(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物が担持されている分子集合体を含み、その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離することによって、生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体であって、遊離する両親媒性分子が、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）
で表わされ、
式中、結合部位Ａは親水部と薬物とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部を結合する部位であり、親水部は、ポリエチレングリコールであり、−（結合部位Ｂ）−（疎水部）で表わされる部分は、下記式［I］、［II］又は［III］：
【化１】
0005038128.tif 000028
で表されるものである、薬物運搬体。
【請求項２】
薬物が担持されている分子集合体を含み、その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離することによって、生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体であって、遊離する両親媒性分子が、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）
または
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ａ）−（薬物）
で表わされ、
式中、結合部位Ａは薬物と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部を結合する部位であり、親水部は、ポリエチレングリコールであり、−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−で表わされる部分は、下記式［IV］：
【化２】
0005038128.tif 000029
で表わされるものである、薬物運搬体。
【請求項３】
分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、この分子集合体の分散液の希釈によるものである、請求項１又は２のいずれか１項に記載の薬物運搬体。
【請求項４】
分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、温度変化によるものである、請求項１から３までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。
【請求項５】
分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、プロトン、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンからなる群から選択される少なくとも１種の濃度変化によるものである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。
【請求項６】
分子集合体からの両親媒性分子の遊離がアミド結合の加水分解によるものである、請求項１から５までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。
【請求項７】
分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、ジスルフィド結合の還元によるものである、請求項２に記載の薬物運搬体。
【請求項８】
両親媒性分子の遊離に伴う分子集合構造の一部または全体的な破壊によって、分子集合体に保持されていた薬物が放出されるものである、請求項１から７までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。
【請求項９】
分子集合体が小胞体構造を有するものである、請求項１から８までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。
【請求項１０】
両親媒性分子の遊離に伴う小胞体構造の一部または全体的な破壊によって、小胞体内水相に保持されていた薬物が放出されるものである、請求項９に記載の薬物運搬体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子集合体に薬物を担持させ、分子集合体の構成成分の一部である両親媒性分子が分子集合体から遊離する現象を利用して薬物動態を制御する薬物運搬体製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、薬物を分子集合体中に組み込んだ薬物運搬体をドラッグデリバリーシステムとして利用する試みが盛んに研究され、一部は既に臨床応用されている。例えば、親水性の薬物に関しては、リン脂質分子が集合して構築する二分子膜小胞体、いわゆるリポソームの内水相に内包させた薬物運搬体がある。また、疎水性の薬物に関しては、ｏ／ｗエマルジョンであるリピッドマイクロスフェア、界面活性剤または両親媒性高分子が構築するミセルなどの分子集合体の疎水部に物理的に溶解あるいは化学的に担持させた薬物運搬体がある。あるいはリポソームの二分子膜疎水部に疎水性薬物を包埋させる場合もある。
これらの薬物運搬体を例えば血中に投与すると、主に細網内皮系の発達した臓器（例えば脾臓、肝臓など）の貪食細胞に取り込まれるため、血中滞留時間は著しく短く、これらの臓器を標的にする薬物運搬体に適用が限られる。そのため、血中滞留時間を延長させる方策が採られている。例えば水溶性で生体適合性の高い高分子であるポリエチレングリコール鎖などを被覆したリポソームが、いわゆるステルスリポソームとして多用されている。この技術は、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉらの血清アルブミンをポリエチレングリコール鎖で修飾する研究からはじまり、すでに１９９０年代前半にアデノシンデアミナーゼ、アスパラギナーゼを修飾したものが臨床認可されている。ポリエチレングリコール鎖にて蛋白質を修飾することで、抗原性の減少、血中滞留性の増大などの効果が得られることが報告されている。
ポリエチレングリコール鎖の表面修飾リポソーム（ＰＥＧ−リポソーム）は、細網内皮系の取り込みを回避し、長時間血中に滞留することができる。この特性を生かした、固形癌組織へのパッシブターゲティングがドラッグデリバリーシステムの戦略の一つになっている。
一般的に固形癌組織は、分岐の多い新生血管が異常に発達し、その血管壁は薄く不連続という特徴を有している。血中滞留性の高いＰＥＧ−リポソームは、そのサイズを３００ｎｍ以下にすると、癌組織の透過性の高い血管壁を介して血中から間質へ漏出することが可能となり、一旦出たものは管腔側に戻りにくく蓄積するようになる。そのため、ＰＥＧ−リポソームは、低分子の薬物よりも固形癌組織に高い集積性が得られるという効果、すなわち、ＥＰＲ効果を持っており、腫瘍組織へのターゲティングにおいては重要な要素のひとつである。
最近では、リポソーム表面に組織や臓器を特異的に認識する抗体、インテグリンの一部、またはリガンド分子を担持して、積極的な認識によって組織または臓器をターゲティングする試みが検討されている。これをアクティブターゲティングと呼んでいる。血中滞留時間を延長させる目的でポリエチレングリコール鎖にて表面修飾されたリポソームでは、この認識部位がポリエチレングリコール鎖で隠されているとアクティブターゲティングが阻害されるため、ポリエチレングリコール鎖の末端の一部に認識部位を結合させる方法が採用されている。
一方、別の側面であるリポソームの安定性から考えると、分子集合体であるリポソームはそれを構成する両親媒性分子を何らかのエネルギー照射にて水中に分散させ、疎水性相互作用により自己集合する現象を利用して調製するため、物理化学的には準安定状態である。従って、保存時に凝集または融合が起こり、やがて沈殿が起こる場合がある。そのため、血中安定性も考慮してリポソームの構成脂質には負電荷脂質またはコレステロールを混合させ、ポリエチレングリコール鎖または糖鎖でリポソームの表面を修飾することにより、その解決が図られてきた。そのため、ポリエチレングリコール鎖によるリポソームの表面修飾の方法が重要であり、ポリエチレングリコール鎖をジアシルホスファチジルエタノールアミンまたはコレステロールに結合させた脂質が広く使用されている。このポリエチレングリコール結合ジアシル型脂質はリン脂質二分子膜小胞体から遊離することが報告されている（Ｊ．Ｒ．Ｓｉｌｖｉｕｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，３１５３，１９９３、Ｋ．Ｓｏｕ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ，１１，３７２，２０００）。この脂質の遊離速度は、ポリエチレングリコール鎖の分子量と疎水部の大きさ（アシル鎖を構成する炭素数）、すなわち親水性−疎水性バランスによって左右され、親水部が相対的に大きい脂質が遊離し易い。そこで、我々は、モノデンドロン構造を利用して、一本のポリエチレングリコール鎖と多数のアルキル鎖を結合させた脂質を開発し、分子量の大きなポリエチレングリコール鎖を結合させても脱離し難い一連の両親媒性分子を手にすることができた（特許第３１８１２７６号公報）。
【発明の開示】
【０００３】
上述した研究背景の中で、本発明者らは、これまで合成した一連のポリエチレングリコール結合脂質を用いて、ポリエチレングリコール結合脂質のポリエチレングリコール鎖の末端に更に親水性の認識部位、例えば蛋白質などを結合させた場合、親水性−疎水性バランスがより親水性に傾くために遊離が起きてしまうことを明らかにした。このため、親水性の認識部位が遊離しないように当該認識部位をリポソームの表面に安定担持させる目的で、結合脂質の疎水部を大きくさせることを検討してきた。しかし、結果的には依然として遊離が起こり、完全に遊離を抑えることは困難であった。そして、完全に遊離を抑制する分子設計としては、例えば膜貫通蛋白質のようにペプチド鎖を複数回膜に貫通させた分子構造が必要であると思われた。これに対し、本発明者らは蛋白質結合ポリエチレングリコール鎖結合脂質の遊離現象を好ましくないものと考えずに、むしろ遊離速度を制御することによって、リポソームの血中滞留性の制御や薬物の徐放性の制御につながるとの発想の転換から、遊離現象を積極的に利用する方針への変更を検討するに至った。
本発明者らは、両親媒性分子からなる分子集合体に薬物を担持させ、分子集合体を構成する脂質（例えばポリエチレングリコール結合脂質）の遊離現象を利用し、薬物運搬体の体内動態が制御される薬物運搬体製剤を提供することを本発明の課題のひとつとした。さらに拡張して、希釈効果（濃度変化）、温度変化、ｐＨ変化、化学反応など様々な外部刺激によってその遊離が促進されれば、薬物運搬体の体内動態の積極的な制御法として利用できるので、これも課題のひとつとした。そして、本課題をリン脂質の分子集合体であるリポソームのみならず、エマルジョンまたはミセルなどの分子集合系を基盤とした薬物運搬体全体への適応に拡大させることも検討した。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、分子集合体を構成する両親媒性分子を所定の分子構造とし、当該分子集合体の外部環境を変えることで両親媒性分子の遊離を任意に調節し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、薬物が担持されている分子集合体を含む薬物運搬体であって、その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離することによって、生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体である。より具体的に、本発明は、以下に示した薬物運搬体等を提供するものである。
（１）薬物が担持されている分子集合体を含む薬物運搬体であって、その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離することによって、生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体。
（２）遊離する両親媒性分子が、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    １
または
（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｃ）−（薬物）    ２
［式中、結合部位Ａは親水部と薬物とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｃは疎水部と薬物とを結合する部位である］で表されるものである（１）記載の薬物運搬体。
（３）遊離する両親媒性分子が、
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    ３
または
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    ４
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｄは親水性高分子と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｅは認識部位と親水性高分子とを結合する部位である］で表され、この両親媒性分子の遊離によって生体内における薬物動態が制御される（１）記載の薬物運搬体。
（４）（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    ５
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｅは認識部位と親水部とを結合する部位である］で表される両親媒性分子５が担持されている分子集合体であって、該分子集合体に導入されている
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    ３
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｄは親水性高分子と親水部とを結合する部位である］で表される両親媒性分子３が両親媒性分子５の認識を阻害する状態にあって、両親媒性分子３の遊離によって両親媒性分子５の認識能が発現されることで生体内における薬物動態が制御されるものである（１）記載の薬物運搬体。
（５）遊離する両親媒性分子の疎水部が２本以上１８本以下の炭化水素鎖を含有するものである（１）から（４）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（６）遊離する両親媒性分子の結合部位Ｂにオリゴ糖鎖、オリゴペプチド鎖、ポリエステル鎖、ビニル系オリゴマーまたはデンドロン構造を含む（５）記載の薬物運搬体。
（７）遊離する両親媒性分子が、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）    ６
または
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ａ）−（薬物）    ７
［式中、結合部位Ａは薬物と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位である］で表されるものである（１）記載の薬物運搬体。
（８）遊離する両親媒性分子が、
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）    ８
または
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子）    ９
または
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子）    １０
または
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｅ）−（認識部位）    １１
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｄは親水性高分子と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｅは認識部位と親水性高分子とを結合する部位である］で表され、この両親媒性分子の遊離によって生体内における薬物動態が制御されるものである（１）記載の薬物運搬体。
