(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームを、このリポソームの内部に位置するイオン透過担体およびキレート化剤とともに含み、
該リポソームが、
1以上の、α粒子を放出する原子量150を超える放射性核種、および/または
α粒子放出体である212Ｂｉ用のジェネレーターとしての212Ｐｂ
をさらにカプセル封入している
ことを特徴とする複合体。
【請求項２】
上記リポソーム内部のキレート化剤の濃度が、上記α粒子を放出する原子量150を超える放射性核種および/または212Ｐｂの放射性崩壊によって生じる娘核種を保持するのに適していることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
上記キレート化剤が、
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸（ＤＯＴＡ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロトリデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸（ＴＲＩＴＡ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸（ＴＥＴＡ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-テトラ（メチレン）ホスホン酸（ＤＯＴＭＰ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロトリデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-テトラ（メチレン）ホスホン酸、
1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-テトラ（メチレン）ホスホン酸、
ジエチレントリアミン-N,N',N''-五酢酸およびその異性体誘導体、
クリプテート[2,2,2]、クリプテート[3,2,2]、クリプテート[2,2,1] およびそのモノ−およびジ−ベンゾ誘導体、
富電子（ドナー）基（ヒドロキシル、カルボキシル、エステル、アミド、アミン）を有する架橋カリックス[4]アレン、
1,10-ジアザ-4,7,13,16-テトラオキサシクロオクタデカン-1,10,N,N'-ビス-酢酸、および
1,10-ジアザ-4,7,13,16-テトラオキサシクロオクタデカン-1,10,N,N'-ビス-マロネート
からなる群より選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
上記リポソームが膜中に活性化された基を含有しており、タン白質または他の受容体親和性の分子がこれらの活性化された基に複合するのを可能にすることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の複合体。
【請求項５】
上記の活性化された基がポリエチレングリコールである、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
上記リポソームが受容体結合性のタン白質に複合されていることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の複合体。
【請求項７】
上記の受容体結合性のタン白質がモノクローナルまたはポリクローナル抗体または抗体フラグメントまたは構築物または葉酸塩である、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
上記リポソームがＩｇＭまたはＩｇＧクラスの抗体、またはこれらのクラスの抗体からのフラグメントまたは構築物と複合されていることを特徴とする請求項６に記載の複合体。
【請求項９】
上記リポソームがＩｇＭまたはＩｇＧクラスの抗体、またはこれらのクラスの抗体からのフラグメントまたは構築物と複合されており、その抗体、フラグメントまたは構築物が葉酸塩および１つの放射性核種または異なる放射性核種の混合物で標識されていることを特徴とする請求項６に記載の複合体。
【請求項１０】
上記リポソームに複合された抗体または抗体フラグメントまたは構築物が、ネズミ、キメラまたはヒトのモノクローナルまたはポリクローナルであることを特徴とする請求項１〜９の何れかに記載の複合体。
【請求項１１】
上記抗体または抗体フラグメントまたは構築物が葉酸塩で標識されており、その抗原結合性部位が葉酸塩結合性タン白質（ＦＢＰ）に向けて指令されていることを特徴とする請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
上記抗体または抗体フラグメントまたは構築物が葉酸塩で標識されており、抗原結合性部位がＦＢＰとは異なる抗原に向けて指令されていることを特徴とする請求項１０に記載の複合体。
【請求項１３】
上記α粒子を放出する原子量150を超える放射性核種および/またはα粒子放出体である212Ｂｉ用のジェネレーターとしての212Ｐｂが、211Ａｔ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、212Ｐｂ、225Ａｃ、223Ｒａ、224Ｒａ、および227Ｔｈから選択されることを特徴とする請求項１〜１２の何れかに記載の複合体。
【請求項１４】
上記リポソームに212Ｐｂがカプセル封入されており、212Ｐｂの放射性崩壊によって212Ｂｉが生じることを特徴とする請求項１〜１３の何れかに記載の複合体。
【請求項１５】
イオン透過担体および好適な濃度のキレート化剤を含むリポソームについて、
1以上の、α粒子を放出する原子量150を超える放射性核種、および/または
α粒子放出体である212Ｂｉ用のジェネレーターとしての212Ｐｂ
を含有する溶液と上記リポソームを含有する溶液とを混合することにより、原子量150を超えるα粒子エミッターでの放射能標識を安定的に行い、
生理的温度と比較して上昇した温度でインキュベートし、上記放射性核種および/または212Ｐｂを上記リポソーム内に輸送させる
ことを特徴とする、放射能標識された複合体の調製方法。
【請求項１６】
上記キレート化剤が
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸（ＤＯＴＡ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロトリデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸（ＴＲＩＴＡ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸（ＴＥＴＡ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-テトラ（メチレン）ホスホン酸（ＤＯＴＭＰ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロトリデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-テトラ（メチレン）ホスホン酸、
1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-テトラ（メチレン）ホスホン酸、
ジエチレントリアミン-N,N',N''-五酢酸およびその異性体誘導体、
