(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリケチドシンターゼ（“PKS”）複合体内のアシルトランスフェラーゼ（“AT”）ドメイン又は少なくとも１つのATドメインを含むその一部の特異性の変更方法であって、前記ATドメインの残基の５％以下を選択的に変更することを含んで成り、ここで前記変更された残基の少なくとも１つが６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（“DEBS”）の第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列内に位置し、前記残基の変更が前記ATドメインの基質特異性の変更をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項２】
下記残基：
（ａ）DEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列のすぐ下流の残基；
（ｂ）GHSモチーフのすぐ下流の残基；
（ｃ）GQGモチーフから３残基下流の残基；及び
（ｄ）DEBSの第1モジュールにおいて残基252として見出されるような保護されたアルギニン残基の４残基下流の残基の１又は複数の残基がまた変更される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記モチーフが、
（ａ）ATドメインの配列を決定することにより；
（ｂ）他のATドメインの多くの配列との配列一列整列を行うことにより；そして
（ｃ）前記モチーフに対応する残基を同定することにより位置決定される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記PKS酵素複合体が、モジュラーI型PKS酵素複合体の少なくとも一部である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記変更されたATドメインが負荷モジュールに組込まれる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記変更されたATドメインがKSqドメインの後に続く請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記変更されたATドメインが、延長モジュールに組込まれる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記変更された残基が、XAFH, XASH及びXAGHから選択されたモチーフ内にあり、Xは任意のアミノ酸であり、そして/又はそのようなモチーフを創造する請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記変更された残基がXAGH内にあり、そしてXがF、T、V及びHから選択される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記変更された残基がXAFH内にあり、そしてXがHである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記変更された残基がXASH内にあり、そしてXがY、 H、W及びVから選択される請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記変更がプロリン含有モチーフを生成するか又は変更し、前記モチーフが、DEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列である請求項１〜11のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記変更がDEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列における残基の変更を包含し、そしてマロニル−CoAに対して特異的であるモチーフの生成をもたらす請求項１〜12のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記４残基配列に続いて、すでに存在しない場合、変更により生成されるSが存在する請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記活性部位におけるGHSモチーフに続く残基が、すでに存在しない場合、変更により生成される、V、I又はLである請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記GQGモチーフの３残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成される、R、H又はTである請求項13記載の方法。
【請求項１７】
前記DEBSの第１モジュールにおける残基252で見出されるような保存されたRの４残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されるMである請求項13記載の方法。
【請求項１８】
前記変更がDEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列における残基の変更を包含し、そしてメチルマロニル−CoAに対して特異的であるモチーフの生成をもたらす請求項１〜12のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記４−前記配列に続いて、すでに存在しない場合、変更により生成される、S、G、C又はTから選択された残基が存在する請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記活性部位におけるGHSモチーフに続く残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されるQである請求項18記載の方法。
【請求項２１】
前記GQGモチーフの３残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されるWである請求項18記載の方法。
【請求項２２】
前記DEBSの第１モジュールにおける残基252で見出されるような保存されたRの４残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成される、I又はLである請求項18記載の方法。
【請求項２３】
前記変更がDEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列における残基の変更を包含し、そしてエチルマロニル−CoAに対して特異的であるモチーフの生成をもたらす請求項１〜12のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記DEBSの第１モジュールにおける残基252で見出されるような保存されたRの４残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されるWである請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記ATドメインがGHSモチーフと共に活性部位を有し、そしてYASHモチーフに対応し、そして前記変更された残基に少なくとも１つを含む前記モチーフが前記GHSモチーフから80〜110下流の残基で開始する請求項１〜24のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
１つの化合物又は個々の化合物の少なくとも一部がポリケチドシンターゼ（“PKS”）酵素複合体の生成物である、前記１つの化合物又は化合物の混合物の合成方法であって、（i）請求項１〜25のいずれか１項記載の方法を実施し、それにより、前記少なくとも１つの変更されたATドメインを含むPKS酵素複合体を供給し、そして（ii）前記PKS酵素複合体により合成をもたらし、１つの化合物又は前記化合物の混合物を生成することを含んで成る方法。
【請求項２７】
前記段階（i）が、前記複合体をコードする核酸分子を供給し、そして発現をもたらすことを含んで成る請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸配列が、特定部位の突然変異誘発にゆだねられ、その結果、それらが前記変更されたATドメインをコードする請求項27記載の方法。
【請求項２９】
発現が、ポリケチドを生成できる発現生物においてもたらされる請求項27又は28記載の方法。
【請求項３０】
前記変更されたATドメインを含む前記PKSが、ハイブリッドPKSにスプライスされる請求項26〜29のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
ポリケチドの組合わせライブラリーの製造方法であって、
（i）請求項１記載の方法によりPKS複合体内のATドメインの特異性を変更し；そして
（ii）前記PKS酵素複合体により合成をもたらし、化合物の混合物を生成することを含んで成る方法。
【請求項３２】
請求項１〜25のいずれか１記載の方法により生成されるような変更されたATドメインを含むPKS酵素複合体をコードする核酸。
【請求項３３】
請求項32記載の核酸を含むベクター。
【請求項３４】
請求項32記載の核酸を含み、そしてPKS酵素複合体を発現することができる宿主生物。
【請求項３５】
少なくともその一部が、前記PKS酵素複合体の作用に起因するポリケチドである化合物を合成するよう適合される請求項34記載の宿主生物。
【請求項３６】
少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメインを含むポリケチドシンターゼ（PKS）酵素複合体の合成方法であって、前記ATドメインの残基の５％以下を選択的に変更することを含んで成り、ここで前記変更された残基の少なくとも１つが６−デオキシエリスロノリドBシンターゼ（“DEBS”）の第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列内に位置し、前記残基の変更が前記ATドメインの基質特異性の変更をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項３７】
下記残基：
（ａ）DEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列のすぐ下流の残基；
（ｂ）GHSモチーフのすぐ下流の残基；
（ｃ）GQGモチーフから３残基下流の残基；及び
（ｄ）DEBSの第1モジュールにおいて残基252として見出されるような保護されたアルギニン残基の４残基下流の残基の１又は複数の残基がまた変更される請求項36記載の方法。
【請求項３８】
請求項36又は37記載の方法により生成されるようなポリケチドシンターゼ酵素複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野：
本発明は、ポリケチド（ployketide）の合成のためのアシルチオエステル単位の選択に影響を及ぼすために使用され得る方法及び材料（例えば、酵素系、核酸、ベクター及び培養物）、及び新規であるその得られるポリケチドに関する。それは特に、マクロライド、ポリエーテル又はポリエン、及び組換え合成を利用してのそれらの調製に関する。
【０００２】
