(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸結合性固相を有する抽出カラムを用いて、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引し、上記抽出カラム内の液面を光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出し、核酸を上記核酸結合性固相に結合し、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出し、上記核酸結合性固相から非特異的な結合物を除去し、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出し、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項２】
核酸結合性固相を有する抽出カラムを用いて、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引し、上記抽出カラム内の液面を超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出し、核酸を上記核酸結合性固相に結合し、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出し、上記核酸結合性固相から非特異的な結合物を除去し、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出し、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項３】
核酸結合性固相を有する抽出カラムを用いて、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引し、上記抽出カラム内の液面を画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出し、核酸を上記核酸結合性固相に結合し、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出し、上記核酸結合性固相から非特異的な結合物を除去し、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引し、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出し、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項４】
請求項１、２、３のうちのいずれか一項記載の核酸抽出方法において、上記洗浄液は、第１洗浄液と第２洗浄液からなり、第１洗浄液で上記核酸結合性固相から除去できなかった非特異的な結合物を、第２洗浄液で除去することを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項５】
核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、
核酸結合性固相を有する抽出カラムと、
上記抽出カラムに溶液を吸引させ、吐出させる吸引吐出手段と、
上記抽出カラム内の液面を検出することにより、上記抽出カラム内の一定量の溶液が残留しているか否かを検出する光センサと、
上記吸引吐出手段の動作を制御し、上記残量検出手段からの検出信号に基づいて、上記吸引吐出手段の吐出動作を停止させる制御手段と、
を備え、上記制御手段は上記吸引吐出手段の動作を制御して、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記光センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出させ、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出装置。
【請求項６】
核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、
核酸結合性固相を有する抽出カラムと、
上記抽出カラムに溶液を吸引させ、吐出させる吸引吐出手段と、
上記抽出カラム内の液面を検出することにより、上記抽出カラム内の一定量の溶液が残留しているか否かを検出する超音波センサと、
上記吸引吐出手段の動作を制御し、上記残量検出手段からの検出信号に基づいて、上記吸引吐出手段の吐出動作を停止させる制御手段と、
