(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの効力及び安定性をアッセイするための方法であって、
ａ）カスパーゼ３誘導に対して感受性の細胞群を、該ウイルスと接触させる工程；及び
ｂ）ウイルスの安定性の指標としてカスパーゼ３活性を測定し、カスパーゼ３の活性がより高いほど、ウイルスの安定性がより高いことを示す工程を含む方法。
【請求項２】
カスパーゼ３活性を、蛍光定量基又は比色定量基と結合したカスパーゼ３基質を用いて測定する請求項１の方法。
【請求項３】
基質が、ペプチドＡｓｐ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-Ａｓｐである請求項２の方法。
【請求項４】
ウイルスが、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、又は風疹ウイルスのいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
細胞群がＶｅｒｏ細胞又はＲＫ-１３細胞である請求項４の方法。
【請求項６】
工程（ａ）の前に、ウイルスが凍結乾燥されている請求項１の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）を、時間をあけて２回以上繰り返す請求項１の方法。
【請求項８】
工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、細胞を凍結させ、次いで解凍する請求項１の方法。
【請求項９】
安定化製剤を同定する方法であって、
ａ）第１の細胞群に、第１の試験製剤中に保存されたウイルスを感染させ、第２の細胞群を、第２の試験製剤中に保存されたウイルスと接触させる工程であって、該第１及び第２の細胞群は、同一株であり、カスパーゼ３誘導に対して感受性である工程；及び
ｂ）該安定化製剤を同定するため、該第１及び該第２の試験製剤の中に保存された該ウイルスにより生成したカスパーゼ３活性を測定し、カスパーゼ３の活性がより高いほど、ウイルスの安定性がより高いことを示す工程を含む方法。
【請求項１０】
工程（ａ）が、第３の細胞群を、第３の試験製剤中に保存されたウイルスと接触させること、及び第４の細胞群を、第４の試験製剤中に保存されたウイルスと接触させることをさらに含み、該第３及び第４の細胞群は、該第１及び第２の細胞群と同一の株である請求項９の方法。
【請求項１１】
カスパーゼ３活性を、蛍光定量基又は比色定量基と結合したカスパーゼ３基質を用いて測定する請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
基質が、ペプチドＡｓｐ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-Ａｓｐである請求項１１の方法。
【請求項１３】
ウイルスが、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、又は風疹ウイルスのいずれかである請求項１２の方法。
【請求項１４】
第１、第２、第３、及び第４の細胞群が、Ｖｅｒｏ細胞又はＲＫ-１３細胞のいずれかである請求項１３の方法。
【請求項１５】
第１の製剤、第２の製剤、第３の製剤、及び第４の製剤の中に保存されたウイルスが、凍結乾燥されている請求項１２の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）を、時間をあけて２回以上繰り返す請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ウイルスの効力及び安定性を測定するためのアッセイ、並びに異なる製剤中のウイルスの安定性を評価するためのアッセイに関する。
【０００２】
（発明の背景）
本明細書において引用された参照は、特許請求の範囲に記載された発明に対する先行技術とは認められない。
【０００３】
生ウイルスワクチンの開発においては、適度な免疫感作を確実にするため、ウイルスの効力及び安定性を決定することが重要である。プラークアッセイは、ウイルスの効力及び安定性を決定するための常法である。プラークアッセイは、ウイルスの安定性に対する異なる保存条件の効果を調査するためにしばしば用いることができる。
【０００４】
プラークアッセイには、予想された（推定された）効力により決定された希釈率で、ウイルスを細胞層へと接種することが含まれる。感染細胞を含有するプレートを、特定の時間インキュベートし、次いで染色する。ウイルス感染は、プラークの形成、又は死滅した、もしくは分離された細胞の領域をもたらす。プラーク数を計数することにより、効力の尺度である、対応するプラーク形成単位（ＰＦＵ）が得られる。ウイルスの安定性は、経時的なＰＦＵの変化を調査することにより決定される。
