(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端２０番目のロイシン残基からＮ末端３３３番目のアラニン残基まででなるインターロイキン−６レセプターのＣ末端側に、Ｎ末端２８番目のアラニン残基からＮ末端２１２番目のメチオニン残基まででなるＩＬ−６が直接結合したインターロイキン−６レセプターとインターロイキン−６の融合蛋白質を有効成分として含む、神経前駆細胞の神経系細胞への分化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターロイキン−６レセプター（以下、ＩＬ−６Ｒと記載する）とインターロイキン−６（以下、ＩＬ−６と記載する）の融合蛋白質（以下ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質と略す）を主成分として含む、神経前駆細胞の神経系細胞への分化促進剤に関するものである。また本発明は、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を有効成分として含む神経前駆細胞の神経系細胞への分化促進剤を投与することからなる神経系細胞分化促進に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ｇｐ１３０蛋白質は細胞膜上に発現した分子量１３万の糖蛋白質で、標的細胞により多様なシグナルを伝える分子であることが知られている。この事実を利用して、例えば、ｇｐ１３０蛋白質を刺激することによりニューロンから神経突起が伸長する方法が報告されている（特開平９−８７１９８号公報参照）。
【０００３】
最近、マウス胎児から調製した神経前駆細胞を、ＩＬ−６Ｒの細胞外領域とＩＬ−６の共存下、あるいはＣＮＴＦ（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）の共存下におき、ｇｐ１３０蛋白質を刺激しながら培養すると、アストロサイト（神経系細胞）に分化することが報告された（Ｂｏｎｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻、４７７頁、１９９７年）。この報告は、ｇｐ１３０蛋白質を刺激することにより神経前駆細胞を神経系細胞に分化させることを示すものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６を共存させてｇｐ１３０蛋白質を刺激することで神経前駆細胞を神経系細胞に分化させることは明らかとなっているが、しかし、その分化促進効果は充分とはいえず、ｇｐ１３０蛋白質を刺激することによる神経系細胞分化促進剤を提供するにはなおいっそうの分化促進効果を達成する必要があった。
【０００５】
従って本願発明の目的は、ｇｐ１３０蛋白質を刺激することにより、神経前駆細胞をアストロサイト等の神経系細胞に分化させる分化促進剤であって、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６を共存させた場合に比較してより強力な分化促進効果を奏する分化促進剤を提供することにある。また本願発明の他の目的は、かかる強力な分化促進剤を用いて神経前駆細胞を神経系細胞に分化させる分化促進方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために成された本願請求項１の発明は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質を有効成分として含む、神経前駆細胞の神経系細胞への分化促進剤である。また前記他の目的を達成するために成された本願請求項２の発明は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質を有効成分として含む神経系細胞分化促進剤を投与する、神経前駆細胞の神経系細胞への分化促進方法である。以下、本願発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明で用いるＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質としては、例えば、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６がジスルフィド結合により結合されたものを例示することができる。また例えば、後述する遺伝子工学的手法により製造される、そのＮ末端側にＩＬ−６Ｒが位置し、Ｃ末端側にＩＬ−６が位置する融合蛋白質であり、両蛋白質の間が、例えば任意アミノ酸配列のリンカーやαヘリックス型構造を取るアミノ酸配列のリンカーを介して結合されたものを例示できる。リンカー配列を有しておらず、両蛋白質が直接結合された融合蛋白質は、前記リンカー配列に起因する抗原性を持たないため、本願の分化促進剤を人体等に投与する場合等を考えると好ましい。
【０００８】
