(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
副腎におけるスーパーオキシドが介在する非炎症性ストレス応答の指標剤であって、IL−18とさらにＰ３８ＭＡＰキナーゼを含有してなる指標剤。
【請求項２】
前記IL−18が血中に存在する活性型IL−18である請求項１に記載の指標剤。
【請求項３】
前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼがリン酸化されたものである請求項１または２に記載の指標剤。
【請求項４】
前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼがマウス由来であり、当該キナーゼのリン酸化部位がThr180またはTyr182である請求項３に記載の指標剤。
【請求項５】
前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼがヒト由来であり、当該キナーゼのリン酸化部位がThr185またはTyr187である請求項３に記載の指標剤。
【請求項６】
さらにカスパーゼ−１１を含有してなる請求項１〜５いずれか１項に記載の指標剤。
【請求項７】
さらにカスパーゼ−１を含有してなる請求項１〜６いずれか１項に記載の指標剤。
【請求項８】
前記カスパーゼ−１が活性化カスパーゼ−１である請求項７に記載の指標剤。
【請求項９】
前記非炎症性ストレスが精神的ストレスである請求項１〜８いずれか１項に記載の指標剤。
【請求項１０】
前記精神的ストレスが拘束ストレスである請求項９に記載の指標剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１項に記載の指標剤を検出するための副腎における非炎症性ストレス応答の可視化剤であって、少なくともIL−18抗体を含有する可視化剤。
【請求項１２】
IL−18抗体およびＰ３８ＭＡＰキナーゼ抗体を含有する請求項１１に記載の可視化剤。
【請求項１３】
前記IL−18抗体が活性型IL−18を特異的に認識するものである、請求項１２に記載の可視化剤。
【請求項１４】
前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体が抗リン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体である請求項１２に記載の可視化剤。
【請求項１５】
前記抗リン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体がリン酸化Thr180もしくはTyr182を有するＰ３８ＭＡＰキナーゼ、またはリン酸化Thr185もしくはTyr187を有するＰ３８ＭＡＰキナーゼを認識するものである請求項１４に記載の可視化剤。
【請求項１６】
さらにカスパーゼ−１１抗体を含有する請求項１１〜１５いずれか１項に記載の可視化剤。
【請求項１７】
さらにカスパーゼ−１抗体またはカスパーゼー１の基質を含有する請求項１１〜１６いずれか１項に記載の可視化剤。
【請求項１８】
前記カスパーゼ−１抗体が活性化カスパーゼ−１を特異的に認識するものである、請求項１７に記載の可視化剤。
【請求項１９】
請求項１〜１０いずれか１項に記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする非炎症性ストレスの程度を測定する方法。
【請求項２０】
前記非炎症性ストレスが精神的ストレスである請求項１９に記載の測定方法。
【請求項２１】
前記精神的ストレスが拘束ストレスである請求項２０に記載の測定方法。
【請求項２２】
請求項１１〜１８いずれか１項に記載の可視化剤を用いることを特徴とする、請求項１９〜２１いずれか１項に記載の測定方法。
【請求項２３】
請求項１１〜１８いずれか１項に記載の可視化剤を、ヒトを除く動物に適用することを特徴とする、非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動を予防、改善または予想する方法。
【請求項２４】
前記動物がヒトを除く脊椎動物である請求項２３に記載の予防、改善または予想方法。
【請求項２５】
請求項１１〜１８いずれか１項に記載の可視化剤を含む非炎症性ストレスの測定キット。
【請求項２６】
請求項１〜１０いずれか１項に記載の指標剤の量または活性を低減させるための、非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態変動の治療剤であって、下記からなる群より選ばれる治療剤：
IL−18抗体および抗IL−18受容体抗体。
【請求項２７】
前記有効成分がIL−18抗体であり、当該IL−18抗体が活性型IL−18に特異的に結合するものである請求項２６に記載の治療剤。
【請求項２８】
請求項１〜１０いずれか１項に記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、精神的ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項２９】
請求項１〜１０いずれか１項に記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、酸化ストレスに対する抑制効果若しくは防止効果を有する物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非炎症性ストレス応答の指標剤およびその利用に関するものである。詳しくは、分子生物学的にストレスを解明してメンタルヘルス分野の科学的発展に寄与するものである。
【背景技術】
【０００２】
精神的および／または肉体的ストレスは、神経、内分泌および免疫系を含む宿主の防御に影響を及ぼす（非特許文献１および２を参照）。種々のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなど）は、ストレスによってアップレギュレートする（非特許文献１および３を参照）。このことは、サイトカインが宿主防御の妨害に関与している可能性を示唆する（非特許文献４を参照）。しかしながら、ストレスが宿主防御を損なうサイトカインを誘導する分子機構は、十分に理解されていない。【０００３】
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導因子として発見されたサイトカインである（非特許文献５および特許文献１を参照）。ＩＬ−１８は、Ｆａｓリガンドの誘導、Ｔ細胞の細胞溶解活性の上昇（非特許文献６を参照）ならびにＩＬ−４およびＩＬ−１３の産生（非特許文献７を参照）を初めとする多彩な生物活性を有する（非特許文献８を参照）。ＩＬ−１８は、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅレセプター２を活性化させ（非特許文献９を参照）、骨髄分化タンパク質（Ｍｙｄ）−８８を活性化させる（非特許文献１０を参照）。これらの活性化はＩＬ−６の誘導に必要である（非特許文献１１を参照）。したがって、ＩＬ−１８は、Ｔｈ１およびＴｈ２両サイトカインの産生に関与している（非特許文献１２を参照）。【０００４】
ＩＬ−１８は、２４ｋＤの前駆体タンパク質として産生され、ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ、またはカスパーゼ−１ともいう）により、１８ｋＤの成熟活性型にプロセッシングされる（非特許文献１３を参照）。カスパーゼ−１は、不活性型前駆体タンパク質プロカスパーゼ−１として誘導され、カスパーゼ−１１によって活性化される（非特許文献１４を参照）。カスパーゼ−１１ｍＲＮＡの発現は、ＮＦ−κＢのトランス活性化を必要とし（非特許文献１５を参照）、この活性化はＰ３８ＭＡＰキナーゼが媒介することが報告されている（非特許文献１６を参照）。カスパーゼ−１１ｍＲＮＡのＬＰＳ（リポポリサッカリド）による誘導ならびにその後のカスパーゼ−１の活性化は、神経膠腫細胞株Ｃ６において、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０により抑制されることが報告されている（非特許文献１７を参照）。【０００５】
最近の研究では、ＩＬ−１８ｍＲＮＡは副腎において副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）および寒冷ストレスに応答して発現することが報告されている（非特許文献１８を参照）。また、副腎と免疫細胞とではＩＬ−１８ｍＲＮＡについては異なるプロモーターを使用していることが報告されている（非特許文献１９を参照）。しかしながら、成熟型のＩＬ−１８の誘導は、前記両研究では示されていない。他方、精神医学的患者において、血漿中のＩＬ−１８の上昇が報告されている（非特許文献２０を参照）。【０００６】
現代社会においては、ヒトは様々なストレスに曝されて労働し、生活している。一般に、ストレスの感じ方には個人差があり、ストレスの有無や強弱について明確な指標がなかった。これまでの研究では、ストレスがＩＬ−１８などのサイトカインの上昇を招いているのかどうか、ならびにＩＬ−１８がストレスにより誘導される宿主防御の障害に役割を果たしているのかどうかは明らかにされていない。
【特許文献１】特開平８−１９３０９８号公報
【非特許文献１】Ｄｕｇｕｅ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ５３，  ５５５−５６１  （１９９３）
【非特許文献２】Ｋｉｅｃｏｌｔ−Ｇｌａｓｅｒ，  Ｊ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３，  ３０４３−３０４７  （１９９６）
【非特許文献３】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３，  ２５２３−２５３０  （１９９３）
【非特許文献４】Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍ．  Ｍｅｄ．  ６１，  ８７６−８８２  （１９９９）
【非特許文献５】Ｚｈｏｕ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，  ８８−９１  （１９９５）
【非特許文献６】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９  ４２３−４７４  （２００１）
【非特許文献７】Ｈｏｓｈｉｎｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２，  ５０７０−５０７７  （１９９９）
【非特許文献８】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，  Ｃ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ６３，  ６５８−６６４  （１９９８）
【非特許文献９】Ｂｌｅａｓｅ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｒｅｓ．  ５０，  ５５２−５６０  （２００１）
【非特許文献１０】Ａｄａｃｈｉ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９，  １４３−１５０  （１９９８）
【非特許文献１１】Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５，  ５３９２−５３９６  （２０００）
【非特許文献１２】Ｈｏｓｈｉｎｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６，  ７０１４−７０１８  （２００１）
【非特許文献１３】Ｇｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，  ２０６−２０９  （１９９７）
【非特許文献１４】Ｗａｎｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ９２，  ５０１−５０９  （１９９８）
【非特許文献１５】Ｓｃｈａｕｖｌｉｅｇｅ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ４１６２４−４１６３０  （２００２）
【非特許文献１６】Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ３２８５−３２９０  （１９９８）
【非特許文献１７】Ｈｕｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５０７，  １５７−１６２  （２００１）
【非特許文献１８】Ｃｏｎｔｉ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ２０３５−２０３７  （１９９７）
【非特許文献１９】Ｓｕｇａｎｕｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５，  ６２８７−６２９２  （２０００）
【非特許文献２０】Ｋｏｋａｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２５，  ６８−７１  （２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ストレスに曝された生体内の事象を分子生物学的に可視化し、定量的に検出できる系を提供することにある。本発明の別の目的は、ストレスによる身体障害を管理回避可能な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、拘束ストレスを受けたマウスにおけるサイトカインの発現を調べるに際し、ＩＬ−１８前駆体タンパク質のプロセッシングと血漿中への成熟型ＩＬ−１８の放出に焦点を定めて研究を進めていったところ、ストレスによりＩＬ−１８を活性化させる生体内のカスケードが誘導されることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］スーパーオキシドが介在する非炎症性ストレス応答の指標剤であって、非炎症性ストレスカスケードに関与する成分を含有してなる指標剤、
［２］前記非炎症性ストレスカスケードに関与する成分が、ＩＬ−１８、活性型ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、リン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ１１、カスパーゼ１、活性化カスパーゼ１からなる群から選択される１または２以上のタンパク質を含有することを特徴とする上記［１］記載の指標剤、
［３］前記非炎症性ストレスカスケードに関与する成分が、ＩＬ−１８である上記［１］記載の指標剤、
［４］前記ＩＬ−１８が血中に存在する活性型ＩＬ−１８である上記［３］に記載の指標剤、
［５］さらにＰ３８ＭＡＰキナーゼを含有してなる上記［３］または［４］に記載の指標剤、
［６］前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼがリン酸化されたものである上記［５］に記載の指標剤、
［７］前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼがマウス由来であり、当該キナーゼのリン酸化部位がＴｈｒ１８０またはＴｙｒ１８２である上記［６］に記載の指標剤、
［８］前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼがヒト由来であり、当該キナーゼのリン酸化部位がＴｈｒ１８５またはＴｙｒ１８７である上記［６］に記載の指標剤、
［９］さらにカスパーゼ−１１を含有してなる上記［３］〜［８］いずれかに記載の指標剤、
［１０］さらにカスパーゼ−１を含有してなる上記［３］〜［９］いずれかに記載の指標剤、
［１１］前記カスパーゼ−１が活性化カスパーゼ−１である上記［１０］に記載の指標剤、
［１２］前記非炎症性ストレスが精神的ストレスである上記［３］〜［１１］いずれかに記載の指標剤、
［１３］前記精神的ストレスが拘束ストレスである上記［１２］に記載の指標剤、
