(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移を含む反応によって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成し、Ｃａ２＋で活性化されず、かつ、ＥＤＴＡで阻害されない、下記＜Ａ＞乃至＜Ｃ＞のいずれかに記載の理化学的性質を有する、バチルス属微生物由来のα−イソマルトシル転移酵素：
＜Ａ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において１１２，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法においてｐＩ５．５±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において４５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下においてｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．０乃至９．０の範囲で安定；
（７）  部分アミノ酸配列
配列表における配列番号１のアミノ酸配列を有する；
＜Ｂ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において１０２，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法においてｐＩ５．６±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下においてｐＨ５．５乃至６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．５乃至９．０の範囲で安定；
（７）  部分アミノ酸配列
配列表における配列番号１乃至４のアミノ酸配列を有する；
＜Ｃ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において１１２，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法においてｐＩ７．８±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下においてｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４５℃まで安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．５乃至１０．０の範囲で安定；
（７）  部分アミノ酸配列
配列表における配列番号１、５乃至７のアミノ酸配列を有する。
【請求項２】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移を含む反応によって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成し、Ｃａ２＋で活性化されず、かつ、ＥＤＴＡで阻害されない、下記＜Ｄ＞又は＜Ｅ＞に記載の理化学的性質を有するアルスロバクター属微生物由来のα−イソマルトシル転移酵素：
＜Ｄ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において１１６，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法においてｐＩ４．２±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下においてｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４５℃まで安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ３．６乃至９．０の範囲で安定；
（７）  部分アミノ酸配列
配列表における配列番号８のアミノ酸配列を有する；
＜Ｅ＞
（１）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において５０℃；
（２）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下においてｐＨ６．５；
（３）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４５℃まで安定；
（４）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．５乃至９．０の範囲で安定。
【請求項３】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質が、パノース又はイソマルトシルマルトースである請求項１又は２記載のα−イソマルトシル転移酵素。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のα−イソマルトシル転移酵素産生能を有するバチルス属又はアルスロバクター属の微生物を栄養培地で培養して得られる培養物からα−イソマルトシル転移酵素を採取することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のα−イソマルトシル転移酵素の製造方法。
【請求項５】
バチルス・グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）、バチルス・グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）、バチルス・グロビスポルス（Ｂａｓｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｎ７５、（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、アルスロバクター・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｍｏｓｕｓ）Ｓ１（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ａ１９（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）、又はそれらのα−イソマルトシル転移酵素産生能を有する変異株である請求項１乃至３のいずれかに記載のα−イソマルトシル転移酵素産生能を有する微生物。
【請求項６】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を含有する溶液に、請求項１乃至３のいずれかに記載のα−イソマルトシル転移酵素を作用させることを特徴とするα−イソマルトシル転移反応方法。
【請求項７】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質が、パノース又はイソマルトシルマルト−スである請求項６記載のα−イソマルトシル転移反応方法。
【請求項８】
α−イソマルトシル転移反応に際し、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、Ｄ−リボース、Ｌ−リボース、Ｄ−プシコース、ソルビトール、キシリトール、アラビトール、リビトール、エリスリトール、マルト−ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース、コージビオース、ニゲロース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソパノース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、イソマルトシルグルコシド、及びＬ−アスコルビン酸から選ばれる１種又は２種以上の受容体共存下で反応させて糖転移物を生成させることを特徴とする請求項６又は７記載のα−イソマルトシル転移反応方法。
【請求項９】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を含有する溶液に、請求項１乃至３のいずれかに記載のα−イソマルトシル転移酵素を作用させることを特徴とするサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖又はこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１０】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質が、パノース又はイソマルトシルマルト−スであることを特徴とする請求項９記載の環状四糖又はこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１１】
α−イソマルトシル転移酵素を作用させた後、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させることを特徴とする請求項９又は１０記載の環状四糖又はこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１２】
α−イソマルトシル転移酵素を作用させた後、脱色、脱塩、カラムクロマトグラフィーによる分画、膜による分離、微生物による醗酵処理及びアルカリ処理による分解除去から選ばれる１種又は２種以上の精製方法を用いることを特徴とする請求項９乃至１１のいずれかに記載の環状四糖又はこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１３】
得られる環状四糖又はこれを含む糖質の形態が、シラップ、マスキット、非晶質粉末、非晶質固状物、結晶粉末、又は結晶固状物である請求項９乃至１２のいずれかに記載の環状四糖又はこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１４】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を含有する溶液に、請求項１乃至３のいずれかに記載のα−イソマルトシル転移酵素を作用させサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖含有溶液を調製する工程と、当該環状四糖含有溶液を精製、濃縮して過飽和にし、有機溶媒を用いることなく水溶液から晶出させる工程とを含んでなる環状四糖の結晶の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−イソマルトシル転移酵素とその製造方法並びに用途に関し、より詳細には、新規α−イソマルトシル転移酵素、当該酵素を産生する微生物、当該酵素の製造方法、当該酵素を用いるα−イソマルトシル転移反応方法、当該酵素を用いて得られるサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖、又はこれを含む糖質及びそれらの製造方法、更には、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖、又はこれを含む糖質、及びその糖質を含有せしめた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースを構成糖とする糖質としては、例えば、澱粉の部分分解物であるアミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端にそれぞれ非還元末端と還元末端とを有し、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、固形物当たりの還元力の大きいものは、通常、分子が小さく低粘度で甘味が強いものの、他の化合物との反応性が高く、例えば、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起し易く、褐変や悪臭を生じ、その品質劣化を起こし易い欠点のあることが知られている。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、『ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）』、第７１巻、３５３乃至３５８頁（１９４９年）で開示されているように、澱粉にマセランス・アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ  ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合したα−、β−又はγ−環状デキストリンを生成させる方法が知られている。昨今、澱粉からこれら環状デキストリンが工業的規模で生産され、これら環状デキストリンは、それらが有する非還元性、無味性、包接能などの特性を生かした用途に利用されている。また、先に本出願人が、特開平７−１４３８７６号公報、特開平７−２１３２８３号公報などで開示したように、マルトオリゴ糖など澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグルコースがα，α−結合したトレハロースを生成させる方法が知られている。現在では、α，α−トレハロースは、澱粉から工業的規模で生産され、その非還元性、温和で高品質な甘味特性などを生かした用途に利用されている。このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース、グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−環状デキストリンは、それぞれの特性を生かして工業的規模で生産され、利用されているものの、その種類が限られており、更に多様な非還元性糖質乃至低還元性糖質の提供が望まれている。
【０００３】
一方、近年、グルコースを構成糖とする新たな環状の四糖類が報告された。即ち、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８頁（１９９４年）には、主としてグルコース残基がα−１、３結合とα−１，６結合で交互に連なっている、アルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることにより、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（本明細書においては、本糖質を「環状四糖」と略称することもある。）が生成し、これを有機溶媒の一種であるメタノール共存下で晶出させることが示されている。
【０００４】
環状四糖は、環状構造を有することから、各種化合物を包接する能力を有すると共に、非還元性故に、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく各種用途に加工、利用できることが期待される。しかしながら、環状四糖の製造原料としてのアルテルナンや、環状四糖の製造に必要な酵素であるアルテルナナーゼの入手が困難である上、それらを産生する微生物も容易に入手できる状態にはない。
【０００５】
斯かる状況下、斯界に於いては、環状四糖を工業的規模で容易に実施できる新たな製造方法の確立と、理化学的性質の解明された環状四糖の提供が鶴首される。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は、入手容易な糖質から環状四糖を生成する新規酵素、当該酵素の製造方法、当該酵素を用いるα−イソマルトシル転移反応方法、当該酵素を用いて得られる環状四糖、又はこれを含む糖質及びその製造方法、及び、環状四糖、又はこれを含む糖質を含有せしめた組成物を提供することにある。
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決するために、イソマルトオリゴ糖に着目し、その内、パノースから環状四糖を生成する新規な酵素を得ることを目的として、広く微生物を検索してきた。その結果、岡山県岡山市の土壌から単離したバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新規微生物（「Ｃ９株」、「Ｃ１１株」及び「Ｎ７５株」）並びに長野県下高井郡の土壌及び岡山県岡山市の土壌からそれぞれ単離したアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物（「Ｓ１株」及び「Ａ１９株」）が、前記酵素の産生能を有することを見出した。
【０００８】
本発明者等は、前記微生物Ｃ９株、Ｃ１１株、Ｎ７５株、Ｓ１株、及びＡ１９株のいずれの株も、新規酵素、即ち、新規なα−イソマルトシル転移酵素を生産し、この新規酵素は、パノースやイソマルトシルマルトースなどの非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有しているグルコース重合度が３以上の糖質（本明細書においては、本糖質を「α−イソマルトシルグルコ糖質」と略称することもある。）に作用して環状四糖を生成することを見出した。また、本発明者等は、当該酵素の諸性質を明らかにすると共に、その製造方法を確立し、また、当該酵素による転移反応方法、及び当該酵素を用いた環状四糖、又はこれを含む糖質の製造方法を確立した。更に、本発明者等は、この環状四糖の理化学的性質を調べたところ、環状四糖の形態として、５乃至６含水結晶、１含水結晶、無水結晶などの結晶及び非晶質の形態のものが存在すること、また、メチルアルコールやエチルアルコールなどの有機溶媒を用いることなく、環状四糖の過飽和水溶液から前記結晶を容易に晶出し、採取できることを見出した。更に、このようにして得られる環状四糖は、例えば、エチルアルコールや酢酸などの揮発成分を包接する能力を有すること、また、アミノカルボニル反応を起こさず、自体、褐変や劣化が比較的少ないこと、熱やｐＨに安定であること、更には、食品本来の風味を損なうことのない温和で低甘味の糖質であること、難発酵性、難消化性で食物繊維として好適であるなどの種々の有用な特性を有していることを見出した。また、環状四糖、又はこれを含む糖質を含有せしめた組成物、例えば、風味良好な高品質の食品、低カロリー食品、ダイエット食品、安定で高品質な化粧品、更に、高活性で安定な医薬品とそれらの製造方法を確立して本発明を完成した。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、本発明のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた糖質を高速液体クロマトグラフィーにかけたときの溶出パターンを示す図である。
図２は、本発明のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
図３は、本発明のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（13Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
図４は、環状四糖の構造が、サイクロ｛−６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１，３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１，６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１，３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−｝であることを示す図である。
図５は、本発明のバチルス・グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
図６は、本発明のバチルス・グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
図７は、本発明のバチルス・グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
図８は、本発明のバチルス・グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
図９は、本発明のバチルス・グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
図１０は、本発明のバチルス・グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
図１１は、本発明のバチルス・グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
図１２は、本発明のバチルス・グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
図１３は、本発明のバチルス・グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
図１４は、本発明のバチルス・グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
図１５は、本発明のバチルス・グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
図１６は、本発明のバチルス・グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
図１７は、本発明のアルスロバクター・ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
図１８は、本発明のアルスロバクター・ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
図１９は、本発明のアルスロバクター・ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
図２０は、本発明のアルスロバクター・ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
図２１は、本発明のアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
図２２は、本発明のアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
図２３は、本発明のアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
図２４は、本発明のアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
図２５は、本発明のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖５乃至６含水結晶状粉末の顕微鏡写真をディスプレー上に表示した中間調画像である。
図２６は、本発明のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖５乃至６含水結晶状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
図２７は、本発明のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖５乃至６含水結晶粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
図２８は、本発明の環状四糖１含水結晶粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
図２９は、本発明の環状四糖１含水結晶粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
図３０は、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶粉末を４０℃で真空乾燥して得た環状四糖無水結晶粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
図３１は、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶粉末を１２０℃で真空乾燥して得た環状四糖無水結晶粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
図３２は、本発明の無水環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明による微生物Ｃ９株、Ｃ１１株及びＮ７５株（以上バチルス属）ならびに微生物Ｓ１株及びＡ１９株（以上アルスロバクター属）の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００１１】
