(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルスの感染性ウイルス粒子を産生する方法であって：
培養細胞に、該細胞内で該ウイルスの完全なゲノムvRNA分節を発現する発現ベクターを導入することを含んでなり、ここで、該細胞は該ウイルスの増殖を支持し、かつ、該細胞は核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼを提供し、それにより、該ウイルスのゲノムvRNA分節を含むRNP複合体が形成されて、ヘルパーウイルスの不在下で該感染性ウイルス粒子が該細胞により産生され、そして該細胞はインターフェロンを産生しない、上記方法。
【請求項２】
前記細胞において、前記核タンパク質および前記RNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットから選択される１種以上のタンパク質を発現させるために、１以上の別の発現ベクターを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１種以上の前記核タンパク質および前記RNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットを発現することができる細胞系を用いる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスが２種以上の親ウイルスに由来するvRNA分節をもつ再構築ウイルスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞がベロ細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１において規定された前記発現ベクターが前記ウイルスのゲノムvRNA分節を発現する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
同一または異なる細胞を用いる１回以上の追加の細胞感染ステップにより、前記形成されたウイルス粒子を増幅することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
感染性ウイルス粒子を単離することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスの弱毒化または不活化ステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
必要とされる全ての発現ベクターを、リポソームトランスフェクション試薬、リン酸カルシウム沈降またはエレクトロポレーションを用いて、前記細胞中に共トランスフェクトする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記発現ベクターがすべてプラスミドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１において規定された前記発現ベクターが、前記ウイルスの各vRNA分節を発現させるための別個の発現ベクターから構成される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
各vRNA分節の発現が哺乳動物PolIプロモーターに由来するプロモーター配列の制御下にある、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロモーター配列が、対応する天然プロモーターのヌクレオチド-250から-1までからなるトランケートされたヒトPolIプロモーター配列またはT7 RNAポリメラーゼプロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現ベクター中の各vRNA分節のコード配列の後に前記各RNAの正しい3'末端をつくるリボザイム配列または転写ターミネーターが続く、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記別の発現ベクターからの１種以上のウイルスタンパク質の発現が、ヒトアデノウイルス２型のスプライスされた三分節リーダー配列に連結されたアデノウイルス２主要後期プロモーターもしくはヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターから選択される調節配列、またはT7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下にある、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
ワクチン組成物中に弱毒化または不活化ウイルスを組み入れることをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスが、該ウイルスに感染した標的細胞中で該ウイルスに対して異種の配列の発現を指令することができる少なくとも１つのvRNA分節を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスに対して異種の配列が抗原ペプチドまたは抗原ポリペプチドをコードし、そして、前記方法が、該ウイルスをワクチン組成物中に組み入れることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記感染性ウイルス粒子を産生する請求項１または５に記載の方法によって産生された細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の改変された細胞を培養することを含む、分節化(−)鎖ウイルスの感染性ウイルス粒子の産生方法。
【請求項２２】
培養細胞において、Ａ型インフルエンザウイルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法であって：
細胞を用意することを含んでなり、ここで、該細胞は該ウイルスの増殖を支持する能力があり、かつ、(a)該ウイルスのゲノムvRNAと、(b)核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼと、を提供するよう改変されており、それにより、該ゲノムvRNAを含むRNP複合体が形成されて該感染性ウイルス粒子が組み立てられ、該ゲノムvRNAは該細胞内で哺乳動物PolIプロモーターまたはT7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に、ヘルパーウイルスの不在下で直接発現され、
そして該細胞はインターフェロンを産生しない、上記方法。
【請求項２３】
同一のまたは異なる細胞を用いる１回以上の追加の細胞感染ステップにより組み立てられた前記ウイルス粒子を増幅することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
感染性ウイルス粒子を単離することをさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスの弱毒化または不活化ステップをさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ワクチン組成物中に弱毒化ウイルス粒子または不活化ウイルス粒子を組み入れることをさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスが、該ウイルスに感染した標的細胞中で該ウイルスに対して異種の配列の発現を指令することができる少なくとも１つのvRNA分節を含み、そして、前記方法が、該ウイルスを、適宜に弱毒化または不活化した後で、製薬上許容される担体または希釈剤と共に医薬組成物中に組み入れることをさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞がベロ細胞である、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記感染性ウイルス粒子を産生する、請求項２２または２８の方法によって産生された細胞。
【請求項３０】
請求項２９に記載の改変された細胞を培養することを含む、分節化(−)鎖ウイルスの感染性ウイルス粒子の産生方法。
