(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの産生方法であって：
（ａ）当該ポリペプチドの産生を誘導する培地中で、当該ポリペプチドをコードする第１核酸配列と、これに作用可能に連結した、当該第１核酸配列とは異種の共通翻訳開始配列を含んで成る第２核酸配列を含んで成る糸状菌宿主細胞を培養し（ここで、共通翻訳開始配列の３’末端は、第１核酸配列の開始コドンのすぐ上流にあり、そして共通翻訳開始配列は、配列番号２の核酸配列から成る）、そして
（ｂ）培養液から当該ポリペプチドを単離すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
第１核酸配列が前記糸状菌宿主細胞に対して異種のポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドがホルモン、ホルモン変異体、酵素、受容体又はその一部、抗体又はその一部、あるいはレポーターである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、又は連結酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記糸状菌宿主細胞が、同一の産生条件下で培養されたとき、前記ポリペプチドをコードする核酸配列と作用可能に連結した非共通翻訳開始配列を含む真菌細胞と比較して、少なくとも約２５％以上のポリペプチドを産生する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号２の核酸配列から成る単離された共通翻訳開始配列の核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸と作用可能に連結したポリペプチドをコードする核酸から成る核酸コンストラクト。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸コンストラクトを含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸コンストラクトを含んで成る組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明はポリペプチドを産生するための方法に関する。本発明はまた、ポリペプチドをコードする核酸配列と作用可能に連結した共通翻訳開始配列を含んで成る核酸コンストラクト、ベクター、及び宿主細胞、並びに単離された共通翻訳開始配列に関する。
【０００２】
関連技術の説明
真菌宿主細胞、特に糸状菌細胞、例えばアスペルギルス（Aspergillus）における、異種タンパク質の組換え体産生は、商業的に適した量の当該タンパク質を産生するのに更に望ましい担体を提供しうる。
【０００３】
異種タンパク質の組換え体産生は、当該タンパク質をコードするＤＮＡが、宿主細胞にとって適当な、制御される遺伝子から切り出されたプロモーターの調節下に据えられた発現カセットを構築することによって達成される。当該発現カセットは、通常プラスミドを介した形質転換によって宿主細胞に導入される。異種タンパク質の産生は、引き続いて、発現カセットに含まれるプロモーターが適切に機能するのに必要な誘導条件の下、形質転換した宿主細胞を培養することによって達成される。
【０００４】
タンパク質の組換え体産生の改良は、通常宿主細胞におけるタンパク質の発現を調節するのに適当な新規制御配列の利用可能性を必要とする。
【０００５】
Kozak, 1981, Nucleic Acids Research 9: 5233-5252、において、高等真核生物における翻訳の開始のための、次の「共通」配列が提示された。
ＡａＡｃｃＡＵＧＧ
「共通Kozak」と称される、この配列において、最も高度に保存されたヌクレオチドは、プリンであるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）であり、これを大文字で上文に示した。突然変異的な解析によって、これらの２つの位置が最も強力に開始に影響を持つことを確認された（Kozak, 1987,m Molecular Cel Biology 7:3438-3445)。Kozakはまた、共通Kozakの上流の配列の変化が、翻訳に影響を及ぼしうることを決定した（Kozak, 1986, Proceedings of the National Academy of Science USA 83: 2850-2854）。
【０００６】
本発明の目的は、共通翻訳開始配列を用いる、真菌宿主細胞においてポリペプチドを産生するための改良方法を提供することである。
【０００７】
本発明の要約
本発明は、ポリペプチドを産生するための方法であって、（ａ）当該ポリペプチドの産生を誘導する培地中で、当該ポリペプチドをコードする第１核酸配列と、これに作用可能に連結した、当該第１核酸配列とは異種の共通翻訳開始配列を含んで成る第２核酸配列を含んで成る真菌宿主細胞を培養し（ここで、共通翻訳開始配列の３’末端は、第１核酸配列の開始コドンのすぐ上流にあり、そして共通翻訳開始配列は、５’−ＮＹＣＮＮＢＣＡＣＣ−３’（配列番号１）を含んで成り、ここで、Ｎはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）から成る群から選択されるヌクレオチドであり；Ｙはシトシン（Ｃ）、又はチミン（Ｔ）；そしてＢはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）から成る群から選択されるヌクレオチド、である）、そして（ｂ）培養液から当該ポリペプチドを単離すること、を含んで成る方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、単離した共通翻訳開始配列、並びにポリペプチドをコードする核酸配列と作用可能に連結した、１又は複数の共通翻訳開始配列を含んで成るコンストラクト、ベクター、及び真菌宿主細胞に関する。
【０００９】
本発明の詳細な説明
本発明は、ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）当該ポリペプチドの産生を誘導する培地中で、当該ポリペプチドをコードする第１核酸配列と、これに作用可能に連結した、当該第１核酸配列とは異種の共通翻訳開始配列を含んで成る第２核酸配列を含んで成る真菌宿主細胞を培養し、（ｂ）培養液から当該ポリペプチドを単離すること、を含んで成る方法に関する。
【００１０】
本発明の産生方法において、当該細胞は、当業界で知られている方法を用いて、当該ポリペプチドの産生に適した栄養培地において培養される。例えば、前記細胞は適当な培地中で、且つ当該ポリペプチドを発現させ、そして／あるいは単離する条件下で行われる、研究又は工業用の発酵槽における振盪フラスコ培養、小規模又は大規模な発酵（連続、バッチ、フェドバッチ、又は固体発酵を含む）によって培養されうる。前記培養は炭素及び窒素源並びに無機塩を含んで成る適当な栄養培地において、当業界で知られている方法を用いて起こる。適当な培地は商業的な業者から入手可能であり、又は公開されている組成（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ）に従い調製されうる。当該ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、当該ポリペプチドは培地から直接回収されうる。当該ポリペプチドが栄養培地中に分泌されない場合、当該ポリペプチドは細胞可溶化物から回収されうる。
【００１１】
当該ポリペプチドは、当該ポリペプチドに特異的な当業界で知られている方法を用いて検出されうる。これらの検出法は特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消失を含みうる。
【００１２】
本発明の方法において、同一の産生条件下で培養した場合、真菌細胞は、ポリペプチドをコードする核酸と作用可能に連結した非共通翻訳開始配列を含む真菌細胞と比較して、好ましくは少なくとも約２５％以上、より好ましくは少なくとも約５０％以上、より好ましくは少なくとも約７５％以上、より好ましくは少なくとも約１００％以上、さらにより好ましくは少なくとも約２００％以上、最も好ましくは少なくとも約３００％以上、さらに最も好ましくは少なくとも約４００％以上産生する。
【００１３】
生じた当該ポリペプチドは、当業界で知られている方法によって単離されうる。例えば、当該ポリペプチドは、限定しないが遠心、濾過、抽出、スプレー乾燥、蒸発又は沈澱を含む常用の方法によって栄養培地から単離されうる。
【００１４】
当該ポリペプチドは、続いて限定しないがクロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、等電点及びサイズ排除）、電気泳動的方法（例えば、調製用等電点電気泳動）、溶解度の差（例えば、硫酸アンモニウム沈澱）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）を含む当業界で知られている様々な方法によって精製されうる。
【００１５】
共通翻訳開始配列
用語「翻訳開始配列」は、ポリペプチドをコードする核酸配列のオープンリーディングフレームの開始コドン又は出発コドンのすぐ上流に位置する１０個のヌクレオチドとして定義される。開始コドンはアミノ酸のメチオニンをコードする、いわゆる「出発」コドンである。開始コドンは典型的にＡＴＧであるが、任意な機能的開始コドン、例えばＧＴＧであってもよい。ＲＮＡにおいて、ウラシル（Ｕ）が、デオキシヌクレオチドであるチミン（Ｔ）の代わりとなることは、当業界で周知である。
【００１６】
用語「共通翻訳開始配列」は、ポリペプチドをコードする次の配列：
５’−ＮＹＣＮＮＢＣＡＣＣ−３’（ここで、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴ；Ｙ＝Ｃ、又はＴ、；そしてＢ＝Ａ、Ｃ、又はＴ、である。配列番号１）
を有する核酸配列のオープンリーディングフレームの開始コドン又は出発コドンのすぐ上流に位置する１０個のヌクレオチドとして定義される
【００１７】
本発明はまた、その様な単離共通翻訳開始配列に関する。好ましい態様において、共通翻訳開始配列は、核酸配列５’−ＧＴＣＣＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２）、又は配列番号２の共通翻訳開始配列と同程度の生物活性を有するその亜配列を有する。別の好ましい態様において、共通翻訳開始配列は、核酸配列５’−ＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３）、又は配列番号３の共通翻訳開始配列と同程度の生物活性を有するその亜配列を有する。別の好ましい態様において、共通翻訳開始配列は、核酸配列５’−ＧＴＣＣＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号４）、又は配列番号４の共通翻訳開始配列と同程度の生物活性を有するその亜配列を有する。
【００１８】
用語「作用可能に連結」は、調節配列、例えば共通翻訳開始配列が、コード配列によってコードされるポリペプチドの産生を管理する様な、当該コード配列に関連する位置に適当に配置されている配置として本明細書で定義される。
【００１９】
用語「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に据えられた場合、ｍＲＮＡに転写され、そしてポリペプチドに翻訳される配列である。当該コード配列の境界は、前記ｍＲＮＡの５′末端側のオープンリーディングフレームのちょうど上流に位置するＡＴＧ開始コドンと、前記ｍＲＮＡの３′末端側のオープンリーディングフレームのちょうど下流に位置する転写終結因子配列とによって通常決定される。コード配列は、限定しないがゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成、組換え核酸配列を含むことがある。
【００２０】
本発明の方法において、共通翻訳開始配列は、注目のポリペプチドをコードする核酸配列とは異種のものであるが、当該共通翻訳開始配列又は核酸配列は、真菌宿主細胞にとって天然のものであってもよい。
【００２１】
核酸配列をコードするポリペプチド
当該核酸配列によってコードされるポリペプチドは、注目の宿主細胞にとって天然又は異種のものであると思われる。
【００２２】
用語「ポリペプチド」は、コードされた生成物の具体的な長さを言及することを本明細書で意味しておらず、そしてそれ故にペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含する。用語「異種ポリペプチド」は、真菌細胞にとって天然でないポリペプチド、修飾が天然配列を変化させるために行われた天然ポリペプチド、又は発現が組換えＤＮＡ技術による真菌細胞の操作の結果として定量的に変化した天然ポリペプチドとして本明細書で定義する。例えば、天然ポリペプチドは当該ポリペプチドの発現を増強し、シグナルペプチドの使用によって注目の天然ポリペプチドの細胞の外側への輸送促進し、そして当該細胞によって通常産生するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増大せしめる、本発明の共通翻訳開始配列の制御下に当該ポリペプチドをコードする遺伝子を配置することによって、組換え的に産生され得る。当該真菌細胞は、前記ポリペプチドをコードする核酸の１又は複数のコピーを含みうる。
【００２３】
好ましくは、前記の当該ポリペプチドはホルモン、又はその変異体、酵素、受容体若しくはその一部、抗体若しくはその一部、又はレポーターである。好ましい態様において、当該ポリペプチドは細胞外に分泌される。更に好ましい態様において、当該ポリペプチドは酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、又は連結酵素である。より更に好ましい態様において、当該ポリペプチドはアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファーグルコシダーゼ、ベーターグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである。
【００２４】