［１４］上記［１］〜［１３］いずれかに記載の指標剤を検出するための非炎症性ストレス応答の可視化剤、
［１５］ＩＬ−１８抗体を含有する上記［１４］に記載の可視化剤、
［１６］前記ＩＬ−１８抗体が活性型ＩＬ−１８を特異的に認識するものである、上記［１５］に記載の可視化剤、
［１７］さらにＰ３８ＭＡＰキナーゼ抗体を含有する上記［１５］または［１６］に記載の可視化剤、
［１８］前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体が抗リン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体である上記［１７］に記載の可視化剤、
［１９］前記抗リン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体がリン酸化Ｔｈｒ１８０もしくはＴｙｒ１８２を有するＰ３８ＭＡＰキナーゼ、またはリン酸化Ｔｈｒ１８５もしくはＴｙｒ１８７を有するＰ３８ＭＡＰキナーゼを認識するものである上記［１８］に記載の可視化剤、
［２０］さらにカスパーゼ−１１抗体を含有する上記［１５］〜［１９］いずれかに記載の可視化剤、
［２１］さらにカスパーゼ−１抗体またはカスパーゼー１の基質を含有する上記［１５］〜［２０］いずれかに記載の可視化剤、
［２２］前記カスパーゼ−１抗体が活性化カスパーゼ−１を特異的に認識するものである、上記［２１］に記載の可視化剤、
［２３］上記［１］〜［１３］いずれかに記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする非炎症性ストレスの程度を測定する方法、
［２４］指標剤が、ＩＬ−１８または活性型ＩＬ−１８である上記［２３］記載の方法。
［２５］上記［１４］〜［２２］いずれかに記載の可視化剤を用いることを特徴とする上記［２３］または［２４］に記載の方法、
［２６］前記非炎症性ストレスが精神的ストレスである上記［２３］〜［２５］のいずれかに記載の方法、
［２７］前記精神的ストレスが拘束ストレスである上記［２６］に記載の方法、
［２８］上記［１４］〜［２２］いずれかに記載の可視化剤を含む非炎症性ストレスの測定キット。
［２９］前記可視化剤がＩＬ−１８抗体を含有する上記［２８］記載のキット、
［３０］前記ＩＬ−１８抗体が活性型ＩＬ−１８を認識するものである上記［２９］記載のキット、
［３１］上記［１４］〜［２２］いずれかに記載の可視化剤を動物に適用することを特徴とする、非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動を予防、改善または予想する方法、
［３２］前記動物がヒトを除く脊椎動物である上記［３１］に記載の予防、改善または予想方法、
［３３］上記［１］〜［１３］いずれかに記載の指標剤の量または活性を低減させるための非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態変動の治療剤、
［３４］前記治療剤の有効成分がＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ−１８受容体抗体である上記［３３］に記載の治療剤、
［３５］前記有効成分がＩＬ−１８抗体であり、当該ＩＬ−１８抗体が活性型ＩＬ−１８に特異的に結合するものである［３４］に記載の治療剤、
［３６］前記治療剤の有効成分がスーパーオキシドジムスターゼまたはビタミンＥである上記［３３］記載の治療剤、
［３７］上記［１］〜［１３］いずれかに記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質をスクリーニングする方法、
［３８］前記指標剤が、ＩＬ−１８または活性型ＩＬ−１８である上記［３７］記載の方法。
［３９］前記疾患が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、気管支喘息、乾癬、脳虚血、脳変性、脳炎、関節リウマチ、月経異常、子宮内膜症または性欲低下である上記［３７］または［３８］記載の方法、
［４０］上記［１］〜［１３］いずれかに記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、酸化ストレスに対する抑制効果若しくは防止効果を有する物質をスクリーニングする方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の指標剤によれば、ＩＬ−１８成分、および非炎症性ストレスにより発生したスーパーオキシドが介在するＰ３８ＭＡＰキナーゼを開始点とするカスケード（以下、ストレスカスケードと称する）レベルが明らかになり、個々の生体が受ける非炎症性ストレスの程度のみならず、宿主防御崩壊の危険を評価または予測する指標として役立つ。【００１１】
また、本発明の指標剤によれば、ストレスカスケードに関与する成分を含むことから、これらの成分および活性を減少させる物質のスクリーニングに利用することができ、かかる物質を有効成分とする医薬品ならびに保健機能食品（特定保健用食品および栄養機能食品）の開発に役立つ。【００１２】
本発明の可視化剤によれば、ＩＬ−１８およびストレスカスケードのレベルを定量することができ、制御が困難であった非炎症性ストレスを制御する途を開くことができる。【００１３】
本発明の非炎症性ストレスの程度を測定する方法によれば、個々の生体が受けるストレスの程度を容易に定量することが可能であり、特に労働者のメンタルヘルスに配慮した対策を講じるために有用である。【００１４】
本発明の非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動を予防、改善または予想する方法によれば、家畜または愛玩動物等の動物に適用することによって、人工的に飼育することがストレスを負荷することにつながりやすい畜産またはペット産業の分野において、動物の免疫状態を良好に維持し、病気に罹りにくい動物を飼育できるという効果を発揮する。【００１５】
本発明の免疫状態変動の治療剤によれば、非炎症性ストレスにより発症、悪化または再発する疾患の治療に役立つ。【００１６】
ケラチノサイトは、表皮を形成しているので、ＩＬ−１８の放出は皮膚の炎症と免疫に重大な影響を与えると考えられる。実際に、本発明者はＩＬ−１８を発現しないマウスでは紫外線による炎症、免疫低下が乏しく、また皮膚硬化と肥厚が起きないことを確認している。よって、本発明の治療剤によれば、ＩＬ−１８の放出、ひいては皮膚の炎症、免疫変動、分化・増殖の調節異常を防ぐことができる。これは全くの新概念であり、紫外線などによる皮膚障害、また、ＩＬ−１８が関与することが推測されているアトピー性皮膚炎、乾癬、尋常性挫創、天疱瘡、魚鱗癬、光線過敏症のほか、皮膚における炎症性変化を病態に含む熱傷、放射線皮膚障害、創傷治癒などに対しても、本発明の治療剤が有効である。さらに本発明の可視化剤を用いることが病態の解明、創薬開発、治療モデル開発に役立つ。【００１７】
マイクログリアやアストロサイトは中枢神経系に分布し、神経細胞の生存や中枢神経系における炎症や生体防御システムの中核をになっている。ＩＬ−１８は、急性に作用した場合炎症を引き起こすなどの効果を持つので、これによりマイクログリアやアストロサイトが関与する脳の炎症、神経細胞の脱落、脳機能異常に対して本発明の治療剤が適用可能である。たとえば、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆、びまん性レビー小体病、ピック病、ビンスワンガー病、パーキンソン氏病、パーキンソン症候群、脳虚血、脳虚血・再還流性障害、一酸化炭素中毒、シンナー中毒、新生児出血性脳症、低酸素脳症、高血圧性脳症、てんかん、多発性硬化症、ＨＩＶ脳症、脳循環障害、脳血管障害などの疾患に対して適用可能である。また、アストロサイトやマイクログリアは視床下部・下垂体などの内分泌関連箇所においても存在し、神経内分泌の制御に関与しているので、日周リズム異常、食欲異常、アジソン病や末端肥大症や性腺発達障害などの下垂体機能異常症、甲状腺機能異常症、肥満、血糖制御異常、二次的には原発性アルドステロン症、クッシング病などの副腎機能異常症、さらに消化管運動の制御や骨形成の異常などに対してもそれらグリア細胞からのＩＬ−１８は関与しており、本発明の治療剤によって、非炎症ストレスによって上記の疾患や機能異常症が発症悪化するプロセスを回避制御できる。【００１８】
マクロファージは生体のいたるところに存在し、血管中から組織中に遊走するなどして生体防御反応・炎症の制御の中心的役割をになっている。本発明の治療剤によれば、非炎症ストレスが関与してマクロファージ、ＩＬ−１８が介在するあらゆる炎症性疾患と自己免疫性疾患、生体防御系の調節異常を回避制御できる。【００１９】
滑膜細胞は関節包を形成し、特に関節リウマチにおいては滑膜細胞とマクロファージが関与した炎症が病態の中核をなすことが知られている。また、関節炎などによって滑膜細胞において炎症が発生した場合は、肥厚変形によって関節機能の障害や可動域制限が生じる。これらの現象にはサイトカインの関与が示唆されていたが、サイトカイン放出カスケードの下流にあるサイトカインを制御することでは炎症の制御に限界があり、リバウンドによる炎症の激化などが問題であった。本発明の治療剤によれば、マクロファージに加えて滑膜組織からのＩＬ−１８の放出を抑制回避でき、それに続くサイトカインの放出や炎症機転を制御できる。これにより、関節リウマチや痛風や関節炎などの関節の炎症を病態の中核とする疾患が寒冷や精神的ストレス、睡眠不足や血流障害、物理的重量の負荷などの非炎症性ストレスによって発症・再発・増悪することを、本発明の可視化剤・指標剤を制御することで回避制御できる。【００２０】
腎尿細管上皮細胞は体液調節において重要な役割を持ち、その局所における障害は腎不全、体液調節の異常、カリウム・ナトリウム・塩素イオンのバランスの崩壊、浮腫、糖尿病などの耐糖能障害、るいそう、痙攣、心不全、肺水腫、低蛋白血症、出血傾向などを招く。本発明の治療剤によれば、感染や毒物、腎尿細管を傷害するシスプラチン・カルボプラチンなどの抗ガン剤によって、あるいは特発性の機序をもって腎尿細管上皮細胞の脱落、炎症を病態の中核とする疾患の発症増悪を回避制御できる。【００２１】
また、血中ＩＬ−１８の上昇が、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン（ＬＨ）の血中レベルの変動を惹き起こすことから、本発明の治療剤によって、血中ＩＬ−１８の放出をコントロールすることにより、月経異常、子宮内膜症、性欲低下などの下垂体機能異常に起因する疾患が寒冷や精神的ストレス、睡眠不足や血流障害、物理的重量の負荷などの非炎症性ストレスによって発症・再発・増悪することを、本発明の可視化剤・指標剤を制御することで回避制御できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中ＩＬ−１８およびＡＣＴＨレベルを示す図である。
【図１Ｂ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中ＩＬ−１８レベルが抗ＡＣＴＨ抗体またはデキサメタゾンにより抑制されることを示す図である。
【図１Ｃ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中ＩＬ−１８が抗ＡＣＴＨ抗体またはデキサメタゾンにより抑制されることを示す図である。
【図１Ｄ】ＡＣＴＨ  を投与した後の血漿中ＩＬ−１８と拘束ストレス負荷後の血漿中ＩＬ−１８とを比較した図である。
【図１Ｅ】ＡＣＴＨ  を投与した後の副腎中ＩＬ−１８と拘束ストレス負荷後の副腎中ＩＬ−１８とを比較した図である。
【図１Ｆ】副腎（レーン１−３）および血漿（レーン４−６）中のＩＬ−１８タンパク質をウエスタンブロッティングにより調べた結果を示す図である。レーン１および４は対照、レーン２および５はＡＣＴＨ投与した後、レーン３および６は拘束ストレスを負荷した後を示す。
【図２Ａ】副腎中のプロカスパーゼ−１をウエスタンブロッティングにより調べた結果を示す図である。レーン１は対照、レーン２はＡＣＴＨ投与後、レーン３は拘束ストレス負荷後である。
【図２Ｂ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中カスパーゼ−１活性がカスパーゼ−１阻害剤ＹＶＡＤ−ＣＨＯにより抑制されることを示す図である。
【図２Ｃ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中ＩＬ−１８がＹＶＡＤ−ＣＨＯにより抑制されることを示す図である。
【図２Ｄ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中ＩＬ−１８はＹＶＡＤ−ＣＨＯにより抑制されないことを示す図である。
【図２Ｅ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中カスパーゼ−１活性がカスパーゼ−１１阻害剤Ｚ−ＦＡ−ｆｍｋにより抑制されることを示す図である。
【図２Ｆ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中ＩＬ−１８活性がカスパーゼ−１１阻害剤Ｚ−ＦＡ−ｆｍｋにより抑制されることを示す図である。
【図３Ａ】拘束ストレスによりアップレギュレートされるカスパーゼ−１１前駆体がＰ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０により抑制されることを示す図である。
【図３Ｂ】拘束ストレスにより誘導されるカスパーゼ−１活性がＳＢ２０３５８０により抑制されることを示す図である。
【図３Ｃ】拘束ストレスにより誘導される血漿中ＩＬ−１８がＳＢ２０３５８０により抑制されることを示す図である。
【図３Ｄ】副腎中のリン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼをウエスタンブロッティングにより調べた結果を示す図である。レーン１はストレスなし、レーン２はストレス負荷、レーン３はＹＶＡＤ−ＣＨＯを添加、レーン４はＺ−ＦＡ−ｆｍｋを添加、レーン５はストレス負荷したカスパーゼ−１ＫＯマウスの場合を示す。
【図３Ｅ】ストレス負荷マウスの副腎の免疫組織化学を用いた染色の結果を示す写真である。副腎皮質の網状帯の重複した領域で、ＩＬ−１８（パネル１）、プロ／カスパーゼ−１（パネル２）、プロ／カスパーゼ−１１（パネル３）、および活性化（リン酸化）Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（パネル４）の誘導を示す。
【図３Ｆ】カスパーゼ阻害剤の存在下で活性化（リン酸化）Ｐ３８ＭＡＰキナーゼの発現を示す写真である。パネル１はＺ−ＦＡ−ｆｍｋを添加、パネル２はＹＶＡＤ−ＣＨＯを添加した場合を示す。
【図４Ａ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる活性化（リン酸化）Ｐ３８ＭＡＰキナーゼがＳＯＤにより抑制されることを示す図である。
【図４Ｂ】拘束ストレスによりアップレギュレートされるプロカスパーゼ−１１がＳＯＤにより抑制されることを示す図である。
【図４Ｃ】拘束ストレスにより誘導されるカスパーゼ−１活性がＳＯＤにより抑制されることを示す図である。
【図４Ｄ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中ＩＬ−１８がＳＯＤにより抑制されることを示す図である。
【図４Ｅ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中ＩＬ−１８がＳＯＤにより抑制されないことを示す図である。
【図４Ｆ】拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中ＩＬ−１８がＤＰＩにより抑制されることを示す図である。
【図５Ａ】ストレス負荷したマウスにおける血漿中ＩＬ−６レベルを示す図である。
【図５Ｂ】ストレス負荷した野生型マウスにおいて、アップレギュレートされる血漿中ＩＬ−６レベルがカスパーゼ−１阻害剤、ＳＯＤおよび抗ＩＬ−１８抗体により抑制されることを示す図である。
【図６】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて、ストレス負荷によるループス腎炎の増悪が抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−１８受容体抗体投与により抑制されることを示す図である
