(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
0005038572.tif 000040
［式中、
Ｒ1は
1.飽和の直鎖状、分枝状、または不飽和の直鎖状、分枝状の２〜３０個の炭素原子を有する炭素鎖であり、この炭素鎖は場合により
1.1  −ＯＨ、
1.2  ＝Ｏ、
1.3  −Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは線状または分枝状である）、
1.4  −Ｏ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.5  −Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは線状または分枝状である）、
1.6  −アリール、
1.7  −Ｃ1〜Ｃ6−アルキルベンゼン、
1.8  −ジフェニル、
1.9  −ＮＨ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは線状または分枝状である）、
1.10  −ＮＨ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.11  −ＮＨ2、
1.12  ＝Ｓ、
1.13  −Ｓ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは線状または分枝状である）、
1.14  −Ｓ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.15  ハロゲン、
で一置換または二置換されており、
Ｒ2は
1.0  Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは非置換であるか、または1.1〜1.15に記載したように一置換または二置換されている）、
2.0  Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル（アルケニルは非置換であるか、または1.1〜1.15に記載したように一置換または二置換されている）、または
3.0  Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル（アルキニルは非置換であるか、または1.1〜1.15に記載したように一置換または二置換されている）であり、
Ｅはリン（Ｐ）または硫黄（Ｓ）原子であり、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は互いに独立して、
1.0  −Ｏ−、
2.0  −ＮＨ−、
3.0  −Ｎ＝、
4.0  −Ｓ−、または
5.0  −ＣＨ2−および−ＣＨＲ2である］
の化合物、その全ての立体化学的形態およびこれらの形態の任意な比率の混合物、またはその生理的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ1が飽和の直鎖状、分枝状、または不飽和の直鎖状、分枝状の１０〜１８個の炭素原子を有する炭素鎖であり、この炭素鎖が非置換であるか、または1.1〜1.15に記載したように一置換または二置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩。
【請求項３】
Ｒ1が
1.0   −(ＣＨ2)15ＣＨ3、
2.0   −(ＣＨ2)13ＣＨ(ＣＨ3)2、
3.0   −(ＣＨ2)11ＣＨ(ＯＨ)(ＣＨ2)3ＣＨ3、
4.0   −(ＣＨ2)11ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)2、
5.0   −(ＣＨ2)12ＣＨ(ＯＨ)(ＣＨ2)2ＣＨ3、
6.0   −(ＣＨ2)13ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ3、
7.0   −(ＣＨ2)14ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ3、
8.0   −(ＣＨ2)15ＣＨ2(ＯＨ)、
9.0   −(ＣＨ2)16ＣＨ3、
10.0  −(ＣＨ2)13Ｃ＝ＯＣＨ2ＣＨ3、
11.0  −(ＣＨ2)12Ｃ＝ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、
12.0  −(ＣＨ2)11Ｃ＝ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、
13.0  −(ＣＨ2)13ＣＨ3、
14.0  −(ＣＨ2)11ＣＨ(ＣＨ3)2、
15.0  −(ＣＨ2)14ＣＨ3または
16.0  −(ＣＨ2)12ＣＨ(ＣＨ3)2
であることを特徴とする、請求項１または２に記載の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩。
【請求項４】
Ｒ2がＣ1〜Ｃ6−アルキルであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩。
【請求項５】
Ｒ2が−ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3または−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3であることを特徴とする、請求項４に記載の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩。
【請求項６】
微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107，DSM 13381、またはその変種もしくは突然変異体の一つを、培地中で好適な条件下に、１種またはそれ以上の式Ｉの化合物が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いで該化合物を培地から単離し、場合により該化合物を化学的等価物または生理的に許容される塩に変換することにより製造しうる、請求項１〜５のいずれかに記載の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩。
【請求項７】
微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381、またはその変種もしくは突然変異体の一つを、培地中で好適な条件下に、１種またはそれ以上の式Ｉの化合物が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いで該化合物を培地から単離し、場合により該化合物を化学的等価物または生理的に許容される塩に変換することを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩の製造方法。
【請求項８】
発酵を好気性条件下に１８〜３５℃の温度およびｐＨ６〜８において行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
医薬として使用するための、請求項１〜６のいずれかに記載の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩。
【請求項１０】
リパーゼ阻害用の医薬として使用するための、請求項１〜６のいずれかに記載の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩。
【請求項１１】
抗糖尿病剤として使用するための、請求項１〜６のいずれかに記載の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の少なくとも１種の式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩を含む医薬調製物。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載の少なくとも１種の式Ｉの化合物またはその許容される塩を、好適な賦形剤および／または担体を用いて好適な投与形態にすることを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の医薬調製物の製造方法。
【請求項１４】
ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ストレプトマイセス属の種 HAG 004107 (DSM 13381) の培養により得られるシクリポスチン類と呼ばれる新規な化合物、およびその生理的に許容される塩および化学的等価物に関する。本発明はさらに、シクリポスチン類の製造方法、微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107 (DSM 13381)、シクリポスチン類およびその生理的に許容される塩および化学的等価物の、医薬として、特にリパーゼの阻害剤としての使用、およびシクリポスチン類またはその生理的に許容される塩または化学的等価物を含む医薬調製物に関する。
