(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  αペプチド鎖を有する両親媒性直鎖ポリアミノ酸(PAA)ベースであり；
−  前記PAAの親水性部分が前記PAAの疎水性部分よりもより可溶化されるためにディスクリート超分子配置で組織化されるようになると後者が沈殿する水性溶媒と、前記PAAとを接触させることによって自己形成することが可能であり；
−  平均径が200μm未満であり、
−  かつ、少なくとも１の活性成分(AP)と会合し、持続的かつ制御された様式でin vivoにて前記後者を放出することが可能であり；
前記PAAの主鎖を構成する反復アミノ酸類(rAA)が互いに同一であるか異なっており、かつグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸の塩およびアスパラギン酸の塩から選択されることと、
これらのrAAのいくつかが各々少なくとも１の疎水性R0基を有し、これらの疎水性R0基は互いに同一または異なっており、かつ、
(i)直鎖または分枝鎖のアルキル、アシルまたはアルケニル；
(ii)アリール、アラルキルまたはアルキルアリール；および
(iii)コレステロール；
からなる群より選択されることと、および
前記疎水性R0基の各々がエステルおよび／またはアミド型の共有結合を介して当該rAA鎖に結合していることと、
を特徴とする
送達粒子(DP)。
【請求項２】
請求項１に記載の送達粒子であって、前記PAAの疎水性部分のよりも前記PAAの親水性部分の方がより可溶化される水性溶媒が水であることを特徴とする送達粒子。
【請求項３】
R0基が無作為にまたは規則的に当該ポリマー鎖に分布していることを特徴とする請求項１または２に記載の送達粒子。
【請求項４】
R0基が以下の基の群：メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、ヘキサデシルまたはオクタデシルから選択されることを特徴とする請求項３に記載の送達粒子。
【請求項５】
疎水性rAA0部分が3%以上の割合で存在することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の送達粒子。
【請求項６】
前記PAAが1000までのrAAを含むポリマーであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の送達粒子。
【請求項７】
それらが0.01〜0.5μmの平均径を有する送達粒子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の送達粒子。
【請求項８】
より大きいサイズの新たな送達粒子を得るために凝集していることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の送達粒子。
【請求項９】
少なくとも１の活性成分を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の送達粒子。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の両親媒性直鎖ポリアミノ酸(PAA)であることを特徴とするDP前駆体。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の送達粒子のコロイド水性懸濁液。
【請求項１２】
少なくとも１の活性成分を含むことを特徴とする請求項１１に記載のコロイド水性懸濁液。
【請求項１３】
I−  グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸の塩およびアスパラギン酸の塩からから選択された反復アミノ酸(rAA)のαペプチド鎖を含む直鎖両親媒性PAAを用いて；
これらのrAAのいくつかが各々少なくとも１の疎水性R0基を有し、これらの疎水性R0基は互いに同一または異なっており、かつ、
(i)直鎖または分枝鎖のアルキル、アシルまたはアルケニル；
(ii)アリール、アラルキルまたはアルキルアリール；および
(iii)コレステロール；
からなる群より選択されることと、および
前記疎水性R0基の各々がエステルおよび／またはアミド型の共有結合を介して当該rAA鎖に結合していることと、
を特徴とする；
II−  水性溶媒中に当該両親媒性PAAを入れて；
III−  次いで、少なくともR0含有rAAを当該溶媒に溶解させず、これらのrAAを沈殿させて、それによりディスクリート超分子配置を形成する；
ことを特徴とする請求項１１または１２に記載のコロイド懸濁液の製造方法。
【請求項１４】
当該送達粒子DPを含む当該水性溶媒に少なくとも１の活性成分が配合され、それにより活性成分が添加されたDPのコロイド懸濁液が得られることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
塩、酸、塩基、ポリマー、任意のイオン性ポリマーまたはその混合物からなる少なくとも１の凝集剤を用いて当該送達粒子を凝集させる少なくとも１の更なる工程を含むことを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの活性成分が、
タンパク質および／またはペプチド、
多糖、
核酸
およびその混合物
から選択される医薬活性成分である請求項９に記載の送達粒子、または請求項１２に記載の懸濁液。
【請求項１７】
前記少なくとも１の活性成分が、前記タンパク質および／またはペプチドから選択され、かつヘモグロビン、シトクロム、アルブミン、インターフェロン、抗原、抗体、エリトロポエチン、インスリン、成長ホルモン、IX因子、インターロイキンまたはその混合物から選択される請求項９に記載の送達粒子、または請求項１２に記載の懸濁液。
【請求項１８】
