(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨＣクラスＩモノマー４量体複合体であって、該ＭＨＣクラスＩモノマーは、α３ドメイン内においてＭＨＣクラスＩモノマーがＴリンパ球のコレセプタＣＤ８と相互作用するゾーンの位置２４５にバリン残基へのアラニン残基の突然変異を有し、Ｔリンパ球のコレセプタＣＤ８に対する前記４量体複合体の親和力は、対応する未変性４量体複合体の親和力と比べて減少している、４量体複合体。
【請求項２】
ＭＨＣクラスＩモノマーは、ＭＨＣ結合ペプチドとの複合体の形態にあることを特徴とする請求項１に記載の４量体複合体。
【請求項３】
ペプチド特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球個体群を検出および／または分離するための、請求項１または２の４量体複合体の使用。
【請求項４】
細胞選別方法における、請求項３による４量体複合体の使用。
【請求項５】
細胞選別方法は、免疫磁気選別法である、請求項４による４量体複合体の使用。
【請求項６】
ポリクローナル個体群からペプチド特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球個体群を検出する方法において、
ＭＨＣクラスＩモノマー／ペプチドの複合体と前記複合体に対する親和力を有するＴリンパ球レセプタとの間の相互作用を可能にする条件下で、請求項１または２の４量体複合体とポリクローナル個体群とを接触させる段階、および
前記複合体に対する親和力を有するＴリンパ球を検出して、ペプチド特異的ＣＤ８＋個体群を検出する段階
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項７】
ＭＨＣクラスＩモノマー／ペプチド複合体は、蛍光化合物を含み、検出段階は、前記蛍光複合体の蛍光を検出することを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
ポリクローナル個体群からペプチド特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球個体群を分離する方法において、
ＭＨＣクラスＩモノマー／ペプチド複合体と前記複合体に対する親和力を有するＴリンパ球レセプタとの間で相互作用を可能にする条件下に、請求項１または２の４量体複合体が固定されている磁球とポリクローナル個体群とを接触させる段階、および
固定されたＴリンパ球を回収し、ペプチド特異的ＣＤ８＋個体群を分離する段階
を含んで成ることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＨＬＡという背景において提示されるペプチドに特異的なＣＤ８＋  Ｔリンパ球個体群の検出及び精製手段を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｔリンパ球は、ＴＣＲと呼ばれる、このリンパ球が対抗する抗原に特異的なレセプタを支持している。このＴＣＲは、複数の鎖で構成され、そのうちα及びβ鎖は、ＨＬＡ分子内で提示された特定の抗原ペプチドに特異的な認識に関与している。この認識は、標的細胞の表面に存在するＨＬＡ−ペプチド複合体に対し一定の親和力をもって固定されるＴリンパ球のα／β ＴＣＲの能力により示される。相互的に、可溶性ＨＬＡ−ペプチド複合体は、考慮対象のＨＬＡ−ペプチド複合体に特異的なＴリンパ球の表面に存在するＴＣＲに固定される能力をもつ。
【０００３】
現在、分子的に最も良く研究されている系は、クラスＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子の中及び対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ０２０１の中で提示された抗原ペプチドのＣＤ８＋  Ｔリンパ球による認識である。
【０００４】
