(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分（ＰＡ）を運ぶためのサブミクロンの大きさの粒子の水性安定コロイド懸濁液の調製方法であって、
・前記粒子はα-ペプチド結合を有する直鎖の両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）に基づき個別化された超分子配列であり、その配列は、２つの異なるタイプの反復するアミノ酸：Ｇｌｕから成る親水性アミノ酸（ＡＡＩ）およびＬｅｕから成る疎水性中性アミノ酸（ＡＡＯ）を含み、および
・前記方法は以下の工程を含む；
１）Ｏ-アルキル化グルタミン酸のＮ−カルボキシアミノ酸の無水物からなるモノマーとロイシンのＮ−カルボキシアミノ酸の無水物を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）の存在下で、非プロトン性溶媒から成る共溶媒の不存在下で、共重合すること；
２）工程１）において得られるコポリマーが水相との接触にもたらされ、工程１）において得られるコポリマーの反復して現れる親水性アミノ酸前駆体（ｐＡＡＩ）モチーフが反復して現れる親水性アミノ酸（ＡＡＩ）モチーフに変換され；
３）反応媒体が中和され；
４）反応媒体が構築された粒子の水性懸濁液を精製するために透析され；
５）工程４）の懸濁液が濃縮される。
【請求項２】
６）液体媒体が粒子を含む粉状固体から除去される工程を、さらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程１）の共重合化溶媒が、プロトン性溶媒、水およびアルコールから選択される少なくとも１種の共溶媒を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程１）の終わりで、得られるコポリマーポリ（疎水性中性アミノ酸（ＡＡＯ））（親水性アミノ酸前駆体（ｐＡＡＩ））が沈殿し、沈殿が回収されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
粉状固体が、疎水性中性アミノ酸（ＡＡＯ）のための非溶媒水性媒体との接触にもたらされる工程を、さらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
ＰＡの粒子との結合がＰＡを含む液相を粒子のコロイド懸濁液との接触によりもたらされる工程を、さらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＰＡの粒子との結合が固体状態のＰＡを粒子のコロイド懸濁液との接触によりもたらされる工程を、さらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
請求項２記載の方法により得られる粉状固体がＰＡを含む液相との接触によりもたらされる工程を含む懸濁液を調製する方法。
【請求項９】
請求項２記載の方法により得られる粉状固体が固体形態のＰＡとの接触によりもたらされ、固体のこの混合物が液相中に分散される工程を含む懸濁液を調製する方法。
【請求項１０】
粒子の前駆体である両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）コポリマーからなることを特徴とする請求項４記載の方法により得られた中間生成物。
【請求項１１】
構築された粒子は、延長されているか、および／または遅延した様式で、コロイド懸濁液中で、溶解していない状態で、少なくとも１種のＰＡを結合し、それを放出することが可能である、請求項１記載の方法により得られた、コロイド懸濁液
【請求項１２】
請求項１記載の方法により得られた、コロイド懸濁液であって、
・懸濁液は、界面活性剤の不在下で４ないし１３のｐＨで安定であり、
・インスリンについての負荷率Ｔａは、コポリマーの質量に対する結合されたインスリン質量の％として表現され、Ｔａは、７≦Ｔａであり、および
・平均流体力学直径Ｄｈはナノメートル（ｎｍ）で表現され、Ｄｈは、１０ｎｍ≦Ｄｈ≦１５０ｎｍである、
コロイド懸濁液。
【請求項１３】
請求項１記載の方法により得られた、コロイド懸濁液であって、
粒子の構成成分両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）が、「ブロック」両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）であり、
・％として表現される疎水性中性アミノ酸（ＡＡＯ）（親水性アミノ酸（ＡＡＩ）＋疎水性中性アミノ酸（ＡＡＯ））モル比が、１０％≦疎水性中性アミノ酸（ＡＡＯ）／（親水性アミノ酸（ＡＡＩ）＋疎水性中性アミノ酸（ＡＡＯ））≦７０％、であり、
・鎖の重合度ＤＰが３０ないし６００である、
コロイド懸濁液。
【請求項１４】
粒子の構成成分両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）が「ジブロック」両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）である請求項１３記載のコロイド懸濁液。
【請求項１５】
・ワクチン、
・ヘモグロビン、チトクローム、アルブミン、インターフェロン、抗原、抗体、エリスロポイエチン、インスリン、成長ホルモン、第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子、インターロイキンまたはそれらの混合物、造血刺激因子から選ばれるたんぱく質および／またはペプチド、
・多糖、
・核酸、
・様々な抗癌化学療法クラスに属する非ペプチドたんぱく質分子、
・およびそれらの混合物
から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む請求項６乃至９のいずれか１項記載の方法により得られる懸濁液。
【請求項１６】
少なくとも１種の栄養分、植物保護または化粧用有効成分を含む請求項６乃至９のいずれか１項記載の方法により得られる懸濁液。
【請求項１７】
請求項１５または１６記載の懸濁液を含むことを特徴とする製薬学的、栄養的、植物保護または化粧製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明の分野は、活性成分（ＰＡ）を投与するために有用である担体粒子（ＰＶ）の分野である。活性成分は、好ましくは、経口、鼻、膣、目、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、脳内、または腸管外経路などにより動物またはヒトに対して投与するための医薬または栄養分である。しかしながら、これは、また化粧品または除草剤、殺害虫剤（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）、殺昆虫剤（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）または殺菌剤などのような植物生産用製品も含む。化学的性質の観点では、限定されないが、本発明において特に含まれるＰＡは、例えば、たんぱく質、糖たんぱく質、ペプチド、多糖類、リポ多糖類、オリゴヌクレオチド、ポリ核種および有機分子である。
【０００２】
本発明は、より正確には、ポリアミノ酸（ＰＡＡ）に基づく、有利には、サブミクロンのタイプの担体粒子のコロイド懸濁液に関する。本発明は、被覆されていない粒子それ自体、および考えられるＰＡが負荷される粒子からなるＰＡのための担体系の両方に関する。本発明はまた、それらのＰＶを含む粉状固体にも関する。本発明はまた、ＰＡの有無に関わらない前記粒子のコロイド懸濁液を調製するための方法にも関する。
【０００３】
先行技術