ＩＬ−６Ｒは、全長４６８アミノ酸残基で構成される膜蛋白質で、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域から成り（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１、８２５頁、１９８８年参照）、ＩＬ−６と結合すると更に細胞膜上のｇｐ１３０蛋白質と結合して細胞内にシグナルを伝える。ＩＬ−６との結合及びｇｐ１３０蛋白質との結合にはその細胞外領域のみが必要であり、膜貫通領域や細胞内領域を欠失した可溶性ＩＬ−６Ｒであっても、ＩＬ−６と結合後、更にｇｐ１３０蛋白質と結合してシグナルを伝達することができる（登録特許第２８６５３００号公報参照）。ヒトＩＬ−６Ｒの場合、シグナル領域はＮ末端１番目のメチオニン残基付近から１９番目のアラニン残基付近まで、細胞外領域は２０番目のロイシン残基付近から３５８番目のアスパラギン酸残基付近まで、膜貫通領域は３５９番目のセリン残基付近から３８６番目のロイシン残基付近まで、細胞内領域は３８７番目のアルギニン残基付近から４６８番目のアルギニン残基付近までと考えられている。細胞外領域はイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域に分けられ、イムノグロブリン様領域は２０番目のロイシン残基付近から１１１番目のアスパラギン酸残基付近まで、サイトカインレセプター領域は１１２番目のバリン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までと考えられている。また、ＩＬ−６との結合に必須なのはサイトカインレセプター領域であり、イムノグロブリン様領域は不要であることが知られている。なおサイトカインレセプター領域は、７つのβシートから構成されるバレル（樽）様の構造体が短い２個つながった構造体である（Ｙａｗａｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２、１７０５頁、１９９３年参照）。
【０００９】
上記の観点から、本発明で用いるＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を構成するＩＬ−６Ｒとしては、全長のＩＬ−６Ｒはもちろんのこと、その細胞外領域全体又はサイトカインレセプター領域のいずれか、即ち部分的ＩＬ−６Ｒを用いることもできる。ＩＬ−６と結合してそのシグナル伝達系を構成するのはサイトカインレセプター領域であり、細胞外領域は該領域を含む領域だからである。本発明者らの知見によれば、例えば、具体的にそのＮ末端として、Ｎ末端２０番目のロイシン残基、Ｎ末端１１２番目のバリン残基、及びＮ末端１１６番目のグルタミン酸残基が例示できる。また本発明者らの知見によれば、例えば、具体的にＩＬ−６ＲのＣ末端として、Ｎ末端３２３番目のアラニン残基から３６１番目のセリン残基までの３９個のアミノ酸残基のうちのいずれか一つ、特に好ましくは３２３番目のアラニン残基、３３３番目のアラニン残基、３３４番目のロイシン残基、３３５番目のトレオニン残基、３３８番目のリジン残基又は３４３番目のイソロイシン残基の６個のアミノ酸残基のいずれか一つを用いることが例示できる。即ち、前記Ｎ末端として例示したアミノ酸残基から前記Ｃ末端として例示したアミノ酸残基までのアミノ酸配列を、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質におけるＩＬ−６Ｒ部分として使用し、そのＣ末端側にＩＬ−６のＮ末端を結合させるのである。なおＩＬ−６ＲのＮ末端は、融合蛋白質のシグナル伝達における作用効果を勘案して適宜削除することができる。
【００１０】
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を構成するＩＬ−６は、４つのαヘリックスから構成される全長２１２アミノ酸残基の分泌型蛋白質であり（Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３１巻、１９８６年参照）、ＩＬ−６が活性を示すためには、これら４つのαヘリックス全てが必要であることが知られている。従って本発明で使用するＩＬ−６としては、４つのαヘリックスすべてを有するものであれば、特に制限はない。即ち、全長のＩＬ−６はもちろんのこと、例えばＮ末端やＣ末端の一部アミノ酸残基が削除された部分的ＩＬ−６であってもよい。例えば、具体的に分泌型ＩＬ−６の構造として知られているＮ末端２８番目のアラニン残基又は２９番目のプロリン残基から２１２番目のメチオニン残基までのＩＬ−６を例示することができる。またその他にも、ＩＬ−６の発現例（例えばＹａｓｕｋａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．、１２，４１９頁、１９９０年）やＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の発現例（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５，１４２頁、１９９７年）を参照して部分的ＩＬ−６としていかなる配列のものを使用するか決定することができる。
【００１１】
