(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列と95％以上の同一性を有する蛋白質をコードするDNAであって、ここで、該蛋白質はGC-boxに結合するzincフィンガー領域を有し、かつ、該蛋白質はCMVプロモーターの転写活性を抑制する、DNA。
【請求項２】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコードするDNAであって、ここで、該DNAは下記（ａ）または（ｂ）のDNA。
（ａ）配列番号：２の271〜398番目のアミノ酸配列を含む蛋白質断片をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：３の811〜1194番目のヌクレオチドを含むDNA。
【請求項３】
請求項１または２に記載のDNAによりコードされる蛋白質またはペプチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のDNAまたは請求項４に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、請求項３に記載の蛋白質またはペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項３に記載の蛋白質またはペプチドに結合する抗体。
【請求項８】
請求項３に記載の蛋白質またはペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質またはペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質またはペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質またはペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項９】
請求項３に記載の蛋白質またはペプチドの転写制御活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該蛋白質またはペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質またはペプチドの転写制御活性を検出する工程、
（ｃ）被検試料を接触させない場合と比較して、工程（ｂ）において検出される転写制御活性を低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の蛋白質もしくはペプチドまたはこれらをコードするDNAを含むプロモーター活性制御剤。
【請求項１１】
プロモーターがCMVプロモーターである、請求項１０に記載のプロモーター活性制御剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ｚｉｎｃフィンガードメインを有し、ＧＣ−ｂｏｘに結合する新規な蛋白質、およびその遺伝子、並びにそれらの製造および用途に関する。
背景技術
ＧＣ−ｂｏｘやＧＴ−ｂｏｘのようなＧリッチエレメントは、ハウスキーピング遺伝子をはじめ、組織特異的遺伝子や胎児期で発現する遺伝子などさまざまな遺伝子のプロモーター配列中に見いだされている、転写因子の結合配列である。Ｇリッチエレメントは、転写因子の結合による遺伝子発現に深く関るほか、発生や分化とも密接に関係している。
Ｓｐ１は、ＳＶ４０のプロモーター配列のＧＣ−ｂｏｘに結合し、その転写活性を制御するＤＮＡ結合性転写因子として見いだされた（Ｄｙｎａｎ  ＷＳ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３５，７９−８７、Ｇｉｄｏｎｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，４０９−１３）。Ｓｐ１は、そのＣ末端領域に３つのｚｉｎｃフィンガードメインを持ち、このドメインを介してＧＣ／ＧＴ−ｂｏｘに結合する（Ｋａｄｏｎａｇａ  ＪＴ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１，１０７９−９０）。また、転写の活性化に必要なグルタミンリッチな領域を２つ持ち（Ｃｏｕｒｅｙ  ＡＪ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５５，８８７−９８）、さらに２つのセリン／スレオニンリッチな領域も持つことが知られている。Ｓｐ１には相同性の高い転写因子ホモログ、Ｓｐ２（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２，４２５１−６１）、Ｓｐ３及びＳｐ４（Ｈａｇｅｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０，５５１９−２５）が存在し、ファミリーを形成している。いずれの転写因子もＣ末端領域に非常に高く保存された３つのｚｉｎｃフィンガードメインを持ち、これ以外にもグルタミンリッチ領域やセリン／スレオニンリッチ領域を持つ。Ｓｐ３とＳｐ４はＳｐ１と同様、ＧＣ／ＧＴ−ｂｏｘに結合するが（Ｈａｇｅｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０，５５１９−２５、Ｈａｇｅｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ  １３，３８４３−５１）、Ｓｐ２はＴＣＲのＶαプロモーター領域ではＧＣ−ｂｏｘには結合せず、ＧＴ−ｂｏｘに結合するという報告もある（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２，４２５１−６１）。
最近、Ｓｐ１の３つのｚｉｎｃフィンガードメインに高い相同性を持つ転写因子が多数報告されている（Ｐｈｉｌｉｐｓｅｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７，２９９１−３０００）。これらはＳｐ１と同様、Ｃ末端領域に３つのｚｉｎｃフィンガードメインを持ち、ＧＣ／ＧＴ−ｂｏｘに結合することが示されているが、それ以外の領域ではＳｐファミリーとの相同性は低く、Ｓｐ１では転写活性領域として機能しているグルタミンリッチ領域は持たない。
これらのＧＣ／ＧＴ−ｂｏｘ結合性転写因子は、転写活性を増強あるいは抑制することが知られており、発生や分化を含むさまざまな細胞で遺伝子発現を制御していることが考えられる。このような特性から、ＧＣ／ＧＴ−ｂｏｘ結合性転写因子は、現在、医薬品開発の標的として注目されている。
発明の開示
本発明は、ｚｉｎｃフィンガードメインを有し、ＧＣ−ｂｏｘに結合する新規な蛋白質、その遺伝子、およびそれらと機能的に同等な分子、並びにそれらの製造および用途を提供する。
本発明者らは、心筋分化に関連する遺伝子を見出すために、ＤＭＳＯ添加による心筋様細胞への分化誘導系が構築されているマウスＣＬ６細胞を用い、分化に伴って発現の上昇する遺伝子の探索を行った。
まず、本発明者らは、未分化なＣＬ６細胞およびＤＭＳＯ添加後４日目のＣＬ６細胞から調製したｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡを用いたサブトラクション法を実施し、分化誘導直後に発現の上昇する多数の遺伝子断片を得た。この中の１つのクローンＰＳ４０−２８５について、相同性検索およびアミノ酸配列のモチーフ検索を行った結果、ジンクフィンガー（ｚｉｎｃフィンガー）ドメインを有する新規遺伝子であることが判明した。そこで、該遺伝子の全ＯＲＦを含むｃＤＮＡのクローニングを行い、塩基配列の決定を行った。
その結果、このマウス新規遺伝子（ｍ２８５）によりコードされる蛋白質は、３つのｚｉｎｃフィンガーモチーフを有する、３９８アミノ酸からなる蛋白質であることが判明した。３つのｚｉｎｃフィンガードメインはＣ末端付近に位置し、この配列は既知のＳＰファミリー転写因子（ＳＰ１、２、３および４）等の３つのｚｉｎｃフィンガードメインと高い相同性を有していた。また、Ｎ末端付近にもＳＰ１、２および４と高い相同性を持つ領域があることが判明した。それ以外の領域では既知遺伝子と高い相同性は見られなかった。
次いで、ＣＬ６細胞のＤＭＳＯ刺激による分化誘導過程でのｍ２８５の発現を調べたところ、分化誘導後４日目に一過性に発現していることが判明した。さらに、ノーザンブロットによる発現組織分布の解析を行った結果、ｍ２８５は、マウス１７日目胚で非常に強く発現し、７日目、１１日目、１５日目胚ではほとんど発現が認められなかった。成体では精巣での発現が認められ、また少ないながらも脳、心臓、肝臓及び腎臓で発現していることが判明した。
また、本発明者らは、ｍ２８５のヒトカウンターパートであるヒト新規遺伝子（ｈ２８５）についても、全ＯＲＦを含むｃＤＮＡをクローニングした。ｈ２８５はｍ２８５と同様に３９８アミノ酸をコードしていた。取得できたｈ５８４をｍ５８４と比較すると、コーディング領域での核酸配列で９１．１％、アミノ酸配列で９７．５％の相同性を持つことが判明した。
一般に転写因子は核に存在することから、ｍ２８５の細胞内分布を調べた。その結果、ｍ２８５は核に存在し、核移行には３つのｚｉｎｃフィンガードメインを含むＣ末側領域が必要であることが判明した。さらに、ＤＮＡ結合アッセイより、ｍ２８５はＳＰファミリー転写因子と同様に、３つのｚｉｎｃフィンガードメインを含むＣ末端領域を介してＧＣ−ｂｏｘの塩基配列に結合することが判明した。ＧＣ−ｂｏｘは多くの遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域に存在することが知られている。これらの事実から、２８５は、ＧＣ−ｂｏｘに結合し、遺伝子の転写調節を行う機能を有していると考えられる。
そこで、２８５が、転写をどのように調節（転写の促進または抑制）を行っているかを、哺乳動物Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ法によって検討した。その結果、２８５はＣＭＶプロモーターの転写活性を抑制することが判明した。これにより２８５が転写因子として機能していることが明らかになった。