ＰＶへのＰＡの封入は、特に、作用の持続時間の変更、および／または治療の部位へのＰＶの輸送、および／または前記ＰＡの生物学的利用性の増加を意図する。多数の封入技術がすでに提案されている。そのような技術は、身体のために利用可能な量を所望のレベルに維持するために、一方で、身体による攻撃（加水分解、酵素による消化など）にたいしてＰＡを保護しながら、治療作用の部位へのＰＡの輸送を可能とし、他方、作用の部位でＰＡの放出を制御することが意図される。身体中におけるこれらの移動と滞留の変化に関与するＰＡは、例えば、たんぱく質であるが、しかし、合成または天然起源の完全に異なる有機分子である生成物でもあり得る。
【０００４】
Ｍ．Ｊ．ハンフリーによる概説（Ｓ．デービスおよびＬ．イラムにより刊行された、ペプチド薬剤のためのデリバリーシステム、プレナム・プレス、ニューヨーク、１９８６年）は、ＰＡの生物学的利用性の向上に関連する問題ならびに担体および制御された放出系の利点を報告する。
【０００５】
ＰＶを形成することが考えられ得る全ての材料の中で、ポリマーは、その固有の特性のためにますます使用されている。ＰＶについて得ることを所望する仕様に関しては、それらは特に要求が多く、特に以下の仕様を含む。
【０００６】
１  ＰＶについて所望される第１の仕様は、ＰＶを構成するポリマーが生体適合性であり、（分泌により）排除されることが可能であり、および／または生分解性であり、さらに好ましくは、身体にとって毒性でない生成物に代謝されることであろう。加えて、身体における生分解が十分に短い持続時間のものであることが適切であろう。
【０００７】
２  ＰＶは有機溶媒および／または界面活性剤の補助無しで安定な水性懸濁液を形成することが可能であることが有益であろう。
【０００８】
３  ＰＶは、液体中での懸濁状態において、細孔直径が０．２μｍ以下であるフィルターにより滅菌ろ過を受けることが可能であるのに十分に小さいサイズを有することもまた望ましいであろう。
【０００９】
４  ＰＶおよびＰＶ−ＰＡ系はＰＡが変性しない方法により得られることが望ましい。
【００１０】
５  ＰＶは、有利には、ＰＡの放出の速度を制御することを可能とすべきである。
【００１１】
６  もう１つの重要な仕様は、ＰＶ−ＰＡ系が優れた注射可能な医薬を構成し得ることであろう。例えば、静脈内または筋肉内注射のような注射による投与のためのこの向上した性質、「注射可能性」は、
（ｉ）（所定の治療投与量についての）減少した注射量
（ｉｉ）小さな粘性
を特徴とする。
ＰＡの治療投与量がＰＡの最少量と結びつくとき上記２つの特性が満足される。言葉を変えれば、ＰＶは、大きなＰＡ負荷率を有するべきである。
【００１２】
７  注射可能性調製物におけるＰＶに特有の経費は減少させるべきであり、ここでもまた、ＰＶは大きなＰＡ負荷率を有することが適切である。最終的な分析において、小さなサイズと大きな負荷率は、ＰＶについて探索される主要な仕様である。
【００１３】
８  また、ＰＶを構成するポリマーは、免疫応答を誘発しないことも有益である。
【００１４】
以下に記載される従前の技術上の提案が、それら全ての仕様を満足させるために試みられた。例示として、従前の提案（ａ）から（ｈ）を記述することができる。
【００１５】
（ａ）特許ＵＳ−Ａ−５２８６４９５は、反対の電荷を有する物質、すなわち、アルギン酸塩（負に荷電）およびポリリシン（正に荷電）を用いて水相中のたんぱく質の気化（ｖａｐｏｒｉｚａｔｉｏｎ）により封入する方法に関する。この製造方法は、３５μｍを超えるサイズを有する粒子を製造することを可能とする。
【００１６】
（ｂ）さらに、エマルジョン技術が、ＰＡを負荷された微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を調製するために通常用いられる。例えば、特許出願ＷＯ９１／０６２８６、ＷＯ９１／０６２８７およびＷＯ８９／０８４４９は、有機溶媒が例えば、ポリ乳酸タイプ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ｔｙｐｅ）のポリマーを溶解させるために用いられるそのようなエマルジョン技術を開示する。しかしながら、その溶媒は、特にペプチドまたはポリペプチドＰＡを変性させることが見出された。
【００１７】
（ｃ）マーセル編集、デッカー社刊行（１９７７）の「分子進化と生命の起源」においてＸ．フォックスおよびＫ．ドーズにより１９７０年から記載されてきたプロティノイド（ｐｒｏｔｅｉｎｏｉｄ）と呼ばれる生体適合性ＰＶもまた公知である。したがって、特許出願ＷＯ８８／０１２１３は、溶解性がｐＨに依存する合成ポリペプチドの混合物に基づく系を提案する。この発明により母材となる微小粒子を得るために、微小粒子はポリペプチドの混合物を可溶化し、次いで、ｐＨの変化とともに、微小粒子は、プロティノイド粒子の沈殿を引き起こす。沈殿がＰＡの存在下で実施されるとき、ＰＡは、粒子に封入される。
【００１８】
（ｄ）注意すべきものとして、本発明に特異的であるＰＡの担体形成の分野とは異なる分野に属する米国特許第４３５１３３７号もまた言及され得る。この特許は、身体の中のまったく正確な部位で接着し位置する塊の移植物（ｍａｓｓ  ｉｍｐｌａｎｔ）を開示する。それらの移植物は、アミノ酸のＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）モノマーの共重合により得られる、例えば、ポリ（グルタミン酸−ロイシン）またはポリ（ベンジルグルタメート−ロイシン）のようなコポリ（アミノ酸）であるコポリマーからなる微小サイズ（１６０μｍおよび２０００μｍに等しい長さを有する）の中空管またはカプセルである。ＰＡの封入は、ポリマーとＰＡの混合物のための溶媒の蒸発させる技術により起こる。米国特許第４４５０１５０号は、上記米国特許第４３５１３３７号と同じ種類に属し、本質的には同じ目的を有する。構成成分のＰＡＡは、ポリ（グルタミン酸−エチルグルタメート）である。
【００１９】
（ｅ）特許出願ＰＣＴ／ＦＲ  ＷＯ９７／０２８１０は、少なくとも部分的に結晶性である生分解性ポリマー（乳酸ポリマー）の粒子とこの粒子に吸収されたＰＡの複数層状粒子を含む有効成分の制御された放出のための組成物を開示する。この場合において、有効成分の放出は、脱着により起こる。
【００２０】
（ｆ）刊行物「ケミストリー・レターズ１９９５、７０７、アキヨシら」は、コレステロールのグラフト形成により疎水化された多糖類により複合する超分子によるインスリンの安定化に関する。
【００２１】
（ｇ）「マクロモレキュールズ１９９７、３０、４０１３−４０１７」において見られる記事は、Ｌ−フェニルアラニン、（−ベンジル−Ｌ−グルタメートまたはＯ−（テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｌ−セリンに基づくポリペプチドブロックおよびポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）またはポリ（２−フェニル−２−オキサゾリン）のような合成ブロックで構成されるコポリマーを記述する。ポリマーは、酵素リパーゼと結合することが可能である４００ｎｍの粒子を形成するように水性媒体中で凝集する。結合という用語は、ここでは、たんぱく質が（共有結合ではなく）物理的現象により粒子上に吸着することを意味する。
【００２２】
（ｈ）特許出願ＦＲ２７４６０３５号は、特に、２８ページ３から１６行において、ポリロイシン／グルタミン酸ナトリウムタイプのポリアミノ酸、画分ココナッツ油（ミグリオール（登録商標））および脱イオン水もしくは緩衝生理食塩水（リン酸バッファー２５℃でｐＨ７．４）から得られる複合ゲル微小粒子のコロイド懸濁液を記述する。それらの複合ゲル微小粒子の平均基準直径（ｍｅａｎ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）Ｄ［４，３］は２８００ｎｍである。ＦＲ２７４６０３５の全ての例から、最小平均基準直径Ｄ［４，３］は１９００ｎｍに等しいことが明瞭である。
【００２３】
