(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
30％グルコースおよび１％酵母エキスを含む培地中でグルコースをエリトリトールに変換することができるモニリエラ（Moniliella）属の酵母菌株であって、運動性胞子がないこと；有隔菌糸体；無性生殖；腎臓形細胞がないこと；長柄ではなく小歯状突起の上に任意に形成された分生胞子；射出分生子がないこと；広い基底部上での単極性でない出芽；分芽分生子の求頂性鎖；暗褐色の厚壁の厚膜胞子；発酵能力；シュークロース、グリセロールおよびマルトースを同化できること；ラクトースを同化できないこと；ガラクトースを発酵できないこと；並びに25℃〜36℃で生育できることを特徴とするモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項２】
シュークロースを発酵できること、およびガラクトースを同化できないことを更に特徴とする請求項１記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項３】
グルコースおよびマルトースを発酵できることを更に特徴とする請求項２記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項４】
シュークロースを発酵できること、およびガラクトースを同化できることを更に特徴とする請求項１記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項５】
グルコースおよびマルトースを発酵できることを更に特徴とする請求項４記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項６】
グルコースをエリトリトールに変換することができるモニリエラ（Moniliella）属の酵母菌株であって、運動性胞子がないこと；有隔菌糸体；無性生殖；腎臓形細胞がないこと；長柄ではなく小歯状突起の上に任意に形成された分生胞子；射出分生子がないこと；広い基底部上での単極性でない出芽；分芽分生子の求頂性鎖；暗褐色の厚壁の厚膜胞子；並びに明細書の表１〜６の一つに記載の生理学的特徴により特徴づけられるモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項７】
明細書の表１に記載の生理学的特徴により特徴づけられる請求項６記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項８】
明細書の表２に記載の生理学的特徴により特徴づけられる請求項６記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項９】
明細書の表３に記載の生理学的特徴により特徴づけられる請求項６記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項１０】
明細書の表４に記載の生理学的特徴により特徴づけられる請求項６記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項１１】
明細書の表５に記載の生理学的特徴により特徴づけられる請求項６記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項１２】
明細書の表６に記載の生理学的特徴により特徴づけられる請求項６記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項１３】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）により受託番号PTA-1227、PTA-1228、PTA-1229、PTA-1230、PTA-1231、またはPTA-1232を付与された請求項６記載のモニリエラ属の酵母菌株；または前記モニリエラ属の酵母菌株に由来し、グルコースをエリトリトールに変換する能力を維持する変異株。
【請求項１４】
受託番号PTA-1227を付与された請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項１５】
受託番号PTA-1228を付与された請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項１６】
受託番号PTA-1229を付与された請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項１７】
