(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口または経腸投与したインスリンを腸管内から血中に移行させる医薬組成物であって、成分として該インスリンおよび以下の（１）または（２）のペプチドを含有することを特徴とする医薬組成物。
（１）Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓのアミノ酸配列からなる、天然型アミノ酸で構成されるペプチド。
（２）（１）のアミノ酸配列において１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなり、かつインスリンを腸管内から血中に移行させる、天然型アミノ酸で構成されるペプチド。
【請求項２】
インスリンと前記（１）または（２）のペプチドが共有結合で連結されていないことを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリンの活性を保持した状態で腸管内から血中に移行させるための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、ペプチドやタンパク質からなるいくつかの生理活性物質が臨床現場に登場し、医薬品として使用されて顕著な治療効果を示している。しかしながら、現在その投与方法はほとんどの場合注射剤に限られている。これは、ペプチドやタンパク質は経口投与をした際には消化管に存在する酵素（プロテアーゼ）による分解を受けやすく、また腸管からの吸収効率が低いために経口投与されたペプチドやタンパク質のごく一部しか血中に到達しないことが主な理由となっている。特に後者については、腸管は、本来生体にとって有害な物質を体内に入れないための障壁としての役割を担っているために、腸管上皮細胞層は本質的にペプチド、タンパク質のようなある程度以上の分子量を有する親水性の物質を透過させにくい性質を有しており、この障壁を越えて生理活性タンパク質を血中に移行させることは非常に困難と考えられている。
【０００３】
薬剤を注射投与することは、特に、治療が頻回、長期にわたる場合には、患者および医師にとって大きな負担であり、このため生理活性ペプチドやタンパク質を経口投与可能にするための様々な方法が検討されてきた。例えば、添加物として界面活性剤などを共存させて人工的に腸管の浸透性を向上させる方法が試みられているが、非特異的に腸管透過性を上げる物質を用いることは生体にとって有害な物質も体内に流入する危険性を排除できない。
【０００４】
近年、特定の配列を有する両親媒性ペプチドが、細胞膜を透過する性質を有することが見いだされてきている。例えば、一次構造上疎水性の領域と親水性の領域がわかれて存在する“Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃｉｔｙ”を有するペプチドや、ペプチドがαヘリックスなどの２次構造をとったときに疎水性の面と親水性の面が生じる“Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃｉｔｙ”を有するペプチドにおいて細胞膜を効率よく透過して細胞内に移行するペプチドが存在することが示されており、このような細胞透過性のペプチドに蛋白質、ＤＮＡなどをコンジュゲート化することで目的物質を細胞外から細胞内に取り込ませることが可能であることが報告されている（非特許文献１、２参照）。
【０００５】
このような細胞透過性ペプチドと薬剤のコンジュゲートを用いることで経口投与した薬剤を腸壁を透過させて血中へ移行させることは、可能性として提示はされているものの、実証には到っていない。これは、腸壁を透過させて薬剤を血中に移行させることは、腸壁細胞層を構成する上皮細胞の管腔側の刷子縁膜と血管側の側底膜の２つのバリアを透過する必要があり、細胞内への侵入とは異なった機能が必要とされることに起因すると考えられる。また、腸管内には、ペプチド分解活性を持つ酵素（プロテアーゼ）が種々存在しているため、用いる細胞透過性ペプチドが速やかに分解されてしまい、その機能を失う可能性も考えられる。この酵素分解の受け易さはペプチドの配列に依存するため、試験管内の細胞実験において高い細胞膜透過性を示すペプチドであっても、その配列によっては腸管内では機能しないことが考えられる。このような要因から、これまでに、細胞透過性ペプチドを利用して腸管内から血中への高効率での生理活性タンパク質の移行を実証した例は知られていない。
【０００６】
