(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２枚の基板の界面に少なくとも流路が形成され、該流路内に、反応領域と、該反応領域の下流側に検出領域を有するマイクロチップにおいて、反応領域の流路の幅が、検出領域の流路の幅よりも広く、且つ、検出領域の流路の深さが、反応領域の流路の深さよりも深いことを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
前記反応領域は反応に寄与する界面を有し、該界面は流路の界面の少なくとも一部であり、該反応領域の比界面積は前記検出領域の比界面積よりも増大している請求項１記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記反応領域は下面及び上面を有し、該下面及び上面の少なくとも一方が反応に寄与する界面である請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記反応に寄与する界面は、被測定物質である生物学的物質を捕捉するための、該生物学的物質に親和的結合性のある抗生物学的物質が固定された界面である請求項２記載のマイクロチップ。
【請求項５】
前記抗生物学的物質は、流路内の界面に固定された核酸に結合されている請求項４記載のマイクロチップ。
【請求項６】
前記抗生物学的物質は磁性粒子表面に固定され、該磁性粒子は、流路内又は流路外に設置された磁石の磁力により流路内の界面に固定されている請求項４記載のマイクロチップ。
【請求項７】
反応領域の流路の幅が、１μｍ以上２ｍｍ以内である請求項１、２、３、４、５又は６記載のマイクロチップ。
【請求項８】
反応領域の流路の幅が、１μｍ以上５００μｍ以内である請求項１、２、３、４、５又は６記載のマイクロチップ。
【請求項９】
検出領域の流路の深さが、１０μｍ以上２ｍｍ以内である請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載のマイクロチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応効率を大幅に上昇させることが可能で、且つ、安定性及び再現性の高い測定を実現する流路を設計したマイクロチップに関し、特に、高感度な診断用に適したマイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、μＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ  ｔｏｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ）、或いはｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐと呼ばれる化学システム・分析システムの開発が盛んに行われている。これはマイクロチップと呼ばれる数センチメートル角のガラス、シリコン或いはプラスチック基板に、断面幅が数μｍ〜数ｍｍの微細な流路を作製し、化学分析操作を集積化したマイクロチップを用いた化学システム・分析システム（以後、μＴＡＳと称すことがある。）である。該システムは、比界面積の増大に伴う化学反応の効率化、反応時間の大幅な短縮などのメリットが発揮されることが知られている。比界面積は、液量に対する固液界面積で表され、微細な流路が形成されたマイクロチップにおいては、具体的には、試料体積あたりの流路壁面の表面積で表すことができる。比界面積は、数μｍ〜数ｍｍの微細な流路を形成したマイクロチップを採用することにより増大する。
また、μＴＡＳは、マイクロチップにおける流路内の空間が狭いため、物質の拡散距離が短くてすむことから、マイクロチップにおける反応時間の大幅な短縮が可能となる。【０００３】
μＴＡＳを診断用分析システムに応用した、免疫測定システムが報告されている。μＴＡＳを用いた免疫測定システムの構築では被測定物質を流路内に捕捉するための抗体を何らかの手段で流路内に配置させる必要がある。佐藤らの報告（Analytical chemistry 2001,73,1213-1218 Sato et al.）（非特許文献１）では、マイクロチップの流路内に堰き止め構造を形成しておき、抗体を結合させたポリスチレンビーズを堰き止め構造の上流側に充填し、続いて、試料及び標識抗体を順次送液することにより、該ビーズ表面において抗原抗体複合体を形成させ、続いて、熱レンズ顕微鏡により抗原抗体複合体中の標識物質を検出することが報告されている。非特許文献１の免疫測定システムは、通常マイクロタイタープレート等を用いて行う免疫測定系を、マイクロチップ上の微小空間に集積化することにより構築したものであり、従来のマイクロタイタープレートを用いたシステムに比較して、反応時間の大幅な短縮、検出感度の上昇が実現されたことが、非特許文献１に報告されている。【０００４】
非特許文献１の、流路を形成し、流路内にポリスチレンビーズを堰き止めたマイクロチップを用いた免疫測定法において、感度を高めるためには流路内に高密度にビーズを充填して反応表面積を大きくする必要があるので、送液の際の圧力が高くなり正確な流速の維持、及び、ビーズ間の隙間での均一な送液の維持が困難であるという問題がある。【０００５】
Lab on a chip 2002,2,27-30（非特許文献２）に、磁性粒子表面に抗体を固定化し、これを送液によりマイクロ流路内に設置した磁石上に移動させて該磁性粒子を固定化し、試料及び標識抗体を順次送液することにより磁性粒子表面で免疫複合体を形成させて電気化学的な検出を行う測定系が報告されている。非特許文献２の方法は、汎用されている従来法であるマイクロタイタープレート法と比べ反応時間は短縮されるものの、検出感度の上昇は認められないという不都合がある。その原因は、恐らく、抗原抗体複合体が形成されている磁性粒子表面と測定用の電気化学センサーとの距離が遠いため、センサーに到達する電気化学的信号が微弱であるからと考えられる。これを改善するために流路の深さを浅くすることも考えられるが、現状の技術では限界がある。【０００６】
Biosensors and Bioelectronics 19(2004)1193-1202 （非特許文献３）に、多項目同時測定システムとしてMicromosaic immunoassay が報告されている。非特許文献３は、抗体を基板に直接固定化し、そこに試料及び蛍光標識抗体を順次送液することにより、基板上で免疫複合体を形成させ、蛍光顕微鏡により標識物質を検出している。非特許文献３の方法は免疫学的分析に一般的に用いられているラテックス比濁法に比較して優位性は認められていない。また、上記非特許文献３のマイクロチップは、固定化基板と流路基板を粘着性のあるポリジメチルシロキサンを用いて形成しているため、熱融着等の必要は無いが、基板の材質がゴム状で形態保持性が不安定なために、厳密な検出精度が要求されるマイクロチップとしての製品化には不向きである。【０００７】
【非特許文献１】Analytical chemistry 2001,73,1213-1218 Sato et al.
