(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ ハイオニューモニエによる感染に対してヒト以外の動物を免疫化するためのワクチン組成物であって、
免疫化量のマイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリン；
アクリル酸ポリマー、および代謝可能なオイルとポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーの混合物を含むアジュバント混合物；および、
医薬上許容されるキャリアを含み、単回投与後、６ヶ月の期間、該ヒト以外の動物にてマイコプラズマ ハイオニューモニエからの予防免疫性を誘発するところの組成物。
【請求項２】
アジュバント混合物が、アクリル酸ポリマーの、代謝可能なオイルとポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとの混合物に対する比率が１：２５〜１：５０である、アクリル酸ポリマーと、１またはそれ以上のテルペン炭化水素を含む代謝可能なオイルおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーの混合物とから成る、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項３】
アジュバント混合物が、ワクチン組成物の１−２５％ｖ／ｖを構成する、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項４】
アクリル酸ポリマーが、１％ｖ/ｖの最終濃度で存在し、およびテルペン炭化水素とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとの混合物が  ５％〜約１０％ｖ/ｖの最終濃度で存在する、請求項３記載のワクチン組成物。
【請求項５】
アジュバント混合物が、ワクチン組成物の２％〜１５％ｖ／ｖを構成する、請求項３記載のワクチン組成物。
【請求項６】
アジュバント混合物が、ワクチン組成物の５％〜１２％ｖ／ｖを構成する、請求項５記載のワクチン組成物。
【請求項７】
代謝可能なオイルがスクアランまたはスクアレンである、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項８】
アクリル酸ポリマーがカルボポルである、請求項６または請求項７記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ヘモフィラス パラサイス、パスツレラ マルトシダ、ストレプトコッカム サイス、アクチノバシラス プレウロニューモニエ、ボルデテラ ブロンキセプチカ、サルモネラ コレラおよびレプトスピラ細菌から成る群から選択される少なくとも一つのバクテリンをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
マイコプラズマ ハイオニューモニエにより引き起こされる疾患に対してブタ動物を保護する方法であって、
免疫化量のマイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリン；
アクリル酸ポリマーと、代謝可能なオイルおよびポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーの混合物とから成るアジュバント混合物；および、
医薬上許容されるキャリアから成るワクチン組成物を当該ブタ動物に投与することを含み、単回投与後、６ヶ月の期間、マイコプラズマ ハイオニューモニエ疾患に対して当該ブタ動物に予防免疫性を誘発するところの方法。
【請求項１１】
バクテリンの免疫化量が、１×１０８〜３×１０１１ＭＨＤＣＥ／ｍＬである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
バクテリンの免疫化量が、１×１０９〜３×１０９ＭＨＤＣＥ/ｍＬである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ワクチン組成物が、筋肉内、皮下、腹腔内、エアゾル、経口、または鼻腔内経路により投与される、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
アジュバント混合物が、１−２５％ｖ/ｖの最終濃度で存在している、アクリル酸ポリマーおよび１またはそれ以上のテルペン炭化水素から成る代謝可能なオイルとポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーの混合物から成る、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
アジュバント混合物のアクリル酸ポリマーがカルボポルである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
アジュバント混合物の代謝可能なオイルが、スクアレンおよびスクアランからなる群から選択されるテルペン炭化水素である、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
ヘモフィラス パラサイス、パスツレラ マルトシダ、ストレプトコッカム サイス、アクチノバシラス プレウロニューモニエ、ボルデテラ ブロンキセプチカ、サルモネラ コレラおよびレプトスピラ細菌から成る群から選択される少なくとも一つのさらなるバクテリンを同時投与することをさらに含む、請求項１０〜１６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、本明細書中に出典明示によりその全開示を組み込む、２０００年１２月１９日に出願された、同時に係属している仮出願出願番号６０/２５６，６３７号からの優先権を主張する。
本発明は、マイコプラズマ ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)に対する予防免疫性を誘導するための改良法であって、特に、マイコプラズマ ハイオニューモニエによる感染に対してレシピエント動物を単回投与にて免疫化するのに有効な量で、不活性化されたマイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリンを用いる方法に関する。
