(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（I）：
【化１】
0005068535.tif 000013
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示すが、これらのうち少なくとも１個は、被ラベル化物質に共有結合を介して結合可能な反応性官能基を示し、ただし該反応性官能基はベンゼン環に置換するカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、及びペンタフルオロフェニルエステルからなる群から選ばれる活性エステル基に変換したものであり；Ｒ5はアルキル基又はアルコキシ基を示し；Ｒ6及びＲ7はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ8は水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し、ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5の組み合わせは、式（I）で表される化合物が被ラベル化物質に共有結合した後において実質的に高い蛍光性になるように、それらが結合するベンゼン環の還元電位を該共有結合後に−２．１Ｖ以下にする組み合わせである）で表される蛍光ラベル化剤。
【請求項２】
被ラベル化物質がタンパク質である請求項１に記載の蛍光ラベル化剤。
【請求項３】
被ラベル化物質を蛍光ラベル化する方法であって、請求項１又は２に記載の蛍光ラベル化剤と被ラベル化物質とを反応させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光ラベル化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質や生理活性物質など微量の生体物質を高感度、高精度で検出・定量することはケミカルバイオロジーやバイオテクノロジーの発展における重要な研究課題である。この目的のため、蛍光ラベル化技術が汎用されている。蛍光ラベル化とは、有機蛍光色素などラベル化剤を標的物質である生体物質と結合させ、ラベル化剤特有の励起・蛍光スペクトル等の蛍光特性を利用することにより標的物質の検出・定量を可能とする方法である。この目的のため、蛍光ラベル化剤には、強い蛍光を持つ蛍光団と、標的物質である生体物質と迅速に反応できる反応性の高い活性基（反応性官能基）とを持つことが望まれる。【０００３】
フルオレセインは吸収極大492 nm、蛍光極大515 nmを示す蛍光性色素であり、量子収率も0.85と高く、蛍光ラベル化剤の母核として汎用されている。フルオレセインは、通常、488 nmのアルゴンレーザーにて励起され、530 nmにて検出される。このフルオレセインを応用した最も汎用される蛍光ラベル化剤としてカルボキシフルオレセインが知られている。この物質は、高い蛍光性のフルオレセインに対してタンパク質などに結合させるためのラベル化部位（反応性官能基）としてカルボキシル基が導入された化学構造を有しており、２種の位置異性体（5-カルボキシフルオレセイン及び6-カルボキシフルオレセイン）が存在する。しかしながら、これらの２つの異性体を分離して合成することは困難であり、ほとんどの場合には混合物のまま蛍光ラベル化剤として用いられている。また、蛍光ラベル化剤はタンパクのリシン残基などのアミノ基修飾の目的のため、スクシンイミジルエステルやイソチオシアネート体として提供されることも多い。
【化１】
0005068535.tif 000002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、これまで蛍光ラベル化剤として汎用されてきたカルボキシフルオレセイン類の化学構造を光物理化学的観点から最適化することで、さらなる高感度化を可能とする新規蛍光ラベル化剤を開発すべく研究を行なった。
本発明者らは、カルボキシフルオレセインを用いてタンパク質などをラベル化するためにエステル体やアミド体に変換すると、カルボキシフルオレセインの蛍光量子収率が低下する場合があることを見いだした。これは光誘起電子移動によることが考えられる。【０００５】
一方、本発明者らは、ごく最近、従来フルオレセインの蛍光特性に必須であると考えられてきた2-位のカルボキシル基は他の置換基に置き換えることが可能であることを見いだした（WO2004/005917）。そして、フルオレセインのカルボキシル基をメチル基又はメトキシ基に置換した化合物の蛍光特性は、フルオレセインと同様の励起・蛍光波長、蛍光量子収率を示すという知見を得ることに成功した。
以上の知見を併せ、フルオレセインを蛍光団であるキサンテン部位とこれに直交するベンゼン環部位に分けて考える手法を採用し、フルオレセインのベンゼン環部の2位のカルボキシル基をメチル基又はメトキシ基などに置換することにより、ベンゼン環部位の電子密度を高め、励起蛍光団からの光誘起電子移動(Donor-Excited Photoinduced Electron Transfer; d-PeT)を起こしにくくし、カルボキシフルオレセインで見られたラベル化による蛍光量子収率の低下を克服した新規蛍光ラベル化剤を開発することに成功した。【０００６】
本発明により、下記の式（I）：
【化２】
