(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アゴニストのスクリーニング方法であって、
レセプターを発現し、そしてランダム化したアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する酵母を得る工程；および
発現した該アゴニスト候補物質が該レセプターに結合している酵母を検出する工程；
を含み、
該酵母が、該検出の感度を上昇させるように改変されている、方法。
【請求項２】
前記改変が、前記アゴニスト候補物質の発現量の最適化である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レセプターにおける細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が酵母に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記レセプターが、Ｇタンパク質共役型レセプターであり、該レセプターのアゴニスト結合部位が細胞膜外側に保持され、そして該レセプターが、前記酵母の細胞質内のＧタンパク質と相互作用してシグナル伝達を引き起こす、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記検出が、レポータータンパク質の発現に基づいて行われ、そして前記改変が、該レポータータンパク質の発現量の増加である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記レポータータンパク質をコードする遺伝子が、マルチコピープラスミドによってまたはゲノム上への多コピーインサートの挿入によって前記酵母に組み込まれている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞内レセプター共役タンパク質がＧｐａ１タンパク質であり、そして前記改変が、ＳＳＴ２遺伝子、ＦＡＲ１遺伝子、またはＢＡＲ１遺伝子の破壊または欠損である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記レセプターにおける細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が哺乳類に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記レセプターが、細胞内で発現される第１のマーカータンパク質をさらに有し；前記酵母が、該第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質と、哺乳類のＧタンパク質との、融合タンパク質を細胞内に発現し；そして、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質との相互作用が検出可能である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１および第２のマーカータンパク質の組み合わせが、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質の組み合わせ、あるいはβ−ガラクトシダーゼΔαおよびβ−ガラクトシダーゼΔωの組み合わせである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
酵母Ａｇａ１遺伝子または酵母Ｆｉｇ１遺伝子の３’−末端側にＥＧＦＰ遺伝子が融合されている、α−因子応答性レポーター遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レセプター結合性物質、すなわち、アゴニストおよび細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レセプターは、そのほとんどが細胞膜に存在し、外部の刺激を認識して情報を伝達するための構造を有している。言い換えれば、レセプターは、ホルモン、神経伝達物質などの細胞外に存在する物質または物理的もしくは化学的刺激が、何らかの細胞応答を引き起こす場合の、その物質または刺激を特異的に認識するシグナル伝達の入口である。レセプターに結合して細胞応答を引き起こす物質をアゴニストといい、アゴニストまたは刺激がレセプターに作用し、タンパク質間相互作用を介して直接的または第二メッセンジャーを介して間接的に細胞応答を引き起こす。
レセプターとしては、代表的には、以下のような種類が知られている：（１）三量体Ｇタンパク質共役型（７回膜貫通型）：Ｎ末端を細胞外にＣ末端を細胞内に向けて７個の疎水性部が細胞膜を貫通する構造をとり、アセチルコリン、ノルアドレナリンなどの化学物質、光（ロドプシン）などを認識して、Ｇタンパク質を活性化し、種々のエフェクター分子にシグナルを伝達する；（２）レセプター型キナーゼ：１回膜を貫通し、細胞質内のＣ末端側がプロテインキナーゼ活性を有し、アゴニストによって酵素が活性化され、標的タンパク質をリン酸化することによってシグナルを伝達する；（３）サイトカインレセプター型：１回膜を貫通するが、細胞質内Ｃ末端が短く、特定の機能を持たず、共役する他のタンパク質を活性化してシグナルを伝達する；（４）イオンチャンネル型：アゴニストや刺激により、内在するイオンチャンネルの透過性が変化してシグナルを伝達するもので、膜を４回通過するＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター、１回貫通するイノシトール１，４，５−トリスリン酸レセプターなどがある；および（５）脂溶性ホルモンレセプター：細胞質内や核内の可溶性のタンパク質レセプターであり、細胞膜を通過したアゴニストが結合して、転写を活性化する。
なかでも、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）は、生体の基礎的機能において重要であり、ｃＤＮＡクローニングされているものだけでも数百種類が知られており、千種類以上存在すると予想されている。このような生体機能に重要と思われるレセプターに対するアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングすることは、創薬における第１段階であり、そのための方法が、いくつか報告されている（特表２００２−５４１４３９号公報、特表平１１−５０７５１８号公報、特表２００１−５１９１５７号公報、および特表平８−５１０１１５号公報参照）。例えば、特表２００１−５１９１５７号公報では、異種性ＧＰＣＲを発現する組換え酵母細胞にスクリーニングすべき物質を外的に添加することによって、あるいは該酵母細胞自体がスクリーニングすべき物質を発現して分泌することによって、レセプター結合性物質をスクリーニングしている。
【発明の開示】
【０００３】
より低濃度のアゴニスト候補物質、またはアゴニスト活性の低い化合物やペプチドを検出できるようになれば、より多種類のアゴニスト候補物質が得られる。そこで、本発明は、より感度の高いアゴニスト検出系を提供することを目的とする。
本発明は、アゴニストのスクリーニング方法を提供し、該方法は、
レセプターを発現し、そしてランダム化したアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する酵母を得る工程；および
発現した該アゴニスト候補物質が該レセプターに結合している酵母を検出する工程；
を含み、
該酵母が、該検出の感度を上昇させるように改変されている。
１つの実施態様では、上記改変は、上記アゴニスト候補物質の発現量の最適化である。
さらなる実施態様では、上記レセプターにおける細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位は酵母に由来する。
好適な実施態様では、上記レセプターは、Ｇタンパク質共役型レセプターであり、該レセプターのアゴニスト結合部位が細胞膜外側に保持され、そして該レセプターは、上記酵母の細胞質内のＧタンパク質と相互作用してシグナル伝達を引き起こす。
より好適な実施態様では、上記検出は、レポータータンパク質の発現に基づいて行われ、そして上記改変は、該レポータータンパク質の発現量の増加である。
他の好適な実施態様では、上記レポータータンパク質をコードする遺伝子は、マルチコピープラスミドによってまたはゲノム上への多コピーインサートの挿入によって前記酵母に組み込まれている。
さらに好適な実施態様では、上記細胞内レセプター共役タンパク質はＧｐａ１タンパク質であり、そして上記改変は、ＳＳＴ２遺伝子、ＦＡＲ１遺伝子、またはＢＡＲ１遺伝子の破壊または欠損である。
１つの実施態様では、上記レセプターにおける細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位は哺乳類に由来する。
好適な実施態様では、上記レセプターは、細胞内で発現される第１のマーカータンパク質をさらに有し；上記酵母は、該第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質と、哺乳類のＧタンパク質との、融合タンパク質を細胞内に発現し；そして、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質との相互作用が検出可能である。
より好適な実施態様では、上記第１および第２のマーカータンパク質の組み合わせは、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質の組み合わせ、あるいはβ−ガラクトシダーゼΔαおよびβ−ガラクトシダーゼΔωの組み合わせである。
本発明はまた、アゴニストの他のスクリーニング方法を提供し、該方法は、
レセプターを発現している酵母を、アゴニスト候補物質とともに培地中で７２時間以内の範囲で培養する工程；および
該アゴニスト候補物質が結合した酵母を検出する工程；
を含む。
１つの実施態様では、上記培地中の前記アゴニスト候補物質の濃度は最適化されている。
ある実施態様では、上記レセプターにおける細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位は酵母に由来する。
