(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物である、式(ＩＶ)：
【化１２】
0004910695.tif 000046
で表される化合物または生理的に許容されるその塩が陽電子放出同位元素11Ｃにより標識化されてなる化合物を、作用物質として含むことを特徴とする血栓造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質(ＧＰ)ＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物を含む血栓造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血管内で引き起こされる病的血栓形成は、心筋梗塞、脳梗塞、末梢神経循環障害等の虚血性疾患の発症原因であるが、実際には病態において血栓形成の経時変化、分布についてはあまり知られていない。それは、今日まで血栓形成を定量的に感度良くとらえる造影法が確立されていないことが要因である。このような造影法が確立されれば、脳梗塞薬の薬効評価、抗血栓剤等の薬剤の効果が期待できる新しい病態の探索等にきわめて有用な方法になり得ると考えられる。【０００３】
血栓造影に関する研究としては、放射性テクネチウム(99mＴｃ)で標識したペプチドＰ２８０を用いた深部静脈血栓症患者における血栓の造影(非特許文献１)、99mＴｃで標識した活性血小板レセプター結合ペプチドを用いたイヌ静脈血栓の造影(非特許文献２)、放射性ヨウ素(125Ｉ)で標識したタンパク質を用いたイヌ深部静脈血栓の造影(非特許文献３)等の報告がある。
すなわち、アデノシンジホスフェート(ＡＤＰ)誘導血小板凝集阻害試験において、ＩＣ50＝０．０８７μＭを示す標識したペプチドまたはＩＣ50＝０．０７９μＭ±０．０１７μＭを示す標識したペプチドを用いて血栓の造影を行い得ることが知られている(非特許文献１および非特許文献２)。また、ＡＤＰで活性化した血小板に結合性を示す標識したタンパク質を用いて血栓の造影を行ない得ることも知られている(非特許文献３)。【０００４】
血栓の主たる構成成分は血小板であり、その膜上にはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが存在する。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、血小板および血小板産生細胞にしか発現しておらず、血流中に静止型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが存在し、血栓形成部位に活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが特異的に存在することが知られている。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、接着性タンパク質フィブリノゲン(フィブリンの前駆体)、フィブロネクチン、フォン・ウィルブランド因子、ヴィトロネクチンのレセプターとして機能し、血栓形成に重要な役割を果たしている。【０００５】
一方、フィブリノゲン受容体アンタゴニストとして、一般式(Ｉ)：
【化１】
0004910695.tif 000002
【０００６】
(式中、Ｒ1は、１つ以上の置換基を有していてもよいＮ−含有シクロアルキル基を表し；
Ｒ2は、カルボキシ基または保護されたカルボキシ基を表し；
Ａ1は、それぞれ１つ以上の置換基を有していてもよい低級アルキレン基、低級アルカニル−イリデン基または低級アルケニレン基を表し；
Ａ2は、低級アルキレン基を表し；
Ａ3は、１つ以上の置換基を有していてもよい低級アルキレン基を表し；【０００７】
【化２】
0004910695.tif 000003
【０００８】
で表される部分は、式：【０００９】
【化３】
0004910695.tif 000004
【００１０】
で表される、１つ以上の置換基を有していてもよいＮ−含有複素環式基であり；
Ｘ1は、Ｏ、ＳまたはＮＨを表し；
Ｙ1は、ＮＨを表し；
Ｚ1は、【００１１】
【化４】
0004910695.tif 000005
【００１２】
(ここで、Ｒ3は水素原子または低級アルキル基である)を表し；
ｍ、ｎおよびｐは、同一または異なって、それぞれ、０または１の整数を表す)
で表される化合物、一般式(ＩＩ)：【００１３】
【化５】
0004910695.tif 000006
【００１４】
(式中、Ｒ4は、ピペリジル基、テトラヒドロピリジル基、アゼチジニル基またはテトラヒドロイソキノリル基を表し、これらのピペリジル基、テトラヒドロピリジル基、アゼチジニル基およびテトラヒドロイソキノリル基はアミノ保護基を有していてもよい；
Ｒ5は、カルボキシ基または保護されたカルボキシ基を表し；
Ａ4は、低級アルキレン基、低級アルカニル−イリデン基、低級アルケニレン基、シクロ(低級)アルキレン基またはアリーレン基を表し；
Ａ5は、アリーレン基または１つ以上の置換基を有していてもよい低級アルキレン基を表し；【００１５】
【化６】
0004910695.tif 000007
【００１６】
で表される部分は、ピペリジンジイル基またはテトラヒドロイソキノリンジイル基を表し；ｒは、０または１の整数を表す)
で表される化合物、一般式(ＩＩＩ)：【００１７】
【化７】
0004910695.tif 000008
【００１８】
(式中、Ｒ6は、水素原子またはアミノ保護基を表し；
Ａ6は、低級アルキレン基または低級アルケニレン基を表し；
