(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のポリペプチドまたはアデニン結合受容体活性を保持し配列番号２のポリペプチドに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含んでなるアデニン結合Ｇタンパク質共役型受容体、をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含んでなる請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
アデニン結合受容体活性を保持し配列番号２の配列を有するポリペプチドに少なくとも９０％の配列同一性を有する、アデニン結合Ｇタンパク質共役型受容体ポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項４】
プロモーターに操作可能に連結した請求項１または２のいずれかに定義された核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターを有する単離された宿主細胞。
【請求項６】
請求項３記載のポリペプチドをコードする核酸の１５から５０個までのヌクレオチドのフラグメントから成る核酸プライマーであって、該核酸に選択的にハイブリダイズすることが可能であり、制限酵素認識部位を含むリンカーである４から１５ヌクレオチドの配列に３’または５’で操作可能に連結する、上記核酸プライマー。
【請求項７】
−アデニン結合活性を有し配列番号１に少なくとも９０％の配列同一性を有する単離されたポリヌクレオチドによってコードされている少なくとも１個のポリペプチドを含んでなるＧタンパク質共役型受容体を提供し、
−該受容体を推定される相互作用化合物と接触させ、
場合により該受容体を同時にまたは連続してアデニンと接触させ、そして
−該化合物がアデニン誘導受容体活性をモジュレートするかどうかを決定する
ことを含んでなる、Ｇタンパク質共役型受容体のアデニン誘導受容体活性のモジュレーターを同定するためのインビトロアッセイ。
【請求項８】
該モジュレートすることが、該化合物が該受容体に結合する能力により決定される、請求項７記載のインビトロアッセイ。
【請求項９】
該モジュレートすることが、該化合物が該受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力により決定される、請求項７記載のインビトロアッセイ。
【請求項１０】
該受容体が、細胞の中で請求項３記載のポリペプチドが請求項４記載のベクターより発現される細胞の膜内に位置する、請求項７から９までのいずれか１項記載のインビトロアッセイ。
【請求項１１】
配列番号１に少なくとも９０％の配列同一性を有しプロモーターに操作可能に連結した該ポリヌクレオチドを宿主細胞に提供し、該宿主細胞を該推定される相互作用化合物と接触させることを含んでなる、請求項７記載のインビトロアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規の哺乳動物Ｇタンパク質共役型受容体、それをコードする核酸およびアッセイにおけるその使用に関する。
発明の背景
ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、リガンド、例えばホルモンおよびその他の化学メディエーターのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）への結合と、細胞内エフェクターの活性化との間の媒介体として作用する。ＧＰＣＲへのリガンドの結合の際、受容体の細胞質ドメインは、受容体とＧタンパク質との相互作用を可能とし、他方では細胞内中間体、例えばアデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣまたはイオンチャンネルの活性化を可能とするコーホーメーション変化を受ける。ＧＰＣＲにおける単一リガンドの結合に応答して多数の二次メッセンジャーが産生できるので、かかる系は、当初のシグナルの増幅を可能とする。この機序を通じて、細胞は、これらの外的環境中の変化を感知および応答できる。
【０００２】
Ｇタンパク質共役型受容体は内在性形質膜タンパク質のスーパーファミリーを形成し、それぞれの受容体は７個の疎水性膜貫通ドメインの共通の特徴を共有し、そのそれぞれは、２０〜３０アミノ酸長さでありそして種々の長さの親水性アミノ酸配列により連結している。受容体のアミノ末端は細胞外にあり、細胞の細胞質内に見出されるカルボキシ末端を有する。
【０００３】
ＧＰＣＲは、広範囲の組織および細胞タイプ内に見出されそして多数の異なる生理学的プロセス内に含まれる。これらは、広範囲のリガンド、例えばホルモン、例えば黄体刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、チロトロピン、アドレノコルチコトロピン、グルカゴンおよびバソプレッシン、神経伝達物質、例えば５−ＨＴ、アセチルコリン（ムスカリン性ＡｃｈＲ）、ヒスタミン、プロスタグランジン、カルシトニン、ロイコトリエンおよびＣａ2+により活性化される。ＧＰＣＲの広範な分布および各種の役割は、ＧＰＣＲが各種の病理学的条件において重要な役割を演するであろうことを示す。実際に、ＧＰＣＲは、気管支収縮、高血圧、炎症、ホルモン障害、糖尿病、アポトーシス、痛覚(nociception) 、神経伝達の促進および振せん障害に関係する疾患に関係することが見出されている。
【０００４】
特に重要なＧＰＣＲの一つの群は、ヌクレオチドのための受容体として作用するものである。ヌクレオチド受容体は、３ファミリー：Ｐ１、Ｐ２ＹおよびＰ２Ｘ(Ralevic and Burnstock, 1998 Pharmacological Reviews 50(3);413-492) から構成され、この中で、Ｐ１およびＰ２ＹファミリーがＧＰＣＲである。Ｐ１受容体はアデノシンにより活性化されそしてアデニンを結合しない(Bruns et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77(50):5547-51, 1980、Schwabe and Trost, 1980 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmocol. 313(3):197-87、Schwabe et al.,1982 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmocol. 321(1):84-87) 。Ｐ１受容体ファミリーのメンバーは、アデノシンタイプ１ファミリー、アデノシンタイプ２ファミリーおよびアデノシンタイプ３ファミリーとして知られる３種のサブファミリーに分類される。
【０００５】
Ｐ２Ｙファミリーは、ヌクレオチドにより活性化されるＧＰＣＲの４種のファミリーを含む。詳細には、これらはＰ２Ｙ１（ＡＤＰおよびＡＴＰにより活性化）、Ｐ２Ｙ（Ｐ２Ｕとも呼ばれ、これらのＧＰＣＲはＡＴＰおよびＵＴＰにより同等の効力で活性化される）、Ｐ２Ｙ３およびＰ２Ｙ６（相対アゴニスト強さは、ＵＤＰ＞ＵＴＰ＞ＡＤＰ）およびＰ２Ｙ４（ＵＴＰ＞ＡＴＰ）である。Ｐ２Ｙ２群に配列相同性を有する多数の他のＧＰＣＲは、最初にはヌクレオチド受容体とも考えられた（Ｐ２Ｙ５、Ｐ２Ｙ７、Ｐ２Ｙ９およびＰ２Ｙ１０）が、しかし今ではヌクレオチドにより活性化されないことが分かっている。
【０００６】
Ｐ２Ｘファミリーは、Ｇタンパク質に連結しない無関係なタンパク質の群である。この群のメンバーはリガンド依存性イオンチャンネルである。
【０００７】
Ｇタンパク質共役型受容体は広範囲の細胞および生理学的プロセスにおいてこのような重要な役割を演ずるので、かかる受容体の機能および種々の疾患におけるこれらの可能な役割を評価することが益々重要となる。
発明の要旨
ＧＰＣＲに関する研究の過程で、本発明者らは、ＧＰＣＲの新しい種類を表しそしてアデニン結合ＧＰＣＲを呼ばれる新規ＧＰＣＲを発見した。ラット内の新規ＧＰＣＲの配列を従来技術で利用されるものと比較すると、本発明者らは、最も近縁のＧＰＣＲが新規受容体と約５０％の配列同一性を共有するのみであり、新規ＧＰＣＲがＧＰＣＲの新しい種類のメンバーを表すと示唆することを意外にも発見した。さらなる研究は、受容体の天然リガンドがアデニンであることを同定した。これは、天然リガンドとしてアデニンを有するＧＰＣＲの最初の証明であり、このＧＰＣＲがＧＰＣＲの新しい種類を表すことを示唆する。実際、これはその自然リガンドとしてアデニンを有するあらゆる種類の受容体の最初の証明であり、そして、この新規受容体が哺乳動物皮質中に存在することが発見されたので、神経伝達物質としてのアデニンの最初の発見である。さらなる研究は、受容体の６種のヒト同族体を同定し、これらも本発明の一部を形成する。
【０００８】
本発明は、アデニン結合Ｇタンパク質共役型受容体を提供する。具体的には、本発明は、配列番号２または配列番号４の配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。配列番号２または配列番号４の該ポリペプチドのフラグメントであるポリペプチドも提供し、該フラグメントは、少なくとも１０、例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００または１５０またはそれ以上のアミノ酸の大きさである。かかるフラグメントは、それぞれ配列番号２または配列番号４のＮ−末端領域より誘導されてもよい。Ｎ−末端領域を含むフラグメントは、受容体の細胞外部分を再構成して受容体結合部位を提供するために使用してもよい。好ましくは、フラグメントはアデニンを結合する能力を保有する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドに少なくとも５０％そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドを提供する。かかるポリペプチドは、望ましくは、アデニンを結合しそして好ましくはアデニンにより活性化できる受容体を形成する能力を保有する。同様に、好ましくはＮ末端フラグメントを含み、適当な長さの配列番号２または配列番号４のフラグメントに少なくとも５０％そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するこれらのポリペプチドの少なくとも２０アミノ酸のフラグメントであるポリペプチドが提供される。かかるポリペプチドは、望ましくは、アデニンを結合しそして好ましくはアデニンにより活性化できる受容体を形成する能力を保有する。
【００１０】
本発明は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードする単離された核酸配列も提供する。好ましい局面では、単離された配列は、配列番号１または配列番号３のものである。本発明は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子も提供する。本発明により、上記の２パラグラフに記載したポリペプチドをコードする単離された核酸も提供する。さらに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が提供される。
【００１１】
本発明の核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、６、７、８もしくは９またはこれらの相補体の核酸配列に少なくとも５０％そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％の配列同一性を有する配列を含んでなる核酸をさらに含む。好ましくは、これらの配列は非特異性結合を最少化するために制御された条件下で相当な核酸にハイブリダイズする。好ましくは、ストリンジェントないし中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。適当な条件は、例えば、約８０〜９０％同一である配列の検出のためには、０．２５Ｍ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、４２□Ｃでの一晩のハイブリダイゼーションおよび０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５□Ｃでの最終洗浄を含む。約９０％同一を越える配列の検出のためには、適当な条件は、０．２５Ｍ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、６５□Ｃでの一晩のハイブリダイゼーションおよび０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０□Ｃでの最終洗浄を含む。
【００１２】
かかる核酸は「全長」ポリペプチドをコードする必要は必ずしもないことが認められ、従って例えば終止コドンをもたらす置換またはフレームシフト突然変異のいずれかによりコーディング配列が事前に終止したアデニン結合ＧＰＣＲ遺伝子の突然変異形を表す核酸を含むであろう。これらも本発明の核酸である。
【００１３】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである核酸も提供する。一つの局面では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその相補体をコードする配列の１５〜５０、例えば１５〜３５、１８〜３５、１５〜２４、１８〜３０、１８〜２１または２１〜２４ヌクレオチドから本質的に成る核酸プライマーを提供する。
【００１４】
