(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸又はその薬剤学的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含有する炎症性疾患予防又は治療剤。
【請求項２】
6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の薬剤学的に許容される塩がナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のいずれかである請求項１の炎症性疾患予防又は治療剤。
【請求項３】
6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の薬剤学的に許容されるエステルが6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸を構成脂肪酸として含有するトリグリセリド、ジグリセリド、若しくはモノグリセリド、又は6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の低級アルコールエステルである請求項１の炎症性疾患予防又は治療剤。
【請求項４】
炎症性疾患が慢性炎症性疾患である請求項１、２又は３の炎症性疾患予防又は治療剤。
【請求項５】
請求項１ないし４いずれかの炎症性疾患治療剤、及び使用説明書を含む炎症性疾患の予防又は治療用キット。
【請求項６】
魚油を原料とし、蒸留、尿素付加、カラムクロマトグラフィー、酵素反応、超臨界流体抽出、銀錯体形成、低温分別、溶媒分別から選ばれるいずれかの方法により構成脂肪酸中の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸含有量を濃縮させたトリグリセリド又は6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸のエチルエステルを１日当たり５０〜１０００ｍｇ摂取するための量を含有する機能性食品。
【請求項７】
機能性食品が構成脂肪酸中の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸含有量を濃縮させたトリグリセリド又は6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸のエチルエステルを含有するカプセルである請求項６の機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸又はその薬剤学的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含有する炎症性疾患の予防又は治療剤、炎症性疾患の予防又は治療のための医薬を製造するためのそれらの使用、あるいはそれらの薬理的な有効量をヒト又は非ヒト温血動物に投与する炎症性疾患の予防又は治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症とは、（1）病原微生物に対する生体の防御反応の結果生ずる現象（2）古典的に発赤、疼痛、腫脹、発熱を伴う（3）組織の機能喪失を伴う（4）免疫系細胞から分泌されるサイトカインが様々な反応を仲介する。これらの状態を伴う病気の総称が、炎症性疾患である。関与する因子としては、サイクロオキシゲナーゼや種々のサイトカインが中心的な役割を担っている。炎症性疾患には、多くの場合、サイクロオキシゲナーゼ阻害薬やステロイド剤が有効である。しかし、慢性炎症性疾患の場合、長期投与による副作用等の問題から使用できる薬物は制限されているのが現状である。特に、慢性の炎症性疾患である、リューマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、アトピー性皮膚炎、乾癬、全身性エリテマトーデス、痛風等が代表的な慢性炎症性疾患として認識されている。
クローン病と潰瘍性大腸炎は，消化管各部の慢性炎症で特徴づけられる疾患である。両疾患ともに、スルファサラジン系薬物が有効である場合が多いが、治癒する方法は知られていない。近年、治療法の進展により、有力な免疫制御療法として、インターロイキン-1遮断薬、インターロイキン-12に対する抗体、そして最も効果が確かな、腫瘍壊死因子（THF-alpha）に対するモノクローナル抗体が臨床応用されつつあり、これらの疾患においては、副作用の存在が懸念されるサイクロスポリンやアザチオプリンのような一般的な免疫抑制剤よりも、特定のサイトカイン（TNF-alpha, IL-1等）を抑制する療法に期待が高まっている。
同様に、リュウマチの治療においても、インフリキシマブ等のTNF-alpha抗体薬が承認され、このようなサイトカインを抑制することの意義が認知されている。【０００３】
高度不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids）とは、一般に二重結合を複数個以上有する不飽和脂肪酸に対する呼称で、魚油に多く含まれるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などがこれに相当する。高度不飽和脂肪酸はα-リノレン酸、ＥＰＡ、ＤＨＡなどのｎ−３系列と、リノール酸、γ-リノレン酸、アラキドン酸などのｎ−６系列に大別され。二重結合の位置がメチル末端から３番目の位置に存在するものと、６番目の位置に存在するものという観点で分類されている。ｎ−６系列の脂肪酸は植物等に多く含まれており、一方ｎ−３系列の脂肪酸は水棲生物等に多く含まれており、最近では、ｎ−３とｎ−６の脂肪酸をバランス良く摂取することが重要であるとされている。第五次改定日本人の栄養所要量１９９４年ではｎ−６：ｎ−３＝４：１のバランスが良いと報告されている。このバランスを１：１にまで引き上げる必要があるという学者も存在する。【０００４】