【非特許文献２】Lab on a chip 2002,2,27-30
【非特許文献３】Biosensors and Bioelectronics 19(2004)1193-1202
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
μＴＡＳにおいてはその反応の場の微小性から、反応により得られたシグナルを検出する際の検出技術において制限を受ける。例えば、高感度で安定した検出を目指したμＴＡＳにおいては、反応領域で得られたシグナルの増幅を行い、増幅されたシグナルを反応領域とは異なる検出領域に送り込んで検出する方法をとる場合がある。このような場合に単純に流路全体の体積を縮小することにより反応効率が増大されたマイクロチップを使用すると、当然に検出領域も縮小されるため、光路長が短くなり、検出する際の再現性を確保することが困難となる。【０００９】
μＴＡＳにおける検出する際の再現性を確保することが困難であることについて、免疫測定システムを例にして、次にさらに具体的に説明する。抗体の標識物質としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素を用いた場合（ＥＬＩＳＡ法）、最終的に標識物質を測定するのに酵素基質を送液して、酵素反応により変化した基質を反応領域より下流の検出領域で検出することが可能となる。このときの基質としては発色基質、蛍光基質、化学発光基質等が使用されるが、これらの酵素反応基質を検出する検出領域は、マイクロ流体システムにおいては、ある程度大きい方が検出感度の上昇や検出シグナルの安定性が期待できる。
例えば、蛍光基質や化学発光基質を用いて検出する場合には、検出領域において、酵素反応により生成した基質代謝物質の絶対量が多い程検出感度は上昇する。【００１０】
また、発色基質を熱レンズ顕微鏡を用い励起光の焦点を流路内で絞り込んで検出する場合には、光路長が長いほうがシグナルの検出の高い再現性が得られる。しかし、光路長が一定以下になるとシグナルが小さくなり、シグナルの検出の再現性が得られない。即ち、熱レンズ顕微鏡では機械的な振動、測定位置合わせ精度の不備、マイクロチップの作製精度誤差等の諸要因に起因する誤差が存在し、それらにより流路内における焦点の相対的な位置が変化することは避けられない。誤差が光路長よりも大きい場合は、例えば、光路長が余りにも短いために誤差が光路長よりも大きくなる場合には、熱レンズ顕微鏡の励起光の焦点が流路の外に位置してしまうこともあり、このような場合には、測定ができない状態になってしまうこともある。これに対して流路内の光路長が長ければ焦点距離が多少ずれても流路内での焦点の相対的な位置はほとんど変化しないために安定した再現性が得られる。なお、励起光が流路の上部（平板状マイクロチップの平板面）側から照射される場合は、照射される方向からの流路の深さが光路長にあたり、流路の側面（平板状マイクロチップの側面）側から照射される場合は流路の幅が光路長となる。【００１１】
しかしながら、このような微小空間を測定できる検出技術は未だ発展途上であり、研究開発レベルの実験で測定が可能であっても、臨床検査、環境検査、食品検査等に代表される測定装置に求められる、検出感度、検出シグナルの安定性及び再現性を確保することが難しい。【００１２】
本発明の目的は、マイクロ流体システムによる診断装置に利用されるマイクロチップにおいて、反応効率を大幅に上昇させることが可能で、且つ、安定性及び再現性の高い測定を実現する流路を有するマイクロチップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記した目的を達成するための本発明のマイクロチップは、２枚の基板の界面に少なくとも流路が形成され、該流路内に、反応領域と、該反応領域の下流側に検出領域を有するマイクロチップにおいて、反応領域の流路の幅が、検出領域の流路の幅よりも広く、且つ、検出領域の流路の深さが、反応領域の流路の深さよりも深いことを特徴とする。
【００１５】
本発明において「流路の深さ」とは、検出方向と同一方向の流路内の長さをいう。例えば平板状のマイクロチップにおいて、平板面に垂直に検出する場合には、流路の深さは平板面に垂直の検出方向の流路の内寸である。また、側面から検出する場合には、流路の深さは、側面に垂直の検出方向の流路の内寸である。【００１６】
本発明において「流路の幅」とは、検出方向に対して垂直方向のマイクロチップ内の流路の内寸をいう。【００１７】
本発明において「検出方向」とは、熱レンズ顕微鏡による検出や蛍光法による検出の場合は流路内へ励起光が入射する方向のことをいい、吸光法による検出の場合は測定物質が吸収をもつ光が入射する方向のことをいい、発光法による検出の場合は、発光した光を検出する検出器に検出される光が入射する方向をいう。【００１８】
本発明において「反応領域」は、反応が寄与する界面を有し、該界面は流路の界面の少なくとも一部、即ち、一部又は全部である。反応領域には、例えば、被測定物質である生物学的物質を捕捉するための、該生物学的物質に親和的結合性のある抗生物学的物質が流路内の界面に固定されたものを好ましく用いることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のマイクロチップは、反応領域の流路の幅が、検出領域の流路の幅よりも広く、且つ反応領域の流路の深さが、検出領域の流路の深さよりも浅いので、反応領域の流路における比界面積が増大し、反応領域における反応効率が上昇し、高感度となり、検出領域の流路の深さが反応領域における深さよりも相対的に深くなるので、検出の安定性、再現性が高いマイクロチップとなる。
