(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１９６、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１９７、またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０１９８で標示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１９６、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１９７、またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０１９８で標示されるハイブリドーマ細胞。
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１９７のモノクローナル抗体を含有する、肝炎の予防および／または治療剤である医薬組成物。
【請求項４】
さらに抗α４インテグリン抗体を含有する、請求項３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトα９インテグリンおよびマウスα９インテグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体；前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞；前記モノクローナル抗体を含有する医薬組成物；前記モノクローナル抗体を含有する診断剤；前記モノクローナル抗体の製造方法；前記ハイブリドーマ細胞の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞はインテグリンとよばれる一群の細胞表面受容体を介して細胞外マトリックス（extracellular matrix；以下、ＥＣＭと略称する）に結合する。インテグリンはα鎖とβ鎖が１：１のヘテロ二量体を形成することによって機能する。現在までに少なくともα鎖１８種類、β鎖８種類およびαβヘテロ二量体２４種類が同定確認されている。各インテグリンはそれぞれが特異的なリガンドを認識することが知られている。インテグリンはリガンドに対する特異性や機能からサブファミリーに分類され、コラーゲン受容体、ラミニン受容体、ファイブロネクチンやビトロネクチンなどに含まれるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を認識するＲＧＤ受容体、白血球にのみに存在する白血球特異的受容体に区別される(非特許文献１：Hynes RO. 2002. Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110: 673-87；非特許文献２：Miyasaka M. 2000. New edition of Adhesion Molecule handbook. Shujunsya)。α４とα９インテグリンは、これらにどれにも属さないサブファミリーでありα４インテグリンサブファミリーと呼ばれている（非特許文献３：Elise L. Palmer, Curzio Rfiegg, Ronald Ferrando, Robert Pytela, Sheppard D. 1993. Sequence and Tissue Distribution of the Integrin a9 Subunit, a Novel Partner of 131 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology 123: 1289-97）。一方、これまでＥＣＭは細胞間の単なる詰め物としてしか考えられていなかったが、インテグリンを介したＥＣＭと細胞との相互作用が細胞の増殖、接着、運動などの調節に深く関与し、癌の進展や炎症増悪などの疾患発症に関わることが明らかとなってきた。
【０００３】
ＥＣＭの一種であるオステオポンチン（osteopontin；以下、ＯＰＮと略称する）は分子量約４１ｋＤａの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質であり、乳汁、尿、腎尿細管、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化T細胞、腫瘍組織など広く発現が認められている分子である。分子中央部に細胞接着配列ＧＲＧＤＳとヒトＯＰＮではＳＶＶＹＧＬＲ配列、マウスＯＰＮではＳＬＡＹＧＬＲ配列、その直後にはトロンビン切断部位を有しており、ＧＲＧＤＳ配列を介してＲＧＤインテグリンと、ＳＶＶＹＧＬＲ配列あるいはＳＬＡＹＧＬＲ配列を介してα４（α４β１）とα９（α９β１）インテグリンと接着する。
【０００４】
α４β１はトロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＮ末端フラグメント（切断型ＯＰＮ）の両方に結合し、α９β１は切断型ＯＰＮにのみ結合するという様式の差も見出されている（非特許文献４： Y. Yokosaki et al., (1999) The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334；非特許文献５： P. M. Green et al., (2001) FEBS Letters 503, 75-79；非特許文献６： S. T. Barry et al., (2000) Experimental Cell Research 258, 342-351）。
【０００５】
α４およびα９インテグリンは、ＯＰＮ以外にも多くの共通するリガンドを有している。ファイブロネクチンのＥＤＡ部位、プロペプチド-フォンビルブラントファクター（ｐｐ−ｖＷＦ）、組織型トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、第ＸＩＩＩ血液凝固因子そしてVascular Cell Adhesion Molecule-1（ＶＣＡＭ−１）などが知られている。またα４インテグリンが特異的に認識するリガンドとしてファイブロネクチンのＣＳ−１ドメイン、ＭａｄＣＡＭ−１（α４β７）などが知られている。α９インテグリンが特異的に認識するリガンドは、テネイシンＣ、プラスミンなどが知られている。
【０００６】
α９、α４およびβ１のインテグリンサブユニットのアミノ酸配列は公知である。例えば、ヒトα９はＮＭ＿００２２０７、マウスα９はＮＭ＿１３３７２１、ヒトα４はＮＭ＿０００８８５、マウスα４はＮＭ＿０１０５７６、ヒトβ１はＸ０７９７９、マウスβ１はＮＭ＿０１０５７８としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。また、これらのインテグリンは種間でアミノ酸配列間の類似性が高いことが知られている。
【０００７】
ＷＯ０２／０８１５２２（特許文献１）には、ＯＰＮ欠損マウスやＯＰＮに対する中和抗体を用いたＯＰＮ機能抑制による、リウマチ様関節炎や肝炎の治癒効果について開示されている。また、この公報には、炎症性疾患発症にはα９インテグリン、α４インテグリン認識配列であるＳＶＶＹＧＬＲ配列が重要であること、ＯＰＮに対する受容体が免疫担当細胞などにおいて発現し、炎症性疾患に関連していることが開示されている。
【発明の概要】
【０００８】
現在、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患の治療薬は種々知られているが、より改善された治療効果を有する癌、炎症性疾患、自己免疫疾患の予防薬および／または治療薬等を開発することが望まれていた。
【０００９】
そこで、本発明者らはインテグリンに着目し、種々の研究を行った結果、α９インテグリンに対する特異的阻害抗体が癌抑制効果、抗炎症効果を有することを見出し、本発明を完成した。すなわち、具体的には、本発明は以下に記載のモノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞、医薬組成物等を提供する。
（１）ヒトα９インテグリンおよびマウスα９インテグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体。
（２）ヒトおよび／またはマウスα９インテグリンとα９インテグリンのリガンドとの結合を阻害する上記（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）α９インテグリンのリガンドがオステオポンチンである上記（２）に記載のモノクローナル抗体。
（４）受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９７、またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９８で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される上記（１）から（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（５）上記（１）から（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