この系では、ＨＬＡ−ペプチド複合体に対するＴＣＲの親和力は、その抗原に対する抗体の親和力に比べきわめて低いことが立証されている。このような理由で、ペプチドを含んだ標識づけされた可溶性ＨＬＡ−Ａ０２０１分子を用いたこのＨＬＡという背景内で、特異的ペプチドに対する反応性をもつＴＣＲキャリア（ＴＣＲを支持した）リンパ球を検出することは不可能である。この低い親和力を補正するため、Altman et al（１）は、ＨＬＡの重鎖がビオチニル化されかくしてストレプトアビジンとの４量体会合が可能となっているＨＬＡ−Ａ０２０１−ペプチド複合体で構成された多価の試薬を製造した。このＨＬＡ−ペプチド４量体は、適切なＴＣＲキャリアＴリンパ球について増大された結合力を呈し、従って反応性個体群を免疫螢光により視覚化させるために使用され得る。
【０００５】
しかしながら、ＴＣＲはＨＬＡ−ペプチド複合体と相互作用できるＴリンパ球の唯一の分子ではない。実際、生理学的認識の際には、ＣＭＨ−ペプチド複合体に対するＴＣＲの固定は、クラスＩのＭＨＣ分子の定常部分に対するコレセプタＣＤ８の固定によって補強される。相互作用におけるＣＤ８の参加は、リンパ球クローン毎に変動し、或る種の場合には、一定の与えられたＨＬＡ−ペプチド複合体に対する固定能力のきわめて大幅な増大を導く可能性がある。クラスＩのＨＬＡに固定されるこのＣＤ８の能力は、結果として、ＨＬＡ−ペプチド複合体の非特異的ＴＣＲを支持する（carry）ＣＤ８＋  Ｔリンパ球上のクラスＩのＨＬＡ４量体の固定の暗騒音をひき起こす。この暗騒音は、使用される４量体の濃度と共に増大し、免疫螢光の偽陽性を導く可能性がある。この非特異的標識付けを減少させようとして、大部分の研究班は、抗ＣＤ８抗体の存在下でクラスＩのＨＬＡ４量体を用いてそれらの標識付けを実施している。ただし、或る種の抗ＣＤ８抗体のみが有効であり、抗体と４量体の間の濃度の最適な比率を各テストで再調整する必要がある。これらの欠点のため、非特異的個体群内でわずかな割合（例えば約０.１〜１％）しか占めていない特異的下位個体群の検出は、困難なものとなる。
【０００６】
なお、ＨＬＡ４量体のもう１つの潜在的応用分野が考慮されてきた。それは、in vitroでの拡張そして次に抗ウイルス又は抗腫瘍受動免疫プロトコルにおける治療向け使用を目的として一定の与えられたＨＬＡ−ペプチド複合体に対して反応性をもつリンパ球個体群を選別（フローサイトメトリー又は免疫磁気選別）により分離することから成る。しかし、ＣＤ８の参与に起因する４量体の固定暗騒音は、選択するＨＬＡ−ペプチド複合体に対し反応性をもたないＴリンパ球の往々にして大きな画分の分離を導くことから、この応用分野に対する重大な障害を構成しうる。
【０００７】
Salter et al（２）は、コレセプタＣＤ８ααに形質移入された細胞により発現された膜ＨＬＡの固定が、ＨＬＡがα３ドメイン内に１つの突然変異を有している場合に改変されるということを示した。
【０００８】
本発明者らによるかかる突然変異の研究から、本発明者らは、突然変異を受けた可溶性の４量体が実際に、Ｔリンパ球の表面でＴＣＲに結びつけられているかいないかに関わらず、又ααであるかαβであるかに関わらず、ＣＤ８を固定することの少ないものであるということを確認するに至り、このことは、暗騒音の減少という形で現われている。
【０００９】
このとき、突然変異の結果としての親和力の喪失が、或る種のＣＤ８依存性Ｔリンパ球クローンに制限された又は完全な特異的信号の喪失を導くことを予想するとこができた。この点でSalter et alの記事は、或る種のＣＤ８依存性同種異系反応性クローンが、突然変異を受けたＨＬＡ−Ａ２を支持する細胞に対するその細胞毒性を失ない、一方その他のクローンはほとんど影響を受けない、ということを示している。
【００１０】
かくして、突然変異を受けた４量体がポリクローナル個体群の内部で（最もＣＤ８依存性の低い）反応性細胞の１画分しか検出しないことが可能であったはずである。
【００１１】