＜微生物Ｃ９株＞
Ａ  細胞形態
（１）  肉汁寒天培養、２７℃
通常０．５乃至１．０μｍ×１．５乃至５.０μｍの桿菌。多形性なし。運動性あり。球形の胞子を細胞内の端に形成。膨潤した胞子嚢を形成。グラム陽性。
Ｂ  培養性質
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：  円形、大きさは２日間で１乃至２ｍｍ
周縁：  全縁
隆起：  半レンズ状
光沢：  鈍光
表面：  平滑
色調：  不透明、淡い黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：  中程度
形状：  放散状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化する。
Ｃ  生理学的性質
（１）  ＶＰ試験：  陰性
（２）  インドールの生成：  陰性
（３）  硝酸からのガス生成：  陽性
（４）  澱粉の加水分解：  陽性
（５）  色素の生成：  可溶性色素の生成はない
（６）  ウレアーゼ：  陽性
（７）  オキシダーゼ：  陽性
（８）  カタラーゼ：  陽性
（９）  生育の範囲：  ｐＨ５．５乃至９．０、温度１０乃至３５℃
（１０）  酸素に対する態度：  好気性
（１１）  炭素源の利用性と酸生成の有無
利用性        酸生成
Ｄ−グルコース        利用する      陽性
グリセロール          利用する      陽性
スクロース            利用する      陽性
ラクトース            利用する      陽性
（１２）  ＤＮＡのＧＣ含量：  ４０％
【００１２】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、バチルス・グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）に属する新規微生物であり、α−イソマルトシルグルコ糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成する本発明のα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有する微生物であることが判明した。
【００１３】
これらの結果より、本発明者等は、本菌をバチルス・グロビスポルスＣ９と命名し、平成１２年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３として受託された。
【００１４】
＜微生物Ｃ１１株＞
Ａ  細胞形態
（１）  肉汁寒天培養、２７℃
通常０．５乃至１．０μｍ×１．５乃至５μｍの桿菌。多形性なし。運動性あり。球形の胞子を細胞内の端に形成。膨潤した胞子嚢を形成。グラム陽性。
Ｂ  培養性質
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：  円形、大きさは２日間で１乃至２ｍｍ
周縁：  全縁
隆起：  半レンズ状
光沢：  鈍光
表面：  平滑
色調：  不透明、淡い黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：  中程度
形状：  放散状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化する。
Ｃ  生理学的性質
（１）  ＶＰ試験：  陰性
（２）  インドールの生成：  陰性
（３）  硝酸からのガス生成：  陽性
（４）  澱粉の加水分解：  陽性
（５）  色素の生成：  可溶性色素の生成はない
（６）  ウレアーゼ：  陽性
（７）  オキシダーゼ：  陽性
（８）  カタラーゼ：  陽性
（９）  生育の範囲：ｐＨ５．５乃至９．０、温度１０乃至３５℃
（１０）  酸素に対する態度：  好気性
（１１）  炭素源の利用性と酸生成の有無
利用性        酸生成
Ｄ−グルコース        利用する      陽性
グリセロール          利用する      陽性
スクロース            利用する      陽性
ラクトース            利用する      陽性
（１２）  ＤＮＡのＧＣ含量：３９％
【００１５】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、バチルス・グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）に属する新規微生物であり、α−イソマルトシルグルコ糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成する本発明のα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有する微生物であることが判明した。
【００１６】
これらの結果に基づき、本発明者等は、本菌を新規微生物バチルス・グロビスポルスＣ１１と命名し、平成１２年４月２５日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４として受託された。
【００１７】
＜微生物Ｎ７５株＞
Ａ  細胞形態
（１）  肉汁寒天培養、２７℃
通常０．５乃至１．０μｍ×１．５乃至５μｍの桿菌。多形性なし。運動性あり。球形の胞子を細胞内の端に形成。膨潤した胞子嚢を形成。グラム陽性。
Ｂ  培養性質
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：  円形、大きさは２日間で１乃至２ｍｍ
周縁：  全縁
隆起：  半レンズ状
光沢：  鈍光
表面：  平滑
色調：  不透明、淡い黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：  中程度
形状：  放散状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化する。
Ｃ  生理学的性質
（１）  ＶＰ試験：  陰性
（２）  インドールの生成：  陰性
（３）  硝酸からのガス生成：  陽性
（４）  澱粉の加水分解：  陽性
（５）  色素の生成：  可溶性色素の生成はない
（６）  ウレアーゼ：  陽性
（７）  オキシダーゼ：  陽性
（８）  カタラーゼ：  陽性
（９）  生育の範囲：  ｐＨ５．７乃至９．０、温度１０乃至３５℃
（１０）  酸素に対する態度：  好気性
（１１）  炭素源の利用性と酸生成の有無
利用性        酸生成
Ｄ−グルコース        利用する      陽性
グリセロール          利用する      陽性
スクロース            利用する      陽性
ラクトース            利用する      陽性
（１２）  ＤＮＡのＧＣ含量：４０％
【００１８】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、バチルス・グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）に属する新規微生物であり、α−イソマルトシルグルコ糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成する本発明のα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有する微生物であることが判明した。
【００１９】
これらの結果より、本発明者等は、本菌をバチルス・グロビスポルスＮ７５と命名し、平成１３年５月１６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１として受託された。
【００２０】
＜微生物Ｓ１株＞
Ａ  細胞形態
（１）  肉汁寒天培養、２７℃
通常０．３乃至０．７μｍ×０．８乃至３．５μｍの桿菌。多形性あり。運動性なし。無胞子。グラム陽性。
（２）  ＥＹＧ寒天培地、２７℃
桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
Ｂ  培養性質
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：  円形、大きさは１日間で２乃至３ｍｍ
周縁：  全縁
隆起：  半レンズ状
光沢：  鈍光
表面：  平滑
色調：  不透明、淡い黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：  中程度
形状：  糸状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
Ｃ  生理学的性質
（１）  澱粉の加水分解：  陰性
（２）  色素の生成：  可溶性の色素の生成はない
（３）  ウレアーゼ：  陽性
（４）  オキシダーゼ：  陽性
（５）  カタラーゼ：  陽性
（６）  酸素に対する態度：  好気性
（７）  細胞壁の主要ジアミノ酸：  リジン
（８）  細胞壁のペプチドグリカン型：  リジン−アラニン
（９）  細胞壁のＮ−アシル型：  アセチル
（１０）  細胞壁の構成糖：  ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノース
（１１）  ビタミンの要求性：  なし
（１２）  ＤＮＡのＧＣ含量：  ６５％
（１３）  ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジー：  アルスロバクター・ラモサス（ＡＴＣＣ  １３７２７）との間で８４．４％のＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーを示す
【００２１】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、アルスロバクター・ラモサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒａｍｏｓｕｓ）に属する新規微生物であり、α−イソマルトシルグルコ糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成する本発明のα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有する微生物であることが判明した。
【００２２】
これらの結果より、本発明者等は、本菌をアルスロバクター・ラモサスＳ１と命名し、平成１３年５月１６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２として受託された。
【００２３】
＜微生物Ａ１９株＞
Ａ  細胞形態
（１）  肉汁寒天培養、２７℃
通常０．４乃至０．８μｍ×１．０乃至４．０μｍの桿菌。多形性あり。運動性なし。無胞子。グラム陽性。
（２）  ＥＹＧ寒天培地、２７℃
桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
Ｂ  培養性質
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：  円形、大きさは１日間で２乃至３ｍｍ
周縁：  全縁
隆起：  半レンズ状
光沢：  鈍光
表面：  平滑
色調：  不透明、黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：  中程度
形状：  糸状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
Ｃ  生理学的性質
（１）  澱粉の加水分解：  陰性
（２）  色素の生成：  可溶性の色素の生成はない
（３）  ウレアーゼ：  陽性
（４）  オキシダーゼ：  陽性
（５）  カタラーゼ：  陽性
（６）  酸素に対する態度：  好気性
（７）  細胞壁の主要ジアミノ酸：  リジン
（８）  細胞壁のペプチドグリカン型：  リジン−アラニン
（９）  細胞壁のＮ−アシル型：  アセチル
（１０）  細胞壁の構成糖：  ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノース
（１１）  ビタミンの要求性：  なし
（１２）  ＤＮＡのＧＣ含量：  ６２％
（１３）  ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジー：  アルスロバクター・グロビホルミス（ＡＴＣＣ  ８０１０）との間で６６．５％のＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーを示す
【００２４】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、アルスロバクター・グロビホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）に属する新規微生物であり、α−イソマルトシルグルコ糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成する本発明のα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有する微生物であることが判明した。
【００２５】
これらの結果より、本発明者等は、本菌をアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９と命名し、平成１３年５月１６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０として受託された。
【００２６】
本発明には、上記菌株はもとより、それらの変異株、更には、α−イソマルトシル転移酵素産生能を有する他の微生物、及びそれらの変異株も包含されることは言うまでもない。
【００２７】
本発明の微生物の培養に用いる培地は、当該微生物が生育でき、α−イソマルトシル転移酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地及び天然培地のいずれも用いることができる。炭素源としては、当該微生物の生育に利用できるものであればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、Ｌ−ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸などを適宜用いることができる。培地中のこれらの炭素源の濃度は、炭素源の種類により適宜選択すればよい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、及び尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物などを適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、及びコバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸類、ビタミン類なども適宜用いることができる。
【００２８】
本発明の微生物の培養は、通常、４乃至４０℃、好ましくは、２０乃至３７℃、ｐＨ４乃至１０、好ましくは、ｐＨ５乃至９から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は、当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好適には、１０時間乃至１５０時間とする。また、培養液の溶存酸素濃度は特に制限はないが、通常、０．５乃至２０ｐｐｍの範囲となるように、通気量を調節したり、攪拌したり、通気に酸素を使用又は追加したり、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００２９】
当該酵素活性は、菌体を含め培養物全体に認められることから、このようにして得られる培養物をそのまま粗酵素液として用いることも、また、斯かる培養物から菌体を破砕又は除去した後の培養液を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去する方法としては、公知の固液分離法を採用できる。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。前述のように、菌体除去後の培養液は粗酵素液として用いることができ、一般的には、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などの膜濃縮法により当該酵素を濃縮して利用する。
【００３０】
前記粗酵素液、濃縮酵素液中に含まれる本発明のα−イソマルトシル転移酵素、及び以下に述べる精製α−イソマルトシル転移酵素は、公知の方法により固定化して用いることもできる。その固定化方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いる包括法などを適宜採用できる。
【００３１】
本発明のα−イソマルトシル転移酵素を分離・精製するには、酵素や蛋白質を分離・精製するための公知の方法を適宜組み合わせて実施することができる。その具体例としては、例えば、前記粗酵素液や濃縮酵素液を硫安塩析して濃縮し、透析後、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いる陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いるアフィニティークロマトグラフィー、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー、及び『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いるアフィニティークロマトグラフィーを順次適用することにより、電気泳動的に単一な本発明のα−イソマルトシル転移酵素を得ることができる。
【００３２】
このようにして得られる本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、α−イソマルトシルグルコ糖質からα−イソマルトシル転移を含む反応によって環状四糖を生成する酵素であって、詳細には、下記の理化学的性質を有する。
（１）  作用
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移を含む反応によって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する；
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において約８２，０００ダルトン乃至約１３６，０００ダルトン；
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法においてｐＩ約３．７乃至ｐＩ約８．３；
（４）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において約４５℃乃至約５０℃；
（５）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下においてｐＨ約５．５乃至ｐＨ約６．５；
（６）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で安定温度域を約４５℃まで安定；
（７）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ約３．６乃至ｐＨ約１０．０の範囲で安定；
（８）Ｎ末端アミノ酸配列
Ｎ末端アミノ酸配列として、イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン（配列表における配列番号１）又はアスパラギン酸−スレオニン−ロイシン−セリン−グリシン−バリン−フェニルアラニン−ヒスチジン−グリシン−プロリン（配列表における配列番号８）で表されるアミノ酸配列を有する場合がある。
【００３３】
本発明のα−イソマルトシル転移酵素を作用させて環状四糖を生成させるための基質としては、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有しているグルコース重合度が３以上の糖質、例えば、パノース、イソマルトシルマルトースなどが有利に用いられる。パノースを調製するには、例えば、プルランを酸加水分解したり、プルランをサーモアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）α−アミラーゼやネオプルラナーゼで分解したり、マルトースにα−グルコシダーゼを作用させたり、マルトースとスクロースとの混合物にデキストランスクラーゼを作用させ転移させるなどの方法が有利に採用できる。イソマルトシルマルトースを調製するには、例えば、プルランにβ−アミラーゼとプルラナーゼとを同時に作用させ加水分解したり、アミロペクチンやグリコーゲンを細菌糖化型α−アミラーゼで加水分解したり、マルトトリオースにα−グルコシダーゼを作用させたり、マルトトリオースとスクロースとの混合物にデキストランスクラーゼを作用させるなどの方法が有利に採用できる。
【００３４】
本発明のα−イソマルトシル転移酵素を基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．１ｗ／ｖ％の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明のα−イソマルトシル転移酵素の反応は進行して環状四糖を生成する。工業的には、基質濃度１ｗ／ｖ％以上、望ましくは、１０ｗ／ｖ％以上が好適であり、この条件下で、環状四糖を有利に生成できる。また、基質溶液としては、完全には溶けきらない不溶性の基質を含有するまでの高濃度の基質溶液であってもよい。反応温度は反応が進行し得る温度、即ち、６０℃付近以下の温度が望ましく、より望ましくは、３０乃至５０℃付近の温度が用いられる。反応ｐＨは、通常、ｐＨ３．６乃至９の範囲に調整すればよく、望ましくは、ｐＨ約５．５乃至ｐ７の範囲とする。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行の程度により適宜選択すればよい。
【００３５】
上記の酵素反応によって得られた溶液は、通常、環状四糖と共にグルコース、マルトース、更には、残存する基質としての非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質などを含有しており、そのまま環状四糖含有糖液として用いることができる。また、必要に応じて、α−イソマルトシル転移酵素を作用させた後に、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上を作用させて、夾雑するオリゴ糖を加水分解した環状四糖含有液として用いることもできる。一般的には、更に、精製して用いる。その精製方法としては、公知の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、環状四糖を利用せず夾雑糖質を資化又は分解する微生物、例えば、乳酸菌、酢酸菌、酵母などによる発酵処理、アルカリ処理などにより残存する還元性糖質を分解除去するなどの１種又は２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００３６】
とりわけ、環状四糖の工業的大量製造方法としては、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーが好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報又は特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、環状四糖以外の夾雑糖類を除去し、含有量を高めた環状四糖、又はこれを含む糖質水溶液を有利に製造することができる。このカラムクロマトグラフィーに於いては、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式、バッチ方式、半連続方式、連続方式のいずれの方式も適宜採用することができる。
【００３７】
