(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0004943585.tif 000018
[式中、
Ｒ6は、独立に、Ｈ、アルキル基および置換アルキル基から成る群より選択され；
Ｒ４およびＲ5は、独立に、置換アルキル基であるか、または置換アリール基で置換されたアルキル基であり；
Ｒ3、Ｒ8およびＲ9は、独立に、アルキレン基であり；
ここで、置換アルキルは、Ｃ1-Ｃ6アルキル、アリール、アシル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキサ、飽和または不飽和環状炭化水素、および複素環から選ばれる１以上の置換基を含むアルキルであり；
置換アリールは、（ａ）Ｃ1-Ｃ6アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、フェノキシ、メルカプト、および飽和または不飽和環状炭化水素から選択される１以上の置換基、並びに（ｂ）式：
【化２】
0004943585.tif 000019
（Ｒ7は、Ｈ、アルキル基および前記置換アルキル基から成る群より選択される。）
の構造を有する基、から選ばれる。]
の構造を有する化合物。
【請求項２】
Ｒ3、Ｒ8およびＲ9は、各々、Ｃ1〜Ｃ10アルキレンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ3、Ｒ8およびＲ9は、各々、Ｃ2〜Ｃ6アルキレンである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ3は直鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキレンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
式：
【化３】
0004943585.tif 000020
（式中、
Ｍ、ｎ、ＰおよびＺは、１〜５の整数から成る群から独立して選択され；
Ｒ3、Ｒ6およびＲ7は、請求項１で定義したとおりである。）
の構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式：
【化４】
0004943585.tif 000021
（Ｒ7は、請求項１で定義したとおりである。）
の構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
金属イオンと請求項１に記載の化合物との間で形成される錯体。
【請求項８】
前記錯体はルミネセンスを放出する、請求項７に記載の錯体。
【請求項９】
前記ルミネセンスは円偏光ルミネセンスである、請求項８に記載の錯体。
【請求項１０】
前記ルミネセンスは、前記錯体の電気化学的励起によって生じる、請求項７に記載の錯体。
【請求項１１】
前記金属イオンは、ランタニド系列のイオンである、請求項７に記載の錯体。
【請求項１２】
少なくとも０．１の量子効率を有する、請求項１１に記載の錯体。
【請求項１３】
前記ランタニド系列のイオンが、ユーロピウム、テルビウムおよびそれらの組合せから選択される金属のイオンである、請求項１２に記載の錯体。
【請求項１４】
前記金属がテルビウムである、請求項１３に記載の錯体。
【請求項１５】
前記ランタニド系列のイオンは、テルビウム、サマリウム、ユーロピウム、ジスプロシウムおよびネオジミウムから成る群から選択された金属イオンである、請求項１１に記載の錯体。
【請求項１６】
前記金属がテルビウムであり、前記化合物が以下：
【化５】
0004943585.tif 000022
（式中、ｎが１、２または３である。）
の構造を有する、請求項１５に記載の錯体。
【請求項１７】
ｎが３である、請求項１６に記載の錯体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
研究および診断用の混合物から被験物としての化学物質、生化学物質および生体物質を検出、定量するための迅速な、高特異性の方法はたえず、ますます強く求められている。特に貴重なのは、少量の核酸、ペプチド、医薬、代謝産物、微生物および診断上意義のある他物質を測定する方法である。そうした物質の例は低分子の生体活性物質（麻薬や毒薬、治療薬、ホルモンなど）、病原性の微生物やウィルス、抗体、それに酵素や核酸など、特に病状に関連するものである。
【０００２】
特定の被験物の存在はしばしば、多くの生化学系、生体系を特徴づける高度の特異性に着目した結合法によって判別することができる。よく使用される方法は、たとえば抗原−抗体系や核酸ハイブリダイゼーション、タンパク質−配位子系などを基礎にしている。これらの方法では、診断上意義のある複合体の存在が一般に、1種以上の相互作用物質にあらかじめ結合させておいた観察可能な「標識」の有無により判別される。選択される具体的な標識法はしばしば、目的の被験物を検出するための特定系の有効性と多用途性を決定する。好ましい標識は廉価、安全で、しかも多様な化学、生化学および生体物質に、そうした物質の重要な結合特性をあまり変化させることなく能率的に結合させることができるものである。標識はきわめて特徴的なシグナルを発して、かつ天然にはめったに、好ましくはまったく存在しないものがよい。標識は最長数か月間にわたって水性系中で安定的かつ検出可能であるのがよい。標識の検出は高価な専門の施設または格別の安全対策を必要とせず、迅速、高感度で再現可能であるのが好ましい。標識の定量は、温度や検査対象混合物の組成といった変数と比較的無関係であるのが好ましい。
【０００３】
多様な標識がこれまでに開発されてきたが、それぞれ一長一短がある。たとえば放射性標識はきわめて用途が広く、またごく低濃度でも検出可能であるが、高価、危険であり、その使用には精巧な装置と熟練要員が必要となる。そのため非放射性標識、特に分光測光法や電子スピン共鳴法、発光法による観察が可能である標識、およびそうした分子を産生する酵素などのような反応性物質に対し、幅広い関心が向けられている。
【０００４】
蛍光分光法を使用して検出することができる標識は、技術上周知のものがきわめて多いという意味で、特に重要である。さらに、他分子にたやすく結合させうるように誘導される蛍光標識の合成法が文献に満ちあふれているし、またその種の蛍光標識は市販されているものも多い。
【０００５】
蛍光標識には、直接検出が可能なだけでなく隣接する第2蛍光標識の蛍光を消光するようはたらくものも多い。こうした蛍光化学種の消光機能は、消光団と蛍光団の間の距離と相互作用の度合いに依存するため、分子のコンホメーションや結合等の相互作用に対する敏感なプローブを提供してくれる。蛍光リポーター−消光団ペアの優れた用例は核酸の検出と分析に見られる。
【０００６】
別の検出法としては時間分解蛍光分光法があり、これは理論的にはオートラジオオグラフィーよりも敏感である。この方法では長発光寿命のキレート化ランタニド金属を目的分子に結合させる。パルス励起とゲート検出装置の組み合わせにより、短寿命のバックグラウンド発光との効果的な識別が可能になる。たとえば、この方法を用いて、ユーロピウム標識抗体を介してDNAハイブリッドを検出定量する手法はすでに実証されている［Syvanen et al., Nucleic Acids Research 14:1017-1028 (1986)］。さらに、Eu標識ストレプトアビジンを使用したマイクロタイターウェルでのビオチニル化DNAの測定も行われた［Dahlen, Anal. Biochem. 164:78-83 (1982)］。しかし、この種の検定法には標識をプローブから洗い去り、またその蛍光を増強液中で発現させなければならないという短所がある。さらに、生成する蛍光の寿命がナノ秒(ns)台にすぎず、短寿命すぎて標識分子の十分な検出やバックグラウンド蛍光からの識別には概して耐え得ないという欠点もある。
【０００７】
予測可能な実際的な利点を考えると、使用されるランタニドキレートは減衰時間10 μs超の遅延蛍光を示すのが一般に望ましいとされるに至っている。既知の蛍光キレートには蛍光が水による阻害を受けやすいものも多い。検定法、特に免疫検定法では一般に水が不可欠なので、水の存在下で蛍光が阻害されるランタニド錯体は多くの用途でかなり不都合または非実用的とみなされる。さらに、蛍光減衰時間の短さも欠点と考えられる。こうした蛍光阻害は、配位結合する水分子に対するランタニドイオンの親和性に起因する。ランタニドイオンに水分子が配位結合していると吸収光エネルギー（励起エネルギー）は蛍光として放出されずに錯体から溶媒へと伝達する。
【０００８】
したがって、優れた蛍光特性をもつランタニドキレート特に協調的飽和キレートが大いに望ましい。あるいは、水の存在下で満足な蛍光を示す協調的不飽和ランタニドキレートもまた好都合である。1以上の検定成分との結合を可能にするよう誘導されるその種のキレートは多様な検定方式に使える。本発明はこれらやそれ以外の化合物、およびそうした化合物を使用する検定方法を提供する。
発明の要約
（蛍光と燐光を含む）発光マーカーには化学や医学、工学の分野で多様な用途がある。多くの場合、これらのマーカーは放射性標識や色原体、放射線−濃染料などの強力な代用品となる。さらに、蛍光分光装置の改良により達成可能な感度が増し、定量分析が可能になってきた。
【０００９】
ランタニドキレートと時間分解蛍光分光法の組み合わせは免疫化学ツールとして一般に受け入れられている。目下の好ましいランタニドイオンはDy3+、Sm3+、Tb3+、Er3-およびEu3+、Nd3+、Yb3+などである。La3+、Gd3+、Lu3+などのような他のランタニドイオンも有用であるが、一般にそれほど好ましくはない。
【００１０】
本発明は、発光性にきわめて優れ、また蛍光検定法用の蛍光マーカーおよびプローブとして望ましい特徴を数多く備えたランタニド錯体を提供する。そうした利点はたとえば、1)キレート剤としても発色団／エネルギー伝達手段としても機能する配位子、2)錯体のランタニドイオン蛍光の、水中での、ミセルやフッ化物などの外的増強手段をまたない、きわめて高い量子収量、3)錯体の高い水中安定性および可溶性、4)値段の安い出発原料を使用するきわめて容易な合成、5)これらの発光プローブを、たとえば免疫反応物質または固形担体（高分子など）に結合するための多数の誘導体の入手しやすさなどである。
【００１１】
本発明は、構造内にサリチルアミド部分を組み込んだ新種のランタニド−錯化配位子およびこれらの配位子の発光金属錯体を提供する。本発明の化合物はサリチルアミド系の単座配位子、四座配位子および他の五座以上の多座配位子を含む。本発明の化合物は容易に高収量で調製される。
【００１２】
したがって、本発明は一態様においてランタニド系列の金属イオンと少なくとも1個のサリチルアミジル部分を含む錯化剤とを含んで成る発光ランタニド金属キレートを提供する。
【００１３】
本発明は第2の態様において、式Ｉ
【００１４】
【化１４】
0004943585.tif 000002
【００１５】
で示される化合物を提供する。
【００１６】
式Ｉ中、R1とR2はアルキル基、置換アルキル基、ハロゲンおよび-OR6から成る群より独立に選択されるが、この場合のR6はH、アルキル基、置換アルキル基および単一負電荷から成る群より選択される。R4、R5、R7、R10およびR20はH、アルキル基および置換アルキル基から成る群より独立に選択される。R3、R8およびR9はアルキル基と置換アルキル基から成る群より独立に選択される。R11、R12、R13、R21、R22およびR23はアルキル基、置換アルキル基、H、-NR14R15、-NO2、-OR16、-COOR17（ただしR14、R15、R16およびR17はH、アルキル基および置換アルキル基から成る群より独立に選択される）から成る群より独立に選択されるが、この場合、R12は随意にR11、R13またはその両方と環を形成することができるし、またR22はR21、R23またはその両方と随意に環を形成することができる。これらの環は、環式アルキル、置換環式アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式および飽和ヘテロ環式の各環系から成る群より独立に選択される。Q1は-OR18であり、Q2は-OR19であるが、この場合のR18とR19はH、酵素的に不安定な基、加水分解的に不安定な基および単一負電荷から成る群より独立に選択される。文字aおよびzは0と1から成る群より選択されるが、ただしaが0の場合にはN1’はカルボニル基の1’位に直接、共有結合的に結合し、またzが0の場合にはN2’がカルボニル基の2’に直接、共有結合的に結合するものとする。
発明と好ましい実施態様の詳細な説明
略号
略号SLは本書では本発明のサリチルアミジル系配位子を指す。SLは本発明の配位子を、遊離状態と1以上の金属イオンとの錯形成状態の両方とも包摂する。さらにSLは1以上のサリチルアミジル基と1以上のフタミジル基から成る組み合わせを含む配位子（＝SPL）をも包摂する。
定義
本書で使用する諸々の専門用語、学術用語は一般に、別段の定義がない限り、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味をもつ。一般に分子生物学、有機・核酸化学およびハイブリダイゼーションの分野に関しては、本書で使用する命名法と以下で説明する実験手順は技術上周知であり、常用されているものである。核酸とペプチドの合成には標準手法を使用する。一般に酵素反応と生成ステップはメーカーの仕様書に従って行う。種々の手法と手順は一般に関連技術分野における通常の方法および本書で随時掲げる種々の一般的な参考文献［一般に、参照指示により本書に組み込まれるSambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed.(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照］に従って行う。分析化学や有機合成の分野に関しては、本書で使用する命名法と以下で説明する実験手順は技術上周知であり、常用されているものである。化学合成と化学分析には標準手法とその修正版を使用する。
【００１７】
「被験物」は本書では、診断試験の対象、目的となる任意の化合物または分子、たとえば生体高分子または低分子の生体活性物質を意味する。被験物の例はタンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウィルス、基質、代謝産物、遷移状態の類似物、補因子、阻害物質、薬物、染料、栄養物、増殖因子などであるが、それだけに限らない。
【００１８】
「エネルギー伝達」は本書では、蛍光団の蛍光発光が蛍光変性団による変性を受ける過程をいう。蛍光変性団が消光団であれば蛍光団からの蛍光発光は減衰（消光）する。エネルギー伝達は蛍光共鳴エネルギー伝達を通じて、または直接エネルギー伝達を通じて起こりうる。これら2つの場合の厳密なエネルギー伝達機構は異なる。本書でいうエネルギー伝達は機構的に明確に異なるこれらの現象をすべて包摂するものとする。
【００１９】
「エネルギー伝達対」は本書では、エネルギー伝達に関与する任意の2分子をいう。一般に、一方の分子は蛍光団として働き、他方の分子は蛍光変性団として働く。本発明の好ましいエネルギー伝達対は本発明の蛍光団と消光団から成る。本書ではエネルギー伝達対の個別メンバーの本体に対する制限は何もない。要求されるのはただ、エネルギー伝達対全体としての分光特性が、個別メンバー間の距離が何らかの臨界量だけ変化したときに測定可能な形で変化するという条件だけである。
【００２０】
「エネルギー伝達対」は、エネルギー伝達の場となる単一錯体を形成する分子団を指す。そうした錯体はたとえば、互いに異なる2つの蛍光団と１つの消光団、2つの消光団と1つの蛍光団、または複数の蛍光団と複数の消光団を含む場合があろう。複数の蛍光団や複数の消光団が存在する場合、個々の原子団は互いに異なってもよい。
【００２１】
「蛍光変性団」は本書では、蛍光団からの蛍光発光を何らかの形で変化させることができる本発明の分子をいう。蛍光変性団は一般にエネルギー伝達機構を通じてその機能を果たす。蛍光発光は蛍光変性団の本体次第で、減衰、完全消光、増強、波長シフト、偏向性シフト、蛍光寿命の変化などを含むがそれだけに限らない多数の変化をこうむることができる。
【００２２】
「蛍光共鳴エネルギー伝達」または「FRET」はFETと互換的に使用されるが、励起された蛍光団によって放出される光が本発明の蛍光変性団により少なくとも部分的に吸収されるエネルギー伝達現象をいう。蛍光変性団が消光団である場合には、その基は吸収光のかなりの部分を異なる波長の光としては放出しないで、熱として放散するのが好ましい。FRETは蛍光団の発光スペクトルと消光団の吸収スペクトルの間の重複に依存する。FRETはまた消光団と蛍光団の間の距離にも依存する。
【００２３】
「部分」は別の部分に結合する分子のラジカルをいう。
【００２４】
「核酸」は本書では、DNA、RNA、一本鎖・ニ本鎖またはもっと高集合性のハイブリダイゼーションモチーフ、およびその任意の化学修飾態をいう。修飾は、追加の電荷、分極性、水素結合、静電的相互作用およびフラクショナリティーを組み込む化学基を核酸配位子塩基または核酸配位子総体に与えるものなどを含むが、それだけに限らない。そうした修飾態はペプチド核酸、ホスホジエチル基修飾（ホスホロチオエート、メチルホスホネートなど）、2’位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、環外アミン修飾、4-チオウリジン置換、5-ブロモ-または5-ヨード-ウラシル置換、主鎖修飾、メチル化、異常塩基対合の組み合わせ（イソ塩基、イソシチジン、イソグアニジンなど）を含むが、それだけに限らない。また、修飾にはSL、蛍光団または別の部分によるキャッピングなどのような3’位および5’位修飾を含めてもよい。
【００２５】
「消光団」は本書では、蛍光団によって放出される光を少なくとも部分的に減衰させることができる本発明の任意の蛍光変性団をいう。したがって、消光団の存在下に蛍光団を照射すると発光シグナルは予想外に弱くなるか、または完全に欠けることになる。消光は一般に蛍光団と消光団の間のエネルギー伝達を通じて起こる。
【００２６】
「ペプチド」は、アミノ酸である単量体がアミド結合を形成している高分子をいい、ポリペプチドともいう。アミノ酸がαアミノ酸である場合には、L型光学異性体、D型光学異性体いずれでも使用できる。さらに、βアラニンやフェニルグリシン、ホモアルギニンなどのような非天然アミノ酸も含まれる。本発明には、遺伝子にコード化されていないが普通に存在するアミノ酸を使用してもよい。本発明に使用されるすべてのアミノ酸はD型異性体、L型異性体のいずれでもよい。一般にL型異性体が好ましい。さらに、他の疑似ペプチドも本発明には有用である。概説としては、Spatola, A.F. in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983)を参照。
【００２７】
「アルキル」は本書では、一般に炭素原子数が約1〜20の、好ましくは4〜20の、もっと好ましくは6〜18の、枝分かれした、または枝分かれしない飽和または不飽和の一価炭化水素基をいう。アルキル基は炭素原子数が1〜6の場合には「低級アルキル」という。適当なアルキル基は、たとえば1以上のメチレン、メチン基をもつ構造などである。枝分かれ構造はi-プロピル、t-ブチル、i-ブチル、2-エチルプロピルなどと類似の枝分かれモチーフをもつ。この用語は本書では「置換アルキル」と「環式アルキル」を包摂する。
【００２８】
「置換アルキル」は上述のアルキルであって、1以上の置換基を含むものをいい、置換基の例としては低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン（すなわち、CF3などのようなハロアルキル）、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルアミド、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和・不飽和両環式炭化水素、ヘテロ環式などがある。これらの基はアルキル部分の任意の炭素または置換基に結合してよい。さらに、これらの基はアルキル鎖の側鎖でも、アルキル鎖と一体化していてもよい。
【００２９】
「アリール」は本書では芳香族置換基をいい、単一芳香環でもよいし、融合した、共有結合した、またはメチレンまたはエチレン部分などのような共通基に結合した複数の芳香環でもよい。共通の結合基はベンゾフェノンの場合のようにカルボニルでもよい。芳香環としてはフェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチル、ベンゾフェノンなどがある。「アリール」は「アリールアルキル」と「置換アリール」を包摂する。
【００３０】
「置換アリール」は上述のアリールであって、1以上の官能基を含むものをいい、官能基としては低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（CF3など）、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、フェノキシ、メルカプト、および（芳香環と融合した、共有結合した、またはメチレンまたはエチレン部分などのような共通基に結合した）飽和・不飽和両環式炭化水素などがある。結合基はシクロヘキシルフェニルケトンなどの場合のようにカルボニルでもよい。「置換アリール」は「置換アリールアルキル」を包摂する。
【００３１】
「アリールアルキル」は本書では、「アリール」の部分集合であって、アリール基が本書で定義するアルキル基によって他の基に結合しているものをいう。
【００３２】
「置換アリールアルキル」は、「置換アリール」の部分集合であって、置換アリール基が本書で定義するアルキル基によって他の基に結合しているものをいう。
【００３３】
「アシル」はケトン置換基-C(O)Rをいう。ここに、Rは本書に定義するアルキルまたは置換アルキル、アリールまたは置換アリールである。
【００３４】
「ハロゲン」はフッ素、臭素、塩素およびヨウ素原子をいう。
【００３５】
「ヒドロキシル」は-OH基をいう。
【００３６】
「アミノ」は-NRR’基をいう。ここに、RとR’は独立にH、アルキル、アリールまたはその置換類似体である。「アミノ」は、第2級および第3級アミンを意味する「アルキルアミノ」とRC(O)NR’基を意味する「アシルアミノ」を包摂する。
【００３７】
「アルコキシ」は本書では-OR基をいう。ここに、Rはアルキルまたはその置換類似体である。適当なアルコキシ基はメトキシ、エトキシ、t-ブトキシなどである。
【００３８】
「アリールオキシ」は本書では、酸素原子を介して直接別の基に結合している芳香族基をいう。この用語は、芳香族基が前述のように「置換アリール」に置換している「置換アリールオキシ」部分を包摂する。アリールオキシ部分の例はフェノキシ、置換フェノキシ、ベンジルオキシ、フェネチルオキシなどである。
【００３９】
「アリールオキシアルキル」は本書では、本書で定義するアルキル基に酸素原子を介して結合した芳香族基をいう。「アリールオキシアルキル」は、芳香族基が前述のように「置換アリール」に置換している「置換アリールオキシアルキル」部分を包摂する。
【００４０】
「メルカプト」は本書では、一般構造-S-Rの部分をいう。ここに、RはH、アルキル、アリール、または本書で定義するヘテロ環式である。
【００４１】
「飽和環式炭化水素」はシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルなどやその置換類似体のような基をいう。これらの環式炭化水素は単環、多環いずれの構造でもよい。
【００４２】
「不飽和環式炭化水素」は、シクロペンテン、シクロヘキセンなどやその置換類似体のような、少なくとも1個の二重結合をもつ一価非芳香族基をいう。これらの環式炭化水素は単環、多環いずれの構造でもよい。
【００４３】
「ヘテロアリール」は本書では、芳香環であって、芳香環の1個以上の炭素原子が窒素、酸素、硫黄などのようなヘテロ原子によって置換されているものをいう。ヘテロアリールの構造は、単芳香環や多芳香環でも、または1個以上の非芳香環と結合した1個以上の芳香環でもよい。多環構造では、環は融合していても、共有結合していても、あるいはメチレンまたはエチレン部分などのような共通基に結合していてもよい。共通結合基はフェニルピリジルケトンの場合のようにカルボニルでもよい。チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、フランなどの環やそのベンゾ融合類似体は本書では「ヘテロアリール」として定義される。
【００４４】
「ヘテロアリールアルキル」は、「ヘテロアリール」の部分集合であって、本書の定義によるアルキル基がヘテロアリール基を他の基に結合させているものをいう。
【００４５】
「置換ヘテロアリール」は、前述のヘテロアリールであって、ヘテロアリール核が1以上の官能基、たとえば低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（CF3など）、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプトなどによって置換されているものをいう。したがって、ヘテロ環式芳香環の置換類似体、たとえばチオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、フランなどやそれらの環のベンゾ融合類似体は「置換ヘテロアリール」とされる。
【００４６】
「置換ヘテロアリールアルキル」は、前述の置換ヘテロアリールの部分集合であって、本書の定義によるアルキル基がヘテロアリール基を別の基に結合させているものをいう。
【００４７】
「ヘテロ環式」は本書では、環内の炭素原子数が1〜12、ヘテロ原子（窒素、硫黄または酸素から選択される）数が1〜4の単環または複数の縮合環をもつ一価の飽和または不飽和非芳香族基をいう。ヘテロ環式の例はテトラヒドロフラン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどである。
【００４８】
「置換ヘテロ環式」は本書では、「ヘテロ環式」の部分集合であって、本書での定義によるアルキル基がヘテロ環式基を別の基に結合させているものをいう。
序論
本発明は、サリチルアミジル系配位子（SL）の金属キレート、特にランタニド系列キレートを土台にした発光プローブ群を提供する。本発明の他の化合物（SPL）は、単一配位子中にサリチルアミジル部分とフタミジル部分の両方を含む。本発明の化合物は光を放出する。またはリポーター蛍光団によって放出される光を吸収するために使用することができる。本発明の蛍光団は溶液検定に低分子として使用することができるし、あるいは被験物に結合させて、または被験物と相互し被験物の検出や定量を可能にするような化学種に結合させて、標識として使用することができる。
【００４９】
