(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物依存症に有効な化合物のスクリーニング方法であって、
(1)配列番号１の塩基配列を有する遺伝子、及び配列番号４の塩基配列を有する遺伝子からなる群より選択される遺伝子（対象遺伝子）を発現する細胞を用意するステップ、
(2)前記細胞に試験化合物を曝露するステップ、
(3)試験化合物の曝露後の前記細胞における、前記対象遺伝子の発現量を測定するステップ、
(4)試験化合物の曝露による、前記対象遺伝子の発現量変化を求めるステップ、を含むスクリーニング方法。
【請求項２】
薬物依存症に有効な化合物のスクリーニング方法であって、
(i)非ヒト動物を用意するステップ、
(ii)前記非ヒト動物に試験化合物を投与するステップ、
(iii)試験化合物の投与後、前記非ヒト動物の中枢神経系組織内における、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子、及び配列番号４の塩基配列を有する遺伝子からなる群より選択される遺伝子（対象遺伝子）の発現量を測定するステップ、
(iv)試験化合物の投与による、前記対象遺伝子の発現量変化を求めるステップ、
を含むスクリーニング方法。
【請求項３】
前記非ヒト動物が、薬物依存症のモデル動物である、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記対象遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子であり、
前記非ヒト動物がマウスである、請求項２又は３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
a)対象から採取された生体試料を用意するステップ、
b)配列番号４の塩基配列を有する遺伝子の前記生体試料中の発現量を測定するステップ、
を含む、薬物依存症診断用の情報を取得する方法。
【請求項６】
配列番号１又は４の塩基配列を有する単離された核酸を含む薬物依存症研究用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な精神障害関連遺伝子の医療分野及び研究分野での利用に関する。詳しくは、新規な精神障害関連遺伝子を利用したスクリーニング方法、抗精神障害薬などを本発明は提供する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化が進みつつある現在、精神障害の患者数は今後も増加することが確実とみられている。また、社会構造が変化し「ストレスの時代」といわれるようになった現代は、子供から大人まで日常的に様々なストレスに晒されており、ストレスが原因の精神異常は特定の年齢層の問題ではない。一方、覚醒剤などに関する依存症、即ち薬物依存症は大きな社会問題となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような中、統合失調症や薬物依存症など精神障害の治療法の開発は極めて緊急な課題である。しかしながら抜本的な治療法は確立されるに至っていない。ところで、適切な治療処置を行うためには、罹患の有無、病態などを正確且つ客観的に判定ないし把握することが重要である。ところが現状では、精神障害の診断は患者自身の申告に依るところが大きいため、正しい診断が行えない場合も少なくない。また、病態が多様であるために時として適切な処置の選択に誤ることも経験的事実の示すところである。一方、事前に罹患リスクを評価できれば、予防措置を講じることによって患者数の大幅な減少を望め、医療界への貢献度は計り知れない。また、精神障害の発症及び進行機構は不明な点が多く、今後の研究成果の蓄積が期待されている。
本発明は以上の課題に鑑み、精神障害の治療や診断に有用な手段を提供することを目的の一つとする。治療用途に関しては特に、精神障害に対する薬剤候補を選抜する方法を提供することで、治療法の確立に貢献することを目的とする。診断用途に関しては特に、罹患の有無の判定、病態の把握、さらには罹患リスクの評価などを可能とする手段を提供することを目的とする。また本発明は、精神障害の治療に直接的に有効な手段を提供することも目的の一つとする。さらに本発明は、精神障害の原因究明など、研究目的において有効な研究ツールを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
以上の目的の下、本発明者らは精神障害に関与する遺伝子を同定することを試みた。まず、薬物依存に伴う精神障害を呈するマウスを用意し、精神障害の発現と関連する遺伝子を選抜することにした。ここに、メタンフェタミンを投与されたマウスは運動量過多を示すが、連日投与を行うと、運動量の増加の程度が増加してくる。これを薬物依存に伴う精神障害と捉えることができる。このマウスの側坐核において発現量が際だって増加している遺伝子を検索した。その結果、新規な三つの候補遺伝子を見出すに至った。さらに研究を進めた結果、これらの遺伝子の発現量と薬物依存症に特徴的な症状との間に明かな関連を認め、当該三つの遺伝子が精神障害に関連する遺伝子であることが確認された。即ち、精神障害に関連する新規な遺伝子を同定することに成功した。これによって、当該遺伝子をターゲット分子とした、精神障害に対する薬剤の開発が可能となり、一方で精神障害の発症及び進行機構の究明に向けた研究も可能となる。
本発明者らは更に、同定に成功した遺伝子についてヒト相同遺伝子が存在するとの予測の下、公共のデータベースを用いてホモロジー検索を実施した。その結果、各遺伝子に対するヒト相同遺伝子の存在を確認した。即ち、本発明者らは精神障害に関連すると考えられるヒト遺伝子の同定にも成功した。これらの遺伝子は精神障害の治療又は診断（発症リスク診断も含む）において、或いは精神障害に対する薬剤の開発や精神障害の発症又は進行機構の究明においてその利用が図られるものであり、有用性は非常に高い。
本発明は主として以上の成果ないし知見に基づくものであり、次の構成を提供する。即ち、本発明の第１の局面は精神障害に有効な化合物のスクリーニング方法であって、(1)配列番号１の塩基配列を有する遺伝子、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子、配列番号３の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの相同遺伝子からなる群より選択される遺伝子（対象遺伝子）を発現する細胞を用意するステップ、(2)前記細胞に試験化合物を曝露するステップ、(3)試験化合物の曝露後の前記細胞における、前記対象遺伝子の発現量を測定するステップ、及び(4)試験化合物の曝露による、前記対象遺伝子の発現量変化を求めるステップを含むことを特徴とする。
本発明の一態様では、動物個体を用いたスクリーニング方法が提供される。当該スクリーニング方法は、(i)非ヒト動物を用意するステップ、(ii)前記非ヒト動物に試験化合物を投与するステップ、(iii)試験化合物の投与後、前記非ヒト動物の中枢神経系組織内における、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子、配列番号３の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの相同遺伝子からなる群より選択される遺伝子（対象遺伝子）の発現量を測定するステップ、及び(iv)試験化合物の投与による、前記対象遺伝子の発現量変化を求めるステップを含むことを特徴とする。
本発明の一態様では非ヒト動物として、精神障害の病態を呈する非ヒト動物が使用される。
本発明のスクリーニング方法において非ヒト動物として例えばマウスが使用される。この場合、列番号１の塩基配列を有する遺伝子、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子、又は配列番号３の塩基配列を有する遺伝子が検出対象の遺伝子となる。
本発明のスクリーング方法はその好適な一形態において、薬物依存症に有効な化合物を選抜・同定することを目的とする。
本発明の他の局面は、精神障害関連遺伝子の診断用途への適用に関する。この局面では、精神障害診断用の情報を取得する方法が提供される。当該方法は、a)対象から採取された生体試料を用意するステップ、及びb)配列番号４の塩基配列を有する遺伝子、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子、配列番号６の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの天然変異体からなる群より選択される遺伝子の前記生体試料中の発現量を測定するステップを含むことを特徴とする。
本発明の更に他の局面は、精神障害関連遺伝子の治療用途への適用に関する。この局面では、配列番号４の塩基配列を有する遺伝子、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子、配列番号６の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの天然変異体からなる群より選択される遺伝子の標的組織内発現量を増加させる化合物を含む抗精神障害薬が提供される。
本発明の一態様では、抗精神障害薬の有効成分として、配列番号１０のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、配列番号１１のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、配列番号１２のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、これらの天然変異体、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、及び前記天然変異体をコードする単離された核酸からなる群より選択される化合物が用いられる。
本発明の更なる局面は、精神障害関連遺伝子の研究用途への適用に関する。この局面では配列番号１〜６のいずれかの塩基配列を有する単離された核酸を含む精神障害研究用試薬又はそれを含むキットが提供される。
本発明の更に、配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を保持する、精神障害治療用又は精神障害研究用発現ベクターを提供する。本発明はまた、配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質に対する、単離された精神障害治療用、精神障害診断用又は精神障害研究用抗体を提供する。好ましい一態様において本発明の抗体は、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異的結合性を有することを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】マウスにメタンフェタミンを連続投与することによって自発運動量が亢進することを示すグラフである。マウスは6日間メタンフェタミン (2mg/kg, s.c.) を投与された。結果は平均値±標準誤差で示した(n=20-30)。*P<0.05 対 生理食塩水-投与群。繰り返しのある二元配置分散分析において、有意な差が認められた。
【図２】スクリーニングの結果、マウス側坐核において大幅な発現増加が認められた遺伝子のリストである。
【図３】Gene1の塩基配列を基にBLAST検索した結果を示す。尚、下欄には一部の領域のみを特異的に増幅させるためのプライマーが示される。
【図４】Gene2の塩基配列を基にBLAST検索した結果を示す。尚、下欄には一部の領域のみを特異的に増幅させるためのプライマーが示される。
【図５】メタンフェタミン連続投与後のGene1 mRNAの発現変化を示す図である。マウスは6日間メタンフェタミン(2mg/kg, s.c.)を投与され、最終投与後2時間で断頭された(n=4-5)。
【図６】Gene1の大きさと側坐核におけるメタンフェタミン連続投与後のGene1 mRNAの発現変化を示す図である。マウスに6日間メタンフェタミン(2mg/kg, s.c.)を投与し、最終投与後2時間で断頭した(n=4-5)。ノーザンハイブリダイゼーションによってGene1 mRNAの発現変化を調べた。データは、GAPDH mRNAを用いてデータ補正した。
【図７】メタンフェタミン連続投与後のGene2 mRNAの発現変化を示す。マウスに6日間メタンフェタミン(2mg/kg, s.c.)を投与し、最終投与後2時間で断頭した(n=4-5)。
【図８】Gene2の大きさと側坐核におけるメタンフェタミン連続投与後のGene2 mRNAの発現変化を示す図である。マウスに6日間メタンフェタミン(2mg/kg, s.c.)を投与し、最終投与後2時間で断頭した(n=4-5)。ノーザンハイブリダイゼーションによってGene2 mRNAの発現変化を調べた。データは、GAPDH mRNAを用いてデータ補正した。
【図９】メタンフェタミン投与後の側坐核でのPiccolo mRNAの発現変化を示す図である。マウスに6日間メタンフェタミン(2mg/kg,皮下投与)を投与し、最終投与24時間後に取り出した脳の中からの側坐核をサンプルとした。
【図１０】メタンフェタミン単回および連続投与後のGene1 mRNAの発現変化を示す図である。マウスに6日間メタンフェタミン(2mg/kg, s.c.)を投与し、最終投与後2時間で断頭した。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8)。* P<0.05 対 生理食塩水投与群。