抗ＣＤ８抗体での２重標識付けで本発明者らが実施した突然変異を受けた及び未変性（native）の４量体を用いたポリクローナル個体群の数多くの比較用標識付けにより、反対に予想外にも、突然変異を受けた４量体が未変性４量体と同じ百分率の特異的細胞を認識することが明らかにされている。
【００１２】
その上、ＣＤ８依存性のきわめて高いクローン及びＣＤ８依存性のほとんどないクローン上の突然変異を受けた４量体での標識付けの比較は、ＴＣＲの発現強度と関係づけた４量体の比較可能な固定効力を示している。
【００１３】
従って、突然変異はＣＤ８単独に対する４量体の固定をきわめて大幅に減少させるものの、ＴＣＲ−ＣＤ８複合体に対するその固定にははるかに少ない影響しか及ぼさないと思われる。
【００１４】
【発明の開示】
従って、本発明は、突然変異又はさらに一般的には改変を受けたＨＬＡ多量体において明らかにされた特性を利用することにあり、新規製品としてかかる多量体及びその抗原ペプチドとの複合体を提供する。
【００１５】
本発明は同様に、ペプチド特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球個体群の検出及び／又は分離のためのこれらの分子の使用をも提供する。
【００１６】
さらに本発明は、特に診断及び治療での適用のために、ペプチドを含んだ（charged with）かかる分子を用いてかかる個体群を検出し及び／又は分離する方法を提供する。
【００１７】
本発明による多量体は、クラスＩのＭＨＣに類似した組換え型タンパク質から作製され、該タンパク質は、ＣＤ８と重鎖の間の相互作用の親和力の減少を、ひいては抑制までもを導く少なくとも１つの改変を、Ｔリンパ球のコレセプタＣＤ８とクラスＩのＭＨＣ重鎖の相互作用ゾーン内に有していることを特徴とする。
【００１８】
相互作用ゾーンの改変は、より特定的には、重鎖のα３ドメインに関している。
【００１９】
特に問題となっているのは、前記コレセプタＣＤ８に固定される能力をもつ未変性重鎖の対応するドメインとの関係における少なくとも１つのアミノ酸のα３ドメイン内の突然変異である。
【００２０】
例えば、ＨＬＡ−Ａ２分子のα３ドメインの位置２４５におけるバリン残基へのアラニン残基の突然変異が挙げられる。
【００２１】
改変は同様に、少なくとも１つのアミノ酸の化学的修飾及び／又は少なくとも１つのアミノ酸の欠失から成るものであってよく、この又はこれらのタイプの改変は場合によって、単数又は複数の突然変異に追加される。
【００２２】
本発明、また、新しい生成物として、上述の多量体及び抗原ペプチドから作製された複合体をも提供する。
【００２３】
これらの複合体においては、多量体は特に４量体の形を呈する。
【００２４】
本発明によると、これらの複合体は、複合体の抗原ペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋  Ｔリンパ球個体群の検出及び／又は分離のために使用される。
【００２５】
上述の複合体の使用により、特異的標識づけ（marking）を改変することなく非特異的な固定（binding）の暗騒音（バックグラウンドノイズ）をきわめて大幅に削減することができ、さらに、免疫螢光分析の際に抗ＣＤ８抗体を一緒に使用する必要性を無くすることができる。
【００２６】
好ましい使用においては、前記複合体は、免疫磁気選別といったような細胞選別（screening）方法において使用される。
【００２７】
マウスにおける特異的Ｔリンパ球を分離するために免疫磁気選別技術についてはLuxembourg et al,(５）によって記述される。
【００２８】
この技術は、ＭＨＣ−ペプチド複合体（ペプチドを含んだ化学的にビオチニル化された、ショウジョウバエ属系で産生された複合体）で被覆された球系に基づくものである。
【００２９】
本発明は、また、ポリクローナル個体群からペプチド特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球個体群を検出し分離する方法をも提供する。この検出方法は、
