサイトカイン遺伝子は、アイオワ大学のTimothy  Ratliff博士から提供された。サイトカイン遺伝子をpCI−neo発現ベクター（Promega）の中にクローニングした。エンドフリープラスミドクイアゲン（Endofree  plasmid  Qiagen）キット（Qiagen  GmbH、ドイツ国）を使用して、プラスミドDNAを調製した。
動物
シンガポールのナショナル大学の実験動物センター（The  Laboratory  Center  of  the  National  University  of  Singapore）から大学の動物保持ユニット（Animal  Holding  Unit）において、C57／BL6雌マウス（ほぼ4〜6週齢）入手した。
表面マーカーのin  vitro発現
6ウェルの組織培養プレートの中において10％FIBS（Biosciences、オーストラリア国）、2mMのL−グルタミン、50U／mlのペニシリンおよび0.05mg／mlのストレプトマイシン（Sigma  Chemical  Co.、アメリカ合衆国ミゾリー州セントルイス）を補充したRPMI  1640中に2×105細胞をプレートした。細胞を1×PBSで2回洗浄し、3.75μgの単一サイトカイン遺伝子および3.75μgの各サイトカイン遺伝子（20μgのDOTAP（Roche  Diagnostics、ドイツ国マンハイム）および40μgのメチル−β−シクロデキストリン可溶化コレステロール（Sigma）で複合化した、IL−2＋GMCSF組合わせについての）でトランスフェクトした。DNAおよびDMBCを20mMのHepes緩衝液（Gibco  BRL、アメリカ合衆国マリイランド州ロックビレ）で165μlに構成し、15分間混合することによって、複合体を形成した。これをRPMI  1640培地で1mlとし、ウェルに適当な時間の間添加し、次いで洗浄し、3mlのRPMI  1640培地で置換した。48時間後、細胞をPBSで洗浄し、固定し、抗MHC  I、抗MHC  IIおよび抗FAS抗体で標識化した。使用した二次抗体はフルオレセインイソチオシアネート（FITC；Pharmingen、アメリカ合衆国カリフォルニア州）であった。また、アイソタイプ対照の抗体を含めた。二重レーザー流サイトメーター（Couletr  Epics  Elite、アメリカ合衆国フロリダ州）により、標識化細胞を分析した。
異なるサイトカイン処置の抗腫瘍作用
0.1mlのPBS中の5×105生存可能なMB49細胞を有する単細胞懸濁液を、処置7〜10日前に、側腹部に皮下注射した。ほぼ0.15〜0.25cm3の均一な腫瘍可溶化を有するマウスのみを選択し、腫瘍内処置のためにグループにランダム化した。腫瘍内注射により、処置を週2回3週間実施し、そして100μlの1×PBS、DMBC（Dotap＋メチル化−β−シクロデキストリンを含有するコレステロール）、IL−2＋DMBC、GMCSF＋DMBC、IFNγ＋DMBC、またはIL−2＋DMBC＋GMCSFの組合わせから成っていた。週齢が合致する腫瘍実験に使用されてない対照には処置を与えなかった。注射前から第38日まで3日前毎に、腫瘍サイズをキャリパーで測定した。腫瘍体積を下記式により計算した：長さ×幅×高さ
単細胞懸濁液およびフローサイトメトリー
脾臓を記載したように収集した。フィコエリトリン（PE）に複合化した抗CD4、αβ、γδ、NKおよび抗CD−8で単細胞懸濁液を標識化し、そしてフルオレセインイソチオシアネート（FITC）に複合化した抗体でCD3＋細胞を標識化した。すべての抗体をファーミンゲン（Pharmingen、アメリカ合衆国カリフォルニア州）から購入した。標識化した細胞を二重レーザーフローサイトメーターで分析した。
mRNA抽出およびRT−PCR
全RNA抽出のために、脾臓を製造業者の使用説明書に従い1mlのトリゾル（Trizol）試薬（Gibco  BRL、アメリカ合衆国マリイランド州ロックビレ）中の均質化した。
実施例
実施例1：  非ウイルス剤のin  vitroトランスフェクション効率
pCMVlacZ発現プラスミドを使用して、MB49細胞について、2時間の期間において、種々の非ウイルス剤のトランスフェクション効率を評価した。DOTAPおよびスーパーフェクトの両方は、それぞれほぼ20.4％および14.8％の効率で2時間以内にMB49細胞をトランスフェクトすることができた（下記表1参照）。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
