(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィーダー細胞を本質的に含まない組成物であって、
（１）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）及びラミニンから選択されるマトリクッス上に播種された増殖中のヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、および
（２）ｂＦＧＦを含有する培地であって、ヒト包皮繊維芽細胞及びヒト胚性繊維芽細胞から選択されるヒト細胞を含む細胞培養物から馴化された培地、
を含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（技術分野）
本発明は、胚細胞の細胞生物学の分野に一般的に関与する。より詳細には、本発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖、増殖を促進する培養条件、ならびに遺伝的改変、ｃＤＮＡライブラリーの産生、および組織再生を目的とする分化した細胞の産生のための使用に関与する。
【０００２】
（関連申請書の参考）
本願は、以下の係属中の米国特許出願（ＵＳＳＮ６０／１７５，５８１，２０００年１月１１日提出；ＵＳＳＮ６０／２１３，７４０、２０００年６月２２日提出；ＵＳＳＮ６０／２１３，７３９、２０００年６月２２日提出；ＵＳＳＮ６０／２１６，３８７、２０００年７月７日提出；ＵＳＳＮ６０／２２０，０６４、２０００年７月２１日提出；および０９／６８８／０３１、２０００年１０月１０日提出）に対して優先権を主張する。
【０００３】
米国における手続き上の目的に対して、これらの優先権出願は、本明細書中によって、それら全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００４】
【従来の技術】
（背景）
最近の発見は、幹細胞が、疾患、感染の過程で、または先天性異常のために損傷した細胞および組織の置換源であり得るという期待を生じた。推定される幹細胞の種々の型は、それらが分裂する場合に、分化して、心臓、肝臓、または脳のような特定の組織の独特の機能を実行し得る細胞へ成熟する。特に重要な開示は、ほとんどいずれの細胞型へ分化する能力を有すると考えられる、多能性幹細胞の発生である。
【０００５】
多能性幹細胞の初期の研究は、マウスにおいて実施された（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：１７３，１９９７；およびＰｅｄｅｒｓｅｎ，Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５４３，１９９４に総説される）。マウス幹細胞は、早期胚細胞および胚組織の両方から単離され得る。多能性幹細胞の所望される特徴は、それらが、未分化状態におけるインビトロでの不明確な増殖を可能にし、正常な核型を保持し、そしてすべての三つの胚性胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の派生物に分化する能力を保持することである。
【０００６】
ヒト多能性幹細胞の調製の開発は、多くの技術的な困難を克服する工程を含み、マウス細胞における研究に比べてほとんど進歩していない。
【０００７】
Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号；  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４，１９９５）は、初めて霊長類から多能性幹細胞を首尾よく単離し、そして増殖させた。彼らは、それに続いてヒト胚盤胞からヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株を誘導した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，１９９８）。Ｇｅａｒｈａｒｔおよび共同研究者らは、胎児性腺組織からヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８；および米国特許第６，０９０，６２２号）。
【０００８】
ｈＥＳ細胞およびｈＥＧ細胞の両方が、長い期間探求された以下の多能性胚細胞の特徴を有することが報告された：それらが、分化することなくインビトロにおいて長期増殖し得ること、それらが、通常の核質を有すること、そしてそれらが、多くの異なる細胞型を産生し得るままであること。このことによって、これらは、遺伝的な異常、外傷または疾患状態によって損なわれたほとんどすべての組織の再生のための貯蔵器として作用する、ヒトの治療における使用に関してかなりの見込みを保有する。
【０００９】
治療のための多能性幹細胞の使用への重要な問題は、多能性幹細胞が、分化を防ぐためにフィーダー細胞の層の上に伝統的に培養されることである（米国特許第５，８４３，７８０号；米国特許第６，０９０，６２２号）。培養環境においてフィーダー細胞が存在しないとき、ｈＰＳ細胞は、まもなく死ぬか、または約束される細胞の異種の集団に分化する。白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、マウスＰＳ細胞の分化を阻害するが、これは、ヒトＰＳ細胞の分化の防止において、フィーダー細胞の役割を置き換えるのではない。不幸にも、フィーダー細胞の使用は、生産コスト、損傷、スケールアップを増加させ、そして多能性幹細胞をフィーダー細胞成分から分離させることを必要とする、混合した細胞集団を産生させる。
【００１０】
別の問題は、幹細胞の各々の患者の処置に必要な特定の型の組織への分化を制御することである。分化の過程のよりよい理解が、多能性幹細胞の増殖および分化の間の遺伝子発現を観察することによって獲得されるということが本発明の仮説である。
【００１１】
国際特許公開ＷＯ９９／２０７４１（Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｔｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓという表題である。低浸透圧および低エンドトキシンレベルである、実質的に未分化状態である霊長類由来の始原幹細胞を増殖するための細胞培養培地が、提供される。基本培地は、フィーダー細胞の基質またはフィーダー細胞マトリックス上の霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するのに有効な血清と組み合せる。培地は、非必須アミノ酸、抗酸化剤、およびヌクレオシドまたはピルビン酸塩のいずれかである成長因子をさらに含む。
【００１２】
初期ヒト発生についての配列に基づく研究は、胎児の器官および組織から産生されたライブラリー（例えばＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ協会（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／）から供給される胎児ライブラリーの）に焦点が置かれた。国際特許公開ＷＯ９８／００５４０（Ｉｎｃｙｔｅ）は、ＴＨＰ−１細胞および膀胱腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリーから単離された幹細胞抗原の部分配列を報告する。
【００１３】
未分化の多能性幹細胞の増殖および操作を容易にする新たな技術は、胚性細胞療法の完全な可能性の理解への主要な業績である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖、増殖を促進する培養条件、ならびに遺伝的改変、ｃＤＮＡライブラリーの産生、および組織再生を目的とする分化した細胞の産生を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
（発明の要旨）
本開示は、フィーダー細胞の非存在下において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するための改良された系を提供する。フィーダー細胞の役割は、細胞外マトリックス上における培養を支持し、そして馴化培地において細胞を培養する工程によって置き換えられる。商業的スケールで馴化培地を産生し得る永久的な細胞株が、提供される。ウイルスベクターまたはＤＮＡ／脂質複合体を用いて細胞に導入することによって、ｐＰＳ細胞を遺伝的に変更する方法もまた、発見された。本開示において記載される系は、ｐＰＳ細胞分化の生物学の研究における使用の目的に、ｐＰＳ細胞の大量の増殖を可能にし、ヒト治療における使用の目的に重要な生成物の産生を可能にする。
【００１６】
本質的にフィーダー細胞を含まない増殖中のｐＰＳ細胞を含む組成物が、本開示において記載される。この組成物は、フィーダー細胞の培養物から培地を収集することによって産生された馴化培地、および細胞外マトリックス成分によってコートされた基質もまた含み得る。ｐＰＳ細胞は、未分化状態においてこの増殖条件下に継代され、そして拡大され得る。
【００１７】
本開示は、培地中において細胞を培養することによって培地を馴化する工程、および馴化培地を収集する工程を含む、本質的にフィーダー細胞を含まない増殖環境下において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するために適切な馴化培地を産生するための方法もまた提供する。培地を馴化するために用いられる細胞は、非悪性供給源由来であり、そして通常の核型を有するような、大規模な培養が可能である（６０日またはそれ以上のような）ような一つ以上の所望される特徴を有し得、線維芽細胞に特徴的な形態的な特徴または細胞マーカーを有し得、そして不死化される（例えば、テロメラーゼ逆転写酵素を発現するように遺伝的に改変されることによって）。ヒト胚性幹細胞から適切なヒトフィーダー細胞株を産生するための方法を記載する
本開示は、フィーダー細胞を含まない培養物においてｐＰＳ細胞が分化することを引き起こす工程または可能にする工程を含む、分化した細胞集団を産生する方法を提供する。
【００１８】
本開示はまた、直接分化によって（フィーダー細胞の存在または非存在下において培養された）ｐＰＳ細胞から分化した細胞を産生するための方法を提供する。細胞懸濁液が、過増殖、コロニーの形成、胚様体の形成、または他の凝集体の形成が存在する前に未分化のドナー培養物から調製され、次いで固体表面上へ直接的にプレートする。表面は、（ポリリシンまたはポリオルニチンのような）ポリカチオンを帯び得る。特定の細胞系統への分化はまた、フィーダー細胞のない培養においてまたはリプレーティング後のいずれかにおいて、分化を阻害する血清または因子を除去すること、および／または分化を促進する因子を添加することによって促進され得る。
【００１９】
本開示は、細胞毒性または細胞の調節についての化合物のスクリーニングの方法もまた提供し、この方法は、化合物に本発明の分化した細胞を接触させる工程、化合物との接触に起因する、任意の細胞における表現型または代謝の変化を決定する工程、およびこの変化を細胞毒性あるいは細胞機能または生化学における他のすべての変化と相関させる工程を含む。
【００２０】
遺伝子およびタンパク質の発現は、ｐＰＳ細胞から得られる異なる細胞集団の間で比較され得、そして分化の過程において上方制御または下方制御される因子を同定および特徴付けするために使用され得、そして変質した遺伝子のヌクレオチドコピーを産生する。
【００２１】
本開示は、遺伝的に変更された霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞を産生するための方法もまた提供する。一つのバリエーションにおいて、ｐＰＳ細胞は、フィーダー細胞のない培養においてトランスフェクトされる。別のバリエーションにおいて、ｐＰＳ細胞は、薬剤耐性であり、そして首尾よくトランスフェクトされたｐＰＳ細胞の薬剤選択に耐えるフィーダー細胞を含む培養においてトランスフェクトされる。トランスフェクションに用いるベクターは、未分化のｐＰＳ細胞において転写を促進するプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質コード領域をしばしば含む。霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞またはそれから分化した細胞の集団もまた、提供され、ここで実質的な比率の細胞が、ポリヌクレオチドを用いて安定にトランスフェクトされているか、またはこのポリヌクレオチドを遺伝的に受け継いだこのような細胞の子孫である。
【００２２】
本開示は、分化前または後の霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞からのｍＲＮＡ調製物またはｃＤＮＡライブラリーを産生するための方法もまた提供し、この方法は、本質的にフィーダー細胞のない、未分化のｐＰＳ細胞の培養物を提供する工程、必要に応じてｐＰＳ細胞を分化させる工程、そして未分化または分化した細胞からのｍＲＮＡを単離する工程を含む。これらの技術は、ｃＤＮＡ発現またはサブトラクションライブラリーの調製に用いられ得る。ｍＲＮＡを、フィーダー細胞のないｐＰＳ培養物から得る場合、ｃＤＮＡライブラリーは、未分化のｐＰＳ細胞、またはｐＰＳ細胞から分化した細胞のいずれかにおいて、ｍＲＮＡレベルで発現された少なくとも１，０００の遺伝子を含み得、本質的に他の脊椎動物のｃＤＮＡを含まない。未分化のｐＰＳ細胞、およびその分化した子孫において発現する遺伝子に対する配列情報は、ｃＤＮＡおよび発現した遺伝子のタンパク質誘導体、ならびにその遺伝子産物に対する特異的な抗体の調製に用いられ得る。
【００２３】
本発明は、フィーダー細胞を本質的に含まない、増殖中の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を含有する組成物を提供する。本発明はまた、この組成物の細胞の分化を引き起こすか、または分化を可能にすることによって調製される、分化した細胞集団を提供する。
【００２４】
本発明はまた、フィーダー細胞を本質的に含まない増殖環境において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するために適切な馴化培地を産生するための細胞株を提供する。
【００２５】
本発明はまた、未分化の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞のドナー培養物から、以下の工程を包含する方法によって産生される分化した細胞を提供する：ａ）この未分化のドナー培養物から細胞の懸濁液を調製する工程；ｂ）この懸濁された細胞を、それらが胚様体を形成せずに分化するように、固相表面上に再播種し、そして培養する工程；およびｃ）分化した細胞をこの固相表面から収集する工程。
【００２６】
本発明はまた、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の集団を提供し、この未分化のｐＰＳ細胞の少なくとも２５％が、ポリヌクレオチドで安定にトランスフェクトされているか、またはこのポリヌクレオチドを遺伝したそのような細胞の子孫である、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の集団である。
【００２７】
本発明はまた、未分化のｐＰＳ細胞またはｐＰＳ細胞から分化した細胞のいずれかにおいてｍＲＮＡレベルで発現される少なくとも１，０００遺伝子のｃＤＮＡライブラリーであって、他の脊椎動物のｃＤＮＡを本質的に含まない、ｃＤＮＡライブラリーである。
【００２８】
本発明はまた、細胞傷害性または細胞調節について化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、本発明の分化した細胞を、この化合物と接触させる工程、この化合物との接触から生じるこの細胞における任意の表現型または代謝変化を決定する工程、およびこの変化を細胞傷害性または細胞調節と相関させる工程を包含する。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明のｐＰＳ細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞である。
【００３０】
本発明は、フィーダー細胞を本質的に含まない、増殖中の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を含む、組成物を提供する。１つの実施形態において、この組成物は、フィーダー細胞の培養物から培地を収集することによって産生された馴化培地をさらに含む。さらに別の実施形態において、これらの組成物は、細胞外マトリクス成分（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニンまたはコラーゲン）をさらに含む。
【００３１】
本発明はまた、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するための方法を提供し、この方法は、フィーダー細胞を本質的に含まないが、フィーダー細胞の培養物から培地を収集することによって産生された馴化培地を含む増殖環境において、ｐＰＳ細胞を培養する工程を包含する。
【００３２】
本発明はまた、フィーダー細胞を本質的に含まない増殖環境において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するために適切な馴化培地を産生するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）この培地中で細胞を培養することによって培地を馴化する工程であって、ここで、この細胞は、少なくとも６０日間培養中で増殖し得る正倍数体細胞である、工程；およびｂ）この馴化培地を収集する工程。別の実施形態において、本発明は、この方法によって産生された、フィーダー細胞を本質的に含まない増殖環境における、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の培養を支持するための馴化培地を提供する。
【００３３】
１つの実施形態において、馴化培地を産生するために使用される本発明の細胞株は、１つ以上の以下の特性を有する：
ｉ）正倍数体である；
ｉｉ）不死化マウス細胞株である；
ｉｉｉ）ヒト細胞株である；
ｉｖ）線維芽細胞株である；または
ｖ）少なくとも６０日間培養中で増殖し得る。
【００３４】
本発明はまた、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の培養物を、線維芽様細胞を含む分化した細胞の集団へと分化させ、次いで、線維芽様細胞をこの培養物から選択することによって得られた、ヒト細胞株を提供し、ここで、この線維芽様細胞の培養物から培地を収集することによって産生された馴化培地は、フィーダー細胞を本質的に含まない培養環境においてｐＰＳ細胞の増殖を支持する。
【００３５】
１つの実施形態において、馴化培地を産生するために使用される本発明の細胞株は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を上昇したレベルで発現するように遺伝的に変更されている。
【００３６】
本発明はまた、分化した細胞集団を産生する方法を提供し、この方法は、本発明の組成物の細胞の分化を引き起こすか、または可能にさせる工程を包含する。
【００３７】
本発明はまた、未分化の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞のドナー培養物から分化した細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）この未分化のドナー培養物由来の細胞の懸濁液を調製する工程；ｂ）この懸濁した細胞を、それらが胚様体を形成せずに分化するように、固相表面上に再播種する工程；およびｃ）この固相表面から分化した細胞を収集する工程。本発明はまた、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞のドナー培養物から分化した細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）フィーダー細胞を本質的に含まない、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の培養物を提供する工程；ｂ）この細胞が培養される培地を変更する工程；およびｃ）この変更した培地中での一定時間の培養後に、分化した細胞を収集する工程。１つの実施形態において、これらのｐＰＳ細胞のドナー培養物は、本発明の、フィーダー細胞を本質的に含まない培養物である。別の実施形態において、これらの方法は、以下の少なくとも１つの特徴を有する：ｉ）固相表面が、ポリカチオン（例えば、ポリリジンまたはポリオルニチン）を保有する；ｉｉ）細胞が再播種後に培養される培地からの分化を阻害する、血清、血清置換物、または因子を取り除くことによって、分化が促進される；またはｉｉｉ）細胞が再播種後に培養される培地において、分化を促進する因子（例えば、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）またはニュートロフィン−３（ＮＴ−３））を添加することによって、分化が促進される。本発明はまた、上記の方法によって産生される、分化した細胞集団を提供する。本発明はまた、細胞毒性または細胞の調節について化合物をスクリーニングする方法であり、この方法は、これらの化合物に、この分化した細胞を接触させる工程、化合物との接触に起因する任意の細胞における表現型または代謝の変化を決定する工程、およびこの変化を細胞毒性または細胞機能と相関させる工程を含む。
【００３８】
本発明は、未分化の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞と比較して、方向付けられた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞、または分化した細胞において異なるレベルで発現されるｍＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを産生するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）方向付けられた細胞または分化した細胞における複数のｍＲＮＡの発現レベルを、未分化のｐＰＳ細胞における同じｍＲＮＡの発現レベルと比較して、測定する工程。ｂ）この未分化のｐＰＳ細胞と比較して、方向付けられた細胞または分化した細胞において異なるレベルで発現されるｍＲＮＡを同定する工程；およびｃ）この同定したｍＲＮＡに含まれる少なくとも３０の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを調製する工程。
【００３９】
本発明は、遺伝的に改変された霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を産生する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）本発明の本質的にフィーダー細胞を含まないｐＰＳ細胞の組成物を、提供する工程；ｂ）この組成物中のｐＰＳ細胞中にポリヌクレオチドを移入する工程；および、次いで、必要に応じて、ｃ）このポリヌクレオチドで遺伝的に改変されている細胞を優先的に選択する工程。本発明はまた、遺伝的に改変された霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を産生する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）薬剤耐性のフィーダー細胞の層上にｐＰＳ細胞の組成物を提供する工程；ｂ）この組成物中のｐＰＳ細胞中にポリヌクレオチドを移入する工程；および、次いで、必要に応じて、ｃ）このフィーダー細胞が耐性である薬剤を使用して、この組成物において遺伝的に改変されている細胞を優先的に選択する工程。１つの実施形態において、これらのポリヌクレオチドは、未分化のｐＰＳ細胞においてコード領域の転写を促進するプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質コード領域を含む。
【００４０】
本発明はまた、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の集団を提供し、ここで、未分化のｐＰＳ細胞の少なくとも２５％が、ポリヌクレオチドで安定にトランスフェクトされているか、またはこのポリヌクレオチドを遺伝している細胞の子孫である。本発明はまた、この細胞を分化することによって得られる、遺伝的に改変された分化した細胞の集団を提供する。
【００４１】
本発明は、分化前または後の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞から、ｍＲＮＡ調製物またはｃＤＮＡ発現ライブラリーを産生する方法を提供し、この方法は、本質的にフィーダー細胞を含まない未分化のｐＰＳ細胞の培養物を提供する工程、必要に応じてこのｐＰＳ細胞を分化させる工程、およびこの未分化または分化した細胞から、ｍＲＮＡを単離する工程を包含する。１つの実施形態において、この方法は、本質的にフィーダー細胞を含まないｐＰＳ細胞からｍＲＮＡを単離する工程、およびこのｍＲＮＡのｃＤＮＡのコピーをクローニングベクターに組換える工程を包含し、ここで、このｃＤＮＡのコピーは、未分化のｐＰＳ細胞においてこのｃＤＮＡの転写を促進する、転写調節制御エレメント（例えば、ＰＧＫプロモーター）に作動可能に連結される。別の実施形態において、これらの方法は、第１の細胞集団において、第２の細胞集団と比較して差示的に発現される転写物について富化されたｃＤＮＡサブトラクションライブラリーを生成するための方法であって、第１の細胞集団および第２の細胞集団から得られたｍＲＮＡ（または、そのｃＤＮＡコピー）の調製物を、その両方の調製物に存在するポリヌクレオチドをクロスハイブリダイズさせる条件下で、共にインキュベートする工程；および、次いで、クロスハイブリダイズされなかったポリヌクレオチドを、クローニングベクターに組換える工程を包含する。本発明はまた、これらの方法に従って産生されたｃＤＮＡライブラリーを提供する。本発明はまた、未分化のｐＰＳ細胞、またはｐＰＳ細胞から分化した細胞のいずれかにおいてｍＲＮＡレベルで発現された少なくとも１，０００遺伝子のｃＤＮＡライブラリーを提供し、これは、本質的に他の脊椎動物のｃＤＮＡを含まない。１つの実施形態において、これらのライブラリーのｃＤＮＡセグメントの少なくとも３０％は、その対応するｍＲＮＡのコード領域全体を含む。
【００４２】
本発明はまた、未分化または分化したｐＰＳ細胞において発現されるｍＲＮＡの配列を含むポリヌクレオチドを産生するための方法を提供し、この方法は、これらの方法に従って得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ由来のヌクレオチド配列を決定する工程、およびその決定した配列を含むポリヌクレオチドを製造する工程を包含する。
【００４３】
本発明はまた、未分化または分化したｐＰＳ細胞において発現されるポリペプチドの配列を含むアミノ酸を産生するための方法を提供し、この方法は、これらの方法に従って得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのタンパク質コード領域由来のアミノ酸配列を決定する工程、およびその決定した配列を含むタンパク質を製造する工程を包含する。
【００４４】
本発明はまた、未分化または分化したｐＰＳ細胞において発現されるポリペプチドに特異的な抗体を産生するための方法を提供し、この方法は、これらの方法に従って得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのタンパク質コード領域由来のアミノ酸配列を決定する工程、およびその決定した配列を含むタンパク質を用いて、動物を免疫化するか、または免疫応答性の細胞または粒子に接触させる工程を包含する。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明のｐＰＳ細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞である。
【００４６】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下に続く記載から明らかである。
【００４７】
【発明の実施の形態】
（詳細な説明）
本開示は、分化を抑制するためにフィーダー細胞の層を必要とすることなく、インビトロにおける霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を増殖させるための系を提供する。
【００４８】
フィーダー細胞の役割は、分化なしに細胞の増殖を支持する培養環境における特徴によって置き換え得ることが発見された。その特徴の一つは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびラミニンによって例示される細胞外マトリックスのような、培養表面上の適切な基質である。別の特徴は、馴化培地に例示される、いくつかの方法において効果的に分化を抑制する因子を含む培養培地の使用である。ｐＰＳ細胞を支持するように培地を馴化するための細胞は、初代胚性線維芽細胞、テロメア化した線維芽細胞、および培養されたｐＰＳ細胞から分化し、そして選択された線維芽様細胞を含む。
【００４９】
例示的な調製において、未分化のｈＥＳコロニーを、フィーダー細胞上のｈＥＳ培養物から回収し、次いで各９．６ｃｍ2ウエルに約１５コロニーで、馴化培地中の各Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基質の上に播種した。播種の次の日、未分化のｈＥＳ細胞は、約１００〜２０００個の細胞の小さなコロニーとして可視であり、そして単一の細胞が、分化しているか、または死んでいるようにみえるコロニーの中間に存在する。ｈＥＳ細胞が増殖されるにつれて、コロニーは、大きくそしてコンパクトになり、これは、培養皿の表面領域の大部分を提案する。コンフルエント近くになると、細胞のほとんどが、未分化細胞の形態的な特徴を有し、コロニーの間にある分化細胞は、培養物中の細胞の１０％未満に相当した。
【００５０】
倍化速度は、ほぼ２０〜４０時間程度であり、フィーダー細胞上に増殖されるｈＥＳ細胞と比較し得る。培地は、毎日換えられ、そして細胞は、６日または７日ごとに分割および継代された。最初の播種の１９日後、細胞は免疫蛍光法によって細胞表面の表現型に関して試験された。９０％以上を超える細胞が、ＳＳＥＡ−４およびＴｒａ−１−６０に関して陽性に染色され；８０％以上を超える細胞が、Ｔｒａ−１−８１に関して陽性に染色されたが、１５％未満が、ＳＳＥＡ−１に関して陽性に染色された。このことは、調製物中の細胞の少なくとも約８０％は、未分化ｈＥＳ細胞として予測される表現型を有したことを示す。
【００５１】
フィーダー細胞が、高品質の馴化培地を産生する能力を失わせることなく、長期間の培養において不死化および維持され得ることもまた発見された。例えば、初代マウス胚性線維芽細胞は、これらテロメラーゼ逆転写酵素を発現するように遺伝的に改変することによって、不死化され得る（実施例８）。培地を馴化するのに適切なヒト細胞が、インビトロにおいて胚性幹細胞を分化することによって得られ得ることもまた発見された。ｈＥＳ細胞は、懸濁液中における胚様体の形成、そして次いで線維芽様細胞の同種の集団が得られるような様式での培養によって分化された(実施例１２および１３）。
【００５２】
形質導入されていないｈＥＦ細胞株およびテロメア化されたｈＥＦ細胞株の両方は、連続細胞培養物中で増殖し、そして馴化培地を産生するために用いられた。この培地中において増殖されるｈＥＳ細胞の培養は、初代ｍＥＦフィーダー細胞の層の上に直接的に増殖されたｈＥＳ細胞と区別できない未分化ｈＥＳ細胞の形態的な特徴を有するコロニーを形成することが発見された（図１４、パネルＡ）。このことは、培養を続けるために、反復的に初代フィーダー細胞の培養物を調製する必要性を除去し、一貫して高品質な商業的スケールにおいてｐＰＳ細胞を産生させることを可能にするという理由で、重要である。
【００５３】
フィーダー細胞を含まない環境においてｐＰＳ細胞を培養することは、多数の重要な利点を有する。例えば：
・ｐＰＳ細胞およびその誘導体の産生は、商業的産生にまで、より容易に拡大縮小可能である。培養を支持するために、継続中の基準でフィーダー細胞を産生する必要がなく、そして細胞の継代が機械的に行われ得る。
・細胞の方向付けられた前駆体への分化または最終的に分化した細胞への分化が、フィーダーを含まない培養物中で促進される。フィーダーを含まない培養物から形成される胚様体は、より一貫した細胞集団を産生する。あるいは、直接的な分化が、フィーダーを含まない幹細胞を、適切な固相支持体上に直接プレーティングすることによって、行われ得る。条件に依存して、顕著に均一な細胞集団が、得られ得る。
・フィーダーを含まずにｐＰＳ細胞を生成し得ること、そして培地を馴化するためにヒト細胞を使用することは、規制の調査の展望から魅力的である−ｐＰＳ細胞は、培養物中に、異種成分および他の細胞由来の癌性起源の成分を含まない。
・薬剤、毒素または可能性のある分化モジュレーターのスクリーニングもまた促進される。物質が、培養物を支持するために使用されるフィーダー細胞に対する二次的な効果を伴わずに、培養培地に添加され得る。
・高い質のｍＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーが、フィーダーを含まないｐＰＳ細胞培養物を使用して容易に産生され得る。培養物面積１ｃｍ2あたりのｍＲＮＡの収量が、より高い。このライブラリーは、フィーダー細胞からの転写物（異なる種または異なるヒト遺伝子型のｃＤＮＡ）の混入がなく、そして発現パターンは、９０％程度の高い未分化ｐＰＳ細胞表現型を反映し得る。発生の間に調節される遺伝子の全長ｃＤＮＡが富化されたサブトラクションライブラリーもまた、得られ得る。
・フィーダー細胞を含まない培養物の遺伝子トランスフェクションは、トランスフェクションされた細胞の薬物耐性マーカーによる選択を促進し、そしてかなりより高いレベルの一過性発現を生じる。薬物耐性フィーダー上、またはフィーダーを含まない培養物上のいずれにおいても、ｐＰＳ細胞を分化させることなくｐＰＳ細胞を遺伝的に改変する方法が見出された。フィーダーを含まない系は、トランスフェクションの効率を改善するというさらなる利点を有する。モデル実験において、フィーダーを含まない培養物中の約１５％の細胞がマーカー遺伝子でトランスフェクションされ、一方、初代フィーダー層におけるトランスフェクション効率は、代表的には、ポジィティブであった初代フィーダー層上でトランスフェクトされた未分化ｈＥＳ細胞のほんの５％のみであり、このことは、トランスフェクション効率が、フィーダーを含まない培養条件を用いて有意に増強されることを示す。
【００５４】
本発明において提供される技術は、研究および治療使用のための、多能性幹細胞の可能性のある使用における重要な進歩を示す。本発明のさらなる進歩が、以下の節から理解される。
【００５５】
（定義）
プロトタイプの「霊長類多能性幹細胞」（ｐＰＳ細胞）は、受精後の任意の時点の前胚性組織、胚性組織、または胎児組織由来の多能性細胞であり、正常な条件下で、いくつかの異なる細胞型の子孫を産生し得る特徴を有する。ｐＰＳ細胞は、当該分野で受け入れられている標準的試験（例えば、適切な宿主内で奇形腫を形成する能力）に従って、３つの胚層（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の各々の誘導体である子孫を生成し得る。
【００５６】
ｐＰＳ細胞の定義に含まれるものは、Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５、１９９８）によって記載されるようなヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞；Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４、１９９５；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３８：１３３、１９９８）によって記載されるアカゲザルまたはマーモセットの幹細胞のような他の霊長類の由来の胚性幹細胞；およびＳｈａｍｂｌｏｔｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６、１９９８）において記載されるヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞によって例示される種々の型の胚細胞である。多能性細胞の他の型もまた、この用語に含まれる。胚性組織由来であるか、胎児組織由来であるかまたは他の供給源由来であるかにかかわらず、３つの生殖層の全ての誘導体である子孫を産生し得る霊長類起源の任意の細胞が含まれる。本発明の多くの実施形態について、核型が正常であり、悪性供給源由来でないｐＰＳ細胞を使用することが、有利である。
【００５７】
ｐＰＳ細胞培養物は、集団中の幹細胞およびその誘導体のかなりの割合が、それらを胚起源または成体起源の分化した細胞と明らかに区別する、未分化細胞の形態学的特徴を示す、「未分化」または「実質的に未分化」として記載される。未分化のｐＰＳ細胞は、当業者によって容易に認識され、そして高い核／細胞質の比および目立った核小体を有し、顕微鏡視野において２次元で代表的に現れる。集団内の未分化細胞のコロニーが、分化した隣接細胞によってしばしば囲まれることが理解される。それにもかかわらず、その集団が適切な条件下において培養または継代される場合、未分化のコロニーが存続し、そして、個々の未分化細胞は、細胞集団のかなりの割合を構成する。実質的に未分化である培養物は、少なくとも２０％の未分化ｐＰＳ細胞を含み、そして（未分化である同一の遺伝子型を有する細胞の百分率に関する）優先性を増加するために、少なくとも４０％、６０％または８０％を含み得る。本開示において記載される方法を使用して、実質的に未分化である培養物中に、比較的低い割合（５％または１０％程度の低さでさえある）の分化したｐＰＳ細胞を含む培養物を生じるか、または継代することが、時として可能である。
【００５８】
本開示において、培養物または細胞集団が「分化することなく」増殖するといわれる場合は常に、増殖後に、組成物が上記の定義に従って実質的に未分化であることを意味する。分化することなく少なくとも４回の継代（約２０回の倍増）を通じて増殖する集団は、起源の培養物と同程度のコンフルエンスにおいて評価した場合、実質的に同じ割合（または、可能性として、より高い割合の未分化細胞）の未分化細胞を含む。