本発明の核酸およびポリペプチドは、疾患を治療するために治療的に使用してもよい。具体的には、これらは、その病理がプリン受容体における作用に関連する疾患、特に本来のアデニン結合ＧＰＣＲの発現の突然変異またはダウンレギュラーションに関連するものを治療するために使用してもよい。特定すると、これらは、抗痙攣剤、鎮静剤、催眠剤、降圧剤、抗不整脈剤、陰性変時剤、変動剤および変力剤として、または病理学的振セン障害、運動失調症、または神経伝達の侵害または促進に関連する疾患の治療に使用されてもよい。さらに、ＣＮＳと関連する障害への使用の発見と同様に、これらは血小板凝固の阻害剤、心臓血管系内の血管内皮細胞によるＮＯ産生の促進剤として、胃腸分泌の阻害剤としてまたはアポトーシス、気管支収縮、血管拡張または炎症と関連する疾患に使用してもよい。
【００１５】
別の局面では、該核酸の配列を含んでなるベクター、特に本発明の核酸配列に操作可能に連結するプロモーターを含んでなる発現ベクターが提供される。ベクターは、宿主細胞により保持され、そして該細胞内で発現されてもよい。該発現の後、本発明のポリペプチドを回収してもよい。
【００１６】
別の局面では、本発明は、本発明のポリペプチドの活性を結合または調節する物質の同定のためのアッセイ方法を提供する。具体的には、ペプチドまたは非ペプチドであってもよいかかる分子を上記の治療の方法に使用することをこれは意図する。
【００１７】
発明者らは最初に、その自然リガンドとしてアデニンを有するある種類の受容体を同定し、そして、新規の受容体が哺乳動物皮質内に存在することを発見したので、発明者らはアデニンを神経伝達物質として開示する最初のものである。従って、本発明は、アデニン自体および／またはアデニンを模擬またはアンタゴナイズする化合物を治療用途に使用する可能性を開示する。従って、本発明はヒトまたは動物身体の治療方法における使用のためのアデニンにさらに拡張される。特に、アデニンは疾患の病理がプリン受容体、特にアデニン受容体における作用と関連する疾患の治療のために使用されることが予見される。さらに、本発明は上記のあらゆる疾患または状態の治療のための薬剤の調製におけるアデニンの使用に拡張される。
【００１８】
本発明は、本発明のポリペプチドに選択的に結合が可能な抗体およびその結合フラグメントも提供する。従って、抗体および結合フラグメントは、生物学的試料中の本発明のポリペプチドの同定のための診断試験に使用してもよい。
【００１９】
本発明のこれらおよびその他の局面は、本明細書中でさらに詳細に説明される。
配列の説明
配列番号１は、ラットアデニン結合ＧＰＣＲのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、ラットアデニン結合ＧＰＣＲのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ３のヌクレオチド配列を示す。
配列番号７は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ４のヌクレオチド配列を示す。
配列番号８は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ５のヌクレオチド配列を示す。
配列番号９は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ６のヌクレオチド配列を示す。
発明の詳細な記述
核酸
核酸は、ＤＮＡ（ゲノムおよびｃＤＮＡの両者と含む）およびＲＮＡを含む。本発明による核酸がＲＮＡを含む場合には、添付の表中に示した配列の引用は、Ｔを置換したＵを有するＲＮＡ等価物への引用としても考慮するものとする。
【００２０】
本発明の核酸は、一本鎖および二本鎖であってもよい。本発明の一本鎖核酸は、アンチセンス核酸を含む。従って、配列番号１もしくは配列番号１を含んでなる配列またはそれらのフラグメントの引用が、本文内容が明確に反対でない限り、相補配列を含むと理解される。同様のことが配列番号３、５、６、７、８および９にも適用される。
【００２１】
一般に、本発明による核酸は、単離物、単離および／または精製された形、またはそれが自然に関連している物質を含まないかまたは本質的に含まないで、例えばヒトゲノム内の遺伝子に近接する核酸を含まないかまたは本質的に含まないで提供され、ただし発現のための可能な１個またはそれを越える調節配列を除く。核酸は、完全にまたは部分的に合成されてもよくそしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。
【００２２】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである核酸も提供する。一つの局面では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその相補体をコードする配列の１５〜５０、例えば１５〜３５、１８〜３５、１５〜２４、１８〜３０、１８〜２１または２１〜２４ヌクレオチドから本質的になる核酸プライマーを提供する。
【００２３】
「本質的に成る」の用語とは、しかしながら、いかなる追加の５’または３’核酸配列をも含まない核酸を呼ぶ。本発明の別の局面では、以上に定義した１５〜３０ヌクレオチドから本質的になる本発明の核酸が、これらが自然には連結していない追加の配列をショート（例えば４から１５、例えば４から１０ヌクレオチド）して３’においてしかし好ましくは５’において連結してもよい。かかる追加の配列は、好ましくは、本発明の核酸が例えばＰＣＲプライマーとして使用される場合にクローニングを促進するための制限酵素認識部位を含んでなるリンカーである。
【００２４】
本発明のプライマーは、望ましくは、本発明のポリペプチドをコードする核酸に選択的にハイブリダイズ可能である。「選択的」とは、他のプリン受容体をコードする配列に関して、そして特にアデニン受容体以外の受容体に関する選択的を意味する。選択的にハイブリダイズする配列の能力は、実験または計算により決定してもよい。
【００２５】
例えば、プライマーのＴｍを算出するための一つの方法は、相同標的配列へのプライマーのＴｍを算出するための式を引用することによる。この式は、Ｔｍ（□Ｃ）＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）−５である。これは３ｘＳＣＣおよび０．１％ＳＤＳ（ここでＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である）の条件下でのＴｍを与える。この式は、一般に長さ約５０ヌクレオチドまでのプライマーに適する。本発明において、この式は、本発明のポリペプチドをコードする配列から誘導された特定の配列のためのプライマーの見かけのＴｍを算出するためのアルゴリズムとして使用してもよい。Ｔｍは、これらの他の配列のいかなる部分にでも適合する最大数に基づいて、ヒトおよびラットのＧＰＣＲ配列に対する算出Ｔｍと比較してもよい。
【００２６】
標的配列にハイブリダイズするプライマーのための適当な条件も実験的に測定してもよい。適当な実験条件は、本発明のポリペプチドをコードする核酸および他のアデニン受容体をコードする核酸の両者への候補プライマーを固体担体上、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば５５□Ｃでの６ｘＳＳＣ）下でハイブリダイゼーションし、低いＳＳＣおよび／または高い温度、例えば４５□Ｃでの０．２ｘＳＳＣにおいて洗浄し、そしてハイブリダイゼーション温度を段階的に上昇して、プライマーが本発明のポリペプチドをコードする核酸へはハイブリダイズできるがしかし他のプリン受容体をコードする核酸にはしないハイブリダイゼーション条件を決定することを含んでなる。
【００２７】
本発明による核酸、特にプライマーは、顕示的な標識を有してもよい。適当な標識は、放射性同位元素、例えば32Ｐまたは35Ｓ、蛍光標識、酵素標識、またはその他のタンパク質標識例えばビオチンを含む。かかる標識は、本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーに加えてもよくそして自体公知の技術を用いて検出してもよい。
【００２８】
本発明のプライマーは、合成核酸、例えば細胞内の核酸の安定性を改善する目的の修飾骨格構造を有するものを含んでなってもよい。オリゴヌクレオチドへの修飾の多数の異なるタイプが当該技術分野では公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端へのアクリジンまたはポリリシン連鎖の付加が含まれる。本発明の目的のために、本明細書中に記載のポリヌクレオチドが当該技術分野で入手可能ないかなる方法によって修飾されてもよいと理解されるべきである。かかる修飾は、本発明のポリヌクレオチドの生体内活性または寿命を増進するために行ってもよい。
【００２９】
本発明の範囲内には、本明細書中に記載の核酸配列、好ましくはオリゴヌクレオチド、特には安定化されたオリゴヌクレオチド、またはリボザイムの形に基づくアンチセンス配列が含まれる。
【００３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸、プレ−ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの相補配列にハイブリダイズして、与えられた標的ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの産生を妨害し、その発現が低下または完全に防止されるように設計してもよい。リボザイムは、本発明の核酸配列をコードするアデニン結合ＧＰＣＲによりコードされるｍＲＮＡを、望ましくはアデニン結合ＧＰＣＲに特異性の標的配列、すなわち他のＧＰＣＲ配列と共通ではない標的配列において開裂するように設計される。アンチセンス配列の構造およびこれらの使用は、ペイマンおよびウルマン(Peyman and Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584,(1990)) 、クルック(Crooke,Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376, (1992))およびザメツニクおよびステフェンソン(Zamecnik and Stephenson, P.N.A.S., 75:280-284,(1974))に記載されている。リボザイムの構造およびこれらの使用は、例えばジブソンおよびシリトウ(Gibson and Shillitoe, Molecular Biotechnology 7(2):125-137(1997))中に記載されている。
【００３１】
本発明のアンチセンスおよびリボザイム配列は、培養中の哺乳動物細胞系統内に導入して、アデニン結合ＧＰＣＲの機能を、例えばこの遺伝子のダウンレギュラーションを起こして表現型効果、またはアデニン結合ＧＰＣＲと関連する本明細書中に記載のタンパク質の発現または場所を観察することにより研究してもよい。アデニン結合ＧＰＣＲの異常な発現が起きる細胞内で、かかるアンチセンスおよびリボザイム配列は遺伝子の発現をダウンレギュラーションするために使用されてもよい。
【００３２】
本発明のＧＰＣＲのｃＤＮＡ配列は、標準ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いてクローニングされてもよい。これは、配列番号１の反対鎖上の５’および３’末端にプライマーの対を作製し、哺乳動物皮質細胞から得たｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにプライマーを接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたフラグメントを単離し（例えば反応混合物をアガロースゲルで精製して）そして増幅されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適当なクローニングベクター内にクローニングできるような適当な制限酵素認識部位を含むように設計されてもよい。同様のことは配列番号３、５、６、７、８および９にも適用される。
【００３３】
配列番号１または配列番号３の配列と１００％相同ではないがしかし配列番号２もしくは配列番号４または本発明の他のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドは、多数の方法で得ることができる。
【００３４】
例えば、配列番号１または配列番号３の配列の部位特異的変異誘発を行ってもよい。これは、例えばポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞のためのコドン優先を最適化するための配列に、例えばサイレントコドン変化が配列に要求される場合に有用である。その他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するために、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質または機能を改変するために望ましいであろう。さらなる変化は、例えば保存的置換を得るために必要である特定のコーディング変化を表すために望ましいであろう。
【００３５】
本発明の核酸は、５’または３’末端で追加の配列を含んでなってもよい。例えば、合成または自然の５’リーダー配列は、本発明のポリペプチドをコードする核酸に結合してもよい。追加の配列は、特定の宿主細胞内で本発明の核酸の転写のために必要な５’または３’非翻訳領域も含んでもよい。
【００３６】
さらに、他の動物、具体的には哺乳動物（例えばヒトまたはラビット）、さらに具体的にはヒトを含む霊長類の、アデニン結合ＧＰＣＲの同族体が得られるであろう。かかる配列は、他の動物種からの分裂中の細胞または組織から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを作製または得て、そして中程度ないし高いストリンジェンシー（例えば約５０℃〜６０℃での０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件下で配列番号１または配列番号３の全てまたは部分を含んでなるプローブを用いてかかるライブラリーをプローブして得てもよい。