Ｒ7は、水素原子；またはアミノ、低級アルカノイルアミノ、アル(低級)アルコキシカルボニルアミノ、アリール、アロイルアミノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニルアミノ、アル(低級)アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシもしくはヒドロキシ(これらのうち、アリールおよびアロイルアミノはさらにカルボキシ、低級アルコキシもしくは低級アルコキシカルボニルで置換されていてもよい)で置換されていてもよい低級アルカノイル基；低級アルコキシ、アリールもしくはシクロ(低級)アルキルで置換されていてもよい低級アルコキシカルボニル基；低級アルケニルオキシカルボニル基；ジ(低級)アルキルアミノスルホニル基；低級アルコキシで置換されていてもよいシクロアルカノイル基；(Ｃ3〜Ｃ6)アルコキシ、カルバモイル(低級)アルコキシ、Ｎ−(低級)アルキルカルバモイル(低級)アルコキシ、Ｎ,Ｎ−ジ(低級)アルキルカルバモイル(低級)アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシ(低級)アルコキシ、アル(低級)アルコキシ、低級アルコキシカルボニル(低級)アルコキシ、シクロ(低級)アルコキシ、低級アルコキシカルボニルアミノ、シクロ(低級)アルキル(低級)アルコキシ、低級アルカノイルアミノもしくは低級アルキルカルバモイルで置換されていてもよいアロイル基；アリールオキシカルボニル基；ヘテロサイクリルカルボニル基；保護されたカルボキシカルボニル基ならびにヘテロサイクリルオキシカルボニル基からなる群から選択されるアシル基で置換されていてもよいアミノ基を表し；Ｒ8は、水素原子または１つ以上のヒドロキシおよび／または低級アルコキシで置換されていてもよいアリールもしくはアラルキル基を表し；
式：【００１９】
【化８】
0004910695.tif 000009
【００２０】
で表される部分は、２価のＮ−含有６〜８員の複素環式基を表す)
で表される化合物等が知られている(特許文献１〜４)。
これらの化合物は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗剤として血栓形成の予防等に有効であることは知られていたが、血栓造影剤として用い得ることは知られていなかった。
【特許文献１】国際公開第９５／０８５３６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９６／２９３０９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９７／３３８６９号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／６０８１３号パンフレット
【非特許文献１】Muto P. et al., J. Nucl Med. 1995; 36: p.1384〜1391
【非特許文献２】Lister-James L. et al., J. Nucl Med. 1996; 37: p.775〜781
【非特許文献３】Knight L. C. et al., Thromb Haemost., 1998; 80: p.845〜851
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
この発明は、血栓に特異的に結合することができ、バックグラウンドノイズを低下させ、血栓造影の解像度を向上させることができる血栓造影剤、およびそれを用いた血栓の検出方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、上記の一般式(Ｉ)〜(ＩＩＩ)および下記の式(ＩＶ)：【００２３】
【化９】
0004910695.tif 000010
【００２４】
(式中、Ｒ9は水素原子またはアミノ保護基を表す)
で表される化合物ならびに生理的に許容されるそれらの塩から選択される、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物を標識化してなる物質を作用物質として含む血栓造影剤を提供するものである。【００２５】
本発明は、また、上記の一般式(ＩＶ)で表される化合物および生理的に許容されるその塩を提供するものである。
本発明は、さらに、上記の血栓造影剤を哺乳動物に投与し、血栓に局在化した標識を検出する工程を含む血栓の検出方法をも提供するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の血栓造影剤は、血栓に特異的に結合することができることから、バックグラウンドが少なく解像度を向上させた血栓の造影を行うことが可能であるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物を標識化してなる物質を作用物質として含む血栓造影剤である。
上記ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物は、血小板表面に産生するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合性を有する化合物であればよく、好ましくは、活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに選択的に結合性を有する化合物である。このようなＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物を用いることにより、血栓の主たる構成成分である血小板の膜上に存在する活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的に結合し、血流中に存在する静止型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合性が低い血栓造影剤を得ることができる。【００２８】
本明細書において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合性を有する化合物としては、後記のアデノシンジホスフェート(ＡＤＰ)により誘導される血小板凝集阻害活性の測定方法により、活性化された血小板の凝集阻害が観察される化合物が好ましい。
上記のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物は、後記の血小板凝集阻害活性の測定結果およびプロスタグランジンＥ１(ＰＧＥ１)処理血小板のフィブリノゲン粘着抑制活性の測定結果を用いて、Ｒ／Ａ比を算出することにより、活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異的結合性を判定することができる。【００２９】
