(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象である標本の画像を取得するレーザー顕微鏡の制御を行う顕微鏡制御装置であって、
前記標本の観察のために用いられるレーザー光の強度を設定する強度設定手段と、
画像を検出する光検出器の感度を設定する感度設定手段と、
前記強度設定手段により設定されたレーザー光の強度と前記感度設定手段により設定された前記光検出器の感度とが記憶される記憶手段と、
前記感度設定手段により設定される前記光検出器の感度を決定する感度決定手段と、
を有し、
前記感度決定手段は、前記標本の通常観察時に用いられるレーザー光の強度とフォトブリーチ実行時に用いられるレーザー光の強度とに基づいて、フォトブリーチ実行時の画像を検出する光検出器の感度を決定することを特徴とする顕微鏡制御装置。
【請求項２】
前記感度決定手段は、通常観察時の光検出器の感度と、通常観察時のレーザー光強度とフォトブリーチ実行時のレーザー光強度との比と、に基づいて、フォトブリーチ実行時の光検出器の感度を決定することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡制御装置。
【請求項３】
観察対象である標本の画像を取得するレーザー顕微鏡の制御をコンピュータに実行させるための顕微鏡制御プログラムであって、
前記標本の通常観察時に用いられるレーザー光の強度とフォトブリーチ実行時に用いられるレーザー光の強度とに基づいて、フォトブリーチ実行時の画像を検出する光検出器の感度を決定する、
ことを前記コンピュータに実行させるための顕微鏡制御プログラム。
【請求項４】
前記強度設定手段は、標本観察を行なうための第１の強度と、フォトブリーチを行なうための第２の強度とに切り換え設定可能であることを特徴とする請求項１の顕微鏡制御装置。
【請求項５】
前記感度設定手段は、標本観察用の第１の感度とフォトブリーチ用の第２の感度とに切り換え設定可能であり、
前記記憶手段は少なくとも前記第１の強度と前記第１の感度を記憶し、
前記感度決定手段は、前記第１の強度、前記第１の感度及び前記第２の強度に基づいて、前記第２の感度を決定することを特徴とする請求項４の顕微鏡制御装置。
【請求項６】
前記標本に対するレーザーの走査と画像取得を所定のインターバル時間をおいて繰り返す時間経過観察処理を行なう時間経過観察制御手段を備え、
所定のインターバル時間での時間経過観察処理を実行中に前記顕微鏡制御装置がフォトブリーチ用の条件設定指示を受け付けた場合、前記強度設定手段がレーザ光の強度を前記第２の強度に設定し、前記感度設定手段が光検出器の感度を前記第２の感度に設定し、前記記憶手段が前記所定のインターバル時間を記憶し、かつ前記時間経過観察制御手段が前記インターバル時間を最小に設定して当該時間経過観察処理を行なうことにより、フォトブリーチを実行することを特徴とする請求項４または５の顕微鏡制御装置。
【請求項７】
前記フォトブリーチ実行中に前記顕微鏡制御装置が通常観察用の条件設定指示を受け付けた場合、前記強度設定手段がレーザ光の強度を前記第１の強度に設定し、前記感度設定手段が光検出器の感度を前記第１の感度に設定し、前記時間経過観察制御手段が前記インターバル時間を前記所定のインターバル時間に設定して当該時間経過観察処理を行なうことにより、フォトブリーチ後の標本観察を実行することを特徴とする請求項６の顕微鏡制御装置。
【請求項８】
前記感度設定手段に代えて、検出光路上に設けられた光透過率変更デバイスに対して当該光透過率を設定する透過率変更手段を備えることを特徴とする請求項１，４，５，６または７のいずれかに記載の顕微鏡制御装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、観察対象である標本の画像を取得するレーザー顕微鏡の制御を行う顕微鏡制御装置、顕微鏡制御方法、及び顕微鏡制御プログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種研究所等では、走査型レーザー顕微鏡を使用したＦＲＡＰ(Fluorescence Recovery After Photobleaching)の実験が行われている。走査型レーザー顕微鏡は、点光源であるレーザービーム（レーザー光）を対物レンズを介して標本のＸ軸及びＹ軸方向に走査しながら照射し、標本からの反射光又は蛍光を再び対物レンズ等の光学系を介して光検出器で検出し、２次元画像の濃淡情報を得るようにしたもので、この濃淡情報の２次元分布をＸ−Ｙ走査位置に対応させてＣＲＴモニタ、カラープリンタ等の画像出力装置に輝点の分布として表示することで画像化し、観察できるようにしている。