【０００５】
（発明の開示）
ウイルスによるカスパーゼ３活性の誘導は、ウイルスの活性の信頼性のある尺度を提供することが見出された。ウイルスによるカスパーゼ３活性の誘導のアッセイは、例えば、ウイルスの効力及び安定性を測定するための方法、並びに異なる製剤中のウイルスの安定性を評価するための方法において用いられうる。
【０００６】
従って、本発明の第１の面は、ウイルスによるカスパーゼ３活性の誘導を測定することにより、ウイルスの効力及び安定性をアッセイする方法を記載する。該方法は、カスパーゼ３誘導に対して感受性の細胞群（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）にウイルスを感染させること、並びにウイルスの効力及び安定性の指標としてカスパーゼ３活性を測定することを含む。細胞群とは、同一細胞株の集団である。
【０００７】
本発明のもう１つの面は、ウイルスのための安定化製剤を同定する方法を記載する。該方法は、カスパーゼ３誘導に対して感受性の細胞株に、異なる試験製剤中のウイルスを感染させることを含む。細胞株は、異なる細胞群として提供され、各細胞群がウイルス感染を受ける。異なる製剤中で保存されたウイルスにより生成したカスパーゼ３活性の誘導が、ウイルスを安定化する製剤を同定するため、測定される。
【０００８】
本発明のその他の特徴及び利点は、本明細書に提供される記載に基づき明らかとなる。本明細書に提供された具体例は、本発明を実施するために有用な異なる成分及び方法論を例示するものである。具体例は、特許請求の範囲に記載された発明を制限しない。本開示に基づき、当業者は、本発明を実施するためのその他の成分及び方法論を同定し使用することができる。
【０００９】
（図面の簡単な説明）
図１ａ及び１ｂは、凍結乾燥ウイルス及び液体バルクウイルス（即ち、清浄化ウイルスの濃縮ロット）を用いた、カスパーゼ３活性のための誘導時間を示す図である。ＲＦＵ（相対蛍光単位）値は、バックグラウンドシグナルを差し引くことにより調整された（調整ＲＦＵ）。図１ａは、凍結乾燥流行性耳下腺炎ウイルス（「ＭｕＶ」）、凍結乾燥風疹ウイルス（「ＲｂＶ」）、及び凍結乾燥麻疹ウイルス（「ＭｅＶ」）を用いた誘導時間を示す図である。図１ｂは、バルク麻疹ウイルスを用いた誘導時間を示す図である。
【００１０】
図２ａ及び２ｂは、カスパーゼ３活性誘導の線形域を示す図である。図２ａは、麻疹ウイルスを用いた結果を示す。図２ｂは、流行性耳下腺炎ウイルスを用いた結果を示す。
【００１１】
図３は、様々な試料における麻疹ウイルス誘導の変動を示す図である。「液体」は、非凍結乾燥凍結部分を示す。「Ｄ０」は、−７０℃で保存された凍結乾燥非インキュベーション試料を示す。１週間試料は、最初に凍結乾燥させられ、３７℃で１週間保存された。「Ａ」、「Ｃ」、「Ｄ」、及び「Ｆ」は、異なるワクチン製剤をさす。
【００１２】
図４は、プラークアッセイとカスパーゼ３アッセイとの比較を示す図である。活性は、異なる環境で保存された麻疹ウイルスを用いて測定された。「Ｌｉｑ」は、非凍結乾燥凍結部分を示す。「Ｄ０」は、−７０℃で保存された凍結乾燥非インキュベーション試料を示す。「Ｄ７」は、３７℃で１週間インキュベートされた凍結乾燥試料を示す。「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、及び「Ｄ」は、異なる製剤をさす。
【００１３】
図５は、プラークアッセイとカスパーゼ３アッセイとの比較を示す図である。ウイルス活性は、異なる環境で保存された流行性耳下腺炎ウイルスを用いて測定された。「Ｌｉｑ」は、非凍結乾燥凍結部分を示す。「Ｄ０」は、−７０℃で保存された凍結乾燥非インキュベーション試料を示す。「Ｄ７」は、３７℃で１週間インキュベートされた凍結乾燥試料を示す。「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、及び「Ｄ」は、試験された異なるワクチン製剤をさす。
【００１４】
図６は、プラークアッセイとカスパーゼ３アッセイとの比較を示す図である。ウイルス活性は、異なる環境で保存された風疹ウイルスを用いて測定された。「Ｌｉｑ」は、非凍結乾燥凍結部分を示す。「Ｄ０」は、−７０℃で保存された凍結乾燥非インキュベーション試料を示す。「Ｄ７」は、３７℃で１週間インキュベートされた凍結乾燥試料を示す。「Ｈ」、「Ｉ」、「Ｊ」、「Ｋ」、及び「Ｌ」は、異なるワクチン製剤をさす。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