本発明におけるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物は、上記の一般式(Ｉ)〜(ＩＶ)で表される化合物およびそれらの生理的に許容される塩から選択される化合物であり、好ましくは、下記の式(ＩＩＩ−１)：【００３０】
【化１０】
0004910695.tif 000011
【００３１】
または上記の式(ＩＶ)で表される化合物および生理的に許容されるそれらの塩である。
上記の一般式(Ｉ)で表される化合物としては、国際公開公報ＷＯ９５／０８５３６号に記載の化合物を含む。上記の一般式(ＩＩ)で表される化合物としては、国際公開公報ＷＯ９６／２９３０９号に記載の化合物を含む。上記の一般式(ＩＩＩ)で表される化合物としては、国際公開公報ＷＯ９７／３３８６９号、国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号および国際公開公報ＷＯ００／２１９３２号に記載の化合物を含む。【００３２】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物としては、また、国際公開公報ＷＯ９５／２５０９１号、国際公開公報ＷＯ９７／４１１０２号、国際公開公報ＷＯ９９／２１８３２号に記載の化合物等を用いてもよい。
従って、上記の一般式(Ｉ)〜(ＩＩＩ)の化合物の詳細については、ここに参考文献として組み込まれるこれらの特許文献を参照されたい。
因みに、アミノ保護基としては、通常のアミノ保護基を用いることができ、アセチル、プロピオニル等の低級アルカノイル基；ベンゾイル、ナフトイル等のアロイル基；ベンジル、４−ニトロベンジル、フェネチル、１−フェネチル、ベンズヒドリル、トリチル等の置換基を有していてもよいアル(低級)アルキル基；ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル等の低級アルコキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル等のアル(低級)アルコキシカルボニル基等が挙げられる。【００３３】
また、一般式(Ｉ)〜(ＩＶ)の化合物の生理的に許容される塩としては、通常の非毒性な生理的に許容される塩であればよく、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アンモニウムとの塩；有機塩基、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン等の有機アミンとの塩；塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸付加塩；ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等の有機カルボン酸またはスルホン酸付加塩；アルギニン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の塩基性または酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。【００３４】
本発明におけるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物のうち、一般式(ＩＶ)で表される化合物は、例えば、次に示す方法により製造することができる。【００３５】
【化１１】
0004910695.tif 000012
(式中、Ｘは、ハロゲン原子を表す)【００３６】
式(ａ)の化合物と式(ｂ)の化合物との反応は、適切な縮合剤の存在下で行うことが好ましい。上記縮合剤としては、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、ＤＣＣ(ジシクロヘキシルカルボジイミド)等を用いることができ、中でも、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩が好ましい。【００３７】
式(ｄ)において、Ｘで表されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子のいずれでもよいが、臭素原子が好ましい。
式(ｃ)の化合物と(ｄ)の化合物との反応は、適切な触媒の存在下で行うことが好ましい。触媒としては、ヨウ化テトラブチルアンモニウム等を用いることができる。
このようにして得られる式(ｅ)の化合物における保護基の脱離は、常法により、例えば化合物(ｅ)を塩酸で処理することにより、化合物(ＩＶ)へ導くことができる。【００３８】
本発明におけるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物は、標識化してなるものである。標識化としては、生理的に許容されるものであればよく、そのようなものとしては、放射性標識、蛍光標識、常磁性標識等が挙げられる。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物は、放射性標識により標識化してなるものが好ましい。放射性標識としては、陽電子放射型断層撮影法により検出することができるものが好ましく、11Ｃ、18Ｆ等の陽電子放出同位元素を好適に用いることができる。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物は、陽電子放出同位元素により標識してなるものが好ましい。
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物を標識する方法としては、従来公知の標識方法を用いることができる。例えば11Ｃにより標識する方法としては、[11Ｃ]ＣＨ3Ｉを用いたメチル化方法等を用いることができる。このような方法により、上記の(Ｉ)〜(ＩＶ)で表される化合物およびそれらの生理的に許容される塩を任意に標識することができる。【００３９】
