(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の軟骨組織の修復に使用するためのポリマー組成物であって、少なくとも血液と混合され、血液と混合されると混合物になり、前記混合物が、時間が経つ又は加熱されると非液体状態に変化し、導入部位に保持され、前記軟骨組織の修復のためにそこに接着するポリマー組成物において、ポリマーを含み、無機塩又は有機塩を含む緩衝液に溶解又は懸濁され、前記ポリマーとして少なくともキトサンを含む、ポリマー組成物。
【請求項２】
天然、組換えもしくは合成蛋白質、またはポリアミノ酸を含む、請求項１記載のポリマー組成物。
【請求項３】
ポリアミノ酸がポリリジンである、請求項２記載のポリマー組成物。
【請求項４】
天然蛋白質が可溶性コラーゲンまたはゼラチンである、請求項２記載のポリマー組成物。
【請求項５】
カルボキシル官能基、アミノ官能基、スルホン官能基、ホスホン官能基、ホスフェン官能基を含み、さらなる官能基を含むまたは含まない、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、合成ホモコポリマーおよびブロックコポリマーを含む、請求項１記載のポリマー組成物。
【請求項６】
さらなる官能基が、ヒドロキシル基、チオール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、およびアロイルオキシ基からなる群より選択される、請求項５記載のポリマー組成物。
【請求項７】
無機塩がナトリウム塩、塩化物、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、硫酸塩、およびカルボン酸塩からなる群より選択される、請求項１記載のポリマー組成物。
【請求項８】
グリセロールリン酸、フルクトースリン酸、グルコースリン酸、Ｌ−セリンリン酸、アデノシンリン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＭＥＳからなる群より選択される有機塩を含む緩衝液中に溶解または懸濁される、請求項１記載のポリマー組成物。
【請求項９】
６．５と７．８の間のｐＨを持つ、請求項１〜８のいずれか記載のポリマー組成物。
【請求項１０】
ポリマー溶液の浸透圧が、２５０ ｍＯｓｍ／Ｌと６００ｍＯｓｍ／Ｌの間の生理的値に調節される、請求項１〜９のいずれか記載のポリマー組成物。
【請求項１１】
血液が、静脈血、動脈血、骨由来の血液、骨髄由来の血液、臍帯血、および胎盤血からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか記載のポリマー組成物。
【請求項１２】
血液の成分の凝固が阻止されている、請求項１〜１１のいずれか記載のポリマー組成物。
【請求項１３】
血液の成分が、クエン酸塩、ヘパリン、およびＥＤＴＡからなる群より選択される抗凝固剤を含む、請求項１２記載のポリマー組成物。
【請求項１４】
導入部位での凝固／固体化を向上するために、血液が凝固促進物質を含む、請求項１〜１３のいずれか記載のポリマー組成物。
【請求項１５】
凝固促進物質が、トロンビン、カルシウム、コラーゲン、エラグ酸、エピネフリン、アデノシン二リン酸、組織因子、リン脂質、および凝固因子からなる群より選択される、請求項１４記載のポリマー組成物。
【請求項１６】
凝固因子が第ＶＩＩ因子である、請求項１５記載のポリマー組成物。
【請求項１７】
血液が、自己または非自己である、請求項１〜１６のいずれか記載のポリマー組成物。
【請求項１８】
血液又は血液の成分の量に対して１：１００から１００：１までの種々の比の量で使用される、請求項１〜１７のいずれか記載のポリマー組成物。
【請求項１９】
ポリマー組成物および血液が音波、撹拌、ボルテックス、またはシリンジを何度も通過させることによって機械的に混合される、請求項１〜１８のいずれか記載のポリマー組成物。
【請求項２０】
緩衝液が、グリセロールリン酸を含む緩衝液である、請求項８記載のポリマー組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
(a) 発明の分野
本発明は軟骨組織、ならびに半月板、靭帯、腱、骨、皮膚、角膜、歯周組織、膿瘍、切除した腫瘍、および潰瘍を含むがこれらには限定されることのない他の組織の修復の改善および再生のための組成物および方法に関する。
【０００２】
(b) 先行技術の説明
1) 軟骨修復の問題
軟骨：構造、機能、発生、病理
関節軟骨は可動関節の骨の末端を覆い、下にある骨構造に移動力を分散させ、同時にほぼ摩擦のない関節界面を形成している。このような性質は、II型コラーゲンおよび他の少量コラーゲン成分、ならびに高含有量のプロテオグリカンアグリカンからなる細胞外マトリックスによって提供されている。一般に、線維性コラーゲンのネットワークは張力および剪断力に抵抗し、高い電荷を持つアグリカンは圧縮および間質液の流れに抵抗する。摩擦の低さは、関節面の特別な分子組成および滑液のため、ならびに関節面に加重がかかると間質液が滲出するためである（Ateshian、1997; Higakiら、1997; SchwartzおよびHills、1998）。
【０００３】
関節軟骨は、長骨の発生時に、前軟骨間葉細胞の凝縮、ならびに主にI型コラーゲンからII型コラーゲンおよびアグリカンへの表現型の転換の誘導後に、形成される（Hall、1983; Pechakら、1986）。軟骨細胞が肥大し、X型コラーゲン発現に転換し、それにともない血管の侵襲、マトリックスの石灰化、骨芽細胞の出現、および骨マトリックスの生産が起きると、骨が形成される。成人では、関節軟骨の薄い層が骨の末端に残り、細胞外マトリックスの合成、集合、および代謝回転を通して軟骨細胞によって維持される（Kuettner、1992）。関節軟骨の疾病は、物理的な外傷のために骨折が起きたり、多くの関節炎に特徴的に見られるようなよりゆるやかな侵食によって肋軟骨下骨が露出して症候性の関節痛を発現して起きる（McCartyおよびKoopman、1993）。成人では、関節軟骨以外にも、耳や鼻などの、しばしば再建手術の対象となるいくつかの体の部位にも、軟骨組織は残っている。
【０００４】
2) 軟骨の修復：自然の応答
損傷に対する成人の関節軟骨の反応は限定的であるが、これは主に血管化の欠如と、高密度のプロテオグリカンに富む細胞外マトリックスの存在のためである（Newman、1998; BuckwalterおよびMankin、1997; MinasおよびNehrer、1997）。前者は炎症性および多分化能性修復細胞の出現を阻害し、後者は移動を促進しないマトリックス中に定住軟骨細胞を拘束する。しかし、肋軟骨下骨を貫通する病変は、高度に血管化した骨への導管を形成し、病変に骨および骨髄由来のフィブリン凝塊を形成させ、肉芽組織が生じる。肉芽組織の深い部分は、肋軟骨下骨プレートを再構成し、上部は線維軟骨性の修復組織に転換する。この組織は、一時的に硝子軟骨の組織学的形態を示すが、機械的性質は異なり（Weiら、1997）、局所的な機械的環境に耐えられず、損傷後1年以内に分解が見られる。したがって、成人の関節軟骨における修復に対する自然の応答は、部分的な厚さの病変では修復応答がなく（軟骨の流れと局所的な軟骨細胞のクローニングのみ）、骨貫通した全層の病変では、限定的で不成功な応答が見られる。しかし、未熟な関節軟骨における全層の病変は、成人よりもうまく治癒し（DePalmaら、1966; Weiら、1997）、胎児関節軟骨の表面的な裂傷は、脈管構造または骨由来の細胞の関与なく完全に治癒するので（Nambaら、1998）、年齢は重要な要素である。
【０００５】
3) 補助した軟骨修復に対する現在のアプローチ
症候性軟骨欠損に対する現在の臨床治療の技術の目的は：1) 削りと壊死組織切除による表面の不揃いの除去、2) 上述の自然な修復応答を補うための、穿孔、破砕、または剥離による肋軟骨下骨の貫通（一連の骨髄刺激技術）、3) 残存軟骨を関節に使用するための関節の再配置または骨切り、4) 薬理学的修飾、5) 組織移植、および6) 細胞移植（Newman、1998; BuckwalterおよびMankin、1997）である。これらの方法の大部分は、症状軽減のために短期的（数ヶ月から数年）な利益があるが、数年後にも関節病変の修復の成功を一貫して示せるものはない。削り、壊死組織切除、穿孔、破砕および剥離関節形成という骨髄刺激技術は、症状の一時的緩和をもたらすが、機能の低い線維軟骨性組織を生成し、これは最終的には分解される。欠損部位に成長因子を供給する薬理学的修飾は、自然の修復を補うが、現在のところまだ十分ではない（HunzikerおよびRosenberg、1996; Sellersら、1997）。生存可能な軟骨細胞を含む同種および自家の骨軟骨組織移植片では修復はより成功するが、ドナーがかなり限られているという問題がある（Mahomedら、1992; Outerbridgeら、1995）。
【０００６】
4) 骨髄刺激
一連の骨髄刺激技術には、壊死組織切除、削り、穿孔、微小破砕、および剥離関節形成術が含まれる。これらは現在、全層、すなわち肋軟骨下骨に達し、通常は面積が3 cm2未満の限られたサイズの関節軟骨の巣状病変の治療に整形外科診療で広く使用されている。これらの手技の使用は、軟骨/骨の界面を乱すことによって、骨から無血管の軟骨欠損への出血を誘導することにより、関節軟骨病変部に血塊を形成できると考えたプライディー（Pridie）らが開始した（Pridie、1959; Insall、1967; DePalmaら、1966）。その後この血腫は、治癒の成功または少なくとも血管化組織の創傷における瘢痕化に至る創傷治癒現象の古典的カスケードを開始する（Clark、1996）。プライディー（Pridie）の穿孔技術の改変は、その後提案されたが、これには剥離関節形成（ChildersおよびEllwood、1979; Johnson、1991）および微小破砕（Rodrigoら、1993; Steadmanら、1997）が含まれる。剥離関節形成は、電動器具を用いて異常に緻密な肋軟骨下骨を破砕し、より柔らかい深部の骨中の血液に到達するものである。微小破砕技術では、ピックまたは突きぎりを用いて十分に深く（通常3〜4 mm）肋軟骨下骨プレートに穿孔し、やはり脈管供給源に到達して軟骨病変内で血塊を形成する。微小破砕技術を行なう医療従事者によると、この方法では熱に誘導される壊死がなく、穿孔のようにプレートに大きな穴を開ける代わりに数多くの小さな破砕を行なうので肋軟骨下骨プレートの生体力学的な不安定化が少ないので、成功率が高いことが観察されるという（Steadmanら、1998）。関節軟骨の巣状病変治療のさらに別の関連する技術は、モザイク形成または骨軟骨自家移植(OATS)で、軟骨/骨シリンダーが関節の末梢の「使用されない」領域から、軟骨病変を含む高度に加重される領域に移植される（Hangodyら、1997）。