蛍光標識には、取り扱い注意が少なくてすむ、高処理量の視覚化手法（コンピュータを含む統合系による画像のデジタル化処理による分析などを含む光学的分析）になじみやすいなどの利点がある。好ましい標識は一般に、高感度、高安定性、低バックグラウンド、長寿命、低環境感度および高特異性標識などの特徴を1つ以上そなえる。
【００５０】
本発明の蛍光団は、エネルギー伝達プローブ成分としての他の蛍光団または消光団と併用することができる。多数の蛍光標識が本発明のSLやSPLとの併用に有効である。その種の標識は市販されているものも多く、たとえばSIGMA Chemical Company(ミズーリ州セントルイス)、Molecular Probes(オレゴン州ユージン)、R&D Systems(ミネソタ州ミネアポリス)、 Pharmacia LKB Biotechnology(ニュージャージー州ピスカタウェー)、CLONTECH(カリフォルニア州パロアルト)、Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company(ウィスコンシン州ミルウォーキー)、Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc.(メリーランド州ゲーサーズバーグ)、Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG。スイス／ブッフス)、Applied Biosystems(カリフォルニア州フォスターシティー)や、当業者には周知のその他多数の業者から出ている。さらに、当業者は特定の用途に合わせて適当な蛍光団を選択する方法を認識しているだろうし市販品として入手できない場合には必要な蛍光団を新規に合成し、あるいは市販の蛍光化合物を合成的に改変して所望の蛍光レベルに到達させることもできよう。
【００５１】
低分子の蛍光団に加えて、天然の蛍光タンパク質やそうしたタンパク質の改変類似体もまた本発明のSLやSPLとの併用に有効である。その種のタンパク質には刺胞動物の緑色蛍光タンパク［Ward et al., Photochem, Photobiol. 35:803-808(1982); Levine et al., Comp. Biochem. Physiol., 72B:77-85(1982)］、Vibrio fischeri株由来の黄色蛍光タンパク［Baldwin et al., Biochemistry 29:5509-15(1990)］、渦鞭藻類Symbiodinium sp.由来のペリジニン−クロロフィル［Morris et al., Plant Molecular Biology 24:673-77 (1994)］、Synechococcusなどの海洋シアノバクテリアに由来するフィコビリンタンパク、たとえばフィコエリトリンやフィコシアニン［Wilbanks et al., J.Biol.Chem. 268::1226-35(1993)］などがある。
【００５２】
本発明の化合物はプローブとして、特定のイオンを他の溶質から分離する手段として、鏡検、酵素学、臨床化学、分子生物学および医学の分野におけるプローブとして使用できる。本発明の化合物は光力学治療などのような物理療法の治療薬として、磁気共鳴映像法などのような画像診断法の診断薬としても有効である。さらに、本発明の化合物は光の光学増幅器、導波管などのコンポーネントとしても有用である。また、本発明の化合物は紙幣等の流通証券に使用されるようなインクや染料に組み込むこともできる。
【００５３】
本発明の化合物は技術上周知の方法、たとえば光や電気化学エネルギーで励起することにより発光させることができる［Kulmala et al., Analytica Chimica Acta 386:1(1999)などを参照］。発光は本発明のキラル化合物の場合には、円偏光させることができる［たとえばRiehl et al., Chem. Rev. 86:1(1996)を参照］。
【００５４】
以下の項で説明する化合物、プローブおよび方法は一般に本発明の化合物およびそうした化合物が使用可能な方法を表す。以下の説明は本発明の特定の側面と実施態様を解説しようとするものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
化合物
本発明は、少なくとも1個のサリチルアミジル部分を骨組み構造内にもつサリチルアミジル系金属キレート配位子（SL）を数多く提供する。このキレート基は少なくとも1個のサリチルアミジル基を、好ましくは2〜100個のサリチルアミジル基を、もっと好ましくは3〜75個のサリチルアミジル基を、さらにもっと好ましくは4〜50個のサリチルアミジル基を、そしてなおいっそう好ましくは5〜25個のサリチルアミジル基を含む。この錯体はまた、量子収量が好ましくは少なくとも約0.1である。さらにもっと好ましくは、錯体のランタニドイオンはユーロピウム、テルビウムおよびそれらの組み合わせから選択される。
【００５５】
キレート基に含まれる少なくとも1個のサリチルアミジル基は1以上の電子吸引性基および／または電子供与性基で置換することができる。どの置換基が、芳香環に付加したときに、電子吸引性または電子供与性を示すかは当業者には自明であろう。本発明のSLに含めるのに適した置換基の表は文献に求めることができる。たとえばHammett, J. Am. Chem. Soc. 59: 96 (1937); Johnson, THE HAMMETT EQUATION, Cambridge University Press, New York, 1973; Hansch et al., J. Med. Chem. 16:1207(1973);およびHansch et al., SUBSTITUENT CONSTANTS FOR CORRELATION ANALYSIS CHEMISTRY AND BIOLOGY, Wiley, New York, 1979を参照。
【００５６】
さらに、錯体のサリチルアミジル基は実質的に任意の長さおよび化学組成の主鎖によって結合することができる。ただし、主鎖はサリチルアミジル環および他の環を、所望金属イオンの錯化を助長するように配向する必要がある。主鎖はまた、錯体の使用条件に対して安定的であることが一般に好ましい。したがって、代表的な主鎖は、たとえばアルキル基、置換アルキル基、接合不飽和系、アリール基、ヘテロアリール基、デンドリマー、ポリエーテル、ポリアミド、ポリイミン、生体高分子、およびこれらの基の1以上の組み合わせである主鎖などが含まれる。他の有用な主鎖系は当業者には自明であろう。
【００５７】
本発明は第2の態様において、式Ｉで示される構造をそなえた化合物を提供する：
【００５８】
【化１５】
0004943585.tif 000003
【００５９】
式Ｉ中、R1とR2はアルキル基、置換アルキル基、ハロゲンおよび-OR6から成る群より独立に選択されるが、この場合のR6はH、アルキル基、置換アルキル基および単一負電荷から成る群より選択される。R4、R5、R7、R10およびR20はH、アルキル基および置換アルキル基から成る群より独立に選択される。R3、R8およびR9はアルキル基と置換アルキル基から成る群より独立に選択される。R11、R12、R13、R21、R22およびR23はアルキル基、置換アルキル基、H、-NR14R15、-NO2、-OR16、-COOR17（ただしR14、R15、R16およびR17はH、アルキル基および置換アルキル基から成る群より独立に選択される）から成る群より独立に選択されるが、この場合、R12は随意にR11、R13またはその両方と環を形成することができるし、またR22はR21、R23またはその両方と随意に環を形成することができる。これらの環は、環式アルキル、置換環式アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式および飽和ヘテロ環式の各環系から成る群より独立に選択される。Q1は-OR18であり、Q2は-OR19であるが、この場合のR18とR19はH、酵素的に不安定な基、加水分解的に不安定な基、および単一負電荷から成る群より独立に選択される。文字aおよびzは0と1から成る群より選択されるが、ただしaが0の場合にはN1’はカルボニル基の1’位に直接、共有結合的に結合し、またzが0の場合にはN2’がカルボニル基の2’に直接、共有結合的に結合するものとする。
【００６０】
本発明は別の実施態様において、式Ｉで示される化合物であって式中R8が(CH2)Pであり、Pが1から5までの整数であり、またR4が式IVで示される構造をもつ部分で置換されたアルキル基である化合物を提供する：
【００６１】
【化１６】
0004943585.tif 000004
【００６２】
式IV中、R29はアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、ハロゲン、および-OR7から成る群より選択されが、この場合のR7はH、アルキル基、置換アルキル基、ヘテロアリール基、ヘテロ環式基および単一負電荷から成る群より選択される。R46はH、アルキル基、置換アルキル基から成る群より選択される。R31、R32およびR33はアルキル基、置換アルキル基、H、-NR24R25、-NO2、-OR26、-COOR27から成る群より独立に選択される。この場合、R24、R25、R26およびR27はH、アルキル基および置換アルキル基から成る群より独立に選択され、R32はR31、R33またはその両方と随意に環を形成することができる。その環は環式アルキル、置換環式アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式および飽和ヘテロ環式の各環系から成る群より独立に選択される。R3は(CH2)Xであり、Xは1から5までの整数である。Q3は-OR28であり、この場合のR28はH、酵素的に不安定な基、加水分解的に不安定な基および単一負電荷から成る群より選択される。
【００６３】
本発明はさらなる好ましい実施態様において、式Ｖで示される構造をもつ化合物を提供する：
【００６４】
【化１７】
0004943585.tif 000005
【００６５】
本発明はさらに別の実施態様において、式Ｉと式IVの組み合わせで示される化合物を提供するが、式中R4は式IVで示される構造をもつ基で置換されたアルキル基であり、R5は式VIで示される構造をもつ部分で置換されたアリール基である：
【００６６】
【化１８】
0004943585.tif 000006
【００６７】
式VI中、R39はアルキル基、置換アルキル基、アリール基、ハロゲン、および-OR7から成る群より選択されが、この場合のR7はH、アルキル基、置換アルキル基および単一負電荷から成る群より選択される。R45はアルキル基と置換アルキル基から成る群より選択される。R41、R42およびR43はアルキル基、置換アルキル基、H、-NR34R35、-NO2、-OR36、-COOR37から成る群より独立に選択される。この場合、R34、R35、R36およびR37はH、アルキル基および置換アルキル基から成る群より選択され、R42はR41、R43またはその両方と随意に環を形成することができる。その環は環式アルキル、置換環式アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式および飽和ヘテロ環式の各環系から成る群より独立に選択される。
【００６８】
本発明はさらに別の好ましい実施態様において、式VII で示される構造をもつ化合物を提供する：
【００６９】
【化１９】
0004943585.tif 000007
【００７０】
式VII 中、M、N、PおよびZは1から5までの整数から成る群より独立に選択される。
R基について
本項では説明の明確を期すために、以上掲げた各式中のさまざまなR基（R1、R2、R3など）について、それぞれの本体をまとめて特定する。以下の説明は本書に掲げた各式に等しく当てはまる。さらに、説明の主眼は一部の代表的な式におかれるものの、それはR基の説明を簡明にする意味であって、R基の範囲を限定するものではない。
【００７１】
式ＩおよびIIの組み合わせならびにその結果として得られる3個のサリチルアミジル環を備えた錯化剤に関しては、以下の説明は一般に本発明の任意の化合物に当てはまる。本発明の化合物に追加のサリチルアミジル環や結合基、主鎖が含まれるとき、以下の説明がそれらにも等しく当てはまることは当業者には自明であろう。
【００７２】
本発明の各化合物を通して、非アミジルカルボニル炭素上の置換基（R1、R2など）は好ましくは、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲンおよびアルコキシおよび一般構造-OR7のアリールオキシ部分から成る群より選択されるが、その場合のR7は好ましくはH、アルキル、置換アルキル基、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環式および単一負電荷から成る群より選択される。
【００７３】
好ましい実施態様では、1以上の前記R基がH、C1〜C10アルキルおよびC1〜C10置換アルキルから成る群より独立に選択され、さらに好ましくはH、C2〜C6アルキルおよびC2〜C6置換アルキルから成る群より独立に選択される。
【００７４】
別の好ましい実施態様では、1以上の前記R基がH、アリール、置換アリールおよびそれらの組み合わせから成る群より独立に選択される。
【００７５】
さらなる好ましい実施態様では、1以上の前記R基がHと多環式アリール基（好ましくはナフチル基）置換アルキル基から成る群より独立に選択される。
【００７６】
さらに別の好ましい実施態様では、1以上の前記R基がHと第1級アルキルアミン（好ましくはω位にアミン部分をもつC1〜C10アルキル鎖、もっと好ましくはω位にアミン部分をもつC2〜C6アルキル鎖）から成る群より独立に選択される。
【００７７】
なおさらなる好ましい実施態様では、1以上の前記R基がポリエーテルであり、好ましくはエチレングリコール、エチレングリコールオリゴマーおよびそれらの組み合わせから成る群より選択され、その分子量は約60 Daないし約10,000 Da、もっと好ましく約100 Daないし約1,000 Daである。
【００７８】
代表的なポリエーテル系置換基は次の構造を含むが、それだけに限らない：
【００７９】
【化２０】
0004943585.tif 000008
【００８０】
式中jは1から100までの数字である。他の官能化ポリエーテルは技術上周知であり、たとえばShearwater Polymers, Inc.（アラバマ州）などから市販されているものも多い。
【００８１】
別の好ましい実施態様では、1以上の前記R基が前記化合物を分子と表面から成る群より選択されるものに結合させるための反応性基を含む。有用反応性基の代表例は次項でさらに詳しく説明する。有用反応性基についての追加情報は技術上周知である。たとえば、Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996を参照。
【００８２】
好ましい実施態様では、1以上の前記R基はω-カルボキシルアルキル基、ω-カルボキシル置換アルキル基およびそれらの組み合わせから成る群より選択され、もっと好ましくはR基は式IIで示される構造をもつ：
【００８３】
【化２１】
0004943585.tif 000009
【００８４】
式II中、XはO、SおよびNR50から選択される。R50は好ましくはH、アルキルおよび置換アルキルから選択される。Yは好ましくはHと単一負電荷から選択され、またjとkは好ましくは1から18までの整数から成る群より選択される。
【００８５】
さらなる好ましい実施態様では、1以上の前記R基が式III で示される構造をもつ：
【００８６】
【化２２】
0004943585.tif 000010
【００８７】
式中Yは前掲式IIの場合と実質的に同じである。
さらに別の好ましい実施態様では、1以上のR基は1以上の前記R基の特徴を併せ持つことができる。たとえば次式のように1個の好ましいR基がポリエーテル、反応性基双方の属性を併せ持つ：
【００８８】
【化２３】
0004943585.tif 000011
【００８９】
式中jは1から100までの整数である。こうした「キメラ的な」R基としてはほかに、糖（反応性ヒドロキシル基を備えたポリオールなど）、アミノ酸、アミノアルコール、カルボキシアルコール、アミノチオールなどのような部分が含まれるがそれだけに限らない。
【００９０】
なおさらなる好ましい実施態様では、本発明の化合物は単一分子上に1種以上のR基をもつ。たとえば単一分子が、ポリエーテルであるR基とアミンであるR基を含むことができる。そうした異種置換基の組み合わせは他にも当業者に自明のものが多いであろう。この実施態様に基づく代表的な構造を示すと次のようになる：
【００９１】
【化２４】
0004943585.tif 000012
【００９２】
式中nは0から6までの、好ましくは1から3までの整数であり、また少なくとも1個のX’は窒素または置換窒素ではない。X’の本体は好ましくは、たとえばCH2、OおよびSである。
【００９３】
本発明のランタニドキレートの模範例は構造式1で示される構造をもつ：
好ましい金属キレートは次の構造をもつ：
【００９４】
【化２５】
0004943585.tif 000013
【００９５】
式中nは1から5までの整数であり、Rはアミドであり、R’、R’’、R’’’およびR’’’’はH、OH、アルキルおよびハロゲンから成る群より独立に選択される。前掲構造で示される化合物の例を表1に示す。
【００９６】
【表１】
0004943585.tif 000014
【００９７】
3Li＝1,3-ジアミノプロパン
4Li＝1,4-ジアミノプロパン
TREN＝トリス(2-アミノエチル)アミン
Am32 =ポリ(プロピレンイミン)デンドリマー、第4世代
さらに別の実施態様では、本発明の化合物は弱い（たとえばvan der Waals）相互作用により別の分子と会合して、たとえば包接錯体などのような化学種を形成する。PLと相互作用する好ましい分子はデンドリマー、マクロサイクル、シクロデキストリンなどであるが、それだけに限らない。
反応性官能基
本発明の化合物の幾つかは、構成成分としてリンカーアームなどの、任意のアリール核上のまたはアリール核に結合したアルキル鎖などの鎖上の、あるいは錯化剤の骨格上の任意の場所に位置することが可能な反応性官能基を持つ。これらの化合物を本明細書では「反応性配位子」と呼ぶ。反応基がアルキル、またはアリール核に繋がれた置換されたアルキル鎖に結合しているとき、反応基はアルキル鎖の末端位置に位置していることが好ましい。本発明を実施するに当たって有用な反応基および反応の種類は、一般にバイオコンジュゲートケミストリーの業界では周知のものである。本発明の反応性配位子に関して現在利用できる好都合な反応の種類は、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらには求核置換（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシルとの反応物、すなわち活性エステル類）、求電子置換（例えばエナミン反応）、炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子の多重結合の付加反応（例えば、ミカエル反応、ディールス−アルダー付加反応）が含まれるが、これには限定されない。これらのそしてまたその他の有用な反応は例えば、Ｍａｒｃｈ著、「ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、「ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＥＳ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ．１９９６；およびＦｅｅｎｅｙ等の著、「ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２の中で論述されている。
【００９８】
有用な反応性官能基には例えば下記のものがある。
【００９９】
（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル類、酸性ハロゲン化物、アシルイミダゾール類、チオエステル類、ｐ−ニトロフェニールエステル類、アルキル、アルケニル、アルキニル、および芳香族エステル類を含むカルボキシル基およびそのさまざまな誘導体。ただしこれには限定されない。
【０１００】
（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒドなどに転換することが可能なヒドロキシル基。
【０１０１】
（ｃ）ハロゲン化物を後に求核基、例えばアミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどで置き換えることが可能であり、それによりハロゲン原子の部位に新しい基の共有結合をもたらすハロアルキル基。
【０１０２】
（ｄ）ディールス−アルダー反応に加担することが可能な、例えばマレイミド基などのジエノフィル基。
【０１０３】
（ｅ）続いて起こる誘導体化が、カルボニル誘導体、例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、またはオキシムなどの形成により、あるいはグリニャール付加反応またはアルキルリチウム付加反応のような機構により可能なようなアルデヒドまたはケトン基。
【０１０４】
（ｆ）続いて起こるアミンとの反応が、例えばスルホンアミドを形成するハロゲン化スルホニル基。
【０１０５】
（ｇ）ジスルフィドに転換することが可能な、あるいはハロゲン化アシルと反応することが可能なチオール基。
【０１０６】
（ｈ）例えばアシル化、アルキル化、または酸化されることが可能なアミンまたはスルフヒドリル基。
【０１０７】
（ｉ）例えばシクロ付加反応、アシル化、ミカエル付加反応などを受けることが可能なアルケン類。
【０１０８】
（ｊ）例えばアミン類およびヒドロキシル化合物と反応することが可能なエポキシド類。
【０１０９】
（ｋ）ホスホラミダイト類および核酸合成に有用なその他の標準的な官能基。
【０１１０】
反応性官能基は、反応性配位子を組み立てるのに必要な反応に加担しないまたはそれに干渉しないようなものが選択される。別法では反応性官能基は、保護基を存在させることにより反応に加担できないようにすることができる。当業者ならば選択された一組の反応条件に干渉しないように特定の官能基をどのように保護すべきか分かるはずである。有用な保護基の例については、例えばＧｒｅｅｎｅ等の著、「ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。
ドナーおよびアクセプター部分
本発明の化合物の利点の一つは、これらを蛍光エネルギー伝達プローブを構築するために広範囲のエネルギードナー分子およびアクセプター分子と一緒に使用することができることである。ＳＬに関連する有用かつ膨大な数のいろいろな発蛍光団が当業者に知られている。例えばＣａｒｄｕｌｌｏ等の論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８７９０〜８７９４（１９８８）；Ｄｅｘｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．の論文、Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２１：８３６〜８５０（１９５３）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ等の論文、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１３３〜１４１（１９９２）；Ｓｅｌｖｉｎ，Ｐの論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２４６：３００〜３３４（１９９５）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｉの論文、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｍ．，４０：８３〜１１４（１９７１）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．の論文、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｍ．，４７：８１９〜８４６（１９７８）；Ｗａｎｇ等の論文、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３１：６４９３〜６４９６（１９９０）；Ｗａｎｇ等の論文、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６７：１１９７〜１２０３（１９９５）を参照されたい。
【０１１１】
本発明の消光団と一緒に用いることができる例示的ドナーの非限定的なリストを表２に示す。
【０１１２】
表２
ＦＥＴペアにおけるドナーまたはアクセプターとして選ぶことができる好適な片方の部分
４−アセトアミド−４′−イソチオシアナートスチルベン−２，２′ジスルホン酸
アクリジンおよび誘導体：
アクリジン
イソチオシアン酸アクリジン
５−（２′−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）
４−アミノ−Ｎ−〔（３−ビニルスルホニル）フェニル〕ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸エステル
Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド
アントラニルアミド
ＢＯＤＩＰＹ
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ
クマリンおよび誘導体：
クマリン
７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａ．Ｍ．Ｃ．Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １２０）
７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒａｎ  １５１）
シアニン染料
シアノシン
４′，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
５′，５″−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）
７−ジエチルアミノ−３−（４′−イソチオシアナートフェニル）−４−メチルクマリン
五酢酸ジエチレントリアミン
４，４′−ジイソチオシアナートジヒドロ−スチルベン−２，２′−ジスルホン酸
４，４′−ジイソチオシアナートスチルベン−２，２′−ジスルホン酸
