(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体外で、レシピエントから得た末梢血単核球細胞(ＰＢＭＣ)においてＴ細胞寛容を誘導するための方法であって、調節組成物を該末梢血単核球細胞に添加することを含み、該組成物は照射されたドナー刺激細胞およびＴＧＦ−βを含む方法。
【請求項２】
末梢血単核球細胞を増やす工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
調節組成物がＩＬ−２およびＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
医薬としてレシピエント細胞を製剤化することをさらに含む、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ドナー細胞に対するＴ細胞寛容を誘導するための医薬の製造のための、請求項１−４のいずれかに記載の方法に従って処理されたレシピエント末梢血単核球細胞(ＰＢＭＣ)の使用。
【請求項６】
移植拒絶反応を防止するための医薬を製造するための方法であって、
a）臓器ドナーから得た末梢血単核球細胞(ＰＢＭＣ)由来のＴ細胞枯渇単核球細胞を照射すること、
b）体外で、レシピエントから得た末梢血単核球細胞(ＰＢＭＣ)を、照射されたドナーＴ細胞枯渇単核球細胞の集団およびＴＧＦ−βを含む調節組成物と混合し、レシピエント抑制Ｔ細胞の集団を誘導すること、
c）該レシピエント抑制Ｔ細胞の集団を増やすこと、
d）該レシピエント抑制Ｔ細胞を医薬として製剤化すること、
を含む方法。
【請求項７】
調節組成物がＩＬ−２およびＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
レシピエントから得たＰＢＭＣが、ＣＤ４＋Ｔ細胞を多く含んでいる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を多く含んでいる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
レシピエントから得たＰＢＭＣが、ＣＤ８＋Ｔ細胞を多く含んでいる、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年４月１１日に提出のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ. ６０,１９６,４４６の継続出願である。
【０００２】
本発明の分野は、臓器移植後レシピエントにおける移植拒絶反応を防止するための、有用な組成物および方法に関する。
【０００３】
（背景技術）
臓器移植は、ヒトの生活の質を高めるために利用されてきた。実質的な進歩が腎臓、心臓、肺、肝臓および膵臓に関する移植でなされてきた。一般的に、免疫抑制剤は、これら臓器の直接的拒絶反応を遮断する場合に有効である。しかし、臓器が、非近縁のドナーからである場合、即ち同種異型移植片である場合、免疫抑制剤が慢性的同種移植片拒絶反応を遮断するのに有効でないことが多いため、これらの薬剤は、時間経過と共に有効性が低下する。さらに、長期間の免疫抑制治療に関連する強い副作用が存在する。毎年、おおよそ１０,０００件の肝臓移植がアメリカでは行われている。移植が、少なくとも１年間は十分機能するという見込みが増加する一方、過去２０年間、慢性的同種移植拒絶反応を防止することに進歩がなかった（参照. 図１；In Fundamental Immunology, 4th ed., Paul, W.E.(ed.), Lippincott-Raven, Philadelphia, 1999, p.1201）。結果として、僅か５０％の移植が数年後も依然機能している。そのため、慢性拒絶反応を防止するための新規方法に対する緊急的な必要性が存在する。
【０００４】
レシピエントの免疫系が外来の組織適合性抗原を認識する場合に、移植拒絶反応が生じる。まれに、拒絶反応は前もって形成されたか、又は反復輸血の結果により、抗体によって引き起こされる。一般的に、拒絶反応は、レシピエントからのＴリンパ球がドナー組織適合性抗原を認識し、それに応答する場合に生じる (Pescovitz MD, Thistlethwaite JR Jr, Auchincloss H Jr, et al. J Exp Mad 1984;160:1495-1508)。
【０００５】
２つの主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)座が存在する。主要および副の両方の組織適合性抗原が、それらをコードする遺伝子とともに発表されている。１つは、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるＭＨＣクラスＩ抗原をコードするものでり、もう１つは、ＣＤ４＋細胞によって認識されるＭＨＣクラスＩＩ抗原をコードするものである。ＭＨＣクラスＩ抗原は、体の殆どすべての組織上で発現する。 ＭＨＣＩおよびＩＩ抗原の両方は非常に多形であり、関連のない個体からの抗原が同一であることはほとんどありえない。
【０００６】
ドナーおよびレシピエント間のＭＨＣ抗原における違いが、移植臓器の拒絶反応をもたらすレシピエントによる強い免疫応答の引きがねとなる。外来ＭＨＣ抗原は、レシピエントの免疫細胞によって直接認識され、ドナーＭＨＣ抗原で処置されたレシピエントの抗原提示細胞によっても間接的に認識される。同種移植拒絶反応の古典的モデルは、ドナーのＭＨＣクラスＩＩ抗原を認識するレピシエントのＣＤ４＋Ｔ細胞を力説するものであった。これら活性化ＣＤ４＋細胞は、ドナーＭＨＣクラスＩ抗原の直接的な認識によって感作されるレシピエントＣＤ８＋に対するヘルパー細胞として機能する。次いで、活性化ＣＤ８＋細胞は、ドナー細胞を溶解することによって殺す(Mizuochi T, Golding H, Rosenberg AS, Glimcher LH, Malek TR, Singer A. J. Exp Med 1985;162:427-443. 205)。さらなる研究により、レシピエント抗原提示細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞のさらなる関与が明らかとなり、移植拒絶反応に関与し得る機構についての複雑さが増した。
