(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的修飾が、一または複数の外来核酸分子の発現が野生型植物における対応する遺伝的修飾を受けていない植物細胞に比較してＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の活性減少を導く一または複数の外来核酸分子の存在にある、遺伝的に修飾されたトランスジェニック植物細胞であって、
少なくとも９０％のアミロペクチン含量を有し、ｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞からのでんぷんと比較して、少なくとも０．５℃低下したゼラチン化温度を有する修飾でんぷんを含み、
前記外来核酸分子が、
ａ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の発現減少をもたらす少なくとも一のアンチセンスＲＮＡをコードしているＤＮＡ分子であって、ＧＢＳＳＩ蛋白質および／またはＢＥ蛋白質をコードしている全配列、またはその部分を含むＤＮＡ分子、
ｂ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の発現減少を共抑制効果により導くＤＮＡ分子であって、ＧＢＳＳＩ蛋白質および／またはＢＥ蛋白質をコードしている全配列、またはその部分を含むＤＮＡ分子、
ｃ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の転写産物を特異的に切断する少なくとも一のリボザイムをコードしているＤＮＡ分子、および
ｄ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子に突然変異または異種配列の挿入を導くものであって、突然変異または導入が、ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ遺伝子の発現減少、または不活性なＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質の合成、をもたらすものである、インビボ突然変異誘発により導入された核酸分子、
からなる群から選択される、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２】
一または複数の外来核酸分子の存在および／または発現が、ＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の発現阻害を導くものである、請求項１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３】
該ＢＥ蛋白質がＢＥＩ蛋白質であり、前記ＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子が前記ＢＥＩ蛋白質をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４】
前記ゼラチン化温度が、ｗａｘｙ表現型対応の植物細胞からのでんぷんに比較して少なくとも１．５℃低下している、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項５】
ポテト植物細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のうちの少なくとも１項に記載のトランスジェニック植物細胞を含む、トランスジェニック植物。
【請求項７】
でんぷん貯蔵植物である、請求項６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
ポテト植物である、請求項７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
トランスジェニック植物のでんぷんが、少なくとも９０％のアミロペクチン含量と、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんと比較して少なくとも０．５℃低下したゼラチン化温度とを有するトランスジェニック植物の製造方法であって、
ａ）植物細胞が、存在および／または発現がＧＢＳＳＩの活性減少を導く請求項１で定められたような１つまたは複数の外来核酸分子の導入によって遺伝子的に修飾され、
ｂ）植物が、工程ａ）にしたがって製造された細胞から再生される、方法。
【請求項１０】
さらに、前記工程ｂ）にしたがって製造されたトランスジェニック植物から、栄養増殖または有性生殖によって、別の植物が製造される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のうちの少なくとも１項に記載された植物細胞を含有している、請求項６に記載の植物の増殖材料。
【請求項１２】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の植物細胞または請求項６〜８のうちのいずれか１項に記載の植物の製造における、ＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の酵素活性をもつ蛋白質またはその断片をコードしている一または複数の外来核酸分子の使用。
【請求項１３】
請求項１〜５のうちいずれか１項に記載された植物細胞、または請求項６〜８のうちのいずれか１項に記載された植物、または請求項１１に記載された増殖材料、からのでんぷんの抽出を含む、修飾でんぷんの製造方法。
【請求項１４】
前記でんぷんが、少なくとも９０％のアミロペクチン含量と、ｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞からのからのでんぷんと比較して少なくとも０．５℃低下したゼラチン化温度とを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記でんぷんが、少なくとも９０％のアミロペクチン含量と、ｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞からのからのでんぷんと比較して少なくとも１．５℃低下したゼラチン化温度とを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記でんぷんが、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんと比較して３０％まで増加した燐酸基含量を有する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、減少したＧＢＳＳＩ蛋白質活性および減少したＢＥ蛋白質特にＢＥＩ蛋白質活性を有するトランスジェニック植物細胞および植物、ならびにその製造のための手段および方法に関するものである。この型の植物細胞および植物は、少なくとも９０％のアミロペクチン含量をもち、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんに比較して燐酸基含量が増加し、および／またはゼラチン化温度が低下した修飾でんぷんを合成することができる。したがって、この発明はまた、この発明による植物細胞および植物が合成したでんぷんおよびこのでんぷんの製造方法にも関するものである。さらに、この発明は、少なくとも９０％のアミロペクチン含量をもち、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんに比較して燐酸基含量が増加し、および／またはゼラチン化温度が低下したでんぷんを合成する植物の製造のためのある種の核酸分子の使用に関するものである。
【０００２】
再生可能な原料源（raw material source）として植物成分に最近与えられた重要性が増大しつつあることを考慮すると、これらの植物性原料を加工工業の要求に適合させる努力をすることは、生物工学的研究の一目的をなすものである。これらの再生可能な原料をできるだけ多くの使用分野に適用可能とするためには、さらにきわめて多様な物質を入手することが必要である。
【０００３】
油、脂肪および蛋白質に加えて、多糖類は植物から得られる再生可能な原料として不可欠である。多糖類の場合、中心的位置はセルロースのほかにでんぷんによって占められるが、これは高等植物における最も重要な貯蔵物質の一つである。トウモロコシは、世界的にでんぷん製造用の最も重要な農業植物であるため、ここで最も興味ある植物の１つである。
【０００４】
多糖類であるでんぷんは、化学的に均一な基本単位であるグルコース分子から構成されるポリマーである。しかし、それは重合度およびグルコース鎖の分枝の存在に関して相違をもつ種々の形態の分子からなる複雑な混合物である。したがって、でんぷんは均一な原料ではない。区別は、特にα−１，４−グリコシド結合をしたグルコース分子の本質的に非分枝のポリマーであるアミロースでんぷんと、その部分が異なって分枝したグルコース鎖の複雑な混合物であるアミロペクチンでんぷんの間でなされる。分枝は、さらにα−１，６−グリコシド結合が存在することによって起こる。例えばトウモロコシまたはポテト類（potatoes）のようなでんぷんの製造に使用される典型的な植物では、合成されたでんぷんは約２０％−３０％のアミロースでんぷんおよび約７０％−８０％のアミロペクチンでんぷんを含んでいる。
【０００５】
でんぷんの用途を可能な限りもっとも広範にするためには、目的とする種々の用途に特に適した修飾でんぷん（modified starch）を合成できる植物が得られるようにすることが、望ましいと思われる。育種に加えて、この型の植物が得られるようにするための一つの可能性は、でんぷん産生植物のでんぷん代謝に対して遺伝子工学的方法により制御された遺伝的修飾を行うことである。
【０００６】
アミロースに対するアミロペクチンの比率は、でんぷんの生理化学的性質、したがってこれらでんぷんの特定の応用可能性に、大きな影響をもつ。これら２種の成分の分離方法は時間がかかり費用がかさむので、この型の方法はもはや大きな工業規模で使用されない（Ａ．Ｈ．ヤング、Ｓｔａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｅｄｓ．Ｒ．Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，Ｊ．  Ｎ．ＢｅＭｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｆ．Ｐａｓｃｈａｌｌ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４，２４９−２８３中）。したがって、多数の用途については、２種のポリマーの一方のみを含有するでんぷんが得られるようにすることが望ましいであろう。
【０００７】
従来、対応する野生型植物に比較して修飾されているアミロペクチン／アミロース比を有する突然変異および遺伝子工学的方法により製造された植物の両者が報告されている。例えば、ＧＢＳＳＩと略記される顆粒結合でんぷんシンターゼＩをコードしている遺伝子に突然変異がある、トウモロコシのいわゆる「ｗａｘｙ」突然変異（アカスカおよびネルソン、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１，（１９６６），２２８０−２２８５；シュアーら、Ｃｅｌｌ  ３５（１９８３），２２５−２３３）は、本質的にアミロペクチンからなるでんぷんを産生する。以下、ｗａｘｙでんぷんとは少なくとも９０％のアミロペクチン含量を有するでんぷんを意味するものと解される。
【０００８】
ポテト類の場合、そのでんぷんが本質的にアミロペクチンでんぷんからなる遺伝子型は半数体系の化学的突然変異誘発（ホーベンカンプ−ヘルメリンクら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２２５，（１９８７），２１７−２２１）およびＧＢＳＳＩ遺伝子のアンチセンス阻害の両者により製造された。対応する野生型植物からのでんぷんに比較して、この型のｗａｘｙポテト（ｐｏｔａｔｏ）でんぷんは、燐酸基含量に関して、でんぷん顆粒の形態においてまたは鉄含量において差異がない（ビッサーら、Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｅｒｋｅ，４９，（１９９７），４３８−４４３）。
