(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ７分子およびＩＣＡＭ分子からなる群より選択されるＴ細胞補助的刺激分子、及び、少なくとも一つのＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）に対する細胞性応答を可能とするのに十分な時間及び条件の下でII型インターフェロン（ＩＦＮ）の存在下で培養され、その後、動物細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間及び条件の下で少なくとも一つのＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の存在下で培養された動物細胞を含む組成物であって、ここで、該Ｔ細胞補助的刺激分子は前記細胞の表面で発現し、さらにここで、Ｔ細胞補助的刺激分子を発現する前記細胞は、(a)動物細胞の不均質集団から単離され、増殖が阻害されるように不活性化された、または、(b)Ｔ細胞補助的刺激分子がそれから発現するポリヌクレオチドを前記細胞中に導入することによって該Ｔ細胞補助的刺激分子を発現するように改変された細胞である、組成物。
【請求項２】
該II型ＩＦＮが約１００〜約２０００国際単位／ｍＬの濃度で該培養培地中に存在するものである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該Ｉ型ＩＦＮが約１００〜約２０００国際単位／ｍＬの濃度で該培養培地中に存在するものである、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該動物細胞が、該動物細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間及び条件の下で、II型インターフェロン（ＩＦＮ）並びに第一のＩ型ＩＦＮ及び第二のＩ型ＩＦＮの一方又は両方の存在下で培養されたものである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
該II型ＩＦＮがＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ガンマの生物活性断片、ＩＦＮ−ガンマの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ガンマの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−ガンマの類似体からなる群より選択されるものである、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
それぞれのＩ型ＩＦＮがＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−アルファの生物活性断片、ＩＦＮ−ベータの生物活性断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体、ＩＦＮ−アルファの類似体及びＩＦＮ−ベータの類似体からなる群より選択されるものである、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
該Ｔ細胞補助的刺激分子がＢ７−１分子及びＢ７−２分子からなる群より選択されるものである、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
該Ｔ細胞補助的刺激分子がＢ７−１分子である、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
該Ｂ７−１分子が配列番号：１４に記載された配列、又はその生物活性断片、又はこれらの変異型若しくは誘導体を含むものである、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
該Ｔ細胞補助的刺激分子がＢ７−２分子である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
該Ｂ７−２分子が配列番号：１６に記載された配列、又はその生物活性断片、又はこれらの変異型若しくは誘導体を含むものである、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
該Ｔ細胞補助的刺激分子がＩＣＡＭ−１分子及びＩＣＡＭ−２分子からなる群より選択されるものである、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
該動物細胞が癌細胞又は腫瘍細胞である、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
該癌細胞又は腫瘍細胞が肺臓、乳房、子宮、子宮頸部、卵巣、結腸、膵臓、前立腺、精巣、胃、膀胱、腎臓、骨、肝臓、網内系、食道、脳、皮膚、及び柔組織からなる群より選択される組織、器官、又は系に由来するものである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
癌細胞又は腫瘍細胞がメラノーマ細胞及び乳癌細胞からなる群より選択されるものである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
動物細胞の免疫増強を強化する方法であって、
− 少なくとも一つのＩ型ＩＦＮに対する細胞性応答を可能とするのに十分な時間及び条件の下でII型インターフェロン（ＩＦＮ）の存在下で、および、該細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間及び条件の下で少なくとも一つのＩ型ＩＦＮの存在下でＢ７分子およびＩＣＡＭ分子からなる群より選択されるＴ細胞補助的刺激分子を発現する該動物細胞を培養する工程であって、ここで、該動物細胞は、(a)動物細胞の不均質集団から単離され、増殖が阻害されるように不活性化された、または、(b)Ｔ細胞補助的刺激分子がそれから発現するポリヌクレオチドを前記細胞中に導入することによって該Ｔ細胞補助的刺激分子を発現するように改変された細胞である工程、
を含む方法。
【請求項１７】
該II型ＩＦＮが約１００〜約２０００国際単位／ｍＬの濃度で該培養培地中に存在するものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
Ｉ型ＩＦＮのそれぞれが約１００〜約２０００国際単位／ｍＬの濃度で該培養培地中に存在するものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該細胞がII型ＩＦＮの存在下で約１６時間から約９６時間までそして続いて少なくとも一つのＩ型ＩＦＮの存在下で約１６時間から約７２時間まで培養されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
該Ｔ細胞補助的刺激分子を発現する細胞を動物細胞の不均質集団から単離する工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
該Ｔ細胞補助的刺激分子を発現するように動物細胞を改変する工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
該改変がＴ細胞補助的刺激分子がそれから発現するポリヌクレオチドを該動物細胞中に導入する工程を含むものである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該II型ＩＦＮがＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ガンマの生物活性断片、ＩＦＮ−ガンマの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ガンマの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−ガンマの類似体からなる群より選択されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
Ｉ型ＩＦＮのそれぞれがＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−アルファの生物活性断片、ＩＦＮ−ベータの生物活性断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体、ＩＦＮ−アルファの類似体及びＩＦＮ−ベータの類似体からなる群より選択されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
該細胞を不活性化する工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２６】
該不活性化工程が該細胞を増殖不可能にするようにそれらを処理する工程を含むものである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該ＩＦＮ−ガンマが配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を含むものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
該ＩＦＮ−ベータがＩＦＮ−ベータ１である、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
該ＩＦＮ−ベータが配列番号：４に記載されたアミノ酸配列を含むＩＦＮ−ベータ１である、請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
該ＩＦＮ−ベータがＩＦＮ−ベータ２である、請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
該ＩＦＮ−ベータが配列番号：６に記載されたアミノ酸配列を含むＩＦＮ−ベータ２である、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
該ＩＦＮ−アルファが配列番号：８に記載されたアミノ酸配列を含むものである、請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
該ＩＦＮ−アルファがＩＦＮ−アルファ１である、請求項２４記載の方法。
【請求項３４】
該ＩＦＮ−アルファ１が配列番号：１０に記載されたアミノ酸配列を含むものである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該ＩＦＮ−アルファがＩＦＮ−アルファ２である、請求項２４記載の方法。
【請求項３６】
該ＩＦＮ−アルファが配列番号：１２に記載されたアミノ酸配列を含むＩＦＮ−アルファ２である、請求項２４記載の方法。
【請求項３７】
該動物細胞が単一のＩ型ＩＦＮと該細胞を接触させることにより培養されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項３８】
該Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−アルファの生物活性断片、ＩＦＮ−ベータの生物活性断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体、ＩＦＮ−アルファの類似体及びＩＦＮ−ベータの類似体からなる群より選択されるものである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮ−ベータである、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
該動物細胞が第一の外因性型Ｉ型ＩＦＮ及び第二の外因性型Ｉ型ＩＦＮと該細胞を接触させることにより培養されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項４１】
第一のＩ型ＩＦＮ及び第二のＩ型ＩＦＮが、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ベータの生物活性断片、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−ベータの類似体、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−アルファの生物活性断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−アルファの類似体からなる群よりそれぞれ独立に選択されるものである、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
II型ＩＦＮがＩＦＮ- ガンマであり、且つ、第一のＩ型ＩＦＮ及び第二のＩ型ＩＦＮが個別にＩＦＮ−アルファ及びＩＦＮ−ベータから選択されるものである、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
該II型ＩＦＮがＩＦＮ- ガンマであり、且つ、該第一のＩ型ＩＦＮがＩＦＮ−ベータでありそして第二のＩ型ＩＦＮがＩＦＮ−アルファである、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
該細胞がＩＦＮ−ガンマの存在下で約４８時間から約９６時間まで培養され、その後ＩＦＮ−アルファ及び／又はＩＦＮ−ベータの存在下で約２４時間から約７２時間まで培養されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項４５】
該細胞がＩＦＮ−ガンマの存在下で約４８時間から約９６時間まで培養され、その後ＩＦＮ−ベータの存在下で約２４時間から約７２時間まで培養されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項４６】
抗原の免疫原性を増強し又は他の方法で改良するインビトロの方法であって、
− Ｂ７分子およびＩＣＡＭ分子からなる群より選択されるＴ細胞補助的刺激分子を発現する動物細胞を提供する工程であって、ここで、該動物細胞は少なくとも一つのＩ型ＩＦＮに対する細胞性応答を可能とするのに十分な時間及び条件の下でII型インターフェロン（ＩＦＮ）の存在下で、かつ、該細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で少なくとも一つのＩ型ＩＦＮの存在下で培養された細胞であって、さらにここで、該動物細胞は、(a)動物細胞の不均質集団から単離され、増殖が阻害されるように不活性化された、または、(b)Ｔ細胞補助的刺激分子がそれから発現するポリヌクレオチドを前記細胞中に導入することによって該Ｔ細胞補助的刺激分子を発現するように改変された細胞である工程、及び
− このＩＦＮ処理された動物細胞上に該抗原を負荷させる工程、
を含む方法。
【請求項４７】
該抗原がウイルス、細菌、真菌、又は原生動物起源のものである、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
Ｂ７分子およびＩＣＡＭ分子からなる群より選択されるＴ細胞補助的刺激分子を発現する動物細胞を含む、標的抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物であって、ここで、該動物細胞は少なくとも一つのＩ型ＩＦＮに対する細胞性応答を可能とするのに十分な時間及び条件の下でII型インターフェロン（ＩＦＮ）の存在下で、かつ、該細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で少なくとも一つのＩ型ＩＦＮの存在下で培養された細胞であって、さらにここで、該動物細胞は、(a)動物細胞の不均質集団から単離され、増殖が阻害されるように不活性化された、または、(b)Ｔ細胞補助的刺激分子がそれから発現するポリヌクレオチドを前記細胞中に導入することによって該Ｔ細胞補助的刺激分子を発現するように改変された細胞であり、さらにここで、該標的抗原に相当する抗原が前記ＩＦＮ処理動物細胞の上に負荷されたものである組成物。
【請求項４９】
請求項１〜１５、及び４８のいずれか１項に記載の組成物を含む、宿主の免疫系を刺激するためのワクチンであって、さらに一つ以上の薬学的に許容しうる担体、アジュバント及び／又は希釈剤を任意選択的に含むワクチン。
【請求項５０】
請求項１〜１５、及び４８のいずれか１項に記載の組成物、又は、請求項４９に記載のワクチンの、腫瘍形成の治療又は予防のための薬剤の調製における使用。
【請求項５１】
腫瘍形成の治療又は予防における同時の、別々の、又は順次の使用のための組み合わされた調製の際の、可溶性のＴ細胞補助的刺激分子、及び請求項１〜１５のいずれか１項に記載された培養された動物細胞を含む産物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に免疫増強組成物に関する。より具体的には、本発明は抗原提示機能の増強を示す細胞を含む組成物（composition of matter)に関する。本発明の組成物は、一般に、選択的なそして標的に向けられた免疫細胞応答を含む宿主の免疫細胞応答の刺激を促進する際に有用である。本発明の組成物は癌や腫瘍の治療及び／又は予防においてとりわけ有用である。
【０００２】
本明細書で数値で言及する出版物の書誌学的情報は明細書の末尾に集めてある。
【０００３】
発明の背景
インターフェロン（ＩＦＮ）はウイルス感染、特異的抗原又はマイトジェンへの応答として種々の細胞により生産される一群の糖タンパク質を含む。それらの発見以来（１）、ＩＦＮは、例えば、抗ウイルス性、抗増殖性、分化及び免疫調節性の応答（２）において重要な役割を果たすことが見出されてきた。
【０００４】
ＩＦＮがそれらの受容体に結合した後、細胞内のＪＡＫファミリーのチロシンキナーゼが活性化されるようになり、そしてＳｔａｔ（転写の情報伝達及び活性化因子）と呼ばれる転写因子分子をリン酸化する。Ｓｔａｔ１のホモ二量体の形成を活性化することによりＩＦＮ−ガンマは情報を発信する。ＩＦＮ−アルファ又はベータは主に、結合して第３のタンパク質であるｐ４８ＩＳＧＦ３−ガンマを含む三量体を生産するホモ二量体又はヘテロ二量体としてのＳｔａｔ１及び／又はＳｔａｔ２の複合体であるインターフェロン感受性遺伝子因子３（ＩＳＧＦ３）を活性化することにより情報を発信する。活性化の後、これらの転写因子複合体は核へ移動し、標的ＤＮＡ配列に結合することによりインターフェロン感受性遺伝子（ＩＳＧ）の発現に影響を与える。Ｓｔａｔ１ホモ二量体はＧＡＳ部位として知られるＴＴＣＮＮＮＧＡＡという配列に結合する。ＩＦＮの情報発信も一つの他のインターフェロン調節因子であるＩＲＦ−１をも活性化する。ＩＲＦ−１とＩＳＧＦ３は両因子ともＤＮＡ配列であるＧＡＡＡＮＮの直接反復を含む複数のＩＳＧのプロモーター領域にある調節応答因子を介して結合し、ＩＳＧからの転写の活性化をもたらす（総説については（３、４）を参照）。
【０００５】
ＩＦＮをコードする遺伝子及びＩＦＮ情報発信経路の成分は腫瘍抑制遺伝子のファミリーに属すると提案されている（５）。従って、ＩＦＮ情報伝達経路の如何なる工程を破壊する突然変異もＩＦＮへの細胞応答性を低下させ、ＩＦＮ作用の腫瘍抑制機能を排除し、それにより癌の発症を促進すると予想されるであろう。
【０００６】
後期悪性メラノーマの治療におけるＩＦＮの効果が幾つかの臨床試行で証明されてきた。この点で、ＩＦＮ−アルファは皮膚メラノーマ患者の一群（約２３％）のみに有効である。この現象に対して、メラノーマ細胞のＩＦＮ情報発信特性に検出された異常性に基づく一つの説明が提唱された（６〜８）。進行したステージIII の転移メラノーマから確立した継代回数のすくない短期間培養の成長に関する研究から、ＩＦＮ感受性メラノーマ細胞系統及びメラノサイトと比べると、全ての患者の試料がＩＦＮに耐性であることが明らかにされた（６）。その結果、進行した転移メラノーマを持つ患者の大多数は、ＩＦＮに明確に応答することができない。なぜなら、それらの腫瘍細胞はＩＦＮの直接の作用に適切に応答することができないからである。ＩＦＮは、イン・ビボで免疫エフェクター細胞を間接的に刺激するか又は腫瘍細胞標的に直接作用するかの二つの様式で作用する（９）。（Ｓｔａｔ１欠乏マウスか又はＩＦＮ−ガンマ受容体欠乏マウスを用いることにより）ＩＦＮ−非感受性とされたノックアウトマウス中で生産された腫瘍細胞系統の研究は、ＩＦＮの直接の効果が免疫の監視にとって重要であることを明らかにした（１０）。ＩＦＮ−ガンマ非感受性マウスで確立した癌細胞は、共通遺伝子の野性型マウスを通過させると、もはやこの免疫系により拒絶されなかった。こうして、ＩＦＮの作用は部分的に、おそらくは腫瘍細胞の免疫原性の増強を誘導することにより、該腫瘍細胞への直接的効果を通じて媒介されたものと結論された（１０）。したがって、腫瘍抑制因子としてのＩＦＮに対する応答の喪失は、それが腫瘍に免疫監視を巧みに回避させ、該腫瘍に相当の生存可能性を与えるものであるから、悪性腫瘍の発症における初期の重要な進展の一つである。