【０００７】
移植後最初の数週間に生じる移植片破壊は、「急性拒絶反応」と呼ばれる。通常、免疫抑制剤の使用は一時的にこの結果を防止する。残念ながら、この移植片は、数週間もしくは数ヶ月後についに不作用となることがある。この不作用は「慢性拒絶反応」と呼ばれる。体液および細胞の両方のメカニズムが、慢性拒絶反応に影響する。抗ドナー抗体は、慢性拒絶反応を促進すると主張されてきたが、これが論争点となっている。一般的に、慢性拒絶反応は、ドナーＭＨＣ抗原に対する免疫系の永続的感作の結果であると考えられる。レシピエントの免疫細胞は、自身ではＭＨＣ抗原を受容することを「学習」できず、移植片を攻撃することによって応答する。
【０００８】
移植拒絶反応を防止するために２つの方法がある。第一は非特異的免疫抑制剤での処置によるもので、第二はドナー特異的寛容を誘導することである。
【０００９】
標準的な第一の方法は、免疫抑制剤、例えば、ステロイド、アザチオプリン、マイコフェノレート、シクロスポリン、ＦＫ-５０６、ラパマイシン、レフルノマイド、または１５-デオキシスペルグアリンを使用することである。これらの薬剤は、リンパ球遺伝子転写、サイトカインシグナルトランスダクション、ヌクレオチド合成および細胞分化を阻害することにより免疫応答を抑制する。これらの薬剤は、感染および悪性腫瘍のリスクを、生涯を通じて増加させかねない。さらに、抗Ｔ細胞抗体、例えば、抗リンパ球細胞血清または抗胸腺細胞グロブリンは強力な免疫抑制剤である。しかし、それらは血清不調および感染合併症を含む重い副作用を持つ。さらに近年、ＯＫＴ３、ヒトのＣＤ３抗原に対するマウス抗体が医療用移植に広く使用されている(Cosimi AB, Burton RC, Colvin RB, et al Transplantation 1981;32:535-539)。別の使用されているモノクローナル抗体には、ＩＬ-２受容体(抗ＣＤ２５)抗体および抗ＩＣＡＭ-１または抗ＴＮＦ-α抗体があり、これらは移植拒絶反応のエフェクターメカニズムを遮断する。これらのモノクローナル抗体も広い毒性副作用を有する。
【００１０】
移植免疫学の最終ゴールは、レシピエントがドナー組織適合性抗原に寛容となるようにすることである。即ち、移植片が拒絶反応を示さないようにレシピエントの免疫細胞がドナー抗原を認識するのを防止することである（即ち、ドナー臓器を"自身"として受容すること)。この分野における現状は、本明細書中もしくは他の文献でも説明されている(See Hugh Auchincloss, Jr., Megan Sykes, and David H. Sachs In Fundamental Immunology, 4th ad., Pau), W.E. (ed.), Lippincot-Raven, Philadelphia, New York, 1999 pp 1182-1222)。
【００１１】
寛容は３つのメカニズムによって達成され得る。第一番目は、「クローン削除」、即ちドナー抗原に反応するリンパ球の排除である。第二番目は、「クローンアネルギー」、即ちドナー抗原への応答においてＴ細胞が増殖しないことである。一般的には、アネルギー(不応答性)は可逆的であり、抗原の感染または排除によって可逆的となり得る(Roche B, Tanchot C, Von Boehmer H. J Exp Mad 1993;177:1517-1521) (Ramsdell F, Fowlkes BJ. Science 1992;257:1130-1134)。第三番目は、「抑制」である。この抑制は非特異的もしくは抗原特異性的のいずれかで有り得る。非特異的抑制は、免疫機能を阻害する可溶性分子の分泌から生じ得る。抑制分子は、プロスタグランジン(Snijdewint FGM, Kalinski P, Wierenga EA, Bos JD, Kapsenberg ML. J Immunol 1993;150:5321-5329; Betz M, Fox BS. J Immunol 1991;146:108-113)、酸化窒素(Langrehr JM, Dull KE, Ochoa JB, et al. Transplantation:1992;53:632-640)およびサイトカイン(Verbanac KM, Carver FM, Haisch CE, Thomas JIM. Tranplantation 1994;57:893-900; Raju GP, Belland SE, Eisen HJ. Transplantation 1994;58:392-396)を包含する。
【００１２】
「抑制性細胞」と呼ばれるＴ細胞は、非特異的に移植拒絶反応を遮断するＩＬ-４、ＩＬ-１０、ＴＧＦ-βを包含する抑制サイトカインを産生する(Qin L, Chavin KD, Ding Y, Woodward JE, Favaro JP, Lin J, Bromberg JS. Ann Surg 1994;220:508-519); (Qin L, Chavin KD, Ding Y, et al. J Immunol 1996; 156:2316 -2323); (Zheng XX, Steele AW, Nickerson PW, Steurer W, Steiger J, Strom TB. J Immunol 1995;154:5590-5600)。同種抗原-抑制性細胞の存在が報告されているが(Pearce NW, Spinelli A, Gurley KE, Hall BM. Transplantation 1993;55:374-379; Roser BJ. Immunol Rev 1989; 107:179-202; Tomita Y, Mayumi H, Eto M, Nomoto K. J Immunol 1990;144:463-473)、これらの細胞はクローン化が難しい(Koide J, Engleman EG. J Immunol 1990;144:32-40)。
【００１３】
