(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを有し、当該レポーター蛋白質を１種類以上の非神経細胞で発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡが、該ＤＮＡの上流に存在するプロモーター活性を有するＤＮＡと連結されており、プロモーター活性を有するＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡである、上記のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）ｌｏｘＰ、ＰＧＫプロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子、ｌｏｘＰ、ＣＡＧプロモーターの順に連結されたＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｃ）（ｂ）のＤＮＡの有する塩基配列において、１〜２０個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｄ）（ｂ）のＤＮＡの有する塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
【請求項２】
非神経細胞が、上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官、および感覚器からなる群から選ばれる部位を構成する細胞である、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
上記レポーター蛋白質を、上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官、および感覚器の全ての組織又は器官で発現する、請求項１又は２記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）アポエクオリンをコードするＤＮＡ；
（ｂ）カメレオンをコードするＤＮＡ；
【請求項５】
非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサルからなる群から選ばれる非ヒト哺乳動物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
非ヒト哺乳動物が、染色体上に変異遺伝子を有する非ヒト哺乳動物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の受精卵にマイクロインジェクションし、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植した後、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項８】
外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入し、該胚性幹細胞を非ヒト哺乳動物の受精卵に導入し、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管または子宮に移植し、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項９】
外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の細胞に導入し、該細胞の核を、脱核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に導入し、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管または子宮に移植し、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項１０】
外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の精子に取り込ませ、該精子を非ヒト未受精卵と受精させ、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管または子宮に移植し、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項１１】
外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をレトロウイルスベクターに組み込み、該レトロウイルスベクターを含むウイルスを非ヒト受精卵に感染させ、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管または子宮に移植し、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に用いる、外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを導入した非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞であって、外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡが、該ＤＮＡの上流に存在するプロモーター活性を有するＤＮＡと連結されており、プロモーター活性を有するＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡである、上記胚性幹細胞。
（ａ）ｌｏｘＰ、ＰＧＫプロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子、ｌｏｘＰ、ＣＡＧプロモーターの順に連結されたＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｃ）（ｂ）のＤＮＡの有する塩基配列において、１〜２０個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｄ）（ｂ）のＤＮＡの有する塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞。
【請求項１４】
細胞が、胚性幹細胞、卵および精子からなる群から選ばれる細胞である、請求項１３記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の細胞の核。
【請求項１６】
外来性のレポーター蛋白質を発現する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞を用い、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
【請求項１７】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、生きているトランスジェニック非ヒト哺乳動物である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２または１４に記載の胚性幹細胞を分化誘導し、該分化誘導によって得られる細胞の細胞内カルシウムイオンの濃度変化を、胚性幹細胞に導入した外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
【請求項１９】
被検物質と、外来性のレポーター蛋白質を発現する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞とを接触させ、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出し、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度調節に関する物質をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
請求項１３または１４記載の細胞を用いることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項２１】
請求項１５記載の細胞の核を用いることを特徴とする、クローン非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１記載の方法により作製されるトランスジェニックまたはクローン非ヒト哺乳動物。
【請求項２３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の動物とを交配させることを特徴とする、請求項１の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子改変哺乳動物の製造法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法により取得される、請求項１の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡを有する遺伝子改変哺乳動物。
【請求項２５】
外来性のレポーター蛋白質を発現する、請求項２２または２４に記載の哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞を用い、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
【請求項２６】
哺乳動物が、生きている哺乳動物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
被検物質と、外来性のレポーター蛋白質を発現する、請求項２２または２４に記載の哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞とを接触させ、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出し、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度調節に関する物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。さらに詳細には、本発明は、薬理評価動物として有用な、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを１以上の組織または器官で発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法、上記方法により作製した動物の利用方法、上記方法に用いるプロモーター活性を有するＤＮＡ及びその利用方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は多くの細胞から構成されており、それら細胞が密接に連絡を取りながら生命活動を営んでいる。その密接な細胞間の連絡には、ホルモン、神経伝達物質、細胞増殖因子などの生理活性物質が関与しているが、これら生理活性物質の中には、細胞内のカルシウムイオンの濃度を変化させることで情報伝達を行っているものが多く存在する。
【０００３】
細胞内情報伝達物質としてのカルシウムイオンの役割は、１９６０年代にEbashiらにより骨格筋において示された（Ann. Rev. Physiol., 38, 293, 1976）。その後、Ozawaらにより、カルシウムイオンは筋収縮に関与するだけではなく、その他の酵素反応にも関与することが示され（J. Biochem., 61, 531, 1967）、今日では、神経の興奮（Ann. Rev. Physiol., 60, 327, 1998）、分泌腺からの生理活性物質の分泌（Cell Calcium., 24, 367, 1998）、細胞増殖あるいは分化（Cellular Signalling, 9, 483, 1997）を含む様々な生理現象に関与していることが明らかにされている。細胞質内へのカルシウムイオン導入のメカニズムに関しては、Michellによりホスファチジルイノシトール代謝回転が細胞質内におけるカルシウムイオンの濃度を変化させるのに重要な働きを担っていることが示唆された後（Biochim. Biophys. Acta, 415, 81, 1975）、カルシウムイオンの細胞内プールである小胞体にイノシトール１，４，５−トリリン酸（ＩＰ３）の受容体が存在し、この受容体を介したカルシウムイオンの放出の機構が明らかにされ、カルシウムイオンがセカンドメッセンジャーと呼ばれる細胞内情報伝達物質の一つであることが示された（Nature, 342, 32, 1989）。
【０００４】
このように、細胞内でのカルシウムイオンの動態変化は多くの生理現象に関与しており、生体においてカルシウムイオンの濃度変化を正確に測定しモニターすることは医療分野や医薬開発において非常に重要である。
【０００５】
細胞内のカルシウムイオン濃度を測定する方法としては、１）ｆｕｒａ−２やｉｎｄｏ−１等のカルシウム指示薬を用いる方法（Nature, 290, 527, 1981; J. Cell. Biol., 94, 325, 1982）、２）カルシウム二価イオン感受性微少電極を用いる方法〔Detection and Measurement of Free Ca2+ in cells (Elsevier, North-Holland, Amsterdam, 1979)〕、３）蛍光のエネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer; FRET）を利用する方法、４）カルシウムイオン感受性発光蛋白質エクオリンを用いる方法（Biochem. Biophys. Res. Commun., 29, 229, 1967）などが挙げられる。
【０００６】
カルシウム指示薬を用いる測定法は最も広く用いられているが、これら指示薬は蛍光物質であるために測定において励起光を照射する必要があり、そのことに起因する問題がある。すなわち、生体試料中には血清成分を始めとする自家蛍光物質が含まれているため、これら物質の蛍光の影響を考慮する必要がある（J. Biol. Chem., 260, 3440, 1985）。また、細胞内のＮＡＤＨやＮＡＤＰＨも自家蛍光を発することが知られている（細胞工学, 17, 584, 1998）。さらに、励起光を照射できない複雑な構造体を有する生体試料（例えば、器官や組織をそのまま培養した状態の試料）では細胞内カルシウムイオンの測定は困難である。
【０００７】
カルシウム二価イオン感受性微少電極を用いた方法でも、測定するためには細胞内に電極を挿入する必要があるという本質的な制約がある。
【０００８】
蛍光のエネルギー移動を利用した方法としては、二種類の蛍光蛋白質をカルモジュリンとＭ１３ぺプチドで連結させたキメラ蛋白質Ｃａｍｅｌｅｏｎを用いる方法（Nature, 388, 882, 1997）が開発されているが、測定においては励起光の照射が必要であり、カルシウム指示薬を用いて測定する場合と同様の問題点が指摘されている（細胞工学, 17, 584, 1998）。
【０００９】
次にカルシウムイオン感受性発光蛋白質エクオリンを用いた方法について説明する。エクオリンは発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）の傘周辺に存在する生物発光タンパク質複合体であり、1962年にShimomuraらにより精製された（J. Cell Comp. Physiol., 59, 223, 1962; Methods in Enzymol., 57, 271,1978）。エクオリンは、タンパク質部分のアポエクオリン、発光基質であるセレンテラジンおよび分子状酸素からなる複合体であり、カルシウムイオンとの結合により発光するタンパク質複合体である（Pharmacol. Rev., 28, 1, 1976; Biochem. Biophys. Res. Comm., 211, 359, 1995 ）。1985年には Charbonneauらがアポエクオリンのアミノ酸配列を決定し（Biochemistry, 24, 6762, 1985）、Cormierら（Biochem. Biophys. Res. Comm., 126, 1259, 1985;特開昭 61-224989号）および Inouyeら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3154, 1985;特開昭 61-135586号）がアポエクオリン遺伝子をクローニングし、その塩基配列を明らかにした。その後、より強く発光する変異体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 80, 1989; 米国特許第 5,541,309号）、カルシウムイオン感受性を高めた変異体（Biochemical Journal, 228, 745, 1985）、熱や凍結乾燥に対する安定性を高めた変異体（特開平9-278796号）、小胞体に局在するように改変した変異体（EMBO J., 14, 5467, 1995）が作製されている。
【００１０】
エクオリンはカルシウムイオンとの結合により発光を生じることから、カルシウムイオン濃度の測定に用いられており、例えば、アポエクオリン蛋白質を直接細胞内にインジェクションする方法（Biochem. J., 248, 313, 1987）や、培養細胞でアポエクオリン遺伝子を発現させる方法（J. Biol. Chem., 270, 9896, 1995）が用いられている。しかしながら、これらの方法では、カルシウムイオン濃度の測定の対象となる試料は一定期間in vitroで培養できる細胞に限定される。また、蛋白質あるいは遺伝子の導入効率が限られるため、培養に供している生体試料の全ての細胞にアポエクオリンをインジェクションまたは発現させることは困難である。特に、培養状態の器官や組織からなる生体試料へのアポエクオリンの導入は困難である。
【００１１】
また、生体内で生体の一部を構成している状態の細胞と、生体から単離しin vitroで培養している状態の細胞とでは、生理的機能や外部からの刺激に対する応答が異なることが知られている（Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, 385, 1989）。従って、細胞の本来の機能は生体を構成している状態の細胞を用いて評価することが望ましく、より生体に近い状態を反映した環境において、細胞の機能を調べることができる方法の開発が求められている。
【００１２】
上記課題を解決する一つの手段として、トランスジェニック個体の作製が試みられてきた。例えば、アポエクオリンを導入したハエを用いて神経ぺプチドの作用機構が解析されている（J. Cell Sci., 110, 1683, 1997）。植物では、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターの下流にアポエクオリン遺伝子を結合させた遺伝子を導入したトランスジェニック植物が作製され、接触や低温ショックによる細胞内のカルシウムイオン濃度の変化が観察されている（Nature, 352, 524, 1991）。哺乳動物においては、神経細胞特異的プロモーター、すなわち、エノラーゼプロモーターの下流にアポエクオリン遺伝子を結合させた遺伝子を導入したトランスジェニックマウスが作製され、薬物応答による神経細胞での細胞内カルシウムイオンの濃度変動の測定が可能であることが示されている（米国特許第5,714,666号）。
【００１３】
トランスジェニック個体を作製する場合、導入遺伝子は該個体の染色体上にランダムに挿入されるため、導入遺伝子の発現効率や発現分布に個体差が生じる。例えば、ハウスキーピング遺伝子として各細胞で構成的に発現していると考えられるβアクチン遺伝子のプロモーターを用いて遺伝子導入を行っても、導入遺伝子を発現しない細胞が観察されることが報告されている（Development, 106, 37, 1989）。より強力なプロモーター活性を示すことが知られているヒトサイトメガロウイルスのＩＥ（immediate early）遺伝子のエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターを融合させたプロモーター（以下、ＣＡＧプロモーターと称する）を用いて遺伝子導入を行っても、臓器での発現は個体間で必ずしも一致しない（Develop. Growth  Differ., 37, 455, 1995; FEBS Letters, 407, 313, 1997）。また、哺乳動物において神経以外の生体組織にアポエクオリンを長期に発現させた場合に生ずる毒性や生理機能障害についての知見は報告されていない。トランスジェニック動物を作製する際には、導入遺伝子の挿入位置に存在する既存遺伝子の破壊の影響も考慮する必要があり、導入遺伝子の染色体上の挿入位置が異なる個体は遺伝的背景が異なる別の系統として扱われる。候補医薬を薬理評価する場合には、遺伝的背景が均一な近交系動物がモデルとして用いられることが多い。したがって、より多くの組織や器官で導入遺伝子が安定的に発現しているトランスジェニック動物を作製することができれば、遺伝的背景が同一で、かつ、細胞内カルシウムイオンの濃度変化を測定する目的に有用な多様な組織、器官あるいは細胞を供給することが可能となる。
【００１４】
トランスジェニック動物の作製方法に関しては様々な報告がある。
1980年、Gordonらによって、受精卵へ直接ＤＮＡをインジェクションすることによってトランスジェニックマウスが作製されて以来（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380, 1980）、同様の方法を用いてトランスジェニックゼブラフィッシュ（Development, 109, 577, 1990）、トランスジェニックニワトリ(Bio/Technology, 12, 60, 1994）、トランスジェニックラット（Nature, 344, 541, 1990）、トランスジェニックウサギ（Nature, 315, 680, 1985）、トランスジェニックブタ（Immunol. Immunopathol., 17, 303, 1987）の作製が報告されており、受精卵へ直接ＤＮＡをインジェクションすることによってトランスジェニック動物を作製する方法は汎用性の高い方法であることが示されている。
【００１５】
また、マウス胚性幹細胞が樹立されて以来（Nature, 292, 154, 1981 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981）、効率的な胚性幹細胞の樹立方法、例えば非マウスにおける胚性幹細胞の樹立法（米国特許第5,453,357号;米国特許第 5,670,372号）などが研究され、ラット（Dev. Biol., 163, 288, 1994）、ニワトリ（米国特許第5,340,740号;米国特許第 5,656,479号）、ブタ（Reprod. Fertil. Dev., 6, 563, 1994）、サル（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7844, 1996）、ヒト（Science, 282, 1145, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13726, 1998）の胚性幹細胞が樹立されている。これら胚性幹細胞への遺伝子導入は、通常の培養細胞への遺伝子導入の場合と同様に行うことができ、目的遺伝子を導入後、集合キメラ法や注入キメラ法等の手法によりトランスジェニック動物を作製できる〔Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)(以下、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版と略す); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993);バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング,ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995); 発生工学実験マニュアル, トランスジェニック・マウスの作り方, 講談社 (1987)〕。
【００１６】
さらに、1997年、Wilmutらによって哺乳動物ではじめて、体細胞の核由来のクローン個体である羊ドリーが作製されて以来（Nature, 385, 810, 1997）、胎児細胞の核を用いたクローンウシ（Science, 280, 1256, 1998）、皮膚、筋肉、耳殻、卵管、卵丘細胞の核を用いたクローンウシ（蛋白核酸酵素, 44, 892, 1999）、クローンヤギ（Nature Biotechnology, 17, 456, 1999）、卵丘細胞の核を用いたクローンマウス（Nature, 394, 369, 1998）、雄の尾の細胞を用いたクローンマウス（Nature Genetics, 22, 127, 1999）の作製が報告されている。体細胞や胚由来細胞への遺伝子導入は、通常の培養細胞への遺伝子導入の場合と同様に行うことができ、目的遺伝子を導入した核を脱核した卵へ移植することによってトランスジェニック動物が作製されている（Science, 280, 1256, 1998; Science, 278, 2130, 1997）。
【００１７】
さらにまた、顕微受精技術の進歩は、本来受精能を有していない精細胞にも受精能があることを明らかにし、マウス精母細胞（Biol. Reprod., 53, 855, 1995）、マウス精子細胞（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7460, 1994）、ウサギ精子細胞（J. Assist. Reprod. Genet., 11, 335, 1994）、ウシ精子細胞（Hum. Reprod., 11, 824, 1996）、ヒト精子細胞（New Eng. J. Med., 333, 525, 1995）を雄配偶子とした個体が得られている。さらに、凍結乾燥あるいは凍結融解した精子と外来遺伝子とを混合した後に顕微受精することで、目的とする外来遺伝子を染色体上に導入したトランスジェニックマウスが作製されている（Science, 284, 1180, 1999）。
【００１８】
卵細胞においては、８細胞期の胚にレトロウイルスを感染させることでトランスジェニック動物を作製する方法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）が一般的であるが、第二減数分裂中期の未受精卵にレトロウイルスを用いて遺伝子導入を行うことで、従来より効率良くトランスジェニックウシを作製できることが報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14028, 1998）。
【００１９】
また、胚性幹細胞から各種細胞への分化に関しても様々な報告がある。胚性幹細胞を胚性幹細胞と同系の個体の皮下に移植すると様々な組織が混じりあった奇形腫瘍テラトーマが誘導される（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）。胚性幹細胞のin vitro培養においても、内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイトに誘導されたことが報告されている（Reprod. Fertil. Dev., 10, 31, 1998）。
【００２０】
上記したようにトランスジェニック動物の作製方法は幾つか知られているが、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを有し、当該レポーター蛋白質を神経以外の組織で発現するトランスジェニック動物の作製はこれまでのところ報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを有し、当該レポーター蛋白質を１以上の組織または器官で発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて細胞内カルシウムイオンの濃度変化を検出する方法、上記作製方法に用いるプロモーター活性を有するＤＮＡ、並びにそのＤＮＡの利用方法を提供することを解決すべき課題とした。