【０００７】
多くの研究は、ＩＦＮ系の様々な欠陥が他のタイプの腫瘍から確立された細胞系統におけるＩ型ＩＦＮ（タイプＩＩＦＮ）への感受性の相違の原因であると報告した。即ち、（ｉ）急性白血病細胞系統（１１）及び悪性Ｔ細胞（１２）におけるＩＦＮ−アルファ／−ベータ遺伝子欠失、（ii) 毛様細胞性白血病（１３）及びリンパ芽球細胞（１４）におけるＩＦＮ−アルファ受容体遺伝子発現の変化又は下位レベル調節、（iii)Ｂリンパ球細胞系統（１５）及びバーキットリンパ腫細胞（１６）におけるＩＦＮ刺激遺伝子の発現の誘導の妨害、（iv) ダウディ細胞（１７）及び一次白血病細胞（１８）における転写因子の活性化の欠陥である。さらに、高感受性から比較的耐性までに及ぶＩＦＮの抗増殖性（１９）及び抗ウイルス性（２０）活性へのそれらの応答における広い変動を伴うメラノーマ細胞系統が記述されてきた。
【０００８】
ＩＦＮへの応答の異なるメラノーマ細胞系統におけるＩＦＮ情報発信に関する本発明者らの初期の研究は、これらの細胞系統が細胞表面受容体へＩＦＮの結合レベル（２１）には又はＩＦＮ受容体関連ＪＡＫチロシンキナーゼの活性化（７）には有意の相違を示さないことを明らかにした。したがって、ＩＦＮ応答性の喪失は受容体情報発信のＩＦＮ媒介活性化における異常によるものには見えなかった。しかしながら、検討した全てのＩＦＮ耐性メラノーマ細胞で、ＩＦＮ活性化情報発信経路における次のレベルで欠乏が検出された（６）。この点で、膜から細胞核へＩＦＮ情報を伝達するために必須のトランス活性化リレー因子の細胞内レベルが遙に低下していることが検出された（総説については、（８）を参照）。従って、ＩＦＮにより通常誘導される、そして腫瘍が認識され身体の免疫系により消失されるべきであるならば必須のものである遺伝子発現における変化が、ＩＦＮ耐性の腫瘍細胞中では起こらない。何故なら、核に到達するその情報が不十分だからである。
【０００９】
ＩＦＮに対する細胞の応答はＩＦＮで先に処置することにより増加させることができる（２２）。このプロセスは、「プライミング」（６）と呼ばれ、ＩＲＦ−１及びＩＳＧＦ３の３成分全て、即ちＳｔａｔ１、Ｓｔａｔ２、及びｐ４８を含む同起源の転写因子のレベルを高める。ＩＲＦ−１、Ｓｔａｔ２、及びｐ４８のプロモーターの調節は記載されており（例えば、（２３）を参照）、これらの遺伝子の発現はＩＦＮにより調節される。Ｓｔａｔ１タンパク質はＩＲＦ−１、ｐ４８及びＳｔａｔ２の発現を活性化する際に関与する。
【００１０】
Ｓｔａｔ１は、それがＩ型及びII型（タイプII）ＩＦＮ受容体情報の両方に要求されるのでＩＦＮ情報発信における中枢の点である（３）。Ｓｔａｔ１の他の重要な役割が重要な細胞機能に与えられたので、Ｓｔａｔ１活性の調節は同様に他の理由から重要な生物学的問題となった。こうして、ＩＦＮは、細胞周期の阻害因子であるＣＫＩｐ２１ＷＡＦ（２４、２５）の発現を直接誘導することにより、細胞成長を調節するようにＳｔａｔ１を介して作用する。さらに、Ｓｔａｔ１はアポトーシスに関与するカスパーゼ１、２及び３の発現を調節する（２６）。
【００１１】
本発明に至る研究において、本発明者らによるヒトメラノーマ細胞の分析は、Ｓｔａｔ１（６、７）及びＩＲＦ−１が一貫してＩＦＮ耐性メラノーマ細胞に欠如していることを明らかにした。特に、この証拠は、ＩＦＮ耐性細胞ではｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルでほとんど発現しなかった転写因子、Ｓｔａｔ１の重要な役割を指摘した。そしてさらにＳｔａｔ１の発現レベルを増加させるためにＩＦＮ耐性メラノーマ細胞をトランスフェクトすることにより、ＩＦＮへの応答は大きく増強された（６）。同様な結果は、より広範な問題の可能性を提起する乳癌細胞の試料でも同様に起こることが示された（２７、２８）。これは癌一般におけるＳｔａｔ１欠乏のより広範な意義を強調するものである。この仮説と一致して、幾つかの研究により、それ以来、Ｓｔａｔ１欠乏が共通して指摘された他のタイプの癌が報告された（２９、３０）。
【００１２】
本発明は、ＩＦＮ−ガンマの高レベルでメラノーマ細胞を処理（ガンマ−プライミング）することにより、治療された細胞が、顕著に増加したレベルのｐ４８及びＳｔａｔ２並びにＳｔａｔ１を発現することをも発見した（６）。Ｉ型ＩＦＮ耐性メラノーマ細胞でさえも、Ｓｔａｔ１のレベルはガンマ−プライミング後に増加した。さらに、Ｉ型ＩＦＮでの処理に対する細胞応答性はガンマ−プライミングの後に増加した。この増加には、電気泳動ゲル移動シフト検定（ＥＭＳＡ）により検出されたＩＳＧＦ３結合活性の顕著な増大及び免疫化学的方法により検出されたＩＳＧの誘導の増加が含まれる。その発現が増加した複数のＩＳＧの中には、ＩＦＮにより誘導可能な表面抗原、クラスＩＭＨＣ及びＩＣＡＭ−１（６）があり、これらは腫瘍細胞の免疫細胞による認識において重要である。
【００１３】
発明の概要
本発明者らは、驚くべきことに、癌細胞の表面上にか又は可溶性型のいずれかで存在する免疫刺激分子との組合せで、インターフェロンで処理した癌細胞を含む組成物を用いてワクチン注射することにより、該癌に対するより強力な免疫応答が誘導されることを発見した。インターフェロン処理と免疫刺激分子の組合せは、該処理された細胞の抗原提示機能の相乗的増加を産み出す。それは適切な宿主中に導入されると、これらの細胞により提示される抗原に対する免疫応答の顕著に改善された刺激を誘発する。上の発見は、以下に説明するように、組成物、キット、検定法及び治療法の形態で実施するように変形された。
【００１４】
こうして、本発明の一つの側面では、免疫刺激分子及び細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間及び条件の下で外因性型のII型インターフェロン（ＩＦＮ）及び少なくとも一つの外因性型Ｉ型ＩＦＮの存在下で培養され且つ該ＩＦＮ類を除去するため洗浄された動物細胞を含む組成物が提供される。
より好ましい実施態様では、該II型ＩＦＮは約１００〜約２０００国際単位／ｍＬの濃度で培養培地中に存在する。
別の好ましい実施態様では、該Ｉ型ＩＦＮは約１００〜約２０００国際単位／ｍＬの濃度で培養培地中に存在する。
【００１５】
免疫刺激分子は該細胞の表面上に存在することもでき又は可溶性の形で存在することもできる。
【００１６】
動物細胞は癌細胞又は腫瘍細胞であることが好ましい。癌細胞又は腫瘍細胞にはメラノーマ細胞及び哺乳動物癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の別の一側面においては、動物細胞の免疫増強を強化する方法であって、
−  該細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で外因性型
のII型インターフェロン（ＩＦＮ）及び少なくとも一つの外因性型Ｉ型Ｉ
ＦＮの存在下で免疫刺激膜分子を発現する動物細胞を培養する工程、及び
−  該ＩＦＮ類を除去するため該細胞を洗浄する工程、
を含む方法が提供される。
【００１８】
この方法は動物細胞の不均質集団から該免疫刺激性膜分子を発現する細胞を単離する工程をさらに含むことが好ましい。
【００１９】
この方法は該免疫刺激性膜分子を発現するように動物細胞を改変する工程をさらに含んでもよい。
【００２０】
この改変工程はそれから免疫刺激性膜分子が発現できるポリヌクレオチドを該動物細胞中に導入する工程を含むことが好ましい。
【００２１】
この動物細胞は少なくとも一つのＩ型ＩＦＮへの細胞性応答を可能とするのに十分な時間及び条件の下で、II型ＩＦＮと該細胞を接触させることにより培養し、次いで該培養した細胞を少なくとも一つのＩ型ＩＦＮと、該細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間及び条件の下で少なくとも一つのＩ型ＩＦＮと接触させることが好ましい。
【００２２】
II型ＩＦＮはＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ガンマの生物活性断片、ＩＦＮ−ガンマの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ガンマの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−ガンマの類似体からなる群より選択されることが好ましい。
【００２３】
該少なくとも一つのＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−アルファの生物活性断片、ＩＦＮ−ベータの生物活性断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体、ＩＦＮ−アルファの類似体及びＩＦＮ−ベータの類似体からなる群より選択されることが好ましい。
【００２４】
上に広く記述されたこの方法は動物細胞を不活性に又は増殖できないようにする工程をさらに含むことが好ましい。例えば、該動物細胞は、意図された宿主中でこの動物細胞を増殖できないようにするために、当分野で知られているように、例えば、ガンマ照射などの適当な量の放射線で照射してもよい。
【００２５】
さらに別の側面では、本発明は動物細胞の免疫増強を強化する方法であって、
−  細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で、外因性型
のII型インターフェロン（ＩＦＮ）及び少なくとも一つの外因性型Ｉ型Ｉ
ＦＮの存在下で動物細胞を培養する工程、
−  該ＩＦＮ類を除去するため該細胞を洗浄する工程、及び
−  該細胞を可溶性形の免疫刺激分子と混合する工程、
を含む方法が意図される。
【００２６】
本発明の別の一側面は、動物細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で、外因性型のII型インターフェロン（ＩＦＮ）及び第一の外因性型Ｉ型ＩＦＮと第二の外因性型Ｉ型ＩＦＮの一方又は両方の存在下で培養され且つ該ＩＦＮ類を除去するため洗浄された該動物細胞、と免疫刺激分子とを含む組成物に関する。ここで、該II型ＩＦＮはＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ガンマの生物活性断片、ＩＦＮ−ガンマの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ガンマの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−ガンマの類似体からなる群より選択されるものであり、該第一のＩ型ＩＦＮはＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ベータの生物活性断片、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−ベータの類似体から成る群より選択されるものであり、そして該第二のＩ型ＩＦＮはＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−アルファの生物活性断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−アルファの類似体から成る群より選択されるものである。
さらに別の側面では、本発明は、免疫刺激分子、及び動物細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で外因性型のII型インターフェロン（ＩＦＮ）及び外因性型Ｉ型ＩＦＮの存在下に培養され且つＩＦＮ類を除去するため洗浄された該動物細胞を含む物質の組成物を特徴とする。ここで、該II型ＩＦＮはＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ガンマの生物活性断片、ＩＦＮ−ガンマの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ガンマの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−ガンマの類似体からなる群より選択されるものであり、該Ｉ型ＩＦＮはＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ベータの生物活性断片、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−ベータの類似体から成る群より選択されるものである。
【００２７】
別の一側面では、本発明は、動物細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で、外因性型II型インターフェロン（ＩＦＮ）及び外因性型Ｉ型ＩＦＮの存在下で培養され且つ該ＩＦＮ類を除去するため洗浄された該動物細胞と、免疫刺激分子とを含む組成物に及ぶ。ここで、該II型ＩＦＮはＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ガンマの生物活性断片、ＩＦＮ−ガンマの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ガンマの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−ガンマの類似体からなる群より選択されるものであり、そして該Ｉ型ＩＦＮはＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−アルファの生物活性断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体及びＩＦＮ−アルファの類似体から成る群より選択されるものである。
【００３０】
別の一側面では、本発明は抗原の免疫原性を増強又は他の仕方で改良する方法であって、
−  動物細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で、外因
性型II型インターフェロン（ＩＦＮ）及び少なくとも一つの外因性型Ｉ型
ＩＦＮの存在下で培養され且つ該ＩＦＮ類を除去するため洗浄された該動
物細胞を提供する工程、及び
−  該抗原をＩＦＮで処理された動物細胞上に負荷する工程、
を含む方法を意図する。
【００３１】
該抗原はウイルス起源、細菌起源、真菌類起源又は原生動物起源であることが好ましい。
【００３２】
別の一側面によれば、本発明は標的抗原に対する免疫応答を誘発する組成物であって、動物細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で外因性型II型インターフェロン（ＩＦＮ）及び少なくとも一つの外因性型Ｉ型ＩＦＮの存在下で培養され且つ該ＩＦＮ類を除去するため洗浄された該動物細胞を含み、該標的抗原に対応する抗原がＩＦＮで処理された動物細胞の上に負荷されたものである組成物を明らかにする。
【００３３】
別の一側面では、本発明は上で広く述べた組成物を含む、宿主の免疫系を刺激するためのワクチンであって、任意選択的に一つ以上の薬学的に許容しうる担体、アジュバント及び／又は希釈剤をさらに含むものであるワクチンに関する。
【００３４】
さらに別の一側面では、本発明は疾病又は状態を治療及び／又は予防する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、上で広く述べた組成物又はワクチンの治療上有効な量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３５】
一つの実施態様では、該投与する工程は可溶性の免疫刺激性分子及び該培養された動物細胞を該患者に別々に、逐次、又は同時に投与する工程を含む。
【００３６】
さらなる側面によれば、本発明は動物細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間及び条件の下で外因性型II型インターフェロン（ＩＦＮ）及び少なくとも一つの外因性型Ｉ型ＩＦＮの存在下で培養され且つ該ＩＦＮ類を除去するため洗浄された該動物細胞を、免疫刺激性分子と一緒に含む組成物を含むキットを提供する。
【００３７】
本発明の好ましい側面では、腫瘍形成を治療及び／又は予防する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、上で広く述べた組成物又はワクチンの治療上有効量を投与する工程を含む方法が提供される。
【００３８】
さらなる側面では、本発明は少なくとも一つのインターフェロン（ＩＦＮ）を用いる治療に対する動物細胞の応答性を評価するプロセスであって、インターフェロン情報発信に関与するポリペプチドのレベル及び／又は機能的活性又は該ポリペプチドを調節する調節物質のレベル及び／又は機能的活性又は該ポリペプチドの下流の細胞性標的のレベル及び／又は機能的活性又は該ポリペプチド、該調節物質及び該下流の細胞性標的からなる群より選択されるメンバーをコードする遺伝子配列の発現生産物のレベルを該動物細胞で検出する工程を含むプロセスを提供する。
【００３９】
該ポリペプチドはＳｔａｔ１であることが好ましい。
【００４０】
本発明は、別の一側面では、標的細胞に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の細胞溶解活性を検出するための検定法における該標的細胞の使用であって、該標的細胞が、該標的細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で、外因性型II型インターフェロン（ＩＦＮ）及び少なくとも一つの外因性型Ｉ型ＩＦＮの存在下で培養され且つ該ＩＦＮ類を除去するため洗浄されたものである使用を意図する。
【００４１】
一つの実施態様では、該標的細胞は免疫刺激性膜分子を発現する。別の実施態様では、該標的細胞は可溶性免疫刺激性分子の存在下で該ＣＴＬと接触させられる。
【００４２】
該ＣＴＬはＣＤ８+ ＣＴＬであることが好ましい。
【００４３】
さらに別の一側面では、本発明は細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により媒介される標的細胞の溶解を検出する方法であって、
−  標的細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で外因性
型II型インターフェロン（ＩＦＮ）及び少なくとも一つの外因性型Ｉ型Ｉ
ＦＮの存在下で培養され且つ該ＩＦＮ類を除去するため洗浄された該標的
細胞を提供する工程、
−  この標的細胞を、該標的細胞に対して細胞溶解活性を有するＣＴＬと接触
させる工程、及び
−  該標的細胞の、ＣＴＬにより媒介される溶解を検出する工程、
を含む方法を特徴付ける。
【００４５】
本発明は、ポリペプチドと免疫的相互作用を行なう抗原結合分子又は上で広く述べた調節物質、及び少なくとも一つのインターフェロン（ＩＦＮ）での処理に対する動物細胞の応答を評価するためのキットにおける該発現生産物にハイブリダイズする検出用ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるメンバーの使用をも包含する。
【００４６】
【表Ａ】
0004943621.tif 000002
【００４７】
【表Ａ−１】
0004943621.tif 000003
【００４８】
発明の詳細な説明
１．定義
特に断らない限り、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解される意味と同義である。本明細書で記載されたものと類似の又は同等の任意の方法及び材料は本発明の実施又は試験に用いることができるが、好ましい方法及び材料が記述されている。本発明ために、下記の用語については以下に定義される。
【００４９】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書で用いられるとき、この冠詞の文法上の客体の一つ又は二つ以上（即ち、少なくとも一つ）を指す。例を挙げれば、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は一つの要素又は二つ以上の要素を意味する。
【００５０】
本明細書で用いるとき、用語「約」とは、特定された条件に対して３０％だけ、好ましくは２０％だけ、そしてより好ましくは１０％だけ変化する条件（例えば、数量、濃度、時間等）を指す。