（６）上記（１）から（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物。
（７）請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体および抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物。
（８）炎症性疾患の予防および／または治療剤である、上記（６）または（７）に記載の医薬組成物。
（９）上記（１）から（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する、炎症性疾患の診断剤。
（１０）α９インテグリンを過剰発現する細胞を抗原として用いることを特徴とする、上記（１）から（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体の製造方法。
（１１）α９インテグリンを過剰発現する抗原として用いた細胞とは別の種の細胞を用いることを特徴とする、上記（５）に記載のハイブリドーマ細胞の製造方法。
（１２）α９インテグリン結合性機能分子（例えば、OPN、VCAM-1、テネイシンC、ファイブロネクチン、pp-vWF、tTGなど）を有効成分として含有する、細胞および／または組織のリモデリングの抑制および／または促進剤。
（１３）α９インテグリン発現細胞および／または組織（例えば、腫瘍細胞、好中球、平滑筋など）とα９インテグリン結合性機能分子（例えば、OPN、VCAM-1、テネイシンC、ファイブロネクチン、pp-vWF、tTGなど）とを接触させることを特徴とする細胞および／または組織のリモデリングの抑制および／または促進方法。
【００１０】
本発明の抗α９インテグリン抗体はα９インテグリン機能抑制により、癌、例えば癌細胞の増殖、転移、そして炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、さらには自己免疫疾患等に対する治療効果を奏する。
また、本発明の抗α９インテグリン抗体と抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された炎症性疾患の治療効果を奏する。本発明ではマウスα９インテグリン、ヒトα９インテグリンに対するそれぞれのモノクローナル抗体を作製した。抗マウスα９インテグリン抗体では、動物実験に使用することができ、抗ヒトα９インテグリン抗体では治療薬として使用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はインテグリン遺伝子導入細胞におけるｍＲＮＡ発現量の解析結果を示す図である。
【図２】図２は抗マウスα９インテグリン抗体のFACS解析の結果を示す図である。
【図３】図３は抗マウスα９インテグリン抗体による正常組織の染色像を示す図である。
【図４】図４は免疫染色の結果を一覧した図である。
【図５】図５は抗マウスα９インテグリン抗体４クローンの細胞接着阻害効果を示す図である。
【図６】図６は抗マウスα９インテグリン抗体クローンの細胞接着阻害効果を比較した図である。
【図７】図７は競合阻害試験による抗体のエピトープ解析の結果を示す図である。
【図８】図８はマウスメラノーマ細胞株におけるα４およびα９インテグリンの発現解析の結果を示す図である。
【図９】図９は単球系細胞株におけるα９インテグリンの発現解析の結果を示す図である。
【図１０】図１０はマウス好中球のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図１１】図１１はマウス肝臓浸潤白血球のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図１２】図１２は抗α４インテグリン抗体およびα９インテグリン抗体によるＢ１６−ＢＬ６の細胞接着阻害効果を示す図である。
【図１３】図１３は抗α４インテグリン抗体および抗α９インテグリン抗体による肝炎治療効果を示す図である。
【図１４】図１４は腱線維芽細胞のα９インテグリン発現を示す図である。
【図１５】図１５はトロンビン切断型OPNにより腱線維芽細胞のMMP-13 mRNAの転写が増加することを示す図である。
【図１６】図１６は抗α９インテグリン抗体により腱線維芽細胞からのMMP-13 mRNA転写が抑制されていることを示す図である。
【図１７】図１７はB16-BL6細胞の増殖を抗α９インテグリン抗体で抑制したことを示す図である。
【図１８】図１８はVCAM-1刺激によるB16-BL6細胞の増殖を抗α９インテグリン抗体と抗α４インテグリン抗体との併用で抑制したことを示す図である。
【図１９】図１９は抗ヒトα９インテグリン抗体のFACS解析の結果を示す図である。
【図２０】図２０は抗ヒトα９インテグリン抗体４クローンとY9A2との細胞接着阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
抗インテグリン抗体として、α４インテグリンに対する中和抗体はすでに臨床試験に進んでいる。例えば、２００４年７月には米食品医薬品局（ＦＤＡ）が、バイオジェン・アイデック（Biogen Idec Inc.、米マサチューセッツ州）とエラン（Elan Corporation、アイルランド）による多発性硬化症治療薬Tysabri（登録商標）（natalizumab）の承認申請を受理し、Tysabri（登録商標）は優先審査の対象に指定されている。Tysabri（登録商標）はまた、クローン病、リウマチ様関節炎等の疾患を対象としている。また、Ｐ４Ｃ２という抗ヒトα４β１インテグリンモノクローナル抗体が実験室レベルで用いられている。
【００１３】
しかし、α９インテグリンに対する抗体はヒトα９インテグリンを抗原とし、ヒトおよびモルモットのα９インテグリンに特異性を示すＹ９Ａ２と呼ばれる中和抗体（A. Wang et al., (1996) Am. J. Respir., Cell. Mol. Biol. 15, 664-672）が実験室レベルで用いられてはいるものの、臨床的に用いられているわけではない。
【００１４】
一方、抗ヒトα９インテグリン抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、開発段階では直接ヒトへの投与はできず、その効果を確認できない。すなわち、効果を確認するための動物実験が必要となり、この効果が確認できれば、ヒト化抗体等を作製することとなる。マウスはその遺伝的背景が明らかとなっている系統が多く、また世代あたりの時間が短い特徴を有する。さらに、マウスはヒトの疾患とほぼ同一の疾患を観察することができることが知られているので、実験動物として好適であるが、マウスα９インテグリンと交叉反応を示す中和抗体はこれまで報告されていない。
【００１５】
本発明では、以下の４工程を注意深く進めることにより、ヒト、マウスそれぞれに対するα９インテグリンに特異的に反応する阻害抗体を得ることができた。
【００１６】
（１）α９インテグリン過剰発現株の作製
遺伝子発現細胞のスクリーニングは通常であれば、タンパク質レベルや遺伝子レベルで行うが、今回は、α９インテグリンの機能である細胞接着能を用いたスクリーニングにより、ヒトまたはマウスα９インテグリンをそれぞれ細胞膜上に過剰発現する細胞株を樹立した。
ヒトまたはマウスα９インテグリン発現細胞は、マウスあるいはハムスターへそれぞれ免疫に使用することができた。
【００１７】
（２）細胞の選択
マウスα９インテグリンに対する抗体を作製するために、シリアンハムスターに免疫することを考えた。そのために、ハムスターの卵巣由来細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞へマウスα９インテグリンの遺伝子導入を行い、ハムスター内で主にマウスα９インテグリンに対する抗体のみの抗体価を増加させる実験系を構築した。
ヒトα９インテグリンに対する抗体は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞へヒトα９インテグリンの遺伝子導入を行い、マウス内でヒトα９インテグリンに対する抗体を増加させる実験系を構築した。
【００１８】
（３）抗マウスα９インテグリン抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング
種々のハイブリドーマからマウスα９インテグリンのみに反応するクローンを効率よく得るために、免疫した細胞の親細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）とは異なる細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）にα９インテグリンを発現させた細胞をスクリーニングに使用した。さらにα９インテグリンと同じインテグリンファミリーに属するマウスα４インテグリンをＮＩＨ３Ｔ３細胞に発現させた細胞を用いて、α９インテグリン以外のインテグリンとは交差反応性を示さないクローンを選抜することにより、効率的にマウスα９インテグリンに特異的に反応する抗体を得た。