クリプテート[2,2,2]、クリプテート[3,2,2]、クリプテート[2,2,1] およびそのモノ−およびジ−ベンゾ誘導体、
富電子（ドナー）基（ヒドロキシル、カルボキシル、エステル、アミド、アミン）を有する架橋カリックス[4]アレン、
1,10-ジアザ-4,7,13,16-テトラオキサシクロオクタデカン-1,10,N,N'-ビス-酢酸、および
1,10-ジアザ-4,7,13,16-テトラオキサシクロオクタデカン-1,10,N,N'-ビス-マロネート
からなる群より選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記リポソームが膜中に活性化された基を含有しており、タン白質または他の受容体親和性の分子がこれらの活性化された基に複合するのを可能にすることを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記の活性化された基がポリエチレングリコールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記リポソームが受容体結合性のタン白質に複合されていることを特徴とする請求項１５〜１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
上記の受容体結合性のタン白質がモノクローナルまたはポリクローナル抗体または抗体フラグメントまたは構築物または葉酸塩である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記リポソームがＩｇＭまたはＩｇＧクラスの抗体、またはこれらのクラスの抗体からのフラグメントまたは構築物と複合されていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
上記リポソームがＩｇＭまたはＩｇＧクラスの抗体、またはこれらのクラスの抗体からのフラグメントまたは構築物と複合されており、上記抗体が、抗体を葉酸塩および放射性核種で標識するための標準的操作を用いて、葉酸塩および１つの放射性核種または異なる放射性核種の混合物で標識されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
上記リポソームに複合された抗体、または抗体フラグメントまたは構築物が、ネズミ、キメラまたはヒトのモノクローナルまたはポリクローナルであることを特徴とする請求項１５〜２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
上記抗体または抗体フラグメントまたは構築物が葉酸塩で標識されており、その抗原結合性部位がＦＢＰに向けて指令されていることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記抗体または抗体フラグメントまたは構築物が葉酸塩で標識されており、その抗原結合性部位がＦＢＰとは異なる抗原に向けて指令されていることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
上記α粒子を放出する原子量150を超える放射性核種および/またはα粒子放出体である212Ｂｉ用のジェネレーターとしての212Ｐｂが、211Ａｔ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、212Ｐｂ、225Ａｃ、223Ｒａ、224Ｒａ、および227Ｔｈから選択されることを特徴とする請求項１５〜２５の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
上記原子量150を超えるα粒子エミッターでの放射能標識が、212Ｐｂを含有する溶液を用いて行われ、212Ｐｂの放射性崩壊によって212Ｂｉが生じることを特徴とする請求項１５〜２６の何れかに記載の方法。
【請求項２８】
ヒトを含む哺乳類に注射または注入するのに適した医薬溶液の調製のための請求項１〜１４の何れかに記載の複合体の使用。
【請求項２９】
ヒトを含む哺乳類に、静脈内へ、および／または局所へ、および／または腫瘍内への投与経路で注射または注入するのに適した医薬溶液の調製のための請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
放射能免疫複合体または数種の放射能免疫複合体および／または他の形態の放射線医薬品治療法、化学療法、外部光線療法または外科手術と組み合わせた、悪性疾患を処置するための請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
リポソームを、このリポソームの内部に位置するイオン透過担体およびキレート化剤とともに含むリポソーム溶液を含有するバイアルと、
溶液で
1以上の、α粒子を放出する原子量150を超える放射性核種、および/または
α粒子放出体である212Ｂｉ用のジェネレーターとしての212Ｐｂ
を含有するバイアルと
を含み、
放射性標識を容易にするように混合できることを特徴とする請求項１〜１４の何れかに記載の複合体を調製するためのキット。
【請求項３２】
リポソームを、このリポソームの内部に位置するイオン透過担体およびキレート化剤とともに含むリポソーム溶液を含有するバイアルと、
溶液で
1以上の、α粒子を放出する原子量150を超える放射性核種、および/または
α粒子放出体である212Ｂｉ用のジェネレーターとしての212Ｐｂ
を含有する第二のバイアルと、
受容体親和性を有する分子を含有する第三のバイアルと
を含み、
放射性標識および受容体親和性の分子での標識を容易にするように混合できることを特徴とする請求項１〜１４の何れかに記載の複合体を調製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、リポソームをこのリポソームの内部に位置するイオン透過担体（イオノフォア）およびキレート化剤（chelator）とともに含み、上記リポソームがα粒子を放出する重放射性核種で安定的に標識されている複合体系（conjugator system）に関する。本発明はさらに、この複合体系の調製方法およびこの系の使用、ならびにこの複合体系を調製するためのキットに関する。
【０００２】
抗癌剤治療法における放射性核種の生物医学的利用は、これまで、陽イオン種または陰イオン種、例えば甲状腺癌に対しては［131Ｉ］沃化物、および骨格癌の転移からの疼痛を寛解するためには89Ｓｒの使用、そしてたいていはモノクローナル抗体に結合させたベータ線放出放射性核種の使用に集中してきた (DeVita ら, 1996)。
【０００３】
癌を標的にした放射性核種治療法の利用は、放射性核種を腫瘍特異的な担体化合物に結合させる方法を見出す能力に依存する (Gaze, 1996)。今日、有用な放射線特性を有する放射性核種のいくつかは、放射性核種と担体化合物との間に化学的に安定な結合を与える問題があるため、腫瘍ターゲティングには使用することができない。しかしながら、新しい担体系は、放射性同位体元素の利用のみならず治療法に有用であると考えられる放射性核種の「兵器庫」の両方を拡大することができる (Gaze, 1996)。
【０００４】