【００５９】
「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、別の型の細胞と同時培養され、第二の型の細胞が増殖し得る環境を提供する１つの型の細胞である。フィーダー細胞は、必要に応じて、支持する細胞と異なる種由来である。例えば、ｐＰＳ細胞の特定の型が、本開示において以下に記載されるように、マウス胚性線維芽細胞、不死化マウス胚性線維芽細胞、またはｈＥＳ細胞から分化したヒト線維芽細胞様細胞の初代培養物によって支持され得る。ｐＰＳ細胞との同時培養において、フィーダー細胞は、照射または抗有糸分裂薬剤（例えば、マイトマイシンｃ）での処理によって代表的に不活化され、フィーダー細胞が支持する細胞よりも増殖することを防ぐ。馴化培地の生成における使用のために、細胞の不活化は任意であり得、そして部分的に培地産生の機械的な局面に依存する。
【００６０】
ｐＰＳ細胞集団は、ｐＰＳ細胞がｐＰＳの増殖を支持するための新鮮なフィーダー細胞が添加されない分割の後に少なくとも１回増殖した場合、フィーダー細胞を「実質的に含まない」といわれる。フィーダー細胞を含有する以前の培養物が、新鮮なフィーダーが添加されない培養物についてのｐＰＳの供給源として使用される場合、継代を生き残るいくつかのフィーダー細胞が存在することが、認識される。例えば、ｈＥＳ細胞が、ほぼコンフルエンスの約３７５，０００個の照射された初代胚性線維芽細胞の表面上の９．６ｃｍ2ウェル中に、しばしば培養される。培養の終了までに、おそらく１５０，０００個のフィーダー細胞が、なお生存可能であり、そして分割され、そして約１００万〜１５０万の数に増殖したｈＥＳとともに継代される。１：６分割の後、ｈＥＳ細胞は、一般に増殖を再開するが、線維芽細胞は増殖せず、そして培養の約６日の終了までに、ほんの少しの割合のみが生存可能である。この培養物は、フィーダー細胞を本質的に含まず、組成物は、約５％未満のフィーダー細胞を含む。１％、０．２％、０．０５％、または０．０１％未満（培養物中の総細胞の％として示す）のフィーダー細胞を含む組成物が、ますますより好ましい。
【００６１】
本開示において、培養物または細胞集団が、「フィーダーを含まない」といわれる場合は常に、上記の定義に従って（明示的に必要とされる場合、さらなる拘束にのみ供される）、組成物が、フィーダー細胞を本質的に含まないことを意味する。
【００６２】
「増殖環境」は、目的の細胞がインビトロにおいて増殖する環境である。環境の特徴としては、細胞が培養される培地、温度、Ｏ2分圧およびＯ2、ならびに存在する場合、支持する構造（例えば、固体表面上の基板）が挙げられる。
【００６３】
「栄養培地」は、増殖を促進する栄養を含有する、細胞培養のための培地である。栄養培地は、適切な組み合わせにおいて以下の任意のものを含有し得る：等張生理食塩水、緩衝液、アミノ酸、抗生物質、血清または血清置換物、および外来的に添加された因子。「馴化培地」は、培地中に第１の集団の細胞を培養し、次に培地を回収することによって調製される。次に、馴化培地（細胞によって培地中に分泌される任意のものとともに）を使用して、第２の集団の細胞の増殖を支持し得る。
【００６４】
「制限された発生系列細胞」は、胚組織に由来する（代表的には、ｐＰＳ細胞の分化または部分的分化による）細胞である。これらの細胞は、増殖し得、そしていくつかの異なる細胞型に分化し得るが、そのレパートリーの範囲は制限されている。例は、血球型について多能性である造血細胞、ならびに類洞内皮細胞、肝細胞、および可能性のある他の肝細胞について多能性である肝細胞前駆体である。別の例は、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトへと発達するグリア細胞前駆体、ならびにニューロンへと発達するニューロン前駆体を生成し得る神経制限細胞である。
【００６５】
用語「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー性形態をいう。含まれるものは、遺伝子および遺伝子フラグメント、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離されたＤＮＡおよびＲＮＡ、核酸プローブ、ならびにプライマーである。本開示において使用される場合、用語ポリヌクレオチドとは、互換可能に、二本鎖分子および一本鎖分子をいう。他に特定されるか、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、ならびに二本鎖形態を作製することが公知であるかまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を含む。同一性の程度について、ポリヌクレオチド間で比較がなされる場合、相補的鎖が容易に生成され、比較されるポリヌクレオチド間での同一性の程度を最大化するセンス鎖またはアンチセンス鎖が選択されるか、または予測されることが、無条件に理解される。配列同一性の百分率は、第１に、試験されるポリヌクレオチドを参照対応物と整列し、次に、明らかな挿入または欠失の存在についてのペナルティーを用いずに、比較される配列間で共有される残基の数を、試験をする領域の百分率として計数することによって計算される。
【００６６】
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの機能的調節（例えば、複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、複製（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転写、スプライシング、翻訳、またはポリヌクレオチドの分解）に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。転写制御エレメントとしては、プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。
【００６７】
遺伝子エレメントは、その遺伝子エレメントがその予測された機能に従った様式において作動することを許容する構造的関係にその遺伝子エレメントがある場合、「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写の開始を補助する場合、コード領域に作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード配列との間に介在配列が存在し得る。
【００６８】
「クローニングベクター」は、宿主細胞において、ビヒクル中に挿入された配列の複製を許容するポリヌクレオチドビヒクル（例えば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物ウイルスもしくは動物ウイルス）である。ｃＤＮＡライブラリーの場合、複製したベクターは、複数の遺伝子から転写された不均一のｍＲＮＡ調製物からコピーされた異種ポリヌクレオチド挿入物を含む。挿入物が、宿主細胞において、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルにおいて挿入物の発現を許容する転写調節制御エレメントに作動可能に連結される場合、ビヒクルはまた、「発現ベクター」といわれ得る。
【００６９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本開示において互換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、改変されたアミノ酸を含み得、直鎖状であっても分岐していてもよく、そして非アミノ酸によって中断され得る。配列同一性の百分率は、第１に、試験されるポリペプチドを参照対応物とまたはプロトタイプと整列し、次に、挿入または欠失の存在についてのペナルティーを用いずに、比較される配列間で共有される残基の数を、試験をする領域の百分率として計数することによってポリペプチドについて計算される。置換がなされる場合、保存的置換（１つのアミノ酸が、類似の電荷、サイズ、疎水性、または芳香族性を有する別のアミノ酸によって置換される）が代表的により良好に許容される。所望の配列は、プロトタイプの機能を保つ：例えば、酵素活性、特異的基質の結合、および標準的な競合的阻害イムノアッセイにおいて検出可能なような特異的抗体の結合。
【００７０】
ポリヌクレオチドが、人工的操作の任意の適切な手段によって細胞中に移入された場合、または細胞が、そのポリヌクレオチドを遺伝によって受け継いだ、初めに改変された細胞の子孫である場合、その細胞は、「遺伝子改変された」、「トランスフェクトされた」、または「遺伝子形質転換された」といわれる。ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする転写可能な配列（細胞が、上昇したレベルのタンパク質を発現するのを可能にする）をしばしば含む。内在的遺伝子の作用を、機能的に改変するか、または廃止することを生じる任意の手段による遺伝子改変がまた、含まれる。
【００７１】
遺伝子改変は、改変された細胞の子孫が、同一の改変を有する場合、「遺伝性」といわれる。遺伝子改変が遺伝性であるか否かの決定は、ポリヌクレオチド鋳型の存在の検出（例えば、ＰＣＲ増幅による）によるか、または現れる遺伝的改変に依存する表現型の特徴（例えば、遺伝子産物の発現、もしくはその効果）の検出によって、なされ得る。
【００７２】
遺伝子改変は、少なくとも４回の細胞複製を通して遺伝可能である場合（第７世代の細胞においてポリヌクレオチド鋳型の存在として検出可能）、「安定」だといわれる。表現型の発現（ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、または機能的レベルにおいて）は、第７世代の細胞における表現型の特徴が、親の遺伝子改変細胞における表現型の特徴の少なくとも１０％（そしてしばしば少なくとも５０％）の場合、「安定」だといわれる。安定な発現は、遺伝子改変もまた、安定であることを示す。遺伝子改変は、ポリヌクレオチド鋳型が、７回目の細胞分裂によって、最初の遺伝子改変された細胞の子孫に存在しない場合、「一過性」だといわれる。表現型の発現は、第７世代細胞における表現型の特徴が、最初に遺伝子改変された細胞における表現型の特徴の５％以下である場合に（鋳型の損失に起因しようと、またはその鋳型の発現を阻害するある機構のためであろうと）、「一過性」だといわれる。
【００７３】
「細胞株」は、少なくとも１０回の継代を通じて培養物中で増殖し得る細胞の集団である。この集団は、表現型において均一であり得るか、またはその集団は、測定可能に異なる表現型の混合物であり得る。細胞株の特徴は、全体として１０回の継代の後に本質的に不変である、集団の特徴である。
【００７４】
細胞は、細胞が、細胞中でＴＥＲＴが転写されそして翻訳されるような様式において、任意の種のテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸を用いて遺伝子改変される場合、「テロメラーゼ化された」と記載される。この用語はまた、ＴＥＲＴのコード領域を上昇したレベルで発現する能力を遺伝によって受け継いだ、最初に遺伝子改変された細胞の子孫に適用される。ＴＥＲＴコード配列は、代表的には、哺乳動物ＴＥＲＴ遺伝子（以下に記載されるように、ヒトおよびマウスのＴＥＲＴによって例示される）から取り出されるか、または適用される。
【００７５】
細胞株は、細胞株が以下の性質の少なくとも１つを有する場合、「永久」または「不死化」と記載される：１）（例えば、ＴＲＡＰアッセイにおける増加したテロメラーゼ活性として）検出可能な、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の上昇した発現について、遺伝子改変されている；２）別の状態では１５回以下の集団の複製を行い得ない細胞株について、適切な培養条件下で、少なくとも２０回の集団の複製にまで、その複製能力を伸ばすように遺伝子改変されている；または３）別の状態では１５回を超えた集団の複製を行い得る細胞株について、代表的な培養条件下で、細胞株の複製能力を有意に伸ばすように遺伝子改変されている。この定義を満たす細胞として、初めに遺伝子改変された細胞のみではなく、列挙された判定基準を満たすような細胞の全ての子孫も挙げられることが理解される。
【００７６】
本開示において使用される場合、用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方をいう。この用語の境界は、意図的に、インタクトな免疫グロブリン分子のみならず、免疫グロブリン分子のフラグメントおよび誘導体（例えば、単鎖Ｆｖ構築物）、ならびに当該分野において公知の技術によって調製され得、そして所望の抗原結合特異性を保持する、Ｔ細胞レセプターのような免疫グロブリンの等価物のフラグメントおよび誘導体を包含する。
【００７７】
（一般的技術）
本発明の実施において有用な一般的技術をさらに精巧にするために、実施者は、細胞生物学、組織培養、および発生学の標準的な教科書および総説を参照し得る。これらには、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．１９８７）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００、１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆＥｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、１９９３）が含まれる。幹細胞の分化は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：１７３、１９９７；およびＰｅｄｅｒｓｅｎ、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．１０：３１、１９９８に概説される。
【００７８】
分子遺伝学および遺伝子操作の方法は、一般に、現在の版のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙおよびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第三版（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編）；およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｗｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に記載される。本開示において参照される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈのような市販業者から入手可能である。
【００７９】
ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーの調製およびそれらの分析に関与する一般的な技術について、当業者は、ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｒ．Ｅ．Ｆａｒｒｅｌｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）；ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＣｏｗｅｌｌおよびＡｕｓｔｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＨｕｎｔおよびＬｉｖｅｓｅｙ編、２０００）；ならびにＡｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｅ  Ｌａｎｄｅｒ編、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗによって毎年刊行）を利用できる。技術はまた、他の発現ライブラリーの記載から推論され得る。例えば、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（米国特許第５，７８９，１５８号）；Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ａ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ（米国特許第５，６４３，７６１号）；Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＷＯ９５／２０６８１、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；Ａ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｐ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｓｋａｒｎｅｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：９０３、１９９２）；Ｓａｓａｋｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４９：１６７、１９９８；Ａｄｊａｙｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６：３３７、１９９７；Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１９：７４９、１９９６；およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１６３５、２０００。
【００８０】
抗体を、惹起、精製および改変するために用いられる一般的な技術、ならびに免疫細胞化学を含む免疫アッセイの設計および実行について、読者は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎら編）；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｍａｓｓｅｙｅｆｆら編、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ＧｍｂＨ）を参照する。
【００８１】
細胞培養および培地収集における一般技術は、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：１４８、１９９７）；Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｋ．Ｋｉｔａｎｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：７３、１９９１）；Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：３７５、１９９１）；およびＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２５１、１９９０）において要点が述べられる。他の興味深い読み物としては、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ．（Ｍ．ＭｃＬｕｈａｎ、Ｍｅｎｔｏｒ  ＮＹ、１９６４）およびＴｈｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｉｓ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ（Ｍ．ＭｃＬｕｈａｎおよびＱ．Ｆｉｏｒｅ、Ｂａｎｔａｍ  ＮＹ、１９６７）が挙げられる。
【００８２】
（多能性幹細胞の供給源）
本発明に従う培養および分化のために適切な供給源細胞としては、妊娠の後に形成された組織由来の多能性細胞の樹立株が挙げられる。例示的な初代組織供給源は、胚性組織（例えば、胚盤胞）、または妊娠の間の任意の時間に採取された胎児組織（代表的には妊娠１０週前であるが、その必要はない）である。非限定的な例は、霊長類胚性幹（ＥＳ）細胞および胚性生殖（ＥＧ）細胞の樹立株である。そのような細胞の最初の樹立または安定化の間の本開示の技術の使用もまた意図される。この場合、供給源細胞は、列挙された組織から直接採取された初代多能性細胞である。
【００８３】
（培地およびフィーダー細胞）
ｐＰＳ細胞を単離し、そして増殖するための培地は、得られる細胞が所望の特徴を有し、そしてさらに増殖し得る限り、任意のいくつかの異なる処方を有し得る。適切な供給源は、以下のとおりである：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１０８２９−０１８；２００ｍＭＬ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  ＃１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示的な血清含有ＥＳ培地は、８０％  ＤＭＥＭ（代表的にはＫＯ  ＤＭＥＭ）、２０％  非熱非働化規定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを用いて作製される。この培地を濾過して、２週間以内４℃で保存する。血清を含まないＥＳ培地を、８０％  ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％血清置換物、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを用いて作製する。全ての血清置換物が作用するわけではない；効果的な血清置換物は、Ｇｉｂｃｏ  ＃１０８２８−０２８（専売特許の処方；製品は、製造業者より入手可能）である。培地を濾過して、２週間以内４℃で保存する。使用直前に、ヒトｂＦＧＦを、最終濃度４ｎｇ／ｍＬで添加する。
【００８４】
ｐＰＳ細胞は、代表的には、種々の方法においてｐＰＳ細胞を支持する（例えば、ｐＰＳ細胞の生存もしくは増殖を促進するかまたは分化を阻害する可溶性因子の産生）フィーダー細胞の層上で培養する。フィーダー細胞は、代表的には線維芽細胞型細胞であり、しばしば、胚組織または胎児組織由来である。頻繁に使用される供給源は、マウス胚である。有用なフィーダー細胞株は、胚性線維芽細胞を得て、それらをトランスフェクトしてテロメラーゼを発現させ、次にそれらを継代するかまたは将来の使用のために冷凍することによって得られた。細胞株をほぼコンフルエントにまでプレーティングし、照射して増殖を防ぎ、ｐＰＳ細胞培養を支持するために使用する。
【００８５】
１つの例において、ｐＰＳ細胞を、最初に誘導し、そして初代胚性線維芽細胞上で支持する。マウス胚性線維芽（ｍＥＦ）細胞は、異系交配ＣＦ１マウス（ＳＡＳＣＯ）または他の適切な株から得られ得る。妊娠１３日目のマウスの腹部を、７０％エタノールでふき取り、そして脱落膜をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に取り除く。胚を回収し；胎盤、膜、および軟組織を取り除く；そして死体をＰＢＳで二回洗浄する。次に、これらを、２ｍＬ  トリプシン／ＥＤＴＡを含む新鮮な１０ｃｍの細菌ディッシュに移し、微細に細分化する。５分間３７℃でのインキュベートの後、トリプシンを、１０％のＦＢＳを含有する５ｍＬのＤＭＥＭで不活化し、そして混合物を１５ｍＬの円錐チューブに移す。砕片を２分間沈降させ、上清を１０ｍＬの最終容量とし、そして１０ｃｍの組織培養プレート上またはＴ７５フラスコ上にプレーティングする。このフラスコを、攪拌せずに２４時間インキュベートし、その後、培地を置きかえる。フラスコがコンフルエントである時に（約２〜３日）、細胞を、新しいフラスコに１：２に分割する。
【００８６】
フィーダー細胞をｍＥＦ培地（９０％  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１９６５−０９２）、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＃３００７１−０３）、および２ｍＭ  グルタミンを含む）中で増殖させる。ｍＥＦをＴ１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃４３０８２５）において増殖させ、一日おきに細胞をトリプシンで１：２に分割し、細胞をコンフルエント以下に保つ。フィーダー細胞層を調製するために、細胞を、増殖を阻害するが、ｈＥＳ細胞を支持する重要な因子の合成を許容する線量（約４０００ラドのγ線照射）で照射する。６ウェルの培養プレート（例えば、Ｆａｌｃｏｎ  ＃３０４）を、１ウェルあたり１ｍＬの０．５％ゼラチンを用いて一晩３７℃でインキュベーションすることによってコートし、そして１ウェルあたり３７５，０００個の照射されたｍＥＦをプレーティングする。フィーダー細胞層を、プレーティングの５時間〜４日後に使用する。ｐＰＳ細胞を播種する直前に、培地を、新鮮なｈＥＳ培地で置換する。
【００８７】
（ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の調製）
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３頁以降、１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、  ９２：７８４４、１９９５）によって記載されるように調製し得る。
【００８８】
手短には、ヒト胚盤胞を、ヒトのインビボ着床前胚から得る。あるいは、インビトロで受精した（ＩＶＦ）胚を使用し得るか、または１細胞期のヒト胚を、胚盤胞段階まで増殖させ得る（Ｂｏｎｇｓｏら、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ４：７０６、１９８９）。ヒト胚を、Ｇ１．２培地およびＧ２．２培地中で胚盤胞段階まで培養する（Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４、１９９８）。発生した胚盤胞を、ＥＳ細胞単離のために選択する。透明帯を、プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）への手短な曝露によって胚盤胞から取り除く。内部細胞塊を、免疫手術（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｇｅｒｙ）（胚盤胞を、１：５０希釈のウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に対して３０分間曝露し、次にＤＭＥＭ中で５分間３回洗浄し、そして１：５希釈のモルモットの補体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する（Ｓｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：５０９９、１９７５を参照のこと））によって単離する。ＤＭＥＭでの２回のさらなる洗浄後、溶解した栄養外胚葉細胞をインタクトな内部細胞塊（ＩＣＭ）から、緩やかなピペッティングによって取り除き、そしてＩＣＭをｍＥＦフィーダー層上にプレーティングする。
【００８９】
９〜１５日後、内部細胞塊誘導増殖は、１ｍＭ  ＥＤＴＡを伴うカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に曝露することによって、ディスパーゼまたはトリプシンに曝露することによって、またはマイクロピペットを用いる機械的解離のいずれかによって、凝集塊に解離され、次いで、新鮮培地中のｍＥＦ上に再移植される。解離された細胞は、新鮮なＥＳ培地におけるｍＥＦフィーダー層上に再移植され、そしてコロニー形成について観察される。未分化な形態を示すコロニーは、個々にマイクロピペットにより選択され、機械的に凝集塊に解離され、そして再移植される。ＥＳ様形態は、明らかに高い核対細胞質比および顕著な仁を有する緻密なコロニーとして特徴付けられる。次いで、生じたＥＳ細胞は、短時間のトリプシン処理、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（カルシウムもマグネシウムも伴わず、２ｍＭ  ＥＤＴＡを伴う）への曝露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）への曝露またはマイクロピペットによる個々のコロニーの選択により１〜２週間毎に慣用的に分割される。凝集塊の大きさは、約５０〜１００細胞が最適である。
【００９０】
（ヒト胎児生殖（ｈＥＧ）細胞の調製）
ヒト胎児生殖細胞は、最後の月経期後、約８〜１１週目に取得されたヒト胎児物質中に存在する始原生殖細胞から調製され得る。適切な調製方法は、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６、１９９８および米国特許第６，０９０，６２２号において記載される。
【００９１】
手短に言うと、生殖隆起を等張緩衝液でリンスし、次いで、０．１ｍＬ  ０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭナトリウムＥＤＴＡ溶液（ＢＲＬ）中に置き、＜１ｍｍ3の厚切りにする。次いで、この組織を１００μＬチップを介してピペッティングし、さらに細胞をばらばらにする。それを３７℃で約５分間インキュベートし、次いで、約３．５ｍＬ  ＥＧ増殖培地を添加する。ＥＧ増殖培地は、ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ  ｍＭ  炭酸水素ナトリウム；１５％ＥＳ条件付きウシ胎児血清（ＢＲＬ）；２ｍＭグルタミン（ＢＲＬ）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ）；１０００〜２０００  Ｕ／ｍＬ  ヒト組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；１〜２ｎｇ／ｍｌヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；および１０μＭフォルスコリン（１０％  ＤＭＳＯ中）である。代替的アプローチにおいて、ＥＧ細胞は、ヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼ／デオキシリボヌクレアーゼを使用して単離される。腸間膜を伴う生殖腺原基または生殖隆起が、胎児物質から切り出され、この生殖隆起をＰＢＳにてリンスし、次いで、０．１ｍｌＨＣＤ消化溶液（０．０１％ヒアルロニダーゼＶ型、０．００２％デオキシリボヌクレアーゼＩ、０．１％コラゲナーゼＩＶ型、すべてはＥＧ増殖培地において調製されるＳｉｇｍａ由来である）中に置く。組織をみじん切りにし、そして３７℃において１時間または一晩インキュベートし、１〜３ｍＬのＥＧ増殖培地中に再懸濁し、そしてフィーダー層にプレートする。
【００９２】
９６ウェル組織培養プレートが、ＬＩＦ、ｂＦＧＦまたはフォルスコリンを含まない改変されたＥＧ増殖培地において３日間培養されたフィーダー細胞のコンフルエント未満の層とともに調製され、５０００ｒａｄ  γ−照射で不活性化される。適切なフィーダーはＳＴＯ細胞である（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５０３）。約０．２ｍＬの１次生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を各ウエルに添加する。第１の継代は、ＥＧ増殖培地において７〜１０日後行われ、各ウエルを、照射されたＳＴＯマウス線維芽細胞を用いて以前に調製された２４ウェル培養皿の１ウェルに移す。この細胞を、形態学的にＥＧ細胞と一致する細胞が観察されるまで毎日培地を交換して培養する（代表的には７〜３０日後または１〜４継代後）。
【００９３】
（フィーダー細胞の非存在下におけるｐＰＳ細胞の増殖）
ｐＰＳ細胞は、分化を促進することを伴わずに増殖を支持する培養条件の組み合わせを使用して、培養において連続的に増殖され得る。ｈＥＳ細胞は、フィーダー細胞の非存在下においてさえも、分化を伴わずに増殖され得ることが決定されてきた。フィーダーを含まない培養に関して、適合性の培養表面（基質）およびフィーダー細胞により提供される影響のいくつかを与える栄養培地を提供することは有益である。
【００９４】
フィーダーを含まないｐＰＳ培養のための基質として特に適切なものは、細胞外マトリックス成分である（基底膜由来か、または接着分子レセプターリガンドカップリングの一部を形成する）。市販の調製物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）という名前でＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎより入手可能であり、そして通常の、または増殖因子を減少させた（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｅｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ）処方物において得られ得る。両方の処方物は、効果的である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性の調製物であり、再構成された基底膜を室温にて形成するゲルである。
【００９５】
他の細胞外マトリックス成分および成分の混合物は、代替物として適切である。増殖される細胞型に依存して、細胞外マトリックスは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸塩など、単独で、または種々に組み合わせたものを含む。ラミニンは、脊椎動物におけるすべての基底膜の主要成分であり、これはインテグリンのヘテロダイマー(例えば、α６β１およびα６β４（ラミニンに対して特異的である））および他のヘテロダイマー（他のマトリックスと交叉反応する）と相互作用する。実施例において例示される培養条件を使用すると、コラーゲンＩＶは、ｈＥＳ細胞増殖を支持するが、コラーゲンＩは支持しない。本明細書中に記載される実験手順を使用して試験され得る基質としては、他の細胞外マトリックス成分だけでなく、ポリアミン（例えば、ポリオルニチン、ポリリジン）および他の市販の被覆剤が挙げられる。
【００９６】
多能性細胞を、適切な分布ならびに細胞の生存、増殖、および所望の特徴の保持を促進する培地の存在下において基質上にプレートする。これらの特徴は、接種分布に対する慎重な注意から利益を得る。この分布の１つの特徴は、プレーティング密度である。少なくとも、約１５，０００細胞ｃｍ-2のプレーティング密度は、生存を促進し、かつ分化を制限することが見出されてきた。代表的に、約９０,０００ｃｍ-2と約１７０,０００ｃｍ-2との間のプレーティング密度が使用される。
【００９７】
別の特徴は、細胞の分散である。マウス幹細胞増殖は、細胞を単一細胞懸濁液に分散させることを含む（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７５：１７３，１９９７  １７７頁にて）。対照的に、霊長類のＰＳ細胞を継代することは、以前は小さなクラスターにおいて、その細胞をともに維持する必要があると思われていた。細胞が完全に分散する前に、酵素消化を停止する（例えば、約５分、コラゲナーゼＩＶを使用する）。次いで、そのプレートをピペットを用いて、穏やかにはがし、そして、接着細胞の凝集塊（約１０〜２０００細胞の大きさ）のように懸濁されるまでピペットを用いて細胞を粉砕する。次いで、凝集塊をさらなる分散を伴わずに直接基質の上にプレートする。
【００９８】
適切な酵素および培地が選択され、そしてプレーティング密度が十分に高い場合、霊長類のＰＳ細胞は、さらに細かい細胞の懸濁液としてフィーダーを含まない培養をする傍ら、継代され得ることが現在発見されている。説明の目的で、フィーダーの非存在下において培養されたコンフルエントなヒト胚性幹細胞は、０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）および０．０５３ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液とともに５〜１５分間３７℃にてインキュベートすることによってプレートから除去される。ピペットを使用して、プレート内の残りの細胞を取り出し、そしてその細胞を、単一細胞およびいくつかの小さなクラスターを含む懸濁液に分散されるまでピペットを用いて粉砕する。次いで、この細胞を５０，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ2の密度にてプレートして、生存を促進させ、かつ分化を制限する。この技術により継代されたＥＳ細胞の表現型は、細胞がコラーゲン消化によりクラスターとして収集される場合に観察されるものと類似している。別の選択肢として、この細胞は、そのプレートがコンフルエントになる前に、酵素を伴わずに収集され得る。この細胞をＰＢＳ中０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ単独の溶液において約５分間インキュベートし、培養容器から洗浄し、次いで、さらなる分散を伴わずに新しい培地にプレートする。
【００９９】
新鮮なフィーダー細胞の非存在下においてプレートされたｐＰＳ細胞は、栄養培地において培養されることから利益を得る。一般的に、この培地は、細胞の生存を増強させる通常成分（等張緩衝液、必須無機質、および血清または血清に代わる何かのいずれか）を含む。フィーダー細胞により提供されるいくつかのエレメントを供給するように馴化された培地が特に有益である。
【０１００】
馴化培地は、血清を含まない培地（例えば、血清の代わりに２０％で追加されたＫＯ  ＤＥＭＥおよび４ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ））において約５〜６×１０4ｃｍ-2の密度において、照射された１次マウス胚性線維芽細胞（または別の適切な細胞調製）を培養することにより調製され得る。培養上清を約１日後に３７℃にて収集する。付着依存性細胞を増殖するためのデバイスには、Ｔフラスコ、ローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ）、ガス透過性バッグ（ｇａｓ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｂａｇ）、ホローファイバーバイオリアクター（ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、フラットベッドバイオリアクター（ｆｌａｔ−ｂｅｄ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、およびパラレルプレートバイオリアクター（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｐｌａｔｅ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）が挙げられる。この細胞が、３次元マトリクスに移される場合、この細胞は、連続攪拌タンクバイオリアクターまたはエアリフトバイオリアクターにおいて培養され得る。