0005068535.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示すが、これらのうち少なくとも１個は、被ラベル化物質に共有結合を介して結合可能な反応性官能基を示し；Ｒ5は水素原子、カルボキシル基またはスルホン酸基以外の一価の基を示し；Ｒ6及びＲ7はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ8は水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し、ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5の組み合わせは、式（I）で表される化合物が被ラベル化物質に共有結合した後、実質的に高い蛍光性になるように、それらが結合するベンゼン環に低い還元電位を与える組み合わせである）で表される蛍光ラベル化剤が提供される。【０００７】
上記発明の好ましい態様によれば、Ｒ5がアルキル基又はアルコキシ基である上記蛍光ラベル化剤；該反応性官能基が、カルボキシル基又はその反応性誘導体である上記蛍光ラベル化剤；該反応性官能基が活性エステル基である上記蛍光ラベル化剤；被ラベル化物質がタンパク質、核酸、又は脂質である上記蛍光ラベル化剤が提供される。【０００８】
式（I）で表される化合物において、Ｒ1〜Ｒ5の組み合わせは、例えば、被ラベル化物質に共有結合した後、式(I)で表される化合物に由来する残基が実質的に高い蛍光性になるように、それらが結合するベンゼン環の還元電位を-2.1V以下にする組み合わせである。
別の観点からは、被ラベル化物質を蛍光ラベル化する方法であって、上記の蛍光ラベル化剤と被ラベル化物質とを反応させる工程を含む方法が本発明により提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の蛍光ラベル化剤は、カルボキシフルオレセインで見られたラベル化による蛍光量子収率の低下を克服しており、高い量子収率を有する蛍光ラベル化剤としてタンパク質又は有機化合物などのラベル化に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は本発明の蛍光ラベル化剤及び対照のカルボキシフルオレセイン-SEにより修飾されたBSAの吸収スペクトルを示した図である。
【図２】図２は本発明の蛍光ラベル化剤及び対照のカルボキシフルオレセイン-SEにより修飾されたBSAの蛍光スペクトル(励起波長：490 nm)を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の蛍光ラベル化剤の代表例を以下に示す。これらの化合物においては、ベンゼン環に置換するカルボキシル基が被ラベル化物質に存在するアミノ基、水酸基、チオール基などと反応して、被ラベル化物質を蛍光ラベル化することができる。
【化３】
0005068535.tif 000004
特に、上記の各化合物は、ベンゼン環上のカルボキシル基を使用し、被ラベル化物質の水酸基やアミノ基との間でエステル結合又はアミド結合などの共有結合を介して蛍光ラベル化しても実質的に蛍光強度が低下しないという優れた特徴を有しており、カルボキシフ
ルオレセインに比べて標的物質の高感度なラベル化が可能である。【００１２】
ラベル化剤としては、上記の化合物において、被ラベル化物質に共有結合を介して結合可能なベンゼン環上のカルボキシル基が、その誘導体であってもよく、例えば、カルボキシル基が酸ハロゲン化物又は混合酸無水物を形成してもよく、また、ニトロまたはハロゲン置換フェノール、N-ヒドロキシスクシンイミドと活性エステルを形成してもよい。特にベンゼン環に置換するカルボキシル基を活性エステル（例えば、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、p-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステルなど）に変換した化合物は本発明の蛍光ラベル化剤として好ましい。また、被ラベル化物質に共有結合を介して結合可能なベンゼン環上の官能基として、例えば、イソシアナート基、イソチオシアナート基を用いてもよい。さらに、モレキュラープローブス社のカタログ（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Ninth Edition）の第1章（Fluorophores and Their Amine-Reactive Derivatives）、第2章（Thiol-Reactive Probes）第３章（Reagents for Modifying Groups Other Than Thiols and Amines）に記載された反応性官能基を用いることもできる。
ベンゼン環上の２位の置換基としては、例えば、アルキル基又はアルコキシ基が好ましく、より好ましくはメチル基又はメトキシ基を用いることができる。【００１３】
以下に示すとおり、従来のカルボキシフルオレセインを水酸基に対する蛍光ラベル化剤として使用すると顕著な蛍光量子収率の減少が観測されるが、本発明の化合物12を蛍光ラベル化剤として用いた場合には、ラベル化後にも高い量子収率を保っている。
【化４】
0005068535.tif 000005
