(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一次乳化剤としてのソルビタンエステルを溶解した溶媒に水を加えて処理液とし、この処理液をホモミキサーによって攪拌した後に冷却しながら超音波照射を照射・停止のサイクルを繰り返しながら行って乳化させる一次乳化工程と、前記処理が行われた処理液から溶媒を留去し、これに二次乳化剤としてソルビタンエステルのエチレンオキシド付加物とＰＥＧ脂質を配合して乳化させる二次乳化工程を含むことを特徴とする粒径が１．０μｍ未満の脂質ベシクルの製造方法。
【請求項２】
前記ソルビタンエステルとしてソルビタンオレイン酸モノエステルを、前記溶媒としてヘキサンを用いる請求項１に記載の脂質ベシクルの製造方法。
【請求項３】
ソルビタンオレイン酸モノエステルに対して２ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を加えることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の脂質ベシクルの製造方法。
【請求項４】
一次乳化工程において処理液にさらにイソチオシアン酸オクタデシルエステル（ＩＡＯＥ）を混入するとともに、二次乳化工程の後に、可溶性プロテインＡを混入する工程と、抗ＩｇＭ抗体を添加する工程を含むことを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の脂質ベシクルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌治療や遺伝子治療のためのＤＤＳ（脂質分子膜からなる閉鎖小胞体）における、薬物キャリアとして有用な脂質ベシクルおよび脂質ベシクルの製法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＤＳに使用される非ウィルス性キャリアとしては、脂質膜成分の５０％以上（現実的にはほぼ全て）が天然リン脂質よりなるリポソームであり、これらは逆相蒸発法あるいは超音波照射法などによって調製されている。しかしながらこれらのリポソームは、▲１▼リポソーム内部への物質包括率が小さい、▲２▼リポソームの内水相容積が小さいため、遺伝子などのマクロ分子を包括させ難い、▲３▼リポソームの安定性が悪い、▲４▼高価である、などの問題があった。
【０００３】
これに対し、ソルビタンエステルで人工脂質膜を構成したベシクルの製法も提案されており、安定性にすぐれしかも安価なキャリアーとして期待されている。ところで癌治療等で化学療法を行う場合に、薬剤が標的となる患部の細胞以外の正常細胞をも傷つけてしまうという副作用の問題がある。たとえば、抗癌剤を使用する場合には副作用が伴う場合があり、副作用を軽減するよう抗癌剤の投与量を抑えれば癌細胞に十分に作用することはできない。さらに、体内にはマクロファージのような食細胞があり、キャリアーとしてリポソームやベシクルを投与しても患部に達して作用する前に食細胞に貪食（捕捉・分解）されてしまうという問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的とするところは、食細胞に捕捉されにくく、効果的な化学治療ができるＤＤＳにおけるキャリアーとして有効な脂質ベシクルおよびその製法を提供することにある。さらに、キャリアーとしての脂質ベシクルに目標である細胞に対する標的指向性（ミサイル機能）を付与することも目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明における脂質ベシクルの製法は、▲１▼ベシクルを二段階乳化法によって調製する際に、一次乳化の攪拌を超音波照射攪拌によって行う、▲２▼脂質ベシクル成分を予め溶解させたヘキサンに水を加え、処理液を冷却しながら超音波照射攪拌する、▲３▼ベシクルの主成分として人工脂質のソルビタンエステルを使用する、という一次乳化工程と、▲４▼二次乳化剤としてのソルビタンエステル・エチレンオキシド付加物にＰＥＧ脂質を加えて二次乳化を行う工程とを含むものである。この製法により、粒径が１μｍ未満（多くの場合１００ｎｍ程度又はそれ以下）のいわゆるナノサイズであり外部に極めて親水性の高いＰＥＧ脂質を有する脂質ベシクルが得られるが、このＰＥＧ脂質の親水性により体内の食細胞による貪食を回避することができる（ステルス機能）。そして、ＰＥＧ脂質として脂質誘導体を持つＰＥＧ脂質を使用することにより高いステルス機能が得られる。また、一次乳化工程において処理液にさらにＩＡＯＥを混入するとともに、二次乳化工程の後に、可溶性プロテインＡを混入する工程と、抗ＩｇＭ抗体を添加する工程を含むようにすることにより、脂質ベシクルの表面に抗ＩｇＭ抗体を結合させ、患部の標的細胞への指向性をもたせることができる。