【図７Ａ】パラコート刺激によるケラチノサイトからのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ＳＯＤ）の効果を示す図である。
【図７Ｂ】パラコート刺激によるケラチノサイトからのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ビタミンＥ）の効果を示す図である。
【図７Ｃ】ＵＶ−Ｂ線照射によるケラチノサイトからのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ＳＯＤ）の効果を示す図である。
【図７Ｄ】ＵＶ−Ｂ線照射によるケラチノサイトからのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ビタミンＥ）の効果を示す図である。
【図８Ａ】パラコート刺激によるマイクログリア細胞からのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ＳＯＤ）の効果を示す図である。
【図８Ｂ】パラコート刺激によるマイクログリアからのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ビタミンＥ）の効果を示す図である。
【図９Ａ】パラコート刺激によるアストロサイトからのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ＳＯＤ）の効果を示す図である。
【図９Ｂ】パラコート刺激によるアストロサイトからのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ビタミンＥ）の効果を示す図である。
【図１０Ａ】パラコート刺激によるマクロファージからのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ＳＯＤ）の効果を示す図である。
【図１０Ｂ】パラコート刺激によるマクロファージからのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ビタミンＥ）の効果を示す図である。
【図１１Ａ】パラコート刺激による滑膜組織からのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ＳＯＤ）の効果を示す図である。
【図１１Ｂ】パラコート刺激による滑膜組織からのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤ビタミンＥ）の効果を示す図である。
【図１２Ａ】パラコート刺激による腎尿細管上皮細胞からのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ＳＯＤ）の効果を示す図である。
【図１２Ｂ】パラコート刺激による腎尿細管上皮細胞からのＩＬ−１８放出に対するスーパーオキシドの抑制剤（ビタミンＥ）の効果を示す図である。
【図１３Ａ】ＩＬ−１８投与により惹き起こされる血漿中ＡＣＴＨ濃度の変動を示す図。
【図１３Ｂ】ＩＬ−１８投与により惹き起こされる血漿中ＦＳＨ濃度の変動を示す図。
【図１３Ｃ】ＩＬ−１８投与により惹き起こされる血漿中ＬＨ濃度の変動を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、非炎症性ストレスにより誘導されるスーパーオキシドが介在する新規カスケード（ストレスカスケード）を見出し、かかる知見から非炎症性ストレスを可視化および管理することを可能ならしめたものである。【００２４】
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３８：  ９  （１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。【００２５】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：２、４、６、８または１０）で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。【００２６】
従って本明細書において「ＩＬ−１８タンパク質」または単に「ＩＬ−１８」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２）で示されるヒトＩＬ−１８やその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１５６２）に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−１８  や、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。【００２７】
また本明細書において「Ｐ３８ＭＡＰキナーゼタンパク質」または単に「Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号４）で示されるヒトＰ３８ＭＡＰキナーゼやその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿１３８９５７）に記載のアミノ酸配列を有するヒトＰ３８ＭＡＰキナーゼや、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。【００２８】
また本明細書において「カスパーゼ−１１タンパク質」または単に「カスパーゼ−１１」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号６）で示されるマウスカスパーゼ−１１やその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＭＭＣＡＳＰ１１）に記載のアミノ酸配列を有するマウスカスパーゼ−１１や、そのヒトホモログ、ラットホモログなどが包含される。【００２９】
また本明細書において「カスパーゼ−１タンパク質」または単に「カスパーゼ−１」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号８）で示されるヒトカスパーゼ−１やその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０３３２９２）に記載のアミノ酸配列を有するヒトカスパーゼ−１や、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。【００３０】
また本発明において「ＩＬ−６タンパク質」または単に「ＩＬ−６」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号１０）で示されるヒトＩＬ−６やその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０００６００）に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−６や、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。【００３１】
本発明における「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。【００３２】
また、本発明において、「生体防御系」とは、免疫系機能による防御系、神経・内分泌系機能による防御系、特に、大脳皮質−視床下部−下垂体−副腎皮質系と自律神経系による防御系、並びにサイトカインを介した神経、内分泌及び免疫系による宿主の防御系を指す。【００３３】
本明細書において「非炎症性ストレス」とは、感染、腫瘍などによる炎症性ストレスを除くストレスをいい、スーパーオキシドが介在する、いわゆる酸化ストレスをも含むものであり、以下、単に「ストレス」と省略する場合がある。非炎症性ストレスとしては、具体的には、高温、低温、高圧、低圧、騒音、放射線、紫外線などによる物理的ストレス、酸素欠乏、重金属、ヒ素などの有害化学物質による化学的ストレス、怒り、不安、恐怖、緊張、拘束などによる精神的ストレスが例示できるが、本発明においては物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスが好ましく、精神ストレスとしては拘束ストレスがより好ましく、特に長時間の拘束ストレスが好ましい。ここで、長時間とは生物や個体差により一概には言えないが、動物の場合で６時間以上が例示される。物理的ストレスとしては、紫外線照射によるストレスが好ましく、化学的ストレスとしては、有害化学物質曝露によるストレス、特にパラコート曝露によるストレスが好ましい。【００３４】
本明細書において「非炎症性ストレス応答」とは、非炎症性ストレスに曝された生体のストレスに対する生体内反応をいう。【００３５】
本明細書において「スーパーオキシド」とは、生体内で生じる活性酸素の一種をいい、スーパーオキシドアニオンまたはラジカルが代表的であり、体内でスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）により除去されたり、他の物質と反応することが知られているが、本発明ではスーパーオキシドの代謝産物を含めた意味で用いられる。【００３６】
本発明の「指標剤」とは、スーパーオキシドが介在する非炎症性ストレス応答の指標となるものであって、以下の知見に基づいて本発明者により初めて明らかにされた「非炎症性ストレスにおけるサイトカインカスケード（ストレスカスケードと称する）」の発見によって完成されたものである。【００３７】
動物に拘束ストレスを与えると、副腎では２４ｋＤのＩＬ−１８前駆体タンパク質を、および血漿中では１８ｋＤ成熟型のレベルを増加させる（図１）。このような増加は、ストレスによって血漿中の副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）が上昇した後に起こる。このことは、副腎中ではＩＬ−１８前駆体の誘導にＡＣＴＨが関与することを示す。これは、抗ＡＣＴＨ抗血清投与が成熟型および前駆体型ＩＬ−１８の両方のレベルの増加を阻害することと、ストレスにより誘導されたＡＣＴＨ放出がデキサメタゾンによって阻害され、それにより成熟型および前駆体型ＩＬ−１８も阻害されることの発見から支持される。これらの結果は、拘束ストレスがＡＣＴＨを誘導し、次に副腎中のＩＬ−１８前駆体を誘導することを示す。【００３８】
ストレス負荷された動物の副腎では、ＩＬ−１８前駆体タンパク質のみならず成熟型ＩＬ−１８も誘導され（図１Ｆ）、ストレスによって前駆体型から成熟型への変換が生じていることを示唆する。ＡＣＴＨによる副腎中のＩＬ−１８前駆体誘導を阻害すると、血漿中のＩＬ−１８レベルの抑制につながる。以上まとめると、ＡＣＴＨによって誘導される副腎中のＩＬ−１８前駆体は成熟型に変換されて血漿中に分泌されることが示唆される。ＩＬ−１８前駆体の成熟型への変換は、ストレス負荷された動物で血漿中の成熟ＩＬ−１８の蓄積における重要な制御過程である。【００３９】
カスパーゼ−１前駆体とその活性は、ＬＰＳによって副腎で誘導されることが報告されている。本発明では、カスパーゼ−１前駆体はストレスによっても副腎で誘導されることが示された（図２Ａ）。カスパーゼ−１阻害剤であるＹＶＡＤ−ＣＨＯは、血漿ＩＬ−１８の上昇を阻害する（図２Ｂ）が、副腎のＩＬ−１８前駆体誘導は阻害しない（図２Ｄ）。ストレス負荷したカスパーゼ−１ノックアウト（ＫＯ）動物では、ＩＬ−１８前駆体は副腎でアップレギュレートされるが、血漿ＩＬ−１８は検出不可能であった。これらの結果から、ストレスにより誘導されたカスパーゼ−１は、血漿中の成熟ＩＬ−１８の蓄積に関して副腎中のＩＬ−１８前駆体のプロセッシングを生じさせていることが示唆される。【００４０】
カスパーゼ−１１は、カスパーゼ−１を活性化させることが報告されている。本発明では、カスパーゼ−１１の阻害剤であるＺ−ＦＡ−ｆｍｋがストレスによって活性化されるカスパーゼ−１の活性化を阻害したことから、ストレス負荷動物のカスパーゼ−１活性化におけるカスパーゼ−１１の関与が示唆される。カスパーゼ−１１前駆体の誘導は、ＮＦ−κＢのトランス活性化を必要とすること、およびＰ３８ＭＡＰキナーゼがＮＦ−κＢのトランス活性化を媒介することが報告されている。さらに、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０がカスパーゼ−１１の誘導をダウンレギュレートすることが報告されている。【００４１】
本発明者は、前記ＳＢ２０３５８０がストレスにより誘導されたカスパーゼ−１１のタンパク質レベル（図３Ａ）、カスパーゼ−１活性（図３Ｂ）および血漿ＩＬ−１８レベル（図３Ｃ）それぞれの増加を阻害していることを発見した。カスパーゼ−１阻害剤ＹＶＡＤ−ＣＨＯとカスパーゼ−１１阻害剤Ｚ−ＦＡ−ｆｍｋは、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化に影響を与えることなく、血漿ＩＬ−１８レベルのストレスによって誘導される上昇を抑制する（図３Ｄおよび３Ｆ）。Ｐ３８ＭＡＰキナーゼタンパク質のストレスによって誘導されるリン酸化は、カスパーゼ−１ＫＯ動物でも野生型動物でも起こった（図３Ｃ）。これらの結果から、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼはカスパーゼ−１１の上流にあり、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ→カスパーゼ−１１→カスパーゼ−１カスケードを形成して、副腎でＩＬ−１８前駆体から成熟型への変換をもたらし、ストレス負荷動物で血漿中に活性型（成熟型）ＩＬ−１８を放出することが示唆される。【００４２】
活性酸素種は、肺の繊維芽細胞、好中球および単球においてＰ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化を媒介していることが報告されている。本発明においては、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）がＰ３８ＭＡＰキナーゼの活性化（図４Ａ）、カスパーゼ−１１の誘導、副腎でのカスパーゼ−１の活性化および血漿中のＩＬ−１８レベルの上昇（図４Ｂ，Ｃ，Ｄ）を阻害した。しかしながら、副腎でのＩＬ−１８前駆体の誘導はＳＯＤによって影響されなかった（図４Ｅ）。これらの結果より、ストレスがスーパーオキシドを誘導し、これがＰ３８ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化させることが示唆される。したがって、ストレス負荷動物における血漿中のＩＬ−１８が生成する過程は以下のようにまとめられる。ストレスが視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸を活性化してＡＣＴＨを誘導する。また、ストレスはスーパーオキシドを生成させ、これがＰ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）を誘導し、リン酸化されたＭＡＰキナーゼがカスパーゼ−１１を誘導し、カスパーゼ−１１が今度はカスパーゼ−１を活性化する。このように活性化されたカスパーゼ−１が副腎でＩＬ−１８前駆体をプロセッシングして成熟型にし、この成熟型が血漿中に分泌される。このような経路を「非炎症性ストレスにおけるサイトカインカスケード（ストレスカスケード）」と称する。【００４３】
ＩＬ−１８は、ＩＬ−６の誘導に必要なＴＬＲ２およびＭｙｄ８８を活性化させることから、ＩＬ−１８がＩＬ−６を誘導する可能性が示唆される。本発明者は、ストレス負荷した野生型動物で血漿中のＩＬ−６レベルが上昇するがＩＬ−１８ＫＯ動物では上昇しないことを見出した（図５Ａ）。このことは、ＩＬ−６がＩＬ−１８依存的に誘導されることを示唆する。これは、カスパーゼ−１阻害剤とＳＯＤで動物を処理すると血漿中のＩＬ−１８およびＩＬ−６のストレスによって誘導される上昇が阻害されたという結果、ならびにストレス負荷動物で抗ＩＬ−１８抗体がＩＬ−６レベルを抑制するという結果により支持される。このような結果は、非炎症性ストレスがＩＬ−１８依存的に血漿中のＩＬ−６レベルを上昇させるという最初の実証である。【００４４】
すなわち、本発明のスーパーオキシドが介在する非炎症性ストレス応答の指標剤は、非炎症性ストレスにおけるサイトカインカスケードに関与する成分を含有することを特徴とする。サイトカインカスケードに関与する成分は、ＩＬ−１８、活性型ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、リン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ１１、カスパーゼ１、活性化カスパーゼ１からなる群から選択される１または２以上のタンパク質を含有することが好ましく、ＩＬ−１８を含有することがさらに好ましい。前記ＩＬ−１８は、ヒトまたはマウスにおいては２４ｋＤ前駆体または１８ｋＤ成熟体（または活性型ともいう）タンパク質として存在するが、前記知見から、血中、より好ましくは血漿中に存在する活性型ＩＬ−１８であることが好ましい。前記活性型ＩＬ−１８は、ヒトの場合、配列番号２のアミノ酸配列において、３７〜１９３番目のアミノ酸配列を有するものが例示される。【００４５】
本発明の指標剤は、ＩＬ−１８に加えて、前記知見から、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼを含有することが好ましい。前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、リン酸化されたものであることがより好ましく、前記Ｐ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化部位は、マウスの場合Ｔｈｒ１８０またはＴｙｒ１８２であること、またはヒトの場合Ｔｈｒ１８５またはＴｙｒ１８７であることがさらに好ましい。【００４６】
本発明の指標剤は、ＩＬ−１８およびＰ３８ＭＡＰキナーゼに加えて、前記知見から、カスパーゼ−１１を含有することが好ましい。【００４７】
本発明の指標剤は、ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼおよびカスパーゼ−１１に加えて、前記知見から、カスパーゼ−１を含有することが好ましい。前記カスパーゼ−１は、プロカスパーゼ−１であっても活性化カスパーゼ−１（成熟体）であってもよいが、ＩＬ−１８前駆体のプロセッシングを生じさせることから、活性化カスパーゼ−１が好ましい。前記活性化カスパーゼ−１は、ヒトの場合、配列番号８のアミノ酸配列において、１２０〜４０４番目のアミノ酸配列を有するものが例示される。【００４８】
本発明の指標剤は、少なくともＩＬ−１８を含有していれば、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１およびカスパーゼ−１の１種または２種以上を含有するものであってもよいが、指標剤を構成する前記サイトカインおよび酵素は、別々の容器に格納されていることが好ましい。また、本発明の指標剤は、前記サイトカインおよび酵素を主成分とする限り、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、緩衝液、生理食塩水等の溶媒、安定化剤、静菌剤、防腐剤などがあげられるが、これに限定されるものではない。【００４９】
本発明の指標剤は、非炎症性ストレス、好ましくは物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスおよび酸化ストレス、より好ましくは紫外線照射によるストレス、化学物質暴露によるストレス、拘束ストレスおよびこれらに起因する酸化ストレス、特に好ましくは拘束ストレスに動物が曝され、応答していることの指標となるものである。特に動物の血中、好ましくは血漿中の活性型ＩＬ−１８を指標とすることにより、ストレスの程度を容易かつ定量的に知ることができる。血漿中のＩＬ−１８の量は、例えばマウスの場合、ストレス負荷前は１００ｐｇ／ｍｌ以下であったものが１時間のストレス負荷の後５時間での値が１２０〜２００ｐｇ／ｍｌ、６時間のストレス負荷後には１０００ｐｇ／ｍｌを超える値となり、ストレスの負荷が増すにつれてＩＬ−１８の量も増加する。さらに、ＩＬ−１８の半減期は、約１０時間であることからも、ＩＬ−１８を含有する指標剤が非炎症性ストレス応答の指標として好適である。ＩＬ−１８に加え、副腎中のＰ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化の上昇、カスパーゼ−１１の量の増大またはカスパーゼ−１の活性の上昇も非炎症性ストレス応答の指標となる。具体的には、本発明の指標剤に含まれるＩＬ−１８の濃度を正常値から弱いストレスないしは強いストレスの場合の濃度までのものを準備し、検体と比較できるようにしておくことが好ましい。【００５０】
また、本発明の指標剤は、ＩＬ−１８を始めとするストレスカスケードに関与する成分を含むことから、これらの成分および活性を減少させる物質のスクリーニングに利用することができる。本発明の指標剤を用いるスクリーニング方法としては特に限定されるものではないが、例えば、ストレス負荷した動物に種々の物質を投与し、血中の活性型ＩＬ−１８の量を有意に減少させる物質を選択する方法があげられる。かかるスクリーニング方法によって選別された物質は、ストレスを管理可能な医薬品または保健機能食品の有効成分として使用することができる。【００５１】
本発明の非炎症性ストレス応答の可視化剤は、前記指標剤を検出するためのものである。したがって、本発明の可視化剤は、ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１およびカスパーゼ−１の少なくとも１種または２種以上を検出するものであれば特に制限されるものではなく、前記サイトカインまたは酵素に特異的に結合する各種化合物、前記酵素の特異的基質を含有するものがあげられる。【００５２】
本発明の可視化剤は、ＩＬ−１８を検出するためには、ＩＬ−１８抗体を含有することが好ましく、前記ＩＬ−１８抗体は活性型ＩＬ−１８を特異的に認識するものであることがより好ましい。【００５３】
本発明の可視化剤は、ＩＬ−１８抗体に加え、さらにＰ３８ＭＡＰキナーゼ抗体を含有することが好ましく、当該Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体は、抗リン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体であることがより好ましい。前記抗リン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体は、マウスの場合リン酸化Ｔｈｒ１８０またはＴｙｒ１８２を有するＰ３８ＭＡＰキナーゼを認識するものであり、ヒトの場合リン酸化Ｔｈｒ１８５またはＴｙｒ１８７を有するＰ３８ＭＡＰキナーゼを認識するものであることがより好ましい。【００５４】
本発明の可視化剤は、ＩＬ−１８抗体およびＰ３８ＭＡＰキナーゼ抗体に加え、さらにカスパーゼ−１１抗体を含有することが好ましい。【００５５】
本発明の可視化剤は、ＩＬ−１８抗体、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体およびカスパーゼ−１１に加え、さらにカスパーゼ−１抗体を含有することが好ましい。前記カスパーゼ−１抗体は、活性化カスパーゼ−１を特異的に認識するものであることがより好ましい。【００５６】
本発明の可視化剤は、ＩＬ−１８抗体、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体およびカスパーゼ−１１に加え、さらにカスパーゼ−１活性を測定可能な基質を含有することが好ましい。前記基質は、検出を容易にするため、酵素で切断されると蛍光を発するものであることがより好ましい。このような基質としては、例えば、実施例に記載されているＡｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡがあげられる。【００５７】
本発明の可視化剤は、少なくともＩＬ−１８抗体を含有しているものが好ましく、さらにＰ３８ＭＡＰキナーゼ抗体、カスパーゼ−１１抗体、カスパーゼ−１抗体およびカスパーゼ−１基質の１種または２種以上を含有するものであってもよいが、可視化剤を構成する前記抗体または基質は、別々の容器に格納されていることが好ましい。また、本発明の可視化剤は、前記抗体または基質を主成分とする限り、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、緩衝液、生理食塩水等の溶媒、安定化剤、静菌剤、防腐剤などがあげられるが、これに限定されるものではない。【００５８】
前記抗体または基質は、被験者における前記指標剤の有無またはその程度を検出することによって、該被験者が非炎症性ストレスに曝されているか否かまたはそのストレス応答の程度を測定することのできるツール（ストレスマーカー）として有用である。【００５９】
また前記抗体は、後述する非炎症性ストレスに基づく免疫状態の変動の予防、改善または予想において、ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１およびカスパーゼ−１のいずれかの発現変動を検出するためのツール（ストレスマーカー）としても有用である。【００６０】
前記抗体は、その形態に特に制限はなく、ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１およびカスパーゼ−１のいずれかを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらにこれらタンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。【００６１】
これらの抗体の製造方法は、公知であり、前記抗体も常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１．１２〜１１．１３（２０００））。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１を用いて、あるいは常法に従ってこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１もしくはカスパーゼ−１、またはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。【００６２】
抗体の作製に免疫抗原として使用され、かつ本発明の指標剤に含まれるＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１、３、５、７）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８３），  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ＤＭ．  Ｇｌｏｖｅｒ，  ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ  （１９８５））などに準じて行うことができる。【００６３】
具体的には、ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これらＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１の部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号２、４、６、８）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。抗リン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体を製造するためには、リン酸化されたＴｈｒまたはＴｙｒを含むペプチドを合成すればよい。【００６４】
本発明の非炎症性ストレスの程度を測定する方法は、本発明の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする。指標剤としては、ＩＬ−１８が好ましく、活性型ＩＬ−１８がさらに好ましい。【００６５】
上記方法において「非炎症性ストレス」としては、好ましくは物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスおよび酸化ストレス、より好ましくは、紫外線照射によるストレス、化学物質暴露によるストレス、拘束ストレス、およびこれらに起因する酸化ストレス、特に好ましくは拘束ストレスを挙げることができる。【００６６】
本方法の測定対象としては、動物から採取された血液、体液、組織、細胞、排泄物またはそれらの抽出物や、培養細胞から得られる細胞抽出液（抽出物）、細胞培養液等を挙げることができるが、動物から採取した血液や、培養細胞の培養液が好ましい。前記動物としては、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスター、ニワトリ等を挙げることができる。前記培養細胞としては、ＩＬ−１８を産生する能力を有する細胞が好ましく、例えば、滑膜細胞、腎尿細管上皮細胞、マイクログリア、アストロサイト、マクロファージ、ケラチノサイト等を挙げることができる。【００６７】
上記方法において、指標剤の検出、定量等は、従来公知の方法がいずれも使用可能であるが、本発明の可視化剤を用いることが好ましく、これら可視化剤を用いて、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット解析法等およびこれに準ずる方法に従い行うことができる。前記可視化剤は、ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１に特異的に結合する性質を有することから、動物の組織内に発現した前記サイトカインまたは酵素を特異的に検出することができる。【００６８】
上記方法は、例えば、ＩＬ−１８を指標とする場合、血中または血漿中に放出された活性型ＩＬ−１８を検出すればよいので、測定が容易である。前述したように、血漿中のＩＬ−１８の量は、例えばマウスの場合、ストレス負荷前は１００ｐｇ／ｍｌ以下であったものが１時間のストレス負荷の後５時間での値が１２０〜２００ｐｇ／ｍｌ、６時間のストレス負荷後には１０００ｐｇ／ｍｌを超える値となり、ストレスの負荷が増すにつれてＩＬ−１８の量も増加する。さらに、ＩＬ−１８の半減期は、約１０時間であることからも、ＩＬ−１８を含有する指標剤が非炎症性ストレス応答の指標として好適である。動物の代わりに培養細胞を用いて、培地（または培養液）中に放出されたＩＬ−１８を検出、定量してもよい。【００６９】
また、カスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１の場合、前記した基質との反応により生じた生成物を検出することによっても、ストレスの程度を測定することができる。具体的には、例えば、切断されると蛍光を発するようにしたカスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１の基質を動物に投与し、副腎中で切断されて血中に放出された蛍光を検出することができる。動物の代わりに培養細胞を用いた場合には、細胞抽出液中の蛍光を検出、定量することができる。検出された蛍光の強度から前記酵素活性の上昇の程度がわかり、あらかじめ決定しておいた基準値と比較することにより、非炎症性ストレスの程度を測定することができる。あるいは、上記抗体に蛍光剤、放射性分子または金属を結合させたものを動物に投与し、副腎での蛍光、放射性分子または金属の蓄積をＣＴ（ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＭＲＩ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）またはＳＰＥＣＴ（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）などを用いて調べ、ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１を検出することができる。検出された蓄積量からこれらストレス応答指標剤の各成分の有無またはその量の多少がわかり、あらかじめ決定しておいた基準値と比較することにより、検体におけるストレスの程度を測定することができる。【００７０】