を備え、上記制御手段は上記吸引吐出手段の動作を制御して、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記超音波センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出させ、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出装置。
【請求項７】
核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、
核酸結合性固相を有する抽出カラムと、
上記抽出カラムに溶液を吸引させ、吐出させる吸引吐出手段と、
上記抽出カラム内の液面を検出することにより、上記抽出カラム内の一定量の溶液が残留しているか否かを検出する画像センサと、
上記吸引吐出手段の動作を制御し、上記残量検出手段からの検出信号に基づいて、上記吸引吐出手段の吐出動作を停止させる制御手段と、
を備え、上記制御手段は上記吸引吐出手段の動作を制御して、
上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記核酸含有液体試料が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に洗浄液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記洗浄液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出させ、
上記抽出カラム内に溶出液を吸引させ、上記抽出カラム内の液面を上記画像センサを用いて検出することにより上記抽出カラム内に上記溶出液が一定量残留していることを判断し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出させ、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させることを特徴とする核酸抽出装置。
【請求項８】
請求項５、６、７のうちのいずれか一項記載の核酸抽出装置において、上記洗浄液は、第１洗浄液と第２洗浄液からなり、上記制御手段は、第１洗浄液で上記核酸結合性固相から除去できなかった非特異的な結合物を、第２洗浄液で除去させることを特徴とする核酸抽出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を含有する試料から核酸を抽出するための核酸抽出方法及び核酸抽出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝情報を担う物質である核酸の分析は、学術研究や医療等の多岐の分野で実施されている。核酸の分析方法としては、主に、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等の核酸増幅技術を利用されることが多い。ここで、ＰＣＲとは核酸を塩基配列特異的に増幅する方法であり、極微量の目的遺伝子の検出や定量が可能である。
【０００３】
ＰＣＲ等の核酸分析においては生物試料等から抽出した核酸を用いるが、この核酸抽出では分析反応に対する阻害物質、例えば、分析結果に擬陽性をもたらすような外部環境に由来する核酸等を含むコンタミネーション物質の影響を排除する必要がある。
【０００４】
生物試料等から核酸を抽出する方法としては、フェノールやクロロホルム等の毒劇物を使用し、エタノール沈殿等の操作を行う従来方法があるが、近年では、カオトロピック物質の存在下でシリカ含有核酸結合性固相等に核酸が結合する性質を利用する方法や、特許文献１に記載されるようなカオトロピック物質と水溶性有機溶媒の存在下でアセチルセルロース等の有機高分子に核酸が結合する性質を利用する方法がより一般的となっている。
【０００５】
特許文献１に記載される方法は、アセチルセルロース等の有機高分子を核酸結合用の部材として備える抽出カートリッジに核酸を含有する溶液を投入し、加圧によって核酸結合用部材を通して溶液を排出し、核酸を核酸結合用部材に結合させる方法である。
【０００６】
この際、溶液全量が排出された直後の抽出カラム内部の圧力変化を解析し、圧力開放弁を作動させて抽出カラム内部の加圧エアーを放出することにより、残留加圧エアーによるミスト状の排出液飛散を抑止してコンタミネーション発生リスクを軽減させている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２０４５７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述の特許文献１に記載される方法のように、溶液全量が排出された直後の抽出カラム内部の圧力変化を検出する場合は、溶液全量が排出される直後に発生するミスト状や液滴状の排出液の飛散を完全に抑止することはできない。
【０００９】
