(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される菌根菌生長促進物質としてのペプチドを加え、無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質および核酸物質を加えた固形培地または液体培地である培養基で、菌根菌を培養する
ことを特徴とする菌根菌培養方法。
【化１】
0004979551.tif 000008
【請求項２】
下記式（２）で表されるぺプチドを培養基に加える
ことを特徴とする請求項１記載の菌根菌培養方法。
【化２】
0004979551.tif 000009
【請求項３】
菌根菌は、アーバスキュラー菌根菌、エリコイド菌根菌および外生菌根菌のいずれかである
ことを特徴とする請求項１または２記載の菌根菌培養方法。
【請求項４】
炭素繊維を活性化させた活性炭素繊維を培養基に加える
ことを特徴とする請求項１ないし３いずれか記載の菌根菌培養方法。
【請求項５】
赤色光照射の光環境条件で、菌根菌を培養する
ことを特徴とする請求項１ないし４いずれか記載の菌根菌培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌根菌の菌糸および胞子を培養する菌根菌培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の菌根菌培養方法としては、宿主の根を用いた菌糸の培養や胞子生産方法が知られている。また、消毒した宿主の根を用いて、体外的なイン ビトロ（in vitro）において無菌状態下で菌根菌を培養することも知られている。すなわち、従来は、これら菌根菌培養方法のように、絶対共生菌である菌根菌の培養においては、宿主の根なくしては無菌状態下で純粋に菌根菌を培養して、胞子を得るまで増殖できないと考えられていた。
【０００３】
ところが、近年、フラッシュクロマトグラフィーで得たバヒアグラス根の２５質量％のメタノール溶出物を用いて、菌根菌の中でも代表的なアーバスキュラー菌根（Arbuscular Mycorrhiza：ＡＭ）菌の純粋培養が成功している（例えば、特許文献１、並びに非特許文献１および２参照）。そして、この培養方法においては、赤色光から遠赤色光までの光の照射によって、菌根菌の菌糸生長が著しく促進することも知られている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、これらの培養方法は、バヒアグラスという宿主から得た根抽出物を用いた培養基においての成功であり、バヒアグラス根の採取時期の判断が極めて重要であるとともに、胞子の生産効率が余り良くないので、実用化が容易ではない（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
ここで、菌根菌は、植物の根に共生し、宿主の植物から光合成産物を得る見返りとして、植物の養水分を促進させ、生長を旺盛にさせるとともに、病害虫や環境ストレスに対する抵抗性を植物に付与する働きを有している。このため、この菌根菌の利用としては、１）低投入で持続可能な作物生産、２）環境に優しく、安心・安全な食料生産、３）乾燥地・半乾燥地における環境緑化、などに着目されている。ところが、菌根菌は絶対共生微生物であるので、この菌の純粋培養が容易ではないと考えられていたため（例えば、非特許文献３参照）、この菌の基礎研究や応用研究が非常に制限されていた。
【特許文献１】特開平８−１９１６８５号公報
【特許文献２】特開２００３−２７４９３０号公報
【非特許文献１】石井孝昭、外４名，園芸学会，１９９５年，第６４巻，別冊１，ｐ．１９０−１９１
【非特許文献２】石井孝昭、外４名，ＩＣＯＭ４（The Fourth International Conference on Mycorrhizae），（カナダ），２００３年，ｐ．６９６
【非特許文献３】デクレエーク（Declerck S.）、外２名，イン ビトロ カルチャー オブ マイコライザス（In Vitro Culture of Mycorrhizae），（ドイツ），２００５年，ｐ．１−３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上のように、菌根菌は絶対共生微生物であることから、この菌根菌の純粋培養が容易ではないと考えられていたという問題を有している。
【０００６】