【００２１】
本発明のマイクロチップは、反応領域の流路の界面において、比測定物質である生物学的物質を捕捉するための、該生物学的物質に親和的結合性のある抗生物学的物質が固定されているので、前記効果に加えて、生物学的物質の分析が行え、診断用マイクロチップとしての利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、対照としての標準型流路を示し、反応領域及び、反応領域の前後の領域が、共に同じ形状（幅０．３ｍｍ、深さ０．１ｍｍ）であり、図１ａは流路の上面図、図１ｂは流路の断面図である。
【図２】図２は、本発明にかかる流路の１形態を示し、図２ａは流路の上面図、図２ｂは断面図である。
【図３】図３は、本発明のマイクロチップにおける流路の別の形態を示し、図３ａは流路の上面図、図３ｂは流路の断面図である。
【図４】図４は、本発明のマイクロチップにおける流路のさらに別の形態を示し、図４ａは流路の上面図、図４ｂは流路の断面図である。
【図５】流路の深さが０．１ｍｍの時の励起光の各焦点位置での熱レンズ顕微鏡による信号強度を、縦軸に熱レンズ信号をとり、横軸に励起光焦点の流路上面からの距離をとったグラフである。
【図６】流路の深さが０．０２ｍｍの時の励起光の各焦点位置での熱レンズ顕微鏡による信号強度を、縦軸に熱レンズ信号をとり、横軸に励起光焦点の流路上面からの距離をとったグラフである。
【図７】実施例２において、ＳＡＴＢｌｕｅ（商品名、同仁化学研究所製）を送液しながら、反応領域の下流の検出領域で、励起光が６３３ｎｍ、プローブ光が４８８ｎｍの波長に設定し、熱レンズ顕微鏡により流路の深さ方向のシグナルを検出し、得られた結果を、縦軸に熱レンズ信号強度、横軸に相補配列ビオチン標識オリゴヌクレオチドの濃度をとったグラフである。
【図８】実施例３において、ＳＡＴＢｌｕｅ（商品名、同仁化学研究所製）を送液しながら、反応領域の下流の検出領域で、励起光が６３３ｎｍ、プローブ光が４８８ｎｍの波長に設定し、熱レンズ顕微鏡により流路の深さ方向のシグナルを検出し、得られた結果を、縦軸に熱レンズ信号強度、横軸にＨＢｓＡｇの濃度をとったグラフである。
【図９】比較例１において、ＳＡＴＢｌｕｅ（商品名、同仁化学研究所製）の発色を６６０ｎｍの吸収により測定し、得られた結果を、縦軸に吸光度、横軸にＨＢｓＡｇの濃度をとったグラフである。
【符号の説明】
【００２３】
１、１１、２１、３１    送液口
２、１２、２２、３２    流路
３、１３、２３、３３    排液口
４、１４、２４、３４    反応領域
５、１５、２５、３５    検出領域
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明のマイクロチップによれば、流路における反応領域の比界面積が流路における検出領域よりも増大している。即ち、反応領域の体積が流路における検出領域よりも縮小しているので、反応領域においては、物質の界面への拡散効率が上昇することにより反応効率が増大する。【００２５】
本発明のマイクロチップにおける反応領域は、反応が寄与する界面を有し、該界面は、流路の界面の少なくとも一部、即ち、一部又は全部である。【００２６】
本発明のマイクロチップの流路の断面形状は、三角形、正方形、長方形、台形、平行四辺形、その他の四角形、５個以上の頂点を持つ多角形、円形・楕円形など界面の全部が曲面である形状、半月形のように界面のうち一面以上が平面でその他の部分が曲面である形状などが挙げられる。【００２７】
流路内の界面における反応性について言えば、前記したように、流路の体積を小さくするに従い、比界面積が増大し、物質の界面への拡散効率が上昇することにより反応効率が増大する。例えば、長方形の断面を持つ流路で、流路上面から流路下面に向かって検出する場合を考えてみると、流路の下面又は上面、或いはその両方が反応に寄与する界面となっている場合には流路の深さを浅くすることで反応面の比界面積が増大するので反応性は増大する。また、流路の側面の一方もしくは両方が反応面となっている場合には流路の幅を縮めることにより反応面の比界面積が増大するので反応性は増大する。また、流路界面の全面が反応面である場合は、流路の幅及び深さの一方又は両方を縮小することにより比界面積が増大するので反応性が増大する。従って、反応領域の体積は、安定に送液できる程度に小さくすることが好ましい。【００２８】
この例において、「流路の下面」とは、平板上のマイクロチップを水平に載置したときの流路内の底面をいう。【００２９】
この例において、「流路の上面」とは、平板上のマイクロチップを水平に載置したときの流路内の天井面をいう。【００３０】
この例において、「流路の側面」とは、流路内面のうち平板上のマイクロチップの側面と平行な側面をいう。【００３１】
本発明において「比界面積」とは、流路の体積に対する流路壁面の表面積の割合のことをいう。例えば、幅０．１ｍｍ、深さ０．２ｍｍ、長さ０．５ｍｍの断面が長方形の場合、比界面積は、