特に、生体試料や界面活性剤等を含むような溶液の場合は、溶液の粘性が大きいため、大きい圧力を印加して溶液を通液させる必要があり、溶液全量排出後の残圧も大きい。また、溶液全量が排出される際に気泡が生成されることもあり、この気泡生成過程においては抽出カラム内部の圧力変化を検出し難い。
【００１０】
従って、残圧により気泡が破裂してミスト状や液滴状の排出液が飛散し、或いは、残圧により成長した気泡が抽出カラムの排出口周辺に付着し、コンタミネーション発生の原因となり得る。
【００１１】
本発明の目的は、飛散による排出液の抽出カラム排出口周辺への付着等を防止可能な核酸抽出方法及び核酸抽出装置の実現に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため、本発明は次のように構成される。
【００１３】
核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引し、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出し、核酸を上記核酸結合性固相に結合し、上記抽出カラム内に洗浄液を吸引し、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出し、上記核酸結合性固相から非特異的な結合物を除去し、上記抽出カラム内に溶出液を吸引し、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出し、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させる。
【００１４】
また、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、核酸結合性固相を有する抽出カラムと、上記抽出カラムに溶液を吸引させ、吐出させる吸引吐出手段と、上記抽出カラム内の一定量の溶液が残留しているか否かを検出する残量検出手段と、上記吸引吐出手段の動作を制御し、上記残量検出手段からの検出信号に基づいて、上記吸引吐出手段の吐出動作を停止させる制御手段とを備える。そして、上記制御手段は上記吸引吐出手段の動作を制御して、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を吸引させ、上記抽出カラム内に核酸含有液体試料を一定量残留させて上記核酸含有試料を上記抽出カラムから吐出させ、上記抽出カラム内に洗浄液を吸引させ、上記抽出カラム内に上記洗浄液を一定量残留させて上記洗浄液及び非特異的な結合物を上記抽出カラムから吐出させ、上記抽出カラム内に溶出液を吸引させ、上記抽出カラム内に上記溶出液を一定量残留させて上記溶出液及び目的の核酸を上記抽出カラムから吐出させ、目的の核酸を上記核酸結合性固相から溶出させる。
【発明の効果】
【００１５】
溶液全量が排出される直後に発生するミスト状や液滴状の排出液の飛散、或いは、気泡破裂による排出液の飛散による抽出カラム排出口周辺への付着等を防止可能な核酸抽出方法及び核酸抽出装置を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について添付図面を参照して説明する。
【００１７】
図１は、本発明の一実施形態である核酸抽出方法の概略動作フローチャートである。この核酸抽出方法は、核酸結合工程（Ａ）と、第１洗浄工程（Ｂ）と、第２洗浄工程（Ｃ）と、核酸溶出工程（Ｄ）とを備えている。
【００１８】
核酸結合工程（Ａ）では、核酸含有試料に結合試薬を添加した混合液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して混合液を核酸結合性固相内部を通して排出し、抽出カラム内部の残留液量が所定量となったことを検知し、加圧を解除する（ステップ１００〜１０５）。
【００１９】
第１洗浄工程（Ｂ）では、第1洗浄液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して、洗浄液を核酸結合性固相内部に通して排出し、抽出カラム内部の残留液量が所定量となったことを検知し、加圧を解除する（ステップ１０６〜１１０）。
【００２０】
第２洗浄工程（Ｃ）では、第２洗浄液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して洗浄液を核酸結合性固相内部に通して排出し、抽出カラム内部の残留液量が所定量となったことを検知、加圧を解除し、残留液を除去する（ステップ１１１〜１１６）。
【００２１】
第１洗浄工程（Ｂ）及び第２洗浄工程（Ｃ）は、核酸結合性固相に目的とする核酸のみ残し、他の核酸は除去する工程である。
【００２２】