【０００９】
でんぷんの機能的性質は、アミロース／アミロペクチン比に加えて、燐酸基含量、分子量、側鎖分布パターン、鉄含量、脂質および蛋白質含量などにより大きな影響を受ける。ここで引用できる重要な機能的性質の例としては、溶解度、戻り凝集性、水結合能、膜形成特性、粘度、ゼラチン化特性、安定性などがある。でんぷん顆粒の寸法もまた、種々の用途において重要なことがありうる。
【００１０】
燐酸基含量は、基本的に、遺伝子工学的手法（例えば、ＷＯ９７／１１１８８−Ａ１；サフォードら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３５，（１９９８），１５５−１６８参照）およびそれに続く化学的燐酸化（例えば、Ｓｔａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｅｄｓ．Ｒ．  Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，Ｊ．Ｎ．ＢｅＭｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｆ．Ｐａｓｃｈａｌｌ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８，３４９−３６４参照）の両者により修飾されうる。しかし、通例化学的修飾は費用および時間がかかる。
【００１１】
現在まで、ｗａｘｙ表現型対応植物（類）（細胞類）からのでんぷんに比較して燐酸基含量が増加し、および／またはゼラチン化温度が低下したｗａｘｙでんぷんを合成する植物細胞および植物の製造は可能でなかった。この型の植物細胞および植物の製造方法並びにこの型のでんぷんの製造方法は、まだ先行技術に記載されていない。
【００１２】
でんぷんの燐酸基含量はそれらの性質に影響するため、ｗａｘｙ表現型対応植物細胞および植物に比較して修飾されている構造的および／または機能的性質を有するｗａｘｙでんぷんを合成する植物細胞および植物が得られるようにすることは、望ましいことであろう。
【００１３】
したがって、この発明は、ｗａｘｙ表現型対応植物細胞および植物に比較して修飾されている構造的および／または機能的性質を有するでんぷんを合成する植物細胞および植物、並びに、他のｗｚｘｙでんぷんと構造的および／または機能的性質が異なっており、したがって目的とする一般および特定用途にさらによく適合したｗａｘｙでんぷんが得られるようにするという目的を基礎とするものである。
【００１４】
この目的は、特許請求の範囲に記載した実施態様を提供することにより達成される。
【００１５】
したがって、この発明は、遺伝的修飾が、野生型植物における対応する遺伝的修飾を受けていない植物細胞に比較して、植物細胞内に内因的に存在する一または複数のＧＢＳＳＩ蛋白質の活性減少および植物細胞内に内因的に存在する一または複数のＢＥ蛋白質の活性減少を導くものである、遺伝的に修飾されたトランスジェニック植物細胞に関するものである。
【００１６】
遺伝的修飾は、対応する野生型植物における遺伝的修飾を受けていない植物細胞に比較して、植物細胞内に存在する内因的ＧＢＳＳＩ蛋白質およびＢＥ蛋白質の活性減少を導く任意の遺伝的修飾でありうる。
【００１７】
これに関連する「トランスジェニック」の語は、この発明による植物細胞が、遺伝的修飾特に一または複数の外来核酸分子導入の結果、対応する遺伝的修飾を受けていない植物細胞と遺伝情報において異なることを意味する。
【００１８】
これに関連する「遺伝的に修飾された」の語は、一または複数の外来核酸分子の導入により植物細胞の遺伝情報が修飾されていること、および外来核酸分子の存在または発現が表現型の修飾を導くことを意味する。「表現型の修飾」は、好ましくは細胞の一または複数の機能における測定可能な修飾を意味し；この発明による植物細胞は特に少なくとも一の内因性ＧＢＳＳＩ遺伝子および少なくとも一の内因性ＢＥ遺伝子の発現減少および／または少なくとも一ＧＢＳＳＩ蛋白質および少なくとも一のＢＥ蛋白質の活性減少を示す。
【００１９】
「ＧＢＳＳＩ蛋白質」の語は、この発明の文脈中において、可溶性でんぷんシンターゼのクラスではなく、顆粒結合でんぷんシンターゼアイソフォームＩ（＝ＧＢＳＳＩ、ＥＣ２．４．１．２１）のクラスに属する任意の蛋白質を意味すると解される。この蛋白質の酵素活性が著しくまたは完全に減少した植物は、本質的にアミロース非含有のいわゆるｗａｘｙでんぷんを合成し（シュアーら、（１９８３）前掲；ホーベンカンプ−ヘルメリンクら、（１９８７）前掲；ビッサーら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２５，（１９９１），２８９−２９６）、その結果、この酵素はアミロースでんぷんの合成において決定的な役割を与えられている。ＧＢＳＳＩ蛋白質をコード化している核酸分子は、数々の植物、例えばトウモロコシ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０７９２６０，ＡＦ０７９２６１）、コムギ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＢ０１９６２２，ＡＢ０１９６２３，ＡＢ０１９６２４）、イネ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０９２４４３，ＡＦ０９２４４４，ＡＦ０３１１６２）、ポテト類（ｐｏｔａｔｏｅｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５８４５３）、オオムギ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ０７９３１，Ｘ０７９３２）について報告されている。これら既知の核酸分子の助けをかりると、当業界の熟練者は、他の生物、特に植物性生物から、標準的方法、例えば異種スクリーニング法により、対応する配列を単離することができる。
【００２０】
この発明の文脈中において、分枝酵素すなわちＢＥ蛋白質（α−１，４−グルカン：α−１，４−グルカン−６−グリコシルトランスフェラーゼ、ＥＣ．２．４．１．１８）は、α−１，４−グルカンドナーのα−１，４−結合が加水分解され、遊離したα−１，４−グルカン鎖がα−１，４−グルカンアクセプター鎖に転移し、そこでα−１，６−結合に変換される、グリコシル転移反応を触媒する蛋白質、好ましくはＢＥＩ蛋白質を意味するものと解される。
【００２１】
「ＢＥＩ蛋白質」の語は、アイソフォームＩの分枝酵素（ＢＥ）を指す。アイソフォームの指定は、スミス−ホワイトおよびプライス（スミス−ホワイトおよびプライス、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１２，（１９９４），６７−７１，ラルソンら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３７，（１９９８），５０５−５１１）が提案した命名法にしたがう。この発明に関しては、トウモロコシからの蛋白質のＢＥＩＩアイソフォーム（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０７２７２５，Ｕ６５９４８）よりもトウモロコシからのＢＥＩ蛋白質に構造的に、すなわちアミノ酸配列のレベルにおいて類似する全ての酵素（ババら、Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１（１），（１９９１），８７−９４；キムら、Ｇｅｎｅ  ２１６，（１９９８），２３３−２４３）はアイソフォームＩと指定される。ポテト（ｐｏｔａｔｏ）植物において、ＢＥＩ遺伝子は主として塊茎においておよびまれに葉において発現する（ラルソンら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７，（１９９８），５０５−５１１）。
【００２２】
ＢＥＩ蛋白質をコードしている核酸分子は、数々の植物、例えばトウモロコシ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ１１０８１，ＡＦ０７２７２４）、イネ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ１１０８２）、ポテト類（ポテトからのＢＥＩ遺伝子（蛋白質）の種々の形態が、例えばコシュノディら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２（１），１４８−１５５（１９９６）；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｙ０８７８６、コスマンら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０，（１９９１），３９−４４について報告されている）、エンドウ類（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ８００１０）について報告されている。これら既知の核酸分子の助けをかりると、当業界の熟練者は、他の生物、特に植物性生物から、標準的方法、例えば異種スクリーニング法により、対応する配列を単離することができる。
【００２３】
この発明はさらに、遺伝的修飾が、一または複数の外来核酸分子であってその存在および／または発現が野生型植物における対応する遺伝的修飾を受けていない植物細胞に比較してＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の活性減少を導くものの導入にある、遺伝的に修飾されたトランスジェニック植物細胞に関するものである。
【００２４】
ＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の活性が減少したこの発明によるこの型の植物細胞の製造は、当業界の熟練者に既知の種々の方法、例えばＧＢＳＳＩ蛋白質またはＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の発現阻害を導く方法により、達成することができる。これらには、例えば、対応するアンチセンスＲＮＡの発現、共抑制効果を仲介する分子またはベクターの提供、ＧＢＳＳＩ蛋白質またはＢＥ蛋白質をコードしている転写産物を特異的に切断させる対応構築リボザイムの発現、すなわちいわゆる「インビボ突然変異誘発」が含まれる。これらの方法は全て、植物細胞のゲノムに対する一または複数の外来核酸分子の導入に基づくものである。
【００２５】
「外来核酸分子」の語は、対応植物細胞内に天然に存在しないか、または実際の空間的配置において、植物細胞内に天然に存在しないか、もしくはそれが天然に存在しない植物細胞のゲノム部位に位置する型の、核酸分子を意味すると解される。外来核酸分子は、その組み合わせまたは特定の空間的配置が植物細胞内に天然に存在しない種々の要素からなる組換え核酸分子であるのが好ましい。
【００２６】
「外来核酸分子」は、例えば、一または複数の内因性ＧＢＳＳＩ遺伝子の発現を阻害するためおよび一または複数のＢＥ遺伝子の発現を阻害するための両方の遺伝情報を含有するか、またはその存在および／または発現が一または複数のＧＢＳＳＩ蛋白質または一または複数のＢＥ蛋白質の活性減少を導く、植物形質転換用の単一ベクターと解される、いわゆる「二重構築物」でありうる。
【００２７】
この発明の別の実施態様において、単一の特定ベクターのみでなく、複数の異なる外来核酸分子であって、これらの外来核酸分子の一つは、例えば、内因性ＧＢＳＳＩ遺伝子の発現減少をもたらす共抑制構築物であるＤＮＡ分子であり、別の外来核酸分子は、例えば、ＢＥ遺伝子の発現減少をもたらすアンチセンスＲＮＡをコードしているＤＮＡ分子であるものが、植物細胞のゲノム内に導入される。しかし、原則として、外来核酸分子の構築においては、遺伝的に修飾された植物細胞内において内因性ＧＢＳＳＩおよびＢＥ遺伝子の遺伝子発現の同時減少を導くか、またはＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の活性の同時減少を導く、アンチセンス、共抑制およびリボザイム構築物またはインビボ突然変異誘発のあらゆる組み合わせの使用が適当である。