前記活性成分が、インスリンである請求項９に記載の送達粒子または請求項１２に記載の懸濁液。
【請求項１９】
前記少なくとも１の活性成分が、少なくとも１の栄養、植物保護または美容用製品によって形成される、請求項９に記載の送達粒子、または請求項１２に記載の懸濁液。
【請求項２０】
請求項９に記載の送達粒子または請求項１２に記載の懸濁液を含むことを特徴とする医薬、栄養、植物保護または美容専門製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野は活性成分(AP)の投与に使用できる送達粒子(DP)の分野である。後者は、好ましくは動物またはヒト生体に対して経口、鼻腔、膣、眼、皮下、静脈、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、非経口などの経路を介して投与するための医薬製剤または栄養剤である。しかしながらそれらはまた。除草剤、病虫害防除剤(pesticede)、殺虫剤(insecticide)、殺菌剤などの植物保護製剤でもあり得る。化学的性質に関して、本発明は、専用ではないが、特に関連するAPとしては、例えばタンパク質類、糖タンパク質類、ペプチド類、多糖類、リポ多糖類、オリゴヌクレオチド類およびポリヌクレオチド類がある。
【０００２】
本発明はさらに詳しくは、ポリアミノ酸(PAA)ベースの、有利にはミクロン以下の種類の送達粒子に関する。本発明はむき出しの粒子自体と、考慮中のAPが添加された粒子からなるAPベクター系との双方に向けられる。本発明はまたこれらのDPを含む水性コロイド懸濁液に関する。
【０００３】
本発明はまた前記粒子、およびAPを含む、また含まないコロイド懸濁液を製造する方法に関する。
【０００４】
DPにAPを封入する目的は特に該APの生物学的利用能を高めることにある。すでの多くのカプセル化技術が提案されている。かかる技術は第一にその治療作用部位へのAPの輸送を可能にすると同時に、身体の攻撃(加水分解、酵素消化など)からそれ保護することに、第二にその作用部位にわたるAPの放出を制御して所望のレベルで生物に利用できる量を維持することに向けられる。これらの送達の偶発と体内での滞留と関係するAPとしては例えばタンパク質があるが、合成または天然源のその他のいずれの産物であってもよい。M.J. HUMPHREY (Delivery System for peptide Drugs, S. DAVISおよびL. ILLUM編, Plenum Press, N.Y., 1986)による総説ではAPの生物学的利用能の改良、ならびに送達および制御放出系の利点に関する問題を説明している。
【０００５】
DPを製造するために考えられるあらゆる材料のうち、ポリマーがそれらの固有の特性のためにますます用いられている。このようなDPのために得ることが望まれる仕様リストについては、これは特に以下の仕様を要し、またこれを含む。
1  有利には選択された投与様式および／または標的とされる治療部位に対して制御され、かつ好適な粒径分布が得られるべきである。
2  DPに関しては放出部位に到達するまでAPを保護することが望ましい。
3  DPは有利にはAPの放出速度を制御すべきである。
4  DPを構成するポリマーに関しては生体適合性があり、除去可能であり(排泄による)、および／または生分解性があり、より好ましくは身体に無毒な産物に代謝されることが望ましい。
5  DPを構成するポリマーに関しては免疫応答を誘導しないことも有利である。
6  最後に、これに関しては、APを変性させない方法を用いてDPおよびDP-AP系が得られることも望ましい。
【０００６】
上記の先行技術の提案はこの一連の仕様を満たすことを試みた。例としては第一の試みによれば、提案(a)〜(d)を含む先行提案(a)〜(h)が挙げられ、送達支持体の形成中に活性成分の包摂が起こり；第二の試みによれば、提案(e)〜(h)が挙げられ、一度製造されればAPへの吸着によって自然に会合することができるDPが製造される。
【０００７】
(a)  特許US-A-5,286,495は、反対の電荷、すなわちアルギン酸塩(負電荷)およびポリリジン(正電荷)を有する物質を用いて水相でタンパク質を噴霧することによるカプセル化法に関する。この製造方法により35μmより大きい粒子が製造できる。
【０００８】
(b)  さらに、APが添加された微粒子を製造するには一般に乳化技術が用いられる。例えば特許出願WO91/06286、WO91/06278およびWO89/08449ではかかる乳化技術が開示されており、ここではポリマー、例えばポリ乳酸系のものを可溶化するために有機溶媒が用いられる。しかしながらこれらの溶媒は、特にペプチドまたはポリペプチドAPに関しては変性する可能性があることが分かっている。
【０００９】
(c)  1970年といった初期の頃にW. FOXおよびK. DOSEにより"Molecular Evolution and the origin of life", Marcel DEKKER Inc. (1977)編に記載されている、水溶液中で形成され、プロテノイドと呼ばれる生体適合性DPも知られている。例えば、特許出願WO88/01213では、アミノ酸の熱縮合によって得られる人工ポリペプチド混合物ベースの系が提供されている。その発明の微粒子はpHを変化させてプロテノイド粒子を沈殿させることによって得られる。
【００１０】
