(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常感染型プリオンのコンホメーションを認識するヒト抗プリオン抗体であって、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の組み合わせが、配列番号５１と配列番号５６、または配列番号６１と６６に示されるアミノ酸配列であるヒト抗プリオン抗体。
【請求項２】
Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の組み合わせが、配列番号５１と配列番号５６、または配列番号６１と６６に示されるアミノ酸配列である、Ｈ鎖可変領域フラグメントとＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、異常感染型プリオンのコンホメーションを認識するヒト抗プリオン抗体の一本鎖可変領域フラグメント。
【請求項３】
Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の組み合わせが、配列番号５１と配列番号５６、または配列番号６１と６６に示されるアミノ酸配列である、Ｈ鎖可変領域フラグメントとＬ鎖可変領域フラグメントに、それぞれヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、異常感染型プリオンのコンホメーションを認識するヒト抗プリオン抗体、またはＦab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb及びscFv-Fcからなる群から選ばれるその抗体フラグメント。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の抗体、またはＦab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb及びscFv-Fcからなる群から選ばれるそのフラグメントとペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載の抗体、またはＦab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb及びscFv-Fcからなる群から選ばれるそのフラグメントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれかに記載の抗体、またはＦab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb及びscFv-Fcからなる群から選ばれるそのフラグメントをコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項９】
請求項６に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗プリオン抗体またはその断片を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリオン蛋白質に結合し、正常型プリオンと異常感染型プリオンの立体構造の違いを識別するヒト抗プリオン抗体及び該抗体フラグメントに関する。当該抗体及び抗体フラグメントは、異常感染型プリオンの生成または蓄積の抑制と、それらが原因とされるプリオン病の診断及び治療薬として期待される。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病は、プリオン蛋白質を病原因子とする神経変性疾患であり、正常個体に発現しているαへリックスリッチな正常型プリオン蛋白質（cellular isoform of prion protein: PrPC）に、βシートリッチで感染性を有する異常感染型プリオン蛋白質（scrapie isoform of prion protein: PrPSc）が作用して、将棋倒し式に立体構造変換を起こすことで病気を発症すると考えられている。【０００３】
正常型プリオンは多くの細胞で細胞表面に発現しており、特に中枢及び末梢神経系のニューロンにおいて高レベルで発現している。正常型プリオンはプリオン病の発症に必須であり、プリオンノックアウトマウスではプリオン病であるスクレイピーに耐性となることが報告されている（非特許文献１）。【０００４】
PrPCとPrPScとの間の違いについては、１）アミノ酸配列上の差異は認められないが、蛋白質分解酵素に対する部分抵抗性、界面活性剤への不溶性及び感染性の有無に違いがあること、２）PrPCのβシート型構造が３％以下であるのに対し、PrPScでは４０％以上と増加しており、蛋白質の高次構造が大きく異なっていること、が明らかになっている。【０００５】
プリオン複製機構の説明としては、１）シード説と２）ヘテロ二量体説が提唱されているが、いずれも「PrPScを鋳型とするPrPCの高次構造変換によるPrPScの複製機構」という概念であることには変わりない。【０００６】
プリオン病には、１）原因不明の孤発性クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、２）ゲルストマン症候群（ＧＳＳ）、家族性致死性不眠症（ＦＦＩ）といった遺伝性を有する家族性、あるいは、３）感染性に分類される食人習慣に伴うクールーや医療行為による医原性プリオン病（乾燥硬膜移植後ＣＪＤなど）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）に由来するとされるvariant CJD（ｖＣＪＤ）が挙げられる。ヒト以外の動物においても、前述のＢＳＥ以外に、２００年以上前からその存在が知られていたヒツジのスクレイピー、北米大陸で懸念されている野生のシカのプリオン病であるchronic wasting disease（ＣＷＤ）などが挙げられる。【０００７】
これらのプリオン病は、致死性の神経変性疾患であり、治療法は確立されていない。イギリスでは人口の相当数がBSE関連のプリオン株に暴露されており、ｖＣＪＤ発症のリスクにさらされていると言われている。【０００８】
感染の機序としては、異常感染型プリオンPrPScは消化管でも分解されないため、小腸上皮から腸管のリンパ組織であるパイエル板や末梢神経を経て、腹腔神経節経由で脊髄に到達すると考えられている。腸管の神経叢は、PrPScへの感染に必要なPrPCが多く発現されていることや、腸管粘膜下のパイエル板にある濾胞性樹状細胞が補体を用いてPrPScを捕捉することが原因で、腸管のリンパ系組織にもPrPScの感染が拡大するとの解釈もある。【０００９】
そこで、免疫療法によるプリオン病の予防または治療の試みが検討されている。【００１０】
プリオンに対する液性免疫応答が、プリオン感染に対して防御的に機能することが報告されているが、特に、正常型プリオンの立体構造を認識する抗体が重要であることが示唆されている（非特許文献２）。【００１１】
試験管内での検討から、PrPScへの親和性を有しない抗PrPモノクローナル抗体が、PrPCのPrPScへの変換を阻害することが示されている（非特許文献３及び非特許文献４）。【００１２】
また、マウススクレイピーモデルにおいて、抗PrPモノクローナル抗体が生体内でもプリオンの増殖を抑えるか否かが検討され、末梢のPrPSc濃度のレベルとプリオン感染性が著しく抑えられることが示された。更に、これらの抗体投与群は、未処理群がその病のために死んだ後３００日以上も健康体で生存した（非特許文献５）。【００１３】
これらの発見は、ヒトのプリオン病に免疫療法が有効であることを強く示唆している。しかしながら、プリオンのワクチンとしての使用については、野生型マウスを用いた検討では、これまでに大きな成果は得られていない（非特許文献６）。野生型マウスでは正常型プリオンを発現していることから、正常型プリオンに対してトレランスを獲得しているためと考えられる。【００１４】
このことから、ヒトにおいても健常者にワクチンを接種することで、プリオンに対する免疫応答を惹起することは、現状では困難であると考えられる。【００１５】
更に最近、PrPScに対する抗体の方が、PrPCに対する抗体よりもより効果的に、培養細胞中でのPrPScの増幅を抑制するとの報告がなされ、正常型プリオン及び異常感染型プリオンのいずれに対する抗体もプリオン病治療薬になりうる可能性が示唆された（非特許文献７）。【００１６】