高度不飽和脂肪酸、特に、ｎ−３やｎ−６系統に属する脂肪酸には様々な生理機能が有り、各方面で盛んに研究が進められてきた。本発明の主眼である炎症、免疫あるいはアレルギーに対しても、食事中に含まれるｎ−３あるいはｎ−６脂肪酸の摂取バランスが重要であるという考え方が、広く認識されている。アラキドン酸はいわゆるアラキドン酸カスケードの主役であり、アラキドン酸代謝物の原料物質として、炎症、アレルギー等の症状の悪化に関与するために、過剰摂取には問題がある。ｎ−３系脂肪酸のα-リノレン酸、ＥＰＡやＤＨＡはアラキドン酸の作用を弱める（詳細には、細胞膜からのｃＰＬＡ２によるアラキドン酸の遊離を阻害する。アラキドン酸代謝物の作用する受容体に対して、抑制的に働く等の機能が見出されている。）作用機構によって、炎症を抑制する作用があることが広く知られる。この他にも、ｎ−３脂肪酸であるヘキサデカテトラエン酸、オクタデカテトラエン酸、オクタデカトリエン酸等にも、抗炎症／抗アレルギー作用が報告されている。このように、ｎ−３系統の脂肪酸には、抗炎症／抗アレルギー作用を発現するものが多く、ｎ−６系統の脂肪酸とは、明らかに異なる作用を有することが知られている。【０００５】
一方、メチル末端の炭素に二重結合が存在する高度不飽和脂肪酸、即ち、ｎ−１系統の脂肪酸は極めて珍しい脂肪酸である。6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸（C16:4（n-1）とも記す）は、イワシ等に特徴的に微量含まれる高度不飽和脂肪酸の一種である。非特許文献１にはその単離、分析方法について報告されている。6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸に限らず、ｎ−１系統の脂肪酸に関しての生理活性を研究した報告はほとんどない。【０００６】
この6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の異性体である4,7,10,13-ヘキサデカテトラエン酸については、各種作用が知られているｎ−３系の脂肪酸であることから、ｎ−３系の脂肪酸の混合物の作用についての報告の中でｎ−３系の脂肪酸の混合物中の１成分としての報告（非特許文献２等）があるが、精製した単一物質として作用が報告されているものとして、海藻に由来する4,7,10,13-ヘキサデカテトラエン酸がマウスのマストセル（ＭＣ／９）においてロイコトリエンＢ４、ロイコトリエンＣ４、５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸の産生を抑制するという報告（非特許文献３）と、海藻由来の4,7,10,13-ヘキサデカテトラエン酸に細胞活性化作用があるという報告（特許文献１）がある。【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２３０２８号
【非特許文献１】Journal of the American chemists’Society, 66(9), 1323-1325, 1989.
【非特許文献２】Biochimica et Biophysica Acta, 1095, 187-195, 1991.
【非特許文献３】Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(7), 1412-1415, 1998.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗炎症作用、抗アレルギー作用、免疫抑制作用を有する炎症性疾患の治療薬を提供することを課題とする。 
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の薬理作用について鋭意研究を行った結果、該化合物がインターロイキン、ＴＮＦ−αなどの産生抑制作用を有することを見出し本発明を完成させた。
本発明は、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸又はその薬剤学的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含有する炎症性疾患予防又は治療剤を要旨とする。
本発明は、上述の炎症性疾患治療剤と使用説明書を含む炎症性疾患の予防又は治療用キットを要旨とする。
本発明は、炎症性疾患の予防又は治療剤を製造するための、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸又はその薬剤学的に許容される塩若しくはエステルの使用を要旨とする。
本発明は、有効量の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸又はその薬剤学的に許容される塩若しくはエステルを炎症性疾患の予防又は治療を必要とするヒト又は非ヒト温血動物に投与することを含む炎症性疾患の予防又は治療方法を要旨とする。
本発明は、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸又はその食品添加物として許容される塩若しくはエステルを有効成分として含有する炎症性疾患予防又は治療用機能性食品を要旨とする。
本発明は、前記の炎症性疾患治療用機能性食品と炎症性疾患に使用するための使用説明書を含む炎症性疾患の予防又は治療用機能性食品を要旨とする。
上記の炎症性疾患予防又は治療剤、使用、予防又は治療方法、予防又は治療用機能性食品において、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の薬剤学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。また、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の薬剤学的に許容されるエステルとしては、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸を構成脂肪酸として含有するトリグリセリド、ジグリセリド、若しくはモノグリセリド、又は6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の低級アルコールエステルが好ましい。本発明は、炎症性疾患の中でも慢性炎症性疾患に有効である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸、又はその薬剤学的に許容される塩若しくはエステルは、各種サイトカインの産生を抑制し、抗炎症剤／抗アレルギー剤／免疫抑制剤等の炎症細胞が関与する、様々な炎症性疾患に対して有効な予防又は治療効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いられる6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸とは、炭素数１６の直鎖脂肪酸であり、6位、9位、12位、15位に二重結合を有する。C16:4のように表記されることもある。