好ましいタイプの態様においては、異なったポリケチド生合成遺伝子クラスターに由来する、ポリケチド生合成遺伝子又はそれらの一部は、特定のポリケチド、例えば予測される構造の12−、14−及び16−員のマクロイドの生成を可能にするために操作される。本発明は、例えば（ａ）マロネート連鎖延長剤単位；又は（ｂ）メチルマロネート連鎖延長剤単位；又は（ｃ）エチルマロネート連鎖延長剤単位；又は（ｄ）追加のタイプの連鎖延長剤単位；又は（ｅ）アセテート及び/又はマロネート開始剤単位；又は（ｆ）プロピオネート及び/又はメチルマロネート開始剤単位；又は（ｇ）ブチレート及び/又はエチルマロネート開始剤単位；又は（ｈ）追加のタイプの開始剤単位を組み込む予定されたケチド単位を有するポリケチドを調製するために、一般的にアシルCoA；ACPトランスフェラーゼ（AT）機能をコードする遺伝子材料を修飾することによるそのAT機能の修飾に特に関する。もちろん、本発明は、ポリケチド中の１つよりも多くのケチド単位に影響を及ぼすために使用され得る。この方法は、ポリケチドシンターゼによるタンパク質構造の変更を最小にすることができる。
【０００３】
ポリケチドは、抗生物質又は他の薬理学的性質を有する多くの化合物、例えばエリスロマイシン、テトラサイクリン、ラパマイシン、アベルメクチン、モネンシン、エポチロン及びFK506を包含する、多くの及び構造的に異なった種類の天然の生成物である。特に、ポリケチドは、ストレプトミセス（Streptmyces）及び関連する放線菌により多量生成される。それらは、脂肪酸生合成の態様に類似する態様でアシルチオエステルの反復された段階的縮合により合成される。
【０００４】
天然のポリケチド間に見出される構造的多様性は、“開始剤”又は“連鎖延長剤”単位（種々の他のタイプの単位の１つが時折り、選択され得るか）としての（通常）アセテート（マロニールCoA）又はプロピオネート（メチルマロニル−CoA）の選択から一部、及び個々の縮合の後に形成されるβ−ケト基の異なった程度のプロセッシングから発生する。プロセッシング段階の例は、β−ヒドロキシアシル−への還元、還元に続く２−エノイル−への脱水、及び飽和アシルチオエステルへの完全な還元を包含する。それからのプロセッシング段階の立体化学結果がまた、連鎖延長の個々のサイクルのために特定される。α−炭素又はβ−ヒドロキシでのメチル化がまた、時々観察される。
【０００５】
ポリケチドの生合成は、ポリケチドシンターゼとして知られている鎖−形成酵素グループにより行われる。２種の広い種類のポリケチドシンターゼ（PKS）が、放線菌において記載されている。マクロライドエリスロマイシン、オレアンドマイシン、アベルメクチン及びラパマイシンのためのPKSにより及びポリエーテルモネンシンのためのPKSにより表される、１つの種類、すなわちI型PKSは、ポリケチド鎖延長の個々のサイクルのための酵素の異なった組み又は“モジュール”から成る。例については、図１（Sortes, J. など. Nature (1990) 348: 176-178; Donadio, S. などScience (1991) 2523: 675-679; Swan, D. G. など. Mol. Gen. Genet. (1994) 242: 358-362; MacNeil. D. J. など. Gene (1992) 115: 119-125; Schwecke, T. など. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839-7843; また、特許出願WO93/01546号）を参照のこと。
【０００６】
多くのI型PKSをコードする遺伝子は、配列決定されており、そしてそれらの配列は、公的に入手できるDNA及びタンパク質配列データベース、例えばGenbank, Swissprot and EMBLに開示されている。例えば、中でもエリスロマイシン（Cortes, J. など. Nature (1990) 348: 176-178; 受託番号X62569号, Donadio, S. など. Science (1991) 252: 675-679；受託番号M63677号）；ラパマイシン（Schwecke, T. など. Proc. Natl. Acad. Sci. (1995): 7839-7843；受託番号X86780号）；リファマイシン（Angust, P. など. Chem. Biol. (1998) 5: 69-79; 受託番号AF040570号）及びチロシン（Elililly、受託番号U78289号）の合成を支配するPKSについての配列は入手できる。
【０００７】
用語“ポリケチドシンターゼ”（PKS）とは、本明細書において使用される場合、ポリケチドの生合成を担当する酵素活性の複合体を言及する。それらの酵素活性は、β−ケトアシルACPシンターゼ（KS）、アシルトランスフェラーゼ（AT）、アシルキャリヤータンパク質（ACP）、β−ケトレダクターゼ（KR）、デヒドラターゼ（DH）、エノイルレダクターゼ（ER）及びチオエステラーゼ（TE）を包含するが、但しそれらの活性には限定されない。それらの活性の個々は、この活性を担当する別々のタンパク質又はポリペプチドフラグメント上に存在する。
【０００８】
そのようなフラグメントは、“ドメイン”と称する。本明細書において使用される用語“モチーフ”又は“標識配列”とは、触媒機能、例えば基質の選択の１つの観点を担当する（少なくとも部分的に）ドメイン内の小さな範囲のアミノ酸（通常、10個以下のアミノ酸）を言及する。用語“延長モジュール”とは、本明細書において使用される場合、ポリケチド鎖延長の１つのサイクルを達成する、β−ケトアシル−ACPシンターゼ（“KS”）ドメインから次のアシルキャリヤータンパク質（“ACP”）ドメインまでの連続ドメインの組みを言及し；これはポリケチド鎖の還元プロセッシングを担当するドメインを含んでも又は含まなくても良い。用語“負荷モジュール”とは、PKS上に開始剤単位の負荷を達成し、そして従って、特定の延長モジュールのKSドメインに対してそれを入手可能にするいずれかのグループの連続ドメインを言及するために使用される。
【０００９】
背景技術：
遺伝子工学によりPKSのポリケチド生成物の性質を変更するいくつかのアプローチはこれまで提案されている：特に、WO93/13663号及びWO98/01571号を参照のこと。形成されるポリケチドの長さは、エリスロマイシン生合成の場合、鎖−開放チオエステラーゼ/シクラーゼ活性を含むエリスロマイシン生成PKSの酵素ドメインの遺伝子工学を用いての特定の再配置により変更されて来た（Cortes, J. など. Science (1995) 268: 1487-1489; Kao, C.M. など. J. Am. Chem. Soc. (1995) 117: 9105-9106）。
【００１０】
エリスロマイシン生成PKS（また、６−デオキシエリスロノリドBシンターゼ、DEBSとしても知られている）のモジュール５におけるケトレダクターゼドメインの部分をコードするDNAのイン−フレーム欠失が、エリスロマイシン類似体５，６−ジデオキシ−３−α−マイカロシル−５−オキソエリスロノリドB、 ５，６−ジデオキシ−５−オキソエリスロノリドB及び５，６−ジデオキシ、６β−エポキシ−５−オキソエリスロノリドBの形を誘導することが示されている（Donadio, S. など. Science (1991) 252: 675-679）。
【００１１】
同様に、その対応するPKS−コードのDNAの遺伝子工学による、DEBSにおけるモジュール４のエノイルレダクターゼドメインにおける活性部位残基の変更、及びサッカロポリスポラ・エリトラエア（Saccharopolyspora erythraea）中へのその導入は、６，７−アンヒドロエリスロマイシンCの生成を導入した（Donadio, S. など. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7119-7123）。
【００１２】
特許出願WO00/01827号は、β−炭素の酸化状態を変えるためにPKSを操作するさらなる方法を記載する。ラパマイシンPKSモジュール10及び13に由来するドメインによる、エリスロマイシン生成PKSのモジュール２の還元性ドメインの置換は、それぞれ、C10−C11のオレフィン−エリスロマイシンA及びC10−C11のジヒドロエリスロマイシンAの形成を誘導した。
【００１３】
第２種類のPKS、すなわちII型PKSは、芳香族化合物のためのジシンターゼにより表される。II型PKSは、鎖延長のための１組の酵素活性のみを含み、そしてそれらは連続的サイクルにおいて適切な場合、再使用される（Bibb, M. J. など. EMBO J. (1989) 8: 2727-2736; Sherman, D. H. など. EMBO J. (1989) 8: 2717-2725; Fernandez-Moreno, M.A. など. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278-19290）。II型PKSのための“連鎖延長剤”単位は通常、アセテート（マロニル−CoA）単位であり、そして特定のシクラーゼの存在は、芳香族生成物中への完結された鎖の環化のための好ましい経路を指図する（Hutchinson, C.R. and Fujii, I. Annu. Rev. Microbiol. (1995) 49: 201-238）。
【００１４】
ハイブリッドポリケチドは、異なったII型PKS遺伝子クラスターを含むもう1つの株中へのクローン化されたII型PKS遺伝子含有DNAの導入により、例えばストレプトミセス・ガリレウス（Streptomyces galileus）のアントラキノンポリケチド−生成株中への、アクチノロジン、すなわちストレプトミセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）からの青色ポリケチドのための遺伝子クラスター由来のDNAの導入により得られて来た（Bartel, P.L. など. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816-4826）。時折り、異常な開始剤単位が、特にオキシテトラサイクリン、フレノリシン及びダウノルビシンの生合成においてII型PKSにより導入され、そしてそれらの場合、別々のATが開始剤単位をPKSにトランスファーするために使用され得る。
【００１５】
菌類PKS、例えば６−メチルサリチル酸又はロバスタチンPKSは典型的には、それらの分子のポリケチド部分の合成のために必要とされるほとんどの活性を包含する単一の多−ドメインポリペプチドから成る（Hutchinson C. R. and Fujii I. Annu. Rev. Microbiol. (1995) 49: 201-238）。II型菌類PKSもまた知られている。
ポリケチドシンターゼ及び非リボソームペプチドシンターゼ分子を含んで成る多くの混合されたシステム、例えばエポチロン及びブレオマイシン生合成クラスターが同定されている。
【００１６】
多数の治療的に重要なポリケチドが同定されているが、増強された性質を有するか、又は完全に新規の生活性を有する新規ポリケチドを獲得する必要がある。I型PKSにより生成される複合体ポリケチドは、それらが駆虫剤、殺昆虫剤、抗癌剤、免疫抑制剤、抗菌剤又は殺菌剤としての既知の利用性を有する化合物を包含することにおいて、特に価値がある。それらの構造的複雑性のために、そのような新規ポリケチドは、全体的な化学合成により、又は既知のポリケチドの化学的修飾により容易に得ることができない。
【００１７】
所望される特定の変化は、組み込まれる開始剤及び/又は連鎖延長剤単位の性質を変えることによる炭素骨格の変化、鎖延長の後に生じる一連の還元段階を変更することによるβ−ケト炭素の酸化レベル及び従って、酵素置換のパターンの変化、及び一般的に、ポリケチド分子のヒドロオキシル化、メチル化又はグリコシル化を包含する後PKS“調整（tailoring）”段階の変化である。
【００１８】
構成されるハイブリットPKS遺伝子のすべて、又は大部分が実施可能であり、且つ所望するポリケチド生成物を生成するよう、個々のモジュールを実際的に開発する信頼できる且つ特定の手段を開発する必要性がある。種々の方法が、特に組換えDNA技法新規生合成を用いて、それらのハイブリッドPKSを生成することが記載されている。PKSタンパク質構造への変更を最小にする態様でそれらのPKSを操作する方法を開発する特定の必要性がある。それらの操作を達成するための存在する方法は時々、修飾されていないPKSが生成物を製造する割合のわずか１％又はそれ以下で、所望する生成物を付与するハイブリッドPKS多酵素を生成する。
