(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する、バチルス属またはアルスロバクター属微生物由来の、下記＜Ａ＞乃至＜Ｄ＞のいずれかに記載の理化学的性質を有するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素：
＜Ａ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１４０，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．２±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、４０℃；
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ２＋存在下、４５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ６．０乃至６．５；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、３５℃以下で安定；
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、４０℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ４．５乃至９．０の範囲で安定；
＜Ｂ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１３７，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．２±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、４５℃；
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ２＋存在下、５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４０℃以下で安定；
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、４５℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ５乃至１０．０の範囲で安定；
＜Ｃ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１３６，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ７．３±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、５０℃；
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ２＋存在下、５５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４５℃以下で安定；
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、５０℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ５．０乃至９．０の範囲で安定；
＜Ｄ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、９４，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ４．３±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ８．４、６０分間反応で、６０℃；
ｐＨ８．４、６０分間反応で１ｍＭＣａ２＋存在下、６５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ８．４；
（５）  温度安定性
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、５５℃以下で安定；
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、６０℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ５．０乃至９．０の範囲で安定。
【請求項２】
配列表における配列番号１、配列番号５乃至７、配列番号１１乃至１４、および配列番号１８に示すアミノ酸配列から選ばれる１種または２種以上の配列を有する、請求項１記載のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素。
【請求項３】
デキストラン生成能を有さず、ＥＤＴＡによって活性が阻害される請求項１又は２記載のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素。
【請求項４】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉およびグリコーゲンから選ばれる１種または２種以上の糖質である請求項１乃至３のいずれかに記載のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素産生能を有するバチルス属またはアルスロバクター属微生物を栄養培地で培養して得られる培養物からα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を採取することを特徴とするα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の製造方法。
【請求項６】
バチルス属微生物が、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｎ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、またはそれらの変異株である請求項５記載のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の製造方法。
【請求項７】
アルスロバクター属微生物が、アルスロバクター  グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ａ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）、またはその変異株である請求項５記載のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の製造方法。
【請求項８】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質を含有する溶液に、請求項１乃至４のいずれかに記載のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、α−グルコシル転移反応させ、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質を生成させることを特徴とするα−イソマルトシルグルコ糖質の製造方法。
【請求項９】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉およびグリコーゲンから選ばれる１種または２種以上の糖質である請求項８記載のα−イソマルトシルグルコ糖質の製造方法。
【請求項１０】
澱粉を糊化および／または液化した溶液に、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する作用を有する、バチルス属またはアルスロバクター属微生物由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させ、α−イソマルトシルグルコ糖質を生成させる工程と、生成したα−イソマルトシルグルコ糖質に、α−イソマルトシルグルコ糖質から、α−イソマルトシル転移を含む反応によって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する作用を有する、バチルス属またはアルスロバクター属微生物由来のα−イソマルトシル転移酵素を作用させサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成させる工程とを含んでなる、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１１】
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が、下記＜Ａ＞乃至＜Ｄ＞のいずれかに記載の理化学的性質を有することを特徴とする請求項１０記載の環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法：
＜Ａ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１４０，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．２±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、４０℃；
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ２＋存在下、４５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ６．０乃至６．５；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、３５℃以下で安定；
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、４０℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ４．５乃至９．０の範囲で安定；
＜Ｂ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１３７，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．２±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、４５℃；
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ２＋存在下、５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４０℃以下で安定；
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、４５℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ５乃至１０．０の範囲で安定；
＜Ｃ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１３６，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ７．３±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、５０℃；
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ２＋存在下、５５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４５℃以下で安定；
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、５０℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ５．０乃至９．０の範囲で安定；
＜Ｄ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、９４，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ４．３±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ８．４、６０分間反応で、６０℃；
ｐＨ８．４、６０分間反応で１ｍＭＣａ２＋存在下、６５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ８．４；
（５）  温度安定性
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、５５℃以下で安定；
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、６０℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ５．０乃至９．０の範囲で安定。
【請求項１２】
α−イソマルトシル転移酵素が、下記＜Ｅ＞乃至＜Ｉ＞のいずれかに記載の理化学的性質を有することを特徴とする請求項１０記載の環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法：
＜Ｅ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１１２，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．５±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において、４５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下において、ｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４０℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ４．０乃至９．０の範囲で安定；
＜Ｆ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１０２，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．６±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において、５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下において、ｐＨ５．５乃至６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４０℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ４．５乃至９．０の範囲で安定；
＜Ｇ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１１２，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ７．８±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において、５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下において、ｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４５℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ４．５乃至１０．０の範囲で安定；
＜Ｈ＞
（１）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において、５０℃；
（２）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下において、ｐＨ６．５；
（３）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４５℃以下で安定；
（４）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ４．５乃至９．０の範囲で安定；
＜Ｉ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１１６，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ４．２±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において、５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下において、ｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４５℃以下で安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ３．６乃至９．０の範囲で安定。
【請求項１３】
バチルス属微生物が、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｎ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）、またはそれらの変異株である請求項１０記載の環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１４】
アルスロバクター属微生物が、アルスロバクター  グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ａ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）、またはその変異株である請求項１０記載の環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１５】
澱粉を糊化および／または液化した溶液が、ＤＥ２０以下の溶液である請求項１０乃至１４のいずれかに記載の環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１６】
澱粉を糊化および／または液化した溶液に、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素を作用させるに際し、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれかに記載の環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１７】
得られる環状四糖またはこれを含む糖質に、更にα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびα−グルコシダーゼから選ばれる１種または２種以上の酵素を作用させることを特徴とする請求項１０乃至１６のいずれかに記載の環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１８】
更に、脱色、脱塩、カラムクロマトグラフィーによる分画、膜による分離、微生物による醗酵処理およびアルカリ処理による分解除去から選ばれる１種または２種以上の精製方法を用いることを特徴とする請求項１０項乃至１７のいずれかに記載の環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法。
【請求項１９】
得られる環状四糖またはこれを含む糖質が、シラップ、マスキット、非晶質粉末、非晶質固状物、結晶粉末、または結晶固状物の形態にある請求項１０乃至１８のいずれかに記載の環状四糖またはこれを含む糖質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とその製造方法並びに用途に関し、詳細には、新規なα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とこの酵素を製造する方法、当該酵素を用いたα−グルコシル転移方法、α−イソマルトシルグルコ糖質の生成方法、加えて、当該酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを併用したサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖の製造方法、並びにこれらの糖質を含有せしめた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースを構成糖とする糖質、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物としては、アミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端が、それぞれ非還元末端と還元末端とからなり、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ、ＤＥ）として表わしている。この値の大きいものは、通常、分子が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起し易く、褐変し悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質を有することが知られている。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、『ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）』、第７１巻、３５３乃至３５８頁（１９４９年）に開示されているように、澱粉にマセランス  アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ  ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合したα−、β−またはγ−シクロデキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれらシクロデキストリンが工業的規模で生産され、これらシクロデキストリンは、それらが有する、非還元性で、無味であり、包接能などの特性を生かした用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特開平７−１４３８７６号公報、および特開平７−２１３２８３号公報などで開示したように、マルトオリゴ糖など澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素およびトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグルコースがα，α−１，１結合したトレハロースを生成させる方法も知られている。現在では、澱粉からトレハロースが工業的規模で生産され、その非還元性で、温和で高品質な甘味特性などを生かした用途に利用されている。このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース、グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−シクロデキストリンは、それぞれの特性を生かして工業的規模で生産、利用されているものの、その種類が限られており、更に多様な非還元性糖質乃至低還元性糖質の提供が望まれている。
【０００３】
一方、近年、グルコースを構成糖とする新たな環状の四糖類が報告された。即ち、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８（１９９４年）には、主として、グルコース残基がα−１，３結合とα−１，６結合によって交互に連なっているアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることによりサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（本明細書では特にことわらない限り、本糖質を「環状四糖」と略称することもある。）が生成し、これを有機溶媒の一種であるメタノール共存下で晶出させることが示されている。
【０００４】
環状四糖は、環状構造を有し、非還元性の糖質ゆえに、包接能を示し、揮発性有機物を安定化する作用やアミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工できることが期待される。しかしながら、環状四糖の製造に必要な原料のアルテルナンや酵素のアルテルナナーゼの入手が困難である上、それらを産生する微生物も入手できる状態にはない。
【０００５】
斯かる状況下、本発明者等は、先に特願２０００−１４９４８４号明細書および特願２０００−２２９５５７号明細書に開示したように、非還元末端の結合様式として、α−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質（本明細書においては、本糖質を「α−イソマルトシルグルコ糖質」と略称することもある。）を原料とし、これに、当該糖質のα−イソマルトシル部分とそれ以外のグルコ糖質部分とを特異的に切断し、このα−イソマルトシル部分を転移して環状四糖を生成するα−イソマルトシル転移酵素を作用させて環状四糖を生産することに成功した。このα−イソマルトシル転移酵素は、α−イソマルトグルコ糖質からα−イソマルトシル転移することによって環状四糖を生成する酵素であって、下記に示す理化学的性質を有する酵素である。
（１）  作用
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移を含む反応によって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約８２，０００ダルトン乃至約１３６，０００ダルトン；
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．７乃至約８．３；
（４）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下において、約４５℃乃至約５０℃；
（５）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下において、ｐＨ約５．５乃至約６．５；
（６）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、約４５℃以下で安定；
（７）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ約３．６乃至約ｐＨ１０．０の範囲で安定；
【０００６】
しかしながら、環状四糖の原料糖質についてみると、豊富で安価に供給される澱粉からの生産が望まれるものの、実際には、α−イソマルトシル転移酵素が澱粉に直接作用しないことから、予め、澱粉を前述の特定構造を有するα−イソマルトシルグルコ糖質、例えば、パノースやイソマルトシルマルトースなどの比較的低分子のイソマルトオリゴ糖に変換させ、次いで、これにα−イソマルトシル転移酵素を作用させて環状四糖を生成させる手法が採用されている。
【０００７】
一方、原料からの環状四糖の生成率についてみると、パノースを用いる場合、原料パノース重量当たり約４４％である。同様に、イソマルトシルマルトースを用いる場合、約３１％であるのに対して、澱粉を用いる場合には、予め、α−アミラーゼ、澱粉枝切り酵素、β−アミラーゼおよびα−グルコシダーゼなどを作用させてパノースなどの比較的低分子のイソマルトオリゴ糖を生成させる必要があるだけでなく、環状四糖の生成率も約１５％と極めて低いことが判明している。
【０００８】
澱粉からの環状四糖の生産は、このように低い生成率でも実用可能であるものの、コスト高が懸念される。斯かる状況下、澱粉などの容易に入手できる材料を原料とする、環状四糖の生成率の高い新規な環状四糖の製造方法の確立が望まれる。
【発明の開示】
【０００９】
本願発明は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とその製造方法、当該酵素を用いて得られる環状四糖またはこれを含む糖質、およびそれらの用途を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決するために、澱粉を原料とし、澱粉から環状四糖を高収率で得るために使用することできる新規な酵素に期待を込めて、斯かる酵素産生能を有する微生物を広く検索してきた。その結果、意外にも、先に特願２０００−１４９４８４号および特願２０００−２２９５５７号明細書で開示した、土壌から分離したバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはアルスロバクター属に属する微生物であって、α−イソマルトシル転移酵素産生能を有する、バチルス  グロビスポルスＣ９株、バチルス  グロビスポルスＣ１１株、バチルス  グロビスポルスＮ７５株、または、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株（以下、それぞれ「微生物Ｃ９株」、「微生物Ｃ１１株」、「微生物Ｎ７５株」、および「微生物Ａ１９株」と言う。）が、本発明者等が目指していた新規なα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素産生能をも併せ持つことを見出した。澱粉部分分解物をはじめとする比較的高分子のグルコ糖質に、この新規なα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを作用させることにより、本発明者等が目指していた環状四糖の生成率を著しく向上させることができる事実を新規に見出し、また、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の諸性質を明らかにすると共に、その製造方法を確立し、更には、当該酵素によるα−グルコシル転移反応方法、α−イソマルトシルグルコ糖質の生成方法、および当該酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを併用した環状四糖、またはこれを含む糖質およびその製造方法を確立して本発明を完成した。併せて、このようにして得られる環状四糖、または、これを含む糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立して、本発明を完成した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の新規なα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素産生能を有する、微生物Ｃ９株、Ｃ１１株、Ｎ７５株、およびＡ１９株の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００１２】