【０００３】
この走査型レーザー顕微鏡を使用したＦＲＡＰの実験では、例えば、まずフォトブリーチ実行前の標本画像を取得し、続いてフォトブリーチを実行し、そしてフォトブリーチ終了後及び蛍光復帰の間の標本画像を取得する等の手順で実験が行われる。このとき、フォトブリーチ実行中に標本へ照射するレーザービームの強度は、フォトブリーチ実行前後の画像取得時に標本へ照射するレーザービームの強度よりも遥かに大きい強度で照射される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そのため、フォトブリーチ実行中に画像取得を行おうとすると、その強度の強いレーザービームによって標本からの蛍光量が増大し、前述のフォトブリーチ実行前後における光検出器の感度のままでは、いわゆるサチュレートした不適正な画像しか得られず、適正な画像を取得することが出来なかった。従って、従来においては、フォトブリーチ実行中の画像観察が出来ないという問題があった。
【０００５】
例えば、特開２０００−３５４００号公報には、フォトブリーチングを行うレーザー走査型顕微鏡が記載されているが、フォトブリーチング中の画像取得については何ら開示されていない。
本発明の課題は、上記実情に鑑み、フォトブリーチ実行中の画像観察を可能にする顕微鏡制御装置、顕微鏡制御方法、及び顕微鏡制御プログラムを提供することである。
【０００６】
請求項１記載の発明は、観察対象である標本の画像を取得するレーザー顕微鏡の制御を行う顕微鏡制御装置であって、前記標本の観察のために用いられるレーザー光の強度を設定する強度設定手段と、画像を検出する光検出器の感度を設定する感度設定手段と、前記強度設定手段により設定されたレーザー光の強度と前記感度設定手段により設定された前記光検出器の感度とが記憶される記憶手段と、前記感度設定手段により設定される前記光検出器の感度を決定する感度決定手段と、を有し、前記感度決定手段は、前記標本の通常観察時に用いられるレーザー光の強度とフォトブリーチ実行時に用いられるレーザー光の強度とに基づいて、フォトブリーチ実行時の画像を検出する光検出器の感度を決定することを特徴とする顕微鏡制御装置である。
【０００９】
上記の構成によれば、フォトブリーチ実行中の画像取得を可能にする光検出器の感度を決定することができる。
請求項３記載の発明は、観察対象である標本の画像を取得するレーザー顕微鏡の制御をコンピュータに実行させるための顕微鏡制御プログラムであって、前記標本の通常観察時に用いられるレーザー光の強度とフォトブリーチ実行時に用いられるレーザー光の強度と
に基づいて、フォトブリーチ実行時の画像を検出する光検出器の感度を決定する、ことを前記コンピュータに実行させるための顕微鏡制御プログラムである。
【００１０】
上記のプログラムをコンピュータに実行させることにより、フォトブリーチ実行中の画像取得を可能にする光検出器の感度を決定することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡制御装置を含む顕微鏡システムのシステム構成を示す図である。
【００１２】
同図において、顕微鏡システムは、走査型レーザー顕微鏡１及び顕微鏡制御装置２から構成されている。
走査型レーザー顕微鏡１は、レーザー光源３、ミラー４、ダイクロイックミラー５、２次元走査ユニット６、レボルバ７、対物レンズ８、ステージ９、試料１０、レンズ１１、ピンホール板１２および光検出器１３を有している。
【００１３】
