(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料から電気泳動によってアルカリホスファターゼアイソザイムを分離する方法において、電気泳動用支持体の表面全体をレクチンに含浸させることなく電気泳動用支持体の所定の局在化ゾーンにレクチンの溶液を付着させた後に、分析される生物学的試料に含まれるＡＬＰアイソザイムと前記レクチンが相互作用する条件下で、電気泳動を電気泳動用支持体に対して実施し、ここで、レクチン溶液の付着が、骨画分とからと肝臓画分とから構成されるＡＬＰアイソザイムを分離させるのに適した条件下でなされることを特徴とする方法。
【請求項２】
生物学的試料から電気泳動によってアルカリホスファターゼアイソザイムを分離する方法において、電気泳動用支持体の第一の局在化ゾーンにレクチンの溶液を付着させ、前記第一の局在化ゾーンとは隔てられた第二の局在化ゾーンに生物学的試料を付着させた後に、分析される生物学的試料に含まれるＡＬＰアイソザイムと前記レクチンが相互作用する条件下で、電気泳動を電気泳動用支持体に対して実施し、ここで、レクチン溶液の付着が、骨画分とからと肝臓画分とから構成されるＡＬＰアイソザイムを分離させるのに適した条件下でなされることを特徴とする方法。
【請求項３】
電気泳動によってアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アイソザイムを分離する請求項１又は２に記載の方法において、
−  分離されるＡＬＰアイソザイムを含む生物学的試料を電気泳動用支持体に付着させ；
−  試料に含まれるＡＬＰアイソザイムと相互作用可能なレクチンの溶液を電気泳動用支持体に付着させ；
−  電場を印加して、骨及び肝臓ＡＬＰ画分の差次的分離が可能になる条件下でＡＬＰアイソザイムを移動させて電気泳動分離を行い；
−  分離されたＡＬＰアイソザイムを明らかにする；
こをと含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
ＡＬＰアイソザイムの電気泳動による分離の後に、異なる分離ＡＬＰアイソザイムを定量分析する工程が続くことを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項５】
レクチン溶液の付着と生物学的試料の付着が同時に行われることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項６】
レクチン溶液の付着が生物学的試料の付着の後に行われることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項７】
レクチン溶液の付着が生物学的試料の付着の前に行われることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項８】
レクチン溶液の付着時間及び／又は試料の付着時間が５から２０分の範囲であることを特徴とする請求項１ないし６の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項９】
レクチン溶液の濃度が電気泳動用支持体の温度とレクチン溶液が支持体に適用される時間の関数として決定されることを特徴とする請求項１ないし８の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１０】
レクチン溶液が、０．１ｍｇ／ｍｌから水への溶解限界までの範囲の濃度を有することを特徴とする請求項１ないし９の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１１】
レクチン溶液が、１から１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有することを特徴とする請求項１ないし９の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１２】
レクチン溶液が、１から１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有し、移動温度が１８℃から５３℃の範囲にあることを特徴とする請求項１１に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１３】
レクチン溶液の濃度が、移動工程の間に電気泳動用支持体で達成される最高温度の関数として決定されることを特徴とする請求項１ないし１２の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１４】
