(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞内で活性を持つプロモーターの制御下にｐ３００をコードするＤＮＡを有する外来ＤＮＡを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
心筋細胞内で活性を持つプロモーターが、α−ミオシン重鎖プロモーターであることを特徴とする請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
次の工程、すなわち（１）請求項１又は２記載のトランスジェニック非ヒト動物に被検物質を投与する工程及び、（２）前記トランスジェニック非ヒト動物において、心肥大が抑制されるか否かを確認する工程を含むことを特徴とする心不全治療能を有する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、p300をコードするDNA（以下、「p300遺伝子」という）が心筋細胞内で発現するように導入されている動物、及びそれを利用したスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓は絶えず収縮と弛緩を繰り返すというユニークな機能を持った器官である。心臓の主な構成成分である心筋細胞は、分化後も分裂能を維持し、胎生期には活発に分裂・増殖を続けるが、出生と同時にその分裂能を喪失し、以後の心臓の成長は、個々の心筋細胞の大きさが増すこと（生理的肥大）による。
【０００３】
心臓は、高血圧などさまざまな刺激に反応して生理的な成長以上に大きくなる場合があり、これは一般に心肥大と呼ばれる。心肥大は、限界のある代償機構であり、これ自体が心臓の収縮機能を低下させるわけではない。しかし、限界を超えた高度の肥大は、心筋細胞の生化学的変化を伴い、心臓は収縮機能不全（心不全）に陥る。
【０００４】
心不全の発症機序に関しては、既に幾つかの報告がある。例えば、Hasegawaらは、GATA転写因子群が心不全発症の細胞内情報伝達において重要な役割を果たしていることを報告しており（非特許文献1：Hasegawa K et al.:Circulation 1997;96:3943-3953）、Morimotoらは、GATA転写因子の中でもGATA-5が特に重要な役割を果たしていることを報告している（非特許文献2：Morimoto T et al.:J. Biol. Chem. 1999;274:12811-12818）。また、Iwanagaらは、心筋中のエンドセリン-1の発現亢進が高血圧による代償性心肥大から心不全への進展に重要な役割を果たしていることを報告している（非特許文献3：Iwanaga Y et al.:Circulation 1998;98:2065）。更に、長谷川らは、adenovirus E1A結合蛋白の一つであるp300がGATA-5のco-activatorとして機能していることを報告している（非特許文献4：長谷川浩二ら 血圧vol.6 1999:665-669）。一方、金井らによってp300が心筋細胞のアポトーシスを誘導することも確認され（非特許文献5：第63回日本循環器学会総会・学術集会での発表、1999年3月27〜29日）、p300が心肥大を抑制する方向へ働く可能性も示唆されており、p300と心肥大との関係が明確になっていない状況である。
【０００５】
このように心不全の発症機序は、次第に明らかにされつつあるが、いまだ十分に解明されていない部分も多々ある。このような研究の遅れの一つの原因として、心不全のモデルとなる実験動物が開発されていないという事実が挙げられる。
【０００６】
【非特許文献】
【非特許文献１】
Hasegawa K et al.:Circulation 1997;96:3943-3953
【非特許文献２】
Morimoto T et al.:J. Biol. Chem. 1999;274:12811-12818
【非特許文献３】
Iwanaga Y et al.:Circulation 1998;98:2065
【非特許文献４】
長谷川浩二ら 血圧vol.6 1999:665-669
【非特許文献５】
第63回日本循環器学会総会・学術集会での発表、1999年3月27〜29日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、その目的とするところは、心不全発症機序の解明に有用な心不全発症モデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、心不全の発症に関与する様々な因子の中からp300に着目し、p300遺伝子を動物に導入することにより心不全に近似した病態を発症させ得ることを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、p300遺伝子と心筋細胞内で活性を持つプロモーターが導入されていることを特徴とするトランスジェニック動物である。
また、本発明は、次の工程
（１）上記トランスジェニック動物に被検物質を投与する工程
（２）前記トランスジェニック動物において、心肥大が抑制されるか否かを確認する工程を含むことを特徴とする心不全治療能を有する物質のスクリーニング方法である。
【００１０】
更に、本発明は、上記スクリーニング方法によって得られる物質である。
更に、本発明は、上記スクリーニング方法によって得られる物質を有効成分として含有することを特徴とする心不全治療剤である。本発明のトランスジェニック動物は、p300遺伝子と心筋細胞内で活性を持つプロモーターが導入されていることを特徴とするものである。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のトランスジェニック動物は、p300遺伝子と心筋細胞内で活性を持つプロモーターが導入されていることを特徴とするものである。
【００１２】
動物の種類は、ヒト以外の動物であればどのようなものでもよいが、好ましい動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ブタなどを挙げることができる。
【００１３】
p300遺伝子としては、例えば、ヒト由来のp300遺伝子（配列番号１）を使用することができるが、これ以外のp300遺伝子を使用してもよい。
【００１４】
導入するプロモーターは、心筋細胞内で活性を持ち、動物の成長に伴い活性が高くなるものであれば特に限定されない。好ましいプロモーターとしては、α−ミオシン重鎖プロモーター（配列番号２）を挙げることができる。このプロモーターは、胎生期では活性が低く、動物の成長に伴い活性が高くなる。従って、このプロモーターを使用することにより、動物が十分成熟しない段階で心不全を発症し、死亡してしまうことを避けることができる。
【００１５】
本発明のトランスジェニック動物は、例えば、以下のようにして作製することができる。
(i)  p300遺伝子と心筋細胞内で活性を持つプロモーターを含むベクターを作製する。ヒト由来のp300遺伝子は、配列番号１記載の配列に基づいて作製することができる。また、他のp300遺伝子の配列も米国国立バイオテクノロジー情報センターが管理するGenBankにおいて公開されているので、それらの配列に基づいて作製することができる。心筋細胞内で活性を持つプロモーターの一つであるα−ミオシン重鎖プロモーターは、配列番号２記載の配列に基づいて作製することができる。以上のように作製したp300遺伝子及び心筋細胞内で活性を持つプロモーターを、市販のベクター、例えば、pBluescript IIなどに挿入することにより、目的のベクターを作製することができる。
(ii)  作製したベクターから発現カセットを切りだし、全能性細胞に導入する。全能性細胞としては、受精卵、初期胚、ES細胞などを用いることができる。全能性細胞への導入は、静電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法などにより行うことができる。
(iii)  上記処理を行った全能性細胞を仮親の卵管に移植し、産仔を出生させ、その産仔の中から外来のp300遺伝子が有する個体を選抜する。外来のp300遺伝子を有する個体であるかどうかは、外来のp300遺伝子に特異的なプローブやプライマーを用いたサザンブロッテイングやPCRにより判断できるが、外来のp300遺伝子を有する個体の方が内在遺伝子しか持たない個体よりもp300遺伝子の発現量が多いので、発現量の差異からも判断することは可能である。
【００１６】
本発明のトランスジェニック動物は、心肥大や心筋内でのエンドセリン-1の過剰合成といった心不全に特有の病態を示すことから、心不全のモデル動物として利用できる。
【００１７】
また、本発明のトランスジェニック動物に被検物質を投与し、その後、この動物において心肥大が抑制されるか否かを確認することにより、心不全治療能を有する物質のスクリーニングを行うことができる。
【００１８】
被検物質は、特に限定されず、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液などが挙げられる。
被検物質の投与手段は、特に限定されず、経口投与、注射投与などを例示できる。
【００１９】
心肥大が抑制されるか否かは、被検物質を投与したトランスジェニック動物から心臓を摘出し、その重量を測定し、コントロール（被検物質を投与しないトランスジェニック動物）の心臓の重量と比較することにより、判断できる。また、心肥大が生じているかどうかは心エコー法などによっても確認できるので、それにより抑制の有無を判断できる。更に、心肥大に伴い、心房性利尿ペプチドの過剰合成やβ−ミオシン重鎖遺伝子の発現などがみられるので、これらを指標として抑制の有無を判断してもよい。なお、β−ミオシン重鎖遺伝子の発現は、Hasegawaらの方法に従って確認することができる（Hasegawa K et al.:Circulation 1977:96:3943-3953）。これらの手法に加え、死亡率によっても心肥大の抑制の有無を判断してもよい。本発明のトランスジェニック動物は、心肥大が抑制されなければ高い確率で心不全を起こし、死亡するからである。
【００２０】
以上のスクリーニング方法によって得られる物質は、心不全治療能を有するので、公知の製剤学的製造法により製剤化し、心不全治療剤、又は心不全予防剤として使用することができる。
【００２１】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０００−２１５１４３号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（実施例１）
pCMVwtp300をNotI及びHindIIIで処理し、p300遺伝子を含む断片を切りだした後、この断片のNotI切断部位を平滑化した。一方、α−ミオシン重鎖プロモーター（αMHCプロモーター）を含むα-MHC Clone26（accession no. U71441）をSalI及びHindIIIで処理した後、SalI切断部位を平滑化し、この切断部位に前述のp300遺伝子（Eckner,R. et al.:Genes Dev. 1994:8:869-884, accession no.U01877）を含む断片を挿入し、αMHCプロモーターとp300遺伝子とを含むpαMHC-p300を作製した。pCMVwtp300、α-MHC Clone26、pαMHC-p300の構造は図１に示すとおりである。なお、pCMVwtp300は、Drs.Richard Eckner and David M. Livingston (Harvard Medical School, Boston, MA)から譲り受けたものであり、α-MHC Clone26は、Robbins,J.（Molecular Card. Biol., Children’s Hospital, Cincinati, OH）から譲り受けたものである。
【００２３】
pαMHC-p300をNotIで消化し、αMHCプロモーターとp300遺伝子とを含む断片を切り出した。このDNA断片の濃度が3ng/μlになるように調製した後、C57BL/6J系統のマウス（日本クレア製）から採取し、凍結保存を行った後、融解した前核期受精卵に注入した。受精卵へのDNAの注入はマイクロインジェクション法（上田乙也ら:ジーンターゲッティングの最新技術：2000:190-207）によって行った。DNAを注入した受精卵319個中236個が生存し、このうち199個が２細胞期胚にまで分化した。この２細胞期胚を、予め偽妊娠させたレシピエントマウス（ICR系統、日本クレア製）の卵管に移植した。産仔は54匹得られた。得られた産仔がαMHCプロモーターとp300遺伝子とを含むかどうかをサザンブロット法により調べた。プローブとしては、pαMHC-p300を鋳型とし、以下のプライマーを用いたPCRにより増幅されるDNA断片を用いた。
【００２４】
センスプライマー      ：TCTTAGCAAACCTCAGGCAC（配列番号３）
（配列番号２の5230〜5249に対応）
アンチセンスプライマー：CCACCATTGGTTAGTCCCAA（配列番号４）
（配列番号１の1356〜1375に対応）
【００２５】
サザンブロットの結果、6個体に目的のDNAが含まれていることを確認した。6匹中3匹のトランスジェニックマウス系統を確立した。
【００２６】
この3匹のマウス（21系統、39系統、40系統）を野生型のC57BL/6J系統のマウスと交配し、仔マウスを得た。これらの仔マウスが導入遺伝子を含むかどうかを、上記と同様のサザンブロット法により調べた。仔マウスの雌雄及び導入遺伝子の有無を下表に示す。