ここで、レーザー光源３は、標本となる試料１０の表面を走査するスポット光としてのレーザー光を発生するためのもので、顕微鏡制御装置２により設定されるレーザー光の強度（レーザー光量）に応じたレーザー光を発生する。このレーザー光源３からのレーザー光は、ミラー４により反射され、ダイクロイックミラー５を介して２次元走査ユニット６に導かれる。
【００１４】
２次元走査ユニット６は、顕微鏡制御装置２からの制御信号に基づいて、ミラー４より与えられたレーザー光源３からのレーザー光を試料１０上に２次元走査するためのもので、例えばＸ軸方向走査用のガルバノミラーとＹ軸方向走査用のガルバノミラーを有していて、これらガルバノミラーをＸ軸方向およびＹ軸方向に振ることで対物レンズ８に対するスポット光の光路をＸＹ方向に振らせるように構成されている。
【００１５】
レボルバ７は、倍率の異なる複数の対物レンズ８を保持するもので、レボルバ７の切換えにより、複数の対物レンズ８のうち所望の倍率を持つものが顕微鏡の観察光路中に選択挿入される。そして、この選択挿入された対物レンズ８を通して２次元走査ユニット６により２次元走査されたスポット光は、ステージ９上の試料１０に照射される。
【００１６】
試料１０からの反射光や蛍光などの画像情報は、対物レンズ８を通して２次元走査ユニット６に戻され、この２次元走査ユニット６を介してダイクロイックミラー５に戻される。ダイクロイックミラー５は、２次元走査ユニット６に対するレーザー光源３の出射光路上に設けられた半透明鏡であって、２次元走査ユニット６を介して与えられる試料１０からの画像情報を光検出系に導くためのものである。
【００１７】
ダイクロイックミラー５を介して得られた２次元走査ユニット６からの画像情報は、レンズ１１で集光され、ピンホール板１２に与えられる。ピンホール板１２は、所定径のピンホールを開けたもので、光検出器１３の受光面の前面の結像位置に、そのピンホールを位置させるように配置されている。光検出器１３は、ピンホール板１２のピンホールを介して得られる光を、その光量対応の電気信号に変換する光検出素子から構成されている。尚、この光検出器１３の感度（検出感度）は、顕微鏡制御装置２により設定可能に構成されている。
【００１８】
一方、顕微鏡制御装置２は、操作パネル１４、コントローラ１５、メモリ１６、画像モニタ１７を有している。
操作パネル１４は、キーボードの他に、トラックボールやジョイスティク或いはマウスなどのポインティングデバイス等を含んでおり、ユーザからの指示によりコントローラ１５に対して走査指示、フォトブリーチ用条件設定指示、通常観察用条件設定指示、及び画像入力指示等を出力する。
【００１９】
コントローラ１５は、内部にＣＰＵ（中央演算処理装置）を備え、ＲＯＭ１８に格納されている制御プログラムに従い、顕微鏡制御装置２の制御を行うと共に、走査型レーザー顕微鏡１の制御を行う。例えば、レーザー光源３に所定の制御信号を出力することによりレーザー光源３に所定のレーザー光の強度（レーザー光量）を設定し、また、光検出器１３に所定の制御信号を出力することにより光検出器１３に所定の感度を設定する。また、設定したレーザー光の強度及び光検出器１３の感度をメモリ１６に記憶する。また、操作パネル１４を介して受け付けた走査指示により、２次元走査ユニット６に対しレーザービーム走査指令を出力し、光検出器１３より検出される試料１０の画像情報を取り込み、その画像情報をメモリ１６に転送すると共に、その画像情報を画像モニタ１７に表示する。
【００２０】
メモリ１６には、前述のレーザー光の強度、光検出器１３の感度、コントローラ１５を介して転送される光検出器１３からの試料１０の画像情報、及び時間経過観察処理時のインターバル時間等が記憶される。本実施形態では、メモリ１６は、レーザー光の強度及び光検出器１３の感度が記憶されるメモリ部と、試料１０の画像情報が記憶されるメモリ部等を有している。
【００２１】
また、画像モニタ１７には、メモリ１６に記憶された試料１０の画像情報に基づく画像等が表示される。