【０００７】
どのタイプの関節軟骨病変に、どのタイプの治療を施すかということに関しては、整形外科医間でも意見の一致はない。また、特定の適用に関して、これらの治療の有効性を示す正確な科学的研究もない。したがって、軟骨病変の治療法の選択は、医療従事者の訓練、好み、および個人的経験に負うところが多い。意見の一致がない理由はいくつもあるが、治療する病変のタイプの変動が大きく、「良質の」血塊の形成の成功が制御できないとまでは言わなくとも変動的なためでもある。これらの手技で良質の血塊を形成する際の問題点には、1) 骨からの出血が制御できないという性質があることで、出血は軟骨病変部を完全に充填することはないこと、2) 血塊形成後、数分以内に血小板を介した血塊の収縮が起こるため、血塊のサイズが低下し、周りの軟骨からはがれることがあること（Cohenら、1975）、3) 骨の血液が滑液または循環する関節鏡検査の液体で希釈されること、および4) 滑液による線維素溶解または血塊溶解活性（Mankin、1974）がある。これらの問題のために、血塊をエクスビボで形成させ、大きさに合わせて切断し、半月板欠損（Arnoczkyら、1988）または骨軟骨欠損（Paletteら、1992）に詰めるという研究が行われた。すると結果として古典的な創傷治癒カスケードに類似したものが起こり、欠損の治癒が助けられる。このアプローチは欠損を修復組織でより多く充填はしたが、修復組織の質は一般に許容できるものではなく、主に線維性であり機械的に不十分であった。このアプローチでは満足できない修復組織が得られた理由はおそらく、1) 血小板を介した血塊の収縮が続く、2) 広範なエクスビボの操作のために血液成分の中には生存能力を失うものがあった、3) エクスビボで血塊の固体化が起こるために、軟骨欠損部を取り囲む全ての組織表面への接着が十分行われず、欠損の充填が限定される。まとめると、現在、整形外科医が関節軟骨の巣状病変を治療するために実施する臨床手技は、主に病変内の血塊の形成に依存している。しかし、病変部を充填し、創傷治癒に適切な要素（血小板、単球、フィブリンネットワーク等）を全て生存可能な状態で含む良質の血塊を形成する能力は、首尾一貫せずしばしば満足できない結果を生じる。本発明の態様の1つは、これらの血液に含まれる創傷治癒の要素を、完全な体積で収縮しないマトリックスとして、関節軟骨病変部に送達する組成物および方法を提供することによって、この状況を改善する。
【０００８】
5) 生体材料および成長因子
生体材料および成長因子を、時には単独で、しばしば組み合せて用いて軟骨病変部の修復を行なういくつかの実験的技術が提案されている。上述の一連の骨髄刺激技術との類似は明らかである。血塊のフィブリン骨格は、前もって組み立てられた生体材料の骨格で置き換え、血塊中の天然の分裂促進および走化性因子は、ユーザーが決めた量および種類の組換え成長因子のような可溶性因子で置き換えられる。このアプローチの例には、インスリン様成長因子（Nixonら、1999）およびトランスフォーミング増殖因子（HunzikerおよびRosenberg、1996）のような組換え蛋白質を送達するためのフィブリン糊の使用がある。他の生物製剤は、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)、コラーゲンマトリックスならびに骨形態形成蛋白質（Sellersら、1997; Sellers、2000; Zhangら、国際公開公報第00/44413号、2000）、アンジオテンシン様ペプチド（RogersおよびDizerega、国際公開公報第00/02905号、2000）および骨蛋白質またはBPと呼ばれる複数の蛋白質を含む骨抽出物（Atkinson、国際公開公報第00/48550号、2000）を含めたフィブリン糊のような一般的な生物製剤と組み合わされてきた。後者の方法では、BPに浸したコラーゲンスポンジは、別のフィブリン/トロンビンベースの接着剤を用いて軟骨欠損部に保持される必要があり、複雑で再現の困難な創傷治癒環境が作られた。細胞の接着および細胞の移動を助けるために、生体材料をフィブロネクチンまたはRGDペプチドでコートすることも行われた（BreckkeおよびCoutts、特許第6,005,161号、1999）。以前の方法の中には、骨髄刺激と、滑膜包への成長ホルモンの術後注射とを組み合せたものもあったが、限定的な成功しかしなかった（DunnおよびDunn、特許第5,368,051号、1994）。コラーゲン、キトサン、およびグリコアミノグリカンの混合物（Collombelら、特許第5,166,187号、1992; Suhら、国際公開公報第99/47186号、1999）、粉砕した軟骨および骨のペースト（Stone、特許第6,110,209号、2000）、コラーゲンベースの多成分の構築物（Pahcenceら、特許第6,080,194号、2000）、および硬化性の化学反応性メタクリレートベースの樹脂（Bradenら、特許第5,468,787号、1995）のような、特定の生体材料組成物も提案された。以下のいくつかの問題を克服できないために、これらのアプローチで臨床に使われるようになったものはない。1) 軟骨欠損部での生体材料の保持および接着がないこと、2) 長期間にわたって有効量のこれらの分子の活性型が持続して放出されないこと、3) 送達される分子に複数の制御できない生体活性があること、4) PGAおよびPLAの酸性分解産物の細胞毒性、5) 担体生体材料の不適切な分解動態または免疫原性、および6) 活性生物製剤の望ましくない全身性または異所性効果（組織の石灰化）。これらのアプローチを成功させるためには、このような問題のいくつかまたは全ての解決が待たれる。
【０００９】
6) 細胞移植
細胞移植に関する技術は、近年注目を集めてきたが、これはエクスビボでの継代および操作の後に、自己軟骨（Grandeら、1989; Brittbergら、1994および1996; Breinanら、1997）、同種軟骨（ChestermanおよびSmith、1968; BentlyおよびGreer、1971; Green、1977; AstonおよびBently、1986; Itayら、1987; Wakatiniら、1989; Robinsonら、1990; Freedら、1994; Noguchiら、1994; Hendricksonら、1994; Kandelら、1995; SamsおよびNixon、1995; Specchiaら、1996; Frankelら、1997; Hycら、1997; Kawamuraら、1998）、異種軟骨（Hommingaら、1991）、軟骨膜細胞（Chuら、1995; Chuら、1997）、または自己および同種骨髄由来の間充織幹細胞（Wakatiniら、1994; Butnariu-Ephrat、1996; Caplanら、1997; Nevoら、1998）を大量に関節欠損部に導入することによって軟骨の修復を促進することができるためである。細胞移植のアプローチには、他の軟骨修復技術に比べて以下のようないくつかの可能性のある利点がある：1)軟骨および骨の追加の損傷を最低限に押さえること、2) エクスビボの細胞生産によってドナーへの依存を低減すること、3) 軟骨発生の自然の生物過程を模倣できること、および4) より良い修復のために好適なタイプの細胞を提供できること。自己軟骨を用いた1つの技術は、公知の分野ものであり、市販され、数千人の米国およびスウェーデンの患者に使用されている（http://www.genzyme.com）。この技術では、非加重部分の軟骨生検から軟骨細胞を単離し、数週間増殖させ、患者の頚骨から採取した縫合されフィブリンシールされた骨膜パッチの下に注入することによって軟骨病変部に再導入する。その有効性に関する知識には疑問が持たれ（MessnerおよびGillquist、1996; Brittberg、1997; Newman、1998）、FDAに要請された制御型無作為化臨床試験が完了していないため、あいにく不明である。最近の動物試験では、注入された継代された自己軟骨は観察される治癒にはほとんど貢献しておらず、転帰は骨髄刺激を用いて得られたものと類似していることを示している（Breinanら、1997およびBreinanら、2000）。したがって、この手技でも、欠損部の手術の準備が、修復を誘導した主な要素になっている可能性がある。それにもかかわらず、細胞移植の潜在的な大きな利点のために、過去2年間、すべて軟骨修復に使用するための、自己軟骨処理（Tuboら、特許第5,723,331号、1998; Villeneuve、特許第5,866,415号、1999）、および脂肪細胞の使用と調製（MuellerおよびThaler、特許第5,837,235号、1998; Halvorsenら、欧州特許番号第1 077 253号、2001）、造血前駆細胞（PetersonおよびNousek-Goebl、特許第6,200,606号、2001）、羊膜細胞（Sackier、1997）、間充織幹細胞(CaplanおよびHaynesworth、特許第5,811,094号、1998; NaughtonおよびNaughton、特許第5,785,964号、1998; NaughtonおよびWilloughby、特許第5,842,477号、1998; GrandeおよびLucas、特許第5,906,934号、1999; JohnstoneおよびYoo、特許第5,908,784号、1999)、および軟骨細胞/線維芽細胞およびその祖先、上皮細胞、脂肪細胞、胎盤細胞および臍帯血細胞を用いる一般的技術（Purchioら、特許第5,902,742号、1999）の局面を保護するために、多数の特許が付与されてきた。
【００１０】
7) 細胞送達の問題
