(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
日本脳炎ウイルスのキャプシドタンパク質、プレメンブランタンパク質、ならびにＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５からなる非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、日本脳炎ウイルス以外の第２のフラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子であって、
ここで、該日本脳炎ウイルスのプレメンブランタンパク質および非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上生じるヌクレオチド変異を含み、
該ウイルスを弱毒化するアミノ酸変異が、プレメンブランタンパク質の１番目のメチオニンのイソロイシンによる置換；プレメンブランタンパク質の１４８番目のアスパラギンのトレオニンによる置換；ＮＳ２Ａタンパク質の４番目のアラニンのセリンによる置換；ＮＳ４Ｂタンパク質の５１番目のアスパラギンのリジンによる置換；ＮＳ４Ｂタンパク質の５２番目のバリンのイソロイシンによる置換；ＮＳ４Ｂタンパク質の６８番目のトレオニンのセリンによる置換；ＮＳ５タンパク質の１２６番目のロイシンのメチオニンによる置換；および／または、ＮＳ５タンパク質の８５４番目のセリンのアスパラギンによる置換である、
核酸分子。
【請求項２】
前記日本脳炎ウイルスが、ＭＬ-１７株である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記第２のフラビウイルスが、西ナイルウイルス、デング（１〜４型）ウイルス、黄熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、キィアサヌアフォレストウイルス、マリー谷脳炎ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ポワサンウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ヨコセウイルス、アポイウイルス、およびアロアウイルスからなる群より選択される、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子によりコードされる、弱毒キメラフラビウイルス。
【請求項５】
請求項４記載の弱毒キメラフラビウイルスを含む、弱毒生ワクチンであって、前記日本脳炎ウイルスがＭＬ−１７株であり、前記第２のフラビウイルスが西ナイルウイルスである、弱毒生ワクチン。
【請求項６】
以下の工程を包含する、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子の作製方法：
日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中のエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、日本脳炎ウイルス以外の第２のフラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列と組換える工程；および
該日本脳炎ウイルスのプレメンブランタンパク質ならびにＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５からなる非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列中に、ウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上生じるヌクレオチド変異を導入する工程。
【請求項７】
以下の工程を包含する、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子の作製方法：
プレメンブランタンパク質ならびにＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５からなる非構造タンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上含む日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中の、エンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、日本脳炎ウイルス以外の第２のフラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列と組換える工程。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子から、キメラフラビウイルスタンパク質を発現させる工程を包含する、弱毒キメラフラビウイルスの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、フラビウイルス感染を予防するための弱毒生ワクチンとして有用な、弱毒日本脳炎ウイルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラビウイルスに関する。
【背景技術】  フラビウイルス科に属するウイルス（以下、フラビウイルスと略称する）は、現在、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、デング（１〜４型）ウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ−１〜４  ｖｉｒｕｓ）、黄熱ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、クンジンウイルス（Ｋｕｎｊｉｎ  ｖｉｒｕｓ）、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、キィアサヌアフォレストウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、マリー谷脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、オムスク出血熱ウイルス（Ｏｍｓｋ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ポワサンウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ロシア春夏脳炎ウイルス（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｓｐｒｉｎｇ−Ｓｕｍｍｅｒ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ヨコセウイルス（Ｙｏｋｏｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、アポイウイルス（Ａｐｏｉ  ｖｉｒｕｓ）、アロアウイルス（Ａｒｏａ  ｖｉｒｕｓ）など、約６０種類以上が知られている。
これらのフラビウイルスは、一本鎖（＋）ＲＮＡのゲノムを有し、遺伝子構造は互いに類似している。フラビウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、その５’末端から３つの構造タンパク質（キャプシド（Ｃ）タンパク質、メンブラン（Ｍ）タンパク質の前駆体であるプレメンブラン（ｐｒＭ）タンパク質、およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質）、続いて、７つの非構造（ＮＳ）タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５）をコードしている。
これらのフラビウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質は、単一のポリタンパク質として翻訳され、次いで、翻訳されたポリタンパク質は、宿主細胞およびウイルスの、プロテアーゼおよびプロテアーゼ活性を有するＮＳ３タンパク質によってプロセシングされて、上記の３種類の構造タンパク質から構成される成熟ビリオンを形成する。
上記のフラビウイルスの多くは、蚊やダニなどの昆虫を媒介して、ヒトを含む哺乳動物や鳥類に感染し、脳炎および／または発熱症状を引き起こすことが知られている。本来、これらのフラビウイルス種の各々は、特定の地域に生息しており、それ故、感染の流行地域は限られていた。しかし、近年、交通／流通の発達や気候の変化などにより、種々のフラビウイルス感染が、原因となるフラビウイルスの本来の生息地域外にも拡大しており、公衆衛生上の重大な問題となっている。
ウイルス感染の拡大を防ぐには、ワクチンによる予防が効果的である。しかしながら、上記のように多数のフラビウイルス科に属するウイルスが認識されているにもかかわらず、フラビウイルス感染に対するワクチンとしては、黄熱ウイルスおよび日本脳炎ウイルス感染に対する弱毒生ワクチン、ならびに日本脳炎ウイルスおよびダニ媒介脳炎ウイルス感染に対する不活化ワクチンのみが実用化されているにすぎない。特に、弱毒生ワクチンは、安価でありかつ長期間の免疫を誘導するワクチンとして有用であるが、上記の他に認可されている生ワクチンはない。
このような状況において、近年、種々のフラビウイルス感染に対する新規の弱毒生ワクチンを迅速に開発する手段として、遺伝子工学的手法で作製されたキメラフラビウイルスを利用するストラテジーが注目されている。