【００２２】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、様々な生理活性物質の薬理評価に有用と考えられ、特に、生理機能を保ったままin vitroで培養することが難しい細胞や、複雑な細胞間ネットワークを持つ組織あるいは器官における薬物応答等を調べる際に有用と考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、様々な組織および器官において導入遺伝子の高い発現を促すプロモーター活性を有するＤＮＡ配列を探索し、該ＤＮＡ配列に連結した細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを哺乳類卵あるいは胚性幹細胞に導入することによってトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製した。さらに、本発明者らは、作製したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の各種組織および器官における導入遺伝子産物の発現を鋭意検討した結果、少なくとも１以上の非神経細胞（例えば、上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官、感覚器、および爪の各組織および各器官の細胞）で目的とする導入遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００２４】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（６１）に関する。
（１）  細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを有し、当該レポーター蛋白質を１種類以上の非神経細胞で発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（２）  非神経細胞が、上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官、感覚器、および爪からなる群から選ばれる部位を構成する細胞である、（１）記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【００２５】
（３）  外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡである、（１）または（２）記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）  アポエクオリンをコードするＤＮＡ；
（ｂ）  アポエクオリンが有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）  アポエクオリンが有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）カメレオンをコードするＤＮＡ；
（ｆ）カメレオンが有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）カメレオンが有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）（ｅ）〜（ｇ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
【００２６】
（４）  外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡが、該ＤＮＡの上流に存在するプロモーター活性を有するＤＮＡと連結されていることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（５）  プロモーター活性を有するＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡである、（４）記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）  ＳＥプロモーター配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）  ＣＡＧプロモーター配列を有するＤＮＡ；
（ｃ）  ＰＧＫプロモーター配列を有するＤＮＡ；
（ｄ）  ２種類のプロモーターの間にｈｐｒｔ遺伝子の挿入された配列を有するＤＮＡ；
（ｅ）  ｌｏｘＰ、プロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子、ｌｏｘＰ、プロモーターの順に連結されたＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのＤＮＡの有する塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのＤＮＡの有する塩基配列と５０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｉ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
【００２７】
（６）  非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサルからなる群から選ばれる非ヒト哺乳動物である、（１）〜（５）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（７）  非ヒト哺乳動物が、染色体上に変異遺伝子を有する非ヒト哺乳動物である、（１）〜（６）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（８）  外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の受精卵にマイクロインジェクションし、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植した後、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
（９）  外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入し、該胚性幹細胞を非ヒト哺乳動物の受精卵に導入し、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管または子宮に移植し、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【００２８】
（１０）  外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の細胞に導入し、該細胞の核を、脱核した哺乳動物の未受精卵に導入し、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管または子宮に移植し、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
（１１）  外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の精子に取り込ませ、該精子を未受精卵と受精させ、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管または子宮に移植し、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【００２９】
（１２）  外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーター活性を有するＤＮＡとを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をレトロウイルスベクターに組み込み、該レトロウイルスベクターを含むウイルスを卵細胞に感染させ、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管または子宮に移植し、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
（１３）  （１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に用いる、外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを導入した非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞。
（１４）  （１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞。
（１５）  細胞が、胚性幹細胞、卵および精子からなる群から選ばれる細胞である、（１４）記載の細胞。
【００３０】
（１６）  （１３）〜（１５）のいずれかに記載の細胞の核。
（１７）  外来性のレポーター蛋白質を発現する、（１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞を用い、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
（１８）  トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、生きているトランスジェニック非ヒト哺乳動物である、（１７）記載の方法。
（１９）  （１３）または（１５）に記載の胚性幹細胞を分化誘導し、該分化誘導によって得られる細胞の細胞内カルシウムイオンの濃度変化を、胚性幹細胞に導入した外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
【００３１】
（２０）  被検物質と、外来性のレポーター蛋白質を発現する、（１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞とを接触させ、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出し、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度調節に関する物質をスクリーニングする方法。
（２１）  （１４）または（１５）記載の細胞を用いることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（２２）  （１６）記載の細胞の核を用いることを特徴とする、クローン非ヒト哺乳動物の作製方法。
（２３）  （２１）または（２２）記載の方法により作製されるトランスジェニックまたはクローン非ヒト哺乳動物。
【００３２】
（２４）  （１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の動物とを交配させることを特徴とする、遺伝子改変哺乳動物の製造法。
（２５）  （２４）に記載の方法により取得される遺伝子改変哺乳動物。
（２６）  外来性のレポーター蛋白質を発現する、（２３）または（２５）に記載の哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞を用い、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
（２７）  哺乳動物が、生きている哺乳動物である、（２６）に記載の方法。
（２８）  被検物質と、外来性のレポーター蛋白質を発現する、（２３）または（２５）に記載の哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞とを接触させ、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出し、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度調節に関する物質をスクリーニングする方法。
【００３３】
（２９）  以下の（ａ）〜（ｆ）より選ばれるＤＮＡ。
（ａ）  ２種類のプロモーターの間にｈｐｒｔ遺伝子の挿入された配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）  ｌｏｘＰ、プロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子、ｌｏｘＰ、プロモーターの順に連結されたＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡの有する塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡの有する塩基配列と５０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
【００３４】
（３０）  ２種類のプロモーターの間にｈｐｒｔ遺伝子の挿入された配列を有するＤＮＡが、ＰＧＫプロモーターおよびＣＡＧプロモーターの間にｈｐｒｔ遺伝子の挿入された配列を有するＤＮＡである、（２９）に記載のＤＮＡ。
（３１）  ｌｏｘＰ、プロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子、ｌｏｘＰ、プロモーターの順に連結されたＤＮＡが、ｌｏｘＰ、ＰＧＫプロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子、ｌｏｘＰ、ＣＡＧプロモーターの順に連結されたＤＮＡである、（２９）に記載のＤＮＡ。
（３２）  哺乳類動物の染色体上に組み込まれたとき、ＤＮＡを構成するｌｏｘＰ、プロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子がそれぞれ、単独で有するプロモーター活性より高いプロモーター活性を有する、（２９）〜（３１）のいずれかに記載のＤＮＡ。
【００３５】
（３３）  上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器、感覚器及び爪からなる群から選ばれる部位を構成する細胞において、哺乳類動物の染色体上に組み込まれたとき、ＤＮＡを構成するｌｏｘＰ、プロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子がそれぞれ、単独で有するプロモーター活性より高いプロモーター活性を有する、（３２）に記載のＤＮＡ。
（３４）  （２９）〜（３３）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、外来性の蛋白質をコードするＤＮＡが連結されているＤＮＡを有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（３５）  外来性の蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡである、（３４）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｂ）細胞を標識するための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００３６】
（３６）  細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡである、（３５）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）アポエクオリンをコードするＤＮＡ；
（ｂ）アポエクオリンが有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）アポエクオリンが有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）カメレオンをコードするＤＮＡ；
（ｆ）カメレオンが有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）カメレオンが有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）（ｅ）〜（ｇ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
【００３７】
（３７）  細胞を標識するための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡである、（３５）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｂ）発光あるいは発色蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３８）  蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群から選ばれるＤＮＡである、（３７）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）クラゲの緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡ；
（ｂ）イソギンチャクの赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ）をコードするＤＮＡ；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の蛍光蛋白質が有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ蛍光を発する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）に記載の蛍光蛋白質が有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ蛍光を発する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ蛍光を発する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００３８】
（３９）  発光あるいは発色蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡである、（３７）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（ａ）ホタルのルシフェラーゼをコードするＤＮＡ；
（ｂ）ウミシイタケのルシフェラーゼをコードするＤＮＡ；
（ｃ）アルカリホスファターゼをコードするＤＮＡ；
（ｄ）β―ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ；
（ｅ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１項に記載の発光あるいは発色蛋白質が有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ任意の基質に作用して発光あるいは発色を触媒する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１項に記載の発光あるいは発色蛋白質が有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ任意の基質に作用して発光あるいは発色を触媒する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ任意の基質に作用して発光あるいは発色を触媒する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００３９】
（４０）  非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサルからなる群から選ばれる非ヒト哺乳動物である、（３４）〜（３９）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（４１）  非ヒト哺乳動物が、染色体上に変異遺伝子を有する非ヒト哺乳動物である、（３４）〜（４０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（４２）  （２９）〜（３３）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、外来性の蛋白質をコードするＤＮＡが連結されているＤＮＡを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の受精卵にマイクロインジェクションし、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植した後、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（３４）〜（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【００４０】
（４３）  （２９）〜（３３）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、外来性の蛋白質をコードするＤＮＡが連結されているＤＮＡを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入し、該胚性幹細胞を非ヒト哺乳動物の受精卵に導入し、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植した後、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（３４）〜（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
（４４）  （２９）〜（３３）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、外来性の蛋白質をコードするＤＮＡが連結されているＤＮＡを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の細胞に導入し、該細胞の核を、脱核した哺乳動物の未受精卵に導入し、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植した後、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（３４）〜（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【００４１】
（４５）  （２９）〜（３３）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、外来性の蛋白質をコードするＤＮＡが連結されているＤＮＡを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子を非ヒト哺乳動物の精子に取り込ませ、該精子を未受精卵と受精させ、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植した後、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（３４）〜（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
（４６）  （２９）〜（３３）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、外来性の蛋白質をコードするＤＮＡが連結されているＤＮＡを含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をレトロウイルスベクターに組み込み、該レトロウイルスベクターを含むウイルスを卵細胞に感染させ、得られた卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植した後、該移植された動物を飼育し、産まれた仔から、導入遺伝子を有する個体を選択する工程を含む、（３４）〜（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【００４２】
（４７）  （３４）〜（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に用いる、外来性の蛋白質をコードするＤＮＡを導入した非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞。
（４８）  （３４）〜（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞。
（４９）  細胞が、胚性幹細胞、卵および精子からなる群から選ばれる細胞である、（４８）に記載の細胞。
（５０）  （４７）〜（４９）のいずれかに記載の細胞の核。
【００４３】
（５１）  外来性のレポーター蛋白質を発現する、（３５）、（３６）、（４０）、（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞を用い、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
（５２）  トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、生きているトランスジェニック非ヒト哺乳動物である、（５１）に記載の方法。
（５３）  （４７）または（４９）に記載の胚性幹細胞を分化誘導し、該分化誘導によって得られる細胞のカルシウムイオンの濃度変化を、胚性幹細胞に導入した外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
（５４）  被検物質と、外来性のレポーター蛋白質を発現する、（３５）、（３６）、（４０）、（４１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、あるいは該動物の組織、器官または細胞とを接触させ、細胞内におけカルシウムイオンの濃度変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出し、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度調節に関する物質をスクリーニングする方法。
【００４４】
（５５）  外来性のレポーター蛋白質を発現する、（３４）〜（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の組織、器官または細胞を、免疫的に拒絶されない別の個体に移植し、移植した該組織、器官または細胞の生理的変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
（５６）  （４７）または（４９）に記載の胚性幹細胞または該胚性幹細胞を分化誘導した細胞を、免疫的に拒絶されない別の個体に移植し、移植した該細胞の生理的変化を、胚性幹細胞に導入した外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法。
（５７）  （４８）または（４９）に記載の細胞を用いることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（５８）  （５０）に記載の核を用いることを特徴とする、クローン非ヒト哺乳動物の作製方法。
【００４５】
（５９）  （５７）または（５８）に記載の方法により作製されるトランスジェニックまたはクローン非ヒト哺乳動物。
（６０）  （３４）〜（４１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の動物とを交配させることを特徴とする、遺伝子改変哺乳動物の製造法。