【請求項３１】
増幅に使用される細胞がMDBK細胞またはMDCK細胞である、請求項７〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
増幅に使用される細胞がMDBK細胞またはMDCK細胞である、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ワクチンとして使用されるウイルス粒子のin vitro産生のための、請求項１〜１６、２１〜２５、２８または３０〜３２のいずれか１項に記載の方法により産生されたウイルス粒子の使用。
【請求項３４】
ウイルス粒子の産生に使用される細胞のin vitro感染のための、請求項１〜１６、２１〜２５、２８または３０〜３２のいずれか１項に記載の方法により産生されたウイルス粒子の使用。
【請求項３５】
ワクチンのin vitro調製のための、請求項１〜１６、２１〜２５、２８または３０〜３２のいずれか１項に記載の方法により産生されたウイルス粒子の使用。
【請求項３６】
前記in vitro産生、感染または調製が孵化鶏卵内で起こる、請求項３３、３４または３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
前記細胞が核タンパク質をもたらすことができるように改変されたものである、請求項１〜１９、２１〜２８または３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
産生された該ウイルス粒子を、ワクチンとして使用されるウイルス粒子の産生のために使用することをさらに含む、請求項１〜１６、２１〜２５、２８、３０〜３２、３５または３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３３または３４において産生されたウイルス粒子の使用であって、該ウイルスは、ワクチン製造用のＡ型インフルエンザウイルスである、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、培養細胞において、組換えDNAから、分節化した(−)鎖RNAウイルスを再構築（レスキュー）することに関する。さらに特定すると、本発明は、例えば、３分節より多いゲノムvRNA分節をもつウイルス（特に、通常は８ゲノムvRNA分節をもつインフルエンザウイルス）を、ヘルパーウイルスの必要性を回避する完全なベクター駆動系によって、レスキューすることに関する。
【０００２】
ここ５年間で、組換えDNAから重要な非分節化(−)鎖RNAウイルスの大半をレスキューできることが証明された。最初に、Schnellらが、組換えDNAからの狂犬病ウイルスの回収に成功した(EMBO J. (1994) 13, 4195-4203)。その直後に、プラスミドをベースとしたレスキュー系が水疱性口内炎ウイルス(Lawsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 4477-4481; Whelanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 8388-8392)、レスピラトリー・シンシチアルウイルス(Collinsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 11563-11567; Jinら, Virology (1998) 251, 206-214)、麻疹ウイルス(Radeckeら, EMBO J. (1995) 14, 5773-5784)、およびセンダイウイルス(Garcinら, EMBO J. (1995) 14, 6087-6094; Katoら, Genes Cells (1996) 1, 569-579)について開発された。比較的最近では、ヒトのパラインフルエンザ３型(Durbinら, Virology (1997) 235, 323-332; HoffmanおよびBanerjee, J. Virol. (1997) 71, 4272-4277)、牛疫ウイルス(BaronおよびBarrett, J. Virol. (1997) 71, 1265-1271)、シミアンウイルス５(Heら, Virology (1997) 237, 249-260)、ウシのレスピラトリー・シンシチアルウイルス(Buchholzら, J. Virol. (1999) 73, 251-259)、およびニューカッスル病ウイルス(Peetersら, J. Virol. (1999) 73, 5001-5009)についてのプラスミドベースのレスキュー系が開発されている。
【０００３】
BridgenおよびElliott(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 14, 15400-15404)は、アンチゲノムRNAおよびウイルスタンパク質をバクテリオファージT7プロモーターの制御下で発現させることにより、cDNAからゲノムvRNA分節を３つしかもたないブンヤウイルスのヘルパーウイルスフリーレスキュー(helper virus-free rescue)を報告している。しかしながら、インフルエンザウイルスのようなvRNA分節数のより多い分節化(−)鎖RNAウイルスを、ヘルパーウイルスの助けをかりずに、レスキューするために、完全にプラスミドに基づいたストラテジーを成功裏に使用できるか否かは、これまでのところ不明である。
【０００４】
インフルエンザは世界中でヒトの健康を絶えず脅かす存在であり、したがって、ゲノムvRNA分節のいずれかに突然変異のあることが知られた改変型インフルエンザウイルスをすぐに作製できる方法が必要とされている。また、異種配列を発現させるためのインフルエンザvRNA分節の遺伝子工学的操作も、例えばインフルエンザウイルスと第２の病原体に対して有効な新ワクチンを開発する上で、非常に関心がもたれている。Ａ、ＢおよびＣ型と呼ばれる３種類のインフルエンザウイルスが知られている。これまでは、主としてＡ型インフルエンザウイルスが遺伝子操作に関して注目されてきた。野生型のＡ型インフルエンザウイルスのゲノムは８分節の一本鎖(−)センスRNAから構成されており、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質(PB1、PB2およびPA)、核タンパク質(NP)、マトリックスタンパク質(M1、M2)、リポタンパク質外被から突き出ている２つの表面糖タンパク質（ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)）、ならびに非構造タンパク質NS1およびNS2からなる10種類のポリペプチドをコードしている。HA、NA、NPおよびポリメラーゼタンパク質はモノシストロン性のゲノム分節によりコードされている。
【０００５】
他の分節化した(−)鎖RNAウイルスの場合と同様に、インフルエンザウイルスの複製サイクル中に、そのウイルスゲノムはmRNAに転写されて、相補的RNA(cRNA)に複製される。そのためには、ゲノムvRNA分節が核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼと会合してリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成する必要がある(Huangら, J. Virol. (1990) 64, 5669-5673; Garcia-Sastre, Trends In Biotechnology (1998) 16, 230-235)。初期には、インフルエンザウイルスのゲノムを操作するために、精製したインフルエンザウイルスから単離されたポリメラーゼタンパク質PB1 、PB2、PAおよび核タンパク質の存在下でプラスミドDNAから転写されたRNAからin vitroでRNPを再構築していた(Enamiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87, 3802-3805; EnamiおよびPalese, J. Virol. (1991) 65, 2711-2713; MusterおよびGarcia-Sastre, Textbook of influenza (1998), ch. 9, Nicholsonら編中のGenetic manipulation of influenza viruses)。in vitroで再構築されたRNPを、ヘルパーインフルエンザウイルス（残りの必要なウイルスタンパク質とRNA分節を提供する）に感染させた細胞にトランスフェクトすると、トランスフェクタントウイルスが生じる。この技術はインフルエンザウイルスの分子生物学および病原性の理解を深める上できわめて有用であった。しかしながら、ヘルパーウイルスからトランスフェクタントウイルスを分離するには、高度に専門的な選別法が必要であるため、その使用は限られた数のウイルス株の特定のRNA分節に制限されてしまう。