(d)  また、興味深いものとして米国特許第4,351,337号および同第4,450,150号の、本発明の特徴をなすAPの送達以外の分野の製品が挙げられる。これらの特許は体内のかなり厳密な部位に付着および定着される移植塊を開示している。これらの移植片はポリ-α-アミノ酸型のポリマー物質から製造される(それぞれLeu/GluOHおよびGluOEt/GluOH)。その特許の教示によれば、好ましいポリアミノ酸は疎水性アミノ酸が豊富で(例えば50%を超えるロイシンまたはGluOEt)、かつ水に不溶なものである。APはポリ-α-アミノ酸の有機溶媒溶液に配合できる。この溶液を用いて成形／乾燥(蒸発)により移植片を形成する。別法によれば、マイクロカプセルの核にAPを包摂するが、この場合には共重合体溶液を用いて得られ、その直径は5000μm以上である。この核は純粋なAP、またはAPを含む共重合体マトリックスからなってよく、PAAの有機溶媒溶液から得ることができる。
【００１１】
(e)  PCT特許出願WO/FR97/02810では、複数の生分解性ポリマー、少なく部分的には結晶性の物質(乳酸ポリマー)と、前記粒子に吸着させた活性物質との積層粒子からなる、活性成分の制御放出のための組成物が開示されている。活性成分の放出は脱離によって起こる。
【００１２】
(f)  刊行物"CHEMISTRY LETTERS 1995, 707, AKIYOSHIら"はコレステロールをグラフトすることによって疎水性となる10程の多糖鎖から形成されたナノ粒子との超分子との複合化によるインスリンの安定化に関するものである。
【００１３】
(g)  "MACROMOLECULES 1997, 30, 4013-4017"に発表された文献では、L-フェニルアラニン、γ-ベンジル-L-グルタメートまたはO-(テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)-L-セリンベースのペプチドブロック、およびポリ(2-メチル-2-オキサゾリン)またはポリ(2-フェニル-2-オキサゾリン)などの合成ブロックからなる共重合体が記載されている。これらの重合体のいくつかは水性媒質中で凝集して酵素、リパーゼと会合し得る400nmの粒子を形成する。
【００１４】
(h)  特許FR95-03978の主題は活性成分を送達するために使用でき、かつ、それらの構成ポリアミノ酸が少なくとも２種の循環アミノ酸、すなわちAAN(天然疎水性)およびAAI(イオン化親水性)を含むことを特徴とするポリアミノ酸粒子である。これらの粒子は水溶液中のポリアミノ酸粉末分散系によって自然に得られる。このようにして得られた粒子は水性懸濁液中で活性成分(例えば、天然タンパク質である)と自然会合する。
【００１５】
これらの先行する教示的提案は上記の仕様リストの仕様を多かれ少なかれ満たす。しかしながらかかる活性成分の送達粒子はまだ完全ではない。
【００１６】
この議論の余地のない事実によれば、本発明の本質的な目的の１つは、直鎖両親媒性ポリ-α-アミノ酸(PAA)ベースの新規なDPを提供することによって(h)FR95-03978に挙げられた先行技術の提案を改良することにあり、この親水性および疎水性の性質はそれぞれポリマー主鎖のアミノ酸によって、また共有結合を介して該アミノ酸部分に側鎖として結合した疎水基によって提供される。この改良はさらに厳密にはAPの添加度合いを改良するため、および／またはAPの放出の動力学を改良するため、APとDPとの間の会合の特徴を制御する手段に関する。
【００１７】
本発明のもう１つの本質的な目的は、上記の目標となる仕様を満たし、かつ、ヒトまたは動物に対する投与、例えば経口投与に適当かつ好適な薬学的形態を構成するPAA粒子を含む、活性成分の送達粒子の水性コロイド懸濁液を提供することにある。
【００１８】
本発明のもう１つの本質的な目的は、特に活性成分のベクターとして使用できるPAA粒子を製造する方法を提供することにあり、この方法はよりいっそう経済的で、実施が簡単で、かつ、活性成分に関しては変性しないものでなければならず、また得られる粒子の平均粒径の微制御が可能でなければならない。
【００１９】
本発明のもう１つの本質的な目的は、特に、タンパク質類、糖タンパク質類、ペプチド類、多糖類、リポ多糖類、オリゴヌクレオチド類またはポリヌクレオチド類などの活性成分の投与、特に経口、鼻腔、膣、眼、皮下、静脈、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、非経口での投与のための医薬製品(例えばワクチン)および／または栄養剤を製造するための上記懸濁液および粒子の使用にある。
【００２０】
本発明のもう１つの本質的な目的は、ヒトまたは動物生体へ前記APを投与するための、PAAベースの、かつ、AP、特に医薬および／または栄養剤APのベクターとして使用できる、DP(部分的にミクロン下粒子とミクロン粒子が存在)の懸濁液を提供することにある。
【００２１】
本発明のもう１つの目的は、活性成分の徐放系などの医薬製剤を提供することにあり、これはまた製造が容易で経済的であり、さらに生体適合性があり、APの極めて高レベルの生物学的利用能を保証できる。
【００２２】
本発明のもう１つの本質的な目的は、本来非免疫原性であって１種以上の抗原と組合せられるワクチン送達系を提供することにある。
【００２３】
本製剤に関する目的はとりわけ、中でも特に活性成分の送達に使用できる粒子(DP)に関するものであって、
−  αペプチド鎖を有する両親媒性直鎖ポリアミノ酸(PAA)ベースであり；
−  該PAAの親水性部分が前記PAAの疎水性部分よりも溶解度が高いためにディスクリート超分子配置で組織化されるようになると後者が沈殿する液体媒質、好ましくは水とPAAとを接触させることによって自己形成でき；
−  平均径が200μm未満、好ましくは100μm未満、より好ましくは0.01ないし20μmの間であり、
−  かつ、少なくとも１のAPと会合し、持続的かつ制御された様式でin vivoにて後者を放出可能で；
前記PAAの主鎖を構成する循環アミノ酸(rAA)が互いに同一または異なった構造であり、かつ、酸性タイプのアミノ酸、すなわちグルタミン酸およびアスパラギン酸、および／またはその塩、それぞれのグルタメートおよびアスパルテートからなる群より選択されることと、