本発明は、以上のような知見を基に完成されたものであり、ｚｉｎｃフィンガードメインを有し、ＧＣ−ｂｏｘに結合する新規な蛋白質「２８５」、その遺伝子、およびそれらと機能的に同等な分子、並びにそれらの製造および用途を提供する。
より具体的には、本発明は、
（１）  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２）  配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ。
（３）  （１）または（２）に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質またはペプチド。
（４）  （１）または（２）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
（５）  （１）または（２）に記載のＤＮＡまたは（４）に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
（６）  （５）に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、（３）に記載の蛋白質またはペプチドの製造方法。
（７）  （３）に記載の蛋白質に結合する抗体。
（８）  配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（９）  （３）に記載の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
（１０）  （３）に記載の蛋白質の転写制御活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該蛋白質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質またはその部分ペプチドの転写制御活性を検出する工程、
（ｃ）被検試料を接触させない場合と比較して、工程（ｂ）において検出される転写制御活性を低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法。
（１１）  （９）または（１０）に記載のスクリーニングにより単離し得る化合物。
（１２）  （３）に記載の蛋白質もしくはペプチドまたはこれらをコードするＤＮＡを含むプロモーター活性制御剤。
（１３）  プロモーターがＣＭＶプロモーターである、（１２）に記載のプロモーター活性制御剤、を提供するものである。
本発明は、ｚｉｎｃフィンガードメインを有し、ＧＣ−ｂｏｘに結合する新規な蛋白質をコードするマウス由来遺伝子「ｍ２８５」、およびヒト由来遺伝子「ｈ２８５」を提供する（以下、必要に応じて「ｍ２８５」と「ｈ２８５」を併せて「２８５」と称する）。
ｍ２８５の塩基配列を配列番号：１に、ｈ２８５の塩基配列を配列番号：３に示した。また、ｍ２８５によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２に、ｈ２８５によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：４に示した。
本発明のｍ２８５遺伝子は、未分化なマウスＣＬ６細胞にＤＭＳＯを添加することにより分化誘導を行い、分化誘導直後に発現の上昇する新規な遺伝子として単離された。また、本発明のｈ２８５遺伝子は、ヒトにおける該遺伝子のホモログとして単離された。本発明の遺伝子がコードする蛋白質は、相同性解析の結果、３つのｚｉｎｃフィンガードメインを含み、Ｓｐファミリー転写因子の３つのｚｉｎｃフィンガードメインと高い相同性が見られた。さらに該蛋白質は、細胞の核に分布し、かつＧＣ−ｂｏｘの塩基配列を認識し結合することから、転写因子として機能しているものと考えられた。実際、本発明の２８５蛋白質は、ＭＧ６３細胞でのＣＭＶプロモーターの活性を抑制する機能を有していた。このように本発明の２８５蛋白質は、その発現特性や、構造上の特性から、生体において重要な機能を担う分子であると考えられ、医薬品開発の有用な標的となる。さらに、本発明の２８５蛋白質やその部分ペプチドあるいはそれらをコードするＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの活性を抑制する薬剤（試薬および医薬）として利用することも考えられる。
本発明は、また、２８５蛋白質（配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）と機能的に同等な蛋白質を包含する。このような蛋白質には、例えば、２８５蛋白質の変異体やホモログ等が含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質が、２８５蛋白質と同様に、ｚｉｎｃフィンガードメインを有する転写因子として機能することを指す。具体的な機能としては、例えば、ｚｉｎｃフィンガードメインを介したＧＣ−ｂｏｘへの結合およびＭＧ６３細胞でのＣＭＶプロモーターの活性の抑制が挙げられる。
対象となる蛋白質のＧＣ−ｂｏｘへの結合活性は、例えば、実施例に記載のようにゲルシフトアッセイにより判定することができる。具体的には、目的の蛋白質とＧＣ−ｂｏｘを含む標識したＤＮＡプローブとを混合した後、非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、標識下ＤＮＡプローブのゲル上での移動度を検出する。目的の蛋白質がＧＣ−ｂｏｘを含む標識ＤＮＡと結合する場合には、該標識ＤＮＡ単独の場合よりＤＮＡ−蛋白質複合体のバンドの移動度は小さくなる。従って、この移動度の小さいバンドが観察される場合、目的の蛋白質はＧＣ−ｂｏｘと結合するものと判定することができる。また、対象となる蛋白質のＭＧ６３細胞でのＣＭＶプロモーターの活性の抑制は、実施例８に記載のリプレッションアッセイにより判定することができる。
ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、蛋白質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、２８５蛋白質のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、２８５蛋白質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明の蛋白質に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内）であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
２８５蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白質には、これら蛋白質を含む融合蛋白質が含まれる。融合蛋白質は、これら蛋白質と他のペプチド又は蛋白質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合蛋白質の作製においては、２８５蛋白質をコードするＤＮＡと他のペプチド又は蛋白質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチド又は蛋白質としては、特に限定されない。
本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の蛋白質との融合に付される他の蛋白質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合蛋白質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡを本発明の蛋白質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合蛋白質を調製することができる。
また、ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、２８５蛋白質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１または３）もしくはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから蛋白質と機能的に同等な蛋白質を単離することも通常行いうることである。
本発明には、２８５蛋白質をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードし、２８５蛋白質と機能的に同等な蛋白質が含まれる。このような蛋白質としては、例えば、マウスおよび他の哺乳動物のホモログ（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ウシなどがコードする蛋白質）が挙げられる。
２８５蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、ハイブリダイゼーションにかえて、２８５蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または３）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、２８５蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、通常、２８５蛋白質（配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の蛋白質には、２８５蛋白質と機能的に同等であり、かつ該蛋白質のアミノ酸配列と高い相同性を有する蛋白質も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。蛋白質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明の蛋白質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた蛋白質が、２８５蛋白質と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の蛋白質を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の蛋白質のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明の蛋白質はこのような蛋白質も包含する。