トランスフェクション条件を各非ウイルス剤について最適化して、2時間におけるトランスフェクションを最大にした。X−galで青色に染色された細胞の百分率を計数することによって、トランスフェクション効率を測定した。7.5μgのDNAおよび20μgのDOTAPを使用して、最適なトランスフェクションを得た。スーパーフェクトを使用すると、DOTAPと同様なトランスフェクション率を得るために、非常に少ない量のDNAを必要とした、すなわち、2μgのDNA＋7.5μgのスーパーフェクト。フジーン（Fugene）で非常にで低い1.02％のトランスフェクション率を得られた。塩化カルシウム（0〜40μg）、DEAE−デキストラン（0〜2μg）および裸DNAのいずれもMB49細胞をトランスフェクトすることができなかった。
【００５８】
トランスフェクション率を改良するために、DNA添加前にMBCをDOTAPと混合し、この混合物を室温において15分間インキュベートした。MBCを添加すると、第1A図〜第1C図に示すように首尾よくトランスフェクトされる細胞の数は増加した。トランスフェクション効率の増加は、MBCをDOTAPと組み合わせて使用したとき、3.9倍であり、そしてスーパーフェクトと組み合わせて使用したとき、2.4倍であった（第1D図）。しかしながら、トランスフェクション効率のこの増加を発生させるために必要なMBCの量は、使用する非ウイルス剤とともに変化した。最適なDOTAPトランスフェクションは40μgのMBCで得られたが、スーパーフェクトについて10μgは最適であった。最良のトランスフェクション率はDOTAP＋MBC（DMBC）を使用して得られたので、この組合わせをすべてのそれ以上の実験において使用した。また、DMBCおよび慣用のDOTAP：コレステロール（1：1）混合物（AVDC）のトランスフェクション効率を比較した。AVDCはCos−7細胞をトランスフェクトすることができが、MB49細胞を非常によくトランスフェクトしなかった。対照的に、DMBCはMB49細胞をトランスフェクトし、ならびにAVDCに比較したときCos−7のトランスフェクションを増強した（第1E図）。
実施例2：  β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の期間
DMBCを使用するトランスフェクション後の時間の関数としてβ−ガラクトシダーゼ（β−gal）遺伝子発現の特性決定を実施した。第2A図に示すように、ONPGアッセイにより測定して、タンパク質発現は因子の除去の1時間以内に起こり、トランスフェクション後48時間まで増加した。48時間後、タンパク質発現は一定に減少し、トランスフェクション後12日では、β−gal活性は第2日における発現に比較して7分の1に減少した（第2B図）。細胞が複製するとき、遺伝子は失われおよび／またはサイレンスとなるように思われる。
実施例3：  トランスフェクション後のDNA吸収
DOTAPおよびDMBCを使用するとき、DNA吸収の差が存在するかどうかを決定するために、細胞から抽出したプラスミドDNAの量をトランスフェクションして2時間後に測定した。表面結合DNAの量を最小にし、かつ真のDNA吸収の推定をよりよくするために、1×PBSで複数回洗浄し、DNアーゼで消化した。MB49細胞から抽出したDNAのPCR分析を第3A図および第3B図に示す。MB49細胞は両方の因子で同様な量のプラスミドDNAを内在化したように思われる。したがって、トランスフェクション効率において観測された差はプラスミドDNAの吸収が異なるためでなく、多分いったん細胞の中に取り込まれたDNAの安定性のためである。
実施例4：  プラスミドDNAの核および細胞質中の蓄積
DOTAPおよびDMBCを使用するトランスフェクション後のDNAの局在化を決定するために、核および細胞質の抽出物をトランスフェクトした細胞から調製した。これらの抽出物中のDNAの存在はDMBCでトランスフェクトした細胞において、lacZ遺伝子は核および細胞質の両方の画分の中に局在化された。しかしながら、DOTAP単独では、プラスミドDNAは細胞質の中にのみ見出された（第4A図および第4B図）。GADPH遺伝子を使用して、核抽出物中の核DNAの存在および核DNAによる細胞質画分の汚染の欠如を確証した。
