(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源及び窒素源を含有する培地を連続的に培養槽に添加する微生物の連続培養によるエリスリトールの製造方法において、（１）培養槽内の培養液量及び培養液の炭素源濃度を測定し、（２）測定された培養液量及び炭素源濃度の測定値に基づき培養槽に投入される新規培地の投入速度及び培養槽から抜き出される培養液の抜き出し速度を算出し、（３）算出された新規培地の投入速度及び培養液の抜き出し速度に基づき新規培地の投入量及び培養液の抜き出し量を制御することにより、培養槽内の培養液量及び培養液中の炭素源濃度を一定値に保ち、かつ、（４）新規培地中の、炭素源中の炭素と窒素源中の窒素の比（Ｃ／Ｎ比）を一定値に設定すること、を特徴とする連続培養によるエリスリトールの製造方法。
【請求項２】
培養液中の炭素源濃度が１〜１００ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載の連続培養によるエリスリトールの製造方法。
【請求項３】
新規培地中の窒素源量が、炭素源中の炭素と窒素源中の窒素の比（Ｃ／Ｎ比）で４０〜４００であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の連続培養によるエリスリトールの製造方法。
【請求項４】
微生物がオーレオバシディウム属、トリコスポロノイデス属、モニリエラ属、イエロビア属、ウスチラゴ属、フィロバヂウム属、トリゴノプシス属、カンジダ属、トルロプシス属、ハンゼヌラ属、ピヒア属、デバリオミセス属、ハンゼニアスポラ属、サッカロミセス属、クロエケラ属、クリュベロミセズ属、トルラスポラ属、アスペルギルス属、ユーペニシリウム属、モナスカス属、ペニシリウム属、ベルチシリウム属、チゴピヒア属、ヤマダジマ属、ロドトルラ属に属する微生物であることを特徴とする請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
（１）培養槽内の培養液量測定装置、（２）培養槽内の培養液の炭素源濃度測定装置、（３）コンピューター及び（４）培地の投入速度並びに培養液の抜き出し速度の制御装置から構成される装置であり、（１）の装置及び（２）の装置で測定された各データが、（３）のコンピューターに自動的に入力されるように接続してあり、入力された当該データに基づき（３）コンピュータが設定した培地の投入速度及び培養液の抜き出し速度を（４）の装置に伝送するように接続してあり、（４）の装置が伝送された当該速度に基づき培地の投入量及び培養液の抜き出し量を制御することを特徴とする請求項１〜請求項４の何れか一項に記載のエリスリトールの製造方法を実施するための装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エリスリトール生産能を有する微生物を連続的に培養してエリスリトールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エリスリトールの製造方法としては、回分培養によるもの、例えばオーレオバシデュウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）によるもの（特開昭６３−９８３１号公報）、モニリエラ属（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）によるもの（特開昭６０−１１０２９５号公報、特開平１０−２１５８８７）、トリコスポロノイデス・オエドセファリス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｏｉｄｅｓ  ｏｅｄｏｃｅｐｈａｌｉｓ）（特開平９−２５１７６５号公報）、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｏｉｄｅｓ  ｍｅｇａｃｈｉｌｉｅｎｓｉｓ）（特開平１０−９６号公報）などが知られている。
【０００３】
また、エリスリトールの生産性を上げるため、連続培養による生産、例えばオーレオバシデュウム属（特公平７−３４７４９号公報）、オーレオバシデュウム属及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）によるもの（特開平５−１３７５８５号公報）が知られている。これらの連続培養を実施する上での制御方法としては、培養槽内の培養液の溶存酸素濃度を０．２ｐｐｍ以上に維持し、菌体量を４０〜２００ｇ／Ｌに維持する方法（特公平７−３４７４９号公報）及び供給する培地の炭素源と窒素源の濃度比により菌体の窒素含有率を制御し、その窒素含量を２．５〜４．５％に維持する方法（特開平５−１３７５８５号公報）が用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これら培養槽内の菌体濃度を一定に保つ方法では、単位菌体当たりのエリスリトール生産性が変化した場合、培養槽から出てくる培養液の糖組成と液量が変化し、培養後の精製工程の運転管理が難しくなる。また、菌体内の窒素含量により連続培養を制御する方法では、オンラインで窒素含量を測定することが困難であり自動化に関し問題がある。
【０００５】
これらの問題を解決する方法として、コンピューターによって培養槽内の炭素源濃度を常に低レベルに維持するように制御する微生物の好気的培養方法（特開平５−７６３４６号公報）がある。これは、培養槽内の炭素源が枯渇するときに生ずるｐＨの上昇又は溶存酸素濃度の上昇をセンサーにより検出し、コンピューターを介してフィード液のフィード速度を算出する方法である。
【０００６】
ところが、微生物によるエリスリトールの生産において、培養液中のｐＨはエリスリトールとともに生成する有機酸などにより低下するが、効率的にエリスリトールを生産するためにはｐＨ値を一定に保つ必要があり、水酸化ナトリウム等のアルカリによりコントロールを行っている。即ち、ｐＨ値を一定に維持する必要性が強い培養条件下では、ｐＨ値がほぼ一定に保たれているため、ｐＨを指標に炭素源の投入速度をコントロールする連続培養法の実施はできない。