＜微生物Ｃ９株＞
＜Ａ  細胞形態＞
肉汁寒天培養、２７℃
通常０．５乃至１．０×１．５乃至５μｍの桿菌。多形性なし。運動性あり。球形の胞子を細胞内の端に形成。膨潤した胞子嚢を形成。グラム陽性。
＜Ｂ  培養性質＞
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：円形  大きさは２日間で１乃至２ｍｍ。
周縁：全縁
隆起：半レンズ状
光沢：鈍光
表面：平滑
色調：不透明、淡い黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：中程度
形状：放散状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化する。
＜Ｃ  生理学的性質＞
（１）  ＶＰ試験：陰性
（２）  インドールの生成：陰性
（３）  硝酸からのガス生成：陽性
（４）  澱粉の加水分解：陽性
（５）  色素の生成：可溶性色素の生成はない
（６）  ウレアーゼ：陽性
（７）  オキシダーゼ：陽性
（８）  カタラーゼ：陽性
（９）  生育の範囲：ｐＨ５．５乃至９．０  温度  １０乃至３５℃
（１０）  酸素に対する態度：好気性
（１１）  炭素源の利用性と酸生成の有無
利用性        酸生成
Ｄ−グルコース      利用する      陽性
グリセロール        利用する      陽性
スクロース          利用する      陽性
ラクトース          利用する      陽性
（１２）  ＤＮＡのＧＣ含量：４０％
【００１３】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）に属する微生物であることが判明した。また、本菌は、澱粉部分分解物からα−イソマルトシルグルコ糖質を生成するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、および該糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成するα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有している。
【００１４】
これらの結果より本発明者等は、本菌をバチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９と命名し、平成１２年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３として受託された。
【００１５】
＜微生物Ｃ１１＞
＜Ａ  細胞形態＞
肉汁寒天培養、２７℃
通常０．５乃至１．０×１．５乃至５μｍの桿菌。多形性なし。運動性あり。球形の胞子を細胞内の端に形成。膨潤した胞子嚢を形成。グラム陽性。
＜Ｂ  培養性質＞
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：円形  大きさは２日間で１乃至２ｍｍ。
周縁：全縁
隆起：半レンズ状
光沢：鈍光
表面：平滑
色調：不透明、淡い黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：中程度
形状：放散状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化する。
＜Ｃ  生理学的性質＞
（１）  ＶＰ試験：陰性
（２）  インドールの生成：陰性
（３）  硝酸からのガス生成：陽性
（４）  澱粉の加水分解：陽性
（５）  色素の生成：可溶性色素の生成はない
（６）  ウレアーゼ：陽性
（７）  オキシダーゼ：陽性
（８）  カタラーゼ：陽性
（９）  生育の範囲：ｐＨ５．５乃至９．０  温度１０乃至３５℃
（１０）  酸素に対する態度：好気性
（１１）  炭素源の利用性と酸生成の有無
利用性        酸生成
Ｄ−グルコース      利用する      陽性
グリセロール        利用する      陽性
スクロース          利用する      陽性
ラクトース          利用する      陽性
（１４）  ＤＮＡのＧＣ含量：３９％
【００１６】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）に属する微生物であることが判明した。また、本菌は、澱粉部分分解物からα−イソマルトシルグルコ糖質を生成するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、および該糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成するα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有している。
【００１７】
これらの結果より本発明者等は、本菌をバチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１と命名し、平成１２年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４として受託された。
【００１８】
＜微生物Ｎ７５＞
＜Ａ  細胞形態＞
肉汁寒天培養、２７℃
通常０．５乃至１．０×１．５乃至５μｍの桿菌。多形性なし。運動性あり。球形の胞子を細胞内の端に形成。膨潤した胞子嚢を形成。グラム陽性
＜Ｂ  培養性質＞
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：円形  大きさは２日間で１乃至２ｍｍ。
周縁：全縁
隆起：半レンズ状
光沢：鈍光
表面：平滑
色調：不透明、淡い黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：中程度
形状：放散状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化する。
＜Ｃ  生理学的性質＞
（１）  ＶＰ試験：陰性
（２）  インドールの生成：陰性
（３）  硝酸からのガス生成：陽性
（４）  澱粉の加水分解：陽性
（５）  色素の生成：可溶性色素の生成はない
（６）  ウレアーゼ：陰性
（７）  オキシダーゼ：陽性
（８）  カタラーゼ：陽性
（９）  生育の範囲：ｐＨ５．７乃至９．０  温度１０乃至３５℃
（１０）  酸素に対する態度：好気性
（１１）  炭素源の利用性と酸生成の有無
利用性        酸生成
Ｄ−グルコース      利用する      陽性
グリセロール        利用する      陽性
スクロース          利用する      陽性
ラクトース          利用する      陽性
（１２）  ＤＮＡのＧＣ含量：４０％
【００１９】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、バチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）に属する微生物であることが判明した。また、本菌は、澱粉部分分解物からα−イソマルトシルグルコ糖質を生成するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、および該糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成するα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有している。
【００２０】
これらの結果より本発明者等は、本菌を新規微生物バチルス  グロビスポルスＮ７５と命名し、平成１３年５月１６日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１として受託された。
【００２１】
＜微生物Ａ１９＞
＜Ａ  細胞形態＞
（１）  肉汁寒天培養、２７℃
通常０．４乃至０．８×１．０乃至４．０μｍの桿菌。多形性あり。運動性なし。無胞子。グラム陽性。
（２）  ＥＹＧ寒天培地、２７℃
桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
＜Ｂ  培養性質＞
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：円形  大きさは１日間で２乃至３ｍｍ。
周縁：全縁
隆起：半レンズ状
光沢：鈍光
表面：平滑
色調：不透明、黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：中程度
形状：糸状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
＜Ｃ  生理学的性質＞
（１）  澱粉の加水分解
：陰性
（２）  色素の生成：可溶性の色素の生成はない
（３）  ウレアーゼ：陽性
（４）  オキシダーゼ：陽性
（５）  カタラーゼ：陽性
（６）  酸素に対する態度：好気性
（７）  細胞壁の主要ジアミノ酸：リジン
（８）  細胞壁のペプチドグリカン型：リジン−アラニン
（９）  細胞壁のＮ−アシル型：アセチル
（１０）細胞壁の構成糖：ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノース
（１１）ビタミンの要求性：なし
（１２）ＤＮＡのＧＣ含量：６２％
（１３）ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジー：アルスロバクター  グロビホルミス（ＡＴＣＣ  ８０１０）との間で６６．５％のＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーを示す。
【００２２】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、アルスロバクター  グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）に属する微生物であることが判明した。また、本菌は、澱粉部分分解物からα−イソマルトシルグルコ糖質を生成するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、および該糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成するα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有している。
【００２３】
これらの結果より本発明者等は、本菌を新規微生物アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９と命名し、平成１３年５月１６日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０として受託された。
【００２４】
本発明に於いては、上記菌株のみに限定されることなく、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素産生能を有する微生物である限り、バチルス属、アルスロバクター属、およびそれ以外の属に属する微生物はもとより、それら微生物の変異株も適宜用いることができる。尚、上記菌株以外の他の微生物をスクリーニングする方法は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の理化学的性質を指標として、公知の微生物スクリーニング方法を用いることにより、容易にスクリーニングすることができる。
【００２５】
また、本発明で用いることのできるα−イソマルトシルグルコ糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成するα−イソマルトシル転移酵素として、本発明者等が、岡山県岡山市の土壌から単離したアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物（以下、「微生物Ｓ１株」と言う。）由来のα−イソマルトシル転移酵素も有利に用いることができる。この微生物Ｓ１株の同定試験結果を下記に示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００２６】
＜微生物Ｓ１株＞
＜Ａ  細胞形態＞
（１）  肉汁寒天培養、２７℃
通常０．３乃至０．７μｍ×０．８乃至３．５μｍの桿菌。多形性あり。運動性なし。無胞子。グラム陽性。
（２）  ＥＹＧ寒天培地、２７℃
桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
＜Ｂ  培養性質＞
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：円形、大きさは１日間で２乃至３ｍｍ
周縁：全縁
隆起：半レンズ状
光沢：鈍光
表面：平滑
色調：不透明、淡い黄色
（２）  肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：中程度
形状：糸状
（３）  肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
＜Ｃ  生理学的性質＞
（１）  澱粉の加水分解：陰性
（２）  色素の生成：可溶性の色素の生成はない
（３）  ウレアーゼ：陽性
（４）  オキシダーゼ：陽性
（５）  カタラーゼ：陽性
（６）  酸素に対する態度：好気性
（７）  細胞壁の主要ジアミノ酸：リジン
（８）  細胞壁のペプチドグリカン型：リジン−アラニン
（９）  細胞壁のＮ−アシル型：アセチル
（１０）  細胞壁の構成糖：ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノース
（１１）  ビタミンの要求性：なし
（１２）  ＤＮＡのＧＣ含量：６５％
（１３）  ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジー：アルスロバクター  ラモサス（ＡＴＣＣ  １３７２７）との間で８４．４％のＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーを示す。
【００２７】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ』、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、アルスロバクター  ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｍｏｓｕｓ）に属する新規微生物であり、α−イソマルトシルグルコ糖質からα−イソマルトシル基を転移して環状四糖を生成する本発明に係るα−イソマルトシル転移酵素を産生する文献未記載の特徴を有する微生物であることが判明した。
【００２８】
これらの結果より、本発明者等は、本菌をアルスロバクター  ラモサスＳ１と命名し、平成１３年５月１６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２として受託された。
【００２９】
本発明に於いては、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素産生能を有する微生物である限り、前記微生物Ｓ１株の変異株も適宜用いることができる。尚、微生物Ｓ１株の変異体をスクリーニングする方法は、本発明に係るα−イソマルトシル転移酵素の理化学的性質を指標として、公知の微生物スクリーニング方法を用いることにより、容易にスクリーニングすることができる。
【００３０】
本発明で用いる微生物の培養に用いる培地は、当該微生物が生育でき、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を産生し得る栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、当該微生物が生育に利用できるものであればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いられる。
【００３１】
培養は、通常、温度４乃至４０℃、好ましくは２０乃至３７℃、ｐＨ４乃至１０、好ましくは５乃至９から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は微生物が増殖し始める時間以上であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましく、例えば、通気量を調節したり、攪拌したり、通気に酸素を追加したり、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００３２】
このようにして微生物を培養した後、本発明の酵素を回収する。α−イソマトシルグルコ糖質生成酵素活性は、菌体を含め培養物全体に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。前述のように、菌体除去後の培養液は、粗酵素液として用いることもでき、一般的には、硫安塩析法、アセトンおよびアルコール沈殿法、減圧濃縮、平膜、中空膜などの膜濃縮法により当該酵素を濃縮して利用する。
【００３３】
このようにして得られる、本発明の酵素を含む除菌液およびその濃縮液はそのまま、またはそれらの溶液中に含まれる当該酵素を公知の方法により固定化して用いることもできる。この際、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂および膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００３４】
前記酵素液中には、通常、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とが共存している。必要に応じて、公知の方法によって、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を分離・精製して、利用することもできる。一例として、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー、さらに再度、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を電気泳動的に単一な酵素として得ることができる。
【００３５】
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の理化学的性質の特徴は、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成し、デキストラン生成能を有さず、ＥＤＴＡによって活性が阻害される酵素であって、詳細には、下記の理化学的性質を有する。尚、前記非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質としては、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉およびグリコーゲンから選ばれる１種または２種以上の糖質を例示できる。
（１）  作用
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてα−１，６グルコシド結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７４，０００乃至１６０，０００ダルトン；
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃至７．８；
（４）  至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、約４０乃至５０℃；
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ２＋存在下、約４５乃至５５℃；
ｐＨ８．４、６０分間反応で、６０℃；  または、
ｐＨ８．４、６０分間反応で１ｍＭＣａ２＋存在下、６５℃；
（５）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至８．４；
（６）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、４５℃以下で安定；
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、約５０℃以下で安定；
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、約５５℃以下で安定；  または、
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下で安定；
（７）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ約４．５乃至１０．０の範囲で安定；
（８）  Ｎ末端アミノ酸配列
チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシン、ヒスチジン−バリン−セリン−アラニン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−ロイシン、または、アラニン−プロリン−ロイシン−グリシン−バリン−グルタミン−アルギニン−アラニン−グルタミン−フェニルアラニン−グルタミン−セリン−グリシン
【００３６】
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の基質としては、澱粉、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲンなどのα−１，４グルコシド結合を含む多糖や、それらをアミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖などの部分分解物が用いられる。これらα−１，４結合を含むグルコ糖質を、更にブランチングエンザイムなどの枝付け酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）で処理した糖質を用いることも随意である。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｍｙｌａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ』、パーガモン・プレス社（東京）（１９８８年）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２）、マルトトリオース生成アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１６）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）などのアミラーゼで分解した部分分解物を用いることができる。更には、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）などの澱粉枝切り酵素を作用させることも随意である。
【００３７】
基質としての澱粉は、とうもろこし、小麦、米などの穀類に由来する地上澱粉であっても、また馬鈴薯、さつまいも、タピオカなどの地下澱粉であってもよく、好ましくは、澱粉を糊化および／または液化した溶液として用いられる。その澱粉の部分分解の程度は低い程、環状四糖の生成率が高くなることから、ＤＥ約２０以下、望ましくは約１２以下、更に望ましくは約５以下が好適である。
【００３８】
本酵素の転移受容体としては、上記の基質自体が受容体となり得るばかりでなく、グルコース、キシロース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、フコース、ソルボース、およびＮ−アセチルグルコサミンなどの単糖類、トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、ラクトース、およびスクロースなどのオリゴ糖類、マルチトール、Ｌ−アスコルビン酸などを用いることができる。
【００３９】
基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．１％（以下、本明細書では、特に断らない限り、「ｗ／ｗ％」を単に「％」と略称する）の低濃度溶液として用いた場合でも、本発明の酵素反応は進行するが、工業的には、１％以上が好適である。また、基質溶液中に、完全に溶けきらない不溶性基質を含有する形態の懸濁状溶液であってもよい。望ましくは、濃度４０％以下、更に望ましくは３０％以下が好適である。
【００４０】
反応温度は反応が進行する温度、すなわち６５℃付近までの温度で行なえばよい。好ましくは３０乃至５５℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４．５乃至１０の範囲に調整すればよい。好ましくはｐＨ約５．５乃至９の範囲に調整する。反応時間は酵素反応の進行により適宜選択する。
【００４１】
本酵素の反応によって生成したα−イソマルトシルグルコ糖質に対して、α−イソマルトシル転移酵素を作用させることにより著量の環状四糖を製造することができる。α−イソマルトシル転移酵素の作用は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させ、本酵素を失活させた後に行なってもよい。好ましくは、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを併用して作用させる。例えば、澱粉またはその部分分解物やグリコーゲンの水溶液に本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを共存させ併用して作用させることにより、澱粉またはその部分分解物からは環状四糖が固形物当たり約３０％以上の高い生成率で、グリコーゲンの場合は約８０％以上もの高い生成率で環状四糖が得られる。このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との併用における環状四糖の生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推察される。
（１）  本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質、例えば、澱粉、グリコーゲン、またはこれらの部分分解物などの糖質に作用し、非還元末端グルコース残基を他の非還元末端グルコース残基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有する糖質が生成する。
（２）  α−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有する糖質に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端に位置するイソマルトシル基を有する糖質の非還元末端グルコース残基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有する糖質を生成する。
（３）  続いて、α−イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有する糖質に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を前記糖質から切り離し、これを環状化して環状四糖を生成する。
（４）  切り離された糖質は、再度、（１）から（３）の反応を経由することによって、環状四糖を生成し、更にそれらの反応が繰返されて著量の環状四糖を蓄積する。
【００４２】
以上、説明したように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との併用により、上記のように両酵素がそれらの基質に繰り返し作用し、環状四糖の生成率が著しく向上するものと推察される。
【００４３】
また、この環状四糖生成反応の際、他の転移酵素を更に併用して、環状四糖の生成率を向上させることも有利に実施できる。即ち、例えば、濃度約１５％の澱粉部分分解物に、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素の二者を併用して作用させることにより、約５５％の生成率で環状四糖が得られるところ、同じ条件でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの三者を併用して作用させることにより、環状四糖の最高生成率を、さらに約５乃至１０％高めて約６０乃至６５％に向上させることができる。