【００５１】
用語「同時投与」又は「同時に投与する」とは免疫刺激性分子とインターフェロン処理された動物細胞の両方を含む単一の組成物の投与、又はそれぞれの活性物を別の組成物として投与すること及び／又はこれらの活性物の両方が単一の組成物として投与される場合に得られる効果と同等の効果が得られるような十分に短い時間内に別の経路により送達されることを意味する。
【００５２】
「作用物質」とは天然に生ずる分子又は合成的に製造される分子であって、そのレベル及び／又は機能的活性が調節されるべきである標的メンバーと直接的又は間接的に相互作用する分子を意味する。
【００５３】
用語「類似体」とは、参照分子と機能において実質的に類似する分子又は生物学的に活性なその断片を意味する。
【００５４】
「抗原結合分子」とは、標的抗原に対し結合親和性を有する分子を意味する。この用語は免疫グロブリン、免疫グロブリンの断片、及び非免疫グロブリンから誘導された抗原結合活性を示すタンパク質枠組みにまで及ぶものと理解される。
【００５５】
「自己由来の」とは、同一生物から誘導したあるもの（例えば、細胞、組織など）を意味する。
【００５６】
用語「同種異系の」とは、本明細書で用いられるとき、遺伝子構成が異なる細胞、組織、生物などを意味する。
【００５７】
「生物活性断片」とは、全長親ポリペプチドの断片であって、親ポリペプチドの活性を保持する断片を意味する。従って、生物活性断片は、とりわけ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、Ｂ７−１分子及びＢ７−２分子から選択される親ポリペプチドの生物活性を有する。本明細書で用いるとき、用語「生物活性断片」には、例えば、少なくとも８個の、好ましくは少なくとも１０個の、より好ましくは少なくとも１５個の、さらにより好ましくは少なくとも２０個の、そしてさらに一層好ましくは少なくとも３０個の連続したアミノ酸の、上記の活性を含む欠失突然変異体及び小さなぺプチドが含まれる。このタイプのぺプチドは標準的組換え核酸技法の適用により得られ、又は通常の液相若しくは固相合成法を用いて合成しうる。例えば、上述の溶液合成又は固相合成については、例えば、ニコルソンにより編集されブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズにより出版された「合成ワクチン」という表題の出版物に含まれるアサートンとシェパードによる「ぺプチド合成」という表題の第９章を参照しうる。または、ぺプチドは本明細書のポリペプチドを、エンドＬｙｓ−Ｃ、エンドＡｒｇ−Ｃ、エンドＧｌｕ−Ｃ、及びスタフィロコッカスＶ−８−プロテアーゼなどのプロテイナーゼで消化することにより調製できる。この消化された断片は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により精製することができる。
【００５８】
本明細書で用いられるとき、「細胞性組成物」、「細胞性ワクチン」又は「細胞性免疫原」とは、活性成分として、任意選択的に失活されている、少なくとも一つの細胞集団を含む組成物を意味する。
【００５９】
本明細書を通じて、文脈が他の意義を要求しない限り、語「含む（comprise）」、「含む（comprises ）」及び「含む（comprising）」は、述べられた工程若しくは要素又は工程群若しくは要素群を含むことを意味するが、如何なる他の工程若しくは要素又は工程群若しくは要素群を排除することを意味するものではないと理解される。
【００６０】
「対応する」又は「対応している」とは、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全部又は一部と実質的に同一又は相補的であるヌクレオチド配列を有する、又は（ｂ）ぺプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドを意味する。この用語はその範囲内に参照ぺプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するぺプチド若しくはポリペプチドをも含む。
【００６１】
「誘導体」とは、修飾により例えば、他の化学的部分と結合又は複合体形成により、又は当分野で理解されているような翻訳後修飾法により、基本配列から誘導されたポリペプチドを意味する。用語「誘導体」には、機能的に等価の分子を生ずる付加又は欠失を含む、親配列に加えられた変更もその範囲内に含まれる。
【００６２】
当分野で良く知られているように、免疫応答を強化すること（「免疫増強」）とは、外来性の抗原又は疾病特異的抗原（例えば、癌抗原）に応答する動物の能力を強化する、即ち、そのような抗原を攻撃するように準備されたこれらの細胞は、その数、活性、及びこれらの抗原を検出し破壊する能力において強化されることを意味する。免疫応答の強度は、当分野で知られた手段による末梢血リンパ球の直接測定、天然キラー細胞の細胞障害性検定法（例えば、プロヴィンシアリ，Ｍら（1992, J. Immunol. Meth. 155: 19-24参照) 、細胞増殖検定法( 例えば、フォッレンヴァイダー，Ｉとグロズールト，Ｐ．Ｊ．(1992, J. Immunol. Meth. 149: 133-135 を参照) 、免疫細胞及び下位集合の免疫検定法（例えば、レフラー，Ｄ．Ａ．ら(1992, Cytom. 13: 169-174)、リボルチニ，Ｌ．ら (1992，Can. Immunol. Immunother. 34: 241-251)を参照) 、又は細胞により媒介された免疫についての皮膚試験（例えば、チャング，Ａ．Ｅ．ら（1993，Cancer Res. 53: 1043-1050 を参照) を含む標準的試験により測定される。前記の試験により測定された免疫応答の強さにおける統計学的に有意の増加はすべて、本明細書で用いられる「強化された免疫応答」、「免疫強化」又は「免疫増強」と考えられる。強化された免疫応答は、発熱や炎症並びに全身的及び局部的感染の回復などの肉体的発現、及び疾病の症候の緩和、即ち、腫瘍サイズの減少、ハンセン病、結核、マラリア、ナフタウス潰瘍、ヘルペス性いぼ及びパピローマ性いぼ、歯肉炎、アテローム性動脈硬化症、カポジ肉腫などのＡＩＤＳの併発症、気管支感染などを含むがこれらに限定されない疾病又は状態の症候の緩和によっても示される。このような肉体的発現も、本明細書で使用される「強化された免疫応答」、「免疫向上」又は「免疫増強」を明確に確定する。
【００６３】
本明細書で用いられるとき、用語「機能」とは、生物学的、酵素的、又は治療上の機能を意味する。
【００６４】
分子発現の文脈における「大きく増加したレベル」又は「高レベル」とは、参照レベルの１０倍、より好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、さらに好ましくは２００倍以上のレベルでの分子の発現を意味する。例えば、Ｂ１６Ｈｉｇｈ細胞が本明細書で用いられるとき、その表面に非常に増加したレベルのＢ７分子を発現し、そのレベルは野性型のＢ１６細胞の１０倍、より好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、さらに好ましくは２００倍以上である。
【００６５】
「相同性」とは、同一のアミノ酸又は表Ａの下方で定義されたような同類置換を構成するアミノ酸の数のパーセンテージを意味する。相同性はＧＡＰ（デベローら，1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395) などの配列比較プログラムを用いて決定しうる。このようにして、本明細書で引用されたものに類似の長さの又は実質的に異なる長さの配列が整列へのｇａｐの挿入により比較されうる。このようなｇａｐは、例えば、ＧＡＰにより用いられる比較アルゴリズムにより決定される。
【００６６】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオチド配列が対合してＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生ずることを記すために本明細書で用いられる。相補的な塩基配列は塩基対合規則により関連付けられる配列である。ＤＮＡでは、ＡはＴと対になり、ＣはＧと対になる。ＲＮＡでは、ＵはＡと対になり、ＣはＧと対になる。この点で、用語「適合」及び「不適合」は、本明細書で用いられるとき、相補的な核酸の鎖における対合したヌクレオチドのハイブリダイゼーションの可能性を意味する。上記の古典的Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃ塩基対などの適合するヌクレオチドは効率的にハイブリダイズする。不適合は効率的にハイブリダイズしないヌクレオチドの他の組合せである。
【００６７】
本明細書で「免疫−相互作用性」というときは、分子の間の、とりわけ該分子の一方が免疫システムの一成分又はそれを模倣するものである場合の、如何なる相互作用、反応、又は結合の他の形態への言及をも含む。
【００６８】
細胞の「不活性化」とは、細胞が、子孫を形成するための細胞分割ができないようにされたことを示すために本明細書で用いられる。それにもかかわらず該細胞は刺激に対し応答することができ、あるいはサイトカインなどの細胞生産物の生合成及び／又は分泌をすることができる。不活性化の方法は当分野で知られている。不活性化の好ましい方法は、マイトマイシンＣなどの毒素での処理、又は照射である。固定された細胞又は透過可能とされた細胞や分裂できない細胞は不活性化された細胞の例でもある。
【００６９】
「単離された」とは、その天然の状態でそれを通常伴う成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。
【００７０】
組成物は、若しそれがａ）本来の個体中で抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する免疫応答を形成すること、又はｂ）該化合物又は組成物が投与されなかったならば起こったであろう免疫応答を越えて個体における免疫応答を再構成し、増強し、又は維持すること、のいずれかができるならば、「免疫原性」である。組成物は、若しそれが単一投与又は複数投与で投与される場合、これらの基準のいずれかを達成できるならば、免疫原性である。
【００７１】
「調節する」とは、標的分子のレベル及び／又は機能的活性を、直接的又は間接的に増加させ又は減少させることを意味する。例えば、ある作用物質は標的分子以外の分子と相互作用することにより該レベル／活性を間接的に調節しうる。この点で、標的ポリペプチドをコードする遺伝子の間接的調節の範囲には、第一の核酸分子の発現生成物が標的ポリペプチドをコードする核酸分子の発現を調節するものである場合、この第一の核酸分子の発現の調節が含まれる。
【００７２】
「から得られる」とは、例えば、核酸抽出物又はポリペプチド抽出物などの試料が宿主の特定の供給源から単離され、又は誘導されることを意味する。例えば、該抽出物は宿主から直接単離された組織又は生体液から得られうる。
【００７３】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合を介して連結された複数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの関連する構造変異体若しくは合成類似体）から成るポリマー（又はその関連する構造変異体若しくは合成類似体）を意味するために本明細書で用いられる。こうして、用語「オリゴヌクレオチド」は、通常そのヌクレオチド残基及びそれらの間の結合が天然に生ずるものであるヌクレオチドポリマーを意味するが、この用語はその範囲内にぺプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボ核酸などの種々の類似体を含むが、これらに限定されないものと理解される。この分子の正確な大きさは具体的適用に応じて変化し得る。オリゴヌクレオチドは通常長さはかなり短く、一般に約１０から３０ヌクレオチド残基までであるが、この用語は如何なる長さの分子をも意味し得る。もっとも、大きなオリゴヌクレオチドに対しては用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」が通常用いられる。
【００７４】
「機能しうるように連結された」とは、転写調節核酸及び翻訳調節核酸が、ポリヌクレオチドが転写されそしてポリペプチドが翻訳されるように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関して配置されることを意味する。
【００７５】
用語「患者」とは、ヒト又は他の哺乳動物の患者を意味し、本発明の方法を用いて検査又は治療をすることが望まれる任意の個体を含む。しかしながら、「患者」は症候が存在することを意味するものではないと理解される。本発明の範囲に入る適当な哺乳動物としては、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、実験室テスト動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ）及び捕獲された野性動物（例えば、キツネ、シカ、ディンゴ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
「薬学的に許容しうる担体」とは、局所投与又は全身投与で安全に使用しうる固体若しくは液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化用物質を意味する。
【００７７】
本明細書で用いられるとき用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを意味する。この用語は通常長さが３０ヌクレオチドよりも大きなオリゴヌクレオチドを意味する。
【００７８】
用語「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」とは、参照ポリヌクレオチド配列と実質的に同一の配列を示すポリヌクレオチド又は以下に記載される厳格条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。これらの用語は、一つ以上のヌクレオチドが付加され又は欠失され、又は異なるヌクレオチドと置換されたポリヌクレオチドを包含する。この点で、変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物機能又は活性を保持したままで、突然変異、付加、欠失及び置換を含む何らかの変更が該参照ポリヌクレオチドに加えられ得ることは当分野で十分に知られている。用語「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」は天然に生ずる対立遺伝子変異型をも含む。
【００７９】
「ポリペプチド」、「ぺプチド」及び「タンパク質」は本明細書では互換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマー及びその変異体及び合成類似体を意味する。こうして、これらの用語は、並びに天然に生ずるアミノ酸ポリマーの外に、一つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生ずるアミノ酸の化学類似体などの天然に生じない合成アミノ酸であるようなアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００８０】
用語「ポリペプチド変異型」とは、参照ポリペプチドから少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失又は置換により変更されるポリペプチドを意味する。一部のアミノ酸を、ポリペプチドの活性の本性を変えることなく、広範に類似した特性を有する他のアミノ酸に変えうることは当分野でよく理解されている。従って、ポリペプチド変異型は本明細書で用いられるとき、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、Ｂ７−１分子及びＢ７−２分子から選択される親ポリペプチドと類似の活性を有するポリペプチドを包含する。好ましい変化型ポリペプチドには、同類アミノ酸置換が含まれる。ポリペプチドにおける典型的な同類置換は次の表に従って行なうことができる。
【００８１】
【表Ｂ】
0004943621.tif 000004
【００８２】
【表Ｂ−１】
0004943621.tif 000005
【００８３】
機能の実質的変更は、表Ｂに示されるものよりも保存性の低い置換を選択することにより行なう。他の置換は、非同類置換となり、それらの比較的少数が許容されるであろう。一般に、ポリペプチドの特性に最大の変化を生ずる可能性のある置換は、（ａ）親水性残基（例えば、Ｓｅｒ又はＡｓｎ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ又はＶａｌ）の代わりに、又は疎水性残基により置換される場合、（ｂ）システイン又はプロリンが他の任意の残基の代わりに、又は他の任意の残基により置換される場合、（ｃ）正電荷の側鎖を持つ残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓ）が負電荷残基の代わりに、又は負電荷残基（例えば、Ｇｌｕ又はＡｓｐ）により置換される場合、又は（ｄ）小さな側鎖を持つ残基（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）又は側鎖を持たない残基（例えば、Ｇｌｙ）が大きな側鎖を持つもの（例えば、Ｐｈｅ又はＴｒｐ）の代わりに、又は大きな側鎖を持つものにより置換される場合である。
【００８４】
「プライマー」とは、ＤＮＡの１本の鎖と対になると、適切な重合化物質の存在下でプライマー伸長生産物の合成を開始できるオリゴヌクレオチドを意味する。このプライマーは増幅の最大効率のためには１本鎖であることが好ましいが、代わりに二本鎖であることもできる。プライマーは重合化物質の存在下で伸長生産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの長さは、適用、使用温度、鋳型反応条件、他の試薬、及びプライマーの供給源などの多くの要因に左右される。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５〜３５又はそれ以上のヌクレオチド残基を含むが、より少ないヌクレオチド残基しか含まなくてもよい。プライマーは約２００ヌクレオチドから数キロ塩基以上までの大きなポリヌクレオチドであることもできる。プライマーは、それがハイブリダイズしそして合成の開始のための部位として役立つように設計された鋳型上の配列に「実質的に相補的」であるように選択されうる。「実質的に相補的」とは、該プライマーが標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするための十分な相補性を有することを意味する。プライマーはそれがハイブリダイズするように設計された鋳型との不適合を含まないことが好ましいが、これは本質的ではない。例えば、プライマー配列の残りの部分が鋳型に相補的である場合は、非−相補的ヌクレオチド残基をプライマーの５’末端に結合させうる。または、プライマー配列がハイブリダイズする鋳型の配列と十分な相補性を有することにより、プライマーの伸長生産物の合成のための鋳型を形成するのであれば、非−相補的ヌクレオチド又は非−相補的ヌクレオチドの断片をプライマー中に散在させることができる。
【００８５】
「プローブ」とは、別の分子の特定の配列又は部分配列又は他の部分に結合する分子を意味する。特に断らない限り、用語「プローブ」は、通常、しばしば「標的核酸」と呼ばれる別の核酸に相補的塩基対合により結合するポリヌクレオチドプローブを意味する。プローブは、該プローブとの完全な配列相補性を持たない標的核酸に、ハイブリダイゼーション条件の厳格性に依存して、結合できる。プローブは直接的又は間接的に標識化できる。
【００８６】
用語「組換えポリヌクレオチド」とは、本明細書で用いられるとき、核酸の操作によりイン・ビトロで天然では通常見出されない形に形成されたポリヌクレオチドを意味する。例えば、組換えポリヌクレオチドは発現ベクターの形であってもよい。一般に、このような発現ベクターには、ヌクレオチド配列に機能しうるように連結された転写調節核酸及び翻訳調節核酸が含まれる。
【００８７】
「組換えポリペプチド」とは、組換え技法を用いて、即ち、組換えポリヌクレオチドの発現により、作製されたポリペプチドを意味する。
【００８８】