【０００７】
また、溶存酸素濃度は培養液中の炭素源濃度と比例関係になく、上記公報に記載があるようにセンサーの信頼性が低いうえ、通気攪拌状態により大きく変動してしまう。このため、溶存酸素濃度を指標とする培養の制御は、実用には適さない。さらに上記方法は、炭素源が枯渇してからフィードを行うため培養槽内の炭素源濃度が常に一定とはならず、抜き出した培養液の組成も一定とはならないため精製工程が煩雑となる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、培養中の運転制御方法が容易であり、工業的に効率よくエリスリトールを生産する方法及びそのための装置を見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、炭素源及び窒素源を含有する培地を連続的に培養槽に添加する微生物の連続培養によるエリスリトールの製造方法において、（１）培養槽内の培養液量及び培養液の炭素源濃度を測定し、（２）測定された培養液量及び炭素源濃度の測定値に基づき培養槽に投入される新規培地の投入速度及び培養槽から抜き出される培養液の抜き出し速度を算出し、（３）算出された新規培地の投入速度及び培養液の抜き出し速度に基づき新規培地の投入量及び培養液の抜き出し量を制御することにより、培養槽内の培養液量及び培養液中の炭素源濃度を一定値に保ち、かつ、（４）新規培地中の、炭素源中の炭素と窒素源中の窒素の比（Ｃ／Ｎ比）を一定値に設定すること、
を特徴とする連続培養によるエリスリトールの製造方法に存する。
【００１０】
さらには、（１）培養槽内の培養液量測定装置、（２）培養槽内の培養液の炭素源濃度測定装置、（３）コンピューター及び（４）培地の投入速度並びに培養液の抜き出し速度の制御装置から構成される装置であり、（１）の装置及び（２）の装置で測定された各データが、（３）のコンピューターに自動的に入力されるように接続してあり、入力された当該データに基づき（３）コンピューターが設定した培地の投入速度及び培養液の抜き出し速度を、（４）の装置に伝送するように接続してあり、（４）の装置が伝送された当該速度に基づき培地の投入量及び培養液の抜き出し量を制御することを特徴とするエリスリトールの製造方法を実施するための装置に存する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明で使用される微生物は、エリスリトール生産能を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば以下に示す微生物が使用される。
【００１２】
特公昭６３−９８３１号公報に記載されるオーレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）に属する微生物。特公平４−６３５号公報、特開平９−１５４５８９号公報、特開平９−２５２７６５号公報、特開平１０−９６号公報、特開平１０−９４３９８号公報、特開平１０−２１５８８７号公報又は特開平１１−３２７５４号公報に記載されるトリコスポロノイデス属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｏｉｄｅｓ）に属する微生物。特開昭６０−１１０２９５号公報、特開平９−１５４５８９号公報又は特開平１０−２１５８８７号公報に記載されるモニリエラ属（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）に属する微生物。特開平９−１５４５９０号公報又は特開平１０−２１５８８７号公報に記載されるイエロビア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌｌａｇｏ）、フィロバヂウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）又はトリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）に属する微生物。特公昭４７−４１５４９号公報に記載されるトリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する微生物。特公昭５１−２１０７２号公報に記載されるカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）又はデバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物。
【００１３】
バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｌｅｔｔ．，７（４），１１９−２３４（１９８５））に記載されるハンゼニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、クリュベロミセズ属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）又はトルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）に属する微生物。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属する微生物（Ｓ．Ａ．Ｂａｒｅｒ，  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２５３８−２５８６（１９５８））。エクスペリメンタル・マイコロジー（Ｇａｂｙ．Ｅ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，４，１６０−１７０（１９８０））に記載されるユーペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属する微生物。チゴピヒア属（Ｚｙｇｏｐｉｃｈｉａ）（現在はヤマダジマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）に分類される）に属する微生物（鈴木、発酵と工業、３５（６）、（１９７７））。ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）に属する微生物（Ｊ．Ｇｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１８，２６９（１９５８））。