ＡＬＰアイソザイムがアノード方向への移動を示し、レクチンがアノードと生物学的試料の間に沈着することを特徴とする請求項１ないし１３の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１５】
レクチンが、生物学的試料と移動工程の終わりに腸画分３（Ｉ３）に通常占められるゾーンの間に沈着することを特徴とする請求項１４に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１６】
レクチンがコムギ胚芽（コムギ胚芽凝集素すなわちＷＧＡ）であることを特徴とする請求項１ないし１５の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１７】
電気泳動用支持体がアガロースゲル又はポリアクリルアミドである請求項１ないし１６の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１８】
電気泳動用支持体がセルロースアセテート膜である請求項１ないし１６の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項１９】
明らかにされたＡＬＰの画分を定量することを特徴とする請求項１ないし１８の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項２０】
定量分析が、ＡＬＰ基質を用いてＡＬＰ画分を染色した後の電気泳動用支持体の濃度を測定することにより実施される請求項１９に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項２１】
一又は複数のＡＬＰアイソザイムの異常な存在を検出するものである請求項１ないし２０の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項２２】
肝臓又は胆管の疾患のインビトロでの診断に用いられる請求項１ないし２１の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項２３】
骨の疾患のインビトロでの診断に用いられる請求項１ないし２１の何れか１項に記載の電気泳動による分離方法。
【請求項２４】
−  分析される生物学的試料を付着させ、電気泳動による移動を行わせるのに適した多孔性材料からなる電気泳動用支持体と、
−  ０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するレクチン溶液と、
を含むことを特徴とする、請求項１ないし２３の何れか１項に記載の方法の実施に適した電気泳動による分離を実施するためのキット。
【請求項２５】
請求項１ないし２３の何れか１項に記載の方法において電気泳動用支持体上の局在化された一ゾーンへの付着を行うためのレクチン溶液の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
アルカリフォスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１．）（略：ＡＬＰ）は、動物体、特に人間の異なる組織に存在する一群のアイソザイムからなる金属酵素である。
アルカリフォスファターゼアイソザイムは成人又は子供の様々な症状を診断するためのプロトコールとして重要であり、そのようなアイソザイムを分離、アッセイする多くの方法が提案されている。ＡＬＰアイソザイムは４つの分類：非特定組織（骨、肝臓及び腎臓）、成人腸、胎児腸、及び胎盤に分けることができる。１つの分類に多くの種類が存在し、つまり：
−  肝臓：肝臓１（Ｈ１）、肝臓２（Ｈ２）；
−  ウルトラファースト（ＵＦ）；
−  骨（Ｏｓ）；
−  胎盤：胎盤１（Ｐ１）、胎盤２（Ｐ２）；
−  腸：腸１（Ｉ１）、腸２（Ｉ２）、腸３（Ｉ３）。
よって、９つの画分が区別でき、それらは、特に肝臓及び胆管の疾患と骨の癌又はパジェット病を含むある種の骨の疾患でのそれらの検出のために分離、同定及び定量されている。
【０００２】
時に、文献ではＡＬＰアイソザイムの分類又はアイソザイムの分類の特定の変異体を示すのに、「画分」という用語を用いる。電気泳動用支持体上で、「画分」は泳動の後に暴露されたバンドに相当する。
もっとも頻繁に常用される分析は、一般にパラニトロフェニルホスフェートである酵素の基質を用いた全体の酵素活性の測定からなるアルカリホスファターゼアイソザイムで実施される。しかしながら、その方法は異なったアイソザイムのレベルを決定できない。