【図１１】メタンフェタミン単回および連続投与後のGene2 mRNAの発現変化を示す図である。マウスに6日間メタンフェタミン(2mg/kg, s.c.)を投与し、最終投与後2時間で断頭した。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8)。* P<0.05 対 生理食塩水投与群。
【図１２】マウスにおけるメタンフェタミン処置後のPiccolo（Gene3）mRNAの発現変化を示す図である。マウスに6日間メタンフェタミン(1mg/kg,皮下投与)を単回、連続投与した。最終投与2時間後に断頭し、サンプルとした。個体数は各群5〜8匹とした。* P<0.05 対 生理食塩水投与群。
【図１３】マウス生体内各組織におけるGene1の発現量を示す図。
【図１４】メタンフェタミン誘発自発運動量亢進におけるGene1アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。マウスに5日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与した。自発運動量を2時間測定した。右脳室内(AP-0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV-2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC)、人工脳脊髄液 (CSF)が浸透圧ポンプによって持続的に注入された。結果は平均値±標準誤差で示した(n=5-7)。繰り返しのある二元配置分散分析において有意な差が認められた。* P<0.05 対 生理食塩水+CSF-処置群。# P<0.05 対 生理食塩水+Gene1-SC-処置群。
【図１５】メタンフェタミン誘発自発運動量亢進におけるGene2アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。マウスに5日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与された。自発運動量を2時間測定した。右脳室内(AP-0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV-2.0 mm from the skull)にGene2アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene2-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene2-SC)、人工脳脊髄液(CSF)が浸透圧ポンプによって持続的に注入された。結果は平均値±標準誤差で示した(n=3-5)。
【図１６】メタンフェタミンによる場所嗜好性の形成におけるGene1アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。条件付けの間マウスにメタンフェタミン(0.3mg/kg, s.c.)あるいは生理食塩水を投与した。右脳室内(AP-0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV-2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC)、人工脳脊髄液(CSF)が浸透圧ポンプによって持続的に注入された。結果は平均値±標準誤差で示した(n=5-12)。* P<0.05 対 生理食塩水-処置群。# P<0.05 対 メタンフェタミン+CSF-処置群とメタンフェタミン+Gene1-SC-処置群。
【図１７】メタンフェタミンによる場所嗜好性の形成におけるGene2アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。条件付けの間マウスにメタンフェタミン(0.3mg/kg, s.c.)あるいは生理食塩水を投与した。右脳室内(AP-0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV-2.0 mm from the skull)にGene2アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene2-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene2-SC)、人工脳脊髄液(CSF)が浸透圧ポンプによって持続的に注入された。結果は平均値±標準誤差で示した(n=4-8)。* P<0.05 対 生理食塩水-処置群。# P<0.05 対 メタンフェタミン+CSF-処置群。
【図１８】メタンフェタミン誘発性の逆耐性に対する内因性Piccolo(Gene3)の影響を示す図である。Piccoloアンチセンスオリゴヌクレオチド(アンチセンス濃度 0.6nmol/6μl/day)、センスオリゴヌクレオチド(センス濃度 0.6nmol/6μl/day)、人工脳脊髄液は浸透圧ミニポンプを用いて脳室内に持続注入した。投与部位はブレグマから後ろへ0.5mm、左へ1mm、深さ2mmとした。メタンフェタミンを６日間投与した。個体数は４〜５匹とした。
【図１９】Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド注入処置マウスにおけるメタンフェタミン連続投与によるGene1 mRNAの発現変化を示す図。* P<0.05 対 生理食塩水+CSF-処置群。# P<0.05 対 生理食塩水+Gene1-SC-処置群。$ P<0.05 対 生理食塩水+Gene1-AC-処置群。 + P<0.05 対 メタンフェタミン+Gene1-SC-処置群。
【図２０】側坐核でのメタンフェタミン誘発Gene1 mRNAの発現増加におけるドパミンD1受容体拮抗薬R(+)-SCH23390とドパミンD2受容体拮抗薬racloprideの効果を示す図。* P<0.05 対 賦形剤/生理食塩水-投与群。# P<0.05 対 賦形剤/メタンフェタミン-投与群。
【図２１】Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド注入マウスにおけるメタンフェタミン連続投与によるTNF-α mRNAの発現変化を示す図。* P<0.05 対 生理食塩水-投与群。# P<0.05 対 生理食塩水+CSF-処置群と生理食塩水+Gene1-SC-処置群。$ P<0.05 対 メタンフェタミン+Gene1- SC処置群。
【図２２】メタンフェタミン誘発細胞外ドパミン量の増加におけるGene1アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivoの効果を示す図。* P<0.05 対 Gene1-SC-注入群。
【図２３】メタンフェタミン誘発シナプトソーム[3H]DA 取り込みの低下におけるGene1の効果を示す図。* P<0.05対 生理食塩水+CSF-注入群。# P<0.05 メタンフェタミン+Gene1-SC-注入群。
【図２４】メタンフェタミン誘発シナプト小胞[3H]DA 取り込みの低下におけるGene1の効果を示す図。* P<0.05対 生理食塩水+CSF-処理群と生理食塩水+Gene1-SC-処理群。# P<0.05 メタンフェタミン+Gene1-SC-処理群。
【図２５】Gene1の全長又はフラグメントの発現実験に利用した発現ベクター（pcDNA-DEST53）の構成。塩基1650と3312の領域をGene1 DNA (全長あるいはフラグメント)で置換した。attR1のサイトに以下のいずれかを組み換えた。塩基番号1643〜1767。塩基番号3202〜3326。
【図２６】メタンフェタミン誘発[3H]DA取り込み低下におけるトランスフェクションしたGene1の効果を示す図。* P<0.05 対 pcDNA-DEST53ベクター導入細胞。# P<0.05 対 Gene1 全長導入細胞。$ P<0.05 対 Gene1フラグメント導入細胞。+ P<0.05 対 メタンフェタミン+pcDNA-DEST53ベクター導入細胞。
【図２７】Gene1全長発現ベクターを導入したPC12細胞におけるメタンフェタミン作用後のGene1 mRNA発現量変化を示す図。PC12細胞にリポフェクトアミンを用いてGene1全長を発現する発現ベクター、Gene1フラグメントを発現する発現ベクター、又はpcDNA-DESTベクター（空ベクター）をトランスフェクトした。24穴プレートで細胞を2〜3日間培養した後、30分間メタンフェタミン(1.0μM)で前処置した。その後、細胞内のGene1 mRNA発現量をRT-PCR法で測定した。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8)。* P<0.05 対 pcDNA-DEST53ベクター処置細胞、# P<0.05 対 Gene1 全長処置細胞、$ P<0.05 対 Gene1 フラグメント処置細胞、+ P<0.05 対 メタンフェタミン+pcDNA-DEST53ベクター処置細胞。
【図２８】メタンフェタミン連続投与後の側坐核でのGene1の局在を示す図。マウスに６日間メタンフェタミン(2mg/kg, s.c.)を投与し、最終投与から２４時間後に断頭した。側坐核を、Gene1がコードする部分ペプチドに対するポリクローナル抗体で免疫染色した。メタンフェタミン／Gene1は、Gene1部分ペプチドに対するポリクローナル抗体を用いて染色した結果である。また、メタンフェタミン／NeuNは抗NeuN（神経細胞マーカー）抗体による染色結果、メタンフェタミン／MAP2は抗MAP2（神経細胞マーカー）抗体による染色結果、メタンフェタミン／GFAPは抗GFAP（グリア細胞マーカー）抗体による染色結果である。右列のメタンフェタミン／mergeはそれぞれ、左二つの染色結果の合成である。スケールバー：20μm。
【図２９】ニコチン、アルコール、フェンサイクリジンにおけるGene1 mRNAの発現変化を示す図。* P<0.05 対 生理食塩水-投与群。
【図３０】神経細胞でのPiccoloタンパク質の発現を示す図。TH:抗TH（tyrosine hydroxylase)抗体を用いた免疫染色像、Piccolo：抗Piccolo抗体を用いた免疫染色像、Merge：左二つの染色像の合成。
【図３１】中脳ドパミン神経の神経前節におけるPiccoloタンパク質の発現を示す図。TH:抗TH（tyrosine hydroxylase)抗体を用いた免疫染色像、Piccolo：抗Piccolo抗体を用いた免疫染色像、Merge：左二つの染色像の合成。
【図３２】ヒトドパミントランスポーターを強制発現させたPC12細胞でのドパミン取り込み抑制に対するPiccolo C2Aドメインの作用を示す図。
【図３３】ヒトドパミントランスポーターを強制発現させたPC12細胞でのドパミン取り込みに対する、Piccolo発現抑制の効果を示す図。
【図３４】メタンフェタミンによるドパミントランスポーターの細胞内移動に対するPiccoloの作用を示す図。
【図３５】ドパミン作動性神経細胞におけるPiccoloの局在を示す図。
【図３６】PC12細胞におけるドパミントランスポーターとPiccoloタンパク質の関係をまとめた図。メタンフェタミンを作用させるとドパミントランスポーターの内在化がおこる（図３６（ａ））。また、ドパミントランスポーターとピッコロのC2Aドメインは同じ場所に発現している（図３６（ｂ））。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
精神障害は一般に、病因を基にして内因性精神障害（統合失調症など）、外因性精神障害、器質性精神障害（痴呆症など）、症状性精神障害（躁うつなど）、中毒性精神障害（アルコール依存、薬物依存症など）、及び心因性精神障害（神経症、心身症など）に分類される。本発明は好ましくは内因性精神障害及び中毒性精神障害を対象とし、更に好ましくは内因性精神障害の一つである統合失調症、又は中毒性精神障害の一つである薬物依存症を対象とし、一層好ましくは薬物依存症を対象とし、最も好ましくは薬物依存症の中でも嗜好的な薬物依存症を対象とする。原因となる薬物によっても異なるが、薬物依存症は薬物の精神的な作用（効果）に依存する精神依存、退薬に伴う生体反応を避けるための身体依存、又は耐性の獲得（或いはこれらの組み合わせ）を特徴とする。薬物依存症の原因となる薬物としては、メタンフェタミン、モルヒネ、コカイン、ニコチン、アルコール、フェンサイクリジン、ベンゾジアゼピン類等(各種の塩を含む)を例示できるが、本発明が対象とする薬物依存症はこれらの薬物に関連するものに限られない。
本明細書において「抗精神障害薬」とは、精神障害の発症を抑制するために使用される薬剤、又は精神障害の症状を改善（部分的又は完全な治癒を含む）するために使用される薬剤のことをいう。したがって本発明の抗精神障害薬には、精神障害の予防的処置に使用可能な薬剤、及び精神障害の治療に使用可能な薬剤が含まれる。
本発明において遺伝子に言及する場合、その天然変異体についても考慮される。【０００７】
（スクリーニング方法）
本発明の一局面は精神障害に対して有効な化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法で選抜された化合物は、精神障害に関する医療措置に対して有効であると期待される。即ち、本発明のスクリーニング方法によって選抜された化合物は精神障害に対する薬剤の有力な候補又はそのような薬剤を開発する際の有用な材料となる。選抜された化合物が精神障害に対して十分な薬効を有する場合にはそのまま薬剤の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で薬剤の有効成分としての使用に供することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。
