(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシ外皮から澱粉質及び蛋白質を除去した残部をアルカリ抽出し、さらにキシラナーゼで処理して得られた平均分子量が２万〜２０万のヘミセルロースの部分分解物を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍組成物。
【請求項２】
経口投与により腫瘍の増殖を抑制する作用を有する請求項１に記載の抗腫瘍組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トウモロコシ外皮を原料とする抗腫瘍組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、癌による死亡率は増加し続けており、癌の治療及びその症状を軽減するための薬剤や治療方法の研究が進められている。
【０００３】
従来より、癌の治療は、早期発見及び外科的切除が主要な方法とされているが、癌が外科的に切除し難い部位に発生した場合、原発部位以外の部位へ転移した場合又は浸潤が惹起された場合には、患部への放射線照射、抗腫瘍剤の定期的投与等による治療が行われている。
【０００４】
抗腫瘍剤としては、例えばインターロイキン、サイトカイン等の免疫賦活物質、アドリアマイシン、カルチノフィリン等の抗生物質、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモン剤等が知られている。
【０００５】
しかし、上記の抗腫瘍剤の多くは、抗腫瘍活性が強い反面、腫瘍細胞のみならず、正常細胞に対しても毒性を有しており、患者に投与した場合、嘔吐、悪心、食欲不振、脱毛等の副作用を引き起こす問題があった。
【０００６】
そのため、細胞毒性などの毒性が低く、副作用のない、天然物由来の抗腫瘍活性成分の検索も行われており、例えば特開２００１−６４１９０号公報には、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）に属する微生物を培養して得られる培養物を８０℃以上の通常許容される熱水抽出温度で抽出して得られる抽出物を有効成分として含有してなる水溶性抗腫瘍剤が開示されている。
【０００７】
また、特開２００１−５５３３０号公報には、フラボノイドの一種のモリン（morin）を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤が開示されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような天然物由来の抗腫瘍活性成分は、原料が高価であったり、抗腫瘍活性成分の調製に非常に手間がかかるなど、コスト的に高くなってしまうという問題があった。また、その抗腫瘍活性も充分満足できるものではなかった。
【０００９】
一方、食物繊維として飲食品等に幅広く利用されているヘミセルロースは、便秘改善作用、コレステロール上昇抑制作用、血糖値上昇抑制作用、肝機能改善作用、抗脂肪肝作用、腸内環境改善作用等の生理活性が知られているが、抗腫瘍活性については知られていない。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、安価に調製することができ、長期間使用しても安全性が高く、かつ充分な抗腫瘍活性を有するトウモロコシ外皮由来の成分を有効成分として含有する抗腫瘍組成物を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、トウモロコシ外皮から調製されたヘミセルロースの部分分解物が抗腫瘍活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の抗腫瘍組成物は、トウモロコシ外皮から澱粉質及び蛋白質を除去した残部をアルカリ抽出し、さらにキシラナーゼで処理して得られた平均分子量が２万〜２０万のヘミセルロースの部分分解物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１６】
本発明によれば、安価で、かつ長期間使用しても副作用のない安全な抗腫瘍組成物を提供できる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の抗腫瘍組成物の有効成分であるヘミセルロースの部分分解物は、トウモロコシ外皮から調製できる。
【００１８】