これらのrAAのいくつかが夫々少なくとも１の疎水性R0基を有し、これらの疎水性R0基は互いに同一または異なっていることとを特徴とする
タイプのものである本発明によって達成される。
【００２４】
本発明の粒子の形成条件の１つは、PAAの親水性部分がその疎水性部分より液体懸濁媒質中でよりよく溶解するということである。
【００２５】
本発明に従って選択される循環アミノ酸(rAA)としては、COOHの形態または塩(カルボキシレート)COO-、X+(ここで、Xはアルカリ金属、好ましくはNaに相当する)の形態にあるカルボン酸官能基(GluおよびAsp)を含むアミノ酸がある。
【００２６】
DPを構成する材料のために、その（コ）モノマーが極性のある循環アミノ酸であり(rAA)、該rAA部分に疎水性側鎖を付加することによって親水性の性質を改変して両親媒性とした特定の種類のポリ-α-アミノ酸が選択されたことは本出願者らにとって賞賛に値することである。このようにして獲得された両親媒性の性質はPAAに、意図される適用において遭遇する生理学的媒質のpHに適合するDPのコロイド懸濁液を形成できる可能性を与えるものである。
【００２７】
有利にはこの選択によって疎水基の性質を考慮してより幅広い選択が可能となり、従ってポリマーおよびDPの疎水性を制御する手段がよりよいものとなり、それによりAPの会合と遊離を最適なものとすることができる。
【００２８】
PAAポリマーの構造、アミノ酸AspおよびGulならびに疎水基の性質は、ポリマー鎖が、小さく、かつ生理学的媒質中で安定な粒子の形態に自然と構成されるように選択する。
【００２９】
PAAポリマーの構造、アミノ酸AspおよびGulならびに疎水基の性質は、自然にかつタンパク質に関しては変性しないようなメカニズムによって水性媒質中でDPがタンパク質またはその他のAPを封入するように選択する。
【００３０】
PAAポリマーの構造、アミノ酸AspおよびGulならびに疎水基の性質は、DPが生理学的媒質中へAPを放出するように選択し、さらに厳密にはin vivoにおいて放出動力学はポリマーおよび形成し得るDPの性質によって異なる。
【００３１】
限定されるものではないが、この選択はより具体的にはその主鎖が互いに同一であるrAAからなるPAAに向けられる。PAAの一次構造は規則的な交互のブロック型(ブロックPAA)であっても、あるいは不規則なランダムブロック型(ランダムPAA)であってもよい。本発明の好ましい特徴によれば、PAAは約1000までのrAA、好ましくは約500までのrAA、より好ましくは約200までのrAAを含むポリマーである。
【００３２】
疎水性のR0基はDP形成の中心にあるポリマー鎖の凝集に寄与する。本発明の好ましい配置によれば、これらのR0基は互いに同一であっても異なっていてもよく、
(i)直鎖または分枝、好ましくは直鎖C1-C20、より好ましくはC2-C18、アルキル、アシルまたはアルケニル；
(ii)１以上のヘテロ原子を含む炭化水素系基、好ましくは酸素および／または硫黄を含むもの、より好ましくは下式：
【化２】
0004927256.tif 000002
【００３３】
｛式中、
R1基は互いに同一または異なっており、水素または上記(i)で示されたものと同じ定義を満たす基に相当し、
q=1ないし100｝
で示されるもの；
(iii)アリール類、アラルキル類またはアルキルアリール類、好ましくはアリール類；
(iv)天然の疎水性誘導体、好ましくはコレステロール、ホスファチジルコリン類およびジアシルグリセロール類；
からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の目的のためには、「炭化水素ベースの基」とは特に水素および炭素原子からなる基を意味するものとする。
【００３５】
好ましくはR0基は以下の基の群：メチル、エチル、プロピル、ドデシル、ヘキサデシル、オクタデシルから選択される。
【００３６】
本発明によれば、疎水性R0基の各々が好ましくは化学的加水分解および／または酵素的加水分解によって切断可能な共有結合を介して主鎖に結合しており、該結合はさらにとりわけエステルまたはアミド型のものである。
【００３７】
有利には疎水基を含むrAAモノマー部分は3%以上、好ましくは3ないし70%の間、より好ましくは13ないし60%の間の割合である。
【００３８】
特に本発明の懸濁液のDPを構成するPAAとしては例えば、
グルタメートベースのポリマー；
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-ブロック-(グルタミン酸メチル)、
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-ブロック-(グルタミン酸エチル)、
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-ブロック-(グルタミン酸プロピル)、
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-ブロック-(グルタミン酸オクタデシル)、
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-ブロック-(グルタミン酸ベンジル)、
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-コ-(グルタミン酸メチル)、
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-コ-(グルタミン酸エチル)、
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-コ-(グルタミン酸プロピル)、
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-コ-(グルタミン酸ドデシル)、
ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-コ-(グルタミン酸オクタデシル) 、
アスパルテートベースのポリマー；
ポリ(アスパラギン酸ナトリウム)-ブロック-(アスパラギン酸メチル)、
ポリ(アスパラギン酸ナトリウム)-ブロック-(アスパラギン酸エチル)、
ポリ(アスパラギン酸ナトリウム)-ブロック-(アスパラギン酸プロピル)、
ポリ(アスパラギン酸ナトリウム)-ブロック-(アスパラギン酸オクタデシル)、
ポリ(アスパラギン酸ナトリウム)-ブロック-(アスパラギン酸ベンジル)
がある。
【００３９】
平均径が0.01ないし0.5μm、好ましくは0.01ないし0.2μmの間のDPが有利である。本発明の目的のためには「平均径」または「平均粒径」とは体積による直径の算出[D4、3]、レーザー光散乱によって確定されたもの、弾性光散乱によって測定される旋回径を意味するものとする。
【００４０】
本発明の長所の１つは、それがこれらのマトリックス物質の平均粒径およびそれらの粒径分布の極めて良好な制御を達成したことである。この制御には、凝集によってこれらのナノ粒子を大きくすることができるという知見において極めて小さな、数ナノメートルのオーダーで、極めて多分散性の低い粒径を達成することを含む。
【００４１】
DPの大きさの制御はポリアミノ酸のrAAとR0の組成によって、また同じ組成でもブロック構造や製造方法の選択によって行う。
【００４２】
本発明の懸濁液のDPの大きさを選択考慮することにより、より大きな新たな粒子を得るためにこの送達粒子DPを凝集させる。
【００４３】
本発明のDPを構成するPAA材料は好ましくはホモポリマー、またはrAA=Aspおよび／またはGluであって、該rAA部分に疎水性の前記R0側鎖を付加することによってこのrAAの親水性の性質を改変することで両親媒性としたコポリマーである。このようにして得られた両親媒性の性質により少なくとも３つの新たな驚くべき特性を併せ持つことが可能となる；
１．第一に、意図される治療適用において遭遇する生理学的媒質のpHと適合するDPのコロイド懸濁液を自然形成することができることと；
２．第二に、水以外にそれらの溶媒として用いられる薬剤の不在下でDPとAPとが自然会合し、タンパク質の場合には変性しないことと；
３．第三に、意図される治療領域に使用できる薬物動力学および薬力学プロフィールを備えた生理学的条件下でAP-DP会合複合体のAPを放出することができること。
【００４４】
AP、特に天然タンパク質であるAPは実際に送達粒子DPによって捕捉され、これは水とPAAからなるマトリックスにAPが分散したものに当たる。それらの放出は自然解離によるか、またはPAAの分解およびその後の粒子の崩壊過程で起こる。該APの捕捉は、単にこれらを本発明のDPの水性コロイド懸濁液に混合することで自然に生じる。
【００４５】
少なくとも１の活性成分APが添加されたDP粒子は本発明のもう１つの主題をなす。
【００４６】
もう１つのその態様によれば、その本質的な主題をなす粒子の上流では、本発明はまたDPの前駆体に関し、この前駆体は先に定義されたように選択されたPAAである。
【００４７】
DPの下流では、本発明はまた、先に定義された粒子のコロイド、好ましくは水性懸濁液を包含する。
【００４８】
APが添加されたこのDPのコロイド懸濁液は治療を目的としたin vivoにおける該DPの送達、および持続的かつ制御的放出に使用できる。
【００４９】
本発明はさらに上記の粒子、例えば活性成分(AP)の送達粒子(DP)のコロイド懸濁液を製造する方法に関し、これは；
I  天然の極性アミノ酸、すなわちグルタミン酸およびアスパラギン酸、および／またはその塩、それぞれのグルタメートおよびアスパルテートから選択される循環アミノ酸(rAA)(なお、これらのrAAのいくつかは各々少なくとも１の疎水性R0基を含み、これらのR0基は互いに同一または異なっている)のαペプチド鎖を含む直鎖PAAを用いること；
II  溶媒、好ましくは水性媒質中に両親媒性PAAを入れること；および
III  次いで、少なくともR0含有rAAを媒質なしで不溶として、これらのrAAを沈殿させてディスクリート超分子配置(discrete supramolecular arrangement)を形成すること；
から実質的になることを特徴とする。
【００５０】
この方法の有利な変法によれば、少なくとも１の活性成分を粒子DPを含む液体媒質に配合して活性成分が添加されたDPのコロイド懸濁液を得る。
【００５１】
さらに、粒子を大きくするためには、この懸濁液製造工程において、塩および／または酸および／または塩基および／またはポリマー、所望によりイオン性ポリマー(例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミンなど)からなる少なくとも１の凝集剤を用いて該粒子を凝集させる少なくとも１つの付加工程を予め行うことが考えられる。さらなる詳細については特許出願FR95-03918を参照されたい。
【００５２】
粒子、該粒子のPAA前駆体、これらの粒子のコロイド懸濁液、およびこの懸濁液の製造の点で本発明の本質的な特徴を詳細に論じた後で、以下に、第一にPAAおよびAPが添加されていても添加されていなくともよい粒子の製造態様、第二にDP、およびAPの持続および制御放出のための医薬系におけるこれらのDP懸濁液の使用態様を多少さらに開発するのが適当である。
【００５３】