前述した、リンカーを介して又はリンカーを介することなく結合された一本鎖のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、これをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換え操作を行うことにより容易に作製することができる。ＩＬ−６Ｒ又はＩＬ−６をコードする遺伝子は既に単離されており、その塩基配列もよく知られている。従って、本発明の融合蛋白質を作製する際には、融合蛋白質を構成するＩＬ−６ＲとＩＬ−６のアミノ酸配列から必要な遺伝子配列を調製し、これを制限酵素を用いて結合させておけば良い。またここで、天然の遺伝子配列を用いる以外にコドンの縮合を勘案し、任意のコドンを同一のアミノ酸残基をコードするが塩基配列の異なるものに置換するなどしても良い。遺伝子組換えにより宿主に蛋白質を発現させる場合、特定のコドンを使うと発現率や翻訳率が向上することがあるからである。
【００１２】
本発明の融合蛋白質を遺伝子組換えで作製する場合に使用する宿主に特別の制限はなく、従来の報告を参考にしつつ、通常の遺伝子組換え操作で使用されている大腸菌やＣＨＯ細胞等に代表される動物細胞を使用することができる（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１０８，６７３頁、１９９０年参照）。中でも、本実施例に示したピキア・パストリス種の酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母で、ＣＨＯ細胞等のような動物細胞と比較して安価に培養できることから特に好ましい宿主として例示できる。
【００１３】
前述した、本発明の融合蛋白質を遺伝子組換えで作製するための遺伝子は、宿主に導入する（形質転換する）際には、発現ベクターの中に組み込んで使用する。発現ベクターは当該遺伝子の他に、発現制御遺伝子や形質転換された宿主の選択のための指標となる遺伝子等を組み込むが、かかる遺伝子は使用する宿主との関係で適宜選択して使用すれば良い。例えばピキア・パストリス種の酵母を宿主として使用するのであれば、その染色体ＤＮＡ中にＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を導入するためのアルコールオキシダーゼ遺伝子の上流配列と下流配列、選択の指標となるヒスチジン合成遺伝子そして発現制御のためのアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター配列等が、大腸菌を宿主として使用するのであれば選択の指標となるアンピシリン耐性遺伝子や発現制御のためのＬａｃプロモーター／オペレーター配列等が例示できる。なお、市販の発現ベクター（例えばｐＰＩＣ９、ピキア・パストリス種の酵母用の発現ベクター、インビトロジェン社製）に本発明の遺伝子を導入して使用することもできる。
【００１４】
本発明において、好ましくピキア・パストリス種の酵母をＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換して融合蛋白質を作製する場合は、発現ベクター中に、融合蛋白質のシグナルペプチドとしてＩＬ−６Ｒ本来のシグナルペプチドやα因子のシグナルぺプチドを組み込むことが好ましく、特に高発現を実現できることからα因子のシグナルぺプチドを用いることが好ましい。
【００１５】
前述の形質転換された宿主を適当な条件下で培養し、発現ベクター中の発現制御遺伝子との関係で必要に応じて融合蛋白質の発現を誘導すれば融合蛋白質を作製することができる。本発明において、好ましくピキア・パストリス種の酵母を宿主とする場合は、ジャーファーメンターを用いる方法が例示できる。より具体的には、１００ｍＬの培地が仕込まれた５００ｍＬ容量の振とうフラスコに、あらかじめ作製しておいたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を発現するピキア・パストリス種の酵母の２０％グリセロール凍結菌株を接種し、２８〜３０℃で２０時間振とう培養する。次に６〜９Ｌの培地が仕込まれた１６Ｌ容量のジャーファーメンターに上記培養液１００ｍＬを接種し、２８〜３０℃にて通気撹拌培養を開始する。培養中の酵母の状態をモニタリングするために、ＯＤ６００、ｐＨ、溶存酸素濃度、撹拌速度、温度をモニタリングしてかつ制御することが好ましい。培地は天然物由来の炭素源を含むものであれば特に種別は問わないが、具体的組成は実施例を参考にすればよい。また、該培養を実施するためのジャーファーメンターとしては市販の装置を使用することができる。培養開始後、培養液中のグリセロールが枯渇した段階でメタノールを添加すればよい。グリセロールの枯渇は溶存酸素をモニタリングすることにより知ることができる。メタノールの添加は枯渇後５時間以内に行うことが望ましい。メタノールの添加量は多すぎると酵母に毒性を示すが、少なすぎるとアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター配列が十分に機能しないことを勘案すると、０．５％以上５％以下（質量／容量）が好ましい。
【００１６】