まず、トウモロコシ外皮からヘミセルロースを抽出する方法としては、例えばアルカリ又は酸による抽出、エクストルーダーやオートクレーブによる加圧、熱水抽出、セルラーゼ等の酵素剤を用いた抽出、あるいはこれらを適宜組み合わせた方法を採用することができる。本発明においては、より高純度のヘミセルロースを得るために、トウモロコシ外皮から澱粉質、蛋白質、更に必要に応じて脂質、無機質等を除去した残部をアルカリ抽出してヘミセルロースを調製する。
【００１９】
トウモロコシ外皮から澱粉質、蛋白質、更に必要に応じて脂質、無機質等を除去する方法としては、酵素処理、化学的処理、物理的処理のいずれを採用してもよく、あるいはこれらを適宜組み合わせてもよい。酵素処理は、例えばα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ等の澱粉分解酵素、プロテアーゼ等の蛋白分解酵素、リパーゼ等の脂質分解酵素、セルラーゼ等の繊維素分解酵素を、ｐＨ３〜９、温度３０〜１００℃の条件下に添加、作用させて処理することにより行われる。また、化学的処理は、例えばトウモロコシ外皮に鉱酸、有機酸の水溶液を添加し、ｐＨ２〜５の条件下で加熱するか、又は食品用界面活性剤を添加し、ｐＨ３〜８の条件下で熱処理することにより行われる。更に物理的処理は、例えばトウモロコシ外皮をホモゲナイザー、ハンマーミル等の粉砕機で粉砕した後、篩別することにより行われる。
【００２０】
また、ヘミセルロースを部分分解する方法としては、繊維素分解酵素、例えば市販のセルラーゼ、キシラナーゼ等で処理する方法が挙げられる。本発明においては、キシラナーゼで処理する。
【００２１】
本発明で用いられるヘミセルロースの部分分解物は、具体的には以下のようにして調製することができる。
【００２２】
好ましくは上記の前処理をしたトウモロコシ外皮５〜２０質量部に、水８０〜９５質量部を添加し、アルカリ化合物を添加してｐＨ１０〜１３に調整し、８０〜１４０℃で０．５〜１０時間撹拌混合して、ヘミセルロースを抽出する。上記アルカリ化合物としては、特に制限はなく、例えば水酸化カルシウムや水酸化ナトリウムが挙げられる。なお、アルカリ化合物は予め水溶液にして加えてもよい。
【００２３】
次いで、この抽出液を清澄濾過した後、ｐＨ調整し、５０〜６０℃の温度下にキシラナーゼを添加して反応させる。キシラナーゼの添加量は、抽出物の固形分１ｇ当たりに対して、０．０００１〜１０単位程度が好ましく、反応時間は３〜９６時間程度が好ましい。
【００２４】
なお、キシラナーゼの力価の測定は、トウモロコシ外皮からアルカリ抽出して得たヘミセルロースを基質として、ｐＨ７、６０℃の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とすることにより行った。
【００２５】
また、キシラナーゼとしては、糖化型のものより、液化型のものが好ましく、カビ起源のものでも、バクテリア起源のものでも使用できるが、バクテリア起源のキシラナーゼの方が純度が高いので好ましい。特に好ましい例としては、特公昭５０−１３３５７号公報に記載されたアルカリ側に至適ｐＨを有するアルカリキシラナーゼが挙げられる。
【００２６】
次いで、加熱等により酵素を失活させた後、反応液を、脱色、脱塩処理し、濃縮、あるいはさらに乾燥することにより、ヘミセルロースの部分分解物を得ることができる。
【００２７】
また、上記のようにしてアルカリ抽出したヘミセルロース抽出液を有機酸や無機酸等で中和し、中和によって沈殿した蛋白質を遠心分離等の手段で分離除去した後、その上澄液を必要に応じて更に透析、イオン交換樹脂処理、イオン交換膜処理、限外濾過膜処理、アルコール精製、濾剤処理等を単独又は適宜組み合わせて行ないヘミセルロースを精製し、このヘミセルロースを３〜３０質量％含有する溶液を調製して、上記と同様にして酵素反応を行ない、酵素を失活させた後、遠心分離等により固液分離し、上澄液を濃縮、乾燥することにより、より純度の高いヘミセルロースの部分分解物を得ることができる。
【００２８】
なお、上記のような方法でトウモロコシ外皮から調製されたヘミセルロースの部分分解物は、「セルエース」（商品名、日本食品化工株式会社製）として市販されている。
【００２９】
本発明において、トウモロコシ外皮由来ヘミセルロースの部分分解物は、その平均分子量（質量平均分子量）が２万〜２０万である。２万〜１０万であることがより好ましく、２万〜４万であることが最も好ましい。このような平均分子量を有するヘミセルロースの部分分解物は、その５質量％水溶液の粘度が３〜２０ｃｐｓ（Ｂ型粘度計、６０ｒｐｍ、２５℃）と低粘度であり、飲食品等の原料に添加したときに、飲食品等の食感や風味を良好に保つことができる。ヘミセルロースの部分分解物の平均分子量が２０万を超えると、粘度が高くなりすぎて飲食品の原料等に添加しにくくなり、２万未満であると、食物繊維としての生理活性効果が失われる虞れがあるため好ましくない。
