(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・サブチルスFERM P-18351である菌。
【請求項２】
請求項１による菌又はその培養産物を含有してなる抗菌剤。
【請求項３】
請求項２による抗菌剤を用いることからなる、植物、動物（ヒトを除く）、水、土壌、家屋又は畜舎の殺菌又は滅菌方法。
【請求項４】
請求項２による抗菌剤からなる生ゴミの発酵促進材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な塩基配列、該配列を有するベクターならびに菌、該菌又はその培養産物を含有してなる抗菌剤等及びそれを用いることからなる殺菌又は滅菌方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
世界的に高度な経済発展を達成した20世紀は化学工業の世紀で、化石資源をエネルギー源・原材料として様々な工業製品を作り出すことによって経済的に豊かな社会を創生してきた。
しかし、専ら化石資源に依存する化学工業が形成する社会には、様々な歪みが生じて社会構成の根本を揺るがしており、化石資源に頼る科学技術を駆使する産業形態から地球環境と調和した新しい科学技術に依存する社会への転換が必要になっている。
こうした状況から、生物機能を有効に利用する技術(バイオテクノロジー)の研究開発が精力的に進められており、バイオテクノロジーが21世紀には主流の技術になるであろうとの予測から、21世紀は生物(バイオ)の世紀と言われるようになっている。
【０００３】
21世紀がバイオの世紀と言われる理由の一つに、近い将来、世界的な食料の不足が予測され、農・水産業が重要な産業となるであろうとの予測がある。20世紀の後半では、ともすれば農業の基本が軽視され、大量の化学薬剤とエネルギーを投入して効率を上げる農・水産業が展開されてきた。
しかし、これは、直接・間接に人類の健康や地球環境に大きな負担を強いてきた。従来、農・水産業は地球環境と調和した産業と考えられてきたが、実態はこれとは乖離した状況を生み出してきたのであり、その反省に立って、地球環境と調和した農・水産業を目指す動きが世界的規模で台頭してきた。いわゆる、有機農業・持続的農業と呼ばれる新しい農業形態である。有機農業では、化学薬剤の投入を極力抑えて、自然界での生物の調和(バイオホロニズム)の仕組みを利用して有利に農産物を生産すること目指している。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、自然界における微生物と植物の営みについて研究した結果、自然界では植物(特に作物)とこれらの生育を阻害する微生物(植物病害菌類)、この植物病害菌の生育を阻害する微生物が互いに作用しあいながら、生物環境を作り上げている中にあって、植物病害菌の生育阻害作用を有するバチルス・サブチルスの菌株を見い出し、この菌株が特定のプラスミドを保有することによって、該作用を奏していることを見出した。
【０００５】
したがって、本発明によれば、新規な塩基配列、該配列を有するベクターならびに菌、該菌又はその培養産物を含有してなる抗菌剤等及びそれを用いることからなる殺菌又は滅菌方法が提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
配列SEQ ID NO:1で表される塩基配列は、本発明者が奈良市内の畑土壌から分離した微生物から得られた。
この微生物の性質を詳細に調べたところ、この微生物は真正細菌のバチルス(Bacillus)属に分類された。
次いで、菌体のリボソーム溶解により得た本菌のリボソーム16sDNA (16s rDNA)の塩基配列を参考例に示す方法によって検討し、本菌をバチルス・サブチルスに属する一菌株(以降、バチルス・サブチルスTS-A株又はTS-A株)と同定した。
【０００７】
本発明者がTS-A株を固体培地上の植物病害菌に接種したところ、病害菌の数を減少させる抗菌活性が認められた。
一方、TS-A株中のプラスミドがエンコードする塩基配列(SEQ ID NO: 1)を実施例に記載するようにしてホモロジー検索したところ、この配列は全く新規であった。