ウイルスによるカスパーゼ３活性の誘導の測定は、ウイルスの効力及び安定性の信頼性のある尺度を提供することが見出された。ウイルスによるカスパーゼ３活性の誘導の測定の有用な特性には、カスパーゼ３活性の誘導が麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、及び風疹ウイルスを含む異なるウイルスにより達成されること；カスパーゼ３活性の誘導が再現性を有すること；カスパーゼ３活性の誘導がウイルス希釈に対して高感度であること；カスパーゼ３活性の誘導が試料の差違に対して高感度であること；及びカスパーゼ３活性の誘導がプラークアッセイと相関していることが含まれる。従って、カスパーゼ３アッセイは、異なる製剤及び多様なウイルスに適用される事ができる。さらに、カスパーゼ３活性は、凍結及び解凍により実質的に影響を受けず、特異的に検出され、かつ中断可能である。これらの利点は、日常的な実験的操作のため容易にアッセイを実行することを可能にする。
【００１６】
カスパーゼ３アッセイのもう１つの利点は時間である。ウイルスの安定性を測定する場合、カスパーゼ３アッセイはプラークアッセイよりも迅速に達成されうる。標準的なプラークアッセイは、およそ７〜１０日を要するが、カスパーゼ３アッセイはその約半分の時間で実施されうる。
【００１７】
（カスパーゼ３）
カスパーゼ３（ＣＰＰ３２、アポパイン（ａｐｏｐａｉｎ）としても既知）は、カスパーゼプロテアーゼファミリーのメンバーである。カスパーゼは、能動的な細胞自殺過程であるアポトーシスにより誘導される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４５６−１４６２，１９９５；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：２９７−３０１，１９９６；Ｌｉｎｃｚ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７６：１−１９，１９９８）。アポトーシスは、異なるウイルスによる感染を含む、異なる刺激により誘導されることが示されている（Ｓｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ５：１０５−１１１，１９９５；Ｓａｄｚｏｔ−Ｄｅｌｖａｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６：２８７５−２８７９，１９９５；Ｅｓｏｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６９：３９５５−３９５８，１９９５；及びＩｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１１５−１２２，１９９６）。しかしながら、カスパーゼ３を阻害するバキュロウイルスタンパク質ｐ３５のような、ある種のウイルスタンパク質は、アポトーシスを遮断することが示されている（Ｌｉｎｃｚ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７６：１−１９，１９９８）。
【００１８】
カスパーゼ３は、活性型プロテアーゼを形成させるＡｓｐ残基における分解により、プロ酵素から合成されるシステインプロテアーゼである。活性型カスパーゼ３プロテアーゼも、Ａｓｐ残基において分解する。カスパーゼ３のための特異的な認識配列は、ペプチドＡｓｐ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-Ａｓｐである（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：３０７６１−３０７６４；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：３７−４３，１９９５；Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２７０９９−２７１０６，１９９６；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：１８４１−１８４４，１９９６；及びＣａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１９５７−１９６４（これらの参照はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる））。
【００１９】
（適切なウイルス及び細胞の選択）
本発明において用いるための適当なウイルス及び細胞は、特定の細胞の、特定のウイルスに感染した場合のカスパーゼ３誘導に対する感受性に基づき、選択する事ができる。特定の細胞に感染するウイルスの能力は、ウイルスがカスパーゼ３活性を誘導する能力と同様に、容易に決定できる。細胞及びウイルスの妥当性を測定するために用いられる手法の例は、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、及び風疹ウイルスを用いた後述の実施例の項に記載されている。その他の細胞（例えば、ＭＲＣ−５）及びウイルス（例えば、水痘−帯状疱疹ウイルス）も、本発明において有用であると予想される。