【００２７】
【表１】
0004864275.tif 000002
【００２８】
（実施例２）
トランスジェニックマウスの各種臓器中で導入したヒトp300遺伝子が発現しているかどうかを、この遺伝子に特異的なプライマーを用いたRT-PCR及びこの遺伝子に特異的なプローブを用いたRT-サザンハイブリダイゼーションにより調べた。
【００２９】
トランスジェニックマウス（個体番号６）の心臓、肺、肝臓、腎臓、並びに野生型マウス（個体番号５６、２、５９）の心臓からmRNAを調製し、これを鋳型とし、RT-PCRを行った。各臓器からのmRNAの調製は、RNA抽出用試薬「ISOGEN」（（株）ニッポンジーン）のマニュアルに従った。RT-PCRは、「mRNA Selective PCR kit」（TaKaRa）のマニュアルに従い、以下のように行った。
【００３０】
まず、表２に示す組成のRT反応液を調製し、これを30℃10分、46℃22分、5℃5分という条件で反応させた。次に、このRT反応液と各種試薬から表３に示す組成のPCR反応液を調製し、85℃−30秒、55℃−30秒、72℃−60秒を１サイクルとした加熱冷却を40サイクル繰り返した。使用したプライマーは、以下の通りである。
【００３１】
センスプライマー      ：GCA ACA GGT GCT TAG TAT CC（配列番号５）
（p300遺伝子（配列番号１）の7400〜7419番目の塩基に対応）
アンチセンスプライマー：CTG TTG CAT GTG ATG CTG CA（配列番号６）
（p300遺伝子（配列番号１）の7879〜7898番目の塩基に対応）
【００３２】
【表２】
0004864275.tif 000003
【００３３】
【表３】
0004864275.tif 000004
【００３４】
RT-PCRの増幅産物を1％アガロースゲルで電気泳動により分離させた後、ナイロンフィルターに転写し、RT-サザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、「Express Hyb Hybridization Solution」（CLONTECH）のマニュアルに従って行った。プローブは、pCMVwtp300を鋳型とし、上記プライマーでPCRを行い、その増幅産物を使用した。
【００３５】
トランスジェニックマウスにおけるRT‐サザンハイブリダイゼーションの結果を図２に示す。この図に示すように、トランスジェニックマウスにおいては、心臓においてのみp300遺伝子が発現しており、他の臓器では発現していなかった。また、野生型マウスでは、心臓においてもp300遺伝子は発現していなかった（図には示さない）。
【００３６】
（実施例３）
トランスジェニックマウス（個体番号５、９、３６）及び野生型マウス（８、１２、３５）から心筋細胞を採取し、これからタンパク質を抽出した。タンパク質の抽出は、Hasegawaらの方法（Hasegawa K. et al.: Circulation 1997:96:3943-3953）に従って行った。この心筋細胞由来のタンパク質中にp300が含まれるかどうかを抗ヒトp300抗体（CT-Power ClonalTM, up state biotechnology製）を用いたウェスタンブロットにより調べた。この抗体は、導入遺伝子の発現産物であるヒト由来p300だけでなく、内在マウスp300とも反応する。ウェスタンブロットは、Morimotoらの方法（Morimoto T et al.: The Journal of Biological Chemistry 2000:275:13721-13726）に従って行った。
【００３７】
ウエスタンブロットの結果を図３に示す。この図に示すように、野生型マウス（WT）においてもp300は検出されたが、その量はトランスジェニックマウス（TG）に比べはるかに少ないものであった。
【００３８】
（実施例４）
マウスの心筋中に含まれるエンドセリン-1の量をIwanagaらの方法（Circulation 1998 98:2065-2073）に従って測定した。
【００３９】
トランスジェニックマウス（個体番号１、３、７、２０、３２、３４、５１、５６）及び野生型マウス（個体番号２、３３、４９、５５、５９）をペントバルビタールで麻酔した後、心臓を摘出した。心臓から心房を取り除き、左右の心室を冷生理食塩水で洗浄した。これを9 mol/L酢酸水溶液（0.1% Triron-X含有）とともにポリトロンホモジナイザーに入れ、30秒間ホモジナイズした後、7分間煮沸し、遠心分離（2000g, 30分, 4℃）を行った。上清を採取し、−80℃で保存した。
【００４０】
心室組織ホモジネート上清からエンドセリン-1の抽出は、Kitamuraらの方法（Kitamura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989;156:1182-1186）に従って行った。また、エンドセリン-1含量の測定は、EIAキット（和光純薬製）を使用し、Suzukiらの方法（Suzuki et al. J. Immunol. Methods. 1989;118:245-250）に従って行った。この測定法は、エンドセリン-1を0.5pg/mlの濃度まで検出可能であり、また、エンドセリン-3やビッグエンドセリン-1との交差反応性は、0.1%以下である。
各マウス心筋中のエンドセリン-1含量を下表に示す。
【００４１】
【表４】
0004864275.tif 000005
【００４２】
上表に示すように、トランスジェニックマウスの心筋中のエンドセリン-1含量は、野生型マウスに比べ顕著に高かった。
【００４３】
（実施例５）
p300遺伝子の発現と心筋細胞の肥大化との関係を調べる目的で、トランスジェニックマウスと野生型マウスの心臓重量及び全体重を調べた。この結果を下表に示す。
【００４４】
【表５】
0004864275.tif 000006
【００４５】
上表に示した各個体のうち、親系統、性別、出生日が同じもの同士を一つのグループとし、そのグループ内における表現型と心体重比との関係を調べた。結果を下表に示す。
【００４６】
【表６】
0004864275.tif 000007
【００４７】
上表に示すように、トランスジェニックマウスの方が野生型マウスよりも10〜30％程度心体重比が増加していた。
【００４８】
（実施例６）
p300遺伝子の発現と心筋細胞の肥大化との関係を調べる目的で、月齢２、６、１０ヶ月のトランスジェニックマウス及び野生型マウスについて心エコーを行った。
【００４９】
マウスは、ケタミン（50mg/kg）及びキシラジン（2.5mg/kg）で麻酔し、心臓超音波診断装置（Toshiba Power Vision SSA-380A）を用いて、7.5-MHzのトランスデューサーで断層心エコー図を記録した。
【００５０】
鮮明な二次画像を得た後、Ｍモードで心エコーを測定し、左室拡張末期径（LVDd）、左室収縮末期径（LVDs）をアメリカ心エコー協会が採択する leading edge-to-leading edge法により求めた。また、左室内径短縮率（%FS）を下記の式により求めた。
%FS＝［（LVDd−LVDs）/ LVDd］x 100
【００５１】
その他、計測値の扱いはInokoらの方法（Inoko et al. Am. J. Physiol. 1994;267:2471-2481）を参考にした。
【００５２】
結果を下表及び図４、図５に示す。なお、図表中の記号は、以下のとおりである。
ＨＲ      ：心拍数（beat/min）
(ＬＶ)Ｄｄ：左室拡張末期径（単位mm）
(ＬＶ)Ｄｓ：左室収縮末期径（単位mm）
ＩＶＳＴ  ：心室中隔壁厚（単位mm）
ＬＶＰＷＴ：左室後壁厚（単位mm）
％ＦＳ    ：左室内径短縮率
【００５３】
【表７】
0004864275.tif 000008
【００５４】
上表及び図４、５からわかるように、左室拡張末期径及び左室収縮末期径は、２月齢ではほとんど差違はないが、６月齢、１０月齢においてはトランスジェニックマウスの方が野生型よりも有意に値が大きくなった。また、６月齢、１０月齢においては心拍数及び左室内径短縮率はトランスジェニックマウスの方が低く、トランスジェニックマウスでは心不全を生じていることが認められた。なお、心室中隔壁厚及び左室後壁厚は月齢による変動が小さく、またトランスジェニックマウスと野生型の間に統計的有意差は認められなかった。
【００５５】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、新規なトランスジェニック動物を提供する。このトランスジェニック動物は、心不全の発症機序の解明や心不全治療薬開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、pCMVwtp300、α-MHC clone 26及びpαMHC-p300の構造を示す。
【図２】図２は、実施例２で行ったサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図３】図３は、実施例３で行ったウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図４】図４は、実施例６で行った心エコーにおける各計測値をマウスの月齢ごとに比較したグラフ（4-1〜4-6）を示す。
【図５】図５は、実施例６で行ったＭモード心エコー図と各計測値を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号３：実施例１のPCRで用いたセンスプライマー
配列番号４：実施例１のPCRで用いたアンチセンスプライマー
配列番号５：実施例２のPCRで用いたセンスプライマー
配列番号６：実施例２のPCRで用いたアンチセンスプライマー
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISYA
KOJI HASEGAWA
<120> p300 TRANSGENIC ANIMAL
<130> P02-0583
<140> JP 2002-511583
<141> 2001-07-13
<150> JP2000-215143
<151> 2000-07-14
<160> 6
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 9046
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1200)..(8441)
<400> 1
ccttgtttgt gtgctaggct gggggggaga gagggcgaga gagagcgggc gagagtgggc 60
aagcaggacg ccgggctgag tgctaactgc gggacgcaga gagtgcggag gggagtcggg 120
tcggagagag gcggcagggg ccagaacagt ggcagggggc ccggggcgca cgggctgagg 180
cgacccccag ccccctcccg tccgcacaca cccccaccgc ggtccagcag ccgggccggc 240
gtcgacgcta ggggggacca ttacataacc cgcgccccgg ccgtcttctc ccgccgccgc 300
ggcgcccgaa ctgagcccgg ggcgggcgct ccagcactgg ccgccggcgt ggggcgtagc 360
agcggccgta ttattatttc gcggaaagga aggcgaagga ggggagcgcc ggcgcgagga 420
ggggccgcct gcgcccgccg ccggagcggg gcctcctcgg tgggctccgc gtcggcgcgg 480
gcgtgcgggc ggcgctgctc ggcccggccc cctcggccct ctggtccggc cagctccgct 540
cccggcgtcc ttgccgcgcc tccgccggcc gccgcgcgat gtgaggcggc ggcgccagcc 600
tggctctcgg ctcgggcgag ttctctgcgg ccattagggg ccggtgcggc ggcggcgcgg 660
agcgcggcgg caggaggagg gttcggaggg tgggggcgca ggcccgggag ggggcaccgg 720
gaggaggtga gtgtctcttg tcgcctcctc ctctcccccc ttttcgcccc cgcctccttg 780
tggcgatgag aaggaggagg acagcgccga ggaggaagag gttgatggcg gcggcggagc 840
tccgagagac ctcggctggg caggggccgg ccgtggcggg ccggggactg cgcctctaga 900
gccgcgagtt ctcgggaatt cgccgcagcg gaccggcctc ggcgaatttg tgctcttgtg 960
ccctcctccg ggcttgggcc aggccggccc ctcgcacttg cccttacctt ttctatcgag 1020
tccgcatccc tctccagcca ctgcgacccg gcgaagagaa aaaggaactt cccccacccc 1080
ctcgggtgcc gtcggagccc cccagcccac ccctgggtgc ggcgcgggga ccccgggccg 1140
