(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメイン１及び２を含むヒトライノウイルスに結合する免疫接着物（immunoadhesin）であって、該キメラＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメイン１及び２が、Ｊ鎖及び分泌成分に連関する免疫グロブリン重鎖定常領域に結合しているヒトライノウイルス受容体である免疫接着物であって、ここで該免疫接着物は分泌成分を含む免疫接着物であり、そして、該免疫接着物は植物において発現されグリコシル化されるものである。
【請求項２】
少なくとも１つの追加のキメラヒトＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１の免疫接着物。
【請求項３】
該ライノウイルス受容体タンパク質がヒトＩＣＡＭ−１の細胞外ドメイン１および２を含み、該免疫グロブリン重鎖がＩｇＡ2重鎖の少なくとも一部分を含む、請求項１の免疫接着物。
【請求項４】
単子葉植物において発現される、請求項１の免疫接着物。
【請求項５】
双子葉植物において発現される、請求項１の免疫接着物。
【請求項６】
すべてのタンパク質がヒトタンパク質である、請求項１の免疫接着物。
【請求項７】
毛状根培養物において発現される、請求項１の免疫接着物。
【請求項８】
培養中の植物細胞において発現される、請求項１の免疫接着物。
【請求項９】
該免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＡ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＭよりなる群から選ばれる、請求項１の免疫接着物。
【請求項１０】
ヒトライノウイルスに結合する免疫接着物および植物材料を含む組成物であって、該免疫接着物がキメラＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメイン１及び２を含み、該キメラＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメイン１及び２が、Ｊ鎖及び分泌成分に連関する免疫グロブリン重鎖定常領域に結合しているヒトライノウイルス受容体、又は、他の免疫グロブリン重鎖と多量体化する能力の付与に十分な免疫グロブリン重鎖定常領域と結合しているヒトライノウイルス受容体である組成物、ここで該免疫接着物および植物材料は植物において発現されグリコシル化されるものである。
【請求項１１】
該免疫グロブリンが ＩｇＡ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン重鎖よりなる群から選ばれる、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの追加のキメラヒトＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１０の組成物。
【請求項１３】
該ライノウイルス受容体タンパク質が、ヒトＩＣＡＭ−１の細胞外ドメイン１および２を含み、該免疫グロブリン重鎖が ＩｇＡ2 重鎖である、請求項１０の組成物。
【請求項１４】
ヒト・ライノウイルス感染に感受性の宿主細胞のヒト・ライノウイルスによる感染を減少せしめるための医薬の製造のための、請求項１の免疫接着物の使用、ここで該免疫接着物がヒト・ライノウイルスに接触し結合してその感染力を減少する。
【請求項１５】
ヒト・ライノウイルスによる普通の風邪の開始または伝播を減少せしめるための医薬の製造のための、請求項１の免疫接着物の使用、ここで該免疫接着物がヒト・ライノウイルスに接触し結合してその感染力を減少する。
【請求項１６】
ヒトにおけるヒト・ライノウイルス感染の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１の免疫接着物の使用、ここで該免疫接着物の有効量がヒトに投与され、該免疫接着物がヒト・ライノウイルスの感染力を減少する。
【請求項１７】
対象者におけるヒト・ライノウイルス感染の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１の免疫接着物の使用、ここで該免疫接着物の有効量が該対象者の鼻腔内に投与され、該免疫接着物がヒト・ライノウイルスの感染力を減少する。
【請求項１８】
対象者におけるヒト・ライノウイルス感染の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１の免疫接着物の使用、ここで該免疫接着物の有効量が該対象者に口腔を経て投与され、該免疫接着物がヒト・ライノウイルスの感染力を減少する。
【請求項１９】
請求項１の免疫接着物を薬学的に許容される緩衝液中に含む医薬組成物。
【請求項２０】
植物プロモーターに操作的に結合しているヒトライノウイルスに結合するキメラヒトＩＣＡＭ−１分子をコードする遺伝子を含む発現ベクターであって、該キメラヒトＩＣＡＭ−１分子が、Ｊ鎖及び分泌成分に連関する免疫グロブリン重鎖定常領域に結合しているヒトライノウイルス受容体であるベクター。
【請求項２１】
他の免疫グロブリン重鎖またはＪ鎖と多量体化する能力の付与に十分な免疫グロブリン重鎖定常領域がＪ鎖及び分泌成分に連関する免疫グロブリン重鎖の少なくとも一部分を含むものである、請求項１の免疫接着物。
【請求項２２】
該免疫グロブリン重鎖が、多量体化する能力の付与に十分なＩｇＧ1重鎖の少なくとも一部分を含む、請求項１０の組成物。
【請求項２３】
該ライノウイルス受容体タンパク質がヒトＩＣＡＭ−１の細胞外ドメイン１、２、３、４、および５を含む、請求項１の免疫接着物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
優先権
本出願は、１１９(ｅ)の米国仮特許出願６０/２００,２９８（出願：２０００年４月２８日、表題：ライノウイルス感染を防止するための新規の免疫接着物（IMMUNOADHESIN）、発明者：J. W. Larrick および K. L. Wycoff）の利益を享受する。この出願は出典明示により、全体およびすべての目的について本明細書の一部とする。
【０００２】
連邦政府援助の研究または開発についての記述
連邦研究支援が SBIR Phase I 許可(R43AI43122)および SBIR Phase II 許可(2R44AI43122-02)の形態でなされた。
【０００３】
発明の分野
本発明は、免疫接着物、ヒト・ライノウイルス受容体タンパク質と免疫グロブリンの融合物、および植物における免疫接着物の発現に関する。また、ヒト・ライノウイルス感染の予防および治療のため、免疫接着物の医療上の使用にも関する。
【０００４】
発明の背景
通常の風邪は一般的に比較的緩和な疾患であるが、風邪からくるかなりの合併症、例えば、中耳炎、副鼻腔炎、喘息悪化が生じやすい。ヒト・ライノウイルスは全成人の風邪の５０％および小児の風邪の２５％の原因である（Bella and Rossmann, J Struct Biol. 128: 69-74, 1999；Sperber and Hayden, Antimicrob Agents Chemother. 32: 409-19, 1988)。社会に対する出費は年間１０億ドルにもなる。これらの小さい非包膜ＲＮＡはサブグループのピコルナウイルスを表す(Rueckert, Virology, pp. 507-548, eds. Fields et al., Raven Press, Ltd. New York, 1990)。ライノウイルスのＸ線結晶学的検査により、直径３００Å（１Å＝０.１nm)で正２０面体対称を持つカブシドが同定され、ウイルス・コート・タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３の各６０コピーから構築された（Rossmann, Nature 317: 145-153, 1985)。ＨＲＶ上の表面デプレッションすなわち「canyon」は、受容体結合部位と示唆された（Colonno et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5449-5453, 1985; Rossmann et al., Nature 317: 145-153, 1985)。１０２の特徴解明されたＨＲＶセロタイプのうち、９１(メジャーグループとされる）がその受容体として、細胞間接着分子−１(ＩＣＡＭ−１）として知られる細胞表面糖タンパク質を共有する（Greve et al., Cell 56: 839-847, 1989; Staunton et al., Cell 56: 849-853, 1989)；結合部位はＮ末端ドメイン１内に位置する(Greve et al., J Virol. 65: 6015-6023, 1991; Staunton et al., Cell 61: 243-254, 1990)。
【０００５】
ＩＣＡＭ−１は、５細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、短い細胞質ドメインを有する膜タンパク質である。ＩＣＡＭ−１は多くの主要な細胞で免疫および炎症の応答において発現され、他の細胞で誘発的である（Casasnovas et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 4134-9, 1998)。ＩＣＡＭ−１は白血球インテグリンＬＦＡ-１およびＭａｃ-１についてリガンドとして機能する（Springer, Cell. 76: 301-14, 1994; Staunton et al., Cell 61: 243-254, 1990)。細胞表面で、ＩＣＡＭ−１は膜貫通ドメインの連関により主に二量体である（Miller et al., J Exp Med. 182: 1231-41, 1995; Reilly et al., J Immunol. 155: 529-32, 1995)。
【０００６】
５つの細胞外ドメインからなる組換え溶性ＩＣＡＭ−１（sＩＣＡＭ−１)は、インビトロでヒト細胞のライノウイルス感染を阻止するのに有効であるとされている(Greve et al., J Virol. 65:6015-6023, 1991；Marlin et al., Nature 344: 70-2, 1990)。実験室株および野外単離体のスペクトルに対する sＩＣＡＭ−１活性についての評価によると、ＨＲＶのすべてのメジャー株がsＩＣＡＭ−１に感受性である。マイナー株は、受容体としてＩＣＡＭ−１を使用せず、sＩＣＡＭ−１により影響を受けない（Crump et al., Antiviral Chem Chemother. 4: 323-327, 1993; Ohlin et al., Antimicrob Agents Chemother. 38: 1413-5, 1994)。
【０００７】
溶性ＩＣＡＭ−１のインビトロでの抗ウイルス活性は、複数のメカニズムにより仲介されるようである。それらのメカニズムには、結合部位についての細胞表面ＩＣＡＭ−１との競合、ウイルスの侵入または脱コートの妨害、ウイルスＲＮＡの未熟放出および空のカプシドの形成による直接的不活化がある（Arruda et al., Antimicrob Agents Chemother. 36: 1186-1191, 1992; Greve et al., J Virol. 65: 6015-6023, 1991；Marlin et al., Nature 344: 70-2, 1990; Marlin et al., J Virol. 67: 3561-8,1993)。
【０００８】
ＨＲＶの宿主の範囲は霊長類に限定される。最近の研究によると、溶性ＩＣＡＭ−１がチンパンジーのライノウイルス感染を予防するのに有効である（Huguenel et al., Am J Respir Crit Care Med. 155: 1206-10, 1997)。チンパンジーは臨床徴候を示さないが、血清変換およびウイルス脱落を測定して感染が明らかにされた。単一量１０mgの溶性ＩＣＡＭ−１は鼻腔内噴霧で、ＨＲＶと共投与されたとき、またはウイルスが１０分後に投与されたときに、ＨＲＶ−１６による感染を予防するのに有効である。
【０００９】
溶性ＩＣＡＭ−１のヒト臨床試験によると、このものは試験的ＨＲＶ風邪の重篤度を減少する(Turner et al., JAMA 281: 1797-804, 1999)。この試験で全１９６対象者が種々の製剤形態で溶性ＩＣＡＭ−１かプラセボのいずれかを摂取した。ある対象者は、ＨＲＶ３９の接種７時間前から始まり溶性ＩＣＡＭ−１またはプラセボが与えられ、他の対象者は、ウイルス接種１２時間後から与えられた。その投与は、経鼻溶液または粉末であり、７日間で６日投与（合計１日につき４.４ mg)である。この試験において、ウイルス単離または血清変換のいずれかでの測定で、溶性ＩＣＡＭ−１は感染を防止しなかった（感染率、プラセボ処置で９２％、溶性ＩＣＡＭ−１処置で８５％)。しかし、溶性ＩＣＡＭ−１は疾患のすべての指標に効果があった。全症候スコアーが４５％減少し、臨床風邪のある対象者の率が２３％低下し、鼻粘膜の重量が５６％減少した。粉末製剤と溶液製剤との間、および接種前と後との間に有意差がなかった。溶性ＩＣＡＭ−１ での処置で有害な副作用または鼻粘膜による吸収が認められなかった。また、抗 ＨＲＶ型特異的抗体の発達に対する阻止もなかった。
【００１０】
すでに述べたように、ＩＣＡＭ−１は細胞表面で二量体である。最初に提言された Marlin et al., J Virol. 67: 3561-8,1993 によると、多量体の溶性ＩＣＡＭによるＨＲＶとの多価結合が高い効果的な親和性、結合性をもたらし、もってウイルスの脱コートを容易にするようである。かれらは、多価ＩＣＡＭ−１／免疫グロブリン分子を構築し、それが１価溶性ＩＣＡＭ−１より、ＨＲＶの中和に効果的であり、もって治療上の有用性を増加すると考えた。これらのＩＣＡＭ−１／免疫グロブリン分子は、ＩｇＡ１(ＩＣ１−２Ｄ／ＩｇＡ)、ＩｇＭ(ＩＣ１-２Ｄ／ＩｇＭ)、ＩｇＧ１(ＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＧ) の重鎖のヒンジおよび定常ドメインに融合しているＩＣＡＭ−１アミノ末端ドメイン１および２を含む。さらに、５細胞外ドメインがＩｇＡ１(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ) に融合していた。これらのＩＣＡＭ−１／免疫グロブリン分子は、２(ｓＩＣ１-２Ｄ)および５(ｓＩＣ１-５Ｄ)ドメインを有する溶性形態のＩＣＡＭ−１と、ＨＲＶ結合、感染能、配座について比較された。ＩＣＡＭ−１/ＩｇＡ 免疫グロブリン(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)は２００倍、ＩＣＡＭ−１/ＩｇＭ免疫グロブリン(ＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＭ)は２５倍、ＩＣＡＭ−１/ＩｇＧ免疫グロブリン(ＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＧ)は１０倍、溶性ＩＣＡＭ−１よりも効果的であった。これらの分子は、ライノウイルスの細胞への結合を阻止するのに、およびウイルス・カプシドの配座を破壊するのに、非常に有効である。ＩＣＡＭ−１/ＩｇＡ免疫グロブリン分子はナノモル濃度範囲で有効であった。ＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＡ とＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＧとの比較によると、使用のＩｇ定常領域のクラスが効力に大きい影響を与えた。
【００１１】
続く試験で、溶性ＩＣＡＭ−１に中程度の耐性について選択された９メジャー ＨＲＶセロタイプおよび１ＨＲＶ−３９の変種に対する溶性ＩＣＡＭ−１およびＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡの阻害活性が比較された（Crump et al., Antimicrob Agents chemother. 38: 1425-7, 1993)。ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ は、単量体の溶性ＩＣＡＭ−１よりも重量ベースで５０から１４３倍、モルベースで６０から１７０倍、標準的セロタイプに対して効力が強い。ＨＲＶ−３９変種は、溶性ＩＣＡＭ−１に対する耐性が野生型よりも３８倍であり、ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡに対する耐性が５倍にすぎなかった。このことは、多価分子による阻害からのウイルスの逃走が単量体の溶性受容体による阻害からのウイルス逃走よりも低い頻度でおきるのではないかとの仮説（Martin et al., J. Virol. 67: 3561-8, 1993)に適合する。ウイルスの不活性化を測定するように設計されたアッセイによると、ＨＲＶ−３９およびＨＲＶ−１３は、溶性ＩＣＡＭ−１により有意に（感染能の低下、＜０.５ｌｏｇ10)直接不活性化されなかった。しかし、ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡとインキュベートすると、これらの同じウイルスの感染能が約１.０ ｌｏｇ10 低下した(Crump et al., Antimicrob Agents chemother. 38: 1425-7, 1994)。Martin et al.（J. Virol. 67: 3561-8, 1993)によると、価が大きくなるほど、分子の効果が大きくなる。ＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＭの二量体および十量体がスクロース傾斜沈降により分離可能であった。十量体は二量体より、ＨＲＶのＨｅＬａ細胞との結合を阻止するのに、５倍有効であった。
【００１２】
発表されてきたＩＣＡＭ−１／免疫グロブリンはいくつかの欠点がある。例えば、労力の多い生産法やその方法についての高い費用などである。さらに、これらのＩＣＡＭ−１／免疫グロブリン分子は、この分子がライノウイルスを不活性化しなければならない厳しい環境において、多量体としての安定性が限定されている。
【００１３】
本発明の免疫接着物は、当技術分野で発表されてきたものより非常に優れている。植物で発現される本発明の免疫接着物は、単に二量体というよりは四量体である。複数の結合部位を有する免疫接着物は、ウイルスに対して高い効果的な親和性を持ち、もって免疫接着の効果を増加する。さらに、分泌成分および免疫グロブリンＪ鎖と本発明の免疫接着物との連関が、粘膜性の環境(Corthesy, Biochem Soc Trans. 25: 471-475, 1997)において免疫接着物の安定性を増加する。分泌ＩｇＡは、分泌成分と連関するものであり、ミルクや初乳などの粘膜分泌に通常見られる抗体イソタイプである。他の抗体イソタイプと異なり、ＳＩｇＡはほとんどタンパク質分解なしに消化管を通過できる。これはまた粗製の植物製剤で室温で安定である。分泌成分のフラクションは、粘膜の厳しい環境から抗体を保護することが予定されているようである（Paul, Fundamental Immunology, Raven Press, NY, Third Edition, pp. 303-304, 1993)。さらに、本発明の免疫接着物は、動物よりも植物の細胞培養で非常に安価につくることができ、植物での生産は、植物がいかなる動物ウイルスも保持していないことが知られているので、ヒト使用が安全となる。