本発明のスクリーニング方法は、特定の細胞又は動物個体を利用して実施することができる。【０００８】
（細胞ベースのスクリーニング方法）
本発明の一態様では細胞ベースのスクリーニング方法が提供される。この態様では試験化合物の曝露（投与、添加）によって細胞内における特定の遺伝子の発現量が変化するか否かが調べられる。具体的には、本発明のスクリーニング方法では以下の各ステップが実施される。
ステップ1：配列番号１の塩基配列を有する遺伝子、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子、配列番号３の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの相同遺伝子からなる群より選択される遺伝子（対象遺伝子）を発現する細胞を用意するステップ。
ステップ2：上記細胞に試験化合物を曝露するステップ。
ステップ3：試験化合物の曝露後の上記細胞における、対象遺伝子の発現量を測定するステップ。
ステップ4：試験化合物の曝露による、対象遺伝子の発現量変化を求めるステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明する。【０００９】
１．ステップ１
ステップ１では検出対象の遺伝子（本明細書において「対象遺伝子」という）を発現する細胞を用意する。対象遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子（本明細書において「対象マウス遺伝子１」ともいう）、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子本明細書において「対象マウス遺伝子２」ともいう）、配列番号３の塩基配列を有する遺伝子（本明細書において「対象マウス遺伝子３」ともいう）、及びこれらの相同遺伝子の中らか選択される。これら二種類以上を検出対象としてもよい。尚、対象マウス遺伝子１〜３はいずれも、薬物依存症に関連性が認められたマウスの遺伝子である（後述の実施例を参照）。【００１０】
ここでの「相同遺伝子」とは、マウスの遺伝子である対象マウス遺伝子１〜３のいずれかに対応するヒト、ラット等の相同遺伝子である。対象マウス遺伝子１、対象マウス遺伝子２、及び対象マウス遺伝子３に対応するヒト相同遺伝子はそれぞれ配列番号４の塩基配列を有する遺伝子（本明細書において「対象ヒト遺伝子１」ともいう）、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子（本明細書において「対象ヒト遺伝子２」ともいう）、及び配列番号６の塩基配列を有する遺伝子（本明細書において「対象ヒト遺伝子３」ともいう）である。尚、その他の相同遺伝子は、公共のデータベースなどを用いたホモロジー検索（例えばBLASTサーチ）によって見つけ出すことが可能である。【００１１】
ここでの「細胞」として好ましくは哺乳動物細胞が用いられる。哺乳動物細胞の例として、マウス、ラット、モルモット等の齧歯類の細胞、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類の細胞を挙げることができる。細胞の由来は特に限定されないが、中枢神経系組織に由来する細胞を使用することが好ましい。中枢神経系組織の中でも前脳の前頭前皮質、側坐核、線条体、中脳、又は海馬に由来する細胞を使用することが特に好ましい。
ヒト以外の動物細胞（例えばマウス、ラット、ウサギ、ニワトリなど）であることを条件として、生体から分離されていない状態（即ち生体を構成している状態）の細胞を使用してもよい。【００１２】
分散した状態の細胞ではなく、細胞間にネットワークの形成が認められる細胞群（例えば特定の組織を形成した細胞）をスクリーニングに使用することもできる。また、異なる二種類以上の細胞を併用して本発明のスクリーニング方法を実施してもよい。【００１３】
対象遺伝子を本来的に発現する細胞の他、人為的な操作の結果として対象遺伝子を発現することになった細胞を用いることもできる。例えば、対象遺伝子を発現可能な状態で導入して得られる形質転換細胞を使用してもよい。形質転換に供することが可能な細胞としてHeLa細胞、COS細胞、CHO細胞を例示することができる。これらの細胞は例えばATCCなどの細胞バンクから容易に入手可能である。【００１４】
使用する細胞の数は特に限定されず、検出感度、実験設備等を考慮して定めることができる。例えば、1〜105個、好ましくは10〜104個、更に好ましくは102〜103個の細胞を用いることができる。【００１５】
２．ステップ２
ステップ２では、用意した細胞に試験化合物を曝露する。試験化合物の曝露は例えば、培養液中に試験化合物が存在する条件下で細胞を所定時間培養することによって実施される。或いは、試験化合物又はそれを含む溶液などを直接細胞に接触させることにしてもよい。
曝露量は任意に設定可能である。例えば、細胞に致死的な影響を与えない範囲で可能な限り最大の曝露量を採用することができる。
曝露時間は特に限定されない。例えば、曝露時間を１分〜１０日の範囲内で設定することができる。間隔をおいて連続的に曝露してもよい。【００１６】
本発明のスクリーニング方法に供する試験化合物としては、様々な分子サイズの有機化合物（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等））又は無機化合物を用いることができる。試験化合物は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを試験化合物として用いてもよい。【００１７】
３．ステップ３
ステップ３では、試験化合物の暴露後の細胞を用いて対象遺伝子の発現量を測定する。本発明の一態様では対象遺伝子の発現量として、対象遺伝子の転写産物であるmRNAの量が測定される。mRNAの検出にはRT-PCR法、特異的なプローブを用いた各種ハイブリダイゼーション法（例えばサザンハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション）などの常法を採用できる。
本発明の他の態様では、対象遺伝子の発現産物であるタンパク質の量が測定される。例えば、目的のタンパク質に対して特異的に結合する化合物を用いて検出（測定）を実施できる。検出方法（又は測定方法）は、これに限定されるものではないが、免疫学的手法によることが好ましい。免疫学的手法では特定のタンパク質に対する抗体が使用され、当該抗体の結合性（結合量）を指標として当該タンパク質が検出される。ここでの用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、又はこれらの断片等を含む。本発明における抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。
免疫学的検出法によれば迅速で感度のよい検出が可能となる。また、操作も簡便である。尚、検出方法としては例えば、ELISA法、ラジオイムノアッセイ、FACS、免疫沈降法、イムノブロッティング等の方法が挙げられる。【００１８】
標識化した抗体を用いることにより、上記の検出等を容易に実施することが可能である。抗体の標識化には例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、32P、131I、125I等の放射性同位体、及びビオチン等を用いることができる。【００１９】
４．ステップ４
ステップ４では、上記ステップの測定結果を用いて対象遺伝子の発現量変化を求める。例えば、試験化合物を曝露する細胞（曝露群）と試験化合物を曝露しない細胞（非曝露群、対照群）とを用意し、曝露群、非曝露群それぞれについて対象遺伝子の発現量を測定し、両者を比較する。尚、試験化合物の曝露がないときの対象遺伝子の発現量が予め判明している場合には、この発現量を非曝露群の発現量として用いることもできる。比較結果から、試験化合物の曝露の結果として対象遺伝子の発現が変化した程度（発現量変化）が求められる。このようにして対象遺伝子の発現量に対する試験化合物の作用を評価する。
非暴露群に比較して暴露群の発現量が多い場合、即ち試験化合物に発現量増加作用が認められる場合には、当該試験化合物が精神障害に対して有効な化合物であると判定できる。暴露群において発現量の顕著な増加が認められる場合には、当該試験化合物が精神障害に対して特に有効な化合物であると判定できる。
以上のように、当該ステップの結果を用いて精神障害に対する試験化合物の有効性が評価される。【００２０】
ある細胞（細胞群）において曝露前後の遺伝子発現量を比較することによっても、試験化合物の作用を評価することができる。例えば、(1)対象遺伝子がレポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）とともに導入された細胞を用意し、(2)導入された対象遺伝子の発現量をレポーター遺伝子の発現量を指標として試験化合物の曝露前後で測定し（レポーターアッセイ）、測定結果を比較する。【００２１】
（動物個体ベースのスクリーニング方法）
精神障害に有効な化合物のスクリーニングを、動物個体を用いて実施することもできる。即ち本発明は、以下のステップを含む動物個体ベースのスクリーニング方法も提供する。
ステップi：非ヒト動物を用意するステップ。
ステップii：上記非ヒト動物に試験化合物を投与するステップ。
ステップiii：試験化合物の投与後、上記非ヒト動物の中枢神経系組織内における、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子、配列番号３の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの相同遺伝子からなる群より選択される遺伝子（対象遺伝子）の発現量を測定するステップ。
ステップiv：試験化合物の投与による、対象遺伝子の発現量変化を求めるステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明するが、特に言及しない事項については上記の細胞ベースのスクリーニング方法の説明における対応する記述が援用される。【００２２】
１．ステップi
ステップiでは非ヒト動物を用意する。非ヒト動物とは、例えばヒト以外の霊長類（サル、チンパンジーなど）、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ等である。この中でもマウス又はラットを好適に用いることができる。
非ヒト動物は通常、対象マウス遺伝子１〜３に対する、その種固有の相同遺伝子を発現する。後述のように遺伝子改変動物を使用する場合は例外として、通常、この相同遺伝子の発現量を本スクリーニング法での検出対象とする。
精神障害の病態を呈している非ヒト動物を用いることが好ましい。かかる疾患モデル動物を使用すれば、精神障害状態において対象遺伝子の発現に対する試験化合物の作用が調べられる。つまり実際の治療時を想定したスクリーニング系となる。かかるスクリーニング系によれば、精神障害に実際に作用し且つ有効性に優れた化合物を効率的に選抜することが可能となる。一方、対象遺伝子の発現量の測定に並行して非ヒト動物の病態の変化を観察すれば、対象遺伝子の発現量変化と病態の変化との間の相関性を調べることができ、試験化合物の作用を評価する上で有益な情報が得られる。
精神障害の病態を呈する非ヒト動物として、遺伝子改変及び／又は特定の条件下での飼育によって特定の病態を呈するに至る動物を使用することができる。例えば、NMDA受容体ε１やε４を欠く遺伝子改変マウス等が統合失調症のモデル動物として有効であると提案されており（Miyamoto, Y., Yamada, K., Noda, Y., Mori, H., Mishina, M. and Nabeshima, T.: Hyperfunction of dopaminergic and serotonergic neuronal systems in mice lacking the NMDA receptor ε1 subunit.: FASEB J., 15, 1407-1409 (2001)、Miyamoto, Y., Yamada, K., Noda, Y., Mori., H., Mishina, M. and Nabeshima, T., :Lower sensitivity to stress and altered monoaminergic neuronal function in mice lacking the NDMA receptor ε4 subunit.: J. Neurosci., 21, 750-757 (2001)）、これらの非ヒト動物を本発明に利用することができる。また、マウスなどへのフェンシクリジン（PCP）の投与によって統合失調症の症状が再現されたマウス（Noda Y, et al.,Repeated phencyclidine treatment induces negative symptom-like behavior in forced swimming test in mice: imbalance of prefrontal serotonergic and dopaminergic functions. Neuropsychopharmacology. 2000 Oct. 23(4):375-87）などを、統合失調症のモデル動物として本発明に利用することができる。一方、後述の実施例にも示されるように、メタンフェタミンなどの連続投与を受けたマウスは薬物依存症の病態を呈する。従って、このような条件で処理されたマウスを薬物依存症のモデル動物として好適に本発明に利用することができる。【００２３】
２．ステップii