さらに、それらの複合ゲル微小粒子は、ファクターＴａ≧７％に従い、コロイド懸濁液中に非溶解状態でインスリンと結合し得ない。それらの条件の下で、複合ゲル微小粒子は仕様と合致せず、特に、注射可能性および結合およびインスリンの放出についての能力に関する仕様と合致しないことが明らかである。
【００２４】
加えて、ＦＲ２７４６０３５による方法は、非芳香族極性溶媒を含まず、微小粒子の形成は、水性媒体中では自発的に起こらないが、しかし、回転子／固定子（ｒｏｔｏｒ／ｓｔａｔｏｒ）タイプの装置の補助による強い均質化の使用を含む。
【００２５】
（ｉ）ＰＣＴ出願ＷＯ９６／２９９９１の主題は、ＰＡの担体形成にとって有用なポリアミノ酸粒子である。それらの粒子は、１０ないし５００ｎｍ、好ましくは３０ないし４００ｎｍのサイズを有する。このＰＣＴ出願の例において、粒子のサイズは、回転半径により測定される。それらの例において得られる粒子の回転半径は、５５から２８０ｎｍまで変化する。コロイド粒子のサイズを測定するための他の技術が存在する。準弾性光散乱（ｑｕａｓｉｅｌａｓｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＱＥＬＳ）による粒子の平均流体力学（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）直径（Ｄｈ）の定量は、簡便な方法の測定の例である。本開示の全体において、Ｄｈを測定するためのＭｄ手順は参照として採用される。Ｍｄは後に記述される。したがって、ＰＣＴ  ＷＯ９６／２９９９１の例による粒子のＤｈは、１５０ｎｍから７５０ｎｍまで大きくなる。ここで問題のＰＶは、親水性毛（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｈａｉｒ）により取り囲まれる疎水性核（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｒｅ）からなることが注意されるべきである。それらの目的物の流体力学的直径は、例えば、書物、Ｂ．Ｊ．ベルーおよびＲ．ペカラン著（Ｗｉｌｅｙ，１９７６）「動的光散乱」およびＲ．Ｆ．プロブスタイン著（Ｗｉｌｅｙ，１９９４）「物理化学的流体力学」に説明されている回転半径の２倍未満である。粒子についての負荷率Ｔａは、インスリンの質量対乾燥ＰＶの質量の比により簡便に表現される。ＷＯ９６／２９９９１の例によれば、インスリンからなるＰＡについては、多くとも０．０６５ｍｇ／ｍｇであり、それは、ＰＡＡの質量に対して６．５乾燥重量％のインスリンである。Ｔａは、後に記載される手順Ｍａにより測定される。ＷＯ９６／２９９９１による粒子は、ＰＡＡを水溶液との接触にもたらすことにより自発的に生成する。ＰＡＡは、中性で疎水性のアミノ酸モノマーＡＡＯおよびイオン化性で親水性のモノマーＡＡＩを含む。それらのＰＡＡは、ジオキサン／トルエン混合物の溶液中でＡＡＩ前駆体（例えば、Ｇｌｕ−ＯＭｅ）のＮＣＡおよびＡＡＯ（例えば、Ｌｅｕ）のＮＣＡの共重合により調製される。溶液中で得られるコポリ（Ｇｌｕ−ＯＭｅ）（Ｌｅｕ）は、水中での沈殿、ろ過および乾燥により回収される。このコポリマーは次いで、コポリマーが溶解するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）にコポリマーを含ませることにより酸加水分解に供される。コポリマー（Ｇｌｕ−Ｏ−Ｎａ）（Ｌｅｕ）は、中和、透析、ろ過および凍結乾燥の後回収される。このｃｏＰＡＡは、ＮａＣｌの水溶液中に分散し、ナノ粒子の懸濁液は、自発的に生成する。上記のように、ナノ粒子は、１５０ｎｍを超えるＤｈサイズおよび６．５０％のインスリン負荷率Ｔａを有する。
【００２６】
それゆえ、上記初期の技術的提案、特に提案（ｉ）は、上記新たな仕様、特にろ過による滅菌についての能力、大きな分解速度、注射による医薬の投与についての制約に対する適合性、小さな経費および大きなＰＡ負荷率を不完全にしか満足させないことが上記から明らかである。
【００２７】
滅菌ろ過能力については、ＰＶ粒子は、液体中の懸濁状態において、詰まることなく、カットオフが０．２μｍ以下であるフィルターを通過するのに十分に小さいことが重要である。そのようなろ過滅菌の簡便さと効率は、注射用医薬について特に歓迎される。
【００２８】
ＰＶの注射のための能力については、ＰＡの所定の投与について、少量の液体懸濁物を注射することが可能であり、この懸濁物があまり粘性でないことが適切である。このことは、ＰＡの目標治療投与量と比較して賦形剤（ＰＶ）の量を減少させることを可能とし、ＰＡの負荷能力を増加させながら可能な限り小さいサイズを有するＰＶを提供することを可能とすることを含む。
【００２９】
ＰＶの生分解性に関する仕様については、ＰＶのサイズが小さいほど、生分解性が優れ、その急速な除去がなされ得る。
【００３０】
加えて、経済的な理由のためにそして注射可能な医薬の許容量を高めるために賦形剤（ＰＶ）の量を減少させることが可能であることが容易に理解される。
【００３１】
発明の簡単な開示
これらの状況の下で、本質的な目的は、界面活性剤または有機溶媒の補助無しにＰＶの安定な水性懸濁液を自発的に生成する新規なＰＶを提供することを可能とすることである。
【００３２】
本発明のもう１つの本質的な目的は、安定な水性コロイド懸濁液または粉状形態として、そしてポリ（アミノ酸）（ＰＡＡ）に基づいて新規なＰＶを提供することであり、それらの新規のＰＶは、上記仕様の仕様１から８を可能な限り多く満足させる。
【００３３】
本発明のもう１つの本質的な目的は、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／２９９９１において開示されている粒子を改善することである。
【００３４】
本発明のもう１つの本質的な目的は、特にＰＡ負荷率の点でおよびＰＡの放出の動力学の制御の点で、その特性が完全に制御されるＰＶの新規な懸濁液を提供することである。
【００３５】
本発明のもう１つの本質的な目的は、注射可能な医療用懸濁液を提供することである。そのような懸濁液について要求される仕様は、注射のための少ない量と小さな粘性である。注射投与量当たりのコロイド粒子の質量は、治療効率を損なわないように、コロイド粒子により運ばれる有効成分ＰＡの量を限定することなく可能な限り小さいことが重要である。
【００３６】
本発明のもう１つの本質的な目的は、上記目標とされる仕様を満足させる有効成分を運ぶための粒子を含み、投与、例えばヒトまたは動物への経口投与のための適当で適切なガレン形態（ｇａｌｅｎｉｃ  ｆｏｒｍ）を構成する水性コロイド懸濁液または粉状固体を提供することである。
【００３７】
本発明のもう１つの本質的な目的は、滅菌目的のための０．２μｍフィルター上でろ過され得る有効成分を運ぶための粒子を含むコロイド懸濁液を提供することである。
【００３８】
本発明のもう１つの本質的な目的は、特に有効成分のための担体として有用であるＰＡＡ粒子（乾燥または液体中の懸濁液として）を調製するための方法を提案するものであり、ＰＡＡ粒子は、使用する上でより単純であるように前記方法にとって必須であり、有効成分を変性させず、得られる粒子の平均粒子サイズの精密な制御を常に可能とする。
【００３９】
本発明のもう１つの本質的な目的は、
・医薬（例えばワクチン）の調製であって、特に投与、特に、経口、鼻、膣、目、皮下、静脈内、筋肉内、真皮内、腹膜内、脳内または腸管外投与のための医薬であって、それらの医薬の有効成分が、特に、たんぱく質、糖たんぱく質、ペプチド、多糖類、リポ多糖類、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドであることが可能である医薬の調製、
・および／または栄養分の調製、
・および／または化粧品または植物保護製品の調製、
・および／または有機医薬分子の調製
のための水性懸濁液または固体形態としての上記粒子の使用である。