核酸溶出工程（Ｄ）では、溶出液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して洗浄液を核酸結合性固相内部に通して排出し、抽出カラム内部の残留液量が所定量となったことを検知し、加圧を解除し、核酸結合性固相の目的核酸を排出して核酸溶液を得る（ステップ１１７〜１２２）。
【００２３】
核酸含有試料としては、例えば、全血、血漿、血清、尿、唾液、喀痰、精液等の体液、動植物の組織や細胞、微生物、細菌、ウイルス等、及びそれらの懸濁物、或いは溶解物が使用できる。
【００２４】
また、結合試薬としては、核酸含有試料中の核酸を遊離化し、且つ核酸と核酸結合性固相の結合を促進し得るものであり、各種のカオトロピック塩が使用できる。カオトロピック塩としては、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等を使用できる。
【００２５】
また、核酸の遊離化を促進する為に界面活性剤やタンパク質分解酵素等が使用できる。界面活性剤としては非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート等が使用できる。
【００２６】
また、核酸含有試料に内在、或いは外部環境に由来する核酸分解酵素を不活性化する為に、２−メルカプトエタノールやジチオトレイトール等の還元剤やエチレンジアミン四酢酸塩等の金属キレート剤が使用できる。
【００２７】
また、核酸の遊離化を促進するために、加温、攪拌、ホモジナイズ、超音波等の処理を併用することができる。また、核酸と核酸結合性固相の結合を促進する為に有機溶媒を使用できる。有機溶媒としては水溶性有機溶媒が好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、乳酸エチル等が使用できる。
【００２８】
図２は、本発明の一実施形態において使用する核酸結合性固相を備える抽出カラム３５の説明図である。
【００２９】
図２において、抽出カラム３５は、溶液を投入する開口部２１、加圧機構を接続する接続部２２、及び溶液を排出する為の開口部２３が形成された配管部２６を備え、配管部２６の内部に、保持部材２５により固定された核酸結合性固相２４が配置されている。
【００３０】
核酸結合性固相２４としては、例えば、ガラス、シリカ、ケイソウ土等、或いは、アセチルセルロース等を含有する固相であり、連続する複数の通液孔を有して通液可能であり、通液の際に溶液との十分な接触効率を得られるように、微細且つ緊密なフィルター状の構造であるものが使用できる。
【００３１】
保持部材２５は、核酸結合性固相２４の形状や設置位置を維持することができ、且つ、連続する複数の通液孔を有し通液可能である部材が使用でき、例えばプリプロピレン粒子の焼結体等が使用できる。
【００３２】
図３は、溶液を投入した抽出カラム３５の内部を加圧し、溶液を核酸結合性固相２４内部に通して排出する為の加圧機構の説明図である。
【００３３】
図３において、加圧機構は、抽出カラム３５内部を加圧する為のシリンジ３１と、プランジャ３２と、このプランジャ３２を上下駆動するためのプランジャ駆動用モータ３３と、シリンジ３１及びプランジャ３２を上下駆動させるためのシリンジ駆動用モータ３４と、シリンジ３１と抽出カラム３５とのシール部材３６と、抽出カラム保持スタンド３７と、廃液受容器３８と、廃液受容器保持スタンド３９とを備える。
【００３４】
上記加圧機構においては、プランジャ３２とシリンジ３１とを上方へ移動させ、抽出カラム３５と廃液受容器３８を各保持スタンドに設置する。そして、抽出カラム３５内部に所定の溶液を投入し、シリンジ３１を下方へ移動させ、シール部材３６を介してシリンジ３１と抽出カラム３５を密着させる。さらに、プランジャ３２を下方へ移動させ、抽出カラム３５内部を加圧し、抽出カラム３５内部の溶液を核酸結合性固相２４内部に通して廃液受容器３８に排出する。
【００３５】
抽出カラム３５の核酸結合性固相２４の通液孔は、微細且つ緊密な構造であり、試料と結合液の混合液のような粘性の大きい溶液に対しては通液抵抗が大きく、通液処理を効率的に行う為には大きな圧力をかける必要がある。
【００３６】
しかし、大きな加圧力の負荷により溶液を通液させた場合は、溶液全量を排出する直後の残圧が大きく、ミスト状や液滴状の排出液の飛散、或いは気泡破裂による排出液の飛散、或いは気泡の抽出カラム排出口２３周辺への付着、等が発生し得る。
【００３７】
従って、所定量の残留液量を検知して、溶液全量を排出する直前に加圧を解除して、溶液排出を停止させることにより、上記コンタミネーションの発生リスクを排除することが必要となる。
【００３８】
溶液の排出過程において、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となったことを検知する方法としては、溶液に対して非接触による方法が好ましく、光センサ、圧力センサ、画像センサ、或いは、超音波センサ等の各種センサを利用する方法がある。
