(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IgSF4に対する特異的結合性を有し、IgSF4を介してADCC活性を発揮することを特徴とする単離された抗体であって、
以下のa〜vからなる群より選択される組合せの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を備える、単離された抗体：
(a)配列番号：２のCDR1、配列番号：３のCDR2、及び配列番号：４のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：６のCDR1、配列番号：７のCDR2、及び配列番号：８のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(b)配列番号：１０のCDR1、配列番号：１１のCDR2、及び配列番号：１２のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：１４のCDR1、配列番号：１５のCDR2、及び配列番号：１６のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(c)配列番号：１８のCDR1、配列番号：１９のCDR2、及び配列番号：２０のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：２２のCDR1、配列番号：２３のCDR2、及び配列番号：２４のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(d)配列番号：２６のCDR1、配列番号：２７のCDR2、及び配列番号：２８のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：３０のCDR1、配列番号：３１のCDR2、及び配列番号：３２のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(e)配列番号：３４のCDR1、配列番号：３５のCDR2、及び配列番号：３６のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：３８のCDR1、配列番号：３９のCDR2、及び配列番号：４０のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(f)配列番号：４２のCDR1、配列番号：４３のCDR2、及び配列番号：４４のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：４６のCDR1、配列番号：４７のCDR2、及び配列番号：４８のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(g)配列番号：５０のCDR1、配列番号：５１のCDR2、及び配列番号：５２のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：５４のCDR1、配列番号：５５のCDR2、及び配列番号：５６のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(h)配列番号：５８のCDR1、配列番号：５９のCDR2、及び配列番号：６０のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：６２のCDR1、配列番号：６３のCDR2、及び配列番号：６４のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(i)配列番号：１のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：５のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(j)配列番号：９のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：１３のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(k)配列番号：１７のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：２１のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(l)配列番号：２５のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(m)配列番号：３３のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：３７のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(n)配列番号：４１のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：４５のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(o)配列番号：４９のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：５３のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(p)配列番号：５７のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：６１のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(q)配列番号：２２２のCDR1、配列番号：２２３のCDR2、及び配列番号：２２４のCDR3からなるCD Rを有する重鎖可変領域と、
配列番号：２２６のCDR1、配列番号：２２７のCDR2、及び配列番号：２２８のCDR3からなるCD Rを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(r)配列番号：２３０のCDR1、配列番号：２３１のCDR2、及び配列番号：２３２のCDR3からなるCD Rを有する重鎖可変領域と、
配列番号：２３４のCDR1、配列番号：２３５のCDR2、及び配列番号：２３６のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(s)配列番号：２３８のCDR1、配列番号：２３９のCDR2、及び配列番号：２４０のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：２４２のCDR1、配列番号：２４３のCDR2、及び配列番号：２４４のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(t)配列番号：２２１のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：２２５のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(u)配列番号：２２９のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：２３３のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(v)配列番号：２３７のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号：２４１のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ。
【請求項２】
ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
IgG、Fab、Fab'、F(ab')２、scFv、又はdsFv抗体である、請求項１又は２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体を有効成分として含む癌治療剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体を含んでなる、肝癌検査用、成人T細胞白血病検査用、肝癌研究用、又は成人T細胞白血病研究用試薬。
【請求項６】
肝癌診断用の情報を取得する方法であって、
(1)生体から分離された被検細胞を用意するステップ、及び
(2)前記被検細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ、
を含む方法。
【請求項７】
肝癌細胞の悪性度を判定するためにIgSF4を検出する方法であって、
(1)生体から分離された被検肝細胞を用意するステップ、及び
(2)前記被検肝細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ、
を含む方法。
【請求項８】
肝癌細胞に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング法であって、
(1)IgSF4と試験化合物とを接触させるステップ、
(2)試験化合物のIgSF4に対する結合性を評価するステップ、
を含むスクリーニング法。
【請求項９】
肝癌の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法であって、
(1)IgSF4遺伝子を発現する細胞を用意するステップ、
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ、
(3)癌細胞の死滅又は減少を評価するステップ、
を含むスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌細胞特異的に発現するIgSF4を特異的に認識する抗体（抗IgSF4抗体）及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌に対するハーセプチン（非特許文献１）、悪性Bリンパ腫に対するリツキサン（非特許文献２）の成功は、癌治療法として抗体が治療薬となり得ることを示した。ある種の抗体は、細胞膜上に存在する抗原分子と複合体を形成し、それが引き金となってADCC作用（非特許文献３）およびCDC作用（非特許文献４）により、抗原を発現する細胞を殺す。抗原抗体複合体形成がアポトーシスの引き金となることもある。抗体による細胞に対するこれらの致死作用は、癌細胞であるか正常細胞であるかを区別しない固有の機能である。そこで、癌に対する抗体治療薬開発の成否は、正常細胞に対する影響（副作用）を最小限にしつつ対象の癌細胞を全て殺すことが可能な抗体の標的となる抗原（癌抗原）をいかに見つけ出すかにかかっている。
ヒトゲノムの全塩基配列が決定されたことにより、ゲノム上にコードされた全タンパク質のアミノ酸一次配列は推定可能である。正常細胞で使用されない遺伝子の異常発現により癌化が起こり、その遺伝子産物が膜タンパク質であれば、HER2/ハーセプチンの例で示されるごとく抗体の標的となる。この考え方に基づいてDNAマイクロアレイを用いて癌細胞と正常細胞の転写産物の質的および量的差を解析する研究が、世界中の多くの研究室で実施されている。【０００３】
【特許文献１】再表01/062907
【特許文献２】再表01/096401
【非特許文献１】Mass R, et al.: The Concordance Between the Clinical Trials Assay(CTA) and Fluorescence in Situ Hybridization(FISH) in the Herceptin Pivotal Trials. : Proc Am Soci Clin Oncol 19, 75a, 2000
【非特許文献２】Berinstein NL, Grillo-Lopez AJ, White CA, Bence-Bruckler I, Maloney D, Czuczman M, et al. Association of serum Rituximab (IDEC-C2B8) concentration and anti-tumor response in the treatment of recurrent low-grade or follicular non-Hodgkin's lymphoma. Annals of Oncology 1998, 9:995-1001.
【非特許文献３】Bruggemann M., Williams G. T., Bindon C. I., Clark M. R., Walker M. R., Jefferis R., Waldmann H., Neuberger M. S. (1987). Comparison of the effector functions of human immunoglobulins using a matched set of chimeric antibodies. J. Exp. Med., 166, 1351-1361.
【非特許文献４】Loos M. (1982). The classical complement pathway: mechanism of activation of the first component by antigen-antibody complexes. Prog. Allergy, 30, 135-192. Mol Immunol. 1982 May;19(5):651-7.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌細胞と正常細胞の相違に関するタンパク質レベルでの解析は、プロテオミクス研究で用いられる二次元ゲル電気泳動を中心とする様々な手段で研究されている。MS等の解析機器の飛躍的性能向上とデータベースの拡充がこの解析法の価値を大幅に高めた。しかし癌治療薬としての抗体を単離しようとする際に以上二つの方法は、目標到達までに膨大な労力と費用を必要とする長いプロセスを経る。なぜならばDNAマイクロアレイを用いて癌細胞と正常細胞の転写産物の質的および量的差を解析する研究では、その存在が明確に知られている転写産以外は選択的スプライシングを明確には区別できていない。又、翻訳後修飾を含む翻訳後の３次構造が予測不明な点などを加味すれば、抗体創薬を目指すに至る為の情報としてはいくつかの致命的な欠点を解決できてはいない。他方、癌細胞と正常細胞の相違に関するタンパク質レベルでの解析は、プロテオミクス研究で用いられる二次元ゲル電気泳動を中心とする研究では、膜蛋白であるが故に奇麗に二次元展開が可能でなかったり、多次元LCを用いた解析ではそのLCに用いる溶媒等の性質により物質をインタクトな状態で解析できない等の重大な問題が残っている。さらに実験方法としても同じ癌（例えば肝癌）と分類される症例でも、個別癌に於ける遺伝子発現パターンを詳細に比較すると千差万別であり、その個体差が癌の特性に由来するか如何に判断できるかという問題に関しては上記のマイクロアレイ、プロテオミクスの両アプローチとも明確には解決した事例は無い。これらの問題を解決すべく本発明者らは、1000億個の独立したクローンからなる巨大なヒト抗体ライブラリーを作製し、それを利用した様々な技術開発を行った（特願2004-349783、再表01/062907(特許文献１)、再表01/096401（特許文献２））。【０００５】
以上の背景の下で本発明は、癌細胞特異的に発現し、癌治療や癌診断の標的となる分子を明らかにすることで、この分子の医療分野又は研究分野での利用を図ることを目的とする。特に、当該分子を利用した癌治療に有効な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上の目的を達成するための戦略として本発明者らは、独自に開発したscFv-CL抗体ファージライブラリー（再表01/096401）を利用して肝癌細胞特異的抗体の取得を試みた。その結果、肝癌細胞に対して高い特異性で結合する抗体を複数取得することに成功した。そして各抗体の可変領域（VH、VL）の配列を同定することに成功し、更にそのCDRも明らかにした。尚、得られた抗体は肝癌細胞の細胞膜上のインタクトなタンパク質の複数のエピトープを正確に認識していた。【０００７】
続いて、得られた抗体の診断分野での有効性を検討した。具体的には当該抗体を用いて肝癌細胞及び肝癌組織の免疫染色を施行したところ、肝癌細胞及び肝癌組織を特異的に染色できることが判明した。即ち、当該抗体によれば、肝癌細胞又は肝癌組織と正常組織とを染め分けることが可能であった。一方、分化度（悪性度）の異なる肝癌細胞に対する染色性を調べたところ、細胞の分化度と染色性との間に一定の関連性を認めた。この結果から、取得に成功した抗体を用いれば肝癌細胞（組織）の悪性度を判定することが可能になると考えられた。以上のように、取得に成功した抗体が肝癌の診断用途において非常に有用であることが明らかとなった。【０００８】
次に、取得した抗体の抗原、即ち肝癌細胞特異的に発現するタンパク質の同定を試みた。試行錯誤の末、目的のタンパク質を同定することに成功した。公共のデータベースを検索したところ、同定に成功したタンパク質がIgSF4（BL2、ST17、NECL2、TSLC1、IGSF4A、SYNCAMなどとも呼ばれる）として登録されていることが分かった。IgSF4はヒトの11番染色体の11q23.2に存在ししているORF(オープンリーディングフレーム)由来であると考えられている。IgSF4は主に肺癌の抑制遺伝子として知られており、脳の神経接合への関与も報告されている。また、正常細胞の中では脳、精巣、及び甲状腺における発現が報告されている。これら以外の細胞においてIgSF4の顕著な発現は知られておらず、本発明者らの上記研究成果によって、IgSF4が新たに肝癌特異的マーカーとしても利用可能であることが明らかとなった。【０００９】
さらに、このIgSF4分子に関しては、成人T細胞白血病（Adult T cell Leukemia；ATL）のマイクロアレイ解析にてIgSF4の発現の差異が最も顕著であったという報告があり、取得に成功した、膜表面のIgSF4を認識する抗体はATLを特異的に認識しこれらの診断・治療にも役立つ可能性があるのではないかと考えた。
成人T細胞白血病（Adult T cell Leukemia；ATL）は日本の西南地方（沖縄、鹿児島、宮崎、長崎各県のキャリア率は約5%に及ぶ。）およびカリブ海沿岸に集中して発生し、リンパ増殖性疾患のなかでもっとも治療成績が悪い極めて予後不良なヘルパーT細胞性の白血病である。今日ではヒトレトロウイルス(Human Retrovirus)であるHTLV-1(Human T cell Leukemia Virus Type 1)の感染がATLの発症の重要な因子であることが明らかにされている。幼少時に母乳を介し母親から感染し、HTLV‐1キャリアに5〜10%の頻度で発症し、2年以内にほとんど死亡する。日本全国のHTLV‐1キャリア数は約100万人、ATL発症数は年間約700例といわれており、現在有効なATL治療法が確立されていない。
リツキサン（anti-CD20）は現在最も良く知られる癌治療抗体であり、既に非ホジキン型リンパ腫にしか治療能が無い事が知られている。本取得された抗体はフローサイトメトリー（FCM）の結果、非常に特異的にIgSF4発現型ATLに対する結合能があり、本抗体を用いたIgSF4発現型ATL診断或いは毒素やRIコンジュゲートした本取得抗体はIgSF4発現型ATLの治療に有用であると考えられる。【００１０】
一方、取得に成功した抗体の癌細胞に対する作用・効果を調べたところ、驚くべきことに、一部の抗体はADCC活性（Antibody-dependent Cell-mediated cytotoxicity）を発揮することが明らかとなった。即ち、癌細胞に対する傷害活性が高く、抗体医薬として有効な抗体を取得することに成功したことが判明した。また、抗IgSF抗体によってADCCによる細胞傷害が認められたことから、IgSF4が癌治療における有効な標的となることが明らかとなった。即ち、IgSF4を標的とした抗体を利用すれば、癌細胞を特異的に傷害することが可能であることが判明した。
本発明は以上の成果に基づき、IgSF4に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。
本発明の抗体は、IgSF4に対する特異的結合性を有することを特徴とする。一態様では本発明の抗体はIgSF4を介して細胞障害活性を発揮する。好ましい一態様では、本発明の抗体はIgSF4を介してADCC活性を有する。また、好ましい他の態様では、本発明の抗体はIgSF4を介して細胞増殖活性を発揮する。
本発明の抗体の一態様は、配列番号：２〜４、１０〜１２、１８〜２０、２６〜２８、３４〜３６、４２〜４４、５０〜５２、５８〜６０、２２２〜２２４、２３０〜２３２、及び２３８〜２４９のいずれかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号：６〜８、１４〜１６、２２〜２４、３０〜３２、３８〜４０、４６〜４８、５４〜５６、６２〜６４、２２６〜２２８、２３４〜２３６、及び２４２〜２４４のいずれかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むCDRを有する軽鎖可変領域とを備えることを特徴とする。
本発明の抗体の一態様は、以下のa〜vからなる群より選択される組合せの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を備えることを特徴とする。
(a)配列番号２のCDR1、配列番号：３のCDR2、及び配列番号：４のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：６のCDR1、配列番号：７のCDR2、及び配列番号：８のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(b)配列番号：１０のCDR1、配列番号：１１のCDR2、及び配列番号：１２のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：１４のCDR1、配列番号：１５のCDR2、及び配列番号：１６のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(c)配列番号：１８のCDR1、配列番号：１９のCDR2、及び配列番号：２０のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：２２のCDR1、配列番号：２３のCDR2、及び配列番号：２４のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(d)配列番号：２６のCDR1、配列番号：２７のCDR2、及び配列番号：２８のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：３０のCDR1、配列番号：３１のCDR2、及び配列番号：３２のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(e)配列番号：３４のCDR1、配列番号：３５のCDR2、及び配列番号：３６のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：３８のCDR1、配列番号：３９のCDR2、及び配列番号：４０のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(f)配列番号：４２のCDR1、配列番号：４３のCDR2、及び配列番号：４４のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：４６のCDR1、配列番号：４７のCDR2、及び配列番号：４８のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(g)配列番号：５０のCDR1、配列番号：５１のCDR2、及び配列番号：５２のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：５４のCDR1、配列番号：５５のCDR2、及び配列番号：５６のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(h)配列番号：５８のCDR1、配列番号：５９のCDR2、及び配列番号：６０のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：６２のCDR1、配列番号：６３のCDR2、及び配列番号：６４のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(i)配列番号：１のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：５のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(j)配列番号：９のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：１３のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(k)配列番号：１７のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：２１のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(l)配列番号：２５のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(m)配列番号：３３のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：３７のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(n)配列番号：４１のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：４５のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(o)配列番号：４９のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：５３のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(p)配列番号：５７のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：６１のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(q)配列番号：２２２のCDR1、配列番号：２２３のCDR2、及び配列番号：２２４のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：２２６のCDR1、配列番号：２２７のCDR2、及び配列番号：２２８のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(r)配列番号：２３０のCDR1、配列番号：２３１のCDR2、及び配列番号：２３２のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：２３４のCDR1、配列番号：２３５のCDR2、及び配列番号：２３６のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(s)配列番号：２３８のCDR1、配列番号：２３９のCDR2、及び配列番号：２４０のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号：２４２のCDR1、配列番号：２４３のCDR2、及び配列番号：２４４のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(t)配列番号：２２１のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：２２５のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(u)配列番号：２２９のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：２３３のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(v)配列番号：２３７のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号：２４１のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ。
本発明の一態様ではヒト抗体又はヒト化抗体が提供される。また、本発明の抗体は様々な形態として構築される。例えばIgG、Fab、Fab'、F(ab')２、scFv、又はdsFv抗体として構築される。
本発明は更に、抗IgSF4抗体のCDRを提供する。本発明のCDRは配列番号：２〜４、６〜８、１０〜１２、１４〜１６、１８〜２０、２２〜２４、２６〜２８、３０〜３２、３４〜３６、３８〜４０、４２〜４４、４６〜４８、５０〜５２、５４〜５６、５８〜６０、６２〜６４、２２２〜２２４、２２６〜２２８、２３０〜２３２、２３４〜２３６、２３８〜２４０、及び２４２〜２４４のいずれかのアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域、又は本発明のCDRをコードする単離された核酸分子を提供する。
本発明はさらに、当該分子を発現可能に保持するベクター、当該核酸分子が導入されている形質転換体に関する。
本発明は他の局面として、上記本発明の抗体を有効成分として含む癌治療剤を提供する。
本発明はさらに他の局面として、抗IgSF4抗体を含んでなる、肝癌検査用、成人T細胞白血病検査用、肝癌研究用、又は成人T細胞白血病研究用試薬を提供する。さらに、当該試薬と、使用説明書を含んでなる、肝癌検査用、成人T細胞白血病検査用、肝癌研究用、又は成人T細胞白血病研究用のキットも提供する。
本発明は更なる局面として、肝癌又は成人T細胞白血病診断用の情報を取得する方法であって、
(1)生体から分離された被検細胞を用意するステップ、及び
(2)前記被検細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ、
を含む方法を提供する。
さらに、肝癌細胞の悪性度を判定する方法であって、
(1)生体から分離された被検肝細胞を用意するステップ、及び
(2)前記被検肝細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ、
を含む方法も提供される。
本発明はさらに、肝癌細胞又は成人T細胞白血病細胞に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング法であって、
(1)IgSF4と試験化合物とを接触させるステップ、
(2)試験化合物のIgSF4に対する結合性を評価するステップ、
を含むスクリーニング法を提供する。
また、肝癌の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法であって、
(1)IgSF4遺伝子を発現する細胞を用意するステップ、
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ、
(3)癌細胞の死滅及び減少を評価するステップ、
を含むスクリーニング法を提供する。
また、成人T細胞白血病の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法であって、
(1)成人T細胞白血病細胞を用意するステップ、
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ、
(3)前記細胞の死滅又は減少を評価するステップ、
を含むスクリーニング法を提供する。
本発明は更に、IgSF4の抗原としての用途を提供する。この用途では癌治療用抗体を作製するための抗原としてIgSF4が使用される。ここでのIgSF4として以下のいずれかを用いることができる。
(1)大腸菌の発現系を用いて生産されたIgSF4、
(2)動物細胞の発現系を用いて培地中に分泌させたIgSF4、
(3)動物細胞の発現系を用いて細胞表面上に発現させたIgSF4、
(4)T抗原を発現していて一過性の発現が可能である動物細胞の発現系を用いて、培地中に分泌させた又は細胞表面上に発現させたIgSF4。
一方、IgSF4の細胞外領域を抗原として用いて、癌治療用抗体を作製してもよい。
本発明はまた、癌細胞を保有する対象に抗IgSF4抗体を投与するステップを含む癌治療法も提供する。抗IgSF4抗体としてADCC活性を有するものが好適に使用される。また、成人T細胞白血病細胞を保有する対象に抗IgSF4抗体を投与するステップ、を含む成人T細胞白血病治療法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】scFv抗体遺伝子ライブラリーの作製に用いたベクターの模式図である。