本発明によれば、上記可視化剤を含む非炎症性ストレスの測定キットが提供される。【００７１】
本発明のキットに含まれる可視化剤としては、ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１およびカスパーゼ−１の少なくとも１種または２種以上を検出するものであれば特に制限されるものではなく、前記サイトカインまたは酵素に特異的に結合する各種化合物、前記酵素の特異的基質を含有するものを挙げることができるが、ＩＬ−１８抗体を含有することが好ましく、前記ＩＬ−１８抗体は活性型ＩＬ−１８を特異的に認識するものであることがより好ましい。本発明のキットによれば、測定対象の非炎症性ストレスの程度を簡便かつ迅速に測定することが可能となる。また、本発明の測定キットには、本発明の可視化剤のほか、測定、検出を実施するに際して必要な任意の他の試薬を更に包含することができる。具体的には、例えば、蛍光標識したＩＬ−１８や活性型ＩＬ−１８、アッセイ緩衝液等を例示することができる。【００７２】
上記キットにおいて「非炎症性ストレス」としては、好ましくは物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスおよび酸化ストレス、より好ましくは、紫外線照射によるストレス、化学物質暴露によるストレス、拘束ストレス、およびこれらに起因する酸化ストレス、特に好ましくは拘束ストレスを挙げることができる。【００７３】
非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動の診断に際しては、動物の種類に応じて血中のＩＬ−１８の正常値（対照値）を決定しておき、診断対象の血中のＩＬ−１８の量を測定して正常値と比較して判定することが好ましい。測定値が正常値（対照値）と比べて有意に高い場合、免疫状態の変動が起きていると判断することができる。【００７４】
本発明においては、スーパーオキシドが介在する非炎症性ストレス応答が免疫状態の変動を起こしていることから、前記測定方法、測定キットにおいて、または下記予防、改善または予想方法において、スーパーオキシドによりもたらされる血液、髄液、尿または唾液中の過酸化物をさらに測定することが好ましい。【００７５】
前記過酸化物としては、特に限定されるものではないが、脂質の過酸化反応によって生成するアクロレイン、４−ヒドロキシノネナール、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシ−２−ヘキセナール、クロトンアルデヒド等の過酸化脂質、メチルグリオキザール等の過酸化糖質、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン等の酸化塩基があげられる。過酸化物の有意な上昇と本発明による指標剤の有意な上昇とが確認された場合、動物が免疫状態の変動を起こしていることの有力な証拠となり、好ましい。【００７６】
前記可視化剤のうち、抗体を含有する可視化剤は、動物に適用することによって、非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動を予防、改善または予想することができ、本発明はかかる方法を提供する。【００７７】
前記動物は、ヒトを除く脊椎動物であることが好ましく、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、ネコ等の家畜または愛玩動物が好ましい。本発明の予防、改善または予想方法を家畜または愛玩動物に適用することによって、人工的に飼育することがストレスを負荷することにつながりやすい畜産またはペット産業の分野において、動物の免疫状態を良好に維持し、病気に罹りにくい動物を飼育できるという効果を発揮する。【００７８】
本発明は、前記指標剤の量または活性を低減させるための非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態変動の治療剤を提供する。【００７９】
本発明の治療剤は、前記指標剤の量または活性を低減させるためのものである。したがって、本発明の治療剤は、ＩＬ−１８、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１およびカスパーゼ−１の少なくとも１種または２種以上の量または活性を低減させるものであれば特に制限されるものではなく、前記サイトカインまたは酵素に特異的に結合する各種化合物またはスーパーオキシドの抑制剤（抗酸化物質、抗酸化剤ともいう。）を有効成分として含有するものがあげられる。【００８０】
前記化合物としては、前記各種抗体があげられ、好ましくはＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ−１８受容体抗体であり、より好ましくは活性型ＩＬ−１８に特異的に結合する抗体である。【００８１】
前記スーパーオキシドの抑制剤としては、チオール化合物、抗酸化ペプチド・アミノ酸、植物由来の各種ポリフェノール、大豆レシチン、コレステロール、クロロフィル、ハーブ抽出物（例えば、Ｃａｒｎｏｓｏｌ）、ワサビ抽出物、スルフォラファン（ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ）およびその誘導体アナログ、イソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）およびその誘導体アナログ、６−（ｍｅｔｈｔｈｙｌｓｕｆｉｎｙｌ）ｈｅｘｙｌ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、カロチノイド、ビタミンＢ２、ビタミンＥ、亜鉛、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼ、クルクミン、ゴマリグニン、ビタミンＣ（アスコルビン酸誘導体を含む）、カロテン類（例えば、β−カロチン、リコピン）、キサントフィル類（例えば、アスタキサンチン）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、コエンザイムＱ１０、ピクノジェノール、オレイン酸、リノール酸などの食品成分、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）、ミエロパーオキシダーゼ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼ抗体などの酵素由来成分、インスリン、エストロゲン、メラトニン、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）などのホルモン、脳保護剤（例えば、エダラボン（商品名））、ＤＥＴＡ  ＮＯＮＯａｔｅ（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ  ＮＯＮＯａｔｅ）などのＮＯ（一酸化窒素）供与化合物などがあげられる。また、二次的な抑制剤として、キナクリンなどのフォスフォリパーゼ抑制剤、インドメタシンなどのアラキドン酸遊離抑制剤、プロブコールなどの高脂血症治療薬、ＡＴ１ブロッカー、ＡＣＥインヒビターなどの経口血糖降下剤、マイナートランキライザーなどの精神安定剤が挙げられ、好ましくはＳＯＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０であり、より好ましくはＳＯＤまたはビタミンＥである。【００８２】
本発明の治療剤は、前記有効成分そのままであってもよく、公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製したものであってもよく、当該医薬組成物は、目的に応じて各種の形態、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤等に調製してもよい。【００８３】
上記担体としては、例えば乳糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロピルアルコール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、カルメロースカルシウム、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用することができる。【００８４】
さらに錠剤については、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶性被包錠、フィルムコーティング錠あるいは二層錠、多層錠とすることができる。【００８５】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として従来この分野で公知のものを広く使用できる。その例としては、例えば結晶セルロース、乳糖、デンプン、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤、カルメロースカルシウム、カンテン等の崩壊剤等が挙げられる。【００８６】
カプセル剤は、常法に従い通常有効成分化合物を上記で例示した各種の担体と混合して、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。【００８７】
注射剤として調製する場合、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているもの、例えば水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。この場合等張性の溶液を調製するのに必要な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。【００８８】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用することができる。その例としては、例えば半合成グリセライド、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。【００８９】
さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有させることもできる。本発明のこれらの医薬製剤中に含有されるべき有効成分化合物の量は、特に限定されずに広範囲から適宜選択されるが、通常製剤組成物中に約１〜７０重量％、好ましくは約５〜５０重量％とするのがよい。【００９０】
本発明のこれら医薬製剤の投与方法は特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の程度およびその他の条件に応じた方法で経口投与または非経口投与することができる。例えば、錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には、経口投与され、注射剤の場合は、単独でまたはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、さらに必要に応じて単独で筋肉内、皮下もしくは腹腔内投与される。
坐剤の場合は直腸内投与される。【００９１】
また、投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。【００９２】
治療目的である疾患（非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患）または状態は、スーパーオキシドが介在する非炎症性ストレス応答により生じた免疫変動に基づくものであれば特に限定されるものではなく、これにはＩＬ−１８およびＩＬ−１８が誘導するサイトカイン群が関与して発症、悪化、または再発する疾患も含まれる。具体的には、自己免疫疾患、自己免疫疾患の悪化もしくは再発、精神的疾患、悪性腫瘍などを挙げることができる。【００９３】
具体的な非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患としては、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、（気管支）喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、肺水腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆、びまん性レビー小体病、ピック症、ビンスワンガー病、パーキンソン氏病、パーキンソン症候群、脳虚血、脳虚血・再還流性障害、新生児出血性脳症、てんかん、ＨＩＶ脳症、脳循環障害、脳血管障害、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、関節リウマチ、関節炎、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ホジキン病、肝硬変、腎不全、アレルギー性喘息、腎炎、心筋梗塞、シェーグレン症候群、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鬱病、摂食障害、異食症、味覚障害、尋常性坐瘡、天疱瘡、魚鱗癬、乾癬、熱傷、光線過敏症、紫外線皮膚障害、創傷治癒、または放射性障害、一酸化炭素中毒、シンナー中毒、低酸素症もしくはそれらの二次性障害、子宮内膜症、副腎機能異常、月経異常、心筋症、心身症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、精子減少、性欲低下、下垂体機能低下症、下垂体機能異常症などがあげられる。【００９４】
前記自己免疫疾患または精神的疾患としては、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ホジキン病、ＳＬＥ、肝硬変、腎不全、アレルギー性喘息、腎炎、心筋梗塞、シェーグレン症候群、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鬱病、摂食障害、異食症、味覚障害、尋常性坐瘡、天疱瘡、魚鱗癬、乾癬、熱傷、光線過敏症、紫外線皮膚障害、または放射性障害、一酸化炭素中毒、低酸素症もしくはそれらの二次性障害などがあげられる。【００９５】
悪性腫瘍としては、急性白血病、慢性白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症などの造血器腫瘍の他、大腸癌、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫などの固形腫瘍を挙げることができる。【００９６】
血中においてＩＬ−１８が上昇すると、それに引き続いて各種のサイトカインが放出される。なかでもＩＬ−６は、数多くの炎症性疾患に関与し増悪因子として注目されている。全身性にこれらのサイトカインが上昇することで引き起こされるあるいは増悪することが知られている疾患としては、上記した疾患群のなかでも、虫垂炎、腹膜炎、膵炎、潰瘍性・偽膜性・急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、皮膚炎、皮膚筋炎、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、骨髄炎、筋膜炎、リウマチ熱、髄膜炎、脳炎、パジェット病、痛風、歯周病、甲状腺炎、神経炎、ブドウ膜炎、Ｉ型糖尿病、胃潰瘍、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍などの炎症性メカニズムが関与する疾患の他、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、ギランバレー症候群、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、気管支喘息、免疫複合体疾患、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、関節リウマチ、結節性動脈周囲炎、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、悪性異常高熱症、習慣性流産、子宮内膜症などサイトカインや自己免疫機構の関与が知られる疾患、さらに枯草熱、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞などの感染症、加えて、病態が完全に明らかにはなっていないが上記サイトカインの関与が示されているアカラシア、ホイップル病、火傷、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳卒中、痛風、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、甲状腺炎、バーガー病、ＩＩ型糖尿病、肥満、ライター症候群、ホジキン病、肝硬変、腎不全、心筋梗塞、シェーグレン症候群、鬱病、摂食障害、異食症、味覚障害などがあげられる。【００９７】