（６１）  （６０）に記載の方法により取得される遺伝子改変哺乳動物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下、本発明の実施態様および実施方法について詳細に説明する。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が有する外来性の蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡは、以下の２つに大別される。
（ａ）  細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）  細胞を標識するための外来性のレポーター蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明において、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質とは、細胞内に発現し、カルシウムイオン依存的に発光や蛍光、転写など何らかの機能を発揮することで細胞の外に細胞内のカルシウムイオン濃度の情報を伝えうるレポーター蛋白質を包含する。その例としては、アポエクオリン、カメレオンまたはそれらの変異体が挙げられる。
【００４７】
アポエクオリン遺伝子のＤＮＡ配列は、Cormierら（Biochem. Biophys. Res. Comm., 126, 1259, 1985;特開昭 61-224989号公報）および Inouyeら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3154, 1985;特開昭 61-135586号公報）により報告されており、既知である。カメレオン遺伝子のＤＮＡ配列は、Miyawakiら（Nature, 388, 882, 1997）により報告されており、既知である。
アポエクオリン蛋白質の変異体をコードするＤＮＡとしては、元のアポエクオリン遺伝子のＤＮＡ塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたものが挙げられる。アポエクオリン蛋白質またはその変異体をコードするＤＮＡとしては、具体的には以下のものが挙げられる。
（ａ）  アポエクオリンをコードするＤＮＡ；
（ｂ）  アポエクオリンが有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）  アポエクオリンが有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
【００４８】
上記において、「アポエクオリンが有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列」とは、野生型アポエクオリン蛋白質のアミノ酸配列において、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換または付加（本明細書で付加という場合には、配列の内部に挿入される場合または配列の外部に付加される場合の両方が含まれる）されたアミノ酸配列を意味する。
上記において、「アポエクオリンが有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する」とは、ＢＬＡＳＴ（J.Mol.Biol., 215, 403, 1990）やＦＡＳＴＡ（Methods in Enzymology, 183, 63-69, 1990）等の解析ソフトを用いて計算したときに、野生型アポエクオリン蛋白質に対するアミノ酸レベルでの配列同一性として少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上を示すことを意味する。
【００４９】
上記において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつカルシウムイオンとの結合により発光する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、野生型アポエクオリンをコードするＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、４２〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、４２〜６８℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーション法は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。該ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、野生型アポエクオリンをコードするＤＮＡの有する塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００５０】
上記において、「カルシウムイオンとの結合によって発光する機能を有する蛋白質」とは、野生型アポエクオリン蛋白質と同様に、発光基質であるセレンテラジンの存在下においてカルシウムイオンとの結合により発光しうる蛋白質を意味する。
アポエクオリン変異遺伝子を得る方法としては、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当分野で既知の任意の方法を用いることができる。例えば、野生型アポエクオリン遺伝子を得て、これを基にしてアポエクオリン変異遺伝子のＤＮＡを得ることができる。
【００５１】
野生型アポエクオリンをコードする遺伝子への変異導入は多くの方法により行うことができる。なお、変異導入はサブクローニングした野生型アポエクオリン遺伝子フラグメントに対して行ってもよいし、野生型アポエクオリン遺伝子全長に対して行ってもよい。例えば、野生型アポエクオリン遺伝子または野生型アポエクオリン遺伝子を含む組み換えＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487, 1982、Nucleic Acids Research, 12, 9441, 1984、Nucleic Acids Research, 13, 4431, 1985、Nucleic Acids Research, 13, 8749, 1985、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409, 1982、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488, 1985、Gene, 34, 315, 1985、Gene, 102, 67, 1991等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００５２】
野生型アポエクオリン遺伝子の一部のフラグメントに対し変異を導入した場合には、その後、他のフラグメントと連結し、全長のアポエクオリン変異遺伝子とすることが好ましい。得られたアポエクオリン変異遺伝子はＤＮＡシークエンシング法によってその塩基配列を確認できる。
既に本明細書中で上記した通り、アポエクオリン変異体としては、より強く発光する変異体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 80, 1989; 米国特許第5,541,309号）、カルシウムイオン感受性を高めた変異体（Biochemical Journal, 228, 745, 1985）、熱や凍結乾燥に対する安定性を高めた変異体（特開平9-278796号）、小胞体に局在するように改変した変異体（EMBO J., 14, 5467, 1995）などが報告されているが、本発明ではこのような変異体をコードする遺伝子を用いることもできる。
【００５３】
カメレオン蛋白質の変異体をコードするＤＮＡとしては、元のカメレオン遺伝子のＤＮＡ塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたものが挙げられる。カメレオン蛋白質またはその変異体をコードするＤＮＡとしては、具体的には以下のものが挙げられる。
（ｅ）カメレオンをコードするＤＮＡ；
（ｆ）カメレオンが有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）カメレオンが有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）（ｅ）〜（ｇ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
上記において、「カメレオンが有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列」とは、元のカメレオン蛋白質のアミノ酸配列において、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００５４】
上記において、「カメレオンが有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する」とは、ＢＬＡＳＴ（J. Mol. Biol., 215, 403, 1990）やＦＡＳＴＡ（Metods in Enzymology, 183, 63-69, 1990）等の解析ソフトを用いて計算したときに、元のカメレオン蛋白質に対するアミノ酸レベルでの配列同一性として少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上示すことを意味する。
上記において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつカルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、元のカメレオンをコードするＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、４２〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、４２〜６８℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。該ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴ等を用いて計算したときに、元のカメレオンをコードするＤＮＡの有する塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００５５】
上記において、「カルシウムイオンとの結合により蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす機能を有する蛋白質」とは、元のカメレオン蛋白質と同様に、カルシウムイオンとの結合により立体構造が変化し、蛍光のエネルギー移動を起こしうる蛋白質を意味する。
上記したようなカメレオン蛋白質の変異体の遺伝子配列は、アポエクオリン変異遺伝子を得る場合と同様に、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当分野で既知の任意の方法を用いて作製することができる。
【００５６】
また、本発明において、細胞を標識するためのレポーター蛋白質とは、細胞内に発現し、蛍光、あるいは任意の基質に作用して発色や発光を触媒するなど何らかの機能を発揮することで、標識された細胞の識別の情報を伝えうるレポーター蛋白質を包含する。その例としては、蛍光蛋白質、発光あるいは発色蛋白質、またはそれら変異体が挙げられる。
蛍光蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、Clontech社より市販されているオワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の緑色蛍光蛋白質ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＹＦＰ、ＧＦＰｕｖ、イソギンチャク（Discosoma striata）由来の赤色蛍光蛋白質ＤｓＲｅｄ、Aurora Biosciences社のＧＦＰEmerald、ＧＦＰTopaz、ＧＦＰSapphire、ＧＦＰS65T、またはNature Biotech., 18, 313, (2000)若しくはNature Cell Biol., 2, 25, (2000)に記載の蛍光蛋白質などが挙げられる。
発光あるいは発色蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、Promega社より市販されているホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼ、ウミシイタケ（Renila reniformis）由来のルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、Clontech社より市販されているヒト胎盤由来のアルカリホスファターゼＳＥＡＰ、β―ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
【００５７】
蛍光蛋白質の変異体をコードするＤＮＡとしては、元の蛍光蛋白質の遺伝子のＤＮＡ塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたものが挙げられる。蛍光蛋白質またはその変異体をコードするＤＮＡとしては、具体的には以下の（ａ）〜（ｅ）のものが挙げられる。
（ａ）クラゲの緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡ；
（ｂ）イソギンチャクの赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ）をコードするＤＮＡ；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の蛍光蛋白質が有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ蛍光を発する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）に記載の蛍光蛋白質が有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ蛍光を発する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ蛍光を発する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
【００５８】
上記において、「蛍光蛋白質が有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列」とは、元の蛍光蛋白質のアミノ酸配列において、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を意味する。
上記において、「蛍光蛋白質が有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する」とは、ＢＬＡＳＴ（J. Mol. Biol., 215, 403, 1990）やＦＡＳＴＡ（Metods in Enzymology, 183, 63-69, 1990）等の解析ソフトを用いて計算したときに、元の蛍光蛋白質に対するアミノ酸レベルでの配列同一性として少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上示すことを意味する。
【００５９】
上記において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ蛍光を発する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、元の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、４２〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、４２〜６８℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。該ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、元の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの有する塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００６０】
上記において、「蛍光を発する機能を有する蛋白質」とは、元の蛍光蛋白質と同様に、励起光を受けることで蛍光を発しうる蛋白質を意味する。
上記したような蛍光蛋白質の変異体の遺伝子配列は、アポエクオリン変異遺伝子を得る場合と同様に、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当分野で既知の任意の方法を用いて作製することができる。
【００６１】
発光あるいは発色蛋白質の変異体をコードするＤＮＡとしては、元の発光あるいは発色蛋白質の遺伝子のＤＮＡ塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたものが挙げられる。発光あるいは発色蛋白質、またはその変異体をコードするＤＮＡとしては、具体的には以下の（ａ）〜（ｈ）のものが挙げられる。
（ａ）ホタルのルシフェラーゼをコードするＤＮＡ；
（ｂ）ウミシイタケのルシフェラーゼをコードするＤＮＡ；
（ｃ）アルカリホスファターゼをコードするＤＮＡ；
（ｄ）β―ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ；
（ｅ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ;
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１項に記載の発光あるいは発色蛋白質が有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ任意の基質に作用して発光あるいは発色を触媒する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１項に記載の発光あるいは発色蛋白質が有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ任意の基質に作用して発光あるいは発色を触媒する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ任意の基質に作用して発光あるいは発色を触媒する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００６２】
上記において、「発光あるいは発色蛋白質が有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列」とは、元の発光あるいは発色蛋白質のアミノ酸配列において、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を意味する。
上記において、「発光あるいは発色蛋白質が有するアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する」とは、ＢＬＡＳＴ（J. Mol. Biol., 215, 403, 1990）やＦＡＳＴＡ（Metods in Enzymology, 183, 63-69, 1990）等の解析ソフトを用いて計算したときに、元の発光あるいは発色蛋白質に対するアミノ酸レベルでの配列同一性として少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上示すことを意味する。
【００６３】
上記において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ任意の基質に作用して発光あるいは発色を触媒する機能を有する蛋白質」とは、元の発光あるいは発色蛋白質をコードするＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、４２〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、４２〜６８℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。該ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、元の発光あるいは発色蛋白質をコードするＤＮＡの有する塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００６４】
上記したような発光あるいは発色蛋白質の変異体の遺伝子配列は、アポエクオリン変異遺伝子を得る場合と同様に、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当分野で既知の任意の方法を用いて作製することができる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを１種類以上の非神経細胞において発現し、好ましくは、上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官、感覚器、および爪から成る群から選択される１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは５以上、さらに好ましくは１０以上、特に好ましくは１５以上、最も好ましくは全ての組織または器官で発現する。
【００６５】
本明細書において、「上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官、感覚器、および爪」の各用語は、それらの用語が有する最も広い意味を示すものとし、上皮組織の中には皮膚、毛根などが含まれ、結合組織の中には皮膚、尾などが含まれ、骨組織の中には頭蓋骨などが含まれ、筋組織の中には腹筋、横隔膜などが含まれ、口腔内組織の中には舌などが含まれ、血液組織の中には血液などが含まれ、循環器の中には血管、心臓などが含まれ、リンパ性器官の中には胸腺、脾臓などが含まれ、消化管の中には食道、胃、小腸、大腸などが含まれ、呼吸器の中には肺などが含まれ、泌尿器の中には腎臓、膀胱などが含まれ、生殖器の中には精巣、精嚢、陰茎、卵巣、子宮、卵管などが含まれ、内分泌器官の中には甲状腺、副腎などが含まれ、感覚器の中には耳、水晶体などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６６】
目的とするＤＮＡを対象動物で発現させるプロモーター配列とは、当該ＤＮＡを対象動物の少なくとも１以上の非神経細胞（例えば、上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官、感覚器、および爪から成る群から選択される1以上の組織または器官の細胞）で発現させうるプロモーター配列を包含する。
本発明で用いるプロモーターとしては、例えば、ウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス、シミアンウイルス、レトロウイルスなど）由来遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子〔例えば、アルブミン、インスリンII、エリスロポエチン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１,Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンI型およびII型、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ-水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（一般にＮａ,Ｋ−ＡＴＰａｓｅと略される）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスI抗原（一般にＨ−２Ｌと略される）、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドPコンポーネント、ミオグロビン、レニン、解糖系酵素、ヒートショック蛋白質などの遺伝子〕のプロモーター、各種遺伝子のエンハンサー配列やプロモーター配列を融合させたプロモーター（例えば、ＳＲαプロモーター、ＣＡＧプロモーターなどの遺伝子）などが挙げられる。
【００６７】
本発明においては、サイトメガロウィルスプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどを用いることが好ましく、ヒトサイトメガロウイルスのＩＥ（immediate early）遺伝子のエンハンサーを上記各プロモーターと共に用いた融合プロモーターを用いることが特に好ましい。
本発明で用いるプロモーター配列の好ましい具体例としては、以下の（ａ）〜（ｉ）が挙げられる。
（ａ）  ＳＥプロモーター配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）  ＣＡＧプロモーター配列を有するＤＮＡ；
（ｃ）  ＰＧＫプロモーター配列を有するＤＮＡ；
（ｄ）  ２種類のプロモーターの間にｈｐｒｔ遺伝子の挿入された配列を有するＤＮＡ；
（ｅ）  ｌｏｘＰ、プロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子、ｌｏｘＰ、プロモーターの順に連結されたＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのＤＮＡの有する塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのＤＮＡの有する塩基配列と５０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｉ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
【００６８】
上記（ｇ）において、「塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列」とは、該塩基配列において、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を意味する。
上記において、「塩基配列と５０％以上の相同性を有する塩基配列」とは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、該塩基配列に対するＤＮＡレベルでの配列同一性として少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上を有する塩基配列を意味する。
【００６９】
上記において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ」とは、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、４２〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、４２〜６８℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。該ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、配列番号１の塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
