(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）から（iv）
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA；
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１から５０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA；
（iv）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；
のいずれかに記載のDNAにコードされる蛋白質であって、インスリン・デグレーディング・エンザイム（IDE）、プレセニリン−１（PS-1）、p0071（plakophilin-4）、SART-1、MSP58、ATRX、CSA2（RED protein）、p68（RNA helicase/ATPase）、OS-9、ZNF189、KIAA1221、α-Actinin4、および ZIP kinase からなる群より選択される蛋白質と結合する活性を有する蛋白質とインスリン・デグレーディング・エンザイム（IDE）、プレセニリン−１（PS-1）、p0071（plakophilin-4）、SART-1、MSP58、ATRX、CSA2（RED protein）、p68（RNA helicase/ATPase）、OS-9、ZNF189、KIAA1221、α-Actinin4、および ZIP kinase からなる群より選択される蛋白質との結合を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下、該（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNAにコードされる蛋白質であって該結合する活性を有する蛋白質とインスリン・デグレーディング・エンザイム（IDE）、プレセニリン−１（PS-1）、p0071（plakophilin-4）、SART-1、MSP58、ATRX、CSA2（RED protein）、p68（RNA helicase/ATPase）、OS-9、ZNF189、KIAA1221、α-Actinin4、および ZIP kinase からなる群より選択される蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）これら蛋白質の結合を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質の結合を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項２】
下記（ｉ）から（iv）
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA；
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１から５０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA；
（iv）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；
のいずれかに記載のDNAにコードされる蛋白質であって、JNKインターラクティング・プロテイン1（JIP-1）蛋白質に結合する活性を有する蛋白質をコードする蛋白質とJIP-1蛋白質との結合を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下、該（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNAにコードされる蛋白質であって該結合する活性を有する蛋白質とJIP-1蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）これら蛋白質の結合を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質の結合を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項３】
下記（ｉ）から（iv）
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA；
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１から５０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA；
（iv）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；
のいずれかに記載のDNAにコードされる蛋白質であって、JNKインターラクティング・プロテイン1（JIP-1）蛋白質に結合する活性を有する蛋白質の活性を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNAにコードされる蛋白質であって該結合する活性を有する蛋白質を発現させた細胞に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞におけるMKK7/JNKを介するシグナル伝達を検出する工程、
（ｃ）該シグナル伝達を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、MKK7/JNKを介するシグナル伝達をc-Jun依存的な転写を指標として検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
癌の検査方法であって、患者由来の被検試料中におけるインスリン・デグレーディング・エンザイム（IDE）、プレセニリン−１（PS-1）、p0071（plakophilin-4）、SART-1、MSP58、ATRX、CSA2（RED protein）、p68（RNA helicase/ATPase）、OS-9、ZNF189、KIAA1221、α-Actinin4、ZIP kinase、および JNKインターラクティング・プロテイン1（JIP-1）からなる群より選択される蛋白質と結合する活性を有する蛋白質をコードする下記（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNA、またはアルマジロリピート構造を有する蛋白質をコードする下記（ｉ）、（ii）、または（iv）に記載のDNAの発現量を検出する工程を含む方法。
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA；
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１から５０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA；
（iv）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
【請求項６】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法によりDNAの発現量を検出する、請求項５に記載の方法。
（ａ）患者由来のRNA試料に、
（１）インスリン・デグレーディング・エンザイム（IDE）、プレセニリン−１（PS-1）、p0071（plakophilin-4）、SART-1、MSP58、ATRX、CSA2（RED protein）、p68（RNA helicase/ATPase）、OS-9、ZNF189、KIAA1221、α-Actinin4、ZIP kinase、および JNKインターラクティング・プロテイン1（JIP-1）からなる群より選択される蛋白質と結合する活性を有する蛋白質をコードする下記（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNA、
（２）アルマジロリピート構造を有する蛋白質をコードする下記（ｉ）、（ii）、または（iv）に記載のDNA、または
（３）（１）または（２）に記載のDNAの相補鎖
に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを接触させる工程
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA；
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１から５０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA；
（iv）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；
（ｂ）該RNA試料への該ポリヌクレオチドの結合を検出する工程
【請求項７】
下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法によりDNAの発現量を検出する、請求項６に記載の方法。
（ａ）患者由来のRNA試料からcDNAを合成する工程
（ｂ）合成したcDNAを鋳型に、
（１）インスリン・デグレーディング・エンザイム（IDE）、プレセニリン−１（PS-1）、p0071（plakophilin-4）、SART-1、MSP58、ATRX、CSA2（RED protein）、p68（RNA helicase/ATPase）、OS-9、ZNF189、KIAA1221、α-Actinin4、ZIP kinase、および JNKインターラクティング・プロテイン1（JIP-1）からなる群より選択される蛋白質と結合する活性を有する蛋白質をコードする下記（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNA、
（２）アルマジロリピート構造を有する蛋白質をコードする下記（ｉ）、（ii）、または（iv）に記載のDNA、または
（３）（１）または（２）に記載のDNAの相補鎖
に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA；
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１から５０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA；
（iv）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；
（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNAを検出する工程
【請求項８】
癌の検査方法であって、患者由来の被検試料中における下記（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNAにコードされる蛋白質であって、インスリン・デグレーディング・エンザイム（IDE）、プレセニリン−１（PS-1）、p0071（plakophilin-4）、SART-1、MSP58、ATRX、CSA2（RED protein）、p68（RNA helicase/ATPase）、OS-9、ZNF189、KIAA1221、α-Actinin4、ZIP kinase、および JNKインターラクティング・プロテイン1（JIP-1）からなる群より選択される蛋白質と結合する活性を有する蛋白質、または下記（ｉ）、（ii）、または（iv）に記載のDNAにコードされる蛋白質であって、アルマジロリピート構造を有する蛋白質の存在量を検出する工程を含む方法。
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA；
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１から５０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA；
（iv）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
【請求項９】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法により蛋白質の存在量を検出する、請求項８に記載の方法。
（ａ）該（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNAにコードされる蛋白質であって該結合する活性を有する蛋白質に結合する抗体、または該（ｉ）、（ii）、または（iv）に記載のDNAにコードされる蛋白質であってアルマジロリピート構造を有する蛋白質に結合する抗体を、患者由来の蛋白質試料に接触させる工程
（ｂ）該蛋白質試料への該抗体の結合を検出する工程、を含む方法
【請求項１０】
下記（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNAにコードされる蛋白質であって、インスリン・デグレーディング・エンザイム（IDE）、プレセニリン−１（PS-1）、p0071（plakophilin-4）、SART-1、MSP58、ATRX、CSA2（RED protein）、p68（RNA helicase/ATPase）、OS-9、ZNF189、KIAA1221、α-Actinin4、ZIP kinase、および JNKインターラクティング・プロテイン1（JIP-1）からなる群より選択される蛋白質と結合する活性を有する蛋白質に結合する抗体、または下記（ｉ）、（ii）、または（iv）に記載のDNAにコードされる蛋白質であって、アルマジロリピート構造を有する蛋白質に結合する抗体を含む癌の検査試薬。
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA；
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１から５０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA；
（iv）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
【請求項１１】
（１）インスリン・デグレーディング・エンザイム（IDE）、プレセニリン−１（PS-1）、p0071（plakophilin-4）、SART-1、MSP58、ATRX、CSA2（RED protein）、p68（RNA helicase/ATPase）、OS-9、ZNF189、KIAA1221、α-Actinin4、ZIP kinase、および JNKインターラクティング・プロテイン1（JIP-1）からなる群より選択される蛋白質と結合する活性を有する蛋白質をコードする下記（ｉ）から（iv）のいずれかに記載のDNA、
（２）アルマジロリピート構造を有する蛋白質をコードする下記（ｉ）、（ii）、または（iv）に記載のDNA、または
（３）（１）または（２）に記載のDNAの相補鎖
に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む癌の検査試薬。
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA；
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１から５０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA；
（iv）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はアルマジロリピートと呼ばれる繰り返し配列を含む新規蛋白質およびこれをコードする遺伝子に関する。本発明はまた、得られたｃＤＮＡおよびこれにコードされる蛋白質のヒト癌あるいはアルツハイマー病病理の診断における利用にも関する。
背景技術
Ａｒｍ（アルマジロ）ファミリーを構成する蛋白はショウジョウバエのアルマジロ遺伝子産物と相同性を有し、種々の重要な細胞機能への関与が知られている。これらのアルマジロ関連蛋白に共通して認められる特徴は一連の４２アミノ酸から成る不完全な繰り返し構造（Ａｒｍモチーフ）にある（Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ７６，７８９−７９１）。このモチーフは１９８９年にショウジョウバエのアルマジロ遺伝子座の解析に於いて初めて記述された（Ｒｉｇｇｌｅｍａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３，９６−１１３）。以来数多くの相同なモチーフを含有する蛋白をコードする遺伝子がクローン化されその塩基配列が明らかにされている。これらの内には、ヒトα−、β−、γ−、δ−カテニンを初めとして癌抑制遺伝子であるａｄｅｎｏｍａ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）、癌遺伝子ｓｒｃ蛋白質リン酸化酵素の基質であるｐ１２０、蛋白質の核内輸送に関与するｉｍｐｏｒｔｉｎおよびｒａｓを初めとする低分子量Ｇ蛋白のグアニンヌクレオチド交換反応に関与するｓｍｇＧＤＳ等が含まれる（Ｈａｔｚｆｅｌｄ，Ｍ．（１９９９）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１８６，１７９−２２４）。Ａｒｍモチーフは進化の過程を通じて見出されており、ヒトと酵母の様な隔たった種間でもよく保存されている。Ａｒｍモチーフの反復は通常蛋白分子中直列に近接して配置されており、現在までのところ６個未満の反復を含む蛋白は報告されていない。アルマジロ関連蛋白はこのＡｒｍドメインを介して種々の異なる蛋白と相互作用する事が知られている（Ｏｚａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１８，１０７７−１０８２；Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，５５４９−５５５５；Ｔｒｏｙａｎｏｖｓｋｙ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０９，３０６９−３０７８；Ｍｕｒａｙａｍａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３３，７３−７７）。
最近、Ａｒｍ蛋白のアルツハイマー病への関与が明らかになりつつある。ヒトのＡｒｍ蛋白であるβ−、γ−、δ−カテニンおよびｐ００７１がプレセニリン−１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１；ＰＳ−１）蛋白と相互作用する事が見出された（Ｚｈｏｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ８，２０８５−２０９０；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９５，６９８−７０２；Ｓｔａｈｌ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，９１４１−９１４８）。ＰＳ１およびｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ２（ＰＳ２）遺伝子の変異が大多数の場合の早期発症家族性アルツハイマー病の原因である事が明らかとなっている（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１，４７９−５０５）。ＰＳ１およびＰＳ２の変異によりアミロイド斑中心部へのβアミロイドペプチド（１−４２）の蓄積量が増大する事が示され、ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓのＡＰＰ分解への関与が示唆されている。カテニン類とｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓとの相互作用の詳細な意義については不明であるが、野生型のＰＳ１はβカテニンを安定化可能であるのに対して変異ＰＳ１はこの安定化能を欠いている事が示されている。
先に述べた様に、Ａｒｍ蛋白は細胞内に於いて種々の機能を担っている。ショウジョウバエのアルマジロ遺伝子はｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル伝達系の１因子として同定された（Ｗｉｅｓｃｈａｕｓ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｒｉｇｇｌｅｍａｎ，Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４９，１７７−１８４）。同様に、脊椎動物に於いてアルマジロ蛋白に相当するβカテニンの場合も初期発生に於いて細胞の運命を決定するＷｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓ増殖因子のシグナル伝達系の重要な因子である事が知られている。βカテニンがＷｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓ増殖因子のシグナル伝達に関与する機序はβカテニンがＴＣＦ／ＬＥＦ１ファミリーの転写因子と複合体を形成して核に移行する事の発見により明らかにされた（Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，６３８−６４２；Ｍｏｌｅｎａａｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８６，３９１−３９９）。ＴＣＦｓ自体は転写因子として弱い活性しか持っていないがβカテニンと複合体を形成する事により強力な転写活性化因子となる。
このシグナル伝達に於ける機能に加えて、βカテニンは固形組織の形態形成およびこれに続く組織構造の維持に於いて主要な役割を担っている。βカテニンはｃａｄｈｅｒｉｎの高度に保存された細胞内ドメインおよびαカテニンに結合し、αカテニンはａｃｔｉｎに結合する事が知られており、ｃａｄｈｅｒｉｎ−カテニンの複合体は細胞接着や細胞運動を制御するシグナルの標的とされている（Ｋｉｎｃｈ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３０，４６１−４７１）。
哺乳動物細胞ではβカテニンは別の癌抑制遺伝子産物であるＡＰＣと相互作用する事が明らかとなっている（Ｓｕ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，１７３４−１７３７）。ＡＰＣ遺伝子の変異は家族性あるいは散発性の大腸癌に伴って認められる（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８７，１５９−１７０）。βカテニン結合部位を欠いた変異ＡＰＣ蛋白が細胞質中のβカテニン量を増加せしめ、構成的にβカテニン・ＴＣＦ複合体による転写を活性化する事から、ＡＰＣの機能はβカテニンの安定性を低下させるものと考えられる。
以上述べた如く、Ａｒｍ蛋白は組織の構造維持および細胞内シグナル伝達に関与している。Ａｒｍ蛋白は腫瘍形成の制御に於いて中心的な役割を担っており、アルツハイマー病に於いても関与が知られている。従って、未だ未知であるＡｒｍファミリー蛋白が存在すれば、これらの疾患の病理に関与している可能性が考えられ、故にこれらの疾患に対する治療の有用な標的となる可能性がある。
ところで、近年数々の研究室から、インスリン・デグレーディング・エンザイム（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ；ＩＤＥ）がラットあるいはヒトの神経系組織に於いて中性領域でβアミロイドペプチドを分解する主要な蛋白質分解酵素である事が報告されている（Ｋｕｒｏｃｈｋｉｎ，Ｉ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｇｏｔｏ，Ｓ．（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４５，３３−３７；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ａ．Ｍ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２２，４９−５６；Ｑｉｕ，Ｗ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２７３０−３２７３８）。しかし、大部分のＩＤＥ蛋白が細胞質に分布する事から、ＩＤＥが如何にして分泌用細胞内小器官に於いてアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）から生成されるβアミロイドペプチドに到達し得るかについては不明である。
発明の開示
本発明はアルマジロリピートと呼ばれる繰り返し配列を含む新規蛋白質およびこれをコードする遺伝子を提供することを課題とする。本発明はまた、得られたｃＤＮＡおよびこれにコードされる蛋白質のヒト癌あるいはアルツハイマー病病理の診断および医薬品開発に於ける利用を提供することを課題とする。
