(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２７８）の生菌又は／及び死菌を含む、胃酸又はガストリンの産生を抑制するための医薬品。
【請求項２】
乳酸菌ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２７８）の生菌又は／及び死菌を含む、プロトンポンプ・インヒビター（ＰＰＩ）によるガストリンの産生過多を緩和するための医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌の生菌又は死菌を生体へ投与することによって、胃液中の酸濃度の減少およびピー・エイチ（ｐＨ）の強酸性への傾きの抑制、ならびにガストリンの産生を抑制するための医薬品に関する。また、乳酸菌の生菌又は死菌を投与することでプロトンポンプ・インヒビター（以下ＰＰＩと略記する）の継続的投与による副作用を緩和するための医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃幽門部で産生されるガストリンは、胃液中の酸濃度の上昇およびｐＨを強酸性へと傾ける効果を有するホルモンである（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ＭＬ，Ｐｅｕｒａ  ＤＡ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３４：１８４２−１８６０，２００８）。つまり、ガストリンの産生を抑制することで、胃液中の酸濃度の減少およびｐＨの強酸性への傾きを抑制することができる。
【０００３】
ラットの胃において、ガストリンの産生が細菌の存在によって抑制されることが示唆される報告がある（Ｕｒｉｂｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０７：１２５８−１２６９，１９９４）。また、ヒトの胃はほぼ無菌の状態にあり、齧歯類の胃に比べ胃液中の酸濃度が高く、ｐＨも強酸性である（Ｋａｂｉｒ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｕｔ，４１：４９−５５，１９９７）。ヒトの胃に常在できる細菌として、病原菌であるヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）が挙げられる。ヘリコバクター・ピロリ菌感染患者がその除菌を行うと、胃液中の酸濃度が上昇すること、また、逆流性食道炎への罹患率が高まることが報告されている（Ｌａｂｅｎｚ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１２：１４４２−１４４７，１９９７）。
【０００４】
ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（以下、Ｎｏ．１０８８と略記）は本発明者によって開発されたラクトバシラス属乳酸菌であり、ヒトの胃液より単離されたものであるため、非常に優れた耐酸性をもちヒトの胃内でも生存できる特性をもつ。また、病原菌（大腸菌Ｏ−１５７やヘリコバクター・ピロリ菌など）に対して強い増殖抑制効果があり、ラクトバシラス属の細菌の中でも非常に有用な菌株であることが示されている（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２７８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
胃液中の酸濃度が高い、つまりは過酸症の状態にあると、胃液が食道に逆流した際に食道の上皮細胞に傷害を与え、炎症が起こる。これが軽度の場合は胸やけの症状を呈し、重症化すると逆流性食道炎を患う。さらに、これが進行すると食道組織の変性・癌化が起こり、バレット食道癌などに発展する。また近年、本国での食文化が欧米化してきたことなどによって、胃噴門部と食道の境に存在する括約筋の働きが弱まり、胃酸が逆流しやすくなっていることがある。実際に、現在の本国において逆流性食道炎やバレット食道癌の罹患率が増加傾向にある。
【０００６】
ヘリコバクター・ピロリ菌感染患者がその除菌を行うと、胃液中の酸濃度が上昇すること、また、逆流性食道炎になるリスクが高まることが報告されている（Ｌａｂｅｎｚ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１２：１４４２−１４４７，１９９７）。
【０００７】
