(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１および第２のＤＮＡ基質分子を組換えることによりＤＮＡ基質分子によってコードされるタンパク質を進化させるための方法であって、ここで該第１および第２の基質分子が、少なくとも２つのヌクレオチド位で互いに異なり、そして該第１および第２の基質分子の各々が、複数の規定されたセグメントを含み、以下の工程：
（ａ）複数の架橋オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、該架橋オリゴヌクレオチドは各々、第１の部分配列および第２の部分配列を含み、該第１の部分配列は、該第１のＤＮＡ基質分子における少なくとも１つのセグメントに相補的であり、該第２の部分配列は、該第２のＤＮＡ基質分子のセグメントに相補的であり、該第２のＤＮＡ基質分子のセグメントは、該第１のＤＮＡ基質分子における該少なくとも１つのセグメントに対応する、該第２のＤＮＡ基質分子の部分に隣接するものである、工程；
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応において工程（ａ）の架橋オリゴヌクレオチドを用いて、該第１および第２のＤＮＡ基質分子の規定されたセグメントを増幅する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の産物を集合させて、組換えＤＮＡ基質分子の多様性ライブラリーを生成する工程；
（ｄ）所望の特性について工程（ｃ）の産物によってコードされるタンパク質をスクリーニングまたは選択する工程；および
（ｅ）進化したタンパク質をコードする、工程（ｄ）に由来する少なくとも１つの組換えＤＮＡ基質分子を回収する工程、
を包含し、該第１および第２のＤＮＡ基質分子が、工程（ａ）の前に変異誘発に供される、方法。
【請求項２】
前記第１および第２のＤＮＡ基質分子が、変異体のライブラリーから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋オリゴヌクレオチドが、縮重しており、かつ、該架橋オリゴヌクレオチドが、前記第１および第２のＤＮＡ基質分子の１つより多い変異体または多形性のヌクレオチド配列を増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
変異誘発が循環配列組換である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、1994年２月17日に出願された米国特許出願第08/198,431号（現在、1997年２月25日に公開された米国特許第5,605,793号）、1995年２月17日に出願された同第PCT/US95/02126号、1995年４月18日に出願された同第08/425,684号、1995年10月30日に出願された同第08/537,874号、1995年11月30日に出願された同第08/564,955号、1996年３月25日に出願された同第08/621,859号、1996年３月25日に出願された同第08/621,430号、1996年４月18日に出願された同第PCT/US96/05480号、1996年５月20日に出願された同第08/650,400号、1996年７月３日に出願された同第08/675,502号、1996年９月27日に出願された同第08/721,824号、1996年９月27日に出願された同第08/722,660号、および1996年12月18日に出願された同第08/769,062号の一部係属出願であり、これらの明細書を、全ての目的のためにその全体において参考として援用する。
発明の背景
循環配列組換えは、組換えの反復周期を行い、そしてスクリーニングまたは選択して、個々の遺伝子、全体のプラスミドもしくはウイルス、多重遺伝子クラスター、または全体のゲノムさえ「進化させる」（Stemmer, Bio/Technology 13:549-553（1995））。このような技術は、ポリペプチド操作のための従来の方法に必要な幅広い分析および計算を必要としない。循環配列組換えは、伝統的な対の組換え事象とは対照的に、最小数の選択周期において多数の変異体の組換えを可能にする。
従って、循環配列組換え（RSR）技術は、これらのいずれかまたは全てにおける変異の間の組換えを提供し、それにより、変異の異なる組合せが、所望の結果をもたらし得る様式を開発する非常に早い方法を提供する点で、特定の利点を提供する。
しかし、いくつかの場合に、循環配列組換えには必要ではないが、技術の改変のための機会を提供する構造的および／または機能的情報が利用可能である。他の場合に、多数の組換えの選択および／またはスクリーニングは、高価でありえるかまたは時間がかかり得る。さらなる問題は、大きな核酸分子の操作であり得る。本発明は、これらの問題点および他の問題点に取り組む。
発明の要旨
本発明の１つの局面は、DNA基質分子によってコードされるタンパク質を進化させるための方法であり、この方法は以下の工程を含む：
（a）少なくとも第１および第２のDNA基質分子を消化する工程であって、ここで、少なくとも第１および第２の基質分子は、制限エンドヌクレアーゼによって少なくとも１つのヌクレオチドにおいて互いに異なる工程；
（b）混合物を連結して、組換えDNA分子のライブラリーを作製する工程；
（c）所望の特性について（b）の産物をスクリーニングまたは選択する工程；および
（d）進化したタンパク質をコードする組換えDNA基質分子を回収する工程。
本発明のさらなる局面は、DNA基質分子によってコードされるタンパク質を、少なくとも第１および第２のDNA基質分子を組換えることによって進化させるための方法であり、ここで少なくとも第１および第２の基質分子は、少なくとも１つのヌクレオチドにおいて互いに異なり、そして規定されたセグメントを含み、この方法は以下の工程を含む：
（a）１セットのオリゴヌクレオチドPCRプライマーを提供する工程であって、各セグメントについて少なくとも１つのプライマーを含み、ここでプライマー配列が、別のセグメントとの少なくとも１つの結合部に相補的である工程；
（b）ポリメラーゼ連鎖反応において、少なくとも第１および第２のDNA基質分子のセグメントを工程（a）のプライマーで増幅させる工程；
（c）工程（b）の産物を集合させて、組換えDNA基質分子のライブラリーを作製する工程；
（d）所望の特性のための（c）の産物をスクリーニングまたは選択する工程；ならびに
（e）組換えDNA基質分子を、進化したタンパク質をコードする（d）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、変異配列についてのDNAフラグメントの集団を富化する方法であり、この方法は以下の工程を含む：
（a）フラグメントの集団を変性および再生して、少なくとも１つの二本鎖フラグメントが、少なくとも１つの塩基対ミスマッチを含むハイブリッド二本鎖フラグメントの集団を作製する工程；
（b）（a）の産物を、約20〜100bpのフラグメントにフラグメント化する工程；
（c）アフィニティーマトリックス上のミスマッチを有するフラグメントをアフィニティー精製して、変異配列について富化されたDNAフラグメントのプールを作製する工程；ならびに
（d）（c）の産物を集合させて、組換えDNA基質分子のライブラリーを作製する工程。
本発明のさらなる局面は、DMA基質分子によってコードされるタンパク質を、少なくとも第１および第２のDNA基質分子を組換えることによって進化させるための方法であり、ここで少なくとも第１および第２の基質分子は、約10〜100塩基対の配列相同性の領域を共有し、そして規定されたセグメントを含み、この方法は以下の工程を含む：
（a）少なくとも第１および第２のDNA基質分子において相同な領域を、少なくとも２つの規定されたセグメントの間にイントロン配列を挿入することによって提供する工程；
（b）（a）のDNA基質分子をフラグメント化しそして組換える工程であって、ここで相同性の領域が、イントロンによって提供される工程；
（c）所望の特性について（b）の産物をスクリーニングまたは選択する工程：および
（d）組換えDNA基質分子を、進化したタンパク質をコードする（c）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、DNA基質分子によってコードされるタンパク質を、少なくとも第１および第２のDNA基質分子を組換えることによって進化させる方法であって、ここで少なくとも第１および第２の基質分子が、少なくとも１つのヌクレオチドにおいて互いに異なり、そして規定されたセグメントを含み、この方法は以下の工程を含む：
（a）１セットのオリゴヌクレオチドPCRプライマーを提供する工程であって、ここで各セグメントの各鎖について１対のプライマーが提供され、対の１つのメンバーとしてジェネリックプライマーを有するDNA分子の末端とともに、各対の１つのメンバーは、セグメントの１つの末端で結合部を架橋し、そして他のメンバーは、セグメントの他の末端で結合部を架橋し、そしてここで、１セットのプライマーが、少なくとも第１および第２の基質分子の各々について提供される工程；
（b）ポリメラーゼ連鎖反応において、少なくとも第１および第２のDNA基質分子のセグメントを、（a）のプライマーで増幅する工程；
（c）（b）の産物を集合させて、組換えDNA分子のプールを作製する工程；
（d）所望の特性について、（c）の産物を選択またはスクリーニングする工程；ならびに
（e）組換えDNA基質分子を、進化したタンパク質をコードする（d）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、タンパク質の発現を、タンパク質を進化させることによって最適化するための方法であって、ここでタンパク質は、DNA基質分子によってコードされ、この方法は以下の工程を含む：
（a）１セットのオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここで各オリゴヌクレオチドは、DNA分子に相補的な少なくとも２つの領域、および少なくとも１つの縮重領域を含み、各縮重領域が、タンパク質のアミノ酸配列の領域をコードする工程；
（b）オリゴヌクレオチドのセットを、全長遺伝子のライブラリーに集合される工程；
（c）宿主細胞において（b）の産物を発現させる工程；
（d）タンパク質の改良された発現について（c）の産物をスクリーニングする工程；および
（e）進化したタンパク質をコードする組換えDNA基質分子を、（d）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、DNA基質分子によってコードされるタンパク質の発現を、タンパク質を進化させることによって最適化するための方法であって、ここでDNA基質分子は、少なくとも１つのlacオペレーター、およびタンパク質をコードするDNA配列の、lacヘッドピース（headpiece）二量体をコードするDNA配列との融合を含み、この方法は以下の工程を含む：
（a）宿主細胞を、変異誘発したDNA基質分子のライブラリーで形質転換する工程；
（b）（a）のライブラリーによってコードされるタンパク質の発現を誘導する工程；
（c）（b）の産物の抽出物を調製する工程；
（d）不溶性タンパク質を、可溶性タンパク質およびDNAの複合体から分画する工程；および
（e）進化したタンパク質をコードするDNA基質分子を、（d）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、タンパク質をコードするDNA配列の、繊維状ファージタンパク質をコードするDNA配列との融合を含むDNA基質分子によってコードされるタンパク質の機能的発現を進化させて、融合タンパク質を作製するための方法であって、この方法は以下を含む：
（a）変異誘発したDNA基質分子のライブラリーによってコードされる融合タンパク質を発現する感染性粒子を産生する宿主細胞を提供する工程；
（b）融合タンパク質を提示する感染性粒子を（a）から回収する工程；
（c）タンパク質についてのリガンドを用いて、変異体タンパク質を提示する粒子をアフィニティー精製する工程；および
（d）進化したタンパク質をコードするDNA基質分子を、（c）のアフィニティー精製した粒子から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、タンパク質をコードするDNA配列のlacヘッドピース二量体との融合を含む、DNA基質分子によってコードされるタンパク質の発現を最適化するための方法であって、ここでDNA基質分子は、第１のプラスミドベクター上に存在し、この方法は以下の工程を含む：
（a）少なくとも１つのシャペロニン遺伝子および少なくとも１つのlacオペレーターの変異体のライブラリーを含む第１のベクターおよび第２のベクターで形質転換した宿主細胞を提供する工程；
（b）（a）の産物の抽出物を調製する工程；
（c）可溶性タンパク質とDNAとの複合体から不溶性タンパク質を分画する工程；および
（d）シャペロニン遺伝子をコードするDNAを（c）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、タンパク質をコードするDNA配列の繊維状ファージ遺伝子との融合を含むDNA基質分子によってコードされるタンパク質の発現を最適化するための方法であって、ここで融合は、シャペロニン遺伝子変異体のライブラリーを含むファージミド上において行われ、この方法は以下の工程を含む：
（a）変異誘発したDNA基質分子のライブラリーによってコードされる融合タンパク質を発現する感染性粒子を産生する宿主細胞を提供する工程；
（b）融合タンパク質を提示する感染性粒子を（a）から回収する工程；
（c）タンパク質についてのリガンドを用いて、タンパク質を提示する粒子をアフィニティー精製する工程；および
（d）変異体シャペロニンをコードするDNAを、（c）のアフィニティー精製した粒子から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、宿主におけるタンパク質の分泌を、分泌機能をコードする遺伝子を進化させることによって最適化するための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）分泌機能をコードする遺伝子のクラスターを提供する工程；
（b）分泌機能をコードする（a）の遺伝子クラスターにおいて、少なくとも第１および第２の配列を組換えて（少なくとも第１および第２の配列は、少なくとも１つのヌクレオチドにおいて互いに異なる）、組換え配列のライブラリーを作製する工程；
（c）宿主細胞培養物を（b）の産物で形質転換する工程であって、ここで宿主細胞が、タンパク質をコードするDNA配列を含む工程；
（d）（c）の産物を、タンパク質の分泌についてのスクリーニングまたは選択に供する工程；および
（e）分泌機能をコードする進化した遺伝子をコードするDNAを、（d）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、改良されたDNAポリメラーゼを進化させるための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）変異体DNAポリメラーゼをコードする変異体DNA基質分子のライブラリーを提供する工程；
（b）（a）でトランスフェクトした細胞の抽出物をスクリーニングし、そして野生型DNAポリメラーゼと活性を比較する工程；
（c）変異体DNA基質分子を、野生型DNAポリメラーゼを超える改良された活性を有する変異体DNAポリメラーゼを発現する（b）における細胞から回収する工程；および
（d）進化したポリメラーゼをコードするDNA基質分子を、（c）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、野生型DNAポリメラーゼのものよりも大きな誤差率を有するDNAポリメラーゼを進化させるための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）復帰可能な（revertible）変異体を有する指標遺伝子を含む宿主細胞において、変異体DNAポリメラーゼをコードする変異体DNA基質分子のライブラリーを提供する工程であって、ここで指標遺伝子が、変異体DNAポリメラーゼによって再複製される工程；
（b）（a）の産物を、指標遺伝子の復帰突然変異体（revertant）についてスクリーニングする工程；
（c）変異体DNA基質分子を、復帰突然変異体から回収する工程；および
（d）進化したポリメラーゼをコードするDNA基質分子を、（c）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、DNAポリメラーゼを進化させるための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）変異体DNAポリメラーゼをコードする変異体DNA基質分子のライブラリーを提供する工程であって、このライブラリーが、プラスミドベクターを含む工程；
（b）プラスミド調製物、および（a）の産物でトランスフェクトした宿主細胞の抽出物を調製する工程；
（c）PCR反応における各プラスミド調製物を、このプラスミドによってコードされる変異体ポリメラーゼを用いて増幅する工程であって、このポリメラーゼが、宿主細胞抽出物に存在する工程；
（d）（c）のPCR産物を回収する工程；および
（e）進化したポリメラーゼをコードするDNA基質分子を、（d）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、DNA基質分子によってコードされるホスホネターゼ（phosphonatase）からのp-ニトロフェノールホスホネターゼを進化させるための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）DNA基質分子の変異体のライブラリーを提供する工程であって、このライブラリーが、プラスミド発現ベクターを含む工程；
（b）宿主をトランスフェクトする工程であって、ここで宿主phnオペロンが欠失される工程；
（c）（b）のトランスフェクト体の増殖について、基質としてp-ニトロフェノールホスホネターゼを用いて選択する工程；
（d）DNA基質分子を、（c）から選択されたトランスフェクト体から回収する工程；および
（e）DNA基質分子を、進化したホスホネターゼをコードする（d）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、DNA基質分子によってコードされるプロテアーゼを進化させるための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）DNA基質分子の変異体のライブラリーを提供する工程であって、このライブラリーは、プラスミド発現ベクターを含み、ここでDNA基質分子が、分泌リーダーに連結される工程；
（b）宿主をトランスフェクトする工程；
（c）複合体タンパク質培地における（b）のトランスフェクタントの増殖について選択する工程；および
（d）DNA基質分子を、進化したプロテアーゼをコードする（c）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、ファージ上に提示されるプロテアーゼ変異体のライブラリーをスクリーニングして、改良されたプロテアーゼを得るための方法であって、ここでプロテアーゼをコードするDNA基質分子は、繊維状ファージタンパク質をコードするDNAに融合して、融合タンパク質を作製し、この方法は以下の工程を含む：
（a）融合タンパク質を発現する宿主細胞を提供する工程；
（b）宿主細胞をプロテインネット（protein net）で覆い、ファージを捕捉する工程；
（c）（b）の産物を洗浄して、プロテインネットの消化によって遊離されたファージを回収する工程；
（d）（c）の産物からDNAを回収する工程；および
（e）DNA基質を、改良されたプロテアーゼをコードする（d）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、プロテアーゼ変異体のライブラリーをスクリーニングして、改良されたプロテアーゼを得るための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）ペプチド基質のライブラリーを提供する工程であって、このペプチド基質が発蛍光団および蛍光消光剤を含む工程；
（b）プロテアーゼ変異体のライブラリーを、ペプチド基質を切断する能力についてスクリーニングする工程であって、ここで蛍光が測定される工程；および
（c）少なくとも１つのプロテアーゼ変異体をコードするDNAを（b）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、αインターフェロン遺伝子を進化させるための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）変異体αインターフェロン遺伝子のライブラリーを提供する工程であって、このライブラリーが、繊維状ファージベクターを含む工程；
（b）レポーター構築物を含む細胞を刺激する工程であって、このレポーター構築物が、インターフェロン応答性プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を含み、そしてここで、レポーター遺伝子がGFPである工程；
（c）GFPを発現する細胞をFACSによって分離する工程；
（d）（c）の産物からファージを回収する工程；および
（e）進化したインターフェロン遺伝子を、（d）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、タンパク質をコードするDNA基質の変異体のライブラリーを、進化したDNA基質についてスクリーニングするための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）変異体のライブラリーを提供する工程であって、このライブラリーが発現ベクターを含む工程；
（b）哺乳動物宿主細胞を、（a）のライブラリーでトランスフェクトする工程であって、ここで変異体タンパク質が、細胞の表面上で発現される工程；
（c）タンパク質についてのリガンドで、（b）の産物をスクリーニングまたは選択する工程；
（d）変異体タンパク質をコードするDNAを、（c）の産物から回収する工程；および
（e）進化したDNA基質を（d）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、インターフェロンαをコードするDNA基質分子を進化させるための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）変異体αインターフェロン遺伝子のライブラリーを提供する工程であって、このライブラリーは発現ベクターを含み、ここでαインターフェロン遺伝子が、誘導性プロモーターの制御下で発現される工程；
（b）宿主細胞を（a）のライブラリーでトランスフェクトする工程；
（c）（b）の産物をウイルスと接触させる工程；
（d）変異体αインターフェロンを、工程（c）で生存する宿主細胞から回収する工程；および
（e）進化したインターフェロン遺伝子を、（d）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、血清安定性、またはDNA基質分子によってコードされるタンパク質の循環半減期を進化させる方法であり、このDNA基質分子は、タンパク質をコードするDNA配列の、融合タンパク質を作製するための線状ファージタンパク質をコードするDNA配列との融合物を含み、この方法は以下の工程を含む：
（a）融合タンパク質の変異体のライブラリーを発現する宿主細胞を提供する工程；
（b）タンパク質についてのリガンドで変異体をアフィニティー精製する工程であって、ここでリガンドは、ヒト血清タンパク質、組織特異的タンパク質、またはレセプターである工程；
（c）変異体タンパク質をコードするDNAを、（b）のアフィニティー選択した変異体から回収する工程；および
（d）タンパク質をコードする進化した遺伝子を、（c）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、少なくとも２つのサブユニットを有するタンパク質を進化させるための方法であって、この方法は以下の工程を包含する：
（a）各サブユニットについての変異DNA基質分子のライブラリーを提供する工程；
（b）上記のライブラリーを、タンパク質の一本鎖構築物のライブラリーに組換える工程であって、この一本鎖構築物は、各サブユニット配列をコードするDNA基質分子を含み、このサブユニット配列は、リンカーによって、１つのサブユニットのアミノ末端をコードする核酸配列で、第２のサブユニットのカルボキシ末端をコードする核酸配列に連結される工程；
（c）（Ｂ）の産物をスクリーニングまたは選択する工程；
（d）組み換え一本鎖構築物DNA基質分子を、（c）の産物から回収する工程；
（e）（d）の産物を変異誘発に供する工程；および
（f）進化した一本鎖構築物DNA基質分子を（e）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、哺乳動物7回膜貫通型レセプターの、酵母シグナル伝達経路へのカップリングを進化させるための方法であって、この方法は以下を含む：
（a）宿主細胞において、哺乳動物Ｇαタンパク質変異体のライブラリーを発現させる工程であって、ここでこの宿主細胞が、哺乳動物の7回膜貫通型レセプターおよびレセプター遺伝子を発現し、このレセプター遺伝子が、フェロモン応答プロモーターの制御下で発現される工程；
（b）7回膜貫通型レセプターについてのリガンドの存在下で、レポーター遺伝子の発現について（a）の産物をスクリーニングまたは選択する工程；および
（c）進化したＧαタンパク質変異体をコードするDNAを、スクリーニングまたは選択した（b）の産物から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、少なくとも第１および第２のDNA基質分子を組み換えるための方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（a）宿主細胞を少なくとも第１および第２のDNA基質分子でトランスフェクトする工程であって、ここで少なくとも第１および第２のDNA基質分子が、宿主細胞において組み換えられる工程；
（b）（a）の産物を所望の特性についてスクリーニングまたは選択する工程；および
（c）組換えDNA基質分子を（b）から回収する工程。
本発明のさらなる局面は、目的のタンパク質をコードするDNA基質配列を進化させるための方法であって、ここでDNA基質はベクターを含み、このベクターは一本鎖DNAを含み、この方法は以下の工程を含む：
（a）一本鎖ベクターDNA、およびDNA基質配列の変異体のライブラリーを提供する工程；
（b）（a）のライブラリーからの一本鎖DNAを、（a）の一本鎖ベクターDNAにアニールする工程；
（c）（b）の産物を宿主に形質転換する工程；
（d）（c）の産物を所望の特性についてスクリーニングする工程；および
（e）進化したDNA基質DNAを、（d）の産物から回収する工程。
【図面の簡単な説明】
図１は、ウシ胎児腸アルカリホスファターゼの進化についての、オリゴPCRプライマーのアラインメントを示す。
図２は、αインターフェロンのアミノ酸および核酸の配列のアラインメントを示す。
図３は、キメラαインターフェロンアミノ酸配列のアラインメントを示す。
特定の実施態様の説明
本発明は、再帰組換え法を介してポリペプチドを進化させるための多数のストラテジーを提供する。いくつかの実施態様において、本発明のストラテジーは、一般的に、「粗粒シャフリング（coarse grain shuffling）」または「細粒シャフリング（fine grain shuffling）」として分類され得る。以下に詳細に記載するように、これらのストラテジーは、いくつかの構造または機能の情報が目的のポリペプチドに関して利用可能である場合、操作される核酸が大きい場合、多くの組み換えたいの選択またはスクリーニングが扱いにくい場合などに、特に適用可能である。「粗粒シャフリング」は、一般的に、機能的ドメイン、エキソン、制限エンドヌクレアーゼフラグメントとして規定されるか、または他に任意に規定されたセグメントである核酸のセグメントの変更または組換えを含む。「細粒シャフリング」は、一般的に、セグメント内（例えば、コドン内）の配列変化の導入を含む。
粗粒および細粒シャフリングは、核酸配列内に生じる変化の分析を可能にし、「配列空間の探索」とも称される。両方の技術は賞賛に値するが、結果は質的に異なる。例えば、粗粒探索は、しばしば、ポリケチドオペロンのような多重遺伝子クラスターを至適化するのにより適しており、一方、細粒探索は、しばしば、コドン頻度ライブラリーを用いるタンパク質発現のような特性を至適化するのに適している。
