(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（I）で表されるガラクトース誘導体。
【化２８】
0005087924.tif 000029
式（I）中、Ｘは次の式（II）を表し、Ｚは次の式（IV）を表し、Ｒは次の式（VI）を表す。
Ｘ：
【化２９】
0005087924.tif 000030
Ｚ：
【化３０】
0005087924.tif 000031
Ｒ：
【化３１】
0005087924.tif 000032
式（II）中、Ｙは次の式（VIII）又は（IX）を表し、Ｒ’ はアルコキシ又はハロゲンで置換されていてもよい、炭素数１〜４のアルキルを表す。式（VI）中、Ｒ’’は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
Ｙ：
【化３２】
0005087924.tif 000033
式（VIII）、（IX）中、ｎ、ｐはそれぞれ独立して０〜５０の整数を表す。
但し、ｎが０であるガラクトース誘導体を除く。
【請求項２】
下記（１）〜（３）のガラクトース誘導体からなる群から選択される請求項１に記載のガラクトース誘導体。
（１）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛１４−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサ｝テトラデカノール、
（２）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛１１−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９−トリオキサ｝ウンデカノール、
（３）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛２９−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサ｝ノナコサノール、
【請求項３】
次の一般式（I）で表されるガラクトース誘導体とカチオン性脂質とを含有する薬物担体。
【化３３】
0005087924.tif 000034
式（I）中、Ｘは次の式（II）を表し、Ｚは次の式（IV）を表し、Ｒは次の式（VI）を表す。
Ｘ：
【化３４】
0005087924.tif 000035
Ｚ：
【化３５】
0005087924.tif 000036
Ｒ：
【化３６】
0005087924.tif 000037
式（II）中、Ｙは次の式（VIII）又は（IX）を表し、Ｒ’ はアルコキシ又はハロゲンで置換されていてもよい、炭素数１〜４のアルキルを表す。式（VI）中、Ｒ’’は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
Ｙ：
【化３７】
0005087924.tif 000038
式（VIII）、（IX）中、ｎ、ｐはそれぞれ独立して０〜５０の整数を表す。
【請求項４】
ガラクトース誘導体が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジル−N−（１−デオキシラクチト−１−イル）エタノールアミンである、請求項３に記載の薬物担体。
【請求項５】
カチオン性脂質が２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールである、請求項３又は４のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項６】
更にリン脂質を含有する、請求項３〜５のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項７】
医薬を包含する、請求項３〜６のいずれかに記載の薬物担体を含有する医薬組成物。
【請求項８】
医薬が、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴ核酸又は水溶性陰イオン化合物である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
オリゴ核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム又はアプタマーである、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトース誘導体、肝臓への指向性を有する薬物担体及び医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞の膜表面上には、アシアロ糖タンパク質を認識するレセプターが存在する。かかるレセプターは、アシアロ糖タンパク質中のガラクトース残基を認識し、アシアロ糖タンパク質を肝細胞に取り込む機能を有している（例えば、非特許文献１を参照）。【０００３】
このような基質特異性を利用して、リポソームを構成する脂質にガラクトースを付加させることにより、リポソームの肝臓への指向性の向上が検討されているが、いずれも充分満足できる結果は得られていない（例えば、特許文献１を参照）。【０００４】
一方、近年、ＲＮＡ干渉［ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（以下、「ＲＮＡｉ」という）］を利用したｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（以下、「ｓｉＲＮＡ」という）といわれる核酸医薬が注目され、盛んに研究されている（例えば、特許文献２ないし３を参照）。ｓｉＲＮＡは、単独で人体に投与しても細胞内に移行し難いため、適当な担体に包含して投与する必要がある。【０００５】
【特許文献１】特開平６−２７１５９７号
【特許文献２】国際公開第０２／０５５６９２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／０５５６９３号パンフレット
【非特許文献１】Ｍ．Ｓｐｉｅｓｓ、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、１９９０年、２９巻、ｐ．１０００９−１００１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、主として、新規有用なガラクトース誘導体、それを必須構成成分として含有する薬物担体及び医薬を包含する当該薬物担体を含有する医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ガラクトース、適当なスペーサー及び一定の脂質からなるガラクトース誘導体を、薬物担体の構成成分として用いることにより、当該担体の肝臓への指向性が有意に向上することを見出し、本発明を完成した。【０００８】
本発明としては、例えば、下記１．〜３．を挙げることができる。
１．次の一般式（I）で表されるガラクトース誘導体（以下、「本発明誘導体」という）。
【化１】
0005087924.tif 000002
式（I）中、Ｘは次の式（II）を表し、Ｚは次の式（IV）を表し、Ｒは次の式（VI）を表す。
Ｘ：
【化２】
0005087924.tif 000003
Ｚ：
【化３】
0005087924.tif 000004
Ｒ：
【化４】
0005087924.tif 000005
式（II）中、Ｙは次の式（VIII）又は（IX）を表し、Ｒ’ はアルコキシ又はハロゲンで置換されていてもよい、炭素数１〜４のアルキルを表す。式（VI）中、Ｒ’’は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
Ｙ：
【化５】
0005087924.tif 000006
式（III）、（VIII）、（IX）中、ｎ、ｐはそれぞれ独立して０〜５０の整数を表す。
但し、ｎが０であるガラクトース誘導体を除く。
２．次の一般式（I）で表されるガラクトース誘導体とカチオン性脂質とを含有する薬物担体（以下、「本発明担体」という）。
【化６】
0005087924.tif 000007
式（I）中、Ｘは次の式（II）を表し、Ｚは次の式（IV）を表し、Ｒは次の式（VI）を表す。
Ｘ：
【化７】
0005087924.tif 000008
Ｚ：
【化８】
0005087924.tif 000009
Ｒ：
【化９】
0005087924.tif 000010
式（II）中、Ｙは次の式（VIII）又は（IX）を表し、Ｒ’ はアルコキシ又はハロゲンで置換されていてもよい、炭素数１〜４のアルキルを表す。式（VI）中、Ｒ’’は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
Ｙ：
【化１０】
0005087924.tif 000011
式（VIII）、（IX）中、ｎ、ｐはそれぞれ独立して０〜５０の整数を表す。
３．医薬を包含する上記２．の薬物担体を含有する医薬組成物（以下、「本発明組成物」という）。
【０００９】
本発明において、Ｒ’に係る炭素数１〜１０のアルキルとしては、直鎖状か分枝鎖状か特に制限されず、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１〜４のアルキルが好ましく、特にメチル、エチルがより好ましい。置換されている当該アルキルとしては、例えば、アルコキシ、ハロゲン化アルキルを挙げることができる。かかるアルコキシの具体例としては、メトキシ、エトキシを挙げることができる。ハロゲン化アルキルのアルキル部分は、上記アルキルと同義である。また、ハロゲン化アルキルのハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素を挙げることができる。具体的には、塩化メチル、塩化エチル、フッ化メチルを挙げることができる。
Ｒ’’に係る炭素数１０〜３０の飽和の脂肪族炭化水素基としては、例えば、カプリル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１０〜２０の飽和の脂肪族炭化水素基が好ましく、特にステアリルがより好ましい。また、炭素数１０〜３０の不飽和の脂肪族炭化水素基としては、例えば、オレイル、リノレイル、アラキドニルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１０〜２０の不飽和の脂肪族炭化水素基が好ましく、特にオレイルがより好ましい。炭素数１０〜３０の飽和の脂肪酸残基としては、例えば、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１０〜２０の飽和の脂肪酸残基が好ましく、特にステアロイルがより好ましい。炭素数１０〜３０の不飽和の脂肪酸残基としては、例えば、オレオイル、リノレオイル、アラキドノイルを挙げることができる。それらの中で、特にオレオイルが好ましい。
ｍ、ｎ、ｐとしては、それぞれ独立した０〜５０の整数であることが適当であり、０〜２０の整数であることが好ましく、０〜１０の整数であることがより好ましい。【００１０】
好ましい本発明誘導体としては、例えば、
（１）２−Ｏ−｛２−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノエチル｝カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、
