(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の化合物。
【化１】
0005008044.tif 000022
式中、リンカー基Ｑは、次式の基であり、
【化２】
0005008044.tif 000023
（式中、
Ｒ10基は水素及び、非置換又はフェニルで置換されていてもよいＣ1−Ｃ4アルキルから選択されるか、又は、２個以上のＲ10基が、次式の基：
【化３】
0005008044.tif 000024
と共に、Ｒ7で置換された炭化水素環であって、−Ｏ−、−Ｓ−又は＞ＮＲ7（式中、Ｒ7は以下の通り定義される。）から選択されるヘテロ原子を含んでもよい炭化水素環系を形成するものであり、ｎ＝１、２又は３である。）、
基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6はＸ及びＹを含む環に結合するか、又はＺ1及びＺ2環構造の原子に結合しており、
Ｚ1及びＺ2は、各々結合を示すか、或いは炭素原子と２個以下の酸素、窒素及び硫黄原子とから選択される５個又は６個の元素を有する１個又は２個の縮合芳香族環を完成させるのに必要な原子であり、
Ｘ及びＹは、同一又は異なるもので、ビス−Ｃ1−Ｃ4アルキル−及びＣ4−Ｃ5スピロアルキル−置換炭素、酸素、硫黄、セレン、−ＣＨ＝ＣＨ−並びにＮ−Ｗから選択され、式中、Ｎは窒素であり、Ｗは水素、基−（ＣＨ2）mＲ8（式中、ｍは１〜２６の整数であり、Ｒ8は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド及び置換アミドから選択される。）から選択されるものであり、
基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7の少なくとも一つは−Ｅ−Ｆの基であり、式中、Ｅはスペーサー基であって、
−（ＣＨＲ’）p−、
−｛（ＣＨＲ’）q−Ｏ−（ＣＨＲ’）r−｝s−、
−｛（ＣＨＲ’）q−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r｝s−、
−｛（ＣＨＲ’）q−（ＣＨ＝ＣＨ）−（ＣＨＲ’）r｝s−、
−｛（ＣＨＲ’）q−Ａｒ−（ＣＨＲ’）r−｝s−、
−｛（ＣＨＲ’）q−ＣＯ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r−｝s−、又は
−｛（ＣＨＲ’）q−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r−｝s−
（式中、Ｒ’は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、又はスルホネートで置換されたＣ1−Ｃ4アルキル基であり、Ａｒはフェニレン又はスルホネートで置換されたフェニレンであり、ｐは１−２０であり、ｑは１−５であり、ｒは０−５であり、ｓは１−５である。）から選択されるものであり、Ｆは標的結合基であって、標的物質上の官能基と反応するカルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホロアミデイトから選択される反応性基、又は標的物質上の反応基と反応するアミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、ホスフェート及びチオホスフェートから選択される官能基であり、
残りの基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7基は、独立して水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、ＯＲ9、ＣＯＯＲ9、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、４級アンモニウム、ホスフェート、スルホネート及びスルフェートから選択され、式中、Ｒ9はＨ及びＣ1−Ｃ4アルキルから選択されるものであり、
残りのＲ1及びＲ2は、非置換Ｃ1−Ｃ10アルキル又はフェニルで置換されたＣ1−Ｃ10アルキルから選択され、該フェニルはカルボキシル、スルホネート及びニトロ基から選択される２個以下の置換基で置換されていてもよく、
基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7の少なくとも一つは、当該化合物の蛍光放射を、本質的に非蛍光であるように減少させる１個以上のニトロ基を含むことを特徴とするが、リンカー基Ｑがスクアライン（squaraine）環系ではないことを条件とする。
【請求項２】
次式の化合物。
【化４】
0005008044.tif 000025
式中、
基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｘ及びＹを含む環に結合しているか、又はＺ1及びＺ2構造の原子に結合しており、ｎは１−３の整数であり、
Ｚ1及びＺ2は、各々結合を示すか、或いは炭素原子と２個以下の酸素、窒素及び硫黄原子とから選択される５個又は６個の元素を有する１個又は２個の縮合芳香族環を完成させるのに必要な原子であり、
Ｘ及びＹは、同一又は異なるもので、ビス−Ｃ1−Ｃ4アルキル−及びＣ4−Ｃ5スピロアルキル−置換炭素、酸素、硫黄、セレン、−ＣＨ＝ＣＨ−並びにＮ−Ｗから選択され、式中、Ｎは窒素であり、Ｗは水素、基−（ＣＨ2）mＲ8（式中、ｍは１〜２６の整数であり、Ｒ8は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド及び置換アミドから選択される。）から選択されるものであり、
基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7の少なくとも一つは−Ｅ−Ｆの基であり、式中、Ｅはスペーサー基であって、
−（ＣＨＲ’）p−、
−｛（ＣＨＲ’）q−Ｏ−（ＣＨＲ’）r−｝s−、
−｛（ＣＨＲ’）q−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r｝s−、
−｛（ＣＨＲ’）q−（ＣＨ＝ＣＨ）−（ＣＨＲ’）r｝s−、
−｛（ＣＨＲ’）q−Ａｒ−（ＣＨＲ’）r−｝s−、
−｛（ＣＨＲ’）q−ＣＯ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r−｝s−、又は
−｛（ＣＨＲ’）q−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r−｝s−
（式中、Ｒ’は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、又はスルホネートで置換されたＣ1−Ｃ4アルキル基であり、Ａｒはフェニレン又はスルホネートで置換されたフェニレンであり、ｐは１−２０であり、ｑは１−５であり、ｒは０−５であり、ｓは１−５である。）から選択されるものであり、Ｆは標的結合基であって、標的物質上の官能基と反応するカルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホロアミデイトから選択される反応性基、又は標的物質上の反応基と反応するアミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、ホスフェート及びチオホスフェートから選択される官能基であり、
残りの基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7基は、独立して水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、ＯＲ9、ＣＯＯＲ9、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、４級アンモニウム、ホスフェート、スルホネート及びスルフェートから選択され、式中、Ｒ9はＨ及びＣ1−Ｃ4アルキルから選択されるものであり、
残りのＲ1及びＲ2は、非置換Ｃ1−Ｃ10アルキル又はフェニルで置換されたＣ1−Ｃ10アルキルから選択され、該フェニルはカルボキシル、スルホネート及びニトロ基から選択される２個以下の置換基で置換されていてもよく、
基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7の少なくとも一つは、当該化合物の蛍光放射を、本質的に非蛍光であるように減少させる１個以上のニトロ基を含むことを特徴とする。
【請求項３】
基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7の少なくとも一つがニトロ基であるか、並びに／或いはＲ1及びＲ2の少なくとも一つがモノ−又はジ−ニトロ−置換ベンジル基である、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物で標識された、生物学的物質。
【請求項５】
一方が共鳴エネルギーのドナーとして作用し得る蛍光色素で標識され、他方が上記ドナーから伝達される共鳴エネルギーのアクセプターとして作用し得る請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物で標識された二つの成分を含む、生物学的物質。
【請求項６】
抗原、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスフェート及びチオホスフェート基を含むか又は含むように誘導体化されたヌクレオチド、並びに１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスフェート及びチオホスフェート基を含むか又は含むように誘導体化されたオキシ又はデオキシポリ核酸、微生物物質、医薬及び毒素からなる群から選択される、請求項４又は請求項５記載の生物学的物質。
【請求項７】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物の使用を含む、生物学的基物質の存在の検出法。
【請求項８】
ｉ）抗原、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド、微生物物質、医薬、毒素及びこれらの組合わせを含む群から選択された生物学的物質を含む液体に、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物を添加する工程と、
ｉｉ）上記化合物と生物学的化合物を反応させて、上記化合物を生物学的物質と共有結合させて標識する工程と
を含む、生物学的物質の標識法。
【請求項９】
ｉ）第１成分が蛍光ドナー色素で標識され、第２成分が非蛍光シアニンアクセプター色素としての請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物で標識された、エネルギー伝達関係にある二つの成分を分離する工程と、
ｉｉ）放射蛍光の測定によって第１成分の存在を検出する工程と
を含む、アッセイ方法。
【請求項１０】