【００３０】
本発明の抗腫瘍組成物は上記ヘミセルロースの部分分解物を主成分として含有し、例えば上記ヘミセルロースの部分分解物を含む水溶液、濃縮液あるいは乾燥粉末などとして製品化することができる。なお、上記ヘミセルロースの部分分解物の他に、除去しきれなかった澱粉質、蛋白質、若干のリグニン、セルロース、灰分等を含有していてもよい。
【００３１】
本発明の抗腫瘍組成物は、乾燥粉末とした場合でも容易に水に溶けるので、そのまま健康飲食品、医薬品として利用可能である。また、飲食品に少量添加することにより、飲食品の風味、食感を害することなく抗腫瘍活性を付与することができる。
【００３２】
本発明の抗腫瘍組成物を飲食品に添加する場合、飲食品の食感を害することなく抗腫瘍活性を期待できる添加量としては、０．１〜１０質量％が好ましい。また、本発明の抗腫瘍組成物の摂取量は、抗腫瘍活性を発現するためには体重６０ｋｇの成人男性で１〜１０ｇ／日が好ましく、３〜５ｇ／日が特に好ましい。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例
トウモロコシ外皮１００質量部に、水１０００質量部、水酸化カルシウム１質量部を加え、８５℃で３時間加熱した。この反応液を６０℃まで冷却した後、硫酸を添加してｐＨ７に調整した。
【００３４】
そして、特公昭５０−１３３５７号公報に記載された方法で調製したアルカリキシラナーゼ（商品名「セルザイム」、日本食品化工株式会社製）を、この反応液の固形分１ｇ当たり０．０１単位添加して、６０℃で４８時間反応させた。酵素反応終了後、９０℃で３０分間加熱して酵素を失活させた後、濾過して濾液を回収し、さらに清澄濾過、脱色、脱塩を行ない精製した後、スプレードライヤーで噴霧乾燥してトウモロコシ外皮由来ヘミセルロースの部分分解物（粉末）を得た。
【００３５】
試験例
Colon26結腸癌担癌マウスを用いて、トウモロコシ外皮由来ヘミセルロースの部分分解物の抗腫瘍活性について検討した。
【００３６】
・Colon26担癌マウスの作製
in vivoで継代移植を継続しているColon26担癌マウスから腫瘍を摘出し、癌細胞を分離して使用した。具体的には、皮下移植２１日目のColon26担癌マウスから腫瘍部を摘出した。そして、滅菌生理食塩水２０ｍｌを加えたシャーレに載せた金属メッシュ上で注射筒の内筒ゴム部を用いて摘出した腫瘍部を磨り潰し、細胞を分離した。分離した細胞をシャーレ内でピペットを用いて懸濁した後、遠心分離（７００ｒｐｍ、５分間）して細胞を回収し、再度滅菌生理食塩水５ｍｌを加えて懸濁して、０．０４％トリパンブルーを用いて細胞総数を測定した。その後、遠心分離（７００ｒｐｍ、５分間）して細胞を回収し、癌細胞数１×１０5／１００μｌとなるように滅菌生理食塩水を加えて癌細胞懸濁液を調製した。
【００３７】
そして、６週齢の雄マウス（BALB/c）２０匹（日本クレア（株）より購入）に、上記癌細胞懸濁液（癌細胞数１×１０5個／１００μｌ／匹）を腹部皮下に移植し、Colon26担癌マウスを作製した。
【００３８】
上記のようにして作製したColon26担癌マウスを２群（１群１０匹）に分けて、試験群には胃ゾンデを用いて実施例１で調製したヘミセルロースの部分分解物を蒸留水で溶解したものを２１日間連続経口投与（ヘミセルロースの部分分解物５０ｍｇ／ｋｇ体重／日）し、コントロール群には蒸留水を同様にして投与した。また、試験期間中は、設定温湿度：２４±１℃、５５±５％、照明時間：１２時間自動点灯・消灯の環境で飼育し、摂餌及び摂水は自由とした。
【００３９】
・皮下腫瘍体積の測定
試験期間中、７、１４、２１日目にノギスを用いて皮下腫瘍部の長径（ｍｍ）及び短径（ｍｍ）を測定し、下記の式により皮下腫瘍の体積を求めた。
【００４０】
【数１】
腫瘍体積（ｍｍ3）＝腫瘍部の長径×腫瘍部の短径2×０．４
【００４１】
その結果を表１及び図１に示す。なお、測定結果は、平均値±標準誤差で表し、有意差検定はStudent's T-Testを用いた（以下、同様）。
【００４２】
【表１】
0004869492.tif 000002
【００４３】
表１及び図１から、試験群は、コントロール群に比べて各測定時における腫瘍体積が小さく、癌細胞移植後の早期における癌細胞の生着及び癌細胞の増殖を抑制していることが分かる。
【００４４】