注目のポリペプチドをコードする核酸配列は、いずれかの原核細胞、真核細胞又は他の供給源から獲得されうる。本発明の目的のために、用語「獲得」は与えられた供給源と関連して本明細書で使用する場合、前記ポリペプチドが前記供給源によって又は前記供給源由来の遺伝子が挿入された細胞によって産生することを意味するはずである。
【００２５】
注目のポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化するために使用する技術は当業界で知られており、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組み合わせを含む。その様なゲノムＤＮＡからの核酸配列のクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによってもたらされることがある。例えば、Innis et al., 1990, PCR Protocols : A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照のこと。前記のクローニング方法は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及び単離、前記フラグメントのベクター分子への挿入、前記核酸配列の複数のコピー又はクローンが置換されるであろう突然変異真菌細胞への組換えベクターの組み込みを含みうる。前記核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
【００２６】
本発明の方法において、当該ポリペプチドは更に、別のポリペプチドが前記ポリペプチド又はそのフラグメントのＮ末端又はＣ末端で融合されている融合又は混成ポリペプチドを含むことがある。融合ポリペプチドは、あるポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を、別のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）に融合することによって産生する。融合ポリペプチドを産生するための技術は当業界で知られており、そして前記ポリペプチドをコードするコード配列がインフレームにあり、そして融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーター及びターミネーターの支配下にある様にそれらを連結することを含む。前記混成ポリペプチドは、１又は複数のものが突然変異真菌細胞にとって異種であってもよい、少なくとも２つの異なるポリペプチドから獲得される部分的又は完全なポリペプチドの組み合わせを含んで成ってもよい。
【００２７】
核酸コンストラクト
本発明はまた、本発明の共通翻訳開始配列と作用可能に連結したポリペプチドをコードする核酸配列及び、適当な宿主細胞における、当該調節配列と適合性のある条件下での前記コード配列の発現を指示する１又は複数の調節配列を含んで成る核酸コンストラクトに関する。発現は、限定しないが転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む前記ポリペプチドの産生に関与するいずれかの段階を含むと理解されるだろう。
【００２８】
「核酸コンストラクト」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの、天然の遺伝子から単離した又は他の方法で天然に存在しないであろう方法で組み合わされ、そして並列した核酸のセグメントを含む様に修飾した核酸分子として定義される。核酸コンストラクトの用語は、前記核酸コンストラクトがコード配列の発現に必要な全ての調節配列を含む場合に、発現カセットの用語と同義である。
【００２９】
ポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、当該ポリペプチドの発現のために提供される様々な方法で更に操作され得る。核酸配列の、ベクター内へのその挿入前の操作は、発現ベクターに依存して所望とされるか、又は必要とされ得る。組換えＤＮＡ技術を利用する核酸配列を修飾する技術は当業界で周知である。
【００３０】
本発明の方法において、当該核酸配列は１又は複数の天然調節配列を含んで成ることがあり、あるいは１又は複数の天然調節配列は宿主細胞におけるコード配列の発現を向上せしめるために、当該核酸配列とは異種の１又は複数の調節配列で置換されることもある。
【００３１】
用語「調節配列」は、本発明のポリペプチドの発現に必要又は有利な全ての要素を含むと本明細書で定義する。各調節配列は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然又は外来であってもよい。前記調節配列は、限定しないがリーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、本発明の共通翻訳開始配列、シグナルペプチド配列、及び転写終結因子を含む。最低限、前記調節配列はプロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。前記調節配列は、当該ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と、前記調節配列とのライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーと一緒に提供されうる。
【００３２】
前記調節配列は適当なプロモーター配列、前記核酸配列の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列であってもよい。前記プロモーター配列は、当該ポリペプチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。前記プロモーターは、変異の、短かくなった、及び混成のプロモーターを含む、選択した宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であってもよく、そして宿主細胞にとって同種又は異種のいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から獲得されうる。
【００３３】
糸状菌宿主細胞における、本発明の核酸コンストラクトの転写を指示するのに適当なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のタカアミラーゼ、リゾムコール・ミエーイ（Rhizomucor miehei)のアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の中性アルファーアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定アルファーアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー若しくはアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエーイのリパーゼ、アスペルギルス・オリザエのアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)のアセトアミダーゼ、アスペルギルス・オリザエのアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、フサリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）のアミログルコシダーゼ、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)のトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）から獲得されるプロモーター、及びＮＡ２−ｔｐｉ（アスペルキルス・ニガーの中性アルファアミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の混成プロモーター）、並びにそれらの変異の、短かくなった、及び混成のプロモーターである。
【００３４】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ(ENO-1)遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ・ガラクトキナーゼ遺伝子(GAL1)、サッカロミセス・セレビシエ・アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2/GAP)、及びサッカロミセス・セレビシエ  3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast、8:423-488に記載されている
【００３５】
前記調節配列は、転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列である、適当な転写終結配列であってもよい。前記終結配列は当該ポリペプチドをコードする核酸配列の３′末端に作用可能に連結する。選択した宿主細胞において機能的であるいずれかの終結因子が本発明で使用されうる。
【００３６】
糸状菌宿主細胞にとって好ましい終結因子は、アスペルギルス・オリザエのタカアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニル酸塩合成酵素、アスペルギルス・ニガーのアルファーグルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から獲得される。
【００３７】
酵母宿主細胞のための好ましい終結因子は、サッカロミセス・セレビシエ・エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ・シトクロムC(CYC1)、又はサッカロミセス・セレビシエ・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子から獲得される。酵母宿主細胞のために有用な他の終結因子は、前述のRomanos et al.,1992に記されている。
【００３８】
前記調節配列は更に、適当なリーダー配列、前記宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。前記リーダー配列は、当該ポリペプチドをコードする核酸配列の５′末端に作用可能に連結する。選択した宿主細胞において機能的ないずれかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。
【００３９】
糸状菌宿主細胞にとって好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエのタカアミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から獲得される。
【００４０】
酵母宿主細胞にとって適当なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ・エノラーゼ(ENO-1)遺伝子、サッカロミセス・セレビシエの3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエのα-因子、及びサッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2/GAP)から獲得される。
【００４１】
前記調節配列は更に、ポリアデニル化配列、前記核酸配列の３′末端に作用可能に連結し、そして転写されるときに、転写されるｍＲＮＡにポリアデノシン残基を加えるためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列であってもよい。選択した宿主細胞において機能的ないずれかのポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。
【００４２】
好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエのタカアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニル酸塩合成酵素、フサリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガーのアルファーグルコシダーゼから獲得される。
【００４３】
酵母宿主細胞にとって有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology、15:5983-5990(1995に記載されている。
【００４４】
前記調節配列は更に、当該ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、そしてコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせるシグナルペプチドのコード領域であってもよい。前記核酸配列のコード配列の５′末端は、本質的に翻訳の読み枠において分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然において連結する、シグナルペプチドのコード領域を含みうる。あるいは、前記コード配列の５′末端は、前記コード配列に対して外来であるシグナルペプチドのコード領域を含みうる。前記の外来のシグナルペプチドのコード領域は、前記コード配列がシグナルペプチドのコード領域を天然に含まない場合に必要だろう。あるいは、前記の外来のシグナルペプチドのコード領域は、前記ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドのコード領域を置換する。しかし、発現した当該ポリペプチドを、選択した宿主細胞の分泌経路に向かわせる、いずれかのシグナルペプチドのコード領域が、本発明において使用されうる。
【００４５】
糸状菌宿主細胞にとって有効なシグナルペプチドのコード領域は、アスペルギルス・オリザエのタカアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、リゾムコール・ミエーイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）のセルラーゼ及びフミコラ・ラヌギノサのセルラーゼをコードする遺伝子から獲得されるシグナルペプチドのコード領域である。