（流路壁面の表面積）÷ (流路の体積）＝｛（０．１ｍｍ×０．５ｍｍ×２面）＋（０．２ｍｍ×０．５ｍｍ×２面）｝÷（０．１ｍｍ×０．２ｍｍ×０．５ｍｍ）＝３０  となり比界面積は３０と算出される。【００３２】
さらに、上記流路の底面（幅０．１ｍｍ、長さ０．５ｍｍ）の比界面積は、
（流路底面の表面積）÷ (流路の体積）＝（０．１ｍｍ×０．５ｍｍ) ÷（０．１ｍｍ×０．２ｍｍ×０．５ｍｍ）＝５  となり、流路底面の比界面積は５と算出される。【００３３】
そして、上記流路の深さを０．２ｍｍから０．１ｍｍに縮小したときの流路底面の比界
面積を算出すると
（流路底面の比界面積）÷（流路の体積）＝（０．１ｍｍ×０．５ｍｍ）÷（０．１ｍｍ×０．１ｍｍ×０．５ｍｍ）＝１０  となり、上記のように流路の深さを縮小した場合に流路底面の比界面積が２倍になることが分かる。【００３４】
本発明において「線流速」とは、単位時間あたりに液体が進む距離のことをいい、単位時間あたりに送液される液体の量を表す流速とは異なる概念である。例えば、幅０．１ｍｍ、深さ０．２ｍｍ、の断面が長方形の筒型の流路Ａと、幅０．１ｍｍ、深さ０．１ｍｍの断面が正方形の筒型の流路Ｂを比較した場合、同じ流速で液体を送液すると、流路Ｂにおける一定時間に流路内を液体が進む距離は、流路Ａにおけるそれに比べ２倍になる。これは、流路Ａの深さが流路Ｂの深さの２倍であることにより、流路Ａは流路Ｂの２倍の体積をもつことになるためである。つまり、流速が一定であっても、流路Ｂの線流速は流路Ａの線流速の２倍になる。【００３５】
図２ａ、図２ｂは、本発明のマイクロチップにおける流路の１形態を示す。図２ａは流路の上面図、図２ｂは流路の断面図である。流路１２の途中において、測定すべき生体物質を捕捉するための抗生体物質が固定された反応領域１４が形成されている。流路１２の一方の末端には試薬や検体試料を供給するための送液口１１、他方の末端には、流路１２内の液体を排出するための排液口１３が設けられている。前記反応領域１４の下流の流路１２において、検出領域１５が設けられている。検出領域１５は、蛍光法、化学発光法、熱レンズ分光法等の光学的な分析手段を利用して流路１２におけるシグナルを測定するための領域である。反応領域１４の流路の幅Ｗ1 は、反応領域１４の前後の領域の幅Ｗ2 、Ｗ3 よりも広く、反応領域１４の流路の深さＨ1 は、反応領域１４の前後の領域の深さＨ2 、Ｈ3 よりも浅い。【００３６】
図３ａ、図３ｂは、本発明のマイクロチップにおける流路の別の形態を示す。図３ａは流路の上面図、図３ｂは流路の断面図である。流路２２の途中において、測定すべき生体物質を捕捉するための抗生体物質が固定された反応領域２４が形成されている。流路２２の一方の末端には試薬や検体試料を供給するための送液口２１、他方の末端には、流路２２内の液体を排出するための排液口２３が設けられている。前記反応領域２４の下流の流路２２において、検出領域２５が設けられている。検出領域２５は、蛍光法、化学発光法、熱レンズ分光法等の光学的な分析手段を利用して流路２２におけるシグナルを測定するための領域である。反応領域２４の流路の幅Ｗ4 は、検出領域２５の幅Ｗ6 よりも広く、反応領域２４の上流の流路の幅Ｗ5 と同じであり、反応領域２４の流路の深さＨ4 は、反応領域２４の下流の領域の深さＨ6 よりも浅く、反応領域２４の上流の流路の深さＨ5 と同じである。
【００３７】
図４ａ、図４ｂは、本発明のマイクロチップにおける流路のさらに別の形態を示す。図４ａは流路の上面図、図４ｂは流路の断面図である。流路３２の途中において、測定すべき生体物質を捕捉するための抗生体物質が固定された反応領域３４が形成されている。流路３２の一方の末端には試薬や検体試料を供給するための送液口３１、他方の末端には、流路３２内の液体を排出するための排液口３３が設けられている。前記反応領域３４の下流の流路３２において、検出領域３５が設けられている。検出領域３５は、蛍光法、化学発光法、熱レンズ分光法等の光学的な分析手段を利用して流路におけるシグナルを測定するための領域である。反応領域３４の流路の幅Ｗ7 は、反応領域３４の前後の領域の幅Ｗ8 、Ｗ9 よりも広く、反応領域３４の深さＨ7 が反応領域３４の前後の領域の深さＨ8 、Ｈ9 よりも小さい。反応領域３４の上流の流路３２は、幅Ｗ8 が漸次増大しており、且つ、深さＨ8 が漸次減少している。このような流路３２の形状を漸次変化させることにより、流路３２における線流速を一定にコントロールしたり、線流速を漸増、漸減したりコントロールすることができる。【００３８】
マイクロチップへの試料液或いは薬液の送液において、目的とする流速を反応領域の流速に合わせると、反応領域を通過した後の溶液の流速が遅くなり、検出領域に到達するまでの時間が長くなり迅速な測定の障害となってしまうことがある。或いは逆の場合には、反応領域を溶液が瞬時に通過することになるために、増幅効率が低下し、シグナル増幅という目的の達成が困難となることがある。これらの不都合の解決策として、反応領域の流路の深さを縮小した場合には流路の幅を広げ、反応領域の流路の幅を縮小したときには流路の深さを増大させることにより、反応領域における反応面の比界面積を大きくしつつ流路全体の線流速を一定にコントロールする流路設計を行うことが好ましい。【００３９】