本発明者らは、ＩＤＥをβアミロイドペプチド生成の場に誘導するアダプター蛋白の存在を仮定する事により、ＩＤＥがβアミロイドペプチドに到達し得るとの仮説を構築した。さらにこのアダプター蛋白の機能の異常がアルツハイマー病に於けるβアミロイドペプチドの蓄積に寄与している可能性を想定した。この仮説に基づいて本発明者らは、酵母２ハイブリッド法を駆使して上記機能を満足するＩＤＥ結合蛋白の検索を実施した。その結果本発明者らは、４５３アミノ酸からなるＡＬＥＸ１（Ａｒｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｏｓｔ  ｉｎ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｘ−１）と命名した新規なアルマジロ（Ａｒｍ）リピート蛋白をコードする新規なｃＤＮＡのクローニングに成功した。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験に於いてＩＤＥとＡＬＥＸ１蛋白の直接的な相互作用が示された。塩基配列からの予測により、該蛋白はアルマジロリピートと呼ばれる他の蛋白との相互作用に関与するとされる構造を２個含む事が明らかとなった。ＮＣＢＩのデータベースに対して実施した相同性検索の結果、ＡＬＥＸ１は機能未知の蛋白をコードするＫＩＡＡ０５１２、ＫＩＡＡ０４４３および複数個のＥＳＴを組み合わせて構成されるオープンリーディングフレームに対応するＴＨＣ２５７９２５と有意な相同性を示した。以上の結果よりＫＩＡＡ０５１２およびＴＨＣ２５７９２５に対応する遺伝子をそれぞれ、ＡＬＥＸ２およびＡＬＥＸ３と命名した。アミノ酸配列の比較検討結果から、ＡＬＥＸ１、ＡＬＥＸ２、ＡＬＥＸ３そして恐らくＫＩＡＡ０４４３は新規な蛋白質ファミリーを構成するものと考えられた。そしてこの４個のファミリーメンバーをコードする遺伝子がＸ染色体上の同一の領域に位置している事から、４つのＡＬＥＸ遺伝子は古典的なＡｒｍリピートファミリーメンバー遺伝子と関連する共通な祖先遺伝子が増幅、分化の過程を経て進化した事が示唆される。
ＡＬＥＸ１蛋白全体の他のＡｒｍファミリー蛋白に対する相同性は低いが、Ａｒｍリピートを含む部位に限局するとｉｍｐｏｒｔｉｎαや酵母のＶａｃ８ｐの該当する部位と高い相同性を示し、またこれらよりは低いもののアルマジロ、βカテニンあるいはｐｌａｋｏｇｌｏｂｉｎとも相同性を認める。核移行シグナル受容体として知られるｉｍｐｏｒｔｉｎα（α−ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎ）は蛋白質の核内輸送に関与している。酵母のＶａｃ８ｐは細胞内小胞の親細胞から娘細胞への分配に関与している事が知られている（Ｗａｎｇ，Ｙ．−Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４０，１０６３−１０７４）。また、Ｖａｃ８ｐ変異酵母細胞ではａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｉを細胞質から小胞に送る事ができない事から、細胞質から小胞への蛋白質の移送系の主要な要素と考えられている。興味深い事にＶａｃ８ｐ蛋白はｉｎ  ｖｉｖｏに於いて通常ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ化の修飾を受けている（Ｗａｎｇ，Ｙ．−Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４０，１０６３−１０７４）が、ＡＬＥＸ１の場合にもそのＮ端近傍に４個のｍｙｒｉｓｔｏｙｌ化部位が存在する。ＡＬＥＸ１蛋白がＶａｃ８ｐと同様な細胞質蛋白を細胞内小胞体に移送する機能に関与している可能性がある。
近年、ｐ００７１、β−、γ−、δ−カテニン等のＡｒｍリピートファミリー蛋白がプレセニリン−１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１；ＰＳ−１）と結合する事が報告されている。ＰＳ１変異を有するアルツハイマー病に於いては通常より長い形のβアミロイドペプチドの産生が亢進している。さらに新しい知見によれば、ＰＳ１はＡＰＰのγセクレターゼによる分解を制御しているか、あるいはそれ自身がγセクレターゼである可能性が示唆されている（Ｄｅ  Ｓｔｒｏｏｐｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，３８７−３９０；Ｗｏｌｆｅ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，５１３−５１７）。本発明に於いて、ＩＤＥがｉｎ  ｖｉｔｒｏに於いてＡＬＥＸ１と相互作用する事が示された。さらに、ＡＬＥＸ１はＰＳ１とも相互作用することが判明した。つまり、ＡＬＥＸ１蛋白はアダプター蛋白として機能し、ＩＤＥをＰＳ１、すなわちβアミロイドペプチド産生の場の近傍に誘導する可能性が高い。興味深い事に、アルツハイマー病の原因となるＰＳ１変異はＡｒｍリピート蛋白との結合に影響を与えない（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９５，６９８−７０２）事が報告されている。この事から、ＡＬＥＸ１がＰＳ１と複合体を形成しており、ＡＬＥＸ１の変異または発現の低下が、この複合体形成を弱めるかあるいは破壊する事により病態に寄与している可能性が考えられる。この関連に於いて、晩発性アルツハイマー病原因遺伝子の全ゲノムにわたる最近の検索の結果、幾つかの候補遺伝子座の中にＡＬＥＸ１が位置するＸ染色体の部分（Ｋｅｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８，２３７−２４５）、及びＩＤＥが位置する第１０染色体長腕部分（Ｂｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０，２３０２−２３０３，Ｅｒｔｅｋｉｎ−Ｔａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ｉｂｉｄ，２３０３−２３０４，Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ｉｂｉｄ，２３０４−２３０５）に疾病感受性遺伝子座が見出されていることも、上記可能性を示唆している。βカテニンあるいは他のアルマジロリピート含有蛋白の機能からの類推により、正常脳組織に於いてはＡＬＥＸ１がアルマジロリピートを介してｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１（ＰＳ−１）と結合する事により、ＩＤＥをβアミロイドペプチド産生の場に誘導し、βアミロイドペプチドの分解に寄与する事によってβアミロイドペプチドの蓄積を制御している可能性が示唆される。
従って、ＡＬＥＸ１蛋白質はアルツハイマー病の予防または治療のための標的分子となり、ＡＬＥＸ１遺伝子またはＡＬＥＸ１蛋白質を用いた薬剤のスクリーニングにより新規なアルツハイマー病治療薬の開発が可能である他、ＡＬＥＸの発現を検出することにより、アルツハイマー病の診断・検査を行うことができると考えられる。
ＡＬＥＸ１発現解析の結果、白血球を除く殆ど全てのヒト組織に於いて発現が認められた（図４）。最も高い発現は心臓、骨格筋、脳、卵巣および前立腺に於いて認められ、肝臓、胸腺に於いては辛うじて発現を認める程度であった。またＡＬＥＸ１の発現は調べた限りに於いてヒト脳の全ての領域に認められた。末梢白血球にのみ発現が認められない事はこの蛋白が何らかの細胞間接着を介したシグナル伝達、あるいは細胞の極性を決定するうえで何らかの関与をしていることを示唆している。実際、全ての検討した組織の中で唯一白血球のみが他から独立した１個の細胞として存在し、長時間安定な極性を持った細胞形態をとる事なく、最も高い運動能を有している。一方これに反して、最も高いＡＬＥＸ１の発現を認める組織である脳、心臓および骨格筋は、身体中の如何なるタイプの細胞と比べても著しく分極した形態を示す細胞によって構成されている。
ＡＬＥＸ１のマウス相同遺伝子の発現は個体発生の過程で制御されており、胎生７日から１１日にかけて顕著な誘導が観察される（図８）。個体発生のこの時期は初期の臓器形成が起こる時期である事から、ＡＬＥＸ１は他のＡｒｍリピート蛋白でＷｎｔシグナル経路の構成要素であるβカテニンと同様、形態形成および／または胎生期に於ける体躯のパターン形成の決定に関与している可能性が示唆される。
ＡＬＥＸ１とＡＬＥＸ２は極めて類似した発現パターンを示した。ＡＬＥＸ１同様、ＡＬＥＸ２のＮ末には膜貫通ドメインが存在し、小胞体膜との結合に関与しているものと推測された。そして最も重要な知見は、ＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２の発現がヒト癌あるいは癌組織に由来する細胞株に於いて著しく低下、若しくは欠失している点にある（図５、６、７）。本発明に於いて、ＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２の転写産物がヒト癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）由来細胞株に於いて低下若しくは消失しているが、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫あるいは肉腫に於いては正常レベルの発現が認められる事が示された。Ｃａｒｃｉｎｏｍａは上皮性組織由来の癌であり、全てのヒト腫瘍の約７０％がこれに属する。ＡＬＥＸ１とＡＬＥＸ２の発現が種々の組織に由来するｃａｒｃｉｎｏｍａに於いて減弱していると云う事実は、この蛋白が正常な細胞増殖を制御する共通な因子である事を示唆している。この２つの遺伝子の発現パターンが正常組織および腫瘍組織の何れに於いても高度に類似している事は２つの遺伝子が同一の転写因子によって制御されている事を示唆している。
ＡＬＥＸ１とＡＬＥＸ２のｍＲＮＡの発現は種々のヒト癌サンプルあるいは種々のヒト癌に由来する細胞株に於いて欠失あるいは有意に低下していたが、これらの遺伝子の発現は他の種類のヒト腫瘍、すなわち肉腫、神経芽細胞腫あるいは神経膠腫由来の細胞株に於いては正常細胞と同等であったという知見から、本発明において、ＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２遺伝子の変異の有無や発現の低下を指標とした上皮性腫瘍の新規な診断方法が提供される。また、ＡＬＥＸ１遺伝子の発現や、ＡＬＥＸ１蛋白質の活性を調節する薬剤を用いて、癌の予防や治療を行うことも可能であると考えられる。
ＡＬＥＸ１の生理的役割を理解する目的で、酵母２ハイブリッド法を用いてＡＬＥＸ１と相互作用する蛋白の同定を試みた。この試みに於いて、ＪＮＫ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＪＩＰ−１）に由来する３つの重複するクローンが得られた。ＪＩＰ−１は近年同定された蛋白でＪＮＫシグナル伝達経路の構成要素である、ＭＬＫ３（ＭＡＰＫＫＫ）→ＭＫＫ７（ＭＡＰＫＫ）→ＪＮＫ（ＭＡＰＫ）のリン酸化酵素を結合して反応の足場となる事により、効率良いシグナル伝達を可能とする（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，１６７１−１６７４）。ＭＫＫ７はＴＮＦα刺激あるいは浸透圧のショックを与えた細胞に於ける主要なＪＮＫの活性化因子である。さらに本発明者らは、ｃ−Ｊｕｎ依存レポーター遺伝子システムを利用してｉｎ  ｖｉｖｏに於けるＡＬＥＸ１のｃ−Ｊｕｎ依存転写活性化に及ぼす効果を検討した。その結果、ＡＬＥＸ１の発現は用量依存的にｃ−Ｊｕｎに依存した転写活性化を著明に阻害する事が判明した。種々の欠失変異ＪＩＰ−１蛋白を用いた検討から、ＪＩＰ−１のＡＬＥＸ１結合部位は報告されているＭＫＫ７結合ドメインと重複しているがＪＮＫあるいはＭＬＫ３の結合部位とは異なる事が判明した。以上の結果より、ＡＬＥＸ１は足場蛋白であるＪＩＰ−１とＭＫＫ７との結合を競合阻害する事によりＪＮＫシグナル経路を負に制御しているものと推察される。すなわちＡＬＥＸ１がＭＫＫ７のステップを阻害する事により、上流であるＭＬＫ３から下流のｅｆｆｅｃｔｏｒであるＪＮＫへのシグナルの流れが中断される。従ってＡＬＥＸ１の発現が低下あるいは消失した癌細胞に於いては負の制御が消失する事からＪＮＫさらにはｃ−Ｊｕｎが活性化され腫瘍化に寄与しているものと考えられる。
さらに本発明者らは、ＡＬＥＸ１のＮ末端に存在する膜貫通ドメイン（アミノ酸番号１−２７）を除去したものをｂａｉｔとする酵母２ハイブリッド法を用いて、ＡＬＥＸ１と相互作用する蛋白の検索を行った結果、ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、およびＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅが、上記のＮ末が欠失したＡＬＥＸ１蛋白質と相互作用することを見出した。
ＡＬＥＸ１蛋白質のこれらの活性を指標に、ＡＬＥＸ１蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングすれば、癌やアルツハイマー病に対する予防や治療に有効な薬剤を得ることが可能であると考えられる。
すなわち本発明のＡＬＥＸ１蛋白質およびこれをコードする遺伝子は、癌およびアルツハイマー等の疾患の検査のための指標として、また、これら疾患の病理機構の解明のためのツールとして、さらには、これら疾患に対する医薬品開発のための標的として有用であると考えられる。
本発明は新規「ＡＬＥＸ１」蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子、並びにそれらの製造および用途に関し、より具体的には、
（１）アルマジロリピート構造を有する蛋白質をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（２）インスリン・デグレーディング・エンザイム（ＩＤＥ）、プレセニリン−１（ＰＳ−１）、ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、およびＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅからなる群より選択される蛋白質と結合する活性を有する蛋白質をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（３）ＪＮＫインターラクティング・プロテイン１（ＪＩＰ−１）蛋白質に結合する活性を有する蛋白質をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（４）ｃ−Ｊｕｎ依存的転写を阻害する活性を有する蛋白質をコードする（３）に記載のＤＮＡ、
（５）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
（６）（１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質またはペプチド、
（７）（１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
（８）（１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（７）に記載のベクターを保持する宿主細胞、
（９）（８）に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、（６）に記載の蛋白質またはペプチドの製造方法、
（１０）（６）に記載の蛋白質に結合する抗体、
（１１）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
（１２）アルツハイマー病または癌の検査のために用いる、（１）から（４）のいずれかに記載のＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
（１３）（６）に記載の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１４）（１）から（４）のいずれかに記載のＤＮＡの発現を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該ＤＮＡを内因的に発現する細胞に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該発現を検出する工程、
（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合と比較して、該発現を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１５）（１）から（４）のいずれかに記載のＤＮＡの発現を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）（１）から（４）のいずれかに記載のＤＮＡの内因的転写制御配列の下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を有するベクターが導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内におけるレポーター遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合と比較して、レポーター遺伝子の発現を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１６）（２）に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質とインスリン・デグレーディング・エンザイム（ＩＤＥ）、プレセニリン−１（ＰＳ−１）、ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、およびＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅからなる群より選択される蛋白質との結合を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下、（２）に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質とインスリン・デグレーディング・エンザイム（ＩＤＥ）、プレセニリン−１（ＰＳ−１）、ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、およびＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅからなる群より選択される蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）これら蛋白質の結合を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質の結合を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１７）（３）に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質とＪＩＰ−１蛋白質との結合を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下、（３）に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質とＪＩＰ−１蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）これら蛋白質の結合を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質の結合を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１８）（３）に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質の活性を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）（３）に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質を発現させた細胞に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞におけるＭＫＫ７／ＪＮＫを介するシグナル伝達を検出する工程、
（ｃ）該シグナル伝達を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１９）工程（ｂ）において、ＭＫＫ７／ＪＮＫを介するシグナル伝達をｃ−Ｊｕｎ依存的な転写を指標として検出する、（１８）に記載の方法、
（２０）（１３）から（１９）のいずれかに記載の方法により単離されうる化合物、
（２１）（２０）に記載の化合物を有効成分とする医薬組成物、
（２２）アルツハイマー病または癌の予防または治療のための、（２１）に記載の医薬組成物、
（２３）アルツハイマー病または癌の検査方法であって、患者由来の被検試料中における（６）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡの発現量を検出する工程を含む方法、
（２４）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法によりＤＮＡの発現量を検出する、（２３）に記載の方法、
（ａ）患者由来のＲＮＡ試料に（１２）に記載のポリヌクレオチドを接触させる工程
（ｂ）該ＲＮＡ試料への該ポリヌクレオチドの結合を検出する工程
（２５）下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法によりＤＮＡの発現量を検出する、（２４）に記載の方法、
（ａ）患者由来のＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成する工程
（ｂ）合成したｃＤＮＡを鋳型に、（１２）に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程
（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡを検出する工程
（２６）アルツハイマー病または癌の検査方法であって、患者由来の被検試料中における（６）に記載の蛋白質の存在量を検出する工程を含む方法、
（２７）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法により蛋白質の存在量を検出する、（２６）に記載の方法、
（ａ）患者由来の蛋白質試料に（１０）に記載の抗体を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質試料への該抗体の結合を検出する工程、を含む方法、
（２８）アルツハイマー病または癌の検査方法であって、（６）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡにおける変異を検出することを特徴とする方法、
（２９）（６）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、健常者の配列と比較する工程を含む、（２８）に記載のアルツハイマー病または癌の検査方法、
（３０）下記（ａ）から（ｆ）の工程を含む方法により変異を検出する、（２９）に記載の方法、
（ａ）患者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）（１２）に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いて患者由来のＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）分離したＤＮＡ断片に対し、検出可能な標識をした（１２）に記載のポリヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイズさせる工程
（ｆ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、健常者の対照と比較する工程
（３１）下記（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法により変異を検出する、（２９）に記載の方法、
（ａ）患者からＲＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）大きさに応じて調製したＲＮＡを分離する工程
（ｃ）分離したＲＮＡに対し、検出可能な標識をした（１２）に記載のポリヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイズさせる工程
（ｄ）検出されたＲＮＡの大きさを、健常者の対照と比較する工程
（３２）下記（ａ）から（ｆ）の工程を含む方法により変異を検出する、（２９）に記載の方法、
（ａ）患者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）（１２）に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして患者由来のＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程
（３３）下記（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法により変異を検出する、（２９）に記載の方法、
（ａ）患者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）（１２）に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして患者由来のＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程
（３４）アルツハイマー病または癌の検査方法であって、（６）に記載の蛋白質における変異を検出することを特徴とする方法、
（３５）変異の検出が、ＩＤＥ、ＰＳ−１、ＪＩＰ−１、ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、およびＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅからなる群より選択される蛋白質との結合活性を指標として行われる、（３４）に記載の方法、
（３６）（１０）に記載の抗体を含むアルツハイマー病または癌の検査試薬、
（３７）（１２）に記載のポリヌクレオチドを含むアルツハイマー病または癌の検査試薬、に関する。