【０１０１】
以下の実施例において例示されるように、代表的に、１〜２日間馴化された培地を使用して、ｐＰＳ細胞培養を１〜２日間支持し、次いで、培地を交換する。この培地は、馴化された後、直接使用され得、それはそのまま、または抽出物として保存され得る（例えば、４℃にて、２、６、もしくは１４日間または−２０℃にて凍結）。この培地をろ過する際には、注意が払われるべきである。他のフィルターが活性を除去するような場合、いくつかのフィルター（例えば、セルロースアセテート２０μ非タンパク結合膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３０７６９）が適切であり得る。初期の研究において、代表的に培地は希釈されずに使用され得る。希釈の有効性および他の操作が、この培地を用いて７日間以上ｐＰＳ細胞を維持すること、そしてこの培養物が未分化ｐＰＳ細胞に特有な特徴を維持するか否かを決定することにより評価され得る。
【０１０２】
所望される場合、馴化培地が、ｐＰＳ細胞培養に利益を与えるさらなる増殖因子ともに使用する前に追加され得る。ｈＥＳのために、増殖因子様ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−４がしばしば使用される。ｈＥＧのために、増殖因子様ｂＦＧＦ、ｇｐ１３０のインデューサー（例えばＬＩＦまたはオンコスタチン−Ｍ）およびおそらく環状ＡＭＰレベルを上昇させる因子（例えば、フォルスコリン）が増殖培地に追加され得る。他の型のｐＰＳ細胞は、培地中の他の因子（例えば、幹細胞因子（Ｓｔｅｅｌ因子、ｃ−ｋｉｔリガンド）またはＩＬ−６）から利益を獲得し得る。馴化する前にｂＦＧＦまたはＦＧＦ−４のような増殖因子の両方をこの培地に添加し、次いで、ｐＰＳ細胞の増殖を支持するためにこの培地を使用する前に再びｂＦＧＦまたはＦＧＦ−４のような増殖因子の両方をこの培地に添加することはしばしば有益である。
【０１０３】
本明細書中に記載される各条件が、独立して最適化され得、そして特定の条件の組み合わせが、さらなる試験に対して有効であると証明されることが認識されるべきである。このような最適化は、慣用的な実験の問題であり、この開示において提供される本発明の趣旨から逸脱しない。
【０１０４】
（馴化培地のために適切な細胞株）
マウス線維芽細胞の初代培養に対する代替物として、馴化培地が、他の細胞型から調製され得る。テロメア化された胚性線維芽細胞株および線維芽細胞の形態学的特徴を有する分化したｐＰＳ細胞が例示的である。
【０１０５】
（馴化培地のための例示的な非ヒト細胞株）
代表的に、フィーダー細胞は、線維芽細胞型の細胞を含む。１次胚細胞または胎性フィーダー細胞培養は、細胞の混合された集団であり、線維芽細胞ならびに初期の筋肉細胞および神経細胞の形態を有する細胞を含む。その集団において異なる細胞は、ｐＰＳ培養を支持する際に異なる役割を果たし得、そしてその培養の分布および特徴が変化し得る。
【０１０６】
より持続性のフィーダー細胞株が、非ヒト種由来（例えば、マウス（先に記載されたように調製された））の胚性線維芽細胞を使用して本発明に従って培地を産生するために開発され得る。この細胞は、遺伝的に不死化遺伝子（例えば、テロメラーゼを発現する遺伝子）で改変される。細胞をテロメア化し、そしてテロメラーゼ活性を試験するための手順は、この開示において後ほど見出され得る。
【０１０７】
さらに、馴化培地のために使用される細胞は、遺伝的に改変され、１つ以上のさらなる特徴を提供する。例えば、スクリーニングの目的のために、１つ以上の抗生物質（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはピューロマイシン）に対する薬剤耐性遺伝子とともに細胞が提供され得る（実施例８）。細胞は、マーカー遺伝子（例えば、緑蛍光タンパク質（実施例８）、βガラクトシダーゼまたは免疫単離のためにタグを提供する特定の細胞表面抗原（例えば、短縮型ＮＧＦレセプター）とともに提供され得る。細胞はまた、ｐＰＳ培養を支持するための培地の効力を提供する因子の生合成および分泌のための遺伝子とともに提供され得る。ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および本開示において列挙される他の栄養補給剤が例示的である。
【０１０８】
培地を馴化するために使用される細胞株の複製能力を増加させるために、本開示の他のところで記載されるように細胞株はテロメア化（さもなくば不死化）され得る。
【０１０９】
（馴化培地のための例示的なヒト細胞株）
ヒト胚由来細胞から分化した特定の特徴を有する細胞を使用して、未分化ｐＰＳ細胞の培養を支持し得ることが発見された。ヒト胚細胞由来の特定の線維芽細胞様細胞（または間葉細胞）は、この特性を有し、そして先に記載されたアッセイに従って同定され得る。
【０１１０】
適切な細胞を得るための例示的な方法は、ｐＰＳ細胞（例えば、ｈＥＳ細胞）の培養物を分化させることを含む。特定の表現型を有する分化した細胞は、混合された分化細胞の集団の中から選択され、そして選択された細胞を用いて培養することにより馴化された培地が、実質的にフィーダー細胞を含まない培養環境下においてｐＰＳ細胞の増殖を支持するその能力について試験される。
【０１１１】
ｐＰＳの分化は、例えば、ドナーｐＰＳ細胞培養物の過増殖によって、または胚様体（ＥＢ）を形成させる低い接着特性を有する基質を有する培養容器内でｐＰＳ細胞を培養することによって、最初に凝集体を形成することにより開始され得る。胚様体は、懸濁培養において作製され得る；未分化ｐＰＳ細胞は、短時間のコラゲナーゼ消化によって収集され、クラスターに解離され、そして非接着性細胞培養プレートにプレートされる。その凝集体は数日毎に培地が与えられ、次いで、適切な期間の後、収集される（代表的に４〜８日間）。次いで、この細胞は、培地馴化細胞の濃縮を促進する培地において、および／または基質上で培養される。あるいは、未分化ｐＰＳ細胞の懸濁液を調製し、次いで、培地馴化細胞への調節された分化を促進する基板上に直接プレーティングすることにより、直接ｐＰＳ細胞を区別することによって得られ得る。適切な基材は、ポリ陽イオン性基質（例えば、ポリオルニチン、または細胞外マトリックス）で被膜されたガラスまたはプラスチックのカバースリップを含む。
【０１１２】
一旦、分化されると、その集団は、細胞が発現するいずれかのマーカー（例えば、免疫標識および蛍光分類によって、磁気ビーズによる分類によって、または夾雑細胞の免疫特異的溶解によって）に従って培地馴化細胞について濃縮され得る。
【０１１３】
ｈＥＳ細胞から分化した線維芽細胞様細胞は、本発明に従う馴化培地について特に適切であることが発見された。線維芽細胞様細胞が形態学的基準（特に、結合組織において見出される線維芽細胞のものと類似する細胞質プロセスを有する細胞の星状形態または紡錘形態）によって認識され得る。細胞の線維芽細胞性質のさらなる確認が、マーカーおよびその細胞の分泌産物（例えば、コラーゲンマトリクス、コラゲナーゼ、および線維芽細胞増殖因子の種々のアイソタイプ（特にｂＦＧＦ））によって得られ得る。これらのマーカーは、転写または翻訳レベルにおいて検出される。
【０１１４】
次いで、分化したｐＰＳ細胞は、上記で概要を述べられたアッセイに従って試験され得、分化したｐＰＳ細胞は、培地がフィーダーを含まない培養におけるｐＰＳ細胞増殖を支持するという様式において馴化培地に適切であるか否かを決定する。
【０１１５】
この様式においてｈＥＳから分化し、かつ選択された細胞株は、代表的に、細胞培養において少なくとも約３０日間複製し得る（実施例１２および１３；図１２）。いくつかの実施形態において、その細胞は６０日間または１２０日間複製する（約１０倍増、２５倍増、または５０倍増）。高い複製能力は部分的である。なぜなら、これらの細胞は、実質的に不死である幹細胞から分化され、そして一次胚細胞と矛盾のない長さのテロメアを有するためである。これらの細胞は、しばしば、さらなる適応を伴わずに馴化培地に適切である。所望される場合、その細胞はまた、遺伝的に改変されて、テロメラーゼ逆転写酵素を発現し得るか、さもなくば、先に記載されるように不死化される。これは、老化を未然に防ぎ、そして非改変化細胞の複製能力を超えて複製能力を増加させ、これは、この培地の商業生産を促進し、かつバッチ間の再現性を改善する。
【０１１６】
必要に応じて、馴化培地に適した分化したヒトＰＳ細胞はさらに適応され得、例えば、前節において記載されるように、遺伝的に細胞を改変して、増殖因子様ｂＦＧＦを発現させるか、もしくはＴＥＲＴを発現させるか、もしくはその細胞を不死化させることによって適応され得る。
【０１１７】
（それを産生するために馴化培地および細胞を試験する工程）
馴化培地は、ｐＰＳ細胞を初代マウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）（証明された標準）により馴化された培地の代わりにフィーダーを含まない培養系にスワップすることにより、ｐＰＳ細胞を支持する能力について試験され得る。ｐＰＳ細胞が、実質的に未分化な状態で増殖する場合、その馴化培地は、フィーダーを含まない培養においてｐＰＳ細胞を支持するものとして特徴づけられ得る。
【０１１８】
ｐＰＳ細胞が分化するか否かを決定するための都合良い方法は、そのコロニーの形態的特徴を理解することである（以下に記載される）。このアッセイ方法に従って、コンフルエント未満の培養物（代表的に、継代約５日間後）における未分化ｐＰＳ細胞の割合が、少なくとも、その馴化培地（必要に応じて、さらなる増殖因子を追加されるか、そうでなければ適切な場合には処理される）における４回の継代の間に実質的に減少しない場合、馴化培地はｐＰＳ細胞の増殖を支持し得ると見なされる。
【０１１９】
所望される場合、このアッセイの定量的読み出しが得られ、この培地中のｐＰＳ細胞支持因子の質または濃度を評価し得る。１つの例において、基礎培地が、種々の期間（例えば、６時間、１２時間、２４時間および４８時間）の間馴化され、そしてその馴化培地は、連続２４時間の期間の間、フィーダーを含まないｐＰＳ細胞培養物を支持するそれらの能力についてそれぞれ試験される。短い処理時間という理由のため、短い馴化期間により有効性を与えられた培地が所望され得る。別の例において、２４時間馴化された基礎培地が、ｐＰＳ培養を支持する能力について希釈分析により試験される（基礎培地における希釈工程、必要に応じて他の栄養剤が追加される）。より大きな希釈の後に有効である培地（例えば、１：１、１：２および１：４の馴化培地：希釈培地）が、保存の容易性のために所望され得る。特定の特徴の選択は、この適用に依存する。
【０１２０】
細胞株は、適切な時間で基礎培地において細胞を培養することにより、馴化培地を産生する能力について試験され得、次いで、上記のように、フィーダーを含まないｐＰＳ細胞培養を支持する能力についてその培地を試験する。馴化培地が、フィーダーを含まないｐＰＳ培養物を支持しない場合、その馴化の方法は、種々にパラメーター（例えば、培養時間、使用される基礎培地、細胞密度および培養後の培地の可能な処理またはさらなる添加剤の追加）において調節され得る。これらおよび他のパラメーターの調節は、経験的に、および慣用的な実験の問題として実行され得る。細胞株が、馴化の間の任意の培養パラメーターの慣用的な最適化後に、フィーダーを含まないｐＰＳ培養を支持する馴化培地を産生する場合、細胞株はその試験を通過したと見なされる。
【０１２１】
所望される場合、馴化培地およびこの培地を産生する細胞は、以下に記載されるように、それらが支持するｐＰＳ細胞の他の特徴に基づいて、さらに評価され得る。
【０１２２】
（馴化培地のバッチ産生）
本発明の馴化培地は、この培地において細胞を培養することにより産生され、次いで、その細胞培養物から馴化培地を収集する。
【０１２３】
馴化のために使用される細胞は、すでに記載されるように、フィーダーを含まない形態においてｐＰＳ細胞を支持する能力を馴化培地に与える様式において培地を馴化する能力を有する。馴化のために使用される基礎培地は、任意の異なるいくつかの製法を有し得、その製法は、使用される細胞の型に部分的に依存する。その培地は、少なくとも培地の馴化のために使用される細胞株の培養を支持することが可能でなくてはならない。馴化後、その培地はまたｐＰＳの培養を支持することが都合が良い。しかし、代替物として、この培地は、他の因子を追加され得るか、さもなくば馴化後、ｐＰＳ細胞の培養について培地を適合するために処理され得る。
【０１２４】
フィーダーを含まない培養においてｐＰＳ細胞を支持するために、適切な基礎培地が、以下の成分から作製され得る；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウト（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ）ダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；Ｈａｍ’ｓＦ１２／５０％ＤＥＭＥ基礎培地；２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；βメルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示的な血清含有ＥＳ培地は、８０％ＤＥＭＥ（代表的にＫＯ  ＤＥＭＥ）、２０％限定されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（熱非働化していない）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールとともに作製される。この培地をろ過し、そして４℃にて２週間を超えないように保存する。血清を含まないＥＳ培地は、８０％ＫＯ  ＤＥＭＥ、２０％血清置換、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールとともに作製される。すべての血清置換が役に立つわけではない；有効な血清置換は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８（特許製法；その製造業者から入手可能な製品）である。この培地をろ過し、そして４℃にて２週間を超えないように保存する。馴化のために使用される細胞を組み合わせる直前に、ヒトｂＦＧＦが、４ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで添加され得る。
【０１２５】
次いで、細胞にｐＰＳ細胞を支持する成分を培地に放出させるような環境下において、この選択培地を馴化のために使用される細胞と組み合わせる。必要に応じて、この細胞は、照射（例えば、約４，０００ｒａｄ）により、マイトマイシンＣのような化学的失活剤を用いる処置により、または任意の他の有効な方法によって、不活性化され得る（すなわち、実質的な複製の不能を与えられる）。ｐＰＳ細胞培養物を支持する際に使用する前に、培地が馴化細胞から分離される場合、細胞の不活性化は、必ずしも必要ではない。
【０１２６】
この細胞は、ｐＰＳ細胞培養を支持する放出された因子の適切な濃度を可能にするための十分な時間で培地において培養される。代表的に、２４時間３７℃において培養することにより馴化された培地は、ｐＰＳ細胞培養物を２４時間支持する因子の濃度を含む。しかし、培養期間は、より長くまたはより短く調節され得、経験的に（または必須因子の濃度をアッセイすることにより）適切な期間を構成するものを決定する。馴化培地のバッチを収集した後、この細胞を使用して、さらなる培養期間（細胞が、適切な方法において培地を馴化する能力を保持する限り、所望される場合と同じくらい多くのサイクルの間）にわたって、さらなるバッチの培地を馴化し得る。例えば、胚性幹細胞の分化に由来する線維芽細胞様細胞を使用して、１日周期で１〜２週間にわたって培地を馴化し得る（実施例１２および１３）。
【０１２７】
培地を馴化するための培養装置の選択は、培地収集の規模および目的に基づいてなされ得る。初期の研究において、そしてスクリーニングする目的のために、標準的な培養フラスコまたは複数のウェルプレートにおいて培養培地を産生することは、しばしば都合が良い。初期のスケールアップが、多数の面を有するより大きな容器においてなされ得る（例えば、Ｎｕｎｃ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）。ラージスケール、自動化、またはＧＭＰに従う産生は、より特殊化されたデバイスの使用を含み得る。
【０１２８】
連続的細胞培養系は、Ｊ．Ｆｕｒｅｙ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ  ２０：１０、２０００年５月１５日）により概説されている。灌流培養は、培養チャンバーからの培地の除去を含み、そして新鮮な培地を補填する。スピンバスケット系において、バスケット様デバイスをドライブシャフトに接続し、そして培地が交換され得る多孔性スクリーンにより覆われる。外部フィルター灌流系において、培養液は、中空繊維フィルターモジュールを介して容器から循環され、そしてその循環を提供するためのループに接続されたポンプを用いて、容器にもどす。特定の灌流系、ＡＴＦ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪから市販）は、中空繊維ハウジングの一方の末端にある膜ポンプ、バイオリアクターと接続される中空繊維ハウジングのもう一方の末端から構成される。そのファイバーを介する、交流する接線方向の流れは、低い剪断層流を産生し、これは高流速、拡張性、および異なるバイオリアクターに対する適応性を提供する。
【０１２９】
ラージスケール培養系はまた、Ａａｓｔｒｏｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  ＭＩから入手可能である。Ａａｓｔｒｏｍ  ＲｅｐｌｉｃｅｌｌTM系は、小さな開始細胞集団からの拡張を提供する（Ｋｏｌｌｅｒら、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌ．２１：６５３、１００９；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８６：１７８４、１９９５）。Ｃｅｌｌｓｔａｓｉｓ（登録商標）培養技術は、Ｇｅｎｅｓｐａｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｏｔｈｅｌｌ  ＷＡにより市販される。細胞は、キャピラリー外空間に存在し、そして中空線維は、培養環境に新鮮な培地および酸素をもたらす（Ｒ．Ｌｅｗｉｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ１８（９）、１９９８年５月１日）。任意の他の適切なデバイスが、本発明とともに使用され得る。米国特許第４，５０１，８１５号は、分化細胞を培養するためのデバイスを記載する。米国特許第４，２９６，２０５号は、細胞培養および連続透析フラスコならびにそれらの用途を記載する。米国特許第５，９９４，１２９号は、生物学的細胞を維持する際に使用する移動式カセットを記載する。米国特許第５，３６２，６４２号は、細胞培養培地の貯蔵、再構成、分配、および収集についての閉じ込め系（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）を記載する。米国特許第６，０２２，７４２号は、培養デバイスおよび方法を記載する。
【０１３０】
本発明の特定の実施形態は、馴化培地を調製するための適合するデバイスであり、このデバイスは、培地を馴化し得る本発明の細胞を含む培養チャンバーおよび細胞による馴化の後、培養チャンバーから培地を回収するために必要に応じて閉鎖し得る排出ポートを有する。そのデバイスはまた、馴化された培地から培養細胞を分離させるプレート、中空線維、または他の構造の形態において大量移行ミクロ細孔表面を有し得、これは培地の自由な通過を可能にし、排出ポートへの通過を提供する。このデバイスはまた、新鮮な培地を導入するか、さらなる細胞を導入するか、または死細胞および細胞破片を除去するための１つ以上のポートを有し得る。連続フロー系について、ポンプは、循環を提供するために培地入口ポートまたは培地排出ポートに接続され得る。
【０１３１】
馴化培地の収集の後、適切である場合、馴化培地はｐＰＳ細胞増殖を支持するために直接使用され得る。この培地が、ろ過され、凍結され、さもなくば初めて新しい技術を使用して処理された場合、小さなバッチを試験して、再構成された培地においてなおも活性が存在するか否かを決定することは、価値がある。
【０１３２】
ある実施形態において、馴化培地に、ｐＰＳ細胞培養のためになる付加的な増殖因子を使用前に補充した。ｈＥＳに対して、ｂＦＧＦ様の増殖因子が、しばしば用いられる。フィーダー細胞なしの培養においてｈＥＳ細胞を支持する培地の能力は、培地の馴化の前および後の両方においてｂＦＧＦを加えることによって利益を得うることが見出された(実施例１１)。ｈＥＧに対して、培養培地に、ｂＦＧＦ様の増殖因子、ＬＩＦ、ＩＬ−６またはオンコスタチン−Ｍのようなｇｐ１３０のアクチベーター、およびフォルスコリンまたはコレラ毒素のようなおそらくは環状ＡＭＰレベルを上昇させる因子を補充し得る、ｐＰＳ細胞の他の型は、（ｃ−ｋｉｔのリガンドである、Ｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒとしても公知の）幹細胞因子のような培地中の他の因子によって利益を得うる。
【０１３３】
特定の実施形態において、馴化培地が、さらに処理される。例えば、塩析または選択的な濾過によって濃縮され得るし、また有効な成分を分離または保管するために抽出され得る。次いで培地抽出物は、ｐＰＳ培養物を支持するために、使用前に新鮮な培養培地によって再構成されるか、またはこれを補充され得る。
【０１３４】
調製後、培地は、上述のように、フィーダー細胞なしの培養においてｐＰＳ細胞を支持するために用いられ得る。それはまた、他の目的に適切であり、そして制限なくそのような目的に用いられ得る。例えば、培地は、さらに細胞の増殖を支持するが、または分化の制限するために、フィーダー細胞の存在下で培養されたｐＰＳに添加され得る。培地はまた、経験的に決定され得るように、培養前駆細胞、または終末分化した細胞の他の型の増殖の維持または促進に用いられ得る。
【０１３５】
（フィーダー細胞非存在下において成長したｐＰＳ細胞の特徴付け）
ヒトＥＳ細胞は、未分化の幹細胞の特徴的な形態的な特色を有する。二次元の標準的な顕微鏡画像において、ｈＥＳ細胞は、その画像の平面、突出した核小体、およびほとんど識別できない細胞接合部を伴う緻密なコロニー形成において核／細胞質の高い比を有する。細胞株は、標準的なＧバンド技術（日常的な核型決定サービスを提供する、オークランドＣＡの細胞遺伝学研究室のような多くの臨床診断研究室において利用可能な技術）を用いて核型決定され得、そして公開されヒト核型と比較され得る。「正常な核型」を有する細胞（その細胞が正倍数性であり、その中にすべてのヒト染色体が存在し、そして目立って変質されていないことを意味する）を獲得することが所望される。
【０１３６】
ｈＥＳ細胞およびｈＥＧ細胞はまた、発現する細胞マーカーの特徴付けられ得る。一般的に、本開示において記述される組織特異的なマーカーは、膜結合型マーカーに対するフローサイトメトリー、細胞内マーカーに対する免疫組織化学、および培地中に分泌されたマーカーに対する酵素結合イムノアッセイのような、適切な免疫学的技術を用いて検出され得る。タンパク質マーカーの発現はまた、マーカー特異的なプライマーを用いた逆転写酵素ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベルで検出され得る。さらなる詳細は、米国特許番号５，８４３，７８０を参照のこと。
【０１３７】
発生段階特異的胎児性抗原（ＳＳＥＡ）は、特定の胚性細胞型に特徴的である。ＳＳＥＡ−１，ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４に対する抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）より入手可能である。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と命名された抗体（Ａｎｄｒｅｗｓら  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒｓ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９８７、前出）を用いて検出可能である。マウスＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１に対する陽性コントロールとして、そしてＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１に対する陰性コントロールとして使用され得る。ＳＳＥＡ−４は、ヒト胚性癌（ｈＥＣ）細胞に一貫して存在する。インビトロにおけるｐＰＳ細胞の分化は、結果としてＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の発現の減少ならびにＳＳＥＡ−１の発現の増加を導く。ＳＳＥＡ−１はまた、ｈＥＧ細胞において見出される。ｐＰＳ細胞はまた、製造者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡ）によって記載されたように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定する工程、および次いでベクターレッドを基質として発色させる工程によって検出され得るアルカリフォスファターゼ活性の存在によって特徴付けられ得る。ｈＴＥＲＴおよびＯＣＴ−４の発現（ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能)ならびにテロメアーゼ活性（ＴＲＡＰアッセイによって検出可能）はまた、多くの型の未分化のｐＰＳ細胞に特徴的である（実施例３）。
【０１３８】
増殖したｐＰＳ細胞の所望される他の特色は、三つすべての胚葉（内胚葉組織、中胚葉組織および外胚葉組織）の細胞へ分化する能力である。ｈＥＳ細胞の多能性は、約３．０Ｘ１０6の細胞を８〜１２週齢の雄性ＳＣＩＤマウスの後脚筋へ注入することによって確認し得る。結果生じる腫瘍は、発生８〜１６週目において４％パラホルムアルデヒドで固定され得、そしてパラフィン包埋後に組織学的に検査され得る。三つすべての胚葉の組織（例えば、軟骨、平滑筋、または横門筋（中胚葉)；毛嚢を伴った重層扁平上皮、心室層、中間層、または外套層を伴う神経管 (外胚葉）；そして、繊毛円柱上皮、および吸収性の腸細胞または粘液分泌杯細胞によって裏打ちされた繊毛(内胚葉)）を示す奇形腫が、発育する。ｐＰＳ細胞の多能性は、本開示の下記の手順に従って、特定の細胞株への分化に関してさらに試験され得る。
【０１３９】
フィーダー細胞非存在下で成長するｈＥＳ細胞の模範的な調製を、実施例１に下述する。培養１９日において、細胞の８０％より多くが、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１について陽性に染色されたが、細胞の１５％未満が、ＳＳＥＡ−１について陽性に染色された。
【０１４０】
本開示に記載の特定の細胞集団は、実質的に未分化であり、そして新たなフィーダー細胞を加えることなく多岐の培養間で継代し得る。特定の継代中に、いくつかの細胞が、分化し得ることが確認された（特に低密度で単一細胞をリプレートした場合、または大きなクラスターが形成され得る場合）。しかし、培養物は、培養期間の間により大きな割合の未分化細胞を代表的には再樹立する。特に目的であるのは、フィーダー細胞なしの系において少なくとも３ヶ月の間増殖され得る細胞である。最適なことに、増殖した細胞が、約２０〜４０時間にすぎない倍化時間を有し得る。
【０１４１】
ｐＰＳ細胞、またはｐＰＳ細胞から分化した細胞の複製能力が増加することが所望される場合、以下に記載の方法を用いて、それらは不死化またはテロメア化（分化前または後のどちらかに）され得る。
【０１４２】
（増殖されるｐＰＳ細胞の直接的な分化)
本発明はまた、ｐＰＳ細胞が、中間段階として胚様体を形成せずに、方向付けられた前駆細胞または十分に分化した細胞へ分化するための新しい系を提供する。
【０１４３】
胚様体の培養における一般的原理は、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ（Ｎｅｗ  Ａｎａｔ．２５７：３２３，１９９９）に報告されている。ｐＰＳ細胞は、凝集が形成するのを許容する様式においてに培養される。多くの選択肢（例えば、ドナーｐＰＳ細胞培養の過成長によるか、またはＥＢ形成を許容する低い接着性質を伴う基質を含む培養容器中でｐＰＳ細胞を培養することによる）が、この様式のために利用可能である。胚様体はまた、懸濁培養においても形成され得る。ｐＰＳ細胞は、短いコラゲナーゼ分解によって収集され、クラスターへ解離され、そして非接着性細胞培養プレートへプレーティングされる。この凝集体は、２〜３日ごとに播かれ、次いで代表的には４〜８日の、適切な期間の後に収集される。この細胞は、次いで、特定の系統の細胞の濃縮を促進する培地および／または基質中で培養され得る。この基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ(登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、または最初にマトリックス産生細胞株を培養し、次いでそのマトリックスが容器の表面に付着し続けるような方法で溶解および洗浄することによって産生されるマトリックスのようなマトリックス構成成分を含み得る。胚様体は、潜在的には内胚葉外面、そして中胚葉外面および外胚葉内面を有する、異種細胞集団を含む。
【０１４４】
ｐＰＳ細胞が、中間の段階として胚様体または凝集体を形成することなく、方向付けられた前駆細胞または終末分化細胞へ分化し得ることが、現在までに発見されている。簡単には、未分化なｐＰＳ細胞の懸濁液が、調製され、次いで分化を促進する固体表面上にプレートされる。代表的には、ｐＰＳ細胞は、過成長が許容される場合、コントロールされない様式において分化するので、このｐＰＳ細胞の培養物は、過密度時においてではなく、十分な密度にまで増殖した場合に、代表的には回収される。適切な懸濁液は、コラーゲナーゼＩＶとともに培養皿を約５〜２０分間インキュベートし、次いで皿から細胞をかき集めることによって調製され得る。この細胞は、例えば、ピペット中で粉砕することによって分離され得る。分化の多くの型について、その細胞が完全には分離していないことが推奨され、ゆえにｐＰＳの大多数は、約１０〜２００の細胞の凝集塊である。
【０１４５】
この懸濁液は、次いで、方向付けられた前駆細胞への調節された分化を促進する基質上にプレートされる。適切な基質は、接着性のガラス表面またはプラスチック表面を含む。例えば、ガラスカバーグラスは、ポリカチオン性基質（ポリリシン、ポリオルニチンのようなポリアミン、または他の同種のポリペプチドもしくは混合されたポリペプチド、または優勢な陽性電荷を伴う他のポリマー）によってコートされ得る。この細胞は、次いで、所望される細胞株への分化を促進するのに適応した、適切な栄養性培地中で培養される。
【０１４６】
いくつかの場合において、分化は、この培養培地から血清および血清置換体を除去することによって促進される。このことは、血清または血清置換体のない培地に置き換えることによって（例えば、再プレーティング時に、未分化細胞の成長を促進するかまたは分化を阻害するこの培地の一つ以上の構成成分を除去することによって）達成し得る。例は、特定の増殖因子、マイトジェン、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および馴化培地中の他の構成成分を含む。
【０１４７】
いくつかの場合において、分化は、所望される細胞株への分化を促進する培地構成成分、または所望されない特徴を伴う細胞の成長を阻害する培地構成成分を加えることによって促進される。例えば、神経系統またはグリア系統へと方向付けられた細胞を産生するために、この培地は、効果的な組み合わせで、以下に示す任意の因子または培地成分を含み得る：脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、レチノイン酸（ＲＡ）、ソニックヘッジホッグ、ＦＧＦ−８，アスコルビン酸、フォルスコリン、胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）。
【０１４８】
多能性幹細胞由来の組織細胞を得るための一般的な原理は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５４３，１９９４）、および米国特許第６，０９０，６２２号に論評される。神経性前駆体、神経系限定（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ）の細胞前駆体およびグリア細胞前駆体に関しては、Ｂａｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００：１２５２，１９９４；Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：９２，１９９７；Ｗｏｊｃｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１３０５−１３０；Ｍｕｊｔａｂａら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１４：１１３，１９９９；および米国特許第５，８５１，８３２号、同第５，９２８，９４７号、同第５，７６６，９４８号、および同第５，８４９，５５３号を参照のこと。心筋および心筋細胞に関しては、Ｃｈｅｎら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ  １９７：２１７，１９９３およびＷｏｂｕｓら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ４８：１７３，１９９１を参照のこと。造血性の前駆体に関しては、Ｂｕｒｋｅｒｔら、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．３：６９８，１９９１およびＢｉｅｓｅｃｋｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１：７７４，１９９３を参照のこと。米国特許第５，７７３，２５５号は、グルコース反応性インシュリン分泌膵β細胞株に関する。米国特許番号第５，７８９，２４６号は、肝細胞前駆細胞に関する。目的の他の前駆体は、軟骨細胞、骨芽細胞、網膜色素上皮細胞、繊維芽細胞、皮膚細胞(例えば、ケラチンノサイト、樹状細胞、毛胞細胞、腎管上皮細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞）、精巣前駆体、および血管上皮細胞にを含むが、これらに制限されない。
【０１４９】
Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの研究者は、成長因子レセプターに結合するリガンドの存在下においてｐＰＳ細胞または胚様体細胞を培養することが、神経性前駆細胞の富化を促進することを発見した。この成長環境は、フィブロネクチンのような神経細胞支持可能な細胞外マトリックスを含み得る。適切な増殖因子は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、そしてこれらリガンドに対するレセプターに対する抗体を含むが、これらに限定されない。レチノイン酸のような補因子もまた、含まれ得る。培養された細胞は、次いで、Ａ２Ｂ５のようなマーカーを発現するか否かを基準にして必要に応じて分離され得る。適当な環境下において、Ａ２Ｂ５マーカーの発現が豊富な細胞の集団は、神経細胞（成熟したニューロンを含む)、およびグリア細胞(星状細胞および稀突起膠細胞を含む)の両方を産生する能力を有し得る。必要に応じて、例えば、ｃＡＭＰのアクチベータ−を含む培地中での培養によって、この細胞集団は、さらに分化する。目的のマーカーは、以下を含むが、それに限定されない：ニューロン特異的βチューブリンＩＩＩまたは微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）；星状細胞に存在するグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；稀突起膠細胞特異的ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；未分化ｈＥＳ細胞に特徴的なＯＣＴ−４；神経前駆体および他の細胞に特徴的なネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）またはムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）；およびにｐＰＳ細胞から分化した神経性前駆体の集団に見られるＡ２Ｂ５およびＮＣＡＭの両方。
【０１５０】
Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの研究者はまた、肝細胞分化薬剤の存在下におけるｐＰＳ細胞または胚様体細胞の培養が肝細胞様細胞の富化を促進することを発見した。この成長環境は、コラーゲンまたはＭａｔｒｉｇｅｌ(登録商標)のような肝細胞支持可能な細胞外マトリックスを含み得る。適切な分化薬剤は、酪酸塩およびそのアナログの種々の異性体（ｎ−酪酸塩によって例証される）を含む。培養された細胞は、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）様のような有機溶媒のような肝細胞成熟因子；レチノイン酸のような成熟補因子；またはサイトカインもしくはホルモン（例えば、グルココルチコイド、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、インシュリン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ），ヘパリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ−１およびＩＬ−５）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、およびヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ−１））と、必要に応じて同時に、または連続的に培養される。ｐＰＳ細胞から分化した肝細胞株は、以下に示すマーカーの少なくとも三つを代表的には示す：α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）合成、アルブミン合成、アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＲ）発現、α−胎児性タンパク質の不在、グリコーゲン貯蔵の証拠、シトクロムｐ４５０活性の証拠、およびグルコース６リン酸化酵素活性の証拠。
【０１５１】
ｐＰＳ細胞由来の混合した細胞集団に存在する細胞の型は、特徴的な形態およびそれらの発現するマーカーによって認識され得る。骨格筋に関しては：ｍｙｏＤ、ミオゲニン、およびｍｙｆ−５。内皮細胞に関しては：ＰＥＣＡＭ（血小板内皮細胞接着分子)、Ｆｌｋ−１、ｔｉｅ−１、ｔｉｅ−２、血管内皮（ＶＥ）カドヘリン、ＭＥＣＡ−３２、およびＭＥＣ−１４．７。平滑筋に関しては：特異的ミオシン重鎖。心筋細胞に関しては：ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心性トロポニンＩ、αミオシン重鎖、およびＡＮＦ。膵細胞に関しては：ｐｄｘおよびインシュリン分泌。造血細胞およびその前駆体に関しては：ＧＡＴＡ−１、ＣＤ３４、β主要グロブリン、およびβ主要グロブリン様遺伝子βＨ１。
【０１５２】
適切な表面上への直接的なプレーティングによって、またはフィーダー細胞なしの培養においてｐＰＳ細胞を提供し、そして適切に培地を交換することによって分化するｐＰＳ細胞は、系統制限された細胞または終末分化した細胞の驚くほど同種の集団を産生し得る。用いられる条件に依存して、５０％を十分超えて同種性を有する細胞集団（７５％、９０％、または９８％同種性と同程度に)は、識別する技術の使用を有する必要なしでさえ、得られ得る。
【０１５３】
治療目的に関して、分化した細胞集団が、未分化のｐＰＳ細胞を実質的に含まないことが通常所望される。この集団から未分化な幹細胞を除去する一つの方法は、未分化な細胞において優先的な発現を生じるプロモーターの制御下にエフェクター遺伝子を有するベクターでこの細胞を形質転換することである。適切なプロモーターは、ＴＥＲＴプロモーターおよびＯＣＴ−４プロモーターを含む。エフェクター遺伝子は、この細胞を直接溶解し得る（例えば、毒素またはアポトーシスのメディエータをコードする遺伝子）。あるいは、エフェクター遺伝子は、仔の細胞を抗体またはプロドラッグのような外部の薬剤の毒性効果感受性にし得る。それが、ガンシクロビルに感受性であるように発現される細胞を生じる単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子が、例である。適切なＴＥＲＴプロモーターｔｋ構築物は、ＷＯ９８／１４５９３（Ｍｏｒｉｎら）中に提供される。
【０１５４】
（ｃＤＮＡライブラリー)
フィーダー細胞と共に成長したかまたはフィーダー細胞なしの培養物から成長した未分化なｐＰＳ細胞は、これらの細胞の遺伝子発現パターンを反映するｍＲＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを調製するのに用いられ得る。ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡはまた、分化した細胞から作製し得、そして分化中に上方制御または下方制御される転写物について濃縮されたサブトラクションライブラリーの生成に使用し得る。
【０１５５】
（ｍＲＮＡの単離および増幅されたコピーの生成）
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、ｐＰＳ細胞またはそれらの分化した子孫からｍＲＮＡを単離する工程；このｍＲＮＡのポリヌクレオチドコピーを作製する工程、および補充され得る形態でポリヌクレオチドコピーを含むライブラリーを産生する工程を、代表的には含む。代表的には、このポリヌクレオチドコピーは、ｍＲＮＡテンプレートより逆転写酵素反応によって産生されるｃＤＮＡであるが、本来のｍＲＮＡ集団の配列を保持する他の任意の型のコピーは、使用され得る。さらに、異なる供給源(例えば、ｐＰＳおよび分化した細胞)由来のポリヌクレオチドコピーは、この二つの集団の間で差示的発現されるコピーが豊富であるライブラリーの産生のために差し引かれる。選択されたポリヌクレオチドコピーは、クローニングベクター中ヘ代表的に操作されるが、ベクター内、宿主細胞内でのこのコピーの再生の任意の方法、または化学的な手段は、等価なものとして理解される。
【０１５６】
例として、フィーダー細胞なしの培養におけるｈＥＳ細胞は、コラゲナーゼを用いてマトリックスから分離されるか、遠心によって収集されるか、または適切な溶媒を用いて培養中で直接的に溶解される。総ＲＮＡは、標準の技術の適切な組み合わせ(例えば、酸フェノール／クロロホルム抽出、ＣｓＣｌを通した遠心、オリゴｄＴマトリックスへの結合、など；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと)によってその細胞から調製する。実施例１４に示すように、総ＲＮＡは、グアニジウムイソチオシアネートの溶液中で細胞を溶解する工程およびＲＮｅａｓｙ(登録商標)スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）のような適切なマトリックスに懸濁液中のＲＮＡを結合する工程によって、収集されたｈＥＳ細胞から単離され得る(米国特許第５，２３４，８０９号）。総ＲＮＡは、マトリックスから溶出され、次いでポリＡ+ｍＲＮＡが、結合したｄＣ10Ｔ30オリゴヌクレオチドを有するＯｌｉｇｏｔｅｘTMビーズへ結合されることによって得られる。この結合画分は、低塩緩衝液中に収集され、そしてｃＤＮＡライブラリーを調製するのに用いられ得る。
【０１５７】
種々の方法は、ｍＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへ変換するために利用可能である。産生物は、開始ｍＲＮＡ集団をあらわすように設計された一次ライブラリーを含む：サブトラクションライブラリー（一つの集団において優先的に発現するｍＲＮＡを濃縮するために、二つ以上の異なるｍＲＮＡ集団に共通するｍＲＮＡ種が、最終ｃＤＮＡ調製物において減少されるライブラリー)；規格化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ライブラリ−(独立したｍＲＮＡの相関的存在度が、等しい表示に平均化されるライブラリー)；および全長偏向（ｂｉａｓｅｄ）ライブラリー（ｃＤＮＡの産生物が、本来のｍＲＮＡのコード配列全体を含むｃＤＮＡを高頻度に産生するように至適化されるライブラリー）。
【０１５８】
これらの方法における第一の反応は、代表的には、オリゴｄＴプライマーまたはランダムヘキサマープライマーによってプライムされた温度依存的な逆転写反応を用いたｍＲＮＡの一本鎖ｃＤＮＡへの任意の変換である。この反応は、商業的供給業者から容易に入手可能な種類の酵素である、逆転写酵素によって触媒される。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ(登録商標)（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）が、例であり、これは、天然の酵素のＲＮＡｓｅＨ活性が減少し、それによって全長第一鎖ＤＮＡの産生の頻度が増加する逆転写酵素の改変型である。オリゴｄＴプライマーは、クローニングを容易にする制限エンドヌクレアーゼ認識配列を５’端に組み込むように、代表的には改善される。しばしば、一つのヌクレオチド三リン酸のメチル化型が、第一鎖反応に含まれる。そのため、最終ｃＤＮＡは、最終産物を制限するのに代表的に用いられる制限エンドヌクレアーゼによる消化から防御される。
【０１５９】
逆転写酵素反応の一本鎖ｃＤＮＡ産物の二本鎖ｃＤＮＡへの変換は、いくつかの手段によって達成され得る。代表的には、第一鎖ｃＤＮＡは、適切なＤＮＡポリメラーゼによる相補的な鎖合成のプライムを許容するように適応する。ＳＭＡＲＴTM  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、第一鎖産物の末端の末端シトシン残基からの第二鎖合成をプライムする鎖スイッチオリゴヌクレオチドを利用する。第一鎖ｃＤＮＡ産物を適応させる他の技術は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いたホモポリマー尾部の導入、続いて相補的なホモポリマーによる第二鎖プライミング、または適切なオリゴヌクレオチドの連結、続いて連結したオリゴと相補的なプライマーによる第二鎖プライミングを含む。この後者のアプローチを用いて、連結したオリゴヌクレオチドおよびその相補体は、クローニングを容易にする制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むように設計され得る。
【０１６０】
一つの例において、ＲＮＡｓｅ  Ｈの作用が、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に切れ目を導入するのに用いられ、次いでこの二重鎖は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＰｏｌ１のようなＤＮＡポリメラーゼのプライミング部位に適切になる。この方法は、有効であるが、配列情報が、ｃＤＮＡの５’端から失われ得る。５’末端（本来のｍＲＮＡのポリＡ＋部位と逆の末端）の上にあるプライミングＲＮＡは、引き続く二本鎖ｃＤＮＡのプロセッシングによって失われる。あるいは、５’配列情報が保存された二本鎖ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプライマーと第一鎖ｃＤＮＡの３’端との連合を含む。この連合反応は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（一本鎖オリゴヌクレオチドの末端５’リン酸を第一鎖ｃＤＮＡ産物の３’ヒドロキシルに連結し得る酵素）によって触媒される。用いられたオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡへの連合を許容するために５’末端リン酸を提供し、そして自己鎖状体化を防ぐためにアミノ誘導体またはジデオキシ誘導体のような３’ブロッキング基を提供するように合成される。このオリゴヌクレオチドはまた、引き続くベクターへのクローニングに適切な部位を適合させる制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする。第一鎖産物へのオリゴヌクレオチドの連合に引き続き、第二鎖ｃＤＮＡ合成は、熱安定性のポリメラーゼのような適切なＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて、連合したオリゴと相補的なオリゴヌクレオチドによってプライミングされる。配列例：第一鎖ｃＤＮＡ連合オリゴ５’Ｐ−ＡＧＧＴＣ  ＧＡＣＧＡ  ＧＡＧＡＧ−３’ＮＨ−Ｘ（配列番号１）、ここではＰ＝リン酸、ＮＨ−Ｘ＝アミンブロッキング基；相補的オリゴ５’ＯＨ−ＣＴＣＴＣ  ＴＣＧＴＣ  ＧＡＣＣＴ−ＯＨ−３’（配列番号２）、ここでは−ＯＨ＝ヒドロキシル基。
【０１６１】
特定の手順が、サンプル中の全長ｃＤＮＡの比率を増加するのに用いられ得る。この目的に適切なのは、ＲＩＫＥＮ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｊａｐａｎにおいて開発された技術（Ｃａｒｎｉｎｃｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３：１９，１９９９；Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．９：４６３，１９９９；国際特許出願ＷＯ９８／２０１２２も参照のこと）である。ｍＲＮＡは、ビオチンをそのｍＲＮＡの５’末端の７−メチルＧキャップ構造に加えることによって適合される。第一鎖ｃＤＮＡの産物は、すでに記載のように達成され、そしてｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドは、一本鎖ｍＲＮＡを分解するＲＮＡｓｅＩで処理される。全長ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって保護されないｍＲＮＡは、加水分解され、一方全長ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドは、残存する。このハイブリッドは、５’キャップのビオチンと結合するストレプトアビジンでコートされたビーズを用いて精製され、そして標準的技術を用いて二本鎖ｃＤＮＡへ変換される。サンプル中の全長ｃＤＮＡの結果的な比率は、伝統的方法によって作製されたライブラリーに存在するものよりも、代表的に大いに高い。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびＳｅｑｗｒｉｇｈｔ  Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を含むいくつかの商業ベンダーが、全長偏向ｃＤＮＡを産生するためのサービスを提供する。
【０１６２】
サブトラクションライブラリーは、発現レベルが二つのｍＲＮＡ集団の間で異なる遺伝子の豊富な供給源を提供する。サブトラクションライブラリーを作製するための方法は、以下の工程を代表的に含む：ｐＰＳ細胞由来のｍＲＮＡを (例えば、すでに記載のようにｃＤＮＡ集団を形成することによって) 増幅する工程；分化した細胞由来のｍＲＮＡを増幅する工程；ｐＰＳ細胞およびその分化した細胞の両方において発現するｍＲＮＡから増幅したポリヌクレオチドをクロスハイブリダイズさせる条件下で二つのプールを一緒にインキュベートする工程；次いで、クロスハイブリダイズされなかった増幅したポリヌクレオチドを回収する工程。
【０１６３】
同様の方法において、サブトラクションライブラリーは、ｍＲＮＡ単離物の他の組み合わせ（例えば、（フィーダー細胞培養から得たｐＰＳ細胞）対（フィーダー細胞なしの培養中のｐＰＳ細胞）；（部分的に分化した細胞対終末分化した細胞）；（または二つ以上の異なる系統の分化した細胞の集団））から作製され得る。別の例において、（マトリックスもしくは分化を促進するほかの基質上へのプレーティングによって、またはＤＭＳＯもしくはレチノイン酸のような薬剤での処理によって）単層培養において分化したｐＰＳ細胞由来のｃＤＮＡは、それぞれのコロニーの辺縁に形成する分化した細胞の集団を補正するために、フィーダー細胞なしの培養中で成長するｐＰＳ細胞由来のｃＤＮＡから差し引かれる。サブトラクションライブラリーはまた、未分化なｐＰＳ細胞での発現パターンに対する、化合物または培養条件の変化の効果を確証するために、作製され得る。増幅されたｍＲＮＡは、その化合物または条件に曝された細胞から作製され、そしてコントロール細胞から増幅されたｍＲＮＡを差し引かれる。したがって、そのライブラリーは、その変化の結果として上方制御または下方制御される転写産物が濃縮される。
【０１６４】
サブトラクションライブラリーの調製は、以下のように示され得る：二つの独立したｍＲＮＡプールが調製され、一つはテスター（ｔｅｓｔｅｒ）そして他方はドライバ（ｄｒｉｖｅｒ）と称する。この例において、これらは適切な形態（しばしば一本鎖ｃＤＮＡ（一つのプールはセンス方向、他方はアンチセンス方向））に変換され、次いでハイブリダイゼーションさせるために混合される。両方のｍＲＮＡ集団に共通の転写産物は、ハイブリッドを形成し、一方、一つのプールにおいてのみ見出される転写産物、または一つのプールにおいて実質的により高いレベルで発現される転写産物は、ハイブリダイズされずに残存する。次いで、このハイブリッドが、代表的にはクロマトグラフィーのカラムによる分配によってか、またはストレプトアビジン／ビオチンのような特定の生化学的な系を用いた回収によって、取り除かれる。テスターｍＲＮＡプールにおいてより高度に発現する遺伝子がこのとき濃縮されている、残存する一本鎖配列は、適切なベクターにクローン化される。サブトラクションライブラリー作製の多くの変化形が、開発された。規準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を組み込んだ、サブトラクションハイブリダイゼーションの特徴を結びつけた方法は、市販されている（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＳＨ），ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。
【０１６５】
（組換え発現ライブラリーの調製）
これらの技法により作製された二本鎖ｃＤＮＡは、種々のクローニングベクター中に操作され得る。適切なベクター系は、細菌宿主におけるクローニングのための細菌プラスミドおよびλバクテリオファージを含む。このｃＤＮＡがエンドヌクレアーゼ制限された末端とともに生成されるとき、クローニングは、しばしば、対応して制限されたベクターＤＮＡとの連結により達成される。配列分析のためにプラスミドライブラリーが好適である。なぜなら、個々のクローンが、高スループット精製およびＰＣＲ増幅プロトコールによって容易にプロセッシングされ得るからである。
【０１６６】
本発明の特定の実施形態では、このクローニングベクターはまた、単離されたプラークが、遺伝子産物を得るために細胞中にトランスフェクトされ得るように設計された発現ベクターである。従って、増幅された転写物は、転写および翻訳制御要素の制御下でベクター中に配置される。例えば、プラスミドｐＣＭＶＳｐｏｒｔTM６．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）は、多重クローニング部位の対向する側面上にＳＰ６およびＴ７ウイルスＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、クローン化されたｃＤＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖の転写を可能にする。同様に、ＣＭＶプロモーターカセットは、哺乳動物宿主細胞中に導入されるとき、インビボ転写を与える。従って、このようなベクター中に挿入されたｃＤＮＡは、ｐＰＳ細胞を含む種々の宿主細胞における発現について試験され得る。このベクターはまた、多重クローニング部位に隣接するλファージ付着配列に特徴を持ち、それらを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧａｔｅｗａｙTMベクターに適合するようにする。このＧａｔｅｗａｙTM系は、λファージの酵素カクテルおよびＥ．ｃｏｌｉ組換え酵素活性の使用により、クローン化配列のベクター間移動を可能にする配列で特異的に改変されているベクターを含む。これは、ベクター間で配列を移動するとき、制限酵素消化を用いる必要性を取り除く。
【０１６７】
特に重要なのは、多能性幹細胞におけるｃＤＮＡの発現について最適化されたライブラリーである。胚細胞におけるメチル化パターンおよびその他の調節制御機構は、大部分のその他の真核細胞型の中で活性である、ＣＭＶのようなプロモーターの制御下で遺伝子の転写を抑制し得る。ｐＰＳ細胞中で活性なハウスキーピング遺伝子のプロモーターが、人工的に導入されたコード領域の転写を制御するために有効であり得ることが発見された。実施例１４に示されるように、適切なプロモーターを、試験プロモーター配列、グリーン蛍光タンパク質またはβガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子、および薬物耐性遺伝子を含むレポーター構築物を用いて経験的に選択し得る。適切なプロモーターは、分化に失われる細胞の比率を実質的に増加することなく、レポーター遺伝子の発現を引き起こす特徴を有する。この選択戦略を用い、ＰＧＫ、ＥＦ１α、およびＵｂｉＣのプロモーターが、ｐＰＳ細胞で発現可能なライブラリーの構築に有効であると決定された。
【０１６８】
（組換え発現ライブラリーの特徴付け）
ｃＤＮＡライブラリーをいくつかの規準により特徴付け得る。ｃＤＮＡ長の単純かつ直接推定は、個々のクローンからのプラスミド調製物を、ｃＤＮＡ挿入物を放出する制限酵素で消化することによりなされ得る。この消化産物は、アガロースゲルを用いる電気泳動によりサイズ分けされ得、そして中間ｃＤＮＡ挿入物長が計算され得る。発現ライブラリーの特定の特徴付けは、個々のｃＤＮＡクローンの５’末端から生成された配列を、公開データベース中に見いだされる配列と比較することにより達成され得る。本発明のポリヌクレオチド単離物およびクローン化挿入物は、当該分野の任意の適切な方法を用いて配列決定され得る。例として、自動化ＤＮＡシークエンサーを用いて解析されるように蛍光産物を形成するＰＣＲを基礎にする配列決定方法である。プラスミドＤＮＡおよび配列決定プライマーを、蛍光により標識されたジデオキシヌクレオチドトリホスフェートを含むＰＣＲ反応条件下で反応させる。得られる反応産物を、ＡＢＩ  ３７７（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）のような、適切なＤＮＡシークエンサー上で分離する。蛍光シグナルが検出され、生の配列情報に変換され、そして処理される。これらの方法に実質的に基づくＤＮＡ配列決定サービスが、Ｌａｒｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ；およびＩｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡのような会社から商業的に利用可能である。配列をコードするｍＲＮＡのオープンリーディングフレームを得ると、タンパク質遺伝子産物のアミノ酸配列は、通常、このコード配列を遺伝子コードに従って翻訳することによって、さらなる実験なくして決定され得る。
【０１６９】
配列データは、提示される独立遺伝子の数に基づいて、ｃＤＮＡライブラリーの多様性の一般的な推定を提供する。例えば、ＵＮＩＧＥＮＥコレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に対してｃＤＮＡ配列を比較することは、大部分の配列について特有のクラスター同定物の割当を可能にする。評価されたｃＤＮＡの総数に対して割当られたクラスター同定物の数を比較することにより、クローン多様性の推定が達成され得る。
【０１７０】
より複雑でないｍＲＮＡ供給源を提示するライブラリーは、より複雑なｍＲＮＡ供給源から作製されたライブラリーに比較して、所定の数のｃＤＮＡで提示される相対的により少ない独立遺伝子配列を有する。本発明の特定の実施形態では、ｍＲＮＡ調製物、ｃＤＮＡ調製物、およびクローニングベクター中のライブラリーは、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫においてｍＲＮＡレベルで発現される、少なくとも１００、１，０００、１０，０００、または５０，０００もの遺伝子を提示する配列を含む。
【０１７１】
ライブラリーはまた、それらが単一遺伝子型の細胞からの転写物を含むか否かにより特徴付けられ得る。異なるプラークからの粗配列データを、ヒト配列のデータベース、およびこれもまた存在していると疑われる他の種の配列とマッチされる。ライブラリー中の約１％未満の転写物コピーが、それらがｃＤＮＡライブラリーが所望する遺伝子型に由来しなかったことを確立して配列を有する場合、このライブラリーは、その他の種、脊椎動物、哺乳動物、および同じ種の異なる遺伝子型のｃＤＮＡが「本質的にない」と呼ばれる。本開示において記載される無フィーダー培養システムを用いて、外来転写物によるｐＰＳ細胞ライブラリーの汚染の程度は、フィーダー層上のｐＰＳ細胞の最後の培養からの継代の数に依存して０．２％、０．０５％、０．０１％、または０．００１％未満であり得る。
【０１７２】
ｃＤＮＡからの５’配列はまた、注釈付き完全長ｍＲＮＡ配列のコレクションと比較して完全長配列を提示するｃＤＮＡの比率を決定し得る。この文脈では、完全長配列は、コードされるタンパク質の開始メチオニンコドンを含むものとして規定され得る。例えば、５’配列の読みは、ＢＬＡＳＴのような適切なサーチプログラムを用いてＲＥＦＳＥＱコレクション（ＧｅｎＢａｎｋ）と比較され得る。ＲＥＦＳＥＱエントリーにマッチさせるこれらｃＤＮＡ配列について、配列アラインメントの評価は、ｃＤＮＡ配列が、ＲＥＦＳＥＱエントリーによりコードされるタンパク質の開始メチオニンを含むか否かを示し得、そしてそれ故、完全長ｃＤＮＡの比率が推定され得る。このＲＥＦＳＥＱコレクションは、完全長ｍＲＮＡの推定されたサイズを示すために注釈付きであるので、この分析は、特定サイズのｍＲＮＡに対応する完全長ｃＤＮＡのパーセンテージをさらに決定するために評価され得る。例えば、長さが１ｋｂより大きいｍＲＮＡに対応する完全長ｃＤＮＡのパーセンテージに対して、長さが１ｋｂより小さいｍＲＮＡに対応する完全長ｃＤＮＡのパーセンテージを比較することが可能である。
【０１７３】
このような産物が誘導される方法に依存して、対応するｍＲＮＡの全長コード領域を含むｃＤＮＡの比率は、調製物中のポリヌクレオチドまたはベクターの少なくとも１５％、３０％、そしてしばしば５０％であり得る。挿入物の中間長さは、２本鎖ｃＤＮＡ調製物を取得かつ選択するために用いた方法に依存して、少なくとも約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、または４ｋｂであり得る。
【０１７４】
（発現ライブラリーからの情報の使用）
一旦、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの配列が決定されると、それは、このような配列を含むポリヌクレオチド、それらがコードするポリペプチドおよびこのポリペプチドに特異的な抗体の製造に用いられ得る。
【０１７５】
ポリヌクレオチドは、研究、診断、または治療適用における任意の適切な目的のために核酸化学の技法により製造される。ヌクレオチド配列は改変されて、ネイティブのコード領域のセグメントを除去し、付加的コード配列を付加し、または任意の所望の目的のために変異およびその他の改変を導入し得る。実質的に同一のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドフラグメントが、ストリンジェントな条件下で、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫からの発現ライブラリー中のｃＤＮＡに、ヒトゲノム中に含まれるか、またはその他の細胞型で発現されるその他のヌクレオチド配列に優先してハイブリダイズする。約１００塩基対以上のプローブの結合のための高ストリンジェンシーの代表的条件は、２×ＳＳＣ中６５℃のハイブリダイゼーション反応、その後の０．１×ＳＳＣにおける繰り返し洗浄である。特定の実施形態では、製造されたポリヌクレオチドのセグメントは、本開示で記載されたように得たｃＤＮＡについて決定された配列または配列の一部に少なくとも約８０％、９０％、９５％、または１００％同一である。例示の配列と比較された、同一または相同配列中の連続残基の長さは、増加する優先度の順で、少なくとも約１５、３０、５０、７５、１００、２００または５００残基であり得る。
【０１７６】
所望の核酸配列に基づき、ポリヌクレオチドは、任意の適切な技法によって製造され得る。約５０塩基対未満のオリゴヌクレオチドが、商業的サービスによるか、またはトリエステル法もしくはホスファイト法のような公知の合成方法によるかのいずれかにより、化学合成により首尾よく調製される。適切な方法は、モノヌクレオシドホスホルアミダイトカップリングユニット（Ｈｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．１９：２４４９−２４５２、１９７８：米国特許第４，４１５，７３２号）を用いる固相合成である。改変された骨格を持つポリヌクレオチドは、米国特許第５，５７８，７１８号；同第５，５４１，３０７号；同５，３７８，８２５号に記載のように調製され得る。ペプチド核酸の調製は、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７６６，８５５号、第５，７８６，４６１号およびＥＰ出願第９７９１８５４９．２号に記載されている。
【０１７７】
あるいは、ポリヌクレオチドは、所望の配列を持つテンプレートを用いてＰＣＲ増幅により製造され得る。所望の配列に亘るオリゴヌクレオチドプローブをこのテンプレートにアニールし、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、次いで高温で融解させ、テンプレートと伸長したオリゴヌクレオチドを解離させる。このサイクルを、所望の量の増幅されたポリヌクレオチドが得られるまで繰り返す（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）。適切なテンプレートは、ｐＰＳ細胞またはその子孫から調製された発現ライブラリー、またはヒトにおいて対応する遺伝子が発現される任意の組織からのライブラリーを含む。大きなポリヌクレオチドの産生スケール量は、所望の配列を適切なクローニングベクター中に挿入すること、およびクローンを再生することか、またはこの配列を適切な宿主細胞中にトランスフェクトすることのいずれかによって首尾よく得られる。ヌクレオチドクローニングのための技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ（前述）中、および米国特許第５，５５２，５２４号中に与えられる。ポリヌクレオチドは、供給源に従って適合された、フェノール−クロロホルム抽出、アガロースゲル電気泳動、および当該分野で公知のその他の技法のような、核酸化学における標準的な技法により精製され得る。
【０１７８】
ｐＰＳ細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの配列データはまた、コード領域に含まれる配列を含むペプチドを製造するために用いられ得る。アミノ酸配列を改変して、セグメントを除去もしくは付加するか、または任意の所望の目的のために変異およびその他の改変を導入し得る。実質的に同一のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、ヒトゲノム中に含まれるか、またはその他の細胞型で発現されるその他のヌクレオチド配列に優先して、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫からの発現ライブラリーのｃＤＮＡ中にコードされたタンパク質に特異的な抗体によって認識されるエピトープを共有する。特定の実施形態では、ペプチドは、増加する優先度の順で、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ中にコードされるペプチドまたはペプチドフラグメントに、６０％、８０％、９０％、９５％または１００％同一である。プロトタイプのポリペプチドと比較される同一または相同配列の長さは、全長タンパク質の長さまで、増加する優先度の順に、約７、１０、１５、２５、５０または１００残基であり得る。
【０１７９】
ポリペプチドおよびそれらの改変体は、任意の適切な技法により製造され得る。短ポリペプチドは、固相化学合成により調製され得る。固相化学合成の原理は、Ｄｕｇａｓ  ＆  Ｐｅｎｎｅｙ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  ＮＹ  ５４−９２頁（１９８１）、および米国特許第４，４９３，７９５号に見いだされ得る。自動化固相ペプチド合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡから市販されるＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａペプチド合成機のようなデバイスを用いて実施され得る。
【０１８０】
より長いポリペプチドは、インビトロ翻訳系における翻訳、または適切な宿主細胞中の発現により首尾よく製造される。発現ベクターを生成するために、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写および翻訳のための制御要素に作動可能に連結し、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような真核微生物、または昆虫もしくは哺乳動物細胞のような高等真核生物を含む、適切な宿主細胞中にトランスフェクトする。本発明のペプチドを産生するために適切な多くの発現系は、米国特許第５，５５２，５２４号に記載されている。発現クローニングが、Ｌａｒｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸのような商業的サービスから利用可能である。産生後、タンパク質は、代表的には、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはＨＰＬＣを包含し得る、適切な組み合せのタンパク質化学の標準的な方法によって精製される。
【０１８１】
本発明のｍＲＮＡおよびｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドに特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、発現ライブラリー中のタンパク質コード領域からのアミノ酸配列を決定すること、および決定された配列を含むタンパク質で動物を免疫すること、またはそれを免疫コンピテント細胞または粒子と接触させることにより得られ得る。モノクローナル抗体の産生は、Ｈａｒｒｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ（１９８８）のような標準的な文献、米国特許第４，４９１，６３２号、同第４，４７２，５００号および同第４，４４４，８８７号、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７３Ｂ：３（１９８１）に記載されている。特異的抗体分子（必要に応じて単鎖可変領域の形態にある）を得る他の方法は、免疫コンピテント細胞またはウイルス粒子のライブラリーを標的抗原と接触させること、およびポジティブに選択されたクローンを成長させることを含む。Ｍａｒｋｓら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３５：７３０、１９９６、国際特許公開ＷＯ９４／１３８０４、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９０／０２８０９、およびＭｃＧｕｉｎｅｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１４４９、１９９６を参照のこと。本開示のｐＰＳを用いてポジティブ選択すること、および（分化した胚細胞のような）より広範に分布した抗原を持つ細胞または成体由来幹細胞を用いてネガティブに選択することにより、所望の特異性が得られ得る。
【０１８２】
本発明のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡから得られた配列データ由来のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体は、多くの重要な商業的用途を有する。例えば、ｐＰＳ細胞で発現されるが、分化の間に減少する遺伝子またはタンパク質は、未分化状態の分子マーカーとして用いられ得る。抗体のような、これらのマーカーに対応する試薬は、免疫アフィニティー単離または補体媒介溶解による分化細胞の集団から未分化ｐＰＳ細胞を除くために用いられ得る。分化の間に発現レベルが増加する遺伝子またはタンパク質は、同様の様式で、ｐＰＳ細胞由来の特定の細胞型を精製、濃縮、取り出し、または除去するために用いられ得る。これらのマーカーは、中胚葉、内胚葉または外胚葉系列で発現される遺伝子またはタンパク質のような、広範なクラスの細胞分化の指標として供され得るか、または高度に分化した細胞型の限られたスペクトルの特異的マーカーとして供され得る。
【０１８３】
発現の間にアップレギュレートされる遺伝子はまた、ｐＰＳ細胞の特定の系列への分化に影響するために有用である得る。例えば、転写因子、増殖因子、レセプターおよびシグナル伝達分子をコードする導入遺伝子の未分化ｐＰＳ細胞における強制発現は、特定細胞系列への分化に影響する能力について試験され得る。
【０１８４】
（多能性幹細胞の遺伝的改変）
本開示はまた、一時的または安定な様式のいずれかで、遺伝子的に改変されたｐＰＳ細胞を得るための系を提供する。これは多くの目的に所望される。ｐＰＳ細胞の有望な１つは、研究、診断、および治療目的のための異なる組織型のリザーバーを得る能力である。特定の分化した細胞集団の濃縮を促進するために、分化に影響するか、または未分化細胞の除去を補助する遺伝子を導入することが可能であり得る。遺伝子選択の方法は、例えば、米国特許第５，６０２，３０１号、同第５，７３３，７２７号、および同第６，０１５，６７１号；および国際特許公開ＷＯ９８／３２８６８、ＷＯ９９／５３０２２、およびＷＯ９９／５５８４１に記載される。
【０１８５】
特定の実施形態では、本発明は、薬物耐性であるフィーダー細胞の層上にｐＰＳ細胞の組成物を提供すること、この組成物中のｐＰＳ細胞中にポリヌクレオチドを移入すること；およびフィーダー細胞が耐性である薬物を用いてこの組成物中の遺伝的に改変された細胞を選択することによって遺伝的に改変されたｐＰＳ細胞を得る方法を提供する。特定の実施形態では、このポリヌクレオチドは、未分化ｐＰＳ細胞でコード領域の転写を促進するプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質コード領域を含む。他の実施形態では、このポリヌクレオチドは、ｐＰＳ細胞を分化させることにより産生される１つ以上の細胞型でコード領域の転写を促進するプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質コード領域を含む。