当該アッセイがタンパク質分解酵素開裂活性及びヌクレアーゼ酵素開裂アッセイから選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ｉ）第１成分が蛍光ドナー色素で標識され、第２成分が非蛍光シアニンアクセプター色素としての請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物で標識されている特異的結合ペアの第１成分と第２成分とを結合させて、第１成分と第２成分との間にエネルギー伝達関係を生じさせる工程と、
ｉｉ）放射蛍光の測定によって第１成分と第２成分の結合を検出する工程と
を含む、アッセイ方法。
【請求項１２】
特異的結合ペアが抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／（ストレプト）アビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質又はコファクター、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
当該結合アッセイが、免疫アッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、タンパク質結合アッセイ、ホルモン受容体結合アッセイ及び酵素アッセイからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
蛍光共鳴エネルギー伝達を利用したアッセイ方法に使用されるアクセプター色素であって、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物からなるアクセプター色素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー伝達の分野に関する。特に、本発明は、非蛍光消光色素の新規クラスを含む蛍光原アッセイ、および新規消光色素化合物そのものに関する。
【０００２】
蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)は、二つのフルオロフォアの電子励起状態の間で、互いに十分に近接である場合に起こり、ドナーフルオロフォアの励起状態エネルギーはアクセプターフルオロフォアに伝達される。結果は、ドナー種の蛍光の寿命の減少および消光およびこれに付随するアクセプター種の蛍光強度の増加である。この原理の一つの適用において、蛍光部分を消光剤分子に近接させる。この配置において、励起ドナーフルオロフォアからのエネルギーを消光剤に伝達させ、蛍光エネルギーよりもむしろ熱として消散させる。
【０００３】
生物学的システムにおける蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)標識の使用は既知である。この原理は、蛍光共鳴エネルギー伝達を用いるアッセイにおける結合事象または開裂反応の検出に使用されている。ペプチド開裂反応の場合、蛍光ドナー分子および蛍光アクセプター分子を、開裂されるペプチド基質のいずれかの側に、ドナーとアクセプター種の間の非発光性エネルギー伝達が起こるような距離で結合させる。例えば、EPA428000は、蛍光ドナー分子およびそれに結合した消光アクセプター分子が関与する新規蛍光原ペプチド基質を記載する。標識基質は、ウイルスプロテアーゼ酵素の検出およびアッセイに使用でき、それにより、試験サンプル中に酵素が存在する場合、基質が開裂し、ドナーおよびアクセプター種がそれにより分離する。ドナー種の得られる蛍光放射が測定できる。適当な蛍光ドナーは、フルオレッセイン誘導体、クマリンおよび５−((２−アミノエチル)アミノ)−ナフタレン−１−スルホン酸(EDANS)を含む。適当な消光アクセプターは、２,４−ジニトロフェニル(DNP)および４−(４−ジメチルアミノフェニル)アゾ安息香酸(DABCYL)を含む。
【０００４】
蛍光エネルギー伝達は、また核酸ハイブリダイゼーションの研究にも使用されている。例えば、TyagiおよびKramer(Nature Biotechnology, 14, 303-8, (1996))は、蛍光標識されたプローブを使用する同種ハイブリダイゼーションアッセイを記載する。ヘアピンプローブは、標的核酸に相補的な一本鎖核酸配列を、プローブ配列の側面の二つの相補的アームから形成される幹配列と共に含む。フルオロフォア(EDANS)は、一つのアームに結合し、非蛍光消光部分(DACBYL)は補足的アームに結合する。標的の非存在下で、幹は蛍光および消光グループを、フルオロフォアの蛍光の消光をもたらす近接に保つ。プローブが核酸標的に結合可能であるとき、立体的変化が起こり、より安定なハイブリッドを標的と形成し、アーム配列(およびフルオロフォアと消光剤)を移動し、離す。フルオロフォアは、次いで、適当な波長の光で励起させたとき、蛍光を放射する。
【０００５】
蛍光共鳴エネルギー伝達実験の成功は、適当なドナー／アクセプターペアの選択に依存する。ドナーとアクセプターの間のエネルギー伝達を最適化できる場合、ドナー／消光剤ペアが近接した時に残存蛍光が最小となり、シグナルの大きな変化をそれらが分かれたときに得ることができる。アッセイ小型化およびハイスループットスクリーニングアッセイへの傾向が増し、その結果、必要な感受性レベルを達成するために、高い励起係数のフルオロフォアの利用が有益である。このようなアッセイに関する更なる問題は、アッセイ媒体における、３５０−４５０nm範囲のスペクトルを強く吸収する傾向にある着色サンプルの存在によりもたらされる色消失に帰する。
【０００６】
本発明は、生物学的分子が関与する反応における結合および／または開裂事象が関与するアッセイに関する、蛍光ドナー／アクセプターペアの一つの要素として使用できる非蛍光シアニンアクセプター色素を提供する。蛍光ドナー色素は高い励起係数を有し、それにより低レベルのフルオロフォアの検出を可能にする。更に、蛍光色素ペアは生物学的サンプルが関与する自動蛍光、および着色サンプルによる退色が実質的に関係ない範囲の励起および放射波長を有する。更に、色素は相対的にｐＨ非感受性であり、高い程度のスペクトル重複を有し、効率的なエネルギー伝達を可能にする。
【０００７】
したがって、本発明は式(１)：
【化５】
0005008044.tif 000002
〔式中、リンカー基Ｑは少なくとも一つの２重結合を含み、ＸおよびＹを含む環と共役系を形成する；
基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6はＸおよびＹを含む環に結合するか、または、所望により、Ｚ1およびＺ2環構造の原子に結合してもよい；
Ｚ1およびＺ2は、各々結合を示すか、または、炭素原子、および、所望により、２個以上ではない酸素、窒素および硫黄原子から選択される５個または６個の元素を有する１個または２個の縮合芳香族環を完成させるのに必要な原子である；
ＸおよびＹは、同一または異なって、ビス−Ｃ1−Ｃ4アルキル−およびＣ4−Ｃ5スピロアルキル−置換炭素、酸素、硫黄、セレン、−ＣＨ＝ＣＨ−およびＮ−Ｗから選択され、式中、Ｎは窒素およびＷは水素、基−(ＣＨ2)mＲ8(式中、ｍは１から２６の整数およびＲ8は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、およびアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される)から選択される；
少なくとも一つの基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は標的結合基である；
残りの基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7基は、独立して水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、ＯＲ9、ＣＯＯＲ9、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、４級アンモニウム、ホスフェート、スルホネートおよびスルフェートから選択され、式中、Ｒ9はＨおよびＣ1−Ｃ4アルキルから選択される；
残りのＲ1およびＲ2は、Ｃ1−Ｃ10アルキルから選択され、これは非置換であるか、所望によりカルボキシル、スルホネートおよびニトロ基から選択される２個までの置換基で置換されていてもよいフェニルで置換されていてもよい；
少なくとも一つの基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、該色素の蛍光放射を、本質的に非蛍光であるように減少させる置換基を含むことにより特徴付けられる；
ただし、リンカー基Ｑはスクアライン(squaraine)環系ではない〕
の化合物に関する。
【０００８】
好ましくは、リンカー基Ｑは１個、２個または３個の、ＸおよびＹを含む環と結合した２重結合を含む。
【０００９】
好ましくは、Ｑは基：
【化６】
0005008044.tif 000003
〔式中、
Ｒ10基は水素および、非置換またはフェニルで置換されていてもよいＣ1−Ｃ4アルキルから選択されるか、または、２個またはそれ以上のＲ10基が、基：
【化７】
0005008044.tif 000004
と共に、Ｒ7で置換されており、−Ｏ−、−Ｓ−または＞ＮＲ7から選択されるヘテロ原子を含んでもよい炭化水素環系を形成し、式中Ｒ7は前記で定義の通りである；および
ｎ＝１、２または３である〕
である。
【００１０】
適当には、本発明で使用する非蛍光シアニン色素は、式(２)：
【化８】
0005008044.tif 000005
〔式中、
基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、ＸおよびＹを含む環に結合しているか、または、所望によりＺ1およびＺ2構造の原子に結合し、ｎは１−３の整数である；
Ｚ1およびＺ2は、各々結合を示すか、または、炭素原子、および、所望により２個以上ではない酸素、窒素および硫黄原子から選択される５個または６個の元素を有する１個または２個の縮合芳香族環を完成させるのに必要な原子である；
ＸおよびＹは、同一または異なって、ビス−Ｃ1−Ｃ4アルキル−およびＣ4−Ｃ5スピロアルキル−置換炭素、酸素、硫黄、セレン、−ＣＨ＝ＣＨ−およびＮ−Ｗから選択され、式中、Ｎは窒素およびＷは水素、基−(ＣＨ2)mＲ8(式中、ｍは１から２６の整数およびＲ8は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、およびアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される)から選択される；
少なくとも一つの基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は標的結合基である；