培養により作製された融合蛋白質は、適当な方法で培地等から取得することが可能である。宿主として大腸菌を用いた場合は、発現された融合蛋白質は大腸菌内に不溶性塊として蓄積されることから、菌体を破砕後、適当な条件下でリフォールディングや精製操作を行えばよい。好ましくピキア・パストリス種の酵母を宿主として用いた場合には、その培養上清から融合蛋白質を精製して取得することが可能である。精製原料は融合蛋白質を含む溶液であれば特に制限はなく、例えば融合蛋白質を含むピキア・パストリス種の酵母の培養液を例示することができる。該溶液はそのまま用いてもよく、またはそれらを緩衝液あるいは純水により希釈したり、限外ろ過膜あるいは硫酸アンモニウム等により濃縮した後に用いてもよい。精製操作としては、液体クロマトグラフィー操作を例示することができる。好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの３種類のクロマトグラフィーの組み合わせを例示することができる。
【００１７】
ピキア・パストリス種の酵母の培養上清は容量が大きいため、最初にイオン交換クロマトグラフィーにかけることが好ましい。イオン交換クロマトグラフィーは陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーに分かれるが、除蛋白質効率を考慮するして適宜選択することができる。前者の例としては陽イオン交換基としてＳＰを、後者の例としては陰イオン交換基としてＤＥＡＥを例示することができる。ここで流速を毎分１００ｍｌ以上に上げられることと、１μｍ以下のフィルターを通していないサンプルを添加することができることを勘案すると、後の実施例に示すように、陽イオンクロマトグラフィーとしては吸着流動床Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰ  Ｃ−５０カラム（アマシャムファルマシア社製）を好ましく例示することができる。上記方法により得た融合蛋白質を含む画分は、次に疎水性クロマトグラフィーにかけ、さらに融合蛋白質の純度がより高い画分を得ることができる。この画分は、後の実施例に示すように、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーで濃縮することにより、ゲルろ過クロマトグラフィーを効率よく行うことができる。
【００１８】
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、製剤化することにより神経系細胞分化促進剤とすることができる。製剤化は、例えば生理食塩水、ブドウ糖液、マンソトール、メチルセルロース、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等の通常の賦形剤と混合することにより達成される。製剤中のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の量は重量比にして０．０１％程度以上であることが例示できるが、上限は特に制限されない。また製剤にはＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質以外の成分が存在していても良い。更にＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は凍結乾燥品とすることも可能であり、この場合には使用直前に生理食塩水、ブドウ糖液又はリンゲル液等の等張液により再溶解すれば良い。
【００１９】
本発明の神経系細胞分化促進剤は、ヒト等の哺乳動物に対し、例えば静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与等、非経口的に投与することが好ましい。投与量は、神経前駆細胞の不足症状を示す疾患の種類、投与対象患者等の状態等により適宜決定されるが、一般には１〜５００μｇ／ｋｇ／日の範囲であり、神経系細胞の増多の様子を観察しつつ継続的な投与を行えば良い。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、発明の実施の形態により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
１４．５日目のＩＣＲマウス胎児（日本クレア社から購入）の神経上皮細胞を取り出し、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含むＮ２−ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ギブコ社製）６ｍｌ中に加えて４日間培養することにより、神経前駆細胞を調製した。
【００２２】
次に、上記細胞を０．８×１０5細胞／ウェルになるように調製し、Ｎ末端２０番目のロイシン残基〜Ｎ末端３３３番目のアラニン残基からなるＩＬ−６ＲのＣ末端側に、Ｎ末端２８番目のアラニン残基〜Ｎ末端２１２番目のメチオニン残基からなるＩＬ−６が結合した、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質５０ｎｇ／ｍｌ存在下（Ａ）、同ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質２０ｎｇ／ｍｌ存在下（Ｂ）、Ｎ末端２８番目〜２１２番目のアミノ酸配列を含むＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＮ末端２０番目〜３４４番目のアミノ酸配列を含むＩＬ−６Ｒ（１２５ｎｇ／ｍｌ）存在下（Ｃ）、同ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）及び同ＩＬ−６Ｒ（１２５ｎｇ／ｍｌ）存在下（Ｄ）、そして前記融合蛋白質又は、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒ非存在下（Ｅ）でさらに３日間培養した。