【００１４】
発明の要旨
本発明は、免疫グロブリン重鎖の少なくとも一部分に結合しているライノウイルス受容体タンパク質を有するキメラＩＣＡＭ−１分子を含む免疫接着物に関し、そこでは、Ｊ鎖および分泌成分がキメラＩＣＡＭ−１分子に連関している。
【００１５】
好ましい実施態様において、本発明の免疫接着物は、免疫グロブリン重鎖に結合しているライノウイルス受容体タンパク質、ＩＣＡＭ−１の細胞外ドメイン１、２、３、４、５のいかなる組合せからもつくられるライノウイルス受容体タンパク質を含む。本発明はまた、免疫グロブリンがＩｇＡ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、または異なる免疫グロブリン・イソタイプ由来のドメインまたはセグメントからつくられたキメラ免疫グロブリンである、本発明の免疫接着物に関する。
【００１６】
本発明の他の好ましい実施態様において、免疫接着物は、Ｊ鎖および分泌成分に連関している複数のキメラＩＣＡＭ−１分子を含む。原子価の増加はライノウイルスについて高い効果的な親和性をもたらし、もって免疫接着物の効果を増加する。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の免疫接着物をつくるのに使用されるすべてのタンパク質は、ヒト・タンパク質である。植物体または植物細胞での産生に加えて、本発明は、哺乳動物細胞、毛状根培養物、組織培養中の植物細胞、および植物、脊椎動物または無脊椎動物から誘導される異型の細胞において発現される免疫接着物に関する。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様において、免疫接着物は、植物ゲノムの部分として単子葉植物および双子葉植物を含む植物において発現される。植物における発現は、培養細胞での発現と異なり、免疫接着物の生産費用を非常に減少し得る。
【００１９】
本発明は、植物特異的グリコシル化を有する免疫接着物に関する。アミノ酸配列中にグリコシル化シグナル・アスパラギン-Ｘ-セリン／トレオニン（Ｘはいかなるアミノ酸残基でもよい）を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、植物細胞中で発現されるときに、配列のアスパラギン残基に結合しているオリゴ糖によりグリコシル化される。グリコシル化シグナルとして機能するポリペプチド配列についての総説は、Marshall, Ann. Rev. Biochem., 41: 673 (1972)および Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40: 17 (1974) を参照。これらのシグナルは哺乳動物でも植物細胞でも認められる。その成熟の終了時において、植物体または植物細胞で発現されたタンパク質は、哺乳動物細胞および昆虫細胞を含む他の型の細胞で発現されるタンパク質と異なるパターンのグリコシル化を有する。植物特異的グリコシル化の特徴および他の細胞型でのグリコシル化との比較についての詳細な研究は、例えば、下記の文献に記載されている：Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4): 365-372 (1999) および Altmann, Glycoconjugate J. 14: 643-646 (1997)。これらの文献などによると、植物特異的グリコシル化はマンノースに結合β(１,２)したキシロースを有するグリカンをつくるが、哺乳動物および昆虫の細胞においてはグリコシル化の結果としてキシロースがマンノースに結合β(１,２)していない。植物特異的グリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃに結合α(１,３)したフコースをもたらすが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃに結合α(１,６)したフコースをもたらす。さらに、植物特異的グリコシル化はシアル酸をタンパク質グリカンの末端に付加しないが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化ではシアル酸が付加される。
【００２０】
他の実施態様において、本発明の免疫接着物は、植物材料ならびにＪ鎖および分泌成分に連関している免疫接着物を含む組成物の部分である。本植物材料は、植物細胞壁、植物細胞小器官、植物細胞質、無傷の植物細胞、生存植物などであり得る。存在し得る特定の植物材料または植物高分子は、リブロース・ビスホスフェート・カルボキシラーゼ、集光性色素タンパク質複合体、二次代謝物または葉緑素を含む。本発明の組成物は、免疫接着物の濃度が水分を除き０.００１％から９９.９％であり得る。別の実施態様において、免疫接着物は水分を除き０.０１％から９９％の濃度で存在する。別の実施態様において、本発明は、水分を除き０.０１％から９９％の濃度で存在する植物材または植物高分子を有する。
【００２１】
本発明はまた、対象者におけるヒト・ライノウイルス感染の治療または予防のための方法に関し、ウイルスに本発明の免疫接着物を接触せしめること（免疫接着物がヒト・ライノウイルスに結合してその感染力を減少せしめる）により、ウイルス感染に感受性のある宿主細胞のヒト・ライノウイルス感染を減少せしめること、およびヒト・ライノウイルスによる普通の風邪の開始または伝播を減少せしめることを含む。免疫接着物は、結合部位について細胞表面ＩＣＡＭ−１との競合、ウイルスの侵入または脱コートの妨害、および/またはウイルスＲＮＡの未熟放出および空のカプシド形成による直接的不活性化によって、感染に介入し得る（Arruda et al., Animicrob. Agents chemother. 36:1186-1191, 1992; Greve et al., J. Virol. 65:6015-6023, 1991; Martin et al., Nature 344:70-2, 1992; Martin et al., J. Virol. 67:3561-8, 1993)。他の実施態様において、対象者におけるヒト・ライノウイルス感染を、本発明の免疫接着物の有効量を鼻腔内に投与すること、および免疫接着物がヒト・ライノウイルスに結合してその感染力を減少せしめることを含む方法によって、処置する。
【００２２】
図面の説明
図１は、ベクターｐＳＳＰＨｕＡ２を表示する。このベクターにおいて、ヒトＩＣＡＭ−１の最初の５ドメインを含有するキメラＩＣＡＭ−１をコードする遺伝子とヒトＩｇＡ２ｍ(２)のＦｃ領域が融合している。このベクターは、シグナル・タンパク質の発現を駆動するためのＳｕｐｅｒＭａｓプロモーターおよびヒトＩｇＡ２ｍ(２)重鎖の定常領域を含有する。ＩＣＡＭ−１ドメイン１−５をコードする配列をＰＣＲで増幅すると、シグナル・ペプチドとＣα１ドメインの間への挿入のための便利な制限部位（５'ＳｐｅＩおよび３'ＳｐｅＩ）を含有するようになる。ＥＲ保持シグナル(ＲＳＥＫＤＥＬ)をコードするＤＮＡを、構築体の発現レベルの増強のために重鎖の３'末端につけた。
【００２３】
図２は、キメラＩＣＡＭ 分子を表示する。２Ａは、キメラＩＣＡＭ−１分子がつくられるＤＮＡ発現カセットを示す。２Ｂは、融合タンパク質の成熟形についての、シグナル・ペプチド開裂後のアミノ酸配列を示す。クローニング法により導入されたアミノ酸に下線を引いた。これはＩＣＡＭ−１の５細胞外ドメインとＩｇＡ２ｍ(２)重鎖のＣα１-Ｃα３ドメインとの接合を表す。太字のＮは、１５の可能性あるグリコシル化部位を示す。
【００２４】
図３は、独立的に形質転換されたタバコ・カルス（tabacco calli）における免疫接着物の発現を表示する。３Ａは、非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの免疫ブロットを示す。形質転換された異なるタバコ・カルス（Ｃ)および水性抽出物（Ａｑ）を含有するサンプルを用い、ヒトＩＣＡＭ−１の存在を調べた。分子量マーカーを表示する。参考の標準物（Ｒ)はヒトＩＣＡＭ（〜７５ｋＤ）とヒトＳｉｇＡ(＞＞２５０ｋＤ)との混合物(各〜７５ng）である。３Ｂは、カルスＲｈｉ１０７−１１由来の部分的精製の免疫接着物の種々のフラクションを含有する非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの免疫ブロットを示す。分析された精製フラクションは、ジュース(Ｊ)、Ｇ-１００フラクション(Ｇ)、無菌ろ過Ｇ-１００フラクション(ＳＧ)、ヒトＳｉｇＡ(７５ng) とヒトＩＣＡＭ−１(７５ng)の参照標準混合物である。
【００２５】
ブロットは、ヒトＩＣＡＭ（〜ＩＣＡＭ)、ヒトＩｇＡ重鎖(〜α)、ヒト分泌成分(〜ＳＤ)、ヒトＪ鎖(〜Ｊ)に対する抗体で調べた。二次的に、酵素コンジュゲート抗体を、免疫陽性バンドのアルカリホスファターゼでの標識のために必要に応じ用いた。
【００２６】
図４は、抗ＩＣＡＭｍＡｂとの結合に対する、植物抽出物と溶性ＩＣＡＭ−１との競合に関する酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ)による結果を表示する。アッセイにおいて、９６ウエル・プレートを０.２５μｇ溶性ＩＣＡＭ−１/mlで被覆した。一定量のマウス(抗ヒトＩＣＡＭ）抗体についての接着ＩＣＡＭ との競合における、ＩＣＡＭ−１の増加濃度を四角で、カルス抽出物（Ｇ-１００由来の無菌ろ過フラクション）の増加量を丸で表す。
【００２７】
図５は、ヒト・ライノウイルスの殺ＨｅＬａ細胞作用を阻害する免疫接着物の能力を示すアッセイ（細胞障害作用、すなわち ＣＰＥアッセイ）の結果を表示する。５Ａは、ＨｅＬａ細胞に対するヒト・ライノウイルスのＣＰＥを、ＩＣＡＭ-Ｆｃ融合物中の免疫接着物(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)を含有するか、ドクソルビシンに対する抗体を含有する部分的に精製された抽出物の存在において、比較したアッセイの結果を示す。通常三角形および逆三角形は、免疫接着物を含有する Ｒｈｉ１０７-１１由来の２種の抽出物を表す。５Ｂは、ＨｅＬａ細胞に対するヒト・ライノウイルスのＣＰＥを、溶性ヒトＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ-Ｆｃ融合(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)中の免疫接着物からの抽出物の存在において、比較したアッセイの結果を示す。挿入図は、溶性ＩＣＡＭ（１.３５μg/ml)およびＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ(０.１２μg/ml；１１.３倍少ない）についてのＩＣ50の範囲を拡大スケールで示す。
【００２８】
図６は、１ｇの最終的免疫接着物をつくるのに必要な産生についての評価を示す。この図において、１ｇの免疫接着物に要する植物数、２０％収率、発現の期待レベルで、植物重量を表示する。異なるレベルの免疫接着物の発現(mg/kg 新鮮重量）および全体の回収（２０％に設定）において、各植物の重量および植物の全数を、合理的な可能性の範囲（点線での四角枠）中での具体的な産生目標（１g/採取）について決定できる。必要な植物の数は、具体的な成長および再成長期間の数とは逆に減少する。期待されるバイオマス産生、時間と成長条件の函数が採取までの時間および採取間の時間に影響を与える。この成長期間を精製スケジュールの実際に、植えたり収穫する日をずらして、調整できる。
【００２９】
図７は、表２に揚げた各免疫グロブリン遺伝子およびタンパク質のコードおよびアミノ酸配列を示す。
【００３０】
図８は、本発明の免疫接着物の発現試験に使用のため、実施例２に記載のように、植物を形質転換するのに用いられるプラスミドの配列を示す。
図８Ａは、プラスミドＰＳＳｐＩＣＡＭＨｕＡ２についてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列を示す。
図８Ｂは、ビーン・レグミン・シグナル・ペプチドについてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列を示す。
図８Ｃは、ｐＳＨｕＪのタンパク質コード領域についてのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す。
図８Ｄは、ｐＳＨｕＳＣのタンパク質コード領域についてのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す。
図８Ｅは、プラスミドｐＢＭＳＰ−１についてのヌクレオチド配列を示す。
図８Ｆは、プラスミドｐＢＭＳＰ-１ｓｐＪＳＣ についてのヌクレオチド配列を示す。
【００３１】
図９は、ＩＣＡＭ−１およびヒトＩｇＡ２についてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および他のヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
発明の詳細な説明
Ａ．定義
本明細書での使用において、下記の略号および用語は、必ずしもそれに限定されるわけでないが、下記の定義を含む。
【００３３】
本発明の実施において、特に別記しない限り、当技術分野内にある免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、組換えＤＮＡについての通常の技術を用いる。参照、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., (1987)); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); M.J. MacPherson et al., eds. Pcr 2: A Practical Approach (1995); Harlow and Lane, eds, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), and H. Jones, Methods In Molecular Biology vol. 49, "Plant Gene Transfer And Expression Protocols" (1995)。
【００３４】
免疫グロブリン分子または抗体。一緒に共有結合し、抗原に特異的に結合し得る免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含有するポリペプチドまたは高分子タンパク質。免疫グロブリンまたは抗体分子は、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ(ＳＩｇＡ)、ＩｇＭ、ＩｇＥなどのいくつかの型の分子を含む大きいファミリーの分子である。
【００３５】
構築体またはベクター。標的植物の組織または細胞中に移行される人工的に会合させたＤＮＡセグメント。典型的には、構築体は、特定的に所望の遺伝子、マーカー遺伝子、適当なコントロール配列を含む。用語「プラスミド」は、自律性、自己複製性染色体外ＤＮＡ分子を意味する。好ましい実施態様において、本発明のプラスミド構築体は、抗体の重鎖および軽鎖をコードする配列を含有する。適当な調節エレメントを含有するプラスミド構築体は、「発現カセット」とも表す。好ましい実施態様において、プラスミド構築体は、スクリーニングまたは選択可能なマーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子も含有し得る。
【００３６】
選択可能マーカー。選択培地上でトランスジェニック組織の成長を可能にする産物をコードする遺伝子。限定的な例でないが、選択可能遺伝子は、アンピシリンやカナマイシンなどの抗生物質耐性をコードする遺伝子を含む。他の選択可能マーカーは当技術分野で既知である。
【００３７】
トランスジェニック植物。遺伝子学的に処理された植物またはその子孫。トランスジェニック植物は、ウイルスや他の植物または動物などの関連しない生物の少なくとも１つに由来する材料を含有する。
【００３８】
キメラＩＣＡＭ−１分子。ＩＣＡＭ−１の細胞外ドメイン１、２、３、４、５のいかなる組合せと免疫グロブリン重鎖の少なくとも一部分との融合。免疫グロブリン重鎖遺伝子のＩＣＡＭ−１配列上流を結合させ、構築体からのコードタンパク質を発現さすことによりつくる。
【００３９】
キメラ免疫グロブリン重鎖：異なるイソタイプまたはサブタイプあるいはある種の他のペプチド、ポリペプチド、タンパク質の免疫グロブリン重鎖から誘導されるアミノ酸配列の少なくとも一部分を有する免疫グロブリン誘導重鎖。典型的には、キメラ免疫グロブリン重鎖は、少なくとも２つの異なるイソタイプまたはサブタイプの免疫グロブリン重鎖から誘導されるアミノ酸残基配列を有する。
【００４０】
双子葉類（dicots)：胚が２つの種子葉すなわち子葉を有する下記の植物。この例としては、タバコ、トマト、アルファルファを含む豆果、カシ類、カエデ類、バラ類、ミント類、カボチャ類、ヒナギク類、クルミ類、サボテン類、ビオレット類、キンポウゲ類がある。
【００４１】
有効量：本発明の免疫グロブリンの有効量は、ライノウイルスの感染、細胞毒性または複製を検出可能的に阻害するのに、またはライノウイルス感染の強さまたは長さを減少するのに十分な量である。
【００４２】
ヒト・ライノウイルス（ＨＲＶ)：ヒトの普通の風邪の主原因であるピコルナウイルスのサブグループを表す非包膜ＲＮＡウイルス。ライノウイルスについては、Rhinoviruses, Reoviruses, and Parvovirus, pp. 1057-1059, Zinsser Microbiology, Joklik et al., eds. Appleton and Lange (1992) に記載されている。
【００４３】
免疫接着物：キメラＩＣＡＭ−１分子を含有し、および選択的に分泌成分およびＪ鎖を含有する複合体。
【００４４】
免疫グロブリン重鎖：免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部分および免疫グロブリン重鎖の可変領域の少なくとも一部分または免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含有するポリペプチド。すなわち、重鎖から誘導される免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーと相同のアミノ酸配列の有意の領域を有する。例えば、Ｆａｂ断片中の重鎖は免疫グロブリン誘導の重鎖である。
【００４５】