【００４４】
また、環状四糖を生成させるに際し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素産生能と、当該生成酵素で生成するα−イソマルトシルグルコ糖質のα−イソマルトシル部分とそれ以外のグルコ糖質部分とを特異的に切断しこのα−イソマルトシル部分を転移するα−イソマルトシル転移酵素産生能とを有する微生物を用いる培養方法により環状四糖を製造方法することもできる。
【００４５】
斯かる微生物を用いる環状四糖を生成する方法において用いる培養培地は、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質を含み、かつ当該微生物が生育し得る合成培地又は天然培地のいずれをも用いることができる。その他の培養条件は、前記した本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を産生させる条件を採用することができる。
【００４６】
上記の反応または培養によって得られた溶液は、環状四糖、またはこれを含有する糖質を含む溶液としてこのまま用いることもできる。一般的には、これら糖質は精製して用いられる。精製方法としては、公知の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭での脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂での脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、アミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）などやα−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）などの酵素で残存している他の糖質の分解、酵母での発酵処理、アルカリ処理などによる残存している還元性糖質の分解除去などの精製方法を１種または２種以上組み合せて精製することができる。
【００４７】
とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーが好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去することにより、目的物の含量を向上させた環状四糖、またはこれを含む糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００４８】
このようにして得られた環状四糖、またはこれを含む糖質を濃縮し、シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００４９】
環状四糖結晶を製造するには、例えば、有機溶媒存在下又は純度約５０％以上、濃度約３０％乃至９０％の環状四糖高含有液を助晶缶にとり、環状四糖固形物当たり０．１乃至２０％の種結晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは１０乃至９０℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、環状四糖結晶を含有するマスキットを製造する。マスキットから環状四糖結晶またはこれを含有する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。
【００５０】
このようにして製造される本発明の環状四糖は、上品で低甘味を有する非還元性の白色粉末で、安定な糖質であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少ない。
【００５１】
また、本発明の環状四糖は、包接能を有していることから、香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化を防止し、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れている。この際、必要ならば、シクロ（環状）デキストリン類、分岐シクロデキストリン類、シクロデキストラン類、シクロフラクタン類など他の環状糖質を併用することで、包接能による安定化を強化することも有利に実施できる。シクロデキストリン類などの環状糖質としては、高純度のものに限る必要はなく、低純度の環状糖質、例えば、多量のマルトデキストリンとともに各種のシクロデキストリンを含有した澱粉部分分解物なども有利に利用できる。
【００５２】
更に、本発明の環状四糖は、アミラーゼやα−グルコシダーゼによって分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、また、腸内細菌によって醗酵されにくく、極めて低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。虫歯誘発菌などによっても、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。粉末状物の付着、固結を防止することもできる。更に、本発明の環状四糖自体は、無毒、無害の天然甘味料であり、何らの危険性もなく、安定な甘味料であることにより、結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤と糖衣錠として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖の結晶防止性、難醗酵性などの性質を具備している。
【００５３】
従って、本発明の環状四糖、またはこれを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００５４】
本発明の環状四糖、またはこれを含む糖質は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロース、グリシン、アラニンなどの他の甘味料と併用することも、又、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と併用することもできる。とりわけ、エリスリトール、キシリトール、マルチトールなどの低カロリー甘味料やα−グリコシルステビオシド、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ及びスクラロースなどの１種又は２種以上の高甘味度甘味料と併用して、低カロリー甘味料又はダイエット甘味料などとして好適に利用することができる。
【００５５】
また、本発明の環状四糖、またはこれを含む糖質は、そのままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である。
【００５６】
更に、本発明の環状四糖、またはこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタれ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステら、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。また、和洋焼菓子の焼き立ての風味維持にも有利に使用できると共に、家畜、家禽、その他、蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター（ＴＮＦ）−α、ツモ���・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類またはローヤルゼリーなどの各種生理活性物質、更には、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペーストなどの有効成分や活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品や医薬品などを容易に製造できる。
【００５７】
上記で述べた、本発明の環状四糖又はこれを含む糖質による、香気成分の揮散防止（保香）、活性成分の劣化防止、保湿、離水防止、他の糖質の晶出防止、蛋白質変性防止、脂質劣化防止、乳化状態の安定化などの効果や、それ自体の安定性・賦形性などは、当然のことながら、皮膚外用に通常利用される他の成分と配合した場合にも効果的に発揮される。そして、本発明の環状四糖又はこれを含む糖質は、他の天然の糖質と同様に、皮膚に適用したときの刺激が極めて低く、かつ、皮膚における水分の保持にも奏功するので、当該糖質は、皮膚外用組成物に配合して利用することも有利に実施できる。斯かる皮膚外用組成物において、本発明の環状四糖又はこれを含む糖質は、通常、皮膚への適用が許容される他の成分の１種又は２種以上、例えば、皮膚への外用が許容される、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、エステル類、アルコール類、界面活性剤、色素、香料、ホルモン類、ビタミン類、植物エキス、動物エキス、微生物エキス、塩類、紫外線吸収剤、感光色素、抗酸化剤、防腐・殺菌剤、制汗・消臭剤、清涼剤、キレート剤、美白剤、消炎剤、酵素、糖質、アミノ酸類、増粘剤などから適宜選ばれる１種又は２種以上とともに配合される。当該皮膚外用組成物は、例えば、化粧品分野においては、ローション、クリーム、乳液、ゲル、粉末、ペースト、ブロックなどの形態で、石けん、化粧石けん、肌洗い粉、洗顔クリーム、洗顔フォーム、フェイシャルリンス、ボディーシャンプー、ボディーリンス、シャンプー、リンス、髪洗い粉などの清浄用化粧品、セットローション、ヘアブロー、チック、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアローション、養毛料、染毛料、頭皮用トリートメント、びん付油、つや出し油、髪油、スキ油などの頭髪化粧品、化粧水、バニシングクリーム、エモリエントクリーム、エモリエントローション、パック用化粧料（ゼリー状ピールオフタイプ、ゼリー状ふきとり型、ペースト状洗い流し型、粉末状など）、クレンジングクリーム、コールドクリーム、ハンドクリーム、ハンドローション、乳液、保湿液、アフターシェービングローション、シェービングローション、プレシェーブローション、アフターシェービングクリーム、アフターシェービングフォーム、プレシェーブクリーム、化粧用油、ベビーオイルなどの基礎化粧品、ファンデーション（液状、クリーム状、固型など）、タルカムパウダー、ベビーパウダー、ボディパウダー、パヒュームパウダー、メークアップベース、おしろい（クリーム状、ペースト状、液状、固型、粉末など）、アイシャドウ、アイクリーム、マスカラ、眉墨、まつげ化粧料、頬紅、頬化粧水などのメークアップ化粧品、香水、練香水、粉末香水、オーデコロン、パフュームコロン、オードトワレなどの芳香化粧品、日焼けクリーム、日焼けローション、日焼けオイル、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼け止めオイルなどの日焼け・日焼け止め化粧品、マニキュア、ペディキュア、ネイルカラー、ネイルラッカー、エナメルリムーバー、ネイルクリーム、爪化粧料などの爪化粧品、アイライナー化粧品、口紅、リップクリーム、練紅、リップグロスなどの口唇化粧品、練歯磨、マウスウォッシュなどの口腔化粧品、バスソルト、バスオイル、浴用化粧料などの入浴用化粧品などの用途に利用されるよう提供される。また、例えば、医薬品分野においては、当該皮膚外用組成物は、湿布剤、噴霧剤、塗布剤、浴剤、貼付剤、軟膏剤、パスタ剤、リニメント剤、ローション剤、パップ剤などの形態で提供される。
【００５８】
本発明の環状四糖又はこれを含む糖質とともに皮膚外用組成物に配合することができる他の成分を以下より具体的に述べると、油脂類としては、例えば、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、ゴマ油、サフラワー油、大豆油、ツバキ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油などの植物油（常温で液体）、カカオ脂、ヤシ脂、パーム油、モクロウなどの植物脂（常温で個体）、ミンク油、卵黄油、タートル油などの動物油が挙げられる。
【００５９】
本発明で利用できるロウ類としては、例えば、ホホバ油、カルナウバロウ、キャンデリラロウなどの植物性ロウ、マッコウ鯨油、槌鯨油、ミツロウ、鯨ロウ、ラノリンなどの動物性ロウ、モンタンロウなどの鉱物性ロウが挙げられる。
【００６０】
本発明で利用できる炭化水素類としては、例えば、パラフィン（別名「固形パラフィン」）、流動パラフィン、セレシン、マイクロクリスタリンワックス、ワセリンなどの鉱物性炭化水素、スクワラン、スクワレンなどの動物起源の炭化水素が挙げられる。
【００６１】
本発明で利用できる脂肪酸類としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ベヘニン酸、ウンデシレン酸、ラノリン脂肪酸、硬質ラノリン脂肪酸、軟質ラノリン脂肪酸、イソステアリン酸ならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００６２】
本発明で利用できるアルコール類としては、例えば、ラウリルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、ラノリンアルコール、水添ラノリンアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール、ポリエチレングリコールなどの高級アルコール（多価アルコールを含む）、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの低級アルコール（多価アルコールを含む）ならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００６３】
本発明で利用できるエステル類としては、例えば、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ステアリン酸コレステリル、酢酸コレステリル、ｎ−酪酸コレステリル、カプロン酸コレステリル、ラウリン酸コレステリル、ミリスチン酸コレステリル、パルミチン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、１２−ヒドロキシステアリン酸コレステリル、オレイン酸デシル、オレイン酸オクチルドデシル、ラノリン脂肪酸イソプロピル、トリミリスチン酸グリセリン、ジオレイン酸プロピレングリコール、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、酢酸ラノリン、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシルならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００６４】
本発明で利用できる界面活性剤としては、例えば、ラウリン酸亜鉛、ミリスチン酸亜鉛、パルミチン酸亜鉛、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、セチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンセチルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ラウロイルサルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸サルコシントリエタノールアミン、ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、大豆リン脂質などの陰イオン性界面活性剤、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化アルキルイソキノリニウム、ドデシルジメチル２−フェノキシエチルアンモニウムブロマイドなどの陽イオン性界面活性剤、β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインなどの両イオン性界面活性剤、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、親油型モノステアリン酸グリセリン、ジオレイン酸プロピレングリコール、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ショ糖脂肪酸エステル、ウンデシレン酸モノエタノールアミド、ヤシ油ジエタノールアミド、モノオレイン酸ポリエチレングリコール、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビット、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの非イオン性界面活性剤や、以上の化合物の誘導体が挙げられる。
【００６５】
本発明で利用できる色素としては、例えば、アマランス、エリスロシン、ローズベンガル、アシッドレッド、レーキレッドＣ、リソールレッド、ローダミン、ブリリアントレーキレッド、エオシンＹＳ、ビオラミンＲ、ブリリアントファストスカーレット、ボンソーＲなどの赤色タール系色素、ジブロモフルオレセイン、パーマネントオレンジ、エリスロシン黄ＮＡ、オレンジＩなどの橙色タール系色素、タートラジン、サンセットエロー、ウラニン、ベンチジンエローＧ、ナフトールエローＳ、エローＡＢなどの黄色タール系色素、ファストグリーンＦＣＦ、アリザニンシアニングリーンＦ、ライトグリーンＳＦ黄、ナフトールグリーンＢなどの緑色タール系色素、ブリリアントブルーＦＣＦ、インジゴカルミン、インジゴ、パテントブルーＮＡ、カルバンスレンブルー、スダンブルーなどの青色タール系色素、レゾルシンブラウンなどの褐色タール系色素、アリズリンパープル、アリズロールパープルなどの紫色タール系色素、ナフトールブルーブラックなどの黒色タール系色素、酸化亜鉛、酸化チタン、水酸化コバルト、水酸化アルミニウム、タルク、カオリン、雲母、ベントナイト、マンガンバイオレット、雲母チタンなどの無機顔料、β−カロチン、リコピン、クロシンなどのカロチノイド系色素、シソニン、サフロールイエロー、ルチン、ケルセチンなどのフラボノイド系色素、リボフラビンなどのフラビン系色素、コチニール、アリザニン、シコニンなどのキノン系色素や、以上の化合物の誘導体が挙げられる。
【００６６】
皮膚外用もしくは化粧品用に一般に利用される香料は、大別すると、天然香料である動物性香料及び植物性香料のほか、合成香料及びこれらを適宜配合した調合香料に分類される。本発明で利用できる動物性香料としては、例えば、じゃ香、霊猫香、海猫香、龍涎香などが挙げられる。植物性香料としては、例えば、アニスの実、バジルの葉、キャラウェイの果実、シナモンの樹皮、コリアンダーの種子、ラベンダーの花、ナツメグの種子、ペパーミントの葉、バラの花、ローズマリーの花種又は葉、タイムの葉などから水蒸気蒸留などによって得られる留出物（精油類）、ヒアシンスの花、ジャスミンの花、ミモザの花、バラの花、バニラの種子などから得られる抽出物（一般に、性状、製法によってアブソリュート類、レジノイド類、オレオレジン類、チンキ類に分類される）などが挙げられる。合成香料としては、例えば、アセトフェノン、アネソール、ベンジルアルコール、酢酸ブチル、カンフル、シトラール、シトロネロール、クミンアルデヒド、エストラゴール、エチルバニリン、酢酸ゲラニル、リナロール、メントール、メチルｐ−クレゾール、サリチル酸メチル、フェニル酢酸、バニリンならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。また、本発明においては、以上のような香料を適宜配合した調合香料を利用することもできる。
【００６７】
本発明で利用できるホルモン類としては、例えば、エストロン、エストラジオールなどの卵胞ホルモン類、プロゲストロン、プレグノロンなどの黄体ホルモン類、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ホルモン類が挙げられ、ビタミン類としては、例えば、レチノール、レチノイン酸、α−、β−、及びγ−カロテン、これらの誘導体などのビタミンＡに属する化合物、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン（以上ビタミンＢ６）、これらの誘導体などのビタミンＢに属する化合物、Ｌ−アスコルビン酸や、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸をはじめとするグリコシル−Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビンもしくはグリコシル−Ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体（別名「脂溶性ビタミンＣ」）、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステルなどその他のＬ−アスコルビン酸誘導体などのビタミンＣに属する化合物、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、これらの誘導体などのビタミンＤに属する化合物、α−、β−、γ−、及びδ−トコフェロール、α−、β−、γ−、及びδ−トコトリエノール、これらの誘導体などのビタミンＥに属する化合物が挙げられる。
【００６８】
本発明で利用できる植物抽出物としては、上記で述べた香料として利用される植物抽出物以外に、例えば、カミツレ抽出物、セージ抽出物、アロエ抽出物、サルビア抽出物、アシタバ抽出物、アボガド抽出物、イラクサ抽出物、ウイキョウ抽出物、ウーロン茶抽出物、オウバク抽出物、オオムギ抽出物、オクラ抽出物、オーリス抽出物、海藻抽出物、カリン抽出物、カンゾウ抽出物、クインスシード抽出物、クチナシ抽出物、クマザサ抽出物、ケイヒ抽出物、紅茶抽出物、コメヌカ抽出物、コメヌカ発酵抽出物、ステビア抽出物、セロリ抽出物、センブリ抽出物、ダイズ抽出物、タイム抽出物、茶抽出物、ツバキ抽出物、トウキ抽出物、トウモロコシ抽出物、ニンジン抽出物、ハマナス抽出物、ヒノキ抽出物、ヘチマ抽出物、ベニバナ抽出物、マツ抽出物、モモ抽出物、ユーカリ抽出物、ユキノシタ抽出物、ユズ抽出物、ユリ抽出物、ヨクイニン抽出物、ヨモギ抽出物、藍藻抽出物、海藻抽出物、リンゴ抽出物、レイシ抽出物、レタス抽出物のほか、ヒノキチオール、アズレン、クロロフィル、グリチルリチンなどの植物からの単離化合物などが挙げられる。本発明で利用できる動物抽出物としては、例えば、胎盤抽出物が挙げられる。
【００６９】
本発明で利用できる微生物エキスとしては、例えば、酵母エキスが挙げられる。当該皮膚外用組成物において、塩類としては、皮膚外用が通常許容されている塩類が一般に利用できるほか、海水、海洋深層水、海水乾燥物、鉱泉塩などの天然塩（溶液を含む）も有利に利用できる。
【００７０】
本発明で利用できる紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシルエステル、シノキサート、パラメトキシ桂皮酸エチルヘキシルエステル、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、オキシベンゾゾン、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチルならびにこれらの化合物の誘導体のほか、５−クロロウラシル、グアニン、シトシンなどの紫外線遮蔽能を有する有機物質が挙げられ、感光色素としては、例えば、２，２′［３′−［２−（３−ヘプチル−４−メチル−２−チアゾリン−２−イリデン）エチリデン］プロペニレン］ビス［３−ヘプチル−４−メチル］チアゾリニウムヨーダイド（別名「プラトニン」）、２−［２−（３−ヘプチル−４−メチル−２−チアゾリン−２−イリデン）メチン］−３−ヘプチル−４−メチルチアゾリニウムヨーダイド（別名「ピオニン」）、６−［２−［（５−ブロモ−２−ピリジル）アミノ］ビニル］−１−エチル−２−ピコリニウムヨーダイド（別名「タカナール」）、２−（２−アニリノビニル）−３，４−ジメチル−オキサゾリニウムヨーダイド（別名「ルミネキス」）ならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００７１】
本発明で利用できる抗酸化剤としては、既に述べた成分で抗酸化作用を有するものの他、例えば、没食子酸プロピル、没食子酸ブチル、没食子酸オクチル、没食子酸ドデシル、ノルジヒドロガイアレン酸（別名「ＮＤＧＡ」）、ブチルヒドロキシアニソール（別名「ＢＨＡ」）、ジブチルヒドロキシトルエン（別名「ＢＨＴ」）、４−ヒドロキシメチル１−２，６−ジターシャリーブチルフェノールならびにこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【００７２】
本発明で利用できる防腐・殺菌剤としては、既に述べた成分で防腐又は殺菌作用を有するモノの他、例えば、フェノール、パラクロロメタクレゾール、レゾルシン、パラオキシ安息香酸エステル、クレゾールなどのフェノール類、安息香酸、ソルビン酸、サリチル酸、ほう酸などの酸類（いずれも塩の形態を含む）、ヘキサクロロフェン、ビチオノール、ジクロロフェンなどのハロゲン化ビスフェノール類、３，４，４′トリクロロカルバニリド、ウンデシレン酸モノエタノールアミドなどのアミド類、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化デカリニウムなどの４級アンモニウム化合物の他、塩酸クロルヘキシジン、１−ハイドロキシピリジン−２−チオン、塩化リゾチームや、以上の化合物の誘導体が挙げられる。
【００７３】
本発明で利用できる制汗・消臭剤としては、塩化アルミニウム、塩化亜鉛、クロルヒドロキシアルミニウム、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アラントインジヒドロキシアルミニウム、アルミニウムクロルヒドレート類などが挙げられ、清涼剤としては、例えば、メントール、ハッカ油、ペパーミント油、カンフル、チモール、スピラントール、サリチル酸メチルなどが挙げられ、キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸誘導体、トリポリリン酸、ヘキサメタクリン酸、ジヒドロエチルグリシン、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、糖酸が挙げられる。
【００７４】
本発明で利用できる美白剤としては、既に述べた成分で美白作用を有するものの他、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、タイロシネース遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）などの核酸、コウジ酸、乳酸、アントラニル酸、クマリン、ベンゾトリアゾール、イミダゾリン、ピリミジン、ジオキサン、フラン、ピロン、ニコチン酸、アルブチン、バイカリン、バイカレイン、及びベルベリン並びにこれらの化合物の誘導体、メラニン色素生成抑制剤、タイロシネース生成抑制剤、タイロシネース阻害剤が挙げられる。
【００７５】
本発明で利用できる消炎剤としては、既に述べた成分で消炎作用を示すものの他、アラントイン、アラントインアセチル−ＤＬ−メチオニン、アラアントインβ−グリチルレチン酸、イクタモール、インドメタシン、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、シコン抽出物などが挙げられ、酵素としては、枯草菌、放線菌、酵母などの微生物や、植物、動物に由来するプロテアーゼ、リパーゼ、リゾチームなどが挙げられる。
【００７６】
本発明で利用できる糖質としては、スクロース、マルトース、フラクトース、ラクトース、トレハロースなどの少糖類、シクロデキストリン類などの環状四糖以外の環状糖質類、マルチトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、アラビトールなどの糖アルコール類、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、プルラン、セルロール、澱粉、デキストラン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、水飴、アラビアガム、トラガントガム、キサンタンガム、キチンなどの多糖類ならびにそれらの誘導体又は部分分解物が挙げられ、アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、シスチン、アスパラギン、グルタミン、ピロリドンカルボン酸、ヒドロキシプロリン、ピペコリン酸、サルコシン、ホモシステイン、ホモセリン、シトルリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインスルフィン酸、アルギニノコハク酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、β−アラニン、タウリン、β−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸や、以上の化合物の塩が挙げられる。
【００７７】
本発明で利用できる増粘剤としては、既述の成分で増粘作用を有するもののほか、例えば、クインスシード、アルギン酸ナトリウム、カチオン化セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチル澱粉、アルギン酸プロピレングリコール、コラーゲン、ケラチン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドエーテル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン−ビニルアセテート共重合物、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルメチルエーテル、カルボキシビニルポリマーなどの水溶性高分子、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなどの電解質のほか、各種の油分などが挙げられる。