【００４６】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのα−因子及びサッカロミセス・セレビシエのインベルターゼのための遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドのコード領域は、前述のRomanos et al., 1992に記載されている。
【００４７】
前記調節配列は更に、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドのコード領域であってもよい。生じたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（あるいはいくつかの場合においてチモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは通常不活性であり、そして前記プロポリペプチド由来のプロペプチドの触媒的又は自己触媒的な開裂によって、成熟な活性ポリペプチドに変換されうる。前記プロペプチドのコード領域は、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のアルカリプロテアーゼ（aprE)、バチルス・サブチリスの中性プロテアーゼ（nprT）、サッカロミセス・セレビシエのα-因子、リゾムコール・ミエーイのアスパラギン酸プロテイナーゼ及びマイセリオフソラ・サーモフィラ(Myceliophthola thermophila)のラッカーゼをコードする遺伝子から獲得されうる（ＷＯ９５／３３８３６）。
【００４８】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域、その両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、前記プロペプチド領域は前記ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そして前記シグナルペプチド領域は前記プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【００４９】
宿主細胞の増殖に関係するポリペプチドの発現の制御を行う制御配列を付加することが望ましいであろう。制御系の例は、制御化合物の存在を含む、化学的又は物理的刺激に応じて切り替わりうる遺伝子の発現をもたらすものである。原核の系における制御系は、lac、tac、及びtrpオペレーター系を含む。酵母においては、ADH2系又はGAL1系が使用され得る。糸状菌においては、タカアルファーアミラーゼのプロモーター、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼのプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエのグルコアミラーゼのプロモーターが制御配列として使用されうる。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものを含む。真核の系においては、これらはメトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合において、当該ポリペプチドをコードする核酸配列は制御配列と作用可能に連結するだろう。
【００５０】
本発明はまた、宿主細胞にとって内因性のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変化させるための核酸コンストラクトに関する。当該コンストラクトは、内因性遺伝子の発現を変化させるのに必要な最小数の成分を含み得る。１つの態様において、核酸コンストラクトは、好ましくは、（ａ）ターゲッティング配列、（ｂ）本発明の共通翻訳開始配列、（ｃ）エキソン、及び（ｄ）スプライス供与部位を含む。核酸コンストラクトの細胞への導入時には、当該コンストラクトは、内因性遺伝子部位で細胞ゲノム内への相同的組換えにより挿入する。ターゲッティング配列は、因子（ｂ）〜（ｄ）が作用可能に内因性遺伝子と連結されるように、内因性遺伝子への因子（ａ）〜（ｄ）の組込みを指示する。別の態様において、核酸コンストラクトは、（ａ）ターゲッティング配列、（ｂ）本発明の共通翻訳開始配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライス供与部位、（ｅ）イントロン、及び（ｆ）スプライス受容部位を含むが、この場合、ターゲッティング配列は、因子（ｂ）〜（ｆ）が作用可能的に内因性遺伝子と連結されるように、因子（ａ）〜（ｆ）の組込みを指示する。しかしながら、当該コンストラクトは、選択マーカーのような追加の成分を含み得る。
【００５１】
両態様において、これらの成分の導入は、内因性遺伝子の発現が変化する、新規の転写単位の生成をもたらす。本質的に、新規の転写単位は、ターゲッティングしたコンストラクトにより導入された配列と内因性遺伝子との融合生成物である。内因性遺伝子が変化する態様において、前記遺伝子は活性化される。この態様において、相同組換えは、親細胞の内因性遺伝子に通常付随する制御領域を、対応する親細胞において明らかとなっているものより高いレベルで遺伝子を発現させる制御配列の挿入を介して、置換し、破壊し、又は無能にするために使用される。活性化された遺伝子は、当業界で周知の方法（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号を参照のこと）を用いて、コンストラクト内への増幅可能な選択性マーカー遺伝子の含入により更に増幅され得る。内因性遺伝子が変化する別の態様において、前記遺伝子の発現は低下する。
【００５２】
ターゲッティング配列は、内因性遺伝子内、当該遺伝子の直前、上流遺伝子内、又は上流遺伝子内の、又は内因性遺伝子の下流、及びそれから離れた位置に存在し得る。１又は複数のターゲッティング遺伝子が用いられる。例えば環状プラスミド又はＤＮＡフラングメントは、好ましくは単一のターゲッティング配列を用いるが、一方直鎖状プラスミド又はＤＮＡフラングメントは、好ましくは２つのターゲッティング配列を用いる。
【００５３】
当該コンストラクトは更に、内因性遺伝子の１又は複数のエキソンを含む。エキソンは、ＲＮＡにコピーされ、そして成熟ｍＲＮＡ分子内に存在すると、その結果、当該エキソン配列が内因性遺伝子のコード領域と読み枠が一致する様なＤＮＡ配列と定義される。エキソンは、１又は複数のアミノ酸をコードする、そして／あるいは部分的にアミノ酸をコードするＤＮＡを任意に含む。あるいは、エキソンは、５’非コード領域に対応するＤＮＡを含む。１又は複数の外因性エキソンが、１又は複数のアミノ酸及び／又はアミノ酸の一部をコードする場合、核酸コンストラクトは、転写及びスプライシング時に、読み枠が内因性遺伝子のコード領域と一致し、その結果二次エキソンに由来するｍＲＮＡの部分の適切な読み枠が変化しないように設計される。
【００５４】
当該コンストラクトのスプライス供与部位は、一方のエキソンのスプライシングを他方のエキソンに指示する。典型的には、一次エキソンは二次エキソンの５’側にあり、そしてその３’側で一次エキソンと隣接するスプライス供与部位は、二次エキソンの５’側で二次エキソンと隣接するスプライス受容部位を認識する。スプライス受容部位は、スプライス供与部位と同様、一方のエキソンのスプライシングを他方のエキソンに指示する配列である。スプライス供与部位とともに作用する場合、スプライシング装置はスプライス受容部位を用いてイントロンの除去を実行する。
【００５５】
本発明は更に、ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）本発明の共通翻訳開始配列、エキソン、及び／又は当該ポリペプチドをコードする内因性の核酸配列の二次エキソンを作用可能に連結したスプライス供与部位、を含んで成る新規転写単位が組み込まれた相同組換え細胞を、当該ポリペプチドの産生を誘導する培地中で培養し、（ｂ）培養液から当該ポリペプチドを単離すること、を含んで成る方法に関する。当該方法は、遺伝子活性化技術の使用、例えば米国特許第５，６４１，６７０号に記載されているものに基づいている。
【００５６】
発現ベクター
本発明はまた、本発明の共通翻訳開始配列、ポリペプチドをコードする核酸配列、並びに転写終結シグナル及び翻訳終結シグナルを含んで成る組換え発現ベクターに関する。上述した様々な核酸及び調節配列は、１又は複数の簡便な制限部位を、その様な部位で当該ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換をせしめる様に含みうる組換え発現ベクターを産生するために一緒に連結しうる。あるいは、当該ポリペプチドをコードする核酸配列は、共通翻訳開始配列又は配列を含んで成る核酸コンストラクトを発現に適したベクターに挿入することによって発現しうる。前記発現ベクターの作製において、コード配列は、コード配列が、本発明の共通翻訳開始配列及び発現に適した１又は複数の調節配列と作用可能に連結する様に前記ベクター内に配置される。
【００５７】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便にかけることができ、そして当該核酸配列の発現をもたらすことができるいずれかの発現ベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってもよい。前記ベクターの選択は、典型的に前記ベクターが導入され得る宿主細胞と、前記ベクターとの適合性に依存するだろう。前記ベクターは直鎖状又は閉環状プラスミドであってもよい。
【００５８】
前記ベクターは自己複製ベクター、すなわち染色体外の実在物として存在し、染色体の複製に非依存的なベクター、例えばプラスミド、染色体外因子、ミニ染色体、又は人工染色体であってもよい。前記ベクターは自己複製を保証するいずれかの手段を含んでもよい。あるいは、前記ベクターは、宿主細胞に導入される場合に、ゲノムに組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。更に、宿主細胞のゲノムに導入され得る全ＤＮＡを一緒に含む単一のベクター若しくはプラスミド又は２又はそれ以上のベクター若しくはプラスミド、あるいはトランスポゾンが使用され得る。
【００５９】
本発明のベクターは、好ましくは形質転換した細胞の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは生物致死又はウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子生成物である。酵母宿主細胞に適当なマーカーは、ADE2，HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、及びURA3である。糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーは、限定しないがａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）、並びにそれらと等しいものを含む群から選択されうる。アスペルギルス細胞における使用にとって好ましいのは、アスペルギルス・ニジュランス又はアスペルギルス・オリザエのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子並びにストレプトマイセス・ハイグロスコピカスのｂａｒ遺伝子である。
【００６０】
本発明のベクターは、好ましくは前記ベクターの宿主細胞への安定な組み込み又はゲノムから独立した、細胞におけるベクターの自律複製を可能にする因子を含む。
【００６１】
宿主細胞のゲノムへの組み込みのために、前記ベクターは当該ポリペプチドをコードする核酸配列又は相同若しくは非相同組換えによる前記ゲノムへの前記ベクターの安定な組み込みのための、前記ベクターのいずれかの他の因子に依存することがある。あるいは、前記ベクターは宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組み込みを指示するための追加の核酸配列を含みうる。前記の追加の核酸配列は染色体において正確な位置で前記ベクターを前記ゲノムに組み込むことを可能にする。正確な位置での組み込みの見込みを増大させるために、組み込み因子は、好ましくは相同組換えの可能性を増強するために相当する標的配列と高度に相同性の、十分な数の核酸、例えば１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜１，５００塩基対、及び最も好ましくは８００〜１，５００塩基対を含むべきである。前記組み込み因子は宿主細胞のゲノムの標的配列と相同性があるいずれかの配列であってもよい。更に、前記組み込み因子は核酸配列をコードしていなくても、又はコードしていてもよい。一方、前記ベクターは非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【００６２】
自律複製のために、前記ベクターは更に、問題の宿主細胞において自律的に複製することを前記ベクターに可能にさせる複製起点を含んで成ることがある。酵母宿主細胞で用いるための複製起点の例は、２μの複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、ならびにＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主細胞中でその機能を温度感受性にする突然変異を有するものであってもよい（例えば、Ehrlich 、1978、「Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA」75:1433 を参照のこと）。
【００６３】
ポリペプチドをコードする核酸配列の１以上コピーが、宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の産生を増大せしめるために挿入されうる。当該核酸配列のコピー数の増大は、当該配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに組込むことにより、又は増幅可能な選択マーカー遺伝子を当該核酸配列に含めることにより得られるが、この場合、選択マーカー遺伝子の増幅コピーを含む細胞と、それによる核酸配列の追加のコピーが、適切な選択可能な作用物質の存在下で細胞を培養することにより選択され得る。
【００６４】