以上のことから、抗プリオン抗体による受動免疫療法は、現時点においては最も効果的かつ現実的な、プリオン病に対する治療または予防法であると考えられる。【００１７】
【非特許文献１】Bueler, H. R. et al., Cell, 73, 1339-1347 (1993)
【非特許文献２】Polymenidou, M. et al., Pro. Natl. Acad. Sci., 101, 14670-14676 (2004)
【非特許文献３】Enari, M. et al., Pro. Natl. Acad. Sci., 98, 9295-9299 (2001)
【非特許文献４】Peretz, D. et al., Nature, 412, 739-743 (2001)
【非特許文献５】White, A. R. et al., Nature, 422, 80-83 (2003)
【非特許文献６】Heppner, F. L. et al., Curr. Opin. Immunol., 16, 594-598 (2004)
【非特許文献７】Beringue, V. et al., J. Biol. Chem., 279, 39671-39676 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
正常型プリオンと異常感染型プリオンをダイレクトに見分ける抗体、つまりコンフォメーションを識別するモノクローナル抗体を開発することができれば、プリオン病の治療や診断に有用であることが期待される。【００１９】
現在取得されている、正常型プリオンと異常感染型プリオンを識別するとされているモノクローナル抗体は、構造変化したときに表面に提示されるＹＹＲモチーフを認識するもののみで、またこの抗体も、ＹＹＲペプチドを免疫して得られた抗体であるため、表面にチロシン（Ｙ）やアルギニン（Ｒ）を提示する他の蛋白質と相互作用する可能性があるなど、様々な問題点が残っていた。また、従来の抗原蛋白を直接免疫するハイブリドーマ法では、そのコンフォメーションをコントロールできないと考えられるため、ダイレクトに立体構造を認識する抗体を取得するには、従来法では困難であることが予想されていた。【００２０】
また、従来の抗プリオン抗体に、プリオン病に対する治療または予防効果が確認されたとしても、これらの抗体は非ヒト由来のため、その高い免疫原性によって、ヒトに対して投与した場合、異物として認識・排除される。したがって、それらを疾患の治療薬剤として用いることは困難である。この問題を解決する方法として、プリオンに対するマウスモノクローナル抗体を、蛋白工学的手法を用いてヒト化することが考えられるが、マウスモノクローナル抗体由来の配列を一部含むため、反復投与や長期投与により、投与するヒト化抗プリオン抗体の活性を阻害するような抗体が作られ、その効果を著しく減弱するだけでなく、重篤な副作用を招く可能性がある。また、ヒト化により活性が低下することも多く、構築には多大な労力とコストを要する。【００２１】
本発明は、in vitroで様々なコンフォメーションのプリオンを作成し、ダイレクトにヒト抗体を提示した抗体ファージライブラリを反応させることにより、αヘリックス型（正常型）プリオン及びβシート型（異常感染型）プリオンそれぞれに特異的で、かつ安全性と治療効果を兼ね備えたヒト抗プリオン抗体およびその断片を提供するとともに、それらの利用方法を提案するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明では以上の知見にもとづき、各種コンフォメーションを有するプリオン作成技術及びヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを用いることにより、αヘリックス型（正常型）プリオンに特異的に結合するヒト一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を５種類、及びβシート型（異常感染型）プリオンに特異的に結合するヒト一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を２種類単離することに成功した。【００２３】
すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として下記１）〜２５）の発明を含むものである。【００２４】
１）プリオンに結合性を有するヒト抗プリオン抗体。【００２５】
２）当該プリオンが正常型プリオンまたは異常感染型プリオンである上記１）に記載のヒト抗プリオン抗体。【００２６】
３）以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む上記１）または２）に記載のヒト抗プリオン抗体。
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２または６２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３または６３のいずれか一つ、ＣＤＲ３として配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４または６４のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４または６２〜６４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７または６７のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８または６８のいずれか一つ、ＣＤＲ３として配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９または６９のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９または６７〜６９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。【００２７】
４）Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号２〜４、配列番号１２〜１４、配列番号２２〜２４、配列番号３２〜３４、配列番号４２〜４４、配列番号５２〜５４、配列番号６２〜６４のいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸配列であり、Ｌ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号７〜９、配列番号１７〜１９、配列番号２７〜２９、配列番号３７〜３９、配列番号４７〜４９、配列番号５７〜５９、配列番号６７〜６９のいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸配列である上記１）から３）のいずれかに記載のヒト抗プリオン抗体。【００２８】
５）Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３及びＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２〜４及び配列番号７〜９、配列番号１２〜１４及び配列番号１７〜１９、配列番号２２〜２４及び配列番号２７〜２９、配列番号３２〜３４及び配列番号３７〜３９、配列番号４２〜４４及び配列番号４７〜４９、配列番号５２〜５４及び配列番号５７〜５９、配列番号６２〜６４及び配列番号６７〜６９のいずれか一つの組み合わせである上記１）から４）のいずれかに記載のヒト抗プリオン抗体。【００２９】
６）以下の（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む上記１）から５）のいずれかに記載のヒト抗プリオン抗体。
