(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の波長のレーザー光を発振するレーザー光源手段と、前記複数種類の波長のレーザー光の中から少なくとも一種類の波長のレーザー光を選択するためのレーザー光選択手段と、前記レーザー光を試料に集光する対物レンズと、前記レーザー光を試料上で走査する走査手段と、前記レーザー光を試料に照射することにより前記試料から発生する蛍光と前記レーザー光を分離する特性を有し、選択するレーザー光の波長に対応して切り換え可能に保持された波長特性の異なる複数のダイクロイックミラーと、前記試料からの蛍光を対物レンズを介して検出する蛍光検出手段と、前記試料を透過した前記レーザー光を検出する透過光検出手段を備えた走査型レーザー顕微鏡において、
前記レーザー光選択手段で選択するレーザー光を切り換え、その波長に対応させて前記複数のダイクロイックミラーを切り換えるとともに、切り換えられる前記レーザー光および前記ダイクロイックミラーの各々に対して、蛍光画像を前記蛍光検出手段により取得すると同時に、前記試料を透過した透過光による透過光画像を前記透過光検出手段により取得し、前記レーザー光毎に取得された透過光画像を画像処理することにより、前記ダイクロイックミラー毎に取得された蛍光画像の位置ずれ量を求め、このずれ量に基づいて前記ダイクロイックミラー毎に取得された蛍光画像の位置ずれを補正した少なくとも二つの蛍光画像を重ね合わせ表示する制御手段を備えたことを特徴とする走査型レーザー顕微鏡。
【請求項２】
前記制御手段は、複数種類の蛍光色素で染色された多重染色試料に対して前記各蛍光色素を励起する波長のレーザー光を前記レーザー光選択手段により前記走査手段に同期して切り換えるとともに、切り換えられたレーザー光の波長に対応する前記ダイクロイックミラーを前記走査手段に同期して切り換え、各レーザー光および各ダイクロイックミラーに対応する各々の蛍光画像を前記蛍光検出手段により時分割で取得する時に、前記ダイクロイックミラー毎の蛍光画像の取得と同時に、前記試料を透過した透過光による透過光画像を前記透過光検出手段により取得し、前記レーザー光毎の透過光画像を画像処理することにより、前記ダイクロイックミラー毎の蛍光画像の位置ずれ量を求め、このずれ量に基づいて前記ダイクロイックミラー毎の蛍光画像の位置ずれを補正して表示する制御手段を備えたことを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザー顕微鏡。
【請求項３】
前記制御手段は、前記透過光検出器の検出感度を、切り換えられる前記レーザー光の各々に対して前記透過光検出器の出力が飽和しないレベルに、レーザー光の切り換えに同期して切り換えることを特徴とする請求項２に記載の走査型レーザー顕微鏡
【請求項４】
前記制御手段は、前記レーザー光毎の蛍光画像において共通に取得されている領域の画素のみを重ねて表示することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の走査型レーザー顕微鏡。
【請求項５】
前記透過光検出手段は視野絞りを有しており、前記制御手段は、前記画像処理を、透過光画像に写る視野絞りを画像処理することにより行うことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の走査型レーザー顕微鏡。
【請求項６】
複数種類の波長のレーザー光を発振するレーザー光源手段と、前記複数種類の波長のレーザー光の中から少なくとも一種類の波長のレーザー光を選択するレーザー光選択手段と、前記レーザー光を試料に集光する対物レンズと、前記レーザー光を試料上で走査する走査手段と、前記レーザー光を試料に照射することにより前記試料から発生する蛍光と前記レーザー光を分離する特性を有し、選択するレーザー波長に対応して切り換え可能に保持された波長特性の異なる複数のダイクロイックミラーと、前記試料からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する蛍光検出手段と、前記試料を透過した前記レーザー光を検出する透過光検出手段を備えた走査型レーザー顕微鏡の画像取得方法において、
前記レーザー光選択手段で選択するレーザー光を切り換え、その波長に対応させて前記複数のダイクロイックミラーを切り換え、切り換えられる前記レーザー光および前記ダイクロイックミラーの各々に対して、蛍光画像を前記蛍光検出手段により取得すると同時に、前記試料を透過した透過光による透過光画像を前記透過光検出手段により取得し、前記レーザー光毎に取得された透過光画像を画像処理することにより、前記ダイクロイックミラー毎に取得された蛍光画像の位置ずれ量を求め、このずれ量に基づいて前記ダイクロイックミラー毎に取得された蛍光画像の位置ずれを補正して表示することを特徴とする走査型レーザー顕微鏡の画像取得方法。
【請求項７】
前記走査型レーザー顕微鏡の画像取得方法は、複数種類の蛍光色素で染色された多重染色試料に対して前記各蛍光色素を励起する波長のレーザー光を前記レーザー光選択手段により前記走査手段に同期して切り換えるとともに、切り換えられたレーザー光の波長に対応する前記ダイクロイックミラーを前記走査手段に同期して切り換え、各レーザー光および各ダイクロイックミラーに対応する各々の蛍光画像を前記蛍光検出手段により時分割で取得する時に、前記ダイクロイックミラー毎の蛍光画像の取得と同時に、前記試料を透過した透過光による透過光画像を前記透過光検出手段により取得し、前記レーザー光毎の透過光画像を画像処理することにより、前記ダイクロイックミラー毎の蛍光画像の位置ずれ量を求め、このずれ量に基づいて前記ダイクロイックミラー毎の蛍光画像の位置ずれを補正して表示することを特徴とする請求項６に記載の走査型レーザー顕微鏡の画像取得方法。
【請求項８】
前記走査型レーザー顕微鏡の画像取得方法は、前記透過光検出器の検出感度を、切り換えられる前記レーザー光の各々に対して前記透過光検出器の出力が飽和しないレベルに、レーザー光の切り換えに同期して切り換えることを特徴とする請求項７記載の走査型レーザー顕微鏡の画像取得方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はレーザー光を対物レンズにより集光して試料上に光スポットを結ばせ、試料からの蛍光を光検出器で検出する走査型レーザー顕微鏡及びその画像取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