【００１９】
（４）抗ヒトα９インテグリン抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング
種々のハイブリドーマからヒトα９インテグリンのみに反応するクローンを効率よく得るために、遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１に反応を示し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に反応しないクローンを選抜した。また、ヒトα４インテグリン遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞に反応しないことを確認することで、ヒトα９インテグリンに特異的に反応する阻害抗体を得た。
【００２０】
［α９インテグリンに対するモノクローナル抗体］
本発明はα９インテグリンに対するモノクローナル抗体を提供する。本発明において「抗体」とは、抗原であるα９インテグリンまたはその部分ペプチドに結合し得る抗体分子全体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2断片）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明においてはモノクローナル抗体を意味する。また、本発明において「抗体」は、ヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体を包含する。
【００２１】
上記「ヒト型化抗体」とはマウス等のヒト以外の種に由来する抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造で置き換えた抗体を言う。また、「キメラ抗体」とは、異種抗体由来のＦａｂ領域とＦｃ領域とを有する抗体を意味する。
【００２２】
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、それぞれ１つの抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するために「Ｆｃ」と呼ばれる断片が生じる。また、ペプシン消化により２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）2断片、及び、残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。
【００２３】
ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は１つの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが非共有結合により強く連結された二量体である（ＶH−ＶL二量体）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶH−ＶL二量体の表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合部位を付与するものである。しかしながら、１つの可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００２４】
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常ドメイン、および、重鎖の細胞の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端由来する数個の残基を付加的に有する点で異なる。
【００２５】
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混在しないハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。
【００２６】
以下、抗α９インテグリンモノクローナル抗体の作製について詳述するが、該抗体の作製はこれに限定されることはない。
【００２７】
［α９インテグリン（抗原）］
本発明において抗原として使用するα９インテグリンは、（１）ヒトやその他の哺乳動物のα９インテグリンを発現するあらゆる細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質、（２）α９インテグリンをコードする遺伝子ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡを細菌、酵母、動物細胞等の細胞株に導入、発現させた組換えタンパク質であってもよく、また（３）合成タンパク質であってもよい。
【００２８】
また、本発明のα９インテグリンには、各種哺乳動物のα９インテグリンのアミノ酸配列、特に好ましくはヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号：１）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
【００２９】
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンと実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１ないし１０個のアミノ酸、特に好ましくは１ないし数個（例えば、１ないし５個）のアミノ酸が置換、欠失および／または修飾されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド、ならびに該天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンのアミノ酸配列中に、複数個のアミノ酸、好ましくは１ないし１０個のアミノ酸、特に好ましくは１ないし数個（例えば、１ないし５個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド
を意味する。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を有する変異ポリペプチドであってもよい。
【００３０】
本発明のα９インテグリン、特にはヒト由来のα９インテグリンは、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
【００３１】
また、変異ポリペプチドの製造方法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド部位突然変異導入法（gapped duplex法）、亜硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、Ｂａ１３１酵素等により欠失変異体を作製する方法、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマー法、ＤＮＡセグメント合成法などを挙げることができる。
【００３２】
また、本発明のα９インテグリンには、該α９インテグリンの「一部」も包含される。ここで「一部」とは、α９インテグリンのリガンド、例えばＯＰＮやVCAM-1、Tenascin-C等と結合するために必要な領域を含む部分であり、具体的には配列番号：１で表されるアミノ酸配列の１４番目から９８０番目、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１１番目から９８１番目を含む部分をいう。該α９インテグリンの「一部」は、後述する当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また細胞培養方法により単離したα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンをタンパク分解酵素等により適切に切断することで製造することができる。
【００３３】
抗原としてはまた、α９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体、あるいはその膜画分等を用いることができる。
【００３４】
本発明のα９インテグリンには、ヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号：１）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして、具体的には、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有する、マウスα９インテグリンがあげられる。本発明では、疾患モデル動物としてマウスを考慮しているので、本発明の抗原としてマウス由来のα９インテグリンが好適に用いられる。また、特に本発明ではα９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体が好適に用いられる。したがって、後述するような、α９インテグリンをコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を公知の遺伝子工学技術を用いてクローニングし、α９インテグリンを細胞膜上に過剰発現する細胞自体、またはその細胞膜画分を抗原として調製する場合もある。