【０００６】
近年、細胞内で転写されたvRNA分節からのRNP複合体の細胞内再構築は、プラスミドにより発現されたNPおよびポリメラーゼタンパク質を用いても可能であることが判明した(Neumannら, Virology (1994) 202, 477-479; ZhangおよびAir, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1994) 200, 95-101; Pleschkaら, J. Virol. (1996) 70, 4188-4192)。例えば、Pleschkaらは、プラスミドから発現させたＡ型インフルエンザのPB1 、PB2、PAおよびNPが、トランスフェクトされたヒト293細胞中で包膜し、転写し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子を含むインフルエンザウイルスvRNA様RNAを複製することを明らかにした。このvRNA様レポーター遺伝子を、vRNAコード領域の上流にトランケート型ヒトRNAポリメラーゼＩプロモーター（ヌクレオチド-250から-1）を有するプラスミドDNA(pPOLI-CAT-RT)のトランスフェクションにより所定の宿主細胞に導入した。転写されたvRNAの正しい3'末端を得るためのRNAプロセッシングを確実にする目的で、デルタ肝炎ウイルスのゲノムリボザイム配列をvRNAコード領域の下流に位置づけた。さらに、同じ研究グループによって、CATレポーター遺伝子をコードするプラスミドを、真正Ａ型インフルエンザvRNA分節をコードするプラスミドで置き換えることによって、細胞内で再構築されたRNP複合体は、トランスフェクト細胞にインフルエンザヘルパーウイルスを感染させると、トランスフェクタントウイルスへとレスキューされることが報告された。このようなヘルパーウイルスに基づくレスキュー系は、Pleschkaらによって、細胞内転写された突然変異Ａ型インフルエンザNA vRNA分節を用いて研究された。しかし、インフルエンザウイルスのための完全にプラスミドをベースとしたレスキュー系への動きは、必要とされる全配列の十分な発現および完全なウイルスを組み立てるためのこれら配列の正しい協力を得ることに関して、新たな問題点を提起した。
【０００７】
BridgenおよびElliottは、アンチゲノムRNAではなくゲノムvRNAセグメントの発現を指令するプラスミドを用いて、Bunyamweraブンヤウイルスをレスキューすることに失敗した。しかし、今回、細胞培養物でのＡ型インフルエンザウイルスのヘルパーウイルスフリーレスキューが、８分節のvRNAと、RNP複合体の形成に必要な核タンパク質および３種のRNAポリメラーゼタンパク質と、を共発現することができる12のプラスミドの培養細胞への共トランスフェクションにより実現可能であることが見いだされた。この同じストラテジーを、多数のゲノムRNA分節（例えば、６分節以上）をもつ他の種々の分節化(−)鎖RNAウイルス、例えば、他の型のインフルエンザウイルス、６分節のvRNAを含むトゴトウイルス(thogotovirus)などのオルソミクソウイルス科の他のメンバーに応用することができる。野生型のＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスはともに８分節のvRNAをもつが、追加のvRNA分節をもつ改変型のＡ型インフルエンザウイルスが記載されており(Enamiら, Virology (1993) 185, 765-90)、Ｃ型インフルエンザウイルスは１分節少ないvRNAをもつ。
【０００８】
発明の概要
本発明は、したがって、培養細胞において、３分節より多いゲノムvRNA分節をもつ分節化(−)鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法を提供し、前記方法は、
(i) 第１の集団の細胞を用意すること、ここで、該細胞は、該ウイルスの増殖を支持する能力があり、かつ、ゲノムRNA分節をもたらすヘルパーウイルスの不在下で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA分節を提供するゲノムvRNA分節または対応するcRNAを直接発現することができる第１のセットの発現ベクターを導入したものであり、
さらに、該細胞は核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼをもたらす能力があり、それにより、該ウイルスのゲノムvRNA分節を含むRNP複合体を形成して、該細胞内で該ウイルス粒子を組み立てることができること、
(ii) 該細胞を培養することにより、該ウイルス粒子を産生させること、
を含んでなる。
【０００９】
選ばれた宿主細胞は、例えば、さらに該細胞内で１種以上の必要なウイルスタンパク質の発現を指令することができる１以上の別の発現ベクターを導入していてもよい。例えば、第２のセットの発現ベクターは宿主細胞において核タンパク質とRNA依存性ポリメラーゼサブユニットの全てを発現させるために使用しうる。有利には、これらタンパク質のそれぞれのための個別の発現ベクターを用いる。あるいはまた、選ばれた宿主細胞は、例えば、必要な核タンパク質とRNA依存性ポリメラーゼサブユニットの１種以上を発現するように遺伝子操作されてもよい。vRNAの包膜（キャプシド化）、転写および複製に不可欠な全タンパク質が出発宿主細胞によって提供される場合は、第１のセットの発現ベクターのみが必要となることが理解されよう。さらに、選ばれた出発宿主細胞は、所望のウイルスのゲノムvRNA分節の１以上を発現するように遺伝子操作された細胞であってもよい。本発明の方法を用いることにより、分節化(−)鎖RNAウイルスのレスキューを、いかなるウイルスの助けもかりずに、例えば完全にプラスミドに基づいた方法で、達成できることが理解されるだろう。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、培養細胞において、分節化(−)鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法を提供し、前記方法は、
(i) 第１の集団の細胞を用意すること、ここで、該細胞は、該ウイルスの増殖を支持する能力があり、かつ、(a) ヘルパーウイルスの不在下で該ウイルスのゲノムvRNAと、(b) 核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼと、をもたらす能力があり、それにより、該ゲノムvRNAを含むRNP複合体を形成して、該ウイルス粒子を組み立てることができるように改変されており、
該ゲノムvRNAは該細胞内でヒトPolIプロモーターまたはその機能性誘導体の制御下に直接発現されること、
(ii) 該細胞を培養することにより、該ウイルス粒子を産生させること、
を含んでなる。
【００１１】
上記のようにウイルスレスキュー用に改変された宿主細胞は本発明の別の態様を構成することが理解されるだろう。第１の集団の細胞により産生されたウイルス粒子は、例えば、第１の集団の細胞と同一のまたは異なる培養細胞を用いて、１回以上のさらなる細胞感染ステップで増幅することができる。使用のために、このようにして産生されたウイルス粒子を単離することができる。
【００１２】