aagaagagat ttcctgagga ttctggtttt cctcgcttgt atctccgaaa gaattaaaa  1199
atg gcc gag aat gtg gtg gaa ccg ggg ccg cct tca gcc aag cgg cct   1247
Met Ala Glu Asn Val Val Glu Pro Gly Pro Pro Ser Ala Lys Arg Pro
1               5                  10                  15
aaa ctc tca tct ccg gcc ctc tcg gcg tcc gcc agc gat ggc aca gat   1295
Lys Leu Ser Ser Pro Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ser Asp Gly Thr Asp
20                  25                  30
ttt ggc tct cta ttt gac ttg gag cac gac tta cca gat gaa tta atc   1343
Phe Gly Ser Leu Phe Asp Leu Glu His Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile
35                  40                  45
aac tct aca gaa ttg gga cta acc aat ggt ggt gat att aat cag ctt   1391
Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Gly Gly Asp Ile Asn Gln Leu
50                  55                  60
cag aca agt ctt ggc atg gta caa gat gca gct tct aaa cat aaa cag   1439
Gln Thr Ser Leu Gly Met Val Gln Asp Ala Ala Ser Lys His Lys Gln
65                  70                  75                  80
ctg tca gaa ttg ctg cga tct ggt agt tcc cct aac ctc aat atg gga   1487
Leu Ser Glu Leu Leu Arg Ser Gly Ser Ser Pro Asn Leu Asn Met Gly
85                  90                  95
gtt ggt ggc cca ggt caa gtc atg gcc agc cag gcc caa cag agc agt   1535
Val Gly Gly Pro Gly Gln Val Met Ala Ser Gln Ala Gln Gln Ser Ser
100                 105                 110
cct gga tta ggt ttg ata aat agc atg gtc aaa agc cca atg aca cag   1583
Pro Gly Leu Gly Leu Ile Asn Ser Met Val Lys Ser Pro Met Thr Gln
115                 120                 125
gca ggc ttg act tct ccc aac atg ggg atg ggc act agt gga cca aat   1631
Ala Gly Leu Thr Ser Pro Asn Met Gly Met Gly Thr Ser Gly Pro Asn
130                 135                 140
cag ggt cct acg cag tca aca ggt atg atg aac agt cca gta aat cag   1679
Gln Gly Pro Thr Gln Ser Thr Gly Met Met Asn Ser Pro Val Asn Gln
145                 150                 155                 160
cct gcc atg gga atg aac aca ggg acg aat gcg ggc atg aat cct gga   1727
Pro Ala Met Gly Met Asn Thr Gly Thr Asn Ala Gly Met Asn Pro Gly
165                 170                 175
atg ttg gct gca ggc aat gga caa ggg ata atg cct aat caa gtc atg   1775
Met Leu Ala Ala Gly Asn Gly Gln Gly Ile Met Pro Asn Gln Val Met
180                 185                 190
aac ggt tca att gga gca ggc cga ggg cga cag gat atg cag tac cca   1823
Asn Gly Ser Ile Gly Ala Gly Arg Gly Arg Gln Asp Met Gln Tyr Pro
195                 200                 205
aac cca ggc atg gga agt gct ggc aac tta ctg act gag cct ctt cag   1871
Asn Pro Gly Met Gly Ser Ala Gly Asn Leu Leu Thr Glu Pro Leu Gln
210                 215                 220
cag ggc tct ccc cag atg gga gga caa aca gga ttg aga ggc ccc cag   1919
Gln Gly Ser Pro Gln Met Gly Gly Gln Thr Gly Leu Arg Gly Pro Gln
225                 230                 235                 240
cct ctt aag atg gga atg atg aac aac ccc aat cct tat ggt tca cca   1967
Pro Leu Lys Met Gly Met Met Asn Asn Pro Asn Pro Tyr Gly Ser Pro
245                 250                 255
tat act cag aat cct gga cag cag att gga gcc agt ggc ctt ggt ctc   2015
Tyr Thr Gln Asn Pro Gly Gln Gln Ile Gly Ala Ser Gly Leu Gly Leu
260                 265                 270
cag att cag aca aaa act gta cta tca aat aac tta tct cca ttt gct   2063
Gln Ile Gln Thr Lys Thr Val Leu Ser Asn Asn Leu Ser Pro Phe Ala
275                 280                 285
atg gac aaa aag gca gtt cct ggt gga gga atg ccc aac atg ggt caa   2111
Met Asp Lys Lys Ala Val Pro Gly Gly Gly Met Pro Asn Met Gly Gln
290                 295                 300
cag cca gcc ccg cag gtc cag cag cca ggt ctg gtg act cca gtt gcc   2159
Gln Pro Ala Pro Gln Val Gln Gln Pro Gly Leu Val Thr Pro Val Ala
305                 310                 315                 320
caa ggg atg ggt tct gga gca cat aca gct gat cca gag aag cgc aag   2207
Gln Gly Met Gly Ser Gly Ala His Thr Ala Asp Pro Glu Lys Arg Lys
325                 330                 335
ctc atc cag cag cag ctt gtt ctc ctt ttg cat gct cac aag tgc cag   2255
Leu Ile Gln Gln Gln Leu Val Leu Leu Leu His Ala His Lys Cys Gln
340                 345                 350
cgc cgg gaa cag gcc aat ggg gaa gtg agg cag tgc aac ctt ccc cac   2303
Arg Arg Glu Gln Ala Asn Gly Glu Val Arg Gln Cys Asn Leu Pro His
355                 360                 365
tgt cgc aca atg aag aat gtc cta aac cac atg aca cac tgc cag tca   2351
Cys Arg Thr Met Lys Asn Val Leu Asn His Met Thr His Cys Gln Ser
370                 375                 380
ggc aag tct tgc caa gtg gca cac tgt gca tct tct cga caa atc att   2399
Gly Lys Ser Cys Gln Val Ala His Cys Ala Ser Ser Arg Gln Ile Ile
385                 390                 395                 400
tca cac tgg aag aat tgt aca aga cat gat tgt cct gtg tgt ctc ccc   2447
Ser His Trp Lys Asn Cys Thr Arg His Asp Cys Pro Val Cys Leu Pro
405                 410                 415
ctc aaa aat gct ggt gat aag aga aat caa cag cca att ttg act gga   2495
Leu Lys Asn Ala Gly Asp Lys Arg Asn Gln Gln Pro Ile Leu Thr Gly
420                 425                 430
gca ccc gtt gga ctt gga aat cct agc tct cta ggg gtg ggt caa cag   2543
Ala Pro Val Gly Leu Gly Asn Pro Ser Ser Leu Gly Val Gly Gln Gln
435                 440                 445
tct gcc ccc aac cta agc act gtt agt cag att gat ccc agc tcc ata   2591
Ser Ala Pro Asn Leu Ser Thr Val Ser Gln Ile Asp Pro Ser Ser Ile
450                 455                 460
gaa aga gcc tat gca gct ctt gga cta ccc tat caa gta aat cag atg   2639
Glu Arg Ala Tyr Ala Ala Leu Gly Leu Pro Tyr Gln Val Asn Gln Met
465                 470                 475                 480
ccg aca caa ccc cag gtg caa gca aag aac cag cag aat cag cag cct   2687
Pro Thr Gln Pro Gln Val Gln Ala Lys Asn Gln Gln Asn Gln Gln Pro
485                 490                 495
ggg cag tct ccc caa ggc atg cgg ccc atg agc aac atg agt gct agt   2735
Gly Gln Ser Pro Gln Gly Met Arg Pro Met Ser Asn Met Ser Ala Ser
500                 505                 510