ステップiiでは非ヒト動物に試験化合物を投与する。投与経路は特に限定されず、経口投与、静脈内投与（注射）、皮内投与（注射）、皮下投与（注射）、経皮投与、口腔内投与、標的組織への直接投与（注射）等から適当なものを選択できる。尚、ここでの標的組織は、精神障害に関与する組織であり、典型的には中枢神経系組織（前脳の中でも前頭前皮質、側坐核、線条体、中脳、海馬など）が該当する。
投与量は任意に設定可能である。例えば、非ヒト動物に致死的な影響を与えない範囲で可能な限り最大の投与量とすることができる。
投与回数も任意に設定可能である。例えば、投与回数を１回〜２０回の範囲内とする。【００２４】
３．ステップiii
ステップiiiでは、試験化合物の投与後の非ヒト動物を用いて、中枢神経系組織（前脳の中でも前頭前皮質、側坐核、線条体、中脳、海馬など）内における対象遺伝子の発現量を測定する。即ち、特定の中枢神経組織内における、対象遺伝子のmRNA及び／又は発現産物（タンパク質）の量が測定される。尚、組織抽出液を用いた測定、組織切片を用いた測定（例えば免疫組織染色）のいずれを実施してもよい。
ここで、使用する非ヒト動物がマウスであれば、対象マウス遺伝子１〜３のいずれか（又はこれらの任意の組合せ）を検出対象とする。使用する非ヒト動物がマウス以外の種であれば、対象マウス遺伝子１〜３に対応する当該種の相同遺伝子を検出対象とする。例えば、ラットを使用する場合にはラット相同遺伝子が検出対象となる。但し、他の種の相同遺伝子を発現する非ヒト動物（遺伝子組み換え動物）を用いた場合には、当該相同遺伝子を検出対象とすることができる。このように、遺伝子組み換え技術を利用して、その動物種が本来は発現しない遺伝子を検出対象としたスクリーニング方法を構築してもよい。【００２５】
４．ステップiv
ステップivでは、上記ステップの測定結果から対象遺伝子の発現量変化を求める。例えばまず、試験化合物を投与する動物個体（投与群）と試験化合物を投与しない動物個体（非投与群）とを用意し、投与群と非投与群それぞれについて対象遺伝子の発現量を測定する。続いて、投与群の発現量と非投与群の発現量とを比較する。比較結果から、試験化合物の投与の結果として対象遺伝子の発現が変化した程度（発現量変化）が求められる。このようにして対象遺伝子の発現量に対する試験化合物の作用を評価する。
非投与群に比較して投与群の発現量が多い場合、即ち試験化合物に発現量増加作用が認められる場合には、当該試験化合物が精神障害に対して有効な化合物であると判定できる。投与群において発現量の顕著な増加が認められる場合には、当該試験化合物が精神障害に対して特に有効な化合物であると判定できる。
以上のように、当該ステップの結果を用いて精神障害に対する試験化合物の有効性が評価される。
尚、細胞ベースのスクリーング方法と同様、ある動物個体（動物群）において試験化合物投与前後の遺伝子発現量を比較することによって試験化合物の作用を評価することにしてもよい。【００２６】
（診断用途）
本発明の他の局面は、本発明者らが同定に成功した遺伝子の診断用途に関する。この局面の一態様は精神障害診断用の情報を取得する方法に関し、次のステップを含む。
ステップa：対象から採取された生体試料を用意するステップ。
ステップb：配列番号４の塩基配列を有する遺伝子、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子、配列番号６の塩基配列を有する遺伝子、及びこれらの天然変異体からなる群より選択される遺伝子の前記生体試料中の発現量を測定するステップ。
当該方法で得られる情報は精神障害の診断に利用される。例えば、精神障害の患者を対象として上記方法を実施して得られた情報は、当該患者の病態の評価ないし把握、治療効果の評価などに利用できる。例えば、精神障害の治療と並行して本発明の方法を実施すれば、結果として得られる情報を基に治療効果を評価することができる。具体的には、薬剤投与後に本発明の方法を実施することで特定の遺伝子の発現量の変化を調べ、発現量の増減から治療効果を判定することができる。このように本発明の方法を治療効果のモニターに利用してもよい。
一方、患者以外の者、即ち精神障害が認定されていない者を対象とした場合に得られた情報は、精神障害に関して罹患の有無の判定、罹患リスクの評価等に利用できる。
本発明の方法によれば、遺伝子の発現量という客観性に優れた指標を基に精神障害の診断を行えることから、従来では客観的に診断することが困難であった精神障害の診断分野においてその価値は非常に高い。【００２７】
１．ステップa
ステップaでは対象（被験者）から採取された生体試料を用意する。精神障害の患者に限らず、健常者（精神障害のおそれがある者を含む）をここでの対象とすることもできる。例えば、対象から採取された組織片、細胞抽出液、脳脊髄液等を生体試料として用いることができる。生体試料として好ましくは核酸試料を用いる。核酸試料は、対象（被験者）の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。【００２８】
２．ステップb
ステップbでは生体試料を用いて特定遺伝子の発現量を測定する。測定対象の遺伝子は、配列番号４の塩基配列を有する遺伝子（対象ヒト遺伝子１）、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子（対象ヒト遺伝子２）、又は配列番号６の塩基配列を有する遺伝子（対象ヒト遺伝子３）である。これらの遺伝子の天然変異体を測定対象としてもよい。天然変異体が複数存在する場合にはその中の一つ又は任意の組合せを測定対象とすることができる。
標準型遺伝子と変異型遺伝子の両者を測定対象としてもよい。例えば標準型遺伝子と変異型遺伝子の両者を同時に測定し、得られた総発現量を診断用の情報として利用することができる。又は、標準型遺伝子の発現量と変異型遺伝子の発現量をそれぞれ求め、両者の比較データを診断用の情報として利用してもよい。
尚、対応するmRNA量又はタンパク質量を測定することによって、特定の遺伝子の発現量を求めることができる（具体的な測定法は上記スクリーニング方法の欄を参照）。【００２９】
本発明は更に、対象ヒト遺伝子１〜３の精神障害のリスク診断への適用に関する。即ちこの局面は、精神障害のリスク診断用の情報を取得する方法に関し、以下のステップを含むことを特徴とする。
ステップＡ：対象から採取された核酸試料を用意するステップ。
ステップＢ：核酸試料中における、配列番号４の塩基配列を有する遺伝子、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子、及び配列番号６の塩基配列を有する遺伝子からなる群より選択される遺伝子の型を解析するステップ。【００３０】
ステップＡは、上記ステップａと同様に実施することができる。ステップＡにおける核酸試料は、対象（被験者）の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。解析対象の遺伝子を含むものであれば任意の長さのゲノムDNAを核酸試料として用いることができる。また、複数の遺伝子を解析対象とする場合、必ずしも解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在する核酸試料を用いる必要はない。即ち、本発明の核酸試料としては、解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在しているもの、解析対象の遺伝子が複数の核酸上に分かれて存在しているもののいずれをも用いることができる。尚、核酸試料において解析対象の遺伝子が完全な状態（即ち、遺伝子の全長が存在する状態）でなくても、遺伝子の型の解析に必要な部位（即ち多型部位）が少なくとも存在している限りにおいて断片的、部分的な状態であってもよい。【００３１】
ステップＢでは遺伝子の型が解析される。即ち、特定の遺伝子の多型解析を実施する。一般に、遺伝子はそれを構成しているＤＮＡ配列に個体差が存在する。この個体差は遺伝子多型と呼ばれる。遺伝子多型には、１個の塩基が他の塩基に置き換わっているもの（ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism））、通常１〜数十塩基が欠失や挿入されているもの（挿入／欠失型多型）、２〜数個の塩基からなる繰り返し配列における繰り返し数が異なるもの（ＶＮＴＲ（variable number of tandem repeat）及びマイクロサテライト多型）等が知られている。これらの遺伝子多型は、当該遺伝子の発現状態を規定したり、当該遺伝子がコードするタンパク質中のアミノ酸を変化させてその機能に影響を及ぼしたりする場合がある。従って、ある遺伝子の多型を解析することによって、当該遺伝子がコードするタンパク質の潜在的機能を評価することができる。
ステップＢの結果得られた遺伝子型に関する情報は、精神障害のリスク診断に利用することができる。例えば、遺伝子型（特定のアリルの組合せ）に基づいて、精神障害の遺伝的リスクの程度を判定することができる。【００３２】
多型解析方法は特に限定されるものではなく例えばアリル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって解析する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アリル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、又はTaqMan-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))、Invader法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat Genet 19,225(1998))、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を採用できる。さらに、解析対象の多型部分を直接シークエンスすることにより解析してもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて多型解析を行ってもよい。また、PCR法又はPCR法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの解析方法を適用することもできる。【００３３】
多数の核酸試料を解析する場合には、アリル特異的PCR法、アリル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan-PCR法、Invader法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、又はDNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で解析することが可能な解析方法を用いることが特に好ましい。【００３４】
解析対象の遺伝子の転写産物であるmRNAを利用して各遺伝子の多型を解析することもできる。例えば被験者の血液、尿等から解析対象である遺伝子のmRNAを抽出、精製した後、ノーザンブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.42,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、ドットブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、RT-PCR法（Molecular Cloning, Third Edition,8.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、DNAチップ（DNAアレイ）を用いた方法などを実行することにより、mRNAを出発材料として多型解析を行うことができる。【００３５】
解析対象の遺伝子の発現産物を用いて多型解析を行うこともできる。この場合、多型部位に対応するアミノ酸を含んでいる限り、部分タンパク質、部分ペプチドであっても解析用試料として用いることができる。
このような遺伝子の発現産物を用いて解析する方法としては、多型部位のアミノ酸を直接分析する方法、又は立体構造等の変化を利用して免疫学的に分析する方法などが挙げられる。前者としては周知のアミノ酸配列分析法（エドマン法を利用した方法）を用いることができる。後者としては、多型を構成するいずれかの遺伝子型を有する遺伝子の発現産物に特異的な結合活性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着定量法）、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫拡散法等を用いることができる。【００３６】
（治療用途）
本発明の更なる局面は、本発明者らが同定に成功した遺伝子の治療用途に関する。この局面の一態様では抗精神障害薬が提供される。本発明の抗精神障害薬は、配列番号４の塩基配列を有する遺伝子（対象ヒト遺伝子１）、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子（対象ヒト遺伝子２）、配列番号６の塩基配列を有する遺伝子（対象ヒト遺伝子３）、及びこれらの天然変異体からなる群より選択される遺伝子の標的組織内発現量を増加させる化合物を含む。このように本発明の抗精神障害薬は、標的組織内において特定の遺伝子の発現量を増加させる作用を有する。
通常、中枢神経系組織がここでの「標的組織」となる。中枢神経系組織において上記遺伝子の発現量を増加させれば、精神障害に対する直接的な作用を期待できる。【００３７】
