(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉酸リセプターベータ(FR-β)に対する単クローン抗体であって、
配列番号１に示される重鎖可変領域および配列番号２に示される軽鎖可変領域を含んでなり、
マクロファージ上に発現する葉酸リセプターベータ(FR-β)と反応し、ＫＢ癌細胞上に発現する葉酸リセプターアルファ(FR-α)と反応しない、単クローン抗体。
【請求項２】
IgG型である請求項１に記載のFR-β単クローン抗体。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のFR-β単クローン抗体とトキシンとを結合したFR-β抗体イムノトキシン。
【請求項４】
前記トキシンが、リシンA鎖(ricin A chain)、 脱糖鎖リシンA鎖 (deglycosylated ricin A chain)、 リボソーム不活化蛋白(a ribosome inactivating protein)、 アルファーサルシン(alpha-sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレース(ribonuclease)、エピポドフィロトキシン(epipodophyllotoxin)、 ジフテリア  トキシン(diphtheria toxin)およびシュドモナス  エクソトキシン(Pseudomonas exotoxin)からなる群から選択された、請求項３に記載のFR-β抗体イムノトキシン。
【請求項５】
酵素、サイトカイン、アイソトープ、化学療法剤からなる群から選ばれた少なくとも１つの生物学的または化学的に活性のある分子と、請求項１または請求項２に記載のFR-β単クローン抗体との結合物。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載のFR-β単クローン抗体と化学療法剤とを含むリポソーム。
【請求項７】
請求項３または４に記載のFR-β抗体イムノトキシン、請求項５に記載の結合物、請求項６に記載のリポソームからなる群から選ばれた少なくとも１つを有効成分とする、医薬組成物。
【請求項８】
請請求項３または４に記載のFR-β抗体イムノトキシン、請求項５に記載の結合物、請求項６に記載のリポソームからなる群から選ばれた少なくとも１つを有効成分とする、マクロファージが病態の中心となる疾患の治療剤。
【請求項９】
前記マクロファージが病態の中心となる疾患が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、マクロファージ活性化症候群、敗血症ショックからなる群から選ばれた疾患である、請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載の治療剤の投与形態が関節注入剤である、関節リウマチまたは若年性関節リウマチの治療剤。
【請求項１１】
請求項３または４に記載のFR-β抗体イムノトキシン、請求項５に記載の結合物、請求項６に記載のリポソームから選ばれた少なくとも１つを有効成分とする、白血病の治療剤。
【請求項１２】
前記白血病が急性骨髄性白血病である、請求項１１に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）発現細胞に対して特異的なイムノトキシンのマクロファージ活性化を病態の中心とする疾患やＦＲ−β発現白血病の治療用組成物および治療方法に関する。より詳しくはＦＲ−β抗原に対する単クローン抗体にトキシンを結合させたイムノトキシンの関節リウマチ、若年性関節リウマチ、マクロファージ活性化症候群，敗血症性ショック、急性骨髄性白血病の治療開発に関するものである。
【背景技術】単クローン抗体について：
単クローン抗体は、ケラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とマイルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の方法またはその変形方法を用いて製造される。（ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．１９７５  Ａｕｇ  ７；２５６（５５１７）：４９５−７）（非特許文献１）
トキシンについて：
細菌由来のトキシンであるシュドモナス  エクソトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）（ＰＥ）はアミノ酸配列２７９と２８０が切断されることにより活性型となる。（Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｒｇ２７９  ａｎｄ  Ｇｌｙ２８０  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｗｈｉｃｈ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７（３５）：２５３  ９６−４０１）（非特許文献１）
遺伝子改変ＰＥは細胞表面に結合するＩａドメインが欠損し、アミノ酸配列２８０から始まる。また、Ｃ末端部位に細胞障害能を増加させるため、ＫＤＥＬ，ＲＥＤＬＫが付加されている。（Ｋｒｅｉｔｍａｎ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ−ｂａｓｅｄ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００１  ２（９）：１２８２−９３）（非特許文献３）
また、ＰＥの他様々な異なる１型リボソームを含むイムノトキシン（モモルデイン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、サポリン、ブリオデイン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、及びボウガニン）を使用した前臨床研究の報告がある。（Ｐａｓｔａｎ  Ｉ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ：ａ  ｓｈｏｒｔ  ｈｉｓｔｏｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３；５２（５）：３３８−４１）（非特許文献４）、（Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３  Ｍａｙ；５２（５）：３２８−３７）（非特許文献５）、Ｍｉｌｅｎｉｃ  ＤＥ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ：ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．２００２；８（１９）：１７４９−６４）（非特許文献６）
イムノトキシンについて：
これまでリコンビナントＰＥを使用した多数のイムノトキシンが開示されている。
米国特許第６．７０３．４８８（特許文献１）の請求項６にＩＬ−１３リセプター抗体とトキシンの結合物作成について、実施例１にＩＬ−１３リセプター抗体の遺伝子改変ＰＥ４０とのリコンビナントトキシンの作成の記載がある。
米国特許第６．７０３．０２０（特許文献２）の請求項１６にＶＥＧＦリセプター抗体とＰＥの結合物作成の記載がある。
米国特許第６．６９６．０６４（特許文献３）の請求項６にトランスフェリンリセプター抗体と遺伝子改変ＰＥ３８の結合物作成の記載がある。
米国特許第６．６８９．８６９（特許文献４）の請求項２にＣＤ１８抗体と酵素抑制物との結合物作成について、明細書にＣＤ１８抗体とＰＥの結合物作成の記載がある。
米国特許第６．４１７．３３７（特許文献５）の請求項５にＣＥＡ抗体のトキシンの結合物作成について、明細書においてトキシンにはＰＥが含まれる記載がある。
米国特許第６．３９５．２７６（特許文献６）の請求項１にＣＤ２２抗体とトキシンの結合物作成について、実施例５において、ＣＤ２２抗体遺伝子改変ＰＥのダウデー（Ｄａｕｄｉ）細胞移植ＳＣＩＤマウスの生存延長効果についての記載がある。
米国特許第６．３４８．５８１（特許文献７）の請求項４にＴＡＧ−７２抗体とトキシンの結合物作成について、記述においてトキシンにＰＥが含まれる記載がある。
米国特許第６．３４６．２４８（特許文献８）の請求項１にＣＤ８６抗体とトキシンの結合物について、記述においてトキシンにＰＥが含まれる記載がある。
米国特許第６．３１９．８９１（特許文献９）の請求項７にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）抗体とＰＥの結合物作成の記載がある。
米国特許第６．３１２．６９４（特許文献１０）の請求項３１にアミノフォスフォリピッド（Ａｍｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）抗体とＰＥの結合物作成についての記載がある。
米国特許第６．２８７．５６２（特許文献１１）の請求項４にルイスＹ（Ｌｅｗｉｓ  Ｙ）抗体とＰＥの結合物作成について、実施例７にルイスＹ（Ｌｅｗｉｓ  Ｙ）抗体と遺伝子改変ＰＥ３８の結合物あるいはその単鎖リコンビナントイムノトキシンが細胞株の増殖を抑制した記載がある。
米国特許第６．２６７．９６０（特許文献１２）の請求項４にプロスタータ幹細胞抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ）抗体とＰＥ、あるいは遺伝子改変ＰＥ４０の結合物作成の記載がある。
米国特許第６．０７４．６４４（特許文献１３）の請求項１に遺伝子改変ＰＥ（１−２７９アミノ酸残基、ドメインＩｂの大半を欠く）と抗体成分ＶＨあるいはＶＬからなる蛋白と抗体成分ＶＬあるいはＶＨからなる蛋白のＳ−Ｓ結合による２重鎖リコンビナントイムノトキシンの作成に関して、請求項３にこれらの抗体成分はＰＥとＢ１，Ｂ３，Ｂ５，ｅ２３，ＢＲ９６，Ｔａｃ，ＲＦＢ４，ＨＢ２１抗体成分からなる記載がある。
米国特許第６．０３３．８７６（特許文献１４）の請求項４にＣＤ３０抗体とトキシンの結合物作成について、記述でトキシンにＰＥ３８、ＰＥ４０が含む記載がある。
米国特許第５９８０８９５（特許文献１５）の請求項１に抗体成分ＶＨと遺伝子改変ＰＥ（１−２７９アミノ酸残基、ドメインＩｂの大半を欠く）の結合物と抗体成分ＶＬの結合物をＳ−Ｓで結合させた２重鎖リコンビナントイムノトキシン作成について、請求項３においてこのリコンビナントイムノトキシンのＶＨ，ＶＬはＢ１，Ｂ３，Ｂ５，ｅ２３，ＢＲ９６，Ｔａｃ，ＲＦＢ４，ＨＢ２１抗体由来である記載がある。
米国特許第５．８４０．８５４（特許文献１６）の請求項２１にＧＡ７３３−１抗体とトキシンの結合物作成について、記述でトキシンにＰＥが含まれる記載がある。
米国特許第５．８１７．３１３（特許文献１７）の請求項３にＫ１（ＣＡ１２５）抗体とトキシンの結合物作成について、表７においてＫ１（ＣＡ１２５）抗体ＰＥのＯＶＣＡＲ−３細胞への結合活性についての記載がある。
米国特許第５．７７６．４２７（特許文献１８）の請求項１８にＣＤ５，ＣＤ８，ＣＤ１１／ＣＤ１８，ＣＤ１５，ＣＤ３２，ＣＤ４４，ＣＤ４５，ＣＤ６４，ＣＤ２５，ＣＤ３０，ＣＤ５４，ＣＤ７１，ＨＭＦＧ−２，ＳＭ−３，Ｂ７２．３，ＰＲ５ｃ５，ＲＲ４０２，２７，ＯＶ−ＴＬ３，Ｍｏｖ１８，Ｐ１８５（ＨＥＲ２）抗体とＰＥの結合物作成についての記載がある。
米国特許第５．７５９．５４６（特許文献１９）の請求項１１にＣＤ４抗体とトキシンの結合物の記述において、トキシンにＰＥが含まれることの記載がある。
米国特許第５．５０６．３４３（特許文献２０）の請求項１２に脱糖鎖（Ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＤＦ３抗体とトキシンの結合物作成について、記述においてトキシンにＰＥが含まれる記載がある。
米国特許第５．０４５．４５１（特許文献２１）の請求項１にＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ５，ＣＤ７，ＣＤ８，グリコフォリン（Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ），Ｔｈｙ１．１，ＣＤ２２抗体とトキシンの結合物作成について、記述においてトキシンにＰＥが含まれる記載がある。
米国特許第４．８０６．４９４（特許文献２２）の請求項２に卵巣癌（ＯＶＢ−３）抗体とＰＥの結合物作成の記載がある。
米国特許第４．５４５．９８５（特許文献２３）の請求項３にＴＡＣ、トランスフェリンリセプター抗体とＰＥとの結合物作成の記載がある。
ヨーロッパ特許ＷＯ９９６４０７３（特許文献２４）の請求項２にＨＩＶＧＰ１２０抗体と遺伝子改変ＰＥの結合物作成の記載がある。
ヨーロッパ特許第ＮＺ３３６５７６（特許文献２５）の要約にＥＧＰ２，ＭＵＣ１，ＭＵＣ２，ＭＵＣ３抗体とＰＥの結合物作成の記載がある。
ヨーロッパ特許ＣＮ１３３００８１（特許文献２６）の要約にＨＩＶ抗体とリコンビナントＰＥの結合物作成の記載がある。
ヨーロッパ特許第ＷＯ９７１３５２９（特許文献２７）の請求項１にＰＥ（１−２７９のアミノ酸残基を欠損）遺伝子と抗体ＶＨ遺伝子から生成された蛋白と抗体ＶＨ蛋白をＳ−Ｓ結合させた２重鎖リコンビナントトキシンの作成について、請求項に抗体はＢ１，Ｂ３，Ｂ５，ｅ２３，ＢＲ９６，Ｔａｃ，ＨＢ２１抗体である記載がある。
ヨーロッパ特許第ＷＯ９８４１６４１（特許文献２８）の請求項３７にＣＤ２２抗体ＶＨとＰＥ３８遺伝子から作成された蛋白とＣＤ２２抗体ＶＬ蛋白をＳ−Ｓ結合させた２重鎖リコンビナントイムノトキシンの作成法と実施例８にＣＤ２２発現ヒトＢ細胞腫を移植したマウスにおけるそのリコンビナントイムノトキシンの抗腫瘍効果の記載がある。
ヨーロッパ特許第ＷＯ９４１３３１６（特許文献２９）の請求項２１に細胞への結合を弱くするためドメイン１に変異を導入、抗体との結合のためドメイン２，３にチスチン（ｃｙｓｔｅｉｎ）残基を付加した遺伝子改変ＰＥと抗体の結合物作成の記載がある。
ヨーロッパ特許第ＥＰ０５８３７９４（特許文献３０）の請求項６にドメイン１Ａの細胞結合部位に変異を導入し、ドメインＩＩのほとんどあるいは１部を欠損させた遺伝子改変ＰＥと抗体の結合物作成の記載がある。
遺伝子改変抗体について：
さらに、抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の抗原結合部位とトキシンのＤＮＡを遺伝子操作にて結合させ、大腸菌内で蛋白を産生させることにより、単鎖リコンビナントイムノトキシンを作成することができる。（Ｈａａｓａｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳＳ（ｄｓＦｖ）ＰＥ３８  ａｎｄ  ＳＳ１（ｄｓＦｖ）ＰＥ３８，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２  Ｎｏｖ；８（１１）：３５２０−６）（非特許文献７）
通常、単鎖リコンビナントイムノトキシンはＨ鎖とＬ鎖の間にアミノ酸１５程度を翻訳する介在配列を含む。（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆｖ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８  Ｄｅｃ；１６（１２）：５１３−２０）（非特許文献８）
さらに、Ｈ鎖あるいはＬ鎖抗原結合部位ＤＮＡとトキシンＤＮＡを遺伝子操作にて結合させ、大腸菌内で蛋白を作成し、別にＬ鎖あるいはＨ鎖抗原結合部位ＤＮＡから蛋白を作成し、これらの蛋白をＳ−Ｓ結合にて結合させた２重鎖リコンビナントイムノトキシンの作製がある。（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９３；９０（１６）：７５３８−４２）（非特許文献９）
キメラ化抗体、ヒト化抗体について：
マウス免疫グロブリンの抗原結合部位（Ｆａｂ部分）ＤＮＡとヒト由来の免疫グロブリンＦｃ部分ＤＮＡを遺伝子操作にて結合させ、大腸菌に産生させたキメラ抗体はヒトにおいて、マウス抗体部分に対する抗体の産生が少なく、臨床投与に有用である記載がある。（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ）：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３；２２（４７）：７３５９−６８）（非特許文献１０）
さらに、マウスＦａｂ部分のＣＤＲ１，２、３でヒト免疫グロブリンのＣＤＲ１、２、３をおきかえたヒト化抗体はマウス抗体部分に対する抗体の産生が少なく、臨床投与に有用である記載がある。（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４；２６（１）：３９−６０）（非特許文献１１）
リポソームについて：
薬剤の輸送システムとして、脂質膜で薬剤を包むリポソームの投与が試みられている。さらに、薬剤の特異的な細胞輸送のために、リポソーム内に薬剤に加えて細胞に特異的に結合する抗体も含まれる。（Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｆｏｌａｔｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｇｒａｆｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１９９９；１０（２）：２８９−９８）（非特許文献１２）
葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）を介したドラッグデリバリーシステムは葉酸リセプターアルファ（ＦＲ−α）の場合と同様に有用であることが推測され、葉酸リポソームにモモルデン、サポリン等の毒素や抗癌剤をもちいたインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の研究がある。（Ｐａｎ  ＸＱ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ａ  ＫＢ  ｏｒａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００３  Ｍａｒ；２０（３）：４１７−２２）（非特許文献１３）、（Ｓｕｄｉｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０００  Ｍａｒ  ３０；４１（２）：１４７−６２）（非特許文献１４）
関節リウマチについて：
本発明者らは活性化されたマクロファージや関節リウマチ滑膜マクロファージにおいて葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）の発現増強を報告した。（Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９９９；４２（８）：１６０９−１６）（非特許文献１５）
ＲＡ滑膜炎の治療に効果的な薬剤である金剤やメソトレキセートの作用機序として、単球、マクロファージの遊走・活性化を抑制する作用の報告がある。
（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｒｉｓｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｏｌｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｏｎ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００３  Ｓｅｐ；２（３）：２１６−２３．）（非特許文献１６）、（Ｂｏｎｄｅｓｏｎ  Ｊ．Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎｔｉｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；２９（２）：１２７−５０）（非特許文献１７）