胃潰瘍や十二指腸潰瘍などの消化性潰瘍などに対する治療として、胃酸の分泌を阻害するＰＰＩを継続的に使用するが、この副作用としてガストリンの産生過多が知られている。またこれに伴って胃粘膜細胞の過剰な増殖や巨大化、胃組織の肥大化などが動物実験では実証されており、ヒトへの臨床試験でも同様のことが示唆される結果がある。さらには消化性潰瘍などの寛解によってＰＰＩの使用を中止した際に、ガストリン過多状態にあることから胃酸の過剰分泌が起こるなどの症状が知られている（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ＭＬ，Ｐｅｕｒａ  ＤＡ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３４：１８４２−１８６０，２００８）。
【０００８】
以上の問題を解決するため、胃酸又はガストリンの産生を抑制する方法を開発することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
課題を解決する本発明は、病原性をもたず胃中で作用する細菌を用いることでガストリンの産生を抑制するための医薬品を提供する。当該医薬品は、乳酸菌の生菌又は死菌を生体に投与することでガストリンの産生を抑制する。
【００１０】
課題を解決する本発明は、乳酸菌の生菌又は死菌を投与することでＰＰＩの継続的投与による副作用の緩和をするための医薬品である。
【実施例】
【００１１】
本発明は、一部には以下の実験結果に基づいている。
【００１２】
１．Ｎｏ．１０８８の生菌投与による胃酸及びガストリン産生の抑制
１−１）Ｎｏ．ｌＯ８８生菌投与マウスの作製
８週齢のジャーム・フリー（GF）Balb/c  雄マウス（東海大学医学部、アイソレーター内で飼育管理）を７匹ずつ２群用意した。片方の群にはＮｏ．１０８８の生菌１×１０９ＣＦＵをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁したものを経口投与し、もう一方の群には等量のＰＢＳを経口投与した。
【００１３】
１−２）胃組織切片の作製
投与より１０日後にマウスを屠殺し、胃を摘出し、１０％ホルマリン（和光純薬）・ＰＢＳに浸し、室温にて一晩置き固定した。次に、固定された胃組織をエタノールに浸し、キシレンに浸した後、パラフィンを用いて包埋した。これをミクロトームにて２μｍの厚さで薄切し、シランコーティーングスライドグラス（MUTO PURE CHEMICALS社）に貼り付け、６２℃下で一晩乾燥させ作製した。
【００１４】
１−３）胃組織切片を用いたガストリンの免疫染色
作製した切片をキシレン及びエタノール処理にて脱パラフィンを行った後、ターゲット・レトリーバル・ソリューション（Target retrieval solution,Dako社）を用い９８℃下１０分間でマイクロウエーブを行い抗原を賦活化した。その組織切片に一次抗体としてラビット・ポリクローナル・抗ガストリン抗体（Rabbit polyclonal anti gastrin antibody,Dako社）を４℃下で一晩反応させた後、二次抗体としてゴート・抗ラビット・アイジージー・アレクサ４８８修飾抗体（Goat anti rabbit IgG Alexa 488 antibody,Molecular Probe社）を室温下で２時間反応させ、細胞核を染色するダピ（ＤＡＰＩ）を加えた退色封入剤を用いて封入した。
【００１５】
１−４）蛍光顕微鏡での観察
細胞のＤＮＡに結合する蛍光色素ＤＡＰＩ、および抗ガストリン抗体で染色した組織切片を蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（Keyence社）にて観察、撮影した。その結果を図１に示す。図に示す通り、Ｎｏ．１０８８生菌を投与してもＤＡＰＩ染色による胃粘膜組織中の細胞数に大きな変化は認められないが、抗ガストリン抗体染色によるガストリン陽性細胞数は減少していることを認めた。すなわち、Ｎｏ．１０８８の生菌の投与によってガストリンの産生を抑制していることが示唆された。
【００１６】
１−５）ガストリン陽性細胞数の統計学的解析
各群のガストリン産生の変化を組織切片から統計学的に解析するため、組織写真中の胃幽門部の粘膜層の長さをアキシオヴィジョン（Axio Vision，Zeiss社）にて計測し、その中のガストリン陽性細胞数を目視にて計測、単位長（１ｍｍ）あたりのガストリン陽性細胞数（個）に換算した。それらの数値をＳＰＳＳ（SPSS社）を用いたマンホイットニー・ユー・テストで解析を行った結果を図２に示す。Ｎｏ．１０８８生菌投与群ではＰＢＳ投与群より有意差をもって５０％以上の減少をしていることが認められた。すなわち、Ｎｏ．１０８８の生菌を投与することでガストリンの産生を抑制することが示された。また同様の現象がラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＪＣＭ１１８７の生菌投与でも認められた。