【００３７】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離されたＤＮＡに拡張されるが、しかしその中でコードする配列は２個またはそれを越える（好ましくは５個を越えない、例えば４個または３個）エキソンに分割される。かかるエキソン配列は、自然のままであるかまたはゲノムクローン、または合成から得てもよい。エキソン配列は、その配列が１個またはそれ以上のエキソン配列により中断されている本発明のポリペプチドをコードする核酸を含んでなるミニ遺伝子配列の構築物中に使用してもよい。
【００３８】
ミニ遺伝子は、あらゆる真核起源から誘導された異種エキソンを用いて構築されてもよい。
【００３９】
本発明による核酸、例えば全長コーディング配列またはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、例えば内容が外部環境から保護されている適当な容器、例えばバイアル中のキットの一部分として提供されてもよい。キットは、例えばＰＣＲおよび／または試験試料内の重要な核酸の存在を決定するための方法において核酸の使用のための説明書を含んでもよい。核酸をＰＣＲに使用することを意図するキットは、反応に必要な１種またはそれ以上の薬品、例えばポリメラーゼ、ヌクレオシド、緩衝液などを含んでもよい。
【００４０】
本発明の核酸は、ラット、ヒトまたはその他の哺乳動物の身体もしくは組織またはそれらから得た試料中のアデニン結合ＧＰＣＲをコードする配列を検出するための核酸に基づく試験中に使用してもよい。検出の場合に、これはＤＮＡチップ上のマイクロアレイ技術のような方法を含み、定性的および／または定量的であってもよい。検出は、検出段階、例えば遺伝子の全体または部分を配列決定することを含むものも含む。
【００４１】
検出のためのかかる試験は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むヒト試料を、本発明の核酸または本発明のプライマーを含んでなるプローブとハイブリダイジング条件下で接触させ、そしてプローブと試料中の核酸との間に形成されたあらゆる二本鎖を検出することを一般的に含んでなる。かかる検出は、例えばＰＣＲのような技術を用いるかまたはプローブ固体担体上に固定し、プローブにハイブリダイズされなかった試料中の核酸を除去し、次いでプローブにハイブリダイズされた核酸を検出することにより達成されてもよい。あるいは、試料核酸は、固体担体上に固定してもよく、そうするとかかる担体に結合したプロブの量が検出できる。そのあらゆる他のフォーマットの適当なアッセイ方法は、例えばＷＯ８９／０３８９１号およびＷＯ９０／１３６６７号中に見出すことができる。
【００４２】
本発明による検出のさらなる方法は、野生型アデニン結合ＧＰＣＲ遺伝子の変化を、単一塩基変化を含み、例えば一本鎖コンホーメーション多形性（ＳＳＣＰ）分析を用いて検出する方法である。試料中のアデニン結合ＧＰＣＲをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの全体または部分からの核酸配列は基準配列にハイブリダイズされてもよく、そしてハイブリッドの移動性は、二本鎖内のあらゆる非ハイブリダイズ領域が移動性を変化させるような条件下でゲル中で観察される。
【００４３】
本発明の核酸は、皮質、後根（ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ）、ＣＮＳおおびＰＮＳおよびその他の組織中のこの遺伝子の分布の知識を確認および拡張するための組織分布研究にも有用である。
ポリペプチド
本発明の単離されたポリペプチドは、上記に定義のようにこれが自然に関連する物質、例えばこれが細胞内に見出される他のポリペプチドを含まないかまたは本質的に含まない単離された形にあるものである。ポリペプチドは、勿論、希釈剤またはアジュバントを用いて処方されてもよく、そして実際的な目的から、単離されていてもよく、例えば免疫アッセイに使用するためのマイクロタイター(microtitre)プレートをコーティングするために使用される場合に、ポリペプチドはゼラチンまたはその他のキャリヤーと通常は混合される。ポリペプチドは、自然にまたは異種真核細胞の系のいずれかによりグリコシル化されてもよく、またはこれらは非グリコシル化であってもよい（例えば原核細胞内の発現により産生された場合）。ポリペプチドは、リン酸化および／またはアセチル化されてもよい。
【００４４】
本発明のポリペプチドは本質的に精製された形であってもよく、この場合に、これは調製物中のポリペプチド中に、調製物中のポリペプチドの９０％以上、例えば９５％、９８％または９９％が本発明のポリペプチドである調製物中のポリペプチドを一般的に含んでなる。
【００４５】
本発明のポリペプチドは、例えばこれらの精製を援助するためのヒスチジン残基の添加によりまたは細胞からのこれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加により変更されてもよい。
【００４６】
配列番号２または配列番号４に少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチドは、それそれ配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列変種、対立遺伝子、誘導体または変異体であるポリペプチドであってもよく、そして本発明により供給される。例えば、かかるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のものから１個またはそれを越える（例えば１〜２０、例えば２、３、４、または５〜１０個）アミノ酸の１個またはそれを越える付加、置換、欠失および挿入により相違するアミノ酸配列を有してもよい。
【００４７】
ポリペプチド配列の同一性百分率は、基準配列（例えば本発明の配列番号２または配列番号４）と質問(query) 配列とを比較する市場で入手できるアルゴリズムを用いて算出できる。アッセイ方法のこれ以上の詳細は、以下に記載される。
【００４８】
本研究において、配列番号２のヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴ（(Altschulet al., 1997))サーチにより、既知リガンドと関連するＧＰＣＲが発見できるかどうかを検査するために分析した。しかし、選別されたこのオーファンＧＰＣＲの最も近い同族体は、オーファンＧＰＣＲ自体であった。これらはラットアデニン結合ＧＰＣＲと共通の残基の約５０％を有する後根神経節からクローニングしたヒトＧＰＣＲ（ダーウエント(Derwent) 配列データベース受託番号Ｚ１００６７、Ｚ１００６８、Ｚ１００６９、Ｚ１００７０、Ｚ１００７１およびＺ１００７２）のファミリーであった。ここで本発明は、これら６個のオーファンＧＰＣＲをラットアデニン結合ＧＰＣＲの６個の同族体として同定した。この６個の同族体は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１、２、３、４、５および６とそれぞれ名付けられた。次に最も近い同族体は、アデニン結合ＧＰＣＲと３３％の残基を共有するｍａｓ関連遺伝子である。
【００４９】
質問配列が配列番号２または配列番号４のものと少なくとも５０％そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有し、該配列がアデニン結合受容体活性を保有するポリペプチドのものであると決定された場合に、かかる配列は本発明の一部分を形成する。
【００５０】
本発明によるポリペプチドは、例えばコードするアミノ酸からの発現による産生の後に単離および／または精製（例えば抗体を用いる）してもよい。単離および／または精製されたポリペプチドは、組成物の処方内に使用されてもよく、これは少なくとも１種の追加の成分、例えば製剤学的に許容できる賦形剤、ビヒクルまたはキャリヤーを含む薬剤組成物を含んでもよい。
【００５１】
本発明によるポリペプチドは、免疫原としてもしくは特異性抗体を得るために使用してもよい。抗体は精製およびその他のポリペプチドの操作、診断スクリーニングおよび治療の範囲内で有用である。これはさらに以下に考察する。
【００５２】
本発明によるポリペプチドは、これに結合するかまたはその活性または機能を変更する分子に関するスクリーニングに使用してもよい。かかる分子は、治療（予防も多分含み）の範囲内で有用であってもよい。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、顕示的な標識で標識されてもよい。顕示的な標識は、ポリペプチドを検出させるあらゆる適当な標識であってもよい。適当な標識には、放射性同位元素、例えば 125Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびリンカー例えばビオチンを含む。本発明の標識したポリペプチドは、診断処置、例えば試料内の本発明のポリペプチドの量を決定するための免疫アッセイ中に使用してもよい。本発明のポリペプチドまたは標識したポリペプチドは、標準プロトコールを用いる動物およびヒト中での該ポリペプチドへの免疫反応性の検出のための血清学的または細胞媒介免疫アッセイに使用してもよい。
【００５４】
本発明のポリペプチドもしくは標識したポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、固相、例えば免疫アッセイウエルまたはディップスティックの表面に固定してもよい。かかる標識および／または固定化ポリペプチドは、適当な容器内に、適当な試薬、対照体、説明書などと一緒にキットとして包装してもよい。
【００５５】
かかるポリペプチドおよびキットは、試料もしくは活性部分またはそれらのフラグメント内に存在するかかるポリペプチドへの抗体の免疫アッセイによる検出の方法に使用してもよい。
【００５６】
免疫アッセイ法は、当該技術分野では周知でありそして一般に
（ａ）該タンパク質に対する抗体により結合可能なエピトープを含んでなるポリペプチドを提供し、
（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能とする条件下で該ポリペプチドと一緒に生物学的試料をインキュベーションし、そして
（ｃ）該ポリペプチドを含んでなる抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを決定する
ことを含んでなる。
配列同一性
核酸およびポリペプチド配列の同一性百分率は、基準配列を質問配列と比較する市場で入手できるアルゴリズムを用いて算出できる。下記のプログラム（National Center for Biotechnology Information により提供される）を相同性／同一性性を決定するために使用してもよい：ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、これらはデフォールトパラメーターを用いて使用してもよい。
【００５７】
アルゴリズムＧＡＰ（Genetics Computer Group, Madison, WI) は、適合の数を最大化しそしてギャップの数を最小化するように２個の完全配列を整列するニードルマンとヴンシュ(Needleman and Wunsch)アルゴリズムを使用する、一般に、gap creation penalty＝１２、およびgap extension penalty ＝４のデフォールトパラメーターを用いる。
【００５８】
核酸配列またはその部分と質問配列との間の最善の全体的適合を決定するための別の方法は、ブルトラグら(Brutlag et al., Comp. App. Biosci., 6; 237-245(1990))のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムの使用である。このプログラムは、包括的配列整列を提供する。該包括的配列整列の結果は、同一性百分率である。同一性百分率を算出するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢサーチに使用される適当なパラメーターは下記である：Matrix＝Unitary 、k-tuple ＝４、Mismatch penalty＝１、Joining   Penalty ＝３０、Randomization Group length＝０、Cutoff Score＝１、Gap Penalty ＝５、Gap Size Penalty＝０．０５、およびWindow Size ＝５００またはヌクレオチド塩基で表した質問配列長さのいずれか短い方。アミノ酸整列の同一性および類似百分率を算出するために適当なパラメーターは下記である：Matrix＝PAM 150 、k-tuple ＝２、Mismatch penalty＝１、Joining Penalty ＝２０、Randomization Group length＝０、Cutoff Score＝１、Gap Penalty ＝５、Gap Size Penalty＝０．０５、およびWindow Size ＝５００またはヌクレオチド塩基で表した質問配列長さのいずれか短い方。
抗体
本発明のポリペプチドの提供は、特定の様式でラットまたはヒトアデニン結合ＧＰＣＲを結合できる抗体の産生を可能とする。従って、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合できそしてその他のプリン作動性ＧＰＣＲには結合しない抗体を提供する。かかる抗体は、本発明のポリペプチドに対して、他のプリン作動性ＧＰＣＲよりも少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍高いポリペプチドへの親和性を有する。かかる抗体は、他のＧＰＣＲ中には存在しない本発明のポリペプチドのエピトープを用いて産生してもよい。かかるエピトープは、本発明のポリペプチドと他のプリン作動性ＧＰＣＲの間の相違を追求して決定できる。
【００５９】