最近、抗ＴＮＦ−α抗体療法がＲＡに著効を示す報告あるが、その作用機構としてマクロファージ細胞膜表面のＴＮＦ−αを介した抗体依存性細胞傷害機構が推測される。（Ｍａｉｎｉ  ＲＮ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｗ  ｄｏｅｓ  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｗｏｒｋ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ？Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．２００２；４  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２２−８．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｍａｒ  ２７）（非特許文献１８）
また、ラット実験的関節炎において、関節炎局所の葉酸の取り込みが増加しており、この取り込みは葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）発現細胞によることが推測されている。（Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｌａｔｅ−ｔａｒｇｅｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｊｕｖａｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００２  Ｊｕｌ．４６（７）：１９４７−５５）（非特許文献１９）、（Ｐａｕｌｏｓ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉ  Ｒｅｖ  ２００４  Ａｐｒ：５６（８）：１２０５−１７）（非特許文献２０）
本発明者らは、葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）に特異性のある葉酸拮抗剤
Ｌｙ３０９８８７がマウス実験的関節炎を抑制することを報告した。（Ｎａｇａｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｙ３０９８８７，ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２００３  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ：２１（６）：７１９−２５）（非特許文献２１）
ＲＡの治療を目的としたイムノトキシンとして、すでにヒトへの投与がなされたものに、ＩＬ−２デニリューキン  ヂフテトクスがある。（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ  ｄｉｆｔｉｔｏｘ），（Ｓｔｒａｎｄ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ  ５  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９３  Ｓｕｐｐｌ  ８：Ｓ１６１−３）（非特許文献２２）
抗ＣＤ５抗体リシンＡ（ｒｉｃｉｎＡ）（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ５  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｏ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９４；２１（４）：５９６−６０４）（非特許文献２３）
また関節腔内に存在するマクロファージ傷害を目的に抗ＣＤ６４抗体リシンＡ（ｒｉｃｉｎ  Ａ）（ｖａｎ  Ｒｏｏｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  ａｎ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００３；４８（５）：１２２９−３８）（非特許文献２４）の報告がある。
その他、開示として、米国特許第６．６４５．４９５（特許文献３１）の請求項７にＣＤ４０Ｌ抗体ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）作成について、実施例４において活性化Ｔ細胞の増殖抑制効果が記載されている。
米国特許第６．３４６．２４８（特許文献３２）の請求項２にＣＤ８０抗体ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ＣＤ８６抗体（ｇｅｌｏｎｉｎ）の自己免疫疾患への適用が記載されている。
マクロファージ活性化症候群について：
マクロファージ活性化症候群では、マクロファージが異常に活性化されたことが病態の中心と考えられる。（Ｒａｖｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００２  Ｓ；１４（５）：５４８−５２）（非特許文献２５）
敗血症性ショックについて：
敗血症性ショックは一般的にグラム陰性バクテリア感染の結果として認識されているが、グラム陽性微生物からもおそらく真菌、ウイルス及び寄生虫によっても結果として生じ得ることが現在明らかである。微生物自体、その構成物又は産物はホスト細胞、特にマクロファージを誘発し、ＴＮＦ−αのような炎症性媒介物を放出し、それにより悪液質及び敗血症性ショックを導く出来事のカスケードを開始する。（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９６  Ｏｃｔ；１９５（４−５）：６５５−９）（非特許文献２６）
急性骨髄性白血病について：
葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）の発現は正常な細胞ではほとんどなく、急性骨髄性白血病の一部でＦＲ−βの発現が亢進していることが報告された。（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ＣＤ３４（＋）ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．１９９９  Ｊｕｎ  １；９３（１１）：３９４０−８）（非特許文献２７）
ヨーロッパ特許第ＷＯ０３０７２０９１（特許文献３３）の請求項１に、骨髄性白血病細胞のＦＲ−β発現をレチノイン酸で亢進させ、葉酸、薬剤を含むリポソームについて、明細書に急性骨髄性白血病の７０％においてＦＲ−βの発現がみられ、インビボ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において葉酸リポソームに薬剤を加えた組成物は骨髄性白血病細胞の増殖を抑制したことが記載されている。急性骨髄性白血病の治療のためのイムノトキシンとしては２０００年にヒト型抗ＣＤ３３抗体カルケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）がＦＤＡで承認され、良い治療効果をあげている。（Ｇｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３  Ｎｏｖ  １５；９８（１０）：２０９５−１０４）（非特許文献２８）
その他、抗ＣＤ３０抗体ヂアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）が報告されている。（Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−ＣＤ３０  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｄｉａｎｔｈｉｎ  ３０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９９５；４０（２）：１０９−１４）（非特許文献２９）
抗ＣＤ３３抗体ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）が報告されている。（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍ１９５−ｇｅｌｏｎｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９６；１０（２）：３２１−６）。（非特許文献３０）
抗ＣＤ３３リシン（ｒｉｃｉｎ）が報告されている。（Ｒｕｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ３３  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｒｉｃｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｈｕｍａｎ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９２；２０（４）：４４２−８）（非特許文献３１）
抗ＣＤ６４抗体ＰＥが報告されている。（Ｔｕｒ．Ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＣＤ６４−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３（２３）：８４１４−９）（非特許文献３２）
抗ＣＤ６４抗体リシン（ｒｉｃｉｎ）が報告されている。（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ６４−ｒｉｃｉｎ  ａ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００１；１０（１）：９５−１０５）（非特許文献３３）
抗ＨＩＭ６抗体シトシン  アラビノシドが報告されている（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＨＩＭ６）ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ］Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｋｅ  Ｘｕｅ  Ｙｕａｎ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．１９９３；１５（４）：２８６−９０）（非特許文献３４）。
ＧＭ−ＣＳＦ  ＰＥが報告されている。（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＧＭ−ＣＳＦ−ＰＥ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｉｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７；７５（３）：２８９−９４）（非特許文献３５）
ＧＭ−ＣＳＦジフテリアトキシンが報告されている。（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｔｏｘｉｎ）（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．ＤＴ３８８−ＧＭ−ＣＳＦ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｈｏｓｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ａ  ＳＣＩＤ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９；１３（４）：６２９−３３）（非特許文献３６）
ＩＬ−３ジフテリアトキシンが報告されている。（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａｔｏｘｉｎ）（Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＤＴ（３８８）ＩＬ３）ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００３；１７（１）：１５５−９）（非特許文献３７）
ＩＬ−９  ＰＥが報告されている。（Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ−Ａ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９（ｒｈＩＬ−９−ＥＴＡ’）ｓｈｏｗｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ＩＬ−９−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９９６；２（３）：１３９−４６）（非特許文献３８）のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ），エクソビボ（ｅｘｏ  ｖｉｖｏ）での効果が報告されている。
文献リスト：
【特許文献１】米国特許第６．７０３．４８８号公報
【特許文献２】米国特許第６．７０３．０２０号公報
【特許文献３】米国特許第６．６９６．０６４号公報
【特許文献４】米国特許第６．６８９．８６９号公報
【特許文献５】米国特許第６．４１７．３３７号公報
【特許文献６】米国特許第６．３９５．２７６号公報
【特許文献７】米国特許第６．３４８．５８１号公報
【特許文献８】米国特許第６．３４６．２４８号公報
【特許文献９】米国特許第６．３１９．８９１号公報
【特許文献１０】米国特許第６．３１２．６９４号公報
【特許文献１１】米国特許第６．２８７．５６２号公報
【特許文献１２】米国特許第６．２６７．９６０号公報
【特許文献１３】米国特許第６．０７４．６４４号公報
【特許文献１４】米国特許第６．０３３．８７６号公報
【特許文献１５】米国特許第５．９８０８９５号公報
【特許文献１６】米国特許第５．８４０．８５４号公報
【特許文献１７】米国特許第５．８１７．３１３号公報
【特許文献１８】米国特許第５．７７６．４２７号公報
【特許文献１９】米国特許第５．７５９．５４６号公報
【特許文献２０】米国特許第５．５０６．３４３号公報
【特許文献２１】米国特許第５．０４５．４５１号公報
【特許文献２２】米国特許第４．８０６．４９４号公報
【特許文献２３】米国特許第４．５４５．９８５号公報
【特許文献２４】ヨーロッパ特許第ＷＯ９９６４０７３号公報
【特許文献２５】ヨーロッパ特許第ＮＺ３３６５７６号公報
【特許文献２６】ヨーロッパ特許第ＣＮ１３３００８１号公報
【特許文献２７】ヨーロッパ特許第ＷＯ９７１３５２９号公報
【特許文献２８】ヨーロッパ特許第ＷＯ９８４１６４１号公報
【特許文献２９】ヨーロッパ特許第ＷＯ９４１３３１６号公報
【特許文献３０】ヨーロッパ特許第ＥＰ０５８３７９４号公報
【特許文献３１】米国特許第６．６４５．４９５号公報
【特許文献３２】米国特許第６．３４６．２４８号公報
【特許文献３３】ヨーロッパ特許第ＷＯ０３０７２０９１号公報
【非特許文献１】ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．１９７５  Ａｕｇ  ７；２５６（５５１７）：４９５−７．
【非特許文献２】（３５）Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｒｇ２７９  ａｎｄ  Ｇｌｙ２８０  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｗｈｉｃｈ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７（３５）：２５３９６−４０１．
【非特許文献３】Ｋｒｅｉｔｍａｎ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ−ｂａｓｅｄ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００１  ２（９）：１２８２−９３．
【非特許文献４】Ｐａｓｔａｎ  Ｉ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ：ａ  ｓｈｏｒｔ  ｈｉｓｔｏｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３；５２（５）：３３８−４１．
【非特許文献５】Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３  Ｍａｙ；５２（５）：３２８−３７．
【非特許文献６】Ｍｉｌｅｎｉｃ  ＤＥ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ：ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．２００２；８（１９）：１７４９−６４．
【非特許文献７】Ｈａａｓａｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳＳ（ｄｓＦｖ）ＰＥ３８  ａｎｄ  ＳＳ１（ｄｓＦｖ）ＰＥ３８，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２  Ｎｏｖ；８（１１）：３５２０−６．
【非特許文献８】Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆｖ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８  Ｄｅｃ；１６（１２）：５１３−２０．
【非特許文献９】Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；９０（１６）：７５３８−４２．
【非特許文献１０】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ）：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３；２２（４７）：７３５９−６８．
【非特許文献１１】Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４；２６（１）：３９−６０．
【非特許文献１２】Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｆｏｌａｔｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｇｒａｆｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１９９９；１０（２）：２８９−９８．
【非特許文献１３】Ｐａｎ  ＸＱ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ａ  ＫＢ  ｏｒａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００３  Ｍａｒ；２０（３）：４１７−２２．
【非特許文献１４】Ｓｕｄｉｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０００  Ｍａｒ  ３０；４１（２）：１４７−６２．
【非特許文献１５】Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９９９；４２（８）：１６０９−１６．
【非特許文献１６】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｒｉｓｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｏｌｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｏｎ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００３  Ｓｅｐ；２（３）：２１６−２３．