リポソームは、その表面に結合した受容体親和性基を有するものまたは有しないものも、薬剤の送達について評価されてきたが、いくつかの癌の形態において化学療法剤を送達するために臨床的に使用されている。最近、リポソームの研究の発展は薬物動態学による新しい解釈に導いており、これは、当該化合物を癌に対する内部放射線治療用の放射性核種担体として有用なものにすることができた (Gabizon, 1995)。リポソームの調製および処方における最近のこれらの開発は、結果として、延長された循環時間を有する１００ｎｍ未満の小さい小胞をもたらした。なぜならば、リポソームの大きさは、膜を通す押し出し法を用いることにより、小さい直径にうまく閉じ込められるからである。さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトしたリポソームの導入は、血漿タン白質からの干渉を減少させ、したがって細網内皮系のマクロファージが作用する認識およびクリアランスを減少させた (Maruyama ら, 1997)。したがって、血中濃度を維持することにより腫瘍取り込みレベルの上昇が達成された。もっと多い腫瘍取り込みは、受容体親和性を有する分子、例えばモノクローナル抗体または葉酸塩(folate)をリポソームの表面に複合（conjugate）させることにより達成された。加えて、いくつかの研究は、ＰＥＧをリポソームと標的リガンド（targeting ligand）との間のリンカーとして使用する利点を示した。なぜならば、これは、受容体への到達性をも改善できるからである (例えば Maruyama ら, 1997; Gabison ら, 1999; Lee ら, 1994)。
【０００５】
リポソームは、以前は放射性同位体のための担体として研究されてきた (Goins ら, 1998; Turner ら, 1988)。Pikul ら (1987) は、受動的に取り込まれた212Ｐｂ-デキストランに基づく研究を報告した（すなわち、リポソームを形成する間に212Ｐｂ-デキストランを加え、リポソームの内部である水相と一緒に212Ｐｂ-デキストランの一部分が取り込まれた）。上記の著者らは、これらのリポソームが癌の治療に適したことを示唆したのではなく、主としてインビトロで放射性同位体を用いて細胞内での細胞殺傷を研究することに使用していた。212Ｐｂの崩壊から生成した212Ｂｉの運命に関するデータは示されず、リポソームの大きさは３５０〜５００ｎｍの程度であった。この大きさは、現在、インビボ腫瘍治療に最適であると考えられる大きさ（約１００ｎｍ）（Forssen, 1997）と比較して非常に大きい。さらに、そのリポソームはその膜内にＰＥＧを含んでいなかった。
【０００６】
Ogihar-Umeda ら (1996) は、ガンマ線を放出する放射性核種67Ｇａ、111Ｉｎおよび99mＴｃの担体としてリポソームを用い、放射性標識されたリポソームをイメージングに使用することを示唆した。
理論的研究において、Kostarelos ら (1999) は、潜在的に治療効果のある放射性核種131Ｉ、67Ｃｕ、188Ｒｅおよび211Ａｔで標識されたリポソームの使用を示唆したが、放射性標識されたリポソームを調製する化学的手順は示唆されなかった。
【０００７】
EP 386 146 B1 には、中性子捕獲腫瘍治療用のリポソームカプセル封入化合物のための組成物およびその使用方法が記載されている。しかしながら、これらのリポソームには、活性化の後でしか放射性にならない安定元素（例えば硼素）が充填されており、そのリポソームはイオン透過担体またはキレート化剤のどちらも含有していない。
【０００８】
Utkhede ら (1994) は、90ＹおよびＤＴＰＡ（これは本発明で記載するキレート化剤とは異なるキレート化剤である）を負荷したリポソームを記載している。さらに、母／娘核種の保持は記載されておらず、加えて90Ｙは、本願で記載する元素のような重元素ではない。
重アルファ線を放出する放射性核種を用いて、担体の充分安定な放射能標識を達成するには、各元素の化学的性質に適するように適合させた特別な化学的手順が必要であり、このような方法は知られていない。放射性標識、例えばＧａ，Ｉｎ、Ｔｃ、ＣｕまたはＲｅに用いられる手順が、例えば212/213Ｂｉ、212Ｐｂ、223/224Ｒａ、227Ｔｈまたは225Ａｃのような重放射性核種（原子量１５０を超えるもの）の陽イオン性アルファ線エミッターに適合すると予測することはできない。
【０００９】
それゆえに、本発明の目的は、(1) キレート化剤およびアルファ粒子放射線を放出する重放射性核種をカプセル封入しており、(2) 母核種をリポソームに導入したときに娘核種を保持することができ、そして (3) 放射性核種の一団にとり有効な能動的導入の手順で調製することができる、放射性核種-リポソーム複合体系（受容体親和性基を有するかまたは有しない）、この系の使用ならびにこの複合体系を調製するためのキットを提供することである。これらの目的は、添付の特許請求の範囲で特徴づけた本発明によって達成された。
【００１０】
本発明は、リポソームを、このリポソームの内部に位置するイオン透過担体（すなわち、リポソームのための金属抽出剤）、およびキレート化剤および重放射性核種（原子量１５０を超える）とともに含む複合体系に関する。リポソームは、放射性核種の能動的導入法を用いて、すなわち、イオン透過担体を介して調製される。また典型的には１００ｎｍの大きさのリポソームを生成する手順に従って調製される。得られた生成物は数日間にわたり良好な化学的安定性を示し、そしてまた、例えば212Ｂｉへの212Ｐｂの変換からの娘核種をリポソーム内部に保持することができる。リポソームは、膜に結合したポリアルキレンオキサイド、例えばＰＥＧのような修飾基を用いてまたは用いずに調製することができる。本発明者らは、このような放射性標識したリポソームを、例えば葉酸塩が複合した（conjugated）モノクローナル抗体のような腫瘍探索性のタン白質に連結する方法も、本明細書に記載する。
【００１１】
癌治療に適する放射性標識したリポソームを開発するために、本発明者らは、重放射性核種212Ｂｉ、213Ｂｉ、223Ｒａ、224Ｒａ、225Ａｃ、212Ｐｂ、および227Ｔｈに基づいて、アルファ粒子を放出する重放射性核種（すなわち、原子量１５０を超える）を負荷したリポソームの調製および使用を研究した。イオン透過担体を有するリポソーム（小胞）を用いて、好ましくはキレート化剤で放射性標識したリポソーム（すなわち、リポソームは放射性核種およびキレート化剤をカプセル封入している）を、放射性核種の能動的導入法の利用により調製し、典型的には１００ｎｍの大きさのリポソームを生成する手順に従って調製した。
【００１２】
単層小胞を、脂質薄層水和および押し出し法（thin lipid film hydration and extrusion） (Olson ら, 1979, MacDonald ら, 1991) により、下記のように調製した：モル比２：１のＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）およびコレステロール、典型的にはそれぞれ１０および５μmolを丸底フラスコ中でクロロホルムに溶解した。溶剤を減圧下、ロータリーエバポレータを用いて除去した。次いでこの乾燥脂質フィルムを、０.５〜１ｍｌの１５０ｍＭクエン酸、３０ｍＭ ＤＯＴＡ（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸）、ｐＨ４の中で水和させた。得られた懸濁液を５サイクルの凍結および解凍を受けさせ、次いで手動の押し出し装置 (Avenstin, Ottawa, Canada) を用い、孔サイズ１００ｎｍのポリカーボネートフィルターを通して５回、そして孔サイズ５０ｎｍのフィルターを通して押し出しを繰り返した。この生成物は約３０ｍＭの脂質濃度を有していた。このリポソームに放射性核種を負荷する前に、外部溶液を PD-10 カラム上で溶出により、２５０ｍＭショ糖、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N',2-エタンスルホン酸）、ｐＨ７.４と交換した。