本発明の血栓造影剤は、さらに、生理的に許容される通常の担体、その他の添加剤を含んでいてもよい。生理的に許容される担体としては、液剤、乳剤、懸濁剤等の調製に際して、通常、使用されるものを用いることができる。その他、例えば、補助剤、安定化剤、濃厚剤、着色剤等も適宜添加することができる。
本発明の血栓造影剤におけるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物の含量は、該血栓造影剤を用いた検出において血栓に局在化した標識を検出できる程度であればよく、用途に応じて適宜選択される。【００４０】
上記のようにしてなる血栓造影剤を哺乳動物に投与し、血栓に局在化した標識を検出する工程を含む血栓の検出方法もまた、本発明の一つの実施形態である。
本発明の血栓造影剤の投与量は、標識化したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物を検出する検出器の感度により適宜選択される。例えば、サルでは１８５〜７４０ＭＢｑ程度、ヒトでは１８５〜７４０ＭＢｑ程度となる量で投与することが好ましい。【００４１】
標識を検出する工程は、例えば、陽電子放射型断層撮影法を用いて行われる。陽電子放射型断層撮影法としては、例えば、標識化した物質から放出される陽電子を検出し、コンピュータ等で解析することにより生体組織の特定の生化学的性質を反映する断層画像を合成する撮影方法が挙げられる。
【実施例】
【００４２】
製造例１  ２,２'−[[４−([メチル[(２Ｅ)−３−(４−ピペリジニル)−２−プロペノイル]アミノ]アセチル)−１,２−フェニレン]ビス(オキシ)]ジ酢酸塩酸塩の製造
ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ；２ｍｌ)中の式：【００４３】
【化１２】
0004910695.tif 000013
【００４４】
で表される(２Ｅ)−３−[１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)−４−ピペリジニル]アクリル酸(１２０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ)、式：【００４５】
【化１３】
0004910695.tif 000014
【００４６】
で表される１−(３,４−ジヒドロキシフェニル)−２−(メチルアミノ)エタノン(８５．２ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ)および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(６９．９ｍｇ、０．５１７ｍｍｏｌ)の溶液に、氷浴で冷却しながら１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(ＷＳＣＤ．ＨＣｌ；９９．１ｍｇ、０．５１７ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を室温で３時間攪拌した後、窒素気流下で濃縮し、残渣を酢酸エチルと水とに分配した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を１Ｎ  ＨＣｌおよび飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をクロロホルム−メタノール(１０：１)混液で溶出する分取薄膜シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、式：【００４７】
【化１４】
0004910695.tif 000015
【００４８】
で表される４−[(１Ｅ)−３−[[２−(３,４−ジヒドロキシフェニル)−２−オキソエチル](メチル)アミノ]−３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレート(１３１ｍｇ、６６．６％)を油状物として得た。
1H-NMR (300MHz, CDCl3) δ; 1.33-1.45(2H, m), 1.46(9H, s), 1.70-1.82(2H, m), 2.28-2.46(1H, m), 2.71-2.84(2H, m), 2.91(3H, s), 3.49(2H, brs), 4.06-4.22 (2H, m), 4.78(2H, s), 6.37(1H, d, J=15.8Hz), 6.80(1H, d, J=8.1Hz), 6.92(1H, dd, J=15.8, 7.0Hz), 7.30(1H, d, J=8.1Hz), 7.36(1H, s); MS(ES+) m/z419(M+1)【００４９】
ＤＭＦ(１．５ｍｌ)中の４−[(１Ｅ)−３−[[２−(３,４−ジヒドロキシフェニル)−２−オキソエチル](メチル)アミノ]３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレート(１２５ｍｇ、０．２９９ｍｍｏｌ)と、ｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート(１２２ｍｇ、０．６２７ｍｍｏｌ)と、ヨウ化テトラブチルアンモニウム(１１ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ)との溶液に、氷浴で冷却しながら炭酸カリウム(８６．７ｍｇ、０．６２７ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を６０℃で３０分間攪拌した後、減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチルと水とで分配した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をクロロホルム−メタノール(１０：１)混液で溶出する分取薄膜シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、式：【００５０】
【化１５】
0004910695.tif 000016
【００５１】