本発明は、このような点に鑑みなされたもので、菌根菌の純粋培養が容易にできる菌根菌培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１記載の菌根菌培養方法は、下記式（１）で表される菌根菌生長促進物質としてのペプチドを加え、無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質および核酸物質を加えた固形培地または液体培地である培養基で、菌根菌を培養するものである。
【０００８】
【化３】
0004979551.tif 000002
【０００９】
請求項２記載の菌根菌培養方法は、請求項１記載の菌根菌培養方法において、下記式（２）で表されるぺプチドを培養基に加えるものである。
【００１０】
【化４】
0004979551.tif 000003
【００１１】
請求項３記載の菌根菌培養方法は、請求項１または２記載の菌根菌培養方法において、菌根菌は、アーバスキュラー菌根菌、エリコイド菌根菌および外生菌根菌のいずれかであるものである。
【００１２】
請求項４記載の菌根菌培養方法は、請求項１ないし３いずれか記載の菌根菌培養方法において、炭素繊維を活性化させた活性炭素繊維を培養基に加えるものである。
【００１３】
請求項５記載の菌根菌培養方法は、請求項１ないし４いずれか記載の菌根菌培養方法において、赤色光照射の光環境条件で、菌根菌を培養するものである。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１記載の菌根菌培養方法によれば、式（１）で表される菌根菌生長促進物質としてのペプチドを加えた培養基で、菌根菌を培養することにより、純粋に菌根菌の菌糸を生長でき、この菌根菌の胞子を生産できるから、この菌根菌の純粋培養が容易にできる。
【００１５】
また、無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質および核酸物質を加えた固形培地および液体培地のいずれかの培地基とすることにより、菌根菌の菌糸の生長を旺盛にでき、胞子の形成率を向上できる。
【００１６】
請求項２記載の菌根菌培養方法によれば、請求項１記載の菌根菌培養方法の効果に加え、式（２）で表されるぺプチドを加えた培養基で、菌根菌を培養することにより、菌根菌の菌糸がより効率よく生長し、この菌根菌の胞子を生産できるから、この菌根菌の純粋培養をより効率よくできる。
【００１７】
請求項３記載の菌根菌培養方法によれば、請求項１または２記載の菌根菌培養方法の効果に加え、アーバスキュラー菌根菌、エリコイド菌根菌および外生菌根菌のいずれの菌根菌であっても、これら菌根菌の胞子を効率良く増殖できる。
【００１８】
請求項４記載の菌根菌培養方法によれば、請求項１ないし３いずれか記載の菌根菌培養方法の効果に加え、活性炭素繊維を培養基に加えることにより、菌根菌の菌糸の生長および分岐を促進できるから、この菌根菌の胞子形成率をより向上できる。
【００１９】
請求項５記載の菌根菌培養方法によれば、請求項１ないし４いずれか記載の菌根菌培養方法の効果に加え、赤色光照射の光環境条件で、菌根菌を培養することにより、この菌根菌の菌糸の生長がさらに旺盛になるから、この菌根菌の胞子形成率をより向上できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に、本発明の菌根菌培養方法の一実施の形態について説明する。
【００２１】
まず、この菌糸菌培養方法は、菌根菌が感染し得る宿主の根や根抽出物を全く用いない人工の培養基を用い、この培養基に活性炭素繊維を添加したり、光環境条件を調整したりすることによって、菌根菌の菌糸および胞子を純粋に増殖できる菌根菌の純粋培養技術である。なお、この菌根菌としては、この種の菌根菌を代表とするアーバスキュラー菌根菌（ＶＡ菌根菌）、エリコイド菌根菌および外生菌根菌のいずれかが用いられる。ただし、これらアーバスキュラー菌根菌、エリコイド菌根菌および外生菌根菌以外の菌根菌であっても用いることができる。
【００２２】
また、この菌根菌の純粋培養技術には、特別な化学物質である菌根菌生長促進物質としてのペプチドと、菌根菌の栄養素、例えば無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質および核酸物質とを添加した固形培地または液体培地のような人工の培養基を用いる。ここで、菌根菌生長促進物質としては、下記式（１）で表されるトリプトファンダイマー（Ｔｒｐ−Ｔｒｐ）であるＡＭ菌生長促進物質と、下記式（２）で表される活性分であるロイシルプロリン（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）とのような低分子のペプチドが用いられる。
