(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のA型ボツリヌス毒素を含有する、哺乳動物が体験する炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群を軽減するための医薬組成物であって、前記炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群の発生に先立って脊髄内投与するためのものであり、前記A型ボツリヌス毒素はそれに固有でないニューロンターゲティング部分に結合されていない医薬組成物。
【請求項２】
前記A型ボツリヌス毒素が10-3U/kg〜60U/kgの量で投与される請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記A型ボツリヌス毒素が10-2U/kg〜50U/kgの量で投与される請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記A型ボツリヌス毒素が10-1U/kg〜40U/kgの量で投与される請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記A型ボツリヌス毒素が1U/kg〜30U/kgの量で投与される請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
前記A型ボツリヌス毒素が1U/kg〜20U/kgの量で投与される請求項4に記載の組成物。
【請求項７】
疼痛軽減効果が10日まで持続する請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
疼痛軽減効果が20日まで持続する請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
クモ膜下投与される請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
中枢神経系の頭部にクモ膜下投与される請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
中枢神経系の頚部にクモ膜下投与される請求項9に記載の組成物。
【請求項１２】
中枢神経系の胸部にクモ膜下投与される請求項9に記載の組成物。
【請求項１３】
中枢神経系の腰部にクモ膜下投与される請求項9に記載の組成物。
【請求項１４】
中枢神経系の仙骨部にクモ膜下投与される請求項9に記載の組成物。
【請求項１５】
前記脊髄内投与が、
（a）哺乳動物の中枢神経系のクモ膜下腔に脊椎穿刺によってアクセスする段階、および
（b）前記クモ膜下腔にA型ボツリヌス毒素を注入する段階、
を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】
前記脊髄内投与が、炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群が発生する0.5時間以上前〜14日前の間に行われる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１７】
前記脊髄内投与が、炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群が発生する0.5時間以上前〜10日前の間に行われる請求項1に記載の組成物。
【請求項１８】
前記脊髄内投与が、炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群が発生する0.5時間以上前〜7日前の間に行われる請求項1に記載の組成物。
【請求項１９】
前記脊髄内投与が、炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群が発生する0.5時間以上前〜4日前の間に行われる請求項1に記載の組成物。
【請求項２０】
前記脊髄内投与が、炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群が発生する0.5時間以上前〜24時間前の間に行われる請求項1に記載の組成物。
【請求項２１】
前記脊髄内投与が、炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群が発生する0.5時間以上前〜6時間前の間に行われる請求項1に記載の組成物。
【請求項２２】
前記脊髄内投与が、炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群が発生する2時間前〜5時間前の間に行われる請求項1に記載の組成物。
【請求項２３】
炎症性疼痛または神経障害性疼痛症候群に影響する、患者の選択した脊髄内部分の一部に脊髄内投与する請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記哺乳動物の脊髄内部分または後根神経節に投与する請求項1に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は疼痛の処置方法に関する。特に本発明は、神経毒の脊髄内投与による疼痛の処置方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
身体の不具合は、ほとんどとは言わないまでも、その多くが疼痛を引き起こす。一般に疼痛は、皮膚および一定の体内組織の痛み受容器を構成する自由神経終末が機械的、熱的または化学的刺激を受けた時に起こる。痛み受容器は求心性ニューロンに沿って中枢神経系に、そしてそこから脳に、シグナルを伝達する。
【０００３】
疼痛の原因としては、例えば炎症、傷害、疾患、筋痙攣および神経障害イベントまたは症候群の発生を挙げることができる。疼痛が有効に処置されないと、機能が制限され、運動能が低下し、睡眠が乱れ、生活の質が著しく損なわれることにより、その疼痛を持つ人にとっては大きな打撃になりうる。
【０００４】
炎症性疼痛は、例えば手術に起因して起こりうるような損傷、有害な物理的、化学的もしくは熱的イベントに起因する損傷、または生物因子による感染に起因する損傷などといった損傷を組織が受けた場合に起こりうる。炎症性疼痛は一般的には可逆的であり、傷害組織が修復されるか、その疼痛を誘発していた刺激が取り除かれると治まるが、現在の炎症性疼痛処置法には多くの欠点と不備がある。例えば、通例行われるように、疼痛の諸症状を処置するために鎮痛剤を、または炎症性疼痛原因因子を処置するために抗生物質などを経口、非経口または局所投与すると、薬物は広く全身に分布し、望ましくない副作用が起こりうる。また、現在の炎症性疼痛治療法は、薬効持続時間が短いために薬物を頻繁に再投与する必要があり、その結果、薬物耐性、抗体産生および/または薬物依存および薬物嗜癖という、いずれも望ましくない事象が起こる可能性があるという欠点を持っている。さらにまた、頻繁な薬物投与によって患者の医療費は増し、投薬スケジュールの厳守を患者が忘れずにいなければならない場合もある。
【０００５】
神経障害性疼痛は、神経系、末梢神経、後根神経節あるいは後根、または中枢神経系への損傷によって起こりうる持続性または慢性の疼痛症候群である。神経障害性疼痛症候群には、異痛症、帯状疱疹痛および三叉神経痛といった様々な神経痛、幻肢痛、および反射性交感神経性ジストロフィーおよびカウザルギーといった複雑な局所疼痛症候群が含まれる。カウサルギーは痛覚過敏および異痛を伴う自発性灼熱痛を特徴とする。
【０００６】
残念ながら、トリガーポイント、末梢神経、神経叢、後根、および交感神経系を標的とする局所麻酔ブロックなどによる現在の神経障害性疼痛処置方法では、短寿命の抗侵害受容効果しか得られない。また、フェノール注射によるブロックまたは低温療法などのより時間持続する鎮痛処置法では、不可逆的機能傷害の危険がかなり高くなる。さらにまた、クロニジン、ステロイド、オピオイドまたはミダゾラムなどの薬物の慢性的硬膜外またはクモ膜下（総称して「脊髄内」）投与には重大な副作用があり、その効力にも疑問の余地がある。
【０００７】
不幸にして、発生した神経障害性疼痛を十分に、予想通りに、かつ特異的に処置する既存の方法は存在せず（Woolf C.ら、Neuropathic Pain: Aetiology, Symptoms, Mechanisms, and Management、Lancet 1999；353:1959-64）、神経障害性疼痛の現在の処置方法は、患者が体験する疼痛を軽減または除去することによるよりもむしろ、心理療法または作業療法によって、患者が対処することを手助けしようとしているに過ぎない。
【０００８】
痙縮または筋痙攣は、脊髄への外傷または脊髄内に損傷を生じる他の障害の重大な合併症である場合があり、筋痙攣はしばしば疼痛を伴う。筋痙攣中に体験する疼痛の原因としては、機械感覚性痛み受容器を刺激する筋痙攣の直接効果、または血管を圧迫し虚血を引き起こす痙攣の間接的効果が挙げられる。痙攣は患部筋組織における代謝率を増加させるので相対的虚血はより強くなり、疼痛誘発物質を放出する条件が増す。