−  改変されたクラスＩのＭＨＣ／ペプチドの複合体と、この複合体に対する親和力をもつＴリンパ球レセプタとの間の相互作用を可能にする条件下で、上述のような抗原ペプチドと複合体形成された多量体とポリクローナル個体群とを接触させる段階、
−  前記複合体に固定された（bound to）リンパ球個体群を顕示する段階、
を含んで成ることを特徴とする。
【００３０】
この顕示（visualization）は、例えば、螢光化合物を含む多量体を使用することによって螢光によって実施される。
【００３１】
ポリクローナル個体群からペプチド特異的リンパ球個体群を分離する方法も又、本発明の枠内に入り、場合によっては、上述の検出段階の後に実施可能である。
【００３２】
この方法は、免疫磁気選別の技術を使用し、
−  上述のようなクラスＩのＭＨＣ類似体とペプチドの複合体が上に固定されている磁球とポリクローナル個体群を、前記複合体とこの複合体に対する親和力をもつＴリンパ球のレセプタの間の相互作用を可能にする条件下で接触させる段階、
−  固定された個体群を回収する段階、
を含んで成り、望ましい場合には選別作業が繰返され及び／又は場合によってその後に、
−  選択された個体群をin vitroで増幅させる段階、
が続いていることを特徴とする。
【００３３】
上述のような改変された多量体での特異的標識付けと暗騒音の間の差異の増大により、ポリクローナル個体群の内部での特異的リンパ球個体群のより優れた弁別（discrimination）が可能となり、かくしてこれらの多量体での免疫磁気選別が非常に効果的なものになる。
【００３４】
ＭＨＣ分子は例えば、重鎖上に酵素によるビオチニル化パターンを含む。複合体が上に固定される球は、ストレプトアビジンにカップリングされる。
【００３５】
ポリクローナル個体群は、滑液又は末梢血の単核細胞といったような患者から採取した標本に由来する。
【００３６】
選択された個体群の増幅段階は、有利には、増幅された個体群の代表性に影響を及ぼさない条件下でのポリクローナル刺激によって実施される。例えば、照射されたＰＨＡ，ＩＬＺ又はＰＢＬが使用される。
【００３７】
本発明は、また、選択されたそして場合によっては増幅されたＴリンパ球個体群において一定の与えられた複合体のペプチドに対し反応性をもつＴリンパ球のみで構成されていることを特徴とするTリンパ球個体群をも提供する。
【００３８】
かかるペプチド特異的な個体群は、治療において、そしてより特定的には養子免疫療法に従ったその再投与に基づく応用分野のために、きわめて有利なものである。
【００３９】
従って、本発明は、薬学的ビヒクルと結びつけた形で上述のようなペプチド特異的Tリンパ球個体群から作製されることを特徴とする薬学組成物を提供する。
【００４０】
かかる組成物は有利には注射により投与可能である。
【００４１】
かくして、それぞれ規定のウイルス又は腫瘍ペプチドとクラスＩのＭＨＣの複合体を認識するＴリンパ球の注射後に抗ウイルス又は抗腫瘍免疫性を回復させるか又は、免疫応答の活性化又は阻害特性を呈し一定の与えられた抗原に向けられたＴ細胞の投与により免疫不均衡（例えば自己免疫のケース）を補正することが可能である。
【００４２】
本発明のその他の特徴及び利点は、添付図面の図１〜７を参照する、純粋に例示を目的として示された以下の実施例の中で記されている。
【００４３】
【発明の実施の形態】
実施例１：  コレセプタＣＤ８との相互作用ゾーン内で突然変異を受けた４量体ＨＬＡ−Ａ０２０１の製造。
酵素によるビオチニル化パターンについてコードする１配列だけ延長されたＨＬＡ０２０１の重鎖についてコードするｃＤＮＡを含有する細菌発現プラスミドを使用した（Altman et al（１）に従った構成体）。α３ドメインについてコードするゾーンを、配列番号１；
５’ＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣ３’
及び配列番号２；
５’ＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＧ３’
の特異的プライマで増幅した。
【００４４】