リポソーム成分：
ａ）内部水性媒体：ｐＨ１〜１４、好ましくは２〜９、より好ましくは４〜５。成分：水；所望の時間間隔、すなわち、イオン透過担体で仲介される放射性核種の導入を開始するまで、内部水性媒体において所望のｐＨを維持できる物質。好ましくは、内部水性媒体の成分は、放射性金属の錯体形成機能をも生じさせる。この機能は、i) 例えば、ｐＨ調節に用いられる該物質の静電的ドナー機能、例えば酢酸塩、クエン酸塩および関連化合物の酸素原子；ii) 内部水性媒体において、例えばＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＭＰおよび関連化合物などの錯体形成剤を有することによってその作用をもたらすことができる。
【００１３】
ｂ）イオン透過担体：例えば、放射性金属を、脂質二重層を通ってリポソーム外部相からリポソーム内部へ、実質的に不可逆的に輸送できる物質。例：この望ましい様式で機能することが示されるイオン透過担体：カルシウムイオン透過担体 A 23187、ジシクロヘキシル18-C6、ビベンゾ-18-C6、2,3-ジメルカプト-1-プロパノール、Ｐｂ-イオン透過担体。
【００１４】
ｃ）脂質二重層の成分：脂質二重層の成分は、好ましくは結果として小胞を形成できる混合物を生じ、そのために液体から固体に転移する温度は、生理的温度よりも高い；例えば、i) リン脂質、例：長鎖アルキル-ホスファチジルコリン、例えば 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；
ii) ステロールまたは類似の特性を有する化合物、これらは脂質二重層を堅くする（脂質二重層の流動性を減少させる）。例：ステロール群の化合物：コレステロールおよびコレステロール-3-スルフェート、および iii) 構築物が腫瘍細胞をターゲティングする特性を増強し、そして血中滞留時間を延長させるための（立体的に）インビボ安定剤、例えばポリエーテル、ポリエチレングリコール。リポソーム処方物にＰＥＧおよび／またはＰＥＧ誘導体を含ませると、注射したリポソームの細網内皮系による循環系からのクリアランスが減少する点で利点が得られる。通常は、リン脂質に対して３〜１０モル％の量で調製物に含まれる。しかしながら、所望の安定化効果を得るために必要な安定剤の量は、単量体（静電的特性および極性特性）および反復単位の数、すなわち鎖長に依存する。例（ＰＥＧおよび／またはＰＥＧ誘導体）： 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ポリ(エチレングリコール)2000]（ＰＥＧ2000ＤＪ/ｌＰＥ）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ポリ(エチレングリコール)2000]（ＰＥＧ2000ＤＰＰＥ）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ポリ(エチレングリコール)2000]（ＰＥＧ2000ＤＳＰＥ）。
【００１５】
ｄ）腫瘍細胞をターゲティングする特性を有するように構築物の改質を容易にする成分：活性化した適切な脂質の選択は、ハプテンの性質ならびに調査の必要条件によって決められるであろう。反応の効率は脱離基、親水性スペーサー、リポソームの材料特性および反応関与体の濃度によって支配されるであろう。ハプテンをリポソームと会合したままにしておく必要のあるインビボ調査のためには、よりゆっくりと膜間で交換する、より長いアシル鎖の脂質アンカーを選択することによって、目覚しい利点が得られるであろう。さらに、ハプテンと脂質アンカーとの間の共有結合は、化学的および酵素的な開裂の両方に対して安定であるべきである。活性化した脂質は、脂質と改質剤との間で例えばアミン、アミド、チオエーテルまたはジスルフィド結合を形成するように機能することができる。立体的安定剤、例えばＰＥＧおよび／またはＰＥＧ誘導体が調製物に含まれているならば、結合のために機能する基は、好ましくはその安定剤と同一または類似の化合物の末端に存在し、そして安定剤の有効鎖長と同一またはそれより長い有効鎖長で存在する。例：構築物が腫瘍細胞をターゲティングする特性を有するように改質するのを容易にする、ＰＥＧおよび／またはＰＥＧ誘導体からの小胞成分： N-[w-(2-ピリジルジチオプロピオニルアミノ)ポリ(エチレングリコール)2000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（ＰＤＰ-ＰＥＧ 2000-ＤＳＰＥ）、N-[w-[4-(p-マレイミドフェニル)ブタノイル]アミノ]ポリ(エチレングリコール)2000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（ＭｐＢ-ＰＥＧ 2000-ＤＳＰＥ）。
【００１６】
リポソームに会合した放射性核種を会合していない放射性核種から分離することは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて行った (Mauk および Gamble, 1979; Tilcock ら, 1991)。リポソーム負荷の手順後の分離のために、DP-10 サイズ排除カラムを使用した。PD-10 カラムに適用した１ｍｌまたはそれ以下の容量から、リポソームが最初の４.５ｍｌに溶離した。リポソームと結合していない放射性核種は、低分子量種に相当するフラクションに溶出した。ＰＢＳ中での負荷したリポソームの（放射性核種の保持に関する）安定性の研究にも、PD-10 カラムを用いた。
【００１７】
血清中のリポソームに会合した放射性核種を遊離の放射性核種から分離することは、セファロース CL-4B カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより行った (Hwang および Mauk, 1977)。これによって、未結合の放射性核種を実質的に含まない液体担体中に分散した放射性リポソームを含有する溶液を調製することができた。
【００１８】
クロマトグラフィー操作の前に、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン-N,N'-四酢酸）を加え、リポソームに会合した画分から容易に分離できる状態に遊離放射性核種を安定化した。
リポソームに会合した放射性核種の放射性核種負荷収率および潜在期間を、228Ａｃ、223Ｒａ、212Ｐｂ、212Ｂｉ、205Ｂｉおよび207Ｂｉについてガンマ線スペクトロスコピーで確立した。228Ａｃおよび205/207Ｂｉを、それぞれ治療上有用な放射性核種225Ａｃ、212Ｂｉおよび213Ｂｉのための追跡子（tracer）として用いた。
【００１９】
本発明者らは、この種のリポソームに導入された212Ｐｂが崩壊した後は、212Ｂｉが有意には移動しなかったという有意義かつ予想外の発見をした。分子的に連結された212Ｂｉ用ジェネレーターとして、212Ｐｂを利用する現在の状況は、相当の放出（≧３０％）が通常はキレート化剤から生じることを示している (McClure および Feinendegen, 1998; Mirzadeh ら, 1993)。しかしながら、例えばリポソーム内部のような高濃度のキレート化剤中に212Ｐｂを閉じ込めることにより、娘生成物の放出を回避することができ、核変換後に娘核種を閉じ込めるのに使用可能な複合体系を提供することができた。212Ｂｉ娘核種をほとんど定量的に保持できた212Ｐｂのための複合体系を報告するのは、今回が初めてである。したがって、本発明は、リポソームの内部に位置する放射性核種およびキレート化剤を含むイオン透過担体と一緒になったリポソーム（複合体系）に関し、ここで、この複合体系は娘核種を保持できるかまたは保持できない。