好適な実施態様では、上記レセプターは、Ｇタンパク質共役型レセプターであり、該レセプターのアゴニスト結合部位が細胞膜外側に保持され、そして該レセプターは、上記酵母の細胞質内のＧタンパク質と相互作用してシグナル伝達を引き起こす。
より好適な実施態様では、上記検出は、レポータータンパク質の発現に基づいて行われ、そして上記酵母は、該レポータータンパク質の発現量を増加させるように改変されている。
他の好適な実施態様では、上記レポータータンパク質をコードする遺伝子は、マルチコピープラスミドによってまたはゲノム上への多コピーインサートの挿入によって上記酵母に組み込まれている。
より好適な実施態様では、上記細胞内レセプター共役タンパク質はＧｐａ１タンパク質であり、そしてＳＳＴ２遺伝子、ＦＡＲ１遺伝子、またはＢＡＲ１遺伝子が破壊または欠損されている。
１つの実施態様では、上記レセプターにおける細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位は哺乳類に由来する。
好適な実施態様では、上記レセプターは、細胞内で発現される第１のマーカータンパク質をさらに有し；上記酵母は、該第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質と、哺乳類のＧタンパク質との、融合タンパク質を細胞内に発現し；そして、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質との相互作用が検出可能である。
より好適な実施態様では、上記第１および第２のマーカータンパク質の組み合わせは、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質の組み合わせ、あるいはβ−ガラクトシダーゼΔαおよびβ−ガラクトシダーゼΔωの組み合わせである。
本発明はさらに、細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法を提供し、該方法は、
ランダム化した哺乳類ｃＤＮＡライブラリー由来の細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を細胞内に発現し、そしてアゴニスト結合部位を細胞膜外側に保持しかつ細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位を細胞膜内側に保持するレセプターを細胞膜に発現する酵母を得る工程；
該酵母を含む培地中にアゴニストを予め最適化された濃度で添加して７２時間以内の範囲で培養する工程；および
該アゴニストと該レセプターとの結合によって該レセプターと該細胞内レセプター共役タンパク質との相互作用が生じた酵母を検出する工程；
を含む。
本発明の第１の局面のアゴニストのスクリーニング方法においては、対象となるレセプターと同一細胞の表層上に発現したアゴニスト候補物質のみが該レセプターに結合するため、ランダム化したアゴニスト候補物質を導入した組換え酵母を構築して培養するのみで、スクリーニングが可能である。また、アゴニスト候補物質とレセプターとが細胞内で１対１対応しているため、１細胞ずつに分けてアッセイを行う必要がなく、その同定が確実であるという利点がある。さらに、アゴニスト候補物質の発現量および／またはレポータータンパク質の発現量が最適化され得るので、検出感度も良好である。
本発明の第２の局面のアゴニストのスクリーニング方法によれば、アゴニスト候補物質の添加後の培養時間を適切に設定することによって、より高感度な検出が可能である。また、添加すべきアゴニスト候補物質の濃度を最適化することによって、さらに高感度な検出が可能である。
本発明の第３の局面の細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法の場合も、最適濃度のアゴニストを添加し、そして培養時間を適切に設定することによって、高感度な検出が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、アゴニストおよび細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法のメカニズムを示す模式図である。
図２は、酵母におけるＧｐａ１タンパク質周辺のシグナル伝達を示す模式図である。
図３は、ＢＹ４７４１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ株におけるα−因子添加後の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
図４は、ＢＹ４７４１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ株におけるα−因子添加後の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
図５は、種々のＢＡＲ１またはＦＡＲ１遺伝子破壊株におけるα−因子添加後の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
図６は、種々のＳＳＴ２遺伝子破壊株におけるα−因子添加後の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
図７は、種々のα−因子細胞表層提示株における蛍光検出結果を示すグラフである。
図８は、種々のα−因子細胞表層提示株における蛍光検出結果を示す微分干渉顕微鏡写真（Ａ）および蛍光顕微鏡写真（Ｂ）である。
図９は、マルチコピー型プラスミドによって形質転換した種々の酵母株における、α−因子添加後の蛍光検出結果を示すグラフである。
図１０は、マルチコピー型プラスミドによって形質転換した種々の酵母株における、α−因子添加後の蛍光検出結果を示す微分干渉顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真である。
図１１は、マルチコピー型プラスミドによって形質転換した種々のα−因子細胞表層提示株における蛍光検出結果を示すグラフである。
図１２は、種々のレポーター候補タンパク質遺伝子座にＥＧＦＰ遺伝子を組み込んだ種々のＢＹ４７４１株におけるα−因子添加後の蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の第１の局面では、アゴニストのスクリーニング方法が提供され、この方法は、レセプターを発現し、そしてランダム化したアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する酵母を得る工程；および発現した該アゴニスト候補物質が該レセプターに結合している酵母を検出する工程；を含む。この局面で用いられる酵母は、検出の感度を上昇させるように改変されている。
まず、本発明において、アゴニスト候補物質がレセプターに結合している酵母を検出するためのメカニズムを説明する。酵母において発現しているレセプターのアゴニスト結合部位にアゴニストまたはアゴニスト候補物質が結合すると、レセプターの細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位と、細胞内レセプター共役タンパク質とが（例えば、リン酸化などを介して）相互作用する。この相互作用によってシグナル伝達が行われる場合もある。本発明においては、この相互作用またはシグナル伝達の発生を検出する。
ここで「細胞内レセプター共役タンパク質」とは、アゴニストが結合しているレセプターと相互作用するタンパク質をいい、特に、細胞内へのシグナル伝達または増幅の役割を果たすタンパク質をいう。細胞内レセプター共役タンパク質も、レセプター結合性物質の一種であり得る。代表的には、Ｇタンパク質が挙げられる。ここで、相互作用とは、結合、会合、コンホメーション変化などが挙げられる。
本発明において、細胞内レセプター共役タンパク質として、（Ａ）酵母由来のタンパク質を用いる場合、および（Ｂ）哺乳類由来のタンパク質を用いる場合があり得る（図１を参照のこと）。
（Ａ）細胞内レセプター共役タンパク質として酵母由来のタンパク質を用いる場合、対象とされるレセプターの少なくとも細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位は、酵母で作動可能であればその由来は特に限定されないが、酵母由来であることが好ましい。そのため、新薬開発の点で、アゴニストのスクリーニングの対象とされるレセプターは、酵母内で作動し得る哺乳類のレセプターか、あるいはアゴニスト結合部位が哺乳類由来であり、かつ細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が酵母由来であるキメラレセプターが好ましい。以下、キメラレセプターを用いる場合についてより詳細に説明する。
細胞内レセプター共役タンパク質がＧタンパク質である場合を例に挙げて、具体的に説明する。図１の（Ａ）および図２に示すように、Ｇタンパク質は、通常３量体の形態で存在しており、Ｓｔｅ２という酵母のＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）に対しては、Ｇｐａ１、Ｓｔｅ４、およびＳｔｅ１８という３つのサブユニットが会合しているＧタンパク質が共役する。酵母ＧＰＣＲのＳｔｅ２にアゴニストが結合すると、Ｇｐａ１がＳｔｅ２の細胞質内部位と相互作用（結合）し、三量体Ｇタンパク質は活性化する。二量体Ｇタンパク質が活性化されると、Ｇｐａ１とＳｔｅ４・Ｓｔｅ１８複合体とに解離し、Ｓｔｅ４・Ｓｔｅ１８複合体（特にＳｔｅ４）が、次のＭＡＰキナーゼカスケード（ＭＡＰＫカスケード）を活性化する。ＭＡＰＫカスケードが活性化されると、Ｓｔｅ１２という転写因子を活性化し、最終的に細胞応答に関与するレポータータンパク質の発現が引き起こされる。このようなタンパク質として、Ｆｕｓ１、Ａｇａ１などが知られている（ＭａｃＫａｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ，ａｐｐｅａｒｅｄ  ｏｎ  Ｍａｙ  １，２００４，ａｃｃｅｐｔｅｄ  ｏｎ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ６，２００４）。