走査型レーザー顕微鏡は、レーザー光を対物レンズにより集光して標本（以下試料と称する）上に光スポットを結ばせ、試料からの蛍光を光検出器で検出している。走査型レーザー顕微鏡では、使用される蛍光色素に合わせて試料に照射するレーザー光の波長を複数種類用意し、かつ、レーザー光と蛍光波長に合わせてダイクロイックミラーを複数種類用意している。蛍光色素に対応して、レーザー光の波長及びダイクロイックミラーを切り換えて画像取得している。
【０００３】
ここでダイクロイックミラーの切り換えの際、一般に、各ダイクロイックミラーの角度成分の誤差により走査位置にずれが生じるため、通常、ダイクロイックミラ一の切り換え前後の画像には位置ずれが発生してしまう。このため、多重染色蛍光標本の観察においては、蛍光色素毎に画像を重ねて表示する際に蛍光色素毎に蛍光画像位置がずれてしまい、正確な観察ができない。また、取得した画像を後で重ねる場合も、蛍光色素毎に試料内で蛍光が出ている部位が異なるため正確に重ね合せることが困難である。
【０００４】
特開平１１−５２２５２号には、この問題を解決する蛍光顕微鏡（走査型レーザー顕微鏡）が開示されている。特開平１１−５２２５２号の装置では、各ダイクロイックミラー毎の画像ずれ量を予め求めて記憶手段に記憶させておき、そのずれ量の情報に基づいて、各ダイクロイックミラー毎に走査ミラーの走査波形を変更制御したり、光検出のサンプリングのタイミングを変更制御したり、試料を搭載したステージの位置を変更制御したりすることにより、ダイクロイックミラー切り換え時の蛍光画像の位置ずれを補正している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
特開平１１−５２２５２号の走査型レーザー顕微鏡では、実際に基準となる図形パターン等の画像で各ダイクロイックミラー毎の画像を取得して画像ずれ量を求めて、装置に情報を記憶させるという調整工程が必要である。しかし、後々、使用するレーザー光源や蛍光色素が追加になり、新しくダイクロイックミラーを追加する場合、上記調整工程を必ず行わなければならず、非常に面倒である。
【０００６】
さらに、出荷時にわかっているダイクロイックミラーに対してはこの調整工程を製造メーカーが出荷時または納品の装置セットアップ時に行うことができるが、前述したようにダイクロイックミラーが、納品後しばらく経過してから、ユーザー自身で追加される場合は、装置を使用しているユーザー自身で調整を行うことになり、調整ミスが生じたり、調整を忘れたりしてしまう恐れがある。これらの調整不良（調整ミスや調整忘れ）のまま装置を使用した場合、正確な多重染色画像の観察ができない。
【０００７】
また、走査ミラーの波形制御の変更や光検出のサンプリングのタイミングの変更等は装置を複雑化するため信頼性に疑問がある。
【０００８】
本発明はこのような不具合を解決するために成されたものであり、その目的は、複雑な調整工程や複雑な制御を必要としない簡単な構成でありながら、複数の蛍光色素画像が位置ずれなく重ねられた画像を取得し得る走査型レーザー顕微鏡及びその画像取得方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明はひとつには走査型レーザー顕微鏡であり、複数種類の波長のレーザー光を発振するレーザー光源手段と、前記複数種類の波長のレーザー光の中から少なくとも一種類の波長のレーザー光を選択するためのレーザー光選択手段と、前記レーザー光を試料に集光する対物レンズと、前記レーザー光を試料上で走査する走査手段と、前記レーザー光を試料に照射することにより前記試料から発生する蛍光と前記レーザー光を分離する特性を有し、選択するレーザー光の波長に対応して切り換え可能に保持された波長特性の異なる複数のダイクロイックミラーと、前記試料からの蛍光を対物レンズを介して検出する蛍光検出手段と、前記試料を透過した前記レーザー光を検出する透過光検出手段を備えた走査型レーザー顕微鏡において、前記レーザー光選択手段で選択するレーザー光を切り換え、その波長に対応させて前記複数のダイクロイックミラーを切り換えるとともに、切り換えられる前記レーザー光および前記ダイクロイックミラーの各々に対して、蛍光画像を前記蛍光検出手段により取得すると同時に、前記試料を透過した透過光による透過光画像を前記透過光検出手段により取得し、前記レーザー光毎に取得された透過光画像を画像処理することにより、前記ダイクロイックミラー毎に取得された蛍光画像の位置ずれ量を求め、このずれ量に基づいて前記ダイクロイックミラー毎に取得された蛍光画像の位置ずれを補正して表示する制御手段を備えたことを特徴とする。
【００１０】
本発明はひとつには走査型レーザー顕微鏡の画像取得方法であり、複数種類の波長のレーザー光を発振するレーザー光源手段と、前記複数種類の波長のレーザー光の中から少なくとも一種類の波長のレーザー光を選択するレーザー光選択手段と、前記レーザー光を試料に集光する対物レンズと、前記レーザー光を試料上で走査する走査手段と、前記レーザー光を試料に照射することにより前記試料から発生する蛍光と前記レーザー光を分離する特性を有し、選択するレーザー波長に対応して切り換え可能に保持された波長特性の異なる複数のダイクロイックミラーと、前記試料からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する蛍光検出手段と、前記試料を透過した前記レーザー光を検出する透過光検出手段を備えた走査型レーザー顕微鏡の画像取得方法において、前記レーザー光選択手段で選択するレーザー光を切り換え、その波長に対応させて前記複数のダイクロイックミラーを切り換え、切り換えられる前記レーザー光および前記ダイクロイックミラーの各々に対して、蛍光画像を前記蛍光検出手段により取得すると同時に、前記試料を透過した透過光による透過光画像を前記透過光検出手段により取得し、前記レーザー光毎に取得された透過光画像を画像処理することにより、前記ダイクロイックミラー毎に取得された蛍光画像の位置ずれ量を求め、このずれ量に基づいて前記ダイクロイックミラー毎に取得された蛍光画像の位置ずれを補正して表示することを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１２】
第一実施形態
本実施形態の走査型レーザー顕微鏡は、図１において、蛍光を励起するためのレーザー光を射出するためのレーザー光射出手段と、レーザー光を集光して試料に照射するための集光光学系と、レーザー光を試料上で走査するためのＸＹガルバノミラー６と、試料から発生する蛍光とレーザー光とを分離するための励起ダイクロイックミラーユニット５と、試料からの蛍光を検出するための蛍光検出手段と、試料を透過したレーザー光を検出するための透過光検出手段とを備えている。