残りの基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7基は、独立して水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、ＯＲ9、ＣＯＯＲ9、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、４級アンモニウム、ホスフェート、スルホネートおよびスルフェートから選択され、式中、Ｒ9はＨおよびＣ1−Ｃ4アルキルから選択される；
残りのＲ1およびＲ2は、Ｃ1−Ｃ10アルキルから選択され、これは非置換であるか、所望によりカルボキシル、スルホネートおよびニトロ基から選択される２個までの置換基で置換されていてもよいフェニルで置換されていてもよい；
少なくとも一つの基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、該色素の蛍光放射を、本質的に非蛍光であるように減少させる置換基を含むことにより特徴付けられる〕
の化合物である。
【００１１】
適当には、本発明の色素の少なくとも一つの基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ6およびＲ7は、色素の蛍光放射を本質的に非蛍光であるように減少させる置換基を含む。適当には、構造式(１)および(２)の非蛍光シアニン色素の少なくとも一つの基Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7はニトロ基であり、これはＸおよびＹを含む環に直接結合し得る。別法として、モノ−またはジ−ニトロ−置換ベンジル基は、ＸおよびＹを含む環に結合し得、これは、所望により更に、直接芳香族環に結合した１個またはそれ以上のニトロ基により置換されていてもよい。好ましくは、構造式(１)および(２)の非蛍光シアニン色素の少なくとも一つの基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ6およびＲ7は、少なくとも一つのニトロ基を含む。
【００１２】
標的結合基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、担体物質または生物学的化合物のような標的物質に非蛍光シアニン色素を結合させるのに適当な基であり得、それ自体当業者に既知である。例えば、標的結合基は、標的物質上の官能基と反応する反応基であり得る。あるいは、標的結合基は、官能基であり得、標的は反応性成分を含み得る。
【００１３】
好ましくは、標的結合基は構造−Ｅ−Ｆの基であり、式中、Ｅはスペーサー基およびＦは反応性または官能基である。色素の反応性基は、適当な条件下で、標的分子の官能基と反応できる；色素の官能基は、適当な条件下で標的分子の反応性基と反応でき、それにより標的分子は色素で標識されるようになる。
【００１４】
好ましくは、反応性基Ｆは、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジンおよびホスホロアミデイトから選択される。好ましくは、官能基Ｆは、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、ホスフェートおよびチオホスフェートから選択される。これらの反応性および官能基の力により、非蛍光シアニン色素は標的分子と反応性となり共有結合的結合し得る。
【００１５】
適当なスペーサー基は、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリンから選択される１−６０個の鎖原子を含む。例えばスペーサー基は：
−(ＣＨＲ')p−
−{(ＣＨＲ')q−Ｏ−(ＣＨＲ')r−}s−
−{(ＣＨＲ')q−ＮＲ'−(ＣＨＲ')r}s−
−{(ＣＨＲ')q−(ＣＨ＝ＣＨ)−(ＣＨＲ')r}s−
−{(ＣＨＲ')q−Ａｒ−(ＣＨＲ')r−}s−
−{(ＣＨＲ')q−ＣＯ−ＮＲ'−(ＣＨＲ')r−}s−
−{(ＣＨＲ')q−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ'−(ＣＨＲ')r−}s−
〔式中、Ｒ'は水素、または所望によりスルホネートで置換されていてもよいＣ1−Ｃ4アルキル置換、Ａｒは所望によりスルホネートで置換されていてもよいフェニレン、ｐは１−２０、好ましくは１−１０、ｑは１−５、ｒは０−５およびｓは１−５である〕
であり得る。
【００１６】
反応性基Ｒ1−Ｒ7およびＲ1−Ｒ7が反応できる基の例を表１に示す。別の言い方では、Ｒ1−Ｒ7は、標的分子の反応性基と反応する表１の官能基であり得る。
【表１】
0005008044.tif 000006
【００１７】
特に適当な、利用可能なアミノおよびヒドロキシル官能基を有する標的成分の標識に特に有用な反応基Ｒ1−Ｒ7は：
【化９】
0005008044.tif 000007
〔式中、ｍは１−１０の整数である〕
を含む。
【００１８】
アリールは６個から１０個の炭素原子を有する１個または２個の縮合芳香族環を含む芳香族置換基、例えば、フェニルまたはナフチルであり、アリールは所望により、そして独立して、１個またはそれ以上の置換基、例えば、ハロゲン、１個から１０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキル基、アラルキルおよびアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシおよびｎ−ブトキシで置換されていてもよい。
【００１９】
ヘテロアリールは、単または二環式５から１０員芳香族環系であり、少なくとも一つのそして３個を超えない、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子を含み、所望により、そして独立して、１個またはそれ以上の置換基、例えばハロゲン、１個から１０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキル、アラルキルおよびアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシおよびｎ−ブトキシで置換されていてもよい。
【００２０】
アラルキルは、アリールまたはヘテロアリール基で置換されたＣ1−Ｃ6アルキル基である。
ハロゲンおよびハロ基は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される。
【００２１】
本発明で使用する非蛍光シアニン色素はまた、色素に親水性特性を付与する、結合した水可溶化成分を含み得る。それらは、直接シアニン色素の芳香族環系に結合するか、またはスペーサー基Ｅに結合し得る。適当な可溶化成分は、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、４級アンモニウムおよびヒドロキシルからなる群から選択される。非蛍光消光色素の芳香族環に直接結合したスルホネートまたはスルホン酸基は、特に好ましい。水溶性は、タンパク質を標識する場合、必要である。
【００２２】
第２の態様において、本発明は非蛍光シアニン色素で標識した生物学的物質に関する。
【００２３】
更なる態様において、本発明は、一つは、共鳴エネルギーのドナーとして作用し得る蛍光色素で標識し、他方はドナーから伝達される共鳴エネルギーのアクセプターとして作用し得る非蛍光標識シアニン色素で標識する二つの成分を含む生物学的物質に関する。
【００２４】
更に別の態様において、本発明は：
ｉ)第１成分が蛍光ドナー色素で標識され、第２成分が非蛍光シアニンアクセプター色素で標識された、エネルギー伝達関係にある二つの成分の分離；および
ii)放射蛍光の測定による第１成分の存在の検出
を含む、アッセイ法に関する。
【００２５】
更に別の態様において、本発明は：
ｉ)第１成分が蛍光ドナー色素で標識され、第２成分が非蛍光シアニンアクセプター色素で標識され、第１および第２成分の間にエネルギー伝達関係が引き起こされるものである、特異的結合ペアの一つの成分と、該ペアの第２成分との結合；および
ii)放射蛍光の測定による第１および第２成分の結合の検出
を含む、アッセイ法に関する。
【００２６】
本発明の非蛍光シアニン色素は、蛍光共鳴エネルギー伝達を使用するアッセイ法でアクセプター色素として用いる。本発明の非蛍光シアニン色素が蛍光ドナー色素とエネルギー伝達関係であるとき、ドナーの蛍光放射はアクセプターによる消光により減少する。共鳴エネルギー伝達が蛍光ドナー色素とアクセプター色素の分離を通して損失したとき、ドナー色素による蛍光放射は回復する。有効な非蛍光消光色素は、吸収入射光を蛍光に変えるのに低い効率であり、それ自体、高い程度の感受性が必要であるとき、蛍光標識として不適当である。非蛍光シアニン色素の消光色素としての相対的有効性は、本発明の代表的非蛍光シアニン色素と、同じクラスで類似の吸収特性を有する対応する色素の、スペクトルの可視領域における比較を示した図１に説明する。
【００２７】
本発明のシアニン色素の固有の蛍光は、それらをエネルギーアクセプターとして使用したとき、好ましくはドナー励起波長でのドナー色素の励起およびドナー放射波長の放射の検出によるドナーの蛍光放射の１０％より少ない。図３は、ドナー色素の放射最大で測定したときの、アクセプター色素として化合物IIおよび化合物XIの使用により得たバックグラウンドシグナルの、標準適合蛍光シアニンアクセプター色素(Cy5)と比較した減少を示す。バックグラウンド蛍光への寄与は、したがって、本発明の非蛍光シアニン色素を消光色素として使用することにより最小化される。更に、本色素は、蛍光ドナー色素と重なるそのスペクトルが最大化され、それにより消光の効果を改善するように設計される。
【００２８】
生物学的材料は、二つの成分部分に開裂し得る生物学的分子であり得る；または、生物学的物質は、互いに共有結合または非共有会合により結合し得る前記のような二つの成分を含み得る。
【００２９】
本発明は、したがって、新規蛍光原基質および二つの成分部分への分子の開裂の検出および測定のアッセイ方法に関し、第１成分は、第２成分に結合した非蛍光シアニンアクセプター色素と電子伝達関係にある蛍光ドナー色素で標識されている。
【００３０】
アッセイは、本発明にしたがって、化合物を、調査中の反応における、その阻害作用、増強効果、作動または拮抗効果を含む、ハイスループットスクリーニング適用で行い得る。このようなアッセイの例は、プロテアーゼによるペプチドまたはタンパク質の開裂およびヌクレアーゼによるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の開裂を含むが、これらに限定されない。このアッセイ形態で、酵素基質(ペプチドまたは核酸)は、構造が蛍光ドナー色素分子と非蛍光シアニンアクセプター色素を合わせ、開裂する基質のいずれかの側で基質に結合した配列を含む。基質は蛍光ドナーおよびアクセプター部分を近接に結合させる。ドナーの内因性の蛍光は、色素のペアの間の共鳴エネルギー伝達のために、アクセプターによる消光を介して減少される。共鳴エネルギー伝達は、ドナーとアクセプター部分の間の距離が約１００オングストロームより大きいとき、小さくなる。基質の開裂は、ドナーとアクセプター色素の間の分離および付随した共鳴エネルギー伝達の損失をもたらす。ドナー蛍光色素の蛍光シグナルは増加し、それにより開裂反応の正確な測定が可能となる。