例えば、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ−ＪＥは、黄熱ウイルスワクチン１７Ｄ株の２つの構造タンパク質（ｐｒＭ−Ｅ）をコードする遺伝子を、日本脳炎ウイルスワクチンＳＡ１４−１４−２株の対応する遺伝子と組換えることにより作製されたキメラフラビウイルスである（例えば、国際公開第９８／３７９１１号パンフレットおよび国際公開第０１／３９８０２号パンフレットを参照）。このＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ−ＪＥは、日本脳炎ウイルスワクチンＳＡ１４−１４−２株のＥタンパク質に対応するウイルスポリタンパク質中に複数存在する野生型からのアミノ酸変異に起因して、ワクチンとして使用できる程度に弱毒化されている（例えば、Ａｒｒｏｙｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：９３４−９４２，２００１を参照）。
さらに、このＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ−ＪＥの手法を基にして、黄熱ウイルスワクチン１７Ｄ株の遺伝子をバックボーンとして有する、デング（１〜４型）ウイルスとのキメラフラビウイルス（ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ−ＤＥＮ（１〜４））（例えば、国際公開第９８／３７９１１号パンフレットおよび国際公開第０１／３９８０２号パンフレットを参照）や、西ナイルウイルスとのキメラフラビウイルス（ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ−Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）（例えば、国際公開第２００４／０４５５２９号パンフレットを参照）も開発されている。
これらのキメラフラビウイルスもまた、ワクチンとして使用できる程度に弱毒化されており、その弱毒性は、主に、ｐｒＭ−Ｅタンパク質に対応するウイルスポリタンパク質中に存在する野生型からのアミノ酸置換に起因している。
しかし、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ−ＤＥＮ１の弱毒性は、主に、ワクチン製造のためにこのキメラフラビウイルスを細胞中で継代する過程で生じるＥタンパク質のアミノ酸変異に起因していることが報告されている（例えば、Ｇｕｉｒａｋｈｏｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：９９９８−１０００８，２００４を参照）。さらに、デング出血熱の発生原因の１つとして、異なった血清型のデングウイルスによる再感染が想定されるため、このワクチンは実用化には至っていない。
また、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ−Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅは、野生型の強毒西ナイルウイルスＮＹ−９９株に由来するＥタンパク質中に人為的にアミノ酸変異を導入して弱毒化を促進している（例えば、国際公開第２００４／０４５５２９号パンフレットを参照）。
黄熱ウイルス（ＹＦ−１７Ｄ）以外の遺伝子バックボーンを用いたキメラフラビウイルスとしては、デング４型ウイルスのｐｒＭ−Ｅタンパク質をコードする遺伝子を、西ナイルウイルスＮＹ９９株の対応する遺伝子と組換えることにより作製されたキメラフラビウイルス（ＷＮ／ＤＥＮ４キメラウイルス）が報告されている（例えば、Ｐｌｅｔｎｅｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：３０３６−３０４１，２００２を参照）。
ＷＮ／ＤＥＮ４キメラウイルスは、その親株である西ナイルウイルスおよびデング４型ウイルスと比較して弱毒化されているが、その弱毒化のメカニズムは完全には解明されておらず、またワクチンとしての実用化にも至っていない。
【発明の開示】
上記のような従来の方法によって、種々のフラビウイルス感染に対する弱毒生キメラフラビウイルスワクチンを開発する場合、組み合わせるフラビウイルス種毎に、構築したキメラウイルスの安全性、即ち、脳神経毒性、末梢からの中枢神経系への感染性（脳神経侵襲性）や感染予防効果、中和抗体の産生などについて検討する必要があり、このことは、弱毒生ワクチンの実用化までの期間を長引かせる大きな原因となり得る。
さらに、生ワクチンは、安全性のために弱毒化すると抗体産生能が反比例して低下するという問題が残されている。なぜならば、中和抗体を誘導するための抗原決定基は、Ｅタンパク質中に存在するため、上記のようなＥタンパク質の改変によるウイルスの弱毒化は、ワクチンとしての免疫誘導能（抗体産生能）を低下させる可能性があるためである。
従って、本発明は、Ｅタンパク質以外の部分に弱毒化変異を有する弱毒キメラフラビウイルスを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ブタ用日本脳炎ウイルスワクチンＭＬ−１７株が、Ｅタンパク質以外のｐｒＭおよびＮＳタンパク質中に、ＭＬ−１７株に固有の複数のアミノ酸変異を有することを見出し、これらのアミノ酸変異がＭＬ−１７株の弱毒性に関与しているという示唆を得た。この知見に基づいて、ＭＬ−１７株に固有のアミノ酸変異の１つ以上を含む日本脳炎ウイルスの、Ｅタンパク質以外の構造および非構造タンパク質（すなわち、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質、およびＮＳタンパク質）を有するキメラフラビウイルスを構築することを着想し、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］  日本脳炎ウイルスのキャプシドタンパク質、プレメンブランタンパク質、および非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、第２のフラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子であって、
ここで、該日本脳炎ウイルスのプレメンブランタンパク質および／または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上生じるヌクレオチド変異を含む、核酸分子。
［２］  前記日本脳炎ウイルスが、ＭＬ−１７株である、［１］記載の核酸分子。
［３］  前記第２のフラビウイルスが、西ナイルウイルス、デング（１〜４型）ウイルス、黄熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、キィアサヌアフォレストウイルス、マリー谷脳炎ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ポワサンウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ヨコセウイルス、アポイウイルス、およびアロアウイルスからなる群より選択される、［１］、または［２］記載の核酸分子。
［４］  ［１］〜［３］のいずれか１項記載の核酸分子によりコードされる、弱毒キメラフラビウイルス。
［５］  ［４］記載の弱毒キメラフラビウイルスを含む、弱毒生ワクチン。
［６］  以下の工程を包含する、［１］記載の核酸分子の作製方法：
日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中のエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、第２のフラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列と組換える工程；および
該日本脳炎ウイルスのプレメンブランタンパク質および／または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列中に、ウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上生じるヌクレオチド変異を導入する工程。
［７］  以下の工程を包含する、［１］記載の核酸分子の作製方法：
プレメンブランタンパク質および／または非構造タンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上含む日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中の、エンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、第２のフラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列と組換える工程。
［８］  ［１］〜［３］のいずれか１項記載の核酸分子から、キメラフラビウイルスタンパク質を発現させる工程を包含する、弱毒キメラフラビウイルスの作製方法。
［９］  プレメンブランタンパク質および／または非構造タンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上含む日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