ストラテジーは、一般的に、遺伝子またはそのセグメントの進化を伴い、異種細胞における機能の保持、または同種もしくは異種細胞における機能の改良を可能にする。進化は、一般的に、循環配列組換えと称されるプロセスによってもたらされる。循環配列組換えは、以下にさらに詳細に記載されるように、多くの異なるフォーマットおよびフォーマットの組合せにおいて達成され得る。これらのフォーマットは、いくつかの一般的な理論を共有する。循環配列組換えは、組換えの首尾良い周期を伴い、分子多様性を作製する（すなわち、核酸分子のファミリーの創製は、互いに実質的な配列同一性を示すが、変異体の存在下で異なる）。各組換え周期の後に、所望の特徴を有する分子についてのスクリーニングまたは選択の少なくとも１つの周期が続く。１ラウンド形態で選択された分子は、次のラウンドの多様性を作製するための出発物質を形成する。任意の所定の周期において、組換えは、インビボまたはインビトロで生じ得る。さらに、組換えから生じる多様性は、任意の周期において、組換えについての基質または組換えの産物のいずれかへの変異誘発の先行技術（例えば、誤りがちなPCRまたはカセット変異誘発、細菌変異誘発遺伝子株を通じての継代、化学変異誘発物での処理、同種遺伝子ファミリーからの配列多様性との「スパイキング（spiking）」）を適用することによって増強され得る。
１.循環配列組換えのためのフォーマット
循環配列組換え（時々、DNAシャフリング、進化、または分子育種と称される）のためのいくつかのフォーマットおよび例は、本発明者らおよび共同研究者によって、同時係属出願米国特許出願第08/198,431号（1994年２月17日出願）、同第PCT/US95/02126号（1995年２月17日出願）、同第08/425,684号（1995年４月18日出願）、同第08/537,874号（1995年10月30日出願）、同第08/564,955号（1995年11月30日出願）、同第08/621,859号（1996年、３月25日出願）、同第08/621,430号（1996年３月25日出願）、同第PCT/US96/05480号（1996年４月18日出願）、同第08/650,400号（1996年５月20日出願）、同第08/675,502号（1996年７月３日出願）、同第08/721,824号（1996年９月27日出願）、および08/722,660号（1996年９月27日出願）；Stemmer, Science 270:1510（1995）；Stemmerら、Gene 164:49-53（1995）；Stemmer, Bio/Technology 13:549-553（1995）；Stemmer, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91:10747-10751（1994）；Stemmer, Nature 370:389-391（1994）；Crameriら、Nature Medicine 2（1）:1-3（1996）；Crameriら、Nature Biotechnology 14:315-319（1996）（これらの各々を、全ての目的のために、その全体において参考として援用する）に記載されている。
一般的には、用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するDNAの任意のセグメントまたは配列を幅広くいうために本明細書中で使用される。遺伝子は、種々の供給源（目的の供給源からのクローニングまたは公知もしくは予測配列情報からの合成を含む）から入手され得、そして所望の特徴を有するように設計された配列を含み得る。
広範な種々の細胞型が、進化した遺伝子のレシピエントとして使用され得る。特定の目的の細胞は、多くの細菌細胞型（グラム陰性およびグラム陽性の両方、例えば、Rhodococcus、Streptomycetes、Actinomycetes、Corynebacteria、Penicillium、Bacillus、Escherichia coli、Pseudomonas、Salmonella、およびErwinia）を含む。目的の細胞はまた、真核生物細胞、特に哺乳動物細胞（例えば、マウス、ハムスター、霊長類、ヒト）、細胞株および初代培養物の両方を含む。このような細胞としては、幹細胞が挙げられ、胎児性幹細胞、接合体、線維芽、リンパ球、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、マウス線維芽（NIH3T3）、腎臓、肝臓、筋肉、および皮膚細胞を含む。目的の他の真核生物細胞としては、植物細胞（例えば、トウモロコシ、コメ、小麦、綿、大豆、サトウキビ、タバコ、）およびarabidopsis；魚、藻類、真菌（Penicillium、Fusarium、Aspergillus、Podospora、Neurospora）、昆虫、酵母（PicchiaおよびSaccharomyces）が挙げられる。
宿主の選択は、多数の要因に依存し、これらは、操作される宿主の意図される用途に依存し、病原性、基質範囲、環境耐久力、重要な中間体の存在、遺伝子操作の容易さ、および遺伝情報の他の生物への無差別移入の可能性を含む。好ましい宿主は、ベクターDNAを複製する能力、目的のタンパク質を発現する能力、および目的のタンパク質を適切に輸送する能力を有する。特に有利な宿主は、E.coli、lactobacilli、Streptomycetes、Actinomycetes、真菌（例えば、Saccaromyces cerivisiaeまたはPischia pastoris）、シュナイダー細胞、L-細胞、COS細胞、CHO細胞、および形質転換したＢ細胞株（例えば、SP2/0、J558、NS-1、およびAG8-653）である。
育種手順は、一般的に互いに実質的な配列同一性（すなわち、少なくとも約50％、70％、80％、または90％の配列同一性）を示すが、特定の位置で互いに異なる、少なくとも２つの基質とともに出発する。差異は、任意の型の変異（例えば、置換、挿入、および欠失）であり得る。しばしば、異なるセグメントは、おそらく５〜20位において互いに異なる。出発物質に関する増加した多様性を作製する組換えのために、出発物質は、少なくとも２つのヌクレオチド位で互いに異ならなければならない。すなわち、２つの基質のみが存在する場合、少なくとも２つの異なった位置が存在するべきである。３つの基質が存在する場合、例えば、１つの基質は単一位として第２とは異なり得、そして第２は、異なる単一位で第３と異なり得る。出発DNAセグメントは、互いの天然の改変体（例えば、対立遺伝子または種改変体）であり得る。セグメントはまた、非対立遺伝子からのものであり得、これらは構造のいくらかの程度、および通常は機能的相関性を示す（例えば、イムノグロブリンスーパーファミリーのようなスーパーファミリー内の異なる遺伝子）。出発DNAセグメントはまた、互いの誘導された改変体であり得る。例えば、あるDNAセグメントは他の誤りがちなPCR複製によって、または変異誘発カセットの置換によって産生され得る。誘導される変異体はまた、変異誘発株におけるセグメントの１つ（または両方）を増殖させることによって調製され得る。これらの状況において、厳密にいえば、第２のDNAセグメントは単一のセグメントではないが、関連するセグメントの大きなファミリーである。出発物質を形成する異なるセグメントは、しばしば、同じ長さであるか、または実質的に同じ長さである。しかし、このことは、事実である必要はない。例えば、１つのセグメントは、別の部分配列（subsequent）であり得る。セグメントは、大きな分子（例えば、ベクター）の一部として存在し得るか、または単離形態であり得る。
出発DNAセグメントは、本明細書中に提供される任意の循環配列組換えフォーマットによって組み換えられ、組換えDNAセグメントの多様性ライブラリーを作製する。このようなライブラリーは、10未満から105、109、または1012メンバーを越えるサイズにおいて幅広く変化し得る。一般的には、出発セグメントおよび作製された組換えライブラリーは、発現のために必要な全長コード配列および任意の必須調節配列（例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列）を含む。しかし、このことが事実と異なる場合、ライブラリーにおける組換えDNAセグメントは、スクリーニング／選択を行う前に、欠失配列を提供する一般的なベクターに挿入され得る。
使用される循環配列組換えフォーマットが、インビボフォーマットである場合、作製される組換えDNAセグメントのライブラリーは、細胞内に既に存在しており、これは、通常、変更された基質特異性を有する酵素の発現が所望される細胞型である。循環配列組換えがインビトロで行われる場合、組換えライブラリーは、好ましくは、スクリーニング／選択前に、所望の細胞型に導入される。組換えライブラリーのメンバーは、導入前にエピソームもしくはウイルスに連結され得るか、または直接導入され得る。本発明のいくつかの実施態様において、ライブラリーは、第１宿主において増幅され、次いで宿主から回収され、そして発現、選択、もしくはスクリーニング、または任意の他の所望のパラメーターにより従順して第２宿主に導入される。ライブラリーが細胞型に導入される様式は、細胞型のDNA取り込み特性（例えば、ウイルスレセプターを有する、結合し得る、または天然にコンピテントである）に依存する。細胞型が、天然および化学誘導した適応性には非感受性であるが、エレクトロポレーションに感受性である場合、通常エレクトロポレーションを使用する。細胞型がエレクトロポレーションにも非感受性である場合、微粒子銃を使用する。微粒子銃PDS-1000 Gene Gun（Biorad, Hercules, CA）は、ヘリウム圧を使用して、DNAコートした金またはタングステンマイクロキャリアを、標的細胞へ向かって加速させる。プロセスは、植物、細菌、真菌、藻類、インタクトな動物組織、組織培養細胞、および動物胚を含む広範な組織に適用可能である。１つは、電子パルス送達を使用し得、これは、動物および植物における生組織のための本質的に穏和なエレクトロポレーションフォーマットである。Zhao、Advanced Drug Delivery Reviews 17:257-262（1995）。細胞コンピテントを作製するための新規な方法は、同時係属出願米国特許出願第08/621,430号（1996年３月25日出願）に記載される。組換えDNA遺伝子のライブラリーの導入の後、細胞は必要に応じて育種されて、生じる遺伝子の発現を可能にする。
Ａ．インビトロフォーマット
循環配列組換えのための１つのフォーマットは、関連配列のプールを利用する。配列は、DNAまたはRNAであり得、そして組換えまたは再会合されるべき遺伝子またはDNAフラグメントのサイズに依存する種々の長さであり得る。好ましくは、配列は、50bp〜100kbである。
関連基質のプールは、通常はランダムに、約５bp〜５kb以上のフラグメントにフラグメント化され得る。好ましくは、ランダムなフラグメントのサイズは約10bp〜1000bpであり、より好ましくは、DNAフラグメントのサイズは約20bp〜500bpである。基質は、多数の異なる方法（例えばDNAselまたはRNAse消化、ランダム剪断または制限酵素消化）によって消化され得る。特定の長さの核酸フラグメントの濃度は、しばしば、全核酸重量の0.1％または１％未満である。混合物における異なる特異的な核酸フラグメントの数は、通常少なくとも約100、500、または1000である。
混合した核酸フラグメントの集団は、約80℃〜100℃、より好ましくは90℃〜96℃に加熱することによって変性されて、一本鎖核酸フラグメントを形成する。次いで、他の一本鎖核酸フラグメントとの配列同一性の領域を有する一本鎖核酸フラグメントは、６℃〜75℃、および好ましくは40℃〜65℃に冷却することによって再アニールされ得る。再生は、ポリエチレングリコール（「PEG」）または塩の添加によって加速され得る。塩濃度は、好ましくは０mM〜600mMであり、より好ましくは、塩濃度は10mM〜100mMである。塩は、（NH4）2SO4、KCl、またはNaClのようなものであり得る。PEGの濃度は、好ましくは０％〜20%、より好ましくは５％〜10％である。再アニールするフラグメントは、異なる基質由来であり得る。
アニールした核酸フラグメントは、核酸ポリメラーゼ（例えば、TaqまたはKlenow）、１mM〜20mMのMg++、およびdNTP（すなわち、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP）の存在下でインキュベートされる。配列同一性の領域が大きい場合、Taqまたは他の高温ポリメラーゼは、45〜65℃のアニーリング温度で使用され得る。同一性の領域が小さい場合、Klenowまたは低温で活性な他のポリメラーゼが、６〜30℃の間のアニーリング温度で使用され得る。ポリメラーゼは、アニーリングの前、アニーリングと同時、またはアニーリング後に、ランダムな核酸フラグメントに添加され得る。
ポリメラーゼの存在下でのランダムな核酸フラグメントの変性、再生、およびインキュベーションの周期は、時々、インビトロでの核酸の「シャフリング」といわれる。この周期は、所望の回数反復される。好ましくは、周期は２〜100回反復され、より好ましくは、配列は10〜40回反復される。得られる核酸は、約50bp〜約100kb、好ましくは500bp〜50kbの二本鎖ポリヌクレオチドのファミリーである。集団は、出発基質の改変体を示し、これらは、それに対する実質的な配列同一性を示すが、いくつかの位置で異なりもする。集団は、出発基質より多くのメンバーを有する。組換えから得られるフラグメントの集団は、好ましくは、まずPCRによって増幅され、次いで、適切なベクターにクローン化され、連結混合物を用いて宿主細胞を形質転換する。
インビトロシャフリングの変化において、組換え基質の結果は、不完全に意図される産物の実質的な画分（代表的には少なくとも20％以上）を産生する条件下で、全長配列を増幅することによって作製され得る。増幅産物（不完全に意図された増幅産物を含む）は変性され、そして再アニーリングおよび増幅の少なくとも１つのさらなる周期に供される。この変化（ここで、再アニーリングおよび増幅の少なくとも１つの周期が、不完全に意図された産物の実質的な画分を提供する）は、「シャフリング」と称される。続く増幅回において、不完全に意図された産物は、異なる配列関連テンプレート種にアニールし、そしてこの伸張をプライムする。
さらなる変化において、増幅の少なくとも１つの周期は、関連配列の一本鎖DNAフラグメントに重複する、および異なる長さの集合物を用いて行われ得る。各フラグメントは、集合物からの第２のフラグメントのポリヌクレオチド鎖伸張にハイブリダイズし、そしてこれをプライムし得、従って配列組換えポリヌクレオチドを形成する。さらなる変化において、可変長の一本鎖DNAフラグメントは、第１のDNAテンプレートにおいてVent DNAポリメラーゼによって、一本鎖プライマーから作製され得る。一本鎖DNAフラグメントは、第２のKunkel型テンプレート（これはウラシル含有環状一本鎖DNAからなる）についてのプライマーとして使用される。このことは、第２のテンプレートへの第１のテンプレートの複数の置換を生じる（Levichkinら、Mol.Biology 29:572-577（1995）を参照のこと）。
核酸配列は、それらが配列相同性を欠く場合でさえ、循環配列組換えによって組み換えられ得る。相同性は、PCRプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。増幅される核酸セグメントに特異的な配列に加えて、ある特定のセグメントを増幅するのに使用されるプライマーの全てが合成されて、遺伝子に対して5’側の20〜40塩基のさらなる配列（配列Ａ）およびセグメントに対して3’側の異なる20〜40塩基配列（配列Ｂ）を含む。隣接するセグメントは、配列Ｂの相補鎖を含む5’プライマー（配列Ｂ’）および異なる20〜40塩基配列を含む3’プライマー（Ｃ）を用いて増幅される。同様に、次の隣接するセグメントのプライマーは、配列Ｃ’（Ｃに相補的）およびＤを含む。このようにして、相同性の小さな領域が導入されて、セグメントを部位特異的組換えカセットにする。個々のセグメントの最初の増幅に続いて、増幅されたセグメントは混合され得、そしてプライマーなしの（primerless）PCRに供され得る。
ポリペプチド内のドメインがシャフリングされる場合、連続したオープンリーディングフレームを維持するという制約に起因して、さらなる隣接配列をドメインに導入することは可能でないかもしれない。かわりに、シャフリングされる遺伝子の１つによってコードされる第１ドメインの3’末端、およびともにシャフリングされる他の遺伝子の全てによってコードされる第２ドメインの5’末端に相同である、一群のオリゴヌクレオチドが合成される。これは、全てのドメインで反復され、従って、その順序を維持しながらタンパク質のドメイン間の組換えを可能にする配列が提供される。
Ｂ．インビボ形式
１．プラスミド-プラスミド組換え
組換えについての最初の基質は、遺伝子の改変体形態を含むポリヌクレオチドの収集物である。改変体形態は、通常、基質間の相同組換えを可能にするに十分な、実質的な配列同一性を互いに示す。ポリヌクレオチド間の多様性は、天然であり得るか（例えば、対立遺伝子改変体または種改変体）、誘導され得るか（例えば、誤りがちなPCRまたは誤りがちな循環配列組換え）、またはインビトロ組換えの結果であり得る。多様性はまた、天然タンパク質をコードする遺伝子を、別のコドン使用を用いて再合成することから生じ得る。組換えが、出発材料に存在するよりも多様な産物を生じ得る、少なくとも十分な多様性が基質間にあるべきである。少なくとも２つの位置において異なる少なくとも２つの基質が存在しなければならない。しかし、通常、103〜108メンバーの基質のライブラリーが使用される。多様性度は、組み換えられる基質の長さ、および進化する機能的変化の程度に依存する。位置の0.1〜25％での多様性が代表的である。多様な基質は、プラスミドに取り込まれる。プラスミドは、しばしば、標準的なクローニングベクター（例えば、細菌の多コピー性プラスミド）である。しかし、以下に記載されるいくつかの方法において、プラスミドは流動化（MOB）機能を含む。基質は、同じかまたは異なるプラスミドに取り込まれ得る。しばしば、異なる型の選択マーカーを有するプラスミドの少なくとも２つの異なる型を用いて、少なくとも２つの型のベクターを含む細胞についての選択を可能にする。また、異なる型のプラスミドが使用される場合、異なるプラスミドは、細胞内の２つの異なるプラスミドの安定な共存を可能にするように、２つの別々の不適合群に由来し得る。それにもかかわらず、同じ不適合群からのプラスミドは、相同組換えを起こさせるのに十分な時間で、同じ細胞内に依然として共存し得る。
多様な基質を含むプラスミドは、任意の方法（例えば、化学的形質転換、本来の能力、エレクトロポレーション、微粒子銃（biolistic）、ファージまたはウイルス系へのパッケージング）によって、細胞に最初に導入される。しばしば、プラスミドは、１つより多くのプラスミドが同じ細胞に侵入する確率を増加させる、（最大トランスフェクション能力に関して）飽和濃度またはそれに近い濃度で存在する。種々の基質を含むプラスミドは、同時に、または複数回でトランスフェクトされ得る。例えば、後者のアプローチにおいて、細胞は、プラスミドの第１のアリコートでトランスフェクトされ得、トランスフェクタントは選択および増殖され、次いでプラスミドの第２のアリコートに感染させる。
プラスミドが細胞に導入されると、組換え遺伝子を生じる基質間の組換えは、単に細胞を増殖させることによって、複数の異なるプラスミドを含む細胞内に生じる。しかし、１つのプラスミドのみを受け取る細胞は、組換えに関与し得ず、そして進化に対するこのようなプラスミドにおける基質の潜在的な寄与は、十分には活用されない（これらのプラスミドは、それらがミューテーター細胞において増殖する場合、ある程度は寄与し得るが）。進化の速度は、全ての基質を、組換えに関与させることによって増加し得る。このようなことは、トランスフェクトした細胞を、エレクトロポレーションに供することによって達成され得る。エレクトロポレーションの条件は、外因性DNAを細胞に導入するために従来使用された条件と同じである（例えば、1,000〜2,500ボルト、400μF、および１〜２mMギャップ）。これらの条件下で、プラスミドは細胞間で交換され、全ての基質が組換えに関与することを可能にする。さらに、組換えの産物は、互いに、または最初の基質と、さらなる回の組換えを行い得る。進化の速度はまた、結合移入の使用によって増加し得る。結合移入を活用するために、基質は、MOB遺伝子を有するプラスミドにクローン化さ得れ、そしてtra遺伝子もまた、シスまたはトランスでMOB遺伝子に提供される。結合移入の効果は、単に培養物を増殖することによって、プラスミドが細胞間を移動するのを可能にし、そして任意の基質と以前の組換えの産物との間の組換えが生じるのを可能にする点で、エレクトロポレーションと非常に類似する。進化の速度はまた、細胞を融合することによって増加して、プラスミドまたは染色体の交換を誘導し得る。融合は、化学薬剤（例えば、PEG）、またはウイルスタンパク質（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、HSV-1 gBおよびgD）によって誘導され得る。進化の速度はまた、ミューテーター宿主細胞（例えば、細菌におけるMut L、S、D、T、H、およびAtaxia telangiectasiaヒト細胞株）の使用によって増加し得る。
細胞が増殖しそして組み換えが生じるまでの時間は、もちろん、細胞型によって変化するが、一般的には重要ではない。なぜなら、わずかな程度の組換えでさえ、出発材料に対して多様性を実質的に増加し得るからである。組換えられた遺伝子を含むプラスミドを保有する細胞は、所望の機能についてのスクリーニングまたは選択に供される。例えば、進化した基質が薬物耐性遺伝子を含む場合、薬物耐性について選択する。スクリーニングまたは選択を生き延びた細胞は、１回以上のスクリーニング／選択に供され、続いて組み換えられるか、またはさらなる回の組換えに直接供され得る。本明細書中で使用される「スクリーニング」は、一種のスクリーニングのような「選択」を含むことが意図される。
次の回の組換えは、以前の回とは独立したいくつかの異なる形式によって達成され得る。例えば、さらなる回の組換えは、上記のプラスミドのエレクトロポレーションまたは結合媒介性細胞間移入を単に再開することによってもたらされ得る。あるいは、１つまたは複数の新鮮な基質（以前の基質と同じかまたは異なる）は、選択／スクリーニングを生き延びた細胞にトランスフェクトされ得る。必要に応じて、新たな基質は、異なる選択マーカーを保有するプラスミドベクターおよび／または最初のプラスミドとは異なる不適合性群からのプラスミドベクターに含まれる。さらなる代替物として、選択／スクリーニングを生き延びた細胞は、２つの部分集団に細分され得、そして一方の部分集団からのプラスミドDNAは、他方にトランスフェクトされ、ここで２つの部分集団からのプラスミドからの基質は、さらなる回の組換えを受ける。後者の２つの選択肢のいずれかにおいて、進化の速度は、上記のようなDNA抽出、エレクトロポレーション、結合、またはミューテーター細胞を使用することによって増加し得る。なおさらなる改変物において、スクリーニング／選択を生き延びた細胞からのDNAは抽出され得、そしてインビトロで循環配列組換えに供され得る。
２回目の組換えの後、好ましくは増加したストリンジェンシーの条件下で、２回目のスクリーニング／選択が行われる。所望される場合、さらなる回の組換えおよび選択／スクリーニングが、２回目と同じストラテジーを用いて行われ得る。首尾良い回の組換えおよび選択／スクリーニングを用いて、耐えた組換え基質は、所望の表現型の獲得へと進化する。代表的には、循環組換えのこの方法および他の方法において、所望の表現型を獲得した組換えの最終産物は、出発基質と0.1％〜25％の位置で異なり、そして１世代あたり10-9位置あたり約１変異の自然に獲得される変異によって駆動される進化速度よりも１桁以上大きな速度（例えば、少なくとも10倍、100倍、1000倍、または10,000倍）で進化した（Andersonら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93:906-907（1996）を参照のこと）。「最終産物」は、「シャフリングされた」DNAの利用のためにさらに望ましい別の宿主に移入され得る。このことは、より望ましい宿主が、E.coliのような他の生物について利用可能な分子生物学または遺伝的ツールがないことに起因して、変異／組換えの多くのサイクルについての宿主ほどには効率的でない状況では特に有利である。
２．ウイルス-プラスミド組換え
プラスミド-プラスミド組換えに使用されるストラテジーはまた、ウイルスープラスミド組換えにも使用され得る；通常、ファージ-プラスミド組換え。しかし、ウイルスの使用に独特のさらなるいくつかのコメントが適切である。組換えのための最初の基質は、プラスミドおよびウイルスベクターの両方にクローン化される。通常、ウイルスベクターは、プラスミドとは異なる基質を含むべきであるが、どの基質がウイルスベクターに挿入されるか、およびどの基質がプラスミドに挿入されるかは、通常重要ではない。以前のように、プラスミド（およびウイルス）は、代表的には、選択マーカーを含む。プラスミドおよびウイルスベクターは両方とも、上記のようにトランスフェクションによって細胞に導入され得る。しかし、より効率的な手順は、プラスミドで細胞をトランスフェクトし、トランスフェクタントを選択し、そしてウイルスでトランスフェクタントを感染させることである。なぜなら、多くのウイルスの感染の効率は、100％の細胞にほぼ等しく、この経路によってトランスフェクトされそして感染されたほとんどの細胞は、異なる基質を保有するプラスミドおよびウイルスの両方を含む。
相同組換えは、プラスミドとウイルスとの間に生じ、組換えプラスミドおよび組換えウイルスの両方を生じる。細胞内DNAが、二本鎖および一本鎖の両方の形態で存在する、いくつかのウイルス（例えば、繊維状ファージ）については、両方が組換えに関与し得る。ただし、ウイルスは迅速に細胞を殺傷するものではなく、組換えは、エレクトロポレーションまたは結合の使用によって増強され、細胞間でプラスミドを移動させ得る。組換えはまた、ウイルスのいくつかの型について、ある細胞からの子孫ウイルスが他の細胞に再感染するのを可能にすることによって増強され得る。ウイルスのいくつかの型について、ウイルス感染細胞は、重感染に対して耐性を示す。しかし、このような耐性は、高度な多重度で感染させ、そして／または重感染に対する耐性が減少したウイルスの変異株を用いることによって克服され得る。
プラスミド含有細胞をウイルスで感染した結果は、ウイルスの性質に依存する。いくつかのウイルス（例えば、繊維状ファージ）は、細胞においてプラスミドとともに安定に存在し、そしてまた細胞から子孫ファージを押し出す。他のウイルス（例えば、コスミドゲノムを有するλ）は、細胞において、子孫ビリオンを生成せずにプラスミドのように安定に存在し得る。他のウイルス（例えば、T-ファージおよび溶菌性λ）は、プラスミドとの組換えを経験するが、最終的に宿主細胞を殺傷し、そしてプラスミドDNAを破壊する。宿主を殺傷せずに細胞を感染するウイルスについては、組換えプラスミドおよびウイルスを含む細胞は、プラスミド-プラスミド組換えについてと同じアプローチを用いて、スクリーニング／選択され得る。選択／スクリーニングを生き延びた細胞によって押し出される子孫ウイルスはまた回収され得、そして続く回の組換えにおける基質として使用され得る。それらの宿主細胞を殺傷するウイルスについては、組換えから得られる組換え遺伝子は、子孫ウイルスにのみ存在する。スクリーニングまたは選択アッセイが、細胞において組換え遺伝子の発現を必要とする場合、組換え遺伝子は、子孫ウイルスから別のベクター（例えば、プラスミドベクター）へと移されるべきであり、そして選択／スクリーニングが行われる前に、細胞に再トランスフェクトされるべきである。
繊維状ファージについては、組換えの産物は、組換えを生き延びた細胞およびこれらの細胞から押し出されたファージの両方に存在する。組換え産物の二重供給源は、プラスミド-プラスミド組換えに関していくつかのさらなる選択肢を提供する。例えば、DNAは、インビトロでの組換えの回における使用のために、ファージ粒子から単離され得る。あるいは、子孫ファージは、以前の回のスクリーニング／選択を生き延びた細胞、または組換えのための新鮮な基質でトランスフェクトされた新鮮な細胞を、トランスフェクトもしくは感染するのに使用され得る。
３．ウイルス-ウイルス組換え
プラスミド-プラスミドおよびプラスミド-ウイルス組換えについて記載される原理は、いくつかの改変を有するウイルス-ウイルス組換えに適用され得る。組換えのための最初の基質は、ウイルスベクターにクローン化される。通常、同じベクターが、全ての基質に使用される。好ましくは、ウイルスは、天然で、または変異の結果として、細胞を殺傷しないウイルスである。挿入後、いくつかのウイルスゲノムは、インビトロで、またはパッケージング細胞株を用いてパッケージングされ得る。パッケージングされたウイルスは、細胞が、異なる基質を保有する複数のウイルスを受け取る高い確率が存在するように、高度な多重度で細胞を感染するために使用される。
最初の回の感染後、続く工程は、以前の節で議論されたように、感染の性質に依存する。例えば、ウイルスがファージミド（Sambrookら、Molecular Cloning, CSH Press, 1987）ゲノム（例えば、λコスミドまたはM13、F1またはFdファージミド）を有する場合、ファージミドは、細胞内のプラスミドとして挙動し、そして単に細胞内で増殖することによって組換えを受ける。組換えは、細胞内DNAの一本鎖形態の間で特に効率的である。組換えは、細胞のエレクトロポレーションによって増強され得る。