【００１３】
レーザー光射出手段は、複数種類の波長のレーザー光を選択的に出力し得るレーザー光源部１と、光源部１から出力されるレーザー光を伝送するための光ファイバー３と、光ファイバー３の端面から射出されるレーザー光を平行化するコリメートレンズ４とを有している。
【００１４】
レーザー光源部１は、複数種類の波長のレーザー光を発振するアルゴン（Ａｒ）レーザー１ａと、Ａｒレーザー１ａから発せられる複数種類の波長のレーザー光の中から少なくとも一種類の波長のレーザー光を選択するための音響光学素子（ＡＯＴＦ）２とを有している。
【００１５】
Ａｒレーザー１ａは、４５８ｎｍと４８８ｎｍと５１５ｎｍの波長のレーザー光を同時に発振する。ＡＯＴＦ２は、これに入力される音波の波長に従って、前述の三種類の波長のレーザー光の中から少なくとも一種類の波長のレーザー光を選択し得る。言い換えれば、ＡＯＴＦ２は、前述の三種類の波長のレーザー光の中から任意の組合せのレーザー光を選択し得る。
【００１６】
レーザー光射出手段は、このように選択され、光ファイバー３を通りコリメートレンズ４を介して平行化されたレーザー光をダイクロイックミラーユニット５に向けて射出する。
【００１７】
励起ダイクロイックミラーユニット５は、モーター５ｅによって回転駆動されるターレット５ｆを有しており、ターレット５ｆには、二つの励起ダイクロイックミラー５ａ、５ｂと他の種類の励起ダイクロイックミラーを追加装着するための孔５ｃとが同心円上に設けられている。
【００１８】
励起ダイクロイックミラー５ａは、図２に示されるように、波長４５８ｎｍの光を反射し、波長４５８ｎｍの光により励起された試料から発せられる４５８ｎｍより長い波長域の蛍光を透過させる特性を有している。励起ダイクロイックミラー５ｂは、図３に示されるように、波長５１５ｎｍの光を反射し、波長５１５ｎｍにより励起された試料から発せられる５１５ｎｍより長い波長域の蛍光を透過させる特性を有している。
【００１９】
励起ダイクロイックミラー５ａ、５ｂは、ターレット５ｆをモーター５ｅで回転駆動させることにより、レーザー光射出手段から射出されるレーザー光の波長に応じて選択的に光路上に配置される。
【００２０】
ＸＹガルバノミラー６は、互いに異なる（例えば直交する）二本の軸周りに揺動可能な二つの反射面を有しており、励起ダイクロイックミラーユニット５で反射されたレーザー光を走査する。
【００２１】
集光光学系は、瞳投影レンズ７と結像レンズ８と対物レンズ９とを有しており、ＸＹガルバノミラー６を経由したレーザー光を集光して試料（二重染色試料）１０に照射する。
【００２２】
なお、試料１０は、４５８ｎｍで励起される蛍光蛋白ＣＦＰと５１５ｎｍで励起される蛍光蛋白ＹＦＰとで染色されている（蛍光蛋白ＣＦＰやＹＦＰは、試料となる細胞内で蛍光を発する遺伝子を発現させているため、正確に言えば染色とは異なるが、一般的な蛍光試料の場合、試料は蛍光試薬で染色するとを言うため、ここでは、それらを総称する意味でＣＦＰやＹＦＰの場合も、試料に染色されると言った表現を用いるものとする。）。ＣＦＰの蛍光波長特性４１ｃとＹＦＰの蛍光波長特性４１ｙはそれぞれ図４に示されるとおりである。
【００２３】
レーザー光の照射により試料１０から発生した蛍光は、集光光学系とＸＹガルバノミラー６を通過し、選択されたレーザー光の波長と試料１０からの蛍光波長とに応じて光路上に配置された励起ダイクロイックミラーを透過し、レーザー光から分離される。
【００２４】
蛍光検出手段は、励起ダイクロイックミラーユニット５を通過した蛍光を反射するミラー１３と、蛍光を収束するための共焦点レンズ１４と、対物レンズ９と共役な位置に配置されたピンホール１５と、ピンホール１５を通過した蛍光を分光するための分光ダイクロイックミラーユニット１６と、一対のバンドパスフィルター１７ａ，１７ｂと、一対の蛍光検出器１８ａ，１８ｂとを有している。
【００２５】
ピンホール１５は、集光光学系と共焦点レンズ１４とで構成される光学系に関して試料１０と共焦点の関係に配置されており、励起ダイクロイックミラ一の切り換え時の角度誤差による結像位置ずれを補正するために、ＸＹ電動ステージ１５ａによって光軸に直交する平面内を移動され得る。
【００２６】
分光ダイクロイックミラーユニット１６は、モーター１６ｅによって回転駆動されるターレット１６ｆを有しており、ターレット１６ｆには、分光ダイクロイックミラー１６ａと反射ミラー１６ｂと空孔１６ｃとが同心円上に設けられている。
【００２７】
分光ダイクロイックミラー１６ａは、図５に示されるように、５２０ｎｍの波長の光に対して５０％の透過率を有し、それよりも短波長の光を反射し、それよりも長波長を透過する特性を有している。これにより、分光ダイクロイックミラー１６ａは、試料１０から発するＣＦＰの蛍光を反射し、試料１０から発するＹＦＰの蛍光を透過させる。
【００２８】
分光ダイクロイックミラー１６ａと反射ミラー１６ｂと空孔１６ｃは、ターレット１６ｆをモーター１６ｅで回転駆動させることにより選択的に光路上に配置可能である。本実施形態では、常時、分光ダイクロイックミラー１６ａが光路上に配置される。
【００２９】
バンドパスフィルター１７ａは、図６に実線で示されるように、ＣＦＰの蛍光を励起するための４５８ｎｍの波長のレーザー光をカットし、ＣＦＰの蛍光波長範囲の光を透過させる特性を有している。つまり、バンドパスフィルター１７ａはＣＦＰの蛍光を選択的に透過させる。蛍光検出器１８ａはバンドパスフィルター１７ａを透過したＣＦＰの蛍光を検出する。
【００３０】
バンドパスフィルター１７ｂは、図６に破線で示されるように、ＹＦＰの蛍光を励起するための５１５ｎｍの波長のレーザー光をカットし、ＹＦＰの蛍光波長範囲を透過させる特性を有している。つまり、バンドパスフィルター１７ｂはＹＦＰの蛍光を選択的に透過させる。蛍光検出器１８ａはバンドパスフィルター１７ｂを透過したＹＦＰの蛍光を検出する。
【００３１】
ここで、画像ずれを嫌って励起ダイクロイックミラー５ａ、５ｂを図７に示されるような４５８ｎｍと５１５ｎｍを反射する二重励起タイプのものを用いたと仮定する。この場合、長波長側は５３０ｎｍ位まで取得したいＣＦＰの蛍光のうち、５０５ｎｍないし５２５ｎｍの波長範囲で５０％以上が励起ダイクロイックミラーでカットされてしまう。しかし、本実施形態のように二重励起タイプでないものを用いると、長波長側は分光ダイクロイックミラー１６ａの反射特性で決まるため、５２０ｎｍまでは５０％以上蛍光を取得することが可能で、明るい蛍光観察が可能となる。
【００３２】
