(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Zymomonas mobilis由来のピルベートデカルボキシラーゼ活性を発現する遺伝子およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を発現する遺伝子を含む配列番号7で示される塩基配列からなるＤＮＡにより、発現可能な制御配列下に形質転換された、Corynebacterium glutamicum、Brevibacterium lactofermentum、およびBrevibacterium flavumからなる群から選ばれるコリネ型細菌を用いるエタノール製造方法であって、該形質転換されたコリネ型細菌が増殖を行なわない嫌気的条件下でエタノールを製造させることを特徴とする方法。
【請求項２】
プラスミドｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨである配列番号7で示される発現ベクター。
【請求項３】
請求項２記載の発現ベクターで形質転換されたCorynebacterium glutamicum、Brevibacterium lactofermentum、およびBrevibacterium flavumからなる群から選ばれるコリネ型細菌。
【請求項４】
Corynebacterium glutamicum ｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨ／１３０３２(受託番号：FERM BP-7621)である請求項３記載のコリネ型細菌。
【請求項５】
Brevibacterium lactofermentum ｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨ／１３８６９(受託番号：FERM BP-7622)である請求項３記載のコリネ型細菌。
【発明の詳細な説明】
（発明の属する技術分野）
本発明はエタノールの製造方法に関する。詳しくは、本発明はグルコース等の糖類を原料とする、エタノール製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、ピルベートデカルボキシラーゼ（以下ＰＤＣということがある）活性を発現する遺伝子および、所望により、アルコールデヒドロゲナーゼ（以下ＡＤＨということがある）活性を発現する遺伝子を含むＤＮＡにより発現可能な制御配列下に形質転換されたコリネ型細菌を用い、該形質転換コリネ型細菌が実質的に増殖しないようなエタノール生成反応条件下で、原料となるグルコース等の糖類を発酵させることによりエタノールを生成し、次いでこれを回収することからなる、高効率高生産性のエタノール製造に関するものである。
（従来の技術）
従来、エタノールは、石炭、石油等の化石資源からのエチレンを経由する化学合成法や草木等のバイオマス資源からの糖類の酵母、細菌等微生物による発酵法により製造されている。これらの中でも、エネルギー資源問題や環境問題の観点より再生可能なバイオマス資源を用いる発酵エタノール製造方法が注目されている。
従来からの大規模な工業用発酵エタノール製造方法は、澱粉や各種のバイオマス資源由来の糖類を酵母で発酵させてエタノールを製造する方法、即ち、飲料用エタノールの醸造技術を基礎とする技術である。しかし、この技術は、発酵用微生物として酵母を用いているためエタノールの生産速度が低く、さらに、発酵条件が嫌気的とはいえ通気が必要であり、発酵管理が複雑であるなどの技術的難点がある。
発酵用微生物としてザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属菌を用いることもよく知られている（特公平７−５９１８７号公報）。
ザイモモナス属菌による発酵方法は酵母による発酵方法に比して、エタノールの生産速度が速くなることが認められているが、エタノールの生産性をさらに向上させるために各種の微生物種を用いたバイオテクノロジーによる発酵用微生物の改良技術が提案されている（特表平５−５０２３６６号報、特表平６−５０４４３６号報及び特表平６−５０５８７５号報等）。
これら技術では、具体的には、ザイモモナス属菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のＰＤＣ活性を発現するＤＮＡ断片及びＡＤＨ活性を発現する遺伝子ＤＮＡ断片（グルコース等糖類の解糖経路産物であるピルビン酸からのエタノールへの転換にはピルビン酸からアセトアルデヒドへの反応を触媒するＰＤＣ及びアセトアルデヒドから最終生成物のアルコールへの反応を触媒するＡＤＨが必須となる）を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）やＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅなどの宿主腸内細菌に発現可能な制御配列下に組み込み、このような形質転換体により生産性の高いエタノール発酵が行なわれる。
上記技術によってＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓが元来持つエタノール生産性が向上するメカニズムは、発酵過程において形質転換された細菌が増殖し、発酵槽での発酵用微生物の密度が増大する結果エタノール生成量が増大することによる。このような発酵用微生物の増殖を伴う発酵では、該微生物が増殖するためのエネルギー供給源として糖質原料が使用されるため糖質原料のエタノールへの転換効率が低く、微生物が定常期に到達するまでの期間はエタノール生産速度も低いうえ、定常期以上の微生物濃度で発酵を行なうことができず、さらに、増殖に伴う微生物の密度変化により発酵槽の運転制御も複雑であるなど高効率高生産性エタノール製造方法の達成にはまだまだ多くの技術課題を抱えている。
また、これら技術において宿主細菌として使用されている大腸菌は溶菌し易く、毒性問題が懸念される大腸菌由来の細胞内蛋白が発酵産物中に混入する可能性があるため、毒性物質の分離除去も又一つの技術課題である。
これらの観点より形質転換される宿主細菌の改良が望まれている。
（発明が解決しようとする課題）
本発明は、バイオマス資源由来の糖類を原料とするエタノール製造方法であって、前記公知技術に指摘される各種の問題点が解決され、より優れたエタノールの高効率高生産技術を実現する新規なエタノール製造方法を提供するものである。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは上記問題点を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＰＤＣ活性を発現する遺伝子および、所望により、ＡＤＨ活性を発現する遺伝子を含むＤＮＡにより発現可能な制御配列下に形質転換されたコリネ型細菌を用い、該形質転換コリネ型細菌が実質的に増殖しないようなエタノール生成反応条件下で発酵を行なうことにより、高効率高生産性のエタノール製造が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の一つの特徴は、形質転換される宿主細菌がコリネ型細菌であり、形質転換コリネ型細菌が実質的に増殖しない反応条件下でエタノール製造を行うところにある。