選択／スクリーニングに続いて、組換え遺伝子を含むコスミドは、耐えた細胞から、例えば、cos-溶原性宿主細胞の熱誘導、または標準的な手順によるDNAの抽出によって回収され得、続いてインビトロでコスミドDNAを再パッケージングする。
ウイルスが繊維状ファージである場合、複製形態DNAの組換えは、感染した細胞の培養物を増殖させることによって生じる。選択／スクリーニングは、このような細胞から押し出された感染性粒子（すなわち、ファージまたはパッケージングされたファージミド）とともに、改良された特徴を有する組換え遺伝子を有するウイルスベクターを含む細胞のコロニーを同定する。続く選択肢は、プラスミド-ウイルス組換えについてと本質的に同じである。
４．染色体組換え
この形式は、染色体基質を特に進化させるために使用され得る。この形式は、多くの染色体遺伝子が表現型に寄与するか、または染色体遺伝子の進化させる正確な位置が公知でない状況で、特に好ましい。組換えのための最初の基質は、プラスミドベクターにクローン化される。進化させる染色体遺伝子が公知である場合、基質は、高度な配列同一性を示すが、染色体遺伝子からのいくつかの分岐を示す配列のファミリーを構成する。進化させる染色体遺伝子が位置決定されていない場合、最初の基質は、通常、進化させる遺伝子への配列同一性を少数のみが示すDNAセグメントのライブラリーを構成する。プラスミド保有基質と染色体遺伝子との間の多様性は、変異誘発によって、または染色体を保有する細胞の種とは異なる種からのプラスミド保有基質を得ることによって誘導され得る。
組換えのための基質を保有するプラスミドは、進化させる染色体遺伝子を有する細胞にトランスフェクトされる。進化は、単に培養物を増殖することによって生じ得、そして結合またエレクトロポレーションによって細胞間でプラスミドを移動させることによって加速され得る。進化はさらに、ミューテーター宿主細胞の使用によって、またはミューテーター宿主細胞を用いて進化した非ミューテーター宿主細胞の培養物を播種するか、またはエレクトロポレーションもしくは結合によるプラスミドの細胞内移入を誘導することによって加速され得る。好ましくは、播種のために使用されるミューテーター細胞は、進化させる非ミューテーター細胞の純粋培養物の単離を促進する、ネガティブな選択マーカーを含む。選択／スクリーニングは、所望の機能の獲得に向かって進化した染色体および／またはプラスミドを保有する細胞を同定する。
続く回の組換えおよび選択／スクリーニングは、プラスミド-プラスミド組換えについて記載された様式と同様の様式において進行する。例えば、さらなる組換えは、プラスミドのエレクトロポレーションまたは結合移入と組み合わせた組換えを生き延びた細胞を増殖させることによってもたらされ得る。あるいは、組換えのためのさらなる基質を保有するプラスミドは、耐えた細胞に導入され得る。好ましくは、このようなプラスミドは、異なる不適合群に由来し、そして最初のプラスミドとは異なる選択マーカーを保有して、少なくとも２つの異なるプラスミドを含む細胞についての選択を可能にする。さらなる代替物として、プラスミドおよび／または染色体DNAは、耐えた細胞の部分集団から単離され得、そして第２の部分集団にトランスフェクトされ得る。染色体DNAは、トランスフェクションの前に、プラスミドベクターにクローン化され得る。
５．ウイルス-染色体組換え
上記の他の方法におけるように、ウイルスは、通常、細胞を殺傷しないウイルスであり、そしてしばしば、ファージまたはファージミドである。手順は、プラスミド-染色体組換えについてと実質的に同じである。組換えについての基質はベクターにクローン化される。次いで、基質を含むベクターは、細胞にトランスフェクトされ得るか、またはインビトロでパッケージングされて感染によって細胞に導入され得る。ウイルスゲノムは、単に培養物を増殖させることにより、宿主染色体と組み換わる。進化は、エレクトロポレーションによるウイルスゲノムの細胞間移動、または子孫ビリオンによる細胞の再感染を可能にすることによって加速され得る。スクリーニング／選択は、所望の機能の獲得に向かって進化した染色体および／またはウイルスゲノムを有する細胞を同定する。
続く回の組換えについていくつかの選択肢が存在する。例えば、ウイルスゲノムは、エレクトロポレーションにより、選択／組換えを生き延びた細胞間で移され得る。あるいは、選択／スクリーニングを生き延びた細胞から押し出されるウイルスはプールされ得、そして高い多重度で細胞を重感染するために使用され得る。あるいは、組換えのための新鮮な基質は、プラスミドまたはウイルスベクターのいずれかにおいて、細胞に導入され得る。
II.ポリペプチドの進化に対する循環配列組換えの適用
上記の技術に加えて、ポリペプチドの進化のためのこれらの技術のいくつかのさらに有利な改変が、以下に記載される。これらの方法は、「細粒」シャフリングおよび「粗粒」シャフリングといわれる。粗粒法は、基質にさらにランダムにまたがる多様性を導入するのではなく、ある程度の量の遺伝物質を基質核酸間で交換し、それにより、得られる組換え体における、ドメイン、制限フラグメント、オリゴにコードされる変異ブロック、または他の任意に規定されたセグメントが交換または置換される多様性を制限するのを可能にする。粗粒シャフリングとは対照的に、細粒シャフリング法は、コドンのような単一のセグメント内で、非常に密接に関連する変異の所定のセットの全ての可能な組換え、すなわち置換（permutation）（複数の置換を含む）の生成を可能にする。
いくつかの実施態様において、粗粒シャフリング技術または細粒シャフリング技術は、核酸配列内のすべての可能な変異の網羅的な探索としては行われない。むしろ、これらの技術は、公知の配列または構造情報に基づいて遺伝子内で可能な変異のサンプリングを提供するために利用される。サンプルのサイズは、代表的には、スクリーニングまたは選択プロセスの性質によって決定される。例えば、スクリーニングが96-ウェルマイクロタイター形式で行われる場合、スクリーニングに便利なように、組換えライブラリーのサイズを約100のこのようなマイクロタイタープレートに制限することが好ましくあり得る。
本明細書中に記載される技術は、遺伝子ファミリーからの遺伝子の組換えに特に有用であり、ここでヌクレオチド配列の多様性は、このファミリーにおける遺伝子のヌクレオチド配列に天然に存在する差異によって、全てまたは一部が提供される。
本明細書中で使用される「遺伝子ファミリー」は、類似の機能（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンだが、これらに限定しない）を有する遺伝子；共通の祖先からの遺伝に由来すると考えられる遺伝子；および構造的に相同なタンパク質（例えば、４つのヘリックスバンドルタンパク質（four helix bundle protein））をコードする遺伝子を含むことが意図される
従って、例えば、DNAまたはタンパク質配列は、コンピューターアルゴリズム（例えば、SchomburgおよびLesselによる生命情報科学（bioinformaic）の研究論文（SchomburgおよびLessel, Bioinformatics: From Nucleic Acids and Proteins to Cell Metabolism, 1995年10月9〜11日, Braunschweig, Germany）に記載されるアルゴリズム）によって整列され得る。これらのアルゴリズムは、２つの配列、または配列のサブドメインが、共通の祖先からの遺伝によって互いに関連する尤度を決定し得る。共通の祖先からの遺伝に由来すると判定される配列は、「相同遺伝子ファミリー」を含み、そしてDNAシャフリングは、これらの遺伝子ファミリーの進化を加速するために使用され得る。
さらに、多くの個別のタンパク質配列は、類似のタンパク質折り畳みと一致し、そして配列のこのようなファミリーは、「構造的に相同な」遺伝子ファミリーを含むといわれ得る。４つのヘリックスバンドルタンパク質のスーパーファミリーは、このようなファミリーである。このファミリーは、サイトカインから酵素、この折り畳みを有するDNA結合タンパク質までの範囲の機能的に高度に多様なタンパク質の非常に大きなファミリーであるが、これらのタンパク質が共通の祖先に由来する見込みはない。それらは、類似のタンパク質折り畳みを有するように、「収束的に進化」している可能性がより高い。所望のタンパク質折り畳みを有するタンパク質を設計することを可能にする現在機能的なアルゴリズム（Dahiyatら、Science 278:82-87（1997））が存在し、そしてこのようなアルゴリズムは、例えば、任意の公知の天然のタンパク質に対する一次配列に関連しないジンクフィンガーモチーフを設計するために使用されている。
Ａ．変異を組み換えるための制限酵素部位の使用
いくつかの場合において、目的の核酸配列における変異の組換えを指向する核酸において、制限酵素を使用することは有利である。これらの技術は、反復DNAまたは他の問題のある一次配列モチーフの存在に起因して、存在する方法によっては容易にシャフリングされ得ないフラグメントの進化において特に好ましい。それらの技術はまた、そのサイズのために、容易にシャフリングおよび「PCR増幅」され得ない遺伝子クラスターのような、大きなフラグメント（代表的には、10kbを超える）をシャフリングするために行われる。50kbまでのフラグメントは、PCRによって増幅されたことが報告されているが（Barnes, Proc.Natl,Acad.Sci.（U.S.A）91:2216-2220（1994））、10kbを越えるフラグメントについては問題であり得、従って、10〜50kbおよびそれを越えるの範囲のシャフリングのための別の方法が好ましい。好ましくは、使用される制限エンドヌクレアーゼは、クラスII型（Sambrookら、Molecular Cloning, CSH Press, 1987）、および好ましくは、AlwnI、SfiI、またはBstX1のような非パリンドローム付着末端オーバーハングを作製するものである。これらの酵素は、DNAリガーゼでの効率よい、順序だった再構築を可能にする非パリンドローム末端を作製する。代表的には、制限酵素（すなわちエンドヌクレアーゼ）部位は、従来の制限酵素マッピング技術（Sambrookら、Molecular Cloning, CSH Press, 1987）によって、その遺伝子についての配列情報の分析によって、または合成による、所望の制限部位の核酸配列への導入によって（すなわち、サイレント変異の組み込みによって）同定される。
設計されるDNA基質分子は、インビボ複製DNA由来（例えば、プラスミド分離）、または目的の制限酵素認識部位を、好ましくはフラグメントの末端付近で保有するPCR増幅した核酸フラグメント由来のいずれかであり得る。代表的には、目的の遺伝子の少なくとも2つの改変体（各々が、１つ以上の変異を有する）は、目的の核酸配列内で切断されると決定された、少なくとも１つの制限酵素を用いて設計される。次いで、制限フラグメントは、DNAリガーゼで結合されて、シャフリングされた領域を有する全長遺伝子を生成する。シャフリングされる領域の数は、目的の核酸配列内の切断の数に依存する。シャフリングされる分子は、上記のように細胞に導入され得、そして所望の特性について、スクリーニングまたは選択され得る。次いで、核酸は、プール（ライブラリー）または所望の特徴を有するクローンから単離され得、そして所望の程度の改良が得られるまで、同じ手順に供され得る。
いくつかの実施態様において、少なくとも１つのDNA基質分子またはそのフラグメントが単離され、そして変異誘発に供される。いくつかの実施態様において、再連結された制限フラグメントのプールまたはライブラリーは、消化−連結プロセスが反復される前に、変異誘発に供される。本明細書中で使用される「変異誘発」は、PCR変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、部位特異的変異誘発など、および本明細書中に記載技術のいずれかによる循環配列組換えとして当該分野で公知であるこのような技術を含む。
この形式の使用の例は、ポリケチドクラスターの操作におけるものである。ポリケチドクラスター（Khoslaら、TIBTECH 14, 1996年９月）は、代表的には、10〜100kb長であり、これは、非常に大きな複合酵素複合体へと会合する複数の大きなポリペプチドに特異的である。これらの複合体のモジュール性質および生合成経路のモジュール性質に起因して、タンパク質モジュールをコードする核酸は、異なるポリケチドクラスター間で交換されて、新規かつ機能的なキメラポリケチドを生成し得る。ポリペプチド間で必須ではない部位で、またはポリペプチド内で操作されたイントロンにおける、SfiI（８塩基認識、非パリンドロームオーバーハング）のような稀な制限エンドヌクレアーゼ部位の導入は、上記の技術を用いて核酸セグメントの交換を操作するための「ハンドル」を提供する。
Ｂ.再構築PCR
核酸配列における循環組換え変異のためのさらなる技術は、「再構築PCR」を利用する。この方法は、遺伝子のような全長核酸テンプレートに別々に進化した複数のセグメントを構築するのに使用され得る。この技術は、有利な変異体のプールが、以前の研究から公知であるか、または当該分野で公知の変異誘発技術（例えば、PCR変異誘発、カセット変異誘発、変更（doped）オリゴ変異誘発、化学変異誘発、またはミューテーター株におけるインビボでのDNAテンプレートの増殖）によって作製されて得た変異体をスクリーニングすることによって同定された場合に行われる。目的の核酸配列のセグメントを規定する境界は、好ましくは、遺伝子間領域、イントロン、または目的の変異を有さないようである遺伝子の領域に存在する。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ）は、目的の核酸のセグメントのPCR増幅によって合成され、その結果、オリゴヌクレオチドの配列は、２つのセグメントの接合部に重複する。重複領域は、代表的には、約10〜100ヌクレオチド長である。セグメントの各々は、1セットのこのようなプライマーで増幅される。次いで、PCR産物は、上記のIA-B部において使用されたプロトコルのような構築プロトコルに従って「再構築」されて、ランダムにフラグメント化した遺伝子を構築する。簡単には、構築プロトコルにおいて、PCR産物を、まず、例えば、ゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、プライマーから精製する。精製した産物は一緒に混合され、さらなるプライマーの非存在下で、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）および適切な緩衝塩の存在下で、約１〜10サイクルの変性、再アニール、および伸長に供される（「自己プライム」）。遺伝子に隣接するプライマーを用いる続くPCRは、完全に再構築されかつシャフリングされた遺伝子の収率を増幅するのに使用される。この方法は、必然的に「粗粒」であり、それゆえ、ブロック式様式（オペロン内の多重遺伝子の対立遺伝子変異体を組み換える場合のようないくつかの探索のための利点）で、変異を組換えるのみである。
いくつかの実施態様において、得られる再構築遺伝子は、プロセスが反復される前に変異誘発に供される。
いくつかの実施態様において、プライマーにウラシルを取り込むオリゴヌクレオチドが、PCR増幅に使用される。代表的には、ウラシルは、オリゴヌクレオチドにおいて1つの部位で取り込まれる。産物は、ウラシルグリコシラーゼで処理され、それにより、一本鎖オーバーハングが作製され、そしてRashtchian（Current Biology, 6:30-36（1995））に開示されるような方法により順序付けられた様式で再構築される。
さらなる実施態様において、目的の核酸配列のセグメントの増幅のためのPCRプライマーは、以下のように、目的の遺伝子に改変を導入するために使用される。核酸配列における目的の部位での変異は、スクリーニングまたは選択、核酸配列の相同体を配列決定することなどによって同定される。次いで、目的の部位で野生型または変異体情報をコードするオリゴヌクレオチドPCRプライマーが合成される。次いで、これらのプライマーは、PCR変異誘発に使用されて、指定された位置で、野生型および変異体情報の置換をコードする全長遺伝子のライブラリーを作製する。この技術は、代表的には、スクリーニングまたは選択プロセスが、目的の変異体の遺伝子を配列決定しそして変異原性オリゴヌクレオチドを合成するコストに比べて、高価、厄介、または実用的でない場合に有利である。
この方法の例は、以下に詳細に記載されるように、改良されたTaqポリメラーゼの進化である。この方法の適用から得られる変異体タンパク質は、配列決定反応において同定されそしてアッセイされて、改良された配列決定特性を有する変異体が同定される。このことは、代表的には、高処理量形式（例えば、Broachら、Nature 384（補遺）:14-16（1996）を参照のこと）で行われ、スクリーニング後に、少数（例えば、約２〜100）のさらなる評価のための候補組換え体を得る。次いで、変異体遺伝子は配列決定されて、変異体の位置に関する情報を提供し得る。対応する変異原性オリゴヌクレオチドプライマーは、この情報から合成され得、そして上記のような再構築反応において使用されて、１遺伝子あたり多くの変異の平均を有するライブラリーを効率的に作製し得る。１回以上のこのプロトコールは、Taqポリメラーゼの改良された改変体についての効率的な探索を可能にする。
Ｃ．変異体配列情報の強化
本発明のいくつかの実施態様において、組換え反応（例えば、上記で議論されたもの）は、変異体配列について強化され、その結果、複数の変異体スペクトル（すなわち、変異体の可能な組み合わせ）は、より効率的にサンプリングされる。このことについての基本原理は、以下のとおりである。改良された活性を有する変異体クローンの数ｎが得られ、ここで各クローンが、核酸配列において異なる位置で単一の点変異を有すると仮定する。次いで、１核酸配列あたり平均１つの目的の変異を有する変異体クローンのこの集団が、組換え反応を行う場合、得られた集団は、なお、ポアソン分布によって規定されるような、１核酸配列あたり平均１つの目的の変異を有し、複数の変異スペクトルを比較的まばらなままにする。
２つ以上の変異を有する組換え体を同定するのに必要なスクリーニングの量は、以下の技術によって劇的に減少され得る。目的の核酸配列は、変異体クローンのプールから得られ、そして代表的には、制限エンドヌクレアーゼによる消化、超音波処理、またはPCR増幅によって、フラグメントとして調製される。フラグメントは変性され、次いで再アニールされ、それにより、変異体の１つの鎖が異なる変異体または野生型クローン由来の相補鎖とハイブリダイズされたミスマッチハイブリッドを生成する。次いで、再アニールされた産物は、例えば、DNAseIの使用によって、約20〜100bpのフラグメントにフラグメント化される。このフラグメント化反応は、ミスマッチを含むテンプレートの領域（変異体情報）を、野生型配列をコードする領域から分離する効果を有する。次いで、ミスマッチハイブリッドは、アプタマー、色素、またはミスマッチDNAに結合する他の試薬を用いて、アフィニティー精製され得る。好ましい実施態様は、mutSタンパク質アフィニティーマトリックス（Wagnerら、Nucleic Acids Res. 23（19）:3944-3948（1995）；Suら、Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）, 83:5057-5061（1986））の、構築反応の前のインビトロでのアフィニティー精製した物質を増幅する好ましい工程との使用である。次いで、この増幅した物質は、上記のように構築PCR反応に供される。必要に応じて、この物質は、本来の変異体プールに対して力価測定されて（例えば、mutS強化プールの約100％〜10％）、次回の組換えにおいて、１クローンあたり変異の平均数が制御され得る。
この方法のほかの適用は、天然対立遺伝子変異体もしくは選択された対立遺伝子変異体として、または関連種の相同遺伝子間の差異として生じる多形性塩基について濃縮される遺伝子構築物の構築におけるものである。例えば、あるものは、目的の形質（例えば、干魃耐性）において遺伝性変動を有すると考えられる植物のいくつかの変種を有し得る。次いで、１遺伝子あたり多くの変異を含むこれらの改変体遺伝子のライブラリーを構築することが目的である。MutS選択は、本明細書中に記載される構築技術と組み合わせて適用されて、多形性（「変異体」）情報について高度に強化される、組換え体のこのようなプールを作製し得る。いくつかの実施態様において、組換え遺伝子のプールは、トランスジェニック宿主において提供される。組換え体は、改良された表現型を有すると決定されるトランスジェニック生物からの導入遺伝子のPCR増幅、および本発明に記載される形式をさらに進化させるために適用することにより、さらに進化され得る。
Ｄ．イントロン駆動組換え
いくつかの場合において、組換えについての基質分子は、均一に低い相同性、相同性の散発的な分布領域、または比較的小さな（例えば、約10〜100bp）相同性の領域（例えば、ファージディスプレイペプチドリガンド）を有する。これらの因子は、RSRにおける組換えの効率および乱雑さを減少させ得る。本発明のいくつかの実施態様において、この問題は、タンパク質相同体をコードする配列におけるコードエキソン間へのイントロンの導入によって取り組まれる。本発明のさらなる実施態様において、イントロンが使用され得る（Chongら、J.Biol.Chem., 271:22159-22168（1996））。
この方法において、核酸配列（例えば、遺伝子または遺伝子ファミリー）は、セグメントを有するように任意に規定される。セグメントは好ましくはエキソンである。イントロンは、セグメント間で操作される。好ましくは、第１および第２セグメントの間に挿入されたイントロンは、第２および第３セグメントの間に挿入されたイントロンから少なくとも約10％分岐し、第２および第３セグメントの間に挿入されたイントロンは、任意の以前のセグメント対などの間に、挿入されたイントロンから少なくとも約10％分岐し、以下セグメントｎおよびｎ＋１まで同様。従って、任意の所定のセットのエキソン間のイントロンは、ライブラリーにおける全てのクローン間で当初は同一であるのに対して、エキソンは、配列任意に分岐し得る。それゆえ、イントロンは、RSRについて記載された任意の方法の適用を可能にする相同なDNA配列を提供する一方、エキソンは、配列において任意に小さいかまたは分岐し得、そして進化して、組換えにおける効率を有意に失うことなく、任意の大きな程度の配列分岐を達成し得る。制限部位もまた、目的のイントロン性核酸配列に操作されて、制限フラグメントの特異的再構築を可能にする。開始エキソンDNAは、配列情報から新規に合成され得るか、または任意の核酸調製物（例えば、ゲノム、cDNA、ライブラリーなど）に存在し得る。例えば、１〜10の非相同性イントロンは、エキソン間でそれらを置換することによって目的の核酸配列の組換えを指向するように設計され得る。イントロンの配列は、公知のイントロン配列から全体または部分的に得られ得る。好ましくは、イントロンは自己スプライス性である。順序付けしたセットのイントロンおよびエキソンライブラリーは、標準的な方法によって機能的遺伝子へと構築される（Sambrookら、Molecular Cloning, CSH Press（1987））。
本明細書中に記載されるインビトロまたはインビボ組換えのための任意の形式は、循環エキソンシャフリングに適用され得る。好ましい形式は、イントロン性配列に配置されるSfiIのような非パリンドローム制限部位を使用して、シャフリングを促進することである。選択したクローンのプールは、SfiIで消化され、そして再連結される。非パリンドロームオーバーハングは、シャフリングしたエキソンの順序付けされた再構築を促進する。遺伝子のこれらのライブラリーが発現され得、そして所望の特性についてスクリーニングされ得、次いで、このプロセスによる組換えのさらなる循環回に供され得る。いくつかの実施態様において、ライブラリーは、プロセスが反復される前に変異誘発に供される。
哺乳動物ライブラリー形式へのイントロンの導入がどのように有利に使用されるかの例は、以下のとおりである。lox部位（Sauerら、Proc.Natl.Acal.Sci（U.S.A）, 85:5166-5170（1988））を含むイントロンは、各αインターフェロン親基質におけるアミノ酸92と93との間で任意に導入される。104キメラインターフェロン遺伝子のライブラリーが、２つのエキソン（残基１〜92および残基93〜167）の各々について作製され、複製プラスミドベクターにクローン化され、そして標的細胞に導入される。104という数はスクリーニングにおける便宜のために任意に選択した。哺乳動物細胞における発現のための例示的なベクターは、SV40起源（SV40巨大Ｔ抗原を発現する宿主細胞を伴う）を含み、そのためインターフェロン構築物の一過性発現を可能にする。細胞は、インターフェロン保護アッセイにおいて、水泡性口内炎ウイルス（VSV）のような細胞変性ウイルスでチャレンジされる（例えば、Meisterら、J.Gen.Virol. 67:1663-1643（1986））。インターフェロンの発現に起因して生存する細胞が回収され、インターフェロン遺伝子の2つのライブラリーがPCR増幅され、そしてE.coliにおいて増幅され得るベクターに再クローニングされる。次いで、増幅プラスミドは、高多重度で（例えば、106細胞あたり10マイクログラムのプラスミド）このベクターの複製を支持し得るcre発現宿主にトランスフェクトされる。宿主細胞におけるcreの存在は、インターフェロンイントロンにおいてlox部位での効率的な組換えを促進し、従って選択されたセットのエキソンをシャフリングする。次いで、細胞のこの集団は、第２回の選択において、ウイルスチャレンジによって使用され、そしてこのプロセスは、循環的に適用される。この形式において、creリコンビナーゼは、好ましくは、宿主において複製し得ない同時トランスフェクト分子において、一過的に発現される。従って、cre発現プラスミドからの組換え体の分離の後、さらなる骨組換えは生じず、そして選択は遺伝的に安定なエキソン組み合わせにおいて行われ得る。この方法は、1つより多いイントロン、cre/loxとは異なる組換え増強配列（例えば、int/xisなど）、および限定しないが、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスのような他のベクター系とともに使用され得る。
５．合成オリゴヌクレオチド媒介性組換え
１．配列空間を横切るオリゴ架橋
本発明のいくつかの実施態様において、約80％未満、より代表的には約50％未満の相同性を有する１セットの基質（例えば、遺伝子ファミリーのメンバー）によって規定される配列空間の領域の探索が所望される。この領域（これは、遺伝子の一部もしくはすべてまたは遺伝子であり得る）は、セグメントに任意に線引きされる。このセグメント境界は、天然のエキソンとの対応性に基づいて、構造的考察（ループ、αヘリックス、サブドメイン、ドメイン全体、疎水性コア、表面、動力学的シミュレーション）に基づいて、および遺伝子マッピングデータとの相関に基づいてランダムに選択され得る。
次いで、代表的には、セグメントは、各接合部での「架橋」オリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRによって増幅される。従って、５つの遺伝子のセットが、３つのセグメントＡ、Ｂ、およびＣに切断される場合、そして各セグメントの5つの変動（Ａ１、Ａ２、．．．．Ｃ４、Ｃ５）が存在する場合、各架橋オリゴがＡの１つおよびＢセグメントの１つに対して20塩基の相同性を有するＡ−Ｂ接合部の各鎖について25のオリゴヌクレオチドが作製される。いくつかの場合において、必要なオリゴヌクレオチドの数は、遺伝子ファミリーのメンバーのいくつかまたはすべてにおいて同一であるセグメント境界を選択することによって減少され得る。オリゴヌクレオチドは、Ｂ−Ｃ接合部について同様に合成される。Ａドメインファミリーは、PCRによって、包括的遺伝ＡプライマーおよびＡ−Ｂ接合部オリゴヌクレオチドのプールで増幅される；Ａ−Ｂ架橋およびＢ−Ｃ架橋オリゴヌクレオチドを有するＢドメイン、およびＢ−Ｃ架橋オリゴヌクレオチドおよび外側の包括的プライマーを有するＣドメイン。次いで、全長遺伝子は、構築PCRまたは上記のdUTP／ウラシルグリコシラーゼ法によって作製される。好ましくは、この工程からの産物は、選択および組換えのプロセスが反復される前に、改良の所望のレベルまたは所望の特徴の進化が得られるまで、変異誘発に供される。このことは、代表的には、目的のタンパク質および特徴に適切なスクリーニングまたは選択を用いて決定される。
この方法の例示は、11の相同なヒトαインターフェロン遺伝子組換えについて以下に例示される。
２．相同性変異をコードするオリゴヌクレオチドでの部位特異的変異誘発（SDM）に続くシャフリング
本発明のいくつかの実施態様において、１つ以上の基質配列からの配列情報は、スクリーニングまたは選択の回の間の続く組換えによって、目的の所定の「親」配列に付加される。代表的には、このことは、当該分野で周知の技術（Sambrookら、Molecular Cloning, CSH Press（1987））によって、テンプレートとして１つの基質、および他の基質配列（例えば、相同性遺伝子）からの単一または複数の変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて行われる部位特異的変異誘発で行われる。目的の改良された表現型についてのスクリーニングまたは選択の後、選択された組換え体は、本明細書中に記載のRSR技術を用いてさらに進化される。スクリーニングまたは選択の後、部位特異的変異誘発が、相同体変異をコードするオリゴヌクレオチドの別の収集物とともに再び行われ得、そして上記のプロセスは、所望の特徴が得られるまで反復される。