本発明の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の薬剤学的に許容される塩又はエステルは以下のような方法で製造することができる。一般的に6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の原料として用いられる魚油は大部分がトリグリセライド（TG）であり、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸はそのアシル残基として存在している。魚油にはパルミチン酸やステアリン酸などの高融点の脂肪酸を有するTGも含まれており、冷却してこれらの高融点成分を結晶化して分離除去することにより、TG中の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸を濃縮することができる。この方法を低温分別あるいはウィンタリングと称している。魚油の場合はアセトン等の溶剤に油を溶解し、冷却、結晶を析出させ、分離する方法が一般的に行われている。しかしながらTGには脂肪酸が３分子結合しているため、TGのまま6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸を一定以上に濃縮するのは困難である。高度に濃縮を行う場合は、TGを遊離脂肪酸やモノエステルの形としてから濃縮を行う。遊離脂肪酸やモノエステルの形としてから特定の脂肪酸を分離するには、蒸留、尿素付加、カラムクロマトグラフィー、酵素反応、超臨界流体抽出、銀錯体形成、低温分別、溶媒分別などの方法による。魚油には極めて多種類の構成脂肪酸が含まれており、単独の精製方法では高度精製は難しく、複数の方法を組み合わせて用いられる。【００１２】
本発明において、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の薬剤学的に許容される塩としては、医薬上あるいは生理学的に許容されるアルカリ付加塩が好ましい。例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、ピリジン、トリエチルアミンとの塩などが用いられる。
本発明において、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の薬剤学的に許容されるエステルとしては、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸を構成脂肪酸として含有するトリグリセリド、ジグリセリド、若しくはモノグリセリド、又は6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の低級アルコールエステルが好ましい。トリグリセリド、ジグリセリドの構成脂肪酸として6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸を含むものであれば、構成脂肪酸として他の脂肪酸を含むものでもよい。例えば、原料として魚油由来のトリグリセリドを用いる場合、炭素数１４〜２２、二重結合数０〜６の各種脂肪酸が構成脂肪酸として含まれるが、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸が必要量摂取できる濃度に濃縮されていればよい。低級アルコールエステルとしてはメタノール、エタノールエステルが好ましい。【００１３】
本発明において使用される6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸、又はその薬剤学的に許容される塩若しくはエステルは、種々の形態で投与される。その投与形態としては特に限定はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与される。また注射剤の場合には、単独で或はぶどう糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更には必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下関節内若しくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸内投与される。好適には経口投与である。6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は酸化しやすい液状油脂であるからカプセルに充填するか、抗酸化剤を配合するなど酸化防止処理をする必要がある。【００１４】
これらの各種製剤は、常法に従って主薬に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、溶解剤、矯味剤、矯臭剤、コーティング剤、甘味剤、着色剤、滑沢剤、安定剤、防腐剤、保存剤等の医薬製剤分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ぶどう糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ぶどう糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン糖の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が例示できる。更に、錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠或は二重錠、多層錠とすることができる。 【００１５】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば、ぶどう糖、乳糖、澱粉、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナランカンテン等の崩壊剤等が例示できる。 
坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。 
注射剤として調製される場合には、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものを全て使用でき、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、ぶどう糖、或はグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよい。 【００１６】
上記医薬製剤中に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、カプセルの充填する場合は液状の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸のみを充填することもできるし、その他の製剤にする場合は、通常全組成物中１〜７０重量％含まれる量とするのが適当である。本発明において、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸、又は、その薬剤学的に許容される塩若しくはエステルの投与量は症状、年齢、投与方法等によって異なるが、例えば経口投与の場合には、成人に対して１日あたり１〜１２００ｍｇ、好ましくは５０〜１０００ｍｇを１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。静脈内投与の場合には、成人に対して１日当たり、０．０１〜５００ｍｇ、好ましくは、０．１〜２００ｍｇを１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。【００１７】
6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸を含有する機能性食品としては、カプセル、錠剤のような形状のものでも、牛乳、豆乳、清涼飲料水などの飲料、あるいは食品に添加したものでもよい。【００１８】
本発明の炎症性疾患予防又は治療剤は、ＴＮＦ−α産生抑制、サイトカインの産生抑制作用などの機序による、抗炎症作用、抗アレルギー作用、免疫抑制作用を有するので各種炎症性疾患に有効である。特に慢性炎症性疾患に適している。例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病などの炎症性腸疾患、リュウマチなどの関節炎などが例示される。
6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は、食習慣として長年人類が摂取してきたイワシ、ニシン、メンヘーデンなどのニシン目の魚類に含まれる脂肪酸であり（文献；R. G. Ackman: Fatty Acid Composition of Fish Oils, In Nutritional Evaluation of Long-Chain Fatty Acid in Fish Oil (Edited by S. M. Barlow & M. E. Stansby: Academic Press, London, New York, (1982) pp.25-88). 文献；R. G. Ackman, C. A. Eaton & J. Hingley: Fillet Fat and Fatty Acid Details for Newfoundland Winter  Herring, Canadian Institute of Food Science and Technology Journal,8(3),155-159(1975)）、安全性は高いと考えられる。【００１９】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
In vitro 培養細胞系を用いた6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の活性評価
6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸（C16:4）の各種サイトカイン産生に対する抑制効果を培養細胞系のアッセイ系で評価した。ＴＮＦ−αの試験では、炭素数２０、二重結合数４、ｎ−３系の脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（EPA）を対照として比較検討した。
アッセイ方法
ヒト末梢血単核球（5×105/ml）と薬物をAIM-V培地（pH 7.4）中で30分前培養する。刺激剤（コンカナバリンＡ；２０μｇ／ｍｌ、又は、リポポリサッカライド；２５μｇ／ｍｌ）の添加により細胞を刺激し37℃、5% CO2下で一夜培養する。培養上清中の各種サイトカインのレベルは、サンドイッチELISAによって測定した。薬物の濃度は、30, 10, 3, 1, 0.3μMでスクリーニングし、各種サイトカインの産生抑制をＩＣ50により評価した。
本実施例で使用した6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は実施例３の方法で製造したエチルエステル（純度９６％）である。
結果を表１に示す。6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸（C16:4）はいずれのサイトカインに対しても抑制効果を示した。エイコサペンタエン酸はＴＮＦ−αの産生を３０μＭの濃度においても効果は認められなかった。【００２１】
【表１】
0005046926.tif 000002
上記の結果から、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は、各種サイトカインの産生抑制効果を有することが示された。これらの結果は、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸に抗炎症作用、抗アレルギー作用、免疫抑制作用があることを示唆する。上記、サイトカインの中でも、インターロイキン−２とＴＮＦ-αは、特に各種疾患との関連が重要視されている因子である。
【実施例２】
【００２２】
炎症モデルを用いた6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の活性評価