透過光検出手段は、レンズ１１と透過光検出器１２を有しており、試料１０に対して集光光学系の反対側に配置されている。レンズ１１は試料１０を透過した光を拾い、透過光検出器１２はレンズ１１に入った透過光を検出する。
【００３３】
この透過光検出手段は、蛍光染色された細胞標本の全体像である細胞骨格を観察するために、市販されている蛍光観察用の走査型レーザー顕微鏡に付属されている。蛍光色素は例えば細胞内の核や微小管といった一部の部位に標識して使用するため、蛍光画像のみでは細胞の全体像を把握することができない。透過光検出手段は、このように蛍光画像では把握できない細胞の全体像を把握するために用意されている。透過光検出手段には、細胞の透過像をコントラスト良く観察されるため、ノマルスキー観察を適用してもよい。
【００３４】
走査型レーザー顕微鏡は、図１に示されるように、さらに、制御装置１９と表示手段２０とを備えている。制御装置１９は、励起ダイクロイックミラーユニット５の回転駆動制御、分光ダイクロイックミラーユニット１６の回転駆動制御、ＡＯＴＦ２の制御、ピンホール１５のＸＹ電動ステージ１５ａの移動制御、ＸＹガルバノミラー６の駆動制御、蛍光検出器１８ａ，１８ｂ及び透過光検出器１２の出力をＸＹガルバノミラー６の駆動に同期して取り込む制御を行なう。表示手段２０は、各蛍光検出器１８ａ，１８ｂで検出された蛍光画像を各蛍光毎に擬似カラーをつけて重ねて表示する。
【００３５】
制御装置１９は、レーザー光射出手段から複数種類の波長のレーザー光を切り換えて射出させ、そのレーザー光に対応する励起ダイクロイックミラーが光路上に配置されるように励起ダイクロイックミラーユニット５を切り換えるとともに、切り換えて射出されるレーザー光の各々に対して、試料１０から発生する蛍光を蛍光検出手段で検出して蛍光画像を取得すると同時に試料１０を透過した光を透過光検出手段で検出して透過光画像を取得し、得られた複数の透過光画像に基づいて複数の蛍光画像の位置ずれ量を求め、このずれ量に基づいて複数の蛍光画像の位置ずれを補正して表示手段２０に複数の蛍光画像を重ねて表示させる制御を行う。
【００３６】
次に上記構成の走査型レーザー顕微鏡の動作について説明する。本実施形態では、分光ダイクロイックミラーユニット１６の中の分光ダイクロイックミラー１６ａを光路上に配置させる。図示しないＰＣ（パーソナルコンピューター）等により走査開始の指令を制御装置１９に入力し、二種類の蛍光蛋白に対応する二重染色蛍光画像を、制御装置１９の指令で４５８ｎｍの波長のレーザー光と５１５ｎｍの波長のレーザー光の走査に同期して切り換えて二種類の蛍光を時分割で取得する。
【００３７】
このため、第一の工程においてＣＦＰの蛍光画像を取得するとともにその励起光である波長４５８ｎｍの透過光画像を取得し、第二の工程においてＹＦＰの蛍光画像を取得するとともにその励起光である波長５１５ｎｍの透過光画像を取得し、第三の工程において取得した二枚の透過光画像に基づいて二枚の蛍光画像の位置ずれを補正する。
【００３８】
第一の工程では、制御装置１９により以下の制御を行う。励起ダイクロイックミラーユニット５を回転制御して、励起ダイクロイックミラー５ａを光路上に配置する。ＸＹ電動ステージ１５ａを駆動して、励起ダイクロイックミラー５ａに対応するピンホール位置にピンホール１５を配置させる。ＡＯＴＦ２を制御して、Ａｒレーザー１ａから発せられるレーザー光のうち、４５８ｎｍの波長のレーザー光を選択的にファイバー３に入射させる。
【００３９】
ファイバー３に入射したレーザー光はその内部を伝わり、ファイバー３の端面から射出され、コリメートレンズ４により平行光に変換される。波長４５８ｎｍのレーザー光は、励起ダイクロイックミラー５ａで反射され、ＸＹガルバノミラー６を通過し、瞳投影レンズ７と結像レンズ８と対物レンズ９を経て試料１０に照射され、試料１０上に光スポットを結ぶ。この光スポットはＸＹガルバノミラー６により試料上を二次元的に走査される。
【００４０】
波長４５８ｎｍのレーザー光の照射により試料１０から発生したＣＦＰの蛍光は、レーザー光の照射経路を逆行し、励起ダイクロイックミラー５ａに達し、これを透過する。励起ダイクロイックミラー５ａを透過したＣＦＰの蛍光は、ミラー１３で反射され、共焦点レンズ１４により収束されてピンホール１５を通過し、分光ダイクロイックミラー１６ａで反射され、ＣＦＰ用バンドパスフィルター１７ａを透過し、蛍光検出器１８ａで検出される。
【００４１】
また、試料１０に光スポットを結んだ波長４５８ｎｍのレーザー光は試料１０を透過して、レンズ１１を介して透過光検出器１２で検出される。
【００４２】
ＸＹガルバノミラー６により一枚の画像に対応する範囲を走査しながら蛍光検出器１８ａでＣＦＰの蛍光を検出することによりＣＦＰの蛍光画像が得られる。これと同時に透過光検出器１２で波長４５８ｎｍの透過光を検出することにより、ＣＦＰの蛍光画像に対応する、波長４５８ｎｍの透過光画像が同時に得られる。
【００４３】
第二の工程では、制御装置１９により以下の制御を行う。励起ダイクロイックミラーユニット５を回転制御して、励起ダイクロイックミラー５ｂを光路上に配置する。ＸＹ電動ステージ１５ａを駆動して、励起ダイクロイックミラー５ｂに対応するピンホール位置にピンホール１５を配置させる。ＡＯＴＦ２を制御して、Ａｒレーザー１ａから発せられるレーザー光のうち、５１５ｎｍの波長のレーザー光を選択的にファイバー３に入射させる。
【００４４】
ファイバー３に入射したレーザー光はその内部を伝わり、ファイバー３の端面から射出され、コリメートレンズ４により平行光に変換される。波長５１５ｎｍのレーザー光は、励起ダイクロイックミラー５ｂで反射され、ＸＹガルバノミラー６を通過し、瞳投影レンズ７と結像レンズ８と対物レンズ９を経て試料１０に照射され、試料１０上に光スポットを結ぶ。この光スポットはＸＹガルバノミラー６により試料上を二次元的に走査される。
【００４５】
波長５１５ｎｍのレーザー光の照射により試料１０から発生したＹＦＰの蛍光は、レーザー光の照射経路を逆行し、励起ダイクロイックミラー５ｂに達し、これを透過する。励起ダイクロイックミラー５ｂを透過したＹＦＰの蛍光は、ミラー１３で反射され、共焦点レンズ１４により収束されてピンホール１５を通過し、分光ダイクロイックミラー１６ａを透過し、ＹＦＰ用バンドパスフィルター１７ｂを透過し、蛍光検出器１８ｂで検出される。
【００４６】
また、試料１０に光スポットを結んだ波長５１５ｎｍのレーザー光は試料１０を透過して、レンズ１１を介して透過光検出器１２で検出される。
【００４７】
ＸＹガルバノミラー６により一枚の画像に対応する範囲を走査しながら蛍光検出器１８ｂでＹＦＰの蛍光を検出することによりＹＦＰの蛍光画像が得られる。これと同時に透過光検出器１２で波長５１５ｎｍの透過光を検出することにより、ＹＦＰの蛍光画像に対応する、波長５１５ｎｍの透過光画像が同時に得られる。