２つの相同体の間の差異が、コドンにおける１つ以上の単一の点変異である場合、両方の相同体における配列をコードする縮重オリゴヌクレオチドが使用される。１つのオリゴは、多くのこのような縮重コドンを含み得、そして配列のブロックに対して全ての組み合わせを徹底的に探索することを可能にする。この例は、αインターフェロン遺伝子の進化について以下に提供される。
相同体配列空間が非常に大きい場合、特定の改変体に対する探索を制限することが有利であり得る。従って、例えば、コンピューターモデリングツール（Lathropら、J.Mol.Biol., 255:641−665（1996））は、標的タンパク質への各相同体変異をモデリングするのに使用され、そして構造および機能が明らかに破壊されることが予測される任意の変異が放棄され得る。
Ｆ.宿主機構によって指向される組換え
本発明のいくつかの実施態様において、DNA基質分子は、細胞に導入され、ここで細胞機構は、それらの組換えを指向する。例えば、そして本明細書中に記載の任意の技術によって、変異体のライブラリーが構築され、改良され表現型を有する変異体についてスクリーニングまたは選択される。最良の候補をコードするDNA基質分子は、本明細書中に記載される任意の技術によって回収され、次いでフラグメント化され、そして哺乳動物宿主をトランスフェクトするために使用され、そして改良された機能についてスクリーニングまたは選択される。DNA基質分子は、例えばPCRによって、哺乳動物宿主から回収され、そしてこのプロセスは、所望のレベルの改良が得られるまで反復される。いくつかの実施態様において、フラグメントは変性され、そして感染の前に再アニールされ、recAのような組換え刺激タンパク質でコートされるか、またはNeoRのような選択マーカーとともに同時トランスフェクトされて、目的の遺伝子の組換えバージョンを受け入れる細胞についてのポジティブ選択を可能にする。
例えば、この形式は、RSRによる抗体のインビボアフィニティー成熟について好ましい。簡単には、変異体抗体のライブラリーが、本明細書中に記載のように、48G7アフィニティー成熟について生成される。このライブラリーは、リガンドでFACS精製されて、最高0.1〜10％アフィニティーを有する抗体について濃縮する。V領域遺伝子は、PCRによって回収され、フラグメント化され、そして再構築したV領域遺伝子が組み換えし得るベクターで同時トランスフェクトまたはエレクトロポレーションされる。DNA基質分子は、同時トランスフェクトされた細胞から回収され、そしてこのプロセスは、所望のレベルの改良が得られるまで反復される。他の実施態様は、エレクトロポレーションの前にV領域を再構築することを含み、その結果、インタクトなV領域エキソンは、抗体発現カセットへと組換え得る。さらなる実施態様は、他の真核生物遺伝子のためか、またはウイルス全体の進化のためのこの形式の使用を含む。
Ｇ.ファージミドベースの構築
本発明のいくつかの実施態様において、目的の遺伝子は、一本鎖DNAを生成するベクター（例えば、ファージミド）にクローン化される。得られたDNA基質は、当該分野で公知の任意の方法において、RSRによって変異誘発され、宿主細胞にトランスフェクトされ、そして所望の特性または改良された表現型についてのスクリーニングまたは選択に供される。選択またはスクリーニングされたファージミドからのDNAは、例えば、PCRまたはプラスミド調製によって増幅される。このDNA調製物は、順列を変えることが望まれる種々の変異体配列を含む。このDNAは、フラグメント化され、そして変性され、そして一本鎖DNA（ssDNA）ファージミドテンプレートとアニールされる（ssDNAは、野生型遺伝子およびベクター配列をコードする）。好ましい実施態様は、ssDNAの調製のためのCJ236のようなdut（-）ung（-）宿主株の使用である（Sambrookら、Molecular Cloning CSH Press（1987）。
アニールされたテンプレートのギャップは、DNAポリメラーゼで満たされ、そして連結されて、閉弛緩環を形成する。複数のフラグメントがファージミドにアニールし得るので、新たに合成した鎖は、今度はシャフリングした配列からなる。これらの産物は、dut+ung+であるE.coliのmutS株へと形質転換される。ファージミドDNAは、トランスフェクト宿主から回収され、そして所望のレベルの改良が得られるまでこのプロトコールに再び供される。回収されたファージミドDNAのこのライブラリーにおいて目的のタンパク質コードする遺伝子は、任意の技術（RSRを含む）によって、プロセスが反復される前に、変異誘発され得る。
III．改良されたタンパク質発現
組換えDNA技術は、大量の、純粋な、そして均質なほとんど全ての目的の核酸配列を得るための非常に一般的な方法であることが証明されているが、同様の一般性は、大量の、純粋な、均質のタンパク質の組換え形態での産生については未だ達成されていない。その説明は、おそらく、タンパク質発現、折り畳み、局在化、および安定性が本質的にDNAよりもさらに複雑であり、そして予測不可能であることである。発現されたタンパク質の収量は、転写速度、翻訳速度、リボソームとの相互作用、細胞内でのシャペロニンおよび他のタンパク質との初期のポリペプチドの相互作用、オリゴマー形成の効率、分泌成分および他のタンパク質の輸送経路の成分との相互作用、プロテアーゼ感受性、ならびに最終的な折り畳み状態の本質的な安定性の複合的な関数である。このような複雑なプロセスの最適化は、RSRの適用のために十分に適合される。以下の方法は、タンパク質発現の最適化のためにRSRを適用する詳細な戦略である。
Ａ．コドン使用ライブラリー上でRSRを使用する改良された発現を有する変異体遺伝子の進化
この宿主中での組換えタンパク質の発現に対する、稀なE. coliコドンのネガティブな効果が、明らかに実証されている（Rosenbergら、J. Bact. 175：716-722（1993））。しかし、機能的なタンパク質の発現を最適化するコドン使用パターンの選択に関する一般的な規則は、捕らえどころがない。本発明のいくつかの実施態様において、タンパク質発現は、遺伝子コードの縮重に基づいて目的の遺伝子中で使用されるコドンを変化させることによって最適化される。代表的には、このことは、縮重オリゴヌクレオチドを使用して遺伝子を合成することによって達成される。いくつかの実施態様において、縮重オリゴヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードするDNA基質分子に同一である約20ヌクレオチド、続くタンパク質の領域をコードする約20の縮重ヌクレオチドの領域、続く同一の約20ヌクレオチドの別の領域の一般的な構造を有する。好ましい実施態様において、同一の領域は、宿主について好ましいコドンを利用する。さらなる実施態様において、オリゴヌクレオチドは、DNA基質に対して、少なくとも１つの5’および１つの3’ヌクレオチドで同一であるが、有してDNA基質分子に少なくとも85％の配列相同性を有し、縮重コドンの使用に起因する差異を伴う。いくつかの実施態様において、一組のこのような縮重オリゴヌクレオチドが、各オリゴヌクレオチドが一般式ｎ−10で別のヌクレオチドと重複して使用される。ここでｎはオリゴヌクレオチドの長さである。このようなオリゴヌクレオチドは、代表的には、約20〜1000ヌクレオチドの長さである。次いで、構築された遺伝子がクローニングされ、発現され、そして改良された発現についてスクリーニングされるかまたは選択される。構築した遺伝子は、所望される改良が達成されるまで、上記のような循環的な組換え方法に供され得る。
例えば、この技術を用いて、E. coli中で活性な発現のために、ウシ腸アルカリホスファターゼ（BIAP）を進化させ得る。この酵素は、ELISAのようなアッセイ形式でレポーター遺伝子として一般的に使用される。クローニングされた遺伝子は、良好な収量で、E. coliのような原核生物宿主中では、活性な形態では発現され得ない。このような発現系の開発によって、当業者は、BIAPに関して、そして重要なことには、改良された活性または化学的な結合特性（例えば、抗体に対する化学的な結合）を有する操作された改変体に関して、安価な発現技術に近づけることが可能である。詳細な実施例が、実験的な実施例の節に提供される。
Ｂ．改良された折り畳み
本発明のいくつかの実施態様において、封入体を形成する異種宿主中で過剰発現または発現される場合に、目的のタンパク質は、発現されるタンパク質の大多数が、不溶性の凝集物中で見出される。循環配列の組換え技術を用いて、このような標的タンパク質の折り畳みを最適化し得る。目的の標的タンパク質を進化させる突然変異およびシャペロニンタンパク質を進化させる突然変異を含む、折り畳みを改良するいくつかの方法が存在する。
１．標的タンパク質の進化
ａ．lacヘッドピース（Headpiece）二量体融合タンパク質を使用する封入体分画の選択
lacリプレッサー「ヘッドピース二量体」は、このヘッドピース二量体へのポリペプチドの融合体がアフィニティー精製プロセスを通じてそれらをコードするプラスミドに結合したままであるに十分な親和性でlacオペレーターに結合する、短いペプチドリンカーによって連結された２つのヘッドピースドメインを含む小タンパク質である（Gatesら、J. Mol. Biol. 255：373-388（1995））。この特性を用いて、以下のように、改良された折り畳み特性を有する目的の変異体タンパク質を進化させ得る。目的のタンパク質は、哺乳動物、酵母、細菌などであり得る。
lacヘッドピース二量体と標的タンパク質配列との間の融合タンパク質が、例えば、Gates（前出）によって開示されるように構築される。少なくとも１つのlacオペレーターを含むこの構築物は、PCR変異誘発、化学的変異誘発、オリゴ指向性変異誘発（Sambrookら、Molecular Cloning、CSH Press（1987））のような当該分野で一般的な技術によって変異誘発される。得られるライブラリーは、宿主細胞中に形質転換され、そして融合タンパク質の発現が、好ましくはアラビノースを用いて誘導される。抽出物または溶解物が、構築物を発現するライブラリーの培養物から作製される。不溶性のタンパク質は、遠心分離またはアフィニティークロマトグラフィーによって可溶性のタンパク質／DNA複合体から分画され、そして可溶性のタンパク質／DNA複合体の収量が、プラスミドの定量的PCRによって定量される（Sambrookら、Molecular Cloning、CSH Press、1987）。好ましくは、適切に折り畳まれたタンパク質に特異的な試薬（例えば、モノクローナル抗体または天然のリガンド）を用いて、可溶性のタンパク質／DNA複合体を精製する。この工程に由来するプラスミドDNAが単離され、RSRに供され、そして再度、発現される。これらの工程は、可溶性のタンパク質／DNA複合体の収量が所望の改良されたレベルに到達するまで、繰り返される。次いで、個々のクローンが、目的のタンパク質の機能的特性（例えば、酵素活性など）の保持についてスクリーニングされる。
この技術は、可溶性および他の特性（例えば、目的の宿主細胞中で異種発現されたタンパク質の細胞性の輸送）を進化させるために一般的に有用である。例えば、当業者は、SV40複製起点およびlacオペレーターをコードするプラスミド上にタンパク質をコードし、そしてＴ抗原を発現する哺乳動物宿主中で融合タンパク質を一時的に発現させることによって、lacリプレッサーヘッドピース二量体に融合させたタンパク質の効率的な折り畳みおよび核局在化について選択し得る。核HIRT抽出物からのタンパク質／DNA複合体の精製（SeedおよびAruffo、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）84：3365-3369（1987））によって、当業者は、効率的な折り畳みおよび核局在化タンパク質について選択することが可能である。
ｂ．ファージディスプレイを使用するタンパク質の機能的発現
O’Neilら（Current Biology、5：443-449（1995））に開示されるようなファージディスプレイ法においてしばしば遭遇する課題は、ファージ上での目的のタンパク質の機能的発現の不能性である。いかなる理論にも束縛されることなく、目的タンパク質の不適切な折り畳みが、この問題の原因となり得る。RSRを用いて、ファージ上での機能的発現について目的のタンパク質を進化させ得る。代表的には、融合タンパク質が、遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIと標的タンパク質との間で構築され、次いで、例えば、PCR変異誘発によって変異誘発される。次いで、変異誘発されたライブラリーは、ファージディスプレイ形式で発現され、ファージストックが作製され、そしてこれらのファージが、標的タンパク質に対する既知のリガンドを含有するアフィニティーマトリックスを使用して機能的にディスプレイされた融合タンパク質を保有するファージについて、親和性選択される。機能的に選択されたファージに由来するDNAが精製され、そして目的のディスプレイされた遺伝子がシャフリングされ、そしてファージディスプレイ形式で再度クローニングされる。選択、シャフリング、および再クローニングの工程は、機能的にディスプレイされるタンパク質を有するファージの収量が規定されるような所望のレベル（例えば、リガンドアフィニティーマトリックスまたはディスプレイされたファージに関連する生物学的活性について維持されているファージの画分によって規定されるようなレベル）に到達するまで、繰り返される。次いで、個々のクローンをスクリーニングし、改良されたディスプレイ特性、所望の発現レベル、および目的の機能的特性（例えば、リガンドまたはレセプターに結合する能力、リンホカイン活性、酵素活性など）を有する候補変異体を同定する。
本発明のいくつかの実施態様において、機能的なスクリーニングまたは選択を用いて、ファージ上で発現されない進化したタンパク質を同定する。目的の宿主中で最初は十分には発現され得ない標的タンパク質が変異誘発され、そして機能的スクリーニングまたは選択を用いて、機能的なタンパク質を発現する細胞を同定する。例えば、目的のタンパク質は、宿主細胞中での機能、色素生成性物質の切断などを相補し得る。次いで、循環配列の組換えを用いて、このような改良された変異体のプールから改良された機能的発現を迅速に進化させる。
例えば、AMV逆転写酵素が、特に商業的に重要である。なぜなら、これは、より高い温度（42℃）で活性であり、そして多くの他の逆転写酵素よりも強力であるからである。しかし、これは、原核生物宿主（例えば、E. coli）中で発現させることが困難であり、そしてその結果、これをニワトリの細胞から精製しなければならないので高価である。従って、E. coli中で効率的に発現され得る進化したAMV逆転写酵素が、非常に所望されている。
簡潔には、AMV逆転写酵素遺伝子（Papasら、J. Cellular Biochem 20：95-103（1982））が、当該分野で一般的な任意の方法によって変異誘発される。変異遺伝子のライブラリーが、polA12（Ts）recA718（Sweasyら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90：4626-4630（1993））E. coli宿主中で、lacプロモーターの制御下でcolE1プラスミド（Amp耐性）中にクローニングされる。ライブラリーはIPTGで誘導され、そして非許容温度までシフトされる。これによって、Kimら（Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）92：684-688（1995））によって報告された活性なHIV逆転写酵素変異体の選択について報告された選択的条件下で、機能的に発現された逆転写酵素遺伝子について選択される。選択されたAMV RTX遺伝子は、クローニングされた遺伝子に隣接するオリゴヌクレオチドを使用してPCRによって回収される。得られるPCR産物はインビトロでRSRに供され、上記のように選択され、そしてこのプロセスが、機能的発現のレベルが受容可能になるまで繰り返される。次いで、個々のクローンは、RNA依存性DNAポリメライゼーション、および目的の他の特性（例えば、室温での半減期、エラー率）についてスクリーニングされる。候補のクローンは変異誘発に供され、次いで、E. coli中で高レベルで発現され得るAMV RTを得るために再度試験される。
２．進化したシャペロニン
本発明のいくつかの実施態様において、タンパク質の過剰発現は、凝集する傾向を有する折り畳み中間体の蓄積を導き得る。いかなる理論にも束縛されることなく、シャペロニンの役割は、凝集に対してこのような折り畳み中間体を安定化させることであると考えられる；従って、目的のタンパク質の過剰発現は、シャペロニンの能力を圧倒することを導き得る。シャペロニン遺伝子は、本発明の技術を使用して、単独で、または目的のタンパク質をコードする遺伝子と組み合わせてのいずれかで、この問題を克服するために進化させられ得る。
このアプローチに特に適切な目的のタンパク質の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：サイトカイン；マラリアコートタンパク質；Ｔ細胞レセプター；抗体；産業的な酵素（例えば、界面活性プロテアーゼおよび界面活性リパーゼ）；ワクチンでの使用のためのウイルスタンパク質；ならびに植物種子貯蔵タンパク質。
シャペロニン遺伝子の供給源として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：チオレドキシン、Gro ES/Gro EL、PapD、ClpB、DsbA、DsbB、DnaJ、DnaK、およびGrpEのようなタンパク質をコードするE. coliシャペロニン遺伝子；Hsp70、Hsp72、Hsp73、Hsp40、Hsp60、Hsp10、Hdj1、TCP-1、Cpn60、BiPのような哺乳動物シャペロニン；ならびに酵母のような他の種中のこれらのシャペロニン遺伝子の相同体（J.G. WallおよびA. Pluckthun, Current Biology、6：507-516（1995）；Hartl、Nature、381：571-580（1996））。さらに、異種ゲノムまたはｃDNAライブラリーを用いて、新規のシャペロニンについて選択またはスクリーニングし得る。
一般に、シャペロニンの進化は、シャペロニン遺伝子の最初の変異誘発、目的の標的タンパク質の改良された発現についてのスクリーニングまたは選択、変異したシャペロニン遺伝子をRSRに供すること、および選択またはスクリーニングの繰り返しによって達成される。全てのRSR技術を用いる場合、これは、目的のタンパク質の発現について所望の改良が得られるまで、繰り返される。２つの例示的なアプローチが以下に提供される。
ａ．改良された機能についてのスクリーニングまたは選択を用いる目的のタンパク質に対してトランスでのシャペロニンの進化
いくつかの実施態様においてシャペロニン遺伝子は、目的のタンパク質の遺伝子（単数または複数）に関して別々に進化される。進化したシャペロニンにおける改良は、例えば、標的タンパク質自体の活性の増強について、または標的タンパク質および選択可能なタンパク質もしくはスクリーニング可能なタンパク質（例えば、GFP、アルカリホスファターゼまたはβガラクトシダーゼ）を含む融合タンパク質の活性についてスクリーニングすることによって、アッセイされ得る。
ｂ．シスでのシャペロニンオペレーター
いくつかの実施態様において、シャペロニン遺伝子および標的タンパク質遺伝子は同じプラスミド上にコードされるが、必ずしもいっしょには進化しない。例えば、lacヘッドピース二量体がタンパク質標的に融合され、可溶性タンパク質をコードするプラスミドの選択を可能にし得る。シャペロニン遺伝子は、この同じプラスミド上に提供され（「シス」）、そしてシャフリングされ、そして標的タンパク質よりもシャペロニン遺伝子が進化される。同様に、シャペロニン遺伝子は、目的のタンパク質を有する遺伝子IIIまたは遺伝子VIII融合体をコードするファージミドプラスミド上にクローニングされ得る。クローニングされたシャペロニンは変異誘発され、そして上記の選択を用いる場合は、機能的にディスプレイされる融合タンパク質を発現するファージがアフィニティーマトリックス上で単離される。これらのファージ由来のシャペロニン遺伝子はシャフリングされ、そして選択、変異、および組換えのサイクルが、融合タンパク質が機能的な形態で効率的にディスプレイされるまで循環的に適用される。
３．改良された細胞内局在化
生物工学的目的の多くの過剰発現されたタンパク質が、精製または活性アッセイにおいて利点を生じるために周辺質または培地中に分泌される。高レベルの分泌への最適化は困難である。なぜなら、このプロセスは多くの遺伝子によって制御されており、従って、最適化はこれらの成分のいくつかの発現レベルおよび構造に影響を与える複数の変異を必要とし得るからである。例えば、E. coli中でのタンパク質の分泌は、以下を含む多くのタンパク質によって影響を受けることが公知である：分泌型ATPase（SecA）、トランスロカーゼ複合体（SecB、SecD、SecE、SecF、およびSecY）、シャペロニン（DnaK、DnaJ、GroES、GroEL）、シグナルペプチダーゼ（LepB、LspA、Ppp）、特異的折り畳み触媒物（DsbA）、ならびに他のほとんど定義されていない機能を有するタンパク質（例えば、Ffh、FtsY）（Sandkvistら、Curr. Op. Biotechnol. 7：505-511（1996））。これらのタンパク質についてのこれらの遺伝子の野生型または変異体コピーの過剰産生は、成熟分泌タンパク質の収量を有意に増大し得る。例えば、secYまたはsecY4の過剰発現は、hIL6-pre-OmpA融合体からの成熟ヒトIL6の周辺質収量を有意に増大させる（Perez-Perezら、Bio-Technology 12：178-180（1994））。同様に、E. coli中でのDnaK／DnaJの過剰発現は、分泌されたヒト顆粒球コロニー刺激因子の収量を改善する（Perez-Perzeら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 210：254-259（1995））。
RSRは、分泌経路の上記の指定された１つ以上の成分を進化させるための方法を提供する。以下の戦略を用いて、E. coli中でのタンパク質の分泌を最適化する。Bacillus subtilis、Pseudomonas、Saccaromyces cerevisiae、Pichia pastoris、哺乳動物細胞、および他の宿主への適用に適切な、この方法の改変もまた記載される。一般的なプロトコールは以下のとおりである。
1つ以上の上記で挙げられた遺伝子が、公知の隣接配列を使用するE. coliゲノムDNAからのPCR増幅によって得られ、そしてプラスミドまたはコスミドベクター中に順序づけられた配列でクローニングされる。これらの遺伝子は、一般には、クラスター中では天然には存在せず、従って、これらは、人工的な遺伝子クラスターを含む。この遺伝子は、その天然のプロモーターの制御下、または別のプロモーター（例えば、lac、tac、アラビノース、もしくはtrpプロモーター）の制御下でクローニングされ得る。代表的には、稀な制限部位（例えば、SfiI）が本発明の方法において記載されるようなシャフリングされた遺伝子の順序づけられた再構築を容易にする遺伝子の間に配置される。
この遺伝子クラスターは変異誘発され、そして目的の遺伝子が誘導的に発現され得る宿主細胞中に導入される。分泌されるべき標的遺伝子の発現、およびクローニングされた遺伝子の発現は、目的のプロモーターについて標準的な方法によって誘導される（例えば、lacプロモーターについては１mMのIPTGの添加）。変異体のライブラリーによるタンパク質分泌の効率は、例えば、コロニーブロッティングの方法によって測定される（Skerraら、Anal. Biochem. 196：151-155（1991））。最高レベルの分泌されるタンパク質（上位0.1〜10％まで；好ましくは上位１％まで）を発現するこれらのコロニーが選択される。プラスミドDNAがこれらのコロニーから調製され、そして本発明の任意の方法に従ってシャフリングされる。
好ましくは、それぞれの個々の遺伝子は集団から増幅され、そしてRSRに供される。フラグメントはSfiI（DNAリガーゼによる順序付けられた再構築を促進するために設計された非パリンドローム突出を有するそれぞれの遺伝子間に導入された）で消化され、そして好ましくは、共有的に閉じられた弛緩した環の形成（＜１ng／マイクロリットル）を促進するために低い希釈で、ともに連結される。PCR増幅された遺伝子の集団各々は、最終的な遺伝子のクラスターへの再構築の前にシャフリングされ得る。連結産物は、目的の宿主へ形質転換されて戻され、そして選択およびRSRのサイクルが繰り返される。
同様の戦略が、Pseudomonas、Bacillus subtillis、酵母、および哺乳動物細胞のような他の宿主中で使用され得る。上記に列挙されるE. coli遺伝子の相同体が最適化のための標的であり、そして実際、これらの相同体の多くが他の種において同定されている（Pugsley, Microb. Rev.、57：50-108（1983））。これらの相同体に加えて、他の成分（例えば、シグナル認識粒子の６つのポリペプチド、トランス局在化鎖関連膜タンパク質（TRAM）、BiP、Ssaタンパク質、および他のhsp70相同体、ならびにprsA（B. subtilis）（SimonenおよびPulva、Microb. Rev.、57：109-137（1993）））が、RSRによる最適化のための標的である。一般に、例えば、哺乳動物細胞についてSV40-neo（Sambrookら、Molecular Cloning、CSH Press（1987）、Northrupら、J. Biol. Chem.、268（4）：2917-2923（1993））、または酵母について２ミクロンプラスミドもしくはarsプラスミド（Strathernら、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces、CSH Press（1982））のような、エピソームベクターの置換が使用される。組み込み型ベクター（例えば、pJM103、pJM113、またはpSGMU2）が、B. subtilisについて好ましい（Perego、第42章、615-624頁、Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria、A Sonenshein、J. HochおよびR. Losick編、1993）。
例えば、効率的に分泌された熱安定性DNAポリメラーゼが進化され得、従って、これによって、発現されたDNAポリメラーゼの精製をほとんど有さないかまたは全く有さないDNAポリメライゼーションアッセイの実行が可能である。このような手順は、高処理量アッセイで試験することが望まれる任意のタンパク質（例えば、表１に列挙される任意の薬学的タンパク質）または任意の産業的酵素の変異体のライブラリーの発現に好ましい。最初の構築物は、シグナルペプチド（例えば、STIIまたはOmpA）を、分泌されるタンパク質のアミノ末端に融合することによって作成される。目的の分泌経路において作用すると考えられるクローニングされた遺伝子の遺伝子クラスターが変異誘発され、そして標的構築物と同時発現される。個々のクローンが遺伝子産物の発現についてスクリーニングされる。改良されたクローンに由来する分泌型遺伝子のクラスターが回収され、そして再度クローニングされ、そしてもとの宿主に導入されて戻される。好ましくは、これらは、このプロセスが繰り返される前に、最初に変異誘発に供される。このサイクルは、分泌されたタンパク質の発現において所望の改良が達成されるまで繰り返される。
IV．進化したポリペプチドの特性
Ａ．進化した遷移状態アナログおよび基質の結合
目的の基質について実質的に最適状態に及ばない活性を有する産業的目的の多くの酵素が存在する。これらの多くの場合、天然から得られた酵素は、それが進化される条件とは非常に異なる条件下で作用するか、または天然の基質とは異なる基質に対して活性を有するかのいずれかのために、必要とされる。
産業的酵素についての進化技術の適用は、しばしば、適用され得る選択の型、およびスクリーニングにおいて調査され得る変異体の適当な数によって、有意に制限される。遷移状態アナログ（McCaffertyら、Appl. Biochem. Biotechnology. 47：157-171（1994））または基質アナログ（Jandaら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）91：2532-2536（1994））の結合について、ディスプレイ形式で発現される酵素または触媒抗体の選択は、改良された触媒効率を有する変異体についての選択のための一般的な戦略を示す。