宿主細胞により最初に産生されたウイルス粒子が弱毒化されていない場合は、例えばワクチン用に製剤化する前に、通常の弱毒化またはウイルス不活化ステップを行なうことができる。本発明により作製されるウイルス粒子は、異種配列を発現することができる組換えウイルス粒子であってもよい。また、そのような粒子は、必要ならば適宜に弱毒化または不活化した後で、ワクチン用にまたは他の治療目的のために製剤化することができる。
【００１３】
初期のヘルパーウイルスに基づいたインフルエンザウイルスレスキュー法とは対照的に、本発明の方法は、いくつかの異なる遺伝子に同時に複数の突然変異を含むＡ、ＢおよびＣ型のいずれの感染性インフルエンザウイルスの作製にも容易に適用することができる。かかる方法はまた、２種以上の親ウイルスに由来するvRNA分節を含む再構築分節化(−)鎖ウイルスの、より簡便で、より直接的な生産を可能とする。通常、再構築ウイルスは混合ウイルス感染の細胞からウイルス粒子をスクリーニングすることにより得られる。本発明の方法は、古典的な方法で単離するのが難しい再構築分節化(−)鎖ウイルスの生産に特に有利である。
【００１４】
図面の説明
図１は、実施例１〜３に記載した本発明の実施形態の概略図であり、Ａ型インフルエンザウイルスのvRNA分節の直接発現、およびＡ型インフルエンザ核タンパク質とRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットの発現のための12のプラスミドが培養ベロ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）に共トランスフェクトされる。この実施形態では、レスキューされたウイルス粒子のプラークアッセイおよび増幅のために、MDBK（Madin-Darbyウシ腎臓）細胞が用いられる。しかし、ベロ細胞やMDCK（Madin-Darbyイヌ腎臓）細胞を含めて、Ａ型インフルエンザウイルスの増殖を支持する他の細胞も同様にプラークアッセイおよび増幅に使用できることが理解されよう。図１において、POL I＝トランケートされたヒトRNAポリメラーゼＩプロモーター、R＝ゲノム肝炎ウイルスリボザイム、MLP＝ヒトアデノウイルス２型のスプライスされた三分節リーダー配列を含む合成配列に連結されたアデノウイルス２型主要後期プロモーター、およびpA＝SV40由来のポリアデニル化配列。
【００１５】
詳細な説明
発現ベクターを用いて、所望のウイルスのゲノムvRNA分節を直接発現させることが好適である。これらは完全に野生型のvRNA分節であってもよいし、また、少なくとも１つの非野生型vRNA分節、例えば１以上のヌクレオチド置換、挿入または欠失をもつ変異型vRNA分節を含んでいてもよい。
【００１６】
例えば、宿主細胞において提供される少なくとも１つのvRNA分節は、レスキューされたウイルスに感染している標的細胞内で、ウイルスゲノムに対して異種の配列を発現しうるキメラvRNA分節であってよい。そのような異種配列はペプチドまたはポリペプチドをコードしうる。あるいは、それはリボザイムやアンチセンス核酸のような核酸をコードしてもよい。異種配列は、実施例８に記載したキメラvRNA分節により例示されるように、完全な天然ウイルスタンパク質をさらにコードするvRNA分節上に提供されるか、またはウイルスタンパク質のコード配列に挿入される。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスのHAタンパク質は、抗原部位Ｂにおいてエピトープグラフト化(epitope-grafting)を許容できることが知られている。そのようなキメラvRNA分節を構築する方法については、例えば、MusterおよびGarcia-Sastre, Ch.9, Textbook of Influenza (1998)およびPaleseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 11354-11358を参照されたい。また、キメラインフルエンザウイルスvRNA分節を構築するためのストラテジーは、公開された国際特許出願WO 91/03552にすでに記載されている。
【００１７】
宿主細胞において提供されるvRNA分節は、追加的にまたは代わりに、１以上の弱毒化性突然変異を組み込んでいてもよい。例えば、vRNA分節は、パン-ハンドル二重鎖プロモーター領域に弱毒化性の塩基対置換、特に、例えばNA特異的vRNAの二重鎖領域の位置11-12'におけるCからAへのおよびGからUへの既知の弱毒化性塩基対置換、をもつＡ型インフルエンザウイルスのvRNA分節であり得る(Fodorら, J. Virol. (1998) 6283-6290)。本発明のレスキュー系を用いることによって、新たな弱毒化性の突然変異を同定することができる。しかし、上述したように、本発明の方法によって最初に弱毒化されていないウイルス粒子が産生されたならば、例えば古典的な方法で、その後ウイルス粒子の弱毒化または不活化を行なうことができる。
【００１８】
本発明に従って産生された弱毒化または不活化ウイルスは、続いて、慣用方法でワクチン組成物中に組み入れることができる。そのようなウイルスが外来抗原をコードする上記のようなキメラvRNA分節をもつ場合は、２種以上の病原体に対して同時にワクチン接種するために該ウイルスが製剤化される。本発明により産生されたキメラvRNA分節を保有する弱毒化組換えウイルスは、その他の治療用途、例えば抗腫瘍薬または遺伝子治療用ツールとしても設計することができ、その場合には、ウイルスの生産後に、該ウイルスを製薬上許容される担体または希釈剤と共に適切な医薬組成物中に組み入れる。
【００１９】
上でも示したように、本発明によるヘルパーウイルスフリーレスキューは、再構築ウイルス、特にワクチン用に所望される再構築インフルエンザウイルスの作製に有利である。例えば、本発明によるウイルスレスキューを用いて、インフルエンザウイルス（例えば、ヒトへの投与に適すると認められているインフルエンザA/PR8/34）のHAおよびNA vRNA分節を、インフルエンザ感染症の流行に関係したインフルエンザ株のHAおよびNA vRNA分節と簡単に置換することができる。そのような再構築インフルエンザウイルスは、例えば、慣用方法で不活化インフルエンザワクチンの製造に使用することができる（実施例４および６参照）。
【００２０】
用いる発現ベクターは、好ましくは、選ばれた宿主細胞内で複製する能力があるプラスミドである。必要とされるそれぞれのvRNA分節または対応するcRNAを直接発現させるために別個の発現ベクターを提供してもよい。すでに上述したように、核タンパク質および個々のRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニット（例えば、インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼのPB1、PB2およびPAサブユニット）のそれぞれに対して第２のセットの発現ベクターを提供してもよい。しかし、上でも示したように、これらのタンパク質の１種以上を発現することができる細胞系を使用してもよく、その場合には第２のセットの発現ベクターを減らしたり、排除さえしてもよい。実施例７には、核タンパク質を安定的に発現している細胞系を用いた、そのようなＡ型インフルエンザウイルスのヘルパーウイルスフリーレスキュー法が示される。
【００２１】
必要とされる全ての発現ベクターは、好ましくは、１回の共トランスフェクションまたは共形質導入ステップで所定の宿主細胞に導入される。そのためには、リポソームトランスフェクションを利用することが好ましく、例えば、DOTAPリポソームトランスフェクション試薬(Boehringer Mannheim) またはLipofectAMINE 2000(Gibco BRL)を用いる。しかしながら、２回以上のベクター導入ステップを行なってもよく、哺乳動物細胞にベクターを導入するための他の公知方法、例えばエレクトロポレーション、DEAE−デキストラントランスフェクション、微粒子ボンバードメント、およびウイルス形質導入（例えば、複製欠損レトロウイルスの使用）を利用できることが理解されるだろう。また、リン酸カルシウム沈降も特に好ましいものである（実施例５参照）。例えば、NPおよびポリメラーゼタンパク質発現用の発現ベクターを宿主細胞に導入し、その後vRNA分節発現用の発現ベクターを導入するように選択しうる。必要なベクターが導入される宿主細胞は培養皿上にあってもよいし、ベクタートランスフェクションまたは形質導入のための他の適当な方法で培養してもよい。