（２）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛１４−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサ｝テトラデカノール、
（３）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル−Ｎ−｛１４−（β−１−ラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシアセチル｝エタノールアミン、
（４）２−Ｏ−［２−Ｎ−｛１４−（β−１−ラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシアセチル｝アミノエチル］カルバモイル−１，３−ジオレオイルグリセロール、
（５）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛１１−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９−トリオキサ｝ウンデカノール、
（６）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛２９−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサ｝ノナコサノール、
（７）２−Ｏ−［２−｛Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）−Ｎ−エチル｝アミノエチル］カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、及び
（８）２−Ｏ−｛１１−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９−トリオキサウンデシル｝カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ルシフェラーゼの発現効率を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性を示し、横軸は検討を行った組成物例を示す。
【００１２】
【図２】図２は、蛍光強度分布を示す。縦軸は細胞数を示し、横軸は蛍光強度を示す。破線は比較対照の組成物、太実線は実施例１３に係る本発明担体を含む組成物を用いた場合の蛍光強度分布を示す。また、細実線は陰性対照の蛍光強度分布を示す。
【００１３】
【図３】図３は、蛍光強度分布を示す。縦軸は細胞数を示し、横軸は蛍光強度を示す。破線は比較対照の組成物、太実線は実施例１４に係る本発明担体を含む組成物を用いた場合の蛍光強度分布を示す。また、細実線は陰性対照の蛍光強度分布を示す。
【００１４】
【図４】図4は、Ｃ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」という）のレプリコン複製抑制活性を示す。縦軸はネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（以下、「ＮＰＴＩＩ」という）の発現率を示し、横軸は検討を行った組成物例及び組成物中に含まれるオリゴＲＮＡの濃度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
Ｉ．本発明誘導体の製造方法【００１６】
１．Ｘが前記式（II）に係る本発明誘導体（Ia）の製造方法
（ａ）Ｘが前記式（II）に係る本発明誘導体（Ia）は、Ｄ−（＋）−ラクト−ス（１）と下記一般式（２）で表されるアミン誘導体を適当な溶媒に溶解し、酸性条件下、還元剤を作用させることにより製造することができる。使用し得る溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール）、ハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム）及びこれらの混合溶媒を挙げることができる。酸性条件下にするために用い得る酸としては、例えば、酢酸や塩酸を挙げることができる。還元剤としては、例えば、水素化ほう素ナトリウム、シアノトリヒドロほう酸ナトリウムを挙げることができる。反応温度は、０〜８０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１〜１００時間の範囲内が適当である。【００１７】
【化１１】
0005087924.tif 000012
（式中、Ｙ、Ｚ、Ｒ、Ｒ’は前記と同義である。）
【００１８】
（ｂ）上記一般式（Ia）中、Ｒ’が水素以外である本発明誘導体（Ia−２）は、上記方法（ａ）により製造される、Ｒ’が水素である本発明誘導体（Ia−１）と下記一般式（３）で表されるケトンあるいはアルデヒドを適当な溶媒に溶解し、酸性条件下、還元剤を作用させることによっても製造することができる。使用し得る溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール）、ハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム）又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。酸性条件下にするために使用し得る酸としては、例えば、酢酸や塩酸を挙げることができる。還元剤としては、例えば、水素化ほう素ナトリウム、シアノトリヒドロほう酸ナトリウムを挙げることができる。反応温度は、０〜８０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１〜１００時間の範囲内が適当である。【００１９】
【化１２】
0005087924.tif 000013
（式中、Ｙ、Ｚ、Ｒは前記と同義である。）
式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素又は置換されていてもよい炭素数１〜９のアルキルを表す。かかる炭素数１〜９のアルキルとしては、直鎖状か分枝鎖状か特に制限されず、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１〜３のアルキルが好ましく、特にメチル、エチルがより好ましい。また、当該アルキルの置換基としては、例えば、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）を挙げることができる。【００２０】
２．Ｘが前記式（III）に係る本発明誘導体（Ib）の製造方法
（ａ）Ｘが前記式（III）に係る本発明誘導体（Ib）は、下記一般式（４）で表されるカルボン酸と前記一般式（２）中、Ｙが前記式（VIII）であって、前記一般式Ｙ中のｎが０であるアミン誘導体（２ｆ）を適当な溶媒に溶解し、適当な縮合剤の存在下、反応させることにより製造することができる。使用し得る溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを挙げることができる。反応温度は０〜３０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１〜３０時間の範囲内が適当である。【００２１】
【化１３】
0005087924.tif 000014
（式中、Ｚ、Ｒ、ｍは前記と同義である。）
【００２２】
３．本発明誘導体（Ia）の原料化合物である、前記一般式（２）で表されるアミン誘導体の製造方法
（ａ）前記一般式（２）中、Ｙが前記式（VIII）であって、Ｚが前記式（IV）であって、Ｒが前記式（VI）であるアミン誘導体（２ａ）は、ホスファチジルコリン（５）、下記一般式（６）で表されるアミノアルコール、ホスホリパーゼＤを用い、文献記載の方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５、ｐ．１０４８７−１０４９１）に従い製造することができる。【００２３】
【化１４】
0005087924.tif 000015
（式中、Ｒ’、Ｒ’’、ｎは前記と同義である。）
【００２４】
（ｂ）前記一般式（２）中、Ｒ’が水素であって、Ｙが前記式（VIII）であって、Ｚが前記式（V）であるアミン誘導体（２ｂ）は、下記一般式（７）で表されるアルコールを適当な溶媒に溶解し、適当なアシル化剤と反応させ、活性化体を得た後、下記一般式（８）で表されるアミン誘導体を反応させて下記一般式（９）で表される化合物を得、その後、Ｒ３を常法により脱保護することにより製造することができる。使用し得る溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、有機アミン類（例えば、ピリジン、ピコリン、コリジン）、ジメチルホルムアミド又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。アシル化剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、クロロ炭酸フェニルを挙げることができる。反応温度は０〜１００℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１〜３０時間の範囲内が適当である。Ｒ３の除去は、常法に従い、酸（例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、塩酸）又は接触還元により行うことができる。【００２５】
【化１５】
0005087924.tif 000016
（式中、Ｒ、ｎは前記と同義である。）
式中、Ｒ３はアミノ基の保護基を表す。かかる保護基としては、特に制限されないが、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルを挙げることができる。それらの中で、特にｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルが好ましい。【００２６】
（ｃ）前記一般式（２）中、Ｒ’が水素以外であって、Ｙが前記式（VIII）であって、Ｚが前記式（V）であるアミン誘導体（２ｃ）は、前記一般式（７）で表されるアルコールと下記一般式（１０）で表されるアミン誘導体を適当な溶媒に溶解し、適当なアシル化剤の存在下、反応させることにより製造することができる。使用し得る溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、有機アミン類（例えば、ピリジン、ピコリン、コリジン）、ジメチルホルムアミド又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。アシル化剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、クロロ炭酸フェニルを挙げることができる。反応温度は０〜１００℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１〜３０時間の範囲内が適当である。【００２７】
【化１６】
0005087924.tif 000017
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、ｎは前記と同義である。）
【００２８】