このようなプラスミド(以降、pTS1)を保持する菌株は現在まで知られておらず、したがって、バチルス・サブチルスTS-A株は新規な菌株である。
【０００８】
本発明によれば、配列SEQ ID NO:1で表される塩基配列、又は当該分野で一般的に採用されるストリンジェントな条件で配列SEQ ID NO:1とハイブリダイズする塩基配列(以降、新規な塩基配列)が提供される。
抗菌活性とは、細菌などの微生物の増殖及び/又は生存を阻害する性質であり、種々の植物及びヒトを含む動物での病害菌のみならず、安全上及び健康上の観点から静菌、滅菌又は殺菌するのが望ましい微生物全てが対象とされる。
【０００９】
このような微生物の一例として、例えば大腸菌(Escherichia coli)；芝草リング病害菌のアブシジン・シリンドラスポラ(Absidia sylindrospora)、キュウリつる割れ病害菌のフサリウム・オキシポラム・ククメリナム(Fusarium oxyporum f.sp.cucumerinum)、ニラ萎黄病害菌のボツリティス・シネレア(Botrytis cinerea)、オクラ腐敗菌のアルタナリア・アルテマタ(Alternaria altemata)、イネ苗立枯病害菌のピシウム・アファニデルマデイウム(Pythium aphanidermatum)；ニジマス病害細菌のビブリオ・アングリラルム(Vibrio Anguillarun)、ネズミチフス菌サルモネラ・チフミリウム(Sallmonella typhmirium)が挙げられる。
【００１０】
プラスミドpTS1を制限酵素処理などに付して、又は合成して得られる配列SEQ ID NO:1は、当該分野で一般的なベクター等に挿入して配列SEQ ID NO:1を有する組換えベクターとして用いることができる。
また、このようなベクターを、通常の遺伝子工学の分野で一般的に採用される方法に利用することにより、形質転換体を得ることができる。被形質転換体は菌のほか、植物又は動物のような多細胞生物であってもよく、特に限定されない。しかしながら、配列SEQ ID NO:1の安定性のため、被形質転換体は菌であることが好ましく、バチルス・サブチルスに属する菌であることがより好ましい。
【００１１】
プラスミドpTS1を保持するバチルス・サブチルスTS-A株は、産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託番号FERM P-18351号として2001年5月25日に寄託されている。
したがって、本発明によれば、新規な塩基配列を有するベクター、該ベクターを含有する菌(以降、抗菌性細菌)、該菌又はその培養産物を含有してなる抗菌剤等、及び該剤を使用することからなる殺菌又は滅菌方法も提供される。
【００１２】
抗菌性細菌は、当該分野で用いられる通常の方法により培養することができ、例えばバチルス・サブチルスTS-A株では、グルコースや酵母エキスなどを含有するpH約6.0〜7.0の液体培地又は固体培地を用いて30〜37℃で24〜168時間、培養するのが好ましい。
培養産物は、抗菌性細菌を所定時間培養した後の液体培地もしくは固体培地自体であってもよい。これらは、培養後に得られる未精製の形態又は任意にろ過・遠心分離などの通常の手段により分離・精製した形態のいずれであってもよく、菌自体と同様に抗菌剤として用いることができる。
【００１３】
抗菌剤は、目的に応じて医薬部外品又は医薬品などのいずれの分野でも使用することができ、当該分野で公知の固体又は液体の担体などを用いて常法により製造することができる。
固体の担体としては、小麦ふすま、もみ殻、米ぬか、麦芽根、おが屑、木材チップ、木材バーク、魚粉、古紙、ばかす粉砕物などの有機性の可分解性物質、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ゼラチン、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、合成又は天然のケイ酸アルミニウム、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母などが挙げられる。また、液体の担体としては、水、種々の液体培地、グリセリン、プロピレングリコール、単シロップ、エタノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトールなどが挙げられる。