【０００２】
リパーゼ阻害剤で特に有利に処置できる疾患は糖疾患すなわち糖尿病である。糖尿病は慢性代謝異常のために上昇した血糖濃度を特徴とする状態である。この代謝異常はインスリン欠乏または低下したインスリン作用に基づいている。不足したインスリン作用は、血中に吸収されたグルコースを体細胞が利用するのを不完全にする。このため、またタンパク質からのグルコースの新生（糖新生）のために、血中グルコースレベルが上昇する。さらに、脂肪組織中でのインスリン作用が低下した場合に、グルカゴンのようなインスリン拮抗性ホルモンは上昇した脂肪分解、従って高まった血中脂肪酸濃度を生じさせる。ケトアシドーシス、すなわち増加したケトン体（酢酸、β−ヒドロキシ酪酸、アセトン）の形成が起こる。急性状態では、生化学的調節不全の程度は生命を脅かし、処置しないと糖尿病性昏睡に至り、最終的には急速な死に至る。糖尿病は最も頻発するヒトの慢性代謝異常であり、そして３％を超える人口までもが糖尿病性または前糖尿病性の素因を有するので、重大な脅威にさらされていると推測される。従って、糖尿病の処置または治癒のための薬剤が要求されている。
【０００３】
糖尿病はインスリンの投与により処置され、成人発症型糖尿病、いわゆるインスリン非依存型（NIDDM）またはII型の糖尿病では、スルホニル尿素が最初に投与される。スルホニル尿素の作用原理は、ホルモン欠乏またはインスリン抵抗性を補償するために膵臓のβ−細胞のインスリン分泌を急増させることである。しかしながら、状態が進行すると、インスリンも使用する必要がある。インスリンの作用は下記のようにまとめることができる。このペプチドホルモンは血中グルコース濃度を低下させ、そして同化作用過程の上昇と同時に異化作用過程の阻害を生じさせる：
・  それは体細胞中でのグルコース輸送を増加させ、
・  それは肝臓中および筋肉中でのグリコーゲン形成を増加させ、
・  それは脂肪分解を阻害し、
・  それは脂肪組織中への脂肪酸の吸収を増加させ、そして
・  それは体細胞中へのアミノ酸の吸収およびタンパク質合成を増加させる。
【０００４】
インスリンの最も強い効果の一つは脂肪分解を阻害することである。II型糖尿病の場合、この脂肪分解の調節はもはや有効でなく、そして血中遊離脂肪酸レベルの上昇が生じる。血中遊離脂肪酸は肝臓中での糖新生を刺激し、骨格筋中でのグルコースの利用を減少させる。脂肪分解、すなわち、いわゆるホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）（これは脂肪細胞中に存在しており、そしてリン酸化カスケードによってインスリンで阻害される）による脂肪酸の放出がコントロールされる。従ってインスリン作用を刺激し、そして血中脂質レベルを低下させることのできる阻害剤、すなわちＨＳＬの阻害剤が望ましいであろう。このような薬剤は、脂質代謝をコントロールするためにII型糖尿病を処置するのに適しているが、他の貯蔵障害に適用することも可能であろう。これらの理由で、ＨＳＬおよび他のリパーゼの新規な阻害剤が至急に必要であり、従って追求されている。
【０００５】
本発明者らは驚くべきことに、微生物株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 が、極めて低い濃度においてさえも、ホルモン感受性リパーゼを阻害する高度に活性な新規リパーゼ阻害剤を形成しうることを見出した。これらの新規な天然化合物は、二重環系（二環）および置換された炭素鎖からなり、そしてリパーゼを特異的に阻害する有機リン酸エステルである。この環構造は、R. Neumann & H. H. Peter により Experientia, 第43巻, 1235-1237頁, 1987 にアセチルコリンエステラーゼ阻害剤 CGA 134 736 として―炭素鎖の代わりにメチル基だけを有する―最初に記載され、そしてのちにシクロポスチンと命名された同じ化合物が T. Kurokawa らにより J. Antibiotics, 46, 1315-1318，1993  に記載された。この構造的に関連する化合物は選択的リパーゼ阻害特性を有しない。これまで公知の物質は、不満足な作用レベル、高い毒性および／または望ましくない副作用として示される欠点を有する。
【０００６】
従って本発明は、式Ｉ
【化２】
0005038572.tif 000002
［式中、
Ｒ1は
1.    直鎖状、分枝状、飽和または不飽和の炭素環式またはヘテロ環式であってもよい２〜３０個の炭素原子を有する炭素鎖であり、この炭素鎖は場合により
1.1   −ＯＨ、
1.2   ＝Ｏ、
1.3   −Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは線状または分枝状である）、
1.4   −Ｏ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.5   −Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは線状または分枝状である）、
1.6   −アリール、
1.7   −Ｃ1〜Ｃ6−アルキルベンゼン、
1.8   −ジフェニル、
1.9   −ＮＨ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは線状または分枝状である）、
【０００７】
1.10  −ＮＨ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.11  −ＮＨ2、
1.12  ＝Ｓ、
1.13  −Ｓ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは線状または分枝状である）、
1.14  −Ｓ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.15  ハロゲン、
で一置換または二置換されており、
ここで、置換基 1.1〜1.15 もさらに置換されていてもよく、または
2.    −[−アリール−(ＣＨ2)n]m（ −[−アリール−(ＣＨ2)n]m は非置換であるか、または 1.1〜1.15 に記載したように一置換または二置換されており、ｎおよびｍは互いに独立して、０、１、２または３の整数である）であり；
【０００８】
Ｒ2は
1.  Ｃ1〜Ｃ6−アルキル（アルキルは非置換であるか、または 1.1〜1.15 に記載したように一置換または二置換されている）、
2.  Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル（アルケニルは非置換であるか、または 1.1〜1.15 に記載したように一置換または二置換されている）、または
3.  Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル（アルキニルは非置換であるか、または 1.1〜1.15 に記載したように一置換または二置換されている）であり、
Ｅはリン（Ｐ）または硫黄（Ｓ）原子であり、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は互いに独立して、
1.  −Ｏ−、
2.  −ＮＨ−、
3.  −Ｎ＝、
4.  −Ｓ−、または
5.  −ＣＨ2−、および−ＣＨＲ2である］
の化合物、それらの全ての立体化学的形態およびこれらの形態の任意の比率の混合物、およびそれらの生理的に許容される塩および化学的等価物に関する。
【０００９】
Ｒ1は好ましくは６〜２４個の炭素原子、極めて好ましくは１０〜１８個の炭素原子の鎖長を有する。この鎖は、飽和、例えば−アルキル（アルキルは線状でも分枝状でもよい）、または不飽和、例えば−アルケニルまたは−アルキニル（アルケニルまたはアルキニルは線状でも分枝状でもよい）であってよい。Ｒ1は非置換であるか、または上記のように基 1.1〜1.15 で同様または別様に一置換または二置換されていてもよい。炭素原子８′〜１６′上の置換基が好ましく、１０′〜１４′位が特に好ましい。置換基 1.1〜1.15 も、さらにアルコール、アルデヒド、アセタール、ケタール、エーテル、カルボキシル、エステル、アミノ、ニトリル、ニトロ、オキシム、オキシエーテルおよびハロゲンから選択される１個またはそれ以上の基で置換されていてもよい。
【００１０】
２〜３０個の炭素原子を有するカルボン酸炭素鎖は、１個またはそれ以上、好ましくは１個、２個または３個の環系を有する２〜３０個の炭素原子を有する鎖であり、これは好ましくはそれぞれの場合に４個、５個、６個または７個の炭素原子からなる。この環は単環式、二環式または三環式、好ましくは単環式であってよく、そして炭素鎖の最初、中央および／または末端に位置していてよい。炭素環は脂肪族または芳香族の性質のものであってよい。その例は：置換されたジフェニルまたはアルキルベンゼンである。