cct atg gga gta aat gga ggt gta gga gtt caa acg ccg agt ctt ctt   2783
Pro Met Gly Val Asn Gly Gly Val Gly Val Gln Thr Pro Ser Leu Leu
515                 520                 525
tct gac tca atg ttg cat tca gcc ata aat tct caa aac cca atg atg   2831
Ser Asp Ser Met Leu His Ser Ala Ile Asn Ser Gln Asn Pro Met Met
530                 535                 540
agt gaa aat gcc agt gtg ccc tcc ctg ggt cct atg cca aca gca gct   2879
Ser Glu Asn Ala Ser Val Pro Ser Leu Gly Pro Met Pro Thr Ala Ala
545                 550                 555                 560
caa cca tcc act act gga att cgg aaa cag tgg cac gaa gat att act   2927
Gln Pro Ser Thr Thr Gly Ile Arg Lys Gln Trp His Glu Asp Ile Thr
565                 570                 575
cag gat ctt cga aat cat ctt gtt cac aaa ctc gtc caa gcc ata ttt   2975
Gln Asp Leu Arg Asn His Leu Val His Lys Leu Val Gln Ala Ile Phe
580                 585                 590
cct acg ccg gat cct gct gct tta aaa gac aga cgg atg gaa aac cta   3023
Pro Thr Pro Asp Pro Ala Ala Leu Lys Asp Arg Arg Met Glu Asn Leu
595                 600                 605
gtt gca tat gct cgg aaa gtt gaa ggg gac atg tat gaa tct gca aac   3071
Val Ala Tyr Ala Arg Lys Val Glu Gly Asp Met Tyr Glu Ser Ala Asn
610                 615                 620
aat cga gcg gaa tac tac cac ctt cta gct gag aaa atc tat aag atc   3119
Asn Arg Ala Glu Tyr Tyr His Leu Leu Ala Glu Lys Ile Tyr Lys Ile
625                 630                 635                 640
cag aaa gaa cta gaa gaa aaa cga agg acc aga cta cag aag cag aac   3167
Gln Lys Glu Leu Glu Glu Lys Arg Arg Thr Arg Leu Gln Lys Gln Asn
645                 650                 655
atg cta cca aat gct gca ggc atg gtt cca gtt tcc atg aat cca ggg   3215
Met Leu Pro Asn Ala Ala Gly Met Val Pro Val Ser Met Asn Pro Gly
660                 665                 670
cct aac atg gga cag ccg caa cca gga atg act tct aat ggc cct cta   3263
Pro Asn Met Gly Gln Pro Gln Pro Gly Met Thr Ser Asn Gly Pro Leu
675                 680                 685
cct gac cca agt atg atc cgt ggc agt gtg cca aac cag atg atg cct   3311
Pro Asp Pro Ser Met Ile Arg Gly Ser Val Pro Asn Gln Met Met Pro
690                 695                 700
cga ata act cca caa tct ggt ttg aat caa ttt ggc cag atg agc atg   3359
Arg Ile Thr Pro Gln Ser Gly Leu Asn Gln Phe Gly Gln Met Ser Met
705                 710                 715                 720
gcc cag ccc cct att gta ccc cgg caa acc cct cct ctt cag cac cat   3407
Ala Gln Pro Pro Ile Val Pro Arg Gln Thr Pro Pro Leu Gln His His
725                 730                 735
gga cag ttg gct caa cct gga gct ctc aac ccg cct atg ggc tat ggg   3455
Gly Gln Leu Ala Gln Pro Gly Ala Leu Asn Pro Pro Met Gly Tyr Gly
740                 745                 750
cct cgt atg caa cag cct tcc aac cag ggc cag ttc ctt cct cag act   3503
Pro Arg Met Gln Gln Pro Ser Asn Gln Gly Gln Phe Leu Pro Gln Thr
755                 760                 765
cag ttc cca tca cag gga atg aat gta aca aat atc cct ttg gct ccg   3551
Gln Phe Pro Ser Gln Gly Met Asn Val Thr Asn Ile Pro Leu Ala Pro
770                 775                 780
tcc agc ggt caa gct cca gtg tct caa gca caa atg tct agt tct tcc   3599
Ser Ser Gly Gln Ala Pro Val Ser Gln Ala Gln Met Ser Ser Ser Ser
785                 790                 795                 800
tgc ccg gtg aac tct cct ata atg cct cca ggg tct cag ggg agc cac   3647
Cys Pro Val Asn Ser Pro Ile Met Pro Pro Gly Ser Gln Gly Ser His
805                 810                 815
att cac tgt ccc cag ctt cct caa cca gct ctt cat cag aat tca ccc   3695
Ile His Cys Pro Gln Leu Pro Gln Pro Ala Leu His Gln Asn Ser Pro
820                 825                 830
tcg cct gta cct agt cgt acc ccc acc cct cac cat act ccc cca agc   3743
Ser Pro Val Pro Ser Arg Thr Pro Thr Pro His His Thr Pro Pro Ser
835                 840                 845
ata ggg gct cag cag cca cca gca aca aca att cca gcc cct gtt cct   3791
Ile Gly Ala Gln Gln Pro Pro Ala Thr Thr Ile Pro Ala Pro Val Pro
850                 855                 860
aca cca cca gcc atg cca cct ggg cca cag tcc cag gct cta cat ccc   3839
Thr Pro Pro Ala Met Pro Pro Gly Pro Gln Ser Gln Ala Leu His Pro
865                 870                 875                 880
cct cca agg cag aca cct aca cca cca aca aca caa ctt ccc caa caa   3887
Pro Pro Arg Gln Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Gln Leu Pro Gln Gln
885                 890                 895
gtg cag cct tca ctt cct gct gca cct tct gct gac cag ccc cag cag   3935
Val Gln Pro Ser Leu Pro Ala Ala Pro Ser Ala Asp Gln Pro Gln Gln
900                 905                 910
cag cct cgc tca cag cag agc aca gca gcg tct gtt cct acc cca aac   3983
Gln Pro Arg Ser Gln Gln Ser Thr Ala Ala Ser Val Pro Thr Pro Asn
915                 920                 925
gca ccg ctg ctt cct ccg cag cct gca act cca ctt tcc cag cca gct   4031
Ala Pro Leu Leu Pro Pro Gln Pro Ala Thr Pro Leu Ser Gln Pro Ala
930                 935                 940
gta agc att gaa gga cag gta tca aat cct cca tct act agt agc aca   4079
Val Ser Ile Glu Gly Gln Val Ser Asn Pro Pro Ser Thr Ser Ser Thr
945                 950                 955                 960
gaa gtg aat tct cag gcc att gct gag aag cag cct tcc cag gaa gtg   4127
Glu Val Asn Ser Gln Ala Ile Ala Glu Lys Gln Pro Ser Gln Glu Val
965                 970                 975
aag atg gag gcc aaa atg gaa gtg gat caa cca gaa cca gca gat acg   4175
Lys Met Glu Ala Lys Met Glu Val Asp Gln Pro Glu Pro Ala Asp Thr
980                 985                 990
cag ccg gag gat att tca gag tct aaa gtg gaa gac tgt aaa atg gaa   4223
Gln Pro Glu Asp Ile Ser Glu Ser Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Glu
995                1000                1005
tct acc gaa aca gaa gag aga agc act gag tta aaa act gaa ata aaa   4271
Ser Thr Glu Thr Glu Glu Arg Ser Thr Glu Leu Lys Thr Glu Ile Lys
1010                1015                1020
gag gag gaa gac cag cca agt act tca gct acc cag tca tct ccg gct   4319