【００４８】
このように時分割により得られる二種類の蛍光画像は、切り換えられる二枚の励起ダイクロイックミラー５ａ，５ｂの角度誤差のために、通常、それらの位置は互いにずれている。
【００４９】
第三の工程では、この位置ずれを補正するために、制御装置１９により以下の制御を行う。第一の工程で取得した透過光画像と第二の工程で取得した透過光画像を画像処理して、二枚の蛍光画像の位置ずれ量を求める。そのずれ量に基づいて、第一の工程で取得したＣＦＰの蛍光画像と第二の工程で取得したＹＦＰの蛍光画像の位置ずれを補正し、これらを表示手段２０に重ねて表示する。
【００５０】
位置ずれ量を求めるための画像処理の手法としては、例えば、二枚の透過光画像に対してコントラストが最も高いパターンをそれぞれ見つけて、それらの位置から位置ずれ量を求める手法や、画像間で画素をずらしながら減算を行い、減算した各画素全体の輝度の絶対値が最も低くなる画素位置を求めて位置ずれ量を求める手法等が考えられる。
【００５１】
二枚の蛍光画像の端の領域は、両者の位置ずれのために、必ずしも両方の画像に共通に取得されていない。表示手段２０には、このような端の領域が除かれた、二枚の蛍光画像に共通に取得されている領域のみが表示されることが望ましい。例えば、図８に示されるように、画素数５１２×５１２の二枚の蛍光画像において、水平方向に２０画素分、垂直方向に１０画素分ずれている場合、両者に共通に取得されている（５１２−２０）×（５１２−１０）＝４９２×５０２画素の範囲が表示されるとよい。
【００５２】
本実施形態では、図示しないＰＣ等による走査開始の指令のみで、制御装置１９が上述した第一の工程、第二の工程、第三の工程を自動的に行なうので、励起ダイクロイックミラーの波長特性による蛍光取得効率の低下を招くことなく、二枚の蛍光画像を位置ずれなく重ねることができ、二重染色蛍光画像を容易に得ることができる。
【００５３】
また、各ダイクロイックミラー毎の蛍光画像の取得と同時に取得した透過光画像に基づいて各ダイクロイックミラー毎の蛍光画像の位置合わせ処理を行なうので、特別な調整工程は不要となる。
【００５４】
第一変形例
上述の本実施形態では、分光ダイクロイックミラー１６ａが常に光路上に配置されているが、制御装置１９によりモーター１６ｅを制御して、ＣＦＰの蛍光像を取得する第一の工程では分光ダイクロイックミラーユニット１６の反射ミラー１６ｂを光路上に配置し、ＹＦＰの蛍光画像を取得する第二の工程では分光ダイクロイックミラーユニット１６の空孔１６ｃを光路に配置してもよい。
【００５５】
本変形例では、ＣＦＰの蛍光は反射ミラー１６ｂにより全てＣＦＰ用バンドパスフィルター１７ａに導かれるので、分光ダイクロイックミラー１６ａで反射される際の損失がなく、更に効率良く検出される。また、ＹＦＰの蛍光は空孔１６ｃにより全てＹＦＰ用バンドパスフィルター１７ｂに導かれるためので、分光ダイクロイックミラー１６ａで透過する際の損失がなく、更に効率良く検出される。
【００５６】
第二変形例
図９に示されるように、分光ダイクロイックミラーユニット１６の空孔１６ｃが光路上に配置されるとともに、蛍光検出手段が、蛍光検出器１８ｂの手前に配置されたバンドパスフィルターユニット２１を更に有している。バンドパスフィルターユニット２１は、モーター２１ｅによって回転駆動されるターレット２１ｆを有しており、ターレット２１ｆには、ＣＦＰ用バンドパスフィルター２１ａとＹＦＰ用バンドパスフィルター２１ｂと孔２１ｃとが同心円上に設けられている。
【００５７】
ＣＦＰ用バンドパスフィルター２１ａとＹＦＰ用バンドパスフィルター２１ｂはそれぞれ上述したＣＦＰ用バンドパスフィルター１７ａとＹＦＰ用バンドパスフィルター１７ｂと同じ波長特性を有するバンドパスフィルターであり、これらはモーター２１ｅによるターレット２１ｆの回転制御により選択的に光路上に配置される。
【００５８】
第一の工程では、バンドパスフィルターユニット２１のＣＦＰ用バンドパスフィルター２１ａを光路上に配置し、これを透過するＣＦＰの蛍光を蛍光検出器１８ｂで検出し、第二の工程では、バンドパスフィルターユニット２１のＹＦＰ用バンドパスフィルター２１ｂを光路上に配置し、これを透過するＹＦＰの蛍光を蛍光検出器１８ｂで検出する。
【００５９】
本変形例では、分光ダイクロイックミラー１６ａによる蛍光の損失がないので、蛍光を更に効率良く検出できる。また、分光ダイクロイックミラーユニット１６と蛍光検出器１８ａは不要であり、これらを省くことにより更に装置の小型化を図ることができる。
【００６０】
第三変形例
本実施形態では、ＣＦＰの蛍光を取得する第一の工程と、ＹＦＰを取得する第二の工程と、画像処理により二種の蛍光画像の位置ずれを補正して表示する第三の工程とを、図示しないＰＣ等による走査開始の一回の指令に応じて、制御装置１９により連続的に実行しているが、各工程毎の開始指令に応じてその工程を実行するように制御装置１９により制御されてもよい。
【００６１】
本変形例では、ＰＣ等から三回の指令入力が必要となるが、長いフローの制御プログラムを必要としないので、プログラム開発の手間が省ける。
【００６２】
第二実施形態
本実施形態の走査型レーザー顕微鏡の構成を図１０に示す。図１０において、第一実施形態において既に説明した部材と同等の部材は同一の参照符号で示されており、以下の記載においてはその詳しい説明は省略する。
【００６３】
本実施形態の走査型レーザー顕微鏡では、レーザー光源部１は、Ａｒレーザー１ａとＡＯＴＦ２に加えて、５４３ｎｍの波長のレーザー光を発振するグリーンヘリウムネオンレーザー（ＨｅＮｅ−Ｇ）１ｂと、ＨｅＮｅ−Ｇ１ｂから発せられるレーザー光を偏向するための反射ミラー１ｃと、ＨｅＮｅ−Ｇ１ｂで発せられた波長５４３ｎｍのレーザー光をＡｒレーザー１ａから発せられるレーザー光に同軸に結合させるためのダイクロイックミラー１ｄとを有している。
【００６４】
励起ダイクロイックミラーユニット５は、励起ダイクロイックミラー５ａ，５ｂに加えて、孔５ｃに新たに取り付けられた励起ダイクロイックミラー５ｄを有している。励起ダイクロイックミラー５ｄは、図１１に示されるように、波長５４３ｎｍの光を反射し、波長５４３ｎｍの光により励起される５４３ｎｍより長い波長域の蛍光を透過させる特性を有している。
【００６５】
試料１００は、波長４５８ｎｍの光で励起される蛍光蛋白ＣＦＰと波長５１５ｎｍの光で励起される蛍光蛋白ＹＦＰと波長５４３ｎｍの光で励起される蛍光蛋白ＲＦＰとで細胞内の各部位が染色されている三重染色試料である。波長５４３ｎｍの光で励起されるＲＦＰの蛍光波長特性４１ｒは図４に示されるとおりである。