本発明は、新規アルマジロリピート含有蛋白質をコードする遺伝子「ＡＬＥＸ１」に関する。ヒト由来のＡＬＥＸ１  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１および２に、これらのｃＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。配列番号：１および２に示すように、ヒトＡＬＥＸ１  ｃＤＮＡは、４５３アミノ酸からなる蛋白質をコードするＯＲＦを有する。本発明のヒトＡＬＥＸ１蛋白質はＩＤＥと結合し、さらにｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１とも相互作用することから、アルツハイマー病の発症に関与していると考えられる。
また、ノーザンブロット解析およびＲＴ−ＰＣＲ法解析により、ヒトＡＬＥＸ１遺伝子は様々な組織で発現が見られ、特に卵巣、心臓、睾丸、前立腺、脳、脾臓、骨格筋、および大腸に於いて特に高いのに対して肝臓、胸腺に於ける発現は弱かった。また末梢白血球に於けるｍＲＮＡの発現は検出限界以下であった。また、癌細胞および癌組織を用いてＡＬＥＸ１の発現を解析した結果、ＡＬＥＸ１の発現は上皮性癌において有意に発現が低下していることが判明した。このことから、本発明のＡＬＥＸ１の発現を検査することにより、癌の検査を行うことも可能である。
本発明は、また、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質（配列番号：３）と機能的に同等な蛋白質を包含する。このような蛋白質には、例えば、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質の変異体、ヒト以外の生物のホモログ等が含まれる。このような蛋白質には、例えば、アルマジロリピート構造を有する蛋白質が含まれる。アルマジロリピート構造を持つか否かは、得られたアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ（質問式）としてＰｆａｍアルゴリズム（Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：２６０−２６２（１９９９））にて解析する事により判定することができる。
Ｐｆａｍによる解析は、例えば、Ｓａｎｇｅｒ  ｃｅｎｔｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／ｓｅａｒｃｈ．ｓｈｔｍｌ）のシステムを利用して行うことができる。Ｅ−ｖａｌｕｅのｃｕｔｏｆｆ値は２０に設定する。Ｅ−ｖａｌｕｅが２０以下（より高精度では１５以下）であれば、検索した蛋白質のアミノ酸配列はアルマジロリピート構造を有すると判定される。例えば、ＡＬＥＸ１（配列番号：３）の場合、最初のａｒｍ  ｒｅｐｅａｔ（アミノ酸番号１９３−２３５）はＥ−ｖａｌｕｅ＝１１、２番目のａｒｍ  ｒｅｐｅａｔはＥ−ｖａｌｕｅ＝２．１で検出される。同様にＫＩＡＡ０１５２（ＡＬＥＸ２）およびＡＬＥＸ３の場合はそれぞれ１個のａｒｍ  ｒｅｐｅａｔがアミノ酸番号４１６−４５７（Ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．５６）、アミノ酸番号１５１−１９２（Ｅ−ｖａｌｕｅ＝９．３）で検出される。また、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ  Ｓｅｒｖｅｒにて行った解析では、ＡＬＥＸ１のアミノ酸番号２４７−２８４に１個のａｒｍ  ｒｅｐｅａｔがｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｓｃｏｒｅとして８．８０２で検出されｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｍａｔｃｈ（有意なマッチ）との結果が得られる。
また、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質（配列番号：３）と機能的に同等な蛋白質としては、インスリン・デグレーディング・エンザイム（ＩＤＥ）蛋白質（Ｋｕｒｏｃｈｋｉｎ，Ｉ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｇｏｔｏ，Ｓ．（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４５，３３−３７；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ａ．Ｍ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２２，４９−５６；Ｑｉｕ，Ｗ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２７３０−３２７３８）に結合する活性を有する蛋白質が含まれる。
ある蛋白質のＩＤＥ蛋白質との結合活性は、例えば、免疫沈降法によりＩＤＥ蛋白を抗ＩＤＥ抗体あるいは特異的なタグを付加したＩＤＥを抗タグ抗体で沈降せしめ、共沈してくる蛋白質を検出する時に、目的の蛋白質にタグを付加しておき、このタグに対する抗体で検出したり、または目的の蛋白質に対する特異抗体を用いて検出する事により、高感度に検出することが可能である。他の方法としては、抗体を使わず、ビーズに結合させたＩＤＥを細胞抽出液と混合して吸着した蛋白質を解析するｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法、あるいはＢＩＡｃｏｒｅにより直接結合を観察する方法、さらにはＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法にて生細胞中での結合を機能的に観察する方法等により、ＩＤＥ蛋白質との結合活性を検出することができる。
上記で用いるＩＤＥ蛋白質は、野生型蛋白質を用いることができるが、変異が導入されたＩＤＥ蛋白質を用いることも考えられる。例えば、実施例に示したＨ１０８Ｑの変異は、ＩＤＥ蛋白質の基質結合活性を保持したまま蛋白分解酵素活性を喪失させる変異である。この変異を導入する事により、結合アッセイを酵母細胞内等で行わせた場合にＩＤＥ蛋白の宿主細胞に対する細胞障害活性を除去する効果と、ＩＤＥに結合した蛋白がＩＤＥの基質であった場合に分解を受けて結合が解消されてしまう事を回避する効果とが得られる。従って、より安定に結合を検出する為にはＨ１０８Ｑを用いることが好ましいと考えられる。また、ＩＤＥに結合する蛋白を安定的に検出することができる限り、他の変異ＩＤＥ蛋白質を用いてもよい。
また、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質（配列番号：３）と機能的に同等な蛋白質としては、プレセニリン−１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１）蛋白質（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  ＷＴ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５（５）３１７３−８；Ｓｅｌｋｏｅ，ＤＪ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８，８，４４７−４５３）に結合する活性を有する蛋白質が含まれる。また、ＪＮＫインターラクティング・プロテイン１（ＪＩＰ−１）蛋白質（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，１６７１−１６７４）に結合する活性を有する蛋白質が含まれる。ＰＳ−１蛋白質との結合活性を有するか否か、そしてＪＩＰ−１蛋白質との結合活性を有するか否かは、上記のＩＤＥ蛋白質との結合活性の検出と同様に、免疫沈降法、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法等により判定することが可能である。
本発明の、ＪＩＰ−１に結合する活性を有する蛋白質は、好ましくはｃ−Ｊｕｎ依存的な転写を阻害する活性を有する。ｃ−Ｊｕｎ依存的な転写を阻害する活性を有するか否かは、例えば、実施例に記載したように、ｃ−Ｊｕｎ依存的ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて、目的の被検蛋白質を発現するベクターを、例えばＭＥＫＫ１発現ベクターと共にトランスフェクトし、ＭＥＫＫ１によるｃ−Ｊｕｎ依存的な転写の活性化を該被検蛋白質が阻害するか否かを、レポーター遺伝子の発現を指標にして決定することが可能である。
また、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質（配列番号：３）と機能的に同等な蛋白質としては、ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、およびＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅからなる群より選択される蛋白質に結合する活性を有する蛋白質が含まれる。これらの蛋白質との結合活性を有するか否かは、上記のＩＤＥ蛋白質との結合活性の検出と同様に、免疫沈降法、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法等により判定することが可能である。これらの蛋白質としては、具体的には以下に示される遺伝子がコードする蛋白質が挙げられる。
ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）：Ａｒｍリピート含有ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ結合蛋白
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｘ８１８８９；Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｐ００７１  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００３６２８；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ  ４（ＰＫＰ４），ｍＲＮＡ
ＳＡＲＴ−１：ヒト扁平上皮癌抗原、増殖細胞のみにて発現
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＢ００６１９８；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＳＡＲＴ−１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｙ１４３１４；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＩｇＥ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ
ＭＳＰ５８：核蛋白、増殖に関連した核蛋白ｐ１２０と相互作用、増殖細胞のみにて発現
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ０１５３０８；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＳＰ５８）ｍＲＮＡ、
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ０６８００７；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｐ７８  ｍＲＮＡ  ＡＴＲＸ：マウス大腸腺癌抗原、細胞周期依存性にリン酸化を受ける、ＳＮＦ２ファミリーのｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅのメンバー
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｕ７２９３８；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＡＴＰａｓｅ  ａｎｄ  ｈｅｌｉｃａｓｅ（ＡＴＲＸ）ｍＲＮＡ，ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ３、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０００４８９；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｌｐｈａ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ／ｍｅｎｔａｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ（ＲＡＤ５４（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｈｏｍｏｌｏｇ）（ＡＴＲＸ），ｍＲＮＡ
ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：軟骨肉腫関連蛋白、核内に点状に分布、転写関連機能？
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ１８２６４５；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ    ２（ＣＳＡ２）ｍＲＮＡ
ｐ６８：ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｘ５２１０４；Ｈｕｍａｎ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｐ６８  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４３９６；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＤＥＡＤ／Ｈ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ／Ｈｉｓ）ｂｏｘ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ５（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ，６８ｋＤ）（ＤＤＸ５），ｍＲＮＡ
ＯＳ−９：ヒト肉腫で増幅、核移行シグナル含有
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００６８１２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ（ＯＳ−９），ｍＲＮＡ
ＺＮＦ１８９：Ｃ２Ｈ２  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ蛋白
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ０２５７７０；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃ２Ｈ２  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＺＮＦ１８９）ｍＲＮＡ
ＫＩＡＡ１２２１：Ｃ２Ｈ２  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ蛋白
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＢ０３３０４７；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＫＩＡＡ１２２１  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐａｒｔｉａｌｃｄｓ
α−Ａｃｔｉｎｉｎ４：アクチン重合に関与、細胞運動、癌の浸潤に関与
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４９２４；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｃｔｉｎｉｎ，ａｌｐｈａ  ４（ＡＣＴＮ４），ｍＲＮＡ  ＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅ
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＢ０２２３４１；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅ
ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、蛋白質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．Ｊ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ．（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質（配列番号：３）のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質（配列番号：３）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明の蛋白質に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、１００アミノ酸以内であり、好ましくは５０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内（例えば５アミノ酸以内）であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。このように、アミノ酸が保存的置換を受けた蛋白質は本発明の蛋白質に含まれる。
あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，５６６２−５６６６；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００；Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４，１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９，６４０９−６４１３）。
ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白質には、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質を含む融合蛋白質が含まれる。融合蛋白質は、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質と他のペプチドまたは蛋白質とが融合したものであり、このような融合タンパク質もまた本発明に含まれる。融合蛋白質を作製する方法は、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質（配列番号：３）をコードするＤＮＡと他のペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡとをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチドまたは蛋白質としては、特に限定されない。
本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の蛋白質との融合に付される他の蛋白質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合蛋白質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡを、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合蛋白質を調製することができる。
また、ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製するための、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１または２）もしくはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡからヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質と機能的に同等な蛋白質を単離することも通常行いうることである。本発明には、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質をコードするＤＮＡもしくはその一部からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードする蛋白質であって、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質と機能的に同等な蛋白質が含まれる。このような蛋白質としては、例えば、ヒト以外の哺乳動物のホモログ（例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシなどがコードする蛋白質）が挙げられる。また、ＡＬＥＸ遺伝子はファミリーを形成していることから、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質をコードするＤＮＡをプローブやプライマーとして用いて、他のＡＬＥＸファミリー遺伝子を単離することも可能である。例えば、ＡＬＥＸ１のアミノ酸配列中特にＡｒｍリピートを含むアミノ酸番号２００番からＣ末端までの２２６アミノ酸配列またはその一部を基にプローブやプライマーを設計し、適当なストリンジェンシー下でのハイブリダイゼーションや、ＰＣＲによる増幅を行うことが考えられる。ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質をコードするＤＮＡと相同性の高いｃＤＮＡを動物から単離する場合、例えば卵巣、心臓、睾丸、前立腺、脳、脾臓、骨格筋、および大腸などを含む、本発明の蛋白質を発現していることが予想される多くの組織や細胞を用いることができるが、それらの臓器に限定されない。
ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えばハイブリダイゼーション後の洗浄において、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられ、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。またより好ましくは、例えば６５℃、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、ハイブリダイゼーションにかえて、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または２）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、通常、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質（配列番号：３）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の蛋白質には、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質と機能的に同等であり、かつ配列番号：３に示されるアミノ酸配列と高い相同性を有する蛋白質も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも６０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。蛋白質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明の蛋白質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点または糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた蛋白質は、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。