で表されるｔｅｒｔ−ブチル  ４−[(１Ｅ)−３−[[２−[３,４−ビス(２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエトキシ)フェニル]−２−オキソエチル](メチル)アミノ]−３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレート(１８３ｍｇ、９４．８％)を油状物として得た。
1H-NMR(300MHz, CDCl3) δ; 1.24-1.51(2H,m), 1.47(9H, s), 1.48(9H, s), 1.49(9H, s), 1.71-1.80(2H, m), 2.26-2.40(1H, m), 2.66-2.84(2H, m), 3.13(3H, s), 4.03-4.20(2H, m), 4.63(2H, s), 4.68(2H, s), 4.82(2H, s), 6.33(1H, d, J=15.0Hz), 6.82(1H, d, J=8.4Hz), 6.89(1H, dd, J=15.0, 8.4Hz), 7.49(1H, s), 7.60(1H, d, J=8.4Hz); MS(ES+) m/z647(M+1)【００５２】
ジオキサン(０．５ｍｌ)中のｔｅｒｔ−ブチル−４−[(１Ｅ)−３−[[２−[３,４−ビス(２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエトキシ)フェニル]−２−オキソエチル](メチル)アミノ]−３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレート(５．６ｍｇ、８．６６μｍｏｌ)の溶液に、氷浴で冷却しながらジオキサン(１．５ｍｌ)中の４Ｎ  ＨＣｌを滴下した。反応混合物を６０℃で５分間攪拌した後、減圧下で濃縮して、式：【００５３】
【化１６】
0004910695.tif 000017
【００５４】
で表される２,２'−[[４−([メチル[(２Ｅ)−３−(４−ピペリジニル)−２−プロペノイル]アミノ]アセチル)−１,２−フェニレン]ビス(オキシ)]ジ酢酸塩酸塩(３．８ｍｇ、８０．３％)を粉末として得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ; 1.43-2.16(4H, m), 2.80-3.48(7H, m), 3.12(3x0.5H, s), 3.20(3x0.5H, s), 4.87(2H, brs), 4.92-4.99(4H, m), 6.29(1H, brd), 6.57-6.79(1H, m), 7.07-7.19(1H, m), 7.50(1H, brs), 7.72-7.80(1H, m), 8.86-9.13(1H, brs); MS(ES+) m/z435(M+1)【００５５】
製造例２  Ｎ−[(３Ｒ)−１−[３−(４−ピペリジル)プロピオニル]−３−ピペリジルカルボニル]−２(Ｓ)−メトキシカルボニルアミノ−β−アラニンの製造
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法(実施例１９)に従い、上記の式(ＩＩＩ−１)の化合物を製造した。【００５６】
製造例３
公知の方法に従い、式：【００５７】
【化１７】
0004910695.tif 000018
【００５８】
で表される化合物を製造した。
製造例４
公知の方法に従い、式：【００５９】
【化１８】
0004910695.tif 000019
【００６０】
で表される化合物を製造した。
製造例５
公知の方法に従い、式：【００６１】
【化１９】
0004910695.tif 000020
【００６２】
で表される化合物を製造した。
製造例６
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００６３】
【化２０】
0004910695.tif 000021
【００６４】
で表される化合物を製造した。
製造例７
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００６５】
【化２１】
0004910695.tif 000022
【００６６】
で表される化合物を製造した。
製造例８
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００６７】
【化２２】
0004910695.tif 000023
【００６８】
で表される化合物を製造した。
製造例９
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００６９】
【化２３】
0004910695.tif 000024
【００７０】
で表される化合物を製造した。
製造例１０
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００７１】
【化２４】
0004910695.tif 000025
【００７２】
で表される化合物を製造した。
製造例１１
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００７３】
【化２５】
0004910695.tif 000026
【００７４】
で表される化合物を製造した。
製造例１２
国際公開公報０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００７５】
【化２６】
0004910695.tif 000027
【００７６】
で表される化合物を製造した。
製造例１３
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００７７】
【化２７】
0004910695.tif 000028
【００７８】
で表される化合物を製造した。
製造例１４
公知の方法に従い、式：【００７９】
【化２８】
0004910695.tif 000029
【００８０】
で表される化合物を製造した。
製造例１５
公知の方法に従い、式：【００８１】
【化２９】
0004910695.tif 000030
【００８２】
で表される化合物を製造した。
製造例１６
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００８３】