ファージディスプレイ（O’Neilら、Current Biology 5：443-449（1995））および本明細書中に一般的に記載される他のディスプレイ形式（Gatesら、J. Mol. Biol. 255：373-386（1995）；Mattheakisら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）91：9022-9026（1994））は、目的のタンパク質への親和性に基づく選択の適用のための一般的な方法論を示す。例えば、MatthewsおよびWells（Science 260：1113-1117（1993））は、改良された基質を選択するためにプロテアーゼ基質のファージディスプレイを使用した。一方、ファージの表面上の活性な酵素のディスプレイは、改良された遷移状態アナログの結合を有する変異体タンパク質の選択を可能にする。遷移状態アナログの親和性における改良は、触媒効率における改良と相関する。例えば、Pattenら、Science 271：1086-1091（1996）は、そのハプテンに対する触媒抗体の親和性における改良が、触媒効率における改良と十分に相関することを示し、エステル分解性抗体について達成されるkcat／Kmにおいて80倍の改良を有する。
例えば、坑生物質の生合成に使用される酵素は、ファージディスプレイ選択を使用する所望の条件下での新規の基質特異性および活性について進化され得る。いくつかの坑生物質が、生物学的に産生された出発化合物の化学的改変によって現在生成されている。所望の分子の完全な生合成は現在は実用的ではない。なぜなら、必要とされる酵素活性および基質特異性を有する酵素を欠失しているからである（Skatrud、TIBTECH 10：324-329、1992年９月）。例えば、7-アミノデアセトオキシセファロスポリン酸（7-ADCA）は、半合成的に産生されたセファロスポリンの前駆体である。7-ADCAは、ペニシリンＧの化学的環膨張、続くフェノキシアセチル基の酵素的脱アセチル化によって生成される。7-ADCAは、デアセチルセファロスポリンＣ（DAOC V）から酵素的に生成され得、これは次いで、適切に改変されたペニシリン膨張酵素（expandase）が進化され得る場合に、酵素環の膨張によってペニシリンＶから誘導され得る（Cantwellら、Curr. Genet. 17：213-221（1990））。従って、7-ADCAは、原則として、ペニシリンＶから改変されたペニシリンＮ膨張酵素（例えば、S. clavuligerus cefE遺伝子の変異形態）を使用して酵素的に産生され得る（Skatrud、TIBTECH 10：324-329、1992年９月）。しかし、ペニシリンＶは、商業的に有用であるに十分な効率を有する任意の公知の膨張酵素によっては、基質として受容されない。以下に概説するように、本発明のRSR技術を用い、cefEまたは他の膨張酵素によってコードされるペニシリン膨張酵素を進化させ得る。その結果、それらは、基質としてペニシリンＶを使用する。
ファージディスプレイまたは他のディスプレイ形質の選択は、ディスプレイ形式においてcefEペニシリン膨張酵素変異体のライブラリーを発現させ、基質に対する結合または遷移状態アナログについて選択し、そして高親和性結合剤を迅速に進化させるためにRSRに適用することによって、この問題に適用される。候補物をさらにスクリーニングし、所望の反応条件（例えば、pH、温度、溶媒濃度など）下でのペニシリンＶに対する改良された酵素活性を有する変異体を同定する。RSRを適用し、所望の膨張酵素活性を有する変異体をさらに進化させる。多数の遷移状態アナログ（TSA’s）が、この反応に適切である。以下の構造は、cefE変異体のディスプレイライブラリーの選択に使用される最初のTSAである：
0005008784.tif 000002
公知のペニシリン膨張酵素のライブラリー（Skatrud、TIBTECH 10：324-329（1992）；Cantwellら、Curr. Genet. 17：13-221（1990））が、本明細書中で記載されるように生成される。ディスプレイライブラリーは、ペニシリンＶおよび／またはペニシリンＶからDAOC Vへの転換についての上記の所定の遷移状態アナログへの結合についての選択に供される。これらの結合選択は、非生理学的条件下（例えば、上昇した温度）で、新規の条件下で活性な変異体を得るために行われる。RSRは、リガンドの選択のための結合親和性において2×105倍の改良を有する変異体に進化させるために適用される。所望のレベルの改良された結合が得られている場合、候補の変異体は、高処理量形式で発現され、そしてペニシリンＶからDAOC Vへの膨張に対する特異的活性が定量的に測定される。改良された酵素活性を有する組換え体は変異誘発され、そしてそれらをさらに進化させるためにプロセスが繰り返される。
示される酵素（例えば、ファージディスプレイ、lacヘッドピース二量体、ポリソームディスプレイなど）によるTSA結合の保持は、活性部位の全体的な完全性の保持についての良好な選択である。従って、これは、目的の条件下で活性を保持している変異体を選択するために利用され得る。このような条件として以下が挙げられるが、これらに限定されない：異なるpH最適条件、広範なpH最適条件、変更された溶媒（例えば、DMSO（Setoら、DNA Sequence 5：131-140（1995）またはホルムアミド（Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）90：5618-5622（1993））中での活性、変更された温度、改良された半減期（shelf life）、変更されたまたは広範な基質特異性、あるいはプロテアーゼ耐性。さらなる例である、哺乳動物ディスプレイ形式を使用する、p-ニトロフェニルエステラーゼの進化が、以下に提供される。
Ｂ．DNAおよびRNAポリメラーゼの改良
特に商業的に重要なものは、核酸配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応での使用のための改良されたポリメラーゼである。以下の特性は、DNA配列決定ポリメラーゼの改良のための魅力的な候補である：（１）標識されたプライマー形式におけるイノシンによる終結の抑制（H. Dierickら、Nucleic Acids Res. 21：4427-4428（1993））、（２）（特に、蛍光標識されたジデオキシターミネーターで）さらに標準化されたピークの高さ（Parkerら、BioTechniques 19：116-121（1995））、（３）高GC含量DNA（＞60％ GC）の、例えば、＞10％ DMSOで寛容化することによる良好な配列決定（D. Setoら、DNA Sequence、5：131-140（1995）；Scheidlら、BioTechniques 19（5）：691-694（1995））、あるいは（４）新規の塩基アナログ（例えば、イノシン、7-デアザdGTP）の改良された受容能（Dierickら、Nucleic Acids Res.、21：4427-4428（1993））または上記の特性を改良する他の新規の塩基アナログ。
ジデオキシのラダーを無効にするためにフライトのマトリックス補助レーザー脱離イオン化時間（matrix assisted laser desorption ionization time of flight（MALDT-TOF））質量スペクトル分析を使用する、新規の配列決定形式が記載されている（Smith、Nature Biotechnology 14:1084〜1085（1996））。DNAの断片化が、DNAの配列決定のための標準的なゲル電気泳動についての可視的な代替法としてのこの方法の開発を制限する唯一の特徴であることがSmithの最近の総説に記載されている。プリン塩基の7-デアザアナログ（Kirpekarら、Rapid Comm. in Mass Spec.、9：525-531（1995））または2’ヒドロキシル（例えば、2’-H、または2’-F）への改変によってＮグリコシド結合を安定化させる塩基アナログは、この技術の「質量範囲の制限を大きく取り除く」（Smith、1996）。従って、MALDI-TOF条件化での断片化に対する耐性を付与するこれらおよび他の塩基アナログを効率良く取り込み得る進化されたポリメラーゼが、有用な改良案である。
RSRによる改良のための目的の他のポリメラーゼ特性は、より有効な変異誘発のための、または上記の目的のための塩基アナログの受容能に有用に相関するような低い適合度の熱安定性DNAポリメラーゼである；PCRのためには、より高い適合度のポリメラーゼ（Lundbergら、Gene 108：1-6（1991））；治療用構築物およびレトロウイルスの変異を減少させるレトロウイルス遺伝子治療ビヒクルについては、より高い適合度の逆転写酵素；GCに富むDNAの改良されたPCRおよび改変された塩基を用いるPCRである（S. TurnerおよびF. J. Jenkins、BioTechniques 19（1）：48-52（1995））。
従って、本発明のいくつかの実施態様において、変異体ポリメラーゼ遺伝子のライブラリーが、改良された配列決定特性についての直接的な高処理量スクリーニングによってスクリーニングされる。次いで、最良の候補が、RSRに供される。簡潔には、候補ポリメラーゼ（例えば、Taqポリメラーゼ）の変異体ライブラリーが、PCR変異誘発（Caldwellら、PCR Meth. App.、2：28-33（1992））および／またはカセット変異誘発（Sambrookら、Molecular Cloning、CSH Press（1987））のような標準的な方法を使用して構築される。Taq DNAポリメラーゼへの変異（例えば、ジデオキシヌクレオチドの受容能を改良するT7ポリメラーゼ由来の活性部位残基（TaborおよびRichardson、J. Biol. Chem. 265：8322-8328（1990））の取り込み、および5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を不活化する変異（R.S. Rano、BioTechniques、18：390-396（1995））が、これらのライブラリー中に取り込まれる。例えば、上記のような再構築PCR技術は、この課題に特に適切である。同様に、キメラポリメラーゼライブラリーが、好熱性ポリメラーゼ、シークエナーゼおよびE. coliのプール（poll）を有するものと、上記の架橋オリゴヌクレオチド法を使用して互いに交雑させることによって作製される。ライブラリーは、個々の選択したコロニーを96ウェルプレート中で複製させるためにヒトまたは機械によるコロニーの採取が使用される形式で発現される。ここで、少量の培養物が増殖させられ、そしてポリメラーゼの発現が誘導される。
各ウェル中で発現されるポリメラーゼの高処理量の、小規模で単純な精製が行われる。例えば、E. coli中で発現されるHisタグ化Taqの単純な一工程の精製が記載されている（Smirnovら、Russian J. Bioorganic Chem.、21（5）：341-342（1995））。そして、これは、96ウェル発現および精製形式に容易に適合され得る。
高処理量配列決定アッセイが、精製されたサンプルを用いて配列決定反応を行うために使用される。このデータは、改良された配列決定特性で変異体を同定するために、任意のこれらの基準のいずれかに従って分析される：より少ない人工的な最終産物および野生型酵素によって与えられるものより強いシグナルのような点を含む、GCに富む（特に、60％のGC以上）テンプレートについてより高い質のラダー；プライマー標識反応（例えば、蛍光標識プライマー）におけるイノシンによる反応のより少ない終結；任意の所定の部位での蛍光ジデオキシヌクレオチドを用いる反応でのシグナルの取り込みにおける少ないバリエーション；野生型酵素で得られるよりも長い配列決定のラダー（例えば、約20〜100ヌクレオチド）；他の既知の塩基アナログ（例えば、7-デアザプリン）の改良された受容能；組み合わせ化学的ライブラリー由来である新規の塩基アナログの改良された受容能（例えば、Hogan, Nature、384（増補）：17-1996を参照のこと）。
次いで、最良の候補は変異誘発に供され、次いで、上記の改良された配列決定特性について選択またはスクリーニングされる。
別の実施態様において、スクリーニングまたは選択は、以下のように行われる。プラスミドの複製は、E. coliまたは他の微生物中で発現されるポリメラーゼの絶対的な制御下に配置され得る。この系の有効性は、哺乳動物ポリメラーゼβ（Sweasyら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）90：4626-4630（1993））、Taqポリメラーゼ（Suzukiら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）93：9670-9675（1995））、またはHIV逆転写酵素（Kimら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）92：684-688（1996））に依存するプラスミドの複製を行うことについて実証されている。変異体ポリメラーゼ遺伝子は、colE1起点を保有するプラスミド上に配置され、そしてアラビノースプロモーターの制御下で発現される。ライブラリーは、Suzukiら（前出）によって記載されるように、本質的には活性なポリメラーゼについて富化され、培養物中でアラビノースの存在によって誘導されるポリメラーゼの発現を伴う。
さらなる定量的スクリーニングは、同じプラスミド上でのGFP（グリーン蛍光タンパク質）の存在、選択的な抗生物質の非存在下での非許容温度でのアラビノース上でのレプリカプレーティング、および各培養物中の蛍光の定量的測定のための蛍光定量計の使用を利用する。GFP活性は、プラスミドの安定性、および続く活性なポリメラーゼの発現に依存するコピー数と相関する。
非常に高い割合でエラーを有するポリメラーゼは、これが、現在使用されている蛍光標識されたジデオキシのような塩基アナログの取り込みについてより通常化されたシグナルを有する場合に、優れた配列決定酵素である。なぜなら、これが、低下した特異性および選択性を有するからである。現在使用されているポリメラーゼのエラー率は、ゲルシステムの分解能を考慮して検出され得るよりも低い大きさである、10-5から10-6の程度の大きさである。１％、およびおそらく10％程度の高さのエラー率は、現在のゲルシステムでは検出され得ない。従って、酵素の「ずさんさ（sloppiness）」を増大するより大きな機会が存在する。誤りがちなサイクリングポリメラーゼは、PCRによる遺伝子の超変異誘発のためのような他の用途を有する。
いくつかの実施態様において、Suzuki（Suzukiら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）96：9670-9675（1996））によって記載されているシステムは、発現されるポリメラーゼに依存するレポータープラスミドの複製を行うために使用される。このシステムは、発現されるポリメラーゼの直接の制御下のColE1起点の隣の最初の200〜300塩基の複製を行う（SweasyおよびLoeb、J. Bact. 177：2923-2925（1995）；Sweasyら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）90：4626-4630（1993））。ストップコドンを含むスクリーニング可能なまたは選択可能なレポーター遺伝子（例えば、１、２、または３つのストップコドンを含むLacZα）が、この領域に配置されている。構築物は、非許容温度でアラビノース上で増殖させられ、回収され、そしてレポーターカセット中のストップコドンの復帰変異を要求する選択的なラクトース最小培地上にプレートされる。変異体ポリメラーゼは、PCRによって生存しているものから回収される。生存しているものは、変異誘発物質について富化されている。なぜなら、それらの変異体の表現形は、lacZαレポーターフラグメント中のストップコドンの復帰変異の割合が増大しているからである。
生存しているものに由来するポリメラーゼ遺伝子はRSRに供され、次いで、ポリメラーゼ変異体が、指標株中に形質転換される。変異誘発物質は、非許容温度でアラビノース／Xgalプレート上にプレーティングされることによって可視的にスクリーニングされ得る。変異誘発ポリメラーゼは、ストップコドン（単数または複数）の復帰変異に起因する、高頻度の青色のパピラを有するコロニーを生じる。候補のパピラを有するもの（papillator）は、最も重度にパピラ形成したコロニー（すなわち、「最良の」コロニー）の非パピラ形成領域を採取し、そして増大したパピラ形成率を有するコロニーをさらにスクリーニングするためにアラビノース／Xgal指標培地上に再プレーティングすることによって再スクリーニングされ得る。これらの工程は、所望の復帰突然変異率が達成されるまで（例えば、１回の複製について１塩基対あたり10-2〜10-3変異）繰り返される。
高頻度のパピラ形成を示すコロニーは、誤りがちなポリメラーゼをコードする候補である。これらの候補は、上記の高処理量スクリーニングに関して必須である、改良された配列決定特性についてスクリーニングされる。簡潔には、変異体Taqタンパク質は発現され、そして96ウェル形式で精製される。精製されたタンパク質は、配列決定反応において使用され、そして配列データは、本明細書中で概説される改良を示す変異体を同定するために分析される。改良された特性を有する変異体はRSRに供され、そして機能におけるさらなる改良のために再スクリーニングされる。
いくつかの実施態様において、ストップコドンを含有するGFPが、ストップコドンを有するlacZαの代わりに構築物に使用される。GFP中に復帰したストップコドンを有する細胞は、蛍光表示式細胞分取機（FACS）によって選択される。一般に、FACS選択は、Danglら（Cytometry 2（6）：395-401（1982））に類似のプロトコールに従って、最も明るい約0.1〜10％の、好ましくは最大0.1〜１％をゲートすることによって行われ、そして採集される。他の実施態様において、polA遺伝子は、lox部位または部位特異的リコンビナーゼの他の標的と隣接する。リコンビナーゼは誘導され、従って、当業者は、polA遺伝子を誘導的に欠失させることが可能である（Mulberyら、Nucleic Acid Res. 23：485-490（1995））。これによって、当業者は、任意の温度および任意の宿主中で「Loeb型」選択を行うことが可能である。例えば、当業者は、誘導性の検出可能な形式でpolA相同体を配置することによって、中温性または高温性のrecA欠損におけるこのような選択を設定し得、従って、より一般的な条件下での活性なポリメラーゼの選択に適用し得る。
さらなる実施態様において、この一般的なシステムは、遺伝子の指向されたインビボでの変異誘発のために好ましい。標的遺伝子は、誤りがちなポリメラーゼの制御下にその複製を絶対とする、プラスミドの複製起点の近傍の領域にクローニングされる。この構築物は、polA（ts）recA株を通じて継代され、そして非許容温度で増殖させられ、従って、高い忠実度でプラスミドの残りを複製しながら標的遺伝子を特異的に変異誘発する。
他の実施態様において、選択は、変更された条件下で、または塩基アナログを利用することによる、PCRによるDNA増幅をする変異体DNAポリメラーゼの能力に基づく。変異体ポリメラーゼは、PCR増幅においてそれらをコードする鋳型に対して作用し、従って、これらのポリメラーゼを別々に複製する。
簡潔には、最初の変異体のライブラリーが、レプリカプレートされる。ポリメラーゼの調製は、96ウェル形式で行われる。粗プラスミド調製は、同じセットで作製される。各プラスミドプレップは、ポリメラーゼを最適化することが望まれる条件（例えば、DMSOまたはホルムアミドの添加、変更された変性または伸長温度の変更、緩衝塩の変更、質量分析列決定と共に使用するチオールdNTPのような塩基アナログを用いるPCR、GCに富む（＞60％ GC）DNAのPCR、7-デアザプリン、2’フルオロdNTP、rNTPのような新規の塩基アナログを用いるPCR、イノシンを用いるPCRなど）下でそのプラスミド由来のポリメラーゼプレップを使用してPCR増幅される。増幅された遺伝子はプールされ、クローニングされ、そして変異誘発に供され、そしてこれらのプロセスが、改良が達成されるまで繰り返される。
Ｃ．進化されたホスホネターゼ
アルカリホスファターゼは、ELISAアッセイ、タンパク質融合アッセイのために、そして哺乳動物細胞についてレポーター遺伝子として分泌された形態で広範に使用されるレポーター酵素である。P-フェニルホスフェート（pNPP）基質の化学的不安定性およびpNPPと交差反応する細胞性ホスファターゼの存在は、このレポーター遺伝子を使用するアッセイの感受性についての重要な制限である。ノイズ特性に対して優れたシグナルを有するレポーター遺伝子が、p-ニトロフェニルホスホネートの加水分解に基づいて開発され得、これは、対応するホスフェートよりも塩基触媒性加水分解に対してはるかにより安定である。さらに、アルカリホスファターゼよりもはるかに少ない、天然に存在する細胞性ホスホネターゼが存在する。従って、p-ニトロフェニルホスホネターゼは、アルカリホスファターゼについて魅力的な置換である。なぜなら、化学的および酵素的加水分解に起因するバックグラウンドがはるかに低いからである。これによって、当業者は、非常に低い濃度の抗原を検出するためのより敏感なELISAを行うことが可能である。
Chenら（J. Mol. Biol. 234：165-178（1993））は、Staph. aureusβラクタマーゼが単一のターンオーバー速度論でp-ニトロフェニルホスホネートエステルを加水分解し得ることを示した。活性部位Ser70（βラクタムの加水分解についての活性部位の求核基）は、基質との共有結合中間体を形成する。これは、βラクタムの加水分解の最初の工程と同様であり、そしてこの酵素は、βラクタムの加水分解と同様の機構によってホスホネートを加水分解するように、RSRによって進化させられ得る。MetcalfおよびWannerは、E. coli中のオペロン（phn）を利用する隠れた（cryptic）ホスホネートを記載しており、そしてphnオペロンの欠失を有する株を構築している（J. Bact. 175：3430-3442（1993））。この論文は、リンがphnオペロン中の遺伝子によるアルカリホスホネートの加水分解によって誘導されるホスフェートを含まない最小培地上での、E. coliの増殖についての選択を開示している。従って、当業者は、規定された最小培地上での生化学的選択を使用して活性である、進化されたp-ニトロフェニルホスホネターゼについて選択し得る。特に、効果的なホスホネターゼは、以下のように進化される。Staph. aureus βラクタマーゼの変異体のライブラリーまたはE. coli phn酵素の変異体のライブラリーが構築される。このライブラリーは、phnオペロンが欠失しているE. coli変異体中に形質転換され、そしてp-ニトロフェニルホスホネートを含有するホスフェートを含まないMOPS最小培地上で増殖について選択される。RSRが、選択された変異体に対して、p-ニトロフェニルホスホネートの改良された加水分解についての酵素をさらに進化させるために適用される。
Ｄ．進化された界面活性プロテアーゼ
プロテアーゼおよびリパーゼは、衣類上のタンパク質および脂質のしみを酵素的に分解するために、界面活性剤に大量に添加される。これらの酵素の界面活性剤中への取り込みは、結果として界面活性剤の調合のコストの削減およびしみの除去特性における改善をともなって、界面活性剤の界面活性の必要性を有意に減少させる。改良された特異的活性、改良されたタンパク質基質特異性の範囲、改良された有効期間、上昇された温度での改良された安定性を有し、そして界面活性の要求性が低減したプロテアーゼが、これらの生成物に価値を加える。
一例として、スブチリシンが、以下のように進化させられ得る。クローニングされたサブチリシン遺伝子（von der Ostenら、J. Biotechnol. 28：55-68（1993））が、複合タンパク質混合物を分解する分泌されたサブチリシンによる複合タンパク質培地上での増殖選択を使用してRSRに供され得る。さらに詳細には、サブチリシン変異体のライブラリーが、Bacillus subtilusによって分泌される変異体タンパク質を指向する発現ベクター中で構築される。このライブラリーで形質転換されたBacillus宿主は、炭素および／または窒素源としての複合タンパク質処方物を含む最小培地中で増殖させられる。サブチリシン遺伝子は、早く増殖するものから回収され、そしてRSRに供され、次いで、所望の特性における改良についてスクリーニングされる。
Ｅ．「プロテインネット」からのファージの回避
いくつかの実施態様において、改良されたプロテアーゼの選択が以下のように行われる。変異体プロテアーゼ遺伝子のライブラリーが、ディスプレイファージで構築され、そしてファージがマルチウェル形式またはプレート上で増殖させられる。ファージは、ファージを捕捉する「プロテインネット」に重ねられる。このネットは、表面にジスルフィドを有する操作されたタンパク質（単数または複数）から構成され得、次いで、ペプチドリンカーのライブラリーで架橋され得る。さらなる実施態様は、ファージのさらなる捕捉のために補助マトリックスを使用する。ファージはさらにインキュベートされ、次いで、遊離したファージを回収するために洗浄され、ここで、ディスプレイされたプロテアーゼは、プロテインネットからファージが遊離することを可能にした。次いで、プロテアーゼ遺伝子は、さらなる進化のためにRSRに供される。さらなる実施態様は、ファージミドによってコードされるプロテアーゼのライブラリーを使用するが、ファージミド上ではディスプレイされない。ここで、ストレプトアビジンは、ペプチドリンカーによってpIIIに融合される。プロテアーゼ変異体のライブラリーは、増幅の回の間にビオチンカラム上でファージミドを選択することによってリンカーを切断するように進化させられる。
さらなる実施態様において、プロテアーゼは、必ずしもディスプレイ形式では提供されない。宿主細胞は、ファージミドによってコードされるプロテアーゼを分泌するが、ファージミドによっては表面ディスプレイされないが、一方で、例えばマイクロタイタープレートのようなウェルに束縛される。ファージディスプレイ形式は、完全な高力価溶解物がプロテインネットマトリックス中に入れられ、そしてファージが、増幅、変異誘発、および選択の次の回で遊離されるマトリックスを消化する活性なおよび広範に特異的なプロテアーゼを発現する場合に好ましい。
さらなる実施態様において、ファージは、ウェルには束縛されないが、むしろタンパク質結合フィルターが、プラークリフトのコロニーを生成するために使用され、そして色素生成性または蛍光生成性基質での活性についてスクリーニングされる。フィルター上でのポジティブなスポットに対応するコロニーまたはプラークが採取され、そしてコードされるプロテアーゼ遺伝子が、例えば、PCRによって回収される。次いで、プロテアーゼ遺伝子はさらなる進化のためにRSRに供される。
Ｆ．改良されたプロテアーゼ活性についてのスクリーニング
カルボキシ末端に結合された発蛍光団およびアミノ末端上の蛍光クエンチング部分を含むペプチド基質（例えば、Holskinら（Anal. Biochem. 227：148-55（1995））に記載されるもの）（例えば、（4-4’-ジメチルアミノフェナゾ）ベンゾイル-arg-gly-val-val-asn-ala-ser-ser-arg-leu-ala-5-（2’-アミノエチル）-アミノ-ナフタレン-1-スルホン酸）が、拡大したまたは変更された特異性についてプロテアーゼ変異体をスクリーニングするために使用される。簡潔には、ペプチド基質のライブラリーは、アミノ末端上に発蛍光団を有し、そしてカルボキシ末端上に強力な蛍光クエンチャーを有するように、またはその逆で設計される。分泌されたプロテアーゼを含有する上清は、種々のライブラリーのメンバーと別々に、または複合カクテルとのいずれかでインキュベートされる。高度に活性であり、そして広範な特異性を有するプロテアーゼは、ペプチドの大部分を切断し、従って、クエンチャーから発蛍光団を放出し、そして蛍光測定機上で陽性のシグナルを生じる。この技術は、高密度マルチウェル形式に容易に出来る。
Ｇ．RSRを使用する薬学的タンパク質の改良
表Ｉは、薬学的産業で特に商業的に興味深いタンパク質を列挙する。これらのタンパク質は全て、機能（例えば、特異的活性、リガンド結合、貯蔵寿命、増強された特異性による副作用の減少など）を改良するためのRSR進化のための候補である。全てが、本発明の技術による操作に十分に適合されている。特に、このリストに適用可能であるさらなる実施態様は、以下に記載される。
第1に、Taqポリメラーゼについての上記の方法に類似する、変異体タンパク質のライブラリーの発現および精製のための高処理量法が、表Ｉのタンパク質に適用される。これらの変異体は、機能的アッセイにおいて活性についてスクリーニングされる。例えば、IL2の変異体は、血漿または組織プロテアーゼによる分解に対する耐性についてスクリーニングされるか；または高親和性のIL2レセプターに対する活性を欠失しているが、低親和性IL2レセプターについての活性は維持していることについてスクリーニングされる。野生型と比較して改良された活性を有する変異体由来の遺伝子は回収され、そしてさらに表現型を改良するためにRSRに供される。