【００１１】
２〜３０個の炭素原子を有するヘテロ環式炭素鎖は、少なくとも１個の炭素原子がＯ、ＳまたはＮのようなヘテロ原子で置き換えられた１個またはそれ以上、好ましくは１〜３個の環系を有する２〜３０個の炭素原子からなる鎖である。これらの環は単環式、二環式または三環式、好ましくは単環式であってよく、そして炭素鎖の最初、中央および／または末端に存在していてよい。これらは好ましくは４員、５員、６員または７員の環であってよく、これらの環は脂肪族または芳香族の性質のものである。その例は：置換されているかまたは非置換のアルキルピペリジンである。
【００１２】
アリールは、６〜１４個、好ましくは６〜１０個の炭素原子を有する芳香族の環または環系、例えば場合により置換されたアルキルフェノールまたはアルキルナフトールである。
ハロゲンは塩素、臭素、フッ素またはプゾイドハライド、例えばシアニド（ニトリル）である。
【００１３】
−Ｃ1〜Ｃ6−アルキルは、１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状のアルキル、例えばメチル、エチル、i−プロピル、tert−ブチルおよびヘキシルである。
−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニルは、２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状のアルケニル、例えばアリル、クロチルおよびペンテニルである。
−Ｃ2〜Ｃ6−アルキニルは、２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状のアルキニル、例えばプロピニル、ブチニルおよびペンチニルである。
【００１４】
Ｒ1は好ましくは
1.   −(ＣＨ2)15ＣＨ3、
2.   −(ＣＨ2)13ＣＨ(ＣＨ3)2、
3.   −(ＣＨ2)11ＣＨ(ＯＨ)(ＣＨ2)3ＣＨ3、
4.   −(ＣＨ2)11ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)2、
5.   −(ＣＨ2)12ＣＨ(ＯＨ)(ＣＨ2)2ＣＨ3、
6.   −(ＣＨ2)13ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ3、
7.   −(ＣＨ2)14ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ3、
8.   −(ＣＨ2)15ＣＨ2(ＯＨ)、
9.   −(ＣＨ2)16ＣＨ3、または
10.0  −(ＣＨ2)13Ｃ＝ＯＣＨ2ＣＨ3、
11.0  −(ＣＨ2)12Ｃ＝ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、
12.0  −(ＣＨ2)11Ｃ＝ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、
13.0  −(ＣＨ2)13ＣＨ3、
14.0  −(ＣＨ2)11ＣＨ(ＣＨ3)2、
15.0  −(ＣＨ2)14ＣＨ3または
16.0  −(ＣＨ2)12ＣＨ(ＣＨ3)2
である。
Ｒ2は好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルキル、特にメチル、エチルまたはプロピルである。
【００１５】
本発明の好ましい化合物を以下に示す：
式IIのシクリポスチンＡ：
【化３】
0005038572.tif 000003
【００１６】
式IIAのシクリポスチンＡ２：
【化４】
0005038572.tif 000004
【００１７】
式IIIのシクリポスチンＢ：
【化５】
0005038572.tif 000005
【００１８】
式IVのシクリポスチンＣ：
【化６】
0005038572.tif 000006
【００１９】
式ＶのシクリポスチンＤ：
【化７】
0005038572.tif 000007
【００２０】
式VIのシクリポスチンＥ：
【化８】
0005038572.tif 000008
【００２１】
式VIIのシクリポスチンＦ：
【化９】
0005038572.tif 000009
【００２２】
式VIIIのシクリポスチンＧ：
【化１０】
0005038572.tif 000010
【００２３】
式IXのシクリポスチンＨ：
【化１１】
0005038572.tif 000011
【００２４】
式ＸのシクリポスチンＮ：
【化１２】
0005038572.tif 000012
【００２５】
式XIのシクリポスチンＰ：
【化１３】
0005038572.tif 000013
【００２６】
式XIAのシクリポスチンＰ２：
【化１４】
0005038572.tif 000014
【００２７】
式XIIのシクリポスチンＱ：
【化１５】
0005038572.tif 000015
【００２８】
式XIIIのシクリポスチンＲ：
【化１６】
0005038572.tif 000016
【００２９】
式XIIIAのシクリポスチンＲ２：
【化１７】
0005038572.tif 000017
【００３０】
式XIVのシクリポスチンＳ：
【化１８】
0005038572.tif 000018
【００３１】
式XVのシクリポスチンＴ：
【化１９】
0005038572.tif 000019
【００３２】
式XVAのシクリポスチンＴ２：
【化２０】
0005038572.tif 000020
それらの全ての立体化学的形態およびこれらの形態の任意の比率の混合物、およびそれらの生理的に許容される塩および化学的等価物。
【００３３】
上記の式においてＮＭＲスペクトルのための炭素原子の番号付けの方法は下記のとおりである：
【化２１】
0005038572.tif 000021
【００３４】
環系はそれ自体で２個の不斉置換された原子、すなわち炭素原子３およびリン原子を有する。両方の原子はＲまたはＳ立体配置で存在することができる。驚くべきことに、菌株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 は、それぞれの場合に式Ｉの化合物の多数の立体異性体を形成できること、すなわちこの菌株は、原子Ｃ３およびＰが互いに独立して、ＲまたはＳ立体配置をとることのできる化合物を合成できることが見出された。炭素（３）においてＲ立体配置にあり、そしてリンにおいてＳ立体配置にある空間的形態を有する異性体は、ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の培養物中に増加した量で生成する。式ＩＡ：
【化２２】
0005038572.tif 000022
しかしながら、加えて、他の立体配置、例えば（Ｒ,Ｒ）、（Ｓ,Ｓ）または（Ｓ,Ｒ）を有するシクリポスチン類も形成され、これらも驚くべきことに著しいリパーゼ阻害作用を有する。
【００３５】
式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩または化学的等価物は、微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107，DSM 13381、またはその変種または突然変異体の一つを、培地中で好適な条件下に、１種またはそれ以上の式Ｉの化合物が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いで該化合物を培地から単離し、場合により該化合物を化学的等価物または生理的に許容される塩に変換することにより製造することができる。
【００３６】
本発明に係るシクリポスチン類は放線菌目の種、好ましくはストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 により生成させることができる。ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 はアイボリー色の菌糸体（RAL 1014）を有し、そしてストレプトマイセス科に特有の分生胞子柄を特徴とする。
【００３７】
単離物は、ブダペスト条約の規則に従って Deutsche Samlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D 38124 Braunschweig, Germany に、2000年３月16日に次の番号で寄託された：ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381。
【００３８】