（ｄ）前記一般式（２）中、Ｒ’が水素であって、Ｙが前記式（IX）であって、ｐが１以上であるアミン誘導体（２ｄ）は、下記一般式（１１）で表されるエチレングリコール誘導体を用い、文献記載の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、６６、ｐ．４４９４−４５０３）に準じて下記一般式（１６）の化合物を得た後、Ｒ４を除去し、その後、適当な縮合剤の存在下、前記一般式（２ｆ）で表されるアミン誘導体と反応させた後、Ｒ３を常法により除去することにより製造することができる。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを挙げることができる。保護基の導入は、常法に従い、例えば、テトラヒドロフラン等の溶媒中、二炭酸ジ−ｔ−ブチル等と反応させることにより行うことができる。Ｒ４の除去は、常法に従い、メタノール等のアルコール中、水酸化ナトリウム水溶液、ナトリウムメチラート等を用いることにより、あるいは、接触還元により行うことができる。【００２９】
【化１７】
0005087924.tif 000018
（式中、Ｚ、Ｒ、Ｒ３は前記と同義である。）
式中、ａは０〜４９の整数を表す。また、Ｒ４は置換されていてもよいアルキルを表す。Ｒ４のアルキルとしては、例えば、炭素数１〜７の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル、具体的には、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、ヘプチルを挙げることができる。また、当該アルキルの置換基としては、例えば、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ）、ニトリル（例えば、シアノ）を挙げることができる。更に、Ｍｓは、メタンスルホニルを表す。【００３０】
（ｅ）前記一般式（２）中、Ｒ’が水素であって、Ｙが前記式（IX）であって、ｐが０であるアミン誘導体（２ｅ）は、上述したアミン誘導体（２ｄ）の製造方法において、上記一般式（１７）で表される化合物の代わりに、下記一般式（１９）で表されるグリシン誘導体を用い、適当な縮合剤の存在下、前記一般式（２ｆ）で表されるアミン誘導体と反応させた後、Ｒ３を常法により除去することにより製造することができる。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを挙げることができる。【００３１】
【化１８】
0005087924.tif 000019
（式中、Ｚ、Ｒ、Ｒ３は前記と同義である。）
【００３２】
４．本発明誘導体（Ib）の原料化合物である、前記一般式（４）で表されるカルボン酸の製造方法
前記一般式（４）で表されるカルボン酸は、下記一般式（２１）で表される、水酸基がアシル化された糖と下記一般式（２２）で表されるアルコール誘導体を適当な溶媒に溶解し、酸触媒の存在下、反応させ、その後、Ｒ４及びＲ５を除去することにより製造することができる。使用し得る溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム）、エーテル類（例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン）又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。酸触媒としては、例えば、三フッ化ほう素・ジエチルエーテル錯体、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを挙げることができる。反応温度は０〜３０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１〜３０時間の範囲内が適当である。Ｒ４及びＲ５の除去は、常法に従い、メタノール中でナトリウムメチラートを加えて行えばよく、この条件でＲ４が除去されない場合には、続いて、酸（例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、塩酸）又は接触還元により行うことができる。【００３３】
【化１９】
0005087924.tif 000020
（式中、Ｒ４、ｍは前記と同義である。）
式中、Ｒ５は置換されていてもよいアシルを表す。Ｒ５のアシルとしては、特に制限されないが、例えば、炭素数１〜６の直鎖状又は分枝鎖状のアルカノイル、具体的には、アセチル、イソブチリル、ピバロイルか、炭素数７〜１３のアロイル、具体的には、ベンゾイル、トルイル、２,４,６-トリメチルベンゾイルを挙げることができる。また、当該アシルの置換基としては、例えば、アルコキシ（例えば、メトキシ）、ハロゲン（例えば、塩素、フッ素）を挙げることができる。【００３４】
５．アミン誘導体（２ａ）の原料化合物である、前記一般式（６）で表されるアミノアルコールの製造方法
前記一般式（６）中、Ｒ’が水素であるアミノアルコール（６ａ）は、前記一般式（１３）中、ａがｎであるアジド誘導体（１３ａ）を用い、文献記載の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、６６、ｐ．４４９４−４５０３）に従い製造することができる。また、前記一般式（６）中、Ｒ’が水素以外であるアミノアルコール（６ｂ）は、Ｒ’が水素である前記アミノアルコール（６ａ）と前記一般式（３）で表されるケトンあるいはアルデヒドを用い、上述した前記一般式（Ia−２）で表される本発明誘導体を製造する際に用いた方法と同様にして製造することができる。還元剤としては、例えば、水素化ほう素ナトリウム、シアノトリヒドロほう酸ナトリウムを挙げることができる。【００３５】
【化２０】
0005087924.tif 000021
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｎは前記と同義である。）
【００３６】
６．アミン誘導体（２ｂ）、（２ｃ）の原料化合物である、前記一般式（７）で表されるアルコールの製造方法
（ａ）前記一般式（７）中、Ｒが前記式（VI）であるアルコール（７ａ）は、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（２４）を用い、文献記載の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９７０年、３５、ｐ．２２１−２２４）に従い製造することができる。塩基としては、例えば、ピリジン、コリジン、トリエチルアミン等の有機アミン類を挙げることができる。【００３７】
【化２１】
0005087924.tif 000022
（式中、Ｒ’’は前記と同義である。）
【００３８】
（ｂ）前記一般式（７）中、Ｒが前記式（VII）であるアルコール（７ｂ）は、二量体のジヒドロキシアセトン（２８）を用い、文献記載の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９７０年、３５、ｐ．２０８２−２０８３）に従い製造することができる。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを挙げることができる。還元剤としては、例えば、水素化ほう素ナトリウムを挙げることができる。【００３９】
【化２２】
0005087924.tif 000023
（式中、Ｒ’’は前記と同義である。）
【００４０】
７．アミン誘導体（２ｂ）の原料化合物である、前記一般式（８）で表されるアミン誘導体の製造方法
前記一般式（８）で表されるアミン誘導体は、前記一般式（１１）中、ａがｎであるエチレングリコール誘導体（１１ａ）を用い、文献記載の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、６６、ｐ．４４９４−４５０３及びＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９０年、３３、ｐ．９７−１０１）に準じて製造することができる。保護基の導入は、常法に従い、例えば、テトラヒドロフラン等の溶媒中、二炭酸ジ−ｔ−ブチル等と反応させることにより行うことができる。【００４１】
【化２３】
0005087924.tif 000024
（式中、Ｒ３、ｎ、Ｍｓは前記と同義である。）
【００４２】
８．アミン誘導体（２ｃ）の原料化合物である、前記一般式（１０）で表されるアミン誘導体の製造方法
前記一般式（１０）で表されるアミン誘導体は、前記一般式（６ａ）で表されるアミノアルコールを用い、文献記載の方法（Ｔｅｔｒａｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９７年、３８、ｐ．５８３１−５８３４）に従い製造することができる。還元剤としては、例えば、水素化ほう素ナトリウム、シアノトリヒドロほう酸ナトリウムを挙げることができる。脱保護は、常法に従い、例えば、接触還元により行うことができる。【００４３】
【化２４】
0005087924.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｎは前記と同義である。）
式中、Ｎｓは２−ニトロベンゼンスルホニルを、Ｂｎはベンジルを、ＤＮｓは２，４−ジニトロベンゼンスルホニルを、ＰＭＢはｐ−メトキシベンジルをそれぞれ表す。【００４４】
９．前記一般式（４）で表されるカルボン酸の原料化合物である、前記一般式（２２）で表されるアルコール誘導体の製造方法
前記一般式（２２）中、ｍが１以上であるアルコール誘導体（２２ａ）は、前記一般式（１１）で表されるエチレングリコール誘導体を用い、文献記載の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、６６、ｐ．４４９４−４５０３）に準じて製造することができる。トリチルの除去は、常法に従い、例えば、酸（例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、塩酸）で処理することにより行うことができる。なお、前記一般式（２２）中、ｍが０であるアルコール誘導体（２２ｂ）は、市販されている。【００４５】
【化２５】
0005087924.tif 000026
（式中、Ｒ４、ａは前記と同義である。）
式中、Ｔｒはトリチルを表す。【００４６】
１０．前記一般式（１１）中、ａが８以上であるエチレングリコール誘導体（１１ｃ）の製造方法
前記一般式（１１）中、ａが８以上であるエチレングリコール誘導体（１１ｃ）は、前記一般式（１１）中、ａがｂであるエチレングリコール誘導体（１１ｂ）、前記一般式（３９）中、ａがｃであるエチレングリコール誘導体（３９ａ）を用い、文献記載の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、６４、ｐ．６８７０−６８７３）に従い製造することができる。なお、前記一般式（１１）中、ａが７以下であるエチレングリコール誘導体（１１ｄ）は、市販されている。【００４７】
【化２６】
0005087924.tif 000027
（式中、Ｔｒは前記と同義である。）
式中、ｂは１〜４８の整数を、ｃは１〜２４の整数をそれぞれ表す。なお、式中、「ｂ＋２ｃ」は、ａであって、８〜５０の整数を表す。また、Ｔｓはｐ−トルエンスルホニルを表す。【００４８】
１１．前記一般式（１３）中、ａが８以上であるアジド誘導体（１３ｃ）の製造方法
前記一般式（１３）中、ａが８以上であるアジド誘導体（１３ｃ）は、前記一般式（３９）中、ｍがｄであるエチレングリコール誘導体（３９ｂ）、前記一般式（１３）中、ａがｅであるアジド誘導体（１３ｂ）を用い、文献記載の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、６６、ｐ．４４９４−４５０３）に従い製造することができる。【００４９】