このようにして得られた環状四糖を含む水溶液、又はその含量を向上させた糖質水溶液は、通常、環状四糖を、固形物当り、１０ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、「ｗ／ｗ％」を「％」と略記する。）以上、望ましくは４０％以上含有する糖質水溶液で、通常、これを濃縮し、シラップ状製品とする。このシラップ状製品は、更に乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００３８】
更には、本発明における環状四糖の結晶を製造するには、通常、前記精製方法により得られる環状四糖を含有する糖質水溶液、望ましくは、環状四糖を固形物当り約４０％以上、更に望ましくは５０％以上含有する糖質水溶液が好適に用いられる。結晶形態として、５乃至６含水結晶を製造する場合には、通常、斯かる糖質水溶液を環状四糖の過飽和水溶液、例えば、濃度約４０％乃至９０％環状四糖水溶液とし、これを助晶缶にとり、約０．１乃至２０％の種結晶共存下で、過飽和を保てる温度、望ましくは、１０乃至９０℃の範囲で攪拌しつつ徐冷し、結晶を含有するマスキットを製造する。環状四糖１含水結晶や無水結晶を晶出させる場合には、一般的には、より高濃度、高温度での過飽和条件が採用される。マスキットから環状四糖の結晶又はこれを含有する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などの公知の方法を適宜採用すればよい。環状四糖１含水結晶や無水結晶は、環状四糖５乃至６含水結晶を脱水又は乾燥させて製造することもできる。このようにして製造される本発明の環状四糖結晶又はその高含有粉末は、上品で温和な低甘味を有する非還元性乃至低還元性の白色粉末乃至固形物で、耐酸性、耐熱性に優れた安定な糖質であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸含有物質と混合し、加工しても、褐変や異臭を発生することは少なく、混合した他の素材を損なうことも殆どない。また、自体吸湿性も低く、粉末状でも付着・固結防止性を有している。
【００３９】
また、本発明の環状四糖は、包接能を有していることから、殊に、揮散し易い香気成分、有効成分などの揮散防止、品質劣化防止、安定化保持などに極めて優れた効果を発揮し、保香剤、安定剤などとして好適に使用できる。この際、必要に応じて、他の環状糖質、例えば、環状デキストリン類、分岐環状デキストリン類、環状デキストラン類、環状フラクタン類などと併用して、安定性を強化することも有利に実施できる。
【００４０】
更に、アミラーゼやα−グルコシダーゼによって実質的に分解されないことから、経口摂取しても実質的に消化吸収されず、また、腸内細菌によって醗酵されにくく、極めて低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。換言すれば、本発明の環状四糖を経口摂取すれば、糖質としての重量、容量があるので、満腹感が得られる一方、本発明の環状四糖は、実質的に消化されないことから、低カロリー食品素材、ダイエット食品素材としても好適に使用できる。また、虫歯誘発菌などによっても醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても好適に利用できる。
【００４１】
更に、本発明の環状四糖は、耐酸性、耐アルカリ性、耐熱性に優れた無毒、無害の安全な天然甘味料であることから、結晶製品の場合、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、及びポリビニルピロリドンなどの１種又は２種以上の結合剤と併用して錠剤や糖衣錠として利用することもできる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、離水防止性、固結防止性、保香性、変色防止性、安定性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、澱粉老化防止性、蛋白質変性防止性、脂質劣化防止性などの種々の性質をも具備している。
【００４２】
従って、本発明の環状四糖、又はこれを含む糖質は、甘味料、難醗酵性食品素材、難消化性食品素材、低う蝕性食品素材、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、固結防止剤、保香剤、変色防止剤、澱粉老化防止剤、蛋白質変性防止剤、脂質劣化防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、そのままで、又は必要に応じて、当該糖質と公知材料と適宜併用して、例えば、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。公知の材料としては、例えば、呈味料、着色料、着香料、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、又は薬効成分などが適宜利用できる。
【００４３】
本発明の環状四糖又はこれを含む糖質は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、α，α−トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロース、グリシン、アラニンなどの他の甘味料と併用することも、また、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と併用することもできる。とりわけ、エリスリトール、キシリトール、マルチトールなどの低カロリー甘味料やα−グリコシルステビオシド、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ及びスクラロースなどの１種又は２種以上の高甘味度甘味料と併用して、低カロリー甘味料又はダイエット甘味料などとして好適に利用することができる。
【００４４】
また、本発明の環状四糖、又はこれを含む糖質の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、又は結合剤などと混合して、顆粒状、球状、短棒状、板状、立方体状、又は錠剤などの各種形状に成形して使用することも随意である。
【００４５】
また、本発明の環状四糖、又はこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良、風味改良、或いは品質改良などに有利に利用できる。
【００４６】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のたれ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料に、甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤などとして利用することができる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、造醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、アミノ酸含有飲料、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付、呈味改良、風味改良、或いは品質改良などに有利に利用できる。
【００４７】
また、家畜、家禽、その他、蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料などの嗜好性を向上又はカロリーを低減させるなどの目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など、固形物、粉末、ペースト状、液状などの各種形態にある嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、更には品質改良剤、安定剤などとしても有利に利用できる。
【００４８】
品質改良剤や安定剤への用途としては、各種有用成分や活性を失い易い各種生理活性物質、又はこれを含む健康食品、化粧品及び医薬品などに有利に利用できる。例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ツモア・ネクロシス・ファクターα、ツモア・ネクロシス・ファクターβ、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンなどのサイトカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、クマザサエキス、モモの葉エキス、ビワの葉エキス、ユズの皮エキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質に本発明の環状四糖、又はこれを含む糖質を配合することにより、それらの有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状、固状又は粉末状の健康食品、化粧品、医薬品などを容易に製造できる。
【００４９】
上記で述べた、本発明の環状四糖又はこれを含む糖質による、香気成分の揮散防止（保香）、活性成分の劣化防止、保湿、離水防止、他の糖質の晶出防止、蛋白質変性防止、脂質劣化防止、乳化状態の安定化などの効果や、それ自体の安定性・賦形性などは、当然のことながら、皮膚外用に通常利用される他の成分と配合した場合にも効果的に発揮される。そして、本発明の環状四糖又はこれを含む糖質は、他の天然の糖質と同様に、皮膚に適用したときの刺激が極めて低く、かつ、皮膚における水分の保持にも奏功するので、当該糖質は、皮膚外用組成物に配合して利用することも有利に実施できる。斯かる皮膚外用組成物において、本発明の環状四糖又はこれを含む糖質は、通常、皮膚への適用が許容される他の成分の１種又は２種以上、例えば、皮膚への外用が許容される、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、エステル類、アルコール類、界面活性剤、色素、香料、ホルモン類、ビタミン類、植物エキス、動物エキス、微生物エキス、塩類、紫外線吸収剤、感光色素、抗酸化剤、防腐・殺菌剤、制汗・消臭剤、清涼剤、キレート剤、糖質、アミノ酸類、増粘剤などから適宜選ばれる１種又は２種以上とともに配合される。当該皮膚外用組成物は、例えば、化粧品分野においては、ローション、クリーム、乳液、ゲル、粉末、ペースト、ブロックなどの形態で、石けん、化粧石けん、肌洗い粉、洗顔クリーム、洗顔フォーム、フェイシャルリンス、ボディーシャンプー、ボディーリンス、シャンプー、リンス、髪洗い粉などの清浄用化粧品、セットローション、ヘアブロー、チック、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアローション、養毛料、染毛料、頭皮用トリートメント、びん付油、つや出し油、髪油、スキ油などの頭髪化粧品、化粧水、バニシングクリーム、エモリエントクリーム、エモリエントローション、パック用化粧料（ゼリー状ピールオフタイプ、ゼリー状ふきとり型、ペースト状洗い流し型、粉末状など）、クレンジングクリーム、コールドクリーム、ハンドクリーム、ハンドローション、乳液、保湿液、アフターシェービングローション、シェービングローション、プレシェーブローション、アフターシェービングクリーム、アフターシェービングフォーム、プレシェーブクリーム、化粧用油、ベビーオイルなどの基礎化粧品、ファンデーション（液状、クリーム状、固型など）、タルカムパウダー、ベビーパウダー、ボディパウダー、パヒュームパウダー、メークアップベース、おしろい（クリーム状、ペースト状、液状、固型、粉末など）、アイシャドウ、アイクリーム、マスカラ、眉墨、まつげ化粧料、頬紅、頬化粧水などのメークアップ化粧品、香水、練香水、粉末香水、オーデコロン、パフュームコロン、オードトワレなどの芳香化粧品、日焼けクリーム、日焼けローション、日焼けオイル、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼け止めオイルなどの日焼け・日焼け止め化粧品、マニキュア、ペディキュア、ネイルカラー、ネイルラッカー、エナメルリムーバー、ネイルクリーム、爪化粧料などの爪化粧品、アイライナー化粧品、口紅、リップクリーム、練紅、リップグロスなどの口唇化粧品、練歯磨、マウスウォッシュなどの口腔化粧品、バスソルト、バスオイル、浴用化粧料などの入浴用化粧品などの用途に利用されるよう提供される。また、例えば、医薬品分野においては、当該皮膚外用組成物は、湿布剤、噴霧剤、塗布剤、浴剤、貼付剤、軟膏剤、パスタ剤、リニメント剤、ローション剤、パップ剤などの形態で提供される。
【００５０】
本発明の環状四糖又はこれを含む糖質とともに皮膚外用組成物に配合することができる他の成分を以下より具体的に述べると、油脂類としては、例えば、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、ゴマ油、サフラワー油、大豆油、ツバキ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油などの植物油（常温で液体）、カカオ脂、ヤシ脂、パーム油、モクロウなどの植物脂（常温で個体）、ミンク油、卵黄油、タートル油などの動物油が挙げられる。
【００５１】
本発明で利用できるロウ類としては、例えば、ホホバ油、カルナウバロウ、キャンデリラロウなどの植物性ロウ、マッコウ鯨油、槌鯨油、ミツロウ、鯨ロウ、ラノリンなどの動物性ロウ、モンタンロウなどの鉱物性ロウが挙げられる。
【００５２】
本発明で利用できる炭化水素類としては、例えば、パラフィン（別名「固形パラフィン」）、流動パラフィン、セレシン、マイクロクリスタリンワックス、ワセリンなどの鉱物性炭化水素、スクワラン、スクワレンなどの動物起源の炭化水素が挙げられる。
【００５３】
本発明で利用できる脂肪酸類としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ベヘニン酸、ウンデシレン酸、ラノリン脂肪酸、硬質ラノリン脂肪酸、軟質ラノリン脂肪酸、イソステアリン酸ならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００５４】
本発明で利用できるアルコール類としては、例えば、ラウリルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、ラノリンアルコール、水添ラノリンアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール、ポリエチレングリコールなどの高級アルコール（多価アルコールを含む）、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの低級アルコール（多価アルコールを含む）ならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００５５】
本発明で利用できるエステル類としては、例えば、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ステアリン酸コレステリル、酢酸コレステリル、ｎ−酪酸コレステリル、カプロン酸コレステリル、ラウリン酸コレステリル、ミリスチン酸コレステリル、パルミチン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、１２−ヒドロキシステアリン酸コレステリル、オレイン酸デシル、オレイン酸オクチルドデシル、ラノリン脂肪酸イソプロピル、トリミリスチン酸グリセリン、ジオレイン酸プロピレングリコール、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、酢酸ラノリン、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシルならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００５６】
本発明で利用できる界面活性剤としては、例えば、ラウリン酸亜鉛、ミリスチン酸亜鉛、パルミチン酸亜鉛、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、セチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンセチルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ラウロイルサルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸サルコシントリエタノールアミン、ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、大豆リン脂質などの陰イオン性界面活性剤、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化アルキルイソキノリニウム、ドデシルジメチル２−フェノキシエチルアンモニウムブロマイドなどの陽イオン性界面活性剤、β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインなどの両イオン性界面活性剤、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、親油型モノステアリン酸グリセリン、ジオレイン酸プロピレングリコール、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ショ糖脂肪酸エステル、ウンデシレン酸モノエタノールアミド、ヤシ油ジエタノールアミド、モノオレイン酸ポリエチレングリコール、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビット、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの非イオン性界面活性剤や、以上の化合物の誘導体が挙げられる。
【００５７】
本発明で利用できる色素としては、例えば、アマランス、エリスロシン、ローズベンガル、アシッドレッド、レーキレッドＣ、リソールレッド、ローダミン、ブリリアントレーキレッド、エオシンＹＳ、ビオラミンＲ、ブリリアントファストスカーレット、ボンソーＲなどの赤色タール系色素、ジブロモフルオレセイン、パーマネントオレンジ、エリスロシン黄ＮＡ、オレンジＩなどの橙色タール系色素、タートラジン、サンセットエロー、ウラニン、ベンチジンエローＧ、ナフトールエローＳ、エローＡＢなどの黄色タール系色素、ファストグリーンＦＣＦ、アリザニンシアニングリーンＦ、ライトグリーンＳＦ黄、ナフトールグリーンＢなどの緑色タール系色素、ブリリアントブルーＦＣＦ、インジゴカルミン、インジゴ、パテントブルーＮＡ、カルバンスレンブルー、スダンブルーなどの青色タール系色素、レゾルシンブラウンなどの褐色タール系色素、アリズリンパープル、アリズロールパープルなどの紫色タール系色素、ナフトールブルーブラックなどの黒色タール系色素、酸化亜鉛、酸化チタン、水酸化コバルト、水酸化アルミニウム、タルク、カオリン、雲母、ベントナイト、マンガンバイオレット、雲母チタンなどの無機顔料、β−カロチン、リコピン、クロシンなどのカロチノイド系色素、シソニン、サフロールイエロー、ルチン、ケルセチンなどのフラボノイド系色素、リボフラビンなどおフラビン系色素、コチニール、アリザニン、シコニンなどのキノン系色素や、以上の化合物の誘導体が挙げられる。
【００５８】
皮膚外用もしくは化粧品用に一般に利用される香料は、大別すると、天然香料である動物性香料及び植物性香料のほか、合成香料及びこれらを適宜配合した調合香料に分類される。本発明で利用できる動物性香料としては、例えば、じゃ香、霊猫香、海猫香、龍涎香などが挙げられる。植物性香料としては、例えば、アニスの実、バジルの葉、キャラウェイの果実、シナモンの樹皮、コリアンダーの種子、ラベンダーの花、ナツメグの種子、ペパーミントの葉、バラの花、ローズマリーの花種又は葉、タイムの葉などから水蒸気蒸留などによって得られる留出物（精油類）、ヒアシンスの花、ジャスミンの花、ミモザの花、バラの花、バニラの種子などから得られる抽出物（一般に、性状、製法によってアブソリュート類、レジノイド類、オレオレジン類、チンキ類に分類される）などが挙げられる。合成香料としては、例えば、アセトフェノン、アネソール、ベンジルアルコール、酢酸ブチル、カンフル、シトラール、シトロネロール、クミンアルデヒド、エストラゴール、エチルバニリン、酢酸ゲラニル、リナロール、メントール、メチルｐ−クレゾール、サリチル酸メチル、フェニル酢酸、バニリンならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。また、本発明においては、以上のような香料を適宜配合した調合香料を利用することもできる。
【００５９】
本発明で利用できるホルモン類としては、例えば、エストロン、エストラジオールなどの卵胞ホルモン類、プロゲストロン、プレグノロンなどの黄体ホルモン類、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ホルモン類が挙げられ、ビタミン類としては、例えば、レチノール、レチノイン酸、α−、β−、及びγ−カロテン、これらの誘導体などのビタミンＡに属する化合物、チアミン（ビタミンＢ1）、リボフラビン（ビタミンＢ2）、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン（以上ビタミンＢ6）、これらの誘導体などのビタミンＢに属する化合物、Ｌ−アスコルビン酸や、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸をはじめとするグリコシル−Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビンもしくはグリコシル−Ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体（別名「脂溶性ビタミンＣ」）、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステルなどのＬ−アスコルビン酸誘導体などのビタミンＣに属する化合物、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、これらの誘導体などのビタミンＤに属する化合物、α−、β−、γ−、及びδ−トコフェロール、α−、β−、γ−、及びδ−トコトリエノール、これらの誘導体などのビタミンＥに属する化合物が挙げられる。
【００６０】
本発明で利用できる植物抽出物としては、上記で述べた香料として利用される植物抽出物以外に、例えば、カミツレ抽出物、セージ抽出物、アロエ抽出物、サルビア抽出物、アシタバ抽出物、アボガド抽出物、イラクサ抽出物、ウイキョウ抽出物、ウーロン茶抽出物、オウバク抽出物、オオムギ抽出物、オクラ抽出物、オーリス抽出物、海藻抽出物、カリン抽出物、カンゾウ抽出物、クインスシード抽出物、クチナシ抽出物、クマザサ抽出物、ケイヒ抽出物、紅茶抽出物、コメヌカ抽出物、コメヌカ発酵抽出物、ステビア抽出物、セロリ抽出物、センブリ抽出物、ダイズ抽出物、タイム抽出物、茶抽出物、ツバキ抽出物、トウキ抽出物、トウモロコシ抽出物、ニンジン抽出物、ハマナス抽出物、ヒノキ抽出物、ヘチマ抽出物、ベニバナ抽出物、マツ抽出物、モモ抽出物、ユーカリ抽出物、ユキノシタ抽出物、ユズ抽出物、ユリ抽出物、ヨクイニン抽出物、ヨモギ抽出物、藍藻抽出物、海藻抽出物、リンゴ抽出物、レイシ抽出物、レタス抽出物のほか、ヒノキチオール、アズレン、クロロフィル、グリチルリチンなどの植物からの単離化合物などが挙げられる。本発明で利用できる動物抽出物としては、例えば、胎盤抽出物が挙げられる。本発明で利用できる微生物エキスとしては、例えば、酵母エキスが挙げられる。当該皮膚外用組成物において、塩類としては、皮膚外用が通常許容されている塩類が一般に利用できるほか、海水、海洋深層水、海水乾燥物、鉱泉塩などの天然塩（溶液を含む）も有利に利用できる。
【００６１】
本発明で利用できる紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシルエステル、シノキサート、パラメトキシ桂皮酸エチルヘキシルエステル、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、オキシベンゾゾン、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチルならびにこれらの化合物の誘導体のほか、５−クロロウラシル、グアニン、シトシンなどの紫外線遮蔽能を有する有機物質が挙げられ、感光色素としては、例えば、２，２′［３′−［２−（３−ヘプチル−４−メチル−２−チアゾリン−２−イリデン）エチリデン］プロペニレン］ビス［３−ヘプチル−４−メチル］チアゾリニウムヨーダイド（別名「プラトニン」）、２−［２−（３−ヘプチル−４−メチル−２−チアゾリン−２−イリデン）メチン］−３−ヘプチル−４−メチルチアゾリニウムヨーダイド（別名「ピオニン」）、６−［２−［（５−ブロモ−２−ピリジル）アミノ］ビニル］−１−エチル−２−ピコリニウムヨーダイド（別名「タカナール」）、２−（２−アニリノビニル）−３，４−ジメチル−オキサゾリニウムヨーダイド（別名「ルミネキス」）ならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００６２】