【００１９】
WO93/13663号及びWO98/01571号は、PKSを構築する新規方法を記載する。ポリケチド分子におけるいずれかの位置で使用される連鎖延長剤単位、特にマロニル−、メチルマロニル−、又はエチルマロニル−CoAの性質を変更する十分に確立された方法は、ドメイン置換によるものである。例えば、WO98/01546号及びアメリカ特許第6,063,561号は、修飾されたエリスロマイシンを形成するためにこの修飾を達成する方法を開示する。新規ポリケチド分子、この場合、特に新規エリスロマイシンは、サッカロミセス・エリトラエア染色体上の完全なATドメイン−コードのDNAフラグメントの、もう１つのPKSクラスターからの同等の異種ATドメイン−コードのフラグメントによる置換により生成される。異種ドメインを挿入するために正確なDNA/タンパク質スプライス部位の選択が、その対応するDNA及びタンパク質配列の詳細な分析を必要とすることは、当業者に良く知られている。
【００２０】
異なった研究者は、タンパク質の保存された、半保存された又は保存されていない領域で、又はATドメインの境界内の又はその境界での部位でのスプライシング部位の使用を選択する。この技術の追加の欠点は、特定の異種ドメインがいずれかの所定の情況下で作動するかどうかを予測することが困難であることである。１つのモジュールにおいて都合良く作動するドメインは、隣接するモジュールにおいてまったく作動しないか、又は莫大に低められた収率でポリケチドを生成することができる。Oliynyk, M. など. (Chem. Biol. (1996) 3: 833-839) 及びRuanなど. (J. Bact. (1997) 179: 6416-6425) は、エリスロマイシンPKSのモジュールにおけるマロニル−CA特異的ATドメインによりリメチルマロニル−CoA特異的ATドメインを交換する研究を公開している。
【００２１】
生成物は、モジュール１及び２における変化についてのみ観察され、そしてモジュール２においては、莫大に低められた収率で生成物が観察された。Stassiなど. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95: 7305-9) は、エチルマロニル−CoA特異的ATにより、エリスロマイシンPKSのモジュール４のメチルマロニルーCoA特異的ATを交換し、そして再び、生成物の収率は、必要とされるエチルマロニル−CoA前駆体の供給を高めると思われるクロトニル−CoAレダクターゼ遺伝子の付加の後でさえ、低かった。制限する収率についての可能性ある理由は、効率的なポリケチド鎖合成のために適切に相互作用すべきである隣接するKS及びACPドメインとの異種ATドメインの構造的又は機械的非適合性である。
【００２２】
結果的に、適切な効率を表示する新規ポリケチド−生成株を得るために多ドメイン交換を試みることがしばしば必要である。なぜならば、それらの変化が二段階二重組み込み方法を通して染色体上での遺伝子置換により行われる場合、特に困難にされるからである。DNAレベルでのスプライシング部位の導入は、時間の浪費であり、そして技術的に困難であり、PKSタンパク質コードの読み取り枠が破壊されないことを確かめるための注意した分析を要する。制限酵素部位の導入はしばしば、さらなるPKSタンパク質構造の破壊及び従って、触媒効率の損失を導く、アミノ酸レベルでの変化を必要とする。
【００２３】
タンパク質の三次構造に対する最少の破壊性を伴って、AT基質特異性に影響を及ぼすよう、特定部位の突然変異誘発のために利用できる多くの技法を使用する方法は、現在の技法に付加価値を与える。
【００２４】
活性部位に対する変化は、他のシステムにおける基質特異性を変更することが示されている。例えば、初期研究においては、Scruttonなど. (Naturo (1990) 343: 38-43) は、グルタチオンレダクターゼの補酵素基質特異性を交換するために特定部位の突然変異誘発を使用した。NADP+結合ドメインにおける“フィンガープリント”構造モチーフを同定し、そして変更する場合、それらは酵素を、NAD+に対する著しい選択を示す酵素に転換することができた。指図された進化の技法が、酵素触媒機能を改良し/変更するために使用されて来た。文献中の多くの例の中で、Zhangなど. (PNAS (1997) 94: 4504-4509) は、それらの技法によるガラクトシダーゼのフコシダーゼへの転換を例示する。その得られるタンパク質は、６個の突然変異を担持し、それらのうち３個は、活性部位に又はその近くに存在する。
【００２５】
PKSドメインに対する、マイナーであるが、しかし指図された変更は、その触媒機能への有意な変化を行うことができる。特許出願WO00/00500号は、連鎖延長剤ケトシンターゼドメインが、活性部位での特定部位の突然変異誘発により、脱カルボキシル化（及び従って、負荷）ケトシンターゼドメインに転換することを教授する。アメリカ特許第6,004,787号及び第6,066,721号、及びJacobsenなど. Science (1997) 277: 367-369は、修飾されたPKSへの合成前駆体の育成により新規ポリケチドの生成を可能にするためにこの活性を不活性化するKS1活性部位における残基の欠失を記載する。
【００２６】
いくつかの研究は、適切な基質、及び特に、基質側鎖（すなわち、アシル−CoAチオエステルのマロニル部分）の性質の認識と、直接的に包含されるアミノ酸を決定するためにATの一次アミノ酸配列とを相互関係づけることを試みた。Haydockなど. (FEBS Lett. (1995) 374: 246-248) による研究は、既知の活性部位の上流のモチーフ11のアミノ酸と、マロニル−又はメチルマロニル−CoA特異的ATの基質特異性とを関連づけた。このモチーフと、E. コリ脂肪酸シンターゼからの既知のアシルトランスファラーゼのタンパク質構造との間の比較は、活性部位へのモチーフ残基の接近性（及び従って、基質を選択するその能力）の著者による評価を可能にした。
【００２７】
その著者は、このようにして同定されたこの規準からはずれた領域が、基質と直接的に接触するほど十分に接近していないが、アシルトランスフェラーゼ活性部位近くに存在することを認識した。他の研究（Katz, L. Chem. Rev. (1997) 97: 2557-2575, Tang, L. など., Gene (1998) 216: 255-265） は、ポリケチド遺伝子クラスター配列決定計画に由来するタンパク質配列からAT基質特異性を予測するための手段としてそれらの残基を用いて、特定の連鎖延長剤単位と追加の残基とを相互関連づけた。残基が機械論的重要性を有するかどうかはまだ、不明確であった。
【００２８】
わずか１つの場合、PKS ATドメイン内の領域が、AT特異性を交換する試みにおいて交換されており；特許出願WO00/01838号及びLauなど. Biochemistry (1999) 38: 164-51) は、連鎖延長剤単位の選択においてATドメインのC−末端での“超可変部”を包含した。それらの研究者は、この25〜30個の長さのアミノ酸を交換し、そしてこの変化がATの基質特異的を変更するのに十分であったことを示し、すべてのATドメインに存在する短い（23〜35個のアミノ酸）C−末端セグメントがそれらの基質特異性の主要決定因子であることを結論づけた。興味あることには、その長さの及びアミノ酸配列は、既知のATドメイン間で相当に変化する。
【００２９】
従って、本発明者は、PKSモジュールによる連鎖延長剤単位の選択は、弱められた又は変更された基質特異性を有する新規ATドメインを生成するために結合突然変異誘発を通して操作され得る“超可変域”により影響されることを示唆する。驚くべきことには、本発明者の構造分子モデリング研究は、この領域が活性部位から離れて表面接近領域で存在し、そして従って、マロニル部分又は使用される基質と直接的に相互作用する（そして従って、直接的に選択する）ことを示す。従って、基質特異性に対する効果はたぶん、三次構造の破壊により、不正確であり、且つより間接的な効果である。
【００３０】
発明の開示：
本発明の第１の観点によれば、少なくともその一部が、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメインを包含するポリケチドシンターゼ（PKS）酵素複合体の生成物であるか、又はそのような生成物から誘導されている化合物の合成方法が提供される。前記方法は、前記ATドメインがわずかな割合のアミノ酸残基を選択的に変えるために変更されている前記PKS酵素複合体を供給する段階を包含する。
【００３１】
前記変更された残基は、ATドメインの活性部位ポケットに存在し、そしてATドメインの基質特異性に影響を及ぼす１又は複数のモチーフを含んで成り、前記変更が前記基質特異性に影響を及ぼし；及び/又はATドメインの基質特異性に影響を及ぼし、そしてDEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列を含んで成るモチーフの１又は複数の残基を含んで成り、前記変更が前記基質特異性に影響を及ぼす。次に、合成は、前記ATドメインが変更されていないPKS酵素により生成され得たものとは異なる１つの化合物又は複数の化合物の混合物を生成するために、前記PKS酵素複合体によりもたらされる。
【００３２】
PKS酵素複合体は、モジュラーI型PKS酵素複合体の少なくとも一部であり得るか、それは、II型PKSシステム、菌類PKSシステム、又はPKS及び非リボソームペプチドシンターゼモジュールを含んで成るハイブリッドシステムから誘導され得る。
【００３３】
本発明は、ATドメインにおける少数のアミノ酸残基、及び特に、ATドメイン内の短い標識“モチーフ”の１又は複数の残基を含んで成るAT活性部位に隣接する残基を変更することによって、そのATドメインにより選択されるアシルチオエステルに影響を及ぼすことが可能であることを教授する。新規ポリケチドは、１又は複数のモジュール上の標識モチーフが変更され、例えばマロニル基質のための異なった特異性に関連するモチーフにより置換されている修飾されたPKSにより製造され得る。さらに、本発明は、不正確な連鎖延長剤単位の非特異的組み込みのために、天然のシステムにおいて時折見出される混合されたポリケチド生成物の割合を低める方法を提供する。逆に言えば、本発明は、PKSにより生成されるポリケチドの多様性を高める、混合された集団のポリケチド生成物を供給する方法を提供する。
【００３４】
本発明は、通常の連鎖延長剤アシルチオエステルの１つの組み込みを特定するATにおける存在するアミノ酸残基モチーフの、他のアシチルチオエステルを特定するもう１つのATに見出されるもう１つのモチーフによる置換による修飾されたPKSの調製を可能にする。これは、ポリケチドシンターゼの基質特異性がポリケチド−生成生物において発現される場合、その基質特異性を変更する。
【００３５】
多くのI型PKS遺伝子クラスターについてのDNA配列は開示されている。マクロライド、特にエリスロマイシン、ラパマイシン、アベルメクチン、リファマイシン、FK506、エポチロン、チロシン、ニダマイシン、イオノホレ、ポリエーテル、特にモネンシン及びポリエン、特にナイスタチンの形成を担当するI型PKSモジュール由来のATドメインの包括的な配列分析は、ATドメインの特徴であるアミノ酸の同定を可能にした。
【００３６】