実施例5：  DMBC／DNA複合体の毒性
細胞増殖アッセイを使用して、トランスフェクション因子の毒性を測定した。プレート後48時間に、トランスフェクトした細胞および非トランスフェクション細胞における増殖を測定することによって、比較毒性を測定した。細胞をトランスフェクション因子に2時間および24時間暴露した。DOTAP（D）またはDMBCに2時間暴露したトランスフェクトした細胞および非トランスフェクション細胞間の14C−チミジン組込みレベルの差は存在しなかった（第5A図）。DNAを含むか、あるいは含まないDMBCにまたはDOTAPに細胞を24時間暴露したとき、細胞増殖能力の減少があったが、これは統計的に有意でなかった（第5B図）。
実施例6：  トランスフェクション因子およびDNAの膀胱内点滴注入によるネズミ膀胱のトランスフェクション
膀胱内点滴注入を介してトランスフェクション因子であるDMBC／DNAを与えたマウス（n＝16）において、管腔に面する膀胱上皮細胞はすべてのマウスにおいて首尾よくトランスフェクトされた（第6A図および第6B図）。in  vivoDOTAP単独は膀胱上皮細胞の効率よいトランスフェクションを生じなかった。膀胱と同様に、肺、腎臓、脾臓、心臓および肝臓をトランスフェクトした動物および対照から収集し、下記表2に要約するように、すべてはβ−galについて陰性に染色されることが見出され、トランスフェクションは膀胱に限定された。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
これは2匹のマウスについて実行したPCR分析（第7図）により確証された。マウスにおいて、脾臓を膀胱と同時に収集し、対照およびトランスフェクトした動物におけるCD3＋、CD4＋、CD8＋、αβおよびγδ  T細胞のレベルをフローサイトメトリーにより測定した。対照グループおよび実験グループの間に差は存在しなかった。
【００６１】
さらに、腫瘍をマウス膀胱の中に移植し、いったん確立させると、これらのマウスをまたpCMVlacZおよびDMBCで膀胱内的に処置した。過形成の表在性管腔細胞層はβ−galの染色を示した（第10A図〜第10B図）。
【００６２】
トランスフェクトした膀胱に対するDMBCおよびDOTAPの作用を透過型電子顕微鏡検査により解析した。各因子を使用する2時間のトランスフェクション暴露は、非トランスフェクション対照膀胱と比較したとき、管腔に面する細胞において識別可能な構造的差を生じなかった。また、小胞中のカチオン脂質またはコレステロールの蓄積の指示は存在しなかった。一般に、膀胱上皮細胞は多数の小胞を含有するが、処置後このような小胞の数が増加するように思われなかった。
実施例7：  トランスフェクション因子に対する暴露時間に関するトランスフェクション効率
より短い暴露時間を使用するトランスフェクション効率を測定するために、トランスフェクション複合体（pCMVlacZ：DMBC）を異なる時間の間細胞に適用し、次いでトランスフェクション複合体を除去し、細胞を完全培地中で48時間培養した後、収集し、酵素的に分析した。β−gal活性はトランスフェクション時間が15分程度に短いときでさえ検出可能であり、そしてこの活性はトランスフェクション因子に対する実験時間とともに増加する（第8A図）。15分の暴露と2時間の暴露との間に4.8倍のトランスフェクション率の差が存在した。in  vivoにおいて、暴露時間をより長くすると、トランスフェクトされる管腔に面する上皮細胞はより多くなった（第8B図）。
実施例8：  in  vivo遺伝子発現期間
マウスにおいて、トランスフェクション後14、21および30日にβ−gal発現をモニターした。30日までに、発現は大きく減少したが、なお明瞭に検出可能であった（第9A図および第9B図）。このシグナルの耐久性は尿路上皮細胞のin  vivo代謝回転が低い結果であることがあり、この低い代謝回転はpCMVlacZ遺伝子の存在時間をより長くするであろう。
実施例9：  MB49細胞および腫瘍増殖に対するDOTAP＋メチル−β−シクロデキストリン可溶化コレステロール（DMBC）の作用の特性決定
表面タンパク質マーカーのin  vitro発現