［１０］  ［９］記載の核酸分子を含む、ベクター。
［１１］  ［９］記載の核酸分子によりコードされる、弱毒日本脳炎ウイルス。
［１２］  日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中のプレメンブランタンパク質および／または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列中に、ウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上生じるヌクレオチド変異を導入する工程を包含する、［９］記載の核酸分子の作製方法。
［１３］  ［９］記載の核酸分子から、日本脳炎ウイルスタンパク質を発現させる工程を包含する、弱毒日本脳炎ウイルスの作製方法。
本発明によって、Ｅタンパク質以外の部分に弱毒化変異を有する弱毒キメラフラビウイルスが提供される。本発明のキメラフラビウイルスの弱毒性は、Ｅタンパク質を改変せずに達成できるため、免疫誘導能を低下させることなく、種々のフラビウイルス感染に対する弱毒生ワクチンを短期間で実用化することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、日本脳炎ウイルスＭＬ−１７株とＪａＯＨ０５６６株との間のゲノムｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびポリタンパク質のアミノ酸配列中の差異を示す。Ｎｔはヌクレオチドを表し、ＡＡはアミノ酸を表す。アミノ酸位置を、ポリタンパク質の開始メチオニンの次のアミノ酸から数えた番号で表す。
図２は、日本脳炎ウイルスＭＬ−１７株のポリタンパク質中の、親株（ＪａＯＨ０５６６株）から変異しているアミノ酸（太字で表す）を、ＪａＯＨ０５６６株、ＪａＯＡｒＳ９８２株、ＪａＧＡｒ０１株、Ｎａｋａｙａｍａ株、Ｂｅｉｊｉｎｇ株、ＳＡ１４株、およびＳＡ１４−１４−２株のポリタンパク質中の対応するアミノ酸と比較した結果を示す。アミノ酸位置を、ポリタンパク質の開始メチオニンの次のアミノ酸から数えた番号で表す。＊は、その位置のアミノ酸がＭＬ−１７株と同一であることを表す。
図３は、組換え日本脳炎ウイルスＭＳ−１４株およびＭＳ−１５株の完全長ｃＤＮＡのＬｏｎｇ−ＰＣＲ法による作製方法の概略を示す。
図４は、ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）キメラフラビウイルスのｃＤＮＡのＬｏｎｇ−ＰＣＲ法による作製方法の概略を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、日本脳炎ウイルス（第１のフラビウイルス）のＣタンパク質、ｐｒＭタンパク質、およびＮＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、第２のフラビウイルスのＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子を提供する。好ましくは、本発明は、日本脳炎ウイルスの５’非翻訳領域のヌクレオチド配列、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質、およびＮＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびに３’非翻訳領域のヌクレオチド配列と、第２のフラビウイルスのＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、核酸分子を提供する。さらに、この核酸分子は、日本脳炎ウイルスのｐｒＭタンパク質および／またはＮＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列中に、以下に記載するような、ウイルスを弱毒化し得るアミノ酸変異を１つ以上生じるヌクレオチド変異を含む。
本発明はまた、このような核酸分子によりコードされる、キメラフラビウイルスを提供する。
本明細書中において、「核酸分子」とは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのことを意味する。
本明細書中において、「ヌクレオチド配列」とは、特に言及しない限り、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴで表す）の配列、またはリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵで表す）の配列を意味する。
本明細書中において、特に言及しない限り、一本鎖ヌクレオチド配列は、左端が５’末端、右端が３’末端を表し、そしてアミノ酸配列は、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）を表す。
本明細書中において、特に言及しない限り、アミノ酸の表記は、アミノ酸に関する標準的な表記である１文字略号または３文字略号を使用する。
本明細書中において、「弱毒」とは、ワクチン接種の対象となる動物｛例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなど）、ならびに鳥類など｝に対して、ワクチンとして安全に使用できる程度の低病原性（低毒性）のことを意味する。
本明細書中において、「ワクチンとして（安全に）使用できる程度」とは、ワクチンを接種した局所において、ウイルスの増殖は認められるが、重篤な症状を示すことなく増殖が終了し、その後の、ワクチンを接種した個体に対する強毒ウイルスによる攻撃試験において、接種したウイルスに起因する疾患の発症を防御することができる特異的免疫を付与することを意味する。
本発明のキメラフラビウイルスの作製に使用される第１のフラビウイルスである日本脳炎ウイルスは、本発明のキメラフラビウイルスのｐｒＭタンパク質および／またはＮＳタンパク質が、最終的に、以下に記載するようなウイルスを弱毒化するアミノ酸変異の１つ以上を含む限り、特に限定はされない。
従って、日本脳炎ウイルスには、種々の株（例えば、ＭＬ−１７株、ＪａＯＨ０５６６株、ＪａＯＡｒＳ９８２株、ＪａＧＡｒ０１株、Ｎａｋａｙａｍａ株、Ｂｅｉｊｉｎｇ株、ＳＡ１４株、ＳＡ１４−１４−２株など）が存在するが、いずれの株を用いてもよい。
種々の日本脳炎ウイルス株のゲノムがクローン化され、その完全または部分ヌクレオチド配列が決定されている。例えば、ＪａＯＡｒＳ９８２株については、Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６１：４９７−５１０，１９８７；Ｎａｋａｙａｍａ株については、ＭｃＡｄａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５８：３４８−３６０，１９８７；Ｂｅｉｊｉｎｇ株については、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １：３０５−３１７，１９８８；ＳＡ１４株およびＳＡ１４−１４−２株については、Ｎｉｔａｙａｐｈａｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７：５４１−５５２，１９９０を参照のこと。
また、種々の日本脳炎ウイルスのゲノム配列に関する情報は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公に利用可能な遺伝子データベースからも入手することができる。例えば、ＪａＯＡｒＳ９８２株については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１８３７０；ＪａＧＡｒ０１株については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０６９０７６；Ｂｅｉｊｉｎｇ−１株については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ４８９６１；ＳＡ１４株については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ５５５０６；ＳＡ１４−１４−２株については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ３１５１１９を参照のこと。
本発明のキメラウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を作製するために、日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が調製され、キメラフラビウイルスの遺伝子バックボーンとして用いられ得る。日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子としては、例えば、ゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。
あるいは、本発明のキメラフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を作製するために、日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の任意の断片（例えば、ＰＣＲによる増幅ＤＮＡ断片など）が用いられ得る。