抗体は、当該技術分野で標準である技術を用いて得てもよい。抗体を産生する方法は、本発明のポリペプチドを用いて哺乳動物（例えばマウス、ラット、ラビット）を免疫化することを含む。抗体は、当該技術分野では公知の種々の技術のいずれかを用いて免疫化した動物から得て、そして好ましくは関係する抗原への抗体の結合を用いてスクリーニングしてもよい。例えば、ウエスタンブロッティング技術または免疫沈降法を使用してもよい(Armitage et al, Nature 357:80-82, 1992)。
【００６０】
ペプチドを用いて哺乳動物を免疫化するための代替または補足として、タンパク質に特異性の抗体は、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え産生ライブラリーから、例えばこれらの表面上に機能性免疫グロブリン結合ドメインを示すラムダバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを用いて得てもよい。例えばＷＯ９２／０１０４７号参照。
【００６１】
本発明による抗体は、多数の方法で修飾できる。実際、「抗体」という用語は、所要の特異性を有する結合ドメインを有するあらゆる結合物質を包含すると解釈される。従って、本発明は、形態が抗原またはエピトープを結合することを可能とする抗体のものを模擬する合成された分子および多数の分子を含み、抗体フラグメント、誘導体、機能性等価物および抗体の同族体を包含する。
【００６２】
抗原またはその他の結合相手を結合できる抗体フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；単離されたＣＤＲ領域およびヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）フラグメントである。単一鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。
【００６３】
試料上の抗体の反応性は、いかなる適当な手段により決定されてもよい。個別のレポーター分子を用いるタグ付加は一つの可能性である。レポーター分子は検出可能、そして好ましくは測定可能なシグナルを直接または間接に生成してもよい。レポーター分子の連結は、直接または間接、例えばペプチド結合を介する共有、または非共有であってもよい。ペプチド結合を介する連結は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え発現の結果であってもよい。
【００６４】
結合を決定するモードは本発明の特徴ではなくそして当該技術分野の熟練者は彼らの選択および一般的知識に従って選定できる。
【００６５】
本発明に従う抗体は、例えば考察したような細胞または細胞溶解物を含む試験試料中のポリペプチドの存在をスクリーニングするために使用してもよく、そして例えばそれらをコードする核酸からの発現によるポリペプチドの産生の後に、本発明によるポリペプチドの精製および／または単離のために使用してもよい。抗体は、それらが結合するポリペプチドの活性を調節してもよくそしてポリペプチドが個体内で有害な影響を有する場合に、治療の範囲内で有用であろう（これは予防を含んでもよい）。
【００６６】
抗体は、抗体を使用するための説明書、例えば試験試料内の特定の物質の存在を決定するためのものを含んでもよいキットとして提供されてもよい。１種またはそれ以上の試薬、例えば標識分子、緩衝液、溶離剤などを含んでもよい。試薬は、外的環境からこれらを防御する容器、例えばシールしたバイアル内で提供されてもよい。
ベクター
本発明の核酸配列は、ベクター、特には発現ベクター中に組み込まれてもよい。ベクターは、適合する宿主細胞内の核酸を複製するために使用されてもよい。従って、別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクター内に導入し、ベクターを適合する宿主細胞内に導入し、そしてベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖することによる本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収されてもよい。適当な宿主細胞は、発現ベクターに関連して以下に記載する。
【００６７】
好ましくは、ベクター内の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコーディング配列の発現をもたらすことができる制御配列に操作可能に連結し、すなわちベクターは発現ベクターである。
【００６８】
「操作可能に連結」の用語とは、記載の成分がそれらの意図する様式でそれらを機能させるような関係にある近位を呼ぶ。コーディング配列に「操作可能に連結」する制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列と整合する条件下で達成されるような様式で結合される。
【００６９】
適当なベクターは、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子およびその他の配列を含む適当な制御配列を含むと選定または解釈できる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、ファジェミドまたはバキュロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、またはＰＡＣなど適宜であってもよい。ベクターは、遺伝子治療ベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えばＨＩＶまたはＭＬＶ）またはアルファウイルスベクターに基づくベクターを含む。
【００７０】
ベクターは、複製の開始点、場合により該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に提供されてもよい。ベクターは、１種またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌性プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターに対するネオマイシン耐性遺伝子を含んでもよい。ベクターは、生体外で、例えばＲＮＡの産生のために使用してもまたは宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するために使用してもよい。ベクターは、生体内で、例えば遺伝子治療の方法内で使用するために適合させてもよい。種々の宿主細胞内でのポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適当な宿主細胞には、細菌、真核細胞、例えば哺乳動物細胞おび酵母、およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系統は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター幼児腎臓細胞、ＣＯＳ細胞および多数のその他のものを含む。
【００７１】
プロモーターおよびその他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞と適合するように選定されてもよい。例えば、酵母プロモーターには、Ｓ．セレビシー(S. cerevisiae) ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、Ｓ．ポンベ(S, pombe)ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターが含まれる。哺乳動物プロモーターには、重金属、例えばカドミウムに応答して誘導できるメタロチオネインプロモーターが含まれる。ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターを使用してもよい。これらのプロモーターのすべては、当該技術分野で容易に利用できる。
【００７２】
ベクターは、他の配列、例えば挿入された核酸発現を作動するプロモーターまたはエンハンサー、ポリペプチドが融合物として産生されるような核酸配列および／または宿主細胞内で産生されるポリペプチドが細胞から分泌されるような分泌シグナルをコードする核酸を含んでもよい。
【００７３】
遺伝子治療に使用するための本発明のポリペプチドの産生のためのベクターは、本発明のミニ遺伝子配列を有するベクターを含む。
【００７４】
これ以上の詳細に関しては、例えば「分子クローニング、実験マニュアル」(Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) を参照のこと。核酸の操作のための多数の既知の技術およびプロトコール、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、およびタンパク質の分析は、「分子生物学の最近のプロトコール」(Current Protocols in MolecularBiology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992)に記載されている。
【００７５】
ベクターは、上記のような適当な宿主細胞内に形質転換して本発明のポリペプチドの発現をもたらしてもよい。従って、別の局面では、本発明はポリペプチドをコードするコーディング配列のベクターにより発現をもたらすための条件下で上記の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、そして発現されたポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明によるポリペプチドを調製するための方法を提供する。ポリペプチドは、生体外の系、例えば網状赤血球溶解物中で発現されてもよい。
【００７６】
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドの複製および発現のためのベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。細胞は、該ベクターと適合するように選定されそして例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳動物性であってもよい。宿主細胞は、遺伝子の発現のための条件下で培養されてもよく、コードされたポリペプチドが産生される。ポリペプチドが適当なシグナルリーダーペプチドに結合して発現される場合には、これは細胞から培地内に分泌されてもよい。発現による産生の後に、ポリペプチドは、該当する場合には宿主細胞および／または培地から単離および／または精製されてもよく、そして引き続いて希望に従って、例えば１種またはそれ以上の追加の成分を含んでもよい組成物、例えば１種またはそれ以上の製剤学的に許容できる賦形剤、ビヒクルまたはキャリヤーを含む薬剤組成物の処方に使用される。
【００７７】
本発明によるポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの産生をもたらすためにアンチセンス方向で上記ベクター内に挿入されてもよい。
アッセイ
本発明は、本発明のアデニン結合ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用が可能な化合物のためのアッセイも提供し、そのアッセイは、本発明による少なくとも一種のポリペプチドを含んでなるＧタンパク質共役型受容体を提供し、受容体を推定結合化合物と接触させ、そして該化合物が該受容体と相互作用が可能かどうかを決定することを含んでなる。
【００７８】
アッセイの一つの態様において、受容体または受容体のサブユニットを結合アッセイ内に使用してもよい。結合アッセイは、競合的でも非競合的であってもよい。かかるアッセイは、存在する場合にどの化合物がポリペプチドに結合できるかどかを決定するために非常に多数の化合物の迅速なスクリーニングを包含することができる。次いで、さらに詳細なアッセイが、かかる化合物が本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかをさらに決定するために、結合すると見出されたこれらの化合物を用いて実施できる。
【００７９】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドを含んでなる受容体の活性を調節する化合物を同定するためのバイオアッセイを提供する。一つの態様では、バイオアッセイは、酵母細胞の接合および交配のために必要なフェロモン経路として通常は機能する内因性ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を置換する本発明のＧＰＣＲおよびラットまたはヒトＧタンパク質を用いて操作されたサッカロミセス・セレビシー(Saccharomyces cerevisiae)細胞を用いて行われる。活性化リガンドに対する通常の酵母反応（成長停止）は、積極的な成長に変換するようにも操作される。かかる操作を用いて、酵母細胞は本発明のＧＰＣＲに対するアゴニストおよびアンタゴニストを、ＧＰＣＲの増殖指示活性化を用いて同定するための機能性アッセイに用いることができる。例えば、バイオアッセイは、本発明のポリペプチドを含んでなるＧＰＣＲを発現するかかる酵母細胞を少なくとも一種の潜在的アゴニストと接触させ、その後、増殖活性における変化に関して細胞を測定して行ってもよい。さらに別の態様では、バイオアッセイは、本発明のポリペプチドを含んでなるかかる酵母細胞発現性受容体を、一定量の既知アゴニスト、例えばアデニンと接触させ、そして少なくとも一種の潜在的アンタゴニストの量を増加させそしてその後増殖における変化に関して細胞を測定することにより行われる。
【００８０】