【００７８】
なお、以上の例示においては、塩の形態をとりうる成分について、その塩の形態を全て例示しているわけではないけれども、皮膚外用剤が許容される塩であれば、例示された以外の塩であっても、本発明において適宜利用できることは言うまでもない。
【００７９】
以上述べたような各種組成物に、環状四糖、またはこれを含む糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１％以上、望ましくは１％以上含有せしめるのが好適である。
【００８０】
以下、本発明を、実験により詳細に説明する。
【００８１】
＜実験１：培養物からの非還元性環状糖質の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学株式会社製造）５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養した後、遠心分離して菌体を除き培養上清を得た。さらに、その培養上清をオートクレーブ（１２０℃、１５分間）し、放冷した後、不溶物を遠心分離して除き上清を回収した。
【００８２】
得られた上清中の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用い２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略す。）を行ない、上清中の糖質を分離した。検出法として、分離した全糖質を硫酸−メタノール法で発色し、また、還元糖質をジフェニルアミン−アニリン法で発色して調べたところ、Ｒｆ値が約０．３１の位置に硫酸−メタノール法で陽性、かつ、ジフェニルアミン−アニリン法で陰性の非還元性糖質が検出された。
【００８３】
先に得た上清約９０ｍｌをｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼ Ｌ「アマノ」』、天野製薬株式会社製造）を固形物１グラム当り１，５００単位とグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１グラム当り７５単位添加して２４時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調整し２時間煮沸して、残存する還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤアイオンＰＫ２１８』と『ダイヤイオンＷＡ３０』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』で再度脱塩し、活性炭で脱色し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し凍結真空乾燥して固形物として約０．６ｇの糖質粉末を得た。
【００８４】
得られた糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、「ＨＰＬＣ」と略称する。）で調べたところ、第１図に示すように、溶出時間１０．８４分に単一ピークのみが検出され、純度は９９．９％以上で極めて高純度であることが判明した。なお、ＨＰＬＣは、『ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製造）を用いカラム温度６０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液として水を用いる条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。
【００８５】
また、還元力をソモギ−・ネルソン法で測定したところ、その還元力は検出限界以下であり、本標品は実質的に非還元性糖質であると判断される。
【００８６】
＜実験２：非還元性糖質の構造解析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、高速原子衝撃法による質量分析（通称「ＦＡＢ−ＭＳ」）したところ、質量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数が６４８であることが判明した。
【００８７】
また、常法に従って、硫酸を用い加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、本糖質の構成糖はＤ−グルコースであることも判明し、質量数を考慮すると、本糖質はＤ−グルコース４分子からなる環状糖質であることがわかった。
【００８８】
さらに、本糖質を用いて核磁気共鳴法（通称、「ＮＭＲ」）を行ったところ、第２図に示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、第３図に示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られ、これらスペクトルを既知糖質のものと異同を比較したところ、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に記載されている非還元性環状糖質サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝のスペクトルと一致し、本糖質の構造が第４図に示す環状四糖、即ち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝であることが判明した。
【００８９】
＜実験３：バチルス  グロビスポルスＣ９によるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学株式会社製造）４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、（アサヒビール株式会社製造）１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００９０】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．４５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．５単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．４５単位／ｍｌの活性（総活性約８，１１０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．５単位／ｍｌの活性（総活性約２６，９００単位）で、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌ（総活性約１７，１００単位）であった。
【００９１】
なお、酵素活性は次のようにして測定した。即ち、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性の測定は、マルトトリオースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成するイソマルトシルマルトースとマルトースのうち、このマルトース量を、実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量とした。本明細書を通じて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性は、以上のようにして測定される単位を意味する。
【００９２】
また、α−イソマルトシル転移酵素の酵素活性の測定は、パノースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成する環状四糖とグルコースのうち、このグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量することによって行った。α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量とした。本明細書を通じて、α−イソマルトシル転移酵素の酵素活性は、以上のようにして測定される単位を意味する。
【００９３】
環状四糖生成活性の測定は、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製造）を濃度２ｗ／ｖ％となるよう５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１００℃で１０分間熱処理して反応を停止させた後、更に、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼ Ｌ「アマノ」』、天野製薬製造）７０単位／ｍｌとグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）２７単位／ｍｌとを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌを加えて、５０℃で６０分間処理し、その液を１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた後、環状四糖量を実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。環状四糖生成活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルの環状四糖を生成する酵素量とした。本明細書を通じて、環状四糖生成活性は、以上のようにして測定される活性（単位）を意味する。
【００９４】
＜実験４：バチルス  グロビスポルスＣ９由来酵素の調製＞
【００９５】
＜実験４−１：バチルス  グロビスポルスＣ９由来酵素の精製＞
実験３で得られた培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４００ｍｌを得た。この粗酵素液は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，１１０単位と、α−イソマルトシル転移酵素活性を２４，７００単位と、環状四糖生成活性を約１５，６００単位有していた。この粗酵素液を三菱化学株式会社製『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１，０００ｍｌ）に供した。この際、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、α−イソマルトシル転移酵素および環状四糖のいずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不純物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とは分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安濃度約０Ｍ付近に溶出し、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオース濃度約３０ｍＭ付近に溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分と本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め回収した。また、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とα−イソマルトシル転移酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【００９６】
以下、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを精製する方法についてそれぞれ述べる。
【００９７】
＜実験４−２：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
実験４−１で得た本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００９８】
【表１】
0004919199.tif 000002
【００９９】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【０１００】
＜実験４−３：α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験４−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
【０１０１】
【表２】
0004919199.tif 000003
【０１０２】
＜実験５：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
【０１０３】
＜実験５−１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験４−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１４０，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１０４】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【０１０５】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を第５図（温度の影響）、第６図（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４０℃（Ｃａ２＋非存在下）、約４５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在下）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０乃至６．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第７図（温度安定性）、第８図（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約３５℃まで（Ｃａ２＋非存在下）、約４０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在下）で、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【０１０６】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表３に示す。
【０１０７】
【表３】
0004919199.tif 000004
【０１０８】
表３の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【０１０９】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示す、チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンの配列を有していることがわかった。
【０１１０】
＜実験５−２：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験４−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１１１】
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．５±０．５であった。
【０１１２】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を第９図（温度の影響）、第１０図（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約４５℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第１１図（温度安定性）、第１２図（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性はｐＨ約４．０乃至９．０であった。
【０１１３】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。
【０１１４】
【表４】
0004919199.tif 000005
【０１１５】
表４の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【０１１６】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号２に示す、イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−アスパラギン−グリシンの配列を有していることがわかった。
【０１１７】
＜実験６：バチルス  グロビスポルスＣ１１によるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【０１１８】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．５５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．８単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．５１単位／ｍｌの活性（総活性約９、１８０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．７単位／ｍｌの活性（総活性約３０，４００単位）で、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌ（総活性約１９，４００単位）であった。
【０１１９】
＜実験７：バチルス  グロビスポルスＣ１１由来酵素の調製＞
【０１２０】
＜実験７−１：バチルス  グロビスポルスＣ１１由来酵素の精製＞
実験６で得られた培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，４４０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約２８，０００単位、環状四糖生成活性を約１７，７００単位有することが判明した。この粗酵素液を、実験４−１に記載の『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性、α−イソマルトシル転移酵素活性、環状四糖生成いずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシル転移酵素と本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安濃度約０．３Ｍ付近で溶出し、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオース濃度約３０ｍＭ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分と本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを別々に集め回収した。実験４に記載のＣ９株の場合と同様に、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシル転移酵素画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性は本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【０１２１】
以下、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを精製する方法についてそれぞれ述べる。
【０１２２】
＜実験７−２：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
【０１２３】
【表５】
0004919199.tif 000006
【０１２４】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【０１２５】
＜実験７−３：α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験７−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表６に示す。
【０１２６】
【表６】
0004919199.tif 000007
【０１２７】
＜実験８：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
【０１２８】
＜実験８−１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１３７，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１２９】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【０１３０】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を第１３図（温度の影響）、第１４図（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４５℃（Ｃａ２＋非存在下）、約５０℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在下）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第１５図（温度安定性）、第１６図（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋非存在下）、約４５℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在下）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０であった。
【０１３１】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表７に示す。
【０１３２】
【表７】
0004919199.tif 000008
【０１３３】
表７の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【０１３４】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示す、チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンの配列を有していることがわかった。
【０１３５】
このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−１のバチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質
生成酵素のＮ末端配列と比較すると同一であることが判明し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号１に示す、チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンの配列であることが判明した。
【０１３６】
＜実験８−２：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験７−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１０２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１３７】
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．６±０．５であった。
【０１３８】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を第１７図（温度の影響）、第１８図（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約５．５乃至６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第１９図（温度安定性）、第２０図（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【０１３９】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
【０１４０】
【表８】
0004919199.tif 000009
【０１４１】
表８の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【０１４２】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号３に示す、イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−チロシン−グリシンの配列を有していることがわかった。このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−２のバチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のＮ末端配列と比較して、α−イソマルトシル転移酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号４に示す、イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリンの配列であることが判明した。
【０１４３】
＜実験９：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素のアミノ酸配列＞
【０１４４】
＜実験９−１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験７−２の方法で得られた精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのトリプシン（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ６４（保持時間約６４分）、Ｐ８８（保持時間約８８分）、Ｐ９９（保持時間約９９分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号５乃至７に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表９に示す。
【０１４５】
【表９】
0004919199.tif 000010
【０１４６】
＜実験９−２：α−イソマルトシル転移酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験７−３の方法で得られた精製α−イソマルトシル転移酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ２２（保持時間約２２分）、Ｐ６３（保持時間約６３分）、Ｐ７１（保持時間約７１分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号８乃至１０に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表１０に示す。
【０１４７】
【表１０】
0004919199.tif 000011
【０１４８】
＜実験１０：バチルス  グロビスポルスＮ７５によるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【０１４９】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌し、冷却して、温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．３４単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．１単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．６９単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．３３単位／ｍｌの活性（総活性約５，９４０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．１単位／ｍｌの活性（総活性約１９，８００単位）で、環状四糖生成活性は約０．６７単位／ｍｌ（総活性約１２，１００単位）であった。
【０１５０】
＜実験１１：バチルス  グロビスポルスＮ７５由来の酵素の調製＞
【０１５１】
＜実験１１−１：バチルス  グロビスポルスＮ７５由来酵素の精製＞