さらに、この新しい蛍光ラベル化剤は合成的観点からも有利である。すなわち、カルボキシル基の置換位置が限定された単一の異性体を高収率で得ることが可能であり、この点に置いてもカルボキシフルオレセイン類に比べて有用性が高い。
本発明の蛍光ラベル化剤は、被ラベル化物質（例えば、タンパク質、核酸、脂質類などの生体分子のほか、各種の有機低分子又は有機高分子化合物など）のラベル化に用いることができる。ラベル化の方法は特に限定されず、従来の蛍光ラベル化剤であるカルボキシフルオレセインなどを用いたラベル化の方法に準じて行なうことが可能である。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：本発明の蛍光ラベル化剤の製造
＜スキーム１＞
【化５】
0005068535.tif 000006
（スキーム中、Meはメチル基、Butはtert-ブチル基を示す。以下同様である。）【００１５】
(A)3-ブロモ-4-メチル安息香酸 tert-ブチルエステル (2)
よく乾燥した容器に3-ブロモ-4-メチル安息香酸 (1) (430 mg, 2 mmol)をtert-ブタノール（10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下でBoc2O (Boc=tert-ブトキシカルボニル, 0.46 mL, 2 mmol)とジメチルアミノピリジン（DMAP, 73 mg, 0.6 mmol)を加えた。40℃にて撹拌しつつオーバーナイトで反応させた。反応溶液を水で希釈した後、酢酸エチル（3×10 mL)にて抽出し、水、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル (9:1)）し、無色の油性化合物2 331 mg (収率61％)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.12 (d, 1H, J = 1.7), 7.81 (dd, 1H, J = 7.9, 1.7), 7.26 (d, 1H, J = 8.1) 2.43 (s, 3H), 1.58 (s, 9H).【００１６】
(B)化合物３
よく乾燥した容器にアルゴン雰囲気下tert-ブチルエステル体 2 (271 mg, 1 mmol)をテトラヒドロフラン（20 mL)に溶かした。-78 ℃にて、tert-ブチルリチウム（tert-ブチルリチウム, 1.48 M, 0.7 mL, 1 mmol)をゆっくり加え30分間同温で撹拌した。この溶液に3,6-ビス-(tert-ブチルジメチルシラニルオキシ)キサンテン-9-オン (91 mg, 0.2 mmol) のテトラヒドロフラン (10 mL)溶液をゆっくりと滴下し、容器をアルミニウムホイルで覆って、更に1時間同温で撹拌した。反応溶液に2 N HCl (5 mL)を加え10分間撹拌した。反応溶液を飽和NaH2PO4水溶液で希釈した後、酢酸エチル (3×15 mL)にて抽出し、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール＝9:1）し、オレンジ色の固体状の化合物3 76 mg (収率95％)を得た。
1H NMR (300 MHz, メタノール-d4) δ 8.10 (dd, 1H, J = 8.1, 1.8), 7.80 (d, 1H, J = 1.8), 7.59 (d, 1H, J = 8.1), 7.02 (d, 2H, J = 9.0), 6.67-6.70 (m, 4H), 2.12 (s, 3H), 1.58 (s, 9H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C25H23O5 403.1546, found 403.1512.【００１７】
(C)化合物４
よく乾燥した容器に化合物3 (60 mg, 0.15 mmol)をトリフルオロ酢酸/ジクロルメタン (1:1, 10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下1時間室温で撹拌した。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール (8:2)）、オレンジ色の固体状の化合物4 51 mg (収率98％)を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.08 (dd, 1H, J = 7.9, 1.7), 7.81 (d, 1H, J = 1.6), 7.64 (d, 1H, J = 8.3), 6.98 (d, 2H, J = 9.0), 6.78-6.74 (m, 4H), 2.01(s, 3H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C21H15O5 347.0920, found 347.0901.【００１８】
(D)4-ブロモ-3-メチル安息香酸 tert-ブチルエステル(6) 