本発明の蛋白質は、当業者に公知の方法により、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として調製することが可能である。組み換え蛋白質であれば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば配列番号：１または２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の蛋白質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明の蛋白質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換え蛋白質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換え蛋白質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて融合蛋白質のうち、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然の蛋白質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明の蛋白質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明の蛋白質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明の蛋白質に対する抗体の作製、本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明の蛋白質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。また、本発明の蛋白質のアンタゴニストや競合阻害剤になり得る。本発明の蛋白質の部分ペプチドとしては、例えばヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質（配列番号：３）の機能ドメインを含む部分ペプチドが挙げられる。このような機能ドメインとしては、例えばＡｒｍドメインが挙げられる。１つまたは複数のＡｒｍドメイン（Ａｒｍ１および／またはＡｒｍ２）（図２参照）を含む部分ペプチドは、本発明の部分ペプチドに含まれる。また、「ＡＬＥＸ１」の膜貫通ドメインを欠失した部分蛋白質（例えば１〜２７アミノ酸を欠失した蛋白質）等であってもよい。本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、上述したような本発明の蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明の蛋白質により治療可能な疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明の蛋白質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明の蛋白質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明の蛋白質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１または２）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明の蛋白質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１または２）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明の蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。同様に、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の内因的転写制御配列を得ることもできる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明の蛋白質を発現する細胞、組織、臓器（例えば、卵巣、心臓、睾丸、前立腺、脳、脾臓、骨格筋、および大腸などの組織）から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製することにより行うことができる。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたＤＮＡ配列等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法や３’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２）に従い、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組み換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組み換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９，ｒ４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）および／または終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、またはＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番号：１の塩基配列において３７２位の塩基Ａから１７３０位の塩基ＣからなるＤＮＡ、配列番号：２の塩基配列において３６４位の塩基Ａから１７２２位の塩基ＣからなるＤＮＡを包含する。
本発明のＤＮＡはまた、配列番号：１または２に示す塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ上記本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを含む。ハイブリダイゼーションにおける条件は当業者であれば適宜選択することができるが、具体的には上記した条件を用いることができる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡを得ることができる。上記のハイブリダイズするＤＮＡは、好ましくは天然由来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡである。
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明の蛋白質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させて大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６；Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．（１９９２）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外においても、例えば、本発明の蛋白質を製造するためのベクターとして、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）や、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７，１０８−１１４）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３等が挙げられる。
さらに、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅させ、遺伝子を安定的に発現させるには、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩ等）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤ等）で形質転換する方法が挙げられる。複製起点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等に由来するものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明の「ＡＬＥＸ１」遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，５．６１−５．６３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ）。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞に関する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の蛋白質の製造や発現のための産生系として使用することができる。蛋白質製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｋａｏ，Ｆ．Ｔ．ａｎｄ  Ｐｕｃｋ，Ｔ．Ｔ．（１９６８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６０，１２７５−１２８１）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリポソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を、目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより蛋白質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏで蛋白質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物または植物の体内で蛋白質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、または昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ等を用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的の蛋白質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｍａ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明の蛋白質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。蛋白質の分離、精製は、通常の蛋白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば蛋白質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用いて高度に精製された蛋白質も包含する。
なお、蛋白質の精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明は、また、本発明の蛋白質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明の蛋白質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明の蛋白質は、その由来となる動物種に制限されないが、哺乳動物、例えばヒト、マウスまたはラット由来の蛋白質が好ましく、特にヒト由来の蛋白質が好ましい。ヒト由来の蛋白質は、本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用される蛋白質は、完全な蛋白質であってもよいし、また、蛋白質の部分ペプチドであってもよい。蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、蛋白質のアミノ（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。また、「ＡＬＥＸ１」の膜貫通領域を含むペプチド等であってもよい。本明細書で述べる「抗体」とは蛋白質の全長または断片に反応する抗体を意味する。
本発明の蛋白質またはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターにより本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的の蛋白質またはその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、蛋白質を発現する細胞またはその溶解物あるいは化学的に合成した本発明の蛋白質を感作抗原として使用してもよい。短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンなどのキャリア蛋白質と適宜結合させて抗原とすることが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇することを常法により確認する。
ここで、本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明の蛋白質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇することを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質、蛋白質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明の蛋白質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明の蛋白質の精製、検出に用いられる他、本発明の蛋白質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、本発明の抗体は、ヒト抗体またはヒト型化抗体であってもよい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となる蛋白質、蛋白質発現細胞またはその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いて蛋白質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組み換え技術を用いて産生させた組み換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。組み換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマまたは抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
さらに、本発明の抗体は、本発明の蛋白質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体または非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）および定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定または酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明の蛋白質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。蛋白質として、蛋白質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と本発明の蛋白質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該蛋白質との免疫複合体を検出または測定することからなる、本発明の蛋白質の検出または測定方法を実施することができる。本発明の蛋白質の検出または測定方法は、蛋白質を特異的に検出または測定することができるため、蛋白質を用いた種々の実験等に有用である。また、後述のアルツハイマー病または癌の検査に有用である。
本発明はまた、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または２）またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの検出、増幅、該ＤＮＡの発現の検出、または該発現の制御に有用である。ここで、ＤＮＡの検出には、ＤＮＡの変異の検出も含まれる。
ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドとしては、ヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または２）またはその相補鎖にハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが含まれる。好ましくは、該ポリヌクレオチドはヒト「ＡＬＥＸ１」蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または２）またはその相補鎖に特異的にハイブリダイズする。特異的にハイブリダイズするとは、通常のハイブリダイゼーションの条件下、好ましくは上記ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件で他の蛋白質をコードするＤＮＡと有意にハイブリダイズしないことを言う。
このようなポリヌクレオチドには、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該ＤＮＡの発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明の蛋白質の発現を制御するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡ等）が含まれる。また、このようなポリヌクレオチドは、ＤＮＡチップやマイクロアレイの作製に利用することもできる。本発明のポリヌクレオチドには、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。また、センスヌクレオチドおよびアンチセンスヌクレオチドが含まれる。
プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的とし、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１または２の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１または２の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型またはエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体またはホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１または２に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１または複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明の蛋白質の産生細胞に作用して、該蛋白質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合することにより、その転写または翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明の蛋白質の発現を抑制することにより、結果的に本発明の蛋白質の作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、または血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチンまたはこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の蛋白質の発現を阻害し、従って本発明の蛋白質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明の蛋白質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
本発明の抗体および本発明のポリヌクレオチドは、癌およびアルツハイマー病の検査に有用である。本発明の「ＡＬＥＸ１」遺伝子は、癌細胞において有意に発現が低下していた。これは、「ＡＬＥＸ１」が癌の検査に利用できることを示している。例えば、被検試料において、本発明の蛋白質または該蛋白質をコードするｍＲＮＡを検出することにより、癌細胞の存在や癌の進行を検査することが可能である。また、「ＡＬＥＸ１」蛋白質は、βアミロイド代謝に関与するＩＤＥと相互作用し、さらにＰＳ−１とも相互作用することから、アルツハイマー病の発症および進行に深く関与していると考えられる。従って、「ＡＬＥＸ１」はアルツハイマー病の検査・診断にも利用することが可能である。
本発明において「アルツハイマー病または癌の検査」とは、ＡＬＥＸ１遺伝子の変異に起因してアルツハイマー病または癌の症状を発現している患者の検査のみならず、被験者がＡＬＥＸ１遺伝子の発現量の異常または遺伝子の変異に起因してアルツハイマー病または癌にかかりやすいか否かを判断するために行う、ＡＬＥＸ１遺伝子の発現量の検査、および遺伝子の変異の検査も含まれる。すなわち、ＡＬＥＸ１遺伝子の発現の異常や、ＡＬＥＸ１対立遺伝子の片方に変異が生じることなどにより、表面上は未だ症状を発現していない場合においても、アルツハイマー病または癌にかかる危険性が非常に増大しているものと考えられる。
本発明のアルツハイマー病または癌の検査は、例えば本発明の蛋白質に結合する抗体、あるいは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用して行うことができる。これら本発明の抗体や本発明のポリヌクレオチドを検査試薬として用いる場合は、適宜安定剤、保存剤、塩、緩衝剤などの溶質、水、生理食塩水などの溶媒と組み合わせることができる。
本発明のアルツハイマー病または癌の検査方法の一つは、被検試料中における本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの発現量を検出する工程を含む方法である。このような検査方法は、（ａ）患者由来のＲＮＡ試料に上記のポリヌクレオチドを接触させる工程、（ｂ）該ＲＮＡ試料への該ポリヌクレオチドの結合を検出する工程、を含む方法が含まれる。このような検査は、例えばノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲなどにより行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲを利用した本発明の検査は、具体的には（ａ）患者由来のＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成する工程、（ｂ）合成したｃＤＮＡを鋳型に、上記ポリヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡを検出する工程、を含む。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲは、公知の遺伝子工学技術により行うことができる。また、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイによる検出も可能である。
また、本発明のアルツハイマー病または癌の検査方法には、患者由来の被検試料中における本発明の蛋白質の存在量を検出する工程を含む方法が含まれる。このような検査は、例えば本発明の蛋白質に対する抗体を用いて行うことができる。本発明の抗体を用いた検査は、具体的には、（ａ）患者由来の蛋白質試料に本発明の抗体を接触させる工程、（ｂ）該蛋白質試料への該抗体の結合を検出する工程、を含む。蛋白質の検出は、本発明の抗体を用いた免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡなどにより行うことができる。
これらの検査は、具体的には、例えばバイオプシーにより採取した組織に対して、免疫組織染色あるいはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の方法で発現を調べる事により癌病巣やアルツハイマー病叢を特定することが考えられる。ＡＬＥＸ１の発現の低下は、癌またはアルツハイマー病の発症および／または進展の可能性を示唆する。また、癌やアルツハイマーなどの疾患は、種々の原因で起こっていると考えられる。例えば癌においてＡＬＥＸ１の発現の低下が認められた場合、ＪＮＫ経路が活性化されている事が予測される事から、この経路を標的とした治療法を施行する、と云ったテーラーメード療法を行う際の診断に利用することが考えられる。
本発明のアルツハイマー病または癌の検査は、また、本発明の蛋白質における変異または該蛋白質をコードするＤＮＡにおける変異を検出することによって行うことも考えられる。ＡＬＥＸ１遺伝子はアルツハイマー病および癌の発症および／または進展に関与していると考えられることから該蛋白質および該ＤＮＡの変異は、アルツハイマー病または癌の発症や進展の危険を示唆する。
本発明の蛋白質の変異には、構造的変異および機能的変異が含まれる。例えば、本発明の抗体を用いて、患者由来の蛋白質試料のウェスタンブロット等により蛋白質の分子量を健常者由来の蛋白質と比較することにより、蛋白質の構造的変異を検査することができる。また、蛋白質の修飾の変化、本発明の蛋白質と結合する蛋白質または抗体の結合性の変化などを指標に、本発明の蛋白質の変異を検出することもできる。これらの検査には、例えば本発明の蛋白質に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法などを利用することができる。
本発明のアルツハイマー病または癌の検査は、本発明の蛋白質と、ＩＤＥ蛋白質、ＰＳ−１蛋白質、またはＪＩＰ−１蛋白質との結合を検出することにより行うこともできる。あるいは、本発明の蛋白質と、ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、またはＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅとの結合を検出することにより行うこともできる。本発明の蛋白質とこれらの蛋白質との結合の阻害は、アルツハイマー病または癌の発症や進展に寄与していると考えられる。蛋白質の結合は、例えば本発明の蛋白質に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法などにより評価することができる。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡにおける変異の検出には、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列、およびゲノムＤＮＡ配列（内因性転写制御配列も含む）の塩基配列、またはその相補鎖と相補的なオリゴヌクレオチド（プローブおよびプライマー）が利用されうる。なお、変異の検査には、ＡＬＥＸ１対立遺伝子の片方のアレルに変異を持つ患者（キャリアー）を特定するための検査も含まれる。