さらに、意図的に反応領域の線流速を早くし、或いは遅くする流路の設計も当然に可能である。例えば、反応領域の流路の深さを２分の１にしたときに線流速を一定に保つためには、流路の幅を２倍にする必要があるが、流路の幅を４倍にすれば、反応領域の線流速が２分の１となる。このような設計にすると測定時間は長くなるが、増幅効率を２倍に上げることができる。このように、目的に応じて反応領域での線流速をコントロールすることも可能である。【００４０】
本発明のマイクロチップにおいて反応領域の流路の幅が、１μｍ以上２ｍｍ以内が好ましく、さらに好ましくは１μｍ以上５００μｍ以内である。流路の幅が１μｍ未満だと溶液の表面張力に起因する抵抗が増大し、溶液を流路に送液する際に非常に高い圧力が必要となり安定した送液が困難である。また、流路の幅が２ｍｍを超えると溶液の流れが乱れ、流路内への均一な送液が困難である。
【００４１】
本発明のマイクロチップにおいて反応領域の流路の深さは、１μｍ以上２ｍｍ以内が好ましく、さらに好ましくは１μｍ以上５００μｍ以内である。流路の深さが１μｍ未満だと溶液の表面張力に起因する抵抗が増大し、溶液を流路に送液する際に非常に高い圧力が必要となり安定した送液が困難である。また、流路の深さが２ｍｍを超えると溶液の流れが乱れ、流路内への均一な送液が困難である。
【００４２】
本発明のマイクロチップにおいて、検出領域の流路の深さが、１０μｍ以上２ｍｍ以内であることが好ましい。流路の深さが１０μｍ未満だとマイクロチップにおいて測定することが困難と、流路の深さが２ｍｍを超えると溶液の流れが乱れ、流路内への送液が困難である。【００４３】
本発明のマイクロチップを製造するための２つの基板の材質としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：略語、Anal.Chem.,Vol.69,pp.3451-3457,1997 ）、アクリル系樹脂(Anal.Chem.,Vol.69,pp.2626,1997)、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ：略語、Anal.Chem.,Vol.69,pp.4783,1997）、ガラス、環状オレフィンポリマー、あるいは、これらの部材の表面にダイアモンドもしくはダイアモンドライクカーボン（特開２００２−３６５２９３号公報）、cetyltrimethylammonium bromide(CTAB)、Surmodics 、Reacti-Bind （Analytical Biochemistry, 317 (2003) 76-84 ）、ポリ−Ｌ−リジン、カルボジイミド、アミノ基、アルデヒド基、マレイミド基、デキストランなどで表面が修飾された物質等を用いてもよい。基板は透明であっても、不透明であってもよいが、不透明な場合には少なくとも検出部は透明であることが望ましい。また、該基板は、親水処理又は疎水処理が施されていてもよい。【００４４】
本発明のマイクロチップは、例えば、次の方法により製造することができる。まず鋳型をシリコンウエハーのエッチングにより作成しておく。これに融解したポリマーを流し込んで構造を転写し、ポリマーを固化させる。転写により、流路となる溝が形成された一方の基板が形成される。他方の平板状の基板と接合すれば、マイクロチップが製造される。
２枚の基板の接合は一般的には加熱により行われる。ＰＤＭＳを素材とすればガラスやＰＤＭＳとの自然吸着により簡単に流路のシーリングが行える。プラスチックを用いたマイクロチップは量産化が容易なので、コストの点で有利である。またガラスの場合は、フッ化水素の反応時間によって深さを調整しなければならないが、プラスチック製の場合は、一度鋳型を作製してしまえば射出成型の技術により再現性高く生産することが可能となる。２枚の基板の接合には、一般的に接着剤を用いた接合、熱融着による接合を行ってもよい。接着剤には、例えば、紫外線等の電離放射線硬化型接着剤、熱硬化型接着剤、アクリル系接着剤、エポキシ系接着剤等の有機系接着剤、あるいは無機系接着剤が挙げられる。【００４５】
本発明のマイクロチップによる検出対象物は、生物学的物質が好適である。生物学的物質としては、抗原、抗体、糖鎖、糖タンパク質、レクチン、受容体、リガンド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他、生体中の物質と特異的に結合することができる物質、その物質の分子量に依存しないものが挙げられる。これらの分析対象物を分析するための試料には、血液、血漿、血清、尿、唾液、その他体液や、ＤＮＡ、ＲＮＡ、染色体や、ＤＮＡ、ＲＮＡを増幅させたもの、抗原、抗体、糖鎖、受容体、リガンドを含む物体が試料となりうる。【００４６】
本発明のマイクロチップの反応領域の反応が寄与する界面に固定される抗生物学的物質としては、抗原に対する抗体、抗体に対する抗原、ビオチンに対するアビジン、アビジンに対するビオチン、ＤＮＡに対するＤＮＡ、ＲＮＡにたいするＤＮＡ、受容体に対するリガンド、リガンドに対する受容体などが挙げられる。【００４７】