PAAはそれ自体公知の方法で得られる。これに関しては例えば"Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, 第12巻, 786頁; John Wiley & Sons"を参照されたい。本発明ではこの点について、好ましくは無水N-カルボキシ-α-アミノ酸を含む重合技術が用いられ、その製造方法は例えば"Biopolymers, 15, 1869 (1976)"に示されている。これらのN-カルボキシ-α-アミノ酸(NCA)モノマーを重合する技術に関しては、詳細はH.R. KRICHELDORF "α-Aminoacid-N-Carboxy Anhydride and Related Heterocycles" Springer Verlag (1987)による書物に示されている。
【００５４】
該ポリマー鎖における疎水基の分布の性質は、選択される合成経路によってランダムであっても規則的であってもよい。この点に関しては、本発明のDPの製造のための原料物質として選択されるPAAを製造する反応スキームには多くのものが存在する。限定されるものではないが、３つの反応スキームを以下に示す；
(i)少なくとも2種の疎水性循環基R01およびR02を含むPAAコポリマーの合成または使用(工程A)、さらに選択的削除によって(工程B)それらのうちの少なくとも一方が削除されて、その改変されない状況下(例えば、R01=メチル；R02=ベンジル；工程BはHBrなどの付加による水素化による脱ベンジルの工程である)でrAAを再生する；
(ii)すべて同一の疎水性R0基(例えば、メチル、エチル、プロピル、ベンジル、ステアリル)を含む疎水性循環アミノ酸(R0-rAA)を(もっぱら)含む疎水性PAAホモポリマーの合成または使用(工程A)、さらにR0基の一部の部分的削除(工程B)(例えば、ポリ(グルタミン酸メチル)PAAの加水分解または鹸化による)；
(iii)親水性循環アミノ酸rAAを(もっぱら)含む親水性PAAホモポリマーの合成または使用(工程A)、さらに１以上のR0基との共有結合の形成による部分的疎水化(工程B)(例えば、脂肪アルコール類を用いるエステル化またはハロゲン化アルキルを用いるイオン置換による)。
【００５５】
これらの3つの変法(i)、(ii)および(iii)において、rAAのペンダント側鎖に疎水性R0基をグラフトする結合単位は有利にはエステルまたはアミド官能基である。
【００５６】
実施上、変法(i)で用いられる疎水性PAAコポリマーとしては例えば、グルタミン酸のコポリマーおよび／またはアスパラギン酸のコポリマーがあり、ここではペンダントカルボキシル側鎖官能基が当業者に公知の技術に従うエステル化によって保護される。それらは例えばrAA01(Glu-O-ステアリル)N-無水カルボキシとrAA02(Glu-O-ベンジル)N-無水カルボキシの重合によって得られるコポリ(グルタミン酸ステアリル-グルタミン酸ベンジル)であってもよい。
【００５７】
コ−PAAの部分的親水化の結果、加水分解および／または鹸化によりR0基の1つが選択的に削除される。これは脱保護と同じであり、上の例では選択的脱ベンジル化である。本明細書においては疎水基R01およびR02を構成する種々のエステル類の切断の受けやすさの差が利用されている。公知の脱保護法の例としては、メチルエステルの鹸化によるもの(STAHMANら, J. Biol. Chem., 197, 771 (1952); KYOWA HAKKO, FR 2152582)または脱ベンジル化によるもの[BLOUTら, J. Amer. Chem. Soc., 80, 4631 (1958)]が挙げられる。
【００５８】
変法(ii)に関しては、疎水性PAAホモポリマーとしては例えば、Glu-O-ステアリルNCAの重合によって得られるポリ(グルタミン酸ステアリル)がある。上記公知の脱保護法によるこの疎水性ホモポリマーの部分加水分解によってポリ(グルタメート)-コ-(グルタミン酸ステアリル)が生じる。
【００５９】
変法(III)では、親水性PAAホモポリマーとしては例えば、グルタミン酸NCAの重合によって合成されるポリグルタミン酸またはポリグルタメートがある。この種のポリGlu  PAAの疎水化は例えば塩基性媒質中でヨウ化ステアリルと反応させることで行う。これにより、ポリ(グルタメート)-コ-(グルタミン酸ステアリル)が生じる。この種の技術は特に[Polymer Bulletin, 32, 127 (1994)]に記載されている。
【００６０】
本発明のコロイド懸濁液の形態の液体媒質中でのDPの形成は先に定義された両親倍性の合成中または合成後に行うことができる。
【００６１】
好ましい本発明によれば、粒子の形成は、溶媒に溶解したR0基含有PAAの溶液に対して水または塩を付加することによって行う。この操作は好ましくは疎水画分の溶解性を低下させてそれを沈殿させ、そうして粒子を形成させることを含む。当業者ならば、例えば温度または溶媒を改変する、または種々の技術を組み合わせることによって該ポリマーの疎水部分の溶解度を低下させるその他の簡単な手段を見出すことができる。
【００６２】
DPのコロイド懸濁液の製造の後、蒸留、濾過、pHの改変、クロマトグラフィーおよび／または透析などの当業者に公知の技術を含む精製工程を行うのが有利である。かかる方法によって望ましくない塩または溶媒を除去することができる。この任意の精製工程の後にDPのコロイド懸濁液が得られるが、これは直接用いることもできるし、あるいは考えられるところでは工程IVに関しては、例えば濾過、限外濾過、密勾配分画、遠心分離、沈殿、所望による酸の付加、または凍結乾燥によるなどのそれ自体公知且つ適切な物理的手段のいずれかで単離または回収することができる。
【００６３】
本発明の変法によれば、該コロイド懸濁液を製造する方法は、粒子DPを含む液体媒質に少なくとも１の活性成分を配合して１種以上の活性成分APが添加された、または会合したDPのコロイド懸濁液を得ることを特徴とする。
【００６４】
DPによるAPの捕捉をなすこの配合は以下のようにして行うことができる：