【図２】pscFvCA9-E8VHdVLdの構造を模式的に示した図である。
【図３−１】pscFvCA9-E8VHdVLdのインサート部の塩基配列（配列番号：１７１）及びそれにコードされるアミノ酸配列（配列番号：１７２）を示した図である。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】pscFvCA-E8VHdのインサートの塩基配列（配列番号：１７５）及び制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：１７６）を示した図である。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】肝癌細胞特異的抗体クローンのスクリーング過程を示す図である。
【図６】選抜された抗体クローンによる組織染色の結果を示す図である。三種類の患者由来の組織に対する抗体染色を行い、染色の癌特異性を検討した。
【図７】抗体クローン035-273による癌組織染色の結果を示す図である。
【図８】抗体クローン035-273による癌組織染色の結果を示す図である。上欄は癌部の染色結果、下欄は非癌部の染色結果である。
【図９】抗体クローン051-129による癌組織染色の結果を示す図である。上欄は癌部の染色結果、下欄は非癌部の染色結果である。
【図１０】抗体クローン035-169による癌組織染色の結果を示す図である。上欄は癌部の染色結果、下欄は非癌部の染色結果である。
【図１１】抗体クローン035-273による細胞染色の結果を示す図である。使用した細胞は、左欄上から順にHepG2細胞、Nuk-1細胞、HLF細胞、右欄上から順にHuH-7細胞、THLE-3細胞である。
【図１２−１】肝癌細胞特異的抗体クローンとして得られたcp3型抗体の配列を示す図である。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１３】肝癌細胞特異的抗体クローンを使用して得られた免疫沈降物をウエスタンブロットで解析した結果である。免疫沈降後、SDS-PAGEを行い、035-283抗体で検出した。レーン１：固相化した035-283抗体クローンとHLF（ヒト低分化型肝臓癌細胞株）のライセートを使用した免疫沈降（IP）によって得られたサンプル。レーン２：035-283抗体クローンとHLF（1のレーンの実験の再現実験）。レーン３：035-283抗体とHepG2（ヒト肝癌由来細胞株）。レーン４：035-283抗体とHepG2（3のレーンの実験の再現実験）。レーン１〜４のバンドを切り出し、質量分析機によりタンパク質のアミノ酸配列を決定した。
【図１４】同定された抗原のアミノ酸配列を示す図である。MSMSで得られた断片の配列である斜体表記（cf:NLMIDIQK）の部分はESI-ionTRAP-MSMSを利用した方法にて同定された配列である。一方、下線（cf：QTIYFR）を付した部分はMALDI-TOF-MSを利用したPMF法にて同定された断片である。斜体及び下線で示した部分（cf：GTYFTHEAK）はMS/MSでもPMF法でも両方で同定されたものである。この抗原は著しい糖鎖修飾を受けていることが確認された。その糖鎖修飾を受ける候補アミノ酸をNで表記した。
【図１５−１】単離されたIgSF4 cDNAクローン（IgSF4N：cDNA1）の配列である。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１６−１】単離されたIgSF4 cDNAクローン（IgSF4X：cDNA2）の配列である。
【図１６−２】図１６−１の続き。
【図１７】IgSF4発現実験の結果（FCM解析結果）を表すグラフである。紫：遺伝子導入なし、赤：cDNA1を導入、緑：cDNA2を導入。左のグラフ：035-273抗体に対する検出結果。右のグラフ：抗インフルエンザ抗体YA14に対する検出結果。
【図１８】IgSF4発現実験の結果（細胞染色結果）を示す図である。左から順にcDNA1を導入した細胞、cDNA2を導入した細胞、遺伝子導入なしの細胞である。
【図１９】HLF細胞を用いたRNAi実験の結果である。（A）：RNAiなし、（B）：IgSF4 RNAi。(A)のピーク位置をもとに、それより蛍光強度の強い細胞の割合をM1とした。
【図２０】HLF細胞を用いたRNAi実験の結果（細胞染色結果）である。左側：IgSF4 RNAi処理なし、右側：IgSF4 RNAi処理。
【図２１】RNAi実験におけるFCM解析結果。
【図２２】単離した抗体クローンの肝癌由来細胞株HEPG2に対するFCM反応性。
【図２３】単離した抗体クローンの肝癌由来細胞株HLFに対するFCM反応性。
【図２４】単離した抗体クローンのヒト胎児腎上皮由来細胞株293Tに対するFCM反応性。
【図２５】単離した抗体クローンのヒト腎癌由来細胞株ACHNに対するFCM反応性。
【図２６】単離した抗体クローンのヒトATL由来細胞株KK1に対するFCM反応性。
【図２７】単離した抗体クローン035-212の反応性と、ATL細胞表面マーカー（抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25の各種抗体）の反応性のFCMでの比較。
【図２８】IgSF4のプロモーターがメチル化されているヒトATL由来細胞株ED、Su9T、SO4と、メチル化されていないヒトATL由来細胞株KK1、KOB及びST1に対する、単離した抗体クローン035-212のFCM反応性。
【図２９】ヒト非ATL由来細胞株MOLT4（ヒトT細胞性白血病由来株）及びJurkatと、ヒトT細胞指向性ウイルス感染（HTLV感染株）T細胞リンパ腫由来のHUT102、MT-2に対する、単離した抗体クローンのFCM反応性。
【図３０】Northern BlotによるIgSF4のmRNA発現解析の結果。HTLV-1感染細胞又はATL由来細胞におけるIgSF4の発現状態が示される。
【図３１】A431細胞株に対するIgG型抗体035-029のFCM反応性。
【図３２】抗体クローン035-029のADCC活性を評価した結果である。肺癌由来細胞核VMRC-LCDを標的細胞とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（用語）
説明の便宜上、本明細書に使用される用語の一部についてその定義をまとめて以下に示す。
本明細書において用語「〜を含む」又は「〜を含んでなる」は、「〜からなる」の意味をも含む表現として使用される。したがって例えば、「複数の要素（部材）を含んで構成される物（又は方法）」と記載した場合には、それが意味するものとして「当該複数の要素（部材）から構成される物（又は方法）」も当然に考慮される。【００１３】
「単離された」とは、その本来の環境（例えば天然の物質の場合は天然の環境）から取り出された状態、即ち人為的操作によって本来の存在状態と異なる状態で存在していることを意味する。
本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸（例えばヒト生体内の核酸）の場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された核酸」の好ましい形態では、天然状態において共存する他のDNA成分（天然状態において隣接するDＮＡ配列を含む）を実質的に含まない。
例えばcDNA分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、dNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
ベクターや組成物の一部として核酸が存在していても、又は外来性分子として細胞内に核酸が存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された核酸」と言える。尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した場合には「単離された状態の核酸」を意味する。
一方、「単離された抗体」には、天然であって且つ何ら外的操作（人為的操作）が施されていない抗体、即ちある個体の体内で産生され、そこに留まっている状態の抗体は含まれない。尚、単離された抗体は、典型的には、他の種類の抗体が混在していない状態、即ち単独で（同種の抗体の集合として）存在している。CDR領域の場合の「単離された」状態には、単独で存在している状態に加え、抗体の他の領域とともに存在している状態も含まれる。即ち、用語「単離されたCDR」には、単独で存在しているCDRは勿論のこと、単離された抗体の一部として存在しているCDRも含まれる。【００１４】
アミノ酸配列に関して使用する用語「実質的に同一」とは、比較される二つのアミノ酸配列間で配列上の相違が比較的小さく且つ配列上の相違がIgSF4に対する特異的結合性に関して実質的な影響を与えないことを意味する。基準となるアミノ酸配列に対して、IgSF4に対する特異的結合性に実質的な影響を与えない範囲で一部の改変を含んでいるとみることができるアミノ酸配列は実質的に同一なアミノ酸配列である。ここでの「アミノ酸配列の一部の改変」とは、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変化が生ずることをいう。アミノ酸配列の変異の位置は特に限定されず、複数の位置で変異を生じていてもよい。ここでの複数とはアミノ酸配列を構成する全アミノ酸の例えば１０％以内に相当する数であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸の１パーセント以内に相当する数である。
二つのアミノ酸が実質的に同一であるか否かは、各アミノ酸配列を含む抗体（他の領域の配列は同一）のIgSF4に対する結合特異性（以下、特に記載のない限り「特異性」は「IgSF4に対する特異性」を意味する）を比較することによって判定できる。例えば、基準となる抗体の生理食塩水環境下でのIgSF4に関する解離定数（Kd）をAとしたとき、比較対象の抗体のKdがA×10-1〜A×10の範囲であれば実質的な同一性を認定できる。【００１５】
本明細書における用語「核酸」はDNA（cDNA及びゲノムDNAを含む）、RNA（mRNAを含む）、DNA類似体、及びRNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち1本鎖及び2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは2本鎖DNAである。またコドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合には、その発現産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。本明細書において「あるタンパク質（例えば抗体）をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られる核酸のことをいい、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸（例えば１又は複数個のイントロンを含むDNA）をも含む。【００１６】
「IgSF4」は、イムノグロブリン・スーパーファミリー・メンバー４（Immunoglobulin superfamily member4）の略称であり、BL2、ST17、NECL2、TSLC1、IGSF4A、SYNCAM、sTSLC-1とも呼ばれる。IgSF4はヒト11番染色体の11q23.2から発現していると考えられている。IgSF4が抑制遺伝子として肺癌特異的に発現していること、脳の神経接合にIgSF4が関与していること等がこれまで報告されている（Biederer T et al.  Science. 2002 Aug 30;297(5586):1525-31）。IgSF4の配列情報や関連するこれまでの報告の詳細はNCBIのウェブページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）でみることができる（Accession No.NM_01433、Definition: Homo sapiens immunoglobulin superfamily, member 4 (IGSF4), mRNA）。尚、IgSF4のアミノ酸配列及び塩基配列をそれぞれ配列番号：１４５と配列番号：１４６に示す。【００１７】
本発明において「悪性度判定法」とは、被検肝細胞の悪性度を判定する方法をいう。用語「悪性度判定」は良性悪性の鑑別を含む概念として用いられる。通常、分化度を用いて癌の悪性度が評価される。癌細胞は一般に高分化癌、中分化癌、低分化癌、及び未分化癌に分類され、分化度が低いほどその悪性度は高い、尚、悪性度（分化度）を測る指標として、N/C比が用いられることがある。N/C比とは核（nucleus）と細胞質（cytoplasm）の比率である。分化度の高い癌細胞（高分化型癌細胞）では一般に、N/C比は低く、細胞サイズも比較的大きい。一方、分化度の低い癌細胞（低分化型癌細胞）では一般にN/C比が高い。未分化型癌細胞では一般に、N/C比が高く、細胞サイズは小さい。
高分化型癌細胞は、本来の組織の性質の多くを保持し、浸潤能ないし転移能はそれほど高くない。他方、分化度が低くなるに従って、その細胞起源が把握し難くなり、浸潤能ないし転移能も高くなる。分化度の低い癌細胞では治療が困難であり、未分化癌ではその予後は極めて不良である。【００１８】
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（H鎖）、軽鎖（L鎖）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）、相補性決定領域（CDR）、第１相補性決定領域（CDR1）、第２相補性決定領域（CDR2）、第３相補性決定領域（CDR3）重鎖の第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖の第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖の第３相補性決定領域（VH CDR3）軽鎖の第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖の第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖の第３相補性決定領域（VL CDR3）【００１９】
本発明の第１の局面は、IgSF4に対する特異的結合性を有する抗体、即ち抗IgSF4抗体に関する。好ましい一態様では、本発明の抗体はADCC活性を有する。後述の実施例に示すように本発明者らは、ファージ抗体ライブラリーを利用した独自の方法によって、肝癌特異的細胞膜表面抗原分子であるIgSF4を同定し、これに対する特異性の高い11種類の抗体（035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体）を取得することに成功した。これらの抗体は細胞膜表面上に発現している状態の、接近可能なIgSF4の細胞外ドメインを認識するため、細胞・組織染色に供することができる。各抗体の可変領域の配列を解析した結果、以下の配列情報が得られた。尚、抗体名に続けて、重鎖可変領域のアミノ酸配列；重鎖CDR1のアミノ酸配列；重鎖CDR2のアミノ酸配列、重鎖CDR3のアミノ酸配列；軽鎖可変領域のアミノ酸配列；軽鎖CDR1のアミノ酸配列；軽鎖CDR2のアミノ酸配列、軽鎖CDR3のアミノ酸配列の順で記載する。【００２０】
035-029抗体  配列番号：１(VH)；配列番号：２(VH CDR1)；配列番号：３(VH CDR2）；配列番号：４(VH CDR3）；配列番号：５(VL)；配列番号：６(VL CDR1)；配列番号：７(VL CDR2）；配列番号：８(VL CDR3）【００２１】
035-212抗体  配列番号：９(VH)；配列番号：１０(VH CDR1)；配列番号：１１(VH CDR2）；配列番号：１２(VH CDR3）；配列番号：１３(VL)；配列番号：１４(VL CDR1)；配列番号：１５(VL CDR2）；配列番号：１６(VL CDR3）【００２２】
035-215抗体  配列番号：１７(VH)；配列番号：１８(VH CDR1)；配列番号：１９(VH CDR2）；配列番号：２０(VH CDR3）；配列番号：２１(VL)；配列番号：２２(VL CDR1)；配列番号：２３(VL CDR2）；配列番号：２４(VL CDR3）【００２３】
035-273抗体  配列番号：２５(VH)；配列番号：２６(VH CDR1)；配列番号：２７(VH CDR2）；配列番号：２８(VH CDR3）；配列番号：２９(VL)；配列番号：３０(VL CDR1)；配列番号：３１(VL CDR2）；配列番号：３２(VL CDR3）【００２４】
035-283抗体  配列番号：３３(VH)；配列番号：３４(VH CDR1)；配列番号：３５(VH CDR2）；配列番号：３６(VH CDR3）；配列番号：３７(VL)；配列番号：３８(VL CDR1)；配列番号：３９(VL CDR2）；配列番号：４０(VL CDR3）【００２５】
040-131抗体  配列番号：４１(VH)；配列番号：４２(VH CDR1)；配列番号：４３(VH CDR2）；配列番号：４４(VH CDR3）；配列番号：４５(VL)；配列番号：４６(VL CDR1)；配列番号：４７(VL CDR2）；配列番号：４８(VL CDR3）【００２６】
051-054抗体  配列番号：４９(VH)；配列番号：５０(VH CDR1)；配列番号：５１(VH CDR2）；配列番号：５２(VH CDR3）；配列番号：５３(VL)；配列番号：５４(VL CDR1)；配列番号：５５(VL CDR2）；配列番号：５６(VL CDR3）【００２７】
051-181抗体  配列番号：５７(VH)；配列番号：５８(VH CDR1)；配列番号：５９(VH CDR2）；配列番号：６０(VH CDR3）；配列番号：６１(VL)；配列番号：６２(VL CDR1)；配列番号：６３(VL CDR2）；配列番号：６４(VL CDR3）【００２８】
051-129抗体  配列番号：２２１(VH)；配列番号：２２２(VH CDR1)；配列番号：２２３(VH CDR2）；配列番号：２２４(VH CDR3）；配列番号：２２５(VL)；配列番号：２２６(VL CDR1)；配列番号：２２７(VL CDR2）；配列番号：２２８(VL CDR3）【００２９】
035-130抗体  配列番号：２２９(VH)；配列番号：２３０(VH CDR1)；配列番号：２３１(VH CDR2）；配列番号：２３２(VH CDR3）；配列番号：２３３(VL)；配列番号：２３４(VL CDR1)；配列番号：２３５(VL CDR2）；配列番号：２３６(VL CDR3）【００３０】
035-169抗体  配列番号：２３７(VH)；配列番号：２３８(VH CDR1)；配列番号：２３９(VH CDR2）；配列番号：２４０(VH CDR3）；配列番号：２４１(VL)；配列番号：２４２(VL CDR1)；配列番号：２４３(VL CDR2）；配列番号：２４４(VL CDR3）【００３１】
本発明の抗体の可変領域は、本発明者らが取得に成功した抗IgSF4抗体のCDRの少なくとも一部を含む。
【００３２】
具体的には例えば、本発明の抗体の重鎖可変領域は以下の群、即ち(1)配列番号：２のアミノ酸配列、(2)配列番号：３のアミノ酸配列、(3)配列番号：４のアミノ酸配列、(4)配列番号：１０のアミノ酸配列、(5)配列番号：１１のアミノ酸配列、(6)配列番号：１２のアミノ酸配列、(7)配列番号：１８のアミノ酸配列、(8)配列番号：１９のアミノ酸配列、(9)配列番号：２０のアミノ酸配列、(10)配列番号：２６のアミノ酸配列、(11)配列番号：２７のアミノ酸配列、(12)配列番号：２８のアミノ酸配列、(13)配列番号：３４のアミノ酸配列、(14)配列番号：３５のアミノ酸配列、(15)配列番号：３６のアミノ酸配列、(16)配列番号：４２のアミノ酸配列、(17)配列番号：４３のアミノ酸配列、(18)配列番号：４４のアミノ酸配列、(19)配列番号：５０のアミノ酸配列、(20)配列番号：５１のアミノ酸配列、(21)配列番号：５２のアミノ酸配列、(22)配列番号：５８のアミノ酸配列、(23)配列番号：５９のアミノ酸配列、(24)配列番号：６０のアミノ酸配列、(49)配列番号：２２２のアミノ酸配列、(50)配列番号：２２３のアミノ酸配列、(51)配列番号：２２４のアミノ酸配列、(52)配列番号：２３０のアミノ酸配列、(53)配列番号：２３１のアミノ酸配列、(54)配列番号：２３２のアミノ酸配列、(55)配列番号：２３８のアミノ酸配列、(56)配列番号：２３９のアミノ酸配列、及び(57)配列番号：２４０のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をCDRの一部又は全部として少なくとも一つ含み（例えばCDR3として含む）、好ましくは二つ含み（例えばCDR2及びCDR3として含む）、更に好ましくは三つ含む（即ちCDR1〜3として含む）。ここで上記(1)、(4)、(7)、(10)、(13)、(16)、(19)、(22)、(49)、(52)、及び(55)は、それが可変領域のCDRとして含まれる場合、CDR1として含まれることが好ましい。同様に上記(2)、(5)、(8)、(11)、(14)、(17)、(20)、(23)、(50)、(53)、及び(56)はCDR2として含まれることが好ましく、上記(3)、(6)、(9)、(12)、(15)、(18)、(21)、(24)、(51)、(54)、及び(57)はCDR3として含まれることが好ましい。【００３３】
一方、本発明の抗体の軽鎖可変領域は以下の群、即ち(25)配列番号：６のアミノ酸配列、(26)配列番号：７のアミノ酸配列、(27)配列番号：８のアミノ酸配列、(28)配列番号：１４のアミノ酸配列、(29)配列番号：１５のアミノ酸配列、(30)配列番号：１６のアミノ酸配列、(31)配列番号：２２のアミノ酸配列、(32)配列番号：２３のアミノ酸配列、(33)配列番号：２４のアミノ酸配列、(34)配列番号：３０のアミノ酸配列、(35)配列番号：３１のアミノ酸配列、(36)配列番号：３２のアミノ酸配列、(37)配列番号：３８のアミノ酸配列、(38)配列番号：３９のアミノ酸配列、(39)配列番号：４０のアミノ酸配列、(40)配列番号：４６のアミノ酸配列、(41)配列番号：４７のアミノ酸配列、(42)配列番号：４８のアミノ酸配列、(43)配列番号：５４のアミノ酸配列、(44)配列番号：５５のアミノ酸配列、(45)配列番号：５６のアミノ酸配列、(46)配列番号：６２のアミノ酸配列、(47)配列番号：６３のアミノ酸配列、(48)配列番号：６４のアミノ酸配列、(58)配列番号：のアミノ酸配列、(59)配列番号：のアミノ酸配列、(60)配列番号：のアミノ酸配列、(61)配列番号：のアミノ酸配列、(62)配列番号：のアミノ酸配列、(63)配列番号：のアミノ酸配列、(64)配列番号：のアミノ酸配列、(65)配列番号：のアミノ酸配列、及び(66)配列番号：のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をCDRの一部又は全部として少なくとも一つ含み（例えばCDR3として含む）、好ましくは二つ含み（例えばCDR2及びCDR3として含む）、更に好ましくは三つ含む（即ちCDR1〜3として含む）。ここで上記(25)、(28)、(31)、(34)、(37)、(40)、(43)、(46)、(58)、(61)、及び(64)は、それが可変領域のCDRとして含まれる場合、CDR1として含まれることが好ましい。同様に上記(26)、(29)、(32)、(35)、(38)、(41)、(44)、(47)、(59)、(62)、及び(65)はCDR2として含まれることが好ましく、上記(27)、(30)、(33)、(36)、(39)、(42)、(45)、(48)、(60)、(63)、及び(66)はCDR3として含まれることが好ましい。【００３４】
本発明の好ましい一形態の抗体では、重鎖可変領域のCDR1が上記(1)、(4)、(7)、（10)、(13)、(16)、(19)、(22)、(49)、(52)、及び(55)のいずれかのアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域のCDR2が上記(2)、(5)、(8)、(11)、(14)、(17)、(20)、(23)、(50)、(53)、及び(56)のいずれかのアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域のCDR3が上記(3)、(6)、(9)、(12)、(15)、(18)、(21)、(24)、(51)、(54)、及び(57)のいずれかのアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のCDR1が上記(25)、(28)、(31)、(34)、(37)、(40)、(43)、(46)、(58)、(61)、及び(64)のいずれかのアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のCDR2が上記(26)、(29)、(32)、(35)、(38)、(41)、(44)、(47)、(59)、(62)、及び(65)のいずれかのアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のCDR3が上記(27)、(30)、(33)、(36)、(39)、(42)、(45)、(48)、(60)、(63)、及び(66)のいずれかのアミノ酸配列を有する。【００３５】
本発明の更に好ましい一形態の抗体では重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のCDR3が以下の(a)〜(k)のいずれかの組合せである。
(a)重鎖CDR3：配列番号：４のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：８のアミノ酸配列
(b)重鎖CDR3：配列番号：１２のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：１６のアミノ酸配列
(c)重鎖CDR3：配列番号：２０のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２４のアミノ酸配列
(d)重鎖CDR3：配列番号：２８のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：３２のアミノ酸配列
(e)重鎖CDR3：配列番号：３６のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：４０のアミノ酸配列
(f)重鎖CDR3：配列番号：４４のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：４８のアミノ酸配列
(g)重鎖CDR3：配列番号：５２のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：５６のアミノ酸配列
(h)重鎖CDR3：配列番号：６０のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：６４のアミノ酸配列
(i)重鎖CDR3：配列番号：２２４のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２２８のアミノ酸配列
(j)重鎖CDR3：配列番号：２３２のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２３６のアミノ酸配列
(k)重鎖CDR3：配列番号：２４０のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２４４のアミノ酸配列
これらは上から順に035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体におけるCDR3の組合せであり、IgSF4に対する高い特異性を期待できる。【００３６】
本発明の一層好ましい一形態の抗体では重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のCDR2とCDR3が以下の(l)〜(v)のいずれかの組合せである。
(l)重鎖CDR2：配列番号：３のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：４のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：７のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：８のアミノ酸配列
(m)重鎖CDR2：配列番号：１１のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：１２のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：１５のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：１６のアミノ酸配列
(n)重鎖CDR2：配列番号：１９のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２０のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：２３のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２４のアミノ酸配列の
(o)重鎖CDR2：配列番号：２７のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２８のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：３１のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：３２のアミノ酸配列
(p)重鎖CDR2：配列番号：３５のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：３６のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：３９のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：４０のアミノ酸配列
(q)重鎖CDR2：配列番号：４３のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：４４のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：４７のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：４８のアミノ酸配列
(r)重鎖CDR2：配列番号：５１のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：５２のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：５５のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：５６のアミノ酸配列
(s)重鎖CDR2：配列番号：５９のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：６０のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：６３のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：６４のアミノ酸配列
(t)重鎖CDR2：配列番号：２２３のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２２４のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：２２７のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２２８のアミノ酸配列
(u)重鎖CDR2：配列番号：２３１のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２３２のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：２３５のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２３６のアミノ酸配列