【０００９】
脊髄は、脊椎骨によって形成される脊髄のための脊柱管の内部にあって、脳を包む髄膜鞘につながる3つの髄膜鞘に囲まれている。これら3つの髄膜鞘の最も外側は硬膜である。これは密な線維性の膜であり、その前面は硬膜上腔によって脊椎の骨膜から隔てられている。硬膜の後面は硬膜下腔である。硬膜下腔は、脊髄を囲む3つの髄膜鞘の2番目、すなわちクモ膜を囲んでいる。クモ膜はクモ膜下（subarachnoidまたはintrathecal）腔によって第3の髄膜鞘、すなわち軟膜から隔てられている。クモ膜下腔は脳脊髄液（CSF）で満たされている。軟膜の下には脊髄がある。したがって、脊椎骨から内側または後面に向かって、硬膜上腔、硬膜、硬膜下腔、クモ膜、クモ膜下腔、軟膜および脊髄ということになる。
【００１０】
一定の薬物の脊髄内への（すなわち硬膜上腔またはクモ膜下腔への）治療的投与は知られている。クモ膜下腔への直接的な薬物の投与は脊椎穿刺注入またはカテーテル法によって行うことができる。クモ膜下薬物投与により、経口摂取した場合に起こる一部の薬物の不活化と、経口投与または静脈内投与の全身作用を避けることができる。また、クモ膜下投与では、経口投与または非経口投与に必要な有効量の一部に過ぎない有効量を使用することができる。さらに、クモ膜下腔は一般に小さいカテーテルを十分収容できるほど広いので、長期的薬物送達システムを使用することができる。例えばバクロフェンのクモ膜下投与による痙縮の処置が知られている。また、筋痙縮を軽減するための筋肉内ボツリヌス毒素の補助を目的とする、バクロフェンのクモ膜下投与とボツリヌス毒素の筋肉内注射の併用も知られている。さらにまた、Gianno，J.ら著、Intrathecal Drug Therapy for Spasticity and Pain、Springer-Verlag（1996）、に記載されているように、オピオイドであるモルヒネおよびフェンタニルの脊髄内投与による疼痛の処置も知られており、前記刊行物の内容は参照により、そのまま完全な形で本明細書に組み入れられるものとする。
【００１１】
現在の慢性疼痛のクモ膜下処置法は、SynchroMed（登録商標）注射システム（Medtronic，Inc.（ミネソタ州ミネアポリス）から入手することができる、プログラム可能な体内埋込み型ポンプ）などのクモ膜下ポンプを使って行われている。現在使用されている抗侵害受容薬または鎮痙薬は活性の持続時間が短いので頻繁に再投与する必要があり、毎日脊椎穿刺注入を実施することによって再投与を行うのは実際的ではないため、ポンプが必要である。ポンプは患者の腹部の皮膚下に外科的に設置される。カテーテルの一端をポンプに接続し、カテーテルの他端を患者の脊髄のCSFで満たされたクモ膜下腔に通す。体内埋込み型ポンプはクモ膜下内に設置したカテーテルを通して薬物を連続的または間欠的に注入するようプログラムすることができる。埋込み手術が必要なため合併症が起こる場合がある。また、クモ膜下投与される既知の鎮痛薬は、活性の持続時間が短く、また脂溶性を持つためにクモ膜下腔からの浸出ならびに全身的輸送および／または高次CNS領域への拡散が起こって呼吸抑制を引き起こす可能性があるという欠点を有する。
【００１２】
したがって、疼痛の処置に使用される既知のクモ膜下投与薬の（全てではないとしても）多くに付随する重大な問題は、それが脊椎穿刺によって投与されるか、カテーテル法によって投与されるかにかかわらず、当該薬物の溶解特性ゆえに薬物はクモ膜下腔を離れ得、さらにニューロン結合性に乏しいゆえに薬物がCSF内を循環してCNSの頭部に達し得、潜在的に脳機能に影響を及ぼしうることである。
【００１３】
ボツリヌス毒素
嫌気性グラム陽性菌であるボツリヌス菌（Clostridium botulinum）は、ヒトと動物にボツリヌス中毒と呼ばれる神経麻痺性障害を引き起こす強力なポリペプチド神経毒、ボツリヌス毒素を産生する。ボツリヌス菌の胞子は土壌中に見いだされ、滅菌と密閉が不適切な零細缶詰工場の食品容器内で成長する可能性があり、これはボツリヌス中毒症例の多くの原因になっている。ボツリヌス中毒の影響は、通例、ボツリヌス菌の培養物または胞子で汚染された食品の飲食後18〜36時間で現れる。ボツリヌス毒素は、消化管の内層を弱毒化されないで通過し、中枢神経系を攻撃することができるようである。最初に最も高次の脳神経が冒され、続いて低次の脳神経が冒され、次に末梢運動ニューロンが冒される。無処置の場合、ボツリヌス中毒の症状は、例えば内直筋麻痺、下垂、光に対する緩慢な瞳孔反応、歩行困難、嚥下困難、会話困難、呼吸筋の麻痺などを経て死に至り得る。
【００１４】
A型ボツリヌス毒素は、人間に知られている天然生物学的物質としては致死性が最も高い物質である。霊長類では39単位/キログラム（U/kg）の筋肉内BOTOX（登録商標）（カリフォルニア州アービンのAllergan，Inc.から販売されているA型ボツリヌス毒素精製神経毒複合体。A型ボツリヌス毒素複合体はPorton Products，Ltd.（英国）からDYSPORTの商標名でも入手することができる）がLD50であると決定されている。1単位（U）のボツリヌス毒素はマウスに腹腔内注射した場合のLD50と定義することができる。BOTOX（登録商標）は100単位バイアル1本につき約4.8ngのA型ボツリヌス毒素複合体を含んでいる。したがって体重70kgのヒトの場合、約40U/kgのLD50は、約134ngまたは28バイアル（2800単位）の筋肉内BOTOX（登録商標）ということになる。免疫学的に異なる7種類のボツリヌス神経毒（それぞれ型特異的抗体による中和によって識別される神経毒血清型A、B、C1、D、E、FおよびG）が特徴づけられている。神経毒成分は無毒性タンパク質に非共有結合的に結合して高分子量複合体を形成する。ボツリヌス毒素の様々な血清型は、それらが冒す動物の種、およびそれらが惹起する麻痺の重篤度と持続時間が異なる。例えばラットで生じる麻痺率によって評価した場合、A型ボツリヌス毒素はB型ボツリヌス毒素より500倍強力である。またB型ボツリヌス毒素は霊長類では480U/kgの投与量で無毒性であることが確認されているが、この投与量はA型ボツリヌス毒素の霊長類LD50の約12倍である（Jankovic，J.ら編、「Therapy With Botulinum Toxin」（1994年、Marcel Dekker、 Inc.）の第6章、71〜85頁のMoyer Eら著「Botulinum Toxin Type B: Experimental and Clinical Experience」）。
【００１５】
過剰な骨格筋、平滑筋および括約筋収縮を減少させるために、微量のボツリヌス毒素が使用されている。ボツリヌス毒素は機能亢進もしくは緊張亢進した筋またはその近傍に直接注射することができ、神経筋接合部の末梢シナプス前神経終末に入ってアセチルコリンの放出を遮断することにより、その作用を発揮すると考えられる。これにより、作用を受けた神経終末は筋収縮の刺激を妨げられ、結果として筋緊張の低下が起こる。このように、治療量を筋肉内注射すれば、A型ボツリヌス毒素は、局在性の化学的除神経によって局在性の弱化または麻痺を引き起こし、過剰な不随意筋収縮を軽減するために使用することができる。
【００１６】
末梢筋肉内A型ボツリヌス毒素の臨床効果は通常、注入後1週間以内に認められる。A型ボツリヌス毒素の1回の筋肉内注射による症候緩和の典型的持続時間は平均して約3ヶ月である。ボツリヌス毒素による治療的処置を受けた筋肉は、おそらくは新しい神経芽の発達もしくは元のシナプスからの神経伝達の再開またはその両者により、毒素が誘発する一時的麻痺から結局は回復する。神経芽は新しい神経筋接合部を確立するだろう。したがって神経筋伝達は数ヶ月の期間をかけて徐々に通常状態に復帰し得る。
【００１７】
骨格筋および平滑筋組織において、ボツリヌス毒素は、この毒素がニューロンの受容体に結合しその受容体によって内部に取り込まれる神経筋接合部で、コリン作動性ニューロン以外の器官または組織にはほとんど親和性を持たず、上述のように、ニューロンの細胞死を引き起こさずに神経伝達物質アセチルコリンのシナプス前放出を遮断するようである。
【００１８】
ボツリヌス毒素は、例えば特定の病巣または部分の横紋筋または平滑筋領域における機能亢進した神経筋活動などを特徴とするコリン作動性神経系伝達に関係する増加している障害の処置に使用されるようになってきた。例えば、眼瞼痙攣、痙性斜頸、片側顔面痙攣、痙攣性発声障害、口下顎ジストニーおよび四肢ジストニー、顔面筋疼痛、歯ぎしり、アカラシア、顎振戦、痙縮、若年脳性麻痺、多汗症、唾液分泌過多、非ジストニー性振戦、眉間のしわ、限局性ジストニー、緊張性頭痛、片頭痛および腰痛などの処置に、1または複数のボツリヌス毒素血清型の筋肉内注射が使用されている。このような筋肉内療法により、疼痛もかなり緩和されることが少なくない。最も一般的にはA型ボツリヌス毒素の局所筋肉内注射後、または1もしくは別の他のボツリヌス神経毒血清型の局所筋肉内注射後に、これらの効果が観察されている。ボツリヌス毒素血清型B、C1、D、EおよびFは、同等な投与量レベルのA型ボツリヌス毒素と比較して、効力が低く、そして/または活性の持続時間が短いようである。