該組成物の分離分析の主な方法は電気泳動技術を用いる。等電点電気泳動がときに使用され、使用される手段により１０〜２０のバンドを分離することができる。該バンド全ての同定は難しく、レンダリング臨床観察は非常に厄介である。
ゾーン電気泳動は、イソホスファターゼの主な形態の良好な分離をすることができる。しかしながら、特定の画分、特にＯｓ、Ｈ１及びＰ１画分は重なり、よって補完的な処理が、それらの分離と同定のために実施される必要がある。そのような処置は、ゲルにそれらを挿入する前に、試験される生物学的試験試料で実施されなければならない。
【０００３】
例えば、そのような処置は、尿素、アミノ酸、などのような特定の阻害剤でのインキュベーション、ノイラミニダーゼ、フィシン、ホスフォリパーゼＣでのインキュベーション、特定の抗胎盤又は抗腸抗血清でのインキュべーションの熱変性からなる。
現在使用されるいくつかの分離手段は、１９９４年３月発行のVan Hoof V.O., De Broe Marc, E., Clinical Laboratory Sciences, Vol. 31, 「アルカリホスファターゼアイソザイムパターンの観察と臨床意義」により扱われている。
ある特別な手段は、少なくとも１の非イオン性界面活性剤及びアニオン性界面活性剤を含むゲル緩衝液を用いたゲル電気泳動反応を使用したＡＬＰアイソザイムの分離を記載した米国特許ＵＳ−Ａ−５２６４０９８に提案されている。
ＡＬＰアイソザイムの同定と定量のための利用できる処理は、通常の分析に関するある不都合を有する。高いコストに加えて、それらは一方では時間がかかり、操作を相当複雑にさせ、他方では、（全てのアイソザイムの）完全な決定には１つの試料のために複数の処理（２又は３）を必要とするため、１つのゲル上で同時に分析できる試料の数は限られている。
【０００４】
他の処理方法が提案され、例えば、電気泳動ゲルに入れる前に試料を処理することを提言している。これに関して、ＷＧＡレクチン（コムギ胚凝集素）の活性は特に興味深い（Sidney B. Rosalki, A. Ying Foo, Clinical Chemistry, 30/7, P. 1182-1186,1984, 「プラズマ中で骨及び肝臓アルカリホスファターゼアイソザイムを分離及び同定するための２つの方法」、５／１１／８６の欧州特許公開ＥＰ−Ａ−０１３１６０６参照）。ＥＰ−Ａ−０１３１６０６は、レクチンでの試験試料の処理、次いで得られた混合物のインキュベート、それに続いての遊離ＡＬＰを含む画分からのレクチンに結合するＡＬＰの分離、及び２つの媒体の１つ又は両方でのＡＬＰ活性の決定からなる骨及び肝臓ＡＬＰアイソザイムの異なった検出を記載している。特にその特許の実施には、２つの画分（レクチンに結合したＡＬＰ及び遊離ＡＬＰ）が電気泳動により分離される。
腸の形態を除いて、全てのイソホスファターゼはシアル酸を有し、従ってＷＧＡレクチンを用いた処理によって、より大きい又は小さい範囲に影響する。骨の画分は、最もシアル化され、よってこの処理によりもっとも影響され、適した条件下で移動性を停滞させ、従って肝臓画分が入れられたゾーンと識別されるゾーンで促進するようにそれを引き起こす。
【０００５】
骨アイソザイムのほうへより選択的にＡＬＰアイソザイム沈殿させるために、ある著者はＴｒｉｔｏｎ X１００（Rosalki）のような界面活性剤を使用した。しかしながら、そのような界面活性剤の存在にもかかわらず、他のイソホスファターゼとＷＧＡレクチンの残りの相互作用が存続し、骨画分と該画分の共沈殿を引き起こす。
特定のこの欠点に加えて、この技術の更なる不都合は、かなり複雑な分析を示すことである。
上に引用したRosalki S. B等による刊行物には、代わりに電気泳動ゲルを使用する前にこのゲルを含浸させるのに使用される緩衝液にレクチンを組込むことを提案している。これは、試料を処理する前に実施する。この場合、骨画分の大部分が、試料が入れられる近くに促進される。腸アイソザイム以外の他の全てのアイソザイムの移動度は前記された界面活性剤の存在にかかわらず、ＷＡＧレクチンの活性に影響される。
この処理を再検討する中で、使用されるレクチンの特性は、シアル酸を含むＡＬＰアイソザイムと特に相互作用するその能力である。
【０００６】
本発明は、従来の方法に在る不都合を少なくとも部分的に克服する方法を提案する。特に、本発明は特異性と感受性に関して向上したＡＬＰアイソザイムの分離及び同定することのできる方法を明示する。