塩化５−〔ジメチルアミノ〕ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ、塩化ダンシル）
４−（４′−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）
４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４′−イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）
エオシンおよび誘導体：
エオシン
イソチオシアン酸エオシン
エリトロシンおよび誘導体：
エリトロシンＢ
イソチオシアン酸エリトロシン
エチジウム
フルオレセインおよび誘導体：
５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）
５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）
２′，７′−ジメトキシ−４′，５′−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）
フルオレセイン
イソチオシアン酸フルオレセイン
ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）
フルオレサミン
ＩＲ１４４
ＩＲ１４４６
マラカイトグリーンイソチオシアナート
４−メチルアンベリフェロン
オルトクレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラローザリニン
Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ
Ｂ−フィコエリトリン
ｏ−フタルジアルデヒド
ピレンおよび誘導体：
ピレン
酪酸ピレン
酪酸スクシンイミジル−１−ピレン
量子ドット
Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）
ローダミンおよび誘導体：
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）
６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
リシアミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）
ローダミンＢ
ローダミン１２３
ローダミンＸイソチオシアナート：
スルホローダミンＢ
スルホローダミン１０１
スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）
テトラメチルローダミン：
イソチオシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）
リボフラビン
ロゾール酸
ランタニドキレート誘導体
下記の参考資料により例示されるように、文献の中には特定のプローブ用の適切なドナー−アクセプターペアを選択するために入手できる膨大な量の実用的な案内書がある。すなわち、Ｐｅｓｃｅ等編、「ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅ等の著、「ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０）など。文献にはまた、リポーター−消光団ペアを選ぶための蛍光および色素産生分子とその関連する光学特性の網羅的なリストを提供する参考資料も含まれている（例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ著、「ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＯＦ  ＡＲＯＭＡＴＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ著、「ＣＯＬＯＵＲ  ＡＮＤ  ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ編、「ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ」（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ著、「ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ著、「ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ」（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９４９）などを参照されたい）。さらに、文献の中には分子に付加することが可能な容易に入手できる反応基により共有結合するようにリポーターおよび消光団の分子を誘導体化するための広範な案内書がある。
【０１１３】
発蛍光団を別の分子および表面に接合するために利用できる化学の多様性および有用性は、発蛍光団で誘導体化される核酸の調製に関する膨大な数の文献により例示される。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄの著書（上記）；Ｕｌｌｍａｎ他の米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａ他の米国特許第４，３５１，７６０号を参照されたい。こうして特定用途のエネルギー交換体のペアを選択すること、およびこのペアのメンバーをプローブ分子、例えば小分子生理活性材料、核酸、ペプチド、またはその他のポリマーなどに接合することは、当業技術者の能力内でうまくやられている。
【０１１４】
ＦＥＴペアにおいてはアクセプターの吸光度バンドが、ドナーの蛍光発光バンドとほぼ重なっていることが一般に好ましい。ドナー（発蛍光団）が蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）を利用するプローブの構成部分である場合、ドナーの蛍光部分および本発明の消光団（アクセプター）は、ドナー部分が励起したときドナーおよびアクセプター部分が蛍光共鳴エネルギー伝達を示すように選択されることが好ましい。発蛍光団−消光団ペアの選択に当たって考慮すべき要素の一つは、それらの間の蛍光共鳴エネルギー伝達の効率である。好ましくはドナーとアクセプター部分の間のＦＲＥＴの効率は少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％である。ＦＲＥＴの効率は、本明細書に記載されている当業界で周知の方法を用いて簡単に、経験的な試験により調べることができる。
【０１１５】
ドナー−アクセプターペアの間のＦＲＥＴの効率はまた、ドナーとアクセプターが二量化または接近して会合する能力を変えることにより調整することができる。ドナーおよびアクセプター部分が知られているかまたは接近して会合することが決まっている場合には、リンカー部分またはプローブ自体の長さをその２つの蛍光タンパク質の間で調節することによって会合の増加または減少を促すことができる。ドナー−アクセプターペアが会合する能力は、疎水性またはイオン性の相互作用、あるいはプローブ構築物中の立体化学的反発を同調させることにより増加または減少することができる。こうしてドナー−アクセプターペアの会合を担っている分子内相互作用を高めまたは弱めることができる。したがって、例えばドナー−アクセプターペアの間の会合は、例えば全体的な負の電荷を運ぶドナーおよび全体的な正の電荷を担っているアクセプターを利用して増加することができる。
【０１１６】
プローブに直接結合している発蛍光団に加えて、発蛍光団はまた間接的な手段により結合することもできる。この実施形態において配位子の分子（例えばビオチン）は、好ましくはプローブの種と共有結合している。次いで配位子は、本質的に検出可能か、あるいは本発明の蛍光化合物または非蛍光化合物の転換により蛍光化合物を産生する酵素などのシグナル系と共有結合しているかのいずれかの別の分子（例えばストレプトアビジン分子）と結合する。標識として興味のある有用な酵素には、例えば加水分解酵素類、具体的にはホスファターゼ、エステラーゼとグリコシダーゼ、またはオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼがある。蛍光化合物には、上記で論述したようにフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどがある。使用可能なさまざまな標識またはシグナル生成系の評価に関しては米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０１１７】
現在、本発明の複合体と一緒に用いられる好ましい発蛍光団には、例えばフルオレセインを含むキサンテン染料、およびローダミン染料がある。そのフェニル部分に置換基を備えた多くの好適な形態のこれら化合物が広く市販されており、結合のための部位としてまたは核酸に結合するための結合官能基として使用することができる。好ましい蛍光化合物の別の群はαまたはβ位にアミノ基を有するナフチルアミン類である。このようなナフチルアミノ化合物には、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸エステル、スルホン酸１−アニリノ−８−ナフタレン、およびスルホン酸２−ｐ−トウイジニル−６−ナフタレンがある。その他のドナーには３−フェニル−７−イソシアナートクマリン、９−イソチオシアナートアクリジンおよびアクリジンオレンジなどのアクリジン、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンゾキサジアゾール類、スチルベン類、ピレン類などがある。
【０１１８】
説明を分かりやすくするために、下記の論述は核酸に本発明の複合体および別の発蛍光団を結合させることに絞る。核酸プローブに関する焦点は本発明の複合体が結合することができるプローブ分子の範囲を限定しようとすることではない。また当業技術者ならば本発明の複合体を、標準的な合成化学またはその改良方法を用いて小分子（例えば小分子の生理活性物質）、タンパク質、ペプチド、合成ポリマー、固形の担体などに結合させることができることを理解するであろう。
【０１１９】
プローブが核酸プローブである例示的実施形態において、アクセプター分子はローダミン染料である。内部の部位もまたＳＬの誘導体化に利用でき選択した目的に対して有用だが、好ましくはローダミン部分は核酸の３′または５′末端のいずれかに結合している。ローダミン誘導体がどちらの末端に結合するにしても、本発明の複合体は通常その鏡像体に結合するかまたは核酸鎖の内部の位置に結合することになる。ローダミンアクセプターは、好ましくは市販のアミダイトを用いて導入される。本発明の別のドナーの基もまた、好ましくはドナーの反応性誘導体（例えばアミダイト）を用いて導入される。別法では、反応性の基（例えば、活性エステルであるイソチオシアン酸エステルなど）を含むドナー基を、核酸に結合した繋ぎ鎖またはリンカーアーム（例えばヘキシルアミン）上の反応性部分との反応を介して導入することができる。
【０１２０】
さらに別の好ましい実施形態において、誘導体化した合成用の担体を使用することによりドナー部分を核酸の３′末端に結合することができる。例えば本発明の錯化剤は、その複合体の類似体で誘導体化される固形の担体に繋がれる。このような誘導体化された担体は当業界で周知であり、ＴＡＭＲＡ発蛍光団（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の類似体で誘導体化される市販の固形の担体を用いて核酸の３′末端に結合するＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミンカルボン酸）誘導体によって例示される。
【０１２１】
核酸への小分子の接合に関するよく知られた多くの文献を視野に入れれば、当業技術者にとってドナー／アクセプターペアを核酸に結合させるための多くの他の方法は明らかであろう。例えばローダミンおよびフレオレセイン染料は、ホスホルアミダイト部分により誘導体化された染料を経由する固相合成の終わりに核酸の５′ヒドロキシルに都合よく結合する（例えば、Ｗｏｏ他の米国特許第５，２３１，１９１号およびＨｏｂｂｓ，Ｊｒ．の米国特許第４，９９７，９２８号を参照されたい）。
【０１２２】
より詳細には、下記の参考資料により例示されるように核酸の５′または３′末端に基を結合させるための多くのリンキング部分および方法がある。Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；Ｚｕｃｋｍａｎ等の論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５３０５〜５３２１（１９８７）（核酸の３′−チオール基）；Ｓｈａｒｍａ等の論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：３０１９（１９９１）（３′−スルフヒドリル）；Ｇｉｕｓｔｉ等の論文、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２２３〜２２７（１９９３）；およびＦｕｎｇ他の米国特許第４，７５７，１４１号（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ．から入手できるＡｍｉｎｏｌｉｎｋ  ＴＭ  ＩＩによる５′−ホスホアミノ基）；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙの米国特許４，７３９，０４４号（３−アミノアルキルホスホリル基）；Ａｇｒａｗａｌ等の論文、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１：１５４３〜１５４６（１９９０）（ホスホルアミデートの結合による結合）；Ｓｐｒｏａｔ等の論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８３７（１９８７）（５−メルカプト基）；Ｎｅｌｓｏｎ等の論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：７１８７〜７１９４（１９８９）（３′−アミノ基）など。
【０１２３】
蛍光標識を検出するための手段は当業技術者には周知である。したがって例えば蛍光標識は、適切な波長の光で発蛍光団を励起し、得られた蛍光を検出することにより検出することができる。蛍光は、写真フィルムの手段により、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子倍増管などの電子式検出器の使用などにより視覚的に検出することができる。同様に酵素標識は、酵素用の適切な基質を準備し、得られる反応生成物を検出することにより検出することができる。
合成
本発明の化合物は、一般によく知られている合成法を適切に組み合わせることにより合成することができる。本発明の化合物の合成に役立つ技術は、当業関連技術者にとって容易に理解でき、かつアクセスしやすい。下記の論述は、本発明の化合物の組み立てに使用するために入手しうるさまざまな方法のうち幾つかを例示するために提供され、本発明の化合物の調製に有用な反応または一連の反応の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１２４】
本発明の化合物は、単一の立体異性体としてまたは立体異性体の混合物として調製することができる。好ましい実施形態において化合物は、ほぼ単一な異性体として調製される。異性体的に純粋な化合物は、異性体的に純粋な合成中間体を、キラル中心の原子の空間的配置を変えずに残すか、または完全に反転させる結果になるいずれかの反応と組み合わせて用いることにより調製することができる。別法では、最終生成物、または合成経路に沿った中間体を単一の立体異性体に分割することができる。特定の立体中心を反転させるかまたは変えずに残す方法および立体異性体の混合物を分割する方法は当業界でよく知られており、それはその当業技術者の特定の状況に対する適切な方法の選択能力内でうまくやられている。一般的には、Ｆｕｒｎｉｓｓ等編、「ＶＯＧＥＬ’Ｓ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」，５TH ＥＤ，Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｔｄ．，Ｅｓｓｅｘ，１９９１，ｐｐ．８０９〜８１６；およびＨｅｌｌｅｒの論文、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）を参照されたい。
【０１２５】
本発明の錯化剤に至る例示的な合成体系を体系１（図１）に示す。サリチル酸メチルをトリス（２−アミノエチル）アミンと混ぜ、加熱して配位子１を得た。
【０１２６】
反転性の活性サリチル酸出発原料の例示的な合成経路を体系２（図７）に示した。３−メチルサリチル酸を化合物２に転換する。そこではカルボン酸が対応するメチルエステルに転換され、フェノールの水酸化物が対応するメチルエステルに転換される。メチルエステルを塩基性条件下で鹸化して化合物３を得る。フェニル環のメチル置換基を過マンガン酸塩で対応するカルボン酸４へ酸化する。その後、化合物４をビス−メチルエステル５に転換し、エステル基の一つを１当量の塩基を用いて鹸化して化合物６を生成する。得られたカルボン酸を酸性の塩化物７に転換し、それは２−メルカプトチアゾリンと反応して化合物８を生成する。
【０１２７】
本発明の幾つかの代表的な配位子を体系３（図８）に示すように調製する。体系３に示した化合物はさまざまな長さの骨格を有する。こうして化合物８を、４つの第一アミン部分および選択した長さの骨格を備えたアミンに加えて化合物９（ｎ＝１）、１０（ｎ＝２）、および１１（ｎ＝３）を得る。化合物９〜１１をＢＢｒ3で処理することにより脱保護して配位子１２、１３、および１４を得る。
【０１２８】
上記で列挙した合成体系は、本発明の若干の実施形態を例示することを意図するものであり、当業技術者ならば本発明の配位子を生成するための多くの他の合成戦略を過度の実験にたよらずに利用できることを理解するであろう。
【０１２９】
サリチルアミジル基上の置換基およびサリチルアミジル基を結び付ける骨格上の置換基はそれ自体、サリチルアミジル基とは別の錯化剤を含むことができる。好ましくはこれらキレート化剤は、カルボン酸エステル基またはホスホン酸エステル基などの複数のアニオン基を含んでいる。好ましい実施形態においてこれら非ＳＬ錯化剤は、それ自体ランタニドキレート化剤として働く能力のある化合物から選択される。別の好ましい実施形態においてキレート化剤はアミノカルボン酸エステル類（すなわち、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ等およびそれらのＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰなどホスホン酸エステル類似体）である。
【０１３０】
多くの有用なキレート基、クラウンエーテル、クリプタンドなどが当業界で知られており、本発明の化合物中に取り込むことができる。例えば本明細書に参照として含まれるＰｉｔｔ等の解説、「Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｒｏｎ  Ｏｖｅｒｌｏａｄ」（Ｍａｒｔｅｌｌ編「ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ」，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８０，ｐｐ．２７９〜３１２）；Ｌｉｎｄｏｙ著「ＴＨＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣ  ＬＩＧＡＮＤ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ」，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８９；Ｄｕｇａｓ著「ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい。
【０１３１】
加えて、錯化剤、クラウンエーテル、およびシクロデキストリンが別の分子に結合することを可能にする多くの経路が当業技術者には利用できる。例えば、Ｍｅａｒｅｓ等の解説、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｈｅｌａｔｅ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」（Ｆｅｅｎｅｙ等編、「ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ，ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＳＰＥＣＴＳ」，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９８２，ｐｐ．３７０〜３８７）；Ｋａｓｉｎａ等の論文、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，９：１０８〜１１７（１９９８）；ｓｏｎｇ等の論文、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，８：２４９〜２５５（１９９７）を参照されたい。
【０１３２】
別の実施形態において、サリチルアミジル基上のまたは骨格上の置換基が蛍光増感剤である。例示的な増感剤には、ローダミン５６０，５７５、および５９０フルオレセイン、２−キノロンまたは４−キノロン、２−クマリンまたは４−クマリンあるいはその誘導体、例えばクマリン４４５、４５０、５００、および５０３、４−トリフルオロメチルクマリン（ＴＦＣ）、７−ジエチル−アミノ−クマリン−３−カルボヒドラジドなど、特にカルボスチリル１２４（７−アミノ−４−メチル−２−キノロン）、クマリン１２０（７−アミノ−４−メチル−２−クマリン）、クマリン１２４（７−アミノ−４−（トリフルオロメチル）−２−クマリン）、アミノメチルトリメチルプソラレン、ナフタレンなどがある。
【０１３３】
好ましい実施形態において増感剤はナフチル部分を含む部分である。
【０１３４】
ＳＬが形成され精製された後、蛍光ランタニド複合体を、例えばキレートの塩をトリハロゲン化ランタニド、トリ酢酸塩などのランタニド塩でインキュベートすることを含む任意の広範囲の技術的に容認されている方法により合成する。
【０１３５】
本発明の化合物は、その接合していない形態においてプローブ、指示薬、分離媒体などとして有用である。さらに本発明の化合物は、さまざまな化合物と接合して特異的な標識、プローブ、診断用および／または治療用試薬などを作り出すことができる。本発明の化合物が接合することができる種の例には、例えばタンパク質（例えば抗体、酵素、受容体など）、核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡなど）、生理活性分子（例えば薬物、毒物など）などの生体分子；ガラスまたは高分子のビーズ、薄板、繊維、膜（例えばナイロン、ニトロセルロース）、スライド（例えばガラス、水晶）、およびプローブなどの固形の基質；その他がある。
【０１３６】
好ましい実施形態において、化合物が接合する種は生体分子である。好ましい生体分子には、抗体、核酸、酵素、ハプテン、炭水化物、および抗原からなる群から選択されるものがある。
アッセイおよびＳＬ担持運ぶプローブ
別の好ましい実施形態において本発明は、プローブ分子およびこれらプローブを用いるアッセイなど、別の分子と繋げるＳＬを提供する。
【０１３７】
アッセイ
一般に下記の論述は、本明細書に記述されたアッセイに関連する。この論述は若干の好ましい実施形態について本発明を例示することを意図するもので、本発明の化合物を使用するプローブと、アッセイの種類の範囲を限定するものと解釈するべきではない。当業技術者には本発明の化合物を利用する別のアッセイの様式が明らかなはずである。
【０１３８】
特異的な結合反応に基づくアッセイは、薬物、ホルモン、タンパク質、抗体、およびさまざまな生体の液体および組織試料中の病原体などのさまざまな物質を検出するために用いられる。一般にアッセイは被験物、被験物の認識部分、および検出可能な標識からなる。競合アッセイの様式は、通常これらの構成要素に加えて結合パートナーを使用する。例示的実施形態において結合パートナーは、認識部分と相互に作用して、認識部分と被験物の間に形成される類似の複合体よりも本質的に不安定であって入ってくる被験物により後に置換される複合体を形成する分子である。
【０１３９】
特異的な結合の相互作用は直接観察できないことが多いため、さまざまな蛍光標識が相互作用の存在を決定するために考案されている。本発明の発蛍光団は、蛍光分光法の使用または肉眼により検出される。本発明の実施に役立つような標識の紹介、標識化の手順、および標識の検出については、Ｐｏｌａｋ等の著、「ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＩＭＭＵＮＯＣＹＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」２nd Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９７７）、およびＨａｕｇｌａｎｄ著、「ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．（１９９６）により出版されたハンドブックとカタログの組合されたもの）の中に見られる。
【０１４０】
幾つかの実施形態において、アッセイは競合アッセイである。実際にはアッセイの構成要素（すなわち被験物の認識部分、結合パートナー、および被験物）はほぼ任意の化学構造をもつことができるが、好ましい実施形態においては認識部分、結合パートナー、および被験物は、独立に小分子の生理活性物質、生体分子、およびその組み合わせからなる群から選択されるメンバーである。アッセイの構成要素が生体分子である場合、生体分子は好ましくはハプテン、抗体、抗原、炭水化物、核酸、ペプチド、酵素、および受容体からなる群から選択されるメンバーである。
【０１４１】
競合アッセイの様式においては、１または複数の構成要素が本発明の化合物により標識される。例えば一実施形態において、結合パートナーは本発明の化合物により標識され、固定化された認識部分由来のその移行をアッセイの液相中に蛍光が現われることにより検出する。別の競合アッセイの様式においては、固定化酵素が本発明の化合物に接合した基質と複合体をつくる。次いで複合体は推定される拮抗物質と接触する。固定化酵素由来の蛍光をアッセイの液相に移すことは、推定される拮抗物質による基質の置換を示している。これらの実施形態は具体例の目的でのみ提供され、別の多くの競合アッセイの様式が本発明の化合物を利用しその恩恵を受けることができることは当業技術者には明らかなはずである。