（ｅ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１または６１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１または６１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６または６６のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６または６６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。【００３０】
７）Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の組み合わせが、配列番号１と配列番号６、配列番号１１と配列番号１６、配列番号２１と配列番号２６、配列番号３１と配列番号３６、配列番号４１と配列番号４６、配列番号５１と配列番号５６、配列番号６１と６６に示されるアミノ酸配列のいずれか一つから選択される上記１）から６）のいずれかに記載のヒト抗プリオン抗体。【００３１】
８）以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドからなる、プリオンに対するヒト由来の抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２または６２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３または６３のいずれか一つ、ＣＤＲ３として配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４または６４のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４または６２〜６４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。【００３２】
９）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号２〜４、配列番号１２〜１４、配列番号２２〜２４、配列番号３２〜３４、配列番号４２〜４４、配列番号５２〜５４、配列番号６２〜６４のいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸配列である上記８）に記載のＨ鎖可変領域フラグメント。【００３３】
１０）当該Ｈ鎖のＣＤＲを含むポリペプチドが、以下の（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドである上記８）または９）に記載のＨ鎖可変領域フラグメント。
（ｅ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１または６１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１または６１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。【００３４】
１１）以下の（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドからなる、プリオンに対するヒト由来の抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７または６７のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８または６８のいずれか一つ、ＣＤＲ３として配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９または６９のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９または６７〜６９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。【００３５】
１２）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号７〜９、配列番号１７〜１９、配列番号２７〜２９、配列番号３７〜３９、配列番号４７〜４９、配列番号５７〜５９、配列番号６７〜６９のいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸配列である上記１１）に記載のＬ鎖可変領域フラグメント。【００３６】
１３）当該Ｌ鎖のＣＤＲを含むポリペプチドが、以下の（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドである上記１１）または１２）記載のＬ鎖可変領域フラグメント。
（ｇ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６または６６のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６または６６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。【００３７】
１４）上記８）から１０）に記載のＨ鎖可変領域フラグメントと、上記１１）から１３）に記載のＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、プリオンに対するヒト由来の抗体の一本鎖可変領域フラグメント。【００３８】
１５）上記８）から１０）に記載のＨ鎖可変領域フラグメント、及び／または、上記１１）から１３）に記載のＬ鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、プリオンに対するヒト由来の抗体またはその抗体フラグメント。【００３９】
１６）当該抗体フラグメントが、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb、またはscFv-Fcである上記１５）に記載の抗体フラグメント。【００４０】
１７）上記１）から１６）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体。【００４１】
１８）上記１）から１７）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体。【００４２】
１９）上記１）から１７）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントをコードする遺伝子。【００４３】
２０）上記１９）に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。【００４４】
２１）上記１９）に記載の遺伝子が導入された形質転換体。【００４５】
２２）上記１９）に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗プリオン抗体またはその断片を生産する方法。【００４６】
２３）上記１）から１６）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記１７）に記載の融合抗体、または上記１８）に記載の修飾抗体を用いた正常型プリオンまたは異常感染型プリオンの検出試薬及び／または診断薬。【００４７】
２４）上記１９）に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。【００４８】
２５）上記１）から１８）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを用いた異常感染型プリオンの増幅抑制剤。【００４９】
２６）上記１）から１８）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを用いたプリオン病の予防または治療剤。【００５０】
これらの抗プリオン抗体及び抗体フラグメントはｓｃＦｖという小さな分子形態でもプリオンの高次構造を認識して特異的な結合を示した。この抗体は分子量がきわめて小さいので脳血管関門を通過できるように抗体エンジニアリングすることができる。例えば、トランスフェリン受容体を介して脳血管関門を通過できるようにトランスフェリンとの融合体や二重特異性抗体などもこの範疇に入る。【００５１】