本発明の組換え発現ベクターを構築するために前記の因子をライゲーションするために用いられる手法は、当業者にとって周知である（例えば、Sambrook et al., 1989（前記）を参照のこと）。
【００６５】
宿主細胞
本発明は更に、ポリペプチドをコードする核酸配列と作用可能に連結した本発明の共通翻訳開始配列であって、当該ポリペプチドの組換え体生成において有利に用いられるものを含んで成る組換え宿主細胞に関する。ポリペプチドをコードする核酸配列と作用可能に連結した本発明の共通翻訳開始配列を含んで成るベクターが宿主細胞内に導入されると、その結果当該ベクターは、上述のように染色体組込み物として、又は自己複製染色体外ベクターとして保持される。「宿主細胞」という用語は、複製中に生じた変異のために親細胞と同一でない親細胞の任意の子孫を含む。宿主細胞の選択は、当該ポリペプチドをコードする遺伝子及びその起源に大いに依存している。
【００６６】
当該宿主細胞は、本発明において有用な、任意の真菌細胞である。「真菌」とは、本明細書中で用いる場合には、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門及び接合菌門（Hawksworth et al., Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi 8th eddition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK による定義）、並びに卵菌門（ Hawksworth et al., 1995（前記）p171に引用）、そしてすべての糸状胞子真菌（Hawksworth et al., 1995（前記））を含む。
【００６７】
好ましい態様において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。「酵母」とは、本明細書中で用いる場合には、子嚢胞子形成酵母（エンドミケス目）、担子菌形成酵母、及び不完全真菌（Blastomycetes）に属する酵母が含まれる。酵母の分類は将来、変わり得るため、本発明の目的のためには、酵母は、Biology and Activities of Yeast（Skinner, F.A., Passmore, S.M.and Davenport, R.R. eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No.9, 1980）に記載されたように定義する。
【００６８】
更に好ましい態様において、酵母宿主細胞は、カンジダ属（Candida）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）又はヤローウィア属（Yarrowia）の細胞である。
【００６９】
最も好ましい態様において、酵母宿主細胞はサッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus ）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis ）又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。別の最も好ましい態様において、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）細胞である。別の最も好ましい態様において、酵母宿主細胞はヤローウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)細胞である。
【００７０】
別の更に好ましい態様において、真菌宿主細胞は糸状真菌細胞である。「糸状真菌」は、真菌門及び卵菌門のすべての糸状形態を含む（Hawksworth et al.,、1995（前記）により定義）。糸状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖で構成される菌糸体壁を特徴とする。植物性成長は菌糸伸張により、そして炭素異化作用は無条件に好気性である。これに対して、酵母、例えばビール酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエによる植物性成長は、単細胞性葉状体の出芽によるもので、炭素異化は発酵であってもよい。
【００７１】
更に好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、限定しないが、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属、フサリウム属、フミコラ属、ムコール属、マオセリオフソラ属、ニューロスポラ(Neurospora)属、ペニシリウム(Penillium)属、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）又はトリコデルマ属（Trichoderma）の種の細胞である。
【００７２】
最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori ）、アスペルギルス・フォエチズス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、フサリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クルックウェレンセ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモルム（Fusarium culmorum ）、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミヌム（Fusarium graminum ）、フサリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum ）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レティキュラツム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロゼウム（Fusarium roseum ）、フサリウム・ザムブチヌム（Fusarium sambucinum ）、フサリウム・ザルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides ）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum ）、フサリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フサリウム・トリコセキオイデス（Fusarium trichothecioides ）、フサリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens ）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）、ムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、アカパンカビ属（Neurospora）クラッサ（crassa）、ペニシリウム属パープロゲヌム（purpurogenum）、トリコデルマ・ハージアヌム（Trichoderma harzianum ）、トリコデルマ・コニンギー（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Trichoderma longibrachiatum ）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
【００７３】
更に最も好ましい態様において、フサリウム・ベネナツム細胞はフサリウム・ベネナツムＡ３／５であり、これはフサリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)として最初に寄託され、そして最近、Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23:62-80 and O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67によってフザリウム・ベネナツムとして；現在知られている種名にも関わらず、分類学的にフサリウム・ベネナツムと同等のものとして分類されている。別の好ましい態様において、フサリウム・ベネナツム細胞はWO97/26330に開示されているように、フサリウム・ベネナツムＡ３／５又はフサリウム・ベネナツムＡＴＣＣ  ２０３３４の形態的突然変異体である。
【００７４】
真菌細胞は、本質的に知られている、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質変換、及び細胞壁の再生を含んで成る工程により形質変換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質変換に適した手法は、欧州特許第２３８０２３号、及びYelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Science USA」 81:1470-1474 に記載されている。フサリウム種の形質変換に適した方法は、Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156及びＷＯ９６／００７８７に記載されている。酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I.editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology」Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al.,1983, Journal of Bacteriology 」153:163;and Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920 に記載された方法を用いて形質変換しされ得る。
【００７５】
本発明は更に、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない以下の例によって説明される。
【００７６】
例
緩衝液及び基質として使用した化学薬品は、少なくとも試薬用の市販の製品である。
【００７７】
培地及び溶液
pH６．５のＭＹ２５培地は、１Ｌ当たり２５ｇのマルトース、２．０ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１０ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、２．０ｇのクエン酸、１０ｇの酵母抽出物、２．０ｇのＫ2 ＳＯ4 、２．０ｇの尿素、１．０mlのＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（１００ｇ／ｌの保存溶液）、及び０．５mlの微量金属溶液から構成した。ＭＹ２５マイクロタイター培地は、４９０mlのガラス蒸留水及び５００mlの２×ＭＹ塩で１：１００に希釈した。培養物は３４℃で生育した。
【００７８】
２×ＭＹ塩のpH６．５の溶液は、１Ｌ当たり４ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４ｇのＫ2 ＳＯ4 、２０ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、４ｇのクエン酸、１mlの微量金属溶液、及び２mlのＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（１００ｇ／ｌの保存溶液）から構成した。
【００７９】
最小培地形質転換プレートは、１Ｌ当たり６ｇのＮａＮＯ3 、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１mlの微量金属溶液、１０ｇのグルコース、５００mgのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３４２．３ｇのスクロース、及び２０ｇのノーブルアガー（pH６．５）から構成した。最小培地のトランスファープレート（pH６．５）は、１Ｌ当たり６ｇのＮａＮＯ3 、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１mlの微量元素、１ｇのグルコース、５００mgのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ及び２０ｇのノーブルアガーから構成した。
【００８０】
フルオロアセトアミドを有する酢酸培地は、１Ｌ当たり１２．７７ｇの酢酸ナトリウム、２ｇの塩化ナトリウム、５００ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、３００mgの尿素、微量の硫酸第一鉄及び硫酸亜鉛、３４２．３ｇのスクロース、２ｇのフルオロアセトアミド及び１２ｇの、pH６．１のノーブルアガーから構成した。
【００８１】
最小培地は、１Ｌ当たり６ｇのＮａＮＯ3 、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１mlの微量金属、１０ｇのグルコース、５００mgのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３４２．３ｇのスクロース、及び２０ｇの、pH６．５のノーブルアガーから構成した。トランスファープレートは上述のものと同一であるが、スクロースは除いてある。
【００８２】
微量金属溶液（１０００×）は、１Ｌ当たり２２ｇのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１１ｇのＨ3 ＰＯ3 、５ｇのＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、５ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１．６ｇのＣｏＣｌ2 ・５Ｈ2 Ｏ、１．６ｇの（ＮＨ4)6 Ｍｏ7 Ｏ24、及び５０ｇのＮａ4 ＥＤＴＡから構成した。
【００８３】
塩素酸塩プレートは、４７０mMの塩酸塩及び唯一の窒素源としての１０mMのグルタミン酸塩を添加した最小培地から構成した。
【００８４】