【非特許文献１７】Ｂｏｎｄｅｓｏｎ  Ｊ．Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎｔｉｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；２９（２）：１２７−５０．
【非特許文献１８】Ｍａｉｎｉ  ＲＮ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｗ  ｄｏｅｓ  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｗｏｒｋ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ？Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．２００２；４  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２２−８．
【非特許文献１９】Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｌａｔｅ−ｔａｒｇｅｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｊｕｖａｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００２  Ｊｕｌ．４６（７）：１９４７−５５．
【非特許文献２０】Ｐａｕｌｏｓ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉ  Ｒｅｖ  ２００４  Ａｐｒ：５６（８）：１２０５−１７．
【非特許文献２１】Ｎａｇａｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｙ３０９８８７，ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｍｕｒｉｎｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２００３  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ：２１（６）：７１９−２５．
【非特許文献２２】Ｓｔｒａｎｄ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ  ５  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９３  Ｓｕｐｐｌ  ８：Ｓ１６１−３
【非特許文献２３】Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ５  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｏ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９４；２１（４）：５９６−６０４．
【非特許文献２４】ｖａｎ  Ｒｏｏｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  ａｎ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００３；４８（５）：１２２９−３．
【非特許文献２５】Ｒａｖｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００２  Ｓ；１４（５）：５４８−５２．
【非特許文献２６】Ｅｖａｎｓ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９６  Ｏｃｔ；１９５（４−５）：６５５−９．
【非特許文献２７】Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ＣＤ３４（＋）ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．１９９９  Ｊｕｎ  １；９３（１１）：３９４０−８．
【非特許文献２８】Ｇｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３  Ｎｏｖ  １５；９８（１０）：２０９５−１０４．
【非特許文献２９】Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−ＣＤ３０  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｄｉａｎｔｈｉｎ  ３０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９９５；４０（２）：１０９−１４．
【非特許文献３０】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍ１９５−ｇｅｌｏｎｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９６；１０（２）：３２１−６．
【非特許文献３１】Ｒｕｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ３３  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｒｉｃｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｈｕｍａｎ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９２；２０（４）：４４２−８．
【非特許文献３２】Ｔｕｒ．Ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＣＤ６４−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３（２３）：８４１４−９．
【非特許文献３３】Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ６４−ｒｉｃｉｎ  ａ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００１；１０（１）：９５−１０５．
【非特許文献３４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＨＩＭ６）ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ］Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｋｅ  Ｘｕｅ  Ｙｕａｎ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．１９９３；１５（４）１２８６−９０．
【非特許文献３５】Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＧＭ−ＣＳＦ−ＰＥ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｉｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７；７５（３）：２８９−９４．
【非特許文献３６】Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．ＧＭ−ＣＳＦ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｔｏｘｉｎ（ＤＴ３８８−ＧＭ−ＣＳＦ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｈｏｓｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ａ  ＳＣＩＤ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９；１３（４）：６２９−３３．
【非特許文献３７】Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＤＴ（３８８）ＩＬ３）ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００３；１７（１）：１５５−９．
【非特許文献３８】Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ−Ａ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９（ｒｈＩＬ−９−ＥＴＡ’）ｓｈｏｗｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ＩＬ−９−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９９６；２（３）：１３９−４６．
【発明の開示】
しかしながら、非特許文献１を有効活用してＩｇＧ型ＦＲ−β単クローン抗体を作成した報告はない。さらに、非特許文献２、非特許文献３を有効に活用して遺伝子改変ＰＥとＦＲ−β単クローン抗体の結合物であるイムノトキシン作成の報告はなく、本発明はＦＲ−β単クローン抗体ＰＥの作成を課題とする。
また、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６を有効に活用してＰＥ以外のトキシンとＦＲ−β単クローン抗体の結合物であるイムノトキシン作成の報告はなく、本発明はＦＲ−β単クローン抗体イムノトキシンの作成を課題とする。
これまでリコンビナントＰＥを使用した多数のイムノトキシンが開示され、インビボ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において種々の疾患での有効性が示されている。しかしながら、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０は活性化マクロファージのみを標的としたイムノトキシンではなく、活性化マクロファージが病態の中心である疾患においては効果が得られない問題点があり、本発明は活性化マクロファージが病態の中心である疾患において、有効な効果を示すＦＲ−β単クローン抗体イムノトキシンの作成を課題とする。
抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の抗原結合部位とトキシンのＤＮＡを遺伝子操作にて結合させ、大腸菌内で蛋白を産生させることにより、単鎖リコンビナントイムノトキシン、２重鎖リコンビナントイムノトキシンを作成することができる。リコンビナントイムノトキシンは分子量が小さいため細胞内に入りやすく、しかも化学的に抗体とトキシンの結合物を作成するのに比べて、大量な精製が可能であるという利点を有する。
これまで、ＦＲ−β単クローン抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子配列が明らかでないため、非特許文献７、非特許文献８を有効に活用してＦＲ−β単クローン抗体単鎖リコンビナントイムノトキシンの作成や非特許文献９を有効に活用してＦＲ−β抗体２重鎖リコンビナントイムノトキシン作成の報告はなく、本発明はＦＲ−β単クローン抗体単鎖リコンビナントイムノトキシン、ＦＲ−β抗体２重鎖リコンビナントイムノトキシン作成のためのＦＲ−β単クローン抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子配列を決定することを課題とする。
キメラ抗体はヒトにおいて、マウス抗体部分に対する抗体の産生が少なく、臨床投与に有用であることが記載されている。これまで、ＦＲ−β単クローン抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子配列が明らかでないため、非特許文献１０を有効に活用したキメラ抗体作成の報告はなく、本発明はＦＲ−β単クローン抗体のキメラ抗体作成のために、ＦＲ−β単クローン抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子配列を決定することを課題とする。
さらに、マウスＦａｂ部分のＣＤＲ１、２、３でヒト免疫グロブリンのＣＤＲ１、２、３をおきかえたヒト化抗体はマウス抗体部分に対する抗体の産生が少なく、臨床投与に有用であることが記載されている。
これまで、ＦＲ−β単クローン抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子配列が明らかでないため、非特許文献１１を有効に活用してヒト化抗体作成の報告はなく、本発明はＦＲ−β単クローン抗体のヒト化抗体作成のために、ＦＲ−β単クローン抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子配列を決定することを課題とする。
薬剤の特異的な細胞輸送のために、リポソーム内に薬剤に加えて細胞に特異的に結合する抗体の利用は治療法として有用であるが、これまで、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４を有効に活用してリポソーム作成にＦＲ−β単クローン抗体を利用した報告はなく、本発明はＦＲ−β単クローン抗体を含むリポソーム作成のための、ＦＲ−β単クローン抗体の作成を課題とする。
関節リウマチの病態に活性化マクロファージの役割が知られ、マクロファージ活性化制御を目的とした治療の有効性を示す非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８の報告があるが、これらの治療はイムノトキシンではなく、細胞の死滅や除去能において問題点がある。
また、非特許文献１９、非特許文献２０は葉酸とアイソトープの結合物の使用であり、しかもこの結合物の治療効果が示されていない点に問題があり、本発明はＦＲ−β単クローン抗体結合物による関節リウマチの活性化マクロファージ活性化制御を課題とする。また、本発明者らによる非特許文献２１は葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）に結合する薬剤が関節炎マウスに有効を示す報告であるが、ＦＲ−β単クローン抗体結合物を使用した報告でなく、本発明はＦＲ−β単クローン抗体結合物による関節リウマチの活性化マクロファージ活性化制御を課題とする。
これまで、関節リウマチの治療を目的としたイムノトキシンとして非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、特許文献３１、特許文献３２が報告されているが、それらの作用の標的には、リンパ球や活性化されていないマクロファージも含まれており、活性化マクロファージ活性化のみの制御ではないため、種々の副作用の問題点がある。さらに、トキシンとしてＰＥ以外のトキシンが使用されており、トキシンとしてのＰＥの作用が明らかでない。本発明はＦＲ−β単クローン抗体イムノトキシン、特にＦＲ−β単クローン抗体ＰＥによる関節リウマチの活性化マクロファージ活性化制御を課題とする。
マクロファージ活性化症候群では、非特許文献２５においてマクロファージが異常に活性化されたことが病態の中心と報告され、活性化マクロファージの死滅あるいは除去が望ましいが、非特許文献２５ではその治療法としてイムノトキシンに言及していない問題点がある。本発明はＦＲ−β単クローン抗体トキシンによる敗血症性ショックの治療を課題とする。
敗血症ショックでは、非特許文献２６においてマクロファージが異常に活性化されたことが病態の中心と報告され、活性化マクロファージの死滅あるいは除去が望ましいが、非特許文献２６ではその治療法としてイムノトキシンに言及していない問題点がある。本発明はＦＲ−β単クローン抗体イムノトキシンによる敗血症性ショックの治療を課題とする。
急性骨髄性白血病の一部で葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）の発現が亢進していることが報告され、非特許文献２７、特許文献３３において、葉酸、薬剤を含むリポソームが急性骨髄性白血病の増殖抑制した報告があるが、葉酸のリセプターにはＦＲ−αもあり、このリポソームはＦＲ−β発現細胞に特異的な作用する治療ではなく、種々の副作用の問題点がある。また、白血病細胞においては薬剤耐性がおこることが知られており、薬剤の併用が望ましい。本発明はＦＲ−β単クローン抗体をふくむリポソームによるＦＲ−β発現急性骨髄性白血病細胞に特異的な急性骨髄性白血病の治療を課題とする。急性骨髄性白血病の治療のためのイムノトキシンとしては非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８の効果が報告されているが、、リガンドとして使用された単クローン抗体やサイトカインは急性骨髄性白血病特異的に結合するものではないため、いずれもＦＲ−β単クローン抗体の使用ではなく、種々の副作用の問題点がある。また白血病細胞においては、表面抗原の消失や薬剤耐性がおこることがしられており、また、薬剤の併用が望ましい。
本発明は、急性骨髄性白血病の治療のためのＦＲ−β単クローン抗体、とくにＩｇＧ型ＦＲ−β単クローン抗体を提供する。
本発明は、ＦＲ−β単クローン抗体イムノイムノトキシンによるＦＲ−β発現急性骨髄性白血病細胞に特異的な急性骨髄性白血病の治療を課題とする。
本発明は、マクロファージの前駆細胞である単球や活性化されないていないマクロファージには作用せず、活性化マクロファージ細胞や急性骨髄性白血病細胞を傷害する新規物質を見出し、この物質の新しい作用機序によって、従来の治療薬では充分治療効果が得られなかった疾患の治療や、従来の治療薬との併用により、さらに治療効果が高まるような治療剤を提供しようとするものである。
本発明の一つの目的は、活性化マクロファージや白血病細胞表面に存在するヒトＦＲ−β抗原に対して結合能を有し、ＦＲ−β発現細胞への結合により細胞死を誘導する単クローナル抗体と、毒性分子とを有するイムノトキシンを提供することにある。
本発明のほかの目的は、ＦＲ−β抗原に対する前記イムノトキシンの結合により、ＦＲ−β発現細胞を除去し、局所的な炎症応答を抑制することにより、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、マクロファージ活性化症候群、敗血症ショックのようなマクロファージ活性化が病態の中心である疾患を治療する方法を提供することである。この方法は、治療を必要とする患者に対して、活性化マクロファージ細胞表面上のヒトＦＲ−β抗原に対して結合能を有するイムノトキシンを、製剤学的に適合性のある賦型剤とともに、治療上の有効量を投与することを含む。
本発明の他の目的は、ＦＲ−β抗原に対する前記イムノトキシンの結合により、ＦＲ−β発現腫瘍細胞が除去されることにより、白血病を治療する方法を提供することである。この方法は、治療の必要な患者に対して、骨髄球由来の腫瘍細胞表面上のＦＲ−βに対して結合能を有するイムノトキシンを、製剤学的に適合性のある賦型剤とともに、治療上の有効量を投与することを含む。
本発明の他の目的は、ＦＲ−β単クローン抗体のリコンビナントイムノトキシン、キメラ抗体、ヒト化抗体の作成のために、ＦＲ−β単クローン抗体の遺伝子の配列に関する知見を提供することである。
葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）は骨髄系細胞以外に発現せず、しかも健常人の細胞での発現は低い。そこで、ＦＲ−β抗原に対する抗体を利用した治療法は有用と考えられるが、ＦＲ−β抗原に対する高親和性のＩｇＧ型抗ＦＲ−β単クローン抗体作成の報告はみられない。現在までのところ、ＦＲ−β発現活性化マクロファージをマクロファージ活性化が病態の中心である疾患において除去するためにＦＲ−β単クローン抗体を使用することは提案されていない。また、ＦＲ−β発現白血病細胞を白血病において除去するためにＦＲ−β単クローン抗体を使用することは提案されていない。