本発明は、アデニン結合ＧＰＣＲ遺伝子の制御領域を調節する化合物を同定するためのバイオアッセイも提供する。かかるアッセイは、本発明のポリペプチド（好ましくは配列番号２または配列番号４のもの）を発現できるラットまたはヒト細胞を用いて行われる。細胞を少なくとも１種の化合物と接触させ、ここで制御領域を調節する該化合物の能力は既知である。その後、細胞を本発明の核酸の発現に関して測定する。あるいは、プロモーターはレポーター遺伝子に結合していてもよい。使用してもよい適当なレポーター遺伝子は、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を含んでもよい。
【００８１】
本発明のポリペプチドの「活性を調節」する化合物またはシグナルとは、ポリペプチドの活性を改変して、化合物またはシグナルが存在する場合には化合物またはシグナルが存在しない場合とは異なって挙動する化合物またはシグナルを呼ぶ。調節に影響を及ぼす化合物には、アゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。アゴニストは、アデニン結合ＧＰＣＲ機能を活性化するアデニンなどの化合物を包含する。あるいは、アンタゴニストは、アデニン結合ＧＰＣＲ機能を妨害する化合物を含む。典型的には、アンタゴニストの効果は、アゴニスト誘導受容体活性化のブロッキングとして観察される。アンタゴニストには、競合的ならびに非競合的アンタゴニストが含まれる。競合的アンタゴニスト（または競合的ブロッカー）は、アゴニスト結合のために特異的な部位と相互作用するかまたはその近傍にある。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニスト相互作用部位以外の部位と相互作用して受容体の機能を不活性化する。以下に記載のように、グアニンはこれらの受容体に対して弱いアンタゴニスト効果を有する。
【００８２】
当該技術分野の熟練者には理解されるように、本発明のポリペプチドのような受容体の活性を調節する化合物を同定するためのバイオアッセイ法は、一般に対照との比較を必要とする。「対照」の一つのタイプは、化合物に暴露される試験細胞または試験培養物と本質的には同様に処理されるが、「対照」細胞または培養物が化合物に暴露されない点のみ異なる細胞または培養物である。使用できる「対照」細胞または培養物の別のタイプは、トランスフェクションされた細胞と同様であるが、しかし「対照」細胞または培養物は機能的アデニン結合ＧＰＣＲを発現しない点が異なる細胞または培養物である。従って、トランスフェクションされた細胞の応答は、同じ反応条件下で同じ化合物に対する「対照」細胞または培養物のものと比較できる。
【００８３】
アッセイの特に好ましいタイプは、下記のように行れる結合アッセイおよび機能アッセイを含む。
結合アッセイ
細胞系統（哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＳｆ９昆虫細胞を含む）中の本発明のポリペプチドをコードする核酸の過剰発現は、リガンド結合研究のために該ポリペプチド（便宜上、本節内ではアデニン結合ＧＰＣＲと呼ぶ）を有する膜調製物を産生するために使用してもよい。これらの膜調製物は、慣用のフィルター結合アッセイ（例えばブランデル(Brandel) フィルターアッセイ装置の使用）または大量迅速処理シンチレーションプロキシミティタイプ結合アッセイ（ＳＰＡおよびサイトスター−Ｔフラッシュプレート(Cytostar-T flashplate) 技術；Amersham Pharmacia Biotech）において、放射能標識プリン作動性リガンド〔２−3Ｈアデニン(Amersham TRK311) および８−3Ｈアデニン(Amersham TRK343) を含む〕の結合および結合部位に対する競合体によるかかる放射性リガンドの転置を検出するために使用できる。放射能は、９６−、３８４−１５３６−マイクロタイターウエルフォーマットから迅速な測定ができるパッカード・トップカウント(Packard Topcount)または同様の装置を用いて測定できる。ＳＰＡ／サイトスター−Ｔ技術は、特に大量迅速処理スクリーニングを扱いやすく、従ってこの技術は標準リガンドを転置できる化合物のためのスクリーンとしての使用に適する。
【００８４】
本来の状態に近似した環境におけるアデニン結合ＧＰＣＲタンパク質へのリガンドの結合を研究する別の方法は、バイオコア(Biocore) 装置(Biocore) により開発された表面プラスモン共鳴効果を利用する。膜調製物または全細胞中のアデニン結合ＧＰＣＲを、バイオコアのバイオセンサーチップに取り付けそしてリガンドの結合を化合物の存在または不在において検査して結合部位の競合体を同定することができる。
機能アッセイ
アデニン結合ＧＰＣＲは、通常はＧＩＲＫ（内向き選別(inward rectifying)カリウムチャンネル）と相互作用するＧi またはＧo （阻害性Ｇタンパク質）を介して作用するので、カリウムイオンフラックスはこれらの受容体の活性化をもたらすであろう。このイオンのフラックスは、種々の技術を用いて実時間で、特定の化合物のアゴニストまたはアンタゴニスト効果を決定して測定してもよい。従って、細胞系統または例えばアメリカツノガエル(Xenopus) 卵母細胞中に発現された組換えアデニン結合ＧＰＣＲ受容体は、全細胞および単一チャンネル電気生理学を用いて重要な化合物作用の機序を決定して特性付けることができる。アデニン結合ＧＰＣＲで活性の化合物に対する電気生理学的スクリーニングは、慣用の電気生理学的技術を用い、そして利用できる場合には、現在開発中の新しい大量迅速処理方法を利用して行ってもよい。
蛍光−カルシウムおよびナトリウムフラックスは、フルオ(fluo)−３、フルオ−４、フルオ−５Ｎ、フラ・レッド(fura red)、ナトリウムグリーン、ＳＢＦＩおよびモレキュラー・プローブ(Molecular Probe) を含む供給者からのその他の類似したプローブを含む吸う種のイオン感受性蛍光色素を用いて測定可能である。アデニン結合ＧＰＣＲの結果としてのカルシウムおよびナトリウム流入は、このようにして、イメージ分析アルゴリズムと組み合わせたレーザー共焦点法を用いるか用いない蛍光顕微鏡測定を含む、蛍光測定および蛍光イメージング技術を用いて実時間で特性付けできる。
【００８５】
別の方法は、カルシウム過渡体(transient) に影響を及ぼすアゴニストまたはモジュレーターのいずれかとして活性の化合物のための大量迅速処理スクリーニングアッセイである。このアッセイは、蛍光イメージングプレートリーダー(Fluorescence Imaging Plate Reader (FLIPR TM), Molecular Devices Corporation) と呼ばれる装置に基づく。その最も通常の構成では、これはフルオレセインに基づく色素により発光する蛍光を励起および測定する。これは蛍光体の４８８ｎｍにおける高出力励起を生成するアルゴンイオンレーザー、９６−／３８４−ウエルプレートのボトムの上を迅速に走査するための光学系および射出された蛍光を捕そくするための高感度、冷却ＣＣＤカメラを用いる。これは９６−／３８４−ウエルプレートのウエル内に試験薬剤の溶液を供給するための装置を可能とする９６−／３８４−ウエルプレートピペッッティングヘッドも含む。ＦＬＩＰＲアッセイは、化合物の添加の前、その間およびその後において、実時間で、すべての９６−／３８４−ウエルから同時に、細胞の集団からの蛍光シグナルを測定するように設計されている。ＦＬＩＰＲアッセイは、細胞系統内で発現された組換えアデニン結合ＧＰＣＲ、例えばラットまたはヒトアデニン結合ＧＰＣＲに対して機能的に活性の化合物をスクリーニングおよび特性付けるために使用してもよい。以下に記載するように、アデニン結合ＧＰＣＲを用いてトランスフェクションした細胞内のカルシウム過渡体は、受容体の自然リガンドを決定するために種々の基体による受容体の活性化を測定するためのＦＬＩＰＲアッセイを用いて測定する。
【００８６】
本発明のポリペプチドの活性を調節することが見出された化合物は、多数の治療用途を有する。ＢＬＡＳＴサーチから明らかなように、アデニン結合ＧＰＣＲは、アデニンと同様の活性化構造であるＧＰＣＲの既知のサブファミリーのいずれにも属していない。これは、アデニン結合ＧＰＣＲがプリン作動性ＧＰＣＲの新しいサブグループのメンバーであり、ここでプリン作動性がこれまで適用されている種々の治療分野のための新規の薬理学を開発することが可能であることを示唆する。具体的には、これはアポトーシス(Chow et al., 1997) 、病理学的振せん障害(Mally and Stone,1996)、痛覚(Brunstock, 1997) に関連する疾患を含む。プリン作動性化合物は、抗痙攣剤、鎮静剤、催眠剤、失調症剤（ＣＮＳ）、降圧剤、抗不整脈剤、陰性変時剤、変動剤および変力剤、血小板凝集の阻害剤、心臓血管系内の血管内皮細胞によるＮＯ産生の刺激剤および胃腸分泌の阻害剤としての使用が示唆されている(Gil-Rodrigo et al. Pharmacol. Res. 22(2):103-13, 1990) 。トランスジェニック動物に基づくさらなる研究は、このファミリーからの受容体が、気管支収縮、血管拡張、炎症および神経伝達の促進に役割を演じることを示唆する(Nyce, 1999)。要約すると、アデニン結合ＧＰＣＲおよび関連する受容体は、種々の治療分野内での薬剤開発のための価値ある道具として使用できる。
【００８７】
さらに、アデニン自体がこの受容体への自然リガンドとして作用するという証明は、アデニンおよびアデニンを模擬またはアンタゴニスト作用する化合物の上記の疾患のための治療の開発に使用の可能性を開く。
組織分布研究
アデニン結合ＧＰＣＲ  ＤＮＡ配列は、ヒトの健康および疾患におけるハイブリダイゼーション／ＰＣＲ研究によるこのＧＰＣＲの分布の知識を確認および拡張するために有用である。細胞系統内の組換えアデニン結合ＧＰＣＲは、アデニン結合ＧＰＣＲ機能を特性づけるために有用でありそして種々の生化学的及び生物物理的方法がこの受容体をアッセイするために利用できる。本明細書中に記載した本発明のアッセイは、薬剤発見スクリーニングの目的のためにも有用である。
結合剤
このように、本発明は、本発明によるアッセイにより得られた調節剤、およびかかる薬剤を含んでなる組成物を含む新規の結合剤をさらに提供する。受容体に結合しそしてアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するであろう薬剤は、その病理がアデニン結合ＧＰＣＲ受容体を介する作用により特性付けられる疾患を治療する方法に使用してもよく、そしてかかる使用は本発明のさらなる局面を形成する。かかる疾患は、アポトーシス、病理学的振せん障害および痛覚、気管支収縮、血管拡張、炎症および神経伝達の促進に関連する疾患を含んでもよい。さらに、この薬剤は、抗痙攣剤、鎮静剤、催眠剤、失調症剤（ＣＮＳ）、降圧剤、抗不整脈剤、陰性変時剤、変動剤および変力剤、血小板凝集の阻害剤、心臓血管系内の血管内皮細胞によるＮＯ産生の刺激剤または胃腸分泌の阻害剤としての使用が有用である治療に使用してもよい。薬剤は本発明の薬剤の有効量を投薬してもよい。多数の上記の病状は慢性でありしばしば治療不能なので、「治療」は一定の期間、例えば数時間、数日または数週間だけ症状を緩和することを含みそして疾患の経過の進行を遅延させることを含むことを意図すると理解される。
【００８８】
かかる薬剤は、薬剤を製剤学的に許容できるキャリヤーまたは増量剤と一緒に含んでなる組成物に処方してもよい。薬剤は生理学的に機能性の誘導体、例えばエステルまたは塩、例えば酸付加塩または塩基性金属塩、またはＮまたはＳ酸化物の形であってもよい。組成物は、投薬のいかなる適当な経路よび手段のために処方されてもよい。製剤学的に許容できるキャリヤーまたは増量剤は、経口、経直腸、経鼻、吸入、局所（バッカルまたは舌下）、経膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、皮内、髄腔内および硬膜を含む）投薬に適する処方に使用されるものを含む。キャリヤーまたは増量剤の選定は、投薬の提示された経路に依存することは勿論であり、これは薬剤およびその治療目的に依存してもよい。処方剤は、便宜的に単位投薬単位として提供してもよくそして薬剤学の当該技術分野では周知のいずれの方法により調製されてもよい。かかる方法は、活性成分を１種またはそれ以上の付加成分を構成するキャリヤーと一緒にする工程を含む。一般に、処方剤は均質にそして活性成分を液状キャリヤーまたは微細に分割した固体キャリヤーまたは両者と緊密に混合し次いで必要な場合には製品を成形する。
【００８９】
固体組成物のために、例えばマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム塩、タルク、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬用グレードを含む慣用の非毒性固体キャリヤーを含んでもよい。上記の定義した活性化合物は、例えばポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどをキャリヤーとし用いる座薬として処方してもよい。液状の薬剤として投薬できる組成物は、例えば上記に定義した活性化合物と場合により薬剤的アジュバントとをキャリヤー、例えば水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなどの中に溶解、分散などにより溶液または懸濁液を形成して調製できる。所望の場合には、投薬される薬剤組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなども含んでもよい。かかる投薬形態を調製するための実際の方法は、当該技術分野の熟練者には既知であるかまたは明らかであり、例えば「レミントンの薬剤科学」(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15 Edition, 1975) 参照。
【００９０】
投薬される組成物または処方剤は、いかなる場合でも、治療される患者の病状を軽減するために有効な量の活性化合物（単独または多数）の量を含む。