本発明の蛋白質は、当業者に公知の方法により、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として調製することが可能である。組み換え蛋白質であれば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の蛋白質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明の蛋白質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換え蛋白質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換え蛋白質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて融合蛋白質のうち、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然の蛋白質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明の蛋白質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明の蛋白質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明の蛋白質に対する抗体の作製、本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明の蛋白質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。また、本発明の蛋白質のアンタゴニストや競合阻害剤になり得る。本発明の２８５タンパク質は、ＧＣ−ｂｏｘ結合活性、核移行活性、および転写制御活性を有するため、本発明の部分ペプチドには、これらの活性の中から少なくとも一つの活性を有する部分ペプチドが含まれる。本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、上述したような本発明の蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明の蛋白質により治療可能な疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明の蛋白質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明の蛋白質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明の蛋白質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１または３）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明の蛋白質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１または３）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明の蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明の蛋白質を発現する細胞、組織、臓器（例えば、精巣、脳、心臓、肝臓、および腎臓）から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）にしたがい、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番号：１の塩基配列において７５位の塩基アデニンから１２７１位の塩基アデニンまでの塩基配列からなるＤＮＡまたは該塩基配列を含むＤＮＡを包含する。配列番号：３の塩基配列においては、１位の塩基アデニンから、１１９７位の塩基アデニンまでの塩基配列からなるＤＮＡまたは該塩基配列を含むＤＮＡを包含する。
本発明のＤＮＡはまた、配列番号：１または３に示す塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ上記本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを含む。ハイブリダイゼーションにおける条件は当業者であれば適宜選択することができるが、具体的には上記した条件を用いることができる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡを得ることができる。上記のハイブリダイズするＤＮＡは、好ましくは天然由来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡである。
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明の蛋白質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明の蛋白質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明の遺伝子を発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明のｈ２８５遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のＤＮＡまたは本発明のベクターを保持する形質転換細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明の蛋白質の製造や発現のための産生系として使用することができる。蛋白質製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより蛋白質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏで蛋白質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内で蛋白質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の蛋白質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明の蛋白質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。蛋白質の分離、精製は、通常の蛋白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば蛋白質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された蛋白質も包含する。
なお、蛋白質を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明は、また、本発明の蛋白質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明の蛋白質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明の蛋白質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来の蛋白質が好ましく、特にヒト由来の蛋白質が好ましい。ヒト由来の蛋白質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用される蛋白質は、完全な蛋白質であってもよいし、また、蛋白質の部分ペプチドであってもよい。蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、蛋白質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とは蛋白質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明の蛋白質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的の蛋白質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、蛋白質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明の蛋白質を感作抗原として使用してもよい。短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンなどのキャリア蛋白質と適宜結合させて抗原とすることが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明の蛋白質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質、蛋白質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明の蛋白質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明の蛋白質の精製、検出に用いられる他、本発明の蛋白質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明の蛋白質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となる蛋白質、蛋白質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いて蛋白質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