1.  炎症性大腸炎モデル-I
24時間絶食した体重200±10gのオスのウイスターラット5尾を1群とした。末梢大腸炎は、DNBS（2,4-Dinitrobenzensulfonic acid, 30 mg in 0.5 ml 30% ethanol）の経腸投与によって誘導した。化合物（2% Polygly ester溶液に溶解）は、試験期間の7日間に渡って1日1回経口投与した。DNBSを最初の薬物投与の24時間後と、2回目の薬物投与の2時間後に経腸投与して、大腸炎を誘導した。コントロール群は、同様な時間にDNBSを投与した。もう一方のコントロール群は、DNBS 無投与の群である。7日間の薬物の連続投与後、24時間目に適切に致死せしめたラットから大腸を分離して重量を測定した。試験期間中、下痢の状態をモニターした。腹腔を開いた時、大腸と他の臓器の癒着を観察し、さらに大腸の潰瘍を評価した。体重に対する大腸の割合を各々の動物で計算し以下の式によって数値化した。
(A)         体重100 g 当りの大腸重量＝摘出大腸×100 / 8日目の体重
(B)         体重100g当たりの大腸増加量＝(A)−無処理コントロールの体重100g当たりの大腸増加量
(C)         体重100g当たりの大腸増加重量減少率＝DNBSコントロールの体重100g当たりの大腸増加量−(B) / DNBSコントロールの体重100g当たりの大腸増加量
本試験では6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は実施例３の方法で製造したエチルエステル（純度78％）を使用した。【００２３】
結果を表２に示した。無処理のコントロール群の体重100g 当たりの大腸重量は、0.293gであったのに対して、DNBS を投与すると、0.784gへと大腸重量が増加した。これは、DNBS 処理によって、大腸に炎症が生じたことを示している。 6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸（C16:4 n-1）の投与は、100 mg/kgの経口投与で、大腸重量の増加を0.656gへと減少させた。減少率は26%であった。また、300 mg/kgの経口投与の場合、大腸重量の増加を0.6gへと減少させた。減少率は37%であった。陽性対照として、Sulfasalazineの効果を検討した。Sulfasalazineは、300 mg/kgの経口投与で大腸重量の増加を0.582gへと減少させた。減少率は41% であった。t-検定の結果、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の100 mg及び300 mg投与群とDNBSのみを投与した対照群との間には、P<0.05で有意差が認められた。また、Sulfasalazine 300 mg投与群は、DNBSのみを投与した対照群と比較して、P<0.01で有意差が認められた。【００２４】
【表２】
0005046926.tif 000003
【００２５】
このように、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸には、現在、実際に臨床に用いられている医薬品であるSulfasalazineとほぼ同様な効果が、同様の投与量でラット炎症性大腸炎モデルにおいて認められた。この結果は、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸が、本モデルに類似したヒト疾患であるクローン病や潰瘍性大腸炎等の治療薬になりうることを示す。【００２６】
2. 炎症性大腸炎モデル-II
同様のモデルで、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸とEPAの効果を比較検討した。
本試験では6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は実施例３の方法で製造したエチルエステル（純度96％）を、EPAはトリグリセリド（脂質組成：トリグリセリド99％、脂肪酸組成：EPA98％）を使用した。
結果を表３に示した。無処理のコントロール群の体重100g当たりの大腸重量は、0.225gであったのに対して、DNBS を投与すると、0.704gへと大腸重量が増加した。これは、DNBS処理によって、大腸に炎症が生じたことを示している。 6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の投与は、100mg/kgの経口投与で、大腸重量の増加を0.574gへと減少させた。減少率は、27%であった。前項の試験結果が、ほぼ確実に再現されたことを示している。一方、EPAの100 mg/kgの経口投与の場合、大腸重量の増加を0.607gへと減少させた。減少率は、20%であった。陽性対照として、Sulfasalazineの効果を検討した。Sulfasalazineは、300 mg/kgの経口投与で大腸重量の増加を0.574gへと減少させた。減少率は、35%であった。t-検定の結果、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の100 mg投与群とDNBSのみを投与した対照群との間には、P<0.01で有意差が認められた。また、Sulfasalazine 300 mg投与群は、DNBSのみを投与した対照群と比較して、P<0.01で有意差が認められた。EPA投与群とDNBSのみを投与した対照群との間には、危険率5%では、有意差は、認められなかった。
これらの結果から、高度不飽和脂肪酸であれば、どのような脂肪酸にもこのような、抗炎症モデルにおいて効果を示すことができるというわけではなく、特に、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸に強い抗炎症作用があることを示唆している。また、EPA は、以前から、抗炎症作用を示すことは、広く研究されてきた高度不飽和脂肪酸の筆頭である。今回の試験は、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸が、EPAよりもさらに強力な抗炎症作用を有する可能性を見い出した最初の試験結果と考えることができる。【００２７】