【０１４２】
結合の事象を確認することに加えて、２つ以上の結合パートナーの間のアフィニティの大きさを定量することが求められることが多い。したがって本明細書に開示された化合物をそのようなアッセイの担体として利用することもまた本発明の範囲内にある。
【０１４３】
最も典型的には存在する被験物の量は、結合の事象に続いて、結合パートナー、被験物、または認識部分に固定された標識の量を定量することにより測定される。蛍光標識を検出し定量する手段は当業技術者にはよく知られている。
【０１４４】
別の好ましい実施形態において２つ以上のアッセイの構成要素の間のアフィニティは、被験物と認識部分の複合体、遊離の被験物、遊離の結合パートナー、結合パートナーと認識部分の複合体、およびその組み合わせからなる群から選択された集団を定量することにより測定される。
【０１４５】
２つの分子のアフィニティのデータを引き出すためのアッセイの様式は、受容体と結合することが知られている配位子が拮抗物質によりその受容体に置き換えられる実施形態を参照することにより理解することができる。この様式のその他の変形形態は当業技術者には明らかなはずである。競合様式は当業技術者にはよく知られている。例えば、米国特許第３，６５４，０９０号および第３，８５０，７５２号を参照されたい。
【０１４６】
拮抗物質と受容体の結合は、その受容体の配位子と拮抗物質を用いる競合結合法により検定することができる。結合アッセイは、例えば９６ウェル濾過プレートアセンブリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）中で行なうことができる。３つの結合パターン（すなわち配位子、拮抗物質、または受容体）のうちの１つが、一般にウェルまたはウェル中に含まれる粒状材料と結合する。
【０１４７】
競合結合データは、非線形最小二乗曲線を当てはめる手順を含む複数のテクニックにより分析することができる。配位子が受容体の拮抗物質である場合、この方法は拮抗物質のＩＣ５０（平衡時に配位子の特異的な結合を５０％抑制する拮抗物質の濃度）を提供する。ＩＣ５０は、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆの式、Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋ｌ／ｋｄ）に基づく拮抗物質の平衡解離定数（Ｋｉ）と関係する。上式でＬは競合結合アッセイに用いられる配位子の濃度であり、Ｋｄはスキャッチャード分析により決まる配位子の解離定数である。これらのアッセイは、なかんずくｍａｄｄｏｘ等の論文、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１（１９８３）；Ｈａｍｐｔｏｎ等の著、「ＳＥＲＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．，１９９０に記述されている。
【０１４８】
本発明のアッセイは、溶液中の幾つかまたは全ての構成要素とともに実施される。別法では、１または複数の構成要素がアッセイ媒体に実質的に不溶であってもよい。好ましい実施形態においては、認識部分、結合パートナー、および被験物からなる群から選択される１または複数のメンバーを表面に結合させる。有用な表面には、ガラスまたは高分子のビーズ、薄板、繊維、膜（例えばナイロン、ニトロセルロース）、スライド（例えばガラス、水晶）などがあるが、これには限定されない。
【０１４９】
アッセイは、さまざまな方法で行なうことができる。例えば、いつランタニドをキレート化することによって蛍光複合体を形成するか、キレートをどのアッセイ構成要素に結合させるべきかなどを選択するのはその当業技術者の能力にかかっている。好ましい実施形態においては、結合パートナー−認識部分の複合体から結合パートナーを置換する前に蛍光複合体を形成する。別の好ましい実施形態においては、結合パートナー−認識部分複合体から結合パートナーを置換した後に蛍光複合体を形成する。
【０１５０】
結合パートナー−認識部分の複合体から結合パートナーを追い出すのに続いてアッセイの残るステップを、置換により形成される混合物あるいは除去することができる１または複数の構成要素の混合物上で行なうことが可能である。好ましい実施形態においてこの方法はさらに、認識部分−結合パートナーペア、被験物−認識部分ペア、およびその組み合わせからなる群のメンバーから遊離の結合パートナーを分離することを含む。
【０１５１】
好ましい実施形態において、本発明のアッセイはイムノアッセイである。イムノアッセイは、さまざまな化合物の特定の抗原決定基と結合する能力のある免疫グロブリン（抗体）と材料（抗原）との間の反応を含む。別の種類の反応は、アビジンとビオチン、タンパク質Ａと免疫グロブリン、レクチンと糖部分などの間の結合を含む。例えば、Ｌｅｕｖｅｒｉｎｇに対して発行された米国特許第４，３１３，７３４号；Ｚｕｋに対して発行された米国特許第４，４３５，５０４号；Ｇｏｒｄｏｎに対して発行された米国特許第４，４５２，９０１号および第４，９６０，６９１号；Ｃａｍｂｅｌｌに対して発行された米国特許第３，８９３，８０８号を参照されたい。
【０１５２】
これらのアッセイのテクニックは、少量の被験物の存在および量の両者を検出する能力を提供し、例えば医療診断および法医学用途において有用である。本発明の方法において被験物、またはその認識部分との結合は、一般に本発明による蛍光標識を使用することにより検出される。
【０１５３】
イムノアッセイには大まかに３種類のタイプがある。例示的な競合結合アッセイにおいて、標識された試薬と標識されていない被験物化合物は結合材料上で結合部位を得ようと競う。インキュベート期間の後、結合していない材料を洗浄して除き、その部位に結合した標識された試薬の量を基準量と比較して試料溶液中の被験物の濃度を決定する。
【０１５４】
二番目のタイプのイムノアッセイはサンドイッチアッセイとして知られており、一般に被験物試料溶液を、被験物に対して免疫学的に特異的な第一結合材料で構成される表面と接触させることを含む。次いで第一結合材料と同じ種類（抗原または抗体）の本発明の化合物を担持する結合材料を含む第二溶液をアッセイに加える。標識された結合材料が、第一結合材料と結合している任意の被験物と結合することになる。次いでアッセイ系を洗浄のステップにかけ、被験物と結合しそこなった標識された結合材料を除去する。残っている標識された材料の量は、通常結合した被験物の量に比例する。
【０１５５】
３番目のタイプのイムノアッセイのテクニックは凝集反応のテクニックを伴っており、周知の血液抗原および血清型に用いるアッセイにより例示される。血清中の抗体と赤血球表面に存在する抗原の間の免疫学的な交差反応性は、赤血球および抗体の三次元架橋した網目の形成により示される。血清／赤血球混合物の凝集は、アッセイの１または複数の構成要素に結合した本発明の化合物の蛍光を介して肉眼で視ることができるペレットの形成をもたらす。
【０１５６】
上記で列挙したこれらアッセイの手順は当初、酵素および放射能標識化反応がマイクロタイタープレートなどの装置の溶液中で遂行される液相の免疫化学のテクニックにより行なわれた。最近では、「固」相アッセイを行なうためのテクニックおよび手順が適応され、そこでは固定化用基質上の溶液中で酵素反応および免疫反応が遂行される。
【０１５７】
競合、サンドイッチ、または凝集タイプのアッセイの原理を採用する幾つもの様式において、免疫クロマトグラフィーイムノアッセイと通常呼ばれるこれらのタイプのアッセイを開発することができる。これらはまた、固定化用基体を横切る流れまたはそれに沿う流れのいずれかを伴うことができる。一般にサンドイッチアッセイは、大きなタンパク質の被験物または抗体の検出に最も役立つ。フローアクロスタイプのアッセイは、サンドイッチタイプのアッセイにおいて最も広範に用いられてきた。
【０１５８】
本発明の蛍光物質を用いる例示的な免疫クロマトグラフィーサンドイッチイムノアッセイ手順は、結合ペア（例えば抗原または抗体）の一方のメンバーに結合する目に見える標識として本発明の多孔性表面または物質を使用する。多孔性表面は一般には平らな薄板であり、通常ナイロン、ニトロセルロース、ガラス繊維などからなる。典型的な免疫クロマトグラフ様式においては多孔性表面の領域または小さな部分は、多孔性の膜表面に結合ペアのメンバーを直接固定化することにより、または多孔性の膜表面で固定化される捕獲粒子（すなわちラテックス、ガラス）上にメンバーを間接的に結合させることにより固相捕獲面となる。結合ペアの多孔性膜または捕獲粒子に対する直接固定化は、静電的相互作用（すなわちイオンの電荷の違い）、疎水性相互作用、または共有結合によって起こる。捕獲粒子を用いる場合、捕獲粒子を多孔性膜に対して固定化することはまた、これと同じ現象によりあるいは細孔または膜の繊維を通過する粒子の移行を妨げるサイズ排除により起こる可能性もある。本発明の化合物を利用して多くの他のタイプのアッセイを行なうことができる。
【０１５９】
典型的な非競合免疫クロマトグラフィーアッセイにおいて血液、血清、血漿、唾液、尿などの生物学的流体の試験試料は、十分な相互作用が問題の被験物、標識された粒子、および捕獲性の固相の間で起こることを可能にするために十分な量でありかつ十分な被験物濃度であらねばならない。反応速度を増すために、できるだけ多くの特異的な結合を生じると同時に任意の非特異的な結合を最小限にするように結合ペアの粒子に標識したメンバーの濃度および多孔性膜または捕獲粒子の表面における結合ペアの濃度を最適化する。粒子を標識したメンバーの濃度は、問題の被験物の濃度範囲全体を通じてプロゾーン現象を起こさない濃度であらねばならない。このような濃度の最適化は、技術者の能力内でうまくやられている。
【０１６０】
免疫クロマトグラフィーアッセイは、本発明の１または複数の化合物あるいは本発明の化合物で官能化された部分が支持体に膠などのバインダーで直接または間接的に固定される疎水性の支持体（例えばマイラー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ガラスなど）を使用する本発明の多層材料の細片または層の形態であってもよい。望むなら免疫反応物が相互に接触した状態にある間、流体の相の蒸発を減らすために疎水性の支持体および収納容器を使用してもよい。
【０１６１】
本発明のこの実施態様による例示的な非競合アッセイにおいては、被験物を可溶化し、析出させ、粒状材料上に結合させる。次いで粒状材料を水和し、適切なところで洗浄のステップをはさみながら連続して一次抗体および一次抗体に対して特異的な、酵素を接合した二次抗体に曝露する。次いで酵素レベルを、例えば当業者によく知られている基質転換実験計画により決定し、こうして一次抗体の量を、並行する標準の流れを基準にして測定することができる。
【０１６２】
さらに、例えば受容体の結合ドメインは、薬物発見用アッセイの中心として働くことができる。そこでは、例えば受容体を固定化し、その結合ドメインと相互作用することが知られている物質（すなわち配位子）および或る量の試験される特定の薬物または阻害物質とともに両者をインキュベートする。インキュベーション用構成要素の一つを本発明の化合物で標識する。次いで、どの程度薬物が受容体と結合しそれによって受容体−配位子複合体の形成を阻害するかを測定することができる。薬物発見用アッセイのそのような可能性が本明細書中で検討され、それは本発明の範囲内と考えられる。その他の焦点および適切なアッセイの様式は当業技術者には明らかなはずである。
【０１６３】
本発明の化合物および方法はまた、核酸およびペプチドを配列するために用いることもできる。蛍光標識したオリゴヌクレオチドプライマーが、ＤＮＡ断片の感受性検出用の放射能標識したプライマーの代わりに用いられている（Ｓｍｉｔｈ他の米国特許第４，８５５，２２５号）。加えて、ＤＮＡシークエンシングの産物を、蛍光ジデオキシヌクレオチドで標識する（Ｐｒｏｂｅｒ他の米国特許第５，０４７，５１９号）か、あるいは蛍光標識したデオキシヌクレオチドを直接取り込むことにより標識する（Ｖｏｓｓ等の論文、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５１７（１９８９））ことができる。本発明の化合物はこれらの様式の両者において有用である。蛍光シークエンシング反応は、現在実施されている放射性核種の使用に関連する多くの問題を回避する。
【０１６４】
上記で論述したように蛍光複合体は、ほぼアッセイの任意のステップにおいて形成することができる。これは、アッセイ混合物の１または複数の構成要素が結合パートナーの置換に続いて除去されるこれら実施形態にも同様にあてはまる。好ましい実施形態において蛍光複合体は分離の後に形成される。
【０１６５】
本発明の化合物は、混合物中の酵素の存在および量を指示するために用いることができる。例えば幾つかの実施形態においてＱ1は酵素に対して不安定な基であり、サリチルアミジル基のフェノールの酸素上に不安定な基が存在するとランタニドイオンが安定な錯体を形成するのを妨げることになる。この状態は反転し、サリチルアミジルキレートが不安定な基を切断する能力のある酵素と接触すると安定なランタニド錯体が形成され、こうしてフェノールの酸素のアニオンを遊離する。上記で論述した実施形態と同様に、アッセイ混合物をアッセイのプロセス中いつでも酵素と接触させることができる。加えて、構成要素を反応混合物から分離する場合（例えば遊離した結合パートナー）、分離された構成要素および／または残りの構成要素を酵素と接触させることができる。
【０１６６】
Ｑ1が酵素に対して不安定な基である好ましい実施形態において、この方法にはさらに結合パートナー−認識部分の複合体、遊離の結合パートナー、およびその組み合わせからなる群から選択されたメンバーを酵素と接触させ、それによって酵素に対して不安定な基を除去することが含まれる。
【０１６７】
数多くのいろいろな酵素により除去可能な基が当業界で知られており、特定の用途のために酵素に対して不安定な適切な基を選択することはその当業技術者の能力にかかっている。好ましい実施形態において酵素に対して不安定な基は、リン酸エステル、硫酸エステル、アシル、およびグリコシド基からなる群から選択されるメンバーを成分として含む。これらの基を取り除く能力のある酵素には、例えばエステラーゼ類、ホスファターゼ類、グリコシダーゼ類などがある。
【０１６８】
別の好ましい実施形態においては、酵素に対して不安定な基の除去およびこれに続く蛍光複合体の形成が、酵素に対して不安定な基を取り除く能力のある酵素の存在を検出するために用いられる。例えば、１９９３年１０月１２日発光のＤｒｅｖｉｎ他の米国特許第５，２５２，４６２号を参照されたい。
【０１６９】
本発明の化合物をアッセイの任意の構成要素に繋ぐことができるが、最も一般的には結合パートナーに結合させることになる。この実施形態において本発明の化合物は、サリチルアミジル部分、骨格、またはアミド置換基上の反応性の基を介して結合パートナーに結合することができる。別法ではこれらを、１または複数のサリチルアミジル、すなわちこの化合物の部分の芳香核上の反応性の基を介して結合パートナーに結合することができる。上記で論述したように多くの好適な反応性の基が当業技術者に知られており、その技術者ならば特定の用途に対して適切に官能基化されるサリチルアミジル−キレートを選択しかつ調製することができるはずである。
【０１７０】
サリチルアミジル−キレートと結合パートナーの間の結合はアッセイの条件下で安定であることが一般には好ましい。結合パートナーと、例えばアミド類、アミン類、エーテル類、尿素類などを含むサリチルアミジルキレートとの間で多くの安定な結合を形成することができる。好ましい実施形態において結合パートナーと本発明の化合物の間の結合は、アミド、チオアミド、チオウレア、およびカルバミン酸エステルの結合からなる群から選択されるメンバーである。好適な反応性の基および結合については上記でより詳細に論述されている。
【０１７１】
一般に、例えば核酸などのターゲット分子の濃度を決定するには、始めに一定量のプローブおよび核酸配位子をさまざまな量のターゲットと接触させる基準データを得ることが好ましい。各基準混合物の蛍光の発光をターゲットの濃度を蛍光の発光と対照するグラフまたは表を導き出すために用いる。例えば、ａ）ターゲットを含まない核酸配位子にハイブリダイズさせ、ｂ）蛍光基およびＳＬ標識化の部位である５′および３′末端を備えたステム−ループ構造を有するプローブを用いてそのような基準データを得ることができる。このようなプローブは、一定量のプローブおよび核酸配位子の存在下で、ターゲットの濃度が増加するに従って蛍光の発光が減少する固有の発光プロフィルを与える。次いで、未知量のターゲットを含む試験混合物を同量の、最初に核酸配位子、次にプローブと接触させ蛍光の発光を決定する。次いで、蛍光の発光値を基準データと比較して試験混合物中のターゲットの濃度を得る。
【０１７２】
マルチプレックス分析
別の好ましい実施形態において本発明の消光団は、混合物中の多数の種を検出するように設計されたアッセイに用いられる１または複数のプローブの構成要素として利用される。異なる発蛍光団を担持する少なくとも２つのプローブを用いることにより２種類以上の種を検出するために用いられるアッセイを、本明細書では「マルチプレックス分析」と呼ぶ。ＳＬを用いるこのようなマルチプレックス分析の模式図を図９に示す。
【０１７３】
本発明の化合物を包むプローブはまた、マルチプレックス型の分析およびアッセイを行なうのに役立つ。典型的なマルチプレックス分析においては、２種類以上の異質の種（あるいは１または複数の種の領域）を、各プローブが異なる発蛍光団で標識されている２つ以上のプローブを用いて検出する。蛍光エネルギー伝達に依拠する好ましいマルチプレックス分析は、幾つかの満たすべき条件に完全に合致する。蛍光種は輝いていてスペクトルでよく分析されるはずであり、蛍光種とアクセプターの間のエネルギー伝達は効率的であるはずである。
【０１７４】
さまざまな発光特性を有する本発明のＳＬはそのままで利用可能であるため、本発明の化合物はマルチプレックス用途に用いるのに特に適している。ある範囲の吸光度特性を有するＳＬにアクセスすることが容易なことは、アクセプターの吸光度特性とＳＬの発光特性が一致し、それによって有用なレベルのスペクトルの重なりをもたらすＦＥＦプローブの設計を可能にする。
【０１７５】
ＦＥＴを用いる２つ以上のプローブの同時使用が当業界で知られている。例えば、異なる配列特異性を有する核酸プローブを用いるマルチプレックスアッセイについて述べられてきた。蛍光プローブは、個体が特定の突然変異に関してホモ接合野生型、ホモ接合突然変異体、または異型接合のいずれであるかを決定するために用いられてきた。例えば、野生型配列を認識する失活したフルオレセインの分子標識と、突然変異体の対立遺伝子を認識する別のローダミンで失活した分子標識とを用いて、βケモキン受容体に関して個体の遺伝子型を決めることが可能である（Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ等の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１２２８〜１２２９（１９９８））。フルオレセインのシグナルのみが存在する場合は個体が野生型であることを示し、ローダミンのシグナルのみが存在する場合は個体がホモ接合突然変異体であることを示す。ローダミンとフルオレセインのシグナルが両方存在するのは異型接合体の特徴である。Ｔｙａｇｉ等の論文、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４９〜５３（１９９８）には、対立遺伝子の識別用に４つの別々に標識した分子標識を同時使用することについて記載されており、またＬｅｅ等の論文、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７：３４２〜３４９（１９９９）は、６つのＰＣＲ産物の７色の均一検出法について記述している。
【０１７６】
本発明のＳＬは、例えば、全細胞、ウィルス、タンパク質（例えば酵素、抗体、受容体）、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞下粒子、生物体（例えばサルモネラ菌）、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似体）、多糖類、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、非生体ポリマー、および生理活性小分子（例えば毒素、薬物、殺虫殺鼠剤、代謝産物、ホルモン、アルカロイド、ステロイド）を含むほぼ任意の種を検出および／または定量するように設計されたマルチプレックスアッセイに使用することができる。
認識部分
本明細書において用いられる「認識部分」という用語は、引付メカニズムまたは反発メカニズムのいずれかを介して被験物と相互反応することができる分子に関連する。好ましい実施形態において、認識部分は、本発明の化合物に接合される。もう一つの代表的な実施形態において、被験物と認識部分は、例えば、共有結合、イオン結合、イオンペアリングおよびファンデルワールス結合などによって密に結合した対を形成する。もう一つの代表的な実施形態において、被験物と認識部分は、不適合立体特性、電荷−電荷反発および親水−疎水相互作用などの反発メカニズムによって相互作用する。「認識部分」および「被験物」の一般用語間で部分的な重なりが存在することは言うまでもない。特定の用途において、ある種は被験物であることが可能である一方で、異なる用途において、その種は認識部分として機能する。特定の実施形態において、本発明の化合物は、認識部分として機能する（例えば、被験物が金属イオンである時）。
【０１７７】
認識部分は、多様な小生物活性分子（例えば、薬物、殺虫剤、毒素など）、有機官能基（例えば、アミン、カルボニル、カルボキシレートなど）、生物分子、金属、金属キレートおよび有機金属化合物から選択することができる。
【０１７８】
認識部分がアミンである時、好ましい実施形態において、認識部分は、アミンとの相互作用（例えば、結合、キレート化）によって反応する被験物（例えば、カルボニル基、アルキルハロ基）上で構造体と相互作用する。もう一つの好ましい実施形態において、アミンは、対象被験物上で酸性部分（例えば、カルボン酸、スルホン酸）によってプロトンを付加される。
【０１７９】
特定の好ましい実施形態において、認識部分がカルボン酸である時、認識部分は、例えば、錯化（例えば、金属イオン）によって被験物と相互作用する。なお他の好ましい実施形態において、カルボン酸は被験物上で塩基性基（例えば、アミン）にプロトンを付加する。
【０１８０】
もう一つの好ましい実施形態において、認識部分は薬物部分である。薬物部分は、臨床使用のために既に受入られた薬剤であることが可能であり、または薬物部分は、その使用が実験的であるか、あるいはその作用活性または作用メカニズムが調査中である薬物であることが可能である。薬物部分は、所定の疾病状態において証明された作用を有することが可能であるか、あるいは所定の疾病状態において望ましい作用を示すことが仮定されているにすぎないことが可能である。好ましい実施形態において、薬物部分は、好んで選ばれる被験物と相互作用する能力で選別される化合物である。そういうものとして、本発明において認識部分として有用な薬物部分には、種々の薬理活性を有する薬物種の広い範囲からの薬物が挙げられる。
【０１８１】
有用な薬剤の種類には、例えば、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）が挙げられる。ＮＳＡＩＤＳは、例えば、（例えば、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナミン酸誘導体、ビフェニルカルボン酸誘導体およびオキシカム）、ヒドロコルチゾンなどを含むステロイド抗炎症剤、抗ヒスタミン薬（例えば、クロルフェニラミン、トリプロリジン）、鎮咳薬（例えば、デキストロメトルファン、コデイン、カルミフェンおよびカルベタペンタン）、鎮痒薬（例えば、メチジリジンおよびトリメプリジン）、抗コリン作動薬（例えば、スコポラミン、アストロピン、ホマトロピン、レボドパ）、催吐薬および制吐薬（例えば、シクリジン、メクリジン、クロルプロマジン、ブクリジン）、食欲抑制薬（例えば、ベンズフェタミン、フェンテルミン、クロルフェンテルミン、フェンフルラミン）、中枢興奮薬（例えば、アンフェタミン、メトアンフェタミン、デキストロアンフェタミンおよびメチルフェニデート）、抗不整脈薬（例えば、プロパノロール、プロカインアミド、ジソピラミド、キニジン、エンカイニド）、β−アドレナリン遮断薬（例えば、メトプロロール、アセブトロール、ベタキソロール、ラベタロールおよびトリモロール）、強心剤（例えば、ミルリノン、アムリノンおよびドブタミン）、抗高血圧薬（例えば、エナラプリル、クロニジン、ヒドララジン、ミノキシジル、グアナドレル、グアネチジン）、利尿薬（例えば、アミロリドおよびヒドロクロロチアジド）、血管伸長薬（例えば、ジルタゼム、アミノダロン、イソスプリン、ニリドリン、トラゾリンおよびベラパミル）、血管収縮薬（例えば、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミンおよびメチルセルギド）、抗潰瘍薬（例えば、ラニチジンおよびシメチジン）、麻酔薬（例えば、リドカイン、ブピバカイン、クロルプロカイン、ジブカイン）、抗うつ薬（例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン）、精神安定剤および鎮静剤（例えば、クロルジアゼポキシド、バナシチジン、ベンズキナミド、フルラザパン、ヒドロキシジン、ロキサピンおよびプロマジン）、抗精神病薬（例えば、クロルプロチキセン、フルフェナジン、ハロペリドール、モリンドン、チオリダジンおよびトリフルオペラジン）、抗菌薬（例えば、抗細菌薬、抗真菌薬、抗原虫薬および抗ウィルス薬）などの種類から選択することができる。
【０１８２】
本組成物に配合するために好ましい抗菌薬には、例えば、β−ラクタム薬、キノロン薬、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アミカシン、トリクロサン、ドキシサイクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クリンダマイシン、エタンブトール、ヘキサミジン、イソチオネート、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネオマイシン、メタサイクリン、メタナミン、ミノサイクリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ステプトマイシン、トブラマイシン、ミコナゾールおよびアマンファジンの薬物学的に許容できる塩が挙げられる。
