(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来のスタニオカルシン１を有効成分とする骨粗しょう症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、骨粗しょう症などの骨疾患の治療剤に関する発明である。
【０００２】
背景技術
骨疾患の多くは、単位容積当りの骨質量の減少が、様々な形で深く係わっており、その代表的な疾患が骨粗しょう症である。
【０００３】
骨粗しょう症には、各種の原因による骨質量の病的な減少の総称で、(1)老人性および閉経後骨粗しょう症、(2)内分泌性骨粗しょう症、(3)先天性骨粗しょう症および(4)不動性または外傷性骨粗しょう症などが含まれる。
【０００４】
特に、近年は、高齢化社会となると共に、食事の欧米化に伴い、カルシウムの摂取量が減少しがちである。
そこで、このような骨質量の減少が係わる骨疾患の予防・治療方法が、ますます重要性を増しており、その中でも、優れた骨疾患治療剤が提供されることが待たれている。
【０００５】
このような骨疾患治療剤としては、例えば、カルシウム剤、ビタミンＤ製剤、女性ホルモン製剤、イプリフラボン、ビタミンＫ２製剤などが提供されているが、未だ、十分な成果を上げているとは言いがたい。
【０００６】
本発明が解決すべき課題は、効果的に骨質量を増大させる成分を見出して、これを有効成分とする骨疾患治療剤、特に、骨粗しょう症などの骨質量の減少が係わる骨疾患の治療剤を提供することにある。
【０００７】
発明の開示
本発明者は、この課題の解決に向けて、鋭意検討を行い、ついに、カルシウム代謝に係わる糖タンパク質の一つである、スタニオカルシン１（以下、ＳＴＣ１ともいう）に、優れた骨形成促進効果が認められることを見出し、このＳＴＣ１を有効成分とする骨疾患治療剤を提供するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ヒト由来のスタニオカルシン１（ＳＴＣ１）を有効成分とする骨粗しょう症治療剤（以下、本治療剤ともいう）を提供する発明である〔本発明において、「治療剤」の治療とは、広義であり、狭義の治療（既に罹患している疾患の治療）と予防の双方を意味するものである〕。
【０００９】
本発明に関連する技術として、「スタニオカルシンα」（ＳＴＣα）に関する知見が、特表平１０−５０９０３６号公報において開示されている。
しかしながら、ＳＴＣα（実質的にＳＴＣ２と同一）とＳＴＣ１とは、アミノ酸配列において大きく異なっているばかりか、その機能においても異なっている。すなわち、ＳＴＣαと実質的に同一のＳＴＣ２は、ＳＴＣ１とは反対に、ＮａＰｉ−３のプロモーター活性を抑制し、腎細胞（ＯＫ細胞）へのリン酸の取込みを抑制する作用が認められている［Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，Ｒｅｓ．２５０，２５２−２５８（１９９８）］。
【００１０】
また、上記の特許公開公報において、ＳＴＣαの骨粗しょう症などの骨疾患に対する効果についての記載は認められるものの、具体的なデータの開示はなく、その効果の根拠も、上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）とＳＴＣが相同の作用を有するという推論から導かれるのに過ぎず、実質的にかかる公報に、ＳＴＣαの骨疾患に対する記載が認められないことは明らかである。
【００１１】
よって、かかる特許公開公報には、本発明に係わる事項については、記載はおろか示唆さえも一切なされていないことは、明らかである。
【００１２】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について説明する。
Ａ．本治療剤の有効成分
本治療剤の有効成分であるＳＴＣ１は、好適には、ヒトに由来するＳＴＣ１である。
【００１３】
かつて硬骨魚類で発見されたスタニオカルシン（ＳＴＣ）は、硬骨魚類に特有のスタニウス小体から分泌される糖蛋白であり、主に、エラのＣａ−ＡＴＰａｓｅ  に作用して、血中のカルシウムレベルを抑制する働きを有しており（Ｈｉｒａｎｏ  Ｔ．，Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｖｏｌ３，１３９−１６９，１９８９およびＷａｇｎｅｒ  Ｇ．Ｆ．，Ｆｉｓｈ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３，２７３−３０６，１９９４）、当初、ＳＴＣは、硬骨魚類に特有のホルモンであると考えられてきた。しかしながら、近年、この硬骨魚類のＳＴＣと高い塩基配列の相同性を有するヒト遺伝子のクローニングに成功し（Ｃｈａｎｇ  Ａ．Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１１２，２４１−２４７，１９９５およびＯｌｓｅｎ  Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３，１７９２−１７９６，１９９６およびｇｅｎｅｂａｎｋ  ＮＭ００３１５５およびｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｕ４６７６８）、次いで、マウス［Ｃｈａｎｇ  Ａ．Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２４（１−２），１８５−１８７，１９９６およびｇｅｎｅｂａｎｋ  ＭＭＵ４７８１５］、ラット（ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｕ６２６６７）、イヌ（ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＡＦ１７８１１６）において、その存在が確認され、ＳＴＣが哺乳類において普遍的に存在することが明らかとなった。その後、最初に見出されたＳＴＣとは別個のアミノ酸配列を有するスタニオカルシンが見出され［Ｃｈａｎｇ  Ａ．Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１４１（１−２），９５−９９，１９９８およびＩｓｈｉｂａｓｈｉ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，２５０（２），２５２−２５８，１９９８およびｇｅｎｅｂａｎｋ  ＡＦ０５５４６０およびｇｅｎｅｂａｎｋ  ＡＢ０１２６６４］、最初に見出された上記のＳＴＣは、ＳＴＣ１と命名され、新たなＳＴＣは、ＳＴＣ２と命名され、ＳＴＣ１とＳＴＣ２とは、明確に別個の存在として認識されるに至っている。
【００１４】
ＳＴＣ１の役割は、今のところ明確には判明していないが、少なくとも、腎臓および小腸でのリンの取り込みを促進し、小腸でのカルシウムの取り込みを抑制することが、すでに報告されている〔例えば、Ｗａｇｎｅｒ  Ｇ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．２，ｐｐ１６５−１７１，１９９７およびＭａｄｓｅｎ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７４（１  ｐｔ  １），Ｇ９６−１０２，１９９８などを参照のこと〕。
【００１５】
上述したようにＳＴＣ１蛋白のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子については、既に明らかにされており、具体的には、第１図に記載の配列に従う〔第１図における上段の塩基配列に対応する下段のアミノ酸標記は、一文字表示であり、Ａ：アラニン，Ｖ：バリン，Ｌ：ロイシン，Ｉ：イソロイシン，Ｐ：プロリン，Ｆ：フェニルアラニン，Ｗ：トリプトファン，Ｍ：メチオニン，Ｇ：グリシン，Ｓ：セリン，Ｔ：トレオニン，Ｃ：システイン，Ｑ：グルタミン，Ｎ：アスパラギン，Ｙ：チロシン，Ｋ：リシン，Ｒ：アルギニン，Ｈ：ヒスチジン，Ｄ：アスパラギン酸，Ｅ：グルタミン酸、である〕。本治療剤の有効成分となり得るＳＴＣ１には、かかるアミノ酸配列の天然型ＳＴＣ１の他に、これを常法〔アミノ酸配列の改変を目的として行われる遺伝子改変法としては、常法、例えば、いわゆるサイト−スペシフィックミュータジェネシス（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，５６６２（１９８４））などを挙げることができる〕により、アミノ酸配列を一部改変したものや、これらのペプチドの断片が、天然型ＳＴＣ１と実質的に同一とみなされる生物学的活性を有する限り含まれる（許容され得るアミノ酸配列の相同性は、１０％程度のアミノ酸配列の相違の範囲内である）。
【００１６】
ＳＴＣ１は、これが存在する生物材料から抽出・精製して得ることも可能であるが、大量かつ均質にＳＴＣ１を得るためには、遺伝子工学的な手法による組換え体を用いることが好適かつ現実的である。
【００１７】
ＳＴＣ１は、上記のごとく既に知られている、ＳＴＣ１をコードする遺伝子に基づいて常法に従って製造することができる。すなわち、例えば、腎臓、卵巣などの適切な材料から得たｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、公知のＳＴＣ１の塩基配列に基づく遺伝子増幅用プライマーを用いて、ＰＣＲ法などの遺伝子増幅法により増幅して得たＳＴＣ１蛋白質をコードする遺伝子や、ホスファイト−トリエステル法（Ｉｋｅｈａｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，５９５６（１９８４））などの化学合成法やこれを用いたＤＮＡシンセサイザーなどにより合成したＳＴＣ１遺伝子を得て、これを、適切な遺伝子発現用ベクターに組み込み、かかる組換えベクターで形質転換を行った大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞などの適切な宿主から、所望するＳＴＣ１を得ることができる。