Glu Glu Glu Asp Gln Pro Ser Thr Ser Ala Thr Gln Ser Ser Pro Ala
1025               1030                1035                1040
cca gga cag tca aag aaa aag att ttc aaa cca gaa gaa cta cga cag   4367
Pro Gly Gln Ser Lys Lys Lys Ile Phe Lys Pro Glu Glu Leu Arg Gln
1045                1050                1055
gca ctg atg cca aca ttg gag gca ctt tac cgt cag gat cca gaa tcc   4415
Ala Leu Met Pro Thr Leu Glu Ala Leu Tyr Arg Gln Asp Pro Glu Ser
1060                1065                1070
ctt ccc ttt cgt caa cct gtg gac cct cag ctt tta gga atc cct gat   4463
Leu Pro Phe Arg Gln Pro Val Asp Pro Gln Leu Leu Gly Ile Pro Asp
1075                1080                1085
tac ttt gat att gtg aag agc ccc atg gat ctt tct acc att aag agg   4511
Tyr Phe Asp Ile Val Lys Ser Pro Met Asp Leu Ser Thr Ile Lys Arg
1090                1095                1100
aag tta gac act gga cag tat cag gag ccc tgg cag tat gtc gat gat   4559
Lys Leu Asp Thr Gly Gln Tyr Gln Glu Pro Trp Gln Tyr Val Asp Asp
1105               1110                1115                1120
att tgg ctt atg ttc aat aat gcc tgg tta tat aac cgg aaa aca tca   4607
Ile Trp Leu Met Phe Asn Asn Ala Trp Leu Tyr Asn Arg Lys Thr Ser
1125                1130                1135
cgg gta tac aaa tac tgc tcc aag ctc tct gag gtc ttt gaa caa gaa   4655
Arg Val Tyr Lys Tyr Cys Ser Lys Leu Ser Glu Val Phe Glu Gln Glu
1140                1145                1150
att gac cca gtg atg caa agc ctt gga tac tgt tgt ggc aga aag ttg   4703
Ile Asp Pro Val Met Gln Ser Leu Gly Tyr Cys Cys Gly Arg Lys Leu
1155                1160                1165
gag ttc tct cca cag aca ctg tgt tgc tac ggc aaa cag ttg tgc aca   4751
Glu Phe Ser Pro Gln Thr Leu Cys Cys Tyr Gly Lys Gln Leu Cys Thr
1170                1175                1180
ata cct cgt gat gcc act tat tac agt tac cag aac agg tat cat ttc   4799
Ile Pro Arg Asp Ala Thr Tyr Tyr Ser Tyr Gln Asn Arg Tyr His Phe
1185               1190                1195                1200
tgt gag aag tgt ttc aat gag atc caa ggg gag agc gtt tct ttg ggg   4847
Cys Glu Lys Cys Phe Asn Glu Ile Gln Gly Glu Ser Val Ser Leu Gly
1205                1210                1215
gat gac cct tcc cag cct caa act aca ata aat aaa gaa caa ttt tcc   4895
Asp Asp Pro Ser Gln Pro Gln Thr Thr Ile Asn Lys Glu Gln Phe Ser
1220                1225                1230
aag aga aaa aat gac aca ctg gat cct gaa ctg ttt gtt gaa tgt aca   4943
Lys Arg Lys Asn Asp Thr Leu Asp Pro Glu Leu Phe Val Glu Cys Thr
1235                1240                1245
gag tgc gga aga aag atg cat cag atc tgt gtc ctt cac cat gag atc   4991
Glu Cys Gly Arg Lys Met His Gln Ile Cys Val Leu His His Glu Ile
1250                1255                1260
atc tgg cct gct gga ttc gtc tgt gat ggc tgt tta aag aaa agt gca   5039
Ile Trp Pro Ala Gly Phe Val Cys Asp Gly Cys Leu Lys Lys Ser Ala
1265               1270                1275                1280
cga act agg aaa gaa aat aag ttt tct gct aaa agg ttg cca tct acc   5087
Arg Thr Arg Lys Glu Asn Lys Phe Ser Ala Lys Arg Leu Pro Ser Thr
1285                1290                1295
aga ctt ggc acc ttt cta gag aat cgt gtg aat gac ttt ctg agg cga   5135
Arg Leu Gly Thr Phe Leu Glu Asn Arg Val Asn Asp Phe Leu Arg Arg
1300                1305                1310
cag aat cac cct gag tca gga gag gtc act gtt aga gta gtt cat gct   5183
Gln Asn His Pro Glu Ser Gly Glu Val Thr Val Arg Val Val His Ala
1315                1320                1325
tct gac aaa acc gtg gaa gta aaa cca ggc atg aaa gca agg ttt gtg   5231
Ser Asp Lys Thr Val Glu Val Lys Pro Gly Met Lys Ala Arg Phe Val
1330                1335                1340
gac agt gga gag atg gca gaa tcc ttt cca tac cga acc aaa gcc ctc   5279
Asp Ser Gly Glu Met Ala Glu Ser Phe Pro Tyr Arg Thr Lys Ala Leu
1345               1350                1355                1360
ttt gcc ttt gaa gaa att gat ggt gtt gac ctg tgc ttc ttt ggc atg   5327
Phe Ala Phe Glu Glu Ile Asp Gly Val Asp Leu Cys Phe Phe Gly Met
1365                1370                1375
cat gtt caa gag tat ggc tct gac tgc cct cca ccc aac cag agg aga   5375
His Val Gln Glu Tyr Gly Ser Asp Cys Pro Pro Pro Asn Gln Arg Arg
1380                1385                1390
gta tac ata tct tac ctc gat agt gtt cat ttc ttc cgt cct aaa tgc   5423
Val Tyr Ile Ser Tyr Leu Asp Ser Val His Phe Phe Arg Pro Lys Cys
1395                1400                1405
ttg agg act gca gtc tat cat gaa atc cta att gga tat tta gaa tat   5471
Leu Arg Thr Ala Val Tyr His Glu Ile Leu Ile Gly Tyr Leu Glu Tyr
1410                1415                1420
gtc aag aaa tta ggt tac aca aca ggg cat att tgg gca tgt cca cca   5519
Val Lys Lys Leu Gly Tyr Thr Thr Gly His Ile Trp Ala Cys Pro Pro
1425               1430                1435                1440
agt gag gga gat gat tat atc ttc cat tgc cat cct cct gac cag aag   5567
Ser Glu Gly Asp Asp Tyr Ile Phe His Cys His Pro Pro Asp Gln Lys
1445                1450                1455
ata ccc aag ccc aag cga ctg cag gaa tgg tac aaa aaa atg ctt gac   5615
Ile Pro Lys Pro Lys Arg Leu Gln Glu Trp Tyr Lys Lys Met Leu Asp
1460                1465                1470
aag gct gta tca gag cgt att gtc cat gac tac aag gat att ttt aaa   5663
Lys Ala Val Ser Glu Arg Ile Val His Asp Tyr Lys Asp Ile Phe Lys
1475                1480                1485
caa gct act gaa gat aga tta aca agt gca aag gaa ttg cct tat ttc   5711
Gln Ala Thr Glu Asp Arg Leu Thr Ser Ala Lys Glu Leu Pro Tyr Phe
1490                1495                1500
gag ggt gat ttc tgg ccc aat gtt ctg gaa gaa agc att aag gaa ctg   5759
Glu Gly Asp Phe Trp Pro Asn Val Leu Glu Glu Ser Ile Lys Glu Leu
1505               1510                1515                1520
gaa cag gag gaa gaa gag aga aaa cga gag gaa aac acc agc aat gaa   5807
Glu Gln Glu Glu Glu Glu Arg Lys Arg Glu Glu Asn Thr Ser Asn Glu
1525                1530                1535
agc aca gat gtg acc aag gga gac agc aaa aat gct aaa aag aag aat   5855
Ser Thr Asp Val Thr Lys Gly Asp Ser Lys Asn Ala Lys Lys Lys Asn
1540                1545                1550