【０１８３】
本発明の実施において役立つ他の薬物部分には、抗新生物薬（例えば、抗男性ホルモン（例えば、リュープロリドまたはフルタミド））、細胞破壊剤（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、α−２−インターフェロン）、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン）、抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン）が挙げられる。
【０１８４】
認識部分は、ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラジオール、リュープロリド、マゲストール、オクテオチドまたはソマトスタチン）、筋肉弛緩薬（例えば、シンナメドリン、シクロベンザプリン、フラボキセート、オルフェナドリン、パパベリン、メベベリン、イダベリン、リトドリン、デプヘノキシレート、ダントロレンおよびアズモレン）、鎮座薬、骨活性薬（例えば、ジホスホネートおよびホスホノアルキルフォスフィネート薬物化合物）、内分泌変調薬（例えば、避妊薬（例えば、エチノジオール、エチニルエストラジオール、ノレチンドロン、メストラノール、デソゲストレル、メドロキシプロゲステロン））、糖尿病の変調成分（例えば、グリブリドまたはクロルプロパミド）、テストラクトンまたはスタノゾロールなどのアナボリック、男性ホルモン（例えば、メチルテストステロン、テストステロンまたはフルオキシメステロン）、抗利尿薬（例えば、デスモプレシンおよびカルシトニン）も含むことが可能である。
【０１８５】
エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベステロール）、グルココルチコイド（例えば、トリアムシノロン、ベタメタソンなど）、およびノルチンドロン、エチノジオール、ノレチンドロン、レボノルゲステルなどのプロゲンストゲン、甲状腺剤（例えば、リオチロニンまたはレボチロキシン）または抗甲状腺剤（例えば、メチマゾル）、アンチハイパープロラクチネミック薬（例えば、カベルゴリン）、ホルモンサプレッサー（例えば、ダナゾールまたはゴセレリン）、子宮収縮薬（例えば、メチレエルゴノビンまたはオキシトシン）も本発明において有用であり、ミノプロストール、アルプロスタジルまたはジノプロストンなどのプロスタグランジンも用いることができる。
【０１８６】
他の有用な認識部分には、免疫調節薬（例えば、抗ヒスタミン剤）、ロドキサミドおよび／またはクロモリンなどの肥満細胞安定化薬、ステロイド（例えば、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベクロメタゾンまたはクロベタゾール）、ヒスタミンＨ2拮抗薬（例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロスポリン）などが挙げられる。スリンダク、エトドラク、カトプロフェンおよびケトロラクなどの抗炎症活性をもつ群も有用である。本発明と合わせて有用な他の薬物は当業者に対して明らかであろう。
【０１８７】
当業者に対してよく知られている方法によって、上述した分子および他の分子を本発明の化合物および固体基板などに結合することができる。十分な手引きは、例えば、生物接合化学および薬物送達の分野に充てられた文献において見られる。例えば、入手できるアミンを含む薬物に直面している技術の一つは、種々のアミン誘導反応の中から選択でき、有機層のための適切に官能化されたパートナー（例えば、カルボン酸末端チオール）を突き止めることができ、そして必要なカップリングを行うために選択された条件下でパートナーを反応させることができるであろう（例えば、脱水剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド）。例えば、Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｉｎｓ：Ｆｏｏｄ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ，ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｆｅｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２，ｐｐ．３７０−３８７、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｍｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９１を参照すること。
【０１８８】
認識部分がキレート化剤、クラウンエーテルまたはシクロデキストリンである時、ホストゲスト化学は、認識部分と被験物との間の相互作用を決定するであろう。ホストゲスト化学を用いることによって、高度の認識部分−被験物特異性を本発明の化合物またはアッセイ中に設計することが可能となる。特定の化合物に結合させるためにこれらの化合物を使用することは当業者に対してよく知られている。例えば、ピット（Ｐｉｔｔ）ら、「Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｒｏｎ  Ｏｖｅｒｌｏａｄ」，Ｉｎ，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｍａｒｔｅｌｌ，Ｅｄ．；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８０，ｐｐ．２７９−３１２、リンドイ（Ｌｉｎｄｏｙ）、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８９、ドガス（Ｄｕｇａｓ）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，およびそれらに含まれた参考文献を参照すること。
【０１８９】
さらに、他の分子へのキレート化剤、クラウンエーテルおよびシクロデキストリンの結合を可能にする多くの経路は、当業者が利用することができる。例えば、メアーズ（Ｍｅａｒｅｓ）ら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｈｅｌａｔｅ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｉｎ，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｉｎｓ：Ｆｏｏｄ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ，ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｆｅｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２，ｐｐ．３７０−３８７、カシナ（Ｋａｓｉｎａ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，９：１０８−１１７（１９９８）、ソング（Ｓｏｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，８：２４９−２５５（１９９７）を参照すること。
【０１９０】
もう一つの好ましい実施形態において、認識部分は、対象被験物と包接錯体を形成する。特に好ましい実施形態において、認識部分は、シクロデキストリンまたは変成シクロデキストリンである。シクロデキストリンは、多くの微生物によって産出される環式オリゴ多糖の群である。シクロデキストリンは、かご様形状を有する環構造をもつ。この形状によって、シクロデキストリンは、内部空胴に多くの種類の分子を含むことが可能となる。例えば、チェツチリ（Ｓｚｅｊｔｉｌｉ）、Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ；Ａｋａｄｅｍｉａｉ  Ｋｌａｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ．１９８２、およびベンダー（Ｂｅｎｄｅｒ）ら、Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９７８を参照すること。
【０１９１】
シクロデキストリンは、例えば、薬物、殺虫剤、除草剤および戦争（ｗａｒ）薬剤を含む一連の生物活性分子と包接錯体を形成することが可能である。タンジアーラ（Ｔａｎｊｉａｒｌａ）ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７：４２５−４２９（１９９８）、ツガール（Ｚｕｇｈｕｌ）ら、Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３；４３−５３（１９９８）およびアルバーズ（Ａｌｂｅｒｓ）ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，１２：３１１−３３７（１９９５）を参照すること。重要なことは、シクロデキストリンが、その包接錯体中の化合物の鏡像異性体の間を識別することが可能なことである。従って、一つの好ましい実施形態において、本発明は、鏡像異性体の混合物中の特定の鏡像異性体を検出することに備えている。コッペンホーファー（Ｋｏｐｐｅｎｈｏｅｆｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ａ７９３：１５３−１６４（１９９８）を参照すること。
【０１９２】
シクロデキストリンまたは他のあらゆる認識部分は、直接またはスペーサーアームを通して本発明の化合物および固体支持体などに結合することができる。ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．１０１：６８５５−６８６０（１９９７）を参照すること。シクロデキストリンを他の分子に結合する方法は、クロマトグラフィーおよび薬学の技術上当業者に対してよく知られている。スリーニバサン（Ｓｒｅｅｎｉｖａｓａｎ，Ｋ．Ｊ．）、Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，６０：２２４５−２２４９（１９９６）を参照すること。
【０１９３】
もう一つの代表的な実施形態において、認識部分は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）などのポリアミノカルボキシレートキレート化剤である。これらの認識部分は、例えば、市販されている二酸無水物（ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））を利用することによって、例えば、本発明の化合物のあらゆるアミン末端成分、固体支持体またはスペーサーアームに結合することができる。
【０１９４】
なお更に好ましい実施形態において、認識部分は、蛋白質、核酸、ペプチドまたは抗体などの生物分子である。本発明の実施において有用な生物分子は、あらゆる供給源から誘導することができる。生物分子は、天然源から単離することが可能であるか、あるいは合成方法によって製造することができる。蛋白質は、天然蛋白質または突然変異蛋白質であることが可能である。突然変異は、化学的変異誘発、部位特異的突然変異誘発または当業者に対して知られている突然変異を誘発する他の手段によって行うことができる。本発明の実施において有用な蛋白質には、例えば、酵素、抗原、抗体および受容体が挙げられる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかであることが可能である。ペプチドおよび核酸は、天然源から単離することが可能であるか、あるいは全面的または部分的に合成のものであることが可能である。
【０１９５】
認識部分が蛋白質または抗体である実施形態において、蛋白質は、蛋白質の表面上で利用できるあらゆる反応性ペプチド残基によって本発明の化合物、固体支持体または架橋剤に結合することができる。好ましい実施形態において、反応基はアミンまたはカルボキシレートである。特に好ましい実施形態において、反応基はリシン残基のε−アミン基である。
【０１９６】
抗体である認識部分は、蛋白質、ペプチド、核酸、糖、あるいは薬物、殺虫剤、除草剤、工業化学薬品および戦争薬剤などの小生物活性材料である被験物を認識するために用いることができる。特定の分子のための抗体を生起させる方法は、当業者に対してよく知られている。１９９２年９月１５日にフェング（Ｆｅｎｇ）らに発行された米国特許第５，１４７，７８６号、１９９４年８月２日にスタンカー（Ｓｔａｎｋａｅｒ）らに発行された米国特許第５，３３４，５２８号、１９９７年１１月１１日にアルバヤチ（Ａｌ−Ｂａｙａｔｉ，Ｍ．Ａ．Ｓ）に発行された米国特許第５，６８６，２３７号および１９９６年１１月１２日にホエス（Ｈｏｅｓｓ）らに発行された米国特許第５，５７３，９２２号を参照すること。抗体剤を表面に結合する方法も技術上知られている。デラマルシェ（Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ）ら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１２：１９４４−１９４６（１９９６）を参照すること。
【０１９７】
上述したような多数の技術上知られている結合方法のいずれかによって、認識部分を本発明の化合物に接合することが可能である。一つの実施形態において、認識部分は、芳香族サリチルアミジル核、主鎖またはアミド置換基上の基を通してサリチルアミジルキレートに直接結合される。もう一つの代表的な実施形態において、反応性二官能性架橋剤は、ＳＬ上での結合された反応基であり、この接合体は、その後、架橋成分上の反応基および認識部分上の相補反応性の基を介して認識部分に結合される。多くの有用な架橋剤を商業的に購入することが可能である（イリノイ州ロックフォードのピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））か、あるいは技術上知られている技術を用いて合成することが可能である。あるいは、認識部分と架橋剤は、サリチルアミジルキレートを認識部分に結合する前に連結（ｃｏｕｐｌｅ）される。
被験物
本発明の材料および方法は、検出可能な方式で認識部分と相互作用するあらゆる被験物、または被験物の種類を検出するために用いることができる。被験物と認識部分との間の相互作用は、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、反発電子相互作用、引付電子相互作用および疎水／親水相互作用を含むあらゆる物理化学的相互作用であることが可能である。
【０１９８】
好ましい実施形態において、相互作用はイオン相互作用である。この実施形態において、酸、塩基、金属イオンまたは金属イオン−結合配位子は被験物である。なお更に好ましい実施形態において、相互作用は水素結合相互作用である。特に好ましい実施形態において、相補配列を有する核酸への核酸のハイブリダイゼーションが検出される。もう一つの好ましい実施形態において、相互作用は、酵素または受容体と、それに結合する小分子またはペプチドとの間である。
【０１９９】
もう一つの実施形態において、被験物は、対象被験物を導入する前に認識部分に結合されていたもう一つの薬剤とで認識部分を競う。この実施形態において、本発明の化合物から検出可能な蛍光レベルをもたらすのは、事前結合薬剤を追い出す被験物のプロセスまたは結果である。認識部分と被験物の適する組合せは、当業者に対して明らかであろう。
【０２００】
現在好ましい実施形態において、被験物は、酸、塩基、有機イオン、無機イオン、薬物、殺虫剤、除草剤および生物分子から成る群から選択されたメンバーである。これらの薬剤の各々は、実用可能な場合、蒸気または液体として検出することができる。これらの薬剤は、構造的に関連ない化合物の混合物、立体異性体のラセミ混合物、立体異性体の非ラセミ混合物、ジアステレオマーの混合物、位置異性体の混合物中の成分として、あるいは純化合物として存在することが可能である。混合物内の他の物質からの妨害なしに特定の対象被験物を検出するためのデバイスおよび方法は本発明の範囲内である。
【０２０１】
実質的に非酸性で非塩基性である有機イオン（例えば、第四アルキルアンモニウム塩）は、本発明の標識認識部分によって検出することが可能である。例えば、イオン交換特性をもつＳＬ−標識認識部分は本発明において有用である。特定の例は、ナトリウムなどの金属イオンとドデシルトリメチルアンモニウムカチオンなどのカチオンとの交換である。有機イオンと包接錯体を形成する認識部分も有用である。例えば、クラウンエーテルおよびクリプタンドは、第四アンモニウムカチオンなどの有機イオンと包接錯体を形成させるために用いることができる。
【０２０２】
金属イオンおよび錯体イオンなどの無機イオン（例えば、ＳＯ4-2、ＰＯ4-3）は、本発明のＳＬおよび方法を用いて検出することも可能である。金属イオンは、例えば、本発明の化合物に結合されたＳＬまたはキレート化剤による金属イオンの錯化またはキレート化によって検出することができる。この実施形態において、認識部分は、単純一価部分（例えば、カルボキシレート、アミン、チオール）であることが可能であるか、あるいは構造的により複雑な薬剤（例えば、エチレンジアミン五酢酸、クラウンエーテル、アザクラウン、チアクラウン）であることが可能である。
【０２０３】
錯体無機イオンは、配位子−金属錯体中の結合金属イオンをＳＬとで競う錯体無機イオンの能力によって検出することができる。ＳＬに結合された配位子が、金属と錯体イオンとの間の錯体のそれより小さい熱力学的安定度定数を有する金属−錯体を形成する時、錯体イオンは、固定化配位子からの金属イオンの解離を引き起こす。金属イオンが錯化ランタニドである場合、蛍光は減少する。金属イオンと配位子との間で形成された化合物に関する安定度定数を決定する方法は、当業者に対してよく知られている。これらの安定度定数を用いて、特定のイオンに対して特異的であるキレートを製造することができる。マーテル（Ｍａｒｔｅｌｌ，Ａ．Ｅ．）、モテカイチス（Ｍｏｔｅｋａｉｔｉｓ，Ｒ．Ｊ．）、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ，２ｄ  Ｅｄ．，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２を参照すること。
【０２０４】
好ましい実施形態において、特定の金属イオンに対する被験物の親和性は、当該の特定の金属イオンを含む本発明の化合物を用いることによって活用される。金属イオンは、一般に、被験物が結合できる利用可能な少なくとも一個の空き配位部位をもたなければならない。あるいは、金属と金属−固定化剤との間の少なくとも一つの結合は、被験物による固定化剤の少なくとも一つの結合の排除を可能にするために被験物の存在下で十分に不安定でなければならない。被験物と金属イオンとの間の相互作用は、例えば、ＵＶ／Ｖｉｓおよび蛍光分光分析法を含む多くの技術上認められた技術を用いて検出することが可能である。
【０２０５】
被験物と認識部分の他の組合せは当業者に対して明らかであろう。
プローブ
本発明は、例えば、標的種、標的種のための配位子（例えば、核酸、ペプチドなど）および小分子（例えば、薬物、殺虫剤など）などに接合されたＳＬ部分を含むプローブを提供する。
核酸プローブ
本発明のＳＬは、核酸プローブと合わせて使用することで有用となり、例えば、５’ヌクレアーゼアッセイ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸系配列増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む多様なＤＮＡ増幅／定量化戦略における検出剤の成分として、および溶液相または固相（例えば、アレイ）アッセイにおいて標的の直接検出のために、本発明のＳＬを用いることができる。さらに、ＳＬ−誘導核酸は、例えば、モレキュラービーコン、スコーピオンプローブ、サンライズプローブ、配座援用プローブ、ライトアッププローブおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブから選択されたフォーマットを含む実質的にあらゆるフォーマットのプローブ中で用いることができる。
【０２０６】
従って、別の態様において、本発明は、核酸標的配列を検出する方法を提供する。その方法は、（ａ）標的配列をディテクター核酸と接触させる、（ｂ）標的配列に標的結合配列をハイブリダイゼーションさせ、よってディテクター核酸のコンホメーションを変え、よって蛍光パラメータの変化を引き起こす、（ｃ）蛍光パラメータの変化を検出し、よって核酸標的配列を検出することを含む。
【０２０７】
本明細書に記載された方法において、特に注記しないかぎり、好ましいディテクター核酸には、一本鎖標的結合配列が含まれる。結合配列は、ｉ）蛍光体およびｉｉ）本発明のＳＬを自身に結合させている。さらに、相補配列へのハイブリダイゼーションの前に、ディテクター核酸は、好ましくは、蛍光体が励起された時に蛍光体とＳＬとの間の蛍光エネルギー伝達を可能にするコンホメーションにある。さらに、この節に記載した方法の各々において、蛍光の変化は標的配列の存在の指標として検出され、蛍光のその変化は、好ましくはリアルタイムで検出される。
【０２０８】
もう一つの態様において、本発明は、核酸標的配列の存在を検出する別の方法を提供する。その方法は、（ａ）一本鎖標的結合配列および標的結合配列に５’分子間で結合した二次構造体含むディテクター核酸を、少なくとも一部が標的配列へのハイブリダイゼーションのために利用できる一本鎖尾を形成する標的配列にハイブリダイゼーションさせる、（ｂ）プライマー伸長反応において、前記分子間結合した二次構造体を鋳型として用いて相補鎖を合成し、よって前記分子間で結合した二次構造体を解離させると共に蛍光パラメータの変化を生じさせる、（ｃ）前記蛍光パラメータの前記変化を検出し、よって前記核酸標的配列を検出すること含む。
【０２０９】
この方法において、そして特に注記しないかぎりこの節に記載した他の方法において、ディテクター核酸は、実質的にあらゆる分子間結合した二次構造を取ることが可能であるが、この構造体は、好ましくは、ヘアピン、ステムループ構造体、疑似ノット、トリプルヘリックスおよび配座援用構造体から選択されたメンバーである。さらに、分子間塩基対合二次構造体は、好ましくは、標的結合配列の一部を含む。さらに、分子間で結合した二次構造体は、好ましくは、全面的にまたは部分的に一本鎖のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む。
【０２１０】
相補鎖は、こうした鎖を調製する技術上認められたあらゆる方法によって調製することができるが、好ましくは、標的増幅反応において、より好ましくは、ディテクター核酸を鋳型として用いる標的配列の伸長によって合成される。
【０２１１】
もう一つの態様において、本発明は、標的配列の増幅を検出する方法を提供する。その方法は、（ａ）標的配列とディテクター核酸をハイブリダイゼーションする工程を含む増幅反応の使用を含む。ディテクター核酸は、一本鎖標的結合配列および標的結合配列に５’で分子間結合した二次構造体を含む。標的配列の少なくとも一部は、標的配列へのハイブリダイゼーションのために利用できる一本鎖尾を形成する。その方法は、前述した工程（ａ）に加えて、（ｂ）ディテクター核酸伸長産物を産出するためにポリメラーゼを用いて前記標的配列上で前記ハイブリダイゼーションされたディテクター核酸を伸長すると共に前記ディテクター核酸伸長産物を前記標的配列から分離する工程と、（ｃ）前記ディテクター核酸伸長産物にプライマーをハイブリダイゼーションさせ、前記ポリメラーゼを用いて前記プライマーを伸長し、よって前記分子間結合した二次構造体を線形化すると共に蛍光パラメータの変化を生じさせる工程と、（ｄ）前記蛍光パラメータの前記変化を検出し、よって前記標的配列を検出する工程とを含む。
【０２１２】
なお別の態様において、本発明は、第１の核酸と第２の核酸がハイブリダイゼーションするか否かを確認する方法を提供する。この方法において、第１の核酸は、本発明によるＳＬを含む。その方法は、（ａ）第１の核酸を第２の核酸と接触させることと（ｂ）前記第１の核酸、前記第２の核酸およびそれらの組合せから選択されたメンバーの蛍光特性の変化を検出し、よってハイブリダイゼーションが起きているか否かを確認することとを含む。
【０２１３】
ＳＬと蛍光体の両方を保持するプローブは用いることが可能であるか、あるいは、核酸の一つ以上に単独にＳＬまたは蛍光体を標識付けすることができる。ＳＬで単独に標識付けられた核酸がプローブである時、第１の核酸と第２の核酸との間の相互作用は、天然核酸蛍光の消失、より好ましくは、第２の核酸に結合された蛍光体の蛍光の消失を観察することにより検出することができる。
【０２１４】
核酸増幅、検出および定量化を探るために設計された種における一般的有用性に加えて、本ＳＬは、今知られているか、あるいは後日に発見される実質的にあらゆる核酸プローブフォーマットにおいて用いることができる。例えば、本発明のＳＬは、Ｔａｑｍａｎプローブ（ヘルド（Ｈｅｌｄ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４（１９９６）、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０（１９９１）、リー（Ｌｅｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３７６１−３７６６（１９９３））、モレキュラービーコン（チアギ（Ｔｙａｇｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８（１９９６）、１９９９年１１月２３日発行のジャヤセナ（Ｊａｙａｓｅｎａ）らによる米国特許第５，９８９，８２３号））、スコーピオンプローブ（ウィトコム（Ｗｈｉｔｏｃｏｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８０４−８０７（１９９９））サンライズプローブ（ナザレンコ（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５１６−２５２１（１９９７））、配座援用プローブ（１９９９年６月９日出願の同時係属で共通に譲渡されたクック（Ｃｏｏｋ，Ｒ）による米国仮出願６０／第１３８，３７６号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ベースのライトアッププローブ’（１９９７年１２月のクビスタ（Ｋｕｂｉｓｔａ）らによるＷＯ９７／４５５３９）および二本鎖特異ＤＮＡ染料（ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：４１３−４１７（１９９２）、ウィットワ（Ｗｉｔｔｗｅｒ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１３０−１３８（１９９７））などのプローブモチーフに組み込むことができる。本ＳＬを合わせて使用できるこれらおよび他のプローブモチーフは、Ｎｏｎｉｓｔｒｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２においてレビューされている。