【００１８】
ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、通常発現しようとする遺伝子の上流域にプロモーター，エンハンサー，および下流域に転写終了配列などを保有するものを用いるのが好適である。
【００１９】
また、ＳＴＣ１遺伝子の発現は、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子，グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子やチオレドキシン遺伝子を利用した融合タンパク質発現系とすることもできる。
【００２０】
遺伝子発現用ベクターとしては、例えば、宿主を大腸菌とするものとしては、ｐＱＥ，ｐＧＥＸ，ｐＴ７−７，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＥＴ，ｐＮＴ２６ＣＩＩなどを例示することができる。また、宿主を枯草菌とするものとしては、ｐＰＬ６０８，ｐＮＣ３，ｐＳＭ２３，ｐＫＨ８０などを例示することができる。
【００２１】
また、宿主を酵母とするものとしては、ｐＧＴ５，ｐＤＢ２４８Ｘ，ｐＡＲＴ１，ｐＲＥＰ１，ＹＥｐ１３，ＹＲｐ７，ＹＣｐ５０などを例示することができる。
【００２２】
また、宿主を哺乳動物細胞または昆虫細胞とするものとしては、ｐ９１０２３，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，ｐＳＶ２ｄｈｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐＡｃＹＭ１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡＩなどを例示することができる。
【００２３】
これらの遺伝子発現ベクターは、ＳＴＣ１を発現させる目的に応じて選択することができる。例えば、大量にＳＴＣ１を発現させる場合には、宿主として大腸菌，枯草菌または酵母などを選択し得る遺伝子発現ベクターを選択するのが好ましく、少量でも確実に活性を有するようにＳＴＣ１を発現させる場合には、哺乳動物細胞や昆虫細胞を宿主として選択し得る遺伝子発現ベクターを選択するのが好ましい。
【００２４】
上記のように既存の遺伝子発現ベクターを選択することも可能であるが、目的に応じて適宜遺伝子発現ベクターを作出して、これを用いることも勿論可能である。
【００２５】
ＳＴＣ１遺伝子を組み込んだ上記遺伝子発現用ベクターの宿主細胞への導入およびこれによる形質転換法は、一般的な方法、例えば宿主細胞が大腸菌や枯草菌である場合には、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法などを；宿主が哺乳動物細胞や昆虫細胞の場合はリン酸カルシウム法，エレクトロポレーション法またはリポソーム法などの手段により行うことができる。
【００２６】
このようにして得られる形質転換体を常法に従い培養することにより、所望するＳＴＣ１が蓄積される。
かかる培養に用いられる培地は、宿主の性質に応じて適宜選択することができるが、例えば宿主が大腸菌である場合には、ＬＢ培地やＴＢ培地などを、宿主が哺乳動物細胞の場合には、ＲＰＭＩ１６４０培地などを適宜用いることができる。
【００２７】
この培養により得られる培養物からのＳＴＣ１の単離および精製は、常法に従い行うことが可能であり、例えば培養物を、ＳＴＣ１の物理的および／または化学的性質を利用した各種の処理操作を用いて行うことが可能である。
【００２８】
具体的には、タンパク沈澱剤による処理，限外濾過，ゲル濾過，高速液体クロマトグラフィー，遠心分離，電気泳動，特異抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー，透析法などを単独でまたはこれらの方法を組み合わせて用いることができる。
【００２９】
以上のようにして、ＳＴＣ１を単離・精製することが可能である。