例えば、ＦＵＳ１遺伝子の３’末端側に続いて強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子を組込むと、Ｆｕｓ１タンパク質の発現と同時にＥＧＦＰも発現し得る。したがって、その蛍光を発する酵母を、例えばフローサイトメトリーにより蛍光を検出し、ソーティングすることによって、シグナル伝達が行われている酵母をスクリーニングすることができる。そこで、哺乳類由来のレセプターを酵母で発現させる場合は、細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位を酵母由来のものに改変すれば、酵母内でシグナル伝達が行われ得る。
（Ｂ）細胞内レセプター共役タンパク質として哺乳類由来のタンパク質を用いる場合は、対象とされるレセプターは、哺乳類由来レセプターが用いられる。この場合、シグナル伝達を確認するために、レセプターは、好ましくは、第１のマーカータンパク質が細胞内で発現するように融合されているキメラレセプターであり、そして細胞内レセプター共役タンパク質は、この第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質との融合タンパク質である（図１の（Ｂ１）および（Ｂ２）のＸに相当）。キメラレセプターとアゴニストとの結合により、このキメラレセプターと細胞内レセプター共役タンパク質とが相互作用する。そのため、第１のマーカータンパク質と第２のマーカータンパク質とが接近するので、これらのマーカータンパク質の蛍光変化などによって検出可能である。
例えば、図１の（Ｂ１）に示すように、第１および第２のマーカータンパク質として、それぞれＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）とＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）とを利用する方法が挙げられる。例えば、ＹＦＰを細胞内レセプター共役タンパク質と融合させた場合、レセプターにはＣＦＰを付加する。アゴニストがレセプターに結合すると、細胞内レセプター共役タンパク質がレセプターと相互作用するので、細胞内レセプター共役タンパク質と融合しているＹＦＰが、レセプターに融合されているＣＦＰに接近する。このとき、ＣＦＰの蛍光波長がＹＦＰの励起波長として作用するため、蛍光の変化が生じ、この変化を検出することができる。ＣＦＰを細胞内レセプター共役タンパク質と融合させ、レセプターにＹＦＰを付加してもよい。
あるいは、図１の（Ｂ２）に示すように、第１および第２のマーカータンパク質として、β−ガラクトシダーゼのΔω（Ｃ末端欠損変異体）とΔα（Ｎ末端欠損変異体）とを利用する方法も挙げられる。例えば、細胞内レセプター共役タンパク質とβ−ガラクトシダーゼΔωとを融合させた場合、レセプターにβ−ガラクトシダーゼΔαを付加させる。アゴニストがレセプターに結合することにより、細胞内レセプター共役タンパク質がレセプターと相互作用すると、ΔωとΔαとの間で会合が生じ、β−ガラクトシダーゼとして機能し得るようになる（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７４巻，２５００−２５０４頁，２００２年）。そこに、当該分野で通常用いられる発色系または発光系の反応試薬を添加することによって、シグナル伝達が行われた酵母を検出することができる。
本発明において「レセプター」とは、上記のように、細胞表面に存在し、細胞外環境と相互作用して、その環境に関する情報を細胞内に伝達または変換する分子をいう。言い換えれば、ホルモン、神経伝達物質などの細胞外の物質や物理的または化学的刺激を特異的に認識し、タンパク質間相互作用を介して直接的または第二メッセンジャーを介して間接的に細胞応答を引き起こす機能を有する分子をいう。本発明においては、好ましくはＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）が対象とされ得る。また、レセプターは、哺乳類由来ＧＰＣＲが好ましく、特に、新薬開発の観点から、ヒト由来ＧＰＣＲであることが最も好ましい。ヒト由来ＧＰＣＲは、上述のようにｃＤＮＡクローニングされているものだけでも数百種類が知られており、本発明においては、これらを酵母で発現させて、アゴニスト／細胞内レセプター共役タンパク質がスクリーニングされ得る。
「キメラレセプター」は、少なくとも２つの別個のポリペプチドが融合しているレセプターをいう。例えば、レセプターの一部が置換されているレセプター、あるいは別のタンパク質が付加しているレセプターが挙げられる。前者の例としては、哺乳類由来のレセプターにおいて、細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が酵母由来となるように置換されているキメラレセプターが好ましい。より具体的には、レセプターのアゴニスト結合部位が哺乳類由来、より好ましくはヒト由来であり、そして細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が酵母由来であるキメラレセプターが好ましい。後者の例としては、シグナル伝達が行われた場合に細胞内で細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用して、検出可能なシグナルを発生し得る第１のマーカータンパク質がレセプターに付加されているキメラレセプターが好ましい。具体的には、哺乳類由来のレセプターとＣＦＰとを含み、該ＣＦＰ部分が細胞内で発現されるキメラレセプター；哺乳類由来のレセプターとβ−ガラクトシダーゼΔαとを含み、該Δα部分が細胞膜内側に保持されるキメラレセプターなどが挙げられる。
「アゴニスト」とは、機能的タンパク質（例えば、レセプター）に特異的に結合する物質（「レセプター結合性物質」ともいう）のうち、結合によって細胞応答を引き起こす物質をいう。例えば、上記酵母由来ＧＰＣＲに対するアゴニストは、α−因子である。アゴニストになり得る物質としては、一般的には、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子などが挙げられるが、本発明においては、ペプチドが好ましい。アゴニストをスクリーニングする場合、「アゴニスト候補物質」とは、コンビナトリアルバイオエンジニアリングによって産生されたランダムなペプチドライブラリーに含まれるペプチドをいう。なお、本明細書において、アゴニストおよびアゴニスト候補物質を「リガンド」という場合もある。
「ランダム化したアゴニスト候補物質」は、組換えＤＮＡのアゴニスト部分をコードするＤＮＡを、コンビナトリアル（バイオエンジニアリング）ＰＣＲを用いて、目的部分をランダム化することによって得られ得る。すなわち、種々のランダムに改変された候補物質をいう。細胞表層に提示されるランダム化した候補物質は、同一酵母において一種であってもよくあるいは複数種であってもよい。
ペプチドライブラリーとしては、完全にランダム化された一本鎖のペプチドだけでなく、ある−定の配列または構造を有するペプチドも用いられ得る。例えば、β−シート構造を有するペプチド（特開平１０−２４５３９８号公報）、α−ヘリカルコイルドコイル構造を有するペプチド（特開平１０−２４５３９７号公報）、立体構造を有するタンパク質またはペプチドのライブラリー（特開２０００−３２７６９７号公報）などが挙げられる。
本発明の第１の局面において、「アゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する」とは、細胞内で産生されたアゴニストまたはアゴニスト候補物質が、細胞内から細胞膜を通過して細胞表層に移動するが、細胞外に分泌されずに、細胞表層に固定されていることをいう。アゴニストまたはアゴニスト候補物質は、例えば、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して細胞表層に提示され得るか、あるいは細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して細胞表層に提示され得る。細胞表層に提示されたアゴニストまたはアゴニスト候補物質は、同一細胞上に発現しているレセプターのアゴニスト結合部位に結合し得る。アゴニストまたはアゴニスト候補物質をアゴニスト結合部位に適切に結合させるために、ＧＰＩアンカーまたは糖鎖結合タンパク質ドメインとアゴニストまたはアゴニスト候補物質との間に、適切な長さのリンカーを有していてもよい。ただし、リンカーが長すぎると、他の細胞のレセプターと結合する可能性が生じるため、好ましくない。また、細胞表層に提示されたアゴニストまたはアゴニスト候補物質が細胞表層から切断されて遊離することを避けるために、酵母はプロテアーゼ低下株または欠損株であることが好ましい。
細胞表層にアゴニストまたはアゴニスト候補物質を提示する一般的な方法について説明する。細胞表層にアゴニストまたはアゴニスト候補物質を提示する方法としては、（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介してアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する方法、（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介してアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する方法、および（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を介してアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する方法がある。