菌株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の代わりに、本発明に係るシクリポスチン類の１種またはそれ以上の化合物を合成するその突然変異体および変種を用いることもできる。このような突然変異体は本来公知の方法で、例えば物理的手段、例えば紫外線またはＸ線での照射によるか、または化学的突然変異誘発物質、例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−ベンゾフェノン（ＭＯＢ）または Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）により生成させることができる。
【００３９】
従って本発明は、微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381、またはその変種または突然変異体の一つを、培地中で好適な条件下に、１種またはそれ以上の式Ｉの化合物が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いで該化合物を培地から単離し、場合により該化合物を化学的等価物または生理的に許容される塩に変換することを含むことを特徴する、式Ｉの化合物またはその生理的に許容される塩の製造方法に関する。
【００４０】
好ましくは、菌株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381、その突然変異体および／または変種を、炭素源および窒素源および慣用の無機塩を含む栄養溶液（培地とも呼ばれる）中で、新規シクリポスチン類が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いでこれらのシクリポスチン類を培地から単離し、場合により個々の活性成分に分離する。
【００４１】
発酵は好ましくは好気性条件で行われ；発酵は１８〜３５℃の温度およびｐＨ６〜８において特に良好に進行する。
本発明に係る方法は、実験室的規模（ミリリットルからリットルの範囲）および工業的規模（立方メートル規模）での発酵に用いることができる。全てのパーセントは、別に述べない限り重量に関する。液体の場合の混合比は、他の詳細が与えられていなければ体積に関する。
【００４２】
好気性発酵に適する好ましい炭素源は、同化可能な炭水化物および糖アルコール、例えばグルコース、ラクトース、スクロースまたはＤ−マンニトール、および炭水化物含有天然産物、例えばオートフレーク、ダイズ粉および麦芽エキスである。可能な窒素含有栄養物は：アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質、およびそれらの分解生成物、例えばペプトンまたはトリプトン、さらに肉エキス、酵母エキス、粉砕種子、例えばトウモロコシ、小麦、マメ、ダイズまたはワタの粉砕種子、アルコール製造、肉ミールまたは酵母エキスの蒸留残留物であるが、アンモニウム塩および硝酸塩でもある。栄養溶液が含有しうる無機塩は、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩である。
【００４３】
本発明に係る式II〜XVAのシクリポスチン類の形成は、約０.１〜５％、好ましくは０.３〜３％のオートフレークおよび微量元素を含有する培地中で特に良好に進行する。パーセントの詳細は、それぞれの場合に培地全体の重量に対する。
式VIII〜XVAのシクリポスチン類の好ましい形成は、約０.１〜５％、好ましくは０.３〜２％のグリセロール、および０.２〜５％、好ましくは０.５〜３％のダイズミール、および０.０５〜１.０ｇ／Ｌ、好ましくは０.１〜１.０ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含有する栄養溶液中で特に容易に行うことができる。
【００４４】
培地中でストレプトマイセス属の種 HAG 004107，DSM 13381 はシクリポスチン類の混合物を形成する。培地の組成に応じて、本発明に係るシクリポスチン類の１種またはそれ以上の定量的な量を変動させることができる。さらに、培地組成により、シクリポスチン類の１種またはその代わりに数種が全く製造されないように、または微生物の検出限界より低い量で製造されるように、個々のシクリポスチン類の合成をコントロールすることが可能である。
培養物は好ましくは検出可能なシクリポスチンを含有する。シクリポスチンＡまたはＰまたはＰ２が好ましく形成される。
【００４５】
シクリポスチンＡ〜Ｔ２（式II〜XVA の化合物）に加えて、他の関連する化合物がストレプトマイセス属の種 HAG 004107，DSM 13381 の培地中で形成され、これらは変更された基Ｒ1およびＲ2によって式II〜XVAで示す化合物とは異なっている。トランケートされている（truncated）か、またはさらに分枝した基Ｒ1を有するシクリポスチン類が、より少ない量で検出された。これらの二次成分の酸化（ヒドロキシル化）生成物も、ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の培養物中に検出できる。
【００４６】
微生物の培養は好気性で、すなわち例えば振盪フラスコまたは発酵槽中で浸漬して振盪または撹拌しながら、適切ならば空気または酸素を導入して行われる。培養は約１８〜３５℃、好ましくは約２５〜３２℃、特に２６〜３０℃の温度範囲内で行われる。ｐＨ範囲は６〜８、好ましくは６.５〜７.８であるべきである。微生物をこれらの条件下で、一般的に２４〜３００時間、好ましくは３０〜９０時間の期間培養する。
【００４７】
有利には、培養は多数の段階で行われ、すなわち最初に液体培地中で一つまたはそれ以上の前培養物を製造し、これを次いで実際の製造培地、主培地中に例えば１：１０の体積比で接種する。前培養物は、例えば、菌糸体を栄養溶液中に接種し、これを約３６〜１２０時間、好ましくは４８〜９６時間成長させることにより得られる。菌糸体は、例えば菌株を固体または液体栄養培地、例えば麦芽／酵母／寒天培地またはオートフレーク／寒天培地で約３〜４０日間、好ましくは４〜１０日間成長させることにより得ることができる。
【００４８】
発酵の経過は、培養物のｐＨまたは菌糸体の体積により、そしてクロマトグラフィー法、例えば薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーによるか、または生物学的活性の試験によりモニターすることができる。本発明に係るシクリポスチン類は菌糸体中に存在し、より少ない部分は培養物濾液中にも存在する。以下に記載する単離方法は、本発明に係るシクリポスチン類の精製、好ましくはシクリポスチンＡおよびＰの精製に役立つ。
【００４９】
培地からの本発明に係るシクリポスチン類の単離および／または精製は、これらの天然物質の化学的、物理的および生物学的特性を考慮して、公知の方法により行われる。培地中または個々の単離段階のシクリポスチン濃度を試験するためには、例えばシリカゲル上で溶離剤として塩化メチレン／酢酸エチルまたはクロロホルム／メタノール混合物（例えば量比９８：１）を用いる薄層クロマトグラフィー、またはＨＰＬＣを使用することができる。薄層クロマトグラフィー分離の場合の検出は、例えばモリブデートリン酸またはＩ2蒸気のような着色試薬により行うことができ、形成された物質の量を好都合には検量溶液と比較する。
【００５０】
本発明に係るシクリポスチン類を単離するために、菌糸体を最初に慣用の方法により培地から分離し、次いで有機溶剤（これは場合により水と混和性である）を用いて細胞塊からシクリポスチン類を抽出する。有機溶剤相は本発明に係るシクリポスチン類を含有しており；これらを場合により真空濃縮し、以下に記載するようにさらに精製する。
【００５１】
培養物濾液を場合により菌糸体抽出物の濃縮物と一緒にし、好適な水混和性有機溶剤、例えば ｎ−ブタノールまたは酢酸エチルで抽出する。続いて分離した有機相を場合により真空濃縮し、最初の体積の１／３０の水／メタノールに溶解する。
【００５２】
本発明に係るシクリポスチン類の１種またはそれ以上のさらなる精製は、好適な材料でのクロマトグラフィーにより、好ましくは例えばモレキュラーシーブ、シリカゲル、アルミナのような順相支持体、イオン交換体または吸着剤樹脂、または逆層（逆転相、ＲＰ）で行われる。これらのクロマトグラフィー法によりシクリポスチン類を分離する。シクリポスチン類のクロマトグラフィーは有機溶剤を用いて、または水溶液および有機溶液の混合物を用いて行われる。
【００５３】
水溶液または有機溶液の混合物は、１０〜１００％の溶剤、好ましくは６０〜９０％の溶剤の濃度の全ての水混和性有機溶剤、好ましくはメタノール、プロパノールおよびアセトニトリル、またはその代わりに有機溶剤と混和性である全ての緩衝水溶液を意味すると理解される。用いられる緩衝剤は上記で示したのと同じである。
【００５４】