【００１７】
２．Ｎｏ．１０８８の生菌投与による胃液中の酸濃度の減少とｐＨの強酸性への傾きの抑制
２−１）Ｎｏ．１０８８生菌投与マウスの作製
８週齢のGF-Balb/c  雄マウスを５匹ずつ２群用意した。片方の群にはＮｏ．１０８８の生菌１×１０９ＣＦＵをＰＢＳに懸濁したものを経口投与し、もう一方の群には等量のＰＢＳを経口投与した。
【００１８】
２−２）胃液中の酸濃度とｐＨの測定
投与より１０日後にマウス及びＰＢＳ投与マウスにメンブタールにより麻酔し、手術台に固定し開腹、胃の噴門部に隣接した食道及び胃の幽門部に隣接した十二指腸を鉗子によってクリップし、２時間静置した後、胃内部に蓄積した胃液を採取した。採取した胃液を０．１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬）により酸塩基滴定を行い、酸濃度を測定した。またｐＨ測定器（Horiba社）を用いて、ｐＨを測定した。それぞれのサンプルより得られた数値を、ＳＰＳＳを用いたマンホイットニー・ユー・テストで解析を行った結果を表１に示す。Ｎｏ．１０８８投与群において、有意差をもって胃液中の酸濃度の減少及びｐＨが弱酸性になっていることが認められた。すなわち、Ｎｏ．１０８８がもつガストリンの産生抑制効果によって胃液中の酸濃度の減少及びｐＨの強酸性への傾きの抑制することが示された。
【表１】
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【００１９】
３．Ｎｏ．１０８８の死菌投与によるガストリン産生の抑制
３−１）Ｎｏ．ｌ０８８死菌投与マウスの作製
８週齢のGF-Balb/c  雄マウスを５匹ずつ２群用意した。片方の群にはＮｏ．１０８８の死菌を生菌の１×１０９ＣＦＵに相当する量をＰＢＳに懸濁したものを経口投与し、もう一方の群には等量のＰＢＳを経口投与した。投与は１日１回、１０日間連続で行った。
【００２０】
３−２）胃組織切片の作製
最終の投与より２４時間後にマウスを屠殺し、胃を摘出し、１０％ホルマリン−ＰＢＳに浸し、室温にて一晩置き固定した。次に、固定された胃組織をエタノールに浸し、キシレンに浸した後、パラフィンを用いて包埋した。これをミクロトームにて２μｍの厚さで薄切し、シランコーティーングスライドグラスに貼り付け、６２℃下で一晩乾燥させ作製した。
【００２１】
３−３）胃組織切片を用いたガストリンの免疫染色
作製した切片をキシレン及びエタノール処理にて脱パラフィンを行った後、ターゲット・レトリーバル・ソリューションを用い９８℃下１０分間でマイクロウエーブを行い抗原を賦活化した。その組織切片に一次抗体としてラビット・ポリクローナル・抗ガストリン抗体を４℃下で一晩反応させた後、二次抗体としてゴート・抗ラビット・アイジージー・アレクサ４８８修飾抗体を室温下で２時間反応させ、退色封入剤を用いて封入した。
【００２２】
３−４）蛍光顕微鏡での観察
染色した組織切片を蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００にて観察、撮影した。Ｎｏ．１０８８死菌投与群とＰＢＳ投与群を比較すると、Ｎｏ．１０８８死菌投与群においてガストリン陽性細胞の数が減少していることが示唆された。
【００２３】
３−５）ガストリン陽性細胞数の統計学的解析
各群のガストリン産生の変化を組織切片から統計学的に解析するため、組織写真中の胃幽門部における粘膜層の長さをアキシオヴィジョンにて計測し、その中のガストリン陽性細胞数を目視にて計測、単位長（１ｍｍ）あたりのガストリン陽性細胞数（個）に換算した。それらの数値をＳＰＳＳを用いたマンホイットニー・ユー・テストで解析を行った結果を図３に示す。Ｎｏ．１０８８死菌投与群ではＰＢＳ投与群より有意差をもって４０％以上の減少をしていることが認められた。すなわち、Ｎｏ．１０８８は生菌の投与だけでなく死菌を投与によってもガストリンの産生を抑制することが示された。また同様の現象がラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＪＣＭ１１８７の死菌投与でも認められた。
【００２４】
４．ヘリコバクター・ピロリ菌の除菌によるガストリン産生の促進とＮｏ．１０８８の死菌投与による促進の抑制
４−１）ヘリコバクター・ピロリ保菌マウスの作製