【０００２】
技術背景
マイコプラズマ ハイオニューモニエは、ブタのマイコプラズマ肺炎の病原体である。この疾患は、低下した体重増加および乏しい栄養効率のために養豚産業において経済的損失の重要な原因である。該疾患は、慢性のせき、くすんだヘアコート、発育遅延および数週間続く元気のない様子を引き起こす。特に腹部先端(ventral apical)および心臓葉(cardiac lobes)における硬化の紫色から灰色の特徴的な領域が感染した動物において認められる。該疾患はほとんど死亡を引き起こさないが、罹患したブタは、死亡またはストレスに帰する日和見感染の病原体による二次感染をしばしば被りやすい。経済的損失だけでも、一年で２億〜２億５千万ドルと見積もられている。
【０００３】
マイコプラズマ ハイオニューモニエは、細胞壁を欠く増殖の遅い、培養条件の面倒な細菌である。それは、同様に呼吸器に住みつく一般的な第二の病原体であるマイコプラズマ ヒヨリニス(Mycoplasma hyorhinis)のために、呼吸器から分離するのがしばしば困難である。疾患は、咳により生じるエアゾールにより、および罹患したもしくは回復期にあるキャリアブタから直接接触により蔓延する。感染した動物と感染していない動物が混在することで、早期のおよび頻繁な再感染を生じる。感染は、分娩期のキャリアの雌ブタによる子ブタの感染でしばしば始まる。群管理法により、感染は寿命の後のほうまで明らかにならない可能性がある。さらなる感染は、ブタが集中管理された場合に引き離された後にたいてい認められる。明白な疾患は６週齡またはそれ以上の齡のブタにおいて通常認められる。罹患した動物において、発育速度および栄養効率が懸著に低下する。抗生物質を用いる処置は値段がはり、かつ長期の使用を必要とする。再感染も問題である。感染およびその結果を防ぐために、ワクチンが現在最も有効な方法である。
【０００４】
フォート・ダッジ・アニマル・ヘルス（ＦＤＡＨ）は、マイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリンを、マイコプラズマ ハイオニューモニエにより引き起こされる臨床徴候から健康なブタを保護するためのワクチンとしての使用のために、Suvasyn(登録商標)Respifend(登録商標)MHの名称下に売買する。ワクチンは、アジュバントとしてカルボポル(Carbopol)を含み、および第１の予防接種の２〜３週後に第２の投与を行う、少なくとも１週齡のブタのための２回投与ワクチンとして推薦されている。しかし、２回投与ワクチンは、疾患に対して全保護を提供するために動物の第２の処置を要するという明らかな不都合がある。
【０００５】
それゆえ、ワクチンの単回投与の投与にて予防免疫性を誘導し、およびこの生物体により引き起こされる疾患を予防する、マイコプラズマ ハイオニューモニエに対する有効な予防接種を提供することが、本発明の目的である。
マイコプラズマ ハイオニューモニエにより引き起こされる感染および疾患に対するブタおける使用に適した、および他のバクテリンおよび／または類毒素と組み合わせて用いられてよいワクチン組成物を提供することが、本発明の別の目的である。
【０００６】
病原たる生物体がマイコプラズマ ハイオニューモニエである疾患の、ワクチンの単回投与の後で予防免疫性を誘発するようにバクテリンの免疫原性を高めるアジュバント処方を用いることによる予防または緩和法を提供することが、本発明のいっそうさらなる目的である。
本発明の他の目的および態様は、以下に示す詳細な説明から明らかとなろう。
【０００７】
本発明は、マイコプラズマ ハイオニューモニエによる感染に対して動物を免疫化するための、不活性化されたマイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリンの免疫化量；アクリル酸ポリマーおよび代謝可能なオイルならびにポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーの混合物を含むアジュバント混合物；および、医薬上許容されるキャリアを含むワクチン組成物であって、単回投与後に、マイコプラズマ ハイオニューモニエからの予防免疫性を誘発するワクチン組成物に関する。
【０００８】
更なる態様において、本発明により、マイコプラズマ ハイオニューモニエによる感染に対して動物を免疫化するための免疫原性組成物であって、不活性化されたマイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリンを前記アジュバント混合物、および医薬上許容される安定化剤、キャリア、または希釈剤と組み合わせて含む免疫原性組成物が提供される。アジュバントはたいてい、約１−２５％（ｖ／ｖ）、および好ましくは約５−１２％（ｖ／ｖ）の最終濃度でこのワクチン組成物中に存在する。組成物はさらに、１またはそれ以上の病原体、ヘモフィラス パラサイス(Haemonphilus parasuis)、パスツレラ マルチオシダ(Pasteurella multioida)、ストレプトコッカム サイス(Streptococcum suis)、アクチノバシラス プレウロニューモニエ(Actionobacillus pleuropneumoniae)、ボルデテラ ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、サルモネラ コレラ(Salmonella choleraesuis)およびレプトスピラなどからの不活性化されたバクテリンまたは精製類毒素を含む他のワクチン成分を含んでもよく、および筋肉内、皮下、経口、エアゾル、または鼻腔内経路により投与されてよい。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明により、マイコプラズマ ハイオニューモニエにより引き起こされる疾患に対して、不活性化されたマイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリンおよびアジュバント混合物を含む前記ワクチンの単回投与を投与することにより動物を予防する方法が提供される。
【００１０】
全特許、特許出願、および本明細書中に引用される他の文献は、本明細書中にその全容を出典明示により組み込む。矛盾する場合には、本開示が勝ることになる。