本発明者は、葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）はマクロファージの前駆細胞である単球や活性化されていないマクロファージには発現しておらず、活性化マクロファージや急性骨髄性白血病細胞のみに発現しており、ＦＲ−β発現細胞が病態に関与している疾患において、ＦＲ−β単クローン抗体を利用した活性化マクロファージや急性骨髄性白血病細胞の死滅や除去を目的とした治療法は有効と考えて、鋭意研究の結果、活性化マクロファージに特異的な葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）に対する単クローナル抗体を新たに作成し、次いでこの抗体にトキシンを結合させたイムノトキシンを作成したことにより発明を完成し、上記課題を解決した。
すなわち本発明は、ＦＲ−β抗原に対する抗体とトキシンとの結合体（イムノトキシン）が、効果的に、ＦＲ−β分子を発現する細胞を死滅させるという検討結果に基づいている。これらのＦＲ−β単クローン抗体イムノトキシンは、葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）を発現する細胞によって仲介される疾患や症状を予防しあるいは治療するために用いられると考えて、ＦＲ−β単クローン抗体イムノトキシンを有効成分とする、とくにＩｇＧ型単クローナル抗体と遺伝子改変緑膿菌毒素との結合物であるイムノトキシンが低濃度で活性化マクロファージ細胞を傷害することや葉酸リセプターベータ発現骨髄性白血病細胞の増殖を阻害する作用機構によって、マクロファージが病態の中心となる疾患または白血病の新規な治療剤を実現したものである。
本明細書において使用する「抗体」の語は、多クローン抗体、単クローン抗体、人体に適合化させた抗体、単鎖抗体、及び、Ｆａｂフラグメントや、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆｖフラグメント等のこれらの抗体のフラグメントや、親抗体の抗原結合能を維持しているその他のフラグメントを意味する。
本明細書において用いる「単クローン抗体」の語は、単一の抗体集団を構成する抗体群を意味する。この語は、その抗体の種や起源に関して限定されないし、抗体の製造方法によっても限定されることを意図するものでもない。この語は、完全なイムノグロブリンの他、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント及び、抗体の抗原結合能を維持するその他のフラグメントを包含するものである。哺乳類、鳥類の単クローン抗体も、この発明において使用できる。
この明細書において使用する単鎖抗体の語は、結合性のある抗体の結合領域（Ｈ鎖及びＬ鎖の双方）を決定し、結合性が維持されるような結合部位を付与することによって調製される抗体をいうものとする。これにより、本質的に抗原に結合するための必要な可変領域部位のみを有する、徹底的に簡略化された抗体が形成される。この明細書において使用する「２重鎖抗体」の語は、結合性のある抗体の結合領域（Ｈ鎖及びＬ鎖の双方）を決定し、Ｈ鎖あるいはＬ鎖とＬ鎖あるいはＨ鎖をｓ−ｓ結合することによって調製される抗体をいうものとする。これにより、本質的に抗原に結合するための必要な可変領域部位のみを有する、徹底的に簡略化された抗体が形成される。
本発明にいうイムノトキシン（ＩＴ）とは、細胞に結合するリガンドが、トキシンあるいはそのサブユニットに結合されたキメラ分子をいうものとする。イムノトキシンのトキシン部分は、植物や細菌等の各種起源に由来するが、ヒト起源のトキシンや合成トキシン（薬剤）も同様に用いることができる。
好ましくは、トキシン部分は、１型や２型のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）のような植物毒素由来である。２型のリボソーム不活性化タンパク質は、例えば、リシンを含んでいる。１型のＲＩＰは、特に、この発明によってイムノトキシンを構築するのに都合がよい。１型のＲＩＰとしては、細菌性毒素の例としては、シュドモナス  エクソトキシン（ＰＥ）、ジフテリアトキシンがある。その他、ブリオディン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、モモルデイン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）がある。
ＩＴのリガント部分は、通常、選択された標的細胞に結合する単クローン抗体をいう。本発明で使用するＩＴの部分は、細菌由来のトキシン  シュドモナス  イムノトキシンＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ（ＰＥ）である。具体的にはＡＤＰリボシル化活性および細胞膜を介してトランスロケーションする能力を具備する。さらに具体的にはＰＥはアミノ酸配列２７９と２８０が切断されることにより活性型となり、天然の毒素の受容体結合ドメインＩａを欠いたＰＥをコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを大腸菌に遺伝子導入することにより作成できる。
本発明にいうＰＥ結合リコンビナントイムノトキシンは細胞表面に結合するＩａドメインが欠損し、アミノ酸配列２８０から始まり、Ｃ末端部位に細胞障害能を増加させるため、ＫＤＥＬ、ＲＥＤＬＫが付加されている。具体的にはトキシンが細胞に対して結合活性のないことは、非特異的な毒性を顕著に低下させる。さらに具体的には遺伝子改変されたＰＥは、改変されていないＰＥに比較して、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でヒトまたは動物細胞に対してより低い毒性を示し、かつ、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で投与した場合に肝臓に対してより低い毒性を具備する。
さらに、本発明でいう単鎖リコンビナントイムノトキシンとは抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の抗原結合部位とトキシンのＤＮＡを遺伝子操作にで結合させ、大腸菌内で蛋白を産生させることにより作成される蛋白をいう。具体的には通常、単鎖リコンビナントイムノトキシンはＨ鎖とＬ鎖の間にアミノ酸１５程度を翻訳する介在配列を含むものをいう。（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆｖ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８  Ｄｅｃ；１６（１２）：５１３−２０）
本発明でいう２重鎖リコンビナントイムノトキシンとは、Ｈ鎖あるいはＬ鎖抗原結合部位ＤＮＡとトキシンＤＮＡを遺伝子操作にて結合させ、大腸菌内で蛋白を作成し、別にＬ鎖あるいはＨ鎖抗原結合部位ＤＮＡから蛋白を作成し、これらの蛋白をＳ−Ｓ結合にて結合させたものをいう。（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  ＳＡ．１９９３；９０（１６）：７５３８−４２）
本発明でいうキメラ化抗体とは、マウス免疫グロブリンの抗原結合部位（Ｆａｂ部分）ＤＮＡとヒト由来の免疫グロブリンＦｃ部分ＤＮＡを遺伝子操作にて結合させ、大腸菌に産生させたものをいう。（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ）：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３；２２（４７）：７３５９−６８）
本発明でいうヒト化抗体とはマウスＦａｂ部分のＣＤＲ１、２、３でヒト免疫グロブリンのＣＤＲ１、２、３をおきかえたものをいう。（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４；２６（１）：３９−６０）
本発明でいうリポソームとは薬剤の輸送システムとして、脂質膜で薬剤を包むものをいう。具体的には，薬剤の特異的な細胞輸送のために、リポソーム内に薬剤に加えて細胞に特異的に結合する抗体が含まれるものをいう。（Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｆｏｌａｔｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｇｒａｆｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１９９９；１０（２）：２８９−９８）
本発明でいう生物学的、化学的に活性のある酵素とは凝固系に作用するウロキナーゼ、プラスミン、プラスミノーゲン、スタフィロキナーゼ、トロンビンや蛋白分解酵素であるメタロプロテアーゼ、コラゲナーゼ、ゲラチナーゼ、ストロメライシンが挙げられる。
本発明でいうサイトカインとは抗腫瘍作用のあるインターフェロン、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αや血管新生抑制作用のあるエンドスタチンや抗炎症作用やあるＩＬ−１リセプターンタゴニスト、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８、Ｉｌ−２９が挙げられる。
本発明でいうアイソトープとはガリウム６７、ガリウム６８、インジウム１１１、インジウム１１３、イオデイン１２３、イオデイン１２５、イオデイン１３１、テクネシウム９９、イットリウム９０、ルビジウム９７、ルビジウム１０３が挙げられる。
本発明でいう化学療法剤とは細胞障害能のある分子をいう。具体的には代謝拮抗剤であるシトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒｂｉｎｏｓｉｄｅ），フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ），メソトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）、アンスラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｉｃｉｎ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ミスラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｉｃｉｎ）、アルキル化剤であるクロラムブチル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｒａｎ）、エンドキサン（ｅｎｄｏｘａｎ）、ＤＮＡ合成阻害剤であるダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ），ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、チュブリン（ｔｕｂｌｉｎ）阻害薬剤であるコルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、タキサン（ｔａｘａｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ），ビンブラスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）のようなビンカアルガロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋａｌｏｉｄ）が挙げられる。
本発明にいう葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）は、活性化マクロファージや急性骨髄性白血病に発現する表面抗原であり、葉酸の細胞内輸送に関与する分子をいう。本発明でいう関節リウマチ（ＲＡ）とは多発性の関節の腫脹、疼痛を症状とする慢性の炎症性疾患であり、ＲＡ滑膜に存在するマクロファージ様細胞がＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＴＮＦ−Ａ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦなどのサイトカインやＩＬ−１と拮抗するＩＬ−１リセプターアンタゴスト、ＮＯ、活性酸素、各種カテプシン、各種メタロプロデアーゼなどを産生し、関節の骨破壊を特徴とする疾病をいう。
本発明でいう若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）は、１６才未満に発症した慢性関節炎を主体として多彩な関節外症状を伴う原因不明の疾患である。具体的にはＪＲＡは全身型、多関節型および少関節型の３つの型に分類されており、全身型は、４０℃〜平熱までの弛張熱、発疹、全身性のリンパ節腫脹、肝脾腫、心膜炎や胸膜炎などを示し、多関節型は、皮下結節を伴うことも多く、発熱、倦怠感などの全身症状、成長障害や体重減少も見られ、少関節炎においては虹彩炎が起こり、視力低下や失明することがある。
本発明でいうマクロファージ活性化症候群とは発熱、汎血球減少、肝機能障害、播種性血管内凝固、骨髄における血球貪食像を示す病態である。具体的には、高サイトカイン血症特に、ＴＮＦ−αの高値を示し、マクロファージ活性化が病態の中心である。（Ｒａｖｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００２  Ｓ；１４（５）：５４８−５２）
本発明でいう敗血症性ショックとは一般的にグラム陰性バクテリア感染の結果として認識されているが、グラム陽性微生物からもおそらく真菌、ウイルス及び寄生虫によっても結果として生じ得ることが現在明らかである。
本発明でいう急性骨髄性白血病とは骨髄球の異常増殖であり、治療抵抗なものは感染、出血で死亡する。具体的にはＦＲ−βを発現している急性骨髄性白血病である。（Ｒｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ｂｅｔａ  ｉｓ  ａ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９９  Ｊａｎ  １５；８５（２）：３４８−５７）
本発明は、ＦＲ−β単クローン抗体である。ＩｇＧ型であるものも本発明に含まれる。本発明のＦＲ−β単クローン抗体には、マウスをＦＲ−β発現Ｂ３００−１９細胞で免疫した後、そのマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させて得られたクローン３６（ｃｌｏｎｅ  ３６）細胞から産生されたものも含まれる。本発明のＦＲ−β単クローン抗体には、マウスをＦＲ−β発現Ｂ３００−１９細胞で免疫した後、そのマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させて得られたクローン９４ｂ（ｃｌｏｎｅ  ９４ｂ）細胞から産生されたものも含まれる。
本発明は、ＦＲ−β単クローン抗体産生クローン３６（ｃｌｏｎｅ  ３６）細胞のＨ鎖とＬ鎖の遺伝子、およびその遺伝子によりコードされる蛋白質である。なおその遺伝子または蛋白質と実質的に同等の生物学的活性を有するバリアントも本発明に含まれる。このクローン３６（ｃｌｏｎｅ  ３６）細胞のＨ鎖の遺伝子、およびＬ鎖の遺伝子をキメラ化することにより得られた、ヒト化したＦＲ−β単クローン抗体も本発明に含まれる。
本発明は、ＦＲ−β単クローン抗体産生クローン９４ｂ（ｃｌｏｎｅ  ９４ｂ）細胞のＨ鎖とＬ鎖の遺伝子、およびその遺伝子によりコードされる蛋白質である。なおその遺伝子または蛋白質と実質的に同等の生物学的活性を有するバリアントも本発明に含まれる。このクローン９４ｂ（ｃｌｏｎｅ  ９４ｂ）細胞のＨ鎖の遺伝子、およびＬ鎖の遺伝子をキメラ化することにより得られた、ヒト化したＦＲ−β単クローン抗体も本発明に含まれる。
本発明のＦＲ−β抗体イムノトキシンは、ＦＲ−β単クローン抗体とトキシンとを結合したものである。ここで該トキシンは、リシンＡ鎖（ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、脱糖鎖リシンＡ鎖（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、リボソーム不活化蛋白（ａｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、アルファーサルシン（ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アスペルギリン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｎ）、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、リボヌクレース（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ジフテリアトキシン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）、シュドモナス  エクソトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）などであるが、それらに限定されるものではない。
本発明にはｃｌｏｎｅ３６のＨ鎖の遺伝子と、ｃｌｏｎｅ３６のＬ鎖の遺伝子とを用いたリコンビナントＦＲ−β抗体イムノトキシンも含まれる。
本発明にはクローン９４ｂのＨ鎖の遺伝子と、クローン９４ｂのＬ鎖の遺伝子とを用いたリコンビナントＦＲ−β抗体イムノトキシンも含まれる。
本発明には酵素、サイトカイン、アイソトープ、化学療法剤からなる群から選ばれた少なくとも一つの生物学的または化学的に活性のある分子と、ＦＲ−β単クローン抗体との結合物も含まれる。
本発明にはＦＲ−β単クローン抗体と化学療法剤とを含むリポソームも含まれる。
本発明には該ＦＲ−β抗体イムノトキシン、該結合物、該リポソームから選ばれた少なくとも一つを有効成分とする医薬組成物も含まれる。
本発明には該ＦＲ−β抗体イムノトキシン、該結合物、該リポソームから選ばれた少なくとも一つを有効成分とするマクロファージが病態の中心となる疾患の治療剤も含まれる。
本発明にはマクロファージが病態の中心となる疾患が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、マクロファージ活性化症候群、敗血症ショックからなる群から選ばれた疾患である上記の治療剤も含まれる。
本発明には上記の治療剤の投与形態が関節注入剤である関節リウマチまたは若年性関節リウマチの治療剤も含まれる。
本発明には該ＦＲ−β抗体イムノトキシン、該結合物、該リポソームからなる群から選ばれた少なくとも一つを有効成分とする白血病の治療剤も含まれる。
本発明には白血病が急性骨髄性白血病である上記の治療剤も含まれる。
本発明のＦＲ−β抗体イムノトキシンは、ＦＲ−β発現マクロファージにプログラム化細胞死の一形態であるアポトーシスを発現させる。また、本発明のＦＲ−β抗体イムノトキシンは、ＦＲ−β発現Ｂ３００−１９細胞に反応し、ＦＲ−β発現Ｂ３００−１９細胞にプログラム化細胞死の一形態であるアポトーシスを発現させる。
以上説明したように本発明により、マクロファージの前駆細胞である単球や活性化されないていないマクロファージには反応せず、活性化マクロファージや急性骨髄性白血病細胞に反応するＦＲ−β単クローン抗体が作成されたことにより、従来の治療薬では充分治療効果が得られなかった疾患の治療や、従来の治療薬との併用により、さらに治療効果が高まるような治療剤が提供される。
ＦＲ−β抗原に高親和性で低分子量のＩｇＧ型ＦＲ−β単クローン抗体が作成されたことより、活性化マクロファージや急性骨髄性白血病細胞に対する特異的な治療効果をもつ治療薬が提供される。
ＩｇＧ型ＦＲ−β単クローン抗体クローン３６およびクローン９４ｂのＨ鎖、Ｌ鎖の可変領域の遺伝子配列が明らかにされたことにより、キメラ抗体、ヒト化抗体、リコンビナントイムノトキシンの提供が可能になり、これらの結合物は大量生産可能な、また、マウス蛋白に対するアレルギーが少ない治療薬を提供する。