さらに、本発明の抗体は、本発明の蛋白質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明の蛋白質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。蛋白質として蛋白質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の蛋白質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該蛋白質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明の蛋白質の検出又は測定方法を実施することができる。本発明の蛋白質の検出又は測定方法は、蛋白質を特異的に検出又は測定することができるため、蛋白質を用いた種々の実験等に有用である。
本発明はまた、２８５蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または３）またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域において、完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドには、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該ＤＮＡの発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明の蛋白質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡ等）が含まれる。また、このような核酸は、ＤＮＡチップの作製に利用することもできる。
プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的とし、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１または３の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１または３の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１または３に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明の蛋白質の産生細胞に作用して、該蛋白質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明の蛋白質の発現を抑制することにより、結果的に本発明の蛋白質の作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の蛋白質の発現を阻害し、従って、本発明の蛋白質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明の蛋白質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
本発明の蛋白質は、これに結合する化合物のスクリーニングに有用である。すなわち、本発明の蛋白質と、該蛋白質に結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触せしめ、そして本発明の蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する、ことを含む本発明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方法において使用される。
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え蛋白質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。また部分ペプチドであってもよい。また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させる本発明の蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、他の蛋白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被検試料に接触させることができる。
本発明の蛋白質を用いて、例えば該蛋白質に結合する蛋白質をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明の蛋白質をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ  Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ  ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，Ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ  Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ  ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明の蛋白質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合蛋白質として本発明の蛋白質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学  １３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などとの融合蛋白質を発現することができるベクターが市販されている。
融合蛋白質にすることにより本発明の蛋白質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合蛋白質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素  ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖蛋白質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０蛋白質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明の蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学  １３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明の蛋白質、それと結合能を有する蛋白質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明の蛋白質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明の蛋白質に対する抗体は、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させた蛋白質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明の蛋白質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合蛋白質として調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明の蛋白質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。  免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降された蛋白質の解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることで蛋白質の分子量により結合していた蛋白質を解析することができる。また、この際、一般的には本発明の蛋白質に結合した蛋白質は、クマシー染色や銀染色といった蛋白質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内の蛋白質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。蛋白質の分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的の蛋白質を精製し、その配列を決定することもできる。
また、本発明の蛋白質を用いて、該蛋白質に結合する蛋白質を単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、精巣、脳、心臓、肝臓、および腎臓）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させた蛋白質を固定し、精製して標識した本発明の蛋白質と上記フィルターとを反応させ、本発明の蛋白質と結合した蛋白質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明の蛋白質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明の蛋白質又は本発明の蛋白質に融合したペプチド又はポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。２−ハイブリッドシステムにおいては、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをＳＲＦ  ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明の蛋白質と結合する蛋白質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードする蛋白質を得ることができる。これにより本発明の蛋白質に結合する蛋白質またはその遺伝子を調製することが可能である。２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