【００３１】
簡単に、タンパク質分解酵素活性の検出のためのアッセイは、下記のように形成される。反応混合物を、プロテアーゼ酵素と、開裂する基質のいずれかの側に結合した基質に結合した蛍光ドナー色素分子および式(２)の非蛍光アクセプター色素を合わせることにより製造する。既知のまたは推定されるプロテアーゼ阻害剤化合物を所望により反応混合物に包含させ得る。典型的に、反応は緩衝溶液中で行い、反応を完了するまで進行させる。反応の進行は、分光蛍光計を使用して記録する、蛍光ドナー色素による安定状態蛍光放射の観察により追試する。
【００３２】
あるいは、本発明は、リガンド／反応体ペアの一つの成分と該ペアの第２成分結合の、共有結合または非共有的会合による結合の検出および測定のアッセイ方法に関し、該第１成分は蛍光ドナー色素で標識され、該第２成分は非蛍光シアニンアクセプター色素で標識されている。このようなアッセイは、簡便には二つのタイプのうちの一つとして類別される。
【００３３】
ｉ)最初のカテゴリーは、特異的結合ペアの一つの成分が、特異的結合ペアの第２成分に非共有結合的に結合している、平衡結合アッセイを含む。このような平衡結合アッセイは、スクリーニングする化合物を含むサンプルを、特異的結合ペアの第１成分の第２成分への結合によるその効果(拮抗または作動)について試験するスクリーニングアッセイに適用し得る。いずれかの成分をドナー色素またはアクセプター色素で標識し得る。結合の非存在下で、標識成分は共鳴エネルギー伝達が起こるには離れすぎている。一つの標識成分のその標識特異的パートナーへの結合により、標識部分がドナーとアクセプター種の間でエネルギー伝達が起こるのに十分近接となり、ドナー蛍光の消光およびドナー蛍光シグナルの減少をもたらす。
【００３４】
例えば、本発明で使用する色素は、完全ＤＮＡ分子または核酸フラグメントの混合物における独得なＤＮＡ配列または特異的遺伝子の検出および同定への使用に関するTyagiおよびKramer(前掲)に記載のように、標識プローブに使用できる。核酸プローブの一端は、蛍光色素で、他端は非蛍光シアニンアクセプター色素で標識する。特異的標的配列非存在下で、蛍光および消光種は、エネルギー伝達が起こるのに十分近くに保持される。その結果、励起光によるフルオロフォアの照射は、蛍光シグナルの減少をさせる。プローブと特異的標的核酸配列の相互作用は、蛍光ドナーおよびアクセプターの距離が離れるような、プローブでの立体配置変化の発生をもたらす。フルオロフォアの励起は、分光蛍光計を使用して記録し得る蛍光シグナルをもたらす。
【００３５】
あるいは、平衡結合アッセイは、１次抗体のような特異的結合ペアの一つの成分が、マイクロタイターウェルプレートのウェルにコートされたサンドイッチアッセイ形態を用い得る。抗原の１次抗体への結合に続き、２次抗原−特異的抗体を次いでアッセイ混合物に添加し、抗原−１次抗体複合体と結合する。この形態で、１次抗体または抗原をドナー色素で標識し、２次抗体をアクセプター色素で標識するか、逆も可能である。１次抗体−抗原−２次抗体複合体の結合の非存在下で、標識成分は共鳴エネルギー伝達が起こるのに離れすぎている。２次抗体と１次抗体−抗原複合体の結合により、標識部分がドナーとアクセプター種の間でエネルギー伝達が起こるのに十分近くなり、ドナー蛍光の消光およびドナー蛍光シグナルの減少をもたらす。蛍光シグナルを測定し、抗原の濃度を標準曲線からの内挿法で決定し得る。
【００３６】
特異的結合ペアの例は、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／(ストレプト)アビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質またはコファクター、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質を含むが、これらに限定されない。本発明において、特異的結合親和性を保持する分子を用い得、本発明のエネルギー伝達色素を特異的結合ペアの一つの成分の標識に使用し得、次にそれを他の成分の結合の検出に使用し得ることは理解される。
【００３７】
ii)第２カテゴリーにおいて、アッセイは、アッセイ媒体中の溶液中の蛍光ドナー色素標識部分(反応体)の、非蛍光アクセプター色素標識部分(基質)への添加、またはその逆の、酵素活性を介した共有結合的結合による検出および測定を含む。このようなアッセイの例は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のリガーゼによる他の核酸分子への結合、ヌクレオチドのポリメラーゼによるＤＮＡまたはＲＮＡ分子への添加、および標識化学部分の一つの分子からのアセチルトランスフェラーゼのようなトランスフェラーゼによる他への移動を含むが、これらに限定されない。既知のまたは推定される酵素阻害剤を所望により反応混合物に包含させ得る。任意の二つの適当な反応体および基質部分を用い得ることは理解される。本発明のドナーまたはアクセプター色素のいずれかを一つの部分の標識に使用し得、それは次ぎに基質との反応の検出および測定に使用し得る。
【００３８】
例えば、ＤＮＡライゲーションアッセイにおいて、結合するＤＮＡ分子を、ＡＴＰを含む水性緩衝液中、ＤＮＡリガーゼの存在下で混合させる。インキュベーションに続き、ＤＮＡ鎖は、二本鎖の両方の鎖における標準ホスホジエステル結合の形成により、正確な立体配置で共有結合的結合する。結合により、標識部分はドナーとアクセプター種の間でエネルギー伝達が起こるのに十分近く、形成されたライゲート産物の量に比例したドナー蛍光の消光およびドナー蛍光シグナルの減少をもたらす。
【００３９】
本発明はまた、少なくとも一つのＲ1−Ｒ7位置の反応または官能基を含む構造式(１)および(２)の非蛍光シアニン色素が、標的物質のアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、カルボキシル、スルフヒドリルまたは他の基と共有結合的に反応する、標識法に関する。このような標的物質は、抗原、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、ホスフェートおよびチオホスフェート基を含むか、含むように誘導体化されたヌクレオチド、ならびに１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、ホスフェートおよびチオホスフェート基を含むか、含むように誘導体化されたオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物物質、医薬および毒素を含む群から成るがこれらに限定されない。
【００４０】
適当な蛍光ドナーおよびアクセプターペアは、一般に、数個に因子に依存する。
ｉ)第１に、ドナーおよびアクセプタークロモフォアは近ＵＶまたは近ＩＲスペクトル範囲に強い電子遷移を有するべきである。
ii)第２に、ドナーおよびアクセプター部分は、互いに相対的に近接しているべきである。適当には、ドナーおよびアクセプター種は、１０−１００オングストローム範囲であるべきである。
iii)第３に、ドナー放射スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの間に適当な重なりがあるべきである。ドナー放射スペクトルとアクセプターの励起スペクトルの重なりが大きいほど、エネルギー伝達が大きい。エネルギー伝達は、最小のスペクトルの重なりを分け合う色素の間で起こることができるが、色素が近接であるときに観察されるのみである。
【００４１】
本発明の実施のためにエネルギー伝達ペアを形成するために非蛍光シアニンアクセプターと組みあわせることができる適当な蛍光ドナー色素は、フルオレッセイン、ローダミンおよびシアニン色素の既知の反応性アナログを含む。他の低分子量蛍光色素は、BODIPYの名でMolecular Probes Inc.から販売されている３,３',５,５'−テトラメチル−２,２'−ピロメチン−１,１'−ボロンジフルオリドのようなビス−ピロメチンボロンジフルオリド色素の誘導体から選択し得る。特に好ましいのはシアニン色素である。
【００４２】
適当なフルオレッセインドナー色素は：５−および６−カルボキシフルオレッセインおよび６−カルボキシ−４',５'−ジクロロ−２',７'−ジメトキシフルオレッセインを含む。適当なローダミン色素は：６−カルボキシローダミン(Rhodamine 110)、５−カルボキシローダミン−６Ｇ(R6G-5またはREG-5)、６−カルボキシローダミン−６Ｇ(R6G-6またはREG-6)、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン(TAMRAまたはTMR)、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン(ROX)を含む。
【００４３】
適当なシアニン色素はCyDyes(登録商標)：Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy7を含む。(CyDyeおよびCyは、Amersham Pharmacia Biotech UK Limitedの商標である。)本発明のアッセイにおいてドナー成分として使用するのが適当なシアニン色素は、米国特許第５２６８４８６号(Waggoner et al)に記載されているか、または英国特許第２３０１８３２号(Waggoner et al)に記載のような堅くしたシアニン色素である。あるいは、ドナー成分として使用する蛍光ドナー種は、蛍光エネルギー伝達色素カセットであり得る。このような蛍光エネルギー伝達色素カセットの例は、英国特許第２３０１８３３号(Waggoner et al)に記載されている。
【００４４】
下記表２は、本発明の方法における使用に適した、蛍光ドナー色素および対応する非蛍光ドナーシアニンアクセプター色素の例を示す。
【００４５】
【表２】
0005008044.tif 000008
＊塩形、不確定。
【００４６】
式(１)および(２)の非蛍光シアニン色素は：
ａ)式(Ａ)：
【化１０】
0005008044.tif 000009
〔式中、Ｘ、Ｚ1、Ｒ1、Ｒ3およびＲ5は上記で定義の通り〕
を有する第１化合物、
ｂ)第１化合物と同一または異なり、式(Ｂ)：
【化１１】
0005008044.tif 000010
〔式中、Ｙ、Ｚ2、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6は上記で定義の通り〕
を有する第２化合物、そして
ｃ)第１および第２化合物の間に架橋を形成するのに適当な第３化合物を反応させ、ａ)、ｃ)およびｂ)は式(１)および(２)の化合物を形成させるために２または１段階工程で反応させることを含む方法で製造し得る。
【００４７】