【００２３】
【化５】
0004979551.tif 000004
【００２４】
【化６】
0004979551.tif 000005
【００２５】
ここで、上記式（１）で表されるトリプトファンダイマーは、ＡＭ菌の菌糸生長を促進させる作用を有するとともに、この菌糸を引きつけるシグナル物質である。また、上記式（２）で表されるロイシルプロリンは、ＡＭ菌の菌糸生長を促進させる作用を有しており、トリプトファンダイマーの補助剤としての作用を有している。
【００２６】
次いで、活性炭素繊維（Activated Carbon Fiber：ＡＣＦ）は、通常の炭素繊維を活性化させたものであり、菌根菌生長促進物質が添加された固形培地または液体培地に添加されて、これら固形培地または液体培地にて培養させる菌根菌の菌糸の生長および分岐を促進させ、この菌根菌の胞子形成率を向上させる。
【００２７】
さらに、この菌根菌の培養期間中に調整する光環境条件としては、暗黒または赤色光照射がある。そして、赤色光照射としては、赤色発光ダイオード（ｒｅｄＬＥＤ）を用いた光照射（５μＥｍ−２Ｓ−１）が好ましい。ここで、この菌根菌は、暗黒条件下でも菌糸が生長して胞子を形成するが、赤色光照射条件下ではより菌糸の生長が旺盛になり、胞子の形成率がより高まる。
【００２８】
次に、上記一実施の形態の菌根菌培養方法にて用いるトリプトファンダイマーおよびロイシルプロリンの抽出方法について説明する。
【００２９】
まず、原料としてバヒアグラスの根または、この根の滲出物を用い、これらバヒアグラスの根または、この根の滲出物からメタノール溶出物を濾過する。
【００３０】
この後、この濾過にて得られたメタノール溶出物を減圧濃縮してからフラッシュクロマトグラフィー装置を用いて分画して、菌根菌の生長を促進するペプチドが含まれる２５質量％メタノール溶出分画を得る。ここで、フラッシュクロマトグラフィーとは、カラムクロマトグラフィーの一種であって、圧縮空気などの加圧された条件下で試料を分離する方法である。
【００３１】
次いで、この２５質量％メタノール溶出分画を、ロトファーと呼ばれる等電点遊動装置で精製して精製液を得る。ここで、等電点遊動とは、等電点の違いを利用して目的とする精製液を分離して精製する方法である。さらに、等電点遊動にて精製された精製液を高速液体クロマトグラフィーで活性を有する部分を分離して取り分け、ニンヒドリン反応液によってペプチドが検出された部分を単離する。
【００３２】
この後、この単離された部分を、タンパク質やペプチドのアミノ酸配列（シーケンス）を決定する装置であるアミノ酸シーケンサー、または核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance：ＮＭＲ）装置にて活性のあるペプチドを同定する。この結果、この部分に含まれているペプチドが、トリプトファンダイマーおよびロイシルプロリンであることを確認できる。なお、この部分に含まれているトリプトファンダイマーおよびロイシルプロリン以外のペプチドについては、微量なため同定することが容易ではない。
【００３３】
上述したように、上記一実施の形態によれば、菌根菌が感染し得る宿主の根や根抽出物を全く用いない特別な化学物質であるトリプトファンダイマーおよびロイシルプロリンをそれぞれ含む人工の培養基内で、菌根菌を培養することにより、純粋にこの菌根菌の菌糸を旺盛に生長させることができる。よって、植物の根や根抽出物を全く用いなくても、この菌根菌の胞子を効率良く増殖できるから、この菌根菌の胞子を効率良く多量に生産でき、この菌根菌の菌糸および胞子の純粋培養が容易にできる。
【００３４】
このとき、この培養基に無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質および核酸物質を添加して、ペプチドの固形培地または液体培地とすることにより、この培養基での菌根菌の生長をより良好にできる。
【００３５】
さらに、この培養基に活性炭素繊維を添加することにより、菌根菌の菌糸の生長や分岐をさらに促進できる。また、この菌根菌の培養期間中に赤色光照射して光環境条件を調整することによって、この菌根菌の菌糸の生長がさらに旺盛になり、この菌根菌の胞子の生産がさらに促進されるから、この胞子の生産をさらに安定化できる。なお、この菌根菌としては、アーバスキュラー菌根菌を用いた場合に、特に顕著に純粋培養の効果を得ることができる。