【００１９】
どのボツリヌス毒素血清型でも神経筋接合部における神経伝達物質アセチルコリンの放出を抑制するようであるが、これは、異なる神経分泌タンパク質に作用することによって、そして/またはそれらタンパク質の異なる部位を切断することによって行われる。例えばA型ボツリヌス毒素とE型ボツリヌス毒素は、どちらも25キロダルトン（kD）シナプトソーム付随タンパク質（SNAP-25）を切断するが、これらの毒素は、このタンパク質内の異なるアミノ酸配列を標的とする。B型、D型、F型およびG型ボツリヌス毒素は小胞付随タンパク質（VAMP、シナプトブレビンとも呼ばれる）に作用し、各血清型はこのタンパク質の異なる部位を切断する。最後に、C1型ボツリヌス毒素はシンタキシンとSNAP-25の両者を切断することが明らかになっている。このような作用機序の相違が、様々なボツリヌス毒素血清型の相対的効力および/または作用の持続時間に影響しているのかもしれない。
【００２０】
分泌されたボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、7つの既知ボツリヌス毒素血清型のいずれについても、約150kDである。興味深いことに、ボツリヌス毒素はクロストリジウム細菌により、150kDボツリヌス毒素タンパク質分子と、関連する非毒素タンパク質とからなる複合体として放出される。例えばA型ボツリヌス毒素複合体はクロストリジウム細菌により900kD、500kDおよび300kD型として産生されうる。B型およびC1型ボツリヌス毒素は500kD複合体の形態でのみ産生されるようである。D型ボツリヌス毒素は300kD複合体としても500kD複合体としても産生される。最後にE型およびF型ボツリヌス毒素は約300kDの複合体の形態でのみ産生される。複合体（すなわち約150kDより大きい分子量）は、非毒素ヘマグルチニンタンパク質と、非毒素かつ無毒性の非ヘマグルチニンタンパク質とを含むと考えられる。（ボツリヌス毒素分子と共に神経毒複合体を構成する）これら2つの非毒素タンパク質は、変性に対する安定性をボツリヌス毒素分子に与え、毒素が摂取された時に毒素を消化酸から保護するように働くのだろう。また、大きい（約150kDよりも分子量が大きい）ボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス毒素複合体の筋肉内注射部位からのボツリヌス毒素の拡散速度を低下させるかもしれない。
【００２１】
中枢神経組織に対するボツリヌス毒素の作用の生化学的機序には議論の余地がある。また、影響を受けるCNS神経伝達物質の数、ならびに様々なCNS神経伝達物質の合成、放出、蓄積および代謝に対するボツリヌス毒素の作用の程度と性質の決定も、まだ終わっていない。ボツリヌス毒素は、脳組織初代細胞培養からのアセチルコリンとノルエピネフリンのカリウムカチオン誘発性遊離をどちらも抑制することが、インビトロの研究によって示されている。また、ボツリヌス毒素は脊髄ニューロンの初代培養物においてグリシンとグルタメートの両方の誘発性遊離を抑制し、また脳シナプトソーム標本においてボツリヌス毒素が神経伝達物質アセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン、CGRPおよびグルタメートの遊離をそれぞれ抑制すると報告されている。
【００２２】
A型ボツリヌス毒素は、既知の手法に従って、発酵槽でボツリヌス菌の培養を樹立し、生育させ、その発酵混合物を収集し精製することによって得ることができる。どの血清型でもボツリヌス毒素血清型は、まず不活性な単鎖タンパク質として合成され、これが神経刺激性を持つようになるにはプロテアーゼによる切断またはニッキングを受けなければならない。A型およびG型ボツリヌス毒素を産生する細菌株は内因性プロテアーゼを持つので、血清型AおよびGは細菌培養物から主に活性型として回収することができる。これに対し、ボツリヌス毒素血清型C1、DおよびEは非タンパク質分解株によって合成されるので、培養物から回収した段階では通例、不活性型である。血清型BおよびFはタンパク質分解性菌株によっても非タンパク質分解性菌株によっても産生されるので、活性型でも不活性型でも回収することができる。しかし、例えばB血清型ボツリヌス毒素を産生するタンパク質分解性菌株でも、生成する毒素の一部しか切断されない。切断分子と非切断分子との正確な比率は培養時間の長さと培養温度に依存する。したがって、例えばB型ボツリヌス毒素製剤はいずれもその一定割合が不活性であると思われる。B型ボツリヌス毒素の効力はA型ボツリヌス毒素と比較してかなり低いことが知られているが、その理由はここにあるのかもしれない。臨床製剤中に存在する不活性なボツリヌス毒素分子は、その製剤の総タンパク質量の一部を占めることになるが、これは臨床効力には貢献せず、抗原性の増加に関連づけられている。また、筋肉内注射した場合、B型ボツリヌス毒素は同じ用量レベルのA型ボツリヌス毒素よりも活性の持続時間が短く、効力も低いことが知られている。
【００２３】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
したがって、活性の持続時間が長く、投与されたクモ膜下腔外への拡散速度が低く、投与部位外にある他のクモ膜下領域への拡散速度が低く、疼痛の処置に対する特異性が高く、処置用量レベルでの副作用が限られているか重大でないという特徴を持つ医薬品の脊髄内投与によって、疼痛および/または痙攣を効果的に処置する方法が必要とされている。
【００２４】
（その解決方法）
本発明はこの必要性を満たし、活性の持続時間が長く、例えば投与されたクモ膜下腔外への拡散速度が低く、投与部位外にある他のクモ膜下領域への拡散速度が低く、疼痛の処置に対する特異性が高く、処置用量レベルでの副作用が限られているか重大でないという特徴を持つ神経毒の脊髄内投与によって、疼痛を効果的に処置する方法を提供するものである。
【００２５】
本発明に従って疼痛を処置する方法は、哺乳動物に神経毒を脊髄内投与し、それにより、前記哺乳動物が体験する疼痛を軽減する段階を含むことができる。使用する神経毒は、ボツリヌス毒素、例えばボツリヌス毒素血清型A、B、C、D、E、FおよびGの1つまたは1もしくは複数の組み合わせであることが好ましい。A型ボツリヌス毒素は効力が高く、入手が容易であり、様々な障害の処置に臨床的に使用されてきた歴史が長いので、使用するボツリヌス毒素は、A型ボツリヌス毒素であることが最も好ましい。
【００２６】
本発明の方法に従って脊髄内投与される神経毒は、ニューロンターゲティング部分にコンジュゲート化、結合、付着、または融合されておらず、またニューロンターゲティング部分と組み合わせて投与されることもない。ニューロンターゲティング部分は、ニューロンの結合部位と機能的に相互作用して、ターゲティング部分および/またはターゲティング部分に結合したコンジュゲートと、一次感覚求心神経などのニューロン表面との物理的結合を引き起こす化合物である。したがってターゲティング部分は1または複数タイプのニューロンに対する特異性または結合親和性をもたらす。本発明では、本発明の方法に従って使用される神経毒を組み込んだ医薬製剤（すなわち神経毒、塩化ナトリウム（生理食塩水）および安定剤（アルブミンなど）の再構成溶液）は、意図的に結合または調製されたニューロンターゲティング部分を欠くか、または実質的に含まない。
【００２７】
1または複数のターゲティング部分人工物または構築物の使用は、不要な物として、本発明の範囲から排除される。なぜなら本発明者らは意外にも、本発明の脊髄内神経毒投与により、神経毒を、その神経毒に固有でないかまたは天然でないニューロンターゲティング部分と組み合わせて投与しなくても、顕著な疼痛の軽減が起こることを見いだしたからである。すなわち本発明者らは、予想外にも、A型ボツリヌス毒素などの天然神経毒を脊髄内投与すると、例えば神経毒へのニューロンターゲティング部分の結合などによってその神経毒に何らかのニューロン特異性または結合親和性が人為的に付与されていなくても、天然神経毒はCNSのニューロンと相互作用して、疼痛の軽減をもたらしうることを見いだした。後述するように、本発明以前は、A型ボツリヌス毒素などの神経毒は、脊髄内投与（クモ膜下投与を含む）した場合、広範で非限局的な拡散性の有害作用（痙縮を含む）をCNSに対して発揮すると考えられていた。したがって、A型ボツリヌス毒素などの神経毒の脊髄内投与に起因すると考えられていたこれらの有害作用を軽減または排除するには、神経毒にニューロンターゲティング部分を意図的に結合させることが必要不可欠であると考えられていた。