【表３】
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【００２８】
3.   カラギーナン浮腫モデル
24時間絶食した体重22±2gのオスのICRマウス6尾を1群とした。薬物を経口投与後、1時間目にカラギーナン（50 μlの1%懸濁液）を足に注射する。後足浮腫を炎症の指標として、カラギーナン投与後４時間目に、専用の測定器で測定した。この試験は、単回投与の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の浮腫の形成に及ぼす影響を解析する、非常に急性のモデルである。本試験では6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は実施例３の方法で製造したエチルエステル（純度78％）を使用した。
結果を表４に示す。コントロール群は、カラギーナンの投与で生じた浮腫によって、後足の体積が、5.7（×0.01 ml）に増加した。6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸をカラギーナン投与の1時間前に投与した群においては、後足の体積が、4.5（×0.01 ml）に押さえられた。陽性対照のアスピリンでは、後足の体積が、3.3（×0.01 ml）に押さえられた。このように、急性の炎症モデルである、動物モデルで、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は、単回投与でも、炎症を抑制する効果が示された。【００２９】
【表４】
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【００３０】
4. モノクローナル抗体誘導性コラーゲン性関節炎
体重20±2gのBALB/cByJマウス5尾を1群とした。II型コラーゲンに対する4種類のモノクローナル抗体（D8, F10, DI-2G, A2）を、0日目にマウス1尾当たり、20mg静脈内投与した。3日目に、lipopolysaccharide(LPS, 25μg/mouse)を静脈内投与して、炎症を誘発した。3日目のLPS投与の1時間後から、1日1回、3日間、薬物を経口投与した。LPS投与から3日目に、後足浮腫を専用の測定器で測定した。本試験では6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は実施例３の方法で製造したエチルエステル（純度78％）を使用した。
結果を表５に示す。コントロール群は、II型コラーゲンに対する4種類のモノクローナル抗体の投与及びLPSの誘発で生じた浮腫によって、後足の体積が、10（x 0.01 ml）に増加した。6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸をLPS投与の1時間後から1日1回、3日間経口投与した群においては、後足の体積が、5.6（x 0.01 ml）に押さえられた。減少率は、44% であり、t-検定によって、有意差が認められた（P<0.05）このように、本モデルにおいても6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸は、炎症を抑制する効果が示された。【００３１】
【表５】
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【００３２】
5. ラットのビール酵母炎症足疼痛に対する6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の鎮痛作用（Randall-Selitto法）
6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸（実施例３の方法で製造したエチルエステル（純度91.５％）を使用）（比重0.9）を833mgポリプロピレン製遠心管中に秤量後、3%ポリグリセリンエステル水溶液25mLを加え、乳化して被検溶液を調製した（30 mg/mL）。
被験溶液は経口経路で投与した。投与は、1日1回、7日間行った。6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸の投与量は300 mg/kg、投与容量は10 mL/kgとした。対照群には被験溶液と同容量の媒体を投与した。ビール酵母（Yeast, Brewers Bottom、Sigma製） 1 gを量り取り、生理食塩液にて懸濁して10 mLにメスアップして10 w/v % ビール酵母生理食塩液を調製した。被験溶液最終投与1時間後、動物の右側後肢足蹠皮下に10 w/v % Brewers yeast生理食塩液を0.1 mL/匹皮下投与して炎症を誘発した。被検溶液投与開始前、被験溶液最終投与1時間前及び4時間後 (10 w/v % Brewers yeast生理食塩液投与から3時間後)の３時点に、ラットの右後肢足にAnalgesy meter (TK-201、ユニコム)によって圧刺激を加え、疼痛閾値を測定した。
各群の代表値は、疼痛閾値の平均値及び標準誤差で表した。対照群と被験溶液群との間でF検定により等分散性を検定し、等分散であったのでStudentのt検定を行った。使用動物数は各群１０匹である。
結果を表６に示す。対照群の被検溶液投与開始前、被験物質最終投与1時間前及び起炎後3時間 (被験物質最終投与4時間後)の平均疼痛閾値 (平均値±標準誤差)は、92±1 mmHg，90±1 mmHg及び39±3 mmHgであり，起炎3時間後の平均痛覚反応は51±3 mmHg低下した。
6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸群の被検溶液投与開始前、被験物質最終投与1時間前及び起炎3時間後の平均疼痛閾値は、92±1 mmHg、89±2 mmHg及び52±3 mmHg、起炎後3時間の平均痛覚反応は37±2 mmHg低下し、対照群に対して起炎後3時間の疼痛閾値において有意（p<0.01）な高値、痛覚反応において有意（p<0.01）な低値が認められた。【００３３】
【表６】
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【実施例３】
【００３４】
１．蒸留