【００４０】
本発明のもう１つの本質的な目的は、ＰＡＡに基づき、ＰＡのための担体として機能することが可能であるサブミクロンの大きさのＰＶ懸濁液であって、特にヒトまたは動物に対して前記ＰＡの投与のための医薬であるもの、または代わりに、栄養分、植物保護または化粧品ＰＡのためのものを提供することである。
【００４１】
本発明のもう１つの目的は、製造が容易で経済的であり、加えて生体適合性であり、きわめて高いレベルの生物学的利用性のＰＡを提供することが可能である有効成分の長期の放出のための系のような医薬を提供することである。
【００４２】
本発明のもう１つの本質的な目的は、本来的に免疫発現性でなく（ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）、１種類以上の抗原との組み合わせの形態にあるワクチンを運ぶための系を提供することである。
【００４３】
（なかんづく）製品に関連する目的は、何よりもまず、特に有効成分ＰＡを運ぶために用いられ得るサブミクロンの大きさに構築された粒子の安定なコロイド懸濁液であって、それらの粒子は個別化された（別々の）超分子配列であり、
・その配列は、ペプチド結合を有し、少なくとも２つの異なるタイプの反復するアミノ酸：親水性ＡＡＩおよび疎水性中性ＡＡＯを含む直鎖の両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）に基づき、それぞれのタイプのアミノ酸は相互に同一か異なり、
・そしてその配列は、特に、生体内で、延長されているかおよび／または遅延した様式で、コロイド懸濁液中で、溶解していない状態で、少なくとも１種のＰＡを結合し、それを放出することが可能であり、
・ポリマー鎖のＡＡＩはイオン化性側鎖を有するアミノ酸から選ばれ、カルボキシル形態および／または塩の形態における中性アミノ酸ＧｌｕおよびＡｓｐが特に好ましいこと、
・ポリマー鎖のＡＡＯは天然中性アミノ酸を含む群より選ばれ、好ましくは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅを含む下位の群に属する天然中性アミノ酸から選ばれること、
・該粒子は、界面活性剤の不在下で４ないし１３のｐＨで水相において安定であること、
・インスリンに関する担体粒子の負荷率Ｔａは、担体粒子の質量に対する結合されたインスリン質量の％として表現され、手順Ｍａにより測定され、Ｔａは、
７≦Ｔａ
好ましくは８≦Ｔａ≦５０
そしてさらにより好ましくは１０≦Ｔａ≦３０
であること、
・平均流体力学直径Ｄｈはナノメートル（ｎｍ）で表現され、手順Ｍｄにより測定され、Ｄｈは、
１０ｎｍ≦Ｄｈ≦１５０ｎｍ
好ましくは、２０ｎｍ≦Ｄｈ≦１００ｎｍ
であることを特徴とする
安定なコロイド懸濁液に関する本発明により達成される。
【００４４】
発明の詳細な説明
ＤｈおよびＴａ測定についての手順ＭｄおよびＭａが以下に詳細に説明される。
【００４５】
手順Ｍｄ：
粉状ＰＡＡ粉末を、ｐＨ７．４、２５℃で、０．０１ないし０．５ｇ／ｌ、好ましくは０．１ｇ／ｌに等しいポリマー濃度で０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液中に懸濁させる。この懸濁液を、４時間攪拌し、次いで、４８８ｎｍの波長を有し、垂直に偏光するレーザー光線で機能するブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タイプの光散乱装置の散乱セルに導入する。流体力学的直径を、マニュアル「界面活性剤科学シリーズ」第２２巻、界面活性剤溶液、Ｒ．ザナ編集第３章Ｍ．デッカー社、１９８４年において記載されている累積率方法（ｃｕｍｕｌａｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）により電界自己相関関数から計算する。
【００４６】
手順Ｍａ：
（ａ）インスリン水溶液の調製：
凍結乾燥されたヒト組み換えインスリン（シグマＮｏ．１０２５９）を、２５℃で５分間かけて０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液に注ぐ。次いでこの溶液を、リン酸緩衝溶液に注ぎ、これを、０．１Ｎ  ＮａＯＨを加えることにより最終的に中和する。次いで、この溶液を、室温で３０分間保ち、次いで、０．８〜０．２μアクロディスクメンブレン上でろ過する。インスリンの質量を、６０ＩＵ／ｍｌの濃度を得るために、溶液の所望の体積に従って計算する。
【００４７】
（ｂ）インスリン溶液中に組み合わせられるＰＡＡ中の担体粒子の分散：
凍結乾燥されたＰＶを、１０ｍｇＰＶ／ｍｌ溶液の量でインスリン溶液に加える。この混合物を、２、３回ボルテックス上で攪拌し、次いで、１８時間室温でロッキングシェーカー（振動振とう器）内に置く。次いで、コロイド懸濁液を４℃で貯蔵する。
【００４８】
（ｃ）結合したインスリンからの遊離インスリンの分離および遊離インスリンの分析：
インスリンとＰＶを含む溶液を、２０℃で６００００ｇで１時間遠心分離する。上清は、限外ろ過膜（カットオフ値１０００００Ｄａ）を備えた管の中に入れ、２０℃で２時間３０００ｇで遠心分離する。ろ液の中のインスリンを、ＨＰＬＣにより分析する。
【００４９】
安定な水性コロイド懸濁液または粉状固体の形態において、これらの新規の担体粒子ＰＶの発明の基礎の１つは、ポリマー群の画期的な選択と画期的な方法の選択によるものであって、これらにより界面活性剤または溶媒の不在下で安定な水性コロイド懸濁液を形成するサブミクロンサイズの粒子を得ることが可能となる。
【００５０】
安定な水性コロイド懸濁液または粉状固体状態でのそれらの新規な担体粒子ＰＶのもう１つの発明の基礎は、Ｔａ≧７％の負荷率およびＤａ≦１５０ｎｍのサイズによる特定のサブミクロンの構造の粒子の群の画期的選択による。この選択は、粒子を製造するための方法についての大規模で長い研究の結果である。実際、ポリアミノ酸の粒子のサイズの減少および負荷容量の増大は、予見的に明らかではなかった。したがって、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／２９９９１において教示されるポリアミノ酸のナノ粒子を製造するための方法を用いて、当業者は、上記規定の新たな仕様に対応する粒子を得て、「計測する」ことが可能ではなかった。
【００５１】
結局、ポリマーの組成と操作条件を変更することにより、本発明者は、ＰＡＡに基づき、まったく驚嘆させ、予測できずに、ＷＯ９６／２９９９１による粒子の負荷特性より３倍まで大きいであろうインスリンについての負荷容量Ｔａを有する極めて小さなサイズの構造化された粒子を単離することが可能であった。
【００５２】
有利には、本発明による懸濁液は、特許出願ＦＲ２７４６０３５による微小粒子の懸濁液と違って、サブミクロンの大きさの粒子が以下の３種の化合物、
−Ｉ）油分
−ＩＩ）水相
−ＩＩＩ）少なくとも２種の異なるタイプのアミノ酸コモノマー：親水性ＡＡＩおよび疎水性ＡＡＯを含む少なくとも１種の合成非架橋直鎖コポリアミノ酸
の存在からその凝集（ｃｏｈｅｓｉｏｎ）を獲得しないことを特徴とする。
【００５３】
ＰＡＡポリマーの構造およびアミノ酸の性質は、
・ポリマー鎖が小さなサイズの粒子（ＰＶ）の形態で自発的に構築されるように、
・粒子が水の中で及び生理学的媒体中で安定なコロイド懸濁液を形成するように、
・ＰＶが、たんぱく質を変性させない自発的機構により水性媒体中でたんぱく質または他のＰＡと結合するように、
・ＰＶが生理学的媒体、より正確には、体内でＰＡを放出するように、そして、放出の動力学がＰＶの前駆体であるＰＡＡポリマーの性質に依存するように、選ばれる。
【００５４】
したがって、ＰＡＡの特定の構造を変化させることにより、動力学的および定量的観点からＰＡを結合し、放出する現象を制御することが可能である。
【００５５】
出願人の功績は、両親媒性であり、それゆえ、ＰＡＡ中でＰＶの特性、すなわち、