２段階合成の場合、中間体色素化合物を最初に構造式(Ａ)の化合物と、結合を形成するのが適当な化合物を反応させ、反応をエタノールまたは酢酸のような適当な極性溶媒中で行う。第２段階において、中間体色素を、構造式(Ｂ)の第２インドレニン化合物化合物と、ピリジン、酢酸および無水酢酸のような媒体中、室温で反応させる。このような反応条件はまた本発明の非蛍光シアニン色素の１段階法での製造にも適している。インドレニン部分の間に結合を形成するのに使用し得る試薬ｃ)は、ポリメチン鎖の形成に適したものである。ポリメチン結合を含むシアニン色素の形成に適した試薬および方法は、当分野で既知のものであり、オルトギ酸トリエチレン、マロンジアルデヒドビス(フェニルイミン)ヒドロクロライドおよびＮ−[(５−フェニルアミノ)−２,４−ペンタジエニリデン]アニリンヒドロクロライドを含む。(例えば、Fry D. J, Cyanine Dyes and Related Compounds, Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Elsevier 1977, page 369-422参照)。
【００４８】
本発明の非蛍光シアニン色素は、前記のようにアッセイ系の成分のような標的物質の共有結合的標識に使用し得る。本発明の化合物を使用した共有結合的標識は、先に定義のような少なくとも一つの官能または反応性基を有する標的により達成し得る。標的は、標的物質の官能または反応性基と共有結合的に結合できる先に定義のような反応性または官能基を含む少なくとも一つのＲ1−Ｒ7を有する一定量の本発明の化合物とインキュベートし得る。標的物質および本発明の化合物は、標的物質が本発明の化合物と共有結合的結合をするのに十分な条件下および時間インキュベートする。
【００４９】
本発明を、以下の実施例および図面を参照して更に説明する。
図面
図１は実施例１２にしたがったCy3と化合物ＶおよびVII(図１ａ)およびCy5と化合物IXおよびXI(図１ｂ)の相対的蛍光放射を説明する。
図２は、実施例１３にしたがった、Cy3−標識オリゴヌクレオチドと、非蛍光Cy5アナログ(化合物II)およびDabcylで標識したその相補的オリゴヌクレオチドの結合による蛍光シグナルの減少が観察される、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを説明する。
【００５０】
図３は、実施例１４にしたがったオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション実験におけるシグナル対ノイズ比増加(および背景減少)における、標準適合蛍光シアニンアクセプター色素(Cy5)と比較したアクセプター色素としての非蛍光シアニン色素を使用した効果を説明する。
図４は、実施例１５にしたがった、ペプシン存在下または非存在下で測定した、時間と蛍光強度に関して測定した、基質Cy5-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys-化合物IIIを利用したプロテアーゼ開裂アッセイの過程を説明する。
【００５１】
実施例
実施例１  ２−{５−[１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル)−１−エチル−３,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−インドリニウム、塩(化合物Ｉ)の製造
【化１２】
0005008044.tif 000011
ｉ)５−ニトロ−２,３,３−トリメチルインドール
硝酸ナトリウム(３.８４ｇ、４５.２mmol)を、濃縮硫酸(１００ml)に溶解した。氷で冷却後、本溶液を２,３,３−トリメチルインドール(６.６５ｇ、４１.８mmol)の濃縮硫酸(１００ml)中に、温度が０−５℃に維持されるように添加した。反応物を０−５℃で９０分撹拌し、次いで、室温に温め、更に１６時間撹拌した。混合物を氷(２００ｇ)上に注ぎ、次いで、５０％水性水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ１２(ｐＨ紙)で塩基性にした。粗生産物を濾過して回収し、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した(〜１０００ml)。オフイエロー(off-yellow)色の固体をポンプで乾燥させ、酢酸エチル(２５０ml)に溶解し、更に乾燥させた(ＭｇＳＯ4)。溶液を更に濾過し、赤色濾液をロータリーエバポレーターで乾燥させた。固体をクロロホルム：酢酸エチル(９５：５、３０ml)に溶解し、シリカフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、２５mmol、６０％収率で、濃黄色固体、５.１２ｇを得た。ＵＶ分析(メタノール)は、λmax＝３００nmの単一ピークを示した。マススペクトル分析(ゲンチシン酸でのMALDI-TOF)により、m/z＝２０３.８(Ｃ11Ｈ12Ｎ2Ｏ2＝２０４.２３)を得た、1Ｈ  ＮＭＲ：δ＝1.97(s, 6H), 2.95(s, 3H), 8.58(d, J=10Hz, 1H), 8.70(s, 1H), 8.78(d, J=10Hz, 1H)。
【００５２】
ii)１−エチル−５−ニトロ−２,３,３−トリメチルインドリウムヨージド
５−ニトロ−２,３,３−トリメチルインドール(５１８mg、２.５４mmol)およびヨウ化エチル(２.５ml、４.８５ｇ、３１mmol、過剰)を混合し、８時間加熱還流した。室温に冷却後、過剰のヨウ化エチルを穏やかな窒素流により除去し、残渣をクロロホルムに溶解し、シリカのプラグを通して濾過した。シリカをクロロホルム(１容量)で洗浄し、合わせた濾液をロータリーエバポレーターに付し、生産物を黄色油状物として得た(４８６mg、１.３５mmol、５３％収率)。
【００５３】
iii)１−(５−カルボキシペンチル)−５−スルホ−２,３,３−トリメチルインドリウムブロミド
５−スルホ−２,３,３−トリメチルインドール(カリウム塩)(５.０ｇ、１８mmol)に、６−ブロモヘキサン酸(１０.５６ｇ、５３.８mmol)の１,２−プロパンジオール(１５mol)溶液に添加し、８０℃で７２時間加熱した。混合物を冷却し、撹拌しながら水(６０ml)およびＮａＯＨ(水中１０％、６０ml)で希釈した。生産物を分取ＨＰＬＣ(Dynamax、Ｃ18カラム、ＴＦＡ／Ｈ2ＯからＴＦＡ／ＭｅＣＮの勾配)で精製し、灰色／ピンク色固体を産生した(２.４ｇ、２８％)。
【００５４】
iv)２−(４−アニリノブタ−１,３−ジエニル)−１−(５−カルボキシペンチル)−３、３−ジメチル−５−スルホ−インドリウム、塩
工程iii)の生産物(４００mg、０.８５mmol)に、マロンジアルデヒドビス−(フェニルイミン)ＨＣｌ(３２２mg、１.２４mmol)の酢酸(５ml)溶液を添加し、混合物を１４０℃で１６時間撹拌しながら加熱した。生産物をＨＰＬＣ(Ｃ4カラム、ＴＦＡ／Ｈ2ＯからＴＦＡ／ＭｅＣＮ勾配)で精製し、赤色／灰色固体を得た(１９４.４mg、３８％)。
【００５５】
ｖ)化合物(Ｉ)の合成
１−エチル−５−ニトロ−２,３,３−トリメチルインドリウムヨージド(１００mg、０.２７７mmol)および段階iv)の生産物(５０mg、０.１０４mmol)をピリジン：酢酸：酢酸無水物(９：９：２、５ml)に溶解し、反応物を室温で暗所に２４時間静置した。溶媒を穏やかな窒素流で除去した後、残渣を水：アセトニトリル(７：３、５ml)に溶解し、生産物を逆相ＨＰＬＣで単離した。ＵＶ(メタノール)：λmax  吸収＝６５２nm、λmax  放射＝６７０nm。ＭＳ：m/z＝６２１.２(Ｃ33Ｈ40Ｎ3Ｏ7Ｓに関して＝６２２.８)。
【００５６】
実施例２  ２−{５−[１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム、塩(化合物II)の製造
【化１３】
0005008044.tif 000012
ｉ)１−(３,５−ジニトロベンジル)−２,３,３−トリメチルインドリウムヨージド
３,５−ジニトロベンジルクロライド(１００mg、０.４６mmol)、２,３,３−トリメチルインドール(７４μｌ、７３.２mg、０.４６mmol)およびヨウ化ナトリウム(６９mg、０.４６mmol)を、１００℃で、スルホラン(５ml)中、１６時間加熱した。室温に冷却後、生産物を逆相ＨＰＬＣで単離した(８９.７mg、０.２６mmol、５７％収率)。
【００５７】
ii)２−{５−[１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリニウム、塩(II)
Ｎ−(３,５−ジニトロベンジル)−２,３,３−トリメチルインドリウムヨージド(２０mg、０.０５９mmol)および実施例１  iv)の生産物(２０mg、０.０４１mmol)を、ピリジン：酢酸：酢酸無水物(２：２：１、２.５ml)に溶解し、反応物を暗所で室温に１６時間静置した。生産物を逆相ＨＰＬＣで単離し、１７.６mg、０.０２４mmol、５９％収率の化合物(II)を得た。ＭＳ：m/z＝７３０(Ｃ38Ｈ41Ｎ4Ｏ9Ｓに関して＝７２９.８)。
【００５８】
iii)２−{５−[１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリニウム、塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル
Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−ビス−(テトラメチレン)−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(１０mg、０.０４mmol)を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(１ml)に溶解し、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１１μｌ、０.０６３mol)を添加した。この溶液から１００μｌを取り、上記ii)からの炭酸(１mg)に添加した。３時間後、マススペクトル分析は、ＮＨＳエステルが形成されていることを示した。生産物を更に精製することなく標識に使用した。ＭＳ：m/z＝７９７(Ｃ43Ｈ49Ｎ4Ｏ9Ｓに関して＝７９７.９)。
【００５９】
実施例３  １−ブチル−２−{５−[１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−６−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル}−３,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−インドリニウム、塩(化合物III)の製造
【化１４】
0005008044.tif 000013