aat aag aaa acc agc aaa aat aag agc agc ctg agt agg ggc aac aag   5903
Asn Lys Lys Thr Ser Lys Asn Lys Ser Ser Leu Ser Arg Gly Asn Lys
1555                1560                1565
aag aaa ccc ggg atg ccc aat gta tct aac gac ctc tca cag aaa cta   5951
Lys Lys Pro Gly Met Pro Asn Val Ser Asn Asp Leu Ser Gln Lys Leu
1570                1575                1580
tat gcc acc atg gag aag cat aaa gag gtc ttc ttt gtg atc cgc ctc   5999
Tyr Ala Thr Met Glu Lys His Lys Glu Val Phe Phe Val Ile Arg Leu
1585               1590                1595                1600
att gct ggc cct gct gcc aac tcc ctg cct ccc att gtt gat cct gat   6047
Ile Ala Gly Pro Ala Ala Asn Ser Leu Pro Pro Ile Val Asp Pro Asp
1605                1610                1615
cct ctc atc ccc tgc gat ctg atg gat ggt cgg gat gcg ttt ctc acg   6095
Pro Leu Ile Pro Cys Asp Leu Met Asp Gly Arg Asp Ala Phe Leu Thr
1620                1625                1630
ctg gca agg gac aag cac ctg gag ttc tct tca ctc cga aga gcc cag   6143
Leu Ala Arg Asp Lys His Leu Glu Phe Ser Ser Leu Arg Arg Ala Gln
1635                1640                1645
tgg tcc acc atg tgc atg ctg gtg gag ctg cac acg cag agc cag gac   6191
Trp Ser Thr Met Cys Met Leu Val Glu Leu His Thr Gln Ser Gln Asp
1650                1655                1660
cgc ttt gtc tac acc tgc aat gaa tgc aag cac cat gtg gag aca cgc   6239
Arg Phe Val Tyr Thr Cys Asn Glu Cys Lys His His Val Glu Thr Arg
1665               1670                1675                1680
tgg cac tgt act gtc tgt gag gat tat gac ttg tgt atc acc tgc tat   6287
Trp His Cys Thr Val Cys Glu Asp Tyr Asp Leu Cys Ile Thr Cys Tyr
1685                1690                1695
aac act aaa aac cat gac cac aaa atg gag aaa cta ggc ctt ggc tta   6335
Asn Thr Lys Asn His Asp His Lys Met Glu Lys Leu Gly Leu Gly Leu
1700                1705                1710
gat gat gag agc aac aac cag cag gct gca gcc acc cag agc cca ggc   6383
Asp Asp Glu Ser Asn Asn Gln Gln Ala Ala Ala Thr Gln Ser Pro Gly
1715                1720                1725
gat tct cgc cgc ctg agt atc cag cgc tgc atc cag tct ctg gtc cat   6431
Asp Ser Arg Arg Leu Ser Ile Gln Arg Cys Ile Gln Ser Leu Val His
1730                1735                1740
gct tgc cag tgt cgg aat gcc aat tgc tca ctg cca tcc tgc cag aag   6479
Ala Cys Gln Cys Arg Asn Ala Asn Cys Ser Leu Pro Ser Cys Gln Lys
1745               1750                1755                1760
atg aag cgg gtt gtg cag cat acc aag ggt tgc aaa cgg aaa acc aat   6527
Met Lys Arg Val Val Gln His Thr Lys Gly Cys Lys Arg Lys Thr Asn
1765                1770                1775
ggc ggg tgc ccc atc tgc aag cag ctc att gcc ctc tgc tgc tac cat   6575
Gly Gly Cys Pro Ile Cys Lys Gln Leu Ile Ala Leu Cys Cys Tyr His
1780                1785                1790
gcc aag cac tgc cag gag aac aaa tgc ccg gtg ccg ttc tgc cta aac   6623
Ala Lys His Cys Gln Glu Asn Lys Cys Pro Val Pro Phe Cys Leu Asn
1795                1800                1805
atc aag cag aag ctc cgg cag caa cag ctg cag cac cga cta cag cag   6671
Ile Lys Gln Lys Leu Arg Gln Gln Gln Leu Gln His Arg Leu Gln Gln
1810                1815                1820
gcc caa atg ctt cgc agg agg atg gcc agc atg cag cgg act ggt gtg   6719
Ala Gln Met Leu Arg Arg Arg Met Ala Ser Met Gln Arg Thr Gly Val
1825               1830                1835                1840
gtt ggg cag caa cag ggc ctc cct tcc ccc act cct gcc act cca acg   6767
Val Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Ser Pro Thr Pro Ala Thr Pro Thr
1845                1850                1855
aca cca act ggc caa cag cca acc acc ccg cag acg ccc cag ccc act   6815
Thr Pro Thr Gly Gln Gln Pro Thr Thr Pro Gln Thr Pro Gln Pro Thr
1860                1865                1870
tct cag cct cag cct acc cct ccc aat agc atg cca ccc tac ttg ccc   6863
Ser Gln Pro Gln Pro Thr Pro Pro Asn Ser Met Pro Pro Tyr Leu Pro
1875                1880                1885
agg act caa gct gct ggc cct gtg tcc cag ggt aag gca gca ggc cag   6911
Arg Thr Gln Ala Ala Gly Pro Val Ser Gln Gly Lys Ala Ala Gly Gln
1890                1895                1900
gtg acc cct cca acc cct cct cag act gct cag cca ccc ctt cca ggg   6959
Val Thr Pro Pro Thr Pro Pro Gln Thr Ala Gln Pro Pro Leu Pro Gly
1905               1910                1915                1920
ccc cca cct aca gca gtg gaa atg gca atg cag att cag aga gca gcg   7007
Pro Pro Pro Thr Ala Val Glu Met Ala Met Gln Ile Gln Arg Ala Ala
1925                1930                1935
gag acg cag cgc cag atg gcc cac gtg caa att ttt caa agg cca atc   7055
Glu Thr Gln Arg Gln Met Ala His Val Gln Ile Phe Gln Arg Pro Ile
1940                1945                1950
caa cac cag atg ccc ccg atg act ccc atg gcc ccc atg ggt atg aac   7103
Gln His Gln Met Pro Pro Met Thr Pro Met Ala Pro Met Gly Met Asn
1955                1960                1965
cca cct ccc atg acc aga ggt ccc agt ggg cat ttg gag cca ggg atg   7151
Pro Pro Pro Met Thr Arg Gly Pro Ser Gly His Leu Glu Pro Gly Met
1970                1975                1980
gga ccg aca ggg atg cag caa cag cca ccc tgg agc caa gga gga ttg   7199
Gly Pro Thr Gly Met Gln Gln Gln Pro Pro Trp Ser Gln Gly Gly Leu
1985               1990                1995                2000
cct cag ccc cag caa cta cag tct ggg atg cca agg cca gcc atg atg   7247
Pro Gln Pro Gln Gln Leu Gln Ser Gly Met Pro Arg Pro Ala Met Met
2005                2010                2015
tca gtg gcc cag cat ggt caa cct ttg aac atg gct cca caa cca gga   7295
Ser Val Ala Gln His Gly Gln Pro Leu Asn Met Ala Pro Gln Pro Gly
2020                2025                2030
ttg ggc cag gta ggt atc agc cca ctc aaa cca ggc act gtg tct caa   7343
Leu Gly Gln Val Gly Ile Ser Pro Leu Lys Pro Gly Thr Val Ser Gln
2035                2040                2045
caa gcc tta caa aac ctt ttg cgg act ctc agg tct ccc agc tct ccc   7391
Gln Ala Leu Gln Asn Leu Leu Arg Thr Leu Arg Ser Pro Ser Ser Pro
2050                2055                2060
ctg cag cag caa cag gtg ctt agt atc ctt cac gcc aac ccc cag ctg   7439
