(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）と炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物とを含有する水性媒体中に保存した、測定対象物質、ならびに、測定対象物質と反応する抗体のいずれをも結合していない不溶性担体粒子を検体と反応させた後、測定対象物質と当該測定対象物質と反応する抗体との抗原抗体反応を行うことを特徴とする測定対象物質の免疫測定方法。
【請求項２】
炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物が、アルカリ金属化合物であることを特徴とする請求項１記載の免疫測定方法。
【請求項３】
炭酸水素イオン濃度が、０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１または２記載の免疫測定方法。
【請求項４】
中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤の濃度が、０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の免疫測定方法。
【請求項５】
不溶性担体粒子がラテックスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の免疫測定方法。
【請求項６】
免疫測定方法が比濁免疫測定法であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の免疫測定方法。
【請求項７】
測定対象物質がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の免疫測定方法。
【請求項８】
中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）と炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物とを含有する水性媒体中に保存した、測定対象物質、ならびに、測定対象物質と反応する抗体のいずれをも結合していない不溶性担体粒子を含有し、当該不溶性担体粒子と検体とを反応させた後、測定対象物質と当該測定対象物質と反応する抗体との抗原抗体反応を行うことを特徴とする測定対象物質の免疫測定用試薬。
【請求項９】
炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物が、アルカリ金属化合物であることを特徴とする請求項８記載の免疫測定用試薬。
【請求項１０】
炭酸水素イオン濃度が、０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項８または９記載の免疫測定用試薬。
【請求項１１】
中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤の濃度が、０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載の免疫測定用試薬。
【請求項１２】
不溶性担体粒子が、ラテックスであることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか記載の免疫測定用試薬。
【請求項１３】
測定対象物質がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか記載の免疫測定用試薬。
【請求項１４】
測定対象物質、ならびに、測定対象物質と反応する抗体のいずれをも結合していない不溶性担体粒子を検体と反応させた後、測定対象物質と当該測定対象物質と反応する抗体との抗原抗体反応を行う測定対象物質の免疫測定において、測定対象物質、ならびに、測定対象物質と反応する抗体のいずれをも結合していない不溶性担体粒子を、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）と炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物とを含有する水性媒体中に保存することを特徴とする不溶性担体粒子を含む免疫測定用試薬の安定化方法。
【請求項１５】
炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物が、アルカリ金属化合物であることを特徴とする請求項１４記載の安定化方法。
【請求項１６】
炭酸水素イオン濃度が、０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１４または１５記載の安定化方法。
【請求項１７】
中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤の濃度が、０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか記載の安定化方法。
【請求項１８】
不溶性担体粒子が、ラテックスであることを特徴とする請求項１４〜１７のいずれか記載の安定化方法。
【請求項１９】
測定対象物質がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれか記載の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不溶性担体粒子を用いる免疫測定方法、不溶性担体粒子を含有する免疫測定用試薬、および、不溶性担体粒子を含有する免疫測定用試薬の安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不溶性担体粒子は、臨床検査の分野において検体中の抗原または抗体を測定する免疫測定法において盛んに使用されている。しかし、長期間保存した不溶性担体粒子を含有する免疫測定用試薬を使用した場合、測定値が安定しないという問題点がある。この結果、常に同一感度の検量線を描くことができず、測定誤差の原因となっている。
【０００３】
本発明の目的は、測定値の正確性および信頼性が高い長期間保存できる不溶性担体粒子を含有する免疫測定用試薬、その試薬を用いる免疫測定方法、および、その試薬の安定化方法を提供することにある。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）と炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物とを含有する水性媒体中に保存した、測定対象物質、ならびに、測定対象物質と反応する抗体のいずれをも結合していない不溶性担体粒子を検体と反応させた後、測定対象物質と当該測定対象物質と反応する抗体との抗原抗体反応を行うことを特徴とする測定対象物質の免疫測定方法（請求項１）や、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物が、アルカリ金属化合物であることを特徴とする請求項１記載の免疫測定方法（請求項２）や、炭酸水素イオン濃度が、０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１または２記載の免疫測定方法（請求項３）や、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤の濃度が、０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の免疫測定方法（請求項４）や、不溶性担体粒子がラテックスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の免疫測定方法（請求項５）や、免疫測定方法が比濁免疫測定法であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の免疫測定方法（請求項６）や、測定対象物質がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の免疫測定方法（請求項７）や、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）と炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物とを含有する水性媒体中に保存した、測定対象物質、ならびに、測定対象物質と反応する抗体のいずれをも結合していない不溶性担体粒子を含有し、当該不溶性担体粒子と検体とを反応させた後、測定対象物質と当該測定対象物質と反応する抗体との抗原抗体反応を行うことを特徴とする測定対象物質の免疫測定用試薬（請求項８）や、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物が、アルカリ金属化合物であることを特徴とする請求項８記載の免疫測定用試薬（請求項９）や、炭酸水素イオン濃度が、０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項８または９記載の免疫測定用試薬（請求項１０）や、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤の濃度が、０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載の免疫測定用試薬（請求項１１）や、不溶性担体粒子が、ラテックスであることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか記載の免疫測定用試薬（請求項１２）や、測定対象物質がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか記載の免疫測定用試薬（請求項１３）や、測定対象物質、ならびに、測定対象物質と反応する抗体のいずれをも結合していない不溶性担体粒子を検体と反応させた後、測定対象物質と当該測定対象物質と反応する抗体との抗原抗体反応を行う測定対象物質の免疫測定において、測定対象物質、ならびに、測定対象物質と反応する抗体のいずれをも結合していない不溶性担体粒子を、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）と炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物とを含有する水性媒体中に保存することを特徴とする不溶性担体粒子を含む免疫測定用試薬の安定化方法（請求項１４）や、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物が、アルカリ金属化合物であることを特徴とする請求項１４記載の安定化方法（請求項１５）や、炭酸水素イオン濃度が、０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１４または１５記載の安定化方法（請求項１６）や、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤の濃度が、０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか記載の安定化方法（請求項１７）や、不溶性担体粒子が、ラテックスであることを特徴とする請求項１４〜１７のいずれか記載の安定化方法（請求項１８）や、測定対象物質がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれか記載の安定化方法（請求項１９）に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明における中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し、炭酸系緩衝剤を除く）としては、ｐＨ７以上で緩衝能を示す緩衝剤であれば特に制限されないが、ｐＨ７〜１２で緩衝能を示す緩衝剤が好ましく、ｐＨ８〜１１で緩衝能を示す緩衝剤が特に好ましい。具体的には、例えば、有機アミン系緩衝剤、グッド緩衝剤、生化学用緩衝剤等を挙げることができる。
【０００６】
上記生化学用緩衝剤としては、イミダゾール緩衝剤、リン酸一ナトリウム−リン酸二ナトリウム緩衝剤、クエン酸−第二リン酸ナトリウム緩衝剤、塩酸−ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム緩衝剤、第一リン酸カリウム−第二リン酸ナトリウム緩衝剤、第一リン酸カリウム−ホウ砂緩衝剤、第一リン酸カリウム−水酸化ナトリウム緩衝剤、塩酸−コリジン緩衝剤、塩酸−ベロナールナトリウム緩衝剤、塩酸−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、塩酸−ホウ砂緩衝剤、ホウ酸−炭酸ナトリウム緩衝剤、ホウ酸−ホウ砂緩衝剤、塩酸−アミノメチルプロパンジオール緩衝剤、塩化アンモニウム−アンモニア緩衝剤、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝剤、塩酸−ジメチルグリシンナトリウム緩衝剤、ホウ砂−水酸化ナトリウム緩衝剤、ホウ砂−炭酸ナトリウム緩衝剤、グリシン−塩化ナトリウム−塩酸緩衝剤、第二クエン酸ナトリウム−塩酸緩衝剤、第二クエン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝剤、ホウ砂−塩化ナトリウム緩衝剤、ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム−塩酸緩衝剤、ホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝剤、トリス−マレイン酸塩緩衝剤、マレイン酸塩緩衝剤、ベロナール−酢酸塩緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ミカエリス緩衝剤、クラーク−ルブス緩衝剤、アトキンス−パンチン緩衝剤、パリティッシュ緩衝剤、コルトホフ緩衝剤、マックイルベイン緩衝剤、ハスチング−センドロイ緩衝剤、ブリトン−ロビンソン緩衝剤、セーレンセン緩衝剤等を挙げることができる。
【０００７】
上記有機アミン系緩衝剤としては、例えば、ジエタノールアミン緩衝剤、２−エチルアミノエタノール緩衝剤、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝剤、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン緩衝剤等を挙げることができる。
【０００８】
上記グッド緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝剤、ビス−トリス［ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン］緩衝剤、ＡＤＡ［Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸］緩衝剤、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）］緩衝剤、ＡＣＥＳ｛２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸｝緩衝剤、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＢＥＳ｛２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸｝緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＥＳ〈２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸〉緩衝剤、ＨＥＰＥＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン］緩衝剤、ＤＩＰＳＯ｛３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸｝緩衝剤、ＴＡＰＳＯ〈２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸〉緩衝剤、ＰＯＰＳＯ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）］緩衝剤、ＨＥＰＰＳＯ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン］緩衝剤、ＥＰＰＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン］緩衝剤、トリシン｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン｝緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、ＴＡＰＳ｛３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸｝緩衝剤、ＣＨＥＳ［２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸］緩衝剤、ＣＡＰＳＯ［３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸］緩衝剤、ＣＡＰＳ［３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸］緩衝剤等を挙げることができる。
【０００９】
なお、本発明における中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤は、炭酸系緩衝剤以外の緩衝剤であり、ここで炭酸系緩衝剤とは炭酸塩に基づく緩衝剤を意味し、かかる炭酸系緩衝剤としては、例えば炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム系緩衝剤、炭酸カリウム−炭酸水素カリウム系緩衝剤等を挙げることができる。
【００１０】
また、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤の濃度は、特に制限されないが、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度が好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度がより好ましく、５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
【００１１】
本発明における炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物としては、炭酸水素イオンを放出する化合物であれば特に制限されないが、アルカリ金属化合物やアルカリ土類金属化合物等を挙げることができ、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウム等をより具体的に挙げることができ、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属化合物が特に好ましく用いられる。
【００１２】
また、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物の濃度は、特に制限されないが、０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度が好ましく、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度がより好ましく、１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
【００１３】
本発明における水性媒体としては、水、具体的には精製水を挙げることができ、必要に応じて、酵素、補酵素、塩化ナトリウム等の可溶性塩類、トリトンＸ−１００、ツイーン２０等の界面活性剤、安定化剤およびアジ化ナトリウム等の防腐剤等を含有してもよい。
【００１４】
本発明における不溶性担体粒子としては、特に制限されないが、例えば、有機高分子物質の微粒子や無機酸化物の微粒子、あるいはこれら有機高分子物質や無機酸化物の表面を有機物質等で表面処理した微粒子を挙げることができる。不溶性担体の材質は特に制限されるものではないが、反応液中に均一に懸濁することができるものが好ましい。
【００１５】
また、不溶性担体粒子の粒子径としては、特に制限されないが、０．０４〜０．８μｍのものが好ましい。より好ましい不溶性担体粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス等のラテックスを挙げることができる。ラテックスの材質としては、ポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックス、アクリル酸系ラテックス等を挙げることができる。また、電荷を与える為に、成分としてアクリル酸系のモノマーやスルホン酸をもつモノマー等を共重合したポリスチレンラテックスも好ましく用いることができる。
【００１６】
不溶性担体粒子の反応液中の濃度または試薬中の濃度は特に制限されないが、溶液中０．００５〜２重量％とすることが好ましい。
【００１７】
本発明の免疫測定方法における測定対象物質としては特に制限されないが、例えば、フェリチン、ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと記す）等の抗原やこれらに対する抗体を挙げることができる。
【００１８】
本発明において、不溶性担体粒子を用いる抗原抗体反応とは、不溶性担体粒子を固相として用いる抗原抗体反応をいい、固相として用いる不溶性担体粒子は、測定対象物質または測定対象物質と反応する抗体があらかじめ結合（担持）したものでもよいが、測定対象物質または測定対象物質と反応する抗体を実質的に結合（担持）していないものでもよい。本発明の水性媒体中で不溶性担体粒子を用いる抗原抗体反応を利用する免疫測定方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、比濁免疫測定方法を挙げることができる。
【００１９】
本発明の免疫測定方法は、１）中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）と炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物とを含有する水性媒体中に前述の不溶性担体粒子を添加し懸濁させる工程、２）不溶性担体粒子を含有する懸濁液と測定対象物質を含むサンプルとを反応させる工程、３）該反応により生成する不溶性担体粒子の凝集を測定する工程を含む。
【００２０】
不溶性担体粒子として、測定対象物質または測定対象物質に対する抗体を実質的に結合（担持）していない状態のものを用いる場合は、該不溶性担体粒子を含有する懸濁液と測定対象物質を含むサンプルとを反応させる工程の後に、測定対象物質と反応する抗体を含む試薬を添加する工程が行われる。
【００２１】
本発明の免疫測定試薬としては、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物及び不溶性担体粒子を含有するものであれば特に制限されないが、これらの中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物及び不溶性担体粒子は、水性媒体中に含有されていてもよい。かかる中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物、不溶性担体粒子及び水性媒体としては、それぞれ前述したと同じものを使用することができる。本発明の試薬には、必要に応じて、抗体、抗原、酵素、補酵素、塩化ナトリウム等の可溶性塩類、トリトンＸ−１００、ツイーン２０等の界面活性剤、安定化剤およびアジ化ナトリウム等の防腐剤等を含有させてもよい。