【００２８】
本発明者らは、意外にも、A型ボツリヌス毒素などのボツリヌス毒素を約10-3U/kg〜約60U/kgの量で脊髄内投与することにより、ヒト患者などの哺乳動物が体験する疼痛を軽減できることを見いだした。好ましくは、使用するボツリヌス毒素を約10-2U/kg〜約50U/kgの量で脊髄内投与する。より好ましくは、ボツリヌス毒素を約10-1U/kg〜約40U/kgの量で投与する。最も好ましくは、ボツリヌス毒素を約1U/kg〜約30U/kgの量で投与する。本方法の特に好ましい実施形態では、ボツリヌス毒素を約1U/kg〜約20U/kgの量で投与し、一部の臨床状況では、ボツリヌス毒素を約1U/kg〜約10U/kgの量で有利に投与することができる。本方法の疼痛軽減効果は、1回の神経毒投与につき、10日まで、または20日まで、また使用する用量などの要因によっては3ヶ月まで、有意に持続することができる。
【００２９】
神経毒の脊髄内投与は、クモ膜下投与（例えば中枢神経系の頭、頚、胸、腰、仙骨または尾骨部へのクモ膜下投与）によって行われることが好ましく、その投与段階は、哺乳動物の中枢神経系のクモ膜下腔にアクセスする段階およびそのクモ膜下腔に神経毒を注入する段階を含むことができる。前記アクセス段階は脊椎穿刺の実施によって行うことができる。
【００３０】
もう一つの選択肢として、前記脊髄内投与段階は、哺乳動物の中枢神経系のクモ膜下腔にカテーテルを挿入する段階と、次いで前記カテーテル挿入段階で挿入したカテーテルを通して神経毒をクモ膜下腔に注入する段階とを含むこともできる。注入段階に先だって、哺乳動物の中枢神経系に神経毒を投与するための投与手段を哺乳動物に取り付けるまたは埋込む段階が存在してもよいことに注意されたい。投与手段は、神経毒の一部をレザバーからクモ膜下腔内のカテーテルの一端に送り出すためのポンプ手段に操作可能に接続された神経毒のレザバーから構成することができる。
【００３１】
前記投与段階は、哺乳動物が体験する侵害受容の（例えば癌、痙攣などに起因する炎症性、神経障害性、傷害誘発性などの）イベントまたは症候群の発生に先立って、またはその発生後に行うことができる点に注意することが重要である。例えば前記投与段階は、侵害受容イベントが発生する約0.5時間以上前〜約14日前の間に行うことができる。より好ましくは、投与段階を、侵害受容イベントが発生する約0.5時間以上前〜約10日前の間に行う。最も好ましくは、投与段階を、侵害受容イベントが発生する約0.5時間以上前〜約7日、4日、24時間または6時間前の間に行う。本発明の特に好ましい実施形態では、投与段階を侵害受容イベントが発生する約2時間前〜約5時間前の間に行う。本方法は、異痛症に伴う疼痛を処置するために使用することができる。
【００３２】
本発明の範囲に包含される方法の具体的実施形態は、第1に、哺乳動物の真皮を貫通して切開を施し、その切開を通してクモ膜下腔にカテーテルを挿入することにより、カテーテルを哺乳動物の中枢神経系のクモ膜下腔に挿入する段階を含むことができる。カテーテルは第1開口端と遠隔第2開口端とを持つ。第2に、哺乳動物の中枢神経系のクモ膜下腔にボツリヌス毒素を投与するための投与手段を哺乳動物に取り付けるか、哺乳動物に埋込む。前記投与手段は複数回投与量のボツリヌス毒素を保持するためのレザバーを含み、レザバーはボツリヌス毒素の一部をレザバーからカテーテルの第1端に送り出すためのポンプ手段に接続されている（カテーテルの第1端はポンプ手段に接続されている）。第3に、ポンプ手段を作動させ、最後に、哺乳動物の中枢神経系のクモ膜下腔にカテーテルの第2端を通して約10-3U/kg〜約60U/kgのボツリヌス毒素を注入し、それにより、哺乳動物が体験する疼痛を軽減する。
【００３３】
本発明の範囲に包含されるもう1つの好ましい方法は、ヒト患者の侵害受容活動または侵害受容体験を生体内で減弱する方法であって、ヒト患者に処置有効量のボツリヌス毒素を脊髄内投与し、それにより、ヒト患者の侵害受容活動または侵害受容体験の生体内での減弱を引き起こす段階を含む方法である。この脊髄内投与段階は、侵害受容性の活動、体験、感覚または症候群の発生（または存在）後、または発生（または存在）前に行うことができる。
【００３４】
本発明の範囲に包含されるさらにもう1つの好ましい方法は、抗侵害受容活性を持つ神経毒を選択し、侵害受容活動に影響する患者の中枢神経系部分を選択し、選択した中枢神経系部分に選択した神経毒を脊髄内投与することによって、疼痛を処置する方法である。
【００３５】
注目すべきことに、本方法を実施するために使用する神経毒は、1または複数のボツリヌス菌、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）およびクロストリジウム・ベラティ（Clostridium beratti）種といったクロストリジウム細菌によって製造することができる。
【００３６】
本発明の範囲に包含されるもう1つの好ましい方法は、哺乳動物の中枢神経系または後根神経節に神経毒を投与し、それにより、その哺乳動物が体験する疼痛を軽減する段階を含む、疼痛の処置方法である。本発明の範囲に含まれるさらにもう1つの好ましい方法は、哺乳動物の中枢神経系または後根神経節に神経毒を投与し、それにより患者機能を改善する段階を含む、患者機能改善方法である。患者機能改善は、疼痛の軽減、臥床時間の減少、歩行運動の増加、より健全な態度、およびより多様なライフスタイルという要素の1または複数の改善によって決定される。
【００３７】
また、修飾神経毒を使用する方法も、本発明の範囲に包含される。修飾神経毒とは、1または複数のアミノ酸が（天然神経毒と比較して）欠失、修飾または置換されている神経毒を意味し、組換え法によって製造された神経毒および組換え生産神経毒の誘導体および断片を包含する。
【００３８】
本発明の上記および上記以外の性質、特徴、および利点は、以下の説明、特許請求の範囲および添付の図面を参照すれば、より良く理解することができる。
【００３９】
本発明は疼痛の処置方法を包含する。本発明者らは、患者の中枢神経系に神経毒を脊髄内投与すると、顕著な望ましくない副作用を伴わずに顕著な長時間持続する疼痛の軽減が起こりうることを見いだした。したがって、本発明の範囲に包含される方法は、抗侵害受容的または鎮痛的な救済を提供する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「脊髄内」とは、硬膜外腔内、クモ膜下腔内、脊髄の白質もしくは灰白質内、または後根および後根神経節などの関連構造内を意味する。
【００４１】
本発明以前は、ボツリヌス毒素などの神経毒の脊髄内投与は、（1）被投与体に著しい痙縮を誘発し、（2）脊髄機能および脳機能に対する有害な影響を増進すると、当業者は考えていた。例えば有害な影響（1）に関して、Williamsonら、Clostridial Neurotoxins and Substrate Proteolysis in Intact Neurons、J. of Biological Chemistry 271:13；7694-7699（1996）には、破傷風毒素とA型ボツリヌス菌はどちらも、マウス胎仔脊髄細胞培養からの神経伝達物質グリシンおよびグルタメートの誘発性遊離を抑制すると報告されており、またHagenahらはEffects of Type A Botulinum Toxin on the Cholinergic Transmission at Spinal Renshaw Cells and on the Inhibitory Action at Ia Inhibitory Interneurones、Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 299，267-272（1977）に、実験的に調製した麻酔ネコにA型ボツリヌス毒素を直接脊髄内注射するとCNSレンショー細胞活動が抑制されると報告している。中枢グリシンおよびグルタメート神経伝達物質遊離の抑制およびレンショー細胞活動のダウンレギュレーションは、どちらも生体内で、顕著な運動ニューロン機能亢進を促進し、続いて末梢筋痙縮を引き起こしうる。
【００４２】