また、細胞透過性ペプチドを用いる以外の方法として、生理活性タンパク質に透過性キャリアとして分子内に疎水性部分を有する低分子量のアミノ酸誘導体を共存させる方法が報告されている（特許文献１参照）が、この方法では共存させるアミノ酸誘導体中の疎水性部分と細胞膜との非特異的かつ受動的な弱い作用で取り込みが起こると考えられ、高い効率で生理活性タンパク質を血中に移行させることは困難であり、必然的に用いるキャリアの量が非常に多くなってしまう。このことは、生体成分ではない修飾アミノ酸誘導体であるキャリアを大量に生体に投与することによる望ましくない影響への懸念につながる。また大量のキャリアを必要とすることはコストの点からも望ましくない。
【非特許文献１】Biopolymers (2004) volume 76, 196-203
【非特許文献２】Experimental Cell Research (2001) volume 269, 237-244
【特許文献１】特表平８−５０９４７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、経口または経腸投与したインスリンを、腸管内から血中に移行させる医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を克服するために、本発明者らは、通常の条件では腸管からの血中移行性の低いインスリンに対して、その腸管吸収性を向上させる手段を検討した結果、インスリンと以下の（１）または（２）のペプチドを含有する組成物が有効であることを見いだした。
（１）Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓのアミノ酸配列からなる、天然型アミノ酸で構成されるペプチド。
（２）（１）のアミノ酸配列において１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなり、かつインスリンを腸管内から血中に移行させる、天然型アミノ酸で構成されるペプチド。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、インスリンの経口または経腸投与が可能となり、従来の注射による投与法に比べ、簡便で患者に優しい薬物治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、インスリンを、腸管内から血中に移行させる医薬組成物であって、成分としてインスリンおよび前述の（１）または（２）のペプチド（以下、両親媒性ペプチド、という。）を含有することを特徴とする医薬組成物である。
【００１１】
本発明において用いられる両親媒性ペプチドには、一次構造上疎水性の領域と親水性の領域がわかれて存在する“Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃｉｔｙ”を有するペプチド、および、ペプチドがαヘリックスなとの２次構造をとったときに疎水性の面と親水性の面が生じる“Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃｉｔｙ”を有するペプチドが含まれる（非特許文献１）。
【００１２】
本発明において用いられる両親媒性ペプチドは、一次構造上疎水性の領域と親水性の領域がわかれて存在するペプチド、例えば、ブロックＡ−ブロックＢまたはブロックＢ−ブロックＡの構造を有し、ブロックＡは８０％以上のアミノ酸が疎水性アミノ酸からなる５−１０個のアミノ酸の並びであり、かつ、ブロックＢは６０％以上のアミノ酸が親水性のアミノ酸から構成される５−１５個のアミノ酸の並びであるペプチドは、特に好ましい。本発明において用いられる両親媒性ペプチドは、親水性アミノ酸として塩基性アミノ酸を有するものは、さらに好ましい。このような性質を持つ特に好適なペプチドの例として、ｐＶＥＣ（非特許文献２）と呼ばれるペプチドがあげられる。
【００１３】
なお、本発明において、疎水性アミノ酸とは、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、アラニンからなる群から選ばれるアミノ酸を表し、親水性アミノ酸とは、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。また、塩基性アミノ酸とは、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。
【００１４】
本発明において用いられる両親媒性ペプチドを構成するアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸が使用される。
【００１５】
本発明において用いられる両親媒性ペプチドは、通常のペプチド合成の方法を用いて合成することが可能である。
【００１６】