【００２８】
ここで外来核酸分子は、植物細胞のゲノムに、同時（「共形質転換」）または連続的に、すなわち時間的にかわるがわる（「スーパー形質転換」）導入することができる。多くの外来核酸分子は結合された形（例えば、「二重構築物」）で存在することができる。
【００２９】
この発明の一実施態様において、一または複数のＧＢＳＳＩ蛋白質の活性減少および／または一または複数のＢＥ蛋白質の活性減少のため、少なくとも一のアンチセンスＲＮＡが植物細胞内で発現される。
【００３０】
このために、例えば、存在するならばフランキング配列を含めて、ＧＢＳＳＩ蛋白質および／またはＢＥ蛋白質をコードしている全配列を含むＤＮＡ分子、および、コーディング鎖の部分のみを含むＤＮＡであってこれらの部分が細胞にアンチセンス効果をもたらすに充分な長さをもつ分子を、使用することができる。一般に、適当な配列は、効果的なアンチセンス阻害について最低の長さ１５塩基対、好ましくは１００−５００塩基対であるもの、特に５００塩基対を超える長さをもつ配列である。概して、５０００塩基対より短いＤＮＡ分子、好ましくは２５００塩基対より短い配列が、このために使用される。
【００３１】
また、植物細胞内に内因的に存在しＧＢＳＳＩ蛋白質またはＢＥ蛋白質をコードしている配列に対して高度のホモロジーをもつＤＮＡ配列を使用することも、可能である。最低のホモロジーは約６５％より大であるべきである。９５ないし１００％のホモロジーをもつ配列の使用が好ましい。
【００３２】
別の実施態様において、植物細胞内におけるＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ活性の減少は共抑制効果により達成される。この方法は当業界の熟練者に既知であり、例えば、ヨルゲンセン（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９０），３４０−３４４）、ニーベルら（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７（１９９５），９１−１０３）、フラベルら（Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７（１９９５），４３−４６）、パラキおよびボーチェレット（Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９（１９９５），  １４９−１５９）、ボーチェレットら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４８（１９９５），３１１−３１７）、ドボルヌら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４３（１９９４），６１３−６２１）、に記載されている。アンチセンス技術の場合と同様に、ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質の全コーディング領域をコード化しているＤＮＡ分子、ならびにコード鎖の部分のみを含むＤＮＡ分子の両者を使用することができる。
【００３３】
また、植物細胞内に内因的に存在しＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質をコードしている配列に対して高度のホモロジーをもつＤＮＡ配列の使用も適当である。最低のホモロジーは約６５％より大であるべきである。９５ないし１００％のホモロジーをもつ配列の使用が好ましい。例えば、ポテト類からのＢＥＩ遺伝子の阻害については、ＢＥＩ蛋白質をコードするＤＮＡ配列、特にポテト類からのもの：コスマンら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０（１９９１），３９−４４）の使用が好ましい。
【００３４】
細胞内におけるある種の酵素における活性減少のためにリボザイムを発現させることは、当業界の熟練者に既知であり、例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３２１２０１に記載されている。植物細胞内におけるリボザイムの発現は、例えばフェイターら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５０（１９９６），３２９−３３８）に記載されている。
【００３５】
この発明による植物細胞内におけるＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ活性の減少は、さらに、細胞形質転換により細胞内にハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチド（「キメロプラスト」）を挿入するいわゆる「インビボ突然変異誘発」（Ｐ．Ｂ．キップら、５ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７年９月２１−２７日、シンガポールにおけるポスターセッション、Ｒ．Ａ．ディクソンおよびＣ．Ｊ．アルンツェン、「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ」アメリカ合衆国コロラド州コッパーマウンテン、キーストンシンポジアにおける会議報告、ＴＩＢＴＥＣＨ  １５，（１９９７），４４１−４４７；国際出願ＷＯ９５１５９７２−Ａ１；クレンら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２５，（１９９７），１４６２−１４６８；コール−ストラウスら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３，（１９９６），１３８６−１３８９）により達成することができる。
【００３６】
ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ成分の一部は、内因性ＧＢＳＳＩ遺伝子および／またはＢＥ遺伝子の核酸配列に相同的であるが、内因性ＧＢＳＳＩ遺伝子および／またはＢＥ遺伝子の核酸配列に比較すると突然変異をもつかまたは同種領域に包含されている異種領域を含有する。
【００３７】
ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドの相同領域および内因性核酸配列の塩基対形成、それに続く相同的組換えにより、ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ成分に含まれる突然変異または異種領域を植物細胞のゲノムに導入することができる。これは、ＧＢＳＳＩ蛋白質および／またはＢＥ蛋白質の活性減少をもたらす。さらに、当業界の熟練者には、非機能的誘導体、特にこのような蛋白質のトランス優勢突然変異の発現により、および／またはこのような蛋白質の拮抗体／阻害剤の発現により、ＧＢＳＳＩ蛋白質および／またはＢＥ蛋白質の活性を達成できることが知られている。このような蛋白質の拮抗体／阻害剤には、例えば、抗体、抗体断片または同様な結合特性をもつ分子が含まれる。例えば、細胞質ｓｃＦＶ抗体が、遺伝的に修飾したタバコ植物におけるフィトクロームＡ蛋白質の活性調節のために使用された（オウエン、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（１９９２），７９０−４；レビュー：Ｅ．フランケン、Ｕ．トイシェルおよびＲ．ハイン、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，（１９９７），４１１−４１６；ホワイトラム、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１（１９９６），２６８−２７２）。
【００３８】
したがって、この発明は、修飾を受けていない植物細胞に比較して減少した内因性ＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質活性を有し、
ａ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の発現減少をもたらす少なくとも一のアンチセンスＲＮＡの合成を導くＤＮＡ分子、
ｂ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の発現減少を共抑制効果により導くＤＮＡ分子、
ｃ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質をコードしている遺伝子の転写産物を特異的に切断する少なくとも一のリボザイムの合成を導くＤＮＡ分子、および
ｄ）インビボ突然変異誘発により、内因性ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質をコードしている少なくとも一の遺伝子に突然変異または異種核酸配列の挿入を導くものであって、突然変異または導入がＧＢＳＳＩ遺伝子および／またはＢＥ遺伝子の発現減少または不活性なＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥ蛋白質の合成をもたらす核酸分子
からなる群から選択される一または複数の外来核酸分子を含有する、トランスジェニック植物細胞に関するものである。
【００３９】
この発明の文脈中における「活性減少」の表現は、ＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の発現が減少すること、細胞内におけるＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の量が減少することおよび／または細胞内におけるＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の酵素活性が減少することを意味する。
【００４０】
発現の減少は、例えば、ＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質をコードしている転写産物の量を例えばノザンブロット分析により測定することにより定量することができる。この場合、減少は、好ましくは対応する遺伝的修飾を受けていない細胞に比較して転写産物の量が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８５％、格別特に好ましくは９５％減少することを意味する。
【００４１】
ＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の量の減少は、例えば、ウエスタンブロット分析により定量することができる。この場合、減少は、好ましくは対応する遺伝的修飾を受けていない細胞に比較してＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の量が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８５％、格別特に好ましくは９５％減少することを意味する。
【００４２】
ＧＢＳＳＩ蛋白質の酵素活性の減少は、例えば、カイパースら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６（１９９４），１７５９−１７７３に記載された方法により定量することができる。ＢＥ蛋白質の酵素活性の減少は、例えば、サフォードら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３５（１９９８），１５５−１６８に記載された方法により定量することができる。この場合、対応する遺伝的修飾を受けていない細胞に比較した酵素活性の減少は、好ましくは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８５％、格別特に好ましくは９５％減少することを意味する。