有害な影響（2）に関して、破傷風神経毒のクモ膜下投与は、CNSニューロンに沿った破傷風毒素の逆行により、脊髄機能および脳機能に対して重大な負の影響を及ぼすので、ボツリヌス毒素などの関連毒素のクモ膜下投与は禁忌であると考えられている。注目すべきことに、ボツリヌス毒素と破傷風毒素は、クロストリジウム属の異なる種によってではあるが、どちらもクロストリジウム細菌によって産生される。明らかに、一部の研究者らは、ボツリヌス毒素も、少なくともある程度は、破傷風毒素の前記神経上行性を持つと報告している。例えばHabermann E.、125I-Labeled Neurotoxin from Clostridium Botulinum A: Preparation, Binding to Synaptosomes and Ascent in the Spinal Cord、Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 281，47-56（1974）を参照されたい。
【００４３】
意外にも、本発明では有害な影響（1）または（2）はどちらも起こらず、本発明の方法を実施することにより、疼痛を効果的に長時間持続して軽減し、処置対象患者の生活の質を全般的に向上することができる。患者が体験する疼痛は、例えば傷害、手術、感染、事故、または例えば神経障害性の疾患および傷害を含む疾患（癌および糖尿病を含む）に起因するものであってよい。
【００４４】
本発明の範囲に包含される方法を実施するために使用する神経毒は、好ましくはボツリヌス毒素、例えば血清型A、B、C、D、E、FまたはGのボツリヌス毒素の一つである。A型ボツリヌス毒素はヒトに高い効力を持ち、容易に入手することができ、筋肉内注射によって局所投与した場合に骨格筋および平滑筋障害の処置に有用であることが知られているので、使用するボツリヌス毒素はA型ボツリヌス毒素であることが好ましい。B型ボツリヌス毒素は、力価および効力がA型と比較してかなり低く、容易に入手することができず、ヒトでの臨床的使用の歴史も限られているので、本方法の実施に使用する毒素として好ましくはない。
【００４５】
本発明による神経毒投与の脊髄内経路は、選択した神経毒の溶解性および投与しようとする神経毒の量などといった基準に基づいて選択することができる。神経毒の投与量は、処置しようとする障害、その重症度および他の様々な患者パラメータ（サイズ、体重、年齢および処置に対する反応性など）に応じて、広範囲にわたって変動しうる。例えば、影響を受けるCNS求心性疼痛ニューロン体の領域の広さは注入した神経毒の体積に比例すると考えられ、鎮痛度は、ほとんどの投与量範囲で、注入した神経毒の濃度に比例すると考えられる。さらに、脊髄内神経毒投与部位は、処置すべき疼痛の皮膚節位置に依存しうる。適切な投与経路および投与量を決定する方法は、一般に、主治医が個別に決定する。このような決定は当業者にとっては日常的業務である（例えばAnthony Fauciら編、Harrison's Principles of Internal Medicine（1997）、第14版、McGraw Hill発行、を参照されたい）。
【００４６】
脊髄内投与はクモ膜下に行うことが好ましい。なぜならクモ膜下腔の方が相対的に大きいのでアクセスが著しく容易であり、好ましい神経毒であるボツリヌス毒素は、脂質に富む硬膜外環境では一般に低い溶解度を示すからである。また、神経毒が、現在考えられているようにCNSおよび後根神経節（DRG）のニューロンへの作用によって抗侵害受容効果を持つためには、神経毒はクモ膜下腔を通して拡散しなければならないので、硬膜外神経毒投与は脊髄内投与経路としては、好ましさが劣る。本発明者らは、炎症性疼痛と神経障害性疼痛の両方を、本明細書に開示する方法により、重大な筋痙縮もしくは筋弛緩または他の副作用を伴わずに、有効に処置できることを見いだした。
【００４７】
本発明による神経毒の脊髄内投与は、例えばカテーテル法または脊椎穿刺注入など、様々な経路で行うことができる。本発明の処置効果には持続性があるので長期的（慢性的）な抗侵害受容薬投与の必要性は実質的になく、したがって本方法は、神経毒の低頻度な脊椎穿刺注入により、有利に実施される。また、クモ膜下脊髄穿刺神経毒投与経路では、カテーテルを動かして他のCNS部位にアクセスする方法と比較して、より正確な局在化した毒素の送達が容易であり、CNSを損傷する危険がより少ない。
【００４８】
クモ膜下神経毒は、ボーラス注射またはカテーテル法によって投与することができる。カテーテルは、ヒトの場合はL1で終わっている脊髄から安全な距離にあるL3-4またはL4-5から挿入し、クモ膜下腔内を上向きに誘導して、所望の部位に設置することができる。疼痛管理の場合、カテーテルの設置または注射器によるボーラス注射の位置は、感知されている疼痛の部位および医師の選択に依存する。
【００４９】
本発明の方法による処置的神経毒投与は、侵害受容イベントまたは症候群の発生前または発生中に実施できることに注目することが重要である。
【００５０】
本発明者らは、ボツリヌス毒素などの神経毒は、約10-3U/kg〜約60U/kgの量で、本発明の方法に従って脊髄内投与できることを見いだした。約10-3U/kgの用量は、CNSの後角または後角上に直接送達するのであれば、そして/またはボツリヌス毒素の送達をイオン導入法などの方法によって補助するのであれば、抗侵害受容効果をもたらすことができる。約10-3U/kg未満の用量の脊髄内投与は、十分な処置成果または持続的な処置成果をもたらさない。60U/kgを越える脊髄内用量は、ボツリヌス毒素などの神経毒の致死量に近づく。抗侵害受容効果を得るために使用する神経毒は、支配される器官または組織における疼痛の知覚または筋痙攣に好ましい影響を及ぼすか、またはそれらをダウンレギュレートするように、CNSの神経に接触することが望ましい。したがって、例えば硬膜外注射によって神経毒を脊髄内投与する場合は、硬膜外腔からクモ膜下腔に至り、そこからCNSの外神経まで拡散した時の神経毒の希釈を見込んで、用量を約10のファクター増加する必要があるかもしれない。
【００５１】
A型ボツリヌス毒素などのボツリヌス毒素のクモ膜下投与に関して、処置対象患者における抗侵害受容効果を達成するのに好ましい範囲は、約10-2U/kg〜約50U/kgである。約10-2U/kg未満の用量では、抗侵害受容効果が比較的軽微であるがまだ観察され、約50U/kgを越える用量では、多少の筋弛緩と毒素中毒の症状が起こる可能性がある。A型ボツリヌス毒素などのボツリヌス毒素のクモ膜下投与に関して、処置対象患者における抗侵害受容効果を達成するのにより好ましい範囲は、約10-1U/kg〜約30U/kgである。約10-1U/kg未満の用量では、望ましい処置効果の持続時間が最適な持続時間または可能な最長持続時間より短くなり得、約30U/kgを越える用量では、なお多少の筋弛緩の症状が起こる可能性がある。A型ボツリヌス毒素などのボツリヌス毒素のクモ膜下投与に関して、処置対象患者における抗侵害受容効果を達成するのに最も好ましい範囲は、約1U/kg〜約20U/kgである。この好ましい範囲におけるA型ボツリヌス毒素などのボツリヌス毒素のクモ膜下投与により、劇的な処置の成功を達成することができる。さらに、本発明者らの実験から、約1U/kg〜約10U/kgの用量範囲では、ヒト患者における炎症性および神経障害性疼痛の処置に、顕著な副作用を伴わずに顕著で長時間持続する抗侵害受容効果が得られることがわかる。
【００５２】
本発明者らは、BOTOX（登録商標）によって生成する切断されたSNAP-25タンパク質の免疫組織化学染色により、クモ膜下投与されたBOTOX（登録商標）は、求心性疼痛線維が終わる脊髄層であるラット後角の表層に分布することを確認した。そこで、特定の理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、クモ膜下ボツリヌス毒素の抗侵害作用効果は、中枢終末求心性感覚ニューロンからおよび/または後角中の二次投射ニューロンからの様々な神経伝達物質の遊離を特異的に阻害することによるという仮説を設ける。
【００５３】
本発明は、その範囲に、患者の中枢神経系に局所適用した場合に長時間持続する抗侵害受容効果を持つ任意の神経毒の使用を包含する。本発明の方法には、例えば、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ブチリカムおよびクロストリジウム・ベラティなどの毒素産生性クロストリジウム細菌の任意の種によって産生される神経毒を使用するか、使用できるように適合させることができる。また、上述のようにA型は最も好ましい血清型であり、B型は最も好ましくない血清型であるものの、ボツリヌス血清型A、B、C、D、E、FおよびGはいずれも、本発明の実施に有利に使用することができる。本発明の実施により、ヒトにおいて、1回の注射につき3ヶ月またはそれ以上鎮痛効果を得ることができる。
【００５４】
重要なことに、本発明の範囲に包含される方法は患者機能を改善することができる。「患者機能の改善」とは、疼痛の減少、臥床時間の減少、歩行運動の増加、より健全な態度、およびより多様なライフスタイル、および/または正常な筋緊張によって認められる回復などといった要素によって測定される改善と定義することができる。
【００５５】