本明細書に用いるように、「バクテリン」は、不活性化された、および所定のアジュバントと組み合わせて、動物に投与された場合に、予防免疫性を誘発して疾患または感染から保護することができる細菌回収物である。
「アジュバント」は、ワクチン組成物において、マイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリンの免疫原性および効力を高める１またはそれ以上の物質から成る組成物を意味する。
【００１１】
本明細書および請求項に用いられているように、ＭＨＤＣＥなる用語は、マイコプラズマ ハイオニューモニエＤＮＡ細胞同等物を示す。
「免疫化量」は、マイコプラズマ ハイオニューモニエに対して免疫化を提供するバクテリンの量である。「免疫化量」は、種、品種、年齢、サイズ、健康状態、および動物が同じ生物体に対するワクチンをすでに受容しているかどうかに依存するであろう。
【００１２】
本発明により、単回投与免疫化に適した、マイコプラズマ ニューモニエに対するワクチンが提供される。本発明のワクチンは、バクテリンの免疫原性を高める、および予防免疫性を誘導する単回投与を提供するアジュバント混合物を含む。
ワクチンは、当該分野で常套である方法により、新たに回収した培養物から調製されてよい(例えば、米国特許第5,338,543号または米国特許第5,565,205号ならびに以下の実施例２を参照されたい）。つまり、生物体を、ＰＰＬＯ（プレウロニューモニエ様生物体）完全培地[Difco. Laboratories]などの培養培地中で増殖させてよい。生物体の増殖は、色調変化単位(color changing unit)(ＣＣＵ）を測定するなどの常套法によりモニターし、そして、有意に高い力価に達した時に回収する。処方のためにワクチン中に含ませる前に、常套法によりストックをさらに濃縮するかまたは凍結乾燥してよい。Thomas, et al., Agri-Practice, Vol. 7 No. 5, pp. 26-30に記載されているような他の方法を用いることができる。
【００１３】
本発明のワクチンは、アジュバント混合物および１またはそれ以上の医薬上許容されるキャリアと組み合わせた不活性化されたマイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリンを含む。使用に適したキャリアには、水性媒質、例えば、塩水、リン酸緩衝塩水、最小必須培地（ＭＥＭ）、またはＨＥＰＥＳバッファーを含むＭＥＭが含まれる。
【００１４】
本発明のワクチン組成物における使用のためのアジュバント混合物は免疫反応を高め、およびアクリル酸ポリマーの、代謝可能なオイル、例えば不飽和テルペン炭化水素またはその水素化生成物、好ましくはスクアラン（２，３，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサン）またはスクアレン、およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーの混合物との混合物から成る。そのようなアクリル酸ポリマーは、ホモポリマーまたはコポリマーであってよい。アクリル酸ポリマーは、好ましくはカーボマーである。カーボマーは、商品名カルボポル(Carbopol)の下に市場入手可能である。アクリル酸ポリマーは、例えば、その開示を出典明示により本明細書中に組み込む米国特許第2,909,462号および3,790,665号に記載されている。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、固体および液体成分の懸濁に役立つ界面活性剤、好ましくは液体界面活性剤である。界面活性剤は、ポリマーとして、商品名プルロニック（登録商標）の下に入手可能である。好ましい界面活性剤は、商品名プロロニック（登録商標）Ｌ１２１の下に市場入手可能なポロキサマー４０１である。
【００１５】
免疫原性刺激アジュバント混合物は、典型的には、約１％〜２５％、好ましくは約２％〜１５％、より好ましくは約５％〜１２％ｖ/ｖのｖ／ｖ量で、本発明のワクチン組成物中に存在する。アジュバント混合物の使用量およびアジュバントの２つの成分の割合は、他のバクテリンまたは精製類毒素の添加により変化してよい。アジュバント混合物は一般に、水性媒質中にエマルジョンとして処方された、代謝可能なオイル、アクリル酸ポリマー、およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む。
【００１６】
このアジュバント混合物において、代謝可能なオイルおよびアクリル酸ポリマーはそれぞれ、約１０〜１５０ｍｌ/Ｌおよび約０.５〜１０ｇ／Ｌの範囲の量で存在してよい。アジュバント混合物の好ましい具体例において、代謝可能なオイルおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー成分の混合物は、約５０〜１００ｍｌ／Ｌの量で存在していてよいスクアランおよびプルロニック（登録商標）Ｌ１２１（ポロキサマー４０１）の混合物であり、およびカルボキシメチレンポリマーは、約２ｍｌ/Ｌの量で存在していてよいカルボポル９３４Ｐ（カーバマー９３４Ｐ）である。典型的には、アジュバント混合物は、約１：２５〜１：５０のアクリル酸ポリマー：代謝可能なオイル/ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー混合物を含む。
【００１７】
好ましいアクリル酸ポリマーは、ポリアリルスクロースと架橋結合したアクリル酸のポリマーであり、および化学式（ＣＨ２ＣＨＯＯＯＨ）ｎを有するカルボポル９３４Ｐ ＮＦおよび９４１ＮＦなどの、B.F Goodrichにより売買されているものである。これらのポリマーは水性キャリアと適切に処方する水性ゲルを形成する。好ましいポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、Pluronic(登録商標)Ｌ１２１、Ｌ６１、Ｌ８１、またはＬ１０１としてＢＡＳＦにより売買されている非イオン性界面活性剤である。
【００１８】
本発明のワクチンは、筋肉内、皮下、鼻腔、腹腔、または経口経路により、好ましくは筋肉内または皮下経路により投与されてよい。