【００２０】
（カスパーゼ３活性の測定）
「カスパーゼ３活性」とは、カスパーゼ３基質Ａｓｐ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-Ａｓｐ（「ＤＥＶＤ」）を分解する能力を有する酵素活性をさす。そのような活性は、カスパーゼ３及び少なくとも１つの関連酵素Ｍｃｈ３αにより生成することが既知である（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：６０４５−６０５２，１９９５（参照により本明細書に組み込まれる））。
【００２１】
本開示に基づき、ウイルス感染により生成したカスパーゼ３活性は、当分野において周知の技術を用いて測定されうる。好ましくは、カスパーゼ３活性は、比色定量用又は蛍光定量用に標識された基質を用いて測定される。より好ましくは、使用される基質は、比色定量基又は蛍光定量基と結合したＤＥＶＤである。そのような基の例には、比色定量基ｐ−ニトロアニリド（λｍａｘ=５０５ｎｍ）及び蛍光定量基７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（「ＡＦＣ」、λｍａｘ=４００ｎｍ）が含まれる（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，７−１４頁，Ｚｈｕ及びＣｈｕｎ編，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ，１９９８（いずれも、参照により本明細書に組み込まれる））。比色定量用又は蛍光定量用に標識された基質は、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，７−１４頁，Ｚｈｕ及びＣｈｕｎ編，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ，１９９８；及びＡｐｏＡｌｅｒｔ（登録商標）ＣＰＰ３２/Ｃａｓｐａｓｅ-３  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（ＰＴ３０８３−１），ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．１９９８（いずれも、参照により本明細書に組み込まれる）により記載されたもののような手法を用いて使用されうる。
【００２２】
カスパーゼ３アッセイは、好ましくは、液体又は凍結乾燥いずれかの形態のウイルスワクチン試料に対して使用される。例えば、凍結乾燥ウイルス試料を、再生し、希釈し、そして細胞層へと播くことができる。試料をインキュベートし、細胞を溶解させ、細胞溶解物を収集し、そして−７０℃で凍結させる。濡れた氷（約５℃）の上で解凍した後、遠心分離により細胞片を除去し、反応緩衝液を含有する新たなチューブへと上清を除去し、そしてＤＥＤＶ−ＡＦＣ基質を細胞上清と共にインキュベートする。
【００２３】
（実施例）
本発明の異なる特徴及び利点をさらに例示するため、以下に実施例を提供する。実施例は、本発明を実施するための有用な方法論も例示する。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載された発明を制限しない。
【００２４】
（方法及び材料）
後述の結果を得るため、細胞の増殖、カスパーゼ３活性の誘導、及びカスパーゼ活性の測定において一般的に用いられた方法及び材料は、以下の通りであった。
【００２５】
（Ｖｅｒｏ細胞及びＲＫ-１３細胞の増殖）
Ｖｅｒｏ細胞は、５％ＣＯ２で、３５℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び０．５％ネオマイシンを含有するＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ/ＢＲＬカタログ番号１１１５０−０５９）中で、１６２ｃｍ２フラスコ内でコンフルエント状態になるまで増殖させた。次いで、フラスコを傾けて上清を捨て、培地を中和するため、１xトリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｇｉｂｃｏ/ＢＲＬカタログ番号２５２００−０５６）３ｍｌを、フラスコへ添加した。フラスコを傾けてトリプシンを捨て、さらに２ｍｌのトリプシンを添加し、５％ＣＯ２で３５℃で１０〜１５分間インキュベートした。次いで、１０％ＦＢＳ及び０．５％ネオマイシンを含有するＭ１９９を２０ｍｌでフラスコの底まで細胞を洗浄した。
【００２６】