上述のように、本発明者らは、驚くほど有効でありかつ長時間持続する疼痛の処置を、患者への神経毒の脊髄内投与によって達成できることを発見した。本発明は、その最も好ましい実施形態では、A型ボツリヌス毒素のクモ膜下注射によって実施される。重要なことに、1または複数の特定タイプのニューロンに対するターゲティング特異性を神経毒に与えるために様々な手法により非神経毒タンパク質などのニューロンターゲティング部分を神経毒に結合または融合しておかなくても、本明細書に開示する方法による神経毒の脊髄内投与により、劇的な長期間鎮痛効果および/または患者機能改善効果を達成できることを、本発明者らは見いだした。したがって、人工的に結合または融合された1または複数のニューロンターゲティング部分を持つ神経毒の使用は、本発明の範囲から除外される。神経毒は、天然神経毒分子の構造に固有の結合部分（例えばボツリヌス毒素の重鎖の結合ドメイン、すなわちHcフラグメント）が存在するため、ニューロンに対して（すなわちニューロン表面の特定の受容体に対して）天然の結合親和性を示すことができる。したがって、はっきりさせるために述べると、本明細書にいう「ターゲティング部分」または「ニューロンターゲティング部分」とは、特異的なまたは増大したニューロン結合親和性を神経毒に与えるターゲティング部分であって、そのようなターゲティング部分を持つ神経毒にとって本来の特徴または固有の特徴ではないターゲティング部分を意味する。これに対して、本明細書にいう「結合部分」とは、ニューロン結合親和性を与える天然神経毒に固有の成分またはドメインを意味する。
【００５６】
本発明は、その範囲に、（a）細菌培養、毒素抽出、濃縮、保存、凍結乾燥および/または再構成によって取得または加工された神経毒、および（b）1または複数のアミノ酸またはアミノ酸配列が既知の化学的/生化学的アミノ酸修飾法によって、または既知の宿主細胞/組換えベクター組換え法を使用することによって、意図的に欠失、修飾または置換されている神経毒である修飾または組換え神経毒、ならびにそのようにして製造された神経毒の誘導体または断片を包含するが、上述のように、1または複数のニューロンターゲティング部分を持つ神経毒は除外される。
【００５７】
本発明に従って使用されるボツリヌス毒素は、減圧下の容器に凍結乾燥状態または真空乾燥状態で保存することができる。凍結乾燥に先立って、ボツリヌス毒素を医薬的に許容できる賦形剤、安定化剤および/または担体（例えばアルブミン）と組み合わせることができる。凍結乾燥体は生理食塩水または水で再構成することができる。
【００５８】
実施例
以下の実施例は、本発明の範囲に包含される、本発明を実施するための好ましい方法の具体例を当業者に示すために記載するものであって、本発明者らが発明と見なしている範囲を限定しようとするものではない。実施例1〜4および6はA型ボツリヌス毒素のクモ膜下投与が炎症性疼痛に対して鎮痛効果を持つことを示し、実施例5および7はA型ボツリヌス毒素のクモ膜下投与が神経障害性疼痛に対して鎮痛効果を持つことを示す。
【００５９】
実施例１
クモ膜下投与したA型ボツリヌス毒素の炎症性疼痛に対する鎮痛効果
この実験の目的は、ラットホルマリンモデルを用いて、炎症性疼痛に対するA型ボツリヌス毒素の鎮痛効果を調べることだった。
【００６０】
体重各270〜350gの雄SDラットをイソフルランで麻酔した。この実施例と、以下の全ての実施例では、神経毒のクモ膜下投与を、Yaksh T.ら、Chronic Catheterization of the Spinal Subarachnoid Space、Physio & Behav 17:1031-1036（1976）に記載されているように、長さ約10cmのPE（ポリエチレン）10チューブを大槽上の硬膜の切開部分から挿入し、ラットの脊髄を約8.5cm尾側に下がった腰膨大の近傍まで通すことによるクモ膜下カニューレ挿入によって実施した。BOTOX（登録商標）または対照液としての生理食塩水を、ホルマリン試験の0〜5時間前に、腰膨大に置いたカテーテルを通してクモ膜下投与した。
【００６１】
Dubuisson D.ら、The Formalin Test: A Quantitative Study of the Analgesic Effects of Morphine, Merperdine, and Brain Stem Stimulation in Rats and Cats、Pain，4（1977），161-174に記載されている鎮痛を評価するためのホルマリン試験に従った。したがってホルマリン（5％、50μl）をラットの右後肢に皮下注射した。本発明者らは、時間中にホルマリンが誘発するフリンチング（flinching）反応の数と、注射を受けた肢のリッキング（licking）に費やす時間とを評価した。このホルマリン試験では、初期反応（初期相）の記録を直ちに開始し、5分間続ける（0〜5分）。後期反応（後期相）の記録はホルマリン注射の10分後に開始し、50分間続ける（10〜60分）。
【００６２】
図1は、ホルマリン注射の2〜5時間前にBOTOX（登録商標）（0.0625U/kg、0.625U/kgまたは3.125U/kg）をクモ膜下投与すると、ホルマリンモデルによって誘発される炎症性疼痛が減少したことを示している。対照群（n＝11）は生理食塩水のクモ膜下投与によって処置した。ラット右後肢へのホルマリン注射は、最初の5分（第1相）でも10〜60分（第2相）でも、一貫したリフト/リッキングおよびフリンチ反応をもたらした。投与量0.0625U/kg（0.003ng/kg；n＝10）、0.625U/kg（0.03ng/kg，n＝14）および3.125U/kg（0.15ng/kg，n＝9）のBOTOX（登録商標）は、第1相および第2相中のリフト／リッキング時間を有意に低下させた。慣例により、1単位（U）の再構成BOTOX（登録商標）はマウスに腹腔内注射した場合の50％致死量（LD50）に相当する。
【００６３】
第1相（図1の時刻0から約＋5〜10分まで）は、持続時間の短い無髄一次求心性ニューロン活動のバーストを表すと考えられる。より長い第2相（図1の時刻約＋5〜10分から始まる）では、長時間にわたる低レベルのC線維活動が、C線維入力に比してWDR（DRは後角を意味する）ニューロンの出力が著しく増大される促通をもたらすと考えられる。
【００６４】
この実施例は、第1相および第2相におけるリフト/リッキング時間の有意な低下によって測定されたように、A型ボツリヌス毒素のクモ膜下投与が、0.0625U/kg（0.003ng/kg；n＝10）、0.625U/kg（0.03ng/kg，n＝14）および3.125U/kg（0.15ng/kg，n＝9）の用量で、炎症性疼痛に対して有意な鎮痛効果を持ったことを示している。
【００６５】
実施例２
クモ膜下投与したA型ボツリヌス毒素の炎症性疼痛に対する鎮痛効果は少なくとも14日間持続する
オスSDラットのクモ膜下カニューレ挿入を実施例1で述べたように行った。図2（対照，n＝8）は、ホルマリン注射の2〜5時間前にBOTOX（登録商標）（0.03ng/kgまたは0.625U/kg，n＝14）でラットを前処置すると、第1相でも第2相でもリフト/リッキング時間が減少することを示している。BOTOX（登録商標）の鎮痛効果はBOTOX（登録商標）による処置後7日間（0.625U/kg，n＝5）持続したが、2時間前処置と比較すると低かった（図2）。また、図3に示すように、A型ボツリヌス毒素クモ膜下投与後7日目の鎮痛効果は用量依存的である。さらに、図4に示すように、BOTOX（登録商標）の鎮痛効果は、少なくとも14日間は持続する（0.625U/kg，n＝4）。図2に示すように、ホルマリン投与を開始する0.5時間前にラットをBOTOX（登録商標）で前処置しても、ホルマリン誘発痛を減少させることはできなかった。
【００６６】
この実施例は、ラットにおいてクモ膜下A型ボツリヌス毒素の有意な鎮痛効果が毒素の投与後少なくとも14日間は持続することを示している。得られたデータから外挿して、ラットでは鎮痛が少なくとも約20日間は持続すると、合理的に推論することができる。したがって、A型ボツリヌス毒素のクモ膜下投与による抗炎症性疼痛鎮痛は、ヒトでは、少なくとも約60日間は持続するだろうと考えることができる。
【００６７】
実施例３
クモ膜下投与したA型ボツリヌス毒素とムシモールの炎症性疼痛に対する鎮痛効果の比較
被験ラットのクモ膜下カニューレ挿入を実施例1に述べたように行った。BOTOX（登録商標）（0.625U/kg、ホルマリン試験の2〜5時間前または6日前）または短時間作用性鎮痛剤ムシモール（1μg，ホルマリン試験の10分前または6日前）をクモ膜下投与し、その後、表示した時刻にホルマリン試験を行った。
【００６８】