（９）遊離する両親媒性分子の親水部または親水性高分子がポリエチレングリコールを含有するものである（１）から（８）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１０）分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、この分子集合体の分散液の希釈によるものである（１）から（９）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１１）分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、温度変化によるものである（１）から（１０）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１２）分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、プロトン、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンからなる群から選択される少なくとも１種の濃度変化によるものである（１）から（１１）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１３）遊離する両親媒性分子の親水部と疎水部とを結合する部位または疎水部に、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合及びシッフ塩基からなる群から選択される少なくとも１種の結合を含有し、かつ分子集合体からの両親媒性分子の遊離がこれらの結合の加水分解によるものである（１）から（１２）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１４）遊離する両親媒性分子の親水部と疎水部とを結合する部位または疎水部にジスルフィド結合を含有し、かつ分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、ジスルフィド結合の還元によるものである（１）から（１３）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１５）両親媒性分子の遊離に伴う分子集合構造の一部または全体的な破壊によって、分子集合体に保持されていた薬物が放出されるものである（１）から（１４）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１６）分子集合体が小胞体構造を有するものである（１）から（１５）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１７）両親媒性分子の遊離に伴う小胞体構造の一部または全体的な破壊によって、小胞体内水相に保持されていた薬物が放出されるものである（１６）記載の薬物運搬体。
本発明によれば、その目的に応じて運搬する薬物の体内動態を制御することができる薬物運搬体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａは、本発明の薬物運搬体に用いる両親媒性分子のモデル構造を示した図である。
図１Ｂは、本発明の薬物運搬体に用いる両親媒性分子のモデル構造を示した図である。
図２は、ＰＥＧ脂質の小胞体からの脱離挙動を比較したグラフである。
図３は、蛋白質担持リポソームからの蛋白質結合膜貫通型脂質の脱離挙動を比較したグラフである。
図４は、還元剤添加による蛋白質結合リポソームからの蛋白質の脱離挙動を比較したグラフである。
図５は、糖脂質のアルキル鎖数の相違による糖脂質のＣＭＣ測定結果を示したグラフである。
図６は、蛋白質の相違による蛋白質結合リポソームからの蛋白質結合膜脂質の脱離速度を比較したグラフである。
図７は、蛋白質分子量の相違による蛋白質結合リポソームからの蛋白質結合糖脂質の脱離速度を比較したグラフである。
図８は、ｐＨ応答性リポソームの低ｐＨによる加水分解後の薄層クロマトグラフィ検出結果を示した図である。
図９は、ｐＨ応答性リポソーム中に内包された蛍光分子のｐＨ変化による放出挙動を示したグラフである。
図１０は、ｐＨ応答性リポソーム中に内包された蛍光分子の各ｐＨにおける経時的な放出挙動を示したグラフである。
図１１は、ｐＨ応答性リポソーム中に内包された蛍光分子のｐＨ変化による放出挙動を示したグラフである。
図１２は、ジスルフィド脂質を含むリポソーム中に内包されたカルセインの還元剤添加による放出挙動を示したグラフである。
図１３は、種々のＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率のリポソーム分散液に対してＣｏｎ  Ａ溶液を添加した際の分散液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を示したグラフである。
図１４は、図１３の０．５分後、５分後の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）変化をＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率に対してプロットしたグラフである。
図１５は、２ｍｏｌ％ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入リポソームに１ｍｏｌ％ＰＥＧ脂質（Ｐ１２５−２Ｃ１４）を導入した系を、希釈倍率を変化させて希釈し、この系にＣｏｎ  Ａ溶液を添加した際の分散液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を示したグラフである。
図１６は、Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅが活性化血小板と特異的に結合すること、並びにＨ１２−ｖｅｓｉｃｌｅにＰＥＧを導入することにより結合が抑制されることを示したグラフである。
図１７は、ＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅのＰＥＧ脱離に伴う活性化血小板への結合率を比較したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明者らの分子集合科学に基づいた研究知見によれば、すべての分子集合体の構成分子は集合体と水相との間で平衡状態をとっており、リン脂質の場合にはその平衡は極めて集合体側に傾いている。しかし、親水性の高いポリエチレングリコール結合脂質、疎水性の低い一本鎖の脂肪酸、あるいはリン脂質のリゾ体などはより多くの分子が水相に遊離している状態で平衡となっている。そして、両親媒性分子の親水性−疎水性バランスの変化によってその両親媒性分子の遊離状態が制御される現象は、この平衡論に基づいて理解されている。例えば、分子集合体の水性分散液において、分子集合体が濃厚な状態では、遊離させたい両親媒性分子の平衡は集合体に傾いている。これを希釈すると、平衡状態は水相への遊離状態に傾き、遊離させたい両親媒性分子は遊離して新たな平衡状態に達する。また、平衡状態は温度の関数であるため、温度を上昇させると両親媒性分子は遊離して新たな平衡状態に達する。この様な物理的な因子で遊離を制御することができる。また、化学的な因子としては、両親媒性分子の疎水部や疎水部と親水部との結合部位を化学的に切断して疎水部を小さくすることによって、親水性−疎水性のバランスが親水性側に傾き、遊離を促進させることができる。切断される化学結合としては、加水分解性のエステル結合、アミド結合、ウレタン結合またはシッフ塩基等、または還元剤にて切断されるジスルフィド結合などが利用できる。
具体的に、本発明者らは、親水性−疎水性バランスを調節できる両親媒性分子として、大きな親水部を持つポリエチレングリコール型脂質、例えばジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にポリエチレングリコールを共有結合させた脂質、グリセロールのジアシル誘導体の水酸基にポリエチレングリコールを共有結合させた脂質、三官能性アミノ酸（グルタミン酸やリジン）のジアルキル誘導体のカルボキシル基やアミノ基にポリエチレングリコールを共有結合させた脂質などの、いわゆる大きな親水部に対してそれを二分子膜に安定固定させるための大きな疎水部を持つ必要性から分子設計を行い、多アシル型脂質の発明に至っている（特許第３１８１２７６号）。本発明者らは、これらの両親媒性分子を用いて、親水性−疎水性バランスが両親媒性分子の遊離速度に及ぼす影響を解析し、大きな疎水部を有する両親媒性分子のリポソームへの固定と遊離に関して、本発明の基礎となる多くの知見を集積し、さらに遊離を促進する物理的因子、化学的因子を整理した。
また、本発明者は、ポリエチレングリコール型脂質の固定とは逆の発想で、この脂質の遊離によって、むしろ効果的に外部刺激に応じた薬物の体内動態が制御できるという発想に至った。
以下、本発明の薬物運搬体についてより具体的に説明する。
まず、本発明の薬物運搬体に用いられる分子集合体について述べる。本発明の薬物運搬体に用いられる分子集合体は、薬物を担持させることができるものであれば特に限定されない。そのような分子集合体としては、例えば、高分子集合体、高分子ミセル、エマルジョン、リピドマイクロスフィア、二分子膜小胞体（リポソーム）、その他分子集合体（チューブ、ファイバー、リボン、シート等）を用いることができる。この分子集合体の構成成分としては、外部環境の変化によって分子集合体から遊離しうる両親媒性分子と、この遊離性両親媒性分子と分子集合体を形成する性質がある高分子とが含まれる。分子集合体を形成する高分子としては、遊離性の両親媒性分子と分子集合体を形成する性質があるものであれば特に限定されず、合成または天然の高分子を使用することができる。合成高分子としては、例えば、両親媒性のブロック共重合体または多糖類などの親水性の主鎖に疎水性の置換基を持つくし型高分子、あるいは両親媒性の膜タンパク質などが挙げられる。これらの高分子が形成する分子集合体の形状は高分子ミセルが一般的であるが、小胞体状またはファイバー状、チューブ状、シート状のものであってもよい。あるいは、ポリ［Ｎ−２（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］（ＰＨＰＭＡ）またはポリ［Ｎ−（イソプロピル）アクリルアミド］（ＰＮＩＰＡＭ）などの温度応答性のビニル系ポリマーなどが転移温度以上で形成する凝集体も分子集合体の構成成分として使用できる。
水と混じり合わないトリグリセリドなどの油滴をリン脂質などの界面活性剤などで安定化させたｏ／ｗエマルジョンやリピドマイクロスフェアは、脂溶性の薬物の安定分散に多用される。この場合、薬物としては、特に限定されるものではないが、例えばドキソルビシン誘導体またはパクリタキセルまたはメトトレキセートなどを用いることができる。
薬物運搬体として汎用されるリン脂質小胞体あるいはリポソームは、脂質及び／又はリポタンパク質によって、水性媒質中で分子間相互作用（疎水性相互作用、静電的相互作用、水素結合など）することにより、共有結合を介さずに構成された膜を持つ小胞構造の分子集合体であり、その膜は単層（一枚の二分子膜）又は多重層（ラメラ）膜を形成するものである。そのサイズは数十ナノメートルから数十マイクロメートルのものがあるが、好ましくは１０ナノメートルから１マイクロメートル、より好ましくは３０ナノメートルから３００ナノメートルである。その他、二分子膜のシート状、リボン状、チューブ状またはファイバー状などの集合形態があり、これらも本発明でいう分子集合体に含まれる。
小胞体構造を有する分子集合体は、小胞体の内水相または二分子膜に水溶性や脂溶性の薬物を保持させることができ、これにより血中滞留時間を延長させることができるので好ましい。小胞体構造を有するものの中でも、特にリン脂質小胞体あるいはリポソームが好ましい。
リン脂質小胞体あるいはリポソームは薬物運搬体の領域で開発が進んでおり、リン脂質単独、あるいはリン脂質とコレステロール及び／又は脂肪酸との混合脂質によって構成される。
リン脂質としては、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、多種の糖脂質などが挙げられる。これらのリン脂質は、エン（二重結合）、イン（三重結合）、ジエン、ジイン、トリエンなどの不飽和部を含有しても良いし、ビニル基などの重合性基、例えばスチリル基を含有しても良い。重合性リン脂質の具体例としては、１，２−ジ（オクタデカ−ｔｒａｎｓ−２，ｔｒａｎｓ−４−ジエノイル）ホスファチジルコリン、１，２−ジ（オクタデカ−２，４−ジエノイル）ホスファチジン酸、１，２−ビスエレオステアロイルホスファチジルコリンなどが挙げられる。リン脂質の含有量は分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、５〜７０モル％であることが好ましく、２０〜５０モル％であることがより好ましい。
アシル鎖を構成する脂肪酸としては、炭素数１２〜２０の飽和または不飽和脂肪酸が用いられる。例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、オクタデカ−２，４−ジエン酸などがある。更には、グリセロール骨格ではなく、３官能性アミノ酸、例えばグルタミン酸やリジン骨格を持つ両イオン性などのアミノ酸型脂質も使用することができる。脂肪酸の含有量は分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、１〜７０モル％であることが好ましく、５〜３０モル％であることがより好ましい。
分子集合体には、負電荷脂質を成分として添加することもできる。膜成分中に負電荷脂質を混合させることで小胞体同士の凝集が抑制され、被覆層数が減少して内包効率を増大させることができるからである。負電荷脂質としては、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、アニオン性アミノ酸型脂質などが使用できる。負電荷脂質の含有量は分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、１〜７０モル％であることが好ましく、５〜３０モル％であることが特に好ましい。
また、分子集合体には、脂質小胞体の膜成分としてステロール類を安定化剤として添加してもよい。そのようなステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレンを有する全てのステロイドが挙げられるが、好ましくはコレステロールである。ステロール類の含有量に制限はないが、小胞体膜の安定性を考慮すれば、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、５〜５０モル％であることが好ましく、より好ましくは１５〜４０モル％である。
本発明において、分子集合体には、外部環境の変化によって分子集合体から遊離しうる両親媒性分子が含まれる。当該両親媒性分子の含有量は、標的となる臓器・組織、薬物の種類、薬物の担持部位、担持方法、分子集合体の形態等に応じて適宜決定されるものであり、特に制限はないが、例えば、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜１００モル％であることが好ましく、０．０５〜５０モル％であることがより好ましく、０．１〜３０モル％であることが特に好ましい。
分子集合体の製造方法は特に限定されるものではなく、一般に公知の方法を用いることができる。例えば、リポソームの製造の手法としては、単独または混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し（エクストルージョン）法、超音波照射法、撹拌（ボルテックスミキシング、ホモジナイザー）法、凍結融解法、マイクロフルイダイザー法などで製造する方法、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールやエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、あるいは、単独または混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎＸまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去して形成する方法、その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用することができる。
このような分子集合体に薬物を担持させる方法は、薬物の種類等に応じて適宜選択すればよい。水溶性薬剤の場合には、例えば、リポソーム製造時に薬剤を水相に溶解させて調製することができる。あるいは、リポソームを製造した後に外水相に水溶性薬剤を添加し、リポソーム膜の透過性を利用して、内水相に薬剤を導入させることができる。内包されなかった水溶性薬剤はゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離できる。脂溶性薬剤の場合には、例えば、単独または混合脂質が有機溶媒に溶けている状態で薬剤を混合して、上述した方法でリポソームを形成させることにより、二分子膜の疎水部に薬物を導入することができる。また、官能基をもった両親媒性分子を含有するリポソームを形成させた後に、リポソーム表面に露出している官能基に、水相での化学反応を用いて薬物を担持させることもできる。あるいは、あらかじめリポソームを製造した後、水と混じり合う有機溶媒に薬剤を溶解させ、これを外水相に添加して薬剤を二分子膜の疎水部に導入させることができる。
次に、本発明の薬物運搬体の具体的態様について述べる。
本発明においては、分子集合体の外部環境の変化によって、分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が分子集合体から遊離する現象を利用する。本発明の薬物運搬体は、この両親媒性分子の遊離現象によって、生体内における薬物動態を制御するものである。「外部環境」とは、分子集合体をとりまく環境を意味し、温度、ｐＨ、分子集合体の希釈度、イオン環境、還元的雰囲気などが挙げられる。