（発明の実施の態様）
本発明で使用される、ＡＤＨ活性を発現する遺伝子及びＰＤＣ活性を発現する遺伝子は種々の生物由来のものが使用できる。それぞれが異なる生物由来のものであっても良いが、好適にはＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ由来のものが使用できる。
具体的には、例えば、以下のごときものが既にクローニングおよび配列決定されているので使用できる。
ＡＤＨ活性発現遺伝子
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ由来：
ＡＤＨＩ遺伝子（ａｃｃ．ＮＯ．Ｍ３２１００）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１７２，２４９１−２４９２（１９９０））
ＡＤＨＩＩ遺伝子（ａｃｃ．ＮＯ．Ｘ１７０６５，Ｍ１５３９４）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１６９，２５９１−２５９７（１９８７））。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来：
ＡＤＨ１遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２５７，３０１８−３０２５（１９８２））
ＡＤＨ２遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２５８，２６７４−２６８２（１９８３））
ＡＤＨ３遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３８７，９０−９３（１９９７））
ＡＤＨ４遺伝子（ａｃｃ．ＮＯ．Ｘ０５９９２）（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ．２０９，３７４−３８１（１９８７））
ＡＤＨ５遺伝子（ＥＭＢＯ  Ｊ．ｖｏｌ．１３，５７９５−５８０９（１９９４））
Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来：
ＡＤＨ遺伝子（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ｖｏｌ．１３８４，１９７−２０３（１９９８））
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来：
ＡＤＨ遺伝子（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１８１（１７），５３１７−５３２９（１９９９）
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来：
ＡＤＨ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３９３，５３７−５４４（１９９８））
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来：
ＡＤＨ遺伝子（ＤＮＡ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ．３，１３７−１５５（１９９６））。
ＰＤＣ活性発現遺伝子
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ由来：
ＰＤＣ遺伝子（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１７０，３３１０−３３１３（１９８８））
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来：
ＰＤＣ１（ａｃｃ．ＮＯ．Ｘ７７３１６）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ１４，８９３−６３−８９７７（１９８６））
ＰＤＣ６（ａｃｃ．ＮＯ．Ｘ６６８４３，Ｘ５５９０５）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１７３，７９６３−７９６９（１９９１））
ＰＤＣ５（ａｃｃ．ＮＯ．Ｘ１５６６８）
ＰＤＣ２（ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ６５６０８）（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ２４１，６５７−６６６（１９９３））
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来：
ｐｄｈＡ遺伝子／ｐｄｈＢ遺伝子（ａｃｃ．ＮＯ．ＡＦ０１２２８５）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１７２，５０５２−５０６３（１９９０））
Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ由来：
ｐｄｈＡ遺伝子／ｐｄｈＢ遺伝子（ａｃｃ．ＮＯ．Ｕ８１８０８）（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ１４２，２５４３−２５４８（１９９６））。
これら２つの遺伝子の活性発現のためには、これらの遺伝子が制御配列下にある必要があるが、必ずしも共通制御配列下にある必要はなく、別個の制御配列下にあってもよいし、場合によっては異なるプラスミドまたは染色体上の異なる位置にあってもよい。
本明細書において「制御配列下」とは、目的遺伝子が、例えばプロモーター、インデューサー、オペレーター、リボソーム結合部位及び転写ターミネーター等との共同作業により自律複製出来ることを意味する。
本発明で形質転換される宿主微生物はコリネ型細菌である。コリネ型細菌はグラム陽性菌であり、前記先行技術において宿主細菌として用いられている大腸菌等のグラム陰性菌とは異なる。
なお、ＵＳＰ５，４８２、８４６号公報及びＵＳＰ５、９１６、７８７号公報には、ＡＤＨ活性及びＰＤＣ活性を発現する遺伝子によるグラム陽性菌の形質転換法が記載されているが、そこで用いられているグラム陽性菌はＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｉｂｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａであり、形質転換される宿主細菌としてコリネ型細菌を使用することは考えられていない。）
元来ピルビン酸からのエタノール生成機能を有していないコリネ型細菌を形質転換される宿主として選択したことが本発明の主要な特徴の一つである。本発明の方法にしたがって形質転換されたコリネ型細菌を用いることにより、通常の酵母やザイモモナス属菌そして前記先行技術の形質転換された大腸菌等の腸内細菌による発酵エタノール製造方法と異なり、発酵用微生物の増殖を実質的に伴わない反応条件下でエタノールの製造を行なうことが可能となった。