用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の性凝集タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン（ＧＰＩアンカーとして使用）、Ｆｌｏ１タンパク質（Ｆｌｏ１タンパク質は、Ｎ末端側のアミノ酸長を種々改変して、ＧＰＩアンカーとして使用し得る；例えば、Ｆｌｏ４２、Ｆｌｏ１０２、Ｆｌｏ１４６、Ｆｌｏ３１８、Ｆｌｏ４２８など；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６０巻，４６９−４７４頁，２００２年：なお、Ｆｌｏ１３２６とは、全長Ｆｌｏ１タンパク質を表す）、Ｆｌｏタンパク質（ＧＰＩアンカー機能を有さず、凝集性を利用するＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇ；Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５１７−４５２２頁，２００２年）、ペリプラズム局在タンパク質であるインベルターゼ（ＧＰＩアンカーを利用しない）などが挙げられる。
まず、（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法について説明する。ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元付近で切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列が特に有用である。
したがって、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的とするアゴニストまたはアゴニスト候補物質をコードするＤＮＡ配列に置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示するための組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。このようなＤＮＡを酵母に導入して発現させることによって細胞表層に提示されたアゴニストまたはアゴニスト候補物質は、そのＣ末端側が表層に固定されている。
次に、（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法について説明する。細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメイン、ＦＬＯタンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
この細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）と目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質とを結合することにより、細胞表層にアゴニストまたはアゴニスト候補物質が提示される。目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質の種類により、細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側にアゴニストまたはアゴニスト候補物質を結合させる、（２）Ｃ末端側にアゴニストまたはアゴニスト候補物質を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なるアゴニストまたはアゴニスト候補物質を結合させることができる。本発明においては、（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とするアゴニストまたはアゴニスト候補物質をコードする遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子；あるいは（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とするアゴニストまたはアゴニスト候補物質をコードする遺伝子、を作成することにより、細胞表層に目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質を提示するための組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、一部のみ存在してもよいが、存在しなくてもよい。また、凝集機能ドメインを用いる場合は、ドメインの長さを調節しやすいため（例えば、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇのいずれかを選択できる）、より適切な長さでアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示できる点で、ならびにアゴニストまたはアゴニスト候補物質のＮ末端またはＣ末端のどちらの側でも結合させることが可能な点で、非常に有用である。
次に、（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を利用する方法について説明する。この場合は、目的とするアゴニストまたはアゴニスト候補物質を、ペリプラズム遊離型タンパク質との融合タンパク質として細胞表層に発現させ得ることに基づく。ペリプラズム遊離型タンパク質としては、例えば、インベルターゼ（Ｓｕｃ２タンパク質）が挙げられる。目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質は、これらのペリプラズム遊離型タンパク質に応じて、適宜Ｎ末端またはＣ末端側に融合され得る。
本発明の第１の局面において、酵母は、少なくともレセプター（好ましくは、キメラレセプター）および細胞表層提示アゴニストまたはアゴニスト候補物質を発現し、検出の感度を上昇させるように改変された遺伝子構築物が導入される。必要に応じて、細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を含む融合タンパク質も細胞内で発現されるように遺伝子構築物が導入される。遺伝子構築物は、酵母に適切なクローニングベクターおよび発現ベクター中に組込まれる。このような適切なベクターは当該技術分野で公知であり、酵母での発現に必要なエレメントが適宜含まれている。酵母への遺伝子構築物の導入とは、細胞の中に遺伝子構築物を導入し、発現させることを意味する。遺伝子構築物の導入の方法としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなど、当業者に公知の種々の方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。導入される遺伝子構築物は、プラスミドの形態で、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。遺伝子構築物が導入された細胞は、選択マーカー（例えばＴＲＰ）で選択され、発現されたタンパク質の活性を測定することにより選択される。タンパク質が細胞表層に固定されていることは、例えば、抗タンパク質抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。このようにして、少なくともキメラレセプターおよび細胞表層提示アゴニストまたはアゴニスト候補物質を発現し、検出の感度を上昇させるように改変され、必要に応じて、細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を含む融合タンパク質を発現する酵母が得られる。
本発明の第１の局面で使用される酵母は、プラスミド発現のためのマーカー遺伝子を有し、アゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示し、レセプター（好ましくは、キメラレセプター）を発現し得る株であれば、特に限定されない。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１、ＡＴＣＣ６０７１５、ＭＴ８−１、Ｗ３０３ａ、ＩＦＯ１０１５０、ＹＰＨ４９９などが挙げられる。シグナル伝達量が多い株が好ましい。
検出の感度を上昇させるための改変としては、例えば、（ｉ）アゴニストまたはアゴニスト候補物質の発現量の最適化、（ｉｉ）アゴニストまたはアゴニスト候補物質の分解の抑制、（ｉｉｉ）シグナル伝達機能と競合または機能阻害する天然のタンパク質の発現の抑制、（ｉｖ）レポータータンパク質の発現量の増加などが挙げられる。
（ｉ）アゴニストまたはアゴニスト候補物質（リガンド）の発現量の最適化とは、レセプターとの結合に最適となるように、リガンドの発現条件について予め検討することをいう。リガンドの発現量が少ない場合は、レセプターに結合する量が少ないため感度が悪くなる。逆にリガンドの発現量が多すぎる場合は、リガンド同士が競合してレセプターに安定に結合できない可能性があるため、感度が高くならない場合がある。したがって、検討すべき発現条件としては、宿主細胞株の選択、細胞表層提示手段の選択、表層提示用リンカーの長さの調節、シグナルペプチドの選択、プロモーターの選択などが挙げられる。例えば、アゴニスト候補物質のうちの代表的な物質について、種々の条件で予備検討が行われ得る。
（ｉｉ）アゴニストまたはアゴニスト候補物質は、ＢＡＲ１遺伝子によりコードされるペプチダーゼなどによってアゴニスト自体が分解されることにより、レセプターとの結合が低下する。あるいは、上述のように細胞表層に提示されたアゴニストまたはアゴニスト候補物質が細胞表層から切断されて遊離する。このようなアゴニストまたはアゴニスト候補物質の分解を抑制するために、例えば、プロテアーゼ低下株または欠損株（例えば、Ｂａｒ１ペプチダーゼ欠損株）を用いることが好ましい。
（ｉｉｉ）シグナル伝達機能と競合または機能阻害する天然のタンパク質の発現の抑制の代表的な例としては、ＧＰＣＲのシグナル伝達系におけるＦＡＲ１遺伝子やＳＳＴ２遺伝子の破壊または欠損が挙げられる。
ＦＡＲ１遺伝子は、上記のＭＡＰＫカスケードにおいて、シグナル伝達によって活性化されて、細胞周期阻止を引き起こす（図２を参照のこと）。そのため、アゴニストがレセプターに結合した場合、その細胞の分裂が阻害されて、細胞が増殖できず、レポーター遺伝子の発現（例えば、ＦＵＳ１の下流に連結されたＥＧＦＰの発現）が低下し得る。そこで、ＦＡＲ１遺伝子を破壊または欠損させれば、このようなＦａｒ１の活性化が生じないため、細胞の分裂も阻害されず、結果として、上記のＦＵＳ１のような他のレポーター遺伝子発現が増強され得る。