【００２０】
本発明に係るキレート化剤は
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸（ＤＯＴＡ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロトリデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸（ＴＲＩＴＡ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-四酢酸（ＴＥＴＡ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-テトラ（メチレン）ホスホン酸（ＤＯＴＭＰ）、
1,4,7,10-テトラアザシクロトリデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-テトラ（メチレン）ホスホン酸、
1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-テトラ（メチレン）ホスホン酸、
ジエチレントリアミン-N,N',N''-五酢酸およびその異性体誘導体、
クリプテート[2,2,2]、クリプテート[3,2,2]、クリプテート[2,2,1] およびそのモノ−およびジ−ベンゾ誘導体、
富電子（ドナー）基（ヒドロキシル、カルボキシル、エステル、アミド、アミン）を有する架橋カリックス[4]アレン、
1,10-ジアザ-4,7,13,16-テトラオキサシクロオクタデカン-1,10,N,N'-ビス-酢酸、および
1,10-ジアザ-4,7,13,16-テトラオキサシクロオクタデカン-1,10,N,N'-ビス-マロネート
からなる群から選択することができる。
【００２１】
別の重要かつ驚くべき発見は、本発明に係るリポソームが223Ｒａを効果的に取り込んで保持できたことである。腫瘍をラジウム-２２３でターゲティングするのに潜在的に有用な複合体系が記載されたのは、これが初めてである。加えて、本発明者らは、ビスマスおよびアクチニウムも、本明細書に記載する種のリポソーム中に導入され強力に保持しうることを示し、このことは212Ｂｉ、213Ｂｉおよび225Ａｃに基づく複合体系をも調製できることを示している。
【００２２】
本発明に係る複合体系は、リポソーム膜における表面基、例えばＰＥＧを改質したり、または改質しないで調製することができる（ＰＥＧグラフト化／ＰＥＧ化リポソーム）。膜にＰＥＧを用いる利点は、それがいくつかのＰＥＧ-反応性基を提供し、その結果、例えば抗体、抗体のフラグメントまたは構築物のようなタン白質または葉酸塩または他の受容体親和性（受容体結合性）のタン白質／分子を複合させるのを可能とすることである。
【００２３】
本発明はさらに、リポソーム膜に結合した受容体結合性タン白質を有する新規な種類のリポソームに関する。本明細書において、本発明者らは、葉酸塩で標識した抗体により複合された、放射性標識のＰＥＧグラフト化リポソームを記載する。葉酸塩結合性タン白質（ＦＢＰ）、すなわち、グリコシル-ホスファチジル-イノシトールが連結した細胞膜タン白質（エンドサイトーシスを介して酸化された葉酸塩の細胞取り込みに関係する）を発現する腫瘍をターゲティングするために葉酸塩および葉酸塩誘導体を使用することは、研究者の中で注目を引いている (Kranz ら, 1996; Reddy ら, 1998; Shinoda ら, 1998; Trippet ら, 1999)。いくつかの種類のヒト癌細胞がＦＢＰを過剰発現することが示されているので、この受容体は、葉酸塩と複合した治療用放射性同位体を送達させるための可能な標的になりうる。したがって、葉酸塩に複合した抗体を用いることにより、癌に対しターゲティングする放射性核種治療法を得ることができるであろう。さらに、葉酸塩で標識した抗体の抗原結合性部位がＦＢＰとは異なる腫瘍関連抗原に対して指令されているならば、二重の結合能力が得られる（すなわち、抗原-抗体およびＦＢＰ受容体の両者に対する親和性が得られる）。本発明者らが知るところでは、葉酸塩で標識した抗体を複合させることを記載するのは、これが初めてである。
【００２４】
本発明に係るリポソームに複合した葉酸塩で標識した抗体は、放射線治療を増強するために、ある放射性核種または異なる放射性核種の混合物でさらに標識することができるであろう。
葉酸塩で標識した抗体がリポソームに複合するこの新規な組み合わせが、葉酸塩受容体を発現する細胞に放射性核種をターゲティングさせるために使用できることを本発明は示す。これはアルファ粒子エミッターで特に有用であり、これらのエミッターは、哺乳類細胞に対して著しい毒性を有する高い線エネルギー付与（高-ＬＥＴ）のエミッターである (Hall, 1994; Larsen ら, 1998; Ritter ら, 1997)。しかしながら、アルファ放射線源は、他の種類の放射線と比較して放射線を特別に小さい面積に送出することができる。したがって、アルファ放射線源を標的組織に導入できるならば、正常組織への組織被爆を減少させることができる。
【００２５】
本発明に係る複合体系はまた、例えばエストロゲンまたはテストステロンに対する抗体を複合させることにより、エストロゲン受容体またはテストステロン受容体を発現する細胞を標的目的とさせるために使用することができるであろう。
本発明により用いられる標識された抗体は、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭクラス、および／またはそのフラグメントおよび／または構築物（例えばミニボディ）のものである。さらに、これらの抗体および／またはフラグメントおよび／または構築物は、ネズミの、キメラの、または充分にヒト化したポリクローナルまたはモノクローナルであろう。
【００２６】
本発明はまた、ヒトを含む哺乳類に、静脈内へ、および／または局所へ、および／または腫瘍内への投与経路で注射または注入するのに適した医薬溶液を調製するための、本発明に係る複合体系の使用に関する。その医薬溶液は、放射能免疫複合体または数種の放射能免疫複合体および／または他の形態の放射線医薬品治療法、化学療法、外部光線療法または外科手術と組み合わせて、悪性疾患を処置するために使用することができる。
【００２７】
本発明はまた、例えば脳癌、肺癌、頚癌、卵巣癌または乳癌または白血病、リンパ腫または悪性黒色腫のような悪性疾患を処置するための、本発明に係る複合体系の使用方法に関する。
本発明はまた、リポソーム溶液を含有するバイアル、および溶液中で放射性核種を含有する第二のバイアルを含み、放射能標識を容易にするように混合できる、本発明に係る複合体系を調製するためのキットに関する。加えて、このキットを、受容体親和性の複合体系を得るために、受容体親和性を有するタン白質および／または分子を含有する第三のバイアルと混合することができるであろう。
【００２８】
試薬および装置