図２は、それらのATドメインの配列比較を示す。この配列比較は、関連する配列のグループからの複数の配列一列整列を創造する方法を用いてのコンピューターを使用して、一般的に便利な手段で生成されて来た。本発明者は、Feng and Doolittle (Journal of Molecular Evolution 25: 351-360 (1987)) の漸進性一列方法の単純化を用いて、複数配列の一列整列を創造する。Pile Up (Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, USA) と呼ばれるプログラムを使用した。使用される方法は、Higgins and Sharp (CABIOS 5:151-153 (1989))により記載される方法に類似する。そのプログラムは、すべての配列の最終一列を形成するために、多数の配列の一緒の比較を可能にする一連の漸進性、対様一列整列を実行する。
【００３７】
ギャップが、強い類似性の領域の一列整列を可能にするために個々の配列中に挿入され得る。これはしばしば、強く保存される領域がしばしば、アミノ酸の数及びアミノ酸のタイプの両者に関して、より種々の領域により分離される場合、必要とされる。異なったプログラムは、それらの比較を行うために異なった数学的アルゴリズムを使用し、マイナーな手段で異なる一列整列をもたらす。しかしながら、強い相同性の領域は、たとえ一列整列プログラムが利用されても、まだ整列できことが予測されている。議論される特定のモチーフは、印が付けられている。
【００３８】
それらのモチーフは、ドメインの開始に隣接する保存されたGQGモチーフ、ACPへのトランスファーの前、アシル鎖を共有結合する活性部位セリンを含むGHSモチーフ、及びドメインの末端に隣接するLPTYモチーフを包含する。アルギニンを包含する、すべてのATに共通する他の残基は、アシルチオエステルのカルボキシレート基を安定化すると思われる。さらなる詳細に配列分析は、マロニル−、メチルマロニル−及びエチルマロニル−CoAの組み込みを担当するAT間で異なるアミノ酸残基の同定を可能にした。それらのアミノ酸又はモチーフのいくつかは、前に論じられたようなクラスターの配列分析の間、これまでに同定されている。
【００３９】
それらのモチーフは、マロニル−/メチルマロニル−CoAが使用され得るかどうかを予測することができるが、それらは一般的に、メチルマロニル−対エチルニル−CoA又は通常使用される他の連鎖延長剤単位間の差異を示すことができない。本発明者は、基質認識に包含される最も重要且つ基本的な残基、及び従って、変更のための最も適切な残基の同定のための重要な必要条件としてこれを見た。精密な分析は、２個の残基がすべてのAT中で実質的に不変であり、そして２個の残基が連鎖延長剤単位に依存して一貫して異なる、４個の残基（位置は図２において明確に同定される）の鎖を同定した。
【００４０】
特に、マロニル−CoAの認識を担当する大部分のATにおいては、残基HAFHの配列が同定された。メチルマロニル−CoAの認識を担当する大部分のATにおいては、同等の残基が残基YASHにより置換された。エチルメロニル−CoA又は他の類似するサイズのCoA単位組み込みを担当するATSにおいては、全体のモチーフは、異なっており、ほとんど保存されないが、しかし一般的に配列XAGH（ここでXは最も頻繁には、F, T, V又はHであるが、但しそれらだけには限定されない）を示した。
【００４１】
本発明者は典型的には、マロニル−CoA、メチルマロニル−CoA及びエチルマロニル/さらなるCoA特異性に関するそれらのモチーフを説明するために用語HAFH, YASH及びTAGHを使用したが、しかしモチーフにおける、特に記載されるような残基１での置換を可能にするために本明細書におけるそれらの用語を使用する。モチーフの実質的な置換及び正確な位置は、図２の調査又は類似する配列分析により当業者に明確であろう。
【００４２】
図２に存在しないAT配列内のモチーフの位置を決定するための下記３種の可能な方法が存在する。それはたぶん、使用されるであろう方法の組合せである。
I)モチーフHAFH、YASH又はTAGHを同定するために配列の可視的調査及び比較による。残基の置換以来、ヒスチジン（H）から1つのアミノ酸（通常F, S又はG）により分離されるアラニン（A）を調べるための有用の方法に遭遇する。
【００４３】
II)活性部位セリンからのアミノ酸の計数による。モチーフの開始は典型的には（但し、制限されるべきではない）、GHS活性部位モチーフの下流の90〜100個のアミノ酸である。
（III）図２に注釈される配列及びモチーフ、又は他のATに対して新規配列の直接的な比較を可能にするコンピューター生成される複数の一列整列による。
【００４４】
これが、モチーフ内に置換が存在する場合、モチーフの明白な同定を可能にするので、第３の方法を使用することが好まし。これは、残基の１つがプロリン（P）により置換され得る、いくつかのより異常なタイプのATにおいて特に必要である。前記第３の方法はまた、モチーフとAT活性部位セリンとの間の残基の数が標準から有意に異なる場合、モチーフを同定するであろう。その第３の方法はまた、アミノ酸の同じか又は類似する開始がドメインにおける他の部分に存在する場合、モチーフをより良好に同定するであろう。
【００４５】
それらのモチーフ残基の特定の特徴は、選択される基質に比較して、第３の残基サイズの関係である。従って、マロニル−CoAが必要とされる場合、第３の残基は大きく（フェニルアラニン）、メチルマロニル−CoAが必要とされる場合、この残基は中間であり（セリン）、そしてエチルマロニル−CoAが必要とされる場合、この残基は小さい（グリシン）。基質側鎖サイズとこの第３の残基との間の逆の関係は、特に注目すべきである。興味アルことには、この関係はまた、例えばPK506（HAGH）の生成の間、鎖延長のいくつかのサイズのために必要とされる。
【００４６】
より異常な連鎖延長剤単位、例えばメトキシマロニル−CoAの組み込みを考慮する場合、適用される。現在、５炭素−CoA単位の組み込みを担当するATの単一の例のみが開示されている。この場合、ATはこの点で異なったモチーフ、すなわちヒスチジンのみが保存されているCPTHを表示する。このモチーフにおけるプロリン残基の組み込みは、大きな基質を特定するATの表示であり得る。プロリンはまた、アベルメクチン及びソラフェンの場合に見られるように、大きな異常な開始剤酸を組み込むATにおけるモチーフにも見出される。この領域における及びその周囲での、但しATドメインの活性部位に存在する残基は、選択される基質に対するドメインの特異性を定義する。
【００４７】
マロニル−及びメチルマロニル−CoA又はメチルマロニル−及びエチルマロニル−CoAのためのモチーフのハイブリッドを表すもモチーフが同定されている。特に、エポチロンモジュール３−予測のHAFH又はYASH（マロイル−CoA又はメチルマロニル−CoA特異的）がHASHを見出し、又はモネンシンモジュール５−予測のTAGH（エチルマロニル−CoA特異的）がVAGHを見出した。有意には、それらの両者の場合、PKSの生成物は、２種の異なった連鎖延長剤単位の組み込みのために、メネンシンA及びB、及びエポチロンA及びBの形成を引き起こすハイブリッドモチーフを含むモジュールによる混合物である。しかしながら、基質供給が形成されるメネンシンA及びBの割合の有意な決定因子であることは知られている（Liu, H. and Reynolds, K. A (1999) J. Bact. 181: 6806-6813）。
【００４８】
前に提案された“予測的な”モチーフの多くは、それらが活性部位ポケットに位置しないので、基質特異性の主要決定因子でありそうもない。基質間を区別するよう作用することができるいずれかのモチーフの特定の必要条件は、それが活性部位近くに、及び好ましくは、基質結合ポケット内に存在することである。この分析においては、本発明者は補酵素A部分よりもむしろアシルチオエステルのマロニル部分を結合し/認識するポケットの一部であるとその基質結合ポケットを考慮する。すべての確立においては、配列分析によりこれまで同定された類似性のいくつかは、機会的必要条件よりもむしろ進化的な保存性のためである。
【００４９】
対照的に、本発明者が同定した残基は、基質結合ポケットに又はそれに接近して存在する。空間でのモチーフの正確な位置を評価するために、本発明者は、I型PKSに由来するATのタンパク質配列と、E．コリ脂肪酸マロニル−CoA：ACPアシルトランスフェラーゼのその配列と比較し、このためには、高分解能X−線結晶構造が存在する（Serre, L. など., J. Biol. Chem. (1995) 270: 12961-12964）。それらのタンパク質間の配列類似性の全体レベルは低いが、基本的残基（及び特に、機械的重要な残基）は保存され、そしてアミノ酸の全体的な空間配置は保存されることが予測される。
【００５０】
多くのグループがモデルATとしてこの構造を使用し、そして構造の保存が配列保存のレベルよりも高いことは当業者において良く知られている。構造分析は、同定されたモチーフが、基質カルボキシレートの結合に関与し、そして結合された基質側鎖と相互作用するのにアシルトランスフェラーゼ部位に十分に接近して存在するが、活性部位セリン及びアルギニンの反対側の活性部位ポケット内に存在することを示した。モチーフに見出される不変のヒスチジンは、セリンヒドロラーゼに典型的に見出されるように、活性部位セリンとの触媒的三元体の一部であると思われる（Serreなど, 前記）。図３は、モデルAT構造におけるモチーフループ及び重要な活性部位の位置を示す。
【００５１】
広範囲には、本発明は、その基質的特異性が変更されるよう基質の選択を担当する４−残基配列又はモチーフを変えることによってATドメインを修飾することに関する。本発明者はまた、活性部位に接近する少数の他の残基を変更することができる。一般的に、変更された残基の合計数は、ATの残基の５％以下である。  モチーフは、図２に示されるような番号付けの、DEBSの第１モジュールのATドメインの残基334−337近くで見出されるYASHモチーフに対応する４−残基配列である。それは典型的には、GHS活性部位モチーフの80〜100個のアミノ酸、より特定には、90〜100個のアミノ酸の下流で開始する。
【００５２】
本発明の好ましい態様においては、所望する構造のポリケチドは、PKS上の存在するATモチーフの、他の連鎖延長剤又は開始剤単位の選択を担当するか、又は変更された程度の選択性（ほとんどの場合、高められた選択性）を担当する他のモチーフによる置換により生成される。これは、PKSクラスターをコードする１又は複数のモジュールにおいて行われ得る。１つのタイプの態様は、“天然においては”隣接するか、又は他方では、結合されたドメインである、２種の隣接するドメインを包含するPKSであり、ここでそれらのドメインの第１ドメインは、４−残基モチーフがその特異性を変えるために変更されているATドメイン（第２ドメインに基質をトランスファーするよう作用する）である。
【００５３】
１つの種類の態様においては、本発明は、PKS多酵素又はその一部、又はそれをコードする核酸（一般的にDNA）を提供し、前記多酵素又はその一部は、好ましくはマクロライド、ポリエーテル又はポリエンから選択されたポリケチドの生成のための、負荷モジュール及び多くの延長モジュールを含んで成り、ここで前記負荷又は延長モジュール、又は少なくともその１つは、任意に置換されたマロニル−CoA残基を負荷し、そしてそれをACP（好ましくは）にトランスファーするよう適合された、修飾されたATドメインを含む。
【００５４】
ATドメインは好ましくは、その基質特異性を変更するために修飾される。このATドメインは、活性部位に存在する少数のアミノ酸の修飾によってのみ、モジュールにおけるこの位置で天然において見出されるドメインとは異なることができる。この修飾は、YASH又はTAGHによる、モチーフ、特にHAFH（これだけには限定されない）のすべて又は一部の交換を含んで成り、又は逆もまた同じである。任意には、この配列の外部に存在するが、しかし好ましくは、AT活性部位に隣接して存在するアミノ酸の変更が行われる。