(v)重鎖CDR2：配列番号：２３９のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２４０のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：２４３のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２４４のアミノ酸配列
これらは上から順に035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体におけるCDR2とCDR3の組合せであり、IgSF4に対する一層高い特異性を期待できる。【００３７】
本発明の最も好ましい一形態の抗体では重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のCDR1〜CDR3が以下の(A)〜(K)のいずれかの組合せである。
(A)重鎖CDR1：配列番号：２のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：３のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：４のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：６のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：７のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：８のアミノ酸配列
(B)重鎖CDR1：配列番号：１０のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：１１のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：１２のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：１４のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：１５のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：１６のアミノ酸配列
(C)重鎖CDR1：配列番号：１８のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：１９のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２０のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：２２のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：２３のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２４のアミノ酸配列
(D)重鎖CDR1：配列番号：２６のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：２７のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２８のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：３０のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：３１のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：３２のアミノ酸配列
(E)重鎖CDR1：配列番号：３４のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：３５のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：３６のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：３８のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：３９のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：４０のアミノ酸配列
(F)重鎖CDR1：配列番号：４２のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：４３のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：４４のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：４６のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：４７のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：４８のアミノ酸配列
(G)重鎖CDR1：配列番号：５０のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：５１のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：５２のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：５４のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：５５のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：５６のアミノ酸配列
(H)重鎖CDR1：配列番号：５８のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：５９のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：６０のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：６２のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：６３のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：６４のアミノ酸配列
(I)重鎖CDR1：配列番号：２２２のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：２２３のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２２４のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：２２６のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：２２７のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２２８のアミノ酸配列
(J)重鎖CDR1：配列番号：２３０のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：２３１のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２３２のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：２３４のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：２３５のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２３６のアミノ酸配列
(K)重鎖CDR1：配列番号：２３８のアミノ酸配列、重鎖CDR2：配列番号：２３９のアミノ酸配列、重鎖CDR3：配列番号：２４０のアミノ酸配列、軽鎖CDR1：配列番号：２４２のアミノ酸配列、軽鎖CDR2：配列番号：２４３のアミノ酸配列、軽鎖CDR3：配列番号：２４４のアミノ酸配列
これらは上から順に035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体におけるCDR1〜CDR3の組合せであり、IgSF4に対するより一層高い特異性を期待できる。【００３８】
本発明の抗体の可変領域においてフレームワーク領域（FR領域）の配列は、IgSF4に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。例えば、本発明の抗体をヒト化抗体として構築する場合には、公知のヒト抗体のFR領域を用いることができる。また、検出用の試薬として使用される抗体又はヒト以外の動物種への適用に使用される抗体を構築する場合など、ヒト抗体FR領域を使用しなくとも期待される効果が奏される場合やヒト抗体FR領域を使用することがむしろ適当でない場合がある。このような場合には、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）のFR領域を用いることができる。【００３９】
本発明の抗体は一態様において、可変領域に加えて定常領域を含む（例えばIgG型抗体の場合など）。当該態様における定常領域の配列は特に限定されない。例えば、後述のように本発明の抗体をヒト化抗体として構築する場合には、公知のヒト抗体の定常領域を用いることができる。また、上記FR領域と同様に、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）の定常領域を用いることもできる。【００４０】
本発明の抗体の一形態はヒト化抗体である。ここでの「ヒト化抗体」とは、ヒトの抗体に構造を類似させた抗体のことをいい、抗体の定常領域のみをヒト抗体のものに置換したヒト型キメラ抗体、及び定常領域及び可変領域に存在するCDR（相補性決定領域）以外の部分をヒト抗体のものに置換したヒト型CDR移植（CDR-grafted）抗体（P.T.Johons et al., Nature 321,522(1986)）を含む。ヒト型CDR移植抗体の抗原結合活性を高めるため、マウス抗体と相同性の高いヒト抗体FRを選択する方法、相同性の高いヒト型化抗体を作製する方法、ヒト抗体にマウスCDRを移植した後さらにFR領域のアミノ酸を置換する方法の改良技術もすでに開発され（米国特許第5585089号、米国特許第5693761号、米国特許第5693762号、米国特許第6180370号、欧州特許第451216号、欧州特許第682040号、特許第2828340号などを参照）、本発明のヒト型抗体の作製に利用することもできる。
ヒト型キメラ抗体は例えば、上記のH鎖可変領域の構造及び／又はL鎖可変領域の構造を有する抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。以下に、ヒト型キメラ抗体の作製方法の一例を示す。
まず、マウス抗IgSF4抗体を産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し、常法に従ってcDNAを合成する。合成したcDNAをベクターに組み込みcDNAライブラリーを構築する。このcDNAライブラリーから、H鎖遺伝子フラグメント及びL鎖遺伝子フラグメントをプローブとして用いることにより、H鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を含有するベクターを選択する。選択されたベクターの挿入配列のシークエンシングを行うことにより、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。このようにして得られた配列データを基にH鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断／再結合等により作製する。得られたH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒトH鎖定常領域をコードするDNAとライゲーションして発現用ベクターに組込むことによりH鎖発現ベクターを作製する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV（パピローマウイルス）basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。一方、同様の方法によりL鎖発現ベクターを作製する。これらH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。【００４１】
一方、ヒト型CDR移植抗体は例えば以下の方法により作製することができる。まず、上記キメラ抗体の製造方法の欄で述べた方法により、マウス抗IgSF4抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を決定する。併せて各CDR領域のアミノ酸配列及び塩基配列を決定する。
具体的なCDRの塩基配列として例えば以下の塩基配列を用いることができる。
H鎖CDR1（VH CDR1）：配列番号：６６、７４、８２、９０、９８、１０６、１１４、１２２、２４６、２５４、及び２６２のいずれかの塩基配列
H鎖CDR2（VH CDR2）：配列番号：６７、７５、８３、９１、９９、１０７、１１５、１２３、２４７、２５５、及び２６３のいずれかの塩基配列
H鎖CDR3（VH CDR3）：配列番号：６８、７６、８４、９２、１００、１０８、１１６、１２４、２４８、２５６、及び２６４のいずれかの塩基配列
L鎖CDR1（VL CDR1）：配列番号：７０、７８、８６、９４、１０２、１１０、１１８、１２６、２５０、２５８、及び２６６のいずれかの塩基配列
L鎖CDR2（VL CDR2）：配列番号：７１、７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、２５１、２５９、及び２６７のいずれかの塩基配列
L鎖CDR3（VL CDR3）：配列番号：７２、８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、２５２、２６０、及び２６８のいずれかの塩基配列【００４２】
CDRの塩基配列として、以下のいずれかの組合せを用いることが好ましい。
(1)VH CDR1：配列番号：６６の塩基配列、VH CDR2：配列番号：６７の塩基配列、VH CDR3：配列番号：６８の塩基配列、VL CDR1：配列番号：７０の塩基配列、VL CDR2：配列番号：７１の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：７２の塩基配列の組合せ
(2) VH CDR1：配列番号：７４の塩基配列、VH CDR2：配列番号：７５の塩基配列、VH CDR3：配列番号：７６の塩基配列、VL CDR1：配列番号：７８の塩基配列、VL CDR2：配列番号：７９の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：８０の塩基配列の組合せ
(3) VH CDR1：配列番号：８２の塩基配列、VH CDR2：配列番号：８３の塩基配列、VH CDR3：配列番号：８４の塩基配列、VL CDR1：配列番号：８６の塩基配列、VL CDR2：配列番号：８７の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：８８の塩基配列の組合せ
(4) VH CDR1：配列番号：９０の塩基配列、VH CDR2：配列番号：９１の塩基配列、VH CDR3：配列番号：９２の塩基配列、VL CDR1：配列番号：９４の塩基配列、VL CDR2：配列番号：９５の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：９６の塩基配列の組合せ
(5)VH CDR1：配列番号：９８の塩基配列、VH CDR2：配列番号：９９の塩基配列、VH CDR3：配列番号：１００の塩基配列、VL CDR1：配列番号：１０２の塩基配列、VL CDR2：配列番号：１０３の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：１０４の塩基配列の組合せ
(6) VH CDR1：配列番号：１０６の塩基配列、VH CDR2：配列番号：１０７の塩基配列、VH CDR3：配列番号：１０８の塩基配列、VL CDR1：配列番号：１１０の塩基配列、VL CDR2：配列番号：１１１の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：１１２の塩基配列の組合せ
(7) VH CDR1：配列番号：１１４の塩基配列、VH CDR2：配列番号：１１５の塩基配列、VH CDR3：配列番号：１１６の塩基配列、VL CDR1：配列番号：１１８の塩基配列、VL CDR2：配列番号：１１９の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：１２０の塩基配列の組合せ
(8) VH CDR1：配列番号：１２２の塩基配列、VH CDR2：配列番号：１２３の塩基配列、VH CDR3：配列番号：１２４の塩基配列、VL CDR1：配列番号：１２６の塩基配列、VL CDR2：配列番号：１２７の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：１２８の塩基配列の組合せ
(9) VH CDR1：配列番号：２４６の塩基配列、VH CDR2：配列番号：２４７の塩基配列、VH CDR3：配列番号：２４８の塩基配列、VL CDR1：配列番号：２５０の塩基配列、VL CDR2：配列番号：２５１の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：２５２の塩基配列の組合せ
(10) VH CDR1：配列番号：２５４の塩基配列、VH CDR2：配列番号：２５５の塩基配列、VH CDR3：配列番号：２５６の塩基配列、VL CDR1：配列番号：２５８の塩基配列、VL CDR2：配列番号：２５９の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：２６０の塩基配列の組合せ
(11) VH CDR1：配列番号：２６２の塩基配列、VH CDR2：配列番号：２６３の塩基配列、VH CDR3：配列番号：２６４の塩基配列、VL CDR1：配列番号：２６６の塩基配列、VL CDR2：配列番号：２６７の塩基配列、及びVL CDR3：配列番号：２６８の塩基配列の組合せ
尚、これらは上から順に035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体における各CDRの組合せに相当する。【００４３】
次に、CDR領域を挟んで存在するFR（フレームワーク領域）を選択する。FRの選択には、およそ三つの方法が採用できる。１つめの方法は、NEWM、REIなど既に三次元構造の明らかとなったヒト抗体フレームを用いる方法である（Riechmann L. et al., Nature 332, 323-3Z7 (1988); Tempst, PR. et al., Protein Engineering 7, 1501-1507 (1994); Ellis JH. etal., J. Immunol 155, 925-937 (1995)）。２つめの方法は、目的のマウス抗体可変領域と最も高いホモロジーを持つヒト抗体可変領域をデータベースより選択し、そのFRを用いる方法である（Queen C. et al., Proc Natl Acad SciUSA 86, 10029-10033 (1989); Rozak MJ. et al., J Biol Chem 271, 22611-22618 (1996); Shearman CW. et al., J.Immunol 147, 4366-4373 (1991)）。３つめの方法は、ヒト抗体のFRで最も共通に用いられるアミノ酸を選択する方法である（Sato K. et al., Mol Immunol 31, 371-381 (1994); Kobinger F. et al., Protein Engineering 6, 971-980 (1993); Kettleborough CA. et al., Protein Engineering 4, 773-783 (1991)）。本発明ではこれらいずれの方法を用いることもできる。【００４４】
尚、選択されたヒトFRのアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列であっても、最終的に得られるヒト型CDR移植抗体がIgSF4に対する特異的結合性を有する限り、FRのアミノ酸配列として利用することができる。特に、選択されたヒトFRのアミノ酸の一部をCDRの由来となった抗体のFRのアミノ酸に変更した場合、抗体の特性が維持される可能性が高い。改変されるアミノ酸の数は好ましくはFR全体の３０％以下であり、更に好ましくはFR全体の２０％以下であり、更に更に好ましくはFR全体の１０％以下である。
次に、これらいずれかの方法により選択したFRと上記CDRとを組み合わせることによりH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAを設計する。この設計を基にH鎖可変領域をコードするDNAとL鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断／再結合等によりそれぞれ作製する。そしてH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンH鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みH鎖発現ベクターを構築する。同様に、L鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンL鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みL鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV（パピローマウイルス）basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以上の方法で作製されたH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型CDR移植抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。【００４５】
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としてはFab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体が挙げられる。
Fabは、IgGをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のH鎖の一部及びL鎖をコードするDNAを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりFabを調製することもできる。
Fab'は、後述のF(ab')2のH鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Fab同様に、Fab'をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
F(ab')2は、IgGをペプシン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される断片（Fab'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Fab同様に、F(ab')2をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
scFvは、H鎖可変領域とL鎖可変領域とからなるFvを、片方の鎖のC末端と他方のN末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（GGGGS）3などを用いることができる。例えば、上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAとペプチドリンカーをコードするDNAを用いてscFv抗体をコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりscFvを調製することができる。
dsFvは、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の適切な位置にCys残基を導入し、H鎖可変領域とL鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたFv断片である。各鎖におけるCys残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したH鎖可変領域及びL鎖可変領域をそれぞれコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりdsFvを調製することができる。
尚、適当なリンカーを用いてscFv抗体、dcFv抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。
本発明の抗体（抗体断片を含む）に低分子化合物、タンパク質、標識物質などを融合又は結合させることにより、融合抗体又は標識化抗体を構成することができる。標識物質としては125I等の放射性物質、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチンなどを用いることができる。【００４６】
本発明の抗体（抗体断片を含む）はIgSF4に対する特異的結合性を有するため、IgSF4を特異的に発現する癌細胞（例えば肺癌細胞や肝癌細胞）に対して特異的に結合する。この特性を利用すれば、癌細胞（又は癌組織）の標識、検出などが行える。また、癌細胞への結合を介した細胞傷害作用の発揮も期待される。実際、後述の実施例に示すように、035-029抗体、035-273抗体、及び051-054抗体にはADCC活性が認められることから、それ自体を癌細胞の傷害（殺傷）に利用できる。ここで、ヒト化した本発明の抗体を用いれば、免疫系によって攻撃、排除されにくくなり、期待される作用を良好に発揮するとともに、重篤な副作用の発生を回避することが可能となる。
さらには、本発明の抗体を、薬物等を肝癌細胞特異的に送達させるための媒体（運搬体）として利用することもできる。即ち、本発明の抗体の用途として、肝癌細胞を標的としたＤＤＳ（Drug delivery system）が想定される。
ここで、本発明者らが取得に成功した抗体を用いた免疫染色実験において、035-273抗体、051-054抗体は分化度の低い肝癌細胞を特異的に認識することが明らかとなった。分化度の低い肝癌を治療することは一般に困難であり、予後が極めて不良である。035-273抗体など、このような治療困難な癌細胞を特異的に認識することができるものであり、治療用途及び診断用途において高い価値を有する。例えば、035-273抗体を薬剤の運搬体として用いれば低分化型肝癌特異的に薬剤を送達すること可能となり、高い治療効果を望める。また、当該抗体を免疫染色用の抗体として用いれば、分化度を反映した染色結果を得ることができる。即ち当該抗体を用いれば癌細胞の分化度を高精度で判定することが可能である。このように当該抗体は診断用途でも非常に有用である。
尚、本発明の抗体の各用途については以下に詳述される。【００４７】
（診断用途）
本発明の他の局面は、IgSF4が肝癌細胞特異的に発現しているという知見に基づき、IgSF4の診断マーカーとしての利用に関する。この局面の一態様は肝癌又は成人T細胞白血病診断用の情報を取得する方法に関し、次のステップを含む。
ステップ(1)：生体から分離された被検細胞を用意するステップ。
ステップ(2)：被検細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ。
当該方法で得られる情報（検出結果）は、被検細胞が肝癌細胞に該当するか否かを判定するため、又は被検細胞が成人T細胞白血病細胞に該当するか否かを判定するために利用される。
ここで、後述の実施例に示すように、悪性度（分化度）の異なる複数の肝癌細胞を、抗IgSF4抗体を用いて免疫染色したところ染色性に顕著な違いを認めた。即ち、肝癌細胞の悪性度とIgSF4の発現量との間に強い関連性が存在することが明らかとなり、肝癌細胞の悪性度判定用のマーカーとしてもIgSF4が有効であることが判明した。この知見に基づき本発明の他の一態様では、上記ステップの検出結果を被検肝細胞の悪性度を判定するために利用した方法、即ち肝癌細胞の悪性度を判定する方法が提供される。【００４８】
本発明の方法による検出結果は肝癌の診断又は成人T細胞白血病の診断に有益である。例えば、肝癌患者を対象として上記方法を実施して得られた情報は、当該患者の病態の評価ないし把握、治療効果の評価などに利用できる。例えば、肝癌の治療と並行して本発明の方法を実施すれば、結果として得られる情報を基に治療効果を評価することができる。具体的には、薬剤投与後に本発明の方法を実施することで肝細胞におけるIgSF4の発現量の変化を調べ、発現量の増減から治療効果を判定することができる。このように本発明の方法を治療効果のモニターに利用してもよい。
一方、患者以外の者、即ち肝癌が認定されていない者を対象とした場合に得られた情報は、肝癌に関して罹患の有無の判定、罹患リスクの評価等に利用できる。本発明の方法によれば遺伝子の発現量という客観性に優れた指標を基に肝癌の診断を行えることから、その価値は非常に高いといえる。【００４９】
以下、本発明を構成する各ステップを詳細に説明する。
１．ステップ(1)
ステップ(1)では対象（被検者、生体）から分離された細胞を用意する。患者（肝癌患者又は成人T細胞白血病患者）に限らず、健常者（肝癌又は成人T細胞白血病のおそれがある者を含む）をここでの対象とすることもできる。例えば、バイオプシー（生検）で採取した、対象の肝臓の一部を被検細胞として本発明の方法に供することができる。
本発明において「被検細胞（被検肝細胞又は被検T細胞）」とは、本発明の方法における検出をする際の試料（対象）となる細胞である。被検細胞は生体より分離される。即ち、生体より分離された状態の被検細胞に対して本発明が適用される。「生体より分離された」とは、被検細胞が存在する生体組織の一部を摘出することによって、被検細胞がその由来の生体と完全に隔離されている状態をいう。ステップ(2)において免疫学的検出法を採用する場合には通常、被検細胞は生体で存在していた状態、即ち周囲の細胞と結合した状態で（組織片として）調製され、本発明の方法に使用される。尚、被検細胞を周囲の細胞から分離（単離）した後に本発明の方法に使用してもよい。【００５０】
被検細胞として肝細胞を用い、検出結果を被検細胞の悪性度の判定に利用する場合、被検細胞として、他の診断法によって癌であると判断される肝細胞、肝癌である蓋然性が高いと判断される肝細胞、又は肝癌である可能性を有する肝細胞が好適に採用される。好ましくは、他の診断法によって肝癌であると判断される肝細胞、又は肝癌である蓋然性が高いと判断される肝細胞が用いられる。ここでの他の診断法としては例えば、Ｘ線造影検査、内視鏡検査、超音波検査、ＣＴ検査、ＭＲＩ検査、ＰＥＴ検査、腫瘍マーカーを用いた診断法などが該当する。通常は、これらの一つ以上によって肝癌が疑われる組織から被検細胞（被検肝細胞）が採取される。
本発明において「肝癌」は広義に解釈することとし、肝癌腫及び肝肉腫を含む。また、本発明において用語「癌」は「腫瘍」と互換的に使用される。また、病理学的に診断が確定される前の段階、すなわち腫瘍としての良性、悪性のどちらかが確定される前には、良性腫瘍、良性悪性境界病変、悪性腫瘍を総括的に含む場合もあり得る。【００５１】
２．ステップ(2)
ステップ(2)では、用意した被検細胞を対象としてIgSF4を検出する。「IgSF4を検出する」とは、IgSF4が発現しているか否か（発現の有無）を調べること、又はIgSF4の発現量を絶対量として又は相対量として把握することをいう。ここでの相対量の基準を例えば、悪性度に応じて用意した標準試料のIgSF4量にすることができる。通常は、IgSF4の発現の有無、及び発現している場合にはその量が調べられることになる。IgSF4を検出する際に厳密にIgSF4量を定量することは必須でない。例えば、被検細胞として肝細胞を用い、被検細胞（被検肝細胞）の悪性度を判定するためにIgSF4を検出する場合には、悪性度の指標となる対照のIgSF4量と比較することによって被検肝細胞の悪性度を判定することが可能な程度にIgSF4量を測定できればよい。