また、Ｐ糖蛋白に対する抗体や脳血管関門の薬剤輸送に関わる受容体と相互作用し得るタンパク質、ペプチドまたは低分子との融合体も可能である。また、さらに、McCaffertyら（J. McCaffertyら、Nature, 348: 552-554, 1990）が報告したように、膜透過性に優れ、抗原性の少ない繊維状ファージの上にこれらの抗体フラグメントを提示させ、脳内に移行させることも可能である。【００５２】
本発明による抗体は完全ヒト抗体であるので、診断薬としての利用が可能であると共に、プリオン病の予防または治療法の開発への道が開ける。それらの医療への貢献は多大である。
【発明の効果】
【００５３】
本発明のヒトモノクローナル抗体及び該抗体フラグメント分子は、ヒト由来抗プリオン抗体の可変領域を有し、それぞれαヘリックス型（正常型）プリオンまたはβシート型（異常感染型）プリオンに対して特異的かつ高親和性の反応を示す。このことから、本発明の抗体及び該抗体フラグメントについては、プリオン病の診断、予防または治療薬への利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】調製したαformプリオンのＣＤスペクトルを示す図。
【００５５】
【図２】調製したβformプリオンのＣＤスペクトルを示す図。
【００５６】
【図３】分離クローンのｓｃＦｖのβ型プリオンへの特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【００５７】
【図４】発現scFv-E-tagの発現を抗E-tag抗体を用いてウエスタンブロッティングで確認した図。
【００５８】
【図５】分離クローンのｓｃＦｖのα型プリオンへの特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【００５９】
【図６】分離クローンのｓｃＦｖのβ型プリオン及びα型プリオンへの特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【００６０】
【図７】分離クローンのｓｃＦｖのβ型プリオンへの反応性について、pH依存性及び抗原濃度依存性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明の抗体及び抗体フラグメントに使用されるｓｃＦｖ等は以下のようにして得られた。【００６２】
健常者２０名分の末梢血Ｂリンパ球より、ＲＴ−ＰＣＲ法にて、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖、軽（Ｌ）鎖ｃＤＮＡを増幅、更に両者をlinker DNAで結合し、健常者リンパ球由来のＨ鎖可変領域（ＶＨ鎖またはＶＨ）とＶＬ鎖のランダムな組み合わせによるｓｃＦｖ ＤＮＡを作製した。【００６３】
このｓｃＦｖ ＤＮＡをファージミドベクターpCANTAB5Eに組込み、109クローンからなる健常者由来ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーを作製した。【００６４】
次に、抗原とするプリオン蛋白質を調製した。市販のプリオン蛋白質（aa#90-230）をＰＢＳに溶解することによりαformプリオンを、また、組換え型プリオン（aa#23-230）を発現させ、既知の最終ｐＨ４に調製する方法でβformプリオンをそれぞれ調製した。ここで、調製したサンプルについては、ＣＤスペクトルを測定することにより、それぞれ目的とした立体構造を保持しているかどうかを調べることができる。また、以降のβformを用いる実験を行う際にはコンフォメーション維持のため、常にｐＨ４の条件で行った。【００６５】
上記のライブラリーを、αformプリオンまたはβformプリオンと結合させて回収、濃縮し、抗プリオンｓｃＦｖディスプレイファージクローンをスクリーニングした。その結果、スクリーニングされた各クローンは、プリオンと結合するｓｃＦｖを産生した。【００６６】
ｓｃＦｖの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等、発現させるｓｃＦｖを機能的に結合させて発現させることが出来る。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーター等を挙げることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、pelBシグナル配列（Lei, SP., et al, J. Bacteriol., 1987, 169 : 4379-4383）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３蛋白のシグナル配列を用いることもできる。【００６７】
発現されたｓｃＦｖは細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本願発明で発現されるｓｃＦｖは、そのＣ末端にE tag配列が付加されているので、抗E tag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。【００６８】
得られた抗体や抗体フラグメントのプリオンに対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ、BIAcore等の方法がある。例えばＥＬＩＳＡを用いる場合、プリオンを直接またはcapture抗体を介して固相化した９６穴プレートに目的の抗体や抗体フラグメントを含む試料、例えば大腸菌の培養上清や精製抗体を加える。次にパーオキシダーゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、発色基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することが出来る。また、BIAcoreを用いる場合、センサーチップにプリオンを直接またはcapture抗体を介して固定化して、目的の試料の結合解離定数を測定することが出来る。【００６９】
上記の方法により、抗プリオンｓｃＦｖを分離し評価した結果、それぞれαヘリックス型（正常型）プリオンまたはβシート型（異常感染型）プリオンに対して特異的かつ高親和性の反応性を有することが示された。従ってこれらの抗体については、生体内でも同様の効果を示し、プリオン病の診断、予防または治療薬への利用が期待できる。【００７０】
上記結合活性を有する７種類のｓｃＦｖ（huPrP-18、huPrP-39、boPrP-2、boPrP-15、boPrP-20、βPrP-7、βPrP-30）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、下記の通りである。【００７１】
（１）クローンhuPrP-18
クローンhuPrP-18のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号２〜４に示した。すなわち、配列番号１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号３）、９９番目〜１１０番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に示した。【００７２】
また、クローンhuPrP-18のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号７〜９に示した。すなわち、配列番号６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号７）、５１番目〜５７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号８）、９０番目〜１００番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示した。【００７３】
（２）クローンhuPrP-39
クローンhuPrP-39のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号１１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号１２〜１４に示した。すなわち、配列番号１１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１３）、９９番目〜１０７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１５に示した。【００７４】