【０２１５】
本発明のプローブ中で用いるための核酸は、適するあらゆるサイズであることが可能であり、好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチドの範囲、より好ましくは約１０〜約８０ヌクレオチドの範囲、なおより好ましくは約２０〜約４０ヌクレオチドの範囲内である。本発明の核酸プローブの厳密な配列および長さは、核酸が結合する標的ポリヌクレオチドの性質にある程度依存する。結合位置および長さは、特定の実施形態に関する適切なアニーリング特性と溶融特性を達成するために変えることができる。こうした設計の選択を行うための手引きは、多くの技術上認められた参考文献において見られる。
【０２１６】
好ましくは、核酸プローブの３’−末端ヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼによって伸長が遮断されているか、あるいは伸長不能にされている。こうした遮断は、連結部分によって核酸プローブの末端３’−位置に供与体分子または受容体分子を結合することにより便利に行われる。
【０２１７】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのキメラ混合物あるいは誘導体または修飾種を含むことが可能である。プローブと標的核酸の両方は、一本鎖、二本鎖、三重鎖などとして存在することが可能である。分子エネルギー伝達供与体部分および分子エネルギー伝達受容体部分で標識付けられることに加えて、核酸は、放射線標識、マイナーグルーブバインダーおよび挿入剤などの他の群で塩基部分、糖部分またはホスフェート主鎖において修飾することができる。
【０２１８】
例えば、核酸は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ6−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシ、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンに限定されないが、それらを含む群から選択された少なくとも一個の修飾塩基部分を含むことが可能である。
【０２１９】
もう一つの実施形態において、核酸は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースに限定されないが、それらを含む群から選択された少なくとも一個の修飾糖部分を含む。
【０２２０】
なおもう一つの実施形態において、核酸は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホラミドチオアート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびフォルムアセタールまたはそれらの類似体に限定されないが、それらを含む群から選択された少なくとも一個の修飾ホスフェート主鎖を含む。
【０２２１】
本発明のホスホジエステル連結核酸は、技術上知られている標準方法、例えば、市販アミジト化学を用いる自動ＤＮＡ合成装置（バイオシステムズ（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などから市販されているものなど）の使用によって合成することができる。修飾ホスホジエステル連結基を保持する核酸は、技術上知られている方法によって合成することができる。例えば、ホスホロジチオアート核酸は、ステイン（Ｓｔｅｉｎ）ら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８））の方法によって合成することができ、メチルホスホネート核酸は、制御ポアガラスポリマー支持体（サリン（Ｓａｒｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））の使用によって調製することができる。ホスホジエステル連結核酸と修飾ホスホジエステル連結核酸の両方を合成する他の方法は当業者に対して明らかであろう。
【０２２２】
本発明の核酸プローブは、多くのアプローチ、例えば、オザキ（Ｏｚａｋｉ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｃｈ，２０：５２０５−５２１４（１９９２）またはアグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｃｈ，１８：５４１９−５４２３（１９９０）などによって合成することができる。本発明の核酸プローブは、ホスホラミジト化学（例えば、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：２２２３−２３１１（１９９２）、モルコ（Ｍｏｌｋｏ）らによる米国特許第４，９８０，４６０号、コステル（Ｋｏｓｔｅｒ）らによる米国特許第４，７２５，６７７号、カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）らによる米国特許第４，４１５，７３２号、第４，４５８，０６６号および第４，９７３，６７９号などの参考文献において開示されたものを参照すること）などの標準化学を用いる自動ＤＮＡ合成装置、例えば、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フォスターシティ）モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で便利に合成されている。ホスホロチオアートおよびホスホラミデートなどの非天然主鎖群を生じさせる別の化学を用いることもできる。
【０２２３】
自動核酸合成装置を用いて核酸を合成する時、安定化部分、エネルギー伝達供与体部分およびエネルギー伝達受容体部分は、好ましくは自動合成中に導入される。あるいは、これらの部分の一つ以上は、自動合成手順を開始する前または開始した後に導入することができる。もう一つの代表的な実施形態において、これらの部分の一つ以上は、自動合成が完了した後に導入される。
【０２２４】
供与体部分は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、より好ましくは約１５ヌクレオチドだけＳＬから離れている。供与体部分は、好ましくは、プローブの３’−または５’−末端ヌクレオチドのいずれかに結合される。ＳＬ部分も、好ましくは、プローブの３’−または５’−末端ヌクレオチドのいずれかに結合される。より好ましくは、供与体部分および受容体部分は、それぞれプローブの３’−および５’−末端ヌクレオチドまたは５’−および３’−末端ヌクレオチドに結合される。
【０２２５】
一旦必要な核酸を合成すると、好ましくは、核酸をその上で合成した固体支持体から核酸を切り取り、存在するあらゆる保護基を除去するために技術上知られている方法によって処理する（例えば、６０℃、５時間、濃アンモニア）。塩基感応基を核酸（例えば、ＴＡＭＲＡ）に結合する実施形態において、除保護は、好ましくは、より穏やかな条件（例えば、ブチルアミン：水＝１：３、８時間、７０℃）を用いる。これらの条件下での除保護は、迅速除保護アミジト（例えば、ｄＣ−アセチル、ｄＧ−ｄｍｆ）の使用によって促進される。
【０２２６】
支持体からの切り取りおよび除保護の後に、核酸は、クロマトグラフィー、抽出およびゲル精製を含む技術上知られているいずれかの方法によって精製される。好ましい実施形態において、核酸はＨＰＬＣを用いて精製される。単離された核酸の濃度および純度は、好ましくは、分光光度計において２６０ｎｍで光学濃度を測定することにより決定される。
ペプチドプローブ
本発明の蛍光体およびＳＬで標識付けられているペプチド、蛋白質およびペプチド核酸は、生体内および試験管内酵素アッセイの両方において用いることができる。
【０２２７】
従って、もう一つの態様において、本発明は、サンプルが酵素を含有するか否かを決定する方法を提供する。その方法は、（ａ）サンプルをペプチド構造体と接触させる、（ｂ）蛍光体を励起させる、および（ｃ）その中の酵素の存在が蛍光特性の変化を生じさせるサンプルの蛍光特性を決定することを含む。
【０２２８】
本発明の実施において有用なペプチド構造体は、ｉ）蛍光体、ｉｉ）本発明のＳＬおよびｉｉｉ）酵素のための開裂認識部位の機能を有するものが挙げられる。さらに、ペプチド構造体は、好ましくは、蛍光体が励起された時に蛍光体とＳＬとの間の蛍光エネルギー伝達を可能にする長さおよび配向であり、且つ伝達を可能にするコンホメーションにある。
【０２２９】
分解酵素（例えば、プロテアーゼ）などの酵素を検出するためにプローブを用い、また予想された量より小さい蛍光共鳴エネルギー伝達の度合が観察される時、これは、一般に酵素の存在を示す。サンプル中の蛍光共鳴エネルギー伝達の度合は、例えば、供与体部分からの蛍光の量、受容体部分からの蛍光の量、供与体部分からの蛍光の量対、受容体部分からの蛍光の量の比または供与体部分の励起状態寿命の関数として決定することができる。
【０２３０】
酵素とタンデム構造体との接触後の第１の時間および第２の時間において蛍光共鳴エネルギー伝達の度合を決定し、そして蛍光共鳴エネルギー伝達の度合の差を決定することによりサンプル中の酵素の量を決定するためにもこのアッセイは有用である。蛍光共鳴エネルギー伝達の度合の差は、サンプル中の酵素の量を表す。
【０２３１】
化合物が酵素の活性を変えるか否かを決定するために、アッセイ法、すなわち、スクリーニングアッセイを用いることもできる。従って、別の態様において、本発明は、生物からのサンプル中の酵素の活性の量を決定する方法を提供する。その方法は、（ａ）酵素と化合物を含むサンプルをペプチド構造体と接触させる、（ｂ）蛍光体を励起させる、および（ｃ）その中の酵素の存在が蛍光特性の変化を生じさせるサンプルの蛍光特性を決定することを含む。本発明のこの態様において有用なペプチド構造体は、直ぐ上で説明したものと実質的に似ている。
【０２３２】
好ましい実施形態において、サンプル中の酵素活性の量は、サンプル中の蛍光共鳴エネルギー伝達の度合の関数として決定され、サンプル中の活性の量は、酵素の同じ量に関する標準活性と比較される。サンプル中の酵素活性の量と標準活性との間の差は、化合物が酵素の活性を変えることを示唆する。
【０２３３】
本発明を実施できる代表的な酵素には、例えば、トリプシン、エンテロキナーゼ、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、プロホルモンコンバターゼ、インターロイキン−１ｂ−変換酵素、アデノウイルスエンドペプチダーゼ、サイトメガロウイルスアセンブリン、リーシュマノリシン、アミロイド前駆物質蛋白のためのβ−セクレターゼ、トロンビン、レニン、アンギオテンシン変換酵素、カセプシン−Ｄおよびキニノゲナーゼおよびプロテアーゼ全般が挙げられる。
【０２３４】
プロテアーゼは、アルツハイマー、高血圧症、炎症、アポプトーシスおよびＡＩＤＳなどの多くの疾病プロセスにおいて不可欠な役割を果たす。それらの活性を遮断するか、あるいは強化する化合物は、治療薬としての可能性を有する。ペプチダーゼの正常基質は線状ペプチドであり、そして確立された手順が非ペプチド類似体を製造するために存在するので、プロテアーゼの活性に影響を及ぼす化合物はコンビナトリアル化学の当然の主題である。コンビナトリアル化学によって産出される化合物のスクリーニングは、便利な酵素アッセイを必要とする。
【０２３５】
プロテアーゼのための最も便利なアッセイは、潜在的開裂部位を含むペプチド短鎖の反対両端に置かれた供与体蛍光体から受容体への蛍光共鳴エネルギー伝達に基づいている（ナイト（Ｋｎｉｇｈｔ  Ｃ．Ｇ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：１８−３４（１９９５））を参照すること）。蛋白分解は蛍光体と受容体を分離し、よって供与体蛍光体の発光において高まった強度をもたらす。既存のプロテアーゼアッセイは、固相ペプチド合成によって集められた不自然色素産生アミノ酸を組み込んだ短いペプチド基質を用いている。
【０２３６】
本発明のアッセイは、プロテアーゼの基質開裂配列を決定し特性分析するためにも、あるいはオーファンプロテアーゼなどのプロテアーゼを識別するためにも有用である。一つの実施形態において、その方法は、特定のリンカー部分アミノ酸配列をアミノ酸のランダム選択を含むものと置換することを含む。蛍光体とＳＬをランダムペプチドリンカー部分によって連結している蛍光ＳＬ−保持プローブのライブラリーは、組み換え工学技術または合成化学技術によって作ることができる。ライブラリーのメンバーのスクリーニングは、開裂酵素をタンデム蛍光ペプチド構造体のライブラリーメンバーの各々と接触させた後、蛍光エネルギー伝達などの開裂に関連した信号を測定することにより実行することができる。予想された量より小さい蛍光共鳴エネルギー伝達の度合は、酵素によって開裂されるリンカー配列の存在を示唆する。サンプル中の蛍光共鳴エネルギー伝達の度合は、例えば、供与体部分からの蛍光体の量、受容体供与体部分からの蛍光の量または供与体部分からの蛍光の量対、受容体部分からの蛍光の量の比あるいは供与体部分の励起状態寿命の関数として決定することができる。
【０２３７】
本発明のタンデム構造体において、供与体部分と受容体部分は、リンカー部分を通して接続される。リンカー部分は，好ましくはペプチド部分を含むが、別の有機分子部分であることも可能である。好ましい実施形態において、リンカー部分は、対象酵素または他の対象開裂剤に関して特異的な開裂認識部位を含む。リンカー部分中の開裂部位は、タンデム構造体が開裂剤と混合された時にリンカーが開裂剤による開裂のための基質であるので有用である。リンカー部分の破壊は、本発明の蛍光体とＳＬの分離の原因となる。この分離は、ＦＲＥＴの変化として測定可能である。
【０２３８】
本発明の開裂剤がプロテアーゼである時、リンカーは、プロテアーゼに関する開裂認識配列を含むペプチドを含むことが可能である。プロテアーゼに関する開裂認識配列は、蛋白分解開裂中にプロテアーゼによって認識される特定のアミノ酸配列である。多くのプロテアーゼ開裂部位は技術上知られており、これらおよびその他の開裂部位は、リンカー部分中に含めることができる。例えば、マタヨシ（Ｍａｔａｔｏｓｈｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：９５４（１９９０）、ダン（Ｄｕｎｎ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１：２５４（１９９４）、セイダー（Ｓｅｉｄａｈ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１７５（１９９４）、ソーンベリー（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：６１５（１９９４）、ウェーバー（Ｗｅｂｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：５９５（１９９４）、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：４１２（１９９４）、ブーバー（Ｂｏｕｖｉｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：６１４（１９９５）、ハーディ（Ｈａｒｄｙ）ら、Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｅｄ．Ｍａｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．ｐｐ．１９０−１９８（１９９４）を参照すること。
固体支持体固定化ＳＬ類似体
本発明のＳＬは、有用なあらゆる構成を有する実質的にあらゆるポリマー、生物分子、固体または半固体材料上に固定化することができる。さらに、一つ以上のＳＬを含むあらゆる接合体は、同様に固定化することが可能である。支持体が固体または半固体である時、核酸プローブの固定化のための支持体の好ましいタイプの例には、制御ポアガラス、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジン被覆ポリスチレンビード、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲルおよび活性化デキストランが挙げられるが、それらに限定されない。これらの固体支持体は、化学的安定性、官能化の容易さおよび明確な表面積のために好ましい。制御ポアガラス（ＣＰＧ、５００オングストローム、１０００オングストローム）および非膨潤性高架橋ポリスチレン（１０００オングストローム）などの固体支持体は特に好ましい。
【０２３９】
本発明によると、固体支持体の表面は、本発明のＳＬまたは本発明のＳＬを含む種で官能化される。説明を明確にするために、以下の議論は、反応性ＳＬを固定支持体に結合することに焦点を当てる。以下の議論は、広くは、反応性ＳＬをその構造体内に含む種を固体支持体に結合すること、および他の分子および構造体へのこうした種と反応性ＳＬ類似体の結合にも関連する。
【０２４０】
ＳＬは、好ましくは、ＳＬ上の反応基と固体支持体の表面上または固体支持体に結合されたリンカーの反応基との間で結合を形成することにより固体支持体に結合され、よって一つ以上のＳＬ類似体を伴った固体支持体が誘導される。固体支持体とＳＬとの間の結合は、好ましくは共有結合である。但し、イオン結合、供与結合および他のこうした結合も有用である。本発明の実施において使用できる反応基は前に詳細に論じられており、それらには、例えば、アミン、ヒドロキシル基、カルボン酸、カルボン酸誘導体、アルケン、スルフヒドリル、シロキサンなどが挙げられる。
【０２４１】
本発明を実施するために適切な多くの固体支持体は市販されており、それらには、例えば、結合アミノ酸および／またはペプチドを伴ったペプチド合成樹脂および結合アミノ酸および／またはペプチドのないペプチド合成樹脂（例えば、アルコキシベンジルアルコール樹脂、アミノメチル樹脂、アミノポリスチレン樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂など）（バケム（Ｂａｃｈｅｍ））、官能化制御ポアガラス（バイオサーチテクノロジーズ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．））、イオン交換媒体（アルドリット（Ａｌｄｒｉｃｈ））および官能化メンブレン（例えば、−ＣＯＯＨメンブレン、旭化成（Ａｓａｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、旭硝子（Ａｓａｈｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ．）および徳山曹達（Ｔｏｋｕｙａｍａ  Ｓｏｄａ  Ｃｏ．））などが挙げられる。
【０２４２】
さらに、適切な固体支持体が市販されていない用途において、固体支持体表面の官能化のために多様な反応タイプを利用できる。例えば、ポリプロピレンなどのプラスチックから製造された支持体は、クロム酸酸化によって誘導され、その後、ヒドロキシル化またはアミノメチル化表面に変換された表面であることが可能である。その後、官能化された支持体は、例えば、ＳＬ活性のエステル、酸塩化物またはスルホン酸エステルなどの、相補反応性のＳＬと反応する。高度に架橋されたジビニルベンゼンから製造された支持体は、クロロメチル化およびその後の官能基操作によって誘導された表面であることが可能である。さらに、官能化された基板は、エッチングされた還元ポリテトラフルオロエチレンから製造することができる。
【０２４３】
支持体がガラスなどの珪質材料から製造される時、その表面は、表面Ｓｉ−ＯＨ、ＳｉＯ−Ｈおよび／またはＳｉ−Ｓｉ基を官能化用試薬と反応させることにより誘導することができる。
【０２４４】
基板がガラスから製造される好ましい実施形態において、ガラス表面に対する反応基の共有結合は、
【０２４５】
【化２６】
0004943585.tif 000015
【０２４６】
などの珪素変成試薬による基板の表面上の基の転化によって達成される。
【０２４７】
式中、Ｒaは、メチルまたはエチルなどのアルキル基であり、Ｒbは珪素とＸaとの間の連結基であり、Ｘaは、反応基または保護された反応基である。式に示したアルコシキ基に加えてハロゲンまたはその他の脱離基を有するシラン誘導体も、本発明において有用である。
【０２４８】
もう一つの好ましい実施形態において、固体支持体を官能化するために用いられる試薬は、各試薬分子当たり一つより多い反応基を備える。以下の式
【０２４９】
【化２７】
0004943585.tif 000016
【０２５０】
の化合物などの試薬を用いると、基板表面上の各反応部位は、本質的に二つ以上の官能基に「増幅」される。
【０２５１】
式中、Ｒaはアルキル基（例えば、メチル、エチル）であり、Ｒbは珪素とＸaとの間の連結基であり、Ｘaは、反応基または保護された反応基であり、ｎは２〜５０の間、より好ましくは２〜２０の間の整数である。珪素含有基板へのＳＬの結合によるＳＬの増幅は、ＳＬ増幅の一般的着想の例として示そうとするものである。この増幅戦略は、ＳＬ類似体をもう一つの分子または固体支持体に結合する本発明の他の態様に等しく適用できる。
【０２５２】
多くのシロキサン官能化用試薬を用いることができる。例えば、
１．ヒドロキシアルキルシロキサン（表面をシリル化し、ジボランで官能化し、Ｈ2Ｏ2でアルコールに酸化する）
ａ．アリルトリクロロシラン→→３−ヒドロキシプロピル
ｂ．７−オクト−１−エニルトリクロルクロロシラン→→８−ヒドロキシオクチル
２．ジオール（ジヒドロキシアルキル）シロキサン（表面をシリル化し、ジオールに加水分解する）
ａ．（グリシジルトリメトキシシラン→→（２，３−ジヒドロキシプロピルオキシ）プロピル
３．アミノアルキルシロキサン（中間官能化工程が要らないアミン）
ａ．３−アミノプロピルトリメトキシシラン→アミノプロピル
４．二量体第二アミノアルキルシロキサン
ａ．ビス（３−トリメトキシシリルプロピル）アミン→ビス（シリルオキシプロピル）アミン
シロキサン以外の支持成分を用いる時、同様に有用な一連の官能化用化学薬品が入手できることは当業者に対して明らかであろう。従って、例えば、シロキサン変成試薬の文脈において上述したように、官能化されたアルキルチオールを金属フィルムに結合することができ、その後、それをＳＬと反応させて、本発明の固定化化合物を生成させることができる。
【０２５３】
本発明の上述した実施形態におけるＲbのために有用なＲ基には、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、アシル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルコキシ、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、飽和環式炭化水素、不飽和環式炭化水素、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリール、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式およびヘテロ環式アルキル基およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
核酸捕獲プローブ
一つの実施形態において、ＳＬを含む固定化核酸を捕獲プローブとして用いる。核酸プローブは、例えば、プローブの３’−または５’−末端ヌクレオチドを固体支持体に結合することにより固体支持体に直接結合することができる。しかし、より好ましくは、リンカー（すなわち、上述したスペーサーアーム）によってプローブは固体支持体に結合される。リンカーは、固体支持体からプローブを遠ざけるように機能する。リンカーは、最も好ましくは長さ約５〜約３０原子、より好ましくは長さ約１０〜約５０原子である。
【０２５４】
なおもう一つの好ましい実施形態において、固体支持体は、プローブの製造における合成支持体としても用いることができる。固体支持体と核酸の第１の３’−単位との間のリンカーの長さおよび化学的安定性は、支持体結合核酸の効果的な合成およびハイブリダイゼーションにおいて重要な役割を果たす。リンカーアームは、高い収率（９７％を超える）を自動合成中に達成できるように十分に長いのがよい。リンカーの必要な長さは、用いられる特定の固体支持体に応じて決まる。例えば、６原子リンカーは、高架橋ポリスチレンを固体支持体として用いる時、核酸の自動合成中に９７％を超える収率を達成するのに一般に十分である。リンカーアームは、ＣＰＧを固体支持体として用いる時、自動合成中に高い収率（９７％を超える）を達成するために、長さが好ましくは少なくとも２０原子である。
【０２５５】
固体支持体上に固定化されたプローブのハイブリダイゼーションは、一般に、プローブが少なくとも３０原子、より好ましくは少なくとも５０原子固体支持体から離れることを必要とする。この分離を達成するために、リンカーは、一般に、リンカーと３’−末端との間に配置されたスペーサーを含む。核酸合成において、リンカーアームは、塩基試薬で開裂されて固体支持体から核酸を遊離させることができるエステル結合によって、通常は３’−末端の３’−ＯＨに結合される。
【０２５６】
核酸プローブを固体支持体に結合するために使用できる様々なリンカーが技術上知られている。リンカーは、固体支持体に結合されたプローブへの標的配列のハイブリダイゼーションを大幅には妨害しない、あらゆる化合物から形成することができる。リンカーは、自動合成によってリンカー上に容易に付加されうる、例えば、ホモポリマー核酸から形成することができる。あるいは、官能化ポリエチレングリコールなどのポリマーをリンカーとして用いることができる。こうしたポリマーは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを大幅には妨害しないのでホモポリマー核酸より現在は好ましい。ポリエチレングリコールは、市販されており、有機媒体と水性媒体の両方に可溶であり、官能化が容易であり、核酸合成条件およびポスト合成条件下で完全に安定であるために特に好ましい。
【０２５７】
固体支持体とリンカーとプローブとの間の結合は、好ましくは、高温における塩基条件下で塩基保護基の合成または除去中に開裂されない。しかし、これらの結合は、様々な条件下で開裂可能である基から選択することができる。現在好ましい結合の例には、カルバメート、エステルおよびアミド結合が挙げられる。