【化２７】
0005087924.tif 000028
（式中、Ｍｓ、Ｔｒ、Ｔｓは前記と同義である。）
式中、ｄ、ｅはそれぞれ独立して１〜４９の整数を表す。なお、式中、「ｄ＋ｅ」は、ａであって、８〜５０の整数を表す。【００５０】
II．本発明担体【００５１】
本発明担体は、本発明誘導体とカチオン性脂質とを必須の構成成分とするものであって、後述する医薬を細胞内に送達しうる性質を有するものである。具体的には、リポソームや脂肪乳剤等の形態をとることができる。【００５２】
本発明担体の必須の構成成分であるカチオン性脂質としては、医薬上許容されるカチオン性脂質であれば特に制限はされないが、例えば、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、Ｎ−{１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル}−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、Ｎ，ＮI，ＮII，ＮIII−テトラメチル―Ｎ，ＮI，ＮII，ＮIII―テトラパルミチルスペルミン、２，３−ジオレイロキシ−Ｎ−{２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル}−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートを挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。それらの中で、特に２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールが好ましい。【００５３】
本発明担体における本発明誘導体とカチオン性脂質との配合比率は、カチオン性脂質１重量部に対して、本発明誘導体０．０１〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．０５〜５重量部の範囲内が好ましく、０．５〜３重量部の範囲内がより好ましい。【００５４】
本発明担体には、必須の構成成分である本発明誘導体及びカチオン性脂質以外にリン脂質を更に加えることができる。かかるリン脂質としては、医薬上許容されるリン脂質であれば特に制限されないが、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチンを挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。それらの中で、特に卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチンが好ましい。【００５５】
更にリン脂質を加える場合、本発明担体における本発明誘導体とリン脂質との配合比率は、リン脂質１重量部に対して、本発明誘導体０．０１〜１００重量部の範囲内が適当であり、０．１〜１０重量部の範囲内が好ましく、０．３〜２重量部の範囲内がより好ましい。また、カチオン性脂質１重量部に対して、本発明誘導体とリン脂質との和が、０．０１〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．０５〜５重量部の範囲内が好ましく、０．５〜３重量部の範囲内がより好ましい。【００５６】
本発明担体の分散液は、本発明誘導体とカチオン性脂質及び／又はリン脂質を混合し、常法により、水溶液中で分散させることにより調製することができる。分散には超音波分散装置、乳化分散装置等の装置を適宜用いることができる。【００５７】
III．本発明組成物【００５８】
本発明組成物に用い得る「医薬」としては、例えば、水溶性陰イオン性化合物、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗生物質を挙げることができる。具体的には、核酸化合物である二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡあるいはオリゴ核酸、酸性糖であるヘパラン硫酸やデキストラン硫酸等、サイトカイン類、サイクリックＡＭＰ、ＡＴＰやＩＰ３等のセカンドメッセンジャー類、ペニシリン類やセファロスポリン類、ビタミンＣやレチノール類のビタミン類、その他酸性基をもった既知の医薬、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、レバミゾール、ペスタチン、レチノイックアシッド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、アデニンアラビノシド（Ａｒａ−Ａ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、アジドチミジン（ＡＺＴ）等を挙げることができる。【００５９】
二本鎖ＲＮＡとしては、例えば、以下のものを挙げることができる。
１．ホモポリマー・ホモポリマー複合体
（１）塩基修飾
ポリイノシン酸・ポリシチジル酸、
ポリイノシン酸・ポリ（５−ブロモシチジル酸）、
ポリイノシン酸・ポリ（２−チオシチジル酸）、
ポリ（７−デアザイノシン酸）・ポリシチジル酸、
ポリ（７−デアザイノシン酸）・ポリ（５−ブロモシチジル酸）。
（２）糖修飾
ポリ（２’−アジドイノシン酸）・ポリシチジル酸。
（３）リン酸修飾
ポリイノシン酸・ポリ（シチジン−５’−チオリン酸）。
２．ホモポリマー・コポリマー複合体
ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、ウリジン酸）、
ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、４−チオウリジン酸）。
３．合成核酸とポリカチオンとの複合体
ポリイノシン酸・ポリシチジル酸・ポリ−Ｌ−リジン。
４．その他
ポリイノシン酸・ポリ（１−ビニルシチジル酸）。【００６０】
オリゴ核酸としては、一分子内に１０〜５０、好ましくは１５〜３０、より好ましくは１８〜２５の核酸塩基を有する、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びそれらの誘導体を挙げることができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、アプタマーを挙げることができる。【００６１】
上記オリゴ核酸は天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。修飾される場合、望ましい修飾は、糖の２’位の修飾、糖のその他の部分の修飾、オリゴ核酸のリン酸バックボーンの修飾等である。糖の２’位の修飾として、ＯＲ６、Ｒ６、Ｒ７ＯＲ６、ＳＨ、ＳＲ６、ＮＨ２、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等の置換基が挙げられる。ここで、Ｒ６はアルキル又はアリール、好ましくは炭素数１〜６のアルキルを、Ｒ７はアルキレン、好ましくは炭素数１〜６のアルキレンを表す。糖のその他の部分の修飾体としては、４’チオ体などが挙げられる。オリゴ核酸のリン酸バックボーンの修飾体としては、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、ホスホロアミデート体等が挙げられる。【００６２】
本発明組成物中に含まれる本発明担体と医薬との重量比（本発明担体／医薬）は、医薬の種類、本発明担体における本発明誘導体とカチオン性脂質との配合比率等によって異なるが、０．０１〜１０００の範囲内が適当であり、１０〜３００の範囲内が好ましく、１００〜２００の範囲内がより好ましい。更に、含有医薬がオリゴ核酸である場合には、０．０１〜１００の範囲内が適当であり、１〜３０の範囲内が好ましく、１０〜２０の範囲内がより好ましい。【００６３】
本発明組成物には、上述した本発明担体と医薬以外に、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６〜２２の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。【００６４】
本発明組成物は、本発明担体の分散液に医薬を加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、本発明担体の製造過程において、医薬を加えることによっても調製することができる。上述した添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。【００６５】
本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。液剤の場合、本発明組成物中に含まれる本発明担体の濃度は、０．００１〜２５％ｗ／ｖの範囲内が適当であり、０．０１〜５％ｗ／ｖの範囲内が好ましく、０．１〜２％ｗ／ｖの範囲内がより好ましい。【００６６】
上記凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。【００６７】
本発明組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。【００６８】
本発明組成物は、投与単位形態で投与することが望ましく、ヒトを含む動物に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与または経直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。これらの投与に適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤で投与されるのはもちろんである。【００６９】
例えば、本発明組成物の医薬としての用量は、医薬の種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して医薬量として、１日当たり０．０１ｍｇ〜１０ｇ／ヒトの範囲が、好ましくは０．１ｍｇから数ｇの範囲が一般的である。更に、本発明組成物に含有されている医薬がオリゴ核酸である場合には、成人に対してオリゴ核酸量として、１日当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ／ヒトの範囲が、好ましくは１ｍｇから数ｇの範囲が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また、１日１回から数回の投与または１日から数日間の間隔で投与することができる。
【実施例】
【００７０】
以下に、参考例、実施例、比較例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。【００７１】
参考例１  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジル−N−（１−デオキシラクチト−１−イル）エタノールアミンの合成