クローン３６（ｃｌｏｎｅ  ３６）細胞のＨ鎖の遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。なお該塩基配列の下に、それがコートする蛋白質のアミノ酸配列を付記する。クローン３６（ｃｌｏｎｅ  ３６）細胞のＬ鎖の遺伝子の塩基配列を、それがコートする蛋白質のアミノ酸配列と共に配列表の配列番号２に示す。クローン９４ｂ（ｃｌｏｎｅ  ９４ｂ）細胞のＨ鎖の遺伝子配列を、それがコートする蛋白質のアミノ酸配列と共に配列表の配列番号３に示す。クローン９４ｂ（ｃｌｏｎｅ  ９４ｂ）細胞のＬ鎖の遺伝子配列を、それがコートする蛋白質のアミノ酸配列と共に配列表の配列番号４に示す。
本願明細書において、配列番号１に示す塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子の塩基配列と配列番号１に示す塩基配列とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。またその様な遺伝子と配列番号１に示す塩基配列の遺伝子とは、ストリンジュエントな条件下でハイブリッドを形成する。配列番号２ないし配列番号４に示す塩基配列が改変された塩基配列についても同様である。その様な遺伝子も、クローン３６（ｃｌｏｎｅ  ３６）細胞のＨ鎖またはＬ鎖、若しくはクローン９４ｂ（ｃｌｏｎｅ  ９４ｂ）細胞のＨ鎖またはＬ鎖と実質的に同等の生物学的活性を有する蛋白質をコードする限り、本発明の範囲内である。
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。
また本願明細書において、配列番号１で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１に示した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列（配列番号１に付記したアミノ酸配列）において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。配列番号２ないし配列番号４に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列が改変されたものについても同様である。その様な蛋白質も、クローン３６（ｃｌｏｎｅ  ３６）細胞のＨ鎖またはＬ鎖、若しくはクローン９４ｂ（ｃｌｏｎｅ  ９４ｂ）細胞のＨ鎖またはＬ鎖と実質的に同等の生物学的活性を有する限り、本発明の範囲内である。
本願明細書において「実質的に同等」とは、蛋白質の活性、例えばＦＲ−β抗原に対して特異的に結合するなどの生理学的な活性、生物学的な活性が実質的に同一であることを意味する。その用語の意味の中には実質的に同質の活性を有する場合を含んでもよく、その実質的に同質の活性とは、例えばＦＲ−β抗原に対して特異的に結合するなど、それらの活性の性質が同質であることを意味し、例えば生理的に、薬理的に、あるいは生物学的に同質であることを意味する。なお活性の量的な程度も同一であることが好ましいが、定量的な要素については異なっていてもよい。
本願明細書において「ストリンジュエント」なハイブリダイゼーションの条件については当業者が適宜選択をすることができるが、具体的には、一例として、以下の操作によってハイブリダイゼーションを行うことができる。試験すべきＤＮＡまたはＲＮＡ分子を転写した膜と標識したプローブを、適用なハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、例えば、５×ＳＳＣ、０．１重量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬及び５０％フォルムアミドから成る。核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬としては、一例として、０．１Ｍマレイン酸と０．１５Ｍ塩化ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ７．５）に市販の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬を１０％になるように溶解したものを使用することができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは、３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。
ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは２×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をプローブに用いた標識を利用して識別することができる。
これまでイムノトキシンは活性化マクロファージのみを標的としたものではなく、活性化マクロファージが病態の中心である疾患においては、副作用や効果が得られない問題点があり、本発明は活性化マクロファージが病態の中心である疾患において、有効な効果を示すイムノトキシンを提供する。
本発明により、活性化マクロファージが病態の中心である疾患の活性化マクローファージに特異的な細胞死や除去能を示す、酵素、サイトカイン、アイソトープ、化学療法薬から選ばれた少なくとも一つとＦＲ−β単クローン抗体との結合物が作成され、これらの結合物は新たな治療薬を提供する。
薬剤の特異的な細胞輸送のために，リポソーム内に薬剤に加えて細胞に特異的に結合する抗体の利用は治療法として有用であるが、これまでＦＲ−β単クローン抗体を含むものはなく本発明は活性化マクロファージが病態の中心である疾患において、副作用の少ない，新たな作用機構をもったリポソームを提供する。
本発明により、活性化マクロファージが病態の中心である関節リウマチ、若年性関節リウマチ、マクロファージ活性化症候群、敗血症ショックの活性化マクロファージに特異的な細胞死や除去能を示す、トキシン、酵素、サイトカイン、アイソトープ、化学療法薬から選ばれたいずれか一つとＦＲ−β単クローン抗体との結合物やＦＲ−β単クローン抗体を含むリポソームは副作用の少ない，新たな作用機構をもった治療薬を提供する。
本発明により得られたトキシン、酵素、サイトカイン、アイソトープ、化学療法薬から選ばれたいずれか一つとＦＲ−β単クローン抗体との結合物やＦＲ−β単クローン抗体を含むリポソームは関節リウマチ、若年性関節リウマチの関節局所への注入が可能であり、関節局所の炎症除去のための新たな治療薬を提供する。
白血病の治療のための治療薬の多くは正常細胞にも作用するため、種々の副作用がある。また、白血病細胞においては表面抗原の消失や薬剤耐性がおこることがしられており、新たな作用機構をもった治療薬が望まれている。本発明により得られたトキシン、酵素、サイトカイン、アイソトープ、化学療法薬から選ばれたいずれか一つとＦＲ−β単クローン抗体との結合物やＦＲ−β単クローン抗体を含むリポソームはＦＲ−β発現白血病細胞に特異的な細胞死や除去能を示すことより，副作用の少ない新たな作用機構をもつ新たな治療薬を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のＦＲ−β抗体の反応性を示す図である。
図２は、本発明のＦＲ−β抗体イムノトキシンとトキシンの分離およびそれらの分子のＡＤＰリボシル化能を示す図である。ＩＴはイムノトキシンを示す。ＰＥはシュドモナス  エキソトキシンを示す。
図３は、本発明のＦＲ−β抗体イムノトキシンがトキシンを含むことを示す図である。ＩＴはイムノトキシンを示す。ｍＡＢはＦＲ−β単クローン抗体を示す。ＰＥはシュドモナス  エキソトキシンを示す。
図４は、本発明のＦＲ−β抗体イムノトキシンによるＢ３００−１９細胞の細胞死を示す図である。なお２４ｈ、３６ｈ、４８ｈはそれぞれ、２４時間後、３６時間後、４８時間後の細胞死を示す。
図５は、マクロファージにアデノベクターによりＦＲ−βを発現させた図である。
図６は、本発明のＦＲ−β抗体イムノトキシンによるＦＲ−β発現マクロファージの細胞死を示す図である。
図７は、関節リウマチ滑膜細胞にＦＲ−βが発現していることを示す図である。
図８は、本発明のＦＲ−β抗体イムノトキシンによる関節リウマチ滑膜細胞の細胞死を示す図である。
図９は、リコンビナント二重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥキメラ抗体のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の図である。
図１０は、種々の濃度のリコンビナント２重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体によるＦＲ−β発現Ｂ３００−１９細胞の細胞死を示す図である。
図１１は、種々の濃度のリコンビナント２重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体によるＦＲ−β発現ＨＬ−６０の細胞死を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】［ＦＲ−β発現細胞の作成］
本発明者は以下の方法にてＦＲ−β発現Ｂ３００−１９細胞を作成する。先ず、ｐＥＦ−ＢＯＳベクターにＦＲ−β遺伝子を組み込む。ベクターはｐＥＦ−ＢＯＳベクターに限らず、哺乳類の発現ベクターのいずれでもよい。次に、ＦＲ−β遺伝子をリポフェクタミン法にてマウスＢ３００−１９細胞に遺伝子導入する。導入法はエレクトロポレーション法でもよい。また、細胞株はマウスＢａｌｂ／Ｃ由来の細胞株であればいずれでもよい。
本発明はこの細胞を免疫することにより、細胞融合法にてＦＲ−β抗原に高親和性で低分子量のＩｇＧ型ＦＲ−β単クローン抗体を作成する。抗体と毒素分子とは、各種周知の化学的方法のいずれか、例えばＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒト゛等の、異なる２価の結合性基を有するクロスリンカーの使用等によって、互いに化学的に結合される。各種イムノトキシンの製造は、当該分野において周知であり、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｉｍｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｂｕｌｌｅｔ，Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１６８−１９０（１９８２）及びＷａｌｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１１６５７（１９９１）に記載されている。これらの二つの文献は、引用により本明細書の一部とされる。
［ＦＲ−β抗体イムノトキシンの作成］
本発明者はこの抗体と遺伝子改変緑膿菌毒素（ＰＥ）をＨａａｓａｎらの方法に準じ（Ｈａａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｋ１−ＬｙｓＰＥ３８ＱＱＲ，ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ａ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０００  Ｊ；２３（４）：４７３−９）、サクシニミヂルトランスー４−マレイミヂルメチシクロヘキサン１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｔｒａｎｓ−４−（ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌｍｅｔｈｙ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ  １−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ）にて結合させ、イムノトキシンを作成する。本発明が使用するトキシンは、ＰＥの他リシンＡ鎖（ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、脱糖鎖リシンＡ鎖（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、リボソーム不活化蛋白（ａ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、アルファーサルシン（ａｌｐｈａ．−ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アスペルギリン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｎ）、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、リボヌクレース（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ジフテリアトキシン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）、シュドモナスエクソトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）のいずれでもよい。
抗体は、単鎖抗体−トキシン融合タンパク質の作製工程と同様にして組換え手法によりトキシンに融合されることもできる。リガンドをコードする遺伝子とトキシンとを周知のクローニング法を用いてｃＤＮＡ中にクローニングし、これらは小さいペプチドリンカーによって直接あるいは離れた状態で結合される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）が参照される。
本発明者は、このイムノトキシンが遺伝子導入マクロファージ、関節リウマチ滑膜細胞、ＦＲ−β遺伝子導入細胞株へ細胞死（アポトーシス）を誘導することをプロピジウムイオジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｕｍ）の取り込みにて示す。このイムノトキシンの効果の証明に用いる細胞はＦＲ−β発現細胞であればいずれでもよい。また、細胞死（アポトーシス）の証明はアネキシンーＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ）染色でもよい。さらに、作用効果はトリチウムウリジン（［３Ｈ］Ｕｒｉｄｉｎｅ）の細胞内取り込みの低下による蛋白合成阻害あるいはＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６，ＩＬ−８などのサイトカイン産生の低下によっても示すことができる。
［ＦＲ−β抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子の塩基配列］
本発明者はＦＲ−β単クローン抗体（クローン３６またはクローン９４ｂ）のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子をＩｇ−Ｐｒｉｍｅ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のプライマー使用にて増幅する。本発明者はＴａｑポリメラーゼをもちいたＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅されたＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子をＴＡクローニング法にて、ｐＣＲ（ｒ）２−ＴＯＰＯ（ｒ）ベクターに組み込む。このベクターを大腸菌に遺伝子導入する。本発明者は大腸菌から、ベクターインサートを精製しベクターに存在するＭ１３あるいはＴ７プライマーを用いて、遺伝子配列を決定する。ベクターは５‘末端のＴをもち、Ｍ１３あるいはＴ７プライマーを含むベクターのいずれでもよい。
［ＦＲ−β抗体イムノトキシンの作用効果］
本発明のイムノトキシンは、活性化マクロファージ活性化が病態の中心である種々の疾患やＦＲ−β発現腫瘍細胞からなる白血病に適用される。マクロファージはＦＲ−β発現がみられないので、アデノウイルスベクターを用いたＦＲ−β発現マクロファージを用いて作用効果をみる。
また、ほとんどの細胞株ではＦＲ−β発現が見られないので通常の哺乳類発現ベクターによりＦＲ−β発現細胞株を作成し、作用効果をみる。
関節リウマチ活膜から得られたマクロファージはＦＲ−β発現がみられるので、作用効果をみるのに適当な細胞である。
［ＦＲ−β抗体イムノトキシンの投与量、投与方法］
関節リウマチ、若年性関節リウマチ、マクロファージ活性化症候群、敗血症ショック、急性骨髄性白血病を治療するのに有効である濃度で投与される。この目的を達成するために、イムノトキシンは、当該技術分野で知られている許容される種々の賦形剤を用いて処方される。典型的には、イムノトキシンは、注射によって、静脈内または関節腔内投与される。本発明組成物は、医薬的に許容される非経口賦形剤と混合して、溶液剤、懸濁液剤または乳剤などの単位投与注射用形態で処方される。かかる賦形剤は、本質的に、無毒性であり、非治療的である。かかる賦形剤の例は、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性賦形剤を用いてもよい。好ましい賦形剤は、生理食塩水中５％のデキストロースである。賦形剤は、バッファーおよび保存剤を含む、等張性および化学的安定性を増強する物質などの少量の添加剤を含有してよい。
投与量および投与形態は、個体に左右されるであろう。一般に、該組成物は、イムノトキシンが、最も好ましくは０．１〜２μｇ／ｋｇの用量で投与されるように投与される。好ましくは、ボーラス投薬として投与される。連続輸液を用いてもよい。特定の場合によると、必要とされる本発明のイムノトキシンの「治療有効量」は、かかる処置を必要とする患者を治療するのにまたは少なくとも該当疾患およびその合併症を一部休止させのに充分な量であるとして決定されるべきである。かかる使用のために有効な量は、疾患の重篤度および患者の全身健康状態に左右されるであろう。単投与または多重投与は、患者によって必要とされ耐えられる投与量および投与回数に依存して要求される。
以下において本発明の特に好ましい具体例を、実施例として記載する。
【実施例】実施例１
関節リウマチ滑膜細胞１ｘ１０７から、トリゾール（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）にて使用説明書にしたがって全ＲＮＡを２００μｇ抽出した。全ＲＮＡ（１μｇ／μｌ）５μｌと１０ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）１μｌ、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー（０．５μｇ／μｌ）１μｌをくわえて６５℃で５分反応させ、その後氷中に１分おいた。
さらに、１０ｘＲＴ緩衝液２μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２２４μｌ，０．１Ｍ  ＤＴＴ２μｌ，ＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ２μｌを加え，２分反応させた。さらに、トランスクリプターゼ（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌを加え、７０℃１５分反応させ、氷中に２分おいた。さらに、ＲＮａｓｅＨ１μｌをくわえ、３７℃で２０分反応させ、ｃＤＮＡ合成を終了した。
ｃＤＮＡを得た後、４．５μｌの反応物とセンス（ＡＧＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＡＴＧＧＡＴＧ）、アンチセンス（ＧＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＴＴ）プライマーをそれぞれ４０ｐＭ、ｄＮＴＰを０．６ｍＭ，ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１．５ｕｎｉｔ  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ）５０μｌをもちいて、９４℃５分、９４℃４５秒、６０℃６０秒、７２℃９０秒で２３サイクルＰＣＲをおこない、その後、７２℃で１０分反応させることにより葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）を増幅した。