よく乾燥した容器に4-ブロモ-3-メチル安息香酸 (5) (430 mg, 2 mmol)をtert-ブタノール (10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下でBoc2O (0.46 mL, 2 mmol)と DMAP (73 mg, 0.6 mmol)を加えた。40 ℃にて撹拌しつつオーバーナイトで反応させた。反応溶媒を水で希釈した後、酢酸エチル (3×10 mL)にて抽出し、水、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル (9:1)）し、無色の油性化合物6 342 mg (収率63％)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.83 (d, 1H, J = 2.0), 7.64 (dd, 1H, J = 8.3, 2.0), 7.56 (d, 1H, J = 8.3) 2.43 (s, 3H), 1.58 (s, 9H).【００１９】
(E)化合物７
よく乾燥した容器にアルゴン雰囲気下tert-ブチルエステル体 6 (271 mg, 1 mmol)をテトラヒドロフラン (20 mL)に溶かした。-100 ℃にて、tert-ブチルリチウム (1.48 M, 0.7 mL, 1 mmol)をゆっくり加え30分間同温で撹拌した。この溶液に3,6-ビス-(tert-ブチルジメチルシラニルオキシ)-キサンテン-9-オン (91 mg, 0.2 mmol) のテトラヒドロフラン (10 mL)溶液をゆっくりと滴下し、容器をアルミニウムホイルで覆って、さらに1時間同温で撹拌した。反応溶液に2 N HCl (5 mL)を加え10分間撹拌した。反応溶液を飽和NaH2PO4水溶液で希釈した後、酢酸エチル (3×15 mL)にて抽出し、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール (9:1)）し、オレンジ色の固体状の化合物7 68 mg (収率85％)を得た。
1H NMR (300 MHz, メタノール-d4) δ 8.05 (s, 1H), 8.01 (d, 1H, J = 8.1), 7.36 (d, 1H, J = 7.9), 7.03 (d, 2H, J = 9.2), 6.68-6.71 (m, 4H), 2.12 (s, 3H), 1.65 (s, 9H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C25H23O5 403.1546, found 403.1501.【００２０】
(F)化合物８
よく乾燥した容器に化合物7 (60 mg, 0.15 mmol)をトリフルオロ酢酸/ジクロルメタン (1:1, 10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下1時間室温で撹拌した。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール (8:2)）し、オレンジ色の固体状の化合物８ 49 mg (収率94％)を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.05 (s, 1H), 7.98 (d, 1H, J = 8.0), 7.43 (d, 1H, J = 7.9), 6.96 (d, 2H, J = 9.2), 6.77-6.73 (m, 4H), 2.07 (s, 3H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C21H15O5 347.0920, found 347.0897.【００２１】
例２：蛍光特性
各化合物の量子収率は、490 nmにおける吸光度が0.02以下となるように、pH 7.4（6CF類についてはpH 9.0）の0.1Mリン酸緩衝液に溶解し、0.1N NaOH水溶液中のフルオレセインを対照（蛍光量子収率 = 0.85）として、相対法により決定した。
【表１】
0005068535.tif 000007
【００２２】
例３：本発明の蛍光ラベル化剤の製造
＜スキーム２＞
【化６】
0005068535.tif 000008
【００２３】
(A)3-ブロモ-4-メトキシ安息香酸 tert-ブチルエステル(10)
よく乾燥した容器に3-ブロモ-4-メトキシ安息香酸(9) (462 mg, 2 mmol)をtert-ブタノール (10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下でBoc2O (0.46 mL, 2 mmol)と DMAP (73 mg, 0.6 mmol)を加えた。撹拌しつつ10時間還流し反応させた。反応溶液を水で希釈した後、酢酸エチル (3×10 mL)にて抽出し、水、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル (9:1)）し、白色の固体状の化合物10 356 mg (収率62％)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.15 (d, 1H, J = 2.0), 7.93 (dd, 1H, J = 8.6, 2.0), 6.89 (d, 1H, J = 8.6) 3.94 (s, 3H), 1.58 (s, 9H).【００２４】
(B)化合物11