日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡは、公知の方法によって、日本脳炎ウイルスを感染させた、細胞（例えば、ＭＭＣ−ＬＫ２細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｎ２ａ細胞、ＰＳ細胞、ＢＳＣ−１細胞、ＨＬ−ＣＺ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞、蚊由来のＣ６／３６細胞、マウスまたはハムスター由来の脳内細胞）、発育鶏卵などから調製することができる。ゲノムＲＮＡを調製するために用いられる日本脳炎ウイルス株は、特に限定されず、例えば、上記に列挙したような株が用いられ得る。
日本脳炎ウイルスのｃＤＮＡは、公知の方法（例えば、Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６１：４９７−５１０，１９８７に記載される方法）に従って、ゲノムＲＮＡから構築できる。
あるいは、日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの任意の断片は、日本脳炎ウイルスのゲノム配列情報に基づいて、公知の方法により化学合成することもできる。
日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの任意の断片は、ゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（「ＰＣＲ法」と略称する）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）、Ｌｏｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（「Ｌｏｎｇ−ＰＣＲ法」と略称する）、および／またはＬｏｎｇ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（「Ｌｏｎｇ−ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することができる。
あるいは、日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの任意の断片を、ベクターに挿入してクローニングすることもできる。
用いられるベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＣＵ１８、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＳＣ１０１、ｐＧＢＭ５、ｐＣＲＩＩなどのプラスミドが挙げられる。また、クローニングベクターとして、バクテリオファージ、コスミド、ファージミドなどを用いることもできる。このようなクローニングベクターは、例えば、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ  ＣＯ．，ＬＴＤ．などから市販されている。
本発明に用いられる第２のフラビウイルスとしては、日本脳炎ウイルスとは異なるフラビウイルス、例えば、西ナイルウイルス、デング（１〜４型）ウイルス、黄熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、キィアサヌアフォレストウイルス、マリー谷脳炎ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ポワサンウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ヨコセウイルス、アポイウイルス、アロアウイルスなどが挙げられる。これらのフラビウイルス種もまた、その各々の種について、様々な変異株が存在するが、いずれの株を用いてもよい。
上記のような、種々のフラビウイルスのＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は公知であり、さらに、これらのフラビウイルス種の多くは、ゲノムの全ヌクレオチド配列が報告されている。例えば、以下を参照のこと：西ナイルウイルス（例えば、Ｗｅｎｇｌｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４７：２６４−２７４，１９８５）；デング１型ウイルス（例えば、Ｍａｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６１：２６２−２６７，１９８７）；デング２型ウイルス（例えば、Ｄｅｕｂｅｌら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５５：３６５−３７７，１９８６；Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１３９１−１３９８，１９８８；Ｈａｈｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６２：１６７−１８０，１９８８）；デング３型ウイルス（例えば、Ｏｓａｔｏｍｉら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２：９９−１０８，１９８８）；デング４型ウイルス（例えば、Ｍａｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５９：２１７−２２８，１９８７；Ｚｈａｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５５：７７−８８，１９８６）；黄熱病ウイルス（例えば、Ｒｉｃｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：７２６−７３３，１９８５）；セントルイス脳炎ウイルス（例えば、Ｔｒｅｎｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６：２９３−３０４，１９８７）；ダニ媒介脳炎ウイルス（例えば、Ｍａｎｄｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６６：１９７−２０５，１９８８）；クンジンウイルス（例えば、Ｃｏｉａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９（Ｐｔ  １）：１−２１，１９８８）；キィアサヌアフォレストウイルス（例えば、Ｖｅｎｕｇｏｐａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：２２７−２３２，１９９４；Ｋｕｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：７３−８３，１９９８）；マリー谷脳炎ウイルス（例えば、Ｄａｌｇａｒｎｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７：３０９−３２３，１９８６）；オムスク出血熱ウイルス（例えば、Ｌｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１３：８１−９０，２００３；Ｌｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８５：１６１９−１６２４，２００４；Ｇｒｉｔｓｕｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：２８７−２９１，１９９３）；ポワサンウイルス（例えば、Ｋｕｎｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６５：６７１−６７６，２００１；Ｍａｎｄｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９４：１７３−１８４，１９９３）；ロシア春夏脳炎ウイルス（例えば、Ｋｕｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：７３−８３，１９９８）；アポイウイルス（例えば、Ｂｉｌｌｏｉｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：７８１−７９０，２０００）；アロアウイルス（例えば、Ｇａｕｎｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：１８６７−１９７６，２００１）。