軟骨修復の援助のための細胞移植には、損傷部位に生存可能で機能的な移植細胞を送達および保持する技術が必要である。細胞がエクスビボで支持体マトリックスありまたはなしで増殖する場合には、欠損部よりもわずかに大きなインプラントを調製し、それを押し込むことによってプレスフィット（press-fitting）が可能なことがある（AstonおよびBentley 1986; Wakatiniら、1989; Freedら、1994; Chuら、1997; Frankelら、1997; Kawamuraら、1998）。プレスフィットにはエクスビボで形成された組織の使用が必要なので、それが移植される部位の幾何学的、物理的および生物学的要素に最適化されているわけではない。インプラントを縫合およびタッキングすると保持の助けになるが（SamsおよびNixon、1995）、縫合は関節表面に対するさらなる損傷となり、さらなる限定的修復過程を誘導することが知られている（Breinanら、1997）。生物糊の試みは、限定的な成功しか収めなかった（Kandelら、1995; Jurgensonら、1997）。収縮するコラーゲンゲルまたはフィブリン塊のようにインプラントがプレスフィットできない場合、または支持体マトリックスなしに細胞のみが移植される場合には、欠損部内に移植材料を保持するために、骨膜または別の類似した組織の縫合されたパッチがしばしば使用される（Grandeら、1989; Brittbergら、1994; Grandeら、1989; Brittbergら、1996; Breinanら、1997）。そのような技術は、骨膜の持つ軟骨形成を刺激する能力の恩恵を受ける可能性があるが（O’Driscollら、1988および1994）、やはり縫合を導入し、さらに骨膜の採取および関節切開を含む複雑な種類の操作が必要となるという問題がある。粘性のあるヒアルロン酸溶液を用いて、深い全層欠損にも細胞が送達された（Robinsonら、1990; Butnariu-Ephrat、1996）。軟骨修復の細胞供給源については、軟骨修復の送達手段の特許が最近いくつか公開されており、これにはゲルマトリックス（Griffithら、1998; Caplanら、1999）、縫合および線維（Vacantiら、1998; VacantiおよびLanger、1998aおよび1998b）、スクリュータイプの装置（Schwartz、1998）、および磁気システム（Halpern、1997）がある。以上を合わせると、軟骨修復のための現在の細胞送達技術は、明らかに最適なものではない。望ましい細胞送達手段は、細胞を含むポリマー性溶液で、欠損部に注入されると固体化し、欠損部に接着および充填し、適切な細胞分化、ならびに密度の高い機械的に機能する関節軟骨細胞外マトリックスの合成および集合を行なわせる一時的な生分解性の骨格を提供するものである。
【００１１】
8) 半月板、靭帯、腱、骨、皮膚、角膜、歯周組織、膿瘍、切除した腫瘍、および潰瘍を含む他の組織の修復
筋骨格および他の組織の自然および補助した修復は、数多くの複雑な生物過程を持った広い分野で、修復過程（骨修復のような）を加速し、固有の修復能力をあまり持たない組織（軟骨修復のような）を助け、瘢痕化（熱傷治療のような）を軽減するためには様々なアプローチがある（Clark、1996）。関与する生体要素や過程には差が確かにあるものの、（非胎児）創傷治癒における全体的事象は同一である。これには、組織破壊部位での血塊の形成、血小板からの走化性および分裂促進因子の放出、炎症細胞および多分化能性修復細胞の流入、血管化、および最後に修復細胞の分化および細胞外マトリックス成分の合成による修復過程の消散が含まれる。修復が成功する場合には、特定の局所的組織環境および特定の局所的多分化能性修復細胞群により、正しいタイプの組織、骨を置換する骨、皮膚を置換する皮膚等が生じる。組織修復過程の一般的要素が類似していることを考えると、1つの組織で修復を助けるアプローチが、他の組織での修復を助けることに成功しても、驚くべきことではない。この可能性は、修復を助ける方法および組成物が、自然の創傷治癒カスケードのある局面を、このある程度最適化された一連の事象から大きくはずれることなく増大するものであれば、さらに高くなる。本発明では、組織修復部位で、より効果的で接着性があり非収縮性の血塊を提供する特定の組成物および方法が提案される。実施例と好ましい態様は、最も修復の困難な組織の1つである軟骨修復について示されている。しかし、本組成物および方法および同じ基本的原理を持つその改変が、半月板、靭帯、腱、骨、皮膚、角膜、歯周組織、膿瘍、切除した腫瘍、および潰瘍を含む他の組織の修復を助けるために適用されることは、当業者には明らかである。
【００１２】
9) 医薬品、創傷治癒、組織修復、および止血剤へのキトサンの使用
エビおよびカニの甲羅の天然成分であるキチンのアルカリ性脱アセチル化で主に得られるキトサンは、1-4結合のグルコサミン（主に）およびN-アセチル-グルコサミンモノマーを含む直線状多糖類のファミリーである(Austinら、1981)。キトサンおよびそのアミノ置換誘導体は、pH依存性の生分解性（bioerodible）および生体適合性のカチオンポリマーで、生物医学業界では、創傷治癒および骨誘導（Denuziereら、1998; Muzzarelliら、1993および1994）、薬物および遺伝子の送達（Carreno-GomezおよびDuncan、1997; Schipperら、1997; Leeら、1998; Bernkop-SchnurchおよびPasta、1998）ならびに細胞増殖および細胞被包のための骨格（Yagiら、1997; Eser Elcinら、1998; Dillonら、1998; Koyanoら、1998; Sechriestら、2000; Lahijiら、2000; Suhら、2000）に使用されてきた。キトサンは、イオンおよび疎水性相互作用により胃腸の上皮の粘液層に接着し、経口薬物送達を促進するため、粘膜接着ポリマーと呼ばれる（Bernkop-SchnurchおよびKrajicek、1998）。キトサンの生分解性は、キチナーゼ（FukamizoおよびBrzezinski、1997）、リゾチーム（Sashiwaら、1990）、セルラーゼ（YalpaniおよびPantaleone、1994）、プロテアーゼ（Terbojevichら、1996）、およびリパーゼ（Muzzarelliら、1995）による酵素切断に感受性であるためである。近年、軟骨細胞が、ヒトのキトサナーゼ類似体であるキトトリオシダーゼを発現できることが示された（Vasiosら、1999）；その生理的役割は、ヒアルロナンの分解である可能性がある。ヒアルロナンは、N-アセチル-グルコサミンおよびグルクロン酸の二糖で構成されているので、キトサンとある類似性を持つ直線状多糖類である。
【００１３】
キトサンは、皮膚、角膜、および硬組織の修復を刺激するために、いくつかの報告（Sallら、1987; BartoneおよびAdickes、1988; Okamotoら、1995; Inuiら、1995; ShigemasaおよびMinami、1996; Uenoら、1999; Choら、1999; Stoneら、2000; Leeら、2000）および発明（SparkesおよびMurray、特許第4,572,906号、1986; Mosbey、特許第4,956,350号、1990; Hanssonら、特許第5,894,070号、1999; GoudaおよびLarm、特許第5,902,798号、1999; Drohanら、特許第6,124,273号、2000; Jorgensen国際公開公報第98/22114号、1998）で、単独または他の成分と合わせて様々な製剤が提案されてきた。創傷修復過程に最も共通して都合の良いとされるキトサンの性質は、生分解性、接着性、脱水予防、および細菌の侵入に対するバリアである。その他の性質としては、細胞活性化および化学誘引物質としての性質（Pelusoら、1994; ShigemasaおよびMinami、1996; Inuiら、1995）、止血活性（Maletteら、1983; MaletteおよびQuigley、特許第4,532,134号、1985）、およびゆるい顆粒化組織を促進することにより線維増殖および瘢痕化を制限する明らかな能力（BartoneおよびAdickes、1988; Stoneら、2000）がある。創傷治癒においてキトサンが有用な効果を持つことについては一般に認められているが、その正確な作用機序は不明で、最も有効な適用方法、すなわち粉末、懸濁液、スポンジ、膜、固相ゲル等も、不明である。作用機序がはっきりしない理由の1つは、以前の研究では、化学的に定義されず（アセチル含量および分布、分子量）、純度も不明なキトサンが使用されたためである可能性がある。キトサンが興味深い止血能力を示すために、移植および創傷部位での出血を低下させるためにキトサンの直接の塗布も行われた（Maletteら、1983; MaletteおよびQuigley、特許第4,532,134号、1985）。研究の中には、キトサンの止血作用は、これが単に赤血球細胞を凝集させる能力によるものとするものもある（RaoおよびSharma、1997）が、そのポリカチオンアミンの性質が血小板を活性化し、トロンビンを放出させ、古典的な凝固カスケードを開始すると考え、フィブリノーゲンおよび精製自己血小板と組み合せて止血剤として使用できるとするものもある（Cochrumら、特許第5,773,033号、1998）。本発明に関連しては、これらの報告および発明では、血液とキトサンを溶液中で混合して、修復部位で血塊を含むキトサンの形成により組織修復を助けるために治療に使用した任意の例が完全に欠如していることに注意することは重要である。
【００１４】
キトサンにしばしば存在する技術的な問題は、生理的なpHおよびイオン強度では溶解度が低いことで、そのために溶液状態での使用には限度がある。したがって、通常はキトサンの溶解は、3.0〜5.6のpHの酸性水溶液中でアミン基のプロトン付加によって行われる。そのようなキトサン溶液はpH 6.2付近まで可溶性であるが、ここでアミン基の中和により鎖間の静電的反発が低下し、水素結合の引力、疎水性およびファン・デル・ワールスの相互作用によって6.3から6.4付近のpHでポリマーが沈殿する。先行発明（Chenite国際公開公報99/07416; Cheniteら、2000）は、キトサンの水溶液にポリオールリン酸二塩基塩（グリセロールリン酸）を混合すると、沈殿を避けつつ溶液のpHを上昇させ得る事を開示した。これらの特定の塩の存在下では、かなりの濃度（0.5〜3％）で高分子量（＞数100 kDa）のキトサン溶液は、6.8〜7.2の生理的に許容できる中性のpH範囲で、低温または室温で長期にわたり液体状態のままである。この局面は、細胞の生存力を維持しつつ、細胞とキトサンとの混合を容易にする。さらなる重要な性質は、そのようなキトサン/ポリオールリン酸（C/PP）水溶液は、適当な温度まで加熱すると固体化またはゲル化するので、キトサン/細胞混合溶液を体内の部位に注入すると、そこで例えばヌードマウスの皮下腔で軟骨小結節が形成される可能性がある（Cheniteら、2000）。他の研究でもキトサンを生理的pHで可溶性の状態に保持したが、これらの研究ではキトサン濃度（LuらBiomaterials 1999では0.1%以下）またはキトサンの分子量および脱アセチル化の程度（Choら、Biomaterials、1999ではそれぞれ〜350 kDおよび50%まで）を低下させる必要があったことに注意することは重要である。他の研究でも、キトサンは軟骨細胞および骨芽細胞の表現型を支持する微小環境を提示することが示されたが（Suhら、2000; Lahijiら、2000; Seichristら、2000）、これらの研究は細胞と混合して注入できるような形の液体キトサンに基づくものではなかった。最後に、NN-ジカルボキシルメチルキトサンスポンジがBMP7に浸され、ウサギの骨軟骨欠損に入れられた（Mattioli-Belmonte、1999）。ここでも、組織化学的および免疫組織化学的転帰のいくらかの改善は見られたが、修復組織による欠損の充填が不完全であること、および欠損内に構築物を保持することが非常に困難であることは、克服できない問題と考えられる。本発明はこれらの問題を克服し、軟骨および他の組織の修復用の組成物の送達のためのいくつかの新規の解決法を提供する。