【０１８６】
幹細胞を遺伝子的に改変する他の理由は、テロメラーゼの触媒成分（ＴＥＲＴ）のための発現系を提供することによりそれらを不死化すること、またはそうでなければ薬物スクリーニングのようなインビトロ使用のためにそれらを遺伝的に適合させることである。治療適用には、治療遺伝子で細胞を改変するか、または細胞を意図されたレシピエントと組織適合性にすることが有益であり得る。遺伝子改変はまた、分化後のソーティングのための細胞を調製するために用いられる得る。例えば、ｈＥＳ細胞は、ＯＣＴ−４プロモーターまたはｈＴＥＲＴプロモーターのような未分化細胞に特異的なプロモーターの制御下（ＷＯ９８／１４５９３）で、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（細胞をガンシクロビル感受性にする）のような薬物感受性遺伝子でトランスフェクトされる。培養物を分化させた後、残存する未分化細胞を、ガンシクロビルを用いてこの集団から除去し得る。
【０１８７】
ｐＰＳ細胞を、一時的であるか、または安定かつ細胞が分裂するとき遺伝可能であるかのいずれかである遺伝子改変を可能にする様式で遺伝子的に改変し得ることを発見した。この遺伝子的に改変された細胞は、培養中で未分化多能性形態で維持され得るか、またはそれは、遺伝子改変をなお保持しながら他の細胞型に分化され得る。有効な方法は、ｈＥＳ細胞を、初代フィーダー細胞上で増殖するときに遺伝子的に改変されることを可能にすることを発見した。ｈＥＳ細胞がトランスフェクション前に無フィーダー環境中にプレートされる方法もまた提供され、これは、多くの重要な利点を提供する。
【０１８８】
細胞中に移入されるポリヌクレオチドは、代表的には、細胞またはその子孫の表現型を所望の様式に変化させる機能を提供する。例えば、それは、未分化ｈＥＳ細胞中、または特定系列の分化細胞中の転写を促進するプロモーターの制御下にあるコード領域を含み得る。それはまた、アンチセンス反応性、三重鎖形成、またはリボザイム作用のような適切な機構により内因性遺伝子発現に影響し得る。
【０１８９】
ｈＥＳ細胞中にベクタープラスミドを移入する適切な方法は、米国特許第５，５７８，４７５号；同第５，６２７，１７５号；同第５，７０５，３０８号；同第５，７４４，３３５号；同第５，９７６，５６７号；同第６，０２０，２０２号；および同第６，０５１，４２９号に記載されるような、脂質／ＤＮＡ複合体を含む。適切な試薬は、膜濾過水中の、ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）（ケミカルアブストラクツレジストリー名は：Ｎ−［２−（２，５−ビス（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキシペンチル（ｏｘｐｅｎｔｙｌ）｝アミノ）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）と中性脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との３：１（ｗ／ｗ）リポソーム処方物である、リポフェクタミンを含む。例示は、処方物Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TM（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１１６６８０１９から入手可能）である。他の試薬は以下を含む：ＦｕＧＥＮＥTM  ６Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．＃１８１４４４３から得られ得る、８０％エタノール中の非リポソーム形態の脂質と他化合物のブレンド）；およびＬｉｐｏＴＡＸＩTMトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、＃２０４１１０からの脂質処方物）。
【０１９０】
安定な遺伝子改変を持つｈＥＳ細胞を産生するための適切なウイルスベクター系は、アデノウイルスおよびレトロウイルスを基礎にし、そして市販のウイルス成分を用いて調製され得る。
【０１９１】
多くの適用には、ｈＥＳ細胞の遺伝子改変は、２つの異なる協議事項への注意が必要である：十分に高い効率の遺伝子改変を達成すること、および所望されない経路に沿ってｈＥＳ細胞の分化を促進しない様式でこの改変を実施することである。種々のトランスフェクションおよび形質導入系のスクリーニング、ならびに反応タイミングおよび反応条件の最適化は、検出可能な標識をコードする領域を持つ発現ベクターを用いる実験で首尾よく実施され得る。特に便利な標識は、ルシフェラーゼ、またはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような本質的蛍光である。この標識はまた、組織病理学で検出され得るか、または酵素反応によって定量化され得る酵素であり得る。例は、アルカリホスファターゼ、およびβガラクトシダーゼを含む。この標識はまた、標識された抗体で染色され、そして例えば、蛍光活性化細胞計数デバイス中で定量され得る細胞表面タンパク質であり得る。一旦、有効な系が同定され、そして最適化されると、次いでこの標識のコード領域は、目的の遺伝子で置換され得る。
【０１９２】
遺伝子的に改変された細胞を分化についてモニターするために、細胞は、ＳＳＥＡ−４、ＯＣＴ−４、およびＴＥＲＴのような、ｐＰＳ細胞の特徴であるマーカーの発現について試験され得る。トランスフェクション効率は、それによって、未分化表現型を持つ細胞のパーセンテージとして算出され得る。遺伝子的に改変された細胞の多能性はまた、インビトロ（例えば、胚葉体形成による）またはインビボ（奇形腫形成）のいずれかで分化を誘導すること、および産生された細胞型を、遺伝子的に改変されないｈＥＳ細胞によって産生されたものと比較することにより確認され得る。
【０１９３】
これらの規準、ならびにＧＦＰ含有プラスミドベクターを用いたトランスフェクションおよびＳＳＥＡ−４の表面発現を追跡することにより、ｐＰＳ細胞が再プレートされ、そしてベクターを添加する前４８時間の間安定化される場合、遺伝子改変の効率が一般に改善され得ると決定された。ＧＦＰのようなマーカーのピーク発現は、約２４時間後に生じる。
【０１９４】
遺伝子改変の効率はまれに１００％であり、そして、通常、首尾よく改変された細胞について集団を濃縮することが所望される。線維芽細胞フィーダー細胞上でｈＥＳ培養が用いられる場合、この効率は未分化細胞の５〜２０％であり得る。遺伝子的に改変された細胞は、新たな遺伝子型の機能的特徴を利用することにより濃縮され得る。例えば、ｐＰＳ細胞が、ＧＦＰのような標識で、またはＮＣＡＭのような免疫染色可能な表面マーカーと共にトランスフェクトされる場合、ｐＰＳ細胞は、懸濁され、蛍光活性化細胞ソーティングにより分離され、そして再プレートされ得る。読者は、ｐＰＳ細胞の完全な分離が、通常、分化を促進することに注意する。
【０１９５】
遺伝子的に改変された細胞を濃縮する特に有効な方法は、ネオマイシンまたはピューロマイシンのような薬物に対する耐性を用いるポジティブ選択である。これを達成するために、細胞は、マーカー遺伝子または目的の遺伝子のためのベクター系、および薬物耐性遺伝子を提供するベクター系と同時に接触させることにより遺伝子的に改変され得る。この混合物中の薬物耐性遺伝子の比率が低い場合（例えば３：１）、大部分の薬物耐性細胞はまた、目的の遺伝子を含む。あるいは、この薬物耐性遺伝子を、目的の遺伝子と同じベクター中に構築し得る。トランスフェクションが生じた後、培養物を対応する薬物で処理し、そして非トランスフェクト細胞を取り除く。不運なことに、ｈＥＳ培養中のフィーダー細胞もまた、通常、この薬物に感受性である。
【０１９６】
この問題を克服するために、本開示はまた、薬物耐性であるフィーダー細胞を提供する。分化することなくｐＰＳ細胞を増殖させるために適切な環境を提供することが知られる細胞は、薬物耐性遺伝子を導入され、次いでフィーダー細胞として作用するそれらの能力について再評価され得る。あるいは、（原発性マウス線維芽細胞のような）フィーダー細胞は、薬物耐性遺伝子についてトランスジェニックとされた非ヒト哺乳動物から作製され得る。このようなマウスは；例えばＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている。このフィーダー細胞はまた、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、またはＳＶ４０ラージＴ抗原のための発現系で遺伝子的に改変することによって不死化され得る。
【０１９７】
実施例８は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、およびピューロマイシンに対する薬物耐性遺伝子を有し、そしてテロメライズ（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅ）されたＮＨＧ１９０と称される永久フィーダー細胞株を例示する。驚くべきことに、すべての操作、および遺伝子混乱にかかわらず、細胞はなお、高度に有効なフィーダーであり、分化なしにｈＥＳ細胞の増殖を支持するマトリックス基質およびコファクターを提供する。ＮＨＧ１９０細胞はまた、無フィーダー培養中でｈＥＳ細胞を支持する馴化培地を作製するために適切である。実施例９は、薬物耐性遺伝子で遺伝的に改変されたｈＥＳ細胞の長期間選択に、薬物耐性フィーダー細胞がどのように用いられ得るかを例示する。
【０１９８】
ｐＰＳ細胞は、それらが無フィーダー培養中で増殖される場合に特に遺伝子改変を受け易いことが発見された（実施例１０に示される）。ＤＮＡ／脂質複合体を用いる一時的トランスフェクションは６０％程度と高くあり得る。細胞は操作することが容易であり、そしてベクターに対するシンクとして作用するフィーダー細胞は周囲にない。薬物選択は、薬物耐性フィーダー細胞の利用可能性を必要としない。トランスフェクション後増殖する未分化ｐＰＳコロニーの数もまた改善され得る。
【０１９９】
遺伝子改変および薬物選択（薬物耐性フィーダーまたは無フィーダー培養） 後、改変された表現型を示すコロニーを釣り上げ、そしてそれらを別々に培養することが可能である。釣り上げられたコロニーは、２５〜１００細胞の小クランプに分散され、そして適切な環境に再プレートされる。このセクションおよび本開示の他の箇所で概説される戦略のいくつかまたは全部を用いて、少なくとも約２５％、５０％、７５％、または９０％でさえある未分化細胞が、遺伝子的に改変されたｐＰＳ細胞の培養を達成することが可能である。
【０２００】
（テロメル化された多能性幹細胞およびその誘導体）
ｐＰＳ細胞、線維芽細胞、または他の細胞型の複製する能力を増加させることが所望される場合、適切なベクターを用いて（上記に例証するように）、これらの細胞を遺伝的に変化させることによってそれらはテロメル化（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅｄ）され得、その結果、これらの細胞はテロメラーゼ触媒成分（ＴＥＲＴ）を発現する。特に適切なものは、ヒトテロメラーゼの触媒成分（ｈＴＥＲＴ）であり、国際特許公開ＷＯ９８／１４５９２において提供される。いくつかの適用のために、他のＴＥＲＴ配列が使用され得る（マウスＴＥＲＴは、ＷＯ９９／２７１１３において提供される）。
【０２０１】
代表的には、ベクターは、意図された、分化していない細胞株または分化した細胞株において転写を促進する異種プロモーターの制御下でＴＥＲＴコード領域を含む。ＴＥＲＴコード領域の発現を駆動し得る配列には、ウイルスＬＴＲ、エンハンサー、およびプロモーター（例えば、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＭｏＬＶ、ＣＭＶ、ＭＳＣＶ、ＨＳＶ、ＴＫ）、真核生物プロモーター（例えば、β−アクチン、ユビキチン、ＥＦ１α、およびＰＧＫ）、またはそれらの組み合わせ（例えば、β−アクチンプロモーターと組み合わせたＣＭＶエンハンサー）が含まれる。マーカー遺伝子の発現は、ＴＥＲＴ遺伝子と同じプロモーターによって、別々の発現カセットとしてか、ポリシストロン性転写物の一部としてか（ここではＴＥＲＴのコード領域およびマーカー遺伝子は、ＩＲＥＳ配列によって分離され、両方の個々のタンパク質が、単一のプロモーターによって駆動される単一の転写物から作られることを可能にする）、または同じカセットの一部（ＴＥＲＴおよびマーカー遺伝子の両方のコード領域との間の融合物、ＴＥＲＴとマーカー遺伝子の両方の機能を提供するタンパク質を産生する）としてのいずれかで駆動され得る。ヒト細胞におけるテロメラーゼのトランスフェクションおよび発現は、Ｂｏｄｎａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３４９、１９９８およびＪｉａｎｇら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１１１，１９９９において記載される。
【０２０２】
テロメル化の前後で、テロメラーゼ活性およびｈＴＥＲＴ発現は、標準的な試薬および方法を使用して決定され得る。例えば、ｐＰＳ細胞は、ＴＲＡＰアッセイ（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１，１９９７；Ｗｅｉｎｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：４９８，１９９７）を使用してテロメラーゼについて評価される。以下のアッセイキットは、研究目的で市販されている：ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標）ＸＫテロメラーゼ検出キット（カタログ番号ｓ７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．，Ｐｕｒｃｈａｓｅ  ＮＹ）；およびＴｅｌｏ  ＴＡＧＧＧ  テロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡｐｌｕｓ（カタログ番号２，０１３，８９；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）。ｈＴＥＲＴ発現はまた、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡで評価され得る。以下のアッセイキットは、研究目的で市販されている：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ  ｈＴＥＲＴ定量キット（カタログ番号３，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
【０２０３】
細胞を不死化させる他の方法（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードするＤＮＡを用いて細胞を遺伝的に変化させること（米国特許第５，８６９，２４３号、国際特許公開ＷＯ９７／３２９７２）、エプスタイン−バーウイルスを用いる感染、ｍｙｃまたはｒａｓのようなオンコジーンの導入、アデノウイルスＥ１ａのようなウイルス複製遺伝子の導入、および、所望の表現型を有する細胞を不死化された細胞株と融合すること）もまた、意図される。オンコジーン産物およびオンコウイルス産物を用いるトランスフェクションは、細胞が治療目的のために使用される場合は、より適切ではない。
【０２０４】
（増殖させたｐＰＳ細胞およびその誘導体の他の用途）
本明細書の記載は、大量の多能性細胞がフィーダー細胞の必要性なしで商業的に産生され得、次いで前駆細胞または最終分化細胞に分化する方法を提供する。これらの細胞集団は、多くの重要な目的のために使用され得る。
【０２０５】
（特異的抗体の調製）
フィーダー細胞なしで維持されるｐＰＳ細胞は、胚マーカー、幹細胞マーカー、生殖細胞マーカー、およびその細胞で発現され得る他の抗原に特異的である抗体を調製するために使用され得る。本明細書の開示で記載される細胞は、このような抗体を惹起する改善された方法を提供する。なぜなら、これらの細胞には、フィーダー細胞由来の抗原が本質的に夾雑していないからである。ポリクローナル抗体は、免疫原性型の本明細書の開示の細胞を脊椎動物に注入することによって調製され得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生方法は、上記に提供される。本明細書の開示のｐＰＳを使用してポジティブに選択すること、および、より広範に分布する抗原を有する細胞（例えば、分化した胚細胞）または成体由来幹細胞を使用してネガティブに選択することによって、所望の特異性が得られ得る。
【０２０６】
（増殖因子、分化因子、および医薬のスクリーニング）
ｐＰＳ細胞は、培養中のｐＰＳ細胞の特徴に影響を与える因子（例えば、低分子薬物、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）または状態（例えば、培養条件または操作）をスクリーニングするために使用され得る。この系は、試験化合物によるフィーダー細胞の摂動によって引き起こされる二次的な効果によって複雑化されない利点を有する。１つの適用において、増殖に影響を与える物質が試験される。馴化培地は、培養から除かれ、そしてより単純な培地（例えば、ＫＯ  ＤＭＥＭ）が代用される。次いで、異なるウェルが、馴化培地の成分を置換するための候補である可溶性因子の異なるカクテルで処理される。各々の混合物の効力は、処理された細胞が、満足できる様式、最適には馴化培地と同様に、維持および増殖されるか否かについて決定される。強力な分化因子または条件は、試験プロトコールに従って細胞を処置することによって試験され得、次いで処理した細胞が、特定の系統の分化した細胞の機能的特性または表現型特性を発現するか否かを決定する。
【０２０７】
フィーダー細胞を含まないｐＰＳ培養物はまた、薬物探索において薬学的化合物の試験において使用され得る。候補の薬学的化合物の活性の評価は、一般的に、本発明の分化した細胞と候補化合物とを組み合わせること、任意の結果の変化を測定すること、および、次いで、観察された変化を有する化合物の効果を相関付けることを包含する。スクリーニングは、例えば、化合物が特定の細胞型に薬理学的な効果を有するように設計されるためにか、または他で効果を有するように設計された化合物は、意図されない副作用を有し得るためにかのいずれかの理由のためになされ得る。２つ以上の薬物が、可能な薬物−薬物相互作用効果を検出するために、組み合わせて（同時にまたは連続してのいずれかで、細胞と合わせることによって）試験され得る。いくつかの適用において、化合物は、最初に、潜在的な毒性についてスクリーニングされる（Ｃａｓｔｅｌｌら、３７５−４１０頁、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７）。細胞毒性は、細胞の生存可能性、生存、形態に対する効果、特定のマーカー、レセプター、または酵素の発現または放出に対する効果、［3Ｈ］−チミジンまたはＢｒｄＵ取り込みによって測定されるＤＮＡ合成または修復に対する効果、または分裂中期スプレッドによって決定される姉妹染色分体交換に対する効果によって決定され得る。読者は一般に、標準的な教科書「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７、および米国特許第５，０３０，０１５号を参照する。
【０２０８】
（ゲノム研究）
本明細書の開示において記載される細胞は、前駆細胞に特徴的な転写物および新規に合成されるタンパク質の発現パターンを同定するために使用され得、そして分化の経路を指図する際に、または細胞間の相互作用を促進する際に補助し得る。目的の細胞集団の発現パターン（例えば、直接的に分化した、または胚様体もしくは特定の系統の細胞を通して分化したヒトＰＳ細胞）は、コントロール細胞株（例えば、未分化のｐＰＳ細胞、他の型の前駆細胞、最終分化細胞、または別の種の分化した細胞（例えば、アカゲザルＰＳ細胞））と比較される。
【０２０９】
タンパク質レベルで発現を比較するための適切な方法には、上記のイムノアッセイまたは免疫細胞化学技術が含まれる。転写レベルで発現を比較するための適切な方法には、ｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ法（Ｌｉａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６９６６，１９９２）およびマトリックスアレイ発現系（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７，１９９５；Ｅｉｓｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３：１７９，１９９９；Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１  補遺  １：３３，１９９９）が含まれる。
【０２１０】
遺伝子発現の分析におけるマイクロアレイの使用は、Ｆｒｉｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：３１６，２０００；「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ＢｉｏｃｈｉｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ；「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｇｗｙｎｎｅ  ＆  Ｐａｇｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９年８月６日補遺）；Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ２３：４１，１９９９；Ｇｅｒｈｏｌｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：１６８，１９９９；インターネットＵＲＬ  ｗｗｗ．Ｇｅｎｅ−Ｃｈｉｐｓ．ｃｏｍ．における「Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐｓ（ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）」，Ｌ．Ｓｈｉによって一般に概説される。マイクロアレイ分析を実行するためのシステムおよび試薬は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ；Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＭＤ；ＨｙＳｅｑ  Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ；Ｎａｎｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ；およびＳｙｎｔｅｎｉ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣＡ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡより獲得）のような会社から市販されている。
【０２１１】
固相アレイは、所望の位置でプローブを合成することによって、またはプローブフラグメントをプレ合成し、次いで固相支持体にそれを結合させることによってのいずれかで、特定の部位にプローブを結合させることによって製造される。種々の固体支持体が使用され得、これらには、ガラス、プラスチック、セラミックス、金属、ゲル、メンブレン、紙、および種々の組成のビーズが含まれる。米国特許第５，４４５，９３４号は、オンチップ合成の方法を開示し、ここではガラススライドが、光切断性の保護基を含む化学種で誘導体化される。各部位は、マスクを通しての放射によって連続して脱保護され、次いで光保護基を含むＤＮＡモノマーと反応される。プレ合成されたプローブを固体支持体に結合させるための方法には、吸着、紫外線連結、および共有結合が含まれる。１つの例において、固体支持体は、プローブが結合する活性基（例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、エポキシド基、ブロモアセチル基、マレイミド基、またはチオール基）を有するように修飾される（米国特許第５，４７４，８９５号および同第５，５１４，７８５号）。
【０２１２】
プローブアッセイは、代表的には、ハイブリダイゼーション条件のために適切な条件下で目的のヌクレオチド配列を含む可能性のある液体によってアレイを接触させ、次に任意のハイブリッド形成を測定することによって行われる。例えば、サンプル中のｍＲＮＡまたはＤＮＡは、適切な標識（例えば、蛍光標識Ｃｙ３またはＣｙ５）に結合されたヌクレオチドの存在下で増幅される。条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補性の一致または種々の程度の相同性で生じるように適切に調整される。次いで、アレイは洗浄され、そして結合している核酸は、固相と結合している標識の存在または量を測定することによって決定される。異なるサンプルは、発現の相対量についてアレイ間で比較され得、必要に応じて目的の大部分の細胞において発現される遺伝子（例えば、リボソーム遺伝子またはハウスキーピング遺伝子）を使用してか、または、サンプル中の全ヌクレオチドの比率として標準化される。あるいは、２つ以上の異なる供給源からのサンプルは、異なる標識を有する各供給源から増幅されたポリヌクレオチドを調製することによって同じアレイ上で同時に試験され得る。
【０２１３】
例示的な方法は、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓアレイジェネレーターおよびＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘTM  Ｓｃａｎｎｅｒを使用して行われる。マイクロアレイは、９６または３８４ウェル様式で分析されるマーカー配列をコードするｃＤＮＡフラグメントを最初に増幅することによって調製される。次いで、ｃＤＮＡは、スライドあたり５，０００よりも高い密度で、スライドガラス上に直接スポットされる。目的の２つの細胞からのｍＲＮＡ調製物を比較するために、１つの調製物は、Ｃｙ３標識されたｃＤＮＡに転換されるが、他方は、Ｃｙ５標識されたｃＤＮＡに転換される。その２つのｃＤＮＡ調製物は、同時にマイクロアレイスライドにハイブリダイズされ、次いで、非特異性結合を除去するために洗浄される。アレイ上の任意の所定のスポットは、２つのもともとのｍＲＮＡ調製物中の転写物の豊富さに比例して、ｃＤＮＡ産物の各々に結合する。次いで、そのスライドは、標識の各々に適切な波長でスキャンされ、得られる蛍光が定量され、そしてその結果は、アレイ上のそれぞれのマーカーについてのｍＲＮＡの相対的な豊富さの指標を与えるように形式付けられる。
【０２１４】
本発明の分化した細胞を特徴付けること、およびその細胞に影響を与えることにおける使用のための発現産物を同定することには、第１の細胞型（例えば、多能性前駆細胞、または特定の経路に沿って分化し得る細胞）におけるＲＮＡ、タンパク質、または他の遺伝子産物の発現レベルを分析すること；次いでコントロール細胞型における同じ産物の発現レベルを分析すること；２つの細胞型間の相対的な発現レベルを比較すること（代表的には、サンプル中の全タンパク質またはＲＮＡによって標準化されるか、または両方の細胞型において同様のレベルで発現されることが予想される別の遺伝子産物（例えば、ハウスキーピング遺伝子）と比較して）；および、次いで比較した発現レベルに基づいて目的の産物を同定すること、を包含する。
【０２１５】
産物は、代表的には、コントロールと比較して、本発明の分化したｐＰＳ細胞において、その相対的発現レベルが、少なくとも約２倍、１０倍、または１００倍上昇（または抑制）される場合に、目的の産物である。この分析は、必要に応じて、独立した座標軸上で各々の細胞型における発現レベルをマークすることによってコンピューターで補助され得、ここで、各々の座標軸に対するマークの位置は、それぞれの細胞における発現レベルに従い、次いで、マークの位置に基づいて目的の産物を選択する。あるいは、第１の細胞とコントロール細胞との間の発現の差違は、色のスペクトル上で表され得る（例えば、黄色が等価な発現レベルを表し、赤が増大した発現を表し、そして青が抑制された発現を表す場合）。次いで、目的の産物は、目的の１つのマーカーの発現を表す色に基づいて、または複数のマーカーを表す色のパターンに基づいて選択され得る。
【０２１６】
分化の間の発現レベルの変化を受ける遺伝子およびタンパク質は、多数の目的のために興味深い。例えば、発現がｐＰＳ細胞中で高く、そして分化の間に減少する場合、未分化状態の分子マーカーとして使用され得る。これらのマーカーに対応する試薬（例えば、抗体）が使用されて、例えば、免疫アフィニティー単離または補体媒介溶解によって、分化された細胞の集団から未分化のｐＰＳ細胞を除去し得る。発現が分化の間増加する場合に、マーカーは、類似の様式において、ｐＰＳ細胞由来の特定の細胞型を精製、富化、除去、または排除するために使用され得る。これらのマーカーは、細胞分化の広範なクラス（例えば、中胚葉、内胚葉、または外胚葉の系統において発現される遺伝子またはタンパク質）の指標として働き得るか、または、高度に分化した細胞型のマーカーとして働き得る。
【０２１７】
発現の間に上方制御される遺伝子はまた、ｐＰＳ細胞の特定の系統への分化に影響を与えるために有用であり得る。例えば、転写因子、増殖因子、レセプター、およびシグナル伝達分子をコードするトランスジーンの未分化ｐＰＳ細胞での強制的な発現は、特定の細胞系統への分化に影響を与える能力について試験され得る。
【０２１８】
（治療的組成物）
本発明の分化した細胞はまた、その必要のあるヒト患者において組織の再構築または再生のために使用され得る。その細胞は、意図された組織部位にその細胞を移植することを可能にし、そして機能的に欠損している領域を再構成または再生する様式で投与される。
【０２１９】
１つの例において、神経幹細胞は、処置される疾患に従って、中枢神経系の実質部位またはクモ膜下腔内の部位に直接的に移植される。移植は、１μＬあたり２５，０００〜５００，０００細胞の密度の単一の細胞懸濁物または小さな凝集物を使用して行われる（米国特許第５，９６８，８２９号）。神経細胞移植物の効力は、ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１４１０，１９９９）によって記載されるように、急性的に損傷した脊髄についてのラットモデルにおいて評価され得る。首尾よい移植は、損傷において２〜５週間後に存在する移植片由来の細胞（星状細胞、稀突起神経膠細胞、および／またはニューロンに分化した）および損傷した末端から脊髄に沿っての移動、ならびに歩行（ｇａｔｅ）、協調（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）、および重量負荷における改善を示す。
【０２２０】
心筋細胞の効力は、処置がない場合、左心室壁組織の５５％が瘢痕組織になることを引き起こす心臓の低温障害についての動物モデルにおいて評価され得る（Ｌｉら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４，１９９６；Ｓａｋａｉら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９、Ｓａｋａｉら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５，１９９９）。首尾よい処置は、瘢痕の領域を減少し、瘢痕の拡大を制限し、そして、収縮期の血圧、拡張期の血圧、そして生じた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）血圧によって決定されるように、心機能を改善する。心臓傷害はまた、左前空間動脈の遠位の部分において塞栓形成コイルを使用してモデル化され得（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９８）、そして処置の効力は、組織学および心機能によって評価され得る。本発明において具体化される心筋細胞調製物は、心筋を再生するために、そして不十分な心機能を処置するために、治療において使用され得る（米国特許第５，９１９，４４９号およびＷＯ９９／０３９７３）。
【０２２１】
肝細胞および肝細胞前駆体は、肝障害を修復する能力についての動物モデルにおいて評価され得る。１つのそのような例は、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注入によって引き起こされる傷害である（Ｄａｂｅｖａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：１６０６，１９９３）。処置の効力は、肝細胞マーカーについての免疫組織化学的染色、増殖している組織において小管構造が形成されるか否かの顕微鏡的決定、および肝細胞特異的タンパク質の合成を回復させる処置の能力によって決定され得る。肝細胞は、直接的投与によって、または劇症肝不全の後に被験体の肝組織がそれ自体を再生する間に一時的に肝機能を提供する生物補助（ｂｉｏａｓｓｉｓｔ）デバイスの一部として、治療において使用され得る。
【０２２２】
ヒトまたは獣医学的治療のために有用である本発明に従って調製される細胞は、最適には、薬学的組成物中に供給され得、ヒト投与のために十分に滅菌した条件下で調製される等張性の賦形剤を含む。医薬処方物における一般的な原理について、読者は、以下を参照する：Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ  ＆  Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；およびＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ  ＆  Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００。その組成物は、組織再生、または治療的に重要な代謝機能を回復させることにおける細胞の使用について書かれた説明書とともにパッケージされ得る。
【０２２３】
以下の実施例は、さらなる例示のために提供され、そして特許請求の範囲に記載される発明の実施におけるいかなる制限も意味されない。
【０２２４】
【実施例】
（実施例）
（実施例１：ｈＥＣ細胞のフィーダー細胞を含まない継代）
この実験において、初代マウス胚フィーダー細胞上で維持されてきた未分化のｈＥＳ細胞を収集し、次いでフィーダー細胞の非存在下で維持した。培養物ウェルを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコートし、細胞を、放射した初代線維芽細胞の培養物から得られた馴化栄養培地の存在下で培養した。
【０２２５】
（初代マウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）からの馴化培地（ＣＭ）の調製）
Ｃａ++およびＭｇ++を含まないＰＢＳで一回洗浄すること、および１．５〜２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で約５分間インキュベートすることによって、Ｔ１５０フラスコから線維芽細胞を収集した。線維芽細胞がフラスコから脱離した後に、それらの細胞をｍＥＦ培地（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）中で収集した。細胞に、４０００ｒａｄで照射し（１４０ｋＶで５０８秒：Ｔｏｒｒｅｘジェネレーターにおいてシェルフ設定６）、計数し、そしてｍＥＦ培地中に約５５，０００細胞ｃｍ-2で播種した（５２５，０００細胞／６ウェルプレートの１ウェル）。少なくとも４時間後、６ウェルプレートの９．６ｃｍウェル当たり３〜４ｍＬを使用して、培地をＥＳ培地を含むＳＲで交換した。馴化培地を、ｈＥＳ培養物の給餌のために毎日収集した。あるいは、培地を、培養フラスコ中にプレートしたｍＥＦを使用して調製し、毎日、０．３〜０．４ｍＬｃｍ-2で培地を交換した。ｈＥＳ培養物に添加する前に、馴化培地を、４ｎｇ／ｍＬのヒトｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）で補充した。線維芽細胞培養物を、この系で約１週間使用した。その後新しく調製した細胞で置き換えた。
【０２２６】
（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティング：）
増殖因子を減少させたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）または通常のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）を、４℃で融解した．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、冷ＫＯ  ＤＭＥＭ中で１：１０〜１：５００（代表的には、１：３０）に希釈した。０．７５〜１．０ｍＬの溶液を、各９．６ｃｍ2ウェルに添加し、そして室温で１時間、または４℃で少なくとも一晩インキュベートした。コートしたウェルを、冷ＫＯ  ＤＭＥＭで１回洗浄し、その後細胞を添加した。コーティング後２時間以内にプレートを使用するか、または４℃でＤＭＥＭ中に保存し、そして約１週間以内に使用した。
【０２２７】
（ヒトＥＳ培養物：）
非分化のｈＥＳコロニーを、以下のようにフィーダー細胞上のｈＥＳ培養物から収集した。培養物を、約２００Ｕ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ中で、３７℃で５分間インキュベートした。コロニーを、顕微鏡下で、個々のコロニーを２０μＬのピペットチップを使用して拾い上げることによってか、またはかき取って馴化培地（ＣＭ）中で小さなクラスターに解離させることによって収集した。次いで、これらの細胞を、馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に、各９．６ｃｍ2ウェルに対して１５コロニーで播種した（１コロニーが約１０，０００細胞の場合、プレーティング密度は約１５，０００細胞ｃｍ-2）。