図5（対照生理食塩水，n＝11）に示すように、ホルマリン試験の6日前に投与されたBOTOX（登録商標）の鎮痛効果は、第2相の大半で、ホルマリン試験の6日前に投与したクモ膜下ムシモールの鎮痛効果よりも長い鎮痛活性の持続時間を持つ。また図5は、ホルマリン投与の2〜5時間前に投与したクモ膜下BOTOX（登録商標）と、ホルマリン投与10分前のクモ膜下ムシモールとが、同等な鎮痛をもたらしたことも示している。
【００６９】
実施例４
クモ膜下投与したA型ボツリヌス毒素の炎症性疼痛に対する部位特異的鎮痛効果
カテーテルを尾側に通常の8.5〜10cmに対して約4.5cmだけ挿入する点を除いて、実施例1で述べたように、クモ膜下疎通を行った。対照（生理食塩水）カテーテルは8.5cm（n＝11）または4.5cm（n＝1）の位置に挿入した。BOTOX（登録商標）を、尾側に4.5cm挿入したカテーテルを通して、0.625U/kg（n＝3）または3.125U/kg（n＝4）の投与量で投与した。次にラットホルマリン試験を行った。図6に示すように、4.5cmの位置に設置したカテーテルによるクモ膜下BOTOX（登録商標）投与によるラットホルマリン試験における鎮痛効果はほとんどないか、全くなかった。
【００７０】
ヒトの踵および足裏は腰膨大に始まる第5腰神経の皮膚節であることが知られており（例えばNetter，F.「Atlas of Human Anatomy」第2版（1997）（Novartis）の図版150を参照されたい）、神経分布はおそらくラットでも同様である。したがって、ホルマリンを注射するラット足底は、ラットの脊髄を尾側に約7.5cm〜9cm下がった位置（被験ラットのサイズに依存する）にある腰膨大から発する神経によって支配されるので、もしクモ膜下投与したBOTOX（登録商標）が脊髄ニューロンに対して部位特異的効果を示すのであれば、尾側に4.5cmしか挿入していないクモ膜下カテーテルでは鎮痛効果が得られない、という仮説を設けることができる。そしてこの仮説は図5に示すデータによって裏付けられる。
【００７１】
この実施例は、疼痛の処置を目的とするクモ膜下ボツリヌス毒素投与の効力と安全性の両方を裏付けている。なぜなら、試用した投与量ではクモ膜下BOTOX（登録商標）投与によって運動障害も血圧変化も起こらなかっただけでなく、クモ膜下BOTOX（登録商標）はCNSに対してそのクモ膜下投与部位だけで限局的な効果を持つらしいこともわかった（図5）からである。
【００７２】
実施例５
クモ膜下投与したA型ボツリヌス毒素の神経障害性疼痛に対する鎮痛効果
この実施例では、A型ボツリヌス毒素がL5、L6神経結紮によって誘発した異痛症を軽減できるかどうかを調べた。Kim S.ら、An Experimental Model for Peripheral Neuropathy Produced by Segmental Spinal Nerve Ligation in the Rat、Pain、50（1992）355-363に記載の方法による外科的神経障害手順に従って、オスSDラット（100〜120g）をイソフルランで麻酔した。L6横突起を露出し、除去した。その後、L4およびL5脊髄神経が分離され、目に見え、3-0絹縫合糸で強く縛ることによってL5の結紮を行った。L6脊髄神経を仙腸関節のすぐ尾側内側に見い出し、これを6-0縫合糸で結紮した。一ヶ月後、異痛症を示すラットに（実施例1で述べたような）クモ膜下カニューレ挿入を行った。
【００７３】
手術後に後肢の変形と趾爪の成長が見られた。ラットは異痛症を発症し、通常は不快感を与えない下記のプロトコールによる機械的刺激に対して、敏感な反応を示した。触覚異痛症はフォン・フライ毛触覚計を使って測定した。A型ボツリヌス毒素（BOTOX（登録商標））の投与前（ベースライン）および投与後にラットを試験した。試験は概日周期の日中部分でのみ行った。肢に完全にアクセスできるように底がワイヤメッシュになっているプラスチックケージにラットを入れた。ケージの探索と目立った毛づくろいが治まるまで、約30分間環境に順化させた。試験した領域は、感度の低い隆起（フットパッド）を避けた坐骨神経分布領域の左後肢中央足底である。実験的に増加する堅さを持つ（0.41、0.70、1.20、2.00、3.63、5.50、8.50および15.10g）一連の8フォン・フライ毛（Stoelting社）の一つで肢に触れた。フォン・フライ毛は肢に対してわずかな屈曲を起こすのに十分な力で足底面に対して垂直に当て、約6〜8秒間維持した。刺激は、先の刺激に対する行動上の反応をはっきり分離できるように、数秒間隔で与えた。肢を素早く引っ込めた場合は陽反応とした。歩行は曖昧な反応とみなし、そのような場合は刺激を繰り返した。手術を受けていない正常なラットおよび擬似手術を受けて治癒したラットでの観察に基づいて、15.10g毛（小さい方のラットの体重の約10％）のカットオフを試験の上限として選択した。なぜなら、これより堅い毛は屈曲するよりもむしろ肢全体を持ち上げがちで、刺激の性質が実質的に変化してしまうからである。
【００７４】
50％逃避閾値（G値）をアップダウン法（Dixon W.、Efficient Analysis of Experimental Observations、Ann Rev Pharmacol Toxicol 1980、20:441-62）によって決定した。このパラダイムでは、上記系列の中央の毛である2.0g毛で試験を開始する。刺激は上方であれ下方であれ常に連続的に与える。最初に選択した毛で肢逃避（引っ込め）反応が認められない場合は、より強い刺激を与える。肢を引っ込めた場合は、次により弱い刺激を選択する。この方法による最適な閾値計算には、50％閾値のすぐ近くで6反応が必要である。閾値は未知なので、どちらかの方向から閾値に近づいたときに一連の同様の反応が得られるだろう。したがって反応は全て記録するが、決定的な6データポイントは反応閾値をまたいでしまうまでは取り始めず、反応閾値をまたいでしまった時点で閾値を挟む2反応を一連の6反応のうちの2反応であるとまず遡及的に指定する。続いて与えられた刺激（ラットの反応に応じて上方または下方に続いて変化する）に対するさらなる4反応が、一連の反応の残りの部分を構成する。
【００７５】
したがって、収集する実際の反応数は、最低4反応（最初の毛2.0gから最弱の毛0.4gに向かって下方に連続して肢を引っ込める場合；閾値は実際の刺激範囲未満にある）から最大9反応（最初の逃避が第5の上方刺激15.1gで起こった後、15.1gまたはそれ以下でも逃避が起こると仮定してさらに4反応を誘発する場合）まで変動した。刺激セットを使い尽くすまで連続した陽反応または陰反応が続けて観察される場合は、15.00gおよび0.25gの値をそれぞれに割り当てる。得られた陽反応および陰反応のパターンを慣例により、X＝逃避（陽反応）、0＝逃避なし（陰反応）として一覧表にし、式：50％グラム閾値＝（10［Xf＝k∂]）/10,000［式中、Xf＝最後のフォン・フライ毛使用の値（log単位）；k＝陽反応と陰反応のパターンについて作成した表からの値；および∂＝刺激間の平均差（log単位）］を使って50％反応閾値を内挿する。
【００７６】
図7（対照，n＝8）は、神経障害ラットにBOTOX（登録商標）を0.625U/kg、0.03ng/kg（n＝11）または3.125U/kg、0.15ng/kg（n＝9）の濃度でクモ膜下投与することにより、ラットにおける異痛症が明らかに軽減され、その鎮痛効果は1週間を越えて持続したことを示している。図4のx軸に沿った時間間隔は、BOTOX（登録商標）のクモ膜下投与後の時間である。G値が高いほど、肢を引っ込ませるのに強い力が必要である。
【００７７】
上記の実施例は、A型ボツリヌス毒素のクモ膜下投与が、炎症性疼痛にも神経障害性疼痛にも顕著で長時間持続する鎮痛効果を持ち、その鎮痛効果は用量依存的かつ部位特異的であることを示している。
【００７８】
さらなる観察により、クモ膜下BOTOX（登録商標）は、使用した用量では、血圧の明らかな変化を引き起こさず、また被験ラットに重大な運動障害を引き起こさないこともわかった。
【００７９】
実施例６
炎症性疼痛の処置
急性炎症性疼痛を持つ45歳の患者を、約0.1U/kg〜30U/kgのA型ボツリヌス毒素のクモ膜下投与（例えば腰部への脊椎穿刺などによる投与）によって処置する。具体的な毒素用量、注射部位、毒素投与の頻度は、上述のように、処置を行う医師の技術の範囲で、様々な要因に依存する。毒素投与後1〜7日以内に患者の疼痛は実質的に軽減される。
【００８０】
ボツリヌス毒素は様々な皮膚節を処置するために（すなわち様々な身体部分の疼痛を処置するために）様々な脊髄レベルに注射することができる。また、チューヒー針を用いた脊椎レベルL3-4またはL4-5での腰椎穿刺により、カテーテルをクモ膜下腔に経皮的に挿入することもできる。CSFフローを確認できたら、カテーテルの設置を検証するためにCアームを使って、シラスティックカテーテルを頭方向に通す。様々なタイプの疼痛および/または痙攣を処置するために、カテーテルは様々な脊椎位置まで進めることができ、そして/または様々な投与濃度で使用することができる。例えばカテーテルは、起こっている疼痛または痙攣の皮膚節レベルのクモ膜下腔内に設置することができる。