本発明で利用できる抗酸化剤としては、既に述べた成分で抗酸化作用を有するものの他、例えば、没食子酸プロピル、没食子酸ブチル、没食子酸オクチル、没食子酸ドデシル、ノルジヒドロガイアレン酸（別名「ＮＤＧＡ」）、ブチルヒドロキシアニソール（別名「ＢＨＡ」）、ジブチルヒドロキシトルエン（別名「ＢＨＴ」）、４−ヒドロキシメチル１−２，６−ジターシャリーブチルフェノールならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００６３】
本発明で利用できる防腐・殺菌剤としては、既に述べた成分で防腐又は殺菌作用を有するモノの他、例えば、フェノール、パラクロロメタクレゾール、レゾルシン、パラオキシ安息香酸エステル、クレゾールなどのフェノール類、安息香酸、ソルビン酸、サリチル酸、ほう酸などの酸類（いずれも塩の形態を含む）、ヘキサクロロフェン、ビチオノール、ジクロロフェンなどのハロゲン化ビスフェノール類、３，４，４′トリクロロカルバニリド、ウンデシレン酸モノエタノールアミドなどのアミド類、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化デカリニウムなどの４級アンモニウム化合物の他、塩酸クロルヘキシジン、１−ハイドロキシピリジン−２−チオン、塩化リゾチームや、以上の化合物の誘導体が挙げられる。
【００６４】
本発明で利用できる制汗・消臭剤としては、塩化アルミニウム、塩化亜鉛、クロルヒドロキシアルミニウム、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アラントインジヒドロキシアルミニウム、アルミニウムクロルヒドレート類などが挙げられ、清涼剤としては、例えば、メントール、ハッカ油、ペパーミント油、カンフル、チモール、スピラントール、サリチル酸メチルなどが挙げられ、キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸誘導体、トリポリリン酸、ヘキサメタクリン酸、ジヒドロエチルグリシン、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、糖酸が挙げられる。
【００６５】
本発明で利用できる糖質としては、スクロース、マルトース、フラクトース、ラクトース、トレハロースなどの少糖類、シクロデキストリン類などの環状四糖以外の環状糖質類、マルチトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、アラビトールなどの糖アルコール類、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、プルラン、セルロール、デキストラン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、水飴、アラビアガム、トラガントガム、キチンなどの多糖類ならびにそれらの誘導体又は部分分解物が挙げられ、アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、シスチン、アスパラギン、グルタミン、ピロリドンカルボン酸、ヒドロキシプロリン、ピペコリン酸、サルコシン、ホモシステイン、ホモセリン、シトルリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインスルフィン酸、アルギニノコハク酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、β−アラニン、タウリン、β−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸や、以上の化合物の塩が挙げられる。
【００６６】
この発明で利用できる増粘剤としては、既述の成分で増粘作用を有するもののほか、例えば、クインスシード、アルギン酸ナトリウム、カチオン化セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチル澱粉、アルギン酸プロピレングリコール、コラーゲン、ケラチン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドエーテル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルメチルエーテル、カルボキシビニルポリマーなどの水溶性高分子、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなどの電解質のほか、各種の油分などが挙げられる。
【００６７】
以上述べたような各種組成物に環状四糖、又はこれを含む糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化などの公知の方法が適宜選ばれる。環状四糖の種々の特性、とりわけ包接作用や、経口摂取される組成物における呈味改良、風味改良などの特性をより効果的に発揮させるためには、環状四糖として、固形物当たり、通常、０．１％以上、より望ましくは、１％以上含有せしめるのが好適である。
【００６８】
以下、本発明を、実験により詳細に説明する。
【００６９】
＜実験１：培養物からの非還元性環状糖質の調製＞
パノース（株式会社林原生物化学研究所製造）５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養した後、遠心分離して菌体を除き培養上清を得た。更に、その培養上清をオートクレーブ（１２０℃、１５分間）し、放冷した後、不溶物を遠心分離して除去し、上清を回収した。
【００７０】
得られた上清中の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジンと水との混液（容量比で６：４：１）、薄層プレートとして、アルミプレート『キーゼルゲル６０』（２０×２０ｃｍ、メルク社製造）を用いて、２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略記する。）を行ない、上清中の糖質を分離した。検出法として、分離した全糖質を硫酸−メタノール法で発色し、また、還元糖質をジフェニルアミン−アニリン法で発色して調べたところ、Ｒｆ値が約０．３１の位置に、硫酸−メタノール法で陽性、かつ、ジフェニルアミン−アニリン法で陰性の非還元性糖質が検出された。
【００７１】
得られた上清約９０ｍｌをｐＨ５．０、４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬアマノ』（天野製薬株式会社製造）を固形物１ｇ当り１，５００単位とグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１ｇ当り７５単位添加して２４時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨ１２に調整し、２時間煮沸して、残存するパノースなど還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、イオン交換樹脂『ダイヤイオンＰＫ２１８』と『ＷＡ３０』（三菱化学工業株式会社製造）を用いて脱色・脱塩し、更に、活性炭で脱色した後、カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』（三菱化学工業株式会社製造）とアニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』（オルガノ株式会社製造）で再度脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し凍結真空乾燥して固形物として約０．５ｇの糖質粉末を得た。
【００７２】
得られた糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する。）で調べたところ、図１に示すように、溶出時間１０．８４分に単一ピークが検出された。このピーク面積から、本糖質の純度は、９９．９％以上であることが判明した。なお、ＨＰＬＣは、『ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製造）を用い、その溶出条件としては、カラム内温度６０℃、溶出液としての水の流速を０．５ｍｌ／ｍｉｎとし、溶出される糖質の検出は、示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。
【００７３】
また、還元力をソモギー・ネルソン法で測定したところ、その還元力は検出限界以下であり、本標品は実質的に非還元性の糖質であると判断した。
【００７４】
＜実験２：非還元性糖質の構造解析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、高速原子衝撃法により質量分析（通称ＦＡＢ−ＭＳ）したところ、質量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数は６４８であることが判明した。
【００７５】
また、常法に従って、硫酸を用いて加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出されたことから、本糖質の構成糖はＤ−グルコースであることも判明した。質量数を考慮すると、本糖質はＤ−グルコース４分子からなる環状糖質であることが判った。
【００７６】
更に、本糖質を用いて核磁気共鳴法（以下、「ＮＭＲ」と略記する）を行ったところ、図２に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、図３に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られ、これらスペクトルにつき、既知糖質のものとの異同を比較したところ、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に記載されている非還元性環状糖質［サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝］のスペクトルと一致し、本糖質の構造が、図４に示す環状四糖、即ち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝であることが判明した。
【００７７】
＜実験３：バチルス・グロビスポルスＣ９からのα−イソマルトシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学株式会社製造）４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製造）１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養して種培養液を得た。
【００７８】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌し、冷却して２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後の培養液中の本発明の酵素の酵素活性は約１．５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの本酵素活性は約１．５単位／ｍｌ（総活性約２６，９００単位）であった。なお、本酵素活性は次のようにして測定した。即ち、パノースを濃度２ｗ／ｖ％となるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質溶液とした。その基質溶液０．５ｍｌに酵素溶液を０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応した。その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量した。α−イソマルトシル転移酵素の酵素活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量とした。本明細書を通じて、α−イソマルトシル転移酵素の酵素活性は、以上の用にして測定される単位を意味するものとする。
【００７９】
＜実験４：バチルス・グロビスポルスＣ９からのα−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験３で得られた培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃で２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して、本発明の酵素活性約２４，７００単位を含む粗酵素液約４００ｍｌを得た。この粗酵素液を『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル（三菱化学株式会社製造）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１０００ｍｌ）に供した。本酵素は、セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製造）を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、セファクリルＨＲ  Ｓ−２００ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。更に、本発明の酵素活性画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー株式会社製造）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本発明の酵素は、ブチル−トヨパール６５０Ｍゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、セファクリルＨＲ  Ｓ−２００ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて精製して、精製α−イソマルトシル転移酵素を得た。各精製ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素の活性量、比活性及び収率を表１に示す。
【００８０】
【表１】
0004919198.tif 000002
【００８１】
７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、本発明の実験で精製したα−イソマルトシル転移酵素標品の純度を検定したところ、本酵素標品の蛋白バンドは単一で、純度の高い標品であった。
【００８２】
＜実験５：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験４の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製造）と比較して本酵素標品の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００８３】
また、前記精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にかけた後、ゲル中の蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素標品の等電点を求めたところ、その等電点（ｐＩ）は約５．５±０．５であった。
【００８４】
本酵素標品の酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図５（温度の影響）、図６（ｐＨの影響）に示した。本酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約４５℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素をｐＨの異なる５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。その結果を図７（温度安定性）と図８（ｐＨ安定性）にそれぞれ示した。これらの図から明らかなように、本酵素の上記の条件下における安定温度域は約４０℃以下であり、また、本酵素の上記の条件下における安定ｐＨ域はｐＨ約４．０乃至約９．０であった。
【００８５】
本酵素の活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表２に示す。
【００８６】
【表２】
0004919198.tif 000003
【００８７】
表２の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ2+で著しく阻害され、Ｃｕ2+でも阻害された。また、Ｃａ2+で活性化されず、ＥＤＴＡで阻害されないことも判明した。
【００８８】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー『モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製造）を用いて分析したところ、Ｎ末端アミノ酸配列として、配列表における配列番号９に示す、イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−アスパラギン−グリシンで表されるアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００８９】
＜実験６：バチルス・グロビスポルスＣ１１からのα−イソマルトシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養液とした。
【００９０】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後の培養液中の本酵素活性は約１．８単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの本酵素活性は１．７単位／ｍｌ（総酵素活性約３０，４００単位）であった。
【００９１】
＜実験７：バチルス・グロビスポルスＣ１１からのα−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験６で得られた培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して本酵素活性を２８，０００単位含む粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液を『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル（三菱化学株式会社製造）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１０００ｍｌ）に供した。本酵素は、セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、セファクリルＨＲ  Ｓ−２００ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。更に、酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、ブチル−トヨパール６５０Ｍゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。再度、この回収した酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、セファクリルＨＲ  Ｓ−２００ゲルを用いるアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製した。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素の活性量、比活性、収率を表３に示す。
【００９２】
【表３】
0004919198.tif 000004
【００９３】
７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製したα−イソマルトシル転移酵素標品の純度を検定したところ、本酵素標品の蛋白バンドは単一で、純度の高い標品であった。
【００９４】
＜実験８：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験７の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１０２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００９５】
本精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％『アンフォライン』（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点（ｐＩ）は約５．６±０．５であった。
【００９６】
本酵素の酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。その結果を図９（温度の影響）、図１０（ｐＨの影響）に示した。本酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約５．５乃至６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素をｐＨの異なる５０ｍＭ緩衝液中で、４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１１（温度安定性）、図１２（ｐＨ安定性）に示した。これらの図に示されるとおり、本酵素の上記の条件下における安定温度域は約４０℃以下であり、また、本酵素の上記の条件下における安定ｐＨ域はｐＨ約４．５乃至約９．０であった。
【００９７】
本酵素の活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。
【００９８】
【表４】
0004919198.tif 000005
【００９９】
表４の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ2+で著しく阻害され、Ｃｕ2+でも阻害された。また、Ｃａ2+で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないことも判明した。
【０１００】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー『モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製造）を用いて分析した。本酵素は、Ｎ末端アミノ酸配列として、配列表における配列番号１０に示す、イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−チロシン−グリシンで表されるアミノ酸配列を有することが判った。
【０１０１】
＜実験９：α−イソマルトシル転移酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験８の方法で得られた精製酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドぺプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。『マイクロボンダパックＣ１８カラム』（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ２２（保持時間約２２分）、Ｐ６３（保持時間約６３分）、Ｐ７１（保持時間約７１分）］を分取し、それぞれ真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。これらのペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号２乃至４に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表５に示す。