免疫グロブリン軽鎖：免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部分および免疫グロブリン軽鎖の可変領域の少なくとも一部分または定常領域の少なくとも一部分を含有するポリペプチド。すなわち、免疫グロブリン誘導の軽鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーと相同のアミノ酸配列の有意の領域を有する。
【００４６】
免疫グロブリン分子：一緒に共有結合し抗原に特異的に結合する免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含有するタンパク質。
【００４７】
ＩＣＡＭ−１：細胞間接着分子-１。ヒトにおいて、ＩＣＡＭ−１はヒト・ライノウイルスの受容体として機能する。
【００４８】
Ｊ鎖：免疫グロブリンの重合化および重合免疫グロブリンの上皮細胞を経る移行に関与するポリペプチド。参照、The Immunoglobulin Helper: The J chain in Immunoglobulin Genes at pg. 345, Academic Press (1989)。Ｊ鎖は、五量体ＩｇＭおよび二量体ＩｇＡに認められ、典型的にはジスルフィド結合で連結する。Ｊ鎖はマウスとヒトで研究されている。
【００４９】
単葉類（monocots)：胚が１つの種子葉すなわち子葉を有する下記の植物。この例としては、ユリ類、草類、トウモロコシ、オートムギ、コムギ、オオムギを含む穀類、ラン類、イリス類、タマネギ類、ヤシ類がある。
【００５０】
グリコシル化：オリゴ糖によるタンパク質の改変。グリコシル化シグナルとして機能するポリペプチド配列の総説については、Marshall, Ann. Rev. Biochem., 421: 673 (1972) および Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40 :17 (1974) を参照。これらのシグナルは哺乳動物および植物の細胞で認められている。
【００５１】
植物特異的グリコシル化：植物発現タンパク質に認められるグリコシル化パターン。これは哺乳動物または昆虫の細胞で認められるものと相違する。植物体または植物細胞中で発現されるタンパク質は、哺乳動物または昆虫の細胞を含む他の型の細胞中で発現されるタンパク質と異なるパターンのグリコシル化を有する。
【００５２】
植物特異的グリコシル化の特徴解明および他の細胞型でのグリコシル化との比較についての詳細な研究は、下記に発表されている：Cabanes-Macheteau et alk Glycobiology 9(4): 365-372 (1999)、Lerouge et al., Plant Molecular Biology 38: 31-48 (1998)、Altmann, Glycocojugate J. 14: 643-646 (1997)。植物特異的グリコシル化はマンノースに結合β(１,２)したキシロースを有するグリカンをつくる。哺乳動物および昆虫のグリコシル化はマンノースに結合β(１,２)したキシロースをつくらない。植物はグリカンの末端に結合するシアル酸を有さないが、哺乳動物細胞は有する。さらに、植物特異的グリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃに結合α(１,３)したフコースをもたらすが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃに結合α(１,６)したフコースをもたらす。
【００５３】
分泌成分（ＳＣ)：不活性化物質に対して免疫グロブリンを保護し、もって分泌免疫グロブリンの生物学的効力を増加するのを助ける分泌免疫グロブリンの成分。分泌成分は、ヒトおよびマウスを含む哺乳動物やげっ歯類に由来し得る。
【００５４】
sＩＣＡＭ：ＩＣＡＭ の疎水性膜貫通ドメインおよびカルボキシル末端細胞質ドメインの両方を欠く天然発生性溶性末端切除型のＩＣＡＭ−１。
【００５５】
本明細書に引用の文献、特許、特許出願は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００５６】
Ｂ．キメラＩＣＡＭ−１分子を含有する免疫接着物
本発明は、キメラＩＣＡＭ−１分子を含有する免疫接着物分子をつくる新規方法を提供する。本発明の免疫接着物は、Ｊ鎖および分泌成分に連関する免疫グロブリン重鎖分子の一部分に結合しているライノウイルス受容体タンパク質からつくられるキメラＩＣＡＭ−１を含有する。本発明のキメラＩＣＡＭ−１分子は、異なる源から誘導される２つの分子、すなわちライノウイルス受容体タンパク質部分および免疫グロブリン鎖部分を含有する。本発明のライノウイルス受容体タンパク質は細胞間接着分子-１(ＩＣＡＭ−１）から誘導する。ヒト・ライノウイルス受容体 ＩＣＡＭ−１ についてのヌクレオチド配列は、下記に決定され、特徴解明されている：Staunton et al., Cell 52: 925-933 (1988); Greve et al., Cell 56: 839-847 (1989); Greve et al., J. Virology 65: 6015-6023 (1991); Staunton et al., Cell, 61: 243-254 (1990)。また、配列番号３に記載し、ジーンバンク受託番号は M24283 である。
【００５７】
ＩＣＡＭ−１分子は、５細胞外ドメイン、１疎水性膜貫通ドメイン、１短い細胞質ドメインを有する膜タンパク質（配列番号１および２）である。これらの特徴は、Casasnovas et al., Proc. Natle. Acad. Sci. U.S.A., 95: 4134-4139 (1998) および Staunton et al., Cell 52: 925-933 (1988) に記載されている。本発明において特に使用するのは、Ｎ末端ドメイン１および２に局在しているヒト・ライノウイルス（Greve et al., J. Virology 65: 6015-6023 (1991); Staunton et al., Cell, 61: 243-254 (1990)）の結合の役割を担うＩＣＡＭ−１分子のドメインである。本発明はまた、ＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメイン１、２、３、４、５のいかなる組合せも含むライノウイルス受容体タンパク質部分にも関する。特に好まし実施態様において、ライノウイルス受容体タンパク質は、ＩＣＡＭ−１分子のドメイン１および２を含み、他の好ましい実施態様において、ＩＣＡＭ−１分子のドメイン１、２、３、４、５が存在する。
【００５８】
５細胞外ドメインの境界は、当技術分野で既知であり、Staunton et al., Cell, 52: 925-933 (1988) に記載されている。概要のドメイン境界を表１に下記する。
【００５９】
0005008811.tif 000002
【００６０】
本発明の使用において、ＩＣＡＭ−１のドメイン１は約残基１から約残基８８；ドメイン２は約残基８９から約残基１０５；ドメイン３は約残基１０６から約残基２８４；ドメイン４は約残基２８５から約残基３８５；ドメイン５は約残基３８６から約残基４５３である。当業者は、これらのドメインの厳密な境界が変り得ることを理解するであろう。
【００６１】
本発明のキメラＩＣＡＭ−１分子は、免疫グロブリン重鎖が免疫グロブリンＪ鎖に結合して、分泌成分に結合するのを可能にするＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖の少なくとも一部分を好ましくは含有する。本発明の免疫グロブリン重鎖から誘導されるキメラＩＣＡＭ−１分子の部分は、ＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖から、または他のイソタイプの重鎖から選択される個々のドメインからなり得る。また、ＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖以外の免疫グロブリン重鎖、または免疫グロブリン軽鎖から誘導される免疫グロブリンを、分子的に処理して免疫グロブリンＪ鎖に結合でき、もって本発明の免疫グロブリンをつくるのに使用できる。
【００６２】
当業者は、免疫グロブリンが概１００-１１０アミノ酸残基であるドメインからなることを理解できるであろう。これらの種々のドメインは、当技術分野で知られており、既知の境界を有す。単一ドメインの除去および他の抗体分子のドメインでの置換は、現在の分子生物学で容易に行い得る。ドメインは鎖間ジスルフィド結合により安定となる球状構造である。このものは、不連続な形態を付与し、ドメインを他の同様に形つくられたドメインで置換可能な自己含有単位とする。免疫グロブリンの重鎖定常領域ドメインは、このドメインを含有する特定の分子に対する抗体エフェクター機能として知られる種々の性質を付与する。エフェクター機能の例には、補体固定、胎盤移行、ブドウ球菌性タンパク質との結合、レンサ球菌性タンパク質との結合、単核細胞や好中球、マスト細胞、好塩基球との結合がある。特定のドメインとこれらのエフェクター機能をもつ特定の免疫グロブリン・イソタイプとの連関は、既知であり、例えば、Immunology, Roitte et al., Mosby St. Louis, Mo. (1993 3rd Ed.) に記載されている。
【００６３】
当業者は、免疫グロブリン重鎖の定常領域配列を同定できる。例えば、多数の免疫グロブリンＤＮＡおよびタンパク質配列がジーンバンクから入手可能である。表２は、免疫グロブリン重鎖遺伝子およびその遺伝子がコードするタンパク質についてのジーンバンクアクセス番号を示す。表２に記載の配列は図７に示す。
【００６４】
表２
【表１】
0005008811.tif 000003
【表２】
0005008811.tif 000004
【００６５】
本発明の免疫接着物は、キメラＩＣＡＭ−１分子に加えて、免疫グロブリン誘導の重鎖に結合する免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリンＪ鎖を含有しうる。好ましい実施態様において、本発明の免疫接着物は、２または４のキメラＩＣＡＭ−１分子および少なくとも１つのキメラＩＣＡＭ−１に結合している１つの免疫グロブリンＪ鎖を含む。Ｊ鎖は当技術分野で既知である。参照、例えば、M. Koshland, The Immunoglobulin Helper: The J chain, in Immunoglobulin Genes, Academic Press, London, pg. 345 (1989) および Matsuuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 456-460 (1986)。免疫グロブリンＪ鎖の配列は米国における種々のデータベースで利用可能である。
【００６６】
本発明の免疫接着物はキメラＩＣＡＭ−１と連関した分泌成分を有し得る。この連関は、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン相互作用、これらの結合の組合せで生じ得る。典型的には、キメラＩＣＡＭ−１分子は、分子間のジスルフィド結合で一緒になっている。キメラＩＣＡＭ−１の相互作用は非共有結合またはジスルフィド結合であり得る。本発明は、ヒト、ウサギ、ウシなどを含む異なる種類に由来する分泌成分の使用に関する。これらの分子のヌクレオチド配列は当技術分野で既知である。例えば、米国特許６,０４６,０３７ は多数の配列を含有する（出典明示により本明細書の一部とする）。
【００６７】
分泌成分、キメラＩＣＡＭ−１分子、Ｊ鎖を含有する本発明の免疫接着物は、下記のひとつで典型的には結合している：水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン相互作用、これらの結合の組合せ。
【００６８】
本発明は、２以上のキメラＩＣＡＭ−１分子を含む免疫接着物にも関する。免疫接着物は、単量体単位であり、他のキメラＩＣＡＭ−１分子と結合しているジスルフィドをもたないキメラＩＣＡＭ−１分子を含有し得る。好ましい実施態様において、免疫接着物は、他のキメラＩＣＡＭ−１分子と連関して、二量体などの多価分子を形成するキメラＩＣＡＭ−１分子を含有する。典型的には、キメラＩＣＡＭ−１は、キメラ分子の免疫グロブリン部分の連関のために、二量体として存在する。キメラＩＣＡＭ−１分子の免疫グロブリン部分は、２つのキメラＩＣＡＭ−１の連関を可能にして、ライノウイルス受容体タンパク質部分からつくられる２つの活性結合部分を有するニ量体分子を形成する。好ましい実施態様において、二量体化は、自然生成の免疫グロブリン分子の部分としての免疫グロブリン・ドメインと天然の免疫グロブリン・タンパク質との間に通常生じるビスルフィド結合領域を介して起きる。当業者は、天然の免疫グロブリン分子に通常存在するこれらのビスルフィド結合を、キメラＩＣＡＭ−１の二量体を形成する能力を保持したままで、改変、移動、除去できることを理解するであろう。
【００６９】
他の好ましい実施態様において、免疫接着物は、Ｊ鎖とキメラＩＣＡＭ−１分子の免疫グロブリン部分との連関による多量体形態のキメラＩＣＡＭ−１分子を含有する。Ｊ鎖の２つのキメラＩＣＡＭ−１分子との連関は、免疫接着物の四量体形態の形成を可能にする。好ましい実施態様において、キメラＩＣＡＭ−１分子の免疫グロブリン部分はＩｇＡ分子から誘導し、Ｊ鎖の添加が、４つのキメラＩＣＡＭ−１分子および４つの結合部位を含有する四量体複合体の形成を可能にする。他の好ましい実施態様において、キメラ分子の免疫グロブリン重鎖部分をＩｇＭから誘導すると、１０または１２分子を含有する多価複合体が形成し得る。他の好ましい実施態様において、キメラＩＣＡＭ−１分子がキメラ免疫グロブリン重鎖を使用すると、キメラＩＣＡＭ−１が、Ｊ鎖形成の役割を担うＩｇＡまたはＩｇＭのいずれかに由来するドメインを介して、二量体またはさら高い多価複合体を形成し得る。他のキメラ免疫グロブリン分子において、２つの免疫グロブリン重鎖間のジスルフィド結合および/または免疫グロブリン軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合に関与する免疫グロブリン部分を、キメラ免疫グロブリン分子に入れると、二量体またはさら高い多価複合体の形成が可能になる。
【００７０】
本発明は、重鎖を含む免疫グロブリン・ドメインが異なるイソタイプの重鎖または軽鎖の免疫グロブリンから誘導されるようなキメラＩＣＡＭ−１分子を含有する免疫接着物に関する。当業者は、分子技術を用いて、これらのドメインを類似のドメインで置換し、２つの異なる免疫グロブリン分子間のハイブリドである免疫グロブリンをつくり得ることを理解するであろう。これらのキメラ免疫グロブリンによって、異なる免疫グロブリン・ドメインにより付与される種々の異なる望ましい性質を含有するような分泌成分を含む免疫接着物を構築できる。
【００７１】
本発明はまた、免疫グロブリン、重鎖または軽鎖から誘導されるキメラ分子の部分が、異なる免疫グロブリン分子から誘導される全ドメインより少ないドメインを含有し得るようなキメラＩＣＡＭ−１分子に関する。同じ分子技術を用いて、このようなキメラＩＣＡＭ−１分子を作り得る。
【００７２】
好ましい実施態様において、本発明のキメラＩＣＡＭ−１は、マウスまたはヒトのＩｇＡ1、ＩｇＡ2またはＩｇＭの少なくともＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含有する。本発明の別の好ましい実施態様において、免疫グロブリン・ドメインは、ＩｇＭの少なくともＣμ１、Ｃμ２、Ｃμ３またはＣμ４ドメインを含有する。
【００７３】
好ましいキメラＩＣＡＭ−１分子は、２つの異なるイソタイプのヒト免疫グロブリンに由来のドメインを含有する。好ましくいキメラＩＣＡＭ−１は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＤの少なくともＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３を含むドメインを含有する免疫グロブリンを含む。キメラＩＣＡＭ−１の部分として使用のための他の好ましい免疫グロブリンは、ＩｇＭまたはＩｇＥの少なくともＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４に由来のドメインを含有する免疫グロブリンを含む。本発明はまた、少なくとも２つの異なるイソタイプの哺乳動物の免疫グロブリンから誘導される免疫グロブリン・ドメインを含有するキメラＩＣＡＭ−１分子に関する。一般的に、いずれの哺乳動物の免疫グロブリンも好ましい実施態様において使用できる。それは下記のようなイソタイプである：いずれのイソタイプのＩｇＧ、いずれのイソタイプのＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ。本発明はまた、ヒト、マウスなどの哺乳動物の１種から誘導されるキメラＩＣＡＭ−１分子に関する。好ましい実施態様において、キメラＩＣＡＭ−１は、ＩｇＡおよびＩｇＭとのＪ鎖の連関の役割を担うＩｇＡまたはＩｇＭの部分を含有する。このように、キメラＩＣＡＭ−１分子中のキメラ免疫グロブリンを使用することにより、Ｊ鎖が、Ｊ鎖または分泌成分に結合しないイソタイプの多いキメラ免疫グロブリンと連関し得る。
【００７４】
本発明はまた、２つの異なるイソタイプのげっし類または霊長類の免疫グロブリンから誘導される免疫グロブリン・ドメインを含有するキメラＩＣＡＭ−１分子に関する。イソタイプのげっし類または霊長類の免疫グロブリンは、当技術分野で既知である。本発明のキメラＩＣＡＭ−１は、少なくとも１つの下記の免疫グロブリン・ドメインを含む免疫グロブリン誘導重鎖を含有し得る：マウス ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２a、ＩｇＧ２b、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；マウスＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン；ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤのＣＨ１ドメイン；ヒトＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン；イソタイプの哺乳動物ＩｇＧ、イソタイプのＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；哺乳動物ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン；イソタイプのげっし類 ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたは ＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；げっ歯類ＩｇＥまたはＩｇＭの ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン；イソタイプの動物ＩｇＧ、イソタイプのＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；動物ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン。本発明はまた、免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーである分子から誘導されるタンパク質ドメインのキメラＩＣＡＭ−１分子への置換または添加に関する。免疫グロブリンのスーパーファミリーに属する分子は、免疫グロブリンに相同のアミノ酸残基配列および核酸配列を有する。免疫グロブリンのスーパーファミリーの部分である分子は、アミノ酸または核酸の配列相同性により同定できる。参照、例えば、Immunoglobulin Genes, Academic Press (1989) p.361。