【００１４】
抗菌剤は、さらに所望により、防腐剤、防カビ剤、色素などの通常の添加剤、また他の抗菌剤と混合されていてもよく、常法により、固形剤、液剤、散剤等の形態に製造することができる。
例えば固形剤の場合、抗菌性細菌又はその培養液を上記のような固体の担体に直接、含浸等させて抗菌剤とすることができ、剤中の水分含量を8％以下に調整することによって、室温条件でも1年間、抗菌作用を維持することができる。
【００１５】
本発明の抗菌剤は、殺菌又は滅菌を目的とする限り使用分野が限定されず、植物、動物、水、土壌のみならず、家屋などにも用いることができる。
具体的には、畜舎内で使用されるオガクズ、ワラなどに、抗菌剤として本発明の抗菌性細菌の培養液をそのまま散布することによって、動物の病害菌を殺菌又は滅菌し、畜舎内の土壌等の品質を改良することができる。魚類の養殖又は家庭で利用される浄水においては、本発明の抗菌性細菌をオガコに吸着等させた固形抗菌剤が充填された装置に水を通すことによって、海水又は淡水などの性質にかかわらず、大量の水を簡便に滅菌し、浄化することができる。また、培養液をふすま又は米ぬかに含浸等させた固形抗菌剤を生ゴミに混合することによって、不要な菌の増殖を妨げると共に、生ゴミを発酵させ、その分解を促進する生ゴミの発酵促進材とすることができる。
【００１６】
医薬品として本発明の抗菌剤を用いる際には、対象とする症状、投与経路などによるが、一般に培養ろ液を有効成分とする場合に1〜10ml/kg/日、好ましくは1〜5ml/kg/日の投与量で、所望の効果を得ることができる。
【００１７】
本発明によるプラスミドpTS1は、潜在性のため、菌株から脱落しがたい性質を有する。
したがって、このプラスミド又は配列SEQ ID NO:1を有するベクターを遺伝子マーカーとし、コロニーハイブリダイゼーション法などの通常の方法を利用することによって、TS-A株の自然界での生存状況を簡単に評価し、またTS-A株を容易に単離・検出することができる。
さらに、TS-A株の有無又はその数を計測することによって、TS-A株が検出された付近での滅菌の程度を簡単に評価することができる。
【００１８】
【実施例】
次に本特許の実施例を示すが、これらは単なる一例に過ぎず、本特許を限定するものではない。
参考例：
奈良市の畑土壌から分離した微生物の性質を、ポテト-デキストロース培地(デイフコ社製)を用いて、バージェイズマニュアル・オブ・デターミネーチブ・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)第８版の方法にしたがって詳細に調べたところ、その性質は以下のとおりであった。
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【００１９】
0004869501.tif 000003
【００２０】
さらに、菌体のリボソーム溶解により得た本菌のリボゾーム16sDNA の塩基配列を、小柳津広志：16s ribosomal RNA配列を用いた種の同定、日本細菌学会誌、49巻、812〜821頁、1994年に記載される方法にしたがって決定し、本菌をバチルス・サブチルスに属する一菌株(バチルス・サブチルスTS-A株)と同定した。
【００２１】
実施例１：
バチルス・サブチルスTS-A株を、次の組成：ブドウ糖2％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.5％からなる培養培地を用いて、37℃で24時間培養し、リゾチームで処理して、本菌の保持するプラスミドを単離した。
このプラスミドを種々の制限酵素で処理して制限酵素地図を作成した(図１)。
さらに、ジデオキシチェーンターミネーション法によって、その塩基配列を決定した(SEQ ID NO: 1)。
この配列を、DNA配列検索システム(FASTA)を用いて検索したところ、このプラスミドは、全く新規な塩基配列をもつことが分かった。
【００２２】
実施例２：