【化３０】
0004910695.tif 000031
【００８４】
で表される化合物を製造した。
製造例１７
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００８５】
【化３１】
0004910695.tif 000032
【００８６】
で表される化合物を製造した。【００８７】
製造例１８
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００８８】
【化３２】
0004910695.tif 000033
【００８９】
で表される化合物を製造した。【００９０】
製造例１９
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００９１】
【化３３】
0004910695.tif 000034
で表される化合物を製造した。【００９２】
製造例２０
国際公開公報ＷＯ０１／６０８１３号に記載の方法に従い、式：【００９３】
【化３４】
0004910695.tif 000035
【００９４】
で表される化合物を製造した。【００９５】
実施例１〜２０および参考例１〜４
製造例１〜２０で製造した化合物を用いて、以下の試験を行った。また、参考例１〜４として、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合剤として知られるヘビ毒タンパク質、エキスタチン(Echistatin)、ならびに、抗血栓症薬であるチロフィバン(Tirofiban；ＭＫ３８３)、ラミフィバン(Lamifiban；Ｒｏ４４−９８８３)およびＦＫ６３３を用いて同様に以下の試験を行った。結果を表１−１〜表１−３に示す。【００９６】
試験１  アデノシンジホスフェート(ＡＤＰ)により誘導される血小板凝集阻害活性の測定
３×１０8の血小板／ｍｌを含有する血小板豊富な血漿(ＰＲＰ)を人血から調製した。２２５μｌのＰＲＰに、試験化合物の水溶液２５μｌを加え、その後３７℃で２分間攪拌した。その溶液に、５μｌのＡＤＰ(最終的には２．５μＭ)を凝集誘導物質として加えた。凝集をアグリゴメータ(aggregometer)(ＮＢＳ ＨＥＭＡ−ＴＲＡＣＥＲ ８０１)を用いて測定した。試験手順としては、以下のとおりであった；ＰＲＰの光透過度を１００％に校正した。ＰＲＰをアグリゴメータ内、３７℃で２分間インキュベーションした。血小板凝集の完全な応答が得られたときにＡＤＰを添加し、光透過率の変化をＰＬ５００レコーダー(横河電機社製)によりモニターした。試験化合物の非存在下での凝集との比較により試験化合物の凝集阻害の割合を算出した。誘導物質(試験化合物)の活性をＩＣ50値、すなわち血小板凝集を完全に阻害するのに必要な用量で表した。
試験１の値が小さいほど、活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する試験化合物の結合性が高いことを表す。【００９７】
試験２  プロスタグランジンＥ１(ＰＧＥ１)処理血小板のフィブリノゲン粘着抑制活性の測定
ヒト静脈血を採取し、クエン酸ナトリウムと混合した。全血から遠心分離により血小板豊富な血漿(ＰＲＰ)を調製した。血小板を１μＭ  ＰＧＥ１を含む調製ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅバッファー(１２９ｍＭ  ＮａＣｌ、２．８ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、８．９ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．５ｍＭ  グルコース、０．１％  ＢＳＡ、ｐＨ７．４)で洗浄した。洗浄後、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１μＭ  ＰＧＥ１を含む調製ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅバッファーに血小板を懸濁し、血小板の数を調整した。【００９８】
粘着アッセイは以下のようにして行った；９６ウェルマイクロタイタープレートを１μｇ／ウェルのヒトフィブリノーゲンでコートし、次いで、プレートを１％  ＢＳＡでブロックした。プレートをバッファーで洗浄した後、試験化合物またはバッファーの存在下、洗浄した血小板を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、プレートをバッファーで３回洗浄した。４１０ｎｍにおいてマイクロプレートリーダーを用いて細胞の酸性ホスファターゼ活性を測定し、粘着した細胞の数を決定した。試験化合物の非存在下での粘着と比較することにより、試験化合物で処理したサンプルの粘着阻害の割合を算出した。試験化合物の活性をＩＣ50値、すなわち血小板粘着を完全に阻害するのに必要な用量で表した。
試験２の値が大きいほど、静止型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する試験化合物の結合性が低いことを表す。【００９９】
試験１で得られたＩＣ50値(Ａ)および試験２で得られたＩＣ50値(Ｒ)を用いて、Ｒ／Ａ比を算出することにより、活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する試験化合物の選択的結合性を評価した。
結果を、表１−１〜表１−４に示す。【０１００】
【表１−１】
0004910695.tif 000036
【０１０１】
【表１−２】
0004910695.tif 000037
【０１０２】
【表１−３】
0004910695.tif 000038
【０１０３】
【表１−４】
0004910695.tif 000039
【０１０４】
表１−１〜表１−４から明らかなように、本発明の血栓造影剤におけるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物は、Ｒ／Ａ値が高く、活性型ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの選択的結合性が高いことが示された。