MB49細胞をサイトカイン遺伝子の単独または組合わせでトランスフェクトした。2日後、発現をフローサイトメトリーにより測定した。MHCクラスI、MHCクラスII、FAS、ICAM  I、ICAM  II、B71およびB72を発現する細胞の比率の増加は、下記表3において要約されているように、非トランスフェクション細胞と比較したとき、サイトカイン遺伝子でトランスフェクトした細胞において見られた。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
確立された腫瘍の腫瘍内療法
確立された腫瘍の根絶のためにサイトカインを送出する本発明のトランスフェクション系の能力を試験した。下記のサイトカイン（IL−2、IFN−γ、GMCSFおよびIL−2＋GMCSF）をコードするDNAを含んでなるトランスフェクション組成物を、腫瘍移植後7〜10日の腫瘍支持マウスの右側腹部に腫瘍内に注射した。第7日にマウスの腫瘍体積を第11図のグラフに示す。サイトカイン遺伝子治療で処置されたマウスは、未処置およびDMBC対照に比較して、より遅い腫瘍のグループを証明した。第38日における腫瘍体積（第12図のグラフに示す）は、IFN−γ（p＝0.041）、GMCSF（p＝0.0014）またはIL−2＋GMCSF（p＝0.004）でトランスフェクトしたマウスについて有意により小さかった。IL−2で処置したマウスは、より遅い腫瘍増殖のみを証明した。IFN−γ、GMCSFおよびIL−2＋GMCSFで処置したすべてのマウスの30％は治癒した。経時的腫瘍体積（第7〜37日）を第13図のグラフに要約する。未処置グループにおいて、1匹のマウスは局所的寛解を示したが、体重を急速に喪失し、早期に死亡し、転移性疾患を示唆した。マウスにおける治癒割合を下記表4に要約する。
【００６５】
【表４】
0004995388.tif 000005
【００６６】
脾細胞中のサイトカイン発現
未処置およびサイトカイン処置した腫瘍支持マウスの脾細胞中のサイトカイン発現を正常（腫瘍をもたない）マウスのサイトカイン発現と比較して、サイトカイン産生が影響を受けるかどうかを決定した。すべてのグループは、IL−2、IFN−γ、TNF−αおよびGMCSFのmRNAを発現した。サイトカイン処置マウスは、未処置、DMBCおよび正常（腫瘍をもたない）対照に比較して、サイトカインmRNA産生の一般的増加を示した。GMCSFおよびIL−2＋GMCSFで処置したマウスは、他のサイトカイン処置グループに比較して、大量のGMCSFを産生した。結果を下記表5に要約する。
【００６７】
【表５】
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【００６８】
脾細胞の表現型の特性決定
表現型特異的モノクローナル抗体を使用するマウスからの脾細胞のフローサイトメトリー分析は、未処置およびDMBC処置グループにおけるCD3、CD4＋およびCD8集団が、正常対照と比較したとき、減少することを示した。サイトカイン遺伝子治療により処置された腫瘍支持マウスは、CD3、CD4＋、CD8、NKおよびαβ集団について、正常対照に類似するプロファイルを有した。結果を下記表6に要約する。
【００６９】
【表６】
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【００７０】
この実施例に記載するこれが証明するように、単一サイトカイン遺伝子を使用するネズミ膀胱癌細胞のトランスフェクションはMHCクラスI、クラスIIおよびFas発現の増加を誘導する。この応答は癌細胞をいっそう免疫原性とする。腫瘍内トランスフェクション実験から、IL−2、IFN−γ、GMCSFおよびIL−2＋GMCSFが腫瘍増殖に対して同様な阻害効果を有することが見出された。37日後、未処置グループと比較したとき、IFN−γ、GMCSF、IL−2＋GMCSFでトランスフェクトしたグループにおいて腫瘍サイズの有意差が存在することが見出された。このデータが証明するように、DMBCは尿路上皮細胞のin  vitroおよびin  vivoトランスフェクションのために有効な因子である。マウスの腫瘍内研究において、非ウイルスベクターを介するサイトカイン遺伝子デリバリーによる尿路上皮腫瘍細胞のトランスフェクションは腫瘍増殖を阻害できることが示された。
【００７１】