【０００６】
また、本発明の脂質ベシクルは、ソルビタンエステルで構成される膜と、当該膜に付着した脂質誘導体を持つＰＥＧ脂質と、プロテインＡと結合した抗体と、前記プロテインＡを結合させる脂質アンカーとしてイソチオシアン酸オクタデシルエステル（ＩＡＯＥ）を有することを特徴とするものであり、ＰＥＧ脂質の親水性によるステルス機能と抗体による標的細胞への指向性を有するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の二段階乳化法によるナノサイズ脂質ベシクルの基本的な製法は、以下のとおりである。
ベシクルの主成分となるソルビタンオレイン酸モノエステル（商品名「スパン８０」和光純薬製）と、予めヘキサン中に溶解させたレシチンとコレステロールを、ホモミキサーによって攪拌しながら少しずつ水を滴下し、超音波ホモジナイザーを用いて超音波照射を繰り返し（一次乳化工程）前記Ｗ／Ｏ型エマルションを得る。このＷ／Ｏ型エマルションをフラスコに入れ減圧下でヘキサンを除去し、このようにして調製されたＷ／Ｌ型エマルション中に、ソルビタンオレイン酸モノエステルのエチレンオキシド付加物（商品名「ツィーン８０」和光純薬製）と脂質誘導体を持つＰＥＧ脂質（商品名「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−２０ＨＣＮ」日本油脂株式会社製）の水溶液を攪拌混合したのち（２次乳化工程）、遠心分離すれば良い。粒径が１μｍ程度のマイクロサイズ脂質ベシクルを調製する場合は、一次乳化工程において超音波照射の代わりにホモミキサーによって攪拌すればよい。
【０００８】
【実施例１】
図１は本実施例の一次乳化の工程を示す断面図である。試験管、ビーカ等の内容器１にベシクルの主成分となるソルビタンオレイン酸モノエステル（商品名「スパン８０」和光純薬製）およびレシチンとコレステロールを入れ、ｎ−ヘキサン（４ｍｌ）に溶解させる。この溶液をホモミキサー（１５，０００ｒｐｍ）で３０秒間攪拌する。ベシクル内の包括物質を所定の濃度に調製した内水相となる水溶液３（０．３ｍｌ）を少しずつ滴下しながら１分間ホモミキサーによって攪拌しながら、その後、超音波ホモジナイザー４を用いて超音波照射を行う。この超音波照射は、１５秒行って１５秒休むというサイクルを３回繰り返した。内容器１の外側に外容器５を設け、内容器１と外容器５の間に氷水６を入れて処理液２を冷却することにより、超音波照射による処理液２の温度上昇を抑え、処理液２中のｎ−ヘキサンが発火することを防止している。このようにして得られたＷ／Ｏ型エマルションをナスフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターで減圧させて２８℃でｎ−ヘキサンを除去する。そして、ナスフラスコの側面についた物質を割り箸等で作ったヘラで削り落とす。このようにして得たＷ／Ｌ型エマルション中に、ソルビタンオレイン酸モノエステルのエチレンオキシド付加物水溶液（商品名「ツィーン８０」和光純薬製）とＰＥＧ脂質（商品名「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−２０ＨＣＮ」日本油脂株式会社製）を入れ、ホモミキサー（３０００ｒｐｍ）を用いて攪拌したのち、遠心分離を行ってナノサイズ脂質ベシクルを調製した。
以上、ナノサイズベシクルの調製を例に説明したが、一次乳化の際に超音波照射を行わずホモミキサーのみで撹拌することにより、上記製法はマイクロサイズベシクルの調製にも適用することができる。
【０００９】
上述の通り、ベシクルの主成分であるソルビタンオレイン酸モノエステルとして市販の製品である商品名「スパン８０」を使用した。ソルビタンオレイン酸モノエステルは１本の脂肪酸の鎖を持つ構造であるが、市販されている製品には２本又はそれ以上の鎖を持つ不純物が含まれている。そして、この不純物を含む製品を用いる方が純粋なソルビタンオレイン酸モノエステルを用いるよりも良好にベシクルを生成できることがわかった。