芝草リング病害菌のアブシジン・シリンドラスポラ、キュウリつる割れ病害菌のフサリウム・オキシポラム・ククメリナム、ニラ萎黄病害菌のボツリティス・シネレア、オクラ腐敗菌のアルタナリア・アルテマタ、イネ苗立枯病害菌のピシウム・アファニデルマデイウム、大腸菌の細胞をポテトデキストロース寒天平板培地上に接種して5℃で5時間放置した後、この培地の中央に、TS-A株を一白金耳接種して30℃で静置培養した。
48時間後における菌の生育状態を観察したところ、固体上でもTS-A株を用いて植物又は動物の病原菌を防除できることが示された(図２)。
【００２３】
実施例３：
ニジマス病害菌のビブリオ・アングリラルムを、1％の食塩を含むニュートリエント・ブロス寒天平板培地上に培養し、これに隣接してTS-A株を接種して室温(25℃)で9日間培養した。
その結果、TS-A株の増殖に伴って、ビブリオ・アングリラルムを殺菌できた(図３)。
【００２４】
実施例４：
TS-A株をグルコース2％、酵母エキス0.1％、ペプトン0.1％及びリン酸第一カリウム0.1％[いずれも和光純薬製] を含む培地(pH6.0)で30℃で7日間培養した培養液の芝草リング病害菌に対する抗菌活性を調べたところ、1.05単位/ml(ナイスタチン50μg/mlの活性を1単位とする)であった。
【００２５】
実施例５：
TS-A株を、グルコース 2％、酵母エキス 0.5％及びペプトン0.5％[いずれも和光純薬製]を含むpH6.5の液体培地を用いて37℃で36時間通気培養し、この培養液1Lを、豚1頭を飼育している2mm2の養豚畜舎内に敷き詰めたオガクズ0.2mm2に散布した。
培養液とオガクズを毎日混ぜ合わせ、TS-A株の培養液の散布から4週間後にTS-A株の菌数とオガクズ中にみられた大腸菌の数をデオキシコール酸培地(白水製薬製)を用いるコロニーハイブリダイゼーション法により測定し、TS-A株の培養液を散布していないオガクズ(対照)における大腸菌数と比較した。
その結果、TS-A株の培養液を散布したオガクズで、TS-A株は1〜8x105個、大腸菌数は1〜7x102個であるのに対し、対照における大腸菌数は1〜7x105個であり、TS-A株の散布によって畜舎を滅菌することができた。
【００２６】
実施例６：
TS-A株をグルコース2％、酵母エキス 1％及び肉汁0.5％[いずれも和光純薬製]の液体培地(pH7.0)で37℃で24時間振盪培養し、培養液50mlを小麦ふすま(水600gを小麦ふすま500gに添加して混合した後、オーブンにて100℃で1時間加熱乾燥する)あるいは米ぬか500gと十分混合する。
これを50℃のオーブンで24時間風乾させ、水分含量を約8％にすることによって、少なくとも3ヶ月間は安定なTS-A株の資材を得ることができた(表１)。
【００２７】
【表１】
0004869501.tif 000004
【００２８】
実施例７：
実施例６で得たTS-A株の固形物50gと生ごみ(魚肉ソーセージ1kg、キャベツ500g及びオガクズ200g)とを生ごみ発酵処理菌(松下電工株式会社製、生ごみイーター)に投入して初発温度30℃で発酵処理を行った。この際、イネ苗立枯病害菌のピシウム・アファニデルマデイウム、大腸菌及びネズミチフス菌サルモネラ・チフミリウムを各105/gになるよう生ゴミに添加した。
発酵処理48時間後の発酵残渣中には、上記菌はいずれも検出できず、TS-A株が生ゴミ中でも病害菌の増殖を阻害することが認められた。
また、生ごみの発酵状況を発酵熱の発生で評価したところ、図４に示すように、TS-A株無添加の場合に比べて多くの発熱が見られ、TS-A株が生ごみを発酵分解する活性、すなわち生ゴミの発酵能を有することが示された。
【００２９】
実施例８：
ニジマス病害細菌のビブリオ・アングリラルム RT 27株を、1％の食塩を含むニュートリエント・ブロスNo.2 [オキソイド社製]に接種し、室温(平均25℃)で攪拌しつつ36時間、培養した。
一方、TS-A株は、ポテトデキストロース培地[デイフコ社製]を用いて、37℃かつ24〜168時間の条件で培養し、菌体を集めて少量のポテトデキストロース培地に懸濁する。これをオガコ(ウグラン、森下機械製、蒸留水で洗浄後加圧滅菌し乾燥した)とバーミキュライトの混合物(混合比１:１)に吸着させ(含水率50％)、スポンジで仕切りをつくったポリカーボネート製の筒に詰めた。
ビブリオ・アングリラルムは、培養液と共に、TS-A株を吸着させた筒に通してポンプで循環させた(毎分約0.5ml)。
【００３０】