【００４３】
この発明によるトランスジェニック植物は、物理化学的性質、例えば、特にアミロース／アミロペクチン比、分枝度、平均鎖長、燐酸基含量、粘度プロフィル、でんぷん顆粒の寸法および／またはでんぷん顆粒の形態が、野生型植物が合成するでんぷんに比較して特定の使用目的に対してよりよく適合するように修飾可能な、修飾でんぷんを合成する。
【００４４】
驚くべきことに、ＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質の活性が減少した植物細胞の場合、でんぷんの組成が、少なくとも９０％のアミロペクチン含量を含むのみならず、さらにｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞に比較して増加した燐酸基含量を含むことが見出された。この増加した燐酸基含量は、でんぷんの機能的性質に対して、特定の使用目的に対してよりよく適合するように作用する。
【００４５】
この発明はまた、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９５％、格別特に好ましくは少なくとも９７％のアミロペクチン含量をもち、ｗａｘｙ表現型対応植物における植物細胞からのでんぷんに比較して燐酸基含量が増加した修飾でんぷんを含有する、トランスジェニック植物細胞に関するものである。
【００４６】
この場合、アミロペクチン含量は、ホーベンカンプ−ヘルメリンクら、（Ｐｏｔａｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１，（１９８８），２４１−２４６）がポテトでんぷんを例にとって記載した方法により定量することができる。この方法はまた、他の植物種の単離でんぷんにも適用することができる。でんぷんの単離方法は当業界の熟練者に既知である。
【００４７】
この発明に関連する「燐酸基含量が増加した」の表現は、共有結合した燐酸基の総含量および／またはこの発明の植物細胞中に合成されたでんぷんのＣ−６位燐酸基の含量が、ｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞に比較して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも７５％、特に１００％増加したことを意味する。
【００４８】
総燐酸基量またはＣ−６位燐酸基の含量は、下に述べる方法により定量することができる。
【００４９】
この発明に関連して、「ｗａｘｙ表現型対応植物」の表現は、同等な植物、好ましくは同じ原変種の植物、すなわち上記の遺伝的修飾の導入によりこの発明のトランスジェニック植物が製造された変種を意味することを意図している。さらに、ｗａｘｙ表現型植物は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９５％、格別特に好ましくは少なくとも９７％のアミロペクチン含量をもつでんぷんを合成する植物細胞を包含する。さらに、ｗａｘｙ表現型植物は、野生型植物の植物細胞に比較してＧＢＳＳＩ蛋白質の酵素活性が減少している。
【００５０】
別に実施態様において、この発明はまた、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９５％、格別特に好ましくは少なくとも９７％のアミロペクチン含量をもち、ｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞からのでんぷんに比較して燐酸基含量が増加し、および／またはｗａｘｙ表現型植物細胞または対応植物からのでんぷんに比較してゼラチン化温度が低下した、トランスジェニック植物細胞に関するものである。
【００５１】
ゼラチン化温度は、この発明の文脈において、ラピッドビスコアナライザー（ＲＶＡ）（オーストラリア国ＮＳＷ２１０２、ウオリーウッド、ニューポート・サイエンス・プロプライエタリ・リミテッド、インベストメントサポートグループ）により得られる粘度プロフィル（図１参照）から決定可能な温度Ｔを意味することを意図している。この場合、粘度プロフィルは、下に述べるプロトコルにしたがってプロットされる。ゼラチン化温度は、でんぷん顆粒の膨潤のために粘度が顕著に増加し始める温度を指す。ゼラチン化温度は、時間の関数としての粘度曲線の勾配により決定される。曲線の勾配が１．２より大であれば（該当値はＲＶＡ装置のユーザーによって特定される）、コンピュータープログラムはこの時間に測定された温度をゼラチン化温度と同定する。
【００５２】
この場合、「ゼラチン化温度が低下した」の語は、ゼラチン化温度がｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞からのでんぷんに比較して少なくとも０．５℃、好ましくは少なくとも１．５℃、特に好ましくは少なくとも３℃、格別特に好ましくは少なくとも５℃低下していることを意味する。
【００５３】
サフォードら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３５，  （１９９８），１５５−１６８）が、ポテト植物のＢＥＩ蛋白質アンチセンス阻害により生成しうる、野生型植物からのでんぷんに比較して増加した燐酸基含量が、上昇した粘性開始温度をもつでんぷんを導くことを示し得たのであるから、ｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞からのでんぷんに比較してこの発明による植物細胞のでんぷんが低下したゼラチン化温度をもつという観察結果は、特に驚くべきものである。
【００５４】
粘性開始温度は、ゼラチン化温度に関係する変数であるが、ゼラチン化温度と異なって示差走査熱量測定法（＝ＤＳＣ）に基づくものである。
【００５５】
植物宿主細胞中にＤＮＡを導入するために多数の技術が利用できる。これらの技術には、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡ、プロトプラスト融合、注入、ＤＮＡ電気穿孔法、バイオリスティック法によるＤＮＡの取り込みおよびその他の可能なものが含まれる。
【００５６】
植物細胞のアグロバクテリア（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）仲介形質転換の使用は、ＥＰ−Ａ−１２０５１６；ヘケマ、Ｔｈｅ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＯｆｆｓｅｔｄｒｕｋｋｅｒｉｊ  Ｋａｎｔｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ（１９８５），Ｃｈａｐｔｅｒ  Ｖ；フラリーら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４，１−４６およびアンら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４，（１９８５），２７７−２８７中で強力に研究され適切に記載されている。ポテト類の形質転換については、例えばローシャ−ソーサら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８，（１９８９），２９−３３参照）。
【００５７】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）をベースとするベクターによる単子葉植物の形質転換も報告されている（チャンら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２２，（１９９３），４９１−５０６；ヒエイら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６，（１９９４）２７１−２８２；デングら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ  ３３，（１９９０），２８−３４；ウイルミンクら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １１，（１９９２），７６−８０；メイら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１  ３，（１９９５），４８６−４９２；コナーおよびドミセ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１５３（１９９２），５５０−５５５；リチーら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２，（１９９３），２５２−２５６）。単子葉植物の形質転換のための別のシステムは、バイオリスティック法（ワンおよびルモー、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４，（１９９４），３７−４８；バジルら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（１９９３），１５５３−１５５８；リタラら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４、（１９９４），３１７−３２５；スペンサーら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７９，（１９９０）、６２５−６３１）、プロトプラスト形質転換、部分的浸透性細胞の電気穿孔、およびガラス繊維によるＤＮＡ取り込みによる形質転換である。特に、トウモロコシの形質転換はくり返し文献に報告されている（例えば、ＷＯ９５／０６１２８、ＥＰ０５１３８４９、ＥＰ０４６５８７５；ＥＰ２９２４３５；フロムら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８、（１９９０）、８３３−８４４；ゴードン−カムら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，（１９９０），６０３−６１８；コジールら、）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（１９９３）、１９４−２００；モロッチら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０，（１９９０），７２１−７２６参照）。
【００５８】
他の型の穀物における形質転換の成功も、例えばオオムギ（ワンおよびルモー、前掲；リタラら、前掲；クレンスら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，（１９８２），７２−７４）およびコムギ（ネーラら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５，（１９９４），２８５−２９７）について、すでに報告されている。
【００５９】
一般に、植物細胞中で活性なあらゆるプロモーターが外来核酸分子（類）の発現に適当である。この場合、プロモーターは、この発明による植物において構成的に、またはある組織においてのみ、植物発生のある時点においてのみ、もしくは外部の影響で決定される時点においてのみ、発現が起こるように選ぶことができる。植物に関しては、プロモーターは同種的でも異種的でもよい。
【００６０】