また、試験対象物質投与終了の翌日（２２日目）に、頚椎脱臼によりマウスを屠殺した後、脾臓を摘出した。そして、摘出した脾臓を、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０培地５ｍｌを加えたペトリ皿中でスライドグラス２枚のすりガラス部分で挟んで磨り潰し、さらに金属メッシュを通して細胞懸濁液を得た。この懸濁液を遠心分離（１６００ｒｐｍ、５℃、２分間）して脾臓細胞を回収し、再度１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁して脾臓細胞懸濁液を調製した。
【００４５】
・ＮＫ活性の測定
上記脾臓細胞懸濁液に１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加して、脾臓細胞数（Ｅ）が５０×１０3個／ｍｌとなるように調整した。また、51Ｃｒラベルした標的細胞ＹＡＣ−１（BIOSOURCE社製）の細胞数（Ｔ）を１×１０3個／ｍｌとなるように調整し、両細胞をＥ：Ｔ比５０：１で混合して４時間培養し、上清中に遊離した51ＣｒからＮＫ活性を測定した。その結果を表２及び図２に示す。
【００４６】
【表２】
0004869492.tif 000003
【００４７】
表２及び図２から、試験群は、コントロール群に比べて有意（**Ｐ＜０．０１）にＮＫ活性が上昇していることが分かる。
【００４８】
・サイトカイン産生能の測定
上記細胞懸濁液に、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加して細胞数が２×１０5個／ｍｌとなるように調整した。この細胞懸濁液を２４孔のプレートに１ｍｌ／孔ずつ分注し、さらにconA及びLPSをそれぞれ１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で４８時間培養した。そして、培養上清中のＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度をそれぞれ測定した。その結果を表３及び図３〜５に示す。なお、上記サイトカインの測定は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ測定用キット「cytoscreenキット」（商品名、BIOSOURCE社製）を用いて行なった。
【００４９】
【表３】
0004869492.tif 000004
【００５０】
表３及び図３〜５から、試験群は、コントロール群に比べてＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度が高く、各サイトカインの産生能が上昇していることが分かる。特に、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γについては、有意差（**ｐ＜０．０１）が認められた。
【００５１】
以上の結果から、トウモロコシ外皮由来ヘミセルロースの部分分解物を投与することにより、腫瘍の増殖を抑制できることが示唆された。その作用機序としては、トウモロコシ外皮由来ヘミセルロースの部分分解物を投与することにより、ＩＬ−２産生能が促進され、ＮＫ活性の上昇、さらに活性化されたＮＫ細胞からＩＦＮ−γを産生させ、また、炎症性のサイトカインであるＴＮＦ−αの産生を促進することによるものと考えられる。
【００５２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、トウモロコシ外皮由来の安価で、かつ長期間使用しても副作用がなく、経口摂取することにより腫瘍の増殖を抑制できる抗腫瘍組成物を提供できる。
【００５３】
本発明の抗腫瘍組成物は、医薬品、飲食品、あるいはそれらへの添加物として、安心して長期にわたり継続して摂取することができ、さらに、ヘミセルロースの部分分解物は低粘度であるため、飲食品等の原料に添加したときに飲食品等の食感や風味を良好に保つことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  皮下腫瘍体積の変化を示す図である。
【図２】  ＮＫ活性の測定結果を示す図である。
【図３】  ＩＬ−２の濃度測定の結果を示す図である。
【図４】  ＩＦＮ−γの濃度測定の結果を示す図である。
【図５】  ＴＮＦ−αの濃度測定の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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