【００２２】
vRNA分節または対応するcRNAの発現は、好ましくは、哺乳動物RNA PolIプロモーターに由来するプロモーター配列の制御下におかれる。この目的に特に好適なものは、対応する天然プロモーターのヌクレオチド-250から-1までのトランケートされたヒトRNA PolIプロモーターまたはその機能性誘導体である(Jonesら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 669-673)。しかし、これとは別に、T7 RNAポリメラーゼプロモーターをはじめとする他のプロモーターを使用してもよい。発現されたそれぞれのvRNAまたはcRNAの正しい3'末端を確実にするために、各vRNAまたはcRNA発現ベクターは、RNAコード配列の下流に、リボザイム配列または適切なターミネーター配列を含むだろう。これは、例えば、デルタ肝炎ウイルスのゲノムリボザイム配列またはその機能性誘導体でありうる。あるいはまた、例えば、PolIターミネーターを使用してもよい(Neumannら, Virology (1994) 202, 477-479)。RNA発現ベクターは、Pleschkaら, J. Virol. (1996) 70, 4188-4192に記載されるvRNA発現ベクターと同様の方法で作製することができる。
【００２３】
１以上のタンパク質発現ベクターがRNP複合体の形成のためにウイルスタンパク質を発現する必要がある場合は、それらは所望のウイルスに対して相同なウイルスタンパク質を発現することが好ましい。核タンパク質とRNA依存性ポリメラーゼサブユニットの発現は、好ましくは、例えば、Bergら, BioTechniques, 14, 972-978に記載されるような、ヒトアデノウイルス２型のスプライスされた三分節リーダー配列に連結されたアデノウイルス２主要後期プロモーターを含む調節配列、または該調節配列の機能性誘導体の制御下におかれる。しかしながら、哺乳動物細胞内で機能しうる代替プロモーター配列、例えばヒトサイトメガロウイルス(CMV)即時型プロモーターまたはT7ポリメラーゼプロモーターなどの他のウイルスプロモーターで置換することもできよう。NPおよびポリメラーゼサブユニット発現用の適切なプラスミドは、例えば、Bergらの上記論文に記載されるプラスミドpGT-hから出発して、作製することができる。
【００２４】
以下で、Ａ型インフルエンザウイルスのレスキューについて詳述することにより、本発明をさらに説明することにする。必要とされるvRNAを直接発現するプラスミドを利用した本発明のストラテジーによるＡ型インフルエンザウイルスのレスキューのためには、例えばベロ（アフリカミドリザル腎臓由来）細胞を用いることが有利であると分かったが、インフルエンザウイルスの増殖を支持する他の細胞、例えば好ましくは293Tヒト胚性腎細胞を使用することもできる。そのような細胞は適当な培養皿の表面上でトランスフェクトされることが好ましい。
【００２５】
ベロ細胞はインターフェロン発現に欠陥のあることが知られており(Diazら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85, 5259-5263)、このことは良好なウイルスレスキューを得るための一要因でありうる。それゆえに、本発明の実施においては、ベロ細胞およびインターフェロン活性または応答に欠陥のある他の細胞が有用であると推測され、これらの細胞は分節化した(−)鎖RNAウイルスの増殖を支持するだろう。
【００２６】
本発明の方法を実施するためのベクターの適切な量および比率は、ルーチンな実験操作により決定することができる。一つの指針としては、宿主細胞へのプラスミドのリポソームトランスフェクションまたはカルシウム沈降の場合、各プラスミドを数μg、例えば１〜10μgで使用して、慣用の方法でトランスフェクション試薬と混合する前に約0.1μg/mlの最終合計DNA濃度にまで希釈することが考えられる。NPおよび／またはRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットを発現するベクターは、vRNA分節を発現するベクターよりも高濃度で使用することが好ましいかもしれない。
【００２７】
さらなる態様において、本発明はさらに、培養細胞において、分節化した(−)鎖ウイルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法を提供し、前記方法は、
(i) １つの集団の細胞を用意すること、ここで、該細胞は、該ウイルスの増殖を支持する能力があり、かつ、(a) ヘルパーウイルスの不在下で該ウイルスのゲノムvRNAと、(b) 核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼと、をもたらす能力があり、それにより、該ゲノムvRNAを含むRNP複合体を形成して、該ウイルス粒子を組み立てることができるように改変されており、
該ゲノムvRNAは該細胞内で哺乳動物PolIプロモーターまたはその機能性誘導体（例えば、上記のトランケートされたヒトPolIプロモーター）の制御下に直接発現されること、
(ii) 該細胞を培養することにより、該ウイルス粒子を産生させること、
を含んでなる。
【００２８】
そのようなウイルス産生細胞は、例えば好ましくは、ベロ細胞または分節化した(−)鎖RNAウイルスの増殖を支持するインターフェロン活性または応答に欠陥のある他の細胞でありうる。前記ゲノムvRNA、核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼのコード配列の全部または一部は、選ばれた宿主細胞に発現ベクターを導入することで、該細胞内に提供され得る。
【００２９】
以下の実施例は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘルパーウイルスフリーレスキューに関して本発明を例示するものである。しかし、上述したとおり、本発明はそのようなウイルスに限定されるものではなく、他の分節化(−)鎖RNAウイルス、例えば他の型のインフルエンザウイルスにも応用することができる。
【００３０】
実施例
実施例１
Ａ型インフルエンザウイルスのvRNA分節をコードするプラスミドの作製
インフルエンザA/WSN/33の異なるvRNA分節をそれぞれ発現する８種のプラスミド(pPOL1-PB2-RT、pPOL1-PB1-RT、pPOL1-PA-RT、pPOL1-HA-RT、pPOL1-NP-RT、pPOL1-NA-RT、pPOL1-M-RT、およびpPOL1-NS-RT)を用いた。これらは、Pleschkaら(1996) J. Virol. 70, 4183-4192に記載される、vRNA分節をコードするモデルプラスミドpPOL1-CAT-RTと構造上類似するpUC19またはpUC18系のプラスミドであるが、ただし、vRNA CATレポーター遺伝子分節をコードするcDNA（インフルエンザA/WSN/33のNSコード化vRNA分節の非コード領域により挟まれた負の極性のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのオープンリーディングフレーム）が、インフルエンザA/WSN/33の天然vRNA分節をコードするcDNAで置換されている。前記プラスミドのそれぞれにおいては、トランケートされたヒトRNA PolIプロモーター(位置-250から-1)をvRNA分節コード化cDNAの末端に融合させて、転写されるvRNAの正しい5'末端を確実なものにした。また、vRNA分節コード化プラスミドのそれぞれにデルタ肝炎ウイルスのゲノムリボザイム配列を含めて、転写されるvRNAの正しい3'末端を確実なものにした。
上記プラスミドのcDNA挿入断片を調製するためのインフルエンザA/WSN/33のサンプルは、例えばW.H.O. Collaborating Centre, Division of Virology, National Institute for Medical Research (London, U.K.)から入手可能である。
【００３１】