１−ブチル−５−ニトロ−２,３,３−トリメチルインドリウムヨージド(２.４５mg、９.３７μmol)を、２−(２−アニリノブテニル)−１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−６−スルホ−ベンズ(ｅ)インドリウム、塩(５mg、９.３７mol)のピリジン：酢酸：酢酸無水物(９：９：２；２００μl)溶液に添加した。反応混合物を暗所で、室温に４日間静置した。溶媒を減圧下除去し、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製して所望の生産物を得た(２.０mg、２.８５μmol、３０％収率)。
【００６０】
実施例４  １−ブチル−２−{７−[１−(５−カルボキシペンチル)３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３,５−ヘプタトリエニル}−３,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−インドリニウム、塩(化合物IV)の製造
【化１５】
0005008044.tif 000014
ｉ)１−ブチル−５−ニトロ−２,３,３−トリメチルインドリウムヨージド
５−ニトロ−２,３,３−トリメチルインドール(２５０mg、１.２２mmol)およびヨウドブタン(１０ml、１６.１７ｇ、８７.８７mmol)を混合し、１６時間加熱還流した。溶媒を除去し、不純物質を−２０℃で続く反応に使用するために貯蔵した。
【００６１】
ii)１−ブチル−２−{７−[１−(５−カルボキシペンチル)３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３,５−ヘプタトリエニル}−３,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−インドリウム、塩(IV)
１−(５−カルボキシペンチル)−５−スルホ−２,３,３−トリメチルインドリウム、塩(５mg、０.０１４１mmol)、１−ブチル−５−ニトロ−２,３,３−トリメチルインドリウムヨージド(４.０２mg、０.０１４１mmol)およびＮ−[(５−フェニルアミノ)−２,４−ペンタジエニリデン]アニリン一塩酸塩(３.６９mg、０.０１４１mmol)をピリジン：酢酸：酢酸無水物(９：９：２、１ml)に溶解し、反応物を室温で暗所に１週間静置した。７５２nmでの１週間にわたるＵＶ分析は、反応がその週の最後には完了していることを示した。生産物を、次いで、逆相ＨＰＬＣで単離し、青色固体を得た(収率＝４.３mg、４５％)、ＵＶ(メタノール)：λmax.吸収＝７５２nm。ＭＳ：m/z＝６７６(Ｃ37Ｈ46Ｎ3Ｏ7Ｓに関して＝６７６.９)。
【００６２】
実施例５  ２−{３−[１−(３−アミノプロピル)−３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１−プロペニル}−３−(３,５−ジニトロベンジル)−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウム、塩(化合物Ｖ)の製造
【化１６】
0005008044.tif 000015
ｉ)３−(３,５−ジニトロベンジル)−２−メチル−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウムヨージド
２−メチルベンゾチアゾール(３ml、２０.１mmol)を、アセトン(２５ml)に溶解し、それに３,５−ジニトロベンジルヨージド(７.４ｇ、２４.１mmol)を添加し、１５時間加熱還流した。反応を冷却させ、エーテル(５００ml)を滴下して細かい黄色固体を得、それを濾過し、一定重量になるまで真空で乾燥させ、３−(３,５−ジニトロベンジル)−２−メチル−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウムヨージド(５ｇ、１０.９mmol、４５％収率)を得た。ＭＳ：m/z＝３２８(Ｃ15Ｈ12Ｎ3Ｏ4Ｓ＝３３０.３)。1H NMR(200MHz-DMSO-d6)：δ2.85(s, 1H); 3.7(s, 3H); 6.35(s, 2H); 7.37(m, 2H); 8.23(d, 1H); 8.53(d, 1H); 8.62(s, 2H); 8.8(s, 1H)。
【００６３】
ii)１−(３−アミノプロピル)−２,３,３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウムブロミド
ａ)２,３,３−トリメチルインドレニウム−５−スルフェート(２０ｇ、８４mmol)およびＮ−(３−ブロモプロピル)フタルイミド(５０ｇ、１８６mmol)をスルホラン(７５ml)中、１１０℃で２８時間撹拌した。更なる量のＮ−(３−ブロモプロピル)フタルイミド(２.５ｇ、８４mmol)を次いで２８時間および４５時間後に添加した。反応混合物を合計６５時間加熱し、次いで冷却して酢酸エチル(８００ml)を添加し、沈殿を形成させ、それを濾過し酢酸エチル(３×３００ｍｌ)およびアセトニトリル(５×４００ml)で洗浄してピンク色固体を得、それを真空で乾燥させて２,３,３−トリメチル−１−(３−フタルイミドプロピル)−５−スルホ−インドリウムブロミド(２５ｇ、４９mmol、５９％収率)を得た。
【００６４】
ｂ)２,３,３−トリメチル−１−(３−フタルイミドプロピル)−５−スルホ−インドリニウムブロミド(１４ｇ、２７.６mmol)をメタノール(５０ml)含有濃縮ＨＣｌ(１００mol)に溶解した。反応混合物を、１００℃で３２時間撹拌した。反応混合物を次いで冷却し、溶媒を減圧下除去し、アセトニトリルに溶解して沈殿を形成させた。溶液を濃縮アンモニア(〜１０ml)で中和し、沈殿を濾過し、最小量の水に溶解して、溶液を２ｇのＣ１８シリカのプラグを通して濾過した。ピンク色固体を凍結乾燥して１−(３−アミノプロピル)−２,３,３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウムブロミド(８ｇ、２１.２mmol、７７％収率)を得た。ＵＶ(メタノール)：λmax＝２５４nm。ＭＳ：m/z＝２９４(Ｃ14Ｈ21Ｎ2Ｏ3Ｓ＝２９７)。1H NMR(200MHz-DMSO-d6)：δ1.5(2s, 6H); 2.1(m, 2H); 2.98(s, 3H); 3.3(m, 2H); 3.6(t, 2H); 6.6(d, 1H, J=7.8Hz); 7.5(m, 2H); 8.2(dd, 1H, J=4および6Hz)。
【００６５】
iii)化合物Ｖの製造
Ｎ,Ｎ'−ジフェニルホルムアミジン(２３６mg、１.２mmol)を、ピリジン(４.５ml)、酢酸(４.５ml)および酢酸無水物(１.０ml)に溶解した３−(３,５−ジニトロベンジル)−２−メチル−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウムヨージド(５００mg、１.０９mmol)および１−(３−アミノプロピル)−２,３,３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウムブロミド(４１２.５mg、１.０９mmol)に添加した。反応物を１００℃で３.５時間加熱し、次いで室温に冷却して逆相ＨＰＬＣで精製した。次いで、単離したピンク色固体を水性塩酸(２.０Ｍ)に溶解し、９５時間還流した。次いで溶液を室温に冷却し、蒸発させ、次いで、逆相ＨＰＬＣで再精製した。回収したピンク色固体を真空で乾燥させた。ＵＶ(エタノール)：λmax＝５５９nm。ＭＳ：m/z＝６３８(Ｃ30Ｈ30Ｎ5Ｓ2Ｏ7＝６３６.６)。
【００６６】
実施例６  ２−[３−(３−(５−カルボキシペンチル)−１,３−ベンゾチアゾール−２(３Ｈ)−イリデン)−１−プロペニル]−３−(３,５−ジニトロベンジル)−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウム、塩(化合物VI)の製造
【化１７】
0005008044.tif 000016
ｉ)３−(５−カルボキシペンチル)−２−メチル−１、３−ベンゾ(benxo)チアゾール−３−イウムブロミド
２−メチルベンゾチアゾール(８０ml、９３.８４ｇ、０.６２９mol)に、６−ブロモヘキサン酸(２５０ｇ、１.２８mol)を添加した。反応混合物を１４０℃で２４時間撹拌した。黄色沈殿が形成された。反応を冷却し、メタノール(３５０ml)に溶解し、酢酸エチル(２ｌ)に滴下した。ベージュ色沈殿を回収し、酢酸エチル(３×５０ml)で洗浄した。次いで、固体を一定重量になるまで真空で乾燥させ、３−(５−カルボキシペンチル)−２−メチル−１,３−ベンゾ(benxo)チアゾール−３−イウムブロミド(１８２.３５ｇ、０.５３mol、８４％収率)を得た。ＵＶ(メタノール)：λmax＝２３７、２７７nm。ＭＳ：m/z＝２６２(Ｃ14Ｈ18ＮＯ2Ｓ＝２６４)を得た。1H NMR(200MHz-DMSO-d6)：δ1.49(m, 4H); 1.9(m, 2H); 2.24(t, 2H, J=6.35Hz); 3.32(s, 3H); 4.72(t, 2H, J=7.81Hz); 7.85(m, 2H); 8.4(dd, 2H, J=8.31Hz)。
【００６７】
ii)２−(２−アニリノエテニル)−３−(３,５−ジニトロベンジル)−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウム、塩
Ｎ,Ｎ'−ジフェニルホルムアミジン(４２.９mg、０.２９mmol)を、３−(３,５−ジニトロベンジル)−２−メチル−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウムヨージド(１００mg、０.２９mmol)(実施例５  ｉ)のように製造)および酢酸ナトリウム(過剰)のエタノール(１ml)溶液に添加した。反応物を４０℃で４時間撹拌し、赤色溶液を得た。溶媒を減圧下で除去し、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製してオレンジ色ゴム状物を得た。
【００６８】
iii)化合物VIの合成
３−(５−カルボキシペンチル)−２−メチル−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウムブロミド(７.９mg、０.０２mmol)を、２−(２−アニリノエテニル)−３−(３,５−ジニトロベンジル)−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウム塩(１０mg、０.０２mmol)および酢酸ナトリウム(過剰)のエタノール(１ml)溶液に添加した。反応を４５℃で撹拌し、ピンク色溶液が観察された。溶媒を真空で除去し、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製して濃ピンク色固体を得た。ＵＶ(水／アセトニトリル)：λmax＝５５８nm。ＭＳ：m/z＝６０４(Ｃ30Ｈ27Ｎ4Ｏ6Ｓ2＝６０３.７)。
【００６９】