プライマーとして用いられる場合、ポリヌクレオチドは、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、ＡＬＥＸ１遺伝子またはその発現を調節する領域の少なくとも一部を増幅しうるものであればいかなるものでもよい。このような領域としては、例えば、ＡＬＥＸ１遺伝子のエキソン領域、イントロン領域、プロモーター領域、エンハンサー領域が含まれる。
一方、プローブとしてのポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドであれば、通常、少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。プラスミドＤＮＡなどのベクターに組み込んだクローンから得た二本鎖ＤＮＡをプローブとして用いることも可能である。プローブとしては、ＡＬＥＸ１遺伝子またはその発現を調節する領域の少なくとも一部の塩基配列またはそれらの相補鎖に相補的であればいかなるものでもよい。プローブがハイブリダイズする領域としては、例えば、ＡＬＥＸ１遺伝子のエキソン領域、イントロン領域、プロモーター領域、エンハンサー領域が含まれる。プローブとして用いる場合、ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ＤＮＡは適宜標識して用いられる。標識する方法としては、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてポリヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法や、クレノウ酵素などのＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドなどをプライマーとして３２Ｐなどのアイソトープや、蛍光色素あるいはビオチンなどによって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法など）が挙げられる。
ＡＬＥＸ１遺伝子の変異を検出する方法の一つの態様は、患者のＡＬＥＸ１遺伝子の塩基配列を直接決定する方法である。例えば、上記ヌクレオチドをプライマーとして、ＡＬＥＸ１の変異に起因する疾患の疑いのある患者から単離したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などにより、患者のＡＬＥＸ１遺伝子の一部もしくは全部（例えばエキソン、イントロン、プロモーター、エンハンサーを含む領域）を増幅し、その塩基配列の決定を行う。これを健常者のＡＬＥＸ１遺伝子の配列と比較することにより、ＡＬＥＸ１遺伝子の変異に起因する疾患を検査することができる。
本発明の検査方法としては、このように直接患者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に種々の方法が用いられる。その一つの態様は、（ａ）患者からＤＮＡ試料を調製する工程、（ｂ）本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして患者由来のＤＮＡを増幅する工程、（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程、（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程、および（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、を含む。
このような方法として、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ａｌｕ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２  Ｊａｎ  １；１２（１）：１３９−１４６、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１  Ａｕｇ  １；６（８）：１３１３−１３１８、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ａｐｒ  １；４（５）：２７５−２８２）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また試料の量も少なくてすむなどの利点を有するため、特に多数のＤＮＡサンプルをスクリーニングするのに好適である。その原理は以下の如くである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入などによる変異が存在することを検出することができる。
具体的には、まず、ＡＬＥＸ１遺伝子の一部、あるいは全部をＰＣＲ法などによって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。また、増幅される領域としては、ＡＬＥＸ１遺伝子の全てのエキソン、全てのイントロンの他、ＡＬＥＸ１遺伝子のプロモーター、エンハンサーも含まれる。ＰＣＲによる遺伝子断片増幅の際、３２Ｐなどのアイソトープ、あるいは蛍光色素やビオチンなどによって標識したプライマーを用いるか、あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐなどのアイソトープ、あるいは蛍光色素やビオチンなどによって標識した基質塩基を加えてＰＣＲを行うことによって合成されるＤＮＡ断片を標識する。あるいはＰＣＲ反応後にクレノウ酵素などを用いて３２Ｐなどのアイソトープ、あるいは蛍光色素やビオチンなどによって標識した基質塩基を合成されたＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識されたＤＮＡ断片を熱を加えることなどにより変性し、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析する。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
本発明の検査方法の他の態様は、（ａ）患者からＤＮＡ試料を調製する工程、（ｂ）本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして用いて患者由来のＤＮＡを増幅する工程、（ｃ）増幅したＤＮＡを切断する工程、（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程、（ｅ）分離したＤＮＡ断片に対し、検出可能な標識をした本発明のプローブＤＮＡをハイブリダイズさせる工程、および（ｆ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、健常者の対照と比較する工程、を含む。
このような方法としては、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などが挙げられる。ＤＮＡを切断する酵素としては、通常、制限酵素を用いる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入、または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが健常者と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも患者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後サザンブロッティングを行うこともできる。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＡＬＥＸ１遺伝子の一部、あるいは全部を増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることもできる。
また、患者から調製したＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いても同様に検出することが可能である。このような方法は、（ａ）患者からＲＮＡ試料を調製する工程、（ｂ）大きさに応じて調製したＲＮＡを分離する工程、（ｃ）分離したＲＮＡに対し、検出可能な標識をした本発明のポリヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイズさせる工程、および（ｄ）検出されたＲＮＡの大きさを、健常者の対照と比較する工程、を含む。具体的な方法の一例としては、患者から調製したＲＮＡを電気泳動し、本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いてノーザンブロッティングを行い、移動度の差を検出する。
本発明の検査方法の他の態様は、（ａ）患者からＤＮＡ試料を調製する工程、（ｂ）本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして患者由来のＤＮＡを増幅する工程、（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、および（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、を含む方法である。
このような方法としては、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）が挙げられる。ＡＬＥＸ１遺伝子の一部、あるいは全部を本発明のプライマーなどを用いたＰＣＲ法などによって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、健常者と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
これら方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法などにより検出できる。また、リポヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、ＡＬＥＸ１遺伝子の一部、あるいは全部をＰＣＲ法などによって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだＡＬＥＸ１  ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィーなどで検出することによって変異の存在を検出することができる。
本発明の蛋白質は、これに結合する化合物のスクリーニングに有用である。すなわち、本発明の蛋白質と、該蛋白質に結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触せしめ、そして本発明の蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する、ことからなる本発明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方法において使用される。
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え蛋白質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。また部分ペプチドであってもよい。例えば膜貫通ドメインを欠失した部分ペプチド、または膜貫通ドメインを含む部分ペプチドなどを用いてスクリーニングを行ってもよい。ＡＬＥＸ１蛋白質の膜貫通ドメインに結合する化合物は、膜貫通ドメインの機能を妨げることによって、ＡＬＥＸ１蛋白質の細胞内局在を制御することができる可能性がある。スクリーニングに用いる蛋白質は、細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させる本発明の蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、他の蛋白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被検試料に接触させることができる。
本発明の蛋白質を用いて、例えば該蛋白質に結合する蛋白質をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明の蛋白質をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２））、ＥＦ−１α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１，２１７−２２３）、ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００）、ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２，６８４−７０４）、ＳＲ  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，４６６−４７２）、ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，３３６５−３３６９）、ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ，Ｄ．ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３８５−３９４）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，９４６−９５８）、ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６）、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３）、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７，１０２５−１０３７；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，２２−３０；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，２３０−２３４）等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明の蛋白質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合蛋白質として本発明の蛋白質を��現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などとの融合蛋白質を発現することができるベクターが市販されている。
融合蛋白質にすることにより本発明の蛋白質の性質をできるだけ変化させないようにするために、数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合蛋白質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖蛋白質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０蛋白質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明の蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明の蛋白質、それと結合能を有する蛋白質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明の蛋白質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明の蛋白質に対する抗体は、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入した大腸菌内で発現させ、発現させた蛋白質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明の蛋白質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合蛋白質として調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明の蛋白質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降された蛋白質の解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることで結合していた蛋白質を蛋白質の分子量により解析することができる。また、この際、一般的には本発明の蛋白質に結合した蛋白質は、クマシー染色や銀染色といった蛋白質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内の蛋白質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。蛋白質の分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的の蛋白質を精製し、その配列を決定することもできる。
また、本発明の蛋白質を用いて、該蛋白質に結合する蛋白質を単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明の蛋白質と結合する結合蛋白質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、卵巣、心臓、睾丸、前立腺、脳、脾臓、骨格筋、及び大腸などの組織）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させ、フィルターに発現させた蛋白質を固定し、精製して標識した本発明の蛋白質と上記フィルターとを反応させ、本発明の蛋白質と結合した蛋白質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明の蛋白質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明の蛋白質または本発明の蛋白質に融合したペプチドまたはポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法または蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１０，２８６−２９２；Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ，Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製））を用いて行う方法が挙げられる。２−ハイブリッドシステムにおいては、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをＳＲＦ  ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明の蛋白質と結合する蛋白質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードする蛋白質を得ることができる。これにより本発明の蛋白質に結合する蛋白質またはその遺伝子を調製することが可能である。２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
本発明の蛋白質と結合する蛋白質のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明の蛋白質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明の蛋白質に結合した蛋白質を調製することができる。
得られた蛋白質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。
本発明において、結合した蛋白質を検出または測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明の蛋白質と被検蛋白質との間の相互作用を微量の蛋白質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。従って、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明の蛋白質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
また、蛋白質に限らず、本発明の蛋白質に結合する化合物（アゴニスト、およびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明の蛋白質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明の蛋白質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３，４５８−６４；Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｇ．Ｌ．（１９９６）Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８４，１１−１３；Ｈｏｇａｎ，Ｊ．Ｃ．Ｊｒ．（１９９６）Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８４，１７−１９）が当業者に公知である。
また本発明は、本発明の蛋白質とＩＤＥ蛋白質との結合を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。この化合物のスクリーニング方法は、（ａ）被検試料の存在下、本発明の蛋白質とＩＤＥ蛋白質とを接触させる工程、（ｂ）これら蛋白質同士の結合を検出する工程、（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質同士の結合を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む。
また、本発明は、本発明の蛋白質とＰＳ−１蛋白質との結合を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。この化合物のスクリーニング方法は、（ａ）被検試料の存在下、本発明の蛋白質とＰＳ−１蛋白質とを接触させる工程、（ｂ）これら蛋白質同士の結合を検出する工程、（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質同士の結合を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む。
また、本発明は、本発明の蛋白質とＪＩＰ−１蛋白質との結合を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。この化合物のスクリーニング方法は、（ａ）被検試料の存在下、本発明の蛋白質とＪＩＰ−１蛋白質とを接触させる工程、（ｂ）これら蛋白質同士の結合を検出する工程、（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質同士の結合を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む。
さらに本発明は、本発明の蛋白質と、ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、およびＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅからなる群より選択される蛋白質との結合を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。この化合物のスクリーニング方法は、（ａ）被検試料の存在下、本発明の蛋白質と、ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、およびＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅからなる群より選択される蛋白質とを接触させる工程、（ｂ）これら蛋白質同士の結合を検出する工程、（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質同士の結合を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む。
これらスクリーニングに用いられる各蛋白質は、結合能あるいは複合体の形成能を有する限りその形態に制限はなく、蛋白質全長でなくとも、変異体、または部分ペプチドであってもよい。また天然の蛋白質でも組換え蛋白質でもよい。また、他のペプチドとの融合蛋白質であってもよい。これらの蛋白質は、上述した本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリーニングに関する場合と同様にして作製することが可能である。また、ＩＤＥ蛋白質、ＰＳ−１蛋白質、およびＪＩＰ−１蛋白質等の本発明の蛋白質に接触させる蛋白質は、ヒト由来の蛋白質、または他の動物由来の蛋白質等を用いることができる。また、被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞紬出物、真核単細胞抽出物または動物細胞抽出物あるいはそれらのライブラリー、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。スクリーニングに用いる蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、他の蛋白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分としてスクリーニングに用いることができる。