また、クローンhuPrP-39のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号１６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号１７〜１９に示した。すなわち、配列番号１６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１７）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１８）、８８番目〜９６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２０に示した。【００７５】
（３）クローンboPrP-2
クローンboPrP-2のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号２１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号２２〜２４に示した。すなわち、配列番号２１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号２２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号２３）、９９番目〜１０８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号２４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２５に示した。【００７６】
また、クローンboPrP-2のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号２６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号２７〜２９に示した。すなわち、配列番号２６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号２７）、５２番目〜５８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号２８）、９１番目〜１０３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号２９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３０に示した。【００７７】
（４）クローンboPrP-15
クローンboPrP-15のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号３１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号３２〜３４に示した。すなわち、配列番号３１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号３２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号３３）、９９番目〜１１３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号３４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３５に示した。【００７８】
また、クローンboPrP-15のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号３６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号３７〜３９に示した。すなわち、配列番号３６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号３７）、５２番目〜５８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号３８）、９１番目〜１００番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号３９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４０に示した。【００７９】
（５）クローンboPrP-20
クローンboPrP-20のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号４１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号４２〜４４に示した。すなわち、配列番号４１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号４２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号４３）、９９番目〜１１１番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号４４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４５に示した。【００８０】
また、クローンboPrP-20のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号４６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号４７〜４９に示した。すなわち、配列番号４６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号４７）、５１番目〜５７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号４８）、９０番目〜１００番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号４９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５０に示した。【００８１】
（６）クローンβPrP-7
クローンβPrP-7のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号５１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号５２〜５４に示した。すなわち、配列番号５１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号５２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号５３）、９９番目〜１１２番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号５４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５５に示した。【００８２】
また、クローンβPrP-7のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号５６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号５７〜５９に示した。すなわち、配列番号５６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３４番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号５７）、５０番目〜５６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号５８）、８９番目〜９７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号５９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６０に示した。【００８３】