本発明の薬剤が含有する化合物（有効成分）の具体例として、配列番号１０のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、配列番号１１のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質を挙げることができる。これらのタンパク質はそれぞれ対象ヒト遺伝子１〜３の発現産物である。従って、これらのタンパク質を含む薬剤によれば、それが標的組織内に送達されることによって標的組織内で対象ヒト遺伝子の発現産物の量が増加する。尚、上記いずれかのタンパク質の天然変異体（対象ヒト遺伝子の天然変異体に対応する）を有効成分として用いることもできる。【００３８】
ここで、タンパク質に関して使用する場合の「単離された」とは、その本来の環境（例えば天然の物質の場合は天然の環境）から取り出された状態、即ち、人為的操作によって、本来の存在状態と異なる状態で存在していることをいう。
本発明におけるタンパク質が天然材料に由来する場合の「単離された」状態とは通常、当該天然材料の中で当該タンパク質以外の成分を実質的に含まない（特に夾雑タンパク質を実質的に含まない）状態をいう。具体的には、本発明の単離されたタンパク質では夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の例えば約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。
一方、タンパク質が組換えDNA技術によって生産されたものである場合の「単離された」状態とは通常、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には、単離されたタンパク質では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の例えば約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。
また、タンパク質が化学合成によって生産されたものである場合の「単離された」状態とは通常、前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態をいう。具体的には、単離されたタンパク質では前駆体の含有量は重量換算で全体の例えば約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。【００３９】
本発明におけるタンパク質は好ましくは遺伝子工学的手法を用いて調製される。例えば、目的のタンパク質をコードする核酸を適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより目的のタンパク質を得ることができる。回収されたタンパク質は必要に応じて精製される。無細胞タンパク質合成系を利用して目的のタンパク質を取得することもできる。無細胞タンパク質合成系とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（DNAやmRNA）からそれがコードするmRNAや蛋白質をin vitroで合成することをいう。無細胞合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、蛋白質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。蛋白質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、蛋白質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、蛋白質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。蛋白質合成に必要な各分子（因子）を再構成した転写／翻訳系の開発も報告されている（Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。この合成系では、バクテリアの蛋白質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる２０種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いて蛋白質合成系をin vitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。【００４０】
用語「無細胞転写／翻訳系」は、無細胞蛋白質合成系、in vitro翻訳系又はin vitro転写／翻訳系と交換可能に使用される。in vitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられて蛋白質が合成される。鋳型RNAとしては全RNA、mRNA、in vitro転写産物などが使用される。他方のin vitro転写／翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。尚、in vitro転写／翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。
現在広く利用されている無細胞合成系には以下のものがある。即ち、大腸菌S30画分抽出液の系（原核細胞の系）、コムギ胚芽抽出液の系（真核細胞の系）、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系（真核細胞の系）である。これらの系はキットとしても市販されており、容易に利用することが可能である。
天然ソース（取得源）からの分離、精製によって目的のタンパク質を調製することもできる。本発明におけるタンパク質のソースとしては例えば、動物細胞（ヒトを含む）、植物細胞、体液（血液、尿等）等が考えられる。【００４１】
本発明の抗精神障害薬が含有する化合物（有効成分）の他の具体例として、上記いずれかのタンパク質をコードする単離された核酸を挙げることができる。即ち、有効成分の例として、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、及び配列番号１２のアミノ酸配列をコードする単離された核酸を挙げることができる。これらの核酸は、本発明の抗精神障害薬が投与された際に標的組織内で発現可能な状態で含有される。例えば、適当な発現ベクターに挿入された状態の核酸が使用される。即ち本発明は、配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸（具体的には例えば配列番号１〜６のいずれかの塩基配列を有するDNA）を保持する発現ベクターを提供する。核酸は、標的組織内で作用する適当な制御配列に対して作動可能に連結された状態で発現ベクターに挿入される。【００４２】
本明細書における用語「核酸」は、DNA（cDNA及びゲノムDNAを含む）、RNA（mRNAを含む）、DNA類似体、及びRNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち1本鎖及び2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは2本鎖DNAである。またコドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合には、その発現産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。【００４３】
本明細書において「タンパク質をコードする核酸」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られる核酸のことをいい、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸（例えば１又は複数個のイントロンを含むDNA）をも含む。
また、本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸（例えばヒト生体内の核酸）の場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された核酸」の好ましい形態では、天然状態において共存する他のDNA成分（天然状態において隣接するDＮＡ配列を含む）を実質的に含まない。
例えばcDNA分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、dDNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
核酸がベクターや組成物の一部として存在していても又は外来性分子として細胞内に存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された核酸」である。【００４４】
本発明に使用する核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって「単離された状態」に調製することができる。例えば、目的の核酸の塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばPCR）を利用して増幅及び単離することができる。尚、オリゴヌクレオチドプライマーは一般に、市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。
本発明に使用する核酸は好ましい態様として、配列番号４〜６のいずれかの塩基配列を有する。本発明の他の態様では、配列番号４〜６のいずれかの塩基配列から、その5’非翻訳領域又はその一部、及び3’非翻訳領域又はその一部のいずれか一つ以上を欠失したDNA分子（例えばコード領域のみからなる核酸）を使用する。尚、コード領域の翻訳に悪影響を与えないことを条件として、本来の非翻訳領域とは異なる非翻訳領域をコード領域に組み合わせた核酸を使用してもよい。【００４５】
本発明の薬剤の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。【００４６】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして調製できる。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）によって患者に適用され得る。
本発明の薬剤中における有効成分（化合物）の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.001重量％〜約90重量％とする。【００４７】
本発明の他の局面では以上の薬剤を使用した精神障害の予防方法又は治療方法（以下、これら二つの方法をまとめて「治療方法等」という）が提供される。本発明の治療方法等は、本発明の抗精神障害薬を生体に投与するステップを含む。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。薬剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約0.001mg〜約100mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。【００４８】
（研究用途）
本発明は更に、同定に成功した遺伝子の研究用途に関する。この局面の一態様では配列番号１〜６のいずれかの塩基配列を有する単離された核酸、又はその相同核酸を含む精神障害研究用試薬が提供される。本発明の他の態様では配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、又はその相同タンパク質を含む精神障害研究用試薬が提供される。
本発明の試薬は精神障害の発症メカニズムや症状の進展メカニズムなどを研究するための実験ツールとして利用され得る。また、本発明の方法（スクリーング方法、診断用の情報を取得する方法など）を実施するための試薬として、又は本発明の薬剤の構成成分として利用することができる。本発明の試薬を、精神障害のモデル動物としてのキメラマウスやトランスジェニックマウスの作製に利用することもできる。
本発明の試薬において核酸は、例えば、適当なベクター（例えば発現ベクター）に挿入された状態で含有される。即ち本発明は、配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を保持する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターの具体的一態様では、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列を有するDNAが保持される。【００４９】
ここでの「相同核酸」とは、基準核酸（配列番号１〜６のいずれかの塩基配列を有する核酸）と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は基準核酸のそれと同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸をいう。相同核酸の例として、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつ精神障害に関連して発現量が増加するという特徴を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような相同核酸は例えば部位特異的変異法を用いて特定の部位において塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように配列番号１〜６のいずれかの配列を有する核酸を遺伝子工学的に改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。【００５０】