実施例２
インフルエンザA/WSN/33のPB1、PB2、PAおよびNPタンパク質の発現用プラスミドの作製
さらに、４種の発現プラスミド(pGT-h-PB1、pGT-h-PB2、pGT-h-PA、およびpGT-h-NP)を作製した。各プラスミドは、必要とされるPB1、PB2、PAおよびNPタンパク質から選ばれた異なるタンパク質を、ヒトアデノウイルス２型のスプライスされた三分節リーダー配列を含む合成配列に連結されたアデノウイルス２主要後期プロモーターの制御下で発現することができる。このプロモーターは無血清懸濁培養に適応させた細胞においてタンパク質の高レベル発現をもたらすことが以前に報告されている(Bergら(1993) BioTechniques, 14, 972-978)。pGT-hセットのタンパク質発現プラスミドは、pGT-hプラスミドのBc1Iクローニング部位にPB1、PB2、PAおよびNPタンパク質のオープンリーディングフレームを挿入することにより構築した(Bergら(1993) 前掲)。
【００３２】
ウイルス核タンパク質と３種類のウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼのタンパク質サブユニットをコードする発現プラスミドを、発現プラスミドpPOL1-CAT-RTをもつヒト293細胞またはベロ細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクトされたヒト293細胞とベロ細胞の両方において、CAT活性が検出された。以下で詳述するトランスフェクトされたvRNA分節からのインフルエンザA/WSN/33のヘルパーウイルスフリー作製のためにはベロ細胞が選ばれたが、その理由は、ベロ細胞がヒト293細胞よりも良好なインフルエンザA/WSN/33の増殖を支持するからである（最大ウイルス力価において約１logの差）。
【００３３】
実施例３
インフルエンザA/WSN/33のヘルパーウイルスフリーレスキュー
ウイルスレスキューのため、直径8.5cmの培養皿上のほぼ集密的なベロ細胞（培養皿の約90%を覆う約107個の細胞）を、上記の４種のタンパク質発現プラスミドと８種のvRNA転写プラスミドにより共トランスフェクトした。この共トランスフェクションステップでは、５μgずつのポリメラーゼタンパク質発現プラスミド、10μgのNP発現プラスミド、および３μgずつの８種のvRNAコード化プラスミドを、20mM Hepesバッファー(pH7.5)により0.1μg/μlの濃度に希釈した。このDNA溶液を、240μlのDOTAPおよび720μlの20mM Hepesバッファー(pH7.5)を含む希釈DOTAPリポソームトランスフェクション試薬(Boehringer Mannheim)に添加した。トランスフェクション混合物を室温で15分インキュベートし、その後0.5%ウシ胎児血清(FCS)、0.3%ウシ血清アルブミン(BSA)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む6.5mlの最少必須培地(MEM)と混合した。この混合物をPBSで洗浄したベロ細胞に加えた。24時間後、トランスフェクション培地を細胞から取り出し、0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む８mlの新鮮な培地(MEM)と取り替えた。トランスフェクトされたベロ細胞はトランスフェクション後少なくとも４日間培養した。毎日、トランスフェクト細胞からの培地を回収し、慣用方法によりMDBK細胞上で0.5mlアリコートを培養してプラークを形成させることにより、インフルエンザウイルスの存在をアッセイした。培地の残りは、レスキューされたウイルスの増幅のために亜集密的MDBK細胞の75cm2フラスコ中に移した。もとのトランスフェクト細胞は８mlの新鮮な培地を加えた後でさらにインキュベートした。
【００３４】
この手順により、トランスフェクション後４日目に感染性のインフルエンザウイルスが回収された。約107個の細胞を含む8.5cm培養皿から約10〜20個のプラーク形成性ウイルス粒子が得られた。レスキューされたウイルスはインフルエンザA/WSN/33ウイルスに特徴的な特定の性質を示した。すなわち、それはトリプシンの不在下においてMDBK細胞上でプラークを形成した。レスキューされたウイルスが形成したプラークは、大きさの点で、同じMDBK細胞上で増殖させた対照の真正A/WSN/33ウイルスサンプルによって形成されたプラークに匹敵するものであった。
【００３５】
トランスフェクト細胞の培地から回収したウイルスにより処理したMDBK細胞上で観察されたウイルスプラークが、クローン化cDNAに由来するものであることを確かめるために、８種のvRNA分節cDNAのうちの２種に遺伝的タグを導入した。HA vRNA分節の3'末端付近に６ヌクレオチドの突然変異をもつ該分節をコードするcDNAを構築した。3'末端からのヌクレオチド31-35(3'-UUUUG-5')を3'-AAAAC-5'で置換すると、シグナルペプチド内のHAのＮ末端付近のアミノ酸４(K→F)およびアミノ酸５(L→V)でアミノ酸置換が生じた。さらに、ヌクレオチド40にサイレントなC→U突然変異を生じさせた。かかる変更により、ユニークなSpeI部位を含むいくつかの新しい制限部位が導入された。NA分節をコードするcDNAには、新しいユニークなSacI制限部位を導入するようにヌクレオチド1358および1360に２つのサイレント突然変異を含むNA分節をコードする突然変異を起こさせた(Pleschkaら, J. Virol (1996) 70, 4188-4192)。
【００３６】
レスキューされたトランスフェクタントウイルスを感染させたMDBK細胞からの培地を用いてvRNAを単離した。100μlの培地を5uのRNアーゼ不含DNアーゼで処理して、キャリーオーバーの残留プラスミドDNAをすべて除去した。37℃で15分後、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を使ってvRNAを単離した。遺伝的タグを含むと予想されたHAおよびNA vRNAの短い領域をRT-PCRで増幅し、次にそれぞれSpeIおよびSacI制限酵素で消化して分析した。対照として、真正インフルエンザA/WSN/33ウイルスから単離されたvRNAから、HAおよびNA分節の同一領域を同じRT-PCRプライマーを使って増幅した。
【００３７】
レスキューされたウイルスおよび対照ウイルスから得られたPCR産物は大きさが同じであった。レスキューされたウイルスのHAおよびNA分節に由来するものは、それぞれSpeIおよびSacIで消化することができた。しかし、対照のウイルスに対応するPCR産物は、予想どおり、同じ酵素によって消化されなかった。対照のRT-PCR反応において逆転写酵素を省くと、肉眼で見えるPCR産物は全く得られなかった。
【００３８】
注解
上記の研究は、あらゆるヘルパーウイルスの不在下において、個々のvRNA分節用の８種の転写プラスミドおよび必要なNP、PB1、PB2およびPAタンパク質をコードする４種の発現プラスミドをベロ細胞に共トランスフェクトすることにより、Ａ型インフルエンザウイルスをレスキューすることが可能であることを示している。
【００３９】
上記の研究で強調すべき点は、(−)センスvRNA分節を発現させることによってインフルエンザウイルスを作製できた点である。このことは、いくつかの初期の研究と矛盾するようである。初期の研究では、ゲノムが３分節であるBunyamweraウイルスを含めて、(−)鎖RNAウイルスをレスキューするために(＋)鎖RNAを使用することの重要性が強調されている(Schnellら(1994) EMBO J., 13, 4195-4203; RobertsおよびRose (1998) Virology 247, 1-6; BridgenおよびElliot (1996) 93, 15400-15404)。しかし、比較的最近では、(−)センスvRNAからの非分節化(−)鎖RNAウイルスの回収が成功したと報じられている(Katoら(1996) Genes Cells 1, 569-579; Durbinら(1997) Virology 235, 323-332)。
【００４０】