本発明の一態様ではIgSF4の転写産物であるmRNAをターゲットとした検出法を実施する。mRNAの検出（測定）にはRT-PCR法、特異的なプローブを用いた各種ハイブリダイゼーション法（例えばノザンハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション）などの常法を採用できる。本発明の他の態様では、IgSF4の発現産物（タンパク質）をターゲットとした検出法を実施する。
免疫学的手法（例えば免疫組織化学的染色法）でIgSF4を検出することが好ましい。免疫学的手法では抗IgSF4抗体が使用され、当該抗体の結合性（結合量）を指標としてIgSF4タンパク質が検出される。免疫学的検出法によれば迅速で感度のよい検出が可能となる。また、操作も簡便である。尚、検出方法としては例えば、ELISA法、ラジオイムノアッセイ、FCM、免疫沈降法、イムノブロッティング等の方法が挙げられる。
免疫組織化学的染色法によれば、迅速に且つ感度よくIgSF4を検出できる。また、操作も簡便である。従って、IgSF4の検出に伴う被検者（患者）への負担も小さくなる。
免疫組織化学的染色法では通常、まず被検細胞に抗IgSF4抗体を接触させるステップを実施し、その後、抗IgSF4の結合量を調べる。具体的には、以下に示す免疫組織化学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。【００５２】
生体組織の免疫組織化学的染色は一般に以下の手順(1)〜(9)で実施される。尚、生体組織の免疫組織化学的染色法については様々な文献及び成書を参照することができる（例えば、「酵素抗体法、改訂第３版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画）。
(1)固定・パラフィン包埋
外科的に生体より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド、無水エチルアルコール等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ（例えば3〜5μm厚）に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えてアルコール固定標本、乾燥封入した標本、凍結標本などを用いる場合もある。
(2)脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
(3)前処理（抗原賦活）
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び／又は加圧処理等を行う。
(4)内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
(5)非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液（例えば1%溶液）で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
(5)一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(6)標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。ペルオキシダーゼを結合させた２次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(7)発色反応
トリス緩衝液にDAB（3,3'-diaminobenzidine）を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間（例えば5分間）切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、DABを除去する。
(8)核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする（通常、数分間）。
(9)脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。【００５３】
免疫学的染色法に使用する抗IgSF4抗体は、IgSF4に対する特異的結合性を有する限り、その種類や由来などは特に限定されない。抗IgSF4抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。抗IgSF4抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。【００５４】
抗IgSF4抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原（IgSF4又はその一部）を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。抗原としては、ヒトIgSF4の他、マウスIgSF4などヒト以外の種のIgSF4を用いることができる。これらのIgSF4は、生体試料を精製することにより得ることができる。また、組換えIgSF4を用いることもできる。組換えヒトIgSF4は例えば、IgSF4をコードする遺伝子（遺伝子の一部であってもよい）を、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製される。
免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。一方、IgSF4（又はその一部）を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン（His）タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。【００５５】
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。【００５６】
IgSF4への特異的結合性を保持することを条件として、得られた抗体に種々の改変を施すことができる。本発明では、このような改変抗体を利用してもよい。【００５７】
抗IgSF4抗体として標識化抗体を使用すれば、標識量を指標に結合抗体量を直接検出することが可能である。従って、より簡易な方法となる。その反面、標識物質を結合させた抗IgSF4抗体を用意する必要があることに加えて、検出感度が一般に低くなるという問題点がある。そこで、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法、二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法など、間接的検出方法を利用することが好ましい。ここでの二次抗体とは、抗IgSF4抗体に特異的結合性を有する抗体であって例えばウサギ抗体として抗IgSF4抗体を調製した場合には抗ウサギIgG抗体を使用できる。ウサギやヤギ、マウスなど様々な種の抗体に対して使用可能な標識二次抗体が市販されており（例えばフナコシ株式会社やコスモ・バイオ株式会社など）、本発明で使用する抗IgSF4抗体に応じて適切なものを適宜選択して使用することができる。【００５８】
標識物質には、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質の中から任意に選択されるものが好適に用いられる。特に、ビオチンを標識物質として用いてアビジンペルオキシダーゼを反応させる方法によれば高感度の検出が可能である。【００５９】
上記本発明の抗体をここでのIgSF4抗体として利用してもよい。具体的には例えば、本発明者らが取得に成功した抗体（035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、又は035-169抗体）を利用することができる。後述の実施例に示すように、取得に成功した抗体の中で035-273抗体等を使用した場合、悪性度の異なる癌を明確に染め分けることができた。従って、肝癌細胞の悪性度を判定する方法において当該抗体は特に利用価値が高い。【００６０】
本発明の悪性度判定法では、典型的には、IgSF4の発現量に対応させた複数の区分のいずれに被検細胞（被検肝細胞）が分類されるかを判定する。ここでの区分数は特に限定されない。例えば３区分（具体的には例えば悪性度１（高分化型）：IgSF4が検出されない、悪性度２（中分化型）：IgSF4発現量が少ない、悪性度３（低分化型又は未分化型）：IgSF4発現量が多い）を設けることが可能である。【００６１】
（治療用途）
本発明の更なる局面は、IgSF4が癌細胞に特異的に発現しており、ADCCを利用した細胞障害の標的になるという知見に基づき、癌治療用途におけるIgSF4の利用に関する。また、成人T細胞白血病とIgSF4との間に関連性が認められるという知見に基づき、成人T細胞白血病治療用途におけるIgSF4の利用に関する。尚、ADCC活性等による細胞障害の標的としてIgSF4が有効であることは、本発明者らが取得に成功した肝癌特異的抗体の抗原を同定する過程において初めて判明したものである。この成果によって、抗IgSF4抗体が癌細胞特異的な傷害に有効な薬剤となると判断された。
この局面ではまず、IgSF4を標的として利用することで、癌細胞特異的に作用し傷害することが可能な薬剤（癌治療剤）及びそれを用いた治療方法、或いは成人T細胞白血病細胞に作用し傷害することが可能な薬剤（成人T細胞白血病治療剤）及びそれを用いた治療方法が提供される。本発明の薬剤の一態様では、抗IgSF4抗体が有効成分として含有される。本発明の薬剤の好ましい一態様では、ADCC活性を有する抗IgSF4抗体が有効成分として含有される。この態様の薬剤では、ADCC活性を利用した細胞障害によって治療効果を得ることができる。ADCC活性を有する抗IgSF4抗体として、後述の実施例に示す035-029抗体、035-273抗体、051-054抗体等（IgSF4に対する特異的結合性及びADCC活性を維持する限りにおいて一部改変したものであってもよい）、又はこれを基に構築されたタイプの異なる抗体（例えばIgG型）を用いる。これらの抗体はIgSF4に対する特異的結合性とADCC活性を併せ持つ。従って、IgSF4を発現する癌細胞に特異的に結合し、その後ADCC活性を発揮し、癌細胞に傷害を与えることが可能である。本発明の薬剤の標的となる癌細胞は特に限定されないが、例えば肝癌細胞、肺癌細胞等を標的とすることができる。【００６２】
本発明の薬剤の別の態様では、抗IgSF4抗体をDDS用の運搬体として利用する。つまりこの態様は抗IgSF4抗体に薬物（細胞毒など）又は放射性同位元素など（これらをまとめて「活性成分」ともいう）を結合して得られる免疫複合体を提供する。殺細胞活性又は細胞傷害活性を持つ薬物（細胞毒）を含有する免疫複合体は一般にイムノトキシンと呼ばれる。細胞毒の例には、タキソール、シトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン並びにこれらの類似体又は同族体を挙げることができる。
本発明の免疫複合体に含有させる活性成分として、所望の生物活性を有するタンパク質又はペプチドを使用してもよい。このような目的において使用可能なタンパク質等の候補として、アブリン、リシンＡ、シュードモナス・エキソトキシン、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子、インターフェロン-γ、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）リンホカインを例示できる。【００６３】
活性部分を抗体に結合させる技術は公知であり、例えばMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)、Controlled Drug Delivery (2nd edition.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照することができる。【００６４】
本発明は更に、標的細胞（即ち、肝癌細胞等の癌細胞又は成人T細胞白血病細胞）においてIgSF4の発現を阻害ないし抑制することによって、標的細胞の悪性度低下又は正常化を促す方法を提供する。IgSF4の発現の阻害ないし抑制は、アンチセンス法やRNA干渉によって、或いはリボザイムの使用によって行うことができる。【００６５】
アンチセンス法による発現阻害を行う場合には例えば、標的細胞内で転写されたときに、本タンパク質をコードするmRNAの固有の部分に相補的なRNAを生成するアンチセンス・コンストラクトが使用される。このようなアンチセンス・コンストラクトは例えば、発現プラスミドの形態で標的細胞に導入される。一方、アンチセンス・コンストラクトとして、標的細胞内に導入されたときに、本タンパク質をコードするmRNA／又はゲノムDNA配列とハイブリダイズしてその発現を阻害するオリゴヌクレオチド・プローブを採用することもできる。このようなオリゴヌクレオチド・プローブとしては、好ましくは、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼなどの内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であるものが用いられる。
アンチセンス核酸としてDNA分子を使用する場合、本タンパク質をコードするmRNAの翻訳開始部位（例えば-10〜+10の領域）を含む領域に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。【００６６】
アンチセンス核酸と、標的核酸との間の相補性は厳密であることが好ましいが、多少のミスマッチが存在していてもよい。標的核酸に対するアンチセンス核酸のハイブリダイズ能は一般に、両核酸の相補性の程度及び長さの両方に依存する。通常、使用するアンチセンス核酸が長いほど、ミスマッチの数が多くても、標的核酸との間に安定な二重鎖（又は三重鎖）を形成することができる。当業者であれば、標準的な手法を用いて、許容可能なミスマッチの程度を確認することができる。【００６７】
アンチセンス核酸はDNA、RNA、若しくはこれらのキメラ混合物、又はこれらの誘導体や改変型であってもよい。また、一本鎖でも二本鎖でもよい。塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格部分を修飾することで、アンチセンス核酸の安定性、ハイブリダイゼーション能等を向上させることなどができる。また、アンチセンス核酸に、細胞膜輸送を促す物質（例えば Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT Publication No. W088/09810, published December 15, 1988を参照されたい)や、特定の細胞に対する親和性を高める物質などを付加してもよい。
アンチセンス核酸は例えば市販の自動ＤＮＡ合成装置（例えばアプライド・バイオシステムズ社等）を使用するなど、常法で合成することができる。核酸修飾体や誘導体の作製には例えば、Stein et al.(1988), Nucl. Acids Res. 16:3209やSarin et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451等を参照することができる。【００６８】
標的細胞内におけるアンチセンス核酸の作用を高めるために、pol IIやpol IIIといった強力なプロモーターを利用することができる。即ち、このようなプロモーターの制御下に配置されたアンチセンス核酸を含むコンストラクトを標的細胞に導入すれば、当該プロモーターの作用によって十分な量のアンチセンス核酸の転写を確保できる。
アンチセンス核酸の発現は、哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）で機能することが知られている任意のプロモーター（誘導性プロモーター又は構成的プロモーター）によって行うことができる。例えば、SV40初期プロモーター領域 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'末端領域由来のプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797)、疱疹チミジン・キナーゼ・プロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)等のプロモーターを使用することができる。【００６９】
本発明の一態様では、RNA干渉（RNAi）により本タンパク質の発現阻害を行う。RNAiは、真核細胞内で引き起こすことが可能な、配列特異的な転写後遺伝子抑制のプロセスである。RNA干渉では、標的mRNAの配列に対応する配列を有する二本鎖RNA（dsRNA）が使用される。哺乳動物細胞は、dsRNAの影響を受ける２つの経路（配列特異的経路及び配列非特異的経路）を有することが知られている。配列特異的経路においては、比較的長いdsRNAが短い干渉性のRNA（siRNA）に分割される。このsiRNAは、それぞれが3'末端に突出部を有する約19ヌクレオチドのsiRNAを形成する約21ヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖を有する。他方、配列非特異的経路は、所定の長さ以上であれば配列に関係なく、任意のdsRNAによって惹起されると考えられている。この経路では、dsRNAが二つの酵素、即ち、活性型となり翻訳開始因子eIF2をリン酸化することでタンパク質合成のすべてを停止させるPKRと、RNAase L活性化分子の合成に関与する2',5'オリゴアデニル酸シンターゼが活性化される。本発明の方法では、この非特異的経路の進行を最小限に留めるために、約30塩基対より短いdsRNAを使用することが好ましい(Hunter et al. (1975) J Biol Chem 250: 409-17; Manche et al. (1992) Mol Cell Biol 12: 5239-48; Minks et al. (1979) J Biol Chem 254: 10180-3; 及び Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-8を参照されたい）。
尚、RNAiは様々な細胞種（例えば、HeLa細胞、NIH/3T3細胞、COS 細胞、293細胞等）において遺伝子発現を減少させる効果的な手段であることが確認されている。また、通常は、アンチセンス法よりも効果的に発現阻害を行える。【００７０】
RNAiに使用するdsRNAは、化学合成によって、又は適当な発現ベクターを用いてin vitro又はin vivoで調製することができる。後者の方法は、比較的長いdsRNAの調製を行うことに特に有効である。dsRNAの設計には通常、標的核酸に固有の配列（連続配列）が利用される。尚、適当な標的配列を選択するためのプログラム及びアルゴリズムが開発されている。【００７１】
本発明の他の一態様ではリボザイムによりIgSF4の発現阻害を行う。部位特異的認識配列でmRNAを開裂させるリボザイムを用いて、本タンパク質をコードするmRNAを破壊することもできるが、好ましくはハンマーヘッド・リボザイムを使用する。ハンマーヘッド・リボザイムの構築方法については例えばHaseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591を参考にすることができる。
アンチセンス法の場合と同様に、例えば安定性やターゲット能を向上させることを目的として、修飾されたオリゴヌクレオチドを用いてリボザイムを構築してもよい。効果的な量のリボザイムを標的細胞内で生成させるために、例えば、強力なプロモーター（例えばpol IIやpol III）の制御下に、当該リボザイムをコードするDNAを配置した核酸コンストラクトを使用することが好ましい。【００７２】
本発明の治療方法（癌細胞等の悪性度低下又は正常化を促す方法を含む）に使用される薬剤の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。【００７３】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして調製できる。
本発明の薬剤を用いた治療においては、癌細胞又は成人T細胞白血病細胞を保有する対象（患者）に本発明の薬剤が投与される。本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射、標的細胞への直接導入など）によって対象（患者）に適用され得る。
薬剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約0.001mg〜約100mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。【００７４】
（スクリーニング法）
本発明は更に、肝癌細胞又は成人T細胞白血病細胞に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング法を提供する。本発明のスクリーニング法は次のステップを含む。
(1)IgSF4と試験化合物とを接触させるステップ。
(2)試験化合物のIgSF4に対する結合性を評価するステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明する。【００７５】
１．ステップ(1)
ステップ(1)ではIgSF4と試験化合物とを接触させる。具体的には例えば、プレートや膜、或いはビーズ等の不溶性支持体に固定したIgSF4に反応用溶液内で試験化合物を接触させる。所定時間経過した後、適当な溶液で洗浄することで非特異的結合成分を除去する。
反応用溶液は特に限定されず、公知又は市販の緩衝液、生理食塩水などを用いることができる。反応条件（反応用溶液の組成及びpH等、並びに反応温度、反応時間等）は例えば、IgSF4とそれに対する特異的結合分子の一つである抗IgSF4抗体を用いた結合実験の結果を基に容易に設定することが可能である。例えば、反応用溶液としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液などを用いることができ、そのpHは例えばpH6.0〜pH8.0、好ましくはpH6.5〜pH7.5とする。また、反応温度は例えば4℃〜45℃、好ましくは4℃〜40℃とすることができる。反応時間については例えば１分〜２４時間の範囲で設定できる（具体的には例えばオーバーナイトで反応させる）。
試験化合物を抗IgSF4抗体と競合的にIgSF4に接触させることにしてもよい。即ち、試験化合物の存在下及び非存在下でそれぞれ、IgSF4と抗IgSF4抗体を接触させる実験系を採用してもよい。IgSF4に対する結合活性を試験化合物が有すれば、試験化合物の存在によって、抗IgSF4抗体のIgSF4に対する結合が阻害される。従って、IgSF4に結合した抗IgSF4抗体の量を、試験化合物の存在下で抗IgSF4抗体を接触させた場合と、試験化合物の非存在下で抗IgSF4抗体を接触させた場合との間で比較すれば、間接的に試験化合物のIgSF4に対する結合活性を求めることができる。
本発明のスクリーニング法に供する試験化合物としては、様々な分子サイズの有機化合物（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等））又は無機化合物を用いることができる。試験化合物は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを試験化合物として用いてもよい。【００７６】
２．ステップ(2)
ステップ(2)では、試験化合物のIgSF4に対する結合性を評価する。即ち、試験化合物のIgSF4への結合量を測定し、測定結果から結合活性を求める。IgSF4に対する結合量の測定は、試験化合物の種類、性状などに応じて適当な方法で実施される。例えば試験化合物がタンパク質性分子であれば、IgSF4に結合した成分を回収した後にタンパク質量を測定することや、試験化合物に特異的に結合性を有する抗体を用いた免疫学的手法などの利用によって、IgSF4に結合した試験化合物量を算出することができる。これらの方法は単なる一例であって、IgSF4への結合量を測定できる限りにおいて任意の測定法を採用することができる。
上記のように抗IgSF4抗体を用いた実験系を採用した場合には、IgSF4に結合した抗IgSF4抗体の量が測定対象となる。そして、測定結果（抗IgSF4抗体の結合量）から試験化合物の結合活性が求められる。【００７７】
本発明のスクリーング法では、IgSF4に対する高い結合活性が認められた試験化合物を有望な化合物であるとして選抜する。本発明のスクリーニング法で選抜された化合物は、IgSF4に結合活性を有する。従って、IgSF4を特異的に発現する癌細胞（即ち、肝癌細胞や成人T細胞白血病細胞など）を標的としたDDS用の運搬体として利用され得る。一方、化合物自体に癌細胞傷害活性が認められれば、それ自体が癌細胞に対する治療薬として利用され得る。このように本発明のスクリーニング法で選抜された化合物は癌に対する医療措置に対して有効であり、癌治療薬の有力な候補、又は癌治療薬を開発する際の有益な材料となる。選抜された化合物が癌に対して十分な薬効を有する場合にはそのまま薬剤の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で薬剤の有効成分としての使用に供することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。【００７８】
本発明は更に、肝癌の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法を提供する。このスクリーニング法は試験化合物の接触（投与、添加）によって癌細胞が死滅するか（又は細胞数が減少するか）が調べられる。具体的には以下の各ステップが実施される。
(1)IgSF4遺伝子を発現する細胞を用意するステップ。
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ。
(3)癌細胞の死滅又は減少を評価するステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明する。【００７９】
１．ステップ(1)
ステップ(1)では、IgSF4遺伝子（標準的なヒトIgSF4遺伝子の塩基配列が配列番号：１４６に示される）を発現する細胞を用意する。好ましくはヒトIgSF4遺伝子を発現する細胞が使用されるが、ヒト以外の種のIgSF4遺伝子（例えばマウスやラットのIgSF4遺伝子）を発現する細胞を使用することもできる。【００８０】
ここでの「細胞」として好ましくは哺乳動物細胞が用いられる。哺乳動物細胞の例として、マウス、ラット、モルモット等の齧歯類の細胞、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類の細胞を挙げることができる。細胞の由来は特に限定されないが、肝臓に由来する細胞を使用することが好ましい。肝癌細胞を使用することが特に好ましい。肝癌細胞株としてHepG2細胞、Nuk-1細胞、HLF細胞が樹立されており、これらの中のいずれかを本発明の方法に供することができる。
ヒト以外の動物細胞（例えばマウス、ラット、ウサギ、ニワトリなど）であることを条件として、生体から分離されていない状態（即ち生体を構成している状態）の細胞を使用してもよい。【００８１】
分散した状態の細胞ではなく、細胞間にネットワークの形成が認められる細胞群（例えば特定の組織を形成した細胞）をスクリーニングに使用することもできる。また、異なる二種類以上の細胞を併用して本発明のスクリーニング法を実施してもよい。【００８２】
IgSF4遺伝子を本来的に発現する細胞の他、人為的な操作の結果としてIgSF4遺伝子を発現することになった細胞を用いることもできる。例えばIgSF4遺伝子を発現可能な状態で導入して得られる形質転換細胞を使用してもよい。形質転換に供することが可能な細胞としてHeLa細胞、COS細胞、CHO細胞を例示することができる。これらの細胞は例えばATCCなどの細胞バンクから容易に入手可能である。【００８３】
使用する細胞の数は特に限定されず、検出感度、実験設備等を考慮して定めることができる。例えば、1〜105個、好ましくは10〜104個、更に好ましくは102〜103個の細胞を用いることができる。【００８４】
２．ステップ(2)
ステップ(2)では、用意した細胞に試験化合物を接触させる。試験化合物の接触は例えば、培養液中に試験化合物が存在する条件下で細胞を所定時間培養することによって実施される。或いは、試験化合物又はそれを含む溶液などを直接細胞に接触させることにしてもよい。
投与量は任意に設定可能である。例えば、細胞に致死的な影響を与えない範囲で可能な限り最大の投与量とすることができる。
接触時間は特に限定されない。例えば、接触時間を１分〜１０日の範囲内で設定することができる。間隔をおいて連続的に接触させてもよい。【００８５】
本発明のスクリーニング法に供する試験化合物としては、様々な分子サイズの有機化合物（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等））又は無機化合物を用いることができる。試験化合物は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを試験化合物として用いてもよい。【００８６】
３．ステップ(3)
ステップ(3)では、試験化合物の接触後、癌細胞の死滅又は減少を評価する。例えば、試験化合物を接触させる細胞（試験群）と試験化合物を接触させない細胞（対照群）とを用意し、試験群、対照群それぞれについて癌細胞数を計測し、比較する。対照群に比較して試験群の生存細胞数が少ない場合、即ち試験化合物に癌細胞死滅作用が認められる場合には、当該試験化合物が肝癌に有効であると判定できる。従って、このような化合物を肝癌治療薬の候補として選抜する。試験群において顕著な細胞の死滅が認められる場合には、当該試験化合物が肝癌に特に有効な化合物であると判定できる。従って、このような化合物を肝癌治療薬の非常に有望な候補として選抜する。【００８７】
以上のように本発明のスクリーニング方法によれば、肝癌治療薬の候補化合物を選抜することができる。選抜された化合物が肝癌に対して十分な薬効を有する場合にはそのまま薬剤の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で薬剤の有効成分としての使用に供することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。【００８８】
本発明は更に、成人T細胞白血病の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法を提供する。このスクリーニング法は試験化合物の接触（投与、添加）によって成人T細胞白血病細胞が死滅するか（又は細胞数が減少するか）が調べられる。具体的には以下の各ステップが実施される。
(1)成人T細胞白血病細胞を用意するステップ。
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ。
(3)前記細胞の死滅又は減少を評価するステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明する。尚、特に言及しない事項については、上記の「肝癌の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法」における対応する説明が準用される。【００８９】
１．ステップ(1)
ステップ(1)では、成人T細胞白血病細胞を用意する。成人T細胞白血病細胞株としてKK1、KOB、ST1が樹立されており、これらの中のいずれかを本発明の方法に供することができる。患者由来の細胞を用いることもできる。【００９０】
２．ステップ(2)
ステップ(2)では、用意した細胞に試験化合物を接触させる。試験化合物の接触方法や投与量、接触時間、使用される試験化合物などは上記の説明に準ずる。【００９１】
３．ステップ(3)
ステップ(3)では、試験化合物の接触後、成人T細胞白血病細胞の死滅又は減少を評価する。例えば、試験化合物を接触させる細胞（試験群）と試験化合物を接触させない細胞（対照群）とを用意し、試験群、対照群それぞれについて成人T細胞白血病細胞数を計測し、比較する。対照群に比較して試験群の生存細胞数が少ない場合、即ち試験化合物に成人T細胞白血病細胞死滅作用が認められる場合には、当該試験化合物が成人T細胞白血病に有効であると判定できる。従って、このような化合物を成人T細胞白血病治療薬の候補として選抜する。試験群において顕著な細胞の死滅が認められる場合には、当該試験化合物が成人T細胞白血病に特に有効な化合物であると判定できる。従って、このような化合物を成人T細胞白血病治療薬の非常に有望な候補として選抜する。【００９２】
以上のように本発明のスクリーニング方法によれば、成人T細胞白血病治療薬の候補化合物を選抜することができる。選抜された化合物が成人T細胞白血病に対して十分な薬効を有する場合にはそのまま薬剤の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で薬剤の有効成分としての使用に供することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。【００９３】