相同核酸の他の例として、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列からなる核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を挙げることができる。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアルデヒド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアルデヒド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
相同核酸の更に他の例として、SNPに代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められる核酸を挙げることができる。【００５１】
（本発明に使用されるキット）
本発明の各方法（スクリーニング方法、診断用の情報を取得する方法など）を、キット化した試薬等を用いて実施してもよい。本発明の他の局面はこのような目的に使用されるキットを提供する。例えば、本発明の方法における検出に利用される核酸（プローブやプライマー）、反応用試薬、希釈液、反応容器などをキットに含めることができる。尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。【００５２】
（本発明のタンパク質に対する抗体）
本発明は更に、配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質（対象タンパク質）に対して特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。本発明の抗体は精神障害の研究用ツールとして有用である。例えば、本発明の抗体は対象タンパク質の検出、測定、定量などにその利用が図られ、精神障害の作用機序の解明への貢献が期待される。本発明の抗体はまた、精神障害の治療又は診断への応用も期待される。【００５３】
本発明の抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。抗IgSF4抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。【００５４】
本発明の抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原（対象タンパク質又はその一部）を調製し、これを用いてウサギ、マウス、ラット等の動物に免疫を施す。抗原は、生体試料を精製することにより得ることができる。また、組換えタンパク質（又はペプチド）を抗原として用いることもできる。後述の通り、本発明者らは２種類の部分ペプチド（CNTAFRGLRQHPRTQLL：配列番号１９、CMSVDSRFRGKGIAKALG：配列番号２０）を抗原として使用し、配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質に対して特異的結合性を有する抗体を得ている。【００５５】
抗原としての組換えタンパク質（又はペプチド）は例えば、配列番号７〜１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（遺伝子の一部であってもよい）を、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製される。
免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLM（Keyhole Light Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。一方、対象タンパク質（又はその一部）を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン（His）タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。【００５６】
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
【実施例】
【００５７】
1.実験材料および方法
1-1.薬物依存関連遺伝子の検索
1-1-1.mRNAの抽出
RNeasy mini kit（キアゲン）を使用し、以下の手順でmRNAを調製した。マウス脳を取り出し、組織を30mg以下になるように取り分ける。蛋白変性剤を含む溶出液に脳組織を溶解し、スピンカラムで遠沈する。エタノール沈殿を繰り返し、最終的にはシリカゲルにてmRNAの精製を行う。
1-1-2.cDNAサブトラクション
CLONTECH PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit（クローンテック）を使用し、添付の説明書に従って実施した。
1-2.場所嗜好性実験
1-2-1.動物
実験には、開始時8週齢のc57/black6 雄性マウス（日本SLC、浜松）を使用した。マウスは明暗サイクルが 12時間（点灯A.M8:00）、室温23±１℃、湿度50±5 %の条件下で飼育し、餌（CE2: 日本クレア、東京）および水は共に自由に与えた。なお、本研究計画は名古屋大学医学部動物実験委員会により承認され、名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care （National Institutes of Health Publication 85-23, 1985）に準じた。【００５８】
1-2-2.薬物
実験には塩酸メタンフェタミン（ヒロポン、大日本製薬、大阪）を生理食塩水（saline）に溶解して用いた。【００５９】
1-2-3.実験装置
実験には明暗の2つのチャンバーからなり、マウスが２つのチャンバーの行き来できないようにすることのできる仕切りを有する装置(それぞれ縦15 cm, 横15 cm, 高さ15cm) を使用した。それぞれの箱の滞在時間はSCANET（ニューロサイエンス、東京）を用いて、測定した。【００６０】
1-2-4.条件付け場所嗜好性試験（conditioned place preference test）
条件付け場所嗜好性試験は、Noda らの方法（Noda Y, Miyamoto Y, Mamiya T, Kamei H, Furukawa H, Nabeshima T: Involvement of dopaminergic system in phencyclidine-induced place preference in mice pretreated with phencyclidine repeatedly. J Pharmacol Exp Ther 286: 44-51 (1998)）に準じて行った。２日間のPre-conditioning testでは1日15分3日間、マウスを両チャンバー間を自由に行き来させ、装置に馴れさせた後、3日目に各チャンバーそれぞれの滞在時間(pre-value)を計測した。Pre-conditioning testにひき続き、６日間のConditioning testを行った。Conditioning testでは、各チャンバー間に仕切りを入れ、いずれの一方のチャンバーのみにマウスが滞在するようにした。4、6、8日目はメタンフェタミンもしくはモルヒネを皮下投与直後後、嗜好性の低かった（Pre-conditioning testにおいて滞在時間の短かった）チャンバーに、5、7、9日目は、生理食塩水を皮下投与した直後に逆のチャンバーに入れた。Post conditioning testでは再びマウスを両チャンバー自由に行き来させ、各チャンバーの滞在時間、即ち、post-valueを計測した。場所嗜好性は（post-value）-（pre-value）で求めた。なお、Leu-Ileはテスト期間の全日においてマウスをチャンバーに入れる1時間前に腹腔内投与を行った。【００６１】
1-2-5.統計解析
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析には一元配置分散分析を行い、有意差が認められた場合、さらにBonferroniの多重比較検定を行った。なお、危険率5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。【００６２】
1-3.自発運動量の測定
1-3-1.動物
実験には、開始時8週齢のICR雄性マウス（日本SLC、浜松）を使用した。マウスは明暗サイクルが12時間（点灯A.M8:00）、室温23±１℃、湿度50±5%の条件下で飼育し、餌（CE2: 日本クレア、東京）および水はともに自由に与えた。なお、本研究計画は名古屋大学医学部動物実験委員会により承認され、名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care （National Institutes of Health Publication 85-23, 1985）に準じた。【００６３】
1-3-2.薬物
実験には塩酸メタンフェタミン（ヒロポン、大日本製薬、大阪）を生理食塩水（saline）に溶解して用いた。【００６４】
1-3-3.実験装置
実験にはホームケージと同一種類のアクリルケージ(縦28 cm, 横17 cm, 高さ13cm)を用い、床には少量の飼育用チップを置いた。実験開始日から終了日まで、測定時のケージおよび飼育用チップは各マウスごとに同一とした。行動量の測定には、infrared detector（ニューロサイエンス、東京）を用い、AB305 MeasureおよびABTEXT（ニューロサイエンス、東京）によって解析した。【００６５】
1-3-4.運動量測定試験
第1〜3日目は、マウスを測定用のケージに2時間入れ、測定環境に馴れさせた。4日目以降は、1日1回、メタンフェタミンの皮下投与を行い、投与直後から2時間の総運動量を測定した。【００６６】
1-3-5.統計解析
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析には二元配置反復測定分散分析を行い、有意差が認められた場合、さらにBonferroniの多重比較検定を行った。なお、危険率5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。【００６７】
2.薬物依存に関連する新規遺伝子の検索
2-1.モデル動物を用いた新規遺伝子の検索
メタンフェタミンを投与されたマウスは運動量過多を示すが、連日投与を行うと、運動量の増加の程度が増加してくる。これを、薬物依存に伴う精神障害と捕らえることができる（図１）。そこで、メタンフェタミンを10日間連続投与したマウス（C57black6）側坐核からmRNAを取り出し、それらをもとに、cDNAサブトラクション（クローンテック）を行い、コントロールに比べ、メタンフェタミンを投与したマウスにおいてmRNA発現量が20倍以上増加している遺伝子を検索した。その結果、５個の遺伝子が条件を満たした（図２）。この中でCREB3とOdz4を除く３個の遺伝子を以降の実験に用いた。尚、説明の便宜上、各遺伝子をGene1、Gene2、Gene3（Piccolo）と呼ぶ。
Gene1、2及び3をBLASTサーチで検索したところ、それぞれBC034068（GenBank Accession No. NM_001001985 XM_194205、Mus musculus cDNA sequence BC034068 (BC034068), mRNA：配列番号１）、8430437Ｇ11Rik（GenBank Accession No. NM_028990、 Mus musculus RIKEN cDNA 8430437G11 gene (8430437G11Rik), mRNA.：配列番号２）、及びPiccolo又はAczonin（GenBank Accession No.NM_011995、Mus musculus piccolo (presynaptic cytomatrix protein) (Pclo), mRNA.：配列番号３）として登録されている遺伝子の部分配列と完全に一致した（図３、図４）。Gene1（BC034068）、2（8430437Ｇ11Rik）、及び3（Piccolo又はAczonin）がコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７、配列番号８、及び配列番号９に示す。尚、Gene1はマウスShatiの名称でGeneBankに登録された（Accession No. DQ174094）。【００６８】
2-2.ヒト相同遺伝子の検索
Gene1、2及び3について、BLASTサーチを用いてヒト相同遺伝子を検索した。その結果、Gene1、2及び3についてそれぞれヒト相同遺伝子（それぞれGene1ヒト相同遺伝子、Gene2ヒト相同遺伝子、及びGene3ヒト相同遺伝子と呼ぶ）が以下の通り見つかった。尚、これらヒト相同遺伝子の中の二つは機能未知の遺伝子であり、残りの一つはPiccolo又はAczoninとして同定されている遺伝子であった。
Gene1ヒト相同遺伝子：Homo sapiens cDNA FLJ3478 fis, clone BRAWH2013219, weakly similar to Homo sapiens N-acetyltransferase Camello 2(CML2) mRNA(Genbank Accession No. AK094797：配列番号４)
Gene2ヒト相同遺伝子：Homo sapiens cDNA FLJ13576 fis, clone PLACE1008715.（Genbank Accession No. AK023638：配列番号５）
Gene3ヒト相同遺伝子：Homo sapiens piccolo (presynaptic cytomatrix protein) (PCLO), mRNA.（Genbank Accession No. NM_033026、XM_168530 ：配列番号６）