すなわち、増殖を伴わないでエタノールの生産が出来ることは、前記したような増殖を伴うエタノール生産技術の多くの問題点が解消されるので、実用的工業生産技術として大きな意義を有するが、本発明者はコリネ型細菌においてその実現が可能であることを見出し、本発明に至ったものである。
細菌類の増殖の実質的な抑制は、例えば、元来好気性細菌であるコリネ型細菌を嫌気性条件下に置くことや、ビオチンの必須栄養源を制限する（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．５，２８９−２９４．（１９９０））等の方法で実施可能である。また、増殖を制御する遺伝子の機能をバイオテクノロジー技術により人為的に調節することも有効な方法であると考えられる。
なお、嫌気性条件下でのエタノール発酵はすでに実施されているが、これらは全て使用されている発酵用微生物の増殖を意図した技術かもしくは増殖が付随する技術である。これに対し、本発明はコリネ型細菌のエタノール反応槽での実質的な増殖を抑制することを意図したものである点でその技術内容は全く異なるものである。
また、前記先行技術には、嫌気性条件でも好気性条件でも同等の形質転換菌の増殖性とエタノール生産性が得られることが記載されており、本発明とは技術思想や内容が異なるものである。
本発明は、コリネ型細菌にＰＤＣ活性を発現する遺伝子および、所望により、ＡＤＨ活性を発現する遺伝子を含むＤＮＡを発現可能な制御配列下に導入することを一つの要件としている。
ここで、ＰＤＣ活性を発現する遺伝子を含むＤＮＡの導入は必須であるが、ＡＤＨ活性を発現する遺伝子を含むＤＮＡの導入は必ずしも必須のものではない。これは、通常コリネ型細菌は上記両酵素活性を発現する遺伝子を有していないとされているが、ＡＤＨに関しては不確実であることによる。即ち、ある種のコリネ型細菌は酵素ＡＤＨ活性を発現する遺伝子を含むＤＮＡを有している可能性があることを否定し得ないからである。このような場合には導入すべき遺伝子としては、酵素ＰＤＣ活性を発現する遺伝子を含むＤＮＡのみで基本的にはよいことになる。
しかしながら、より高度の形質発現のため、宿主として使用されるコリネ型細菌が元来ＡＤＨの生産能力を有している場合に於いても、両遺伝子を導入することが好ましい。
本発明で使用されるＰＤＣ活性を発現する遺伝子および、所望により、ＡＤＨ活性を発現する遺伝子により組み換えられる好気性コリネ型細菌は、通常の好気的条件で増殖可能なコリネ型細菌であれば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリューム属菌そしてマイクロコッカス属菌等が挙げられる。さらに具体的には、コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、ＡＴＣＣ１３０６０、ＡＴＣＣ１３２３２、ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ１３６５５、ＡＴＣＣ１３７４５、ＡＴＣＣ１３７４６、ＡＴＣＣ１３７６１、ＡＴＣＣ１４０２０及びＡＴＣＣ３１８３１等が挙げられる。ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム  フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）及びＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウムアンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２等があげられる。アースロバクター属菌としては、アースロバクター  グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ８０１０、ＡＴＣＣ４３３６，ＡＴＣＣ２１０５６，ＡＴＣＣ３１２５０，ＡＴＣＣ３１７３８及びＡＴＣＣ３５６９８等が挙げられる。
形質転換は、両遺伝子で宿主細菌の染色体を組み換える方法、もしくは、宿主細菌内で自律複製できるプラスミドに両遺伝子を組み込んだ組換え型プラスミドを使用する方法がある。
このような目的で使用されるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、例えば、ｐＡＭ３３０（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．４８，２９０１−２９０３（１９８４）．及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．Ｖｏｌ．１６，２６５−２６７（１９８５）．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ２２５６由来）、ｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．４８、２９０１−２９０３（１９８４）．（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０５８由来）、ｐＣＲＹ３０（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．５７、７５９−７６４（１９９１））、ｐＥＫ０，ｐＥＣ５、ｐＥＫＥｘ１（Ｇｅｎｅ  ｖｏｌ．１０２、９３−９８（１９９１））そしてｐＣＧ４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｖｏｌ．１５９、３０６−３１１（１９８４））
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕａｔｍｉｃｕｍ  Ｔ２５０由来）等が挙げられる。
本発明のコリネ型細菌の形質転換に使用されるプラスミドの構築は、例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ由来遺伝子を用いる場合では完全なＡＤＨ遺伝子を含むＤｒａＩ−ＤｒａＩ  １．４ｋｂ遺伝子断片（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，ｖｏｌ．１６９，２５９１−２５９７（１９８７））及び完全なＰＤＣ遺伝子を含むＤｒａＩ−ＤｒａＩ  １．８ｋｂ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１６９，９４９−９５４（１９８７））それぞれに、適当なプロモーター、ターミネーター等の制御配列を連結後、上記例示されているいずれかのプラスミドベクターの適当な制限酵素部位に挿入し、構築することが出来る。