本明細書で用いられるとき「レポーター分子」とは、その化学的性質により、抗原結合性分子及びその標的抗原を含む複合体の検出を可能とする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を意味する。用語「レポーター分子」は、細胞凝集又はラテックスビーズ上の赤血球のような凝集阻害の使用などにも及ぶ。
【００８９】
本明細書で用いるとき、免疫応答又は免疫学的応答を「刺激する」とは、外来分子、同系異種の細胞、又は腫瘍細胞などの標的物質に宿主の免疫系が反応する能力を、そうでなければ生ずるであろうレベルよりも高いレベルで開始させ、強化し、又は維持する組成物の投与を意味する。「一次」免疫応答を刺激するとは、本明細書では、例えば、標的抗原との接触の欠如、標的への無反応性、又は免疫抑制により、以前に反応性が検出されなかった被験者に特異的な免疫反応性を誘発することを意味する。「二次的」応答を刺激するとは、例えば、天然の免疫、自発的免疫化、又は一つ若しくは複数の組成物若しくは手順を用いる処理により、以前に反応性が検出された被験者の反応性の再開始、強化、又は維持を意味する。
【００９０】
状態を治療するという文脈では、「治療上有効な量」とは、１回投与又は一連の分割投与のいずれかで、そのような治療を必要とする個体の免疫応答を誘発し、その状態の治療のために有効な免疫増強組成物の量の投与を意味する。この有効量は治療される個体の健康状態や肉体的条件、治療される個体の分類学的グループ、組成物の処方、医学的状態の評価、及び他の関連する要因に依存して変わる。この量は比較的広い範囲に入り、機械的試行により決定することができる。
【００９１】
本明細書で用いられるとき「原子価」とは分子１個当たりの有効な結合部位の数を意味する。
【００９２】
「ベクター」とは、核酸分子、好ましくは、例えば、核酸分子がそれに挿入され若しくはクローニングされ得るプラスミド、バクテリオファージ、又は植物ウイルスから誘導されるＤＮＡ分子を意味する。ベクターは好ましくは、一つ以上のユニークな制限部位を含み、標的細胞若しくは組織又はその子孫細胞若しくは組織を含む一定の宿主細胞中で自律複製でき、又はクローニングされた配列が再生産可能なように該一定の宿主のゲノムと一体化できるものである。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、即ち染色体外の実体として存在するベクターであり、その複製は染色体の複製とは無関係なベクターであり、例えば、直鎖状若しくは閉環したプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工的染色体であることができる。ベクターは自己複製を確かにするための何らかの手段を含むことができる。または、ベクターは宿主細胞に導入されると、ゲノムと一体化しそれが合体した染色体（単数又は複数）と一緒に複製されるものであることができる。ベクター系は、単一のベクター若しくはプラスミド、二つ以上のベクター又はプラスミドを含むことができ、これらは一緒になって宿主細胞のゲノム又はトランスポゾンに導入されるべき総ＤＮＡとなる。ベクターの選択は、通常、該ベクターが導入される宿主と該ベクターとの適合性に左右される。該ベクターは適当な形質転換体の選択に使用できる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含むことができる。このような耐性遺伝子の例は当業者に良く知られている。
【００９３】
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【００９４】
３．免疫増強組成物
本発明は、少なくとも部分的には、少なくとも一つのインターフェロンの存在下で、動物細胞を培養し、その後インターフェロン類を除去するため該動物細胞を洗浄することにより動物細胞の免疫増強の相乗的強化が見られるという発見に端を発する。ここで、該動物細胞はその表面に免疫刺激性分子を発現するか又は他の方法で免疫刺激分子と一緒に提供される。
【００９５】
こうして、本発明は、一つの側面で動物細胞の免疫増強を強化する方法であって、該動物細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で少なくとも一つのインターフェロンと共に該動物細胞を培養する工程及び少なくとも一つのインターフェロンを除去するため該動物細胞を洗浄する工程を含み、該動物細胞はその表面上で免疫刺激性分子を発現するか、又は他の方法で免疫刺激分子と一緒に提供されるものである方法を提供する。
【００９６】
好ましい実施態様では、この方法は動物細胞の不均質集団から該免疫刺激性分子を発現する細胞を単離する工程をさらに含む。本発明では、任意の単離方法が意図される。特定の細胞を単離するための適切な方法は当業者に知られている。例えば、不均質集団からその細胞を特異的に単離するため、該細胞の一つ以上の特定の特性を利用することができる。このような特性には、細胞の解剖学的位置、細胞の密度、細胞の大きさ、細胞の形態学、細胞の代謝活性、細胞によるＣａ2 + 、Ｋ+ 、及びＨ+ イオンなどのイオンの取込み、細胞による染料などの化合物の取込み、細胞表面に発現されるマーカー、タンパク質蛍光、及び膜電位などが含まれるが、これらに限定されない。この点で、用いられる適切な方法には、組織の外科的切除、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー法、免疫アフィニティ分離（例えば、Dynabead (商標) 分離などの磁気ビーズ分離) 、密度分離（例えば、メトリザミド、Percoll(商標) 、又は Ficoll(商標) 勾配遠心分離) 、及び細胞型特異的密度分離が含まれる。
【００９７】
本発明では、該細胞はフローサイトメトリーにより、又は免疫刺激性分子と免疫相互作用する抗原結合分子を用いる免疫アフィニティ分離により単離することが好ましい。
【００９８】
別の実施態様によれば、この方法はその表面上に免疫刺激性分子を発現するように動物細胞を改変する工程をさらに含む。こうして、該免疫刺激性分子は、該分子の少なくとも一部が細胞外の環境（即ち、各細胞の外側）に露出されている免疫刺激性膜分子であることができる。この例では、免疫刺激性分子は好ましくはＴ細胞補助的刺激分子である免疫刺激性膜分子であることが好ましい。一つの実施態様では、Ｔ細胞補助的刺激分子はＢ７分子、又はその生物活性断片、又はこれらの変異型若しくは誘導体である。このＢ７分子には、Ｂ７−１及びＢ７−２が含まれるが、これらに限定されない。該Ｂ７分子はＢ７−１であることが好ましい。Ｂ７−１及びＢ７−２の適切なポリペプチド配列には、それぞれ配列番号：１４及び配列番号：１６に記載されたもの、それらの生物活性断片、及びこれらの変異型若しくは誘導体が含まれるが、これらに限定されない。別の実施態様では、Ｔ細胞補助的刺激分子はＩＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−２などのＩＣＡＭ分子である。
【００９９】
該改変の工程は、免疫刺激性分子がそれから翻訳され得るポリヌクレオチドを該動物細胞中に導入する工程を含むことが好ましい。該ポリヌクレオチドは、好ましくは発現ベクターの形で調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結されることが好ましい。該ポリヌクレオチドの発現を調節するために利用され得る調節ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結区を含むが、これらに限定されない。このような調節ポリヌクレオチドは当業者に知られている。この発現ベクターは少なくとも一つのプロモーターを含むことが好ましい。該ポリヌクレオチドの発現を誘導するために利用できる適切なプロモーターには、構成プロモーター及び誘導可能プロモーターが含まれる。
【０１００】
Ｂ７分子をコードする適切なポリヌクレオチドはすべて使用できる。本発明に従って利用できるＢ７−１分子をコードするポリヌクレオチドは、例えば、フリーマンら (1989，J. Immunol. 143: 2714-2722) 、フリーマンら(1992, Blood 79: 489-494) 、及びゲンバンク・データベース[(位置指定 HUMIGB7、受託番号 M27533)及び (位置指定 NM 005191、受託番号 NM 005191)]に記載されている。Ｂ７−１をコードする典型的ポリヌクレオチド配列は配列番号：１３に記載されている。Ｂ７−２分子をコードする適切なポリヌクレオチドは、例えば、アズマら（1993, Nature 336: 76-79)、チェンら (1994, J. Immunol. 152: 4929-4963) 、及びゲンバンク・データベース (位置指定 NM 006889、受託番号 NM 006889) に記載されている。Ｂ７−２をコードする適切なポリヌクレオチドは配列番号：１５に記載されている。
【０１０１】
免疫刺激性タンパク質の発現のための典型的な発現ベクターには、例えば、フォングらによる米国特許第６，０５１，４２８号に記載された単純ヘルペス・アンプリコンが含まれる。
【０１０２】
免疫刺激性分子をコードするＤＮＡを組み立てそして発現させる技法、例えば、オリゴヌクレオチドの合成、核酸増幅法、細胞の形質転換、ベクター、発現系などの構築、及びこのようなＤＮＡを動物細胞中に形質導入又は他の方法で導入すること、は当分野で良く確立されており、ほとんどの実務家は特定の条件や手順についての標準的供給源に通暁しているということは当業者に理解される。
【０１０３】
別の実施態様では、該免疫刺激性分子は可溶形であることが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、該免疫刺激性タンパク質は機能性の膜貫通ドメインを欠如しているＢ７分子である。可溶性のＢ７分子はＢ７細胞外ドメインを含むことが好ましい。このタイプの可溶性Ｂ７−１分子は、例えば、マックヒューら（1998，Clin. Immunol. Immunopathol. 87(1): 50-59)、ファースら (2000, J. Immunol. 164(12): 6340-6348) 及びジーニンら (2000, Immunity 13(3): 303-312)により開示されている。可溶性Ｂ７−１のポリペプチド配列の例としては、配列番号：１８及び配列番号：２０に記載されたもの、それらの生物活性断片、及びこれらの変異形又は誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。このタイプの別の好ましい実施態様では、該免疫刺激性タンパク質はＢ７誘導体である。このＢ７誘導体は、好ましくは免疫グロブリン分子又はその生物活性断片である抗原結合性分子と連結したＢ７分子、又はその生物活性断片、又はこれらの変異形若しくは誘導体を含むキメラ又は融合タンパク質であることが好ましい。
【０１０４】
本発明の好ましいキメラタンパク質は、Ｂ７分子の生物活性断片に対応するポリペプチドを含むキメラタンパク質を含む。例えば、本発明の方法に有用なＢ７分子の誘導体は、Ｂ７分子の細胞外ドメインに対応するポリペプチド及びＢ７分子の溶解性、親和性及び／又は原子価を変更するイムノグロブリン定常領域を含むＢ７Ｉｇ融合タンパク質である。
【０１０５】
好ましい実施態様では、Ｂ７−１分子の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列をコードし、約１位から約２１５位までのアミノ酸を含むポリヌクレオチドは、ＰＣＲを用いて、ヒトＩｇＣγ１のヒンジ領域ＣＨ２及びＣＨ３に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合させて、Ｂ７Ｉｇ融合タンパク質として発現する構築物を形成させる。Ｂ７Ｉｇ融合タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ブダペスト条約に従って1991年 5月31日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）（ロックビル、Ｍｄ）に寄託し、受託番号 68627を受けた。このようなＢ７誘導体を作製し組み立てる方法は、例えば、リンスレーら（米国特許第５，５８０，７５６）により開示されている。ＩｇＧ２ａのＦｃ部分に枠を揃えて融合したＢ７−１又はＢ７−２の細胞外領域を含む融合タンパク質を開示するシュトルムヘーフェルら（1999, Cancer Res. 59: 4964-4972)も参照しうる。
【０１０６】
可溶性の免疫刺激性タンパク質の半減期は、望ましいときは、任意の適切な手順で延長させうる。このような分子は、例えば、チャップマンら（1999，Nature Biotechnology 17: 780-783) により開示されたように、モノメトキシ−ポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて化学的に改変されることが好ましい。
【０１０７】
培養の工程は、少なくとも一つのＩ型インターフェロン及び／又は II 型インターフェロンと該細胞とを接触させる工程を含む。この少なくとも一つのＩ型インターフェロンは、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−アルファの生物活性な断片、ＩＦＮ−ベータの生物活性な断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性な断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該生物活性な断片の誘導体、該変異型の誘導体、ＩＦＮ−アルファの類似体、及びＩＦＮ−ベータの類似体からなる群より選択されることが好ましい。該 II 型ＩＦＮは、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ガンマの生物活性断片、ＩＦＮ−ガンマの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ガンマの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体、及びＩＦＮ−ガンマの類似体からなる群より選択されることが好ましい。
【０１０８】
ＩＦＮ−ガンマは配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０１０９】
一つの実施態様では、ＩＦＮ−ベータはＩＦＮ−ベータ１であり、これは配列番号：４に記載されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。別の実施態様では、ＩＦＮ−ベータはＩＦＮ−ベータ２であり、これは配列番号：６に記載されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０１１０】
一つの実施態様では、該ＩＦＮ−アルファは配列番号：８に記載されたアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、該ＩＦＮ−アルファはＩＦＮ−アルファ１であり、これは配列番号：１０に記載されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。さらに別の実施態様では、該ＩＦＮ−アルファはＩＦＮ−アルファ２であり、これは配列番号：１２に記載されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０１１１】
例えば、ＩＦＮ−アルファ及び／又はＩＦＮ−ベータは該細胞に対し直接使用しうるし、又は該細胞をＩＦＮ−アルファ及び／又はＩＦＮ−ベータで処理する前に、ＩＦＮ−ガンマの存在下でまず培養してもよい。本発明を如何なる一つの理論又は特定の作用様式に制限する意図はないが、このＩＦＮ−ガンマはＩＦＮ−アルファ及びＩＦＮ−ベータにより調節された遺伝子の転写活性化に要求される転写因子のレベルを回復させ又は強化させるものと提唱する。
【０１１２】
従って、培養の工程は、少なくとも一つのＩ型ＩＦＮに該細胞が応答できるほどに十分な時間及び条件の下で II 型ＩＦＮと該細胞とを接触させる工程、及び、次いで該細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で該培養された細胞を少なくとも一つのＩ型ＩＦＮと接触させる工程を含むことが好ましい。
【０１１３】
一つの実施態様では、 II 型ＩＦＮの存在下で培養された細胞は、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ベータの生物活性断片、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体、及びＩＦＮ−ベータの類似体からなる群より選択されたＩ型ＩＦＮと接触させられる。
【０１１４】
別の一実施態様では、 II 型ＩＦＮの存在下で培養された該細胞は、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−アルファの生物活性断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体、及びＩＦＮ−アルファの類似体からなる群より選択されるＩ型ＩＦＮと接触させられる。
【０１１５】
さらに別の一実施態様では、 II 型ＩＦＮの存在下で培養された細胞は、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ベータの生物活性断片、ＩＦＮ−ベータの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−ベータの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体、及びＩＦＮ−ベータの類似体からなる群より選択される第一のＩ型ＩＦＮと接触させられ、そしてＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−アルファの生物活性断片、ＩＦＮ−アルファの変異型、該生物活性断片の変異型、ＩＦＮ−アルファの誘導体、該生物活性断片の誘導体、該変異型の誘導体、及びＩＦＮ−アルファの類似体からなる群より選択される第二のＩ型ＩＦＮと接触させられる。
【０１１６】
該細胞は約１６時間から約９６時間まで II 型ＩＦＮ（例えばＩＦＮ−ガンマ）と共に培養し、次いで約１６時間から約７２時間まで一つ以上のＩ型ＩＦＮ（例えば、ＩＦＮ−アルファ及び／又はＩＦＮ−ベータ）と共に培養することが好ましい。該細胞は約４８時間から約９６時間まで II 型ＩＦＮ（例えばＩＦＮ−ガンマ）と共に培養し、次いで約２４時間から約７２時間まで一つ以上のＩ型ＩＦＮ（例えば、ＩＦＮ−アルファ及び／又はＩＦＮ−ベータ）と共に培養することが好ましい。
【０１１７】
該細胞は、約１００から約２０００国際単位／ｍＬの濃度のＩＦＮ−ガンマで処理し、次いで約１００から約２０００国際単位／ｍＬの濃度のＩＦＮ−アルファ及び／又はＩＦＮ−ベータで処理しうる。該細胞は約１０００国際単位／ｍＬの濃度のＩＦＮ−ガンマと共に培養し、次いで約１０００国際単位／ｍＬの濃度のＩＦＮ−アルファ及び／又はＩＦＮ−ベータと共に培養することが好ましい。
【０１１８】
従って、動物細胞は、宿主受容者では達成し得ない濃縮型の少なくとも一つのＩＦＮに接触させられることが認められる。如何なる一つの特定の理論又は作用様式により縛られることは望まないが、少なくとも一つのＩＦＮの存在下での培養は、抗原処理経路を介して抗原を処理する動物細胞の能力及び処理されたその抗原を該細胞の表面上に提示する能力の両方を増強する。動物細胞の表面上に、又はそれと結合して、好ましくはＴ細胞補助的刺激分子である免疫刺激性分子が存在することは、例えばＴ細胞上に存在するＣＤ２８又はＣＴＬＡ４受容体を通じてＴ細胞活性化を行なう手段を与えることになる。
【０１１９】
該培養工程は、培養中に単離された細胞の集団を拡大させる工程をさらに含むことが好ましい。このような拡大法は当業者に知られている。例えば、以下に記載されるような細胞集団の拡大はフラスコ中で増殖させた単離細胞から調製される。拡大集団の生産は、必要ならば、バイオリアクター又は発酵槽又は大量に細胞を増殖させるのに適した他のこのような容器又は装置中で、該細胞を培養することによりスケールアップすることができる。この単離された集団は繊維芽細胞成長因子を含むがこれに限定されない一つ以上のサイトカイン／成長因子の存在下で、適当な完全な成長培地（例えば、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ又はＤＭＥＭ、又は無血清培地）の存在下で、３７℃で、５〜７％の二酸化炭素の下で拡大することが好ましい。