有用なプロモーターは、例えば、構成的発現に関するカリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡおよびトウモロコシのユビキチンプロモーター、ポテト類における塊茎特異的発現に関するパタチン（patatin）遺伝子プロモーターＢ３３（ローシャ−ソーサら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８，（１９８９），２３−２９）または光合成活性組織においてのみ発現が確実なプロモーター、例えば、ＳＴ−ＬＳ１プロモーター（ストックハウスら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，（１９８７），７９４３−７９４７、ストックハウスら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８，（１９８９），２４４５−２４５１）、Ｃａ／ｂプロモーター（例えばＵＳ５６５６４９６，ＵＳ５６３９９５２，バンサルら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，（１９９２），３６５４−３６５８参照）およびリブロースビス燐酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）ＳＳＵプロモーター（例えばＵＳ５０３４３２２，ＵＳ４９６２０２８参照）またはグルテリンプロモーターの内乳特異的発現に関する（ライジーら、Ｐｌａｎｔ   Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４，（１９９０）４１−５０；ゼンら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４，（１９９３），３５７−３６６；ヨシハラら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８３，（１９９６）２１３−２１８）、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ−１プロモーター（ウエルら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４，（１９８５），１３７３−１３８０）、コムギのＨＭＧプロモーター、ＵＳＰプロモーター、ファゼオリンプロモーターまたはトウモロコシのゼイン遺伝子プロモーター（ピーダーソンら、Ｃｅｌｌ  ２９，（１９８２），１０１５−１０２６；カトロッチオら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，（１９９０），８１−９３）がある。
【００６１】
外来核酸分子（類）の発現は、でんぷん貯蔵植物の器官において特に有利である。このような器官は、例えば、ポテト植物の塊茎またはトウモロコシ、コムギもしくはイネ植物の内乳である。したがって、これらの器官における発現を仲介するプロモーターが好ましい。
【００６２】
しかし、外部の影響で決定される時点においてのみ活性化されるプロモーターもまた使用することができる（例えばＷＯ９３／０７２７９−Ａ１参照）。この場合、単純な誘導を可能とする熱ショック蛋白質のプロモーターが、特に興味がありうる。例えばビビア・ファバ（Ｖｉｖｉａ  ｆａｂａ）のＵＳＰプロモーターのような種子特異的プロモーターもまた、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）およびその他の植物で種子特異的発現が保証されうる（フィードラーら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２、（１９９３）、６６９−６７９；ボイムラインら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５，（１９９１），４５９−４６７）。例えばＷＯ９１／０１３７３−Ａ１に記載されているような果実特異的プロモーターもまた使用しうる。
【００６３】
さらに、転写の正確な終結、および転写産物の安定化作用を担うポリＡ尾部を転写産物に付加する、終結配列も存在しうる。この型の構成成分は、文献（例えばギーレンら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９），２３−２９参照）に記載されており、任意に交換しうる。
【００６４】
この発明による植物細胞は、任意の意図する植物種、すなわち、単子葉植物および双子葉植物の両者に属すことができる。有用な農業植物、すなわち、食物上の目的もしくは技術特に工業上の目的で人類により栽培される植物からの植物細胞が好ましい。この発明は、好ましくは、線維形成性（例えばアマ、アサ、ワタ）、油貯蔵性（例えばナタネ、ヒマワリ、ダイズ類）、蔗糖貯蔵性（例えばテンサイ、サトウキビ、モロコシ）および蛋白質貯蔵性（例えばマメ科植物）の植物に関するものである。別の好ましい実施態様において、この発明は、飼料植物（たとえば飼料草および牧草類（アルファルファ、クローバーなど））ならびに野菜植物（たとえばトマト、レタス、チコリー）に関するものである。
【００６５】
特に好ましい実施態様において、この発明は、でんぷん貯蔵性植物（例えば、コムギ、オオムギ、オート麦類、ライ麦、ポテト類、トウモロコシ、イネ、エンドウ類、カサバ）の植物細胞に関するものであり；ポテト植物細胞が特に好ましい。
【００６６】
この発明による植物細胞は、植物全草の再生に使用することができる。
【００６７】
この発明によるトランスジェニック植物細胞の再生によって得られる植物も同様にこの発明の対象である。さらに、この発明は、上記のようなトランスジェニック植物細胞を含有する植物に関するものである。原理的に、トランスジェニック植物は、任意の意図する植物種、すなわち、単子葉植物および双子葉植物の両者の植物であることができる。それらは、有用植物、すなわち、食物上の目的もしくは技術特に工業上の目的で人類により栽培される植物であるのが好ましい。この発明は、好ましくは、線維形成性（例えばアマ、アサ、ワタ）、油貯蔵性（例えばナタネ、ヒマワリ、ダイズ類）、蔗糖貯蔵性（例えばテンサイ、サトウキビ、モロコシ）および蛋白質貯蔵性（例えばマメ科植物）の植物細胞に関するものである。
【００６８】
別の好ましい実施態様において、この発明は、飼料植物（たとえば飼料草および牧草類（アルファルファ、クローバーなど））ならびに野菜植物（たとえばトマト、レタス、チコリー）に関するものである。
【００６９】
特に好ましい実施態様において、この発明は、でんぷん貯蔵性植物（例えば、コムギ、オオムギ、オート麦類、ライ麦、ポテト類、トウモロコシ、イネ、エンドウ類、カサバ）に関するものであり；ポテト植物が特に好ましい。
【００７０】
また、この発明は、
ａ）植物細胞が、その存在および／または発現がＧＢＳＳＩ蛋白質活性をもつ蛋白質の活性減少およびＢＥ蛋白質活性をもつ蛋白質の活性減少を導く一または複数の外来核酸分子の導入により遺伝的に修飾され；
植物の製造の場合、
ｂ）植物が工程ａ）にしたがって製造した細胞から再生され；適当ならば、別の植物が工程ｂ）にしたがって製造した植物から製造される、
修飾でんぷんを合成するトランスジェニック植物細胞または植物の製造方法に関するものである。
【００７１】
また、この発明は、
ａ）植物細胞が、その存在またはその発現がＧＢＳＳＩ蛋白質の活性をもつ蛋白質の活性減少およびＢＥＩ蛋白質の活性をもつ蛋白質の活性減少を導く一または複数の外来核酸分子の導入により遺伝的に修飾され；
植物の製造の場合、
ｂ）植物が工程ａ）にしたがって製造した細胞から再生され；適当ならば、別の植物が工程ｂ）にしたがって製造した植物から製造される、
そのでんぷんが少なくとも９０％のアミロペクチン含量をもち、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんに比較して燐酸基含量が増加したトランスジェニック植物細胞または植物の製造方法に関するものである。
【００７２】
さらに、この発明は、
ａ）植物細胞が、その存在またはその発現がＧＢＳＳＩ蛋白質の活性をもつ蛋白質の活性減少およびＢＥＩ蛋白質の活性をもつ蛋白質の活性減少を導く一または複数の外来核酸分子の導入により遺伝的に修飾され；
植物の製造の場合、
ｂ）植物が工程ａ）にしたがって製造した細胞から再生され；適当ならば、別の植物が工程ｂ）にしたがって製造した植物から製造される、
そのでんぷんが少なくとも９０％のアミロペクチン含量をもち、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんに比較して燐酸基含量が増加し、および／またはゼラチン化温度Ｔが低下したトランスジェニック植物細胞または植物の製造方法に関するものである。
【００７３】
これに関連する「燐酸基含量が増加した」および「ゼラチン化温度が低下した」の表現は、すでに上で定義したのと同じである。
【００７４】
工程ａ）にしたがって導入される遺伝的修飾に関しては、この発明による植物に別の関連をもってすでに上で説明したことが適用される。
【００７５】
工程ｂ）による植物の再生は、当業界の熟練者に既知の方法によって実施することができる。
【００７６】
この発明の方法の工程ｂ）による別の植物の製造は、例えば、（例えば挿し木、塊茎による、またはカルス培養および植物全草の再生による）栄養増殖、または有性生殖により、実施することができる。この場合の有性生殖は、好ましくは、制御された方法、すなわち、ある種の性質をもつ選択した植物を互いに交配し増殖させることにより行う。もちろん、この発明の植物細胞および植物の製造について、当業界の熟練者には、上記の蛋白質の一の活性がすでに減少し、第二の蛋白質の活性を減少させるためにのみこの発明の方法により遺伝的に修飾する必要があるような、トランスジェニック植物もまた使用できることがわかる。
【００７７】
さらに、当業界に熟練者には、上記のようなスーパー形質転換が必ずしも一次形質転換体で実施するべきものではなく、有利にはすでに例えば稔性、外来遺伝子の安定な発現、半および同型接合などに関する適当な実験により試験されている、あらかじめ選択した安定なトランスジェニック植物で実施するのが好ましいことがわかる。
【００７８】
また、この発明は、この発明の方法により得ることができる植物にも関するものである。
【００７９】
また、この発明は、この発明による植物の増殖材料（reproductive material）、およびこの発明の方法により製造したトランスジェニック植物に関するものである。この場合、増殖材料の語は、栄養的または生殖的経路による子孫の産生に適当な植物成分を包含する。栄養増殖に適当なものは、例えば、挿し木、カルス培養、根茎または塊茎である。その他の増殖材料には、例えば、果実、種子、実生、プロトプラスト、細胞培養などが含まれる。増殖材料は塊茎および種子を含むのが好ましい。
【００８０】
さらに、この発明は、修飾でんぷんを合成する植物細胞または植物の製造における、ＧＢＳＳＩ蛋白質の酵素活性をもつ蛋白質およびＢＥ蛋白質の酵素活性をもつ蛋白質をコードしている一または複数の外来核酸分子の使用または該核酸分子の断片類の使用に関するものである。
【００８１】
さらに好ましい実施態様において、この発明は、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんに比較して燐酸基含量が増加し、および／またはゼラチン化温度が低下した修飾でんぷんを合成する植物の製造における、ＧＢＳＳＩ蛋白質の酵素活性をもつ蛋白質およびＢＥI蛋白質の酵素活性をもつ蛋白質をコードしている一または複数の外来核酸分子の使用または該核酸分子（類）の断片類の使用に関するものである。
【００８２】
これに関連する「断片（類）」の語は、例えば、記載された蛋白質の機能的活性部分をコードしうる、外来核酸分子（類）の一部分を意味することを意図している。また、断片はさらに、リボザイムのアンチセンスまたは共抑制ｍＲＮＡをコードすることができる。断片類の使用にあたっては、ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥもしくはＢＥＩ蛋白質の酵素活性減少を導く断片類のみを使用するように注意しなければならない。
【００８３】
別の実施態様において、この発明は、一の外来核酸分子または複数の外来核酸分子が、
ａ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥＩ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の発現減少をもたらす少なくとも一のアンチセンスＲＮＡをコードしているＤＮＡ分子、