実験１０で得られた培養上清約１８Ｌを６０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を４，７１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約１５，７００単位、環状四糖生成活性を約９，５９０単位有することが判明した。この粗酵素液を、実験４−１に記載の『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着し、α−イソマルトシル転移酵素活性は、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。続いて、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、ＮａＣｌ濃度約０．２５Ｍ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分と本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを別々に集め回収した。実験４に記載のＣ９株の場合および実験７に記載のＣ１１株の場合と同様に、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシル転移酵素画分とα−イソマルトシルグルコ糖質 生成酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性は本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【０１５２】
以下、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを精製する方法についてそれぞれ述べる。
【０１５３】
＜実験１１−２：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオース濃度約３０ｍＭ付近に溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。この回収液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１１に示す。
【０１５４】
【表１１】
0004919199.tif 000012
【０１５５】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【０１５６】
＜実験１１−３：α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験１１−１に記載のイオン交換クロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、『Ｓｅｐｈａｅｒｙｌ  ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。さらに、酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、『Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。この回収液を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃ』ゲルを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃ』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出し、得られた溶出画分を回収し、最終精製酵素標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表１２に示す。
【０１５７】
【表１２】
0004919199.tif 000013
【０１５８】
精製したα−イソマルトシル転移酵素標品を７．５％ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【０１５９】
＜実験１２：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
【０１６０】
＜実験１２−１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験１１−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１３６，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１６１】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質
生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約７．３±０．５であった。
【０１６２】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を第２１図（温度の影響）、第２２図（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約５０℃（Ｃａ２＋非存在下）、約５５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在下）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第２３図（温度安定性）、第２４図（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４５℃まで（Ｃａ２＋非存在下）、約５０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在下）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。
【０１６３】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表１３に示す。
【０１６４】
【表１３】
0004919199.tif 000014
【０１６５】
表１３の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【０１６６】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１１に示す、ヒスチジン−バリン−セリン−アラニン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−ロイシンの配列を有していることがわかった。
【０１６７】
このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−１のバチルス  グロビスポルスＣ９由来及び実験８−１のバチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のＮ末端配列と比較すると、第１番目及び第４番目、第９番目のアミノ酸が異なるものの類似性が高いことが判明した。
【０１６８】
＜実験１２−２：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１１−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１６９】
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドグル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約７．８±０．５であった。
【０１７０】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を第２５図（温度の影響）、第２６図（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第２７図（温度安定性）、第２８図（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４５℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至１０．０であった。
【０１７１】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表１４に示す。
【０１７２】
【表１４】
0004919199.tif 000015
【０１７３】
表１４の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【０１７４】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号３に示す、イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−チロシン−グリシンの配列を有していることがわかった。このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−２のバチルス  グロビスポルスＣ９由来及び実験８−２のバチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のＮ末端配列と比較して、α−イソマルトシル転移酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号４に示す、イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリンの配列であることが判明した。
【０１７５】
＜実験１３：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素のアミノ酸配列＞
【０１７６】
＜実験１３−１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験１１−２の方法で得られた精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に２０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２４時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。『マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム』（直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−３６％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［ＰＮ５９（保持時間約５９分）、ＰＮ６７（保持時間約６７分）、ＰＮ８７（保持時間約８７分）］を分取し、それぞれ真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号１２乃至１４に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表１５に示す。
【０１７７】
【表１５】
0004919199.tif 000016
【０１７８】
＜実験１３−２：α−イソマルトシル転移酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験１１−３の方法で得られた精製α−イソマルトシル転移酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に２０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２４時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。『マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム』（直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−４％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４２．４％アセトニトリル溶液の９０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［ＰＮ２１（保持時間約２１分）、ＰＮ３８（保持時間約３８分）、ＰＮ６９（保持時間約６９分）］を分取し、それぞれ真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基まで（但し、ＰＮ２１は６残基まで）アミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号１５乃至１７に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表１６に示す。
【０１７９】
【表１６】
0004919199.tif 000017
【０１８０】
＜実験１４：アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９によるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【０１８１】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至９．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の本酵素活性は約１．１単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．７単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．３５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約１．０６単位／ｍｌの活性（総活性約１９，１００単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．６単位／ｍｌの活性（総活性約２８，８００単位）で、環状四糖生成活性は約０．２７単位／ｍｌ（総活性約４，８６０単位）であった。
【０１８２】
なお、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定は、基質のための緩衝液として１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた以外、実験３に記載の方法と同様に行った。
【０１８３】
＜実験１５：アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来酵素の調製＞
【０１８４】
＜実験１５−１：アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来酵素の精製＞
実験１４で得られた培養上清約１８Ｌを６０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約８５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，２１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約１５，７００単位、環状四糖生成活性を約２，０９０単位有することが判明した。この粗酵素液を、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ』ゲルを用いたイオン交換カラムクロマログラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。酵素活性は、『ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、ＮａＣｌ濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とは分離して溶出し、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、ＮａＣｌ濃度約０．２Ｍ付近に溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性はＮａＣｌ濃度約０．３Ｍ付近に溶出した。そこで、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とα−イソマルトシル転移酵素活性画分とを別々に集め回収した。また、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とα−イソマルトシル転移酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【０１８５】
以下、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを精製する方法についてそれぞれ述べる。
【０１８６】
＜実験１５−２：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、硫安濃度約０．２Ｍ付近で溶出した。本酵素活性を示す画分を集め回収し、最終精製標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１７に示す。
【０１８７】
【表１７】
0004919199.tif 000018
【０１８８】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【０１８９】
＜実験１５−３：α−イソマルトシル転移酵素の部分精製＞
実験１５−１に記載のイオン交換クロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０Ｍ付近で吸着した酵素が溶出した。本酵素活性を示す画分を集め回収し、部分精製酵素標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表１８に示す。
【０１９０】
【表１８】
0004919199.tif 000019
【０１９１】
部分精製したα−イソマルトシル転移酵素標品を７．５％ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、メインの蛋白バンド以外に、３種のマイナーな蛋白バンドが認められた。
【０１９２】
＜実験１６：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
【０１９３】
＜実験１６−１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験１５−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約９４，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０１９４】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約４．３±０．５であった。
【０１９５】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を第２９図（温度の影響）、第３０図（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ８．４、６０分間反応で約６０℃（Ｃａ２＋非存在下）、約６５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在下）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約８．４であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを８．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第３１図（温度安定性）、第３２図（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約５５℃まで（Ｃａ２＋非存在下）、約６０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在下）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。
【０１９６】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表１９に示す。
【０１９７】
【表１９】
0004919199.tif 000020
【０１９８】
表１９の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害されることが判明した。
【０１９９】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー  モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１８に示す、アラニン−プロリン−ロイシン−グリシン−バリン−グルタミン−アルギニン−アラニン−グルタミン−フェニルアラニン−グルタミン−セリン−グリシンの配列を有していることがわかった。
【０２００】
＜実験１６−２：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１５−３の方法で得た部分精製α−イソマルトシル転移酵素標品を用いて、本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を第３３図（温度の影響）、第３４図（ｐＨの影響）を示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第３５図（温度安定性）、第３６図（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４５℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【０２０１】
＜実験１７：アルスロバクター  ラモサスＳ１によるα−イソマルトシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター  ラモサスＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９２）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養液とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後の培養液中の本酵素活性は約０．４５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの本酵素活性は、０．４４単位／ｍｌ（総酵素活性約７，９２０単位）であった。
【０２０２】
＜実験１８：アルスロバクター  ラモサスＳ１からのα−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験１７で得られた培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析して、本酵素活性を６，０００単位含む粗酵素液約３８０ｍｌを得た。この粗酵素液を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を、遠心分離して不溶物を除いた後、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素は、セファクリルＨＲ  Ｓ−２００ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント及び、これに続いてマルトテトラオース０ｗ／ｖ％から５ｗ／ｖ％のリニアグラジエントで溶出させたところ、マルトテトラオース濃度約２ｗ／ｖ％付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。更に、酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、ブチル−トヨパール６５０Ｍゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収して、精製標品とした。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素の活性量、比活性、収率を表２０に示す。
【０２０３】
【表２０】
0004919199.tif 000021
【０２０４】
７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、本実験で精製したα−イソマルトシル転移酵素標品の純度を検定したところ、本酵素標品の蛋白バンドは単一で、純度の高い標品であった。
【０２０５】
＜実験１９：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験１８の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１６，０００±２０，０００ダルトンであった。
【０２０６】
本精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％『アンフォライン』（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造）含有等電点ポリアクリルアミドグル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点（ｐＩ）は約４．２±０．５であった。
【０２０７】
本酵素の酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。その結果を第３７図（温度の影響）、第３８図（ｐＨの影響）に示した。本酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素をｐＨの異なる５０ｍＭ緩衝液中で、４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第３９図（温度安定性）、第４０図（ｐＨ安定性）に示した。これらの図に示されるとおり、本酵素の上記の条件下における安定温度域は約４５℃以下であり、また、本酵素の上記の条件下における安定ｐＨ域はｐＨ約３．６乃至約９．０であった。
【０２０８】
本酵素の活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表２１に示す。
【０２０９】
【表２１】
0004919199.tif 000022
【０２１０】
表２１の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋でも阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないことも判明した。
【０２１１】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー『モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製造）を用いて分析した。本酵素のＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号１９に示す、アスパラギン酸−スレオニン−ロイシン−セリン−グリシン−バリン−フェニルアラニン−ヒスチジン−グリシン−プロリンで表される配列であることが判明した。
【０２１２】
＜実験２０：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の基質になりうるかどうかの試験をした。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシドを含む溶液を調製した。
【０２１３】
これらの溶液に、実験４−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、または実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、実験１５−２の方法で得たアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを３０℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の酵素の場合、ｐＨ８．４）で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液を、実験１記載のＴＬＣ法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表２２に示す。
【０２１４】
【表２２】
0004919199.tif 000023
【０２１５】
表２２の結果から明らかなように、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、試験した多種の糖質のうち、グルコース重合度３以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質によく作用することが判明した。また、グルコース重合度が２の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも僅かに作用することが判明した。
【０２１６】
＜実験２１：マルトオリゴ糖からの生成物＞
【０２１７】
＜実験２１−１：生成物の調製＞
濃度１％のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースのそれぞれ水溶液に実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、それぞれ固形物１グラム当たり２単位（マルトースおよびマルトトリオース）、０．２単位（マルトテトラオース）、０．１単位（マルトペンタオース）加え、３５℃、ｐＨ６．０で８時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、『ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ３０３』カラム（株式会社ワイ・エム・シー製造）を用いカラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液として水を用いる条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。その結果を表２３に示す。