【００２３】
これを４％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定化し、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を認識する抗体（ＤＡＫＯ社製）及びローダミン結合抗ウサギ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。（Ａ）の結果を図１に、（Ｂ）の結果を図２に、（Ｃ）の結果を図３に、（Ｄ）の結果を図４に、そして（Ｅ）の結果を図５にそれぞれ示す。図１〜図５において、白い粒状に見えるのが神経前駆細胞であり、ヒモ状の突起を有しているのがアストロサイトに分化した細胞である。
【００２４】
図１〜図５で明らかなように、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、融合されていないＩＬ−６とＩＬ−６Ｒを混合して投与した場合に比べ、非常に強くアストロサイトへの分化を促進することが観察された。すなわち、ｇｐ１３０蛋白質を刺激することによる神経系細胞分化促進剤としては、融合されていないＩＬ−６とＩＬ−６Ｒを混合して投与した場合に比べ、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の方が分化促進効果が強力である。
【００２５】
【発明の効果】
従来、神経前駆細胞を神経系細胞へ分化させるのは非常に困難な作業で、しかも分化の程度が弱いものであったため、ヒトをはじめとする哺乳動物における脳神経系の研究には長い時間と膨大な労力が必要であった。
【００２６】
本願発明が提供するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、融合されていないＩＬ−６ＲとＩＬ−６を混合して用いた場合に比較して、より強力に神経前駆細胞をアストロサイト等の神経系細胞に分化させるという分化促進効果を奏する。従って、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を有効成分とする本願発明の分化促進剤は、それ自体が神経前駆細胞の分化促進剤として有用であるばかりでなく、ヒトをはじめとする哺乳動物における脳神経系の研究や、該研究の成果に基づく新しい治療薬又は診断薬の開発等に極めて重要な意義を有するものである。
【００２７】
なお、アストロサイトへの分化促進活性においては、ＣＮＴＦは融合されていないＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの混合物と同等の活性をもつことが報告されている（Ｂｏｎｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻、４７７頁、１９９７年参照）。従ってＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、ｇｐ１３０蛋白質を刺激することによる神経系細胞分化促進剤としては、ＣＮＴＦよりも優れていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１に記載した方法により、神経上皮細胞をＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質５０ｎｇ／ｍｌ存在下で培養したときの結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例１に記載した方法により、神経上皮細胞を（Ｂ）ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質２０ｎｇ／ｍｌ存在下で培養したときの結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例１に記載した方法により、神経上皮細胞を（Ｃ）ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６Ｒ（１２５ｎｇ／ｍｌ）存在下で培養したときの結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例１に記載した方法により、神経上皮細胞を（Ｄ）ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６Ｒ（１２５ｎｇ／ｍｌ）存在下で培養したときの結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例１に記載した方法により、神経上皮細胞を（Ｅ）サイトカイン及びそのレセプター非存在下で培養したときの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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