また、種々のフラビウイルスのゲノムのヌクレオチド配列に関する情報は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公に利用可能な遺伝子データベースからも入手することができる。例えば、以下を参照のこと：西ナイルウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１２２９４；ＮＣ＿００１５６３）；デング１型ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ２３０２７）；デング２型ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１９１９７；ＮＣ＿００１４７４）；デング３型ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ９３１３０）；デング４型ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１４９３１）；黄熱ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ０３７００；ＮＣ＿００２０３１）；セントルイス脳炎ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１６６１４）；ダニ媒介脳炎ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ２７４９５；ＮＣ＿００１６７２）；クンジンウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ２７４５０４；ＡＹ２７４５０５）；キィアサヌアフォレストウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ７４１１１）；マリー谷脳炎ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ１６１２６６；ＮＣ＿０００９４３）；オムスク出血熱ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ１９３８０５；ＡＹ４３８６２６；Ｘ６６６９４；ＮＣ＿００５０６２）；ポワサンウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ３１０９２２；ＡＦ３１０９２０；ＡＦ３１０９１２；Ｌ０６４３６；ＮＣ＿００３６８７）；ヨコセウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＢ１１４８５８；ＮＣ＿００５０３９）；アポイウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ１６０１９３；ＮＣ＿００３６７６）；アロアウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ３７２４１３）。
本発明のキメラウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を作製するために、第２のフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が調製され、そのＥタンパク質をコードする領域が用いられ得る。第２のフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子としては、例えば、ゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。
あるいは、本発明のキメラフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を作製するために、第２のフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の任意の断片（例えば、ＰＣＲによる増幅ＤＮＡ断片など）が用いられ得る。
第２のフラビウイルスのゲノムＲＮＡは、日本脳炎ウイルスと同様の方法によって、調製することができる。
第２のフラビウイルスのｃＤＮＡもまた、日本脳炎ウイルスと同様の手法によって、ゲノムＲＮＡから構築できる。
あるいは、第２のフラビウイルスのゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの任意の断片は、第２のフラビウイルスとして用いるウイルスに関する公知のゲノム配列情報に基づいて、公知の方法により化学合成することもできる。
第２のフラビウイルスのゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの任意の断片は、日本脳炎ウイルスと同様に、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、Ｌｏｎｇ−ＰＣＲ法および／またはＬｏｎｇ−ＲＴ−ＰＣＲ法によって、ゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型として増幅することができる。
あるいは、第２のフラビウイルスのゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの任意の断片を、日本脳炎ウイルスと同様に、上記に列挙したような適切なベクターに挿入してクローニングすることもできる。
本発明のキメラフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中のＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、第２のフラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列と組換えることによって作製される。
日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中のＥタンパク質をコードする領域の組換えは、公知の組換え技術（例えば、Ｍｏｒｉｔａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８７：４１７−４２６，２００１に記載されるＬｏｎｇ−ＰＣＲ法を利用する方法など）によって行うことができる。
あるいは、本発明のキメラフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、日本脳炎ウイルスおよび第２のフラビウイルスに関するゲノム配列情報に基づいて、本発明のキメラフラビウイルスをコードする全ヌクレオチド配列を設計し、化学合成により作製することもできる。
本発明のキメラフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、ＤＮＡとして作製する場合、インビトロ転写のためのプロモーター配列がＤＮＡの５’末端に導入される。本発明のキメラフラビウイルスをコードするＤＮＡは、キメラフラビウイルスタンパク質を発現させる前の任意の段階で、導入されたプロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡへと転写される。用いられるプロモーター配列としては、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどが挙げられる。
本発明のキメラフラビウイルスをコードするＲＮＡは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどの当該分野で公知の遺伝子導入技術により、タンパク質の発現に適切な細胞（例えば、Ｃ６／３６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＭＣ−ＬＫ２細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｎ２ａ細胞、ＰＳ細胞など）に導入され、そしてこの細胞においてキメラフラビウイルスタンパク質が発現される。
あるいは、本発明のキメラフラビウイルスは、細胞破砕液や抽出液に、基質や酵素などを加えることによって、生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃えた、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法（無細胞系発現ともいう；例えば、米国特許第５，４７８，７３０号；Ｍａｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５５９−５６４，２０００；Ｓａｗａｓａｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４６５２−１４６５７，２００２を参照のこと）を利用して、キメラフラビウイルスタンパク質を取得することもできる。
本発明のキメラフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、この核酸分子中の日本脳炎ウイルスに由来するｐｒＭタンパク質および／またはＮＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列中に、ウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上生じるヌクレオチド変異を含む。
詳細には、ウイルスを弱毒化するアミノ酸変異とは、日本脳炎ウイルスＪａＯＡｒＳ９８２株の各構造タンパク質および非構造タンパク質のアミノ酸配列（Ｈ．Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６１：４９７−５１０，１９８７を参照のこと）を基準として表した場合、以下のアミノ酸置換である：ｐｒＭタンパク質の１番目のメチオニンのイソロイシンによる置換；ｐｒＭタンパク質の１４８番目（Ｍタンパク質の５６番目）のアスパラギンのトレオニンによる置換；ＮＳ２Ａタンパク質の４番目のアラニンのセリンによる置換；ＮＳ４Ｂタンパク質の５１番目のアスパラギンのリジンによる置換；ＮＳ４Ｂタンパク質の５２番目のバリンのイソロイシンによる置換；ＮＳ４Ｂタンパク質の６８番目のトレオニンのセリンによる置換；ＮＳ５タンパク質の１２６番目のロイシンのメチオニンによる置換；および／または、ＮＳ５タンパク質の８５４番目のセリンのアスパラギンによる置換。
あるいは、上記のアミノ酸置換はまた、それぞれのアミノ酸位置で導入されたアミノ酸に対する保存的アミノ酸を用いて行われ得る。