胸腺により産生される本来の抑制性Ｔ細胞はマウスで特徴分析されてきた。これらは、ＣＤ２５、細胞表面のＩＬ-２受容体α鎖を発現するＣＤ４＋細胞である(Shevach, E. A. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18:423-449.; Seddon, B., and D. Mason, (2000) 21:95-99,; Sakaguchi, S., N. Sakaguchi, M. Asano, M. Itoh, and M. Toda, (1995) J. Immunol. 155:1151-1164)。近年、このＴ細胞サブセットは、ヒトでは十分説明されておらず、これらの細胞が末梢血管まで増え得るかどうかは知られていなかった。
【００１４】
ＣＤ４＋細胞は、ＩＬ-１０によって繰り返して刺激されるか、未成熟デンドリマー細胞によって活性化されると、下方調節活性を発揮する (Groux, H., A. O'Garra, M. Bigler, M. Rouleau, S. Antojejko, J. E. De Vries, and M. G. Roncarolo, (1997) Nature. 389:737-742; Jonuleit, H., E. Schmitt, G. Schuler, K. Jurgen, and A. H. Erik. (2000) J Exp Med 192:1213-1222)。これらのＴ細胞、いわゆるＴＲ１またはＴＲ１様細胞はアネルギー性であり、それら免疫抑制効果は、ＩＬ-１０およびＴＧＦ-βによって媒介される。アネルギーＴ細胞は、抗原提示細胞を標的化することによって別のＴ細胞の応答を抑制する (Taams, L. S., A. J. M. L. van Rensen, M. C. M. Poelen, C. A. C. M. van Els, A. C. Besseling, J. P. A. Wagenaar, W. van Eden, and M. H. M. Wauben (1998) Eur J Immunol 28:2902-2912; Vendetti, S., J. G. Chaff, J. Dyson, E. Simpson, G. Lombardi and R. Lechler, (2000), J. Immunol. 165:1175-1181)。残念ながら、これら非常に多数の細胞は抑制活性を必要とし、それらは増殖能力が非常に乏しい。
【００１５】
Ｔ細胞によって産生されたサイトカインのプロファイルは、臓器移植片の生存に影響し得る。炎症性Ｔｈ１応答(ＩＬ-２およびＩＦＮ−γ）から、抗炎症性Ｔｈ２(ＩＬ-４、ＩＬ-１０)応答へのＴ細胞応答におけるシフトは、同種移植片の受容に関連する(Roser BJ. Immunol Rev 989: 107: 179-202; Lancaster F, Chui YL, Batchelor JR. Nature 1985;315:336-337; Wilson. Immunol Rev 1989;107:159-176)。非常に限定されたデータが、寛容誘導におけるＴｈ２細胞の活発な役割を示唆している(Bucy RP, Li J, Huang GO, Honjo ,, FASEB J 1995;9:A497; Wilson. Immunol Rev 1989;107:159-176)。さらに、いくつかの場合で、Ｔｈ２細胞は移植拒絶反応について媒介もしくは寄与し得る。
【００１６】
Ｔ細胞を阻害性サイトカインに寛容となる、もしくはそれを産生するように特異的に方向づける方法は、移植臓器の生存を増進させるのに非常に有用である。いくつかの寛容誘導ストラテジーが、従来の免疫抑制剤と併用して試されてきた。齧歯類において、寛容は、マウスに致死量の照射を与え、そしてＴ細胞を涸渇させた同系のおよび同種異系の骨髄細胞を戻して動物を生存せしめることにより達成され得る。動物を再増殖する造血細胞はドナーおよびレシピエント細胞の両方の組織適合性抗原を提示し、そうして、各々のマウス株からの移植片に対して寛容となる (Singer A, Hathcock KS, Hodes RJ. J Exp Mad 1981, 153:1286)。発表されている非骨髄性調整（コンディショニング)養生法では、マウスが致死量以下で照射され、Ｔ細胞がモノクローナル抗体により枯渇され、共刺激分子を遮断する抗ＣＤ１５４またはＣＴＬＡ ４ｌｇのいずれかが与えられる(Wekerle, 1999)。このストラテジーは、中枢性寛容を達成し、長い持続効果を持つが、まだ大きな動物には実施されていなかった。これらのストラテジーを臨床上の移植において長期的治療に代えるために使用されることはなかった。
【００１７】
末梢性寛容は、共刺激分子を遮断することによって達成され得る。ＣＴＬＡ４１ｇと抗ＣＤ１５４の併用は、マウスにおける一次的な皮膚同種移植片の生存を著しく長くした(Larsen CID, Elwood ET, Alexander DZ, et al. Nature 1996;381:434-438; Kirk AD, Harlan DM, Armdtrong NN, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94:8789-8794)。共刺激分子を遮断するためのストラテジーに関する主な問題は、ドナー抗原を認識し得るレシピエントにおいて新規Ｔ細胞の生成を防止できないということである。
【００１８】
造血細胞移植を受けなかったヒトレシピエントの中で何年もの間生存した臓器移植の例がある(Starzl TE, et al. (1993) Transplantaion, 55:1272-1277)。これらの例においては、移植片からのパッセンジャー白血球が胸腺に移動し、それに続いて胸腺細胞を寛容にしたのかもしれない。急性拒絶反応を防止するために使用される大容量の免疫抑制剤は、この胸腺の学習を遮断する。免疫抑制治療に関する用量を低下するためのストラテジーは、この問題を克服し、長く続く中枢性寛容を導くであろう。
【００１９】
移植拒絶反応を防止するための理想的な方法は、ドナー組織適合性抗原に対するレピシレントによる免疫性攻撃を抑制する能力を発達させるように、Ｔ細胞を誘導することであろう。ＩＬ-１０の存在下で、繰り返し活性化されたＣＤ４＋細胞は、強い抑制活性を獲得するが、これらの細胞は非常に短い生存スパンであり、不十分な増殖能力であった(Groux H, et al., (1997) Nature, 389:737-42)。従って、堅固で増殖し得る抑制性Ｔ細胞を生成するための方法が必要とされる。
【００２０】
（発明の要旨）