（７）クローンβPrP-30
クローンβPrP-30のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号６１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号６２〜６４に示した。すなわち、配列番号６１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号６２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号６３）、９９番目〜１０７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号６４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４５に示した。【００８４】
また、クローンβPrP-30のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号６６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号６７〜６９に示した。すなわち、配列番号６６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２４番目〜３４番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号６７）、５０番目〜５６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号６８）、８９番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号６９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号７０に示した。【００８５】
本発明により得られたクローン毎にアミノ酸配列及び塩基配列について上述したが、配列表に記載された各アミノ酸配列情報（ＶＨ鎖、ＶＬ鎖、各ＣＤＲ１〜３）をもとに、単独または複数の配列を適宜組み合わせて使用することも可能である。【００８６】
本発明の抗体およびその抗体フラグメントは、上記ＶＨ鎖及びＶＬ鎖、並びにそれらのＣＤＲとして、上記配列番号に示される配列に限定されるものではなく、それらの一部が改変された変異ポリペプチドであってもよい。【００８７】
すなわち、各配列番号に記載されたアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつプリオンに対するＨ鎖またはＬ鎖の相補性決定領域、Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域となるポリペプチドも含まれる。【００８８】
ここで、「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このような「変異」としては、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然（例えばヒト）に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。【００８９】
なお、上記「変異」は、本発明の抗体またはその抗体フラグメントを、治療薬として利用する場合（ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造またはヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断キットなどとして使用する場合（ヒトに投与しない場合）には、特に制限されない。【００９０】
本発明で開示されるＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖は、ファージ抗体法を用いて主としてｓｃＦｖの形で得られたものであるが、原則としてその適用はｓｃＦｖに限定されることはない。例えば、開示したＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常領域と連結した完全分子型、またヒト免疫グロブリンの定常領域の一部と組み合わせたＦab、Ｆab'またはＦ(ab')２、さらにｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンのＬ鎖の定常領域と結合させた一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）や、ｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンのＨ鎖の定常領域と結合させたｓｃＦｖ-Ｆｃなどの他の抗体フラグメントもその適用範囲に含まれる。【００９１】
また、本発明の抗体またはそのフラグメントは、当該抗体またはフラグメントにペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体であってもよい。【００９２】
また、これらの抗体及び抗体フラグメント蛋白分子に、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子も同様である。【００９３】
Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたｓｃＦｖを調製する場合、ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１０〜２５残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。【００９４】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５または６５及び配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０または７０にそれぞれ示した本発明により得られた各クローンのＶＨ鎖及びＶＬ鎖をコードする遺伝子配列情報をもとに、適当な宿主（例えば、細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはそのフラグメントを発現させることができる。【００９５】
本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、正常型プリオン及び異常感染型プリオンの検出試薬及び診断薬として利用可能である。【００９６】
本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、異常感染型プリオンの増幅抑制剤として利用可能である。【００９７】
さらに、本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、プリオン病の予防または治療剤として利用可能である。【００９８】
以下、本願発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本願発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９９】
《実施例１：健常者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、J. D. Marksら（J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991）により報告されている方法を参考に、健常者２０名由来末梢血由来リンパ球を出発材料に、構築した。構築したＶＨ(γ)−Ｖκ、ＶＨ(γ)−Ｖλ、ＶＨ(μ)−Ｖκ、ＶＨ(μ)−Ｖλの各サブライブラリーはそれぞれ1.1×108、2.1×108、8.4×107、5.3×107クローンの多様性を有すると評価された。【０１００】
《実施例２：抗原の調製》
InPro社より購入したプリオン蛋白質（aa#90-230）をＰＢＳに溶解してすぐにＣＤスペクトル解析した結果を図１に示す。200nmから250nmまでのＣＤを２５℃で、G. Jacksonらの報告（Science, 283: 1935-1937, 1999）に従って測定した。【０１０１】