【０１２０】
本発明の一つの特別な利点は、該細胞の上に提示される抗原のタイプが予め選択されることがないことである。その理由は、該細胞が免疫原の供給源として用いられるからである。したがって、該細胞により正常にプロセスされた抗原の多数のものが免疫細胞のプロセスを活性化するのに利用でき、その結果異なる抗原性標的の範囲に応答する免疫細胞の集団の広範なバリエーションを生ずることになる。例を挙げれば、ある癌細胞は治療される患者の腫瘍により共有される多数の腫瘍関連抗原を発現することになる。
【０１２１】
さらに、抗原は、抗原提示細胞により用いられる天然の選択により展開されるコンフィギュレーションで提示され、その結果強力な免疫細胞の活性化を生ずる。または、治療される細胞は、腫瘍抗原であることが好ましい特定の抗原性ぺプチドを負荷されると特異的標的ワクチンとなる。例えば、ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原をコードする種々の遺伝子を記述するヴァンペルら（1995, Immunol Rev 145: 229-250) 及びＣＴＬ殺滅のため標的として腫瘍細胞の上にぺプチドを負荷する方法の使用を記述するイトーら (1994，J. Immunol. 153: 1202-1205) 及びコールら（1995, Cancer Res. 55: 748-752)を参照しうる。
【０１２２】
好ましい細胞は、規定されたＭＨＣゲノム領域若しくは同等物を持つ細胞、及び細胞表面への抗原性分子のＭＨＣクラスＩ提示を増加若しくは強化する能力を持つ細胞である。
【０１２３】
本発明の細胞は意図された宿主から単離され、処理され、次いで該宿主中に再導入若しくは再注入されうる。外科的切断、生検、採血又は他の適当な技法により治療されるべき宿主から得られる細胞を使用することが特に好ましい。このような細胞は本明細書では「自己由来の」細胞と呼ばれる。または、細胞若しくは細胞系統（例えば、腫瘍細胞系統）は一つの起源から調製及び／又は培養されそして異なる宿主中に導入される。このような細胞は本明細書では「同種異系の」細胞と呼ばれる。同種異系細胞の一つの具体的な形は、潜在的受容体と主要及び／又は少量組織適合性抗原を共有している一般的細胞系統（a generic cell line)を含む。
【０１２４】
上記一般的細胞系統は、意図された宿主中で免疫応答、好ましくはＴ細胞免疫応答、さらに好ましくは細胞障害性Ｔリンパ球免疫応答を開始させるのに十分なレベルで免疫刺激分子、好ましくは免疫刺激膜分子を自然に発現することが好ましい。
【０１２５】
該一般的細胞系統は、特定の状態に罹り易い又は罹る傾向を持つ集団の高いパーセンテージと適合しうる主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ抗原を含むことが好ましい。ワクチン注射により治療され若しくは予防される該状態は癌又は腫瘍であることが適当である。該一般的細胞系統は内因性Ｂ７分子を高レベルで発現することが好ましい。該一般的細胞系統は少なくとも本明細書で記述された一つのＩＦＮによる処理に高度に感受性である（即ち、クラスＩのＨＬＡの高レベル発現を意味する）ことも好ましい。
【０１２６】
一つの実施態様では、処理された細胞（例えば癌細胞）若しくは細胞系統は被験体に投与された場合さらなる増殖を防止するため失活させることが好ましい。物理的、化学的、若しくは生物学的な任意の失活手段を使用しうる。例えば、照射（好ましくは少なくとも約 5,000 cGy、さらに好ましくは少なくとも約 10,000 cGy 、さらに好ましくは少なくとも約 20,000 cGy ）、又はマイトマイシンＣでの処理（好ましくは少なくとも10μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約 50 μｇ／ｍＬ) が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２７】
本発明は、例えば、鳥類種、爬虫類及び哺乳動物から得られる動物細胞にまで及ぶ。哺乳動物が好ましく、そしてこれにはヒト、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ）、及び捕獲野性動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）が含まれる。ヒトは最も好ましい動物であり、自己由来及び同種異系の細胞の両者がヒト被験者で使用されうる。
【０１２８】
動物細胞は癌又は腫瘍の細胞であることが好ましい。本発明の組成物又はワクチンは該腫瘍細胞又は癌細胞から誘導されるであろう。例えば、本発明の方法に従って肺癌の治療をする場合、該肺癌細胞が本明細書で先に記載したように処理されて肺癌ワクチンとなるであろう。同様に、乳房腫瘍若しくは乳癌の細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、膀胱癌細胞、腎臓癌細胞、なども作製され、本発明の物質の組成物又はワクチンがそれから作製された腫瘍細胞若しくは癌細胞の予防及び／又は治療のために、本発明の方法に従って免疫治療物質として用いられるであろう。好ましい実施態様では、該癌細胞若しくは腫瘍細胞はメラノーマ細胞及び乳癌細胞からなる群より選択されることが好ましい。
【０１２９】
本発明の物質の組成物は、該処理された細胞の上に病原生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物の）の抗原を負荷させることによりヒト及び動物に悪影響を与える様々な感染性疾病を治療するために調製することもできよう。同一の疾病を惹き起こす種々の異なる生物により発現される免疫原性の抗原及び防御的抗原のタイプに不均質性があるので、多価組成物及び多価ワクチンが重要な異種抗原を発現する生物のプールから組成物又はワクチンを調製することにより調製され得るであろう。したがって、本発明は、患者の免疫系を刺激する方法、そして好ましくは、該細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間及び条件の下で、この又は各抗原と共に少なくとも一つのインターフェロン（ＩＦＮ）の存在下で培養された動物細胞を患者に投与することにより一つ以上の抗原に対する該患者のＴ細胞応答を調節する方法をも包含する。したがって、抗原の免疫原性は、被験体から動物細胞を単離し、それらを該抗原と「パルスさせ」即ち接触させ、次いでイン・ビトロ又はイン・ビボで自己由来のＴ細胞を刺激するため該パルスさせた細胞を使用することによりイン・ビトロで増強又は他の方法で改良され得る。
【０１３０】
本発明の物質の組成物は、細菌、ウイルス若しくは酵母の感染、原生動物若しくは他の寄生体の感染を受けている若しくは受ける性質を有する動物又はメラノーマ若しくは他の肉腫若しくは腫瘍などの癌を患っている動物で免疫障害を有する動物を治療するためにも調製され得るであろう。
【０１３１】
以上のことから、本発明は、広くいえば、該細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件の下で少なくとも一つのインターフェロンの存在下で培養され且つインターフェロン類を除去するため洗浄された動物細胞と免疫刺激分子を含む物質の組成物に関する。
【０１３２】
好ましい実施態様では、本発明は免疫刺激性膜タンパク質を発現する動物細胞であって、該細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間及び条件の下でＩＦＮ−ガンマ並びにＩＦＮ−アルファ及びＩＦＮ−ベータの一方又は両方の存在下で培養され且つ該ＩＦＮ類を除去するため洗浄された動物細胞を含む物質の組成物を提供する。
【０１３３】
該処理された細胞を上記の免疫刺激性分子と組み合わせると、例えば腫瘍又は癌のような種々の状態の治療又は予防のための活性物として使用することができる。これらの治療用物質は単独でか、又は一以上の薬学的に許容しうる担体、アジュバント及び／又は希釈剤と混合したワクチンの形で患者に投与することができる。
【０１３４】
４．ワクチン
本発明は、上に広く説明した動物細胞の組成物を含む宿主の免疫系を刺激するためのワクチンであって、さらに一以上の薬学的に許容しうる担体、アジュバント及び／又は希釈剤を任意選択的に含むワクチンをも意図する。
【０１３５】
本発明の免疫刺激分子と混合した培養動物細胞はワクチンの調製における活性体として使用しうる。このような調製物は当業者に知られた通常の方法を使用する。典型的には、このようなワクチンは液状の溶液か懸濁液かのいずれかで注射可能なものとして調製される。注射前に液体中の溶液又は懸濁液とするのに適した固状製剤も調製されうる。この調製物は乳化剤としてもよい。この活性な免疫原成分は薬学的に許容しうるそして該活性成分と適合しうる賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びそれらの組み合わせである。さらに、必要ならば、該ワクチンは加湿剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、及び／又はワクチンの有効性を高めるアジュバントなどの補助的物質を少量含んでもよい。効果的なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（thur-MDP) 、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（CGP 11637,  nor-MDP と呼ばれる) 、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（CGP 1983A, MTP-PE と呼ばれる) 、及び細菌、モノホスホリルリピドＡ、ジミコール酸トレハロース及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）から抽出した３成分を２％スクアレン／トゥイーン８０乳液中に含むＲＩＢＩが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アジュバントの有効性は該ワクチンの投与から生ずる抗体であって、該ワクチンの処理細胞により提示される一以上の抗原に対して向けられる抗体、の量を測定することにより決定される。
【０１３６】
この細胞は細胞や個体にたいして毒性のない薬学的に許容しうる担体に混ぜて投与されるべきである。このような担体は該細胞が生育させられた成長培地であってもよい。適合性の賦形剤には、生理学的に適合するリン酸塩若しくはヘペスなどの緩衝液及びデキストロースなどの栄養素、生理学的に適合するイオン若しくはアミノ酸、及び細胞集団と共に使用するのに適する種々の培養培地、とりわけ他の免疫原成分を含まないものを含む又は含まない等張食塩水が含まれる。アルブミンや血漿画分や非活性な濃化剤などの担体試薬も使用しうる。ワクチン中に存在する限りでは活性のない生体成分は処理されるべき動物若しくはヒトと同系の動物若しくはヒトから誘導することが好ましく、被験体から先に得たものがさらに好ましい。注射部位は皮下、腹腔内、筋肉内、皮内又は静脈内であってよい。
【０１３７】
ワクチン中の活性物質として可溶性の免疫刺激分子を用いる場合は、該免疫刺激分子は中性形又は塩形として該ワクチン中に調剤できる。薬学的に許容しうる塩には、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸又は酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸とで形成される酸付加塩（ぺプチドの遊離のアミノ基とで形成される）が含まれる。遊離のカルボキシル基とで形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム若しくは水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導してもよい。
【０１３８】
もし必要ならば、ワクチンを含む装置又は組成物であって徐放性若しくは断続的放出に適するものは、効力を持った状態で体内に埋め込まれ、あるいは体内にこのような物質を比較的ゆっくりと放出するために局所的に適用されうるであろう。
【０１３９】
可溶性の免疫刺激分子が細胞含有組成物の投与とは別に患者に投与されうることも認められる。治療される特定の状態に応じて、該免疫刺激分子は調剤され、全身的に若しくは局所的に投与されうる。調剤及び投与の方法は、「レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ」マック・パブリッシング・コウ．，イーストン，Ｐａ，最新版に載っている。適当な経路には、例えば、経口、経直腸、経粘膜、又は経腸の投与、そして筋肉内注射、皮下注射、脊髄内注射並びにくも膜下注入、直接脳室内注入、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注入又は眼球内注射を含む非経口的送達が含まれる。
【０１４０】
投与すべきＩＦＮ処理細胞の数及び任意選択的に免疫刺激分子の量は、治療すべき被験体に依存し、被験体の年齢、性別、体重及び全身健康状態に依存する。この点で、該物質（単数又は複数）の正確な投与量は実務家の判断に依存することになる。疾病又は状態の治療において投与されるべき物質（単数又は複数）の有効量を決定する場合は、医師が経時的に該疾病又は状態の進行を評価しうる。いずれにしても当業者は不当な実験なしに、本発明の物質の適切な用量を容易に決定しうる。細胞含有組成物及びワクチンは投与当たり約１０4 〜１０10処理細胞の範囲で、より好ましくは約１０6 〜１０8 処理細胞の範囲で患者に投与するのが好ましい。患者に投与される免疫刺激分子の用量は、該ワクチンの細胞成分との組み合わせで、該癌又は腫瘍と関連する症状の低減などの長期にわたる患者に有益な応答を惹き起こすのに十分なものであるべきである。用量の量及び間隔は免疫刺激効果を維持するのに十分な免疫刺激分子の血漿レベルを与えるように個々に調節しうる。全身投与のための通常の患者用量は１〜２０００ｍｇ／日の範囲であり、普通には１〜２５０ｍｇ／日、典型的には１０〜１５０ｍｇ／日の範囲である。患者の体重当たりで言えば、通常の用量は０．０２〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、普通には０．０２〜３ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には０．２／１．５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０１４１】
本発明は、疾病又は状態を治療及び／又は予防する方法であって、上に広く説明したような組成物又はワクチンの治療上有効量をそのような治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法を包含する。
【０１４２】
一つの実施態様では、本発明の細胞を含む組成物又はワクチンは、正常な免疫応答に達することができない免疫抑制された個体に養子免疫細胞移入を行なうため、大量のＣＤ８+ ＣＴＬ又はＣＤ４+ ＣＴＬを形成させるのに用いることもできよう。例えば、抗原特異的ＣＤ８+ ＣＴＬはＨＩＶ感染（クープら，1991, J. Exp. Med. 174: 1593-1600 、カーミケルら, 1993，J. Exp. Med. 177: 249-256 、及びジョンソンら，1992, J. Exp. Med. 175: 961-971)、マラリア（ヒルら，1992，Nature 360: 434-439)及びメラノーマなどの悪性腫瘍( ヴァンデアブローゲンら, 1991，Science 254: 1643-1647、及びヤングとシュタインマン 1990, J. Exp. Med., 171: 1315-1332)で苦しんでいる個体に治療上の目的で養子免疫細胞移入を行なうことができる。
【０１４３】
別の一実施態様では、細胞含有組成物又はワクチンは癌又は腫瘍の治療又は予防に適している。本発明の方法に従って治療されるのが好ましい癌又は腫瘍には、小細胞や大細胞の腺癌や扁平上皮細胞癌や気管支肺胞癌などの肺の癌若しくは腫瘍、導管又は小葉の腺癌などの乳腫瘍、子宮頸部の扁平上皮及び腺癌や子宮・卵巣の上皮腺癌などの婦人科腫瘍、上皮腺癌及びそれらの転移などの大腸腫瘍、膵臓導管腺癌などの膵臓腫瘍、前立腺癌などの前立腺腫瘍、胃癌や移行性の扁平上皮細胞癌などの膀胱腫瘍、肝癌や胆管癌などの腎臓・骨・肝臓の腫瘍、節の又は拡散性のＢ若しくはＴ細胞リンパ腫などの網内系（ＲＥＳ）の腫瘍、プラズマ細胞腫や急性若しくは慢性白血病や食道癌や星状細胞腫や突起神経膠細胞腫や上衣腫や髄芽細胞腫や原始中性外胚葉腫や神経膠腫や膠芽腫やグリオ肉腫などの脳腫瘍、精巣腫瘍、悪性メラノーマなどの皮膚腫瘍、柔組織肉腫や平滑筋肉腫などの柔組織腫瘍、及び種々の白血病やリンパ腫が含まれる。好ましい実施態様では、該癌はメラノーマ又は乳癌である。
【０１４４】
さらに別の一実施態様では、細胞含有組成物又はワクチンはウイルス、細菌又は寄生体の感染の治療又は予防に好ましい。本発明が意図するウイルス感染には、ＨＩＶ、肝炎、インフルエンザ、日本脳炎ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、及びＲＳウイルスにより惹き起こされる感染が含まれるが、これらに限定されない。細菌性感染には、ナイセリア・スピーシーズ、メニンゴコッカス・スピーシーズ、ヘモフィラス・スピーシーズ、サルモネラ・スピーシーズ、ストレプトコッカス・スピーシーズ、レジオネラ・スピーシーズ、及びミコバクテリウム・スピーシーズにより惹き起こされる感染が含まれるが、これらに限定されない。本発明により包含される寄生体感染には、プラスモディウム・スピーシーズ、シストソーマ（Schistosoma)・スピーシーズ、ライシュマニア (Leishmania) ・スピーシーズ、トリパノソーマ・スピーシーズ、トキソプラスマ・スピーシーズ及びギアルディア（Giardia)・スピーシーズにより惹起される感染が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
免疫化の有効性は適当な方法を用いて評価しうる。例えば、ＣＴＬ溶解検定はぺプチドを被覆した又は組換えウイルスを感染させた細胞の上の刺激された脾臓細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用い、51Ｃｒ又は Alamar Blue（商標）で標識した標的細胞を用いて行いうる。このような検定は例えば霊長類、マウス又はヒトの細胞（アレンら，2000, J. Immunol. 164(9): 4968-4978 、下記のウッドベリらも）を用いて行なうことができる。または、免疫化の有効性は、新鮮なＰＢＭＣ及び刺激されたＰＢＭＣの両方のＨＬＡクラスＩテトラマー染色（例えば、上掲のアレンを参照）、増殖検定（アレンら，上掲）、ＥＬＩＳＰＯＴ検定及び細胞内ＩＦＮ−ガンマ染色（アレンら，上掲）、Ｂ細胞の線形の応答に対してＥＬＩＳＡ検定、及び合成ポリヌクレオチドを発現する細胞試料のウェスタンブロットを含む一以上の方法、これらに限定されないが、を用いて監視してもよい。
【０１４６】
５．インターフェロン処理に対する細胞性応答を評価する方法
本発明は少なくとも一つのインターフェロンでの処理に対する動物細胞の応答を評価する方法にも及ぶ。この方法は動物細胞で、（１）インターフェロンのシグナル発信に関与するポリペプチドのレベル及び／又は機能的活性、（２）該ポリペプチドを調節する細胞の調節物質のレベル及び／又は機能的活性、（３）該ポリペプチドの下流の細胞性標的のレベル及び／又は機能的活性、又は（４）該ポリペプチド、該調節物質及び該下流の細胞性標的からなる群より選択される構成員をコードする遺伝子配列の発現生産物のレベル、を検出する工程を含む。
【０１４７】
このポリペプチドはＳｔａｔ１、ＩＲＦ−１、Ｓｔａｔ２及びｐ４８ＩＳＧＦ３からなる群より選択されることが好ましい。このポリペプチドはＳｔａｔ１であることが好ましい。
【０１４８】
５．１  ポリペプチドの検出
上記のポリペプチド、調節物質及び標的ポリペプチドは、該動物細胞の試料又はその抽出物を、該ポリペプチド、調節物質又は標的ポリペプチドと免疫相互作用する抗原結合性分子と接触させる工程、及び該接触させた試料中に該抗原結合分子と該ポリペプチド、調節物質又は標的を含む複合体が存在することを検出する工程によって検出しうる。
【０１４９】