ビブリオ・アングリラルムはニュートリエント・ブロスでは増殖するが、ポテトデキストロースでは生育しない。一方、TS-A株は、ニュートリエント・ブロスで30℃で旺盛に増殖するが、25℃では増殖速度が遅い。
そこで、これらの両菌の生育条件の違いを利用して、上記のようにして筒に通した後に得られる培養液を、(1)ニュートリエント・ブロスNo.2寒天平板培地上に播種し、25℃で72時間培養して形成するコロニーを計数して全生菌数とし、(2)同様に、ポテトデキストロース寒天平板培地上で30℃で48時間培養して形成するコロニーを計数してTS-A株の生菌数とし、(1)−(2)をビブリオ・アングリラルムの生菌数とした。
この結果、TS-A株を用いてニジマス病害細菌を防御できることが明らかになった(図５)。
【００３１】
実施例９：
直径10cm、深さ15mのプラスチック製容器に土壌150gを入れ、これに魚粉5gと蒸留水50mlを添加して十分攪拌した。
この状態で24時間放置した後、0.85％食塩水に懸濁した5mlのTS-A株懸濁液(108/ml)を上記の土壌試料に散布して室温に7日間放置し、土壌試料中のTS-A株数をプラスミドpTS1の特異的な塩基配列をプローブとするコロニーハイブリダイゼーション法によって計測した。
すなわち、土壌を殺菌生理食塩水で抽出し、これをポテトテキストロース寒天培地上に塗沫し、生じたコロニーをナイロンメンブレン(バイオラッド社製)上にレプリカした。
【００３２】
このレプリカメンブレンをポテトデキストロース寒天培地上に載せて10時間培養した後、リゾチーム(2mg/ml)を含む溶液と0.5Nの水酸化ナトリウムに浸して溶菌させた。
次いで、1Mトリス塩酸緩衝液(pH7.4)及び0.5Mトリス塩酸緩衝液(pH7.4)、1.5M塩化ナトリウム(pH7.4)でメンブレンを順次洗浄して中和した。紫外線照射によりDNAをメンブレンに固定した後、pTS1のBamHI消化断片(1.65kb)をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーションを行い、アマシャム・ファルマシア社製のFluorescein gene Image化学発光核酸検出システムを用いてpTS1を保有するTS-A株を検出した。
結果を図６に示す。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、新規な塩基配列、該配列を有するベクターならびに菌、該菌又はその培養産物を含有してなる抗菌剤等及びそれを用いることからなる殺菌又は滅菌方法が提供される。
配列SEQ ID NO:1を有する菌は、自然界に広く存在するので、菌自体又はその培養産物を含有する抗菌剤を製造し、安全かつ有効に種々の細菌を滅菌又は殺菌することができる。
また、配列SEQ ID NO:1は、遺伝子工学の手法により任意のベクターに組み換えて組換えベクターとすることができ、このようなベクターを利用することによって、菌のみならず植物や動物などの生物を被形質転換体とするトランスジェニック生物を得ることができる。
【００３４】
【配列表】
0004869501.tif 000005
0004869501.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミドpTS1の制限酵素地図である。
【図２】  TS-A株による種々の病害菌の増殖抑制を示す。中央に接種したTS-A株の周囲では、対象菌が増殖していない。
【図３】  TS-A株によるビブリオ・アングリラルムの殺菌を示す(矢印で示すゾーンはビブリオ・アングリラルムが死滅したことを示している)。
【図４】  TS-A株含有固形物を生ごみ処理機に投入することによる機内の温度変化を示す。
【図５】  TS-A株を含むオガコとバーミキュライトの混合物の使用による、ニジマス病害細菌ビブリオ・アングリラルムの滅菌効果を示す。
【図６】  左は、寒天培地上のコロニーをレプリカしたニトロセルロースフィルター、右は、プローブを用いたハイブリダイゼーションの結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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