【０１０２】
【表５】
0004919198.tif 000006
【０１０３】
＜実験１０：バチルス・グロビスポルスＮ７５からのα−イソマルトシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養液とした。
【０１０４】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後の培養液中の本酵素活性は約１．１単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの本酵素活性は１．１単位／ｍｌ（総酵素活性約１９，８００単位）であった。
【０１０５】
＜実験１１：バチルス・グロビスポルスＮ７５からのα−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験１０で得られた培養上清約１８Ｌを６０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、同緩衝液に対して透析して本酵素活性を１５，７００単位含む粗酵素液約４５０ｍｌを得た。この粗酵素液を『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１０００ｍｌ）に供した。本酵素は、セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、セファクリルＨＲ  Ｓ−２００ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。更に、酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、ブチル−トヨパール６５０Ｍゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。この回収した酵素液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『スーパーＱ−トヨパール（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｃ』ゲルを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍＬ）に供した。本酵素は、スーパーＱ−トヨパール６５０Ｃゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出し、得られた溶出画分を回収して、精製標品とした。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素の活性量、比活性、収率を表６に示す。
【０１０６】
【表６】
0004919198.tif 000007
【０１０７】
７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、本実験で精製したα−イソマルトシル転移酵素標品の純度を検定したところ、本酵素標品の蛋白バンドは単一で、純度の高い標品であった。
【０１０８】
＜実験１２：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１１の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１０９】
本精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％『アンフォライン』（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点（ｐＩ）は約７．８±０．５であった。
【０１１０】
本酵素の酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。その結果を図１３（温度の影響）、図１４（ｐＨの影響）に示した。本酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素をｐＨの異なる５０ｍＭ緩衝液中で、４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１５（温度安定性）、図１６（ｐＨ安定性）に示した。これらの図に示されるとおり、本酵素の上記の条件下における安定温度域は約４５℃以下であり、また、本酵素の上記の条件下における安定ｐＨ域はｐＨ約４．５乃至約１０．０であった。
【０１１１】
本酵素の活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表７に示す。
【０１１２】
【表７】
0004919198.tif 000008
【０１１３】
表７の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ2+で著しく阻害され、Ｃｕ2+でも阻害された。また、Ｃａ2+で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないことも判明した。
【０１１４】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー『モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製造）を用いて分析した。本酵素のＮ末端アミノ酸配列はイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−チロシン−グリシンであり、実験８で明らかにした、バチルス・グロビスポルスＣ１１由来の該酵素のＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１０）と一致することが判明した。
【０１１５】
上記のＮ末端アミノ酸配列の分析結果と、実験５及び実験８にそれぞれ示したバチルス・グロビスポルスＣ９及びＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のＮ末端アミノ酸配列の分析結果を総合すると、バチルス・グロビスポルスに属する微生物由来のα−イソマルトシル転移酵素は、Ｎ末端アミノ酸配列として、通常、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有すると考えられた。
【０１１６】
＜実験１３：α−イソマルトシル転移酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験１１の方法で得られた精製酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドぺプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。『マイクロボンダパックＣ１８カラム』（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−４％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４２．４％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［ＰＮ２１（保持時間約２１分）、ＰＮ３８（保持時間約３８分）、ＰＮ６９（保持時間約６９分）］を分取し、それぞれ真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。これらのペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、６残基又は８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号５乃至７に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表８に示す。
【０１１７】
【表８】
0004919198.tif 000009
【０１１８】
＜実験１４：アルスロバクター・ラモサスＳ１からのα−イソマルトシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・ラモサスＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養液とした。
【０１１９】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後の培養液中の本酵素活性は約０．４５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの本酵素活性は０．４４単位／ｍｌ（総酵素活性約７，９２０単位）であった。
【０１２０】
＜実験１５：アルスロバクター・ラモサスＳ１からのα−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験１４で得られた培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析して、本酵素活性を６，０００単位含む粗酵素液約３８０ｍｌを得た。この粗酵素液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を、遠心分離して不溶物を除いた後、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、セファクリルＨＲ  Ｓ−２００ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント及び、これに続いてマルトテトラオース０ｗ／ｖ％から５ｗ／ｖ％のリニアグラジエントで溶出させたところ、マルトテトラオース濃度約２ｗ／ｖ％付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。更に、酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、ブチル−トヨパール６５０Ｍゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収して、精製標品とした。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素の活性量、比活性、収率を表９に示す。
【０１２１】
【表９】
0004919198.tif 000010
【０１２２】
７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、本実験で精製したα−イソマルトシル転移酵素標品の純度を検定したところ、本酵素標品の蛋白バンドは単一で、純度の高い標品であった。
【０１２３】
＜実験１６：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１５の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１６，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１２４】
本精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％『アンフォライン』（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点（ｐＩ）は約４．２±０．５であった。
【０１２５】
本酵素の酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。その結果を図１７（温度の影響）、図１８（ｐＨの影響）に示した。本酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素をｐＨの異なる５０ｍＭ緩衝液中で、４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１９（温度安定性）、図２０（ｐＨ安定性）に示した。これらの図に示されるとおり、本酵素の上記の条件下における安定温度域は約４５℃以下であり、また、本酵素の上記の条件下における安定ｐＨ域はｐＨ約３．６乃至約９．０であった。
【０１２６】
本酵素の活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表１０に示す。
【０１２７】
【表１０】
0004919198.tif 000011
【０１２８】
表１０の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ2+で著しく阻害され、Ｃｕ2+でも阻害された。また、Ｃａ2+で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないことも判明した。
【０１２９】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー『モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製造）を用いて分析した。本酵素のＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号８に示す、アスパラギン酸−スレオニン−ロイシン−セリン−グリシン−バリン−フェニルアラニン−ヒスチジン−グリシン−プロリンで表される配列であることが判明した。
【０１３０】
＜実験１７：アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９からのα−イソマルトシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養液とした。
【０１３１】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、２７℃、ｐＨ６．０乃至９．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後の培養液中の本酵素活性は約１．７単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの本酵素活性は１．６単位／ｍｌ（総酵素活性約２８，８００単位）であった。
【０１３２】
＜実験１８：アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９からのα−イソマルトシル転移酵素の部分精製＞
実験１７で得られた培養上清約１８Ｌを６０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析して、本酵素活性を１５，７００単位含む粗酵素液約８５０ｍｌを得た。この粗酵素液を、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』ゲルを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素はＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓゲルに吸着し、ＮａＣｌ濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、ＮａＣｌ濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。更に、酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍＬ）に供した。本酵素は、セファクリルＨＲ  Ｓ−２００ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収して、本酵素の部分精製標品を得た。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素の活性量、比活性、収率を表１１に示す。
【０１３３】
【表１１】
0004919198.tif 000012
【０１３４】
７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、本実験で部分精製したα−イソマルトシル転移酵素標品の純度を検定したところ、本酵素のものと考えられる主たる蛋白バンドの他に、３種のマイナーな蛋白バンドが認められた。
【０１３５】
＜実験１９：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１８の方法で得た部分精製α−イソマルトシル転移酵素標品を用いて、本酵素の酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。その結果を図２１（温度の影響）、図２２（ｐＨの影響）に示した。本酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素をｐＨの異なる５０ｍＭ緩衝液中で、４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図２３（温度安定性）、図２４（ｐＨ安定性）に示した。これらの図に示されるとおり、本酵素の上記の条件下における安定温度域は約４５℃以下であり、また、本酵素の上記の条件下における安定ｐＨ域はｐＨ約４．５乃至約９．０であった。
【０１３６】
＜実験２０：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、本酵素の基質になり得るかどうかの試験をした。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソマルトシルマルトース、イソパノース、α，α−トレハロース、コージビオース、ニゲロース、α，β−トレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、α−環状デキストリン、β−環状デキストリン、γ−環状デキストリン、可溶性澱粉、プルラン、又はデキストランの溶液を調製した。これらの溶液に、実験４の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験７の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験１１の方法で得たバチルス・グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験１５の方法で得たアルスロバクター・ラモサスＳ１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、及び実験１８の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来の部分精製α−イソマルトシル転移酵素標品のいずれかを、基質固形物１ｇ当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを３０℃、ｐＨ６．０で２４時間反応させた。酵素反応前後の反応液を、実験１に記載のＴＬＣ法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表１２に示す。
【０１３７】
【表１２】
0004919198.tif 000013
【０１３８】
表１２の結果から明らかなように、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、試験した各種糖質のうち、グルコース重合度が３以上の糖質であって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合のイソマルトシル基を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するパノース（別名、「イソマルトシルグルコース」）、イソマルトシルマルトースに作用し、環状四糖を生成することが判明した。これら糖質からの環状四糖の生成率を、実験１の方法に準じてＨＰＬＣで測定して得られた糖組成から求めたところ、本実験で用いたいずれも酵素の場合も、パノースからの生成率は約４３乃至４４％で、イソマルトシルマルトースからの生成率は約３１％であった。
【０１３９】
一方、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有するものの、この非還元末端以外の結合様式として更にα−１，６グルコシド結合しているイソマルトトリオースには、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は作用しないことがわかった。なお、高分子グルカンである可溶性澱粉、プルラン、デキストランの場合、上記の試験では、少なくともＴＬＣで確認できる環状糖質などの低分子糖質は生成しないことが判明した。これら高分子糖質が、本発明のα−イソマルトシル転移酵素の作用で還元力を増加せず、加水分解されないことを確認するため、以下の試験を行なった。即ち、可溶性澱粉、プルラン、デキストランの溶液に、実験４の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験７の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験１１の方法で得たバチルス・グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、及び実験１５の方法で得たアルスロバクター・ラモサスＳ１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品のいずれかを、基質固形物１ｇ当たりそれぞれ１２単位ずつ加え、基質濃度を１ｗ／ｖ％になるように調整し、これを３５℃、ｐＨ６．０で４時間作用させた。この酵素反応による反応液の還元糖量を経時的にソモギー・ネルソン法で測定した。また、同時に反応液の全糖量をアントロン法で測定した。還元力生成率（％）は下記に示す計算式を用いて算出し、それらの結果を表１３にまとめた。
【０１４０】
計算式：
【式１】
0004919198.tif 000014
【０１４１】
【表１３】
0004919198.tif 000015
【０１４２】
表１３の結果から明らかなように、可溶性澱粉、プルラン、デキストランいずれも還元力の増加は実質的に見られず、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、これら高分子糖質を実質的に加水分解しないことが判明した。
【０１４３】
以上の表１２、表１３の結果から明らかなように、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端の結合様式以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質に作用して環状四糖を生成するものと判断される。
【０１４４】
＜実験２１：パノースからの生成物＞
濃度５％のパノース水溶液に、実験４の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験７の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験１１の方法で得たバチルス・グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験１５の方法で得たアルスロバクター・ラモサスＳ１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、及び実験１８の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来の部分精製α−イソマルトシル転移酵素標品のいずれかを、基質固形物１ｇ当たり４単位加え、３０℃、ｐＨ６．０で１乃至１２時間作用させた。酵素反応液の糖組成（％）は、実験１に記載のＨＰＬＣで分析した。その結果を表１４に示す。
【０１４５】
【表１４】
0004919198.tif 000016
【０１４６】
表１４の結果から明らかなように、本α−イソマルトシル転移酵素の作用により、基質であるパノース量の減少と共に、グルコースと環状四糖の生成量が顕著に増加した。このことから、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、基質であるパノースにおけるイソマルトシル基と還元末端のグルコースとの間の結合を切断してグルコースを遊離すると共に、イソマルトシル転移を含む反応を触媒することによって、パノースから環状四糖を生成すると考えられた。
【０１４７】