【００３９】
光センサを利用する方法としては、抽出カラム外側の、検知すべき液面位置に光センサの光源部と受光部とを設置し、検知すべき液面位置を液面が通過することにより変化する光学的特性を測定して液面を検知する方法がある。液面の通過に伴う光学特性の変化とは溶液と空気の屈折率差異に基づくものである。
【００４０】
例えば、液面が液面センサの上部にあって抽出カラム３５内部に溶液が在る場合は、抽出カラム３５の屈折率と溶液の屈折率とが小さい為、ある入射角にて入射した光は抽出カラム３５と溶液を透過する。一方、液面が液面センサの下部にあって抽出カラム３５内部に溶液が無い場合は、抽出カラム３５の屈折率と空気の屈折率が大きい為、上記の入射角にて入射した光は抽出カラム３５内面にて全反射、或いは抽出カラム３５内部に溶液が在る場合の透過光と異なる光線路で抽出カラムと溶液を透過する。
【００４１】
図４は、光センサ４１を用いて液面検知する場合の加圧ユニットの説明図である。図４において、光センサ４１を用いた加圧ユニットは、液面検知のための光センサ４１の光源部と全反射光を受光するための受光部とを抽出カラム３５の側面において残留液量約１０ｕｌの液面を検知し得る位置に設置する。
【００４２】
なお、光センサ４１の光源部は入射光が抽出カラム３５と、この抽出カラム３５内部の空気との界面において全反射し、且つ、抽出カラム３５と抽出カラム３５内部の溶液との界面において溶液へ入射するように配置する。光センサ４１の受光部は、上記の全反射光を受光し得るように配置され、核酸結合性固相２４の上部に固定する。液面検知センサは制御部４０を介してシリンジ駆動用モータ３４に連絡されており、液面が所定位置に到達するとシリンジ３１が上方に駆動される。
【００４３】
次に、光センサ４１を用いた加圧ユニットの動作プロトコルを説明する。
【００４４】
まず、加圧ユニットに抽出カラム３５と廃液受容器３８を設置する。そして、２００ｕｌ試料と８００ｕｌ結合液の混合液を抽出カラムに投入し、加圧ユニットを起動する。シリンジ３１が下方へ駆動され、シール材３６を介して抽出カラム３５に密着させられる。そして、プランジャ３２が下方へ駆動され、シリンジ初期容積５ｍｌの空気相が１ｍｌに圧縮される（加圧動作）。以上の動作は、図１のステップ１００〜１０３の動作に対応する。
【００４５】
続いて、抽出カラム３５内部の混合液の残留量が所定量（例えば、１０ｕｌ）となったか否かが検知され、なっていなければ加圧動作が継続される（ステップ１０４）。残留量が１０ｕｌとなると、シリンジ３１が上方へ駆動され、抽出カラム３５との接続が解除されて、プランジャ３２が上方へ駆動される（ステップ１０５）。
【００４６】
次に、１２００ｕｌの第１洗浄液を抽出カラム３５に投入する（ステップ１０６、１０７）。シリンジ３１が下方へ駆動され、シール材３６を介して抽出カラム３５に密着させられる。プランジャ３２が下方へ駆動され、シリンジ初期容積５ｍｌの空気相が１ｍｌに圧縮される（ステップ１０８）。抽出カラム３５内部の洗浄液の残留量が所定量（例えば、１０ｕｌ）となったか否かが検知され、なっていなければ加圧動作が継続される（ステップ１０９）。残留量が１０ｕｌとなると、シリンジ３１が上方へ駆動され、抽出カラム３５との接続が解除されて、プランジャ３２が上方へ駆動される（ステップ１１０）。
【００４７】
次に、１２００ｕｌの第２洗浄液を抽出カラム３５に投入する（ステップ１１１、１１２）。シリンジ３１が下方へ駆動され、シール材３６を介して抽出カラム３５に密着させられる。プランジャ３２が下方へ駆動され、シリンジ初期容積５ｍｌの空気相が１ｍｌに圧縮される（ステップ１１３）。抽出カラム３５内部の洗浄液の残留量が所定量（例えば、１０ｕｌ）となったか否かが検知され、なっていなければ加圧動作が継続される（ステップ１１４）。残留量が１０ｕｌとなると、シリンジ３１が上方へ駆動され、抽出カラム３５との接続が解除されて、プランジャ３２が上方へ駆動される（ステップ１１５）。
【００４８】
再度、ステップ１１１〜１１５が実行される。そして、抽出カラム３５を取り外し、抽出カラム３５を６５℃で５分間加温して、残留洗浄液を揮発させて除去する（ステップ１１６）。
【００４９】
次に、廃液受容器３８を取り外して廃棄し、精製液受容器を設置し、抽出カラム３５を再度設置する。そして、１１０ｕｌ溶出液を抽出カラム３５に投入する（ステップ１１７、１１８）。
【００５０】