得られたＰＣＲ産物は３’端にＡを含むので、５’末端にＴをもつＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とライゲーションをおこなった。すなわち、ＰＣＲ産物２．５μｌにソルト溶液（Ｓｏｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、１μｌ、滅菌蒸留水１．５μｌ、ｐＣＲ（ｒ）２−ＴＯＰＯ（ｒ）ベクター１μｌを加え２２℃５分間インキュベートし、その内２μｌをワンショット大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴＯＰ  １０Ｆ‘）に加え、氷中で３０分反応後、４２℃３０秒の熱ショック、氷中で２−５分静置、その後３７℃に温めたＳ．Ｏ．Ｃメジウム２５０μｌを加え、シェーカー内で  で３７℃１時間反応させた。その間にＬＢプレートを３７℃に温めた。サンプルにＸ−ｇａｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）４０μｌ、ＩＰＴＧ（２０ｍｇ／ｍｌ）４０μｌを加え、それを３．５ｍｌ  ＬＢ寒天培地に混ぜて、ＬＢプレートの上に撒き、３７℃で１晩培養した。
大腸菌培養のため、プレート上より採取した白いコロニーをアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）１μｌを含むＬＢ培地２ｍｌに加え、３７℃１晩シェーカー内で培養した。
ＤＮＡ精製はＱｉａｇｅｎプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）にておこなった。インサートの確認はＥｃｏｒＩ制限酵素処理後７８３ｂｐのバンドを電気泳動ゲルに確認した。インサートを含むベクターをＥｃｏｒ１処理し、アガーロースにて電気泳動した。インサート部分を切り取り、あらかじめ、ＥｃｏＲ１、アルカリホスファターゼ処理したｐＥＦ−ＢＯＳベクター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．ｐＥＦ−ＢＯＳ，ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０；１８（１７）：５３２２．）とＴ４リガーゼをもちいてライゲーションをおこなった。ライゲーション産物を熱ショック法にてワンショット大腸菌（Ｏｎｅ  ｓｈｏｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴＯＰ  １０Ｆ‘）に遺伝子導入をおこなった。遺伝子導入された大腸菌はアンピシリン耐性となるので、アンピシリンを含む１％アガーにて一晩にて培養し、得られたコロニーをさらにアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養した。培養した大腸菌を集め，上記のＤＮＡ精製法にてベクターインサートを精製した。インサートの確認はＥｃｏｒＩ制限酵素処理後７８３ｂｐのバンドを電気泳動ゲルにて確認した。
リポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）２０μｌと精製したＰＥＦベクターインサート１μｇ、ハンクスバランストサルト液１ｍｌを混ぜ、あらかじめ２４ウエルに１ｘ１０５に調整したＢ３００−１９細胞にＦＲ−β遺伝子を導入した。遺伝子導入された細胞を、Ｇ４１８（１０００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ液にて培養し、増殖したＢ３００−１９細胞のＦＲ−βの発現をＩｇＭ型抗ＦＲ−β抗体にて確かめた。すなわち、Ｂ３００−１９細胞５ｘ１０５を０．１ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のＦＲ−β抗体と４℃で３０分反応させた。０．１％ＮａＮ３、１％胎児血清入りＰＢＳで３回細胞を洗った後、蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）と４℃で３０分反応させた。その後、０．１％ＮａＮ３、１％牛胎児血清入りＰＢＳで２回細胞を洗浄したのち、エピクスエリート（ＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ）にて細胞の蛍光を解析した。恒常的に葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）を発現するＢ３００−１９細胞が得られた。
実施例２
ＦＲ−β発現Ｂ３００−１９細胞１ｘ１０７をフロインド完全アジュバンドと混合し、７Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの背部３箇所、腹腔内に免疫した。さらに２週間後、Ｂ３００−１９細胞１ｘ１０７をフロインド不完全アジュバンドと混合し、腹腔内に免疫した。この免疫をさらに２−４回繰り返した。
単クローン抗体は、（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６）の方法またはその変形方法をもちいた。脾臓（および所望によりいくつかの大きなリンパ節）を取り出し、単一細胞に解離した。全ての解離した脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成し、ＨＡＴ選択中で培養した。培養上清のなかで、免疫原と反応するものを選んだ。
得られたハイブリドーマを限定希釈により平板培養し、所望の免疫化細胞−表面抗原に特異的に結合する（無関係の抗原には結合しない）抗体の生産についてアッセイした。次いで、選択された単クローン抗体分泌ハイブリドーマをインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）（例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維反応容器中）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）（マウスの腹水として）で培養した。さらに、培養上清を用い、抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラス抗体、抗マウスアイソクラスタイプ抗体をもちいたマウス  イムノグロブリン  アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で単クローン抗体のアイソタイプ、サブクラスを決定した。
その結果クローン３６はＩｇＧ２ａであり、クローン９４ｂはＩｇＧ１であった。抗体の反応性は実施例１に示したようにフローサイトメトリーにて解析した。図１は得られた抗体がＫＢ細胞には反応せず、ＦＲ−β遺伝子導入細胞に反応することを示す。フローサイトメーターによる解析（明細書参照）でＸ軸は細胞数を、Ｙ軸は細胞の蛍光強度を示す。ＩｇＧ型ＦＲ−β抗体（クローン３６）はＦＲ−β遺伝子導入Ｂ３００−１９細胞に反応（ａ）したが、ＦＲ−βを発現しないＢ３００−１９細胞には反応しなかった（ｂ）。さらに、ＦＲ−αを発現しているがＦＲ−βを発現していないＫＢ細胞（ｃ）には反応しなかった（ｄ）。
実施例３
２週間前にプリスチン０．５ｃｃを腹腔内に注射したマウスの腹腔内にハイブリドーマ細胞１ｘ１０７を注射し、２−３週後に腹水を得た。腹水０．５ｍｌをプロテインＧカラムに結合させ、１０倍量の燐酸バッァーで洗った後、２．５ｐＨグリシンバッファーで溶出した。トリスバッファーでｐＨを８．０に調整したのち、ＰＢＳで２４時間透析、その後溶液を濃縮した。腹水０．５ｍｌから１−２ｍｇのＩｇＧをえた。
実施例４
［大腸菌からのシュドモナス  エクソトキシンの調整］
シュドモナス  エクソトキシン（ＰＥ）を発現させるプラスミドｐＭＳ８−３８−４０２（Ｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ８Ｈ９（Ｆｖ）−ＰＥ３８  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ，ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４（４）：１４１９−２４）とその宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンと０．１ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む５ｍｌのＬＢ培地で、３７℃で１２−１５時間培養した。１２−１５時間後、５ｍｌの培地に２ＬのＬＢ培地を加え、波長６００ｎｍで吸光度が０．５に達するまで培養した。波長６００ｎｍで吸光度が０．５に達した時点で、ＩＰＴＧを濃度１ｍＭになるようにＬＢ培地に加え、９０分間さらに培養した。
培養終了後、細胞を回収して５０ｍｌの３０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４  ２０％  ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で細胞を懸濁し、氷中で１５分間放置した。その後、２，０００ｇで１５分遠心分離を行い、細胞を回収し、５０ｍｌの滅菌蒸留水で懸濁し、氷中で１５分間放置した。その後、１５，０００ｇで１５分遠心分離をして上澄みを集め、これを精製出発物質とした。
実施例５
ＰＥの精製は、ビジョン  ワークステーション（Ｖｉｓｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）液体クロマトグラフィーシステム（日本パーセプティブ社）を用いて行った。最初に２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で予め平衡化した強陰イオン交換樹脂カラム（ＰＯＲＯＳ  ＨＱ  Ｐｏｒｏｓ社製）に流速１０ｍｌ／分でＰＥ精製出発物質を吸着させ、過剰量の同緩衝液でカラムを洗浄した。次に、１ＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を用い、ＮａＣｌ濃度が０％から１００％への到達が１０分となるように設定し、流速１０ｍｌ／分、２ｍｌずつカラムからの溶出液を分取してＰＥを精製した。
分取サンプルの精製度の確認は、後述のラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）法のＳＤＳ電気泳動とＡＤＰリボシル化活性の検定により行った。精製後のＰＥサンプルは、さらに分子サイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ３０００  ＳＷ、東ソー）を用いて１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を流速０．３５ｍｌ／分、１ｍｌずつカラムからの溶出液を分取し、高純度のＰＥを精製した。
実施例６
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
ＳＤＳ電気泳動はラムリ（Ｌａｅｍｌｉ法）（Ｌａｅｍｍｌｉ−ＵＫ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７：６６８０−６８５）に準じて行った。すなわち、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む１０％ポリアクリルアミト゛の平板ゲルを用い、移動層には終濃度０．１％、１３０ｍＭのグリシンを含む２５ｍＭ  トリス緩衝液を用いた。各サンプルは等量の０．２％のＳＤＳを含む１００ｍＭ  トリス緩衝液ｐＨ６．５で調整し、５分間の煮沸処理を行った。煮沸後、平板ゲルにサンプルを投与し、３０ｍＡの定電流で電気泳動を展開させた。展開終了後、０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ（ナカライテスク社）溶液でゲルを染色し、７％の酢酸を含む１０％エタノールで脱色し、タンパク質を検出した。
実施例７
［ＡＤＰリボシル化活性検定］
キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）らの方法に準じた。（Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ．Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ５５３  ｉｓ  ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｅｄ  ｂｙ  ＮＡＤ  ａｎｄ  ｓｈｏｗｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  １４８  ｏｆ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８７；２６２（１８）：８７０７−１１）ＡＤＰ  リボシル化活性検定は、４５μｌの５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．５、４μｌの小麦胚芽エキス（プロメガ社製）、３７ｐＭの１４ＣＮＡＤ（０．０６μＣｉ）、４０ｍＭのＤＤＴ、１ｍＭのＥＤＴＡに、５μｌのＰＥ溶液（約０．１−１．２５μｇ）を加え、３７℃で１０分間反応させた。反応終了後、１０μｌのトリクロロ酢酸（ナカライテスク）を混和し、１５，０００ｇで３分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿物は５％のトリクロロ酢酸溶液の添加と遠心分離によってさらに洗浄した。洗浄後、液体シンチレーションカウンターで沈殿物の１４Ｃ放射能を測定し、ＡＤＰリボシル化活性の指標とした。
実施例８
［イムノトキシンの作製］
概ねハッサン（Ｈａａｓａｎ）らの方法に準じた。（Ｈａａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｋ１−ＬｙｓＰＥ３８ＱＱＲ，ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ａ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０００  Ｊ；２３（４）：４７３−９）
ヒトＦＲ−β抗原に対するＩｇＧ単クローン−抗体（クローン３６）とサクシニミヂルトランス−４−マレイミヂルメチシクロヘキサン１−カルボキシレート
（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｔｒａｎｓ−４−（ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌｍｅｔｈｙ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ  １−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、シグマアルドリッチ）（ＳＭＣＣ）のカップリングを行った。１００ｍＭ  リン酸緩衝液を用いタンパク質濃度３．０ｍｇ／ｍｌに調整した３６抗体溶液１ｍｌに対して１００μｇのＳＭＣＣを添加し、室温で１時間反応させた。
反応終了後、脱塩クロマトグラフィーカラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア）と１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を用いて剰余のＳＭＣＣを除去した。クローン３６抗体とＳＭＣＣのカップリング効率はＤＴＮＢ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ、シグマアルドリッチ）試薬を用い、４１２ｎｍの波長における吸光度を測定し、得られた値を１モルあたりのＤＴＮＢの分子吸光係数１３，６００で換算した。クローン３６抗体１分子に対し、２．８−３．１分子のＳＭＣＣがカップリングされた。
次に、ＰＥとサクシニミジル３−２−ピリヂルジチオプロピオナート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙ１３−２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ、シグマアルドリッチ）（ＳＰＤＰ）のカップリングを行った。１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を用いタンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整したＰＥ溶液１ｍｌに対して４００μｇのＳＰＤＰを添加し、４℃で１２−１５時間反応させた。
反応終了後、脱塩クロマトグラフィーカラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア）と１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を用いて剰余のＳＰＤＰを除去した。ＰＥとＳＰＤＰのカップリング効率は２−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ）を用い、３４３ｎｍの波長における吸光度を測定し、得られた値を１モルあたりのＳＰＤＰの分子吸光係数８，０８０で換算した。ＰＥ１分子に対し、１．２−１．５分子のＳＰＤＰがカップリングされた。
クローン３６抗体−ＳＭＣＣとＰＥ−ＳＰＤＰのカップリングは、３ｍｇの３６−ＳＭＣＣと６ｍｇのＰＥ−ＳＰＤＰを用いて行った。
まず、６ｍｇ相当のＰＥ−ＳＰＤＰ（１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）に１００μｇのトリス２−カルボキシエチルフォスフィン（ｔｒｉｓ−２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社）（ＴＣＥＰ）を加え、室温で２０分間反応させてＰＥ−ＳＰＤＰを活性化させた。
反応終了後、３ｍｇ相当のクローン３６抗体−ＳＭＣＣ（１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を、分子量１０，０００カットの遠心濃縮器（セントリコン１０、Ａｍｉｃｏｎ社製）中で混和し、最終タンパク質濃度が５−７ｍｇ／ｍｌとなるように４，８００ｇ４℃で遠心分離を行った。遠心分離後、タンパク質溶液を４℃で１５−１８時間反応させた。
反応終了後、脱塩クロマトグラフィーカラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア）と２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を用いてタンパク質溶液の置換を行い、イムノトキシンの精製出発物質を調製した。
イムノトキシンの精製は、前述のＰＥ精製に準じて行った。まず、予め２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）平衡化した強陰イオン交換樹脂カラム（ＰＯＲＯＳ  ＨＱ  Ｐｏｒｏｓ社製）に流速１０ｍｌ／分でイムノトキシン精製出発物質を吸着させ、過剰量の同緩衝液でカラムを洗浄した。次に、１ＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を用い、ＮａＣｌ濃度が０％から１００％への到達が１０分となるように設定し、流速１０ｍｌ／分、２ｍｌずつカラムからの溶出液を分取してイムノトキシンを精製した。