【００２２】
本発明の免疫測定試薬は、キットの形態で保存、使用されてもよい。キットの形態としては、２試薬系キットや３試薬系キットがあげられる。２試薬系キットとしては、例えば、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）、及び、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物を水性媒体中に含有する第１試薬と、測定対象物質と反応する抗体を結合した不溶性担体粒子、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）、及び、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物を水性媒体中に含有する第２試薬とからなるキットや、測定対象物質または測定対象物質に対する抗体を実質的に結合（担持）していない状態の不溶性担体粒子、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）、及び、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物を水性媒体中に含有する第１試薬と、該測定対象物質と反応する抗体を水性媒体中に含有する第２試薬とからなるキットを挙げることができる。
【００２３】
本発明の不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の安定化方法としては、不溶性担体粒子を、中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）と炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物とを含有する水性媒体中に含有させる方法であれば特に制限されるものではなく、かかる中性またはアルカリ性領域に緩衝能を有する緩衝剤（但し炭酸系緩衝剤を除く）、炭酸水素イオンを放出する炭酸化合物、不溶性担体粒子及び水性媒体としては、それぞれ前述したと同じものを使用することができる。水性媒体には、必要に応じて抗体、抗原、酵素、補酵素、塩化ナトリウム等の可溶性塩類、トリトンＸ−１００、ツイーン２０等の界面活性剤、安定化剤およびアジ化ナトリウム等の防腐剤等を共存させていてもよい。
【００２４】
また、本発明の免疫測定試薬の保存条件としては特に制限されないが、例えば、０〜３０℃、好ましくは０〜５℃を挙げることができる。本発明の不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の安定化方法によれば、従来試薬の不安定化を招きやすいと考えられている非密閉条件下において、試薬の安定化効果がより高い。
【００２５】
以下に具体的な実施例をあげて本発明を説明するが、該実施例は本発明を限定するものではない。
【００２６】
［例１］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ８．４）              ３．２６ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００（シグマ社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １７．５ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                      ０．０１ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．２ｇ／Ｌ
Ｒ２試薬（抗体感作ラテックス懸濁液）
イミダゾール緩衝剤（半井化学薬品社製、ｐＨ８．４）    ０．６８ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００（シグマ社製）                      ０．１５ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．２ｇ／Ｌ
抗体担持ラテックス（参考例で製造）                    ０．１重量％
【００２７】
［例２］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ８．４）              ３．２６ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００（シグマ社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １７．５ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                      ０．０１ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．４ｇ／Ｌ
Ｒ２試薬（抗体感作ラテックス懸濁液）
イミダゾール緩衝剤（半井化学薬品社製、ｐＨ８．４）    ０．６８ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００（シグマ社製）                      ０．１５ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．４ｇ／Ｌ
抗体担持ラテックス（参考例で製造）                     ０．１重量％
【００２８】
［例３］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ８．４）              ３．２６ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００（シグマ社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １７．５ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                      ０．０１ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．６ｇ／Ｌ
Ｒ２試薬（抗体感作ラテックス懸濁液）
イミダゾール緩衝剤（半井化学薬品社製、ｐＨ８．４）    ０．６８ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００（シグマ社製）                      ０．１５ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．６ｇ／Ｌ
抗体担持ラテックス（参考例で製造）                    ０．１重量％
【００２９】
［比較例１］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ８．４）              ３．２６ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００（シグマ社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １７．５ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                      ０．０１ｇ／Ｌ