【００５５】
第２種類の態様は、１又は複数の修飾されたATドメイン、及び特にモチーフHAFH又はYASH又はTAGH（ここでそれらのモチーフは存在する天然のモチーフを置換する）を有するATドメイン（但し、それだけには限定されない）を組み込むPKS多面酵素を供給することによって、ポリケチド分子の周囲のいずれかの点で所望する延長単位を有するポリケチドの合成方法を提供する。任意には、この配列の外部に存在するが、しかし好ましくは、AT活性部位に隣接して存在するアミノ酸の変更が行われる。
【００５６】
第３種類の態様は、負荷モジュールにおける修飾されたATドメイン、及び特に（但し、それだけには限定されない）、モチーフHAFH又はYASH又はTAGH、又はプロリン残基を組み込むモチーフ（それらのモチーフは存在する天然のモチーフを置換する）を有するATドメインを組み込むPKS多酵素を供給することによって、所望する開始剤単位を有するポリケチドの合成方法を提供する。任意には、この配列の外部に存在するが、しかし好ましくは、AT活性部位に隣接して存在するアミノ酸の変更が行われる。優先的には、このATの後に、KSQドメインが存在するだろうが、しかし他の負荷システムは当業界において知られている（例えば、AT−ACP）。特許出願WO00/00500号は、既知の負荷システムのいくつかを記載する。負荷モジュールの修飾は、他の延長単位における類似する修飾と組み合され得る。
【００５７】
さらなる種類の態様は、配列HAFH、YASH又はTAGHにより、存在するハイブリッド又は他のタンパク質モチーフを置換することによって、天然の副生成物類似体を有さず、そして所望する連鎖延長剤又は負荷単位を有するポリケチドを合成する方法を提供する。エポチロン又はモネンシンPKS遺伝子クラスターにおいてこの変更を行うことが特に有用である。
【００５８】
さらなる観点においては、本発明は、変更された又はハイブリッドのモチーフ、特にHASH又はVAGH（但し、それらだけには限定されない）を有するATを組み込むPKS多酵素を供給することによって、混合された集団のポリケチドを合成するための方法を提供する。この方法の１つの特定の有用性は、化合物の結合ライブラリーの生成である。
【００５９】
さらなる観点においては、修飾されたATドメインを含むPKSは、WO98/01546号及びWO98/01571号、又はWO00/01827号又はWO00/00500号におけるように、生成されるハイブリッドPKSにスプライシングされ得る。天然のポリケチド、例えば14−員のマクロライドの新規誘導体を生成する遺伝子アセンブリーにそのような修飾されたPKSを連結することは特に有用である。
【００６０】
それらの観点及び種類の態様の１つは、ポリケチドシンターゼ多酵素をコードする核酸を供給し、そしてそれを、それが発現され得る生物中に導入することを包含する。適切なプラスミド及び宿主細胞は下記に記載される。そのようなにして生成されるポリケチドシンターゼ又はその一部は、その方法は通常、そのようにすることは好ましくはないが、通常の方法により宿主細胞から単離され得る。宿主細胞はまた、例えばエチルマロニルCoAを生成することによって、必要とされるアシルチオエステルを生成することができる。
【００６１】
所望しないアシルチオエステルの特に強い供給により株からPKSを除去するか、又は特定のアシルチオエステルの強い供給を有するよう特別に選択された株においてその変更されたPKSを発現するか、又は他方では、所望する生成物の発現を増強する培地又は増殖条件を開発することが好都合である。逆に言えば、そのような技法は、所望する場合、生成物の混合物の形成を促進するために使用され得る。培地における所望するアシルチオエステルに化学的前駆体を供給し、例えばジエチルエチルマロネート又はシクロブタンカルボン酸、等を供給することはまた有益であり得る。
【００６２】
宿主細胞はまた、例えばエリスロマイシン（図４に示されるような）及び他のポリケチドの生成において通常の生合成修飾のすべて又はいくらかを実施することによって、初期PKS生成物を修飾することができる。通常の経路のいくらか又はすべてが、例えば１又は複数の“天然の”ヒドロキシ基又はメチル基、又は糖基を有さない生成物を生成するために阻止されるよう、変異体生物を使用することができる。
【００６３】
本発明は、記載される正確なモチーフに制限されるべきではない。本発明者は、図２の調査又は類似する配列データの調査により決定され得るように、モチーフ内の、特に残基１での既知のいくらかの変動を記載している。しかしながら、他の修飾が認識され得；例えば、類似するサイズのチロシンによるマロニル−CoAモチーフにおけるフェニルアラニンの置換は同じ選択性をまだ示すことができる。同様に、エチルマロニル−CoA/他の連鎖延長剤組み込みを担当するモチーフに見出される小さな残基のグリシンの、例えばアラニン（但し、それのみには限定されないが）による置換が行われ得る。それらの及び他の類似する保存性置換が時折、同じ選択性を維持することは、当業者に良く知られている。同様に、メチルマロニル−CoAの組み込みのためのモチーフに見出されるセリン残基は、サイズ的に中間の及び/又は類似する荷電分布を示す残基により置換される。
【００６４】
本発明は、このモチーフにおいてのみ変化することに制限されるべきではない。ATドメインの周囲の他の残基の変更がまた、特異性又は触媒効率のレベルを高め、すなわち所望する生成物の割合又は量を高めるために必要とされ得る。それらの残基は、基質結合ポケットに選択的に接近する。それらの追加の変更のための必要条件は、所望する特定の内容物又は変化に依存するであろう。変更する特定の残基は、図２の調査又は他の類似する配列分析データにより、又は他方では、構造モデルの分析により容易に同定され得る。
【００６５】
モチーフの他に、変更され得る残基は、２種の種類に分割され得る。それらの残基のいくつかは、モチーフの特異性を予測するために使用されるモチーフにおいて、これまで同定されている（Haydockなど. (FEBS Lett. (1995) 375: 246-248)。それらの残基は、基質−結合ポケットに優先的に接近している。それらの残基は、記載される特定の例に制限されるべきではない。
【００６６】
I)変化する第１種類の可能性ある残基は、ポリペプチド鎖上のモチーフに接近する残基を包含する。特定の例は、マロニル−CoA特異的ATにおいては、この残基は一般的に、セリン（S）であり、すなわちこの点でのタンパク質配列は一般的にHAFHSであり、そしてメチルマロニル−CoA特異的ATにおいては、この残基はSであるが、しかしまた、例えばT, G又はCでもあり得る。従って、メチルマロニル−CoA特異的ATを、マロニル−CoA特異的ATに、標識モチーフを変えることによって変えるためには、モチーフのすぐ後の残基がSであることを確保することが有益である。この残基はポリペプチド鎖上のモチーフに接近するので、それは基質結合ポケットに接近して存在する。
【００６７】
II)第２種類の残基は、空間的にモチーフ又は活性部位に接近して存在する残基を包含する。それらの残基は、これまでに記載されたモデルAT構造、又は続いて誘導され得るもう１つのAT構造により最良に同定される。構造分子モデリング又は関連する技法を用いて、関連するタンパク質配列を、存在する構造中に導入することが可能であることは、当業者に知られている。他方では、アシルチオエステルは、活性部位中に形成され得る。それらは好ましい方法であるが、しかし参照点としての高く保存されたモチーフを用いての存在する構造の単純な調査が、適切な近似を付与する。
【００６８】
変更され得るモチーフに対して、空間的に接近する残基の特定の例は、GHS活性部位モチーフのすぐ後の残基である。メチルマロニル−CoA特異的ATにおいては、この残基は一般的に、グルタミン（Q）であり、すなわちこの点でのタンパク質配列はGHSQであり、そしてマロニル−CoA特異的ATにおいては、この残基は例えば、しばしばV, I又はLである。従って、標識モチーフを変えることによって、マロニル−CoA特異的ATをメチルマロニル−CoA特異的ATに変更するためには、GHSモチーフのすぐ後の残基がQであることを確保することが有益である。この残基は、活性部位セリンに接近して存在するので、それは基質−結合ポケット内に存在する。
【００６９】
変更され得る空間的に接近する残基のさらなる例は、GQGモチーフの３個の残基の下流に存在する残基である。メチルマロニル−CoA特異的ATにおいては、この残基は一般的に、トリプトファン（W）であり、すなわちこの点でのタンパク質配列はGQGXXWであり、そしてマロニル−CoA特異的ATにおいては、この残基は例えば、しばしばR, H又はTである。従って、標識モチーフを変えることによって、マロニル−CoA特異的ATをメチルマロニル−CoA特異的ATに変更するためには、GHSモチーフのすぐ後の残基がWであることを確保することが有益である。モデルAT構造の分析は、GQGモチーフが活性部位ポケットに接近して存在し、そして従って、このトリプトファンであることを示す。
【００７０】
変更され得る空間的に接近する残基のさらなる例は、アシルチオエステル基質のカルボキシレート基を安定化すると思われる、上記保存されたアルギニンから４個の残基の下流の残基である。マロニル−CoA特異的ATにおいては、Rの下流のこの残基は一般的に、メチオニン（M）であり、すなわちこの点でのタンパク質配列はRXXXMQであり、そしてメチルマロニル−CoA特異的ATにおいては、この残基は一般的に、I又はLであり、そしてエチルマロニル−CoA特異的ATにおいては、それはしばしば、Wである。従って、標識モチーフを変えることによって、メチルマロニル−CoA特異的ATをマロニル−CoA特異的ATに変更するためには、GHSモチーフのすぐ後の残基がメチオニンであることを確保することが有益である。モデルAT構造の分析は、この残基がが活性部位ポケットに接近して存在することを示す。
【００７１】
さらなる観点においては、本発明は、ベクター、例えば上記観点において定義されるような核酸を包含するプラスミド又はファージ（好ましくは、プラスミド）、及びそのような核酸又は構造体により形質転換された宿主細胞、特にサッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）又はストレプトミセス（Streptomyces）種を提供する。特に、核酸レベルで、ATドメインに対して所望する変更を達成するための複数の分子生物学的方法、例えば特定部位の突然変異誘発又は指図された進化の技法が存在することは、当業者に容易に明らかであろう。
【００７２】
適切なプラスミドベクター、及び変更されたATドメインを組み込むモジュールを有するPKS遺伝子の発現のために適切な遺伝子的に構築された細胞は、当業者により容易に企画されるか又は選択され得る。それらは、I型のハイブリッドPKS遺伝子の発現のために適切であるような、WO98/01546号に記載されるそれらを包含する。効果的な宿主の例は、次のものを包含する：
【００７３】
サッカロポリスポラ・エリトラエア（Saccharopolyspora erythraea）、ストレプトミセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、S．アベルミチリス（S．avermitilis）、S．グリセオフスカス（S．griseofuscus）、S．シンナモネンシス（S．cinnamonensis）、S．フラジアエ（S．fradiae）、S．ロンギスポロフラバス（S．longisporoflavus）、S．ヒグロスコピカス（S．hygroscopicus）、ミクロモノスポラ・グリセオルビダ（Micromonospora griseorubida）、S．ラサリエンシス（S．lasaliensis）、S．ベネズエラ（S．venezuelae）、S．アンチビオチカス（S．antibioticus）、S．リビダンス（S．lividans）、S．リモサス（S．rimosus）、S．アルバス（S．albus）、アミコラトピシス・ミジテラネイ（Amycolatopsis mediterranei）、及びS.ツクバエンシス（S．tsukubaensis）。