上記したような配列番号１の配列の変異体の配列は、アポエクオリン変異遺伝子を得る場合と同様に、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当分野で既知の任意の方法を用いて作製することができる。
【００７０】
上記（ｄ）、（ｅ）において記載されたプロモーターとしては、プロモーター活性を有するものであればいずれも用いることができる。好ましい例としては、ＰＧＫプロモーターとＣＡＧプロモーターの二種類のプロモーターを用いた組み合わせのものを挙げることができる。
本発明のトランスジェニック動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原生殖細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウイルスベクター法などにより目的とする遺伝子を導入することにより作製される。また、該遺伝子導入方法により、胚性幹細胞に目的とする細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを導入し、該胚性幹細胞と非ヒト哺乳動物の受精卵とを用いて、集合キメラ法、注入キメラ法などにより目的とする遺伝子を導入した生殖系列キメラ個体を作製することでトランスジェニック動物を作製することもできる。さらに、目的とする細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡをリン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウイルスベクター法などにより細胞に導入し、該細胞の核を非ヒト哺乳動物の脱核した未受精卵にマイクロマニュピレーターなどの装置を用いて移植し、クローン個体を得ることでトランスジェニック動物を作製することもできる。
【００７１】
本明細書で言う「非ヒト哺乳動物」の具体例としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサルなどが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなどのげっ歯類動物であり、最も好ましくは、マウスである。
また、本明細書で言う「非ヒト哺乳動物」は、種々の疾患モデル動物のような染色体上に変異遺伝子を有する非ヒト哺乳動物であっても構わない。
【００７２】
以下、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法と利用方法について詳細に説明する。
１．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法
（１）導入遺伝子の調製
細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを対象動物に導入する際には、導入の対象動物の細胞内で当該ＤＮＡを発現させうるプロモーターの下流に当該ＤＮＡを連結した遺伝子構築物を用いるのが一般に有利である。導入させる遺伝子は、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により調製することができる。
導入させる遺伝子の全長相補ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、次いで該ＤＮＡ断片、または全長相補ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
【００７３】
動物へ導入させる遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。これらの中でも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく、大腸菌由来のプラスミドが特に好ましい。
本発明で用いるプロモーターの具体例は本明細書中上記した通りである。
本発明で用いる発現ベクターは、トランスジェニック哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子に含まれる同機能を有する配列を用いて遺伝子発現を操作することができる。好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどがよく用いられる。その他、目的遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
【００７４】
細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば、アポエクオリン遺伝子）は、市販のもの（例えば、Molecular Probes社製）を用いてもよいし、以下のごとく生体組織〔例えば、発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）〕から調製してもよい。
公知の方法により生体組織からＲＮＡを調製し相補ＤＮＡを作製する。
【００７５】
生体組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Methods in Enzymology, 154, 3, 1987）、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法（Analytical Biochemistry, 162, 156, 1987;実験医学, 9, 1937, 1991）などが挙げられる。また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等が挙げられる。さらに、Fast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社製）、Quick Prep mRNA Purification Kit（Pharmacia社製）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。相補ＤＮＡを合成する方法としてはモレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid  System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Life Technologies社製）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（STRATAGENE社製）を用いる方法などが挙げられる。取得した相補ＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法〔PCR Protocols, Academic Press (1990)〕を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより目的とする翻訳領域を含む遺伝子を取得することができる。取得した遺伝子の塩基配列の決定は、通常用いられる塩基配列解析法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977）あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（PE Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定できる。また、上記の組織より得られた蛋白質の翻訳領域を、Nucleic Acids Research, 10, 6487, 1982、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409, 1982、Gene, 34, 315, 1985、Nucleic Acids Research, 13, 4431, 1985、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488, 1985等に記載の部位特異的変異誘発法などにより変異した翻訳領域を作製することができる。これらはいずれもトランスジェニック動物に利用可能な材料である。該翻訳領域はトランスジェニック動物において発現しうる遺伝子構築物として前記のプロモーター下流（好ましくは、転写終結部位の上流）に連結させる通常の遺伝子工学的手法により細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだＤＮＡを作製することができる。
【００７６】
（２）トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを対象動物に導入することによって作製できる。具体的には、該遺伝子を対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵、胚性幹細胞、体細胞、精子、未受精卵へ導入することによって、目的とする細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡが胚芽細胞を含むすべての細胞の染色体上に組み込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得、それら個体の中から、少なくとも１以上の非神経細胞に該導入遺伝子産物が存在しているものを選択することによって作製できる。受精卵、胚性幹細胞、体細胞、精子、未受精卵における該遺伝子の導入は、対象非ヒト哺乳動物の胚芽細胞および体細胞を含む全ての細胞の染色体上に存在するように確保されなくてはならない。遺伝子導入後の作製動物の胚芽細胞において該導入遺伝子が存在することは、作製動物の子孫がその胚芽細胞および体細胞の全てに該導入遺伝子を有することを意味する。
個体の選択は、少なくとも１以上の非神経細胞における該導入遺伝子産物の発現を蛋白質あるいはｍＲＮＡレベルで確認することによって行われる。選択された個体の遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫は、少なくとも１以上の非神経細胞に該導入遺伝子産物を有する。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
【００７７】
受精卵あるいは胚性幹細胞への遺伝子導入によるトランスジェニック動物の作製は、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング, ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 (1995)、発生工学実験マニュアル, トランスジェニック・マウスの作り方, 講談社 (1987)等に記載された方法を用い、哺乳類動物細胞への遺伝子導入と核移植によるトランスジェニック動物の作製は、Cibelliら（Science, 280, 1256, 1998）、Schniekeら（Science, 278, 2130, 1997)、Baguisiら（Nature Biotechnology, 17, 456, 1999）等によって報告された方法を用い、精子への遺伝子導入によるトランスジェニック動物の作製は、Perryら（Science, 284, 1180, 1999) やWakayamaら（Nature Biotechnology, 16, 639, 1998)によって報告された方法を用い、未受精卵への遺伝子導入と体外受精によるトランスジェニック動物の作製は、Chanら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14028, 1998) によって報告された方法を用い、例えば以下の方法により作製することができる。
【００７８】
（ａ）受精卵への遺伝子導入によるトランスジェニック動物の作製
トランスジェニック対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子である外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を対象非ヒト哺乳動物またはその先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は、同種の雄非ヒト哺乳動物（好ましくはマウスやラットなど、特に好ましくは近交系の雄マウスや Wistar 系統の雄ラットなど）と雌非ヒト哺乳動物（好ましくは雌マウスや雌ラットなど、特に好ましくは近交系の雌マウスや Wistar 系統の雌ラットなど）を交配させることによって得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌非ヒト哺乳動物（好ましくは雌マウスや雌ラットなど、特に好ましくは近交系の雌マウスや Wistar 系統の雌ラットなど）の性周期を人工的に調節した後、雄非ヒト哺乳動物（好ましくは雌マウスや雌ラットなど、特に好ましくは近交系の雄マウスやWistar 系統の雄ラットなど）と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般に hＣＧと略する）を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。また、近交系のマウスやWister 系統のラットを用いる場合は、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼育した８週齢以上のものが好ましい。非ヒト哺乳動物が雌マウス（好ましくは近系統の雌マウス）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約２〜約２０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。非ヒト哺乳動物が雌ラット（好ましくは Wistar 系統の雌ラット）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、雄ラットと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。
【００７９】
得られた受精卵にマイクロインジェクション法やレトロウイルスを用いた方法等により外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）が導入された後、該受精卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって導入した外来性遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得られる。マイクロインジェクション法により遺伝子を導入する場合には、受精後約１２〜約２４時間の雄性前核が出現している受精卵を用いることが好ましい。マイクロインジェクションで導入される外来遺伝子は、環状化状態、直線化状態いずれでも用いることができるが、発現させたい構造遺伝子および発現調節遺伝子部分を破壊しない形で直線化し導入することが好ましい。レトロウイルスを用いた方法により遺伝子を導入する場合には、収縮桑実胚以前（一般には、８細胞期以前）の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。雌非ヒト哺乳動物へ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましい。偽妊娠雌非ヒト哺乳動物は自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、ＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物を得ることもできる。ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物が雌ラット（好ましくは Wistar 系統の雌ラット）の場合は、通常、ＬＨＲＨあるいはその類縁体(例えば、[3,5-Dil-Tyr5]-LH-RH, [Gln8]-LH-RH, [D-Ala6]-LH-RH, des-Gly10, [D-His(Bzl)6]-LH-RH) Ethylamide など）投与後、約４日目に雄ラットと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μg／個体、好ましくは約４０μg／個体である。
【００８０】
（ｂ）胚性幹細胞への遺伝子導入によるトランスジェニック動物の作製
非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、サルなど）の胚性幹細胞の染色体上に外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を導入後、得られた胚性幹細胞を集合キメラ法または注入キメラ法を用いて非ヒト哺乳動物の受精卵に取り込ませ、該受精卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって導入した外来性遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳キメラ動物が得られる。胚性幹細胞への外来性遺伝子の導入には、公知の遺伝子導入の手法（例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウイルスベクター法等）を用いることができる。導入される外来遺伝子は、環状化状態、直線化状態いずれでも用いることができるが、発現させたい構造遺伝子および発現調節遺伝子部分を破壊しない形で直線化し導入することが好ましい。胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて非ヒト哺乳動物の受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。胚性幹細胞を注入キメラ法を用いて非ヒト哺乳動物の受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。雌非ヒト哺乳動物へ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌非ヒト哺乳動物は、前記した公知の方法を用いることで得られる。
【００８１】
外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳キメラ動物のうちキメラ率の高い個体（好ましくは雄）と非ヒト哺乳動物の個体（好ましくは雌）を交配することによって、全身の細胞の染色体上に導入した外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を有する個体を得ることができ、さらにその個体の雄雌どうしを交配することにより相同染色体の双方に導入した外来性遺伝子が入ったホモザイゴートのトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。
また、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に導入した外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）の発現時期や発現量等を制御することも可能である。このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例（Cell, 87, 1317, 1996）やＣｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例（Science, 278, 5335, 1997）が知られている。従って、染色体上の外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）についても、このように任意の時期における発現やその量の制御ができる。
【００８２】
（ｃ）哺乳類動物細胞への遺伝子導入と核移植によるトランスジェニック動物の作製
非ヒト哺乳動物（好ましくは、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシなど）の細胞の染色体上に外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を導入後、得られた細胞の核を初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって導入した外来性遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得られる。細胞への外来性遺伝子の導入には、公知の遺伝子導入の手法（例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウイルスベクター法等）を用いることができる。導入される外来遺伝子は、環状化状態、直線化状態いずれでも用いることができるが、発現させたい構造遺伝子および発現調節遺伝子部分を破壊しない形で直線化し導入することが好ましい。細胞の核を初期化する方法は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物がヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合は、外来性遺伝子を導入した細胞を５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、好ましくは０.５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地で培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化することが好ましい。非ヒト哺乳動物がマウスなどの場合は、同種の非ヒト哺乳動物の除核した未受精卵に、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入し数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することが好ましい。初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物がヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合は、細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の非ヒト哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることが好ましい。非ヒト哺乳動物がマウスなどの場合は、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入した未受精卵を、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激し細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることが好ましい。発生を開始した卵は、同種の雌非ヒト哺乳動物に公知の方法で人工的に移植および着床され、外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得られる。
【００８３】
（ｄ）精子への遺伝子導入によるトランスジェニック動物の作製
非ヒト哺乳動物（例えば、マウスなど）の精子に外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を取り込ませた後、得られた精子を顕微受精の方法を用いて未受精卵に受精させ、発生を開始した卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって精子に取り込ませた外来性遺伝子を染色体上に組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得られる。精子に外来性遺伝子を取り込ませる場合には、細胞膜を破壊した精子を、約０．５〜約１００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、５〜１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＤＮＡを含む培地（例えば、ＣＺＢ培地やＮＩＭ培地など）中で数分間（好ましくは、１分間程度）インキュベーションする方法を用いることが好ましい。精子の細胞膜を破壊する方法としては、低濃度（例えば、０．０５％）の界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００など）で処理する方法、１０％の仔ウシ胎児血清を含みＥＤＴＡを含まない培地（例えば、ＣＺＢ培地など）中に懸濁した精子を凍結乾燥する方法 、該精子懸濁液を凍結融解する方法のいずれかが好ましい。このような処理をして細胞膜を破壊した精子は、もはや自発的に受精する能力を失っているが、マイクロマニュピレーター等を用いた顕微受精の方法を用いて受精させることで胚の発生を促す。顕微受精を行う場合には、外来性遺伝子を取り込ませた精子の頭部を減数第二分裂中期にある同種の雌非ヒト哺乳動物未受精卵の細胞質に注入する方法が好ましい。発生を開始した卵は、同種の雌非ヒト哺乳動物に公知の方法で人工的に移植および着床され、外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得られる。
【００８４】
（ｅ）未受精卵への遺伝子導入と体外受精によるトランスジェニック動物の作製
非ヒト哺乳動物（好ましくは、マウス、ラット、ウシなど）の未受精卵に、外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を組み込んだレトロウイルスを感染させることで外来性遺伝子を導入し、得られた卵を体外受精の方法を用いて発生させ、発生を開始した受精卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって導入した外来性遺伝子を染色体上に組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得られる。外来性遺伝子を組み込んだレトロウイルスは、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の方法により調製できる。組換えレトロウイルスを未受精卵に感染させる場合には、透明帯を除いた未受精卵を用いることが好ましい。未受精卵の透明帯を除去する方法としては、マイクロマニュピレーター等を用いて物理的に膜を除く方法、化学物質（例えば、酸性タイロードなど）を用いて化学的に膜を溶解して除く方法のいずれかが好ましい。体外受精を行い発生を開始した卵は、同種の雌非ヒト哺乳動物に公知の方法で人工的に移植および着床され、外来性遺伝子（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ）を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得られる。
【００８５】
２．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の利用方法