【０２２８】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上の播種後の翌日、ｈＥＳ細胞は、小さなコロニー（約１００〜２，０００細胞）として見えた。そしてコロニー間に、分化しているかまたは死滅している細胞に見える細胞が存在した。ｈＥＳ細胞が増殖するにつれて、コロニーは、非常に大きくなり、そしてぎっしり詰まるようになり、このことは培養ディッシュの表面領域の大部分を表す。コロニー中のｈＥＳ細胞は、高い核対細胞質比を有し、そしてフィーダー細胞上で維持されるｈＥＳ細胞に類似の顕著な核小体を有した。コンフルエンスにおいて、コロニー間で分化した細胞は、培養物中の細胞１０％未満を表した。
【０２２９】
播種の６日後、培養物はほぼコンフルエントになった。培養物を、ＫＯ  ＤＭＥＭ中で、１ｍＬの約２００Ｕ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ溶液とともに、３７℃で約５分間インキュベートすることによって分割した。このコラゲナーゼ溶液を吸引し、ウェルあたり２ｍＬのｈＥＳ培地を添加し、そしてｈＥＳ細胞を、ピペットを用いてディッシュからこすり取った。細胞懸濁物を、１５ｍＬコニカルチューブに移し、６ｍＬの容量までにし、そして、１０〜２０００細胞の小さなクラスターに細胞を解離させるために穏やかに摩砕した。次いで、この細胞を、上記のように、ＣＭ中の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートしたプレート上に再播種した。細胞を、１：３または１：６の比で、およそ９０，０００〜１７０，０００細胞ｃｍ-2で播種し、各ウェルにおける容量を３ｍＬにした。培地を毎日交換し、そして１３日目に再度細胞を分割し、そして継代し、そして最初の播種から１９日目に再度行う。
【０２３０】
最初の播種後１９日目に、細胞を収集し、そして細胞表面マーカーに特異的な標識された抗体を使用して、免疫蛍光細胞サイトメトリーによって表面マーカー発現について評価した。この実験からの結果は以下の通りである：
【０２３１】
【表１】
0004919445.tif 000002
フィーダー細胞の非存在下で維持されるｈＥＳ細胞について、高い割合がＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、またはＴｒａ１−８１を発現する。これらの３つのマーカーは、フィーダー細胞上で維持される未分化のヒトＥＳ細胞上で発現される（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８）。さらに、ＳＳＥＡ−１の非常に少ない発現が存在し、これは、未分化のＥＳ細胞上では発現しない（か、または、低いレベルで発現する）糖脂質である。ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の免疫細胞化学評価は、これらのマーカーの発現が、ＥＳコロニーに局在し、コロニー間の分化した細胞には局在しないことを示す。
【０２３２】
フィーダー細胞の非存在下で増殖するｈＥＳ細胞はさらに、核型（Ｇ−バンディング（ｂａｎｄｉｎｇ）によって評価される）、ＯＣＴ−４の発現（ＰＣＲによって評価される、未分化のＥＳ細胞に付随するＰＯＵ転写因子ファミリーのメンバー）、奇形腫を形成する能力（約５×１０6細胞でのＳＣＩＤ／ベージュマウスへの注射１〜４ヶ月後）、および凍結保存についての適合性（速度制御フリーザーにおいて、１０％ＤＭＳＯおよび２０〜３０％  ＳＲを補充した標準培地中）によって特徴付けられ得る。
【０２３３】
ｈＥＳ細胞の培養物を、最初の播種後１４７日間にわたって、増殖能力または表現型の見かけの変化を伴わずに、フィーダー細胞の非存在下で増殖させた。ｍＥＦ馴化培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で維持されるヒトＥＳ細胞は、約３１〜３３時間の倍加時間を有し、ｍＥＦフィーダー細胞上で増殖するｈＥＳ細胞についての増殖速度に類似する。フィーダー細胞を含まない培養物の６４時間後のＨ１細胞は、正常な核型を示した。
【０２３４】
（実施例２：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびラミニンは、ｈＥＳ細胞のフィーダー細胞を含まない増殖を支持する）
ｈＥＳ細胞の増殖は、初代マウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）を使用して馴化された培地中で、異なるマトリックス成分の結果として生じる。
【０２３５】
ｈＥＳ培養物は、最初に、４ｎｇ／ｍＬの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ；Ｇｉｂｃｏ）を補充したＥＳ培地（８０％ノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、２０％ノックアウト血清置換物（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１％  非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で維持されるフィーダー細胞培養物から収集した。培養物を、約２００Ｕ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ中、３７℃での約５〜１０分間のインキュベーションによって継代した。次いで、コロニーを、顕微鏡下でＰｉｐｅｔｍａｎTMを用いて個々のコロニーを除去することによってか、または掻き取ることによって収集し、続いて馴化培地中で小さなクラスターに穏やかに解離させ、次いで、マトリックスコートしたプレートに播種する。
【０２３６】
採取したｈＥＳ細胞を、ｍＥＦ馴化培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはゼラチンに播種した。播種の翌日、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）にプレートした細胞をプレートに付着させ、そしてフィーダー層上のｈＥＳコロニーよりあまり密集しない小さなコロニーを形成させた。次の数日後になると、コロニーのサイズが大きくなり、そして細胞がより密集した。得られた培養物は、分化した細胞に取り囲まれた、非常に密な未分化のコロニーを含んでいた。
【０２３７】
播種の約１週間後には培養物はコンフルエントになり、そして継代し得た。対照的に、ゼラチンに播種した細胞は、貧弱な生存を示し、そして生存した細胞は分化したようであった。３つのｈＥＳ細胞株、Ｈ１、Ｈ７およびＨ９を、ｍＥＦ馴化培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において培養した。培養物を、１００日を超えてＥＳ様形態を提示し続けるためのこれらの条件下で維持した。
【０２３８】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の主要成分は、ラミニン、コラーゲンＩＶ型およびヘパリン硫酸プロテオグリカンである。これらの成分がｈＥＳ細胞培養を支持する能力を別々に試験した。ラミニン、コラーゲンＩＶ型またはフィブロネクチン（全てＳｉｇｍａから）を、ＰＢＳ中、それぞれ２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの終濃度まで希釈した。
【０２３９】
ラミニン、フィブロネクチン、またはコラーゲンＩＶ型上に播種したｈＥＳ細胞は、未分化ｈＥＳ細胞のコロニーを有したが、フィブロネクチンまたはコラーゲンＩＶ型上の培養物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上の培養物ほど多くの未分化コロニーを含んでいなかった。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上の細胞がコンフルエントに達したとき、コロニー内の細胞は非常に密集した状態になり、フィーダー上で維持された細胞と形態学的に非常に類似し、そして連続的に継代された。４０日（６回継代）後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびラミニン上の細胞は、高い割合の、長期の培養期間中にＥＳ様形態を提示し続けたコロニーを含んでいた。しかし、フィブロネクチンまたはコラーゲンＩＶ型上で維持した細胞は、適切なＥＳ形態を提示するコロニーがより少なかった。コントロールとして、非馴化培地中でＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上で培養した細胞は、よりゆっくりと増殖するようであり、そして数回の継代の後に分化した形態を示した。
【０２４０】
図１は、フィーダーなしの培養物におけるｈＥＳ細胞の形態を示す。パネルＡ（左側）は、非馴化培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中のフィーダー細胞上で、ｍＥＦ馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチン、またはコラーゲンＩＶ型上で培養したＨ１株のｈＥＳ細胞の形態を示す。パネルＢは、実施例１１に記載される種々の型の馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で維持されたＨ９株のｈＥＳ細胞の形態を示す。
【０２４１】
ラミニンは、脊椎動物における全ての基底層の主要成分であり、これは、細胞膜上のインテグリンヘテロ二量体（例えば、α１β１、α２β１、α３β１、α６β１、およびα６β４）と相互作用し、そして発生の間の細胞増殖および移動を媒介する。これらのインテグリンの中でも、α６β１およびα６β４は、ラミニンに特異的であり；他のインテグリンはまた、他のマトリクスと相互作用する。ラミニンレセプターがｈＥＳ細胞上で発現されるか否か、およびラミニンまたはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養しているｈＥＳがラミニンレセプターの発現を変化させるか否かを、別の実験で試験した。α１、α２、α３、α６、β１およびβ４を含むインテグリンの発現を、フィーダー上、馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上で維持した細胞に対してＦＡＣＳ分析により試験した。インテグリン発現を分析するために、ラミニン特異的インテグリン検査キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）によりインテグリン特異的抗体のパネルで細胞を染色し、そして以下で記載のようにＦＡＣＳにより分析した。
【０２４２】
図１のパネルＣは、非馴化培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中のフィーダー上、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上、またはｍＥＦ馴化培地（ＣＭ）中のラミニン上で維持したＨ１  ｈＥＳ細胞において測定したインテグリン発現を示す。
【０２４３】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）／馴化培地中で維持した細胞およびラミニン／馴化培地中で維持した細胞を、以下のように低温保存した：細胞を、１０％ＤＭＳＯおよびさらなる１０％ＳＲ（計３０％）を補充した標準ｈＥＳ培地（馴化培地でない）中で凍結した。細胞を馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上またはラミニン上で融解した。細胞は、融解後に通常の核型を維持した。
【０２４４】
ｍＥＦ馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で維持したヒトＥＳ細胞は、ｍＥＦフィーダー細胞上で増殖したｈＥＳ細胞の増殖速度と類似して、約３１〜３３時間の倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）を示した。フィーダーなし培養物の６４日後のＨ１細胞は、正常な核型を示した。
【０２４５】
（実施例３：フィーダーなしの培養におけるｈＥＳ細胞の表現型マーカー）
未分化ｈＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴを発現する。フィーダーなしの条件下で維持された細胞がこれらのマーカーを維持したか否かを評価するために、細胞を免疫染色、逆転写酵素ＰＣＲ増幅、およびテロメラーゼ活性に関するアッセイにより評価した。
【０２４６】
図２は、ＦＡＣＳ分析によるフィーダーなしの細胞における表面マーカー発現を示す。パネルＡ：非馴化培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中のフィーダー上、ｍＥＦ馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩＶ型上で維持されたＨ１細胞におけるＳＳＥＡ−４の発現。アイソタイプコントロールを破線で示す。パネルＢ：異なるマトリクス上で培養したＨ１細胞におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の平均蛍光強度。パネルＣ：異なる細胞株に由来する馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養したＨ９細胞におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の平均蛍光強度。
【０２４７】
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による分析のために、ｈＥＳ細胞をＰＢＳ中０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中で解離し、そしてＰＢＳ中０．１％  ＢＳＡを含有する５０μＬ希釈液中、約５×１０5細胞に再懸濁した。表面マーカー発現を分析するために、細胞を、希釈液中に希釈した一次抗体（ＩｇＧアイソタイプコントロール（０．５μｇ／試験）、ＩｇＭアイソタイプコントロール（１：１０）、ＳＳＥＡ−１（１：１０）、ＳＳＥＡ−４（１：２０）、Ｔｒａ−１−６０（１：４０）およびＴｒａ−１−８１（１：８０）を含む）中で４℃で３０分間インキュベートした。希釈液で洗浄した後、細胞を、ＰＥを結合体化したラット抗マウスκ鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒTMフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でＣｅｌｌＱｕｅｓｔTMソフトウェアを用いて分析した。
【０２４８】
フィーダー上のｈＥＳ細胞に類似して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチンまたはコラーゲンＩＶ型上の細胞は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１を発現した。それらは、ＳＳＥＡ−１（未分化ｈＥＳ細胞により発現されない糖脂質）をほとんど発現しなかった。
【０２４９】
図３は、組織化学により検出されたマーカー発現を示す。免疫細胞化学による分析のために、細胞を、ノックアウトＤＭＥＭ中に希釈した一次抗体（ＳＳＥＡ−４（１：２０）、Ｔｒａ−１−６０（１：４０）およびＴｒａ−１−８１（１：８０）を含む）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を温めたノックアウトＤＭＥＭで洗浄し、そして２％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ中の５％ヤギ血清とともにＲＴで３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウス抗体（１：１２５）（Ｓｉｇｍａ）とともにＲＴで３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、そしてマウントした。細胞をまたアルカリホスファターゼ（未分化ＥＳ細胞のマーカー）の発現についても試験した。これは、細胞をチャンバースライド上で培養し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、ＰＢＳで洗浄することにより行った。次いで、細胞をアルカリホスファターゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともに遮光して１時間室温でインキュベートした。スライドを、マウントする前に１００％エタノール中で２〜５分間リンスした。
【０２５０】
結果は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、およびアルカリホスファターゼがフィーダー上の細胞についてみられるように、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上のｈＥＳコロニーにより発現された（しかし、コロニー中で分化した細胞によってではない）ことを示す。
【０２５１】
図４は、逆転写酵素ＰＣＲ増幅により検出されるように、フィーダー上およびフィーダーなしのＨ１細胞のＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴ発現を示す。個々の遺伝子産物の放射活性相対量については、ＱｕａｎｔｕｍＲＮＡTM  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  １８Ｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄプライマー（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ，ＵＳＡ）を、製造業者の指示に従って用いた。簡潔には、特定のプライマー対の増幅の線形範囲を決定し、次いで、ａｌｔｅｒｎａｔｅ  １８Ｓプライマー：コンペティマー（ｃｏｍｐｅｔｉｍｅｒ）の適切な混合物と同時増幅させて、同時に生じる線形範囲を有するＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ反応物にＡｍｐｌｉＴａｑTM（Ｒｏｃｈｅ）を添加する前に、この酵素を、製造業者の指示に従って、ＴａｑＳｔａｒｔTM抗体（ＰｒｏＭｅｇａ）とともに予めインキュベートした。放射活性ＰＣＲ反応物を５％非変性ポリアクリルアミドゲルで分析し、乾燥し、そしてホスホイメージスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に１時間曝した。スクリーンをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８６０でスキャンし、そしてバンド強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔTMソフトウェアを用いて定量した。結果を、ｈＴＥＲＴまたはＯＣＴ−４バンドに組み込まれた放射活性の割合として表し、１８Ｓバンドに組み込まれた放射活性に対して標準化した。
【０２５２】
特定のマーカーについてのプライマーおよび増幅条件は、以下のとおりである。ＯＣＴ−４：センス（配列番号３）５’ＣＴＴＧＣＴＧＣＡＧ  ＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧ  ＡＧＧＡＡ−３’；アンチセンス（配列番号４）５’−ＣＴＧＣＡＧＴＧＴＧ  ＧＧＴＴＴＣＧＧＧＣ  Ａ−３’；ａｌｔｅｒｎａｔｅ  １８：コンペティマー１：４；１９サイクル（９４℃３０秒；６０℃３０秒；７２℃３０秒）、ｈＴＥＲＴ：センス（配列番号５）５’−ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧ  ＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡ−３’；アンチセンス（配列番号６）５’−ＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡ−３’；ａｌｔｅｒｎａｔｅ  １８：コンペティマー１：１２；３４サイクル（９４℃３０秒；６０℃３０秒；７２℃３０秒）。
【０２５３】
転写因子ＯＣＴ−４は、通常、未分化ｈＥＳ細胞において発現され、そして分化の際にダウンレギュレートされる。この実験において、馴化培地（ＣＭ）中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上で２１日間維持された細胞は、ＯＣＴ−４を発現したのに対し、非馴化通常培地（ＲＭ）中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中で維持された細胞は発現しなかったことが見出された。フィブロネクチンまたはコラーゲンＩＶ型上で維持された細胞（これは、大きな程度の分化を示す）は、フィーダー、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上の細胞と比較して、より低レベルのＯＣＴ−４を発現した。
【０２５４】
ｈＴＥＲＴおよびＯＣＴ−４発現は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）および通常培地を除く培養条件全てにおいてみられた。さらに、細胞をレチノイン酸（ＲＡ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（これらは、細胞分化を促進する因子である）に曝した後、ｈＴＥＲＴの発現は顕著に減少した。
【０２５５】
図５は、ＴＲＡＰアッセイにより測定されるテロメラーゼ活性を示す（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１，１９９７；Ｗｅｉｎｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：４９８，１９９７）。培養条件全てがｍＥＦ馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチンまたはコラーゲンＩＶ型上で４０日後に陽性のテロメラーゼ活性を示した。
【０２５６】
（実施例４：インビトロおよびインビボ分化）
インビトロ分化を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチンまたはコラーゲンＩＶで馴化培地中２６日間維持したＨ１  ｈＥＳ細胞において誘導した。ｈＥＳ細胞を、約２００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ中で３７℃で１０分間インキュベートすることによって小塊に解離し、そしてＤＭＥＭ、２０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭ  グルタミン、０．１ｍＭ  βメルカプトエタノール、および０．１ｍＭ  可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を含む培地中で懸濁培養して、胚様体（ＥＢ）を形成させた。懸濁して４日後、凝集物をポリオルニチンコーティングプレート上に移し、そしてさらに７日間培養した。次いで、この培養物を収縮する細胞の存在について試験し、そして免疫細胞化学のために処理した。
【０２５７】
図６は、これらの細胞の免疫細胞化学分析の結果を示す。染色パターンは、ニューロンおよび心筋細胞系列（それぞれ、βチューブリンＩＩＩおよび心臓トロポニンＩ）の細胞と一致した。分化の約８日後、収縮する領域を全ての培養物で同定した。α−フェトプロテイン（内胚葉系列のマーカー）についてもまた細胞を染色した。
【０２５８】
ｈＥＳ細胞を、ＳＣＩＤマウスへの筋肉内注射により奇形種を形成する能力についてもまた試験した。フィーダー上またはフィーダーなしで維持した細胞を採取し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＳＣＩＤ／ベージュマウスに筋肉内注射した（５×１０6細胞／部位）。腫瘍を切除し、そして組織学的分析のために処理した。フィーダーなしの培養物に由来するｈＥＳ細胞は腫瘍を生成し、これを切除し、そして７８〜８４日後に組織学的分析のために処理した。
【０２５９】
図７は、ｍＥＦフィーダー細胞で維持したＨ７細胞（Ａ）またはフィーダーなし培養物（Ｂ）に由来する奇形種の組織病理を示す。ムチン上皮成分、軟骨および神経組織は、フィーダー上で培養したｈＥＳ細胞に由来する奇形種で観察された。嚢胞性上皮構造、おそらく歯科成分、軟骨および腺上皮または神経成分は、フィーダーなしのｈＥＳ培養物に由来する奇形種において見出された。
【０２６０】
（実施例５：ｈＥＳ細胞の直接分化）
凝集物形成の標準的方法を用いる分化を、本発明の技術と比較した。ここで、特定の条件下で固体表面に直接プレートすることにより細胞を分化させた。
【０２６１】
凝集物分化技術のために、アカゲザルおよびヒトのＥＳ株の単層培養物をコラゲナーゼＩＶ中で５〜２０分間インキュベートすることにより採取し、そしてこれらの細胞をプレートから掻き取った。次いで、これらの細胞を解離し、そして０．１ｍＭ  可欠アミノ酸、１ｍＭ  グルタミン、０．１ｍＭ  βメルカプトエタノールを補充したＦＢＳ含有培地（２０％  熱非働化していないＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中、非接着性細胞培養プレートにプレートした。ＥＢに、一日おきに１ウェル（６ウェルプレート）あたり２ｍｌの培地を添加して供給した。培地の容積が４ｍｌ／ウェルを超えたときに、ＥＢを採取し、そして新鮮な培地に再懸濁した。プレートを３７℃のインキュベーター中に入れ、そしていくつかの場合には、振盪機（ｒｏｃｋｅｒ）を用いて、懸濁物中の凝集物の維持を容易にした。懸濁して４〜８日後、凝集体が形成され、そしてさらに分化させるために基板上にプレートした。
【０２６２】
直接分化技術のために、アカゲザルおよびヒトのＥＳ細胞の懸濁物を同様の様式で調製した。次いで、細胞を約５０〜１００細胞の塊に砕くこと（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）により解離し、そしてポリオルニチンで処理したガラスのカバースリップ上にプレートした。細胞を、血清含有培地中、または分析の７〜１０日間前に規定された培地で維持した。細胞を、ニューロン、およびグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に特徴的であり、星状細胞に特徴的であるβチューブリンＩＩＩおよびＭＡＰ−２についての免疫反応性により試験した。
【０２６３】
６つの異なるＥＳ株は、凝集物または直接分化技術のいずれかを用いて、ニューロンおよび星状細胞についてのマーカーを有する細胞に分化した。アカゲザルＥＳ細胞に由来する培養物において、ニューロンを含有した凝集物のパーセンテージは、４９〜９３％であった。ヒトＥＳ細胞に由来する培養物において、ニューロンを含有した凝集物のパーセンテージは、６０〜８０％であった。ＧＡＢＡおよびβ−チューブリンについての二重標識により、ニューロンの亜集団が阻害性神経伝達物質ＧＡＢＡを発現することが示された。星状細胞およびオリゴ樹状細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）を、それぞれＧＦＡＰ免疫反応性およびＧａｌＣ免疫反応性で同定した。従って、ヒトおよびアカゲザルのＥＳ細胞は、中枢神経系における３つの主要な細胞表現型全てを形成する能力を有する。
【０２６４】
ニューロトロフィン増殖因子ファミリーのいくつかのメンバーの効果を試験した。ｈＥＳ細胞を、コラゲナーゼを用いて採取し、解離し、そしてポリオルニチンコーティングしたカバースリップに再播種することにより分化させた。細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎ２＋１０％ＦＢＳ中に一晩入れた。翌日、血清を培地から除去し、そして試験される１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトｂＦＧＦおよび増殖因子と置換した。２４時間後、ｂＦＧＦを培地から取り出した。これらの培養物に、一日おきに補給した。これらを、分化の７日後に固定し、そして分析のために免疫染色した。ニューロン数をβチューブリンについて陽性の細胞を計数することにより評価した。１０ｎｇ／ｍＬの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の存在下で維持した培養物は、コントロール培養物より約３倍多いニューロンを形成した。ニューロトロフィン−３（１ｎｇ／ｍｌ）中で維持した培養物は、コントロール培養物より約２倍を超えるニューロンを形成した。
【０２６５】
心筋形成を評価するために、ＥＢを懸濁培養の４日後、ゼラチンコーティングプレートまたはチャンバースライドに移した。播種後に表面に接着したＥＢを、増殖させ、そして異なる型の細胞に分化させた。自律的に収縮する細胞を、分化８日目に培養物の種々の領域で観察した。そして拍動する領域の数は、約１０日目まで増加した。いくつかの場合において、ＥＢの７５％超が、収縮領域を有した。収縮する細胞は、形態的に、マウスＥＳ細胞由来の拍動する心筋に類似していた。これらの培養物において、収縮する領域の１００％が心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）と免疫反応性であるが、最小限の免疫反応性が、拍動しない細胞において観察された。
【０２６６】
分化したＥＢの培養物を、ｃＴｎＩに対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析に供した。このアッセイは、精製ネイティブヒトｃＴｎＩのサイズに対応する、強い３１ｋＤａタンパク質シグナルを与えた。これは、収縮する細胞を含む分化したヒトＥＳ細胞においては検出されたが、未分化ＥＳ細胞でも分化培養物でも検出されず、収縮する細胞の証拠がなかった。コントロールとして、このブロットは、βアクチン特異的抗体で再プローブし、全てのサンプルにおいて同様の量のタンパク質が存在したことを確認した。
【０２６７】
他の実験において、ＥＢを８〜１６日間培養し、そしてさらに１０日間接着性培養物として維持した。ＲＮＡを分化したヒトＥＳ細胞から調製し、そして半定量的なＲＴ−ＰＣＲを行って、内胚葉特異的産物であるα１アンチトリプシン、ＡＦＰ、およびアルブミンの相対的発現を検出した。低レベルのα１アンチトリプシンおよびＡＦＰを、未分化培養物において検出した；同じ培養物においてアルブミンはほとんどまたは全く検出されなかった。３つのマーカー全てが、分化後に有意に高いレベルで検出された。３つの内胚葉マーカー全ての発現は、１６日目の胚様体よりも８日目の胚様体由来の培養物においてより高かった。
【０２６８】
（実施例６：未分化細胞および分化細胞による発現のマイクロアレイ分析）
異なる遺伝子発現の分析を、未分化Ｈ９培養物由来のｍＲＮＡと、対応するＥＢ由来のｍＲＮＡとを対比することにより行った。ＥＢを増殖培地中で８日間維持するか、または増殖培地中で４日間維持し、次いで、０．５μＭ  レチノイン酸で４日間処理した。ＥＢを２日後、４日後または８日後に採取し、そして得られたｍＲＮＡを未分化培養物由来のｍＲＮＡと直接比較した。この分析は、比較的均質な細胞集団の、分化した細胞型の複雑な混合物への形質転換を追跡し、従って、読み出しは、遺伝子発現における変化の大きさ、および分化した細胞型に特異的な発現の変化の場合には、培養物におけるその細胞型の再提示の両方により影響が及ぼされる。これらの実験サンプル約１０，０００  ｃＤＮＡにおいて使用されるアレイを選択して、特徴付けられたヒト遺伝子の大部分を表した。
【０２６９】
総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙTMミニプレップキットを用いて製造業者の指示に従ってヒトＥＳ培養物またはそれらの分化した誘導体から採取した。２６０ｎｍでの紫外線吸収を測定することによりＲＮＡを定量した。ポリＡ+ｍＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＯｌｉｇｏｔｅｘTMミニプレップを用いて製造業者の指示に従って総ＲＮＡ調製物から調製した。最終的なｍＲＮＡ調製物は、Ａ260測定値により定量し、次いで、ネイティブアガロースゲル上での電気泳動後に目視検査した。サンプルＲＮＡを、Ｃｙ３またはＣｙ５標識ｃＤＮＡプローブへ転換するために契約実験室（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に送り、このプローブを、引き続きＵＮＩＧＥＭ１．０アレイにハイブリダイズさせた。
【０２７０】
ハイブリダイズしたアレイの処理後に、蛍光測定値を定量し、そして結果を分析に返した。プローブ対形成を、Ｃｙ３チャネルの存在下で未分化ＥＳ細胞からのサンプルを用いて行い、そして分化したＥＳ細胞サンプルは、Ｃｙ５チャネルの存在下で行った。発現の変化（Ｃｙ３およびＣｙ５チャネルを比較することにより測定される）は、一般に、差異が少なくとも２．５倍であったか否かを有意とみなした。
【０２７１】
ｈＥＳ細胞の分化は、多くの遺伝子（公知の機能を有さないＥＳＴを含む）の活性化および抑制に関与する。興味深いことに、分化の最後の４日間にわたるレチノイン酸の懸濁培養物への添加は、遺伝子発現パターンに対して比較的微少な効果を有した（４ｄ−／４ｄ＋と８ｄとを比較のこと）。
【０２７２】
発現が分化の間に減少される遺伝子は、広範な機能をサンプリングする（メタロチオネイン、増殖因子（例えば、ＦＧＦ９）、分泌型システインリッチタンパク質（例えば、オステオポンチン、ＡＧＦ−ＢＰ５、Ｃｙｒ６１、結合組織増殖因子）、セレンドナータンパク質ｓｅｌＤなどが挙げられる）。一般に、発現における最も有意な改変は、懸濁培養の４日後に生じ、そして細胞形態の変化の発生と一致する。興味深いことに、Ｄ−グルコースリン酸の異化に関与する２つの遺伝子（ＵＤＰ−グルコースホスホリラーゼおよびホスホグルコムターゼ）の発現は、分化の際に劇的に減少し、このことは、グルコース代謝における潜在的な改変を示唆する。
【０２７３】
これらの実験において使用したアレイは、ｈＴＥＲＴに対応するｃＤＮＡの特徴を含んでいない；しかし、ＴＲＦ１についてのｍＲＮＡの発現の顕著な減少が観察された。ＴＲＦ１は、基本的なテロメア結合因子であり、その発現は、テロメアの長さの短縮化と相関している。従って、テロメアの長さの正のレギュレーター（ｈＴＥＲＴ）および負のレギュレーター（ＴＲＦ１）の両方の発現は、ＥＳ細胞の分化の間に減少した。
【０２７４】
内臓内胚葉および初期の肝臓分化と関連するいくつかの遺伝子は、この分析において顕著であった。これらの遺伝子は、α−フェトプロテイン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質ＡＩ調節タンパク質−１、α1−アンチトリプシンならびにフィブリノーゲンのα、βおよびγ鎖を含む。この誘導は、分化の２日以内に明白になり、そしてレチノイド処置によって実質的に影響を及ぼされない。細胞性レチノイン酸結合タンパク質１および２（ＣＲＡＢＰ  Ｉ、ＩＩ）の発現の誘導は、レチノイドがＣＲＡＢ  Ｉ遺伝子のプロモーターの転写を特異的に阻害する、提唱された負のフィードバックループと一致して、レチノイド処理培養物においては観察されない。
【０２７５】
ＩＬ−６レセプターｇｐ１３０の発現は、ｈＥＳ培養物において低く、そして分化の際に誘導される。これらの結果は、ｈＥＳ培養物におけるＬＩＦ応答性の欠如に関する分子的基礎を提供し（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９９；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００）、そしてマウスＥＳ細胞に対して、ヒトＥＳ細胞におけるｇｐ１３０の実質的に異なる役割を示す。ここで、ＬＩＦシグナル伝達は、未分化状態の維持を直接的に意味する。
【０２７６】
他の分化誘導性遺伝子としては、タンパク質ホモログであるプレイオトロフィンおよびミッドカインが挙げられる。これらの分泌サイトカインは、ニューロン細胞型および肝臓細胞型のマイトジェンとして、または全身的な脈管形成因子としての役割が提唱された（Ｏｗａｄａら、１９９９；Ｓａｔｏら、１９９９）。このようにして、ＥＳ細胞分化において類似の役割が果たされ得る。ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ホメオボックスｂ５タンパク質およびｍｅｉｓ１）の誘導は、分化プロセスにおいて転写調節因子の中心的な役割を反映するようである。
【０２７７】
（実施例７：初代ｍＥＦフィーダー層上で維持されたｈＥＳ細胞の遺伝子改変）
この実施例は、既に記載したように、初代ｍＥＦ上で増殖させたｈＥＳ細胞へ遺伝子改変を導入するための条件を提供する。トランスフェクトする前に、ｈＥＳ細胞をコラゲナーゼ（約２００ユニット／ｍＬ）を用いてフィーダー層からはずし、１８ｍｌの最終容量で懸濁し、そしてゼラチンおよび初代ｍＥＦフィーダー細胞で予めコーティングした６ウェルプレート中、３ｍｌ／ウェルでプレートした。
【０２７８】
次いで、再プレートした細胞を異なるトランスフェクション系で試験した。これらのトランスフェクション系としては以下が挙げられる：ＭａｍｍａｌｉａｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣａＰＯ4およびＤＥＡＥ試薬）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｃａｔ＃２００２８５；ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１  Ｍｉｒｕｓ（Ｐａｎｖｅｒａ）、ｃａｔ＃  ＭＩＲ  ２３１０；ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）；ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）；ＳｕｐｅｒｆｅｃｔTM（Ｑｉａｇｅｎ）；ＥｆｆｅｃｔｅｎｅTM（Ｑｉａｇｅｎ）；ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TMとは異なる）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎTM（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；およびＢｉｏＲａｄTMＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを用いたエレクトロポレーション。