４週齢のGF-Balb/c  雄マウスを５匹ずつ６群用意した。そのうち５群にはヘリコバクター・ピロリ菌の生菌１×１０９ＣＦＵをＰＢＳに懸濁したものを４日間連続で経口投与し、もう一方の群には等量のＰＢＳを４日間連続で経口投与した。ヘリコバクター・ピロリ菌投与より４週間後にヘリコバクター・ピロリ保菌マウスのうちの１群及びＰＢＳ投与群を屠殺し、前記の操作によってパラフィン包埋を行った。残りのヘリコバクター・ピロリ保菌マウスのうちの３群にヒトのヘリコバクター・ピロリ菌の除菌と同様の処理（Lind T,et al. Gastroenterology,116:248-253,1999）を行い、残りの１群には除菌しない対照群として抗生剤を加えていない溶液を投与した。この投与は２週間の連続投与によって行った。除菌処理が終了した２週間後に除菌処理群のうちの１群及び除菌していない対照群を屠殺し、前記の操作によってパラフィン包埋を行った。残りの除菌処理群のうち、片方の群には前記の操作と同様のＮｏ．１０８８の死菌１×１０９ＣＦＵ相当量をＰＢＳに懸濁したものを経口投与し、もう一方の群には等量のＰＢＳを経口投与した。投与は１日１回、１０日間連続で行い、最終の投与より２４時間後にマウスを屠殺し、前記の操作によってパラフィン包埋を行った。また、上記のマウスの作製過程は図４上段にも示した。
【００２５】
４−２）胃組織切片の作製
上記の操作によって得られたパラフィン包埋ブロックをミクロトームにて２μｍの厚さで薄切し、シランコーティーングスライドグラスに貼り付け、６２℃下で一晩乾燥させ作製した。
【００２６】
４−３）胃組織切片を用いたガストリンの免疫染色
作製した切片をキシレン及びエタノール処理にて脱パラフィンを行った後、ターゲット・レトリーバル・ソリューションを用い９８℃下１０分間でマイクロウエーブを行い抗原を賦活化した。その組織切片に一次抗体としてラビット・ポリクローナル・抗ガストリン抗体を４℃下で一晩反応させた後、二次抗体としてゴート・抗ラビット・アイジージー・アレクサ４８８修飾抗体を室温下で２時間反応させ、退色封入剤を用いて封入した。
【００２７】
４−４）蛍光顕微鏡での観察
染色した組織切片を蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００にて観察、撮影した。その結果、まずヘリコバクター・ピロリ保菌マウスとヘリコバクター・ピロリ非感染マウス（ＰＢＳ投与群）を比較すると、ヘリコバクター・ピロリ保菌マウスにおいてガストリン陽性細胞の数が減少していることが認められた。次に、ヘリコバクター・ピロリを除菌したマウスでは、除菌していないマウスと比較してガストリン陽性細胞の数が増加していることが認められた。さらに、除菌後にＮｏ．１０８８の死菌を投与した群とＰＢＳを投与した群を比較すると、Ｎｏ．１０８８死菌投与群においてガストリン陽性細胞の数が減少していることが認められた。
【００２８】
４−５）ガストリン陽性細胞数の統計学的解析
上記のサンプルにおいて、各群のガストリン産生の変化を組織切片から統計学的に解析するため、組織写真中の胃幽門部における粘膜層の長さをアキシオヴィジョンにて計測し、その中のガストリン陽性細胞数を目視にて計測、単位長（１ｍｍ）あたりのガストリン陽性細胞数（個）に換算した。それらの数値をＳＰＳＳを用いたマンホイットニー・ユー・テストでそれぞれのサンプルを採取した週齢間で行った結果を図４に示す。
まずヘリコバクター・ピロリ保菌マウスとヘリコバクター・ピロリ非感染マウス（ＰＢＳ投与群）を比較すると、ヘリコバクター・ピロリ保菌マウスにおいてガストリン陽性細胞の数が減少していることが有意に認められた。次に、ヘリコバクター・ピロリを除菌したマウスでは、除菌していないマウスと比較してガストリン陽性細胞の数が増加していることが有意に認められた。さらに、除菌後にＮｏ．１０８８の死菌を投与した群とＰＢＳを投与した群を比較すると、Ｎｏ．１０８８死菌投与群においてガストリン陽性細胞の数が約４０％減少していることが有意に認められた。
すなわち、ヒトにおけるヘリコバクター・ピロリ除菌の際に胃酸過多になり、逆流性食道炎のリスクが高まることがガストリンの産生亢進によるものであることが示唆され、またＮｏ．１０８８の死菌を投与することによってガストリンの産生促進を抑制できることが示された。
【００２９】
次に本発明のＰＰＩの継続的投与による副作用の緩和法の実施例を記載するが、本発明は以下の実施例のＮｏ．１０８８に限定されるものではなく、乳酸菌の生菌又は死菌によるものである。
【００３０】
５．ＰＰＩの継続的投与による副作用とＮｏ．１０８８の投与によるその緩和
５−１）Ｎｏ．ｌ０８８生菌投与マウスの作製
４週齢のGF-Balb/ｃ  雄マウスを５匹ずつ６群用意した。そのうちの３群にはＮｏ．１０８８の生菌１×１０９ＣＦＵをＰＢＳに懸濁したものを経口投与し、残りの３群には等量のＰＢＳを経口投与した。
【００３１】
５−２）ＰＰＩの継続的投与