【実施例１】
【００３６】
まず、実施例１として、本発明の菌根菌培養方法を用いた純粋培養技術による新しいＡＭ菌胞子生産について説明する。
【００３７】
この実施例１での実験には、表１に示す基本培養液（Base Media：ＢＭ）に、トリプトファンダイマーおよびロイシルプロリンのそれぞれを１０ｐｐｍ加えたゲルライト（１．５質量％）固形培地を用いた。
【００３８】
【表１】
0004979551.tif 000006
【００３９】
また、この培地のみの他に、ＡＣＦを加えて利用した場合や、ｒｅｄＬＥＤにて光照射（５μＥｍ−２Ｓ−１）した場合、およびこれらＡＣＦとｒｅｄＬＥＤとを併用した場合それぞれの効果についても確認した。ここで、この培地を用いて菌根菌としてのＡＭ菌の培養温度を２５℃とした。また、このＡＭ菌としては、主としてギガスポラ・アルビダ（Gigaspora albida）、グロムス・エツニカタム（Glomus etunicatum）およびグロムス・カレドニウム（Glomus caledonium）を用いた。これらＡＭ菌の胞子の表面は、消毒剤で充分に殺菌した。なお、糸状菌の培養に広く用いられているポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）を比較のため用いた。そして、これら培地を用いたＡＭ菌の培養を開始した後に、これらＡＭ菌の菌糸生長や新しく形成された胞子を赤色光下で観察した。
【００４０】
この結果、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）上において暗黒条件で菌根菌を培養したところ（ＰＤＡ＋暗黒区）、いずれの菌根菌においても菌糸生長や胞子形成を全く確認できなかった。また、表１に示す基本培養液(ＢＭ)上において暗黒条件で菌根菌を培養した場合では（ＢＭ＋暗黒区）、いずれの菌根菌の菌糸生長も良好であったが、胞子形成が全く確認できなかった。
【００４１】
これに対して、表１に示す基本培養液にトリプトファンダイマーおよびロイシルプロリンをそれぞれ加えた培地上おいて暗黒条件で菌根菌を培養した場合では（ＢＭ＋ペプチド＋暗黒区）、いずれの菌根菌の菌糸生長が促進されており、これら菌根菌の胞子形成を確認できた。この傾向は、培地へのＡＣＦの添加や、ｒｅｄＬＥＤによる赤色光照射によって促進された。
【００４２】
特に、表１に示す基本培養液にトリプトファンダイマーおよびロイシルプロリンをそれぞれ加えるとともにＡＣＦを入れた培地上にｒｅｄＬＥＤにて赤色光照射した条件で菌根菌を培養した場合では（ＢＭ＋ペプチド＋ＡＣＦ＋ｒｅｄＬＥＤ）、表２に示すように、いずれの菌根菌でも菌糸生長が著しく促進され、新しい胞子の形成がさらに高まっていることを確認できた。
【００４３】
【表２】
0004979551.tif 000007
【００４４】
また、この（ＢＭ＋ペプチド＋ＡＣＦ＋ｒｅｄＬＥＤ）処理区では、図１に示すように、培養２週間後でさえも１個の母胞子から数個の新しい胞子が得られた。ここで、この図１中の△印は、母胞子から発芽した菌糸から新しく形成されたＡＭ菌（グロムス・カレドニウム）の胞子である。
【００４５】
さらに、この（ＢＭ＋ペプチド＋ＡＣＦ＋ｒｅｄＬＥＤ）処理区では、培養１か月後には、図２に示すように、新しく形成されたＡＭ菌胞子は母胞子とほとんど変わらない大きさとなった。なお、この図２中の△印は、母胞子から新しく形成され、この母胞子とほとんど変わらない大きさのＡＭ菌（グロムス・カレドニウム）の胞子である。
【００４６】
なお、このＡＭ菌の菌糸の生長は、青色発光ダイオード（ｂｌｕｅＬＥＤ）を用いた１０μＥｍ−２Ｓ−１以上の光照射で抑制される。
【実施例２】
【００４７】
次に、実施例２として、実施例１での菌根菌培養方法にて生産されたＡＭ菌胞子の感染性について説明する。
【００４８】
この実施例２での実験には、バーミキュライトを入れた２号プラスチックポットに、養成したバヒアグラスの幼苗を移植して用いた。そして、実施例１での純粋培養にてグロムス・カレドニウム（Glomus caledonium）の母胞子を植付けてから１か月後に、新しく形成された胞子（直径５０μｍ〜８０μｍ）を含むゲルライト培地から、この母胞子を取り除いた後に、直径約１ｃｍのゲルライト切片となるように切り取り、このゲルライト切片に含まれている新しく形成されたＡＭ菌の胞子や菌糸をバヒアグラスの根に接触させて接種した。
【００４９】