ガンマ線スペクトロスコピー法は、マルチチャンネル分析器 (EG&GORTEC. Oak Ridge, TN, USA) に繋いだゲルマニウム検出器 (Canberra Meriden, CT, USA) を用いて行った。Beckmann LS 6500 (Beckmann, Fullerton CA, USA) を液体シンチレーション計数に用いた。ＤＳＰＣおよびコレステロールは Northern Lipids (Vancouver, Canada) から購入した。セファデックス G-25 PD-10 カラム (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) を、放射能標識したリポソームの精製に用いた。巨大環状キレート化剤のＤＯＴＡをリポソーム内部のキレート化剤として用い、Macrocyclics (Richardson, TX, USA) から購入した。Ultrex 等級のＨＮＯ3 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA) および６Ｍ ＨＣｌ (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) および、Fluka(Sigma-Aldrich AS, Norway)から得たビス(2-エチルヘキシル)リン酸（ＨＤＥＨＰ）を、この研究に用いた。
【００２９】
イオン透過担体で媒介されるリポソームの陽イオン負荷に用いたすべての緩衝液を、アルギニン（遊離塩基）を用いて所望のｐＨに調節した。用いたすべての水は Milli-Q 浄水装置 (Millipore, Bedford, MA, USA) から得た。イオン交換樹脂は Bio-Rad (Hercules CA, USA) から供給された。
樹脂を水、次いで６Ｍ ＨＣｌ、引き続きアセトン、最後に水で洗浄することにより前処理した。該樹脂はカラムに充填する前においては水中で貯蔵した。
【００３０】
用いたＤＭＳＯを４オングストロームのふるいで貯蔵した。
この実験に用いた232Ｔｈ(ＮＯ3)4は２０年超えて貯蔵しておいたものである。サンプルはオスロ大学化学科核化学グループ（Oslo, Norway）から提供された。
3Ｈ-葉酸を、Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK) から購入した。
【００３１】
他のすべての化学薬品を、Sigma-Aldrich, Norway から購入した。
リポソームとともに実験に用いた放射性核種のいくつかの物理的性質を、表１に示す。
【００３２】
【表１】
0004933712.tif 000002
【００３３】
ベストモード
上記の手順に従って調製したリポソームに、ラジウム-２２３または鉛-２１２を負荷した。その次に、抗体をリポソームと反応させて、リポソームの表面上にある抗体分子とした。約１００μｍのリポソームの大きさが全身的な送達にとって適切であろうが、例えば頭蓋内脳癌を処置するため、または腹腔内卵巣癌を処置するための腔内送達を達成する場合には、２００〜１０００μｍの典型的な大きさを用いることができる。（それより大きなリポソームのサイズは、調製物が注射される体腔からのクリアランス速度を遅くし、これによって腫瘍の領域中で高い濃度が維持されるであろう。）
【００３４】
【実施例】
次に、図面および実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【００３５】
【実施例１】
リポソーム中への212Ｐｂ／212Ｂｉの負荷
方法：  Hassfjell および Hoff (1994) により記載されたように、228Ｔｈ源からの220Ｒｎの放射を介して、212Ｐｂ／212Ｂｉを生じさせた。無担体の212Ｐｂ／212Ｂｉは、採取容器から０.１Ｍ ＨＮＯ3を用いて滲出し、次いでこの溶液を 陽イオン交換樹脂、AG 50W-X4 の２×２０ｍｍカラムに適用した。その後、212Ｐｂ／212Ｂｉを２Ｍ ＨＣｌ中に溶離し、この溶液を蒸発乾固した。次いで212Ｐｂ／212Ｂｉを２００μｌの１０ｍＭ酢酸溶液、ｐＨ５に溶解した。212Ｐｂを、その２３８.６ keV ガンマ線（表１）の測定により定量した。212Ｂｉを、放射平衡でその娘核種208Ｔｌの５８３.１ keV ガンマ線を測定することにより定量した。
【００３６】
結果：  加えた活性の０.２％未満が、３日間までのインキュベーション時間でリポソームと会合したことが認められた。
３０〜６０ｍＭの脂質濃度に相当するリポソームを、イオン透過担体 A 23187のフィルム（１０〜１３ｎＭ）と激しく混合した。次に約１ MBq の212Ｐｂ／212Ｂｉを加え、この混合物を７５℃で３０分間インキュベートした後、PD-10 カラム上で溶離した。負荷した小胞の９５％を超える分を含有する画分を、次いで第二の PD-10 カラム上で溶離した。リポソームに会合した212Ｐｂ／212Ｂｉの潜在期間を、小胞をヒト血清または３７℃、ＰＢＳ中でインキュベートすることにより調査した。活性の分布を２４時間の期間にわたって追跡した。
【００３７】
結果： 212Ｐｂの有効負荷：３４.８％（ｎ＝３）。
ガンマ線スペクトロスコピー法により保持を測定し、212Ｐｂの９９％を超える分が２４時間までのインキュベーション時間にリポソームに会合した。
【００３８】
【実施例２】
リポソームに会合した212Ｐｂの崩壊から形成された212Ｂｉの保持
方法：  上記のようにリポソームに、212Ｐｂを負荷した。１０ｍ Ｍ ＥＤＴＡを含むＰＢＳで前平衡化した PD-10 カラム上で、反応混合物をＰＢＳ中の１０ｍ Ｍ ＥＤＴＡで溶離することにより、放射能を結合したリポソームを単離した。
【００３９】
３時間の後、212Ｐｂと212Ｂｉとの間の過渡平衡の成立を確実にするために、上記溶液のアリコートを１０ｍ ＭＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いて前平衡化した PD-10 カラムに適用して、リポソームに会合した放射性核種から遊離の放射性核種を分離した。活性の分布を２４時間の期間にわたり追跡した。
標準として使用するために、上記分離操作を行わなかった標識リポソームの別のアリコート（クロマトグラフィー手順から得られたものと幾何形態が同一のもの）を測定した。これは、放射平衡における212Ｂｉ／212Ｐｂの活性比を確立するために行った。
【００４０】
結果：クロマトグラフィーで分離したリポソームについて得られた212Ｂｉ／212ｐｂの比を平衡混合物のそれと比較することにより、リポソームに会合した212Ｐｂの崩壊後に212Ｂｉの９５％を超える分がリポソーム中に保持されていたことが示されたと評価した。
さらに、クロマトグラフィーで得られた二つの画分中における212Ｂｉ活性の測定値を比較した。総212Ｂｉ活性の９９％を超える分がリポソームに相当する画分中に溶離していた。
【００４１】
【実施例３】
リポソーム中への可能なＰｂおよびＢｉの再負荷の調査
方法：  １５０ｍＭクエン酸、３０ｍＭ ＤＯＴＡを閉じ込めており、しかもＰＢＳ中に１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する外部溶液を用いた、３０〜６０ｍＭの脂質に相当するリポソームを、イオン透過担体 A23187 のフィルム（ガラスバイアルの内部表面上２０〜２６ nmol）に加えた。次いでＰＢＳ中の212Ｐｂおよび212Ｂｉを加えた後、３７℃でインキュベートした。この溶液のアリコートを PD-10 カラムに通して溶離し、このクロマトグラフィーで得られた、リポソーム溶離物に相当する画分を装填Ｇｅ-検出器でアッセイした。
【００４２】
結果： 212Ｐｂおよび212Ｂｉの検出可能な負荷（＜１％）は、２４時間の期間にわたって観察されなかった。
【００４３】