分取サンプルの精製の確認は、前述のラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）法のＳＤＳ電気泳動とＡＤＰリボシル化活性の検定により行った。精製後のイムノトキシンは、さらに分子サイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ３０００ＳＷ、東ソー）を用いて５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３，１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）で展開し、高純度のイムノトキシンを精製した。高純度のイムノトキシンは、さらに滅菌濾過器で処理した後、−８０度で保存した（最終濃度０．１−０．２ｍｇ／ｍｌ）。
図２はＴＳＫ−ＳＷ３０００による抗ＦＲ−β抗体イムノトキシンのゲルろ過クロマトグラフィーであり、Ｘ軸は溶出量、Ｙ軸の−●−はＯＤ２８０による蛋白濃度、−▲−はシュドモナス  エクソトキシンのＡＤＰリボシル化活性である。蛋白濃度の最初のピークは分子量が大きく、抗体あるいはトキシンの結合した抗体と考えられる。次のピークは分子量がより小さく，トキシンと考えられる。いずれのピークにもＡＤＰリボシル化活性がみられた。
図３はＦＲ−β抗体イムノトキシン（ＩＴ）、ＦＲ−β抗体（ｍＡＢ）、シュドモナス  エクソトキシン（ＰＥ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、それぞれ抗ＰＥ抗体、抗マウスＩｇＧ抗体でウエスタンブロットを行った結果である。ＩＴにおいてのみ、６６ｋＤａから２００ｋＤａに両抗体に反応するバンドがみられた。
実施例９
実施例１にてＢ３００−１９細胞にＦＲ−βを恒常的に発現させた細胞をもちいた。イムノトキシンの傷害能はプロピジウムイオジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｕｍ）とＤＮＡの結合をフローサイトメーターにて測定した。（Ｎｉｃｏｌｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９１；１３９（２）：２７１−９）具体的には種々な時間、Ｂ３００−１９細胞（２ｘ１０５／ｍｌ）と種々な濃度のＦＲ−β抗体イムノトキシンにて培養した。Ｂ３００−１９細胞をＰＢＳにて１回洗浄し、細胞ペレットにプロピジウムイオジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｕｍ）（４０μｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを加え、室温にて１晩反応させ後、細胞の蛍光強度をフローサイトメーターにて測定した。プロピジウム  イオジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｕｍ）に低染色性の細胞を死細胞とし、蛍光強度をフローサイトメーターにて測定した。測定結果を図４に示した。
図４はＢ３００−１９細胞と種々の濃度のＦＲ−β抗体イムノトキシン（Ｘ軸に示す）を混ぜ、２４時間、３６時間、４８時間後の細胞死の割合（Ｙ軸に示す）を示したものである。図４は４回の実験の平均値で、バーはＳＤを示す。
実施例１０
ＦＲ−βのｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳベクターに組み込み、熱ショック法にて大腸菌に遺伝子導入し、一晩でコロニーを増殖させ、アンピシリン耐性のインサート陽性クローンを選んだ。陽性クローンをＬＢ培地２ｍｌで増殖させ、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）にてｃＤＮＡを精製した。
プラスミドから制限酵素ＸｂａＩ処理にてＦＲ−β遺伝子を分離、エタノール沈殿後、ＤＮＡブランチングキット（ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ）（ＴＡＫＡＲＡ）をもちいてＦＲ−β遺伝子を平滑末端化し、電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてゲルから抽出した。フェノール／クロロホルム抽出後エタノール沈殿し、沈殿を水に溶かした。
インサートとコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔをライゲーションし、エタノール沈殿させた。この混合物をＳｗａＩで切断した。切断したものをギガパック３ゴールドパッキング  エクストラクト（Ｇｉｇａｐａｃｋ３Ｇｏｌｄ  ＰａｃｋｉｎｇＥｘｔｒａｃｔ）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）をもちいて大腸菌ＤＨ５αに感染させた。この大腸菌をアンピシリン含有寒天プレートに巻き、コロニーをピックアップし，アンピシリン含有ＬＢ培地１０ｍｌで培養し、アルカリ溶解法にてプラスミドを回収しＰＥＧ沈殿をおこなった。
沈殿を水に溶かし、制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩをもちいて電気泳動によりインサートの向きと構造を確認した。順向き、逆向きのインサート入りコスミドをアンピシリン含有ＬＢ培養液２１にて培養し、ラージコンストラクションキットＬａｒｇｅ  Ｃｏｎｓｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にて多量精製した。
アデノウイルス  エクプレション  ベクター  キット（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ）（ＴＡＫＡＲＡ）に準じ、生成物をカルシウム燐酸法セルフェクト  トランスフェクション  キット（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて制限酵素処理済みＤＮＡ−ＴＰとコトランスフェクションした。簡単にはｐＡｘＣＡｗｔ９μｌ（８．１μｇ）とＤＮＡ−ＴＰＣ１０μｌ（７μｇ）を１０１１のＤ．Ｗ．を混ぜ、カルシウム燐酸法にて、３，５ｍｌファルコンデッシュに８０％コンフルエントに培養したＬ２９３細胞に遺伝子導入した。
２４時間後にＬ２９３細胞をそのままの細胞濃度、１０倍希釈細胞濃度、１００倍希釈濃度に調製し、９６ウエルに移し、約２０日間培養した。死細胞の培養上中に、細胞内で組換えが起こった組換えアデノウイルスがえられた。１０倍希釈，１００倍希釈のウエルの組換えコスミドの確認は細胞を％ＳＤＳで処理し，フェノール／クロロフォルム処理後、ＸｂａＩ，ＢａｍＨＩ制限酵素でコスミドを切断し、１％アガーゲルにてそれぞれ、７６８ｂｐ、１７０３ｂｐのインサートの存在を確認した。
インサートの確認できた培養上清を凍結融解を５回行ない、３０００ｒｐｍで１０分遠心後、上清を得た。その上清をＬ２９３細胞を８０％コンフルエントに培養した２００ｍｌフラスコにくわえ，４日後に死細胞ウェルから上清を得た。同様の操作を繰り返し、高力価のウイルスを得た。
ウイルスの力価の測定は５０％テッシュカルチャーインフェクシャス  ドーズ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｏｓｅ）測定法によった（Ｐｒｅｃｉｏｕｓ，Ｂ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ  Ｗ．Ｃ．（１９８５）ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ｅｄ．Ｍａｈｙ，Ｂ．Ｗ．Ｊ．（ＩＲＬ  Ｏｘｆｏｒｄ），ｐｐ．１９３−２０５）。
実施例１１
健常人をヘパリン入り注射器５０ｍｌ（２００）にて静脈から採血し、血液をＰＢＳにて３倍に希釈した。１５ｍｌのファイコール／ハイパーク入り５０ｍｌチューブに希釈血液を重層し、室温、３０００ｇ１５分に有核細胞を分離した。
上層をあつめ、ＰＢＳを加え、２０００ｇにて５分遠心し、上清を捨て、ペレットをほぐし、ＰＢＳを加え、１０００ｇにて５分遠心した。ペレットをほぐし、１ｘ１０６／ｍｌに調整し、ファルコンデッシュにて３０分培養、ＰＢＳで１０回培養後、リバーポリスマンにて付着細胞をはがした。遠心後、ＤＭＥＭに１ｘ１０６に調整し，再びデッシュに付着させ，同様に付着細胞をえた。付着細胞はＭ−ＣＳＦにて２４時間培養後、ＭＯＩ１００の濃度にてアデノウイルスベクター葉酸リセプターベータ、アデノウイルス逆向きの葉酸リセプターベータを感染させた。
感染実験はウイルス上清を加え、３７℃１時間３０００ｇにておこなった。
５ｘ１０６／ｍｌに調整し７２時間培養した。また，感染細胞にＦＲ−β抗体，ＦＩＴＣ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を順次加え，陽性細胞をフローサイトメーターにて測定した。
図５にセンスＦＲ−βアデノベクター導入によるマクロファージのＦＲ−β発現を示した。
図５（ａ）はセンスＦＲ−β遺伝子を導入し、ＦＲ−β抗体、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体を反応させ、図５（ｂ）はアンチセンスＦＲ−β遺伝子を導入し、ＦＲ−β抗体、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体と反応させた。蛍光強度はフローサイトメトリーにて測定した。Ｘ軸は蛍光強度、Ｙ軸は細胞数である。
実施例１２
１ｘ１０６／ｍｌに調整したマクロファージを１ウエル１ｍｌにて２４ウルデッシュで培養、加えたＦＲ−β抗体イムノトキシンの濃度と、細胞死の測定は実施例６と同様におこなった。図６にＦＲ−β抗体イムノトキシンによるＦＲ−β発現マクロファージの細胞死を示した。
図はセンスＦＲ−β遺伝子を導入したマクロファージと種々の濃度のＦＲ−β抗体イムノトキシン（Ｘ軸）を混ぜ、７２時間後の細胞死の割合から、アンチセンスＦＲ−β遺伝子を導入したマクロファージと種々の濃度のＦＲ−β抗体イムノトキシンを混ぜ、７２時間後の細胞死の割合の差（Ｙ軸）を示したものである。プロピジウムイオジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｕｍ）に低染色性の細胞を死細胞とし、蛍光強度をフローサイトメーターにて測定した。図の値は４名の健常人のマクロファージからえられた実験の平均値で、バーはＳＤを示す。
実施例１３
関節リウマチ患者の膝関節置換術時得られた滑膜から、滑膜細胞を精製した。先ず滑膜を５ｍｍほど細切し、３０ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼタイプ５を含むＤＭＥＭで３７℃３０分処理した。ステンレスメッシュでデブリスをのぞいたのち、等量のＤＭＥＭを追加し、ファイコール／ハイペーク比重遠心法にて室温、１５分２０００ｇにて遠心分離し、上層を集め、２倍量のＤＭＥＭを加え、１５００ｇ、１０００ｇ遠心し滑膜有核細胞をえた。
１ｘ１０７の細胞をファルコンデッシュに加え、３７℃３０分培養し、ＰＢＳにて１０回洗浄し、付着胞を得た。付着細胞をデッシュから，ラバーポリスマンにてはがし、５０ｍｌチューブに集めた。上記の細の付着を繰り返した後、５０ｍｌチューブを１０００ｇで遠心した。１ｘ１０６／ｍｌの細胞濃度に調整し、１０％ヒト血清、１０％牛胎児血清入りＤＭＥＭにて培養した。イムノトキシンを加えたもののコントロールとして抗体とトキシンを等量加えたものを用いた。７２時間後の細胞のアポトーシスを上記の方法にて測定した。
図７に関節滑膜細胞がＦＲ−βを発現していることを示した。関節リウマチ滑膜細胞をＦＲ−β抗体（ａ）、ＣＤ１４抗体（ｂ）、ＤＲ抗体と反応させ、その後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体と反応させた。蛍光強度はフローサイトメーターにて測定した。Ｘ軸は細胞数、Ｙ軸は蛍光強度を示す。４０％以上の関節リウマチ滑膜細胞にＦＲ−βの発現がみられた。
図８にＦＲ−β抗体イムノトキシンによる関節リウマチ滑膜細胞の細胞死を示した。図８は関節リウマチ滑膜細胞と種々の濃度のＦＲ−β抗体イムノトキシン（Ｘ軸）を混ぜ、７２時間後に生じた細胞死の割合から、関節リウマチ滑膜細胞とＦＲ−β抗体、トキシンの等分子量混合物（Ｘ軸）を混ぜ，７２時間後に生じた細胞死の割合の差（Ｙ軸）示したものである。プロピジウムイオジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｕｍ）に低染色性の細胞を死細胞とし、蛍光強度をフローサイトメーターにて測定した。図８の値は関節リウマチ６症例から得られた実験の平均値で、バーはＳＤを示す。
実施例１４
ハイブリドーマ細胞５−１０×１０６にＴＲＩＺＯＬ（ｒ）ＬＳ反応液０．７５ｍｌを加え１５℃から３０℃で５分間置いた。さらに、トリゾールＬＳ反応液０．７５ｍｌあたり０．２ｍｌクロロホルムを加え、撹拌後１５℃から３０℃で２から１５分間置いた。１２０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、最上部の透明層のみを別チューブに移した。
その溶液にトリゾール（ｒ）ＬＳ反応液０．７５ｍｌあたり０．５ｍｌのイソプロピルアルコール液を加え、１５℃から３０℃で１０分間置いた。１２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を捨て、トリゾール（ｒ）ＬＳ反応液０．７５ｍｌあたり１ｍｌの７５％エタノールを加え、７５００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨てた。この過程を繰り返し、その後サンプルを乾燥させた。完全に乾燥する前に１０μｌのＤＮａｓｅ，Ｒｎａｓｅなしの滅菌蒸留水を加えた。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇ／μｌとなるようにＤｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅなしの滅菌蒸留水を加え、その内５μｌに１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １μｌとＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー（０．５μｇ／μｌ）１μｌを加えて６５℃５分インキュバートし、その後氷中に１分間静置、それに１０×ＲＴ緩衝液２μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ、ＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ  ２μｌを加え、４２℃２分間インキュベートし、トランスクリプターゼ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ２ＲＴ）μｌを加え７０℃１５分間インキュベートし、氷中に２分、最後にＲｎａｓｅ  Ｈ  １μｌを加え３７℃２０分間インキュベートし、ｃＤＮＡを得た。
Ｉｇ−プライムキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）と、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１ｕｎｉｔ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各５０μＭ、トリス塩酸（ｐＨ９．０）４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２２１．５ｍＭを含むリアクション  チューブ１３本にそれぞれｃＤＮＡ  １μｌを入れ、Ｈ鎖、Ｌ鎖の遺伝子５‘プライマー０．５μｌと３’プライマー０．５μｌづつ加えた。
ＰＣＲは１：９４℃  １分、２：５０℃１分、３：７２℃２分を２７サイクル行い、７２℃６分のファイナル  エクステンション（ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）をおこなった。クローン３６、クローン９４ｂのＨ鎖の塩基配列決定のための５’プライマーはＭｕＩｇＶＨ５’−Ｂ、３’プライマーはＭｕＩｇＶＨ３’−２を、Ｌ鎖の塩基配列決定のための５’プライマーはＭｕＩｇκＶＬ５’−Ａ，３’プライマーはＭｕＩｇκＶＬ３’−１を使用した。ＰＣＲ産物２．５μｌにソルト溶液（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５ｕｎｉｔ）滅菌蒸留水１μｌ，１．５μｌ、ｐＣＲ（ｒ）２−ＴＯＰＯ（ｒ）ベクター１μｌを加え２２℃５分間インキュベートし、その内２μｌをＯｎｅ  ｓｈｏｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ  １０Ｆ‘）に加え、氷中３０分、熱ショック４２℃３０秒後氷中２−５分、３７℃に温めたＳ．Ｏ．Ｃメジウム２５０μｌを加え、シェーカーで３７℃１時間インキュベートした。その間にＬＢプレートを３７℃に温め、サンプルにＸ−ｇａｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）４０μｌ、ＩＰＧＴ（２０ｍｇ／ｍｌ）４０μｌを加え、それを３．５ｍｌ  ＬＢ寒天培地に混ぜてＬＢプレートの上に撒き、３７℃１晩培養した。
ＬＢ培地２ｍｌにアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）１μｌを加え、そこにプレート上より採取した白いコロニーを入れ、３７℃で１晩培養した。ＤＮＡ精製はＱｉａｇｅｎプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）にておこなった。
塩基配列はビッグ  ダイ  ターミナーターＶ３．１サイクルシークエンシング  キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＶ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にておこなった。すなわち、精製したＤＮＡ溶液（２５μｌ）より５．３μｌとり、レーデー反応ミックス（Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）４μｌを加え、さらにＭ１３ＲプライマーまたはＴ７プライマー０．７μｌを加えた。
ＰＣＲは１：９６℃  １０秒，２：５０℃  ５秒，３：６０℃  ４分で２５サイクル行い、最後に４℃においた。ＰＣＲ産物１０μｌに３Ｍ酢酸Ｎａ  １μｌと１００％エタノール１０μｌを加え、−２０℃で２０分間置き、１５０００ｇ４℃１０分間で遠心分離した後、上清を捨て、７０％エタノール１８０μｌを加え攪拌し、１５０００ｇ  ５分間４℃で遠心分離した後、上清を捨てＤＮＡを乾燥させた。ＤＮＡにテンプレート抑制溶液（Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）１５μｌを加え攪拌し、遠心フラッシュ、攪拌、再度遠心フラッシュし、９９℃５分間インキュベートし、氷中におき、ＡＢＩ３１０シーケンサーにて塩基配列を解析した。
実施例１５
［免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入］
クローン９４ｂの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域（ＶＨ）の６３番目のアミノ酸グリシン（塩基配列ｇｇｃ）をシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異させるようにデザインしたプライマー（ｃａｇａｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｔｇｇａａｇ，ｃｔｔｃｃａａｔｃｃａｃｔｃｃａｇａｃａｃｔｇｔｔｃａｇｇｃｃｔｃｔｇ）を用い、クイックチェンジサイトデレクテッド変異誘発キット（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使って、実施例１４で得たクローン９４ｂのＶＨを含むプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ／９４ｂＶＨに変異誘発処理を施した。
このＰＣＲ反応は、反応液を９５℃で３０秒処理した後、９５℃３０秒、５５℃１分、６８℃４分のサイクルを１２回おこなった。