明確さおよび理解を目的として例示および実施例により本発明を多少詳述に説明したが、当業者にとって明らかなように、ある種の変化および変更が可能である。したがって、説明および実施例は添付された特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ〜Ｃ】  第1A図〜第1C図は、トランスフェクトしてない細胞またはDOTAPまたはDMBCでトランスフェクトした細胞の写真であり、pCMVlacZリポータープラスミドの発現レベルを比較する。トランスフェクトしてない細胞（第1A図）はX−galで染色されなかった。わずかの細胞はpCMVlacZ／DOTAPでトランスフェクトされ、これらはX−galで陽性に染色された（第1B図）。pCMVlacZ／DMBCを使用するトランスフェクションは、X−gal陽性細胞の数を増加させた（第1C図）。こうして、メチル−β−シクロデキストリンを含有するコレステロール（MBC）をDOTAP（D）に添加した後、トランスフェクション効率は増加した。
【図１Ｄ〜Ｅ】  第1D図は、慣用トランスフェクション剤に対するMBCの作用を示す棒グラフである。DOTAP＋メチル−β−シクロデキストリンを含有するコレステロール（DMBC）またはスーパーフェクト＋メチル−β−シクロデキストリンを含有するコレステロール（SMBC）でトランスフェクトした細胞は、DOTAPまたはスーパーフェクト単独に比較して、β−gal活性について陽性に染色される細胞数の増加を示した。MBCは裸DNAの吸収を増強しなかった。
第1E図は、DMBCおよび慣用DOTAP：コレステロール（AVDC）のトランスフェクション効率の比較を示す。非トランスフェクション細胞（CON）は、420nmにおける光学密度により測定して、β−gal活性を示さなかった。AVDCはCOS−7細胞をトランスフェクトすることができたが、MB49細胞を効率よくトランスフェクトしなかった。対照的に、DMBCはMB49細胞をトランスフェクトし、COS−7細胞においてトランスフェクション効率を増強することができた。
【図２】  第2A図〜第2B図は、pCMVLacZ遺伝子の経時的発現を示す棒グラフである。β−gal活性はトランスフェクション後1時間程度に早く見られ、48時間まで絶えず増加した（第2A図）。細胞を実施例の節に記載されているようにトランスフェクトし、2、4、6、8および12日後、ONPGアッセイを使用してβ−gal活性についてアッセイした。β−gal発現は12日において非常に低かった（第2B図）。
【図３Ａ】  第3A図〜第3B図は、DOTAP（D）またはDMBCに対して暴露した細胞によるDNAの内在化を証明する。LacZ遺伝子の存在を非トランスフェクション細胞およびトランスフェトした細胞についてPCRにより決定した（第3A図）。
【図３Ｂ】  アガロースゲル電気泳動後にPCR生成物のデンシトメトリー走査により、GAPDHに関するLacZ遺伝子の発現を決定した（第3B図）。
【図４Ａ】  第4A図〜第4B図は、PCRによりプラスミドDNAの局在化を証明する。第4A図はPCR増幅生成物を示す。LacZ遺伝子はDMBCでトランスフェクトした核（N）および細胞質（CY）画分の両方の中に見出されたが、DOTAP（D）でトランスフェクトした細胞については細胞質画分の中にのみ見出された。
【図４Ｂ】  第4B図は、GADPHに関する核（N）および細胞質（CY）画分のデンシトメトリー分析を示す。
【図５】  第5A図〜第5B図は、DNA：DMBC複合体の抗増殖作用を示す棒グラフである。下記の因子の抗増殖作用を、2時間（第5A図）および24時間（第5B図）の暴露後に、未処理MB49細胞（CON）と比較した：DMBC／DNA、DOTAP（D）／DNA、DNA、DMBC、DOTAP（D）およびMBC。トランスフェクトした細胞および非トランスフェクション細胞における［14C］−チミジン組込みを比較することによって、相対的抗増殖作用を48時間後に決定した。
【図６】  第6A図および第6B図は、in  vivoにおける尿路上皮細胞のトランスフェクションを示す写真である。トランスフェクトした膀胱を12日後に収集し、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。非トランスフェクション膀胱を陰性対照として使用した（第6A図）。トランスフェクトした細胞において、管腔に面する上皮細胞は陽性に染色された（第6B図）。（倍率40×）。