上記組換えプラスミドにおいて、ＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、コリネ型細菌が元来保有するプロモーターが挙げられるが、それに限られるものではなく、ＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子の転写を開始させる機能を有する塩基配列であればいかなるものであってもよい。また、ＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子の下流に配置される制御配列下のターミネーターについても、コリネ型細菌が元来保有するターミネーターが挙げられるがそれらに限定されるものではなく、例えば大腸菌由来のトリプトファンオペロンのターミネーター等のＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子の転写を終了させる機能を有する塩基配列であれば、いかなるものであってもよい。
本発明において、目的遺伝子等を含むプラスミドベクターのコリネ型細菌への導入に先だって実施される該コリネ型細菌の培養は、通常の好気的な条件下で行なうことができる。培養に用いる培地は、通常の微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、必要に応じて、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いる事ができる。
目的遺伝子を含むプラスミドベクターの上記培養後のコリネ型細菌への導入方法としては、電気パルス法（エレクトロポレーション法）やＣａＣｌ２法等コリネ型細菌への遺伝子導入が可能な方法であれば特に限定されるものではない。その具体例として、例えば電気パルス法は、公知の方法
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．５４，４４３−４４７（１９９０）、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１４４，１８１−１８５（１９９３））を用いることができる。
なお、染色体への目的遺伝子の導入に関しても同様の方法が利用可能である。染色体への導入技術の方法としては、公知の技術、例えば、ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖｏｌ．３，３０３−３１０（１９９３）に記載の方法等が利用できる。
形質転換されたコリネ型細菌の取得方法としては、目的遺伝子を含むプラスミドベクターあるいは染色体への導入に用いる薬剤耐性遺伝子等を利用して、適切な濃度の当該薬剤を含むプレート培地上に遺伝子導入処理を行った本発明のコリネ型細菌を塗布することにより形質転換されたコリネ型細菌を選抜することができる。その具体例としては、例えば、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．５４，４４３−４４７（１９９０）、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１４４，１８１−１８５（１９９３）に記載の方法等を用いることができる。
元来、好気性コリネ型細菌を本発明のエタノール製造方法に用いるためには、まず形質転換されたコリネ型細菌を通常の好気的な条件で大量に培養することが必要であるが、本培養は前記のプラスミドベクター導入に供せられる前の形質転換前のコリネ型細菌の培養と同様の方法により行うことが出来る。
好気的条件で培養された本発明のコリネ型細菌は、遠心分離、膜分離等によって回収又は処理（例えば、カラギーナン等による固定化）され、次のエタノール生成反応に用いられる。
エタノール生成反応液には、緩衝液や適当な無機塩を含有する水溶液を使用することが好ましく、水溶液にはエタノール生成原料である糖類例えばグルコース等が投入される。
エタノール生成反応は、形質転換された好気性コリネ型細菌の実質的な増殖が抑制される反応条件下で実施される。実質的な増殖を抑制する方法としては前記の如く種々の方法が実施可能であるが、形質転換された好気性コリネ型細菌を嫌気的条件下におけばよい。エタノール生成反応方式としては、回分式反応でも連続式反応でも可能であるが高い生産性を実現させる観点からは連続式反応が好適である。連続反応方式を用いる場合でも、本発明の方法では形質転換されたコリネ型細菌は実質的に増殖しないので、従来の発酵用微生物の増殖を伴う方法よりその運転制御が容易である。
エタノール生成原料である糖類は特に限定はされないが、エタノール生成速度の早いグルコースが好適に用いられる。
本明細書において「嫌気的条件」とは、水溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えるべく、無酸素状態を造るためのあらゆる条件を意味する。ただし、本発明の形質転換されたコリネ型細菌の実質的な増殖が抑制される限りにおいて微量の溶存酸素は許容されるべきである。本条件は、例えば、容器を密閉して無通気で反応させる、あるいは窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させること等で実現される。エタノール生成反応の温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃である。反応中のｐＨは、５〜９、好ましくは７〜８の範囲で調節される。本発明のエタノール生成反応に用いるコリネ型細菌は、反応中に実質的に増殖しないことから極めて高濃度の量で使用可能であり、例えば、湿菌体濃度で１ｇ／ｌ（リットル）〜１５００ｇ／ｌ（リットル）の量で用いることができる。
本発明のエタノール生成反応では、反応中に発酵用微生物が実質的に増殖しないので原料糖類が増殖のための栄養源として消費されることがなく、また、菌体高密度化のための対数増殖期などの経過時間を必要とせずに反応初期より高密度化した（高濃度の）発酵用微生物によるエタノール生産が行なえるため、高効率高生産性のエタノール製造が実現される。
上記の如き方法で製造されるエタノールは、必要に応じて、反応液から分離、精製され、燃料用エタノールや工業用エタノールとして利用される。
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限を受けるものではない。
（実施例）
実施例１
ザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２９１９１由来のＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子断片を含むＤＮＡのクローン化
（Ａ）ザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２９１９１の全ＤＮＡの抽出：
ザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）増殖用培地（ＺＭ）１Ｌ［組成：２０ｇ  Ｇｌｕｅｏｓｅ，５ｇ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ及び蒸留水１０００ｍｌ］にＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓを白金耳を用いて植菌後、対数増殖期後期まで３０℃嫌気条件下培養し、菌体を集めた。  得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌ濃度になるように、１０ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプロテアーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が０．５％によるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ，２０分間，１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