尚、Gene1ヒト相同遺伝子、Gene2ヒト相同遺伝子、及びGene3ヒト相同遺伝子がコードするアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２に示す。【００６９】
3.新規遺伝子の発現変化
Gene1〜3について、これらの遺伝子の一部分ずつについて、RT-PCR法を行ったところ、すべてのプライマーの組み合わせについて、コントロール群に比べてメタンフェタミン投与群でmRNAの増加が観察された（図５〜９）。さらに、リアルタイムRT-PCR法で、発現量の増加を検討したところ、メタンフェタミン前頭葉皮質、側坐核および線条体においてそれぞれ発現量が増加していた（図１０〜１２）。
マウス各組織におけるGene1の発現量をRT-PCRで調べたところ、大脳及び小脳でGene1が高発現していることが明らかとなった（図１３）。また、肝臓、腎臓及び脾臓においてもGene1が高発現していた。尚、RT-PCRに使用した３種類のプライマーセット及びPCR条件を以下に示す。
(1)プライマーセット１
フォワードプライマー：cttgcctccccagcccatca（配列番号１３）、リバースプライマー：ctgggggccagggttctgct（配列番号１４）
反応条件：95℃×5分の反応の後、94℃×30秒、70℃×40秒、及び72℃×1分からなる反応サイクルを３５回繰り返し、72℃×5分の反応を行い、4℃で放置
(2)プライマーセット２
フォワードプライマー：gggtggccgggtaggtggaa（配列番号１５）、リバースプライマー：ggcagtgcccagcccttcct（配列番号１６）
反応条件：95℃×5分の反応の後、94℃×30秒、71℃×40秒、及び72℃×1分からなる反応サイクルを３５回繰り返し、72℃×5分の反応を行い、4℃で放置
(3)プライマーセット３
フォワードプライマー：tgtacattcctccctggtggtg（配列番号１７）、リバースプライマー：aaatctgagagctgcaagaaaataggg（配列番号１８）
反応条件：95℃×5分の反応の後、94℃×30秒、65℃×40秒、及び72℃×1分からなる反応サイクルを３５回繰り返し、72℃×5分の反応を行い、4℃で放置【００７０】
4.発現抑制実験
4-1.メタンフェタミン誘発自発運動量亢進におけるGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド及びGene2アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
Gene1および2について、それぞれのアンチセンスヌクレオチドを、ミニ浸透圧ポンプを用いてマウスの脳室に持続注入を行い、その動物にメタンフェタミン投与を毎日行い、１、３および５日目の自発運動量を測定した。尚、マウスには5日間メタンフェタミン (1mg/kg, s.c.) を投与した。自発運動量は2時間測定した。右脳室内 (AP -0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV -2.0 mm from the skull) にアンチセンスオリゴヌクレオチド (Gene1-AS又はGene2-AS, 1.8nmol /6μl/ day) 、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド (Gene1-SC又はGene2-SC) 、人工脳脊髄液 (CSF) が浸透圧ポンプによって持続的に注入された。
Gene１についての測定結果を図１４に示し、Gene2についての測定結果を図１５に示す。結果は平均値±標準誤差で示した (Gene1：n=5-7、Gene2：n=3-5)。Gene1に関しては、繰り返しのある二元配置分散分析において、Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群とコントロール群及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群との間に有意な差が認められた（* P<0.05 対 生理食塩水+CSF-処置群。# P<0.05 対 生理食塩水+Gene1-SC-処置群）。【００７１】
4-2.メタンフェタミンによる場所嗜好性形成におけるGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド及びGene2アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
Gene1、Gene2に関して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて場所嗜好性試験を実施した。マウスには条件付けの間メタンフェタミン(0.3mg/kg, s.c.)あるいは生理食塩水を投与した。右脳室内(AP-0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV -2.0 mm from the skull)にアンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS又はGene2-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC又はGene2-SC)、人工脳脊髄液(CSF)が浸透圧ポンプによって持続的に注入された。
Gene1についての測定結果を図１６に示し、Gene2についての測定結果を図１７に示す。結果は平均値 ±標準誤差で示した(n=5-12)。Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群とコントロール群及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群との間に有意な差が認められた（* P<0.05 対 生理食塩水-処置群。# P<0.05 対 メタンフェタミン+CSF-処置群とメタンフェタミン+Gene1-SC-処置群）。【００７２】
4-3.メタンフェタミン誘発自発運動量亢進におけるGene3アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
Gene3(piccolo)について、アンチセンスヌクレオチドをミニ浸透圧ポンプを用いて、脳室に持続注入を行い、その動物にメタンフェタミン投与を毎日行い、１、３および５日目の自発運動量を測定した。マウスには6日間メタンフェタミン(1mg/kg,皮下投与)を連続投与した。最終投与24時間後に断頭し、サンプルとした。個体数は各群5匹とした。
測定結果を図１８に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=5)。繰り返しのある二元配置分散分析において、Gene3アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群とコントロール群及びセンスオリゴヌクレオチド群との間に有意な差が認められた（*** p<0.0005 対  生理食塩水）。【００７３】
4-4. Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処置マウスにおけるメタンフェタミン連続投与によるGene1 mRNAの発現変化
Gene1のアンチセンスヌクレオチドを、ミニ浸透圧ポンプを用いてマウスの脳室に持続注入を行い、その動物にメタンフェタミン投与を毎日行った。実験開始から３日目にマウスを断頭し、側坐核のGene1発現量をリアルタイムRT-PCR法で測定した。測定結果を図１９に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8)。繰り返しのある二元配置分散分析において、Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群、コントロール群及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群の間で有意な差が認められた（* P<0.05 対 生理食塩水+CSF-処置群。#P<0.05 対 生理食塩水+Gene1-SC-処置群。$ P<0.05 対 生理食塩水+Gene1-AC-処置群。 + P<0.05 対 メタンフェタミン+Gene1-SC-処置群）。【００７４】
5. Gene1の作用及び作用機序
5-1. 側坐核でのメタンフェタミン誘発Gene1 mRNAの発現増加におけるドパミンD1受容体拮抗薬R(+)-SCH23390とドパミンD2受容体拮抗薬racloprideの効果
マウスに６日間、１日１回の間隔でメタンフェタミンを（2mg/kg, s.c.）投与するとともに、メタンフェタミン投与の30分前にドパミンD1受容体拮抗薬R(+)-SCH23390 (0.1mg/kg, i.p.)又はドパミンD2受容体拮抗薬raclopride (2mg/kg, i.p.)を投与した。最終投与から２時間後にマウスを断頭し、側坐核のGene1発現量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図２０に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=6-8)。繰り返しのある二元配置分散分析において、賦形剤投与群、R(+)-SCH23390投与群及びraclopride投与群の間で有意差が認められた（* P<0.05 対 賦形剤/生理食塩水-投与群。# P<0.05 対 賦形剤/メタンフェタミン-投与群）。この結果より、Gene1のmRNA発現量の増加がドパミン受容体を介したシグナルによって制御されていることが示唆された。【００７５】
5-2. Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処置マウスにおけるメタンフェタミン連続投与によるTNF-α mRNAの発現変化
マウスに５日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与した。この間、右脳室内(AP ?0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV ?2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC)、人工脳脊髄液(CSF)を浸透圧ポンプによって持続的に注入した。メタンフェタミンの最終投与から２時間後にマウスを断頭し、側坐核のTNF-α mRNA発現量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図２１に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8-10)。Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群、コントロール(CSF処置)群、及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群の間で有意差が認められた（* P<0.05 対 生理食塩水-投与群。# P<0.05 対 生理食塩水+CSF-処置群と生理食塩水+Gene1-SC-処置群。$ P<0.05 対 メタンフェタミン+Gene1- SC処置群）。この結果より、TNF-αを介してGene1が作用する可能性が示唆された。【００７６】
5-3. メタンフェタミン誘発細胞外ドパミン量の増加におけるGene1アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivoの効果
マウスに2日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与した。この間、右脳室内(AP ?0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV ?2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド (Gene1-SC)、又は人工脳脊髄液(CSF)を浸透圧ポンプによって持続的に注入した。3日目にin vivo マイクロダイアリシス法によって側坐核(AP +1.7 mm, ML ?0.8 mm from bregma, DV ?4.0 mm from the skull)における細胞外ドパミン量をメタンフェタミン投与後の220分間測定した。測定結果を図２２に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=5-6)。繰り返しのある二元配置分散分析において、Gene1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理群、コントロール(CSF)群、及びスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド群の間で有意差が認められた（* P<0.05 対 Gene1-SC-処置群）。この結果より、メタンフェタミンによって誘発される細胞外ドパミン量の増加をGene1が抑制していることが示唆された。【００７７】
5-4. メタンフェタミン誘発シナプトソーム[3H]DA 取り込みの低下におけるGene1の効果