【０２７９】
使用した条件下で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TM（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃａｔ＃１１６６８０１９，特許係属中）およびＦｕＧＥＮＥTM（Ｆｕｇｅｎｔ  Ｌ．Ｌ．Ｃ．の登録商標；脂質および他の成分の専売ブレンド（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｂｌｅｎｄ）であり、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｃａｔ＃１  ８１４
４４３から購入した）の両方が、良好なトランスフェクション効率を生じた。この効率は、これらの試薬を、再プレートした後、約４８時間にわたり再プレーとしたｈＥＳ細胞と接触させた場合、概して最良であった。
【０２８０】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TMを用いるトランスフェクションを、以下のように行った：プラスミドＤＮＡ（３〜５μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ＣｌｏｎＴｅｃｈ  ｃａｔ．＃６０８４−１）を水で１００μｌの最終容量に希釈した。予備実験において、５〜３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TM（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ＃１１６６８−０１９）をＯｐｔｉＭＥＭTM（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ＃１１−５８−０２１）で１００μｌの最終容量まで希釈した。次いで、ＤＮＡ溶液をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TM溶液にゆっくりと添加し、そして穏やかに混合した。この混合物を、８００μｌのＯｐｔｉＭＥＭTMを補充する前に、室温で２０〜３０分間インキュベートした。細胞を３ｍｌの予め温めておいたＯｐｔｉＭＥＭTMで洗浄し、そしてウェルあたり（９．６ｃｍ2）、０．５〜１ｍｌのＤＮＡ／脂質混合溶液中、３７℃で４時間インキュベートした。いくつかの実験においては、４ｍｌのｍＥＦ馴化培地を添加する前に、４時間で複合体を取り出した；他では、十分なｍＥＦ馴化培地を、３．５ｍｌの最終容量に達するまでウェルに添加し、そしてこの混合物を細胞上に一晩放置した。他の実験では、ＤＮＡ：脂質混合物を、３．５ｍｌの最終容量になるように、十分なｍＥＦ馴化培地を含むウェルに添加し、そして細胞をこの混合物中で一晩インキュベートした。
【０２８１】
ＦｕＧＥＮＥTMを用いるトランスフェクションを、以下の通りに行った。各ウェルを、ＦｕＧＥＮＥTM  ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、製造業者の指示書に記載されるようにＦｕＧＥＮＥTM試薬のＤＮＡに対する比を３：２として、１０μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。ＯｐｔｉＭＥＭTM無血清培地をトランスフェクションに用いた。「古いプロトコル」では、ＦｕＧＥＮＥTM−ＤＮＡ複合体の添加の４時間後、２．５ｍＬの標準的なｈＥＳ培地を、各トランスフェクトしたウェルに添加した。改定されたプロトコル（「３：２Ｌ」）では、トランスフェクトしたウェルには、標準的なｈＥＳ培地を供給しなかった。トランスフェクションの２４時間後、ＧＦＰ−発現を、フローサイトメトリーによって評価した。
【０２８２】
トランスフェクションの４８時間前に、ｈＥＳ細胞を、ゼラチンおよびｍＥＦフィーダー層で上記のようにコーティングした６ウェルプレートに播種した。ｈＥＳ細胞を、ＦｕＧＥＮＥTM  ６（Ｒｏｃｈｅ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TM（Ｇｉｂｃｏ）を製造業者の説明書に従って用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーの下で目視によってＧＦＰ発現について評価した。図１に示す実験では、３つの方法（標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TMプロトコル、標準的なＦｕＧＥＮＥTMプロトコル、およびＤＮＡ／脂質混合物を細胞とともに一晩放置する改変ＦｕＧＥＮＥTMプロトコル）を比較した。この結果は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TMは高い百分率のＧＦＰ発現細胞を一貫して生じたが、改変ＦｕＧＥＮＥTMプロトコルは、より高い平均蛍光強度を有するＧＦＰ発現細胞を生じたことを実証した。
【０２８３】
アデノウイルスベクターを用いる一過性の形質導入を以下の通りに行った。ベクターＡｄ５ＣＭＶ５−ＧＦＰ（本明細書ではＡｄ５ＧＦＰと呼ぶ）は、ＣＭＶプロモーターの制御下のグリーン蛍光タンパク質コード領域を含む。このベクターを、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＤＶ００３０から購入した。形質導入の７２時間前に、ｈＥＳ細胞を、ゼラチンおよびｍＥＦフィーダー層で上記の通りにコーティングした２４ウェルプレートに播種した。形質導入前に、３ウェルのｈＥＳ細胞を、０．０５％トリプシン／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を３７°で用いて剥離させ、５００μＬの標準的なｍＥＦ増殖培地に再懸濁し、そして血球計算板（７５，０００個のｍＥＦフィーダー細胞を、各ウェルから差し引いた）で計数して、トランスフェクション前の細胞数を樹立した。アデノウイルスのストックを、使用直前に氷上で融解した。
【０２８４】
Ａｄ５ＧＦＰを用いた感染については、増殖培地を、ｈＥＳ細胞を含むウェルから吸引し、そして１ｍＬのｈＥＳ培地＋９μＬのＡｄ５  ＧＦＰストックで置き換えた（４０のＭＯＩ）。２時間後、ウイルス含有培地を、１ウェルあたり１ｍＬのｈＥＳ培地で置き換えた。各形質導入したウェルに、１ｍＬの新鮮ｈＥＳ培地を２４時間毎に再度供給した。ＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーによって評価した。代表的な実験からの結果は、発現が、形質導入の２４時間後に最も高いが、少なくとも８日間は低レベルで維持されたことを示した（より後の時点では、ｈＥＳ細胞の過剰増殖に起因して大量の分化が引き起こされた）。
【０２８５】
図８は、フィーダー層にプレートし、そしてアデノウイルスベクターＡｄ５ＧＦＰ（３０のＭＯＩ）またはレトロウイルスベクターＧＲＮ３５４（４０のＭＯＩ、実施例９）のいずれかに４８時間後に感染させたｈＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。それぞれ２４時間後または４８時間後、細胞を回収し、幹細胞マーカーＳＳＥＡ−４に対する抗体を用いて染色し、そしてＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーによって評価した。上のパネルは、偽感染培養物におけるバックグラウンド蛍光およびＳＳＥＡ−４ポジティブ染色を示す。下のパネルは、ＧＦＰの発現から生じるグリーン蛍光のレベルを示す。
【０２８６】
（実施例８：不死化フィーダー細胞の調製）
初代マウス胚性線維芽細胞（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，前出）を、遺伝子を変更してヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を発現することによって不死化し得る。この線維芽細胞（ｍＥＦ）を、ＭｏＬＶ  ＬＴＲによって駆動されるｈＴＥＲＴコード配列およびＳＶ４０初期プロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルス構築物ｐＢＡＢＥ  ｐｕｒｏ  ｈＴＥＲＴに感染させる。初代ｍＥＦの単離株を、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、および９０％  高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含む増殖培地中で培養する。ｍＥＦを、３日毎に１：２の比で分ける。
【０２８７】
このように４回分けた後、５×１０5ｍＥＦを、１００ｍＭディッシュにプレートする。翌日、細胞を、増殖培地を、５ｍＬのレトロウイルスストック（１×１０6ｐｆｕ／ｍＬ）および４μｇ／ｍＬポリブレンを含む混合物と交換することによって感染させ、そして３７℃でインキュベートする。８時間後、さらに５ｍＬのレトロウイルス／ポリブレン混合物を添加し、そして細胞を３７℃にてインキュベートする。
【０２８８】
翌日、レトロウイルス／ポリブレン混合物を取り出し、そして新鮮な増殖培地と置き換える。４時間後、ｍＥｆを、０．５％トリプシン／５００ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いてプレートから取り出し、そして２５ｍＬの増殖培地／フラスコにおいて２本のＴ１５０フラスコ中に再度プレートする。翌日、この培地を、０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを補充した増殖培地で置き換ええる。
【０２８９】
細胞を、１週間に１回、１：４の比で８週間にわたって分け、そしてピューロマイシン含有培地中で維持する。８週間後、細胞をトリプシン処理し、そして１５０ｍｍプレートあたり２，０００細胞の密度で再度プレートする。個々のコロニーを、２６日後にクローングシリンダーを用いて単離し、増殖させ、そしてテロメラーゼ活性についてスクリーニングする。
【０２９０】
（マウスフィーダー細胞株ＮＨ１９０）
霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の培養のための馴化培地に適切である、永続的なマウス細胞株を樹立した。ＮＨＧ１９０株は、三重薬物耐性であり、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する、テロメラーゼを用いて不死化されたマウス胚線維芽細胞株である。
【０２９１】
２つのマウス株を、抗生物質ネオマイシンまたはハイグロマイシンに対する耐性についての導入遺伝子を有するＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手した。Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｓからのＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ＴｇＮ（ｐＰＧＫｎｅｏｂｐＡ）３ＥｍｓマウスおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＴｇＮ（ｐＰＷＬ５１２ｈｙｇ）１Ｅｍｓマウスを交雑した。ネオマイシン耐性およびハイグロマイシン耐性の両方である胚を、受胎後１３．５日で、フィーダー層のためにマウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）を調製するための標準的なプロトコル（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，７１−１１２頁、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ＣｅｌｌＬｉｎｅｓ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）に従って切開した。誘導されたｍＥＦ細胞を、凍結保存した。
【０２９２】
ｍＥＦを、２０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、８０％  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含む増殖培地中で融解した。この細胞を４継代の間１：２の分割比を用いて増殖させた。約７５％コンフルエンスに達した２本のフラスコに、エレクトロポレーションの４時間前に新鮮な培地を供給した。０．５％トリプシン／５００ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を有する細胞をフラスコから取り出し、室温で４００×ｇにて５分間によってペレット化し、そして４×１０6細胞／ｍＬの濃度で増殖培地中に再懸濁した。
【０２９３】
細胞懸濁物を、２つの５００μＬアリコートにわけ、そして２つの０．４ｃｍのギャップエレクトロポレーションキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に移した。１つのキュベットには５μｇのコントロールプラスミド（ｐＢＳ２１２；ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子）を入れる；他方のものには、５μｇのｐＧＲＮ１９０を入れた。ｐＧＲＮ１９０は、ＭＰＳＶプロモーターによって駆動されるマウステロメラーゼ逆転写酵素（ｍＴＥＲＴ）コード領域＋ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含む。細胞およびＤＮＡを、手動で混合し、そしてＢｉｏＲａｄキャパシタンスエキステンダーを３００Ｖ、９６０μＦに設定して、ＢｉｏＲａｄ  ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを用いてエレクトロポレーションした。
【０２９４】
細胞の各アリコートを、２５ｍＬの増殖培地を含む個々の１５０ｃｍのプレートに移した。このプレート上の培地を、翌日交換し、そしてその次の日、増殖培地を、増殖培地＋０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンによって置換した。このプレート上の培地を、エレクトロポレーション後２９日目になるまで４８時間毎に新鮮なピューロマイシン含有培地に交換した。この時点で、ピューロマイシン耐性細胞の大きな個々のコロニーは、ｐＢＳ２１２をエレクトロポレーションしたプレートおよびｐＧＲＮ１９０をエレクトロポレーションしたプレートの両方において明らかであった。コントロールプレートからの１０個のコロニーおよびｐＧＲＮ１９０をエレクトロポレーションしたプレートからの１２個のコロニーを、クローニングシリンダーを用いて単離し、そして各コロニーを、４８ウェルプレートの１ウェルに移した（１コロニーあたり１ウェル）。
【０２９５】
１週間後、４８ウェルプレート中でコンフルエンスに達するまで増殖させた、全ての生存コロニー（３つのコントロールのコロニー、１個のｐＧＲＮ１９０をエレクトロポレーションしたコロニー）を、２４ウェルプレートのウェルに個々に移した。６日後、増殖し続けた唯一のコロニーは、ｐＧＲＮ１９０をエレクトロポレーションしたプレートに由来し、そして続いてＮＨ１９０と命名した。この細胞を、増殖培地＋０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンにおいて維持した。ＴＲＡＰアッセイ（Ｋｉｍら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５９５，１９９７）によるテロメラーゼ活性についての分析は、ＮＨ１９０細胞が、機能的なテロメラーゼ活性を発現することを実証した。
【０２９６】
混合した培養集団およびインビボにおける細胞のモニタリングを促進するために、ＮＨ１９０細胞を、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を付与するレトロウイルス構築物にさらに感染させた。プラスミドｐＥＧＦＰ−１由来の増強されたＧＦＰ配列は、ＣｌｏｎＴｅｃｈから入手可能なＬｉｖｉｎｇ  ＣｏｌｏｒｓTM蛍光タンパク質ベクターの一つである。これは、増強されたＧＦＰコード領域を含み、制限ヌクレアーゼ切断部位を変更する変化を伴っており、そしてコードされたタンパク質の励起波長および発光波長がシフトする。ＥＧＦＰ−１配列は、ベクターｐＭＳＣＶ．ｎｅｏ、ＣｌｏｎＴｅｃｈカタログ番号Ｋ１０６２−１中にクローニングされた。ＮＨ１９０細胞に、操作されたベクターで形質導入し、そしてＧＦＰポジティブ細胞を、ＦＡＣＳソーティングによって分離した。ＧＦＰ発現細胞株を、ＮＨＧ１９０と命名した。これらの細胞を、３ヶ月を超えて培養で保有した。
【０２９７】
（実施例９：薬物耐性ＮＨＧ１９０フィーダー細胞株上で維持されたｈＥＳ細胞の遺伝的変化）
実施例８に記載されたＮＨＧ１９０細胞を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋２０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）および５ｍＭグルタミン中で培養した。細胞を３日毎に１：１０に分けた。サブコンフルエントな培養物を、トリプシンを用いて剥離させ、１０ｍＬ培地中に懸濁し、そしてＴｏｒｒｅｘ  １５０Ｄ  Ｘ線ジェネレーターを用いて３５００ラドの累積線量で照射した。照射した細胞を、４００×ｇにて５分間ペレット化し、そしてＮＨＧ１９０培地または標準的なｈＥＳ培地のいずれかに１ｍＬあたり１．２５×１０5細胞で再懸濁した。
【０２９８】
ｈＥＳ細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびＮＨＧ１９０フィーダー細胞で予めコーティングした６ウェルプレートに再度プレートすることによりトランスフェクトした。播種の４８時間後、ｈＥＳ細胞を、製造業者のプロトコルに従ってＯｐｔｉＭＥＭTM無血清培地中でＦｕＧＥＮＥTM  ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて１ウェルあたり１０μｇＤＮＡでトランスフェクトした。ＤＮＡは、ｎｅｏrを駆動するＰＧＫプロモーターを含むプラスミドであった。４時間後、３ｍＬのＮＨＧ１９０馴化培地を、各トランスフェクトしたウェルに添加した。細胞に、毎日３ｍＬの馴化培地を再度供給した。トランスフェクションの４８時間後、細胞に、２００μｇ／ｍＬの添加されたジェネティシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＮＨＧ１９０馴化培地を重層し、これをその後、毎日交換した。選択の３日後、さらなる照射したＮＨＧ１９０フィーダー細胞を添加した（ｈＥＳ培地中、１．２５×１０5細胞／ウェル）。２４時間後、培地を、２００μｇ／ｍＬジェネティシンを含有するＮＨＧ１９０馴化培地で再度置き換え、毎日置き換えた。
【０２９９】
個々のコロニーを単離し、そして別の回の選択を通して増殖させた。さらに５日後、個々のコロニーは、顕微鏡によって同定され、そしてこのディッシュの外側にマークした。培地を除去し、そしてコラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ）で置換した。個々のコロニーを、ｐ２０ピペットのチップを用いて拾い、そして２ｍＬ  ＮＨＧ１９０馴化培地（ジェネティシンなし）を含む個々のチューブに移した。この懸濁物を、ばらばらのコロニーになるように５回磨砕し、そして各チューブの内容物を、ゼラチンおよび照射したＮＨＧ１９０細胞（１．８７５×１０5細胞／ウェル）でコーティングした１２ウェルプレートのウェルに移した。細胞に、２４時間後に２ｍＬの新鮮な馴化培地を供給した。播種の２日後、細胞に、２００μｇ／ｍＬジェネティシンを含む２ｍＬの馴化培地を重層し、毎日５日間置換した。各ウェルが５０〜７５％コンフルエントとなったら、細胞を、コラゲナーゼを用いて剥離し、６ｍＬ馴化培地に移し、そして１０〜１２回磨砕した。３ｍＬの細胞懸濁物を、ゼラチンおよび照射したＮＨＧ１９０細胞（３．７５×１０5細胞／ウェル）でコーティングした６ウェルプレートの２つのウェルの各々に添加した；細胞に、２４時間の時点で３ｍＬの馴化培地を再度供給した。次いで、細胞を、ジェネティシンを含む３ｍＬの馴化培地を用いて５日間選択し、そして前のように１：６に分けた。
【０３００】
レトロウイルスを用いる安定な形質導入を、以下の通りに行った。ＧＲＮ３５４と命名されたレトロウイルスベクターを、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．にて、ＣｌｏｎＴｅｃｈ（カタログ番号Ｋ１０６２−１）から購入したＰＭＳＣＶｎｅｏベクターを用いて構築した。ｅＧＦＰコーディング領域を、ＭＳＣＶ  ＬＴＲの下流に挿入した。ＬＴＲはＧＦＰの発現を駆動し、そしてこのベクターはまた、マウスＰＧＫプロモーターによって駆動されるｎｅｏr遺伝子を含む。プレートを、０．５％ゼラチンおよびＮＨＧ１９０フィーダー細胞（２４ウェルプレートについて１ｍＬのＮＨＧ１９０培地中で７．５×１０4；６ウェルプレートについて３ｍＬの培地中で３．７５×１０5）でコーティングした。ｈＥＳ株Ｈ７を、２４ウェルに調製したプレートに、ｈＥＳ培地（１ｍＬ／ウェル）中に播種した。４８時間後、ｈＥＳ細胞の３つのウェルを、０．０５％トリプシン／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を３７℃で用いて剥離させ、５００μＬ  ＮＨＧ１９０培地中に再懸濁させ、そして計数した。レトロウイルス構築物ｐＧＲＮ３５４のストックを、使用の直前に氷上で溶解した。増殖培地をウェルから吸引し、そして４００μＬのｈＥＳ培地＋８μＬのレトロウイルス（１０のＭＯＩ）および４μＬの８ｍｇ／ｍＬポリブレン溶液（Ｓｉｇｍａ）で置き換えた。２時間後、１ウェルあたり８００μＬのｈＥＳ培地を添加した。各形質導入されたウェルに、２４時間毎に１ｍＬの新鮮なｈＥＳ培地を再度供給した。
【０３０１】
形質導入の４日後、培地を、２００μｇ／ｍＬジェネティシンを含有する１ｍＬのｈＥＳ培地で置き換えた。ジェネティシン選択の３日後、細胞を、コラゲナーゼを用いて剥離し、磨砕し、３ｍＬのｈＥＳ培地に再懸濁し、ゼラチンおよびＮＨＧ１９０フィーダーでコーティングした６ウェルプレートの１ウェルに再度播種し、そして２４時間後にｈＥＳ培地を再度供給した。次いで、この培地を、ジェネティシンを含有するｈＥＳ培地で再度置き換え、そして２４時間毎に再度供給した。未分化コロニーは、この選択を生き延び、そして３ヶ月を超えて維持された。ＦＡＣＳ分析は、５０〜６５％の選択された細胞が、たとえ低レベルであってもＧＦＰを発現することを示した。この細胞の核型は正常であった。
【０３０２】
次いで細胞を、懸濁培養に移して、胚様体を形成させ、４日間分化させ、次いで２０％  ＦＢＳ培地中に１週間プレートした。大量の分化が生じた後、この培養物を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして蛍光顕微鏡のために調製した。多くの分化した細胞は、トランスフェクトされた未分化のｈＥＳ細胞株よりも高レベルのＧＦＰを発現した。このことは、分化した細胞型におけるＭＥＳＶ−ＬＴＲの分化活性化と一貫している。
【０３０３】
（実施例１０：フィーダーフリー培養物におけるｈＥＳ細胞のトランスフェクション）
馴化培地中でラミニン上でフィーダーフリー培養物中で維持したｈＥＳ細胞を、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を保有するプラスミドでトランスフェクトすることにより、遺伝的に改変した。
【０３０４】
ｍＥＦ馴化培地を、先に記載の通りに調製した。ｍＥＦに照射し、そして約５．７×１０4細胞ｃｍ-2で播種した。少なくとも１６時間後、この培地を、４ｎｇ／ｍＬになるように添加したｈｂＦＧＦを含むｈＥＳ培地と交換した。馴化培地を、ｈＥＳ培養物の供給のために毎日収集した。ｈＥＳ培養物への添加の前に、この培地に、さらに４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦを補充した。安定なトランスフェクタントの選択が必要な場合、ｍＥＦ馴化培地に、２００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ５０１３）を補充した。
【０３０５】
ｍＥＦフィーダー層上で維持したＨ９  ｈＥＳ細胞を、３７℃にて１０分間の約２００単位／ｍＬのコラゲナーゼＩＶとのインキュベーションにより培養物から収集した。細胞を解離し、そして通常ｈＥＳ培地またはｍＥＦ馴化培地中に再懸濁した。次いで、通常培地中の細胞を、ｍＥＦフィーダー層上に再度播種し
そしてｍＥＦ馴化培地中の細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上にプレートした。全ての培養物についての播種密度は、約４×１０4細胞／ｃｍ2であった。フィーダー層上の細胞を通常培地中で維持し、一方、マトリックス上の細胞をｍＥＦ馴化培地中で、トランスフェクションの前に１日間または２日間維持した。馴化培地を、２４時間毎に置き換えた。
【０３０６】
ｈＥＳ細胞培養物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TMで上記のようにトランスフェクトした。ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析を以下の通りに行った。ｈＥＳ細胞を、ＰＢＳ中の０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて収集し、そして約１×１０6細胞／試験で再懸濁した。細胞を、ＰＢＳおよび２％  ＦＢＳ、０．１％アジ化ナトリウムおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶液中で洗浄した。ＳＳＥＡ−４染色を、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｂａｎｋｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ）から入手した抗体を１：１５希釈で用いて同じ緩衝液中で行った。アイソタイプ適合コントロールを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。細胞を、１００μｌの最終容量において抗体とともに４℃にて３０分間インキュベートし、洗浄し、そしてＰＥと結合体化したラット抗マウスκ鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともに４℃にて３０分間インキュベートした。サンプルを、先の通りに洗浄し、そしてＧＦＰおよびＳＳＥＡ−４発現についてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒTMフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でＣｅｌｌＱｕｅｓｔTMソフトフェアを用いて分析した。
【０３０７】
ｍＥＦ馴化培地中のラミニン上で維持したＨ９株のｈＥＳ細胞を、プレーティング後２４時間または４８時間に、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰを保有するプラスミドでトランスフェクトした。最初の実験は、５μｇのプラスミドおよび１２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TMの混合物を用いた。細胞に１ｍＬのＤＮＡ／脂質複合体を入れ、そして３７℃にて４時間インキュベートした後、３ｍＬのｍＥＦ馴化培地を添加し、次いでトランスフェクションの２４時間後にＧＦＰ発現についてモニタリングした。
【０３０８】
図９は、この実験の結果を示す。パネルＡ：ラミニン上で維持したＨ９細胞の形態。パネルＢ：Ａに示されたのと同じコロニー中で観察されたＧＦＰポジティブ細胞。パネルＣ：ＳＳＥＡ−４高集団（未分化細胞）におけるＧＦＰポジティブ細胞の％のＦＡＣＳ分析。細胞を、播種の２４（バー１および２）または４８時間（バー３および４）にトランスフェクトし、そしてトランスフェクションの２４時間（バー１および３）または４８時間（バー２および４）後に分析した。明るい緑色の細胞が、トランスフェクションの２４時間後に、ラミニン上の未分化ＥＳコロニーの密な領域において観察された（パネルＡおよびＢ）。最初の播種後４８時間でのトランスフェクションは、最大効率を与えた：細胞の３８％が、トランスフェクション後２４時間でのＦＡＣＳ分析により決定したところ、ＧＦＰポジティブであった（パネルＣ）。
【０３０９】
次の実験は、ｍＥＦフィーダー上で維持した細胞と、ｍＥＦ馴化培地中でＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニンでコーティングしたプレート上で維持したＨ９細胞とのトランスフェクション効率を比較した。通常培地中で維持したフィーダー層上の細胞を、コントロールとして用いた。フィーダー上の細胞と、フィーダーのない細胞との間の形態学的差異は、播種後１日または２日で観察された。フィーダー上のコロニーは、フィーダー層なしで維持した細胞よりも密であった；フィーダーのない培養物中の個々のｈＥＳ細胞は、それほど密でなく、そしてより平らであった。ラミニン上の細胞とＭａｔｒｉｇｅｌ上の細胞との間で細胞にもコロニーの形態にも有意な差異は存在しなかった。これらの細胞を、播種後２日目に、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰを発現するプラスミドでトランスフェクトした。このトランスフェクションの２４時間後、細胞を、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ発現について調べた。
【０３１０】
細胞を、ｍＥＦフィーダー上で通常培地中で（ｍＥＦ／ＲＭ）、ラミニン上でｍＥＦによって馴化された培地中で（ラミニン／ＣＭ）、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で馴化培地中で（Ｍａｔｒｉｇｅｌ／ＣＭ）維持した。図１０（Ａ）に示すように、明るい緑色細胞が、フィーダーを含まない培養物の未分化のｈＥＳコロニー中に観察された。対照的に、極わずかな緑色細胞が、フィーダー上のコロニーにおいて観察された。ＦＡＣＳ分析は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上の１６％の細胞およびラミニン上の１４％の細胞がＳＳＥＡ−４高集団中でＧＦＰポジティブであり、一方、フィーダー上の細胞のほんの５％がポジティブであることを示した。これらの結果は、トランスフェクション効率が、フィーダーのない条件を用いることによって有意に増加したことを示す。
【０３１１】
次の実験は、１）ＤＮＡ：脂質の比；２）ｍＥＦ馴化培地の添加の４時間前の細胞へのＤＮＡ／脂質複合体の添加  対  ｍＥＦ馴化培地の存在下での細胞への複合体の添加；および３）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TM  対  ＦｕＧＥＮＥTMの使用の効果を評価した。
【０３１２】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TMを用いるトランスフェクションは、上記に記載される。ＦｕＧＥＮＥTMでのトランスフェクションを、以下の通りに行った。プラスミドＤＮＡ（５〜１０μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ＣｌｏｎＴｅｃｈカタログ番号６０８４−１）を水中で希釈して、１００μｌの最終容量とした。先行実験において、５〜３０μＬのＦｕＧＥＮＥTMを、十分なＯｐｔｉＭＥＭTMに添加して、１００μＬの最終容量を達成した。次いで、ＤＮＡ溶液を、ＦｕＧＥＮＥTM溶液にゆっくりと添加し、そして穏やかに混合した。この混合物を８００μｌのＯｐｔｉＭＥＭTMを補充する前に室温で３０分間インキュベートした。細胞を、３ｍＬの予め温めたＯｐｔｉＭＥＭTMで洗浄し、そして１ｍＬのＤＮＡ／脂質混合溶液中で３７℃にて４時間インキュベートした。いくつかの実験では、４時間で、ウェルにさらに２ｍＬのｍＥＦ馴化培地を入れた；他の実験では、ＤＮＡ／脂質混合物を、２ｍＬのｍＥＦ馴化培地を含むウェルに添加し、そして細胞をこの混合物中で一晩インキュベートした。
【０３１３】
結果を図１０（Ｂ）に示す。最大効率は、以下の条件下で得られた：バー１＝５μｇのプラスミド＋１２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００TMの混合物、２．５ｍＬのｍＥＦ馴化培地を含むウェルに１ｍＬのＤＮＡ／脂質混合物を添加し、そしてこの細胞をこの混合物中で一晩インキュベートする。バー２および３＝１０μｇのプラスミド＋１５μｌのＦｕＧＥＮＥTMの混合物、そして細胞を１ｍＬのＤＮＡ／脂質混合物中で４時間インキュベートし、その後、２．５ｍＬのｍＥＦ馴化培地を添加する。Ｌ＝Ｌｉｐｏｆｅａｔａｍｉｎｅ２０００TM；Ｆ＝ＦｕＧＥＮＥTM。
【０３１４】
別のシリーズの実験では、ｈＥＳ細胞を、（コラゲナーゼの代わりに）滅菌ＰＢＳ中の０．５ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液を用いてフィーダーのない培養物中でマトリックスから剥離した後にトランスフェクトした。細胞を、個々の細胞が丸くなり始めるまでは３７℃にて５分間インキュベートした。次いで、ＥＤＴＡ溶液を除去し、そして約１ｍＬの馴化培地を、ウェルにピペットで入れ、細胞を剥離した。次いで、得られる細胞クラスターを、１：３または１：６の分割比で、フィーダーのない新たな培養物中で再度プレートした。これらの条件下で、これらの細胞を播種後２４時間でリポフェクションした場合、最大の一過性のトランスフェクション効率が達成された。
【０３１５】
フィーダーのないｈＥＳ細胞が安定な遺伝的改変を受けるか否かを調べるために、ＭａｔｒｉｇｅｌTM（登録商標）上で維持したＨ１  ｈＥＳ細胞を、ＥＦ１ａプロモーターによって駆動されるβ−ガラクトシダーゼを保有する７．５μｇのプラスミドと、ネオホスホトランスフェラーゼ遺伝子を駆動するＰＧＫプロモーターを保有する２．５μｇのプラスミドとの混合物で同時トランスフェクトした。この細胞を、ｍＥＦ馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上へのプレート後４８時間でトランスフェクトした。１０μｇのプラスミド＋１５μｌのＦｕＧＥＮＥTMを、１ｍＬにおいて細胞とともに４時間インキュベートし、その後、２．５ｍＬのｍＥＦ馴化培地を添加した。４８時間後、培地を、２００μｇ／ｍＬジェネティシンを補充したｍＥＦ馴化培地に交換した。培養物を、このジェネティシンを含有する培地中で、毎日培地を交換しながら２１日間を越えて維持した。全ての偽トランスフェクション培養物（すなわち、プラスミドではなく水と混合したＦｕＧＥＮＥTMを入れた培養物）は、４８〜７２時間以内に死んだ。薬物耐性コロニーが、ＦｕＧＥＮＥTMおよびプラスミドの両方でトランスフェクトしたウェルにおいて、１０5個の元々トランスフェクトした細胞に対して約１の頻度で生じた。このコロニーを、ジェネティシン含有ｍＥＦ馴化培地中で維持し、そして増殖させた。
【０３１６】
（実施例１１：フィーダーを含まない培養物についての馴化培地の別の供給源）
いくつかの細胞株からの馴化培地を、フィーダーのない培養物においてｈＥＳ細胞の増殖を支持するそれらの能力について試験した。初代マウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）およびＮＨＧ１９０テロメラーゼ化ｍＥＦ株の単離は、既に記載されている。ＳＴＯは、ＡＴＣＣから入手可能な形質転換されたマウス線維芽細胞株である。ＢＪ  ５ｔａは、テロメラーゼ化されたヒト包皮線維芽細胞細胞株である。ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥは、テロメラーゼ化したヒト網膜上皮細胞株である。
【０３１７】
細胞を増殖させるために用いた培地は以下の通りであった。１．ｍＥＦ培地：９０％  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（熱非働化）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン。２．ＳＴＯ培地：０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補充したｍＥＦ培地。３．ＢＪ  ５ｔａ培地：９０％  ＤＭＥＭおよび１０％  Ｃｏｓｍｉｃ仔ウシ血清（熱非働化していない）。４．ＮＨＧ１９０培地：さらに１０％  ＦＢＳを補充したｍＥＦ培地。５．ＲＰＥ培地：９０％  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％  ＦＢＳ（熱非働化していない）、１０ｍＬ  Ｌ−グルタミンおよび３．４８ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム。６．分化培地：８０％ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび１％  非必須アミノ酸、２０％ＦＢＳを補充した。
【０３１８】
馴化培地を調製するために、それぞれの細胞株を、Ｃａ++／Ｍｇ++を含まないＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で約５分間インキュベートし、そしてｍＥＦ培地中に懸濁することにより収集した。細胞を約４０００ラド（１４０ｋＶで約５０８秒間；Ｔｏｒｒｅｘジェネレーター、ＥＧ＆ＧＡｓｔｒｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｌｏｎｇ  Ｂｅａｃｈ  ＣＡにおける棚の設定６）で照射した。次いで、これらを計数し、そしてｍＥＦについては約５５，０００細胞／ｃｍ2で、ＮＨＧ１９０細胞については約３８，０００／ｃｍ2で、ＳＴＯ細胞については約９５，０００／ｃｍ2で、ＢＪ  ５ｔａ細胞については約８０，０００／ｃｍ2で、ＲＰＥ細胞については約９０，０００／ｃｍ2で播種した。少なくとも４時間後、培地を、４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦを含有するＥＳ培地に交換した。馴化培地を、その後毎日収集し、そしてｈＥＳ培養物への供給のために用いた。ｈＥＳ培養物への添加の前に、各馴化培地に、４ｎｇ/ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ；Ｇｉｂｃｏ）を補充した。