Ｒ２試薬（抗体感作ラテックス懸濁液）
イミダゾール緩衝剤（半井化学薬品社製、ｐＨ８．４）    ０．６８ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００（シグマ社製）                      ０．１５ｇ／Ｌ
抗体担持ラテックス（参考例で製造）                    ０．１重量％
【００３０】
［実施例１］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬（ラテックス懸濁液）
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）              ３．２６ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．１ｇ／Ｌ
ラテックス（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）    ０．０３３重量％
Ｒ２試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）              ３．２６ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １５．０ｇ／Ｌ
ツイーン  ２０（和光純薬社製）                          ２．０ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０４ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
【００３１】
［実施例２］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬（ラテックス懸濁液）
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）              ３．２６ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．２ｇ／Ｌ
ラテックス（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）    ０．０３３重量％
Ｒ２試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）              ３．２６ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １５．０ｇ／Ｌ
ツイーン  ２０（和光純薬社製）                          ２．０ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０４ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
【００３２】
［実施例３］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬（ラテックス懸濁液）
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ８．４）              ３．２６ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．２ｇ／Ｌ
ラテックス（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）    ０．０３３重量％
Ｒ２試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）              ３．２６ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １５．０ｇ／Ｌ
ツイーン  ２０（和光純薬社製）                          ２．０ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０４ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
【００３３】
［実施例４］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬（ラテックス懸濁液）
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ８．４）              ３．２６ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム（関東化学社製）                      ０．３ｇ／Ｌ
ラテックス（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）    ０．０３３重量％
Ｒ２試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）              ３．２６ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １５．０ｇ／Ｌ
ツイーン  ２０（和光純薬社製）                          ２．０ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０４ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
【００３４】
［比較例２］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬（ラテックス懸濁液）
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）              ３．２６ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
ラテックス（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）    ０．０３３重量％
Ｒ２試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）              ３．２６ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １５．０ｇ／Ｌ
ツイーン  ２０（和光純薬社製）                          ２．０ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０４ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
【００３５】
［比較例３］
下記のＲ１試薬およびＲ２試薬を調製した。
Ｒ１試薬（ラテックス懸濁液）
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ８．４）              ３．２６ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
ラテックス（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）    ０．０３３重量％
Ｒ２試薬
ビシン緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）              ３．２６ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        １５．０ｇ／Ｌ