４６０ｍｇのＬ-α-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、２２３ｍｇのラクトース１水和物をＨ2Ｏ（２ｍＬ）、メタノール（８ｍＬ）、ジクロロメタン（２ｍＬ）の混合液に溶解し、次いで１ｍＬの酢酸、７８ｍｇのシアノトリヒドロほう酸ナトリウムを加えて６５℃で終夜攪拌した。反応液を濃縮後、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９５９年、３７、ｐ．９１１。以下同じ。）で目的物を抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、目的物を２６７ｍｇ得た。【００７２】
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１０９３．１（［Ｍ+Ｎa］+）【００７３】
実施例１  ２−Ｏ−｛２−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノエチル｝カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールの合成
工程１  １，３−ジオレオイルグリセロールの合成
３．８ｇの二量体のジヒドロキシアセトン、２５ｇのオレイン酸、２０ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１２．９ｇの４−ジメチルアミノピリジンを１５０ｍＬのジクロロメタン中、室温で４時間攪拌した。反応液を０．５Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液にあけ、ジクロロメタンで抽出し、水洗して乾燥後、減圧濃縮した。残渣に１Ｌのメタノールを加えて生じた粉末を集めて乾燥した。かかる粉末を、１７０ｍＬのテトラヒドロフランと１７ｍＬの１０％酢酸水溶液との混合液に溶解し、０℃にて１．７ｇの水素化ほう素ナトリウムを少しづつ加えた。室温で２時間攪拌後、反応液を飽和重曹水にあけ、酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を１４．５ｇ得た。
工程２  ２−Ｏ−（２−アミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールの合成
３．４ｇの上記工程１で得られた１，３−ジオレオイルグリセロールを３０ｍＬのピリジンに溶解し、１．７ｇのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下濃縮後、ジクロロメタンに溶解し、５％リン酸二水素ナトリウム水溶液で洗浄、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。このもの８００ｍｇを３ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、３５８ｍｇのＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−１，２−エチレンジアミンを加えて室温で３時間攪拌した。その反応液を飽和食塩水にあけ、酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣を８ｍＬのジクロロメタンに溶解し、２ｍＬのトリフルオロ酢酸を加えて室温で３０分攪拌した。反応液を飽和重曹水にあけ、酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を６００ｍｇ得た。
工程３  ２−Ｏ−｛２−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノエチル｝カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールの合成
３００ｍｇの上記工程２で得られた２−Ｏ−（２−アミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、１４５ｍｇのラクトース１水和物をＨ2Ｏ（１ｍＬ）、メタノール（４ｍＬ）、ジクロロメタン（１ｍＬ）の混合液に溶解し、次いで０．３ｍＬの酢酸、５３ｍｇのシアノトリヒドロほう酸ナトリウムを加えて６５℃で終夜攪拌した。反応液を濃縮後、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法で目的物を抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、目的物（本発明誘導体）を２４７ｍｇ得た。【００７４】
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１０３４．０（［Ｍ+H］+）【００７５】
実施例２  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛１４−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサ｝テトラデカノールの合成
工程１  １４−｛（メチルスルホニル）オキシ｝−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカノールの合成
１０ｇのペンタエチレングリコール、１０．７ｇの酸化銀に８０ｍＬのジクロロメタンを加え、５．８ｇのメタンスルホニルクロリドのジクロロメタン溶液（１６ｍＬ）を滴下した。反応液を室温で２日間攪拌後、セライトでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を７．８ｇ得た。
工程２  １４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカノールの合成
７．４ｇの上記工程１で得られた１４−｛（メチルスルホニル）オキシ｝−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカノールと２．２８ｇのアジ化ナトリウムに２５ｍＬのジメチルホルムアミドを加え、１１０℃で２．５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、トルエンで共沸した。残渣を酢酸エチルに懸濁し、不溶物をろ過して除き、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を５．７ｇ得た。
工程３  １４−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカノールの合成
５．６ｇの上記工程２で得られた１４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカノールを６０ｍＬのメタノールに溶解し、８００ｍｇの１０％パラジウム/炭素存在下、４時間水素添加した。反応液をろ過し、ろ液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を２ｇ得た。
工程４  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル（１４−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサ）テトラデカノールの合成
１ｇのＬ−α−ジオレオイルホスファチジルコリン、１．９ｇの上記工程３で得られた１４−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカノールに２５ｍＬのジクロロメタン、３．５ｍＬの酢酸ナトリウム（１００ｍＭ）−塩化カルシウム（５０ｍＭ）緩衝液（ｐＨ６．５）、５００ＵのホスホリパーゼＤを加え、３０℃で終夜攪拌した。ジクロロメタン層を濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を７０５ｍｇ得た。
工程５  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛１４−N−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサ｝テトラデカノールの合成
４００ｍｇの上記工程４で得られたＬ−α−ジオレオイルホスファチジル（１４−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサ）テトラデカノール、１７２ｍｇのラクトース１水和物をＨ2Ｏ（２ｍＬ）、メタノール（１０ｍＬ）、ジクロロメタン（２ｍＬ）の混合液に溶解し、次いで０．４ｍＬの酢酸、８２ｍｇのシアノトリヒドロほう酸ナトリウムを加えて７０℃で終夜攪拌した。反応液を濃縮後、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法で目的物を抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、目的物（本発明誘導体）を２４８ｍｇ得た。【００７６】
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１２４７．０（［Ｍ+H］+）【００７７】
実施例３  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル−Ｎ−｛１４−（β−１−ラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシアセチル｝エタノールアミンの合成
工程１  １６，１６，１６−トリフェニル−３，６，９，１２,１５−ペンタオキサヘキサデカノールの合成
１０ｇのペンタエチレングリコールを１００ｍＬのアセトニトリルと３０ｍＬのピリジンとの混合液に溶解し、０℃にて１１ｇの塩化トリチルを加え、室温で終夜攪拌した。反応液を氷水にあけ、酢酸エチルで抽出し、有機層を水洗後乾燥し減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を６ｇ得た。
工程２  １６，１６，１６−トリフェニル−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘキサデコキシ酢酸  ベンジルエステルの合成
５．５ｇの上記工程１で得られた１６，１６，１６−トリフェニル−３，６，９，１２,１５−ペンタオキサヘキサデカノールを３０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶かし、この溶液を、２．３ｇの水素化ナトリウムを１００ｍＬのテトラヒドロフランに懸濁させた液に、０℃にて滴下した。室温で３０分攪拌後、再び０℃に冷却し、次いで、３．５ｇのブロモ酢酸を加えた。室温で２時間攪拌後、反応液を１０％硫酸水素カリウム水溶液にあけ、ジクロロメタンで抽出し、有機層を水洗後、乾燥し、減圧濃縮した。残渣に１．７ｍＬのベンジルアルコール、２．４ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１４４ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンを加え５０ｍＬのジクロロメタン中、室温で終夜攪拌した。反応液を飽和重曹水にあけ、酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を５．５ｇ得た。
工程３  １４−ヒドロキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシ酢酸  ベンジルエステルの合成