増幅フラグメントの中に、StratageneのQuickchange Site-directed Mutagenesis R キットを使用して、アラニンコドンをバリンコドンに形質転換するための塩基の突然変異を導入した。
【００４５】
突然変異を受けたフラグメントを発現プラスミド内に再導入し、突然変異の存在を配列決定によって制御した。
【００４６】
突然変異を受けた重鎖ＨＬＡ−Ａ０２０１を細菌封入体の形で産生し、まずペプチドを含んだＨＬＡ単量体そして次に対応する突然変異を受けた４量体をGarboczi et al（３）によって以前に記述された復元プロトコルに従って獲得することができた。
【００４７】
実施例２：未変性ＨＬＡ−Ａ０２０１ ４量体と異なるペプチドを含んだ突然変異を受けた４量体ＨＬＡ−Ａ０２０１との間の免疫螢光標識付けの特異性及び効率の比較研究
ａ）リンパ球クローンの標識付け
未変性４量体ＨＬＡ−Ａ０２０１と突然変異を受けた対応する４量体に、ＥＢＶのウイルスのＢＭＬＦ１タンパク質に由来するペプチドか又はＣＭＶのタンパク質ｐｐ６５に由来するペプチドを含ませた。
【００４８】
実施例１の技術に従って、ただし突然変異無しで、未変性４量体を得る。
【００４９】
特異的及び非特異的クローンを標識付けし、増大する濃度で使用した。
【００５０】
図１は、未変性ＨＬＡ−Ａ２/ＢＭＬＦ１ ４量体（図１Ａ）及び対応する突然変異を受けた４量体（図１Ｂ）で得られた螢光強度（ＭＦＩ）平均を示す。
【００５１】
未変性４量体ＨＬＡ−Ａ２/ＢＭは、使用される４量体用量と共に増大する非特異的な或る種のクローン上の固定暗騒音を示す、ということがわかる。
【００５２】
この暗騒音は、同じく制限されている抗メラン−ＡクローンＨＬＡ−Ａ０２０１が穏やかな暗騒音を示すのに２つの制限された抗ＩＥ １クローンＨＬＡ−Ａ０２０１が強い暗騒音を示すことから考慮対象のクローンのＨＬＡ制限のみに関係するのではなく、含まれるペプチドにも左右されると思われる。
【００５３】
突然変異を受けた４量体の場合、特異的クローン（ＢＭ/Ａ２）について得られる螢光平均（ＭＦＩ）は、未変性４量体で得られるものよりも低いが、非特異的クローン上の暗騒音は、使用される４量体の濃度の如何に関わらずほぼゼロである。
【００５４】
未変性４量体と突然変異を受けた４量体の間のこの暗騒音の差は、４量体ＨＬＡ−Ａ２/ｐｐ５５でも見られることから、４量体Ａ２/ＢＭに特定的なものではないことがわかるだろう。
【００５５】
図２では、螢光平均は、突然変異を受けた４量体で得られるわずかな標識付けの暗騒音を視覚化する目的で対数目盛で表示されている。ここで特異的標識付けと非特異的標識付けの間の差異が突然変異を受けた４量体Ａ２/ｐｐ６５では約２log(１０２）であったのに対し、未変性４量体では１log にすぎないということがわかる。顕著な２つの例外は、未変性４量体で暗騒音がきわめて低い２つの抗ＥＢＶクローンＣＤ４である。この観察事実は、未変性４量体で得られる標識付け暗騒音がＣＤ８に対する４量体の一定の百分率の非特異的固定に起因するものであるとする仮説を強化している。
【００５６】
図３では、特異的クローン上でのｐｐ６５を含んだ未変性４量体及び突然変異を受けた４量体で得られた標識付けの差が表わされている。突然変異を受けた４量体及び未変性４量体で得られた飽和曲線間の差は、これらのクローン上では突然変異を受けた４量体の場合に比べさらに多数の固定部位が未変性４量体について存在することを示している。従って、未変性４量体の場合、この分子がＴリンパ球の表面でＴＣＲの密度をはるかに上回る密度で発現されることからなおさら、一定の原子価が単独のＣＤ８と相互作用する確率がきわめて高い。
【００５７】
突然変異を受けた４量体での特異的標識付けが特異的クローンのＣＤ８依存度により有意に（significantly）影響されたか否かをテストするため、その他の実験が実施された。実際、ＣＤ８＋  Ｔクローンのうち、いくつかのクローンが、そのＴＣＲとＨＬＡＡ−ペプチド複合体との間の特異的相互作用を強化するためＣＤ８を強く必要としており、一方その他のクローンにはその必要が無いということは周知の事実である。