上記複合体の形成を測定するには任意の適当な手法が使用されうる。例えば、レポーター分子と結合した本発明の抗原結合分子は免疫検定に利用しうる。このような免疫検定には、当業者には良く知られた放射免疫検定（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）及び免疫クロマトグラフィー法（ＩＣＴ）、ウェスタンブロットが含まれるが、これらに限定されない。例えば、コリガンら，カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー(John Wiley & Sons, Inc, 1994)を参照のこと。これは本発明に従って使用しうる種々の免疫検定法を開示する。免疫検定法には、当分野で知られているように又は下記の例のように競争的検定法を含んでもよい。本発明は定性的及び定量的な免疫検定法を包含することが理解されよう。
【０１５０】
適当な免疫検定法は、例えば、米国特許第 4,016,043号、第 4,424,279号、第 4,018,653号に記載されている。これらは、伝統的な競争的結合検定法のみでなく非競争型の一部位検定及び二部位検定の両方を含んでいる。これらの検定法は標識した抗原結合分子の標的抗原への直接結合をも含む。
【０１５１】
二部位検定法は本発明で使用するのにとりわけ好ましい。これらの検定法には幾つかの変法があるが、全て本発明により包含されると考える。簡単に述べると、典型的なフォワード検定では、未標識抗体などの未標識抗原結合分子を固体基板上に固定化しそして試験すべき試料をこの結合分子と接触させる。抗体−抗原複合体の形成を可能とするのに十分な時間である適当なインキュベーション時間の後、検出可能なシグナルを生じ得るレポーター分子で標識された該抗原に特異的な第二の抗体が好ましい別の抗原結合分子を添加し、抗体−抗原−標識化抗体という別の複合体を形成するのに十分な時間インキュベートする。未反応の物質は全て洗い流し、そして抗原の存在をレポーター分子により形成されるシグナルを観察することにより測定する。その結果は可視的シグナルの単純な観察による定性的なものか、又は抗原の既知の量を含む対照試料と比較することによる定量的なものかのいずれかである。フォワード検定法の変法には、試料及び標識化抗体の両方が該結合抗体に同時に添加される同時検定が含まれる。これらの手法は容易に分かるような僅かな変法を含め当業者に良く知られている。本発明によれば、試料は血清、全血、及び血漿又はリンパ液を含む抗原を含むかも知れないものである。したがって、該試料は一般に循環液を含む循環試料である。
【０１５２】
典型的なフォワード検定では、抗原又はその抗原性部分に対して特異性を有する第一の抗体を固体表面に共有結合的に又は受動的に結合させる。この固体表面は通常ガラス又はポリマーであり、最も普通に用いられるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。この固体支持体は管、ビーズ、微小板の円盤、又は免疫検定を行なうのに適する他の任意の表面の形状をしてもよい。その結合プロセスは当分野で周知であり、一般に架橋共有結合又は物理的吸着からなり、ポリマー−抗体複合体は試験試料の調製の際に洗浄される。試験対象の試料の部分標本を次に固相複合体に添加して、存在する任意の抗原を該抗体に結合させるのに十分な時間及び適当な条件の下でインキュベートする。このインキュベート時間の後、抗原−抗体複合体を洗浄し、乾燥し、そして該抗原の一部に特異的な第二の抗体とインキュベートする。この第二の抗体は一般に該抗原への第二の抗体の結合を示すために用いられるレポーター分子と結合している。結合しているレポーター分子により測定される結合している標識化抗体の量は固定化された第一の抗体に結合した抗原の量に比例する。
【０１５３】
一つの代替法は生体試料の中で抗原を固定化する工程、次いでその固定化された抗原をレポーター分子で標識化され又はされていない特異的抗体と接触させる工程を含む。標的の量及びレポーター分子のシグナルの強さに応じて、結合した抗原は抗体での直接標識化により検出可能である。または、第一の抗体に特異的な第二の標識化抗体を標的−第一の抗体複合体と接触させて標的−第一抗体−第二抗体の三重複合体を形成させる。この複合体はレポーター分子により放出されるシグナルにより検出される。
【０１５４】
好ましい実施態様では、上に広く記載したポリペプチド、モジュレータ及び標的ポリペプチドを、例えば、クリベンジャーら（1987, J. Cell Physiol. 130: 336-343)及びクハールとレーマン（1991, Oncogene 6: 1499-1506)により開示されたように抗原の発現レベルについて個々の細胞を定量し比較するため、抗体で細胞内の抗原のフローサイトメトリー分析及び免疫蛍光染色により、検出し定量し又は半定量しうる。
【０１５５】
別の実施態様では、検出、定量及び半定量は当分野で知られている免疫組織学的分析（例えば、薄い切片のジアミノベンジジン染色）を用いて行なわれる。
【０１５６】
以上のことから、抗原結合分子と結合しているレポーター分子は次のものを含みうる。即ち
（ａ）該抗原結合分子へのレポーター分子の直接結合、
（ｂ）該抗原結合分子へのレポーター分子の間接的結合、即ち別の検定試薬へのレポーター分子の結合、次いで別の検定試薬が該抗原結合分子に結合する、
（ｃ）該抗原結合分子の次の反応生産物への結合。
【０１５７】
このレポーター分子は色素原、触媒、酵素、蛍光色素、化学発光分子、ユーロピウム（Ｅｕ34）などのランタナイドイオン、放射性同位元素、及び直接的可視標識を含む群から選択しうる。
【０１５８】
直接的可視標識の場合、コロイド状金属若しくは非金属粒子、色素粒子、酵素若しくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、又はシグナル形成物質を含む他の小胞などを使用しうる。
【０１５９】
レポーター分子としての使用に適する多数の酵素が米国特許第４，３６６，２４１号、第４，８４３，０００号及び第４，８４９，３３８号の各明細書に開示されている。本発明に有用な適切な酵素には、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが含まれる。これらの酵素は溶液中で単独で又は第二の酵素と組み合わせて使用してもよい。
【０１６０】
適切な蛍光色素には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）及びテキサスレッドが含まれるが、これらに限定されない。他の蛍光色素の例としては、ダウアーら（国際出願公開番号ＷＯ９３／０６１２１）により論じられたものがある。米国特許第５，５７３，９０９号（シンガーら）、第５，３２６，６９２号（ブリンクレーら）に開示された蛍光色素をも参照しうる。または、米国特許第５，２２７，４８７号、第５，２７４，１１３号、第５，４０５，９７５号、第５，４３３，８９６号、第５，４４２，０４５号、第５，４５１，６６３号、第５，４５３，５１７号、第５，４５９，２７６号、第５，５１６，８６４号、第５，６４８，２７０号及び第５，７２３，２１８号に開示された蛍光色素をも参照しうる。
【０１６１】
酵素免疫検定の場合には、酵素を、一般にグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸により第二の抗体に結合する。しかしながら、容易に分かるように、当業者が容易に利用しうる様々な異なる結合技法が存在する。特定の酵素と共に使用される基質は、一般に、対応する酵素による加水分解の際に検出可能な色素の変化を生ずるものが選択される。適切な酵素の例には、上掲のものが含まれる。上記の色素原基質ではなく蛍光性生産物を生ずる蛍光原基質を用いることも可能である。全ての場合、酵素標識化抗体が第一抗体−抗原複合体に添加される。ついで、それが結合させられ、過剰の試薬が洗い流される。適当な基質を含む溶液が次にその抗体−抗原−抗体という複合体に添加される。この基質は第二抗体に結合した酵素と反応し、定性的な可視的シグナルを生じ、それはさらに通常分光高度計により定量され、該試料中に存在した抗原の量の指標を与える。
【０１６２】
または、抗体の結合能を変更することなしに、フルオレセイン、ローダミン及びランタナイド、ユーロピウム（ＥＵ）などの蛍光性化合物を抗体に化学的に結合しうる。特定の波長の光を照射することにより活性化すると、その蛍光色素で標識した抗体はその光エネルギーを吸収し、その分子内で励起状態を誘導し、続いて光学顕微鏡で可視的に検出しうる特徴的な色の光を放射する。この蛍光標識された抗体を第一抗体−抗原複合体に結合させる。結合していない試薬を洗い流した後、残存する三次複合体を適切な波長の光に曝す。観察される蛍光は目的の抗原の存在を示す。免疫蛍光検定法（ＩＦＭＡ）は当分野で十分に確立されている。しかしながら、放射性同位元素、化学発光性分子若しくは生物発光性分子などの他のレポーター分子を使用してもよい。
【０１６３】
５．２  ポリヌクレオチドの検出
別の一実施態様では、検出方法は、該ポリペプチド、該調節物質及び該下流の細胞性標的からなる群より選択される構成員をコードする遺伝子配列の、動物細胞内若しくはその抽出物内における発現、発現生産物のレベルを検出する工程を含む。ポリヌクレオチドの発現は適当な任意の技法を用いて測定しうる。例えば、該構成員をコードする標識されたポリヌクレオチドを、筋肉細胞から得られたＲＮＡ抽出物のノーザンブロットにおいてプローブとして利用しうる。動物からの核酸抽出物は、ＲＴ−ＰＣＲなどの核酸増幅反応において、該構成員をコードするポリヌクレオチド若しくはその両脇の配列のセンス配列及びアンチセンス配列に相当するオリゴヌクレオチドプライマーと同時に利用することが好ましい。種々の自動化固相検出法も適当である。例えば、非常に大きなスケールで固定化されたプライマー整列（VLSIPS (商標))は、例えば、フォダーら（1991, Science 251: 767-777) 及びカザールら（1996, Nature Medicine 2: 753-759) により記載されたように核酸の検出に使用される。上の一般的技法は当業者に周知である。
【０１６４】
６．細胞障害性Ｔリンパ球の活性を評価する方法
Ｔリンパ球の細胞障害活性は当業者に知られた適切な方法により評価しうる。例えば、細胞障害活性について検定すべきＴリンパ球を含む試料を調製し、次いでそのＴリンパ球を本発明のＩＦＮ処理標的細胞と接触させる。適当な時間、これは細胞障害性細胞になるように誘導できることが知られているＴリンパ球の対照集団の細胞障害活性を評価することにより決定しうる、の後、標準的細胞障害性検定法で評価対象であるＴリンパ球を細胞障害活性について試験する。このような検定法には、当分野で知られたクロム放出ＣＴＬ検定法及び Alamar Blue( 商標) 蛍光検定法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６５】
ＣＴＬ活性を評価するこの方法は、腫瘍又は病原性生物の抗原（例えば、ウイルス抗原）を発現する細胞に対して細胞障害性応答を形成する個体の能力を評価する場合にとりわけ有用である。したがって、この方法は癌又は病原性生物に対する免疫応答を形成する個体の能力を評価する場合に有用である。
【０１６６】
本発明は、標的細胞の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により媒介される溶解の検出感度を増強するための、本発明で教示されたＩＦＮ処理の使用をも意図する。したがって、標的細胞のＩＦＮ処理は、標的細胞に対する免疫応答とりわけＣＴＬ応答、及びより具体的にはＣＤ８+ ＣＴＬ応答の検出感度の改良された検定法を開発するために有利に使用できる。
【０１６７】
本発明が容易に理解され実施できるように、特に好ましい実施態様を以下の非限定的実施例を用いてここに説明する。
【０１６８】
実施例
実施例１
ＩＦＮ刺激を行なう細胞培養
単独、又はネズミＢ７−１（ＰＣＲ系の方法によりｐＥＦ−ＭＣ１Ｎｅｏ−ｐＡ中にクローニングされたネズミＢ７−１をコードするポリヌクレオチド）を発現するベクターで形質導入されたメラノーマ細胞系統Ｂ１６（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ロックヴィル，ＭＤ，ＵＳＡ）を 10 ％ v/v失活化ウシ胎児血清(FCS) 、Ｌ−グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ1640培地中、37℃で、5 ％ v/vＣＯ2 インキュベーター中で増殖させた。全ての実験で、細胞を、ＩＦＮで刺激する前に無血清培地（10％v/v FCS なし) 中に２４時間維持した。ガンマ−プライミングを用いる実験では、細胞を、16-18 時間、37℃で、5 ％ v/vＣＯ2 インキュベーター中で 1000 IU/mL ＩＦＮ−ガンマ（アマシャム，シドニー，ニューサウスウェールズ，オーストラリア）前処理した後、指示された時間の間、 1000 IU/mL ＩＦＮ−アルファ２ａ（ホフマン−ラロッシュ，バーゼル、スイス）で刺激した。
【０１６９】
研究を通じて組換えＩＦＮ類を使用した。ネズミＩＦＮ−ベータは東レ株式会社，神奈川，日本から入手した。ネズミＩＦＮ−ガンマは、大腸菌ＤＨ５α株（４３）中でｐＰＲ−ＴＧＡＴＧ−１ベクター系を用いて実験室内で調製し、封入体を単離し、６Ｍ塩酸グアニジンで変性させ、ゆっくり透析して再生させ、Ｓ−セフェローズ・ファスト・フロー（ファルマシア）上のイオン交換クロマトグラフィーにより澄明にし精製した。ＩＦＮ類の生物活性（IU/mL)は、（４４）に記載された方法と同様に、ＭＤＢＫ細胞中のセムリキフォレストウイルスの細胞病理学的効果の阻害に基づく抗ウイルスバイオアッセーを用いて、NIH IFN −アルファ及びベータ参照標準（ナショナル・インスティチュート・オブ・アレルギー・アンド・インフェクションズ・ディジーシーズ, ベセスダ, MDから入手したIFN-ベータ# Gb02-902-511, IFN-アルファ#Ga02-901-511)に対して計算された。
【０１７０】
実施例２
細胞障害性Ｔ細胞検定
クロム放出検定法
４時間51Ｃｒ放出細胞障害性Ｔ細胞検定法は、標的としてＢ１６マウスメラノーマ細胞系統またはＢ７−１を発現するトランスフェクトされたＢ１６細胞を用いて行なわれた。この標的はＣＴＬ検定の６０時間前に準コンフルエント状態に設定された。（ダルベッコの修正イーグル培地, 10％ FCS、50 U/mL ペニシリン、50μｇ/mL ストレプトマイシン中で）培養中の細胞を設定した１２時間以内に、ネズミインターフェロン−ガンマを 1000 IU/mL で添加し、続いてその24時間後に 1000 IU/mL のネズミインターフェロン−ベータを添加した。
【０１７１】
標準的なクロム放出検定法は、この標的が 150μCi/mL Ｎａ2 51ＣｒＯ4 で 60-90分間標識され、37℃、 5％ CO2で 4時間、培養された脾臓細胞と共にインキュベートするために使用された。ＣＴＬ溶解は、100 ： 1から 0.4：1 までの範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で測定された。上清（50μＬ/ 試料) を採取し、シンチレーションカクテール（200 μＬ/ 試料・穴)(スターシント, キャンベラ・パッカード) を用い、トップカウント（キャンベラ・パッカード) 中、96穴プレート方式を用いて計数した。上清はガンマカウンター（キャンベラ・パッカード) を用いて直接計数もした。比溶解％は下記の式を用いて計算した。
【０１７２】
【外１】
0004943621.tif 000007
【０１７３】
この標的の最大放出は１％ＮＰ−４０での溶解により測定した。自発的放出値（ｃｐｍ）が最大放出の２０％を超えた場合のＣＴＬ検定では、この検定は廃棄された。
【０１７４】
蛍光に基づくＣＴＬ検定法
Alamar Blue ( 商標) （バイオソース・インターナショナル，カマリロ，CA, USA)を用いる細胞障害性検定法については、ノキアリら，1998（４２）の方法に従った。こうして、１×１０3 の標的細胞を各ウェルに播種し、必要な場合は30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、7.5:1 、5:1 、2.5:1 、1.25:1、0.625:1 、0.3125:1、0.156:1 及び 0.078:1のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）を用いた。各Ｅ：Ｔ比は４連の穴で行なわれた。ＣＴＬ検定を設定した後、０時にAlamar Blue ( 商標) ストック溶液を最終濃度が10％になるように穴に添加し、このプレートを加湿 CO2インキュベーター中で３７℃でインキュベートし、２４時間後に読み取った。各ウェル中に形成された蛍光シグナルを 520-530ｎｍの励起波長及び 590-595ｎｍの放射波長を用いて測定した。標的単独及びエフェクター単独に対して検出された蛍光単位をＥ：Ｔ混合ウェルに対する値と相関させた。
【０１７５】
細胞の溶解は下記の方程式を用いて計算した。
【０１７６】
【外２】
0004943621.tif 000008
【０１７７】
＊ＡＦは標的のみ又はエフェクターのみ、又はＥ：Ｔ混合物の絶対蛍光単位の平均値マイナス培地プラス色素対照の平均蛍光単位を表す。
【０１７８】
実施例３
ＣＴＬ検定のための脾臓細胞の調製
ＣＴＬ検定の13日前に、C57B7/6J雄マウスを免疫化計画に付した。このマウスの腹腔に照射した１０7 のＢ16細胞又はＢ16Ｂ7.1 細胞を注射した。ワクチンとして使用した細胞調製物は使用前にインターフェロン−ガンマで 72 時間、ネズミインターフェロン−ベータで 48 時間、前処理した。免疫原の注射の６日後に、脾臓リンパ球を調製した。赤血球は、トリスｐＨ7.2 で緩衝化された0.83％塩化アンモニウム溶液で 37 ℃で 2分間溶解した。脾臓リンパ球を、24穴プレートに 4×106 細胞/ ウェルで、10％ FCS (コモンウェルス・シーラム・ラボ) 、50U/mLのペニシリン (トレース・サイエンティフィックLtd)、50μｇ/mL のストレプトマイシン( トレース・サイエンティフィックLtd)、1.66 mM L-グルタミン酸塩 (シグマ) 、 2 mM のピルビン酸ナトリウム (シグマ) 、20 mM のヘペス( シグマ) 、50μＭの 2- メルカプトエタノール(ICN) を補足したＲＰＭＩ−1640（シグマ）培地中に播種した。
【０１７９】
培養中の脾臓リンパ球に、２×105/ウェル の照射した刺激用細胞／ウェルを添加し、37℃、5 ％ CO2でインキュベートした。刺激剤は B16細胞又は B16-B7.1 細胞から構成され、これらはネズミインターフェロン−ガンマで72時間そしてネズミインターフェロン−ベータで48時間前処理された。
【０１８０】
ＣＴＬ検定の２日前に、リンパ球培養物（ＭＬＣ）／刺激物培地混合物に新鮮な培地を補充した。
【０１８１】
ＣＴＬ検定の日に、該ＭＬＣ／刺激物をプールし、小容積に再懸濁し、フィコールパック（シグマ）のクッション上に重層した。1200 rpmで20分間遠心分離した後、ＣＴＬを該クッションと成長培地の間の界面から集めた。ＰＢＳでＣＴＬを洗浄し、3-6 ×107 細胞/mL で再懸濁し、次いで 100:1〜0.4:1 までのエフェクター：標的比でプレートできるように準備した。
【０１８２】
実施例4
免疫蛍光サイトメトリー
ＩＦＮ処理後、細胞（3 ×105 ) を、抗単形態性ＭＨＣクラスＩ抗血清の適当な希釈物（１×ＰＢＳ，0.5% v/v FCSを含む) と共に、氷上で 1時間、インキュベートした。１×ＰＢＳ／0.5% v/v FCSで 3回洗浄した後、抗マウスＦＩＴＣ結合抗血清（シレヌス）を添加し、氷上でさらに 1時間インキュベートした。この細胞を再び３回洗浄し、固定溶液（1% v/vホルムアルデヒド、0.03% NaN3及び 1g/50mLのグルコース) 中で一晩インキュベートし、次いでベクトン・ディッキンソンFACS IV ゲイトを用いフローサイトメトリーにより分析した。
【０１８３】
FACSCalibur(商標)(ベクトン・ディッキンソン, マウンテンビュー, Ca) 上での免疫蛍光スキャンニングによる細胞分析のために使用する方法は、先に記載された (ウォングら, J. Immunol. 1998, 160: 5475-5484を参照) 。使用した抗体は、ラット IgG2a、抗ネズミB7-1モノクローナル抗体 1G10,フィコエリトリン結合 (ファーミンゲン, サンジエゴ, Ca) 、IgG2a, YN1/17.4 ラット抗ネズミICAM-1モノクローナル抗体(ATCC CRL1879,アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, ロックヴィル, Md) 、マウス抗ネズミMHC H-2 K b D b モノクローナル抗体, ASH 1474 (イアン・マッケンジー教授, オースチン・リサーチ・インスティチュート, ハイデルベルグ, メルボルンから恵与された) であった。