本発明の細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、該レポーター蛋白質をコードするＤＮＡが、少なくとも１以上の非神経細胞（例えば、上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官、感覚器、および爪から成る群から選択される1以上の組織または器官における細胞）で高発現されており、これら組織あるいは器官における生理活性物質（例えば、薬物）や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価および活性評価に有用である。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に心疾患（例えば、急性心不全、慢性心不全、心筋炎など）、呼吸器系疾患、関節疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症など）、腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症など）、動脈硬化症、乾癬症、高脂血症、アレルギー疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎など）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、低カルシウム血症など）、血液疾患、脳血管性傷害、外傷性脳障害、感染症、痴呆症および慢性炎症性疾患などを誘発し、その病態モデル動物における細胞内カルシウム濃度の変動を測定することができ、これら疾患の病態機序の解明、治療方法の検討、並びに治療薬、予防薬および診断薬の研究開発を目的とした候補化合物のスクリーニングを行うことが可能である。その場合、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化を惹起する内在性生理活性物質または（および）その受容体の生体内における機能がさらに解明される可能性が考えられ、それらの機構を解明する実験モデルとしての利用も期待される。
【００８６】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の利用方法としては、例えば以下のものが挙げられる。
（１）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用い、生体内における細胞内カルシウムイオンの濃度変化を該哺乳動物を生かしたまま検出する方法および該方法を用いた薬剤のスクリーニング方法
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることにより、該哺乳動物を生かしたまま、導入したレポーター蛋白質をコードするＤＮＡの発光量を検出することによって生体内における細胞内カルシウムイオンの濃度変化を測定することができる。生体からの発光蛋白質の発光を検出する方法の一例として、ContagらがＩＣＣＤカメラを用い生きた動物からの発光蛋白質の発光を検出した方法が挙げられる（Molecular Microbiology, 18, 593, 1995; Nature Medicine, 4, 245, 1998）。ＩＣＣＤの代わりにより感度の高い冷却ＣＣＤカメラを用いてもよい。生体内における細胞内カルシウムイオンの濃度変化を哺乳動物を生かしたまま検出する該方法によって、in vivoにおける生理変化や薬物応答を調べることができ、生理活性を有する物質をより生体に近い環境下で評価、スクリーニングすることができる。具体的には、被験物質を本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与して、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、構成的に発現している外来性のレポーター蛋白質を利用して検出することにより、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度調節に関する物質を、生体環境下で、評価、スクリーニングすることができる。
【００８７】
（２）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物より摘出した組織、器官、細胞を用い、これら組織、器官、細胞における細胞内カルシウムイオンの濃度変化を検出する方法および該方法を用いた薬剤のスクリーニング方法
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることにより、該哺乳動物から摘出後培養した組織、器官、細胞における細胞内カルシウムイオンの濃度変化を、導入したレポーター蛋白質に基づく発光量を検出することによって測定することができる。in vitroで組織、器官、細胞を培養する方法としては、動物組織培養法, モダンバイオロジー・シリーズ２３, 共立出版,（1974）、細胞培養マニュアル, 講談社サイエンティフィック,（1982）、Use of Isolated Liver Cells and Kidney Tubules in Metabolic Studies, Elaevier/North-Holland Publishing Co., New York・Amsterdam・Oxford,（1976）等に記載の公知の方法が挙げられる。培養した組織、器官、細胞から発光蛋白質の発光を検出する方法としては、前記したContagらの方法、冷却ＣＣＤカメラを用いた方法、ルミノメーター（例えば、EG&G BERTHOLD社製）を用いた方法等が挙げられる。培養した組織、器官、細胞における細胞内カルシウムイオンの濃度変化を測定する該方法によって、複雑な細胞間ネットワークを保った組織や器官、あるいはより生体の機能を反映しやすいと考えられる初代培養細胞の状態において、生理活性を有する物質を評価、スクリーニングすることができる。具体的には、被験物質を本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物より調製した組織、器官または細胞と接触させ、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度変化を、構成的に発現している外来性のレポーター蛋白質を利用して検出することにより、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度調節に関する物質を、より生体に近い環境下で、評価、スクリーニングすることができる。
【００８８】
（３）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の製造に用いる胚性幹細胞を用い、該胚性幹細胞を分化誘導することで得られる細胞の細胞内カルシウムイオンの濃度変化を検出する方法および該方法を用いた薬剤のスクリーニング方法
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の製造に用いる胚性幹細胞を用いることにより、該胚性幹細胞を分化誘導することで得られる細胞の細胞内カルシウムイオンの濃度変化を、導入したレポーター蛋白質に基づく発光量を検出することによって測定することができる。in vitro培養において、胚性幹細胞から内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイトが誘導されることが知られており（P. D. Rathjenら; Reprod. Fertil. Dev., 10, 31, 1998）、該胚性幹細胞を誘導することで分化した細胞を得る方法としては、上記P. D. Rathjenらの文献に記載の方法が挙げられる。分化誘導した細胞から発光蛋白質の発光を検出する方法としては、前記したContagらの方法、冷却ＣＣＤカメラを用いた方法、ルミノメーター（例えば、EG&G BERTHOLD社製）を用いた方法等が挙げられる。胚性幹細胞より分化誘導した細胞における細胞内カルシウムイオンの濃度変化を測定する該方法によって、生体から摘出しにくい細胞や生体に少数しか存在しない細胞などおいても、生理活性を有する物質を評価、スクリーニングすることができる。
なお、上記の（１）〜（３）に記載した本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の利用方法に関して、薬剤のスクリーニング方法に供される薬剤の種類は何らかの生理活性を有する可能性のある物質であれば特に限定されず、例えば、サイトカイン類、低分子化合物、ホルモン類、抗体、ペプチドまたはペプチド模倣物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなど任意の物質を挙げることができる。
【００８９】
（４）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞、卵、精子、核を用いた遺伝子改変動物の作製と作製された該遺伝子改変動物の利用
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞、卵、精子、核を用いることにより、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを含み、かつ更なる染色体上の遺伝子の改変を行った遺伝子改変哺乳動物を得ることができる。胚性幹細胞、卵、精子、核を用い遺伝子改変動物を得る方法としては前記した公知の方法が挙げられる。更なる染色体上の遺伝子の改変としては、例えば、既知でその遺伝子の機能を破壊することである病態が惹起されることが公知になっている遺伝子を、相同組み換え法によるノックアウトの手法や、ドミナントネガティブ体の遺伝子導入の手法などによって作製することが挙げられる。このような遺伝子改変動物は、細胞内のカルシウムイオン濃度の変化と該遺伝子改変動物が示す病態との関係の解析に有用である。細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを含み、かつ更なる染色体上の遺伝子の改変を行った遺伝子改変哺乳動物は、医療の開発や医薬の開発等に利用できる。
【００９０】
（５）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の動物との交配による遺伝子改変動物の作製と作製された該遺伝子改変動物の利用
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の動物（例えば、ヒト疾患モデル動物）とを交配させることにより、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを含み、かつある表現系（例えば、ヒト病態と類似の症状）を示す遺伝子改変哺乳動物を得ることができる。交配の方法としては、自然交配以外にも公知である体外受精の方法が挙げられる。疾患モデル動物としては、先天性および後天性を疾患を問わず多くのモデルが公知である。このような遺伝子改変動物は、細胞内のカルシウムイオン濃度の変化と該遺伝子改変動物が示す表現系（例えば、ヒト病態と類似の症状）との関係の解析に有用である。細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを含み、かつある表現系（例えば、ヒト病態と類似の症状）を示す遺伝子改変哺乳動物は、医療の開発や医薬の開発等に利用できる。
【００９１】
３．本発明のＤＮＡの作製
本発明のＤＮＡは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の通常の遺伝子工学の手法を用い、ｌｏｘＰ、プロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子、ｌｏｘＰ、プロモーターの各ＤＮＡ配列を適当なリンカーＤＮＡにより結合することで作製できる。
リンカーＤＮＡは、任意の制限酵素認識部位を有し、数ｂｐ〜数ｋｂｐ、好ましくは１０ｂｐ〜１ｋｂｐ、より好ましくは１０ｂｐ〜１００ｂｐの長さからなるＤＮＡが望ましい。
【００９２】
プロモーター部分のＤＮＡとしては、プロモーター活性を有するものであればいずれも用いることができる。例えば、市販のプロモーターＤＮＡや、プロモーター活性を有する公知のＤＮＡ塩基配列に基づいて市販のプロモーターＤＮＡに改変を加えたＤＮＡを挙げることができる。好ましい例としては、ＰＧＫプロモーターやＣＡＧプロモーターを挙げることができる。
ｌｏｘＰ部分の塩基配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識され組換えが起こる配列であればいずれも用いることができ、例えば、Nucleic Acids Res., 25, 868, (1997)、Nucleic Acids Res., 23, 485, (1995)等に記載の塩基配列が挙げられる。
【００９３】
ｈｐｒｔ遺伝子は、適当なプロモーターの下流に連結することによって転写・翻訳されＨＰＲＴ蛋白質として発現可能な配列であればいずれも用いることができる。ｈｐｒｔ遺伝子の配列は公知であり、例えば、Lexicon Genetics社等から入手できる。
これら本発明を構成する各ＤＮＡ配列は、公知のＤＮＡ塩基配列情報に基づいて、ホスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機model 392等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより調製することもできる。
上記方法で得られる本発明のＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号１の塩基配列が挙げられる。
【００９４】
４．本発明のＤＮＡの利用
本発明のＤＮＡは、哺乳動物の染色体上に組み込まれた場合、本発明のＤＮＡを構成するｌｏｘＰ、プロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子がそれぞれ単独で有するプロモーター活性より高いプロモーター活性を安定に示すことが期待され、少なくとも１以上の非神経組織（例えば、上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器、感覚器及び爪からなる群から選ばれる１以上の組織または器官における細胞）において、本発明のＤＮＡの下流に結合させた遺伝子を高発現させることができる。このような本発明のＤＮＡの特性は、例えば、薬理評価用の動物の上記組織に外来性のレポーター蛋白質（例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするための外来性のレポーター蛋白質、細胞を標識するための外来性のレポーター蛋白質、または任意の蛋白質）を発現させる目的に適しており、有用である。
本発明のＤＮＡの下流に、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、３．に記載の方法で作製した本発明のＤＮＡをプロモーターとして用い、１．に記載の方法に従い作製することができる。具体的な例としては、アポエクオリンまたはカメレオン蛋白質をコードするＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を挙げることができる。これらトランスジェニック非ヒト哺乳動物の利用方法としては、２．に記載した利用方法が挙げられる。
【００９５】
本発明のＤＮＡの下流に、細胞を標識するための外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、３．に記載の方法で作製した本発明のＤＮＡをプロモーターとして用い、１．に記載の方法に従い作製することができる。具体的な例としては、蛍光蛋白質、または、発光あるいは発色蛋白質をコードするＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を挙げることができる。蛍光蛋白質として、例えば、Clontech社より市販されているオワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の緑色蛍光蛋白質ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＹＦＰ、ＧＦＰｕｖ、イソギンチャク（Discosoma striata）由来の赤色蛍光蛋白質ＤｓＲｅｄ、Aurora Biosciences社のＧＦＰEmerald、ＧＦＰTopaz、ＧＦＰSapphire、ＧＦＰS65T、またはNature Biotech., 18, 313, (2000)若しくはNature Cell Biol., 2, 25, (2000)に記載の蛍光蛋白質などを用いることができる。また、発光あるいは発色蛋白質をコードするＤＮＡとして、例えば、Promega社より市販されているホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼ、ウミシイタケ（Renila reniformis）由来のルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、Clontech社より市販されているヒト胎盤由来のアルカリホスファターゼ(ＳＥＡＰ)、β―ガラクトシダーゼなどを用いることができる。これらトランスジェニック非ヒト哺乳動物の利用方法としては、外来性のレポーター蛋白質で標識されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の組織、器官または細胞を、免疫的に拒絶されない別の個体に移植し、移植した該組織、器官または細胞の挙動、分化、癌化等の生理的変化を、該外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法が挙げられる。また、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に用いた胚性幹細胞または該胚性幹細胞を分化誘導した細胞を、免疫的に拒絶されない別の個体に移植し、移植した細胞の挙動、分化、癌化等の生理的変化を、導入した外来性のレポーター蛋白質を利用して検出する方法も挙げられる。そのような具体的な例としては、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 14809, (1997)、Cell Transplant., 5, 131, (1996)、Exp. Neurol., 149, 28, (1998)、Science, 285, 754, (1999)等に記載の方法が挙げられる。
【００９６】
また、本発明のＤＮＡの下流に、任意の蛋白質をコードするＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することで、該蛋白質の生理機能をin vivoで効率的に調べることができる。
本発明のＤＮＡの下流に外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞および細胞の核を用いることにより、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物のクローンおよび外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを含みかつ更なる染色体上の遺伝子の改変を行った遺伝子改変哺乳動物を作製することができる。この場合の細胞としては、例えば、胚性幹細胞、卵、または精子などがあげられる。上記のトランスジェニックまたはクローン非ヒト哺乳動物および遺伝子改変哺乳動物の作製法および利用法の詳細は２．（４）に記載の通りである。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例１：アポエクオリン発現プラスミドの構築
１）ＳＶ４０初期プロモーターの下流にアポエクオリン遺伝子を有するプラスミドpAGE107AEQの構築（図１を参照）
プラスミドpAGE107（特開平3-22979号; Cytotechnology, 3, 133, 1990）２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｍ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＸｂａＩと１０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約４．６ＫｂのＤＮＡ断片をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて回収した(以下、アガロースゲルからのＤＮＡの回収にはこの方法を用いる)。
【００９８】
また、プラスミドpAGE107 ２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＰｓｔＩと１０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約１．７ＫｂのウサギβグロビンのポリＡ付加シグナルを含むＤＮＡ断片を回収した。
一方、プラスミドpMAQ2（Molecular Probes社製）２μgを３０μlのUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＸｂａＩと１０単位のＰｓｔＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、 アポエクオリンを含む約０．６３ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
【００９９】
上記で得た、プラスミドpAGE107由来のＸｂａＩ−ＳａｃＩＩ断片（４．６Ｋｂ）０．１μg、プラスミドpAGE107由来のＰｓｔＩ−ＳａｃＩＩ断片（１．７Ｋｂ）０．１μg、プラスミドpMAQ2由来のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片（０．６３Ｋｂ）０．１μgをＴ４リガーゼ緩衝液３０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 69, 2110, 1972）（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いる）によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）株を得た。この形質転換株から公知の方法（Nucleic Acids Res., 7, 1513, 1979）(以下、プラスミドの単離方法はこの方法を用いる)に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをpAGE107AEQと称す。
【０１００】
２）アポエクオリン遺伝子を有するプラスミドpBSAEQpAの構築（図２を参照）
Inouyeらの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3154, 1985; 特開昭 61-135586号）に記載されているアポエクオリン遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列から配列番号２で示される塩基配列を有する２７マーのプライマー１、および配列番号３で示される塩基配列を有する２８マーのプライマー２を作製し、プラスミドpAGE107-AEQを材料にして常法により反応液を調製後、９５℃で５分間反応させ、次いで９５℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で４分間のサイクルを３０サイクル反復し、最後に７２℃で１０分間反応させ、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロフォルム抽出処理し、エタノール沈殿法により増幅させたＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を３０μｌのUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＸｂａＩと１０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、アポエクオリンを含む約０．６５ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
次に、プラスミドpRL-TK（Promega社製）２μgを３０μｌのUniversal BufferＨ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＸｂａＩと１０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約０．２５ＫｂのＳＶ４０後期遺伝子のポリＡ付加シグナルを含むＤＮＡ断片を回収した。
【０１０１】
さらに、プラスミドpBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約２．９ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得た、アポエクオリンを含むＤＮＡ断片（０．６５Ｋｂ）０．１μg、プラスミドpRL-TK由来のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片（０．２５Ｋｂ）０．１μg、プラスミドpBluescriptII SK(-)由来のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（２．９Ｋｂ）０．１μgをＴ４リガーゼ緩衝液３０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
【０１０２】
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ampr）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って塩基配列を決定し、該プラスミドには公知のアポエクオリンｃＤＮＡ配列が含まれていることを確認した。以下、このプラスミドをpBSAEQpAと称す。
【０１０３】
３）ＣＡＧプロモーターを有するプラスミドpBSKS(+)CAG promoterの構築（図３を参照）
コスミドpAxCAwt（Nucleic Acids Research, 23, 3817, 1995）２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＳａｌＩと１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、ＣＡＧプロモーターを含む約１．７ＫｂのＤＮＡ断片をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて回収した。
次に、プラスミドpBluescriptII KS(+)（Stratagene社製）２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＳａｌＩと１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約２．９ＫｂのＤＮＡ断片をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて回収した。
【０１０４】
上記で得た、コスミドpAxCAwt由来のＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片（１．７Ｋｂ）０．１μgとプラスミドpBluescriptII KS(+)由来のＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片（２．９Ｋｂ）０．１μgをＴ４リガーゼ緩衝液３０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐr）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをpBSKS(+)CAG promoterと称す。
【０１０５】
４）ＣＡＧプロモーターの下流にアポエクオリン遺伝子を有するプラスミドpCAG-AEQの構築（図４を参照）
プラスミドpBSKS(+)CAG promoter ２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＳａｌＩと１０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、ＣＡＧプロモーターを含む約１．７ＫｂのＤＮＡ断片をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて回収した。