次に、上述した構成の顕微鏡システムにおいて、コントローラ１５によって行われる、本発明に関係する各種の制御処理を、図２及び図３を用いて説明する。尚、これらの処理は、コントローラ１５のＣＰＵがＲＯＭ１８に格納されている制御プログラムを実行することにより行われる処理である。
【００２２】
図２は、ＦＲＡＰの実験時に実行される顕微鏡システムの動作処理の一例を示すフローチャートである。
同図に示したように、まず、フォトブリーチ実行前の通常観察時の条件として、できる限り弱いレーザー光の強度に対応するレーザー光量Ｌｎをレーザー光源３に設定すると共に、試料１０の画像情報を取得できるレベルの光検出器１３の感度Ｖｎを光検出器１３に設定した上で、試料１０の画像情報を取得する（Ｓ２０１）。
【００２３】
続いて、このときに設定されたレーザー光量Ｌｎと光検出器１３の感度Ｖｎをメモリ１６に記憶する（Ｓ２０２）。尚、レーザー光量Ｌｎは、レーザー光の強度に対応するものであるので、レーザー光の強度とも言えるものである。
続いて、フォトブリーチを実行するために、最大強度のレーザー光の強度に対応するレーザー光量Ｌｐをレーザー光源３に設定する（Ｓ２０３）。
【００２４】
続いて、Ｓ２０２の処理でメモリ１６に記憶された、フォトブリーチ実行前の通常観察時のレーザー光量Ｌｎを読み出し、このレーザー光量Ｌｎと前述のレーザー光量Ｌｐを用いて、次の式（１）により補正係数Ｋを求める（Ｓ２０４）。
Ｋ＝Ｌｎ／Ｌｐ  式（１）
続いて、この補正係数Ｋと、Ｓ２０２の処理でメモリ１６に記憶された、フォトブリーチ実行前の通常観察時の光検出器１３の感度Ｖｎを用いて、フォトブリーチ実行中の光検出器１３の感度Ｖｐを次の式（２）により求める（Ｓ２０５）。
【００２５】
Ｖｐ＝Ｋ *Ｖｎ      式（２）
続いて、求めた光検出器１３の感度Ｖｐを光検出器１３に設定し、フォトブリーチを実行し（Ｓ２０６）、その実行中の試料１０の画像情報を取得する。このフォトブリーチの実行は、例えば、ユーザ（観察者等）が、試料１０の画像情報に基づく画像を画像モニタ１７を介して観察しながら、フォトブリーチの実行が充分に行われたと判断されるまで行われる。
【００２６】
そして、このフォトブリーチの実行が終了すると、レーザー光の強度と光検出器１３の感度を通常観察時の設定に戻すため、先のＳ２０２の処理でメモリ１６に記憶された通常観察時のレーザー光量Ｌｎと光検出器１３の感度Ｖｎを読み出し、これらをレーザー光源３と光検出器１３に設定する（Ｓ２０７）。
【００２７】
以降は、この設定されたレーザー光量Ｌｎと光検出器１３の感度Ｖｎで、試料１０に対する走査と画像情報の取得を繰り返す時間経過観察処理を実行し（Ｓ２０８）、当該フローを終了する。
このように、図２に示したフローによれば、通常観察時とフォトブリーチ実行時のレーザー光の強度の比から求められた減衰率（補正係数Ｋ）に応じて、フォトブリーチ実行中の画像取得を可能にする光検出器１３の感度を決定・設定することができる。従って、フォトブリーチ実行中の画像観察において、いわゆるサチュレートした不適正な画像情報が得られることはなく、通常観察時と同様に適正な画像情報に基づく画像の観察が可能になる。また、ユーザ（観察者等）は、フォトブリーチ実行を、どの程度継続すれば良いか等を判断することが可能になり、より効率的なＦＲＡＰの実験が可能になる。
【００２８】
また、本フローによれば、通常観察時とフォトブリーチ実行時のレーザー光の強度の比から自動的に減衰率（補正係数Ｋ）を求めているので、オートコントラストのような走査条件を決定するための走査を必要としない。
次に、ＦＲＡＰの実験時に行われる顕微鏡システムの動作処理の他の例について説明する。
【００２９】
図３は、このＦＲＡＰの実験時に実行される顕微鏡システムの動作処理の他の例を示すフローチャートであり、特に、試料１０に対する走査と画像情報の取得を繰り返す時間経過観察処理中にフォトブリーチを実行させる場合の処理例を示したものである。
【００３０】