Leu Gln Gln Gln Gln Val Leu Ser Ile Leu His Ala Asn Pro Gln Leu
2065               2070                2075                2080
ttg gct gca ttc atc aag cag cgg gct gcc aag tat gcc aac tct aat   7487
Leu Ala Ala Phe Ile Lys Gln Arg Ala Ala Lys Tyr Ala Asn Ser Asn
2085                2090                2095
cca caa ccc atc cct ggg cag cct ggc atg ccc cag ggg cag cca ggg   7535
Pro Gln Pro Ile Pro Gly Gln Pro Gly Met Pro Gln Gly Gln Pro Gly
2100                2105                2110
cta cag cca cct acc atg cca ggt cag cag ggg gtc cac tcc aat cca   7583
Leu Gln Pro Pro Thr Met Pro Gly Gln Gln Gly Val His Ser Asn Pro
2115                2120                2125
gcc atg cag aac atg aat cca atg cag gcg ggc gtt cag agg gct ggc   7631
Ala Met Gln Asn Met Asn Pro Met Gln Ala Gly Val Gln Arg Ala Gly
2130                2135                2140
ctg ccc cag cag caa cca cag cag caa ctc cag cca ccc atg gga ggg   7679
Leu Pro Gln Gln Gln Pro Gln Gln Gln Leu Gln Pro Pro Met Gly Gly
2145               2150                2155                2160
atg agc ccc cag gct cag cag atg aac atg aac cac aac acc atg cct   7727
Met Ser Pro Gln Ala Gln Gln Met Asn Met Asn His Asn Thr Met Pro
2165                2170                2175
tca caa ttc cga gac atc ttg aga cga cag caa atg atg caa cag cag   7775
Ser Gln Phe Arg Asp Ile Leu Arg Arg Gln Gln Met Met Gln Gln Gln
2180                2185                2190
cag caa cag gga gca ggg cca gga ata ggc cct gga atg gcc aac cat   7823
Gln Gln Gln Gly Ala Gly Pro Gly Ile Gly Pro Gly Met Ala Asn His
2195                2200                2205
aac cag ttc cag caa ccc caa gga gtt ggc tac cca cca cag ccg cag   7871
Asn Gln Phe Gln Gln Pro Gln Gly Val Gly Tyr Pro Pro Gln Pro Gln
2210                2215                2220
cag cgg atg cag cat cac atg caa cag atg caa caa gga aat atg gga   7919
Gln Arg Met Gln His His Met Gln Gln Met Gln Gln Gly Asn Met Gly
2225               2230                2235                2240
cag ata ggc cag ctt ccc cag gcc ttg gga gca gag gca ggt gcc agt   7967
Gln Ile Gly Gln Leu Pro Gln Ala Leu Gly Ala Glu Ala Gly Ala Ser
2245                2250                2255
cta cag gcc tat cag cag cga ctc ctt cag caa cag atg ggg tcc cct   8015
Leu Gln Ala Tyr Gln Gln Arg Leu Leu Gln Gln Gln Met Gly Ser Pro
2260                2265                2270
gtt cag ccc aac ccc atg agc ccc cag cag cat atg ctc cca aat cag   8063
Val Gln Pro Asn Pro Met Ser Pro Gln Gln His Met Leu Pro Asn Gln
2275                2280                2285
gcc cag tcc cca cac cta caa ggc cag cag atc cct aat tct ctc tcc   8111
Ala Gln Ser Pro His Leu Gln Gly Gln Gln Ile Pro Asn Ser Leu Ser
2290                2295                2300
aat caa gtg cgc tct ccc cag cct gtc cct tct cca cgg cca cag tcc   8159
Asn Gln Val Arg Ser Pro Gln Pro Val Pro Ser Pro Arg Pro Gln Ser
2305               2310                2315                2320
cag ccc ccc cac tcc agt cct tcc cca agg atg cag cct cag cct tct   8207
Gln Pro Pro His Ser Ser Pro Ser Pro Arg Met Gln Pro Gln Pro Ser
2325                2330                2335
cca cac cac gtt tcc cca cag aca agt tcc cca cat cct gga ctg gta   8255
Pro His His Val Ser Pro Gln Thr Ser Ser Pro His Pro Gly Leu Val
2340                2345                2350
gct gcc cag gcc aac ccc atg gaa caa ggg cat ttt gcc agc ccg gac   8303
Ala Ala Gln Ala Asn Pro Met Glu Gln Gly His Phe Ala Ser Pro Asp
2355                2360                2365
cag aat tca atg ctt tct cag ctt gct agc aat cca ggc atg gca aac   8351
Gln Asn Ser Met Leu Ser Gln Leu Ala Ser Asn Pro Gly Met Ala Asn
2370                2375                2380
ctc cat ggt gca agc gcc acg gac ctg gga ctc agc acc gat aac tca   8399
Leu His Gly Ala Ser Ala Thr Asp Leu Gly Leu Ser Thr Asp Asn Ser
2385               2390                2395                2400
gac ttg aat tca aac ctc tca cag agt aca cta gac ata cac           8441
Asp Leu Asn Ser Asn Leu Ser Gln Ser Thr Leu Asp Ile His
2405                2410
tagagacacc ttgtattttg ggagcaaaaa aattattttc tcttaacaag actttttgta 8501
ctgaaaacaa tttttttgaa tctttcgtag cctaaaagac aattttcctt ggaacacata 8561
agaactgtgc agtagccgtt tgtggtttaa agcaaacatg caagatgaac ctgagggatg 8621
atagaataca aagaatatat ttttgttatg ggctggttac caccagcctt tcttcccctt 8681
tgtgtgtgtg gttcaagtgt gcactgggag gaggctgagg cctgtgaagc caaacaatat 8741
gctcctgcct tgcacctcca ataggtttta ttattttttt taaattaatg aacatatgta 8801
atattaatga acatatgtaa tattaatagt tattatttac tggtgcagat ggttgacatt 8861
tttccctatt ttcctcactt tatggaagag ttaaaacatt tctaaaccag aggacaaaag 8921
gggttaatgt tactttgaaa ttacattcta tatatatata aatatatata aatatatatt 8981
aaaataccag ttttttttct ctgggtgcaa agatgttcat tcttttaaaa aatgtttaaa 9041
aaaaa                                                             9046
<210> 2
<211> 5443
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(5443)
<400> 2
ggatcctgca aggtcacaca agggtctcca cccaccaggt gccctagtct caatttcagt 60
ttccatgcct tgttctcaca atgctggcct ccccagagct aatttggact ttgtttttat 120
ttcaaaaggg cctgaatgag gagtagatct tgtgctaccc agctctaagg gtgcccgtga 180
agccctcaga cctggagcct ttgcaacagc cctttaggtg gaagcagaat aaagcaattt 240
tccttaaagc caaaatcctg cctctagact cttcttctct gacctcggtc cctgggctct 300
agggtgggga ggtggggctt ggaagaagaa ggtggggaag tggcaaaagc cgatccctag 360
ggccctgtga agttcggagc cttccctgta cagcactggc tcatagatcc tcctccagcc 420
aaacatagca agaagtgata cctcctttgt gacttcccca ggcccagtac ctgtcaggtt 480
gaaacaggat ttagagaagc ctctgaactc acctgaactc tgaagctcat ccaccaagca 540
agcacctagg tgccactgct agttagtatc ctacgctgat aatatgcaga gctgggccac 600
agaagtcctg gggtgtagga actgaccagt gacttttcag tcggcaaagg tatgaccccc 660
tcagcagatg tagtaatgtc cccttagatc ccatcccagg caggtctcta agaggacatg 720
ggatgagaga tgtagtcatg tggcattcca aacacagcta tccacagtgt cccttgcccc 780
ttccacttag ccaggaggac agtaacctta gcctatcttt cttcctcccc atcctcccag 840
gacacacccc ctggtctgca gtattcattt cttccttcac gtcccctctg tgacttccat 900
ttgcaaggct tttgacctct gcagctgctg gaagatagag tttggcccta ggtgtggcaa 960
gccatctcaa gagaaagcag acaacagggg gaccagattt tggaaggatc aggaactaaa 1020