【００７５】
本発明の好ましい実施態様において、免疫接着物を、植物特異的グリコシル化を有する免疫接着物をつくる方法で発現せしめる。このグリコシル化が植物細胞におけるタンパク質の主要な改変であることは当分野でよく知られている（Lerouge et al., Plant Molecular Biology 38: 31-48, 1998)。タンパク質のグリコシル化は、哺乳動物および昆虫の細胞を含む他の細胞型においても生じる。グリコシル化過程は、小胞体において、未完成ポリペプチド鎖の特異的残基への前駆物質オリゴ糖の共翻訳的移行により始まる。このオリゴ糖の異なるタイプのグリカンへの移行は、存在残基の型および残基間の結合性質で異なり、糖タンパク質が小胞体からその最終方向へ移動するにつれて、分泌経路において生じる。当業者はよくわかるところであるが、この成熟の終了点で、植物体または植物細胞中で発現されたタンパク質は、哺乳動物や昆虫の細胞を含む他の型の細胞中で発現されるタンパク質と異なるパターンのグリコシル化を有する。植物特異的グリコシル化の特徴解明および他の細胞型中のグリコシル化との比較についての詳細な研究は、例えば、下記の文献に記載されている：Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4): 365-372 (1999) および Altmann, Glycoconjugate J. 14: 643-646 (1997)。これらの文献などによると、植物特異的グリコシル化はマンノースに結合β(１,２)したキシロースを有するグリカンをつくるが、哺乳動物および昆虫の細胞においてはグリコシル化の結果としてキシロースがマンノースに結合β(１,２)していない。植物特異的グリコシル化は隣接 ＧｌｃＮＡｃに結合α(１,３)したフコースをもたらすが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化は隣接 ＧｌｃＮＡｃに結合α(１,６)したフコースをもたらす。さらに、植物特異的グリコシル化はシアル酸をタンパク質グリカンの末端に付加しないが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化ではシアル酸が付加される。
【００７６】
植物特異的にグリコシル化される本発明の免疫接着物は、ＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメイン１、２、３、４、５のいかなる組合せも含むキメラＩＣＡＭ−１分子を含有し得る。図２Ｂは、本発明のキメラＩＣＡＭ−１/ＩｇＡ２分子のアミノ酸配列（配列番号８）を示し、ＩＣＡＭ−１のすべての５ドメインを含有する。太字のＮ’は、植物細胞ならびに哺乳動物および昆虫の細胞におけるグリコシル化の際にオリゴ糖部分が連結するアスパラギン残基を表す。当業者に知られているように、グリコシル化部位はトリペプチドＡｓｎ-Ｘ-Ｓｅｒ/Ｔｈｒ (Ｘはプロリンおよびアスパラギン酸を除くいかなるアミノ酸でもあり得る）である（Kornfeld and Kornfeld, Annu Rev Biochem 54: 631-664, 1985)。従って当業者は理解するように、植物特異的グリコシル化を有するタンパク質のアミノ酸は、存在するＩＣＡＭ−１のドメインに依存する。ＩＣＡＭ−１の配列およびドメイン境界が知られているので（参照、Staunton et al., Cell 52: 925-933, 1988)、５つのＩＣＡＭ−１ドメインのいずれについての可能な組合せでの植物特異的グリコシル化部位をいかに決定するかは、当業者に明らかである。
【００７７】
本発明の他の好ましい実施態様において、植物特異的グリコシル化を有し、ＩＣＡＭ−１ 細胞外ドメイン１、２、３、４、５のいかなる組合せも有するキメラＩＣＡＭ−１分子を含有する免疫接着物は、該キメラＩＣＡＭ−１分子に連関するＪ鎖および分泌成分をさらに含む。キメラＩＣＡＭ−１分子について、当業者は、Ｊ鎖および分泌成分の配列における植物特異的グリコシル化のための部位を同定し得る。
【００７８】
本発明は、植物特異的グリコシル化を有する免疫接着物に関し、これは免疫グロブリン重鎖を下記の群から選択するキメラＩＣＡＭ−１を含有する：ＩｇＡ（配列番号１５−１８)、ＩｇＡ1（配列番号１５−１６)、ＩｇＡ2（配列番号１７)、ＩｇＧ1（配列番号１０−２０)、ＩｇＧ2（配列番号２１−２２)、ＩｇＧ3（配列番号２３−２４)、ＩｇＧ4（配列番号２５−２６)、ＩｇＭ（配列番号４６−４７)、ＩｇＤ（配列番号２７−３２、３６−４１−４３)、ＩｇＥ（配列番号４４−４５)およびキメラ免疫グロブリン重鎖。当業者は理解するように、免疫接着物が結合しているこれらの免疫グロブリン重鎖配列または免疫グロブリン重鎖配列の組合せは、免疫接着物のキメラＩＣＡＭ−１分子におけるグリコシル化の数および位置に対する作用を有する。キメラＩＣＡＭ−１について、当業者は、構築できる種々のキメラ免疫グロブリン重鎖を含む免疫グロブリン重鎖における植物特異的グリコシル化のための部位を同定し得る。
【００７９】
本発明はまた、免疫接着物の機能性誘導体を提供する。「機能性誘導体」とは、本発明のポリペプチドまたは核酸の「化学的誘導体」、「断片」または「変種」であって、タンパク質機能、例えば、タンパク質特異的抗体との反応性、酵素活性または結合活性の少なくとも一部分を保持し、本発明において有用性をもたらすものを意味する。当技術分野で知られているように、遺伝子コードの縮重により多くの異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードできる。また、よく知られているように、アミノ酸中に保存的変化をつくって、元の機能を保持するタンパク質またはポリペプチドを達成できる。両方の場合とも、本開示がすべての順列を含むものとする。
【００８０】
誘導体を通常の方法で処理して、免疫接着物の多量および/または比較的に純粋または単離の量をつくりうるような親和性精製タグを含め得る。免疫接着物の１以上の成分中に組み込み得る多くの異なる種類のタグが存在する。好ましくは、タグの不存在で免疫接着物の望ましい結合活性を破壊しない。このようなタグは、本発明の免疫接着物をコードする核酸配列と融合した発現可能コード核酸配列として処理できる。タグをさらに処理して、市販の酵素などで取り除き得る。
【００８１】
さらに、コドンを欠失せしめるか、１以上のコドンを退化コドン以外のコドンで置換して、構造的に改変されたコドン、しかし改変されない核酸分子によりつくられるポリペプチドと同じ有用な活性を実質的に有するコドンをつくることが可能である。当技術分野で認められているように、核酸分子間の相違が遺伝子コードの縮重に関係していなくても、２つのポリペプチドは、それらをつくる２つの核酸分子と同様に、機能的に均等であり得る。
【００８２】
この種の操作および産生後の化学的誘導化を行って、例えば、安定性、溶解性、吸収性、生物学的および治療的効果および/または生物学的半減期を増加できる。このような作用に関与し得る物質は、例えば、Ｒemington's Ｐharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Eaton, PA (1990) に開示されている。本発明の範囲内にある機能性誘導体は、天然のポリペプチドに比して１以上のアミノ酸を欠くか、追加または置換のアミノ酸を含有する「変種」ポリペプチドである。この変種は天然に生じる複合体成分から、タンパク質ＤＮＡコード配列を適当に改変することにより、誘導すると、Ｃ末端、Ｎ末端および/または天然配列内の１以上の部位で１以上のアミノ酸についてコドンを改変できる。理解されるように、付加、置換および/または追加のアミノ酸を有するこのような変種が、上記のように天然タンパク質の１以上の特徴的部分を保持する。
【００８３】
欠失、挿入および/または置換のアミノ酸残基を有する機能性誘導体を、当業者によく知られる標準的技術を用いてつくることができる。例えば、機能性誘導体の改変成分を、部位特異的変異導入法（例えば、Adelman et al., 1983, DNA 2: 183)を用いて、つくることができる。そこでは、ＤＮＡコード配列中のヌクレオチドを改変して、改変コード配列をつくり、ついで上記のような技術を用いて、真核または原核の宿主細胞中で、この組換えＤＮＡを発現させる。あるいは、欠失、挿入および/または置換のアミノ酸残基を有する機能性誘導体を、標準的技術を用いて都合よくつくり得る。タンパク質の機能性誘導体は天然のタンパク質と同じ性質の生物学的活性を典型的には発揮する。
【００８４】
さらに、本発明の免疫接着物は、改変 ＩＣＡＭ−１/Ｉｇ 免疫接着物でないこともあり、ヒト、霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、鳥類などの天然ＩＣＡＭファミリー・メンバー、イソタイプおよび/または他の相同性のアミノ酸配列も含み得る。さらに、免疫接着物で使用されるＩｇ型は、種々であり、例えば、所定の種内または種外で異なるＩｇファミリー・メンバー同定を推定できる。ＩＣＡＭおよびＩｇは、様々であり、所定の生物で多かれ少なかれ異なる有用性を持つ異なる免疫接着物をつくるのに当業者が用い得るような既知の配列を有す。説明として、他の免疫接着物をつくるのに使用できるＩＣＡＭ−１相同性をもつ分子の例は、下記の表中のものを含む。
【００８５】
表３
【表３】
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【表４】
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【００８６】
同様に、ヒトや他の種における異なるＩｇ分子の多くの重鎖定常領域は、本明細書に記載のこれら特異的Ｉｇ領域について置換できることがわかる。
【００８７】
Ｃ．免疫接着物を含有するベクター、細胞、植物体
本発明はまた、本発明の免疫接着物を含有する発現およびクローニングのベクター、細胞、植物に関する。免疫接着物の種々の部分をコードする遺伝子を単離する技術は、当業者に既知であり、種々の必要な遺伝子を発現ベクターおよびクローニングベクター中に挿入して、これらのベクターが細胞中およびトランスジェニック植物中に導入できるようにする。
【００８８】
本発明は、下記の工程を含む免疫接着物を会合せしめる方法に関する：生物体へキメラＩＣＡＭ−１分子、免疫グロブリンＪ鎖をコードするＤＮＡセグメントを導入すること、および同じ生物体へ分泌成分をコードするＤＮＡを導入すること。好ましい分泌成分は、ヒト・ポリ免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ) アミノ酸残基配列の残基１〜約６０６または他種由来の類似アミノ酸残基の少なくとも１つのセグメントを含有する（Mostov, Ann Dev. Immu. 12: 63-84, 1994)。
【００８９】
本発明は、本発明の免疫接着物を含有する植物細胞などの真核細胞に関する。本発明はまた、本発明の免疫接着物の種々の成分をコードするヌクレオチド配列を含有する植物細胞に関する。当業者は、分泌成分保護タンパク質およびキメラＩＣＡＭ−１分子およびＪ鎖をコードするヌクレオチド配列が、典型的には操作的にプロモーターに連結し、発現ベクターまたはカセットの部分として存在することを理解するであろう。典型的には、使用の真核細胞が植物細胞であると、使用されるプロモーターは植物細胞中で操作可能なプロモーターである。キメラＩＣＡＭ−１遺伝子、分泌細胞遺伝子、Ｊ鎖遺伝子を単離した後、それらを発現ベクター中で複製プロモーターに典型的には操作的に連結する。本発明はまた、発現の調節配列に操作的に連結されているキメラＩＣＡＭ−１分子をコードするヌクレオチドを含有する発現ベクターに関する。この発現ベクターは、ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の転写および発現を進めるプロモーター配列の特定の細胞３'で発現されるように、ヌクレオチドを位置つける。発現ベクターは、この転写の効率を改善する種々のエンハンサー配列を含有し得る。さらに、ターミネータなどの配列、ポリアデニル化（poly Ａ) 部位、他の３'末端プロセス・シグナルを含めて、特定の細胞内で転写されるヌクレオチド配列の量を高め得る。
【００９０】
選択の生物体における成分の発現は、独立的に複製のプラスミドから、染色体の恒常成分から、成分をコードする転写体を一時的に生じ得るなんらかのＤＮＡから駆動できる。形質転換に適した生物体は真核または原核のいずれでもよい。複合体成分の導入は、直接ＤＮＡ形質転換、生物体への生物的送達、他の生物体、例えば組換え Agrobacterium の植物細胞に対する作用による仲介であり得る。トランスジェニック生物におけるタンパク質の発現は、適当なプロモーター・エレメントとポリアデニル化シグナルの共導入を通常必要とする。本発明のひとつの実施態様において、プロモーター・エレメントは植物のすべての細胞において成分の構成的発現を強力に進め得る。大部分またはすべての細胞で生じる構成的発現は、会合が生じるのに要するであろう同じ細胞の内膜システムを、前駆物質が占拠できるのを確実にする。
【００９１】
宿主細胞に和合性の発現ベクター、好ましくは植物細胞に和合性のベクターを用いて、本発明の遺伝子を発現せしめる。植物における遺伝子の発現に有用な典型的な発現ベクターは公知であり、Agrobacterium tumefaciens の腫瘍誘発(Ｔｉ)プラスミドから誘導されるベクターを含む（Rogers et al., Meth. in Enzymol., 153: 253-277, 1987)。しかし、いくつかの他の発現ベクター系が植物で機能するのが知られている。参照、例えば、Verma et al., PCT 公開 WO 87/00551; Cocking and Davey, Science, 236: 1259-1262 (1987)。
【００９２】
上記の発現ベクターはプロモーターを含む発現調節エレメントを含有する。発現される遺伝子は発現ベクターに操作的に連結し、所望のポリペプチド・コード遺伝子のＲＮＡポリメラーゼ結合および合成を指示する。遺伝子の発現に有用なプロモーターは誘発性、ウイルス性、合成性、構成性、調節性である。どのような発現ベクターを選択するか、または最終的にどのようなプロモーターに本発明の免疫接着物の一部分をコードするヌクレオチド配列を操作的に連結せしめるかは、当技術分野でよく知られるように、所望の機能的性質、例えばタンパク質発現の位置および時期、および形質転換される宿主細胞に依存している。これらは、組換えＤＮＡ分子の構築法に固有の限界である。しかし、本発明の実施に有用な発現ベクターは複製を少なくとも指示し得るものであって、好ましくはまた、操作的に連結しているＤＮＡセグメントに含まれるポリペプチド・コード遺伝子の発現を指示し得るものである。
【００９３】
好ましい実施態様において、遺伝子の発現に使用される発現ベクターは植物細胞で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含む。好ましい薬剤耐性選択マーカーは、発現がカナマイシン耐性をつくるような遺伝子、すなわちノパリン・シンターゼ・プロモーター、Ｔｎ５ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼIIおよびノパリン・シンターゼ３'非翻訳領域（Rogers et al., in Methods For Plant Molecular Biology, A Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1988))を含有するキメラ遺伝子である。有用な植物発現ベクターは、Pharmacia, Piscataway, N.J. から市販されている。植物における外来タンパク質の発現のための発現ベクターおよびプロモーターは、米国特許 5,188,642、5,349,124、5,352,605、5,034,322（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。
【００９４】
相補性粘着末端によりＤＮＡをベクターに操作的に連結するために、種々の方法が開発されてきた。例えば、相補性ホモポリマー・トラックをＤＮＡセグメントに加えて、ベクターＤＮＡに挿入する。ベクターとＤＮＡセグメントを相補性ホモポリマー・テイル間の水素結合で結合し、組換えＤＮＡ分子を形成する。あるいは、１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーを用いて、ＤＮＡセグメントを発現ベクターに結合できる。合成リンカーの平滑末端ＤＮＡセグメントへの接着には、平滑末端ＤＮＡセグメントを大過剰の合成リンカー分子とともに、平滑末端ＤＮＡの連結反応を触媒し得る酵素、例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートする。反応産物は末端に合成リンカー配列を保持するＤＮＡセグメントである。ついで、ＤＮＡセグメントを、適当な制限エンドヌクレアーゼで開裂せしめ、合成リンカーに和合性の末端をつくる酵素で開裂された発現ベクター中に連結する。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、New England BioLabs, Bevery, Mass. を含む多くの会社から市販されている。
【００９５】
本発明の分泌成分、Ｊ鎖、キメラＩＣＡＭ−１分子をコードするヌクレオチド配列を同じ植物細胞中に直接的に導入するか、または各成分を植物細胞中に導入し、植物を再生し、種々の成分と交差ハイブリドして、すべての必要な成分を含有する最終の植物細胞をつくる。
【００９６】
いずれの方法を用いても、本発明の免疫接着物の成分をコードするヌクレオチドを真核細胞に導入できる。例えば、遺伝子を植物に導入する方法には、Agrobacterium 仲介植物形質転換、原形質体形質転換、花粉中への遺伝子移転、再生臓器への挿入、非未熟胚への挿入がある。これらの方法の各々は明白な長所と欠点を有する。すなわち、遺伝子を特定の真核細胞または植物種へ導入するひとつの特定の方法は、必ずしも他の真核細胞または植物種にとって最も効果的でない。
【００９７】