実施例７  ３−[４−(カルボキシメチル)ベンジル]−２−{３−[１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１−プロペニル}−１,３−ベンゾキサゾール−３−イウム、塩(化合物VII)の製造
【化１８】
0005008044.tif 000017
ｉ)３−[４−(カルボキシメチル)ベンジル]−２−メチル−１,３−ベンゾキサゾール−３−イウムブロミド
２−メチルベンゾキサゾール(黄色)を、真空下で蒸留し、無色液体を得た(３３ml)。４−(ブロモメチル)フェニル酢酸(２０ｇ、８７.３mmol)および２−メチルベンゾキサゾール(蒸留、３３ml、２７８mmol)を１,２−ジクロロベンゼン(７０ml)に溶解した。反応混合物を８０℃で２.５日間加熱し、黄色沈殿を得た。反応混合物を室温に冷却し、沈殿を濾過して回収し、１,２−ジクロロベンゼン(３×１００ml)およびジエチルエーテル(４×２００ml)で洗浄した。クリーム状固体を回収し、真空で乾燥させ、３−[４−(カルボキシメチル)ベンジル]−２−メチル−１,３−ベンゾキサゾール−３−イウムブロミド(２０ｇ、５５.３mmol、６３％収率)を得た。ＵＶ(メタノール)：λmax＝２７７nm。ＭＳ：m/z＝２８２(Ｃ17Ｈ16ＮＯ3＝２８２.３２)。順相ＴＬＣ(エーテル)は、出発２−メチルベンゾキサゾールがＲf＝０.９±０.０５を有し、生産物がＲf＝０であることを示す。1H NMR(200MHz-DMSO-d6)：δ1.75(s, 2H); 3.2(s, 3H); 5.85(s, 2H); 7.31(d, 2H, J=6.8Jz); 7.53(d, 2H, J=6.8Hz); 7.72(m, 2H, J=6.3Hz); 7.89(d, 1H, J=8.3Hz); 8.17(d, 1H, J=7.3Hz); 9.8(s, 1H)。
【００７０】
ii)１−(３,５−ジニトロベンジル)−５−スルホ−２,３,３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムブロミド
３,５−ジニトロベンジルクロライド(２２.１ｇ、１０２mmol)および臭化ナトリウム(１０.５ｇ、１０２mmol)を、２,３,３−トリメチル−５−スルホ−インドール、カリウム塩(５.０ｇ、２０.４mmol)のスルホラン(２５ml)溶液に添加した。反応混合物を１００℃で５時間撹拌した。次いで、溶液を室温に冷却し、アセトン(３００ml)を反応フラスコに添加した。茶色沈殿が形成され、それを濾過して回収し、逆相ＨＰＬＣで精製した。これにより、ベージュ色固体を得、それを真空で乾燥させた。ＵＶ(水／アセトニトリル)：λmax＝２８３nm。ＭＳ：m/z＝４２０(Ｃ18Ｈ18Ｎ3Ｏ7Ｓ＝４２０.４)。
【００７１】
iii)２−(２−アニリノエテニル)−３−[４−(カルボキシメチル)ベンジル]−１,３−ベンゾキサゾール−３−イウム、塩
エチルＮ−フェニルホルムイミデート(０.９４ｇ、６.２７mmol)を、２−メトキシエタノール(１０ｍｌ)に溶解した３−[４−(カルボキシメチル)ベンジル]−２−メチル−１,３−ベンゾキサゾール−３−イウムブロミド(１.０ｇ、２.７６mmol)に添加し、１００℃で１.５時間加熱した。溶液を、次いで室温に冷却して逆相ＨＰＬＣで精製した。得られた明黄色固体を真空で乾燥させた。
【００７２】
iv)化合物VIIの合成
１−(３,５−ジニトロベンジル)−２,３,３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウムブロミド(１３０mg、０.２６mmol)を、ピリジンおよび酢酸無水物(２０：０.６、１０ml)に溶解した２−(２−アニリノエテニル)−３−[４(カルボキシメチル)ベンジル]−１,３−ベンゾキサゾール−３−イウムブロミド(１００mg、０.２６mmol)に添加した。反応物を、暗所に２４時間、室温で静置した。次いで、溶媒を除去し、生産物を逆相ＨＰＬＣによる精製後に単離した。ＵＶ(エタノール)：λmax＝５１２nm。ＭＳ：m/z＝７１４(Ｃ36Ｈ31Ｎ4Ｏ10Ｓ＝７１１.７)。
【００７３】
実施例８  １−(５−カルボキシペンチル)−２−{３−[１−(５−カルボキシペンチル)−３−メチル−５−ニトロ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イリデン]−１−プロペニル}−３−メチル−５−ニトロ−３Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イウム、塩(化合物VIII)の製造
【化１９】
0005008044.tif 000018
ｉ)１−(５−カルボキシペンチル)−２,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イウムヨージド
６−ヨウドヘキサン酸(６.３３ｇ、２６.１５mmol)を、スルホラン(１０ml)に溶解させた２,３−ジメチル−５−ニトロベンズイミダゾール(１.０ｇ、５.２３mmol)に添加し、２４時間、１００℃で撹拌した。反応混合物を、次いで、室温に冷却し、酢酸エチル(２００ml)に滴下した。黄色沈殿が形成され、それを濾過して回収し、真空で乾燥させた。これにより、１−(５−カルボキシペンチル)−２,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イウムヨージドが黄色固体として得られた(１.７７ｇ、４.０９mmol、７８％収率)。ＵＶ(エタノール)：λmax＝２８５nm。ＭＳ：m/z＝３０６(Ｃ15Ｈ20Ｎ3Ｏ4＝３０６)。順相ＴＬＣ(エタノール)は、Ｒf＝０.６±０.０５の出発物質およびＲf＝０の生産物を示した。1H NMR(200MHz-DMSO-d6)：δ2.3(m, 8H); 2.95(s, 3H); 4.0(s, 3H); 4.6(t, 2H); 8.24(d, 1H, J=9.28Hz); 8.5(dd, 1H, J=9.28および1.95Hz); 9.09(d, 1H, J=1.95Hz)。
【００７４】
ii)２−(２−アニリノエテニル)−１−(５−カルボキシペンチル)−３−メチル−５−ニトロ−３Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イウム、塩
エチルＮ−フェニルホルムイミデート(３８４.９mg、２.５８mmol)を、２−メトキシエタノール(５ml)に溶解した１−(５−カルボキシペンチル)−２,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イウムヨージド(５００mg、１.２９mmol)に添加した。反応物を、１００℃で１時間加熱し、室温に冷却して逆相ＨＰＬＣで精製した。黄色固体を更なる反応のために真空で乾燥させた。
【００７５】
iii)化合物VIIIの合成
１−(５−カルボキシペンチル)−２,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イウムヨージド(９.４mg、０.０２４mmol)を、ピリジン、酢酸無水物およびトリエチルアミン(２０：０.６：０.７、２ml)に溶解させた２−(２−アニリノエテニル)−１−(５−カルボキシペンチル)−３−メチル−５−ニトロ−３Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イウム塩(１０mg、０.０２４mmol)に添加した。反応物を２４時間暗所に静置した。溶媒を次いで蒸発させ、生産物を逆相ＨＰＬＣでの精製後に単離した。ＵＶ：λmax＝５３５nm。ＭＳ：m/z＝６２２(Ｃ31Ｈ37Ｎ6Ｏ8＝６２１.６)。
【００７６】
実施例９  ２−{５−[１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−５,７−ジスルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル}−３−(３,５−ジニトロベンジル)−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウム、塩(化合物IX)の製造
【化２０】
0005008044.tif 000019
ｉ)１−(５−カルボキシペンチル)−２,３,３−トリメチル−５,７−ジスルホ−３Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドリウムブロミド
６−ブロモヘキサン酸(３０ｇ、０.１５３mol)を、２,３,３−トリメチル−３Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−５,７−ジスルホン酸(５０ｇ、０.１１２mol)のニトロベンゼン(２００ml)溶液に添加し、２４時間、１２０℃で撹拌した。反応混合物を室温に冷却した。茶色沈殿が形成され、それを濾過して回収し、２−プロパノール(２５０ml)で洗浄した。次いで、固体を２−プロパノールから再結晶させた。暗灰色固体を濾過し、逆相ＨＰＬＣで精製した。これにより、灰色固体を得、それを真空で乾燥させた。ＵＶ(水／アセトニトリル)：λmax＝２７３nm、２８３nm。ＭＳ：m/z＝４８４(Ｃ21Ｈ26ＮＯ8Ｓ2＝４８４.５)。1H NMR(200MHz-DMSO-d6)：δ1.7(m, 14H); 2.2(t, 2H); 2.9(s, 2H); 8.2(d, 1H, J=9.28Hz); 8.4(d, 2H, J=4.39Hz), 9.15(d, 1H, J=9.28Hz)。
ii)化合物IXの合成
マロンアルデヒドビスフェニルイミン一塩酸塩(１４１mg、０.５５mmol)を、ピリジン(１８ml)、酢酸(１８ml)および酢酸無水物(４ml)に溶解した１−(５−カルボキシペンチル)−２,３,３−トリメチル−５,７−ジスルホ−３Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドリウムブロミド(２８６mg、０.５５mmol)および３−(３,５−ジニトロベンジル)−２−メチル−１,３−ベンズチアゾール−３−イウムヨージド(２００mg、０.５５mmol)(実施例５  ｉ)のように製造)に添加した。反応を、８０℃で４時間撹拌し、室温に冷却させた。溶媒を蒸発させ、混合物を逆相ＨＰＬＣで精製した。青色固体として得た生産物を真空で乾燥させた。ＵＶ(エタノール)：λmax＝６７６nm。ＭＳ：m/z＝８５３(Ｃ39Ｈ37Ｎ4Ｏ12Ｓ3＝８４９.９)。
【００７７】
実施例１０  １−ブチル−２−[７−(３−(５−カルボキシペンチル)−１,３−ベンゾチアゾール−２−イリデン)−１,３,５−ヘプタトリエニル]−３,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−インドレニウム、塩(化合物Ｘ)の製造
【化２１】
0005008044.tif 000020
ｉ)化合物Ｘの合成