アクリルアミド−固定化プローブ
もう一つの好ましい実施形態において、種はアクリルアミドマトリックスなどのマトリックス内にあり、種はＳＬを保持しているか、あるいは固定化種の存在は、ＳＬを保持するプローブを用いて確認される。好ましい実施形態において、固定化は、モザイクテクノロジーズ（Ｍｏｓａｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（マサツセッチュ州ケンブリッジ、レーマン（Ｒｅｈｍａｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：６４９−６５５（１９９９）を参照すること）によって発明され商業化された「アクリジト」プロセスと合わせて実行される。アクリジト法は、重合されたポリアクリルアミド網目内にアルケン標識付け獲得プローブの固定化を可能にする。標的混合物が電気泳動条件下で固定化プローブ帯を通り過ぎる時、標的核酸は、実質的に定量的に捕獲される。しかし、この事象の検出は、現在第２のプローブを必要とする。一つの実施形態において、ＳＬおよび／または蛍光体を保持するプローブは、アクリルアミドマトリックス内で固定化され、その後、標的混合物と接触する。捕獲プローブとして蛍光プローブを用いることにより、標的混合物からの信号をリアルタイムで直接検出することができる。
マイクロアレイ
本発明はまた、固定化ＳＬとＳＬで官能化された化合物を含むマイクロアレイを提供する。さらに、本発明は、ＳＬで官能化されるプローブを用いてマイクロアレイに応答（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）させる方法を提供する。固定化種およびプローブは、小分子、ペプチド、酵素および核酸などに限定されないが、それらを含む分子の実質的にあらゆるタイプから選択される。
【０２５８】
多数の固定化核酸から成る核酸マイクロアレイは、ゲノム情報の作成のための画期的なツールである。デボーク（Ｄｅｂｏｕｃｋ）ら、ｉｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：４８−５０（１９９９）を参照すること。以後に続く議論は、核酸マイクロアレイと合わせたＳＬの使用に焦点を当てている。この焦点は、説明することを意図しており、本発明のこの態様を実施できる材料の範囲を限定しない。
【０２５９】
従って、もう一つの好ましい実施形態において、本発明の化合物はマイクロアレイフォーマットで用いることができる。ＳＬまたはＳＬを保持する種は、それ自体マイクロアレイの成分であることが可能であるか、あるいは、マイクロアレイの成分をスクリーニングするツールとしてそれらを利用することができる。
【０２６０】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、マイクロアレイをスクリーニングする方法を提供する。その方法は、マイクロアレイのメンバーをＳＬ−保持プローブと接触させ、蛍光の領域に関してマイクロアレイに応答させることを含む。蛍光領域は、ＳＬ−保持プローブとマイクロアレイ成分との間の相互作用の存在を示す。本方法のもう一つの変法において、蛍光が消失する領域に関してマイクロアレイに応答させる。ここでもそれはＳＬ−保持プローブとマイクロアレイの成分との間の相互作用の存在を示す。
【０２６１】
もう一つの好ましい実施形態において、アレイは、応答させる種として固定化ＳＬ−保持ＦＥＴプローブを含む。この実施形態において、プローブは、その標的にハイブリダイゼーションされた時に「ターンオンする」。こうしたアレイは、容易に調製され、読まれ、そして定量的データを与えるように設計することができる。ＳＬ−保持プローブを含むアレイは、発現分析および臨床的なゲノムスクリーニングのための貴重なツールである。
【０２６２】
もう一つの好ましい実施形態において、固定化ＳＬ−保持プローブは、ＦＥＴプローブではない。フォーマットなどに基づくマイクロアレイは、例えば、プローブと被験物との間で相互作用した後に被験物蛍光の消失を観察することにより被験物と固定化プローブとの間の相互作用の存在を探るために用いることができる。
【０２６３】
別の好ましい実施形態において、マイクロアレイは、同じかまたは異なる核酸配列を含むｎ個のプローブを含む。あるいは、マイクロアレイは、同じかまたは異なる核酸配列の群を含むｎ個のプローブの混合物を含むことが可能である。好ましい実施形態において、ｎは、２〜１００、より好ましくは１０〜１，０００、より好ましくは１００〜１０，０００の数値である。なお別の好ましい実施形態において、ｎ個のプローブは、ｎ個の位置の各々の同定を確認することを可能にするようにｎ個の異なる位置として基板上でパターン化される。
【０２６４】
なおもう一つの好ましい実施形態において、本発明はまた、ｎ個のＳＬ−保持プローブのマイクロアレイを調製する方法を提供する。その方法は、基板の選択された領域にＳＬ−保持プローブを結合させることを含む。アレイ核酸分子などの生物学的高分子のアレイを製造するために様々な方法が現在利用できる。以下の議論は、ＳＬ−保持プローブのマイクロアレイのアセンブリーに焦点を当てる。この焦点は簡潔にするためであり、そして説明することを意図しており、限定することを意図していない。
【０２６５】
基板上にＳＬ−保持プローブの規則的なアレイを製造する一つの方法は、「ドットブロット」アプローチである。この方法において、真空マニホールドは、プローブの複数、例えば、９６個の水性サンプルを直径３ミリメートルのウェルから基板に移送する。プローブは、メンブレンを焼くか、あるいはメンブレンをＵＶ線に照射することにより多孔質メンブレン上に固定化される。この手順の一般的な変形は、「スロットブロット」法であり、その方法においてウェルは非常に長い卵形を有する。
【０２６６】
プローブの規則的なアレイを製造するために用いられるもう一つの技術は、多孔質メンブレンなどの基板に一連のサンプルを移送するために、ウェル、例えば、微量定量プレートの９６個のウェル中に浸漬されたピンのアレイを用いる。一つのアレイは、２２Ｘ２２ｃｍの領域中に９２１６のスポットを作るために、千鳥方式でメンブレンに斑点をつけるように設計される。レーラク（Ｌｅｈｒａｃｈ）ら、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．１，Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９−８１（１９９０）を参照すること。
【０２６７】
プローブの規則的なアレイを作る別の方法は、ピラング（Ｐｉｒｒｕｎｇ）ら（１９９２年発行の米国特許第５，１４３，８５４号）によって、およびフォドー（Ｆｏｄｏｒ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７３（１９９１））によっても記載された方法に似ている。この方法は、粒子または他の基板のばらばらの異なる領域で異なるプローブを合成することを含む。この方法は、好ましくは、例えば、２０塩基（ｂａｓｅ）未満の比較的短いプローブ分子と合わせて用いられる。関連した方法は、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：１０８−１０１７（１９９２））によって記載されている。
【０２６８】
クラプコ（Ｋｈｒａｐｋｏ）ら、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，１：３７５−３８８（１９９１）には、ポリアクリルアミドの薄い層上にＤＮＡの斑点をつけることにより核酸マトリックスを製造する方法が記載されている。斑点をつけるのはマイクロピペットを用いて手で行われる。
【０２６９】
基板は、フォトリトグラフ（クレインフィールド（Ｋｌｅｉｎｆｉｅｌｄ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：４０９８−１２０（１９９８））、フォトエッチング、化学エッチングおよびミクロコンタクト印刷（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ１０：１４９８−５１１（１９９４））などの技術を用いてパターン化することができる。基板上にパターンを形成する他の技術は、当業者に対して容易に明らかであろう。
【０２７０】
基板上のパターンのサイズおよび複雑さは、利用される技術の解像度およびパターンが意図されている目的によってのみ限定される。例えば、ミクロコンタクト印刷を用いると、２００ｎｍ程度に小さい機能が基板上に層状に重ねられる。キア（Ｘｉａ，Ｙ．），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３２７４−７５（１９９５）を参照すること。同様に、フォトリトグラフを用いると、１μｍ程度に小さい機能を有するパターンが作製される。ヒックマン（Ｈｉｃｋｍａｎ）ら、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６０７−１６（１９９４）を参照すること。本発明において有用なパターンには、ウェル、エンクロージャー、パーティション、窪み、入口、出口、チャンネル、トラフおよび回折格子などの機能を含むものが挙げられる。
【０２７１】
現在好ましい実施形態において、パターン化は、プローブを収容するための隣接した複数のウェル、凹みまたは穴を有する基板を作るために用いられる。一般に、これらの基板機能の各々は、隆起した壁または仕切によって他のウェルから分離され、ウェルは流体が連通しない。従って、特定のウェル内に入った粒子または他の物質は、当該のウェルに実質的に封じ込められたままである。もう一つの好ましい実施形態において、パターン化は、デバイスを通したチャンネルの形成を可能にし、それによって被験物または他の物質はデバイスに入るおよび／またはデバイスから出ることが可能である。
【０２７２】
もう一つの実施形態において、プローブは、基板上に直接プローブを「印刷」することにより固定化されるか、あるいは「リフトオフ」技術を利用することができる。リフトオフ技術において、パターン化レジストは基板上に塗られ、有機層は、レジストによって覆われていない領域に塗られ、レジストはその後除去される。本発明の基板と合わせて用いるために適切なレジストは、当業者に対して知られている。例えば、クレインフィールド（Ｋｌｅｉｎｆｉｅｌｄ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：４０９８−１２０（１９９８）を参照すること。フォトレジストを除去した後、第１のプローブとは異なる構造を有する第２のＣＡＰは、レジストによって最初に覆われた領域上で基板に結合することができる。この技術を用いて、特性が異なるプローブのパターンを有する基板を作製することができる。類似の基板構成は、必要な特性を有する層を基板上に直接ミクロ印刷することを通して入手できる。マルキッシュ（Ｍｒｋｉｓｈ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２５：５５−７８（１９９６）を参照すること。
スペーサー基
本明細書において用いられる「スペーサー基」という用語は、ＳＬ−保持プローブの構成成分を指す。スペーサー基は、供与体部分および／または受容体部分ならびに他の基をプローブの核酸、ペプチドまたは他の高分子成分に連結させる。スペーサー基は、親水性（例えば、テトラエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコール）または疎水性（例えば、ヘキサン、デカンなど）であることが可能である。
【０２７３】
好ましい実施形態において、固定化された構造体は、固体支持体反応基とＳＬ類似体との間のスペーサーを含む。リンカーは、好ましくは、Ｃ6〜Ｃ30アルキル基、Ｃ6〜Ｃ30置換アルキル基、ポリオール、ポリエーテル（例えば、ポリ（エチレングリコール））、ポリアミン、ポリアミノ酸、多糖およびそれらの組合せから選択される。
【０２７４】
特定の実施形態において、融通性と高分子成分からの距離とを司る基によって高分子成分に結合されたプローブの部分を有することが有利である。こうしたスペーサー基を用いて、高分子成分に隣接した部分の特性は調整される。通常制御される特性には、例えば、疎水性、親水性、表面活性、核酸からの供与体部分および／またはＳＬ部分の距離ならびにＳＬからの供与体の距離が挙げられる。
【０２７５】
代表的な実施形態において、スペーサーは、核酸からＳＬを遠ざけるように機能する。この特性をもつスペーサーは幾つかの用途を有する。例えば、核酸に近づきすぎて保持されたＳＬは、供与体基と相互作用できないか、あるいはこうしたＳＬは、低すぎる親和性でもって相互作用できるにすぎない。ＳＬがそれ自体立体的に過度に要求する時、クエンチングに導く相互作用は、立体による二成分の接近妨害に起因して、好ましくないほど弱まりうるか、あるいは全く起きない。
【０２７６】
例えば、固体支持体への結合によって、ＳＬを含む構造体が固定化される時、構造体も、固体支持体の反応基とＳＬ類似体または固体支持体に結合された他のプローブ成分との間でスペーサー部分を含むことが可能である。
【０２７７】
なお別の実施形態において、本発明のプローブ中で用いられるスペーサー基は、高分子成分からのＳＬ、蛍光体、マイナーグルーブバインダーおよび挿入部分などの結合部分を開放するために開裂できる基を与えられる。多くの開裂可能な基は技術上知られている。例えば、ジュンング（Ｊｕｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７６１：１５２−１６２（１９８３）、ジョシ（Ｊｏｓｈｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４５１８−１４５２５（１９９０）、ツアーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：９１３−９２０（１９８０）、ブイザー（Ｂｏｕｉｚａｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１５５：１４１−１４７（１９８６）、パーク（Ｐａｒｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：２０５−２１０（１９８６）、ブローニング（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１８５９−１８６７（１９８９）を参照すること。さらに、広範囲の開裂可能な二官能性（ホモ二官能性とヘテロ二官能性の両方）スペーサーアームは、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）などの供給業者から市販されている。
【０２７８】
スペーサー基を用いる代表的な実施形態は、前述した式ＶＩＩおよびＶＩＩＩに記載されている。これらの式において、Ｒbは安定であるか、あるいは化学反応または光化学反応によって開裂することが可能である。例えば、エステル結合またはジスルフィド結合を含むＲb基をそれぞれ加水分解および還元によって開裂することができる。例えば、ニトロベンジル誘導体、フェナシル基、ベンゾインエステルなどの、光によって開裂されるＲb基の使用も本発明の範囲内である。他のこうした開裂可能な基は当業者に対してよく知られている。
キット
もう一つの態様において、本発明は、本発明ＳＬまたはＳＬ−保持組成物の一つ以上を含むキットを提供する。一つの実施形態において、キットは、反応性ＳＬ誘導体およびこの誘導体をもう一つの分子に結合するための手引きを含む。もう一つの実施形態において、キットは、任意に第２の蛍光体または消光団でも標識付けられているＳＬ−標識核酸および一つ以上のアッセイフォーマットでこの核酸を用いるための手引きを含む。キットの他のフォーマットは当業者に対して明らかであろうし、それらの他のフォーマットは本発明の範囲内である。
【０２７９】
本発明は、上述した方法を実施するためのキットを提供する。キットは、上述した組成物のいずれをも含むことが可能であり、任意に、方法を実施するための取扱説明書などの追加の成分、一つ以上のコンテナーまたはコンパートメント（例えば、アッセイ成分、核酸、抗体または禁止剤などを入れるため）またはキット成分を混合するためのロボットアーマチャーなどを更に含む。
【０２８０】
本発明はまた、本明細書において開示された方法を実施するための総合システムを提供する。例えば、アッセイの実施における一つの実施形態において、個々の化合物または化合物成分の送達は、流体を発生源から目的地に輸送するロボットアーマチャー、ロボットアーマチャーを制御するコントローラー、ラベルディテクター、ラベル検出を記録するデータ保存装置およびウェルを含む微量定量皿などのアッセイ部品によって実行される。標識化合物を用いる時、それはラベルディテクターによって検出される。
【０２８１】
多くのロボット流体輸送システムは入手できるか、あるいは既存部品から容易に製造することができる。９６個のウェルの微量定量プレートに並列サンプルを移送して幾つかの並列同時連結反応を開始するために、Ｍｉｃｒｏｌａｂ２２００（ネバダ州レノのハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ））ピペットステーションを用いる、例えば、Ｚｙｍａｔｅ  ＸＰ（マサツセッチュ州ホプキントンのジマークコーポレーション（Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））自動ロボットを用いることができる。
光学的増幅
光学的信号は情報を伝達するために重要である。しかし、光学的信号を光ファイバーを通して伝達する時、ある程度の減衰は常に起き、特定の距離（一般に、ほぼ約５〜１００ｋｍ）後に信号を増幅することが必要である。従来から、その目的で電子増幅器が用いられている。増幅器ステーションにおいて、光学的信号は、電気信号に変換されなければならない。その電気信号は電子増幅器において増幅された後、増幅された電気信号は光学的信号に変換し直される。これは、増幅器ステーションがむしろ複雑な構造をもち、光／電気コンバーターおよび電気／光コンバーターを含む多数の部品があるという欠点を伴うのみではなく、総合的なシステムの帯域幅およびビット伝送速度が電子部品によって制限されることも意味する。従って、光ファイバー増幅器が最近開発されてきた。すなわち、光学的信号を直接的に増幅すると共に電気信号への変換を必要としない増幅器である。こうしたデバイスは、例えば、１９９９年１１月９日発行のヤン（Ｙａｎ）らによる米国特許第５，９８２，９７３号、１９９９年７月２７日発行のクレイナーマン（Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ）による米国特許第５，９２８，２２２号、デサーバー（Ｄｅｓｕｒｖｉｒｅ），Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｔｏｄａｙ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９９４，２０−２７、スルーフ（Ｓｌｏｏｆ）ら、Ｊ．Ａｐｐｌｙ．Ｐｈｙｓ．８３：４９７（１９９８）において開示されている。
【０２８２】
従って、もう一つの実施形態において、本発明は、本発明の化合物を含む、光の伝達および増幅のための基板を提供する。共有結合、コーティングおよびドーピングなどに限定されないが、それらを含む技術上知られているあらゆる方式で、本発明の化合物を基板に組み込むことができる。この基板は、ＵＶ光を可視光に変換するためにも有用である。
【０２８３】
本基板には、ガラス、有機ポリマー、無機ポリマーおよびそれらの組合せに限定されないが、それらを含む特定の用途のために有用なあらゆる材料を挙げることができる。
【０２８４】
上述したように本発明の化合物で誘導された基板によって伝達された光を増幅する方法も提供される。本方法は、こうした基板を通して光を伝達し、よって光を増幅することを含む。
【０２８５】
本発明の基板および方法は、光ファイバーデバイス、センサー（例えば、コペルマン（Ｋｏｐｅｌｍａｎ）らによる米国特許第５，６２７，９２２号およびピンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）らによる米国特許第５，６９０，８９４号を参照すること）および光ファイバー「冷蔵庫」などにおいて用いることができる。
医療用途
本発明の化合物は、光力学的治療（ＰＤＴ）を介して悪性腫瘍を治療するために用いることも可能である。さらに、本発明の錯体は、（１）磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）においてより高いコントラストを達成するための特定の常磁性金属イオン用、および（２）単一放射形断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）または放射形断層撮影法（ＰＥＴ）および／または放射線同位元素媒介放射線治療法における腫瘍撮影のための放射線金属イオン用のキレート化剤として生体内および試験管内で用いられる。従って、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴを用いる核医学において、適切に放射線標識付けられたサリチルアミジドキレートを非侵襲的に撮影することができる。例えば、マルゲラム（Ｍａｒｇｅｒｕｍ）らによる米国特許第６，０１０，６８１号およびウードバーン（Ｗｏｏｄｂｕｒｎ）らによる米国特許第６，０２２，５２６号を参照すること。
分離
もう一つの好ましい実施形態において、溶液中の特定のイオンに対する本発明の化合物の特異性は、本発明の化合物がより低い親和性または特異性を有するイオンを含め、これらのイオンを他の溶質から分離するために活用される。イオン選択性キレート化剤またはイオン特異性キレート化剤の多くの例は技術上知られている。例えば、イザット（Ｉｚａｔｔ）ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７およびマーテル（Ｍａｒｔｅｌｌ）ら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２を参照すること。
【０２８６】
以下の実施例によって、本発明の材料、方法およびデバイスをさらに説明する。これらの実施例は説明のために提示するが、請求された発明を限定するものではない。
実施例
実施例１は、配位子ＴＲＥＮＳＡＭの合成およびメタレーションを記載している。
【０２８７】
実施例２は、ＴＲＥＮＳＡＭの分光光度滴定を記載している。
【０２８８】
実施例３は、ＴｂＴＲＥＮＳＡＭのＸ線構造決定を記載している。
【０２８９】
実施例４は、本発明の配位子用の多様な出発材料の合成を記載している。
【０２９０】
実施例５は、異なる長さの主鎖を有する本発明の幾つかの配位子の合成を記載している。
実施例１
この実施例は、配位子ＴＲＥＮＳＡＭの合成およびメタレーションを詳述している。この合成は図１に概説されている。
１．１  材料および方法
特に注記しないかぎり、出発材料を商業的供給業者から購入し、特に精製せずに用いた。Ｍｅｒｃｋシリカゲル４０〜７０メッシュを用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙによって微量分析を行った。Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙで質量スペクトルを記録した。ＡＭＸ３００またはＡＭＸ４００Ｂｒｕｋｅｒ超伝導フーリエ変換分光計またはＤＲＸ５００Ｂｒｕｋｅｒ超伝導ディジタル分光計で1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲを記録した。Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｍａｇｎａ  ＩＲ５５０フーリエ変換分光計を用いて赤外線スペクトルを測定した。
１．２  トリス[（２−ヒドロキシベンゾイル）−２−アミノエチル]アミン（ＴＲＥＮＳＡＭ）、１の合成、
サリチル酸メチル（７８ミリモル）を蒸留したＴＲＥＮ（１７ミリモル）と混合した。混合物を密封し、１００℃に一晩加熱した。ＣＨ2Ｃｌ2中の０〜４％ＭｅＯＨで溶離させたシリカカラムで、得られた濃厚油を精製し、溶媒の除去後に白色粉末が生じた。真空において一晩乾燥すると、無色のガラスが生じた。収率：４７％。ＩＲ（ＫＢｒ）１５４３、１５９０、１６３６ｃｍ-1。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、２５℃）、２．７８（ｔ、3Ｊ＝６．２Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ2）、３．４９（ｔ、3Ｊ＝６．２Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ2）、６．６８（ｔ、3Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ、ＡｒＨ）、６．８０（ｄ、3Ｊ＝７．４Ｈｚ、３Ｈ、ＡｒＨ）、７．２３（ｔ、3Ｊ＝５．８Ｈｚ、３Ｈ、ＡｒＨ）、７．６３（ｄ、3Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ、ＡｒＨ）、８．４４（ｔｂｒ、３Ｈ、ＮＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、２５℃）、３９．０（ＣＨ2）、５４．６（ＣＨ2）、１１７．１（Ａｒ）、１１８．４（Ａｒ）、１２０．２（Ａｒ）、１２９．０（Ａｒ）、１３４．７（Ａｒ）、１６０．９（ＡｒＣＯ）、１７０．９（Ｃ＝Ｏ）、Ｃ27Ｈ30Ｎ4Ｏ6に関する分析計算値（検出値）：Ｃ：６４．０２（６３．９４）、Ｈ：５．９７（５．９７）、Ｎ：１１．０６（１１．０１）。
１．３  Ｔｂ（ＴＲＥＮＳＡＭ）の合成
ＴＲＥＮＳＡＭ（０．１２ミリモル）を５ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、それにランタニド（０．０１６ミリモル、ＴｂＣｌ3）塩を添加し、その後、過剰のピリジン（０．３ｍＬ）を添加した。Ｔｂ3+を添加すると、ＵＶ線（２５４ｎｍおよび３６５ｎｍ）によって照射した時に濃緑色の溶液が生じた。１５時間にわたり攪拌した後、溶液をＥｔ2Ｏ（５０ｍＬ）で希釈して、白色固形物（４２ｍｇ）を沈殿させ、それを濾過によって集めた。
【０２９１】
メタノール中に配位子を懸濁させ、その後、適切なランタニド塩を添加することにより金属錯体の合成を行った。混合後、過剰の塩基（ピリジン）を添加し、反応をもう数時間にわたり攪拌する。水性反応混合物にＵＶランプ（２５４ｎｍおよび３６５ｎｍ）で照射することにより金属錯体の形成を監視することができる。照射された時に、Ｔｂ3+錯体の反応混合物は明るい緑色光を発光する。色は肉眼で容易に見える。Ｔｂ3+錯体のルミネセンスは、化合物の単離および乾燥後に非常に明るいままである。