このようなスクリーニングは、例えば酵母または動物細胞を用いた２ハイブリッド法を用いて行うことができる。具体的には、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡと、ＩＤＥ、ＰＳ−１、またはＪＩＰ−１等の本発明の蛋白質に接触させる蛋白質をコードするＤＮＡとを、ＧＡＬ４などのＤＮＡ結合配列と転写活性化ドメインをコードする配列のいずれかと融合させ、細胞内でＧＡＬ４ルシフェラーゼレポーターベクターなどと共発現させて、そのルシフェラーゼ活性を指標に促進または阻害物質をスクリーニングすることができる。
また、例えば免疫沈降を用いてスクリーニングを行うことも可能である。被検試料存在下で、本発明の蛋白質と、ＩＤＥ、ＰＳ−１、またはＪＩＰ−１等の本発明の蛋白質に接触させる蛋白質とをインキュベートし、一方の蛋白質に対する抗体、または該蛋白質に融合させたタグに対する抗体等で複合体を回収したのち、他方の蛋白質を、その蛋白質に対する抗体等を用いて検出することにより、本発明の蛋白質との結合を評価することができる。他方の蛋白質を別のタグ等により標識しておけば、検出を容易にすることができる。また、一方の蛋白質を支持体に結合させておき、他方の蛋白質を結合させ、そこに被検試料を適用する。結合していた蛋白質が解離するかを検出することにより被検試料の効果を調べることができる。また、ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングを行うことも可能である。
また、本発明の蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニングで記載したような表面プラズモン共鳴を利用したスクリーニングや、コンビナトリアルケミストリーを利用したハイスループットスクリーニングなどによりスクリーニングを行うことも可能である。
また本発明は、本発明の蛋白質の発現がＭＫＫ７／ＪＮＫを介するシグナル伝達を阻害することを指標としたスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、（ａ）本発明の蛋白質を発現させた細胞に被検試料を接触させる工程、（ｂ）該細胞におけるＭＫＫ７／ＪＮＫを介するシグナル伝達を検出する工程、（ｃ）該シグナル伝達を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む。被検試料は特に制限はない。
本発明の蛋白質、ＭＫＫ７、およびＪＮＫなどは、内因性であっても、外来的に発現させたものであったもよいが、スクリーニングにより得られる化合物のＡＬＥＸ１に対する特異性を確認する為には、内因性のＡＬＥＸ１発現がない細胞を用い、ＡＬＥＸ１遺伝子を外来的に導入することが好ましい。殆どの上皮性の癌細胞はこの条件の合致する。ＡＬＥＸ１遣伝子を導入しない細胞と比較することにより、ＡＬＥＸ１に対する特異性を確認できる。例えば、実施例１０で用いたＨｅＬａＳ３子宮頚部癌細胞は、内因性のＡＬＥＸ１発現がなくＭＫＫ７を内因性に発現している事から、スクリーニングに用いる細胞として好ましいと考えられる。また、スクリーニングの系があまり複雑にならないためには、ＪＮＫ経路の成分およびＪＩＰ１が内因的に発現していて刺激に応答してＪＮＫ経路が作動する細胞が好ましい。この様な例としては、特に限定されないが、ＭＣＦ７乳癌細胞（Ｍｏｎｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０００，１４１（２）：５４４−５０）あるいはＫＢ３細胞（Ｓｔｏｎｅ，Ａ．Ａ．＆  Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｃ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０００，２５４（１）：１１０−９）などを利用し得る。特に前者ではＩＧＦ−１刺激でＪＮＫ経路が活性化される事が報告されているため、ＭＥＫＫ１の導入を必要とせず、より簡便にスクリーニング系を構築することができると考えられる。
また、例えばヒト口内上皮癌細胞株ＫＢ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１７）を用いることも好適であると考えられる。ＫＢ細胞はＭＫＫ７およびＪＮＫを含んでおり、ＴＮＦαによりＪＮＫ経路が活性化される（Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，７０４５−７０５３）。ＫＢ細胞のＪＮＫ経路は、ＩＬ−１でも活性化することができる（Ｋｒａｕｓｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２３６８１−２３６８９）。また、Ａ５４９細胞を用いることもできる。Ａ５４９細胞はノーザンブロットでもＲＴ−ＰＣＲでもＡＬＥＸ１の発現は検出されない（実施例参照）。この細胞のＪＮＫ経路はＥＧＦにより活性化することができる（Ｂｏｓｔ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３３４２２−３３４２９）。他の細胞としては、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ処理でＪＮＫ経路を活性化することができる卵巣癌細胞株  ＳＫ−ＯＶ−３などが挙げられるが、これらに制限されない（Ｐｅｒｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５，１００７−１０１４）。
ＭＫＫ７／ＪＮＫを介するシグナル伝達は、例えば、実施例１０に示したように、ｃ−Ｊｕｎ依存的な転写を検出することによりスクリーニングを行うことが可能である。具体的には、ＧＡＬ４などの適当なＤＮＡ結合蛋白質と融合させたｃ−Ｊｕｎ蛋白質を発現するベクターと、該ＤＮＡ結合蛋白質の結合配列の下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を連結させたレポーターベクターとを本発明の蛋白質が発現する細胞に導入し、被検試料の存在下または非存在下、レポーターの検出を行うことで、被検試料が、本発明の蛋白質によるｃ−Ｊｕｎ依存的転写の促進または阻害に及ぼす効果を指標としてスクリーニングを行うことができる。他の方法としては、ＪＮＫで活性化される事が報告されているＡＴＦ２依存レポーター活性（Ａｄａｍｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００，７４（３）：１２２４−３３）を検出してもよい。また、ＭＫＫ７によるｃ−ＪｕｎあるいはＡＴＦ２蛋白のリン酸化を、抗体を用いて検出する事も可能である。具体的にはｃ−Ｊｕｎの場合には、リン酸化（Ｎ端）ｃ−Ｊｕｎに対する抗体とｃ−Ｊｕｎの他の部位に対する抗体（あるいは抗タグ抗体）を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡで検出することができる。ＡＴＦ２の場合にも同様な系を利用できる。
上記スクリーニングにより単離しうる、本発明の蛋白質に結合する化合物、本発明の蛋白質とそれに結合する蛋白質との結合を調節する化合物、およびＭＫＫ７／ＪＮＫを介するシグナル伝達を制御する化合物は、例えば本発明の蛋白質の活性を促進または阻害するための薬剤の候補となり、本発明の蛋白質の発現異常や機能異常などに起因する疾患や本発明の蛋白質の活性を制御することにより治療可能な疾患の治療への応用が考えられる。
また、本発明の蛋白質をコードする遺伝子またはその発現制御領域を利用して、生体内または細胞内においてこれら遺伝子の発現（転写および翻訳を含む）を調節しうる化合物をスクリーニングすることも考えられる。このスクリーニングは、例えば、癌やアルツハイマー病の治療薬や予防薬の候補化合物のスクリーニングとして利用しうる。
このスクリーニングは、（ａ）本発明のＤＮＡを内因的に発現する細胞に被検試料を接触させる工程、（ｂ）該発現を検出する工程、および（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該発現を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法により実施しうる。ここでＤＮＡの発現には、転写および翻訳が含まれる。
例えば、ＡＬＥＸ１遺伝子を発現している細胞を被検試料と共に培養し、該遺伝子の発現（転写および翻訳を含む）をノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法などのｍＲＮＡを検出する方法、あるいはウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡなどの蛋白質を検出する方法、またはこれらを改良した方法により検出し、被検試料を添加しない場合と比較して、該遺伝子の発現を促進あるいは阻害する化合物を選択することにより、目的の化合物スクリーニングすることができる。
スクリーニングに用いる細胞に特に制限はないが、癌治療の観点からはＡＬＥＸ１の発現を誘導する事が治療につながると予想されるため、種々のＡＬＥＸ１の発現低下が見られる癌細胞株、子宮頸部腺癌由来細胞株ＨｅＬａ、肺癌由来細胞株Ａ５４９、非小細胞性肺癌由来細胞株ＡＢＣ−１、子宮頸部腺癌由来細胞株Ｃ−３３Ａ等を用いて、ＡＬＥＸ１の発現を促進する化合物をスクリーニングすることが考えられる。逆に発現低下を目的とした場合は、膠芽細胞腫由来細胞株Ａ１７２及び骨肉腫由来細胞株ＴＥ−８５あるいは正常繊維芽細胞株ＭＲＣ５等を用いてスクリーニングを行うことができる。
ノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲなどのｍＲＮＡを検出する方法においては、例えば配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして利用することができる。また、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡなどの蛋白質を検出する方法においては、本発明の抗体を利用することができる。
また、本発明の遺伝子の発現制御領域の活性化または不活性化を指標とする方法によって、生体内または細胞内において本発明の遺伝子の発現を調節しうる化合物をスクリーニングすることも考えられる。このスクリーニングは、（ａ）本発明のＤＮＡの内因的転写制御配列の下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子有するベクターが導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、（ｂ）該細胞内におけるレポーター遺伝子の発現を検出する工程、および（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター遺伝子の発現を促進または阻害する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法により実施しうる。
ここで「内因的転写制御配列」とは、本発明のＤＮＡの発現を天然に保持している細胞において、該ＤＮＡの転写を制御している配列のことを言う。このような配列としては、プロモーター、エンハンサー、および／またはリプレッサーなどが含まれる。これら配列としては、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の上流領域のＤＮＡを用いることができる。例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写開始点（または翻訳開示コドン）からその上流数ｋｂまでのＤＮＡ断片には、該遺伝子の内因的転写制御配列が含まれていると考えられる。この断片をレポーター遺伝子と連結することで、レポーター遺伝子の発現を本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写制御下に置くことが可能である。上流領域は適宜欠失または変異を導入して転写制御活性を測定し、転写制御に関与している配列を特定してその断片を用いることも可能である。現在、転写制御に関与する転写因子が結合する多くの転写制御配列が知られている。本発明の蛋白質をコードする遺伝子の上流域から、これら既知の転写制御配列を同定することで、内因的転写制御配列を特定することも考えられる。通常、遺伝子の転写を制御している配列は、１つの遺伝子に複数存在しているが、本発明のスクリーニングにおいては、それらのいずれか、またはその組み合わせを用いることができる。内因的転写制御配列は、他のプロモーターとのキメラにしてもよい。キメラプロモーターは、転写制御の試験においてはよく用いられている。キメラプロモーターの作製に用いる他のプロモーターとしては、例えばＳＶ４０初期プロモーター由来の最小プロモーターなどが挙げられる。なお、「機能的に結合された」とは、該転写制御配列の活性化に応答して、その下流に結合されたレポーター遺伝子が発現しうるように、該転写制御配列とレポーター遺伝子が結合していることを指す。
具体的には、例えば、配列番号：１または２に記載の塩基配列若しくはその一部をプローブとしたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、本発明のＤＮＡの転写制御領域（プロモーター、エンハンサーなど）をクローニングし、これを適当なレポーター遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）の上流に挿入した発現ベクターを作製し、これを哺乳動物細胞に導入する。次いで、被検試料を該細胞株に接触させ、レポーター活性を検出し、被検試料を接触させない細胞におけるレポーター活性と比較して、レポーター活性を増加または減少させる化合物を選択することにより、細胞内において本発明の遺伝子の発現を調節しうる化合物をスクリーニングすることができる。このスクリーニングは、本発明のＤＮＡの発現を、レポーター活性を指標として検出するため、上記したノーザン解析などの直接的な検出と比較して、簡便であるという特徴を有する。
これらスクリーニングにより単離された、本発明の遺伝子の発現を調節する化合物は、該遺伝子の発現異常に起因する種々の疾患に対する医薬品の候補となる。特に、アルツハイマー病や癌などの疾患を予防または治療する薬剤としての利用が期待される。
ＡＬＥＸ１は癌では発症・進展を抑制していると考えられる。また、アルツハイマー病ではアミロイドペプチドの分解に貢献すると考えられるＩＤＥをアミロイド産生の場に誘導する事により発症あるいは進展を抑制していると考えられる。ＡＬＥＸ１とＪＩＰ−１との結合を促進する化合物、ＭＫＫ７／ＪＮＫシグナル伝達を阻害する化合物、およびＡＬＥＸ１の発現を上昇させる化合物は、癌の予防・治療に貢献しうると考えられる。同様にアルツハイマー病では、ＡＬＥＸ１とＩＤＥとの結合を促進する化合物、ＡＬＥＸ１とＰＳ−１との結合を促進する化合物、およびＡＬＥＸ１の発現を上昇させる化合物は、アルツハイマー病の予防・治療に貢献するものと考えられる。さらに、ＪＮＫがアポトーシスに関与していることから、本発明のスクリーニングにより得られる化合物はアポトーシス関連疾患にも適用され得る。ＪＮＫ経路は種々のストレスで活性化されるが、アポトーシスへの関与に関しては、細胞の種類によって異なっている。一例としては、高酸素で障害された心筋細胞のアポトーシスにおいてはＪＮＫ経路がＴＮＦの産生を阻害する事により保護的に作用している（Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９，９６（２６）：１５１２７−３２）事が示唆されている。一方でｃ−Ｊｕｎを欠失したマウス繊維芽細胞はＤＮＡをアルキル化する薬剤に起因するアポトーシスに抵抗性であり、この理由はアルキル化剤によるＣＤ９５Ｌ（ＦＡＳＬ）の発現誘導にｃ−Ｊｕｎが関与している為と説明されている（Ｋｏｌｂｕｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００  Ｊａｎ；２０（２）：５７５−８２）。従って、ＪＮＫの活性化がアポトーシスを促進する様な細胞系と刺激の組み合わせにおいては、ＪＮＫ経路を阻害する事による細胞保護が期待できる。逆にアポトーシスを抑制する様な組み合わせでは、ＪＮＫ経路の阻害により細胞死の誘導が期待できる。
また、ＡＬＥＸ１とＪＩＰ−１との結合を阻害する化合物、ＭＫＫ７／ＪＮＫシグナル伝達を促進する化合物、およびＡＬＥＸ１の発現を低下させる化合物は、通常ＡＬＥＸ１により負に制御されている機構を阻害する事ができるため、臓器再生等での利用が考えられる。また、ＡＬＥＸ１とＩＤＥとの結合を阻害する化合物、ＡＬＥＸ１とＰＳ−１との結合を阻害する化合物、およびＡＬＥＸ１の発現を低下させる化合物は、アルツハイマー病モデル動物の作製やアルツハイマー病の病態解析に有用である。
また、ＡＬＥＸ１と相互作用するｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）、ＳＡＲＴ−１、ＭＳＰ５８、ＡＴＲＸ、ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ６８（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ）、ＯＳ−９、ＺＮＦ１８９、ＫＩＡＡ１２２１、α−Ａｃｔｉｎｉｎ４、およびＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅなどの蛋白質も、アルツハイマー病および／または癌との関連が示唆されることから、ＡＬＥＸ１とこれらの蛋白質との結合を調節する化合物もまた、アルツハイマー病や癌などの疾患を予防または治療する薬剤としての利用が期待される。
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、本発明の蛋白質の活性または発現を調節するための薬剤の候補となり、本発明の蛋白質の発現異常や機能異常などに起因する疾患や本発明の蛋白質の活性や発現を制御することにより治療可能な疾患の治療への応用が考えられる。本発明のスクリーニング方法を用いて単離しうる化合物の構造の一部を、付加、欠失および／または置換により変換される物質も、本発明の蛋白質に結合する化合物に含まれる。
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物をヒトや哺乳動物等、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、蛋白質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明のスクリーニングにより単離しうる、本発明の蛋白質と結合する化合物、本発明の蛋白質の活性を阻害あるいは促進する化合物、さらには本発明の蛋白質の発現を阻害あるいは促進させる化合物等の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、すべて本明細書に組み込まれる。実施例で使用したプライマーは以下の通りである：
ＡＬＥＸ１特異的プライマー：
0004942127.tif 000002
ＡＬＥＸ２特異的プライマー：
0004942127.tif 000003
また、塩基配列解読は２本鎖ＤＮＡの両鎖についてＡＢＩのｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３７７  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて実施した。得られた塩基配列はＡｕｔｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて繋ぎ合わせる事により解析した。ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬのデータベースに登録された既知の核酸あるいは蛋白質との相同性はＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０）にて解析した。アミノ酸配列の比較にはＢＬＡＳＴＰおよびＰＲＯＳＩＴＥのプログラム（Ａｌｔｓｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２；Ｂａｉｒｏｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，１８９−１９６）を使用した。さらにモチーフ検索にはＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＫが提供するＰｆａｍ、蛋白質の膜貫通ドメインの予測にはＳＯＳＵＩ（Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４，３７８−３７９）のプログラムを利用した。アミノ酸配列のアラインメントはＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）にて行った。
［実施例１］ｃＤＮＡクローニングおよび蛋白質の解析
酵母２ハイブリッド法によりＩＤＥと相互作用する蛋白質の単離を試みた。酵母２ハイブリッド法にはＧａｌ４プロモーターの制御下に挿入したＨＩＳ３、ＡＤＥおよびＬａｃＺの３つのレポーター遺伝子を保持しているＰＪ６９−４Ａ（Ｊａｍｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４４，１４２５−１４３６）株酵母細胞を用いた。Ｂａｉｔプラスミドとしては、完全長の変異導入ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ，ＩＤＥ（Ｈ１０８Ｑ：触媒活性を喪失しているが基質結合能は保持した変異）をＧａｌ４−ＤＢ（Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン）とｉｎ−ｆｒａｍｅに接続した後ｐＯＤＢ−８０ベクターに挿入したものを用いた。酵母細胞にｂａｉｔプラスミドを導入後、融合蛋白の発現をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔにて確認した。次に、ｂａｉｔプラスミドを保持している酵母細胞をｐＡＣＴ２−ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のｐｒｅｙプラスミドにて形質転換を行った。Ｂａｉｔとｐｒｅｙの両者を保持した二重形質転換体は直接Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓを含まない合成培地（ＳＤ）に１ｍＭの３−ａｍｉｎｏｔｒｉａｚｏｌｅ（３−ＡＴ）を添加した培地で培養する事により選択した。生育してきたクローンはさらにＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓおよびアデニン不含ＳＤにて選択し、ｆｉｌｔｅｒ  ａｓｓａｙによりβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性の検出を行った。陽性コロニーよりＱｉａｇｅｎのＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを回収し、大腸菌ＤＨ５α株にエレクトロポレーション法にて導入した。得られたヒト脳由来の挿入配列はＧａｌ４−ＡＤ特異的なプライマーを用いて塩基配列を決定した。
この過程で、正常ヒト脳由来ライブラリーから幾つかの候補ｃＤＮＡが得られた。このうちクローンＢ４に挿入された１２９０塩基対からなるｃＤＮＡの塩基配列解析の結果、この配列中には２９３アミノ酸からなるポリペプチドをコードする８７９塩基対のｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）が存在する事が明らかとなった。予想されるアミノ酸配列についてＰｆａｍデータベースに対して行った検索の結果、２個の４２アミノ酸からなるアルマジロ／βカテニン様繰り返し配列が検出された。クローンＢ４に挿入された配列は３’端にｐｏｌｙＡ配列を含んでいたので、残りの部分の配列を得るべく、ヒト心臓由来ｃＤＮＡを鋳型として５’ＲＡＣＥ法を実施した。
５’−ＲＡＣＥ法はＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いＲ３プライマーおよび鋳型としてｐＡＰ３ｎｅｏヒト心臓由来ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造）を用いて実施した。以下に示す条件でタッチダウンＰＣＲを行った：９４℃  １分を１サイクル、［９４℃３０秒、７２℃  ５分］を５サイクル、［９４℃  ３０秒、７０℃  ５分］を５サイクル、［９４℃  ２０秒、６８℃  ５分］を２５サイクル、そして７２℃  ７分を１サイクルの後、４℃に保持。得られたＰＣＲ産物は電気泳動にて精製した後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入し、Ｔ７プライマー、Ｍ１３プライマーおよび種々の挿入配列に特異的なプライマーを利用して塩基配列の決定を行った。
増幅された産物のうち最長のものはＢ４の配列から５’方向にさらに８５１塩基対伸長したもので、Ｂ４の配列と併せて全長２１４１塩基対の配列が得られた（ＡＬＥＸ１と命名した）。このＡＬＥＸ１  ｃＤＮＡの塩基配列および予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：１および３に示す。ＲＡＣＥ法の場合ＰＣＲに起因するエラーの可能性がある事から、さらにハイブリダイゼーションに基づいたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによりＢ４  ｃＤＮＡを得た。
すなわち、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴベクターに挿入されたヒト睾丸由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を３６のプールに分割して各プールが３０７２クローンを含む様にした後、ナイロンフィルター上に格子状にスポットした。これらのプールはＦ１／Ｒ１の組み合わせのプライマーを用いたＰＣＲにてスクリーニングを行い、ＡＬＥＸ１  ｃＤＮＡ陽性のフィルターはさらに同じプライマーを用いたＰＣＲにて調製した２０８塩基対のプローブとハイブリダイズせしめた。プローブは予めＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）にて標識したものを用いた。個々の陽性クローンの挿入配列について塩基配列を決定した。
