(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
走査型顕微鏡法における蛍光の検出のための方法であって、
多光子励起によって試料領域中の蛍光物質を励起する励起ステップと、
前記試料領域中の前記蛍光物質の特性に対して最適な蛍光光子収量を得るために光源の動作変数を適合させる適合ステップであって、前記光源が多光子励起を生じる適合ステップと、
複数の試料領域を同時に照射する照射ステップと、
前記試料領域の蛍光を同時に検出するステップを含み、
前記光源の前記動作変数は前記光源のパルス繰返し数であり、前記適合ステップでは、前記光源の前記パルス繰返し数が、前記蛍光物質の蛍光光子収量が飽和しない値に設定されることを特徴とする方法。
【請求項２】
回転微小レンズホイールまたは反射ディスク走査器が、複数の焦点により前記複数の試料領域を同時に照射するために用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スリット状の照射システムが、焦線により前記複数の試料領域を同時に照射するために用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
蛍光の検出のための装置であって、
少なくとも１つの試料領域を照射するための光源を備えた走査型顕微鏡と、
多光子励起により前記少なくとも１つの試料領域中の蛍光物質を励起するための励起手段と、
最適な蛍光光子収量を得るため前記光源の動作変数を前記試料領域中の前記蛍光物質の特性と適合させるための適合手段であって、前記光源が多光子励起を生じる適合手段と、
複数の試料領域を同時に照射する照射手段と、
前記試料領域の蛍光を同時に検出する手段を具備し、
前記光源の前記動作変数は前記光源のパルス繰返し数であり、
前記適合手段により、前記光源の前記パルス繰返し数は、前記蛍光物質の蛍光光子収量が飽和しない値に設定されることを特徴とする蛍光の検出のための装置。
【請求項５】
前記光源が、モード結合レーザシステムからなる請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記照射手段が、複数の焦点を照射するための回転微小レンズホイールまたは反射ディスク走査器である請求項４に記載の装置。
【請求項７】
前記照射手段が、焦線の照射に用いられるスリット状の照射システムである請求項４に記載の装置。
【請求項８】
前記顕微鏡は共焦点走査型顕微鏡であり、
前記光源はモード結合レーザ光源であり、
前記モード結合レーザの下流に配置される再生増幅器を具え、
前記照射手段は、回転微小レンズホイールまたは反射ディスク走査器と、を具備する請求項４に記載の装置。
【請求項９】
前記光源が、チタン：サファイアレーザまたは半導体レーザまたはフラッシュランプ・ポンプレーザまたは光学パラメータ式発振器または光学パラメータ式増幅器からなる請求項４または請求項５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、走査型顕微鏡法における蛍光検出のための方法に関する。さらに、本発明は、蛍光検出のための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般的なタイプの方法（走査型顕微鏡法における蛍光検出のための方法）および装置（蛍光検出のための装置）については、相当長い間、実用的な用途の観点から知られていた。走査型顕微鏡法において、試料によって発せられる反射光および／または蛍光を検出するために、試料は、光ビームを用いて照射される。多光子走査型顕微鏡法では、検出される蛍光光子は、多光子励起プロセスに起因すると考えられ、蛍光色素の１つの状態から励起状態への遷移は、複数の光子の同時吸収によって実現される。Ｎ個の光子遷移の確率は、照射光の励起光出力のＮ乗に依存する。高い光出力を得るために、照射に用いられる励起光は、一般にパルス化される。
【０００３】