分子集合体から遊離する両親媒性分子は、その分子内の親水部−疎水部バランスによって分子集合体からの遊離速度を制御することが可能である。遊離速度は、標的となる臓器・組織、薬物の種類、薬物の担持部位、担持方法、分子集合体の形態等に応じて適宜調節することができる。例えば、親水部に対し疎水部の比率が大きくなるように設計することにより、遊離速度を低下させることができる。逆に、疎水部に対し親水部の比率を大きくすることにより遊離速度を増大させることができる。
本発明の薬物運搬体は、分子集合体から一部の両親媒性分子が遊離することによって薬物動態を制御できるものであれば特に限定されない。本発明の薬物運搬体は、遊離する両親媒性分子の親水部、疎水部、薬物及び親水性高分子の組み合わせ並びに制御法により、例えば次の４つの態様が挙げられる。
本発明の第１の態様は、遊離する両親媒性分子の親水部あるいは疎水部に薬物を担持させることによって薬物動態を制御する態様である（図１Ａ（ａ））。本発明の第２の態様は、遊離する両親媒性分子の親水部に、親水性高分子、又は認識部位が結合した親水性高分子を担持させることによって薬物動態を制御する態様である（図１Ａ（ｂ））。本発明の第３の態様は、両親媒性分子が分子集合体から遊離してリポソーム等のキャリアー表面の認識部位が発現することによって薬物動態を制御する態様である（アクティブターゲティング、図１Ａ（ｃ））。本発明の第４の態様は、遊離する両親媒性分子が特に膜貫通型の構造を有することによって薬物動態を制御する態様である（図１Ｂ（ｄ））。以下、各態様について説明する。
（第１の態様）
本発明の第１の態様の薬物運搬体は、遊離する両親媒性分子が薬物、親水部及び疎水部から構成されており、遊離する両親媒性分子に薬物を担持させることによって薬物動態を制御するというものである（図１Ａ（ａ））。本態様における分子集合体から遊離する薬物を結合させた両親媒性分子（以下「薬物結合両親媒性分子」ということがある。）の構造としては、両親媒性分子１および２：
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    １
（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｃ）−（薬物）    ２
［式中、結合部位Ａは親水部と薬物とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｃは疎水部と薬物とを結合する部位である］が挙げられる。
（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）は、リン脂質、スフィンゴ脂質、またはアミノ酸型脂質などとして知られる公知の全ての両親媒性分子を対象とすることができる。親水部には、通常の両親媒性分子の親水部として用いられるものの他、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリグルタミン酸、ポリペプチドなどの親水性の高分子を含有する場合もある。
結合部位Ｂは、親水部と疎水部とを結合する部位であり、両親媒性分子において通常このような機能をもつものとして知られているものであれば特に限定されない。結合部位Ｂは、グリセロール、オリゴ糖類、オリゴペプチド類、ポリエステル類、ビニル系オリゴマー、グルタミン酸またはリジンなどのアミノ酸、あるいはこれらから構成される多分岐構造、たとえばデンドロン構造などを介して、一つの親水部と一つまたは二つ以上の疎水部とを結合している。これらの中でも、結合部位Ｂは、オリゴ糖鎖、オリゴペプチド鎖、ポリエステル鎖、ビニル系オリゴマーおよびデンドロン構造からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。例えば、グリシンユニットをスペーサーとしたグルタミン酸の繰返しからなるオリゴペプチド鎖は、側鎖にカルボン酸基を任意の数だけもっており、そこに疎水部をアミド結合またはエステル結合にて任意の数だけ導入することができ、親水部はオリゴペプチド鎖のＮ末端に結合できる。あるいは、オリゴアクリル酸またはオリゴビニルアルコールのカルボン酸基またはヒドロキシル基に疎水部を高分子反応にて結合させることができる。例えば、イニファーター重合にてこれらのオリゴマーを重合させた場合、分子量を制御するとともに、末端に官能基を導入させることができるため、この末端に親水部を結合させることができる。あるいは、グルタミン酸またはリジンからなるモノデンドロンでは、末端の官能基の数を世代数にて制御できる。第一世代では２個、第二世代では４個、第三世代では８個となる。ここに疎水部を結合させることによって疎水部の数を制御することができる。親水部はモノデンドロンの逆側に１個ある官能基に結合させることができる。
疎水部は、両親媒性分子に十分な疎水性を付与できるものであれば特に限定されない。例えば、疎水部としては、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、飽和高級アルコール、不飽和高級アルコール、ステロイド類などが使用される。これらは直鎖であってもよく分岐鎖であってもよい。
本発明においては、遊離する両親媒性分子の疎水部が２本以上の炭化水素鎖を有することが好ましい。ここでいう「疎水部が２本以上の炭化水素鎖を有する」とは、結合部位Ｂに炭化水素鎖が２本以上結合する場合をいう。炭化水素鎖は分岐鎖であってもよく、分岐鎖としては、例えば、長鎖にイソプレノイド構造を持つものが挙げられる。
炭化水素鎖の数は特に限定されないが、２本以上が好ましい。炭化水素鎖の数には上限は特に設定されないが、合成が容易である点で通常は１８本以下であることが好ましい。
疎水部に導入される炭化水素鎖としては、アルキル鎖、アルケニル鎖またはアルキニル鎖が好ましく、立体障害を最小にすることができ分子集合体に導入しやすいことから、特にアルキル鎖が好ましい。これらの炭化水素鎖は、両親媒性分子の疎水部として十分な疎水性を示し、かつ、分子集合体への導入を阻害しない範囲であれば、置換基を有していてもよい。また、炭化水素鎖は、酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ−（ただし、Ｒは置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を表す。）等で、中断されていてもよい。炭化水素鎖の炭素数は特に限定されるものではないが、４〜２４が好ましく、１０〜２０がより好ましく、１２〜１８が特に好ましい。なお、結合部位Ｂとしてグルタミン酸またはリジンを含む場合には、これらの持つ２個のカルボン酸基または２個のアミノ基に、上記の疎水部を結合させることもできる。
具体的に、（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）で表される両親媒性分子としては、ポリエチレングリコール脂質、糖脂質、ペプチド結合脂質、蛋白質（抗体、酵素等）結合脂質、核酸等薬物結合両親媒性分子、多アシル鎖型脂質、膜貫通型脂質などが採用できる。ポリエチレングリコール脂質の例としては、分子量２００Ｄａから１２５００Ｄａ程度、好ましくは１０００Ｄａから５０００Ｄａ程度の片末端、あるいは両末端にアミノ基、カルボキシル基、水酸基、マレイミド基等の置換基を持つポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体などが挙げられ、またそれらの末端置換基を活性化した誘導体も含まれる。糖脂質は還元性末端基を有するもので、分岐または直鎖の糖重合度が２〜４００のオリゴ糖や多糖であればよく、天然糖または合成糖のいずれでも良い。オリゴ糖は、例えば、グルコース、フルクトース、キシロース、ガラクース、マンノース、グルコサミン等の一種又は二種以上がα結合またはβ結合した糖であり、例えば、マルトオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖、セロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、ラクトオリゴ糖、メリオリゴ糖、イヌロオリゴ糖などが挙げられる。多糖類では、デンプン、セルロース、ムコ多糖類（ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマンタン硫酸、ケタラン硫酸、ヘパリン等）、キチン、キトサン、その他多糖類の分解物、細胞、細菌由来の複合糖質等が挙げられる。
本態様において、薬物は、結合部位Ａによって親水部に結合された式１で表される両親媒性分子１、または、結合部位Ｃによって疎水部末端に結合された式２で表される両親媒性分子２によって分子集合体に共集合により導入される。結合部位Ａ、Ｃは、それぞれ薬物を親水部または疎水部と結合する部位である。結合部位Ａ、Ｃとしては、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、ウレタン結合、ジスルフィド結合、メルカプト基とマレイミド基とが付加した結合などが挙げられる。
本発明の薬物運搬体に担持させることのできる薬物は、少なくとも標的となる臓器または組織の一つに作用するものであれば特に限定されない。そのような薬物としては、例えば、酵素、ペプチド又はタンパク質、各種抗生物質、各種ペプチド性ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＳｉＲＮＡ、プラスミド、各種抗がん剤、中枢神経系用薬、末梢神経用剤、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官および肛門用薬、外皮用薬、歯科口腔用剤、ビタミン剤、滋養強壮薬、血液および体液用薬、人工透析用薬、その他の代謝性医薬品、細胞賦活用剤、腫瘍用薬、放射性医薬品、アレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、抗生物質製剤、化学療法剤、生物学的製剤、診断用薬などがある。ペプチドまたはタンパク質の一例としては、インターロイキン等の各種サイトカイン、細胞伝達因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、ケラチン、プロテオグルカン等細胞外マトリックス剤としてのポリペプチドまたはその構造の一部としてのオリゴ体、あるいはオキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の機能性ポリペプチドが挙げられる。酵素としては、カタラーゼ、キモトリプシン、チトクローム、アミラーゼなどが挙げられるが、これらに何ら限定されるものではない。これらの薬物は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
この分子集合体を、例えば、血中に投与すると、分子集合体が希釈されることによって、リポソームに担持された薬物結合両親媒性分子が遊離する。遊離した薬物結合両親媒性分子は、血流に乗って循環し、吸収・代謝・排泄される。このため、薬物結合両親媒性分子は平衡に達することなく分子集合体から一方的に遊離する。遊離速度は、薬物結合両親媒性分子の親水性−疎水性バランスが親水性側に傾いた両親媒性分子ほど速い。この遊離速度は、親水部における親水性高分子の分子量または電荷量、あるいは疎水部におけるアルキル長鎖などの炭化水素鎖の長さまたは本数によって制御することができる。
両親媒性分子１または２の親水性−疎水性バランスは、薬物の種類、標的となる臓器または組織、病態、両親媒性分子１または２自体の動態などに応じて適宜設計すればよい。この様な両親媒性分子１または２は、上述した方法により分子集合体、例えばリン脂質からなるリポソームの二分子膜に導入することができる。
第１の態様において、両親媒性分子１および２の含有量は、薬物の種類、標的となる臓器または組織、病態などに応じて適宜決定されるものではあるが、それぞれ、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜３０モル％であることが好ましく、０．１〜１０モル％であることが特に好ましい。
（第２の態様）
本発明の第２の態様の薬物運搬体は、遊離する両親媒性分子の親水部に、親水性高分子、又は認識部位が結合した親水性高分子を担持させることによって薬物動態を制御するというものである（図１Ａ（ｂ））。本発明の第２の態様の薬物運搬体は、第１の態様の「薬物」の部分が「親水性高分子」となっており、基本的に親水性高分子、親水部及び疎水部を含むものである。また、本態様には、親水性高分子に、さらに認識部位が結合されたものも含まれる。
本態様における分子集合体から遊離する両親媒性分子の構造としては、分子内に親水性高分子が結合した両親媒性分子３および４：
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    ３
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    ４
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｄは親水性高分子と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｅは認識部位と親水性高分子とを結合する部位である］が挙げられる。
式３または４で表される両親媒性分子は、例えばリン脂質と共集合させることにより、リポソームの表面を親水性高分子によって修飾することができるものである。親水性高分子としては、第１の態様の親水部の説明で記載したものと同じものを使用できる。親水性高分子の分子量は２００Ｄａから２００００Ｄａ程度であることが好ましく、２０００Ｄａから１２５００Ｄａ程度であることが特に好ましい。親水性高分子がポリエチレングリコール鎖であれば、修飾していないリポソームと比較してリポソームの血中滞留時間を大幅に延長させる効果がある。また、親水性高分子自体を、臓器または組織を構成する細胞に認識されやすい多糖類とすることにより、その臓器または組織に対する特異性を高めることができる。特に、両親媒性分子４は、例えば表面修飾ポリエチレングリコール鎖などの親水性高分子の末端にオリゴペプチド鎖または糖鎖などの認識部位を有しており、薬物運搬体の体内動態を制御することができる。
本発明では、両親媒性分子３または４が外部環境の変化で遊離することによって、薬物運搬体の体内動態をより精度よく制御することができる。例えば、リポソームを修飾しているポリエチレングリコール結合脂質がリポソームの血中滞留時間を増大させているが、これがリポソームから遊離することによって、血中滞留時間を短くすることができる。遊離する速度は、ポリエチレングリコールの分子量または疎水部の大きさによって調節できる。また、両親媒性分子４を導入したリポソームでは、両親媒性分子４を認識する臓器または組織を構成する細胞への特異的な集積性を高めることができるが、両親媒性分子４の遊離によって特異性が低下して、さらに遊離した両親媒性分子４がその被認識部位に結合して、両親媒性分子４が修飾されているリポソームの認識を阻害するのでより特異性が低下する。更には、両親媒性分子３および４を混合してリポソーム表面に導入し、更にそれらの遊離速度を各々制御することによってより精度高く薬物運搬体の体内動態を制御することができる。
結合部位ＤまたはＥは、それぞれ親水性高分子と親水部との結合、あるいは親水性高分子と認識部位との結合であれば特に限定されない。そのような結合部位ＤまたはＥとしては、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、ウレタン結合、ジスルフィド結合、メルカプト基とマレイミド基との縮合結合やアルデヒド基とアミノ基とのシッフ塩基などが挙げられる。
認識部位としては、標的となる臓器または組織を特異的に認識するものであれば特に限定されない。認識部位の一例としては、上記記載のオリゴ糖、抗体、ペプチドホルモン、レクチン、糖タンパク等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
第２の態様において、両親媒性分子３および４の含有量は、所望の血中対流時間や認識能に応じて適宜決定されるものではあるが、それぞれ、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜５０モル％であることが好ましく、０．１〜２０モル％であることが特に好ましい。
（第３の態様）
本発明の第３の態様の薬物運搬体は、分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が遊離することによって分子集合体表面の認識部位が発現し、それにより薬物動態を制御するというものである（図１Ａ（ｃ））。本態様の薬物運搬体としては、例えば、両親媒性分子５が担持されている分子集合体であって、該分子集合体に導入されている両親媒性分子３が両親媒性分子５の認識を阻害する状態にあって、両親媒性分子３の遊離によって両親媒性分子５の認識能が発現されることで薬物動態が制御される薬物運搬体が挙げられる。
本態様において、両親媒性分子５および３：
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    ５
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）    ３