また、上記の反応中に生成した他の成分についてみてみると、反応初期（反応開始後１時間）には、３種類の未同定の成分Ａ、Ｂ、Ｃの生成が認められた。上記の５種類の酵素標品による反応液における成分Ａ同士、成分Ｂ同士、成分Ｃ同士はＨＰＬＣにおける保持時間が互いに一致し、このことから、上記の５種類の反応液中に生成した成分Ａ同士、成分Ｂ同士、成分Ｃ同士は、それぞれ同一の物質と判断された。これらの３種の成分のうち、成分Ａは、反応後期（反応開始後１２時間）には消失したが、成分Ｂ及びＣは幾分残存していた。これらのことから、本酵素によるパノースからの環状四糖の生成は、本酵素によるイソマルトシル転移によって生成する成分Ａを中間体として経由する一方、成分Ｂ及びＣは本酵素の作用による生成物ではあるけれども環状四糖に変換されにくい中間体であると推察された。
【０１４８】
上記の未同定の成分Ａ、Ｂ及びＣを同定するために、分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  Ｒ３５５−１５Ｓ−１５  １２Ａ』（株式会社ワイエムシイ製造）を用いて、バチルス・グロビスポルスＣ９由来酵素による上記の反応１時間の反応物からそれぞれを単離し、常法に従ってメチル化分析（表１５）と13Ｃ−ＮＭＲ分析（表１６）を行なった。
【０１４９】
【表１５】
0004919198.tif 000017
【０１５０】
【表１６】
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0004919198.tif 000019
【０１５１】
これらの結果から、成分Ａは、パノースの非還元末端グルコースの３位水酸基にイソマルトシル基がα結合した５糖で、下記に示す化学式１で表わされる３−Ｏ−α−イソマルトシルパノースであることが判明し、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、パノースの非還元末端グルコースの３位水酸基にイソマルトシル基を転移する作用を有することが判明した。
【０１５２】
化学式１：
【化１】
0004919198.tif 000020
【０１５３】
また、成分Ｂは、パノースの非還元末端グルコースの４位水酸基にイソマルトシル基がα結合した５糖で、下記に示す化学式２で表わされる４−Ｏ−α−イソマルトシルパノースであることが判明し、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、パノースの非還元末端グルコースの４位水酸基にイソマルトシル基を転移する作用を有することが判明した。
【０１５４】
化学式２：
【化２】
0004919198.tif 000021
【０１５５】
さらに、成分Ｃは、パノースの還元末端グルコースの１位水酸基にイソマルトシル基がα結合した５糖で、下記に示す化学式３で表される１−Ｏ−α−イソマルトシルβ−パノシドであることが判明し、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、パノースの還元末端グルコースの１位水酸基にイソマルトシル基を転移する作用を有することが判明した。
【０１５６】
化学式３：
【化３】
0004919198.tif 000022
【０１５７】
次に、上記で同定された成分Ａ、Ｂ及びＣからの環状四糖の生成を、精製α−イソマルトシル転移酵素を用いて以下のようにして調べた。すなわち、成分Ａ（３−Ｏ−α−イソマルトシルパノース、化学式１）、成分Ｂ（４−Ｏ−α−イソマルトシルパノース、化学式２）及び成分Ｃ（１−Ｏ−α−イソマルトシルβ−パノシド、化学式３）のいずれかの１ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ６．０）を調製し基質溶液とした。これらの基質溶液に、実験４の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品及び実験７の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品のいずれかを基質固形分１ｇ当たり１単位加え、３５℃で８時間作用させた後、ＨＰＬＣで反応後の糖組成（％）を調べた。結果を表１７に示す。
【０１５８】
【表１７】
0004919198.tif 000023
【０１５９】
表１７から明らかなように、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は成分Ａによく作用し、この酵素作用によって等モルのグルコースと環状四糖が生成した。一方、成分Ｂ及びＣに対しては本酵素は比較的作用し難く、成分Ａを基質とする場合と比べると環状四糖の生成は少なく、また、α−イソマルトシル転移によるさらに別の生成物と思われる他のオリゴ糖の生成も比較的多く認められた。以上のことから、本酵素の作用によるパノースからの環状四糖の生成反応は、主に成分Ａを中間体として経由し、一部は、成分Ｂ及びＣを中間体として経由しているものと推察された。
【０１６０】
以上のことから、本発明のα−イソマルトシル転移酵素のパノースに対する主たる作用は、以下のように判断された。
（１）  本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、パノースに作用してイソマルトシル基と還元末端グルコースとの間のα−１，４グルコシド結合を切断し、分子間のα−イソマルトシル転移反応によって、イソマルトシル基を、パノースの非還元末端グルコースの３位又は４位の水酸基若しくはパノースの還元末端グルコースの１位の水酸基に転移し、それぞれ、３−Ｏ−α−イソマルトシルパノース（上記で同定した成分Ａ、化学式１）、４−Ｏ−α−イソマルトシルパノース（上記で同定した成分Ｂ、化学式２）、及び１−Ｏ−α−イソマルトシルβ−パノシド（上記で同定した成分Ｃ、化学式３）を生成する。
（２）  本発明のα−イソマルトシル転移酵素は上記の生成物にも作用し、当該酵素が３−Ｏ−α−イソマルトシルパノースに作用すると、この糖質におけるα−イソマルトシル−（１→３）−イソマルトシル基と還元末端グルコースとの間のα−１，４グルコシド結合を切断し、分子内転移の環化反応によって、α−イソマルトシル−（１→３）−イソマルトシル基における還元末端の１位の原子をそれ自身の非還元末端グルコースの３位の水酸基に転移して環を閉じ、環状糖質である環状四糖を生成する。
【０１６１】
このように、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、分子間転移と分子内転移の２つの転移作用を有しており、本酵素の分子間転移は、非還元末端のイソマルトシル基に隣接するα−１，４グルコシド結合に作用して、そのイソマルトシル基を、他分子の非還元末端グルコースの３位又は４位の水酸基若しくは還元末端グルコースの１位水酸基に転移する分子間イソマルトシル転移作用であること、また、本発明のα−イソマルトシル転移酵素の分子内転移は、主として、非還元末端のα−イソマルトシル−（１→３）−イソマルトシル基に隣接するα−１，４グルコシド結合に作用し、α−イソマルトシル−（１→３）−イソマルトシル基における還元末端をそれ自身の非還元末端グルコースの３位水酸基に分子内転移し、環状糖質である環状四糖を生成する作用であることが判明した。
【０１６２】
以上、実験２０及び実験２１の結果から、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質に作用して環状四糖を生成するものと判断される。
【０１６３】
＜実験２２：転移受容体特異性＞
各種糖質が本発明のα−イソマルトシル転移酵素の転移受容体になり得るかどうかについて、以下の試験を行った。即ち、被験糖質として、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、メチル−α−Ｄ−グルコシド、メチル−β−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−リボース、Ｌ−リボース、Ｄ−プシコース、ソルビトール、キシリトール、マンニトール、アラビトール、リビトール、エリスリトール、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース、コージビオース、ニゲロース、セロビオース、ゲンチビオース、イソパノース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、イソマルトシルグルコシド、α−環状デキストリン、β−環状デキストリン、γ−環状デキストリン、及びＬ−アスコルビン酸を用い、これらのいずれかを含む水溶液を調製した。これらの被験糖質の水溶液それぞれに、糖供与体としてパノースを等濃度になるように加え、さらに、実験４の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験７の方法で得たバチルス・グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験１１の方法で得たバチルス・グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、実験１５の方法で得たアルスロバクター・ラモサスＳ１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品、及び実験１８の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来の部分精製α−イソマルトシル転移酵素標品のいずれかを、糖質固形物１ｇ当たり１０単位ずつ加え、糖濃度を３．２ｗ／ｖ％になるように調整した。以上の反応液を３０℃、ｐＨ６．０で２４時間保持して酵素反応に供した。酵素反応後の反応液を、被験糖質が単糖又は二糖の場合はガスクロマトグラフィー法（以下、「ＧＬＣ法」と略記する。）で、被験糖質が三糖以上の場合はＨＰＬＣ法で分析し、糖転移物が生成したか否かによって、それぞれの被験糖質が本酵素の転移受容体となり得るか否かを調べた。なお、ＧＬＣでは、ＧＬＣ装置は株式会社島津製作所製『ＧＣ−１６Ａ』、カラムはジー・エル・サイエンス株式会社製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を充填したステンレスカラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の速度で昇温し、検出は水素炎イオン検出器で分析した。ＨＰＬＣに於いて、ＨＰＬＣ装置は東ソー株式会社製『ＣＣＰＤ』、カラムは『ＯＤＳ−ＡＱ−３０３』（株式会社ワイエムシィー社製造）、溶離液は水を流速０．５ｍｌ／分で、検出は示差屈折計で分析した。結果を表１８に示す。
【０１６４】
【表１８】
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【０１６５】
表１８の結果から明らかなように、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、転移受容体として種々の糖質が利用できることが判明した。詳細には、バチルス・グロビスポルスに属する微生物であるＣ９株、Ｃ１１株及びＮ７５株由来の当該酵素は、特に、Ｄ−グルコース、Ｄ−及びＬ−キシロース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、イソマルトース、ネオトレハロース、ゲンチビオース、イソマルトシルグルコシド、及びＬ−アスコルビン酸によく転移し、次いで、Ｌ−ソルボース、マルトース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、セロビオース、ラクトース、スクロース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、イソパノース、エルロース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、エリスリトール、マルチトール、マルトトリイトールに転移し、さらには、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｌ−ラムノースにも転移することが判明した。アルスロバクター・ラモサスＳ１由来の当該酵素は、特に、Ｄ−グルコース、Ｄ−及びＬ−キシロース、メチル−α−グルコシド、Ｌ−リボース、イソマルトース、ネオトレハロース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、イソマルトシルグルコシド、Ｌ−アスコルビン酸によく転移し、次いで、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、メチル−β−グルコシド、Ｄ−リボース、マルトース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、セロビオース、ゲンチビオース、ラクトース、スクロース、イソパノース、エルロース、マルトテトラオース、エリスリトール、マルチトール、マルトトリイトールに転移し、さらには、Ｄ−プシコース、マルトペンタオース、ソルビトール、キシリトール、アラビトール、リビトールにも転移することが判明した。アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来の当該酵素は、特に、Ｄ−グルコース、Ｄ−及びＬ−キシロース、メチル−α−グルコシド、イソマルトース、ネオトレハロース、イソマルトシルグルコシドによく転移し、次いで、Ｌ−ソルボース、メチル−β−グルコシド、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトトリオース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、セロビオース、ゲンチビオース、イソパノース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、Ｌ−アスコルビン酸に転移し、さらには、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−リボース、Ｌ−リボース、Ｄ−プシコース、ソルビトール、キシリトール、エリスリトールにも転移することが判明した。
【０１６６】
以上述べた本発明のα−イソマルトシル転移酵素の性質のうち、精製標品について得られたものを、先にアルテルナンから環状四糖の生成が報告されている『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー』、第２２６巻、６３３乃至６３９頁（１９９４年）記載の加水分解酵素アルテルナナーゼの場合と比較した。その結果を表１９にまとめた。
【０１６７】
【表１９】
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【０１６８】
表１９から明らかなとおり、本発明のα−イソマルトシル転移酵素は、アルテルナナーゼとは全く異なる性質を有する新規な酵素であるといえる。
【０１６９】
＜実験２３：環状四糖の調製＞
パノース（株式会社林原生物化学研究所製造）の水溶液（約１００Ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験７の方法で得た本発明の精製α−イソマルトシル転移酵素標品をパノース１ｇ当たり２単位加え、４８時間作用させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この反応液の一部を採り、ＨＰＬＣで環状四糖生成量を調べたところ、糖組成として約４４％であった。この反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、実験１と同様にα−グルコシダーゼ処理（固形物１ｇ当たり１５００単位を添加）とナガセ生化学工業社製グルコアミラーゼ剤（グルコチーム）処理（固形物１ｇ当たり７５単位を添加）を２４時間行い、残存する還元性オリゴ糖などを加水分解し、更に、水酸化ナトリウムでｐＨ５．８に調整し９０℃で１時間保持して酵素を失活させ、不溶物を濾過して除去した。この濾液を逆浸透膜を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法に従って脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約３６５０ｇを含む糖液約６．１ｋｇを得た。得られた糖液を、オルガノ製イオン交換樹脂（アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型）を充填したカラム（ゲル量約２２５Ｌ）に供し、カラム内温度６０℃で流速約４５Ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行なった。溶出液の糖組成を実験１に記載のＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖の純度が９８％以上の画分を回収し、常法に従って脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約１０００ｇを含む糖液約３ｋｇを得た。得られた糖液の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は約９９．２％であった。
【０１７０】
＜実験２４：水溶液からの結晶化＞
実験２３の方法で得た環状四糖水溶液をエバポレーターで濃度約５０％に濃縮した後、得られた濃縮糖液約２ｋｇを円筒状のプラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約２０時間で温度を６５℃から２０℃まで下げて晶析させ、乾燥して、白色の結晶状粉末を得た。その顕微鏡写真を図２５に示す。続いて、遠心濾過器を用いて分蜜して、結晶状物を湿重量で５４２ｇ回収した。更に、６０℃で３時間乾燥して環状四糖結晶状粉末を４５６ｇ得た。得られた結晶状粉末の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は９９．９％以上で、極めて高純度であった。
【０１７１】
この環状四糖の結晶状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、図２６に示すように、主な回折角（２θ）として、１０．１°、１５．２°、２０．３°及び２５．５°を有することを特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、その水分は１３．０％であること、また、環状四糖１分子当たり５乃至６分子の水を含む結晶であることが判明した。
【０１７２】
更に、この環状四糖の結晶粉末を熱重量測定したところ、図２７に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、１５０℃まで温度を上昇させたとき、４乃至５分子の水に相当する重量減少が認められ、続いて、２５０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、更に、２８０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶は、常圧において、温度を１５０℃まで上昇させることにより結晶分子当たり４乃至５分子の水が離脱して１分子の水を含む結晶になり、更に２５０℃付近で１分子の水が結晶から離脱して無水結晶になることが判明した。
【０１７３】
＜実験２５：環状四糖１含水結晶への変換＞
実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末をガラス容器に入れ、予め温度１４０℃に保温したオイルバス中にそのガラス容器を３０分間保持した。得られた環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、熱処理前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折とは全く異なり、図２８に示すように、主な回折角（２θ）として、８．３°、１６．６°、１７．０°及び１８．２°を有することを特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、その水分は約２．７％で、環状四糖１分子当たり１分子の結晶水を含むことが判明した。更に、この結晶粉末を熱重量測定したところ、図２９に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度２７０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、更に、温度２９０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、本実験例で得た環状四糖結晶状物は１含水結晶であることが判明した。
【０１７４】
＜実験２６：無水結晶への変換＞
実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末を温度４０℃又は１２０℃でそれぞれ１６時間真空乾燥した。得られた環状四糖粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、真空乾燥温度４０℃の場合は水分が約４．２％であり、真空乾燥温度１２０℃の場合は水分が約０．２％で、実質的に無水であることが判明した。これら真空乾燥した環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、真空乾燥前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折及び１含水結晶のものとは全く異なり、図３０（真空乾燥温度４０℃）、図３１（真空乾燥温度１２０℃）に示すように、主な回折角（２θ）として、１０．８°、１４．７°、１５．０°、１５．７°及び２１．５°を有することを特徴とする回折スペクトルが得られた。両回折スペクトル間のピーク強度に強弱が認められるものの、基本的にピークの回折角（２θ）は同一で、結晶学的に同一の無水結晶であると判断された。また、回折スペクトルのベースラインは山状を呈し、真空乾燥前の環状四糖５乃至６含水結晶のもの、及び１含水結晶のものと比べ結晶化度が低下しており、非結晶状態（アモルファス）の環状四糖が存在していることが判明した。このことから、真空乾燥４０℃の場合の水分を約４．２％含む環状四糖粉末は、その水分を含む環状四糖アモルファスと、環状四糖無水結晶とが混在する粉末であると推察された。
【０１７５】
以上のことから、環状四糖５乃至６含水結晶粉末を真空乾燥することにより、環状四糖５乃至６含水結晶は水分子を失い、非結晶状態のアモルファスと無水結晶に変換することが判明した。なお、水分０．２％の無水環状四糖粉末について、実験２４と同様に熱重量分析したところ、図３２に示すように、温度２７０℃付近から環状四糖の熱分解と考えられる重量減少のみが観察された。
【０１７６】
＜実験２７：水に対する飽和濃度＞
温度１０乃至９０℃での水に対する環状四糖の飽和濃度を調べるため、密栓付きガラス製容器に水１０ｍｌを入れ、それに実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶を、各温度で完全に溶解する量以上の量を加えた後、ガラス容器を密封し、飽和に達するまで温度１０乃至９０℃で保温しながら２日間攪拌した。それぞれの温度の環状四糖飽和溶液を精密濾過して未溶解の環状四糖を除去した後、その濾液の水分を乾燥減量法（１２０℃で真空乾燥）で調べ、各温度での飽和濃度（無水物換算）を求めた。結果を表２０に示す。
【０１７７】
【表２０】
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【０１７８】
＜実験２８：熱安定性＞
実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶を水に溶解し濃度１０ｗ／ｖ％の環状四糖水溶液を調製し、その溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、実験１記載の液体クロマトグラフィー法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とした。結果を表２１に示す。
【０１７９】
【表２１】
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【０１８０】
表２１の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は１２０℃の高温加熱でも着色はなく、糖組成の純度の低下もなく、環状四糖は熱に対して安定な糖質であることが判明した。