上記目的に従って、本発明は、実質臓器移植のレシピエント中にＴ細胞寛容を誘導するために使用され得る組成物および方法を提供する。本組成物は、抑制活性を発揮するようにＴ細胞群を誘導することにより免疫機能を阻害または抑制する化合物を包含する。本発明の組成物中の有用な化合物は、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ-４、ＩＬ-１０およびＴＧＦ-β、ケモカイン、プロスタグランジンおよび酸化窒素を包含する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、ドナーおよびレシピエントから末梢単核血液細胞(ＰＢＭＣ)を取出すこと、そのドナーおよびレシピエント細胞を共に、Ｔ細胞抑制活性を誘導する化合物の存在下で培養すること、これらの処置細胞をレシピエントへ移植片の移植後に投与すること、を含むレシピエントにおける移植拒絶反応を阻止する方法を提供する。
【００２２】
さらなる実施態様において、本発明は、Ｔ細胞群の精製、調整および増加のために閉鎖系を使用し、次いでＴ細胞を患者に投与する。
【００２３】
（図面の簡単な説明）
図１は、ここ２０年間で慢性拒絶反応の防止について進歩がないことを示す。
【００２４】
図２は、細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する細胞の発生におけるＴ細胞サブセットに対するＴＧＦ-βの効果を示す。１方向の同種混合リンパ球反応(ＭＬＲ)を、細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する調節性Ｔ細胞を生成するために用いる。同種のＭＬＲにおいて、１つの個体(即ち、Ａ)からのＴ細胞を、関連のない個体(即ち、Ｂ)からの細胞と混合する。細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する調節性Ｔ細胞がない場合、個体ＡのＴ細胞は、Ｂの細胞を外来物質として認識し、Ｂの細胞を殺す能力を顕出する。
【００２５】
この殺傷を防止する調節性Ｔ細胞サブセットは、負の選別によりＡからつくる。すなわち、その細胞を適切なモノクローナル抗体で染色し、次いで免疫磁性ビーズを用いて、染色された細胞を除去する。得られるＴ細胞サブセットを、ＴＧＦ-βの存在下でＢからの細胞と５日間培養する。コントロールは、ＴＧＦ−βの非存在下で刺激細胞と培養したＴ細胞からなる。
【００２６】
ＴＧＦ-β調整したＴ細胞サブセットの同種ＭＬＲに対する作用を、調節性細胞とエフェクター細胞とを１：４の比で混合することによって測定した。Ｂからの刺激細胞とともに５日間培養した後、ＡからのＴ細胞の細胞毒性活性を、標準的なクロミウム放出アッセイを用いて測定した。このアッセイにおいて、表示のエフェクター対標的細胞比で、Ａからのエフェクター細胞をＢからのクロミウム標識化リンパ芽球と混合してある。クロミウム放出は、４時間のアッセイで測定した(白四角□)。ＴＧＦ-βの非存在下で刺激細胞と共に培養したコントロールＴ細胞サブセットは、白丸（○）によって示した。ＴＧＦ-βの存在下で刺激細胞と共に培養したＴ細胞サブセットは黒丸(●)として示した。全ての実験において、ＴＧＦ-βは細胞毒性活性の発生を抑制するＴ細胞サブセットの能力を増強した。
【００２７】
図３は、ＴＧＦ-βの存在または非存在下で、刺激細胞と共に培養したＣＤ４ ＣＤ４５ＲＡＴ細胞に対するＴＧＦ-βの制御効果について、２つの独立した実験を示す。ＴＧＦ-βの非存在下で刺激細胞と培養したコントロールＣＤ４ＣＤ４５ＲＡ細胞は、緩和な抑制活性を持っていた。一方、ＴＧＦ-β１ng/mlで起動されたＴ細胞は、同種ＣＴＬ活性を著しく抑制または消失した。
【００２８】
図４は、ＣＤ４抑制細胞が、細胞毒性Ｔ細胞活性を阻害するために細胞接触を必要とすることを示す。この実験において、ＣＤ４ＣＤ４５ＲＡからの調節性ＣＤ４細胞を、図２および３に記載のＴＧＦ-βで調整した。その細胞のアリコートを、Ａからの応答Ｔ細胞およびＢからの刺激細胞と混合した。調節性細胞の分離アリコートを、膜によって応答細胞および刺激細胞から分離した。結果は、それらの調節効果を発揮するために抑制性Ｔ細胞が細胞接触を必要とすることを示した。
【００２９】
図５は、ＴＧＦ-βによって誘導された調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞によるリンパ球増殖の抑制を示す。ＡからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、上記記載のように刺激細胞と混合し、表示の割合で新しい応答細胞と刺激細胞を添加した。このバーは、培養７日後のトリチウム化チミジン±ＳＥＭの平均的取りこみを示す。白色バー（Ｎｉｌ)は、ＣＤ４＋細胞を含まない応答Ｔ細胞の増殖性応答を示す。濃い斜線のついたバーは、ＴＧＦ-βを含まないで刺激細胞とともに培養したコントロールＣＤ４+細胞の作用を示す。黒いバーは、ＴＧＦ-β(1 ng/ml)存在下に刺激細胞とともに培養したＣＤ４＋細胞の作用を示す。培養７日後の照射した刺激細胞に添加した新しい応答細胞の増殖性応答に対する、これらＣＤ４+細胞の作用を示す。
【００３０】
図６は、ＴＧＦ-βによって誘導されたＣＤ４+調節性Ｔ細胞の強さを示し、それらがＣＤ２５を発現することを示す。照射した同種刺激細胞±ＴＧＦ-β(1 ng/ml)で免疫起動したナイーブＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ４調節性細胞を、細胞分類によってＣＤ２５＋およびＣＤ２５−の分画に分離した。図６Ａは、１：４の割合で新規Ｔ細胞と混合した起動ＣＤ４＋細胞の効果を示す。この抑制活性はＣＤ２５分画に集中する。図６Ｂは、ＣＴＬ活性の発生に対する、新しい応答性細胞に添加したこれら起動ＣＤ４＋Ｔ細胞の様々な希釈の効果を示す。表示の結果は、エフェクターと標的細胞を１００：１の割合で実施した。顕著な抑制活性は、１以下のＣＤ４regを１００の応答性Ｔ細胞と混合した場合に存在する。
【００３１】