ＣＯＶＥプレートは、１Ｌ当たり３４３．３ｇのスクロース、２０mlのＣＯＶＥ塩溶液、１０mlの１Ｍアセトアミド、１０mlの３Ｍ  ＣｓＣｌ、及び２５ｇのノーブルアガーから構成した。ＣＯＶＥ塩（５０×）溶液は、１Ｌ当たり２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、７６ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、及び５０mlのＣＯＶＥ微量金属溶液から構成した。ＣＯＶＥ微量金属溶液は、１Ｌ当たり０．０４ｇのＮａＢ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 Ｏ、０．０４０ｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．７０ｇのＦｅＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、０．８０gのＮａ2 ＭｏＯ2 ・２Ｈ2 Ｏ、及び１０ｇのＺｎＳＯ4 から構成した。
【００８５】
ＣＯＶＥオーバーレイは、１Ｌ当たり０．５２ｇのＫＣｌ、０．５２ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１．５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１mlの微量金属、０．８Ｍスクロースから構成し、そして１％の低溶解アガーは、それらを形質転換プレート上に施すために使用した。ＹＥＧ培地は、１Ｌ当たり５ｇの酵母抽出物及び２０ｇのデキストロースから構成した。
【００８６】
例１：ｐＢＡＮｅ８の構築
ｐＢＡＮｅ８は、以下の通りにＴＡＫＡ／ＮＡ２−ｔｐｉリーダーハイブリッドプロモーター、ＰａｃＩ及びＳｗａＩ部位によって区切られたフミコラ・ラヌギノサ由来のリパーゼ遺伝子、ＡＭＧターミネーター、並びに選択マーカーとしての完全長のアスペルギルス・ニジュランスのａｍｄＳ遺伝子を含む様に構築された。
【００８７】
ＰＣＲは、以下のプライマー１及び２を用いてｐＴｏＣ９０（Christensen et al., 1988, Biotechnology 6: 1419-1422）の完全長ａｍｄＳ遺伝子に隣接するＮｓｉＩ部位を挿入し、そして以下のプライマー３及び４を用いてｐＪａＬ２９２（図１）のＮＡ２−ｔｐｉリーダーハイブリッドプロモーターの５′末端にＥｃｏＲＩ部位を、そして３′末端にＳｗａＩ部位を挿入するために利用した。前記プライマーは、Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA ）を用いて、取扱い説明書に従い合成した。
【表１】
0004927281.tif 000002
【００８８】
増幅反応液（１００μｌ）は、鋳型として約０．２μｇのｐＴｏＣ９０又はｐＪａＬ２９２のいずれかを用いて調製した。各反応液は、以下の成分：０．２μｇのプラスミドＤＮＡ、４８．４pmolの上流プライマー、４８．４pmolの下流プライマー、１mMの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、並びに２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）を含む。反応液は、Ericomp TwinBlock （商標）System（Ericonp, Inc., San Diego, CA）において、以下の通りにプログラムされてインキュベートされた：９５℃で５分間１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、そして７２℃で２分間を各３０サイクル。
【００８９】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、２．７kbのａｍｄＳフラグメント及び０．６kbのＮＡ２−ｔｐｉフラグメントの存在を確認した。
【００９０】
ＰＣＲ産物は、引き続いて、ＴＡクローニングキット（Invitrogen, San Diego, CA ）を取扱い説明書に従い用いてｐＣＲII内にサブクローニングした。次に、形質転換体が、ＱＩＡｗｅｌｌ−８プラスミドキット（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA）を取扱い説明書に従い用いて、形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、そしてＮｓｉＩ又はＥｃｏＲＩ／ＳｗａＩのいずれかでプラスミドを制限消化することによって、続いてＮｓｉＩ  ａｍｄＳフラグメント及びＳｗａＩ／ＥｃｏＲＩ  ＮＡ２−ｔｐｉフラグメントに関する、それぞれ２．７kb及び０．６kbの正確なサイズのフラグメントの存在を確認するためのアガロース電気泳動によってスクリーニングした。ＰＣＲ産物を確認するために、当該産物は、Ｍ１３下流（−４８）及びＭ１３上流（−２０）プライマー（New England Biolabs, Beverly, MA）並びに配列決定されるＤＮＡに独特なプライマーを用いる、ダイターミネーター化学（Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38: 47-60）によるプライマーウォーキングを用いて、両方の鎖に対して、Applied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）によって配列決定された。正確な形質転換体に由来するプラスミドは、引き続き、設計したプラスミドの制限酵素で消化され、１％アガロースゲルで分離され、そしてＦＭＣ  ＳｐｉｎＢｉｎｄキット（FMC, Rockland, ME ）を取扱い説明書に従い用いて精製した。
【００９１】
ｐＫＳ６（図２）は、ＴＡＫＡアミラーゼプロモーター、ポリリンカー、ＡＭＧターミネーター、及びアスペルギルス・ニジュランスのｐｙｒＧ遺伝子を含んでおり、ＴＡＫＡアミラーゼプロモーター部分を除去するためにＥｃｏＲＩ及びＳｗａＩで消化された。この領域は、ｐＢＡＮｅ１３（図３）を産生するために、ＮＡ２−ｔｐｉ  ＰＣＲ産物で置換された。
【００９２】
ｐＢＡＮｅ１３は、アスペルギルス・ニジュランスのｐｙｒＧ遺伝子を除去するためにＮｓｉＩで消化された。この領域は、続いてｐＢＡＮｅ６（図４）を産生するために、上述した完全長のａｍｄＳ遺伝子のＰＣＲ産物で置換された。
【００９３】
ＰＣＲは、以下のプライマー５及び６を用いて、ｐＭＨａｎ３７（図５）の、完全長のフミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子上にＳｗａＩ及びＰａｃＩ隣接部位を挿入するために使用した。プライマー５及び６は上述の通りに合成した。
【表２】
0004927281.tif 000003
【００９４】
増幅反応液（１００μｌ）は以下の成分：１００ngのｐＭＨａｎ３７、４８．４pmolのプライマー５、４８．４pmolのプライマー６、１mMの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、並びに２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。反応液は以下の通りにプログラムされたEricomp TwinBlock （商標）System内でインキュベートされた：９５℃で５分間１サイクル、続いて９５℃で１分間、５５℃で１分間、そして７２℃で２分間をそれぞれ３０サイクル。２μｌの反応液を１％アガロースゲル上での電気泳動にかけ、約９００bpのリパーゼ遺伝子産物の増幅を確認した。
【００９５】
ＰＣＲで増幅したリパーゼ遺伝子産物は引き続いて、ＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲII内にサブクローニングされた。形質転換体は、ＱＩＡｗｅｌｌ−８プラスミドキットを用いて形質転換体から抽出し、プラスミドＤＮＡをＳｗａＩ／ＰａｃＩで制限消化し、そしてＰＣＲ産物を確認するために上述の方法に従い当該ＤＮＡを配列決定することによってスクリーニングされた。
【００９６】
当該リパーゼ遺伝子は、ＳｗａＩ及びＰａｃＩで消化することによってｐＣＲIIプラスミドから切り出され、そして次に、ｐＢＡＮｅ８（図６）を産生するために、ＳｗａＩ／ＰａｃＩで消化したｐＢＡＮｅ６内にサブクローニングされた。
【００９７】
例２：ｐＢＡＮｅ１５の構築
プラスミドｐＢＡＮｅ１５は、アスペルギルス・ニジュランスのａｍｄＳ遺伝子、及びアスペルギルス・オリザエのアルファアミラーゼプロモーターとアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼターミネーターとの間にポリリンカー部位を含む様に構築された。
【００９８】
ＰＣＲは、Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizerを取扱い説明書に従い用いることによって合成した以下のプライマー７及び８を用いて、完全長のａｍｄＳ遺伝子の両末端にＮｓｉＩ部位を挿入するために使用された。
【表３】
0004927281.tif 000004
【００９９】
増幅反応液（１００μｌ）は、鋳型として約０．２μｇのｐＴｏＣ９０（Christenfen et al., 1998, Biotechnology 6:1419-1422）を用いて調製した。各反応液は、以下の成分：０．２μｇのｐＴｏＣ９０、４８．４pmolのプライマー７、４８．４pmolのプライマー８、１mMの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、並びに２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）を含む。反応液は、Ericomp TwinBlock （商標）Systemにおいて、以下の通りにプログラムされてインキュベートされた：９５℃で５分間１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、そして７２℃で２分間を各３０サイクル。
【０１００】
ＰＣＲ産物は、引き続いて、ＴＡクローニングキットを取扱い説明書に従い用いてｐＣＲII内にサブクローニングした。次に、形質転換体が、ＱＩＡｗｅｌｌ−８プラスミドキット（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA）を取扱い説明書に従い用いて、形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、そして正確なサイズのフラグメントの存在を確認するためにＮｓｉＩでプラスミドＤＮＡを制限消化し、そしてＰＣＲ産物を確認するために例１に記載の方法に従いＤＮＡを配列決定することによってスクリーニグした。正確な形質転換体に由来するブラスミドは、引き続き、ＮｓｉＩで消化され、１％アガロースゲルで分離され、そしてＦＭＣ  ＳｐｉｎＢｉｎｄキットを取扱い説明書に従い用いて精製した。
【０１０１】
ｐＫＳ６は、アスペルギルス・ニジュランスのｐｙｒＧ遺伝子を除去するためにＮｓｉＩで消化され、ｐＢＡＮｅ１５（図７）を産生するために、上述した完全長のａｍｄＳ遺伝子のＮｓｉＩフラグメントで置換された。
【０１０２】
例３：ｐＤＢＥＬ１及びその変異体の構築
プラスミドｐＢＡＮｅ８及びｐＢＡＮｅ１５をそれぞれＰａｃＩ及びＳｗａＩで消化した。消化後、２５μｌの各反応液は、４０mMのＴｒｉｓ−酢酸−１mM  ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＡＥ）緩衝液を用いて、１％のアガロースゲル上での電気泳動にかけられた。適切なサイズのフラグメント（６９０４bpのｐＢＡＮｅ１５フラグメント及び９０８bpのリパーゼフラグメント）をゲルから切り出し、そしてQiagen Gel Extraction キット（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA）を、取扱い説明書に従い用いて精製した。これらのフラグメントは、アスペルギルス・ニジュランスのａｍｄＳ遺伝子、ｐＢＡＮｅ１５由来のアスペルギルス・オリザエのアルファアミラーゼプロモーター及びアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼターミネーター、並びにｐＢＡＮｅ８由来のフミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子を含む、ｐＤＢＥＬ１（図８）を産生するために、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで共にライゲーションされた。ｐＤＢＥＬ１におけるフミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の上流にある翻訳開始領域のヌクレオチド配列は、−３位にＡのヌクレオチドを含む、ＣＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＧ（配列番号１３）であることが決定された。
【０１０３】
フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の上流の−３位は、Stratagene QuikChange （商標）Site-Directed Mutagenesis キット（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）を、取扱い説明書に従い用いて、そして以下に列記したプライマーを用いて変化させた。ｐＤＢＥＬ１の３つの変異体は、−３位のヌクレオチドのみが異なる様に産生された。
【表４】
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【０１０４】