【０２１８】
【表２３】
0004919199.tif 000024
【０２１９】
表２３の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトースからは、主にグルコースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）とが生成し、基質マルトトリオースからは、主にマルトースとα−イソマルトシルマルトース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）とが生成し、少量ながらグルコース、マルトテトラオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）、生成物Ｘが生成することが判明した。基質マルトテトラオースからは、主にマルトトリオースと生成物Ｘとが生成し、少量ながらマルトース、マルトペンタオース、α−イソマルトシルマルトース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）、生成物Ｙが生成することが判明した。基質マルトペンタオースからは、主にマルトテトラオースと生成物Ｙとが生成し、少量ながらマルトトリオース、マルトヘキサオース、生成物Ｘ、生成物Ｚが生成することが判明した。
【０２２０】
基質マルトテトラオースからの主生成物である生成物Ｘ、並びに基質マルトペンタオースからの主生成物である生成物Ｙの単離・精製を行った。分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  Ｒ３５５−１５Ｓ−１５  １２Ａ』（株式会社ワイエムシイ製）を用いて精製し、上記のマルトテトラオースからの反応物、マルトペンタオースからの反応物それぞれから、純度９９．９％以上の生成物Ｘ標品を固形物収率約８．３％で、純度９９．９％以上の生成物Ｙを固形物収率約１１．５％で単離した。
【０２２１】
＜実験２１−２：生成物の構造解析＞
実験２１−１の方法で得た生成物Ｘおよび生成物Ｙを用いて、常法に従ってメチル化分析とＮＭＲ分析を行なった。メチル化分析の結果は表２４にまとめた。ＮＭＲ分析の結果については、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを第４１図（生成物Ｘ）、第４２図（生成物Ｙ）に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを第４３図（生成物Ｘ）、第４４図（生成物Ｙ）に、生成物Ｘ、Ｙの帰属を表２５にまとめた。
【０２２２】
【表２４】
0004919199.tif 000025
【０２２３】
【表２５】
0004919199.tif 000026
【０２２４】
これらの結果から、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素によるマルトテトラオースからの生成物Ｘは、マルトテトラオースの非還元末端グルコース残基の６位水酸基にグルコシル基がα結合した五糖で、構造式１で表わされるα−イソマルトシルマルトトリオース（別名、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース）であることが判明した。
【０２２５】
構造式１：
【化１】
0004919199.tif 000027
【０２２６】
また、マルトペンタオースからの生成物Ｙは、マルトペンタオースの非還元末端グルコース残基の６位水酸基にグルコシル基がα結合した六糖で、構造式２で表わされるα−イソマルトシルマルトテトラオース（別名、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース）であることが判明した。
【０２２７】
構造式２：
【化２】
0004919199.tif 000028
【０２２８】
以上のことから、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のマルトオリゴ糖に対する作用は以下のように判断された。
（１）  本酵素は、基質として、α−１，４結合からなるグルコース重合度が２以上のマルトオリゴ糖に作用し、その非還元末端のグルコース残基を他の分子の非還元末端のグルコース残基の６位に転移する作用を有する分子間の６−グルコシル転移を触媒して、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するグルコース重合度が１増加したα−イソマルトシルグルコ糖質（別名、６−Ｏ−α−グルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
（２）  本酵素は、４−グルコシル転移も僅かに触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が１増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
【０２２９】
＜実験２２：還元力生成試験＞
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が還元力生成能を有するかどうかを調べるため、以下の試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、または、実験１５−２の方法で得たアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の酵素の場合、ｐＨ８．４）で作用させ、その反応液の一部を経時的に採り、１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応液の還元力を測定した。即ち、その酵素反応前後の溶液の還元糖量をソモギ−・ネルソン法で測定し、また、同時にその酵素反応前後の溶液の全糖量をアントロン硫酸法で測定し、還元力生成率（％）は以下の計算式を用いて算出した。結果を表２６に示す。
【０２３０】
計算式：
【式１】
0004919199.tif 000029
【０２３１】
【表２６】
0004919199.tif 000030
【０２３２】
表２６の結果から明らかなように、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、マルトテトラオースを基質として作用させると、反応物の還元力を実質的に増加しないこと、即ち、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は加水分解作用を示さないか、示すとしても検出できないほど僅かなものであることが判明した。
【０２３３】
＜実験２３：デキストラン生成試験＞
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素がデキストラン生成作用を有するかどうかを調べるため、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５６巻、１６９乃至１７３（１９９２年）に記載の方法に準じて試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たＣ９株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素および実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、または、実験１５−２の方法で得たアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９酵素の場合、ｐＨ８．４）で４時間および８時間作用させた後、１００℃で１５分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の５０μｌを遠心管に入れ、それに３倍量のエタノールを加え十分に攪拌した後、４℃で３０分間静置した。次いで、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し、その上清を除去した後、１ｍｌの７５ｗ／ｗ％のエタノールを加え攪拌して洗浄した。再度、遠心分離してその上清を除き、真空乾燥した後、１ｍｌの脱イオン水を加え十分に攪拌した。その液中の全糖量（グルコース換算）をフェノール硫酸法で測定し、試験の全糖量とした。反応のブランクとして、１００℃で１０分間熱処理し失活させたバチルス  グロビスポルスＣ９由来またはバチルス  グロビスポルスＣ１１由来、バチルス  グルビスポルスＮ７５由来、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて同様に行い、ブランクの全糖量とした。デキストラン生成量は以下の計算式で計算した。結果を表２７に示す。
【０２３４】
計算式：
【式２】
0004919199.tif 000031
【０２３５】
【表２７】
0004919199.tif 000032
【０２３６】
表２７の結果から明らかなように、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をマルトテトラオースに作用させてもデキストランを生成しないこと、つまり、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、デキストラン生成作用を実質的に有さないか、有するとしてもその生成量は検出限界以下であることが判明した。
【０２３７】
＜実験２４：転移受容体特異性＞
各種糖質を用いて、本酵素の転移受容体になりうるかどうかの試験をした。Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｄ−プシコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ソルビトール、トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセロール、マルチトール、ラクトース、スクロース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、Ｌ−アスコルビン酸の溶液を調製した。
【０２３８】
これらの受容体溶液（濃度１．６％）に、糖供与体として澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（濃度４％）を加え、実験４−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、実験１１−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、または、実験１５−２の方法で得たアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を糖供与体固形物１グラム当たりそれぞれ１単位ずつ加え、これを３０℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９酵素の場合、ｐＨ８．４）で２４時間作用させた。酵素反応後の反応液を、受容体が単糖または二糖の場合はガスクロマトグラフィー法（以下、「ＧＬＣ法」と略する。）で、受容体が三糖以上の場合はＨＰＬＣ法で分析し、それぞれの糖質が本酵素の転移受容体になるかを確認した。なお、ＧＬＣに於いて、ＧＬＣ装置は『ＧＣ−１６Ａ』（株式会社島津製作所製）、カラムはジー・エル・サイエンス株式会社製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を充填したステンレス製カラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の速度で昇温し、検出は水素炎イオン検出器で分析した。ＨＰＬＣでは、ＨＰＬＣの装置は東ソー株式会社製『ＣＣＰＤ』、カラムは『ＯＤＳ−ＡＱ−３０３』（株式会社ワイエムシィー社製）、溶離液は水を用い、流速０．５ｍｌ／分で、検出は示差屈折計を用いて行った。結果を表２８に示す。
【０２３９】
【表２８】
0004919199.tif 000033
【０２４０】
表２８の結果から明らかなように、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、転移受容体として種々の糖質が利用でき、バチルス  グロビスポルスＣ９、Ｃ１１およびＮ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、特に、Ｄ−／Ｌ−キシロース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトースおよびスクロースによく転移し、次いで、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−フコース、Ｄ−プシコース、Ｌ−ソルボース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グリセロールおよびＬ−アスコルビン酸に転移し、更には、Ｄ−アラビノースにも転移することが判明し、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、特に、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、トレハロース、セロビオース、マルチトール、ラクトースおよびスクロースによく転移し、次いで、Ｄ−グルコース、Ｄ−／Ｌ−キシロース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−プシコース、Ｌ−ソルボース、イソマルトース、ゲンチビオース、グリセロールおよびＬ−アスコルビン酸に転移し、更には、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコースおよびイソマルトトリオースにも転移することが判明した。
【０２４１】
以上に述べた本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質について、先に報告されている６−グルコシル転移作用を有する酵素、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５６巻、第１６９乃至１７３頁（１９９２年）に記載のデキストリン・デキストラナーゼおよび『日本農芸化学会誌』、第３７巻、第６６８乃至６７２頁（１９６３年）に記載のトランスグルコシダーゼと比較した。その結果を表２９にまとめた。
【０２４２】
【表２９】
0004919199.tif 000034
【０２４３】
表２９から明らかなように、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、既知のデキストリン・デキストラナーゼやトランスグルコシダーゼとは全く異なる新規な理化学的性質を有することが判明した。
【０２４４】
＜実験２５：環状四糖の生成＞
各種糖質を用いて、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の作用による環状四糖生成試験を行った。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製）またはグリコーゲン（カキ由来、和光純薬株式会社販売）の溶液を調製した。
【０２４５】
これらの水溶液（濃度０．５％）に、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位とを加え、これらを３０℃、ｐＨ６．０で作用させた。作用条件は、以下の４つの系で行った。
（１）  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、α−イソマルトシル転移酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（２）  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを同時に２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（３）  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（４）  α−イソマルトシル転移酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
【０２４６】
これら熱失活させた反応液中の環状四糖の生成量を調べるために、実験１と同様のα−グルコシダーゼ・グルコアミラーゼ処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表３０に示す。
【０２４７】
【表３０】
0004919199.tif 000035
【０２４８】
表３０の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質も、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみの作用およびα−イソマルトシル転移酵素のみの作用では、環状四糖は全く生成しなかったのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を併用することにより環状四糖が生成した。その生成量は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後にα−イソマルトシル転移酵素を作用させた場合には、約１１％以下と比較的に低いのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを同時に作用させると、いずれの糖質でも環状四糖の生成量は向上し、特に、グリコーゲンでは約８７％に増加し、澱粉部分分解物では約６４％に増加することが判明した。
【０２４９】
このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との併用における環状四糖の生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推察される。
（１）  本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、グリコーゲンや澱粉部分分解物などのα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基に作用し、そのグルコース残基を他のα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（２）  α−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（３）  続いて、α−イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基をα−１，４グルカン鎖から切り離し、環状化して環状四糖が生成する。
（４）  切り離されたα−１，４グルカン鎖は、再度、（１）から（３）の反応を受けることによって、更に、環状四糖が生成する。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との併用で、上記のように両酵素が繰り返し作用し、環状四糖の生成量が増加すると推察された。
【０２５０】
＜実験２６：澱粉液化程度の影響＞
とうもろこし澱粉を濃度１５％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』（ノボ社製）を澱粉１グラム当り０．２乃至２．０％を加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃で２０分間オートクレーブし、約３５℃に急冷して、ＤＥ３．２乃至２０．５の液化溶液を得、これに、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり２単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り２０単位を加え、３５℃で２４時間反応させた。１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表３１に示す。
【０２５１】
【表３１】
0004919199.tif 000036
【０２５２】
表３１の結果から明らかなように、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とによる環状四糖の生成は、澱粉の液化の程度で影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、ＤＥが低値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率は高く、逆に、液化の程度が高いほど、即ち、ＤＥが高値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率が低いことが判明した。具体的には、澱粉の部分分解の程度は約２０以下、望ましくは、ＤＥ約１２以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。
【０２５３】
＜実験２７：澱粉部分分解物濃度の影響＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（ＤＥ約２乃至５）の最終濃度０．５乃至４０％の水溶液を調製し、それぞれに、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位を加え、両酵素を併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表３２に示す。
【０２５４】
【表３２】
0004919199.tif 000037
【０２５５】
表３２の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が０．５％の低濃度では、環状四糖の生成量は約６４％であるのに対し、濃度４０％の高濃度では、環状四糖の生成量は約４０％と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存して環状四糖の生成量が変化することが判明した。この結果から、環状四糖の生成量は、澱粉部分分解物が低濃度であるほど高まる傾向にあることが判明した。
【０２５６】
＜実験２８：シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ添加効果＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（濃度１５％）を調製し、実験７−２の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たＣ１１株由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位と、バチルス  ステアロサーモフィルス由来シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を固形物１グラム当り０乃至０．５単位加え、両酵素を併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表３３に示す。
【０２５７】
【表３３】
0004919199.tif 000038
【０２５８】
表３３の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅを添加することによって、環状四糖の生成量が増加することが判明した。
【０２５９】
＜実験２９：環状四糖の調製＞
トウモロコシ由来フィトグリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約１００Ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位加え、４８時間作用させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この反応液の一部を採り、ＨＰＬＣで環状四糖生成量を調べたところ、糖組成として約８４％であった。この反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖などを加水分解し、さらに、水酸化ナトリウムでｐＨを５．８に調整し温度９０℃で１時間保持して、酵素を失活させ、不溶物を濾過して除去した。この濾液を、逆浸透膜を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法に従って脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約３，７００ｇを含む糖液約６．２ｋｇを得た。
【０２６０】
得られた糖液を、オルガノ製イオン交換樹脂『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ型）』を充填したカラム（ゲル量約２２５Ｌ）に供し、カラム温度６０℃で流速約４５Ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行なった。溶出液の糖組成を実験１に記載のＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖の純度が９８％以上の画分を回収し、常法に従って脱塩、脱色、濾過、濃縮したところ、固形分約２，５００ｇを含む糖液約７．５ｋｇを得た。得られた糖液の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は約９９．５％であった。
【０２６１】
＜実験３０：環状四糖の水溶液からの結晶化＞
実験２９の方法で得られた純度約９８％以上の環状四糖画分をエバポレーターで固形物濃度約５０％に濃縮した後、この濃縮糖液約５ｋｇを円筒状のプラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約２０時間で温度を６５℃から２０℃まで降下させることにより晶析させたところ、白色の結晶状粉末が得られた。その顕微鏡写真の一例を第４５図に示す。続いて、遠心濾過器を用いて分蜜し結晶状物を湿重量として１，３６０ｇを回収した。さらに、６０℃で３時間乾燥して環状四糖結晶状粉末を１，１７０ｇ得た。得られた結晶粉末の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は９９．９％以上と極めて高純度であった。
【０２６２】
この環状四糖の結晶状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、第４６図に示すように、主な回折角（２θ）として１０．１°、１５．２°、２０．３°および２５．５°を特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、水分は１３．０％であることがわかり、環状四糖１分子当たり５乃至６分子の水を含む結晶であることが判明した。
【０２６３】
さらに、この環状四糖の結晶粉末を熱重量測定したところ、第４７図に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度１５０℃までの上昇で４乃至５分子の水に相当する重量減少が認められ、続いて、温度２５０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度２８０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶は、常圧において、温度を１５０℃まで上昇させることにより結晶分子当たり４乃至５分子の水が離脱して１分子の水を含む結晶になり、さらに温度２５０℃までに１分子の水が結晶から離脱して無水結晶になることが判明した。
【０２６４】
＜実験３１：環状四糖１含水結晶への変換＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶粉末をガラス容器に入れ、予め温度１４０℃に保温したオイルバス中にそのガラス容器を３０分間保持した。得られた環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、熱処理前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折とは全く異なり、第４８図に示すように、主な回折角（２θ）として、８．３°、１６．６°、１７．０°および１８．２°を特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、水分が約２．７％であることがわかり、環状四糖１分子当たり１分子の水を含むことが判明した。さらに、この結晶粉末を熱重量測定したところ、第４９図に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度２７０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度２９０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、本発明の環状四糖結晶状物は１含水結晶であることが判明した。
【０２６５】