例としてのみであるが、米国特許第５，０３４，６１３号およびドイツ特許第４４  １４  ９４０号を参照されたい。これらの特許は、試料が焦点を結ぶ光ビームによって励起される共焦点走査型顕微鏡について開示している。この事例では、２光子遷移は、パルス化された光によって実現される。個々のパルスのパルス持続時間は、フェムト秒またはピコ秒である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、一般的な方法および装置は、得ることができる蛍光光子収量の点から言えば、きわめて非能率的である。これにはさまざまな理由がある。一方、蛍光光子収量は、照射光出力を増大させることによって任意に増大させることはできない。蛍光マーカが飽和出力に達するとすぐに、すべての蛍光マーカが１つのレーザパルスによって蛍光を放つように励起される。そうすると、照射出力をさらに増大すると、蛍光マーカの漂白作用と言う点で、不都合な影響があり、試料の熱負荷を伴うであろう。蛍光を発する試料の２光子励起については、Ｗ．Ｄｅｎｋ，Ｄ．Ｗ．Ｐｉｓｔｏｎ，ａｎｄ  Ｗ．Ｗ．ＷｅｂｂによるＨａｎｄｂｏｏｋｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（生物共焦点顕微鏡法ハンドブック），１９９５，ｅｄ．  Ｊ．Ｂ．Ｐａｗｌｅｙ，４４５−４５８の論文「Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（レーザ走査型顕微鏡法における２光子分子励起）」にさらに記載されている。
【０００５】
また、ドイツ特許第１９６  ５３  ４１３号のほか、欧州特許第０  ７５３  ７７９号およびドイツ実用新案第４４  ３７  ８９６  Ｃ１号によって、回転微小レンズディスクまたは反射ディスクによって、試料が約２０〜５０個の試料点を同時に励起光によって照射される装置について、本質的には知られている。
【０００６】
上述した事情に鑑み、本発明の目的（第一の目的）は、最適な試料検出を可能にするために、多光子励起によって蛍光を発するように励起される蛍光物質の蛍光光子収量が、最適化または増大するような方法を提供することにある。
【０００７】
また、本発明の別の目的（第二の目的）は、最適な試料の検出を可能にするために、多光子励起によって蛍光を発するように励起される蛍光物質の蛍光光子収量が、最適化または増大するような装置を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記した第一の目的は、以下のステップ、すなわち、
多光子励起によって試料領域中の蛍光物質を励起するステップと、
試料領域中の蛍光物質の特性に対して最適な蛍光光子収量を得るために光源の動作変数を適応させるステップであって、光源が多光子励起を生じるステップと、
多数の試料領域を同時に照射するステップと、
試料領域の蛍光を同時に検出するステップと、
を含む走査型顕微鏡法における蛍光を検出するための方法によって実現される。
また、第二の目的は、
少なくとも１つの試料領域を照射するための光源を備えた走査型顕微鏡と、
多光子励起による少なくとも１つの試料領域中の蛍光物質を励起するための手段と、
試料領域中の蛍光物質の特性に対して最適な蛍光光子収量を得るために光源の動作変数を適合させるための手段であって、光源が多光子励起を生じる手段と、
多数の試料領域を同時に照射する手段と、
試料領域の蛍光を同時に検出する手段と、
を具備する蛍光の検出のための装置によって実現される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
最適蛍光光子収量に関して、多光子励起を生ずる光源２の動作変数および共焦点走査型顕微鏡のシステム変数が、蛍光材料の特性に適合される。光源２のパルス繰返し数は、図２の図によって定義される。この図では、蛍光光子収量は、光源２の一定の平均光出力に対して、パルス繰返し数の関数としてプロットされている。蛍光光子収量は、太い実線として図にプロットされている。蛍光物質の飽和現象のため、蛍光光子収量は、より低い繰返し数およびより高いパルス出力（光源２の平均光出力は一定である）で、任意に増大させることができず、したがって、最大達成可能蛍光光子収量は点線としてプロットされている。値Ｒを超えるパルス繰返し数の低下したがってパルスの出力の増加は、蛍光光子収量の任意の増大を生ずることはなく、光源２のパルス繰返し数は、値Ｒに設定される。
【００１０】
光源２は、チタン：サファイアレーザ３およびチタン：サファイアレーザ３の下流に再生増幅器４から成る。
【００１１】
光源２から放射された光は、ミラー５で反射した後、ビーム分割器６に向かう。ビーム分割器６は、照射光ビーム７を３つの平行照射ビーム８に分割する。傾斜可能であるように取付けられ、2 色ビームスプリッタとして構成される走査ミラー９は、３つの部分の照射ビーム８を反射し、ミラーが傾斜している結果ビームを偏向し、試料１を走査することができる。走査ミラー９の偏向は、互いに略垂直である２つの方向（一方のみが図示されている）になされる。３つの部分照射ビーム８に照射光ビーム７を分割した結果として、顕微鏡対物レンズ１０によって３つの部分照射光ビーム８の焦点を合わせた後、３つの試料領域が同時に照射され、そこにある蛍光物質が励起して蛍光を発する。
【００１２】