それらの異なる極性に基づくシクリポスチン類の分離は、逆相クロマトグラフィーを用いて、例えば MCI (登録商標)（Mitsubisi, Japan からの吸着剤樹脂）または Amberlite XAD (登録商標)（TOSOHAAS）、他の疎水性材料、例えば RP-8 または RP-18 相で行われる。さらに分離は標準相クロマトグラフィーを用いて、例えばシリカゲル、アルミナなどで行うことができる。
【００５５】
シクリポスチン類のクロマトグラフィーは、緩衝水溶液または酸性化水溶液、または水溶液とアルコールまたは他の水混和性有機溶剤との混合物を用いて行われる。用いられる有機溶剤は、好ましくはプロパノールおよびアセトニトリルである。
【００５６】
緩衝水溶液または酸性化水溶液は、例えば、水、１mM〜０.５Ｍの濃度のリン酸塩緩衝剤、酢酸アンモニウム、クエン酸塩緩衝剤、および好ましくは０.０１〜３％、特に０.１％のギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸または当業者に公知の全ての市販の酸を意味すると理解される。
【００５７】
クロマトグラフィーは、１００％水性緩衝剤から始めて１００％溶剤で終わる勾配を用いて行われ；好ましくは５０〜１００％の２−プロパノールまたはアセトニトリルの線形勾配で操作する。
その代わりに、ゲルクロマトグラフィーまたは疎水性相でのクロマトグラフィーを行うこともできる。
【００５８】
ゲルクロマトグラフィーはポリアクリルアミドまたは混合重合体ゲル、例えば Biogel-P 2 (登録商標)、Fractogel TSK HW 40 (登録商標)（Merck, Germany または Toso Haas, USA）または Sephadex (登録商標)（Pharmacia, Uppsala, Sweden）で行われる。
上記のクロマトグラフィーの順序は逆にすることができる。
【００５９】
シクリポスチン類のための他の極めて効果的な精製段階は結晶化である。シクリポスチン類は有機溶剤中の溶液から、および水と有機溶剤との混合物から結晶化する。結晶化は本来公知の方法で、例えば飽和シクリポスチン溶液の濃縮または冷却により行われる。
本発明に係るシクリポスチン類は固体および液体の状態、および４〜８、特に５〜７のｐＨ範囲の溶液中で安定であり、従って慣用の医薬調製物中に導入することができる。
【００６０】
本発明はさらに、式Ｉの化合物の自明の化学的等価物を含み、これらの等価物は僅かな化学的相違を有し、すなわち同じ活性を有するか、または温和な条件下で本発明に係る化合物に変換できるものである。上記の等価物としては、例えば本発明に係る化合物のエステルおよびエーテル、および酸化、還元および水素化生成物が挙げられる。
エステル、およびエーテル誘導体、酸化生成物、水素化生成物および還元生成物は、文献、例えば“Advanced Organic Synthesis", 第４版, J. March, John Wiley & Sons., 1992 に記載の方法により製造することができる。
【００６１】
本発明は式Ｉ〜XVAの化合物の全ての立体異性体形態を含む。式Ｉ〜XVAの化合物に含まれる不斉中心は、全て互いに独立して、Ｓ立体配置またはＲ立体配置を有することができる。本発明は全ての可能なエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびに２種またはそれ以上の立体異性体形態の任意の比率の混合物、例えばエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物を含む。従って本発明は、左旋性および右旋性の対掌体の両方としてエナンチオマー的に純粋な形態のエナンチオマー、ラセミ体の形態および２種のエナンチオマーの任意の比率の混合物の形態のＲおよびＳ立体配置に関する。シス／トランス異性が存在する場合、本発明はシス形態およびトランス形態の両方、およびこれらの形態の任意の比率の混合物に関する。
【００６２】
それらの価値ある薬理学的特性のために、本発明に係る化合物はヒトの医学および／または獣医学における医薬として使用するのに適している。これらはリパーゼを阻害し、そして脂質代謝の障害に原因がある代謝異常の処置に好ましい特性を有する。本発明に係る式Ｉの化合物は、脂肪細胞中のアロステリック酵素であるホルモン感受性リパーゼＨＳＬ（これはインスリンにより阻害され、そして脂肪細胞中の脂肪の分解、従って血流中への脂肪成分の移動の原因となる）に対する驚くべき阻害作用を有する。従ってこの酵素の阻害は、本発明に係る化合物のインスリン様作用に相当し、この作用は最終的には血中の遊離脂肪酸および血糖の減少を生じさせる。従ってこれらの化合物は、インスリン非依存型糖尿病、糖尿病性症候群および膵臓の直接的損傷におけるような代謝不全に使用することができる。
【００６３】
従って本発明は、本発明に係るシクロポスチンおよび／またはその化学的等価物の１種またはそれ以上を含有する医薬調製物に関する。好適な賦形剤または担体材料との混合物として使用することが好ましい。ヒトに使用できる担体材料は、薬理学的に許容される全ての担体材料および／または賦形剤である。
【００６４】
本発明はさらに、本発明の化合物の少なくとも１種を、製薬上好適であり生理的に許容される担体、および適切ならば他の好適な活性化合物、添加剤または賦形剤を用いて、好適な投与形態にすることを含むことを特徴とする、本発明に係る医薬の製造方法に関する。
【００６５】
本発明に係る医薬は一般的に経口的、局所的または非経口的に投与されるが、直腸内投与も原則として可能である。好ましい固体または液体の医薬調製物形態は、例えば粒剤、粉剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液、エアゾール、ドロップまたはアンプル形態の注射溶液、および活性化合物の放出が遅延された調製物であり、これらの調製物には担体および添加剤および／または賦形剤、例えば崩壊剤、被覆剤、膨潤剤、滑剤または潤滑剤、矯味矯臭剤、甘味料または可溶化剤が普通に用いられる。挙げることのできる頻用される担体または賦形剤は、例えば炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトールおよび他の糖類、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、澱粉、ビタミン類、セルロースおよびその誘導体、動物油または植物油、ポリエチレングリコールおよび溶剤、例えば滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールである。
【００６６】
適切ならば、放出を遅延させるか、または放出をより長期間にわたって延長させるために、例えば粒子形態の活性化合物を被覆するか、または好適な重合体、ワックスなどに埋め込むことにより、用量単位を経口投与のためにマイクロカプセル封入することができる。
【００６７】
医薬調製物を製造し、そして用量単位で投与することが好ましく、各単位は活性成分として本発明に係るシクリポスチン類および／またはその化学的誘導体の１種またはそれ以上の化合物の特定用量を含有する。固体の用量単位、例えば錠剤、カプセルおよび坐剤の場合、この用量は、１日当たり約２００mgまでであってよいが、好ましくは約０.１〜１００mgであってよく、そしてアンプル形態の注射溶液の場合は約２００mgまでであってよいが、好ましくは約０.１〜１００mgであってよい。
【００６８】
投与すべき日用量は哺乳類の体重、年齢、性別および状態に依存する。しかしながら事情によっては、より高いかより低い日用量も適切であろう。日用量の投与は個々の用量単位の形態または多数のより少ない日用量で１回投与するか、または分割した用量を特定間隔で反復投与することによって行われる。
【００６９】
本発明はまた、本発明に係るシクリポスチン類および／またはそれらの化学的誘導体の１種またはそれ以上を含有する医薬調製物に関する。好適な賦形剤または担体材料と混合して使用することが好ましい。ヒトの場合、用いられる担体材料は全ての薬理学的に許容される担体材料および／または賦形剤であってよい。
本発明に係る式Ｉの化合物の作用を下記の酵素試験系について試験した。
【００７０】
酵素の調製：
部分精製ＨＳＬの調製：