ＳＳＴ２遺伝子は、Ｇタンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ交換を制御するタンパク質であるＳｓｔ２ｐをコードする。したがって、ＳＳＴ２遺伝子を破壊することにより、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換の認識が甘くなるため、低濃度でもリガンド結合の検出が可能になる。シグナル伝達を阻害する他の遺伝子としては、Ｇｐａ１タンパク質からのシグナル伝達を抑制する（図２を参照のこと）。
（ｉｖ）レポータータンパク質の発現量を増加させる手段としては、上記（ｉｉｉ）によるシグナル伝達系を阻害するタンパク質の発現抑制の他に、レポーター遺伝子をマルチコピープラスミドを用いて導入すること、ゲノム上へのレポーター遺伝子の多コピーインサートの挿入、レポーター遺伝子のプロモーターとして適切なプロモーターを選択することなどが挙げられる。
遺伝子構築物は、上述のように、プラスミドの形態で、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。しかし、レポータータンパク質の発現量を増加させるためには、マルチコピープラスミドを用いることまたはゲノム上への多コピーインサートの挿入が好適である。このようなマルチコピープラスミドは、当業者には公知である。また、レポーター遺伝子のゲノム上への挿入位置の好適な例としては、リボソーム遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子のプロモーター遺伝子としては、一般的にはそのレポーター遺伝子自体のプロモーターが用いられる。しかし、例えば、ＧＰＣＲにおいては、Ｇｐａ１のシグナル伝達下流で転写量がα−因子により増加する遺伝子のプロモーターであれば、このシステムのレポーター遺伝子のプロモーターとして用いることが可能である。
このようにして得られた酵母においては、単に培養するだけで、結合可能なアゴニスト候補物質がレセプター（好ましくは、キメラレセプター）に結合してシグナル伝達が行われ得るため、アゴニスト候補物質のスクリーニングが可能である。あるいは、レセプター（好ましくは、キメラレセプター）に対するアゴニストが該レセプターに結合し、次いで細胞内レセプター共役タンパク質候補物質と該レセプターとが相互作用してシグナル伝達が行われ得るため、細胞内レセプター共役タンパク質候補物質のスクリーニングも可能である。細胞内レセプター共役タンパク質を介するシグナル伝達の反応様式（例えば、第１および第２のマーカータンパク質の結合など）に応じて、シグナル伝達の有無を確認することができる。例えば、ナノチャンバーアレイのような１細胞ずつアッセイするためのシステムにおいて、チャンバーに酵母を１細胞ずつ分注して、蛍光変化を直接的に検出してもよいし、あるいは各チャンバーに反応試薬を添加することによって、発色反応、発光反応、またはレポーター遺伝子の発現を検出してもよい。２ｃｍ×２ｃｍのナノチャンバーアレイを用いると、１回で１０４〜１０５個の細胞についてアッセイすることができる。あるいは、酵母を分けずにまとめて培養し、その後ＦＡＣＳにより１細胞ずつソーティングして、蛍光変化を検出してもよい。
シグナル伝達が行われたことが確認された酵母について、アゴニスト候補物質をコードする遺伝子配列を、当業者が通常用いる手段により同定することによって、アゴニスト／アンタゴニストになり得るペプチドを同定することができる。
本発明の第２の局面におけるアゴニストのスクリーニング方法は、レセプターを発現している酵母を、アゴニスト候補物質とともに培地中で７２時間以内の範囲で培養する工程；および該アゴニスト候補物質が結合した酵母を検出する工程を含む。
この方法において用いられる酵母は、アゴニスト候補物質を細胞表層に発現していない点で、上記の第１の局面とは異なり、一方、アゴニスト候補物質がレセプターに結合している酵母を検出するための基本的なメカニズムを備えている点で、上記の本発明の第１の局面と同様である。したがって、この局面で用いられる酵母は、良好な検出系を有するように改変されていれば、アゴニスト候補物質を発現するように遺伝子操作されている必要はない。この改変は、上記（ｉ）の細胞表層提示手段に関する改変を除いて、上記の第１の局面に記載した（ｉｉ）〜（ｉｖ）と同様である。ただし、上記の第１の局面のように種々のアゴニスト候補物質が混在する系でのスクリーニングは不可能であり、個々のアゴニスト候補物質ごとに分けてスクリーニングする必要がある。
本発明の第２の局面においては、アゴニスト候補物質添加後の酵母の培養時間が適切に設定されているため、検出の感度が良好になっている。培養時間は、７２時間以内の範囲、４８時間以内の範囲、通常には約４０時間以内の範囲、好適には２４時間以内の範囲、より好適には５〜２０時間、さらに好適には１０〜１５時間であり、最も適切には、約１２時間である。培養時間が短すぎると、検出するためのレポータータンパク質の発現が十分でないため、検出感度が劣る。逆に培養時間が長すぎると、アゴニスト候補物質の結合によるレポータータンパク質の発現誘導のピークが過ぎて、発現量が低下し、検出感度が低くなる。
さらに、本発明の第２の局面においては、アゴニスト候補物質の濃度を適切に設定することによって、より検出感度を良好にすることができる。適切な濃度は、それぞれの酵母株によって大きく異なっているため、アゴニストが既知であるならば、アゴニスト候補物質のスクリーニングを行う前に、当該アゴニストを用いて適切な濃度について検討することが好ましい。
本発明の第３の局面では、細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法を提供し、この方法は、ランダム化した哺乳類ｃＤＮＡライブラリー由来の細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を細胞内に発現し、そしてアゴニスト結合部位を細胞膜外側に保持しかつ細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位を細胞膜内側に保持するレセプターを細胞膜に発現する酵母を得る工程；該酵母を含む培地中にアゴニストを予め最適化された濃度で添加して７２時間以内の範囲で培養する工程；および該アゴニストと該レセプターとの結合によって該レセプターと該細胞内レセプター共役タンパク質との相互作用が生じた酵母を検出する工程；を含む。
ここで、「ランダム化した哺乳類ｃＤＮＡライブラリー由来の細胞内レセプター共役タンパク質候補物質」とは、ｃＤＮＡライブラリー由来のタンパク質をコードするＤＮＡを、コンビナトリアル（バイオエンジニアリング）ＰＣＲを用いて、目的部分をランダム化することによって得られ得る、種々のランダムに改変された候補物質をいう。細胞内で発現されるランダム化した候補物質は、同一酵母において一種であってもよくあるいは複数種であってもよい。
本発明の第３の局面においては、予め最適に設定された濃度のアゴニストを添加して７２時間以内の範囲で培養することによって、シグナル伝達が生じた酵母を確実にかつ感度よく検出することができる。アゴニストの濃度および培養時間の設定については、第２の局面に関して記述したのと同様である。
シグナル伝達が行われたことが確認された酵母について、細胞内レセプター共役タンパク質候補物質をコードする遺伝子配列を、当業者が通常用いる手段により同定することによって、細胞内レセプター共役タンパク質になり得るペプチドを同定することができる。
【実施例】
【０００６】
以下の調製例および実施例において、形質転換は、酢酸リチウム法を用いた。ＹＰＤ培地の組成は、１％Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（ナカライテスク）、２％ペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、および２％グルコース（ナカライテスク）とした。ＳＲＧＣ培地の組成は、０．６７％Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、２％ラフィノース（ＳＩＧＭＡ）、２％ガラクトース（ナカライテスク）、および２％カザミノ酸（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）とした。ＳＤ培地の組成は、０．６７％Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、および２％グルコースとした。ＳＧ培地の組成は、０．６７％Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、および２％ガラクトースとした。ＳＤおよびＳＧ培地には、必要な栄養源のうち、Ｌ−ロイシンを３０ｍｇ／Ｌ、ならびにＬ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、およびウラシルをそれぞれ２０ｍｇ／Ｌ添加した。
（調製例１：欠損酵母株の構築）
（調製例１−１：ＦＵＳ１−ＥＧＦＰゲノム組込み用プラスミドの構築）
酵母由来ＦＵＳ１遺伝子（シグナル伝達により転写が開始される遺伝子）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子配列のうちＣ末端側から１０００ｂｐの配列を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）により配列番号１および２に示すプライマーを用いて、制限酵素部位を付加した増幅断片（ａ）を得た。一方、プラスミドｐＥＧＦＰを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号３および４に示すプライマーを用いて、制限酵素部位を付加したＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のＯＲＦ配列（ｂ）を増幅した。増幅断片（ａ）をＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩにて、そして断片（ｂ）をＳａｃＩおよびＳａｌＩにてそれぞれ消化した。これらの消化した断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩにて消化したｐＵＣ１１９ベクターに挿入して、プラスミドｐＵＣ１１９−ＦＵＳ１ｍ−ＥＧＦＰ＋ＥｃｏＲＶを得た。