・目標の治療適用に遭遇する生理学的媒体のｐＨと相容性であるＰＶのコロイド懸濁液を自発的に形成する可能性、
・ＰＡの溶媒として機能し、たんぱく質の場合には非変性である水とは異なる別の薬剤の不在下でのＰＡのＰＶとの自発的な結合、
・生理学的条件の下で、治療分野における有益な使用（ＰＡ担体化）を予見することを可能とする薬物動態学および薬力学的プロフィールを有するＰＡ−ＰＶ結合複合体からＰＡを放出する可能性
を有し、さらに、
・滅菌目的のために０．２μｍ以下のカットオフ値を有するろ過性を有し、
・より優れて生分解性であり、
・最適化された注射性能を有する
新規な特性を有するポリアミノ酸の特定の組成をＰＶの構成材料として選んだことである。
【００５６】
小さなナノメートルサイズおよび大きな負荷率であるところのＰＶの主要技術的機能によりそれらの新たな特性を得ることが可能である。
【００５７】
それらのＰＡＡをさらにもう少し規定するために、ＰＡＡは、交互順序の秩序ある（ブロック）タイプまたは不規則順序の秩序のないタイプのものであり得ることを指摘することが可能である。
【００５８】
したがって、本発明によるＰＶの第１の態様によれば、構成成分ＰＡＡは「ブロック」タイプのものであり、
・１０％≦ＡＡＯ／（ＡＡＯ＋ＡＡＩ）≦７０％、
・好ましくは２０％≦ＡＡＯ／（ＡＡＩ＋ＡＡＯ）≦６０％、
・さらにより好ましくは３５％≦ＡＡＯ／（ＡＡＩ＋ＡＡＯ）≦５０％
であるようなＡＡＯ／（ＡＡＩ＋ＡＡＯ）モル比を特徴とする。
【００５９】
有利には、ＡＡＯの数として表現されるそれぞれのＡＡＯブロックの絶対長は、
・好ましくはＡＡＯ＞１０、
・さらにより好ましくは、２０≦ＡＡＯ≦１００
というものである。
【００６０】
本発明によるＰＶの第２の態様によれば、構成成分ＰＡＡは、「ランダム」タイプのものであり、すなわち、ＡＡＩモノマーとＡＡＯモノマーの同時共重合により調製され、ＡＡＯ／（ＡＡＯ＋ＡＡＩ）モル比は、
・ＡＡＯ／（ＡＡＯ＋ＡＡＩ）＞１０％、
・好ましくは、ＡＡＯ／（ＡＡＯ＋ＡＡＩ）≧２０％、
・さらにより好ましくは、３０％≦ＡＡＯ／（ＡＡＩ＋ＡＡＯ）≦７０％
というものである。
【００６１】
有利には、それらのランダムＰＡＡの分子量Ｍｗは、
・Ｍｗ≧２０００ｇ／ｍｏｌ、
・好ましくは、Ｍｗ≧５５００ｇ／ｍｏｌ、
・さらにより好ましくは、５５００ｇ／ｍｏｌ≦Ｍｗ≦２０００００ｇ／ｍｏｌ
というものである。
【００６２】
本発明の好ましい特徴によれば、粒子の構成成分ブロックまたはランダムＰＡＡは、３０ないし６００、好ましくは５０ないし２００、さらにより好ましくは６０ないし１５０の重合度（ＤＰ）を有する。
【００６３】
有利には、ＰＶ粒子の構成成分ＰＡＡは「ジブロック」ＰＡＡである。
【００６４】
本発明は、上記規定のような被覆されていない粒子の懸濁液のみならず、少なくとも１種の有効成分ＰＡを含む粒子にも関する。好ましくは、本発明により懸濁液は、水性であり安定である。ＰＡを負荷されているか負荷されていないそれらの粒子は、有利には、液体、好ましくは水性液体における分散形態（懸濁液）で存在するが、しかし、また上記規定のＰＶの懸濁液から得られた粉状固体状態でも存在し得る。
【００６５】
したがって、本発明は、ＰＶのコロイド懸濁液（好ましくは水性懸濁液）以外に、ＰＶを含み、本発明による懸濁液から得られる粉状固体に関する。
【００６６】
本発明のもう１つの本質的な主題は、コロイド懸濁液および粉状固体の形態の両方の（上記記載の）選択された粒子の調製に関する。考えられる調製の方法は、本質的には、前駆体ＰＡＡを合成することおよびそれらを構造化粒子に転換することからなる。
【００６７】
より正確には、このことは、何よりもまず、特に有効成分を運ぶために用いられることが可能なサブミクロンの大きさで構築された粒子を調製するための方法を含み、それらの粒子は、別々の超分子配列であって、該配列は、
・結合（−ＡＡＩ親水性およびＡＡＯ疎水性）を有する直鎖両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）に基づき、それぞれのタイプのアミノ酸は相互に同一であるかまたは異なり、
・ｎｍで表現され、手順Ｍｄにより測定された平均直系Ｄｈが
１０≦Ｄｈ≦１５０
好ましくは２０≦Ｄｈ≦１００
であり、
・一方で水性媒体に溶媒または界面活性剤を加える必要無しに水性媒体中での単純な混合により安定なコロイド懸濁液を形成することが可能であり、
・他方、％として表現され、手順Ｍａにより測定された負荷率Ｔａが、７≦Ｔａ、好ましくは８≦Ｔａ≦２５であるように、液体媒体中で少なくとも１種のＰＡ、特にインスリンと結合し得、他方延長され、制御された様式で特に生体内でＰＡを放出することが可能である
配列である。
【００６８】
この方法は、
１．一方でＮＣＡ−ｐＡＡＩ（「ｐＡＡＩ」はＡＡＩの前駆体を指称する）および他方でＮＣＡ−ＡＡＯの少なくとも２つの異なるタイプのモノマー、アミノ酸のＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）の共重合が、
・好ましくは、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ピロリドンを含み、ＮＭＰが特に好ましい群より選ばれる少なくとも１種の非芳香族極性溶媒の存在下で、
・および、任意に、好ましくは、ピロリドン、水、アルコールを含み、メタノールが特に好ましい群より選ばれる少なくとも１種のプロトン性共溶媒の存在下で
実施され、
２．水性酸相が上記有機媒体に加えられる加水分解、好ましくは酸加水分解を用いて粒子の前駆体ＰＡＡコポリマーの反復するｐＡＡＩモチーフが反復するＡＡＩモチーフに変換され、
３．任意に、反応媒体が中和され、
４．任意に、反応媒体が構造化粒子の水性懸濁液を得るために透析により精製され、
５．任意に、この懸濁液が濃縮され、
６．任意に、粒子を含む粉状固体を集めるために液体媒体が除去される
ことを特徴とする。
【００６９】
該方法の第１工程は、例えば、記事「バイオポリマーズ、１５、１８６９（１９７６）」およびＨ．Ｒ．クリシェルドルフによる書物「アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物および関連するヘテロ環」、スプリンガー・バーラグ出版（１９８７）において記載されているＮ−カルボキシ−アミノ酸（ＮＣＡ）の無水物の重合の公知技術に基づいている。沈殿ならびに水および非芳香族極性有機溶媒の存在下での酸加水分解の使用を回避しながらの慎重に選ばれた極性非芳香族非プロトン性共重合溶媒の使用は、大きいＰＡ負荷能力を有する構造化された分離したサブミクロンの大きさの粒子をもたらし、水性媒体中で安定なコロイド懸濁液を形成する新規で発明的な方法を構成する。それらの粒子は、初期の提案（ｄ）と関連する上記タイプの微視的凝集沈殿とはまったく比較不可能である。
【００７０】
１つの変形によれば、工程１の最後に、得られたコポリマーポリ（ＡＯＯ）（ｐＡＡＩ）は、好ましくは水中で、沈殿し、この沈殿は、回収される。この変形は、コポリマーポリ（ＡＡＯ）（ｐＡＡＩ）が安定な中間生成物を生成する沈殿の形態で単離される粒子を調製するためのバッチ様式に対応する。この沈殿は、例えば、ろ過され、洗浄され、そして乾燥され得る。
【００７１】
さらにより好ましくは、ＮＣＡ−ｐＡＡＩは、例えば、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｍｅ、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−ＥｔまたはＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｂｚ（Ｍｅ＝メチル、Ｅｔ＝エチル、Ｂｚ＝ベンジル）のようなＯ−アルキル化グルタミン酸もしくはアスパラギン酸のＮＣＡである。
【００７２】