【００１０】
また、本例の製法において加えるＰＥＧ脂質のスパン８０に対する最適な比率も明らかになった。この結果を図２および図３に示す。図２はマイクロサイズベシクルの場合であり、図３はナノサイズベシクルの場合である。横軸にはスパン８０に対するＰＥＧ脂質のモル％である。一方、縦軸はベシクルの生成率であり、ベシクルの一次乳化調製時に滴下した水溶液に含ませておいた蛍光物質カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の濃度と最終的に生成したベシクルの内層水超に中に取り込まれたＣＦの濃度の比率で示した数値である。これより、スパン８０に対してＰＥＧ脂質が２ｍｏｌ％程度のときが生成率が高く、最適値であることがわかる。
【００１１】
また本例の製法によって生成したＰＥＧ脂質ベシクルとＰＥＧを含まないベシクルを生理的食塩水中に３０日おいて安定性を比較した。マイクロサイズベシクル、ナノサイズベシクルともにＰＥＧ脂質ベシクルの方が安定性が高いことが確認された。
【００１２】
以上、表面にＰＥＧ脂質を持つ親水性の高い脂質ベシクルの製法について述べた。本例の製法によって生成したＰＥＧ脂質ベシクルを食細胞の一種であるマクロファージのＵ９３７細胞と接触させたところ、ＰＥＧ脂質を含まないベシクルに比べてＵ９３７細胞に貪食されにくいことが観察され、食細胞からの回避機能（ステルス機能）を備えることが確認された。マイクロサイズベシクル、ナノサイズベシクルともにステルス機能が得られたが、マイクロサイズベシクルにおいて特にＰＥＧ脂質よるステルス機能向上の効果が高い。また、接触させたＵ９３７細胞の死滅はＰＥＧ脂質ベシクルの場合の方がＰＥＧ脂質を含まないベシクルより少なく、毒性が低いことも観察された。
【００１３】
【実施例２】
本実施例において、ステルス機能を有するＰＥＧ脂質ベシクルに抗体を固定化して標的指向性を付与する製法について説明する。本例の製法も実施例１の製法を基本とするが、さらに抗体を固定するために、プロテインＡを固定化する脂質アンカーであるＩＡＯＥと抗体を姿勢制御するためのプロテインＡおよび抗体を添加する作業が加わる。
【００１４】
ベシクル調製に際して、脂質アンカーであるイソチオシアン酸オクタデシルエステル（ＩＡＯＥ）が必要となるが、その合成方法について説明する。なお、ＩＡＯＥの化学式はＣＨ３（ＣＨ２）１７ＮＣＳである。▲１▼１−アミノオクダデカン（1-aminooctadecane）４．３ｇを２５０ｍｌのジエチルエーテル（Et2O）に溶解する（これをＡ液とする）。▲２▼１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）３．４ｇを２００ｍｌのEt2Oに溶かし、氷と塩で−１０℃に冷却して二硫化炭素（ＣＳ２）を８ｍｌ加える（これをＢ液とする）。▲３▼Ａ液をＢ液にゆっくり加えていく。▲４▼常温で５時間静置し、析出したチオ尿素を濾去する。▲５▼濾液を温めながらエバポレーターにかけてEt2Oを取り除く。▲６▼エバポレーターによる減圧の途中で析出するチオ尿素は、さらに濾過して取り除く。▲７▼Et2Oがなくなるとオイル状のＩＡＯＥが得られ、放置すると結晶化する。▲８▼エタノールで再結晶し精製する。なお、反応式は以下の通りである。
ＣＳ２＋ＤＣＣ＋ＣＨ３（ＣＨ２）１７ＮＨ２→ＣＨ３（ＣＨ２）１７ＮＣＳ＋（Ｃ６Ｈ１１ＮＨ）２ＣＳ
【００１５】
次に、抗体を固定したベシクルの調製について説明する。なお、ここではナノサイズベシクルの調製を例に説明するが、一次乳化の際に超音波照射を行わずホモミキサーのみで撹拌することにより、マイクロサイズベシクルの調製にも適用できる。▲１▼ベシクルの主成分となるスパン８０（４３．７ｍｇ）に脂質アンカーであるＩＡＯＥ（７．５ｍｇ：全脂質量に対し１０ｗ％）を混入し、レシチン（０．８６５ｍｇ）、コレステロール（１．７３ｍｇ）を添加して、試験管を用いてｎ−ヘキサン（２ｍｌ）に溶解し、これをホモミキサーで３０秒撹拌した後、撹拌しながら包括物質を所定の濃度に調製した水溶液を０．３ｍｌ／ｍｉｎの滴下速度で１分間滴下する。▲２▼試験管を氷水で冷却しながら、超音波照射を１５秒照射・１５秒停止のサイクルで３回行う。▲３▼このようにして得られたＷ／Ｏ型エマルションをナスフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターで減圧させて２８℃でｎ−ヘキサンを除去する。