次に、プラスミドpBSAEQpA ２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＳａｌＩと１０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アポエクオリン遺伝子を含む約３．８ＫｂのＤＮＡ断片をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて回収した。
【０１０６】
上記で得た、プラスミドpBSKS(+)CAG promoter由来のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１．７Ｋｂ）０．１μgとプラスミドpBSAEQpA由来のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片（３．８Ｋｂ）０．１μgをＴ４リガーゼ緩衝液３０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐr）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをpCAG-AEQと称す。
【０１０７】
５）プラスミドploxp#1の構築（図５参照）
プラスミドpKO（Lexicon Genetics Inc.社製）２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｍ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＫｐｎＩと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約１．９７ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
次に、Arakiらの報告（Nucleic Acids Res., 25, 868, 1997）に記載されているｌｏｘＰ配列を含む配列番号４で示される塩基配列を有する４４マーの一本鎖合成ＤＮＡloxPKpnI/XhoI-A、および配列番号５で示される塩基配列を有する５２マーの一本鎖合成ＤＮＡloxPKpnI/XhoI-Bを作製し、アニーリングすることで二本鎖ＤＮＡとした。
【０１０８】
該二本鎖ＤＮＡ０．１μgと、上記で得たプラスミドpKO由来ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片（１．９７Ｋｂ）１．０μgとをＴ４リガーゼ緩衝液３０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐr）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをploxp#1と称す。
【０１０９】
６）プラスミドploxpの構築（図６を参照）
プラスミドploxｐ#1 ２μgを３０μｌのUniversal Buffer H(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＢａｍＨＩと１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約２．０２ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
次に、loxP配列を含む配列番号６で示される塩基配列を有する４７マーの一本鎖合成ＤＮＡloxPBamHI/ClaI-A、および配列番号７で示される塩基配列を有する４５マーの一本鎖合成ＤＮＡloxPBamHI/ClaI-Bを作製し、アニーリングすることで二本鎖ＤＮＡとした。
【０１１０】
該二本鎖ＤＮＡ０．１μgと、上記で得たプラスミドploxP#1由来ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ断片（２．０２Ｋｂ）１．０μgとをＴ４リガーゼ緩衝液３０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐr）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをploxpと称す。
【０１１１】
７）プラスミドploxpHPRTの構築（図７を参照）
プラスミドploxp ２μgを３０μｌのNEB Buffer 4(New England Biolabs社製)に溶解し、１０単位のＡｓｃＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約２．０７ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を３０μｌのAlkaline Phosphatase Buffer(宝酒造株式会社製)に溶解し、４４単位のウシ小腸由来のアルカリホスファターゼ（宝酒造株式会社製）を加えて３７℃で３０分間反応を行い、フェノールークロロフォルム抽出後、エタノール沈殿法により脱リン酸化された約２．０７ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
【０１１２】
次に、プラスミドpKOselectHPRT（Lexicon Genetics Inc.社製）２μgを３０μｌのNEB Buffer 4(New England Biolabs社製)に溶解し、１０単位のＡｓｃＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子を含む約３．８ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得た、プラスミドploxp由来ＡｓｃＩ断片（２．０７Ｋｂ）０．１μgとプラスミドpKOselectHPRT由来ＡｓｃＩ断片（３．８Ｋｂ）０．１μgをＴ４リガーゼ緩衝液３０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
【０１１３】
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐr）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをploxpHPRTと称す。
【０１１４】
８）プラスミドploxpHPRT2の構築（図８を参照）
プラスミドploxpHPRT ２μgを３０μｌのUniversal Buffer K(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＨｐａＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約２．０７ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を３０μｌのAlkaline Phosphatase Buffer(宝酒造株式会社製)に溶解し、４４単位のウシ小腸由来のアルカリホスファターゼ（宝酒造株式会社製）を加えて３７℃で３０分間反応を行い、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により脱リン酸化された約５．９ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得た、プラスミドploxpHPRT由来ＨｐａＩ断片（５．９Ｋｂ）０．１μgと８マーの合成リンカーpBamHI(8mer)（5’-pd(CGGATCCG)-3’；宝酒造株式会社製）０．１μgをＴ４リガーゼ緩衝液３０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐr）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをploxpHPRT2と称す。
【０１１５】
９）ＰＧＫプロモーターの下流にｈｐｒｔ遺伝子を有し、 かつさらに下流にＣＡＧプロモーターに連結したアポエクオリン遺伝子を有するプラスミドpCAG-AEQ-pHPRTpの構築（図９を参照）
プラスミドploxpHPRT2 ２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｌ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。その後、４μlの１０倍濃度のUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)と１０単位のＳａｌＩを全体量が４０μlになるように添加し３７℃でさらに２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、ｈｐｒｔ遺伝子を含む約３．８ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
次に、プラスミドpCAG-AEQ ２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｌ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。その後、４μlの１０倍濃度のUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)と１０単位のＳａｌＩを全体量が４０μlになるように添加しさらに３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約５．５ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
【０１１６】
上記で得た、プラスミドploxpHPRT2由来ＫｐｎＩ−ＳａｌＩＩ断片（３．８Ｋｂ）０．１μｇとプラスミドpCAG-AEQ由来ＫｐｎＩ−ＳａｌＩＩ断片（５．５Ｋｂ）０．１μｇをＴ４リガーゼ緩衝液３０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐr）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをpCAG-AEQ-pHPRTpと称す。
プラスミドpCAG-AEQ-pHPRTpのＣＡＧプロモーターを含むＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片（５．８ｋｂ）を配列番号１として示した。
【０１１７】
実施例２：アポエクオリン発現プラスミドの哺乳類細胞への導入とアポエクオリン一過性発現量の検討
実施例１で構築したアポエクオリンをコードするＤＮＡを含むプラスミドpBSAEQpA、pAGE107AEQまたはpCAG-AEQをジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を欠損したチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯｄｈｆｒ（−）ＤＧ４４）(Biochemistry, 36, 10901, 1997; Cell, 33, 405, 1983）に導入させてアポエクオリン遺伝子を一過性に発現させ、その発現量の比較を行った。
アポエクオリン発現プラスミドのＣＨＯｄｈｆｒ（−）細胞ＤＧ４４への導入は、リポフェクション法に準じて行った。すなわち、該細胞株を３×１０5個/穴になるように、２ｍｌの１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地（GIBCO BRL社製）を用いて、６穴の組織培養用マイクロプレート（岩城硝子株式会社製；コード3810-006）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で２４時間培養後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（GIBCO BRL社製）で数回洗浄した。２μgのプラスミドを含む１００μlのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地と６μlのリポフェクトアミン試薬（GIBCO BRL社製）を含む１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を穏やかに混合し室温で３０分間反応させた後、全量をＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を用いて１ｍｌとし、洗浄した上記細胞に加え４時間培養を行った。４時間後、１ｍｌの２０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地を加えさらに２４時間培養することで遺伝子の導入を行った。
【０１１８】
次に、遺伝子を導入した細胞をＩＭＤＭ培地で一回洗浄し、１０μｍｏｌ／ｌのセレンテラジン（Molecular Probes社製）を含む１ｍｌのＩＭＤＭ培地を加え４時間培養した。４時間後、０．０５％のトリプシン溶液を用いて細胞を剥がし、改変クレブスリンガー緩衝液〔１２５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ4、１ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ2、１ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、５．５ｍｍｏｌ／ｌのグルコースを含む２０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）溶液〕に１×１０6個/ｍｌとなるように懸濁し、１００μｌ/穴で９６穴の細胞培養用白色プレート（住友ベークライト株式会社製；品番MS-8096W）に播種した。マイクロプレートルミノメーターＬＢ９６Ｐ（EG&G BERTHOLD社製）を用いて、２μｍｏｌ／ｌのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Research Biochemical International社製）を含む１００μｌの改変クレブスリンガー緩衝液を、細胞を播種した各穴に添加し、添加直後から３秒間毎に発光量を測定した。
【０１１９】
上記の方法により、プラスミドpAGE107-AEQ、プラスミドpCAG-AEQ、またはプラスミドpBSAEQpAをＣＨＯｄｈｆｒ（−）細胞ＤＧ４４に導入した細胞のＡ２３１８７刺激によるエクオリンの発光量を指標にして各プラスミドのプロモーター活性の比較を行った。結果を図１０に示す。 ＣＡＧプロモーターは、哺乳動物細胞での発現に一般的に用いられるＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターよりも強い転写活性を有していることが示された。
【０１２０】
実施例３：アポエクオリン発現プラスミドの哺乳類細胞への導入による安定形質転換体の取得とアポエクオリン発現量の検討
マウスミエローマ細胞Ｐ３．Ｘ６３／Ａｇ８．Ｕ１（以下、Ｐ３Ｕ１と略す）（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978）にプラスミドpCAG-AEQ-pHPRTpを導入した安定形質転換体を取得し、さらに該細胞にＣｒｅリコンビナーゼを一過性に発現させることでｈｐｒｔ遺伝子の発現ユニットを除去した変異体を取得し、ｈｐｒｔ発現ユニットの除去前後でのアポエクオリンの発現量の比較を行った。
プラスミドpCAG-AEQ-pHPRTpのＰ３Ｕ１細胞への導入は、エレクトロポレーション法に準じて行った。すなわち、該細胞株を８×１０6個／ｍｌになるようにＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、１．５ｍｍｏｌ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、４ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2）に懸濁し、この細胞懸濁液２００μｌと１μg/μｌに調整したプラスミドpCAG-AEQ-pHPRTp ４μlを融合チャンバーGene Pulser Cuvette（電極間距離2mm）（BIORAD社製；カタログ番号165-2086）内で混合した。細胞融合装置ジーンパルサー（BIORAD社製）を用いて、パルス電圧０．２５ＫＶ、電気容量１２５μＦの条件で遺伝子導入し、１０mlの１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO BRL社製）に懸濁後、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。培養後、HAT-Media Supplement（50×）（Boehringer Mannheim Biochemica社製）を２００μl添加しさらに６日間培養することでアミノプテリン耐性株を取得した。取得した薬剤耐性株の生細胞数を計測し、５個/ｍｌになるように、２％HT-Media Supplement（５０×）（Boehringer  Mannheim Biochemica社製）および１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて希釈し、１００μｌ／穴で９６穴プレートに播種した。１週間後単一コロニーを形成した穴の細胞を取得した。実施例４の３）に記載のサザンハイブリダイゼーション法を用い、導入された遺伝子のコピー数を発生工学実験マニュアル, トランスジェニック・マウスの作り方, 講談社 (1987)に記載された方法に従って測定し、導入遺伝子が１コピー挿入された細胞株を選択した。以下、この細胞をクローン２１と称す。
【０１２１】
次に、１．１×１０7個／ｍｌになるようにＰＢＳ緩衝液に懸濁したクローン２１細胞およびＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含有する１μg/μｌに調整したプラスミドpBS185（GIBCO BRL社製）２５μｌを融合チャンバーGene Pulser Cuvette（電極間距離４ｍｍ）（BIORAD社製；カタログ番号165-2088）内で混合した。細胞融合装置ジーンパルサー（BIORAD社製）を用いて、パルス電圧０．２３ＫＶ、電気容量５００μＦの条件で遺伝子導入し、１０ｍｌの１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO BRL社製）に懸濁後、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。２４時間培養後、６-チオグアニン（2-amino-6-mercaptopurine；Sigma社製）を１０μｍｏｌ／ｌになるように添加し６日間培養することで６-チオグアニン耐性株を取得した。以下、この薬剤耐性株をクローン２１Δｈｐｒｔと称す。
取得した細胞株を１×１０6個／ｍｌとなるように１０μｍｏｌ／ｌのセレンテラジンを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、４時間培養した。培養後、１，０００×ｇで５分間の遠心分離操作により細胞を回収し、改変クレブスリンガー緩衝液を用いて２回洗浄した後、改変クレブスリンガー緩衝液を用いて１×１０6個／ｍｌとなるように懸濁し、１００μｌ/穴で９６穴の細胞培養用白色プレート（住友ベークライト株式会社製；品番MS-8096W）に播種した。マイクロプレートルミノメーターＬＢ９６Ｐ（EG&G BERTHOLD社製）を用いて、２μｍｏｌ／ｌのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Research Biochemical International社製）を含む１００μlの修正クレブスリンガー緩衝液を、細胞を播種した各穴に添加し、添加直後から３秒間毎に発光量を測定した。
【０１２２】
上記の方法により、プラスミドpCAG-AEQ-pHPRTp形質転換細胞株クローン２１とクローン２１株よりｈｐｒｔ遺伝子の発現ユニットを除去した変異株クローン２１Δｈｐｒｔのアポエクオリンの発現量の比較を行った。結果を図１１に示す。ＰＧＫプロモーターの下流にｈｐｒｔ遺伝子を有したｈｐｒｔ遺伝子発現ユニットを含むクローン２１株の方が、 ｈｐｒｔ遺伝子発現ユニットを含まないクローン２１Δｈｐｒｔよりもアポエクオリン遺伝子をより高発現していることが示された。
【０１２３】
実施例４：ＰＧＫプロモーターの下流にｈｐｒｔ遺伝子を有し、 かつさらに下流にＣＡＧプロモーターに連結したアポエクオリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの作製
１）受精卵へのＤＮＡの注入と該受精卵の移植
採卵用としてマウスＢＤＦ１系統を８週齢で購入し、８：００〜２０：００の１２時間明期条件で1週間飼育した。
飼育後１日目１７：００に卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性の性腺刺激ホルモン、以下ＰＭＳＧと略する）（５ＩＵ/個体）を腹腔注射した。
３日目の１７：００に黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、以下ｈＣＧと略する）（５ＩＵ/個体）を腹腔注射後、雄マウスＢＤＦ１系統８週齢以降の個体とつがいで同居させ、交配させた。
【０１２４】
４日目９：００に交配させた雌ラットの膣栓確認を行い、１３：３０から膣栓確認した個体を屠殺後、採卵を開始した。ＰＧＫプロモーターに連結したｈｐｒｔ遺伝子とＣＡＧプロモーターに連結したアポエクオリン遺伝子を含む約６．６ＫｂのＤＮＡ断片（以下トランスジーンと略す）は、実施例１の９）で得られたプラスミドpCAG-AEQ-pHPRTpを制限酵素ＰｖｕＩとＳａｃＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後QIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて０．１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／ｌのトリス（ｐＨ８．０）溶液に回収し ＰＢＳ溶液を用いて１０μｇ〜１００μｇ／ｍｌの濃度に調整したものを用いた。受精卵で前核形成卵を選択し、１４：３０から、調製した該トランスジーンのＤＮＡ溶液１〜２μｌを顕微鏡下で観察しながら受精した単細胞期のＢＤＦ１系統マウス卵の雄前核へ注入した。続いて、卵細胞を、公知の改変ウイッテン培地で培養した。
５日目１３：３０に２細胞期胚を確認してから、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版に記載された方法に従って、該偽妊娠の雌ＭＣＨ系統マウスの卵管に移植し、着床させた。該偽妊娠の雌ＭＣＨ系統マウス（１０週齢以降）には、発情期前期から発情期にある雌ＭＣＨ系統マウスを精管結紮雄ＭＣＨ系統マウス１０週以降の個体と４日目１７：００につがいで同居させ、交配させた後、５日目９：００に膣栓確認を行ったマウスを用いた。
【０１２６】
２）産仔からのトランスジーンの検出
２週齢に達した出産仔の尾から採取したゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりアポエクオリン遺伝子を有するマウス個体を選別した。すなわち、アポエクオリン遺伝子ｃＤＮＡ塩基配列を含む配列番号２で示される塩基配列を有する２７マーのプライマー１、および配列番号３で示される塩基配列を有する２８マーのプライマー２を用いてＰＣＲを行った。分析に用いたゲノムＤＮＡは、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版に記載された方法により、尾の約０．５ｃｍ断片から抽出した。得られた核酸ペレットを７０％エタノール中で1回洗浄、乾燥し、３００μｌの２００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡおよび１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含む１０ｍｍｏｌ／ｌのトリス（ｐＨ８．０）に再懸濁して尾ゲノムＤＮＡ調製物とした。尾ゲノムＤＮＡ調製物１μｌを滅菌水で５０倍に希釈して、プライマー１およびプライマー２を用いて、９４℃５分間反応させ、次いで９４℃１分間、６４℃２分間、７２℃３分間のサイクルを３０回反復し、最後に７２℃１０分間反応させ、４℃一晩保存する条件でＰＣＲを行い、該反応物を１．０％アガロースＧＴＣ（ＦＭＣバイオプロダクト社製）ゲルを通して電気泳動して、約６００ｂｐの大きさのＤＮＡバンドを示すマウスを選別した。合計２１匹の出産仔のうち５匹から約６００ｂｐの大きさのＤＮＡバンドが観察された。以上の結果からトランスジーンを少なくとも尾の細胞に含むマウスは個体番号98075-02-2（雌）、98075-04-5（雄）、98075-04-6（雄）、98075-04-7（雌）および98075-04-9（雌）の５個体であることが確認された。
【０１２７】
３）生殖系列トランスジェニックマウスの同定
尾のゲノムＤＮＡよりトランスジーンの存在が確認された５個体を８週齢まで飼育し、マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統８週齢以降の個体とつがいで交配させ産仔を得、得られた産仔の尾から採取したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりアポエクオリン遺伝子を有するマウス個体を選別した。
ゲノムＤＮＡの調製は、実施例４の２）に記載の方法を用いて行った。ＰＣＲはアポエクオリン遺伝子ｃＤＮＡ塩基配列を含む２７マーのプライマー１および２８マーのプライマー２を用いて行った。尾ゲノムＤＮＡ調製物１μｌを滅菌水で５０倍に希釈して、プライマー１およびプライマー２を用いて、９４℃５分間反応させ、次いで９４℃１分間、６４℃２分間、７２℃３分間のサイクルを３０回反復し、最後に７２℃１０分間反応させ、４℃一晩保存する条件でＰＣＲを行い、該反応物を１．０％アガロースＧＴＣ（ＦＭＣバイオプロダクト社製）ゲルを通して電気泳動して、約６００ｂｐの大きさのＤＮＡバンドがみられるマウスを選別した。
【０１２８】
個体番号98075-02-2の個体由来の産仔合計１７匹うち９匹から、個体番号98075-04-5の個体由来の産仔合計１５匹うち９匹から、個体番号98075-04-6の個体由来の産仔合計１８匹うち１３匹から約６００ｂｐの大きさのＤＮＡバンドがみられた。個体番号98075-04-7の個体および個体番号98075-04-9の個体由来の産仔からはバンドは観察されなかった。
次に、これらＰＣＲ陽性３個体の産仔各一匹について、尾ゲノムＤＮＡ調製物およびアポエクオリン遺伝子配列を含むラジオアイソトープ標識ＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。各個体より調製した尾からのＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、得られた断片およびプラスミドpBSAEQpA由来のアポエクオリン遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（０．６Ｋｂ）を32Ｐ―ｄＣＴＰ（Deoxycytidine 5'-triphosphate(dCTP),[α-32P]; NEN社製）で標識した断片をプローブとして用い、サザンハイブリダイゼーションを行なった。標識には市販のT7 QuickPrime Kit（Pharmacia Biotech社製）を用いた。３匹のＰＣＲ陽性個体ＤＮＡそれぞれ１０μgを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に切断し、０．８％アガロースゲルを通して電気泳動を行い、かつSouthern（J.Mol.Biol., 98, 503, 1975）により記載された方法でナイロンフイルター（HybondTM-N+; Amarsham社製）へ移した。このフィルターを標識したプローブと一晩ハイブリッドさせ、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液を用いて、６５℃で５分間の洗浄を２回、１０分間の洗浄を１回行なった、Ｘ線フィルム（Kodak Scientific Imaging Film X-OMATTM AR; Kodak社製）と重ねあわせ−８０℃で一晩感光させ、翌日現像した。