上に示した本発明のプロトコルでは、トランスフェクション後の早い段階で、４種のタンパク質発現プラスミドからの(＋)センスmRNAが、転写プラスミドから転写された裸の(−)センスゲノムvRNAと共存する。こうして、二本鎖RNAが形成される。かかる二本鎖RNAをヒト細胞において形成させると、おそらく、インターフェロン媒介抗ウイルス応答が誘導され、その結果、レスキューされたウイルスの増殖が抑制されるだろう。しかしながら、そのようなインターフェロン誘導はベロ細胞では一つの問題として解消されている。なぜならば、ベロ細胞はインターフェロン発現に欠陥があるからである。
【００４１】
実施例４
A/PR/8/34インフルエンザ（ケンブリッジ変異体）のヘルパーウイルスフリーレスキュー
組換えDNAからA/PR/8/34を完全にレスキューするために、12のプラスミドを作製した。これら12のプラスミドは、2,3の改変があるものの、A/WSN/33ウイルスのレスキュー（上記の実施例１および２参照）に関して記載したものと同様である。細胞性RNAポリメラーゼ１による８種のvRNA分節の合成に必要とされる８個のプラスミドは、vRNA分節の正確な3'末端を生成するために、デルタ肝炎ウイルスリボザイムの代わりにマウスrDNAターミネーター配列(GenBank、登録番号M12074)をもつ。A/PR/8/34ポリメラーゼサブユニット(PB1 、PB2、PA)および核タンパク質(NP)用の４種のタンパク質発現プラスミドは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターとウシ成長ホルモン(BGH)ポリ(A)部位を含む市販のpcDNA3(Invitrogen、カタログ番号V790-20)に基づくものである。
【００４２】
プラスミドpPolISapITの構築
８種のvRNA分節の容易なクローニングを可能にする目的で、新規の基本クローニングベクターpPolISapITを構築した。この新しい構築物では、マウスrDNAターミネーター配列（位置+572から+715）がPolIプロモーターの下流に存在する。PolIプロモーターとターミネーター配列は、SapI制限部位を含む24bpのリンカー配列(5'-AGAAGAGCCAGATCTGGCTCTTCC-3')によって分離されている。
【００４３】
プラスミドpPolISapITは、pPolI-CAT-RT（Pleschkaら, J. Virol. 70, 4188-4192, 1996に最初に記載された）から誘導されたものである。マウスrDNAターミネーター配列（位置+335から+715、GenBank登録番号M12074）を含むDNA断片を、pPolI-CAT-RTのSalI部位に挿入してpPolI-CAT-Tを作製した。次に、逆PCR法を用いて、CAT遺伝子、リボザイムおよびマウスrDNAターミネーター配列の一部（位置+335から+571）をpPolI-CAT-Tから欠失させた。同時に、上記の24bpリンカー配列をPolIプロモーターとマウスrDNAターミネーター配列の間にPCRプライマーを介して導入した。
【００４４】
vRNA発現ベクターの構築
SapIオーバーハングをもつPCRプライマーを使って、インフルエンザA/PR/8/34ウイルス（ケンブリッジ変異体）より単離されたvRNAからcDNAを作製した。SapI消化後、PCR産物を、SapIで消化したpPolISapITにクローニングした。
【００４５】
ウイルスのレスキュー
12のプラスミドを、DOTAPトランスフェクション試薬を用いて実施例３に記載のプロトコルに従ってベロ細胞に共トランスフェクトしたところ(Fodorら, J. Virol. (November 1999) 73, 9679-9682も参照のこと)、トランスフェクション後４日目に感染性のインフルエンザA/PR/8/34粒子が得られた。プラークアッセイおよびウイルス増幅を0.5μg/mlのトリプシンの存在下にMDCK細胞上で行なった。
【００４６】
注解
これらの結果は、インフルエンザA/PR8/34ウイルスが本発明のヘルパーウイルスフリーレスキュー法によって成功裏にレスキューされることを実証している。このことには次の理由で特に興味がもてる。つまり、インフルエンザA/PR8/34はヒトには無毒性であることが知られているが(Beareら(1975)「A/PR8/34(HON1)および野生H3 N2インフルエンザウイルスから作られた生存組換え体を用いたヒトでの実験」Lancet(ii) 729-732)、インフルエンザA/WSN/33は、マウスで神経向性があることが分かっているため、ヒトへの投与には不向きであると考えられる。したがって、インフルエンザA/PR8/34は、適切に弱毒化された形で、生ワクチン開発用の親ウイルスとして適するであろう、と提案される。例えば、A/PR8/34ウイルスのHAおよびNAゲノム分節を、インフルエンザ感染症の流行に関係したインフルエンザ株のHAおよびNAゲノム分節で置換する点を除けば、本発明のヘルパーウイルスフリーレスキュー法を用いることにより、インフルエンザA/PR8/34のvRNA用の発現ベクターから出発して弱毒化された再構築ウイルスを作製することができる。再構築インフルエンザウイルスを作製するために本発明のヘルパーウイルスフリーレスキュー法を用いた別の例を以下の実施例６に示す。
【００４７】
実施例５
インフルエンザA/WSN/33のヘルパーウイルスフリーレスキューのための改良プロトコル
実施例２に記載した４種のタンパク質発現プラスミドを、pcDNA3から誘導された実施例４に記載のタンパク質発現プラスミドと置き換えた。これら４種のタンパク質発現プラスミドを実施例１(Fodorら, J. Virol. (November 1999) 73, 9679-9682も参照のこと)に記載の８種のvRNA転写プラスミドと共に以下で説明する３つのプロトコルにおいて使用すると、トランスフェクション後２日目に106個の細胞から100〜10,000個のプラーク形成性ウイルス粒子が得られた。これは実施例３で報告したトランスフェクション研究により得られたものより少なくとも100倍多いウイルスである。
【００４８】
プロトコル(a):  「LipofectAMINE 2000」トランスフェクション試薬を用いた293T細胞のトランスフェクション
１μgずつの12のプラスミドを合わせ、OPTIMEM培地(Gibco BRL)を添加してその容量を50μlに調整した。ポリスチレン製チューブの中に、12μlのLipofectAMINE 2000(Gibco BRL、カタログ番号11668-027)と238μlのOPTIMEM培地を合わせて、この混合物を室温で５分インキュベートした。次に、DNA混合物を、希釈したLipofectAMINE 2000トランスフェクション試薬に滴下した。DNA-Lipofectamine混合物を室温で約20分インキュベートした後、この混合物を293T細胞懸濁液（10% FCSを含み抗生物質を含まないDMEM１ml中の約106個の細胞）に滴下した。トランスフェクトしてから約16〜24時間後に、トランスフェクション混合物を取り出し、0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのDMEMと取り替えた。24〜48時間後、トランスフェクトされた293T細胞からの培地100μlをMDBK細胞上に置いてプラークを形成させることにより、さらに、残りの培地を25cm2の半集密的MDBKフラスコ中で継代することにより、レスキューされたウイルスをスクリーニングした。トランスフェクトされた293T細胞に0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのDMEMを加え、さらに２〜３日間インキュベーションを続けてから、MDBK細胞上でのプラーク形成および増幅を繰り返した。
【００４９】
プロトコル(b):  リン酸カルシウム沈降を用いた293T細胞のトランスフェクション