＜実験３２：無水結晶への変換＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶粉末を温度４０℃乃至１２０℃でそれぞれ１６時間真空乾燥した。得られた環状四糖粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、真空乾燥温度４０℃の場合は水分が約４．２％であり、真空乾燥温度１２０℃の場合は水分が約０．２％で、実質的に無水であることが判明した。これら真空乾燥した環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、真空乾燥前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折および１含水結晶のものとは全く異なり、第５０図（真空乾燥温度４０℃）、第５１図（真空乾燥温度１２０℃）に示すように、主な回折角（２θ）として、１０．８°、１４．７°、１５．０°、１５．７°および２１．５°を特徴とする回折スペクトルが得られた。両回折スペクトル間でのピーク強度の強弱は認められるものの、基本的にピークの回折角度は同一で、結晶学的に同一無水結晶と推察された。また、回折スペクトルのベースラインは山状を呈し、真空乾燥前の環状四糖５乃至６含水結晶のものおよび１含水結晶のものと比べ結晶化度が低下しており、非結晶状態（アモルファス）の環状四糖が存在していることが判明した。このことから、真空乾燥４０℃の場合の水分を約４．２％含む環状四糖粉末は、その水分を含む環状四糖アモルファスと、環状四糖無水結晶とが混在する粉末と推察された。以上のことから、環状四糖５乃至６含水結晶粉末を真空乾燥することにより、５乃至６含水結晶は水分子を失い、非結晶状態のアモルファスと無水結晶に変換することがわかった。なお、水分０．２％の無水環状四糖粉末について、実験３１と同様に熱重量分析したところ、第５２図に示すように、温度２７０℃付近から環状四糖の熱分解と考えられる重量減少のみが観察された。
【０２６６】
＜実験３３：環状四糖の水に対する飽和濃度＞
温度１０乃至９０℃での水に対する環状四糖の飽和濃度を調べるため、密栓付きガラス製容器に水１０ｍｌを入れ、それに実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を、各温度で完全に溶解する量以上の量を加えた後、ガラス容器を密封し、飽和に達するまで温度１０乃至９０℃で保温しながら２日間攪拌した。それぞれの温度の環状四糖飽和溶液を精密濾過して溶けていない環状四糖を除いた後、その濾液の水分を乾燥減量法で調べ、各温度での飽和濃度を求めた。結果を表３４に示す。
【０２６７】
【表３４】
0004919199.tif 000039
【０２６８】
＜実験３４：熱安定性＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を水に溶解し濃度１０ｗ／ｖ％の環状四糖水溶液を調製し、その溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果は表３５に示す。
【０２６９】
【表３５】
0004919199.tif 000040
【０２７０】
表３５の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は１２０℃の高温加熱でも着色はなく、糖組成の純度の低下もなく、環状四糖は熱に対して安定な糖質であることが判明した。
【０２７１】
＜実験３５：ｐＨ安定性＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を各種の緩衝液（２０ｍＭ）に溶解し、環状四糖を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨを２乃至１０に調整した環状四糖溶液を調製した。それぞれの溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で２４時間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果は表３６に示す。
【０２７２】
【表３６】
0004919199.tif 000041
【０２７３】
表３６の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は１００℃の高温で２４時間加熱しても、ｐＨ２乃至１０の広範囲で着色はなく、ｐＨ２において糖組成の純度は僅かに低下するものの、ｐＨ３乃至１０の範囲では全く糖組成の純度は低下せず、環状四糖は広いｐＨ範囲、換言すれば、ｐＨ３乃至５の酸性側、ｐＨ６乃至８の中性側、ｐＨ９乃至１０のアルカリ側で煮沸しても極めて安定な糖質であることが判明した。
【０２７４】
＜実験３６：アミノカルボニル反応＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を水に溶解し、さらに、それに市販試薬特級のグリシンとリン酸緩衝液を加え、５０ｍＭリン酸緩衝液でｐＨ７．０に調整した１ｗ／ｖ％グリシンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果を表３７に示す。
【０２７５】
【表３７】
0004919199.tif 000042
【０２７６】
表３７の結果から明らかなように、環状四糖は、グリシン共存下で加熱しても着色はなく、グリシンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、アミノカルボニル反応（メイラード反応とも言う）を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０２７７】
＜実験３７：アミノカルボニル反応＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶と市販ポリペプトン（日本製薬製）とを脱イオン水に溶かし、５ｗ／ｖ％ポリペプトンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。同時に、ポリペプトンのみを含む溶液をブランクとして同様に加熱した。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度からブランクの吸光度を差し引いた値に基づいて評価した。結果を表３８に示す。
【０２７８】
【表３８】
0004919199.tif 000043
【０２７９】
表３８の結果から明らかなように、環状四糖は、ポリペプトン共存下で加熱して、ポリペプトンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、アミノカルボニル反応を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０２８０】
＜実験３８：包接作用＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を脱イオン水に溶かし、２０％水溶液を調製した。その水溶液１００ｇ当たり、メタノールは２ｇ、エタノールは３ｇ、酢酸は４．６ｇを加えて包接を行なった。その後、それぞれを濾過し濾液を凍結乾燥し、未包接物を除去した。対照として、包接能を有することが知られている分枝シクロデキストリン（商品名『イソエリートＰ』、マルハ株式会社販売）を用いて同様に行なった。
【０２８１】
凍結乾燥粉末中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥粉末１ｇを５ｍｌの水に溶かし、それに５ｍｌのジエチルエーテルを加えて抽出を行ない、再度、抽出を繰り返した後、ジエチルエーテル中の抽出物をガスクロマトグラフィー法で定量した。結果を表３９に示す。
【０２８２】
【表３９】
0004919199.tif 000044
【０２８３】
表３９の結果から明らかなように、環状四糖は包接能を有しており、その包接能は、分枝サイクロデキストリンと比べ、重量当たり約２倍も高いことが判明した。
【０２８４】
＜実験３９：甘味度＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を脱イオン水に溶かして、固形物濃度１０乃至３０％の水溶液とし、これらの水溶液を甘味度試験溶液とした。一方、蔗糖（市販グラニュー糖）６％水溶液を基準として、パネラー８名で官能試験を行なった。その結果、環状四糖の甘味度は、蔗糖の約２７％であった。
【０２８５】
＜実験４０：消化性試験＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『日本栄養食糧学会誌』、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０年）に記載の岡田等の方法に準じて、試験管内での唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼ、小腸粘膜酵素による環状四糖の消化性を調べた。対照として、難消化性糖質として知られているマルチトールを用いて行なった。結果を表４０に示す。
【０２８６】
【表４０】
0004919199.tif 000045
【０２８７】
表４０の結果から明らかなように、環状四糖は、唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼで全く消化されず、小腸粘膜酵素によって僅かに消化されたが、その程度は０．７４％と低値であり、対照の難消化性糖質マルチトールの値と比較すると１／５以下であり、環状四糖が極めて消化されにくい糖質であることが判明した。
【０２８８】
＜実験４１：醗酵性試験＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・サイエンス・アンド・ビタミノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ）』、第３７巻、５２９乃至５４４頁（１９９１年）に記載のＯｋｕ等の方法に準じて、ラット盲腸内容物による環状四糖の発酵性を調べた。盲腸内容物は、ウィスター系雄ラットをエーテル麻酔下で屠殺し嫌気的に採取し、４倍量の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に懸濁したものを用いた。環状四糖は盲腸内容物重量当たり約７％を添加し、添加直後および１２時間後に残存する環状四糖量はガスクロマトグラフィー法で定量した。その結果、添加直後の環状四糖濃度は盲腸内容物ｇ当たり６８．０ｍｇ、１２時間後の環状四糖濃度は盲腸内容物ｇ当たり６３．０ｍｇであり、９３％が醗酵されず残存していることがわかり、環状四糖は極めて醗酵されにくい糖質であることが判明した。
【０２８９】
＜実験４２：資化性試験＞
実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『腸内フローラと食物因子』、光岡知足編、学会出版センター（１９８４年）に記載の方法に準じて、各種腸内細菌の資化性を調べた。即ち、予め培養しておいた新鮮な菌を、環状四糖を０．５％添加したＰＹＦ培地５ｍｌに約１０７ＣＦＵ接種し、嫌気条件下で３７℃、４日間培養した。対照として、資化されやすい糖質グルコースを用いて行なった。資化性の判定は、培養後の培養液のｐＨが、６．０以上の場合、資化されない（−）とし、６．０未満の場合、資化される（＋）とした。さらに、培養液中に残存する糖質をアンスロン法で測定し糖質の減少量を調べ、資化性の判定を確認した。結果を表４１に示す。
【０２９０】
【表４１】
0004919199.tif 000046
【０２９１】
表４１の結果から明らかなように、環状四糖は、試験した腸内細菌株のいずれにも資化されなく、対照のグルコースはいずれにも資化されることがわかり、環状四糖が腸内細菌に極めて資化されにくい糖質であることが判明した。
【０２９２】
＜実験４３：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験３０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を経口投与して急性毒性試験を行なった。その結果、環状四糖は低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。従って、正確な値とはいえないが、そのＬＤ５０値は、５０ｇ／ｋｇマウス体重以上であった。
【０２９３】
以上の実験４０乃至４３の結果から、環状四糖は、経口摂取しても、消化、吸収されにくく、無カロリー乃至低カロリーの可食素材として、ダイエット甘味料、高甘味度甘味料の賦形剤、ダイエット飲食物の増粘剤、増量剤、賦形剤、更には、食物繊維、脂肪代替食品材料などとしての利用が期待できる。
【０２９４】
以下、本発明の環状四糖、それを含む糖質の製造方法を実施例１乃至１０で、環状四糖、それを含む糖質を含有せしめた組成物を実施例１１乃至３１で示す。
【実施例１】
【０２９５】
バチルス  グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を実験３の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を８．８単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を２６．７単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１Ｌを回収した。
【０２９６】
馬鈴薯澱粉乳を濃度約２％澱粉乳とし、これに最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、９５℃に約２０分間加熱して糊化を行い、次いで約３５℃に冷却し、これに前記方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に、濃縮し、噴霧乾燥して、環状四糖含有粉末を原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。
【０２９７】
本品は、固形物当たり、グルコース０．７％、イソマルトース１．４％、マルトース１１．１％、環状四糖６２．１％、およびその他の糖質を２４．７％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例２】
【０２９８】
馬鈴薯澱粉を濃度約６％澱粉乳とし、これに濃度０．１％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％になるように加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例１の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。
【０２９９】
本品は、固形物当たり、グルコース０．９％、イソマルトース１．５％、マルトース１１．３％、環状四糖６０．１％、およびその他の糖質を２６．２％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例３】
【０３００】
バチルス  グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）を実験６の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を９．０単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を３０．２単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１Ｌを回収した。タピオカ澱粉を濃度約２５％澱粉乳とし、これにα−アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％加え、８５乃至９０℃で約２０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに上記の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ  Ｌ「アマノ」』、天野製薬株式会社製）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９６℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。
【０３０１】
本シラップは、固形物当り、グルコース３８．４％、環状四糖５８．１％、その他の糖質を３．５％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【０３０２】
とうもろこし澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例３の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ  Ｌ「アマノ』、天野製薬株式会社製造）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。
【０３０３】
本シラップは、固形物当り、グルコース３４．２％、環状四糖６２．７％、その他の糖質を３．１％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【０３０４】
実施例３の方法で得られた環状四糖含有シラップを、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ形）』、オルガノ株式会社製）を用いたカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、環状四糖高含有液を原料澱粉固形物当たり収率約２１％で得た。本高含有液は、固形物当たり約９８％の環状四糖を含有していた。
【０３０５】
本溶液を濃度約７０％に濃縮した後、助晶缶にとり、種晶として環状四糖５乃至６含水結晶約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマスキットを得た。本マスキットを乾燥搭上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ２の高圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥搭の上部より送風し、底部に設けた移送用金網コンベア上に結晶粉末を捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥搭外に徐々に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成搭に充填して温風を送りつつ、１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、環状四糖５乃至６含水結晶粉末を得た。
【０３０６】
本品は、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例６】
【０３０７】
実施例４の方法で得られた環状四糖含有シラップを原糖液とし、環状四糖の含量を高めるため、実施例５の方法に準じて塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なって、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、環状四糖高含有液を原料澱粉固形物当たり収率約６０％で得た。本高含有液は、固形物当たり約９０％の環状四糖を含有していた。
【０３０８】
本溶液を濃度約８５％に濃縮して助晶機にとり、攪拌しつつ徐冷して助晶し、これをプラスチック製バットに取り出し、室温で２日間放置し、晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕して環状四糖５乃至６含水結晶粉末を得た。
【０３０９】
本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例７】
【０３１０】
実施例６の方法で得られた環状四糖高含有液を、濃縮しながら連続晶析させ、得られるマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少量の水スプレーし洗浄して高純度の環状四糖５乃至６含水結晶を固形物当たり約５５％の収率で得た。
【０３１１】
本品は、固形物当り９８％以上の高純度環状四糖５乃至６含水結晶であって、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物、更には、工業試薬、化学原料などにも有利に利用できる。
【実施例８】
【０３１２】
トウモロコシ由来フィトグリコーゲン５．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、容量３０Ｌのファーメンターに約２０Ｌ入れて、１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して温度２７℃とした後、実験６の方法に準じて種培養したバチルス  グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）の種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至７．０に保ちつつ、７２時間通気攪拌培養した。その培養液を１２１℃、２０分間加熱殺菌した後、冷却し、遠心分離し、その上清を回収し、更に、その上清をＵＦ膜濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形およびＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩して精製して、環状四糖含有液を原料フィトグリコーゲン固形物当たり収率約４０％で得た。本含有液は、固形物当たり約８７％の環状四糖を含有していた。
【０３１３】
本環状四糖含有液を、濃縮しながら連続晶析させ、得られるマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少量の水スプレーし洗浄して純度９８％以上の高純度環状四糖５乃至６含水結晶を原料フィトグリコーゲン固形物当たり収率約２５％で得た。
【０３１４】
本品は、高純度の環状四糖５乃至６含水結晶であって、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物、更には、工業試薬、化学原料などにも有利に利用できる。
【実施例９】
【０３１５】
バチルス  グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１）を実験１０の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を６．０単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を２０．０単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約８００ｍｌを回収した。とうもろこし澱粉を濃度約３０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約５１℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに上記の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．４ｍｌの割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り３単位になるように加え、ｐＨ５．５、温度５１℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ Ｌ「アマノ」』、天野製薬株式会社製）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり２０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ形およびＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、環状四糖を固形物当り４４．０％含有するシラップを得た。得られた環状四糖含有シラップを原糖液とし、環状四糖の含量を高めるため、実施例５の方法に準じて塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なって、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、濃縮し、噴霧乾燥して、環状四糖含有粉末を原料澱粉固形物当たり収率約４５％で得た。
【０３１６】
本品は、固形物当たり、グルコース３．７％、環状四糖８０．５％、およびその他の糖質を１５．８％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１０】
【０３１７】
アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）を実験１４の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を１５．２単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を２３．０単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１Ｌを回収した。
【０３１８】
馬鈴薯澱粉を濃度約５％澱粉乳とし、これに濃度０．１％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％になるように加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに上記の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り０．５ｍｌの割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度７０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。
【０３１９】
本品は、固形物当たり、グルコース２．５％、イソマルトース６．３％、環状四糖３０．１％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１１】
【０３２０】
＜甘味料＞
実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶０．８重量部に、トレハロース含水結晶（株式会社林原商事販売、登録商標『トレハ』）０．２重量部、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名『αＧスイート』）０．０１重量部、およびＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（商品名『アスパルテーム』）０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成形機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有している。本品のカロリーは、環状四糖５乃至６含水結晶が難消化性、難発酵性で実質的に無カロリーであることから、甘味度当たり蔗糖の約１０分の１である。しかも、本品は、室温保存下、変質劣化の懸念が無く、安定である。従って、本品は、高品質の低カロリー、低う蝕性甘味料として好適である。
【実施例１２】
【０３２１】
＜ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００重量部に実施例２の方法で得た環状四糖含有シラップ５０重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸０．６重量部および適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成形し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出も起こさず、吸湿性少なく、ダレも起こさない安定で高品質のハードキャンディーである。
【実施例１３】
【０３２２】
＜チューインガム＞
ガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに無水結晶マルチトール２重量部、キシリトール２重量部、実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶２重量部、およびトレハロース含水結晶１重量部を加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、呈味、風味良好で、低う蝕性、低カロリーのチューインガムとして好適である。
【実施例１４】
【０３２３】
＜加糖練乳＞
原乳１００重量部に実施例５の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末２重量部および蔗糖２重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で風味も良く、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【実施例１５】
【０３２４】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５重量部、実施例４の方法で得た環状四糖含有シラップ１３０重量部およびラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）５０重量部を水１，１５０重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、オリゴ糖、環状四糖を含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を有する乳酸菌飲料として好適である。