約220nmに負の吸収が認められるため、この蛋白質はαヘリックスリッチなコンフォメーションをとっていることが考えられた。【０１０２】
このαヘリックスリッチなプリオンをαformプリオンとし、αformを特異的に認識するヒト抗体の単離を試みた。【０１０３】
また、βformプリオンの調製に関しては、組換え型プリオン（aa#23-230）及び発現ベクター（長崎大学片峰先生より供与）を用い、1999年のScience誌で報告されたCollingeらによるプロトコールに従って行った。【０１０４】
ここで、注目すべき点は透析する最終ｐＨが４であるという点で、今後βformを用いる実験をする際にはβのコンフォメーション維持のため、常にｐＨ４の条件で行った。【０１０５】
調製したβformのプリオンのＣＤスペクトルを上記と同様に解析した結果を図２に示す。予想通り、215nmに負のピークがあるため、βシートが形成されていることが推定された。【０１０６】
このβシートリッチなプリオンをβformプリオンとし、βformのコンフォメーションを特異的に認識するヒト抗体の単離を試みた。【０１０７】
《実施例３：パンニング》
（１）αformを用いたパンニング
５μgのヒトαformプリオン及びウシαformプリオンを0.1M NaHCO3で希釈し、ヒトプリオンはイムノチューブに、ウシプリオンは35mmペトリ皿にそれぞれコートした。固定化は４℃で一晩行った。【０１０８】
0.5％ゼラチン／ＰＢＳで２時間ブロックし、PBST（0.1％Tween20含有ＰＢＳ）でプレートを10回洗浄した。ファージディスプレイライブラリー（1×1012 TU）を加え、１時間反応させ、PBSTで７回洗浄した。【０１０９】
１mg/mL ＢＳＡを含む0.1Mグリシン／HCl（pH2.3）１mlを加え、５分間インキュベートし、ファージを溶出した。溶出液を１M Tris-Cl (pH9.1)と混ぜ、中和した後、TG1に感染させ、増幅させた。【０１１０】
このパンニングはヒト及びウシPrPの両方に対して上記の同じ手法で行った。なお、同じ条件で2ndパンニングまで行い、ヒトPrPに対するパンニングでは64クローンのファージを、ウシPrPに対するパンニングでは46クローンのファージを単離した。【０１１１】
（２）βformを用いたパンニング
コンフォメーションを認識する抗体の単離が目的であるため、タンパク質が本来のコンフォメーションを常に保つように、直接プレートにβformプリオンを固定化せず、いくつかのトリックを施してパンニングを行った。まず、この蛋白にはHis-tagがついているのでこのtagを利用すること、及び、前述したようにβformを調製するリフォールディングの最終ｐＨが４であるので、このｐＨを保つことがポイントである。【０１１２】
まず、10μg/mlのanti-His tag mAb（Amersham Pharmacia Biotech）をプレート５枚にコートした。希釈は0.1M NaHCO3で行い、４℃で一晩インキュベートした。0.25％BSA/pH4 bufferでプレートを２時間ブロックし、PBSTで１０回洗浄した。
次に、ファージディスプレイライブラリーのサブトラクションを行った。ファージディスプレイライブラリー（5×1011TU）を一枚目のプレートに反応させた。ファージの希釈は0.25％BSA/pH4 bufferで行った。室温で４０分間インキュベートして、その上澄みを２枚目のプレートに反応させた。室温で４０分間インキュベートし、その上澄みを３枚目のプレートに反応させた。室温で４０分間インキュベートして、その上澄みを別のチューブに回収した（１ml）。このライブラリーの溶液に５μgのβform PrPを加え、４℃で一時間インキュベートした。その溶液を２つに分け、４枚目と５枚目のプレートにそれぞれ反応させた。室温で３０分間インキュベートし、His-tagを介してファージ／プリオンのコンプレックスをキャプチャーさせた後、PBSTで７回洗浄した。１mg/mL BSAを含む0.1Mグリシン／HCl（pH2.3）を１ml加え、５分間インキュベートし、ファージを溶出させた。その溶出液を１M Tris-HCl（pH9.1）と混ぜ、中和した後、TG1に感染させ、増幅させた。【０１１３】
このパンニングはヒトのβform PrPに対してだけ行い、２ndパンニングまで行った。その結果、１５クローン回収し、それらについてＥＬＩＳＡを行った。【０１１４】
《実施例４：ファージ抗体のＥＬＩＳＡによる反応性解析》
αformに対する反応性をファージＥＬＩＳＡにより解析した。
ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）にヒトPrP、ウシPrP（いずれもInPro）及びヒトIgGを60ng/40μL/wellで、４℃１６時間固定化した。洗浄後、ファージクローン（1012virions/40μL/well）を反応させた。ビオチン化anti-M13 mAb（Pharmacia）とアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識ストレプトアビジン（Vector Lab.）とを組み合わせて検出した。405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーNJ-2300（Nunc）を用いて測定した。反応性が確認されたクローンについて、以後の解析を行った。【０１１５】
次に、βformに対する反応性をファージＥＬＩＳＡにより解析した。
ファージクローンを５μgのβform PrPとｐＨ４で混合し、４℃でインキュベートした。反応時間に関しては、ｐＨ４でファージを長時間インキュベートすることにより、ファージの表面タンパク質が変化し、非特異的な結合をもたらす可能性が懸念されるので、オーバーナイト、及び１時間の条件で検討した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）にanti-His tag mAb（Amersham Pharmacia Biotech）を40ng/40μL/wellで、４℃１６時間固定化した。洗浄後、上記のファージクローンとβform PrPとの混合液をアプライし、反応させた。ビオチン化anti-M13 mAb（Pharmacia）とＡＰ標識ストレプトアビジン（Vector Lab.）とを組み合わせて検出した。405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーNJ-2300（Nunc）を用いて測定した。また、特異性確認のため、ファージをαformプリオン、または同じHis-tagをもつコントロール蛋白としてTim1と反応させて、ＥＬＩＳＡを行った。結果を図３示す。ファージとβformプリオンをｐＨ４の条件で反応させた場合のみ結合活性があることから、これら２種のファージクローンはαformプリオンに結合せず、βformプリオンを特異的に認識していることが分かった。また、懸念されたｐＨ４がファージに与える影響であるが、一時間とオーバーナイトの反応性に変化はなく、ｐＨ４でファージはβformプリオンに特異性を示すことが分かった。【０１１６】
《実施例５：クローンの配列分析》
単離したαform及びβformに対するクローンのｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ塩基配列をDye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit（Applied Biosystems）を用いて決定した。ＥＬＩＳＡ及び配列分析の結果、単離したクローンは、ヒトプリオン結合性のクローンが２種（huPrP-18、huPrP-39）と、ウシプリオン結合性のクローンが３種（boPrP-2、boPrP-15、boPrP-20）、そしてβプリオン結合性のクローンが２種（βPrP-7、βPrP-30）に分類された。【０１１７】
《実施例６：ヒト由来抗プリオンｓｃＦｖの発現と精製》