次いで、プラスミドｐＷＧＰ３を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号５および６に示すプライマーを用いて、制限酵素部位を付加したＧＡＰＤＨのターミネーター配列（ｃ）を増幅した。一方、プラスミドｐＲＳ４０３を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号７および８に示すプライマーを用いて、制限酵素部位を付加したＨＩＳ３配列（ｄ）を増幅した。さらに、酵母由来ＦＵＳ１遺伝子のターミネーターをコードする遺伝子配列のうち５’末端側から１０００ｂｐの配列を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号９および１０に示すプライマーを用いて、制限酵素部位を付加した増幅断片（ｅ）を得た。増幅断片（ｃ）をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩにて、断片（ｄ）をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩＩにて、そして断片（ｅ）をＳａｃＩＩおよびＳｐｈＩにてそれぞれ消化した。これらの消化した断片を、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩにて消化したｐＵＣ１１９ベクターに挿入し、プラスミドｐＵＣ１１９−ｔｅｒｍ−ＨＩＳ３−ｔＦＵＳ１を得た。
プラスミドｐＵＣ１１９−ＦＵＳ１ｍ−ＥＧＦＰ＋ＥｃｏＲＶを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩにて消化し、（ａ）と（ｂ）とを含む断片を得た。また、プラスミドｐＵＣ１１９−ｔｅｒｍ−ＨＩＳ３−ｔＦＵＳ１を、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩにて消化して、（ｃ）と（ｄ）と（ｅ）とを含む断片を得た。これらの断片を、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩにて消化したｐＵＣ１１９ベクターに挿入して、プラスミドｐＵＣ１１９−ＦＵＳ１−ＥＧＦＰ−ＨＩＳ３を得た。
（調製例１−２：ＢＡＲ１遺伝子破壊株の構築）
プラスミドｐＲＳ４０５を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号１１および１２に示すプライマーを用いて、ＢＡＲ１遺伝子（プロテアーゼ遺伝子）のＯＲＦから上流５０ｂｐおよび下流５０ｂｐの領域を付加したＬＥＵ２遺伝子配列（ｆ）を増幅した。酵母Ｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１に増幅断片（ｆ）を形質転換し、遺伝子破壊株ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１を得た。
（調製例１−３：ＦＡＲ１遺伝子破壊株の構築）
ＦＡＲ１（シグナル伝達により細胞周期阻止を引き起こす遺伝子）が破壊されているＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１株は、ＲｅｓＧｅｎ社より購入した。
（調製例１−４：ＢＡＲ１，ＦＡＲ１遺伝子破壊株の構築）
上記のようにして得たＬＥＵ２遺伝子配列（ｆ）を増幅し、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１株に形質転換して、遺伝子破壊株ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１を得た。
（調製例１−５：ＳＳＴ２遺伝子破壊株の構築）
プラスミドｐＡＵＲ１２３を鋳型として、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）により配列番号１３および１４に示すプライマーを用いて、酵母由来ＡＵＲ１遺伝子の変異体であるＡＵＲ１−Ｃ遺伝子をコードする配列（ｇ）を得た。ＢＹ４７４１、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１、およびＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１の４種の株を、それぞれ増幅断片（ｇ）で形質転換し、４種のＳＳＴ２遺伝子（Ｇｐａ１タンパク質からのシグナル伝達を抑制する遺伝子）破壊株ＢＹ４７４１ΔＳＳＴ２、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＳＳＴ２、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１ΔＳＳＴ２、およびＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ΔＳＳＴ２を得た。
（調製例１−６：ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰゲノム組込み株の構築）
プラスミドｐＵＣ１１９−ＦＵＳ１−ＥＧＦＰ−ＨＩＳ３を、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩにて消化し、断片（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を含む断片（ｈ）を得た。ＢＹ４７４１、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１、ＢＹ４７４１ΔＳＳＴ２、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＳＳＴ２、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１ΔＳＳＴ２、およびＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ΔＳＳＴ２の８種の株を、酢酸リチウム法によりそれぞれ断片（ｈ）で形質転換し、８種の遺伝子破壊株ＢＹ４７４１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、およびＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰを得た。
（調製例２：α−因子表層提示用プラスミドの構築）
（調製例２−１：ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ４２、１０２、１４６、および３１８の構築）
酵母由来ＭＦα１遺伝子のＯＲＦ領域のうち１つ目の成熟タンパク質までをコードする遺伝子配列を鋳型として、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−により配列番号１５および１６に示すプライマーを用いてＭＦα１遺伝子の３’末端側にＦＬＡＧタグ配列、および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ｉ）を得た。増幅断片（ｉ）をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて消化し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて消化したｐＥＳＣ−ＵＲＡベクターに挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣαｆを得た。
酵母の凝集性タンパク質Ｆｌｏ１をコードするＦＬＯ１遺伝子の各種欠損型遺伝子をコードするプラスミドｐＩＦ４２、ｐＩＦ１０２、ｐＩＦ１４６、およびｐＩＦ３１８（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６０巻，４６９−４７４頁，２００２年）を用いて、以下のようにｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ４２、１０２、１４６、および３１８を構築した。
プラスミドｐＩＦ４２を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号１７および２１に示すプライマーを用いて、両末端に制限酵素部位を付加したＦＬＯ４２遺伝子配列（ｊ）を増幅した。プラスミドｐＩＦ１０２を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号１８および２１に示すプライマーを用いて、両末端に制限酵素部位を付加したＦＬＯ１０２遺伝子配列（ｋ）を増幅した。プラスミドｐＩＦ１４６を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号１９および２１に示すプライマーを用いて、両末端に制限酵素部位を付加したＦＬＯ１４６遺伝子配列（ｌ）を増幅した。プラスミドｐＩＦ３１８を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号２０および２１に示すプライマーを用いて、両末端に制限酵素部位を付加したＦＬＯ３１８遺伝子配列（ｍ）を増幅した。
増幅断片（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、および（ｍ）を、それぞれＸｈｏＩおよびＮｈｅＩにて消化した。これらの断片を、ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩにて消化したプラスミドｐＵＥＳＣαｆにそれぞれ挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ４２、ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ１０２、ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ１４６、およびｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ３１８を得た。