【００８１】
実施例７
神経障害性疼痛の処置
神経障害に起因する疼痛を持つ36歳の患者を、約0.1U/kg〜30U/kgのA型ボツリヌス毒素の腰部への脊髄穿刺によるクモ膜下投与によって処置する。1〜7日以内に疼痛症状が実質的に軽減される。
【００８２】
実施例８
脊髄傷害後に起こる疼痛の処置
脊髄傷害後に起こった疼痛を持つ39歳の患者を、約0.1U/kg〜30U/kgのA型ボツリヌス毒素の脊髄（脊髄の腰部など）へのクモ膜下投与（例えば脊椎穿刺またはカテーテル法などによる投与）によって処置する。具体的な毒素用量、注射部位、毒素投与の頻度は、上述のように、処置を行う医師の技術の範囲で、様々な要因に依存する。毒素投与後1〜7日以内に患者の疼痛は実質的に軽減される。
【００８３】
実施例９
肢傷害後に起こる疼痛の処置
手、腕、足または脚への傷害後に起こった疼痛を持つ51歳の患者を、約0.1U/kg〜30U/kgのA型ボツリヌス毒素の脊髄（脊髄の腰部など）へのクモ膜下投与（例えば脊椎穿刺またはカテーテル法などによる投与）によって処置する。具体的な毒素用量、注射部位、毒素投与の頻度は、上述のように、処置を行う医師の技術の範囲で、様々な要因に依存する。毒素投与後1〜7日以内に患者の疼痛は実質的に軽減される。
【００８４】
実施例１０
癌に伴う疼痛の処置
癌に伴う疼痛に苦しむ63歳の患者を、約0.1U/kg〜30U/kgのA型ボツリヌス毒素の脊髄（脊髄の腰部など）へのクモ膜下投与（例えば脊椎穿刺またはカテーテル法などによる投与）によって処置する。具体的な毒素用量、注射部位、毒素投与の頻度は、上述のように、処置を行う医師の技術の範囲で、様々な要因に依存する。毒素投与後1〜7日以内に患者の疼痛は実質的に軽減される。
【００８５】
実施例１１
糖尿病に伴う疼痛の処置
糖尿病に伴う疼痛に苦しむ47歳の患者を、約0.1U/kg〜30U/kgのA型ボツリヌス毒素の脊髄（脊髄の腰部など）へのクモ膜下投与（例えば脊椎穿刺またはカテーテル法などによる投与）によって処置する。具体的な毒素用量、注射部位、毒素投与の頻度は、上述のように、処置を行う医師の技術の範囲で、様々な要因に依存する。毒素投与後1〜7日以内に患者の疼痛は実質的に軽減される。
【００８６】
本願発明に従って疼痛を処置するための脊髄内神経毒投与法には、例えば以下に述べるように多くの利益および利点がある。
1．疼痛の症状を劇的に軽減することができる。
2．1回の神経毒注射で疼痛の症状を約2〜約4ヶ月間軽減することができる。
3．注射した神経毒はCNS部位特異的抗侵害受容効果を発揮する傾向がある。
4．注射した神経毒はCNS注射部位から離れた位置に拡散または輸送される傾向がほとんどまたは全くない。
5．神経毒の脊髄内注射に起因する顕著な望ましくない副作用はほとんどまたは全くない。
6．脊髄内注射される神経毒量は、他の投与経路（すなわち筋肉内、括約筋内、経口または非経口投与）によって同等な効果を達成するのに必要な同神経毒の量よりもかなり少なくすることができる。
7．本方法の抗侵害受容効果は、多くの場合、患者の運動能の増大、積極的な態度の増進、および生活の質の改善という望ましい副次的作用をもたらす。
【００８７】
特定の好ましい方法に関して本発明を詳細に説明したが、他の実施形態、変法および変形も本発明の範囲内で考えられる。例えば本発明の方法には広範囲にわたる様々な神経毒を有効に使用することができる。また本発明の方法は、2または3以上の神経毒（例えば2または3以上のボツリヌス毒素）を同時にまたは引き続いて投与する脊髄内投与法も包含する。例えばA型ボツリヌス毒素を臨床反応が喪失するか中和抗体が生成するまで脊髄内投与した後、E型ボツリヌス毒素を投与することができる。あるいは、所望する処置成果の発現および持続時間を調節するために、2または3以上のボツリヌス毒素血清型A〜Gの組み合わせを脊髄内投与することもできる。さらに、例えば鎮痛効果を増進したり、ボツリヌス毒素などの神経毒がその鎮痛効果を発揮し始める前により迅速な鎮痛効果を発揮したりするなどの補助効果を得るために、神経毒の投与に先立って、または神経毒の投与と同時に、または神経毒の投与後に、非神経毒化合物を脊髄内投与することもできる。
【００８８】
神経毒の脊髄内投与による疼痛処置のための医薬の製造にボツリヌス毒素などの神経毒を使用することも、本発明の範囲に包含される。
【００８９】
したがって特許請求の範囲の思想と範囲は上述した好ましい実施形態の説明に制限されないものとする。
【図面の簡単な説明】
図1〜7のいずれにおいても、「注入」とはクモ膜下注入を意味する。
【図１】  本発明の範囲に包含される方法が、ラットホルマリンモデルにおいて誘発炎症性疼痛を軽減することを示す用量反応グラフ。x軸はラットにおけるホルマリンモデル開始後の時間を分の単位で表す。y軸は、ホルマリン投与開始の2時間〜5時間前に対照（生理食塩水、n＝11）ならびに濃度0.0625U/kg（n＝10）、0.625U/kg（n＝14）および3.125U/kg（n＝9）のBOTOX（登録商標）（A型ボツリヌス毒素精製神経毒複合体）注入を使用した場合に、ホルマリン注射肢のリフティングとリッキングに費やされた時間を表す。
【図２】  本発明の範囲に包含される方法が、ラットホルマリンモデルにおいて、ホルマリン試験開始の半時間より前に注入した場合に、少なくとも7日間は誘発炎症性疼痛を軽減することを示す時間経過グラフ。x軸はラットにおけるホルマリンモデル開始後の時間を分の単位で表す。y軸は、対照注入（生理食塩水、n＝8）および濃度0.625U/kgのBOTOX（登録商標）注入（ホルマリン投与開始の0.5時間前、2時間〜5時間前（n＝14）および7日前（n＝5）に注入）を使用した場合に、ホルマリン注射肢のリフティングとリッキングに費やされた時間を表す。
【図３】  本発明の範囲に包含される方法が、様々な濃度のA型ボツリヌス毒素を使用した場合に、ラットホルマリンモデルにおいて、少なくとも7日間は誘発炎症性疼痛を軽減することを示す用量反応グラフ。x軸はラットにおけるホルマリンモデル開始後の時間を分の単位で表す。y軸は、対照注入（生理食塩水、n＝11）ならびに濃度0.0625U/kg（n＝8）、濃度0.625U/kg（n＝7）および濃度3.125U/kg（n＝6）のBOTOX（登録商標）注入（ホルマリン投与開始の7日前に注入）を使用した場合に、ホルマリン注射肢のリフティングとリッキングに費やされた時間を表す。
【図４】  本発明の範囲に包含される方法が、ラットホルマリンモデルにおいて誘発炎症性疼痛を軽減することを示す時間経過グラフ。x軸はラットにおけるホルマリンモデル開始後の時間を分の単位で表す。y軸は、対照（生理食塩水、n＝11）および濃度0.625U/kgのBOTOX（登録商標）（n＝4）（ホルマリン投与開始の2時間14日前に注入）を注入した場合に、ホルマリン注射肢のリフティングとリッキングに費やされた時間を表す。
【図５】  ラットホルマリンモデルにおける誘発炎症性疼痛に対するA型ボツリヌス毒素とムシモールの鎮痛効果の比較を示すグラフ。x軸は、ラットにおけるホルマリンモデル開始後の時間を分の単位で表す。y軸は、対照注入（生理食塩水、n＝11）、ホルマリン投与開始の2時間〜5時間前または6日前に注入した濃度0.625U/kgのBOTOX（登録商標）、および10分前または6日前に注入した1μgのムシモールを使用した場合に、ホルマリン注射肢のリフティングとリッキングに費やされた時間を表す。
【図６】  本発明の範囲に包含される方法が、ラットホルマリンモデルにおいて誘発炎症性疼痛を局所クモ膜下鎮痛効果によって軽減することを表すグラフ。x軸はラットにおけるホルマリンモデル開始後の時間を分の単位で表す。y軸は、ホルマリン注射肢のリフティングとリッキングに費やされた時間を表す。対照の場合、生理食塩水のクモ膜下注入に使用したカテーテルはその挿入点から尾側に4.5cm（n＝1）または8.5cm（n＝11）（したがって腰膨大）の位置に置いた。濃度0.625U/kg（n＝3）または3.125U/kg（n＝4）のBOTOX（登録商標）は、挿入点から尾側に4.5cmの位置にあるカテーテルだけを通して注入した。
【図７】  本発明の方法に包含される方法が、手術によって誘発された神経障害性疼痛を軽減することを表すグラフ。x軸は生理食塩水（n＝8）または濃度0.625U/kg（n＝11）もしくは3.125U/kg（n＝9）のBOTOX（登録商標）を注入した後の経過時間を時間の単位で表す。y軸は鎮痛効果の尺度であるG値を表す。BLはベースラインを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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