次に、反応後のＤＮＡを大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔｓ  ｃｅｌｌ）に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドをＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出した。さらに、Ｍ１３  リバースプライマー（ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃ）と塩基配列決定キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をもちい、ＡＢＩ３１０シーケンサーにて塩基配列を決定し、６３番目のグリシン（塩基配列ｇｇｃ）がシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異したことを確認した。
実施例１６
［ｐＲＫ７９／ＰＥ３８ベクターに変異を導入した免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域を挿入］
次に、ＰＥ３８遺伝子を含むｐＲＫ７９ベクター（ＰＲＫ７９／ＰＥ３８）に、クローン９４ｂの変異を導入したＶＨの挿入を以下の方法にておこなった。
変異を導入したクローン９４ｂのＶＨの５’末端（ＦＲ１）と３’末端（ＪＫ）のアニーリングプライマーとして、ｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇｇａｇｇｔｔｃａｇｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃとｇｃｃｃｔｃｇｇｇａｃｃｔｃｃｇｇａａｇｃｔｔｔｔｇａｇｇａｇａｃｔｇｔｇａｇａｇｔｇｇをそれぞれデザインした。ＦＲ１アニーリングプライマーには制限酵素ＮｄｅＩ部位があり、この部位でのクローニングにより、同部位中のａｔｇを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。ＪＫアニーリングプライマーでは、ＪＫアニーリング配列の次にａを配置し、続いて制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位がくるようにデザインしてあり、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位でクローニングすると、クローンＶＨとｐＲＫ７９ベクター上のＰＥ３８が一致したフレームで連結することを可能である。
これらのプライマーの組み合わせとＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使って、変異を導入したｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ／９４ｂＶＨプラスミドにＰＣＲを行った。
このＰＣＲ反応は、９５℃４分を１サイクルした後、９５℃１分、５４℃１分、７２℃１分のサイクルを３０回、次に７２℃１０分を１サイクルおこなった。
次に、ＰＣＲ産物を電気泳動し、ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ゲルから目的の大きさのＤＮＡを回収し、さらに、回収産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断した。制限酵素処理した変異導入ＶＨと同じ制限酵素で処理したｐＲＫ７９／ＰＥ３８を混ぜ、ライゲーションハイ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ）（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて１６℃で一晩ライゲーション反応を行った。
次に、ライゲーション産物を大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に遺伝子導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で形質転換体を選択した。
形質形質転換体のＤＮＡをＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出し、プラスミドの塩基配列を、Ｔ７プロモータープライマー（ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ）と塩基配列決定キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をもちい、ＡＢＩ３１０シーケンサーにて塩基配列を決定し、変異導入ＶＨの塩基配列がｐＲＫ７９ベクター上のＴ７プロモーター下流領域とＰＥ３８塩基配列に連結していることを確認した。
実施例１７
［免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入］
クローン９４ｂの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域（ＶＬ）の１２５番目のアミノ酸グリシンをシステインに変異させ、変異導入ＶＬをｐＲＫ７９ベクターに挿入することを目的に以下のことをおこなった。５‘末端のアニーリングプライマーとして、ｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇｔｃａｃａａｔｃをデザインした。このプライマーは制限酵素ＮｄｅＩ部位を含むため、この部位でクローニングすることにより、ａｔｇを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。
３’末端（ＪＫ）のアニーリングプライマーとして、
ｇｃｔｔｔｇｔｔａｇｃａｇｃｃｇａａｔｔｃｃｔａｔｔｔｇａｔｔｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃａｃａａｃｃｇａａｃｇｔをデザインした。このプライマーは１２５番目のグリシン（ｇｇａ）をシステイン（ｔｇｔ）に変異させ、終始コドンｔａｇに続いて制限酵素ＥｃｏＲＩ部位がくるようにデザインしてある。これらのプライマーとＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使って、実施例１４で得たクローン９４ｂのＶＬを含むプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ／９４ｂＶＬにＰＣＲを行った。
このＰＣＲ反応は、９５℃４分を１サイクルした後、９５℃１分、５４℃１分、７２℃１分のサイクルを３０回、次に７２℃１０分を１サイクルである。
実施例１８
［ｐＲＫ７９ベクターに変異免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域を挿入］
ＰＣＲ産物を電気泳動し、ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ゲルから目的の大きさのＤＮＡを回収した。
回収ＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断し、同じ酵素で切断したｐＲＫ７９プラスミドとまぜ、ライゲーションＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて１６℃で一晩ライゲーション反応を行った。次に、ライゲーション産物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で形質転換体を選択した。
形質転換体から、ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）によりプラスミドを抽出し、Ｔ７プロモーター（ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ）と塩基配列決定キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をもちい、ＡＢＩ３１０シーケンサーにて塩基配列を決定し、変異導入ＶＬの１２５番目のグリシン（ｇｇａ）がシステイン（ｔｇｔ）に変異していることやｐＲＫ７９ベクター上のＴ７プロモーター下流領域に連結していること、ＪＫ配列の次に終始コドンｔａｇが配置されていることを確認した。
実施例１９
［リコンビナント蛋白封入体の調製］
上記の変異導入ＶＨを組み込んだプラスミドｐＲＫ７９／ＰＥ３８、変異導入ＶＬを組み込んだプラスミドｐＲＫ７９を５０ｎｇ用い、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３λ）に遺伝子導入した。
遺伝子が導入された大腸菌の選抜は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で３７℃、１５−１８時間の培養で行った。
選択培養終了後の大腸菌は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含む５００ｍｌのスーパーブロース（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）培地で３７℃で、波長６００ｎｍで吸光度が０．６に到達するまで培養した。
さらに、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｒｉｏｓｉｄｅ）１ｍＭを加え、３７℃で９０分間培養した。  培養終了後の大腸菌は、遠心分離で回収した後、５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を用いて懸濁し、同緩衝液で最終容量２０ｍｌに調整し、ホモゲナイザーに移した。ホモゲナイザーに移した大腸菌懸濁液２０ｍｌに、最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌとなるように卵白リゾチームを添加し、室温で１時間反応させて大腸菌体成分を破壊した。破壊後、２．５ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌ溶液と２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液をそれぞれ加え、ホモゲナイズした後、室温で６０分反応させた。反応終了後、２０，０００ｘｇ、４℃で遠心分離を行って沈殿物を回収した。
回収した沈殿物は、２０ｍｌの同トリス緩衝液で再懸濁し、２．５ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌ溶液と２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液をそれぞれ加えてホモゲナイズ後、２０，０００ｘｇ、４℃で遠心分離を行い、沈殿物を回収した。この作業を８回繰り返した後、２０ｍｌの同トリス緩衝液で再懸濁し、ホモゲナイズ後、２０，０００ｘｇ、４℃で遠心分離し、沈殿物を回収した。この作業を５回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、６Ｍ  グアニジン塩酸塩を含む）で溶解させ、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌとなるように同緩衝液で調節し、−８０℃で保存した。
実施例２０
［リコンビナント二重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体の作成］
−８０℃で保存したリコンビナント蛋白封入体溶液を、室温にて融解後、０．５ｍｌのＶＨ、０．２５ｍｌのＶＬを、それぞれ別個の１．５ｍｌチューブに移した。次にジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度１０ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、室温で４時間の還元処理を行った。還元処理後、０．５ｍｌのＶＨと０．２５ｍｌのＶＬを混和し、７５ｍｌの０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０，０．５Ｍ  アルギニン、０．９ｍＭ  酸化型グルタチオン、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）に溶解させた。この溶液を１０℃で４０時間放置する事によってＶＨとＶＬを結合させた。結合終了後の溶液は、分子量１０，０００カットの遠心濃縮器（セントリコン１０、Ａｍｉｃｏｎ社）を用いて５ｍｌまで濃縮し、さらに５０ｍｌの蒸留水で希釈した。この希釈駅をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
実施例２１
［リコンビナント二重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体の精製］
最初に、２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で予め平衡化した強陰イオン交換樹脂カラム（Ｈｉ−ｔｒａｐ  Ｑアマシャム・ファルマシア社）に、３０ｍｌ／時間の流速で上記精製出発物質を吸着させ、２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で吸光度２８０ｎｍで０．００５以下になるまで洗浄した。次に、０．３ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で溶出させた。溶出後、２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）中で透析／脱塩を行った。
次に、パーヒュージョンクロマトグラフィーシステム（アプライドバイオシステム）、と強陰イオン交換樹脂カラム（ＰＯＲＯＳ  ＨＱ  Ｐｏｒｏｓ社製）を用い、さらに精製した。２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で予め平衡化したカラムに、透析した精製物質を１０ｍｌ／分の流速で吸着させた。吸着後、同緩衝液でカラムを洗浄後、リコンビナントイムノトキシンをＮａＣｌの濃度勾配（０Ｍから１Ｍへの到達が１０分となるように設定）によって精製した。カラムからの溶出液を２ｍｌずつ分取し、精製度の高い画分を精製リコンビナントイムノトキシンとした。精製度の確認は、後述のＬａｅｍｍｌｉ法のＳＤＳ電気泳動により行った。
実施例２２
［エンドトキシン除去］
精製後のリコンビナントイムノトキシンのエンドトキシン除去は、パーヒュージョンクロマトグラフィーシステム（アプライドバイオシステム）と分子サイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ３０００  ＳＷ、東ソー社）を用いて行った。まず、クロマトグラフィーシステムおよび分子サイズ排除クロマトグラフィーカラムの洗浄７５％の消毒用エタノールで４８時間行い、その後、日本薬局方注射用蒸留水（大塚製薬）でさらに洗浄した。蒸留水で洗浄後、日本薬局方生理食塩液（大塚製薬）で分子サイズ排除クロマトグラフィーの平衡化を行った。平衡化終了後、精製後のリコンビナントイムノトキシンを分子サイズ排除クロマトグラフィーに投与し、流速０．２５ｍｌ／分でカラムからの溶出液を分取した。精製後の高純度リコンビナントイムノトキシンは、さらに滅菌濾過器で処理し、一部をタンパク質濃度の定量に用い、残りを−８０℃で保存した。この方法で７．５ｍｇのリコンビナントイムノトキシン封入体より０．１５ｍｇのエンドトキシンを除去した高純度リコンビナントイムノトキシンが得られた。
実施例２３
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
ＳＤＳ電気泳動はラムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）法に準じて行った。すなわち、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む１０％ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動層には終濃度０．１％、１３０ｍＭのグリシンを含む２５ｍＭ  トリス緩衝液を用いた。各サンプルは等量の０．２％のＳＤＳを含む１００ｍＭ  トリス緩衝液ｐＨ６．５で調整し、５分間の煮沸処理を行った。煮沸後、平板ゲルにサンプルを投与し、３０ｍＡの電流で電気泳動を展開させた。展開終了後、０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ溶液でゲルを染色し、７％の酢酸を含む１０％エタノールで脱色し、タンパク質を検出した。
図９はリコンビナント２重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動像を示したものである。リコンビナント二重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥキメラ抗体（分子量６０ｋＤａ．）は還元することにより、ＶＨ―ＰＥ（５０ｋＤａ．）とＶＬ（１０ｋＤａ．）にそれぞれ分解した。レーンの左から順に、ＶＬタンパク質、リコンビナント二重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体（ＩＴ）、ＶＨ―ＰＥ融合タンパク質を還元条件で電気泳動した図、分子量マーカー（Ｍｒ）、非還元条件でのリコンビナント二重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体（ＩＴ）を示す。
実施例２４
［ＦＲ−β発現ＨＬ−６０細胞の作成］
実施例１で得られたＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ／ＦＲ−βを制限酵素ＥｃｏＲ１で処理、同じ制限酵素処理したベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混ぜ、ライゲーシン反応をおこなった。また、ヒト急性骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０細胞に実施例１と同様な方法で遺伝子導入をおこない、ＦＲ−β発現ＨＬ−６０細胞株を得た。
実施例２５
［リコンビナント２重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体の作用］
リコンビナント２重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体がＦＲ−β発現Ｂ３００−１９細胞株、ＦＲ−β発現ＨＬ−６０細胞株に細胞傷害を  誘導するか否かについて、実施例８と同様な測定を行った。図１０は、ＦＲ−β発現Ｂ３００−１９細胞と種々の濃度のリコンビナント２重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥキメラ抗体を混ぜ、２４時間、３６時間、４８時間後の細胞死の割合（Ｙ軸に示す）を示したものである。図１０は３回に実験の平均値でバーはＳＤを示す。
図１１は、ＦＲ−β発現ＨＬ−６０細胞株と種々の濃度のリコンビナント２重鎖Ｆｖ抗ＦＲ−βＰＥ抗体を混ぜ、２４時間、４８時間、７２時間後の細胞死の割合（Ｙ軸に示す）を示したものである。図１１は３回に実験の平均値でバーはＳＤを示す。
【図１】
0004943144.tif 000002
【図２】
0004943144.tif 000003
【図３】
0004943144.tif 000004
【図４】
0004943144.tif 000005
【図５】
0004943144.tif 000006
【図６】
0004943144.tif 000007
【図７】
0004943144.tif 000008
【図８】
0004943144.tif 000009
【図９】
0004943144.tif 000010
【図１０】
0004943144.tif 000011
【図１１】
0004943144.tif 000012
【配列表】
0004943144000001.xml