そして、プランジャ３２が下方へ駆動され、シリンジ３１の初期容積２ｍｌの空気相が１ｍｌに圧縮される（ステップ１１９）。抽出カラム３５内部の洗浄液の残留量が所定量（例えば、１０ｕｌ）となったか否かが検知され、なっていなければ加圧動作が継続される（ステップ１２０）。残留量が１０ｕｌとなると、シリンジ３１が上方へ駆動され、抽出カラム３５との接続が解除されて、プランジャ３２が上方へ駆動される（ステップ１２１）。そして、精製液受容器に約１００ｕｌの溶出液が得られる（ステップ１２２）。
【００５１】
なお、上述した溶液の排出過程において、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となったことを検知して加圧を解除する方法としては、以下の方法がある。
【００５２】
つまり、光センサ４１とシリンジ上下駆動用モータ３４とを連絡する制御部４０によってシリンジ３１を上方に移動させて抽出カラム３５との接続を断って抽出カラム３５内部の圧力を解除する方法がある。
【００５３】
また、光センサ４１とプランジャ上下駆動用モータ３３とを連絡する制御部４０によってプランジャ３２を上方に移動させて抽出カラム３５内部の圧力を解除する方法もある。
【００５４】
また、シリンジ３１内部と連絡した電磁弁を設置して、その電磁弁を開放する方法等がある。或いは、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となる前に加圧を段階的に低減し、所定量となったところで加圧を完全に解除することもできる。
【００５５】
残留液量が所定量となる前に加圧を段階的に低減し、所定量となった際に加圧を完全に解除する方法としては、残留液量が所定量となる液面、及びその上部の液面を検知し得る少なくとも１箇所以上に設置した光センサ４１により液面の降下を段階的に検知して、プランジャ３２を上方に移動させて抽出カラム３５内部の圧力を段階的に低減し、残留液量が所定量となったところで抽出カラム３５内部の圧力を完全に解除する方法がある。
【００５６】
なお、第１洗浄液としては、核酸と核酸結合性固相の結合を維持して、タンパク質等の非特異的な結合物を除去し得るものであり、結合液において用いることができるカオトロピック塩、界面活性剤、還元剤、金属キレート剤、有機溶媒等を含む溶液が使用できる。
【００５７】
また、第２洗浄液としては、核酸と核酸結合性固相との結合を維持して、第１洗浄液で除去しきれなかった非特異的な結合物と第１洗浄液の残留成分を除去し、且つ、次工程の溶出液に持ち越されて後段の分析反応を阻害しない水準まで除去可能なものであり、エタノールやアセトン等の揮発性を有する有機溶媒等を含有する溶液が使用できる。第２洗浄液の残液を除去する方法としては、抽出カラム３５を加温して残留洗浄液を揮発させる方法が使用できる。
【００５８】
また、溶出液としては、核酸を核酸結合性固相から溶離し、且つ、後段の分析反応を阻害する成分を含有しないものであり、核酸分解酵素を含有しない純水、或いは低塩濃度緩衝液等が使用できる。なお、核酸の溶離を促進する為に溶出液を加温することができる。
【００５９】
次に、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となったことを検知する方法として、圧力センサを利用する方法を説明する。
【００６０】
この方法は、シリンジ３１内部と接続した圧力センサにより、シリンジ３１及び抽出カラム３５内部の圧力を測定して残留液量を算出する方法である。加圧時のシリンジ３１、及び抽出カラム３５内部の圧力は、プランジャ３２の初期位置と移動量、及び溶液の初期容量と残留液量に従って決定される。例えば、プランジャ３２の初期位置と溶液の初期容量を一定量とした場合、残留溶液量は、抽出カラム３５内部の圧力とプランジャ駆動用モータ３３の駆動量に従うプランジャ移動量から算出できる。
【００６１】
図５は、圧力センサを用いて液面検知する場合の加圧ユニットの説明図である。図５において、加圧ユニットは、上述の図３に示す加圧機構において、残留液量検知のための圧力センサ５１を設置したものを使用する。
【００６２】
圧力センサ５１は、シリンジ３１の内部との連絡通路を介してシリンジ下部側面と接続される。圧力値、プランジャ３２の初期位置、及びプランジャ３２の移動量から残留液量が算出される。なお、圧力センサ５１は制御部４０を介してプランジャ駆動用モータ３３とシリンジ駆動用モータ３４に連絡されており、残残留液量が約１０ｕｌに対応する圧力値に達するとシリンジ３１が上方に駆動される。
【００６３】
なお、上述した溶液の排出過程において、抽出カラム３５内部の残留液量が所定量となったことを検知して加圧を解除する方法としては、光センサを用いる場合において説明した方法の他に、次のものがある。
【００６４】