【００１５】
10) 先行技術の要約
軟骨修復の補助のための先行技術の要約として、関節軟骨の非常に限られた自然の修復応答を改善するために多くの技術が提案され実験的に検証されたといえる。これらの技術の中には、臨床現場である程度受け入れられたものもあるが、これは主として、一連の骨髄刺激技術が適用された場合に見出されたものと比較して、修復応答を改善する実際的で明らかに有効な方法がないためである。本発明は関節軟骨の修復のために細胞および血液成分を使用する際の主な問題点のいくつかを解決する。有効な軟骨修復手技の開発のための1つの主要な障害は、軟骨の増殖を必要とする空間内で（軟骨欠損または組織のバルキング（bulking）もしくは組織の再建を必要とする他の部位）、適切な高分子環境を提供する組成物および方法がないことである。この高分子環境またはマトリックスは、1) 活性な生物成分（細胞、蛋白質、遺伝子、血液、血液成分）を液体状態で添加しやすい、2) それから欠損または軟骨増殖を必要とする領域全体を充填するために欠損部位に注入可能である、3) どちらも軟骨細胞表現型（軟骨組織生産性）よりも線維細胞表現型（線維組織生産性）を誘導し、欠損壁からマトリックスも遊離させ得る、細胞接着および細胞を介したマトリックスの収縮を制限するような、主に非蛋白性環境を提供する、4) 細胞適合性で、生理的レベルのpHおよび浸透圧を持ち、細胞毒性のある成分がない、5) 分解性ではあるが、含有する生物活性成分が、機械的加重を支持できる軟骨組織を完全に再建できるだけ十分に長時間、分解せずに存在する必要がある。さらに、そのような特性の組み合せは、わずかな改変によって、半月板、靭帯、腱、骨、皮膚、角膜、歯周組織、膿瘍、切除した腫瘍、および潰瘍のような他の組織の修復に適用できることは、当業者には明らかである。
【００１６】
軟骨組織の修復および再生に使用する新しい組成物が提供されることが非常に望ましいと思われる。
【００１７】
発明の概要
本発明の1つの目的は、軟骨組織の修復および再生に使用する新しい組成物を提供することである。
【００１８】
本発明により、軟骨組織または半月板、靭帯、腱、骨、皮膚、角膜、歯周組織、膿瘍、切除した腫瘍、および潰瘍のような他の組織の修復、再生、再建、またはバルキングに使用する組成物が提供される。
【００１９】
本発明により、生体要素と混合して体の部位に置くまたは注入するポリマー溶液の使用も提供されるが、その部位において混合物は組織の修復、再生、再建、またはバルキングを助ける。修復される組織には、軟骨、半月板、靭帯、腱、骨、皮膚、角膜、歯周組織、膿瘍、切除した腫瘍、および潰瘍が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
生体要素は、好ましくは自己または非自己由来の血液、血液成分または単離された細胞に基づく。
【００２１】
また本発明により、患者の組織の修復のための方法が提供されるが、この方法は、組成物が組織に接着し、組織の修復のための細胞増殖を支持するように、温度依存性のポリマーゲル組成物を組織に導入する段階を含む。
【００２２】
組成物は好ましくは少なくとも1つの血液成分を含む。
【００２３】
さらに本発明により、患者の組織の修復のための方法が提供されるが、この方法は、組織にポリマー組成物を導入する段階を含み、ポリマー組成物は少なくとも1つの血液成分と混合でき、ポリマー組成物は血液成分と混合されると混合物を形成し、混合物は時間が経つまたは加熱されると非液体状態に変化し、混合物は導入部位に保持されそこに接着し組織の修復を行なう。
【００２４】
ポリマーはキトサン、キチン、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、またはヘパリン硫酸のような修飾または天然の多糖類であり得る。
【００２５】
ポリマー組成物は、可溶性コラーゲンまたは可溶性ゼラチンまたは例えばポリリシンのようなポリアミノ酸のような天然、組換え、または合成蛋白質を含む可能性がある。
【００２６】
ポリマー組成物は、カルボキシル官能基、アミノ官能基、スルホン官能基、ホスホン官能基、ホスフェン官能基を含み、さらに例えばヒドロキシル基、チオール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、およびアロイルオキシ基のようなさらなる官能基を含むまたは含まない、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、合成ホモコポリマーおよびブロックコポリマーを含む可能性がある。
【００２７】
ポリマー組成物は、好ましくはまず塩化ナトリウム、カリウム カルシウム、マグネシウムリン酸塩、硫酸塩、およびカルボン酸塩のような無機塩を含む緩衝液中に溶解または懸濁される。
【００２８】
ポリマー組成物は、グリセロールリン酸、フルクトースリン酸、グルコースリン酸、L-セリンリン酸、アデノシンリン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、HEPES、PIPES、およびMESのような有機塩を含む緩衝液中に溶解または懸濁されてもよい。
【００２９】
ポリマー組成物は、好ましくは6.5と7.8の間のpHを持ち、浸透圧は250 mOsm/Lと600 mOsm/Lの間の生理的値に調節される。
【００３０】
血液成分は、全血、加工した血液、静脈血、動脈血、骨由来の血液、骨髄由来の血液、骨髄、臍帯血、または胎盤血である可能性があるが、これらに限定されるわけではない。さらに赤血球、白血球、単球、血小板、フィブリノーゲン、トロンビン、または血小板に富む無赤血球血漿を含む可能性がある。
【００３１】
血液成分は、クエン酸塩、ヘパリン、またはEDTAのような抗凝固剤も含む可能性がある。逆に血液成分は、導入部位での凝固/固体化を改善するために、トロンビン、カルシウム、コラーゲン、エラグ酸、エピネフリン、アデノシン二リン酸、組織因子、リン脂質、および第VII因子のような凝固因子のような凝固促進物質を含む可能性がある。
【００３２】
血液成分は、自己または非自己でよい。
【００３３】
ポリマー組成物は、好ましくは血液成分に対して1:100から100:1の種々の比で使用される。
【００３４】
ポリマー組成物および血液成分は、好ましくは音波、撹拌、ボルテックス、またはシリンジを何度も通過させることによって機械的に混合される。
【００３５】
修復または再生されうる組織は、例えば、軟骨、半月板、靭帯、腱、骨、皮膚、角膜、歯周組織、膿瘍、切除した腫瘍、および潰瘍を含むがこれらに限定されるわけではない。場合によっては、体内の導入部位は異常な組織を除去するために外科的に準備される。そのような手技は、隣接組織領域または血管化領域への穴開け、剥離、または穿孔により、ポリマー成分が修復を必要とする部位へ移動するためのチャネルを形成することによって実行されうる。
【００３６】
さらに本発明により、インビボで組織の修復または再生をするための細胞の送達に使用するキトサン溶液が提供される。キトサン溶液は0.5〜3％w/vのキトサンを含み、熱でゲル化するよう調製され、溶液は修復または再生する組織に注入される前に細胞と混合される。溶液は例を挙げるとえばリン酸塩、グリセロールリン酸またはグルコサミン等でこれらの添加によって、熱でゲル化するように誘導される。好ましくは、キトサン溶液は6.5から7.8の間のpHを持つ。
【００３７】
細胞は例えば、初代細胞、継代細胞、選択された細胞、血小板、間質細胞、幹細胞、および遺伝的に改変された細胞からなる群より選択される場合がある。好ましくは、細胞は、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、コラーゲン、アルギン酸塩、または可溶性ポリマーのような担体溶液中に懸濁される。
【００３８】
本発明により、インビトロでの細胞培養に使用するゲル化するキトサン溶液も提供される。キトサン溶液は、0.5〜3％w/vのキトサンを含み、熱でゲル化するように調製されており、この溶液は培養前にインビトロで細胞と混合される。
【００３９】
好ましくは、ポリマー組成物は、平均分子量が1 kDaから10 Mdaの間の0.01％と10％w/vの間の20％〜100％脱アセチルキトサン、および血液成分を含む。
【００４０】
本発明により、組織の修復に使用するポリマー組成物およびその使用がさらに提供される。この組成物は、組織修復の治療薬の製造にも使用され得る。
【００４１】
本発明の目的のため以下のように用語が定義される。
【００４２】
「ポリマー」または「ポリマー溶液」という用語は、本出願では互換性があり、ポリマー溶液、ポリマー懸濁液、ポリマー粒子または粉末、およびポリマーミセル懸濁液を意味するがこれらに限定されるわけではない。
【００４３】
軟骨および他の組織に関する「修復」という用語は、組織の修復、再生、再建、またはバルキングを意味するが、これらに限定されるわけではない。
【００４４】
詳細な説明
血液または血液成分と混合された場合、ポリマーは水溶液または水性懸濁液、または粒子状であり得るが、ポリマー調製物の基本的な特性は、1) 血液または血液の選択された成分と混合可能であること、2) 得られた混合物は、組織の修復、再生、再建、またはバルキングを必要とする体内の部位に、注入可能または添加することができる、および3) 混合物は添加された部位における組織の修復、再生、再建、またはバルキングに有用な効果を持つ。
【００４５】