（研究用途）
本発明は更に、肝癌細胞で特異的に発現することが明らかとなったIgSF4遺伝子の研究用途に関する。この局面の一態様では配列番号：１４６の塩基配列を有する単離された核酸、又はその相同核酸を含む肝癌研究用試薬が提供される。本発明の他の態様では配列番号：１４５のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、又はその相同タンパク質を含む肝癌研究用試薬が提供される。
本発明の試薬は肝癌の発症メカニズムや症状の進展メカニズムなどを研究するための実験ツールとして利用され得る。また、本発明の方法（肝癌診断用の情報を取得する方法、肝癌の悪性度判定法、スクリーング方法など）を実施するための試薬として、又は本発明の薬剤の構成成分として利用することができる。本発明の試薬を、肝癌のモデル動物としてのキメラマウスやトランスジェニックマウスの作製に利用することもできる。
本発明の試薬において核酸は、例えば、適当なベクター（例えば発現ベクター）に挿入された状態で含有される。【００９４】
ここでの「相同核酸」とは、基準核酸（配列番号：１４６の塩基配列を有する核酸）と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は基準核酸のそれと同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸をいう。相同核酸の例として、配列番号：１４６の塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつ肝癌の悪性度に関連して発現量が増加するという特徴を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような相同核酸は例えば部位特異的変異法を用いて特定の部位において塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように配列番号：１４６の配列を有する核酸を遺伝子工学的に改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。【００９５】
相同核酸の他の例として、配列番号：１４６のいずれかの塩基配列からなる核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を挙げることができる。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアルデヒド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアルデヒド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
相同核酸の更に他の例として、SNPに代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められる核酸を挙げることができる。【００９６】
（本発明に使用されるキット）
本発明の各方法（スクリーニング法、診断用の情報を取得する方法など）を、キット化した試薬等を用いて実施してもよい。本発明の他の局面はこのような目的に使用されるキットを提供する。例えば、本発明の方法における検出に利用される核酸（プローブやプライマー）、反応用試薬、希釈液、反応容器などをキットに含めることができる。尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。
キットを用いることによって、本発明の方法をより簡便に且つより短時間で実施することが可能となる。【００９７】
キットの構成について、免疫学的手法を利用して肝癌細胞の悪性度を判定する方法に使用される場合を例として詳細に説明する。この態様のキットは、IgSF4に特異的結合性を有する試薬を含む。当該試薬の好適な例は抗IgSF4抗体であるが、これに限られるものではない。抗IgSF4抗体の結合量を直接検出する方法用のキットの場合には、標識化された抗IgSF4抗体が用いられる。一方、間接的検出方法用のキットの場合には、未標識の抗IgSF4抗体が用いられる。この場合には、標識物質で標識化された二次抗体（標識二次抗体）をキットに含めてもよい。二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用した検出法用のキットとする場合には、当該ポリマーをキットに含めてもよい。【００９８】
一方、キットにIgSF4（抗原）を更に含めることにしてもよい。キットに含有させる抗IgSF4抗体が認識できる限り、完全長のIgSF4でなくともよい。また、組み換えIgSF4であってもよい。IgSF4は、キットを使用して得られた染色性が抗IgSF4抗体とIgSF4との特異的結合に基づくものであることを確認するために使用される。具体的にはまず、このIgSF4で抗IgSF4抗体を処理する。処理後の抗IgSF4抗体を用いて免疫染色を行う。得られた染色像と、未処理の抗IgSF4抗体を使用して得られた染色像とを比較する。後者の染色像の方に強い染色性が認められれば、その染色性は抗IgSF4抗体とIgSF4との特異的結合に基づくものであることを確認できる。
また一方で、タグやキャリアタンパク質（以下、タグ等という）との融合タンパク質を抗原として作製した抗IgSF4抗体を使用する場合には、用いたタグ等をキットに更に含めることにしてもよい。キットを構成する抗IgSF4抗体中に、その作製過程で使用したタグ等に反応性を有する抗体が混在しているおそれのある場合に当該タグ等が必要となる。以下のように当該タグ等を利用すれば、キットを使用して得られた染色性が抗IgSF4抗体とIgSF4抗体との特異的結合に基づくものであることを確認することができる。まず、このタグ等で抗IgSF4抗体を処理する。処理後の抗IgSF4抗体を用いて検体の免疫染色を行う。得られた染色像と、未処理の抗IgSF4抗体を使用して得られた染色像とを比較する。両者の間で染色性に相違がなければ、後者の染色像における染色性は抗IgSF4抗体とIgSF4との特異的結合に基づくものであることを確認できる。
本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫染色を実施する上で必要な一以上の試薬（例えば、組織固定・包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻害するためのBSA、DAB等の発色試薬、核染色用のヘマトキシリン溶液など）や器具などを更に含めてもよい。また通常は、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。【００９９】
（抗原としてのIgSF4の利用）
本発明の更なる局面は、IgSF4を抗原として利用することに関する。つまり、IgSF4を抗原として利用することによって、IgSF4に特異的結合性を有する抗体を取得する方法が提供される。例えば、古典的な免疫学的手法による免疫用抗原として、又はファージディスプレイ法などの遺伝子工学的手法を用いた抗体作製法におけるスクリーニング用抗原としてIgSF4が用いられる。
抗原としてのIｇSF4として、以下のいずれかのIgSF4を用いることができる。
(1)大腸菌の発現系を用いて生産されたIgSF4、
(2)動物細胞の発現系を用いて培地中に分泌させたIgSF4、
(3)動物細胞の発現系を用いて細胞表面上に発現させたIgSF4、
(4)T抗原を発現していて一過性の発現が可能である動物細胞の発現系を用いて、培地中に分泌させた又は細胞表面上に発現させたIgSF4。
また、抗原として用いる場合、IgSF4は膜タンパクであるため、細胞外ドメインの部分タンパクを抗原として用いることが好ましく、さらに好ましくは細胞に発現されている状態の膜画分、最も好ましくはIgSF4高発現細胞自身を抗原としてIgSF4抗体取得に用いるのが好ましい。これらIgSF4細胞外ドメインを認識する抗体は免疫染色に用いられるだけでなくADCC活性を呈するポテンシャルがあり、IgSF4を抗原として結合抗体を得る方法は治療用抗体を取得する方法として有効である。
【実施例】
【０１００】
１．scFv抗体遺伝子ライブラリーを作製するためのベクターの作製
1-1 scFv抗体遺伝子ライブラリーを作製するためのベクターの作製
図１に概念的に示すように、pTZ19Rファージミドベクター（ファルマシア）にM13ファージのpelB(シグナル配列)、His6タグ配列、M13ファージのcp3蛋白質（Δcp3（198aa-406aa）N端欠失キャプシド蛋白質３）配列、proteinA蛋白質配列を適当な制限酵素部位で組み込みベクターpAALFabを作製した(Iba Y. et al., Gene 194 : 35-46, 1997. 参照)。このpAALFabから組み込み用ベクターpFCAH9-E8dを作成した。【０１０１】
このベクターの所定の位置に重鎖と軽鎖の遺伝子を挿入することにより、実際の抗体蛋白質発現ベクターが完成することとなる。完成したベクターによって発現される抗体の形状はscFv型であり、軽鎖定常領域CL遺伝子は前述のcp3遺伝子と結合されており、結果として発現蛋白質はscFv-CL-cp3の形状となる。具体的には、以下のような操作を行った。
用いたプライマー：
527 Reverse（配列番号：１４７）：
5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
599 E8VHf-PstR:（配列番号：１４８）
3'-CGGCTCCAAGTCGACGTCGTCA-5'
544 E8VHf-PstF:（配列番号：１４９）
5'-CAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAA-3'
545 E8VHf-XbaR:（配列番号：１５０）
3'-AGACCGAAGTTGTAATTTCTGTGGATATACGTGACCCACTTCGTCTCCGGACTTTTCCCAGATCTCACCTAACCTTCCTAA-5'
546 E8VHf-XbaF:（配列番号：１５１）
5'-AAGGGTCTAGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAGTGGTAATACTAAATATGACCCGAAGGACAAGGCCACTATAACAGCA-3'
547 E8VHf-EcoR（配列番号：１５２）
3'-TTCCTGTTCCGGTGATATTGTCGTCTGTGTAGGAGGTTGTGTCGGATGGATGTCGACTTAAGGGAC-5'
548 E8VHf-EcoF（配列番号：１５３）
5'-CAGCTGAATTCCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTGGT-3'
549 E8VHf-BstR（配列番号：１５４）:
3'-CAGATAATGACACGACCAATACTAATGCCGTTGAAACTGATGACCCCGGTTCCGTGGTGCCAGTGGCACAAGG-5'
590 His6-SmaR（配列番号：１５５）:
3'-GGTTCTCTAACAGTAGTGGTAGTAGTGGTAATTATTCTCGATAGGGCCCTCGAA-5'
542 E8VLf-SacF（配列番号：１５６）:
5'-GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAGCCTCCCTTTCTGCGTCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGT-3'
539 E8VLf-KpnR（配列番号：１５７）:
3'-TGACAGTGGTAGTGTACAGCTCGTTCACCCTTATAAGTGTTAATAAATCGTACCATGGTCGTC-5'
542 E8VLf-KpnF（配列番号：１５８）:
5'-GCATGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTAT-3'
543 E8VLf-BamR（配列番号：１５９）:
3'-GGAGTCGAGGACCAGATATTACGTTTTTGGAATCGTCTACCACACGGTAGTTCCAAGTCACCGTCACCTAGGCCTTGTGTT-5'
562 E8VLf-XhoR（配列番号：１６０）:
3'-TCATGAGGCACCTGCAAGCCACCTCCGTGGTTCGAGCTCTAGTTT-5'
563 E8VLf-XhoF（配列番号：１６１）:
5'-AGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAA-3'
613 NheR（配列番号：１６２）:
3'-ATCGACAGCT-5'
600 E8VLKpnXhoR（配列番号：１６３）:
3'-AAGCCACCTCCATGGTTCGAGCTCTAGTTT-5'
LCP3ASC（配列番号：１６４）:
3'-TCGAAGTTGTCCTTACTCACAAGCCGCGCGGTCAGCTGAGGTAA-5'
hCH1Bst（配列番号：１６５）:
5'-ACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG-3'
hCH1midAS（配列番号：１６６）:
3'-GGGAGTCGTCGCAGCACTGGCACGGGAGGTCGTCGAA-5'
hCH1midS（配列番号：１６７）:
5'-GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCC-3'
hCH1H6（配列番号：１６８）:
3'-GGGTCGTTGTGGTTCCACCTGTTCTTTCAACTCGGGTTTAGAACAGTAGTGGTAGTAGTGGTA-5'
hCH1H6Sma（配列番号：１６９）:
3'-GGGTTTAGAACAGTAGTGGTAGTAGTGGTAATTATTCTCGATAGGGCCCTCGAACG-5'
702 BstXhoF（配列番号：１７０）:
5'-GGCACCACGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC-3'【０１０２】
＜pFCAH3-E8T H鎖部分の作製＞
１）pAALFabを鋳型にして527-599を用いたPCR, 547-590を用いたPCRを行いDNA断片を作製した。
２）544-545,546-547,548-549にてPCRを行いDNA断片を作製した。
３）１）２）を混合し527,590によるPCRを行い、これをpAALFabのHindIII-SmaI siteにクローンニングした。【０１０３】
＜pFCAH3-E8T L鎖部分＞
４）542-562, 561-613を用いたPCRを行いDNA断片を作製した。
５）538-539,542-543にてPCRを行いDNA断片を作製した。
６）４）５）を混合し538,562によるPCRを行い、これをpAALFabのSacI-NheI siteにクローンニングした。【０１０４】
＜pFCAH9-E8d＞
７）VH stuffer部分の作製
pFCAH3-E8TをXbaI,EcoRIにて消化、klenow fragmentを作用させて平滑末端に変えた後self ligationさせてVH部分のstufferを作製した。
８）VL stuffer部分の作製
pFCAH3-E8Tを鋳型にして527-600にてPCR。７）のHindIII-XhoI siteにクローニングした。
９）これをKpnIにて消化、self ligationさせてVL部分のstufferを作製した。
１０）SfiI,NcoI,SpeI siteの導入
pFCAH3-E8Tを鋳型にして527-663にてPCR。１）のHindIII-SacI siteにクローニングした。
１１）AscI siteの導入
pFCAH3-E8Tを鋳型にして527-LCP3ASCにてPCRし、それをSacI完全消化、SalI部分消化した２）にクローニングした。
１２）gammaCH1部分をヒト遺伝子に変換
ヒトgammaCH1部分にはBstPI siteが存在するためこれをなくす設計でクローニングを行った。ヘントウ腺cDNAを鋳型にしてhCH1Bst-hCH1midS, hCH1midAS-hCH1H6にてPCRしたのち、これを混合してhCH1Bst-hCH16SmaにてPCRし、そのDNA断片を３）のBstPI-Sma siteにクローニングした
１３）Xho siteの導入
１２）を鋳型に702-663にてPCRを行い、これを１２）のBstPI-SacI siteにクローニングした。【０１０５】
＜pscFvCA9-E8VHdVLdの作製＞
pFCAH9-E8d 3μg（3μL）（図１Ｄを参照）をBstPI（3U/μL）3μL、10×H buffer 5μL、DW39μLと混合し、37℃で2時間、制限酵素処理を行った。処理後、エタノール沈殿して得られた沈殿を10μLのTEバッファーに溶解した。これに、SacI（10 U/μL ）1μL、10×L buffer 5μL、DW34μLを混合して37℃で2時間、制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動して、4.7kb断片を回収した。回収物をエタノール沈殿して10μLとした（pFCAH9-E8d BstPI- SacI断片）。【０１０６】
一方、プライマーlinF(100pmol/μL)5μLとプライマーlinR(100pmol/μL) 5μLを混合し、94℃で5分加熱した後、80℃5分、70℃5分、室温放置30分によりアニールさせた。このうち、2μLと上記で得られたpFCAH9-E8d BstPI- SacI断片1μL、10×ligation buffer1.5μL、DW 9.5μL、T4DNAligase 1μLを混合し、16℃で16時間反応させた。反応後、エタノール沈殿して3μLに濃縮し、そのうち1.5μLを用いて、大腸菌DH12Sコンピテントセル20μLをエレクトロポレーションにより形質転換した。得られたクローンのプラスミドを抽出し、塩基配列を確認して、pscFvCA9-E8VHdVLdと名づけた。図２にpscFvCA9-E8VHdVLdの構造を模式的に示した。また、図３−１〜図３−２にpscFvCA9-E8VHdVLdのインサート部の塩基配列（配列番号：１７１）及びそれにコードされるアミノ酸配列（配列番号：１７２）を示した。
プライマーlinF（配列番号：１７３）
GTCACCGTCTCGAGAGGCGGTGGCGGATCAGGTGGCGGTGGAAGTGGCGGTGGTGGGTCCATGGCCGACATCGAGCT
プライマーlinR（配列番号：１７４）
CGATGTCGGCCATGGACCCACCACCGCCACTTCCACCGCCACCTGATCCGCCACCGCCTCTCGAGACG【０１０７】
1-2 重鎖可変領域（VH）を一時的にクローニングするためのベクターの作製
公知の手法(Iba Y. et al., Gene 194:35-46, 1997.参照)に従って、まずpAALFabベクター（図１Ａ）を作製した。pAALFabベクターのXbaIからEcoRIの間を欠落させ、新たに制限酵素切断部位Kpn I, Sfi I, Nco I, Spe Iを付加して、pFCAH3-E8T（図１Ｂ）を経て、VH(重鎖可変領域)をクローニング可能としたベクターpscFvCA-E8VHd（図１Ｃ）を作製し、重鎖可変領域を一時的にクローニングするためのベクターとした。図４−１〜図４−２にpscFvCA-E8VHdのインサートの塩基配列（配列番号：１７５）及び制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：１７６）を示した。【０１０８】
具体的には、primer610とprimer611をアニールさせ、それをpFCAH3-E8TのBstPI-SacI siteにクローニングしてsingle chainの作製を行なった。さらに、primer527とprimer619にてPCRを行い、これをさらにHindIII-PstI siteにクローニングし、SfiI,NcoI siteの導入を行った。以下にベクターの作製に用いたプライマー配列を示す。
610 scBstSpeSacF（配列番号：１７７）:
5'-CACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGCGGATCAGGTGGCGGTGGAAGTGGCGGTGGTGGGTCTACTAGTGACATCGAGCTCACCCAG-3'
611 scBstSpeSacR（配列番号：１７８）:
3'-GTGGTGCCAGTGGCAGAGGAGTCCGCCACCGCCTAGTCCACCGCCACCTTCACCGCCACCACCCAGATGATCACTGTAGCTCGAGTGGGTC-5'
527 Reverse（配列番号：１７９）:
5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
619 E8VHf-SfiNcoPstR（配列番号：１８０）:
3'-GACGCCGGGTCGGCCGGTACCGGCTCCAAGTCGACGTCGTCA-5'【０１０９】
２．イムノグロブリン軽鎖ライブラリーの作製
2-1 PCRを用いたイムノグロブリン軽鎖遺伝子の単離
骨髄細胞（検体No.59）4×107 cells、および臍帯血と末梢血のリンパ球から、市販のキット（Pharmacia Biotech社製 QuickPrep Micro mRNA Purification Kit）を用いて、2.6μgのmRNAを得た。このmRNAからcDNAを作製した。cDNAは、GibcoBRL社製 SuperScriptPreamplification Systemによって作製した。プライマーには、オリゴdTを用いた。得られたcDNAを鋳型にして、軽鎖遺伝子の取得用５’プライマー（κ1 〜κ6、λ1〜λ6 ）と3’プライマー（hCKASCプライマーまたはhCLASCプライマー）を用いて、PCRを行った。PCR産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して10μLのTEバッファーに懸濁した。用いたプライマーの塩基配列とPCRの条件は以下のとおりである。軽鎖遺伝子取得用プライマーの塩基配列中、下線部はNcoIサイト、AscIサイトを示す。【０１１０】
5’-プライマーκ1〜κ6
hVK1a（配列番号：１８１）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
hVK2a（配列番号：１８２:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC
hVK3a（配列番号：１８３）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC
hVK4a（配列番号：１８４）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GACATCGTGATGACCCAGTCTCC
hVK5a（配列番号：１８５）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAACGACACTCACGCAGTCTCC
hVK6a（配列番号：１８６）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC
5’-プライマーλ1〜λ6
hVL1（配列番号：１８７）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC
hVL2（配列番号：１８８）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC
hVK3a（配列番号：１８９）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC
hVL3b（配列番号：１９０）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC
hVL4（配列番号：１９１）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CACGTTATACTGACTCAACCGCC
hVL5（配列番号：１９２）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGCC
hVL6（配列番号：１９３）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
3’-プライマーhCKASC（配列番号：１９４）:
TCGACTGGCGCGCCGAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTG
3’-プライマーHCLASC（配列番号：１９５）:
TCGACTGGCGCGCCGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC【０１１１】
PCRの条件
cDNA                              2μL
10× buffer ♯1（KODに添付）      10μL
dNTP mix(2.0mM)                   10μL
25mM MgCl2                         4μL
5'側プライマー(100pmol/μL)        1μL
3'側プライマー(100pmol/μL)        1μL
滅菌済MilliQ                      71μL
KOD DNA polymerase(東洋紡2.5U/μL) 1μL
94℃ 1分、55℃ 2分、74℃ 1分を35サイクル【０１１２】
2-2-1 軽鎖遺伝子のファージミドへの組込み
１で得たPCR産物を以下の条件で制限酵素処理した。
PCR産物                      10μL
10×NEB4（AscIに添付）        5μL
滅菌済MilliQ                 33μL
AscI (NEB社  10 U/μL)        1μL
NcoI (宝酒造社  10 U/μL)     1μL【０１１３】
37℃で1時間、50℃で1時間反応後、そのうち10μL分をアガロースゲル電気泳動し、600bp付近のバンドを切り出して、ジーンクリーンIIキット（フナコシ株式会社）で精製した。PCR産物と同様に制限酵素処理したpscFvCA9-E8VHdVLdをジーンクリーンIIキットで精製し、制限酵素処理したPCR産物と以下の条件で16℃で4時間〜一晩反応させることによりライゲーションした。
制限酵素処理したpscFvCA9-E8VHdVLd    2μL
制限酵素処理したPCR産物              1μL
10×ligation buffer                1.5μL
（T4 DNA ligaseに添付）
10mM ATP                           1.5μL
滅菌済MilliQ                         8μL
T4 DNA ligase  (宝酒造 10 U/μL)     1μL【０１１４】
2-2-2 ファージミドの大腸菌への導入
得られたligated DNAを用いて以下のように大腸菌DH12Sを形質転換した。即ち、ligated DNA を一旦エタノール沈殿し、1/5TE(TEを滅菌済MilliQで5倍希釈したもの)3μLに溶解した。そのうち、1.5μLをコンピテントセルDH12S(GIBCO BRL製)20μLに懸濁し、以下の条件でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター
BRL社Cell-Porator(Cat.series 1600)
設定条件；voltage booster    4kΩ
capacitance        330μF
DC volts           LowΩ
charge rate        Fast【０１１５】
形質転換した上記の大腸菌を形質転換用培地（SOB）2mLに植え、37℃で1時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ampプレート）にまき、残りは、0.1%グルコース、100μg/mLアンピシリン含有2×TY培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は30℃でincubateし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、軽鎖遺伝子の塩基配列を調べた。【０１１６】
SOB培地：950mLの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後250mMのKCl溶液10mLを加え、5N NaOHでpH7.0に調製した。精製水を加えて1000mLに調整した後、オートクレーブで２０分間滅菌し、使用直前に滅菌した2MのMgCl2を5mL加えた。
bacto-tryptone      20g
bacto-yeast extract  5g
NaCl               0.5g
2×YT培地：900mLの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後5N NaOHでpHを7.0に調製し、精製水を加えて1000mLとした。オートクレーブで20分間滅菌して使用した。
bacto-tryptone        16g
bacto-yeast extract   10g
NaCl                   5g
その他の試薬は以下から購入した。
メーカー        品名
シグマ          アンピシリンナトリウム
和光純薬        フェノール
シグマ          BSA
DIFCO           ２×YT培地
和光純薬        カナマイシン硫酸塩
ナカライテスク  ポリエチレングリコール6000
ナカライテスク  Tween20
片山化学        NaCl
和光純薬        IPTG
和光純薬        スキムミルク
和光純薬        アジ化ナトリウム
和光純薬        トリエチルアミン
和光純薬        過酸化水素
和光純薬        ＯＰＤ錠
和光純薬        エタノール【０１１７】
κ1、κ2、κ3、κ4、κ5、およびκ6、並びにλ1、λ2、λ3a、λ3b、λ4、λ5、λ6、λ7、λ8、λ9、およびλ10の全てについて以上の操作を行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。続いてκ1、κ2などの各グループのクローンをin vivoでの使用頻度に近い比率になるように混合した。これら軽鎖の各グループは、それぞれ実際の生体内でどのような割合で発現しているのかが既に知られている。PCR法で増幅してベクターに組み込んだこれらの遺伝子クローンを、in vivoでの使用頻度に近い比率になるように混合しVLライブラリーとした。VLライブラリーにおける各familyの構成比率を以下に示す。【０１１８】
〔表１〕
-------------------------------------------------
family in vivoでの VLライブラリー KL200での
使用頻度(%)* での構成比率(%) 構成比率(%)
Vκ1 39 37 30.7
Vκ2 12 12 19.8
Vκ3 36 35 33.7
Vκ4 12 12 10.9
Vκ5 1 2 5.0
Vκ6 -** 2*** 0.0
-------------------------------------------------
* Griffith AD et al. EMBO J. (1994) 13, 3245-60.
**発表時記載なし。
*** プライマーVK6-2で作製したcDNAとプライマーVK6-3で作製したcDNAを等量混合。【０１１９】
〔表２〕
-------------------------------------------------
family in vivoでの VLライブラリー KL200での
使用頻度(%)* での構成比率(%) 構成比率(%)
Vλ1 43 41 34.1
Vλ2 15 15*3 15.2
Vλ3 34 32*4 25.3
Vλ4 0 1.5*5 0.0
Vλ5 0 1.0*6 11.1
Vλ6 0 1.0 14.1
Vλ7 6 6 0.0
Vλ8 1 1 0.0
Vλ9 1 1 0.0
Vλ10 -*2 1 0.0
-------------------------------------------------
* Griffith AD et al. EMBO J. (1994) 13, 3245-60.