また本発明は、主にアルカリアイソホスファターゼを分離、同定及び定量する手段を需要者、特に臨床医に提供し、その手段は、製造の容易な単一の電気泳動用支持体上での単一の工程で実施されうる。
従って本発明は、レクチンが局在化した様態で電気泳動用支持体上に付着することを特徴とする、電気泳動によるＡＬＰアイソザイムの分離及び同定の新規な方法を提示する。
局在化した様態の溶液中で付着されたレクチンは、電気泳動の間、この支持体の決定されたゾーンに局在化して残っている場合、支持体に拡散することができる。
試料が付着したゾーン近くに局在化した、当該付着物は従来技術として記載されているように、伸展するゾーンにわたって、又は電気泳動用支持体の全体にわたって入れられる、同様のものと区別される。
【０００７】
従って本発明は、分析された生物学的試料に含まれる前記レクチンとＡＬＰアイソザイムの間の相互作用が許容される条件下で、所定のゾーンの電気泳動用支持体にレクチン溶液を付着した後に、分析される生物学的試料に含まれるＡＬＰアイソザイムと前記レクチンが相互作用する条件下で、電気泳動反応が電気泳動用支持体上で実施され、さらに該レクチン溶液の付着は骨画分からと肝臓画分から構成されるＡＬＰアイソザイムを分離させるのに適した条件下で実施されることを特徴とする、電気泳動による生物学的試料からアルカリホスファターゼアイソザイムを分離する方法を提供する。
当該相互作用は、均衡になるまでレクチンとＡＬＰアイソザイムの間の複合体の形成を引き起こす。
本発明の方法は、ＡＬＰの骨画分を、レクチンでのこの画分の反応のために他のＡＬＰ画分上よりもより特異的である手段に従って行われるようにする。
分析される生物学的試料は、ＡＬＰを含みうるいくつかの生物学的試料、特に血清又は血漿試料のような生物流動体試料、又は患者から取り出された組織試料でありうる。
本発明において、電気泳動は任意の適した電気泳動用支持体、特にゲル、より特別にはアガロース又はポリアクチルアミドゲル、あるいは特にセルロースアセテートで作られたような多孔性膜上で実施される。
【０００８】
本発明の電気泳動を実施するための前記される様な特別な条件は、自動であっても自動でなくてもよい既知の電気泳動方法の環境を適用できる。
局在化レクチン付着ゾーンは、試料とレクチンの泳動の方向性の関数として決定される。従って、レクチン付着ゾーンは、例えば試料がレクチンを妨害すること、考慮される泳動の間のレクチンの移動性で泳動の間に選択される。同様に、他のＡＬＰアイソザイムにより到達される最終的な位置は、通常、試料のそれに関してレクチン付着ゾーンを決定するように考慮される。実際、試料が入れられる場合には、レクチンと試料は１ｍｍから１０ｍｍ、好適には５ｍｍ離される。
レクチンの濃度、電気泳動用支持体への適用時間のような、レクチンの局在付着のための他の条件は、例えばそれらが骨及び肝臓ＡＬＰアイソザイムを泳動反応条件下で電気泳動の間に分離させることができるように決定される。
言い換えれば、いったん電気泳動のパラメーターが特にレクチンの付着に関して決定されると、本発明の方法は他のＡＬＰアイソザイム、特にその定量に関してそれを同定するのに充分な条件下で骨及び肝臓アイソザイムを分離することができる。他のＡＬＰアイソザイムの移動度はレクチンの存在するゾーンの通過の間、影響され、通常のこのゾーンの外側に戻る。
骨ＡＬＰ画分がさらにシアル化されるので、その電気泳動は支持体上に付着されたレクチンを通しての試料の通過によりもっとも影響される。その結果、他のＡＬＰアイソザイムの泳動ゾーンから区別されるゾーンに沈殿される。
【０００９】
本発明の好ましい実施態様において、電気泳動によるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アイソザイムの分離の方法は次の構成に特徴づけられる：
−  電気泳動用支持体上での分離されるＡＬＰアイソザイムを含む生物学的試料の付着；
−  電気泳動用支持体上での試料に含まれるＡＬＰアイソザイムと相互作用可能なレクチンの溶液の付着；
−  骨及び肝臓ＡＬＰ画分を差次的に分離できる条件下でのＡＬＰアイソザイムの泳動による電気泳動分離させるための電場の印加；
−  分離されたＡＬＰアイソザイムの暴露。
暴露は、いくつかの既知の方法、好ましくはＡＬＰ担体を用いて実施される。
電気泳動用支持体上でＡＬＰアイソザイムを分離させる工程の終わりに、異なる分離されたアイソザイムの定量分析、又はそれらの確定が実施されうる。
異なる方法は電気泳動の終わりに検出されたＡＬＰアイソザイムを定量するのに使用される。例えば、電気泳動用支持体の濃度測定は、ＡＬＰ担体を用いて分離されたＡＬＰ画分を染色した後に計測されうる。