本発明のワクチンは、一般に、不活性化されたマイコプラズマ ハイオニューモニエ、代謝可能なオイル、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、およびアクリル酸ポリマーを水中油型エマルジョンの形態で含む。ワクチンは好ましくは、０.５〜１０ｇ／Ｌの範囲内の濃度でアクリル酸ポリマーを含む。ワクチンは、好ましくは２〜６ｍｌ／Ｌの範囲内の濃度で代謝可能なオイルを含む。ワクチンは好ましくは、１〜３ｍｌ／Ｌの範囲内の濃度でポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む。
【００１９】
単回投与のためには、ワクチンは好ましくは、約１×１０８〜３×１０１１ＭＨＤＣＥ／ｍＬ、好ましくは約１×１０９〜３×１０９ＭＨＤＣＥ／ｍＬに対応する量のマイコプラズマ ニューモニエバクテリンを含む。約１〜５ｍＬ、好ましくは２ｍＬを動物当たりに、筋肉内、皮下、または腹腔内投与してよい。１〜１０ｍＬ、好ましくは２〜５ｍＬを経口または鼻腔内投与してよい。
以下の実施例により、本発明を、その範囲を制限することなくさらに説明することを意図する。
【００２０】
実施例１
マイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリン
ワクチン組成物の調製
ウイルスストックに関する記載.  マイコプラズマ ハイオニューモニエは、かなり多数の容易に入手可能な源から得ることができる。一具体例において、マイコプラズマ ハイオニューモニエ株Ｐ−５７２２−３を用いてよい。培養物は、インディアナ州ウェストラファイエットにあるPurdue大学のC. Armstrong氏から得た。マイコプラズマ ハイオニューモニエ培養物を受け取った後、７回マイコプラズマ ハイオニューモニエブロスに通し、マスターシードを確立した。
【００２１】
細胞培養．  マイコプラズマ ハイオニューモニエをBacto PPLO粉末、酵母抽出物、グルコース、Ｌ−シスステインヒドロクロライド、アンピシリン、酢酸タリウム、フェノールレッド、泡止め剤、通常の無菌のブタ血清、および水を含んでいる培地中で１８−１４４時間増殖させた。不活性化のために、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）を発酵容器内の産生培養物に対して添加する。ｐＨを７.４へと調整し、次いで常套法に従い回収して、マイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリンを得る。
【００２２】
ワクチン組成物の調製
用いた保存剤の組成および割合．
回収したバクテリンをチメロサールおよびエチレンジアミネートテトラ−酢酸、テトラ−ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）のそれぞれわずか０.０１および０.０７％の添加により保存する。アンピシリンＵ.Ｓ.Ｐは、増殖培地中、０.２５０ｇ／ｌで存在する。残存アンピシリン濃度は、回収した液体の体積に依存して最終生成物において変化し、完成した生成物における残存アンピシリン濃度は３０μｇ／ｍｌを超えない。
【００２３】
製品の標準化.  マイコプラズマ濃度は、ＤＮＡ蛍光アッセイにより定量する。
１またはそれ以上のテルペン炭化水素を含む代謝可能なオイルおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーの混合物、例えばスクアラン／プロニックＬ１２１混合物を、１０ｇの塩化ナトリウム、０.２５ｇの塩化カリウム、２.７２ｇのリン酸ナトリウム二塩基酸、０.２５ｇのリン酸カリウム一塩基酸、２０ｍＬのプルロニックＬ１２１（ＢＡＳＦコーポレーション）、４０ｍＬのスクアラン（コダック）、３.２ｍＬのトゥイーン８０を１０００ｍｌに対して十分量の９００ｍＬの精製水中に溶解することにより調製する。混合後、成分をオートクレーブしてよい。混合物を次いで、適当なエマルジョンが形成されるまで均質化する。ホルマリンを０.２％の最終濃度まで添加してよく、またはチメロサールを１：１０，０００の最終濃度まで添加してよい。
【００２４】
シリアルを作製するためのユニットのアッセンブリー
十分量のマイコプラズマ ハイオニューモニエ濃縮物を、アジュバント、保存剤、および希釈剤と、アジテーターを備えた無菌容器中に無菌状態で合わせ、そして３０分ほど混合する。
【００２５】
【表１】
0005074656.tif 000002
【００２６】
最終容器の充填および封入に関する方法および技術
容器.  製品を無菌の２００-５００ミクロンのフィルターエレメントを通して粗濾過し、次いで９ＣＦＲ１１４.６中にて指定される条件下で、無菌最終容器中へ、充填操作のために指定された部屋の中で充填してよい。ガラス性またはプラスチック容器をゴム栓でふさぎ、そしてアルミニウム封印紙でしわをつけて封じる。各２.０ｍｌの投与製剤は、２×１０９ほどのマイコプラズマ ハイオニューモニエＤＮＡ細胞同等物を含む。
【００２７】
効能に関する試験.  完成された製品の大量の、もしくは最終的なサンプルを、以下のように効能に関して試験することができる。
効能試験のためのアッセイ法：６〜７週齡の、Harlan Sprague Dawleyまたは他のふさわしい供給業者からの委託販売のＩＣＲ雌マウスを用いる。最少２０匹が、それぞれ未知および引用のバクテリンでの免疫化のために必要である。最少５匹のマウスを非予防接種対照として確保する。試験および引用バクテリンは、別個に完全に混合する。５／８インチの針による２５ゲージで適合させた無菌の使い捨ての注射器を用いて、マウスを、宿主動物投与量の１０分の１（０.２ｍＬ）にて鼠蹊領域に皮下接種する。マウスの各グループを別個の単位として飼育し、１４日間、食餌および水を自由に摂ることができるようにする。各マウスを次いで麻酔する。麻酔したマウスを仰向けにする。一つの手で頭を押さえ、一つの前足を体から離して伸ばす。解剖用のメスを用いて、伸ばした前足と胸部の間に約１／２−インチの長さの皮膚切開をなし、腕の動脈を切断する。針のない３.０ｍＬの注射器を用いて、切開にて溜まる血液を集める。血液をラベルをつけた試験管に注ぎ、そして凝血させる。血餅が生じた管を１，０００×ｇにて遠心分離し、血餅から血清を分離する。個々の血清を−２０℃またはそれより低温で、試験まで貯蔵する。