５．３ｇの上記工程２で得られた１６，１６，１６−トリフェニル−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘキサデコキシ酢酸  ベンジルエステルを８０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、４ｍＬのトリフルオロ酢酸を加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を飽和重曹水にあけ、酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を２ｇ得た。
工程４  １４−（β−１−ヘプタアセチルラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシ酢酸  ベンジルエステルの合成
１．７６ｇのβ−ラクト−ス  オクタアセタート、１．５ｇの上記工程３で得られた１４−ヒドロキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシ酢酸  ベンジルエステルを２０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０℃にて２．４ｍＬの三フッ化ほう素ジエチルエーテル錯体を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を飽和重曹水にあけ、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を１．１ｇ得た。
工程５  １４−（β−１−ラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシ酢酸の合成
１ｇの上記工程４で得られた１４−（β−１−ヘプタアセチルラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシ酢酸  ベンジルエステルを１８ｍＬのメタノールに溶解し、２ｍＬの２８％  ナトリウムメトキシド／メタノール溶液を加えて、室温で２時間攪拌した。反応液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＣ−５０で中和後、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を水−酢酸エチルで分液し、水層を凍結乾燥して目的物を３１０ｍｇ得た。
工程６  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル−Ｎ−｛１４−（β−１−ラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシアセチル｝エタノールアミンの合成
１５０ｍｇの上記工程５で得られた１４−（β−１−ラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシ酢酸、３６０ｍｇのＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１３９ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、３３ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを３ｍＬのジクロロメタン中で終夜攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物（本発明誘導体）を４４ｍｇ得た。【００７８】
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１２６９．２（［Ｍ+Na］+）
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１２９１．３（［Ｍ+２Na］+）
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１３４４．９（［Ｍ-H］-）【００７９】
実施例４  ２−O−［２−N−｛１４−（β−１−ラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシアセチル｝アミノエチル］カルバモイル−１，３−ジオレオイルグリセロールの合成
２２８ｍｇの実施例１・工程２で得られた２−Ｏ−（２−アミノエチル）カルバモイル−１，３−ジオレオイルグリセロール、１００ｍｇの実施例３・工程５で得られた１４−（β−１−ラクトシロキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデコキシ酢酸、４６ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、３３ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを３ｍＬのジクロロメタン中で終夜攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物（本発明誘導体）を６５ｍｇ得た。【００８０】
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１２３２．２（［Ｍ+Na］+）【００８１】
実施例５  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛１１−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９−トリオキサ｝ウンデカノールの合成
工程１  １１−｛（メチルスルホニル）オキシ｝−３，６，９−トリオキサウンデカノールの合成
２５ｇのテトラエチレングリコール、３２．８ｇの酸化銀に２５０ｍＬのジクロロメタンを加え、１７．７ｇのメタンスルホニルクロリドのジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）を滴下した。反応液を室温で２日間攪拌後、セライトでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を２４ｇ得た。
工程２  １１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカノールの合成
２３．５ｇの上記工程１で得られた１１−｛（メチルスルホニル）オキシ｝−３，６，９−トリオキサウンデカノールと８．４ｇのアジ化ナトリウムに１００ｍＬのジメチルホルムアミドを加え、１１０℃で３時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、トルエンで共沸した。残渣を酢酸エチルに懸濁し、不溶物をろ過して除き、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を１８．５ｇ得た。
工程３  １１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカノールの合成
３ｇの上記工程２で得られた１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカノールを３５ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、３．９５ｍｇのトリフェニルホスフィンを加え、室温で１８時間攪拌した後、水１０ｍＬを加え、更に終夜攪拌した。反応液をトルエンと水で分液し、水層を凍結乾燥して目的物を２．４ｇ得た。
工程４  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル（１１−アミノ−３，６，９−トリオキサ）ウンデカノールの合成
１ｇのＬ−α−ジオレオイルホスファチジルコリン、１．５ｇの上記工程３で得られた１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカノールに２５ｍＬのジクロロメタン、３．５ｍＬの酢酸ナトリウム（１００ｍＭ）−塩化カルシウム（５０ｍＭ）緩衝液（ｐＨ６．５）、５００ＵのホスホリパーゼＤを加え、３０℃で終夜攪拌した。ジクロロメタン層を濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を１．１２ｇ得た。
工程５  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛１１−N−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９−トリオキサ｝ウンデカノールの合成
６００ｍｇの上記工程４で得られたＬ−α−ジオレオイルホスファチジル（１１−アミノ−３，６，９−トリオキサ）ウンデカノール、２４７ｍｇのラクトース１水和物をＨ2Ｏ（１ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）、ジクロロメタン（１ｍＬ）の混合液に溶解し、次いで０．６ｍＬの酢酸、８６ｍｇのシアノトリヒドロほう酸ナトリウムを加え、７０℃で終夜攪拌した。反応液を濃縮後、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法で目的物を抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物（本発明誘導体）を４２３ｍｇ得た。【００８２】
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１２００．９（［Ｍ-Ｈ］-）【００８３】
実施例６  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛２９−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサ｝ノナコサノールの合成
工程１  １１−アジド−１−｛（メチルスルホニル）オキシ｝−３，６，９−トリオキサウンデカンの合成
１３．５ｇの実施例５・工程２で得られた１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカノールと１２．５ｇのトリエチルアミンを２００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０℃にて９．２ｇのメタンスルホニルクロリドを滴下後、室温で１時間攪拌した。その後、反応液を減圧濃縮し、酢酸エチル／へキサン（１／１）を加えて不溶物をろ過して除き、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を１５．３ｇ得た。
工程２  １９，１９，１９−トリフェニル−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサノナデカノールの合成
２５ｇのヘキサエチレングリコールを１００ｍＬのアセトニトリルと３０ｍＬのピリジンとの混合液に溶解し、０℃にて１２．５ｇの塩化トリチルを加え、室温で終夜攪拌した。反応液を氷水にあけ、酢酸エチルで抽出し、有機層を水洗後乾燥し減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を１５．７ｇ得た。
工程３  １−アジド−３１，３１，３１−トリフェニル−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサヘントリアコンタノールの合成