プライマー９及び１０はｐＤＢＥＬ１Ｔを産生するために、プライマー１１及び１２はｐＤＢＥＬ１Ｃを産生するために、そしてプライマー１３及び１４はｐＤＢＥＬ１Ｇを産生するために使用した。各反応液は、以下の成分：１００ngのｐＤＢＥＬ１、５０pmolの上流プライマー、５０pmolの下流プライマー、２００μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Invitrogen, San Diego, CA ）、並びに２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）を含む。反応液は以下の通りにプログラムされたPerkin-Elmer Model 9600 Thermocycler内でインキュベートされた：９５℃で３０秒間１サイクル、引き続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、そして６８℃で１４秒間１２サイクル。ＰＣＲ反応液は、非変異型の親ＤＮＡを消化するために１０ユニットのＤｐｎＩで処理した。当該反応液は、続いて、Stratagene QuikChange （商標）Site-Directed Mutagenesis キットのプロトコールに従い、Ｅ．コリのＸＬ１−Ｂｌｕｅのスーパーコンピテント細胞を形質転換させるために使用された。
【０１０５】
ｐＤＢＥＬ１変異体（ｐＤＢＥＬ１Ｔ，ｐＤＢＥＬ１Ｃ，ｐＤＢＥＬ１Ｇ）のヌクレオチド配列は、蛍光標識したヌクレオチドによるＴａｑポリメラーゼサイクル配列決定を用いて決定された。配列決定反応は、Applied Biosystems Automatic DNA Sequencer Model 377のｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０上での電気泳動にかけられた。使用した配列決定プライマーを以下に列記する。
【表５】
0004927281.tif 000006
【０１０６】
ｐＤＢＥＬ１変異体のヌクレオチド配列は以下の通りである：
【表６】
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【０１０７】
例４：アスペルギルス・オリザエのＢＡＮｅ３の構築
アスペルギルス・オリザエのＨｏｗＢ７１１を、２５mlの０．５％酵母抽出物−２％グルコース（ＹＥＧ）培地中で２４時間、３７℃及び２５０rpm で生育した。続いて、菌糸をMiracloth (Calibiochem, La Jolla, CA）を介する濾過によって回収し、そして蒸留水で３回洗浄した。過剰な水は菌糸調製物から排出し、続いてこれを液体窒素中で凍結させた。凍結した菌糸体調製物を、乳針及び乳棒で細かい粉末にすりつぶし、そして当該粉末を、２０mlの１０mM  Ｔｒｉｓ−１mM  ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液及び５mlの２０％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む使い捨てのプラスチック製遠心管に加えた。混合物は、混合を確かなものにするために、おだやかに複数回反転させられ、そして等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖ）で抽出された。酢酸ナトリウム（３Ｍ溶液）を、最終濃度が０．３Ｍになる様に抽出試料に加え、引き続いて２．５倍量の氷冷エタノールをＤＮＡ沈澱させるために加えた。管を１５，０００×ｇで３０分間遠心し、ＤＮＡをペレット化させた。ＤＮＡのペレットを３０分間風乾させ、その後０．５mlのＴＥ緩衝液中で再懸濁された。ＤＮアーゼを含まないリボヌクレアーゼＡを、濃度が１ml当たり１００μｇになるまで再懸濁したＤＮＡのペレットに加え、そして次に混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。プロテイナーゼＫ（２００μｇ／ml）を加え、そして管を更に１時間インキュベートした。最後に、試料はフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで２回抽出され、そしてＤＮＡをエタノールで沈澱させた。沈澱したＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥させ、ＴＥ緩衝液中で再懸濁し、そして４℃で保存した。
【０１０８】
ａｍｄＳ遺伝子は、以下に示すプライマー１５及び１６を用いて、上述の様に単離した、アスペルギルス・オリザエのＨｏｗＢ７１１のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。当該プライマーは、Gomi et al. (1991, Gene 108: 91-98）に報告されているアスペルギルス・オリザエのａｍｄＳ遺伝子に基づいている。反応液は以下の成分：２００ngのゲノムＤＮＡ、５０pmolの上流プライマー、５０pmolの下流プライマー、２００μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Invitrogen, San Diego, CA ）、並びに２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）を含む。反応液は、以下の通りにプログラムされたEricomp TwinBlock （商標）System内でインキュベートされた：９５℃で５分間１サイクル、引き続いて９５℃で１分間、５５℃で１分間、そして７２℃で１．５分間３０サイクル。
【表７】
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【０１０９】
１０μｌの反応液を、ＴＡＥ緩衝液を用いて、１％アガロースゲル上での電気泳動にかけた結果、これは２６６０bpの産物を生成していた。この２６６０bpのフラグメントをｐＣＲII内にサブクローニングし、そしてＴＡクローニングキットを用いて、取扱い説明書に従い、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｅ．コリＴＯＰ１０のコンピテント細胞）を形質転換せしめた。当該ヌクレオチド配列は、Applied Biosystems Automatic DNA Sequencer (Model 373A, version 1.2.0 ）を用いるＭ１３下流（−４８）及びＭ１３上流（−２０）プライマーの蛍光標識ヌクレオチドによる、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼサイクル配列決定を用いて、ＰＣＲ産物がａｍｄＳであることを確認するために決定された。
【０１１０】
ｐＵＣ４Ｌは、ｐＵＣ４Ｋ（Pharmacia, Uppsala, Sweden）をＰｓｔＩで消化し、そして消化されたプラスミドをウシアルカリホスファターゼで処理することによって構築された。消化したプラスミドは、ＴＡＥ緩衝液を用いる１％アガロースゲル上での電気泳動にかけられ、そして３．９kbのバンドがゲルから切り出された。切り出したＤＮＡは、Ｐｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅキット（BioRad, Hercules, CA）を用いて精製した。以下の自己相補的オリゴヌクレオチドが、ｐＵＣ４Ｋ−ＰｓｔＩ内のリンカーを作製するために使用された。
【表８】
0004927281.tif 000009
【０１１１】
前記オリゴヌクレオチドを１．０mMのＡＴＰの存在下で、標準的な条件のもとＴ４キナーゼで処理し、６８℃で３０分間加熱し、そして３０分間、ゆっくりと室温にまで冷却することによってアニーリングさせた。アニーリングしたプライマー及び消化したｐＵＣ４Ｋを共にライゲーションさせ、そしてＥ．コリのＤＨ５αを形質転換させるために使用した。コロニーは、ＤＮＡを単離し、そしてＸｂａＩによって、そして更にＳｔｕＩとＳｃａＩによってＤＮＡを制限消化することによってスクリーニングした。ｐＵＣ４Ｌは、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Promega, Madison, WI）を用いて単離した。
【０１１２】
ｐＵＣ−４ＡＮ．ｐｙｒＧ１＆２（図９）は、ＥｃｏＲＶでｐＵＣ４Ｌを消化し、そして消化したプラスミドをウシアルカリホスファターゼで処理することによって構築した。消化され、そしてリン酸化されたｐＵＣ４Ｌは、約３．９kbのフラグメントを単離するために、ＴＡＥ緩衝液による１％アガロースゲルを用いる電気泳動にかけられた。３．９kbのＥｃｏＲＶフラグメントを切り出し、そしてBioRadのＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅキットを用いてゲル精製した。精製したＥｃｏＲＶフラグメントは、ｐＰＹＲＧ１（Fungal Genetics Stock Center, Kansas City, KS ）由来のアスペルギルス・ニジュランスｐｙｒＧ遺伝子を含む約１．６kbのフラグメントとライゲーションされた。ｐＰＹＲＧ１は、ＳｃａＩ及びＮｄｅＩで消化され、そして次に、末端を埋めるためにｄＮＴＰの存在下、クレノーフラグメントで処理された。当該フラグメントは、ＴＡＥ緩衝液を用いる１％アガロースゲル上での電気泳動にかけられ、そして１．６kbのアスペルギルス・ニジュランスのｐｙｒＧフラグメントを含むバンドを切り出した。ｐｙｒＧフラグメントは、BioRadのＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅキットを用いて精製した。
【０１１３】
ｐＵＣ４ＬとｐｙｒＧフラグメントのライゲーションは、Ｅ．コリのＤＨ５αを形質転換するために使用された。形質転換体は、プローブとして、ｐＪｅＲＳ４（米国特許第５，８６１，２８０号）から１．７kbのフラグメントとして得られた、アスペルギルス・オリザエのｐｙｒＧ遺伝子を用いるハイブリダイゼーションによってスクリーニングされた。４つのポジティブなコロニーが同定され、そして更に、アスペルギルス・ニジュランスのｐｙｒｇ１遺伝子の存在を確認するために、ＸｂａＩで制限消化することによって解析された。
【０１１４】
アスペルギルス・オリザエのａｍｄＳ位の破壊のためのカセットを得るために、ａｍｄＳ遺伝子内の８００bpのＮｓｉＩフラグメントを欠失させ、そして以下の様にアスペルギルス・ニジュランスのｐｙｒＧ遺伝子によって置換した。ａｍｄＳ遺伝子は、ＥｃｏＲＩで消化することによってｐＣＲIIベクターから切り出され、そして引き続きｐＢＡＮｅ１１（図１０）を産生するために、ｐＵＣ１１８内にサブクローニングされた。
【０１１５】
ｐＵＣ４−ＡＮ．ｐｙｒＧ１＆２はＮｓｉＩで消化され、そしてｐｙｒＧ遺伝子を含む１．６kbのフラグメントが、ＴＡＥ緩衝液を用いる１％アガロースゲルでの電気泳動によって単離され、そして次にＦＭＣ  ＳｐｉｎＢｉｎｄキットを用いて精製された。精製したフラグメントはエタノール沈澱され、そして３０μｌのＴＥ中で再懸濁された。ａｍｄＳ遺伝子を破壊するために、ｐＢＡＮｅ１１は８００bpのフラグメントを切り出すためにＮｓｉＩで消化され、そして１．６kbのアスペルギルス・ニジュランスのｐｙｒＧ遺伝子は、ｐＢＡＮｅ１２（図１１）を産生するために挿入された。ｐＢＡＮｅ１２はＥｃｏＲＩで消化することによって直線化され、そしてフラグメントはＦＭＣ  ＳｐｉｎＢｉｎｄキットを用いて精製された。この直鎖性フラグメントは、アスペルギルス・オリザエのＨｏｗＢ４２５を形質転換するために使用された。
【０１１６】
アスペルギルス・オリザエのＨｏｗＢ４２５は、１３０rpm で振盪しながら、１５０mlのＹＥＧ培地中で３４℃で１６〜１８時間生育された。菌糸は、０．２μｍのフィルターを介して、約１０mlのものがフィルター上に残るまで濾過することによって回収し、約５０mlの１Ｍ  ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（０．２μｍのフィルターを濾過したもの）を用いて洗浄し、そして次に滅菌したスパチュラで回収し、そして１２５mlのアーレンマイヤー（Ｅｈｒｌｅｍｍｅｙｅｒ）フラスコ中に据えた。当該菌糸は、引き続き２０mlの１Ｍ  ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ中の５mg／mlのＮＯＶＯＺＹＭ  ２３４（商標）（Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）を用いて再懸濁された。懸濁液は、プロトプラストを産生するために、８０rpm でおだやかに振盪しながら約３０分間３４℃でインキュベートされた。
【０１１７】
１２５mlのアーレンマイヤーフラスコ中の中身を、引き続き滅菌したＭｉｒａｃｌｏｔｈを介して、３０mlのポリプロピレン遠心管中に濾過し、そしてＭｉｒａｃｌｏｔｈを２０mlの２Ｍソルビトールで洗浄した。管にキャップをし、おだやかに混合し、そしてプロトプラストを回収するために、スインギングバケットＳｏｒｖａｌ  ＲＴ６０００ローター内で、３０００×ｇで１５分間遠心した。上清を回収し、そしてプロトプラストを１mlの１Ｍソルビトール中で再懸濁した。１Ｍのソルビトールで体積を３０μｌに増やし、そして２０００×ｇで１０分間遠心した。洗浄は、ＳＴＣ（１．２Ｍソルビトール−１０mM  Ｔｒｉｓ−１０mM  ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、pH７．５）を用いて繰り返した。プロトプラストは、ＳＴＣ中で、１ml当たり２×１０7 の終濃度に再懸濁された。
【０１１８】
アスペルギルス・オリザエのＨｏｗＢ４２５の形質転換は、１ml当たり２×１０7 個のプロトプラストの濃度のプロトプラストで行った。１００μｌのプロトプラストを、ｐＢＡＮｅ１２由来の５μｇのＥｃｏＲＩフラグメントと一緒に、氷の上に３０分間据えた。１mlのＳＰＴＣ（４０％ポリエチレングリコール４０００−０．０５Ｍ  ＣａＣｌ2 −０．８Ｍソルビトール−０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、pH８．０）を加え、そしてプロトプラストを３７℃で２０分間インキュベートした。５mlのＳＴＣが、フルオロアセトアミドを有する最小培地又は酢酸塩培地上のいずれかに、それぞれ３mlプレーティングする前に各形質転換物に加えられた。プレートは、３７℃で５〜７日間インキュベートされた。コロニーは、滅菌つまようじを用いて、同一の培地のプレートに突きさされた。コロニーは、胞子をストリーキングし、そして単離したコロニーを突きさすことによって精製した。４７個及び６５個の形質転換体が、それぞれ最小培地又は酢酸塩培地上で得られた。コロニーは、胞子の精製のために、最初に生育した同一の型の培地にトランスファーされた。
【０１１９】