ナトリウムエチラートを用いてエチルエステルとしたイワシ油エチルエステル（6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル1.9%含有）を135℃、0.1mmHgの条件にて蒸留を行い、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステルを4.25%含有する留分を得た。
２．尿素付加
得られた留分60.5gを、尿素180.0gを溶解させた60℃のメタノール溶液（600ml）に滴下し、1時間攪拌後、さらに4℃で16時間攪拌し、析出した結晶を吸引ろ過して除去した。得られた溶液のメタノールを留去後、ヘキサン400ml、蒸留水400mlにて分配し、得られたヘキサン層をさらに400mlの蒸留水で3回洗浄した。また、1回目に得たれた水層をヘキサン400mlで4回抽出した。すべてのヘキサン層を合わせ、無水硫酸マグネシウムにて脱水、無水硫酸マグネシウムをろ過後、ヘキサンを留去し、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステルを17.1%含有する尿素処理油を14.0g得た。尿素付加処理での6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステルの回収率は92.6%であった。同条件での尿素付加処理をさらに10回行い、6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステルを17.4%含有する尿素処理油を得た。
３．カラム
得られた6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル17.4%の尿素処理油35gを、オクタデシルシリル化シリカゲル（富士シリシア化学株式会社製、100-200mesh）を充填したオープンカラム（7.5cmφ×25cm）に付し、95%メタノールにて800ml通液した後200mlずつフラクション取りした。得られたフラクションの溶媒を留去した結果、フラクション3より79.7%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル1.3g（回収率17.5%）を得た。その他のフラクションでは、フラクション4より59.5%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル5.3g（回収率51.6%）、フラクション5より26.4%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル6.0g（回収率26.2%）が得られ、合計の回収率は95.3%であった。
同条件のカラム処理を何度か行い、純度の低いフラクションを集めて31.2%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステルとし、その35gを再度カラム処理した結果、フラクション3より94.7%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル2.3g（回収率21.1%）を得た。その他のフラクションでは、フラクション4より58.2%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル10.1g（回収率56.3%）、フラクション5より26.3%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル8.7g（回収率21.9%）が得られ、合計の回収率は99.2%であった。【００３５】
上述の方法と同様に調製した96.0%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステルを400MHz 1H-NMR、GC-MSにて分析した結果n-1系脂肪酸の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸である事を確認した。
1H-NMR (400MHz,CDCl3) ： 1.25 (t, J=7.1Hz, 3H), 1.38 (m, 2H), 1.6 (m, 2H), 2.1 (m, 2H), 2.30 (t, 2H), 2.8 (m, 6H), 4.12 (quart., J=7.1Hz, 2H), 5.0 (m, 2H), 5.3-5.4 (m, 6H), 5.7 (m, 1H)
Mass m/z: 276(M+.), 261, 247, 235, 208, 189, 171, 161.
【実施例４】
【００３６】
高速液体クロマトグラフによる製造方法
高速液体クロマトグラフを用いた検討を行った。6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル（34.5%）の50%メタノール溶液200μl（油として約90mg）をナカライテスク社製コスモシール5C18-ARパックドカラム（20.0mmI.D.×250mm）を用いた高速液体クロマトグラフでの分取を行ったところ（溶媒メタノール、流速5ml/h）、95.4%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル18.7mg（回収率57.3%）を得た。
同条件の高速液体クロマトグラフでの分取を何度か行い得られた94.5%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステルの50%メタノール溶液200μl（油として約90mg）を、再度同条件にて分取したところ、99.1%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル15.9mg（回収率18.5%）、97.5%の6,9,12,15-ヘキサデカテトラエン酸エチルエステル28.1mg（回収率32.2%）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
炎症性疾患あるいは炎症性疾患に起因する疾病、例えば大腸炎、関節炎等の予防薬又は治療薬を提供することができる。また、食品由来の脂肪酸であり高い安全性が期待できることから、炎症性疾患の予防又は治療の機能を有する機能性食品を提供することができる。