*2 発表時記載なし。
*3 プライマーVL2で作製したcDNA5%とプライマーVL2-2で作製したcDNA10%を混合。
*4 プライマーVL3a-2で作製したcDNA17%とプライマーVL3bで作製したcDNA15%を混合。
*5 プライマーVL4aで作製したcDNA0.5%とプライマーVL4bで作製したcDNA0.5%とプライマーVL4cで作製したcDNA0.5%を混合。
*6 プライマーVL5abdeで作製したcDNA0.5%とプライマーVL5cで作製したcDNA0.5%を混合。【０１２０】
３．軽鎖遺伝子ライブラリーと重鎖遺伝子ライブラリーの組み合わせライブラリー（scFv抗体遺伝子ライブラリー）の作製
3-1-1 PCRを用いたイムノグロブリン重鎖遺伝子の単離
2-1と同様の手順を用いて臍帯血、骨髄液、および末梢血のリンパ球、並びに扁桃腺からhuman μ primer（以下に示すプライマーの６３４）あるいはrandom hexamerを用いてcDNAを調製し、このcDNAを鋳型にして、以下に示すヒト抗体重鎖遺伝子の取得用5’プライマー（VH1〜VH7）と3’プライマー（human JHプライマー4種を等量混合したもの、以下に示すプライマーの６９７〜７００）、または、humanμプライマー（以下に示すプライマーの６３４）を用いて、PCRを行った。表中、下線をつけた部分はSfiIサイトを示す。hVH2aはgerm line VH2 familyに対応していないため、新たにVH2a-2を設計した。またhVH4aではVH4ファミリー全体に対応していないため、新たにhVH4a-2を設計した。VH5aもgerm line VH5 subfamilyに対応していなかったため新たにVH5a-2を設計した。またVH7に対応するprimerとしてhVH7を設計した。これらについても遺伝子増幅を行い、pscFvCA-E8VHdに組み込み、どのような遺伝子がとれたのかを塩基配列決定した。hVH5a-2についてはhVH1aと配列が酷似しているため、hVH1aで増幅させたものと同様の遺伝子産物が得られることが予想されるためこれについては使用しなかった。PCR産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して10μLのTEバッファーに懸濁した。【０１２１】
634 humμCH1R（配列番号：１９６）:
ATGGAGTCGGGAAGGAAGTC
各VH familyの増幅に使用したprimer 
Human VH primer  SfiI siteを下線で示す。
628 hVH1a（配列番号：１９７）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
629 hVH2a（配列番号：１９８）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG
630 hVH3a（配列番号：１９９）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
631 hVH4a（配列番号：２００）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG
632 hVH5a（配列番号：２０１）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC
633 hVH6a（配列番号：２０２）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG
629-2 hVH2a-2（配列番号：２０３）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC
631-2 hVH4a-2（配列番号：２０４）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG
632-2 hVH5a-2（配列番号：２０５）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
712 hVH7（配列番号：２０６）:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGT
Human JH primer  BstPI, XhoI siteを下線で示す。
697 hJH1-2（配列番号：２０７）:
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGC
698 hJH3（配列番号：２０８）:
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCATTGTCC
699 hJH4-5（配列番号：２０９）:
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC
700 hJH6（配列番号：２１０）:
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTGGTCC
cDNA                                2μL
10× buffer  ♯1（KODに添付）      10μL
dNTP mix(2.0mM)                    10μL
25mM MgCl2                          4μL
5'側プライマー(100pmol/μL)         1μL
3'側プライマー(100pmol/μL)         1μL
滅菌済MilliQ                       71μL
KOD DNA polymerase(東洋紡2.5U/μL)  1μL
PCR条件：94℃ 1分、55℃ 2分、74℃ 1分を35サイクル【０１２２】
3-1-2 重鎖遺伝子ライブラリーの作製
3-1-1で得たPCR産物を以下の条件で制限酵素処理した。
PCR産物                    10μL
10×K buffer（宝酒造）      5μL
滅菌済MilliQ               33μL
SfiI (NEB社10 U/μL)        1μL
XhoI (宝酒造12 U/μL)       1μL
37℃で2時間反応後、そのうち10μL分をアガロース電気泳動し、400bp付近のバンドを切り出して、ジーンクリーンIIキット（フナコシ株式会社）で精製した。PCR産物と同様に制限酵素処理したpscFvCA-E8VHdをジーンクリーンIIキットで精製し、制限酵素処理したPCR産物と以下の条件で16℃で4時間〜一晩反応させることによりライゲーションした。
制限酵素処理したpscFvCA-E8VHd    2μL
制限酵素処理したPCR産物          1μL
10×ligation buffer            1.5μL
（T4 DNA ligaseに添付）
10mM ATP                       1.5μL
滅菌済MilliQ                     8μL
T4 DNA ligase  (宝酒造 10 U/μL) 1μL【０１２３】
3-1-3 ファージミドの大腸菌への導入
得られたDNAを大腸菌DH12Sに形質転換した。具体的には DNA を一旦エタノール沈殿し、1/5TE(TEを滅菌済MilliQで5倍希釈したもの)3μLに溶解する。そのうち、1.5μLをコンピテントセルDH12S(GIBCO BRL製)20μLに懸濁し、エレクトロポレーション法により形質転換を行った。
エレクトロポレーター
BRL社Cell-Porator(Cat.series 1600)
設定条件；voltage booster    4kΩ
capacitance        330μF
DC volts           LowΩ
charge rate        Fast【０１２４】
形質転換用培地（SOB）2mLに上記操作の終了した形質転換大腸菌を植え、37℃で1時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ampプレート）にまき、残りは、0.1%グルコース、100μg/mLアンピシリン含有2×YT培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は30℃でインキュベートし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、重鎖遺伝子の塩基配列を調べた。VH1〜VH7の全てについてこれらのことを行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。これらの各グループ（ファミリー）のクローンをin vivoでの使用頻度に近い比率になるように混合してVHライブラリーとした。VHライブラリーにおける各ファミリーの構成比率を以下に示す。【０１２５】
〔表３〕
-------------------------------------
family in vivoでの VLライブラリー
使用頻度(%)* での構成比率(%)
VH1 25 29**
VH2 6.6 7
VH3 40 40
VH4 19 19***
VH5 5 - **
VH6 3.8 4
VH7 1.2 2
-------------------------------------
*Griffith AD et al. EMBO J. (1994) 13, 3245-60.
** 実際にはVH1とVH5は同一のプライマーで増幅されるため、分離して集計できない。
***VH4プライマーで作製したcDNAとVH4-2プライマーで作製したcDNAを混合してこの割合とした。【０１２６】
3-2 組み合わせ遺伝子ライブラリーの作製
VHライブラリー200μgを下記条件でHindIIIとXhoIで消化し、重鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンIIキットで精製した。
VHライブラリー200μg       100μL
10×K buffer（宝酒造）      40μL
滅菌済MilliQ               205μL
HindIII (宝酒造40 U/μL)    30μL
XhoI (宝酒造50 U/μL)       25μL
VLライブラリーの挿入されたベクターpscFvCA9-E8VHdVLdについても下記条件でHindIIIとXhoIで消化し、軽鎖遺伝子を含む断片を、ジーンクリーンIIキットで精製した。
VLライブラリーを挿入したpscFvCA9-E8VHdVLd   100μg   100μL
10×K buffer（宝酒造）             40μL
滅菌済Milli-Q                     230μL
HindIII (宝酒造40 U/μL)           15μL
XhoI (宝酒造50 U/μL)              15μL【０１２７】
次に、VH遺伝子ライブラリー断片と軽鎖遺伝子の挿入されたpscFvCA9-E8VHdVLdベクターを、次の条件下、16℃で一晩反応させてライゲーションした。
制限酵素処理した
VHライブラリー断片  10μg       50μL
制限酵素処理した
VLライブラリーの断片
を含むpscFvCA9-E8VHdVLd  40μg    50μL
10×ligation buffer
（T4 DNA ligaseに添付）          100μL
10mM ATP                           100μL
滅菌済MilliQ                       670μL
T4 DNA ligase  (宝酒造 10 U/μL)    30μL
反応の終了したDNAを用いて大腸菌DH12Sを形質転換した。具体的にはDNAを一旦エタノール沈殿し、1/5TE(TEを滅菌済MilliQで5倍希釈したもの)30μLに溶解した。これをコンピテントセルDH12S(GIBCO BRL製)500μLに懸濁し、エレクトロポレーションを行った。【０１２８】
エレクトロポレーター
BRL社Cell-Porator(Cat.series 1600)
設定条件；voltage booster    4kΩ
capacitance        330μF
DC volts           LowΩ
charge rate        Fast【０１２９】
形質転換用培地（SOB）12mLに上記操作の終了した大腸菌を植え、37℃で1時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ampプレート）にまき、残りは、0.1%グルコース、100μg/mLアンピシリン含有2×YT培地500 mLで培養し、グリセリンストックした。寒天培地は30℃でインキュベートし、生えてきたコロニーの数から得られたクローンの数を推定した。8.5×1010クローンが得られた。【０１３０】
４．  scFv-CL抗体遺伝子ライブラリーからscFv-CL抗体ファージライブラリーの作製
１％グルコース及び100μg/mL のアンピシリンを加えた2×YT培地300mLを入れた５リットルのフラスコ16本にAIMS-5懸濁液を2.5mLを加え、３７℃で振とう培養し１時間おきに波長600nmにおける吸光度を測定しながら、吸光度が1.0になるまで増殖させた。培養液にヘルパーファージ液(M13KO7)をフラスコ当たり12mL加えてヘルパーファージを感染させ、３７℃で２時間培養し、ヘルパーファージ感染済みDH12Sとした。
5リットルのフラスコ24本に2×YT培地600mLと100μg/mLのアンピシリン0.6mL、50μg/m、38Lのカナマイシン0.8mL、ヘルパーファージ感染済みDH12S 200mLを加えて３７℃で20時間振とう培養した。【０１３１】
菌体は４℃で8000rpm、１０分間遠心し、上清を集めた。上清に20％のポリエチレングリコール／2.5M NaCl 4Lを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で8000rpm、２０分間遠心、沈殿を1LのPBSで溶かし、20％のポリエチレングリコール／2.5M NaCl 200mLを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で8000rpm、２０分間遠心した。上清を捨ててさらに４℃で8000rpm、３分間遠心して沈殿を回収した。沈殿は0.05％ NaN3を加えたPBSで溶解し、４℃で1000rpm、１５分間遠心し、上清を回収した後、４℃で8000rpm、３分間さらに遠心して上清を回収した。
回収したファージ溶液の力価は以下のようにチェックした。すなわち、ファージ溶液をPBSで106、107、108倍希釈し、その10μLをDH12S 990μLに感染させ、３７℃で１時間培養した。これをLBGAプレートに100μL播いて３０℃で１８時間培養した。コロニーの数をカウントすることにより希釈前の原液の力価を算出した。ファージ溶液原液を0.05％ NaN3を含むPBSに2×1014/mLになるよう懸濁した。【０１３２】
５．肝癌細胞特異的抗体クローンの取得
5-1  肝癌細胞株HepG2、Nuk-1を使用したスクリーニング
まずHepG2細胞を15cm ディッシュで培養し、それを2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させた。それを冷却したPBSで洗い、4x107を使用した。これに1x1013cfuのヒト抗体ファージライブラリーを混ぜ、反応液の終濃度を1%BSA-0.1%NaN3/MEM、容積1.6mlとし、４℃にて４時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれを0.6mlの有機溶液(dibutyl phtalate cycloheximide 9:1)の上に重層し、マイクロ遠心機にて3000rpmの遠心力を２分間作用させ、細胞をチューブの底に沈降させた。それぞれのチューブについて、溶液を捨て、細胞を0.7mlの1%BSA/MEMで懸濁、0.7mlの有機溶媒の上に重層して遠心した。この操作をもう一度繰り返したのち、溶液を捨て、細胞を0.3mlのPBSで懸濁、液体窒素で凍結し、３７℃で融解した。【０１３３】
これをOD0.5の大腸菌DH12S 20mlに１時間感染させ、その一部をアンピシリンプレートに蒔いて回収されたファージのtiterを算出した。ファージ感染大腸菌は600mlの2xYTGA培地（2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate, 1% glucose）にて30℃で通夜培養した。この通夜培養10mlを2xYTA培地（2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate）200mlと混ぜ、37℃にて1.5時間培養後ヘルパーファージKO7を1x1011入れ、３７℃にて１時間培養したのち、800mlの2xYTGAK(2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate, 0.05% glucose, 50μg/ml kanamycin)を入れて３０℃にて通夜培養した。これを8000rpmにて10分間遠心して上清1lを調製、それに200mlのPEG液（20% polyetyleneglycol 6000, 2.5M NaCl）を混ぜてよくかきまぜたのち、8000rpm 10分間の遠心を行いファージを沈殿させた。これを10mlのPBSに懸濁し、その一部を使用して大腸菌感染数を調べた。これが1stスクリーニングのファージである。
2edスクリーニングには培養細胞2x107と1stファージ1x1010を使用し、反応液の容積を0.8mlとした。反応液は1%BSA-0.1%NaN3/MEMで、全体のスケールを1stスクリーニングの半分で行った。
3rdスクリーニングは2ndファージ1x109を使用する以外は2ndスクリーニングと同じ条件で行った。
C型肝炎患者由来の肝癌細胞株についてのスクリーニングもHepG2に対するスクリーニングと同様にして行った。【０１３４】
5-2  抗体クローンの選抜、選抜された抗体クローンを用いた免疫染色
HepG2についての3rdスクリーニングの段階で回収率が上がったことから（図５）、この段階でHepG2細胞特異的な抗体クローンが濃縮されたと判断し、480個のクローンをピックアップした。これらについて、抗体発現チェックを行い、発現陽性のクローン225個を選択した。次にこれらの陽性のクローンについて、H鎖部分の塩基配列解析を行ったところ、130種類に分類されることがわかった。それら130個について、抗体サンプルを調整し、3人の患者より得た手術材料について、肝癌部と肝非癌部についての組織染色を行ったところ、癌特異的な染色が観察されたのは33個であった。これらのうち、特に癌の膜部分を染色していたものは19個であった（図６）。同様にC型肝炎患者由来の肝癌細胞株NUK-1をスクリーニングし（図５）、肝癌部の細胞膜を特異的に染色する抗体クローン８個を得た（図６）。これらの抗体クローンについて、不死化肝細胞THLE-3、肝癌細胞株HepG2, HLFについての細胞染色を行い、癌細胞膜特異的認識を示す抗体クローンを選別した。その結果、035-029, 035-212, 035-215, 035-273, 035-283, 040-131, 051-054, 051-181, 051-129、035-130、及び035-169が特に癌細胞特異性が高いことが示された。
図７、８に抗体クローン035-273による肝癌組織の染色像を示す。同様に、図９に抗体クローン051-129による肝癌組織の染色像を、図１０に抗体クローン035-169による肝癌組織の染色像をそれぞれ示す。図７〜１０より明らかなように、これらの抗体は癌部の細胞膜を特異的に染色し、非癌部の組織は染色しない。また、図１１に示すように、抗体035-273は低分化型肝癌細胞株HepG2, 未分化型肝癌細胞株HLF, C型肝炎患者由来細胞株Nuk-1を染色するが、高分化型肝癌細胞株HuH-7や不死化肝細胞THLE-3はほとんど染色しなかった。尚、抗体クローン035-029, 035-212, 035-215, 035-283, 040-131, 051-054, 051-181によっても同様の染色結果が得られた（結果を図示せず）。
尚、細胞染色及び組織染色はそれぞれ次の手順で行った。【０１３５】
5-2-1  細胞染色
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収し、1x105を使用した。これを2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、cp3型抗体を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3マウスモノクローナル抗体（株式会社医学生物学研究所）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、上清を捨て、これにベックマン・コールター社製OptiLyse B 50μlを加えて室温にて10分間静置し、細胞を固定した。これに1ng DAPI/BSA液950μlを加え、室温にて10分静置、遠心して細胞を集め、ICN社製MULTITEST SLIDEに封入して顕微鏡観察した。【０１３６】
5-2-2  組織染色
(1)抗体サンプルの調製
大腸菌通夜培養液0.5mlを10mlの2xYTAI(2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate,0.5mM IPTG)に植えて30℃にて通夜培養、マイクロ遠心機にて15000rpm 5分間遠心して上清を回収した。これに等量の飽和硫安を加えて室温に30分静置したのち、室温にて10000rpm 5分間遠心して上清を捨て、得られた沈殿物を1mlのPBS-0.05%NaN3, プロテアーゼインヒビター液にて懸濁、4℃にて15000rpm 5分間遠心して上清を回収した。
(2)組織染色用切片作製
摘出された組織は5mm×5mm×10mmほどの大きさにし、4℃の4%PFA/0.01%グルタールアルデヒド/0.1Mカコジル酸バッファーに入れ（PFAは和光純薬、グルタールアルデヒドは関東化学、カコジル酸ナトリウムはSIGMA）、電子レンジ（SHARP）を用いてマイクロウェーブ固定した後に、同固定液にて4℃で１時間再固定した。それから10％sucrose/PBSに移し4℃にて4時間浸漬後、15％sucrose/PBSに置換して4℃にて4時間浸漬したのち、20%/sucrose/PBSに置換して4℃にて一晩浸漬させ、OTC compoundにて包埋、ドライアイス・ヘキサン中で急速に凍結した。これを、クリオスタット（Reichert-Jung 2800 FRIGCUT E）にて4μmの厚さに薄切し、シランコートスライドガラス（MATSUNAMI）に貼り付け、冷風ドライヤーにて30分風乾した。
(3)組織染色
切片を貼付したスライドガラスは、PBS中で5分間ずつ3回浸漬して親水化した。次に50μlの0.3%H2O2/0.1%NaN3を滴下し、室温にて10分間反応させて内因性ペルオキシダーゼのブロッキングをおこなった後、PBSで5分間ずつ3回洗浄した。そして2%BSA/PBS中で室温で10分間反応させ、非特異反応のブロッキングをした。その後、余分な液を落としたところへ抗体サンプル50μlを滴下し、室温にて1時間反応させたのち、PBSで5分間ずつ3回洗浄した。次に、50μlの抗CP3ウサギ抗体5μg/mlを滴下し、室温にて45分間二次抗体反応させたのち、PBSで5分間ずつ3回洗浄した。そして50μlのパーオキシダーゼ標識デキストラン結合抗ウサギイムノグロブリン・ヤギポリクローナル抗体（DAKO）を滴下して、室温にて30分間三次抗体反応を行った。これをPBSで5分間ずつ3回洗浄したのち、50μlのDAB・H2O2発色液を滴下し、褐色に発色後、蒸留水を満たしたバットに移して反応を停止させた。その後10分間水洗したのち、ヘマトキシリンによる核染後、脱水・透徹し、マリノールにて封入し、鏡検した。【０１３７】
６．抗体クローンの塩基配列決定、発現確認
スクリーニングによって得られた大腸菌を希釈して、100μg/mlのampicillinの入った普通寒天培地に蒔き、得られるコロニーをピックアップして2xYTGA培地にて30℃通夜培養、クラボウのPI-50にてDNAを抽出、dideoxy法で塩基配列を決定した。また、この通夜培養0.05mlを1.2mlの2xYTAI(2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate,0.5mM IPTG)に植えて30℃にて通夜培養、マイクロ遠心機にて15000rpm 5分間遠心して上清をとった。【０１３８】
抗体はcp3融合タンパクとして発現されるので、それを用いた発現検討を行った。即ち、まず得られた上清をMaxisorp(NUNC)に37℃にて２時間反応させたのち、液を捨て、5%BSAを37℃にて2時間反応させてブロッキングを行った。液を捨て、0.05%Tween/PBSで2000倍希釈したウサギ抗cp3抗体（株式会社医学生物学研究所）を室温にて1時間反応させたのちPBSで洗浄し、0.05%Tween/PBSで2000倍希釈したHRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体（株式会社医学生物学研究所）を室温にて1時間反応させたのちPBSで洗浄し、100μlのOPD液を室温にて15分反応させ、2M硫酸アンモニウムにて反応を停止し、SPECTRAmax 340PC（Molecular Devices）にて492nmの吸光度を測定した。【０１３９】
同じ塩基配列を有する抗体クローン又は発現しない抗体クローンをこの段階で除き、最終的に１１個の抗体クローン（035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体）を得た。各抗体クローンのアミノ酸配列は次の通りでる。
(1)035-029抗体
VH：配列番号：１、VH CDR1：配列番号：２、VH CDR2：配列番号：３、VH CDR3：配列番号：４
VL：配列番号：５、VL CDR1：配列番号：６、VL CDR2：配列番号：７、VL CDR3：配列番号：８、VLCL：配列番号：１２９
(2)035-212抗体
VH：配列番号：９、VH CDR1：配列番号：１０、VH CDR2：配列番号：１１、VH CDR3：配列番号：１２
VL：配列番号：１３、VL CDR1：配列番号：１４、VL CDR2：配列番号：１５、VL CDR3：配列番号：１６、VLCL：配列番号：１３１
(3)035-215抗体
VH：配列番号：１７、VH CDR1：配列番号：１８、VH CDR2：配列番号：１９、VH CDR3：配列番号：２０
VL：配列番号：２１、VL CDR1：配列番号：２２、VL CDR2：配列番号：２３、VL CDR3：配列番号：２４、VLCL：配列番号：１３３
(4)035-273抗体
VH：配列番号：２５、VH CDR1：配列番号：２６、VH CDR2：配列番号：２７、VH CDR3：配列番号：２８
VL：配列番号：２９、VL CDR1：配列番号：３０、VL CDR2：配列番号：３１、VL CDR3：配列番号：３２、VLCL：配列番号：１３５
(5)035-283抗体
VH：配列番号：３３、VH CDR1：配列番号：３４、VH CDR2：配列番号：３５、VH CDR3：配列番号：３６
VL：配列番号：３７、VL CDR1：配列番号：３８、VL CDR2：配列番号：３９、VL CDR3：配列番号：４０、VLCL：配列番号：１３７
(6)040-131抗体
VH：配列番号：４１、VH CDR1：配列番号：４２、VH CDR2：配列番号：４３、VH CDR3：配列番号：４４
VL：配列番号：４５、VL CDR1：配列番号：４６、VL CDR2：配列番号：４７、VL CDR3：配列番号：４８、VLCL：配列番号：１３９
(7)051-054抗体
VH：配列番号：４９、VH CDR1：配列番号：５０、VH CDR2：配列番号：５１、VH CDR3：配列番号：５２
VL：配列番号：５３、VL CDR1：配列番号：５４、VL CDR2：配列番号：５５、VL CDR3：配列番号：５６、VLCL：配列番号：１４１
(8)051-181抗体
VH：配列番号：５７、VH CDR1：配列番号：５８、VH CDR2：配列番号：５９、VH CDR3：配列番号：６０
VL：配列番号：６１、VL CDR1：配列番号：６２、VL CDR2：配列番号：６３、VL CDR3：配列番号：６４、VLCL：配列番号：１４３【０１４０】
一方、各抗体クローンの塩基配列は次の通りである。
(1)035-029抗体
VH：配列番号：６５、VH CDR1：配列番号：６６、VH CDR2：配列番号：６７、VH CDR3：配列番号：６８
VL：配列番号：６９、VL CDR1：配列番号：７０、VL CDR2：配列番号：７１、VL CDR3：配列番号：７２、VLCL：配列番号：１３０