【００２８】
血清学的試験：ＥＬＩＳＡ法を用いて、引用および／または未知のバクテリンに対するマウスの抗体反応を測定する。ＥＬＩＳＡ法を、Dynatechからの使い捨てImmulon II平底マイクロタイタープレートまたは同等物、およびＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて行う。
【００２９】
試験試薬：
【表２】
0005074656.tif 000003
【００３０】
【表３】
0005074656.tif 000004
【００３１】
陽性対照血清：陽性対照血清は、マイコプラズマ ハイオニューモニエバクテリンで予防接種したマウスからの血清を溜めたものである。
【００３２】
コンジュゲートおよび基質：
アフィニティ精製した抗−マウスＩｇＧペルオキシダーゼー標識コンジュゲートを、KirkegaardおよびPerry Laboratories, Inc.から得た（カタログ番号074-1802)。コンジュゲートの最適の希釈を決定するための方法を以下に示す。ペルオキシダーゼ基質溶液（ＡＢＴＳ）は、KirkegaardおよびPerry, Incから得る。
コンジュゲートの滴定：Immulon II平底プレートを、１０ｍＭのＧＢＳ中に希釈した、２０μｇ／ｍＬのマイコプラズマ ハイオニューモニエ完全細胞抗原で１００μｌ／ウェルにて覆う。プレートを１時間ほど３７℃+２℃にてインキュベートし、次いで１８時間ほどおよび１週間ほど２−７℃へと移す。使用前にプレートを、各洗浄の間に１分間の浸漬時間を取って、３回ＰＢＳＴにて洗浄し、次いで液を除いて乾燥させる。陽性対照血清のＰＢＳＴ中１：４０希釈物を調製し、次いで希釈した陽性血清（１００μL/ウェル）をプレート中のウェルの半分に添加する。ＰＢＳＴをウェルの残りの半分に添加する。プレートを１時間室温でインキュベートし、その後プレートを３回洗浄する。コンジュゲートした血清は、ＰＢＳＴで、１：１００希釈で始め、１：１０，２４０希釈で終える２倍連続希釈する。１００μｌの各コンジュゲート希釈物を陽性血清の４つのウェルおよびＰＢＳＴの４つのウェルに添加し、次いで１時間半室温にて反応させる。プレートを４回洗浄し、次いで１００μｌのペルオキシダーゼ基質溶液（ａｂｔｓ）をウェル当たりに添加する。プレートを、Ｔλ＝４５０の２波長設定にて読む。ＰＢＳＴ対照の値を陽性対照血清の値から差し引いた場合に陽性対照血清に関して０.８５０〜１.０５０の記録を示すコンジュゲートの希釈を選択する。
【００３３】
試験抗原：
マイコプラズマ ハイオニューモニエ抗原は、完全細胞調製物であり、フォート・ダッジアニマルヘルスにより供給される。
ＥＬＩＳＡを以下のように行う。Dynatech Immulon II平底マイクロタイタープレートを用いる。１バイアルの凍結乾燥したマイコプラズマ ハイオニューモニエ完全細胞抗原をグリシン緩衝塩水（ＧＢＳ）で１０ｍｌへと復元する。復元したマイコプラズマタンパク質の濃度は２０μｇ／ｍＬである。１００μｌ（２μｇ）の希釈抗原を次いでプレートの全ウェルに添加する。プレートを３７±２℃にて１時間ほどインキュベートし、次いで最短１８時間、および最長１週間２−７℃へ移す。プレートを、各洗浄の間に１分間浸漬して、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで液を除いて乾燥させる。血清をＰＢＳＴにて１：４０に希釈する。陽性対照血清を各プレートに関して４倍にて含める。ウェル当たりのサンプル容積は１００μｌである。シリアル試験血清サンプルおよび引用血清サンプルは、同じプレートにおいて２倍で試験する。プレートを１時間室温でインキュベートし、次いで３回ＰＢＳＴで洗浄する。ＰＢＳＴにて希釈した、１００μｌの抗−マウスＩｇＧペルオキシダーゼ−標識コンジュゲート（KirkegaardおよびPerry)を全ウェルに添加し、次いでウェルを３０分間室温にてインキュベートする。プレートを４回ＰＢＳＴで洗浄する。１００μｌのペルオキシダーゼ基質溶液（ＡＢＴＳ）を全ウェルに添加し、次いでプレートを、器械をＰＢＳＴ対照ウェルに対してブランクにする場合に陽性対照血清が０.８５０〜１.０５０のＯＤ４０５（４５０）に達するまでインキュベートする。プレートを記録し、次いでＰＢＳＴウェルに対してブランクをとる。有効な試験であるためには、引用バクテリンで接種したマウスの血清は０.５００の最小平均値を生じなければならず、および非ワクチン処置対照マウスの血清は、０.１００の最大平均値を超えてはならない。または、引用バクテリンで接種したマウスの血清の平均値と非予防接種対照マウスの血清の平均値の間の差は、０.４００より大きいか、それと等しくなければならない。
【００３４】
シリアル予防接種、引用予防接種、および対照に関する平均値を以下のように算定および評価する。十分と見なされるためには、試験バクテリンは引用と等しいかまたはそれより大きい平均の平均光学濃度値を示さなければならない。または、片側スチューデントＴ検定を用いて、試験バクテリンは引用バクテリンよりも有意に（ｐ＜０.０５信頼レベル）低い必要はない。１.６８６に等しいかまたはそれより大きい算定Ｔ値はいずれも引用および試験バクテリンの間の有意な差を示し、試験バクテリンが却下される原因となる。１．６８６未満の算定Ｔ値はいずれも、十分なシリアルを示す。製品の効能に関連しないいずれかの理由のために不十分であると、試験により決定されたあらゆる試験バクテリンを再試験し、そして、最初の試験は無効とみなす。
【００３５】
実施例２
試験ワクチン：
試験のためのワクチンは、１またはそれ以上のテルペン炭化水素を含む代謝可能なオイルおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーの５％の混合物（スクアラン/プルロニックＬ１２１混合物）をアジュバントとして、および０.２％のアクリル酸ポリマー（カルボポル）、および２×１０９のＭ.ハイオニューモニエＤＮＡ細胞同等物（ＭＨＤＣＥ）を１投与量当たりに用いて、実施例１に記載する方法に従い調製した。
【００３６】
実施例３
本試験は、３週齡における実施例２のワクチンの単回投与予防接種により誘導される、ブタにおける４ヶ月の免疫性持続（ＤＯＩ）を立証するために設計した。