【００６６】
バンドパスフィルターユニット２１は、ＣＦＰ用バンドパスフィルター２１ａとＹＦＰ用バンドパスフィルター２１ｂに加えて、孔２１ｃに新たに取り付けられたＲＦＰ用バンドパスフィルター２１ｄを有している。このＲＦＰ用バンドパスフィルター２１ｄは、図６に一点鎖線で示されるように、ＲＦＰの蛍光を励起するための５４３ｎｍの波長のレーザー光をカットし、ＲＦＰの蛍光波長範囲の光を透過させる特性を有している特性を有している。
【００６７】
次に上記構成の走査型レーザー顕微鏡の動作について説明する。本実施形態では、分光ダイクロイックミラーユニット１６の中の空孔１６ｃを光路上に配置させる。図示しないＰＣ等により走査開始の指令を制御装置１９に入力し、三種類の蛍光蛋白に対応する三重染色蛍光画像を、制御装置１９の指令で波長４５８ｎｍのレーザー光と波長５１５ｍのレーザー光と波長５４３ｎｍのレーザー光を走査に同期して切り換えて三種の蛍光を時分割で取得する。
【００６８】
このため、第一の工程においてＣＦＰの蛍光画像を取得するとともにその励起光である波長４５８ｎｍの透過光画像を取得し、第二の工程においてＹＦＰの蛍光画像を取得するとともにその励起光である波長５１５ｎｍの透過光画像を取得し、第三の工程においてＲＦＰの蛍光画像を取得するとともにその励起光である波長５４３ｎｍの透過光画像を取得し、第四の工程において取得した三枚の透過光画像に基づいて三枚の蛍光画像の位置ずれを補正する。
【００６９】
第一の工程では、制御装置１９により以下の制御を行う。励起ダイクロイックミラーユニット５を回転制御して、励起ダイクロイックミラー５ａを光路上に配置する。ＸＹ電動ステージ１５ａを駆動して、励起ダイクロイックミラー５ａに対応するピンホール位置にピンホール１５を配置させる。バンドパスフィルターユニット２１を回転制御してＣＦＰ用バンドパスフィルター２１ａを光路上に配置する。ＡＯＴＦ２を制御して、Ａｒレーザー１ａから発せられるレーザー光のうち、４５８ｎｍの波長のレーザー光を選択的にファイバー３に入射させる。
【００７０】
ファイバー３に入射したレーザー光はその内部を伝わり、ファイバー３の端面から射出され、コリメートレンズ４により平行光に変換される。波長４５８ｎｍのレーザー光は、励起ダイクロイックミラー５ａで反射され、ＸＹガルバノミラー６を通過し、瞳投影レンズ７と結像レンズ８と対物レンズ９を経て試料１００に照射され、試料１００上に光スポットを結ぶ。この光スポットはＸＹガルバノミラー６により試料上を二次元的に走査される。
【００７１】
波長４５８ｎｍのレーザー光の照射により試料１００から発生したＣＦＰの蛍光は、レーザー光の照射経路を逆行し、励起ダイクロイックミラー５ａに達し、これを透過する。励起ダイクロイックミラー５ａを透過したＣＦＰの蛍光は、ミラー１３で反射され、共焦点レンズ１４により収束されてピンホール１５を通過し、分光ダイクロイックミラーユニット１６の中の空孔１６ｃを通過し、ＣＦＰ用バンドパスフィルター２１ａを透過し、蛍光検出器１８ｂで検出される。
【００７２】
また、試料１００に光スポットを結んだ４５８ｎｍのレーザー光は試料１００を透過して、レンズ１１を介して透過光検出器１２で検出される。
【００７３】
ＸＹガルバノミラー６により一枚の画像に対応する範囲を走査しながら蛍光検出器１８ｂでＣＦＰの蛍光を検出することによりＣＦＰの蛍光画像が得られる。これと同時に透過光検出器１２で波長４５８ｎｍの透過光を検出することにより、ＣＦＰの蛍光画像に対応する、波長４５８ｎｍの透過光画像が同時に得られる。
【００７４】
第二の工程では、制御装置１９により以下の制御を行う。励起ダイクロイックミラーユニット５を回転制御して、励起ダイクロイックミラー５ｂを光路上に配置する。ＸＹ電動ステージ１５ａを駆動して、励起ダイクロイックミラー５ｂに対応するピンホール位置にピンホール１５を配置させる。バンドパスフィルターユニット２１を回転制御してＹＦＰ用のバンドパスフィルター２１ｂを光路上に配置する。ＡＯＴＦ２を制御して、Ａｒレーザー１ａから発せられるレーザー光のうち、５１５ｎｍの波長のレーザー光を選択的にファイバー３に入射させる。
【００７５】
ファイバー３に入射したレーザー光はその内部を伝わり、ファイバー３の端面から射出され、コリメートレンズ４により平行光に変換される。波長５１５ｎｍのレーザー光は、励起ダイクロイックミラー５ｂで反射され、ＸＹガルバノミラー６を通過し、瞳投影レンズ７と結像レンズ８と対物レンズ９を経て試料１００に照射され、試料１００上に光スポットを結ぶ。この光スポットはＸＹガルバノミラー６により試料上を二次元的に走査される。
【００７６】
波長５１５ｎｍのレーザー光の照射により試料１００から発生したＹＦＰの蛍光は、レーザー光の照射経路を逆行し、励起ダイクロイックミラー５ｂに達し、これを透過する。励起ダイクロイックミラー５ｂを透過したＹＦＰの蛍光は、ミラー１３で反射され、共焦点レンズ１４により収束されてピンホール１５を通過し、分光ダイクロイックミラーユニット１６の中の空孔１６ｃを通過し、ＹＦＰ用バンドパスフィルター２１ｂを透過し、蛍光検出器１８ｂで検出される。
【００７７】
また、試料１００に光スポットを結んだ５１５ｎｍのレーザー光は試料１００を透過して、レンズ１１を介して透過光検出器１２で検出される。
【００７８】
ＸＹガルバノミラー６により一枚の画像に対応する範囲を走査しながら蛍光検出器１８ｂでＹＦＰの蛍光を検出することによりＹＦＰの蛍光画像が得られる。これと同時に透過光検出器１２で波長５１５ｎｍの透過光を検出することにより、ＹＦＰの蛍光画像に対応する、波長５１５ｎｍの透過光画像が同時に得られる。
【００７９】
第三の工程では、制御装置１９により以下の制御を行う。励起ダイクロイックミラーユニット５を回転制御して、励起ダイクロイックミラー５ｄを光路上に配置する。ＸＹ電動ステージ１５ａを駆動して、励起ダイクロイックミラー５ｄに対応するピンホール位置にピンホール１５を配置させる。バンドパスフィルターユニット２１を回転制御してＲＦＰ用バンドパスフィルター２１ｄを光路上に配置する。ＡＯＴＦ２を制御して、ＨｅＮｅ−Ｇレーザー１ｂで発せられる５４３ｎｍの波長のレーザー光を選択的にファイバー３に入射させる。
【００８０】
ファイバー３に入射したレーザー光はその内部を伝わり、ファイバー３の端面から射出され、コリメートレンズ４により平行光に変換される。波長５４３ｎｍのレーザー光は、励起ダイクロイックミラー５ｄで反射され、ＸＹガルバノミラー６を通過し、瞳投影レンズ７と結像レンズ８と対物レンズ９を経て試料１００に照射され、試料１００上に光スポットを結ぶ。この光スポットはＸＹガルバノミラー６により試料上を二次元的に走査される。