未処理の雄ラット（ウィスター系、２２０〜２５０ｇ）の精巣上体脂肪細胞から、出版された手法（例えば S. Nilsson et al., Anal. Biochem. 158, 1986, 399-407; G. Fredrikson et al., J. Biol. Chem. 256, 1981, 6311-6320; H. Tornquist et al., J. Biol. Chem. 251, 1976, 813-819）によりコラゲナーゼ処理することにより、単離ラット脂肪細胞を得る。１０匹のラットからの脂肪細胞を、それぞれの場合に５０mlの均質化緩衝液（２５ml Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、０.２５Ｍスクロース、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、１０μｇ／mlのロイペプチン、１０μｇ／mlのアンチパイン、２０μｇ／mlのペプスタチン）で浮遊させることにより３回洗浄し、最後に１０mlの均質化緩衝液に吸収させる。脂肪細胞をテフロン−イン−ガラス製ホモジナイザー（Braun-Melsungen）中で１５００rpmおよび１５℃で１０ストロークにより均質化する。この均質化物を遠心する（Sorvall SM24 管、５０００rpm、１０分、４℃）。上にある脂肪層とペレットの間の下層を除去し、遠心を繰り返す。これから得られた下層を再び遠心する（Sorvall SM24 管、２００００rpm、４５分、４℃）。下層を除去し、１ｇのヘパリン−セファロース（Pharmacia-Biotech、CL-6B、２５ml Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１５０mM ＮａＣｌで５回洗浄）で処理する。４℃で６０分間のインキュベーション（１５分間隔で振盪）ののち、バッチを遠心する（Sorvall SM24 管、３０００rpm、１０分、４℃）。上澄み液を酢酸の添加によりｐＨ５.２にし、４℃で３０分間インキュベートする。沈殿物を遠心（Sorvall SS34 管、１２０００rpm、１０分、４℃）により集め、２.５mlの２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.０、１mM ＥＤＴＡ、６５mM ＮａＣｌ、１３％のスクロース、１mM ＤＴＴ、１０μｇ／mlのロイペプチン／ペプスタチン／アンチパインに懸濁させる。この懸濁液を２５ml Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、５０％のグリセロール、１mM ＤＴＴ、１０μｇ／mlのロイペプチン、ペプスタチン、アンチパインに対して４℃で一夜透析し、次いでヒドロキシアパタイトカラム（１mlの懸濁液当たり０.１ｇ、１０mMリン酸カリウム、ｐＨ７.０、３０％のグリセロール、１mM ＤＴＴで平衡化）にかける。カラムを４体積の平衡化緩衝液で２０〜３０ml／ｈの流速で洗浄する。ＨＳＬを、０.５Ｍリン酸カリウムを含む１体積の平衡化緩衝液で溶離し、次いで透析し（上記参照）、４℃での限外濾過（Amicon Diaflo PM 10 Filter）により５〜１０倍に濃縮する。この部分精製ＨＳＬは −７０℃で４〜６週間貯蔵できる。
【００７１】
アッセイ：
基質を調製するため、２５〜５０μCiの［3Ｈ］トリオレイルグリセロール（トルエン中）、６.８μMolの未標識トリオレイルグリセロールおよび０.６mgのリン脂質（ホスファチジルコリン／ホスファチジルイノシトール３：１ｗ／ｖ）を混合し、Ｎ2により乾燥し、次いで２mlの０.１Ｍ ＫＰi（ｐＨ７.０）中に超音波処理（Branson 250、マイクロチップス、セッティング１〜２、１分間隔で２×１分間）により吸収させる。１mlのＫＰiを添加し、新たに超音波処理（氷上で３０秒間隔で４×３０秒間）したのち、１mlの２０％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（ＫＰi中）を加える（トリオレイルグリセロールの最終濃度１.７mM）。反応させるため、１００μｌの基質溶液を１００μｌのＨＳＬ溶液（上記のように調製したＨＳＬ、２０mM ＫＰi、ｐＨ７.０、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、０.０２％ＢＳＡ、２０μｇ／mlのペプスタチン、１０μｇ／mlのロイペプチンに希釈）にピペットで加え、３７℃で３０分間インキュベートする。３.２５mlのメタノール／クロロホルム／ヘプタン（１０：９：７）および１.０５mlの０.１Ｍ Ｋ2ＣＯ3、０.１Ｍホウ酸（ｐＨ１０.５）を加えたのち、バッチをよく混合し、最後に遠心する（８００×ｇ、２０分間）。相分離したのち、１当量の上相（１ml）を除去し、放射能を液体シンチレーション測定により決定する。
【００７２】
評価：
基質を４つの独立したバッチで慣用法により試験する。試験物質によるＨＳＬの酵素活性の阻害を、非阻害コントロール反応との比較により決定する。ＩＣ50値の計算を、試験物質の少なくとも１０種の濃度を用いて阻害曲線により行う。データを解析するために、GRAPHIT ソフトウェアパッケージ、Elsevier-BIOSOFTを用いる。
【００７３】
この試験において、化合物は下記の作用を示した：
シクリポスチンＡ、Ｐ、Ｐ２およびＲは、ラット脂肪細胞中での脂肪分解をＩＣ50＝〜０.２μＭで阻害し、基質としてトリオレイルグリセロールを用いてヒトホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）を：ＩＣ50＝〜０.０７〜０.５μＭで阻害する。基質としてＮＢＤ（４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾール）を用いると、ラットからのＨＳＬを４nM〜１０nMの濃度で阻害する。
【００７４】
シクリポスチン類はホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）およびラット抽出物のモノアシルグリセロールリパーゼの両方をマイクロモル以下の濃度で阻害する。
本発明を下記の実施例においてさらに説明する。パーセントは重量に関する。液体の場合の混合比は、他の詳細が与えられていないならば体積に関する。
【００７５】
【実施例】
実施例１
ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 のグリセロール培養物の製造
３００mlの滅菌三角フラスコに入れた１００mlの栄養溶液（麦芽エキス２.０％、酵母エキス０.２％、グルコース１.０％、(ＮＨ4)2ＨＰＯ4 ０.０５％、ｐＨ６.０）を、菌株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 で接種し、回転振盪装置上で２８℃および１８０rpmで７日間インキュベートする。次いで１.５mlのこの培養物を１.５mlの９９％濃度のグリセロールで希釈し、−２０℃で貯蔵する。
【００７６】
実施例２
三角フラスコ中でのストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の前培養物の製造
次の栄養溶液：１５ｇ／Ｌのグルコース、１５ｇ／Ｌのダイズ粉、５ｇ／Ｌのコーンスティープ、２ｇ／ＬのＣａＣＯ3および５ｇ／ＬのＮａＣｌを入れた３００mlの滅菌三角フラスコを、傾斜試験管（同じ栄養溶液であるが２％の寒天を含む）で成長させた培養物または１mlのグリセロール培養物（実施例１参照）で接種し、振盪装置上で１８０rpmおよび２８℃でインキュベートする。同じ栄養溶液の４８〜９６時間経過した浸漬培養物（約１０％の接種量）が１０〜２００Ｌの発酵槽の接種のために充分である。
【００７７】
実施例３
三角フラスコ中でのストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の培養物の製造
１００mlの下記の栄養溶液：
２０ｇ／Ｌのイヌ用オートフレーク
２.５mlの微量元素溶液
を入れた３００mlの滅菌三角フラスコを１０％の接種量の前培養物（実施例２）で接種し、振盪装置上で１８０rpmおよび２８℃でインキュベートする。この培養物は２日後に、シクリポスチン類を得るため、または発酵槽を接種するために使用できる。微量元素溶液は下記の組成を有する：
３ｇ／ＬのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ；
１ｇ／Ｌのクエン酸鉄(III) ；
０.２ｇ／ＬのＭｎＳＯ4×Ｈ2Ｏ；
０.１ｇ／ＬのＺｎＣｌ2；
０.０２５ｇ／ＬのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ；
０.０２ｇ／Ｌのテトラホウ酸Ｎａ；
０.００４ｇ／ＬのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ；
０.０１ｇ／Ｌのモリブデン酸Ｎａ。
【００７８】
実施例４
式II〜IXのシクリポスチン類の製造
２００Ｌの発酵槽を、９０リットルの栄養溶液を用いて下記の条件下で操作する：
0005038572.tif 000023
この栄養溶液を３０分間加熱滅菌し、冷却したのち、その５％の体積を実施例３により得た接種材料で接種する。
【００７９】
0005038572.tif 000024
消泡剤を添加しないで発酵を行う。約４０〜７６時間後に生産最大に達する。
【００８０】
実施例５
シクリポスチンＸおよびXVAの製造
２００Ｌの発酵槽を下記の条件下で下記成分１００Ｌを充填して操作する：
0005038572.tif 000025