同図に示したように、まず、通常観察時の条件として、できる限り弱いレーザー光の強度に対応するレーザー光量Ｌｎをレーザー光源３に設定すると共に、試料１０の画像情報を取得できるレベルの光検出器１３の感度Ｖｎを光検出器１３に設定した上で、試料１０の画像情報を取得する（Ｓ３０１）。そして、このときに設定されたレーザー光量Ｌｎと光検出器１３の感度Ｖｎをメモリ１６に記憶する（Ｓ３０２）。尚、このＳ３０１及びＳ３０２の処理は、図２のＳ２０１及びＳ２０２の処理と同様である。
【００３１】
続いて、この設定された通常観察時のレーザー光の強度及び光検出器１３の感度の下で、試料１０に対する走査と画像情報の取得を所定のインターバル時間を設けて繰り返す時間経過観察処理を実行する（Ｓ３０３）。また、この時間経過観察処理中は、操作パネル１４を介してユーザからのフォトブリーチ用条件設定指示を受け付ける（Ｓ３０４）。
【００３２】
この通常観察時の時間経過観察処理中において、ユーザが、例えば試料１０の複数の画像情報を取得した後にフォトブリーチを実行させるため、操作パネル１４の所定のボタンを介してフォトブリーチ用条件設定指示を行ったときには、その指示を受け付ける（Ｓ３０４がＹｅｓ）。そして、レーザー光の強度として最大強度に対応するレーザー光量Ｌｐをレーザー光源３に設定する（Ｓ３０５）。また、Ｓ３０２の処理でメモリ１６に記憶された通常観察時のレーザー光量（レーザー強度）Ｌｎを読み出し、このレーザー光量Ｌｎと前述のレーザー光量Ｌｐを用いて、前述の式（１）により補正係数Ｋを求め、また、求めた補正係数Ｋと、Ｓ３０２の処理でメモリ１６に記憶された通常観察時の光検出器１３の感度Ｌｎを用いて、フォトブリーチ実行中の光検出器１３の感度Ｖｐを前述の式（２）により求める（Ｓ３０６）。尚、このＳ３０５乃びＳ３０６の処理は、図２に示したＳ２０３乃至Ｓ２０５に示した処理と同様である。更に、前述の通常観察時の時間経過観察処理におけるインターバル時間をメモリ１６に記憶すると共に、レーザー光をできる限り多く試料１０に照射するために、そのインターバル時間を最小（最短）に設定する（Ｓ３０７）。
【００３３】
続いて、この設定されたレーザー光の強度、光検出器１３の感度、及びインターバル時間で、試料１０に対する走査（フォトブリーチ実行）と画像情報の取得を繰り返す時間経過観察処理を実行する（Ｓ３０８）。また、この時間経過観察処理中は、操作パネル１４を介してユーザからの通常観察用条件設定指示を受け付ける（Ｓ３０９）。
【００３４】
この時間経過観察処理中において、ユーザが、例えば取得した画像情報に基づく画像を画像モニタ１７を介して観察し、そこでフォトブリーチ実行によって褪色レベルが所望のレベルに達したと判断し、フォトブリーチ実行を終了させるために操作パネル１４の所定のボタンを介して通常観察用条件設定指示を行ったときには、その指示を受け付ける（Ｓ３０９がＹｅｓ）。そして、レーザー光の強度と光検出器１３の感度を通常観察時の設定に戻すため、先のＳ３０２の処理でメモリ１６に記憶された通常観察時のレーザー光量Ｌｎと光検出器１３の感度Ｖｎを読み出し、これらをレーザー光源３と光検出器１３に設定する（Ｓ３１０）。また、各走査間のインターバル時間を通常観察時の設定に戻すため、先のＳ３０７の処理でメモリ１６に記憶された通常観察時のインターバル時間を読み出し、これを設定する（Ｓ３１１）。
【００３５】
続いて、この設定されたレーザー光の強度、光検出器１３の感度、及びインターバル時間で、試料１０に対する走査と画像情報の取得を繰り返す、通常観察時の時間経過観察処理を実行し（Ｓ３１２）、当該フローを終了する。
このように、図３に示したフローによれば、試料１０に対する走査と画像情報の取得を繰り返す一連の時間経過観察処理において、通常観察処理とフォトブリーチ実行処理の両方を実行することが可能になる。また、ユーザは、取得される画像情報に基づく画像を観察しながら、フォトブリーチ実行の開始時期及び終了時期を、フォトブリーチ実行用条件設定指示及び通常観察用条件設定指示を行うことにより、自由に操作することが可能になると共に、一連の画像の変化をもれなく取得することが可能になる。
【００３６】
尚、本実施形態において、上述した式（２）の代わりに次の式（３）を使用することも可能である。
Ｋ＝ｋ(v) * Ｌｎ／Ｌｐ        式（３）