【００９１】
０．２５〜９５％の範囲内の活性成分を非毒性キャリヤーから成る残部と共に含む投薬形または組成物を調製してもよい。
【００９２】
経口投与のために、製剤学的に許容できる非毒性組成物は、通常使用される賦形剤、例えばマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、クロスカルメロースナトリウム(sodium crosscarmellose)，デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬用グレードのいずれかを組み込んで形成される。かかる組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、徐放処方などの形を取る。かかる組成物は、活性成分１％〜９５％、さらに好ましくは２〜５０％、最も好ましくは５〜８％を含んでもよい。
【００９３】
非経口投与は、一般に皮下、筋肉内または静脈内のいずれかによる注射によることを特徴とする。注射用薬剤は、慣用の形、すなわち液状溶液または懸濁液、注射の前に液体中の溶液または懸濁液とすることに適する固体形、またはエマルションとして調製できる。適当な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに所望の場合には、投薬される薬剤組成物は少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、トリエタノールアミンナトリウムアセテートなども含んでもよい。
【００９４】
かかる非経口組成物内に含まれる活性化合物の割合は、その特定の性質、ならびに化合物の活性および患者の必要性に大きく依存する。しかし、溶液中の０．１％〜１０％の活性成分の割合が使用可能であり、そして組成物が、後に上記の割合に希釈される固体である場合にはさらに高いであろう。好ましくは、組成物は溶液内で活性薬剤の０．２〜２％を含む。
【００９５】
実施例
下記の実施例は、本発明を例示する。その他の態様は、これらの実施例を参考にして当該技術分野の熟練者により考案されるであろう。
【００９６】
実施例１  新規ＧＰＣＲの分析
配列番号１中に記載の配列は、既知リガンドを有する関連ＧＰＣＲが発見できるかどうかを試験するためにＢＬＡＳＴ(Altschul et al., 1997) サーチにより分析した。しかし、選別されたこのオーファンＧＰＣＲの最も近い同族体はオーファンＧＰＣＲ自体であった。新規のＧＰＣＲ（ラットアデニン結合ＧＰＣＲ）と共通の残基を約５０％有する後根神経節からクローンしたヒトＧＰＣＲのファミリーがあった（ダーヴェント配列データベース受託番号Ｚ１００６７、Ｚ１００６８、Ｚ１００６９、Ｚ１００７０、Ｚ１００７１およびＺ１００７２）。次に最も近い同族体は、アデニン結合ＧＰＣＲと３３％の残基を共有するｍａｓ関連遺伝子であった。
【００９７】
配列番号１のヌクレオチド配列を用いて、本発明者らは、上記のヒトＧＰＣＲがラットの新規ＧＰＣＲの６個のヒト同族体であると同定した。これらはヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１（配列番号３）、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ２（配列番号５）、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ３（配列番号６）、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ４（配列番号７）ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ５（配列番号８）およびヒトアデニン結合ＧＰＣＲ６（配列番号９）と名付けられた。ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１のヌクレオチドおよび核酸配列を配列番号３および配列番号４に示し、ラットアデニン結合ＧＰＣＲ（配列番号２およびヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１（配列番号４）のアミノ酸配列を整列して図１に示した。ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ２、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ３、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ４、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ５およびヒトアデニン結合ＧＰＣＲ６の核酸配列を、それぞれ配列番号５〜９に示した。配列番号５中の「Ｎ」はＡまたはＴまたはＣまたはＧである。
【００９８】
実施例２  新規ＧＰＣＲの自然リガンドの同定
既知リガンドと関連するＧＰＣＲが従来技術からは発見できなかったので、発明者らは、どの自然リガンドが受容体に結合するかを同定する試みを始めた。配列決定されたＧＰＣＲの自然リガンドを同定するために、「逆薬理学」を採用した。本質的に、このＧＰＣＲが発現される組織（大脳皮質）からの抽出物を調製し、そして自然リガンドの精製に次いでオーファンＧＰＣＲの活性化に基づく細胞アッセイを行った。
【００９９】
実施例３  哺乳動物内の一過性発現およびＦＬＩＰＲアッセイ
全長リーディングフレームを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)内に挿入し、そして得られた発現構築物をＦｕＧＥＮＥ試薬(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim、ドイツ) を用いて、ｐＬＥＧ／ＧｑｉまたはｐＬＥＧ／Ｇｑｉｏ(Molecular Devices, Sunnydale, CA, U.S.A.)を用いて安定にトランスフェクションしたＨＥＫ２６３細胞(E. Bender, 未発表) 内に一過性トランスフェクションした。供給者の推奨に従って、フルオ−４(Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.)を細胞に加えた。
【０１００】
実施例４  組織抽出物の調製および抽出物分別
ブタ皮質１０ｋｇをホモジナイズし、そしてメタノール／水／酢酸、９０／９／１，ｖ／ｖ／ｖ中で抽出した。遠心分離した後、上清をｎ−ヘキサン抽出により脱脂質しそして水相をメガボンデルト(Megabondelute) 分別により分別した。５０％アセトニトリル／Ｈ2 Ｏで溶離する物質をさらにＨＰＬＣ１８カラムで分別した。これから誘導された画分をＦＬＩＰＲアッセイおける新規ＧＰＣＲの活性化に関して試験した。引き続くハイパーシル(Hypersil)Ｃ１８、分析Ｃ８カラム、バイオセプ(Biocep)カラム、そして最後にＨＰＬＣ  Ｃ１８カラムでの精製工程に続いて、新規のＧＰＣＲトランスフェクション細胞を活性化する画分のためのＦＬＩＰＲに基づく活性化アッセイを行った。最終精製工程後に活性を含む画分を質量分光測定により分析した（Ｑ−ＴＯＦ、MicroMass, Manchester, U.K.)。
【０１０１】
Ｃ１８カラムによる最初の分別の後のブタ皮質抽出物のスクリーニングは、むしろ広範囲の画分を与え、これは新規のＧＰＣＲ発現構築物を用いて一過性トランスフェクションした細胞に対して一過性細胞内Ｃａ2+放出をもたらした。これはＧｑｏまたはＧｑｉキメラのいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞の場合に該当する（図２および図３）が、しかし野生型ＨＥＫ２９３細胞の場合には該当しない（データは記載しない）。これらの画分の一つである両方のＧタンパク質キメラに対して強い刺激を発生した第１９番をさらなる二次分別のために選定しそして上記のように処理した。精製は、活性アッセイに基づくＦＬＩＰＲにより行われそして最後のカラム流から活性を示した画分を質量分光測定にかけて純度ならびにこれが含む化合物の構造を決定した。
【０１０２】
実施例５  質量分光測定による活性化物質の同定
シンメトリー(Symmetry)Ｃ１８（４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍ、Waters）逆相カラムからの活性精製画分の質量分析は、ｍ／ｚ１３６における一つの主要イオンを与えた。質量を、重要なイオン（１３６．０６２３Ｄａ）に対してさらに正確な質量を与える（ＮａＩ＋Ｎａ）+ イオン（１７２．８８４０Ｄａ）に固定した。この質量を元素組成分析に使用した。質量精度許容範囲を２０ｐｐｍに設定した。最善の適合はＣ5 Ｈ6 Ｎ5 （１３６．０６２３Ｄａ）により与えられ、これはアデニン＋Ｈ+ に相当する。本来の分子のＣＩＤスペクトルを合成アデニンのものと比較した。
【０１０３】
両方の親分子のフラグメント化は、ｍ／ｚ１１９．０、１０９．０、９４．０、９２．０、８２．０、７７．０、６７．０および６５．０における同じフラグメントイオンをもたらした。Ｑ−ＴＯＦに基づくタンデム質量分光測定により得られた結果からの結論は、活性化物質はアデニンであるというものであった。従って、新規ＧＰＣＲはアデニン結合ＧＰＣＲと命名された。
【０１０４】
実施例６  選択された純粋化合物を用いる新規ＧＰＣＲの試験
質量分光測定から得られた結果を確認するために、純粋アデニンを最終濃度３．３ｎＭ〜３３μＭとなるようにＰＢＳ中に溶かし、そしてラット新規ＧＰＣＲ（アデニン結合ＧＰＣＲ）／ｐｃＤＮＡ発現構築物を用いて一過性トランスフェクションしたＨＥＫ２９３／Ｇａｑｏ細胞、および空の発現ベクターを用いてトランスフェクションしたものに加えた。上記のＦＬＩＰＲアッセイを用いて、２種の過渡体の間の差として測定した新規ＧＰＣＲへ帰属できる過渡体を有する両方の細胞の組内でカルシウム過渡体を測定した。結果を図４に示す。アデニンは、細胞内で投与量応答性カルシウム過渡体を引き起し、新規ＧＰＣＲ（アデニン結合ＧＰＣＲ）がこの化合物に対して高い親和性を有することを示した。反対に、他のプリン類およびピリミジン類は、アゴニスト活性を示さなかった。図５は、カルシウム過渡体が３．３μＭのウリジン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、カフェイン、ＵＤＰまたはＵＤＰの添加によりＨＥＫ２９３／Ｇａｑｏ細胞中に誘発できず、アデニンに対するアデニン結合ＧＰＣＲ受容体の特異性を確認した。アデニンに対する受容体の特異性をさらに試験するために、多数のヌクレオシドおよびヌクレオチド誘導体を同じアッセイを用いて試験した。結果を図６に示す。アデニンのヌクレオシドおよびヌクレオチド誘導体に対して、アデノシンおよびＡＭＰのみが高濃度でいくらかの弱い部分アゴニズムを示す（＞３．３・Ｍ）。
【０１０５】
同じ化合物の間で、アンタゴニスト性を有する分子を見出すことができるかどうかを試験するために、アデニン結合ＧＰＣＲを用いてトランスフェクションした細胞を種々のプリン類（グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、カフェイン、テオフィリン）、ピリミジン類（ウリジン、ＵＤＰ、ＵＴＰ）、他のヌクレオチド受容体に対する既知アンタゴニスト（スラミン、反応性ブルー）およびアデニンのヌクレオシドおよびヌクレオチド誘導体（アデノシン、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ）に３０μＭから３０ｐＭの範囲の濃度で、ＦＬＩＰＲでＣａ2+過渡体を測定しながら暴露した。上記の以外のさらなるアゴニスト効果はこの実験で発見されなかった。室温で１５分間のインキュベーションの後、同じ細胞を３０ｎＭアデニンを用いてチャレンジしてスーパーフュージョンの第一ラウンドで加えた分子のアンタゴニスト性質を検出した。グアニンのみが３０および３μＭで弱いアンタゴニスト効果を示した（図７）。すべての他の化合物は、試験した濃度ではアデニン結合ＧＰＣＲに対してアンタゴニスト効果を誘発しなかった。
【０１０６】
実施例７〜１２  一過性および永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞上のラットアデニン受容体の特性付け
新規のラットアデニン受容体をさらに特性付けるために、リポフェクタミンプラス法(lipofectamine plus method) を用いてＣＨＯ細胞を一過性および永久トランスフェクションした。種々のアデニン誘導体の薬理学的性質は、放射リガンド結合実験、〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の刺激およびｃＡＭＰ測定を用いて評価した。すべてのこれらの実験は、対照としての野生型ＣＨＯ細胞と平行して行った。
【０１０７】
実施例７は、一過性および永久トランスフェクションしたＣＨＯ細胞中での〔 3Ｈ〕アデニンを用いる放射リガンド結合実験を記述する。アデニンに応答する〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳの結合の測定は、実施例８および１０中のそれぞれ一過性および永久トランスフェクションした細胞について記述する。アデニンに応答するｃＡＭＰの測定は、実施例９および１１中のそれぞれ一過性および永久トランスフェクションした細胞について記述する。実施例１２では、細胞内Ｃａ2+へのアデニンの効果を記述する。
細胞培養およびトランスフェクション方法