【実施例４】
リポソーム中への223Ｒａの負荷
227Ａｃに基づくジェネレーターから文献記載のように223Ｒａを形成した (Larsen および Henriksen, 1999)。簡単にいうと、227Ａｃおよびその娘核種227Ｔｈを抽出クロマトグラフィー樹脂のカラムに保持し、鉱酸を用いて223Ｒａの溶離を容易にする。リポソーム中にラジウムを導入するために、ジェネレーターから溶出した溶液を蒸発乾固し、次いで223Ｒａを５ｍＭシトレート、ｐＨ７.４に溶解した。
【００４４】
３０〜６０ｍＭの脂質濃度に相当するリポソームを、イオン透過担体 A23187のフィルム（ガラスバイアルの内部表面上１０〜１３ nmol）と激しく混合した。その後、約５０ kBq の223Ｒａを加え、この混合物を７５℃で２０分間インキュベートした。次いで反応混合物を１００μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡに加え、脂質小胞と会合した放射能を単離するために、PD-10 カラム上で溶出した。
【００４５】
リポソームに会合した223Ｒａの保持を、ヒト血清 (Sigma) または５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するヒト血清中、０.３ｍｇ総脂質／ｍｌ血清のリポソーム濃度で、３７℃でインキュベートすることにより調べた。その結果を表２に示す。これらの結果は223Ｒａがリポソーム中に極めて安定的に保持されることを示している。
【００４６】
【表２】
0004933712.tif 000003
【００４７】
【実施例５】
再負荷が223Ｒａの保持実験に寄与するかどうかの決定
方法：  １５０ｍＭクエン酸、３０ｍＭ ＤＯＴＡおよび外部溶液としてＰＢＳまたは血清を用いて脂質フィルムを水和することにより形成した、３０〜６０ｍＭの脂質に相当するリポソームを、イオン透過担体 A23187 のフィルム（ガラスバイアルの内部表面上１０〜１３ nmol）に加えた。次いで５ｍＭシトレート、ｐＨ7.4の223Ｒａを加えた後、３７℃でインキュベートした。この溶液のアリコートを PD-10 カラムに通して溶離し、このクロマトグラフィーで得られたリポソームに相当する画分を搭載Ｇｅ-検出器でアッセイした。
【００４８】
【実施例６】
リポソーム中への207Ｂｉの負荷
天然鉛を標的とする（ｐ，ｘｎ）反応により203-207Ｂｉを生成させ、鉛選択的な抽出クロマトグラフィー樹脂を用いて精製した (HenriksenとFoff, 1998)。
主に205Ｂｉおよび207Ｂｉからなる同位体Ｂｉ混合物（以下、207Ｂｉとして示す）を、この実験に用いた。１０-4Ｍ ＨＣｌ中の207Ｂｉ溶液５０μｌを、３０〜６０ｍＭの脂質に相当するリポソーム（これは、前もってイオン透過担体 A 23187 のフィルム（ガラスバイアルの内部表面上１０〜１３nmol）と混合し、７5℃で３０分間インキュベートした）に加えた。次いで反応混合物を１００μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡに加え、PD-10 カラム上で溶離して、脂質小胞に会合した放射能を単離した。
【００４９】
結果：  総207Ｂｉの３２％がリポソームと会合したことが認められた。
【００５０】
【実施例７】
リポソーム中への228Ａｃの負荷
232Ｔｈ(ＮＯ3)4調製物から、溶剤抽出とイオン交換との組み合わせにより228Ａｃを単離した。232Ｔｈ(ＮＯ3)4（もとは４Ｈ2Ｏ）を２０ｍｌの０.１Ｍ ＨＮＯ3に溶解し、５００ｍｌの分離ロートに加え、ヘプタン中の２Ｍ ＨＤＥＨＰ溶液５×１００ｍｌと接触させた。次いで水相をヘプタンで３回洗浄し、その後、228Ａｃを文献(Cabell, 1959)記載のように分離するために、AG50W-X12 陽イオン交換樹脂の３×４０ｍｍカラムに適用した。このカラムから212Ｐｂ、212Ｂｉ、224Ｒａおよび228Ｒａを３Ｍ ＨＮＯ3中に溶離し、この溶液を＞２０時間放置した。次にこの溶液を蒸発乾固した後、放射性核種を該容器から１ｍｌの１Ｍ ＨＮＯ3で滲出した。この溶液を AG50W-X12 の３×４０ｍｍカラムに適用した。再び212Ｐｂ、212Ｂｉ、224Ｒａおよび228Ｒａを３Ｍ ＨＮＯ3中に溶離した。228Ａｃを６Ｍ ＨＮＯ3に溶離し、溶離物を蒸発乾燥した。次いで228Ａｃを容器から２００μｌの５ｍＭ ＨＮＯ3を用いて滲出した。約６kBq の228Ａｃを上記のようにイオン透過担体 A23187 を含有するリポソームに加え、７５℃で６０分間インキュベートした。それから反応混合物を１００μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡに加え、PD-10 カラム上で溶離して、脂質小胞に会合した放射能を単離した。負荷した小胞の９５％を超える分に相当する画分をプールし、次に第二の PD-10 カラム上で溶離した。放射能標識した小胞をヒト血清またはＰＢＳ中で３７℃でインキュベートすることにより、リポソームの228Ａｃの保持を調べた。活性の分布を２４時間の期間にわたって追跡した。
結果：  負荷実験では、加えた228Ａｃの約９０〜９５％（標識および精製中の崩壊に関して補正した）が、負荷操作後にリポソームに会合していた。保持実験では、228Ａｃの９８％を超える分が、２４時間までのインキュベーション時間にリポソームに会合したと認められた。
【００５１】
【実施例８】
90Ｙの負荷
方法：  放射能標識したリポソームの挙動を研究するためのこの実施例において、90Ｙを追跡子として用いた。この研究では液体シンチレーション計数により90Ｙおよび90Ｓｒを測定した。
【００５２】
Dietz および Horwitz (1992) により記載されたように、ストロンチウム選択的な抽出クロマトグラフィー樹脂を用いて、90Ｙを90Ｓｒから単離した。ここで、０.１Ｍ ＨＮＯ3中の90Ｓｒ (Amersham, Buckinghamshire, England) を蒸発乾固し、残留物を３Ｍ ＨＮＯ3に加えた。この溶液をＳｒ樹脂 (EiChroM, Darien, IL, USA) の３×２０ｍｍカラムに載せ、このカラムを５ｍｌの３Ｍ ＨＮＯ3で洗浄した。
【００５３】
この手順は90Ｙを選択的に溶離する一方で、Ｓｒはカラム上によく保持され、90Ｓｒ／90Ｙ混合物の90Ｓｒを約１０3だけ低下させる (Dietz および Horwitz, 1992)。この後、０.０５Ｍ ＨＮＯ3を用いて90Ｓｒをストリップさせ、この溶液を、90Ｙを成長させるために１週間放置した。次いでこの溶液を蒸発乾固し、残留物を３Ｍ ＨＮＯ3に加えた後、第二のＳｒ樹脂のカラム上で放射性核種を分離した。90Ｙを含有する溶離物を蒸発乾固し、２００μｌの５ｍＭ ＨＮＯ3を用いて容器から滲出した。この溶液を、イオン透過担体 A23187（先に記載した通り） を含有するリポソームに加え、７５℃で６０分間インキュベートした。次いで反応混合物に５０μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡを加え、PD-10カラムで溶離して、脂質小胞に会合した放射能を単離した。次いで小胞の９５％を超える分に相当する画分を第二の PD-10 カラム上で溶離した。ヒト血清またはＰＢＳ中、３７℃で小胞をインキュベートすることにより、リポソームに会合した90Ｙのリポソーム保持を調査した。活性の分布を４日の期間にわたって追跡した。
【００５４】
結果：ゲル排除カラム上で負荷して精製した１時間後に、加えた90Ｙの９５％を超える分がリポソームに会合していた。