ｂ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥＩ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の発現減少を共抑制効果により導くＤＮＡ分子、
ｃ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥＩ蛋白質をコードしている内因性遺伝子の転写産物を特異的に切断する少なくとも一のリボザイムをコードしているＤＮＡ分子、および
ｄ）ＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥＩ蛋白質をコードしている一または複数の内因性遺伝子に突然変異または異種配列の挿入を導くものであって、突然変異または導入がＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥＩ遺伝子の発現減少または不活性なＧＢＳＳＩおよび／またはＢＥＩ蛋白質の合成をもたらす、インビボ突然変異誘発により導入された核酸分子
からなる群から選択される一の分子または複数の分子である、少なくとも９０％のアミロペクチン含量をもちｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんに比較して燐酸基含量が増加し、および／またはゼラチン化温度が低下した修飾でんぷんを合成する植物の製造における、一または複数の外来核酸分子の使用に関するものである。
【００８４】
すでに上で説明したように、外来核酸分子は、植物細胞のゲノム中に、同時に、でなければ連続的に、導入することができる。この場合、外来核酸分子の同時導入は、時間および費用の節約になる：すなわち、上記この発明の方法による形質転換実験において、核酸分子（類）は、好ましくは、その存在および適当ならば発現がＧＢＳＳＩ蛋白質の活性をもつ蛋白質の活性減少およびＢＥ蛋白質好ましくはＢＥＩ蛋白質の活性をもつ蛋白質の活性減少を導く植物細胞中に導入される。したがって、またこの発明は、少なくとも一の上記のような核酸分子を含有する組成物に関するものである。植物細胞中への導入がＧＢＳＳＩ蛋白質の活性減少およびＢＥ蛋白質、好ましくはＢＥＩ蛋白質の活性をもつ蛋白質の活性減少を導くのが好ましい。この場合、この発明の組成物において、植物細胞中におけるそれぞれの存在がＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質、好ましくはＢＥＩ蛋白質の活性減少を導く核酸分子が、別個にまたは一緒に組換え核酸分子に含有されることができる。第一の場合、この発明の組成物は、例えば、その植物細胞中における同時存在が該表現型を導く二またはそれ以上の組換えベクターを含有することができる。この発明において好ましい第二の場合、組換え核酸分子は、ＧＢＳＳＩおよびＢＥ蛋白質、好ましくはＢＥＩ蛋白質の活性減少を導く遺伝子情報を含有する。例えば、このような組換え核酸分子において、植物細胞中におけるその存在がＧＢＳＳＩまたはＢＥもしくはＢＥＩ蛋白質の活性減少を導く上記の核酸分子が、キメラ遺伝子または別個の遺伝子として存在することができる。このような二重または多重構築物の数々の例が、技術文献中に記載されている。上記の組換え核酸分子は、それによって同様にこの発明の主題となる任意の意図する宿主細胞中に存在することができる。二重または多重構築物使用の別の利点は、この発明による植物細胞および植物が、例えばＰＣＲプライマーもしくはサザンブロッティングを適当に選択することにより、さらに容易に同定できることである。したがって、好ましくは、この発明の植物細胞および植物は、このような二重または多重構築物の存在により特徴づけられる。
【００８５】
その存在またはその発現が野生型植物における対応する遺伝的修飾を受けていない植物細胞に比較してＧＢＳＳＩ蛋白質およびＢＥ蛋白質、好ましくはＢＥＩ蛋白質の活性減少をもたらす一の外来核酸分子または複数の外来核酸分子の発現により、この発明のトランスジェニック植物細胞および植物は、物理化学的性質特にアミロース／アミロペクチン比および／または燐酸基含量および／またはゼラチン化特性が野生型植物が合成するでんぷんに比較して修飾されているでんぷんを合成する。
【００８６】
したがって、この発明は、この発明のトランスジェニック植物細胞、植物および増殖材料から得られうるでんぷんに関するものである。
【００８７】
さらに、この発明は、少なくとも９０％のアミロペクチン含量をもち、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんに比較して燐酸基含量が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも７５％、ｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞からのでんぷんに比較して特に少なくとも１００％増加した、でんぷんに関するものである。
【００８８】
燐酸基含量が増加したことにより、この発明のでんぷんは、従来のｗａｘｙでんぷんに比較して、その修飾された物理化学的性質のため特定の使用目的に対してよりよく適合するという利点を有する。燐酸基含量が増加したことにより、この発明のでんぷんは、従来のｗａｘｙでんぷんに比較して、続いて受けるべき化学的燐酸化は必要がないかまたは弱いものとなる。
【００８９】
この発明のでんぷんは、化学的に燐酸化されたモノ燐酸系ｗａｘｙでんぷんに比較して、構造的／機能的性質が好ましく異なっている。
【００９０】
燐酸化されたｗａｘｙでんぷんは、デザート類、珍味類および即時提供型食物分野、また特に急速冷凍製品における、あらゆる皮膜およびゲル形成がない増粘剤として、特に適当である。工業分野では、でんぷんモノ燐酸は場合により製紙で、さらにサイジング、凝集および浮遊剤としておよび洗浄剤添加物として使用される。
【００９１】
別の実施態様において、この発明はまた、少なくとも９０％のアミロペクチン含量をもち、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんに比較して燐酸基含量が少なくとも３０％増加し、および／またはゼラチン化温度Ｔが低下した、でんぷんに関するものである。
【００９２】
これに関連する「ゼラチン化温度が低下した」の語は、すでに上で定義した意味をもつことを意図する。
【００９３】
ある種の用途および工業的方法において、ゼラチン化温度が低下したことは、熱エネルギーの節約および／または方法設備の簡略化を可能にする。
【００９４】
特に好ましい実施態様において、この発明は、少なくとも９０％のアミロペクチン含量をもち、ｗａｘｙ表現型対応植物からのでんぷんに比較して燐酸基含量が少なくとも３０％増加し、および／またはゼラチン化温度Ｔが低下した、ポテト植物のでんぷんに関するものである。
【００９５】
トウモロコシ、イネまたはコムギ植物からの天然でんぷんに比較して、天然のポテトでんぷんは燐酸基含量が増加し、このことによりそれらはある種の用途にふさわしいものになる。驚くべきことに、この発明の方法を用いると、ｗａｘｙポテトでんぷんの燐酸基含量をさらに増加することができ、その結果この発明のポテトでんぷんは、対応する野生型植物からのポテトでんぷんおよび／またはｗａｘｙ表現型対応ポテト植物に比較して、燐酸基含量が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも１００％増加したものとなる。さらに、ポテトでんぷんは、穀物でんぷん（例えばコムギ、オーツ類、トウモロコシ、イネ）よりも脂質および蛋白質の含量が少ないという利点を有する。
【００９６】
この発明の別の好ましい実施態様において、ポテトでんぷんは、少なくとも９３％、特に好ましくは９５％および格別好ましくは９７％のアミロペクチン含量、および／またはｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞からのでんぷんに比較して燐酸基含量が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも１００％増加しおよび／またはｗａｘｙ表現型対応植物の植物細胞からのでんぷんに比較して少なくとも０．５℃、好ましくは少なくとも１．５℃、特に好ましくは少なくとも３℃および格別好ましくは少なくとも５℃ゼラチン化温度が低下したことを特徴とする。
【００９７】
これに関連する「燐酸基含量が増加した」および「ゼラチン化温度が低下した」の表現は、すでに上で記載したのと同じように定義される。
【００９８】
さらに、この発明は、上記のこの発明による植物（細胞）および／またはこのような植物のでんぷん貯蔵部位からのでんぷん抽出工程を含む、修飾でんぷんの製造方法に関するものである。また、このような方法は、でんぷん抽出前における栽培植物および／またはこれら植物のでんぷん貯蔵部位の収穫工程および特に好ましくはさらに収穫前におけるこの発明の植物の栽培工程を含むのが好ましい。植物からまたは植物のでんぷん貯蔵部位からのでんぷん抽出方法は、当業界における熟練者に公知である。さらに、種々の他のでんぷん貯蔵植物からのでんぷん抽出方法が、例えば、「Ｓｔａｒｃｈ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ウイスラー、ベミラーおよびパスカル編（１９９４）、第２版、アカデミック・プレスインコーポレイテッド・ロンドン・リミテッド；ＩＳＢＮ０−１２−７４６２７０−８；例えば第１２章４１２−４６８頁：トウモロコシおよびモロコシでんぷん：製造法；ワトソン；第１３章４６９−４７９頁：タピオカ、クズウコンおよびサゴでんぷん：製造法；コービシュリーおよびミラー；第１４章４７９−４９０頁：ポテトでんぷん：製造法および用途；ミッチ；第１５章４９１−５０６頁：コムギでんぷん：製造法、修飾および用途；ナイトおよびオーソン；並びに第１６章５０７−５２８頁：コメでんぷん：製造法および用途；ローマーおよびクレム；トウモロコシでんぷん参照：エクホッフら、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．７３（１９９６）５４−５７、概して工業規模におけるトウモロコシでんぷんの抽出はいわゆる湿潤粉砕法で行われる）」に記載されている。通常植物材料からのでんぷん抽出法に使用される器具は、分離機、デカンター、ハイドロサイクロン、噴霧乾燥機および流動床乾燥機である。
【００９９】
さらに、この発明は、上記この発明の方法により得ることができるでんぷんに関するものである。
【０１００】
この発明によるでんぷんは、次いで当業界の熟練者に既知の方法により修飾することができ、非修飾または修飾済の形態で食品および非食品分野の種々の用途に適当である。
【０１０１】
基本的に、でんぷんの用途の可能性は2種の大きな分野に分割される。一方の分野には、酵素的または化学的方法で得られるグルコースおよびグルカン単位を主とする、でんぷんの加水分解産物が含まれる。それらは、発酵のような別の化学的修飾および方法の出発物質として役立つ。費用低減のため、ここでは加水分解方法の簡単および安価な実施が重要でありうる。現在、それは基本的にアミログルコシダーゼを用いて酵素的に行われる。酵素の使用量を低減することによる費用削減が考えられる。でんぷんの構造の修飾、例えば顆粒の表面拡大、または分枝もしくは使用する酵素の接近を制限する立体構造の度合いが低いことによる消化の容易さがこれをもたらす。
【０１０２】
でんぷんが、その重合体としての構造のためいわゆる天然でんぷんとして使用されるその他の分野は、二種の別の使用分野に分割される。
【０１０３】
１．食品工業
でんぷんは多数の食品における古典的添加物であり、そこでは基本的に水性添加物の結合機能を果たすか、または粘度の増加もしくはその他のゲル形成性増大を起こす。重要な特徴的性質は、流動および吸収性、膨潤およびゼラチン化温度、粘度および増粘能力、でんぷんの溶解度、透明性およびゲル構造、熱、せん断および酸安定性、劣化傾向、膜形成能力、冷凍／解凍安定性、消化性、および、例えば無機または有機イオンとの複合体形成能力である。