【００７４】
それらは、SCP2★−由来のプラスミドが自律的に複製することが知られている宿主、例えばS.コエリコロル、S.アベルミチリス、及びS．グリセオフスカス；及び他の宿主、例えばSCP2★−由来のプラスミドがプラスミド挿入体上の配列と染色体上の配列との間での相同組換えを通して染色体中に組み込まれるように成るサッカロポリスポラ・エリトラエア；及び自殺プラスミドベクターにより統合的に形質転換されるすべてのそのようなベクターを包含する。int配列を有するプラスミドは、宿主の染色体上の特異的結合部位中に組み込むであろう。
【００７５】
I型PKSからの比較できるATドメインをコードする核酸間の全体的な配列類似性は、十分に高く、そして異なったI型PKSのドメイン組織は異なったポリケチド−生成生物間で一致し、記載される新規ハイブリッドポリケチドを得るための方法は、すべての天然のモジュラーI型PKS又はそれらの誘導体に適用できることは、当業者に明らかである。
本発明は、現在、例示されるが、しかしいくつかの例により制限されるものではない。
【００７６】
それらの標準の１文字コードにより十分に定義されて来たアミノ酸は次の通りである：A−アラニン、R−アルギニン、N−アスパラギン、D−アスパラギン酸、C−システイン、Q−グルタミン、E−グルタミン酸、G−グリシン、H−ヒスチジン、I−イソロイシン、L−ロイシン、K−リシン、M−メチオニン、F−フェニルアラニン、P−プロリン、S−セリン、T−トレオニン、W−トリプトファン、Y−チロシン及びV−バリン。
【００７７】
実施例
例１．プラスミドpHP41の構成
プラスミドpHP41は、負荷モジュール、すなわちDEBS及び鎖終結チオエステラーゼの第１及び第２延長モジュールを含んで成るDEBS1 DKS遺伝子を含むpCJR24−基材のプラスミドである。第１モジュールのATドメインのモチーフYASHは、HAFHに変更されている。プラスミドpHP41を、次の通りにして、いくつかの中間体プラスミドにより構成した。プラスミドpD1AT2 (Oliynyk, M. など. Chem. Biol. (1996) 3: 833-839) を、NdeI及びXbaIにより消化した。約11kbpのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、そしてDNAをそのゲルから精製した。
【００７８】
このフラグメントを、NdeI及びXbaIによる消化により線状化され、そしてアルカリホスファターゼにより処理されたpCJR24（Rowe, C.J. など. Gene (1998) 216: 215-223） 中に連結した。連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10B細胞を形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドpCJR26について調べた。プラスミドpCJR26を制限パターンにより同定した。pCJR26により、E．コリ株ET12567（McNeil, D.J. など. Gene (1992) 111: 61-68）を形質転換し、そして個々のコロニーを一晩、増殖し、脱メチル化されたDNAを単離した。このDNAを、MscI及びAvrIIを用いて線状化し、そして約13kbのフラグメント（フラグメントA）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製した。
【００７９】
ヌクレオチド42104からヌクレオチド41542までに及ぶ、S．エリトラエアからのeryAI遺伝子（開始ヌクレオチド45368, 終結ヌクレオチド34734）のDNAセグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRにより増幅した：5’-TTTTTTTGGCCAGGGTTGGCAGTGGGCGGGCA-3’；及び5’-TTTTTACGGCCAGCCGCTTGGCGCGGAT-3’。pCJR24及びDEBS1 TE由来のpCJR65と称するプラスミドからのDNAを、鋳型として使用した。ヌクレオチド42105でMscIを導入されているプライマー、及び位置41546でBstXI部位を通して感作された第２プライマーの企画を行った。574bpのPCR生成物を、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてSmaIによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドPUC18に連結した。
【００８０】
連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10Bを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドpHP39の存在について調べた。プラスミドpHP39を、制限パターン及び配列分析により同定した。脱メチル化されたDNAを、プラスミドDNAによりE．コリ株ET12567を形質転換することにより生成した。得られるDNAを、MscI及びBstXIによる消化により線状化し、そしてその得られる552bpのフラグメント（フラグメントB）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製した。
【００８１】
ヌクレオチド41557からヌクレオチド41120に及ぶS．エリトラエアからのeryAI遺伝子のDNAセグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRにより増幅した：5’-CGGTGCCTAGGTGCACCGACTCCCAGTCC-3’及び5’-TTTTTCCAAGCGGCTGGCCGTGGACCACGCGTTCCACTCCTCGCACGTCGAGACGAT-3’。プラスミドpCJR65からのDNAを、鋳型として使用した。ヌクレオチド41125でAvrII部位を導入されているプライマー及びヌクレオチド41557でBstXI部位を通して感作された第２プライマーを企画し、そしてアミノ酸配列YASH〜HAFH（ヌクレオチド41537〜41526によりコードされる）を突然変異誘発した。442bpのPCR生成物を、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてSmaIによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドpUC18に連結した。
【００８２】
この連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10Bを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドpHP40の存在について調べた。プラスミドpHP40を、制限パターン及び配列分析により同定した。プラスミドpHP40を、制限酵素AvrII及びBstXIによる消化により線状化し、そして427bpのフラグメント（フラグメントC）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてそのゲルから精製した。フラグメントA, B及びCを、一緒に連結し、そして得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10Bを形質転換した。個々のクローンを、DEBS由来の挿入体の存在について調べた。得られるプラスミドを、pHP41と命名した。配列分析を用いて、クローンが正しいモチーフHAFHを含むことを確かめた。
【００８３】
例２．S．エリトラエアNRRL2338 JC2/pHP41の構成及びトリケチドの生成
S．エリトラエアNRRL2338 JC2は、TEの他に、eryAI, eryAII及びeryAIIIの欠失を含む（Rowe, C.J. など. Gene 216, 215-223）。プラスミドpHP41を、相同性領域としてTEを用いて、S．エリトラエアNRRL2338 JC2プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、40μg/mlのチオストレプトンを含むR2T20寒天上で選択した。S．エリトラエアNRRL2338 JC2 (pHP41) を、40μg/mlのチオストレプトンを含むSM3寒天（特許出願WO00/01827号を参照のこと）上にプレートし、そして30℃で11日間、増殖した。約1cm2の寒天を均質化し、そして1.2mlの酢酸エチル及び20μlの蟻酸の混合物により抽出した。
【００８４】
溶媒をデカントし、そして蒸発により除去し、そして残留物を、メタノールに溶解し、そしてGC/MSにより分析した。主用生成物を、標準（Oliynyk, M. など. Chem. Biol. (1996) 3:833-839）との比較により、トリケチドラクトン（2S, 3R, 5R）−２−メチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン（APP, すなわち、アセテート、アセテート、プロピオネート組み込み）、（2S, 3R, 5R）−２−メチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン（PAP）、（2R, 3R, 4S, 5R）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン−（PPP）及び（2R, 3S, 4S, 5R）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン（APP）として同定した。
【００８５】
それらの生成物を、正確な質量144、158、172及び158に対応するそれらのアンモニウムアダクトとして同定した。４種の生成物を、この株において、及び実験の条件下で、負荷モジュールは、アセテート及びプロピオネートの両者を負荷し、そして修飾されたATがマロニル−CoA及びメチルマロニル−Coaを負荷するので、生成した。３種のトリケチドラクトンピークのみが標準条件下でGC/MSスペクトルとして観察され、これは同等の質量のAPP及びPAP化合物の同時溶出によるものであった。イソクラチックグラジエントを用いて、このピークが２種の成分から構成されたことを確かめた。さらなる組みの実験においては、S．エリトレエアJC2（pHP41）を用いて、5μg/mlのチオストレプトンを含むTSB5mlを接種した。
【００８６】
３日間の増殖の後、この培養物1.5mlを用いて、250mlのフラスコ中、5μg/mlのチオストレプトンを含むSM3培地25mlを接種した。フラスコを、30℃、250rpmで６日間インキュベートした。この時点で、上清液を、蟻酸によりpH3に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をGC/MSにより分析した。個々の実験において、本発明者は、４種の生成物AAP, PAP, PPP及びAPPを同定したが、しかしその絶対比及び量は、たぶん、個々のフラスコ内の正確培地及び増殖条件に依存して、変化する（図６）。
【００８７】
例３．S．エリトラエアNRRL2338（pHP41）の構成及び12−デスメチルエリスロマイシンBを生成するためへのその使用