マウスが８週齢に達した時点で、Ｎｏ．１０８８投与マウス及びＰＢＳ投与マウスのうち１群ずつにＰＰＩであるオメプラゾール（アストラゼネカ社）２００μｇをＰＢＳ２００μＬに溶解したものを一日おきに皮下に投与する処置を開始し（ＰＰＩの８週間の連続投与）、１２週齢に達した時点で各投与マウス１群ずつに同様の処置を開始（ＰＰＩの４週間の連続投与）、残りの各投与マウス１群ずつはオメプラゾールの処置は行わず対照群とした。
【００３２】
５−３）胃重量の測定ならびに胃組織切片の作製
各群のマウスが１６週齢になった時点でマウスを屠殺し、体重を量った後、胃を摘出、胃内容物（飼育飼料など）をＰＢＳで洗浄し除去した後、胃重量を計測した。次に採取した胃組織を１０％ホルマリン−ＰＢＳに浸し、室温にて一晩置き固定した。次に、固定された胃組織をエタノールに浸し、キシレンに浸した後、パラフィンを用いて包埋した。これをミクロトームにて２μｍの厚さで薄切し、シランコーティーングスライドグラスに貼り付け、６２℃下で一晩乾燥させ作製した。
【００３３】
５−４）胃組織切片を用いたガストリンの免疫染色
作製した切片をキシレン及びエタノール処理にて脱パラフィンを行った後、ターゲット・レトリーバル・ソリューションを用い９８℃下１０分間でマイクロウェーブを行い抗原を賦活化した。その組織切片に一次抗体としてラビット・ポリクローナル・抗ガストリン抗体を４℃下で一晩反応させた後、二次抗体としてゴート・抗ラビット・アイジージー・アレクサ４８８修飾抗体を室温下で２時間反応させ、退色封入剤を用いて封入した。
【００３４】
５−５）蛍光顕微鏡での観察
染色した組織切片を蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００にて観察、撮影した。ＰＢＳ投与マウスではＰＰＩの投与によってガストリン産生細胞の増加が認められた。一方で、Ｎｏ．１０８８生菌投与マウスではＰＰＩによるガストリン陽性細胞の数の増減はないことが認められた。すなわち、Ｎｏ．１０８８の生菌の投与によってＰＰＩによるガストリンの産生促進を抑制していることが示唆された。
【００３５】
５−６）胃重量比及びガストリン陽性細胞数の統計学的解析
各群のサンプルより胃を摘出する際に計測した体重及び胃重量を用い、胃重量の体重比（％）を算出した。また、各群のガストリン産生の変化を組織切片から統計学的に解析するため、組織写真中の胃幽門部の粘膜層の長さをアキシオヴィジョンにて計測し、その中のガストリン陽性細胞数を目視にて計測、単位長（１ｍｍ）あたりのガストリン陽性細胞数（個）に換算した。それらの数値をＳＰＳＳを用いたクラスカル・ワリス・ティー・テストで解析を行った結果、胃重量の体重比については図５ａに、ガストリン陽性細胞数については図５ｂに示す。ＰＢＳ投与マウスではＰＰＩの投与によって、胃重量比ならびにガストリン産生細胞数が投与期間に比例して有意に増加していた。一方で、Ｎｏ．１０８８投与マウスではＰＰＩによる胃重量比ならびにガストリン産生細胞数の増減はなかった。すなわち、ＰＰＩの継続的投与による副作用であるガストリンの産生過多、胃粘膜細胞の過剰な増殖や巨大化、胃組織の肥大化などをＮｏ．１０８８に代表される乳酸菌の投与によって緩和できると示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上記載したとおり、乳酸菌の生菌又は死菌を投与することで、胃酸及びガストリンの産生を抑制することが示された。すなわち、乳酸菌の生菌又は死菌を摂取することでの胃液中の酸濃度の制御ならびにｐＨの安定化を可能にする医薬品や機能性食品、健康食品などへの利用が可能である。また、乳酸菌の生菌又は死菌を投与することでＰＰＩに代表される胃酸分泌抑制剤の副作用を緩和する医薬品などに利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】蛍光顕微鏡を用いた免疫染色による胃組織中のガストリン陽性細胞像とＮｏ．１０８８の生菌投与によるガストリン陽性細胞数の減少を示す写真
【図２】Ｎｏ．１０８８の生菌投与によるガストリン産生の抑制
【図３】Ｎｏ．１０８８の死菌投与によるガストリン産生の抑制
【図４】ヘリコバクター・ピロリ菌の除菌によるガストリン産生の促進とＮｏ．１０８８の死菌投与による促進の抑制
【図５ａ】胃重量比の統計学的解析
【図５ｂ】ガストリン陽性細胞数の統計学的解析
【図２】
0005075254.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図１】
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