Ｎ−５−(フェニルアミノ)−２,４−ペンタジエニリデン]アニリン一塩酸塩(１８mg、０.０６４mmol)を、１−ブチル−２,３,３−トリメチル−５−ニトロ−３Ｈ−インドリウムヨージド(２５mg、０.０６４mol)および３−(５−カルボキシペンチル)−２−メチル−１,３−ベンゾチアゾール−３−イウムブロミド(２２mg、０.０６４mmol)の酢酸(０.５ml)およびピリジン(０.５ml)溶液に添加した。反応を４０℃で４時間加熱した。次いで、溶液を室温に冷却し、溶媒を減圧下で蒸発させた。暗緑色残渣をジメチルスルホキシドに溶解し、逆相ＨＰＬＣで精製して緑色固体を得た。ＵＶ(メタノール)：λmax＝７６８nm。ＭＳ：m/z＝５８７(Ｃ34Ｈ40Ｎ3Ｏ4Ｓ＝５８６.７)。
【００７８】
実施例１１  ２−{５−[１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム、塩(化合物XI)の製造
【化２２】
0005008044.tif 000021
ｉ)化合物XIの合成
反応を、化合物IXで記載のものと類似の方法で、１−(３,５−ジニトロベンジル)−２,３,３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウムブロミド(５０mg、０.１２mmol)および１−(５−カルボキシペンチル)−２,３,３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウムブロミド(４３mg、０.１２mmol)を使用して、マロンアルデヒドビスフェニルイミン一塩酸塩(３２mg、０.１２mmol)存在下、酢酸(０.９ml)、ピリジン(０.９ml)および酢酸無水物(０.２ml)中で行った。生産物を青色固体として単離した。ＵＶ(エタノール)：λmax＝６５１nm。ＭＳ：m/z＝８１１(Ｃ38Ｈ41Ｎ4Ｏ12Ｓ2＝８０９.９)。
【００７９】
実施例１２  非蛍光シアニン色素の相対的蛍光放射
化合物Ｖ、VII、IXおよびXIを、エタノール(５×１０-5Ｍ)の溶液として調製した。比較のために、蛍光色素色素Cy3およびCy5を、同じ濃度でエタノール中に調製した。各色素溶液の蛍光強度を蛍光プレートリーダーを使用して測定した。全ての色素溶液のエタノールでの連続希釈(１：１)を次いで行い、蛍光強度を各希釈について測定した。非蛍光シアニン色素の通常蛍光シアニン色素に対する蛍光放射を図１に示す。
【００８０】
実施例１３  核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
１３.１  プローブ調製
オリゴヌクレオチドＡ(５'−C6−アミノモディファイアー−TAC CCA GAC GAG CAAビオチン−３')および相補的オリゴヌクレオチドＢ(５'−TTG CTC GTC TGG GTA−C7−アミノモディファイアー−３')を、標準の方法および材料を使用して、Applied Biosystems 391 DNAシンセサイザーをで合成した。オリゴヌクレオチドを、１７時間、４０℃で脱保護し、Ｃ１８カラムおよび４０％ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用した逆相ＨＰＬＣで精製した。望ましいピークを回収し、凍結乾燥し、サンプルを滅菌Ｈ2Ｏに再懸濁した。
【００８１】
オリゴヌクレオチドＡおよびＢを、各々１０倍モル過剰のCy3  ＮＨＳ−エステル色素および２−{５−[１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−５−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−インドリニウム塩(化合物II)−ＮＨＳ−エステルと、０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液(ｐＨ９)中、一晩２２℃でインキュベートした。翌日、オリゴヌクレオチドをエタノールを使用して沈殿させ、得られるペレットを水に再懸濁した。標識オリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラムおよび６０％ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用した逆相ＨＰＬＣで精製し、所望のピークを回収し、凍結乾燥した。残渣をＨ2Ｏに再懸濁し、回収物質の濃度を測定した。
【００８２】
コントロールオリゴヌクレオチドＣ(５'−TTG CTC GTC TGG GTA−Dabcyl−３')を上記のように合成した。Dabcyl部分は、３'−Dabcyl cpgカラムを使用して添加した。合成に続き、記載のようにオリゴヌクレオチドＣを１７時間、４０℃で脱保護し、ＨＰＬＣで精製した。
【００８３】
１３.２  結合アッセイ
黒色、ストレプトアビジンコートした９６ウェルプレートのウェルをCy3−標識オリゴヌクレオチドＡ(１００pmol／ウェル、１００μl  ＰＢＳ／１ＭｇＣｌ2)で１２０分、環境温度でコートした。非結合物質をウェルを激しく緩衝液(ＰＢＳ／１mM  ＭｇＣｌ2／０.１％ＢＳＡ)で洗浄した。化合物II−標識オリゴヌクレオチドＢおよびDabcyl−標識オリゴヌクレオチドＣを、緩衝液中０.２pmol／μlに希釈し、１００μlを環境温度で１２０分、コートしたウェルとインキュベートした。ウェルを激しくＰＢＳで洗浄し、蛍光強度を、Cy3に適当にセットしたフィルターを使用して、蛍光プレートリーダーで測定した。Cy3−標識オリゴヌクレオチドＡ単独でコートしたウェルのシグナルを、Cy3−オリゴヌクレオチドＡでコートし、化合物II−標識オリゴヌクレオチドＢまたはコントロールオリゴヌクレオチドＣとインキュベートしたものと比較した。結果を図２に示す。Cy3−オリゴヌクレオチドＡでコートしたウェルは、強い蛍光強度を提供した。このシグナルは、化合物II−標識オリゴヌクレオチドＢとのハイブリダイゼーションに続き９５％および、オリゴヌクレオチドＣとのハイブリダイゼーションに続き７５％減少した。
【００８４】
実施例１４  ハイブリダイゼーション実験における、標準適合蛍光シアニンアクセプター色素(Cy5)と比較した非蛍光色素の使用
３'−末端をビオチンで、５'−末端をCy3で標識したオリゴヌクレオチド(５'−TAC−CCA−GAC−GAG−CAA−３')を、ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレートのウェルと結合させた。コートしたウェルを次いで個々に非蛍光シアニンアクセプター色素(化合物IIおよび化合物XI)で標識した相補的オリゴヌクレオチドプローブとインキュベートした。ハイブリダイゼーションに続き、ウェルを洗浄し、相対的蛍光をCy3ドナー色素での励起により測定した。コントロール測定を、相補的非標識、Cy5−標識および２,４−ジニトロベンゾイル−標識オリゴヌクレオチドで行った。結果を図３に示す。データは、非蛍光シアニン色素(化合物IIおよび化合物XI)の使用が、Cy5により得られたものの約２の因数の比率までシグナル対ノイズ比を増加させることが可能であることを示す。
【００８５】
実施例１５  プロテアーゼ開裂アッセイ
１５.１  プロテアーゼ基質の調製
ペプチドAla−Ala−Phe−Phe−Ala−Ala−Lysを、Perkin Elmer 433Aペプチドシンセサイザーで、標準Fmoc化学を使用して合成した。Cy5−NHS−エステル色素(僅かにモル過剰)を、２％v/vジイソプロピル−エチルアミン含有ＤＭＳＯ中での一晩のインキュベーション中に樹脂上のペプチドのＮ−末端に結合させた。標識ペプチド樹脂を連続してＤＭＳＯ(〜１０ml)、メタノール(〜１０ml)およびジクロロメタン(〜５ml)およびで洗浄し、乾燥させた。９０分の９５％ＴＦＡ／２.５％トリイソプロピルシラン／２.５％Ｈ2Ｏ中でのインキュベーションは、側鎖脱保護および樹脂からの開裂を促進した。グラスウールを通した濾過後、ペプチドを青色沈殿として氷冷ジエチルエーテル中に単離した。生産物をＤＭＳＯに再懸濁させ、逆相ＨＰＬＣ(勾配：水＋０.１％ＴＦＡから７０％ＭｅＣＮ＋０.１％ＴＦＡ)で精製し、所望のフラクションを回収し、凍結乾燥した。
【００８６】
Cy5−Ala−Ala−Phe−Phe−Ala−Ala−Lysを、２％v/vジイソプロピルエチルアミン含有ＤＭＳＯ中、僅かにモル過剰の１−ブチル−２−{５−[１−(５−カルボキシペンチル)−３,３−ジメチル−６−スルホ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル}−３,３−ジメチル−５−ニトロ−３Ｈ−インドリニウム塩(化合物III)、ＮＨＳ−エステルと一晩インキュベートした。２重−標識ペプチドを再び逆相ＨＰＬＣで単離し、凍結乾燥した。残渣をＨ2Ｏに再懸濁し、濃度を決定した。
【００８７】
１５.２  プロテアーゼ酵素のアッセイ
プロテアーゼ基質(Cy5−Ala−Ala−Phe−Phe−Ala−Ala−Lys−化合物III)を、０.０２吸収単位／cm(６５０nmで)に、クエン酸緩衝液(１００mM  ｐＨ３.０)で希釈した。キュベット中の標識支持体のその溶液(１ml)に、２５ngペプシン(１０μl容量)を添加した。プロテアーゼ添加前の蛍光ベースラインおよび強度の続く増加を、適当な波長で記録した。コントロール実験(ペプシンなし)を同様の方法で行った。結果を図４に示す。そのままの基質におけるCy5蛍光の有効な消光は、低いシグナルをもたらした。この基質のプロテアーゼ触媒加水分解は、この消光を取り去り、Cy5蛍光を元に戻した。蛍光強度の増加は連続してモニターでき、プロテアーゼ活性と比例する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１２にしたがったCy3と化合物ＶおよびVII(図１ａ)およびCy5と化合物IXおよびXI(図１ｂ)の相対的蛍光放射を説明する。
【図２】  実施例１３にしたがった、Cy3−標識オリゴヌクレオチドと、非蛍光Cy5アナログ(化合物II)およびDabcylで標識したその相補的オリゴヌクレオチドの結合による蛍光シグナルの減少が観察される、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを説明する。
【図３】  実施例１４にしたがったオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション実験におけるシグナル対ノイズ比増加(および背景減少)における、標準適合蛍光シアニンアクセプター色素(Cy5)と比較したアクセプター色素としての非蛍光シアニン色素を使用した効果を説明する。
【図４】  実施例１５にしたがった、ペプシン存在下または非存在下で測定した、時間と蛍光強度に関して測定した、基質Cy5-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Lys-化合物IIIを利用したプロテアーゼ開裂アッセイの過程を説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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