図７は、ＣＤ４＋細胞によるＣＤ２５およびＣＴＬＡ-４の発現に対する調節組成物の効果を示す。Ｔ細胞サブセットを、ＤＢＡ/２マウスの脾臓から調製した。ＣＤ４＋細胞を、示した日数の間、ＴＧＦ-β(０.１-１ng/ml)の存在または不存在で、Ｃ５７ＢＬ/６マウスから照射した同種異系の脾臓リンパ球と培養した。細胞を、ＣＤ２５もしくはＣＴＬＡ-４について染色し、各マーカーを発現する細胞の％をフローサイトメトリーにより測定した。５日まで、ＴＧＦ-βの存在は、ＣＤ２５およびＣＴＬＡ-４の発現を著しく増強した。
【００３２】
図８は、同種異系抗原に対するＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の増殖性応答を示す。本来のＣＤ４＋Ｔ細胞と照射刺激細胞(１x１０６/ml)を、ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞をつくるために、血清不含培地中５日間±ＴＧＦ-βで培養した。その細胞を洗浄し、１０％正常ヒト血清を含む培養培地中で３日間おいた。その細胞を、カルボキシフルオレッセイン(ＣＦＳＥ）で標識し、照射した同種異系刺激細胞により再び刺激した。培養３日および５日後のＣＦＳＥ染色の強度を示す。太線はＣＤ４調節性細胞を示し、細い線はＴＧＦ-βを含まない同種異系抗原で起動したＣＤ４＋細胞を示す。ＴＧＦ-βで起動したＣＤ４＋細胞の増殖性応答は、コントロールＣＤ４＋細胞よりも強かった。類似の結果を４つの別の実験で得た。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、長期間の移植拒絶反応を防止する方法を使用して実質臓器、例えばヒトの腎臓、心臓、肺、肝臓および膵臓の移植を可能とした。抑制活性を誘導する化合物と多数のＴ細胞を体外で混合することによって、抑制または調節性Ｔ細胞の群を生成した。ドナー細胞の殺傷からレシピエントＴ細胞を防止し、それにより移植片に対する寛容およびその長い生存を誘導するために、移植前、移植時、移植後に、抑制性細胞をレシピエントに投与することができる。この方法の特別な利点は、レシピエントの免疫系を利用して、従来の実験的治療法が達成できなかった機能を発揮し得ることである。
【００３４】
即ち、本発明は、レシピエントの細胞においてＴ細胞活性を抑制し、寛容状態を誘導することによって移植拒絶反応を防止する。これは、いくつかのレシピエント細胞に監視的役割を持たせて、別のレシピエント細胞が移植片に対する免疫攻撃を持つことを防止するように誘導して達成する。正味の効果は、レシピエントのリンパ球がドナーの組織適合性抗原に対して寛容となり、それにより移植片の長期生存を可能にすることである。
【００３５】
このストラテジーは、近年使用されている殆ど全ての他の治療方法とは異なる。その理由は、全体として臓器レシピエントというよりはむしろ個々の細胞が、強い薬理学的薬剤で処理されているからである。このストラテジーで、レシピエントは、これら薬剤と関連のある重度の副作用から免れる。
【００３６】
本発明の利点は、臓器移植のレシピエントに与えねばならない高い毒性の免疫抑制医薬品を投与する必要性を低下もしくは最小にし得るということである。本発明において、レシピエント自身の免疫細胞が免疫応答を抑制するように誘導され、それにより、この目的のために投与される毒性免疫抑制剤の用量を低下することができる。
【００３７】
即ち、本発明は、免疫応答を遮断し得る極少量の化合物をレシピエントに戻すだけであるので、重度の副作用に関する蓋然性の低下を提供する。
【００３８】
本発明は、レシピエントＴ細胞群がドナー臓器に対する免疫攻撃を遮断するために誘導され得ることを示す。理論にしばられずに、本発明の方法は単独もしくは併用で機能し得るいくつかの手段があるということがわかる。第一に、レシピエント細胞を活性化して、ドナー細胞に寛容とし得る。第二に、レシピエント細胞を活性化して、監視的役割を与え、別のレシピエント細胞がドナー細胞を殺すことを防止し得る。第三に、抑制化合物でのレシピエント細胞の処理は、別のレシピエント細胞に抑制活性を持つように誘導することによって、いくつかのレシピエントＴ細胞の細胞毒性活性を阻害し得る。例えば、図２-４において、ＴＧＦ-βは、抑制活性を持ち、ドナー細胞の分解を防止するＴ細胞サブセットを誘導するために使用されている。レシピエント細胞によるドナー細胞の分解を抑制するので、慢性的な移植拒絶反応を低下もしくは消失する。
【００３９】
従って、本発明は、臓器移植レシピエントにおけるＴ細胞寛容を誘導する組成物および方法を提供するものである。本発明は、レシピエントおよびドナーの両方から末梢単核血液細胞(ＰＢＭＣ)を取出すこと、レシピエントおよびドナー細胞を一緒に混合すること、抑制性Ｔ細胞群を生成するために調節組成物によりその細胞を処置することを含む方法を提供する。これら抑制性Ｔ細胞は、移植と同時に、もしくはその後様々な時間に、レシピエントに導入し、慢性的移植拒絶反応を防止することが可能である。
【００４０】
本明細書で「患者」とは、臓器移植を受けようとするヒトを意味する。ある場合において、レシピエントは、限定しないが、マウス、ラット、ハムスターなどのゲッシ類、飼育動物、野生動物および霊長類を含む動物であってよい。同様に、本発明の目的において、「ドナー」は、臓器を提供するヒトまたは動物である。
【００４１】
本発明は、臓器移植で利用される方法を指向する。本明細書中で使用される「臓器」は、実質臓器、例えば、肝臓、心臓、肺、肝臓および膵臓を意味する。
【００４２】
好ましい実施態様において、移植された臓器の拒絶反応の防止は、抑制性細胞となるように調整されたＴ細胞の投与によりレシピエントＴ細胞における寛容を誘導することによってなされる。「寛容」もしくは「Ｔ細胞寛容」、またはその文法学的等価語は、ドナー細胞に対して免疫非応答性、即ち、ドナーの組織適合性抗原に対する寛容を意味する。即ち、ドナー細胞に対するレシピエント細胞による細胞毒性Ｔ細胞活性の消失である。好ましくは、レシピエントＴ細胞が、別の抗原を外因性物質として認識し、腫瘍殺生および外因性抗原に対する一般的な免疫応答を促進する能力を維持する。
【００４３】
Ｔ細胞は、調節組成物による処理によって抑制性細胞となるように調整する。調節組成物は、Ｔ細胞に抑制活性を発揮するように誘導する少なくとも１つの化合物を包含する。本明細書中における「抑制活性」は、処理された少なくともいくつかのＴ細胞が、別のＴ細胞における細胞毒性Ｔ細胞活性を防止する能力を発揮することを意味する。
【００４４】