つまり、圧力センサ５１により抽出カラム３５内部の圧力を測定して残留液量を算出し、残留液量が所定量に達する前に、プランジャ３２を上方に移動させて抽出カラム３５内部の圧力を段階的に低減し、残留液量が所定量となったところで抽出カラム内部の圧力を完全に解除する方法、或いは、画像センサにより残留液量を検知し、残留液量が所定量に達する前に、プランジャを上方に移動させて抽出カラム３５内部の圧力を段階的に低減し、残留液量が所定量となったところで抽出カラム３５内部の圧力を完全に解除する方法がある。
【００６５】
また、加圧センサ５１を用いた加圧ユニットの動作プロトコルについては、光センサ４１を用いた加圧ユニットの動作プロトコルにおいて、加圧動作の停止判断が、液面を検知するか、圧力を検知するかの点のみ相違し、他の動作は互いに同様となるので、詳細な説明は省略する。
【００６６】
なお、図１に示したステップ１２２以降の処理である抽出後の核酸を対象とする後段の分析反応としては、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-Polymerase  Chain Reaction）、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）、  ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）等の核酸増幅、逆転写反応、核酸伸長反応、制限酵素等の酵素反応、或いは電気泳動等の核酸分析が適用できる。
【００６７】
次に、本発明の一実施形態において行なった検証実験にて使用した試料、試薬、装置及び方法ついて説明する。
【００６８】
試料は、ＨＢＶ陽性血清からの精製ＤＮＡを陰性血清に添加した擬似陽性検体（１０３ｃｏｐｙ／２００μｌ）を使用した。
【００６９】
試薬は、結合試薬、６Ｍ  グアニジン塩酸塩、１００ｍＭ  ＭＥＳ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、２０％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを使用した。
【００７０】
第１洗浄液は、２．５Ｍ  グアニジンチオシアン酸塩、１００ｍＭ  ＭＥＳ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１％（ｖ／ｖ）  ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを使用した。
【００７１】
第２洗浄液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、８０％（ｖ／ｖ）  ＥｔＯＨを使用した。
【００７２】
溶出液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）を使用した。
【００７３】
抽出カラムは、図２に示す抽出カラム３５において、抽出カラム３５の内部容量を２ｍｌ、抽出カラム３５の材質をポリプロピレン、核酸含有核酸結合性固相を平均粒子保持径０．７μｍのガラス繊維濾紙、保持部材を平均粒子保持径約１００μｍのポリプロピレン粒子焼結体としたものを使用した。
【００７４】
核酸分析方法は、ＰＣＲを使用した。ＨＢＶ  由来ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとするＰＣＲは、（J.Clin.Microbiol.,29(9),1804-1811(1991)）の報告に基づいて下記条件においてＰＣＲを実施した。
【００７５】
Ｐｒｉｍｅｒ  １：  ５’ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＧＣ    ３’
Ｐｒｉｍｅｒ  ２：  ５’ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＧＧ    ３’
温度条件：９４℃（５ｍｉｎ）→９４℃（１ｍｉｎ）→５５℃（１ｍｉｎ）→７２℃（１ｍｉｎ）→７２℃（１０ｍｉｎ）、ただし、（９４℃（１ｍｉｎ）→５５℃（１ｍｉｎ）→７２℃（１ｍｉｎ））は、３０サイクル行なった。
【００７６】
ＬＡＭＰ：ＨＢＶ  由来ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとするＬＡＭＰは、（Nucleic Acid Research,28(12),e63(2000)）の報告に基づいて下記条件においてＬＡＭＰを実施した。
【００７７】
Ｐｒｉｍｅｒ  ＦＩＰ：５’ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＡＣＧ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  Ｔ  ３’
Ｐｒｉｍｅｒ  ＢＩＰ：５’ＧＡＴ  ＡＡＡ  ＡＣＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＡ  ３’