公知の方式では、共重合は、２０ないし１２０℃の温度で、大気圧で、そして例えばＮＨ3 のようなアミン含有開始剤の存在下で起こる。合成の間の非芳香族極性溶媒（好ましくはＮＭＰ）中のＮＣＡおよび／またはポリマーの濃度、および／またはプロトン性共溶媒の濃度または性質のような他の実験パラメーターは、当業者に公知の所望の効果にしたがって調節され得る。
【００７３】
酸加水分解（工程２）は、水ならびに、リン酸もしくは塩酸（後者が好ましい）のような少なくとも１種の無機酸および／またはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、酢酸、ジクロロ酢酸または有機スルホン酸のような有機酸を用いて実施される。
【００７４】
加水分解のための酸性水性相中の重量部で表現される水／酸比は、有利には、
・６０／１から２／１、
・好ましくは４０／１から２／１、
・さらにより好ましくは、２０／１から２／１
である。
【００７５】
重量部で表現される、加水分解のための酸性水相／ＮＭＰの比は、有利には、
・５／１００から２００／１００
・好ましくは１０／１００から１００／１００
・さらにより好ましくは２０／１００から８０／１００
である。
【００７６】
ポリマー濃度、反応混合物の温度、加水分解のために酸性水相を加える方式、減圧の使用、反応の持続時間などのような他のパラメーターは、所望の効果に従って調節され、当業者に周知である。
【００７７】
中和（工程３）は、実際、例えば、水酸化ナトリウムを用いて実施される。
【００７８】
次いで、中和の後に生成する塩ならびに溶媒は、いずれか適切な物理的分離処理により、例えば、ダイアフィルトレーション（透析）（工程４）、ろ過、ｐＨ修飾、クロマトグラフィーなどにより除去される。
【００７９】
これは、例えば、蒸留もしくは限外ろ過、遠心分離のようないずれか他の適切な物理的手段により濃縮され得る構造化粒子の水性懸濁液を与える。
【００８０】
工程６において、液体懸濁媒体から粒子を分離するために、水相は、任意に、例えば（例えばオーブン中での）乾燥により、凍結乾燥または限外ろ過、遠心分離のようないずれか他の適切な物理的手段により除去される。白色の粉状固体は、この工程６の終わりに回収される。
【００８１】
１つの変形によれば、濃縮工程は、グルタミン酸塩モノマーの親水性部分を酸に変換し、それらを水に不溶性にするｐＨの減少のような化学的処理により実施され得る。それらの酸性ＰＡＡ中間体は、ろ過され、洗浄され、乾燥され得る。前記酸性中間体は、粒子の懸濁液を得るために後の工程において化学的塩基で中和されうる。
【００８２】
上記方法の工程１、２、３、４および任意に工程５の使用は、サブミクロンの大きさの粒子のコロイド懸濁液の調製およびＰＡについての大きな負荷率に対応することに注意すべきである。
【００８３】
コロイド懸濁液の調製の間に、工程２の両親媒性ＰＡＡポリ（ＡＡＯ）（ＡＡＩ）は、ＡＡＩの少なくとも一部が溶解性であり、ＡＡＯの少なくとも一部が不溶性である水性媒体中に置かれる。ＰＡＡは、この水性媒体中でナノ粒子の形態で存在する。
【００８４】
本発明によるＰＶ懸濁液を調製するための代替法は、上記の、そして生成物としての、そして生成の代替方法による粉状固体をＡＡＯのための非溶媒水性媒体と接触させることからなる。
【００８５】
１種類以上のＰＡを粒子と結合させることを実施するために、本発明によるいくつかの方法を用いることが可能である。それらの方法の発明を限定しない例が以下に列挙される。
【００８６】
第１の方法によれば、ＰＡの粒子との結合は、ＰＡを含む液相（水性または別のもの）を粒子のコロイド懸濁液と接触させることにより実施される。
【００８７】
第２の方法によれば、ＰＡの粒子との結合は、固体状態のＰＡを粒子のコロイド懸濁液と接触させることにより実施される。固体ＰＡは、例えば、凍結乾燥、沈殿または粉末形態などで存在し得る。
【００８８】
第３の方法によれば、生成物としてそしてその製造特性により上記の粉状固体（ＰＡＡ）は、ＰＡを含む液相（水性または別のもの）と接触される。
【００８９】
第４の方法によれば、生成物としてそしてその製造特性により上記粉状固体が固体形態のＰＡと接触される。次いで、固体のこの混合物は、液相、好ましくは水溶液中に分散される。
【００９０】
これらの全ての方法において、用いられるＰＡは、純粋または事前配合（ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）形態で存在し得る。
【００９１】
ナノメートルサイズの粒子が与えられれば、懸濁液は滅菌フィルター上でろ過され得、そのことは、容易に、そしてより少ないコストで無菌の注射可能な医療用液体を得ることを可能とする。本発明により粒子のサイズを制御し、２５ないし１００ｎｍのＤｈ値を達成することが可能であるという事実は、大きな利益である。
【００９２】
本発明はまた、上記方法の新規な中間生成物であって、粒子の前駆体であるＰＡＡコポリマーからなることを特徴とする新規な中間生成物にも関する。
【００９３】
産業上の利用
本発明の側面のもう１つによれば、本発明は、上で規定した、および／または上記提示の方法により得られる、懸濁液および／または粉状固体に関し、この懸濁液およびこの固体は、好ましくは、
・ワクチン、
・その中で最も好ましく選択されるものがヘモグロビン、チトクローム、アルブミン、インターフェロン、抗原、抗体、エリスロポイエチン、インスリン、成長ホルモン、第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子、インターロイキンまたはそれらの混合物、造血刺激因子であるところのたんぱく質および／またはペプチド、
・ヘパリンが特に選択されるところの多糖、
・好ましくはＲＮＡおよび／またはＤＮＡオリゴヌクレオチドである核酸、
・様々な抗癌化学療法クラスに属する非ペチド（ｐｅｔｉｄｏ）たんぱく質分子、特に、アントラサイクリンおよびタキソイド、
・およびそれらの混合物
から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む。
【００９４】
本発明はまた、栄養分、植物保護または化粧用ＰＡを負荷された懸濁液および／または粉末固体にも関する。
【００９５】
最終的に、本発明は、製薬学的、栄養分、植物保護、化粧用の特許権を持つ製品に関し、本発明は、ＰＡを負荷され、上記定義の懸濁液および／または粉状固体を含むことを特徴とする。
【００９６】
もう１つの主題によれば、本発明はまた、ＰＡの放出が制御された系のような医薬の製造のためのＰＡを負荷された（懸濁液または固体形態の）ＰＶの使用にも関する。
【００９７】
医薬の場合には、それらは、例えば、好ましくは、経口、鼻、膣、目、皮下、静脈内、筋肉内、真皮内、腹膜内、脳内または腸管外経路により投与され得るものであり得る。
【００９８】
想定され得る化粧品用途は、例えば、本発明によるＰＶと組み合わせられたＰＡを含み、真皮間経路により適用され得る組成物である。
【００９９】
関連する植物保護生成物は、例えば、除草剤、殺害虫剤、殺昆虫剤、殺菌剤などでありうる。
【０１００】
以下の例は、様々の生成物／方法／用途側面について本発明をよりよく理解することを可能とするであろう。それらの例は、有効成分を負荷されているかまたは別に有するポリアミノ酸の粒子の調製を例示し、それらの例は同様に、それらの粒子の構造上の特色および特性を提示する。
【０１０１】
例
例１−ブロックポリアミノ酸ポリ（Ｌｅｕ／Ｇｌｕ）４０／８０ジブロックからの担体粒子の水性安定コロイド懸濁液および微粉砕固体形態における製造