５．４x１０４個/ｍｌの細胞を２４穴プレートに播いた。各ウェルに、希釈された細胞（１０％ＦＢＳ及び０．５％ネオマイシンを含有するＭ１９９で希釈）２ｍｌを添加した。プレートを３５℃で２日間インキュベートし、次いでカスパーゼ３誘導のため用いた。ＲＫ-１３細胞の増殖は、培地の除きＶｅｒｏ細胞と同一であった。ＲＫ-１３細胞は、１０％ＦＢＳ及び０．５％ネオマイシンを含有するＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ/ＢＲＬ）で増殖させた。６．０x１０４個/ｍｌの密度で、１ウェル当たり２ｍｌの細胞を播いた。
【００２７】
（カスパーゼ３活性の誘導）
一般的に、麻疹ウイルス及び流行性耳下腺炎ウイルスの感染にはＶｅｒｏプレートを用い、風疹ウイルス感染にはＲＫ-１３細胞を用いた。麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、及び風疹ワクチンの組み合わせの凍結乾燥製剤を用いた。凍結乾燥製剤は、０．７ｍｌのｄＨ２Ｏで再生した。凍結液体試料は、用いる前に室温で解凍した。再生又は液体解凍の後、試料を各希釈液で１：２、１：５、１：１０、又は１：２０に希釈した。希釈液は、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、及び風疹ウイルスのうちアッセイされないウイルスに対する抗体を含有していた（例えば、麻疹ウイルス抗体についてアッセイする場合には、流行性耳下腺炎ウイルス及び麻疹ウイルスに対する抗体が用いられた）。
【００２８】
細胞（２．０x１０５個）に、希釈された試料５０μｌを感染させた。各試料は、２４穴プレート上の６ウェルを感染させるために用いられた。次いで、流行性耳下腺炎ウイルス及び麻疹ウイルスについてアッセイするプレートの場合には１時間、風疹ウイルスについてアッセイするプレートの場合には２時間、５％ＣＯ２で、３５℃で、プレートをインキュベートした。この接着期の間、細胞層が培地で適切に覆われるよう、１５分毎にプレートを振とうした。接着期の後、Ｖｅｒｏ細胞については、１０％ＦＢＳ及び０．５％ネオマイシンを含有するＭ１９９培地１ｍｌ、ＲＫ-１３細胞については１０％ＦＢＳ及び０．５％ネオマイシンを含有するＭＥＭ１ｍｌを細胞に重層した。次いで、５％ＣＯ２で、３５℃で、９３〜９６時間、プレートをインキュベートした。
【００２９】
（カスパーゼ３アッセイ）
誘導期の後、ウェルから培地を吸引した。１ウェル当たり３０μｌの冷却細胞溶解緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。試料を氷上で１０分間インキュベートし、次いで１つの微量遠心管へ、２ウェルを共にプールした。試料は、ドライアイス上で凍結させ分析時まで−７０℃で保存するか、又は直ちにアッセイした。
【００３０】
試料を４℃で５分間１２，０００ｒｐｍで沈降させた。上清（５０μｌ）を新たな微量遠心管へ除去し、７ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する２x反応緩衝液５０μｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ＣＨＡＰＳ）を添加した。１ｍＭ  ＤＥＶＤ-ＡＦＣ基質５μｌを反応液に添加し、簡単に攪拌した。次いで、循環水浴中で３７℃で１時間、試料をインキュベートした。インキュベーション後、１０％Ｈ３ＰＯ４２０μｌを用いて反応を中断させた。中断させられた反応液（１００μｌ）を９６穴プレートに添加し、ＴＥＣＡＮ蛍光プレートリーダーで読み取った（励起：３９０ｎｍ、放出：４８０ｎｍ、利得：６０）。
【００３１】
（結果）
（麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、及び風疹ウイルスにより誘導されたカスパーゼ３活性の検出）
麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、及び風疹ウイルスの、細胞におけるカスパーゼ３活性を誘導する能力を、Ｖｅｒｏ細胞及びＲＫ-１３細胞を用いて確認した。カスパーゼ３活性は、前記の方法及び材料のようにして測定した。Ｖｅｒｏ細胞は、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、及び風疹ウイルスで誘導し、ＲＫ-１３細胞は風疹ウイルスで誘導した。結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0004864209.tif 000002
【００３３】