【００３５】
［抗体産生細胞の調製］
抗原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、マウス、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、本発明ではハムスターが好適に用いられる。
【００３６】
治療の対象がヒトであり、ＯＰＮ阻害抗体産生動物がマウスの場合には、ヒトマウスキメラ抗体やヒト化抗体を用いるのが望ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いてヒト型モノクローナル抗体を作成して用いるのが望ましい。
【００３７】
［抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合］
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒト等に由来する細胞が用いられる。例えばマウスミエローマＰ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３等があげられるが、抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。ミエローマ細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。本発明ではＰ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３が好適に用いられる。
【００３８】
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などがあげられる。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞とミエローマ細胞を１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養を続ける。
【００３９】
［ハイブリドーマ細胞の選別］
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常、５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％ＣＯ2下で行なうことができ
る。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体の産生は、新臨床免疫実験操作法（part 3）、科学評論社、1997に記載される細胞ＥＬＩＳＡ法を用いて確認およびスクリーニングできる。免疫に用いた細胞をスクリーニングに使用するとバックグラウンドが高くなることや偽陽性が多くなることが予想される場合、免疫に用いた細胞とは別の細胞で過剰発現するα９インテグリンに反応し、かつ、α４インテグリンを過剰発現する細胞に反応しないクローンを抗α９インテグリン抗体とすることができる。このようなクローンから限界希釈法を１から５回、好適には２から４回繰り返すことによりモノクローナル抗体を調製できる。
【００４１】
［抗体の分離精製］
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができるAntibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.（Amersham Biosciences）等が挙げられる。
【００４２】
［抗体の標識化］
得られた抗体を、公知の方法または市販のキットを用いて各種標識化（例えば、ビオチン標識、ＦＩＴＣ標識、ＡＰＣ標識）できる。本発明では、Biotin Labeling Kit（同仁化学）を用いたビオチン標識が好適に用いられる。
【００４３】
［本発明のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物］
本発明は上記のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物を提供する。本発明のモノクローナル抗体を有効成分として含有してなる医薬組成物は、癌、例えば癌細胞の増殖、転移、そして炎症性疾患、例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）および自己免疫疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物はまた、臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療にも用いることができる。
【００４４】
本発明の抗体を含有する上記疾病の予防および／または治療剤は低毒性であり、適当な溶媒に配合して液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の関節リウマチ患者の予防および／または治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を
投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００４５】
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。このような組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００４６】
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００４７】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍ
ｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【００４８】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
【００４９】
前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００５０】
なお、本発明は、 α９インテグリン結合性機能分子（例えば、OPN、VCAM-1、テネイシンC、ファイブロネクチン、pp-vWF、tTGなど）を有効成分として含有する、細胞および／または組織のリモデリングの抑制および／または促進剤；並びに、α９インテグリン発現細胞および／または組織（例えば、腫瘍細胞、好中球、平滑筋など）とα９インテグリン結合性機能分子とを接触させることを特徴とする細胞および／または組織のリモデリングの抑制および／または促進方法にも関する。このような治療剤の有効成分の投与量、投与方法、製剤化などについては上記抗体含有医薬の記載を参照して適宜決定することができる。
【００５１】
［本発明のモノクローナル抗体を含有する診断剤］
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物は、癌、例えば癌細胞の増殖、転移、そして炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫等の診断剤、また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトー
デス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、α９インテグリンを特異的に認識することができるので、被検液中のα９インテグリンの定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどによる定量、免疫染色などに使用することができる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要としない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて測定系を構築すれ
ばよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
【００５２】
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、α９インテグリンを感度良く定量することができる。さらに、本発明の抗体を用いる、生体内でのα９インテグリンの定量法を利用することにより、α９インテグリンが関連する各種疾患の診断をすることができる。例えば、α９インテグリンの発現量の増減が検出された場合は、α９インテグリンが関連する疾患、例えば癌や炎症性疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するα９インテグリンを特異的に検出するために使用することができる。また、α９インテグリンを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画に含まれる