【０１８１】
＜実験２９：ｐＨ安定性＞
実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶を各種緩衝液（２０ｍＭ）に溶解し、環状四糖を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ２乃至１０に調整した環状四糖溶液を調製した。それぞれの溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で２４時間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、実験１に記載の液体クロマトグラフィー法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とした。結果を表２２に示す。
【０１８２】
【表２２】
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【０１８３】
表２２の結果から明らかなように、環状四糖は１２０℃の高温で２４時間加熱しても、ｐＨ２乃至１０の広範囲で着色はなく、ｐＨ２において糖組成の純度は僅か低下するものの、ｐＨ３乃至１０の範囲では全く糖組成の純度は低下せず、環状四糖は広いｐＨ範囲で換言すれば、ｐＨ３乃至５の酸性側、ｐＨ６乃至８の中性側、ｐＨ９乃至１０のアルカリ側で煮沸しても極めて安定な糖質であることが判明した。
【０１８４】
＜実験３０：アミノカルボニル反応＞
実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶を水に溶解し、更に、それに市販試薬特級のグリシンとリン酸緩衝液を加え、５０ｍＭリン酸緩衝液でｐＨ７．０に調整した１ｗ／ｖ％グリシンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とした。結果を表２３に示す。
【０１８５】
【表２３】
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【０１８６】
表２３の結果から明らかなように、環状四糖は、グリシン共存下で加熱しても着色はなく、グリシンとの褐変を引き起こさない、換言すればアミノカルボニル反応（メイラード反応とも言う）を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１８７】
＜実験３１：アミノカルボニル反応＞
実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶と市販ポリペプトン（日本製薬製）とを脱イオン水に溶かし、５ｗ／ｖ％ポリペプトンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。同時に、ポリペプトンのみを含む溶液をブランクとして同様に加熱した。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とし、ブランクの吸光度を差し引いた値とした。結果を表２４に示す。
【０１８８】
【表２４】
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【０１８９】
表２４の結果から明らかなように、環状四糖は、ポリペプトン共存下で加熱して、ポリペプトンとの褐変を引き起こさない、換言すれば、アミノカルボニル反応を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１９０】
＜実験３２：包接作用＞
実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶を脱イオン水に溶かし、２０％水溶液を調製した。その水溶液１００ｇ当たり、メタノールは２ｇ、エタノールは３ｇ、酢酸は４．６ｇを加えて包接を行なった。その後、それぞれを濾過し濾液を凍結乾燥し、未包接物を除去した。対照として、包接能を有することが知られている分枝サクロデキストリン（商品名『イソエリートＰ』、マルハ株式会社販売）を用いて同様に行なった。
【０１９１】
凍結乾燥粉末中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥粉末１ｇを５ｍｌの脱イオン水に溶かし、それに５ｍｌのジエチルエーテルを加えて抽出を行ない、再度、抽出を繰り返した後、ジエチルエーテル中の抽出物をガスクロマトグラフィー法で定量した。結果を表２５に示す。
【０１９２】
【表２５】
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【０１９３】
表２５の結果から明らかなように、環状四糖は包接能を有しており、その包接能は、分枝サイクロデキストリンのそれと比べ、重量当たり約２倍もの強さであることが判明した。
【０１９４】
＜実験３３：甘味度＞
実験２４の方法で得られた環状四糖５乃至６含水結晶を脱イオン水に溶かし固形物当たり１０％水溶液を調製し、この環状四糖１０％水溶液を基準とし、蔗糖（市販グラニュー糖）の濃度を変え、パネラー５名で官能試験を行なった。その結果、環状四糖の甘味度は、蔗糖の約２０％であった。
【０１９５】
＜実験３４：消化性試験＞
実験１４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『日本栄養食糧学会誌』、第４３巻、２３乃至２９頁（１９９０年）に記載の岡田等の方法に準じて、試験管内での唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼ、小腸粘膜酵素による環状四糖の消化性を調べた。対照として、難消化性糖質として知られているマルチトールを用いた。結果を表２６に示す。
【０１９６】
【表２６】
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【０１９７】
表２６の結果から明らかなように、環状四糖は、唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼで全く消化されず、小腸粘膜酵素によって僅かに消化されたが、その程度は０．７４％と低値であり、対照の難消化性糖質マルチトールの１／５以下であり、環状四糖が極めて消化されにくい糖質であることが判明した。
【０１９８】
＜実験３５：醗酵性試験＞
実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・サイエンス・アンド・ビタミノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ）』、第３７巻、５２９乃至５４４頁（１９９１年）に記載のＯｋｕらの方法に準じて、ラット盲腸内容物による環状四糖の発酵性を調べた。盲腸内容物は、ウィスター系雄ラットをエーテル麻酔下で屠殺し嫌気的に採取し、４倍量の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に懸濁したものを用いた。環状四糖は盲腸内容物重量当たり約７％を添加し、添加直後及び１２時間後に残存する環状四糖量はガスクロマトグラフィー法で定量した。その結果、添加直後の環状四糖濃度は盲腸内容物ｇ当たり６８．０ｍｇ、１２時間後の環状四糖濃度は盲腸内容物１ｇ当たり６３．０ｍｇであり、９３％が醗酵されず残存していることがわかり、環状四糖は極めて醗酵されにくい糖質であることが判明した。
【０１９９】
＜実験３６：資化性試験＞
実験２４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『腸内フローラと食物因子』、光岡知足編、学会出版センター（１９８４年）に記載の方法に準じて、各種腸内細菌による資化性を調べた。即ち、予め培養しておいた新鮮な菌を、環状四糖を０．５％添加したＰＹＦ培地５ｍｌに約１０7ＣＦＵ接種し、嫌気条件下で３７℃で４日間培養した。対照として、資化されやすい糖質グルコースを用いた。資化性の判定は、培養後の培養液のｐＨが６．０以上の場合、資化されない（−）とし、６．０未満の場合、資化される（＋）とした。更に、培養液中に残存する糖質をアンスロン法で測定し糖質の減少量を調べ、資化性の判定を追認した。結果を表２７に示す。
【０２００】
【表２７】
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【０２０１】
表２７の結果から明らかなように、環状四糖は、試験した腸内細菌株のいずれにも資化されず、対照のグルコースはいずれにも資化されたことから、環状四糖が腸内細菌に極めて資化されにくい糖質であることが判明した。
【０２０２】
＜実験３７：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験２４の方法で得た環状四糖高含水結晶を経口投与して急性毒性試験を行なった。その結果、環状四糖は低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。従って、そのＬＤ50値は、５０ｇ／ｋｇマウス体重以上であることが判明した。
【０２０３】
以上の実験３３乃至３７の結果から、環状四糖は、経口摂取しても、消化、吸収されにくく、無カロリー乃至低カロリーの可食素材として、ダイエット甘味料、高甘味度甘味料の賦形剤、ダイエット飲食物の増粘剤、増量剤、賦形剤、更には、食物繊維、脂肪代替食品材料などとして有利に利用できる。
【０２０４】
以下、本発明の環状四糖、それを含む糖質の製造方法を実施例１乃至９で、環状四糖、それを含む糖質を含有せしめた組成物を実施例１０乃至３４で示す。
【実施例１】
【０２０５】
バチルス・グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）を実験６の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、本発明の粗α−イソマルトシル転移酵素液約１Ｌ（３０．２単位／ｍｌ）を回収した。次いで、パノース（株式会社林原生物化学研究所製造）を１０％濃度になるように水に溶解させた後、ｐＨ６．０、温度３５℃に調製し、これに上記の方法で調製した粗α−イソマルトシル転移酵素をパノース１ｇ当たり２単位の割合になるように加え、３６時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得た濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に、濃縮し、乾燥し、粉砕して、環状四糖含有粉末を固形物当たり収率約９１％で得た。
【０２０６】
本品は、固形物当たり、グルコース３４％、イソマルトース２．１％、パノース２．３％、環状四糖４５．０％、イソマルトシルパノース４．８％、イソマルトシルパノシド１．８％、及びその他の糖質を１０．０％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
【実施例２】
【０２０７】
粉末マルトース（株式会社林原製造、登録商標『サンマルト』）を３０％水溶液とし、これにα−グルコシダーゼを含有する酵素剤（天野製薬株式会社、商品名『トランスグルコシダーゼ  Ｌ  アマノ』をマルトース固形物当たり０．０８％加え、ｐＨ５．５に調整し、５５℃で１８時間反応させ、次いで加熱失活させた後、ｐＨ６．０、温度３５℃に調製し、これに実施例１の方法で調製した粗α‐イソマルトシル転移酵素を固形物１ｇ当たり２単位の割合になるように加え、３６時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得た濾液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度７０％のシラップを固形物当たり収率約９２％で得た。
【０２０８】
本品は、固形物当たり、グルコース３２．５％、マルトース１５．７％、イソマルトース９．８％、マルトトリオース４．０％、パノース０．３％、イソマルトトリオース１．６％、環状四糖１７．５％、イソマルトシルパノース１．２％、イソマルトシルパノシド０．７％、及びその他の糖質を１６．７％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
【実施例３】
【０２０９】
プルラン（株式会社林原製造）を５％水溶液とし、これにβ−アミラーゼ（生化学工業株式会社製造）及びプルラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）をプルラン固形物１ｇ当たりそれぞれ５００単位、２０単位の割合で加え、ｐＨ６．０に調整し、４５℃で４８時間反応させ、次いで加熱失活させた後、ｐＨ６．０、温度３５℃に調整し、これに実験４の方法で調製した精製α−イソマルトシル転移酵素を固形物１ｇ当たり２単位の割合になるように加え、３６時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得た濾液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度７０％のシラップを固形物当たり収率約９０％で得た。
【０２１０】
本品は、固形物当たり、グルコース１０．７％、マルトース６２．７％、マルトトリオース０．１％、環状四糖２２．６％、イソマルトシルマルトース１．０％、及びその他の糖質を２．９％含有しており、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【０２１１】
とうもろこし澱粉を濃度３３％澱粉乳とし、これに濃度０．１％となるように炭酸カルシウムを加えてｐＨ６．５に調整し、これにα−アミラーゼ剤（ノボ社製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）澱粉１ｇ当り０．２％になるように加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃で２０分間オートクレーブし、約５５℃に急冷し、これにイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉１ｇ当り１，０００単位及びβ−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉１ｇ当り６０単位の割合になるように加え、２４時間反応させ、次いで加熱失活させた。これを濃度３０％、ｐＨ５．５、温度５５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤『トランスグルコシダーゼ  Ｌ「アマノ」』をマルトース固形物１ｇ当り０．０８％加え、１８時間反応させ、次いで加熱失活させた後、ｐＨ６．０、温度３５℃に調製し、これに実験７の方法で調製した精製α−イソマルトシル転移酵素を固形物１ｇ当り２単位の割合になるように加え、３６時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得た濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度７０％のシラップを固形物当り収率９０％で得た。
【０２１２】
本品は、固形物当り、グルコース２５．１％、マルトース１３．８％、イソマルトース１３．９％、マルトトリオース３．５％、パノース０．２％、イソマルトトリオース２．０％、環状四糖１４．５％、イソマルトシルパノース２．５％、イソマルトシルパノシド１．７％、及びその他の糖質を２２．８％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【０２１３】
実施例１の方法で得た環状四糖含有粉末を、濃度５％、ｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、これにα−グルコシダーゼ剤『トランスグルコシダーゼ  Ｌ  アマノ』、グルコアミラーゼ剤（ナガセ生化学工業株式会社製造、商品名『グルコチーム』）を固形物１ｇ当たりそれぞれ１，５００単位及び７５単位添加し、２４時間反応して、その反応液を９５℃に加熱し、１０分間保った後、冷却し、濾過して得た濾液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％のシラップを得た。得られた糖液を、強酸性カチオン交換樹脂『アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型』（オルガノ株式会社製造）を用いてカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層の全長を２０ｍとした。カラム内温度を６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖高含有画分を採取し、環状四糖高含有液を固形物当たり収率約２８％で得た。本高含有液は、固形物当たり約９９％の環状四糖を含有していた。
【０２１４】
本溶液を濃度約７０％に濃縮した後、助晶缶にとり、種晶として環状四糖５乃至６含水結晶約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマスキットを得た。本マスキットを乾燥搭上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ2の高圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥搭の上部より送風し、底部に設けた移送用金網コンベア上に結晶粉末を捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥搭外に徐々に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成搭に充填して温風を送りつつ、１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、環状四糖５乃至６含水結晶粉末を得た。
【０２１５】
本品は、実質的に還元性を示さず、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
【実施例６】
【０２１６】
実施例３の方法で得た環状四糖含有シラップを実施例５の方法に準じてα−グルコシダーゼ処理とグルコアミラーゼ処理をした後、常法に従って、濾過し、活性炭で脱色、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩し、濃縮して、濃度６５％の糖液を得た。本糖液を、実施例５の方法に準じて強酸性カチオン交換樹脂を用いたカラム分画を行ない、環状四糖高含有画分を採取し、環状四糖高含有液を固形物当たり収率約１０．５％で得た。本高含有液は、固形物当たり約９８％の環状四糖を含有していた。
【０２１７】
本溶液を濃度約８０％に濃縮した後、次いで助晶機に移し、これに種晶として環状四糖５乃至６含水結晶１％加え、８０℃で５分間攪拌助晶し、次いで、アルミ製バットに取り出し、室温で２４時間晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕し、流動床乾燥して、環状四糖５乃至６含水結晶粉末を得た。
【０２１８】
本品は、還元性が極めて低く、実質的にアミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
【実施例７】
【０２１９】
実施例６の方法で得られた環状四糖高含有液を、濃縮しながら連続晶析させ、得たマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少量の水でスプレーし、洗浄して高純度の環状四糖５乃至６含水結晶を固形物当り約５５％の収率で得た。
【０２２０】
本品は、固形物当り純度９８％以上の高純度環状四糖５乃至６含水結晶であって、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料，低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物、更には、工業試薬、化学原料などにも有利に利用できる。
【実施例８】
【０２２１】
とうもろこし澱粉を濃度３３％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを濃度０．１％となるように加えてｐＨ６．５に調製し、さらに、α−アミラーゼ剤（ノボ社製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を澱粉１ｇ当り０．２％になるように加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで、１２０℃で２０分間オートクレーブした。オートクレーブ後の反応液を約５５℃にまで急冷し、ｐＨ５．５に調製した後、これにイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉１ｇ当り５００単位と、β−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉１ｇ当り６０単位の割合になるように加え、２４時間反応させ、次いで熱失活させた。これにα−グルコシダーゼ剤『トランスグルコシダーゼ  Ｌ「アマノ」』を固形物１ｇ当り０．０８％加え、さらに、実験１１の方法で調製した精製α−イソマルトシル転移酵素を固形物１ｇ当り１．５単位の割合になるように加え、４８時間反応させた。この反応液を９５℃に加熱して１０分間保持した後、冷却し、濾過して、得られた濾液を、常法にしたがって活性炭による脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、さらに濃縮して濃度７０％のシラップを固形物当り収率９０％で得た。
【０２２２】
本品は、固形物当り、グルコース２３．７％、マルトース１３．８％、イソマルトース１４．１％、マルトトリオース３．２％、パノース０．３％、イソマルトトリオース２．１％、環状四糖１４．０％、イソマルトシルパノース２．４％、イソマルトシルパノシド１．９％、及びその他の糖質を２４．５％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例９】
【０２２３】
アルスロバクター・ラモサスＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）を実験１４の方法に準じてファーメンターで４８時間培養した。得られた培養物約２０ＬをＳＦ膜を用いて除菌濾過し、さらに、その濾液をＵＦ膜濃縮し、本発明の粗α−イソマルトシル転移酵素液を約１Ｌ（８．０単位／ｍｌ）を得た。次いで、パノース（株式会社林原生物化学研究所製）を濃度２５％になるように水に溶解させた後、ｐＨ５．５、温度４５℃に調整し、これに上記で得た粗α−イソマルトシル転移酵素液をパノース１ｇ当り１．５単位の割合になるように加え、４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱して１０分間保持した後、冷却し、濾過して、得られた濾液を、常法にしたがって、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、さらに、濃縮し、乾燥し、粉砕して、環状四糖含有粉末を固形物当り収率約９３％で得た。
【０２２４】
本品は、固形物当り、グルコース３３．３％、イソマルトース２．５％、パノース２．０％、環状四糖４４．５％、イソマルトシルパノース５．２％、イソマルトシルパノシド１．３％、及びその他の糖質を１１．３％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
【実施例１０】
【０２２５】
＜甘味料＞
実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶０．８重量部に、トレハロース含水結晶（株式会社林原商事販売、登録商標『トレハ』）０．２重量部、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名『αＧスィート』）０．０１重量部、及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（商品名『アスパルテーム』）０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成形機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有している。本品のカロリーは、環状四糖５乃至６含水結晶が難消化性、難発酵性で実質的に無カロリーであることから、甘味度当たり蔗糖の約１０分の１である。しかも、本品は、室温保存下、変質劣化の懸念が無く、安定である。従って、本品は、高品質の低カロリー、低う蝕性甘味料として好適である。