抗生物学的物質を反応領域の界面に固定化する方法として、界面に直接抗生物学的物質を結合させる方法と、結合子を介して間接的に固定化する方法が考えられる。抗生物学的物質を反応領域の界面に直接固定化する方法としては、イオン結合や、水素結合、疎水結合、或いは、化学修飾された界面に共有結合で固定化する方法が挙げられる。【００４８】
抗生物学的物質を反応領域の界面に固定化するための結合子には、熱や有機溶媒に安定な性質を持つデオキシリボ核酸等の核酸が挙げられる。核酸を結合子として反応領域の界面に予め固定化しておき、該核酸を固定化した固定化基板と、流路となるべき溝部を形成した流路基板を加熱して張り合わせた後に、固定化基板に固定された核酸と相補的な配列を持つ核酸を抗生物学的物質に結合させたものを、流路に送液することにより、抗生物学的物質を反応領域の界面に固定化することができる。上記のプロセスを経たマイクロチップは、比較的熱に強い核酸のみが加熱を受けるだけであり、抗生物学的物質に対する加熱が回避できるので、熱に弱い抗生物学的物質、例えば、タンパク質等は変性を回避でき、活性を保持できる。また、検出したい生物学的物質が核酸である場合には、該核酸と相補的な配列を持つ核酸を反応領域の界面に固定しておけばよい。【００４９】
抗生物学的物質を反応領域の界面に固定化するための結合子の他の例には、前記核酸以外に、磁性粒子を用いることができる。この場合、予め反応領域の流路内又は流路外に磁石を配置しておき、マイクロチップの流路に磁性粒子表面に固定された生物学的物質を含んだ液を送液することにより、抗生物学的物質を反応領域の界面に固定化することができる。【００５０】
本発明のマイクロチップは反応領域の流路における少なくとも１つの界面自体が反応性を有するように設計されている。このように設計されてなる本発明のマイクロチップは、従来の流路内にポリスチレンビーズを堰き止めたマイクロチップにおける、送液に障害となるようなポリスチレンビーズを使用していないので、マイクロチップの流路における流速及び送液の均一性を損なうことがない。【００５１】
本発明における検出領域における検出手段としては蛍光法、化学発光法、熱レンズ分光法、吸光法が挙げられる。本発明のマイクロチップは、検出領域の流路の深さが、反応領域の流路の深さよりも深いので、検出の安定性、再現性が高い。本発明のマイクロチップは、検出領域の流路の深さが深いことにより、例えば、熱レンズ顕微鏡による測定では、励起光の焦点を流路内に合わせることが容易であると同時に、励起光の焦点位置が流路内の深さ方向に関して、光路中心付近では数十μｍずれても信号強度がほとんど変化しないので、検出の安定性、再現性が高い。【００５２】
また、例えば、蛍光法による測定では、励起光の焦点を絞って流路内に照射する場合には、焦点を流路内に合わせることが容易であり検出の安定性、再現性が高くなり、励起光の焦点を絞らずに照射する場合であれば、励起される蛍光物質の絶対量が増加するため検出感度が高くなる。
また、例えば、化学発光法による測定では、発光物質の絶対量が増加するため検出感度が高くなる。【００５３】
上記の各光学的測定法では、検出領域の流路の深さが、検出のための光を流路の長さ方向に対して垂直に透過したとき、光路長と同じ長さとなる。即ち、本発明において「光路長」とは、流路を横断して通過する光の、流路内の長さをいう。
【実施例１】
【００５４】
マイクロチップの調製
（１）ＤＮＡの固定化
５’末端にアミノ基を導入した５’−ＴＴＧＣＴＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＴＡＴ−３’なる配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上にジーンスライドの商品説明書にしたがって、反応領域となるべき位置に流路方向に沿って該オリゴヌクレオチドを固定化した。【００５５】
（２）流路の作製及びマイクロチップの調製
厚さ１ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の平板に、下記１）に示す対照の標準型流路及び２）に示す本発明の流路とするための溝を形成させて、溝を形成した２種類の平板を得た。溝の作製は、Electrophoresis.2000 Jan;21(1):27-40Mcdonald JC et al.に記載の方法に従った。【００５６】
得られた溝を形成した２種類の平板を、上記工程（１）で得たオリゴヌクレオチド固定化スライドグラスと流路が設置されるように圧着するように貼り合わせることにより接合して、対照及び本実施例１の各マイクロチップを作製した。【００５７】
１）対照の標準型流路
図１ａ、図１ｂは、対照としての標準型流路を示し、ＤＮＡ固定領域（反応領域４）及び、ＤＮＡ固定領域（反応領域４）の前後の領域が、共に同じ形状の標準型流路である。図１ａは流路２の上面図、図１ｂは流路の断面図を示し、幅０．３ｍｍ、深さ０．１ｍｍの流路２が形成されている。流路の一方の末端には試薬や検体試料を供給するための送液口１、他方の末端には、流路２内の液体を排出するための排液口３が設けられている。流路２の中間領域が測定すべき生物学的物質を捕捉するためのオリゴヌクレオチドを固定した反応領域４である。該反応領域４の下流側に、捕捉した生物額的物質を検出するための検出領域５が設けられている。【００５８】
２）本発明にかかる流路の１形態