１５ｇの上記工程２で得られた１９，１９，１９−トリフェニル−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサノナデカノールを１００ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解させた。かかる溶液を、１．３ｇの水素化ナトリウムを５０ｍＬのジメチルホルムアミドに懸濁させた液に、０℃にて滴下した。室温で１時間攪拌後、再び０℃に冷却し、次いで、７ｇの上記工程１で得られた１１−アジド−１−｛（メチルスルホニル）オキシ｝−３，６，９−トリオキサウンデカンを５０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解させた溶液を滴下し、１１０℃で２時間攪拌した。反応液を氷水にあけ、酢酸エチルで抽出し、有機層を水洗後乾燥し減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を１０．５ｇ得た。
工程４  ２９−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサノナコサノールの合成
１０．３ｇの上記工程３で得られた１−アジド−３１，３１，３１−トリフェニル−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサヘントリアコンタノールをベンゼンスルホン酸のメタノール溶液（０．３８Ｍ）４１ｍＬに溶解し、室温で１０分攪拌後、水５０ｍＬを加え、メタノールを減圧濃縮した。残渣をペンタンで洗浄し、水層を凍結乾燥した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を６．７ｇ得た。
工程５  ２９−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサノナコサノールの合成
６．５ｇの上記工程４で得られた２９−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサノナコサノールを６０ｍＬのメタノールに溶解し、１ｇの１０％パラジウム／炭素存在下、６時間水素添加した。反応液をろ過し、ろ液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を４．７ｇ得た。
工程６  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル（２９−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサ）ノナコサノールの合成
１ｇのＬ−α−ジオレオイルホスファチジルコリン、３．６ｇの上記工程５で得られた２９−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサノナコサノールに２５ｍＬのジクロロメタン、３．５ｍＬの酢酸ナトリウム（１００ｍＭ）−塩化カルシウム（５０ｍＭ）緩衝液（ｐＨ６．５）、５００ＵのホスホリパーゼＤを加え、３０℃で終夜攪拌した。ジクロロメタン層を濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を６６０ｍｇ得た。
工程７  Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジル｛２９−N−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサ｝ノナコサノールの合成
５００ｍｇの上記工程６で得られたＬ−α−ジオレオイルホスファチジル（２９−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサ）ノナコサノール、１５８ｍｇのラクトース１水和物をＨ2Ｏ（１ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）、ジクロロメタン（１ｍＬ）の混合液に溶解し、次いで０．６ｍＬの酢酸、５５ｍｇのシアノトリヒドロほう酸ナトリウムを加え、７０℃で終夜攪拌した。反応液を濃縮後、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法で目的物を抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物（本発明誘導体）を３２０ｍｇ得た。【００８４】
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１４６５．０（［Ｍ-Ｈ］-）【００８５】
実施例７  ２−Ｏ−［２−｛Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）−Ｎ−エチル｝アミノエチル］カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールの合成
３００ｍｇの実施例１で得られた２−Ｏ−｛２−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノエチル｝カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、３９ｍｇのアセトアルデヒドをメタノール（１４ｍＬ）、ジクロロメタン（７ｍＬ）の混合液に溶解し、次いで１ｍＬの酢酸、１０９ｍｇのシアノトリヒドロほう酸ナトリウムを加えて５０℃で終夜攪拌した。反応液を濃縮後、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法で目的物を抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物（本発明誘導体）を２００ｍｇ得た。【００８６】
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１０６２．０（［Ｍ+Ｈ］+）【００８７】
実施例８  ２−Ｏ−｛１１−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９−トリオキサウンデシル｝カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールの合成
工程１  １，１１−ジ｛（メチルスルホニル）オキシ｝−３，６，９−トリオキサウンデカンの合成
１５ｇのテトラエチレングリコール、２３．４ｇのトリエチルアミンを２００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、０℃にて２２．１ｇのメタンスルホニルクロリドを滴下し、１時間攪拌した。反応液をろ過して不溶物を除き、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル-水で分液し、有機層を水洗後乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を２７ｇ得た。
工程２  １，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカンの合成
２３ｇの上記工程１で得られた１，１１−ジ｛（メチルスルホニル）オキシ｝−３，６，９−トリオキサウンデカンと１２．８ｇのアジ化ナトリウムを３００ｍＬのジメチルホルムアミド中、１１０℃で２時間攪拌後、反応液を氷水にあけ、酢酸エチルで抽出し、有機層を水洗後乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を１３．８ｇ得た。
工程３  １，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカンの合成
１３．５ｇの上記工程２で得られた１，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカンを３５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、３１．９ｇのトリフェニルホスフィンを加え室温で終夜攪拌した後、水５０ｍＬを加え、更に終夜攪拌した。反応液をトルエンと水で分液し、水層を凍結乾燥して目的物を１０．４ｇ得た。
工程４  １１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３，６，９−トリオキサウンデシルアミンの合成
３ｇの上記工程３で得られた１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカンをテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解し、氷冷下、二炭酸ジ−ｔ−ブチル（１．１４ｇ）のテトラヒドロフラン溶液（５ｍＬ）を滴下した。滴下後室温で終夜攪拌し、反応液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和食塩水で洗浄、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を１ｇ得た。
工程５  ２−Ｏ−（１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデシル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールの合成
実施例１の工程２において、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−１，２−エチレンジアミンの代わりに６５０ｍｇの上記工程４で得られた１１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３，６，９−トリオキサウンデシルアミンを用い、目的物を８００ｍｇ得た。
工程６  ２−Ｏ−｛１１−Ｎ−（１−デオキシラクチト−１−イル）アミノ−３，６，９−トリオキサウンデシル｝カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールの合成
７００ｍｇの上記工程５で得られた２−Ｏ−（１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデシル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、３００ｍｇのラクトース１水和物をＨ2Ｏ（１ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）、ジクロロメタン（１ｍＬ）の混合液に溶解し、次いで０．８ｍＬの酢酸、１５７ｍｇのシアノトリヒドロほう酸ナトリウムを加え、７０℃で終夜攪拌した。反応液を濃縮後、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法で目的物を抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物（本発明誘導体）を５０８ｍｇ得た。【００８８】
ESI-Mass（ｍ/ｚ）＝１１６５．９（［Ｍ+Ｈ］+）【００８９】
実施例９  本発明担体の分散液の調製（１）