好ましくは、ライブラリーは、成熟した折りたたまれたタンパク質が、それをコードする遺伝情報に物理的に連結されるようなディスプレイ形式で生成される。例として、繊維状ファージを使用するファージディスプレイ（O’Neilら、Current Biology 5：443-449（1995））、またはバクテリオファージλ遺伝子Ｖディスプレイ（Dunn、J. Mol. Biol. 248：497-506（1995））、プラスミド上のペプチド（Gatesら、J. Mol. Biol. 255：373-386（1995））（ここでは、目的のポリペプチドはlacヘッドピース二量体に融合され、そして新生翻訳産物がプラスミドまたはPCR産物によってコードされるlacオペレーター部位に結合する）、ならびにポリソームディスプレイ（Mattheakisら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）91：9022-9026（1994））（ここでは、リボソームはmRNA分子上にとどまり、その結果、新生ポリペプチドは留まっているリボソーム／mRNA複合体を破壊することなくコグネイトリガンドとの相互作用に曝される）が挙げられる。選択された複合体は、遺伝子を回収するためにRT-PCRに供される。
そのようにディスプレイされる場合、組換えファージの親和性結合はしばしば、目的のタンパク質のレセプターを使用して行われる。いくつかの場合、全ての所望の生物学的特性を保持している精製されたレセプター（例えば、7回膜貫通型（7-TM）レセプター）を得ることは実用的ではない。このような場合、当業者は、パンニング基質としてレセプターを発現する細胞を使用し得る。例えば、Barryら（Nat. Med. 2：299-305（1996））が、目的のレセプターを発現する細胞に結合するファージを得るための、全細胞に対するM13ライブラリーの好結果のパンニングを記載している。この形式は、一般に、表Ｉに列挙される任意のタンパク質に適用され得る。
いくつかの実施態様において、以下の方法が、選択のために使用され得る。例えば、IFNα変異体をコードするファージミドのストックが、細胞を刺激するための適切な希釈で直接使用され得る。細胞に対する生物学的影響は、標準的なアッセイ（例えば、増殖またはウイルス耐性）によって、あるいはIFN応答性のプロモーター（例えば、MHCクラスＩプロモーター）の制御下でのGFP（Crameriら、Nat. Med. 14：315-319（1996））のようなレポーター遺伝子の活性化を通じて間接的に読まれ得る。1つの実施態様において、応答性細胞の刺激、発現、FACS精製後に付着されたままであるファージミドは、FACSによって精製され得る。好ましくは、最も明るい細胞が回収される。ファージミドは回収され、そしてそれらのDNAが、所望の改良のレベルが達成されるまでRSRに供される。
従って、例えば、IL-3が、これらのディスプレイ形式の1つにおいて調製され、そして所望のレベルの活性を有するアゴニストを進化させるためにRSRに供される。繊維状ファージベクターについてのIL3変異体のライブラリーが作製され、そしてレセプターに対する改良された親和性を有するか、またはファージディスプレイされたIL-3の改良された能力を有する変異体を得るために、精製されたIL3レセプターに対して親和性選択される（「パンニングされる」）。変異体IL-3遺伝子はPCRによって回収され、RSRに供され、そしてディスプレイベクターに再クローニングされる。このサイクルは、所望の親和性またはアゴニスト活性が達成されるまで、繰り返される。
目的の多くのタンパク質が、二量体、またはより高度の多量体形態として発現される。いくつかの実施態様において、上記に記載されているディスプレイ形式は、タンパク質の単鎖バージョンに優先的に適用される。変異誘発（例えば、RSR）が、最初は低いが検出可能な活性を有する多量体因子の改良された単鎖誘導体を進化させるために、これらのディスプレイ形式で使用され得る。このストラテジーは、以下にさらに詳細に記載される。
Ｈ．全細胞選択
いくつかの実施態様において、真核生物細胞が生物学的選択の単位である。以下の一般的のプロトコールが、選択の単位として真核生物細胞を使用するタンパク質の改良のためにRSRを提供するために使用され得る：（１）適切な宿主細胞への変異体のライブラリーのトランスフェクションまたは導入、（２）コードされる遺伝子産物（単数または複数）の一時的または安定した発現、（３）改良された表現形（標的リガンドに対する改良された親和性を有するレセプターの発現；ウイルス耐性など）を有する細胞についての機能的な選択、（４）変異体遺伝子の回収（例えば、PCR、続いてE. coliの形質転換後のHIRT上清の調製）、（５）RSR、および（６）所望の程度の改良が達成されるまでの工程（１）〜（５）の繰り返し。
例えば、上記の作業は、当業者がクローニングした遺伝子を発現する細胞を機能的に選択するため（例えば、発現される表面タンパク質の遺伝子をクローニングする抗体を使用する）の哺乳動物表面ディスプレイを使用し得ることを示す（Seed、Curr. Opin. Biotechnol. 6：567-573（1995）に概説される）。簡潔には、細胞は、複製性のエピソームベクター上に留まっているクローニングされた遺伝子のライブラリーで一時的にトランスフェクトされる。目的のタンパク質（当業者がその遺伝子をクローニングすることを所望する）に対する抗体が、プラスチック皿のような固体表面に固定され、そして目的のタンパク質を発現するトランスフェクトされた細胞が親和性選択される。
例えば、リガンドに対する抗体の親和性は、哺乳動物表面ディスプレイおよびRSRを使用して改良され得る。それらの同種リガンドについてより高い親和性を有する抗体は次いで、１つ以上の以下の特性の改良についてスクリーニングされる：（１）改良された治療特性（増大した細胞殺傷、リガンドの中和、架橋レセプターによるシグナル伝達経路の活性化）、（２）改良されたインビボの画像化適用（放射性核、または非侵襲的手段（例えば、NMR）により体外で検出可能な任意の試薬の共有／非共有結合による抗体の検出）、（３）改良された分析的適用（タンパク質または低分子のELISA検出）、および（４）改良された触媒（触媒抗体）。記載される方法は一般的であり、そして目的の任意のレセプター−リガンド対に拡大され得る。特定の例が、実施例の節で提供される。
１つの変異体配列−１つのトランスフェクト細胞プロトコールの使用が、RSRに基づくプロトコールに特徴的な好ましい設計である。なぜなら、改良された表現形を有する変異体を同定するための機能的選択を使用することが重要であり、そしてトランスフェクションが「クローン」の様式において行われない場合、任意の所定の細胞の機能的な表現形は複数のトランスフェクトされた配列の足し算の結果であるからである。プロトプラスト融合は、この目的を達成するための１つの方法である。なぜなら、各プロトプラストは、代表的には、１つのプラスミド変異体のそれぞれよりも50コピー多く含むからである。しかし、これは、比較的低い効率のプロセスであり（約103〜104の形質転換体）、そしてこれは、Ｂ細胞のようないくつかの非接着細胞株上では十分に作用しない。レトロウイルスベクターは、第２の代替物を提供するが、しかし、これらは、受容可能な挿入物（＜10kb）の大きさが制限され、そしてこれと一致して、高い発現レベルは時として、達成することが困難である。ランダムな組み込みは多様な発現レベルを生じ、従って、ノイズを導入し、そして変異体タンパク質の親和性に対する増大した発現における改良の間を区別するための当業者の能力を制限する。「１遺伝子−１細胞」DNA転移を達成するために効率的に使用され得、そしてRSRの一致する発現レベルに関連するクラスのストラテジーは、lox部位を含むウイルスベクターを使用するため、およびcreリコンビナーゼを好ましくは一時的に発現する宿主にこれを導入し、そしてそのゲノム中へ組み込まれる１つ以上のlox部位を含むためのものである。従って、組み込み部位の可変性が制限される（Rohlmanら、Nature Biotech. 14：1562-1565（1996））。
別のストラテジーは、標的細胞中で複製し得るベクターを使用してプラスミド（すなわち、細胞あたり約１コピー）の制限された濃度でトランスフェクトすることである。例えば、COS細胞中にトランスフェクトされたSV40起点を有するプラスミドを用いる場合である。このストラテジーは、宿主細胞またはベクターのいずれかが、SV40ラージＴ抗原のような複製因子を供給することを必要とする。Northrupら（J. Biol. Chem. 268：2917-2923（1993））は、SV40ラージＴ抗原を発現する安定なトランスフェクタントが次いで、SV40起点を有するベクターでトランスフェクトされるストラテジーを記載する。この形式は、一貫してより高い一時的な発現、およびDpnIによる消化のための感受性によってアッセイされた場合に実証可能なプラスミド複製を生じる。一時的な発現（すなわち、非組み込みプラスミド）が、細胞のディスプレイ選択の好ましい形式である。なぜなら、それは、サイクル数を減少させ、そしてスクリーニングされ得る変異体の数を増大するからである。
SV40ラージＴ抗原または他の複製因子の発現は、いくつかの細胞に対して有害な影響を有し得るか、またはいくつかの細胞において非効率的に作用し得る。このような場合、RSRは、目的の細胞型において改良された活性を有する変異体を進化させるように、複製因子自体に適用される。このような因子を進化させるための一般的プロトコールは以下のとおりである：
標的細胞は、SV40ラージＴ抗原、SV40複製起点、およびGFPのようなレポーター遺伝子を含むベクター上にクローニングされたGFPでトランスフェクトされる；関連する形式は、制限された量のSV40ラージＴ抗原発現ベクター、およびSV40起点含有プラスミド上にクローニングされたGFPのような過剰のレポーターでの同時トランスフェクションである。代表的には、一時的な発現の１〜10日後、最も明るい細胞がFACSによって精製される。SV40ラージＴ抗原変異体が、PCRによって回収され、そして変異誘発に供される。このサイクルが、所望のレベルの改良が達成されるまで繰り返される。
Ｉ．自己分泌（autocrin）選択
いくつかの実施態様において、変異体タンパク質は、変異体タンパク質を発現する細胞上での自己分泌様式において生物学的効果を発揮するそれらの能力に基づいて選択またはスクリーニングされる。例えば、αインターフェロン遺伝子のライブラリーが、以下のようなより強力なまたはより特異的な抗ウイルス活性の誘導について選択され得る。インターフェロンα変異体のライブラリーは、発現の誘導（すなわち、メタロチオネインプロモーターの制御下）およびウェルあたり１つまたは数個の独立のクローンを有するマルチウェル（例えば、96ウェル）形式での十分な分泌が可能であるベクター中で生成される。いくつかの実施態様において、プロモーターは、非誘導性であり、そして構成性であり得る。
クローン化されたインターフェロン遺伝子の発現が誘導される。細胞は、当業者が最適化されたインターフェロン（例えば、小胞性口内炎ウイルス、またはHIV）を進化させることを所望する細胞傷害性ウイルスが要求される。生存している細胞が回収される。クローニングされたインターフェロン遺伝子は、PCR増幅によって回収され、RSRに供され、そしてトランスフェクションベクターに戻されてクローニングされ、そして宿主細胞に再トランスフェクトされる。これらの工程は、所望のレベルの抗ウイルス活性が進化されるまで繰り返される。
いくつかの実施態様において、目的のウイルスは強力には細胞毒性ではない。この場合、条件的に致死性の遺伝子（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）が、ウイルス中にクローニングされ、そしてウイルスでの要求および回収された後に、条件的に致死性の選択的条件が、ウイルスに感染した細胞を死滅させるために適用される。条件的に致死性の遺伝子の一例は、ヘルペスTKであり、これは、チミジンアナログアシクロビルでの、この遺伝子を発現する細胞の処置の際に致死性になる。いくつかの実施態様において、クローニングされたインターフェロンの抗増殖活性は、分裂する細胞を殺傷する試薬（例えば、DNAアルキル化試薬）で細胞を処理することによって選択される。
いくつかの実施態様において、強力なサイトカインが、GFPまたは別のレポーターをサイトカインによって誘導されるプロモーター（例えば、進化させられたαインターフェロンの改変体によって誘導されるMHCクラスIプロモーター）の制御下に有する細胞中でのサイトカインのライブラリーを発現および分泌させることによって選択される。このシグナル伝達経路は、進化させられる野生型サイトカインが弱いが検出可能なシグナルを生じるように構成される。
Ｊ．改良された血清安定性および循環の半減期
本発明のいくつかの実施態様において、タンパク質は、血清中での改良された循環の半減期または安定性を有するように、RSRによって進化させられる。半減期を改良するための好ましい方法は、長く生存する血清タンパク質（例えば、抗体、または他の豊富な血清タンパク質）に対する目的のタンパク質の親和性を進化させることである。抗体に対する親和性が血清の半減期を増強し得る方法の例として、血清の半減期およびヒト組換えIL2の抗腫瘍活性を増大するIL2および抗IL2抗体の同時投与が挙げられる（Courtneyら、Immunopharmacology 28：223-232（1994））。
８個の最も豊富なヒト血清タンパク質は、血清アルブミン、イムノグロブリン、リポタンパク質、ハプトグロビン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、α-１抗トリプシン、およびα-２マクログロブリンである（Doolittle、第６章、The Plasma Protein、F. Putnam編；Academic Press、1984）。これらおよび他の豊富な血清タンパク質（例えば、セルロプラスミンおよびフィブロネクチン）は、半減期を増大させる目的のために表１におけるような治療用タンパク質上の結合部位を進化させる主要な標的である。抗体の場合、好ましいストラテジーは、関連する標的エピトープの濃度における個体変動を最小にするために、可変領域よりもむしろ定常領域に対する親和性を進化させることである（異なる個体間の抗体Ｖ領域の使用法は有意に可変である）。
所望の親和性の結合部位は、ファージディスプレイ、目的のタンパク質のプラスミドディスプレイまたはポリソームディスプレイ選択についてペプチドを適用することによって進化させられる。多様性の供給源として、存在する結合部位をランダムに変異誘発し得るか、またはそうでなければ、標的タンパク質の規定された領域をランダムに変異誘発し得、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部にペプチドライブラリーを機能的に非破壊的なループとして付加し得るか、または相同遺伝子の「ファミリーシャフリング」を使用し得る。DNAシャフリングは、HSAに対する親和性を改良しながら生物学的活性を維持することのような２つ以上の「無関係の」特性を同時に最適化することが必要とされる課題について特に有利である。
本発明の他の実施態様において、半減期は、PEG、他のポリマー結合体、または半減期を増大する化学的部分での誘導体化によって改良される。これらは、治療用タンパク質の半減期を増大させるための確立された方法である（R. Duncan、Clin. Pharmacokinet. 27：290-306（1994）；Smithら、TIBTECH 11 397-403（1993））。そしてこれは、免疫原性を低下させる利点を付与する（R. Duncan、Clin. Pharmacokinet. 27：290-306（1994））。しかし、誘導体化はまた、そのレセプターまたはリガンドに対する治療用タンパク質の親和性を減少させ得る。RSRは、半減期を拡大する化学的部分との化学的または酵素的結合体のためにリジンまたは他の適切な残基で置換され得る一次配列中の別の配列を発見するために使用され、そしてこれは、生物学的活性を最大に維持しているタンパク質を生じる。
好ましいストラテジーは、ディスプレイ形式でタンパク質の変異体のライブラリーを発現すること、ディスプレイ系を生物学的に不活化しない化学を使用して目的の試薬（すなわち、PEG）でライブラリーを誘導体化すること、同種レセプターに対する親和性に基づいて選択すること、選択された変異体をコードする遺伝子をPCR増幅すること、シャフリングすること、再構築すること、ディスプレイ形式中に再クローニングすること、ならびに改変後に所望の活性を有する変異体が得られるまで繰り返すことである。別の形式は、高処理量形式で変異体を発現、精製、および誘導体化すること、最適化された活性を有する変異体をスクリーニングすること、対応する遺伝子を回収すること、RSRに遺伝子を供すること、そして繰り返すことである。
本発明のさらなる実施態様において、目的の特定の組織に局在する標的ヒトタンパク質の結合部位は、RSRによって進化させられる。例えば、インターフェロンは、肝臓表面メンタンパク質（例えば、肝細胞増殖因子レセプター）についての結合部位を含むように進化させられ得、その結果、インターフェロンは肝細胞上に選択的に分配され、そして肝細胞においてより高い特異的抗ウイルス活性を有する。このような進化したインターフェロンは、肝炎の処置に有用である。同様に、血流に対して所定のタンパク質を局在させるように、ABO血液抗原のような赤血球上の豊富なエピトープに対する親和性を改良し得る。
本発明のさらなる実施態様において、目的のタンパク質は、プロテアーゼに対して増大した安定性を有するように進化させられる。例えば、IL2の臨床的な用途は、高用量の投与の必要性に関連する深刻な副作用によって制限される。高用量は、短い半減期（３〜５分、Lotzeら、JAMA 256（22）：3117-3124（1986））に起因して必要とされ、そして結果として、治療レベルのIL2を維持するために高用量が必要となる。治療用タンパク質の短い半減期に寄与する因子の１つが、血清プロテアーゼによるタンパク質分解である。カテプシンＤ（主要な腎臓の酸性プロテアーゼ）は、Balb/cマウスにおけるIL2の分解の原因である（Ohnishiら、Cancer Res. 50：1107-1112（1990））。さらに、Obnishiは、Balb/cマウスのペプスタチン（このプロテアーゼの強力なインヒビター）での処置が組換えヒトIL2の半減期を延長し、そしてこのマウスモデルにおけるリンホカイン活性化キラー細胞活性が増大することを示した。
従って、IL2のプロテアーゼ耐性改変体の進化、または血清もしくは腎臓のプロテアーゼに対して耐性である表1に列挙されたタンパク質の任意のものの進化が、延長された血清半減期を有する改変体を得るための好ましいストラテジーである。
好ましいプロトコールは以下のとおりである。目的の変異誘発されたタンパク質のライブラリーは、遺伝子−遠位エピトープタグ（すなわち、プロテアーゼによって切断される場合、エピトープタグが欠失するようにファージディスプレイ構築物のＮ末端上）を有するディスプレーシステムで発現される。発現されたタンパク質は、規定されたプロテアーゼで、または全ヒト血清のような複合混液で処理される。遺伝子遠位タグに対する抗体を用いる親和性選択が好ましい。生物学的機能（例えば、同種レセプターへの結合）を必要とする第２回目のスクリーニングまたは選択が好ましい。エピトープタグを保持している（および、それによってプロテアーゼ耐性である）ファージが回収され、そしてRSRに供される。このプロセスは、所望のレベルの耐性が達成されるまで繰り返される。
他の実施態様において、この手順は、変異体プロテアーゼが発現され、そして高処理量形式で精製されるスクリーニング形式で行われる。そして生物学的活性の維持を有するプロテアーゼ耐性についてスクリーニングされる。
本発明のさらなる実施態様において、目的のタンパク質は、増大された半減期を有するように進化させられる。目的のタンパク質をコードする変異誘発された核酸配列のライブラリーが、ディスプレイ形式または高処理量発現形式で発現され、そして必要とされる安定性（熱、金属イオン、非生理学的pH（例えば、＜６または＞８）、凍結乾燥、凍結融解）を進化させる条件に対して種々の時間の長さに曝される。遺伝子は、機能的に生存しているものから、例えば、PCRによって回収される。DNAは、変異誘発（例えば、RSR）に供され、そしてこのプロセスが、所望のレベルの改良が達成されるまで繰り返される。
IFNの場合には、改良された半減期を有する組換え体を進化させる機会を示す。このファミリーにおいてアミノ酸多様性の＞1026個の可能性のある組換え体が存在する。これらの組換え体が野生型IFN遺伝子のセグメントから形成されるので、新規のＴ細胞エピトープがこのプロセスによって作製される場合にはあったとしても比較的少ない。高度に活性である分子は、おそらく、天然のインターフェロンに構造的に非常に類似しており、従って、新規のＢ細胞エピトープを、あったとしてもほとんど提示しない。これによって、組換え体の大きなライブラリーを作製する能力が、豊富な血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）に対して親和性を有する組換え体について選択するためのファージパニング能力と組み合わされ得る状況が作られる。長く存在する豊富な血清タンパク質に対する親和性を有するタンパク質は、増強された血清半減期を有することが示されている。従って、HSAのようなタンパク質に対して親和性を有する組換え体について選択するためのファージパニングを使用して、延長された血清半減期を有するIFN組換え体を得られ得る。HSAへの結合またはHSAに対する親和性を生じる変異がIFN活性を除去または実質的に減少するので、強力なIFN活性の保持について対抗スクリーニングしなければならない。ファージのパニングを適用すること、活性スクリーニング、および反復シャフリングによって、標的の血清タンパク質に対して高い活性、および所望のレベルの親和性を有する組換え体が得られ得る。候補のIFNの半減期は、新自己タンパク質としてヒト血清タンパク質を発現するトランスジェニックマウスで試験され得る。
これらのアプローチは、複数の相同なヒト対立遺伝子または非対立遺伝子形態が存在する他のタンパク質について一般化され得る。このアプローチはまた、非対立遺伝子ヒト相同体（例えば、IL2）を含まないタンパク質に適用されるように、さらに一般化される。IL2の遺伝子は、他の哺乳動物（好ましくは、密接に関連した哺乳動物（例えば、霊長類））由来のIL2遺伝子で、シャフリングされる。これらの相同体によって規定される「天然の多様性」の組換えは、ヒトおよびマウス細胞中でシャフリングされたインターフェロンの活性について見られたように、多くの活性な、そして優れた分子を有する非常に高品質のライブラリーを生成することが期待される。
Ｋ．多サブユニット因子の進化させた一本鎖バージョン
上記で議論されるように、本発明のいくつかの実施態様において、RSRによる進化のための基質は、好ましくは、一本鎖構築物である。ホモ多量体タンパク質の構築物上で対称な変異誘発を行う能力は、それらの天然のホモ多量体状態においてタンパク質を受け入れない、このような構築物のさらなる進化のために重要な新規の経路を提供する。詳細には、ホモ多量体中の所定の変異は、同一のサブユニット各々に存在する変化を生じる。しかし、一本鎖構築物においては、ドメインは、互いに独立して変異し得る。
多サブユニットタンパク質の、新規のそして有用な特性を有する一本鎖構築物への転換が、多数のタンパク質について実証されている。最も顕著なものは、抗体重鎖および軽鎖可変ドメインが、単鎖Fvドメイン中に連結されている（Birdら、Science 242：423-426（1988））。そしてこのストラテジーは、改良された熱安定性（Youngら、FEBS Lett 377：135-139（1995））、またはタンパク質分解に対する感受性（Solarら、Plot. Eng. 8：717-723（1995））を有する抗体を生じた。ホモ二量体であるIL5の機能的な一本鎖バージョンが構築され、野生型タンパク質のレセプターに類似のIL5レセプターに対して親和性を有することが示されている。そしてこの構築物は、二量体の非対称な変異誘発を行うために使用されている（Liら、J. Biol. Chem. 271：1817-1820（1996））。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の一本鎖バージョンが作製されており、そして、一本鎖構築物が天然のホモ二量体よりもプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１型に対してより耐性であることが示されている（Higaziら、Blood 87：3545-3549（1996））。最終的に、一本鎖のインシュリン様成長因子I／インシュリンハイブリッドが構築されており、そしてこれは、天然のリガンドのいずれかのものよりも、キメラインシュリン／IGF-1レセプターに対してより高い親和性を有することが示されている（Kristensenら、Biochem. J. 305：981-986（1995））。
一般に、目的のタンパク質の１つのサブユニットのアミノ末端を、複合体中の別のサブユニットのカルボキシル末端に連結するリンカーが、構築される。これらの融合タンパク質は、ホモ二量体、ホモ多量体、ヘテロ二量体、または高次のヘテロ多量体の連結されたバージョンから構成され得る。最も単純な場合には、連結される天然の末端の間にポリペプチドリンカーが付加され、２つの有意な改変が作製され得る。第1に、活性な融合タンパク質の構築を容易にするために、連結部内およびその周辺、ならびにリンカー中に、野生型配列の改変の多様なライブラリーを構築し得る。第２に、Zhangら（Biochemistry 32：12311-12318（1993））は、T4リゾチームの環状の置換体を記載している。ここでは、天然のアミノ末端およびカルボキシル末端が連結されており、そして新規のアミノ末端およびカルボキシル末端がこのタンパク質中に操作されている。環状の置換、リンカーのライブラリー、およびリンカーに隣接する連結部配列のライブラリーの方法によって、位相学的な連結ストラテジーおよび一次配列において多様であるライブラリーを構築することが可能である。これらのライブラリーが発現され、そして活性について選択される。スクリーニングまたは選択のための任意の上記のストラテジーが，ほとんどの場合に好ましいファージディスプレイとともに使用され得る。活性な融合タンパク質をコードする遺伝子が回収され、変異誘発され、再選択され、そしてそれらの機能を最適化するための標準的なRSRプロトコールに供される。好ましくは、選択された変異体一本鎖構築物の集団は、２つの異なるPCR反応においてPCR増幅され、その結果、２つのドメインのそれぞれが、別々に増幅される。オリゴヌクレオチドは、遺伝子の5’および3’末端に由来し、そしてリンカーの両方の鎖に由来する。別々に増幅されたドメインは、別々の反応においてシャフリングされ、次いで、２つの集団が、選択および進化のさらなる回のために完全な一本鎖の構築物を生成するためにPCR再構築を使用して組換えられる。
Ｖ．薬学的タンパク質の改良された特性
Ａ．目的のレセプターまたは細胞型の進化された特異性
表１に列挙されるタンパク質の大部分は、薬学的目的のレセプターまたはリガンドのいずれかである。ケモカインまたはインターロイキンのような多くのアゴニストが、１つを越えるレセプターをアゴナイズする。改良された特異性を有する進化した変異体は、特定の副作用プロフィールに関係するレセプターに対する活性をそれらが欠失していることに起因して、減少した副作用を有し得る。これらのリガンド／レセプターのほとんどについて、改良された親和性を有する変異体形態は、改良された薬学的特性を有する。例えば、CCR5もしくはCXCR4、または両方に対して改良された親和性を有するRANTESのアンタゴニスト形態は、薬物の所定の用量についてより大きいレセプター占有を達成するので、HIV感染の改良されたインヒビターであるはずである。RSRと組み合わせて上記に概説される選択およびスクリーニングを使用して、表１に列挙される任意のタンパク質の親和性および特異性が改良され得る。例えば、哺乳動物ディスプレイ形式は、TNFに対して改良された親和性を有するTNFレセプターを進化させるために使用され得る。
他の例として、腫瘍細胞の増殖を阻止するが、NK細胞を刺激しない進化されたインターフェロンα改変体、低親和性IL2レセプター複合体を刺激するが、高親和性レセプターは刺激しない（またはその逆）IL2改変体、野生型タンパク質によって認識されるＶβタンパク質のサブセット（好ましくは、単一のＶβ）のみを刺激するスーパー抗原、目的のレセプターのみを特異的にアンタゴナイズするケモカインのアンタゴニスト形態、減少した交差反応性を有する抗体、および特定のレセプター複合体を特異的に活性化するキメラ因子が挙げられる。この後者の場合の一例として、IL2レセプターα、β、およびγ鎖にもまた結合し得る、IL2とIL4、7、9、または15との間のキメラを作製し得（Thezeら、Imm. Today 17：481-486（1996））、そして単球上の中間体親和性IL2レセプター複合体への結合を保持しているが活性化Ｔ細胞上の高親和性IL2α、β、γレセプター複合体に対して減少した親和性を有するキメラを選択し得る。
Ｂ．増加した力価を有する進化したアゴニスト