【０１８４】
実施例５
ＣＤ４／ＣＤ８のＣＴＬの精製
異種ＣＴＬ集団であるＣＤ８+ 及びＣＤ４+ を分離し精製するために、製造者（ダイナル・Pty Ltd,カールトンサウス, ビクトリア, オーストラリア) の指示に従ってダイナビーズキットを使用した。
【０１８５】
実施例６
インターフェロン処理はＣＴＬ反応性受容体分子の細胞表面レベルを有意に増加させる
B16 ネズミメラノーマモデルはヒトにおける悪性メラノーマの末期状態の極めて近い複製物である。ヒトメラノーマ細胞系統で示されたように、野性型 B16 F10細胞系統をインターフェロンのいずれかの型で処理すると、その結果その細胞の表面におけるＭＨＣクラスＩ抗原の発現レベルを有意に増加させた。また、ここでもヒトメラノーマ細胞系統の場合と同様に、インターフェロンガンマ／ベータ処理は、ネズミ B16メラノーマ細胞の表面のＭＨＣクラスＩ分子の発現の最高の増加を常に生ずることが見出された。染色細胞のインターフェロンにより媒介されるＭＨＣクラスＩ免疫蛍光スキャンニングの様相における増加の１例を示したのが図２である。 B16細胞が、インターフェロン処理のない場合、非特異的背景蛍光の上のＭＨＣクラスＩ発現レベルが低いことに注意せよ。ＭＨＣクラスＩ発現の大きな増加は、細胞がまず 1000 IU/mL のインターフェロン−ガンマで処理された後にさらなる期間インターフェロン−アルファ(1000 IU/mL)で処理された場合に再現性良く得られた。インターフェロンによる誘導及びＭＨＣクラスＩ発現レベルの相対的増加の経時変化の典型的な結果は表１に示してある。ＭＨＣクラスＩ発現レベルの増加はしばしば対照の無処理細胞集団の発現レベルよりも１００倍の大きさに達した。インターフェロン−ガンマ 72 時間/ ベータ 48 時間による処理はは最適なものとして選択された。何故なら、この処理は通常クラスＩの発現の最高レベルを生じ、該レベルは次いで長期間のインターフェロン処理の後に低下するからである。
【０１８６】
実施例７
インターフェロン処理はＢ16細胞上でのＢ7-1 又はＩＣＡＭ−１の発現には小さな効果しか持たない
共刺激分子であるＢ7-1 は上で論じられた、そしてＣＴＬの活性化及び増殖を刺激する際に重要な役割を演ずることが示された。Ｂ7-1 発現がない場合、ＣＤ３の活性化は、その結果としてキラーＴ細胞の死及びそれに伴うキラー細胞機能の喪失を生ずる（３２）。Ｂ7-1 は表面受容体であるＣＤ２８に結合し（３３、３４、３５）そしてＭＨＣクラスＩとＣＤ３の混合シグナル、Ｂ7-1 とＣＤ２８の混合シグナルが反応性ＣＴＬ類の代表的クローンを拡大させる増殖性応答を駆動する。Ｔ細胞−癌細胞の結合性相互作用にも関与するＢ16上のＢ7-1 抗原及び別の分子であるＩＣＡＭ−１のレベルは、インターフェロン処理により大きくは増加しなかった（図３）。稀に、Ｂ7-1 及びＩＣＡＭ−１の発現に僅かな増加（対照レベルの２〜４倍）が検出されたが、これらは通常再現性がなく、他の場合には、有意の増加は見られなかった（それぞれ表２ａ、２ｂ）。他の研究者らは、Ｂ16細胞がＩＣＡＭ−１又はＢ7-2 を低いレベルから検出できないレベルで発現することをも示した（３６、３７、３８）。この理由で、そしてＢ７の不存在はＴ細胞の喪失を惹き起こすので、Ｂ7-1 抗原の増加したレベルを発現するＢ16細胞系統を作製した。
【０１８７】
実施例８
Ｂ7-1 の増加したレベルを発現するトランスフェクトされたＢ16細胞系統の作製
Ｂ７発現を欠如している野性型のＢ16−Ｆ10細胞は、ＣＴＬ免疫応答をほとんどできないものであることが分かった（以下を見よ）。したがって、Ｂ７抗原の高レベルを発現するＢ16−Ｆ10細胞の亜系統をトランスフェクションにより誘導した。これらの系統は野性型のＢ16細胞と比べＢ7-1 を高レベルで構成的に発現するように選択された。Ｂ−７の異なるレベルを発現するようにトランスフェクトされたクローンとして誘導された二つのＢ16−Ｆ10細胞系統を作製し、そしてさらに研究した。クローンＢ7-1 Med ( 中程度のＢ7-1 発現レベルをもつもの) とクローンＢ7-1 Hi (インターフェロン処理の前後で免疫蛍光スキャンニングにより分析され高い発現レベルを持つもの (図４に結果を示す））である。
【０１８８】
実施例９
ネズミＢ7-1 抗原でトランスフェクトされインターフェロンで処理されたＢ16細胞上でのＭＨＣクラスＩ、Ｂ7-1 、及びＩＣＡＭ−１の発現レベルの増加
これらのクローニングされた系統の上でのＢ7-1 の発現レベルは、これらの細胞をインターフェロンで異なる処理をすることによっても影響を受けなかった。さらに、Ｂ7-1 陽性（Ｂ７＋）細胞系統の両方共、トランスフェクトされたにもかかわらず、インターフェロン処理へのそれらの応答は一般的に変化しなかった。以前のように、インターフェロン処理後にＭＨＣクラスＩのレベルの同様な増加が生じたが、インターフェロンでの最適誘導の後に野性型Ｂ16−Ｆ10細胞上で生成する僅かな増加と比べ、ＩＣＡＭ−１における有意の増加は検出されなかった（図５）。
【０１８９】
実施例１０
インターフェロンで標的細胞を処理すると細胞障害性溶解の程度が大きく増加する
細胞障害性検定における細胞溶解の検出は、細胞障害性Ｔリンパ球、大顆粒リンパ球又はナチュラルキラー細胞を含む混合リンパ球培養物（ＭＬＣ）中で免疫エフェクター細胞の適当な生産を誘導する能力に依存する。これらのエフェクター細胞は、次に５１−クロム、ルシフェラーゼ又は膜の破壊や損傷した標的細胞生存性を検出させる他の分子などの適当な指標を付加した標的細胞を溶解するそれらの能力により検定できる。細胞溶解反応は、死滅応答の活性化を生ずる相手の細胞表面上での一連の調和した複雑な相互作用を介して標的細胞を認識しそしてそれに結合することをエフェクター細胞に要求する。イン・ビボの免疫化の後に生ずる免疫細胞集団のレベルは低いので、それは多くのイン・ビトロ検定でそれらの直接検出を可能とする程に十分ではないことが少なくない。したがって、細胞障害性エフェクター細胞を検出するためそれらの集団の数を検定前にまず増幅しなければならないという中間的調製工程が必要である。この中間的操作は通常照射されたフィーダー／刺激物細胞の存在下で宿主起源から誘導された細胞障害性免疫エフェクター細胞を培養する工程を含む。共培養はしばしばサイトカインであるインターロイキン−２（ＩＬ−２）及び数日間という培養期間にわたって増殖刺激によりエフェクター細胞の数を増加させるのに役立たすための抗原などの付加的な因子をも含む。
【０１９０】
細胞障害性応答のレベルについて免疫化したマウスを検定する手順の間に、脾臓リンパ球が通常マウスから採取され、次いで照射されたフィーダー／刺激物細胞と共に培養皿中に播種される。しばしばＩＬ−２が補足されるこれらの培養物は約１週間インキュベートされ、細胞障害性エフェクター細胞の検出を容易にするため免疫細胞の増殖を誘導しそしてその数を増加させるのに役立つ。本発明者らはエフェクター抗癌免疫細胞の生産に及ぼす癌細胞のインターフェロンでの前処理の効果をイン・ビトロ細胞障害性検定を用いて分析した。こうして、インターフェロンで処理された又は処理されなかった野性型Ｂ16細胞を、以下のいずれかとして用いた場合のそれらの効果を検定することにより比較した。
（ｉ）  免疫原（マウスに１回注射）として、又は
（ii)   注射されたマウスから得たＭＬＣに添加された刺激物（自己由来の
又は同種異系の）として、又は
（iii)  ５１−クロムを付加された標的細胞として。
【０１９１】
刺激物として用いられた癌細胞調製物は全て、さらにＩＬ−２を要求することなく十分な細胞障害性エフェクター細胞活性が形成されることが見出されたので、致死的な照射を行なった後、ＩＬ−２の非存在下で脾臓由来のエフェクター集団と共に共培養した。
【０１９２】
実施例１１
Ｂ7-1 Hi Ｂ16細胞は野性型Ｂ16細胞よりも大きな免疫応答を生ずる
未処理の野性型Ｂ16メラノーマ細胞を免疫原、刺激物及び標的細胞として使用し、イン・ビトロ細胞障害性検定により測定したとき、有意の抗癌免疫細胞活性は生じなかった（図６参照）。しかしながら、Ｂ7-1 を高レベルで発現するＢ16細胞を終始使用したとき、有意の抗癌免疫細胞活性が測定され、12.5：１というエフェクター：標的比で30％の溶解が見られた。この結果により、Ｂ7-1 の発現が免疫エフェクター細胞の生産を刺激するのに重要であったことが確認された。
【０１９３】
実施例１２
インターフェロンで処理し刺激物及び／又は標的細胞集団として使用されたＢ7-1 でトランスフェクトされたＢ16細胞は顕著な免疫応答を生ずる
インターフェロン処理されたＢ7-1  Hi Ｂ16細胞で免疫化された同遺伝子型マウスから得たＭＬＣの調製物を二つの部分に分けた。そのそれぞれを、インターフェロン処理Ｂ7-1  Hi Ｂ16細胞（Ｂ７＋，ＩＦＮ＋、図７）か又はインターフェロンと反応しなかった野性型Ｂ16刺激物細胞（Ｂ７−，ＩＦＮ−、図７）のいずれかを用いて増幅した。この免疫応答を、両方のＭＬＣ調製物に対する標的としてインターフェロン処理された野性型Ｂ16細胞を用いて検定した。Ｂ７＋，ＩＦＮ＋刺激物細胞の使用はＢ７−，ＩＦＮ−刺激物により得られた免疫応答のレベルよりも有意に高いレベルを生じた。この結果は、Ｂ７が負の癌細胞標的に対して免疫応答を生じさせるため、本発明の免疫増強組成物にＢ7-1 が正の細胞のインターフェロン処理を用いることによって得られる利益の大きさを強調する。
【０１９４】
実施例１３
Ｂ７が正の細胞のインターフェロン処理を組み合わせた調製物はインターフェロンの使用無しで得られた免疫細胞応答よりもより強い応答を与える
インターフェロンで処理され又は処理されなかったそして刺激物及び標的として使用されたＢ7-1  Hi Ｂ16細胞の比較から得られた結果は図８Ａ（Ｂ７＋，ＩＦＮ＋対Ｂ７＋，ＩＦＮ−）に示してある。こうして、Ｂ７Ｈｉ刺激物及び標的細胞がインターフェロンで処理された場合（Ｂ７＋，ＩＦＮ＋）は、インターフェロン処理無しのＢ７ＨｉＢ16細胞を用いて得られた場合（Ｂ７＋，ＩＦＮ−）よりも標的細胞を殺す効率（図８Ｂ、[24]に概述された定量法を用いて計算された溶解単位で５倍多い）は有意に増加するという結果が得られた。こうして、Ｂ７が正の刺激物及び標的細胞がインターフェロンで処理されなかった場合、免疫応答の減少が生じた。Ｂ７が正の刺激物及び標的が最初にインターフェロンで処理された場合、僅か 12.5 ：１のエフェクター：標的比で標的細胞の60〜70％までの溶解が起こった（図８参照）。これらの結果は、Ｂ７が正の癌細胞が免疫増強組成物中で使用される場合、強力な免疫応答の形成におけるインターフェロン処理の有益な影響を明瞭に証明するものである。
【０１９５】
実施例１４
細胞障害性応答は主にＣＤ８正のＴリンパ球キラー活性の結果である
同遺伝子型マウス由来のＭＬＣ中でインターフェロン処理された細胞Ｂ16Ｂ7-1 Ｈｉ細胞での刺激から生じた免疫エフェクター細胞のタイプの分析を、Dynabeads(商標) 及びＩｇＧ２ａラット抗ネズミＣＤ４（ＧＫ1.5,アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション TIB207,ロックビル，メリーランド) か又はＩｇＧ抗ＣＤ８（53-69.72, アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション TIB105,ロックビル，メリーランド) のいずれかを用いる細胞親和性精製により行なった。図９に示したその結果は、ＣＤ８正から選択されたキラーＴ細胞集団が抗腫瘍細胞溶解活性の原因となるほとんどの全免疫エフェクター細胞種を説明することを明らかにする。ＣＤ４集団では細胞溶解活性の有意のレベルは検出されなかった。親和性分離の後に、残存する細胞集団に留まる細胞溶解活性も検出されなかった。このことは、ＣＤ８を含まない集団中における全ての免疫エフェクター細胞がこの方法により説明されたことを示す。
【０１９６】
実施例１５
標的癌細胞上でのＢ７の発現及び該細胞のインターフェロンでの処理は効率的な殺しを行なうために必要ではない
本発明者らは改変された癌細胞への強力な免疫応答を生じさせることができることを確立した。治療の一形態としての提唱された免疫増強組成物に関する重要な問題はこれらの誘導された免疫エフェクター細胞がＢ７の発現を欠きインターフェロンと反応しなかった動物内の内因性癌細胞を認識しそして効率的に殺すことができるか否かである。したがって、本発明者らは、細胞障害性検定を用いて測定された標的細胞の認識及び殺しに及ぼすＢ７発現及びインターフェロン処理の効果を測定した。まず、標的細胞に及ぼすＢ７発現の効果を調べた。使用した標的集団はインターフェロン処理Ｂ７Ｈｉ細胞（Ｂ７＋，ＩＦＮ＋標的）又はインターフェロンで処理された野性型Ｂ16細胞（Ｂ７−，ＩＦＮ＋）のいずれかであった。インターフェロンで処理されたＢ7-1 Ｈｉワクチンを同遺伝子型マウスに適用し、インターフェロン処理Ｂ7-1 Ｈｉ刺激物（Ｂ７＋，ＩＦＮ＋）を使用し、そして二つの異なる標的の上のＭＬＣを試験した。その結果を図１０に示す。野性型Ｂ16（Ｂ７−，ＩＦＮ＋）細胞を標的として使用したとき、僅か20％の最大溶解しか得られなかった。しかしながら、標的としてインターフェロン処理されたＢ16Ｂ7-1 Ｍｅｄを用いた場合は35％の最大溶解が得られた。相対溶解単位の定量的比較〔２４〕から、標的（Ｂ７＋，ＩＦＮ＋）上でのＢ７発現はＢ７負細胞（Ｂ７−，ＩＦＮ＋）よりも溶解に対する感受性が３倍以上大きくなったことが示された。それにもかかわらず、Ｂ７負標的細胞は免疫エフェクター細胞により効率的に溶解される。試験された標的がインターフェロンで処理された又は処理されなかったＢ16野性型細胞（Ｂ７−) であった場合（図７参照）、その結果は、インターフェロンで処理されなかったＢ7-1 負癌細胞がなお免疫増強組成物で誘導されたＭＬＣにより効率的に殺されることを示した。インターフェロンで処理された癌細胞標的対インターフェロンで処理されなかった癌細胞標的についての相対溶解単位を比較すると、インターフェロンで処理されなかった標的細胞、（Ｂ７−，ＩＦＮ−）に対して溶解効率で５０％の低下があった。こうして、癌細胞がＢ７を発現せずそしてインターフェロンにより誘導もされなかった状態でさえも、それらは該免疫増強組成物を用いて誘導された免疫細胞による効率的な殺しになお感受性であると結論できる。
【０１９７】
実施例１６
該免疫増強組成物の使用は同種異系マウスで得られたものと同等の免疫応答を同遺伝子型マウスで生ずる
免疫細胞の応答は移植体対宿主の拒絶反応においてしばしば深刻である。何故なら、これらの応答は移植された免疫系と宿主の免疫系の間での相当の遺伝的相違を含む背景に対して誘導されるからである。同種異系の応答は、その含まれる遺伝的相違が容易に検出できる強力な免疫応答を誘発する程に通常十分大きいので、免疫反応に対する正真正銘の標準として普通に使用される。このような理由で、本発明の免疫増強組成物を同遺伝子系と同種異系の両方で比較的強力な抗癌免疫キラー細胞応答を誘発するその能力についてわざと比較した。同種異系については、Ｂａｌｂ／ｃ白マウス株を用いた。これはＭＨＣ遺伝子座が該Ｂ16メラノーマがそれから誘導されたＣ５７ブラック６マウス株のＨ−２ｂとは対照的にＨ−２ｄと遺伝的に規定されている。
【０１９８】
図１１は、Ｃ５７Ｂ１６同遺伝子型マウスで得られた応答と比較して、Ｂａｌｂ／ｃマウスを同種異系の対照系として用いた場合に得られたＣＴＬ応答の分析結果を示す。対照の同種異系の検定では、Ｂａｌｂ／ｃマウスからのＭＬＣは、Ｃ５７Ｂ１６脾臓細胞を刺激物及び標的の両者として使用した場合、Ｃ５７Ｂ１６脾臓細胞の効率的な殺し〔50：1 のエフェクター：標的比で約60％の最大溶解でプラトー（図１１の7,9,98) 〕を生じた。インターフェロンで処理されたＢ16野性型細胞（Ｂ７−，ＩＦＮ＋）が標的として置換された場合、同種異系の殺しは高レベルに留まり、溶解曲線では類似の様相を示すという結果を与えた。しかしながら、同じ同種異系のＭＬＣ集団から得た試料を未処理のＢ16野性型標的細胞（Ｂ７−，ＩＦＮ−、結果は示していない）について検定した場合、有意の殺しの活性は検出されなかった。こうして、インターフェロン処理も野性型Ｂ16標的細胞の同種異系により媒介される細胞障害性溶解を有意に改良した。さらに、インターフェロン処理されたＢ16野性型細胞は、同種異系ＭＬＣ又は同遺伝子型（同系）ＭＬＣのいずれかを用いて検定した場合に、未処理のＢ16野性型細胞よりもより効果的な標的であることが証明された。ただし、同遺伝子型ＭＬＣでの応答は高いエフェクター：標的比でのみ検出され、＜10％という極めて低いレベルの細胞溶解が結果として得られた（図１１）。インターフェロン処理標的対無処理標的を比較する検定の全てにおいて遙かに大きな細胞障害性溶解が観察された。
【０１９９】
図１２は、Ｂ７Ｈｉインターフェロン処理Ｂ16ワクチンを注射され、そしてＢ７Ｈｉインターフェロン処理標的細胞を用いてＢ７Ｈｉインターフェロン処理Ｂ16細胞を刺激した後に分析された同種異系マウス対同遺伝子型マウスで得られた免疫応答の比較分析の一例を示す。二つの遺伝的に異なる系で誘発されて生ずる免疫応答は極めて似ており、両方とも標的細胞の強い溶解を生ずるということが細胞障害性検定から見ることができる。これはそれぞれによって形成される相対的溶解単位の比較分析により確認される。その結果は両調製物について105 エフェクター細胞／１溶解単位（30％溶解) として求められた（参考文献（３９）を参照）。こうして、記載した最適免疫増強組成物を用いると、同遺伝子型マウスで誘発される応答のレベルは同種異系を用いて普通に生ずるレベルに近似する。
【０２００】
実施例１７
癌ワクチンとして該免疫増強組成物を用いた前臨床試行
ガンマインターフェロンで72時間そしてベータインターフェロンで48時間細胞を処理すると、メラノーマ細胞、とりわけヒトメラノーマ細胞上におけるＭＨＣクラスＩの表面発現のレベルの増加を最適誘導することが示された。ヒト細胞上でのＩＣＡＭ−１及びＢ７抗原のレベルもインターフェロン処理により高められた。しかしながら、これらの細胞上でのＢ７発現が共通して失われると、該免疫増強組成物はＢ7-1 抗原を発現するためのトランスフェクションを含む。トランスフェクトされたＢ７を発現するネズミメラノーマ細胞は最適インターフェロン処理へのそれらの応答において変化しないことが示され、ＭＨＣクラスＩ抗原の同様な強い誘導を示す。Ｂ16メラノーマモデルを用いた研究の結果は、Ｂ7-1 の発現とインターフェロン処理がＢ16癌細胞に対して強力な細胞溶解活性を持つＣＤ８正ＣＴＬを形成するのに重要であること、そしてこれらの細胞がたとえＢ７抗原を発現しないしても標的細胞を溶解できることを示した。細胞障害性検定により測定されたＢ７Ｈｉインターフェロン処理Ｂ16細胞により誘導されることが示された免疫性のレベルが与えられると、ワクチンとして注射された場合に全動物に抗癌免疫性を誘導するそれらの能力について同じ細胞調製物を試験した。この実験計画では、野性型Ｂ16細胞のワクチン注射に対してＢ７Ｈｉ／Ｂ16をトランスフェクトされた細胞の使用を比較した。これらの細胞を照射し、６週間まで毎週の腹腔内注射によりマウス集団にワクチン注射をした。ワクチン注射されたマウスは、７週目に５×105 のＢ７ＭｅｄＢ16細胞を後脇腹に皮下注射してチャレンジされた。この試行の結果を図１３に示す。チャレンジ癌細胞のみを受けた２０匹の対照動物は全て３８日までに２ｃｍの腫瘍の成長により死んだ。しかしながら、Ｂ７Ｈｉインターフェロンで処理された免疫増強組成物をワクチン注射されたマウスは該チャレンジに対して最大の抵抗性を生じ、腫瘍の徴候無しに９０％（２０匹のマウスのうちの１８匹）が生存し、その後も腫瘍無しの状態を持続した。他の試行集団は異なるレベルの免疫を示し、成功の結果には至らなかった（詳細は図１３を参照）。こうして、Ｂ７Ｈｉ／インターフェロン処理免疫増強組成物は強力ＣＤ８正ＣＴＬ応答を誘導し、これらの応答はワクチン注射されたマウスの大部分を癌細胞から保護するのに十分な免疫を与えることができると結論できる。
【０２０１】
実施例１８
異種成分からなる抗原性ワクチン