【００５８】
ＣＤ８依存度は、抗ＣＤ８抗体を伴う又は伴なわないCouedel et al(４）の細胞毒性試験に従って見積られ、ＨＬＡ−ペプチド複合体に対するＴＣＲの親和力に反比例するものとみなされる。
【００５９】
図４Ａには、２つの特異的クローンをもったペプチドＢＭＬＦ１（１０μＭ）を含んだＨＬＡ−Ａ０２０１系統に対する細胞毒性試験が表わされている。クローンＡ２．１０は、その細胞毒性が抗ＣＤ８抗体により撤廃されていることから、ＣＤ８依存性が非常に高く、一方クローンＡ４，５は比較的ＣＤ８依存性が低い。
【００６０】
表面で発現されたＴＣＲの数を推定するため、突然変異を受けた４量体での標識付け及び抗ＣＤ３抗体での標識付けを実施した。結果は、図４Ｂ（ＣＤ３  標識付け）及び４Ｃ（突然変異を受けた４量体  ＢＭＦＬ１／Ａ２の標識付け）に示されている。
【００６１】
４量体標識付けとＣＤ３標識付けの比率が２つのクローンについてきわめて似通っていることがわかり、このことはすなわち、突然変異を受けた４量体での標識付けがＣＤ８依存度（ひいては演繹してＴＣＲの親和力）による影響をほとんど受けないということを表わしている。
【００６２】
かくして、ＨＬＡ分子の突然変異によって誘発されるＣＤ８に対する親和力の減少は、４量体の特異的標識付けに有意に影響を及ぼさない。
【００６３】
ｂ）  ポリクローナル個体群の内部での特異的細胞の検出
ポリクローナル個体群の内部での低い百分率の特異的細胞についての未変性４量体及び突然変異を受けた４量体の検出能力を比較するため、（以下Ａ及びＢと呼ぶ）２人のＨＬＡ−Ａ０２０１患者の末梢リンパ球を標識付けした。ここで問題となっているのは、予めその体内でＣＭＶの抗ｐｐ６５ペプチド応答が立証されている患者である。これらのリンパ球は予めin vitroでポリクローナル増幅させられ凍結されていた。
【００６４】
患者Ａ及びＢについて得られた結果は、図５に報告されており、図５Ａは患者Ａに対応し図５Ｂは患者Ｂに対応している。これは、２０μｇ/ｍｌのフィコエリトリンでの４量体ＨＬＡ−Ａ０２０１/ｐｐ６５の単純標識付け及び対応する２重標識付け（ＰＥで標識付けされた４量体及びＦＩＴＣで標識付けされた抗ＣＤ８抗体）の結果である。この図は同様に、螢光強度平均（log)をも示している。
【００６５】
まず第１に、単純標識付けにおける未変性４量体の弁別能力は、出発個体群の中の特異的細胞の百分率に応じて変動可能である。実際、患者Ａについては、５.６０％を占める陽性細胞のピークは容易に識別可能であるが、一方患者Ｂについては、このピークは非特異的標識付けにより汚染され、陽性細胞の百分率の決定を困難にしている。文献と合致して、未変性４量体及び抗ＣＤ８の２重標識付けは、暗騒音を減少させ、このとき陽性下位個体群を明確に識別しその百分率を精確に推定すること（このケースでは０.８４％）を可能にする。従ってこうして、未変性４量体での陽性細胞の百分率の精確な推定が抗−ＣＤ８までの２重標識付けの使用を暗に意味していることが明らかになる。
【００６６】
これに対して、突然変異を受けた４量体での単純標識付けは、２人の患者において陽性細胞のピークを明確に識別できるようにする。得られた陽性細胞百分率は、未変性４量体での２重標識付けにおいて得られたものとほぼ同一である。このことは、未変性４量体による検出が可能な全ての特異的細胞が、突然変異を受けた４量体でも検出可能であることを証明しており、従って、ＣＤ８依存性のきわめて高い及び非常に低いクローンで得られた結果すなわち突然変異が特異的認識に有意に影響を及ぼさないことに確証を与えている。
【００６７】
その上、これらの結果は、突然変異を受けた４量体を用いた２重標識付けが単純標識付けと比べて新しいデータをもたらさないということを示している。最後に、未変性４量体（患者Ａ及びＢについて２１６及び１９３）を用いた２重標識付けの際に抗ＣＤ８抗体で得られた螢光平均が突然変異を受けた４量体（患者Ａ及びＢについて３６６及び３７０）での２重標識付けで得られたものよりも著しく低いということを指摘することができる。抗−ＣＤ８を用いた全個体群の単純標識付けの後に得られる螢光平均は、それぞれ患者Ａ及びＢについて３４０及び３５５であった。これにより、抗ＣＤ８抗体と未変性４量体の間の固定競合が明らかになり、この競合は突然変異を受けた４量体の場合には発生しないものである。