３つの同時に照射される試料領域から発せられた蛍光１１は、顕微鏡対物レンズ１０によって集められ、その持つ波長の結果走査ミラー９として構成される２色ビームスプリッタを通過し、３つの検出器１２によって検出することができる。
【００１３】
２光子励起に用いられる蛍光物質は、試料１の個々の試料領域に特に結合された蛍光染料である。
【００１４】
結論として、上述の典型的な実施形態は、請求された教示を単に示すために使われているもので、これらの典型的な実施形態に限定するものではないことに特に留意されたい。
【００１５】
【発明の効果】
本発明によって認識されたことは、第一に多光子励起プロセスによって誘起される蛍光励起の蛍光の蛍光光子収量が、複数の影響変数に依存することである。たとえば、多光子励起を生ずる光源の特性、共焦点走査型顕微鏡のシステム変数、蛍光物質の特性が重要である。蛍光光子収量に影響する要因がすべて、互いに整合し適合した場合にのみ、最適な蛍光励起および蛍光検出を実現することができる。
【００１６】
蛍光物質の励起状態の寿命は、多光子励起を生ずる光源の動作変数および／または共焦点顕微鏡のシステム変数が適合させることができる蛍光物質の可能な特性として用意してある。また、蛍光物質の励起の有効断面積および／または励起および／または放射の波長、および／または蛍光物質の漂白作用に対する適応性も用意してある。したがって、これらが多光子励起を生ずる光源に対する蛍光材料の最も重要な特性であり、共焦点走査型顕微鏡のシステム変数を適応させなくてはならない。
【００１７】
以下にさらに詳細に論ずる複数のさまざまな方法が、多光子励起を生ずる光源の動作変数を変更するために用意されている。
【００１８】
一例としては、光源の出力をこれに応じて調整することができる。これに関連して、光源の出力は、蛍光物質の飽和出力に対応する出力以上に、または等しくする必要があろう。照射体積の増大に伴い、共焦点走査型顕微鏡に導入される光出力が対応して増大することから、特に共焦点走査型顕微鏡において、蛍光物質の飽和出力は、蛍光物質の多光子励起に用いられる照射パターンに左右される。
【００１９】
蛍光物質の最適励起のためには、光源によって放射される光のパルス持続時間が対応してさらに調整できるとよい。光源によって放射される光のパルス持続時間を左右するためには、たとえば、ドイツ実用新案第４４  ３７  ８９６  Ｃ１号によって知られているようなプレチャープ装置を用いてもよい。このプレチャープ装置を用いて、特に、たとえばガラスファイバなどの光学素子との相互作用の結果として、パルス幅が広がってしまった光パルスは、元のパルス持続時間まで戻すように圧縮される。しかし、このプレチャープ装置は、特に好都合な方式では、蛍光物質の蛍光光子収量の最適化を図るために、光源によって放射された光のパルス持続時間を左右するように用いることができよう。
【００２０】
特に好都合な方式では、光源によって放射された光のパルス繰返し数についてそれに応じて調整できる備えがなされている。特に、光源によって放射された光のパルス繰返し数は、蛍光物質の励起状態の寿命の関数として、飽和挙動に基づいて調整または任意に変更することができる。一般に、７５〜１００ＭＨｚのパルス繰返し数が、蛍光物質の２光子励起に用いられる。ｋＨｚ〜ＧＨｚの範囲のパルス繰返し数の利用は、最適蛍光光子収量に対して有用である可能性がある。
【００２１】
モード結合される光源に関して、パルス繰返し数の調節は、光源の共振器の長さが調節されるという事柄を用いて達成できよう。共振器の長さの減少は、パルス繰返し数の増大を生ずる。たとえば、これは、チタン：サファイアレーザを用いて実現されることができる。センチメートルの範囲の共振器の長さは、数ＧＨｚのパルス繰返し数を生ずる。同様に共振器の長さの増大は、これに対応してパルス繰返し数を減少させる。別法として、アクティブモード結合される光源に関して、パルス繰返し数の増倍は、共振器を同時に循環する複数のパルスを設けることによって実現できよう。この目的のため、アクティブモード結合制御システムは、たとえば、パルス繰返し数の８倍増大を実現するために、適切に設定される必要がある。
【００２２】
蛍光物質の蛍光光子収量の最適化を、適切なパルス繰返し数の選択によって達成しようとする場合には、一般に、所望の領域にあるパルス繰返し数を有する特定のタイプの光源を選択する必要がある。
【００２３】
たとえば、Ｑスイッチを備えたパルスレーザを光源として用いてもよい。この種のレーザでは、光パルスの発生は、対応するＱスイッチシステムによって実現される。このＱスイッチシステムは今度は、この種の光源のパルス繰返し数がＱスイッチシステムも変更することによって、蛍光物質の励起特性に適応させることができるように、特定の領域にわたって、調整することができる。