好ましい態様は実施例5で示され、天然多糖類であるキトサンの溶液が、pH 6.8で、0.135モル/Lグリセロールリン酸二ナトリウム緩衝液中で1.5% w/vの濃度で使用された。この溶液はポリマー溶液1対血液3の割合で、ウサギ末梢血と混合された。ポリマー/血液混合物は、外科的に調製されたウサギの関節軟骨欠損に注入され、5分以内に固体化する（図22）。治癒過程の組織学的観察では、修復が刺激され、6〜8週間後に硝子軟骨の形成が見られた（図24）。ポリマー/血液混合物を注入しなかった対照の欠損では、不完全な治癒または機能しない線維性または線維軟骨性の組織を伴う治癒であった（図24）。この例は、ポリマー/血液混合物の使用は、創傷部位で単に出血を誘導するよりも、効果的な治癒および修復組織のより良い機能性が得ることができることを示す。本発明のささいな改変は、当業者には明らかである。前段落に説明する3つの特性を保持するかぎり、他のポリマーおよびポリマーまたはポリマー混合物の他の配合で、キトサン溶液を置き換えてもよい。また明らかに、この手法は、半月板、靭帯、腱、骨、皮膚、角膜、歯周組織、膿瘍、切除した腫瘍、および潰瘍のような軟骨以外の組織の修復にも適用できる。組織のバルキングおよび再建における用途も明白である。
【００４６】
以下を含む本発明の考えうる作用機序を開示するために実施例および証拠を提示する：1) 固体化の前に血液とポリマーを混合することによる、典型的な血小板を介した血塊の収縮の阻害（図17）、2) 結果として維持される完全な容積の骨格および組織修復のためのより良い欠損充填（図18）、3) 固体化したポリマー/血液混合物の周辺組織への接着（図22A）、4) 単純な血塊と比較して、走化性および分裂促進蛋白質因子のポリマー/血液混合物からのよりゆっくりした放出（図21）、5) ポリマー/血液混合物における白血球および血小板の生存力の維持（図20）、および6) 純粋に蛋白質性のマトリックスよりも軟骨形成を促進する、修復部位における多糖類環境の提供（図2〜6，8〜10，24）。これらの現象は、本発明者らの実施例で起きることが示されている。しかし、これらを示したからといって、ポリマーの細胞分解の動態、およびキトサンによる内因性因子の結合/濃縮のような他の重要な事象が起きる可能性を否定するものではない。
【００４７】
本発明の第2の好ましい態様は実施例1および2に示されており、マウスの皮下領域またはインビトロの培養チェンバーに初代軟骨細胞を送達するために、熱でゲル化するキトサン溶液が使用された。この場合、血液成分がないために、キトサン溶液のみでゲル化能力が必要となり、この性質はグリセロールリン酸および他の類似した緩衝液を用いるキトサン溶液の特定の調製法によって得られる。本発明者らの実施例では、ポリマー溶液を細胞と混合し、ポリマー/細胞溶液をインビボまたはインビトロで注入すると、そこで細胞の機能と生存力を維持しながら溶液がゲル化できることを示している（図1〜11）。細胞はキトサン溶液との混合前に、生理的緩衝液、または等張緩衝液中のセルロースのような他の細胞担体懸濁液に再懸濁できる。本発明者らはこのポリマー溶液とともに初代軟骨細胞が注入された場合に、インビトロ（図2〜6）およびインビボ（図8〜11）で軟骨組織が形成されることを示すデータを示している。本発明のこの態様のささいな改変および延長も当業者に明らかで、同じ結果を得るために別の種類の細胞が使用されたり、キトサンおよび緩衝液の濃度が変更されてもよい。
【００４８】
本発明は以下の実施例に言及することでより容易に理解されるが、これらは本発明の範囲を限定するのではなく説明するために提供される。
【００４９】
実施例1
軟骨のインビトロ増殖のための、熱でゲル化するキトサン溶液と初代軟骨細胞の混合
HCl塩粉末としてのキトサン（0.22g、85％脱アセチル化）は、層流フード中で紫外線照射を行い滅菌し、7.5 ml H2Oに溶解して5.0付近のpHになった。D(+)-グルコサミン（0.215g、MW 215.6）は10 mlの0.1 M NaOHに溶解し、孔サイズ22μmのディスクフィルターで濾過滅菌した。グリセロールリン酸（0.8g、グリセロールリン酸1モルあたり4.5モルの水を含めMW 297）は2.0 ml H2Oに溶解し、22μm孔サイズのディスクフィルターで濾過滅菌した。グルコサミン溶液2.25 mlは滅菌条件で4℃で撹拌しながらキトサン溶液に1滴ずつ添加した。その後グリセロールリン酸溶液1 mlを同じ条件で添加した。この最終溶液は、温度が低く維持されれば、すなわち4℃付近の場合には、まだ液体で、長時間（何日も）液体のままである。この溶液のpHは6.8と生理的条件で、浸透圧も376 mOsm/kg-H2Oあたりと生理的条件である。細胞の生存力を維持するために必要な限度内に、これら2つのパラメーターを維持することが非常に重要である。この限度は細胞の種類によって異なるが、一般に6.6 < pH < 7.8および250 mOsm/kg-H2O < 浸透圧 < 450 mOsm/kg-H2Oである。150 mgヒドロキシエチルセルロース（Fluka）および6 ml DMEM（ダルベッコ改良イーグル培地）を溶解し、22μm孔サイズのディスクフィルターで濾過滅菌して溶液が調製される。細胞ペレットは2 mlのヒドロキシエチルセルロース-DMEM溶液に再懸濁し、キトサン-グリセロールリン酸溶液と混合する。陰性対照として、細胞を含まないヒドロキシエチルセルロース-DMEM溶液2 mlと混合したキトサン溶液が作製された。この溶液を37℃に加熱すると、以前の発明（Cheniteら、国際公開公報第99/07416号）に開示されている熱ゲル化溶液に類似した固体のヒドロゲルに転換する。非常に重要なことは、この以前の発明は、このキトサン溶液中の熱ゲル化過程を通して細胞の生存力が維持されることを示さなかったために、細胞の送達、組織の修復および組織の再生のためにこのキトサン溶液を使用することを可能にしなかったことである。
【００５０】
4℃で液体状態の上記の溶液を、酵素で単離した初代軟骨細胞（Buschmannら、1992）と混合し、プラスチックの培養皿に注いだ（図1Aから1F）。図1Aでは、4℃で細胞のペレットがこの液体キトサンゲル溶液に再懸濁および混合（図1B）される。図1Cおよび1Dでは、液体溶液を組織培養ペトリ皿に注ぎ、37℃で30分間固体化した後、細胞を含んだ固体ゲルをDMEMで洗い、生検パンチを用いてディスクを切り出した。図1Eでは、48ウェルのプレート中に1000μm孔のメッシュグリッドが置かれた。図1Ｆでは、細胞を含んだキトサンゲルディスクが個々のウェルで培養された。
【００５１】
37℃で20分インキュベーションすると細胞を含んだゲルが形成された。生検パンチを用いて、直径6 mm、厚さ1 mmのディスクをゲルから切り出し、最高3週間培養された。ディスクは、全ての表面に培地が接触するように下に無菌ナイロンの1000μMメッシュのある48ウェルの組織培養プレートで別々に培養された。被包された細胞の90％以上が、被包直後および培養期間全体にわたって生存していた（図2A〜2C）。試料は、生細胞（緑）と死細胞（赤）を示すために、カルセインAMおよびエチジウムホモダイマー-1中でインキュベートされた。新しく単離された軟骨細胞（図2A）は、ゲルに被包され、固体化し、直後（図2B）またはゲル中で20日間培養された後に（図2C）、生存率を調べた。図2Cは、は、ゲルの中央から得られた、典型的な軟骨細胞の形態を持つ細胞を示す。
【００５２】
Rat-1、COS、293T、および脱分化したウシ関節軟骨を含む、数種類の別個の細胞が、被包および細胞培養後に同じような高度の生存率を示し、これはゲル化過程でも細胞の生存力が維持され、したがって注入によりインビボに細胞を送達するためにこの過程が使用できることを確認するものである。22日間培養した細胞を含むゲルのトルイジンブルー染色では、被包された初代軟骨細胞を取り巻く異染性のリングが観察され、これはプロテオグリカンまたはGAGの蓄積を示すが、これは密接した細胞間の融合の始まりであった（図3D）。これらの領域は、アグリカン、II型コラーゲンおよびリンク蛋白質に対する抗体でも、染色された。キトサンゲルマトリックスは、トルイジンブルーに結合することも分かった（図3C）。この性質によって、アルデヒド固定後に、ゲルの格子構造を観察することができた。興味深いことに、軟骨細胞の周りに観察されたGAGの細胞周囲リングには、キトサンマトリックスはほとんど含まれておらず、これは軟骨細胞を生産する因子によって分解されてしまったと考えられる（図3D）。初代子ウシ軟骨は、1 mlあたり初代子ウシ軟骨細胞2 x 107の濃度でキトサンゲル中に被包され、6 mmディスクとして最大20日間培養された。初代子ウシ軟骨細胞は、2%アガロース中に被包および培養し、平行して解析した。アガロースゲル培養（図3Aおよび3B）およびキトサンゲル培養（図3Cおよび3D）について、0日および20日目の培養物のパラフィン切片作製およびトルイジンブルー染色を行った。0日目には、核は濃い青に染色されたが（図3Aおよび3C）、蓄積した細胞周囲GAGは異染性の青紫に染色された（図3Bおよび3D、大きな矢印）。これらの細胞周囲領域は、アグリカン、II型コラーゲン、および軟骨リンク蛋白質について免疫陽性であった。図3Eの40xの倍率で、DMMBアッセイ法を用いた培養物の0日、14日、および20日に見られるGAGの定量的生化学分析によって、アガロースゲルと比較してキトサンゲル中でもGAGの同様な蓄積があることが示された。
【００５３】
被包された軟骨細胞で発現するII型コラーゲンおよびアグリカンmRNAのRNA解析では、軟骨中の関節軟骨細胞で観察されるレベル（図4、レーン6）に相当する高いレベルが14日および22日に（図4、レーン4および5）観察された。ウシII型コラーゲン、アグリカン、およびGAPDHに相補的なアンチセンス32P-標識RNAプローブの混合物が、tRNA（レーン1）、またはウシ腎臓（レーン2）、キトサンゲルで0日（レーン3）、14日（レーン4）、もしくは20日（レーン5）培養された初代軟骨細胞（107 /ml）、もしくは成体ウシ関節軟骨（レーン6）の全RNAとハイブリダイズされた。試料はRNase AおよびT1で処理され、電気泳動およびオートラジオグラフィーが行われた。個々の転写物の存在を示す保護されたバンドは、示されたようになっている。キトサン/グリセロールリン酸ゲル中で軟骨細胞表現型が維持されることは、アグリカンおよびII型コラーゲンの発現が継続されることによって示されている。
【００５４】
被包された細胞によって生産される蛋白質のウェスタン解析で、2週間と3週間の間の培養で、軟骨マトリックスリンク蛋白質が蓄積することが示された（図5）。総蛋白質を抽出し、SDS-PAGEで分離し、ビメンチン、PCNA、II型コラーゲンのCプロペプチド、または軟骨リンク蛋白質を認識する抗血清を用いて免疫ブロットした。解析した試料には、細胞なしのキトサンゲル（レーン1）、ウシ腎臓（レーン2）、0日目（レーン3および4）、14日目（レーン5および6）、または20日目（レーン7および8）におけるキトサンゲル中で培養された初代軟骨細胞（107 /ml）の重複する試料、2週間の子ウシ関節軟骨（レーン9）、または成体ウシ軟骨（レーン10）が含まれる。結果は、14日目および20日目に軟骨特異的蛋白質CP2およびリンク蛋白質が蓄積し、細胞増殖のマーカーであるPCNA発現が20日目まで継続していることを示す。