(2)035-212抗体
VH：配列番号：７３、VH CDR1：配列番号：７４、VH CDR2：配列番号：７５、VH CDR3：配列番号：７６
VL：配列番号：７７、VL CDR1：配列番号：７８、VL CDR2：配列番号：７９、VL CDR3：配列番号：８０、VLCL：配列番号：１３２
(3)035-215抗体
VH：配列番号：８１、VH CDR1：配列番号：８２、VH CDR2：配列番号：８３、VH CDR3：配列番号：８４
VL：配列番号：８５、VL CDR1：配列番号：８６、VL CDR2：配列番号：８７、VL CDR3：配列番号：８８、VLCL：配列番号：１３４
(4)035-273抗体
VH：配列番号：８９、VH CDR1：配列番号：９０、VH CDR2：配列番号：９１、VH CDR3：配列番号：９２
VL：配列番号：９３、VL CDR1：配列番号：９４、VL CDR2：配列番号：９５、VL CDR3：配列番号：９６、VLCL：配列番号：１３６
(5)035-283抗体
VH：配列番号：９７、VH CDR1：配列番号：９８、VH CDR2：配列番号：９９、VH CDR3：配列番号：１００
VL：配列番号：１０１、VL CDR1：配列番号：１０２、VL CDR2：配列番号：１０３、VL CDR3：配列番号：１０４、VLCL：配列番号：１３８
(6)040-131抗体
VH：配列番号：１０５、VH CDR1：配列番号：１０６、VH CDR2：配列番号：１０７、VH CDR3：配列番号：１０８
VL：配列番号：１０９、VL CDR1：配列番号：１１０、VL CDR2：配列番号：１１１、VL CDR3：配列番号：１１２、VLCL：配列番号：１４０
(7)051-054抗体
VH：配列番号：１１３、VH CDR1：配列番号：１１４、VH CDR2：配列番号：１１５、VH CDR3：配列番号：１１６
VL：配列番号：１１７、VL CDR1：配列番号：１１８、VL CDR2：配列番号：１１９、VL CDR3：配列番号：１２０、VLCL：配列番号：１４２
(8)051-181抗体
VH：配列番号：１２１、VH CDR1：配列番号：１２２、VH CDR2：配列番号：１２３、VH CDR3：配列番号：１２４
VL：配列番号：１２５、VL CDR1：配列番号：１２６、VL CDR2：配列番号：１２７、VL CDR3：配列番号：１２８、VLCL：配列番号：１４４
(9)051-129抗体
VH：配列番号：２２１、VH CDR1：配列番号：２２２、VH CDR2：配列番号：２２３、VH CDR3：配列番号：２２４
VL：配列番号：２２５、VL CDR1：配列番号：２２６、VL CDR2：配列番号：２２７、VL CDR3：配列番号：２２８
(10)035-130抗体
VH：配列番号：２２９、VH CDR1：配列番号：２３０、VH CDR2：配列番号：２３１、VH CDR3：配列番号：２３２
VL：配列番号：２３３、VL CDR1：配列番号：２３４、VL CDR2：配列番号：２３５、VL CDR3：配列番号：２３６
(11)035-169抗体
VH：配列番号：２３７、VH CDR1：配列番号：２３８、VH CDR2：配列番号：２３９、VH CDR3：配列番号：２４０
VL：配列番号：２４１、VL CDR1：配列番号：２４２、VL CDR2：配列番号：２４３、VL CDR3：配列番号：２４４【０１４１】
７．抗体クローンが認識するタンパク質（抗原）の同定
7-1  pp型抗体発現大腸菌の作製
得られた抗体クローンはcp3型で、その構築は図１２−１、１２−２に示したとおりである（この図では全ての抗体クローンの共通構造を示す）。VH領域、VLCL領域にはそれぞれ図１２−１、１２−２に示したVH配列及びVLCL配列が挿入されている。このDNAをクラボウPI-50にて抽出し、制限酵素SalIにて消化、自己再結合させたのち大腸菌DH12Sに導入して形質転換したのちLBGAプレートに蒔いて30℃にて通夜培養、得られた大腸菌コロニーを2xYTGAにて通夜培養し、pp型抗体発現大腸菌液を得た。【０１４２】
7-2  免疫沈降用抗体の調製 
pp型の抗体クローンを発現するプラスミドを組み込んだ大腸菌10mlをYTGAに植菌し、30℃にて一昼夜震盪培養した(前培養液)。これを4lの2xYT,0.05%glucose,100μg/ml Ampicillinに加え、30℃にて培養した。菌のO.D.が0.5になったとき、1M IPTGを4ml加え、その後30℃にて一昼夜震盪培養した。培養終了後、冷却遠心機にて10000g、4℃、10分間遠心し、得られた培養上清に等量の飽和硫酸アンモニウム水溶液を加え、室温にて1時間攪拌した。この溶液を冷却遠心機にて10000g、4℃、15分間遠心したのち、上清を捨て、得られた沈澱をPBS-NaN3溶液20mlにて懸濁したのち、冷却遠心機にて10000g、4℃、5分間遠心し上清を回収した。これをPBSにて一昼夜透析した。これに、0.05%NaN3/PBSにて平衡化したIgG sepharose 6 Fast Flow（AmershamBiosciences社）2mlを添加し4℃にて一昼夜震盪させながら反応させた。この混合液をカラムに移したのち自然滴下させてビーズに反応しなかった成分をパススルーさせた。このカラムをPBS 100mlにて2回洗浄したのち、0.1%Tween20/PBS 30mlにて4回洗浄、さらにPBS 100mlにて2回洗浄した。これに0.2M Glycine-HCl pH3 4mlを3回ゆっくり加えて溶出成分を回収したのち、3M Tris 80μlを添加して中和した（抗体溶液）。これをMILLEX-GP 0.22μmフィルターにて濾過した後O.D.を測定し、抗体収量を求めた。【０１４３】
7-3  免疫沈降用固相化抗体の調製
まず、抗体溶液をカップリング緩衝溶液（0.1M NaHCO3-NaOH pH9）にて透析した。すなわち、抗体溶液を透析膜（Snake Skin Pleated Dialysis Tubing 10,000 MWCO）に封入し、これをカップリング緩衝溶液（0.1M NaHCO3-NaOH pH9）1.5Lに沈め、4℃でスターラーにて2〜3時間撹拌したのち、緩衝溶液を交換して更に2〜3時間透析した。その後もう一度緩衝溶液を交換して一昼夜透析した。
次に固相化に使用する活性化CNBr-activated Sepharose 4Bを調整した。即ち、Amersham Biosciences社製CNBr-activated Sepharose 4Bを1mM HClにて膨潤させた後、アスピレーターで吸引した。これにカップリング緩衝溶液50mlを添加し撹拌してからアスピレーターで吸引し、吸引したまま、さらにカップリング緩衝溶液を加えた。
抗体の固相化は以下のようにして行った。即ち、5mgの抗体溶液10mlに対して活性化ゲル1mlを加え、室温にて2時間反応させた。反応終了後、ゲルをカラムに移し、カップリング緩衝溶液1mlにて10回洗浄し、未反応抗体の有無をO.D.測定により確認した。固相化ゲルは、0.2M Glycine-NaOH pH8溶液5mlにて2回置換し、さらに同液5mlを添加して室温にて2時間静置したのち、液を自然滴下し、これに0.2M Glycine-HCl pH3 5mlを添加して置換、さらに同液5ml添加し5分間静置したのち自然滴下した。最後にカラムをPBS 20mlにて置換したのち自然滴下し、1%NP40,プロテアーゼインヒビター,0.05%NaN3/PBSを添加してゲルを回収した。【０１４４】
7-4  細胞膜上蛋白のビオチン標識およびcell lysateの作製
培養肝癌細胞株のビオチン標識は以下のようにして行った。即ち、5枚の15cmディッシュにて培養した培養細胞HLFをPBSにて2回洗浄したのち、cell dissociation buffer(GIBCO社製)にて5mg/ml濃度に調整したcollagenaseI(GIBCO社製)を加えて、CO2インキュベータにて37℃で反応させ、細胞を遊離させたのち、培地にて回収、これをPBS(-)にて2回洗浄したのち、血球計算盤にて細胞数を算出、5x107/mlくらいになるようPBS(-)にて懸濁した。これにPBSにて1mg/mlになるように調整したEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit（PIERCE社）を等量加え、室温にて30分静置したのち、PBSにて2回洗浄した。
ビオチン標識細胞についてのcell lysateの調整は以下のようにして行った。即ち、上記のビオチン標識細胞に4mlのlysis buffer(1% NP40/detergent base solution, detergent base solutionの組成は20mM HEPES pH8.0, 140mM NaCl, プロテアーゼインヒビター)を加え、細胞を懸濁し、これを冷却しておいたダウンスホモジナイザーに入れてホモジナイズしたのち、溶液に1/2量(2ml)のdetergent mix solution（1%NP40, tritonX-100,b-D-Maltoside,n-Octyl b-D-Glucoside, n-Octyl b-D-Maltoside, n-Decyl b-D-Maltoside,デオキシコール酸各0.5%/detergent base solution）を加え4℃にて4時間回転混和した。この溶液を100,000rpmにて30分間遠心したのちMILLEX-GP 0.22μmフィルターにて濾過した。【０１４５】
7-5  免疫沈降反応
まず、固相化された抗体（以降、抗体ビーズと表記）約60μl分（溶液150μl分くらい）を2mlチューブに入れ、そこに4mM biotinを1/10 volume（15μl程）添加した。これに、ディッシュ0.5枚分のlysate(600μl)と60μlのbiotin液を混合したものを加え、4℃にて撹拌させながら数時間反応させた後、チューブを遠心（5500g,1分, 4℃）し、上清を除いた。これに洗浄用biotin/lysis-T buffer(0.5mM biotin, 0.1%Tween20/PBS)を800μl加え、転倒混和を２、３回行ったのち、チューブを遠心（5500g, 1分, 4℃）し、上清を除いた。この洗浄操作を再度行った後、抗体ビーズに溶出用クエン酸液（50mMクエン酸pH2.5）を30μl加え、撹拌したのち、チューブを遠心（5500g, 1min, 4℃）し、上清を回収した。残った抗体ビーズに再度溶出用クエン酸溶液を30μl加え、撹拌し、チューブを遠心（5500g, 1min, 4℃）し、上清を回収した。この溶出操作をさらに3回繰り返してサンプル溶液を回収し、それに3M Trisを加えて中和した。このサンプルをSDS-PAGEにて泳動し、銀染色にてバンドの確認を行った。このサンプルについては、同時にストレプトアビジン−HRP（Anti-Streptavidin, IgG Fraction, Conjugated to Peroxidase CORTEX biochem 社）を使用したウエスタンブロットを行いビオチン化された膜蛋白のバンドを検出した（図１３）。【０１４６】
7-6  切り出されたバンドについてのマススペクトル解析
7-6-1  ゲル内トリプシン消化
検出された膜蛋白に対応する部分をゲル内でトリプシン消化し、ペプチドを回収した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を常法に従い行い、クマシーブリリアントブルーで染色することで得られたバンドを切り出した。これを200mM重炭酸アンモニウム-50%アセトニトリル溶液に浸し、37℃で45分間振盪後、溶液を廃棄して、同じ操作を2回繰り返すことでクマシーブリリアントブルーを除いた。このゲルを減圧乾燥し、それに40mM重炭酸アンモニウム(pH8.1)-10%アセトニトリルに溶かしたトリプシン（20μg/ml）をゲルスライスの単位面積（mm2）あたり4μl加えて、室温で1時間置いて充分に浸潤させた。これに先に加えた量の2.5倍量のトリプシン溶液を加えて、37℃で18時間静置した。これをポアサイズが0.22μmのフィルター付きチューブで濾過して、トリプシンにより抗原が切断されて生じたペプチドを回収した。【０１４７】
7-6-2  質量分析による抗原の同定
ゲル内トリプシン消化により得られた試料を、エレクトロスプレーイオン化方式イオントラップ四重極型質量分析装置につないだHPLCにかけた。HPLCの逆相クロマトグラフィーカラムから、0.1%TFAを含む0%から80%のアセトニトリルの直線濃度勾配変化により、疎水性の違いで順次溶出される各ペプチドをエレクトロスプレー法でイオン化し、各ペプチドの質量を分析した。【０１４８】
同時に、それらのイオンの飛行経路の途中に置いたヘリウム原子との衝突により生じる各ペプチドの限定分解産物の質量を分析した。限定分解によりひとつのアミノ酸がはずれると、はずれたアミノ酸の質量分だけ小さいイオンが観測されるので、その質量差によりはずれたアミノ酸の種類を同定できる。さらにもうひとつアミノ酸がはずれると、はずれたアミノ酸の質量分だけ小さいイオンが観測されるので、その質量差によりはずれたアミノ酸の種類を同様に同定できる。同様の実験データ解析を進めることで、内部アミノ酸配列を決定することができる。得られたアミノ酸内部配列のセットを、公開されているアミノ酸配列データベースを用いて検索することにより、抗原の同定を行った。その結果、IgSF4（Accession No.NM_01433、Definition: Homo sapiens immunoglobulin superfamily, member 4 (IGSF4), mRNA）が抗原であることが判明した（図１４）。尚、同定結果は、同定された蛋白質のアミノ酸配列から類推される総質量が、トリプシン分解を行う前の抗原のSDSポリアクリルアミド電気泳動の結果により得られる分子量の実験データと矛盾しないことで、確認された。【０１４９】
８．IgSF4発現実験
8-1  IgSF4 cDNA断片の単離
(1)RNA精製
HLF細胞を15cmディッシュ7枚にて培養したのち、GIBCO社製TRYSIN-EDTA(1X)にて遊離させたのち、培地にて回収、PBS(-)にて２回洗浄したのち、Amersham Pharmacia社製RNA Extraction Kitにてtotal RNAを抽出した。すなわち、細胞にExtraction buffer 5mlを加えたのち、21G針を１０回通過させ、これを日立社製13PAチューブに入れた5mlのCsTFAの上に重層し、日立社製himac CP80betaを用いて15℃、36000rpm、20時間遠心し、得られた沈殿物をRNase free TEにて懸濁、822μgのtotal RNAを得た。
(2)逆転写反応
逆転転写反応にはInvitrogen社製のSuperscript First-Strand Synthesis System For RT-PCRを使用した。反応条件は次の通りとした。
HLF total RNA 10μg
200pmol/μl hIgSF4B  1.2μl
10mM dNTP    2μl
QW     20.8μl
hIgSF4B：5'-GTGTGCGGCCGCCTAGATGAAGTACTCTTTCTTTTC-3'（配列番号：２１１）
これらをよく混ぜた後65℃にて5分処理し、氷上に２分静置した。次に以下の試薬を加えて42℃にて2分間静置した。
5x First Strand buffer  8μl
1M DTT  4μl
Rnase inhibitor  2μl
続いてSuperscript II 2μlを加え、42℃にて50分間反応させた後、70℃にて15分処理して逆転写反応を停止した。これにRibonucleaseH 2μlを加えて37℃にて15分処理した後、フェノール/クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿を行い、最後にQW 80μlに懸濁した。【０１５０】
8-2  発現ベクターの構築
(1)ベクター
IgSF4のcDNAを発現させるためのベクターpCMVSalNotの構築を行った。ベクター構築にはクロンテク社製のpCMV-Scriptを使用した。これをSacIとKpnIにて消化したのち、0.7%アガロースゲルにて電気泳動して4.3kbのバンドを切り出し、タカラ社製suprec01にてDNA断片を抽出、これをフェノール/クロロホルム処理したのちエタノール沈殿し、得られたDNAをQWにて懸濁した。
(2)インサート
合成DNA CMKM-SacIFとCMKM-KpnIRを95℃にて5分間処理したのち室温に戻したのち、SacIとKpnIにて消化し、それをフェノール/クロロホルムにて抽出、エタノール沈殿を行ったのち、QWにて懸濁した。
CMKM-SacIF： 5'caaaagctggagctcgtcgactacccagaattcaagcttattcgcgcggccgcggtaccaggtaagtg3'（配列番号：２１２）
CMKM-KpnIR： 5'cacttacctggtaccgcggccgcgcgaataatctttccttctgggtagtcgacgagctccagcttttg3'（配列番号：２１３）
(3)結合反応
上記のベクターとインサートとを混ぜて結合反応を行い、得られた反応液を用いて大腸菌DH12Sを形質転換してLBGKプレートに蒔き、30℃にて通夜培養して大腸菌コロニーを得た。これを2mlの2xYTKにて30℃通夜培養し、得られた菌液をクラボウ社製PI-50にて処理してDNA液を得た。次にこのDNA 4μlを85℃にて5分間処理したのち、T7プライマー3.2pmol/μl 2μlとDTCSクイックスタートミックス4μlを入れ、96℃ 20sec、50℃ 20sec、60℃ 4minの処理を40サイクル行ったのち、得られた反応液をベックマン社製SEQ 2000 DNA Analysis Systemにて解析し、塩基配列を決定した。【０１５１】
8-3  PCR反応、発現ベクターへの組換え
IgSF4のcDNAクローンを単離するため、東洋紡社製KODを使用してPCR反応を行った。反応条件は次の通りとした。
200pmol/μl hIgSF4A  0.25μl
200pmol/μl hIgSF4B  0.25μl
cDNA  1μl
10xKOD buffer  5μl
25mM MgSO4  2μl
2mM dNTP  1μl
KOD plus  1μl
QW  35.5μl
hIgSF4A：5'-GAGAGTCGACGCCACCATGGCGAGTGTAGTGCTGCCGAGC-3'（配列番号：２１４）
hIgSF4B：5'-GTGTGCGGCCGCCTAGATGAAGTACTCTTTCTTTTC-3'（配列番号：２１１）
これらを氷上で混ぜたのち、ミネラルオイルを重層し、94℃にて3分間処理し、次に以下ののサイクルを33回行った。
94℃  30秒
68℃  3分
反応産物を0.8%アガロースゲルにて電気泳動し、約1.4kbのバンドを切り出した。これをQIAGEN社製Gel Extraction Kitにて回収したのち、制限酵素SalIとNotIによる消化を行い、得られたDNA断片を動物細胞用発現ベクターpCMV-SalNotに組み込んだ。これを用いて大腸菌DH12Sを形質転換したものをLBGKプレートに蒔いて30℃にて通夜培養し、大腸菌コロニーを得た。これを2mlの2xYTKにて30℃通夜培養した後、得られた菌液をクラボウ社製PI-50にて処理してDNAを得た。DNAはベックマン社製SEQ DTCK-Quick Start Kitにて反応した。反応は以下のとおり。DNA 4μlを85℃にて5分間処理したのち、以下のプライマー（T3またはT7プライマー）3.2pmol/μl 2μlとDTCSクイックスタートミックス4μlを入れ、96℃ 20sec、50℃ 20sec、60℃ 4minの処理を40サイクル行った。
プライマー
T3プライマー：AATTAACCCTCACTAAAGGG（配列番号：２１５）
T7プライマー：TAATACGACTCACTATAGGG（配列番号：２１６）
得られた反応液をベックマン社製SEQ 2000 DNA Analysis Systemにて解析し、塩基配列を決定した。その結果、IgSF4 cDNAクローンとしてIgSF4N（cDNA1：図１５−１、１５−２：配列番号２１７）とIgSF4X（cDNA2：図１６―１、１６−２：配列番号２１８）の2種類が単離された。【０１５２】
8-4  IgSF4発現ベクターのNIH3T3-13C7細胞への導入
まず、導入DNA 12μgとOpti-MEM(GIBCO社製）を0.75ml混ぜ、室温にて５分静置した。これにOpti-MEM(GIBCO社製）0.75mlとlipofectamine 2000 30μlを混ぜ、室温にて5分間静置したものを加え、よく混ぜて室温にて20分間静置した。これを10cmディッシュで培養したNIH3T3-13C7細胞に加え、CO2培養器にて37℃で1日間培養した。【０１５３】
8-5  FCM、細胞染色
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でデイッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。これを2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、cp3型抗体（035-029, 035-212, 035-215, 035-273, 035-283, 040-131, 051-054, 051-181, YA14）を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3マウスモノクローナル抗体（株式会社医学生物学研究所）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver（FCM）にて細胞集団の蛍光強度を解析した。
FCMの結果を図１７に示す。遺伝子導入をしていないNIH3T3-13C7はほとんど染色されていなかった。一方、IgSF4（cDNA1又はcDNA2）を強制発現させたNIH3T3-13C7では蛍光強度は約2倍になっていることが観察された。
IgSF4を強制発現させた細胞を免疫染色した結果を図１８に示す。IgSF4（cDNA1又はcDNA2）を強制発現させた細胞集団では明かな染色を認め、この結果は上記のFCM結果と一致していた。【０１５４】
９．発現阻害実験（RNAi）
9-1  d-siRNAの作製
鋳型としてHepG2のcDNAよりhIGSF4C, hIGSF4Dプライマーにて増幅させた880bpのDNA断片を使用した。
hIGSF4C (24mer)：5'-TTCAGGGACTTCAGGCCTTTGAAG-3'（配列番号：２１９）
hIGSF4D (24mer)：5'-CACCGATCACGGCATGATCCACTG-3'（配列番号：２２０）
siRNAの作製方法はINVITROGEN社のプロトコールに従った。即ち、鋳型DNA 100ngにT7リンカーを結合させたのち、2本のチューブに分け、一方はhIGSF4CとT7プライマーでPCR反応を行い、アンチセンス発現用DNA断片を作製、もう一方はhIGSF4DプライマーとT7プライマーでPCR反応を行い、センス発現用DNA断片を作製した。これらのDNA断片それぞれについて、T7 RNA polymeraseによる反応を行ったのち、RNAi Purification Kitを用いて合成RNAを回収し、それぞれ約30 μgのRNA産物を得た。これらを混合したチューブを沸騰した水に入れてやきなましを行い、double strand RNAを作製した。これにDicerを加えて37℃にて17時間反応したのち、RNAi Purification Kitを用いて21 μg のd-siRNAを回収した。【０１５５】
9-2  RNAi反応
細胞は高分化型肝癌細胞株HLFを使用した。細胞は前日に6穴プレート（Falcon 3516）にて継代したものを使用した。まず、Invitrogen社のlipofectamine 2000 10 μgをGIBCO社製Opti-MEM 500μgと混ぜたのち、d-siRNA 1 μgを加え、ゆっくりと混合したのち、室温にて15分間静置、これを細胞に加え、CO2培養器にて2日間培養した。【０１５６】
9-3  FCM、細胞染色
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でデイッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。これを2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、cp3型抗体（035-029, 035-212, 035-215, 035-273, 035-283, 040-131, 051-054, 051-181）を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3マウスモノクローナル抗体（株式会社医学生物学研究所）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver(FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した。【０１５７】
蛍光抗体で標識した細胞を遠心で集めたのち上清を捨て、これにベックマン・コールター社製OptiLyse B 50μlを加えて室温にて10分間静置し、細胞を固定した。これに10ng DAPI/ml PBS液950μlを加え、室温にて10分静置、遠心して細胞を集め、ICN社製MULTITEST SLIDEに封入して顕微鏡観察した。【０１５８】
以上のRNAi実験の結果を図１９、２０に示す。FCM解析では、RNAi処理を行ったものでは全体として蛍光強度が約1/1.6に下がっており、明らかな抗体認識の低下が認められた（図１９）。細胞染色の結果も明らかな膜染色の低下を示しており（図２０）、これらの結果は、サンプル抗体の認識している抗原がIgSF4であることを強く示唆した。【０１５９】
１０．発現阻害実験２（RNAi）
10-1  誘導型RNAiベクターの構築
細胞培養液中のテトラサイクリン（tetracyclin）存在下にてRNAiにおける干渉RNAを発現させ、対象遺伝子発現をノックダウン、コントロールできるシステムを用いてIgSF４のRNAi実験を行った。
IgSF4翻訳領域配列の一部GGCCCAACCTGTTCATCAATA（配列番号：２６９）をRNAi標的とした。ベクターの構築はInvitrogenのBlock-iT Inducible Lentiviral RNAi Systemのマニュアルに従った。即ち、1x anneling buffer条件にて合成DNA 832(5'-CACCAGGCTCAACTTGTTCGTCAATATTCAAGAGATATTGATGAACAGGTTGGGCC-3'：配列番号：２７０)と833(5'-GGCCCAACCTGTTCATCAATATCTCTTGAATATTGACGAACAAGTTGAGCCT-3'：配列番号：２７１)をそれぞれ50μMの濃度になるように混ぜ、95℃にて4分間熱処理したのち、室温にて5分間静置、これを1x anneling bufferにて1万倍希釈した。この2重鎖ds oligo 5μlと1μlのpENTR/H1/TOを混ぜ、附属のligation systemにて結合反応を行ったのち、附属のOne Shot TOP10 Competent E.coliにて形質転換し、50mM Kanamycinプレートに蒔いて形質転換体コロニーを得た。これを50mM Kanamycinn入りのLB培地にて培養したのち、QiagenのQIAprep Spin Miniprep kitにてDNAを調製し、H1 forward primerとV5 reverse primerを使用して、Beckman Coulter社製のGenomeLab DTCS-Quick Start Kitにてsequence反応を行い、得られた配列を解析してpENTR/H1/TO の2138より合成DNA832配列を組み込んだ目的のクローンを得た（Entry clone）。このEntry clone100ngとpLenti4/BLOCK-iT-DEST vector 150ngを混ぜて、TE buffer(pH8.0)にて8μlにメスアップしたのち、附属のLR clonase II enzyme mix 2μlを混ぜて25℃にて1時間静置、得られた反応物をOne Shot Stbl3 Competent E.coliにて形質転換し、100mg/mlアンピシリンプレートに蒔いて形質転換体コロニーを得た。これを100mM ampicillin入りのLB培地にて培養したのち、QiagenのQIAprep Spin Miniprep kitにてDNAを調製し、H1 forward primer（5'-TGTTCTGGGAAATCACCATA-3'：配列番号：２７２）とV5 reverse primer（5'-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3'：配列番号：２７３）を使用して、Beckman Coulter社製のGenomeLab DTCS-Quick Start Kitにてsequence反応を行い、得られた配列を解析したところ、entry vectorと同じ配列が得られたことから、下記に示す配列部分（下線部が合成DNAによる挿入配列（配列番号：２７４））がpLenti4/BLOCK-iT-DESTに組み込まれた、と判断した（pLenti4/BLOCK-iT-DEST expression construct）。