細胞毒性Ｔ細胞活性を遮断するための能力を発揮するＴ細胞は、本明細書中で「抑制性Ｔ細胞」または「調節性Ｔ細胞」という。本明細書中で「抑制性Ｔ細胞」は、別のＴ細胞をドナー細胞の殺生から阻害する能力を発揮するＴ細胞群を意味する。
【００４５】
本明細書中に記載した方法を用いて、移植拒絶反応を低下もしくは消失せしめる。本明細書中で使用される「低下」もしくは「消失」は、移植拒絶反応の少なくとも１つの兆候が改善されるということを意味する。これは、当業者には既知のように、患者側での客観的および主観的の両ファクターを包含する多くの方法において評価し得る。臓器機能不全に関する臨床上のパターンは、拒絶反応の診断を示唆するための助けとなることが多い。しかし、臨床上の兆候によって拒絶反応を明確に診断することはできない。関連のある免疫学的メカニズムの全身的顕現を基にした拒絶反応の症状の発現を同定する手段を決定することは有用であるが、拒絶反応活性(Paul, W.E. (1999) Fundamentals of Immunology)を測定するための十分に確立されたアッセイ法はまだない。
【００４６】
本方法では、レシピエントおよびドナーからの血液細胞を取出す。一般的に、標準的技術を用いてレシピエントおよびドナーから末梢単核血液細胞(ＰＢＭＣ)を取出す。本明細書中「末梢単核血液細胞」すなわち「ＰＢＭＣ」は、リンパ球 (Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など)および単核細胞を意味する。詳しく下記するように、調節組成物の主な効果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／または別のＴ細胞サブセット(即ち、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞)に抑制活性を発揮せしめることである。したがって、ＰＢＭＣ群はＣＤ４＋Ｔ細胞を含まねばならない。赤血球細胞を患者に残すか、または患者にもどして、ＰＢＭＣのみを取出すのが好ましい。これは既知の方法、例えば、白血球分析法(leukophoresis)によりなす。一般に５から７リットルの白血球分析工程を行い、患者からＰＢＭＣを基本的に取出し、残りの血液成分を戻す。細胞サンプルの採取は、ヘパリンなど抗凝固剤の存在下で、既知方法により行う。
【００４７】
一般に、ＰＢＭＣを含有するサンプルは、種々の方法であらかじめ処理し得る。採取した後に、細胞を付加的に濃縮し得るが、もし採取と同時になさないならば、さらに細胞を精製および／または濃縮する。細胞を洗い、計数し、緩衝液に再懸濁する。
【００４８】
ＰＢＭＣは、当分野での標準的技術を用いて処置のためには濃縮するのが普通である。好ましい実施態様において、白血球分析採取工程によってＰＢＭＣの濃縮サンプルを無菌の血球パックに得る。このパックは、調節組成物の試薬や用量を含有し得る。詳しくは下記する。一般に、追加の濃縮／精製工程、当業者には既知のＦicoll−Ｈypaque密度勾配遠心法などを行なう。
【００４９】
好ましい実施態様において、ＰＢＭＣを洗い、血清タンパク質および溶性血液成分、例えば自己抗体、阻害剤などを既知方法を用いて取除く。一般に、生理媒液または緩衝液を加え、遠心法を行なう。必要に応じてこれを繰り返す。ＰＢＭＣを生理媒液、好ましくはＡＩＭ−Ｖ血清なしの培地（Technologie）（血清がかなりの量のＴＧＦ−βの阻害剤を含有するので）に再懸濁するが、ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＢＳ）や生理塩緩衝液（ＰＢＳ）も使用できる。
【００５０】
一般的に、細胞数を数える。おおよそ１×１０9から２×１０9の白血球を５−７リットル白血球分析法の工程から採取する。これらの細胞をおおよそ２００ｍｌの緩衝液または培地に移す。
【００５１】
好ましい実施態様において、ＰＢＭＣは、１以上の細胞タイプについて富化できる。例えば、ＰＢＭＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＮＫＴ細胞について富ますことができる。これは、Gray et al. (1998), J. Immunol. 160:2248（出典明示により本明細書の一部とする）に記載のように、当業者には既知の方法でなし得る。一般的に、これをなすためには、市販の免疫吸収カラムを用いるか、研究的方法で行う（ＰＢＭＣをナイロンウールカラムに加え、溶出する非接着細胞をＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７４に対する抗体で処理し、免疫磁気ビーズで処理して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に富んだ集団を取る）。 ある実施態様において、細胞群をＣＤ４＋細胞について富ます。これらが本発明の方法において最も有用な細胞であるとみられるからである。
【００５２】
好ましい実施態様において、ＣＤ４＋細胞をさらに精製して、分化の生じていない未熟細胞のみにすることも可能である。この方法は、モノクローナル抗体を使用してＣＤ４５ＲＯ＋細胞からＣＤ４＋細胞を枯渇させることによってなす。この方法は、抑制性Ｔ細胞の生成または活性を妨害するかもしれない機能を獲得しているであろうＣＤ４＋細胞の集団を消失する。
【００５３】
別の実施態様において、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４-ＣＤ８−細胞、またはＮＫＴ細胞を、調節組成物で処理し、抑制活性を発生させてもよい。
【００５４】
細胞に必要な前処置を一旦ほどこしてから、細胞を調節組成物で処置する。本明細書中で用いる「処置」とは、細胞を調節組成物と共に十分な時間インキュベートし、特に患者に移植したときに、Ｔ細胞寛容を得るようにすることである。インキュベーションは一般に生理的温度で行う。
【００５５】
「調節組成物」または「寛容組成物」は、ドナー組織適合性抗原に対するＴ細胞寛容を誘導し得る組成物を意味する。調節組成物は、抑制性Ｔ細胞をドナーの組織適合性抗原と反応し得るものにのみ制限するためドナーからの照射されたＴ細胞枯渇単核細胞、および抑制細胞となるようにこれら活性化Ｔ細胞を誘導する少なくとも１つの化合物を包含する。
【００５６】