このスクリーニングで得られた最長の挿入配列（２１２４塩基対）を含むクローン１４４Ｄ１０（配列番号：２）の配列は、上記ＲＡＣＥ法で得られた配列（配列番号：１）と比較すると、５’端の４４塩基は配列番号：１と異なっており、４５番目（Ｇ）が配列番号：１の塩基番号５１番（Ｇ）に相当し、塩基番号７７番の位置に１塩基（Ａ）の挿入および塩基番号１２９番から１３１番迄の３塩基対（ＡＧＴ）の欠失が認められた。また、３’端にも違いがあり、塩基番号２１３０のＡがＣに置換、２１３２のＡがＧに置換、ここが３’端となっておりポリ（Ａ）はなかった。コーディング領域を含むその他の部分は全く同一であった。後に明らかとされるが、後者の塩基配列の違いはこの遺伝子の第一エクソンと第二エクソンの境界部に一致して生じている。
ヒト睾丸由来ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより単離されたＡＬＥＸ１  ｃＤＮＡクローンを含む大腸菌を、「ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−ＡＬＥＸ１」として下記の通り寄託機関に寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：経済産業省  産業技術総合研究所  生命工学工業技術研究所
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８
５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）  平成１２年２月２５日
（ハ）寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５６
ＡＬＥＸ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号：１）において想定される開始コドンは塩基番号３７２番から始まるＡＴＧで翻訳開始シグナルとして妥当な配列（ＡＣＣＡＴＧＧ）中に位置している（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，８５７−８７３）。最初のｉｎ  ｆｒａｍｅの終止コドン（ＴＡＡ）は塩基番号１７３１番に位置しており、その結果計算された分子量４９，１７８、等電点（ｐＩ値）９．５６の４５３アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。ＰｏｌｙＡ付加シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）はｐｏｌｙＡ配列開始点から１９塩基対上流に位置している（配列番号：１）。
ＡＬＥＸ１蛋白のアミノ酸配列解析の結果、先に述べた２つのＡｒｍリピートに加えて、アミノ酸番号１６２から１６９の位置にＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位が存在することが判明した。また、ＡＬＥＸ１蛋白中、リン酸化を受ける可能性のある部位としては、８個のプロテインキナーゼＣによるリン酸化部位、５個のカゼインキナーゼＩＩによるリン酸化部位が存在する。ＳＯＳＵＩアルゴリズムに依れば、Ｎ末端（１番から２５番）に膜貫通ドメインが予測される。さらにこの膜貫通ドメインには４個のｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎを受ける可能性のある残基が含まれる。またＣ末端にはｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇシグナルが存在する。
［実施例２］ＡＬＥＸ１とＩＤＥの相互作用
先に述べた様に、完全長変異ＩＤＥ（Ｈ１０８Ｑ）をｂａｉｔとした酵母２ハイブリッド法によりＡＬＥＸ１蛋白のＣ端側部分（アミノ酸残基番号１６１−４５３）に相当するクローンＢ４が同定された。従って次に完全長のＡＬＥＸ１がＩＤＥと相互作用し得るか、あるいは観察された相互作用が２つの蛋白の直接な相互作用を反映したものであるのか、の２点についてさらに検討を行った。この目的の為に、ＡＬＥＸ１とＩＤＥをＧＳＴとの融合蛋白として発現すべく、完全長のＡＬＥＸ１、ＩＤＥをコードするｃＤＮＡを大腸菌用発現ベクターｐＧＥＸ−５Ｘに挿入して発現を試みたが、何れの蛋白も菌体の不溶性画分に見出された。ＡＬＥＸ１についてはさらに封入体からの可溶化を変性剤を用いて試みたが、得られた蛋白は誤った３次元構造に再構成されたと考えられ複数の無関係な３５Ｓ標識蛋白との相互作用を呈した（データ省略）。この様な哺乳動物細胞由来の蛋白を大腸菌に発現させる難しさは広く知られたところであり、これを克服する目的で昆虫細胞での発現に方向転換を図ったところ、Ｆｌａｇ  ｔａｇを付加した変異ＩＤＥ（Ｈ１０８Ｑ）はＳｆ９細胞で良好な発現を認め、Ｍ２抗Ｆｌａｇ抗体を固定化したアガロースビーズを用いて首尾良く精製可能であった。
具体的には、５’端にＦｌａｇエピトープを付加した変異ＩＤＥ（Ｈ１０８Ｑ）ｃＤＮＡを昆虫細胞発現ベクターｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓ（ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した後、昆虫細胞であるＳｆ９細胞に導入した。安定的な遺伝子導入細胞は０．４ｍｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含んだ培地で選択する事により得た。試験管内結合試験の為に、上記遺伝子導入細胞を回収後ＰＢＳにて洗浄、融解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍより購入したＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌを含む）に再懸濁後、超音波処理にて細胞を破砕し、１５，０００ｘｇ１０分間の遠心分離に付した。遠心分離後の上清は抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体を固定化したアフィニティカラム（Ｓｉｇｍａ）にて精製した。すなわち、遠心分離後の上清をカラムに添加後、結合バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０およびＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌを含む）にて洗浄を行った。結合したＩＤＥ−Ｆｌａｇ蛋白は０．１ｍｇ／ｍｌのＦｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ）にて溶出後、結合バッファーに対して透析する事によりＦｌａｇペプチドを除去した。
一方完全長ＡＬＥＸ１蛋白はウサギ網状赤血球融解液を用いて［３５Ｓ］メチオニンにて標識された蛋白を生合成した。結合試験は５μｌの３５Ｓ標識したＡＬＥＸ１あるいはｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（陰性対照）を０．４ｍｌの結合バッファー中で２．５μｇのＩＤＥと混合し４℃にて２時間孵置を行った。次に１５μｌの抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体を固定化したアフィニティビーズを添加して更に４℃にて２．５時間孵置を行った後、ビーズを結合バッファーにて５回洗浄した。結合した蛋白は０．１ｍｇ／ｍｌのＦｌａｇペプチドにて溶出後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離しＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ染色およびＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ（ＢＡＳ２０００，富士フィルム）による解析を施した。
これにより両者の蛋白質の相互作用を検討したところ、ＡＬＥＸ１はＩＤＥ結合ビーズには結合するがコントロールビーズには結合しない事を見出した（図１）。またＩＤＥ結合ビーズが陰性対照である３５Ｓ標識ルシフェラーゼを結合しない事により、観察された結合の特異性が示された。
［実施例３］ＡＬＥＸ１遺伝子のゲノム構造
ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースに対して行ったＢＬＡＳＴＮ解析により、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにより塩基配列決定されたヒトＸ染色体由来クローンＵ６１Ｂ１１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ７３９１３）がＡＬＥＸ１遺伝子の配列を含む事が明らかとなった。そこで、このゲノム配列を用いてＡＬＥＸ１遺伝子のエクソン・イントロン構成について検討した。その結果、ＡＬＥＸ１遺伝子は５４塩基対から１８９２塩基対にわたる長さの４つのエクソンからなる４．２ｋｂの塩基配列により構成され、蛋白質をコードする部分は一つのエクソン（エクソン４）に局在している事が明らかとなった。また全てのエクソン・イントロンの境界はｓｐｌｉｃｅ  ｄｏｎｏｒ／ａｃｃｅｐｔｏｒ部位のコンセンサス配列（ｇｔ／ａｇ）をとっている事が判明した。
［実施例４］ヒトＡＬＥＸ１蛋白と他の蛋白との相同性の検索
ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いた公的データベースに対する相同性検索の結果、完全長ＡＬＥＸ１蛋白は６３２アミノ酸からなる機能未知のＯＲＦ、ＫＩＡＡ０５１２と最も高い相同性を示す事が判明した。この相同性を示す領域は両アミノ酸配列のＣ端部分に位置し、２３４アミノ酸からなるこの部分は５１％が両アミノ酸配列間で同一であり、また性質の似通ったアミノ酸の置換も含めると７２％の相同性を示す（図２〜３）。またＡＬＥＸ１蛋白とＫＩＡＡ０５１２蛋白は殆ど同一のＮ末端アミノ酸配列（アミノ酸番号１から２５）を有し、この部位を介して両蛋白が小胞体（ＥＲ）膜に結合する事が推測される。さらにＡＬＥＸ１と同様ＫＩＡＡ０５１２のＣ端にはｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌが認められる。
ＫＩＡＡ０５１２と比べると弱いものの、ＡＬＥＸ１は別の機能未知なＯＲＦであるＫＩＡＡ０４４３とも相同性を有する（２２５アミノ酸の領域に渡って３１％のアミノ酸が同一、また類似アミノ酸の置換も含めると５５％の相同性：図２〜３）。
ＡＬＥＸ１配列はまたＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムによっても解析した。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムによる解析法はｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔに内在する情報を部位に依存した重みづけの為のマトリックスに導入して、このマトリックスを反復検索のｑｕｅｒｙ（質問式）として用いる事によりデータベース検索の感度を著しく向上させる（Ａｌｔｓｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２）。これは、統計的に有意ではあるが非常に僅かな配列上の相同性を検出する事を可能にする。実際にＥ−ｖａｌｕｅ＝０．０１にて行った２回目の反復検索でＡＬＥＸ１はＡｒｍリピートファミリーメンバーに対して有意な相同性を示した。この検索ではＡＬＥＸ１はｉｍｐｏｒｔｉｎαあるいは酵母のｖａｃｕｏｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８（Ｖａｃ８ｐ）に最も高い相同性を示した。これらより低い相同性はアルマジロ、βカテニンおよびｐｌａｋｏｇｌｏｂｉｎに対して認められ、相同な領域はＡＬＥＸ１蛋白の２つのＡｒｍリピート部位に一致した。
ＡＬＥＸ１  ｃＤＮＡ配列をｑｕｅｒｙとしたｄｂＥＳＴデータベースに対するＢＬＡＳＴＮ検索により多数の高度に相同なＥＳＴを同定した。これらのうちには先に述べたＫＩＡＡ０５１２あるいはＫＩＡＡ０４４３に相当するＥＳＴに加えて未知のｃＤＮＡに対応するＥＳＴが含まれていた。これらの未知のｃＤＮＡに対応する幾つかの代表的なＥＳＴを用いてＮＣＢＩのｄｂＴＨＣデータベースを検索する事により、４４個のＥＳＴから構成された２０３６塩基対の長さのｃｏｎｔｉｇ配列（ＴＨＣ２５７９２５）が得られた。ＴＨＣ２５７９２５の概念上の翻訳産物は３４２アミノ酸からなる蛋白質をコードしており、ＡＬＥＸ１、ＫＩＡＡ０５１２およびＫＩＡＡ０４４３のＣ端側半分と高い相同性を有していた（図２〜３）。この新規な蛋白は２５９アミノ酸の領域に於いてＡＬＥＸ１蛋白と５５％の同一性を示し、さらに類似なアミノ酸による置換を含めると７４％の相同性を示した。Ｐｆａｍアルゴリズムを用いた解析によれば、このアミノ酸配列中に１個のＡｒｍモチーフ配列を認めこれはＡＬＥＸ１の最初のＡｒｍモチーフに相当する事が明らかとなった。
現在迄に知られているＡｒｍファミリー蛋白には６個未満のＡｒｍリピートを含むものは存在しないし、古典的なファミリーメンバーであるカテニン、ｉｍｐｏｒｔｉｎ等に於いては６個以上のＡｒｍリピートを含有する。従って、ＡＬＥＸ１およびその相同蛋白はＡｒｍリピートファミリー蛋白の定義には合致しない事から、むしろ新規なファミリーを構成するものと考えられ、本発明者らはこのファミリーをＡＬＥＸファミリーと呼ぶ事とした。これに従い、ＫＩＡＡ０５１２および新規なＯＲＦであるＴＨＣ２５７９２５を、それぞれ「ＡＬＥＸ２」および「ＡＬＥＸ３」と命名した。
［実施例５］ＡＬＥＸ遺伝子の染色体上の位置の決定
ＮＣＢＩのＵｎｉＧｅｎｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの検索の結果、ＡＬＥＸ１の３’領域がＨｓ．９７２８のクラスターに一致する事が明らかとなった。このクラスターは染色体マーカー配列ｓｔＳＧ９５５０（ＤＸＳ９９０−ＤＸＳ１０５９）にリンクしている。同様に、ＡＬＥＸ２（ＫＩＡＡ０５１２）およびＡＬＥＸ３（ＴＨＣ２５７９２５）ｃＤＮＡの配列はそれぞれＨｓ．４８９２４およびＨｓ．１７２７８８のクラスターに一致し、何れのクラスターとも同じ領域であるＤＸＳ９９０−ＤＸＳ１０５９に位置するｓｔＳＧ２２１２４およびｓｔＳＧ１３１３５とリンクしている。このＤＸＳ９９０−ＤＸＳ１０５９の領域はヒトＸ染色体長腕ｑ２１．３３−ｑ２２．２（Ｘｑ２１．３３−ｑ２２．２）のバンド上に位置している。さらにＢＬＡＳＴＮ検索の結果、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにより解読されたヒト染色体Ｘｑ２２．１−２３領域由来クローン７６９Ｎ１３の配列がＫＩＡＡ０４４３を含む事が明らかとなった。以上の結果よりＡＬＥＸ１〜３およびＫＩＡＡ０４４３の全てのＡＬＥＸファミリー遺伝子がヒトＸ染色体の同一の領域に局在している事が判明した。
［実施例６］ヒト正常および癌組織に於けるＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２遺伝子発現の解析
種々のヒト組織に於けるＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２遺伝子発現を検討する目的で、種々のヒト組織より調製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを含むＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔおよび両ＡＬＥＸ間で最も相同性の低い領域に由来するプローブを用いてハイブリダイゼーションを実施した。
各々２μｇの種々の組織由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを含むヒトＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ＢｌｏｔｓおよびＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液はＣｌｏｎｔｅｃｈより購入した。ハイブリダイゼーションは１ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌの濃度の標識プローブを用いて６８℃、１時間の条件で実施した。その後、終濃度０．１ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳの溶液にて５０℃、４０分間洗浄を行った後、増感スクリーンを用いて−８０℃にてＨｙｐｅｒｆｉｌｍ上にオートラジオグラフィーを行った。使用したプローブは先に記載した如く、ＰＣＲにて調製後、電気泳動にて精製し３２Ｐ標識した。２２７塩基対のＡＬＥＸ１プローブはＦ２／Ｒ２、３２８塩基対のＡＬＥＸ２プローブはＦ４／Ｒ４の組み合わせのプライマーを用いて調製した。
図４に見られる様に、ＡＬＥＸ１プローブを用いた場合には約２．２ｋｂの転写産物に相当する明瞭な１本のバンドが大部分の組織に於いて観察された。観察された転写産物のサイズから得られたｃＤＮＡがＡＬＥＸ１  ｍＲＮＡの全長に相当する事が確認された。同様にＢｌｏｔをＡＬＥＸ２特異的なプローブにハイブリダイズさせた場合には殆どの組織に於いて約２．７ｋｂの転写産物が検出された。特に骨格筋、睾丸、胎盤に於いてはこれに加えて１．４ｋｂの明瞭なバンドが観察され、さらに脳では約７ｋｂの弱いバンドが観察された。以上の解析からＡＬＥＸ１とＡＬＥＸ２は極めて類似した発現分布を示す事が明らかとなった。両ｍＲＮＡの発現は卵巣、心臓、睾丸、前立腺、脳、脾臓および大腸に於いて特に高いのに対して肝臓、胸腺に於ける発現は辛うじて検出可能なレベルであった。また末梢白血球に於ける両ｍＲＮＡの発現は検出限界以下であり、より感度の高いＲＴ−ＰＣＲによっても、白血球に於けるＡＬＥＸ１、ＡＬＥＸ２転写産物の検出は不可能であった（データ省略）。
次に、ＡＬＥＸ１、ＡＬＥＸ２の種々のヒト腫瘍に於ける発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析した。それぞれの腫瘍に対応する５種の正常組織由来ｃＤＮＡを陽性対照とした。ＰＣＲによるＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２のヒト正常および癌組織に於ける発現の解析は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入したＨｕｍａｎ  Ｉ、Ｈｕｍａｎ  ＩＩおよびＨｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡパネルを用いて行った。プライマーの組み合わせはＡＬＥＸ１についてはＦ３／Ｒ２、ＡＬＥＸ２についてはＦ５／Ｒ５をそれぞれ用いた。図５に示す様に、２例の肺癌およびそれぞれ１例の前立腺腺癌、大腸腺癌由来検体に於いてＡＬＥＸ１、ＡＬＥＸ２何れのｍＲＮＡも検出されなかった。それに加えて、膵臓癌、卵巣癌由来検体に於いてはＡＬＥＸ２転写産物は検出限界以下、ＡＬＥＸ１の発現は対応する正常組織に比較して著明に低下していた。これらの検討に用いられたｃＤＮＡはヌードマウスに異種移植されて継代維持された腫瘍組織より調製したものである。
異種移植継代維持の過程での細胞の性状の変化の可能性を排除する目的で、さらに４人の異なる提供者から得た卵巣癌および対応する卵巣正常組織から調製したｍＲＮＡを含むＢｌｏｔを用いてＡＬＥＸ１の発現を検討した。同一の手術部位より摘出したヒト正常組織および卵巣癌組織より調製された各々２０μｇのＲＮＡを含むＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｔｅｒｒｉｔｏｒｙ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｔｕｍｏｒ  ＢｌｏｔはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手した。ノーザンハイブリダイゼーションは上記と同様に行った。結果は図６に示す様に、４人の提供者何れの場合にもＡＬＥＸ１  ｍＲＮＡは正常組織部位に於いてのみ検出され癌部位に於いては検出されなかった。
［実施例７］各種ヒト腫瘍由来細胞株に於けるＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２の発現の検討
各種ヒト腫瘍由来細胞株に於けるＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した。すなわち、２μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとしてマニュアルに従って逆転写反応を実施した。得られたｃＤＮＡは上記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。結果は図７に示すが、陽性対照として４種の正常組織および２種の正常ヒト２倍体繊維芽細胞株を加えた。両転写産物は膠芽細胞腫由来細胞株Ａ１７２および骨肉腫由来細胞株ＴＥ−８５に於いて発現しており、低レベルのＡＬＥＸ１、ＡＬＥＸ２の発現は骨肉腫由来細胞株Ｕ−２０Ｓに於いて認められた。一方これに反して、不死化した内皮細胞株ｔ−ＨＵＥ２、子宮頸部腺癌由来細胞株ＨｅＬａ、肺癌由来細胞株Ａ５４９、非小細胞性肺癌由来細胞株ＡＢＣ−１、子宮頸部腺癌由来細胞株Ｃ−３３およびサイトメガロウィルスで形質転換した胎児肺繊維芽細胞由来細胞株ＣＭＶ−Ｍｊ−ＨＥＬ−１に於いては何れのシグナルも認められなかった。さらに本発明者らは、他の４種の細胞株についてもＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２の発現を検討した。これら４種の細胞株は、正常ヒト乳腺由来上皮細胞株ＨＢＬ１００、乳腺癌由来細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、および神経芽細胞腫由来細胞株ＳＨ−ＳＹ５ＹおよびＩＭＲ−３２である。ＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２  ｍＲＮＡはＨＢＬ−１００および２種の神経芽細胞腫由来細胞株に於いては認められたがＭＤＡ−ＭＢ−４６８に於いては検出されなかった（データ省略）。以上の結果を纏めると、ＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２の発現はヒト肉腫、膠芽細胞腫および神経芽細胞腫に於いては認められるが、上皮性組織に由来するヒト癌由来細胞株に於いては検出されない事が明らかとなった。
［実施例８］ＡＬＥＸ１は発生過程に於いて制御されている
次に、マウス胎児発生の異なるステージに於けるＡＬＥＸ１  ｍＲＮＡの発現を解析した。マウスＥＳＴデータベースに見出した配列を基にデザインしたプローブを用いてＡＬＥＸ１のマウス相同遺伝子を単離した。図８に見られる様に、マウスＡＬＥＸ１転写物は約２．３ｋｂのサイズからなり、実質的にヒトＡＬＥＸ１の場合と同一であった。低レベルのＡＬＥＸ１の発現は胎生７日に於いて検出可能であり、そのレベルは胎生７日から１１日にかけて著明に増大を認めた。
［実施例９］酵母２ハイブリッド法によるＡＬＥＸ１と相互作用する蛋白の検索
ＡＬＥＸ１と相互作用する蛋白を同定する目的で酵母２ハイブリッド法を試みた。完全長ＡＬＥＸ１をＧａｌ４−ＤＢ（Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン）とｉｎ−ｆｒａｍｅに接続した後ｐＯＤＢ−８０ベクターに挿入したプラスミドをＢａｉｔに用いて、実施例１と同様に２ハイブリッドスクリーニングを行った。完全長ＡＬＥＸ１  ｃＤＮＡをｂａｉｔとしてヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、ＪＩＰ−１（ＪＮＫ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）の互いにｏｖｅｒｌａｐする断片に相当する３つの独立したクローンが得られた。これらはそれぞれ、ヒトＪＩＰ−１蛋白のアミノ酸番号１６０−７１１、１９９−７１１および２５８−７１１に相当する。ＪＩＰ−１は当初、ＪＮＫの核移行を阻害する活性から、ＪＮＫと相互作用する蛋白あるいはＪＮＫによるシグナル伝達の阻害因子として機能付けられた（Ｄｉｃｋｅｎｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，６９３−６９６）。ＪＩＰ−１上のＡＬＥＸ１結合部位を同定する目的で、種々のＪＩＰ−１断片を調製して酵母２ハイブリッド法に供した。その結果図９に示す様にＪＩＰ−１のアミノ酸番号３７４−４７９の領域がＡＬＥＸ１の結合に主として関与している事が明らかとなった。しかし、アミノ酸番号２６２−５８９の領域を含む断片の場合に３７４−７１１の場合と比較してより速い酵母細胞の増殖が見られる事から、アミノ酸番号３７４のＮ端側および４７９のＣ端側に隣接する領域もより強固な結合に必要とされるものと考えられた（図９）。
［実施例１０］ｃ−Ｊｕｎ依存転写活性化に於けるＡＬＥＸ１過剰発現の効果
ＡＬＥＸ１が酵母２ハイブリッド法に於いてＪＩＰ−１と結合するとの知見から、次にＡＬＥＸ１の発現を欠いた細胞にＡＬＥＸ１を強制発現せしめる事によりＪＮＫシグナル経路に如何なる影響を及ぼすかについて検討を加えた。活性化されたＪＮＫは転写因子であるｃ−Ｊｕｎをリン酸化する事によりその転写活性化能を増強する。従ってこの実験に於いて、ＡＬＥＸ１の発現のみられないＨｅＬａ  Ｓ３ヒト子宮頸癌由来細胞株を用いる事とした。