推定上の形質転換体の胞子は、２５mlのＹＥＧ培地中で一晩、３７℃で生育された。菌糸はＭｉｒａｃｌｏｔｈを介して濾過され、そして蒸留水で３回すすがれた。過剰な水分を除き、そして菌糸を液体窒素中で凍結し、そして乳針及び乳棒を用いて、細かい粉末にすりつぶされた。Purgene DNA Isolation キット（Gentra Systems Inc., Minneapolis MN ）は、各形質転換体からゲノムＤＮＡを単離するために使用した。３１個の形質転換体が、上述の方法と同一の方法を用いて、上文に示したプライマー１５及び１６を用いるＰＣＲによってスクリーニングされたが、但し、反応物は９５℃で５分間１サイクル、続いて９４℃で１分間、５５℃で１分間、そして７２℃で２分間、それぞれ２５サイクルでインキュベートされた。形質転換していないコントロールは、２．６６kbのバンドを産生した。前記形質転換体のうちの３つが、ａｍｄＳの破壊に関して、予想されたサイズ（３３７０bp）のＰＣＲ産物を与えた。
【０１２０】
３つの推定されるΔａｍｄＳ菌株は、ａｍｄＳ位が破壊されたことを確認するために、サザンブロットによって解析された。
【０１２１】
推定上のΔａｍｄＳ菌株由来の２μｇのゲノムＤＮＡは、制限酵素ＳａｌＩ，ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，ＢａｍＨＩ、及びＨｉｎｄIII のそれぞれについて、１０μｌの１×緩衝液を用いて、３７℃で２４時間消化された。消化したＤＮＡは、０．６％のアガロースゲル（Seakem Gold, FMC, Rockland, ME）とＴＡＥ緩衝液を用いる電気泳動にかけられた。ゲルを変性させ、中和させ、そして２０×ＳＳＣ中に各段階につき３０分間浸された。消化したＤＮＡは、Ｎｙｔｒａｎ膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH ）上にSchleicher & Schuell Turbo Blotter (Keene, NH)を用いて１６時間トランスファーされた。膜を２×ＳＳＣ中ですすぎ、そしてUV Stratalinker 2400 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）を用いてUV Stratalinkeされた。Genius System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）が膜をプローブするために使用された。膜は、２０mlのＥａｓｙ  Ｈｙｂを用いて、４２℃で１時間プレハイブリダイズされた。ａｍｄＳプローブは、ｐＢＡＮｅ１１  ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド１及び２、５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、並びにBoehringer Mannheim Dig DNA ラベルミックス（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）を用いてＤＩＧ標識された。当該プローブを定量し、そして変性させた後に１ng／mlで加えた。膜は４２℃で一晩プローブされた。プローブを除き、そして膜を２×ＳＳＣ；０．１％  ＳＤＳ中で室温で１５分間、２回、そして０．１×ＳＳＣ；０．１％  ＳＤＳ中で６５℃で１５分間、２回洗浄した。ＤＩＧ標識ヌクレオチドの検出は、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  ５３０を用いる、Boehringer Mannheim によって提供されるプロトコールに従うことによって行われた。膜は、１５分間フィルムに暴露された。
【０１２２】
サザン解析は、菌株のうちの２つ、アスペルギルス・オリザエのＢＡＮｅ１及びＢＡＮｅ２が、２つの隣接領域及び縦列反復配列が、当該ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化したときに３５００bpの位置で観察された。アスペルギルス・オリザエのＢＡＮｅ３は、破壊カセットの１つのコピーがａｍｄＳ位に組込まれた、きれいな破壊であると思われる。アスペルギルス・オリザエのＢＡＮｅ３は、ＢａｍＨＩで消化した場合、わずかに２つの、５．２kbの予想されるバンドを有しており、そしてＨｉｎｄIII で消化した場合、６kb及び３．８kbのものを有していた。
【０１２３】
例５：アスペルギルス・オリザエのＢＡＮｅ３の形質転換
アスペルギルス・オリザエのＢＡＮｅ３は、１６０rpm で振盪しながら、１００mlのＹＥＧ培地中で、３４℃で１６〜１８時間生育された。菌糸は、０．２μｍのフィルターを介して、当該フィルター上に約１０mlのものが残るまで濾過することによって回収され、約２０mlの１Ｍ  ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（０．２μＭのフィルターを濾過したもの）で洗浄され、そして更に滅菌したループで回収され、そして１２５mlのアーレンマイヤーフラスコ中に据えられた。続いて、菌糸は１５mlの１Ｍ  ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ中の７５mgのＮＯＶＯＺＹＭ  ２３４（商標）（Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）を用いて再懸濁された。懸濁液は、プロトプラストを産生させるために、５０rpm でおだやかに振盪しながら、３７℃で約１時間インキュベートされた。
【０１２４】
１２５mlのアーレンマイヤーフラスコの中身は、引き続いてＭｉｒａｃｌｏｔｈを介して３０mlのＣｏｒｅｘ遠心管中に濾過され、６mlの０．６Ｍソルビトール−１００mM  Ｔｒｉｓ、pH７．０に上乗せされ、そしてプロトプラストを回収するために、スインギングバケットローター内で１５分間、３５００×ｇで遠心された。プロトプラストは、パスツールピペットを用いて緩衝液の界面から回収された。プロトプラストは、引き続いて２倍量のＳＴＣ（１．２Ｍソルビトール−１０mM  Ｔｒｉｓ−１０mM  ＣａＣｌ・２Ｈ2 Ｏ、pH７．５）で洗浄され、そして３５００×ｇで５分間遠心された。プロトプラストは、１０mlのＳＴＣ中で２回洗浄され、そして前文の通りに遠心された。プロトプラストは、ＳＴＣ中で終濃度が１ml当たり１．７×１０7 個のプロトプラストとなる様に再懸濁された。
【０１２５】
ａｍｄＳ選別のための、アスペルギルス・オリザエＢＡＮｅ３の形質転換は、１ml当たり１．７×１０7 個のプロトプラスト濃度でプロトプラストを用いて行われた。１０μｇのＤＮＡ（ｐＤＢＥＬ１、ｐＤＢＥＬ１Ｔ、ｐＤＢＥＬ１Ｃ、又はｐＤＢＥＬ１Ｇ）は、１００μｌのプロトプラスト、続いて２５０μｌのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００−１０mM  ＣａＣｌ2 ）に加えられた。混合物を３７℃で３０分間放置した。４mlのＳＴＣが続いて加えられ、そして混合物が、ａｍｄＳを選択するＣＯＶＥプレート上にプレーティングされた。形質転換体は、胞子をストリーキングし、そして３７℃でインキュベートしたＣＯＶＥプレートから単離したコロニーを突きさすことによって精製された。
【０１２６】
例６：リパーゼ産生のための形質転換体の解析
例５で得られたアスペルギルス・オリザエＢＡＮｅ３は、リパーゼの発現のためにアッセイされた。マイクロタイターアッセイのために、ＭＹ２５倍Ａは、４９％のガラス蒸留水及び５０％の２×ＭＹ塩を用いて１００倍に希釈された。体積が１．２５mlの、１／１００の強度のＹＭ２５培地が、２４穴細胞培養プレートの穴に加えられた。当該穴は、各形質転換体由来の１０μｌの胞子で接種され、そして当該プレートは１００rpm で振盪しながら３４℃でインキュベートされた。各形質転換体を３つの穴に接種した。形質転換しなかったアスペルギルス・オリザエＢＡＮｅ３は、３つの穴に接種するために使用した。
【０１２７】
１００μｌの試料が、２４穴細胞培養プレートの各穴から３日目及び５日目に回収された。各試料を、２００μｌの４mM  ＣａＣｌ2 −１００mM  ＭＯＰＳ、pH７．５（ＭＣ緩衝液）中の１００mMアルファオレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）洗剤で希釈し、そして２０μｌの一定分量を９６穴プレートの穴に分配し、続けて２００μｌの希釈した基質を分配した。リパーゼアッセイの基質は、ｐ−ニトロフェニル酪酸塩の保存基質（２１μｌのｐ−ニトロフェニル酪酸塩／ml  ＤＭＳＯ）を使用直前にＭＣ緩衝液中で１：５０に希釈することによって調製した。標準リパーゼ（ＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）、Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）は、０．０２％のＡＯＳ洗剤を含む４０LU／mlのＭＣ緩衝液を含む様に調製された。標準リパーゼは、使用するまで４℃で保存した。標準リパーゼは、使用直前にＭＣ緩衝液中で１／４０に希釈された。プレートリーダーを用いて、４０５nmの吸光度が、約１分間隔で集められた２つの読み込みの差異として記録された。リパーゼユニット／ml（LU／ml）は、リパーゼの標準と比較して算出された。リパーゼアッセイの結果は、ｐＤＢＥＬ１で得られたリパーゼアッセイと比較して表１に示した。
【表９】
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【０１２８】
表１に示した様に、リパーゼの発現は、フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子が−３位にプリンを含んでいたときに最も高く、中でも−３位がＡのヌクレオチドを含んでいたときに最も高かった。−３位がピリミジンを含んでいたとき、リパーゼの発現は有意に低下し、中でも−３位がＴのヌクレオチドを含んでいたときに最も発現が低かった。
【０１２９】
例７：ｐＪａＬ４８５及びその変異体の構築
ｐＪａＬ４８５（図１２）は、短くなったｎｉａＤ遺伝子及び、フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子が、ＮＡ２プロモーターとアスペルギルス・ニガーのＡＭＧターミネーターとの間に挟まれた発現カセットを含む様に構築された。
【０１３０】
アスペルギルス・オリザエのｎｉａＤ遺伝子（Unkles et al., 1989, Molecular General Genetics 218 : 99-104）をコードするプラスミドｐＳＴＡ１４はＨｉｎｄIII で消化され、そして５１３６bpのフラグメントを精製し、そしてＨｉｎｄIII で消化したｐＵＣ１９内にクローニングし、プラスミドｐＴｏＣ１０８を生成せしめた。プラスミドｐＴｏＣ１０８をＢｇｌII−ＳａｌＩで消化し、そして３７００bpのフラグメントを精製し、そしてＢｇｌII−ＳａｌＩで消化したｐＵＣ１９内にクローニングし、プラスミドｐＪａＬ４１０を生成せしめた。このプラスミドは、８５個のＮ末端のアミノ酸が除去された、短くなったｎｉａ遺伝子をコードする。
【０１３１】
プラスミドｐＪａＬ４１０はＳａｃＩ−ＰｓｔＩで消化され、そしてクレノー及びｄＮＴＰで処理され、そして６０１８bpのフラグメントを精製し、そして再びライゲーションしてプラスミドｐＪａＬ４２０を生成せしめた。ｐＪａＬ４２０のＢａｍＨＩ部位は、Chameleon Donble-Stranded Site-Directed Mutagenesis キット（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）を、取扱い説明書に従い用いることによってサイレントな突然変異を作り出すことによって除去し、ｐＪａＬ４２３を与えた。ＢａｍＨＩ部位は、ＢａｍＨＩ部位のＴを、以下のプライマーを用いてＣに変えることによって破壊した。
【表１０】
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【０１３２】
破壊したＢａｍＨＩ部位周辺の配列決定は、更に下流に、ｎｉａＤ遺伝子内にフレームシフト及びＳｍａＩ部位の作製をもたらした、複数の予想されていない変化が存在していることを明らかにした。このフレームシフトを修復するために、ｐＪａＬ４２３内の２９１bpのＡｃｃＩ−ＤｒａＩフラグメントが、ｐＪａＬ４７５を与えるためにｐＪａＬ４２０由来の対応するフラグメントと交換された。
【０１３３】
短くなったｎｉａＤ遺伝子をコードする、ｐＪａＬ４７５由来の３３８１bpのＨｉｎｄIII フラグメントが、プラスミドｐＪａＬ２１１のＨｉｎｄIII 部位内にクローニングされ、プラスミドｐＪａＬ４７９が生成した。２位にあるＨｉｎｄIII は、ＨｉｎｄIII による部分消化、続くクレノー及びｄＮＴＰによる処理によって破壊された。８５８６bpのフラグメントを精製し、そして再びライゲーションしてプラスミドｐＪａＬ４８５（図１２）を生成せしめた。
【０１３４】
ｐＪａＬ４８５におけるフミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の上流にあるヌクレオチド配列は、−３位にＡのヌクレオチドを含む、GGGATCCACCATG(配列番号２９）である。
【０１３５】
ｐＪａＬ４８５の６個の変異体は、Stratagene QuikChange （商標）Site-Directed Mutagenesis キットを、取扱い説明書に従い用い、そして以下に列記するプライマーを用いて、フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の上流のヌクレオチド配列を変化させることによって産生した。
【表１１】
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【０１３６】
プライマー１７及び１８は、フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の−１位においてのみｐＪａＬ４８５と異なるｐＤＢＥＬ２−１Ｔを構築するために使用された。ｐＪａＬ４８５はこの位置にＣのヌクレオチドを含むが、ｐＤＢＥＬ２−１ＴはＴのヌクレオチドを含む。
【０１３７】
プライマー１９及び２０は、フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の−２位においてのみｐＪａＬ４８５と異なるｐＤＢＥＬ２−２Ｔを構築するために使用された。ｐＪａＬ４８５はこの位置にＣのヌクレオチドを含むが、ｐＤＢＥＬ２−２ＴはＴのヌクレオチドを含む。