ＳＴＣ１は、これを用いることにより、骨形成を促進することが可能であり、骨疾患、特に、骨粗しょう症などの、骨形成の異常や骨質量の減少が係わる骨疾患の予防・治療に有効である。具体的には、前述した骨粗しょう症〔(1)老人性および閉経後骨粗しょう症、(2)内分泌性骨粗しょう症、(3)先天性骨粗しょう症および(4)不動性または外傷性骨粗しょう症など〕、骨軟化症、リウマチ性骨疾患、癌に伴う骨疾患、骨折などの外傷性の骨損傷、リン代謝異常若しくはカルシウム代謝異常に伴う骨疾患、くる病、変形性関節症の予防・治療などに対して有効である。
【００３０】
Ｂ．本治療剤の形態
本治療剤は、ＳＴＣ１を有効成分として配合するが、これと共に、適切な医薬製剤担体を配合して、製剤組成物の形態に調製することが可能である（ＳＴＣ１のみでも勿論可能である）。医薬製剤担体としては、例えば、具体的な剤型に応じて、適宜医薬製剤担体として慣用され得る、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、安定剤、溶解補助剤、崩壊剤、表面活性剤などの賦形剤や希釈剤を自由に選択することができる。製剤組成物の形態は、ＳＴＣ１を、骨粗しょう症などの骨疾患の治療用途に効果的に用い得る形態であれば特に限定されず、例えば、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤などの固剤とすることも、液剤、懸濁剤、乳剤などの注射剤形態とすることもできる。また、ＳＴＣ１に適切な担体を添加することによって、用時に液状とするべき乾燥品とすることも可能である。
【００３１】
このようにして得られる本治療剤の投与量は、剤の投与方法、投与形態、患者の症状などに応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されるべきものではないが、一般には、有効成分であるＳＴＣ１を、約０．００００１〜９０質量％程度含有する製剤形態に調製して、この製剤を、これに含有されるＳＴＣ１量が一日成人当り、約１０μｇ〜１０ｍｇ程度となる範囲で、一日１回または数回に分けて投与するのが好適である。
【００３２】
このような各種の形態の医薬製剤は、その形態に応じて適当な投与経路、例えば、注射剤形態の場合には、静脈内、筋肉内、骨内、関節内、皮下、皮内、腹腔内投与などにより、固剤形態の場合には、経口や経腸投与などにより投与され得る。
【００３３】
実施例
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、この実施例の記載は、本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。
【００３４】
〔試験例〕
（１）材料と方法
１）ＳＴＣ１の調製
以下の試験例において用いたＳＴＣ１は、大腸菌を宿主として得たヒト組換え型スタニオカルシン１（ｒ−ｈＳＴＣ１）である。
【００３５】
ｒ−ｈＳＴＣ１は、前述した内容に準ずる常法により調製した。すなわち、ヒト腎臓から、トライゾル（ギブコＢＲＬ社）を用いて得た全ＲＮＡから、オリゴｄＴをプライマーとし、スーパースクリプトＩＩ（ギブコＢＲＬ社）により、ｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲ法による遺伝子増幅には、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｙｅｍ  ２４００（パーキンエルマー社）を用いた。ターゲット遺伝子のプライマーは、既に報告されている遺伝子の塩基配列（ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＭＭＵ４７４８５）を基に、ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅｒｃｈ［ＷＷＷ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐｉｃｋｉｎｇ（ｐｒｉｍｅｒ３）］を用いて設計した。また、ＰＣＲのための増幅サイクル（熱変性：９４℃／３０秒→アニーリング：５６℃／３０秒→伸長反応：７２℃／３０秒）は、３５サイクル行った。
【００３６】
このようにして得たＳＴＣ１遺伝子を、大腸菌用の遺伝子発現ベクター（ｐＱＥ−３０）（Ｑｉａｇｅｎ社製）に組み込み、このＳＴＣ１遺伝子組み込みベクターを宿主である大腸菌（ＪＭ１０９）に形質転換し、具体的に配列を解析することにより、ＳＴＣ１を産生し得る形質転換体を選択した。
【００３７】
次いで、この形質転換体を、ＴＢ培地において培養して、ＩＰＴＧによりＳＴＣ１の発現を誘導し、さらに、菌体を超音波により破砕して、ＳＴＣ１を含む画分を得た。この画分から金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ｒ−ｈＳＴＣ１水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
【００３８】
２）製剤（注射剤）の調製