２つの別個の動物試験を、本試験に関して行った。両試験の全ブタは予防接種の時点で血清陰性であり（抗体力価＜１０）、動物がマイコプラズマ ハイオニューモニエに罹患しやすいことを示した。対照群の全ブタは、攻撃前、ずっと血清陰性であった。これは、予防接種したブタにおける免疫反応がワクチンによるものであり、いずれの環境への暴露によるものでもなかったことを示す。
【００３７】
第１の試験では、実施例２のワクチンを、市場入手可能な製品、Boehringer Ingelheim (BI)により製造されたIngelvac M. hyo(登録商標)と共に用いて、高レベルの毒性Ｍ.ハイオニューモニエ（.４×１０６生物体）攻撃により評価した。１８-２１日齡の２２匹（２２）のブタを、実施例２のワクチンで筋肉内（ＩＭ）予防接種し、および８匹（８）のブタをIngelvac M. hyo(登録商標)[シリアル271032]で予防接種した。２２匹（２２）のブタを攻撃対照として、および１０匹のブタを非攻撃対照として用いた。予防接種および攻撃対照群のブタは、予防接種後４ヶ月で毒性のＭ.ハイオニューモニエで攻撃した。実施例２のワクチンで予防接種したブタは、１５.９％の平均の肺障害を有し、および攻撃対照ブタは１９.６％の平均の肺障害を有した。実施例２のワクチンで予防接種した群における平均の肺障害は、ブタをアイオワ州立大学(ISU)により推奨される投与量よりも高い投与量で攻撃したにもかからわず対照よりも少なかったが、しかし、差は有意ではなかった（ｐ＝０.１９）。同様に、市場入手可能な製品、Ingelvac M. hyo(登録商標)を、同じ投与量の攻撃を用いた動物の同じ群において評価した場合、肺障害の同様のレベルを認めた（１４.６％）。Ingelvac M. hyo(登録商標)予防接種群と対照群の間（ｐ＝０.２７）およびIngelvac M. hyo(登録商標)予防接種群と実施例２のワクチンで予防接種した群の間に有意な差はなかった。
【００３８】
第２の試験では、実施例２のワクチンを、予防接種後４ヶ月での、ISUにより示唆されるレベル（１.０×１０６生物体）での毒性Ｍ.ハイオニューモニエ攻撃により評価した。２３匹（２３）のブタを２１日齡にてワクチンの単回投与にて予防接種し、２５匹のブタを攻撃対照として、および７匹のブタを非攻撃対照として用いた。予防接種および攻撃対照群のブタは、予防接種後４ヶ月で、毒性のＭ.ハイオニューモニエで攻撃した。対照群は１０.４％の平均の肺障害を有し、および予防接種群は５.５％の平均の肺障害を有した。予防接種群と対照群の間には有意な差があった（ｐ＝０.０３１）。これは、実施例２のワクチンが、予防免疫性を刺激するのに効果的であり、これが、３週齡のブタにおける単回投与の予防接種後少なくとも４ヶ月持続し得ることを示す。
【００３９】
２つの試験における実施例２のワクチンに関連するデータを合わせ、そして分析した場合、予防接種群の平均の肺障害は、対照群のものよりも有意に少なかった。
結論として、実施例２のワクチンにより、３週齡のブタにおける単回投与の予防接種後４ヶ月での毒性のＭ.ハイオニューモニエ攻撃に対して予防免疫性が誘導される。
【００４０】
実験データ
２つの別個の試験を本試験において行った。試験１では、６７匹（６７）のブタを、マイクロソフトエクセル無作為化プログラムを用いて４つの群に割り当てた。２４匹（２４）のブタを実施例２に従い調製したワクチンの単回投与にて筋肉内（ＩＭ）にて１８-２１日齡にて予防接種した。２４匹（２４）のブタを攻撃対照として、および１０匹のブタを非攻撃対照として用いた。９匹のブタを市販の製品、Infelvac M.hyo(登録商標)、[シリアル271032、Boehringer Ingelheim (BI)により製造]で、ラベルの指示に従って、ＩＭにて予防接種した。５匹のブタ（実施例２のワクチンで予防接種した２匹のブタ、ＢＩワクチンで予防接種した１匹、および２匹の対照）は、予防接種に関係のない理由のために、予防接種維持期間中に死亡した。予防接種群および攻撃対照群の残るブタを１４ｍＬの毒性Ｍ.ハイオニューモニエ（１.４×１０６生物体）で、予防接種後４ヶ月で攻撃した。全４群のブタを攻撃後３０日で安楽死させ、そして、肺障害を、試験における各ブタに関してスコアした。
【００４１】
第２の試験では、２５匹（２５）のブタを、実施例２に従い調製したワクチンの単回投与にて、２１日齡にてＩＭ予防接種した。２５匹（２５）のブタを攻撃対照として用い、そして１０匹のブタを非攻撃対照として用いた。２匹のブタは、予防接種に関係のない理由のために死亡し、そして１匹のブタは予防接種維持期間中に誤って売却された。予防接種および攻撃対照群の残るブタを、１０ｍＬの毒性Ｍ.ハイオニューモニエ（１.０×１０６生物体）で、予防接種後４ヶ月にて攻撃した。２匹のブタは、予防接種/攻撃に関係のない理由のために、攻撃後の観察期間中に死亡した。全３群の中の残るブタを、攻撃後３０日で安楽死させ、そして肺障害を試験の各ブタに関してスコアした。
【００４２】
予防接種
予防接種群における各ブタに、試験ワクチンの単回２ｍｌ投与量を首の側面にてＩＭにて施した。
【００４３】
攻撃および死体解剖
毒性Ｍ.ハイオニューモニエ攻撃ストック、凍結（−７０℃）肺ホモジェネートは、アイオワ州立大学(ISU)からDr. Eileen Thacker氏により調製された。攻撃ストックは純粋であることが確認され、そして、ｍＬ当たり約１０７のＭ.ハイオニューモニエを含んだ。推奨される攻撃投与量は、１：１００希釈ストックの１０ｍｌ（即ち、１.０×１０６生物体）である。
【００４４】
第１試験における予防接種および攻撃対照群のブタは、１４ｍｌの１：１００期釈ストック（即ち、１.４×１０６生物体）で攻撃した。第２の試験のブタは、推奨されるように１０ｍｌの１：１００希釈ストック（即ち、１.０×１０６生物体）で攻撃した。
攻撃の日、ホモジェネートを温水下に迅速に溶解し、滅菌Ｍ.ハイオニューモニエ増殖培地を用いてＩＳＵによる推奨に従い希釈した。ブタに、５０ｍｇ/ｍＬのキシラジン、５０ｍｇ／ｍＬのケタミン、および１００ｍｇ／ｍＬのテラゾールから成るキシラジン−ケタミン−テラゾール（登録商標）の混合物を鎮静剤として飲ませた。麻酔薬の混合物は、ＩＭにて０.０１−０.０２ｍＬ／Ｉｂ体重にて与えた。各ブタに、攻撃物質の１４ｍＬ（第１試験）または１０ｍＬ（第２試験）の単回投与を気管内投与した。針の配置が正確であることを保証するために、空気を攻撃投与の投与前に注射器に引き入れた。非予防接種非攻撃対照ブタは別の部屋に維持し、そして攻撃しなかった。