APを水溶液に溶かし、次いでDPをコロイド懸濁液の形態かまたは単離されたDPの形態(凍結乾燥物または沈殿物)のいずれかで添加すること；
あるいは、所望により水などの好適な溶媒に乾燥DPを分散させることで即時製造される粒子DPのコロイド懸濁液にAPを溶液かまたは純品か予め配合した状態で添加すること。
【００６５】
この活性成分は本発明の粒子と会合でき、医薬および／または栄養剤となり得る。それは好ましくは：
・タンパク質類および／またはペプチド類（中でも最も好ましく選択されるものはヘモグロビン類、シトクロム類、アルブミン類、インターフェロン類、抗原類、抗体類、エリトロポエチン、インスリン、成長ホルモン類、IX因子、インターロイキン類、またはその混合物である）、
・多糖類（ヘパリンが特に選択される）、
・核酸類および好ましくはRNAおよび／またはDNAのオリゴヌクレオチド類、
・ビタミン類、アミノ酸類および微量元素類、
・およびその混合物
から選択される。
【００６６】
本発明はまた、先に定義された特異なPAAを含むこれらの粒子DPの前駆体に向けられ、それらは上記で挙げられたタイプの医薬用AP、特にインスリン、および／または少なくとも１のワクチンにより形成されたAP用、または栄養用、植物保護用もしくは美容用APを含むことを特徴とする。
【００６７】
本発明はまた、上記のものと同じAPを含むことを特徴とする、特にDP前駆体に関するDPのコロイド懸濁液に関する。
【００６８】
最後に本発明は、APが添加され、先に定義されたDPを含んでなる医薬製品または薬学的若しくは栄養学的専門製品に関する。
【００６９】
もう１つのその態様によれば、本発明はまた、APの制御放出系などの医薬製品を製造するための、APを添加したこれらのDPの使用に向けられる。
【００７０】
医薬製品の場合、それらは例えば好ましくは経口、鼻腔、膣、眼、皮下、静脈、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、または非経口投与できるものであり得る。
【００７１】
考えられ得る美容適用としては例えば、経皮経路を介して適用できる組成物がある。
【００７２】
意図される植物保護製品としては例えば、除草剤、病虫害防除剤、殺虫剤、殺菌剤などが挙げられる。
【００７３】
本発明の主題はまた、上記で対照となる種のAPが添加されたDPを含有する植物保護および美容組成物でもある。
【００７４】
以下に示される例によって、その種々の生成物／方法／適用の態様において本発明がよりよく理解できるであろう。これらの例は、活性成分が添加されていても、されていなくともよいポリアミノ酸粒子の製造を示しており、それらにはまたこれらの粒子の構造的特徴と特性が示されている。
【００７５】
例
例1−ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-ブロック-(グルタミン酸メチル)ポリマーの製造
NCAの、ブロックまたはランダム構造を有するポリマーへの重合に用いられる手法は当業者に公知であり、H. R. KRICHELDORFによる書物 “α-aminoacids-N-Carboxy Anhydrides and Related Heterocycles”, Springer Verlag (1987)に詳細に示されている。以下の合成ではそれらのうちの1つの合成を記載している。
【００７６】
ポリ(GluOMe)63-ポリ(GluOBz)63の合成：60℃においてNCA-GluOMe 10gをジオキサン150mlおよびトルエン450mlの混合物に可溶化する。ジオキサン50ml中のベンジルアミン0.91gの溶液5mlを一定量のモノマーに加える。1時間後、予めジオキサン20mlおよびトルエン60mlの混合物に可溶化したNCA-GluOBz 14.1gを加える。さらに19ないし24時間、重合を続ける。メタノール2リットル中において反応媒質からポリマーを沈殿し、そこにさらに水500mlを加える。得られた固体を濾過し、50℃においてインキュベーターで真空乾燥させる。
【００７７】
収率：90%。NMR  1時間(TEA-d)による組成：GluOBz 45%モル。換算粘度(25℃においてTEA0.5%)：0.3dl/g。GPCによるモル質量：20,000g/mol。
【００７８】
次いでポリマー10gをトリフルオロメタンスルホン酸6mlを加えたTFA200ml中、0℃で15分間反応させる。ベンジル基の加水分解中にポリマーはコロイド粒子の形で沈殿する。乾固した後、粒子を水に溶解し、水酸化ナトリウムでpH7.4に中和する。透析工程によりトリフルオロ酢酸塩の除去を確実に行う。最後に粒子を凍結乾燥により単離する。
定量的収率。元素分析［Na］8.2%(計算組成53% GluONa)。
【００７９】
例2−ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-ブロック-(エチル)ポリマーの製造
このポリマーは1:3のモル比のグルタミン酸エチルNCAおよびグルタミン酸ベンジルNCAを用いて例1に記載の方法により製造する。重合および脱ベンジル化工程の後、pH7での透析によりポリマーを精製し、次いで凍結乾燥させて白色の粉末を得る。
【００８０】
例3−ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-ブロック-(グルタミン酸ヘキサデシル)ポリマーの製造
このポリマーは1:3のモル比のグルタミン酸ドデシルNCAおよびグルタミン酸ベンジルNCAを用いて例1に記載の方法により製造する。重合および脱ベンジル化工程の後、pH7での透析によりポリマーを精製し、次いで凍結乾燥させて白色の粉末を得る。
【００８１】
例4−ポリ(グルタミン酸ナトリウム)-コ-(グルタミン酸ドデシル)ポリマーの製造