tcactggcgg gcctgggggt agaaaaaaga gtgagtgagt ccgctccagc taagccaagc 1080
tagtccccga gatactctgc cacagctggg ctgctcgggg tagctttagg aatgtgggtc 1140
tgaaagacaa tgggattgga agacatctct ttgagtctcc cctcaacccc acctacagac 1200
acactcgtgt gtggccagac tcctgttcaa cagccctctg tgttctgacc actgagctag 1260
gcaaccagag catgggccct gtgctgagga tgaagagttg gttaccaata gcaaaaacag 1320
caggggaggg agaacagaga acgaaataag gaaggaagaa ggaaaggcca gtcaatcaga 1380
tgcagtcaga agagatggga agccaacaca cagcttgagc agaggaaaca gaaaagggag 1440
agattctggg cataaggagg ccacagaaag aagagcccag gccccccaag tctcctcttt 1500
ataccctcat cccgtctccc aattaagccc actcttcttc ctagatcaga cctgagctgc 1560
agcgaagaga cccgtaggga ggatcacact ggatgaagga gatgtgtgga gaagtccagg 1620
gcaacctaag agccagagcc taaaagagca agagataaag gtgcttcaaa ggtggccagg 1680
ctgtgcacac agagggtcga ggactggtgg tagagcctca agataaggat gatgctcaga 1740
atgggcgggg ggggggattc tggggggggg agagagaagg tgagaaggag cctggaacag 1800
agaatctgga agcgctggaa acgataccat aaagggaaga acccaggcta cctttagatg 1860
taaatcatga aagacaggga gaagggaagc tggagagagt agaaggaccc cggggcaaga 1920
catggaagca aggacaagcc aggttgagcg ctccgtgaaa tcagcctgct gaaggcagag 1980
ccctggtatg agcaccagaa cagcagaggc tagggttaat gtcgagacag ggaacagaag 2040
gtagacacag gaacagacag agacggggga gccaggtaac aaaggaatgg tccttctcac 2100
ctgtggccag agcgtccatc tgtgtccaca tactctagaa tgttcatcag actgcagggc 2160
tggcttggga ggcagctgga aagagtatgt gagagccagg ggagacaagg gggcctagga 2220
aaggaagaag agggcaaacc aggccacaca agagggcaga gcccagaact gagttaactc 2280
cttccttgtt gcatcttcca taggaggcag tgggaactct gtgaccacca tcccccatga 2340
gcccccacta cccataccaa gtttggcctg agtggcattc taggttccct gaggacagag 2400
cctggccttt gtctcttgga cctgacccaa gctgacccaa tgttctcagt accttatcat 2460
gccctcaaga gcttgagaac caggcagtga catattaggc catgggctaa ccctggagct 2520
tgcacacagg agcctcaagt gacctccagg gacacagctg cagacaggtg gcctttatcc 2580
ccaaagagca accatttggc ataggtggct gcaaatggga atgcaaggtt gaatcaggtc 2640
ccttcaagaa tactgcatgc aagacctaag acccctggag agaggggtat gctcctgccc 2700
ccacccacca taaggggagt gaactatcct agggggctgg cgaccttggg gagacaccac 2760
attactgaga gtgctgagcc cagaaaaact gaccgccctg tgtcctgccc acctccacac 2820
tctagagcta tattgagagg tgacagtaga tagggtggga gctggtagca gggagagtgt 2880
tcctgggtgt gagggtgtag gggaaagcca gagcagggga gtctggcttt gtctcctgaa 2940
cacaatgtct acttagttat aacaggcatg acctgctaaa gacccaacat ctacgacctc 3000
tgaaaagaca gcagccctgg aggacagggg ttgtctctga gccttgggtg cttgatggtg 3060
ccacaaagga gggcatgagt gtgagtataa ggccccagga gcgttagaga agggcacttg 3120
ggaaggggtc agtctgcaga gcccctatcc atggaatctg gagcctgggg ccaactggtg 3180
taaatctctg ggcctgccag gcattcaaag cagcacctgc atcctctggc agcctgggga 3240
ggcggaaggg agcaaccccc cacttatacc ctttctccct cagccccagg attaacacct 3300
ctggccttcc cccttcccac ctcccatcag gagtggaggg ttgcagaggg agggtaaaaa 3360
cctacatgtc caaacatcat ggtgcacgat atatggatca gtatgtgtag aggcaagaaa 3420
ggaaatctgc aggcttaact gggttaatgt gtaaagtctg tgtgcatgtg tgtgtgtctg 3480
actgaaaacg ggcatggctg tgcagctgtt cagttctgtg cgtgaggtta ccagactgca 3540
ggtttgtgtg taaattgccc aaggcaaagt gggtgaatcc cttccatggt ttaaagagat 3600
tggatgatgg cctgcatctc aaggaccatg gaaaatagaa tggacactct atatgtgtct 3660
ctaagctaag gtagcaaggt ctttggagga cacctgtcta gagatgtggg caacagagac 3720
tacagacagt atctgtacag agtaaggaga gagaggaggg ggtgtagaat tctcttacta 3780
tcaaagggaa actgagtcgt gcacctgcaa agtggatgct ctccctagac atcatgactt 3840
tgtctctggg gagccagcac tgtggaactt caggtctgag agagtaggag gctcccctca 3900
gcctgaagct atgcagatag ccagggttga aagggggaag ggagagcctg ggatgggagc 3960
ttgtgtgttg gaggcagggg acagatatta agcctggaag agaaggtgac ccttacccag 4020
ttgttcaact cacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt aggggaggtg 4080
gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga ggaggaatgt 4140
gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga cctttcatgg 4200
gcaaaccttg gggccctgct gtcctcctgt cacctccaga gccaagggat caaaggagga 4260
ggagccagga caggagggaa gtgggaggga gggtcccagc agaggactcc aaatttaggc 4320
agcaggcata tgggatggga tataaagggg ctggagcact gagagctgtc agagatttct 4380
ccaacccagg taagagggag tttcgggtgg gggctcttca cccacaccag acctctcccc 4440
acctagaagg aaactgcctt tcctggaagt ggggttcagg ccggtcagag atctgacagg 4500
gtggccttcc accagcctgg gaagttctca gtggcaggag gtttccacaa gaaacactgg 4560
atgccccttc ccttacgctg tcttctccat cttcctcctg gggatgctcc tccccgtctt 4620
ggtttatctt ggctcttcgt cttcagcaag atttgccctg tgctgtccac tccatctttc 4680
tctactgtct ccgtgccttg ccttgccttc ttgcgtgtcc ttcctttcca cccatttctc 4740
acttcacctt ttctcccctt ctcatttgta ttcatccttc cttccttcct tccttccttc 4800
cttccttcct tccttccttc ctttctccct tccttccttc cttccttcct tccttccttc 4860
cttccttcct gtgtcagagt gctgagaatc acacctgggg ttcccaccct tatgtaaaca 4920
atcttccagt gagccacagc ttcagtgctg ctgggtgctc tcttaccttc ctcaccccct 4980
ggcttgtcct gttccatcct ggtcaggatc tctagattgg tctcccagcc tctgctactc 5040
ctcttcctgc ctgttcctct ctctgtccag ctgcgccact gtggtgcctc gttccagctg 5100
tggtccacat tcttcaggat tctctgaaaa gttaaccagg tgagaatgtt tcccctgtag 5160
acagcagatc acgattctcc cggaagtcag gcttccagcc ctctctttct ctgcccagct 5220
gcccggcact cttagcaaac ctcaggcacc cttaccccac atagacctct gacagagaag 5280
caggcacttt acatggagtc ctggtgggag agccataggc tacggtgtaa aagaggcagg 5340
gaagtggtgg tgtaggaaag tcaggacttc acatagaagc ctagcccaca ccagaaatga 5400
cagacagatc cctcctatct cccccataag agtttgagtc gac                   5443
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Sense Primer using in PCR of Example 1
<400> 3
tcttagcaaa cctcaggcac 20
<210> 4
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense Primer using in PCR of Example 1
<400> 4
ccaccattggttagtcccaa 20
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense Primer using in PCR of Example 2
<400> 5
gcaacaggtgcttagtatcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Antisense Primer using in PCR of Example 2
<400> 6
ctgttgcatg tgatgctgca 20
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0004864275.tif 000013
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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