受託番号PTA-1230を付与された請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項１８】
受託番号PTA-1231を付与された請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項１９】
受託番号PTA-1232を付与された請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項２０】
受託番号PTA-1227を付与された菌株に由来し、グルコースをエリトリトールに変換する能力を維持する変異株である請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項２１】
受託番号PTA-1228を付与された菌株に由来し、グルコースをエリトリトールに変換する能力を維持する変異株である請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項２２】
受託番号PTA-1229を付与された菌株に由来し、グルコースをエリトリトールに変換する能力を維持する変異株である請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項２３】
受託番号PTA-1230を付与された菌株に由来し、グルコースをエリトリトールに変換する能力を維持する変異株である請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項２４】
受託番号PTA-1231を付与された菌株に由来し、グルコースをエリトリトールに変換する能力を維持する変異株である請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【請求項２５】
受託番号PTA-1232を付与された菌株に由来し、グルコースをエリトリトールに変換する能力を維持する変異株である請求項１３記載のモニリエラ属の酵母菌株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
糖アルコールであるエリトリトールは、シュークロースの60〜80％の甘さである。しかしエリトリトールは、シュークロースの約1/10の発熱量しかなく、虫歯の原因とならない。またエリトリトールは、多くの糖アルコールとは異なり、下痢を引き起こさない。更にエリトリトールは、優れたプロセシング特性を有する：熱安定であり；アミノ基と反応しないため、有機物質の退色（browning）を起こさない。
【０００２】
エリトリトールは、地衣類、麻の葉、キノコ、発酵性食品（例えば、ワインおよび醤油）、および微生物に見出すことができる。エリトリトール産生微生物の中には、Pichia、Candida、Torulopsis、Trigonopsis、Moniliella、Aureobasidium、およびTrichosporon属の酵母菌株が含まれる。
【０００３】
【発明の概要】
本発明は、単純な培地中でグルコースをエリトリトールに変換することができる新規酵母菌株に関する。
【０００４】
本発明の酵母菌株は、運動性胞子もしくは遊走子（即ち、鞭毛を有する胞子）がないこと；有隔菌糸体（即ち、隔壁を有する菌糸体）；無性生殖（即ち、カソガミー（kasogamy）および減数分裂を伴わない生殖）；腎臓形細胞がないこと；長柄ではなく小歯状突起（即ち、小さな歯のような突起）の上に任意に形成された分生胞子；射出分生子（即ち、強制的に放出される胞子）がないこと；広い基底部上での単極性でない出芽（即ち、単一極生長（outgrowth）から新規細胞の発生がない増殖プロセス）；分芽分生子の求頂性鎖（即ち、隔壁によって先端が境界を決められる前に、認識可能な分生胞子先端の著しい肥大化により特徴づけられる分生胞子）；暗褐色の厚壁の厚膜胞子（即ち、プロトプラストの収縮により既存の細胞の一部に内因的にそれぞれ一つずつ生じる１細胞の無性胞子）；発酵能力（即ち、少なくとも一炭素源を半嫌気的に発酵できること）；シュークロース、グリセロールおよびマルトースを同化できること；ラクトースを同化できないこと；ガラクトースを発酵できないこと；並びに25℃、30℃、35℃および36℃で生育できることにより特徴づけれられる。任意に、本発明の酵母菌株は、シュークロース、グルコース（即ち、Ｄ-グルコース）もしくはマルトースを発酵できること；あるいはガラクトースを同化できることもしくは同化できないことにより更に特徴づけることができる。
【０００５】
菌株が、特定の炭素源を発酵もしくは同化できるかできないか、ビタミンフリーの培地で生育できるかできないか、並びに特定の温度で生育できるかできないかを、以下の実施例に記載の手法に従って測定することができる。