調節組成物の濃度は、組成物に含まれる化合物の性質によって変るものであるが、一般的に、生理的濃度、すなわち、所望の作用、調節性細胞の特異的な型を高める作用が得られる濃度である。
【００５７】
ドナー血液細胞をフェレーシスによって得て、赤血球細胞の除去後、１-２x １０９ ＰＢＭＣを、抗Ｔ細胞抗体、例えば抗ＣＤ３抗体で処置し、陽性Ｔ細胞を免疫磁性ビーズによって除去する。Ｔ細胞枯渇ドナー細胞を照射して、増殖させないようにし、レシピエント細胞と混合する。その混合比は、ドナー細胞あたり、０.１から１０、好ましくは約０.１から３ で、特に好ましくは０.５から２:１であり、理想としては１:１である。
【００５８】
抑制性細胞となるようにＴ細胞を活性化するために使用した化合物は、限定しないが、 プロスタグランジン、酸化窒素、ケモカインおよびサイトカインを包含する。好ましい実施態様において、Ｔ細胞を活性化するために使用した化合物はサイトカインである。
【００５９】
好ましい実施態様において、サイトカイン、例えば、インターロイキン２(ＩＬ-２)、インターロイキン１５(ＩＬ-１５)、インターロイキン４(ＩＬ-４)、インターロイキン１０(ＩＬ-１０)および形質転換成長因子β(ＴＧＦ-β)を、Ｔ細胞を活性化するために使用する。
【００６０】
２以上の化合物を含有する組成物を用いて、抑制性細胞となるＴ細胞を活性化させることがでる。組成物は、同じ分類の化合物から２以上の化合物、即ち、２以上のサイトカイン、ケモカインまたはプロスタグランジンを一緒に混合してもよい。また、組成物は、異なる分類の化合物からの化合物、例えば、サイトカインおよびケモカインまたはサイトカインおよびプラオスタグランジンなどを含有することもできる。
【００６１】
好ましい実施態様において、２以上のサイトカインを含有する組成物を用いて、Ｔ細胞を活性化する。例えば、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βを抑制性細胞の生成を増加するために一緒に混合する。
【００６２】
好ましい実施態様おいて、ＴＦＧ−βを、抑制性Ｔ細胞をつくるために用いる。本明細書で「形質転換成長因子−β」すなわち「ＴＧＦ−β」は、ＴＧＦ−βファミリーのいずれか１つを意味する。３種のイソ型、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３がある。参照、Massague,J.(1980),J.Ann.Rev.Cell Biol 6:597。リンパ球および単球は、このサイトカインのβ１のイソ型を生成する(Kehrl,J.H.et al.(1991),lnt J Cell Cloning 9:438-450)。ＴＧＦ−βは、処置されるレシピエント細胞に対して活性であるＴＦＧ−βのいずれの型であってもよい。ヒトでは、組換えＴＦＧ−βが現在のところ好ましい。ヒトＴＧＦ−β２は、Genzyme  Pharmaceuticals，Farmington，MA．から購入できる。一般に、ＴＧＦ−βの濃度は、細胞懸濁液中、約１０pg／ｍｌから約５n／ｍｌであって、約０.１ngから約３ng／ｍｌが好ましく、約１ng／ｍｌが理想的である。
【００６３】
ＴＧＦ-βを、レシピエント細胞および照射したドナーＰＢＭＣの群(上記のように回収した)と共にインキュベートする。ドナー細胞は、それがレシピエント細胞を攻撃することができないように照射する。インキュベーション期間は、効果を生じるに十分な期間であり、一般に４時間から５日であるが、より短時間およびより長時間の両方でもあり得る。
【００６４】
好ましい実施態様において、調節組成物によるレシピエント細胞の処置に引続いて、レシピエント患者に移す前にこれらの細胞の増殖を行う。
【００６５】
別の実施態様において、増殖した細胞の代わりに細胞を移すことが望ましいこともある。この場合では、細胞を、調節組成物を除く洗浄の直後に移し、凍結するかもしくは貯蔵する。
【００６６】
細胞は、処置すると、レシピエントへの移植前に評価もしは試験し得る。例えば、下記：滅菌試験; グラム染色、微生物学的試験; ＬＡＬ試験; マイコプラズマ試験：細胞タイプを同定するためのフローサイトメトリー; 機能試験など、のために試料を取出し得る。これらおよび別のリンパ球試験を、処置前もしくは処置後にしてもよい。好ましい分析はドナー細胞を標識することである；標識群と処置済寛容レシピエント細胞をインキュベートし、レシピエント細胞が寛容であり、かつドナー細胞を殺生しないことを確かめる。
【００６７】
例えば図２に示したアッセイを使用して、調節組成物が抑制性細胞を誘導するかどうかを測定することができる。これは、生成した抑制性細胞とレシピエントＴ細胞とを体外で混合し、ドナー細胞の生存をアッセイすることによって行う。
【００６８】
好ましい実施態様において、この処置によって、移植拒絶反応を防止するためにドナーの組織適合性細胞に対してＴ細胞が非応答性となる。
【００６９】
好ましい実施態様において、Ｔ細胞の単離、調節組成物によるＴ細胞の調整およびＴ細胞の増殖を、産物への毒性の導入を最小にするために閉鎖系、例えば、the Nexell Isolex 300 systemで行う。
【００７０】
レシピエントの処置済Ｔ細胞をレシピエント患者に戻す。これは、一般的に当業者には既知のように行い、通常、当業者に認められているようにレシピエント中に処置細胞を注入もしくは導入することを含む。これは、静脈もしくは動脈を包含する血脈(ＩＶ)投与、腹膜内投与などによりなし得る。例えば、細胞は、滅菌シリンジまたは別の滅菌移送機構を用いて注入することによって５０ml Fenwall インフュージョンバッグ中に置くことも可能である。次いで、細胞を、ある時間、例えば１５分に渡って、患者中へのフリーフローＩＶライン中にＩＶ投与を介してすぐに注入し得る。ある実施態様において、さらなる薬剤、例えば、緩衝液または塩をさらに添加してもよい。
【００７１】
患者中に細胞を再導入した後、処置の効果は、もし必要であれば、一般的に、上記および従来の技術で評価することができる。
【００７２】
下記実施例は、上記記載の発明を使用する方法をより完全に説明することを目的としており、さらに本発明の様々な実施態様を考慮した最良のモデルを例示するものである。これらの実施例は、この発明の真実の範囲を限定するものではなく、むしろ例示目的で記載すると理解されたい。本明細書中に記載の文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００７３】