この接種から１か月後に、バヒアグラスの根を採取し、このバヒアグラスに接種させたＡＭ菌の菌根形成状態を、フィリップスおよびハイマン（Phillips, J.M. and Hayman, D.S.），トランザクションズ オブ ザ ブリティッシュ マイコロジカル ソサイエティ（Transactions of the British Mycological Society），（英国），１９７０年，５５巻，ｐ．１５８−１６１に記載の方法で染色した。
【００５０】
この後、この染色したＡＭ菌の菌根形成状態を、石井および門屋（Ishii, T. and Kadoya, K.），ジャーナル オブ ザ ジャパニーズ ソサエティ フォー ホーティカルチャラル サイエンス（Journal of the Japanese Society for Horticultural Science），１９９４年，６３巻，ｐ．５２９−５３５に記載の方法で確認した。
【００５１】
さらに、この実験は、側面および天井面がガラスにて覆われたガラスハウスの内部で行い、他の胞子の混入を防ぐためにバヒアグラスを移植したポットをそれぞれ隔離した。そして、この実験の期間中は、十分に潅水し、移植２週間後と移植３週間後とのそれぞれにリン濃度を１／２に減らしたホーグランド溶液１０ｍｌを用いて施肥した。
【００５２】
この結果、図３に示すように、実施例１の純粋培養にて生産されたＡＭ菌（グロムス・カレドニウム）の胞子を含むゲルライト切片で接種したバヒアグラスの根の周辺に多数の菌糸が確認でき、このバヒアグラスの根の内部には、のう状体や胞子の形成が数多く確認できた。
【実施例３】
【００５３】
次に、実施例３として、実施例１での菌根菌培養方法にて生産されたＡＭ菌胞子の継代培養について説明する。
【００５４】
この実施例３の実験では、実施例１で用いた培養液に核酸物質を加えた液体培地に、適度な大きさのＡＣＦを入れ、新しく形成されたグロムス・カレドニウム（Glomus caledonium）の胞子（直径約８０μｍ）を植菌した。この後、この液体培地を、ｒｅｄＬＥＤ（５μＥｍ−２Ｓ−１）照射下で、９０ｒｐｍで振とうし、３週間後にＣＣＤカメラを用いて観察した。
【００５５】
この結果、図４に示すように、この液体培地に加えたＡＣＦ上に、新しく形成された胞子から伸長した菌糸が確認でき、この菌糸の先端に３世代目のグロムス・カレドニウム（Glomus caledonium）の胞子が形成されていた。この胞子の大きさは、約６０μｍで黄白色であった。
【００５６】
以上の結果、菌根菌が感染し得る宿主の根や根抽出物を全く用いなくても、無機養分、ビタミン類、糖類、リン脂質、核酸物質を添加した人工の培養基に、ある種のペプチドであるトリプトファンダイマーおよびロイシルプロリンを添加することによって、この菌根菌の菌糸を増殖させて、この菌糸菌の胞子を純粋に多量に生産できる。
【００５７】
さらに、この菌根菌の人工の培養基への活性炭素繊維の添加や、この菌根菌の培養期間中での赤色光照射は、この菌根菌の菌糸の生長や胞子の形成をさらに向上させる上で非常に有効である。また、この純粋培養によって生産された菌根菌の胞子は、培養１か月という短期間で成熟して、植物に感染できる能力を有しているとともに、新しく形成された２世代目の胞子からの継代培養も可能である。
【００５８】
よって、この菌根菌の純粋培養技術の確立は、培養が困難であるために制限されてきた菌根菌と植物との共生メカニズムを解明する糸口となるだけでなく、この菌根菌の胞子を純粋に安定的に大量生産できるという重要な意味を有している。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の菌根菌培養方法を用いて培養されたアーバスキュラー菌根菌の胞子を示すＣＣＤカメラ画像写真であり、（ａ）は培養２週間後を示し、（ｂ）は培養１か月後を示す。
【図２】同上菌根菌培養方法で母胞子から培養されたアーバスキュラー菌根菌の胞子を示す光学顕微鏡写真である。
【図３】同上菌根菌培養方法で培養されたグロムス・カレドニウム（Glomus caledonium）の胞子によるバヒアグラスにおける菌根形成を示す光学顕微鏡写真である。
【図４】同上菌根菌培養方法で活性炭素繊維上に培養された３世代目のグロムス・カレドニウムの胞子を示すＣＣＤカメラ画像写真である。
【図１】
0004979551.tif 000010
【図２】
0004979551.tif 000011
【図３】
0004979551.tif 000012
【図４】
0004979551.tif 000013