本発明の蛋白質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティークロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明の蛋白質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明の蛋白質に結合した蛋白質を調製することができる。
得られた蛋白質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明の蛋白質と被検化合物との間の相互作用を微量の蛋白質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明の蛋白質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
また、蛋白質に限らず、本発明の蛋白質に結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明の蛋白質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明の蛋白質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−９）が当業者に公知である。
本発明の蛋白質は、その転写制御活性を調節する化合物のスクリーニングにも有用である。すなわち、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに該蛋白質の転写制御活性を調節する化合物を含むと予想される被検試料とを接触せしめ、該蛋白質またはペプチドの転写制御活性を検出し、これにより検出される転写制御活性を、被検試料を接触させない場合（対照）と比較して低下または増加させる化合物を選択する、ことを含む本発明の蛋白質の転写制御活性を調節する化合物をスクリーニングする方法において使用される。
このスクリーニングは、例えば、哺乳動物Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ法を利用して以下の如く実施することができる（実施例８参照）。
まず、本発明の蛋白質をＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインのような公知のＤＮＡ結合能を有するペプチドとの融合蛋白質として発現するベクター（これを「第一ベクター」と称する）および、該ＤＮＡ結合能を有するペプチドが結合する配列の下流にその発現を保証するようにレポーター遺伝子が結合されているベクター（これを「第二ベクター」と称する）を構築する。第一ベクターおよび第二ベクターを細胞に導入し、そのレポーター活性を検出する。用いる細胞としては、ＭＧ６３、ＨｅＬａ、２９３等を例示することができる。第二ベクターにおいては、本発明の蛋白質による転写制御活性を検出することを望む適当なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）を用いることができる。これにより検出されるレポーター活性を、第一ベクターを導入しない場合のレポーター活性と比較する。第一ベクターを導入しない場合を基準として、該ベクターを導入することにより、レポーター活性が変化すれば、これを本発明の蛋白質の「転写制御活性」と評価する。
次いで、第一ベクターおよび第二ベクターを有する細胞に被検試料を接触させて、同様にレポーター活性を検出する。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。また、上記の本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリーニングにより単離された化合物を被検試料として用いてもよい。検出の結果、被検試料を接触させることにより、本発明の蛋白質の「転写制御活性」が増加または低下すれば、用いた被検試料は本発明の蛋白質の転写制御活性を調節する化合物であると判定することができる。
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、本発明の蛋白質の発現異常や機能異常などに起因する疾患や本発明の蛋白質の活性を制御することにより治療可能な疾患の治療への応用が考えられる。本発明のスクリーニング方法を用いて単離しうる化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される物質も、本発明の蛋白質に結合する化合物に含まれる。
本発明の蛋白質若しくはペプチド、または本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物をヒトや動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、蛋白質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明の蛋白質の投与量は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約１００μｇから２０ｍｇであると考えられる。
本発明の蛋白質と結合する化合物や本発明の蛋白質の活性を調節する化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。  非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕ｍ２８５遺伝子断片の単離
未分化なマウスｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｐ１９は種々の刺激（ＤＭＳＯ、レチノイン酸など）を加えることで、様々な種類の神経細胞、平滑筋細胞あるいは心筋細胞などへと分化誘導を行うことができる（Ｂａｉｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １６，３４３−３４８、ＭｃＢｕｒｎｅｙ  ＭＷ（１９９３）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７，１３５−１４０）。ＣＬ６細胞はＰ１９より樹立された未分化な細胞株である（Ｈａｂａｒａ−Ｏｈｋｕｂｏ  Ａ（１９９６）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２１，１０１−１１０）。Ｐ１９は浮遊条件で培養し、ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙを形成させ分化誘導を行う必要があるのに対し、このＣＬ６細胞は付着条件で細胞培養培地に１％のＤＭＳＯを添加することによって、効率良く心筋様細胞へと分化誘導を行うことが可能である。ＣＬ６細胞は、１％ＤＭＳＯの刺激を加えた後約８日でｃａｒｄｉａｃ  α  ａｎｄ  β−ＭＨＣといった心筋遺伝子を発現し、刺激後約１０日でシンクロナイズした拍動を開始する。本発明者等は、このＣＬ６細胞の分化誘導系を利用して心筋分化に関連する遺伝子の探索を以下のように行った。
ＣＬ６細胞の培養は羽原−大久保の方法に従った。ＤＭＳＯ未添加あるいは１％ＤＭＳＯ添加後４日目の細胞に対しトリプシン消化を行い、細胞を集めＲＮｅａｓｙ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡよりＭｉｎｉ−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｋｉｔ（５ｐｒｉｍｅ−３ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．）を用いてｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡを得た。ＤＭＳＯ未添加あるいは１％ＤＭＳＯ添加後４日目のＣＬ６細胞より得たｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡを用いて、１％ＤＭＳＯ添加後４日目マイナスＤＭＳＯ未添加のサブトラクションをＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＰＣＲ  ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、キット添付の方法に従って行った。得られたｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔはＺｅｒｏ  ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングした。組み替え体を持つコロニーは後述のコロニーＰＣＲで増幅した後、ｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ１（ｎＰ１）及びｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ２Ｒ（ｎＰ２Ｒ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）で塩基配列を確認した。これにより心筋分化誘導直後に発現の上昇する多数の遺伝子断片を得た。その中の一つ、ＰＳ４０−２８５について実施例２以降の解析を行った。