【００１４】
本発明に使用される微生物として、好ましくはトリコスポロノイデス属に属する微生物、特に好ましくはトリコスポロノイデス・メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４３０、旧名：オーレオバイデウム・ＳＮ−Ｇ４２株）が挙げられる。
【００１５】
本発明で微生物を培養する培地の栄養成分は、一般的に炭素源、窒素源、無機塩類等からなる。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、シュークロース等の糖類及びこれらの糖類を含む澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜等の糖質等を使用することができ、特にこれらに限定されるものではないが、トリコスポロノイデス属に属する微生物を使用する場合は、グルコースの使用が好ましい。
【００１６】
窒素源としては、菌体が利用可能な無機窒素化合物又は有機窒素化合物が使用され、例えば酵母エキス、ペプトン、コーンスチープリカー、アンモニア、アンモニウム塩、尿素、各種アミノ酸等が使用されるが、特にこれらに限定されない。
【００１７】
無機塩類としては、例えばリン酸、マグネシウム、カリウム、カルシウム、鉄等の無機塩類が使用されるが特にこれらに限定されるものではない。また、ビタミン、ヌクレオチド等の微生物の生育を補助する成分を必要に応じ添加する。連続培養時、これらの栄養成分は炭素源と混合しあるいは炭素源と別ラインで培養槽に供給される。
【００１８】
更に、通気攪拌条件下で培養を行う場合は、消泡剤、ｐＨ調整剤、緩衝液を添加することが好ましい。消泡剤としては、無機系、有機系の消泡剤が使用され、例えばポリビニルアルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、シリコン系の化合物等が挙げられ、ｐＨ調整剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、硫酸、塩酸、硝酸等が挙げられ、緩衝剤としては乳酸ナトリウム、各種リン酸塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明では、上記に挙げられる必要な栄養分を含む培地で培養を開始し、培養液中の炭素源濃度が予め設定された炭素濃度に達した時点で、新規培地の投入を開始する。新規培地の投入のために設定される炭素源濃度は、使用する微生物により異なるが通常５〜２００ｇ／Ｌの範囲であり、トリコスポロノイデス属に属する微生物を使用する場合は５〜１００ｇ／Ｌの範囲に設定することが好ましい。また、連続培養時の培養液中の炭素源濃度は、使用する微生物により異なるが通常１〜１００ｇ／Ｌの範囲に維持され、トリコスポロノイデス属に属する微生物を使用する場合は５〜５０ｇ／Ｌの範囲で維持することが好ましい。新規培地はポンプあるいは圧力差などを利用し培養槽に投入される。
【００２０】
培養槽内の炭素源濃度は、生産菌の活性の指標となる。つまり、生産菌の活性あるいはエリスリトール生産性が低下した場合、培養槽内の炭素源濃度の上昇、エリスリトール濃度の減少が起こる。ここで炭素源濃度を一定に保つようにコントロールすると、炭素源の投入速度が遅くなるため滞留時間が延長し、培養槽内のエリスリトール濃度の減少を抑えられ、連続培養期間中の培養液中の糖組成をほぼ一定にすることができる。従って、精製工程の運転条件をコンスタントに実施することが可能となる。また、炭素源濃度の設定は、使用する炭素源が精製工程でエリスリトールと分離可能な場合は、エリスリトールの生成速度が増すため高めの濃度設定を行い、分離困難な場合は出来るだけ低濃度に設定する。
【００２１】
培養槽内の炭素源濃度の測定は、例えば一定量を培養槽からオートサンプラーなどにより抜き取り、高速液体クロマトグラフィーあるいは酵素センサー等の分析装置に供し炭素源濃度を算出する。また、炭素源濃度のコントロールは、算出された炭素源濃度の値をコンピューターに伝送し、該コンピューターによる処理の後、ポンプの速度あるいは調節バルブの調節が自動的に行われ、炭素源の供給速度及び培養液抜き出し速度を調節することによって実施される。
【００２２】
培養槽内の培養液量は、培養条件を安定に維持するために一定に維持する必要がある。培養液量は、通常の培養槽に設置されている液面計、例えば差圧・圧力式液面計、超音波式液面計、電子天秤等によって測定される。また、培養液量のコントロールは、測定された培養液量の値をコンピューターに伝送し、該コンピューターによる処理の後、ポンプの速度あるいは調節バルブの調節が自動的に行われ、培養液抜き出し速度を調節することによって実施される。培養槽内の炭素源濃度のコントロール並びに培養液量のコントロールは同一のコンピューターを用いて、同時に調節されることが好ましく、これら測定から調節までの一連の流れは自動的に行われる。該コンピューターは独立したものに限られず、分析装置、計量機及び流量制御装置から選ばれる１種以上に組み込むことも可能である。
【００２３】