本発明において用いられる両親媒性ペプチドは、大腸菌などの微生物、動物細胞、昆虫細胞などに目的とする両親媒性ペプチドを含む配列をコードする遺伝子を導入して発現させて作製することも可能である。
【００１７】
本発明において用いられる両親媒性ペプチドは、天然に存在するペプチドを単離または単離後分解して用いることも可能である。
【００１８】
本発明において用いられる両親媒性ペプチドは、単一のペプチドとしてもまたは２種以上のペプチドの混合物としても使用することができる。
【００１９】
本発明において用いられる両親媒性ペプチドは、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓのアミノ酸配列からなる。
【００２０】
また、本発明において用いられる両親媒性ペプチドは、インスリンを腸管内から血中に移行させる機能を有する範囲でＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓのアミノ酸配列において１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列であってもよい。
【００２１】
本発明で用いられる両親媒性ペプチドは、その量が多すぎると腸管に対して非特異的な障害作用を示す可能性があり、またコストの面でも投与量が少ないことが望ましい。このため、本医薬組成物におけるインスリンと両親媒性ペプチドの混合比は、（両親媒性ペプチドの分子数）／（インスリンの分子数）の数値として、３０００以下であることが望ましく、より好ましくは１０００以下であり、より好ましくは２００以下である。
【００２２】
インスリンは、天然のタンパク質またはペプチドであっても、その配列の一部を改変した誘導体であっても構わない。また、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化などの化学的な修飾を行った誘導体であっても構わない。
【００２３】
インスリンが腸管内から血中に移行するとは、インスリンを腸管内に投与した時に、そのインスリンの血中濃度の上昇または薬理活性の発現が確認されることを意味する。インスリンの血中濃度は、免疫学的測定法など通常、用いられる方法で測定することができる。またインスリンの薬理活性は、投与した動物の血中グルコース濃度を指標に測定することが可能である。経口または経腸投与したインスリンが医薬品として十分な機能を発揮するためには、ＡＵＣ（血中濃度−時間曲線下面積）の値として、同量のインスリンを皮下に投与したときを１００％としたときに３％以上の移行が認められることが望ましく、１０％以上であることがさらに望ましい。
【００２４】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、インスリンと両親媒性ペプチドが共有結合で連結されていない。
【００２５】
本発明は、インスリンを、腸管内から血中に移行させる医薬組成物であって、成分としてインスリンおよび両親媒性ペプチドを含有することを特徴とする医薬組成物である。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、溶液、固体、粉末状などの種々の形態で使用されうるが、安定性及び取扱いの容易さから、例えば、凍結乾燥等の方法で、固形状あるいは粉末状にした形態が好ましく、粉末または固形製剤であることが好ましい。
【００２８】
経口投与に用いられる医薬組成物としては、好ましくは腸溶性製剤として、例えば腸溶性カプセル等に充填するか、あるいは錠剤として打錠された後、腸溶性コーティングを行うなどの方法によって腸溶性の経口投与用医薬組成物として使用される。
【００２９】
本発明の医薬組成物を、動物（ヒトを含む）に経口または経腸投与する方法には、特にその具体的形態に制限はない。例えば、経口剤としては、乾燥状態のものあるいは溶液状のものをそのまま服用したり、あるいはそれを賦形剤とともにカプセルに充填して服用したり、さらには乾燥状態のものを水に一旦もどして分散させてから服用したりすることができる。坐剤の形態を利用して直腸等に直接的に投与することもできる。インスリンを動物に投与する方法は、経口または経腸投与することが好ましい。
【００３０】
本発明により、これまで注射剤として用いられてきたインスリンの経口または経腸投与が可能となり、患者の苦痛、不便を大幅に改善する薬剤を提供することが出来る。これらの注射剤が患者に与える苦痛や通院の不便を改善することは医療現場における患者本位の医療を実現するだけではなく、これまでのタンパク質製剤の概念を根底から変え、画期的製剤の創製につながる。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されない。