ツイーン  ２０（和光純薬社製）                          ２．０ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム（関東化学社製）                        ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０４ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
【００３６】
［参考例（抗体担持ラテックスの調製）］
平均粒子系０．３１μｍの１０％ポリスチレンラテックス液（ＪＳＲ社製）１容に１／６０ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４になるように１ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウム水溶液で調製したもの）９容を添加してラテックスを希釈し、１％ラテックス液とした。抗ヒトフェリチン抗体（ポリクローナル抗体、協和メデックス社製）は、蛋白濃度が５０μｇ／ｍＬになるように１／６０ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ溶液で希釈し感作用の抗体液とした。１％ラテックス液６００μＬを２５℃のインキューベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、これに抗体液１２００μＬを素早く添加し、２５℃にて２時間攪拌した。その後、下記のブロッキング液１を３ｍＬ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。その後、４℃、１５，０００ｒｐｍにて１時間遠心分離した。得られた沈殿にブロッキング液１を４ｍＬ添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄を３回行った後沈殿を抗体担持ラテックスとして用いた。
【００３７】
ブロッキング液１
イミダゾール緩衝剤０．６８ｇにＢＳＡ（牛血清アルブミン）６ｇ、トリトンＸ−１００（シグマ社製）０．１５ｇ添加し、２０℃でｐＨを計測しながら１ｍｏｌ／Ｌの塩酸または水酸化ナトリウム溶液を加え、ｐＨ７．４に合わせ、精製水で全量を１，０００ｍＬとし、ブロッキング液１を調製した。
【００３８】
［試験例１］
例１〜３および比較例１で調製した各Ｒ１試薬および各Ｒ２試薬を用いて、血清検体中のフェリチン濃度を下記の方法で測定した。フェリチン濃度の測定には、調製直後の各Ｒ１試薬および各Ｒ２試薬を自動分析機用容器に入れ、３日間密封し４℃で保存後に開封した直後の試薬（開封直後とする）、開封した状態で４℃で１４日間保存した試薬（開封保存１４日間とする）、および開封した状態で４℃で２８日間保存した試薬（開封保存２８日間とする）をそれぞれ用いた。
【００３９】
血清検体の調製
人血液を採血管（ベノジェクト真空採血管、テルモ社製）で採血後、２時間放置して得られた上澄み液を血清検体とし、これを使用するまで凍結保存（−２０℃）し、定量直前に融解して使用した。
【００４０】
Ｒ１試薬とＲ２試薬を用いたフェリチン濃度の測定
検量線は、開封直後のＲ１試薬とＲ２試薬を用い、フェリチン（スクリプス社製）を、１０．９、２１．９、４３．８、８７．５、１７５ｎｇ／ｍＬに調製した標準液を用いて作成した。
【００４１】
血清中のフェリチンの測定は、Ｒ１試薬１４０μＬに血清検体を１０μＬ添加し、３７℃で６分間反応させた後、Ｒ２試薬１５０μＬを添加し、３７℃で１３分間反応させた後に主波長７５０ｎｍ、副波長８００ｎｍにおける吸光度変化量を、２ポイントエンド法（測光ポイント２１−３９）により測定した。尚、測定機種として、日立自動分析装置７１７０型を使用した。
【００４２】
例１〜３及び比較例１で製造した試薬を用いて、フェリチン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を測定した結果を第１表に示す。
【００４３】
【表１】
0004950406.tif 000002
【００４４】
第１表に示すように、炭酸水素ナトリウムを添加していないＲ１試薬およびＲ２試薬を用いた比較例１の場合は、試薬開封後の日数が経過するにつれ、フェリチンの測定値は大きく変動するが、炭酸水素ナトリウムを添加したＲ１試薬およびＲ２試薬を用いた例１〜３の場合には、試薬開封後の日数が経過しても、フェリチンの測定値に大きな変化は認められないことがわかる。
【００４５】
［試験例２］
実施例１、２および比較例２並びに実施例３、４および比較例３で調製した各Ｒ１試薬および各Ｒ２試薬を用いて検体中のＨｂＡ１ｃのヘモグロビンに対する割合（以下、ＨｂＡ１ｃ濃度とよぶ）を下記の方法で測定した。ＨｂＡ１ｃ濃度の測定には、Ｒ１試薬については、調製直後の各Ｒ１試薬を自動分析機用容器に入れ、３日間密封し４℃で保存後に開封した直後の試薬（開封直後とする）、開封した状態で４℃で１４日間保存した試薬（開封保存１４日間とする）および開封した状態で４℃で２８日間保存した試薬（開封保存２８日間とする）を用い、また、Ｒ２試薬については、調製直後の各Ｒ２試薬を自動分析機用容器に入れ、３日間密封し４℃で保存後に開封した直後の試薬を用いた。
【００４６】
検体の調製
人血液をＥＤＴＡ採血管（ベノジェクト真空採血管、テルモ社製）で採血後、２時間放置して沈殿した血球層１０μＬをとり、精製水１ｍＬで希釈した。これを−２０℃で凍結保存し使用直前に融解したものを検体として用いた。
【００４７】
Ｒ１試薬とＲ２試薬を用いたＨｂＡ１ｃ濃度の測定
検量線は、開封直後の試薬を用いて、自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ（東ソー社製）による測定でＨｂＡ１ｃ値（＝ＨｂＡ１ｃ濃度）が、０．０％、４．２％、７．７％、１１．３％、１４．８％であった標準検体を用いて作成した。
【００４８】
検体中のＨｂＡ１ｃ濃度の測定は、Ｒ１試薬２４０μＬに上記で調製した検体を３．２μＬ添加し、３７℃で５分間反応させた後、Ｒ２試薬８０μＬを添加し、３７℃で５分反応させた後に、主波長４５０ｎｍ、副波長８００ｎｍにおける吸光度変化量を２ポイントエンド法（測光ポイント１６−３４）により測定した。尚、測定機種として、日立自動分析装置７１７０型を使用した。
【００４９】
実施例１、２および比較例２で製造した試薬を用いてＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した結果を第２表に、実施例３、４および比較例３で製造した試薬を用いてＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した結果を第３表にそれぞれ示す。
【００５０】
【表２】
0004950406.tif 000003
【００５１】
【表３】
0004950406.tif 000004
【００５２】
第２表および第３表に示すように、炭酸水素ナトリウムを添加していないＲ１試薬を用いた比較例２、３の場合は、Ｒ１試薬開封後の日数が経過するにつれ、ＨｂＡ１ｃの測定値は大きく変動するが、炭酸水素ナトリウムを添加したＲ１試薬を用いた実施例１〜４の場合は、Ｒ１試薬開封後の日数が経過しても、ＨｂＡ１ｃの測定値に大きな変化は認められないことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によると、不溶性担体粒子の非特異的凝集が抑制されるので、特異的な定量が可能となり、測定値の正確性および信頼性が高い免疫測定方法を提供することができる。また本発明により、長期間保存しても非特異的凝集が抑制された免疫測定試薬を提供することができる。さらに、本発明により不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の長期保存安定方法を提供することができる。