【００１０】
骨ＡＬＰ画分が、ゲル状に付着されたレクチンの固定許容量に関して過剰である場合、レクチンはこの画分の全体に沈殿しないかもしれない。この場合、非沈殿部分は他の画分で泳動を続け、基礎となるアイソザイム、特にＨ２、Ｉ１、Ｉ２及びＩ３に近い染色の形態に見出されうる。この場合、異なるアイソザイムは、レクチンがないときに同じ支持体上で２回同じ試料を付着させることにより定量されうる。「非レクチン」型では、Ｈ１  Ｏｓ  Ｐ１ブロック及び分離された画分Ｈ２、Ｉ１、Ｐ２、Ｉ２、Ｉ３及びＵＦのパーセンテージが決定される。Ｏｓ画分のパーセンテージは、Ｈ１  Ｏｓ  Ｐ１ブロックからの「レクチンのある」側面から決定されるＨ１及びＰ１のパーセンテージから推測して得られる。
前述される定義の文脈内において、電気泳動用支持体上にレクチンの局在付着がある中で電気泳動を実施する場合、レクチンと試料は電気泳動用支持体上で同時に付着されうる。
本発明の他の実施態様では、試料及びレクチンは異なる時間で付着される。
さらに、試料とレクチン溶液は、それぞれ同一又はことなっていてもよい時間にわたって電気泳動用支持体上に付着される。
有利には、前述された定義の文脈内において、組み合わせることが必要であるなら、レクチンと試料は、実質的に同一の時間をこえて、好ましくは実質的な実用性と経済性の理由のために付着される。
【００１１】
溶液中の試料及びレクチンの決定された濃度、試料の適用及びレクチンの適用の時間にわたって、従って電気泳動用支持体上に付着される試料とレクチンの定量は、骨及び肝臓画分が泳動中に分離されるように、ＡＬＰアイソザイムのＯｓ画分を沈殿するために分離される。レクチン溶液の濃度及び溶液が電気泳動用支持体に適用される以上の時間を決定するために、泳動中の支持体の達する温度にもまた気を配らねばならない。
実際、レクチンと骨ＡＬＰ画分の相互作用は温度に依存するので、泳動工程の間の電気泳動用支持体の温度は、気を付けなければならない。レクチン-骨ＡＬＰ相互作用の減少は、付着されたレクチンの量を増加することにより、例えば使用されるレクチン溶液の濃度を増加させることにより補うことができる。
これらのパラメータは、以下の記載及び実施例で与えられる値に鑑みて決定することができ、以下の実施例に与えられる様な試験を実施することにより、必要に応じて選択された電気泳動条件を適用することができる。
試料の適用及び／又はレクチン溶液の適用の時間は、試料及び／又はレクチンのために、変化させることができ、特に５〜２０分、好ましくは１５分の範囲であり得る。
付着は、既知の手作業の又は自動の方法を用いて、例えば「組み合わせ」型アプリケータ、例えば欧州特許公開ＥＰ−Ａ−０４９３９９６に記載の手段を用いて実施することができる。
使用されるレクチンは水溶液の形態である。
【００１２】
従って、通常の条件下で使用される電気泳動用支持体上に付着するレクチンの濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌから水にレクチンが溶解できる限度までの範囲である。この濃度は、有利には０．５〜１５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
本発明の好ましい手段では、該方法はレクチン濃度が１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で、泳動温度がそれぞれ１８℃から５３℃の範囲であるときに特徴づけらる。これらの条件は、とりわけ欧州特許公開ＥＰ−Ａ−０４９３９９６に記載されるような組み合わせ型アプリケータを用いて約１５分近くの時間にわたってレクチン溶液の付着に適用される。
本発明は好ましくは電気泳動の実施に関し、試験試料に存在するＡＬＰアイソザイムがアノードの方向に電気泳動の泳動性がある場合には、レクチンはアノードと試料の付着ゾーンの間に付着する。
有利には、この場合、腸画分が該試料に存在するとき、レクチンは泳動工程の終わりに腸画分３（Ｉ３）により通常占有されるゾーンと生物学的試料付着部分の間に付着する。
異なるレクチンが本発明で使用されうる。レクチンは、シアル化グループを固定するタンパク質である。引用されうる本発明に使用されうるレクチンは、コムギ麦芽（トリチカムウルガリスTriticum vulgaris）レクチン、又はＷＧＡ（コムギ麦芽凝集素Wheat Germ Agglutinin）を含む。ＷＧＡレクチンはシグマ(Sigma)、ファルマシア(Pharmacia)などから得られうる。