観察されたシグナルがウイルスによるものであることを保証するため、１セットのＶｅｒｏ細胞に麻疹ウイルスを感染させ、もう１セットのＶｅｒｏ細胞にプラセボを感染させた。プラセボは、５０〜５００という調整ＲＦＵを生成させたが、麻疹ウイルスは約７，７５０という調整ＲＦＵを生成させた。これらの結果は、カスパーゼ３活性の有意な変化が、製剤成分ではなくウイルス感染によるものであることを証明している。
【００３４】
（カスパーゼ３活性に対する凍結−解凍の効果）
感染後の様々な時点でアッセイを実施することを可能にするためには、試料を凍結させ、後に都合のよい時点で解凍することができる。凍結及び解凍がカスパーゼ３活性に影響を与えるか否かを決定するため、細胞溶解後、試料をドライアイス上で凍結させ、−７０℃で保存した。次いで、試料を解凍し、凍結していない１セットの試料と共にアッセイした。非凍結細胞は２，１６７という調整ＲＦＵを生成させたが、凍結細胞は約２，１７５．５という調整ＲＦＵを生成させた。従って、凍結−解凍は、カスパーゼ３活性に影響を与えないと考えられる。従って、実際のアッセイを後に実施することができるよう、多くの試料を作成し、次いで、様々な時間保存することができる。
【００３５】
（ウイルスバルクのインキュベーションに必要な最適な時間の決定）
様々な試料でカスパーゼ３活性を誘導するために必要な時間は、ウイルス及び感染多重度（ＭＯＩ）によって異なりうる。麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、及び風疹ウイルスの感染のための好ましい時間を決定するため、Ｖｅｒｏ細胞又はＲＫ-１３細胞に、（１）麻疹ウイルスバルク、並びに（２）異なる凍結乾燥された麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、及び風疹ウイルスを感染させた。流行性耳下腺炎ウイルス及び麻疹ウイルスはＶｅｒｏ細胞に感染させ、風疹ウイルスはＲＫ-１３細胞に感染させた。長期的な研究を開始し、バルク試料については２４、４６、７２、及び９６時間、凍結乾燥試料については２６、４７、７５、９４、９５、９７、及び１００時間の時点で収集を行った。
【００３６】
異なる時点の結果を図１ａ及び１ｂに示す。凍結乾燥製剤中の３種のウイルスは全て９５時間付近でピークシグナルを示す（図１ａ）。麻疹ウイルスバルクによる感染で観察された最適シグナルは、４６時間付近であった（図１ｂ）。バルク試料は、はるかに高い力価を含有し、接種時により多くの細胞に感染することにより、最適なシグナルを保証するために必要な時間を減少させるため、この全体的な時間の差違は予想通りである。
【００３７】
（麻疹ウイルス及び流行性耳下腺炎ウイルスで誘導された細胞からのカスパーゼ３酵素反応の線形性）
酵素活性を検討し比較する場合、アッセイの線形域内で見出されたデータを収集することが重要である。麻疹ウイルス及び流行性耳下腺炎ウイルスによる誘導の後、試料をアッセイし、麻疹ウイルスについては１時間、流行性耳下腺炎ウイルスについては１時間半にわたり、データを収集した。図２ａ（麻疹ウイルス）に示されたデータは、アッセイが少なくとも１時間線形であることを示しており、図２ｂ（流行性耳下腺炎ウイルス）に示されたデータは、アッセイが少なくとも７５分間線形であることを示している。従って、カスパーゼ３酵素活性のため１時間というインキュベーション時間を用いれば、収集されたデータが有意義となることが保証されるであろう。
【００３８】
（非特異的基質分解の決定）
未精製の細胞溶解物を用いる場合に懸念されるのは、溶解物中に見出される他のプロテアーゼに由来する非特異的な基質分解の効果である。カスパーゼ３の特異的阻害剤ＤＥＶＤ-ＣＨＯを用いて、カスパーゼ３アッセイを実施し分析した。非特異的分解がアッセイ中に起こるのであれば、阻害剤の添加は、基質の分解を完全には抑制しないであろう。表２に示された結果は、１μＭ  ＤＥＶＤ-ＣＨＯ阻害剤の添加により、ＲＦＵシグナルが排除されることを示している。
【００３９】
【表２】
0004864209.tif 000003
【００４０】
カスパーゼ３阻害剤なしの試料は、阻害剤を含有する試料よりも約３，０００倍の増加を示す。従って、非特異的分解はこれらの細胞溶解物中で起こっておらず、シグナルはカスパーゼ３活性に由来する。
【００４１】
（１０％Ｈ３ＰＯ４を用いたカスパーゼ３アッセイの中断の効果）
酵素を用いる場合、一貫したデータを保証するためには、反応を中断することができることが有用である。中断は、各試料が同じ量の時間インキュベートされることを保証するために用いられ得る。中断が、生成するＲＦＵシグナルに影響を与えないことを保証するため、中断条件を調査することが有用である。いくつかの状況においては、蛍光ペプチドの中断が、全体的なシグナルを妨害し、データの解釈を困難にする。
【００４２】