なお、本実施例におけるコロニーＰＣＲは次のようにして行った。ＳＰＯＲＴ  ＦＷ（５’−ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  −３’／配列番号：５）、ＳＰＯＲＴ  ＲＶ（５’−ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣＣ−３’／配列番号：６）及びＫＯＤ  ｄａｓｈポリメラーゼを含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液に組み替え体を持つコロニーを直接懸濁し、９４℃で１分、「９６℃で１５秒、５５℃で５秒、７２℃で２５秒」を３２サイクルの条件のＰＣＲを行った。これにより増幅されたＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動で確認し、必要に応じてＰＣＲ生成物をＭｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｓ−３００、Ｓ−４００ゲルろ過（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）あるいはＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＨＶ  ｐｌａｔｅ（ミリポア）＋ＢｉｏＧｅｌ−Ｐ６０（ＢｉｏＲａｄ）で精製し、シークエンス反応のテンプレートとした。
また、本実施例における塩基配列の決定は、次のように行った。シークエンス反応のテンプレートとしては、コロニーＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲなど、ＰＣＲ産物を用いた。ＰＣＲ反応後アガロースゲル電気泳動で生成物を確認し、夾雑物が混入している場合はアガロースゲルより目的ＰＣＲ産物を切り出し、そうでない場合はゲルろ過で精製した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いたサイクルシークエンシングを行った。未反応のプライマー、ヌクレオチド等を９６  ｗｅｌｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ＨＬ  ｋｉｔ（ＡＧＴＣ）で除去し、ＡＢＩ  ３７７あるいはＡＢＩ  ３７７ＸＬ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で塩基配列を決定した。
〔実施例２〕ｍ２８５遺伝子のｃＤＮＡクローニング
マウス１０．５日胚ｃＤＮＡプラスミドライブラリーをテンプレートとして、遺伝子断片であるＰＳ４０−２８５の塩基配列を元にｍ２８５の全ＯＲＦを含むｃＤＮＡをクローニングした（図１）。クローニングできた全ＯＲＦを含むｍ２８５のｃＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列の決定は次のようにして行った。
サブトラクションクローンＰＳ４０−２８５の塩基配列を基にプライマー、２８５−Ａ（５’−ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＡＡＧ  ＴＣ−３’／配列番号：７）、２８５−Ｂ（５’−ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＡＡＣ−３’／配列番号：８）、２８５−Ｃ（５’−ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＡＣＡ  ＡＡ−３’／配列番号：９）、２８５−Ｄ（５’−ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＡＴＴ−３’／配列番号：１０）をベックマンＤＮＡ自動合成機で合成した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｍｏｕｓｅ  １０．５ｄａｙ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（ＧＩＢＣＯ）を２．１ｘ１０３クローンとなるように５ｍｌ  ＬＢ−Ａｍｐ培地に加え、３０℃で培養したのちＱＩＡｓｐｉｎ  ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）でプラスミドを得た。このプラスミドを鋳型とし、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて以下のプライマーおよびサイクルで行った。  即ち、３’ＲＡＣＥプライマーには、２８５−Ａ＋ＳＰＯＲＴ  ＦＷ（一次３’ＲＡＣＥ）および２８５−Ｃ＋ＳＰＯＲＴ  Ｔ７（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’／配列番号：１１）（ｎｅｓｔｅｄ  ３’ＲＡＣＥ）を用い、５’ＲＡＣＥプライマーには、２８５−Ｂ＋ＳＰＯＲＴ  ＲＶ（一次５’ＲＡＣＥ）および２８５−Ｄ＋ＳＰ６（５’−ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  Ａ−３’／配列番号：１２）（ｎｅｓｔｅｄ  ５’ＲＡＣＥ）を用いた。また、一次ＲＡＣＥは、９５℃で１分、「９６℃で１５秒、６３℃で１５秒、６８℃で３分」を３０サイクルで行い、ｎｅｓｔｅｄ  ＲＡＣＥは、上記ＰＣＲを１５サイクルで行った。Ｎｅｓｔｅｄ  ＲＡＣＥ産物はＲＡＣＥに用いたプライマーでその塩基配列を決定した。さらに５’ＲＡＣＥ産物は２８５−Ｅ（５’−ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＣＧＣ  Ａ−３’／配列番号：１３）、２８５−Ｆ（５’−ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＡＣＴ−３’／配列番号：１４）にて塩基配列を決定した。
その結果ｍ２８５は、１８３０塩基であり、３９８アミノ酸をコードしていることが判明した。このアミノ酸配列は、Ｃ末側に３つのｚｉｎｃフィンガードメインを持ち、また、中央部にプロリンリッチおよびアラニンリッチ領域を有していた。（図１）。
次にｍ２８５のｃＤＮＡをＢＬＡＳＴによるデータベースサーチを行った結果、ヒトＵｎｉＧｅｎｅクローン（Ｈｓ．１４５９２１；ＮＣＢＩ  ｈｕｍａｎ  ＵｎｉＧｅｎｅ  ｃｌｏｎｅ  ｎｕｍｂｅｒ）およびヒトＨＴＧクローン（ＡＣ００７４０５；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）と高い相同性を持ち、ｍ２８５はこれらのマウスカウンターパートであることが判明した。しかし、全長にわたって高い相同性を示す既知遺伝子は、データベース中には存在せず、新規な遺伝子であった。ｍ２８５のアミノ酸配列をデータベース検索した結果、Ｃ末端側の３つのｚｉｎｃフィンガードメインがＳｐファミリー転写因子と非常に高い相同性を有していた（図２）。特にＳｐ４との相同性が高く、３つのｚｉｎｃフィンガードメインにおいて８８．６％の一致を示す。また、Ｎ末端側にも（１１アミノ酸残基ながら）Ｓｐ１、Ｓｐ２およびＳｐ４と完全に一致する領域を持っていた（図３）。しかし、これら以外の領域においてはＳｐファミリー遺伝子との相同性はなかった。また、既知遺伝子で、全領域において高い相同性を有するものは存在せず、ｍ２８５が３つのｚｉｎｃフィンガードメインを持つ新規遺伝子であることが判明した。
〔実施例３〕ＣＬ６分化誘導系でのｍ２８５遺伝子の発現
ＣＬ６は未分化な胚性腫瘍細胞株Ｐ１９より単離された細胞株であり、ＤＭＳＯによる分化誘導を行うと約１０日間かけて未分化な形質より心筋様細胞へと分化する。ｍ２８５は、ＣＬ６の心筋分化誘導直後（ＤＭＳＯ刺激後４日目）に発現の上昇する遺伝子として得られたものである。そこで未分化なＣＬ６（ＤＭＳＯ分化誘導なし）、ＤＭＳＯの分化誘導後４日目、８日目及び１２日目のＣＬ６よりＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによってＣＬ６分化誘導系におけるｍ２８５遺伝子の発現を解析した。このとき、成体マウス心臓より単離したＲＮＡも同時に解析に供した。ＲＴ−ＰＣＲは次のようにして行った。
ＤＭＳＯ未添加あるいは１％ＤＭＳＯ添加後４日目、８日目及び１２日目のＣＬ６細胞より調製した全ＲＮＡと、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス心臓ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ニッポンジーン）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ）をＲＴａｓｅとして用い、（ｄＴ）３０ＶＮプライマーでｃＤＮＡ合成をしＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとした。２８５−Ａと２８５−Ｂのプライマーセットと、コントロールとしてＧ３ＰＤＨ  ５’（５’−ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  Ｃ−３’／配列番号：１５）とＧ３ＰＤＨ  ３’（５’−ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＡＣ  Ｃ−３’／配列番号：１６）のプライマーセットを用い、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使ったＲＴ−ＰＣＲを、９５℃で１分、「９６℃で１５秒、６０℃で１５秒、６８℃で３０秒」を２８サイクル（Ｇ３ＰＤＨの時は２０サイクル）で行った。
ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＤＭＳＯの分化誘導後４日目のＣＬ６細胞にのみ、一過性に発現していることが判明した（図４）。分化誘導前、分化誘導後８日目以降のＣＬ６細胞ではその発現は認められず、成体マウス心臓においてもその発現は全く認められなかった。
〔実施例４〕ｍ２８５遺伝子の発現組織分布