ＩＬ−１８およびそれによって放出されるサイトカイン群が関与して発症、悪化、または再発する他の疾患・状態としては、神経・内分泌系の制御異常である日周リズム異常、食欲異常、アジソン病や末端肥大症、性腺発達障害などの下垂体機能異常症、甲状腺機能異常症、肥満、血糖制御異常、二次的には原発性アルドステロン症、クッシング病や、関節リウマチ、痛風および関節炎などの関節の炎症を病態の中核とする疾患の寒冷や精神的ストレス、睡眠不足、血流障害、物理的重量の負荷等の非炎症性ストレスによる発症、再発または増悪、感染や毒物、腎尿細管を傷害するシスプラチン・カルボプラチン等の抗癌剤による、あるいは特発性の機序による腎尿細管上皮細胞の脱落を挙げることができる。【００９８】
本発明の治療剤は上記いずれの疾患の治療、改善に有効と考えられるが、自己免疫疾患、皮膚病、中枢神経系疾患、下垂体機能障害に起因する諸疾患等にさらに有効であり、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、多発性硬化症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、乾癬、脳虚血、脳変性、脳炎、関節リウマチ、月経異常、子宮内膜症、性欲低下などにさらに有効であり、ループス腎炎に特に有効である。【００９９】
さらに、本発明によれば、上記指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質、または酸化ストレスに対する抑制効若しくは防止効果を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。本発明の方法によれば、非炎症性ストレスが直接的または間接的に関与する疾患に対する治療、改善または予防効果を有する物質のスクリーニングを大量、迅速かつ簡便に行うことができる。かかる方法によりスクリーニングされた物質は、非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患に対する治療薬、改善薬または予防薬として有効である。また、本スクリーニング方法によれば、酸化ストレスに対する抑制効果または防止効果を有する物質をスクリーニングすることができる。非炎症性ストレスにおけるサイトカインカスケード上流にスーパーオキシドが介在しているため、本スクリーニング方法によれば、酸化ストレスに対する抑制効果または防止効果を有する物質を、前述の指標剤を指標にしてスクリーニングすることができ、かかる物質を有効成分とする医薬品ならびに保健機能食品（特定保健用食品および栄養機能食品）の開発に役立つ。【０１００】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には例えば以下の工程、
１）培養細胞を被検物質存在条件下で培養する、または、動物を被検物質投与条件下で飼育する工程、
２）前記培養細胞または前記動物から調製した検体中の指標剤を定量する工程、および、
３）被検物質存在条件下または被検物質投与条件下における指標剤の量を被検物質非存在条件下または被検物質非投与条件下における指標剤の量と比較し、有意に指標剤の量を減少または増加させた前記被検物質を、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質と判定する工程、または酸化ストレスに対する抑制効果若しくは防止効果を有する物質と判定する工程、を含む。【０１０１】
本スクリーニング方法で使用される動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、ニワトリ等を挙げることができるが、操作が容易である点で、特にマウスやラットが好ましい。また、非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患のモデル動物、トランスジェニック動物を用いてもよい。使用される前記培養細胞としては、サイトカインを産生する能力を有する細胞、特に、ＩＬ−１８を産生する能力を有する細胞が好ましく、例えば、滑膜細胞、腎尿細管上皮細胞、マイクログリア、アストロサイト、マクロファージ、ケラチノサイト、腸管腺細胞等を挙げることができる。【０１０２】
また、動物および培養細胞は、非炎症性ストレスを予め負荷しているもの、負荷していないものいずれを用いてもよい。例えば、非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患に対する治療効果および改善効果を有する物質をスクリーニングする場合には、あらかじめ培養細胞または動物に非炎症性ストレスを負荷し、その後被検物質を投与等してもよい。一方、前記疾患に対する予防効果を有する物質をスクリーニングする場合には、培養細胞または動物に非炎症性ストレスを負荷する前に被検物質を投与等してもよい。ここで、非炎症性ストレスとしては、物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスおよび酸化ストレスが好ましく、紫外線照射ストレス、化学物質暴露ストレスまたは拘束ストレスおよびこれらに起因する酸化ストレスがさらに好ましく、拘束ストレスが特に好ましい。【０１０３】
前記被検物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、合成化合物、細胞や植物の抽出物等を挙げることができ、これらは、新規物質であっても、公知物質であってもよい。酸化ストレスに対する抑制効果または防止効果を有する物質をスクリーニングする場合の被検物質としては、例えば、各種ビタミン類、チオール化合物、植物由来の各種ポリフェノール、抗酸化ペプチド・アミノ酸類、高脂血症治療薬として用いられるプロブコール、降圧剤として用いられるカプトプリルや前述のスーパーオキシド抑制剤を挙げることができる。【０１０４】
培養細胞または動物から調製した検体としては、細胞培養液、細胞抽出液、あるいは動物から採取された血液、体液、組織、細胞、排泄物またはそれらの抽出物等を挙げることができるが、前記動物から採取した血液または前記培養細胞の培養液を用いることが好ましい。【０１０５】
前記指標剤としては、ＩＬ−１８、活性型ＩＬ−１８が好ましく、特に活性型ＩＬ−１８が好ましい。検体中の指標剤の定量は、従来公知の方法がいずれも使用できるが、本発明の可視化剤を用いることが好ましく、これら可視化剤を用いて、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット解析法等およびこれに準ずる方法に従い行うことができる。【０１０６】
上記非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患としては、前述の自己免疫疾患、皮膚病、種々の感染症、精神的疾患、循環器系疾患、下垂体機能障害に起因する諸疾患、悪性腫瘍等を挙げることができるが、本スクリーニング方法は、好ましくは自己免疫疾患、皮膚病、虚血性疾患、精神的疾患、循環器系疾患、下垂体機能障害に起因する諸疾患、さらに好ましくは、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、脳虚血、脳変性、脳炎、関節リウマチ、多発性硬化症、気管支喘息、心筋症、月経異常、子宮内膜症、性欲低下、特に好ましくはループス腎炎、に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質をスクリーニングする場合に好適に用いることができる。【０１０７】
培養細胞としてケラチノサイトを使用した場合、紫外線などによる皮膚障害、アトピー性皮膚炎、乾癬、尋常性挫創、天疱瘡、魚鱗癬、光線過敏症のほか、皮膚における炎症性変化を病態に含む熱傷、放射線皮膚障害、創傷治癒などの疾患に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる。【０１０８】
培養細胞としてマイクログリアやアストロサイトを使用した場合、脳の炎症、神経細胞の脱落、脳機能異常、たとえば、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆、びまん性レビー小体病、ピック病、ビンスワンガー病、パーキンソン氏病、パーキンソン症候群、脳虚血、脳虚血・再還流性障害、一酸化炭素中毒、シンナー中毒、新生児出血性脳症、低酸素脳症、高血圧性脳症、てんかん、多発性硬化症、ＨＩＶ脳症、脳循環障害、脳血管障害などの疾患に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質や、日周リズム異常、食欲異常、アジソン病や末端肥大症や性腺発達障害などの下垂体機能異常症、甲状腺機能異常症、肥満、血糖制御異常、二次的には原発性アルドステロン症、クッシング病などの副腎機能異常症、さらに消化管運動の制御や骨形成の異常などに対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる。【０１０９】
培養細胞としてマクロファージを使用した場合、例えば、非炎症ストレスが関与してマクロファージ、ＩＬ−１８が介在するあらゆる炎症性疾患と自己免疫性疾患、生体防御系の調節異常に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる。【０１１０】
滑膜細胞を用いた場合には、関節リウマチや痛風や関節炎などの関節の炎症を病態の中核とする疾患が寒冷や精神的ストレス、睡眠不足や血流障害、物理的重量の負荷などの非炎症性ストレスによって発症・再発・増悪に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる。【０１１１】
腎尿細管上皮細胞を用いた場合には、感染や毒物、腎尿細管を傷害するシスプラチン・カルボプラチンなどの抗ガン剤によって、あるいは特発性の機序をもって腎尿細管上皮細胞の脱落、炎症を病態の中核とする疾患の発症、増悪に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる。【０１１２】
本スクリーニング方法は、例えば以下のように行われる。【０１１３】
培養細胞を用いる場合には、ストレス状態にある培養細胞を被検物質存在条件下で培養し、細胞から培養液中に放出されたＩＬ−１８を本発明の可視化剤を用いて検出、定量し、被検物質存在条件下におけるＩＬ−１８の放出量を被検物質非存在条件下におけるＩＬ−１８の放出量と比較し、有意にＩＬ−１８の放出量を減少または増加させた前記被検物質を非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質と判定することにより行う。動物を用いる場合には、ストレス状態にある動物を被検物質投与条件下で飼育し、前記動物の血液中に含まれるＩＬ−１８の濃度を測定し、これを被検物質非投与条件下で飼育した場合のＩＬ−１８の血中濃度と比較し、有意にＩＬ−１８の血中濃度を減少または増加させた前記被検物質を非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質と判定することにより行う。
【実施例】
【０１１４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。【０１１５】
［動物］
雄性Ｃ５７Ｂ６マウスは、Ｓｅａｃ  Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉより購入した。ＩＬ−１８ノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｃ５７／Ｂ６バックグランド、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ８，  ３８３−３９０  （１９９８））およびカスパーゼ−１ノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｂａｌｂ／Ｃバックグランド、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２６７，  ２０００−２００３  （１９９５））は、それぞれ竹田博士および杭田博士より供与された。ＭＲＬ／ＭｐＪＵｍｍＣｒｊ−ｌｐｒ／ｌｐｒ（ＭＲＬ／ｌｐｒ）マウスは、日本チャールスリバー株式会社より購入した。マウスは、２０℃でケージ当たり１匹格納された。マウスを用いる実験は、１０時に開始した。【０１１６】
［試薬］
抗ＡＣＴＨ抗血清はＰｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ（ドイツ）製、抗マウスＩＬ−１８モノクローナル抗体はＭＢＬ（日本）製、抗マウスカスパーゼ−１抗体（ｓｃ−５１５）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（米国）製、抗マウス／ラットカスパーゼ−１１抗体はＢＩＯＭＯＬ（米国）製、および抗リン酸化（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国）製を使用した。抗マウスＩＬ−６ポリクローナル抗体は、ケミコン社製を使用した。抗マウスＩＬ−１８受容体抗体は、常法にしたがって、マウスＩＬ−１８受容体の膜貫通領域直近の親水性領域の部分ペプチド（２０アミノ酸）を合成し、ウサギに免疫し、得られた抗血清を使用した。【０１１７】
合成ＡＣＴＨ（１−２４アミノ酸）は、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（米国）より購入した。Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯおよびＡｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡは、ペプチド研究所より購入した。Ｚ−ＦＡ−ｆｍｋ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２１１５３−２１１５７（２０００））はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  （米国）より、ＳＢ２０３５８０はＢＩＯＭＯＬリサーチ研究所よりそれぞれ購入した。ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼ阻害剤およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）−１は、シグマ（米国）から購入した。【０１１８】
［拘束ストレス］
拘束ストレスとして、マウスを拘束器（２７ｍｍの直径の丸型プラスチックチューブ）中に１、３または６時間置き、ＩＬ−１８レベルを測定した。ＩＬ−６の分析に関しては、マウスを前述のように拘束し、次いで元のケージに６時間収容した後に測定した。【０１１９】
［サイトカインのアッセイ］
拘束後、マウスをジエチルエーテルで麻酔し、血液をＥＤＴＡ含有チューブに採血した。血漿は、４℃、１００００×ｇで１０分間遠心分離により分離し、−８０℃で保存した。ＩＬ−１８およびＩＬ−６は、それぞれＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）およびＯｐｔＥＩＡＴＭ  （ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いるＥＬＩＳＡで分析した。【０１２０】
［統計学的分析］
すべての実験データは、３回以上の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．として示した。異なる処理間の統計学的比較は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により行った。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意であると見なした。図に表された符号は、以下の通りである。