但し、ｋ(v) は、フォトマルの印加電圧ｖによって非線形に変化する値とする。尚、一般的にフォトマルの感度βは、β＝α *ｖn で決定される非線形特性を持っている。ここでα、ｎはフォトマルの構造等により定まる定数である。
【００３７】
このように、式（２）の代わりに式（３）を適用することにより、光検出器１３の非線形の補正を考慮した上での光検出器１３の感度を設定することが可能になる。
また、本実施形態では、光検出器１３の感度を変更することによりフォトブリーチ実行中の画像観察を可能にしたが、例えば、光検出器１３の感度を変更せずに、光検出系の光路上であって光検出器１３の前段に、ＡＯＴＦ（ Acousto-Optic Tunable Filter : 音響光学型波長可変フィルタ）等の高速で透過率を任意に変更可能なデバイスを配置し、フォトブリーチ実行中には、通常観察時からのレーザー光の強度の変化量に応じて、その透過率を変更し、光検出器１３に入射する光量を調整して画像観察を行うようにしても良い。
【００３８】
また、本実施形態に示した図２及び図３に示した処理をコンピュータに実行させることも可能である。この場合は、コントローラ１５のＲＯＭ１８に記憶されている、少なくとも図２及び図３に示した処理を実行するためのプログラムを、例えば、図４に示したように、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピー（登録商標）ディスク（或いはＭＯ、ＤＶＤ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、リムーバブルハードディスク等であっても良い）等の可搬記憶媒体２１に記憶しておき、その可搬記憶媒体２１をコンピュータ２２の媒体駆動装置２３により読み取り、読み取ったプログラムをコンピュータ２２の内部のメモリ（ＲＡＭ又はハードディスク等）２４に格納し、そのプログラムを実行するようにしても良い。或いは、そのプログラムを情報提供者の外部の装置（サーバー等）内の記憶手段（データベース等）２５に記憶しておき、通信によりコンピュータ２２に転送して内部のメモリ２４に記憶し、そのプログラムを実行するようにしても良い。尚、記憶されるプログラムは、図２及び図３に示した処理の一部の処理のみを実行するものであっても良い。
【００３９】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、フォトブリーチ実行中における画像情報の取得及びその画像情報に基づく画像の観察が可能になる。また、ユーザは、フォトブリーチ実行中の画像観察により、そのフォトブリーチ実行をどの程度継続すべきか等の判断が可能になり、効率の良いＦＲＡＰの実験が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態に係る顕微鏡制御装置を含む顕微鏡システムのシステム構成を示す図である。
【図２】ＦＲＡＰの実験時に実行される顕微鏡システムの動作処理の一例を示すフローチャートである。
【図３】ＦＲＡＰの実験時に実行される顕微鏡システムの動作処理の他の例を示すフローチャートである。
【図４】プログラムが記憶される記録媒体の例を示す図である。
【符号の説明】
１      走査型レーザー顕微鏡
２      顕微鏡制御装置
３      レーザー光源
４      ミラー
５      ダイクロイックミラー
６      ２次元走査ユニット
７      レボルバ
８      対物レンズ
９      ステージ
１０    試料
１１    レンズ
１２    ピンホール
１３    光検出器
１４    操作パネル
１５    コントローラ
１６    メモリ
１７    画像モニタ
１８    ＲＯＭ
２１    可搬記憶媒体
２２    コンピュータ
２３    媒体駆動装置
２４    メモリ
２５    記憶手段
【図１】
0004854873.tif 000002
【図２】
0004854873.tif 000003
【図３】
0004854873.tif 000004
【図４】
0004854873.tif 000005