（Ｂ）ザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローン化：
実施例１（Ａ）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲに際しては、ＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子をクローン化するべく、それぞれ下記の１対ずつのプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ＡＤＨ遺伝子増幅用プライマー
0004927297.tif 000002
尚、プライマー（ａ−１）には、ＳａｃＩ制限酵素部位が、プライマー（ｂ−１）には、ＫｐｎＩ制限酵素部位が付加されている。
ＰＤＣ遺伝子増幅用プライマー
0004927297.tif 000003
尚、プライマー（ａ−２）には、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位が、プライマー（ｂ−２）には、ＳａｃＩ制限酵素部位が付加されている。
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・／タカラ・イーエックス・タック（Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ）（宝酒造社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液                          １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液                  １６μｌ
鋳型ＤＮＡ                                    １０μｌ
（ＤＮＡ含有量  １μＭ以下）
上記記載の２種プライマー＊）                各々１μｌ
（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ  ０．５μｌ
滅菌蒸留水                                ６１．５μｌ
＊）ＡＤＨ遺伝子を増幅する場合は、プライマー（ａ−１）と（ｂ−１）の組み合わせ、ＰＤＣ遺伝子を増幅する場合はプライマー（ａ−２）と（ｂ−２）の組み合わせで行った。以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ＡＤＨ遺伝子の場合、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片が、ＰＤＣ遺伝子の場合約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
実施例２
ザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来ＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子によるコリネ型細菌組み換え体の作製
（Ａ）シャトルベクターの構築：
ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９に内在するプラスミドｐＡＭ３３０（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０，２７７１−２７７８（１９８６）、特開昭５８−６７６７９）のＯＲＦ１（ｒｅｐ）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ約３．０ｋｂ  ＤＮＡ断片５μｌと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断したプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）２μｌを混合し、これに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液  １μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５３、１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、クロラムフェニコール  ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天  １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９８  ２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３．０ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
この大腸菌−コリネ型細菌シャトルベクターをｐＫＰ１と記する。
（Ｂ）ｔａｃプロモーターとＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子の連結：
実施例１（Ｂ）において増幅したザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来ＡＤＨ遺伝子を含む約１．２ｋｂＤＮＡ断片５μｌ及びｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）２μｌを各々制限酵素ＳａｃＩ、ＫｐｎＩで切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液  １μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。これをライゲーションＡ液とした。
同じく、実施例１（Ｂ）において増幅したザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来ＰＤＣ遺伝子を含む約１．７ｋｂＤＮＡ断片５μｌ及びｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）２μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩで切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液  １μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。これをライゲーションＢ液とした。