泡形成抑制剤を添加しないで発酵を行う。約４８時間後に生産最大に達する。
【００８１】
実施例６
ストレプトマイセス属の種 HAG 004107，DSM 13381 の培養液からのシクリポスチン混合物の単離
ストレプトマイセス属の種 HAG 004107，DSM 13381 の発酵が完結したのち、実施例４により得られた発酵槽からの１００リットルの培養ブロスを、約２％の濾過助剤（例えば Celite (登録商標)）を加えて濾過し、細胞塊(１０リットル)を４０リットルのメタノールで抽出する。活性化合物を含有するメタノール性溶液を濾過により菌糸体から遊離させ、真空濃縮する。この濃縮物を、７リットルの分取用 MCL GEL, CHP20P (登録商標) カラムにかける。水からプロパン−２−オールまでの勾配を用いて溶離を行う。カラムの流れ（毎時２０リットル）を画分（各１０リットル）として集め、シクリポスチン類を含有する画分（１９〜２１）をそれぞれの場合に真空濃縮する。これらの画分をＨＰＬＣにより調査する（実施例７参照）。画分１９はシクリポスチンＡ〜Ｅおよびそれらの異性体を含有しており、画分２０はシクリポスチンＦおよびその異性体を含有しており、画分２１は阻害剤であるシクリポスチンＮ、Ｐ、Ｐ２、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴ、およびそれらの異性体を含有している。
【００８２】
実施例７
シクリポスチン類のＨＰＬＣ分析
シクリポスチン類の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を、HP 1100 (登録商標) ユニットで YMC Pack Pro C18 (登録商標)カラム［AS-303、２５０×４.６mm、Ｓ−５μｍ、１２０Å］を用いて行う。流量は１ml／分、カラム温度は４０℃である。０.０５％トリフルオロ酢酸からアセトニトリルまでの勾配を用いる。１１分後に１００％アセトニトリルにし、次いでカラムを一定して（アイソクラクチックに）この溶剤でさらに溶離する。検出を２１０nmでの紫外線吸収の測定により行う。この手順を用いると、シクリポスチン類は下記の保持時間を有する：
シクリポスチンＡ      １２.７分、
シクリポスチンＡ２    １２.６分、
シクリポスチンＦ      １３.２分、
シクリポスチンＮ      １５.９分、
シクリポスチンＰ      １７.７分、
シクリポスチンＰ２    １７.３分、
シクリポスチンＱ      １８.３分、
シクリポスチンＲ      １６.７分、
シクリポスチンＲ２    １６.４分、
シクリポスチンＳ      １８.５分、
シクリポスチンＴ      １９.１分および
シクリポスチンＴ２    １８.７分。
【００８３】
実施例８
純粋なシクリポスチンＡおよびＡ２の製造
実施例６により得た画分１９を真空濃縮し、水／メタノール（１：１）に溶解した１ｇの濃縮物を Nucleoprep 100-5 C18 AB (登録商標) カラム」（２１×２５０mm）にかける。０.０１％トリフルオロ酢酸中の５０％アセトニトリルから１００％アセトニトリルまでの勾配を用いて溶離を行う。流量は５０ml／分である。カラムの流れを２１０nmでの光吸収の測定およびリパーゼ阻害特性の試験によりチェックする。それぞれ６０mlの画分を採取する。シクリポスチンＡは画分３４および３５に、シクリポスチンＡ２は画分４１〜４４に存在している。これらの画分をそれぞれの場合に一緒にし、真空濃縮し、SP 250／10 Nucleosil 100-5 C18 HD (登録商標) カラムで連続的に分離する。選択した勾配は０.０１％トリフルオロ酢酸中の５０％〜６６％アセトニトリルであり、この溶液のｐＨを１滴の水酸化アンモニウム溶液で４.０に調節した。純粋な化合物を含有する画分をそれぞれの場合に一緒にし、凍結乾燥した。これらは５.４mgの純粋なシクリポスチンＡをワックス様物質として与え、３mgのシクリポスチンＡ２を油状物として与えた。
【００８４】
実施例９
シクリポスチンＡの特性決定
外観：中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
ＩＲバンド：１７５２および１６７１cm-1 。
ニトロベンジルアルコール／ＬｉＣｌマトリックスを用いた高解像ＦＡＢ質量分析法により、次の分子量を認める：４６７.２７５７amu、これはシクリポスチンＡ−Ｌｉの実験式Ｃ23Ｈ41Ｏ7ＰＬｉに相当する。これから、シクリポスチンＡの実験式はＣ23Ｈ41Ｏ7Ｐとなり、分子量：４６０である。電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式（ＥＳＩ、＋）により、４１６amuで（Ｍ＋Ｈ)+ に相当するピーク；さらに２２１amuでＣ7Ｈ10Ｏ6Ｐに相当する特徴的なピークを認める。ＥＳＩ陰イオン化方式では４５９amu（Ｍ−Ｈ)-、３３７amu（Ｃ16Ｈ34Ｏ5Ｐ）および２１９amu（Ｃ7Ｈ8Ｏ6Ｐ）を認める。アルコール基の位置を決定するため、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化を行い、電子イオン化質量分析法を用いて試料を調査する。トリメチルシリル誘導体は質量５５４amuの
【化２３】
0005038572.tif 000026
となる。シリル化ヒドロキシル基の位置は４９７amu（α−開裂）および１５９amu（α−開裂）における強いイオンによって示される。
ＮＭＲシグナル：表１参照。
【００８５】
【表１】
0005038572.tif 000027
【００８６】
実施例１０
シクリポスチンＢの特性決定
実施例８でシクリポスチンＡについて記載したように、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＢを単離し、実施例９のように特性決定する。
外観：中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式（ＥＳＩ、＋）により、４６１amuで（Ｍ＋Ｈ)+ に相当するピーク；さらに２２１amuでＣ7Ｈ10Ｏ6Ｐに相当する特徴的なピークを認める。ＥＳＩ陰イオン化方式では４５９amu（Ｍ−Ｈ)- 、３３７amu（Ｃ16Ｈ34Ｏ5Ｐ）および２１９amu（Ｃ7Ｈ8Ｏ6Ｐ）を認める。アルコール基の位置を決定するため、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化を行い、電子イオン化質量分析法により試料を調査する。トリメチルシリル誘導体は質量５５４amuの
【化２４】
0005038572.tif 000028
となる。シリル化ヒドロキシル基の位置は５１１amu（α−開裂）および１４５amu（α−開裂）における強いイオンによって示される。
シクリポスチンＢの実験式：Ｃ23Ｈ41Ｏ7Ｐ、分子量：４６０。
【００８７】
実施例１１
シクリポスチンＣの特性決定
実施例８でシクリポスチンＡについて記載したように、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＣを単離し、実施例９のように特性決定する。
外観：中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式（ＥＳＩ、＋）により、４６１amuで（Ｍ＋Ｈ)+ に相当するピーク；さらに２２１amuでＣ7Ｈ10Ｏ6Ｐに相当する特徴的なピークを認める。ＥＳＩ陰イオン化方式では４５９amu（Ｍ−Ｈ)- 、３３７amu（Ｃ16Ｈ34Ｏ5Ｐ）および２１９amu（Ｃ7Ｈ8Ｏ6Ｐ）を認める。アルコール基の位置を決定するため、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化を行い、電子イオン化質量分析法を用いて試料を調査する。トリメチルシリル誘導体は質量５５４の
【化２５】
0005038572.tif 000029
となる。シリル化ヒドロキシル基の位置は５２５amu（α−開裂）および１３１amu（α−開裂）における強いイオンによって示される。
シクリポスチンＣの実験式：Ｃ23Ｈ41Ｏ7Ｐ、分子量：４６０。
【００８８】
実施例１２
シクリポスチンＦの特性決定
実施例６により得た画分２０を実施例８に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＦを単離し、実施例９のように特性決定する。
反応時間：１３.２分。
外観：中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式（ＥＳＩ、＋）により、４５９amuで（Ｍ＋Ｈ)+ に相当するピーク；さらに２２１amuでＣ7Ｈ10Ｏ6Ｐに相当する特徴的なピークを認める。ＥＳＩ陰イオン化方式では４５７.６amu（Ｍ−Ｈ)- 、３３６amu（Ｃ16Ｈ32Ｏ5Ｐ）および２１９amu（Ｃ7Ｈ8Ｏ6Ｐ）を認める。