＊；対照に対してＰ＜０．０５
＊＊；対照に対してＰ＜０．０１
＊＊＊；対照に対してＰ＜０．００１
＃；ストレス負荷に対してＰ＜０．０１（ｎ＝４−９）
ストレス負荷に対してＰ＜０．０５（ｎ＝４−９）（図４の場合）
野生型に対してＰ＜０．０５（図５の場合）
＃＃；ストレス負荷に対してＰ＜０．００１（ｎ＝４−９）
ストレス負荷に対してＰ＜０．０１（ｎ＝４−９）（図４の場合）
野生型に対してＰ＜０．０１（図５の場合）
＋；ストレス負荷した野生型に対してＰ＜０．０１（ｎ＝６）。【０１２１】
［実施例１］
拘束ストレスマウスにおける血漿ＩＬ−１８タンパク質レベルの測定
抗ＡＣＴＨ抗血清（５０μｌ、１：１）、デキサメタゾン（１ｎｇ／５０μｌＰＢＳ（−））または抗ＩＬ−１８抗体（５０μｌ、１：１）をマウスの腹腔内に投与し、１０分経過後、拘束チューブ中に６時間置いた。合成ＡＣＴＨ（２５０μｇ／５０μｌＰＢＳ（−））を左肢に注入し、６時間経過後マウスを実験に供した。結果を図１に示す。【０１２２】
（１）血漿中のＡＣＴＨレベルの上昇は、血漿中のＩＬ−１８レベルの増加に先行する
図１Ａより、拘束ストレスに曝されたマウスの血漿中のＩＬ−１８レベルは、４３±３４．３ｐｇ／ｍｌ（ストレス負荷前）、３３０±６４．３ｐｇ／ｍｌ（ストレス負荷後３時間）および１０５９±３０．０２２ｐｇ／ｍｌ（ストレス負荷後６時間）であった。血漿中のＡＣＴＨは、ＩＬ−１８よりも迅速に増加し、ストレス負荷後１時間以内に約５００ｐｇ／ｍｌに到達したが、３時間で元のレベルに減少した。このことより、血漿中のＡＣＴＨレベルの上昇は、血漿中のＩＬ−１８レベルの増加に先行していることがわかる。なお、血漿中のＡＣＴＨレベルの上昇は、視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸の活性化を表している。【０１２３】
（２）ＡＣＴＨが血漿ＩＬ−１８のストレス誘導的上昇に関与する
ＡＣＴＨは、ＩＬ−１８ｍＲＮＡの副腎特異的発現を引き起こすことが知られている。よって、ＡＣＴＨが血漿ＩＬ−１８のストレス誘導的上昇に関与するかどうかについて調べた。マウスを抗ＡＣＴＨ抗血清またはデキサメタゾンで処置し、血漿中または副腎中のＩＬ−１８レベルを分析した。図１Ｂおよび図１Ｃより、抗ＡＣＴＨ抗血清およびデキサメタゾンは、血漿中（図１Ｂ）および副腎（図１Ｃ）においてストレスにより誘導されたＩＬ−１８レベルの増加を阻害することがわかった。片方の副腎を摘出したマウスでは、ストレス後のＩＬ−１８レベルは擬似操作したマウスよりも低かった。これらの結果から、ストレスにより誘導されたＡＣＴＨによって血漿および副腎中のＩＬ−１８レベルの上昇が引き起こされることが示唆された。【０１２４】
（３）ＡＣＴＨは、まず副腎中のＩＬ−１８タンパク質レベルに影響を及ぼす
ＡＣＴＨを投与すると、血漿中のＩＬ−１８レベルが上昇するが、ストレス負荷の場合よりも程度が低い（図１Ｄ）。副腎中のＩＬ−１８レベルは、ストレス負荷の場合と同じ程度に上昇した（図１Ｅ）。これらの結果から、ストレス負荷マウスでは、ＡＣＴＨは主として副腎中のＩＬ−１８のストレス誘導性上昇を招くが、血漿ＩＬ−１８レベルの上昇には他の因子が関与していることが示唆される。【０１２５】
（４）ＩＬ−１８タンパク質の性状
ＩＬ−１８タンパク質のウエスタンブロッティングによる分析の結果、ＩＬ−１８は血漿中では１８ｋＤの成熟型タンパク質で存在し（図１Ｆ、レーン１−３）、一方、副腎中では主として２４ｋＤの前駆体型で存在している（図１Ｆ、レーン４−６）ことがわかった。これらの結果から、副腎中のＩＬ−１８前駆体がプロセッシングされ、血漿中に放出されることが示唆される。【０１２６】
［実施例２］
ストレスにおけるカスパーゼ−１の役割
マウスを拘束器中に１時間置き、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（２００μＭ  ／５０μｌＰＢＳ（−））、Ｚ−ＦＡ−ｆｍｋ（１００μＭ  ／５０μｌＰＢＳ（−））およびＳＢ−２０３５８０（マウスあたり１００μｇ／５０μｌＰＢＳ（−））を腹腔内に投与した。拘束開始後１および３時間で、ＳＯＤ−１（２０Ｕ）および  ＤＰＩ（３０μｇ）をマウス腹腔内に投与し、ウエスタンブロッティングにより解析した。結果を図２に示す。【０１２７】
カスパーゼ−１は、副腎でＡＣＴＨ（図２Ａ、レーン２）およびストレス（図２Ａ、レーン３）により誘導された。副腎中のカスパーゼ−１活性は、ストレス負荷後１０倍高くなった（図２Ｂ）。カスパーゼ−１の阻害剤ＹＶＡＤ−ＣＨＯは、血漿中のＩＬ−１８レベルのストレス誘導性増加を有効に阻害した（図２Ｃ）が、副腎中のＩＬ−１８前駆体タンパク質レベルを阻害しなかった（図２Ｄ）。カスパーゼ−１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおいて、ストレス前後に血漿中にＩＬ−１８が検出されなかったが、ストレス負荷後にＩＬ−１８前駆体レベルが増加した。これらの結果から、カスパーゼ−１は副腎においてＩＬ−１８前駆体のプロセッシングに必須であり、ストレス負荷マウスにおいて血漿ＩＬ−１８の上昇に必須であることが示唆される。【０１２８】
［実施例３］
ウェスタンブロッティングによるカスパーゼ−１１およびＭＡＰキナーゼの解析
副腎組織中のＩＬ−１８およびリン酸化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼのウェスタンブロット分析は、以下のように行った。副腎組織を、プロテアーゼ阻害剤混合液（ロシュダイアグノスティックス製）を含む免疫沈降（ＩＰ）緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０および０．５％ナトリウムデオキシコレート）中でポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした。得られたホモジネート（１００μｇタンパク質）をプロテインＡ／Ｇアガロース（Ｅｘａｌｐｈａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）で前もって清澄化させ、抗マウスＩＬ−１８モノクローナル抗体または抗リン酸化（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ抗体とプロテインＡ／Ｇアガロース（５０μｌ）とでインキュベートし、遠心分離（１３０００×ｇで２５分間、４℃）した。沈殿物をボイルして副腎タンパク質を回収し、１０−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲル中で電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）ニトロセルロース膜に電気的に移した。前記膜を、抗体（ＩＬ−１８、リン酸化（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１またはカスパーゼ−１１）とともにインキュベートし、反応したタンパク質をＥＣＬプラスシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）で検出した。プロカスパーゼ−１１および活性化Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼは、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ  ９９  イメージアナリシスシステム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ製）を用いて定量化した。【０１２９】
（１）カスパーゼ−１活性のアップレギュレーションにおけるカスパーゼ−１１の関与  カスパーゼ−１がカスパーゼ−１１により活性化されることが報告されているので、血漿中ＩＬ−１８レベルにおけるカスパーゼ−１１阻害剤Ｚ−ＦＡ−ｆｍｋの影響を調べた。結果を図２Ｅおよび２Ｆに示す。【０１３０】
Ｚ−ＦＡ−ｆｍｋは、副腎におけるストレス誘導性カスパーゼ−１活性の増加を抑制し（図２Ｅ）、および血漿ＩＬ−１８レベルを抑制する（図２Ｆ）ことがわかった。このことから、カスパーゼ−１１は副腎中のカスパーゼ−１のストレス誘導性活性化に関与していることが示唆される。【０１３１】
（２）カスパーゼ−１活性のアップレギュレーションにおけるＰ３８ＭＡＰキナーゼの関与
ＬＰＳによるカスパーゼ−１１の誘導はＮＦ−κＢの活性化を必要とし、ＮＦ−κＢの活性化はＰ３８ＭＡＰキナーゼにより媒介されることが報告されている。インビトロでは、カスパーゼ−１１の誘導がＰ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤ＳＢ２０３５８０で抑制されることが報告されている。本発明においては、インビボで、すなわち、ストレス負荷したマウスでカスパーゼ−１１の誘導におけるＳＢ２０３５８０の影響を調べた。結果を図３に示す。【０１３２】
ＳＢ２０３５８０は、プロカスパーゼ−１１タンパク質のストレスにより誘導された増加を阻害した（図３Ａ）。ＳＢ２０３５８０処理したマウスでは、副腎におけるカスパーゼ−１活性（図３Ｂ）および血漿中ＩＬ−１８レベルも、対照マウス（図３Ｃ）に比べて低かった。ＳＢ２０３５８０とＺ−ＦＡ−ｆｍｋとを併用した処理では、カスパーゼ−１の活性（図３Ｂ）、血漿ＩＬ−１８レベル（図３Ｃ）および副腎中の２４ｋＤ  ＩＬ−１８前駆体レベル  （図示せず）  のさらなる減少が起こらなかった。ＹＶＡＤ−ＣＨＯ  またはＺ−ＦＡ−ｆｍｋ  のいずれも、副腎中のＰ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化に影響を与えなかった（図３Ｄ）。Ｐ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化は、野生型マウス（図３Ｄ、レーン２）と同様に、カスパーゼ−１ＫＯマウス（図３Ｄ、レーン５）でストレスにより誘導された。したがって、かかるリン酸化は、カスパーゼ−１に依存しなかった。【０１３３】
［実施例４］
免疫組織化学によるＩＬ−１８、カスパーゼ−１、カスパーゼ−１１およびＰ３８ＭＡＰキナーゼの局在
副腎をホルマリン固定し、パラフィンで包埋し、４μｍの切片に切断した。前記組織切片を抗体（Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１（前三者は２００倍希釈）またはＩＬ−１８（４００倍希釈））とともにインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製）およびジアミノベンジジン（ＤＢＡ）を用いて、発色させた。対照として、一次抗体なしの切片およびストレスなしのマウス由来の切片を用いた。結果を図３Ｅおよび３Ｆに示す。【０１３４】
ストレス負荷されたマウスにおいて、ＩＬ−１８、カスパーゼ−１、カスパーゼ−１１および活性化Ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、副腎皮質の網状帯に共に局在していた（図３Ｅ）が、対照マウスではいずれも検出されなかった。カスパーゼ−１の阻害剤（図３Ｆ、パネル１）およびカスパーゼ−１１の阻害剤（図３Ｆ、パネル２）は、副腎皮質においてリン酸化されたＰ３８ＭＡＰキナーゼの蓄積には影響なかった。【０１３５】
上記実施例３（２）および実施例４の結果より、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、カスパーゼ−１１の誘導を介して血漿ＩＬ−１８レベルのストレスにより誘導された上昇に関与し、これが次にはカスパーゼ−１を活性化することが示される。【０１３６】
［実施例５］
カスパーゼ−１活性の分析
副腎中のカスパーゼ−１活性を、カスパーゼアッセイキット（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）を用いて測定した。簡潔に記載すると、副腎組織のホモジェネートをカスパーゼ−１蛍光基質であるＡｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ（ａｃｅｔｙｌ−  Ｌ−ｔｙｒｏｓｙｌ−  Ｌ−ｖａｌｙｌ−  Ｌ−ａｌａｎｙｌ−  Ｌ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  ４−ｍｅｔｈｙｌ−ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅ）とインキュベートし、前記基質から遊離したＭＣＡを、蛍光プレートリーダー（励起波長３８０ｎｍ、放射波長４２０−４６０ｎｍ）を用いて測定した。【０１３７】
［実施例６］
Ｐ３８ＭＡＰキナーゼのアップレギュレーションにおけるスーパーオキシドの関与
活性酸素種は、肺の繊維芽細胞、好中球および単球においてＰ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化を媒介することが報告されている。ストレスを負荷したマウスにおいて、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化に対するＳＯＤの影響を調べた。結果を図４に示す。【０１３８】
ＳＯＤは、副腎において  Ｐ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化を約７０％阻害することがわかる（図４Ａ）。また、ＳＯＤは、ストレス負荷したマウスでは、プロカスパーゼ−１１（図４Ｂ）、カスパーゼ−１活性（図４Ｃ）および血漿ＩＬ−１８（図４Ｄ）のレベルをも低下させたが、副腎ＩＬ−１８前駆体タンパク質（図４Ｅ）のレベルは低下させなかった。ＳＯＤとＳＢ２０３５８０、Ｚ−ＦＡ−ｆｍｋまたはＹＶＡＤ−ＣＨＯとの併用処理は、それぞれ、プロカスパーゼ−１１、カスパーゼ−１または血漿ＩＬ−１８のレベルをさらに低下させる結果にはならなかった。血漿ＩＬ−１８のストレスによる誘導は、ＤＰＩ、すなわちＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤により抑制された（図４Ｆ）。これは、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼリン酸化を介する血漿ＩＬ−１８のストレスによる誘導にスーパーオキシドアニオンが関与しているという見解を支持する。【０１３９】
［実施例７］
ストレス負荷したマウスの血漿ＩＬ−６レベルの制御におけるＩＬ−１８の関与
ＩＬ−１８欠損マウスを用いて、もうひとつのストレス関連サイトカインであるＩＬ−６と、ＩＬ−１８との間の関連性を調べた。ストレスなしでは、ＩＬ−６はＷＴおよびＩＬ−１８ＫＯで検出不可能であったが、３時間のストレスの後に、ＩＬ−６レベルはＷＴで２３０ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ−１８ＫＯで２５ｐｇ／ｍｌであった（図５Ａ）。ストレスから開放された後、ＷＴでは血漿ＩＬ−６は約８０ｐｇ／ｍｌに維持されたが、ＩＬ−１８ＫＯでは５ｐｇ／ｍｌに減少した（図５Ａ）。ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ＳＯＤおよび抗ＩＬ−１８抗体での処理は、ＷＴで血漿ＩＬ−６レベルのストレスにより誘導された増加を７０％阻害した（図５Ｂ）。これらの結果から、ストレスがＩＬ−１８依存的に血漿中ＩＬ−６を誘導することが示唆される。【０１４０】
［実施例８］
ＩＬ−１８受容体抗体投与によるループス腎炎の治療
１０週令のＭＲＬ／ｌｐｒマウスに３時間の拘束ストレスを負荷し、血漿中のＩＬ−６の濃度を調べた。また、前記マウスにストレス負荷１０分前に抗ＩＬ−１８受容体抗体を投与し、ＩＬ−６の濃度の変化を調べた。その結果、ストレス負荷６時間後における血漿中ＩＬ−１８の濃度は、１１３２、８８２および７９３ｐｇ／ｍｌまで上昇しており、血漿中ＩＬ−６の濃度の上昇は、ストレス負荷後３時間でピークに達した。ストレス負荷後のＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、血漿中ＩＬ−６の上昇が見られたが、ストレス負荷しないマウスではＩＬ−６は検出されなかった。抗ＩＬ−１８受容体抗体を投与したマウスにストレスを負荷すると、ＩＬ−６の上昇は抑制された。【０１４１】