１１２．４ｇのＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅ（０．６０ｍｏｌ）および４４９ｇのＮ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）を、攪拌とともに、２０℃に温度設定された１リットル反応器に導入する。溶解の後、１，４−ジオキサン中のアンモニアの０．３４Ｍ溶液（１．２５ｍｏｌ％／ＮＣＡ）２１．３８ｇを加える。重合をガスベルジャーに放出される二酸化炭素を測定してモニターし、１８６０と１７９０ｃｍ-1におけるＮＣＡの振動バンド特性の消失を確認する。３０分後、６３１ｇのＮＭＰ中の４７．１７ｇのＮＣＡロイシン（０．３０ｍｏｌ）を導入する。１０分の反応の後、温度を６０℃に増加させる。重合を上記のようにモニターし、２時間後完了する。得られる反応混合物の温度を８０℃まで上昇させる。３１．５ｇの濃塩酸（３５％、１２Ｍ）を加え、３０分間機械的攪拌をし、３５０ｇの反応混合物が工程１の終わりに得られる。ついで、反応器を６時間６００ミリバールに調節された減圧下に置く。次いで、３１．５ｇの３５％塩酸と１２６ｇの水の混合物を６０分間加え、続いて、１８時間２５０ミリバールの減圧の第２相に置く。この例において、全体としての水／純粋な塩酸の比は質量比で７．６／１であり、酸性水相／ＮＭＰの比は質量比で６０／１００である。
【０１０２】
ついで、反応混合物を５０℃に冷却し、次いで、水酸化ナトリウム水溶液（３５質量％）で中和する。中和の間生成するＮＭＰと塩化ナトリウムを１０００ダルトンのＭＷＣＯを有する膜（ペリコンＩＩシステム、ミリポア）上で２０倍体積のミリＱ水に対するダイアフィルトレーションにより除去する。担体ナノ粒子の安定な水溶性コロイド懸濁液はこのようにして得られる。ナノ粒子の懸濁液は最終的に凍結乾燥される。
【０１０３】
ロイシンモチーフの含有量は、プロトン核磁気共鳴により定量される（Ｇｌｕの４Ｈについて２．１０、２．２２、および２．５８ｐｐｍおよびＬｅｕの６Ｈについて０．８５ｐｐｍのシグナル）。平均流体力学的直径（Ｄｈ）は、（Ｍｄにしたがって）７０ｎｍである。
【０１０４】
例２−ポリ（Ｌｅｕ／Ｇｌｕ）４０／８０のナノ粒子とのインスリンの結合
手順Ｍａが用いられる。ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより分析される遊離インスリンの濃度は、０．５９ｍｇ／ｍｌに等しく、１．５１ｍｇ／ｍｌに等しい結合したインスリン濃度はそこから推論される。１０ｍｇ／ｍｌのコロイド溶液についての負荷容量は、１．５１ｍｇ／ｍｌのインスリンに達する。したがって、結合したインスリンの質量対ｂＬＥ（Ｔａ）質量の比は、１５．１％である。
【０１０５】
例３−ブロックＰＡＡポリ（Ｌｅｕ／ｇｌｕ）２５／７０ジブロックから担体粒子の安定なコロイド水性懸濁液および粉状固体形態の製造
１４６．４ｇのＮＣＡ  ＧｌｕＯＭｅを５８６ｇのＮＭＰに溶解し、それに、１８．４３ｇの０．４８Ｍのメタノールによるアンモニア溶液を加える。ＮＣＡ  ＧｌｕＯＭｅの重合が完了するとき７０８ｇのＮＭＰ中の４３．９ｇのＮＣＡ  Ｌｅｕの溶液を導入し、ＮＣＡ  Ｌｅｕの重合をモノマーが消失するまで継続する。次いで、媒体を８０℃に加熱し、１２９．４ｇの３５％ＨＣｌをそこに３０分から１時間滴下して加える。６００ミリバールの減圧を６時間適用し、次いで、追加の１２９．４ｇの３５％ＨＣｌを５１７．５ｇの水との混合物として加える。次いで、２５０ミリバールの減圧を１８時間適用する。この工程の後、温度を５０℃に下げ、１リットルの水を導入し、続いてｐＨを７．４にもたらすために２８０ｍｌの３５％ＮａＯＨを導入する。次いで、懸濁液をろ過し（５μｍ）、溶媒と塩を除去するために水中で透析し（カットオフ値１０００Ｄａ）、最終的にろ過する（０．２２μｍ）。この懸濁液は、直接用いられ得るかまたは、水の蒸留（工程５）または凍結乾燥（工程６）のような後の処理に供され得る。
【０１０６】
（Ｍｄによる）平均流体力学的直径Ｄｈは１４．８％である。手順Ｍａにより定量されるインスリン負荷率Ｔａは３５ｎｍである。
【０１０７】
例４−ブロックポリアミノ酸、ポリ（Ｌｅｕ／Ｇｌｕ）５０／７０ジブロックからの担体ナノ粒子の安定な水性コロイド懸濁液の製造およびナノ粒子の特性
３８．９ｇのＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅ（０．２０８ｍｏｌ）と１５６ｇのＮ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）を、攪拌とともに、３０℃に温度設定された０．５リットル反応器に導入する。溶解の後、５．７９ｇの０．４０７Ｍのメタノールのアンモニア溶液（１．２５ｍｏｌ％／ＮＣＡ）を加える。重合をガスベルジャーに放出される二酸化炭素を測定することによりモニターし、１８６０および１７９０ｃｍ-1でのＮＣＡの振動バンド特性の消失から確認する。３０分後、２６３ｇのＮＭＰ中の２３．３ｇのＮＣＡロイシン（０．１４８ｍｏｌ）を導入する。反応の１０分後、温度を６０℃に上げる。重合を上記のようにモニターし、重合は、１〜２時間後に完了する。すでに得られた反応混合物の温度を８０℃に上げる。４１．９ｇの塩酸（質量で３５％）を反応混合物に３０分間機械的攪拌とともに加える。次いで、反応器を６時間６００ミリバールに調節された減圧下に置く。次いで、４１．９ｇの３５％塩酸と１６７．５ｇの水の混合物を６０分間加え、続いて、１８時間２５０ミリバールの減圧の第２相に置く。次いで、反応混合物を５０℃に冷却し、次いで、水酸化ナトリウム水溶液（３５質量％）で中和する。中和の間に生成するＮＭＰと塩化ナトリウムを１０００ダルトンのＭＷＣＯを有する膜（ペリコンＩＩシステム、ミリポア）上で２０倍体積のミリＱ水でダイアフィルトレーションにより除去する。担体ナノ粒子の安定なコロイド水性懸濁液がこのようにして得られる。ナノ粒子の懸濁液は、最終的には凍結乾燥される。
【０１０８】
平均流体力学的直径Ｄｈは、凍結乾燥された生成物の水性懸濁液についてＭｄにしたがって測定される。インスリン負荷率Ｔａは、手順Ｍａに従って定量される。
【０１０９】
例５−ブロックポリアミノ酸、ポリ（Ｌｅｕ／Ｇｌｕ）２５／３５ジブロックからの担体ナノ粒子の安定なコロイド水性懸濁液の製造およびナノ粒子の特性
３８．９ｇのＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅ（０．２０８ｍｏｌ）および１５６ｇのＮ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）を、攪拌とともに３０℃で温度設定された０．５リットル反応器に導入した。溶解の後、５．７８ｇの０．４５２Ｍのメタノールのアンモニア溶液（１．２５ｍｏｌ％／ＮＣＡ）を加える。重合を、ガスベルジャーに放出される二酸化炭素を測定することによりモニターし、１８６０および１７９０ｃｍ-1でのＮＣＡの振動バンド特性の消失により確認する。３０分後、５２１９ｇのＮＭＰ中の２３．３ｇのＮＣＡロイシン（０．１４９ｍｏｌ）の溶液を導入する。１０分の反応の後、温度を６０℃に上げる。重合を上記のようにモニターし、重合を１〜２時間後完了させる。すでに得られた反応混合物の温度を８０℃に上げる。４２．０ｇの塩酸（３５質量％）を反応混合物に３０分間機械的攪拌とともに加える。次いで、反応器を、６時間６００ミリバールで調節された減圧下に置く。次いで、４２．０ｇの３５％塩酸と１６７．９ｇの水の混合物を６０分間加え、続いて、１８時間２５０ミリバールの減圧の第２相に置く。次いで、反応混合物を５０℃に冷却し、次いで、水酸化ナトリウム水溶液（３５質量％）で中和する。中和の間に生成するＮＭＰと塩化ナトリウムを、１０００ダルトンのＭＷＣＯを有する膜（ペリコンＩＩシステム、ミリポア）上で２０倍体積のミリＱ水に対するダイアフィルトレーションにより除去する。担体ナノ粒子の安定なコロイド水性懸濁液がこのように得られる。ナノ粒子の懸濁液は最終的に凍結乾燥される。
【０１１０】