α９インテグリンの検出、被検細胞内におけるα９インテグリンの挙動の分析等に使用することができる。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５４】
実施例１
［マウスα９、α４インテグリンｃＤＮＡのクローニング］
α４インテグリン遺伝子はマウス１２．５日胚、α９インテグリンはＢ１６−ＢＬ６細胞（マウスメラノーマ細胞）の全ＲＮＡからランダムプライマーを用いて逆転写し、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりクローニングを行った。クローニングに用いたプライマーを以下に示す。
mα4Integin-5': 5'-CGTGGATCCGAGCGCATGGCTGCGGAAGCGAGGTGC-3'（配列番号:3）
mα4Integin-3': 5'-CAGCTCGAGTCAGTCATCATTGCTTTTGCTGTTGAC-3'（配列番号:4）
mα9Integin-5': 5'-GTCAAGCTTCTGGGGATGGGCGGCCCGGCTGGGCTG-3'（配列番号:5）
mα9Integin-3': 5'-CGGTCTAGACACGGTGGGTCACTGGTTTTTCTGGAC-3'（配列番号:6）
【００５５】
ＰＣＲは以下の組成：鋳型cDNA 5μl、ＧＣバッファーＩ 25μl、dNTPmix 5μl、10μM primer1 1μl、10μM primer2 1μl、DW 10.5μl、LA Taq（ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（登録商標））0.5μlの反応系を作製し、94℃ 2分→(94℃ 30秒→68℃ 3分、３０サイクル) →4℃の反応条件で、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２７００（アプライドバイオシステムズ））により反応を行った。反応後、１％アガロースゲル電気泳動により、α４インテグリンの場合は３ｋｂ付近のバンドを、α９インテグリンの場合は３ｋｂ付近のバンドを分離後、ゲルより切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標） Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＰＣＲ増幅産物を精製した。
【００５６】
［ヒトα９、α４インテグリンｃＤＮＡのクローニング］
α４インテグリン遺伝子はヒト好中球、α９インテグリンはヒト末梢単核球から抽出した全ＲＮＡからランダムプライマーを用いて逆転写し、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりクローニングを行った。クローニングに用いた
プライマーを以下に示す。
hα4Integin-5': 5'-ACGCTCGAGTGTACCATGTTCCCCACCGAGAGCGCA-3'（配列番号:11）
hα4Integin-3': 5'-TCATCTAGATTAATCATCATTGCTTTTACT-3'（配列番号:12）
hα9Integin-5': 5'-TCGAAGCTTCTGGGGATGGGCGGCCCGGCT-3'（配列番号:13）
hα9Integin-3': 5'-ACCTCTAGATCACTGGTTTTTCTGGACCCA-3'（配列番号:14）
【００５７】
上記のように、ＰＣＲ法により増幅したα４インテグリンおよびα９インテグリンそれぞれのｃＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０（アプライドバイオシステムズ）によりそれぞれの塩基配列を確認した。得られたｃＤＮＡの塩基配列は配列番号：７（マウスα９）および配列番号：８（マウスα４）、配列番号：９（ヒトα９）および配列番号：１０（ヒトα４）の塩基配列とそれぞれ一致した。これらのｃＤＮＡを動物細胞へ導入するために、ｐｃＤＮＡTM３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んだ。その結果得られたベクターをそれぞれマウスα９インテグリン／ｐｃＤＮＡ３．１、マウスα４インテグリン／ｐｃＤＮＡ３．１、ヒトα９インテグリン／ｐｃＤＮＡ３．１、ヒトα４インテグリン／ｐｃＤＮＡ３．１と命名した。
【００５８】
実施例２
［α９インテグリン、α４インテグリン恒常発現細胞株の樹立］
ハムスターに免疫するために、ハムスター卵巣由来細胞株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞にα４インテグリンｃＤＮＡを含むマウスα４インテグリン／ｐｃＤＮＡ３．１、またはマウスα９インテグリンｃＤＮＡを含むα９インテグリン／ｐｃＤＮＡ３．１を導入し、ＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲペプチドとの接着効果能によるスクリーニングで、マウスα9インテグリンを恒常的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（マウスα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞）を３クローン（６Ｆ１、１２Ｃ３、４Ｎ２）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウスα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞）を４クローン（２１Ｈ、７Ａ３、１１Ｃ３、２１Ｄ３）樹立した。
【００５９】
マウスα９インテグリンのコントロールとして同じインテグリンサブファミリーであるα４インテグリンをマウス胎児１２．５日胚からクローニングし、マウスα４インテグリンを恒常的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウスα４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞）を３クローン（３Ｇ１、４Ａ１０、１９Ｆ２）樹立した。
【００６０】
樹立したマウスα９インテグリン発現細胞のα９インテグリン発現量を定量的に解析するためにα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、α９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞から抽出したｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。その結果、図１Ａおよび図１Ｂに示すように、α９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞では２１Ｄ３が、α９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞では１２Ｃ３が最も高いα９インテグリンの発現を示した。また、α４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＦＡＣＳにてタンパク質発現量の解析を行った結果を図１Ｃに示す。４Ａ１０で最も高いマウスα４インテグリン発現上昇が見られた。
【００６１】
同様な方法で、ヒトα9インテグリンを恒常的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞）を１クローン（２０J1）、ヒトα４インテグリンを恒常的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（ヒトα４／ＣＨＯ−Ｋ１細胞）を１クローン（９A5）を樹立した。
【００６２】
実施例３
［抗α９インテグリン抗体を用いたＦＡＣＳ解析］
マウスα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞自体を抗原として用い、シリアンハムスター（７−８週齢、雌）３匹に１×１０7細胞／回／匹を合計５回免疫した。脾細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞であるＸ６３−Ａｇ８−６５３とＰＥＧ法にて細胞融合し、ＨＡＴ培地で選択した。モノクローナル抗体の産生は、細胞ＥＬＩＳＡ法にてスクリーニングを行った。免疫に使用した細胞をスクリーニングに使用するとバックグラウンドが高くなることや偽陽性が多くなることが予想されたので、マウスα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に反応し、且つ、マウスα４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に反応しないクローンを抗α９インテグリン抗体とした。限界希釈法を２回繰り返すことによりモノクローナル抗体を樹立した。その結果、抗マウスα９インテグリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞４クローン（１１Ｌ２Ｂ、１２Ｃ４’５８、１８Ｒ１８Ｄ、５５Ａ２Ｃ）を樹立した。
【００６３】