【実施例１１】
【０２２６】
＜ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００重量部に実施例２の方法で得た環状四糖含有シラップ５０重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸０．６重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成形し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出も起こさず、吸湿性少なく、ダレも起こさない安定で高品質のハードキャンディーである。
【実施例１２】
【０２２７】
＜チューインガム＞
ガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに無水結晶マルチトール２重量部、キシリトール２重量部、実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末２重量部、及びトレハロース含水結晶１重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、呈味、風味良好で、低う蝕性、低カロリーのチューインガムとして好適である。
【実施例１３】
【０２２８】
＜加糖練乳＞
原乳１００重量部に実施例５の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末２重量部及び蔗糖２重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で風味も良く、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【実施例１４】
【０２２９】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５重量部、実施例４の方法で得た環状四糖含有シラップ１３０重量部及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）５０重量部を水１，１５０重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、オリゴ糖、環状四糖を含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を有する乳酸菌飲料として好適である。
【実施例１５】
【０２３０】
＜粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末５０重量部、無水結晶マルチトール１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ酸０．１重量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２重量部、クエン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部及び粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例Ａ−５の方法で得た環状四糖高含有液をバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。また、本品は、異味、異臭がなく、高品質で、低カロリーのジュースとして商品価値の高いものである。
【実施例１６】
【０２３１】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００重量部、実施例２の方法で得た環状四糖含有シラップ１００重量部、トレハロース含水結晶６０重量部、蔗糖４０重量部、及び食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２８０重量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１，０００重量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で、澱粉の老化も抑制され、高品質のカスタードクリームである。
【実施例１７】
【０２３２】
＜チョコレート＞
カカオペースト４０重量部、カカオバター１０重量部及び実験１５の方法に準じて製造した環状四糖１含水結晶５０重量部を混合してレファイナーに通して粒度を下げた後、コンチェに入れて５０℃で２昼夜練り上げた。この間にレシチン０．５重量部を添加して充分に分散させた。次いで、温度調節機で３１℃に調節し、バターの固まる直前に型に流し込み、泡抜きし、１０℃の冷却トンネルを通過させて固化させた。これを型抜きして包装し、製品を得た。本品は、吸湿性がなく、色、光沢共に良く、内部組織も良好であり、口中でなめらかに溶け、上品な甘味とまろやかな風味を有する。又本品は、低う蝕性、低カロリーのチョコレ−トとして有用である。
【実施例１８】
【０２３３】
＜ういろうの素＞
米粉９０重量部に、コーンスターチ２０重量部、無水結晶マルチトール７０重量部、実施例１の方法で得た環状四糖含有粉末５０重量部、及びプルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風味も良い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良く、低カロリーのういろうとしても好適である。
【実施例１９】
【０２３４】
＜あん＞
原料あずき１０重量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重量部を得た。この生あんに蔗糖１４重量部、実施例３の方法で得た環状四糖含有シラップ５重量部及び水４重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えてつぶあんを壊さないように練り上げ、製品のあんを約３５重量部得た。本品は、色焼け、離水もなく安定で、舌触り、風味良好で、あんパン、まんじゅう、団子、最中、氷菓などの製菓材料として好適である。
【実施例２０】
【０２３５】
＜パン＞
小麦粉１００重量部、イースト２重量部、蔗糖５重量部、実施例１の方法で得た環状四糖含有粉末１重量部および無機フード０．１重量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成、焼き上げた。本品は、色相、すだちとも良好で、適度な弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【実施例２１】
【０２３６】
＜ハム＞
豚もも肉１，０００重量部に食塩１５重量部および硝酸カリウム３重量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例５の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末４０重量部および香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、薫煙し、クッキングし、冷却、包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。
【実施例２２】
【０２３７】
＜粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１重量部に、実施例６の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末２重量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための難消化性の食物繊維、整腸材料としても有用である。
【実施例２３】
【０２３８】
＜粉末卵黄＞
生卵から調製した卵黄をプレート式加熱殺菌機で６０乃至６４℃で殺菌し、得た液状卵黄１重量部に対して、実験１６の方法に準じて製造した環状四糖無水結晶含有粉末４重量部の割合で混合した後、バットに移し、一夜放置して、環状四糖５乃至６含水結晶に変換させてブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、粉末卵黄を得た。
【０２３９】
本品は、プレミックス、冷菓、焼菓子、乳化剤などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず経口流動食、経管流動食のための難消化の性食物繊維、整腸材料としても有用である。また、美肌剤、育毛剤などとしても有利に利用できる。
【実施例２４】
【０２４０】
＜浴用組成物＞
ユズの皮ジュース１重量部に対して、実験１６の方法に準じて製造した環状四糖無水結晶含有粉末１０重量部の割合で混合し、環状四糖５乃至６含水結晶を晶出、熟成させた後、粉末化して、ユズの皮エキス含有環状四糖５乃至６含水結晶粉末を得た。
【０２４１】
本粉末５重量部に、焼塩９０重量部、トレハロース含水結晶２重量部、無水ケイ酸１重量部及びα−グルコシル  ヘスペリジン（株式会社林原販売、商品名αＧヘスペリジン）０．５重量部を混合して浴用剤を製造した。
【０２４２】
本品は、ユズの香りも豊かで、入浴用の湯に１００乃至１０，０００倍に希釈して利用すればよく、入浴後は、肌がしっとりしなめらかで、湯冷めしない高品質の浴用剤である。
【実施例２５】
【０２４３】
＜皮膚外用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例５の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末２重量部、α−グルコシル  ルチン（株式会社林原販売、商品名αＧルチン）１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリン１０重量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部および精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例２６】
【０２４４】
＜練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５重量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量部、グリセリン２５重量部、ポオキシエチレンソルビタンラウレート０．５重量部、実施例２の方法で得た環状四糖含有シラップ１５重量部、サッカリン０．０２重量部および防腐剤０．０５重量部を水１３重量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。
【実施例２７】
【０２４５】
＜流動食用固体製剤＞
実施例６の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末１００重量部、トレハロース含水結晶２００重量部、マルトテトラオース高含有粉末２００重量部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５ｇずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。
【０２４６】
本品は、環状四糖により難消化性の食物繊維を強化し、整腸作用に優れた流動食である。１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【実施例２８】
【０２４７】
＜皮膚外用ローション＞
以下の成分を以下の配合にしたがって常法により混合し、ローションを製造した。
１％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液                １８重量部
実施例６の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末
１重量部
ＤＬ−セリン                                    ０．０５重量部
マルチトール                                    ０．２重量部
グリセリン                                      ２重量部
パラオキシ安息香酸メチル                        ０．０５重量部
水酸化カリウム                                  ０．０１重量部
ポリオキシエチレン（１５モル付加）オレイルエーテル
０．３重量部
エタノール                                      ３重量部
香料                                            適量
精製水                                          残余
合計                                      １００重量部
【０２４８】
本ローションは、皮膚への水分の浸透性に優れ、皮膚の保湿性に優れるので基礎化粧品として有用である。また、本ローションは皮膚の角質層を軟化する作用をも比較的顕著に発揮するので、寒冷季に利用する化粧品や、中高年層を対象とする化粧品としても有用である。
【実施例２９】
【０２４９】
＜皮膚外用クリーム＞
メチルポリシロキサン０．３重量部、ステアリン酸６重量部、親油性モノステアリン酸グリセリン３．５重量部、スクワラン２．５重量部、２−エチルヘキセン酸セチル５．５重量部、モノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０モル付加）ソルビタン３重量部を８５℃に加熱しつつ均一に混合した（Ａ液）。別途、９５％グリセリン２重量部、マルチトール２重量部、実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶３．５重量部に適量の精製水を加えて７０℃に加熱しつつ十分に溶解させた（Ｂ液）。このＡ液とＢ液を混合し、均一に撹拌した後、これに３４重量部の精製水を加え、乳化ミキサーを用いて常法により乳化した。この乳化物を３５℃にまで冷却し、これに、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸２重量部を加えた後、適量のクエン酸を加えてｐＨ約６に調整し、さらに精製水を加えて全量を１００重量部としてクリームを製造した。
【０２５０】
本クリームは、皮膚の保湿性に優れる上、皮膚に対する刺激性が極めて低いので、基礎化粧品として有用である。また、本品は、乳化状態が安定に保たれるので、比較的長期の保存にも耐えるという特徴を有している。
【実施例３０】
【０２５１】
＜皮膚清浄用液状組成物＞
３０％ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム水溶液２０重量部、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン５重量部、ポリオキシエチレンジオレイン酸メチルグルコシド４重量部を７０℃に加温しながら混合・溶解し、適量の水を加え、これに、実施例６の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末２重量部、プロピルパラベン０．２重量部、１０％クエン酸水溶液１重量部を加え、さらに精製水を加えて全量を１００重量部とし、液状組成物を得た。
【０２５２】
本液状組成物は、優れた皮膚清浄効果を発揮する上、皮膚の保湿性に優れるので、日常的に利用するボディーソープとして有用である。
【実施例３１】
【０２５３】
＜浴用組成物＞
乾燥硫酸ナトリウム６０重量部、炭酸水素ナトリウム３０重量部、トレハロース５重量部、実施例６の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶５重量部、シトラス系調合香料１重量部、及び青色２号（インジゴカルミン）０．５重量部を均一に混合して、粉末のこの発明の体臭抑制剤を得た。
【０２５４】
本品は、浴湯１００ｌあたり約２０ｇの割合で添加し、溶解させて利用する。本品は、皮膚での保湿効果が優れている上、皮膚からの体臭の発生又は揮散をもよく抑制する上、皮膚への刺激性が極めて低いので、浴用剤として日常的に利用することができる。
【実施例３２】
【０２５５】
＜錠剤＞
アスピリン５０重量部に実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶１４重量部、コーンスターチ４重量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。
【０２５６】
本品は、環状四糖の賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。
【実施例３３】
【０２５７】
＜糖衣錠＞
重量１５０ｍｇの素錠を芯剤とし、これに実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶４０重量部、プルラン（平均分子量２０万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部および酸化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じ環状四糖５乃至６含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部および水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艶出しして光沢のある外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間維持する。
【実施例３４】
【０２５８】
＜外傷治療用膏薬＞
実施例６の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末１００重量部およびマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、環状四糖によりヨウ素、メタノールの揮散を防止し、経時変化が少ない商品価値の高い膏薬である。
【０２５９】
また、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【産業上の利用可能性】
【０２６０】
以上説明したように、本発明は、新規なα−イソマルトシル転移酵素、当該酵素の製造方法、及び用途を提供する発明である。本発明の新規なα−イソマルトシル転移酵素を用いることにより、産業上有用なサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖、これを含む糖質及び組成物を、工業的に安価かつ大量に製造することが可能となった。斯かる環状四糖又はこれを含む糖質は、実質的に非還元性乃至低還元性で、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性、を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
【０２６１】
本発明は斯くも顕著な作用効果を有する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。
【配列表】
【０２６２】
SEQUENCE LISTING
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
<120> α-Isomaltosyl-transferring enzyme, its preparation and uses
<130> WO843
<150> JP 149,484/00
<151> 2000-5-22
<150> JP 229,557/00
<151> 2000-7-28
<160> 10
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 1
Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro
1               5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 2
Gly Asn Glu Met Arg Asn Gln Tyr
1               5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 3
Ile Thr Thr Trp Pro Ile Glu Ser
1               5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 4
Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser
1               5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 5
Asn Trp Trp Met Ser Lys
1               5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 6
Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp
1               5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 7
Asn Ile Tyr Leu Pro Gln Gly Asp
1               5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Arthrobacter ramosus
<400> 8
Asp Thr Leu Ser Gly Val Phe His Gly Pro
1               5                   10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 9
Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Asn Gly
1               5                   10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 10
Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly
1               5                   10
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004919198.tif 000039
【図６】
0004919198.tif 000040
【図７】
0004919198.tif 000041
【図８】
0004919198.tif 000042
【図９】
0004919198.tif 000043
【図１０】
0004919198.tif 000044
【図１１】
0004919198.tif 000045
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0004919198.tif 000048
【図１５】
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【図１６】
0004919198.tif 000050
【図１７】
0004919198.tif 000051
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
0004919198.tif 000059
【図２６】
0004919198.tif 000060
【図２７】
0004919198.tif 000061
【図２８】
0004919198.tif 000062
【図２９】
0004919198.tif 000063
【図３０】
0004919198.tif 000064
【図３１】
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【図３２】
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