本発明の血栓造影剤に用いるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合性化合物は、従来技術に示されたＡＤＰ誘導血小板凝集阻害試験におけるＩＣ50値より低いＩＣ50値を示しており、ＡＤＰで活性化された血小板の表面のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合することが明らかである。【０１０５】
製造例２１  血栓造影剤の製造
ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の(２Ｅ)−３−[１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)−４−ピペリジニル]アクリル酸(１．６ｇ、６．２７ｍｍｏｌ)、式：【０１０６】
【化３５】
0004910695.tif 000040
【０１０７】
で表されるジ−ｔｅｒｔ−ブチル  ２,２'−[[４−(アミノアセチル)−１,２−フェニレン]ビス(オキシ)]ジ酢酸塩酸塩(２．７１ｇ、６．２７ｍｍｏｌ)、およびブロモトリピロリジオノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート(３．４２ｇ、６．５８ｍｍｏｌ)に、氷浴で冷却しながらＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(２．５１ｇ、１９．１ｍｍｏｌ)を滴下した。反応混合物を０℃で２０分間攪拌した後、室温で３０分間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、残渣を酢酸エチルと水とに分配した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を０．５Ｎ硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をクロロホルム−酢酸エチル(９：１)混液で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、式：【０１０８】
【化３６】
0004910695.tif 000041
【０１０９】
で表されるｔｅｒｔ−ブチル  ４−[(１Ｅ)−３−[[２−[３,４−ビス(２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエトキシ)フェニル]−２−オキソエチル]アミノ]−３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレートを非晶質で得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ; 1.18-1.36(2H, m), 1.49(9H, s), 1.53(18H, s), 1.71-1.84(2H, m), 2.32-2.47(1H, m), 2.74-2.99(2H, m), 3.94-4.11(2H, m), 4.71(2H, d, J=5.5Hz), 4.85(2H, s), 4.91(2H, s), 6.14(1H, d, J=15.4Hz), 6.70(1H, dd, J=15.4, 6.2Hz), 7.09(1H, d, J=8.8Hz), 7.49(1H, d, J=2.2Hz), 7.76(1H, dd, J=8.8, 2.2Hz), 8.36(1H, brt, J=5.5Hz); MS(ES+)m/zは検出されず【０１１０】
ＣＨ2Ｃｌ2(１０ｍｌ)中のｔｅｒｔ−ブチル  ４−[(１Ｅ)−３−[[２−[３,４−ビス(２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエトキシ)フェニル]−２−オキソエチル]アミノ]−３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレート(３．６ｇ、５．６９ｍｍｏｌ)および塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル(１．２９ｇ、８．５３ｍｍｏｌ)の溶液に、氷浴で冷却しながら１,８−ジアザビシクロ[５.４.０]ウンデセ−７−エン(１．４７ｇ、９．６７ｍｍｏｌ)を滴下した。反応混合物を室温で２時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチルと水とで分配した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン−酢酸エチル(４：１)混液で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、式：【０１１１】
【化３７】
0004910695.tif 000042
【０１１２】
で表される４−[(１Ｅ)−３−[((Ｚ)−２−[３,４−ビス(２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエトキシ)フェニル]−２−[[ｔｅｒｔ−ブチル(ジメチル)シリル]オキシ]ビニル)アミノ]−３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレートを非晶質で得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ; 0.02-0.08(6H, m), 0.98(9H, s), 1.15-1.30(2H, m), 1.43(9H, s), 1.44(9H, s), 1.46(9H, s), 1.61-1.78(2H, m), 2.27-2.48(1H, m), 2.68-2.91(2H, m), 3.88-4.04(2H, m), 4.70(2H, s), 4.72(2H, s), 6.23(1H, d, J=15.8Hz), 6.71(1H, d, J=6.2Hz), 6.76(1H, d, J=6.2Hz), 6.85-6.94(2H, m), 7.01(1H, dd, J=8.1, 1.8Hz); MS(ES+)m/zは検出されず【０１１３】