１．４  溶液の挙動
配位子ＴＲＥＮＳＡＭと合わせて形成された錯体は、二封止ＴＲＥＮＳＡＭと合わせて形成された錯体と比べて、より低い水溶解度を有する。この理由で、形成された錯体の安定性と性質は、実際的な理由のためにメタノール中で測定されてきた。しかしながら、肉眼で観察できる水中の錯体の非常に濃い緑色ルミネセンスによって示されたように、錯体は水に可溶である。この観察を実施例２に記載された分光計滴定の一部として行った。
実施例２
この実施例はＴＲＥＮＳＡＭの分光計滴定を詳述している。
２．１  材料および方法
バッチ滴定サンプルをＭｅＯＨ（分析用）中で調製した。測定前にサンプルを３７℃で１５時間にわたり保温して、確実に熱力学的平衡に到達させた。配位子の濃度は、すべてのサンプルに関して２．１８・１０-5Ｍであり、ＴｂＣｌ3を０から２．３当量まで滴定した。１．０ｃｍのＳｕｐｒａｓｉｌ石英セル内で、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ９ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ複光束分光計でスペクトルを記録した。Ｎｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１１１水浴を用いて、サンプルを２５．０±０．２℃の一定温度にしておいた。ソフトウェアパッケージＳＰＥＣＦＩＴ２．１０（ガンプ（Ｇａｍｐｐ）ら、Ｔａｌａｎｔａ３３：９４３（１９８６））を用いることによりデータの処理を行った。
２．２  結果
実験をバッチ滴定として行った。得られたスペクトルの因子分析は特に明確であり、二つの吸収種しか存在しないことを全く曖昧さを伴わずに示し、それはこの配位子と合わせて溶液中で一種の錯体しか生成しないことを示している。式（１）のモデルによるデータの当てはめは、溶液中に一種の錯体しか存在しないことを確認し、ＭＬ種としての識別を可能にする。この錯体の安定性は低い。
【０２９２】
【数１】
0004943585.tif 000017
【０２９３】
実施例３
この実施例は、ＴｂＴＲＥＮＳＡＭのＸ線構造決定を詳述している。
３．１  材料および方法
Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＳＭＡＲＴ  Ａｒｅａ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ回折計（ＳＭＡＲＴ、Ａｒｅａ−Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、シーメンスインダストリアル（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、Ｍａｄｉｓｏｎ，１９９４）で、すべてのＸ線構造データセットを収集した。Ｐａｒａｔｏｎｅ油中で石英キャピラリー上に結晶を取り付け、それを屈折計において窒素ストリーム中で冷却した。Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＳＡＩＮＴソフトウェアパッケージ（ＳＡＩＮＴ、ＳＡＸ  Ａｒｅａ−Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｖ４．０２４、シーメンスインダストリアル（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、Ｍａｄｉｓｏｎ，１９９４）を用いてピークの積分を行った。直接法によって構造を解き、ＳＨＥＬＸＴＬソフトウェアパッケージ（ＰＣバージョン、ＳＨＥＬＸＴＬ，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，シーメンスインダストリアル（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、Ｍａｄｉｓｏｎ，１９９４）を用いて改良した。すべての水素原子を計算された位置に固定し、水素原子の熱パラメータを等方的に改良（ｒｅｆｉｎｅ）した。すべての非水素原子を異方的に改良した。
３．２  結果
結晶化の試みの間に、錯体Ｔｂ[ＴＲＥＮＳＡＭ]2+をＴｂ（ＮＯ3）3との共沈によって得た。
【０２９４】
驚くべきことに、解かれた構造は、[Ｅｕ（二封止ＴＲＥＮＳＡＭ）2]+の構造に多くの類似点を有するＭＬ2錯体を示した。Ｔｂ3+金属中心はオクタデンテートであり、より歪んだ正方形−反プリズム（ａｎｔｉｐｒｉｓｍ）形状において配位結合される。非キレート化サリチレートアームはカチオンから遠ざかり（ｐｏｉｎｔ  ａｗａｙ）、溶媒配位に対して今ではもうカチオンを保護しない。
【０２９５】
[Ｅｕ（二封止ＴＲＥＮＳＡＭ）2]+の場合と同様に、二つの配位子は、それら自体直交で配列しない。８：２直ハイブリダイゼーション列の配位数をもつために金属イオンを囲んで二つの配位子を配列するのに四つの可能性が存在する。一つの可能性は、二つの主鎖がＴｂ3+原子上に位置する逆中心（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｅｎｔｅｒ）によって重ねられる場合であり、そして一つの可能性は、二つの主鎖が互いに最直近である場合である。最後に説明した可能性の例は、各々の二つの三脚主鎖の接近が二つの非キレート化アームの間の立体的相互作用を最大にする[Ｔｂ（ＴＲＥＮＳＡＭ）2]+の錯体で見られた。二つの共沈Ｔｂ（ＮＯ3）3を含む結晶構造の表現の中で説明を見つけることができる。この硝酸塩の各Ｔｂ3+原子は、ＭＬ2錯体の配位結合した一つの配位子のフェノール配位酸素と二つの相互作用を示す。これらの特定の相互作用は、おそらく、一方の配位子の他方の配位子と比べた配向の主要な原因である。
【０２９６】
Ｘ線構造は、溶液中に存在する主たる種に対応しないが、最も不溶の錯体は、特定の実験条件下で単離された。
実施例４
実施例４は、本発明の配位子用の多様な出発材料の合成を記載している。
４．１  メチル２−メトキシ−３−メチルベンゾエート、２
５Ｌの丸瓶フラスコ内で乾燥アセトン３．５Ｌに溶解した３−メチル−サリチル酸（１．３２モル）と無水炭酸カリウム（３．６モル）の混合物に、硫酸ジメチル（２．２モル）を数時間において添加した。混合物を一晩還流し、反応をＴＬＣによって監視した。反応混合物の濾過後に、濾液の溶媒を蒸発させ、淡黄色の濃厚油２１５ｇを生製品として得た。収率９１％。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：２．２３６（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、３．７８２（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、３．８５４（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、６．９８４（ｔ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．２７６（ｄ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．５８２（ｄ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：１５．７２、５１．８１、６１．１７、１２３．２６、１２４．３６、１２８．８６、１３２．４６、１３４．８８、１５８．１６、１６６．６１。
４．１  ２−メトキシ−３−メチル安息香酸、３
メタノール（２Ｌ）と水（０．５Ｌ）の混合物中の２（１．１９モル）の溶液に、水酸化カリウムのペレット（１００ｇ、１．５モル）を冷却下で添加した。混合物を一晩還流し、蒸発乾固した。残留物を水（０．５Ｌ）に溶解し、６ＮのＨＣｌで酸性化した。製品は沈殿し、製品１８９ｇを白色結晶として集めた。収率９５％。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：２．２３４（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、３．７１７（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、７．０６２（ｔ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．３６５（ｄ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．４９６（ｄ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）。
４．３  ２−メトキシ−イソフタル酸、４
マグネチックスターラーおよび加熱マントルを装備した５リットルフラスコ内で３（０．４５モル）を４Ｌの水に懸濁させた。水酸化ナトリウム（０．５モル）の添加下で、反応混合物は透明な溶液に変わった。その後、溶液を７５℃に加熱し、過マンガン酸カリウム（１モル）を６時間にわたって小バッチ内で添加した。得られた褐色スラリーを一晩攪拌し、反応混合物の温度を８０〜８５℃の範囲内にしておいた。反応の進行を陽子ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ−ＮａＯＤ中）によって監視した。その後、スラリーを濾過してＭｎＯ2を除去し、濾液を濃ＨＣｌで酸性化した。結晶製品が徐々に沈殿し始めた。濾過によって純白の結晶として７５ｇの純製品を集めた。収率８５％。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6、２５℃）。δ：３．７９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、７．２４３（ｔ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．７９４（ｄ、Ｊ＝７．５、２Ｈ、ＡｒＨ）。
４．４  ジメチル−２−メトキシイソフタレート、５
４（０．７５モル）および無水炭酸カリウム（３．０モル）を５Ｌの丸瓶フラスコ内の３．５Ｌの乾燥アセトンに入れた。硫酸ジメチル（２．５モル）を数回で添加した。混合物を一晩還流し、反応をＴＬＣによって監視した。反応混合物を濾過し、濾液の溶媒を蒸発させた。１５３ｇの淡黄色濃厚油を生製品として得た。収率９１％。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：３．９２２（ｓ、６Ｈ、ＯＣＨ3）、３．９２６（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、７．１９７（ｔ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．９１３（ｄ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：５２．１７、６３．４５、１２３．２５、１２６．３８、１５９．４１、１６５．８５。
４．５  モノメチル−２−メトキシイソフタル酸、６
水酸化ナトリウムの水溶液（５モル、１００ｍｌ）をメタノール（１．５Ｌ）中の５（０．５モル）の溶液に冷却下で添加した。混合物を室温で３日にわたり攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を高温アセトン（２Ｌ）に溶解した。濃厚ペーストがアセトン溶液から一晩で沈殿した（室温）。ＴＬＣによると、上方アセトン溶液は出発ジエステルおよび酸の一ナトリウム塩を主として含有し、下方ペーストは酸の一ナトリウム塩と二ナトリウムとの混合物であったことが示された。アセトンを両方の部分から除去し、両方の部分の傾斜フラッシュシリカゲルカラム（ＣＨ2Ｃｌ2中の０〜３％メタノール）でのクロマトグラフ分離によって、４０ｇの必要な製品が生じた。収率６３％。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：３．９１３（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、３．９８２（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、７．２５２（ｔ、Ｊ＝７．７５、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．９９１（ｄ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．１６６（ｄ、Ｊ＝７．７５、１Ｈ、ＡｒＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：５２．４８、６４．０９、１２４．１０、１２７．６７、１３６．３８、１３６．４９、１５９．７６、１６５．４６、１６７．６９。
４．６  メチル−２−メトキシ−１−（２−メルカプトチアゾリド）イソフタルアミド、８
トルエン（１００ｍＬ）中の６（１０．５ｇ、０．０５モル）のスラリーに、塩化オキサリル（９．１ｇ、０．０８モル）およびＤＭＦの一滴を攪拌しながら添加した。混合物は透明な溶液に変わり、それを６時間にわたり攪拌しておいた。揮発分を減圧下で除去し、生のメチル２−メトキシ−１−（２−メルカプトチアゾリド）塩化イソフタル一酸を淡黄色油として得た。それを特に精製せずに用いた。
【０２９７】
乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のこの塩化一酸の溶液に、乾燥ＴＨＦ１００ｍＬ中の２−メルカプトチオザリン（７．２ｇ、０．６モル）および２０ｍＬのトリエチルアミンを攪拌し冷却しながら滴下した。得られた黄色スラリーを蒸発乾固し、塩化メチレンに溶解した。それを１ＮのＨＣｌおよび１ＮのＫＯＨで逐次抽出した。フラッシュシリカ精製後に１４ｇの純モノチアゾリドを得た。収率８９％。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：３．３７７（ｔ、Ｊ＝７．５、２Ｈ、ＣＨ2）、３．８５０（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、３．８６９（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、４．６０４（ｔ、Ｊ＝７．５、２Ｈ、ＣＨ2）、７．１３７（ｔ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．４２１（ｄ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．８６２（ｄ、Ｊ＝７．５、１Ｈ、ＡｒＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：２９．９７、５２．２１、５５．４０、６３．１６、１２３．４１、１２４．１４、１２４．１４、１３０．５５、１３２．６６、１３３．８４、１５６．９８、１６５．６３、１６７．１７、２０１．１２。Ｃ13Ｈ13ＮＯ4Ｓ2・Ｈ2Ｏ（Ｍｒ．３２９．３９６）に関する分析計算値（検出値）：Ｃ：４７．４０（４７．０２）、Ｈ：３．９８（３．７８）、Ｎ：４．２５（４．１１）。
実施例５
実施例５は、配位子の主鎖が異なる長さである本発明の幾つかの配位子の合成およびこれらの配位子のランタニド錯体の形成を説明している。
５．１  Ｍｅ8Ｈ２２ＩＡＭＣ、９
ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）中のＨ（２，２）−アミン（１ミリモル）の溶液に８（４．８ミリモル）を添加した。混合物を攪拌し、反応の進行をＴＬＣによって監視した。反応混合物を傾斜フラッシュシリカゲルカラム（ＣＨ2Ｃｌ2中の２〜７％ＣＨ3ＯＨ）上に塗布し、適切な部分を蒸発乾固した。０．８１ｇの製品を白色泡として集めた。収率７９％。ＭＳ（ＦＡＢ＋、ｍ／ｅ）１００１．６。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：２．６９９（ｓ、４Ｈ、ＣＨ2）、２．７１８（ｔ、８Ｈ、Ｊ＝６．４、ＣＨ2）、３．４７９（ｑ、Ｊ＝６．４、８Ｈ、ＣＨ2）、３．７７１（ｓ、１２Ｈ、ＣＨ3）、３．７９８（ｓ、１２Ｈ、ＣＨ3）、７．１０９（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．５、ＡｒＨ）、７．７７０（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝７．５、ＡｒＨ）、７．９００（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝５．４、アミドＨ）、７．９８５（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝７．５、ＡｒＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：３７．５９、５１．７４、５２．１２、５３．２５、６３．２１、１２３．９４、１２４．８０、１２８．２４、１３４．１１、１３５．１０、１５７．７３、１６４．７４、１６５．５３。
５．２  Ｍｅ8Ｈ３２ＩＡＭＣ、１０
Ｈ（２，２）−アミンをＨ（３，２）−アミンの代わりに用いた以外は、化合物９と同じ手順によってこの化合物を調製した。収率７９％。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：１．７８９（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝６．５、４Ｈ、ＣＨ2）、２．６７５（ｔ、４Ｈ、Ｊ＝７．５、ＣＨ2）、２．８０１（ｔ、８Ｈ、Ｊ＝６．５、ＣＨ2）、３．５８３（ｑ、Ｊ＝６．５、８Ｈ、ＣＨ2）、３．８２３（ｓ、９Ｈ、ＣＨ3）、３．８５４（ｓ、９Ｈ、ＣＨ3）、３．８９６（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、３．９２２（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、７．１５４（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．５、ＡｒＨ）、７．１７８（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．５、ＡｒＨ）、７．８２４（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７．５、ＡｒＨ）、７．９０６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５、ＡｒＨ）、７．９−８．１（ｍ、８Ｈ、ＡｒＨ＋アミドＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：３７．３５、５１．９１、５２．２９、５２．３９、５２．７８、６３．３９、６３．８６、１２３．９９、１２４．１１、１２５．０３、１２５．２２、１２８．４５、１３４．２９、１３５．１３、１３５．２６、１３５．７８、１５７．９５、１６５．１１、１６５．７２。
５．３  Ｍｅ8Ｈ４２ＩＡＭＣ、１１
Ｈ（４，２）−アミンをＨ（３，２）−アミンの代わりに用いた以外は、化合物１０と同じ手順によってこの化合物を調製した。収率８２％。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：１．４８３（ｓ、ｂｒ、４Ｈ、ＣＨ2）、２．５７９（ｓ、ｂｒ、４Ｈ、ＣＨ2）、２．７５３（ｔ、８Ｈ、Ｊ＝６．５、ＣＨ2）、３．５４９（ｑ、Ｊ＝６．５、８Ｈ、ＣＨ2）、３．８３２（ｓ、９Ｈ、ＣＨ3）、３．８６６（ｓ、９Ｈ、ＣＨ3）、３．９０９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、３．９４３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、７．１７２（ｔ、４Ｈ、Ｊ＝７．５、ＡｒＨ）、７．８３７（ｄ、４Ｈ、Ｊ＝７．５、ＡｒＨ）、７．９５９（ｔ、４Ｈ、Ｊ＝５．５、アミドＨ）、８．０６７（ｄ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ3、２５℃）。δ：２４．１５、３７．６７、５２．３０、５２．４１、５２．８４、５３．３７、５３．８４、６３．３９、６３．９１、１２４．０７、１２４．１４、１２５．１８、１２８．３６、１３４．３５、１３５．３７、１３５．８７、１５７．９７、１５８．８９、１６４．９７、１６５．６６、１６５．７１。
５．３  Ｈ２２ＩＡＭＣ、１２
脱気した乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）にＭｅ8Ｈ（２，２）ＩＡＭＣ（１．０ｇ、１ミリモル）を溶解した。溶液を氷浴中で冷却し、窒素下でシリンジを介してＢＢｒ3（２ｍＬ、２３ミリモル）を添加した。得られた淡黄色スラリーを９６時間にわたり攪拌し、その後、揮発分を真空下で除去し、残留物をメタノール（３０ｍＬ）で冷却した。メタノール溶液を水４０ｍＬで希釈し、透明溶液を得るまで沸騰させた。溶液を濾過し、冷却すると白色沈殿物が沈着した。濾過によってそれを集め、真空乾燥した。収率５０％。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ−ＮＡＯＤ、２５℃）。δ：２．７５７（ｔ、１２Ｈ、Ｊ＝７．２、ＮＣＨ2）、３．２６９（ｔ、８Ｈ、Ｊ＝７．２、ＮＣＨ2）、６．２２０（ｔ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）、７．０４５（ｄ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）、７．５０８（ｄ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）。
５．４  Ｈ３２ＩＡＭＣ、１３
Ｍｅ8Ｈ３２ＩＡＭＣをＭｅ8Ｈ２２ＩＡＭＣの代わりに用いた以外は、化合物１２と同じＢＢｒ3除保護手順によって、この化合物を調製した。収率６５％。ＭＳ（ＦＡＢ＋、ｍ／ｅ）９０３、1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ−ＮａＯＤ、２５℃）。δ：１．５７５（ｓ、ｂｒ、２Ｈ、ＣＨ2）、２．４５３（ｔ、Ｊ＝７．２、４Ｈ、ＣＨ2）、２．６３６（ｔ、８Ｈ、Ｊ＝７．２、ＮＣＨ2）、３．３５８（ｔ、８Ｈ、Ｊ＝７．２、ＮＣＨ2）、６．３２４（ｔ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）、７．１４８（ｄ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）、７．６１１（ｄ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ−ＮａＯＤ、２５℃）、δ：２４．３５、３６．１９、５２．１２、５２．３２、１１１．７１、１１８．８６、１２９．９２、１３１．５２、１３３．１４、１６６．５９、１７０．８１、１７８．９８。
５．５  Ｈ４２ＩＡＭＣ、１４
Ｍｅ8Ｈ４２ＩＡＭＣをＭｅ8Ｈ２２ＩＡＭＣの代わりに用いた以外は、化合物１２と同じＢＢｒ3除保護手順によって、この化合物を調製した。収率６１％。、1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ−ＮａＯＤ、２５℃）。δ：１．３４９（ｓ、ｂｒ、４Ｈ、ＣＨ2）、２．４３９（ｓ、ｂｒ、４Ｈ、ＣＨ2）、２．６５１（ｔ、８Ｈ、Ｊ＝７．２、ＮＣＨ2）、３．４２８（ｔ、８Ｈ、Ｊ＝７．２、ＮＣＨ2）、６．４４２（ｔ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）、７．２５０（ｄ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）、７．７３２（ｄ、Ｊ＝７．５、４Ｈ、ＡｒＨ）。
５．６  Ｔｂ[Ｈ４２ＩＡＭＣ]
Ｔｂ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏ（０．０４７ミリモル、９９．９９９％）を含有するＭｅＯＨの溶液１７ｍｌに１２を懸濁させた。懸濁液を還流まで加熱した。ピリジン４５滴を懸濁液に添加し、沈殿物が現れ、反応混合物の固形物の量が増加した。ＵＶ照射すると溶液の強いグリーン発光を観察した。６時間の還流後、溶媒を除去した。Ｈ2Ｏ１８ｍｌおよびピリジン１０滴を固形物に添加し、得られた懸濁液を１５時間にわたり還流下で攪拌した。製品を濾過し、Ｅｔ2Ｏで洗浄した。固形物の冷却、濾過および乾燥（真空炉）後に、４２ｍｇの製品を集めた。収率７２％。ＴｂＣ44Ｈ45Ｎ6Ｏ16（ＨＢｒ）・３ＣＨ3ＯＨに関する計算値（検出値）：Ｃ：４５．１７（４５．２０）、Ｈ：４．６８（４．９９）、Ｎ：６．７２（６．８８）。
【０２９８】
上述した説明は例証するもので制限するつもりはないことが理解されるべきである。上述した説明を読むと多くの実施形態が当業者に対して明らかであろう。従って、本発明の範囲は、上述した説明に関連して決定されるべきでなく、請求の範囲が権利をもつ均等物の全範囲に加えて、添付した請求の範囲に関して決定されるべきである。特許出願および公報を含むすべての記事および参考文献の開示は本明細書に引用して援用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のTRENSAM配位子を調製するための典型的な合成方式例である。
【図２】  TRENSAM配位子のTbCl3によるMeOH中での回分分光測光滴定で得られたスペクトルのオーバーレイプロットである。
【図３】  M1L1の計算スペクトルとTRENSAMの実測スペクトルのオーバーレイプロットである。
【図４】  （A-B）はTb[TRENSAM]2+のX線結晶解析による結晶構造を示す：(A)全体（上面）図；(B)部分（底面）図。
【図５】  Tb[TRENSAM]2+におけるTb3+のまわりの多面体配位図である。
【図６】  （A-B）は本発明に有用な代表的デンドリマーの構造式である。
【図７】  本発明の配位子の合成に使用される多用途中間体を生み出すための合成方式である。
【図８】  様様な長さの主鎖を備える本発明の配位子を生み出すための合成方式である。
【図９】  本発明の多重検定の略図である。
【図１０】  本発明の化合物例の代表的構造を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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