【０１２９】
このサザンハイブリダイゼーションの結果、検定した３匹全てにおいて４．８ｋｂｐの位置にシグナルが検出されたので、これら３匹は注入されたトランスジーンを保持していることが示された。ＰＣＲ陽性３個体由来の産仔についてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、各個体由来の産仔各一匹計３匹の個体でトランスジーンの導入が確認された。以上の結果から生殖系列トランスジェニックマウスは個体番号98075-02-2（雌）、98075-04-5（雄）および98075-04-6（雄）の３個体であることが確認された。
【０１３０】
実施例５：作製したトランスジェニックマウスの導入遺伝子の発現解析
生殖系列にトランスジーンの存在が確認された３個体の産仔それぞれから、組織および器官を摘出しアポエクオリンの発現を試験した。産仔を屠殺後、胸腺、精巣、精嚢、脾臓、腹筋、横隔膜、腎臓、水晶体、肺、膵臓、脂肪組織、皮膚、肝臓、頭蓋骨、食道、血管、心臓、毛、尾、耳、血液、骨髄、歯、舌、胃、小腸、大腸、膀胱、陰茎、卵巣、子宮、卵管、爪、甲状腺、副腎を摘出した。摘出したこれら臓器（血液、骨髄および毛は除く）は、１０単位／ｍｌのへパリンナトリウムを含むＰＢＳ溶液中で約１〜２ｍｍ四方の立方体に細断し、液を交換することでよく洗浄した。血液は、眼底より約０．５ｍｌ採血し、１．０ｍｌの１０単位／ｍｌのへパリンナトリウムを含むＰＢＳ溶液に懸濁後、１０００×ｇで５分間遠心分離することにより回収した。骨髄はDexterらの方法（J. Cell. Physiol., 91, 335, 1977）により大腿骨より摘出し、５．０ｍｌの１０単位／ｍｌのへパリンナトリウムを含むＰＢＳ溶液に懸濁後、１０００×ｇで５分間遠心分離することで回収した。毛は、体毛を引き抜き毛根部から約５ｍｍのところまでを裁断して回収した。次に、１穴に５０μｌの１０μｍｏｌ／ｌのセレンテラジン（Molecular Probes社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を入れた９６穴の細胞培養用白色プレート（住友ベークライト株式会社製；品番MS-8096W）の各穴に、調製した各種臓器試料を数個（血液および骨髄は回収した細胞すべて、毛は回収した毛根部を含む部分約１００本）ずつ加え、３７℃で５時間培養した。培養後、マイクロプレートルミノメーターＬＢ９６Ｐ（EG&G BERTHOLD社製）を用いて、５０μlの０．０７％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ溶液を添加し、添加直後から２０秒間の発光を測定した。その結果、個体番号98075-04-6由来の雄雌の産仔から調製された、胸腺、精巣、精嚢、脾臓、腹筋、横隔膜、腎臓、水晶体、肺、膵臓、脂肪組織、皮膚、肝臓、頭蓋骨、食道、血管、心臓、毛根、尾、耳、血液、骨髄、歯、舌、胃、小腸、大腸、膀胱、陰茎、卵巣、子宮、卵管、爪、甲状腺、副腎のすべての試料において発光が観察された。代表として、水晶体、頭蓋骨、爪、歯の測定結果を図１２に示す。
【０１３１】
また、個体番号98075-04-6の導入遺伝子を含む産仔に形態的、生理的異常は観察されず、さらに、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと交配させることで、導入遺伝子を持つ子孫がメンデルの法則に従って得られたことから、外来のアポエクオリン導入による毒性等の影響はないことが示された。
【０１３２】
実施例６：作製したトランスジェニックマウスを用いた生理活性物質の測定
個体番号98075-04-6由来の雄雌の産仔から組織あるいは器官を調製し、生理活性物質に対する応答性を試験した。産仔を屠殺後、胸腺、脾臓、血管、心臓、子宮、脂肪組織、精巣、腎臓を摘出した。摘出したこれら臓器は、１０単位／ｍｌのへパリンナトリウムを含むＰＢＳ溶液中で約１〜２ｍｍ四方の立方体に細断し、液を交換しながら十分に洗浄した。次に、２００μｌの１０μｍｏｌ／ｌのセレンテラジン（Molecular Probes社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を入れた５ｍｌチューブ（Rohren-Tubes;Sarstedt社製No.55.476）に、調製した各種臓器試料を３個づつ加え、３７℃で５時間培養した。培養後、ＲＰＭＩ１６４０培地に溶解させた以下に示す各種生理活性物質を順次２００μｌづつ添加し、添加直後から1秒間毎にルミノメーターＡｕｔｏＬｕｍａｔＬＢ９５３（BERTHOLD社製）を用いて、発光を測定した。
ＲＰＭＩ１６４０培地、アンジオテンシンII（終濃度１μｍｏｌ／ｌ）、ブラジキニン（終濃度１０μｍｏｌ／ｌ）、Ａ２３１８７（終濃度１μｍｏｌ／ｌ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（終濃度２％）を副腎、子宮、血管、脾臓の各組織に順次加えた結果を図１３に示す。
【０１３３】
ＲＰＭＩ１６４０培地、カルバコール（終濃度１０μｍｏｌ／ｌ）、αメチルセロトニン（終濃度１０μｍｏｌ／ｌ）、ＡＴＰ（終濃度１００μｍｏｌ／ｌ）、フェニレフィリン（終濃度２０μｍｏｌ／ｌ）、Ａ２３１８７（終濃度１μｍｏｌ／ｌ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（終濃度２％）を胸腺、血管、脾臓の各組織に順次加えた結果を図１４に示す。
ＲＰＭＩ１６４０培地、エンドセリン（終濃度１０ｎｍｏｌ／ｌ）、カルシトニン（終濃度１０ｎｍｏｌ／ｌ）、Ａ２３１８７（終濃度１μｍｏｌ／ｌ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（終濃度２％）を血管、心臓の各組織に順次加えた結果を図１５に示す。
【０１３４】
ＲＰＭＩ１６４０培地、フェニレフィリン（終濃度２０μｍｏｌ／ｌ）、Ａ２３１８７（終濃度１μｍｏｌ／ｌ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（終濃度２％）を脂肪組織、精巣、腎臓の各組織に順次加えた結果を図１６に示す。
なお、実験に用いたアンジオテンシンII（商品コードA-151）、ブラジキニン（商品コードB-120）、カルバコール（商品コードC-107）、αメチルセロトニン（商品コードM-110）、ＡＴＰ（商品コードA-141）、フェニレフィリン（商品コードA-133）、Ａ２３１８７（商品コードC-161）、エンドセリン（商品コードE-134）、カルシトニン（商品コードC-210）はResearch Biochemicals International社より購入した。
【０１３５】
その結果、アンジオテンシンII(終濃度１μｍｏｌ／ｌ)添加、およびブラジキニン(終濃度１０μｍｏｌ／ｌ)添加において、血管、子宮、副腎で強い発光が観察された（図１３）。アドレナリンα１受容体のアゴニストであるフェニレフィリンを終濃度２０μｍｏｌ／ｌで添加したところ、胸腺、血管、脂肪組織、精巣において強い発光が観察された（図１４、図１６）。ムスカリン受容体のアゴニストであるカルバコールを終濃度１０μｍｏｌ／ｌで添加したところ、血管において発光が観察された（図１４）。Ｐ２Ｙ受容体のアゴニストであるＡＴＰを終濃度１００μｍｏｌ／ｌで添加したところ、胸腺、血管、脾臓において強い発光が観察された（図１４）。エンドセリンを終濃度１０ｎｍｏｌ／ｌで添加したところ、血管において強い発光が観察された（図１５）。
【０１３６】
実施例７ マウス胚性幹細胞を用いた、ＰＧＫプロモーターの下流にｈｐｒｔ遺伝子を有し、 かつさらに下流にＣＡＧプロモーターに連結したアポエクオリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの作製
１）マウス胚性幹細胞の培養
マウス胚性幹細胞ＡＢ２．２（Lexicon Genetics社製；カタログNo.C100、以下AB2.2細胞と称す）は１５％ウシ胎児血清（Lexicon Genetics社製；カタログNo.B100）、１０-4ｍｏｌ／ｌのベータメルカプトエタノール（Lexicon Genetics社製；カタログＮｏ．Ｍ２６０）、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン、５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Lexicon Genetics社製；カタログＮｏ．Ｍ２５０）を含むＤＭＥＭ培地（Lexicon Genetics社製；カタログＮｏ．Ｍ２０５）（以下、Ｍ１５培地と称す）を用いて、フィーダープレート上で３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養を行った。フィーダープレートはゲラチンコート処理を施した細胞培養用ディッシュにマイトマイシンＣ処理マウス胚線維芽細胞（Lexicon Genetics社製；カタログＮｏ．Ｃ２００、以下ＳＴＯ細胞と称す）を培養して作製した。すなわち０．１％ゲラチン溶液（Lexicon Genetics社製；カタログＮｏ．Ｍ２１０）で２時間以上細胞培養用ディッシュの培養面を覆うことによりゲラチンコート処理を行い、購入したＳＴＯ細胞を融解後、７％のウシ胎児血清（Lexicon Genetics社製）および ２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン（Lexicon Genetics社製）、５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Lexicon Genetics社製）を含むＤＭＥＭ培地（Lexicon Genetics社製）（以下ＳＴＯ培地と称す）に４．４ｘ１０5個／ｍｌになるよう懸濁し、９６穴プレートに０．０７ｍｌ／穴、３ｃｍディッシュに２ｍｌ、６ｃｍディッシュに４ｍｌ、８．５ｃｍディッシュに１２ｍｌ、マルチディッシュおよび２４穴プレートに０．５ｍｌを播種し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間以上培養したものをフィーダープレートとした。ＡＢ２．２細胞はＭ１５培地に懸濁した後、フィーダープレートに播種して培養を開始した。Ｍ１５培地は９６穴プレートに０．１ｍｌ／穴、マルチディッシュおよび２４穴プレートに０．５ｍｌ、３ｃｍディッシュに２ｍｌ、６ｃｍディッシュに４ｍｌ、８．５ｃｍディッシュに １０ｍｌを使用し、細胞がコンフルエントに到達する前に継代を行った。継代に先駆け、２時間前にＭ１５培地を交換した。ＰＢＳ緩衝液（Lexicon Genetics社製）で２回洗浄した後、９６穴プレートに０．０２５ｍｌ／穴、マルチディッシュおよび２４穴プレートに０．２５ｍｌ、３ｃｍディッシュに１ｍｌ、６ｃｍディッシュに２ｍｌ、８．５ｃｍディッシュに２ｍｌの０．０４％ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシン溶液（Lexicon Genetics社製；M220）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で１５分間放置した後、等量のＭ１５培地を添加し、プラスチック製ピペットを用いて４０回激しく攪拌し細胞を分散させた後、遠心分離により沈殿させた細胞をＭ１５培地に再び懸濁し、新しいフィーダープレート上に播種することで継代を行った。
【０１３７】
２）マウス胚性幹細胞へのアポエクオリン発現遺伝子pCAG-AEQ-pHPRTpの導入とアポエクオリン高発現株の選別
ＡＢ２．２細胞へのpCAG-AEQ-pHPRTpの導入はエレクトロポレーション法により行った。購入したＡＢ２．２細胞３．０×１０6個を６ｃｍディッシュに播種し、４８時間培養した後、８．５ｃｍディッシュへ継代し、さらに２４時間培養した。２４時間後、７ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、２ｍｌのトリプシン溶液（Lexicon Genetics 社製）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で１５分間放置した後、２ｍｌのＭ１５培地を添加し、３ｍｌトランスファーピペット（ファルコン社製；カタログNo．7575）を用いて４０回激しくピペッティングしたのち、遠心分離により沈殿させた細胞１．０×１０7個を０．９ｍｌＰＢＳ緩衝液（Lexicon Genetics社製）に懸濁し、１．１μｇの直鎖状 pCAG-AEQ-pHPRTp２２．７μｌを融合チャンバーGene Pulser Cuvette（電極間距離４ｍｍ）（BIORAD社製；カタログ番号165-2088）内で混合した。直鎖状のpCAG-AEQ-pHPRTpは実施例１の９）で得られたプラスミドpCAG-AEQ-pHPRTpを制限酵素ＡｓｃＩで切断し、フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、０．１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／ｌのトリス（ｐＨ８．０）溶液に溶解したものを用いた。細胞融合装置ジーンパルサー（BIORAD社製）を用いて、パルス電圧０．２３ＫＶ、電気容量５００μＦの条件で遺伝子導入し、５０ｍｌのＭ１５培地に懸濁後、１０ｍｌ／枚で５枚の８．５ｃｍフィーダープレートに播種し、２４時間培養した。２４時間後、HAT Supplement（100x）（Gibco BRL社製；カタログNo．3992）を１×濃度で含むＭ１５培地でさらに８日間培養することで、薬剤耐性コロニーを出現させた。これらコロニーは９６穴フィーダープレートに1コロニー／穴で採取し、培養を継続した後レプリカを作製した。コロニーはＰＢＳ緩衝液（Lexicon Genetics社製）で２回洗浄した後、プラスチック製の滅菌チップを用いて、３０μｌのトリプシン溶液を添加した丸底９６穴プレート（ファルコン社製；カタログNo.3077）へ１コロニー／穴になるように直接拾いあげて採取した。続いて３７℃、５％ＣＯ2条件下で１５分間以上放置した後、７０μｌ／穴のＭ１５培地を添加しプラスチック製の滅菌チップで４０回激しくピペッティングを行い分散させた細胞懸濁液を、各穴に１００μｌのＭ１５培地を添加した９６穴フィーダープレートに播種して３日間培養を行った。３日後、レプリカプレートを作製し、さらに３日間培養した。レプリカプレートは上記の９６穴プレートを一穴につき１００μｌのＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、２５μｌのトリプシン溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で１５分間以上放置した後、２５μｌのＭ１５培地を添加し、プラスチック製の滅菌チップで４０回激しくピペッティングを行い分散させ、続いて２０％ＤＭＳＯ（シグマ社製；カタログNo.D2650）、４０％のウシ胎児血清（Lexicon Genetics社製）を含むＤＭＥＭ培地（以下、２×フリージング培地と称す）を５０μｌ添加して混合した細胞懸濁液から１００μｌを分取し、細胞培養用白色プレート（住友ベークライト株式会社製；品番MS-8096W）に移すことにより作製した。上記プレートはあらかじめゲラチンコート処理した後、一穴につき１００μｌのＭ１５を添加したものを使用した。残りの細胞懸濁液を含むプレートはマスタープレートとして−８０℃で凍結保存した。３日後、培地を除き、��０μｍｏｌ／ｌのセレンテラジンを含むＭ１５培地を１００μｌ／穴で添加し、４時間培養した。４時間後、２μｍｏｌ／ｌのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Research Biochemical International社製）を含む１００μｌの修正クレブスリンガー緩衝液を各穴に添加し、直ちに５秒間の発光量を測定した。上記の方法により測定した各薬剤耐性株のアポエクオリン発現量の比較から、最もアポエクオリン発現量の高い細胞株、ＡＢ２．２クローン番号１Ａ７を選別した。
【０１３８】
次にＡＢ２．２クローン番号１Ａ７のマウス胚盤胞への注入ストックを作製した。凍結保存したマスタープレートを融解し、１Ａ７を含む細胞懸濁液を２ｍｌのＭ１５培地を添加した２４穴フィーダープレートの一穴に播種し２４時間培養した後、培地を交換し、さらに３日間培養を行った。３日後、２４穴フィーダープレートの一穴に継代し、さらに２日間培養した後、３ｃｍディッシュに継代した。２４時間後、継代方法と同様にディッシュより剥離後、遠心分離により沈殿させた細胞を０．５ｍｌのＭ１５培地に懸濁し、さらに０．５ｍｌの２×フリージング培地を加えて混合した懸濁液を０．１ｍｌずつ細胞凍結用チューブに添加後 −８０℃で凍結保存し、マウス胚盤胞への注入ストックとした。
【０１３９】
３）マウス胚性幹細胞の胚盤胞への注入および該胚盤胞の移植
樹立したアポエクオリンを高発現したＡＢ２．２クローン１Ａ７は、マウス胚盤胞への注入に際し、マルチディッシュ（Nunc社製；カタログNo．176740）で培養を行った。マウス胚盤胞注入ストックを融解後、１０ｍｌのＭ１５培地に懸濁し、遠心分離して沈殿させた細胞をマルチディッシュに播種し培養を開始した。２４時間後に再びマルチディッシュへ継代し、さらに２４時間培養後、ＰＢＳ（Lexicon Genetics 社製）０．５ｍｌで２回洗浄した後、０．２５ｍｌのトリプシン溶液（Lexicon Genetics 社製）を加えて、３７℃、５％ＣＯ2条件下で１５分間放置した後、０．７５ｍｌのＭ１５培地を添加し、３ｍｌトランスファーピペット（ファルコン社製；カタログNo．7575）を用いて４０回激しくピペッティングして懸濁したところに、ウシ胎児血清（Lexicon Genetics社製）を加えて混合し、該細胞懸濁液をマウス胚盤胞への注入に用いた。マウス胚盤胞は過排卵処理を施した雌のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを同系の雄マウスと自然交配させ、４日後に摘出した子宮の内部をＭ１５培地で灌流することにより取得した。これらを３７℃、５％ＣＯ2条件下で胚盤胞腔が十分に膨らむまで放置した後、約４℃に冷却した２０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳを含むＭ１５培地中に移し、マイクロインジェクター（成茂科学社製）およびマイクロマニピュレーター（成茂科学社製）を装備した倒立顕微鏡（ニコン社製）下で観察しながら、注入針を操作し１０〜１５個のＡＢ２．２クローン１Ａ７を胚盤胞腔内へ顕微注入した。該胚盤胞を３７℃、５％ＣＯ2条件下で胚盤胞腔が膨らむまで放置した後、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)に記載された方法に従い、偽妊娠の雌ＭＣＨ系統マウスの卵管側子宮部分に移植後、着床させた。偽妊娠の雌ＭＣＨ系統マウス（１０週齢以降）は、発情期前期から発情期にある雌ＭＣＨ系統マウスを精管結紮雄ＭＣＨ系統マウス１０週以降の個体と移植３日前の１７：００に１：１で同居、交配させ、翌朝９：００に膣栓確認を行い、２日後に上記の目的で使用した。
【０１４０】
４）生殖系列キメラマウスの同定
注入した１Ａ７の寄与で、黒色の被毛の中に茶褐色の被毛が現れたキメラ個体のうち、キメラ率が５０％を超える雄の個体を８週齢まで飼育し、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統８週齢以降の個体と１：１で交配させ産仔を得た。該産仔のうち、茶褐色の被毛を有する個体の尾より採取したゲノムＤＮＡを用いて、実施例４の３）に記載の方法を用いて導入遺伝子の有無を試験した。ゲノムＤＮＡの調整は、実施例４の２）に記載の方法を用いて行った。茶褐色の産仔は雄６個体のうち５個体から得られ、うち２個体からは導入遺伝子を有する産仔が得られた。本結果より、上記の２個体、個体名称「クロ」および「リュウ」は生殖系列キメラマウスであると同定した。
【０１４１】
５）マウス胚性幹細胞より作製したトランスジェニックマウスの導入遺伝子の発現解析と該マウスを用いた生理活性物質の測定
「リュウ」由来の産仔からそれぞれ組織あるいは器官を調整しアポエクオリンの発現を実施例５に記載した方法で試験した。その結果、個体番号「リュウ」由来の雄雌の産仔から調整された、胸腺、精巣、精嚢、脾臓、腹筋、横隔膜、腎臓、水晶体、肺、膵臓、脂肪組織、皮膚、肝臓、頭蓋骨、食道、血管、心臓、毛根、尾、耳、血液、骨髄、歯、舌、胃、小腸、大腸、膀胱、陰茎、卵巣、子宮、卵管、爪、甲状腺、副腎のすべての試料において発光が観察された。
次に実施例６に記載した方法で該マウス由来の雄雌の産仔から組織あるいは器官を調整し、生理活性物質に対する応答性を試験した。その代表として、ＲＰＭＩ１６４０培地、カルバコール（終濃度２０μｍｏｌ／ｌ）、αメチルセロトニン（終濃度２０μｍｏｌ／ｌ）、ＡＴＰ（終濃度１００μｍｏｍ／ｌ）、フェニレフィリン（終濃度２０μｍｏｌ／ｌ）、Ａ２３１８７（終濃度１μｍｏｌ／ｌ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（終濃度２％）を子宮に順次加えた結果を図１７に示した。２０μｍｏｌ／ｌのカルバコール、２０μｍｏｌ／ｌのαメチルセロトニン、１００μｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、２０μｍｏｌ／ｌのフェニレフィリンの添加により強い発光が確認された。
【０１４２】
実施例８：本発明のＤＮＡの下流にアポエクオリン遺伝子を導入した安定形質転換体の解析
実施例３に記載した方法に従い、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１にプラスミドpCAG-AEQ-pHPRTpを導入した安定形質転換体を任意に１０株取得し、さらに取得したこれら細胞にＣｒｅリコンビナーゼを一過性に発現させることでｈｐｒｔ遺伝子の発現ユニットを除去した変異体を取得し、ｈｐｒｔ発現ユニットの除去前後でのアポエクオリンの発現量の比較を行った。
いずれの株においても、ｈｐｒｔ遺伝子の発現ユニットを除去することによりアポエクオリン発現の低下が観察された。ほとんどの株では５〜１０倍の発現低下が観察され、１株においては、除去後アポエクオリンの発現がほとんど観察されなかった。
【０１４３】
また、実施例３に記載した方法に従い、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１にプラスミドpCAG-AEQ-pHPRTpまたはpCAG-AEQを導入し２４時間後に、一過性のアポエクオリンの発現量を測定し比較した。pCAG-AEQを導入したＰ３Ｕ１細胞とpCAG-AEQ-pHPRTpを導入したＰ３Ｕ１細胞との間で有為な差は観察されなかった。
以上の結果から、pCAG-AEQ-pHPRTpプラスミドが有するアポエクオリン遺伝子の上流部分、すなわち配列番号１で示されるｌｏｘＰ、ＰＧＫプロモーター、ｈｐｒｔ遺伝子、ｌｏｘＰ、ＣＡＧプロモーターの塩基配列の部分には、染色体上において、下流に存在する遺伝子を強く発現させる作用があることが示唆された。
【０１４４】
実施例９：本発明のＤＮＡ下流にＧＦＰ遺伝子を結合させた遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの作製
１）ＰＧＫプロモーターの下流にｈｐｒｔ遺伝子を有し、かつさらに下流にＣＡＧプロモーターに連結したＧＦＰ遺伝子を含有するプラスミドpCAG-GFP-pHPRTpの構築（図１８を参照）
実施例１−６）に記載した方法に従い作製したプラスミドpCAG-AEQ３μgを２０μｌのUniversal Buffer L(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。その後、４μｌの１０倍濃度のUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)と１０単位のＥｃｏＲＩを全体量が４０μｌになるように添加し、３７℃でさらに２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約４．６ＫｂのＤＮＡ断片をQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて回収した。
【０１４５】
また、プラスミドpEGFP-1（クロンテック社製；カタログNo.6086-1）２μｇを３０μｌのＮＥ Buffer 1(New England Biolabs社製)に溶解し、１０単位のＡｇｅＩを加えて２５℃で２時間消化反応を行った。その後、４μｌの１０倍濃度のＮＥ Buffer 3(New England Biolabs社製)と１０単位のＡｆｌＩＩＩを全体量が４０μｌになるように添加して３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約０．９７ＫｂのＧＦＰ遺伝子とＳＶ４０後期遺伝子のポリＡ付加シグナルを含むＤＮＡ断片を回収した。
上記で得た、プラスミドpCAG-AEQ由来のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片（４．６Ｋｂ）１．０μｇ、プラスミドpEGFP-1由来のＡｇｅＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片（０．９７Ｋｂ）１．０μgそれぞれを、DNA Blunting Kit （宝酒造株式会社製；カタログNo.6025）を用い、添付書に記載された方法で平滑末端化処理を行った。各ＤＮＡを９μｌのキット添付の反応バッファー（宝酒造株式会社製）に溶解し、７０℃で５分間放置した後、全体量が１０μｌになるように1単位のＴ４ＤＮＡpolymerase（宝酒造株式会社製）を添加し、３７℃で５分間反応を行った。その後、直ちにボルテックスミキサーを用いて激しく攪拌し酵素を失活させて反応を終了させた。プラスミドpEGFP-1由来のＡｇｅＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片の反応液は引き続きフェノールークロロホルム抽出を行った後、５μｌを採取し、２．５μｌのT4 polynucleotide kinase buffer（宝酒造株式会社製）と１０単位のT4 polynucleotide kinase （宝酒造株式会社製）を全体量が２５μｌになるように加えて、３７℃で３０分間ＤＮＡの５'末端リン酸化処理を行った。その後６５℃で１０分間放置し、反応を停止させた。上記の方法で調製したプラスミドpCAG-AEQ由来の平滑末端ＤＮＡ断片（４．６Ｋｂ）０．１μｇとpEGFP-1由来のリン酸化平滑末端ＤＮＡ断片（０．９７Ｋｂ）０．１μｇをT4リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをpCAG-GFPと称す。
【０１４６】
次に、実施例１−８）に記載した方法で作製したプラスミドploxpHPRTnew２μgを３０μｌのUniversal Buffer Ｌ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。その後、４μｌの１０倍濃度のUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)と１０単位のＳａｌＩを全体量が４０μｌになるように添加し３７℃でさらに２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、ｈｐｒｔ遺伝子を含む約３．８ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