【実施例１６】
【０３２５】
＜粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末５０重量部、無水結晶マルチトール１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ酸０．１重量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２重量部、クエン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部および粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例５の方法で得た環状四糖高含有濃縮液をバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。又、本品は、異味、異臭がなく、高品質で、低カロリーのジュースとして商品価値の高いものである。
【実施例１７】
【０３２６】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００重量部、実施例２の方法で得た環状四糖含有シラップ１００重量部、トレハロース含水結晶６０重量部、蔗糖４０重量部、および食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２８０重量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１，０００重量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で、澱粉の老化も抑制され、高品質のカスタードクリームである。
【実施例１８】
【０３２７】
＜チョコレート＞
カカオペースト４０重量部、カカオバター１０重量部および実験２４の方法に準じて得た環状四糖１含水結晶５０重量部を混合してレファイナーに通して粒度を下げた後、コンチェに入れて５０℃で２昼夜練り上げた。この間にレシチン０．５重量部を添加して充分に分散させた。次いで、温度調節機で３１℃に調節し、バターの固まる直前に型に流し込み、泡抜きし、１０℃の冷却トンネルを通過させて固化させた。これを型抜きして包装し、製品を得た。本品は、吸湿性がなく、色、光沢共に良く、内部組織も良好であり、口中でなめらかに溶け、上品な甘味とまろやかな風味を有する。又、本品は、低う蝕性、低カロリーのチョコレートとして有用である。
【実施例１９】
【０３２８】
＜ういろうの素＞
米粉９０重量部に、コーンスターチ２０重量部、無水結晶マルチトール７０重量部、実施例１の方法で得た環状四糖含有粉末５０重量部、およびプルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風味も良い。又、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良く、低カロリーのういろうとしても好適である。
【実施例２０】
【０３２９】
＜あん＞
原料あずき１０重量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重量部を得た。この生あんに蔗糖１４重量部、実施例３の方法で得た環状四糖含有シラップ５重量部および水４重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えてつぶあんを壊さないように練り上げ、製品のあんを約３５重量部得た。本品は、色焼け、離水もなく安定で、舌触り、風味良好で、あんパン、まんじゅう、団子、最中、氷菓などの製菓材料として好適である。
【実施例２１】
【０３３０】
＜パン＞
小麦粉１００重量部、イースト２重量部、蔗糖５重量部、実施例１の方法で得た環状四糖含有粉末１重量部および無機フード０．１重量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成、焼き上げた。本品は、色相、すだちとも良好で、適度な弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【実施例２２】
【０３３１】
＜ハム＞
豚もも肉１，０００重量部に食塩１５重量部および硝酸カリウム３重量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例５の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末４０重量部および香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、薫煙し、クッキングし、冷却、包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。
【実施例２３】
【０３３２】
＜粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１重量部に、実施例６の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末２重量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための難消化性の食物繊維、整腸材料としても有用である。
【実施例２４】
【０３３３】
＜粉末卵黄＞
生卵から調製した卵黄をプレート式加熱殺菌機で６０乃至６４℃で殺菌し、得られる液状卵黄１重量部に対して、実験２５の方法に準じて得た環状四糖無水結晶含有粉末４重量部の割合で混合した後、バットに移し、一夜放置して、環状四糖５乃至６含水結晶に変換させてブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、粉末卵黄を得た。
【０３３４】
本品は、プレミックス、冷菓、焼菓子、乳化剤などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず経口流動食、経管流動食のための難消化の性食物繊維、整腸材料としても有用である。又、美肌剤、育毛剤などとしても有利に利用できる。
【実施例２５】
【０３３５】
＜浴用剤＞
ユズの皮ジュース１重量部に対して、実験２５の方法に準じて得た環状四糖無水結晶含有粉末１０重量部の割合で混合し、環状四糖５乃至６含水結晶を晶出、熟成させた後、粉末化して、ユズの皮エキス含有環状四糖５乃至６含水結晶粉末を得た。
【０３３６】
本粉末５重量部に、焼塩９０重量部、トレハロース含水結晶２重量部、無水ケイ酸１重量部およびα−グルコシル  ヘスペリジン（株式会社林原販売、商品名αＧヘスペリジン）０．５重量部を混合して浴用剤を製造した。
【０３３７】
本品は、ユズの香りも豊かで、入浴用の湯に１００乃至１０，０００倍に希釈して利用すればよく、入浴後は、肌がしっとりしなめらかで、湯冷めしない高品質の浴用剤である。
【実施例２６】
【０３３８】
＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例８の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末２重量部、α−グルコシル  ルチン（株式会社林原販売、商品名αＧルチン）１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリン１０重量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部および精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例２７】
【０３３９】
＜練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５重量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量部、グリセリン２５重量部、ポオキシエチレンソルビタンラウレート０．５重量部、実施例２の方法で得た環状四糖含有シラップ１５重量部、サッカリン０．０２重量部および防腐剤０．０５重量部を水１３重量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。
【実施例２８】
【０３４０】
＜流動食用固体製剤＞
実施例６の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末１００重量部、トレハロース含水結晶２００重量部、マルトテトラオース高含有粉末２００重量部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部およびニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。
【０３４１】
本品は、環状四糖により難消化性の食物繊維を強化し、整腸作用に優れた流動食である。１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して流動食とし、経口的、または鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【実施例２９】
【０３４２】
＜錠剤＞
アスピリン５０重量部に実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末１４重量部、コーンスターチ４重量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。
【０３４３】
本品は、環状四糖の賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。
【実施例３０】
【０３４４】
＜糖衣錠＞
重量１５０ｍｇの素錠を芯剤とし、これに実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末４０重量部、プルラン（平均分子量２０万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部および酸化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じ環状四糖５乃至６含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部および水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艶出しして光沢のある外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間維持する。
【実施例３１】
【０３４５】
＜外傷治療用膏薬＞
実施例７の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶粉末１００重量部およびマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、環状四糖によりヨウ素、メタノールの揮散を防止し、経時変化が少ない商品価値の高い膏薬である。
【０３４６】
また、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【産業上の利用可能性】
【０３４７】
以上説明したように、本発明は、新規なα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とその製造方法並びに用途に関し、詳細には、新規なα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とこの酵素を製造する方法、この酵素を産生する微生物、この酵素を用いたα−グルコシル転移方法、α−イソマルトシルグルコ糖質の生成方法、加えて、この酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを併用したサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖の製造方法、並びにこれら糖質を含有せしめた組成物に関する。本発明によれば、産業上有用なサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖、これを含む糖質および組成物を、工業的に安価かつ大量に製造することが可能となった。斯かる環状四糖またはこれを含む糖質は、実質的に非還元性乃至低還元性で、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。本発明は斯くも顕著な作用効果を有する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。
【配列表】
【０３４８】
SEQUENCE LISTING
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
<120> α−Isomaltosylglucosaccharide−forming enzyme, process and uses of the same
<130> WO854
<150> 233,364/00
<151> 2000-8-1
<150> 234,937/00
<151> 2000-8-2
<160> 19
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 1
Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile
1               5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 2
Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Asn Gly
1               5                  10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 3
Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly
1               5                  10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 4
Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro
1               5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 5
Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr
1               5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 6
Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe
1               5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 7
Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe
1               5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 8
Gly Asn Glu Met Arg Asn Gln Tyr
1               5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 9
Ile Thr Thr Trp Pro Ile Glu Ser
1               5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 10
Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser
1               5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 11
His Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu Leu
1               5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 12
Asp Phe Ser Asn Asn Pro Thr Val
1               5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 13
Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala
1               5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 14
Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu
1               5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 15
Asn Trp Trp Met Ser Lys
1               5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 16
Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp
1               5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Bacillus globisporus
<400> 17
Asn Ile Tyr Leu Pro Gln Gly Asp
1               5
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> Arthrobacter globiformis
<400> 18
Ala Pro Leu Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly
1               5                  10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Arthrobacter ramosus
<400> 19
Asp Thr Leu Ser Gly Val Phe His Gly Pro
1               5                  10
【図面の簡単な説明】
【０３４９】
第１図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた糖質を高速液体クロマトグラフィーにかけたときの溶出パターンを示す図である。
第２図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
第３図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
第４図は、環状四糖の構造が、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝であることを示す図である。
第５図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第６図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第７図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第８図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第９図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第１０図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第１１図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第１２図は、バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第１３図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第１４図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第１５図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第１６図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第１７図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第１８図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第１９図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第２０図は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第２１図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第２２図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第２３図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第２４図は、本発明のバチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第２５図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第２６図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第２７図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第２８図は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第２９図は、本発明のアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第３０図は、本発明のアルスロバクター グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第３１図は、本発明のアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第３２図は、本発明のアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第３３図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第３４図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第３５図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第３６図は、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第３７図は、アルスロバクター  ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第３８図は、アルスロバクター  ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第３９図は、アルスロバクター  ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
第４０図は、アルスロバクター  ラモサスＳ１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第４１図は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４２図は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４３図は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４４図は、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４５図は、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶の顕微鏡写真をディスプレー上に表示した中間調画像である。
第４６図は、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
第４７図は、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶状粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
第４８図は、本発明の環状四糖１含水結晶粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
第４９図は、本発明の環状四糖１含水結晶粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
第５０図は、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶粉末を４０℃で真空乾燥して得られる環状四糖無水結晶粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
第５１図は、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶粉末を１２０℃で真空乾燥して得られる環状四糖無水結晶粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
第５２図は、本発明の無水環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。

【図１】
0004919199.tif 000047
【図２】
0004919199.tif 000048
【図３】
0004919199.tif 000049
【図４】
0004919199.tif 000050
【図５】
0004919199.tif 000051
【図６】
0004919199.tif 000052
【図７】
0004919199.tif 000053
【図８】
0004919199.tif 000054
【図９】
0004919199.tif 000055
【図１０】
0004919199.tif 000056
【図１１】
0004919199.tif 000057
【図１２】
0004919199.tif 000058
【図１３】
0004919199.tif 000059
【図１４】
0004919199.tif 000060
【図１５】
0004919199.tif 000061
【図１６】
0004919199.tif 000062
【図１７】
0004919199.tif 000063
【図１８】
0004919199.tif 000064
【図１９】
0004919199.tif 000065
【図２０】
0004919199.tif 000066
【図２１】
0004919199.tif 000067
【図２２】
0004919199.tif 000068
【図２３】
0004919199.tif 000069
【図２４】
0004919199.tif 000070
【図２５】
0004919199.tif 000071
【図２６】
0004919199.tif 000072
【図２７】
0004919199.tif 000073
【図２８】
0004919199.tif 000074
【図２９】
0004919199.tif 000075
【図３０】
0004919199.tif 000076
【図３１】
0004919199.tif 000077
【図３２】
0004919199.tif 000078
【図３３】
0004919199.tif 000079
【図３４】
0004919199.tif 000080
【図３５】
0004919199.tif 000081
【図３６】
0004919199.tif 000082
【図３７】
0004919199.tif 000083
【図３８】
0004919199.tif 000084
【図３９】
0004919199.tif 000085
【図４０】
0004919199.tif 000086
【図４１】
0004919199.tif 000087
【図４２】
0004919199.tif 000088
【図４３】
0004919199.tif 000089
【図４４】
0004919199.tif 000090
【図４５】
0004919199.tif 000091
【図４６】
0004919199.tif 000092
【図４７】
0004919199.tif 000093
【図４８】
0004919199.tif 000094
【図４９】
0004919199.tif 000095
【図５０】
0004919199.tif 000096
【図５１】
0004919199.tif 000097
【図５２】
0004919199.tif 000098