プラスミドpH41を用いて、S．エリトラエアNRRL2338プロトプラストを形質転換した。チオストレプトン耐性コロニーを、40μg/mlのチオストレプトンを含むR2T20寒天上で選択した。いくつかのクローンを、DIGラベルされたベクターDNAによるそれらのゲノムDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより、染色体中に組み込まれるpHP41の存在について試験した。正しく組み込まれたコピーのpHP41を有するクローンを、この手段で同定した。S．エリトラエアNRRL2338（pHP41）を用いて、5μg/mlのチオストレプトンを含むTSB5mlを接種した。
【００８８】
３日間の増殖の後、この培養物1.5mlを用いて、250mlのフラスコ中、5μg/mlのチオストレプトンを含む25mlのEryP培地（特許出願WO00/00500号）を接種した。フラスコを、30℃、250rpmで６日間インキュベートした。この時点で、上清液をアンモニアによりpH9.0に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をHPLC/MSにより分析した。分子質量m/z (M+H)＝704のピークが、エリスロマイシンA（M+H）＝734に対応するピークの他に、C-12デスメチルエリスロマイシンBのために必要とされることが観察された。部分的に処理されたエリスロマイシン中間体に対応する他のピークを同定することができた。
【００８９】
例４．プラスミドpHP048の構成
プラスミドpHP048は、負荷モジュール、すなわちDEBS1及び鎖終結チオエステラーゼの第１及び第２延長モジュールを含んで成るDEBS1 DKS遺伝子を含むpCJR24−基材のプラスミドである。第１モジュールのATドメインのモチーフYASHは、HASHに変更されている。プラスミドpHP048を、次の通りにして、いくつかの中間体プラスミドにより構成した。
【００９０】
ヌクレオチド41557からヌクレオチド41120に及ぶS．エリトラエアからのeryAI遺伝子のDNAセグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRにより増幅した：5’-CGGTGCCTAGGTGCACCGACTCCCAGTCC-3’及び5’-TTTTTCCAAGCGGCTGGCCGTGGACCACGCGTCGCACTCCTCGCACGTCGAGACGAT-3’。プラスミドpCJR65からのDNAを、鋳型として使用した。ヌクレオチド41125でAvrII部位を導入されているプライマー及びヌクレオチド41557でBstXI部位まで延長された第２プライマーを企画し、アミノ酸配列YASH（ヌクレオチド41537〜41526によりコードされる）〜HASHを突然変異誘発した。
【００９１】
442bpのPCR生成物を、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてSmaIによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドpUC18に連結した。この連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10Bを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドpHP022の存在について調べた。プラスミドpHP022を、制限パターン及び配列分析により同定した。
【００９２】
プラスミドpHP022を、制限酵素AvrII及びBstXIによる消化により線状化し、そしてフラグメント（フラグメントD）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてそのゲルから精製した。フラグメントDを、これまでに記載されるフラグメントA及びBにより連結し、そして得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10Bを形質転換した。個々のクローンを、DEBS1由来の挿入体の存在について調べた。得られるプラスミドを、pHP048と命名した。配列分析を用いて、クローンが正しいモチーフHASHを含むことを確かめた。
【００９３】
例５．S．エリトラエアNRRL2338 JC2 (pHP048)の構造及びトリケチドを生成するためへのその使用
S．エリトラエアNRRL2338 JC2は、TEの他に、eryAI, eryAII及びeryAIIIの欠失を含む（Rowe, C.J. など. Gene 216, 215-223）。プラスミドpHP048を、相同性領域としてTEを用いて、S．エリトラエアNRRL2338 JC2プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、40μg/mlのチオストレプトンを含むR2T20寒天上で選択した。S．エリトレエアJC2（pHP048）を用いて、5μg/mlのチオストレプトンを含むTSB5mlを接種した。３日間の増殖の後、この培養物1.5mlを用いて、250mlのフラスコ中、5μg/mlのチオストレプトンを含むSM3培地25mlを接種した。
【００９４】
フラスコを、30℃、250rpmで６日間インキュベートした。この時点で、上清液を、蟻酸によりpH3に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をGC/MSにより分析した。生成物の混合物を、例２に記載のようにして、APP, PAP, APP及びPPPトリケチドラクトンに応答するそれらのアンモニウムアダクトとして同定した。この実験においては、記載される培地/増殖条件下で、HASH変化を有するPKSは、生成される合計量のトリケチドラクトンにより判断される場合、HAFH変化よりも触媒的により活性であるが（例２）、しかしながら、この場合、修飾されたPKSは、AAP：PPPトリケチドラクトンの比により判断される場合、アセテートに対して低い選択性を示すように思える。
【００９５】
例６．プラスミドpHP47の構成
プラスミドpHP47は、負荷モジュール、すなわちDEBS1及び鎖終結チオエステラーゼの第１及び第２延長モジュールを含んで成るDEBS1 PKS遺伝子を含むpCJR24−基材のプラスミドである。第１モジュールのATドメインのモチーフYASHは、VAGHに変更されている。プラスミドpHP47を、次の通りにして、いくつかの中間体プラスミドにより構成した。
【００９６】
ヌクレオチド41557からヌクレオチド41120に及ぶS．エリトラエアからのeryAI遺伝子のDNAセグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRにより増幅した：5’-CGGTGCCTAGGTGCACCGACTCCCAGTCC-3’及び5’-TTTTTCCAAGCGGCTGGCCGTGGACGTCGCGGGGCACTCCTCGCACGTCGAGACGAT-3’。プラスミドpCJR65からのDNAを、鋳型として使用した。ヌクレオチド41125でAvrII部位を導入されているプライマー及びヌクレオチド41557でBstXI部位まで延長された第２プライマーを企画し、アミノ酸配列YASH（ヌクレオチド41537〜41526によりコードされる）〜VAGHを突然変異誘発した。442bpのPCR生成物を、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてSmaIによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドpUC18に連結した。
【００９７】
この連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10Bを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドpHP46の存在について調べた。プラスミドpHP46を、制限パターン及び配列分析により同定した。プラスミドpHP46を、制限酵素AvrII及びBstXIによる消化により線状化し、そしてそのフラグメント（フラグメントE）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてそのゲルから精製した。フラグメントEを、これまでに記載されるフラグメントA及びBを、一緒に連結し、そして得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10Bを形質転換した。個々のクローンを、DEBS由来の挿入体の存在について調べた。得られるプラスミドを、pHP47と命名した。配列分析を用いて、クローンが正しいモチーフVAGHを含むことを確かめた。
【００９８】
例７．プラスミドpLS007の構成
プラスミドpLS007は、細胞内のエチルマロニル−CoAのレベルに影響を及ぼすと思われるS．シンナモネンシスからのクロトニル−CoAレダクターゼ（CCR）遺伝子を含む。プラスミドpSG142 (Gaisserなど. Mol. Microbiol. (2000) 36: 391-401) は、actIプロモーターの制御下に遺伝子を配置し、そしてエリスロマイシン遺伝子クラスターの右側に、又は前もって形質転換された放線菌のactプロモーター領域に組み込むために使用され得る。次の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを、鋳型としてゲノムDNAを用いて、S．シンナモネンシスCCR遺伝子を増幅するために使用した：5’−GGCAAACATATGAAGGAAATCCTGGACGCG−3’及び5’−TCCGCGGATCCTCAGTGCGTTCAGATCAGTGC−3’。
【００９９】
クローニングを促進するためにNdeI及びBamHI制限部位を組み込まれたプライマーを企画した。1.4kbの生成物を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製し、そしてNdeI及びBglIIにより前もって消化されたpSG142により連結した。その得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10B細胞を形質転換した。プラスミドpLS003を、誤りが増幅の間、導入されていないことを確かにするために、制限分析及び配列決定により同定した。この公開された配列との不一致を同定した。しかしながら、他の公開されたCCRタンパク質配列との比較によるさらなる分析は、pLS003が正しかったことを示した。
【０１００】
プラスミドpLS003を、NdeI及びXbaIにより消化し、そして得られる4.5kbのフラグメント（フラグメントF）を、ゲル電気泳動により同定し、そしてゲルから精製した。このフラグメントを、NdeI部位の後ろのactI/actIIプロモーター領域を含むpKC1132の誘導体をpLSB2に連結した。プラスミドpLSB2を、NdeI及びXbaIにより消化し、そしてその得られる約４kbのフラグメント（フラグメントG）を、ゲル電気泳動により分離し、そしてそのゲルから精製した。フラグメントF及びGを一緒に連結し、そしてその得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10B細胞を形質転換した。プラスミドpLS007を、制限分析により同定した。
【０１０１】
例８．S．エリトラエアNRRL2338 JC2 (pHP47/pLS007) の構成及びトリケチドの生成へのその使用
S．エリトラエアNRRL2338 JC2は、TEの他に、eryAI, eryAII及びeryAIIIの欠失を含む（Rowe, C.J. など. Gene 216, 215-223）。プラスミドpHP47を、相同性領域としてTEを用いて、S．エリトラエアNRRL2338 JC2プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、40μg/mlのチオストレプトンを含むR2T20寒天上で選択した。
【０１０２】