【０１０４】
２．非食品工業
この広範な分野において、でんぷんは種々の製造方法における助剤としてまたは工業製品の添加剤として使用される。でんぷんを助剤として使用する場合、紙および板紙製造工業が特にここであげられる。ここでは、でんぷんは主として遅延（固体の保持）、填料の結合および微細材料粒子に、剛化剤としておよび脱水に役立つ。さらに、でんぷんの好ましい性質は剛性、強度、サウンド（ｓｏｕｎｄ）、グリップ（ｇｒｉｐ）、光沢、滑らかさ、結合強度および表面に利用される。
【０１０５】
２．１．紙および板紙工業
製紙法では、４種の分野すなわち外観、塗工、マス（ｍａｓｓ）および噴霧が区別される。表面処理に関連してでんぷんに要求されることは、基本的に、高い白色度、適度の粘度、高い粘度安定性、良好な膜形成性および低い塵埃生成である。塗工に使用する際、固体含有率、適度の粘度、高い結合力および高い色素親和性が重要な役割を果たす。マス（ｍａｓｓ）に対する添加剤としては、急速、均一、無損失分布、高い物理的安定性および紙のウエブ中における完全な保持が重要である。でんぷんを噴霧分野で使用する際には、適当な固体含有量、高い粘度および高い結合力が同様に重要である。
【０１０６】
２．２．接着剤工業
接着剤工業にはでんぷんの広範な使用分野があり、そこでは、用途の可能性は４種の下位分野、すなわち、純でんぷんサイズ類（sizes）としての用途、特定の化学品を用いて製造したでんぷんサイズ類における用途、合成樹脂およびポリマー分散液に対する添加剤としての用途、並びに合成接着剤の増量剤としての用途に分割することができる。でんぷんをベースとする接着剤の９０％は、ダンボール紙の製造、紙のサック、サシェットおよびバッグの製造、紙およびアルミの複合材料の製造、段ボール箱の製造並びに封筒、印紙類などのゴム糊に使用される。
【０１０７】
２．３．織物および織物の手入れ用組成物工業
補助剤および添加剤としてのでんぷんの広範な使用分野は、織物製造および織物の手入れ用組成物の分野である。織物工業では、下記４種の使用分野、すなわち、糊剤として、すなわち平坦化および編織中に作用する引張り力に対する保護のための付着性を強化するため、並びに編織中の磨耗耐性を強化するための補助剤としてのでんぷんの使用、特に漂白、染色などのような品質を損なう前処理後の織物仕上げ剤としてのでんぷん、染料の拡散防止のための染色ペースト製造用増粘剤としてのでんぷん、並びに縫い糸のワーピング剤添加物としてのでんぷんが区別できる。
【０１０８】
２．４．建築材料工業
でんぷんの第４の使用分野は、建築材料の添加剤である。一例は、プラスターボードシートの製造であり、そこでは、プラスタースラリーに混合されたでんぷんが水でゼラチン化し、プラスターシートの表面に拡散し、そこでボードをシートに結合する。さらなる使用分野は、レンダリング（rendering）と鉱物繊維（mineral fibers）に対する混合剤である。混合済みコンクリートの場合、でんぷん製品は硬化遅延のために使用される。
【０１０９】
２．５．土壌安定化
でんぷんの別の市場は、土壌安定用組成物の製造におけるその使用を提供するが、それらは、土壌を人工的に移動させる際水に対する土壌の一時的保護のために使用される。現在の知識では、でんぷんとポリマー乳液の配合製品は腐食および外皮減少作用のために今まで使用された製品と同等視されるべきものであるが、これらより著しく安価である。
【０１１０】
２．６．植物保護剤および肥料としての用途
一つの使用分野は、製剤の特定の性質を修飾するための植物保護剤におけるでんぷんの使用である。すなわち、でんぷんは、植物保護剤および肥料の湿潤を改善するため、活性化合物の計量放出のため、液体・揮発性および／または腐臭性化合物から微細結晶性・安定・成形可能物質への変換のため、非相容性化合物の混合のため、並びに分解の減少による作用持続時間の延長のために使用することができる。
【０１１１】
２．７．製薬、医薬および化粧品産業
別の使用分野は、製薬、医薬分野および化粧品産業である。製薬産業では、でんぷんは錠剤用結合剤またはカプセル剤の結合剤希釈に用いられる。さらに、でんぷんは、嚥下後液体を吸収し、短時間後に活性化合物が放出されるように膨潤するので、錠剤の崩壊剤の役をする。医療用潤滑パウダーおよび創傷パウダーは、品質がよいという理由ででんぷんをベースとしている。化粧品分野では、でんぷんは、例えば香料およびサリチル酸のようなパウダー添加剤の担体として使用される。でんぷんの比較的大きな使用分野は練り歯磨きである。
【０１１２】
２．８．炭（ｃｈａｒｃｏａｌ）およびブリケットに対するでんぷんの添加
でんぷんの一つの使用分野は、炭およびブリケットの添加剤である。炭は、でんぷんを添加して定量的に塊状にしまたは高級なブリケットにすることができ、それによりブリケットの早すぎる崩壊が防止される。バーベキュー用炭の場合、でんぷんの添加率は４ないし６％であり、カロライズ炭（ｃａｌｏｒｉｚｅｄ  ｃｈａｒｃｏａｌ）の場合、それは０．１ないし０．５％である。さらに、でんぷんは、炭およびブリケットへの添加により有害物質の放出を顕著に低減できるため、結合剤として重要になりつつある。
【０１１３】
２．９．鉱石および石炭のスラリー調製
さらに、でんぷんは、凝集剤として鉱石および石炭のスラリー調製に使用することができる。
【０１１４】
２．１０．鋳造補助剤
別の使用分野は鋳造補助剤に対する添加剤である。種々の鋳造方法において、結合剤で処理した砂から作ったコアが必要である。現在使用される結合剤は、主としてベントナイトであり、これは修飾でんぷん、通常膨潤性でんぷんで処理される。
【０１１５】
でんぷん添加の目的は、流動性の増加および接着性の改善である。さらに、膨潤性でんぷんは、冷水に分散でき、再水和でき、砂と容易に混合でき、高い水結合能力を有するというような、別の製造工学的必要性の対象となりうる。
【０１１６】
２．１１．ゴム工業における使用
ゴム工業では、でんぷんは工業的および光学的品質の改善のために使用することができる。この場合、理由となるのは、表面の光沢改善、グリップ（ｇｒｉｐ）および外観の改善（この場合、でんぷんは冷加硫の前にゴム材料のねばついたゴム状表面に散布される）およびゴムの印刷性の改善である。
【０１１７】
２．１２．代用レザーの製造
修飾でんぷんの別の市場可能性は、代用レザーの製造である。
【０１１８】
２．１３．合成ポリマーにおけるでんぷん
プラスチック領域では、次の使用分野が存在する：仕上げ工程におけるでんぷん二次製品の添加（でんぷんは単なる充填材であり、合成ポリマーとでんぷんの間に直接結合はない）またはポリマー製造におけるでんぷん二次製品の添加（でんぷんとポリマーは永続的結合を形成する）。
【０１１９】
タルクのような他の物質と異なり、純粋な充填材としてのでんぷんの使用は競合性がない（not competitive）。もしでんぷんの特異的性質が現れ、その結果最終製品の特徴的性質が顕著に変更されるなら、話が異なる。その例は、ポリエチレンのような熱可塑性プラスチックスの仕上げにおけるでんぷん製品の使用である。ここでは、でんぷんと合成ポリマーは１対１の比率で配合されて「マスターバッチ」とされ、これから種々の製品がポリエチレン顆粒を用いて常法技術により製造されうる。ポリエチレンフィルムへのでんぷん添加により、中空体の場合物質透過性の増加、水蒸気透過性の改善、静電防止性の改善、アンチブロック性の改善および水性染料による印刷特性の改善が達成される。
【０１２０】
別の可能性は、ポリウレタンフォームにおけるでんぷんの使用である。でんぷん誘導体の調整と方法技術の最適化により、合成ポリマーとこれらでんぷんの水酸基の反応を特異的に制御することが可能である。その結果、ポリウレタンフィルムがでんぷんの使用により次の特徴的性質を得るに至る：熱膨張率の低下、収縮性の減少、加圧／引張り特性の改善、水吸収率を変化しないで水蒸気透過性の増加、可燃性および引裂き密度の減少、可燃性部分の脱落欠如、ハロゲン不存在および老化減少。現在なお存在する欠点は、加圧耐性の減少および衝撃強度の減少である。
【０１２１】
一方、製品開発はもはやフィルムに限定されるものではない。ポット、プレートおよび皿のような固体プラスチック製品もまた、５０％を超えるでんぷん含量のものが製造できる。さらに、でんぷん／ポリマー混合物は生分解性が非常に高いので、高く評価される。
【０１２２】
さらに、でんぷんグラフトポリマーは、その極端な水結合能力のため極めて大きな重要性を獲得する。これらは、でんぷんの骨格と、遊離基連鎖機構の原理によりグラフトされた合成モノマーの側鎖格子をもつ製品である。今日入手できるでんぷんグラフトポリマーは、高い粘度と共に、でんぷん１ｇ当たり水１０００ｇにおよぶ優れた結合性と保持能力を特徴とする。これらのスーパー吸収剤の使用分野は近年大いに拡大されており、ダイヤパーおよびパッドのような衛生分野、並びに例えば種子被覆を含む農業領域がある。
【０１２３】
新規かつ遺伝的に修飾されたでんぷんの用途について重大なものは、一方では、構造、水含量、蛋白質含量、脂質含量、繊維含量、灰分／燐酸基含量、アミロース／アミロペクチン比、分子量分布、分枝度、粒度と形状および結晶性であり、他方では、次の特性、すなわち流動および吸収性、ゼラチン化温度、粘度、増粘力、溶解度、ゲル構造と透明性、熱・せん断および酸安定性、劣化傾向、ゲル形成性、凍結／解凍安定性、複合体形成性、ヨウ素結合性、フィルム形成性、接着力、酵素安定性、消化性および反応性を導く性質である。
【０１２４】
遺伝子工学を仲介とした、トランスジェニック植物における修飾でんぷんの製造は、一方では、化学的または物理的方法による別の修飾がそれ以上必要でないと思われるように、植物から得られるでんぷんの性質を変えることができる。他方では、遺伝子工学方法により修飾されたでんぷんは、上記使用分野のどれかに関してそれ以上の品質改善を導く別の化学的および／または物理的修飾を受けさせることができる。このような化学的および物理的修飾は原理的に既知である。特に、それらは、
・熱処理、
・酸処理、
・でんぷんエーテル、でんぷんアルキルエーテル類、Ｏ−アリルエーテル類、ヒドロキシアルキルエーテル類、Ｏ−カルボキシメチルエーテル類、Ｎ−含有でんぷんエーテル類、Ｐ−含有でんぷんエーテル類、Ｓ−含有でんぷんエーテル類の製造
・架橋でんぷんの製造
・でんぷんグラフトポリマーの製造
・酸化、および
・燐酸エステル化、硝酸エステル化、硫酸エステル化、キサンテン酸エステル化、酢酸エステル化およびクエン酸エステル化でんぷんを導くエステル化である。同様に、別の有機酸もエステル化に使用することができる。
【０１２５】
図面中：
図１はＲＶＡの性質の概略図である。
実施例において下記の方法を使用した。
【０１２６】
１．でんぷん分析法
ａ）アミロース／アミロペクチン比の定量
でんぷんを標準的方法によりポテト植物から分離し、アミロペクチンに対するアミロースの比を、ホーベンカンプ−ヘルメリンクら、（Ｐｏｔａｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１，（１９８８），２４１−２４６）が記載した方法にしたがって定量した。
【０１２７】
ｂ）燐酸基含量の定量
でんぷんにおいて、グルコース単位のＣ−２、Ｃ−３およびＣ−６位が燐酸化されうる。Ｃ−６位の燐酸基含量定量については、でんぷん１００ｍｇを０．７Ｍ−ＨＣｌ  １ｍｌ中９５℃で４時間加水分解した（ニールセンら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５、（１９９４）、１１−１１７）。０．７Ｍ−ＫＯＨで中和後、加水分解産物５０μｌを、グルコース−６−燐酸定量のため光学的酵素試験に付した。試験液（イミダゾール／ＨＣｌ  １００ｍＭ；ＭｇＣｌ2１０ｍＭ；ＮＡＤ  ０．４ｍＭ；リューコノストック・メセンテロイド（Leuconostoc mesenteroides）からのグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ２単位；３０℃）の吸収値の変化を３３４ｎｍで測定した。
【０１２８】