［式中、結合部位Ｂおよび結合部位Ｄは前記と同じ意味であり、結合部位Ｅは認識部位と親水部とを結合する部位である。］を共に分子集合体の表面に共集合させる場合、両親媒性分子３の親水性高分子は、両親媒性分子５の認識部位よりも分子量が大きい親水性高分子であることが好ましい。このような組み合わせで両親媒性分子を用いることにより、親水性高分子によって分子集合体表面の認識部位を、臓器または組織の細胞による認識から阻害することができる。この状態で分子集合体を血中に投与すると希釈効果等の外部環境の変化によって両親媒性分子３が遊離する。これに伴って、両親媒性分子５の認識部位がリポソームの表面に露出するとその認識部位によって臓器または組織を構成する細胞への特異的な集積性が高まるため、薬物運搬体の体内動態を制御することができる。さらに、両親媒性分子５が遊離することによって特異的な集積性が低下し、これによっても薬物運搬体の体内動態を制御できる。両親媒性分子５の有する認識部位としては、第２の態様で述べたものと同じものを例示することができる。
例えば、両親媒性分子５としては、グルタミン酸またはリジンなどの親水部の末端にオリゴペプチド鎖または糖鎖などの認識部位を有するものが挙げられる。特に糖鎖は糖結合タンパク質であるレクチンによって構造特異的に認識されることから、糖鎖を認識部位として有する両親媒性分子５を含む分子集合体は、細胞膜表面上のタンパク質や糖鎖などのリガンドやレセプターを特異的に認識するキャリアとして利用することができ、有用性が高い。
両親媒性分子３としては、第２の態様において述べたものと同じものを例示することができる。本態様では、両親媒性分子３の有するポリエチレングリコール鎖などの親水性高分子によって、両親媒性分子５の認識能が阻害される。両親媒性分子３における親水性高分子は、両親媒性分子５の認識能を阻害できるものであれば特に制限されないが、分子量が２００Ｄａから２００００Ｄａ程度であることが好ましく、２０００Ｄａから１２５００Ｄａ程度であることが特に好ましい。
第３の態様において、両親媒性分子５の含有量は、所望の認識能に応じて適宜決定されるものではあるが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜５０モル％であることが好ましく、０．１〜３０モル％であることが特に好ましい。また、両親媒性分子３の含有量は、両親媒性分子５の認識能を阻害できる範囲であれば制限はないが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜３０モル％であることが好ましく、０．０５〜１０モル％であることが特に好ましい。
なお、両親媒性分子３の遊離速度は、親水性高分子の分子量または電荷量あるいは疎水部の大きさによって制御することができる。両親媒性分子５の遊離速度についても同様の方法で制御することができる。従って、これらの両親媒性分子の相対的な遊離速度は目的に応じて適宜設計することができる。
（第４の態様）
本発明の第４の態様は、分子集合体の膜を貫通する膜貫通型両親媒性分子が遊離することによって、薬物運搬体の体内動態を制御するというものである（図１Ｂ（ｄ））。上述した第１〜３の態様で例示した両親媒性分子の構造は、遊離する両親媒性分子が、簡単には親水部−疎水部で示される構造で分類されるものであるが、本発明に用いられる両親媒性分子は親水部−疎水部−親水部で示される構造で分類されるものであっても良い。本態様においては、このような構造を有する両親媒性分子が好ましい。
本態様に用いられる両親媒性分子としては、具体的には、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）    ６
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ａ）−（薬物）    ７
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）    ８
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子）    ９
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子）    １０
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｅ）−（認識部位）    １１
［式中、結合部位Ａ、結合部位Ｂ、結合部位Ｄおよび結合部位Ｅは前記と同じ意味である。］で表される両親媒性分子などが挙げられる。
これらの両親媒性分子は、例えば、リポソームの二分子膜において二分子膜を貫通する構造で集合体中に導入される。疎水部は一本鎖でも二本鎖以上でも構わないが、これは結合部位Ｂによって決まる。また、疎水部の長さは二分子膜を貫通できる長さであれば構わないが、炭素数では２０〜５０、好ましくは２８〜３６である。両親媒性分子７または９のような対称型の構造は合成が容易であるが、例えばリポソームを形成した場合にリポソームの内水相側にも親水性高分子または薬物が配向することになる。このことは遊離速度の制御、即ち薬物動態の制御として都合が良い場合もあるが、親水性高分子または薬物がリポソーム表面に露出しないため、これらが有効に機能し得ず、無駄になる場合がある。後者の場合には、リポソームに両親媒性分子を導入した後、表面に露出している両親媒性分子の末端にのみ薬物または親水性高分子を結合部位Ａまたは結合部位Ｄを介して結合させることもできる。膜貫通型両親媒性分子の場合、遊離速度の制御は親水性−疎水性バランスのほか、内水相に面している親水部の大きさや電荷量も重要な因子となる。すなわち、膜貫通型両親媒性分子の疎水性が低くても、内水相に面している親水性が強ければ膜貫通型両親媒性分子はリポソームから遊離し難くなる。
第４の態様において、両親媒性分子６〜１１の含有量は特に制限されないが、それぞれ、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜１００モル％であることが好ましく、０．１〜２５モル％であることが特に好ましい。
（両親媒性分子の遊離速度の制御方法）
両親媒性分子の分子集合体からの遊離現象は、外部環境の変化により生じる。「外部環境」とは、前述したように分子集合体をとりまく環境を意味し、外部環境としては、例えば、分子集合体を希釈するための希釈液、分子集合体の温度を変化させる周囲温度、分子集合体のｐＨを変化させるための周囲水素イオン濃度などが挙げられる。このように外部環境の変化としては、血中投与した際の希釈による平衡状態から非平衡状態へのシフトに限らない。平衡状態は温度によってもシフトする。例えば、温度が上昇すると平衡状態は遊離側にシフトするので、遊離を促進させることができる。さらに分子集合体の運動性にも影響を受ける。例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリンリポソームの場合、ゲル−液晶相転移温度は４２℃にあるが、相転移温度以下の３５℃よりも相転移温度付近の４０℃や相転移温度以上の４３℃の方が膜の分子充填状態が乱れて遊離し易くなる。従って、カイロ、赤外線、マイクロウエーブまたはカテーテルなどによる局所加温によって分子集合体から両親媒性分子を局所的に遊離させることができる。あるいは酸化鉄の微粒子をリポソームに内包させて、これをマイクロウエーブで加温させることによって、当該リポソームの温度を局所的に制御できる。相転移温度は、相転移温度の異なる脂質の組合せとその組成、例えばジミリストイルフォスファチジルコリンとジパルミトイルフォスファチジルコリンの組成を変えることにより変化させることができる。また、ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）などの温度応答性高分子が遊離する両親媒性分子の親水性高分子であれば、相転移温度以下では親水性が高まり遊離し易くなる。
分子集合体からの両親媒性分子の遊離速度は、例えば、プロトン、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンの濃度変化を利用することにより調節することができる。例えば、親水部にアミノ基を持たせれば、低ｐＨでのアミノ基のプロトン化によって親水性が向上し遊離速度が大きくなる。また、親水部にカルボン酸基を持たせれば、高ｐＨでのカルボン酸基の解離によって親水性が向上し遊離速度が大きくなる。
あるいは、遊離する両親媒性分子の結合部位または疎水部にエステル結合、アミド結合、ウレタン結合及びシッフ塩基からなる群から選択される少なくとも１種の結合を含有し、分子集合体からの両親媒性分子遊離現象がこれらの結合の加水分解によるものであることも好ましい。例えば、結合部位Ｂがリジンであり、そのカルボキシル基に長鎖アルコールをエステル結合させて疎水部を導入し、更にはアミノ基には長鎖脂肪酸をアミド結合させて疎水部を導入した両親媒性分子、または結合部位が２−アミノペンタン二酸などのジカルボン酸誘導体であり、そのカルボキシル基に長鎖アルコールをエステル結合させて疎水部を導入した両親媒性分子、あるいはグリセロールに脂肪酸をエステル結合させて疎水部を導入した両親媒性分子は、ｐＨの低下によって加水分解が起こり、その結合が解離することによって両親媒性分子の親水性−疎水性バランスが大きく親水性側に傾き、分解された両親媒性分子の遊離が起こる。この遊離によってリポソームの二分子膜の分子充填状態が大きく乱れ、内包された薬物の放出が促進されるので、薬物運搬体の体内動態を制御することができる。この体内動態は、血流または臓器、組織のみならず細胞内をも含めることができ、ｐＨ変化に応答して両親媒性分子を遊離する系は細胞内での動態制御にも用いられる。
また、親水部にリン酸基を持つ両親媒性分子は、カルシウムイオンなどの２価のカチオンと結合し、親水性−疎水性バランスが疎水性側に傾き、その遊離速度が低下する。本発明においてはこの現象も利用することができる。更には、クエン酸などのキレート剤によってこのカルシウムイオンを捕捉することによって、抑制されていた遊離速度を促進させることもできる。一般に、解離基を親水部にもち、これによって親水性−疎水性バランスが制御されている両親媒性分子では、水相のイオン強度の増大に伴って電荷遮蔽が起こるため、このバランスは疎水性側に移動して遊離速度が減少する。
遊離する両親媒性分子の結合部位Ｂまたは疎水部にジスルフィド結合を含有し、分子集合体からの両親媒性分子の遊離現象が、ジスルフィド結合の還元による切断であることも好ましい。このような両親媒性分子としては、例えば、システインのアミノ基に脂肪酸をアミド結合にて導入し、もう一つの疎水部をアルカンチオールのジスルフィド結合にてシステインのメルカプト基に導入し、カルボン酸基には親水部を導入させたものが挙げられる。あるいは、疎水部のアルキル鎖にジスルフィド基を導入させる方法も有効である。これは上記の両親媒性分子６から１１までの膜貫通型両親媒性分子の疎水部に導入する場合も含まれる。ジスルフィド基は複数導入することができる。結合部位に導入する場合は、結合部位Ｂに導入するのが好ましい。
これらのジスルフィド基は、生体内または細胞内の還元作用、例えばシステインまたはグルタチオンなどによる還元によって切断されると、両親媒性分子の親水性−疎水性バランスが親水性側に傾き、切断された両親媒性分子が遊離する。本発明はこの現象を利用するものである。
その他、外部環境の変化による両親媒性分子の分子集合体からの遊離を促進する方法としては、ずり応力、振動、光反応、ラジカル反応、活性酸素による過酸化反応、生体由来の界面活性作用などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
本実施例では、リジンをスペーサー（結合部位Ｂに相当する）として親水部にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、疎水部に２本のアルキル基を有する化合物を合成した。
（Ａ）まず、リジンのカルボキシル基に保護基を以下のようにして導入した。すなわち、Ｌ−リジン（５．１ｇ、３５．２ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（１４．７ｇ、７７．３ｍｍｏｌ）およびベンジルアルコール（１４．０ｇ、１２４．１ｍｍｏｌ）を溶媒ベンゼン（３０ｍＬ）に溶解させ、生成水を除去しながら、１００℃で６時間還流させた。溶媒を減圧除去した後、残分に対し、ジエチルエーテルにて再沈殿精製を３回行った。この精製した生成物をメタノール／ジエチルエーテルの混合溶媒から４℃で再結晶し、濾過し、乾燥してカルボキシル基をベンジルエステルで保護したリジン誘導体１（化合物１）を白色固体として得た（１８．０ｇ、収率８８％）。
0005038128.tif 000002
リジン誘導体１の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．２（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３０３４；２９５２［νＮ−Ｈ（ＮＨ３＋）］；１７４９［νＣ＝Ｏ（エステル）］；１６００［δＮ−Ｈ（ＮＨ３＋）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：１．２８，１．４０（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；１．５１（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．８０（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；２．２９（ｓ，６Ｈ，−ＣＨ３）；２．７０（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．０９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；５．２５（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２）；７．１２，７．４８（８Ｈ，ｐ−Ｔｏｓ−ａｒｏｍａ．）；７．３５−７．４２（５Ｈ，ａｒｏｍａ．）；７．６７，８．３８（ｓ，６Ｈ，−ＮＨ３＋）。
（Ｂ）リジン誘導体１のアミノ基に疎水性基としてアルキル基を以下のようにして導入した。すなわち、パルミチン酸（３．２ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．６ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）を溶媒クロロホルムに溶解させ２５℃で３０分間撹拌した後、リジン誘導体１（３．０ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．２ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を４℃で１２時間撹拌し、グラスフィルター（Ｇ４）で濾過した後、溶媒を減圧除去した。残分をクロロホルム（１００ｍＬ）に再溶解させ、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回、水で３回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧除去した。メタノール（２００ｍＬ）から４℃で再結晶し、濾過後、乾燥して各アミノ基にそれぞれアルキル基をアミド結合させたリジン誘導体２（化合物２）を白色固体として得た（２．９ｇ、収率７９％）。
0005038128.tif 000003
リジン誘導体２の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５３（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３１１［νＮ−Ｈ（アミド）］；１７４８［νＣ＝Ｏ（エステル）］；１６４０［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８５（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２３（ｓ，５０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．４６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．５８（ｍ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．６６，１．８２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．１２，２．２０（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．１６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．５８（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；５．１３（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２）；５．６５（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；６．１６（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；７．２９−７．３７（５Ｈ，ａｒｏｍａ．）。
（Ｃ）リジン誘導体２（１．５２ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）をクロロホルム／メタノール混合溶媒（１０／７（容量／容量））に溶解させ、１規定の水酸化ナトリウム水溶液（３．４ｍＬ）を添加した。この反応混合物を２５℃で４時間撹拌した後、１規定塩酸水溶液を添加し（ｐＨ３．０まで）、溶媒を減圧除去した。残分を水およびメタノールで洗浄し、乾燥してジパルミトイルリジン誘導体３（化合物３）を白色固体として得た（１．３ｇ、収率９８％）。