本発明のいくつかの実施態様において、好ましいストラテジーは、RSRと組み合わせた、上記の細胞全体形式を使用する、増加したアゴニスト活性を有する変異体の選択またはスクリーニングである。例えば、IL3の変異体のライブラリーは、Gramら（J. Immun. Meth. 161：169-176（1993））によって記載されるように、ファージまたはファージミド上で活性な形態で発現される。プラーク精製されたファージでの感染から得られるクローンの溶解物は、96ウェルマイクロタイター形式のような高処理量形式で調製される。GFPのようなレポーター遺伝子を発現するIL3依存性細胞株は、高処理量96ウェル中においてファージストックで刺激される。ファージ上清の最も高い希釈で陽性のシグナルを生じるファージが回収される；あるいは、変異体IL3をコードするDNAがPCRによって回収され得る。いくつかの実施態様において、IL3応答性プロモーターの制御下でGFPを発現する単一の細胞が、IL3ファージミドライブラリーで刺激され得、そして陽性の細胞がFACSで分類される。次いで、回収された核酸はPCRに供され、そして所望のレベルの改良が得られるまでこのプロセスが繰り返された。
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Ｃ．真核生物シグナル伝達または転写経路の成分の進化
上記に列挙されるスクリーニングおよび選択を使用して、RSRは、真核生物のシグナル伝達または転写経路を改変するためのいくつかの方法において使用され得る。目的のシグナル伝達経路の任意の成分、または調節領域ならびにこの領域および転写を誘導する化学物質と相互作用する転写活性化因子の任意の成分が、進化され得る。これによって、転写が天然の誘導因子によって、または通常の誘導物質のアナログによってより強力に活性化される調節系が生成される。この技術は、生物工学的目的の様々なアッセイを開発および最適化するために好ましい。例えば、多数の７回膜貫通型レセプター（7-TM）は、薬物の発見に有効と認められた標的である（例えば、Siderovskiら、Curr Biol. 6（2）：211-212（1996）；Anら、FEBS Lett.、375（1-2）：121-124（1995）；Raportら、Gene、163（2）：295-299（1995）；Songら、Genomics、28（2）：347-349（1995）；Straderら、FASEB J. 9（9）：745-754（1995）；Benkaら、FEBS Lett.、363（1-2）：49-52（1995）；Spiegel、J. Clin Endocrinol. Metab.、81（7）；2434-2442（1996）；Postら、FASEB J. 10（7）：741-749（1996）；Reisineら、Ann NY Acad. Sci. 780：168-175（1996）；Spiegel、Annu. Ref. Physiol.、58：143-170（1996）；Barakら、Biochemistry、34（47）：15407-15414（1995）；およびShenker、Baillieres Clin. Endocrinol. Metab.、9（3）：427-451（1995）を参照のこと）。これらのレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストについての好感度高処理量アッセイの開発は、このようなリガンドを発見することにおける組み合わせ化学の全ての可能性を利用するために不可欠である。さらに、種々の化学物質のためのバイオディテクター（biodetector）またはバイオセンサー（biosensor）が、目的の新規の化学物質またはタンパク質に対してアゴニスト的に応答するように7-TMを進化させることによって開発され得る。この場合、選択は、検出される新規の化学物質またはポリペプチドによって活性化される構築物についてである。スクリーニングは蛍光または光活性化された細胞を分別することを用いて、単純に行われ得る。なぜなら、所望の改良は、光の産生に結び付けられるからである。
薬学的薬物および環境汚染物質のような低分子の検出に加えて、レセプターが存在する任意の化学物質、またはレセプターが循環配列組換えによって進化させられ得る任意の化学物質（例えば、ホルモン、成長因子、金属、および薬物）に応答するバイオセンサーが、開発され得る。レセプターは、転写の細胞内および直接の活性化因子であり得、またそれらはシグナルの転写を間接的に（例えば、リン酸化カスケードにより）活性化する膜結合型レセプターであり得る。これらはまた、転写の際には全く作用しないかもしれないが、シグナル生成経路の成分のいくつかの転写後修飾によってシグナルを産生し得る。これらのレセプターはまた、異なるリガンドの結合に応答する融合ドメインを、異なるシグナル伝達ドメインと融合することによって生成され得る。再度、循環配列組換えが、キメラレセプターの発現および作用を最適化するため、ならびにレセプターによって検出される化学物質の特異性を変化させるために生成されるシグナルの振幅を増大させるために使用され得る。
例えば、Ｇタンパク質は、哺乳動物7-TMレセプターを酵母のシグナル伝達経路に効率的に結合させるために進化させられ得る。現在、哺乳動物中の既知のＧαタンパク質遺伝子座が23個存在し、これらは、配列および機能的な類似性によって４つの群（Gs（Gna、Gna1）、Gi（Gnai-2、Gnai-3、Gnai-1、Gnao、Gnat-1、Gnat-2、Gnaz）、Gq（Gnaq、Gna-11、Gna-14、Gna-15）、およびG12（Gna-12、Gna-13））に分類され得る（B. Nurnbergら、J. Mol. Med.、73：123-132（1995））。これらは、リガンド結合レセプターと下流のエフェクター（例えば、酵素およびイオンチャンネル）との間の可逆的な機能的カップリングを可能にする内因性のGTP-ase活性を所有する。Ｇαタンパク質は、それらのコグネイト7-TMレセプター（単数または複数）と同様に、ＧβおよびＧγタンパク質と非共有的に複合体形成する。レセプターおよびシグナル特異性は、Ｇαサブユニット、Ｇβサブユニット（存在する５つの既知の遺伝子座のうち）、およびＧγサブユニット（７つの既知の遺伝子座）の特定の組合せによって制御される。リガンド結合レセプターによるヘテロ三量体複合体の活性化は、Ｇα単量体およびＧβ、γ二量体への複合体の解離を生じ、これは次いで、下流のエフェクタータンパク質との会合によってシグナルを伝達する。Ｇαサブユニットは、7-TMと接触するサブユニットであると考えられており、従って、これは、哺乳動物7-TMから酵母の下流の遺伝子にシグナルを伝達し得るキメラまたは進化したＧαサブユニット進化についての焦点である。
哺乳動物のレセプターの酵母に基づくバイオアッセイは、新規のリガンドの発見を非常に容易にする。Kangら（Mol. Cell Biol. 10：2582-2590（1990））は、哺乳動物およびハイブリッド酵母／哺乳動物Ｇαタンパク質による、SCG1（GPA1）（哺乳動物細胞中でのシグナル伝達に関連するＧタンパク質のαサブユニットの相同体）に変異を保有する酵母株の部分的な相補を記載している。これらのハイブリッドは、部分的な機能（例えば、scg1株における増殖の欠損の相補）を有するが、接合はできず、従って、フェロモンのシグナル伝達経路での機能を完全には相補しない。Priceら（Mol. Cell Biol. 15：6188-6195（1995））は、酵母中でラットのソマトスタチンレセプターサブタイプ２（SSTR2）を発現させ、そしてこの7-TMレセプターによるリガンド結合シグナルの、酵母およびキメラ哺乳動物／酵母ＧαサブユニットからHIS3レポーター遺伝子を介した、そうでなければHIS3（-）細胞がヒスチジンを欠失している最少培地上で増殖することを可能にするフェロモン応答性プロモーターFUS-1の制御下での、伝達（「カップリング」）を実証した。
このような株は、哺乳動物レセプターについてレポーター株として有用であるが、Kangらの研究によって説明されるような重要な制限を受ける。ここで、酵母フェロモンレセプターから哺乳動物Ｇタンパク質へのシグナルの伝達はブロックされるようである。一般に、哺乳動物7-TMレセプターを酵母シグナル伝達経路に結合させるために、哺乳動物レセプターを、酵母、哺乳動物、またはキメラＧαタンパク質に結合させ、次いでこれらは、FUS-1のようなフェロモン応答性プロモーターの発現を誘導する経路の下流の成分と生産的に相互作用する。このような機能的な再構築は、一般的に「カップリング」と呼ばれる。
本明細書中に記載される方法は、哺乳動物7-TMレセプターの酵母シグナル伝達経路へのカップリングを進化させるために使用され得る。代表的なアプローチは、以下のとおりである：（１）Priceによって記載される経路に類似の改変されたフェロモン応答経路を有する酵母株（例えば、Ｇ1サイクリンのネガティブレギュレーターであるFAR1が欠損している株、およびフェロモンの存在に対して過敏である細胞を生じるSST2が欠損している株）中への目的の7-TMのクローニング、（２）GPA1もしくは相同な酵母Ｇαタンパク質と相互作用することが知られ、または、考えられる哺乳動物Ｇαタンパク質（単数または複数）間キメラのライブラリーの構築、（３）フェロモン応答性プロモーターFUS1（Priceら、Mol. Cell Biol. 15：6188-6195（1995））の制御下にあるHIS3のような選択可能なレポーター遺伝子の配置。あるいは、選択可能な遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）がFUS1プロモーターの制御下に配置され得る；（４）株（３）（HIS（-））へのライブラリー（２）の形質転換、（５）目的のリガンドに応答するレポーターの発現についてのスクリーニングまたは選択（例えば、HIS3発現を必要とするリガンドの存在下最少プレート上で形質転換体のライブラリーを増殖させることによる）、（６）選択された細胞の回収、およびフェロモン応答性プロモーターFUS1の制御下にあるレポーターの改良された発現を進化させるためのRSRの適用。
目的のシグナル伝達経路について最適化されたレポーター構築物を有する株を進化させることにおける、第２の重要な要件は、シグナル対ノイズ比（誘導条件対非誘導条件下での遺伝子発現の比）を最適化することである。多くの7-TM経路は漏出性（leaky）であり、その結果、代表的なレポーター遺伝子の最大誘導は、バックグラウンドの５〜10倍である。シグナル対ノイズ比のこの範囲は、多くの高処理量アッセイにおいてわずかな効果を検出するには不充分であり得る。従って、誘導されていない状態で活性化の閾値未満であるが、それに近くなるように調整されている、第２の非線型増幅システムに、7-TM経路を結合させることが重要である。非線型増幅システムの一例は、λPLプロモーターによって駆動される遺伝子の発現である。clプロモーター中の３つの近接した部位で結合したλリプレッサー間の複雑合共動性相互作用は、リプレッサーの特定の濃度以上できわめて十分な抑制を生じる。臨界閾値未満では、劇的な誘導が観察され、そして、リプレッサー濃度におけるわずかな減少が遺伝子発現における大きな増大を導く範囲（window）が存在する（Ptashne、A Genetic Switch：Phage Lambda and Higher Organisms、Blackwell Scientific Publ. Cambridge、MA、1992）。類似の影響が、GAL4によって調節されるプロモーターのような、いくつかの真核生物プロモーターについて観察される。このようなプロモーター（GAL4）に対する転写因子を制限する成分の発現を、GAL4によって増強される7-TM応答性プロモーター制御下に配置することによって、GAL4依存性プロモーターの制御下でもまた、レポーター構築物の発現が非常に大きく変化するように増幅される、7-TM経路シグナルのわずかなレベルの誘導を生じる。
このような結合されたシステムの一例は、FUS-1フェロモン応答性プロモーターの制御下にGAL4を配置すること、およびFUS-1プロモーターの上流にGAL4結合部位を配置することによってそれ自体にポジティブにフィードバックする細胞内GAL4（それ自体が転写のエンハンサーである）のレベルを有することである。レポーター遺伝子はまた、GAL4活性化プロモーターの制御下に置かれる。このシステムは、GAL4の発現が非線型の自己増幅であり、そして細胞内で特定の閾値に到達する際にルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子の発現を同時に増幅するように設計されている。RSRは、所望のシグナル特性を有してレポーター構築物を進化させるために、以下のように非常に有利に使用され得る：（１）GAL4／フェロモン経路調節GAL4遺伝子およびGAL4によって調節されるレポーター遺伝子の両方を含む、単一のプラスミド構築物が構築される。（２）この構築物は変異誘発され、そして7-TMおよび目的のキメラ酵母／哺乳動物タンパク質を発現する適切に操作された酵母核に形質転換される。（３）細胞はアゴニストで刺激され、そしてレポーター遺伝子の活性に基づいてスクリーニング（または選択）される。好ましい形式において、ルシフェラーゼはレポーター遺伝子であり、そして、アゴニストを用いた刺激の前後で活性が定量され、従って、各コロニーについてのシグナル対ノイズ比の定量的測定を可能にする。（４）改良されたレポーター特性を有する細胞が回収され、構築物がシャフルされ、そしてRSRが、ノイズ特性に対して最適なシグナルを生じるプラスミドをさらに改良するために適用される。
これらのアプローチは一般的であり、そしてシグナル伝達経路の任意の成分または転写因子が、上記のようなRSR、ならびにスクリーニングおよび選択を用いて進化させられ得る方法を説明する。例えば、これらの特異的な方法は、新規のリガンドに対する特異性、新規のリガンドに対する核レセプターの特異性（例えば、所定のセットの遺伝子が、所定の化学的薬剤での処置の際に誘導され得るようなトランスジェニック植物中の目的の遺伝子の除草剤または他の低分子誘導性発現を得るため）、ウイルス因子に応答性である転写因子の特異性（このように誘導された細胞中の抗ウイルス遺伝子または致死遺伝子はこの転写因子を発現（トランスジェニック体または遺伝子治療構築物で処置された細胞））、あるいは、ガン細胞中の活性に対する転写因子の特異性（例えば、p53欠損細胞、従って、腫瘍特異的様式で条件的に致死遺伝子を発現する遺伝子治療構築物で感染することを可能にする）を有する7-TMレセプターを改良するために使用され得る。
以下の実施例は、説明のために提供され、制限のために提供されるものではない。
実施例
Ｉ．BIAPの進化
BIAPを進化させるための好ましいストラテジーは以下のとおりである。各オリゴの中心の20塩基が野生型タンパク質を特定するが、縮重コドンを有する野生型タンパク質をコードするように、コドン使用ライブラリーが60merのオリゴヌクレオチドから構築される。好ましくは、選択される原核生物宿主（例えば、E. coli）について非常に稀なコドンは使用されない。オリゴの各末端の20塩基は縮重されていないが、好ましくは、E. coli中のコドンを用いる。オリゴヌクレオチドは上記のように全長の遺伝子に構築される。構築された産物は、当該分野で周知の技術によって発現ベクター中にクローン化される。いくつかの実施態様において、コドン使用ライブラリーは、分泌リーダー配列のライブラリーを用いて発現され、そのそれぞれが、E. coli周辺質にコードされたBIAPタンパク質を指向させる。リーダー配列のライブラリーは、リーダー配列と変異体との組合せを最適化するために使用される。リーダー配列の例は、Schatzら（Ann Rev. Genet. 24：215-248（1990））に概説されている。クローニングされたBIAP遺伝子は、アラビノースプロモーターのような誘導性プロモーターの制御下で発現される。アラビノースで誘導されるコロニーが、BIAPの基質であるブロモクロロインドリルホスフェート（BCIP）を噴霧することによってスクリーニングされる。肉眼で最も青色に見えるコロニーが釣り上げられ、そして本明細書中に記載されるRSR手順に供される。
コドン使用ライブラリーの構築のためのオリゴヌクレオチドが、表IIに列挙される。これらのプロモーターの対応する位置は図１に提供される。
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全てのオリゴヌクレオチドは、5’から3’方向に列挙される。縮重位のコードは、Ｒ：ＡまたはＧ；Ｙ：ＣまたはＴ；Ｈ：ＡまたはＣまたはＴ；Ｄ：ＡまたはＧまたはＴである。
II．哺乳動物表面ディスプレイ
免疫応答の間に、抗体は、親和性の成熟化プロセスを自然に受け、それによって、それらのコグネイト抗原に対して改良された親和性を有する変異体抗体を生じる。このプロセスは、クローンの選択と組み合わされた抗体遺伝子の体細胞性超変異によって駆動される（BerekおよびMilstein、Immun. Rev. 96：23-41（1987））。Pattenら（Science 271：1086-1091（1996））は、生殖系統配列からの触媒抗体の進化を再構築した。これは、後天性の９個の体細胞性変異体を有し、そして10ナノモル濃度の親和性で結合する親和性成熟配列に、135マイクロモル濃度の親和性を有してp-ニトロフェニルホスホネートハプテンに結合する。この抗体の親和性成熟化は反復的に発生し得、そしてCDRのカセット変異誘発（または、PCRを用いたようなランダムな変異誘発）、哺乳動物ディスプレイ、改良された結合についてのFACS選択、およびRSRを使用する際に改良された結合をコードする組換え変異体による改良された親和性を迅速に進化させるために改良され得る。
Gascoigneら（Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）84：2936-2940（1987））によって記載されるベクターと同様のゲノム抗体発現シャトルベクターが、変異体Ｖ領域のエキソンのライブラリーがシャトルベクター中に容易にクローニングされ得るように構築される。κ構築物が、ピューロマイシン耐性をコードするプラスミド上にクローン化され、そして重鎖が、ネオマイシン耐性コードベクター上にクローン化される。成熟および生殖系重鎖および軽鎖Ｖ領域をコードする可変領域配列に由来するcDNAは、PCR変異誘発によって、ゲノムシャトルベクター中の適切な位置に配置された相補性SfiI部位を有するSfiI部位に隣接されるゲノムエキソン中に再構築される。VDJエキソンに隣接するイントロンSfiI部位を作製するために使用されるオリゴヌクレオチドは：5’SfiI：5’-TTCCATTTCA TACATGGCCG AAGGGGCCGT GCCATGAGGA TTTT-3’；3’SfiI：5’-TTCTAAATG CATGTTGGCC TCCTTGGCCG GATTCTGAGC CTTCAGGACC A-3’である。標準的なPCR変異誘発プロトコールが、変異体のライブラリーを産生するために適用され、ここで、以下の残基のセット（Kabat、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Dept of Health and Human Services、1991に従って番号付けした）が、NNKコドン（GATC,GATC,GC）に対してランダム化される：
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安定なトランスフェクタント株は、標準的なエレクトロポレーションプロトコールを用いた宿主としてＢ細胞黒色腫AG8-653（J. Kearneyより贈与）を使用して２つの軽鎖および重鎖構築物（成熟および生殖系列）（mature and germline）のそれぞれについて作製する。V-L変異体の示されたライブラリーをコードする変異体プラスミドのライブラリーは、生殖系V-Hを発現する安定な形質転換体にトランスフェクトされる；そしてV-H変異体は、生殖系V-L安定トランスフェクタント株にトランスフェクトされる。両方の場合、ライブラリーは、トランスフェクトされた細胞の大部分が、１つおよび１つのみの変異体プラスミド配列を受容することを確実にするために、プロトプラスト融合（Sambrookら、Molecular Cloning、CSH Press（1987））によって導入される（これは、トランスフェクトされた細胞の大部分が、それぞれ異なる変異体配列を発現する多くのプラスミドを受容するエレクトロポレーションの場合にはそうではない）。
この抗体によって認識されるp-ニトロフェニルホスホネートハプテン（JWJ-1）が、Pattenら（Science 271：1086-1091（1996））によって記載されるように合成される。JWJ-1は、EDAC（March、Advanced Organic Chemistry、第３版、John WileyおよびSons、1985）のような標準的なカップリング化学を使用して、アミド結合の形成によって、5-（（（2-アミノエチル）チオ）アセチル）フルオレセイン（Molecular Probes, Inc.）に直接カップリングされて、単量体のJWJ-1-FITCプローブを生じる。「二量体」結合体（JWJ-1の２つの分子が、FACSマーカーに結合される）が、より高い結合活性プローブを得るために作製され、これによって、FACSによってより容易に検出される低親和性の相互作用（例えば、生殖系抗体との）を作製する。これは、２当量のJWJ-1-FITCの存在下で、抗フルオレセイン抗体に結合されたTexas Redでの染色によって生成される。次いで、IgGの二価の構造が、均質な二価の試薬を提供する。スピンカラムが、抗FITC試薬に結合しない過剰のJWJ-1-FITC分子を除去するために使用される。四価の試薬が、以下のように作製される。1当量のビオチンを２当量のエチレンジアミンにEDACを用いてカップリングさせ、次いで、これをJWJ-1上の遊離のカルボキシレートにカップリングさせる。ビオチン化されたJWJ-1産物は、イオン交換クロマトグラフィーで精製され、そして質量スペクトル分析で特徴付けられる。FITC標識されたアビジンは、四価のプローブを生成するために、ビオチン化されたJWJ-1とともにインキュベートされる。
FACS選択が、Pankaら（Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）85：3080-3084（1988））のプロトコールと類似のプロトコールに従って、以下のように行われる。プロトプラスト融合の方法による変異体抗体遺伝子のライブラリーのトランスフェクション（36〜72時間の回復を伴う）後、細胞は蛍光標識したハプテンとともに氷上でインキュベートされる。インキュベーションは、非特異的バックグラウンドに寄与し得るFITCの結合体の飲作用を最小にするために、氷上で行われる。次いで、細胞は、FACSによって洗浄工程を伴うか、または伴わないで分類される。洗浄工程を伴わないFACSが好ましい。なぜなら、親和性成熟の前の生殖系抗体の消失速度が非常に早いと予想されるからである（＞0.1秒−１；Pattenら、Science 271：1086-1091（1996））；洗浄工程は、複雑な可変性を与える。最も明るい0.1〜10％の細胞が回収される。
４つのパラメーターが、以下の増加した結合の選択を最適化するために操作される：単量体対二量体対四量体ハプテン、染色反応で使用されるハプテンの濃度（低濃度が高親和性のKdについて選択する）、洗浄とFACSとの間の時間（より長い時間が低い消失速度について選択する）、およびゲーティング（gating）における選択性（すなわち、最高0.1％〜10％、より好ましくは、最高0.1％を使用する）。生殖系、成熟、および半生殖系の両方の組み合わせを発現する構築物が、この選択性を最適化するためのコントロールとして使用される。
プラスミドが、Hirt上清でのE. coli宿主の形質転換によってFACS選択された細胞から回収される。あるいは、変異体Ｖ遺伝子エキソンが、FACS選択された細胞からPCR増幅される。回収されたＶ遺伝子エキソンは、RSRに供され、対応するゲノムシャトルベクターに再クローン化され、そしてこの手順が、平均蛍光強度が増加するまで、繰り返して適用される。改良された結合について適切なポジティブコントロールは、親和性成熟48G7エキソンでのトランスフェクションである（Pattenら、前出）。
さらなる実験において、等しい数の生殖系および２つの半生殖系トランスフェクタントのそれぞれが混合される。最も明るい細胞が、上記の条件下で選択される。Ｖ遺伝子はPCRによって回収され、発現ベクター中に再クローニングされ、そして１つのE. coliあたり２つのプラスミドで、続いてプロトプラスト融合によって、またはバルクエレクトロポレーションによってのいずれかで、同時トランスフェクトされる。トランスフェクタントの平均蛍光強度は、生殖系のＶ領域と比較して成熟の増加に起因して増大するはずである。
この方法論は、任意のレセプター−リガンド、または結合パートナー相互作用を進化させるように適用され得る。天然の発現形式が、当業者が天然のまたは新規のリガンドに対する親和性を改良することを望んでいる任意のレセプターの変異体のライブラリーを発現させるために使用され得る。代表的な例は、目的のリガンドのＴ細胞レセプター（すなわち、MHC／腫瘍ペプチド抗原複合体）またはTNFのTNFレセプター（TNFレセプターの可溶性形態がTNF活性を中和するために治療的に使用される）の親和性の改良である
この形式はまた、Wettsteinら（J. Exp. Med. 174：219-28（1991））のストラテジーと類似のストラテジーによって操作された膜アンカーを用いる膜結合形態でリガンドを発現させることによってリガンドの変異体形態を選択するために使用され得る。次いで、FACS選択が、蛍光標識されたレセプターを用いて行われる。この形式において、当業者は、例えば、天然に存在するレセプターアンタゴニスト（例えば、IL1レセプターアンタゴニスト）から改良されたレセプターアンタゴニストを進化させ得る。これらの同種レセプターに対して改良された親和性を有するアゴニストの変異体形態もまた、この形式で進化させられ得る。これらの変異体は、IL3の報告されたアンタゴニスト変異体形態に類似の、改良されたアゴニストまたは強力なレセプターアンタゴニストの候補である。
III．αインターフェロンの進化
18個の既知の非対立遺伝子ヒトインターフェロンα（IFN-α）遺伝子が手近に存在し、高度に関連した（78〜95％同一）一次構造を有し、そして広範な生物学的活性を有する。親の分子とは異なる興味深い生物学的活性を有する多くのハイブリッドインターフェロンが記載されている（HorisbergerおよびDi Marco, Pharm. Ther. 66：507-534（1995）によって概説される）。コンセンサスヒトαインターフェロンIFN-Con1は合成によって構築されており、ここで、14個の既知のIFN-α中の最も共通の残基が各位置に配置されており、そしてこれは、好ましくは、天然に存在するインターフェロンと比較される（Ozesら、J. Interferon Res. 12：55-59（1992））。このIFNは、最も密接に関連するINF-αであるIFN-α2aと比較して、20アミノ酸の変化を含む。IFN-Con1は、抗ウイルス活性、抗増殖活性、およびNK細胞活性において、任意の既知の天然のIFNサブタイプよりも10倍高い特異的抗ウイルス活性を有する。IFN-α Con1は、組換えIFNα-2a（臨床的に使用される主要なINF）よりも10〜20倍高いインビトロでの活性を有する。従って、２つ以上のインターフェロンに由来する最も所望される形質を組み合わせるインターフェロンハイブリッドを産生することに、考慮されるべき目的が存在する。しかし、膨大な数の可能性のあるハイブリッド、およびIFN-αもしくはIFN-αレセプターの結晶構造の欠失を仮定すると、新規のハイブリッドの開発には予想される手詰まりが存在する（HorisbergerおよびDi Marco, Pharm. Ther. 66：507-534（1995））。
IFN-αの生物学的影響は多様であり、そして以下のような特性を含む：抗ウイルス状態の誘導（mRNAの翻訳および分解を停止させる因子の誘導）；細胞増殖の阻害；クラスＩおよびクラスII MHCの誘導；単球およびマクロファージの活性化；ナチュラルキラー細胞の活性化；細胞傷害性Ｔ細胞の活性化；Ｂ細胞中でのIg合成の調節；および発熱物質の活性。
種々のIFN-αサブタイプが、種々の標的細胞に対する活性の特有の範囲、および特有の副作用プロフィールを有する（Ortaldoら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）81：4926-4929（1984）；Overallら、J. Interferon Res. 12：281-288（1992）；FishおよびStebbing、Biochem. Biophys. Res. Comm. 112：537-546（1983）；Weckら、J. Gen. Virol. 57：233-237（1981））。例えば、ヒトIFNαは、非常に穏やかな副作用を有するが、比較的低い抗ウイルス活性を有する。ヒトIFNα8は非常に高い抗ウイルス活性を有するが、比較的重篤な副作用を有する。ヒトIFNα7はNK活性を欠失しており、そして他のIFNαのものによるNKの刺激をブロックする。ヒトIFN-αJはNK細胞を刺激する能力を欠失しているが、これは、NK細胞状のIFN-αレセプターに結合し得、そしてIFN-αAの刺激活性をブロックする（Langerら、J. Interferon Res. 6：97-105（1986））。