【００５５】
初代ウシ関節軟骨細胞を含むディスクが、一軸非限定圧縮応力緩和試験を用いて、培養4日目および13日目に、機械的に評価された。細胞を含まない対照ゲルと比較して、4日目にすでにかなりの細胞に依存した度合いの硬化が観察され、13日目にはさらに著しくなった（図6）。培養4日、13日、および19日目のディスク（直径〜5 mm）は、10秒間ディスクの厚み（〜1.5 mm）の10％の湾曲を5回かけ、その後の応力緩和の間にその変位を保持することによる（グラフには10〜20％の2回目の湾曲が示されている）、非限定圧縮において機械的に調べられた。細胞を含まないゲルディスクは、弱い振る舞いを示したが、細胞を含むゲルは培養時間が経つに連れ明らかに硬くなり、関節軟骨のようなより特徴的な粘弾性を持つようになった。
【００５６】
複合多孔質弾性モデル（composite poroelastic model）（Soulhatら、1999）を用いてこれらのデータを解析すると、非繊維マトリックス率の倍増が見られ（2.5? 5kPa）、線維マトリックス率の5?の増加（100? 500kPa）、ならびにインビトロでのわずか13日の培養によって存在するゲル中の初代軟骨細胞のために水圧の透過性の100?近い低下（5? 0.08 ? 10-12 N-s/m4）も見られた。以上を合わせると、これらの結果は、キトサンゲルが細胞適合性および細胞分解性で、軟骨細胞の表現型の維持を促進し、インビトロでは機械的剛性を大きく上昇させる新軟骨マトリックスの生産を行なわせることを示す。
【００５７】
実施例2
熱でゲル化するキトサン溶液と初代軟骨細胞の混合および軟骨のインビボ増殖のための皮下注入
このインサイチューゲル化システムが動物で使用できることを示すために、無胸腺マウス（CD1 nu/nu）に、実施例1に記述された1 mlあたり1000万の子ウシ関節軟骨細胞を含むキトサンゲルを100μlから300μl背側皮下注射した（図7）。初代子ウシ軟骨細胞のペレットを4℃で液体キトサンゲルと混合し、1〜2 x 107細胞/mlの濃度にし、100μlの皮下背側インプラントとして液体の状態で麻酔したヌードマウスに注射した。注射後5〜10分で、触診によりインサイチューのゲル化は明らかだった。
【００５８】
対照マウスには、キトサンゲルのみを同様に注射した。注射後10分以内に触診可能なゲルが形成された。インプラントは注射後21日目、48日目、および63日目に回収された。トルイジンブルー染色により、細胞を含むインプラントによってGAGに富む細胞外マトリックスの著しい生産が明らかになった（図8A）。キトサンゲルのみのインプラントでは、GAGの蓄積は見られなかった（図8B）。液体キトサンゲル中の2 x 107細胞/mlの初代子ウシ軟骨細胞は、100μlの皮下背側インプラントとして液体の状態で麻酔したヌードマウスに注射した。対照マウスには、液体のキトサンゲルのみの皮下背側インプラント100μlを注射した。注射の48日後、インプラントを採取し、パラフィン組織学およびトルイジンブルー染色を行なった。異染性の紫色の染色は、軟骨細胞を含むインプラント中のGAGの蓄積を示す（図8A）。キトサンゲルのみのインプラントでは、GAGの蓄積は検出されなかった（図8B）。
【００５９】
軟骨細胞特異的mRNA発現である、II型コラーゲンおよびアグリカンは、注射の48日後に初代軟骨細胞を含むインビボインプラント中に検出された（図9）。
【００６０】
キトサンゲルのみのインプラントでは、II型コラーゲンもアグリカンの発現も検出されなかった（図9）。ウシII型コラーゲン、アグリカン、およびGAPDHに相補的なアンチセンス32P-標識RNAプローブの混合物が、tRNA（レーン1）、またはウシ腎臓（レーン2）、48日目のキトサンゲルのみのインビボヌードマウスインプラント（レーン3）、もしくは48日目の2 x 107細胞/mlで初代軟骨細胞を含むキトサンゲルのインビボインプラント（レーン4）、もしくは成体ウシ関節軟骨（レーン5）の全RNAとハイブリダイズされた。試料はRNase AおよびT1で処理され、電気泳動およびオートラジオグラフィーが行われた。個々の転写物の存在を示す保護されたバンドは、示されたようになっている。キトサン/グリセロールリン酸ゲル中で軟骨細胞表現型がインビボで維持されることは、アグリカンおよびII型コラーゲンの発現によって示されている。
【００６１】
初代軟骨細胞を含むインビボインプラントで、注入後48日および63日に、軟骨特異的蛋白質が検出された（図10）。キトサンゲルのみのインプラントには、軟骨特異的蛋白質は検出されなかった（図10）。総蛋白質を抽出し、SDS-PAGEで分離し、ビメンチン、PCNA、II型コラーゲンのCプロペプチド、または軟骨リンク蛋白質を認識する抗血清を用いて免疫ブロットした。解析した試料には、細胞なしのキトサンゲル（レーン1）、ウシ腎臓（レーン2）、63日目におけるキトサンゲルのみのインビボヌードマウスインプラント2つ（レーン3および4）、48日（レーン5）もしくは63日（レーン6）における2 x 107子ウシ軟骨細胞/mlゲルを含むキトサンゲルのインビボインプラント、2週間の子ウシ関節軟骨（レーン7）、または成体ウシ軟骨（レーン8）が含まれる。結果は、軟骨細胞を含むキトサンゲルインプラントのみに、軟骨特異的細胞外マトリックス蛋白質CP2およびリンクが蓄積することを示す。頭字語のPCNAは「増殖性細胞核抗原」を意味する。CPはII型コラーゲンCプロペプチド、リンクは軟骨リンク蛋白質を指す。
【００６２】
細胞を含まないインビボインプラントは糊のような粘稠度だったが、細胞を含むインプラントは、3〜5 mmのディスクを切り出し、機械的試験を行なうと、細胞のないインビトロディスクでは見られない高度な機械的剛性が見られた（図11）。これらのデータは、熱でゲル化するキトサン溶液を担体として、注入によって軟骨細胞をインサイチューに送達できることを示す。注入された軟骨細胞は生存力を持ち続け、プロテオグリカンに富む細胞外マトリックスをかなり合成および集合させ、これは時間が経つと硬化して機能的な軟骨組織を形成する。図11では、液体キトサンゲル中の2 x 107/mlの初代子ウシ軟骨細胞が、麻酔ヌードマウスに100μlの皮下背側インプラントとして液体状で注入された。対照マウスには、液体キトサンゲルのみの皮下背側インプラント100μlが注入された。注入後48日に、インプラントが採取された。キトサンゲルのみのインプラントは糊のような堅さで、機械的試験ができなかった。初代軟骨細胞を含むインプラントは軟骨のような性状で、インプラントの中央から3 mmの生検を切り出し、2.5％の厚さの圧縮、0.05g/分の緩和基準を用いて、非制限圧縮で試験した。細胞を含む48日のインプラントの20％および50％圧縮オフセットでの平衡係数が、42日間インビトロで放置した対照ディスクと比較し示されている。インビボで増殖した軟骨細胞を含むゲルは、機能的な軟骨マトリックスの合成および集合のために、48日間にかなりの機械的剛性を生じた（図8A）。
【００６３】
実施例3
軟骨および骨表面への熱でゲル化するキトサン溶液の接着
軟骨修復のための熱でゲル化するこのキトサン製剤の最大の利点の1つは、組織の修復、再生、再建、またはバルキングが必要な、不揃いの軟骨欠損または他の不揃いの形をした腔に適合し、接着する能力である。多くの現在の組織修復手技に、この点で厳しい問題がある。細胞を含まないキトサン-グリセロールリン酸液体ゲルは、ブタ大腿骨顆軟骨内（骨を含まない）欠損に、エクスビボで送達された。関節軟骨のディスク型の欠損は、生検パンチを用いて作製され（図12A）、実施例1に記述されるキトサン溶液がこれらの欠損に注入され、37℃のインキュベーター中で固体化された。接合する軟骨表面を向かい合わせ、関節の動きのシミュレーションを行なったが、その後もゲルは軟骨欠損中に留まることが観察された（図12B）。ゲルは欠損内に留まったのみならず、周囲の骨および軟骨表面に接着し、収縮しなかった。図12Aおよび12Bでは、液体キトサンゲルを直径6 mmの全層軟骨欠損に入れ（図12A）、加湿したインキュベーター中で、37℃で30分固体化した。その後、関節を閉じ、数分間、関節の動きのシミュレーションをした。関節の動きのシミュレーション後に、キトサンゲルは全ての欠損に接着し、保持されていた（図12B）。
【００６４】
ウサギの膝蓋溝で軟骨内欠損のインビボ充填も行われた。顕微手術用メスを用いて、軟骨を堅い石灰化軟骨層までそぎ取ることにより、長方形（4 mm x 5 mm）の欠損が作製された。16ゲージの針を用いて、いくつかの微小破壊穴が作製された。実施例1に記述された熱でゲル化するキトサン溶液がこの欠損に注入され、5分間固体化し（図13A）、ウサギの膝関節が縫合された。ウサギは自由に歩行させ、翌日、安楽死させて、治療した膝関節の組織学的解析が準備された（図13B）。生きたニュージーランドホワイトウサギが麻酔され、大腿膝蓋溝の滑車に3 x 4 mmの軟骨のみの欠損が作製された。16ゲージの針を用いて、いくつかの微小破壊穴が作製された。液体状の熱でゲル化するキトサンが欠損に添加され、インサイチューで5分間ゲル化された（図13A）。関節を閉じ、ウサギは24時間動きを制限せずに回復させ、その後に屠殺して関節の切開を行なった（図13B）。
【００６５】
組織学的解析（図14）では、ウサギの非常に薄い軟骨層（厚さわずか約0.8 mm）にこの熱でゲル化するキトサンゲルが保持されていることが示された。ゲルは周囲の骨および軟骨組織に強く接着し、良く保持されることを示し、したがって、軟骨および他の組織の修復のための注入可能な熱でゲル化するポリマー送達手段として使用できる。図13Bで示される関節および欠損（熱でゲル化するキトサンで充填され、インビボで24時間滞留）を固定し、LRホワイトプラスチック樹脂に包埋し、切片を作製し、トルイジンブルーで染色した。欠損の断面では、キトサンゲルがインサイチューに保持され、欠損の軟骨および骨表面に接着することが示される。
【００６６】
実施例4
血液/ポリマー混合物の調製、混合、およびインビトロ固体化
血液と水性ポリマー溶液とを混合するために、いくつかの別個の混合方法が使用された（図15A）。血液とポリマーはレシピエントにおいて混合され、均一な血液とポリマーの混合液が得られる。
【００６７】