ヒトα９インテグリンに対する抗体作製は、subtractive immunization法（Williams CV, Stechmann CL, McLoon SC. Biotechniques. （1992）12:842-7.）を参考にしてBALB/cマウス３匹に対して免疫を行った。まず、CHO-K1細胞を４×１０６細胞／匹腹腔内投与し、次の日とその次の日、シクロホスファミドを4mg／匹、腹腔内投与した。シクロホスファミド投与２週間後、ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を２×１０６細胞／匹を腹腔内投与し、さらにその２週間後、ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を３×１０６細胞／匹を腹腔内投与した。ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞に反応し、且つ、ヒトα４／ＣＨＯ−Ｋ１細胞に反応しないクローンを抗α９インテグリン抗体とした。その結果、抗ヒトα９インテグリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞４クローン（1K11、21C5、24I11、25B6）を樹立した。
【００６４】
ここで得られた抗マウスα９インテグリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞１１Ｌ２Ｂは、２００４年１２月２８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９７として寄託されている。
【００６５】
ここで得られたハイブリドーマ細胞１２Ｃ４’５８は、２００４年１２月２８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９６として寄託されている。
【００６６】
ここで得られたハイブリドーマ細胞１８Ｒ１８Ｄは、２００４年１２月２８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９５として寄託されている。
【００６７】
ここで得られたハイブリドーマ細胞５５Ａ２Ｃは、２００４年１２月２８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９８として寄託されている。
【００６８】
抗マウスα９インテグリン抗体がＦＡＣＳにて使用可能かをマウスα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウスα４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて検討した。全て、細胞数は１．０×１０5個にて行い、抗体との反応は氷上にて行った。また、Ｆｃ受容体との非特異反応をブロックするために、抗ＦｃγＲＩＩ抗体（２．４Ｇ２）を添加した後に、一次抗体を添加した。２．４Ｇ２処理をしたα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、α４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞あるいは、内在性のα９インテグリンが発現するマウスメラノーマ細胞株であるＢ１６−ＢＬ６細胞に、作製した抗体（５μｇ／ｍｌ）を一次抗体として５０μｌとして添加し３０分反応させた。次にＦＩＴＣラベルした抗ハムスターＩｇＧ抗体５０μｌを添加し３０分反応後、ナイロンメッシュを通した後、ＦＡＣＳ解析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒTM（ベクトンアンドディッキンソン）にて行った。ビオチン化抗体を使用する際は、Ｆｃ受容体をブロックするために２．４Ｇ２処理をした細胞に、ビオチン化抗体（５μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加、３０分反応後、ＡＰＣラベル、あるいはＦＩＴＣラベルしたストレプトアビジンを５０μｌ添加しＦＡＣＳ解析を行った。
【００６９】
その結果、図２に示すようにすべての抗マウスα９インテグリン抗体でマウスα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＢ１６−ＢＬ６細胞上のα９インテグリンを検出することができた。またすべての抗体は、マウスα４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞には反応しなかった。これらの結果から、全ての抗マウスα９インテグリン抗体が細胞上に発現するマウスα９インテグリンタンパク質をＦＡＣＳにて検出できることがわかった。
【００７０】
実施例４
［細胞染色の検討］
免疫組織化学を行うためにマウスより種々の生体組織を摘出し、O.C.T. コンパウンド(ティシューテック)にて包埋し、液体窒素にて凍結後、コールドトーム（サクラ）にて5μm厚に薄切した。薄切した組織を一昼夜風乾した後、-20℃のアセトンにて固定し、正常ヤギ血清にて非特異反応のブロックを行った。次に抗α9インテグリン抗体クローン12C4’58をそれぞれ一次抗体として2μg/mlの濃度で室温1時間反応させ、PBSで500倍希釈したビオチン化ヤギ抗シリアンハムスターIgG抗体（ジャクソン）を二次抗体として添加し、室温で３０分反応させた。ベクターステインABCキット（ベクターラボラトリー）を用いて室温で３０分間反応後、DAB+基質キット（ダコ）を室温で１から５分間程度反応させ検出を行った。組織はその後、ヘマトキシリン（和光）による核染色を行いカバーガラスと包埋剤でマウントした。マウス脳、肝臓、肺、筋肉の染色像を図３に示す。染色像一覧（図４）に示したように、脳の脈絡叢、肺の血管内皮・平滑筋・肺胞マクロファージ、肝臓の類洞細胞、腎臓の血管内皮・平滑筋・糸球体、胃の平滑筋・粘膜筋板、筋肉の血管内皮・筋繊維芽細胞・リンパ管そして子宮の血管内皮・平滑筋・動脈平滑筋等の細胞でα9インテグリンの発現が見られた。本結果より本発明で見出された抗α9インテグリン抗体は、免疫染色に使用できることが分かり、診断薬としての有用性が期待できる。
【００７１】
実施例５
［細胞接着阻害効果の検討］
樹立した４種類の抗マウスα９インテグリン抗体が細胞接着阻害活性を有するか調べるために、ＧＲＧＤＳ、テネイシンＣ、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドとマウスα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて細胞接着阻害試験を行った。ＧＲＧＤＳペプチドに含まれるＲＧＤ配列は多くのＥＣＭに共通して存在する細胞接着部位である。テネイシンＣの細胞接着部位であるＡＥＩＤＧＩＥＬペプチドは、α９インテグリンは接着することができるが、α４インテグリンは接着することができない。ヒトＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲペプチドは、α４、α９インテグリンと接着することができる。これら３種類のペプチド固相によるマウスα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する細胞接着におけるそれぞれの抗α９インテグリン抗体の接着阻害能を検討した。
【００７２】
ＯＰＮ細胞接着領域ＳＶＶＹＧＬＲ配列（配列番号：１５）、ＧＲＧＤＳ配列（配列番号：１６）、テネイシンＣのＡＥＩＤＧＩＥＬ配列（配列番号：１７）を固相化し（１０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）、ブロッキング液（０．５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ）でブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、ＤＭＥＭ／０．２５％  ＢＳＡ培地中の予め抗体と反応させたα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞（１．０×１０5個／ｍｌ）を添加した。３７℃で１時間培養し、非接着細胞をＰＢＳで洗浄し、接着細胞は、０．５％  クリスタルバイオレット／２０％  メタノールで固定、染色し、室温３０分放置、２０％  酢酸溶液を添加することにより転溶し、接着活性は波長５９０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより定量化した。
【００７３】
その結果、図５に示すように、ＧＲＧＤＳペプチドの固相においては、α９インテグリンはＲＧＤ非依存性の接着であるので、全ての抗α９インテグリン抗体では阻害できなかった。Tenascin-C機能部位であるＡＥＩＤＧＩＥＬペプチドとOPN機能部位であるＳＶＶＹＧＬＲペプチドを固相した場合には１１Ｌ２Ｂ、１２Ｃ４’５８、５５Ａ２Ｃの３種類で顕著な細胞接着の阻害が見られた。１８Ｒ１８Ｄはほとんど阻害能を示さなかった。