シクリポスチンＦの実験式：Ｃ23Ｈ39Ｏ7Ｐ、分子量：４５８。
【００８９】
実施例１３
シクリポスチンＰの特性決定
実施例５および６により得た画分２１を実施例８に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＰを単離し(２１０mg)、実施例９のように特性決定する。
２１０mgを３mlのプロパン−２−オールおよび１３mlのアセトニトリルに溶解し、８mlの水を加えることによりシクリポスチンＦを結晶化させた。濾別し、冷アセトニトリルで洗浄したのち、最終重量１３５mgのシクリポスチンを得た。融点５８〜５９℃。
保持時間：１７.７分。
外観：中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
ＩＲバンド：２９１７、２８５２、１７５３、１６７１、１４７１、１２１４、９９６および８３２cm-1。
ニトロベンジルアルコールマトリックスを用いた高解像ＦＡＢ質量分析法により、次の分子量を認める：４４５.２７１７amu、これはシクリポスチンＰに対する（Ｍ＋Ｈ)+ のＣ23Ｈ42Ｏ6Ｐに相当する。これから、シクリポスチンＰの実験式はＣ23Ｈ41Ｏ6Ｐとなり、分子量：４４４である。
電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式（ＥＳＩ、＋）により、４４５amuで（Ｍ＋Ｈ)+ に相当するピーク；さらに２２１amuでＣ7Ｈ10Ｏ6Ｐに相当する特徴的なピークを認める。ＥＳＩ陰イオン化方式では４４３amu（Ｍ−Ｈ)- 、３２１amu（Ｃ16Ｈ34Ｏ4Ｐ）および２１９amu（Ｃ7Ｈ8Ｏ6Ｐ）を認める。
【化２６】
0005038572.tif 000030
ＮＭＲデータを表２に示す。
【００９０】
【表２】
0005038572.tif 000031
【００９１】
実施例１４
シクリポスチンＰ２の特性決定
実施例５および６により得た画分２１を実施例８に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＰ２を単離し（１３０mg）、実施例９のように特性決定する。
保持時間：１７.１分。
外観：中性、無色、油状物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
ニトロベンジルアルコールマトリックスを用いた高解像ＦＡＢ質量分析法により、次の分子量を認める：４４５.２７２１amu、これはシクリポスチンＰに対する（Ｍ＋Ｈ)+ のＣ23Ｈ42Ｏ6Ｐに相当する。これから、シクリポスチンＰ２の実験式はＣ23Ｈ41Ｏ6Ｐとなり、分子量：４４４である。電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式（ＥＳＩ、＋）により、４４５amuで（Ｍ＋Ｈ)+ に相当するピーク；さらに２２１amuでＣ7Ｈ10Ｏ6Ｐに相当する特徴的なピークを認める。ＥＳＩ陰イオン化方式では４４３amu（Ｍ−Ｈ)- 、３２１amu（Ｃ16Ｈ34Ｏ4Ｐ）および２１９amu（Ｃ7Ｈ8Ｏ6Ｐ）を認める。
【化２７】
0005038572.tif 000032
シクリポスチンＰ２のＮＭＲデータを表３に示す。
【００９２】
【表３】
0005038572.tif 000033
【００９３】
実施例１５
シクリポスチンＮの取得および特性決定
実施例５および６により得た画分２１を実施例８に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＮを単離し（２mg）、実施例９のように特性決定する。
保持時間：１５.９分。
外観：中性、無色、油状物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
高解像質量分析法［空格子点］ＦＡＢ条件により、４１７.２４０５でＣ21Ｈ38Ｏ6Ｐ（理論値：４１７.２４０６）の実験式に相当する準分子イオン（Ｍ＋Ｈ)を観測した。ＥＳＩ+ 方式における特徴的な断片：２２１amu。
【００９４】
【表４】
0005038572.tif 000034
【００９５】
実施例１６
シクリポスチンＲの取得および特性決定
実施例５および６により得た画分２１を実施例８に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＲを単離し（８mg）、実施例９のように特性決定する。
保持時間：１６.７分。
外観：中性、無色、結晶性物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
高解像質量分析法［空格子点］ＦＡＢ条件により、４３１.２５６１でＣ22Ｈ40Ｏ6Ｐ（理論値：４３１.２５６２）の実験式に相当する準分子イオン（Ｍ＋Ｈ)を観測した。ＥＳＩ+ 方式における特徴的な断片：２２１amu。
【００９６】
【表５】
0005038572.tif 000035
【００９７】
実施例１７
シクリポスチンＲ２の取得および特性決定
実施例５および６により得た画分２１を実施例８に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＲ２を単離し（８mg）、実施例９のように特性決定する。
保持時間：１６.４分。
外観：中性、無色、油状物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
高解像質量分析法［空格子点］ＦＡＢ条件により、４３１.２５６４でＣ22Ｈ40Ｏ6Ｐ（理論値：４３１.２５６２）の実験式に相当する準分子イオン（Ｍ＋Ｈ)を観測した。ＥＳＩ+ 方式における特徴的な断片：２２１amu。
【００９８】
【表６】
0005038572.tif 000036
【００９９】
実施例１８
シクリポスチンＳの取得および特性決定
実施例５および６により得た画分２１を実施例８に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＳを単離し（０.７mg)、実施例９のように特性決定する。
保持時間：１８.５分。
外観：中性、無色、固体の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
高解像質量分析法［空格子点］ＦＡＢ条件により、４５９.２８８３でＣ24Ｈ44Ｏ6Ｐ（理論値：４５９.２５７５）の実験式に相当する準分子イオン（Ｍ＋Ｈ)を観測した。ＥＳＩ+ 方式における特徴的な断片：２３５amu。
【０１００】
【表７】
0005038572.tif 000037
【０１０１】
実施例１９
シクリポスチンＴの取得および特性決定
実施例５および６により得た画分２１を実施例８に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＴを単離し（５mg）、実施例９のように特性決定する。
保持時間：１９.１分。
外観：中性、無色、固体の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
高解像質量分析法［空格子点］ＦＡＢ条件により、４７３.３０３０でＣ25Ｈ46Ｏ6Ｐ（理論値：４７３.３０３２）の実験式に相当する準分子イオン（Ｍ＋Ｈ)を観測した。ＥＳＩ+ 方式における特徴的な断片：２４９amu。
【０１０２】
【表８】
0005038572.tif 000038
【０１０３】
実施例２０
シクリポスチンＴ２の取得および特性決定
実施例５および６により得た画分２１を実施例８に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンＴ２を単離し（４mg）、実施例９のように特性決定する。
保持時間：１８.７分。
外観：中性、無色、固体の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
ＵＶ極大：メタノール中２２８nm。
高解像質量分析法［空格子点］ＦＡＢ条件により、４７３.３０３５でＣ25Ｈ46Ｏ6Ｐ（理論値：４７３.３０３２）の実験式に相当する準分子イオン（Ｍ＋Ｈ)を観測した。ＥＳＩ+ 方式における特徴的な断片：２４９amu。
【０１０４】
【表９】
0005038572.tif 000039
【０１０５】
実施例２１
ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）の阻害
ラットからのホルモン感受性リパーゼは、基質としてトリオレイルグリセロールを用いて下記の濃度（ＩＣ50）で阻害される。
シクリポスチンＡ        ２０nM、
シクリポスチンＮ      ４５０nM、
シクリポスチンＰ        ３０nM、
シクリポスチンＰ２      ４０nM、
シクリポスチンＲ        １０nM、
シクリポスチンＲ２    ２２０nM、
シクリポスチンＳ        ２０nM、
シクリポスチンＴ      ２００nM、
シクリポスチンＴ２      ６０nM。