本明細書中において、「保存的アミノ酸」とは、物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。
好ましくは、本発明のキメラフラビウイルスは、上記のアミノ酸置換の内、少なくとも、ｐｒＭタンパク質の１番目のメチオニンのイソロイシンによる置換、および／または、ｐｒＭタンパク質の１４８番目（Ｍタンパク質の５６番目）のアスパラギンのトレオニンによる置換を含む。
上記のアミノ酸変異は、本発明のキメラフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を作製する任意の工程において導入することができる。
上記のアミノ酸変異の導入は、例えば、Ｍｏｒｉｔａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８７：４１７−４２６，２００１に記載されるＬｏｎｇ−ＰＣＲ法を利用する部位特異的変異誘発方法、あるいは、プラスミドへクローニングしたｃＤＮＡに対して、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法などの公知の方法またはこれらの方法を利用した変異導入用キット（例えば、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．より入手可能）などを用いて行うことができる。
あるいは、ｐｒＭおよび／またはＮＳタンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上含む日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、本発明のキメラフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の作製に用いることによって、本発明のキメラフラビウイルスにこれらの変異を導入できる。
ｐｒＭおよび／またはＮＳタンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上含む日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、前述の公知の部位特異的変異誘発方法を用いて、これらの変異を含まない日本脳炎ウイルス株（例えば、ＪａＯＨ０５６６株、ＪａＯＡｒＳ９８２株、ＪａＧＡｒ０１株、Ｎａｋａｙａｍａ株、Ｂｅｉｊｉｎｇ株、ＳＡ１４株、ＳＡ１４−１４−２株など）のゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡに、これらの変異を人為的に導入することによって作製することができる。
このようにして人為的に作製した、ｐｒＭおよび／またはＮＳタンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上含む日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子から、前述したような公知の方法によって、ウイルスタンパク質を発現させて、組換え日本脳炎ウイルスを作製することができる。
この組換え日本脳炎ウイルスを、前述したような適切な細胞に感染させ、細胞を培養することにより、培養した細胞から大量のゲノムＲＮＡが調製できる。
さらに、この組換え日本脳炎ウイルスは、それ自体が、弱毒日本脳炎ウイルスであり、日本脳炎に対する有望な弱毒生ワクチン候補であり得る。
ｐｒＭおよび／またはＮＳタンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上含む日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子はまた、このようなアミノ酸変異の１つ以上を生来含む日本脳炎ウイルス変異株からゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡを取得することにより調製することもできる。
ｐｒＭおよび／またはＮＳタンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異の１つ以上を生来含む日本脳炎ウイルス変異株としては、例えば、日本脳炎ウイルスＭＬ−１７株が挙げられる。ＭＬ−１７株は、ブタ用日本脳炎ウイルスワクチン株であり（例えば、Ｙｏｓｈｉｄａら、ＢＩＫＥＮ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ２４：４７−６７，１９８１を参照のこと）、財団法人  阪大微生物病研究会（大阪府吹田市山田丘３番１号  大阪大学内）から入手可能である。
あるいは、細胞での継代などにより生じた日本脳炎ウイルスの突然変異株の中から、ｐｒＭおよび／またはＮＳタンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異の１つ以上を含む株を、公知の方法により選抜して、そのゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡを、本発明のキメラフラビウイルスの作製に用いることもできる。
このようにして調製された、ｐｒＭおよび／またはＮＳタンパク質中にウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上含む日本脳炎ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡ）は、必要に応じて断片化して、前述したようなクローニングベクターに挿入してもよい。例えば、このような組換えベクターを利用すれば、安全かつ簡便に本発明のキメラフラビウイルスを作製することができる。
本発明のキメラフラビウイルスの構築を確認するには、例えば、作製したキメラウイルスから遺伝子を取得して、その塩基配列または対応するアミノ酸配列の全てもしくは一部（例えば、変異を導入した部分、２つのウイルスの連結部分など）を決定し、その配列が、意図された配列と一致していることを確かめればよい。
本発明はまた、本発明のキメラフラビウイルスを含む弱毒生ワクチン（以下、本発明のワクチンともいう）を提供する。ウイルスのＥタンパク質は、中和抗体を誘導する抗原決定基を含むため、ワクチンとして本発明のキメラフラビウイルスを接種すると、Ｅタンパク質として用いた第２のフラビウイルス種に対する抗体が産生される。
本発明のワクチンは、種々のフラビウイルス感染を予防するために、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなど）、ならびに鳥類などの動物に接種され得る。
本発明のワクチンは、懸濁液または凍結乾燥剤の形態で製造可能である。本発明のワクチンには、本発明のキメラフラビウイルスに加えて、ワクチン製剤において通常用いられる、薬学的に受容可能な、安定剤（例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、血清アルブミンなど）、無痛化剤（例えば、ブドウ糖など）などが配合され得る。
ワクチン接種の際、本発明のワクチンは、通常、薬学的に受容可能な担体に溶解または懸濁され得る。担体としては、例えば、水、食塩水（生理食塩水を含む）、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）などの液体の担体が挙げられる。
本発明のワクチンは、代表的には、０．１〜１．０ｍｌの用量あたり１０２〜１０６ＰＦＵの本発明のキメラフラビウイルスを含有する無菌水溶液として処方され、例えば、皮下、皮内、筋肉内などに接種され得る。
あるいは、フラビウイルスの中には、粘膜を介して感染することが知られている種もあるため、選択した第２のフラビウイルス種に応じて、本発明のワクチンを経口または経鼻投与してもよい。
さらに、本発明のキメラフラビウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）自体を、核酸ワクチン製剤として使用することもできる。
構築したキメラウイルスの効果および安全性の確認は、当該分野で公知の評価方法により、例えば、動物（例えば、マウス、サルなど）における、脳神経毒性、末梢からの中枢神経系への感染性（脳神経侵襲性）、感染予防効果、ウイルス血症の有無、中和抗体の産生などを評価することによって行うことができる。
以下の実施例によって、本発明をより具体的に説明するが、実施例は、本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】  （実施例１）
（日本脳炎ウイルスワクチンＭＬ−１７株の弱毒化変異部位の決定）
日本脳炎ウイルスワクチンＭＬ−１７株の弱毒化変異部位を決定するために、初めに、ＭＬ−１７株と、その親株である野生型の毒性日本脳炎ウイルスＪａＯＨ０５６６株との間で、完全長ゲノムｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびポリタンパク質のアミノ酸配列を比較した。