そして、ナスフラスコの側面についた物質を割り箸等で作ったヘラで削り落とす。▲４▼得られたＷ／Ｌ型エマルション中に、ツィーン８０（２１ｍｇ）とＰＥＧ脂質「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−２０ＨＣＮ」（５．７５ｍｇ、すなわちツィーン８０とＩＡＯＥの合計量に対し２ｍｏｌ％）を入れ、ホモミキサーを用いて攪拌する。▲５▼得られたベシクル溶液に可溶性プロテインＡ（５０ｍｌ）を混入し、冷蔵庫に入れて１日保管する。▲６▼翌日、得られた液をマグネチックスターラーで撹拌する。▲７▼ベシクル溶液を超遠心分離して上澄み液を取り除き、残った液の最も濁度の濃い部分をゲル濾過する。▲８▼この溶液に抗ヒトＩｇＭ抗体を調製した溶液を添加し、ゆっくり撹拌する。▲９▼再び超遠心分離とゲル濾過を行い抗体を固定化したＰＥＧ脂質ベシクルを得る。
【００１６】
本実施例の製法により調製されたベシクルにおいて、抗体は抗原結合点と反対側の部位（Ｆｃ部）でプロテインＡと結合し、このプロテインＡは脂質アンカーであるＩＡＯＥによってＰＥＧ脂質ベシクル表面に強固に固定化されている。従来の抗体固定化法ではＰＥＧ脂質でコーティングされた脂質ベシクルの表面に抗体を姿勢制御して固定化することは困難であるが、本例の製法に拠れば抗体の抗原と結合するＦａｂフラグメントを外向きにして姿勢制御した形で固定化できる。また、ＰＥＧ脂質とプロテインＡはそれだけでも両者の親水性親和力によって結合性がよく、プロテインＡによる姿勢制御をＰＥＧ脂質ベシクルに適用することは極めて有効である。
【００１７】
本実施例の製法を用いてマイクロサイズベシクルおよびナノサイズベシクルを調製し、癌細胞との接触を行った。使用した細胞は肺癌患者由来のリンパ腫とリンパ球とをかけ合わせたハイブリドーマであるＨＢ４Ｃ５細胞である。ＨＢ４Ｃ５細胞は抗ヒトＩｇＭ抗体に対する抗原であるＩｇＭ抗体をその細胞表面に産生する。脂質ベシクルはその内水中にＤＮＡ−ＰＩが含まれるよう調製されており、接触後にＤＮＡ−ＰＩの作用によって発生する蛍光を観測することにより、脂質ベシクル内の包括物質ＤＮＡ−ＰＩがＨＢ４Ｃ５細胞中に取り込まれたか否かを判定できるようにしてある。その結果、本製法により抗体を固定化したベシクルを接触させた場合にはＰＩの蛍光がＨＢ４Ｃ５細胞中に見らた。一方、比較として抗体を持たないベシクルを接触させた場合には、ＰＩの蛍光が見られなかった。これらのことより、本製法によるベシクルは標的指向性を有することが確認できた。また、マイクロサイズベシクルでもナノサイズベシクルでも同様に標的指向性が確認され、ステルス機能と標的指向性の両方を同時に備える脂質ベシクルの実現に成功した。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の脂質ベシクルの製法は、食細胞による補足を回避できるステルス機能を実現できるという効果がある。生成されたＰＥＧ脂質ベシクルは安定性にすぐれ、毒性が低い。さらに、本発明の脂質ベシクルの製法によりＰＥＧ脂質ベシクルに抗体を姿勢制御して固定し、ステルス機能と標的指向性の両方を同時に備える脂質ベシクルの実現ができる。本発明の脂質ベシクルに抗癌剤や遺伝子を内包させてＤＤＳのキャリアーとして使用することにより、副作用が少なく効果の高い治療に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一の実施例における一次乳化を示す断面図である。
【図２】マイクロサイズベシクルの調製における全脂質に占めるＰＥＧ脂質の割合とベシクルの生成率の関係を示すグラフである。
【図３】ナノサイズベシクルの調製における全脂質に占めるＰＥＧ脂質の割合とベシクルの生成率の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１．内容器
２．処理液
３．水（又は水溶液）
４．超音波ホモジナイザー
５．外容器
６．氷水
【図１】
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【図２】
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【図３】
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