次に図５で阻害効果の見られた１１Ｌ２Ｂ、１２Ｃ４’５８、５５Ａ２Ｃの３種類の阻害効果の比較を行った。ＡＥＩＤＧＩＥＬペプチドとＳＶＶＹＧＬＲペプチドの固相を５μg/mlで固定し、阻害抗体の濃度を細胞接着阻害試験にて比較検討した。図６に示すように５５A２Cが最も阻害能が高いことが分かった。50%阻害濃度(IC50)をも図６に示す。
【００７４】
実施例６
［競合阻害試験によるエピトープ解析］
実施例５の細胞接着阻害試験により、各抗α９インテグリン抗体の阻害活性に差がある結果が得られている。このことは、これらの抗体はα９インテグリン上のそれぞれ異なるエピトープを認識していることを示唆している。そこで、抗体のビオチン化を行い、競合阻害試験によるエピトープ解析を行った。ビオチン化抗体として１２Ｃ４’５８と１８Ｒ１８Ｄを用いて、当該２クローンと全クローンとのエピトープの差異を検討した。図７に示したように、両抗体とも、同一クローンによる競合では完全にビオチン化抗体の結合は阻害された。ビオチン化１８Ｒ１８Ｄを用いた際には、全クローンで阻害することができなかった。一方で１２Ｃ４’５８では５５Ａ２Ｃより一部、結合が阻害されることが分かり、１２Ｃ４’５８と５５Ａ２Ｃでは一部エピトープが重複していることが示唆された。
【００７５】
実施例７
［培養細胞株におけるα９インテグリンの発現解析］
培養細胞上でのα９インテグリン発現を調べるために、マウスメラノーマ培養細胞であるＢ１６−Ｆ１とＢ１６−Ｆ１０、Ｂ１６−ＢＬ６でＦＡＣＳ解析を行った。その結果、図８に示すように、Ｂ１６−Ｆ１、Ｂ１６−Ｆ１０、Ｂ１６−ＢＬ６全ての細胞においてα９インテグリンの発現を確認することができた。
【００７６】
またヒトの末梢血単核球において低いレベルで発現が確認されていたことから、マウス骨髄単球性白血病細胞であるＷＥＨＩ−３Ｂ細胞とマクロファージ様細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞においてＦＡＣＳ解析を行った。図９に示すように、ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞では発現を検出できなかったが、ＲＡＷ２６４．７細胞では強い発現を確認できた。
【００７７】
実施例８
［好中球におけるα９インテグリンの発現解析］
α９インテグリンはヒト好中球において高発現していることが既に報告されている。そこで、マウス好中球上におけるα９インテグリン発現を解析するために、チオグチコレート誘導腹腔細胞を回収しマウス好中球の発現解析に使用した。Ｍａｃ−１+Ｇｒ−１+の細胞を好中球とし、その細胞群におけるα９インテグリンの発現をＦＡＣＳ解析した。図１０に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、ＣＢＡ、Ｃ３Ｈ全系統マウスでα９インテグリン発現を確認することはできなかった。この結果からマウス好中球上には通常ではα９インテグリンが発現していないことが明らかとなった。
【００７８】
実施例９
［α４インテグリンとα９インテグリンの発現様式の解析］
α４インテグリンとα９インテグリンは同じインテグリンサブファミリーに属し、多くのリガンドを共有していることから、類似する機能を発揮することが示唆されている。また、マウス肝内白血球中に存在するＮＫＴ細胞が、α４とα９インテグリンを同時に発現する事がｍＲＮＡレベルの解析によって既に報告されている（ Diao H, Kon S, Iwabuchi K, Kimura C, Morimoto J, Ito D, Segawa T, Maeda M, Hamuro J, Nakayama T, Taniguchi M, Yagita H, Van Kaer L, Onoe K, Denhardt D, Rittling S, T. U. 2004. Osteopontin as a mediator of NKT cell function in T cell-mediated liver diseases. Immunity 21: 539-50））。そこで、α４インテグリンとα９インテグリンは同一細胞上に実際に発現しているのかを確認するために、マウス肝浸潤白血球を分離し両インテグリン抗体による二重染色を行った。その結果、図１１に示すように、α４インテグリンは全肝内白血球の約３９％程度が発現しており、α９インテグリンは全肝浸潤白血球の約１２％程度が発現していた。α９インテグリンはα４インテグリン発現細胞の約７４％に発現している
ことが分かった。
【００７９】
実施例１０
［ＯＰＮのＢ１６−ＢＬ６細胞との接着様式の検討］
Ｂ１６−ＢＬ６細胞をはじめ多くの細胞がα４インテグリンとα９インテグリンを同時に発現している。またα４インテグリンとα９インテグリンはＯＰＮやＶＣＡＭ−１等リガンドを共有していることから、現在臨床応用されつつあるα４インテグリン機能抑制だけでは、その機能がα９インテグリンによりレスキューされてしまうことが予想される。そこで、抗α４インテグリン抗体と抗α９インテグリン抗体の併用によるＳＶＶＹＧＬＲペプチドとＢ１６−ＢＬ６細胞との接着阻害効果の相乗効果を検討した。
【００８０】
具体的には抗α４、α９インテグリン抗体によるＢ１６−ＢＬ６細胞に対する接着阻害効果は、ＳＶＶＹＧＬＲ配列固相（５μｇ／ｍｌ）の細胞接着試験で検討した。接着の際に、培地に１ｍＭ  ＭｎＣｌ2を添加し反応させた。抗体は抗α４インテグリン抗体（クローンＲ１−２）(Pharmingen)と抗α９インテグリン抗体（クローン１１Ｌ２Ｂ）を用いて行った。抗α４インテグリン抗体のコントロール抗体として正常ラット抗体（NRG）、抗α９インテグリン抗体のコントロール抗体として正常ハムスター抗体（NHG）を使用した。阻害活性は抗体５０μｇ／ｍｌ、２種併用の際は抗体それぞれ２５μｇ／ｍｌで検討を行った。
【００８１】
その結果、図１２に示すように、抗α４インテグリン抗体と抗α９インテグリン抗体それぞれ単独では、阻害効果をほとんど見出すことができなかった。一方、抗α４インテグリン抗体と抗α９インテグリン抗体を併用した際には阻害効果を見出した。この結果は、α４インテグリン、α９インテグリンは片方のみでもＳＶＶＹＧＬＲ配列に対してほぼ完全なる細胞接着能を有することを示唆している。生体内では、α４とα９の両インテグリンを発現している細胞（好中球やＮＫＴ細胞等）が疾患発症に関わっていることが示されており、さらに、これら両インテグリンは多くのリガンドを共有することから考えると、抗α９インテグリン抗体と抗α４インテグリン抗体とを併用することにより、より効率
的に疾患治療効果を得ることができることが推察され、新たな治療法となりうる可能性を示すことができた。
【００８２】
実施例１１
［抗α９インテグリン抗体による肝炎治療効果］
これまで我々は、OPN機能阻害により肝炎が治療できることを示している（特許文献１）。そこで、抗α９インテグリン抗体クローン11L2Bおよび抗α４インテグリン抗体R1-2 (Pharmingen)を用いた治療実験を行った。肝炎はコンカナバリンA (ConA)(Vector社) を２００μg静脈内投与し、１２時間後の血中AST値、ALT値をＧＰＴ/ＡＬＴ−ＰIIIとＧＯＴ/ＡＳＴ−ＰIII（富士フイルム）を用いて測定した。抗体は、ConAを投与する３時間前に２００μｇを静脈内投与した。図１３に示すように、抗α９インテグリン抗体によりAST値、ALT値の減少が見られ、治療効果を見出すことができた。さらに、その治療効果は抗α４インテグリン抗体との併用により亢進させることができた。抗α９インテグリン抗体により肝炎治療ができることが分かった。
【００８３】
実施例１２
［腱線維芽細胞を用いた抗α９インテグリン抗体によるMMP-13の変化］
マウス膝蓋腱から、腱線維芽細胞を回収しα９インテグリンの発現をFACSと細胞染色により検討した。抗α９インテグリン抗体はクローン18R18D、抗α４インテグリン抗体はR1-2を用いた。図１４に示すように腱線維芽細胞にはα９インテグリンが発現していることが分かった。α４インテグリンは発現していなかった。
【００８４】
リコンビナント全長型OPNとトロンビン切断型OPN（それぞれ１０μg/ml）を固相し、腱線維芽細胞を４８時間培養し、MMP-13 mRNA量をリアルタイムPCRを用いて定量化した。トロンビン切断型OPNで腱線維芽細胞を刺激した際に、MMP-13の転写が促進されることが分かった（図１５）。次に抗α９インテグリン抗体55A2Cを30μg/mlになるように培養液中に添加して、MMP-13 mRNA量変化を調べた。図１６に示すように、抗α９インテグリン抗体（クローン55A2C）によりMMP-13転写量を抑制することが分かった。コントロール抗体としては、ハムスターIgGを用いた。
MMP-13はコラゲナーゼとも呼ばれ、マウスにおけるコラゲナーゼはMMP-13が代表的なMMPであるが、ヒトにおいてはMMP-1やMMP-8, MMP-13が関係している。MMP-13は関節炎（特に関節リウマチ(RA)や変形性関節症(OA)）の増悪化に強く関与することが示されている(Skotnicki JS, DiGrandi MJ, Levin JI.  Design strategies for the identification of MMP-13 and Tace inhibitors. Curr Opin Drug Discov Devel. (2003) 6:742-59. Review.)。抗α９インテグリン抗体によりMMP-13の転写が抑制できるという本知見から、抗α９インテグリン抗体を用いることにより、関節炎が治療できることが強く示唆できる。