【００１３】
また本発明は前述の定義を満たすような方法に関し、区別して、又は組み合わせても利用され、ＡＬＰの骨及び肝臓１以外の画分の分離も改善する。
従って本発明は、通常の臨床分析と両立できる状況で利用可能にし、１又は複数のＡＬＰアイソザイムの異常な存在の生物学的試料のインビトロ検出に重要である。
この方法は特に肝臓ＡＬＰ画分の異常な存在に相当する肝臓又は胆管の疾患を診断するためのプロトコールの間で実施されうる。本発明はまた、骨画分の異常な存在で骨の疾患の存在の診断に関連して調べることを可能にする。
本発明はまた、電気泳動によって、ＡＬＰアイソザイムにより構成される画分の分離を実施するためのキットに関する。
従って、本発明の方法は、単一の支持体上への１つの付着でのＡＬＰアイソザイムの全ての量的決定及び２つの付着でのそれらの量的決定を実施するための、試料の前処理なしで、単一の電気泳動用支持体の使用の利点を有する。電気泳動用支持体は、その使用前にレクチンを遊離し、利用する温度条件下で保存されるようにし、その工業的費用は変わらない。
キットは例えば次の構成：
−  分析される生物学的試料を付着させ、電気泳動による移動を行わせるのに適した多孔性材料からなる電気泳動用支持体；
−  ０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、有利には１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するレクチン溶液
本発明のキットはまた、電気泳動反応に必要とされる緩衝液を包含する。また試薬を暴露するＡＬＰ反応を含むことができる。
さらに本発明の利点と特徴は次の実施例からさらに明らかになるであろう。
【００１４】
（実施例）
電気泳動ゲル中に均一に分散したレクチンを用いる反応の原理
僅かにシアル化されたイソホスファターゼとのＷＧＡレクチンの相互作用は、次の平衡式：
0004871477.tif 000002
により表すことができる。
通常の電気泳動条件下、すなわち塩基性ｐＨでは、イソホスファターゼがアノード移動度を有する一方、レクチンは僅かにカソード移動度を持つ。{イソホスファターゼ-ＷＧＡ}複合体の移動度はこのように遊離のイソホスファターゼの移動度よりも低い。
移動時間の全体にわたって、イソホスファターゼは反応式（Ａ）の平衡に従ってＷＧＡレクチンと相互作用し、よって遅くなる。
よって、与えられた条件下で、Ｈ１、Ｏｓ（おそらくはＰ１）アイソザイムによって構成されるブロックを例外として全ての画分が分離されるＷＧＡレクチンのないゲルで得られるパターンは、Ｈ１（おそらくはＰ１）が骨画分から離れるが、一方ではＨ１、Ｐ１画分が、他方ではＷＧＡレクチンのないゲルで分離したＨ２、Ｉ２画分が一緒になるパターンになる。ついで、試料のアイソザイムの簡単な定性的な推定に対してでさえ、二つのタイプのゲルで電気泳動を実施することが必要になり、これがよって分析を複雑にする。
この不具合に加えて、ＷＧＡレクチンは熱感性であり、それを含むゲルの製造が困難になる。更に、消費者はその性能をそのまま保存するためにはこれらのゲルを４℃と８℃の間で保存しなければならない。
【００１５】
局在化された形で電気泳動ゲルに付着されるレクチンを使用する、本発明の反応の原理
本発明では、ＷＧＡレクチンの溶液が試料の前、すなわち、試料とアノードの間に付着させられる。電気泳動ゲルの全表面にわたってレクチンが含浸させられることはない。ＷＧＡレクチンは試料に同時に付着させられてもさせられなくともよい。両方の付着がなされたら、電気泳動での分離をなすために電圧を印加する。
これらの条件下では、Ｏｓ画分の主要部分は、ＷＧＡレクチンが付着させられたゾーンを通過するとき析出する。他のイソホスファターゼ画分の電気泳動移動度は次の平衡反応：
0004871477.tif 000003
に従ってＷＧＡレクチンにより影響を受けるが、ＷＧＡレクチンを含むゾーンを横切るときのみである。このゾーンは非常にサイズが小さく（＜１ｍｍ）、これは、Ｈ１及びＰ１画分から離れている骨画分を例外として、プロフィールがレクチンがない場合に得られるものと実際に同一であることを意味している。これらの条件下で、試料の前にレクチンが付着させられた試料の電気泳動により、一回の工程での単一のゲルの定性的分析が可能になる：アイソザイムの全てを、使用について追加的な処理をすることを必要としないで、その位置から同定することができる。
【００１６】