次に、ノーザンブロットによりｍ２８５の発現組織を解析した。実施例３の５’ＲＡＣＥ生成物をテンプレートとし、２８５−Ｅおよび２８５−ＦでＰＣＲを行い、約０．９Ｋｂの産物を得た。このＰＣＲ産物をＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈｅｒｍ）を使用し［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベリングし、未反応の［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを除去したものをｍ２８５プローブとした。Ｍｏｕｓｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ｂｌｏｔ、およびＭｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  ＭＴＮ  ｂｌｏｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中で、添付マニュアルの方法に従い、６８℃でハイブリダイゼーションを行った。イメージングプレートで感光し、解析はＢＡＳ２０００イメージングアナライザーで行った。
その結果、ｍ２８５は胎児期においては１７日目胚で非常に強く発現し、７日目、１１日目、１５日目胚ではほとんど発現が認められなかった。また、成体マウスでは精巣での発現が認められ、また少ないながらも脳、心臓、肝臓及び腎臓で発現していることが判明した（図５）。上述のＣＬ６分化誘導系での発現パターンと考え併せると、ｍ２８５は１７日目胚で非常に強く発現しているので発生の後期に何らかの関与をしているものと思われる。
〔実施例５〕ｈ２８５遺伝子のｃＤＮＡクローニング
ｍ２８５の塩基配列と、上述したヒトＵｎｉＧｅｎｅクローン（Ｈｓ．１４５９２１；ＮＣＢＩ  ｈｕｍａｎ  ＵｎｉＧｅｎｅ  ｃｌｏｎｅ  ｎｕｍｂｅｒ）およびヒトＨＴＧクローン（ＡＣ００７４０５；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）の塩基配列を基に、ｈ２８５遺伝子のクローニングを次のようにして行った。
ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｂｒａｉｎ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をテンプレートとし、２８５−Ｊ（５’−ＣＴＴ  ＴＧＣ（Ａ／Ｇ）ＣＡ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＧＡＴ−３’／配列番号：１７）およびＡＰ１（１ｓｔ．３’ＲＡＣＥ）、２８５−ｈＣ（５’−ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＣＡＣ−３’／配列番号：１８）およびＡＰ２（ｎｅｓｔｅｄ  ３’ＲＡＣＥ）のＲＡＣＥをＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い以下のサイクルで行った。即ち、一次ＲＡＣＥは、９５℃で１分、「９６℃で１５秒、６３℃で１５秒、６８℃で２分」を３５サイクルで、ｎｅｓｔｅｄ  ＲＡＣＥは上記ＰＣＲを２０サイクルで行った。
Ｎｅｓｔｅｄ  ＲＡＣＥ  ｐｒｏｄｕｃｔはｒＴａｑ（ＴａＫａＲａ）でｄＡを付加した後、ｐＣＲ  ２．１  ＴＯＰＯ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。
ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をテンプレート、２８５−ｈＧ（５’−ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡ−３’／配列番号：１９）および２８５−ｈＢ（５’−ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＡＧＣ  ＴＴ−３’／配列番号：２０）をプライマーとして、ＰＣＲｘ  ｓｙｓｔｅｍ−Ｐｌａｔｉｎｉｕｍ  Ｔａｑ（ＧＩＢＣＯ）を利用して、９５℃で１分、「９６℃で１５秒、５８℃で１５秒、７２℃で１分３０秒」を４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＲＴ−ＰＣＲ産物はｒＴａｑ（ＴａＫａＲａ）でｄＡを付加した後、ｐＣＲ  ２．１  ＴＯＰＯ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した（図６）。
その結果、取得できたｈ２８５のｃＤＮＡはｍ２８５と同様、３９８アミノ酸をコードしているものと考えられた。ｍ２８５と比較すると、コーディング領域での核酸配列で９１．１％、アミノ酸配列で９７．５％の相同性を持つことが判明した（図７）。ｃＤＮＡ配列はヒトＵｎｉＧｅｎｅクローン（Ｈｓ．１４５９２１）およびヒトＨＴＧクローン（ＡＣ００７４０５）とほぼ同一の塩基配列であった（これらの配列には、シークエンシングのエラーと思われる数塩基の付加／欠失が認められる）。ｈ２８５のアミノ酸配列もｍ２８５と同様、Ｃ末端にＳｐファミリーと非常に相同性の高い３つのｚｉｎｃフィンガードメインを有し、Ｎ末端に１１アミノ酸残基のＳｐ１、Ｓｐ２およびＳｐ４と完全に一致する領域、中央部にプロリンリッチおよびアラニンリッチ領域を有していた（図７）。
ｍ２８５と同様にｈ２８５も、全領域において高い相同性を有する既知遺伝子は存在せず、新規遺伝子であることが判明した。
〔実施例６〕ｍ２８５の細胞内局在
一般に転写因子は、ＤＮＡに結合することによって遺伝子の発現をさまざまに制御している。通常は細胞質に存在し、何らかのシグナル／刺激によって核に移行し転写制御をする転写因子も知られているが、Ｓｐファミリー転写因子を含め多くの転写因子は、細胞中で核に局在する。そこでクローニングしたｍ２８５の細胞内局在を調べた。
全長ｍ２８５（２８５Ｆ；アミノ酸残基１−３９８）、Ｎ側ｍ２８５（２８５Ｎ；アミノ酸残基１−２７８）およびＣ側ｍ２８５（２８５Ｃ；アミノ酸残基２７１−３９８）をＥＧＦＰとの融合蛋白質として発現するプラスミドを構築した。なお、２８５ＮにはＮ末端１１アミノ酸残基のＳｐ１、Ｓｐ２およびＳｐ４と完全に一致する領域、プロリンリッチおよびアラニンリッチ領域が含まれ、２８５ＣはＣ末端のＳｐファミリーと非常に相同性の高い３つのｚｉｎｃフィンガードメインが含まれる。プラスミドの構築は次のようにして行った。
ｍ２８５由来の２８５ＥｃｏＲＩ−Ｎ（５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＧ−３’／配列番号：２１），２８５ＥｃｏＲＩ−Ｐ（５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ−３’／配列番号：２２），２８５ＳａｌＩ−Ｋ（５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＡＧ−３’／配列番号：２３），２８５ＳａｌＩ−Ｍ（５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＴＡＧ  ＧＴＣ−３’／配列番号：２４）を合成した。ＤＭＳＯ刺激後４日目のＣＬ６細胞より単離したｔｏｔａｌ  ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、２８５ＥｃｏＲＩ−Ｎ＋２８５ＳａｌＩ−Ｍ（２８５Ｆ）、２８５ＥｃｏＲＩ−Ｎ＋２８５ＳａｌＩ−Ｋ（２８５Ｎ）、２８５ＥｃｏＲＩ−Ｐ＋２８５ＳａｌＩ−Ｋ（２８５Ｃ）でＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物はｒＴａｑ（ＴａＫａＲａ）でｄＡを付加した後、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにそれぞれサブクローニングした。
ｐＣＲ２．１−２８５Ｆ、２８５Ｎおよび２８５ＣをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、得られたフラグメントをｐＧＥＸ  ４Ｔ−３（ファルマシア）にインフレームで組み込んだ。このプラスミドをＪＭ−１０９にトランスフォームし、メーカー記載の方法でＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−２８５Ｆ、ＧＳＴ−２８５ＮおよびＧＳＴ−２８５Ｃ）を得た。この融合タンパクは後述のＤＮＡ結合アッセイに供した。
同様に、ｐＣＲ２．１−２８５Ｆ、２８５Ｎおよび２８５ＣのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にインフレームで組み込んだ（ｐＥＧＦＰ−２８５Ｆ、ｐＥＧＦＰ−２８５ＮおよびｐＥＧＦＰ−２８５Ｃ）。
次に構築したＥＧＦＰ融合蛋白質発現プラスミドを、ＣＬ６細胞にＦｕＧＥＮＥ６（ロシュダイアグノスティック）を用いてメーカー記載の方法でトランスフェクションし、一過性に融合蛋白質を発現させ、４８時間後に蛍光顕微鏡にて観察を行った。この時、ＥＧＦＰのみの発現プラスミドも同様にトランスフェクションした。
蛍光顕微鏡での観察の結果、ＥＧＦＰ単独およびＥＧＦＰ−２８５Ｎは細胞全体で、ＥＧＦＰ由来の蛍光が観察できたのに対し、ＥＧＦＰ−２８５ＦおよびＥＧＦＰ−２８５Ｃは、蛍光が核で観察された（図８）。このことから、ｍ２８５が核に局在する蛋白質で、核移行には３つのｚｉｎｃフィンガードメインを含むＣ末端領域が必要であることが判明した。
〔実施例７〕ＤＮＡ結合活性