インターフェロンの治療適用は、インフルエンザ様の症状、疲労、幻覚を含む神経学的障害、発熱、肝臓酵素の増大、および白血球減少症を含む、多様なおよび重篤な副作用プロフィールによって制限される。IFN-αの影響の多様性は、それらが１つより多いレセプターまたはIFN-αファミリーの多成分レセプターが存在し得るという仮説を奨励している（R. Huら、J. Biol. Chem. 268：12591-12595（1993））。従って、IFN-αレセプターの複雑さ、および活性を伴う、ヒトαIFN中の豊富な天然に存在する多様性の存在（および従って、組換え体の大きな配列空間）は、優れたハイブリッドの構築物の機会を与える。
Ａ．配列空間の複雑さ
図２は、11個のヒトIFN-αのタンパク質配列を示す。コンセンサスからの差異が示される。縮重コドンが多様性のすべてを捕捉し得るこれらの部位が、星印で示される。アラインメントされた配列の考察によって、この群のαインターフェロン遺伝子によってコードされる２つの可能性のあるアミノ酸を有する57部位、３つの可能性のあるアミノ酸を有する15部位、４つの可能性のあるアミノ酸を有する４部位が存在することを明らかにする。従って、この天然に存在する多様性の全ての順列においてコードされる可能性のある多様性は：257×315×44＝5.3×1026である。11個のインターフェロン遺伝子中の全175部位の全てに広がる76の多形性のこれらのハイブリッドのうち、175個のうちの171個の変化が、対応する部位での単一の縮重コドンを使用して相同ライブラリー中に取り込まれ得る。例えば、Arg、Trp、およびGlyは全て、縮重コドン（A,T,G）GGによってコードされる。このようなストラテジーを使用して、1.3×1025個のハイブリッドが縮重オリゴヌクレオチドの単一のセットで捕捉され得る。表IIIからVIから明らかなように、27個のオリゴヌクレオチドが、全11のヒトαインターフェロンをシャフリングするために十分である。これによって、実質的に全ての天然の多様性がコードされ、そして表Ｖの９個の「ブロック」オリゴヌクレオチド中の縮重によって完全に置換される。
Ｂ．相同体配列空間の「粗粒（Coarse Grain）」検索の特性
IFNαのモデル化された構造（Kontsek, Acta Vir. 38：345-360（1994））は、単一のユニットとして二次構造エレメントを維持する基準、および高度に同一な領域のセグメント境界の配置／配置の選択の基準の組み合わせに基づいて、９個のセグメントに分けられている。従って、当業者は、穏やかな縮重オリゴヌクレオチドの単一のセットを有する全ファミリーを捕捉し得る。表IIIおよび図２は、それぞれタンパク質およびDNAレベルで、これらの境界の正確な位置を与える。この特定のセグメント化スキームが任意であり、そして他のセグメント化スキームもまた追求され得ることが、強調されるべきである。一般的なストラテジーは、ファミリーメンバー間で高く同一な領域での組換え境界の配置、またはセグメントの構造を破壊する任意の特定のアルゴリズムには依存しない。
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多くのIFNがいくつかのセグメントにわたって同一であり、従って、11より少ない異なる各セグメントの「対立遺伝子」が存在する。従って、セグメント「対立遺伝子」の順列からなるライブラリーは、2.1×107（５つのセグメント＃１倍の複雑さ×10個のセグメント＃２の複雑さ×．．．．×９個のセグメント＃９）の可能性のある複雑さを有する。これは、記載されるスクリーニング手順のほとんどで試験され得るよりもはるかに多く、従って、これは、配列空間の研究のためのRSRの使用のための良好な課題である。
Ｃ．IFN-α相同体配列空間の検索のためのRSRの使用についての詳細なストラテジー
オリゴによって誘導されるシャフリング（すなわち、架橋オリゴヌクレオチド）について本明細書中で記載される方法は、インターフェロンαハイブリッドのライブラリーを構築するために使用され、そして上記に記載される一般的な方法が、改良された機能についてこれらの変異体をスクリーニングまたは選択するために使用される。改良されたインターフェロン活性についてのスクリーニングまたは選択のための多数の形式が存在するが、これらの多くは、インターフェロンの特有の特性に基づき、IFNに基づくアッセイの例示的な記載が以下に記載される。
Ｄ．ハイブリッドIFNα配列空間の粗粒検索のためのプロトコール
簡潔には、ライブラリーが構築され、ここで、９個のセグメントの11個の相同体の形態が置換される（多くの場合、２つの相同体が所定のセグメントにわたって同一であることに留意すること）。全ての９個のセグメントが表IVに列挙される18個のオリゴヌクレオチドを用いて全ての11個のIFNα遺伝子からPCR増幅され、そしてオリゴによって誘導される組換えを用いて全長の遺伝子の再構築される。ライブラリーに由来する、恣意的な数（例えば、1000個）のクローンが、96ウェル発現／精製形式で調製される。最も強力な抗ウイルス活性を有するハイブリッドがスクリーニングされる。核酸がPCRによって回収され、そして架橋オリゴヌクレオチドを使用する組換えに供される。これらの工程は、所望の特性を有する候補が得られるまで繰り返される。
Ｅ．1026を超える良好な細粒ハイブリッドの空間を試験するためのストラテジー
簡潔には、９個のセグメントのそれぞれが、１つのセグメントあたり１つの縮重オリゴヌクレオチドを用いて合成される。縮重は、任意の非天然の配列を付加することなく単一の縮重コドンで捕捉され得るIFN-αの多様性の全てを捕捉するように選択される。９個のセグメントをコードする縮重オリゴヌクレオチドの第２のセットが生成され、ここで、天然の多様性の全てが捕捉されるが、さらなる非天然の変異体が、遺伝コードの制約によって必然的に伴われる部位に含まれる。ほとんどの場合、多様性の全てが、単一の縮重コドンで捕捉され得る；いくつかの場合には、縮重コドンが、全ての天然の多様性を補足するが、１つの非天然の変異を付加する；いくつかの部位では、１つ以上の非天然の変異を作製する高度な縮重コドン中に配置することなく天然の多様性を捕捉することは、可能ではない。この第２のセットのオリゴヌクレオチドが、より包括的であるということによって第１のセットとは異なるのは、これらの部位で存在する。次いで、９個の合成セグメントのそれぞれが、18個のPCRオリゴヌクレオチドを用いてPCRによって増幅される。オリゴによって誘導される組換え方法を使用する全長の遺伝子が生成され、宿主にトランスフェクトされ、そして所望の特性を有するハイブリッドについてアッセイされる。最良のハイブリッド形態（例えば、最上部の10％、１％、または0.1％；好ましくは、最上部の１％）がRSRに供され、そして所望の特性を有する候補が得られるまでこのプロセスが繰り返される。
Ｆ．「穏やかではない」細粒検索
一方、当業者はライブラリーを作製し得、ここで、各セグメントが相同体の多様性のランダムな置換をコードする縮重合成オリヌクレオチドから誘導される。この場合、最初のライブラリーは、このファミリーの遺伝子をおそらく有する1025個を超える細粒ハイブリッドの空間は非常にまばらに検索される。この検索からポジティブを一緒に交配させることによって進行し得る。しかし、このようなライブラリーの個々のメンバーの間に多数の差異が存在し、そしてその結果、交配プロセスは非常に「穏やか」ではない。なぜなら、比較的多様な遺伝子のプールが、各工程で組み合わされるからである。
Ｇ．「穏やかな」細粒検索
このアプローチをより「穏やか」にするための１つの方法は、候補の開始点を得ること、およびそれらから穏やかに検索することである。この開始点は、天然のIFN-αのいずれか１つ（例えば、IFNα-2a、これは、治療的に最も広範に使用されているIFNαである）、特徴付けられたIFN-Con1コンセンサスインターフェロン、または上記のシャフリングされたIFN-αのスクリーニングからのヒットしたもののいずれかであり得る。開始点が与えられると、別のライブラリがを作製され、ここで、縮重セグメントのライブラリーを１回に１つずつ交配させて始原配列となす。次いで、各ライブラリーに由来する改良されたヒットは、分子を通じて全体にの変異が穏やかに形成されるように互いに交配される。
Ｈ．機能的細胞アッセイ
当該分野で周知の以下のアッセイが、IFNα変異体をスクリーニングするために使用される：ウイルス殺傷の阻害；30〜50％の標準誤差；プラーク形成単位の阻害；非常に少ない標準誤差（少ない影響を測定し得る）；減少したウイルス収量（致死的ではない非プラーク形勢ウイルスに有用）；細胞増殖の阻害（3H-チミジン取り込みアッセイ）；腫瘍細胞を殺傷するNK細胞の活性化；ヒト腫瘍を植えられたヌードマウスに投与されたヒトINFによる腫瘍形成の抑制（例えば、皮膚の腫瘍）。
これらのアッセイのほとんどは、高処理量スクリーニングに受け入れられる。組換えIFNα変異体のライブラリーが発現され、そして抗IFN抗体、またはエピトープタグおよびアフィニティー樹脂を使用する96ウェル形式での発現、溶解、および精製のような高処理量形式で精製される。精製されたIFN調製物が、高処理量形式でスクリーニングされ、評価され、そして目的の最も高い活性をコードする変異体がさらなる変異誘発（例えば、RSR）に供される。そしてこのプロセスが、所望のレベルの活性が得られるまで繰り返される。
Ｉ．ファージディスプレイ
標準的なファージディスプレイ形式が、生物学的に活性なIFNを示すために使用される。キメラIFN遺伝子のライブラリーがこの形式で発現され、そして１つ以上の精製されたIFNレセプター調製物または１つ以上のIFNレセプター発現細胞型への結合（または、結合の減少）について選択（ポジティブまたはネガティブ）される。
Ｊ．IFN-α依存性プロモーターの制御下のGFPまたはルシフェラーゼ
変異体によって発現されるタンパク質は、IFNα応答性プロモーター（例えば、GFPの発現を駆動するMHCクラスＩプロモーター）の制御下でGFPまたはルシフェラーゼを発現するレポーター細胞株について、高処理量形式でスクリーニングされ得る。
Ｋ．インタクトな感染性粒子での標的細胞の刺激
活性なIFNの精製は、上記のアッセイの処理量を制限する。線維状ファージM13上での活性なIFNαの発現によって、数千から数万の変異体が容易に処理され得る形式でIFN変異体の均質な調製物を得ることが可能である。Gramら（J. Imm. Meth. 161：169-176（1993））は、ヒトIL3（IFNαに対して位相類似性したタンパク質折り込みを有するサイトカイン）がM13の表面上で発現され得ること、および得られたファージがIL3依存性細胞株に対して活性なIL3を示し得ることを実証した。同様に、Saggioら（Gene 152：35-39（1995））は、ヒト毛様体神経栄養因子（４ヘリックス束状構造サイトカイン）が、可溶性のサイトカインの濃度と同様の濃度でファージ上で発現された場合に生物学的に活性であることを示した。同様に、M13上でIFNα変異体のライブラリーが発現され得、そして規定された力価のファージストックが、本明細書中に記載される高処理量アッセイおよび選択において生物学的に活性なIFNを示すために使用される。
以下の計算は、IFNαに対するこの技術の適用の実施可能性を支持する。仮定（１）インターフェロンの５個の活性なコピーを有する1×1010ファージ／mlの力価が、１個のファージあたりに示される、および（２）示されたインターフェロンは、可溶性の組換えインターフェロンに対して同等に活性である（これは、多効果に起因してより強力になり得る）、次いで、問題は、生物学的活性を見るために合理的に予想され得るかどうかである。
（1×1010ファージ/ml）×（５個のIFN分子/ファージ）×（１モル/6×1023分子）×（26,000gm/モル）×（109ng/gm）＝2.2ng/ml
生物学的アッセイで使用される濃度の範囲は、以下である：NK活性化について１ng/ml、Eskol細胞上での抗増殖活性について0.1〜10ng/ml、そしてDaudi細胞上で0.1〜１ng/ml（Ozesら、J. Interferon Res. 12：55-59（1992））。いくつかのサブタイプがグリコシル化されるが、インターフェロンα2aおよびコンセンサスインターフェロンは、E. coli中で活性な組換え形態で発現されるので、少なくともこれらの２つは活性のためにグリコシル化を必要としない。従って、繊維状ファージ上で発現されるIFNαは、さらなる濃縮をせずにファージストックとして生物学的に活性であるようである。IFNキメラのライブラリーはファージ示形式で発現され、そして上記のアッセイおよびRSRのさらなる回に供される改良された特性を有する変異体を同定するために以下に記載されるアッセイでスコアされる。
１つのファージが示されたタンパク質の多価状態によって１つの細胞を活性化するために十分である場合（遺伝子III形式でファージあたり５個；遺伝子VIII形式でファージあたり数百個；λ遺伝子Ｖ形式で数十個）、ファージストックは、IFN応答性プロモーターの制御下でGFPレポーター構築物で細胞を刺激するために適切な希釈で直接使用され得る。応答性細胞の刺激、発現、およびFACS精製後にファージが付着したままであると仮定すると、当業者は、非常に大きなライブラリー（FACSの作動あたり107個のファージまで、およびおそらくそれ以上）から改良された活性を有するハイブリッドを直接FACS精製し得る。
FACSがこの形式で有利に使用される第２の方法は、以下のとおりである。細胞は、ウェルあたり１個のファージストック、およびGFP型レポーター構築物を有するマルチウェル形式で刺激され得る。全ての刺激された細胞は、最も明るい細胞を回収するためにFACS精製され、そしてIFN遺伝子が回収され、そしてRSRに供される。そしてこのプロトコールは、所望のレベルのの改良が得られるまで繰り返される。このプロトコールにおいて、刺激は、個々の濃縮された溶解物を用いて行われ、従って、単一のファージが細胞を刺激するために十分であるという要件が満たされる。さらに、当業者は、最も明るい細胞を回収するためにゲートし得、次いで、それらに付着した最も強力なファージを有するはずである。
Ｌ．IFNα変異体の細胞表面示プロトコール
IFNα変異体の細胞表面示のためのサンプルプロトコールは、以下のとおりである。ディスプレイのこの形態は、ファージディスプレイを上回る少なくとも２つの利点を有する。第１に、タンパク質は、真核生物細胞によって示され、従って、いくつかのIFNα（および他の増殖因子）について必要とされ得る適切なグリコシル化形態で発現され得る。第２に、これは非常に多価のディスプレイ形式であり、そして非常に弱く活性な変異体から活性を検出することにおいて好ましい。
簡潔には、変異体IFNのライブラリーが構築され、ここで、ホスホイノシトール末端の付加のためのポリペプチドシグナルがカルボキシル末端に融合されている。従って、表面発現のためのタンパク質を標的化する（Wettsteinら、J. Exp. Med. 174：219-28（1991））。ライブラリーは、マイクロタイター形式で上記のレポーター細胞（ルシフェラーゼレポーター遺伝子）をトランスフェクトするために使用される。陽性は、電荷結合デバイス（CCD）カメラで検出される。核酸は、HIRTおよび宿主の再形質転換、またはPCRのいずれかによって回収され、そしてさらなる進化のためにRSRに供される。
Ｍ．ウイルス耐性についての自己分泌ディスプレイプロトコール
IFNα変異体の自己分泌プロトコールのサンプルプロトコールは、以下のとおりである。簡潔には、IFN変異体のライブラリーが、発現（すなわち、メタロチオネインプロモーター）および十分な分泌の誘導を可能にするベクター中で作製される。IFN応答性レポーターカセット（GFPまたはルシフェラーゼ）を有するレシピエント細胞株が、変異体IFN構築物でのトランスフェクションによって誘導される。IFN応答性プロモーターを刺激する変異体は、FACSまたはCCDカメラによって検出される。
この形式のバリエーションは、ウイルスでトランスフェクタントをチャレンジすること、および生存しているものについて選択することである。当業者は、複数回のウイルスチャレンジを行い得、そして遺伝子の回収の前に各トランスフェクタントのセットを成長させ得る。複数回の殺傷および成長によって、小さい効果の指数的な増幅が可能であり、従って、ウイルスの殺傷における小さい改良を検出することにおける利点を提供する。
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括弧は、これらの部位で特定された塩基の等量の混合物での縮重を示す。縮重の目的は、プライマーのこの１つのセットに同様の効率を有するIFNファミリーの全てのメンバーを感作させることである。組換え点を駆動するオリゴの選択は、交配の各回においてそれらが「上書き」されるので、重要である。従って、複数回の選択にわたって配列の休止を伴って同時には進化させ得ない。
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この表に基づいて、縮重コドンによって全ての多様性が捕捉され得るIFNαにおける多形性部位が、同定される。表VIから推測される縮重を有する上記の表Ｖに示される長さのオリゴヌクレオチドが合成される。
Ｎ．改良されたIFN-αの進化
１．  クローニング
IFN遺伝子を、上記に一般的に議論されるような方法によって縮重プライマーの12個のセットを用いてゲノムDNAからPCR増幅によってクローニングした。PCR産物を、fdバクテリオファージ遺伝子IIIへの融合物として標準的なファージミドディスプレイベクターにクローニングした。30個のクローンを配列決定し、そして文献におけるヒトαIFN遺伝子と比較した。配列のほとんどは、正確に、またはほとんど正確に（＞98％のDNA同一性）既知の配列と適合した。いくつかのクローンは、任意の既知のIFNとは十分には適合しなかった（すなわち、約93％の同一性）。そしてこれらは新規のIFN遺伝子の候補である。１つの遺伝子は、明らかに組換え体であり、これは、おそらく、PCRの間に作製された。10個のクローンのうちの８個をプールし、そしてシャフリングした。これらの８個の配列は、この遺伝子のファミリーにおいて約66％の既知のアミノ酸変化を含む。
２．シャフリング
遺伝子を以下のようにシャフリングした。20〜50bpおよび50〜100bpのフラグメントのプールを、上記のように部分的なDnaseI消化によって調製した。さらに、20〜100bpのフラグメントを、ヒトゲノムDNAの調製PCR産物から12個のプライマーの同じセットを用いて調製した。これらのフラグメントは、ヒトαインターフェロン遺伝子座に全ての配列多様性を含むはずである。キメラを、20サイクルの（94℃×60秒、６℃×60秒、25℃×120秒）、続く２回のPCR緩衝液への1：10希釈による交差PCRによって構築し、そして20サイクルの（94℃×30秒、40℃×30秒、72℃×（30＋2ｎ）秒）によって再構築した。ここで、ｎはサイクル数である。全長の遺伝子を、外部プライマーを用いるPCRによってレスキューし、そして物質を標準的な方法によってファージミドディスプレイベクターにクローニングした。2.5×104、3.0×105、および2×108の複雑さのライブラリーを、20〜50bp、50〜100bp、およびゲノムPCRフラグメントからそれぞれ得た。ランダムなキメラの配列決定によって、シャフリングが効率的に行われたことを確認した。
３．ファージミドの生物学的活性の確認
プラスミド粒子のラージスケールのプレップを、標準的な方法によって、ヘルパーファージとしてM13 VCSを使用して作製した。IFN-遺伝子III融合遺伝子を、0.02％のアラビノースの添加によって中期対数期でインキュベートした。PRG沈殿させたファージミド粒子をCsCl結合させ、そして透析した。ファージミド粒子は、ヒトDaudi細胞の抗増殖アッセイ（ヒト細胞）において、IFN-Con1、IFN2a、または８個のクローニングされた野生型IFNを発現するファージミドプレップの生物学的活性によって示されるように、活性なIFNを示した（Tymmsら、Genet. Anal. Techn. Appl. 7：53-63（1990））。
４．Daudiアッセイにおける改良された活性のスクリーニング
２つのスクリーニングストラテジーを、改良された活性を有するクローンを同定するために使用した：ランダムに選択されたクローンについての活性アッセイ、およびCsCl結合させたプールの活性アッセイ、続く最も活性なプールに由来する最良のクローンの同定。
一例として、８個のランダムに選択されたキメラのうちの３つがCon1よりも活性であり、１つは、Con1とIFN2aとの間の中間であり、そして４つが陰性であった。図３は、IFN-Con1を有する４つのキメラインターフェロンのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
プールされたクローンの例は以下のとおりである。96個のクローンを、12個のうちの８個の異なるプールと組み合わせ、そしてDaudi細胞上のプールとしてアッセイした。CsClプレップを、最も活性なプール（P12.7またはプール「F」）中の12個のクローンから作製した。これらのクローンの１つ（F4）は、Con1よりも約60倍大きく、そしてIFN2aよりも約1000倍大きい活性を有して、高度に活性である。Con1よりも大きい活性を有する親IFNは存在しない。従って、これは、最良の親クローンと比較して約60倍の増大を示す。このクローンは、ヒトのウイルス防御アッセイ（WISH細胞）においてアッセイされている（Jilbertら、Micrbiol. Path. 1：159-168（1986））。そしてこのクローンは、このアッセイにおいて、Con1よりもより活性であることが見出されており、これによって、一般化された毒性よりもむしろbona fideインターフェロン活性を確認する。
５．マウス細胞上の活性の進化
８個の野生型マウスIFN遺伝子を、標準的な方法似よってPCR増幅し、そしてファージミドベクターにクローニングした。これらのクローンの１つは、このベクター中で示された場合に、マウス抗ウイルスアッセイ（マウス細胞）（Beilhartzら、J. Interferon Res. 9：305-314（1988））において高度に活性であった。８個のヒト親IFNクローンおよびIFN2aは、全て不活であり；そしてCon1はマウス抗ウイルスアッセイにおいて弱く活性であった。8個のランダムにスクリーニングされたヒトキメラのうちの１つは、Con1よりもさらに活性であった。12個のクローンの８個のプールのうちの１つ（プール「Ｇ」）は、マウスアッセイにおいて活性であった。プール「Ｇ」は、１つの高度に活性なクローンＧ8を生じた。96のうちの16個のプールの１つが、活性であった。この96個のプールは、12個のうちの８個のプールになるまで壊し、そしてこれらのプールの２つは高度に活性であった。
６．解釈
まとめると、これらのデータは、本明細書中に記載されるスクリーニング方法と組み合わせた本明細書中に記載される組換え技術が、ヒト細胞上のすでに強力なインターフェロンの活性を改良するために使用され得ることを示す。さらに、この方法は、最初の遺伝子集団中には検出可能なレベルでは予め存在しない「関連する」活性（マウス細胞上での活性）を生成するために使用され得る。データはさらに、優れた組換え体が容易に得られ得る活性のGaussian様分布を有する組換え遺伝子の集団を作製するための本発明の適用可能性を実証する。
IV．改良されたルシフェラーゼの進化
Photinus pyralisのルシフェラーゼを、pGL2 basic（Promega Corporation, Madison, WI）からPCR増幅した。Luciola mingrelicaのルシフェラーゼをpJGR（Devineら、Biochim. Biophys. Acta 1173：121-132（1993））からPCR増幅した。両方を、NcoIによってコードされるそれらの開始コドンからｐBAD24（Guzmanら、J. Bacter. 177：4121-4130（1995））にクローニングした。DNAseI消化のために、いくつかの隣接領域を含むルシフェラーゼ遺伝子を、プライマーBADup（TGCACGGCGTCACACTTTGCTA）およびBADdown（TACTGCCGCCAGGCAAATTCT）によってPCR増幅した。PCR産物を等モル量で混合し、そしてDNAseIで部分的に消化した。70〜280bpのフラグメントをゲル精製した。５μgのフラグメントを、Taqポリメラーゼおよびロボサイクラー中での以下の15サイクル：94℃、30秒；６℃60秒；25℃、180秒により、10μlの容量で構築した。サンプルを1：6希釈し、そしてDNAエンジン中でTaqポリメラーゼおよびPwoポリメラーゼの1：1混合物を使用してさらに20サイクル（94℃、30秒；40℃、30秒。72℃、30秒）回転させる。サンプルを1：4希釈し、そしてDNAエンジン中でTaqポリメラーゼおよびPwoポリメラーゼの1：1混合物を使用してさらに20サイクル（94℃、30秒；40℃、30秒。72℃、30秒）回転させる。構築したDNAフラグメントを増幅するために、構築反応物を、1：10〜1：100に希釈し、そしてプライマー＃773（TAGCGGATCCTACCTGACGC）および＃297（TGAAAATCTTCTCTCATCCG）を、DNAエンジン中でTaqポリメラーゼおよびPwoポリメラーゼの1：1混合物を使用する、次の25サイクル（94℃、30秒；45℃、30秒。72℃、110秒）インキュベートした。PCR産物を、NcoI／HindIII消化し、そしてpCKX-GFPに連結した。pCKX-GFPはｐBAD24であり、ここで、ClaI、NcoIアラビノース調節単位カセットが、pJGR（Devineら、Biochem. Biophys. Acta 1173：121-132（1993））由来のVibrio fischeriのluxオートインデューサーシステムの変異体によって置き換えられている。連結物を、XL1-Blueに形質転換した。ライブラリーをLB-Amp200上にプレートし、そして37℃で一晩増殖させた。コロニーを６個の384ウェルプレートに採取し、そして一晩増殖させた。培養物をニトロセルロース上にグリッドし、そしてコロニーを一晩（ON）30℃にて増殖させた。プレートを45分間、60℃にてインキュベートした。次いで、ニトロセルロースフィルターを、0.2％のTriton X-100および１mMのD-ルシフェリンを含有する100mMのクエン酸ナトリウム（pH5）を含むブロッティングペーパー上に置いた。これを、ニトロセルロースを含むプラスッチクラップ上に配置し、そしてコロニーを表を下に向けた。このアセンブリを30分間フィルムカセット中のBIOMAX MR上に置いた。現像後、フィルムを眼でスコアし、最も明るいコロニーを384ウェルプレートから接種し、そしてこれらのコロニーを、96ウェル形式で75μlのLB-Amp中で30℃にて一晩増殖させた。ルシフェラーゼを、以下のようにこれらの培養物から抽出した。20μlの培養物容量を、20μlの溶解緩衝液I（100mMのTris-CL、ｐH7.8、５％のTriton X-100、10mMのDTT、10mMのEDTA、２mg/mlのポリミキシンＢ硫酸）と混合した。振盪後、反応混合物を１時間、-70℃にて凍結させ、そしてその後、室温で融解させた。60μlの溶解緩衝液II（100mMのTris-Cl、pH7.8、0.25U/μlのDNAseI、1.5mg/mlのニワトリ卵リゾチーム、40mMのMgSO4）を添加し、そして溶解混合物を室温で30分間インキュベートした。溶解物のアリコートを、30℃〜42℃の間の種々の温度で30分間��ンキュベートした。さらに、アリコートを、数日間室温で放置した。標準的な溶解物および熱処理した溶解物の５μlのルシフェラーゼ活性を、50μlの完全なアッセイ緩衝液（20mMのTris-Cl、pH7.8、５mMのMgSO4、0.5mMのATP、0.5mMの補酵素Ａ、0.5mMのD-ルシフェリン、５mMのDTT）を使用してTopcount照度計中で測定した。いくつかのクローンが、残存している活性において、熱処理後および数日間室温で放置した場合に増大を示した。１つのクローンは、39℃で30分間処置した場合に、E. coli抽出物中のLuciola mingrelica野生型クローンの５倍のルシフェラーゼ活性の増大を示した。室温での４日間のインキュベーション後、同じクローンが、同一の処置をされた野生型のL. Mingrelicaルシフェラーゼよりも10倍大きい活性を示した。さらに、このクローンは、37℃で増殖させた場合に、野生型を上回る、活性における有意な増大（２倍）を示した。
これらの結果は、親のドナー分子基質と比較して改良された安定性を有するルシフェラーゼの進化を実証する。
上記の発明は、理解を明確にする目的のために説明および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変が添付の請求の範囲内で行われ得ることが明らかである。
本明細書中で引用される全ての参考文献は、全ての目的について、その全体が、明示的に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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