【００６８】
従って、突然変異を受けた４量体の使用によって、ポリクローナル個体群の内部での特異的細胞の百分率を推定するために抗ＣＤ８での２重標識付け無しですますことが可能となる。
【００６９】
実施例３：未変性４量体 ＨＬＡ−Ａ０２０１及びペプチドｐ６５を含んだ突然変異を受けた４量体 ＨＬＡ−Ａ０２０１で実施された免疫磁気選別の特異性及び効率の比較研究
ビオチニル化されペプチドｐｐ６５を含んだ単量体ＨＬＡ−Ａ０２０１をストレプトアビジン（Dynabeads M-２８０ Streptanidin, DYNAL）にカップリングされた磁球上に固定した。該研究において使用されたリンパ球個体群は、リウマチ様多発関節炎を患う患者の滑液又はＰＢＬ，又はＣＭＶに対する血清陽性の健康な供与体に由来するＰＢＬに由来するものである。
【００７０】
図６には、これらのポリクローナル個体群についての未変性４量体及び突然変異を受けた４量体を用いた単純標識付けの結果が示されている。突然変異を受けた４量体を用いた場合、未変性４量体ではほとんど識別不可能な陽性細胞である２回の採取における低い百分率の陽性細胞（０.２２％及び０.１４％）を明らかにすることが可能である。
【００７１】
これらの個体群を、未変性４量体又は突然変異を受けた４量体を含んだ球で選別し、その後選択された個体群を、増幅された個体群の代表性に影響を及ぼすことのない刺激であるポリクローナル刺激（照射されたＰＨＡ，ＩＬ２，ＰＢＬ）によってin vitroで増幅した。
【００７２】
この時点で、これらの選別され２つの４量体で増幅された個体群について、標識付けを行なった。
【００７３】
図６に表わされているように、未変性４量体での選別に由来する細胞はこの同じ４量体で陽性として標識付けされるものの、逆にこれらの細胞のうち突然変異を受けた４量体で陽性であるものの百分率はきわめて低い（０.７％及び２.８８％）。
【００７４】
結果は、選別された個体群が２つの突然変異を受けた４量体で強い陽性を示すことから、突然変異を受けた４量体での選別後では顕著に異なっている。
【００７５】
突然変異を受けた４量体で得られた陽性細胞での富化係数は採取１については４２１であり（９２.６４％対０.２２％），採取２については６９３（９７.０１％対０.１４％）である。
【００７６】
これらの結果は、突然変異を受けた４量体を用いて選別を行なうことにより、その個体群が０.１〜０.２％を占める標本から９０％以上の割合で純粋な１つの陽性個体群を得ることが可能であるということを示している。
【００７７】
この観察事実の一般性は、患者及び健康な供与体の滑液リンパ球及びＰＢＬから未変性４量体及び突然変異を受けた４量体で行なわれた選別の結果を記す以下の表によって例示されている。
【表１】
0005020452.tif 000002
【００７８】
突然変異を受けた４量体を用いて反復的選別を行なうことにより、なお一層頻度の低い下位個体群（表中のＰＢＬ５参照）から純粋な特異的個体群を得ることが可能である。反対に、この結果は、未変性４量体を用いて得ることがはるかに困難なものである。実際、未変性４量体での１回目の選別によって分離された非特異的細胞は、その後の選別の際に新たに選択されるのに充分な親和力をもつと思われる。従って、２回目の選別（ＰＢＬ３及びＳＦＬ４参照）を行なうことにより非常に凡庸な富化係数（concentration factor）にたどりつくことになる。
【００７９】
もう１つの研究は、突然変異を受けた４量体 Ａ２/ｐｐ６５を固定するその能力のために選択された細胞が、生理学的状況下で、このＨＬＡ−ペプチド複合体に対し充分反応性を有していたことを確認することを目的とする、選別された個体群の反応性に関するものであった。