【０３１９】
図１、パネルＢ（右側）は、非馴化の、通常培地（ＲＭ）と比較して、ｍＥＦ、ＮＨＧ１９０、ＳＴＯおよびＢＪ  ５ｔａ細胞により馴化された培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で維持されたＨ９株のｈＥＳ細胞の形態を示す。ＲＰＥ馴化培地中の細胞は、培養の最初の週のうちに分化した。他の馴化培地中の細胞はすべて、適切なＥＳ形態を備えたｈＥＳコロニーを有していた。形態、培養の集密度、および非分化細胞に対する分化細胞の比率に基づき、馴化培地は、以下のように優先度が減少する順にランク付けされる：始原ｍＥＦ、ＮＨＧ１９０、ＳＴＯ、およびＢＪ５ｔａ。
【０３２０】
始原ｍＥＦからの馴化培地中で維持された細胞と同様に、ＮＨＧ１９０、ＳＴＯおよびＢＪ５ｔａを含む他の細胞株により馴化された培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上の細胞は、ＦＡＣＳ分析により分析したとき、高レベルでＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１を、しかし低レベルのＳＳＥＡ−１を発現した（図２Ｃ）。ｍＥＦ馴化培地またはＮＨＧ１９０馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上の細胞は、３つの胚葉細胞型に分化し得た。この分化した培養の免疫細胞化学的分析は、ニューロンに一致するβチューブリンＩＩＩ（外胚葉系統）、心筋細胞に一致する心臓トロポニンＩ（中胚葉系統）、および内胚葉系統の細胞に一致するαフェトプロテインについて陽性の染色を示した。
【０３２１】
実施例１〜３では、ｍＥＦで調整する前に、そして次いでこの馴化培地を集めそしてｈＥＳ細胞を養うために用いるときに再び、培地に、４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦを添加することによって培地を調製した。ｈｂＦＧＦの培地への両方の添加が、ＥＳ細胞を未分化状態に維持するために必要である否かを決定するために、ｈｂＦＧＦの一方または両方の添加をなくした実験を実施した。
【０３２２】
ｈｂＦＧＦの第２が添加ないの馴化培地中で維持された培養は、初期継代では健常には見えず、そして培養２９日後に分化したように見えた。ｈｂＦＧＦの第１の添加がない馴化培地中で維持された細胞は、大部分が分化した形態を示したが、培養２７日後により小さい未分化コロニーをなお形成した。ｈｂＦＧＦのいずれの添加も行わない馴化培地中に維持された細胞は、１８日後完全に分化した。対照的に、ｂＦＧＦの両方の添加を行って調製した馴化培地中で培養した細胞は、長期間培養で健常かつ未分化であるように見えた。従って、フィーダー細胞で培養する前後の両方でｂＦＧＦを添加することにより馴化培地を調製することは、次のフィーダーのない（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ）培養におけるｈＥＳ細胞の分化を防ぐ助けとなる。
【０３２３】
馴化培地の貯蔵は以下のように試験した：回分培地は、上記のようにｍＥＦ細胞培養中で１−２日調整することにより調製し、そしてシールされた培養フラスコ中４℃で貯蔵した。フィーダーのないｈＥＳ細胞培養を、貯蔵培地を毎日交換して維持した。未分化幹細胞の特徴的な形態特徴は、新鮮馴化培地中に維持されたｈＥＳ細胞に匹敵して、少なくとも７日間後にもなお存在した。
【０３２４】
白血病阻害因子（ＬＩＦ）が、フィーダーのないｈＥＳ細胞を維持することにおいて馴化培地を置換し得るか否かを決定するために、Ｈ１およびＨ９株の細胞を、ＬＩＦを最終濃度１５００、１，０００、または５００Ｕ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓからの組換えＬＩＦ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２５０−Ｌ）で含むＥＳ培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養した。細胞は、陽性コントロールとしてのｍＥＦ馴化培地、および陰性コントロールとしての非馴化ＥＳ培地と同時に培養した。１週間後、ＬＩＦを含むかまたは含まない、いずれの培地における培養も、大きな程度の分化を示したが、ｍＥＦ馴化培地中に維持された培養は、未分化コロニーを主に含んでいた。これらのデータは、ＬＩＦがフィーダー細胞の不在下では未分化状態にあるｈＥＳ細胞を維持しないことを示す。
（実施例１２：Ｈ９幹細胞株からのヒト胚線維芽細胞様細胞によって調整された培地）
細胞は、線維芽細胞および間葉細胞の形態的規準を有するｈＥＳ細胞に由来した。それらは、フィーダーのない培養でｈＥＳ細胞を支持し得る。
【０３２５】
Ｈ９  ｈＥＳ細胞株を本開示の別の箇所に記載のように得た。胚様体を形成するため、ｈＥＳ細胞を、３７℃１０分間の約２００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶとのインキュベーションの後回収し、そして分化培地中小クラスターに解離させ、そして非接着性細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で培養し、懸濁液中に凝集体を形成した。約２×１０6細胞を各ウェル（９．６ｃｍ2）中に接種した。懸濁液中で２日後、凝集体をゼラチン被覆プレート中に写した。それらは、プレートに付着し、そして異なる形態を有する細胞に分化し続けた。線維芽細胞様細胞は、さらに１１日後、分化細胞の混合集団中１００〜１０００細胞のクラスターで観察された。
【０３２６】
線維芽細胞様細胞を単離するため、培養を約２００Ｕ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ中３分間３７℃でインキュベートした。線維芽細胞様細胞のクラスターを、顕微鏡下でＰｉｐｅｔｍａｎTMで取り出し、そして分化培地を含むチューブに直接移すか、またはコラゲナーゼ溶液中に放出し、そして次に集めた。細胞を遠心分離し、分化培地中に再懸濁し、そして６ウェルプレートの１つのウェル上にプレートした。細胞を増殖させ、そして連続的に継代した．第３回目の継代で、培養をｍＥＦ培地にスイッチした。すべての手順で、細胞は、２−３日毎に養われた。
【０３２７】
線維芽細胞様細胞中にテロメラーゼを導入するために、これらは、以下のように、レトロウイルスを発現するｈＴＥＲＴに感染させた。細胞を、感染の１日前に、８．６×１０4細胞／ウェル（９．６ｃｍ2）で６ウェルプレート上に接種し、ｍＥＦ培地に交換される８時間前に、４μｇ／ｍＬポリブレンを補填したウイルス含有培地とともにインキュベートした。異なるウェルを、ｐＢＡＢＥ−ｈＴＥＲＴまたはｐＢＡＢＥベクターコントロールで感染した。ｐＢＡＢＥ−ｈＴＥＲＴは、ｈＴＥＲＴコード配列（５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは除去、そしてＡＴＧ開始コドンから−１〜−５の位置にあるＫｏｚａｋコンセンサス翻訳開始部位）を、市販のｐＢＡＢＥ．ｐｕｒｏのＥｃｏＲＩ部位中に、ｈＴＥＲＴコード領域を５’ＬＴＲと同じ配向に配置してクローニングすることにより構築した（Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅら、Ｈｕ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．９：４０３、２０００）。細胞をさらに６日培養し、そして最終濃度１．６μｇ／ｍＬのピューロマイシン中でさらに８日間選択した。次いで細胞を回収し、そしてｍＥＦ培地中に再接種した。
【０３２８】
細胞を増殖させ、そして５０日間線維芽細胞様形態を提示し続けた。細胞を、感染後２０日に、ＴＲＡＰアッセイのために集めた。細胞は、０日から２７日までｍＥＦ培地中に維持され、そして２８日から４３日まで分化培地にスイッチした。細胞を選択後に各継代ごとに計数し、そしてその集団の倍化を計算した。
【０３２９】
テロメラーゼ化細胞株およびコントロール細胞株（コントロールレトロウイルスで非形質導入または形質導入）の両方は、５０日の培養の間約７または８倍化する培養で増殖した。ｈＴＥＲＴ発現カセットで形質導入した細胞は、ＴＲＡＰアッセイで陽性のテロメラーゼ活性を示したが、コントロール細胞は、任意の活性を示さなかった。ｈＴＥＲＴ−ｈＥＦ細胞は、コントロール細胞の増殖速度と同様の増殖速度で連続的に継代した。
【０３３０】
馴化培地を調製するために、ｈＴＥＲＴトランスフェクト細胞を、Ｃａ++／Ｍｇ++を含まないＰＢＳで１回洗浄し、そして１．５−２ｍＬトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で２分間インキュベートすることにより回収した。この細胞をプレートから脱離させた後、それらをｍＥＦ培地に集めた。それらを４０００ｒａｄで照射し、カウントしそして約３．７−５×１０5細胞／ウェルで接種した。少なくとも１６時間後、培地を、ｈＥＳ培地＋４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦで交換した（４ｎｇ／ｍＬの外から添加したヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を含む上記の血清補充培地）。６ウェルプレートのウェルあたり３〜４ｍＬを用いた。
【０３３１】
馴化培地をｈＥＳ培養を養うために毎日集めた。ｈＥＳ培養への添加の前に、馴化培地を４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）で補填した。ｈＴＥＲＴ−ｈＥＦ培養を、この系で１−２週の間用いた。
【０３３２】
この培地のｈＥＳ細胞増殖を支持する能力を、Ｈ１  ｈＥＳ細胞株に対して試験した。ｈＥＦ馴化培地により支持されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上のフィーダーのない培養中に再プレートしたｈＥＳ細胞の培養（パネルＣ＆Ｆ）は、未分化ｈＥＳ細胞の形態特徴を持つコロニーを形成した。この培養は、始原ｍＥＦフィーダー細胞の層上に直接、または始原ｍＥＦにより調整された培地中Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で増殖したｈＥＳ細胞から識別不能に見えた。ｈＥＳ細胞の健常コロニーは、サイズが増加し、そして未分化胚性幹細胞の特徴的な特色を有していた。２〜３のコロニーは、所定の程度の分化を示したが、分化の程度は、各々の培養条件の下で同様であった。
【０３３３】
接種後７日で、培養はほぼ集密になり、そして１：３または１：４の比、約１３０，０００〜１７０，００細胞ｃｍ-2で分裂した。細胞を、３０日にわたってこの条件下で、ｈＥＳ細胞の形態的特徴を提示しながら維持した。
【０３３４】
（実施例１３：Ｈ１株からのｈＥＦにより調整された培地）
第２のヒト胚線維芽細胞（ｈＥＦ）様細胞株を、Ｈ１と称する、異なるｈＥＳ細胞株から発生させた。胚様体が以前のように形成され、そして４日後，懸濁液で、培養を、さらなる９日間のためにゼラチン被覆プレート上にプレートした。
【０３３５】
この実施例では、線維芽細胞をピペットにより選択するよりむしろ、バルク培養から発生させた。培養は、ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩ型において、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を回収し、解離し、遠心分離し、分化培地中に再懸濁し、そして６ウェルプレート中にプレートした。増殖細胞をｈＥＦ培地（９０％ＤＭＥＭ、１０％熱不活化ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および２ｍＭのＬ−グルタミン）中で継代し、そして２−３日毎に養った。２継代の後、この細胞集団は、線維芽細胞の形態的特徴を備え均一であるように見えた。このｈＥＦ細胞株をＨＥＦ１と称した。
【０３３６】
亜集団を、実施例１２中のように、レトロウイルステロメラーゼ発現ベクター（ｐＢＡＢＥ−ｈＴＥＲＴ）、またはベクターコントロールで形質転換した。
【０３３７】
図１１（パネルＡ）は、ＨＥＦ１細胞株の形態を示す。パネルＢ（下）は、ＴＲＡＰアッセイで測定したときのテロメラーゼ活性を示す。ｈＴＥＲＴ発現カセットで形質転換した細胞は、形質導入後２０または６５日で陽性のテロメラーゼ活性を示した。非形質導入細胞株、またはベクターコントロールで形質導入した細胞は、テロメラーゼ活性を示さなかった。
【０３３８】
図１２は、ｈＴＥＲＴ形質導入ＨＥＦ１細胞、およびベクターコントロールで形質導入された細胞の増殖曲線を示す。両方の株は、コントロール細胞が分裂することを停止した（多分それらはヘーフリック限度に到達したためである）３８日の時点まで、ほぼ２日毎に倍化した。ｈＴＥＲＴトランスフェクト細胞は、６０日の時点（３０倍化）を越えて一致した増殖速度で増殖を継続した。
【０３３９】
図１３は、細胞老化の既知のバイオマーカーである（Ｄｉｍｉｔｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９３６３、１９９５）、老化関連βガラクトシダーゼに対する染色後の、ｈＴＥＲＴ形質導入細胞およびコントロール細胞の顕微鏡写真である。チャンバースライド上で増殖した細胞を、ＰＢＳ中の０．２％のグルタルアルデヒド中で２分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、そして４０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ６．０中の、１ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）、５ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6、５ｍＭのＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＬのＭｇＣｌ2で一晩インキュベートした。ＨＥＦ１コントロール細胞は、βガラクトシダーゼについて強く染色され、その一方、ｈＴＥＲＴ形質導入細胞は、染色されなかった。合わせた結果は、ｈＴＥＲＴの発現が、ＨＥＦ１細胞の寿命特徴を延長することを示す。
【０３４０】
培地は、６０００ｒａｄで照射したＨＥＦ１細胞を用いて実施例１２におけるように調整し、そして約４．１〜５．５×１０4細胞ｃｍ-2で接種した。この培地を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基体上で培養したＨ９  ｈＥＳ細胞株の増殖を支持するその能力について試験した。
【０３４１】
図１４は、マウス胚線維芽細胞によるか、またはＨＥＦ１細胞株のいずれかにより調整した培地中に継代した後のｈＥＳ細胞のコロニーを示す。ｈＥＳ細胞は、４継代の間、ＨＥＦ１馴化培地を用いて維持され、未分化ＥＳ細胞の形態を提示し続けた。このｈＥＳ細胞は、ｈＴＥＲＴおよびＯＣＴ−４の発現を維持することが見出された。パネルＢに示されるように、それらもまた、未分化ｈＥＳ細胞の特徴である、ＴＲＡＰアッセイで測定されたとき、テロメラーゼ活性を示し続けた。
【０３４２】
（実施例１４：ｃＤＮＡライブラリー）
ポリＡ＋ｍＲＮＡを、以下のように、未分化および分化ｐＰＳ細胞から単離した。
【０３４３】
ヒト胚性幹細胞を、本開示の他の箇所で記載されたように、フィーダー細胞上からか、またはフィーダーのない環境中のいずれかで増殖した培養から得た．ｃＤＮＡライブラリーは両方から得た。フィーダーのない培養を用いることは、マウスＲＮＡを汚染することのないライブラリーを生成する利点を有し、そしてｍＲＮＡ単離のために多数の細胞を産生するためにより容易に大規模化され得る。
【０３４４】
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙTMプロトコールおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、製造業者の指示書に従ってｈＥＳ細胞から単離された。簡単に述べれば、細胞を、グアニジニウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）の溶液を用いて培養皿中で直接溶解し、そして得られる抽出物を、ＲＮＡは結合するが夾雑物およびゲノムＤＮＡは結合しない条件下で、ＲＮｅａｓｙTMマトリックスに結合させた。このマトリックスを、製造業者により供給される定められた緩衝液で洗浄した後、総ＲＮＡを水で溶出し、そして２６０ｎｍにおける吸光度により定量した。
【０３４５】
次いで、ポリＡ＋ｍＲＮＡを、総ＲＮＡ調製物から、ＯｌｉｇｏｔｅｘTMプロトコールおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることにより精製した。簡単に述べれば、共有結合したｄＣ10Ｔ30オリゴヌクレオチドを含むビーズマトリックスを総ＲＮＡと混合し、ｍＲＮＡのポリＡ＋テイルと、ｄＣ10Ｔ30結合ビーズとの間の相互作用を可能にした。規定した洗浄溶液を用いた洗浄の後、結合したｍＲＮＡを、低塩緩衝液中に放出し、そして収率を２６０ｎｍにおける吸光度により定量した。ゲル電気泳動で、ポリＡ＋ｍＲＮＡの全体の純度を確認した。
【０３４６】
ｃＤＮＡ合成は、標準的なプロトコール（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM  Ｌａｍｂｄａ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて達成された。１μｇのポリＡ＋ｍＲＮＡを、オリゴｄＴ−ＮｏｔＩプライマー／アダプターおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩ逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡに変換した。［32Ｐ］ｄＣＴＰをこの反応中に含め、第１鎖変換効率の計算を可能にした。次いで、一本鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮａｓｅＨの存在下、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換した（すべての酵素はＥ．ｃｏｌｉ起源）。この二本鎖ｃＤＮＡを、ＳａｌＩアダプターと連結し、次いでゲル排除クロマトグラフィーにより分析した。カラムフラクションの各々の一部分を、ゲル電気泳動により分析し、そして２ｋｂｐまたはそれより大きい推定中間サイズをもつｃＤＮＡを含むフラクションをプールした。次いで、サイズ選択されたｃＤＮＡプールを、ＮｏｔＩエンドヌクレアーゼで制限し，そしてＮｏｔＩ／ＳａｌＩ制限ｐＳｐｏｒｔ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と連結した。連結産物を用いて、ＵｌｔｒａＭａｘTMコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換し、それを次いでアンピシリンを含む培地プレート上にプレートした。代表的には、これらの方法により生成されたライブラリーは、個々のコロニーからのプラスミド調製物のＰＣＲにより判定したとき、−１．２ｋｂｐの中間ｃＤＮＡ挿入サイズをもつ、５×１０6以上の独立クローンから構成されていた。
【０３４７】
ｃＤＮＡライブラリーはまた、胚様体（ＥＢ）細胞から調製され、これは、ｈＥＳ細胞から分化した細胞の混合集団を含む。ＥＢを調製するために、ｈＥＳ細胞の単層培養を、約２００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶと、約５−２０分３７℃でインキュベートすることにより回収した。このｈＥＳ細胞を、クラスターに解離し、そして８０％ＫＯ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、２０％非加熱不活化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  グルタミン、および０．１ｍＭβメルカプトエタノールを含む、分化培地中、非接着細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中にプレートした。
【０３４８】
次いで、このＥＢを、９．６ｃｍ2ウェルあたり２ｍＬの培地中１：２の比率で接種した。このＥＢは、一日おきに、ウェルあたり２ｍＬの培地を４ｍＬ／ウェルまで添加すること、次いで集められそして２ｍＬの新鮮培地中に再懸濁することにより養われた。総ＲＮＡは、懸濁培養中約２−８日後に調製された。あるいは、ＥＢは、懸濁培養中に約４日間維持され、次いでゼラチン被覆プレート上にプレートし、そしてさらに７日間培養した。これは、多様な細胞集団の形成をもたらし、そしておそらくはより高い細胞密度のためにＲＮＡの収率を向上させる。約２０〜５００×１０6細胞からの総ＲＮＡの収率は、約２５〜２５００μｇであった。
【０３４９】
（ｈＥＳ細胞における発現のためのプロモーターの選択）
種々のプロモーターを、未分化ｈＥＳ細胞における安定な長期間遺伝子発現を駆動するそれらの能力について試験した。構築物は、レトロウイルス形質導入によるか、またはＦｕＧＥＮＥTM媒介リポフェクションによるかのいずれかで導入した。
【０３５０】
６ウェルプレートにプレートされたｈＥＳ細胞は、フィーダー層から、コラゲナーゼ（約２００単位／ｍＬ）を３７℃で７−１０分間用いて取り出した。コロニーが脱離はじめるとき、各ウェルからのコラゲナーゼを吸引し、そして２ｍＬの標準ｈＥＳ培地／ウェルで置換した。ｈＥＳ細胞を、単一ウェルの表面を５ｍＬピペットで掻き取ることにより取り出し、そして５０ｍＬのコニカルチューブに移した。さらなるｈＥＳ培地を添加して最終容量を１０ｍＬにした。細胞懸濁液を、１０ｍＬピペットで１０−１２回摩砕し、そしてさらなる８ｍＬの標準ｈＥＳ培地を添加した。３ｍＬの細胞懸濁液を、上記のようにゼラチンおよびｍＥＦフィーダー層で予備被覆された６ウェルプレートの各ウェルに添加した（すなわち、６ウェルプレートの１ウェルが新たなプレートの６ウェルを接種するに十分であった）。
【０３５１】
レトロウイルスを用いる形質導入は、以下のように行った。ＧＲＮ３５４と称するレトロウイルスベクターは、ＣｌｏｎＴｅｃｈから購入したＰＭＳＣＶｎｅｏベクター（カタログ番号Ｋ１０６２−１）を用いてＧｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．で構築された。ｅＧＦＰコード領域は、ＭＳＣＶ  ＬＴＲから下流に挿入された。このＬＴＲは、ＧＦＰの発現を駆動し、そしてこのベクターはまた、マウスＰＧＫプロモーターにより駆動されるｎｅｏr遺伝子を含む。
【０３５２】
プレートは、０．５％ゼラチンおよびＮＨＧ１９０フィーダー細胞（２４ウェルプレートについて１ｍＬ  ＮＨＧ１９０培地中７．５×１０4；６ウェルプレートについて３ｍＬ培地中３．７５×１０5）で被覆した。ｈＥＳ株Ｈ７を、ｈＥＳ培地中に、２４ウェル調製プレート上に接種した（１ｍＬ／ウェル）。４８時間後、３ウェルのｈＥＳ細胞を、３７℃で０．０５％トリプシン／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いた脱離させ、５００μＬのＮＨＧ１９０培地中に再懸濁し、そして計数した。レトロウイルス構築物ｐＧＲＮ３５４のストックを使用の直前に氷上で融解した。増殖培地をウェルから吸引し、そして４００μＬ  ｈＥＳ培地プラス８μＬのレトロウイルス（ＭＯＩ  １０）および４μＬの８ｍｇ／ｍＬポリブレン溶液（Ｓｉｇｍａ）で置換した。２時間後、８００μＬのｈＥＳ培地をウェルあたり添加した。形質導入したウェルの各々に、１ｍＬの新鮮ｈＥＳ培地を２４時間毎に再供給した。
【０３５３】
形質導入の４日後、培地を、２００μｇ／ｍＬゲネチシンを含む１ｍＬのｈＥＳ培地で置換した。ゲネチシン選択の３日後、細胞をコラゲナーゼで脱離させ、摩砕し、３ｍＬのｈＥＳ培地中に再懸濁し、ゼラチンおよびＮＨＧ１９０フィーダーで被覆した６ウェルプレートの１つのウェル中に再接種し、そして２４時間後、ｈＥＳ培地を再供給した。次いで培地を、ゲネシチンを含むｈＥＳ培地で再び置換し、そして２４時間毎に再供給した。
【０３５４】
ＦｕＧＥＮＥTM６（Ｒｏｃｈｅ）を用いるリポフェクチンを、製造業者の指示書に従って構築した。このプラスミドＤＮＡ（５−１０μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ＣｌｏｎＴｅｃｈカタログ番号６０８４−１）を水中に最終容量１００μｌまで希釈した。パイロット実験では、５−３０μＬのＦｕＧＥＮＥTMを、十分なＯｐｔｉＭＥＭTM溶液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１−５８−０２１）に添加し、１００μＬの最終容量を達成した。次いで、このＤＮＡ溶液をＦｕＧＥＮＥTM溶液にゆっくり添加し、そして穏やかに混合した。この混合物を、８００μｌのＯｐｔｉＭＥＭTMで補填する前に、３０分間室温でインキュベートした。
【０３５５】
トランスフェクションの４８時間前、ｈＥＳ細胞を、ゼラチンおよびｍＥＦフィダー層で被覆した６ウェルプレート上に接種した。細胞を、３ｍＬの余熱したＯｐｔｉＭＥＭTMで洗浄し、そして３７℃で４時間ＤＮＡ／脂質混合物中でインキュベートした。いくつかの実験では、４時間後、ウェルに、さらなる２ｍＬのｍＥＦ馴化培地を入れた；他には、ＤＮＡ／脂質混合物を、２ｍＬのｍＥＦ馴化培地を含むウェルに添加し、そして細胞をこの混合物中で一晩インキュベートした。
【０３５６】
次の実験では、ｈＥＳ細胞のフィーダーのない培養を、ＦｕＧＥＮＥTMを用いてトランスフェクトした。これらの実験では、未分化ｈＥＳ細胞を、ｍＥＦ馴化培地プラス付加的な４ｎｇ／ｍＬ  ｈｂＦＧＦ中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）被覆６ウェルプレート上に接種した（約１．５×１０4細胞ｃｍ-2の代表的密度）。プレーティングの４８時間後、細胞を、すでに記載したように、ＦｕＧＥＮＥTMでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞に、ｍＥＦ馴化培地プラス４ｎｇ／ｍＬ  ｈｂＦＧＦおよび２００μＧ／ｍＬゲネチシンを再供給した。次いで、細胞に、日毎のベースで２００μＧ／ｍＬゲネシチンを含む培地を再供給した。
【０３５７】
代表的実験の結果を表２に要約する。
【０３５８】
【表２】
0004919445.tif 000003
これらの規準により、ＰＧＫ、ＥＦ１α、およびＵｂｉＣプロモーターは、未分化ｈＥＳ細胞におけるｃＤＮＡクローンの安定な長期間発現に適切である。
【０３５９】
この開示は、フィーダー細胞の非存在下でヒト多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するための改善されたシステムを提供する。そのフィーダー細胞の役割は、細胞外マトリックス上のその培養物を支持し、そしてその細胞を馴化培地で培養することによって置き換えられ得る。商業的規模で馴化培地を産生し得る永久的な細胞株が提供される。ウイルスベクターまたはＤＮＡ／脂質複合体を細胞に導入することによって、ｐＰＳ細胞を遺伝的に変更する方法もまた見出された。本開示により記載されるシステムは、ｐＰＳ細胞分化の生物学の研究、およびヒト治療における使用のための重要な製品の産生において使用するためのｐＰＳ細胞の大規模増殖を可能にする。
【０３６０】
本明細書で提供される組成物および手順は、以下の請求項で具現化される本発明の思想から逸脱することなく当業者によって効果的に改変され得ることが認識される。
【０３６１】
【表３】
0004919445.tif 000004
0004919445.tif 000005
【０３６２】
【発明の効果】
本発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖、増殖を促進する培養条件、ならびに遺伝的改変、ｃＤＮＡライブラリーの産生、および組織再生を目的とする分化した細胞の産生のための使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、フィーダー細胞のない培養におけるｈＥＳ細胞の形態を示す顕微鏡写真のハーフトーン製版である。パネルＡ（左側）は、通例の培養培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中においてフィーダー細胞上に培養されたｈＥＳ細胞の形態、あるいはｍＥＦ馴化培地中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチン、またはコラーゲンＩＶ上に培養されたｈＥＳ細胞の形態を示す。パネルＢ（右側）は、馴化されていない通例の培地（ＲＭ）と比較された、ｍＥＦ細胞、ＮＨＧ１９０細胞、ＳＴＯ細胞およびＢＪ５Ｔａ細胞によって馴化された培地中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上に維持されたｈＥＳ細胞の形態を示す。通例の培地におけるｈＥＳ細胞は、培養の最初の週の間に分化した。特定の型の馴化培地中におけるｈＥＳ細胞は、未分化の細胞に関して適切な形態を持ったコロニーを含んだ。パネルＣは、通例の培地（ｍＥＦ／ＲＭ））中においてフィーダー細胞上に維持されたｈＥＳ細胞、あるいはｍＥＦ馴化培地中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上またはラミニン上に維持されたｈＥＳ細胞において測定されたインテグリン発現を示す棒グラフである。インテグリン構成成分α６およびβ１は、ｈＥＳ細胞の細胞外マトリックスへの接着における役割を演じ得る。
【図２】図２は、ＦＡＣＳ解析によるフィーダー細胞なしの細胞における表面マーカー発現を示す。パネルＡは、通例の培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中においてフィーダー細胞上に増殖されたｈＥＳ細胞、または馴化培地を用いて細胞外マトリックス上に増殖されたｈＥＳ細胞によって発現された糖タンパク質ＳＳＥＡ−４の発現を示すＦＡＣＳスキャンプロフィールである。パネルＢは、異なるマトリックス上で培養されたｈＥＳ細胞に関する表面マーカーの蛍光強度を示す棒グラフである。パネルＣは、異なる細胞株由来の馴化培地中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上に培養されたｈＥＳ細胞に関する表面マーカーの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３】図３は、初期フィーダー細胞（ｍＥＦ）によって増殖された細胞、あるいは馴化培地中において細胞外マトリックスＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上に増殖された細胞に対する免疫組織化学によって検出されたマーカー発現を示す顕微鏡写真のハーフトーン製版である。フィーダー細胞のない培養物において増殖されたｈＥＳ細胞は、マウス線維芽フィーダー細胞上に増殖されたｈＥＳ細胞に類似する表現型のマーカーを有する。
【図４】図４は、通例の培地（ＲＭ）または馴化培地（ＣＭ）とともに、フィーダー細胞（ｍＥＦ）あるいは細胞外マトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン）とともに培養されたｈＥＳ細胞におけるＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴ発現の解析を提供する。上のパネルは、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルでのＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴの発現を示すゲルのコピーである。下のパネルは、１８ｓスタンダードに対するＯＣＴ−４またはｈＴＥＲＴの比率として表された、異なる基質上に増殖する細胞に対する発現のレベルを比較する棒グラフである。馴化培地中において、ラミニンおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上に生育されたｈＥＳ細胞は、フィーダー細胞層上に増殖されたｈＥＳ細胞のパターンと類似した発現パターンを有する。
【図５】図５は、ＴＲＡＰアッセイによって培養されたｈＥＳ細胞において測定されたテロメラーゼ活性を示す、ゲルのハーフトーン製版である。すべての培養条件は、フィーダー細胞なしの培養物において４０日間後に、陽性のテロメラーゼ活性を示した。
【図６】図６は、胚様体形成を通しての分化を可能にされた、培養されたｈＥＳ細胞において実施された免疫組織化学のハーフトーン製版である。ｈＥＳが、フィーダー細胞上または細胞外マトリックス上において培養されたかどうかに関わらず、染色パターンは、異なる細胞型への分化の能力と一致する。染色パターンは、神経および心筋細胞系統（βチュブリンＩＩＩおよび心臓のトロポニンＩ）の細胞をそれぞれ示す。内胚葉系統のマーカー、αフェトプロテインに対して染色した細胞もまた存在する。
【図７】図７は、異なる細胞系統へ分化する能力の別の指標として、ｈＥＳ細胞由来のテラトーマの組織病理学のハーフトーン製版である。パネルＡ（上列）は、ｍＥＦフィーダー細胞上で増殖されるｈＥＳ由来のテラトーマにおける異なる細胞の数を示す。パネルＢ（下列）は、フィーダー細胞なしの培養において増殖されるｈＥＳ由来のテラトーマにおける異なる細胞を示す。
【図８】図８は、ＧＦＰ発現および未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−４に関する、形質導入されたｈＥＳ細胞のＦＡＣＳプロフィールである。ｈＥＳ細胞は、フィーダー細胞層上にプレートされ、両方ともＧＦＰ発現カセットを含むアデノウイルスベクターＡｄ５ＧＦＰまたはレトロウイルスベクターＧＲＮ３５４のいずれかを用いて、４８時間後に感染された。細胞は、回収され、ＳＳＥＡ−４に対する抗体を用いて染色され、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現をアッセイした。上のパネルは、偽感染培養物におけるバックグラウンド蛍光およびＳＳＥＡ−４陽性染色を示す。下のパネルは、ＧＦＰの発現から生じる緑色の蛍光のレベルを示す。
【図９】図９は、ｈＥＳが、リポフェクションによってフィーダー細胞なしの培養物中で遺伝的に変更された実験の結果を示す。パネルＡは、ＧＦＰ発現のためにトランスフェクトされた後の、ラミニン上のｈＥＳ細胞の形態を示す明視野顕微鏡写真のハーフトーンである。パネルＢは、同一コロニーにおけるＧＦＰ発現を示す蛍光顕微鏡写真のハーフトーンである。パネルＣは、種々の条件下におけるＧＦＰ発現細胞の割合を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、ＳＳＥＡ−４陽性細胞集団（未分化ＥＳ細胞）におけるＧＦＰ陽性細胞の割合を示す棒グラフである。パネルＡ：明るい緑色の細胞が、フィーダー細胞なしの培養の未分化ｈＥＳコロニーにおいて観察された。対照的に、緑色の細胞は、フィーダー上で増殖されたｈＦＳ細胞のコロニーにおいて、ほとんど見出されなかった。ＦＡＣＳ解析は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上の細胞の１６％およびラミニン上の細胞の１４％が、ＳＳＥＡ−４陽性（未分化）細胞集団においてＧＦＰ陽性であり、一方、フィーダー細胞上の細胞のたった５％が、陽性であったことを示し、これは、トランスフェクション効率が、フィーダーを含まない条件を使用することによって有意に増加されることを示唆する。パネルＢは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００TM（Ｌ）またはＦｕＧＥＮＥTM（Ｆ）の異なる条件を用いたＧＦＰレポータープラスミドのトランスフェクション効率を示す。
【図１１】図１１は、フィーダー細胞なしの培養において、ｈＥＳ細胞を支持する馴化培地を産生し得るヒト細胞株の特徴を示す。パネルＡは、ＨＥＦ１細胞株が線維芽細胞の形態的な特徴を有することを示す、位相差顕微鏡写真のコピーである。パネルＢ（下）は、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のレトロウイルスベクターで形質転換されたＨＥＦ１細胞が、テロメラーゼ活性を獲得したことを示すＴＲＡＰアッセイの結果のコピーである。
【図１２】図１２は、ｈＴＥＲＴを形質導入されたＨＥＦ１細胞、およびベクターコントロールで形質転換された細胞の増殖を示すグラフである。両株は、最初、二日ごとに約一度倍加した。しかし、コントロール細胞は、３８日目において増殖を停止し、一方ｈＴＥＲＴトランスフェクト細胞は、一貫した増殖速度で６０日以上増殖し続けた。
【図１３】図１３は、細胞の老化について既知の生物マーカーである、老化に関連したβガラクトシダーゼに対する染色の後の、ｈＴＥＲＴ形質導入細胞およびコントロール細胞の顕微鏡写真である。ｈＴＥＲＴでのトランスフェクションは、細胞株の寿命を伸長し、そして老化を妨げる。
【図１４】図１４は、馴化培地への継代の後のｈＥＳ細胞のコロニーを示す。パネルＡは、初代マウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）によって、またはヒト線維芽細胞様細胞株ＨＥＦ１によって馴化された培地中に維持されたｈＥＳ細胞の培養物中の未分化のコロニーを示す、明視野顕微鏡写真のコピーである。パネルＢ（右）は、ＨＥＦ１馴化培地を用いて維持されたｈＥＳ細胞が、未分化細胞のテロメラーゼ活性の特徴を示すことを示した、ＴＲＡＰの結果のコピーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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