【００８５】
実施例１３
［癌細胞株の増殖における抗α９インテグリン抗体の機能］
図２で示すように、B16-BL6はα９インテグリンが強く発現している。また、MMP-13は癌の増悪に関与している（Ala-aho R, Kahari VM. Collagenases in cancer.Biochimie. (2005) 87:273-86. Review.）という報告もある。そこで、樹立した４種類の抗マウスα９インテグリン抗体の癌細胞の細胞増殖阻害活性をを検討した。細胞培養用の96ウェルプレート（ベクトンアンドディッキンソン）にB16-BL6細胞を10% FCS/DMEMで5x104cells/mLに調製し、抗マウスα９インテグリン抗体、抗マウスα４インテグリン抗体を１０μg/mlで添加後、細胞-抗体懸濁液を100μLずつウェルに添加した。37℃、5% CO2存在下で24時間培養し、各ウェルに10μLずつセルカウンティングキット８（同仁化学研究所）を添加し、さらに37℃、5% CO2存在下で1時間培養し、O.D.450の吸光度を計測し細胞数を定量的に解析した。図１７に示すように、12C4’58が最も阻害活性が高く、35%程度B16-BL6細胞の増殖を抑制した。55A2CとR1-2も２０％程度、増殖を抑制することができた。
【００８６】
次に、より生体の条件に近い条件における細胞増殖の抑制効果を解析するために、VCAM-1を固相化し同様の検討を行った。VCAM-1はα9インテグリンのリガンドであり、VCAM-1の可溶型リコンビナントタンパクであるrhVCAM-1-Fc chimera(ロシュ)を使用した。rhVCAM-1-Fc chimera を10μg/mLで固相して使用し、0.5% BSA/PBSで非特異的反応のブロックを行った。抗体単独の場合は１０μg/mlで、併用の場合はそれぞれ５μg/mlの濃度を添加した。その後は、図１７と同じ方法で行った。その結果、図１８に示すように12C4’58抗体単独及びα4阻害抗体であるクローンR1-2単独投与では全く効果は得られないかあるいは微弱な効果しか得られなかったのに対し、12C4’58とR1-2の同時投与においては、約20%程度の顕明な細胞増殖抑制効果を示した。
【００８７】
実施例１４
［抗ヒトα９インテグリン抗体の機能解析］
抗ヒトα９インテグリン抗体がＦＡＣＳにて使用可能かをヒトα９／CHO-K1細胞、CHO-K1細胞、内在的にα９インテグリンを発現するヒト好中球を用いて検討した。ヒト好中球はFACSの方法は図２と同様な方法で行ったが、Ｆｃ受容体との非特異反応のブロックは、５０％ヤギ血清を用いて行った。二次抗体はＦＩＴＣラベルした抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。その結果、図１９に示すようにすべての抗ヒトα９インテグリン抗体はヒトα９／CHO-K1細胞とヒト好中球上のα９インテグリンを検出することができた。またすべての抗体は、ヒトα４／CHO-K1細胞には反応しなかった。これらの結果から、全ての抗ヒトα９インテグリン抗体が細胞上に発現するヒトα９インテグリンタンパク質をＦＡＣＳにて検出できることがわかった。
【００８８】
実施例１５
α９インテグリンのリガンドである、OPNとTenascin-C機能ペプチドを用いて、細胞接着試験を行った。細胞は、ヒトα９／CHO-K1細胞を用いて、各種抗α９インテグリン抗体の阻害能の検討を行った。ペプチドは5μg/mlで固相し、抗体は5μg/mlで阻害を行った。図２０に示すようにOPNに対する接着阻害試験では、クローン21C5が最も効果的な阻害活性を示した。1K11, 24I11の阻害効果は低かった。一方で、Tenascin-Cに対する接着阻害能は、Y9A2が最も効果的に阻害活性を示した。今回作製した抗α９インテグリン抗体４クローンはTenascin-Cに対してはあまり阻害活性を示さなかった。
既にヒトα９インテグリンに対する中和抗体Y9A2は報告され、Chemicon社から製品化されているが、Y9A2は、ヒトα９インテグリンを遺伝子導入したマウス線維芽細胞株L cellを通常の免疫法（腹腔内投与）で作製している。本発明の抗ヒトα９インテグリン抗体はsubtractive immunization法で作製しており、免疫方法が異なっている。さらに図１９で示すように、クローン21C5は、ヒトα９/CHO-K1細胞のFACS図の検出パターンが異なっており、また、図２０で示すように、細胞接着試験の阻害効果様式も異なっていることから、今回作製した抗α９インテグリン抗体４クローンはY9A2とはエピトープが異なっていると考えられる。
【００８９】
まとめ
マウスα９インテグリンの機能を阻害する抗体の作製と疾患・病態におけるα９インテグリンの機能を解明する目的で、マウスα９インテグリンに対する４種のモノクローナル抗体と抗ヒトα９インテグリン抗体を４種類作製した。これらの抗体を用いた研究で以下のことを明らかにすることができた。
【００９０】
（１）作製した４種の抗マウスα９インテグリン抗体は、全てＦＡＣＳ解析に利用可能であり、それぞれ異なる細胞接着阻害能を有した。
（２）抗マウスα９インテグリン抗体クローン12C4'58が免疫染色に利用できることが分かった。
（３）マクロファージ様細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞、メラノーマ細胞であるＢ１６−Ｆ１、Ｂ１６−Ｆ１０、Ｂ１６−ＢＬ６細胞でα９インテグリンは発現していた。マウス好中球ではα９インテグリン発現が観察されず、ヒトで発現が確認できたことから、好中球上のα９インテグリンの発現には種間で差があることが示された。脾細胞のＢ２２０-ＣＤ３-細胞群やＢ２２０+ＣＤ３+細胞群において、一部α９インテグリンを発現する細胞群が存在した。また肝臓浸潤白血球のα９インテグリン発現は、α４インテグリン発現細胞上に多く見られた。
（４）α９とα４インテグリンが同時に存在し、両者が認識するリガンドが存在する場合、その接着能は相補的であった。
（５）抗マウスα９インテグリン抗体により、肝炎治療効果を見出すことができ、その効果は抗マウスα４インテグリン抗体により亢進した。
（６）腱線維芽細胞上にα９インテグリンの発現していることが分かり、腱線維芽細胞をトロンビン切断型ＯＰＮで刺激すると、MMP-13発現が亢進することが分かった。そのMMP-13亢進は、抗α９インテグリン抗体で阻害がかかることが分かった。
（７）B16-BL6細胞の増殖を抗α９インテグリン抗体で抑制できることが分かった。また、VCAM-1刺激による細胞増殖は、抗α９インテグリン抗体と抗α４インテグリン抗体を同時に併用投与することにより、単独投与を比べ、増殖抑制効果が亢進した。
（８）作製した４種の抗ヒトα９インテグリン抗体は、全てＦＡＣＳ解析に利用可能であり、それぞれ異なる細胞接着阻害能を有した。また、FACSや接着阻害試験により、既存の抗ヒトα９インテグリン抗体Y9A2と異なる反応性を示したことから、エピトープが異なることが考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のモノクローナル抗体は、α９インテグリン機能抑制により、癌、例えば癌細胞の増殖、転移、そして炎症性疾患、例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、自己免疫疾患等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗α９インテグリン抗体と抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された癌、炎症性疾患の治療効果を奏する。本発明のモノクローナル抗体は、マウスα９インテグリンをも認識するので、マウスを用いた動物実験に利用できる。
【図２−２】
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【図５】
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【図７】
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【図１５】
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【図２０】
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【図１】
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【図２−１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【配列表】
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