Agrobacterium tumefaciens 仲介移転は、遺伝子を植物細胞中に導入するのに広く用いられているシステムである。ＤＮＡを全植物組織に導入でき、原形質由来の無傷の植物の再製を回避できるからである。Agrobacterium 仲介発現ベクターを用いてＤＮＡを植物細胞に導入することは、当技術分野でよく知られている。参照、例えば、Fraley et al., Biotechnology, 3: 629 (1985) および Rogers et al., Methods in Enzymology, 153: 253-277 (1987)。さらに、Ｔｉ-ＤＮＡの組込みは、ほとんど再調整を必要としない比較的正確な方法である。移転されるＤＮＡの領域は境界配列で明確にされ、介在ＤＮＡは植物ゲノムに通常挿入される（Spielmann et al., Mol. Gen. Genet., 205: 34 (1986); Jorgensen et al., Mol. Gen. Genet., 207: 471 (1987))。最新の Agrobacterium 形質転換ベクターは、大腸菌および Agrobacterium において複製可能であり、便利な操作をもたらす（Klee et al., in Plant DNA Infectious Agents, T. Hohn and J. Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985))。Agrobacterium 仲介遺伝子移転のためのベクターについてのさらに最近の技術的進歩は、ベクター中の遺伝子および制限部位の調節を改善し、種々のポリペプチドコード遺伝子を発現し得るベクターの構築を容易にする。Rogers et al., Methods in Enzymology, 153: 253-277 (1987)に記載のベクターは、挿入されたポリペプチド・コード遺伝子の直接的発現のためにプロモーターとポリアデニル化部位にはさまれた便利な多リンカー領域を有し、本目的に適している。
【００９８】
Agrobacterium 仲介形質転換が効率的であるこれらの植物種において、遺伝子移転の容易で明確な性質から方法を選択する。リーフ・ディスクなどの組織のAgrobacterium 仲介形質転換は、Agrobacterium tumefaciens が天然に感染する植物種に限られているようである。すなわち、Agrobacterium 仲介形質転換は双子葉植物において最も効果的である。
【００９９】
単子葉類のほとんどが Agrobacterium の天然宿主でないようであるが、トランスジェニック植物がアスパラガスで、Agrobacterium ベクターを用いて作られている（Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 5345 (1987))。従って、市販の主要な穀類、コメ、トウモロコシ、コムギは、変換法を用いてつくられるであろう。植物原形質の形質転換は、リン酸カルシウム沈降法、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションおよびこれらの方法の組合せを基にする方法で行い得る。参照、例えば、Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199: 183 (1983); Lorz et al., Mol. Gen. Genet., 199: 178 (1985); Fromm et al., Nature, 319: 791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet., 204: 204 (1986); Callis et al., Genes and Develpment, 1: 1183 (1987); Marcotte et al., Nature, 335: 454 (1988)。
【０１００】
これらの方法の異なる植物種への適用は、原形質から特定の植物種を再生する能力に依存する。原形質から穀類の再生についての説明的方法は下記の文献に記載されている：Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2: 74 (1985); Toriyama et al., Theor Appl. Genet., 73: 16 (1986); Yamada et al., Plant Cell Rep., 4: 85 (1986); Abdullah et al., Biotechnology, 4: 1087 (1986)。
【０１０１】
原形質からうまく再生されない植物種を形質転換するためには、ＤＮＡを無傷の細胞または組織に導入する別の方法を利用できる。例えば、未熟の胚または外植物体からの穀類の再生は、Vasil, Biotechnology, 6: 397 (1988) に記載のようにできる。さらに、「パーティクルガン」すなわち高速マイクロプロジェクト法を使用できる。このような技術を用いて、ＤＮＡは、毎秒百から数百メートルに加速されている小さい（０.５２５μm）金属粒子上の細胞質中に運ばれる（Klein et al., Nature, 327: 70 (1987); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 8502 (1988); McCabe et al., Biotechnology, 6: 923 (1988))。金属粒子が細胞の数層を貫通し、外植物体の組織内で細胞の形質転換を可能にする。金属粒子を用いて、トウモロコシ細胞をうまく形質転換し、また生殖力のある安定な形質転換タバコおよび大豆がつくられている。外植物体組織の形質転換は原形質段階を経る必要がないのでトランスジェニック植物の産生を速める。
【０１０２】
ＤＮＡはまた、花粉への直接的ＤＮＡ移転により植物に導入できる（Zhou et al., Methods in Enzymology, 101: 433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107: 367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6: 165 (1988))。ポリペプチド・コード遺伝子の発現は、植物の生殖器官中へのＤＮＡの注入により行い得る（Pena et al., Nature, 325: 274 (1987))。ＤＮＡはまた未熟胚の細胞中に直接注入でき、乾燥胚の再水和を行う（Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75: 30 (1987); Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp 27-54 (1986)。
【０１０３】
単一の植物原形質または種々の外植物体からの植物の再生は当技術分野でよく知られている。参照、例えば、Methods For Plant Molecular Biology, A Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1988))。この再生および成長プロセスは、形質転換細胞および新芽の選択、形質転換新芽の植えつけ、植物の土壌での成長についての工程を含む。
【０１０４】
葉の外植物体から Agrobacterium tumefaciens により導入された外来遺伝子を含有する植物の再生は、Horsch et al., Science, 227: 1229-1231 (1985) に記載のように行い得る。この方法において、形質転換体は選択剤の存在で、形質転換された植物種中に新芽の再生を誘発する培地において成長せしめる（Fraley et al., Proc, Natl, Acad. Sci, U.S.A. 80: 4803 (1983)。この方法は、典型的には２から４週以内に新芽をつくり、ついで形質転換新芽を、選択剤および細菌成長防止用の抗生物質を含有する適当な根誘発培地に移す。選択剤の存在下で植え付けて小植物体を形成した形質転換新芽を土壌に移植し、根がつくられるようにする。これらの方法は、用いる特定の植物種によって変わり、その変形は当技術分野でよく知られている。
【０１０５】
本発明の免疫接着物は、単子葉または双子葉の植物、ナス科、アルファルファ科、豆果、タバコから誘導される植物細胞を含むすべての植物細胞から作り得る。
【０１０６】
本発明のトランスジェニック植物は、当業者に既知のいかなる方法を用いて、形質転換できる性交差可能植物種から作り得る。有用な植物種は、タバコ、トマト、豆果、アルファルファ、カシ類、カエデ類を含む双子葉植物；草類、トウモロコシ、穀類、オートムギ、コムギ、ハダカムギを含む単子葉植物；裸子植物、毬果植物、トクサ類、ヒカゲノカズラ類、ゼニゴケ類、マツモ類、コケ類、藻類、配偶体、胞子体、シダ植物を含む低級植物である。
【０１０７】
本発明はまた、哺乳動物細胞を含む真核細胞中での免疫接着物の発現に関する。 当業者は、哺乳動物細胞における免疫接着物の発現に利用可能な種々のシステムを理解し、これらのシステムを容易に改変して、これらの細胞中で本発明の免疫接着物およびキメラＩＣＡＭ−１分子を発現し得る。好ましい実施態様において、本発明のキメラＩＣＡＭ−１、Ｊ鎖、分泌成分分子を、すでに発表（Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 8573-8577 (1987))されているベクターｐＣＤＭ８に入れる。ｐＣＤＭ８構築体の使用は、決して独特なものでなく、ｃｏｇ細胞発現システムを利用する多くの他のシステムが使用可能である。例えば、下記の米国特許は、キメラＩＣＡＭ−１や免疫接着物の他の分子とともに使用できる有用な発現システムを記述している。
【０１０８】
Ｄ．免疫接着物を含有する組成物
本発明はまた、本発明の免疫接着物を植物のマクロ分子または材料とともに含有する組成物に関する。典型的には、これらの植物のマクロ分子または材料は、本発明で有用な植物から誘導する。植物マクロ分子は、本発明の免疫接着物とともに、例えば、植物細胞、植物細胞抽出物、植物体中に存在する。組成物において本発明の免疫接着物に連関する典型的な植物マクロ分子は、リブロース・ビスホスフェート・カルボキシラーゼ、集光性色素タンパク質複合体(ＬＨＣＰ)、二次代謝体、クロロフィルである。本発明の組成物は、植物材料またはマクロ分子を、水分を除き０.０１％から９９％の重量濃度で有する。他の組成物として、本発明の免疫接着物が水分を除き１％から９９％の重量濃度で存在する組成物である。他の組成物は免疫接着物を５０％から９０％の重量濃度で含む。
【０１０９】
本発明の組成物は、植物マクロ分子を、水分を除き０.１％から５％の濃度で含有し得る。典型的には、組成物中に存在するものは、本発明の植物マクロ分子または免疫接着物からなっている。本発明の免疫接着物が、より高いまたはより低い濃度で存在していると、組成物中に存在の植物マクロ分子の濃度は逆に変動する。他の実施態様において、植物マクロ分子の組成物は、水分を除き０.１２％から１％の濃度で存在する。
【０１１０】
本発明は、下記のすべてまたは部分を含む組成物に関する：キメラＩＣＡＭ−１、Ｊ鎖、分泌成分。これらの成分は複合体を形成し、上記のように連関している。典型的には、組成物は、植物から誘導された分子も含有する。この組成物はまた、機能性免疫接着物および植物誘導分子をつくる抽出プロセスの後に得ることもできる。
【０１１１】
抽出法は、複合体含有の植物に力をかける工程を含み、それによって植物のアポプラスト分画が該複合体を放出しながら破壊される。この力はアポプラスト液を放出する主要な方法としてのせん断を含む。
【０１１２】
全植物または植物抽出物は、免疫接着物と植物の種々の他のマクロ分子との混合物を含有する。混合物中に含有されるマクロ分子には、リブロース・ビスホスフェート・カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ)またはＲｕＢｉｓＣｏの断片がある。他のマクロ分子はＬＨＣＰである。他の分子はクロロフィルである。
【０１１３】
キメラＩＣＡＭ−１分子を有する免疫接着物含有の組成物をつくるのに有用な他の方法は、種々の溶媒での抽出および植物材料への真空適用を含む。本発明の組成物は植物材料を、水分を除き０.１％から５％の濃度で含有し得る。
【０１１４】
本発明はまた、患者または動物の処置に使用できる医薬組成物に関する。医薬組成物の投与は植物などのトランスジェニック生物の抽出の前または後に行い得る。一旦抽出してから、免疫接着物をさらに通常の技術、サイズ除外法、イオン交換法、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製もできる。植物分子を複合体とともに投与できる。
【０１１５】
本発明はまた、植物誘導分子および動物誘導分子の相対比が変わり得ることにも関する。ＲｕＢｉｓＣｏやクロロフィルなどの具体的な植物タンパク質の量は、水分を除き抽出物重量の、少ないと０.０１％または多いと９９.９％であり得る。
【０１１６】
本発明はまた、具体的な治療成分のさらなる精製なしに免疫接着物を含有する治療的植物抽出物の直接的使用に関する。投与は、局所適用、経口摂取、経鼻噴霧または粘膜標的病原体に抗体を送達するのに適したいかなる他の方法でもなし得る。
【０１１７】
Ｅ．医薬組成物、製剤法、投与経路
本明細書に記載の免疫接着物は患者に、好ましくは適当な医薬組成物の形態で投与できる。この組成物は、上記のものに加えて、あるいは代わりに成分を含み得る。組成物は、投与されたときに治療と予防のいずれかまたは両方の性質を好ましくは発揮する。この組成物の調製は、当技術分野での通常の方法にしたがって行うことができ、種々の形態がある。例えば、溶液、懸濁液、エマルション、摂取の前に液体に入れるのに適した固体の形態である。ポリペプチドおよびタンパク質の製剤法および投与法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Eaton, PA, 最新版 に記載がある。これらの方法を用いて、当業者は本発明の免疫接着物を過度の実験なしに使用できる。
【０１１８】
１．投与経路
本発明における適当な投与経路には、例えば、経口、経鼻、吸入、経眼、経咽頭、経気管支、経粘膜、経腸がある。あるいは、化合物を局所的な手法、例えば、化合物を好ましい作用部位への注射などの適用により投与できる。
【０１１９】
２．製剤法
本発明の医薬組成物はそれ自体既知の方法で製造できる。例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣、摩砕、乳化、封入、包含、凍結乾燥などによる。賦形剤および/または他の補助剤を含む１以上の生理的に許容される担体を用いて、活性化合物を医薬製剤に容易にできる。適切な製剤は、選択した特定の投与経路に依存する。
【０１２０】
注射のためには、本発明の物質を水溶液に製剤できる。好ましくは、ハンクス液、リンガー液、生理食塩水などの生理的に和合性のある緩衝液に製剤できる。経粘膜投与のためには、貫通すべきバリアーに適した浸透剤を製剤に使用する。浸透剤は当技術分野で広く知られている。
【０１２１】
経口投与のためには、活性化合物を既知の薬学的に許容される担体に組み合せて、化合物を容易に製剤できる。このような担体によって、本発明の化合物を、処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤できる。適当な担体は下記を含む：賦形剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールを含む糖類などの充填剤；セルロース製剤、例えば、トウモロコシ・デンプン、コムギ・デンプン、コメ・デンプン、ジャガイモ・デンプン、ゼラチン、タラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)。必要に応じ、崩壊剤を加えることができる。例えば、橋かけポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウムなどのこれらの塩を加えることができる。
【０１２２】
糖衣のコアに適当な被覆を施す。この目的のために濃厚糖液を使用できる。この液は選択的に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー液、適当な有機溶媒、溶媒の混合物を含む。染料または色素を錠剤または糖衣の被覆に加えて、活性化合物の用量について異なる組合せの同定または特徴化に役立て得る。
【０１２３】
経口で使用される医薬製剤は、ゼラチンからつくられる硬カプセルおよびグリセロールやソルビトールなどの可塑剤およびゼラチンからつくられる軟密封カプセルを含む。硬カプセルは活性成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクやステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および選択的に安定剤を有する混合物中に含有し得る。軟カプセルにおいて、活性化合物を、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体中に溶解または懸濁し得る。さらに安定化剤を添加できる。経口投与用のすべての製剤はその投与に適した含量とする。
【０１２４】
口腔投与のために、組成物は、通常の方法で製剤された錠剤または口内錠の形態を取り得る。
【０１２５】
吸入による投与のために、本発明で使用される化合物は、加圧パックまたはネブライザーからのエアゾル・スプレーの形態で都合よく送達できる。これは適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素などの適当な気体を伴う。加圧エアゾルの場合、用量単位は、決められた量を送達するバルブによって定め得る。吸入器またはインスフレーターでの使用のためのゼラチンなどのカプセルまたはカートリッジは、活性化合物とラクトースやデンプンなどの適当な粉末基剤の粉状混合物を含有するように製剤し得る。
あるいは、活性成分は、無菌パイロジェンなしの水などの適当な担体で使用前に調製する粉末形態でもあり得る。
【０１２６】
さらに、化合物をデポ製剤としても製剤できる。このような長時間作用製剤は、植え込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与できる。例えば、化合物を、適当な重合性または疎水性材料(例えば、許容される油のエムルション）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは難溶性塩などの難溶性誘導体として、製剤できる。
【０１２７】
さらに、治療物質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスなどの持続放出システムを用いて、化合物を送達できる。種々の持続放出材料が確立されており、当業者に周知である。持続放出カプセルは、その化学的本質に応じて、数週間から１００日以上で化合物を放出する。治療物質の化学的本質および生物学的安定性によって、タンパク質の安定のために追加の処置を講じることができる。
【０１２８】
医薬組成物はまた、適当な固体またはゲル相の担体あるいは賦形剤を含み得る。この担体または賦形剤の例として、限定でないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどのポリマーがある。
【０１２９】