一方、プラスミドpCAG-GFP２μｇを３０μｌのUniversal Buffer Ｌ(宝酒造株式会社製)に溶解し、１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。その後、４μｌの１０倍濃度のUniversal Buffer Ｈ(宝酒造株式会社製)と１０単位のＳａｌＩを全体量が４０μｌになるように添加しさらに３７℃で２時間消化反応を行った。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、アンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を含む約５．６ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。
【０１４７】
上記で得た、プラスミドploxpHPRTnew由来ＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片（３．８ｋｂ）０．１μgとプラスミドpCAG-GFP由来ＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片（５．６ｋｂ）０．１μｇをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをpCAG-GFP-pHPRTpと称す。
【０１４８】
２）ＰＧＫプロモーターの下流にｈｐｒｔ遺伝子を有し、かつさらに下流にＣＡＧプロモーターに連結したＧＦＰ遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの作製
実施例７に記載した方法に従い、作製したＧＦＰ発現遺伝子pCAG-GFP-pHPRTpをマウス胚性幹細胞ＡＢ２．２へ導入し、出現した薬剤耐性株の中からＧＦＰ高発現株を選別し、選別した株をマウス胚盤胞へ注入後、偽妊娠させた雌マウスの子宮に移植し、出産したキメラマウスの中から生殖キメラマウスを同定することで、配列番号１に示された塩基配列にＧＦＰ遺伝子が連結した遺伝子を含有するトランスジェニックマウス３Ｃ５'を作製した。作製したトランスジェニックマウス３Ｃ５'の産仔は、ＧＦＰ遺伝子を高発現しているため、蛍光灯下でも皮膚が緑に見え、ゲノムＤＮＡを用いてトランスジーンを検出する必要なくトランスジェニックか否かの判定ができた。
作製したトランスジェニックマウス３Ｃ５'の産仔から組織および器官を摘出し、ＧＦＰの蛍光が観察されるか試験した。蛍光の検出は富士写真フィルム社製のルミノイメージアナライザーLAS-1000を用いて行った。産仔を屠殺後、胸腺、精巣、精嚢、脾臓、腹筋、横隔膜、腎臓、水晶体、肺、膵臓、脂肪組織、皮膚、肝臓、頭蓋骨、食道、血管、心臓、毛根、尾、耳、血液、骨髄、歯、舌、胃、小腸、大腸、膀胱、陰茎、卵巣、子宮、卵管、爪、甲状腺、副腎を摘出した。これら臓器を暗箱内に設置されたトレーに置き、臓器の持つ蛍光を冷却ＣＣＤカメラで測定した。励起光源には４７０ｎｍを中心とした青色光を放つBlue-SQW-LED（日亜化学工業製）を使用し、カメラレンズの前面に蛍光フィルターY515-Di（富士写真フィルム社製）を装着して撮影した。その結果、摘出したすべての試料において、ＧＦＰの蛍光が観察された。産仔を開腹後、ハンディ紫外線照射装置ModelUVGL-58（UVP Inc.社製）を用いて内蔵にＵＶを照射したところ、各臓器から緑色の蛍光が発せられているのが肉眼でも確認できた。
【産業上の利用の可能性】
【０１４９】
本発明の細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターする外来性のレポーター蛋白質をコードするＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、該ＤＮＡを上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官、感覚器、および爪から成る群から選択される１以上の組織または器官において発現しており、これら組織あるいは器官における生理活性物質（例えば、薬物）や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価および活性評価に利用することができる。特に、生理機能を保ったままin vitroで培養することが難しい細胞や、複雑な細胞間ネットワークを持つ組織あるいは器官における薬物応答等を調べる目的に利用し得る。また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に心疾患（例えば、急性心不全、慢性心不全、心筋炎など）、呼吸器系疾患、関節疾患（例えば、関節リュウマチ、変形性関節症など）、腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症など）、動脈硬化症、乾癬症、高脂血症、アレルギー疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎など）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、低カルシウム血症など）、血液疾患、脳血管性傷害、外傷性脳障害、感染症、痴呆症および慢性炎症性疾患などを誘発し、その病態モデル動物における細胞内カルシウム濃度の変動を測定することができ、これら疾患の病態機序の解明、治療方法の検討および治療薬研究開発を目的とした候補化合物スクリーニングを行うことに利用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】  図１はプラスミドpAGE107AEQの構築を示す図である。
【図２】  図２はプラスミドpBSAEQpAの構築を示す図である。
【図３】  図３はプラスミドpBSKS(+)CAG promoterの構築を示す図である。
【図４】  図４はプラスミドpCAG-AEQの構築を示す図である。
【図５】  図５はプラスミドploxp#1の構築を示す図である。
【図６】  図６はプラスミドploxpの構築を示す図である。
【図７】  図７はプラスミドploxpHPRTの構築を示す図である。
【図８】  図８はプラスミドploxpHPRT2の構築を示す図である。
【図９】  図９はプラスミドpCAG-AEQ-pHPRTpの構築を示す図である。
【図１０】  図１０はＡ２３１８７刺激によるエクオリンの発光量を指標にして各プラスミドのプロモーター活性の比較を行った結果を示す図である。
（１）はpCAG-AEQ、（２）はpAGE107AEQ、（３）はpBSAEQpAを導入したＣＨＯｄｈｆｒ（−）ＤＧ４４細胞を用いた結果を示す。
ＲＬＵは相対蛍光(Relative Luminescence unit)を表す。
【図１１】  図１１はプラスミドpCAG-AEQ-pHPRTp形質転換細胞株クローン２１とクローン２１株よりｈｐｒｔ遺伝子の発現ユニットを除去した変異株クローン２１Δｈｐｒｔのアポエクオリンの発現量の比較を示す図である。
【図１２】  図１２は本発明のトランスジェニックマウスから調製した水晶体、頭蓋骨、爪、歯における導入遺伝子の発現の解析の結果を示す図である。
【図１３】  図１３は本発明のトランスジェニックマウスを用いて生理活性物質の測定を行った結果を示す図である。
(１)はＲＰＭＩ１６４０、(２)はアンジオテンシンIIを終濃度１μｍｏｌ／ｌ、(３)はブラジキニンを終濃度１０μｍｏｌ／ｌ、（４）はＡ２３１８７を終濃度１μｍｏｌ／ｌ、（５）はＴｒｉｔｏｎＸ−１００を終濃度２％、各矢印で示された時間に添加したことを示す。
【図１４】  図１４は本発明のトランスジェニックマウスを用いて生理活性物質の測定を行った結果を示す図である。
(１)はＲＰＭＩ１６４０、(２)はカルバコールを終濃度１０μｍｏｌ／ｌ、(３)はαメテルセロトニンを終濃度１０μｍｏｌ／ｌ、(４)はＡＴＰを終濃度１００μｍｏｌ／ｌ、（５）はフェニレフィリンを終濃度２０μｍｏｌ／ｌ、(６)はＡ２３１８７を終濃度１μｍｏｌ／ｌ、（７）はＴｒｉｔｏｎＸ−１００を終濃度２％、各矢印で示された時間に添加したことを示す。
【図１５】  図１５は本発明のトランスジェニックマウスを用いて生理活性物質の測定を行った結果を示す図である。
(１)はＲＰＭＩ１６４０、(２)はエンドセリンを終濃度１０ｎｍｏｌ／ｌ、(３)はカルシトニンを終濃度１０ｎｍｏｌ／ｌ、(４)はＡ２３１８７を終濃度１μｍｏｌ／ｌ、（５）はＴｒｉｔｏｎＸ−１００を終濃度２％、各矢印で示された時間に添加したことを示す。
【図１６】  図１６は本発明のトランスジェニックマウスを用いて生理活性物質の測定を行った結果を示す図である。
(１)はＲＰＭＩ１６４０、(２)はフェニレフィリンを終濃度２０μｍｏｌ／ｌ、(３)はＡ２３１８７を終濃度１μｍｏｌ／ｌ、（４）はＴｒｉｔｏｎＸ−１００を終濃度２％、各矢印で示された時間に添加したことを示す。
【図１７】  図１７は本発明のトランスジェニックマウスから調製した子宮を用いて生理活性物質の測定を行った結果を示す図である。ＲＰＭＩ１６４０培地、カルバコール（ｃａｒ）を終濃度２０μｍｏｌ／ｌ、αメチルセロトニン（ａＭｅ−５ＨＴ）を終濃度２０μｍｏｌ／ｌ、ＡＴＰを終濃度１００μｍｏｌ／ｌ、フェニレフィリン（ＰＥ）を終濃度２０μｍｏｌ／ｌ、Ａ２３１８７を終濃度１μｍｏｌ／ｌ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を終濃度２％で、順次、矢印で示された時間に添加したことを示す。
【図１８】  図１８はプラスミドpCAG-GFP-pHPRTpの構築を示す図である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
<120> A transgenic non-human mammalian animal for monitoring the change of the calcium ion concentration in cells
<130> A01394MA
<150> JP 11-314512
<151> 1999-11-5
<160> 7
<210> 1
<211> 5581
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: DNA constructed from  DNAs with different origin
<220>
<222> (1)..(48)
<223> Synthetic DNA containing loxP sequence
<220>
<222> (48)..(56)
<223> DNA originated from pKO plasmid
<220>
<222> (56)..(3732)
<223> DNA containing PGK promoter and hprt gene
<220>
<222> (3732)..(3741)
<223> DNA originated from pKO plasmid
<220>
<222> (3741)..(3787)
<223> Synthetic DNA containing loxP sequence
<220>
<222> (3787)..(3830)
<223> DNA originated from pKO plasmid
<220>
<221> promoter
<222> (3830)..(5558)
<223> DNA containing CAG promoer
<220>
<222> (5558)..(5575)
<223> DNA originated from pBluescritIIKS(+) plasmid
<400> 1
ggtaccgcgg ccgcataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatct cgaggggcgc 60
gccctaccgg gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc 120
cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac 180
cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc 240
cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga 300
agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt 360
aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct ttggctcctt cgctttctgg gctcagaggc 420
tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc 480
gaaggtcctc cggaagcccg gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt 540
tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga cctgcagggg ggggggggtc ttgctgcgcc 600
tccgcctcct cctctgctcc gccaccggct tcctcctcct gaacaatcag cccgcgcgcc 660
ggccggctcc gttatggcga cccgcagccc tggcgtcgtg attagtgatg atgaaccagg 720
ttatgacctt gatttatttt gcatacctaa tcattatgct gaggatttgg aaagggtgtt 780
tattccccat ggactaatta tggacaggta agtaagatct taaaatgagg ttttttactt 840
tttcttgtgt taatttcaaa catcagcagc tgttctgagt acttgctatt tgaacataaa 900
ctaggccaac ttattaaata actgatgctt tctaaaatct tctttattaa aaataaaaga 960
ggagggcctt actaattact tagtatcagt tgtggtatag tgggactctg tagggaccag 1020
aacaaagtaa acattgaagg gagatggaag aaggaactct agccagagtc ttgcatttct 1080
cagtcctaaa cagggtaatg gactggggct gaatcacatg aaggcaaggt cagattttta 1140
ttattatgca catctagctt gaaaattttc tgttaagtca attacagtga aaaaccttac 1200
ctggtattga atgcttgcat tgtatgtctg gctattctgt gtttttattt taaaattata 1260
atatcaaaat atttgtgtta taaaatattc taactatgga ggccataaac aagaagacta 1320
aagttctctc ctttcagcct tctgtacaca tttcttctca agcactggcc tatgcatgta 1380
tactatatgc aaaagtacat atatacattt atattttaac gtatgagtat agttttaaat 1440
gttattggac acttttaata ttagtgtgtc tagagctatc taatatattt taaaggttgc 1500
atagcattct gtcttatgga gataccataa ctgatttaac cagtccacta ttgatagaca 1560
ctattttgtt cttaccgact gtactagaag aaacattctt ttacatgttt ggtacttgtt 1620
cagctttatt caagtggaat ttctgggtca aggggaaaga gtttattgaa tattttggta 1680
ttgccaaatt ttcctctaag aagttgaatc attttatact cctgatgtta tatgagagta 1740
cctttctctt cacaatttgt ctcttttttt tttttttttg agacaaggtc tctgttgccc 1800
aggctggggt gcagtgcagc agaatgatca cagttcactg cagtctcaac ctcctgggtt 1860
caagcgatcc ttccacctca gcctcctgag tagctgggac tataggtgtg cgccaccaat 1920
cccagctaat atttttattt tgtagaaaca gggttcgcca tgttacccag cctcccaaag 1980
tgctgggatt acaggcatga gccactggcc cagtttatac agtctctctt aatatggtat 2040
attatccaga aaatttcatt taatcagaac ctgccagtct gataggtgaa aatggtatct 2100
tgtttttatt tgcatttaaa aaaaattatg atagtggtat gcttggtttt tttgaaggta 2160
tcaaattttt taccttatga aacatgaggg caaaggatgt gttacgtgga agatttaaaa 2220
aaaattttta atgcattttt ttgagacaag gtcttgctct attgtccagg ctggagtgca 2280
gtggcacaat cacagttcac tccagcctca acatcctgca ctaaagtgat tttcccacct 2340
cacttctcaa gtagctggga ctacaggtac atgctaccat gcctggctaa tttttttttt 2400
tttgcaggca tggggtctca ctatattgcc caggttggtg tggaagttta atgactaaga 2460
ggtgtttgtt ataaagttta atgtatgaaa ctttctatta aattcctgat tttatttctg 2520
taggactgga ctgaacgtct tgctcgagat gtgatgaagg agatgggggg ccatcacatt 2580
gtagccctct gtgtgctcaa ggggggctat aaattctttg ctgacctgct ggattacatc 2640
aaagcactga atagaaatag tgatagatcc attcctatga ctgtagattt tatcagactg 2700
aagagctatt gtaatgacca gtcaacaggg gacataaaag taattggtgg agatgatctc 2760
tcaactttaa ctggaaagaa tgtcttgatt gtggaagata taattgacac tggcaaaaca 2820
atgcagactt tgctttcctt ggtcaggcag tataatccaa agatggtcaa ggtcgcaagc 2880
ttgctggtga aaaggacccc acgaagtgtt ggatataagc cagactttgt tggatttgaa 2940
attccagaca agtttgttgt aggatatgcc cttgactata atgaatactt cagggatttg 3000
aatcatgttt gtgtcattag tgaaactgga aaagcaaaat acaaagccta agatgagagt 3060
tcaagttgag tttggaaaca tctggagtcc tattgacatc gccagtaaaa ttatcaatgt 3120
tctagttctg tggccatctg cttagtagag ctttttgcat gtatcttcta agaattttat 3180
ctgttttgta ctttagaaat gtcagttgct gcattcccta aactgtttat ttgccctatg 3240
agcctataga ctatcagttc cctttgggcg gattgttgtt taacttgtaa atgaaaaaat 3300
tctcttaaac cacagcacta ttgagtgaaa cattgaactc atatctgtaa ggaaataaag 3360
agaagatata ttagtttttt aattggtatt ttaattttta tatatgcagg aaagaataga 3420
agtgattgaa tattgttaat tataccaccg tgtgttagaa aagtaagaag cagtcaattt 3480
tcacatcaaa gacagcatct aagaagtttt gttctgtcct ggaattattt tagtagtgtt 3540
tcagtaatgt tgactgtatt ttccaacttg ttcaaattat taccagtgaa tctttgtcag 3600
cagttccctt ttaaatgcaa atcaataaat tcccaaaaat ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagtaccttc tgaggcggaa 3720
agaaccagcc tggcgcgccg ggatctataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 3780
ggatccatcg atcctagaga attcctagac cgcggctaga cccggggggg tcgacattga 3840
ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 3900
gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 3960
cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 4020
tgacgtcaat gggtggacta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 4080
catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 4140
gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 4200
gctattacca tgggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc 4260
ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc 4320
gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 4380
ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 4440
cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 4500
cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 4560
tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 4620
agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttaaagggc 4680
tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc 4740
gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 4800
cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg gtgccccgcg 4860
gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga 4920
gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc ctccccgagt 4980
tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg gggcgtggcg cggggctcgc 5040
cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc cgcctcgggc 5100
cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg 5160
gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg 5220
tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg 5280
ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc gtgcgtcgcc 5340
gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc cgcaggggga cggctgcctt 5400
cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc 5460
tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt 5520
gttgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttgatttatc gataagcttg atatcgaatt 5580
c                                                                 5581
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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cttgtcgaca tgcaggtctc tgtcacg     27
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cttgtcgaca ctagttctct gtcatact    28
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cgcggccgca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatc   44
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tcgagataac ttcgtatagc atacattata cgaagttatg cggccgcggt ca    52
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gatctataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatg gatccat     47
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cgatggatcc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttata    45
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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