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ３：５’ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  Ａ  ３’
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂ３：５’ＣＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＡＣ  ３’
温度条件：９５℃（５ｍｉｎ）→Ｏｎ  ｉｃｅ（３ｍｉｎ）→Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添加→６５℃（１ｈ）→８０℃（１０ｍｉｎ）
増幅産物の確認：０．８％アガロースゲルを支持体とする電気泳動を実施し、２本鎖ＤＮＡに特異的に結合する蛍光色素で染色し、紫外線照射下において確認した。
【００７８】
実験と結果：上述の試料から、各種試薬、加圧ユニットＡ（光センサによる液量検知）及びその動作プロトコルを用いてＤＮＡ抽出を実施して得た溶出液１０ｕｌを用いてＰＣＲを実施し、また、同様に加圧ユニットＢ（圧力センサによる液量検知）及びその動作プロトコルを用いてＤＮＡ抽出を実施して得た溶出液１０ｕｌを用いてＬＡＭＰを実施し、各々の増幅産物を確認した。
【００７９】
この結果、双方とも良好な増幅産物が得られたことから正常な核酸抽出が行われ、後段の分析反応への適性を有することが実証された。そして、加圧による溶液排出工程においては、溶液全量が排出される前に加圧が解除され、溶液全量が排出される直後に発生するミスト状や液滴状の排出液の飛散、或いは、気泡破裂による排出液の飛散、或いは、気泡の抽出カラム排出口周辺への付着は発生しないことが確認された。
【００８０】
したがって、本発明によれば、飛散による排出液の抽出カラム排出口周辺への付着等を防止可能な核酸抽出方法及び核酸抽出装置の実現することができる。
【００８１】
なお、光センサを用いて、液面検知する場合、光センサを鉛直方向に２つ配置し、上方に配置された光センサが液面を検知してから、下方に配置された光センサが液面を検知するまでの時間と距離とにより、液面の降下速度を算出し、所定の液量となる時刻を予測して、加圧解除を行なうように制御することもできる。シリンジ３６又はプランジャ３２は、移動停止指令を受けてから、実際に動作停止するまでにタイムラグがあると考えられるが、液面の降下速度を算出し、所定の液量となる時刻を予測して制御するようにすれば、上記タイムラグを考慮して、シリンジ３６又はプランジャ３２の動作停止を行なうことができる。
【００８２】
また、光センサに代えて超音波センサを用いて、液面検知することができるが、超音波センサを用いる場合は、超音波発生素子と超音波検出素子とを互いに対向して、抽出カラムに配置し、超音波発生素子と超音波検出素子との間に溶液が存在するか否かにより、超音波検出素子の検出レベルが異なることを利用して液面の位置を検知することができる。
【００８３】
また、画像センサを用いて、液面検知を行なうことができるが、画像センサにより得られた画像を画像処理することにより液面を検知することができる。この画像処理は、制御部４０により行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明の一実施形態における核酸抽出方法の概略動作フローチャートである。
【図２】本発明の一実施形態において使用する核酸結合性固相を備える抽出カラムの説明図である。
【図３】本発明の一実施形態において使用する抽出カラムの加圧機構説明図である。
【図４】本発明の一実施形態において使用する抽出カラムの液面検出ユニットの一例を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態において使用する抽出カラムの液面検出ユニットの他の例を示す図である。
【符号の説明】
【００８５】
２１・・・溶液投入開口部、２２・・・加圧機構接続部、２３・・・溶液排出開口部、２４・・・核酸結合性固相、２５・・・保持部材、３１・・・シリンジ、３２・・・プランジャ、３３・・プランジャ駆動用モータ、３４・・・シリンジ駆動用モータ、３５・・・抽出カラム、３６・・・シール部材、３７・・・抽出カラム保持スタンド、３８・・・廃液受容器、３９・・・廃液受容器保持スタンド、４０・・・制御部、４１・・・光センサ、５１・・・圧力センサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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