0005038128.tif 000004
ジパルミトイルリジン誘導体３の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．４５（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３０５［νＮ−Ｈ（アミド）］；１７２１［νＣ＝Ｏ（カルボニル）］；１６３８［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８４（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２４（ｓ，５０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．４７（ｍ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．５５，１．６７（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．０２，２．０９（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；２．９９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．１４（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；７．５５（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；７．７８（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；１２．２３（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）。
ＭＳ（ＬＣＱ）：Ｃ３８Ｈ７４Ｎ２Ｏ４についての計算値：６２３．０：実測値：６２３．５（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｄ）パルミチン酸の代わりにミリスチン酸、ステアリン酸を用いた以外は上記（Ｂ）および（Ｃ）と同様の操作により、それぞれ白色固体のジアルキルリジン誘導体（ジミリストイルリジン誘導体４（化合物４）およびジステアロイル誘導体５（化合物５））を得た。
0005038128.tif 000005
ジミリストイルリジン誘導体４の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．４０（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３０５［νＮ−Ｈ（アミド）］；１７２１［νＣ＝Ｏ（カルボニル）］；１６３８［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８４（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２４（ｓ，４２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．４７（ｍ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．５５，１．６７（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．０２，２．０９（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；２．９９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．１４（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；７．５５（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；７．７８（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；１２．２３（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）。
ジステアロイル誘導体５の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５３（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３０５［νＮ−Ｈ（アミド）］；１７２１［νＣ＝Ｏ（カルボニル）］；１６３８［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８４（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２４（ｓ，５６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．４７（ｍ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．５５，１．６７（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．０２，２．０９（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；２．９９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．１４（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；７．５５（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；７．７８（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；１２．２３（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）。
（Ｅ）ジパルミトイルリジン誘導体３とポリエチレングリコールとを以下のようにして結合させた。すなわち、ジパルミトイルリジン誘導体３（１２５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（４１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）をクロロホルムに溶解し、４℃で１時間撹拌した後、分子量５０００のモノメトキシアミノポリエチレングリコール（５００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（２４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を溶解したクロロホルム溶液中に滴下した。この反応混合物を２５℃で６時間撹拌した後、グラスフィルター（Ｇ４）で濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下した。沈殿物を濾過回収し、乾燥した後、シリカゲルカラム（溶媒：クロロホルム／メタノール＝６／１（容量／容量）で両親媒性化合物６（化合物６）を単離した（５００ｍｇ、収率８８％）。
0005038128.tif 000006
化合物６の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．７３（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３２９４［νＮ−Ｈ（アミド）］；１６３４［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．６３−１．８０（８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．２７，２．３８（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．２９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；３．３８（３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ３）；３．４３（２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．６６（ＰＥＧ）；４．３９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：１４．１２；２２．６８；２５．７４；２８．７５；２９．３４；２９．５３；２９．６５；３１．９２；３６．３５；３８．１３；５９．０２；７０．４４；７１．９５。
（Ｆ）上記（Ｅ）と同様の操作により、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量と疎水基の炭素数が異なる組合わせで次の化合物を得た。
Ｐ５０−２Ｃ１４の分析結果：ＰＥＧ分子量（５０００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×２）
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５５（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３２９４［νＮ−Ｈ（アミド）］；１６３４［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，４６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．６３−１．８０（８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．１５，２．２３（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．２９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；３．３８（３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ３）；３．４３（２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．６６（ＰＥＧ）；４．３９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）。
Ｐ１２５−２Ｃ１４の分析結果：ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×２）
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５０（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３２９４［νＮ−Ｈ（アミド）］；１６３４［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，４６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．６３−１．８０（８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．１５，２．２３（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．２９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；３．３８（３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ３）；３．４３（２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．６６（ＰＥＧ）；４．３９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）。
Ｐ１２５−２Ｃ１６の分析結果：ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１６ＣＨ３×２）
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．６３（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３０５［νＮ−Ｈ（アミド）］；１６３８［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５６［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．６３−１．８０（８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．２７，２．３８（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．２９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；３．３８（３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ３）；３．４３（２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．６６（ＰＥＧ）；４．３９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）。
【実施例２】
【０００７】
本実施例では、実施例１の方法で得られたリジン型ＰＥＧ脂質（以下「ＰＥＧ脂質」という）の小胞体への導入安定度および小胞体凝集抑制効果をＰＥＧ脂質構造との相関から明らかにした。
小胞体分散液（１７．０ｍＭ，１５．０ｍＬ）にＰＥＧ脂質水溶液（１７．０μＭ，２２．６ｍＬ）を混合後３７℃にて撹拌しＰＥＧ脂質導入小胞体分散液を得た。このＰＥＧ脂質導入小胞体分散液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．０）で６倍希釈し、１２時間後まで経時的に導入量を測定した。導入量は以下のように算出できる（Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｈ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９１，１２，８６１）。
ＰＥＧ脂質導入小胞体分散液を超遠心分離（３３，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）して、未導入ＰＥＧ脂質を分離した後、真空乾燥してＣＤＣｌ３に溶解した。不溶成分をＰＴＦＥフィルター（０．２μｍ）で除去した後、１Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、ＤＰＰＣコリンメチルプロトン（δ＝３．３６ｐｐｍ）とＰＥＧ鎖メチレンプロトン（δ＝３．６４ｐｐｍ）の面積比を利用して導入率を算出した。超遠心分離を行ったものと行っていないものの小胞体コリンメチルプロトンの積分値を一定としたときのＰＥＧ鎖メチレンプロトンの積分値をそれぞれＨＰＥＧ＋、ＨＰＥＧ−とし、ＰＥＧ脂質の仕込み濃度をＡ（ｍｏｌ％）とすると、ＰＥＧ脂質導入量は次式から算出できる。
［ＰＥＧ−ｌｉｐｉｄ］＝Ａ×（ＨＰＥＧ＋／ＨＰＥＧ−）    （ｍｏｌ％）
ＰＥＧ脂質の小胞体からの脱離挙動
ＰＢＳ（ｐＨ７．０）により６倍希釈した後のＰＥＧ脂質の小胞体からの脱離挙動の観測結果（１Ｈ−ＮＭＲ）を図２に示した。図２中の記号はそれぞれ、（●）Ｐ５０−２Ｃ１４，（○）Ｐ１２５−２Ｃ１４，（▲）Ｐ５０−２Ｃ１６，（△）Ｐ１２５−２Ｃ１６，（□）Ｐ１２５−２Ｃ１８，（■）Ｐ１２５−４Ｃ１６，（◆）Ｐ５０−ＤＰＰＥ，（◇）Ｐ１２５−ＤＳＰＥを表す。２本鎖のＰＥＧ脂質については、Ｐ１２５−２Ｃ１８（ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１６ＣＨ３×２））、Ｐ１２５−４Ｃ１６（ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×４））およびＰ５０−２Ｃ１６（ＰＥＧ分子量（５０００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×２））では脱離が認められなかったのに対し、Ｐ１２５−ＤＳＰＥ（ＰＥＧ分子量（１２５００）がジステアロイルホスファチジルエタノールアミンＤＳＰＥに結合したＰＥＧ脂質）やＰ１２５−２Ｃ１６（ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×２））では３時間後には各々約８％、約１０％が小胞体から脱離した。他方、Ｐ５０−２Ｃ１４（ＰＥＧ分子量（５０００）、疎水基（−（ＣＨ２）１２ＣＨ３×２））、Ｐ１２５−２Ｃ１４（ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１２ＣＨ３×２））では１２時間後にそれぞれ約２０、３０％が小胞体から脱離した。従ってＰＥＧ鎖の分子量の増大あるいはアルキル鎖長を短くすることでリポソーム表面のＰＥＧ鎖が脱離し易くなり、血中滞留性の制御ならびに指向性の増大が可能となった。