一般に、血液3容に対して等張および等浸透圧溶液の1.5%多糖類1容の割合で混合された。キトサンゲルの場合は、1.5%キトサンは70 mM HClおよび135 mM ?-グリセロールリン酸中に溶解された。第1の血液/ポリマー混合法では、1本の1 cc シリンジに750μlの末梢全血を充填し、第2の1 ccシリンジに250μlの液体ポリマー溶液を充填した。シリンジ同士を結合し、均一に見えるまで40回押したり引いたりして2つの層を混合した。第2の混合方法では、625μlの液体ポリマー溶液を、いくつかの3 mm〜6 mmスチールボールを入れた2.0 mlクリオバイアル（Corning）中に添加した。クリオバイアルを1.875 mlの全血で充填し、キャップをねじ込み、バイアルを10秒間激しく振った。第3の混合方法では、2 mlの液体ポリマー溶液を12 mlの無菌ホウケイ酸ガラスバイアル（InterGlass 5 cc血清バイアル）に入れた。ゴムのストッパーと金属のクリンパーでバイアルを閉じ、10 mlシリンジおよび20ゲージ針を用いて、バイアルに25 ml 空気吸引（air vacuum）された。適切な静脈切開技術を用いて、ウサギの動脈、またはヒトもしくはウマの静脈から末梢血が無菌10 mlシリンジに採取された。20ゲージの針がシリンジに接続され、バイアルのゴムストッパーを貫通して挿入された。末梢血6 mlがバイアルに添加された。バイアルは全速で10秒間ボルテックスで混合された。これらの混合技術の後、得られた混合液は、室温の4 mlホウケイ酸ガラスバイアル、37℃のプラスチックバイアル、またはアガロースウェル（図15および15C）、またはエクスビボの関節軟骨欠損に添加された。対照として、末梢全血のみで同じ処理が行われた。別の対照として、CBCおよび血小板数の測定のために、EDTA処理した血液がバキュテナバイアル（vacutainer vial）で採取された。検査された全ての血液試料は、各々の種の正常なCBCおよび血小板数を示した。種に無関係に、調製された血液/ポリマーは混合後2.5〜18分以内に、固体化してガラスバイアルの壁に強く接着した（図16）。混合された末梢全血は、血液/キトサンゲルよりも、一般にゆっくりと固体化した（図16）。液体キトサンゲルありまたはなしの血液試料が混合され、混合してから元の混合バイアルまたは2次レシピエント中で接着性のある固体になるまでにかかる時間（分）として、固体化時間は測定された。
【００６８】
血液/ヒアルロン酸、血液/ヒドロキシエチルセルロース、および血液/アルギン酸塩を含む、さらなる血液/ポリマー溶液の試験によって、これらの混合物も、血液のみに相当する時間で固体化することが示された（図17A）。ここで、キトサン液体ゲルを末梢全血に混合すると、血塊の形成が促進され、血液/キトサンゲル固体化時間は臨床応用に許容できると結論された。収縮は、ウサギの混合された新鮮な末梢血、またはPBSもしくはグリセロールリン酸緩衝液中のキトサンを含む種々の1.5%多糖類溶液と混合されたウサギ血液で調べられた。混合しない新鮮な血液も解析された。グリセロールリン酸緩衝液中のヘパリン血/キトサンも解析された。各試料500μlが37℃で4 mlガラスチューブに添加された。いくつかの時点で、各チューブから排除された血漿を全て取り出し、計量して、血塊の収縮量を決定した。血液/キトサングリセロールリン酸混合物以外の全ての試料は、元の体積の30〜50％に収縮した。血液/キトサン混合物の収縮はわずかで、最初の体積の約90％が維持された。
【００６９】
凝固した全血に対する、固体化した血液/ポリマー混合物の収縮の程度を調べるために、いくつかの対照を用いて、血液/ポリマー試料のアレイで、血塊収縮試験が行われた（図17A、17Bおよび17C）。対照の1群は、撹拌しない末梢全血、または撹拌した末梢全血、または3:1（体積：体積）でリン酸緩衝生理食塩水と撹拌した末梢全血で構成されていた。これらの試料は、末梢全血の3容に対してPBSに溶解した1.5%の異なる多糖類溶液（アルギン酸塩、ヒドロキシエチルセルロース、またはヒアルロン酸）の1容で撹拌した実験試料と比較された。別の試料は、末梢全血の3容に対して混合した1容のキトサングリセロールリン酸溶液から構成されていた。固体化後18時間までのいくつかの時点で、各条件で排除された血清が3回通り測定され、収縮の程度の指標とされた。末梢血±PBSの試料は、元の体積の30％まで収縮した（図17A）。多糖類であるアルギン酸塩、ヒドロキシエチルセルロール、またはヒアルロン酸と混合された末梢血は、元の体積の40〜50％まで収縮した（図17A）。血液/キトサンゲル試料の収縮は無視できる程度で、元の体積の90％まで収縮した（図17A）。ヘパリン血/キトサンゲル試料も収縮に抵抗し、元の体積の85％まで収縮した（図17A）。これらのデータから、血液/キトサンゲルは収縮に抵抗性で、軟骨欠損内でより空間を充填するフィブリン骨格を提供すると結論された。図17Bおよび17Cで示されている試料は、血液(1)、または混合した血液(2)、血液/PBS (3)、血液/グリセロールリン酸中のキトサン(4)、ヘパリン血/キトサン(5)、血液/アルギン酸塩(6)、血液/ヒドロキシエチルセルロース(7)、および血液/ヒアルロン酸(8)を示す。
【００７０】
凝固阻害した血液が血液/多糖類インサイチュー固体化インプラントの作製に使用できるかどうかを調べるために、1.5 mM EDTA、0.38％クエン酸、酸-0.38％クエン酸デキストロース、またはヘパリンナトリウム（Becton Dickinson）で処理した血液3容が、1容のキトサン-グリセロールリン酸溶液と混合された。キトサン-グリセロールリン酸溶液は、ヘパリン（図18）、EDTA、およびクエン酸を介する凝固阻害を逆行させることができた。グリセロールリン酸中の1.5％キトサン、または3つの異なる1.5％多糖類溶液は、多糖類溶液：末梢全血が1:3の体積比で混合された。各試料500μlをホウケイ酸ガラスチューブに添加し、37℃で60分間固体化させた。異なる多糖類にはヒアルロン酸-PBS (1)、ヒドロキシエチルセルロース-PBS (2)、アルギン酸塩-PBS (3)、およびキトサン-グリセロールリン酸(4)が含まれている。対照として、ヘパリン血のみが解析された(5)。60分後に、チューブを水平に置き、写真で記録した。キトサン-グリセロールリン酸とヘパリン血の混合物のみが固体化した。
【００７１】
ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、またはヒアルロン酸を用いた他のヘパリン血/多糖類混合物は固体化しなかった（図18）。これらのデータから、抗凝固血を用いても血液/キトサンインサイチュー固体化インプラントが作製できると結論された。
【００７２】
固体の血液/ポリマー試料の組織切片は、混合物は均一で、混合または固体化後に赤血球は溶血せず、血小板は活性化され機能した（密なフィブリンネットワークの作製で示される）ことが示された（図19Aから19C）。血液/キトサンの固体化混合物を固定し、LRホワイトプラスチックに包埋し、切片を作製し、トルイジンブルーで染色した。20xの倍率の図19Aでは、全体の均一な混合が明らかである。100xの倍率の図19Bでは、赤血球およびキトサンハイドロポリマーの混合したプールが明らかである。2000xの倍率（環境電子走査顕微鏡）では、血液/キトサン複合物全体にわたって、フィブリン線維のネットワークが存在することが明らかである。
【００７３】
混合および固体化後、何時間かはいくらかの白血球が生存していた（図20）。末梢全血はキトサンゲルと混合され、固体化した。固体化の60分後の図20Aでは、カルセインAM/エチジウムホモダイマー-1の生存力染色にプラグを入れ、生きた白血球細胞（緑の細胞、大きな矢印）、生きた血小板（緑の細胞、小さな矢印）、および死んだ白血球細胞（赤の核）が明らかになった。図20Bでは、異なる試料を固体化後180分において固定し、LRホワイトに包埋し、透過型電子顕微鏡で観察した。細胞の生存力を反映する末梢単球（矢先）による活性な食細胞活動が、混合および固体化の3時間後に、TEM顕微鏡写真で明らかである。
【００７４】
固体化後に血液または血液/キトサンから失われた総血清蛋白質の解析が行われた。等量の血液または血液/キトサンゲルが、アガロースウェル中で固体化された。ディスクは、1 ml PBSを含む48ウェルのプレートの個々のウェルに移され、37℃で3時間インキュベートされた。4時間、5時間、7時間、および19時間後に、ディスクは引き続いて37℃の新しいPBS中に移された。PBS洗浄液は軽く遠心して解析前に細胞を除去した。PBS中に3時間または19時間入れた後に、いくつかのディスクから総蛋白質が抽出された。ディスクまたはPBS洗浄液中に存在する総蛋白質は、SDS-PAGEおよびシプロオレンジ（Sypro Orange）染色による総蛋白質染色で解析した。血清蛋白質は、血液試料に比べて、血液/キトサン試料からよりゆっくりと、より持続的に放出された（図21）。これらのデータは、創傷治癒に関与する血液および血小板由来蛋白質は、血塊に充填された欠損と比較して、血液/キトサンに充填された欠損から、より持続的に長時間放出されることを示唆する。血液/キトサンゲルまたは血液のみの固体ディスクが元の液体体積が150μlの液体から作製された。得られたディスクは1 ml PBSで3時間洗い、4時間、5時間、7時間、および19時間の時点で移し替え、合計さらに4回1 ml PBSで洗った。3時間または19時間の洗浄後、代表するディスクをGuClで抽出して、保持された総蛋白質を可溶化した。可溶性蛋白質を等体積のGuCl抽出物またはPBS洗浄液から沈殿させ、SDS-PAGEゲルで分離し、シプロオレンジを用いて総蛋白質を染色した。比較すると、19時間の洗浄期間を通して、血液ディスクよりも血液/ポリマーディスクの方が多くの蛋白質を保持していた。比較すると、19時間の洗浄期間を通して、血液よりも血液/ポリマーの方が、よりゆっくりと、より長時間にわたって血清蛋白質をPBS洗浄液に放出した。
【００７５】
実施例5
関節軟骨欠損の治癒を改善するための血液/ポリマー混合物の調製、混合、および注入
肋軟骨下骨へ貫通する軟骨欠損を、液体として送達される液体の末梢血/キトサングリセロールリン酸混合物で処理し、インサイチューで固体化させた（図22Aおよび22C）。図22Aでは、3 x 4 mmの全層軟骨欠損が成体（7ヶ月以上）ニュージーランドホワイトウサギの大腿膝蓋溝に作製された。骨に直径1 mmのマイクロドリル穴を4つ、出血が観察されるまで開けた。図22Bでは、液体の全血を3容の血液、グリセロールリン酸溶液中キトサン1容の割合で混合し、欠損に充填した。図22Cでは、インサイチュー5分後に、血液/キトサンインプラントが固体化しているように見える。被膜と皮膚を縫合し、ウサギは動きの制限なしに回復させた。