（調製例２−２：ｐＵＥＳＣαｆ−ＡＧの構築）
プラスミドｐＵＥＳＣαｆを鋳型として、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−により配列番号１５および２２に示すプライマーを用いてＭＦα１遺伝子の３’末端側にＦＬＡＧタグ配列、および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ｎ）を得た。増幅断片（ｎ）をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて消化し、これをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて消化したｐＥＳＣ−ＵＲＡベクターに挿入して、プラスミドｐＵＥＳＣαｆ（ＡＧ）を得た。
α−アグルチニンをコードするプラスミドｐＵＣＳｘｙｌＡｆを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号２３および２４に示すプライマーを用いて、両末端に制限酵素部位を付加したα−アグルチニンの３’側半分の遺伝子をコードする増幅断片（ｏ）を得た。増幅断片（ｏ）をＸｈｏＩおよびＮｈｅＩにて消化し、これをＸｈｏＩおよびＮｈｅＩにて消化したプラスミドｐＵＥＳＣαｆ（ＡＧ）に挿入して、プラスミドｐＵＥＳＣαｆ−ＡＧを得た。
（調製例２−３：ｐＵＥＳＣαｆ−ＳＵＣ２（Ｎ）およびｐＵＥＳＣ−ＳＵＣ２ｆα（Ｃ）の構築）
ペリプラズムに局在するインベルターゼＳｕｃ２タンパク質の遺伝子を有するｐＷＧＰ３−ＳＵＣ２（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２８巻，２５９−２６４）を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号２５および２６に示すプライマーを用いて、両末端に制限酵素部位を付加したＳＵＣ２の２１〜５３３番目のアミノ酸残基をコードする遺伝子配列（ｐ）を増幅した。増幅断片（ｐ）をＸｈｏＩおよびＮｈｅＩにて消化し、ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩにて消化したプラスミドｐＵＥＳＣαｆに挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣαｆ−ＳＵＣ２（Ｎ）を得た。
また、ｐＷＧＰ３−ＳＵＣ２を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号２７および２８に示すプライマーを用いて、３’末端にＦＬＡＧタグ、ＭＦα１遺伝子の１つ目の成熟タンパク質をコードする遺伝子、および終止コドンを付加し、両末端に制限酵素部位を付加したＳＵＣ２のＯＲＦ領域をコードする遺伝子配列（ｑ）を増幅した。増幅断片（ｑ）をＳａｌＩおよびＮｈｅＩにて消化し、これをＳａｌＩおよびＮｈｅＩにて消化したプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡに挿入して、プラスミドｐＵＥＳＣ−ＳＵＣ２ｆα（Ｃ）を得た。
（調製例２−４：ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＳ（Ｎ）およびｐＵＥＳＣ−ＦＳｆα（Ｃ）の構築）
Ｆｌｏ１タンパク質の欠失変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドｐＷＩＦＳ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５１７−４５２２頁，２００２年）を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号２９および３０に示すプライマーを用いて、両末端に制限酵素部位を付加したＦＳの２７８〜１０９９番目のアミノ酸残基をコードする遺伝子配列（ｒ）を増幅した。増幅断片（ｒ）をＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩにて消化し、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩにて消化したプラスミドｐＵＥＳＣαｆに挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣαｆ−ＦＳ（Ｎ）を得た。
ｐＷＩＦＳを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号３１および３２に示すプライマーを用いて、３’末端にＦＬＡＧタグ、ＭＦα１遺伝子の１つ目の成熟タンパク質をコードする遺伝子、および終止コドンを付加し、両末端に制限酵素部位を付加したＦＳのＯＲＦ領域をコードする遺伝子配列（ｓ）を増幅した。増幅断片（ｓ）をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて消化し、これをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて消化したプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡに挿入して、プラスミドｐＵＥＳＣ−ＦＳｆα（Ｃ）を得た。
（調製例２−５：ｐＵＥＳＣαｓｆの構築）
プラスミドｐＵＥＳＣαｆを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号１５および３３に示すプライマーを用いて、３’末端にＦＬＡＧタグをコードする遺伝子および終止コドンを付加し、両末端に制限酵素部位を付加したＭＦα１遺伝子のＯＲＦ領域のうち１つ目の成熟タンパク質までをコードする遺伝子配列（ｔ）を増幅した。増幅断片（ｔ）をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて消化し、これをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて消化したｐＥＳＣ−ＵＲＡベクターに挿入して、プラスミドｐＵＥＳＣαｓｆを得た。
（調製例３：マルチコピー型プラスミドｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１の構築）
酵母由来ＦＵＳ１遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）からＯＲＦまでの領域をコードする遺伝子配列を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号３４および２に示すプライマーを用いて、制限酵素部位を付加した増幅断片（ｕ）を得た。プラスミドｐＵＣ１１９−ＦＵＳ１−ＥＧＦＰ−ＨＩＳ３を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより配列番号３および３５に示すプライマーを用いて、制限酵素部位を付加したＥＧＦＰのＯＲＦおよびＧＡＰＤＨターミネーターを含む遺伝子配列（ｖ）を増幅した。増幅断片（ｕ）をＢｓｓＨＩＩおよびＳａｃＩにて、そして断片（ｖ）をＳａｃＩおよびＢｓｓＨＩＩにて消化した。これらの断片をＢｓｓＨＩＩにて消化したプラスミドｐＲＳ４０３＋２μｍに挿入して、プラスミドｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１を得た。
（実施例１：ＥＧＦＰゲノム組込み株におけるＦＵＳ１−ＥＧＦＰタンパク質の発現確認およびα−因子添加濃度の最適化）
ＢＹ４７４１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰを、５ｍＬのＹＰＤ培地中で、初期ＯＤ６００＝０．０３で３０℃にて１５０ｒｐｍで培養した。培養開始時には、α−因子（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、および５０ｎＭの濃度となるように添加した。コントロールとして、α−因子を添加していないＢＹ４７４１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰも培養した。培養菌体をサンプリングし、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）による蛍光強度解析を行った。結果を図３に示す。
レポーターであるＦｕｓ１−ＥＧＦＰタンパク質の発現量は、リガンドであるα−因子の添加により上昇した後、速やかに減少することがわかった。発現量が最大になる時間は、リガンドの濃度に応じて変化するが、本実施例においては、５〜２０時間であった。また、レポーター遺伝子の発現には、適切なリガンド濃度（１〜５０μＭ）があることもわかった。したがって、新規リガンドをスクリーニングする際には、化合物ライブラリーの濃度（あるいは、細胞表層での発現量）を種々改変して、最適な化合物ライブラリーの濃度を選択する必要があると考えられる。
（実施例２：ＳＳＴ２遺伝子破壊株におけるＦｕｓ１−ＥＧＦＰタンパク質の発現確認およびα−因子添加濃度の最適化）
ＢＹ４７４１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰを、５ｍＬのＹＰＤ培地中で、初期ＯＤ６００＝０．０３で３０℃にて１５０ｒｐｍで培養した。培養開始時には、α−因子を５０μＭ、５μＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、および５０ｐＭの濃度となるように添加した。コントロールとして、α−因子を添加していないＢＹ４７４１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰも培養した。培養菌体をサンプリングし、ＦＣＭによる蛍光強度解析を行った。結果を図４に示す。
上記実施例１の場合と同様に、ＳＳＴ２遺伝子破壊株においても、Ｆｕｓ１−ＥＧＦＰタンパク質の発現量は、リガンド添加により上昇した後に速やかに減少し、そして適切なリガンド濃度（５ｎＭ〜５０μＭ）があることがわかった。
（実施例３：ＢＡＲ１およびＦＡＲ１遺伝子破壊によるＦｕｓ１−ＥＧＦＰタンパク質発現量への影響）