ＤＭＦ(２ｍｌ)中の４−[(１Ｅ)−３−[((Ｚ)−２−[３,４−ビス(２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエトキシ)フェニル]−２−[[ｔｅｒｔ−ブチル(ジメチル)シリル]オキシ]ビニル)アミノ]−３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレートの溶液に、氷浴で冷却しながら水素化ナトリウム(１７．７ｍｇ、７３６ｍｍｏｌ)を逐次添加し、０℃で５分間攪拌した。次いで反応混合物に、[11Ｃ]ＣＨ3Ｉ(１０５ｍｇ、７３６ｍｍｏｌ)を同温度で添加して５分間攪拌し、室温で５分間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルとリン酸緩衝液標準溶液(ｐＨ６．８６)とで分配した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン−酢酸エチル(１：１)混液で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、式：【０１１４】
【化３８】
0004910695.tif 000043
【０１１５】
で表される４−[(１Ｅ)−３−[((Ｚ)−２−[３,４−ビス(２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエトキシ)フェニル]−２−[[ｔｅｒｔ−ブチル(ジメチル)シリル]オキシ]ビニル)([11Ｃ]メチル)アミノ]−３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレートを非晶質で得た。【０１１６】
トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ；１ｍｌ)およびＣＨ2Ｃｌ2(１ｍｌ)の混合物に、氷浴で冷却しながらＣＨ2Ｃｌ2(０．５ｍｌ)中の４−[(１Ｅ)−３−[((Ｚ)−２−[３,４−ビス(２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエトキシ)フェニル]−２−[[ｔｅｒｔ−ブチル(ジメチル)シリル]オキシ]ビニル)([11Ｃ]メチル)アミノ]−３−オキソ−１−プロペン−１−イル]−１−ピペリジンカルボキシレートを滴下した。反応混合物を室温で３０分間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、アセトニトリル−水(１０：１)混液で溶出するＯＤＳクロマトグラフィーで精製し、式：【０１１７】
【化３９】
0004910695.tif 000044
【０１１８】
で表される２,２'−[[４−([[11Ｃ]メチル[(２Ｅ)−３−(４−ピペリジニル)−２−プロペノイル]アミノ]アセチル)−１,２−フェニレン]ビス(オキシ)]ジ酢酸トリフルオロ酢酸塩を非晶質で得た。【０１１９】
製造例２２  血栓造影剤の製造
製造例１５で製造したアセトニトリル(１．５ｍＬ)中の化合物(１３．０ｍｇ，３０μｍｏｌ)の溶液を、[18Ｆ]フッ素イオンの溶液に添加した。混合物を８５℃で２０分間加熱した。室温に冷却後、４Ｍ  ＨＣｌ(１．０ｍＬ)を添加した。混合物を１００℃で１０分間加熱した。得られた混合物を、０．１％アセトニトリル−０．０５Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃで溶出するＨＰＬＣカラム(ＹＭＣ−パック Ｃ１８ Ｐｒｏ、１０×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製)で精製して、[18Ｆ]で標識された血栓造影剤を得た。【０１２０】
実施例２１および２２
製造例２１で製造した[11Ｃ]で標識された血栓造影剤、および製造例２２で製造した[18Ｆ]で標識された血栓造影剤を用いて、サル(Ｍａｃｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ)の体内での標識化合物の動向を調べた。
イヌ伏在静脈(足の母指の背側指静脈と足背静脈弓の合流によりつくられ、内果の前方、大腿骨内側顆の後方上行し、大腿広筋膜の伏在裂孔を横切り、大腿三角の上部で大腿静脈に注ぐ)血栓モデル(Knight L. C. et al., Thromb Haemost., 1998; 80: p.845〜851およびLister-James L. et al., J. Nucl Med. 1996; 37: p.775〜781を参照)に従って、麻酔下のサルの右大腿静脈に塞栓形成用プラチナコイル(ボストンサイエンティフィックジャパン社製)を挿入、固定して傷口を縫合した。【０１２１】
コイル挿入３時間後に、製造例２１および２２で製造した血栓造影剤(７４０ＭＢｑ／２ｍＬ生理食塩水)をそれぞれ静脈内投与した。その後、高分解能陽電子放射型断層撮影(ＰＥＴ)スキャナ(ＳＨＲ−７７００、浜松ホトニクス社製)を用いて９０分間撮影を行った。ＰＥＴ測定後、コイルを除去して右大腿静脈を採取して血栓サンプルを得た。また、大腿筋肉を採取し、さらに伏在動脈から動脈血を採取した。これらの血栓、大腿筋肉および動脈血のサンプルをそれぞれ秤量し、ガンマカウンター(１４８０ＷＩＺＡＲＤ；Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ社製)を用いてそれらの放射活性を測定した。
結果を以下の表２に示す。データは、パーセント／投与量として計算した(％ＩＤ／ｋｇ／ｇ)。【０１２２】
【表２】
0004910695.tif 000045
【０１２３】
表２から明らかなように、投与の９０分後に、製造例２１の血栓造影剤は約２４倍(血液比)、および約９５倍(筋肉比)の比で血栓に集積し、製造例２２の血栓造影剤は、約４．８倍(血液比)、および１６倍(筋肉比)の比で血栓に集積した。すなわち、本発明の血栓造影剤は、血栓に特異的に結合することがわかる。
また、ＰＥＴによる撮影では、バックグラウンドノイズが低く、解像度が高い血栓の撮影を行うことが可能であった。