ＣＨＯ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、および１００ＩＵ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、１１０μｇ／μｌピルビン酸および３００μｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミンを含む抗生物質溶液を１：１の比で補足したダルベッコ(Dulbecco)の変更イーグル培地（ＤＭＥＭ）／栄養素混合物ハム(Ham) のＦ１２(Life Technologies、ベルギー）中で維持した。細胞を１７５ｃｍ2 培養フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ2 環境中で培養した。永久トランスフェクションされた細胞のために、２週間に１回、トランスフェクションされた細胞を、８００μｇ／ｍｌゲネチシン(geneticine)（Ｇ４１８）を含む選択培地（ダルベッコの変更イーグル培地（ＤＭＥＭ）  栄養素混合物ハムのＦ１２（比率１：１）、Life Technologies 、ベルギー）中で培養した。
【０１０８】
ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションのために、リポフェクタミンＰＬＵＳ法(Life Technologies) を利用した。トランスフェクションの１日前に、ＤＭＥＭ栄養素混合物ハムのＦ１２（比率１：１）(Life Technologies) 中に２０，０００細胞／ｃｍ2 の密度で、５０ｍｍペトリ皿中にＣＨＯ細胞を接種分散した。１枚のペトリ皿のトランスフェクションのために、６．５μｇ  ＤＮＡを１７．５μｌ  ＰＬＵＳ試薬(Life Technologies) に加え、混合しそして１５分間室温でインキュベーションした（溶液Ａ）。リポフェクタミンＰＬＵＳ試薬１５μｌを７３５μｌ無血清培地に加えた（溶液Ｂ）。溶液ＡおよびＢを一緒にし、軽く混合しそして１５分間室温でインキュベーションして複合体を形成させた。１５分後に、３．５ｍｌ無血清培地を混合物に加えた。細胞を無血清培地を用いて１回洗浄しそしてＤＮＡ−リポフェクタミンＰＬＵＳ複合体（最終体積５ｍｌ中）を細胞上に加えそして３時間、３７℃、５％ＣＯ2 のインキュベーター中でインキュベーションした。インキュベーションの後、２０％熱不活性化ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ／ハムのＦ１２（比率１：１）５ｍｌを細胞上に加えそして一晩インキュベーター内に置いた。次の日に、培地を取り去りそして上記と同じ培養培地と交換した。
【０１０９】
リポフェクタミンＰＬＵＳ法は、ＣＨＯ細胞の永久トランスフェクションのためにも僅かな変更を加えて利用した。トランスフェクションの１日後、培地を選択培地に交換し、これを２〜３日毎に交換した。細胞をコロニーが出現するまで培養し（８〜１０日）そしてさらなる培養および実験のために１７５ｃｍ2 培養フラスコに分けた。モノクローナル細胞系統は、９６ウエルプレート内に限定希釈接種により調製した。
膜調製
膜は、全粒状画分として調製した。細胞系統を１４５ｍｍペトリ皿上で９０％集密となるまで培養しそして５ｍＭ酪酸ナトリウムを用いて採取の２４時間前に処理した。培地を取り除きそして細胞を氷冷リン酸塩緩衝塩水（Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まないＰＢＳ）を用いて２回洗浄し、プレートから５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中にかき落とし、そして遠心分離（１６，０００ＲＰＭ、４℃で１０分間）により捕集した。細胞ペレットを等張性５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中に再懸濁し、そしてウルトラタラックス(Ultra Turrax)ホモジナイザー(Janker Kunkel、ドイツ）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズ物を１８，０００ＲＰＭ、４℃で２０分間遠心分離した。最終ペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中に再懸濁し、そして−７０℃のアリコート内に保管した。タンパク質測定は、ブラドフォード(Bradford)タンパク質アッセイ(Biorad 、ドイツ）を用い、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて行った。
【０１１０】
実施例７  〔3Ｈ〕アデニン結合
Ａ）方法−〔3Ｈ〕アデニン結合実験は、トランスフェクション前の野生型細胞系統ならびに一過性および永久トランスフェクションした細胞系統を特性付けるために行った。膜を氷上で解凍しそして１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 および１ｍＭ  ＥＧＴＡを補足した５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中で希釈した。非特異性結合は１μＭアデニンの存在下で定義されそして２５℃で〔 3Ｈ〕アデニン（比放射能３０．４Ｃｉ／ミリモル）を用いる１時間インキュベーションが、飽和および競合結合アッセイのために最適と分かった。両方のアッセイは、最終体積５００μｌで、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞のためには膜タンパク質１８μｇそして野生型ＣＨＯ細胞のためには膜タンパク質３０μｇを飽和結合のために使用して行った。競合結合実験のためには、膜タンパク質１５および５０μｇをそれぞれトランスフェクションおよび野生型細胞のために使用した。反応は、ブランデル(Brandel) ミニチャンネル細胞ハーベスター（９６ウエル）を用いてウオットマン(Whatman) ＧＦ／Ｂフィルターを通す迅速濾過により終結させた。フィルターを３回、氷冷５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４を用いて洗浄し、液体シンチレーションバイアルに移しそしてシンチレーション液３ｍｌ（Ultima Gold MV, Packard,オランダ）３ｍｌを加えた。ガラス繊維フィルターを均等に半透明にするために、試料を少なくとも６時間後にβ−シンチレーションカウンターで計数した。
【０１１１】
〔3Ｈ〕アデニン結合の飽和分析は、０．２〜９０ｎＭの範囲の放射リガンドの１８種の濃度を用いて行った。
【０１１２】
化合物、アデニン、１−メチルアデニンおよびその他の類似体による〔3Ｈ〕アデニンの競合的阻害は、〔3Ｈ〕アデニン１０ｎＭおよび５桁にわたる種々の濃度の非標識化合物を用いて行った。
【０１１３】
結合部位の最高数（Ｂmax）、見かけの平衡解離定数（ＫD）およびｐＩＣ50値（ＩＣ50値としては比放射リガンド結合の５０％を阻害する濃度を表す）を非線型あてはめより誘導した。
ｂ）結果：〔3Ｈ〕アデニンを用いる予備放射リガンド結合実験を種々の受容体の野生型細胞について行った。アッセイ条件は、トランスフェクションされた細胞のためのものと同様であった。種々の細胞系統を用いて得られた結合結果を以下に示す。
Ｃ６グリオーム：        ８３９  ｆモル／ｍｇタンパク質
Ｃｏｓ７：              ２２６  ｆモル／ｍｇタンパク質
ＨＥＫ２９３：          １６８  ｆモル／ｍｇタンパク質
ＮＩＨ３Ｔ３：          ６４２  ｆモル／ｍｇタンパク質
ＣＨＯ：                ３０３  ｆモル／ｍｇタンパク質（プール１）
５８３  ｆモル／ｍｇタンパク質（プール２）
ＣＨＯ細胞は、ラットアデニン受容体を用いるトランスフェクションおよびさらなる実験のために選択した。
【０１１４】
独立した実験で、トランスフェクション（熟練者には公知の慣用の技術を用いるβ−ｇａｌ染色により評価して効率は約５０〜６０％であった）後４８時間のＣＨＯ細胞を〔3Ｈ〕アデニン結合に関して評価した。４ｎＭ〔3Ｈ〕アデニンを用いて行った予備結合実験において、下記の結合レベルが観察された：
プール１                ３５５４  ｆモル／ｍｇタンパク質
プール２                ３４４４  ｆモル／ｍｇタンパク質
プール３                ２４３６  ｆモル／ｍｇタンパク質
プール４                １７１７  ｆモル／ｍｇタンパク質
〔 3Ｈ〕アデニンの飽和結合分析は、トランスフェクションならびに野生型ＣＨＯ細胞に対して１００・Ｍグアニリルイミドジホスファート（Ｇｐｐ−ＮＨｐ）を加えおよび加えないで、０．１〜８０ｎＭの範囲の平均して１６種の放射リガンド濃度を用いて行った（表１）。Ｇｐｐ−ＮＨｐの添加は、ＧＰＣＲの高親和性またはアゴニスト結合部位をブロックして、低親和性部位のみが利用された。
【０１１５】
トランスフェクションされた細胞中で、平均飽和結合レベルは約１９ｐモル／ｍｇであり、〔 3Ｈ〕アデニンに対するＫD 値は２４ｎＭであった。同様のＫD 値を有する特異性結合が野生型ＣＨＯ細胞でも観察されたが、しかし大幅に低いＢｍａｘ（約１．１ｐモル／ｍｇ）を有していた。さらに、トランスフェクションされた細胞のＫDはＧｐｐ−ＮＨｐ添加に影響を受けたが、一方、野生型細胞におけるＫDは影響を受けなかった。
【０１１６】
種々のアデニン誘導体による〔3Ｈ〕アデニン結合の競合阻害は、受容体を用いて一過性トランスフェクションされた細胞および野生型ＣＨＯ細胞に対して〔3Ｈ〕アデニン１５ｎＭを用いて行った（表２）。
【０１１７】
高親和性競合結合は、アデニン自体を用いてのみ得られ、１８ｎＭのＫｉ値を有し、これは直接測定したＫD 値に非常に近かった。
【０１１８】
実施例８  一過性感染細胞における〔35Ｓ〕ＧＴＰ・Ｓ結合
ａ）方法−Ｇタンパク質への〔35Ｓ〕ＧＴＰ・Ｓ結合の決定は、ラザレノ(Lazareno, Methods Mol.Biol., 83:107-116, 1997) の変更した方法に従って行った。これらの実験は、膜調製のレベルに対する受容体の一次機能評価のために行った。
【０１１９】
予備〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合実験において、アッセイ条件を最適化し、これは下記のインキュベーション緩衝液の選択となった：１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０・Ｍ  ＧＤＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 および１０μｇ／ｍｌサポニンを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４。アッセイ混合物は、トランスフェクションおよび野生型ＣＨＯ細胞に対してそれぞれ１０および３５μｇの膜タンパク質を含んでいた。
【０１２０】
アゴニスト活性を試験するために、希釈した膜１７５μｌを上記の緩衝液中で、緩衝液２５μｌおよび種々の濃度の化合物２５μｌと一緒に全体積２２５μｌ中で前インキュベーションした。３０℃での２０分間の前インキュベーション期間の後、〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ  ２５μｌを最終濃度０．２５ｎＭまで加えそしてアッセイ混合物をさらに２０分間、３０℃でインキュベーションした。結合および遊離〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳを、フィルターメイト(Filtermate)１９６濾過を用いる減圧下でのユニフィルターTM(Unifilter) −９６、ＧＦ／ＢTM上での迅速濾過(Packard Company、オランダ）により分離した。フルター装置上の結合放射能の量は、フィルターの乾燥およびシンチラント(scintillant) 添加(Microscint-O; Packard Company) の後に液体シンチレーション計数により決定した。
【０１２１】
基礎〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合は、化合物の不在で測定した。アゴニストによる刺激は、基礎レベル上の増加割合として算出した。Ｓ字型アゴニスト濃度−応答曲線は、グラフパッドプリズム(GraphPad Prism)プログラムを用いる非線型回帰より解析した。種々の濃度点で二重に試験し、そして報告したデータは独立した実験から選別した。
ｂ）結果−一過性トランスフェクションされたＣＨＯ細胞からの膜上の〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合は、基礎結合レベルの１５０％上のアデニンによる最高刺激を有していた。アデニンの平均ＥＣ50は１１２ｎＭであった。１−メチルアデニンおよびＡＭＰは、受容体を部分的に大きく下回る効力で刺激し、これは競合結合アッセイにおけるこれらの低い親和性と同一性した。
【０１２２】
ＧＴＰγＳ結合の非刺激が、野生型ＣＨＯ細胞中で測定された（表３および図８ａ（一過性トランスフェクションされたＣＨＯ）および表８ｂ（野生型ＣＨＯ）参照）。百分率の値は、最高アデニン応答に対して正規化しすなわち基礎レベル上のアデニン刺激を１００％とした。
【０１２３】
実施例９  一過性トランスフェクションされたＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ測定
ａ）方法−一過性トランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対して、ｃＡＭＰ測定をＮＥＮ（ベルギー）からの直接ＲＩＡキットを用いて行った。
【０１２４】
１ｍｌ  ０．０４％ＥＤＴＡを加えて細胞を５０ｍｍペトリ皿から採取しそしてＰＢＳ（Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まず）中に再懸濁した。次いで細胞を５分間、１，５００ＲＰＭで遠心分離し、上清を取り去りそしてペレットを刺激緩衝液（供給者のＮＥＮから提供）中に再懸濁した。細胞を計数しそして５０μｌを９６ウエルフラッシュプレートのそれぞれのウエルに１０6 細胞／ウエルの密度で加えた。ｃＡＭＰの標準曲線は、１０〜１，０００ｎＭの範囲にわたる刺激緩衝液中で調製し、そして５０μｌをフラッシュプレートに加えた。