【００８０】
このため、ペプチドｐｐ６５を含んだ細胞Ｔ２（Ａ０２０１＋）の存在下に置いた後、ＩＬ２でのレセプタ（ＣＤ２５）のα鎖の表面における誘発によって明らかにされる、選別されたリンパ球個体群の活性化を研究した。
【００８１】
図７が示しているように、未変性４量体を用いて選別された個体群は、ペプチドを含んだ細胞Ｔ２との接触の後ＣＤ２５を発現しない。
【００８２】
反対に、突然変異を受けた４量体で選別された細胞の大部分は、ペプチドｐｐ６５を含んだＴ２の存在下で活性化され、ＣＤ２５での陽性細胞百分率は、突然変異を受けた４量体により標識付けされた細胞の百分率と充分に対応している。（患者１及び２についてそれぞれ活性化された細胞の９０.６３％対標識付けされた細胞９２.６４％及び９７.２０％対９７.０１％）。
【００８３】
これらの結果は、突然変異を受けた４量体で標識付けされ選別された細胞が排他的（独占的）に反応性細胞であり、一方未変性４量体で選別された細胞が非反応性であることを明らかにしている。
【００８４】
この個体群の中にいくつかの陽性細胞が識別できたにも拘わらず未変性４量体での選別後は反応性細胞が全くみあたらないという事実は、おそらく機能的試験において検出するにはあまりにも低すぎるこれらの細胞の百分率のせいであると思われる。
【００８５】
これらの結果全体は、出発個体群の中での代表性が低い個体群を免疫磁気選別により選択するためには、未変性４量体に比べ突然変異を受けた４量体の方が明らかに優れていることを立証している。
【００８６】
出発採取の中で特異的個体群の数がさらに多い場合には、未変性４量体で反応性細胞を分離することが可能となるが、得られる個体群の純度は、突然変異を受けた４量体と並行して得られたものよりもきわめて低いものである（表）。
【参考文献】
１）  Altman J.D. et al, １９９６，Science ２７４：９４−６  及び  米国特許第５,６３５,３６３号．
２）  Salter R.D. et al, １９９０，Nature ３４５：４１−４６
３）  Garboczi D.N. et al, １９９２，Proc Natl Acad Sci USA ８９：３４２９−３３．
４）  Couedel, C., M. et al, １９９９，J. Immunol １６２−６３５１−８．
５）  Luxembourg A.T. et al, Nature Biotechnology, 第１６巻 １９９８年３月、２８１−２８５
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＢＭＬＦ１に由来するペプチドを含んだ４量体についての、未変性４量体（１Ａ，２Ａ）及び対応する突然変異を受けた４量体（１Ｂ，２Ｂ）の濃度に応じた螢光強度（平均）を表わす。
【図２】  ｐｐ６５に由来するペプチドを含んだ４量体についての、未変性４量体（１Ａ，２Ａ）及び対応する突然変異を受けた４量体（１Ｂ，２Ｂ）の濃度に応じた螢光強度（平均）を表わす。
【図３】  特異的クローンを用いた、未変性４量体と突然変異を受けた４量体濃度に応じた螢光強度平均を示す。
【図４】  図４Ａは、ペプチドＢＭＬＦ１を含んだＢ系統ＨＬＡ−Ａ０２０１の２つの特異的クローンの抗ＣＤ８抗体を伴う又は伴わない溶解百分率を表わし、図４Ｂ及び４Ｃは、これらのクローンの標識付けの結果を表わす。
【図５】  ２人の患者のリンパ球を用いた、未変性４量体及び突然変異を受けた４量体の単純（フィコエリトリン、ＰＥでの）標識付け及び２重（ＰＥ及び標識付け済み抗ＣＤ８抗体）標識付けの結果を表わす。
【図６】  未変性４量体及び突然変異を受けた４量体を用いて実施された免疫磁気選別の結果を示す。
【図７】  未変性４量体及び突然変異を受けた４量体を用いて実施された免疫磁気選別の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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