【０００６】
また、上述の形態学的特徴および以下の表１、２、３、４、５または６に挙げた生理学的特徴により特徴づけられる酵母菌株は、本発明の範囲内に想定されるものである。例としては、American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USAに、2000年１月27日に寄託された６菌株が含まれるがこれに限定されない。寄託された菌株の受託番号は、PTA-1227、PTA-1228、PTA-1229、PTA-1230、PTA-1231、およびPTA-1232である。寄託された菌株に由来する変異株も、本発明の範囲内である。
【０００７】
本発明の酵母菌株は、Moniliella acetobutenに最も近縁である。実際、上述の酵母菌株の形態学的特徴は、M.acetobutenの特徴と一致する。一方、その生理学的特徴は、M.acetobutenとは僅かに異なっている。例えば、M.acetobutenと違って、本発明の菌株はラクトースを同化しない。更に、本発明の菌株は、単純な培地中（例えば、グルコースおよび酵母エキスのみ）で、M.acetobutenからは予想されない速い速度でグルコースをエリトリトールに変換することができる。
【０００８】
本発明のその他の特徴もしくは利点は、以下の（実施例を含む）詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【０００９】
【詳細な説明】
本発明の酵母菌株は、天然資源、例えば、ハチ蜜、保存果実、および花粉のような糖含有量の高いサンプルから単離することができる。各菌株は、グルコースをエリトリトールに変換する能力、並びに種々の形態学的および生理学的特徴に基づいて同定される。本発明の酵母菌株は、１ｇのグルコースを少なくとも0.3ｇのエリトリトール（即ち変換率＞30％）に変換することができる。30％グルコースおよび１％酵母エキスを含む10ｍLブロスを含有する50ｍLフラスコ内（初期の細胞密度１×105 細胞/ｍL）で、ロータリーシェーカー150rpm、30℃で６日間本発明の菌株を培養することにより、変換率は測定される。形態学的特徴は、４％麦芽エキス/0.5％酵母エキス寒天上、20℃で10日間生育後、測定される。A Taxonomic Study, Edited by Kurtzman et al., 4th Ed., ページ 785, Elsevier, Amsterdam (1998)を参照のこと。一方、生理学的特徴は、以下の実施例に記載の方法により測定される。
【００１０】
本発明の他の酵母菌株は、天然資源から単離された菌株に由来する変異株であり得る。例えば、このような菌株は、ＵＶ照射、Ｎ-メチル-Ｎ’-ニトロソグアニジン処理、エチルメタンスルホネート処理、亜硝酸処理、アクリジン処理などにより得られる変異株であり得る。またこのような菌株は、細胞融合もしくは組換えＤＮＡ技術により遺伝的に産生された組換え株であり得る。
【００１１】
当業者であれば、説明のためだけであって他の開示内容を限定する意図のない以下の特定の実施例に基づいて、本発明の酵母菌株を入手し最大限に利用することができる。本明細書で引用された全ての文献は、参照により本明細書の開示内容の一部とする。
【００１２】
【実施例】
ハチ蜜、未処理の花粉、処理済みの花粉、保存果実、新鮮な果実、糖製造からの廃水、および糖みつから、370のサンプルを収集した。次に、収集したサンプルを40％グルコースおよび１％酵母エキスを含む培地中で３〜４日間培養した。次に、培養物を20％グルコースおよび１％酵母エキスを含む寒天プレート上に播き、その後30℃で３〜４日間インキュベーターでインキュベートした。コロニーの外観に基づいて、種々の菌株を選び取り、30％グルコースおよび１％酵母エキスを含むブロスに接種し、30℃で４〜５日間インキュベーターで培養した。各々の上清中のエリトリトールの量をＨＰＬＣおよびＴＬＣで測定し、単離した菌株のエリトリトール産生能力を決定した。
【００１３】
ＨＰＬＣ分析は、Hewlett Packard H4033Aアナライザーにより、Ion-300クロマトグラフィーカラムで、移動相として0.1Ｎ硫酸を流速0.4 mL/分で用い、温度を75℃に設定して行なった。ＴＬＣ分析は、Neissnerらの手法に従った（Neissner, et al. 1980. Herstellung, aanalyse und DC-trennung von fettsaure erythritpartialestern. FETTE・SEIFEN・ ANSTRICHMITTEL. 82: 10-16.）。４％ホウ酸でKieselgel 60F254（Merck）をリンスした後、使用前にそのゲルを105℃で20分間、インキュベーターで加熱した。展開溶媒は、エチルメチルケトン：アセトン：水（体積比で100：10：10）であり、発色現像剤は、濃硫酸中のKMnO4であった。