ＢＹ４７４１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、およびＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰを、それぞれ５ｍＬのＹＰＤ培地中で、初期ＯＤ６００＝０．０３で３０℃にて１５０ｒｐｍで培養した。培養開始時には、α−因子を５μＭとなるように添加した。コントロールとして、α−因子を添加していない株についても同様の実験を行った。培養菌体をサンプリングし、ＦＣＭによる蛍光強度解析を行った。結果を図５に示す。
上記実施例１および２の場合と同様に、ＢＡＲ１およびＦＡＲ１遺伝子破壊株においても、Ｆｕｓ１−ＥＧＦＰタンパク質の発現量は、リガンド添加により上昇した後に速やかに減少し、そして適切なリガンド濃度があることがわかった。
また、ＳＳＴ２遺伝子破壊株についても同様に、ＢＡＲ１およびＦＡＲ１による影響を調べるため次の実験を行った。ＢＹ４７４１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ、およびＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ΔＳＳＴ２ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰを、それぞれ５ｍＬのＹＰＤ培地中で、初期ＯＤ６００＝０．０３で３０℃にて１５０ｒｐｍで培養した。培養開始時には、α−因子を５０ｎＭとなるように添加した。コントロールとして、α−因子を添加していない株についても同様の実験を行った。培養菌体をサンプリングし、ＦＣＭによる蛍光強度解析を行った。結果を図６に示す。
図５の結果と比較して、ＳＳＴ２破壊株を用いることにより、Ｆｕｓ１−ＥＧＦＰタンパク質の発現が増強される傾向にあることがわかった。このことから、Ｇｐａ１タンパク質のシグナル伝達下流のタンパク質の遺伝子を改変することによって、レポーターの発現量を増加させることが可能であると考えられる。
（実施例４：α−因子の酵母細胞表層提示および提示α−因子−Ｓｔｅ２間の結合試験）
ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＵＥＳＣαｓｆ、ｐＵＥＳＣαｆ−ＡＧ、ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ４２、１０２、１４６、３１８、ｐＵＥＳＣαｆ−ＳＵＣ２（Ｎ）、ｐＵＥＳＣ−ＳＵＣ２ｆα（Ｃ）、ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＳ（Ｎ）、およびｐＵＥＳＣ−ＦＳｆα（Ｃ）を、それぞれ１００ｍＬのＳＲＧＣ培地中で、初期ＯＤ６００＝０．０３で３０℃にて１５００ｐｍで培養した。コントロールとして、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡについても同様の実験を行った。７２時間培養後、菌体をサンプリングし、ＦＣＭによる蛍光強度解析を行った。結果を図７に示す。
これまでに酵母におけるペプチドライブラリーの細胞表層提示アンカーとして使用できることが知られているα−アグルチニン、Ｆｌｏ４２、Ｆｌｏ１０２、およびＦｌｏ１４６に加えて、Ｆｌｏ３１８、Ｓｕｃ２（Ｎ）、Ｓｕｃ２（Ｃ）、ＦＳ（Ｎ）、およびＦＳ（Ｃ）も、ペプチドライブラリーの細胞表層アンカリングタンパク質として使用できることがわかった。
次に、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＵＥＳＣαｓｆ、ｐＵＥＳＣαｆ−ＡＧ、ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ４２、１０２、１４６、および３１８について、免疫蛍光染色を行った。７２時間培養後の菌体に、１次抗体として抗ＦＬＡＧ  Ｍ２（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を添加し、１時間反応後に洗浄した。さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を添加し、１時間反応後に洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。結果を図８に示す。図８からわかるように、ＡＧ、Ｆｌｏ４２、１０２、１４６、および３１８において、細胞表層にα−因子が発現していることを確認できた。
（実施例５：マルチコピー型プラスミドによるＦｕｓ１−ＥＧＦＰ発現）
マルチコピー型プラスミドｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１で形質転換したＢＹ４７４１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１、およびＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１を、それぞれ５ｍＬのＳＤ−Ｈｉｓ培地中で、初期ＯＤ６００＝０．０３で３０℃にて１５０ｒｐｍで培養した。培養開始時には、α−因子を５μＭとなるように添加した。コントロールとして、α−因子を添加していない株についても同様の実験を行った。２４時間培養後、菌体をサンプリングし、ＦＣＭによる蛍光強度解析および蛍光顕微鏡観察を行った。結果をそれぞれ図９および１０に示す。
図９および図１０からわかるように、ＦＡＲ１遺伝子欠損株では、レポーターの発現量が多いことがわかった。これは、ＦＡＲ１遺伝子欠損株でリガンド・レセプター反応の起きている細胞の分裂が阻害されないため、結果として、リガンド・レセプター反応の起きている細胞（レポーター遺伝子発現細胞）の割合が高くなったためと考えられる。
（実施例６：マルチコピー型Ｆｕｓ１−ＥＧＦＰ導入株による提示α−因子−Ｓｔｅ２間の結合試験）
マルチコピー型プラスミドｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１で形質転換したα−因子提示型のＢＹ４７４１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１／ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ４２、ＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１／ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ４２、ＢＹ４７４１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１／ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ４２、およびＢＹ４７４１ΔＢＡＲ１ΔＦＡＲ１ＦＵＳ１：：ＥＧＦＰ／ｐＭＨＲＳ−ｐＦＵＳ１／ｐＵＥＳＣαｆ−ＦＬＯ４２を、それぞれ１００ｍＬのＳＤ−Ｈｉｓ，Ｕｒａ培地中で、初期ＯＤ６００＝０．０３で３０℃にて１５０ｒｐｍで２４時間培養後、菌体を回収・洗浄し、ＳＧ−Ｈｉｓ，Ｕｒａ培地１００ｍＬに培地交換した。６３時間培養後、菌体をサンプリングし、ＦＣＭによる蛍光強度解析を行った。結果を図１１に示す。
上記実施例５と同様に、ＦＡＲ１遺伝子欠損株では、レポーターの発現量が多いことがわかった。また、マルチコピー型の菌株を用いた場合（図１１）、図７と比較してレポーターの発現量が多く、したがってリガンドの検出感度も明らかに上昇していた。
（実施例７：新規レポーター候補タンパク質の探索）
上記実施例では、いずれもレポータータンパク質としてＦｕｓ１を使用した。Ｆｕｓ１以外にも、α−因子の添加によって転写量が増加するタンパク質が知られている（ＭａｃＫａｙら、前出）。そこで、この文献の記載に基づいて、レポーター候補として、Ａｇａ１、Ａｓｇ７、Ｆｉｇ１、Ｆｕｓ１、Ｉｑｇ１、およびＰｒｍ１を選択し、α−因子添加による発現レベルを検討した。
それぞれのレポーター候補タンパク質のＣ末端側にＥＧＦＰが融合されて発現するように、各レポーター候補タンパク質の遺伝子座にＥＧＦＰ遺伝子を相同組換えによって酵母ゲノムに組込み、ＢＹ４７４１株を形質転換し、６種の形質転換体：ＢＹ４７４１−ＡＧＡ１Ｃ、ＢＹ４７４１−ＡＳＧ７Ｃ、ＢＹ４７４１−ＦＩＧ１Ｃ、ＢＹ４７４１−ＦＵＳ１Ｃ、ＢＹ４７４１−ＩＱＧ１Ｃ、およびＢＹ４７４１−ＰＲＭ１Ｃを得た。
上記の各形質転換体について、５ｍＬのＹＰＤ培地中で、初期ＯＤ６００＝０．１で３０℃にて１５０ｒｐｍで培養した。培養開始時には、α−因子を２５μＭの濃度となるように添加した。コントロールとして、野生型ＢＹ４７４１株も同様に培養した。１２時間培養した後、培養菌体をサンプリングし、ＦＣＭにより蛍光強度を測定した。結果を図１２に示す。図１２において、白いカラムは培養開始時にα−因子を添加していない細胞、および黒いカラムは培養開始時にα−因子を添加した細胞の蛍光強度を示す。
図１２に示すように、レポーター候補−ＥＧＦＰタンパク質の発現量は、リガンドであるα−因子の添加により上昇した。特に、ＢＹ４７４１−ＡＧＡ１ＣおよびＢＹ４７４１−ＦＩＧ１Ｃは、蛍光強度が非常に強く、α−因子の添加によってＡｇａ１およびＦｉｇ１の発現量が顕著に増加したことがわかった。したがって、Ａｇａ１およびＦｉｇ１は、高感度なレポータータンパク質として有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の方法によれば、生体機能に重要と思われるレセプターに対するアゴニストを、高効率または高感度でスクリーニングすることができる。そのため、本発明の方法は、新薬の開発に利用することができ、時間およびコストの削減が可能である。さらに、本発明の他の方法によれば、細胞内レセプター共役タンパク質の高効率スクリーニングも可能であり、このスクリーニングによって、生体機能の解明が促進され、このことは、治療薬または治療法の開発を促進し得る。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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