よく乾燥した容器にアルゴン雰囲気下tert-ブチルエステル体 10 (287 mg, 1 mmol)をテトラヒドロフラン (20 mL)に溶かした。-100 ℃にて、tert-ブチルリチウム (1.48 M, 0.7 mL, 1 mmol)をゆっくり加え30分間同温で撹拌した。この溶液に3,6-ビス-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)キサンテン-9-オン (91 mg, 0.2 mmol) のテトラヒドロフラン (10 mL)溶液をゆっくりと滴下し、容器をアルミニウムホイルで覆って、さらに1時間同温で撹拌した。反応溶液に2 N HCl (5 mL)を加え10分間撹拌した。反応溶液を飽和NaH2PO4水溶液で希釈した後、酢酸エチル (3×15 mL)にて抽出し、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール (9:1)）し、オレンジ色の固体状の化合物11 48 mg (収率57％)を得た。
1H NMR (300 MHz, メタノール-d4) δ 8.24 (dd, 1H, J = 8.8, 2.2), 7.82 (d, 1H, J = 2.2), 7.35 (d, 1H, J = 8.8), 7.13 (d, 2H, J = 9.3), 6.74-6.70 (m, 4H), 3.82 (s, 3H), 1.58 (s, 9H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C25H23O6 419.1495, found 419.1461.【００２５】
(C)化合物12
よく乾燥した容器に化合物11 (63 mg, 0.15 mmol)をトリフルオロ酢酸/ジクロルメタン (1:1, 10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下1時間室温で撹拌した。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール (8:2)）し、オレンジ色の固体状の化合物12 45 mg (収率83％)を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.20 (dd, 1H, J = 8.8, 2.2), 7.82 (d, 1H, J = 2.0), 7.43 (d, 1H, J = 8.8), 7.09 (d, 2H, J = 9.7), 6.76-6.73 (m, 4H), 3.78 (s, 3H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C21H15O6 363.0869, found 363.0840.【００２６】
(D)化合物14
よく乾燥した容器に4-ブロモ-3-メトキシ安息香酸(13) (462 mg, 2 mmol)をジメチルホルムアミド(10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下でカルボジイミド（CDI, 486 mg, 3 mmol)、DMAP (367 mg, 3 mmol)、ピロリジン (0.33 mL, 4 mmol)を加えた。室温で撹拌しつつオーバーナイトで反応させた。反応溶液を水で希釈した後、酢酸エチル (3×10 mL)にて抽出し、水、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル (2:1 to 1:1)）し、白色の固体状の化合物14 488 mg (収率86％)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.40 (d, 1H, J = 8.1), 6.96 (d, 1H, J =1.7), 6.83 (dd, 1H, J = 8.0, 1.8) 3.77(s, 3H), 3.47 (t, 2H, J = 6.6), 3.28 (t, 2H, J = 6.4), 1.86-1.71 (m, 4H).【００２７】
(E)化合物15
よく乾燥した容器にアルゴン雰囲気下ピロリジンアミド 14 (284 mg, 1 mmol)をテトラヒドロフラン (20 mL)に溶かした。-100 ℃にて、tert-ブチルリチウム (1.48 M, 0.7 mL, 1 mmol)をゆっくり加え30分間同温で撹拌した。この溶液に3,6-ビス-(tert-ブチルジメチルシラニルオキシ)-キサンテン-9-オン (91 mg, 0.2 mmol) のテトラヒドロフラン (10 mL)溶液をゆっくりと滴下し、容器をアルミニウムホイルで覆って、さらに1時間同温で撹拌した。反応溶液に2 N HCl (5 mL)を加え10分間撹拌した。反応溶液を飽和NaH2PO4水溶液で希釈した後、酢酸エチル (3×15 mL)にて抽出し、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール (9:1)）し、オレンジ色の固体状の化合物15 35 mg (収率42％)を得た。
1H NMR (300 MHz, メタノール-d4) δ 7.37 (s, 1H), 7.32 (s, 2H), 7.00 (d, 2H, J = 9.0), 6.56-6.52 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 3.68-3.60 (m, 4H), 2.07-1.99 (m, 4H); HRMS (ESI-MS) [M-H]- calcd for C25H20N1O5 414.1342, found 414.1332.【００２８】
(F)化合物16