薬学的に許容される塩は多くの酸でつくり得る。その酸は、限定でないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸などである。塩は、対応する遊離塩基形態である水性または他のプロトン性溶媒中でさらに溶解し易い。溶液においてｐＨの調整も、所望の性質を最適化するのに日常的に使用できる。
【０１３０】
３．有効用量および用量範囲の決定
本発明の使用に適する医薬組成物は、意図する目的、例えば治療的および/または予防的な使用ができる有効量で活性成分を含有する組成物を含む。医薬的に有効な量は、疾患の症状の予防、軽減、改善のために、または処置される対象者の生存を長くするためにに有効な化合物の量を意味する。医薬的に有効な量の決定は、当業者の能力の範囲内にあり、約０.５μg/kg/日と５００g/kg/日との間であり、個々の用量は、典型的には免疫接着物を１ナノグラムから数グラム含有する。
【０１３１】
本発明方法で使用されるいずれの化合物についても、治療的に有効な量は細胞培養アッセイからまず検査する。例えば、変化量で異なる動物または細胞培養物に投与し、効果を比較する。このようにして、望ましい濃度範囲を定め、ついでその量で調製し投与する。最適化は当業者にとって通常のことである。
【０１３２】
医薬的効果の検討に加えて、当業者は標準的手法で細胞培養または実験動物での毒性を検討する。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対する有効量）を調べる。毒性量と有効量の比率が治療インデクスであり、ＬＤ５０とＥＤ５０との比で表し得る。高い治療インデクスを示す化合物が好ましい。これらの細胞培養および動物試験から得られたデーターをヒトでの使用における用量範囲の決定に用いる。このような化合物の用量は、毒性が無か、ほとんどないようなＥＤ５０を含む濃度範囲にあるのが好ましい。この用量は、用いる投与の形態および経路に依存する範囲内で変わり得る。実際の製剤、投与経路、用量は、患者の状態に応じて個々の医師が選定できる（参照、例えば、Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", ch. 1 p.1)。
【０１３３】
用量および頻度を調節して、医薬効果、例えば治療的および/または予防的効果を維持または準備するのに十分な粘膜レベルの免疫接着物を提供する。最小有効濃度（ＭＥＣ）は、各免疫接着物およびその製剤について変るが、インビボまたはインビトロのデーターから推察できる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は個々の特性および投与経路に依存する。しかし、本明細書に記載のアッセイを用いて、粘膜濃度を決定できる。これを量および実際の製剤においてさらに最適化できる。
【０１３４】
投与間隔もＭＥＣ値を用いて決定できる。間隔時間の１０−９０％、好ましくは３０−９０％、最も好ましくは５０−９０％で、ＭＥＣ以上の粘膜レベルを保持する範囲で、化合物を投与できる。
【０１３５】
組成物は所望に応じて、活性成分を含有する１以上の単位用量形態を含むパックまたはディスペンサー装置で提供できる。パックは、例えば金属またはプラスチックの薄片を含むものであり、例えばブリスター(blister)パックである。パックまたはディスペンサー装置には投与のための説明書を添付する。パックまたはディスペンサー装置にはまた、医薬品の製造、使用、販売を規制する政府当局により定められている形態の容器に関連する注意書も添付する。この注意書はヒトおよび動物への投与用の免疫接着物の形態について当局が承認したことを示す。この注意書は、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局による承認の表示であり、または承認された製品の挿入物である。適切な医薬担体中に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調製し、適当な容器に入れ、適応症の処置、例えば、宿主生物／患者のＩＣＡＭ分子により仲介される疾患の治療または予防について表示する。
【０１３６】
Ｆ．ＩＣＡＭ 仲介障害の治療および予防の方法
本発明の治療的および/または予防的な免疫接着物キメラを必要とする患者に、例えば、風邪とともに生じるようなライノウイルス感染および/または症状に対して、医薬的に有効な量の所望の免疫接着物を、好ましくは上記のように定められ、製造され、投与される医薬組成物の部分として、投与できる。この製剤および送達の様相は非常に多様である。下記する準備的な方法を用いて、ヒトおよび動物において、有効量および毒性を推測でき、また治療および予防のパラメーターおよび範囲を決定できる。これらの方法は説明のためのみであって、本発明を限定する意図ではない。さらに、これらの方法は当業者にとって通常のことである。
【０１３７】
１．ヒトにおけるライノウイルス感染性を減少せしめる免疫接着物の能力：用量増加耐容試験
本発明の免疫接着物について、感染に対する免疫接着物の投与、例えば経鼻投与の効果を調べるために無作為比較試験で検討できる。他の投与経路も使用できる。効果をモニターするのに使用できる種々のアッセイが存在する。例えば、疾患の症候、例えば、ライノウイルス感染により生じる風邪症候を検査するＩＬ−８応答アッセイがある。これらの試験により、患者が摂取した免疫接着物がライノウイルス感染をどの程度まで予防または治療し得るかを検査できる。例えば、健常または病気の対象者に免疫接着物を投与し、時間経過を通じて、例えばライノウイルス攻撃および/または病気の進行とともに、検査する。使用する臨床プロトコールは、ライノウイルス感染またはその改変に対する効力について組換え溶性ＩＣＡＭ−１分子の評価にかって用いられたプロトコール（Turner et al., JAMA 281: 1797-804, 1999) を基にし得る。
【０１３８】
いかなる種類、年齢、健康または疾患状態の雄性または雌性の対象について検査できる。対象は試験の進行とともに抗体力価を中和する血清を提示できる。この力価は感染および免疫接着物投与に応じて変動する。
【０１３９】
本発明の免疫接着物は、免疫接着物の変動量を有する緩衝液として製剤し、種々の間隔で患者に投与できる。単一上昇量および複数上昇量の試験を用いて、免疫接着物の安全性を検査できる。各例において、１以上の対象者を各用量レベルで調べる。ある者は免疫接着物を摂取し、１以上の者が選択的にプラセボを服用する。いずれの場合も、複数の用量レベルを検査できる。用量レベルは変動するが、典型的にはナノグラムからグラムの範囲である。
投与を秒、分、時間、週、月で行い、毒性および/または医薬的効果を検査できる。
【０１４０】
安全性および毒性の検定を、例えば、刺激または炎症の徴候について鼻粘膜の視覚検査で行い得る。血液安全性検査も通常の方法により行い得る。ＥＬＩＳＡなどの感度のよいアッセイを用いて、循環の免疫接着物およびライノウイルスの量を含む種々の血液成分を調べ得る。鼻洗浄試験を同様に通常の方法で行い得る。
【０１４１】
通常の統計解析および計算により、単一の患者および/または患者−レシピエントの集団について時間経過ともに推定の効力および毒性を調べることができる。
【０１４２】
当技術分野でよく知られる攻撃(Challenge)試験を行って、処置による臨床風邪の防止および／またはウイルス攻撃後の風邪症候の減少を提示できる。その場合、ウイルス、細胞、動物などの材料について市販のものを使用できる（参照、例えば、Gwaltney et al., Prog. Med. Virol. 39: 256-263, 1992)。
下記の実施例は開示の発明を説明する。これらの実施例はいかなる場合も本発明を限定するものではない。
【０１４３】
実施例１．免疫接着物の発現カセットの構築
ＩＣＡＭ−１細胞外ドメインＤ１からＤ５をコードするカセットをＰＣＲクローニングで調製した。具体的には、ＩＣＡＭ−１の全５細胞外Ｉｇ様ドメインを含有する断片を、プラスミドｐＣＤＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ (Martin et al., 参照）から、下記のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて増幅した。
【０１４４】
【表５】
0005008811.tif 000007
（配列番号６）
【表６】
0005008811.tif 000008
（配列番号７）
【０１４５】
これら２つのプライマーを設計して、ＰＣＲ断片の５'および３'末端にＳｐｅＩ部位を導入した（下線ヌクレオチド）。ＰＣＲをＰｆｕポリメラーゼで行い（Stratagene)、エラーの蓄積を減少した。ＰＣＲ断片をベクター ＰＣＲＳｃｒｉｐｔにクローン化し(Stratagene)、ヒトＩｇＡ２カセットに融合する前に配列決定した(カルボキシ末端でのＳＥＫＤＥＬの有無で）。
【０１４６】
ヒトＪ鎖および分泌成分およびヒトＩｇＡ２重鎖の植物内発現のための構築体をつくった。重鎖発現カセット・ベクターをつくり、ｐＳＳｐＨｕＡ２と名付けた（参照、図１）。これは、マメ・レグミン・シグナル・ペプチド（Baumlein et al., Nucleic Acids Res. 14(6), 2707-2720,1986)をコードする配列を含有する。マメ・レグミン配列は GenBankアクセス番号Ｘ０３６７７として提供され、マメ・レグミン・シグナル・ペプチドの配列は配列番号１０（参照、図８）であり、間に挟まってＳｐｅＩおよびＳａｃＩ部位を有するＩｇＡ２ｍ(２) 定常領域、およびシグナル・ペプチドとヒトＩｇＡ２ｍ(２)重鎖の定常領域の発現を駆動するためのＳｕｐｅｒＭａｓプロモーターがある。
【０１４７】
ヒトＩＣＡＭ−１の最初の５ドメインをコードする増幅されたＤＮＡとヒト ＩｇＡ２ｍ(２)Ｆｃ領域とを植物発現カセットにおいて融合せしめ、キメラ ＩＣＡＭ−１分子発現構築体をつくった。参照、図２Ａ。これは、ＩＣＡＭ−１ の５細胞外ドメインをコードする断片をベクター ｐＳＳｐＨｕＡ２中にクローニングして、ｐＳＳＰＩＣＡＭＨｕＡ２をつくることにより行った。便利な制限部位（５'ＳｐｅＩおよび３'ＳｐｅＩ）によって、増幅された断片をシグナル・ペプチドとＣα１ドメインとの間に挿入するのを可能になった。得られた構築体において、キメラＩＣＡＭ−１分子の発現は、構成的プロモーター"ｓｕｐｅｒＭＡＳ" (Ni et al., 1995)および nos３'ターミネーター領域の調節下にある。
【０１４８】
得られたキメラＩＣＡＭ−１分子構築体は可変領域を含有しない。ｍＲＮＡの翻訳においてシグナル・ペプチド開裂がＩＣＡＭ−１重鎖融合を植物細胞の小胞体(ＥＲ)に入れると推定する。ＥＲ保持シグナル（ＲＳＥＫＤＥＬ、配列番号５）をコードするＤＮＡを、構築体の発現レベルを強化するために、重鎖の３'末端につけた。アミノ酸配列ＳＥＫＤＥＬ配列番号４）は、植物細胞中の小胞体におけるタンパク質の保持のための共通シグナル配列である。この配列は、植物における抗体の蓄積レベルを高めることが知られている（Schouten et al., Plant Molecular Biology 30: 781-793, 1996)。キメラＩＣＡＭ−１分子構築体のアミノ酸配列は、図２Ｂに示す。構築体のＤＮＡ配列および翻訳フレームを確認してから粒子衝撃に使用した。
【０１４９】
最近の報告によると、Ｊ鎖のＩｇＡとの会合はゴルジ器官で生じる（Yoo et al., J. Biol. Chem. 274: 33771-33777, 1999)。そして重鎖のＳＥＫＤＥＬを有さない重鎖の構築が同様になされている。ＩＣＡＭ−１断片を、ＳＥＫＤＥＬなしでＩｇＡ２ｍ(２) 定常領域を含有する発現カセット中にクローンした。
【０１５０】
実施例２．会合された免疫接着物の植物における発現
Ａ．免疫接着物発現ベクター
プラスミドｐＳＳＰＩＣＡＭＨｕＡ２(配列番号９および図８）は長さが６３１３bp である。ヌクレオチド４９-１１６５はスーパープロモーター(Ni et al., Plant Journal 7: 661-676, 1995)を表す。ヌクレオチド１１６６-３６６２は、ヒトＩＣＡＭ−１/ヒト ＩｇＡ２ｍ(２)定常ハイブリドをコードする配列およびリンカー配列を含む。共通Ｋｏｚａｋ配列（Kozak, Cell 44(2): 283-92, 1986)を含めて(nt 1186-1192)、Ｖ. fabaレグミンからの翻訳開始およびシグナルペプチドを高める（nt 1189-1257; Baeumlein et al., Nucleic Acids Reg．14(6): 2707-2720 (1986)。ヒトＩｇＡ２ｍ(２) 定常領域の配列 (nt 3663-3633) はすでに発表されている（Chintalacharuvu et al., J. Imm. 152: 5299-5304, 1994)。小胞体保持シグナルＳＥＫＤＥＬをコードする配列は重鎖（nt 3634-3654) の末端についている。ヌクレオチド３６６３-３９３３はノパリン・シンターゼ３'末端から駆動する（転写終結およびポリアデニル化シグナル；Depicker et al., 1982)。プラスミドの保持体はベクター ｐＳＰ７２(Promega)から駆動する。
【０１５１】
プラスミドｐＳＨｕＪ(配列番号１１および図８）は長さが４２８３ bp である。ヌクレオチド１４-１１３６はスーパープロモーター(Ni et al., Plant Journal 7: 661-676, 1995)を表す。ヌクレオチド１１３７-１６４８は、図８に示し、生来のシグナル・ペプチド（Max and Korsmeyer, J Imm 152: 5299-5304, 1985) を含むヒトＪ鎖をコードする配列をリンカー配列とともに含む。共通Ｋｏｚａｋ配列（Kozak, Cell 44(2): 283-92, 1986)を含めて(nt 1162-1168)、翻訳開始を高める。ヌクレオチド１６４９-１９０２はノパリン・シンターゼ３'末端から駆動する（転写終結およびポリアデニル化シグナル；Depicker et al., J Mol Appl Genet 1(6): 561-73, 1982)。プラスミドの保持体はベクター ｐＳＰ７２(Promega)から駆動する。
【０１５２】
プラスミドｐＳＨｕＳＣ(配列番号１２および図８）は長さが５６５０bp である。ヌクレオチド１３-１１３６はスーパープロモーター(Ni et al., Plant Journal 7: 661-676, 1995)から誘導する。ヌクレオチド１１３７-２９８１は、生来のシグナル・ペプチド（Krajici et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm 158: 783,1994) を含むヒト分泌成分をコードする配列をリンカー配列とともに含む。共通Ｋｏｚａｋ配列（Kozak, Cell 44(2): 283-92, 1986)を含めて(nt 1151-1157)、翻訳開始を高める。ヌクレオチド２９８２-３２３６はノパリン・シンターゼ３'末端から駆動し、転写終結およびポリアデニル化シグナルを提供する（Depicker et al., J Mol Appl Genet 1(6): 561-73, 1982)。プラスミドの保持体はベクターｐＳＰ７２(Promega)から駆動する。
【０１５３】
プラスミドｐＢＭＳＰ-１（配列番号１３および図８）をｐＧＰＴＶ-ＫＡＮから誘導する。左Ｔ-ＤＮＡ境界の近くに位置する選択可能なマーカーをもつ新しい植物バイナリーベクターおよび左右境界の外側の配列が発表されている（Becker et al., in Plant Molecular Biology 20, 1195-1197, (1992))。ｐＢＭＳＰ-１のヌクレオチド１８-１８７は右ＤＮＡ境界を表し、ヌクレオチド１８１１-７７５はｓｕｐｅｒＭＡＳプロモーターを表す。ヌクレオチド２３９３-２６６３はＮＯＳプロモーター（Depicker et al., J Mol Appl Genet 1(6): 561-73, 1982）を表し、ヌクレオチド２６９８-３４９２は ＮＰＴＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）をコードし、ヌクレオチド３５１１-３７３３は、Ａ. tumefaciens 遺伝子７（Gielen et al., Embo J 3: 835-46, 1984)からのポリアデニル化シグナルである。ヌクレオチド１７６８-９７６はＮＰＴＩＩ遺伝子をコードし、ヌクレオチド４３１７-４４６４は左Ｔ-ＤＮＡ境界を表す。
【０１５４】
プラスミドｐＢＭＳＰ-1ｓｐＪＳＣ（配列番号１４および図８）はｐＢＭＳＰの誘導体であり、スーパープロモーターの調節下にＪおよびＳＣの両方を含有する。このプラスミドにおいて、ヌクレオチド１-１４９は左Ｔ-ＤＮＡ境界を表す。ヌクレオチド９５５-７３３は、Ａ. tumefaciens 遺伝子からのポリアデニル化シグナルである。ヌクレオチド１７６８-９７６はＮＰＴＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）をコードし、ヌクレオチド２０７３-１８０３はＮＯＳプロモーターを表す。ヌクレオチド２６３５-３７６８はｓｕｐｅｒＭＡＳプロモーターを表し、ヌクレオチド３７７４-５５９５はヒト分泌成分を表し、ヌクレオチド５６０３-５８５７は ＮＯＳポリアデニル化シグナルを表す。ヌクレオチド５８８０-６９９１は ｓｕｐｅｒＭＡＳプロモーターを表し、ヌクレオチド７００７-７４９０はヒト・ジョイニング鎖を表し、ヌクレオチド７５０４-７７５７はＮＯＳポリアデニル化シグナルを表す。ヌクレオチド７８８６-８０５７は右Ｔ-ＤＮＡ境界を表す。
【０１５５】
プラスミドｐＧＰＴＶ-ＨＰＴは、ヒグロマイシン耐性を付与する酵素をコードし、Max-Planck-Institut fuer Zuechtungsforchung (ドイツ）から商業的に入手できる。これは Becker: Plant Molecular Biology 20, 1195-1197 (1992) に記載されている。
【０１５６】
Ｂ．植物形質転換および植物での免疫接着物の発現
上記の発現カセットを用いて、植物において会合された免疫接着物をつくった。プラスミドｐＳＳＰＩＣＡＭＨｕＡ２、ｐＳＨｕＪ、ｐＳＨｕＳＣ、ｐＢＭＳＰ-１をタバコ葉の組織（N. tabacum cultivar Xanthi) 中に共衝撃し、形質転換されたミクロカルス(microcalli)をカナマイシンの存在下に栄養寒天上選択した。個々のミクロカルスは独立の形質転換事象の指標であり、植物組織から切開し、カナマイシンとともに栄養寒天上で繁殖せしめた。
【０１５７】
カルス組織を形質転換発現のためにスクリーニングした。カルス＃７１３２がキメラＩＣＡＭ−１免疫接着物およびＪ鎖を発現したのを免疫ブロッティングおよびＰＣＲで示す（データー表示せず）。このカルスはＳＣをコードするＤＮＡを有しない。カルスは培養でよく成長した。十分な量の蓄積時に＃７１３２を再びばら撒いた。その際に上記プラスミドの２つ、Ｊ鎖とＳＣの両者についての発現カセットを含有するＰＢＭＳＰ-１ ＳｐＪＳＣ、およびヒグロマイシン耐性を付与するｈｐｔＩ遺伝子についての発現カセットを含有する ｐＧＰＴＶ-ＨＰＴを持つ。栄養寒天上での選択および成長の後に、いくつかの独立の形質転換体を免疫ブロッティングで同定した。これは、キメラＩＣＡＭ−１分子、Ｊ鎖、ＳＣをいくつかの会合状態で発現した。