【００８１】
波長５４３ｎｍのレーザー光の照射により試料１００から発生したＲＦＰの蛍光は、レーザー光の照射経路を逆行し、励起ダイクロイックミラー５ｄに達し、これを透過する。励起ダイクロイックミラー５ｄを透過したＲＦＰの蛍光は、ミラー１３で反射され、共焦点レンズ１４により収束されてピンホール１５を通過し、分光ダイクロイックミラーユニット１６の中の空孔１６ｃを通過し、ＲＦＰ用バンドパスフィルター２１ｄを透過し、蛍光検出器１８ｂで検出される。
【００８２】
また、試料１００に光スポットを結んだ５４３ｎｍのレーザー光は試料１００を透過して、レンズ１１を介して透過光検出器１２で検出される。
【００８３】
ＸＹガルバノミラー６により一枚の画像に対応する範囲を走査しながら蛍光検出器１８ｂでＲＦＰの蛍光を検出することによりＲＦＰの蛍光画像が得られる。これと同時に透過光検出器１２で波長５４３ｎｍの透過光を検出することにより、ＲＦＰの蛍光画像に対応する、波長５４３ｎｍの透過光画像が同時に得られる。
【００８４】
このように時分割により得られる三種類の蛍光画像は、切り換えられる三枚の励起ダイクロイックミラー５ａ，５ｂ，５ｄの角度誤差のために、通常、それらの位置は互いにずれている。
【００８５】
第四の工程では、この位置ずれを補正するために、制御装置１９により以下の制御を行う。第一の工程で取得した透過光画像と第二の工程で取得した透過光画像と第三の工程で取得した透過光画像を画像処理して、三枚の蛍光画像の位置ずれ量を求める。そのずれ量に基づいて、前記第一の工程で取得したＣＦＰの蛍光画像と第二の工程で取得したＹＦＰの蛍光画像と第三の工程で取得したＲＦＰの蛍光画像との位置ずれを補正し、これらを表示手段２０に重ねて表示する。
【００８６】
本実施形態では、図示しないＰＣ等による走査開始の指令のみで、制御装置１９が上述した第一の工程、第二の工程、第三の工程、第四の工程を自動的に行なうので、励起ダイクロイックミラーの波長特性による蛍光取得効率の低下を招くことなく、三枚の蛍光画像を位置ずれなく重ねることができ、三重染色蛍光画像を容易に得ることができる。
【００８７】
また、本実施形態のように後からＨｅＮｅ−Ｇレーザー１ｂや励起ダイクロイックミラー５ｄを追加した場合でも、特別な調整などは一切行うことなく、画像位置ずれの無い三重染色蛍光画像を容易に得ることができる。
【００８８】
変形例
三種類の蛍光を励起するための三種類のレーザー光の出力が大きく異なる場合が予想される。このような場合、それぞれの透過光画像の明るさが大きく異なり、そのうちの特定のレーザー光に対しては検出器の出力が飽和してしまい、その後の画像処理が正確にできなくなるおそれがある。
【００８９】
本変形例では、第一の工程と第二の工程と第三の工程の各々における透過光検出器の出力が飽和しないように、各工程毎の透過光検出器のゲインを別々に設定にする。ゲインの設定は、各工程での検出器出力が同程度の輝度になるように設定すると好ましい。
【００９０】
このように、各工程で取得した透過光画像のゲインを各工程のレーザー出力強度に合せて別々に設定することより、それぞれのレーザー光の強度に大きな差があっても、第四の工程である画像処理において正確な処理が行える。
【００９１】
第三実施形態
本実施形態は、図１に示される第一実施形態の走査型レーザー顕微鏡のレーザー光射出手段に代えて適用可能な別のレーザー光射出手段であり、その構成を図１２に示す。図１２において、第一実施形態において既に説明した部材と同等の部材は同一の参照符号で示されており、以下の記載においてはその詳しい説明は省略する。
【００９２】
本実施形態のレーザー光射出手段は、図１２に示されるように、レーザー光源部１と光ファイバー３とコリメートレンズ４に加えて、二光子励起による蛍光を観察するための近赤外の極短パルスレーザー２２と、そのレーザー光をレーザー光源部１から射出されるレーザー光に同軸に結合させるための合成ダイクロイックミラー２３とを有している。
【００９３】
近赤外パルスレーザー光は可視レーザー光と同じ光ファイバーで導入することができないため、合成ダイクロイックミラー２３はコリメートレンズ４の後段に位置し、近赤外パルスレーザー２２で発せられるレーザー光をコリメートレンズ４から射出されるレーザー光に同軸に結合させる。
【００９４】
実際には、近赤外パルスレーザー２２から発せられるパルスレーザー光とコリメートレンズ４から射出される可視レーザー光の光軸角度差を完全に０に合せることは難しい。このため、励起ダイクロイックミラーユニット５へ入射する二つのレーザー光に角度差が生じ、角度差は蛍光画像の位置ずれに影響を与える。つまり、パルスレーザー光の照射により取得される蛍光画像の位置ずれは、励起ダイクロイックミラーユニット５の励起ダイクロイックミラー相互間の角度誤差に加えて合成ダイクロイックミラー２３の角度誤差の影響を受ける。
【００９５】
しかし、本実施形態では、これら両者の角度誤差の影響を合わせた位置ずれを、それぞれのレーザー光照射で取得される透過光画像を画像処理することによって補正できる。つまり、励起ダイクロイックミラーと合成ダイクロイックミラー２３の角度誤差の影響を別々に考慮することなく補正できる。
【００９６】
例えば、ＹＦＰの蛍光を一光子励起で取得し、ＣＦＰの蛍光を二光子励起で取得する場合を考える。最初に、励起ダイクロイックミラー５ｂと５１５ｎｍのレーザーを用いて一光子励起でＹＦＰの蛍光画像と波長５１５ｍの透過光画像を取得し、次に、励起ダイクロイックミラー５ｂを７８０ｎｍのパルスレーザー用の励起ダイクロイックミラーに切り換えて波長７８０ｍのパルスレーザーでＣＦＰの二光子蛍光画像と波長７８０ｎｍの透過光画像を取得する。それぞれの蛍光画像と同時に取得した各ダイクロイックミラー毎の透過光画像を画像処理することにより、位置ずれのない二光子蛍光（ＣＦＰ）と一光子蛍光（ＹＦＰ）の画像を得ることができる。
【００９７】
二光子蛍光の場合、特開２０００−３３００２９にも記載されているように、共焦点ピンホールに戻さず、走査手段であるＸＹガルバノミラー６と対物レンズの間で光路を分岐して蛍光検出してもよい。この場合、励起ダイクロイックミラーユニット５には、励起ダイクロイックミラーに代えて反射ミラーが装着される。
【００９８】
本実施形態では、新たに追加された励起ダイクロイックミラーの角度差だけでなく、新たに追加された近赤外パルスレーザー光用の励起ダイクロイックミラーへの入射角度差の影響による蛍光画像の位置ずれも特別な調整を行う必要なく容易に補正できる。
【００９９】
第四実施形態