【００７６】
ヒトの患者の同様な治療が図22Dに模式的に示されており、準備された軟骨欠損にインサイチューで固体化する液体血液/ポリマーを関節鏡注入する。または、液体ポリマーの関節鏡注入物は、欠損部位で骨由来の血液と混合される（図22E）。図22Dでは、患者の血液はエクスビボでポリマーと混合され、関節鏡注入により、準備された欠損部に送達するか、または（図22E）関節鏡を用いてもしくは膝の開放手術中にポリマーを送達し、欠損部から出る患者の血液と欠損部で混合する。
【００７７】
概念実証のために、血液/キトサンゲル治療がウサギで検討された。成体の骨格の成熟したニュージーランドホワイトウサギ（7ヶ月以上）にキシラジン-ケタミンに続きイソフルオレン/酸素ガスで麻酔をした。傍膝蓋骨切開および膝蓋骨移動によって、大腿膝蓋溝の滑車を露出した。大腿膝蓋溝の滑車に最高4 x 5 mmまでの全層軟骨欠損を顕微手術用メスを用いて作製した。深さ4 mm、直径1 mmの４つの骨貫通穴が、4℃ PBSの連続還流を行いながらのマイクロドリル、またはあつらえの突きぎりおよびハンマーを用いた穿孔によって作製された。欠損部にPBSを流し、出血の程度によって、最高200μlのリン酸緩衝生理食塩水中の無菌エピネフリン（2μg/ml）を出血する穴に注入した。軟骨欠損はPBSに浸した無菌ガーゼで覆った。ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）製のバキュテナ（vacutainer）（商標）針および未処理のシリコン加工ガラスの4cc バキュテナ（vacutainer）（商標）バイアルを用いて、耳の中心動脈からウサギの末梢血を採取した。
【００７８】
1つの処理では、血液750μlが無菌の1 ccシリンジに採取された。250μlのキトサン-グリセロールリン酸溶液（1.5％キトサン/70 mM HCl/135 mM ?-グリセロールリン酸）を入れた第2のシリンジを、無菌プラスチックコネクターを用いて血液を入れたシリンジと相互接続した。シリンジは40回押したり引いたりした。混合液を1つのシリンジに入れ、これに20ゲージの針を接続した。混合液の半分をパージした後、1滴（約25μl）を欠損に添加した。別の治療では、667μlの1.5%キトサン/70 mM HCl/135 mM ?-グリセロールリン酸、および直径3.2 mmの無菌ステンレスビーズ6個を入れたポリプロピレンのクリオバイアルチューブに、血液2 mlを添加した。チューブにキャップをし、10秒間激しく振盪した（約40〜50回）。得られた液体血液/キトサン混合物を、無菌の1ccシリンジを用いてバイアルから取り出し、20g針をシリンジに接続した。シリンジから200μlをパージした後、1滴（約25μl）を軟骨欠損部に添加して充填した。血液/キトサン混合物を5分間固体化させ、その後、被膜と皮膚を縫合し、創傷を消毒した。ウサギは1週目（n=1、オス）または51日目もしくは56日目（n=2、オス1匹、メス1匹）に屠殺した。関節を固定し、脱灰し、LR/ホワイトプラスチックに包埋し、切片を作製し、トルイジンブルーで染色した。治癒1週目の血液/キトサン処理欠損は、多数の走化性細胞が血液/キトサン充填領域に移動していることを示した（図23A）。未処理欠損部は、欠損部の上部の血塊に対して、比較的弱い走化性反応を示した（図23B）。成体ニュージーランドホワイトウサギの両側大腿膝蓋溝に、マイクロドリル穴を持つ軟骨欠損を作製し、その1つを血液/キトサンゲルで充填し、もう1つは治療しなかった。治癒1週目に、関節を固定し、LRホワイトで処理し、トルイジンブルーで染色した。軟骨表面の2〜3 mm下に、血液/キトサンで充填した欠損に向かって移動する多数の細胞が明らかであったが（図23A）、未処理の欠損の同じ領域には、より少ない数の移動する細胞しか見られなかった（図23B）。
【００７９】
治癒5週目から8週目には、2羽のウサギ（オス1匹、メス1匹）で、血液/キトサン処理した欠損はガラス状の修復組織で充填されていた（図24A）。この血液/キトサンベースの修復組織は、ガラス状のGAGに富む軟骨修復組織のような外見をしていた。未処理のまたは血液のみで処理した微小破壊欠損の修復組織は、線維軟骨の外見をしていた（図24B）。血液/キトサンまたは血塊が送達後3週間またはそれ以上欠損部位に残ることを示す組織学的証拠はなかった。成体ニュージーランドホワイトウサギの両側大腿膝蓋溝に、マイクロドリル穴を持つ軟骨欠損を作製し、その1つを血液/キトサンゲルで充填し、もう1つは治療しなかった。治癒51日目または56日目に、関節を固定し、LRホワイトで処理し、トルイジンブルーで染色した。図24Aでは、血液/キトサン処理した欠損の修復組織は、異染性の染色硝子軟骨の性状をしており、欠損表面に接着し、欠損を充填していた。図24Bでは、未処理の欠損の修復組織は、線維軟骨の性状をしており、異染性染色のGAGはほとんど見られず、部分的に欠損を充填するのみだった。
【００８０】
本発明は、説明された態様に関して特に記述されたが、当業者には数多くの改変が明らかであると思われる。したがって、上記の説明および添付の図面は、本発明の説明であり、限定するものではないと理解する必要がある。例えば、本発明者らは溶液のキトサンを血液と混合すると、あまり収縮されず、走化性および分裂促進性の血液蛋白質をゆっくりと放出するポリマー/血塊が形成され、血液細胞の生存力が維持され、関節軟骨欠損の修復が劇的に改善することを示した。当業者には、同じ結果を得るために、キトサン溶液を異なる方法で調製できることが明らかである。例には：1) キトサン濃度および血液との混合比率の変更、2) 緩衝液の種類および種の濃度を変更することによる水溶液の選択の変更、3) キトサン凝集物の水性懸濁液、4) 粒子状のキトサン粉末と適切な混合技術を組み合せて、これらの粒子を血液全体に分布させ部分的に溶解させることが含まれる。1) 抗凝固効果が製剤（低濃度を使用したり、トロンビンと組み合せるなど）により凝固促進状態にできる場合には、ヒアルロナンのような他の多糖類、および2) ポリリジンまたはコラーゲンのような蛋白質ポリマーのような他のポリマーも使用して、同様な効果を得ることができる。後者の手法は、免疫原性、毒性、および細胞接着/収縮効果のために、本発明者らの好ましい態様ほどの成功はしないが、これらおよび他の製剤は、本発明の一部と見なされる。それは、1) 血液または血液の選択された成分と混合可能であること、2) 得られた混合物が、組織の修復、再生、再建、またはバルキングを必要とする体の部位に注入可能または入れることができること、および3) 混合物は入れた部位で、組織の修復、再生、再建、またはバルキングに対して有用な効果を持つこと、という本発明のポリマー調製の特徴を持っているためである。
【００８１】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ポリマー溶液と細胞の混合、および軟骨増殖のためのインビトロ固体化および培養を表す模式図である。
【図２】  キトサン/グリセロールリン酸ゲル中での被包および培養後の軟骨細胞の生存力を示す。
【図３】  グリコサミノグリカン(GAG)の蓄積で測定した、インビトロでのキトサンゲル内の軟骨形成を示す。
【図４】  キトサンゲル内で0日、14日、および20日培養した初代軟骨細胞の発現する軟骨特異的mRNAのRNaseプロテクション解析を示す。
【図５】  キトサンゲル内で0日、14日、および20日培養した初代軟骨細胞の発現する軟骨特異的蛋白質のウェスタンブロット解析を示す。
【図６】  軟骨細胞ありおよびなしで培養したゲルディスクの機械的振る舞いを示す。
【図７】  ポリマーと細胞の混合およびマウスへの皮下注射の模式図である。
【図８】  ヌードマウスの皮下で増殖した軟骨のトルイジンブルー組織構造を示す。
【図９】  初代軟骨細胞ありおよびなしのキトサンゲルのインビボインプラントで発現する軟骨特異的mRNAのRNaseプロテクション解析を示す。
【図１０】  初代軟骨細胞を含むキトサンゲルのマウスインプラントがインビボで発現する軟骨特異的蛋白質のウェスタンブロット解析を示す。
【図１１】  ヌードマウスの皮下で増殖した軟骨インプラントの機械的性質を示す。
【図１２】  無傷の関節のエクスビボブタ大腿骨顆の軟骨のみの欠損への熱でゲル化するキトサン溶液の接着を示す。
【図１３】  ウサギの軟骨欠損への熱でゲル化するキトサン溶液の添加およびインビボにおける24時間滞留を示す。
【図１４】  注入24時間後の、ウサギの軟骨欠損における熱でゲル化するキトサン溶液の保持を示す。
【図１５Ａ】  血液/ポリマー混合物の調製、混合、およびインビトロ固体化を示す模式図を表す。
【図１５Ｂ及び１５Ｃ】  ガラスまたはプラスチック製のアガロースウェル（図15B）またはチューブ（図15C）における、インビトロでの液体血液/ポリマーの固体化を示す。
【図１６】  3つの異なる種由来の血液を用いた、血液/キトサン混合物に対する血液のみの平均固体化時間を示す。
【図１７Ａ】  グラスバイアルへの沈着後、時間に対する血漿放出で測定した血液、または血液/ポリマー混合物の凝固収縮を示す。
【図１７Ｂ及び１７Ｃ】  固体血液および血液/ポリマー混合物の物理的性状を示す。ガラスチューブ内、収縮後28時間（図17B）またはアガロースウェル中で自由に膨張したディスクをタイロード緩衝液中でインキュベートしたもの（図17C）。
【図１８】  液体キトサンの混合がヘパリンを介した抗凝固を逆行させるが、他の液体多糖類溶液は逆行させないことを示す。
【図１９】  血液/ポリマー混合物の組織構造を示す。
【図２０】  キトサン溶液と混合した後の白血球および血小板の生存力を示す。
【図２１】  血液のみに比較して、インビトロで形成された血液/ポリマー混合物では血液蛋白質の放出が延長することを示す。
【図２２Ａ〜２２Ｃ】  関節軟骨欠損の治癒を改善するための、ポリマー/血液混合物の調製、混合、および注入を示す。
【図２２Ｄ及び２２Ｅ】  ヒト関節軟骨の治癒のための治療法の模式図である。
【図２３】  骨を貫通する穴をもつ軟骨欠損に血液/ポリマー混合物を送達した1週間後に、骨髄由来で軟骨欠損に移動する修復細胞の走化性が増強したことを示す。
【図２４】  血液/ポリマー混合物で治療した欠損中の硝子軟骨の増殖に対する治療しなかった欠損の線維性組織の増殖を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３】
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【図２４】
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