【００３２】
実施例１  ｐＶＥＣによるインスリンｉｎ  ｓｉｔｕ（ラット）腸管吸収促進効果
＜方法＞
１．インスリン溶液の調製
ヒトリコンビナントインスリン（和光純薬）１．９２３ｍｇ（＝５０ＩＵ＝０．３３μｍｏｌ）を秤量し、０．１Ｍ  塩酸５０μｌに溶解した。これにメチルセルロース（ＭＣ）添加リン酸生理緩衝液ｐＨ７．４（ＰＢＳ）１．２ｍｌおよび０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液５０μｌを加えて中和し、さらにＭＣ添加ＰＢＳ１．２ｍｌを加えて総容量を２．５ｍｌとした。（インスリン濃度０．７６９ｍｇ／ｍｌ＝２０ＩＵ／ｍｌ）。
【００３３】
２．ｐＶＥＣ−インスリン混合溶液の調製
ｐＶＥＣ（シグマジェノシス社にて合成、配列：Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ）０．６０９ｍｇ（０．２５μｍｏｌ）を秤量し、上記１で作製したインスリン溶液０．５ｍｌ（インスリン０．３８５ｍｇ＝０．０６６μｍｏｌ）を添加して溶解し、ｐＶＥＣ−インスリン混合溶液とした。コントロール（ｐＶＥＣ無し）については、インスリン溶液そのものを投与に用いた。
【００３４】
３．ラット腸管吸収実験
２４時間絶食した体重約２００ｇのＳＤ系雄性ラットにペントバルビタールナトリウム５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射することにより麻酔した後、正中線に沿って開腹し、腸管を露出した。回盲接合部から２−３ｃｍ回腸よりの部分からシリコンチューブを、およびその上部約１０ｃｍの部分からゾンデを挿入し、さらに内側６ｃｍの部分に縫合糸を通した。
【００３５】
ゾンデから、あらかじめ３７℃に加温したリン酸生理緩衝液ｐＨ７．４（ＰＢＳ）４０ｍｌを流速５ｍｌ／ｍｉｎで流し込んで内容物を排出させた後、シリコンチューブに栓をして、ゾンデからあらかじめ３７℃に加温したＰＢＳ１ｍｌを投与し、３０分貯留させた。投与後は速やかにゾンデに栓をして、腸管を腹腔内に戻して切開部をクリップで閉じ安静にした。
【００３６】
貯留後、ゾンデおよびシリコンチューブの栓をはずし、ループ内にあらかじめ３７℃に加温したＰＢＳ２０ｍｌを流速５ｍｌ／ｍｉｎで流し込んで内容物を排出させた後、あらかじめ縫合糸を通した６ｃｍの部分を結紮してループを作成した。このループ内に、２．で調製したｐＶＥＣ−インスリン混合溶液０．５ｍｌを投与し、腸管を腹腔内に戻し、切開部をクリップで閉じ安静にした。
【００３７】
実験中のラットは、温水循環ポンプにより３７℃に加温したホットプレート上に背位で固定し体温調節を行った。
【００３８】
投与前および投与後５、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０分後に頸静脈より０．２５ｍｌを採血し、ノボアシストプラスを用いて血糖値の測定を行った。残りの血液は遠心分離により血漿に分離し、酵素免疫測定法によりインスリン濃度を定量した。
【００３９】
同量のインスリン溶液（ｐＶＥＣ無し）を皮下に投与したラットについても、同様にして採血、測定を行ない、その時の血中濃度ＡＵＣ（時間曲線下面積）値および血糖値低下活性を１００％として、生物学的利用能（ＢＡ）および薬理学的利用率（ＰＡ）を算出した。
【００４０】
＜結果＞
コントロールのインスリン単独の投与時と比較して、ｐＶＥＣを同時投与することにより、血中インスリン濃度の明らかな上昇、および血糖値の明らかな低下が認められた（図１および図２）。
【００４１】
本結果から算出される生物学的利用能（ＢＡ）は、インスリン単独投与の場合が０．４３％に対してｐＶＥＣ−インスリン混合溶液投与では１５．５３％、また薬理学的利用率（ＰＡ）はインスリン単独投与の場合が０．０７％に対してｐＶＥＣ−インスリン混合溶液投与では７．７５％と、それぞれ３０倍以上、１００倍以上の顕著な上昇が見られた。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ｐＶＥＣペプチドと混合したインスリンをラット腸管ループ内に投与し、経時的に採血した血漿サンプル中のインスリン濃度を測定した結果を示す。Insulin solutionは、同量のインスリンを単独で投与したコントロールラットでの結果を示す。
【図２】図１の各サンプルにおける血糖値測定結果を示す。Insulin solutionは、同量のインスリンを単独で投与したコントロールラットでの結果を示す。
【図１】
0005076374.tif 000002
【図２】
0005076374.tif 000003