本実施形態は、上述した実施形態の走査型レーザー顕微鏡の透過光検出手段に代えて適用可能な別の透過光検出手段であり、その構成を図１３に示す。
【０１００】
本実施形態の透過光検出手段は、図１３に示されるように、レンズ１１の代わりに、三枚のレンズ１１ａ，１１ｂ，１１ｃと視野絞り３１とを有している。視野絞り３１は、三枚のレンズ１１ａ，１１ｂ，１１ｃで構成される光学系に関して、試料１０と光学的に共役な位置に配置されている。
【０１０１】
このようなレンズ１１ａ，１１ｂ，１１ｃと視野絞り３１は市販されている光学顕微鏡の目視観察用透過照明系に必ず構成されている光学系である。試料１０を透過したレーザー光は、レンズ１１ａとレンズ１１ｂにより視野絞り３１に結像し、さらにレンズ１１ｃを介して透過光検出器１２で検出される。
【０１０２】
これまでの実施形態では試料を透過した光による透過光画像で画像処理を行っている。一般に試料として使われる細胞は無色透明なものが多く、試料上のわずかな透過率差が画像上のコントラストとなる。従って、試料によっては、このコントラストが低すきて、正確な画像処理ができない場合が考えられる。
【０１０３】
本実施形態は、このような不具合を解消するものであり、この視野絞り３１を絞ることにより、透過光検出器１２で得られる透過光画像に視野絞り３１が写し出されるようにする。透過光画像の画像処理では、視野絞り３１が写っている透過光画像に対して、視野絞り３１の内側の範囲を明、外側の範囲を暗として二値化処理し、明の部分の画像重心位置を求める。この画像重心位置の差は各励起ダイクロイックミラー毎の蛍光画像の位置ずれ量に対応している。従って、画像重心位置の差に従って蛍光画像の位置を補正すればよい。
【０１０４】
本実施形態は、走査型レーザー顕微鏡で使用する光学顕微鏡の透過照明系に必ず付随している視野絞りを画像処理に用いているので、各励起ダイクロイックミラー毎の透過光画像の画像処理を簡単な構成で正確に行うことができる。
【０１０５】
以上、各実施形態において、説明してきた内容は一平面の一つの画像について適用したものであるが、本発明はそれに限定されるものではない。例えば試料の三次元的な構造を観察するために走査型レーザー顕微鏡で通常行われる観察方法である、光軸方向に試料または対物レンズを移動させながら複数のスライス画像を取得していくＸＹＺ観察や、試料の時間的な変化を経時的に観察していくために、指定したインターバル毎に観察を行っていくＸＹＴ観察にも適用できる。この場合、画像処理に使用する透過光画像の取得は、各励起ダイクロイックミラーに対して少なくとも一回行えばよい。
【０１０６】
これまで、いくつかの実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。
【０１０７】
上述した実施の形態では、ＣＦＰやＹＦＰ等の蛍光蛋白で試料を染色していたが、これに限られるものではなく、多重染色可能な蛍光試薬であれば適用可能である。
【０１０８】
また、上述した実施の形態では、本発明を走査型のレーザー顕微鏡に適用したものであったが、発明の趣旨を逸脱しない範囲で変形可能であり、例えばレーザーを操作しない蛍光顕微鏡への適用も可能である。
【０１０９】
【発明の効果】
本発明によれば、それぞれの蛍光画像と同時に透過光画像を取得し、取得した蛍光画像に対応する透過光画像に基づいて複数の蛍光画像の間の位置ずれ量を求め、そのずれ量に基づいて複数の蛍光画像の位置ずれを補正することによって、複雑な調整や複雑な制御を必要とすることなく、複数の蛍光色素画像が位置ずれなく重ねられた画像を取得し得る走査型レーザー顕微鏡及びその画像取得方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】第一実施形態の走査型レーザー顕微鏡の構成を示している。
【図２】ＣＦＰの蛍光用の励起ダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図３】ＹＦＰの蛍光用の励起ダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図４】ＣＦＰの蛍光波長特性とＹＦＰの蛍光波長特性とＲＦＰの蛍光波長特性を示している。
【図５】ＣＦＰの蛍光とＹＦＰの蛍光を分光するための分光ダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図６】ＣＦＰ用バンドパスフィルターとＹＦＰ用バンドパスフィルターとＲＦＰ用バンドパスフィルターの透過率特性を示している。
【図７】二重励起タイプの励起ダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図８】画素数５１２×５１２の二枚の蛍光画像とこれらに好適な表示範囲を示している。
【図９】第一実施形態の走査型レーザー顕微鏡の第二変形例の構成を示している。
【図１０】第二実施形態の走査型レーザー顕微鏡の構成を示している。
【図１１】ＲＦＰの蛍光用の励起ダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図１２】図１の走査型レーザー顕微鏡のレーザー光射出手段に代えて適用可能な第三実施形態である別のレーザー光射出手段の構成を示している。
【図１３】第一実施形態と第二実施形態の走査型レーザー顕微鏡の透過光検出手段に代えて適用可能な第四実施形態である別の透過光検出手段の構成を示している。
【符号の説明】
１ａ  アルゴンレーザー
２  音響光学素子
５ａ，５ｂ  励起ダイクロイックミラー
６  ＸＹガルバノミラー
９  対物レンズ
１０  二重染色試料
１１  レンズ
１２  透過光検出器
１６ａ  分光ダイクロイックミラー
１７ａ，１７ｂ  バンドパスフィルター
１８ａ，１８ｂ  蛍光検出器
１９  制御装置
２０  表示手段
【図１】
0004854879.tif 000002
【図２】
0004854879.tif 000003
【図３】
0004854879.tif 000004
【図４】
0004854879.tif 000005
【図５】
0004854879.tif 000006
【図６】
0004854879.tif 000007
【図７】
0004854879.tif 000008
【図８】
0004854879.tif 000009
【図９】
0004854879.tif 000010
【図１０】
0004854879.tif 000011
【図１１】
0004854879.tif 000012
【図１２】
0004854879.tif 000013
【図１３】
0004854879.tif 000014