【００１４】
ＨＰＬＣもしくはＴＬＣによって上清から精製されたエリトリトールを更に、抽出により精製し、次いで減圧下で乾燥させた。更なる精製を行なった生成物およびエリトリトールのスタンダードを、Shindouらの方法に従ってアセチル化した（Shindouら. 1989. ＨＰＬＣおよびＧＣ-ＭＳによるエリトリトールの同定、および種々の果実の果肉における定量測定. J.Agric.Food Chem. 37: 1474-1476.）。得られたサンプルをＧＣ-ＭＳにより分析し、再度精製された生成物がスタンダードサンプルのものと同一であるかを測定した。
【００１５】
合計630の菌株が、370のサンプルから単離された。それらのうち、22の菌株がエリトリトール産生能力を示した。エリトリトール産生菌株６菌株は、ハチ蜜、処理済みの花粉、および糖みつに由来する161の単離株から選択され、0.5〜1.5％の間のエリトリトール変換率を示した。この低い変換率は、サンプルが収集前に加熱および乾燥にさらされたため、エリトリトール産生微生物が死んでしまったためと思われる。（多くは未処理である）49のハチ蜜サンプルから単離された26の菌株のうち３菌株、即ち440、441および442は、高い変換率（＞30％）でグルコースからエリトリトールを産生することが見出された。糖工場に由来する廃水および泥サンプルから単離された66の菌株のうち、何れもエリトリトールを産生する能力を示さなかった。エリトリトール産生に優れた３菌株（変換率＞30％）、即ち166-2、262-1および278-3が、未処理の花粉および保存果実のサンプルから単離された。
【００１６】
エリトリトール産生に対するグルコース濃度の影響を調査するため、菌株166-2、262-1および278-3をそれぞれ、１％酵母エキスと20％、30％、40％グルコースそれぞれを含む培地中で、ロータリーシェーカー150rpmで、30℃で１〜６日間培養した（50ｍLフラスコ中に10ｍL培地；初期の細胞密度 １×105 細胞/ｍL）。次いで、産生されたエリトリトールの量を測定した。その結果より、30％グルコース培地で６日間（本発明の酵母菌株の変換率を測定するための標準的手法で）生育した３菌株の全てが、30％を超える変換率を示すことが明らかにされた。更に、40％グルコースを含む培地で６日間培養した後、３菌株全ての変換率は約30％であることが示された。グルコースの消費に関していうと、30％グルコースを含む培地で培養すると、菌株166-2は５日目にグルコースを全て使い果たし、菌株262-1および278-3は６日目に使い尽くした。
【００１７】
30％グルコース培地にKClもしくはNaClを、それぞれ0.5、1.0および1.5Ｍ添加した研究により示されるように、イオン浸透圧の増大は、３菌株全てに対して変換率を低下させることが見出された。ｐＨプロフィール研究により、ｐＨ4.0〜7.0において30％グルコース培地で生育した３菌株の変換率は、ほぼ同じであることが示された。変換率はｐＨ８で低下した。また、菌株166-2、262-1および278-3を、30％培地でそれぞれ25℃、30℃および35℃において培養した。３菌株全てが、30℃で最も高い変換率を示し、25℃で最も低い変換率を示した。
【００１８】
また、エリトリトール産生に対する種々の培地の影響を調査した。30％グルコースを30％マルトースと置き換えると、３菌株は全てエリトリトールを産生しなかった。30％グルコースを30％マルトデキストリンと置き換えるか、あるいは１％酵母エキスを６％コーン・スティープ・リカーもしくは６％ダイズ・フラワーと置き換えると、変換率は有意に低下した。更に、培地中の酵母エキスの種々の濃度、0.5％、0.75％および1.0％の影響を調査した。その結果は、酵母エキスのレベルに比例して変換率が増大することを示した。更に、種々の無機塩類を種々の濃度、即ち、MgSO4・7H2O（0.02％〜0.1％）、KH2PO4（0.001％〜0.02％）、CaCl2・2H2O（0.1％〜0.4％）、およびCaCO3（0.1％〜１％）で添加したことによって、変換率は有意な影響を受けなかった。
【００１９】