【図７】  第7図は、一時的トランスフェクション後のpCMVLacZの細胞局在化を示す。非トランスフェクションマウスからの器官を対照組織についてCと標識する。pCMVLacZ／DMBC複合体でトランスフェクトしたマウスから収集した器官をDMBCと標識する。膀胱を除外するすべての器官におけるβ−ガラクトシダーゼの非存在をPCRにより確証した。
【図８Ａ】  第8A図は、in  vitroにおけるトランスフェクション効率に対する暴露時間を示す棒グラフである。細胞をDNA：DMBC複合体に対してin  vitroにおいて15、30、60および120分間暴露した。より長い暴露時間は、X−galで陽性に染色される細胞の百分率により測定して、トランスフェクション効率を改良した。
【図８Ｂ】  第8Bi図〜第8iv図は、in  vivoにおけるトランスフェクション効率に対する暴露時間を示す写真である。膀胱をpCMVLacZ／DMBC複合体に対してi）15分間、ii) 30分間、iii) 60分間およびiv) 120分間暴露した（倍率40×）。より多くの尿路上皮細胞がX−galで経時的に染色された。
【図９】  第9A図〜第9B図は、単一膀胱内点滴注入後におけるin  vivo発現期間を示す写真である。トランスフェクション後2日に、管腔に面する細胞の大部分はX−galで陽性に染色された（第9A図）。30日後、β−galの発現は減少した数の細胞においてなお観測することができた（第9B図）（倍率100×）。
【図１０】  第10A図および第10B図は、正常膀胱切片（第10A図）および過形成膀胱切片（第10B図）を示す写真である。MB49腫瘍細胞を移植した膀胱をpCMVLacZ：DMBCで2時間トランスフェクトした。過形成の表在性管腔細胞層において、青色染色が観測された。（倍率100×）。
【図１１】  第11図は、サイトカイン遺伝子治療（IL−2、GMCSF、IL−2＋GMCSFまたはIFN−γ）、またはDMBCで処置したマウスまたは未処置対照における第7日における腫瘍体積を示すグラフである。
【図１２】  第12図は、サイトカイン遺伝子治療（IL−2、GMCSF、IL−2＋GMCSFまたはIFN−γ）、またはDMBCで処置したマウスまたは未処置対照における第38日における腫瘍体積を示すグラフである。
【図１３】  第13図は、サイトカイン遺伝子治療（IL−2、GMCSF、IL−2＋GMCSFまたはIFN−γ）、またはDMBCで処置したマウスまたは未処置対照における経時的（第7〜37日）腫瘍体積を示すグラフである。
【配列表】
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【図１Ａ】
0004995388.tif 000009
【図１Ｂ】
0004995388.tif 000010
【図１Ｃ】
0004995388.tif 000011
【図１Ｄ】
0004995388.tif 000012
【図１Ｅ】
0004995388.tif 000013
【図２Ａ】
0004995388.tif 000014
【図２Ｂ】
0004995388.tif 000015
【図３Ａ】
0004995388.tif 000016
【図３Ｂ】
0004995388.tif 000017
【図４Ａ】
0004995388.tif 000018
【図４Ｂ】
0004995388.tif 000019
【図５Ａ】
0004995388.tif 000020
【図５Ｂ】
0004995388.tif 000021
【図６Ａ】
0004995388.tif 000022
【図６Ｂ】
0004995388.tif 000023
【図７】
0004995388.tif 000024
【図８Ａ】
0004995388.tif 000025
【図８Ｂ】
0004995388.tif 000026
【図９Ａ】
0004995388.tif 000027
【図９Ｂ】
0004995388.tif 000028
【図１０Ａ】
0004995388.tif 000029
【図１０Ｂ】
0004995388.tif 000030
【図１１】
0004995388.tif 000031
【図１２】
0004995388.tif 000032
【図１３】
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