【０１５８】
図３は、独立的に形質転換されたタバコのカルスにおけるキメラＩＣＡＭ−１分子の発現を示す。図３Ａは非還元ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルの免疫ブロットを示し、そこでは、異なる形質転換タバコ・カルス（Ｃ）を含むサンプルおよび水性抽出物（Ａｑ）を用い、ヒトＩＣＡＭの存在を調べた。免疫接着物の溶解性からして、抽出を容易に行うことができ、シグナルの類似性から発現の再現性を確認できた。図３Ｂは、カルスＲｈｉ１０７-１１由来の部分的精製の免疫接着物の種々のフラクションを含有する非還元ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルの免疫ブロットを示す。ブロットを、ヒトＩＣＡＭ−１ (〜ＩＣＡＭ)、ヒト ＩｇＡ 重鎖(〜α)、ヒト分泌成分(〜ＳＣ)、ヒトＪ鎖(〜Ｊ）に対する抗体で調べた。次に、酵素コンジュゲート抗体をアルカリホスファターゼで免疫陽性バンドを標識するのに必要なものとして用いた。免疫ブロッティングの特異性を、非発現カルスの抽出物で免疫陽性バンドを検出しないことでさらに確認した(データは示さず)。二量体キメラＩＣＡＭ−１分子はグリコシル化がなく、予測ＭＷは１７３,３１８ である。この形態は、ＩＣＡＭ−１および重鎖について免疫陽性であるので、２５０ｋＤマーカーの直下に移動するバンド中に存在するようである。このバンドはＳＣ（全予測ＭＷ〜２４８ｋＤ）についても免疫陽性であるが、Ｊ鎖については陽性でない。これは、２つの細胞型(哺乳動物において）を含み、ＳＣの会合の前にＪ鎖の存在を必要とするという、ＳＩｇＡ会合の正統の経路からすると幾分予想外である。四量体免疫接着物は、Ｊ鎖の単一分子およびＳＣの単一分子を含有し、グリコシル化の前で予測ＭＷ〜４４０ｋＤを有する。２００ｋＤを十分越える分子量のいくつかの種は、４プローブで免疫陽性であり、容易に識別できる。
【０１５９】
ＤＮＡ被覆ミクロ注入による衝撃を用いて、植物と動物の両方で安定な形質転換体をつくる（総説、Sanford et al., Meth. Enz. 217: 483-509, 1993)。本発明の免疫接着物をコードするベクターでの粒子介在形質転換を、ＰＣＤ-１０００／Ｈｅ粒子増速装置（Bio-RaD 社製）を用いて行った。ＰＤＳ-１０００／Ｈｅ粒子増速装置はヘリウム圧を使用して、標的細胞に対するＤＮＡ被覆ミクロ粒子を加速する。この技術は、物理的性質からして用途が広く、使用が容易である。タバコを分泌ＩｇＡの全４成分で同時にうまく形質転換できた。
【０１６０】
基本的な生物的方法を下記のように実施した：ミクロ注入のストック懸濁液を、粒子６０mgの絶対エタノール液１ｍｌを混合してつくった。懸濁液をかき混ぜ、２５-５０μlを取りだし、無菌のミクロ遠心管に入れた。３０秒間ミクロ遠心分離した後にエタノールを除去し、ペレットを１ｍｌの無菌水に再懸濁し５分間遠心分離した。次いで水分を除き、プラスミドＤＮＡの混合物を含有するＤＮＡ液２５-５０μl 中にペレットを再懸濁した。しかし、常に等モル量でない。加えられたプラスミドの量は各製剤につき０.５ｎｇから１μｇの範囲である。下記のものを順次加えた：無菌水２２０μl、２.５ＭＣａＣｌ2 ２５０μl、０.１Ｍスペルミジン５０μl。この混合物を少なくとも１０分間かき混ぜ、次いで５分間遠心分離した。上澄み液を除き、絶対エタノール６００μl中に沈澱したＤＮＡ/ミクロ注入物を混合し、１分間遠心分離した。エタノールを除去し、ペレットをエタノール３６μl に再懸濁した。懸濁液１０μl を、Ｋapton (DuPont) からつくられたミクロキャリアーシートの中心にできるだけ平たく置き、エタノールを蒸発した。ミクロキャリアーシートおよび破裂デスクをユニットで置いた。表面無菌タバコを含有するペトリ皿を停止スクリーンの下に置いた。室を２８-２９mm Ｈｇに減圧し、標的に衝撃を１度加えた。タバコおよび他の植物についてのプロトコールを最適化するために、Ｈｅ圧、被覆粒子、ミクロキャリアーと停止スクリーンとの距離、停止スクリーンから組織への飛行距離を変えた。
【０１６１】
キメラＩＣＡＭ−１分子の発現カセットを、Agrobacterium 仲介形質転換に使用のためにバイナリー・ベクターに会合せしめた。ヒトＪ鎖およびヒト分泌成分の両方の発現およびカナマイシン耐性のために設計された Agrobacterium バイナリー・ベクターを、Ａ. tumefaciens 株 ＬＢＡ４４０４中に導入した。他のバイナリー・ベクター中のキメラＩＣＡＭ/ＩｇＡ分子も使用して、ＬＢＡ４４０４を形質転換した。両株の一夜培養を、標準的プロトコール（Horsch et al., Science 227: 1229-1231, 1985) にしたがって、タバコ葉の同時「共培養」のために使用した。
【０１６２】
衝撃および Agrobacterium 両方の形質転換タバコ葉ディスクの再製についての標準的プロトコールを使用した（Horsch et al., Science 227: 1229-1231, 1985)。衝撃された組織から再生された形質転換植物は成熟時に遺伝子サイレンシングをしばしば受けるので、トランスジェニック・タバコ植物を、Agrobacterium 仲介形質転換により作った。これは高収率の発現成熟植物をもたらす。
【０１６３】
実施例３．会合された免疫接着物の精製
実施例３にしたがって発現された免疫接着物を精製した。カルスを大量に成長せしめ、抽出法の進行を容易にした。部分的精製法により種々の緩衝条件で利用できる安定な濃縮体を準備した。免疫接着物のさらなる精製のための続くクロマトグラフィー検査のためである（参照、図３）。カルスを搾り器で抽出し、クエン酸ナトリウム（０.６Ｍ, ｐＨ７.４)および尿素（最終濃度２Ｍ)中に浸すとともに、２つのステンレス鋼ギア間で組織を粉砕する。木綿布（チーズクロス）で粗くろ過した後、液（〜１mg/g 生重量）を ０.６７容量の飽和硫酸アンモニウムで沈降せしめた。緑色ペレットを遠心分離後に集め、Ｄounce ホモゲナイザーで少量の５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ ６.６)中に完全に抽出した。追加の遠心分離後に、澄んだ褐色の上澄み液を集め、脱塩モードの緩衝交換時に、Ｓephadex Ｇ-１００カラムを通すことにより部分的に精製した。脱塩/緩衝交換工程により所望の緩衝液中に部分的精製の濃縮物（〜０.２ ml/g 生重量カルス）を調製し、Ｇ-１００カラムを０.２５ Ｘ リン酸緩衝液で溶出した。この溶出物は２-８℃で少なくとも１０日間安定であった。
【０１６４】
実施例４．免疫接着物がヒト・ライノウイルス感染を阻止する
ヒト・ライノウイルスによる細胞の感染が、実施例３でつくられた免疫接着物により阻止されることを明らかにする。実施例３によりつくられたカルス抽出物は、抗ＩＣＡＭ モノクローナル抗体の結合について溶性ＩＣＡＭ−１に対してよく競合した。図４は、酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ)によるデータを示す。このアッセイのために、９６ウエルプレートを溶性ＩＣＡＭ−１ /ml ０.２５μｇ で被覆した。マウス（抗ヒトＩＣＡＭ）抗体の一定量で接着した ＩＣＡＭ との競合での使用において、四角は sＩＣＡＭ の増加濃度を表し、丸はカルス抽出物（Ｇ-１０Ｑからの無菌ろ過フラクション）の増加量を表す。ウエルを洗浄後、接着マウス抗体をホースラディシュ・ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウス抗体で検出した。接着酵素活性を４９０nm で基質としてオルト-フェニレンジアミンで測定した。データ（四角：sＩＣＡＭ; 丸：抽出物）をＳ状の形態 ＯＤ４９０=ｙ=ｙｏ+ａ/[１＋ｅ-{(ｘ-ｘｏ)/ｂ}] で記載できる。式中、ａ=ｙ max、ｙｏ=ｙ min、ｂ=曲線の急速に変化する部分の傾斜、ｘo=５０％応答レベルでのｘ値である。溶性ＩＣＡＭ−１に比して、ここで試験した免疫接着物抽出物は等量の〜２５０μg ＩＣＡＭ/mlを含有する。これは、ＩＣＡＭ−１ 重鎖融合の二量体および四量体会合の予測結合性効果による過剰評価である。このように、ＥＬＩＳＡによると、免疫接着物は抗 ＩＣＡＭ ｍＡｂに対する結合について溶性ＩＣＡＭ−１と競合する。
【０１６５】
競合ＥＬＩＳＡによって、５０％応答を得るのに必要な種々のフラクションの正常量と比較して、活性回復についての定量検定ができる。精製において、免疫接着物の力価は、５０％応答を得るのに１ミリグラムの免疫接着物を稀釈しなければならないミリリットル数、すなわち逆数稀釈として表現できる。このＥＬＩＳＡは免疫接着物によって精製プロセスの進展を容易にする。
【０１６６】
細胞障害効果アッセイ（ＣＰＥ)は、部分的に精製された免疫接着物がヒトライノウイルスによるヒト細胞の感染を阻止する特異的能力を明らかにした（図５)。ライノウイルス・セロタイプ ＨＲＶ−３９を、ヒトＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ/ＩｇＡ融合物（Tim Springer 博士より受領）、または本発明のＩＣＡＭ−１/ＳＩｇＡ免疫接着物または他の異なる抗体と３３℃で前インキュベートし、ついでＨｅＬａＳ３細胞との各混合物を入れた。３日後に、生きている細胞を固定し、クリスタル・バイオレットのメタノール溶液で染色した。５７０nmでの光学密度が細胞生存性についての比較測定を提供する。
【０１６７】
Ｒｈｉ１０７-１１から誘導された２つの抽出物は、免疫接着物を含有し、ＨｅＬａＳ３細胞に感染しそれを殺すウイルスの能力を明らかに阻止した（図５Ａ、通常三角形および逆三角形）。抽出物が部分的にのみ精製されているので、化学療法剤、ドキソルビシンに対するヒトＩｇＡ２ｍ(２) を含有の、同様につくられた抽出物もアッセイした。この抽出物は、非関連結合特異性を有する類似の免疫接着物を含有し、ライノウイルスの感染性を阻止できないで、ＩＣＡＭ−１ 重鎖融合物の発現が阻止についての特異性を付与することを表す。ＣＰＥアッセイによると、予測されるように、溶性ＩＣＡＭ−１およびＩＣ１-５/ＩｇＡ (Martin et al., 1993) がウイルス感染性を阻止する差別的能力を示した（図５Ｂ)。図５Ｂ中の挿入図は、溶性ＩＣＡＭ−１(１.３５μg/ml)およびＩＣＩ-５/ＩｇＡ(０.１２μg/ml; １１.３倍以下)のＩＣ50範囲の拡大図である。
【０１６８】
実施例５．臨床試験および毒性試験のための免疫接着物の調製および精製
予定の臨床試験および毒性試験のための十分な免疫接着物の生産を、トランスジェニック・タバコ植物をつくって行う。免疫接着物（ＥＲ保持シグナルなし）を発現するトランスジェニック・タバコを、Agrobacterium 仲介組換えによってつくった。ＥＲ保持シグナルの不存在は、会合を高めると予測される。生来のＳＩｇＡが全ゴルジ器官、特にトランス-ゴルジ器官で保持されているからである。そこでは、ＳＣがｄＩｇＡに、パルス追跡試験により示唆されるように、共有結合している（Chintala Charuvu & Morrison, Immunotechnology 4: 165-174, 1999)。Agrobacterium 仲介組換えがトランスジーン発現の一定レベルをもつ植物をつくるようなので、これらの植物の子孫を、臨床用の免疫接着物の生産に使用できるであろう。
【０１６９】
発現レベルを最大にし、真のブリーディング系をつくるために、同型接合の植物をつくるのが望ましい。最も高い生産性の植物（世代Ｔ0)は種子採取前に温室で自己繁殖し得る。１／４のＴ1植物が同型接合であると推定される。これらを温室で生育し、いくつかの植物からの種子サンプルをカナマイシン含有培地に別個に発芽させる。同型接合陽性植物からのすべての子孫（Ｔ2) が緑色であると推定される。異型接合植物のいくつかの子孫が白色または淡黄色と推定される。同型接合を子孫の野生および免疫ブロッティング抽出物へのバック交配により確認する。
【０１７０】
収穫とプロセシングを生産過程中に継続的にかみあわせることができ、特に単一の植付けから複数の収穫物を得ることができるので、１収穫について土レベルにカットされた植物を次ぎの収穫のために再生育する。免疫接着物の生産規模を考慮する場合、最終の免疫接着物の必要量に基づいて、発現レベルの量（存在の免疫接着物 mg/タバコ新鮮重量 kg)、植物の成長速度、平均的植物の推定重量、精製全収率（２０％で設定）を決める必要がある。最終免疫接着物３gを必要とすると、最終の免疫接着物１gの推定収量を各々が有する４収穫を要する。
【０１７１】
これらの標的およびパラメーターが与えられると、植物の必要な数および植物生育に要する広さを決める。図６は、最終の免疫接着物１グラムをつくるのに必要物の検討である。このグラフにおいて、免疫接着物１gに要する植物数を、２０％の収率で、発現の推定レベルおよび植物重量で示す。異なるレベルの発現（mg/kg 新鮮重量）および全体の回復（２０％で設定）で、各植物の重量および植物数を合理的な可能性の範囲内で（破線の四角形）具体的な生産標的（１g/収穫）について決定し得る。必要な植物数は、逆に、具体的な成長および再成長の数とともに減少する。期待のバイオマス生産、時間の関数、成長条件が収穫までの時間および収穫間の時間に影響を与える。これらの成長期間を、植え付けおよび収穫の時期を変えることにより精製計画の実際に調節できる。われわれの経験から、生産にはｘ数の植物を必要とする。例えば、免疫接着物１００mg/kg 新鮮重量の発現レベルを有する植物からの最終免疫接着物１ｇが２５０植物を、２００g/植物（発芽後 ８０〜）の重量で収穫するとき、必要とする。この規模で、これらの植物は約１０m2の成長空間を必要とし、１５０日以上に２回収穫される。
【０１７２】
ある時点でのバイオマスのプロセシング５０+ｋｇは、すべて食品加工産業において対応物を有するいくつかの中程度の操作を必要とする。これには、バルク材の処理、サイズ減少、ジュース化、ろ過がある。Ｖincent ＰressおよびＤurcoろ過系を用いて、この量を効率よく処理できる。ジュース化工程にクエン酸ナトリウムと尿素の簡単な緩衝液を用いる。これらの成分は抽出物を緩衝し、フェノール性の酸化およびタンパク質との結合を防止するのを助け（Gegenheimer, Methods in Enzymology 182: 174-193, 1990; Loomis, Methods in Enzymology, 31, 528-544, 1974; Van Sumere et al., The Chemistry and Biochemistry of Plant Proteins, 1975)、次ぎの酸沈降における免疫接着物の安定性を確実にする。
【０１７３】
酸溶性脂質およびタンパク質（全体の〜９０％) のろ過をタンゼンシャル・フロー超ろ過で行い、免疫接着物を濃縮し、少量のタンパク質、特にフェノール性を除去する。ダイアろ過が小分子の除去を高め、短期間保存および次ぎのクロマトグラフィーのための調製において緩衝を交換する。ＳＰセファロース（ｐＨ５.０以下で結合）およびＱセファロース（ｐＨ５.５以上で結合）は、免疫接着物のろ過に使用できるイオン交換である。これらは、容易に入手でき、規模がよく、安定で、高性能である。特に、これらは、伸張床フォーマットに利用でき、前のろ過工程のストリンジェンシーを下げる。カチオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーよりも選択性が大きく、最初に使用する。免疫接着物を数種の潜在的存在のタンパク質から、少なくとも９５％のタンパク質がＩＣＡＭ−１/ＩｇＡ、ＩＣＡＭ−１/dＩｇＡ またはＩＣＡＭ−１/ＳＩｇＡ の形態にあるまで、精製する。２価および４価のＩＣＡＭ−１ドメイン存在が強力な抗ウイルス活性のために非常に重要であるからである。精製された免疫接着物を、エンドトキシン、ニコチンなどのアルカロイドの許容レベルおよびバイオ負担について検査する。さらに、力価レベル（ＥＬＩＳＡおよびＣＰＥアッセイにより）、タンパク質濃度、ｐＨ、外観をモニターする。ついで、免疫接着物の臨床ロットの安定性を測定し、患者が完全に強い免疫接着物を摂取できるようにする。部分的に精製された抽出物でも凍結すると１０日間安定である。臨床のために製剤した免疫接着物（リン酸緩衝液中）の力価および効力も、-２０℃、２〜８℃、３７℃で、３〜６月間保存して、検査する。
【０１７４】
実施例６．免疫接着物は植物特異的グリコシル化を有する
つくられた免疫接着物を分析して、存在するグリコシル化のパターンを調べる。Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4): 365-372 (1999)は、植物発現の抗体構築物上の植物の典型的ないくつかのグリコシル化部分の存在を明らかにしている。この方法を用いて、実施例１、２、３でつくられた免疫接着物が植物特異的グリコシル化パターンを有することを示す。その多様性は免疫接着物についての多様な源によるのであろう。粗抽出物がインビトロで抗ウイルス活性を有することを示すので（データーを表示せず）、グリコシル化自体は効力に影響を及ぼさないようである。Ｎ結合グリコシル化（図２はキメラＩＣＡＭ−１分子単独で１５の可能性部位を示す）はおそらく、免疫ブロットで見られる多様なバンドに関与する。免疫接着物製剤は、Ｎ-グリコシダーゼＡで消化されて、ブロッティングの前に、結合パターンの相違が極少數の個別のバンドに崩壊することを示す。この場合、グリコ形態は還元または非還元ポリアクリルアミド・ゲルで主に特徴解明できる。さらに、消化および模擬消化フラクションは、CPE アッセイおよび競合ＥＬＩＳＡで試験すると、インビトロで効力および力価に対するＮ-グリコシル化の作用を示す。
【０１７５】
実施例７．免疫接着物はヒト・ライノウイルスを不活化する
実施例１、２、３でつくった免疫接着物を、その能力、ウイルスとの結合によるＨＲＶの不活化、ウイルス侵入の阻止、空のウイルスカプシドの形成誘導について調べる。免疫接着物のＨＲＶとの結合を測定するために、免疫接着物を［3Ｈ］ロイシン標識 ＨＲＶ−３９ともに３０分間インキュベートし、次いでＨｅＬａ細胞に１時間で加える。洗浄後、細胞とウイルスをＴriton Ｘ-１００で分離し、［3Ｈ］をシンチレーション・カウンターで測定する。
【０１７６】
免疫接着物とのインキュベーションによるＨＲＶ−３９の不活性化を、ｓＩＣＡＭ−１によるＨＲＶ不活性化と比較する。ＨＲＶ−３９は単量体sＩＣＡＭ−１によるインキュベーションにより有意の程度（＜０.５ log10 感染能の低下）に直接的に不活性化されないが、ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ とのインキュベーションは感染能を約１.５ log10 低下さす（Arruda et al., Antimicrob. Agents chemother 36: 1186-1191, 1992; Crump et al., Antimicrob. Agents chemother 38: 1425-7, 1994)。ＨＲＶ−３９を不活性化する免疫接着物の能力を試験するために、１０６５０％組織培養感染量(ＴＣＩＤ50)のＨＲＶ−３９を、このウイルスに対する各分子のＩＣ50の１０倍に等しい濃度のsＩＣＡＭ−１または免疫接着物を含有する培地で、またはなにも含まない培地で、１時間３３℃でロッカー・プラットホーム上、インキュベートする。各ウイルス-免疫接着物またはウイルス-培地の混合物を連続的に１０倍稀釈法で稀釈し、９６ウエル・プレートのＨｅＬａ細胞に対する力価を測定する。