上記の１）で調製したｒ−ｈＳＴＣ１の水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１０ｍＬに、安定剤としてゼラチン加水分解物１００ｍｇおよびマンニトール２００ｍｇを加え、さらに蒸留水を加えて、全容量を１００ｍＬとした。これを、０．２２μｍのメンブランフィルターに通過させて滅菌し、バイアルに１ｍＬずつ分注して、凍結乾燥して、１バイアル当り１００μｇのｒ−ｈＳＴＣ１を含有する無菌製剤を調製した。
このｒ−ｈＳＴＣ１製剤を、用時にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で適時に希釈して、以下の試験に、ｒ−ｈＳＴＣ１換算で用いた。
【００３９】
３）培養
ウイスター系ラットの胎仔（妊娠２１日）から頭蓋冠を摘出した（３０個程度）。すべての頭蓋冠を集め、細断して、コラゲナーゼ処理（１０〜２０分間／１処理）を５回行って、頭蓋冠由来細胞を得た。得られた頭蓋冠由来細胞のうち、１分画目を除いた４分画のそれぞれを、１０％牛胎仔血清を含むαＭＥＭ（ＦＣＳ−αＭＥＭ）で、２４時間の前培養（５％ＣＯ２／３７℃）を行った。浮遊細胞を洗浄除去後、各分画の細胞を回収してまとめ、上述のＦＣＳ−αＭＥＭで、細胞数を調整して、２４ウェルプレートに、１ウェル当り５０００〜８０００個の細胞数となるように播種した。播種から２４時間の培養（５％ＣＯ２／３７℃）後に、(1)２８μＭアスコルビン酸単独または(2)同濃度のアスコルビン酸と１０ｎＭデキサメサゾン（ＤＥＸともいう）を含む、上述のＦＣＳ−αＭＥＭ培地へと培地交換を行った。培養（５％ＣＯ２／３７℃）により、細胞がウェル内で密な状態となった後、これらの培養物に、終濃度１０ｍＭのβ−グリセロフォスフェート（β−ＧＰ）を添加した。また、前記のように、細胞が密な状態となる前（上記の最初の培地交換後６日目）に、ｒ−ｈＳＴＣ１を、毎日１回添加した。ｒ−ｈＳＴＣ１は、２００ｎｇ〜２ｆｇの濃度を、段階的に設定し、各群を４〜５ウェルとした。各培地は、２〜３日おきに交換した。
【００４０】
４）石灰化の定量
上記の２次培養後、１４〜２１日目に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）陽性で、石灰化した骨結節（ノジュール）を、組織化学的に検出した。ＡＬＰ染色と石灰化基質の同定のためのフォンコッサ染色は、以下のように行った。
【００４１】
冷ＰＢＳで培養物を洗浄後、冷１０％中性緩衝ホルマリンで１５分間の固定を行い、水洗した。次いで、ＡＬＰ発色液〔ナフトールＡＳ  ＭＸ  ５ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド  ２００μＬ、０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）２５ｍＬ、精製水  ２５ｍＬ、ファーストバイオレットＬＢ  ３０ｍｇ〕で、４０分間染色を行い、水洗後、２．５％硝酸銀溶液で３０分間染色し、水洗し、５％炭酸ナトリウム２５％ホルマリンで３分間固定して、水洗し、乾燥させた。これに対して検鏡を行い、骨結節の数を数えて、ＪＭＰにより統計処理を行い、多重比較検定を行った。
【００４２】
５）骨芽細胞分化マーカーの遺伝子発現量のＲＴ−ＰＣＲによる半定量的解析
上記３）における２次培養後、１４日目および２１日目のプレートから、少なくとも３ウェルをまとめて、トライゾル（ギブコＢＲＬ社）により、全ＲＮＡを回収した。ｃＤＮＡの合成には、２μｇの全ＲＮＡを使用した。オリゴｄＴをプライマーとし、スーパースクリプトＩＩ（ギブコＢＲＬ社）により、ｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲ法による遺伝子増幅には、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｙｅｍ  ２４００（パーキンエルマー社）を用いた。ターゲット遺伝子のプライマーは、既に報告されている遺伝子の塩基配列〔(1)ＡＬＰ：ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｍ６１７０４、(2)ボーンシアロプロテイン（ＢＳＰ）：ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｌ２０２３２、(3)オステオカルシン（ＯＣＮ）：ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｌ２４４２９、(4)ＳＴＣ１：ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＭＭＵ４７４８５、(5)リボゾーム酵素Ｌ３２（内部標準）：ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｍ３５３９７〕を基に、ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅｒｃｈ［ＷＷＷ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐｉｃｋｉｎｇ（ｐｒｉｍｅｒ３）］を用いて設計した。