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ループス腎炎を自然発症している。１２週令のＭＲＬ／ｌｐｒマウスを３週間に亘って２日毎（３回／週）に６時間の拘束ストレスを負荷した。前記マウスをストレスのみの群、抗ＩＬ−６抗体投与群、および抗ＩＬ−１８受容体抗体投与群に分け、一日尿中のアルブミン量（タンパク尿）を調べた。対照として、ストレスを負荷しないＭＲＬ／ｌｐｒマウスについても調べた。結果を図６に示す。【０１４２】
図６より、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ストレスを負荷することによってタンパク尿が増加し、ループス腎炎の増悪が見られた。しかし、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−１８受容体抗体を投与することにより、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ストレスによるループス腎炎の増悪が抑制されていることがわかる。特に、抗ＩＬ−１８受容体抗体の投与が有効であった。【０１４３】
［実施例９］
ヒト初代培養皮膚角化細胞（ケラチノサイト）を、６ｃｍ径の細胞培養用ペトリ皿にケラチノサイト用基礎培地中、１．０−２．０×１０  ６  ／  ｄｉｓｈになるように培養した。これを活性酸素発生剤であるパラコートを１μＭ  含む同培地中で１５分培養した後でパラコート非含有培地に交換し、さらに１時間培養した後で培地を採取し、培地中のＩＬ−１８  蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理時に、活性酸素除去剤であるＳＯＤもしくは水溶性ビタミンＥをＳＯＤ  （１，  ２．５，  ５，  １０，  ２０  Ｕ  ／  ｍｌ），  ビタミンＥ  （１００  ｎＭ，  １，  ２．５，  ５，１０  ｍＭ  ／  ｍｌ）を含む培地中で細胞を培養し、培地中のＩＬ−１８蛋白の濃度を測定した。ケラチノサイトにおいて、活性酸素分子種によるＩＬ−１８の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤であるＳＯＤ、あるいは活性酸素を中和するビタミンＥによって、用量依存的に抑制された（図７Ａおよび７Ｂ）。【０１４４】
ヒト初代培養皮膚角化細胞（ケラチノサイト：ＣＡＭＢＲＥＸ  社から購入）を、６  ｃｍ径の細胞培養用ペトリ皿にてケラチノサイト用基礎培地中、１．０−２．０×１０  ６  ／  ｄｉｓｈ  になるように培養した。これに紫外線Ｂ  線  （ＵＶ−Ｂ線）  を１００  ｍＪ  照射し、その後１時間培養した後で培地を採取して、培地中のＩＬ−１８  蛋白の濃度を測定した。また、ＵＶ−Ｂ線処理後に、活性酸素除去剤であるＳＯＤもしくは水溶性ビタミンＥをＳＯＤ  （１，  ２．５，  ５，  １０，  ２０  Ｕ  ／  ｍｌ），  ビタミンＥ  （１００  ｎＭ，  １，  ２．５，  ５，  １０ｍＭ  ／  ｍｌ）を含む培地中で細胞を培養し、培地中のＩＬ−１８蛋白の濃度を測定した。ケラチノサイトにおいて、活性酸素分子種によるＩＬ−１８の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤であるＳＯＤ、あるいは活性酸素を中和するビタミンＥによって、用量依存的に抑制された（図７Ｃおよび７Ｄ）。【０１４５】
［実施例１１］
マウス新生児脳から、Ｈａｓｓａｎらの方法（Ｈａｓｓａｎ  ＮＦ，  Ｒｉｆａｔ  Ｓ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＤＥ，  ＭｃＣａｗｌｅｙ  ＬＪ，  Ｄｏｕｇｌａｓ  ＳＤ．  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  １９９１  Ｊｕｌ；５０（１）：８６−９２）で単離した脳マイクログリアを１．５−２．０×１０６／ｍｌになるように培養した。これを活性酸素発生剤であるパラコートを  １００  ｎＭ含むダルベッコミニマムエッセンシャル培地中で１時間培養した後でパラコート非含有培地に交換。さらに３時間培養した後で培地を採取し、培地中のＩＬ−１８  蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理後に活性酸素除去剤であるＳＯＤもしくは水溶性ビタミンＥをＳＯＤ  （１，  ２．５，  ５，  １０，  ２０  Ｕ  ／ｍｌ）、ビタミンＥ  （１００  ｎＭ，  １，  ２．５，  ５，  １０  ｍＭ  ／  ｍｌ）含む培地中で細胞を培養し、培地中のＩＬ−１８蛋白の濃度を測定した。マイクログリアにおいて、活性酸素分子種によるＩＬ−１８の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤であるＳＯＤ、あるいは活性酸素を中和するビタミンＥによって、用量依存的に抑制された（図８Ａおよび８Ｂ）。【０１４６】
［実施例１２］
マウス新生児脳から、Ｙａｎｇらの方法（Ｙａｎｇ  Ｐ，  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ＭＲ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２００３  Ｏｃｔ；１２（２）：６７−７６）で単離した脳アストロサイトを１．５−２．０  ×１０  ６  ／ｍｌになるように調製した。これを活性酸素発生剤であるパラコートを１００  ｎＭ含むダルベッコミニマムエッセンシャル培地中で１時間培養した後でパラコート非含有培地に交換。さらに３時間培養した後で培地を採取し、培地中のＩＬ−１８  蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理後に、活性酸素除去剤であるＳＯＤもしくは水溶性ビタミンＥをＳＯＤ（１，  ２．５，  ５，  １０，  ２０  Ｕ  ／  ｍｌ），ビタミンＥ（１００  ｎＭ，  １，  ２．５，  ５，  １０  ｍＭ／ｍｌ）含む培地中で細胞を培養し、培地中のＩＬ−１８蛋白の濃度を測定した。アストロサイトにおいて、活性酸素分子種によるＩＬ−１８の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤であるＳＯＤ、あるいは活性酸素を中和するビタミンＥによって、用量依存的に抑制された（図９Ａおよび９Ｂ）。【０１４７】
［実施例１３］
Ｈａｍｉｌｔｏｎらの方法（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＴＡ，  Ｗｅｉｅｌ  ＪＥ，  Ａｄａｍｓ  ＤＯ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８４  Ｍａｙ；  １３２（５）  ：２２８５−９０）でマウスから単離した腹腔マクロファージを１．０−２．０×１０５  ／ｄｉｓｈになるようダルベッコミニマムエッセンシャル培地中で培養した。培地を、活性酸素発生剤であるパラコートを１００  ｎＭ含む同培地に交換して１５分培養した後でパラコート非含有培地に交換し、さらに３時間培養した後で培地を採取して、培地中のＩＬ−１８  蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理時に、活性酸素除去剤であるＳＯＤを  （１，  ２．５，  ５，  １０，  ２０Ｕ／ｍｌ）含む培地中で細胞を培養し、培地中のＩＬ−１８蛋白の濃度を測定した。マクロファージにおいて、活性酸素分子種によるＩＬ−１８の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤であるＳＯＤ、あるいは活性酸素を中和するビタミンＥによって、用量依存的に抑制された（図１０Ａおよび１０Ｂ）。【０１４８】
［実施例１４］
関節リウマチ患者の病変部位の関節滑膜から採取した滑膜組織をＴａｎａｋａらの方法（Ｔａｎａｋａ  Ｍ，  Ｈａｒｉｇａｉ  Ｍ，  Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｙ，  Ｏｈｔａ  Ｓ，  Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｔ，  Ｔａｋａｇｉ  Ｋ，  Ｏｈｓａｋｏ−Ｈｉｇａｍｉ  Ｓ，  Ｆｕｋａｓａｗａ  Ｃ，  Ｈａｒａ  Ｍ，  Ｋａｍａｔａｎｉ  Ｎ．  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ２００１  Ａｕｇ；２８（８）：１７７９−８７）でウシ胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ−１６４０  培地中で組織培養した。活性酸素発生剤であるパラコートを１００  ｎＭ含む同培地に交換して１５分培養した後、パラコート非含有培地に交換し、さらに１時間培養した後で培地を採取して、培地中のＩＬ−１８  蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理時に、活性酸素除去剤であるＳＯＤ  （１，  ２．５，  ５，  １０，  ２０  Ｕ  ／  ｍｌ）を含む培地中で細胞を培養し、培地中のＩＬ−１８蛋白の濃度を測定した。滑膜組織において、活性酸素分子種によるＩＬ−１８の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤であるＳＯＤ、あるいは活性酸素を中和するビタミンＥによって、用量依存的に抑制された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。【０１４９】
［実施例１５］
ヒト初代培養腎近位尿細管上皮細胞（ＣＡＭＢＲＥＸ  社から購入）を、６  ｃｍ  径の細胞培養用ペトリ皿に腎尿細管細胞用基本培地：内容  １０  μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子）  ０．５  ｍｌ、  ５  ｍｇ／ｍｌ  インシュリン  ０．５  ｍｌ、  ０．５  ｍｇ／ｍｌ  ヒドロコルチゾン  ０．５  ｍｌ、  ＦＢＳ（ウシ胎児血清）  ２．５  ｍｌ、０．５  ｍｇ／ｍｌ  エピネフリン  ０．５  ｍｌ、６．５μｇ／ｍｌ  トリヨードチロニン  ０．５  ｍｌ、１０  ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン  ０．５  ｍｌ、５０  ｍｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン、５０  μｇ／ｍｌ  アンホテリシン−Ｂ  ０．５  ｍｌ）中１．０−２．０  ×１０６／  ｄｉｓｈ  になるように培養した。これを活性酸素発生剤であるパラコートを１００  ｎＭ含む同培地中で１５分培養し、その後でパラコート非含有同培地に交換した。さらに１時間培養した後で培地を採取し、培地中のＩＬ−１８  蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理時に、活性酸素除去剤であるＳＯＤもしくは水溶性ビタミンＥをＳＯＤ  （１，  ２．５，  ５，  １０，  ２０  Ｕ  ／  ｍｌ），  ビタミンＥ  （１００  ｎＭ，  １，  ２．５，  ５，  １０  ｍＭ  ／  ｍｌ）  を含む培地中で細胞を培養し、培地中のＩＬ−１８蛋白の濃度を測定した。腎尿細管細胞において、活性酸素分子種によるＩＬ−１８の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤であるＳＯＤ、あるいは活性酸素を中和するビタミンＥによって、用量依存的に抑制された（図１２Ａおよび１２Ｂ）。【０１５０】
［実施例１６］
ＩＬ−１８は、ＡＣＴＨ、ＦＳＨ、ＬＨの放出を惹き起す
遺伝子組換え技術により作製したＩＬ−１８をＣ５７Ｂ／６マウスに１．５μｇ静脈注射し、以後の血中のＡＣＴＨ、ＦＳＨおよびＬＨのレベルを調べた。図１３Ａに示すように、血中ＡＣＴＨ濃度はＩＬ−１８の投与によって上昇した。図１３Ｂ、１３ＣにＩＬ−１８投与１時間後のマウスから採取した血漿中ＦＳＨおよびＬＨのレベルを示す。ＩＬ−１８の投与により、ＦＳＨおよびＬＨの血漿中濃度が上昇することが示された。このことから、血中にＩＬ−１８の上昇が起きることでＡＣＴＨ、ＦＳＨ、ＬＨの血中レベルに変動が起きることが理解され、ストレスや活性酸素による血中ＩＬ−１８の上昇が全身状態を大きく左右することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明は、非炎症性ストレス応答の指標剤、可視化剤、治療剤およびその利用に関し、生体が受ける非炎症性ストレスの程度の測定、非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態変動の予防、改善または予想、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患の予防または治療、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質、または酸化ストレスに対する抑制効若しくは防止効果を有する物質のスクリーニング等に適用できる。
【図１Ａ】
0005069000.tif 000002
【図１Ｂ】
0005069000.tif 000003
【図１Ｃ】
0005069000.tif 000004
【図１Ｄ】
0005069000.tif 000005
【図１Ｅ】
0005069000.tif 000006
【図１Ｆ】
0005069000.tif 000007
【図２Ａ】
0005069000.tif 000008
【図２Ｂ】
0005069000.tif 000009
【図２Ｃ】
0005069000.tif 000010
【図２Ｄ】
0005069000.tif 000011
【図２Ｅ】
0005069000.tif 000012
【図２Ｆ】
0005069000.tif 000013
【図３Ａ】
0005069000.tif 000014
【図３Ｂ】
0005069000.tif 000015
【図３Ｃ】
0005069000.tif 000016
【図３Ｄ】
0005069000.tif 000017
【図３Ｅ】
0005069000.tif 000018
【図３Ｆ】
0005069000.tif 000019
【図４Ａ】
0005069000.tif 000020
【図４Ｂ】
0005069000.tif 000021
【図４Ｃ】
0005069000.tif 000022
【図４Ｄ】
0005069000.tif 000023
【図４Ｅ】
0005069000.tif 000024
【図４Ｆ】
0005069000.tif 000025
【図５Ａ】
0005069000.tif 000026
【図５Ｂ】
0005069000.tif 000027
【図６】
0005069000.tif 000028
【図７Ａ】
0005069000.tif 000029
【図７Ｂ】
0005069000.tif 000030
【図７Ｃ】
0005069000.tif 000031
【図７Ｄ】
0005069000.tif 000032
【図８Ａ】
0005069000.tif 000033
【図８Ｂ】
0005069000.tif 000034
【図９Ａ】
0005069000.tif 000035
【図９Ｂ】
0005069000.tif 000036
【図１０Ａ】
0005069000.tif 000037
【図１０Ｂ】
0005069000.tif 000038
【図１１Ａ】
0005069000.tif 000039
【図１１Ｂ】
0005069000.tif 000040
【図１２Ａ】
0005069000.tif 000041
【図１２Ｂ】
0005069000.tif 000042
【図１３Ａ】
0005069000.tif 000043
【図１３Ｂ】
0005069000.tif 000044
【図１３Ｃ】
0005069000.tif 000045
【配列表】
0005069000000001.app