分離され、適切な試薬で明らかにされた異なるアイソザイムを定量しなければならない場合、ＷＧＡレクチンによる骨画分の沈殿が、特にこの骨画分が非常に増加した場合には、完全ではない。骨アルカリホスファターゼ分子の一部がレクチン付着物を通過するとき沈殿を逃れる。しかし、Ｏｓ-ＷＧＡ結合は、これらの非沈殿骨画分アルカリホスファターゼ分子がそれらにＷＧＡレクチンを巻き込むに十分である。よって、それらは十分に遅く、Ｈ１Ｐ１ゾーンに達しない。しかして、骨画分の沈殿曲線に加えて、Ｈ２が移動しないゾーンに達する骨アルカリホスファターゼのスメアが得られる。これらの条件下で、このストリークの下にあるアイソザイム、すなわちアイソザイムＨ２、Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３の定量はこのスメアによって乱される。
Ｏｓ画分の量が沈殿可能な量より多い状況において定量を行うには、同じ試料の二つの付着物を、一方がレクチン付着物を持ち他方が持たない状態で並べなければならない。Ｈ１及びＰ１画分はＷＧＡレクチンを持つパターンで定量できる。Ｈ１ＯｓＰ１ブロックと分離されたＨ２、Ｉ１、Ｐ２、Ｉ２、Ｉ３及びＵＦ画分のパーセントがレクチンのないパターンを使用して決定される。Ｏｓ画分のパーセントは、Ｈ１ＯｓＰ１ブロックからのレクチンを持つプロフィールを使用して決められたＨ１及びＰ１パーセントを差し引くことにより得られる。
よって、単一のゲルを用いて、二つの負荷物を持つ工程において試料を前もって処理内でアイソザイムの全てのパーセントを決定することができる。
【００１７】
レクチンの濃度と電気泳動の温度
使用されるレクチンの濃度と移動温度（電気泳動用支持体の温度）は密接に関連している。イソホスファターゼ-ＷＧＡレクチン複合体形成に対する平衡は確かに温度依存性である。よって、温度を増大させると複合体の解離が促進させられる。レクチン濃度は骨画分の同じ沈降力を得るために増加させなければならない。
実際には、使用されるレクチンの濃度はゲルの関数であり、次に表を使用して選択することができる。
0004871477.tif 000004
【００１８】
しかして、移動温度を制御できない電気泳動系（実施例１）において本発明に従って方法を実施する場合は、レクチン濃度は移動中のゲルにより達成される最高温度を考慮して増加させられなければならない。この温度は、イオン強度及びゲルの寸法、移動パラメーター及び移動中の外部温度のような多くのパラメーターに依存する。実施例１において使用される条件下では、ゲルが到達する最高温度は３８℃に近く、よって３ｍｇ／ｍｌのレクチン濃度が使用される。実施例２では、装置は電気泳動温度を２０℃に調節することができる。しかし、電気泳動が２０Ｗの一定電力で実施される場合は、ゲルの効果的な温度は２８℃である。その結果、所望の効果を得るのに必要なレクチン濃度は２ｍｇ／ｍｌである。
【００１９】
レクチン付着の位置と時間
電気泳動に使用されるｐＨ条件（塩基性）下では、全てのアルカリイソホスファターゼの移動はアノードの方向であり、これに対して、レクチンはカソード方向に非常に僅かな移動を示す。骨画分がレクチンに会うためには、レクチンを試料とアノードの間に付着させなければならない。より詳細には、使用される条件下でレクチンが存在しない状態で骨画分が越える距離より少ないか等しい距離にレクチンを付着させなければならない。しかし、他の画分によって既に占められているゾーンにおける骨画分の沈殿を防止するためには、移動の終わりにＩ３画分が占める位置と試料の間の距離にレクチンを付着させることがより賢明であると思われる。実際には、レクチンは試料の前に１から１０ｍｍの範囲、好ましくは５ｍｍに近い距離の場所に付着させられる。
レクチンは同時に又は試料の後に付着させられる。二つを同時に付着させる必要はない。しかし、試料とレクチンが同時に付着させられない場合は、第二のものを付着させるときに第一の付着物が拡散しないように留意されなければならない。このために、試料とレクチンを同時に同じ時間にわたって付着させるのがより簡単である。更に、二つの付着物は互いに平行で移動の方向に直交している。
【００２０】
実施例１
次の組成を有するゲル：
アガロース                      １％
トリス                          ０．０３Ｍ
バルビタールナトリウム          ０．０２５Ｍ
バルビタール酸                  ０．００５Ｍ
アジ化ナトリウム                １ｇ／ｌ
トリトンＸ１００              １０ｇ／ｌ