ロイシンモチーフの含有量は、プロトン核磁気共鳴により定量される（Ｇｌｕの４Ｈについて２．１０、２．２２および２．５８ｐｐｍおよびＬｅｕの６Ｈについて０．８５ｐｐｍのシグナル）。平均流体力学的直径Ｄｈは、凍結乾燥された生成物の水性懸濁液についてＭｄにしたがって測定される。インスリン負荷率は、Ｍａに従って定量される。
【０１１１】
例６−ブロックポリアミノ酸、ポリ（Ｌｅｕ／Ｇｌｕ）５０／１５０ジブロックからの担体ナノ粒子の安定なコロイド水性懸濁液の製造およびナノ相の特性
４６．４ｇのＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅ（０．２４８ｍｏｌ）および１８６ｇのＮ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）を、攪拌とともに、３０℃で温度設定された０．５リットル反応器に導入する。溶解の後、６．９０ｇの０．１９Ｍのメタノールのアンモニア溶液（１．２５ｍｏｌ％／ＮＣＡ）を加える。重合を、ガスベルジャーに放出される二酸化炭素を測定することによりモニターし、１８６０および１７９０ｃｍ-1でのＮＣＡの振動バンド特性の消失により確認する。３０分後、２１８ｇのＮＭＰ中の１２．９７ｇのＮＣＡロイシン（０．０８３ｍｏｌ）の溶液を導入する。反応の１０分後、温度を６０℃に上げる。重合を上記のようにモニターし、１〜２時間後完了させる。すでに得られた反応混合物の温度を８０℃に上げる。４０．３ｇの塩酸（３５質量％）を、反応混合物に３０分間機械的攪拌とともに加える。次いで、反応器を６時間６００ミリバールに調節した減圧下に置く。次いで、４０．３ｇの３５％塩酸と１６１．３ｇの水の混合物を６０分間加え、続いて、１８時間２５０ミリバールで減圧の第２相に置く。次いで、反応混合物を５０℃に冷却し、次いで、水酸化ナトリウム水溶液（３５質量％）で中和する。
【０１１２】
中和の間の生成するＮＭＰおよび塩化ナトリウムを、１０００ダルトンのＭＷＣＯを有する膜（ペリコンＩＩシステム、ミリポア）上の２０倍体積のミリＱ水に対するダイアフィルトレーションにより除去する。担体ナノ粒子の安定なコロイド水性懸濁液は、このようにして得られる。ナノ相の懸濁液は、最終的に凍結乾燥される。
【０１１３】
ロイシンモチーフの含有量を、プロトン核磁気共鳴により定量する（Ｇｌｕの４Ｈについての２．１０、２．２２および２．５８ｐｐｍおよびＬｅｕの６Ｈについての０．８５ｐｐｍのシグナル）。平均流体力学的直径Ｄｈは、Ｍｄにしたがって測定される。インスリン負荷率は、Ｍａに従って定量される。
【０１１４】
例７−ＰＣＴ特許ＷＯ９６／２９９９１の教示により生成する粒子の性質の比較例
特許ＷＯ９６／２９９９１の教示により得られる粒子は、図１において表されているものである。有利には、本発明による粒子は、透過式電子顕微鏡の下で撮影された写真に対応する添付の図２において表されているものである。
【０１１５】
形態およびサイズの差異は、一方で先行技術によるＰＶを表す比較の図１および他方本発明によるＰＶを示す図２において歴然と表されている。形態についての注意すべき差異がここで観察される。図２のＰＶは、大きな大きさの粒子の大半が偏長の形態を示すようになっている。
【０１１６】
例８−ポリマーポリ（Ｌｅｕ／Ｇｌｕ）４０／８０による例２に従って調製されたコロイド懸濁液の安定性の試験
例２の粉状粉末は、リン酸バッファー中に６０ｍｇ／ｍｌの粉末の量で溶解させられる。ｐＨを７．３に調節し、懸濁液の浸透圧モル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）を５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を用いて３００ｍＯｓｍ／ｋｇに調節した。溶液を滅菌１０ｍｌボトルに５ｍｌの割合で分ける前にろ過した（０．２２μｍ）。試料の安定性を４ヶ月間評価した。試料の半分を４℃（±２℃）に保ち、他方、他の試料を、実験室温度、２５℃（±５℃）に維持した。所定の時間に、試料は貯蔵場所から集められ、分析の前に室温で１時間平衡化された。分析方法を詳述し、結果を２つの表の形態で表す。
【０１１７】
１）コロイド溶液の均質性の確認：懸濁液を攪拌することなく、１００μｌ試料を、ボトルの頂部、中部および底部の溶液の状態を表すために３回採集する。それぞれの試料の屈折率を純水に対して較正されたアッベ屈折計により２５℃で測定する。それぞれの試料について３回の読み取りがなされ、３回の平均値が比較される。溶液の濃度のどんな変化も屈折率の違いをもたらす。
【０１１８】
２）流体力学的直径の測定：分析される溶液の１００μｌ試料は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液により１２０倍に希釈され、コロイド粒子のＤｈは、プロトコールＭｄにより測定される。
【０１１９】
３）粘度の測定：測定は、２０．０℃＋／−０．１℃（ペルティエ効果による調節）の温度で、コーン／プレーン（Ｃｏｎｅ／Ｐｌａｎｅ）形態（コーンは４ｃｍ／２℃）を備えるＡＲ１０００流動計（ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）（ＴＡインストルメンツ）を用いて０．７５ｍｌ試料で実施される。剪断勾配の関数としての粘度曲線が、１から１００ｓ-1で変化する勾配について記録される。それらの濃度で、溶液はわずかに流動流体化し（ｒｈｅｏｆｌｕｉｄｉｚｉｎｇ）、選択される粘度値は、１０ｓ-1の勾配について取られる。
【０１２０】
４℃および２５℃でのエージングの後に得られる結果は、表１および２の中にまとめられる。
【表１】
0005095896.tif 000002
【０１２１】
【表２】
0005095896.tif 000003
【０１２２】
例９−インスリンを含む粒子の懸濁液の投与後の動物体内でのインスリンの放出の試験
配合物は、（例３の）ＰＶとインスリンから調製され、それぞれの量は、組み合わせ率の測定（Ｍａ）により定量される。
【０１２３】
１０ないし１２ｋｇの重量の４匹のビーグル犬（雄と雌）の群を１８時間絶食させる。調製物は、１ｍｌのＰＢＳバッファー中に８０ＩＵのインスリンおよび５６ｍｇのＰＶで製剤され、構成される。次いで、犬は、２ＩＵ／ｋｇの重量の割合でこのインスリン調製物の皮下投与を受ける。血液試料が注射の前（−２ｈ、−１ｈおよび０ｈ）および後（１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、１２ｈ、１６ｈ、２０ｈ、２４ｈ、２８ｈ、３２ｈ、３６ｈ、４０ｈ、４４ｈ、４８ｈ）のグルコースおよびインスリンの分析のために集められる。グルコース濃度は、グルコースオキシダーゼ法により試料について測定され、血清インスリンは、放射線免疫学的方法を用いて分析される。図３は、この製剤についてのグルコースの変化の平均を与える。図４は、この製剤についての血清インスリンの変化の平均を与える。
【０１２４】
この例は、生物学的活性を通して、本発明の２つの有利な側面、たんぱく質の変性が起こらないことならびに＞２４ｈまで放出を延長する可能性を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  特許ＷＯ９６／２９９９１の教示により得られるロイシン５０／グルタミン酸塩５０のブロックコポリマーＩａに対応するナノ粒子。
【図２】  本発明によるブロックコポリマーにより得られるナノ粒子（例２）。ここでの棒線はたった５０ｎｍを表すことに注意すべきである。
【図３】  ２  ＩＵ／ｋｇの量でインスリンを負荷されたＰＶ製剤の注射の後のグルコース濃度（４匹の犬で％基準の平均）の変化。
【図４】  ２  ＩＵ／ｋｇの量でインスリンを負荷されたＰＶ製剤の注射の後の血清インスリン濃度（４匹の犬での平均）の変化。
【図１】
0005095896.tif 000004
【図２】
0005095896.tif 000005
【図３】
0005095896.tif 000006
【図４】
0005095896.tif 000007