マウスに３日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与した。この間、右脳室内(AP ?0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV ?2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC)、人工脳脊髄液(CSF)を浸透圧ポンプによって持続的に注入した。[3H]DAの最終濃度は5nMとした。メタンフェタミンの最終投与から２時間後にマウスを断頭し、中脳シナプトソーム内の[3H]DA量を測定した。測定結果を図２３に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=7-8)。生理食塩水+CSF-処置群、生理食塩水+Gene1-SC-処置群、生理食塩水+Gene1-AS-処置群、メタンフェタミン+CSF-処置群、メタンフェタミン+Gene1-SC-処置群、メタンフェタミン+Gene1-AS-処置群のシナプトソーム[3H]DA取り込み量はそれぞれ0.32±0.04、0.29±0.03、0.20±0.02、0.18±0.01、0.20±0.01、0.09±0.01 pmol/4分/mg プロテインである。この結果より、メタンフェタミンによって誘発される、シナプトソームへのドパミン取り込みの低下をGene1が抑制することが示唆された。【００７８】
5-5. メタンフェタミン誘発シナプト小胞[3H]DA 取り込みの低下におけるGene1の効果
マウスに３日間メタンフェタミン(1mg/kg, s.c.)を投与した。この間、右脳室内(AP ?0.5 mm, ML +1.0 mm from bregma, DV ?2.0 mm from the skull)にGene1アンチセンスオリゴヌクレオチド(Gene1-AS, 1.8nmol /6μl/ day)、スクランブルコントロールオリゴヌクレオチド(Gene1-SC)、人工脳脊髄液(CSF)を浸透圧ポンプによって持続的に注入した。[3H]DAの最終濃度は30nMとした。メタンフェタミンの最終投与から２時間後にマウスを断頭し、中脳シナプトソーム内の[3H]DA量を測定した。測定結果を図２４に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8)。生理食塩水+CSF-処置群、生理食塩水+Gene1-SC-処置群、生理食塩水+Gene1-AS-処置群、メタンフェタミン+CSF-処置群、メタンフェタミン+Gene1-SC-処置群、メタンフェタミン+Gene1-AS-処置群のシナプト小胞[3H]DA取り込み量はそれぞれ3.76±0.25、4.05±0.29、2.80±0.20、1.74±0.21、1.85±0.14、0.90±0.14 pmol/4分/mg プロテインである。この結果より、メタンフェタミンによって誘発される、シナプト小胞へのドパミン取り込みの低下をGene1が抑制することが示唆された。【００７９】
5-6. メタンフェタミン誘発[3H]DA取り込み低下におけるトランスフェクションしたGene1の効果
pcDNA-DEST53（Invitrogen社）を利用してGene1の全長又はフラグメントを挿入した発現ベクターを構築した（図２５）。PC12細胞にリポフェクトアミンを用いてGene1全長を発現する発現ベクター、Gene1フラグメントを発現する発現ベクター、又はpcDNA-DESTベクター（空ベクター）をトランスフェクトした。24穴プレートで細胞を2〜3日間培養した後、30分間メタンフェタミン(1.0μM)で前処置した。その後、10μM pagylineと10μM ascorbic acidを添加したKrebs-Ringer HEPESバッファーを用い、細胞内への[3H]DA取り込み量を測定した。[3H]DAの最終濃度は20nMとした。また、細胞を22℃で10分間インキュベートした。結果は平均値±標準誤差で示した(n=9-12)。測定結果を図２６に示す。Gene1全長を発現する発現ベクターをトランスフェクトした細胞では、メタンフェタミンによって誘導される、[3H]DA取り込み量の低下が抑制されていることがわかる（* P<0.05 対 pcDNA-DEST53ベクター処置細胞。# P<0.05 対 Gene1全長処置細胞。$ P<0.05 対 Gene1フラグメント処置細胞。+P<0.05 対 メタンフェタミン+pcDNA-DEST53ベクター処置細胞）。
一方、細胞内のGene1 mRNA発現量をRT-PCR法で測定した結果、Gene1全長を発現する発現ベクターをトランスフェクトした細胞ではGene1 mRNA発現量の顕著な増加が確認された（図２７）。
以上の結果より、メタンフェタミンによって誘発される、細胞内へのドパミン取り込みの低下をGene1が抑制することが示唆された。【００８０】
5-7. メタンフェタミン連続投与後の側坐核でのGene1の局在
Gene1がコードする部分ペプチド（S-3抗原：CNTAFRGLRQHPRTQLL：配列番号１９、又はS-4抗原：CMSVDSRFRGKGIAKALG：配列番号２０）を抗原としてウサギに免疫し、２種類のポリクローナル抗体（Gene1抗体S-3、Gene1抗体S-4）を得た。一方、マウスに６日間メタンフェタミン(2mg/kg, s.c.)を投与し、最終投与から２４時間後に断頭した。側坐核の標本サンプルを作製し、上記ポリクローナル抗体（Gene1抗体S-3）を用いて免疫染色を行った（図２８）。図２８に示す染色結果より、Gene1は神経細胞の細胞質に局在することがわかる。尚、Gene1抗体S-4を使用した場合も同様の染色像が得られた（図示せず）。【００８１】
6. ニコチン、アルコール、フェンサイクリジンにおけるGene1 mRNAの発現変化
ニコチン、アルコール、フェンサイクリジンに対するGene1の応答性を調べた。
(1)ニコチン
マウスに１２日間ニコチン(0.05-1.0mg/kg, s.c.)を投与した。最終投与から2時間後に断頭し、側坐核内のGene1 mRNA量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図２９（ａ）に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=5)。図示の通り、ニコチンの投与とGene1の発現量との間に相関が認められた（* P<0.05 対 生理食塩水-投与群）。
(2)アルコール
マウスに6%エタノール又は水（コントロール）を１２日間摂取させた後、断頭した。側坐核内のGene1 mRNA量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図２９（ｂ）に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=7-8)。図示の通り、エタノールの投与とGene1の発現量との間に有意な相関は認められなかった。
(3)フェンサイクリジン
マウスに１４日間フェンサイクリジン(10mg/kg, s.c.)を投与した。最終投与から2時間後に断頭し、前頭葉皮質内のGene1 mRNA量をRT-PCR法で測定した。測定結果を図２９（ｃ）に示す。結果は平均値±標準誤差で示した(n=8-9)。図示の通り、フェンサイクリジンの投与とGene1の発現量との間に有意な相関は認められなかった。【００８２】
7. Gene3(Piccolo)の発現
以下の手順でPiccoloタンパク質の神経細胞における発現状態を調べた。ラット１３日齢から取り出した中脳培養細胞を用いて、チロシンハイドロキシラーゼおよびPiccoloを蛍光２重染色した。染色結果を図３０、３１に示す。この結果より、ドパミン作動性神経及び中脳ドパミン神経の神経前節においてPiccoloタンパク質が発現していることがわかる。【００８３】
8. メタンフェタミンによるドパミン取り込み抑制に対するPiccoloの作用
8-1. ヒトドパミントランスポーターを強制発現させたPC12細胞でのドパミン取り込み抑制に対するPiccolo C2Aドメインの作用
Piccoloの特定のドメイン（CA2、PDZ）を発現する発現ベクターを構築した（図示せず）。ヒトドパミントランスポーターを強制発現させたPC12細胞に、この発現ベクターをトランスフェクトした後、1μMのメタンフェタミンを30分間作用させ、細胞内へのドパミン取り込み量を測定した。尚、3Hで標識したドパミンを最終濃度20mMになるように10分間作用させた。測定結果を図３２に示す。図示の通り、ヒトドパミントランスポーターを強制発現させたPC12細胞にPiccolo C2Aドメインを発現させると、メタンフェタミンによるドパミン取り込み抑制作用が低下した。【００８４】
8-2. ヒトドパミントランスポーターを強制発現させたPC12細胞でのドパミン取り込みに対する、Piccolo発現抑制の効果
ヒトドパミントランスポーターを過剰発現させたPC12細胞にPiccoloタンパク質のオリゴヌクレオチドアンチセンスまたはセンスを導入した後、3Hで標識したドパミンを最終濃度20nMとなるように10分間作用させ、細胞内の放射能を測定した。測定結果を図３３に示す。この結果より、ヒトドパミントランスポーターを過剰発現させたPC12細胞における、メタンフェタミンによるドパミン取り込み抑制をPiccoloが阻止することが示唆された。【００８５】
8-3. PC12細胞におけるドパミントランスポーターとPiccoloタンパク質の関係
(1)メタンフェタミンによるドパミントランスポーターの細胞内移動に対するPiccoloの作用
PC12細胞にヒトドパミントランスポーターを強制発現させ、メタンフェタミンの作用前後におけるヒトドパミントランスポーターについて蛍光免疫染色を行った。メタンフェタミンを作用させるとヒトドパミントランスポーターの細胞内移動が観察された。また、同じ細胞にPiccoloのC2Aドメインも強制発現させたところ、両タンパクの細胞内局在化は同じであった。
以上の結果より、メタンフェタミンによるドパミントランスポーターの細胞内移動をピッコロCA2ドメインは促進することが判明した。【００８６】
(2)ドパミン作動性神経細胞におけるPiccoloの局在
以下の手順でPiccoloタンパク質のドパミン作動性神経細胞における発現状態を調べた。胎児期１３日目のラット中脳から取り出したドパミン作動性神経を用いて、Piccoloとドパミントランスポターの２重染色を行った。染色結果を図３５に示す。図３５からわかるように、ドパミン作動性神経細胞においてドパミントランスポーターとPiccoloは同じ領域に局在する。
以上の(1)(2)の結果より、メタンフェタミンを作用させるとドパミントランスポーターの内在化がおきること（図３６（ａ））、及びドパミントランスポーターとピッコロのC2Aドメインは同じ場所で発現していること（図３６（ｂ））が明らかとなった。【００８７】
9. まとめ
以上の実験結果から、同定に成功したGene1〜3はいずれも、薬物依存形成とともに中枢神経系組織内での発現量が増加することが明らかとなった。また、Gene1はドパミンの神経細胞内への取り込みに関与することが明らかとなった。また、Gene1はニコチン応答性であることも判明した。Gene3(Piccolo)についてはドパミントランスポーターの内在化に関与することが判明した。このように、薬物依存に強い関連性を有する遺伝子が同定された。また、Gene1〜3のヒト相同遺伝子も同定された。これらの遺伝子は、薬物依存症の診断又は治療において有用であると期待される。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明が提供する精神障害関連遺伝子は、精神障害に有効な化合物のスクリーニングや、精神障害の治療、診断及び研究などにおいてその利用が図られる。【００８９】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
0004942044.tif 000002
【図２】
0004942044.tif 000003
【図３】
0004942044.tif 000004
【図４】
0004942044.tif 000005
【図１０】
0004942044.tif 000006
【図１１】
0004942044.tif 000007
【図１２】
0004942044.tif 000008
【図１４】
0004942044.tif 000009
【図１５】
0004942044.tif 000010
【図１６】
0004942044.tif 000011
【図１７】
0004942044.tif 000012
【図１８】
0004942044.tif 000013
【図１９】
0004942044.tif 000014
【図２０】
0004942044.tif 000015
【図２１】
0004942044.tif 000016
【図２２】
0004942044.tif 000017
【図２３】
0004942044.tif 000018
【図２４】
0004942044.tif 000019
【図２５】
0004942044.tif 000020
【図２６】
0004942044.tif 000021
【図２７】
0004942044.tif 000022
【図２９】
0004942044.tif 000023
【図３２】
0004942044.tif 000024
【図３３】
0004942044.tif 000025
【図５】
0004942044.tif 000026
【図６】
0004942044.tif 000027
【図７】
0004942044.tif 000028
【図８】
0004942044.tif 000029
【図９】
0004942044.tif 000030
【図１３】
0004942044.tif 000031
【図２８】
0004942044.tif 000032
【図３０】
0004942044.tif 000033
【図３１】
0004942044.tif 000034
【図３４】
0004942044.tif 000035
【図３５】
0004942044.tif 000036
【図３６】
0004942044.tif 000037
【配列表】
0004942044000001.app