リポソームの保持実験では次の結果が得られた：５時間および１日後に９９％を超える分がリポソームに会合していた。４日後にリポソームに会合した画分は９８±１％と決定された。
【００５５】
これらの実験で示されたように、アルファ粒子および／またはベータ粒子を放出する放射性核種でリポソームを放射能標識することができ、しかもリポソームはこれらの放射性核種を生理的温度で良好に保持することができる。
【００５６】
【実施例９】
イットリウム-９０／ラジウム-２２３ ＰＥＧ化リポソーム−葉酸塩−Ｆａｂ'の調製
ＰＢＳ中のＦ(ａｂ')2Ｒφ骨髄腫（サブクラスＩｇＧ）１４ｍｇ／ｍｌをこの実験に用いた (Michalsen, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway)。
抗体への葉酸の複合
葉酸・２Ｈ2Ｏを最初にジメチルスルホキシド（Fulka、Ｈ2Ｏ含有量 ０.０５％未満）に溶解した。次いでこの溶液を活性化した４オングストロームのふるい上にカニューレで加え、アルゴン雰囲気中で暗所に６〜１０時間貯蔵した。トリチウムで標識した葉酸塩（3Ｈ-葉酸塩）を、3Ｈ-葉酸カリウム塩水溶液として加えた（クエン酸に対して１％）。タン白質に複合させるのに用いた3Ｈ-葉酸塩の比放射活性は、７〜７.５ GBq/mol であった。
【００５７】
3Ｈ-葉酸塩をＦ(ａｂ')2 骨髄腫抗体に結合させるために、１０モル当量の 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを葉酸塩溶液に加え、室温で３０分間インキュベートすることにより活性化した。その後、３０〜４０倍モル過剰の活性化した葉酸塩を、ＰＢＳ中のタン白質１４ｍｇ／ｍｌに加え、３０〜６０分間反応させた。ＰＢＳ／ホウ酸塩、ｐＨ８.５中の０.３Ｍグリシン０.２ｍｌを加えて反応を停止した。ＰＢＳ中で前平衡化した PD-10 カラムを用いて、葉酸塩Ｆ(ａｂ')2複合体（葉酸塩Ｆ(ａｂ')2）を未反応物質から分離した。葉酸塩Ｆ(ａｂ') を形成するために、葉酸塩Ｆ(ａｂ')2を１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）中で室温、２時間インキュベートし、続いて NAP-5 サイズ排除カラム上で溶離した。この溶液にアルゴンを通気することにより、葉酸塩Ｆ(ａｂ') を含有する画分を脱酸素し、その直後にこの溶液をリポソーム溶液と混合した。
【００５８】
２８０ｎｍでの分光光度計の読みと組み合わせた液体シンチレーション計数 (Beckmann LS6500) で測定した精製タン白質の3Ｈ含有量により、葉酸が複合した程度を決定した。
リポソームに結合した葉酸塩Ｆ(ａｂ') の画分を定量するために、ＤＴＴと反応させる前に痕跡量のヨウ素化Ｆ(ａｂ') を加えた（タン白質を標準的手順に従って IodoGen でヨウ素化した）。
【００５９】
リポソームへの標識した抗体の複合
総リン脂質の５モル％でＤＳＰＥ-ＰＥＧ 2000-ＭＰＢ (Northern Lipids, VA, Canada) のナトリウム塩を含有させた。ほかにイオン透過担体で媒介される陽イオン負荷段階のために、ＰＥＧ化されていないリポソームについて記載したのと同じ方法でリポソームを構築して調製した。
【００６０】
負荷段階後の反応混合物が室温に達した後で、葉酸塩Ｆａｂ' を加えて０.３〜０.５ｍｇ／ｍｌのタン白質濃度を得る前に、リポソーム懸濁液を脱酸素した。脂質濃度は、Bartlett リンアッセイ (Bartlett, 1958) で測定すると、１〜３ｍＭであった。葉酸塩Ｆａｂ' およびリポソームを室温で２時間反応させた。次いで反応混合物をＰＢＳで平衡化した PD-10 カラムに適用した。葉酸塩Ｆａｂ' に複合したＰＥＧ-リポソームを、葉酸塩受容体結合アッセイに用いる前に４℃で１２〜１５時間貯蔵した。
【００６１】
リポソームに結合した放射能を、二重標識サンプルからのそれぞれのチャンネル中へのスピルオーバー（spillover）を補正して NaI ウェル型検出器で測定した。単一の核種および核種混合物のサンプルを参照として用いた。
放射能の測定値から、リポソームの大きさが１００ｎｍおよび８・１０4リン脂質／小胞 (Kirpotin ら, 1997) およびＦａｂ' 骨髄腫抗体の分子量が 52 000 に等しいと仮定して、タン白質濃度をリポソーム当たりのＦａｂ' 数に換算した。
【００６２】
細胞に結合した放射能を、Insta-Gel plus (Packard) の添加後に NaI-検出器（Ｙ-９０に関し３つのより高い濃度）および液体シンチレーション計数により測定した（表３）。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
リポソーム上の3Ｈ-葉酸塩の検出
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／３００ｍＭショ糖中のＰＥＧリポソーム（２.５ｍＭの脂質濃度）を、3Ｈ-葉酸塩に複合したＦａｂ'（ＰＢＳ中０.５ｍｇ／ｍｌ、葉酸塩／Ｆａｂ' 比２±０.２）と反応させた。室温で２時間の後、葉酸塩−Ｆａｂ' が結合したリポソームを、セファロース CL-4B のカラム上で溶離しることにより単離した。クロマトグラフィーで得た画分の液体シンチレーション計数により、リポソーム上の3Ｈ−葉酸塩Ｆａｂ' を定量し、葉酸塩−Ｆａｂ'／リポソームの比が約１１０であると決定した。
略語：
ＤＳＰＣ：  ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＯＴＡ：  1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,N,N',N'',N'''-
四酢酸
ＤＳＰＥ-ＰＥＧ 2000−ＭＰＢ：  N-(4-(p-マレイミドフェニル)ブチリル)-
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン (Northern
Lipids,  VA, Canada)
ＨＥＰＥＳ：  N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸
ＰＢＳ：      リン酸緩衝生理食塩水
ＥＤＴＡ：    エチレンジアミン-N,N'-四酢酸
ＨＤＥＨＰ：  ビス（2-エチルヘキシル）リン酸
ＰＥＧ：      ポリエチレングリコール
ＤＴＴ：      ジチオトレイトール
【００６５】
【表４】
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【００６６】
【表５】
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【００６７】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１：ＯＶＣＡＲ３細胞への、ＰＥＧ化リポソーム（リポソーム膜に複合したＦａｂ’抗体または葉酸塩で標識したＦａｂ’抗体のいずれかを含有する）の結合。
【図２】  図２：ＯＶＣＡＲ３細胞への、葉酸塩化ＰＥＧリポソームの結合、対（versus）、葉酸塩化されていないＰＥＧリポソームの結合。
【図１】
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【図２】
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