化合物15 (62 mg, 0.15 mmol)を1 N NaOH (10 mL)に溶かし2時間還流した。反応溶液を2 N HClで中和し、酢酸エチル (3×15 mL)にて抽出し、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール (8:2)）し、オレンジ色の固体状の化合物16 49 mg (収率90％)を得た。
1H NMR (300 MHz, メタノール-d4) δ 7.82 (d, 1H, J = 1.1), 7.75 (dd, 1H, J = 7.7, 1.3), 7.21 (d, 1H, J = 7.9), 7.02 (d, 2H, J = 9.0), 6.56-6.51 (m, 4H), 3.79 (s, 3H); HRMS (ESI-MS) [M-H]- calcd for C21H13O6 361.0712, found 361.0704.  【００２９】
(G)化合物17
よく乾燥した容器に化合物16 (36 mg, 0.10 mmol)をtert-ブタノール (5 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下でBoc2O (0.11 mL, 0.50 mmol)と DMAP (18 mg, 0.15 mmol)を加えた。室温にて撹拌しつつオーバーナイトで反応させた。反応溶液を水で希釈した後、酢酸エチル (3×5 mL)にて抽出し、飽和食塩水で洗浄して無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製（溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール (9:1)）し、オレンジ色の固体状の化合物17 12 mg (収率29％)を得た。
1H NMR (300 MHz, メタノール-d4) δ 7.79-7.77 (m, 2H), 7.33 (d, 1H, J = 8.3), 6.94 (d, 2H, J = 9.2), 6.56-6.50 (m, 4H), 3.80 (s, 3H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C25H23O6 419.1495, found 419.1489.【００３０】
例４：蛍光特性
各化合物の量子収率は、490 nmにおける吸光度が0.02以下となるように、pH 7.4（6CF類についてはpH 9.0）の0.1Mリン酸緩衝液に溶解し、0.1N NaOH水溶液中のフルオレセインを対照（蛍光量子収率 = 0.85）として、相対法により決定した。
【表２】
0005068535.tif 000009
【００３１】
例５：化合物19の合成
【化７】
0005068535.tif 000010
化合物18はJ. Am. Chem. Soc., 123, pp.2530-2536(2001)に記載の方法で合成した。
化合物18をメタノール溶解し、数滴の硫酸を加え、20時間還流した。ついで、反応液を氷中に注ぎ入れ、酢酸エチルにて抽出し、無水Na2SO4で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、メタノール/ジクロルメタンにて再結晶して化合物19を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ3.63 (s, 3H); 6.30 (br, 2H); 6.84 (m, 4H); 7.76 (m, 2H); 8.06 (m, 2H); 8.30 (m, 1H); 8.89 (s, 1H); 11.04 (br, 1H). HRMS (ESI+): calcd for M++1, 397.107; found, 397.105. Mp: 325℃ dec. Anal. Calcd for C25H16O5・0.75H2O: N; 0, C; 73.25, H; 4.30. Found: N, 0; C; 73.43, H; 4.37.【００３２】
例６：化合物11、17、及び19、並びに4-メトキシカルボニルフルオレセインの蛍光量子収率とベンゼン環部位の還元電位の関係
【表３】
0005068535.tif 000011
【００３３】
化合物11、17、及び19、並びに4-メトキシカルボニルフルオレセインの蛍光量子収率とベンゼン環部位の還元電位の関係を上記の表３に示した。上記のベンゼン環部位の還元電位は、Ａ、Ｂ、及びＣについてはアセトニトリル中で、Ｄについては水溶液中で飽和カロメロ電極（SCE）を参照電極として測定した値である。
4-メトキシカルボニルフルオレセインの蛍光量子収率（0.203）に対し、化合物19の蛍光量子収率は高い（0.673）。両化合物のベンゼン環部位の還元電位の高低も同様の関係にあった。これらの結果から、電子密度が高く還元されにくい化合物は励起蛍光団からの光誘起電子移動(Donor-Excited Photoinduced Electron Transfer; d-PeT)を起こしにくく（Petアクセプターになりにくく）、高蛍光量子収率となることを示すものと考えられた。【００３４】