さらに、Ｐ５０−２Ｃ１６では脱離が認められないのに対し、Ｐ５０−ＤＰＰＥ（ＰＥＧ分子量（５０００）疎水基（−（ＣＨ２）１６ＣＨ３×２））では２０％程度が脱離した。なお、Ｐ５０−ＤＰＰＥは、ＰＥＧ分子量（５０００）がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ脂質である。ＰＥＧ−ＤＰＰＥでは、リン脂質頭部の親水性による脂質全体の親水性増大の影響が考えられる一方で、リジン型ＰＥＧ脂質ではその影響がないばかりでなく、リジン骨格におけるアミド結合部と小胞体リン脂質エステル部の水素結合が安定導入に寄与していると考えられる。
【実施例３】
【０００８】
１．新規膜貫通型脂質の合成
ジアミノＰＥＧ（Ｍ．ｗ．＝２２０）を出発物質として、まず片末端をｔ−ブトキシ（Ｂｏｃ）基で保護した。ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基を用いると最後の脱保護操作（接触還元、又は強酸）で疎水部のジスルフィドが切断される恐れがあるため、弱酸でも脱保護が可能なＢｏｃ基を選択した。また、Ｂｏｃ基の切断を防ぐため、酸の混入と加熱をできるだけ避けた。
４，７，１０−Ｔｒｉｏｘａ−１，１３−ｔｒｉｄｅｃａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（６．６ｇ、３０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（ＴＥＡ、１．５ｇ、１５ｍｍｏｌ）を２０ｍＬ蒸留クロロホルムに溶解し、無水ｔ−ブトキシカルボニル（（Ｂｏｃ）２Ｏ、３．３ｇ、１５ｍｍｏｌ）の蒸留クロロホルム溶液（１００ｍＬ）を徐々に滴下して反応させた。４℃で６時間攪拌後、溶媒を減圧除去し、ベンゼンに再溶解して不溶の塩成分をろ過した。シリカゲルカラム（中性、溶媒：クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）精製により片末端のみをＢｏｃ基で保護したＰＥＧ脂質誘導体（７）（化合物７）を淡黄色粘稠液体で得た（２．４ｇ、収率５０％）。
0005038128.tif 000007
ＰＥＧ脂質誘導体７の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．２７（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３６３（νＮ−Ｈ）；１７０９（νＣ＝Ｏ）；１５２０（νＮ−Ｈ）；１２７１（νＣ−Ｏ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：１．４３（ｓ，９Ｈ，ｔ−ｂｕｔｙｌ）；１．７１−１．７８（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−）；２．７５−２．８１（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ）；３．２０−３．３９（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ−）；３．４９−３．６５（ｍ，１２Ｈ，ＰＯＥ）。
２，２’−ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ（２−ＰＤ、４．３ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２０ｍＬ蒸留ＴＨＦ中で１時間攪拌して脱酸素後、１，１０−ｄｅｃａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ（１．０ｇ、４．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を徐々に滴下させ、３７℃で１０時間、チオール・ジスルフィド交換反応により１，１０−ｄｅｃａｎｅｄｉｔｈｉｏｌの両末端にＰＤ基を導入した（０．８２ｇ、収率４０％）。溶媒を減圧除去し、フラッシュカラム（シリカゲル、溶媒：クロロホルム／酢酸エチル（１０／１）（容量／容量））により精製を行った。２−ＰＤは１，１０−ｄｅｃａｎｅｄｉｔｈｉｏｌに対して４当量仕込んだが、アルキル鎖が数倍長い副生成物が得られて収率が低下したと考えられる。化合物８は１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにて構造確認を行った。再び化合物８（０．７７ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２０ｍＬ蒸留ＴＨＦ中で１時間攪拌して脱酸素を行い、１０−ｃａｒｂｏｘｙ−１−ｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（０．７９ｇ、３．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）を徐々に滴下して１０時間反応させた。ジエチルエーテルにて再沈殿精製を２回行い、クロロホルムより再結晶して炭素鎖が３０のジカルボン酸誘導体９（化合物９）を白色固体で得た（１．１ｇ、収率９３％）。
0005038128.tif 000008
化合物８及び９の分析結果：
（化合物８）：薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／酢酸エチル（１０／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．７（モノスポット））。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：１．２３−１．３８（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ２−）；１．６５−１．７１（ｍ，４Ｈ，−Ｓ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．７９（ｔ，４Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−）；７．０５−８．４６（ｍ，８Ｈ，−Ｃ５ＮＨ４）。
（化合物９）：薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／アセトン（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．２３（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３０３８（νＯ−Ｈ）：１６９４（νＣ＝Ｏ）；１２２９（νＣ−Ｏ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：１．２９−１．３９（ｍ，３６Ｈ，−ＣＨ２−）；１．６１−１．７０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−ＣＯ−，−ＣＨ２−Ｃ−Ｓ−）；２．３５（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．６８（ｔ，８Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−）。
ジカルボン酸誘導体（化合物９）（０．２０ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬（０．３０ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．２２ｇ、２．２ｍｍｏｌ）及び片末端アミノＰＥＧ（化合物７）（０．７４ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を２０ｍＬ蒸留クロロホルム中で１２時間反応させ、アミド結合を形成させた。４％クエン酸水溶液、及び水で分液を行い（クロロホルム相採取）、溶媒を減圧除去した後、フラッシュカラム（シリカゲル、溶媒：クロロホルム／アセトン（２／１）（容量／容量））により精製して化合物１０を白色個体で得た（０．３５ｇ、収率９１％）。
0005038128.tif 000009
化合物１０の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／アセトン（２／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．４４（モノスポット））。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：１．２８−１．３７（ｍ，３６Ｈ，−ＣＨ２−）；１．４４（ｓ，１８Ｈ，ｔ−ｂｕｔｙｌ）；１．５６−１．７０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−ＣＯ−／−ＣＨ２−Ｃ−Ｓ−）；１．７３−１．８０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−）；２．１３−２．１６（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．６６−２．６９（ｔ，８Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−）；３．３１−３．２２（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−）；３．３３−３．３７（ｑ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．５３−３．６６（ｍ，２４Ｈ，ＰＯＥ）。
化合物１０（０．１５６ｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）を５ｍＬジクロロメタンに溶解し、２，６−Ｌｕｔｉｄｉｎｅ（０．８２ｍＬ、１．５Ｍ）及びＴｒｉｍｃｔｈｙｌｓｉｌｙｌ  Ｔｒｉｆｌａｔｅ（０．８９ｍＬ、１Ｍ）を加えて室温で１時間攪拌した。ニンヒドリンスプレーでアミノ基の出現を確認後、耐酸ポンプにて６０〜７０℃で溶媒を減圧除去し、水で２回洗浄した後、ジエチルエーテルにて再沈殿精製を行って、膜貫通型脂質（１１）（化合物１１）を淡黄色固体で得た（０．１２ｇ、収率９３％）。
0005038128.tif 000010
膜貫通型脂質１１の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１９（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３２６（νＮ−Ｈ）；１６３７（νＣ＝Ｏ）；１５４０（νＮ−Ｈ）；１２５２（νＣ−Ｏ）；１１１４（νＣ−Ｏ−Ｃ）；１３１４（νＣ−Ｓ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：１．２８−１．４３（ｍ，３６Ｈ，−ＣＨ２−）；１．５９−１．８０（ｍ，２０Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−ＣＯ−／−ＣＨ２−Ｃ−Ｓ−／−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ）；２．１３−２．１６（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．６６−２．６９（ｔ，８Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−）；２．８７−２．８９（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ−Ｏ−）；３．３２−３．３６（ｑ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．５４−３．６５（ｍ，２４Ｈ，ＰＯＥ）。
２．蛋白質担持リポソームの調製
ＤＰＰＣ（１．０ｇ，１．３６ｍｍｏｌ）、コレステロール（０．４２ｇ，１．０９ｍｍｏｌ）、ＤＰＥＡ（０．１９ｇ，０．２７ｍｍｏｌ）の混合脂質に、膜貫通型脂質（１１）（８．５ｍｇ，８．１６μｍｏｌ）を０．３ｍｏｌ％混合して５ｍＬベンゼンに溶解後、凍結乾燥を行った。ベンゼンを除去した後、脂質濃度が約２ｗｔ％になるようリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に水和した（ｒ．ｔ．、終夜）。その後、凍結融解処理を行い、ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法にて最終孔径５０ｎｍまで透過させた。超遠心分離にて外水相を洗浄した後、リン脂質定量で濃度を調整して、粒径が約１４０ｎｍの１枚膜リポソームを調製した。
３．膜貫通型脂質の導入量測定
導入量は、膜貫通型脂質の両末端アミノ基にフルオレスカミンにて蛍光標識して、蛍光測定により定量した。膜貫通を証明する為に、（ａ）リポソーム表面アミノ基のみ、及び（ｂ）リポソーム中の全アミノ基の２通りの測定を行い、両者を比較した。
Ｇｌｕ２Ｃ１６（３０ｍｇ，５０μｍｏｌ）にＴＨＦ、フルオレスカミン（４２ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて１５分攪拌て希釈後、蛍光測定（λｅｘ＝３９０ｎｍ，λｅｍ＝４７５ｎｍ）により検量線を作成した（Ｒ２＝０．９９９４）。
（ａ）：リポソーム分散液（［ＤＰＰＣ］＝１ｗｔ％，１ｍＬ）に１００μＬフルオレスカミン（１０ｍｇ／５００μＬアセトン）を加えて１５分間攪拌後、超遠心分離で未反応のフルオレスカミンを除去した。ＴＨＦに再溶解し、蛍光測定（λｅｘ＝３９０ｎｍ，λｅｍ＝４７５ｎｍ）を行った。
（ｂ）：リポソーム分散液（［ＤＰＰＣ］＝１ｗｔ％，１ｍＬ）をＴＨＦに溶解し、１００μＬフルオレスカミン（１０ｍｇ／５００μＬアセトン）を加えて１５分間攪拌後、蛍光測定（μｅｘ＝３９０ｎｍ，μｅｍ＝４７５ｎｍ）を行った。
［結果］
蛍光測定の結果、リポソーム表面アミノ基は全アミノ基の約５０％であった（表１）。以上の結果、及び長鎖アルキルがメチレン同士の立体障害を最小にする為に真っ直ぐなコンホメーションをとり易い事を考慮すると、今回導入した合成脂質はリポソーム二分子膜を貫通して膜内に固定化され、末端アミノ基がリポソーム表面から充分に露出していると結論できる。
【表１】
0005038128.tif 000011
４．リポソーム表面への蛋白質の導入
調製したリポソームの表面アミノ基に、架橋剤Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）及びＮ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＭＤＰ）を用いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識したモデル蛋白質（□−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ（分子量：１４ｋＤａ）、ｒＨＳＡ（６６．５ｋＤａ）、ＩｇＧ（１５０ｋＤａ）、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（４６０ｋＤａ）、Ｔｈｙｒｏｇｒｏｂｕｌｉｎ（６７０ｋＤａ））を結合させた。蛋白質は電気泳動マーカーの中から、分子量依存性を解析するために等電点の近いものを選択した（表２）。
【表２】
0005038128.tif 000012
［蛋白質の調製］
蛋白質２．０ｇ／ｄＬ（１ｍＬ、ＰＢＳ）にＳＰＤＰ（３．８ｍｇ／Ｅｔｈａｎｏｌ  ２ｍＬ）を８μＬ（１．５ｅｑ）添加、室温にて３０分攪拌した。その後、ＦＩＴＣ（６ｍｇ／１Ｎ  ＮａＯＨ  ２５０μＬ，ＰＢＳ  ７５０μＬ）を２００μＬ（５ｅｑ）添加、室温にてさらに３０分攪拌した。ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）にて未反応のＳＰＤＰ、ＦＩＴＣを除去した。ＤＴＴ（１５．４ｍｇ／ＰＢＳ  １ｍＬ）を４０μＬ（２０ｍＭ）添加し、３０分攪拌後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）にて未反応のＤＴＴを除去した。
［ＳＭＤＰ結合リポソーム調製］
膜貫通型脂質導入リポソーム分散液（ＰＢＳ  ５ｍＬ，［ＤＰＰＣ］＝２．８ｇ／ｄＬ）にＳＭＤＰ（３０ｍｇ／５００μＬ  ＤＭＦ）を３８μＬ添加し、室温にて１時間撹拌した。超遠心分離（３３，０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ×２）より未反応のＳＭＤＰを除去した。
［蛋白質結合リポソーム調製］
ＳＭＤＰ導入リポソーム分散液（ＰＢＳ  ４ｍＬ（［Ｌｉｐｉｄ］＝０．６ｇ／ｄＬ）にＳＰＤＰ導入蛋白質溶液（０．４ｇ／ｄＬ）を１ｍＬ添加し、４℃にて１２時間攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）より未反応の蛋白質を除去し、リポソーム表面にそれぞれ５種類の蛋白質を結合させた。
［蛋白質結合量の定量］
調製した蛋白質結合リポソーム分散液をエタノール溶液に溶解し、溶液の蛍光強度（λｅｘ＝４９０ｎｍ，λｅｍ＝５２０ｎｍ）を測定して導入された蛋白質の結合数及びリポソーム表面アミノ基に対する結合率を算出した（表３）。
【表３】
0005038128.tif 000013
５．蛋白質結合膜貫通型脂質の脱離速度測定
調製した５種の蛋白質（ＦＩＴＣ標識）結合リポソームをｐＨ７．４、３７℃にて振とうし、蛋白質の脱離挙動を蛍光測定した。