【０１７７】
宿主細胞とのＨＲＶ接着に対する免疫接着物の作用を、ＨｅＬａ細胞をＨＲＶ−３９とともにＭＯＩ０.３で免疫接着物の存在または不存在でインキュベートして調べる。吸光度が１時間４℃で進行し、細胞を洗い、培地を免疫接着物プラスまたはマイナスとする。細胞を１０時間３３℃でインキュベートし(１回の複製可能まで)、ウイルスを細胞の凍結／解凍で採取する。ウイルスのＨｅＬａ細胞に対する力価を調べる。
【０１７８】
ＩＣＡＭ-ＩｇＡ (ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)は sＩＣＡＭ−１よりも、ＨＲＶでの立体配座の変化を誘導することに効果的であり、空の非感染性ウイルス粒子の形成をもたらす(Martin et al., J. Virol. 67: 3561-8, 1993)。ＨＲＶでの立体配座の変化を誘導し、ウイルスＲＮＡの放出をおこす、実施例１、２、３でつくられた免疫接着物の能力を調べるために、精製免疫接着物を、［3Ｈ］ロイシン標識 ＨＲＶ−３９とともに３０分間インキュベートし、ついでウイルスを５から３０％傾斜のスクロースに置く。９０分間４０,０００ rpm で遠心分離した後、フラクションを集め、［3Ｈ］を測定し、フラクションを感染能について検査する。(傾斜スクロースに対する１４９Ｓでの無傷 ＨＲＶセグメント、一方、７５ＳでＲＮＡセグメントを欠く空のカプシド(Martin et al., J. Virol. 67: 3561-8, 1993))。この原子価の増加により、ＩＣＡＭ/ＳＩｇＡ免疫接着物がＩＣＡＭ-ＩｇＡよりも、空の非感染性粒子を誘導するのに効力があると考えられる。
【０１７９】
メジャーおよびマイナー(受容体としてＩＣＡＭ−１を使用しない）の両方の ＨＲＶセロタイプのパネルに対する精製免疫接着物の阻止作用を、ＣＰＥアッセイを用いて検査する。ＨＲＶ感染を阻止するＩＣＡＭ−１の能力は、ウイルス単離体によって変わる。文献(Crump et al., Antimicrob. Agents chemother 38: 1425-7, 1994)によると、sＩＣＡＭ−１についてのＥＣ50は、ＨｅＬａ細胞を用いるＨＲＶメジャー受容体セロタイプ・アッセイのパネルで試験した場合、０.６μg/mlから３２μg/mlの範囲にある。われわれのパネルは、９メジャーセロタイプ(ＨＲＶ−３、-１３、-１４、-１６、-２３、-３９、-６８、-７３、-８０)およびマイナー受容体セロタイプＨＲＶ−１Ａを含む。
【０１８０】
実施例８．臨床試験がヒトにおける感染能を減少する免疫接着物の能力を示す：用量増加耐容試験
本発明の免疫接着物について２つの無作為比較試験を行い、実験的ライノウイルス風邪における感染、ＩＬ-８応答、病態に対する免疫接着物の経鼻投与の作用を調べる。この２つの試験では、ライノウイルス接種の前と後で対象者が摂取した免疫接着物を評価する。ここで使用する臨床プロトコールは、ライノウイルス感染に対する効果について組換え溶性ＩＣＡＭ−１分子を評価したときにかって用いたプロトコール(Turner et al., JAMA 281: 1797-804, 1999)を基としている。
【０１８１】
Ａ．対象者
ヴァージニア大学、Chalottesville、の関係者から対象者を募集する。対象者は健康で、非喫煙者で、年齢１８から６０歳である。アレルギー疾患または非アレルギー鼻炎の病歴、異常な鼻腔形態または粘膜、最近２週間以内の呼吸器感染のある者は除外する。妊娠中および授乳中の女性および医学的に認められていない受胎コントロール中の女性も除外する。試験的ウイルス攻撃試験において(Ｉ/ＩＩ相、下記参照)、対象者は試験ウイルスに感受性を有することを要し、試験開始の９０日以内に測定して、ウイルスに対する血清中和抗体力価が１：４以下である。
【０１８２】
Ｂ．試験薬物
本発明の免疫接着物を、２.６mg/ml 含有のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）噴霧液として製剤する。プラセボはＰＢＳからなり、外観は活性製剤と同じである。溶液の投与には、計量鼻噴霧ポンプを装着した薬物ビンを用いる。このポンプは免疫接着物１８３μｇを含有する溶液７０μｌを各噴霧で送り出す。薬物は鼻腔ごと２回噴霧、１日６回(３時間間隔)で投与し、合計１日量は４.４mgである。これは、mgタンパク質／日において、tremacamra 試験感染での溶性ＩＣＡＭ−１(Turner et al., JAMA 281: 1797-804,1999)について使用された用量と同じである。免疫接着物のモル数は sＩＣＡＭ−１のモル数の約２倍量である。しかし、sＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ/ＩｇＡ融合物の間のインビトロ活性の相違からして、免疫接着物は sＩＣＡＭ−１よりモル・ベースで何倍も有効である。このように、この量はなにが必要であるかについての控え目の計算である。この量を用いる。ただし、用量増加試験でこの量に問題が起きたときは別である。
【０１８３】
Ｃ．試験の設計
単一の増加量および複数の増加量で試験を行って、免疫接着物の安全性を調べる。各場合、３人の対象者で各用量レベルで検査し、２人は免疫接着物を、１人がプラセボを摂取する。単一増加量試験において、４用量レベルで調べる。最低量は攻撃試験での使用予定量の半分であり、最大量は攻撃試験での使用予定量の２倍である。用量レベルは次ぎのとおり：各鼻腔１噴霧(計３６６μg)、各鼻腔２噴霧(計７３２μg)、各鼻腔３噴霧(計１０９８μg)、各鼻腔４噴霧(計１４６４μg)。
【０１８４】
同じ用量レベルを複数増加量試験で用いる。対象者は３時間ごと(１日６回)、５日間摂取する。両試験において、対象者を各用量レベルで調べ、各次ぎのレベルへの移行は前のレベルで急性毒性のないことが明らかになってからとする。すべての対象者は最初の投与後に単一用量２１日に戻り、６週で追跡する(免疫接着物に対する血清抗体の測定のため)。
【０１８５】
１２人の別個の群に各鼻腔に２回噴霧を１回投与し、鼻洗浄を１、２、４、８、１６時間に行う(各時点で２対象者)。インビボでの半減期を計算するために、洗浄物をＰanorama ＲesearchでＥＬＩＳＡにより免疫接着物についてアッセイする。用量増加試験および半減期試験(全２８人について)で使用した免疫接着物の全量は約２７０mgとなる。
【０１８６】
Ｄ．安全性の評価
通常の有害副作用に加えて、免疫接着物の安全性を３方法で調べる。第１は、最初の投与の前および最後の投与の後に鼻粘膜、特に刺激または炎症の徴候について視覚検査を行う。すべての見られる変化を記録する。第２に、標準的血液安全性検査を、処置の前および試験 １、４、８日（および複数増加用量試験では、２１日)の最後の投与後に採取したサンプルについて行う。第３に、血清サンプルを貯め、凍結し、免疫接着物が鼻粘膜を経て血液に移行するかを調べるために用いる。これは次ぎの２つの方法で行う。第１に、血清サンプル中の免疫接着物の存在をＥＬＩＳＡで測定する。この方法では、ミクロタイタープレートに吸収された抗ヒトＩｇＡ抗体が血清中の免疫接着物を捕捉する。これを抗ＩＣＡＭ 抗体が検出する。アッセイ感度の測定には、既知濃度の免疫接着物を有する正常ヒト血清サンプルを用いる。あるいは、抗ＩＣＡＭ抗体をプレートに吸着せしめ、血清中の免疫接着物を捕捉する。これを抗ＩｇＡで検出する。第２に、免疫接着物に対する免疫応答の存在を、ミクロタイタープレートに吸収された免疫接着物を使用するＥＬＩＳＡ法で調べる。血清中の抗免疫接着物が抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭと結合し、これを検出する。処置前と処置後の血清サンプルを比較して、力価の変化を免疫接着物摂取の証拠とする。抗免疫接着物抗体の存在が陽性であれば、追加のアッセイをおこなって抗ＩＣＡＭ−１抗体と抗ＩｇＡ活性の識別をおこなう。
【０１８７】
患者を免疫接着物に対するアレルギー反応の発生についてスクリーニングする（以前の試験で、鼻に局所適用した溶性ＩＣＡＭ−１または口腔に適用した植物体でアレルギー歴がなかった)。鼻のアレルギー徴候を表す者を、鼻洗液中の抗免疫接着物特異的ＩｇＥ抗体について、感受性２工程ＥＬＩＳＡ(R & D System) を用いて試験する。
【０１８８】
Ｅ．統計解析
この試験のサンプルの大きさは、以前のライノウイルス攻撃モデルを用いる試験を基とする。保護試験に企画されたサンプルの大きさは適切であって、臨床風邪の発生の低下がプラセボで７５％、活性処置群で２５％である。αの１側レベル＝０.５、１-β＝８.０である。さらにサンプルの大きさは、全徴候スコア５単位、ＳＤ５.８単位で変化を検出できるのに十分である。
【０１８９】
実施例９．ヒトにおける感染を減少する免疫接着物の能力を示す臨床試験：攻撃試験
攻撃試験を用いて、本発明の免疫接着物での処置が臨床の風邪を防禦し、ウイルス攻撃後の風邪症候を減少することを明らかにする。
【０１９０】
Ａ．攻撃ウイルス
本試験で使用する攻撃ウイルスはライノウイルス３９(ＨＲＶ−３９)である。ライノウイルス３９型は、細胞との接着にＩＣＡＭ−１を必要とするライノウイルスの主要な群である。攻撃ウイルスプールは共通指針にしたがって安全に試験される(Gwaltney et al., Prog. Med. Virol. 39: 256-263, 1992)。すべての対象者に約２００中位組織培養感染量(ＴＣＩＤ50)を接種する。対象者をあお向けにして、ウイルスを滴として、鼻腔ごと２５０μｌの２接種物を約１５分間隔で投与する。
【０１９１】
表１
【表７】
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【０１９２】
Ｂ．試験計画
２つの無作為ライノウイルス攻撃試験を行う(参照、表１)。本発明の免疫接着物の同じ製剤を接種試験の前と後で検査する。両試験において薬物を、６用量で毎日、５日間投与する。対象者を各試験に入る際に無作為に割付け、免疫接着物または対応プラセボのいずれかを摂取するようにする。この試験は盲検であり、すべての臨床関係者、対象者、Ｐanorama Ｒesearch従業員にデーターの回収時まで盲検である。
【０１９３】
前接種試験において、薬物投与はウイルス攻撃の４時間前に開始する(２用量)。ウイルス攻撃を免疫接着物(またはプラセボ)の第２回投与の１時間後に行い、第１日目の残りの投与を予定のとおり行う。この試験で、１８人が活性物を摂取し、１８人がプラセボを摂取する。
【０１９４】
後接種試験では、薬物投与をウイルス攻撃２４時間後に開始する。この時点を選択したのは、ウイルスからの保護についての他の試験で使用されていたからであり、また風邪症状が明らかに存在するようになるからである(Harris & Gwaltney, Clin. Infect. Dis. 23: 1287-90, 1996)。この試験でのウイルス攻撃は、試験日１の朝の試験薬物第１投与の約２４時間前、試験日０の朝に行う。この試験で、３６人が活性物を摂取し、１８人がプラセボを摂取する。
【０１９５】
対象者をホテルの個々の部屋に試験０日(ウイルス攻撃日)から試験６日まで隔離する。これらの期間毎日、症候スコアーとウイルス単離のための洗浄を、薬物投与の第１回の前に朝おこない、第２症候スコアーを各夜に行う。試験日６に対象者の隔離を止めるが、１４日間は各晩に症候スコアーを記録する。対象者は試験２１日に試験場所にもどり、そこで抗免疫接着物抗体の検出のための最終血清サンプルを採取する。２回のウイルス攻撃試験(全５４人について)で使用する免疫接着物の全量は約１２００mgである。
【０１９６】
Ｃ．ウイルスの単離
ウイルスの脱落を細胞培養でのウイルス単離により検出する。鼻洗浄検体を各鼻腔への０.９％塩液５ｍｌの点滴により採取する。この洗液をプラスチックのカップに入れ、１または２時間冷やし、ついでウイルス培養に供する。免疫接着物の標本からの除去を、アガロース支持体 (Affi-Gel 10, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に吸着された抗ＩＣＡＭ−１抗体での処理により行う。一部の各処理標本を-８０℃で保存し、他の部分をＨｅＬａ-１細胞の２試験管、ＩＣＡＭ−１の産生に富むＨｅＬａ細胞系中(Arruda et al., J. Clin. Microb. 34: 1277-1279, 1996)に接種する。ライノウイルスを、典型的な細胞障害作用の発達により同定する。攻撃後試験日のいずれかにおいて陽性のウイルス培養を有する対象者を、感染者とする。-８０℃に保存された標本中のウイルス力価を、ＨｅＬａ-１細胞のマイクロタイター・プレートでの連続的１０倍稀釈法での培養により測定する。
【０１９７】
攻撃ウイルスに対する抗体を、標準的方法 (Gwaltney et al., Diagnostic Procedures for Viral Rickettsial and Chlamydial Infections p. 579-614, American Public Health Association)を用いる血清中和力価で検出する。抗体試験のための血清標本を、スクリーニングの際、ウイルス攻撃の直前および２１日後(回復期)にも採取する。回復期の血清サンプルを急性期血清サンプルと比較したときに、攻撃ウイルスに対する抗体力価が少なくとも４倍上昇している対象者を、感染者とする。
【０１９８】
Ｄ．疾患の重篤度の評価
疾患の重篤度を前に記載(Turner et al., JAMA 281: 1797-804, 1999)のように調べる。症候スコアーをウイルス攻撃(出発点)の前に記録し、さらに毎日２回、約１２時間間隔で次ぎの６日間記録する。試験７日から１４日に各日の晩に１回症候スコアーを記録する。各検査時に最近の症候検査からの期間における下記８症候について最大の重篤度を判定するように対象者に求める：くしゃみ、鼻漏、鼻つまり、咽喉痛、せき、頭痛、吐き気、寒気。各症候について、なし、軽い、中程度、重いとの症候の重篤度の報告に対応して、重篤度スコアー０から３を割り付ける。症候が出発点で存在していると、報告された症候スコアーから出発点スコアーを引く。２つの各日の評価値の高い方を、各症候についての各日の症候スコアーとする。ウイルス攻撃後の最初の５日間(試験１-５日)についてのすべての各日症候スコアーを合計し、試験５日の晩に、すべての対象者に「風邪をひいていると思いますか」とたずねる。全症候スコアーが少なくとも６であり、かつ少なくとも３日間の鼻漏または風邪をひいているとの主観のいずれかをもつ対象者を、臨床的に風邪であるとする。
【０１９９】
排出された鼻分泌物の重量を１-７日間、予め計量した鼻紙の小さい包をすべての対象者に渡し、測定する。鼻紙を使用した後に、それを密封のプラスチック・バッグに保管する。毎朝、使用の鼻紙を、元の小さい包からの未使用の鼻紙と合わせて、収集し、計量する。
【０２００】
Ｅ．ＩＬ−８アッセイ
最近の研究によると、宿主炎症応答、特にインターロイキン８(ＩＬ-８)がライノウイルス感染による通常の風邪症候の病因に関与する。鼻洗浄におけるＩＬ-８の濃度を市販のＥＬＩＳＡ(R & D Systems, Minneapolis, Minn)で、前に記載(Turner et al., JAMA 281: 1797-804, 1999)のように測定する。
【０２０１】
Ｆ．安全性の評価
実施例８に記載の用量増加試験と同じ評価を、攻撃試験について行う。
Ｇ．統計解析
統計解析を、実施例８に記載の用量増加試験について記載した解析と同様に行う。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ベクター pSSPHuA2 を示す。
【図２】  図２は、キメラ ＩＣＡＭ 分子を示す。
【図３】  図３は、独立的に形質転換されたタバコ・カルス（tabacco calli）における免疫接着物の発現を示す。
【図４】  図４は、抗ＩＣＡＭ mＡbとの結合に対する、植物抽出物と溶性 ＩＣＡＭ−１との競合に関する酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ)による結果を示す。
【図５】  図５は、ヒト・ライノウイルスの殺ＨｅＬａ細胞作用を阻害する免疫接着物の能力を示すアッセイの結果を示す。
【図６】  図６は、１ｇの最終的免疫接着物をつくるのに必要な産生についての評価を示す。
【図７】  図７は、表２に揚げた各免疫グロブリン遺伝子およびタンパク質のコードおよびアミノ酸配列を示す。
【図８Ａ】  図８Ａは、プラスミドＰＳＳｐＩＣＡＭＨｕＡ２についてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列を示す。
【図８Ｂ】  図８Ｂは、ビーン・レグミン・シグナル・ペプチドについてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列を示す。
【図８Ｃ】  図８Ｃは、ｐＳＨｕＪのタンパク質コード領域についてのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す。
【図８Ｄ】  図８Ｄは、ｐＳＨｕＳＣのタンパク質コード領域についてのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す。
【図８Ｅ】  図８Ｅは、プラスミドｐＢＭＳＰ−１についてのヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｆ】  図８Ｆは、プラスミドｐＢＭＳＰ-１ｓｐＪＳＣ についてのヌクレオチド配列を示す。
【図９】  図９は、ＩＣＡＭ−１ およびヒト ＩｇＡ2 についてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および他のヌクレオチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ａ−３】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ−１】
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【図８Ｅ−２】
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【図８Ｆ−１】
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【図８Ｆ−２】
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【図８Ｆ−３】
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【図８Ｆ−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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