ｃ−ＪｕｎとしてＧａｌ４−ｃ−Ｊｕｎ融合蛋白を用い、その転写活性化能をレポータープラスミドｐＧ５−ｌｕｃとｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎする事により検討した。ｐＧ５−ｌｕｃはホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に５個のＧａｌ４部位とｍｉｎｉｍｕｍ  ｐｒｏｍｏｔｅｒエレメントを連結したものである。さらにＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子をチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下に含むプラスミドｐＲＬ−ＴＫをｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔする事により内部標準とした。これらのプラスミドのＨｅＬａ細胞への導入はＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１２穴培養プレートにて実施した。遺伝子導入後、細胞を０．５％  ＦＢＳ存在下で培養し、４２時間後にレポーター活性を測定した。
既知のＪＮＫ活性化因子として知られるＭＥＫＫ１はｃ−Ｊｕｎ依存ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を約３０倍増強した（図１０）事からＧａｌ４−ｃＪｕｎ融合蛋白の活性化が示された。Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインのみで活性化ドメインを欠いた断片を含むｐＦＣ−ｄｂｄプラスミド（Ｇａｌ４）を用いた場合にはＭＥＫＫ１の過剰発現によって活性化を受けない事から本実験系の特異性が保証される。ＡＬＥＸ１の強制発現によりＭＥＫＫ１により誘導されたｃ−Ｊｕｎ依存転写活性化能は用量依存的に有意に阻害された（図１０）。
［実施例１１］ＡＬＥＸ１とプレセニリン−１（ＰＳ１）との相互作用
ＡＬＥＸ１とプレセニリン−１（ＰＳ１）との相互作用をプルダウンアッセイにより調べた。デルタカテニンとの結合部位として報告されているＰＳ１の大きな細胞質内に突出したループ部位（ＰＳ１−ＣＬ：アクセッション番号Ｌ７６５１７に記載のＰＳ−１のアミノ酸番号２６３−４０７）、および陰性対照としてＮ末端部分（ＰＳ１−Ｎ：アクセッション番号Ｌ７６５１７に記載のＰＳ−１のアミノ酸番号１−８１）をそれぞれＰＣＲ法にてｐＧＥＸ−５Ｘ−１にクローニングして、ＧＳＴ融合蛋白として大腸菌にて発現せしめた。ＧＳＴ蛋白質単独、あるいはＧＳＴ−ＰＳ１−ＣＬ（２６３−４０７アミノ酸）またはＧＳＴ−ＰＳ１−Ｎ（１−８１アミノ酸）融合蛋白質８０μｇを、グルタチオン−セファロースビーズ２０μｌと共に固定化バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ，ｐＨ７．２  ａｔ  ２５℃，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０およびＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で４℃で１６時間インキュベートして固定化した。混合液を遠心分離して結合しなかった蛋白質を除き、ビーズを５００μｌの結合バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ，ｐＨ７．２  ａｔ  ２５℃，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０，０．１ｍＭ  ＤＴＴ，４ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよびＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に再懇濁させた。インビトロ翻訳（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＴＮＴ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅｓｙｓｔｅｍ）により［３５Ｓ］メチオニンでラベルしたＡＬＥＸ１を混合液に加え、４℃で２．５時間インキュベートして複合体形成せしめた。また陰性対照として、ＡＬＥＸ１の代わりにルシフェラーゼを、陽性対照としてはデルタカテニン（６１５−１２２５）およびデルタカテニン（８２６−１２２５）を用いて同様に実験を行った。ビーズを洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ，ｐＨ７．２  ａｔ  ２５℃，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０およびＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で５回洗い、４０μｌの２×ＳＳＣサンプルバッファーに懸濁して９０℃に加熱した。溶解した蛋白質の半分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％）に供し、ＢＡＳ２０００で可視化した。
その結果、２種のデルタＣａｔｅｎｉｎの断片およびＡＬＥＸ１のみにおいてＧＳＴ−ＰＳ１−ＣＬにより標識蛋白の共沈によるバンドを認めた。これらのバンドはＧＳＴあるいはＧＳＴ−ＰＳ１−Ｎによっては認められなかった。また陰性対照のルシフェラーゼの場合は何れにおいてもバンドを認めなかった。
［実施例１２］酵母２ハイブリッド法によるＡＬＥＸ１結合蛋白の検索
完全長ＡＬＥＸ１をｂａｉｔとした酵母２ハイブリッド法の予備検討の結果、多数の偽陽性クローンが得られた事からさらに検討を加え、ＡＬＥＸ１のＮ末端に存在する膜貫通ドメイン（アミノ酸番号１−２７）を除去したものをｂａｉｔとする事により偽陽性クローンの数を大幅に減らす事が可能である事が明らかとなった。従ってこのｄｅｌｔａ（１−２７）ＡＬＥＸ１をＧａｌ４−ＤＢＤに連結した発現ベクターで酵母ＰＪ６９−２Ａを形質転換した後にｐＡＣＴ２ベクター上にクローン化されたヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を直接トランスフェクションした後に以下に示す栄養要求性の選択を実施した。総計２１０万クローンをスクリーニングした結果、４７６クローンが−Ｈｉｓ条件下で生育し、さらにこのうちの約４０％は−Ｈｉｓ／−Ａｄｅ条件下でも生育可能であった。さらに選択を続け最終的に１８０クローンが−Ｈｉｓ／−Ａｄｅ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ条件下で選択された。次にこれら陽性コロニーからライブラリープラスミドを大腸菌にｒｅｓｃｕｅする事により回収し精製後、総計１５５クローンについて塩基配列の決定を行なった。その結果約１０％のコロニーは２つの異なるライブラリープラスミドを同時に保持している事が明らかとなり、この様な場合には片方は偽陽性である可能性が考えられた。従ってさらに偽陽性クローンを除く目的で、得られた１５５クローン全てについてさらにＧａｌ４−ＤＢＤ−ｄｅｌｔａ（１−２７）ＡＬＥＸ１あるいはｂａｉｔを含まないＧａｌ４−ＤＢＤと酵母ＰＪ６９−２Ａにｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎをした後、−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐの条件下でｂａｉｔ依存的に増殖可能なクローンの選択を行なった。このａｓｓａｙにより約２０％のクローンが偽陽性として除去可能であった。次に同じ組み合わせのプラスミドにて酵母Ｙ１８７株を形質転換した後にβ−ｇａｌアッセイを実施した。幾つかのコロニーはβ−ｇａｌ活性陰性であった。以下のリストは上記全てのテストに合格し、かつ少なくとも２個以上の独立したクローンに含まれるものをその推定される機能とともに纏めたものである。
ｐ００７１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ−４）：Ａｒｍリピート含有ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ結合蛋白
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｘ８１８８９；Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｐ００７１  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００３６２８；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ  ４（ＰＫＰ４），ｍＲＮＡ
ＳＡＲＴ−１：ヒト扁平上皮癌抗原、増殖細胞のみにて発現
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＢ００６１９８；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＳＡＲＴ−１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｙ１４３１４；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＩｇＥ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ
ＭＳＰ５８：核蛋白、増殖に関連した核蛋白ｐ１２０と相互作用、増殖細胞のみにて発現
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦＯ１５３０８；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＳＰ５８）ｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ０６８００７；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｐ７８  ｍＲＮＡ
ＡＴＲＸ：マウス大腸腺癌抗原、細胞周期依存性にリン酸化を受ける、ＳＮＦ２ファミリーのｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅのメンバー
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｕ７２９３８；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＡＴＰａｓｅ  ａｎｄ  ｈｅｌｉｃａｓｅ（ＡＴＲＸ）ｍＲＮＡ，ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ３、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０００４８９；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｌｐｈａ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ／ｍｅｎｔａｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ（ＲＡＤ５４（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｈｏｍｏｌｏｇ）（ＡＴＲＸ），ｍＲＮＡ
ＣＳＡ２（ＲＥＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：軟骨肉腫関連蛋白、核内に点状に分布、転写関連機能？
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ１８２６４５；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＣＳＡ２）ｍＲＮＡ
ｐ６８：ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅ
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．Ｘ５２１０４；Ｈｕｍａｎ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｐ６８  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４３９６；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＤＥＡＤ／Ｈ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ／Ｈｉｓ）ｂｏｘ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ５（ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ，６８ｋＤ）（ＤＤＸ５），ｍＲＮＡ
ＯＳ−９：ヒト肉腫で増幅、核移行シグナル含有
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００６８１２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ（ＯＳ−９），ｍＲＮＡ
ＺＮＦ１８９：Ｃ２Ｈ２  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ蛋白
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＦ０２５７７０；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃ２Ｈ２  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＺＮＦ１８９）ｍＲＮＡ
ＫＩＡＡ１２２１：Ｃ２Ｈ２  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ蛋白
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＢ０３３０４７；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＫＩＡＡ１２２１  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐａｒｔｉａｌｃｄｓ
α−Ａｃｔｉｎｉｎ４：アクチン重合に関与、細胞運動、癌の浸潤に関与
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４９２４；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｃｔｉｎｉｎ，ａｌｐｈａ  ４（ＡＣＴＮ４），ｍＲＮＡ  ＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅ
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＡＢ０２２３４１；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＺＩＰ  ｋｉｎａｓｅ
ＡＬＥＸ１：ホモ２量体形成
［実施例１３］ＮあるいはＣ末端にＧＦＰを付加したＡＬＥＸ１を用いた細胞（ＣＯＳ７細胞）内局在の検討
ＡＬＥＸ１をＥＧＦＰのＣ端（Ｎ−ＥＧＦＰ−ＡＬＥＸ１−Ｃ）あるいはＮ端（Ｎ−ＡＬＥＸ１−ＥＧＦＰ−Ｃ）に付加した融合蛋白をＣＯＳ７細胞に発現せしめて、蛍光顕微鏡を用いて細胞内局在を検討したところ、Ｎ−ＥＧＦＰ−ＡＬＥＸ１−Ｃは核内のみに点状に分布（核小体と思われる）を認めたのに対して、Ｎ−ＡＬＥＸ１−ＥＧＦＰ−Ｃの場合には逆に核から排除されて細胞質への局在が観察された。この結果は恐らくＡＬＥＸ１のＮ端近傍に存在する膜貫通ドメインがＮ−ＥＧＦＰ−ＡＬＥＸ１−Ｃにおいては付加したＧＦＰによりマスクされた結果と考えられた。従ってＡＬＥＸ１の膜貫通ドメインのブロックあるいは酵素的切断を介した細胞内局在の制御の可能性が示唆された。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規なアルマジロリピート含有蛋白質ＡＬＥＸ１、およびその遺伝子が提供された。ＡＬＥＸ１蛋白質は上皮性癌において有意に発現が低下している。また、ＡＬＥＸ１はアルツハイマー病にも関与していることが予想される。これらのことから、ＡＬＥＸ１の発現レベルを検出することにより、癌やアルツハイマー病の検査を行うことが可能になる。また、ＡＬＥＸ１の発現や活性を調節する薬剤をスクリーニングすることにより、これらの疾患を予防・治療するための新しい医薬の開発が可能になる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに於けるＡＬＥＸ１とＩＤＥの相互作用を示す写真である。
試験管内翻訳反応により調製したＡＬＥＸ１蛋白をＦｌａｇ付加ＩＤＥを固定化したビーズあるいはコントロールビーズと孵置した。ビーズ洗浄後、結合した蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、オートラジオグラフィにて観察した。陰性対照として用いた試験管内翻訳ルシフェラーゼ（［３５Ｓ］Ｌｕｃｉｆｅｒ）はＩＤＥ−ｆｌａｇビーズに結合しなかった。反応に用いた［３５Ｓ］ＡＬＥＸ１および［３５Ｓ］ルシフェラーゼ（反応に加えた蛋白の１０％を含む）を比較の為に示した（「インプット」のレーン）。図中レーンＭは［１４Ｃ］メチル化した分子量マーカー蛋白を示す。
図２は、ヒトＡＬＥＸ１、ＡＬＥＸ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＢＡＡ２５４３８）、およびＡＬＥＸ３のアミノ酸配列のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｉｇｎｍｅｎｔを示す図である。
ＡＬＥＸ３のアミノ酸配列はＴＩＧＲデータベース中の仮想ヒトｃＤＮＡ配列（２５７９２５）を翻訳したものである。アミノ酸配列のａｌｉｇｎｍｅｎｔはＣｌｕｓｔａｌＷを用い、相同なアミノ酸の影付けはＢｏｘｓｈａｄｅ３．２１のプログラムを用いた。黒く色づけした残基は同一なアミノ酸を示す。Ａｒｍモチーフにはｂｏｘを付した。
図３は、ヒトＡＬＥＸ１、ＡＬＥＸ２、およびＡＬＥＸ３のアミノ酸配列のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｉｇｎｍｅｎｔを示す図である（図２の続き）。
図４は、ＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２  ｍＲＮＡ発現のＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔによる解析を示す写真である。
種々のヒト成体組織より調製した２μｇ  ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを含むＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２のコーディング領域に対するプローブとハイブリダイズせしめた。分子量マーカーは左端に示した。
図５は、ＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２  ｍＲＮＡの組織特異的発現パターンの正常組織と腫瘍サンプルに於ける比較を示す写真である。
種々の腫瘍サンプルおよび対応する正常組織より調製したｃＤＮＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型としてＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物は２％ａｇａｒｏｓｅ／ＥｔＢｒゲルを用いた電気泳動にて解析した。Ｎは正常組織、肺癌組織は、Ｃ１：ヒト肺癌ＬＸ−１、Ｃ２：ヒト肺癌ＧＩ−１１７、前立腺癌は、Ｃ：ヒト前立腺腺癌ＰＣ３、大腸癌は、Ｃ１：ヒト大腸腺癌ＣＸ−１、Ｃ２：ヒト大腸腺癌ＧＩ−１１２、膵臓癌は、Ｃ：ヒト膵臓腺癌ＧＩ−１０３、卵巣癌は、Ｃ：ヒト卵巣癌ＧＩ−１０２にそれぞれ由来する。ＤＮＡサイズマーカー（ＨａｅＩＩＩ消化ΦＸ１７４断片）はレーンＭに示した。
図６は、ヒト卵巣癌および正常卵巣組織に於けるＡＬＥＸ１発現のＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔによる解析を示す写真である。
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔは、同一の手術部位より摘出した腫瘍組織および対応する正常組織より調製した２０μｇの総ＲＮＡを含む（Ｈｕｍａｎ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｂｌｏｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。検体提供者：１−左側卵巣に発生したｓｅｒｏｕｓ  ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（４８歳）、２−ｓｅｒｏｕｓ  ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（３０歳）、３−ｇｒａｎｕｌｏｓａ−ｔｈｅｃａ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ（４２歳）、４−ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（２８歳）。Ｔは腫瘍組織、Ｎは正常組織を示す。
図７は、ヒト正常およびトランスフォームした細胞株に於けるＡＬＥＸ１およびＡＬＥＸ２  ｍＲＮＡ発現の比較を示す写真である。
種々のヒト細胞株および正常組織より調製したｃＤＮＡを鋳型とし、上図にて用いたのと同じプライマーの組み合わせでＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物は２％ａｇａｒｏｓｅ／ＥｔＢｒゲルを用いた電気泳動にて解析した。正常組織（Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）として脳、心臓、腎臓および脾臓、ヒト由来細胞株としてはＭＲＣ−５：正常胎児肺由来２倍体繊維芽細胞株、ＫＭＳ−６：正常２倍体胎児由来繊維芽細胞株、ＫＭＳＴ−６Ｔ：ＫＭＳ−６に由来する腫瘍化細胞株、ＴＥ−８５：悪性骨肉腫由来細胞株、ｔ−ＨＵＥ２：内皮細胞株ＥＣＶ３０４より樹立した不死化細胞株、Ｕ−２０Ｓ：骨肉腫由来細胞株、ＨｅＬａ：子宮頸部腺癌由来細胞株、Ａ５４９：肺癌由来細胞株、ＡＢＣ−１：非小細胞性肺癌由来細胞株、Ａ１７２：悪性膠細胞腫由来細胞株、Ｃ−３３Ａ：子宮頸部癌由来細胞株、ＣＭＶ−Ｍｊ−ＨＥＬ−１：ＣＭＶでトランスフォームさせた胎児肺由来繊維芽細胞株。ＤＮＡサイズマーカー（ＨａｅＩＩＩ消化ΦＸ１７４断片）はレーンＭに示した。
図８は、マウス胎生期に於けるＡＬＥＸ１  ｍＲＮＡ発現の解析を示す写真である。
異なる発生段階のマウス全胎児より調製した２μｇ  ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを含むＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をマウスＥＳＴデータベースより見出したＡＬＥＸ１に相同な配列をもとに作成したプローブとハイブリダイズせしめた。分子量サイズマーカーは左端に示した。
図９は、ＡＬＥＸ１蛋白とＪＩＰ−１断片の相互作用の解析を示す図および写真である。
種々の欠失を含むＪＩＰ−１断片をＧａｌ４の転写活性化ドメインと連結したプラスミドを用いてｐＯＤＢ−８０−ＡＬＥＸ１を導入した酵母細胞株ＰＪ６９−４Ａを形質転換した後、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ不含、１ｍＭ  ３−ＡＴ含有培地に播種した。−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓプレートでの増殖は相互作用を意味する。これと並行して、同じ酵母細胞の−Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレートでの増殖により形質転換の確認を行った。アミノ酸番号２５８−７１１の断片は最初の酵母２ハイブリッドスクリーニングで同定した最小のＪＩＰ−１由来クローン（１９Ａ３）に相当する。
図１０は、ＡＬＥＸ１によるｃ−Ｊｕｎ依存転写活性化の阻害を示す図である。
ｃ−Ｊｕｎ依存レポーター遺伝子ｐＧ５−Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ蛋白をコードする；５００ｎｇ）を内部標準としてのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするプラスミドｐＲＬ−ＴＫ（５０ｎｇ）およびＧａｌ４（２５ｎｇ）、Ｇａｌ４−ｃＪｕｎ（２５ｎｇ）、ＭＥＫＫ１（５０ｎｇ）、ＡＬＥＸ１の発現プラスミドとそれぞれ示した組み合わせでＨｅＬａ  Ｓ３細胞に導入した。ルシフェラーゼ活性はｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの４２時間後に測定した。縦軸の値はホタルルシフェラーゼ活性の内部標準として用いたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対する相対値として示した。アッセイはｄｕｐｌｉｃａｔｅにて実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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