３．７５ｍｇの２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、１．２５ｍｇの実施例２に係る本発明誘導体及び５ｍｇの卵黄レシチンをバイアル中で０．５ｍＬのクロロホルムに溶解し、これに窒素ガスを吹きつけてクロロホルムを除去し、バイアルの壁面に薄膜を形成させた。これを更に減圧下で一晩放置した後、１．９９５ｍＬの１０％マルトース及び５μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を剥がした。４℃で３時間放置した後、マイクロプローブを用いて、１分間超音波処理を行い、５ｍｇ／ｍＬの本発明担体の分散液を調製した。【００９０】
実施例１０  本発明担体の分散液の調製（２）
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを３．７５ｍｇ、実施例２に係る本発明誘導体を２．５ｍｇ及び卵黄レシチンを３．７５ｍｇ用い、実施例９と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００９１】
実施例１１  本発明担体の分散液の調製（３）
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを３．７５ｍｇ、実施例２に係る本発明誘導体を３．７５ｍｇ及び卵黄レシチンを２．５ｍｇ用い、実施例９と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００９２】
実施例１２  本発明担体の分散液の調製（４）
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを３．７５ｍｇ、実施例２に係る本発明誘導体を５ｍｇ及び卵黄レシチンを１．２５ｍｇ用い、実施例９と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００９３】
実施例１３  本発明担体の分散液の調製（５）
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを３．７５ｍｇ及び実施例２に係る本発明誘導体を６．２５ｍｇ用い、実施例９と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００９４】
実施例１４  本発明担体の分散液の調製（６）
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを３．７５ｍｇ、参考例１に係る化合物を３．７５ｍｇ及び卵黄レシチンを２．５ｍｇ用い、実施例９と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００９５】
実施例１５  本発明担体の分散液の調製（７）
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを３．７５ｍｇ、参考例１に係る化合物を６．２５ｍｇ用い、実施例９と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００９６】
比較例１  比較対照用担体の分散液の調製
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを３．７５ｍｇ及び卵黄レシチンを６．２５ｍｇ用い、実施例９と同様に比較対照用担体の分散液を調製した。【００９７】
試験例１
（１）組成物の調製
１μｇのルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドに５０μＬの１０％マルトースを添加し、２０μｇ／ｍＬの濃度で上記プラスミドを含む溶液を５０μＬ調製した。また、６μＬの実施例９〜１３又は比較例１に係る担体の分散液に、４４μＬの１０％マルトースを添加し、６００μｇ／ｍＬの担体希釈液を５０μＬ調製した。
５０μＬの担体希釈液に対して、５０μＬの上記核酸溶液を添加し、軽く混合した。その後、１５分間室温で放置し、１０μｇ／ｍＬの濃度で上記プラスミドを含む組成物を１００μＬ調製した。
（２）実験方法
９６ウェルプレートに、ヒト肝細胞癌由来の細胞株であるＨｕＨ−７細胞を１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１８時間培養した。その後、1ウェルにつき、上記（１）で調製した実施例９〜１３又は比較例１に係るいずれかの担体を含む組成物を１０μＬ添加し、更に培養を続けた。組成物添加から２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の測定は、Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用い、トップカウント（パッカード社製）により生物発光を検出することにより行った。なお、比較例１に係る担体を含む組成物を添加した細胞を比較対照とした。
（３）試験結果
その結果、図１に示すように、実施例２に係る本発明誘導体を含有する本発明組成物を用いた場合、当該組成物に含有されているルシフェラーゼ遺伝子の発現効率は、比較対照に比べて、当該誘導体の濃度依存的に増加していることが判った。【００９８】
試験例２
（１）組成物の調製
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（キアゲン社製、Ｃａｔ＃１０２２５６３、以下同じ。）を注射用水に溶解させ、２０μＭの濃度で当該ｓｉＲＮＡを含む溶液（以下、「核酸原液」という）を調製した。５μＬの上記核酸原液に４５μLの１０％マルトースを添加し、２μＭの濃度で上記ｓｉＲＮＡを含む溶液（以下、「核酸希釈液」という）を５０μL調製した。また、４．５μＬの実施例１３、１４又は比較例１に係る担体の分散液に、４５．５μＬの１０％マルトースを添加し、４５０μｇ／ｍＬの担体希釈液を５０μＬ調製した。５０μＬの担体希釈液に対して、５０μＬの上記核酸希釈液を添加し、軽く混合した。その後、１５分間室温で放置し、1μＭの濃度で上記ｓｉＲＮＡを含む組成物を１００μＬ調製した。
（２）実験方法
６ウェルプレートにＨｕＨ−７細胞を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１８時間培養した。その後、１ウェルにつき、上記（１）で調製した実施例１３、１４又は比較例１に係るいずれかの担体を含む組成物を、ｓｉＲＮＡの終濃度が１００ｎＭになるように添加し、更に培養を続けた。組成物添加から２４時間後に、細胞を２ｍＬのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）（以下、「ＰＢＳ」という）で２度洗浄し、５００μＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（シグマ社製）で細胞を剥がし、エッペンドルフチューブに回収した。３０００ｒｐｍで3分間遠心した後、上清を除き、１ｍＬのＰＢＳで細胞を再懸濁させた。更に、３０００ｒｐｍで３分間遠心した後、上清を除き、０．５ｍＬのＰＢＳで細胞を再懸濁させた。これらの細胞についてＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂａｒ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて、細胞毎の蛍光強度を測定した。なお、比較例１に係る担体を含む組成物を添加した細胞を比較対照とし、無処理の細胞を陰性対照とした。
（３）試験結果
実施例１３に係る本発明担体を含む本発明組成物の結果を図２に、また、実施例１４に係る本発明担体を含む本発明組成物の結果を図３に示す。これらの結果から、実施例１３及び１４に係る本発明担体を含む両組成物は、肝細胞への指向性を有することが判った。【００９９】
試験例３
（１）オリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液の調製
配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡを、それぞれの濃度が１００μＭになるように注射用水に溶解し、その後、それぞれ２０μＬを試験管中で混合した。これに６０μＬの注射用水を添加することにより、２０μＭの濃度でそれぞれのオリゴＲＮＡを含む溶液（以下、「核酸溶液」という）を調製した。なお、上記２つのオリゴＲＮＡの合成は、日本バイオサービスに依頼した。
（２）組成物の調製
実施例１５又は比較例１に係る担体の分散液と、核酸原液として、上記（１）で調製した核酸溶液を用い、試験例２・（１）と同様に、１μＭの濃度でそれぞれのオリゴＲＮＡを含む組成物を１００μＬ調製した。
（３）使用細胞株
下記（４）では、ＨｕＨ−７細胞を用いた、ＨＣＶのレプリコン保持細胞を用いた。かかる細胞には、ＨＣＶのゲノム構造蛋白質コード領域にネオマイシン耐性遺伝子をコードした、ＨＣＶのレプリコンＲＮＡが導入させている。かかる細胞内では、レプリコンの自律複製がなされるため、ネオマイシン耐性遺伝子の産物であるＮＰＴＩＩが発現する。かかる細胞の詳細については、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０００年、２９３巻、ｐ．９９３−９９９）を参照されたい。なお、評価時の培地としては、ＤＭＥＭ培地（シグマ社製）に１０％のＦＢＳ（バイオウエスト社製）を含有する培地を用いた。評価時以外は、上記培地に、更に４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロジェン社製）を含有する培地を用いた。
（４）実験方法
１２ウェルプレートに細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。翌日、培養プレートから培地を吸引し、０．９ｍｌの培地を加えて培地交換を行った。その後、１ウェルにつき、上記（２）で調製した実施例１５又は比較例１に係る担体を含む組成物を、任意の最終濃度になるように、０．1ｍｌ添加した。当該組成物を添加後、ＣＯ２インキュベーター内にて９６時間培養した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞を回収し、タンパク質を抽出した。
抽出したタンパク質中のＮＰＴＩＩの濃度を、ＰａｔｈｏＳｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＮＰＴＩＩ（アグディア社製）により測定した。なお、タンパク質の抽出にはキットに付属の抽出緩衝液を用いた。また、抽出したタンパク質中の総タンパク質の濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ピアス社製）により測定した。なお、比較例１に係る担体を含む組成物を添加した細胞を比較対照とし、上記（２）で調製した組成物の代わりに１０％マルトースを添加した細胞を陰性対照とした。
（５）評価方法
評価は、陰性対照を加えたときの単位タンパク質量中のＮＰＴＩＩ量を１００％として、ＮＰＴＩＩ発現率を比較することにより行った。ＮＰＴＩＩ発現率が低いほど、レプリコンの複製が抑制されていることを示している。
（６）試験結果
その結果、図４に示すように、実施例１５に係る本発明担体を含む本発明組成物を用いた場合、比較対照よりも強く、レプリコンの複製を抑制していることが判った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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