PLS007を用いて、S．エリトラエアNRRL2338 JC2 (pHP47) のプロトプラストを形質転換し、チオストレプトン及びアプラマイシン耐性クローンを、40μg/mlのチオストレプトン及び50μg/mlのアプラマイシン並びに10mMの塩化マグネシウムを含むR2T20寒天上で選択し、そして耐性マーカーを、同じ構成物質を含む水道水培地上にプレートすることによって確かめた。S．エリトラエアNRRL2338 JC2 (pHP47/pLS007) を用いて、5μg/mlのチオストレプトン及び50μg/mlのアプラマイシンを含む5mlのTSBを接種した。
【０１０３】
３日間の増殖の後、この培養物1.5mlを用いて、250mlのフラスコ中、5μg/mlのチオストレプトン及び5μg/mlのアプラマイシンを含むSM3培地25mlを接種した。フラスコを、30℃、250rpmで６日間インキュベートした。この時点で、上清液を、蟻酸によりpH3に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をGC/MSにより分析した。この実験においては、トリケチド生成物の量は低かったが、しかし生成物の混合物は、正確な質量158、172及び186に対応するそれらのアンモニウムアダクトとして同定され得た。
【０１０４】
例９．S．エリトラエアNRRL2338（pHP47）の構成及びエリスロマイシンを生成するためへの使用
プラスミドpH47を用いて、S．エリトラエアNRRL2338プロトプラストを形質転換した。チオストレプトン耐性コロニーを、40μg/mlのチオストレプトンを含むR2T20寒天上で選択した。S．エリトラエアNRRL2338（pHP47）を用いて、5μg/mlのチオストレプトンを含むTSB5mlを接種した。３日間の増殖の後、この培養物1.5mlを用いて、250mlのフラスコ中、5μg/mlのチオストレプトンを含む25mlのEryP培地を接種した。フラスコを、30℃、250rpmで６日間インキュベートした。この時点で、上清液をアンモニアによりpH9.0に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をHPLC/MSにより分析した。エリスロマイシンAに対応する（M+H）＝734のピークが、観察された。
【０１０５】
例10．プラスミドpSGK051の構成
プラスミドpSGK051は、pPFL43−基材のプラスミドである（WO00／00500号）。負荷ドメインのATドメインのモチーフHAFHは、YASHに変更されていた。プラスミドpSGK051を、次の通りにして、いくつかの中間体プラスミドにより構成した。  プラスミドpPFL43を、制限酵素NcoI及びNotIによる消化により線状化し、そして858bpのフラグメント（フラグメントQ）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製した。
【０１０６】
ヌクレオチド16360−17366からのモネンシン負荷ドメインのDNAセグメント（図５及びPCT/GB00/02072号を参照のこと）を、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRにより増幅した：5’-GGGGACGCGGCCGCAAGGCCCACCACCTGAAGGTCAGCTACGCCTCCCACTCCCCGCACATGGACCCCAT-3’及び5’-GGCTAGCGGGTCCTCGTCCGTGCCGAGGTCA-3’。ヌクレオチド16367でNotI部位を通して増幅され、そしてヌクレオチド16398−16409でのアミノ酸配列HAFH〜YASHを変更されたプライマー、及びpPFL43における部位と同等のNheI部位を導入された第２プライマーを企画した。プラスミドpPFL43を鋳型として使用した。1006bpのPCR生成物を、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてSmaIによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドpUC18に連結した。
【０１０７】
この連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH10Bを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドpCSAT9の存在について調べた。プラスミドpCSAT9を、制限パターン及び配列分析により同定した。プラスミドpCSAT9を、制限酵素NotI及びNheIによる消化により線状化し、そして995bpのフラグメント（フラグメントR）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてそのゲルから精製した。
【０１０８】
プラスミドpPFL43を、NcoI及びNheIにより消化し、1.8kbのフラグメントを除去し、そして大きな方のフラグメント（フラグメントS）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製した。フラグメントQ、R及びSを一緒に連結し、そして得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントE．コリDH108を形質転換した。個々のクローンを、所望するプラスミドpSGK051について調べた。得られるプラスミドを、制限消化により分析し、そして配列決定し、正しいモチーフYASHの存在を確かめた。
【０１０９】
例11．S．エリトラエアNRRL2338 JC2/pSGK051の構成及びトリケチドの生成
プラスミドpSGK051を、相同性領域としてのTEを用いて、S．エリトラエアNRRL2338 J2プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、40μg/mlのチオストレプトンを含むR2T20寒天上で選択した。S．エリトラエアNRRL2338 JC2 (pSGK051) を、40μg/mlのチオストレプトンを含むR2T20寒天上にプレートし、そして30℃で11日間、増殖した。
【０１１０】
約1cm2の寒天を均質化し、そして1.2mlの酢酸エチル及び20μlの蟻酸の混合物により抽出した。溶媒をデカントし、そして蒸発により除去し、そして残留物をメタノールに溶解し、そしてGC/MSにより分析した。主要生成物を、標準との比較により、トリケチドラクトン（2S, 3R, 4S, 5R）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン及び（2S, 3R, 4S, 5R）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシ−ヘキサン酸δ−ラクトンとして同定した。
【０１１１】
例12．S．エリトラエアNRRL2338（pSGK051）の構成及びエリスロマイシンの生成へのその使用
プラスミドpSGK051を、S．エリトラエアNRRL2338 J2プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、40μg/mlのチオストレプトンを含むR2T20寒天上で選択した。S．エリトラエアNRRL2338 (pSGK051) を、40μg/mlのチオストレプトンを含むR2T20寒天上にプレートし、そして30℃で10日間、増殖した。
【０１１２】
約２cm2の寒天を均質化し、そして1.2mlの酢酸エチル及び20μlの蟻酸の混合物により抽出した。溶媒をデカントし、そして蒸発により除去し、そして残留物をHPLC/MSにより分析した。質量m/z (M+H)＝734及び720のピークが、たぶん、不完全なプロセッシングの生成物と共に、観察され得る。標準との比較は、生成される化合物がエリスロマイシンA及び13−メチルエリスロマイシンAであったことを証明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、６−デオキシエリスロノリドBシンターゼ（DEBS）、６−デオキシトロノリドBを生成するモジュラーPKS, エリスロマイシンAの前駆体の機能を示す図である。
【図２】  図２は、代表的なI型PKS遺伝子クラスターのATドメインのアミノ酸配列比較を与える。モチーフGQG, GHS及びLPTYは、アルギニン及び特異性を定義するような本発明において定義されるモチーフと共に、図の低部に印を付けられている。使用されるPKSを定義するために側部で使用される略語は次の通りである：ave: アベルメクチン、debs: エリスロマイシン、epo: エポチロン、sor: ソラフェン、fkb: FK506、rap: ラパマイシン、tyl: チロシン、mon: モネンシン、nid: ニダマイシン、nys: ナイスタチン、rif: リファマイシン。番号はモジュール番号を表す。表示の最後での文字ａはマロニル−CoA特異的ATを示し、文字pはメチルマロニル−CoA特異的ATを示し、そして文字ｂはエチルマロニル−CoA特異的ATを示す。異常な又は不明確なAT特異性を有するさらなる型のATは、文字xにより示される。考慮される配列の数により、50個のアミノ酸の個々のセクションは２ページに及ぶ。モネンシンATの配列は公開されていない。それらはPCT/GB00/02072号に詳しく記載されている。
【図３】  図３は、E.コリアシルトランスファーゼの活性部位の立体的表示である。本明細書に記載されるモチーフの空間的配置は矢印により示され、そして原子は太字で示される。
【図４】  図４は、サッカロポリスポラ・エリトラエアにおいて６−デオキシエリスロノリドBをエリスロマイシンAに転換する酵素的段階を示す。
【図５】  図５は、例８に使用される負荷ATをコードするモネンシンPKSからのDNA配列を示す。
【図１】
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【図２ｌ】
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【図２ｍ】
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【図２ｎ】
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【図２ｖ】
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【図２ａ】
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【図２ｊ】
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【図２ｋ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図２ｉ】
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【図２ｏ】
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【図２ｐ】
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【図２ｑ】
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【図２ｒ】
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【図２ｓ】
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【図２ｔ】
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【図２ｕ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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