［実験方法］  蛋白質結合リポソーム分散液（ＰＢＳ  １０ｍＬ、［Ｌｉｐｉｄ］＝０．８ｇ／ｄＬ、４℃保存）を３７℃にて振とうした。開始５分後にｃｏｎｔｒｏｌ（０ｍｉｎ）１ｍＬを採取し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、上澄み（７００μＬ）の蛍光測定を行い（ＦＩＴＣ、λｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）、検量線より脱離した蛋白質を定量した。２、４、８、１２、２４時間後も同様の操作により、脱離した蛋白質量の経時変化を測定した。結果を図３に示した。図３中の記号はそれぞれ、（●）α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ、（■）ｒＨＳＡ、（□）ＩｇＧ、（▲）Ｆｅｒｒｉｔｉｎ、（△）Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎを表す。
蛋白質分子量の増加に伴いリポソーム表面からの脱離が促進されたが、分子量が６６．５ｋＤａのｒＨＳＡまでは約９０％が安定に保持された。
６．膜透過性還元剤添加による脱離効果
前述の脱離評価より、最も脱離が少なかったα−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ結合リポソームについて、膜透過性の還元剤であるＬ−システイン（Ｃｙｓ）を外水相に共存させて脱離評価を行った。
［実験方法］
α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ結合リポソーム分散液（ＰＢＳ  １ｍＬ×８サンプル、［Ｌｉｐｉｄ］＝０．８ｇ／ｄＬ、４℃保存）を窒素雰囲気下で撹拌（３０ｍｉｎ、４℃）後、２０ｍＭ  Ｃｙｓ溶液を添加し、ｐＨ７．４、３７℃にて振とうした。開始５分後にｃｏｎｔｒｏｌ（０ｍｉｎ）１ｍＬを採取し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、上澄み（７００μＬ）の蛍光測定を行って（ＦＩＴＣ、λｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）、検量線より脱離した蛋白質を定量した。２、４、８、１２、２４時間後も同様の操作により、脱離した蛋白質量の経時変化を測定した。結果を図４に示した。図４中の記号はそれぞれ、（●）α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ（Ｃｙｓ無添加系）、（○）α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ＋Ｃｙｓ溶液（Ｃｙｓ添加系）を表す。
Ｃｙｓ無添加系では２４時間後でも９０％以上がリポソーム表面に保持されていたが、Ｃｙｓ添加系では徐々に蛋白質の脱離が促進され、２４時間後には９５％が脱離した。Ｃｙｓがリポソーム二分子膜を透過し、二分子膜内に導入した膜貫通脂質のジスルフィド結合を還元することによる脱離効果であると考えられる。
【実施例４】
【０００９】
１．多アルキル鎖型糖脂質の合成
ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１００ｍＬ）を８５℃にて沸点還流し、ジンスタークを用いて反応前に水を除去した。反応液にグルタミン酸（２．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）とヘキサデシルアルコール（１０．７ｇ、４４ｍｍｏｌ）、またはオクタデシルアルコール（１０．７ｇ、４４ｍｍｏｌ）を添加し、１０時間生成水を除去しながら沸点還流した。反応の進行に伴い、懸濁液は徐々に溶解し黄色透明に変化した。反応終了後、溶媒を減去し、炭酸ナトリウム飽和水溶液／クロロホルムにて３回分液操作を行った後、硫酸マグネシウムにて脱水、メタノール４℃にて再結晶を行い、ジアシルグルタミン酸誘導体１２（化合物１２）（８３％）および１３（化合物１３）（８５％）を得た。
0005038128.tif 000014
ジアシルグルタミン酸誘導体１２の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．８３（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８９（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６２（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．８４（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２）；２．０８（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２）；２．４５（ｔ，２Ｈ，ｇｌｕγ−ＣＨ２）；３．４５（ｔ，１Ｈ，ｇｌｕα−ＣＨ）；４．０６，４．１０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：５９５．９；Ｆｏｕｎｄ：５９７．３（ＭＨ）＋．
両末端アミンＰＥＧ（９．０１ｇ、４１ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（１０ｍＬ）にトリエチルアミン（５．７１ｍＬ、４１ｍｍｏｌ）を添加し、室温にて攪拌した。Ｚクロライド（６．９８ｇ、４１ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液を滴下漏斗にてゆっくりと（２秒に１滴程度）滴下した。反応は滴下に伴って速やかに進行し、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝４／１，シリカゲルプレート）にて片末端保護の目的物が出現（Ｒｆ＝０．４２）するが、この他に両末端保護の副生成物（Ｒｆ＝０．８１）も生成した。反応終了後、溶媒を減去、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，クロロホルム／メタノール＝４／１）により両末端保護の副生成物とＴＥＡ塩酸塩を除去そ、目的の化合物１４を精製した。化合物の同定はＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにより行った。また、ＴＥＡ塩はベンゼン、酢酸エチルに不溶であり、これを用いて除去も可能である。
0005038128.tif 000015
化合物１４の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．４２（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７１３（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）；１６２３（νＣ＝Ｏ，ａｍｉｄｅ）；１５２８（δＮ−Ｈ，ａｍｉｄｅ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：１．２５（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ２−Ｃ−）；１．８０（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２−Ｃ−ＣＨ２−）；１．９４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；３．１１（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２−ＣＨ２−）；３．３０（ｑ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−）；３．５８（ｔ，１２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−）；５．０８（ｓ，２Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；７．３４（ｔ，５Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；７．５７（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＮＨ−）
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：３５４．４；Ｆｏｕｎｄ：３５５．４（ＭＨ）＋．
化合物１４（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）にトリエチルアミン（１９６μＬ、１．４ｍｍｏｌ）、マルトース（５０７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加して７０℃、１２時間攪拌した。反応の進行に伴い、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４，シリカゲルプレート）にて目的物のスポットが出現（Ｒｆ＝０．０９）した。反応終了後、溶媒を減去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４）により、目的の化合物１５を精製した。化合物の同定はＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにより行った。
0005038128.tif 000016
化合物１５の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１８（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７２０（νＣ＝Ｏ、ｅｓｔｅｒ）；１６５４（νＣ＝Ｏ、ａｍｉｄｅ）；１５４０（δＮ−Ｈ、ａｍｉｄｅ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：１．７１（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．８４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；３．０７（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−）；３．１５（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−）；３．２１（ｔ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−４）；３．３１（ｔ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−４）；３．５７（ｔ，１２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−）；３．４９−３．９６（ｍ，１０Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−２，３，５，６）；４．５９（ｄ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−１）；５．０５（ｂｒ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＮＨ−Ｃ−Ｃ−）；５．１６（ｄ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−１，ａｎｏｍｅｒｉｃＨ）；５．３３（ｄ，２Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；７．３７（ｔ，５Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；８．３９（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＮＨ−）．
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：６７８．７；Ｆｏｕｎｄ：６７９．４（ＭＨ）＋．
化合物１５（１．００ｇ、１．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）にトリエチルアミン（６９８μＬ、５．０ｍｍｏｌ）、エピクロロヒドリン（２２８μＬ、２．８ｍｍｏｌ）を添加し、４０℃にて２時間攪拌した。反応の進行に伴い、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４，シリカゲルプレート）にてエポキシ基の導入による新たなスポットが出現（Ｒｆ＝０．１９，０．２７）したが、化合物１６の単離は行わず、続く反応により１２（Ｇｌｕ２Ｃ１６、２．３３ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を添加し、６０℃にて１８時間攪拌し、エポキシ基に結合させた。反応終了後、ＤＭＦを減去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，クロロホルム／メタノール＝１０／１）により２本鎖糖脂質１７（Ｒｆ＝０．３８，クロロホルム／メタノール＝１０／１，シリカゲルプレート）、４本鎖糖脂質１９（Ｒｆ＝０．５０）を精製した。化合物の同定はＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにより行った。炭素数１８の糖脂質、２本鎖１８（Ｒｆ＝０．４０，クロロホルム／メタノール＝１０／１，シリカゲルプレート）、４本鎖２０（Ｒｆ＝０．５１）も同様に合成した。
0005038128.tif 000017
本反応は水酸基の反応性の差異を利用して６位の一級水酸基にアルキル鎖を導入するものである。アルキル鎖４本の導入では、エステル結合を用いて導入を試みたがアルキルグルタメート同士の立体障害により収率が低く単離が困難であった。より活性の高いエポキシ基を用いることでアルキル鎖４本の導入および単離が可能となり、糖脂質１７〜２０（化合物１７〜２０）の合成が可能であった。
糖脂質１９（４Ｃ１６）の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（１０／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５０（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３１（νＣ＝Ｏ、ｅｓｔｅｒ）；１６７２（νＣ＝Ｏ、ａｍｉｄｅ）；１５２１（δＮ−Ｈ、ａｍｉｄｅ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８９（ｔ，１２Ｈ，−ＣＨ３）；１．２８（ｓ，１０４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６４（ｍ，８Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．７４（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．０１（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．１４（ｍ，２Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２）；２．２９−２．３５（ｍ，８Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）−Ｃ−Ｏ−，ＮＨ−Ｃ−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−）；２．４５（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕγ−ＣＨ２）；２．５５（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ−Ｏ−）；３．１１（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−）；３．１８（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−）；３．４９−３．７４（ｍ，１２Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−２，３，４，５，６）；３．５１（ｍ，１４Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−，ｇｌｕα−ＣＨ）；４．０６（ｔ，２Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−１）；４．１５（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）；４．２７（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）；５．０５（ｍ，２Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；７．３３（ｔ，５Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；８．０１（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＮＨ−）．