また、半定量的ＰＣＲのための増幅サイクル（熱変性：９４℃／３０秒→アニーリング：５６℃／３０秒→伸長反応：７２℃／３０秒）は、(1)ＡＬＰ：２１〜２６サイクル、(2)ＢＳＰ：２０〜２６サイクル、(3)ＯＣＮ：２０〜２６サイクル、(4)ＳＴＣ１：２２〜２８サイクルおよび(5)リボゾーム酵素Ｌ３２（内部標準）：１７〜２１サイクルとした。
【００４３】
各遺伝子を、上記の増幅サイクルで増幅した後、各増幅産物を、２％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。また、各増幅産物をベクターにサブクローニングして配列を確認した。
【００４４】
（２）結果
１）骨結節の計数
ａ）ＡＬＰとフォンコッサ染色像（第２図）
第２図は、ＤＥＸ、β−ＧＰおよびアスコルビン酸の添加培地で、培養１４日目の染色像である。左側（上下）の２つのウェルは、コントロールである。また、左から２番目の２つのウェルから、順に、ｒ−ｈＳＴＣ１  ０．２ｎｇ／ｍＬ、０．０２ｎｇ／ｍＬ、０．００２ｎｇ／ｍＬをそれぞれ添加した。ＡＬＰは赤色に、石灰化基質は黒色に染色される。第２図において、ｒ−ｈＳＴＣ１により、黒色の石灰化像が、コントロールとの比較において多数観察された。
【００４５】
ｂ）ＤＥＸ非存在下で培養２１日目の結果（第３図・第４図）
第３図に示すように、ＤＥＸ非存在下においても、ｒ−ｈＳＴＣ１を添加した場合の骨結節の数は、コントロールに比べて有意に多かった（ｐ＜０．０５）。また、ｒ−ｈＳＴＣ１の最大反応は、ＤＥＸ非存在下で２０ｎｇ／ｍＬであるのに対し、同存在下では０．２ｎｇ／ｍＬであった（第３図・第４図）。
【００４６】
ｃ）ｒ−ｈＳＴＣ１の骨結節の数に対する用量反応（第５図）
ＤＥＸ非存在下は、培養２１日目（第３図に準拠）、ＤＥＸ存在下は、培養１４日目（第４図に準拠）の結果を示している。ＤＥＸ存在下では、同非存在下と比較して、最大反応が、ｒ−ｈＳＴＣ１の低用量にシフトした（約１／１００倍）。
【００４７】
２）骨芽細胞のマーカー
上記（１）・５）の結果を、第６図に示す。第６図により、ｒ−ｈＳＴＣ１の存在下で、ＡＬＰ、ＢＳＰ、ＯＣＮのいずれの発現量もコントロールを上回っていた。
【００４８】
この結果により、(1)ｒ−ｈＳＴＣ１によって、ＤＥＸの存在・非存在にかかわらず、骨結節の形成が促進されること、(2)ｒ−ｈＳＴＣ１によって、骨結節を形成し得る成熟骨芽細胞のマーカーである、ＡＬＰ、ＢＳＰおよびＯＣＮの遺伝子発現量が増加し、骨形成が促進されていることが明らかとなった。
【００４９】
このように、ＳＴＣ１が、骨形成を促進する作用を有していることが明らかになり、ＳＴＣ１を有効成分とする骨疾患治療剤が、各種の骨疾患、特に、骨形成の異常や骨質量の減少に係わる骨疾患、例えば、骨粗しょう症、外傷性の骨損傷、骨軟化症、リウマチ性骨疾患、癌に伴う骨疾患、リン代謝異常若しくはカルシウム代謝異常に伴う骨疾患、くる病または変形性関節症などに対して有効であることが、明確に示された。
【００５０】
産業上の利用可能性
本発明により、骨粗しょう症などの骨質量の減少が係わる骨疾患の治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、スタニオカルシン１遺伝子の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を示した図面である。
第２図は、ウェル中の、頭蓋冠細胞の培養物のアルカリフォスファターゼとフォンコッサ染色像を示した図面である。
第３図は、デキサメサゾン非存在下で、スタニオカルシン１を添加した場合の頭蓋冠細胞由来の骨結節数を検討した結果を示す図面である。
第４図は、デキサメサゾン存在下で、スタニオカルシン１を添加した場合の頭蓋冠細胞由来の骨結節数を検討した結果を示す図面である。
第５図は、デキサメサゾン存在下と非存在下における、スタニオカルシン１を添加した場合の頭蓋冠細胞由来の骨結節について、比較検討した結果を示す図面である。
第６図は、成熟骨芽細胞のマーカーの発現に対するスタニオカルシン１の添加の影響を検討した結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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