別のベンゼン環部位の例として、4-カルボキシアニソールおよび3-カルボキシアニソールのメチルエステル体（Ａ及びＢ）についてその還元電位を確認すると、それぞれ-2.54V、-2.34Vであり、化合物19のベンゼン環部位の2-メトキシカルボニルナフタレン（Ｃ）の還元電位より低く、よりPeTアクセプターになりにくいと考えられた。4-カルボキシアニソールおよび3-カルボキシアニソールをベンゼン環部位として有する化合物12及び16のエステル体の蛍光量子収率はそれぞれ0.842及び0.558であり、6-カルボキシフルオレセインメチルエステルの蛍光量子収率より高い。このようにして、実質的に高い蛍光性になるようにベンゼン環に低い還元電位を与える置換基の組合わせを選択することができることがわかった。化合物12及び16は高量子収率の蛍光ラベル化剤として好適である。【００３５】
例７：スクシンイミジルエステル（SE）類の合成
【化８】
0005068535.tif 000012
【００３６】
化合物4(21a)、化合物8(21b)、化合物12(47a)、化合物16(47b)、それぞれ 1 mmol、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS） 2、3又は10 mmolを無水ジメチルホルムアミド 5 mLに溶解し、これらの溶液に2、3又は10 mmolの水溶性カルボジイミド（WSCD: N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド)を氷冷下加え、0℃で1 又は2時間反応させた。反応後リン酸水溶液を添加し、塩化メチレンで抽出して乾燥した後。溶媒を減圧留去して目的のスクシンイミジルエステル体を得た。必要に応じてシリカゲルカラムにより目的物の精製を行った。【００３７】
21aSE
1H NMR (300 MHz, メタノール-d4) δ 8.28 (dd, 1H, J = 8.2, 1.8), 8.02 (d, 1H, J = 1.7), 7.74 (d, 1H, J = 8.2), 7.06 (d, 2H, J = 9.3), 6.77-6.73 (m, 4H), 2.89 (s, 4H), 2.19 (s, 3H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C25H18NO7+ 444.1083, found 444.1117.
21bSE
1H NMR (300 MHz, メタノール-d4) δ 8.26 (s, 1H), 8.19 (d, 1H, J = 9.2), 7.52 (d, 1H, J = 7.9), 7.06 (d, 2H, J = 9.0), 6.77-6.73 (m, 4H), 2.94 (s, 4H), 2.17 (s, 3H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C25H18NO7+ 444.1083, found 444.1041.【００３８】
47aSE
1H NMR (300 MHz, CD3CN) δ 8.37 (dd, 1H, J = 8.8, 2.2), 7.97 (d, 1H, J = 2.2), 7.39 (d, 1H, J = 8.8), 7.03 (d, 2H, J = 9.5), 6.60-6.57 (m, 4H), 3.82 (s, 3H), 2.83(s, 4H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C25H17NO8+ 460.1032, found 460.0989.
47bSE
1H NMR (300 MHz, CD3CN) δ 7.94 (dd, 1H, J = 7.9, 1.5), 7.87 (d, 1H, J = 1.5), 7.44 (d, 1H, J = 7.9), 7.01 (d, 2H, J = 9.7), 6.58-6.55 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 2.89(s, 4H); HRMS (ESI-MS) [M+H]+ calcd for C25H17NO8+ 460.1032, found 460.1009.【００３９】
例８：本発明の蛍光ラベル化剤を用いたBSAの蛍光修飾
ウシ血清アルブミン(BSA) 15 mgを500 μLの100 mmol/Lホウ酸バッファー（pH 9.0）に溶解し、ここに本発明の蛍光ラベル化剤の20 mMのジメチルホルムアミド溶液50 μLを攪拌しながら添加した。そのまま室温で1.5時間反応させた後、これを1.5 gのセファデックスG25により精製した。溶離液は1×PBS（100 mmol/L NaCl、40 mmol/L NaPi）を用いた。図１には本発明の蛍光ラベル化剤でラベル化されたBSAの吸収スペクトルを示し、図２には本発明の蛍光ラベル化剤でラベル化されたBSAの蛍光スペクトル(励起波長：490 nm)を示した。図に示した結果から、本発明の蛍光ラベル化剤によりBSAの高蛍光性修飾が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の蛍光ラベル化剤は、カルボキシフルオレセインで見られたラベル化による蛍光量子収率の低下を克服しており、高い量子収率を有する蛍光ラベル化剤としてタンパク質は有機化合物などのラベル化に有用である。
【図１】
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【図２】
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