実施例１
細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制するＴＧＦ-β活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞
ドナーおよびレシピエントの両方からの血液をフェレーシスにより得た。各個体からのＰＢＭＣを、Nexell Isolex 500 閉鎖系を用いてＲＢＣから分離した。レシピエントからのＣＤ４＋細胞およびドナーからのＴ細胞枯渇単核細胞を、市販の試薬を用いて調製した。
【００７４】
レシピエントが、単核細胞を入手できないようなドナーから臓器移植を受ける場合、レシピエントＴ細胞を、共通および非共通の組織適合性抗原の広範なパネルを発現するドナープールからの照射した単核細胞で調整した。
【００７５】
レシピエントＣＤ４＋細胞を、照射したドナー単核細胞と、ＴＧＦ-β存在下で５日間培養した。ＴＧＦ-βの存在下でドナー細胞と反応するＣＤ４+細胞を、抑制性Ｔ細胞となるように誘導した。 該細胞をドナー同種抗原または有糸分裂促進物質とともに、さらに１０日間インキュベートし、多数の抑制性Ｔ細胞を増やした。
【００７６】
これらの抑制性Ｔ細胞の強さを試験するために、それらを、キラーＴ細胞を誘導するためにドナーの照射した非-Ｔ細胞と混合したレシピエントのＴ細胞と５日間培養した。次いで、レシピエントＴ細胞を、クロミウム標識したドナーリンパ芽球細胞と混合し、４時間インキュベートした。レシピエント細胞毒性Ｔ細胞がドナー細胞を殺すと、クロミウムが培養培地に放出される。クロミウム放出量を測定することによって、殺生された細胞の割合を測定することが可能である。
【００７７】
図２-４は、ＴＧＦ-βにより生じた調節性Ｔ細胞が、レシピエントＴ細胞のドナーＴ細胞を殺生する能力を遮断することを示す。
【００７８】
図２-４に示した標準的な細胞毒性アッセイにおいて、レシピエント細胞を標識ドナー細胞とともに、２５:１、５０:１および１００:１割合で培養した。レシピエントおよびドナー細胞のこれらの組合せを、エフェクター対標的比と呼ぶ。殺生を、様々なシンボルによって表示する。予想されるように、最も高い殺生は、最も高いエフェクター対標的比で見られる。ドナーの刺激細胞と共に培養したＣＤ４＋細胞は、穏やかな阻害効果を示した。ＴＧＦ-β１ng/mlで調整したＣＤ４＋細胞は、レシピエントＴ細胞のドナー単核細胞を殺生する能力をほぼ完全に消滅せしめた。
【００７９】
実施例２
細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制するＴＧＦ-β活性化Ｔ細胞
ドナーおよびレシピエントからの血液をフェレーシスによって得た。各個体からのＰＢＭＣを、Nexell Isolex 500閉鎖系を用いてＲＢＣから分離した。主要サブセット(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞)および副サブセット(ＴＮＫ細胞およびγδＴ細胞)の両方を含むレシピエントからのＴ細胞、とドナーからのＴ細胞枯渇単核細胞を市販試薬を使用して調製した。
【００８０】
レシピエントＴ細胞を、ＴＧＦ-βの存在下、３〜５日間、照射したドナー単核細胞と培養した。ＴＧＦ-βの存在下でドナー細胞と反応する様々なＴ細胞サブセットを、抑制性Ｔ細胞となるように誘導した。同様の手順を、さらに１０日繰り返し、抑制性Ｔ細胞の数を増やした。
【００８１】
次いで、ＴＧＦ-βの存在下にドナー同種抗原で免疫起動されたレシピエントＴ細胞を抑制活性について試験した。このＴ細胞が、レシピエント前駆体キラー細胞のドナーＴ細胞を殺す能力発揮を防止することを、実施例１に記載の方法によって示す。
【００８２】
実施例３
移植拒絶反応を防止するため、非同一の同胞ドナーからの腎臓移植レシピエントからのＴ細胞の処置
腎臓移植の１日前に１ng/mlのＴＧＦ−βで調整したＣＤ４＋細胞をレシピエントに移し、リンパ球組織に対し「向かう（ホーム）」ようにする。これらのＣＤ４＋細胞は、レシピエントのリンパ様臓器に循環し、ドナー組織適合性抗原に応答するレシピエントＴ細胞を遮断する。結果として、レシピエントＴ細胞はドナー組織適合性抗原に寛容となる。この寛容により、急性拒絶反応が低下し、免疫抑制剤の高用量についての必要性を低くする。レシピエントリンパ球は、長く続く寛容を発揮するように「経験する」ので、慢性的の拒絶反応を低下もしくは消失する。移植拒絶反応のサインを繰り返すなら、調節性Ｔ細胞をさらに注入して、この反応を改善する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ここ２０年間で慢性拒絶反応の防止について進歩がないことを示す。
【図２】  図２は、細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する細胞の発生におけるＴ細胞サブセットに対するＴＧＦ-βの効果を示す。
【図３】  図３は、ＴＧＦ-βの存在または非存在下で、刺激細胞と共に培養したＣＤ４ ＣＤ４５ＲＡＴ細胞に対するＴＧＦ-βの制御効果について、２つの独立した実験を示す。
【図４】  図４は、ＣＤ４抑制細胞が、細胞毒性Ｔ細胞活性を阻害するために細胞接触を必要とすることを示す。
【図５】  図５は、ＴＧＦ-βによって誘導された調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞によるリンパ球増殖の抑制を示す。
【図６】  図６は、ＴＧＦ-βによって誘導されたＣＤ４+調節性Ｔ細胞の強さを示し、それらがＣＤ２５を発現することを示す。
【図７】  図７は、ＣＤ４＋細胞によるＣＤ２５およびＣＴＬＡ-４の発現に対する調節組成物の効果を示す。
【図８】  図８は、同種異系抗原に対するＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の増殖性応答を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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