ポリグルタミン酸（重合度120）10gをジメチルスルホキシド200mlに可溶化する。次いでKHCO315.5g、続いてヨードドデカン2.87mlを加える。反応媒質を窒素気流下において60℃で40時間、維持する。ポリマーを0.1Nの塩酸1.5lにより沈殿させて単離し、このように形成した沈殿物を水で数回洗浄する。この媒質を水酸化ナトリウムでpH7.4に調整して所望のコロイド懸濁液を得、次いで凍結乾燥により脱水する。最後に、凍結乾燥させたポリマーを酢酸エチルで数回洗浄し、50℃で真空乾燥させる。NMR(TEA-d)による組成：ドデシルエステル化グルタミン酸 12%。凍結乾燥後の残留水分：10.5%。元素分析率%（計算値）： C 41.29 (42.15); H 5.99 (6.01); N 7.45 (7.63); Na 10.44 (10.45) 。
【００８２】
例5−光散乱(LS)および走査型電子鏡検法(TEM)によるナノ粒子の証明
ポリマー1の粒子10mgを水10mlまたは塩水溶液に懸濁する。次いでこの溶液をコールター粒度計（またはレーザー回折計）に入れる。調べた種々の製品の粒径分析の結果を以下の表1に示す。
【００８３】
【表１】
0004927256.tif 000003
【００８４】
例6−ナノ粒子とタンパク質（インスリン）との会合に関する試験
pH7.4の等張リン酸バッファーを用いて40IU/mlに相当する1.4mg/mlに滴定したヒトインスリン溶液を調製する。例1で作製されるDP10mgをこのインスリン溶液1mlに分散させる。室温で15時間インキュベーションした後、遠心分離（16,000g、1時間）さらに限外濾過（濾過限界300,000D）によりDPが会合したインスリンと会合していないインスリンとを分離する。濾液から回収される会合していないインスリンをHPLCまたはELISAによりアッセイし、そこから差を計算して会合したインスリン量を推定する。DPが会合したインスリン量は0.77mgを上回っており、用いた全インスリン量の55%を超えていることがわかる。
【００８５】
以下の表では種々のDPについて行った会合の程度についての測定結果を示している。会合度は1.4mg/mlに滴定したインスリン調製物とDP10mg/mlにおける、用いたインスリンに対する会合したインスリンの割合を表す。
【００８６】
【表２】
0004927256.tif 000004
【００８７】
これに対し、インスリンはポリグルタミン酸ナトリウムとは会合しない。この予備試験を用い、DPとインスリンの最適な混合物を求め、DPとインスリンが高率で添加された最適な配合が得られる。
【００８８】
例7−DPと配合した後のタンパク質（インスリン）の解離および同定
DPとインスリンとを各々、例6における会合度の測定により求められた量を用いて製剤を調製する。
【００８９】
pH7.4の等張リン酸バッファーを用いて80IU/mlに相当する2.8mg/mlに滴定したヒトインスリン溶液を調製する。例1で作製されるDP56mgをこのインスリン溶液1mlに分散させる。要すれば、pHと等張性を調整し、PH7.4および280ないし300mOsで製剤を得る。
【００９０】
この調製物を0.01Mリン酸バッファーで、PH7.4において緩衝剤として働く漸増量の等張0.5%ウシアルブミン溶液に希釈する。放出されるインスリン部分をHPLCまたはELISAによりアッセイする。添付図面参照。放出される部分は希釈度とともに増大する。希釈度20で全てのインスリンが放出される。HPLCおよびELISAによるアッセイでこの製剤の90%を超えるインスリンが会合することがわかる。
【００９１】
例8−治療用タンパク質（インスリン）を添加したDPに関するIN-VIVO試験
DPとインスリンとを各々、例7における会合度の測定により求められた量を用いて製剤を調製する。
【００９２】
10ないし12kgの間の体重のビーグル犬（雄および雌）4匹の群を18時間絶食させる。調製物は例8により配合し、PBSバッファー1ml中インスリン80IUおよびDP56mg（例1により作製）からなる。次いでイヌに1IU/重量kgの割合でこのインスリン調製物の皮下投与を施す。グルコースアッセイおよびインスリンアッセイ用に注入前（-2時間、-1時間および0時間）および注入後（1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、20時間、24時間、28時間、32時間、36時間、40時間、44時間、48時間）に血液を採取する。グルコースオキシダーゼ法を用いてサンプル中のグルコース濃度を測定し、放射免疫学的方法を用いて血清インスリンをアッセイする。
【００９３】
添付の図1は例1により作製されるDPの血清インスリンおよびグルコースの、時間T（時間(h)）の関数としての放出の平均の結果である。黒丸の曲線は国際ミリ単位で表されるインスリン血症のものである。白丸の曲線はmmol/lで表される血糖症のものである。
【００９４】
以下の表3は例1ないし5の種々のDPの存在下におけるインスリンの作用の持続時間の結果を示す。
【００９５】
【表３】
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【００９６】
本例では本発明のDPの存在下においてインスリンが変性しないことを示す。
【００９７】
さらに、この例8により、インスリンの作用の持続時間の延長と、その結果としてのインスリンの制御された放出のための遅延系としてのDPの有用性が示される。また妥当な疎水基の選択により作用の持続時間がいかに制御され得るかも示される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  例1により作製されるDPの血清インスリンおよびグルコースの、時間T（時間(h)）の関数としての放出の平均の結果を示す図。
【図１】
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