2087-GAAATCCCTATCAGTGATAGAGACTTATAAGTTCCCTATCAGTGATAGACA CACCAGGCTCAACTTGTTCGTCAATATTCAAGAGATATTGATGAACAGGTTGGGCC TTTTTTGTCGAGCTT【０１６０】
10-2  Entry clone のRNAi作用の確認
Entry clone段階でRNAi作用があることを以下の方法にて確認した。前日に下記のrepressor発現HLF host cell lineを50%コンフリエントになるように10cmディッシュ2枚に継代しておいた（培地は3μg/ml Blasticidin, 10%FBS, 1% penicillin /streptomycin -D MEM）。当日細胞は80-90%コンフリエントであったので、培地を10%FBS-D MEM培地（抗生物質なし）に置き換えた。
Entry cloneのプラスミド10μgにGibco BRL社製のOpti-MEM 1.5mlを入れ、ゆっくりと混ぜた。別のチューブにてInvitrogenのlipofectamine 2000 36μlとOpti-MEM 1.5mlを入れ、ゆっくりと混ぜた。これらを室温にて5分間静置したのち、混ぜ、さらに室温にて20分間静置した。これを、repressor発現HLF host cell lineに加え、ゆっくりと混和したのち、CO2インキュベータにて培養した。6時間後、培地を3μg/mlBlasticidin, 10%FBS（tetracycline tested）, 1%penicillin/streptomycin-D MEMに交換した。翌日、一方のディッシュは1μg/ml tetracycline, 3μg/ml Blasticidin, 10%FBS（tetracycline tested）, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地（tetracyclineあり）にて培地交換し、もう一方のディッシュは3μg/ml Blasticidin, 10%FBS（tetracycline tested）, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地（tetracyclineなし）にて培地交換した。Tetracycline作用後48時間時点にて細胞を回収し、FCMにてRNAi作用を確認した。【０１６１】
10-3  FCM解析
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。これを5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、35-273cp3を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3ウサギポリクローナル抗体（MBL社特注）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗ウサギIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、PBS 1mlにて懸濁し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver(FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した。その結果、tetracyclineを作用させたものでは作用させないものに比較して細胞集団の蛍光強度が顕著に減少していることが観察された。【０１６２】
10-4  Lentivirusの調製
Tetracycline repressor発現用プラスミドpLenti6/TRと上記のpLenti4/BLOCK-iT-DEST expression constructについて、Lentivirusの調製を行った。方法は以下のとおりである。293FT細胞は実験当日に約90%コンフリエントになるよう継代しておいた。当日DNA感作実験の前に抗生物質を抜いた培地におきかえた。プラスミド3μgと附属のViraPower Packaging Mix 9μgを混ぜ、これにGibco BRLのOpti-MEM 1.5mlを入れ、ゆっくりと混ぜた。別のチューブにてInvitrogenのlipofectamine 2000 36μlとOpti-MEM 1.5mlを入れ、ゆっくりと混ぜた。これらを室温にて5分間静置したのち、混ぜ、さらに室温にて20分間静置した。これに、トリプシンではがした293FT細胞1.2ｘ106個を加え、ゆっくりと混和したのち、10cmディッシュに移し、CO2インキュベータにて培養した。翌日培地を10%FBS, 2mM L-glutamine, 0.1mM MEM Non Essential Amino Acids, 1%penicillin/streptomycin, 1mM MEM Sodium Pyruvate入りのD MEMに交換して、さらに２日間培養した。DNA感作後72時間時点にて培地を回収し、0.22μmフィルターにて濾過滅菌した。【０１６３】
10-5  Lentivirusのtiter check
HLF細胞を培養し、実験前日に約25%コンフリエントになるよう6 well plateにて継代し、実験当日に約30-50%コンフリエントになるようにした。当日は、培地(10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM)で希釈したVirus液1mlを作製し、これを各wellに作用させたのち、Polybleneを終濃度6μg/mlになるように入れ、CO2インキュベータにて1日培養した。翌日、培地交換を行った。翌々日、培地をselection mediumに交換した。pLenti6/TR virusのものについては3μg/mlBlasticidin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEMを使用した。pLenti4/BLOCK-iT-DEST expression constructについては、まず細胞をトリプシンではがしたのち、10cmディッシュにて100μg/mlZeocin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地で培養した。培地交換後2週間にて形成されたコロニーを数え、それよりvirus液のtiterを算出した。その間、培地交換は2日ごとに行った。【０１６４】
10-6  Tetracycline repressor発現Host cell lineの構築
上記のpLenti6/TR virusの titer checkより得られたコロニーを10個ピックアップして個別に3μg/mlBlasticidin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地にて培養したのち、細胞をトリプシンにて回収してPBSにて洗浄、PBSにて懸濁した。これをSonifierにて超音波処理したのち、Micro BCAにてタンパク量を測定、20μg分をSDS-PAGEにて泳動し、Mo Bi Tec社製の抗tetracycline repressorウサギポリクローナル抗体にてwestern blotを行い、repressor発現の良いクローンを得た。【０１６５】
10-7  hsRNAi細胞株の選択
上記のTetracycline repressor発現Host cell lineを3μg/mlBlasticidin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地にて培養し、前日に25%コンフリエントになるように10cmディッシュにて継代した。当日はこれにpLenti4/BLOCK-iT-DEST expression construct virusを約200コロニー分感染させ、polybraneを作用させた。翌日培地交換した。翌々日、トリプシンではがして細胞を回収し、3段階の希釈系列を作って15cmディッシュにて継代した。培地は50mM HEPES, 3μg/ml blasticidin,100μg/mlZeocin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEMで、まず4℃にて2時間処理したのち、CO2インキュベータにて37℃の培養を行った。以後は2日ごとに100μg/mlZeocin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地にて培地交換を行い、14日後に24個のコロニーを単離した。これらを個別に培養し、クローン12個を得た。【０１６６】
10-8  tetracycline誘導実験
前日に、上記の各細胞クローンをそれぞれ2 wellずつ、6 well plateに約25%コンフリエントになるよう継代した。培地は 3μg/ml blasticidin,100μg/mlZeocin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEMであるが、FBSはInvitrogenのTetracycline tested FBSを使用した。当日、細胞は50-60%コンフリエントとなっていた。これに対して、1μg/ml tetracycline入りの培地と無しの培地にて培地交換した。培地交換48時間後、細胞を回収してFCM解析を行った。【０１６７】
10-9  FCM解析
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。これを5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、35-273cp3を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3ウサギポリクローナル抗体（MBL社特注）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗ウサギIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、PBS 1mlにて懸濁し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver(FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した。図２１に見られるとおり、テトラサイクリン入り培地で培養された細胞はRNAiが作用し、抗体を作用させない場合と同様FCMシフトが見られなくなり、035-273抗体の認識対象分子がIgSF4であることが確認できた。【０１６８】
１１．抗体クローンの各種細胞株に対する反応性
単離した各種抗体クローンの各種細胞株に対する反応性を以下の通りFCMで確認した。
(1)肝癌由来細胞株HEPG2（図２２）及びHLF（図２３）に対するFCM反応性を調べた。
(2)ヒト胎児腎上皮由来細胞株293T（図２４）に対するFCM反応性を調べた。
(3)ヒト腎癌由来株ACHN(図２５)対するFCM反応性を調べた。
(4)ヒトATL由来株としてKK1を用いたFCM解析を行った（図２６）。【０１６９】
(5)上記結果から最も反応性が良いと考えられた035-212抗体の反応性を、他のATL細胞表面マーカー（抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25の各種抗体）の反応性とFCMで比較した（図２７）。
(6)IgSF4の非発現性ATL細胞株と発現性ATL細胞株の比較として、IgSF4のプロモーターがメチル化されているヒトATL由来細胞株ED、Su9T、SO4と、メチル化されていないヒトATL由来細胞株KK1、KOB及びST1に関してFCMで比較した（図２８）。
(7)ATLはHTLV感染が原因で発症する特殊な白血病と考えられている。そこで、非HTLV感染T細胞株とHTLV感染T細胞株の比較として、ヒト非ATL由来細胞株MOLT4（ヒトT細胞性白血病由来株）及びJurkatと、ヒトT細胞指向性ウイルス感染（HTLV感染株）T細胞リンパ腫由来のHUT102、MT-2に関してFCMで比較した（図２９）。【０１７０】
(1)〜(7)におけるFCM実験操作は以下のようにして行われた。
まず、付着性細胞株については6穴プレート（Falcon 3516）において、ATL由来細胞株などの浮遊細胞株は浮遊培養フラスコ（70ml(スラントネック)）において、培地（RPMI-1640：Sigma-Aldrich 社製、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリンーストレプトマイシン溶液）を用い、CO2インキュベータ内、37℃で培養したものを使用した。【０１７１】
i）付着性細胞株は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。一方、浮遊系細胞の場合は一度培地を除くためにそのままの状態で遠心分離（400xg, 4℃, 2分）した。このような操作の後、各細胞を2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄し、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置した後、106個/wellになるように分注し、遠心分離（400xg, 4℃, 2分）し上清を除いた。【０１７２】
ii-1）cp3型抗体の場合、5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3マウスモノクローナル抗体（株式会社医学生物学研究所）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、固定液（ホルムアル デヒド）50μlを添加し、10分静置した。その後PBS 150μl添加し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver（FCM）にて細胞集団の蛍光強度を解析した（(1)〜(3)）。【０１７３】
ii-2）pp型(protein A型)抗体の場合、5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、固定液（ホルムアルデヒド）50μlを添加し、10分静置した。その後PBS 150μl添加し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver（FCM）にて細胞集団の蛍光強度を解析した((4)〜(7))。【０１７４】
ii-3）また、KK1細胞に関しては他のATL細胞表面マーカー抗体（抗ヒトCD3-マウス抗体（Becton Dickinson社製）、抗ヒトCD4-マウス抗体（Becton Dickinson社製 ）、抗ヒトCD8-マウス抗体（Becton Dickinson社製）、抗ヒトCD25-マウス抗体（Becton Dickinson社製））を用い、取得した抗体と比較するため、コントロールとして以下の手順とした。上記抗体を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、固定液（ホルムアルデヒド）50μlを添加し、10分静置した。その後PBS 150μl添加し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver（FCM）にて細胞集団の蛍光強度を解析した（(5)の抗CD抗体を用いた場合）。【０１７５】
本解析は検出抗体にあらかじめ蛍光色素（Alexa488等）を標識しておき、サンプル抗体を細胞と反応させた後、検出抗体と反応させる。細胞の表面に存在する抗原量に応じて結合する抗体量に差が生じ、その結果蛍光強度が異なってくるため、その細胞の表面に存在する抗原との親和性及び抗原量を推定することができる。更に死細胞およびデブリス等を測定値から除去する為、前方散乱光(Foward Scatter: FSC)をX軸に、側方散乱光(Side Scatter: SSC)をY軸にとり、ドットプロット展開から得られるデータより、生細胞と思われる集団（培養細胞使用の為ほぼ同一集団）にゲートをかけ、このゲート内のみ蛍光強度の測定を行った。【０１７６】
以上の(1)〜(4)の実験結果（図２２〜図２６）から明らかなように、各種抗体が一様にほぼ同じシフトを見せたことから腎癌、肝癌、ATLに見られる細胞膜表面上のIgSF4をマーカーとして捕らえることが可能といえる抗体を数多く取得できていることが明らかになった。また、(5)の実験結果（図２７）から、コントロールとしてのATL細胞表面マーカーCD3、CD4、CD8、及びCD25と比較して、IgSF4は遜色ない或いは勝るATL細胞表面マーカーといえる。また、この実験によって、膜表面上の分子であり、新たなATL細胞表面マーカーとなるIgSF4を特異的に認識する抗体が取得できていることが裏付けられた。【０１７７】
(8)Northern BlotによるIgSF4のmRNA発現解析（図３０）
各細胞よりFastTrack 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用してmRNAを抽出した。その後得られたmRNA3μgを1%アガロースゲルでMOPS緩衝溶液中で電気泳動した後、ナイロンメンブレン(BIODYNE Pall BioSupport, East Hills, NY)に転写したした。その後IgSF4の411位から1371位の961bpのp32標識のプローブを用いてNothern blotを行なった。プローブのラベルはPrime-lt II Random Primer Labeling Kit (Stratagene,  La Jolla, CA)を使用した。
(6)及び(7)の実験結果（図２８、図２９）とNorthern Blotの結果（図３０）を合わせて考えると、細胞表面上にIgSF4分子が発現している、ATL由来細胞株（KK1、KOB、ST1）及びHTLV感染細胞（HUT102、MT-2）を認識する抗体が取得できていることが分かる（プロモーターのメチル化によってIgSF４発現が見られない細胞、及びHTLV非感染細胞はこの抗体で認識されない）。【０１７８】
１２．抗IgSF4抗体のFCM解析及びADCC活性測定
抗体依存性細胞性細胞傷害（Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity、以下ADCCと略す）は、ウイルス感染細胞など人体にとって有害な細胞を殺傷、攻撃する免疫反応であり、膜表面に広く抗体が結合した細胞を標的と見なし、ナチュラルキラー細胞や単球を主とする「エフェクター細胞」が攻撃する機構である。ADCCによる細胞傷害性は、細胞膜表面抗原に特異的に結合する抗体、およびエフェクター細胞の組み合わせに依存して起きる。
腫瘍表面抗原に特異的に結合する抗体のうちのいくつかは抗腫瘍効果、がん治療効果が示され、抗体医薬として販売されているが、これら抗体の主要な作用機序はADCCであるという報告がなされている。そこで、本発明者らが単離に成功したがん抗原特異的抗体に抗腫瘍効果があるか、即ちがん治療用抗体として有望であるかを評価するための方法として、ADCCの検出を試みた。以下に示す実験では標的細胞にIgSF4を認識するヒトIgG型抗体クローンを反応させてエフェクター細胞に提示するという方法を用いた。ADCCの検出は、エフェクター細胞により攻撃された標的がん細胞から培地中へ漏出する乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を、試薬の発色で検出する原理の細胞傷害性検出キットを用い、傷害の度合いを算出した。【０１７９】
12-1  IgG型抗体のFCM解析
i）A431細胞株は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。それを2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、106個/wellになるように分注した。
調製したIgG型抗体035-029を、5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗ヒトIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、固定液（ホルムアル デヒド）50μlを添加し、10分静置した。その後PBS 150μl添加し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver（FCM）にて細胞集団の蛍光強度を解析した(図３１)。【０１８０】
12-2  IgG型抗体の調製
ADCC活性測定実験に用いるIgG型抗体（クローン番号035-029、YA14（抗インフルエンザウイルス抗体）、HR1-007（抗ハブ毒抗体））をコードする遺伝子断片を導入したチャイニーズハムスター細胞株CHO-K1を、無血清培地（CHO-S-SFM II：Invitrogen 社製、1% (v/v) Penicillin - Streptomycin Solution：Sigma-Aldrich 社製、700 μg/ml G418：Sigma-Aldrich 社製）大量培養フラスコ（Becton Dickinson 社製 CELLine 1000 Flask）で2週間培養した培養上清を回収し、Protein G 結合アフィニティカラムへ反応させた。PBSで洗浄後、グリシン塩酸緩衝液（pH 2.7）でカラムから溶出させ、トリス塩酸緩衝液（pH8.9）で中和した。精製された抗体サンプルは透析濃縮用チューブ（Millipore 社製、Amicon Ultra-15）を用いて PBS にて置換、濃縮したものを実験に用いた。【０１８１】
12-3  標的細胞の調製
用いる標的細胞として、直径150mmの培養ディッシュ上で液体培地 1（Minimum Essntial Medium Alpha Medium：Invitrogen 社製、10%(v/v)ウシ胎児血清：Equitic-Bio 社製、1%(v/v)Penicillin - Streptomycin Solution：Sigma-Aldrich 社製）にて肺がん由来培養細胞VMRC-LCD（Japanese Collection of Research Bioresourcesより分与された）を成育させた。液体培地を除去し、細胞をPBS 10 mlで2回洗浄し溶液を除去した後、4%(w/v)コラゲナーゼType IV（Invitrogen 社製）を5 ml加え37℃で10分保温させることにより細胞を培養ディッシュから剥離させた。さらに5 mlの液体培地2（RPMI-1640、10% (v/v) ウシ胎児血清、1% (v/v) Penicillin - Streptomycin Solution：Sigma-Aldrich 社製）（RPMI-1640：Sigma-Aldrich 社製、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリンーストレプトマイシン溶液）を加えてコラゲナーゼ反応を停止させ、浮遊した細胞6.7 x 106を回収した。遠心分離（200 x g、4℃、3 分）を行い上清を除いたあと、細胞密度が3 x 105cells/mlになるように細胞傷害性試験培地（Cytotoxic Medium、以下、CTMと略す。RPMI-1640 培地、1% (v/v)ウシ胎児血清、1% (v/v) Penicillin - Streptomycin Solution、1% (v/v) 1M HEPES buffer (pH7.0)：Invitrogen 社製）にて懸濁し実験に用いた。【０１８２】
12-4  エフェクター細胞を含む末梢血単核球の調製
ボランティアから採血したヘパリン添加末梢血30 mlをPBSで80 mlに希釈し、遠心チューブ4本に10 mlのリンパ球単離試薬Ficoll Paque Plus（Amersham Bioscience 社製）を分注しておいたものに静かに重層し、遠心分離（400 x g、20℃、40分）した。単核球画分（リンパ球と単球を含む）を回収して冷PBSにて80 mlに希釈し、遠心分離（200 x g、4℃、15分）により沈殿させた。沈殿物を細胞密度が7.5 x 106 cells/mlになるようにCTMにて懸濁した。【０１８３】
12-5  ADCC反応
U底96穴マルチプレート（Becton Dickinson 社製）に1ウェルあたり66μlの標的細胞（2 x 104 cells）を入れ、IgG型抗体（3 μg/ml）66 μlを加えたのち、66μlの末梢血単核球懸濁液（7.5 x 105 cells）を加えた。E/T ratio（エフェクター細胞と標的細胞の比率）は20とした。細胞同士の会合を促すため遠心分離（60 x g、4℃、5分）を行い細胞を底部へ沈めたのち、37℃、5% CO2の条件に設定した培養装置で240分保温してADCC反応を誘導した。各抗体サンプルはCTM溶液として調製した。また、それぞれのサンプルについて陰性コントロールとしてCTMを用い、乳酸デヒドロゲナーゼの最大遊離量コントロールとして、標的細胞に100μlの2% Triton X-100 - CTM溶液を加えたものを用いた（Triton X-100によりあらかじめ細胞を破壊）。また、それぞれの実験群につき3つのウェルを使用した。【０１８４】
12-6  細胞傷害性試験
ADCC反応後、細胞傷害性検出キット（Roche Diagnostics 社製）の方法に従って以下のように操作を行った。遠心分離（350 x g、4℃、10分）を行い、上清100μlを回収し、平底96穴マルチプレート（TPP 社製）に移した。各サンプルにつき細胞傷害性検出キットの反応液100μlを加えたのち、室温で静置することにより色素の発色を誘導した。発色の程度は培養上清中に遊離した乳酸デヒドロゲナーゼの濃度に比例し、標的細胞のダメージの指標となる。発色開始から30分後、分光光度計により吸光度（OD490 - OD620（バックグラウンド吸光度））を測定し、各実験群につき3つのウェルの吸光度を平均し細胞傷害性指数（Cytotoxic Index）を算出した。あらかじめ培地のみの吸光度を引き算し、以下の計算式のように行った。
【数１】
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【０１８５】
膜分子IgSF4に特異的に結合するIgG型抗体,クローン035-029の場合、エフェクター細胞を加えた実験群において有意に細胞傷害性が上昇していた（図３２）。すなわち、標的細胞VMRC-LCDに特異的に結合した抗体クローンをエフェクター細胞が認識し、標的を攻撃していることが示された。VMRC-LCDの表面抗原に関連しないと見なしている抗ハブ毒IgG型抗体,クローンHR1-007及び抗インフルエンザ抗体YA14（結果を図示せず）や抗体クローンを加えない実験群では細胞傷害性の上昇は見られなかった。尚、他の抗体クローン（035-273、051-054）についてもcp3型抗体を一次反応させた後、二次抗体として抗cp3ウサギポリクローナル抗体を用いて同様のADCC活性測定実験を行ったところ、抗体クローン035-029と同様にADCC活性を有することが確認された（データ示さず）。
以上の結果から、IgSF4を介して癌細胞を特異的に認識し、そしてADCC活性による傷害効果を発揮する抗体の取得に成功したことが確認された。従ってこれらの抗体は、癌細胞を標的とした抗体医薬として有効であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明によれば、癌特異的に発現し、癌治療や癌診断の標的となる分子を見出したことに基づいて、癌の治療や診断、或いは癌の発症機序などの研究に有効な手段が提供される。本発明が提供する抗IgSF4抗体は、IgSF4を特異的に発現する癌細胞を標的とした治療用抗体、診断用抗体、研究用抗体等として利用されることが期待される。【０１８７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１８】
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【図２０】
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【配列表】
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