【０１３８】
プライマー２１及び２２は、フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の−３位においてのみｐＪａＬ４８５と異なるｐＤＢＥＬ２−３Ｔを構築するために使用された。ｐＪａＬ４８５はこの位置にＡのヌクレオチドを含むが、ｐＤＢＥＬ２−３ＴはＴのヌクレオチドを含む。
【０１３９】
プライマー２３及び２４は、フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の−４位においてのみｐＪａＬ４８５と異なるｐＤＢＥＬ２−４Ｔを構築するために使用された。ｐＪａＬ４８５はこの位置にＣのヌクレオチドを含むが、ｐＤＢＥＬ２−４ＴはＴのヌクレオチドを含む。
【０１４０】
プライマー２５及び２６は、フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の−４位から−１位においてのみｐＪａＬ４８５と異なるｐＤＢＥＬ２−１−４Ｔを構築するために使用された。ｐＪａＬ４８５はこれらの位置にヌクレオチドＣＡＣＣを含むが、ｐＤＢＥＬ２−１−４ＴはヌクレオチドＴＴＴＴを含む。
【０１４１】
プライマー２７及び２８は、フミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子の−９位から−７位及び−５位においてのみｐＪａＬ４８５と異なるｐＤＢＥＬ３を構築するために使用された。ｐＪａＬ４８５は−５位にＣのヌクレオチド、そして−９位から−７位にヌクレオチドＧＧＡを含むが、ｐＤＢＥＬ３は−９位にヌクレオチドＴＣＣ、そして−５位にＴのヌクレオチドを含む。
【０１４２】
ＰＣＲ反応物は、以下の通りにプログラムしたPerkin Elmer 9600 Thermocycler内でインキュベートされた：９５℃で３０秒間１サイクル、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、そして６８℃で１４分間をそれぞれ１２サイクル。ＰＣＲ反応物は、１０ユニットのＤｐｎＩを用いて、変異していない親ＤＮＡを消化すべく処理された。消化した反応物は、Stratagene QuikChange （商標）Site-Directed Mutagenesis キットのプロトコールに従い、Ｅ．コリのＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパーコンピテント細胞を形質転換させるために使用された。
【０１４３】
ｐＪａＬ４８５変異体（ｐＤＢＥＬ２−１Ｔ、ｐＤＢＥＬ２−２Ｔ、ｐＤＢＥＬ２−３Ｔ、ｐＤＢＥＬ２−４Ｔ、ｐＤＢＥＬ２−１−４Ｔ、及びｐＤＢＥＬ３）のヌクレオチド配列は、蛍光標識したヌクレオチドによるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼサイクル配列決定を用いて決定された。配列決定反応物は、Applied Biosystems Automatic DNA Sequencer (Model 377, version 3.0) 上での電気泳動にかけられた。上文で列記した配列決定プライマー（９７１３０８及び９７１３０９）は、ｐＪａＬ４８５変異体の配列決定に使用した。
【０１４４】
例８：アスペルギルス・オリザエＪａＬ２９４の構築
定義したアスペルギルス・オリザエｎｉａＤ変異体の構築のために、置換プラスミドｐＪａＬ４４８（図１３）が、ｎｉａＤ遺伝子のＣ末端部分をアスペルギルス・オリザエのｐｙｒＧ遺伝子で置換することによって構築した。
【０１４５】
プラスミドｐＪａＬ４１０（例７に記載したコンストラクト）をＫｐｎＩで消化し、そして４３０７bpのフラグメントを精製し、そして再ライゲーションしてプラスミドｐＪａＬ４１９を生成せしめた。アスペルギルス・オリザエのｐｙｒＧ遺伝子をコードするプラスミドｐＪｅＲＳ４（米国特許第５，８６１，２８０号）をＫｐｎＩで消化し、そして１５１５bpのフラグメントを精製し、そしてＫｐｎＩで消化したｐＪａＬ４１９とライゲーションしてｐＪａＬ４４８（図３）を生成せしめた。
【０１４６】
プラスミドｐＪａＬ４４８は、アスペルギルス・オリザエのｐｙｒＧ遺伝子（ｐＪｅＲＳ４由来の１５１５bpのＫｐｎＩフラグメント）がｎｉａＤタンパク質のアミノ酸８５〜２７６をコードする７８２bpのＢｇｌII−ＫｐｎＩフラグメント及びｎｉａＤターミネーターを含む８４１bpのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントと隣接している二重交差（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）プラスミドである。
【０１４７】
アスペルギルス・オリザエＪａＬ２５０のプロトプラストは、例５に記載したものと同じプロトコールを用いて調製した。ｐＪａＬ４４８はＸｈｏＩで直鎖化され、そしてアスペルギルス・オリザエＪａＬ２５０（アスペルギルス・オリザエＪａＬ２２８のｐｙｒＧ誘導体）のプロトプラストを形質転換させた。塩素酸塩耐性選択のためのアスペルギルス・オリザエＪａＬ２５０の形質転換は、１ml当たり１．７×１０7 個のプロトプラストの濃度のプロトプラストで行った。１０μｇの直鎖化したｐＪａＬ４４８を１００μｌのプロトプラストに加えた。２５０μｌの体積のＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００−１０mM  ＣａＣｌ2 ）をその次に加え、そして混合物を３７℃で３０分間放置した。４mlのＳＴＣを続いて加え、そして混合物を塩酸塩耐性について選択する最小培地プレート上にプレーティングした。当該プレートを５〜７日間３７℃でインキュベートした。塩酸塩耐性形質転換体（４５個のうち９個）を単離し、そして更に唯一の窒素源としてグルタミン酸塩を有する塩酸塩含有最小培地上で精製した。これらの９個の変異体の、唯一の窒素源としての硝酸塩及び亜硝酸塩上で生育する能力が評価された。３つのものが硝酸還元酵素の構造変異体（ｎｉａＤ）を示す表現型を有しており、すなわち、それらは硝酸塩と共に生育することはできなかったが、唯一の窒素源としての亜硝酸塩上で生育した。
【０１４８】
ｐＪａＬ４１０由来の２kbのＫｐｎＩフラグメント又は３．７kbのＨｉｎｄIII フラグメントのいずれかをプローブとした、３つの変異体菌株由来のＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、及びＨｉｎｄIII で消化したゲノムＤＮＡのサザン解析は、アスペルギルス・オリザエＪａＬ２９４と表される、わずかに１つの形質転換体が、図２に示した様なｎｉａＤ位における予想された遺伝子の置換を有していることを証明した。
【０１４９】
例９：アスペルギルス・オリザエＪａＬ２９４の形質転換
アスペルギルス・オリザエＪａＬ２９４のプロトプラストは、例５に記載したものと同じプロトコールを用いて調製した。
【０１５０】
ｎｉａＤの選択のためのアスペルギルス・オリザエＪａＬ２９４の形質転換は、１mL当たり１．７×１０7 個のプロトプラストの濃度のプロトプラストで行った。１０μｇのＤＮＡ（ｐＤＢＥＬ２−１Ｔ、ｐＤＢＥＬ２−２Ｔ、ｐＤＢＥＬ２−３Ｔ、ｐＤＢＥＬ２−４Ｔ、ｐＤＢＥＬ２−１−４Ｔ、ｐＤＢＥＬ３、又はｐＪａＬ４８５）を１００μｌのプロトプラストに加えた。２５０μｌの体積のＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００−１０mM  ＣａＣｌ2 ）をその次に加え、そして混合物を３７℃で３０分間放置した。４mlのＳＴＣを続いて加え、そして混合物を、ｎｉａＤを選択するための最小培地プレート上にプレーティングした。プレートを５〜７日間、３７℃でインキュベートした。形質転換体は、胞子をストリーキングし、そして３７℃でインキュベートした最小培地プレートから単離したコロニーを突きさすことによって精製した。
【０１５１】
例１０：アスペルギルス・オリザエＪａＬ２９４における組込みイベントの特徴づけ
ゲノムＤＮＡは、以下の手順に従い、全てのアスペルギルス・オリザエＪａＬ２９４から単離した。各形質転換体は、小さいペトリ皿（６０×１５mm）中の５mlのＹＥＧ培地で、２４時間３７℃で生育した。続いて、菌糸をWhatman filter paper No.１（Whatman, Springfield Mill, England）を介する濾過によって各培養物から回収し、そして１．７mlの遠心管に移した。菌糸調製物を液体窒素中で凍結させ、そして SpeedVac（Savant Instrument, Inc., Farmingdale, NY）内で１．５時間乾燥させた。凍結した菌糸調製物を滅菌つまようじで細かい粉末にすりつぶした。Qiagen DNeasy キット（QIAGEN, Inc., Valencia, CA）が、凍結した菌糸からゲノムＤＮＡを抽出するために、取扱い説明書に従い使用された。
【０１５２】
ゲノムＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、そして次にサザンハイブリダイゼーションが、上記のSambrook et al., 1989 に記載の手順に従い、形質転換体内に組込まれたプラスミドの単一コピーが存在しているか否かを決定するために使用された。更に、ゲノムＤＮＡを、形質転換していないアスペルギルス・オリザエＪａＬ２９４から抽出した。消化物のブロットには、ｐＪａＬ４８５から得た０．８３４kbのｎｉａＤフラグメントをプローブとして用いた。当該フラグメントは、Boehringer MannheimのPCR DIG Probe Synthesisキット（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を、取扱い説明書に従って用いて、ジオキシゲニンで標識された。当該ブロットを２時間プレハイブリダイズし、そして５０℃で、ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ中で一晩ハイブリダイズした。当該ブロットを洗浄し、そして製造者によって推奨されている通りに処理された。
【０１５３】
サザンブロットは、ｐＪａＬ４８５が８．５kbのバンドを含み、そして形質転換していないアスペルギルス・オリザエＪａＬ２９４が、ｎｉａＤのフラグメントをプローブとして用いたときに５．７kbのバンドを含むことを証明した。前記プラスミドの単一コピーが組込まれた形質転換体は、１１．７kb及び２．６kbのバンドを含むはずである。前記プラスミドの複数のコピーが組込まれた形質転換体は、同一の１１．７kb及び２．６kbのバンド、並びに８．５kbの第３のバンドを含むはずである。前記プラスミドＤＮＡの単一コピーを組込んだそれらの形質転換体を、続いて振盪フラスコ中で生育し、そして次にリパーゼ発現についてアッセイした。
【０１５４】
例１１：振盪フラスコ中の形質転換体の解析
アスペルギルス・オリザエの形質転換体は、１２５mlのポリプロピレン振盪フラスコ中の、pH６．５の２５mlのＭＹ２５培地に、１７０mlの胞子懸濁液（０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０＋最小培地プレート由来の胞子）を接種し、そして２２５rpm で振盪フラスコを３４℃でインキュベートすることによって培養した。試料を３日目及び５日目に採集し、そして例５に記載の様にリパーゼ活性を測定した。
【０１５５】
表２は、ｐＪａＬ４８５及び全てのその変異体に関する−９位から＋３位までのヌクレオチド配列を示す。得られた結果は、ｐＪａＬ４８５で得られたリパーゼ活性と比較して以下の表３に示す。
【表１２】
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【表１３】
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【０１５６】
表３に示す様に、−１、−２、又は−４位のヌクレオチドがＴのヌクレオチドに変化した場合（ｐＤＢＥＬ２−１、ｐＤＢＥＬ２−２、及びｐＤＢＥＬ２−４）、野生型プラスミド（ｐＪａＬ４８５）と比較して、リパーゼの発現の有意な変化は見られなかった。−３位のヌクレオチドが、Ａのヌクレオチド（ｐＪａＬ４８５）からＴのヌクレオチド（ｐＤＢＥＬ２−３）に変化した場合、リパーゼ発現の有意な低下が見られた。しかしながら、−４位から−１位のヌクレオチド全てがＴのヌクレオチドに変化した場合（ｐＤＢＥＬ２−１−４）、わずかに１つのヌクレオチドが任意の位置で変化したときに見られるもの以上に、リパーゼの発現における低下が存在していた。ｐＤＢＥＬ３は、−９から−１位において、アスペルギルスの共通配列を含んでいた。このことは、リパーゼ発現の有意な増大をもたらした。
【０１５７】
本明細書に記載され、そして特許請求される発明が、本明細書で開示した特定の態様によって範囲が限定されるべきでないのは、これらの態様が本発明の複数の観点の例示を意図しているためである。事実、本明細書で示し、そして説明したものに加えて、本発明の種々の変更が、当業者にとって前述の説明から明らかであるだろう。その様な変更はまた、特許請求の範囲にあることが意図されている。抵触している場合、限定を含む本発明の開示は調整され得る。
【０１５８】
様々な引用文献を列記しており、これらの開示は、引用によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はpJaL292の制限地図を示す。
【図２】  図２はpKS6の制限地図を示す。
【図３】  図３はpBANe13の制限地図を示す。
【図４】  図４はpBANe6の制限地図を示す。
【図５】  図５はpMHan37の制限地図を示す。
【図６】  図６はpBANe8の制限地図を示す。
【図７】  図７はpBANe15の制限地図を示す。
【図８】  図８はp DBEL1の制限地図を示す。
【図９】  図９はp4-AN.pyrG1&2の制限地図を示す。
【図１０】  図１０はpBANe11の制限地図を示す。
【図１１】  図１１はpBANe12の制限地図を示す。
【図１２】  図１２はpJaL485の制限地図を示す。
【図１３】  図１３はpJaL448の制限地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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