ＭＬ−１７株（財団法人  阪大微生物病研究会から入手した）の完全長ゲノムｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびＪａＯＨ０５６６株の完全長ゲノムｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を、Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６１：４９７−５１０，１９８７に開示される方法に従って決定した。いずれの株も、ｃＤＮＡの構築には、表１Ａに示すＰＣＲプライマーを用い、そして、構築したｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定には、表１Ｂに示す配列決定用プライマーを用いた。さらに、ＭＬ−１７株のポリタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）およびＪａＯＨ０５６６株のポリタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を、それぞれの完全長ゲノムｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推定した。
【表１Ａ】
0004871738.tif 000002
【表１Ｂ】
0004871738.tif 000003
＊：Ｆはフォワードプライマーを表し、Ｒはリバースプライマーを表す。
ゲノムｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較の結果、図１に示すように、ＭＬ−１７株は、２５個のヌクレオチド置換を有しており、その内の１０個のヌクレオチド置換に起因して、ポリタンパク質の開始メチオニンの次のアミノ酸から数えて、１２７番目、２７４番目、１２０９番目、２４６２番目、２４６３番目、２４７９番目、２６５２番目、２７５１番目、２８９６番目、および３３８０番目のアミノ酸において１０個のアミノ酸置換を生じていることが明らかとなった。
さらに、上記のＭＬ−１７株のポリタンパク質中のアミノ酸変異を、他の野生型の毒性日本脳炎ウイルスである、ＪａＯＡｒＳ９８２株、ＪａＧＡｒ０１株、Ｎａｋａｙａｍａ株、Ｂｅｉｊｉｎｇ株、およびＳＡ１４株、ならびに他の日本脳炎ウイルスワクチンである、ＳＡ１４−１４−２株のポリタンパク質の対応する部位のアミノ酸配列と比較した。
以下の株のポリタンパク質の推定アミノ酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋから入手して本実施例に用いた：
ＪａＯＡｒＳ９８２株のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１８３７０）；
ＪａＧＡｒ０１株のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０６９０７６）；
Ｂｅｉｊｉｎｇ−１株のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ４８９６１）；
ＳＡ１４株のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ５５５０６）；
ＳＡ１４−１４−２株のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ３１５１１９）。
Ｎａｋａｙａｍａ株のポリタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ１１２２９７；ＭｃＡｄａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１５８（２）：３４８−６０，１９８７などに記載される遺伝子および／またはアミノ酸の部分配列情報から、比較のために必要な領域のアミノ酸配列を入手して本実施例に用いた。
図２に示すように、ポリタンパク質のアミノ酸配列の比較の結果、ＭＬ−１７株とＪａＯＨ０５６６株との間の上記の１０個のアミノ酸置換の内、ポリタンパク質の開始メチオニンの次のアミノ酸から数えて、１２７番目、２７４番目、１２０９番目、２４６２番目、２４６３番目、２４７９番目、２６５２番目、および３３８０番目のアミノ酸位置における合計８個のアミノ酸置換は、ＭＬ−１７株に固有のアミノ酸変異であった。
Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６１：４９７−５１０，１９８７に記載される日本脳炎ウイルス（ＪａＯＡｒＳ９８２株）のポリタンパク質中の各構造タンパク質および非構造タンパク質の位置との比較から、ポリタンパク質中のこれらの８個のアミノ酸置換の位置は、それぞれ、ｐｒＭタンパク質の１番目および１４８番目（Ｍタンパク質の５６番目）；ＮＳ２Ａタンパク質の４番目；ＮＳ４Ｂタンパク質の５１番目、５２番目、および６８番目；ＮＳ５タンパク質の１２６番目および８５４番目のアミノ酸に相当した。
（実施例２）
（組換え日本脳炎ウイルスＭＳ−１４株およびＭＳ−１５株の作製）
ウイルスの弱毒化に対する、ＭＬ−１７株に固有のアミノ酸変異の影響を確認するために、Ｍｏｒｉｔａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８７：４１７−４２６，２００１に記載されるＬｏｎｇ−ＰＣＲ法を利用する部位特異的変異誘発法に従って、野生型の毒性日本脳炎ウイルスＪａＯＡｒＳ９８２株の遺伝子をバックボーンとして用いて、ｐｒＭタンパク質の１番目のメチオニンのイソロイシンによる置換を生じるヌクレオチド変異（ゲノムの４７９位のＧのＡによる置換）を導入した組換え日本脳炎ウイルスであるＭＳ−１４株、およびｐｒＭタンパク質の１４８番目（Ｍタンパク質の５６番目）のアスパラギンのトレオニンによる置換を生じるヌクレオチド変異（ゲノムの９１９位のＡのＣによる置換）を導入した組換え日本脳炎ウイルスであるＭＳ−１５株を作製した。
（ＭＳ−１４株の作製）
図３に示すように、日本脳炎ウイルス（ＪａＯＡｒＳ９８２株）の遺伝子ＲＮＡを鋳型として、プライマー１およびプライマー２のセット、プライマー３およびプライマー４のセット、ならびにプライマー５およびプライマー６のセットを用いて、Ｌｏｎｇ−ＲＴ−ＰＣＲ法により、それぞれのプライマーセットに対応する日本脳炎ウイルス遺伝子フラグメント（フラグメント１、２、および３）を作製した。
さらに、それぞれのフラグメントをアガロース電気泳動法により精製したのち、初めに、フラグメント１および２を鋳型として、プライマー１および４のセットを用いて再びＬｏｎｇ−ＰＣＲ法により遺伝子フラグメント４を作製した。この遺伝子断片を同様に精製し、次に、遺伝子フラグメント３および４を鋳型として、プライマー１および６のセットを用いてＬｏｎｇ−ＰＣＲ法を実施し、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する完全長日本脳炎ウイルスｃＤＮＡ（フラグメント５）を作製した。
この完全長日本脳炎ウイルスｃＤＮＡ（フラグメント５）を鋳型として、試験管内ＲＮＡ合成反応を実施し、人工の完全長日本脳炎ウイルス遺伝子ＲＮＡを作製した。このＲＮＡをエレクトロポレーション法により蚊細胞（Ｃ６／３６細胞）に導入し、５日間培養した後、培養上清中に出現した組換えウイルス（ＭＳ−１４株）を回収した。
（ＭＳ−１５株の作製）
ＭＳ−１５株については、プライマー２をプライマー７に、プライマー３をプライマー８に変更することで組換えウイルスを作製した以外、上記の方法に従って、組換えウイルスを回収した。
さらに、コントロールとして、変異を含まないウイルスを、プライマー２をプライマー９に、プライマー３をプライマー１０に変更することで取得した。
本実施例に用いたプライマーを表２に示す。
【表２】
0004871738.tif 000004
上記表において、Ｓはセンス配列を表し、Ｒは相補配列を表す。下線は、Ｔ７プロモーター配列を表し、二重下線は、ヌクレオチド変異を表す。
（実施例３）
（組換え日本脳炎ウイルスＭＳ−１４株およびＭＳ−１５株のＢＨＫ細胞における増殖能の評価）
実施例２で作製した組換え日本脳炎ウイルスＭＳ−１４株およびＭＳ−１５株の、ＢＨＫ細胞における増殖能を評価した。コントロールとして、野生型の毒性日本脳炎ウイルスＪａＯＡｒＳ９８２株を用いた。
ＭＳ−１４株、ＭＳ−１５株、およびＪａＯＡｒＳ９８２株を、それぞれ、ＢＨＫ細胞に感染させ、感染から２４、４８、および７２時間後の細胞培養上清を採取し、ウイルスの出現を確認した。各々の時間における培養上清中のウイルス量をプラーク法により測定した。全ての株について、ＢＨＫ細胞における増殖が確認された。
（実施例４）
（組換え日本脳炎ウイルスＭＳ−１４株およびＭＳ−１５株の、正常成熟マウスにおける神経毒性の評価）
実施例２で作製した組換え日本脳炎ウイルスＭＳ−１４株およびＭＳ−１５株を用いて、それぞれの株の正常成熟マウスの腹腔内接種法によって神経毒性を評価した。毒性コントロールとして野生型の毒性日本脳炎ウイルスＪａＯＡｒＳ９８２株、弱毒性コントロールとして日本脳炎ウイルスワクチンＭＬ−１７株を用いた。
１０匹のマウス群（４週齢の雌雄ＩＣＲマウス、各群５匹ずつ）に、１０１〜１０６プラーク形成単位のＭＳ−１４株、ＭＳ−１５株、ＭＬ−１７株、ＪａＯＡｒＳ９８２株を脳内接種し、３週間にわたり毎日観察し、ＬＤ５０をＲｅａｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法で算出した。本試験の結果を表３に示す。
【表３】
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＊：ＭＳ−１４  ｒｅｖは、Ｌｏｎｇ−ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発を用いてＭＳ−１４から作製したＭＳ−１４の復帰突然変異体を表す。
表３に示すように、ＭＳ−１４株およびＭＳ−１５株は、毒性のＪａＯＡｒＳ９８２株と比較して、有意に弱毒化されていた。特に、ＭＳ−１４株は、日本脳炎ウイルスワクチン株であるＭＬ−１７株に近い弱毒性を有していた。