総燐酸基含量は、アメスら（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ＶＩＩＩ，（１９６６）１１５−１１８）の方法にしたがって定量した。
【０１２９】
でんぷん約５０ｍｇをエタノール性硝酸マグネシウム溶液３０μｌで処理し、５００℃のマッフル炉中で３時間灰化した。残渣を０．５Ｍ塩酸３００μｌで処理し、６０℃で３０分間反応させた。
【０１３０】
次いで一部を０．５Ｍ塩酸で３００μｌにし、１０％力価のアスコルビン酸１００μｌと２Ｍ硫酸中０．４２％モリブデン酸アンモニウム６００μｌの混合物に加え、４５℃で２０分間反応させた。
【０１３１】
燐酸基検量系列を標準として８２０ｎｍにおける光学的定量を行った。
【０１３２】
ｃ）ゲルの硬さの測定（テクスチャーアナライザー）
でんぷん（ＴＳ）２ｇをＨ2Ｏ（ＲＶＡ参照）２５ｍｌ中でゼラチン化し、密封容器中２５℃で２４時間保存した。試料を、ステーブルマイクロシステムズのテクスチャーアナライザーＴＡ−ＸＴ２のプローブ（円形スタンプ）下に固定し、ゲルの硬さを下記パラメーターを使用して測定した。
・試験速度：０．５ｍｍ／秒
・貫通深度：７ｍｍ
・接触面積：１１３ｍ2
・圧力：２ｇ
【０１３３】
ｄ）粘度プロフィル
でんぷん（ＴＳ）２ｇをＨ2Ｏ２５ｍｌ中にとり、ラピッドビスコアナライザー（オーストラリア国ＮＳＷ２１０２、ウオリーウッド、ニューポート・サイエンス・プロプライエタリ・リミテッド、インベストメントサポートグループ）中での分析に使用した。装置はメーカーの指示にしたがって操作した。でんぷん水溶液の粘度測定のため、でんぷんけんだく液をまず毎分１２℃の速度で５０℃から９５℃に加熱した。次いで温度を９５℃で２．５分間保持した。次に溶液を毎分１２℃の速度で９５℃から５０℃に冷却した。粘度は全時間にわたって測定した。
【０１３４】
ゼラチン化温度は、時間の関数として表した粘度曲線の勾配から測定した。曲線の勾配が１．２（この値はユーザーが特定した）より大きい場合、コンピュータープログラムはこの時点で測定した温度をゼラチン化温度とした。
【０１３５】
ｅ）グルコース、フルクトースおよびスクロースの定量
グルコース、フルクトースおよびスクロースの含量は、スティットら、（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７４、（１９８９）、５１８−５５２）が記載した方法にしたがって定量した。
【０１３６】
ｆ）アミロペクチンにおける側鎖分布の分析
長さに対応する側鎖分布は、リオイドら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３８，（１９９９），５１５−５２１が記載したようにして測定した。下記の溶出条件を選択した。
【０１３７】
時間   ０．１５Ｍ−ＮａＯＨ        ０．１５Ｍ−ＮａＯＨ中１Ｍ−ＮａＡｃ
分     ％                          ％
０     １００                      ０
５     １００                      ０
２０   ８５                        １５
３５   ７０                        ３０
４５   ６８                        ３２
６０   ０                          １００
７０   ０                          １００
７２   １００                      ０
８０   １００                      ０
【０１３８】
ｇ）粒度の測定
粒度の測定は、ドイツ連邦共和国、レッツ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツンクの「ルモゼッド」型フォトセディメントメーターを用いて実施した。
粒度分布は水溶液中で測定し、メーカーの指示にしたがい、文献例えばＨ．ピッツ、粒度測定；ＬＡＢＯ−１９８８／３，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔに基づいて実施した。
【０１３９】
ｈ）水結合能力
水結合能力の測定には、７０℃で膨潤させたでんぷんを遠心して可溶性部分を分離した後残渣を秤量した。でんぷんの水結合能力（ＷＢＡ）は、可溶性マスについて補正した当初のでんぷん重量との関係で示した。
【０１４０】
ＷＢＡ（ｇ／ｇ）＝（残渣−（当初重量−可溶性部分））／（当初重量−可溶性部分）
【０１４１】
実施例において下記のベクターを使用した。
【０１４２】
ベクターｐＢｉｎＡＲ−Ｈｙｇの詳細
プラスミドｐＢｉｎＡＲは２元ベクタープラスミドｐＢｉｎ１９（ベバン、１９８４）からの誘導体であり、下記のように構築した。
カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターにおけるヌクレオチド６９０９−７４３７を含む５２９ｂｐ長の断片を、プラスミドｐＤＨ５１（ピエトロザックら、１９８６）からＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ断片として分離し、ｐＵＣ１８のポリリンカーにおけるＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ切断部位間にライゲートした。プラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓが形成された。プラスミドｐＡＧＶ４０（ヘレラ−エストレラら、１９８３）から、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩを用いて、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（ギーレンら、１９８４）におけるＴ−ＤＮＡのオクトピンシンターゼ遺伝子（遺伝子３）ポリアデニン化シグナル（３’末端）（ヌクレオチド１１７４９−１１９３９）を含む１９２ｂｐ長の断片を分離した。ＰｖｕＩＩ切断部位にＳｐｈＩリンカーを付加後、断片をｐＵＣ１８−３５ＳのＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位間にライゲートした。これからプラスミドｐＡ７が得られた。プラスミドｐＡ７から出発して、３５ＳＲＮＡプロモーター、ｏｃｓターミネーター、および、３５ＳＲＮＡプロモーターとｏｃｓ成分間に位置するポリリンカーの部分を含むＥｃｏＲＩのＨｉｎｄＩＩＩ断片を適当に切断したｐＢＩＢ−Ｈｙｇプラスミド（ベッカー、１９９０）にライゲートした。
【０１４３】
下記の実施例は、この発明を説明するものであって、いかなる意味でもこれを限定するものではない。
【０１４４】
実施例１：ＧＢＳＳＩおよびＢＥＩ蛋白質の活性が減少したトランスジェニックポテト植物の製造
【０１４５】
ＧＢＳＳＩおよびＢＥＩ蛋白質の活性が減少したトランスジェニック植物の製造については、まず、ＧＢＳＳＩ蛋白質の活性が減少したトランスジェニック植物を製造した。この目的のため、ローシャ−ソーサら（ＥＭＢＯ  Ｊ．８，（１９８９），２３−２９）が記載したように、アグロバクテリア（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を用いてプラスミドｐＢ３３ａＧＢＳＳＩ−ＫａｎのＴ−ＤＮＡをポテト（ｐｏｔａｔｏ）植物に移入した。
【０１４６】
プラスミドｐＢ３３ａＧＢＳＳＩ−Ｋａｎの構築のため、ヌクレオチド−１５１２ないし＋１４を含むソラナム・チュベロサム（Solanum tuberosum）のパタチン（patatin）クラスＩ遺伝子Ｂ３３プロモーター領域からのＤｒａｌ／Ｄｒａｌ断片（ローシャ−ソーサら（１９８９）、上記参照）をプラスミドｐＵＣ１９（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ７７７８９）のＳｍａＩ切断部位にライゲートした。得られたプラスミドから、プロモーター断片をプラスミドｐＢｉｎ１９（ベバンら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１、（１９８３）、３６９−３８５）のポリリンカー領域にＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてライゲートした。ついで、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍＧＢＳＳＩ遺伝子のヌクレオチド＋１１８１ないし＋２５１１（ヘルベルスベルグ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｘｙ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｗａｘｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｐｏｔａｔｏｅｓ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｇｎｅ（１９８８））である３’ＥｃｏＲＩ断片を、得られたプラスミドのＥｃｏＲＩ切断部位にライゲートした。プラスミドｐＢ３３ａＧＢＳＳＩ−Ｋａｎが得られた。
形質転換後、ＧＢＳＳＩのｍＲＮＡ含量が顕著に減少しＧＢＳＳＩ蛋白質の活性が減少したトランスジェニックポテト植物の種々の系統が同定された。さらに、この型の植物は少なくとも９０％のアミロペクチン含量をもつでんぷんを合成する。
【０１４７】
これらアミロペクチン合成植物の２つの独立した系統を、プラスミドｐ３５ＳａＢＥＩ−Ｈｙｇを用いて形質転換した。このプラスミドの構築のため、ポテト（ｐｏｔａｔｏ）からのＢＥＩ酵素の部分的ｃＤＮＡを含む約３０００ｂｐ長のＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（コスマン、ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔａｔｏ，Ｄｉｓｓｅｒｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｅｒｌｉｎ，（１９９２））を平滑化し、ベクターｐＢｉｎＡＲ−Ｈｙｇ（上記参照）のＳｍａＩ切断部位に、３５Ｓプロモーターに関してアンチセンス方向に挿入した。
【０１４８】
スーパー形質転換後、確かに同一のＴ−ＤＮＡを含有するがゲノムの異なる部位に組み込まれた、ＧＢＳＳＩ活性減少とＢＥＩ−ｍＲＮＡ量の顕著な減少の両者をもつ種々の独立した系統が同定された。対応する野生型植物に比較して、ＧＢＳＳＩ蛋白質の酵素活性が好ましくは少なくとも９５％減少しＢＥＩ蛋白質の酵素活性が少なくとも９０％減少した植物を、選択した。ついで、これらの植物のでんぷんを分析した。
【０１４９】
実施例２：ＧＢＳＳＩおよびＢＥＩ活性が減少した植物のでんぷんの分析
【０１５０】
実施例１にしたがって製造したトランスジェニックポテト植物の産生するでんぷんは、例えば、野生型植物が合成するでんぷんと、燐酸基またはアミロース含量、並びにＲＶＡで測定した粘度およびゼラチン化性が異なっている。修飾でんぷんの物理化学的特徴づけの結果を表１（［表１］）に示す。
【０１５１】
【表１】
表１
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【０１５２】
凡例：
ＧＢＳＳＩ＝顆粒結合でんぷんシンターゼＩ
ＢＥＩ＝分枝酵素Ｉ
ａｓ＝アンチセンス
ＲＶＡ＝ラピッドビスコアナライザー
Ｍａｘ＝最高粘度
Ｍｉｎ＝最低粘度
Ｆｉｎ＝測定終期粘度
Ｓｅｔ＝セットバック＝ＭｉｎとＦｉｎの差
Ｔ＝ゼラチン化温度
アミロース含量を除いて、％の値は野生型（＝１００％）に対するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＲＶＡプロファイルの概略図である。
【図１】
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