攻撃後（ＤＰＣ）３０日にて、全ブタを安楽死させた。肺を取り出し、そして著しい肺障害を、試験群に関する知識を持たない個人によりスコアした。
【００４５】
サンプル収集および試験：
血液サンプルを予防接種日（０ＤＰＶ）、予防接種後１ヶ月（１ＭＰＶ）、４ＭＰＶ/０ＤＰＣ、および３０ＤＰＣにおいて、競合ＥＬＩＳＡキット（DAKO Co.により製造）により検出されるＭ.ハイオニューモニエに対する血清抗体のために、全ブタから収集した。血清サンプルは試験前、−２０℃にて貯蔵した。
【００４６】
データ分析：
肺障害スコアを、分散分析(ANOVA)により、予防接種群および非予防接種群の間で比較した。肺スコアを逆正弦変換して、残差の分布を改良した。
結果および論考
血清学：両試験の全ブタを、市販の競合ＥＬＩＳＡキットにより、１：１０の血清希釈を全試験に関して用いて、Ｍ.ハイオニューモニエに対する血清抗体に関して試験した。全ブタは予防接種の時点で血清陰性であり（抗体力価＜１０）、動物がＭ.ハイオニューモニエに罹患しやすいことを示した。対照群の全ブタは攻撃前ずっと血清陰性のままであった。これは、予防接種したブタにおける免疫化反応がワクチンによるものであり、およびいずれの環境の暴露にもよるものではないことを示す。予防接種群における全ブタおよび攻撃対照群のブタのほとんど（試験１の２２匹のブタの内の１８匹および試験２の２５匹のブタの内の１５匹）は攻撃後Ｍ.ハイオニューモニエに対して血清変換し、一方、全非攻撃動物は血清陰性をのままであった。これは、攻撃がＭ.ハイオニューモニエ特異的であったことを示す。試験動物の血清学的状態を、表１にまとめる。
【００４７】
第１試験における免疫原性試験
第１試験は、実施例２のワクチンが、予防接種後４ヶ月でのＩＳＵにより推奨されるよりも高レベルの攻撃に対して予防することができる強い免疫化を刺激することができるかどうかを決定するために行った。この試験は、実施例２のワクチンを市場入手可能なIngelvbac M. hyo(登録商標)と、予防接種後４ヶ月で予防免疫化を刺激するその能力に関して比較するものであった。
【００４８】
FDAH Suvaxyn MH-1で予防接種した２２匹のブタ、および認可された製品、Ingelvac M. hyo(登録商標)シリアル271,032で予防接種した８匹のブタを、ブタ当たり１.４×１０６生物体の攻撃物質（ブタ当たり１.０×１０６の生物体がＩＳＵにより推奨されている、セクション５.５を参照されたい）で攻撃した。２２匹のブタを攻撃対照として用い、および１０匹のブタを非攻撃対照として用いた。肺障害の割合を、表２にまとめる。実施例２のワクチンで予防接種したブタは、１５.９％の平均肺障害を有し、および攻撃対照ブタは１９.６％の平均肺障害を有した。実施例２のワクチンで予防接種した群における肺障害は、ブタを高投与量のＭ.ハイオニューモニエで攻撃した場合ですら、対照よりも少なかった。しかし、差は有意ではなかった（ｐ＝０.１９）。同様に、市場入手可能な製品、Ingelvac M. hyo(登録商標)を同じ投与量の攻撃を用いた動物の同じ群にて評価した場合、同様のレベルの肺障害を得た（１４.６％）。Ingelvac M.hyo(登録商標)予防接種群と対照群の間（ｐ＝０.２７）およびIngelvac M.hyo(登録商標)予防接種群と実施例２のワクチンで予防接種した群の間（ｐ＝０.８８）に有意な差はなかった。
【００４９】
実施例２のワクチンを受容している群において、障害の有意でない数値の低下が記録されたが、この試験で得られたデータは、この試験で用いた高攻撃投与量（１.４×１０６生物体）が、市販のIngelvac製品により刺激されたブタの免疫化に対してすら、おそらくは圧倒するものであったことを示す。この攻撃レベルは２０-２５匹の動物から成る群サイズを用いる予防接種／攻撃試験評価に関しては、より大きな群サイズを用いて有意性が判明される可能性はあるが、おそらくは適当でない。
【００５０】
第２試験における免疫原性試験
試験２における予防接種および攻撃対照群のブタは、ＩＳＵにより推奨される攻撃投与量（１.０×１０６生物体）にて、予防接種後４ヶ月にて評価し、４ヶ月のＤＯＩを立証した。肺の障害の割合を表３にまとめる。対照群は１０.４％の平均の肺障害を有した。予防接種群は５.５％の平均の肺障害を有した。予防接種群と対照群の間には優位な差があった（ｐ＝０.０３１）。これは、実施例２のワクチンが予防免疫性を刺激するのに効果的であり、予防免疫性が、３週齡のブタにおける単回投与の予防接種後、少なくとも４ヶ月持続し得ることを示す。
【００５１】
両試験を合わせた結果の評価
２つの試験が明らかに異なる一方で、群における試験の効果は有意ではなかった。群の効果の大きさは、２つの試験の間で同様であった。つまり、群の効果は試験を考慮せずに評価することができた。フルモデルの分析は群と試験の間の相互作用が有意ではないことを示したので、これは、群の効果が両試験において同じであったという見解を支持し、そして２つの試験からのデータの組み合わせを単一の分析とすることが正当化される。このようにして、２つの試験からの実施例２のワクチンに関係するデータを合わせ、そして肺の障害に関する逆正弦変換変数を、独立変数として群および試験を用いて分析した場合（縮約モデル）、該群は統計学的に有意である（ｐ＝０.０１３）。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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【００５４】
【表６】
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【００５５】
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【００５６】
実施例４
単回投与による投与の６ヶ月後の毒性攻撃に対する本発明のワクチン組成物により誘導される長期免疫性の評価
実施例１および２に記載する本質的に同じ方法を用いて、および以下に示す量を用いて、試験ワクチンＡを調製した。
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【００５７】