リン酸カルシウム沈降を用いたトランスフェクションの場合は、１μgずつの12のプラスミドを合わせて、そのプラスミド混合物を250μlの2×HEBSバッファー(40mM Hepes, 280mM NaCl, 10mM KCl, 2mM Na2HPO4, 10mM グルコース, pH7.05)に加えた。その後、250μlの250mM CaCl2を添加し、チューブの内容物を激しく混合した。室温で20〜30分後、沈降物を10% FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのDMEMと混合し、293T細胞懸濁液（10% FCSを含み抗生物質を含まないDMEM１ml中の約106個の細胞）に添加した。トランスフェクトしてから約16〜24時間後に、トランスフェクション混合物を取り出し、0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのDMEMと取り替えた。24〜48時間後、上記のプロトコル(a)と同様にしてレスキューされたウイルスをスクリーニングした。
【００５０】
プロトコル(c): DOTAPトランスフェクション試薬を用いたベロ細胞のトランスフェクション
１μgずつの12のプラスミドを合わせ、20mM Hepes(pH7.5)を添加してその容量を120μlに調整し、約0.1μg/μlのDNA濃度を得た。次に、このDNA溶液を、ポリスチレン製チューブ中の60μlのDOTAPと200μlの20mM Hepes(pH7.5)を含む希釈DOTAPトランスフェクション試薬(Boehringer)に添加した。DNA-DOTAP混合物を室温で約15〜20分インキュベートした後、この混合物をベロ細胞懸濁液（10% FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのMEM中の約106個の細胞）に滴下した。トランスフェクトしてから約16〜24時間後に、トランスフェクション混合物を取り出し、0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのMEMと取り替えた。24〜48時間後、トランスフェクトされたベロ細胞からの培地100μlをMDBK細胞上に置いてプラークを形成させることにより、さらに、残りの培地を25cm2の半集密的MDBKフラスコ中で継代することにより、レスキューされたウイルスをスクリーニングした。トランスフェクトされたベロ細胞に0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのMEMを加え、さらに２〜３日間インキュベーションを続けてから、MDBK細胞上でのプラーク形成および増幅を繰り返した。
【００５１】
実施例６
再構築インフルエンザウイルスのヘルパーウイルスフリーレスキュー
本発明に従うプラスミドベースのレスキューを用いて、再構築インフルエンザウイルスを成功裏に作製した。以下の再構築ウイルスを作製した：
(i)   A/PR/8/34由来のPA分節をもつA/WSN/33
(ii)  A/PR/8/34由来のNP分節をもつA/WSN/33
(iii) A/PR/8/34由来のM分節をもつA/WSN/33
(iv)  A/FPV/Dobson/34由来のPB2分節をもつA/WSN/33
これらの実施例は、再構築ウイルスを単離するためのヘルパーウイルスフリー法の有用性を実証するものである。A/PR8/34（または他の適当な株）に基づいた再構築ウイルスは通常の不活化ワクチンの製造にとって必要なものである。というのは、それらが孵化鶏卵（不活化インフルエンザワクチンの商業生産に使用される）中で高力価へと増殖するからである。したがって、先に示したように、本発明によるヘルパーウイルスフリーウイルスレスキューの重要な用途は、２種類の生存ウイルスによる細胞の混合感染から再構築ウイルスを単離する古典的方法による場合よりも、再構築ウイルスをより簡単に、より直接的に単離することであることが分かる。重要なことは、本発明の方法を使用すると、必要とされる１個のウイルスを単離する前に多くの可能性のある再構築ウイルスをスクリーニングする必要がない、ということである。
【００５２】
実施例７
EcR-293細胞上でのインフルエンザA/WSN/33のヘルパーウイルスフリーレスキュー
11のプラスミドをトランスフェクトすることによって、インフルエンザNPを安定的に発現する細胞系であるEcR-293NP細胞上でインフルエンザA/WSN/33のレスキューを行なった。
【００５３】
EcR-293NP細胞は、エクジソン受容体のRXRサブユニットおよびVgEcRを構成的に発現する市販の細胞系EcR-293(Invitrogen、カタログ番号R650-07)から誘導された。かかる細胞でのインフルエンザNP発現はポナステロンＡに応答して誘導可能である。LipofectAMINE 2000トランスフェクション試薬を用いる実施例５(a)に記載したものと同じプロトコルを用いたが、vRNA分節の初期包膜用のNPタンパク質はEcR-293NP細胞により提供されるので、pcDNA-NPを省いた。
【００５４】
実施例８
外来抗原を発現する組換えインフルエンザウイルスのヘルパーウイルスフリーレスキュー
インフルエンザA/WSN/33ウイルスのNA vRNA分節に基づくキメラvRNA分節を発現することができるプラスミドpPOL1-E6N18-2A-NAを作製した。改変されたvRNAコード配列を、実施例１に記載したPolI発現プラスミドの作製の場合と同様に、トランケートされたヒトPol1プロモーターおよびデルタ肝炎ウイルスリボザイムに対応する配列間に挿入した。得られたキメラ遺伝子は、ヒトパピローマウイルス18(HPV 18)のE6タンパク質の最初の88アミノ酸と、これに続く口蹄疫ウイルス(FMDV)の2Aプロテアーゼの自己開裂モチーフに対応する17アミノ酸と、これに続くインフルエンザA/WSN/33のNAのアミノ酸配列をコードする長いオープンリーディングフレーム(ORF)を含んでいた。このコード領域の両末端にはA/WSN/33ウイルスのNA遺伝子の非コード領域が隣接していた。このようにして、自己開裂を受けるポリタンパク質をコードするキメラインフルエンザウイルス遺伝子が作製され、結果的にHPV由来ポリペプチドとNAタンパク質の生成が得られる。古典的なRNP-トランスフェクションにより、作製したインフルエンザウイルスベクターから外来抗原を発現させるための同様のストラテジーが以前に記載されている(T. MusterおよびA. Garcia-Sastre,「インフルエンザウイルスの遺伝子操作」Textbook of Influenza, K.G. Nicholson, R.G. Webster & A.J. Hay編, pp.93-106 (1998), Blackwell Science Ltd, Oxford, UK)。
【００５５】
HPV18由来抗原を発現する組換えインフルエンザウイルスベクターは、pPOL1-E6N18-2A-NAを、実施例１に記載されるような野生型ウイルスRNA（すなわち、PB2、PB1、PA、HA、NP、MおよびNS）をコードする７種のPol1発現ベクターおよび実施例５に記載されるようなPB2、PB1、PAおよびNPタンパク質をコードする４種のPolII発現ベクターと共に293T細胞に共トランスフェクトすることにより作製した。レスキューされたウイルスは、そのNA特異的ウイルスRNAの配列解析により確認して、正しいヌクレオチド配列をもっていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１〜３に記載した本発明の実施形態の概略図であり、Ａ型インフルエンザウイルスのvRNA分節の直接発現およびＡ型インフルエンザ核タンパク質とRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットの発現のための12のプラスミドが培養ベロ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）に共トランスフェクトされる。図中、POL I＝トランケートされたヒトRNAポリメラーゼＩプロモーター、R＝ゲノム肝炎ウイルスリボザイム、MLP＝ヒトアデノウイルス２型のスプライスされた三分節リーダー配列を含む合成配列に連結されたアデノウイルス２型主要後期プロモーター、およびpA＝SV40由来のポリアデニル化配列。
【図１】
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