投入する窒素源は、炭素源と別経路での投入が好ましいが、炭素源と反応しないものであれば炭素源と混合し投入することもできる。炭素源と窒素源を別経路で投入する場合、炭素源と窒素源の投入量比を維持するため、培養槽内の培養液炭素源濃度に連動して変動する新規培地の炭素源投入量にあわせて、随時窒素源の投入量を変動させる必要がある。窒素源の投入量はコンピューターを介して炭素源との比率（Ｃ／Ｎ比）が一定になるように、窒素源の投入速度をポンプの速度あるいは調節バルブにて調節する。Ｃ／Ｎ比は４０〜４００、好ましくは８０〜２５０の範囲内の一定値に設定される。設定されるＣ／Ｎ比は、使用する生産菌により異なるため、予め予備実験を通してエリスリトールの生産性との関係を求めておけばよい。また、どのＣ／Ｎ比を設定するかは、実際に本発明法にてエリスリトールを製造する場所に於けるコスト試算を行い決定する。
【００２４】
培養液中に生産されたエリスリトールを採取する方法は、公知の方法（特公平７−３４７４８号公報等）に従って行えばよい。例えば、培養液から遠心分離や濾過等により微生物菌体を除去した後、清澄液をイオン交換樹脂、活性炭により脱塩・脱色し、エリスリトールを結晶化させ、乾燥後取得することができる。
【００２５】
本発明の装置は、換言すれば（１）培養槽内の培養液量測定装置、（２）培養槽内の培養液の炭素源濃度測定装置、（３）コンピューター、（４）培地の投入速度及び培養液の抜き出し速度の制御装置から構成される装置であり、（１）の装置及び（２）の装置で測定された各データが、（３）のコンピューターに自動的に入力されるように接続してあり、入力された当該データに基づき（３）コンピュータが設定した培地の投入速度及び培養液の抜き出し速度を、（４）の装置に伝送するように接続されている装置である。
【００２６】
【実施例】
以下に本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、各実施例において使用した装置は図３に示す。これは、図２に示す装置において、炭素源、窒素源及び培養槽内の培養液の重量を測定する計測機として電子天秤、流量制御装置としてポンプ、そして炭素源濃度測定装置として酵素センサーを使用したものである。
【００２７】
実施例１
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％を含む培地５０ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに入れ綿栓し、１２０℃、２０分間滅菌後、常法により斜面培地よりトリコスポロノイデス・メガチリエンシスＳＮ―Ｇ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４３０）を接種した。これを温度３５℃で３日間振盪培養した（得られた種培養液を以下「種培養液１」という）。グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、コーンスチープリカー３．７％を含む培地１．５Ｌを３Ｌ発酵槽に入れ、１２０℃、２０分間滅菌後上記種培養液１を接種し、３５℃で２日間通気攪拌培養した（得られた種培養液を以下「種培養液２」という）。次いで、グルコース４０％、コーンスチープリカー０．８％を含む本培養培地１．５Ｌに上記種培養液２を接種し、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度５００ｒｐｍ、圧力０．５ｋｇ／ｃｍ２で培養した。培養開始後、グルコース濃度が２０ｇ／Ｌになった時点から新規培地の供給を開始し連続培養を開始した。連続培養時の供給培地はグルコース４０％、窒素源量がＣ／Ｎ比で１６７とした。運転条件は、本培養と同一条件で行い、培養槽内のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌに維持されるように設定した。その結果、連続区間中の得られた培養液中のエリスリトール濃度を高速液体クロマトグラフィーの測定値にもとづき算出したところ、エリスリトール収率は５５％、生成速度は２．２ｇ／Ｌ／ｈｒであった。
結果として、培養槽内のグルコース濃度をグルコースセンサーで管理することにより、グルコース濃度を全自動で１０ｇ／Ｌに維持することができ、また、連続培養５５０時間中の平均グルコース投入速度は４ｇ／Ｌ／ｈｒであった。
【００２８】
実施例２
実施例１と同様に種培養と本培養を行い、グルコースが２０ｇ／Ｌになった時点で連続培養を開始した。連続培養時の供給培地の窒素源量をＣ／Ｎ比で９３とし、その他の条件は実施例１と同様に設定した。連続培養中に得られた培養液のエリスリトール濃度を高速液体クロマトグラフィーの測定値にもとづき算出した結果、エリスリトール収率は４７％、生成速度は３．６ｇ／Ｌ／ｈｒであった。
なお、平均のグルコース投入速度は７．８ｇ／Ｌ／ｈｒであった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明は、培養中の運転制御が容易であり、工業的に効率よくエリスリトールを生産することができる。
【００３０】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃ／Ｎ比とエリスリトール収率及び生成速度の関係を示す図である。
【図２】本発明の装置の一例を示す図である。
【図３】実施例１及び２に使用の装置を示す図である。
【図４】実施例１の培養経過を示す図である。
【符号の説明】
１  培養槽
２  培養液
３  抜き取り培養液
４  炭素源
５  窒素源
６  炭素源濃度測定装置
７  コンピューター
８  攪拌機
９  計量機
１０  流量制御装置
１１  電子天秤
１２  ポンプ
１３  酵素センサー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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