上記のｓｃＦｖクローンからプラスミドＤＮＡを回収して、常法に従って大腸菌HB2151を形質転換した。２％グルコース及び100μg/mLのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの２×ＹＴ培地に一部移植し、終濃度１mM IPTG、100μg/mLのアンピシリンを加えて更に一夜培養してｓｃＦｖの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、0.5mM EDTA及び0.5M Sucroseを含む0.2M Tris-HClに懸濁して氷中に３０分菌体を放置した。次いで8,900×gで３０分間遠心し、上清を回収して0.45μmフィルター濾過後、ペリプラズム画分からのｓｃＦｖの精製出発材料とした。【０１１８】
このようにして調製した精製の出発材料を、抗E tag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで常法に従って精製した。ＰＢＳで透析後、分子量カット10,000のCentricon（Amicon社）で濃縮し、0.45μmフィルター濾過して精製標品とした。【０１１９】
《実施例７：ｓｃＦｖ精製品の分子量解析》
12.5% SDS-PAGEとウエスタンブロッティングを、M. Kajiらの報告（J. Biochem., 129: 577-583, 2001）に従って行った。【０１２０】
Semidry electroblotter（Sartorius）を用いてトランスファーしたPVDF膜（Applied Biosystems）をanti-E-tag mAbと反応させた。ECL（Amersham Pharmacia Biotech）により増感させ、luminoimage analyzer LAS-1000（Fuji Film）で検出した。マーカーには、NEB prestained protein marker（NE Biolabs）を使用した。その結果、図４に示すように、約３０Kdaのバンドが確認された。【０１２１】
《実施例８：ｓｃＦｖ精製品のＥＬＩＳＡによる反応性解析１》
上記クローンのαformに対する反応性をＥＬＩＳＡにより解析した。実施例４と同様に抗原をプレートに固定化し、精製ｓｃＦｖ（400ng/40μL/well）を反応させた。anti-E-tag mAb（Pharmacia）とＡＰ標識anti-mouse IgG Ab（Jackson ImmunoResearch）とを組み合わせて検出し、405nmにおける吸光度を測定した。【０１２２】
このＥＬＩＳＡでは、プリオンに対してだけではなく、これらの抗体のアミロイドβ（Ａβ）ペプチドに対する交差反応性も検討した。その結果、図５に示すように、いずれの抗体も、ヒトとウシのプリオンに結合し、monomer及びfiber Ａβに対して結合しないという結果になり、これらの抗体はαformプリオンを特異的に認識する抗体であることが分かった。【０１２３】
また、huPrP-39に関しては、ヒトとウシのプリオンに対する反応性を比較すると、ウシプリオンに低いことが判った。またその他の抗体のヒトとウシのプリオンの交差反応性に関しては、これらの抗体がプリオンの共通した領域を認識していることが示唆された。【０１２４】
《実施例９：ｓｃＦｖ精製品のＥＬＩＳＡによる反応性解析２》
次に、βformに対する反応性をＥＬＩＳＡにより解析した。
精製ｓｃＦｖ（200ng）を１μgのβform PrPとｐＨ４で混合し、４℃で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）にanti-His tag mAb（Amersham Pharmacia Biotech）を80ng/40μL/wellで、４℃一夜固定化した。0.25％BSAで、室温、２時間のブロッキングを行い、0.1％Tween20で洗浄した。その後、上記のｓｃＦｖとβform PrPとの混合液をアプライし、室温で１時間反応させた。ビオチン化anti- E-tag mAb（Pharmacia）とＡＰ標識ストレプトアビジン（Vector Lab.）とを組み合わせて検出した。405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーNJ-2300（Nunc）を用いて測定した。また、特異性確認のため、精製ｓｃＦｖをαformプリオン、または同じHis-tagをもつコントロール蛋白としてTim-3と反応させて、ＥＬＩＳＡを行った。結果を図６に示す。βPrP-7とβPrP-30については、αformプリオンに結合せず、βformプリオンを特異的に認識していることが分かった。また、boPrP-2とboPrP-15に関しては、βformプリオンに結合せず、αformプリオンを特異的に認識していることが分かった。【０１２５】
《実施例１０：βformプリオン特異クローンのＥＬＩＳＡによる性状解析》
次に、βPrP-7とβPrP-30のβformプリオンに対する反応について、pH依存性及び抗原濃度依存性をＥＬＩＳＡにより解析した。
βformヒトPrPをＥＬＩＳＡプレート（Nunc）に、20, 40, 80, 120, 160ng/wellで、４℃一夜固定化した。0.25％BSA/10mM NaOAc+10mM Tris-acetate(pH4.0)または0.25％BSA/PBS(pH7.0)で２時間ブロッキングした後、ｓｃＦｖを発現させた培養上清画分を40μL加え、１時間室温で反応させた。検出は、ビオチン化anti- E-tag mAb（Pharmacia）とＡＰ標識ストレプトアビジン（Vector Lab.）とを組み合わせて行った。反応に用いる緩衝液には、pH4の系では10mM NaOAc+10mM Tris-acetate(pH4.0)を、pH7の系ではPBS(pH7.0)を常に使用した。405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーNJ-2300（Nunc）を用いて測定した結果を図７に示す。βPrP-7については、pH4では抗原濃度依存的な反応を示したが、pH7では反応が認められなかった。βPrP-30については、pH4及びpH7のいずれにおいても抗原濃度依存的な反応が確認された。【０１２６】
《実施例１１：ｓｃＦｖ精製品のBIAcoreによる反応性解析》
各クローンの精製ｓｃＦｖとヒト及びウシのαformプリオンとの解離定数をBIAcore 2000（BIAcore）を用いて検討した。センサーチップCM5（Biacore）に10mM sodium acetate（pH4.0）で希釈したヒトPrP及びウシPrPを、amine coupling kit（Pharmacia biotech）を用いて固定化した。続いてエタノールアミンでブロッキングを行った。【０１２７】
測定は、HBS buffer（10mM HEPES, pH7.4/0.15M NaCl/3mM EDTA/0.005％ Tween20（Pharmacia biotech））で各ｓｃＦｖサンプルを０〜400nMに希釈して、流速は5μL/min、温度は20℃で行った。【０１２８】
各サンプルの測定後に、200mM NaCl含有200mM Glycine-HCl buffer（pH2.2）によりｓｃＦｖを溶出し洗浄した。【０１２９】
得られたセンサーグラムから、BIAevaluation 2.1ソフトを用いて解析し、結合解離定数KD値を算出した。その結果、これらの抗体はヒトPrP及びウシPrPに対し、下記の通り10-7から10-9Mオーダーという強い結合親和性（ＫＤ値）を持つことが分かった。
huPrP-18：ヒトPrP；2.0×10-8M、ウシPrP；6.0×10-8M
huPrP-39：ヒトPrP；3.3×10-8M、ウシPrP；2.9×10-8M
boPrP-2 ：ヒトPrP；1.1×10-7M、ウシPrP；4.1×10-7M
boPrP-15：ヒトPrP；7.8×10-9M、ウシPrP；4.6×10-9M
boPrP-20：ヒトPrP；3.6×10-8M、ウシPrP；3.9×10-9M
【図１】
0004977839.tif 000002
【図２】
0004977839.tif 000003
【図３】
0004977839.tif 000004
【図４】
0004977839.tif 000005
【図５】
0004977839.tif 000006
【図６】
0004977839.tif 000007
【図７】
0004977839.tif 000008
【配列表】
0004977839000001.app