【０１２５】
フォルスコリン(forskolin) （５０μＭで）を含むＰＢＳ中に化合物を希釈し、そして最終濃度の２倍のリガンド５０μｌを細胞に加えそして２０分間、３７℃でインキュベーションした。２０分間のインキュベーションの後、〔 125Ｉ〕ｃＡＭＰトレーサー（２μＣｉ）の１００μｌをそれぞれのウエルに加えて、２００μｌ／ウエルの最終体積とした。プレートをトップカウントTMマイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard, オランダ) 中で計数するまで室温に置いた。Ｓ字型濃度応答曲線（二重測定点）をグラフパッドプリズムプログラム(GraphPad Software, CA, USA)を用いて解析した。
ｂ）結果−直接法を用いるフォルスコリン刺激ｃＡＭＰの阻害は、非常に低かった（１５〜３０％）。フォルスコリン、基礎および両方の方法のｐＥＣ50値を表４に示す。アッセイからの代表的な値を図９ａ（０．５％ｈｉＦＣＳ）および図９ｂ（２％ｈｉＦＣＳ）に示す。
【０１２６】
このアッセイの応答ウインドウは低いけれども、アッセイは受容体に対するアデニンのアゴニスト活性を確認しそして測定されたＥＣ50（約１５ｎＭ）がそのアデニン親和性に近かった。
【０１２７】
一過性トランスフェクションされた細胞に対する機能性ｃＡＭＰアッセイにおける低いシグナルは細胞の異種性（トランスフェクションおよび非トランスフェクション細胞）によるものであったので、永久トランスフェクションされた細胞系統を選択することが決定された。
【０１２８】
多数のモノクローナル細胞系統が、さらなる研究のために選択された３種のクローン２６（マザープレート１）、２８、２９および３０（マザープレート９）を用いて上記の放射リガンド結合により研究された。
【０１２９】
実施例１０  永久トランスフェクションされた細胞における〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合
モノクローナル細胞系統の一次機能的特性検討は、〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合実験で行った。４種の選択したクローンのそれぞれに対するアデニンによる〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の最大刺激は、一過性トランスフェクション体に見出されたものよりもはるかに高く（５００〜６５０倍）、永久細胞系統の期待された通りの良いカプリングを確認した（表５参照）。しかし、６２ｎＭの平均ＥＣ５０は、一過性調製体に近い（実施例８参照）。アデニンによる〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合刺激の例を図１０に示す。
【０１３０】
実施例１１  永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ測定
永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞について、ＮＥＮ（ベルギー）からの間接ＲＩＡキットを用いてｃＡＭＰ測定を行った。
ａ）方法：実験の２日前に、実験の日に約９０％集密となるために必要な密度で９６ウエルプレート中に細胞を接種分散させた。培養媒体を取り去った後に、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2 、１５ｍＭグルコースおよび１５ｍｇ／ｌフェノールレッドを含む制御された塩溶液（ＣＳＳ）を、濃度１ｍＭのホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）および０．１％ＢＳＡの添加を伴って細胞を２回洗浄した。基礎ｃＡＭＰレベルは、これらの添加剤を含むＣＳＳ中で決定しそして最高に刺激されたｃＡＭＰレベルは、５０μＭフォルスコリンの存在下で決定された。アゴニスト活性を試験するために、化合物を細胞を一緒に２０分間、３７℃でインキュベーションした。反応は氷冷ＨＣｌＯ4 （１Ｎ）を添加して停止しそして−２０℃で保管した。解凍の後、混合物を当量のリン酸塩緩衝ＫＯＨを用いて中和し、４℃で３０分間放置して塩を沈降させそして２，０００ＲＰＭで５分間、４℃で遠心分離した。
【０１３１】
ｃＡＭＰレベルの定量的測定のために、ＮＥＮからの９６ウエルフラッシュプレート放射免疫アッセイキットを供給者のプロトコールに従って使用した。Ｓ字型濃度応答曲線（二重点）をグラフパッドプリズムプログラムを用いて解析した。
ｂ）結果−酪酸Ｎａ誘導および種々の血清濃度の影響を評価した。４種の選択したクローンを研究し、クローン２８（ＭＰ９）はフォルスコリン刺激ｃＡＭＰレベルの最高（−７５％）の阻害を示した。野生型ＣＨＯ細胞はアデニンに対していかなる応答も示さなかった。クローン２８および野生型ＣＨＯ細胞のフォルスコリン、基礎およびｐＥＣ50値を表６に示す。ｃＡＭＰ試験における信頼できる高ウインドウは、受容体発現レベルの酪酸Ｎａ誘発の後にのみ得られた。測定されたＲＣ５０は、低いナノモル範囲（３ｎＭ）であった。代表的な濃度応答曲線を永久トランスフェクションおよび野生型ＣＨＯ細胞について図１１ａおよび１１ｂにそれぞれ示す。
【０１３２】
実施例１２  永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞における細胞内カルシウム測定
最後に、細胞内Ｃａ2+の測定を最善に機能的にカプリングしたＣＨＯ細胞系統、すなわちクローン２８、に関して行った。酪酸Ｎａ前処理の効果は、アデニンの投与量応答曲線を用いて研究した。
ａ）方法−実験の２日前に、実験の日に約９０％細胞集密となるために必要な密度で９６ウエルプレート中に細胞を接種分散させた。カルシウム緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ2 、２．５ｍＭプロベネシド、ｐＨ７．４）中で化合物を最終濃度の２倍に希釈した。基礎値のためにはカルシウム緩衝液を加えそして最高応答のためには１０μＭイオノマイシンを使用した。培地を取り去りそしてプロベネシド（５ｍＭ）、指示薬フルオ−３（２μＭ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４および０．１％ＢＳＡを補足した無血清培地内にインキュベーター中３７℃で細胞を加えた。６０分間のインキュベーションの後、細胞をカルシウム緩衝液を用いて３回洗浄した。希釈した化合物１００μｌをウエルに移しそして細胞内カルシウムレベルの変化をＦＬＩＰＲTM（蛍光測定イメージングプレートリーダー、Molecular Devices ）を用いて測定した。それぞれのデータ点は２重に試験しそしてＣａ2+一過性体のピークを関連シグナルと考えた。Ｓ字型濃度応答曲線をグラフパッドプリズムプログラムを用いて解析した。
ｂ）結果−野生型ＣＨＯ細胞はアデニンに対していかなる応答も示さなかった。非−酪酸Ｎａ処理細胞に対しては、アデニンは基礎相対蛍光単位（ＲＦＵ）の１．２５倍の増加を起こし、６８００〜８５００の範囲にあった。酪酸Ｎａ処理細胞に対しては、アデニンはＲＦＵの３倍の増加を誘発し、６６００〜１９８００の範囲であった。アデニン応答のｐＥＣ50値は、それぞれ７．１４おおび７．８３であった。アデニンにより誘発されたＣａ2+応答の代表的な例は、永久トランスフェクションおよび野生型ＣＨＯ細胞に対してそれぞれ図１２ａおよび図１２ｂに示す。
【０１３３】
【表１】
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【０１３４】
【表２】
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【０１３５】
【表３】
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【０１３６】
【表４】
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【０１３７】
【表５】
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【０１３８】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ラットアデニン結合ＧＰＣＲ（配列番号２）およびヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１（配列番号４）のアミノ酸配列の配列整列を示す。
【図２】  Ｇαｑｏキメラを発現するＨＥＫ２９３細胞内に一過性トランスフェクションした後のブタ皮質抽出Ｃ１８フラグメントによるラットアデニン結合ＧＰＣＲの活性化を示す。
【図３】  Ｇαｑｉキメラを発現するＨＥＫ２９３細胞内に一過性トランスフェクションした後のブタ皮質抽出Ｃ１８フラグメントによるラットアデニン結合ＧＰＣＲの活性化を示す。
【図４】  ３．３ｎＭ〜３３ｎＭアデニンの添加によるラットアデニン結合ＧＰＣＲ／ｐｃＤＮＡ３を用いてトランスフェクションしたＨＥＫ２９３／Ｇαｑｉ測定中のＣａ2+過渡体の刺激を示す。
【図５】  ３．３μＭウリジン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、カフェイン、ＵＤＰ、およびアデニンの添加によりラットアデニン結合ＧＰＣＲ／ｐｃＤＮＡ３を用いてトランスフェクションしたＨＥＫ２９３／Ｇαｑｉ細胞中に誘発されたＣａ2+過渡体を示す。
【図６】  ３．３・Ｍアデノシン、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰおよびアデニンの添加によりラットアデニン結合ＧＰＣＲ／ｐｃＤＮＡ３を用いてトランスフェクションしたＨＥＫ２９３／Ｇαｑｉ細胞中に誘発されたＣａ2+過渡体を示す。
【図７】  ３・Ｍ  ＰＢＳ、キサンチン、グアニンおよびヒポキサンチンの添加によりラットアデニン結合ＧＰＣＲ／ｐｃＤＮＡ３を用いてトランスフェクションしたＨＥＫ２９３／Ｇαｑｉ細胞中に誘発されたＣａ2+過渡体を示す。
【図８ａ，ｂ】  ８ａは、ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて一過性トランスフェクションされたＣＨＯ膜に対する〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の刺激を示す。データは３回の独立した実験の平均として表し（±ＳＥＭ、ｎ＝３）、８ｂは、野生型ＣＨＯ膜に対する〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の刺激を示す。データは３回の独立した実験の平均として表す（±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図９ａ，ｂ】  ９ａは、ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて一過性トランスフェクションされたＣＨＯ膜に対するフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ形成の阻害を示す。アッセイは、ＮＥＮからの直接ＲＩＡキットを用いて、０．５％ｈｉＦＣＳ中で行った。代表曲線で、９ｂは、ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて一過性トランスフェクションされたＣＨＯ膜に対するフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ形成の阻害を示す。アッセイは、ＮＥＮからの直接ＲＩＡキットを用いて、２％ｈｉＦＣＳ中で行った。代表曲線。
【図１０】  ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて永久トランスフェクションされたＣＨＯ膜に対する〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の刺激に対するアデニン投与量応答曲線を示す。
【図１１ａ，ｂ】  １１ａは、ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞（クローン２８）に対するフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ形成の阻害を示す。図は、それぞれ酪酸Ｎａ誘導の存在および存在しない場合の０．５および１０％血清濃度を用いて得た代表的曲線を示し、１１ｂは、野生型ＣＨＯ細胞に対するフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ形成の阻害を示す。図は、それぞれ酪酸Ｎａ誘導の存在および存在しない場合の０．５および１０％血清濃度を用いて得た代表的曲線を示す。
【図１２ａ，ｂ】  １２ａは、酪酸Ｎａの存在および存在しない場合のラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞（クローン２８）に対する細胞内Ｃａ2+測定のアデニン投与量応答曲線を示し、１２ｂは、酪酸Ｎａの存在および存在しない場合の野生型ＣＨＯ細胞に対する細胞内Ｃａ2+測定のアデニン投与量応答曲線を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ−ｂ】
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【図９ａ−ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ−ｂ】
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【図１２ａ−ｂ】
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