Ｓｐ１は、３つのｚｉｎｃフィンガードメインを介してＧＣ−ｂｏｘに結合することが知られている。今回クローニングしたｍ２８５は、Ｓｐファミリーと非常に高い相同性を持つ３つのｚｉｎｃフィンガードメインを有しており、ＧＣ−ｂｏｘと結合する可能性が考えられる。そこで、大腸菌にて２８５Ｆ、２８５Ｎおよび２８５ＣをＧＳＴとの融合蛋白質として発現させ、これらの融合蛋白質がＧＣ−ｂｏｘに結合するかどうか調べた。ＧＳＴ融合蛋白質はグルタチオンセファロースにて精製したものを、ＧＣ−ｂｏｘはＷａｆ−１のプロモーター領域に存在するＳｐ１結合能のある塩基配列を持つＤＮＡプローブを使用した。ＤＮＡプローブはＧＣ−ｂｏｘ配列を持つｄｓ−（５’−ＴＣＧ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＣＧＡ  ＧＣＴ−３’／配列番号：２５）を３３−Ｐで標識し作成した。これと上述のＧＳＴ−２８５Ｆ、ＧＳＴ−２８５ＮおよびＧＳＴ−２８５ＣをＥＭＳＡ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  ＮＰ−４０、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１５％  ＢＳＡ、２５ｎｇ／μｌ  ｓｏｎｉｃａｔｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ）中で２０分間反応させた。また、競合阻害の有無を調べるために、同様の系に、未ラベルのＧＣ−ｂｏｘ  ＤＮＡプローブ、あるいは未ラベルのミューテーションＧＣ−ｂｏｘ  ＤＮＡプローブ（ｄｓ−（５’−ＴＣＧ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＣ  Ｔ−３’／配列番号：２６））を共存させた。ポジティブコントロールとして、リコンビナントＳｐ１を用いた。これらの反応物は５％アクリルアミドゲルで電気泳動を行い、イメージングプレートで感光した。解析はＢＡＳ２０００イメージングアナライザーで行った。
ゲルシフトアッセイの結果、ＧＳＴ−２８５Ｆ、ＧＳＴ−２８５ＣあるいはリコンビナントＳｐ１を３３−ＰでラベルしたＧＣ−ｂｏｘ  ＤＮＡプローブと反応させたものにおいて、ＤＮＡ−蛋白質の複合体と思われるバンドが観察できた（図９、レーン１、４、９）。一方、ＧＳＴ−２８５ＮをＧＣ−ｂｏｘ  ＤＮＡプローブと反応させたものは、この複合体バンドは観察できなかった（図９、レーン７）。この反応系に未ラベルのＧＣ−ｂｏｘ  ＤＮＡプローブを加えると、ＧＳＴ−２８５Ｆ、ＧＳＴ−２８５ＣあるいはリコンビナントＳｐ１とＧＣ−ｂｏｘ  ＤＮＡプローブ複合体のバンドは消失あるいは減少した（図９、レーン２、５、１０）。また、同様の反応系に、未ラベルのミューテーションＧＣ−ｂｏｘ  ＤＮＡプローブを存在させてもＧＳＴ−２８５Ｆ、ＧＳＴ−２８５ＣあるいはリコンビナントＳｐ１とＧＣ−ｂｏｘ  ＤＮＡプローブ複合体のバンドには変化がなかった（図９、レーン３、６、１１）。これらの結果から、ｍ２８５は３つのｚｉｎｃフィンガードメインを含むＣ末端側領域を介して、配列特異的にＧＣ−ｂｏｘに結合することが判明した。
〔実施例８〕哺乳動物Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ法による転写制御
Ｓｐ−ｆａｍｉｌｙ転写因子は、グルタミンリッチ領域を介して転写を活性化していることが知られているが、Ｓｐ１やＳｐ３はグルタミンリッチ領域以外の領域を介して転写を抑制しているという報告もある。そこで、今回クローニングした２８５が、転写をどのように（活性／抑制）制御しているかを哺乳動物Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ法（図１０）によって検討した。
ｐＣＲ２．１−２８５Ｆ、２８５Ｎおよび２８５ＣのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＭ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にインフレームで組み込み（ｐＭ−２８５Ｆ、ｐＭ−２８５ＮおよびｐＭ−２８５Ｃ）、Ｇａｌ４  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇドメインと２８５Ｆ、２８５Ｎおよび２８５Ｃが融合蛋白質として発現するベクターを構築した。これらをアッセイプラスミドとする。
アクティベーション（活性）アッセイには、レポーターとプラスミドしてｐＧ５−Ｌｕｃ（５ｘ  Ｇａｌ４  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ−Ｅ１Ｂ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；Ｓｏｗａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４２６６−４２７０）を、ポジティブコントロールプラスミドとしてｐＭ−Ｓｐ１（Ｇａｌ４  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ−Ｓｐ１；Ｓｏｗａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４２６６−４２７０）を用いた。リプレッション（抑制）アッセイには、レポータープラスミドとしてｐＫＯ−１１４（５ｘ  Ｇａｌ４  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ−ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を用いた。ｐＫＯ−１１４はｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）をＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ここにｐＧ５−Ｌｕｃ由来の５ｘ  Ｇａｌ４  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ（ＳｍａＩとＸｂａＩフラグメント）と、ｐｃＤＮＡ３．１−ＨｉｓＡ（インビトロジェン）由来のＣＭＶプロモーター（ＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩフラグメント）を組み込んで作製した。両アッセイとも、インターナルコントロールプラスミドとしてｐＲＬ／ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
ＭＧ６３細胞（京都府立大学より入手）を１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌあたり８ｘ１０４個となるように播き、培養した。翌日、アッセイプラスミド（あるいはポジティブコントロールプラスミド）、レポータープラスミド、インターナルコントロールプラスミドを、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＭＧ６３細胞にトランスフェクションした。２日後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
アクティベーション（活性）アッセイ（図１０）の結果、２８５はＭＧ６３細胞におけるＣＭＶ  ｍｉｎｉｍｕｍプロモーターの転写を活性化しないことが分かった（図１１）。しかし、リプレッション（抑制）アッセイ（図１０）によって、２８５はＭＧ６３細胞におけるＣＭＶプロモーターの転写活性を抑制することが分かった（図１２）。また、この抑制は、コントロールとして用いたＫＲＡＢ（ＫＯＸ由来）の抑制とほぼ同等であった。
以上の結果から、２８５は、転写因子として機能していることが判明した。
産業上の利用の可能性
本発明により、転写因子Ｓｐ１ファミリーに属すると考えられる新規転写因子をコードする遺伝子が提供された。該遺伝子がコードするタンパク質は、そのｚｉｎｃフィンガードメインを介してＧＣ−ｂｏｘに結合し、遺伝子の転写調節を行う機能を有していると考えられる。これら遺伝子や蛋白質は、医薬品開発の標的として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マウス２８５（ｍ２８５）のｃＤＮＡ配列、およびアミノ酸配列を示す図である。３つのｚｉｎｃフィンガー領域を斜体で、プロリンリッチ領域を下線で、アラニンリッチ領域を下点線で示す。
図２は、マウス２８５、Ｓｐファミリー転写因子およびＳｐファミリーｌｉｋｅ転写因子の３つのｚｉｎｃフィンガー部分のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、−はＳｐ１と一致しているアミノ酸。ｚｉｎｃフィンガードメインを下線で示し、また、保存されているシステインおよびヒスチジン残基をグレーの網掛けで示した。
図３は、マウス２８５、マウスＳｐ１、ヒトＳｐ２およびヒトＳｐ４のＮ末端アミノ酸配列の比較を示す図である。一致したアミノ酸の数が３のアミノ酸残基をグレーで、全て一致したものは反転文字で示す。
図４は、ＲＴ−ＰＣＲによる、ＣＬ６の心筋分化誘導におけるｍ２８５の発現を示す写真である。ＤＭＳＯ未刺激を０  ｄａｙとした。
図５は、マウスノーザンブロットによるｍ２８５の発現組織分布を示す写真である。
図６は、ヒト２８５のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。３つのｚｉｎｃフィンガー領域を斜体で、プロリンリッチ領域を下線で、アラニンリッチ領域を下点線で示す。
図７は、マウスおよびヒト２８５のアミノ酸配列の比較を示す図である。３つのｚｉｎｃフィンガー領域を波線で、プロリンリッチ領域を下線で、アラニンリッチ領域を囲み線で示す。互いのアミノ酸配列は９７．５％の相同性を持つ。
図８は、ｍ２８５のＣＬ６細胞中での局在を示す写真である。
図９は、ＧＳＴ融合２８５Ｆ、２８５Ｎおよび２８５Ｃと３３−Ｐで標識したＧＣ−ｂｏｘ  ＤＮＡプローブとの結合アッセイにおける泳動写真である。コンペティターのｄｓ  ｏｌｉｇｏは未標識である。
図１０は、アクティベーション（活性化）アッセイ、およびリプレッション（抑制）アッセイの模式図である。
図１１は、アクティベーションアッセイの結果を示す図である。いずれもＥ１Ｂ  ｍｉｎｉｍａｌプロモーターを活性化できない。
図１２は、リプレッションアッセイの結果を示す図である。２８５Ｆは濃度依存的にＣＭＶプロモーター活性を抑制した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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