自己由来の細胞又はＭＨＣ適合性の同種異系の細胞のいずれかを選択する。これらの細胞を増殖させ、培養として維持する。細胞集団（１〜２×106 /mL)を高レベルのガンマインターフェロン（500 〜1000 IU/mL) で16〜24時間前処理した後、高レベルのＩ型インターフェロン（500 〜1000 IU/mL) で24〜48時間、Ｂ７を含むＭＨＣクラスＩ分子の最大発現が検出されるまで、チャレンジする。この細胞を、この特定細胞について確立された条件の下で複製能力を破壊するための、例えば、照射又は他の適当な手段により処理する。この細胞調製物は ISCOMS(商標) や細菌生産物などのアジュバントを治療用量で含んでもよい。次いで、該ワクチンを皮下又は筋肉内に注射する。該ワクチンの継続的用量は新たに調製され数週間にわたって、インターフェロン無処理細胞に対する受容体の細胞障害性Ｔ細胞応答が有意に高まるまで、毎週注射される。
【０２０２】
実施例１９
標的化された抗原性ワクチン
自己由来の細胞又はＭＨＣ適合性の同種異系細胞のいずれかを選択する。これらの細胞を増殖させ、培養して維持する。細胞集団（１〜２×106 /mL)を高レベルのガンマインターフェロン（500 〜1000 IU/mL) で16〜24時間前処理した後、高レベルのＩ型インターフェロン（500 〜1000 IU/mL) で24〜48時間、ＭＨＣクラスＩ分子の最大発現が検出されるまで、チャレンジする。次いでこれらの細胞を冷酸性緩衝液（0.131 M のクエン酸、0.066 M の Na2HPO4、ｐＨ 3.0) で４℃で１分間洗浄することによりＭＨＣ表面分子からぺプチドエピトープの酸溶出を行なう。この細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、ついで特異的ぺプチド抗原及びベータ−２−ミクログロブリンの存在下でインキュベートする。次いで、この細胞を、その特定細胞について確立された条件の下で複製能を破壊するため、例えば、照射又は他の適当な手段により処理する。この細胞調製物は ISCOMS(商標) や細菌生産物などのアジュバントを治療用量で含んでもよい。次いで、該ワクチンを皮下又は筋肉内に注射する。該ワクチンの継続的用量は新たに調製され数週間にわたって、インターフェロン無処理細胞に対する受容体の細胞障害性Ｔ細胞応答が有意に高まるまで、毎週注射される。
【０２０３】
実施例２０
インターフェロン処理に対するメラノーマ細胞の応答性の評価
本発明者らは、培養継代回数の低いＩＦＮ耐性皮膚メラノーマ細胞ではＳｔａｔ１は不十分なレベルでしか存在しないことを証明した。免疫蛍光サイトメトリーはＳｔａｔ１の発現の相対レベルを検出する。この分析により、患者の腫瘍から直接採取し調製したメラノーマ細胞の試料を分析する方法が与えられる。こうして、メラノーマ系統からの細胞を（３８）に概述されたように透過性とし固定した後、特異的ネズミＩｇＧ１及び抗Ｓｔａｔ１モノクローナル抗体で免疫染色し、ＦＩＴＣ共役アフィニティ精製ヒツジ抗マウスＩｇ二次抗体を用いて検出する。該試料をメラノーマ特異的マーカー、即ちネズミＩｇＧ２ａコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）をメラノーマ特異的マーカーとして、対比染色する。イソ型適合対照マウスＩｇは細胞試料の対照免疫染色のために用いられる。免疫染色された細胞試料は免疫蛍光サイトメータ、例えばＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ベクトン−ディッキンソン）を用いて分析される。この技法の発展により、患者のメラノーマ試料から抽出された腫瘍細胞中でＳｔａｔ１の発現レベル及びその変動を直接測定する場合の特異性及び感度の改良がなされる。この情報は潜在的にＩＦＮに耐性な癌細胞が患者の腫瘍試料中に存在するか否かをイン・ビボで測定するために有用である。この分析のためには試料当たり少なくとも106 〜107 のメラノーマ細胞を提供する麻酔された皮膚からの３ｍｍのパンチ生検又は薄い針吸入物のいずれかのような一次メラノーマの直接試料がこの分析のために十分過ぎる。この検定は、メラノーマの進行及び患者の応答の段階に関してメラノーマ細胞のＩＦＮへの応答性に関する情報を提供する。
【０２０４】
実施例２１
標的細胞集団としてＩＦＮで処理されたＢ7-1 トランスフェクトされたＢ16Ｆ10細胞はイン・ビトロ検定により分析されたＣＴＬ媒介細胞障害性に対しより高感受性である
ＩＦＮ−ガンマ／ベータ処理Ｂ16Ｆ10／Ｂ7-1 hi細胞ワクチンを受けたマウスで得られた腫瘍細胞殺し活性の顕著な増加が明らかになったので（図６〜９）、これらのマウス由来のエフェクターをさらに分析した。殺しの程度に対する改変、Ｂ7-1 発現対ＩＦＮ処理のそれぞれの相対寄与度の評価を行なった。こうして、ＭＬＣは、そのＢ7-1 発現、及びＩＦＮ−ガンマ／−ベータ処理において異なるＢ16Ｆ10腫瘍細胞標的調製物を殺すそれらの能力について比較された。標的として対照Ｂ16Ｆ10（Ｂ7-1 負、ＩＦＮ処理無し) 細胞を用いたとき、ＣＴＬ活性は低いレベルでしか検出されなかった。ただし、得られた細胞を殺すレベルは８回の別々の実験にわたり最大溶解の０〜５％の間で僅かに変動した（１例の曲線は図１４Ａに示してある）。標的として使用されたＩＦＮ−ガンマ／−ベータ処理Ｂ16Ｆ10細胞はより大きな殺細胞応答を誘発し（最大溶解の15〜22％の間) 、ＩＦＮで処理されなかった対照Ｂ16Ｆ10細胞を殺すレベルより一貫して上であった。（４１）に概述された方法に基づいて標的の相対殺滅の定量的比較を行なうことは、対照Ｂ16Ｆ10細胞の殺しのレベルが低かったために、できなかった。ＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理された又は処理されなかったＢ16Ｆ10標的細胞に対するＢ7-1 発現の効果を比較する反復実験から得られた結果は図１４Ａに示してある。こうして、ＩＦＮ−ガンマ／−ベータ処理Ｂ16Ｆ10／Ｂ7-1 hi細胞標的を無処理のＢ16Ｆ10／Ｂ7-1 hi細胞標的と比較した。その結果、ＩＦＮ−ガンマ／−ベータ処理Ｂ7-1 hi細胞に対して60〜70％の間の細胞溶解のプラトーが明らかになった。これらの数値は、標的として無処理のＢ16Ｆ10／Ｂ7-1 hi細胞を用いた幾つかの異なる実験で得られた数値の範囲（15〜40％の間) と比べて遙かに高かった。図１４Ａでの結果からの相対溶解単位の定量分析により、Ｂ7-1 高発現及びＢ16Ｆ10細胞のＩＦＮ−ガンマ／−ベータ処理の組み合わせがＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ16Ｆ10細胞の殺しよりもほぼ６倍までそれらの細胞溶解を増加する（図１４Ｂ）ことが明らかにされた。さらに、後者の細胞はＩＦＮで処理されなかったＢ16Ｆ10／Ｂ7-1 hi標的細胞よりもほぼ５倍もより効率的に殺された。こうして、ＩＦＮ処理はＢ7-1 正Ｂ16−Ｆ10細胞の殺しを全体として27倍増加させる結果となった。
【０２０５】
これらの結果に基づいて、ＩＦＮで処理されなかったＢ7-1 負Ｂ16−Ｆ10細胞は、ＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ16−Ｆ10／Ｂ7-1 hi細胞を含む免疫原性ワクチンの使用から生ずる細胞障害性免疫エフェクター細胞により、低い効率でしか殺されなかったと結論できる。さらに、Ｂ7-1 の発現は、標的腫瘍細胞に対するＩＦＮ−ガンマ／−ベータ処理の効果と共に、これらの腫瘍細胞に結合して殺すＣＴＬの能力を大きく増強する。
【０２０６】
実施例２２
形成されたＣＤ８+ Ｔ細胞はＢ16−Ｆ10に特異的でありそして同遺伝子型のＥＬ−４胸腺腫細胞には特異的でない
同遺伝子型のＥＬ−４胸腺腫細胞を標的として試験し、Ｂ16−Ｆ10メラノーマ細胞と比較すると、二つの別々の実験でのその結果はＥＬ−４標的細胞の低レベルの細胞溶解を示し、より高いＥ：Ｔ比＞６：１ではより顕著であることを示した（図１５を参照）。しかしながら、溶解単位分析に基づき（結果は示していない）、ＥＬ−４標的細胞の細胞溶解の受け易さを定量的に評価すると、Ｂ16−Ｆ10／Ｂ7-1 hi細胞の殺しよりも１０倍低かった。こうして、同遺伝子型のＥＬ−４胸腺腫細胞に対するＣＴＬの反応性はかなり低かった。
【０２０７】
実施例の考察
免疫増強組成物は動物における細胞溶解性抗腫瘍細胞活性の生産を増強するように設計され決められた。改変の適当な組み合わせを行なうと、殺細胞活性における５〜20倍ほどの顕著な増加を得ることができる。この技法は現在市場から容易に入手可能な組換えインターフェロン類の使用を含む。本手順は、インターフェロンの特性が細胞の抗原の処理及び提示の増強に関連する多くの側面を含むという観察から導き出された理論的原理に基づいて設計されたものである。最も重要な表面成分のうちの三つ、即ち、ＩＣＡＭ−１、Ｂ7-1 及びＭＨＣクラスＩに焦点を当てることにより、ガンマプライミング及びＳｔａｔ１の高レベル調節のおかげで本発明者らは本免疫増強組成物の処方が可能になったのである。まず、Ｉ型又はII型のインターフェロンのいずれか単独で又は組み合わせで処理された細胞の蛍光分析により、本発明者らは効率的なＣＴＬ応答に必要なＭＨＣクラスＩ、Ｂ7-1 及びＩＣＡＭ−１受容体の最大同時発現を誘発する最適処理を決定することができた。こうして、インターフェロンガンマでの24時間のプライミングインキュベーションを含む、72時間のインターフェロンガンマ及び48時間のインターフェロンベータは、最大のプラトーレベルに近いＭＨＣクラスＩ及びＩＣＡＭ−１の発現の数値を形成させた。次いで、表面発現のレベルはより長期間のインキュベーション期間にわたり下降した。
【０２０８】
しかしながら、Ｂ16ネズミメラノーマ細胞系統の場合には、ＭＨＣクラスＩ及びＩＣＡＭ−１分子の表面発現の大きな増加にもかかわらず、Ｂ7-1 は検出されなかった。これは、多くの癌がＢ７負である（例えば（４０）を参照）場合の共通の問題であるようである。この理由で、本発明者らはＢ7-1 抗原を発現する癌細胞をトランスフェクトするという方法を採用した。ＣＴＬ・ＣＤ28受容体を介してシグナルを発信する共刺激分子としてのＢ7-1 及びその作用が果たす重要な役割は、Ｂ7-1 の非存在下でのＴ細胞の活力欠如とは対照的にＣＴＬの生存及び増殖を促進するイン・ビトロ及びイン・ビボでの他の研究（３４、３５）で先に十分に確立されてきた。インターフェロン処理野性型Ｂ16−Ｆ10細胞の表面における検出可能なＢ7-1 の非存在下にもかかわらず、これらの細胞が無処理の野性型Ｂ16−Ｆ10細胞よりも遙かに良好な標的である（図６〜９）ことが分かったのは興味深い。この結果は同遺伝子型ＭＬＣのみでなく、同種異系のＭＬＣでも成り立った（図１１、１２）。こうして、インターフェロン処理及びＢ7-1 の組み合わせは、標的癌細胞の有効な殺しを行なわせるのに十分な免疫応答の誘導にとって重要である。
【０２０９】
選択可能な発現ベクターでのトランスフェクションによりＢ7-1 を発現するＢ16−Ｆ10細胞の作製に関する改変は、選択可能なＢ7-1 陽性クローン上でのＩＣＡＭ−１及びＭＨＣクラスＩの発現レベルの匹敵する増加を誘導するインターフェロン処理の能力に悪影響を与えなかった（図５）。これは、次にそれが効率的な刺激物細胞及び／又は標的細胞として作用する性質についてインターフェロン処理Ｂ7-1 陽性野性型Ｂ16−Ｆ10細胞系統とＢ7-1 陰性野性型Ｂ16−Ｆ10細胞系統とを比較することを可能にしたので、重要である。Ｂ7-1 発現の効果は非常に顕著であり、そしてインターフェロンで処理された細胞は免疫原、ＭＬＣ刺激物及び標的として用いられた場合、インターフェロン処理Ｂ16細胞集団上での同種異系のＭＬＣで得られた細胞溶解応答の効率と同様の効率を生じた。
【０２１０】
免疫増強組成物におけるインターフェロン処理とＢ７発現の組み合わせの重要性を示す細胞障害性検定の結果は前臨床試行の結果と一緒に考察されるべきである。Ｂ７Ｈｉワクチン単独は動物の70〜75％を防御したが、インターフェロンと組み合わせの90％の結果程には良好ではない( 図１３）。細胞障害性検定はインターフェロン無しに比べインターフェロン組み合わせにより５倍大きな活性を得るというかなりの改良を示した。バランスすると、該腫瘍細胞の抗原提示機能を最大にし、それにより抗腫瘍ＣＴＬ活性の高レベルを増強する最適な免疫増強ワクチンを提供しそして腫瘍細胞のチャレンジからワクチン注射されたマウスを保護するための最良の処方は、インターフェロン処理とＢ７発現の組み合わせを含むということが結論できる。
【０２１１】
本明細書で引用された全ての特許、特許出願、及び出版物の開示は参照によりその全体が本明細書にインコーポレートされる。
【０２１２】
本明細書における参考文献の引用はこのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解すべきではない。
【０２１３】
本明細書の全体を通じて、その目的は本発明の好ましい実施態様を説明することであって、如何なる一実施態様又は特定の特性の集合に本発明を限定するためのものではない。当業者は、したがって、本開示に照らして、本発明の範囲を逸脱することなく例示された特定の実施態様に様々な修正及び変更を加え得ることを認めるであろう。このような修正及び変更は全て添付された特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０２１４】
【表１】
0004943621.tif 000009
【０２１５】
【表２Ａ】
0004943621.tif 000010
【０２１６】
【表２Ｂ】
0004943621.tif 000011
【０２１７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、癌細胞に対する細胞障害性Ｔリンパ球応答を示す図式的表示である。
【図２】  図２は、Ｂ１６ネズミメラノーマ細胞の表面上でのクラスＩのＭＨＣ発現に及ぼすインターフェロン処理の効果を示すグラフ表示である。
【図３Ａ】  図３Ａは、Ｂ１６野性型細胞の上のＢ７−１のレベルを示すグラフ表示である。
【図３Ｂ】  図３Ｂは、Ｂ１６野性型細胞の上のＩＣＡＭ−１のレベルを示すグラフ表示である。
【図４】  図４は、Ｂ７−１を発現するベクターでトランスフェクトされたＢ１６細胞系統の上でのＢ７−１のレベルを示すグラフ表示である。
【図５Ａ】  図５Ａは、Ｂ１６Ｂ７−１Ｈｉｇｈ細胞の上でのＢ７−１のレベルがインターフェロン処理により影響を受けないことを示すグラフ表示である。
【図５Ｂ】  図５Ｂは、野性型Ｂ１６細胞の上のレベルと比べＢ１６Ｂ７−１Ｈｉｇｈ細胞の上でのＩＣＡＭ−１のレベルが類似のレベルに留まることを示すグラフ表示である。
【図５Ｃ】  図５Ｃは、野性型Ｂ１６細胞に比べＢ１６Ｂ７−１Ｈｉｇｈ細胞の上でのＭＨＣクラスＩのレベルが増加したことを示すグラフ表示である。
【図６】  図６は、インターフェロンで処理されたＢ１６Ｂ７−１Ｈｉｇｈ細胞をワクチン注射された動物から得たＣＴＬによる腫瘍標的の死滅の増加を示すグラフ表示である。
【図７】  図７は、刺激物集団及び標的細胞に及ぼすＢ７発現及びインターフェロン処理の効果を示すグラフ表示である。
【図８Ａ】  図８Ａは、得られるイン・ビトロＣＴＬ応答に及ぼすＢ７発現及びインターフェロン処理の組合せ効果を示すグラフ表示である。
【図８Ｂ】  図８Ｂは、得られるイン・ビトロＣＴＬ応答に及ぼすＢ７．１発現及びインターフェロン処理の組合せ効果を示すグラフ表示である。
【図９】  図９は、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞をワクチン注射されたマウスからのＭＬＣにおける免疫エフェクター集団がＣＤ８+ ＣＴＬを含むことを示すグラフ表示である。Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞をワクチン注射されたマウスから調製されたＭＬＣ集団の試料は、全体を用いる（黒四角）か、又はダイナビーズ上の抗ネズミＣＤ４ｍＡｂ（白丸）又は抗ＣＤ８ｍＡｂ（白ダイア）を用いる細胞アフィニティ精製に付しそして５１−クロミウムを載せたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞を標的として用いてイン・ビトロ細胞障害活性について差別細胞集団検定を行なった。誤差のバーは±Ｓ．Ｄ．である。
【図１０】  図１０は、インターフェロン処理されたＢ１６Ｂ７−１Ｈｉｇｈ細胞をワクチン注射された動物から得たＣＴＬによる異なる標的細胞の死滅を示すグラフ表示である。
【図１１】  図１１は、Ｂａｌｂ／ｃマウスを同種異系の対照システムとして用いた場合に得られたＣＴＬ応答を、Ｃ５７Ｂ１６の同系マウスで得られた応答と比べた場合の分析の結果を示すグラフ表示である。
【図１２】  図１２は、Ｂ７Ｈｉインターフェロン処理Ｂ１６ワクチンを注射されそしてＢ７Ｈｉインターフェロン処理標的細胞を用いてＢ７Ｈｉインターフェロン処理Ｂ１６細胞に刺激を与えた後に分析された同種異系対同系（同遺伝子型）マウスで得られた免疫応答の比較分析の１例を示すグラフ表示である。
【図１３】  図１３は、ワクチンとして本発明の免疫増強組成物を用いた前臨床的試行の結果を示すグラフ表示である。
【図１４Ａ】  図１４Ａは、細胞障害性死滅へのＢ１６−Ｆ１０細胞の感受性に及ぼすＩＦＮ−ガンマ／−ベータ処理及びＢ７−１発現の効果を示すグラフ表示である。Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７hi細胞をワクチン注射されたマウスから調製したＭＬＣについて、Ｂ７−１の発現及びＩＦＮ処理に差異のあるＢ１６−Ｆ１０標的細胞の調製物を死滅させるその能力を検討し、イン・ビトロ細胞障害性検定を用いて測定した。誤差バーは±Ｓ．Ｄ．である。該標的細胞は次の通りである。即ち、対照、無処理のＢ１６−Ｆ１０細胞（白ダイヤ）、ＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ１６−Ｆ１０細胞（白丸）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞（白四角）、及びＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞（白三角）である。
【図１４Ｂ】  図１４Ｂは、ＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞をワクチン注射されたマウスに由来する異なるＢ１６−Ｆ１０細胞調製物の細胞障害活性に対する感受性の定量的比較を示すグラフ表示である。Ａの結果は、ヴンダーリッヒとシェアラー（４１）の方法により分析された。溶解単位は、１５％の細胞溶解を生ずるために必要なエフェクターの相対数として定義された。誤差バーは±Ｓ．Ｄ．である。標的細胞は次の通りである。即ち、ＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ１６−Ｆ１０細胞（白丸）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞（白四角）、ＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞（白三角）である。
【図１５】  図１５は、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞標的集団対同系のＥＬ−４胸腺腫細胞標的集団に対するＭＬＣ細胞障害性エフェクター細胞の特異性を示すグラフ表示である。ＥＬ−４細胞か又はＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞のいずれかをワクチン注射された年齢及び性別を適合させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得たＭＬＣについて、異なる標的細胞集団を殺すそれらの能力をイン・ビトロ細胞障害性検定により試験した。誤差バーは±Ｓ．Ｄ．である。標的細胞は次の通りである。即ち、ＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞ワクチン、刺激物質及び標的細胞（黒三角）、ＥＬ−４細胞ワクチン及び刺激物質、ＩＦＮ処理されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi標的細胞（黒四角）、ＩＦＮ−ガンマ／−ベータで処理されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７−１hi細胞ワクチン及び刺激物質、ＥＬ−４標的細胞（白丸）、ＥＬ−４細胞ワクチン、刺激物質及び標的細胞（白ダイヤ）である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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