１時間のインキュベーション期の後、試料を１０％Ｈ３ＰＯ４を２０μｌで中断し、ＴＥＣＡＮプレートリーダー上で分析した。データを、中断を受けていない試料から得られたものと比較した。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
0004864209.tif 000004
【００４４】
結果は、非誘導試料と誘導試料との比率が同一であることを示している。従って、反応の中断は、相対シグナル強度に影響を与えない。
【００４５】
（カスパーゼ３アッセイの再現性）
麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、又は風疹ウイルスにより誘導された試料を用いて、同一試料のバイアル３個を用いることにより、カスパーゼ３活性の測定の再現性を調査した。表４に表されたデータは、アッセイが再現性を有し、極めて一貫していることを示している。
【００４６】
【表４】
0004864209.tif 000005
【００４７】
（カスパーゼ３シグナルに対する希釈の効果）
定量アッセイを作製するためには、試料を異なる感染多重度に希釈した場合の、シグナルの差違を検出することが重要である。これを解決するため、麻疹ウイルス及び風疹ウイルスの凍結乾燥試料を各希釈液で１：２、１：５、及び１：１０に希釈し、流行性耳下腺炎ウイルスを１：２０、１：４０、及び１：８０に希釈し、カスパーゼ３シグナルに対する効果を測定した。結果を表５及び６に示す。
【００４８】
【表５】
0004864209.tif 000006
【００４９】
【表６】
0004864209.tif 000007
【００５０】
希釈効果は、３つのウイルス全てについて観察された。これは、希釈率を増加した際のシグナルの全体的な減少により観察される。従って、カスパーゼ３活性の誘導は、細胞への感染に用いられる感染多重度により影響を受ける。シグナル出力は希釈により影響を受けるため、ワクチン製剤間の直接的な比較のためには、感染多重度を同一にすることが重要である。
【００５１】
（様々な凍結乾燥試料に由来するシグナルの差違の検出）
異なる条件下で保存されたウイルス調製物の安定性を測定するためにカスパーゼ３アッセイを用いることの妥当性を決定するため、異なる試料及び保存条件の効果を検出するカスパーゼ３アッセイの能力を測定した。
【００５２】
図３に示されたデータは、ウイルスの安定性に対する異なる条件の効果が、カスパーゼ３活性の測定によって測定されることを例示している。従って、カスパーゼ３アッセイは、様々な製剤組成及び保存条件による、ウイルスの効力及び安定性の差違を検出することができる。
【００５３】
（プラークアッセイとカスパーゼ３アッセイとの相関）
麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、及び風疹ウイルスを用いて、プラークアッセイとカスパーゼ３アッセイとの相関を調査するため、安定性研究を実施した。図４〜６に示されたデータは、ＰＦＵ効力が減少するにつれ、対応するカスパーゼ３シグナルも減少することを例示している。
【００５４】
その他の実施態様も、以下の特許請求の範囲に含まれる。いくつかの実施態様が示され、記載されたが、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な修飾を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  図１ａは、凍結乾燥流行性耳下腺炎ウイルス（「ＭｕＶ」）、凍結乾燥風疹ウイルス（「ＲｂＶ」）、及び凍結乾燥麻疹ウイルス（「ＭｅＶ」）の凍結乾燥ウイルス及び液体バルクウイルス（即ち、清浄化ウイルスの濃縮ロット）を用いた、カスパーゼ３活性のための誘導時間を示す図である。
【図１ｂ】  図１ｂは、バルク麻疹ウイルスの凍結乾燥ウイルス及び液体バルクウイルス（即ち、清浄化ウイルスの濃縮ロット）を用いた、カスパーゼ３活性のための誘導時間を示す図である。
【図２ａ】  図２ａは、麻疹ウイルスを用いたカスパーゼ３活性誘導の線形域を示す図である。
【図２ｂ】  図２ｂは、流行性耳下腺炎ウイルスを用いたカスパーゼ３活性誘導の線形域を示す図である。
【図３】  様々な試料における麻疹ウイルス誘導の変動を示す図である。
【図４】  プラークアッセイとカスパーゼ３アッセイとの比較を示す図である。
【図５】  プラークアッセイとカスパーゼ３アッセイとの比較を示す図である。
【図６】  プラークアッセイとカスパーゼ３アッセイとの比較を示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
0004864209.tif 000009
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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