得られた２種のライゲーションＡ液、Ｂ液それぞれを、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５３、１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、アンピシリン  ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天  １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドをライゲーションＡ液の場合、制限酵素（ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ）で、ライゲーションＢ液の場合、制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ）でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ約４．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、ＡＤＨ遺伝子（ライゲーションＡ液）の場合、長さ１．２ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が、ＰＤＣ遺伝子（ライゲーションＢ液）の場合、長さ１．７ｋｂの挿入断片が認められた。
ＡＤＨ遺伝子を含むプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−ＡＤＨ、ＰＤＣ遺伝子を含むプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−ＰＤＣとそれぞれ記する。
次に、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＡＤＨ及びプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＰＤＣを鋳型としたＰＣＲ法により、ｔａｃプロモーターにＡＤＨ遺伝子を連結したＤＮＡ断片及びｔａｃプロモーターにＰＤＣ遺伝子を連結したＤＮＡ断片それぞれを調製するべく、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成した。
0004927297.tif 000004
尚、プライマー（ａ−３）には、ＢｇｌＩＩ制限酵素部位が付加されている。
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・／タカラ・イーエックス・タック（Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ）（宝酒造社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液                                １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液                        １６μｌ
鋳型ＤＮＡ＊）                                      １０μｌ
（ＤＮＡ含有量  １μＭ以下）
上記記載の（ａ−３）及び（ｂ−３）プライマー      各々１μｌ
（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ        ０．５μｌ
滅菌蒸留水                                      ６１．５μｌ
＊）ｔａｃプロモーターにＡＤＨ遺伝子を連結したＤＮＡ断片を増幅する場合は、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＡＤＨを、ｔａｃプロモーターにＰＤＣ遺伝子を連結したＤＮＡ断片を増幅する場合は、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＰＤＣを鋳型ＤＮＡとして用いた。
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ｔａｃプロモーターを連結したＡＤＨ遺伝子の場合、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が、ｔａｃプロモーターを連結したＰＤＣ遺伝子の場合約１．９ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
（ｃ）ｔａｃプロモーターにＡＤＨ遺伝子を連結したＤＮＡ断片とｔａｃプロモーターにＰＤＣ遺伝子を連結したＤＮＡ断片のシャトルベクターへの挿入：
上記実施例２（Ｂ）で増幅産物を確認できたｔａｃプロモーターとＰＤＣ遺伝子を連結した約１．９ｋｂ  ＤＮＡ断片の反応液  ５μｌを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで、上記実施例２（Ａ）で作製したプラスミドｐＫＰ１  ２μｌを制限酵素ＢａｍＨＩでそれぞれ完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液  １μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５３、１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、クロラムフェニコール  ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天  １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記実施例２（Ａ）作製のプラスミドｐＫＰ１約５．２ＫｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
このプラスミドをｐＫＰ１−ＰＤＣと記する。尚、このプラスミドは、制限酵素部位ＢａｍＨＩが１箇所のみ存在する。
上記実施例２（Ｂ）で増幅産物を確認できたｔａｃプロモーターとＡＤＨ遺伝子を連結した約１．４ｋｂ  ＤＮＡ断片の反応液  ５μｌを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで、上記のプラスミドｐＫＰ１−ＰＤＣ  ２μｌを制限酵素ＢａｍＨＩでそれぞれ完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液  １μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｅｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５３、１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、クロラムフェニコール  ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天  １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドｐＫＰ１−ＰＤＣ約７．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１．４ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
このプラスミドをｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨ（配列番号７）と命名した。
（Ｄ）コリネ型細菌への形質転換：
本プラスミドを電気パルス法（Ｙ．Ｋｕｒｕｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：４４３−４４７．１９９０．及びＡ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８１−１８５．１９９３）により、コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２へ導入した。得られた組み換え体：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨ／１３０３２は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託され（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７８８７、寄託日：平成１２年６月６日）、さらに平成１３年５月３１日に原寄託よりブタペスト条約に基く寄託に移管された（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）、受託番分：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６２１）。
実施例３
コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２組換え体（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨ／１３０３２）によるエタノールの生産
尿素：４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１４０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：５．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：５．０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：５．０ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２００ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：２００ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２０００μｇ、塩酸チアミン：１０００μｇ、酵母エキス１０ｇ、カザミノ酸１０ｇ及び蒸留水：１０ｌ（ｐＨ６．６）の培地を５００ｍｌずつ２ｌ容積の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５０％グルコース水溶液４０ｍｌを加え、上記ｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨプラスミドを導入し形質転換させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株（ｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨ／１３０３２）を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した（好気的培養）。培養終了後、遠心分離（８０００ｇ、２０分）により菌体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応、に供試した。
（ＮＨ４）２ＳＯ４：２３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ、蒸留水：１０００ｍｌからなる反応液５００ｍｌを１Ｌ容積のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、密閉した状態（嫌気的反応）で、これを３０℃にてゆるく（２００ｒｐｍ）攪拌し、反応させた。
２時間後及び４時間後のそれぞれの反応液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、得られたそれぞれの上清液をガスクロマトグラフィーで分析したところ、エタノールがそれぞれ３．７９、６．９６（ｇエタノール／ｌ）の濃度で生成した。
これらの結果を下記の表１に示す。
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実施例４
ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９組換え体（ｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨ／１３８６９）によるエタノールの生産
実施例２（Ｃ）の方法により作製したプラスミドｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨを、実施例２（Ｄ）の方法と同様にして、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９に導入した。得られた組み換え体：Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ｐＫＰ１−ＰＤＣ−ＡＤＨ／１３８６９は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託され（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７８８８、受託日：平成１２年６月６日）、さらに平成１３年５月３１日に原寄託よりブタペスト条約に基く寄託に移管された（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６２２）。
得られたコリネ型細菌組換え体を、実施例３と同様の方法に従い、好気的に培養後、嫌気的にエタノール生成反応を行ったところ、４時間後の反応槽のエタノール濃度は４．２１（ｇエタノール／ｌ）であった。従って平均エタノール生成速度は１．０５（ｇエタノール／ｌ／ｈｒ）である。
（発明の効果）
本発明の方法によれば、ＡＤＨ遺伝子及びＰＤＣ遺伝子で組換えた好気性コリネ型細菌を用いた嫌気的条件下における反応により、効率よく、かつ高収率でエタノールを製造することができる。
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【配列表】
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