本実施例１で使用する、流路を有するマイクロチップは、前記に説明した図２ａ、図２ｂの形状の流路を有するものを使用する。本実施例１にかかる流路は、流路１２の中間領域がＤＮＡを固定した反応領域１４であり、その寸法は、幅１．５ｍｍ、深さ０．０２ｍｍである。該反応領域１４の前後の領域における流路１２は、幅０．３ｍｍ、深さ０．１ｍｍである。【００５９】
十分な光路長を有する検出領域でのシグナルの安定性の確認
前記工程で得られた流路（反応領域の幅１．５ｍｍ、深さ０．０２ｍｍ、検出領域の幅０．３ｍｍ、深さ０．１ｍｍ）が形成されたマイクロチップを、反応領域において励起光の光路が流路上面から底面に向かうように、光路に配置した。一方、本実施例１の流路の検出領域においても同様に励起光の光路が流路上面から流路底面に向かうように、マイクロチップを光路に配置した。反応領域については励起光の焦点位置を流路上面から流路底面にかけて５μｍピッチで移動させていき、検出領域については励起光の焦点位置を流路上面から流路底面にかけて１０μｍピッチで移動させていき、それぞれの焦点位置での信号強度（シグナル強度）を熱レンズ顕微鏡により測定した。各流路には、水で１０-4Ｍに調製したサンセットイエロー（商品名、和光純薬（株）製）を満たして熱レンズ顕微鏡により測定した。使用した熱レンズ顕微鏡は励起光波長がサンセットイエロー（商品名、和光純薬（株）製）が吸収をもつ波長である５３２ｎｍ、プローブ光の波長がサンセットイエロー（商品名、和光純薬（株）製）の吸収が低い６３３ｎｍのものを使用した。【００６０】
得られた測定結果を、縦軸に熱レンズの信号強度（シグナル強度）をとり、横軸に励起光焦点の流路上面からの距離をとった図５（検出領域、流路深０．１ｍｍ）及び図６（反応領域、流路深０．０２ｍｍ）のグラフに示す。図５及び図６のグラフによれば、流路の深さが０．１ｍｍの検出部位では、流路の深さが０．０２ｍｍの反応部位に比べて流路内における光路中心付近では数十μｍ集点の位置がずれても信号強度がほとんど変化しないことがわかる。これは流路内に十分な光路長がある検出領域では流路上面及び、流路下面の近傍を除いた光路長における任意の位置を励起光焦点とすれば、機器の振動、測定地点の位置決め精度の不備、マイクロチップの平面性の誤差などによる焦点位置のわずかな変化には影響を受けずに再現性よくシグナルが得られることを示している。
【実施例２】
【００６１】
流路設計の違いによる検出感度の比較−核酸の検出
標準型流路を持つマイクロチップ（反応領域の流路深０．１ｍｍ、検出領域の流路深０．１ｍｍ）と本発明にかかる流路を持つマイクロチップ（反応領域の流路深０．０２ｍｍ、検出領域の流路深０．１ｍｍ）を用いた標的核酸の検出感度の比較を次のようにして行った。【００６２】
標的核酸として、５’末端をビオチン修飾した固定化オリゴヌクレオチドと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドを用い、マイクロ流体システムにより標的核酸の検出を次のようにして行った．即ち、マイクロチップの流路内を１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Atlas Powder社の商品名）を含むＰＢＳ（−）（以下、「洗浄用バッファー」と呼ぶ）で２倍希釈したブロックエース（商品名、雪印乳業社製）で満たし、室温（以後の反応はすべて室温で反応）で１時間インキュベーションすることにより、流路内壁をブロッキングした。続いて、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Atlas Powder社の商品名）を含むＰＢＳ（−）（以下、「反応用バッファー」と呼ぶ）で０、０．２、１、５ｎＭの濃度になるように調製した標的核酸をそれぞれ異なる流路に５分間送液後、洗浄用バッファーを２分間送液して洗浄した。続いて反応用バッファーで１００００倍に希釈したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ストレプトアビジン（ＳＡ）を５分間送液し、洗浄用バッファーを２分間送液した。標的核酸の検出は、ＳＡＴＢｌｕｅ（商品名、同仁化学研究所製）を基質としたＰＯＤ活性を熱レンズ顕微鏡（ＴＬＭ）で検出することにより評価した。即ち、ＳＡＴＢｌｕｅ（商品名、同仁化学研究所製）を送液しながら、反応領域より下流側に位置する検出領域で、励起光が６３３ｎｍ、プローブ光が４８８ｎｍの波長に設定し、ＴＬＭにより流路の深さ方向のシグナルを検出した。得ら
れた結果を、下記の表１、及び縦軸に熱レンズ信号強度、横軸に相補配列ビオチン標識オリゴヌクレオチドの濃度をとったグラフを図７に示す。【００６３】
【表１】
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【００６４】
表１及び図７によれば、反応領域の深さが０．０２ｍｍと浅い本発明のマイクロチップの方が、対照としての反応領域の深さが０．１ｍｍと深い標準型流路のマイクロチップに比べて、検出感度が高く、飛躍的な検出感度の上昇が認められることがわかる。
【実施例３】
【００６５】
流路設計の違いによる検出感度の比較−タンパク質の検出