概要
３３匹の２１日齡のブタを本評価に加えた。２０匹のブタを３週齡にてワクチンＡの単回投与にて筋肉内にて（ＩＭ）予防接種した。１０匹のブタを非予防接種対照として、および３匹のブタを非予防接種環境対照として用いた。
全ブタは予防接種の時点で血清陰性であり（抗体力価＜１０）、動物が、Ｍ.ハイオニューモニエに罹患しやすいことを示した。対照群における全ブタは、攻撃前、ずっと血清陰性のままであった。これは、予防接種したブタにおける免疫化反応がワクチンによるものであり、いかなる環境への暴露によるものでもなかったことを示す。
【００５８】
予防接種の６ヶ月後、２０匹の予防接種ブタと１０匹の非予防接種対照ブタを、毒性Ｍ.ハイオニューモニエ（ブタ当たり１.０×１０６生物体）で攻撃した。３匹のブタを非攻撃対照として用いた。予防接種ブタは３.６％の平均の肺障害スコアを有し、および攻撃対照ブタは、１４.６％の平均の肺障害スコアを有した。予防接種群における肺障害は、対照におけるものよりも有意に少なかった（ｐ＝０.０２１５）。
本評価にて得られたデータは、試験ワクチンＡが、単回投与の予防接種の６ヶ月後の毒性Ｍ.ハイオニューモニエ攻撃に対して長期の予防免疫性を誘導したことを立証する。
【００５９】
実験設計
３３匹の２１日齡のブタを、マイコロソフトエクセル無作為化プログラムを乱雑に(by litter)用いて３つの群（予防接種群、攻撃対照群、および非攻撃環境対照群）に無作為に割り当てた。２０匹のブタを３週齡にて試験ワクチンＡの単回投与にて筋肉内に予防接種した。１０匹のブタを攻撃対照として、および３匹のブタを非攻撃環境対照として用いた。予防接種群および攻撃対照群のブタを、予防接種の６ヶ月後にブタ当たり１０ｍＬの毒性Ｍ.ハイオニューモニエ（１.０×１０６生物体）培養物で攻撃した。３匹の非予防接種ブタを、非攻撃対照として用いた。攻撃ブタおよび非攻撃対照ブタを、攻撃後２６日にて安楽死させ、そして肺障害を各ブタに関してスコアした。
予防接種群の各ブタには、首の側面にＩＭにて、単回２ｍＬの投与量の試験ワクチンを与えた。
【００６０】
攻撃および死体解剖
毒性Ｍ.ハイオニューモニエ攻撃ストック、凍結（＜−７０℃）肺ホモジェネートは、アイオワ州立大学（ISU)からDr. Eileen Thackerにより調製された。攻撃ストックは純粋であることが確認され、そして約１０７のＭ.ハイオニューモニエ生物体をｍＬ当たりに含んだ。
ブタを１：１００希釈のストック１０ｍＬ（即ち、約１.０×１０６生物体）で攻撃した。
攻撃の日、ホモジェネートを温水下で迅速に解凍し、そしてISUによる推奨に従い、滅菌Ｍ.ハイオニューモニエ増殖培地を用いて希釈した。ブタに、５０ｍｇ/ｍＬのキシラジン、５０ｍｇ／ｍＬのケタミン、および１００ｍｇ／ｍＬのテラゾールから成るキシラジン−ケタミン−テラゾール（登録商標）の混合物を鎮静剤として飲ませた。麻酔薬の混合物は、ＩＭにて０.０１−０.０２ｍＬ／Ｉｂ体重にて与えた。各ブタに攻撃物質の単回１０ｍＬ投与量（１.０×１０６生物体）を、気管内投与した。針の配置が正確であることを保証するために、攻撃投与の投与前に空気を注射器に引き入れた。非予防接種非攻撃対照ブタは別の部屋に維持し、そして攻撃はしなかった。
攻撃後（ＤＰＣ）２６日にて、全ブタを安楽死させた。肺を取り出し、そして著しい肺障害を、実施例３に記載するようにスコアした。
【００６１】
サンプルの収集および試験
血液サンプルを、予防接種の日（０ＤＰＶ）、３５ＤＰＶ、−１ＤＰＣ、および２６ＤＰＣにて、競合ＥＬＩＳＡキット（DAKO Co.により製造）により検出されるようなＭ.ハイオニューモニエに対する血清抗体の測定のために収集した。血清サンプルは、試験される前、＜−２０℃にて貯蔵した。
【００６２】
データ分析
肺障害スコアを、片側ANOVAにより、予防接種と対照の間で比較した。肺障害スコアを逆正弦変換して、残差の分布を改良した。肺障害スコアに関する正規性の仮定は疑わしかったので、肺障害スコアと逆正弦変換肺障害スコアを、Wilcoxon Rank Sum試験により分析した。有意なレベルはｐ＜０.０５に設定した。非パラメトリックなWilcoxon Rnak Sum試験からの結果を、報告のために用いた。
【００６３】
結果および論考
血清学
全ブタを、全試験の１：１０血清希釈を用いて、市販の競合ＥＬＩＳＡキットにより、Ｍ.ハイオニューモニエに対する血清抗体に関して試験した。疑わしい試験結果を有するサンプルは、キットの説明に従い、データ分析において陽性として扱う。全ブタは予防接種の時点で血清陰性であり（抗体力価＜１０）、動物がＭ.ハイオニューモニエに罹患しやすいことを示した。対照群における全ブタは攻撃前、ずっと血清陰性のままであった。予防接種後、２０匹の予防接種ブタの１５匹（１５/２０）が少なくとも一度、Ｍ.ハイオニューモニエに対して血清陽性となった（３５ＤＰＶおよび−１ＤＰＣにて収集されたサンプル）。これは、予防接種ブタにおける免疫化反応がワクチンによるものであり、いずれの環境への暴露によるものでもなかったことを示す。全予防接種ブタ、および攻撃対照群の１０匹のブタの内の４匹が、攻撃後、Ｍ.ハイオニューモニエに対して血清陽性となったが、全非攻撃動物は血清陰性のままであった。試験動物の血清学的状態を表４にまとめる。
【００６４】
肺障害スコア
試験ワクチンＡで予防接種した２０匹のブタおよび１０匹の非予防接種対照ブタを、予防接種の６ヶ月後に毒性Ｍ.ハイオニューモニエ（ブタ当たり１.０×１０６生物体）で攻撃した。３匹のブタを非攻撃対照として用いた。２０匹の予防接種ブタの内の８匹（４０％）が攻撃後に肺障害を進行させなかったが、対照群においては、１０匹のブタの内の１匹のみ（１０％）が肺障害を有しなかった。肺障害の割合を表５にまとめる。予防接種ブタは３.６％の平均の肺障害スコアを有し、および攻撃対照ブタは１４.６％の平均の肺障害スコアを有した。予防接種群における肺障害は、対照よりも有意に少なかった（ｐ＝０.０２１５）。
【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
表４および５にて示されるデータから認めることができるように、試験ワクチンＡは、３週齢にて予防接種されたブタにおいて、単回投与後６ヶ月間の毒性Ｍ.ハイオニューモニエ攻撃に対する予防免疫性を誘導する。