上述のようにフラスコ内で培養することに加えて、菌株166-2、262-1、および278-3それぞれを、30℃で６〜７日間、２リットルの30％グルコース/１％酵母エキス培地を含む５リットル発酵槽でも培養した（回転：150rpm；エアレーション：１vvm、即ち体積/分/培地体積；初期の細胞密度：１×105 細胞/ｍL）。グルコースのエリトリトールへの変換は、菌株166-2および262-1の両方とも、５日目終了時にほぼ完了していた。菌株278-3は、より遅い速度でグルコースをエリトリトールに変換したため、その変換は７日目までに完了しなかった。
【００２０】
７日目に、遠心により各培養物から上清を収集し、活性炭で脱色し、次いでイオン交換樹脂（IRA-410：IRA-120B＝２：１）を通して、不純物を除去した。蒸発および再結晶化により凝縮した後、エリトリトールを白色透明の結晶として得た。得られたエリトリトール結晶の構造を、１Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲにより確認した。
【００２１】
菌株166-2、262-1、278-3、440、441および442のそれぞれを、10ｍLの30％グルコース/１％酵母エキス培地（初期の細胞密度１×105 細胞/ｍL）を含有する50ｍLフラスコ内で、ロータリーシェーカー150rpm、30℃で６日間培養すると、これら菌株はそれぞれ、リットルあたり98.7、104.1、117、99、97.8、および102.6ｇのエリトリトールを産生できることが見出された。
【００２２】
The Yeasts, A Taxonomic Study, Edited by Kreger-van Rij et al., 3rd Ed., ページ76-101, Elsevier, Amsterdam (1984)に記載された手法に従って、菌株166-2、262-1、278-3、440、441および442の生理学的特徴を測定した。
【００２３】
特に、全ての糖の発酵は、ダラム管内の２％(w/v)溶液中で試験を行ない、48時間後の麦芽エキス寒天培地の培養株から接種株を得、接種後、発酵基礎培地中、25℃でその細胞をインキュベートした。78〜79ページを参照のこと。
【００２４】
81〜83ページの小見出し“１．液体培地の同化試験”に記載の方法に従って、炭素化合物の好気的利用（同化）に関する試験を行なった。より詳細には、細胞懸濁液を滅菌水道水で調製し、接種後、細胞を25℃でインキュベートした。6.7ｇのBacto酵母窒素ベースおよびグルコースと同等の（即ち、５ｇのグルコースと同量の炭素を含有する）適量の炭素化合物を、100ｍL脱イオン水に溶解することにより、10倍濃縮された培地を調製した。簡潔にするため、全ての正の反応（即ち、１＋、２＋および３＋）を“＋”と示す。
【００２５】
85〜86ページの小見出し“１．液体培地における同化”に記載の方法に従って、窒素化合物の好気的利用（同化）に関する試験を行なった。簡潔にするため、全ての正の反応（即ち、１＋、２＋および３＋）を“＋”と示す。
【００２６】
86〜87ページの小見出し“３．ビタミンフリー培地における生育、ビタミン要求性”に記載の方法に従って、ビタミンフリー培地における生育に関する試験を行なった。簡潔にするため、全ての正の反応（即ち、１＋、２＋および３＋）を“＋”と示す。
【００２７】
88〜89ページの小見出し“５．37℃および他の温度における生育；生育の最大温度”に記載の方法に従って、種々の温度での生育に関する試験を行なった。固形培地を使用した。
【００２８】
試験結果の全てを、以下の表１〜６に示す。
【００２９】
【表１】
0004850998.tif 000002
【００３０】
【表２】
0004850998.tif 000003
【００３１】
【表３】
0004850998.tif 000004
【００３２】
【表４】
0004850998.tif 000005
【００３３】
【表５】
0004850998.tif 000006
【００３４】
【表６】
0004850998.tif 000007
【００３５】
【その他の態様】
上述の説明から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を容易に認識することができ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明に種々の変更および改良を加え、種々の使用および状況に本発明を適合させることができる。例えば、試験を行なった酵母菌株の全てが、30％グルコースおよび１％酵母エキスのみを含む培地中で生育可能であるが、一もしくは複数の栄養素を補充しただけでこのような培地中で生育できる菌株も、本発明の範囲内と想定される。従って、その他の態様も特許請求の範囲に含まれる。