ノニデット(Nonidet)ＮＰ４０      ５ｇ／ｌ
４０ｍｌの脱塩水と０．５ｇのアガロースを１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に導入した。絶えず攪拌しながら５分間沸騰させた後、アガロースが溶解して完全に清澄な溶液を生成させた。この溶液の温度を恒温槽において５０℃まで低下させた。１８ｇ／ｌのトリスと、２７．７５ｇ／ｌのバルビタールナトリウムと、４．６ｇ／ｌのバービタール酸と、５ｇ／ｌのアジ化ナトリウムと、５０ｇ／ｌのトリトンＸ１００と２５ｇ／ｌのノニデットＮＰ４０を含む１０ｍｌの濃縮バッファー溶液を５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に導入した。この溶液を恒温槽で５０℃に維持した。
予め加熱したバッファーをアガロース溶液に添加した。これをホモジナイズし５０℃に維持した。
ピペットでとった５ｍｌの上記溶液をついで１０ｘ８ｃｍの親水性プラスチックシート上に均一に注いだ。
【００２１】
ゲル化し安定化した後にゲルを使用できる。分析される新鮮な血清をカソード側に縁部から２．５ｃｍのところに２つの隣接した付着物として付着させた。コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）レクチンの３ｍｇ／ｍｌ溶液を、各試料の２つの付着物の一方の３２ｍｍ前に、すなわち試料とアノードの間に、同時に同じ時間にわたって塗布した。塗布時間は、欧州特許出願公開第０４９３９９６号に記載されたセビア（Sebia）社より販売されているマイクロポーラス膜アプリケータを用いて生成した各付着物に対して１５分である。
アルカリイソホスファターゼを、タンクがトリス０．００３M、バルビタールナトリウム０．０２５M、バルビタール酸０．００５M、アジ化ナトリウム０．１ｇ／ｌバッファーを含む容器において１００Ｖの一定電圧で５０分間電気泳動を行わせることにより分離した。
ついで、この酵素に対する一般的な基質（例えばブロロクロロインドリルホスフェートとニトロブルーテトラゾリウム）と共にゲルをインキュベートすることによりアルカリホスファターゼ活性を明らかにした。その活性に比例する各イソホスファターゼ画分の位置にこのようにして青色染色が得られた。明らかにした後、ゲルを洗浄し、ついで乾燥させ、デンシトメトリーにより分析して、異なったアルカリイソホスファターゼを定量した。
【００２２】
実施例２
次の組成を有するゲル：
アガロース                      １％
トリス                          ０．３８Ｍ
ホウ酸                          ０．０６Ｍ
アジ化ナトリウム                １ｇ／ｌ
トリトンＸ１００              １０ｇ／ｌ
ノニデットＮＰ４０              ５ｇ／ｌ
４０ｍｌの脱塩水と０．５ｇのアガロースを１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に導入した。絶えず攪拌しながら５分間沸騰させた後、アガロースが溶解して完全に清澄な溶液を生成させた。この溶液の温度を恒温槽において５０℃まで低下させた。２２９．９ｇ／ｌのトリスと、１８．５５ｇ／ｌのホウ酸と、５ｇ／ｌのアジ化ナトリウムと、５０ｇ／ｌのトリトンＸ１００と２５ｇ／ｌのノニデットＮＰ４０を含む１０ｍｌの濃縮バッファー溶液を５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に導入した。この溶液を恒温槽で５０℃に維持した。
予め加熱したバッファーをアガロース溶液に添加した。これをホモジナイズし５０℃に維持した。
【００２３】
ピペットでとった５ｍｌの上記溶液をついで１０ｘ８ｃｍの親水性プラスチックシート上に均一に注いだ。
ゲル化し安定化した後にゲルを使用できる。分析される新鮮な血清をカソード側に縁部から２．５ｃｍのところに２つの隣接した付着物として付着させた。コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）レクチンの２ｍｇ／ｍｌ溶液を、各試料の２つの付着物の一方の５ｍｍ前に、すなわち試料とアノードの間に、同時に同じ時間にわたって塗布した。
アルカリイソホスファターゼを、２０℃に温度を調節することができる装置において電気泳動により分離した。移動は２０Ｗの一定電力で２０分間実施した。
アルカリホスファターゼの活性と濃度を先の実施例のようにして測定した。