【００２４】
さらに、モード結合レーザシステムを光源として用いてもよい。特に、チタン：サファイアレーザが利用できよう。蛍光物質の最適励起に必要な光出力が、モード結合レーザシステムが一般に提供する光出力より大きい場合には、モード結合レーザシステムの下流に再生増幅器を配置するとよい。
【００２５】
半導体レーザも、蛍光物質の多光子励起用の光源として用い得る。この半導体レーザは、利得スイッチングによってパルス化できよう。それによって、半導体レーザのパルス繰返し数をＨｚ領域からＧＨｚ領域まで調整することができる。
【００２６】
別の光源は、フラッシュランプ・ポンプレーザシステムでもよく、大体、フラッシュランプの周波数に実質的に対応するパルス繰返し数を呈する。
【００２７】
特に好都合な方式では、ＯＰＯ（光学パラメータ式発振器）またはＯＰＡ（光学パラメータ式増幅器）を用いてもよい。このような照射システムを用いると、放射光の波長およびパルス繰返し数が連続して変更することができることが特に好都合であるため、たとえば、蛍光物質の吸収波長領域に対してほぼ理想的に適合させることができる。
【００２８】
共焦点走査型顕微鏡のシステム変数に関して、蛍光物質の蛍光光子収量の最適化の点から見ると、一方では検出器システムのダイナミック・レンジおよび／または他方では検出器システムの画素積分時間をそれに応じて調整できよう。特に、共焦点走査型顕微鏡の検出信号の増幅帯域幅およびビーム偏向装置の走査速度もこれに関連する。
【００２９】
特にきわめて好都合な方式では、１つの試料点における蛍光物質の励起の飽和を避けるために、多数の試料領域を同時照射または励起する備えがなされる。この方式では、多光子光源に対して光源によって利用できる励起光出力は、多数の試料点に同時に分散させることができるため、そこに位置する蛍光物質が蛍光を発するように同時に励起される。これは、これらの異なる試料領域を対応して同時に検出する必要性を生じ、既存技術によって知られている対応する照射および検出方法を用いて実現することができる。たとえば、複数の焦点または試料領域の照射は、ドイツ特許第１９６  ５３  ４１３号または欧州特許第０  ７５３  ７７９号によって知られているような回転微小レンズホイールによって実行され得。別法として、照射は、ドイツ実用新案第４４  ３７  ８９６  Ｃ１号によって知られているように、反射ディスク走査器によって行うこともできよう。最も簡素な事例では、この種の装置によって励起される試料点の検出の場合には、プレーナ型検出器を用いてもよい。多光子励起の場合には、１つまたはそれ以上の共焦点検出ピンホールを供給することができる。これは、多光子励起が顕微鏡対物レンズの焦点領域にのみ生じることができるためで、それはそこには十分に高い高原の励起出力があるからである。多数の焦点を照射する別法として、たとえば、スリット状の照射および検出システムを用いて焦線によって照射を行う備えをすることもできよう。しかし、これに関連して、解像度能力は、焦線に垂直である場合のみ共焦点であり、焦線に沿って存在する解像度は、従来の顕微鏡法で得られるものと同様である。
【００３０】
蛍光染料、かご形化合物および／または微小結晶を、蛍光物質として用いることができよう。生体臨床医学分野、生物および生化学の基礎研究の分野で一般に用いられている蛍光物質である。生物試料は、たとえば、相補的な試料領域に対する抗体結合を用いて、蛍光物質に特に結合させることができる。
【００３１】
反復を避けるため、本装置に対して提供される光源およびさまざまな照射モードに関して、読者は、対応する方法のステップに関連する明細書の部分を参照されたい。
【００３２】
本発明の教示を有利に具体化し、発展させるさまざまな方法がある。図面を参照して、本発明の好ましい典型的な実施形態の説明に関連して、一般に好ましい実施形態および教示の発展が提示される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明による装置の第１の例示的な実施形態を概略的に示す。
【図２】  蛍光光子収量が繰返し数の関数としてプロットされる図を示す。
【符号の説明】
１  試料、  ２  光源、  ３  チタン：サファイアレーザ、  ４  再生増幅器、５  ミラー、  ６  ビーム分割器、  ７  照射光ビーム、  ８  部分照射ビーム、  ９  走査ミラー、  １０  顕微鏡対物レンズ、  １１  蛍光、  １２  検出器
【図１】
0005076204.tif 000002
【図２】
0005076204.tif 000003