標準型流路を持つマイクロチップ（反応領域の流路深０．１ｍｍ、検出領域の流路深０．１ｍｍ）と本発明にかかる流路を持つマイクロチップ（反応領域の流路深０．０２ｍｍ、検出領域の流路深０．１ｍｍ）を用いた標的タンパク質の検出感度の比較を次のようにして行った。【００６６】
標的タンパク質として、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ、明治乳業株式会社製）の検出を行った。即ち、マイクロチップの流路内を、洗浄バッファーで２倍希釈したブロックエース（商品名、雪印乳業社製）で満たし、室温（以後の反応はすべて室温で反応）で１時間インキュベーションすることにより、流路内壁をブロッキングした。続いて、反応用バッファーで５０μｇ／ｍＬの濃度になるように調製した、固定化オリゴヌクレオチドと相補的な配列のオリゴヌクレオチドを結合させた抗ＨＢｓＡｇモノクロナール抗体（調製はＯｋｕらの方法（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１Ｄｅｃ  １；２５８（１−２）：７３−８４．）で行った）を流路に１５分間送液後、洗浄用バッファーを５分間送液して洗浄した。続いて、反応用バッファーで０，０．１，０．２ｎｇ／ｍＬの濃度に調製したＨＢｓＡｇをそれぞれ異なる流路に１５分間送液後、洗浄用バッファーを５分間送液して洗浄した。続いて、反応用バッファーで１μｇ／ｍＬの濃度に調製したビオチン標識抗ＨＢｓＡｇ抗体（上記のオリゴヌクレオチド結合抗体とはＨＢｓＡｇとの結合部位が異なる）を１５分間送液し、洗浄用バッファーを５分間送液して洗浄した。１００００倍に希釈したＰＯＤ標識ストレプトアビジンＳＡを１５分間送液し、洗浄用バッファーを５分間洗浄した。標的タンパク質の検出は、前記実施例２と同様に、ＳＡＴＢｌｕｅ（商品名、同仁科学研究所製）を基質としたＰＯＤ活性を熱レンズ顕微鏡（ＴＬＭ）で検出した。【００６７】
得られた結果を、下記の表２、及び縦軸に熱レンズ信号強度、横軸にＨＢｓＡｇの濃度をとったグラフを図８に示す。【００６８】
【表２】
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【００６９】
表２及び図８によれば、反応領域の深さが０．０２ｍｍと浅い本発明のマイクロチップの方が、対照としての反応領域の深さが０．１ｍｍと深い標準型流路のマイクロチップに比べて、検出感度が高く、飛躍的な検出感度の上昇が認められることがわかる。【００７０】
［比較例１］
マイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡでのＨＢｓＡｇ検出感度
前記実施例３の測定で用いた抗体と同じＨＢｓＡｇ抗体の組み合わせを使用して、マイクロタイタープレートによるサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。即ち９６ウェルノマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製した抗ＨＢｓＡｇ抗体をウェル当たりそれぞれ１００μＬ加え、室温（これ以下の反応はすべて室温で反応）で１時間反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ（−）で２倍希釈したブロックエースを２００μＬ入れて１時間ブロッキングを行い測定用のプレートとした。これらのウェルに反応用バッファーで０，０．１，０．２ｎｇ／ｍＬの濃度に調製したＨＢｓＡｇを１００μＬ加え、１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、反応用バッファーで１μｇ／ｍＬの濃度に調製したビオチン標識抗ＨＢｓＡｇ抗体を１００μＬ加え、１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、反応用バッファーで１００００倍希釈したＰＯＤ標識ストレプトアビジンを１００μＬを加え、１時間反応させた。引き続き洗浄した後，ＳＡＴＢｌｕｅを基質とした発色反応によりＰＯＤ活性を６６０ｎｍの吸収で測定した。【００７１】
得られた結果を、下記の表３、及び縦軸にＰＯＤ活性、横軸にＨＢｓＡｇの濃度をとったグラフを図９に示す。【００７２】
【表３】
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【００７３】
図９に示すようにマイクロタイタープレート法では０．２ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇでも全く検出できず、前記実施例３で示したように本発明にかかわる流路を用いたマイクロ流体システムによる免疫測定系がマイクロタイタープレート法と比較して高感度であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明のマイクロチップは、生物学的物質の分析に適しており、各種疾病診断、動植物や微生物のゲノムやタンパク質の解析、遺伝子組み換え食品の安全性検査、環境中の有害物質の検査に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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