このことは、ｐｒＭタンパク質中のアミノ酸置換により、マウスの神経毒性を低下させることが可能であることを示した。
上記の結果から、組換え日本脳炎ウイルスであるＭＳ−１４株およびＭＳ−１５株に導入したアミノ酸変異は、日本脳炎生ワクチン作製上、有用であることが示唆された。さらに、ＭＳ−１４は高濃度接種で低度の病原性が見られることから、ＮＳ上の変異もまた弱毒化に必要であることが示唆された。
（実施例５）
（日本脳炎ウイルスと西ナイルウイルスとのキメラフラビウイルス（ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ））のｃＤＮＡの構築）
日本脳炎ウイルスワクチンＭＬ−１７株のＥタンパク質が西ナイルウイルスのＥタンパク質により置換されたキメラフラビウイルスである、ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）を作製するために、Ｍｏｒｉｔａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８７：４１７−４２６，２００１に記載されるＬｏｎｇ−ＰＣＲ法を利用する組換え日本脳炎ウイルス作製法に従って、ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）のｃＤＮＡを構築した。
図４に示すように、日本脳炎ウイルス生ワクチン株（ＭＬ−１７株）の遺伝子ＲＮＡを鋳型として、プライマー１Ａおよびプライマー２Ａのセット、ならびにプライマー５Ａおよびプライマー６Ａのセットを用いて、Ｌｏｎｇ−ＲＴ−ＰＣＲ法により、それぞれのプライマーセットに対応する日本脳炎ウイルス遺伝子断片（フラグメント１Ａおよび３Ａ）を作製した。
また、西ナイルウイルス（ＮＹ９９−３５２６２−１１株）の遺伝子ＲＮＡを鋳型として、プライマー３Ａおよびプライマー４Ａのセットを用いて、Ｌｏｎｇ−ＲＴ−ＰＣＲ法により西ナイルウイルス遺伝子フラグメント２Ａを作製した。
それぞれのフラグメントを、アガロース電気泳動法により精製したのち、初めに、フラグメント１Ａおよび２Ａを鋳型として、プライマー１Ａおよび４Ａのセットを用いて、再びＬｏｎｇ−ＰＣＲ法により遺伝子フラグメント４Ａを作製した。
この遺伝子フラグメントを同様に精製して、次いで、遺伝子フラグメント３Ａおよび４Ａを鋳型として、プライマー１Ａおよび６Ａのセットを用いてＬｏｎｇ−ＰＣＲ法を実施し、５’末端にＴ７プロモーター配列を有し、かつ西ナイルウイルスＥタンパク質遺伝子を有する、ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）のキメラウイルスｃＤＮＡ（フラグメント５Ａ）を作製した。
本実施例に用いたプライマーを表４に示す。
【表４】
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＊：ＪＥは日本脳炎ウイルスＪａＯＡｒ９８２株を表し、ＭＬ１７は日本脳炎ウイルスＭＬ−１７株の配列を表し、ＷＮは西ナイルウイルスの配列を表す。ＳまたはＮはセンス配列を表し、Ｒは相補配列を表す。下線は、Ｔ７プロモーター配列を表す。
（実施例６）
（ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）のｃＤＮＡからのキメラフラビウイルスの産生）
実施例５で構築した日本脳炎ウイルスと西ナイルウイルスとのキメラフラビウイルスのｃＤＮＡ（図４中のフラグメント５Ａ）を鋳型として、試験管内ＲＮＡ合成反応を実施して、人工の完全長キメラウイルス遺伝子ＲＮＡを作製した。このＲＮＡをエレクトロポレーション法により蚊細胞（Ｃ６／３６細胞）に導入して、５日間培養した後、培養上清中に出現したキメラウイルスを回収した。
（実施例７）
（ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）キメラフラビウイルスの増殖能の評価）
キメラウイルスは、実施例６で得られたＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）を用いた。ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）とＭＬ−１７株を、Ｃ６／３６細胞およびＢＨＫ細胞において増殖させ、その感染培養液を分注して、−７０℃で保存した。何れの細胞にもイーグルＭＥＭ培養液に非必須アミノ酸を添加した培養液を用い、必要に応じた濃度（２〜１０％）で牛胎児血清を添加した。増殖実験の培養液の感染価を表５に示す。ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）は、ＭＬ−１７と同等の増殖能を有していた。
【表５】
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（実施例８）
（ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）キメラウイルスの神経毒性の評価）
実施例６で作製した組換えキメラウイルス、ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）を用いて、正常成熟マウス脳内接種法で神経毒性を評価した。また、腹腔内投与で末梢から中枢神経系への感染（脳神経侵襲性）を調べた。コントロールとして、野生型の強毒株日本脳炎ウイルスであるＪａＯＨ０５６６株、西ナイルウイルスＮＹ９９−３５６２−１１株、弱毒株日本脳炎ウイルスワクチンＭＬ−１７株を用いた。
生後４週齢のＣ５７ＢＬ／Ｂ６マウスに１０１〜１０７の各ウイルスを脳内に接種し、２８日間観察した。ＬＤ５０をＲｅａｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法で算出した。
表６に、実験から得られたＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）のＬＤ５０を示す。ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）は、強毒のＪａＯＨ０５６６株と比較して、有意に弱毒化されていた。特に、ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）は、日本脳炎ウイルスワクチン株であるＭＬ−１７株に匹敵する弱毒性を有していた。
【表６】
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（実施例９）
（ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）キメラウイルスの性状）
ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）キメラウイルスの蚊に対する感染性を検討した。コガタアカイエカＯＫ７（Ｃｕｌｅｘ  ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）に、ウサギ血液（抗体陰性）に混合したウイルスを経膜法により吸わせた。ＰＦＵ（Ｐｌａｑｕｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）、および乳のみマウスの発症率を評価することにより感染率を計算した。
経膜法によりキメラウイルスを吸わせた蚊を１０日、２１日間飼育後、これを乳剤とし、乳のみマウス脳内接種およびＰＦＵの評価によりウイルスの存在の証明を行った。ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）は、蚊１匹あたり１０２ＰＦＵ以上のウイルスを吸わせても、全くウイルスの存在は証明されなかった。
ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）キメラウイルスはコガタアカイエカ（Ｃｕｌｅｘ  ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）に対して感受性を示さなかった。
（実施例１０）
（ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）キメラウイルスを含む生ワクチンの防御効力の評価）
免疫実験には２週齢のＣ５７ＢＬ／Ｂ６およびＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを用いた。
二つの近交系マウスを用いて検討した。免疫をしなかったコントロール群では、西ナイルウイルス（ＮＹ９９−３５２６２−１１株）の脳内チャレンジによって致死的な感染を示したのに対して、ＭＬ−１７／ＷＮ（Ｅ  ｇｅｎｅ）を腹腔内に接種した群では有意な感染防御が認められた。
【産業上の利用可能性】  本発明によって、Ｅタンパク質以外の部分に弱毒化変異を有する弱毒キメラフラビウイルスが提供される。本発明のキメラフラビウイルスの弱毒性は、Ｅタンパク質を改変せずに達成できるため、免疫誘導能を低下させることなく、種々のフラビウイルス感染に対する弱毒生ワクチンを短期間で実用化することができる。
本出願は、日本特許出願、特願２００４−３７４６３０を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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