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：１９８１．４；Ｆｏｕｎｄ：１９８１．４（ＭＨ）＋．
化合物１７（２０ｍｇ、１０ｎｍｏｌ）のエタノール溶液（３ｍＬ）にＰｄブラック粉末（２０ｍｇ）（またはＰｄ／Ｃ粉末）を添加し、Ｈ２ガス（Ｚｎ／Ｈ２ＳＯ４にて発生）通気下、室温にて４時間攪拌した。反応の進行に伴い、ＴＬＣにて、ニンヒドリン陽性のスポット、２１（Ｒｆ＝０．０９，クロロホルム／メタノール＝１０／１，シリカゲルプレート）が出現した。反応終了後、Ｐｄ粉末を濾別し、溶媒を減去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，クロロホルム／メタノール／水＝５／１）により目的の化合物２１を精製した。化合物の同定はＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにより行った。化合物２１（Ｒｆ＝０．１２，クロロホルム／メタノール＝１０／１，シリカゲルプレート）、化合物２２（Ｒｆ＝０．０３）、化合物２４（Ｒｆ＝０．０３）も同様に合成した。
0005038128.tif 000018
化合物２３（４Ｃ１６）の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（１０／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．０９（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３８（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８９（ｔ，１２Ｈ，−ＣＨ３）；１．２８（ｓ，１０４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６１（ｍ，８Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．７７（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．９２（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．１４（ｍ，２Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２）；２．２４−２．４１（ｍ，８Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）−Ｃ−Ｏ−，ＮＨ−Ｃ−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−）；２．４４（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕγ−ＣＨ２）；２．６８（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ−Ｏ−）；３．０９（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−）；３．１５（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−）；３．４９−３．７９（ｍ，１２Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−２，３，４，５，６）；３．６３（ｍ，１４Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−，ｇｌｕα−ＣＨ）；４．０６（ｔ，２Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−１）；４．１５（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）；４．２８（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）．
２．多アルキル鎖型糖脂質の臨界ミセル濃度測定
［方法］
糖脂質（化合物２１〜２４）分散液（純水２ｍＬ，１，５，１０，２０，３０，５０，１００μＭ）にＤＰＨ溶液（３０μＭ，ＴＨＦ）を２μＬ添加し、３７℃にて２時間で振とうした。３７℃にて、蛍光測定（ＤＰＨ、λｅｘ＝３５７ｎｍ、λｅｍ＝４３０ｎｍ）により、蛍光強度が急激に上昇する糖脂質濃度を臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）とした。
［結果］
化合物２１のＣＭＣは２０μＭであるのに対し、化合物２２では１８μＭとなり、アルキル鎖長をＣ１６からＣ１８にすることでＣＭＣは若干低下した。他方、化合物２３のＣＭＣは８．０μＭ、化合物２４では７．０μＭであり、アルキル鎖数を２本から４本に増加させることで大幅なＣＭＣの低下が認められた。このことから、アルキル鎖数を増加させることが疎水性相互作用の増大に有効であることを確認した。結果を図５に示した。図５中の記号はそれぞれ、（□）２１（２Ｃ１６）、（■）２２（２Ｃ１８）、（○）２３（４Ｃ１６）、（●）２４（４Ｃ１８）を表す。
３．糖脂質導入リポソームの調製
ＤＰＰＣ（６００ｍｇ）、コレステロール（３１６ｍｇ）あるいは糖脂質（化合物２１（３．９ｍｇ）、化合物２２（４．１ｍｇ）、化合物２３（６．０ｍｇ）、化合物２４（６．４ｍｇ））（ＤＰＰＣ／コレステロール＝１／１（モル比）、糖脂質＝０．２０ｍｏｌ％）をクロロホルム３０ｍＬに溶解して混合した。クロロホルムをエバポレーターにて除去し、真空乾燥後、ＰＢＳ５０ｍＬ中にて１２時間水和攪拌した（［Ｌｉｐｉｄ］＝２．０ｇ／ｄＬ）。水和後、４５℃にて４時間アニーリング処理し、エクストリューダーにて造粒（３０００→８００→６５０→４５０→３００→２２０ｎｍ×２）し、粒径制御した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）により外水相を除去、ＰＢＳ中に再分散して糖脂質含有リポソーム分散液を調製した。
４．リポソーム表面の糖脂質定量
リポソーム分散液（ＰＢＳ  １ｍＬ，［Ｌｉｐｉｄ］＝０．１５ｇ／ｄＬ）中にフルオレスカミン（３０ｍｇ／Ａｃｅｔｏｎｅ  ４５０μＬ）を１００μＬ添加して、室温にて３０分攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）にて、未反応のフルオレスカミンを除去し、クロロホルム／メタノール＝２／１に溶解（総量２ｍＬ）して、蛍光測定（λｅｘ＝３９０ｎｍ，λｅｍ＝４７５ｎｍ）よりリポソーム表面のアミノ基を定量した（表４）。
【表４】
0005038128.tif 000019
５．リポソーム表面への蛋白質の導入
架橋剤ＳＰＤＰを用いてリポソーム表面に導入したＮＨ２基、および蛋白質表面のＮＨ２基をジスルフィド結合にて架橋し、リポソーム表面にそれぞれ５種類の蛋白質を結合させた（表５）。
【表５】
0005038128.tif 000020
［蛋白質の調製］
蛋白質２．０ｇ／ｄＬ（１ｍＬ、ＰＢＳ）にＳＰＤＰ（３．８ｍｇ／Ｍｅｔｈａｎｏｌ  ２ｍＬ）を８μＬ（１．５ｅｑ）添加し、室温にて３０分攪拌した。その後、ＦＩＴＣ（６ｍｇ／１Ｎ  ＮａＯＨ  ２５０μＬ，ＰＢＳ  ７５０μＬ）を２００μＬ（５ｅｑ）添加し、室温にてさらに３０分攪拌した。ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）にて未反応のＳＰＤＰ、ＦＩＴＣを除去した。ＤＴＴ（１５．４ｍｇ／ＰＢＳ  １ｍＬ）を４０μＬ（２０ｍＭ）添加し、３０分攪拌後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）にて未反応のＤＴＴを除去した。
［ＳＰＤＰ結合リポソーム調製］
糖脂質導入リポソーム分散液（ＰＢＳ  １０ｍＬ［Ｌｉｐｉｄ］＝２．０ｇ／ｄＬ）にＳＰＤＰ（８ｍｇ／Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を４５０μＬ添加し、室温にて３０分攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）より未反応のＳＰＤＰを除去した。
［蛋白質結合リポソーム調製］
ＳＰＤＰ導入リポソーム分散液（ＰＢＳ  ４ｍＬ（［Ｌｉｐｉｄ］＝０．６ｇ／ｄＬ）にＳＰＤＰ導入蛋白質溶液（０．４ｇ／ｄＬ）を１ｍＬ添加、４℃にて１２時間攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）より未反応の蛋白質を除去し、リポソーム表面にそれぞれ５種類の蛋白質を結合させた。
［蛋白質結合量の定量］
蛋白質結合リポソーム分散液（ＰＢＳ  １ｍＬ［Ｌｉｐｉｄ］＝０．８ｇ／ｄＬ）にＤＴＴ（１５．４ｍｇ／ＰＢＳ１ｍＬ）を２０μＬ（２０ｍＭ）添加し、３７℃にて４時間攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、上澄み（７００μＬ）を蛍光測定（ＦＩＴＣ、λｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）、検量線から結合蛋白質量を定量した（表６）。
【表６】
0005038128.tif 000021
６．蛋白質結合糖脂質の脱離速度測定
調製した５種の蛋白質（ＦＩＴＣ標識）結合リポソームをｐＨ７．４、３７℃にて振とうし、蛋白質結合糖脂質の脱離挙動を蛍光測定した。
［実験方法］
蛋白質結合リポソーム分散液（ＰＢＳ１０ｍＬ、［Ｌｉｐｉｄ］＝０．８ｇ／ｄＬ、４℃保存）を３７℃にて振とうした。開始５分後にｃｏｎｔｒｏｌ（０ｍｉｎ）１ｍＬを採取、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、上澄み（７００μＬ）の蛍光測定（ＦＩＴＣ、λｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）、検量線より脱離した蛋白質結合糖脂質を定量した。２、４、８、１２、２４時間後も同様の操作により、脱離した蛋白質量の経時変化を測定した。結果を図６に示した。図６中、（ａ）はα−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ（Ｍｗ：１４．０ｋＤ）、（ｂ）はｒ−ＨＳＡ（Ｍｗ：６６．５ｋＤ）、（ｃ）はＣａｔａｌａｓｅ（Ｍｗ：２３２ｋＤ）、（ｄ）はＦｅｒｒｉｔｉｎ（Ｍｗ：４４０ｋＤ）、（ｅ）はＴｈｙｒｏｇｒｏｂｕｒｉｎ（Ｍｗ：６６９ｋＤ）の測定結果であり、図６中の記号はそれぞれ、（□）２１（２Ｃ１６）、（■）２２（２Ｃ１８）、（○）２３（４Ｃ１６）、（●）２４（４Ｃ１８）を表す。
Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（Ｍｗ：４４０ｋＤａ）の測定結果では、化合物２１の脱離速度は１２％／ｈｒであるのに対し、化合物２２では１１％／ｈｒとなり、アルキル鎖長をＣ１８にすることで脱離速度は若干抑制された。他方、化合物２３の脱離速度は４．４％／ｈｒ、化合物２４では３．５％／ｈｒであり、２Ｃ（２本鎖）群と比較してそれぞれ０．３６倍、０．３２倍となり、アルキル鎖数を２本から４本に増加させることで脱離速度は大幅に抑制され、２４時間後に２．３倍の蛋白質の保持に成功した。また、これらの脱離速度の差異は糖脂質のＣＭＣと一致しており、さらに脱離速度を抑制するには糖鎖の水酸基をアセチル基に変換して疎水部とし、ＣＭＣを小さくする方法が考えられる。
次に、蛋白質分子量と脱離速度との関係を図７に示した。図７中の記号はそれぞれ、（□）２１（２Ｃ１６）、（■）２２（２Ｃ１８）、（○）２３（４Ｃ１６）、（●）２４（４Ｃ１８）を表す。２本鎖では、蛋白質分子量３１倍（１４ｋＤａ〜４４０ｋＤａ）の増加に対して脱離速度は１０．７倍（１．０％／ｈｒ〜１０．７％／ｈｒ）に促進された。他方、４本鎖では脱離速度は５．０倍（０．７％／ｈｒ〜３．９％／ｈｒ）であり、蛋白質分子量４４０ｋＤａまでは分子量が増大しても脱離速度はほとんど促進されなかった。これは、４本鎖では４４０ｋＤａまでは分子量の増大に伴い脱離速度の抑制効果が大きくなることを示している。しかし、４４０ｋＤａ以上では４本鎖でも脱離し易くなり、アルキル鎖数の違いによる影響は分子量の増大と共に小さくなるものと考察される。
【実施例５】
【００１０】
ｐＨ応答性脂質の合成
Ｚ−Ｌｙｓ（Ｈ）−ＯＢｚｌ・ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（１．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬（１．５ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ（３８０ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．３４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）を３０ｍＬ蒸留ジクロロメタン中で４℃、６時間反応させ、アミノ結合を形成させた。飽和炭酸ナトリウム、および水で分液を行い（クロロホルム相採取）、溶媒を減圧除去後、淡黄色粘稠液体を得た（２．０１ｇ、収率９１％）。その後接触還元法にて脱保護し、カラム（シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝（８／１）（容量／容量））による精製を行って２５を淡黄色粘稠液体で得た（５９６ｍｇ、収率５０％）。２５（５９６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（２５９ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、ｎ−テトラデカノール（３００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）をベンゼン１００ｍＬ中で１０５℃、１２時間沸点還流しエステル結合を形成させた。飽和炭酸ナトリウム水溶液、および水で分液を行い（クロロホルム相採取）、溶媒を減圧除去後、メタノール再結晶による精製を行い白色固体２６（５５０ｍｇ、収率５８％）を得た。
0005038128.tif 000022
化合物２６の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５０（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｍ，３８Ｈ，−ＣＨ２−，−Ｌｙｓ−β−γ−，ＣＨ２−）；１．６（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−，−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ−ＣＯ−）；３．６（ｔ，１Ｈ，−Ｌｙｓ−）；４．０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；４．９（ｂ，１Ｈ，−Ｎ−Ｈ−Ｃ−Ｏ−）。
化合物２６（２００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬（２０２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（４８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（１３９ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬ蒸留クロロホルム中で１２時間反応させ、アミド結合を形成させた。飽和炭酸ナトリウム、及び水で分液を行い（クロロホルム相採取）、溶媒を減圧除去後、凍結乾燥し２７（８０ｍｇ、３０％）を得た。
0005038128.tif 000023
化合物２７の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．７１（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｍ，３８Ｈ，−ＣＨ２−，−Ｌｙｓ−β−γ−，ＣＨ２−）；２．２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ−ＣＯ−）；３．２（ｔ，１Ｈ，−Ｌｙｓ−）；４．０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；５．１（ｂ，１Ｈ，−Ｎ−Ｈ−Ｃ−Ｏ−）；７．３（ｓ，１Ｈ，−Ｇｌｕ−ＣＯ−ＮＨ−）。
また、次のようにして、化合物２８及び２９を合成した。
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ−ｇ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ（７６４ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（５１３ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、４℃で３０分間撹拌した後、Ｇｌｕ２Ｃ１６（１ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメタン溶液に滴下した。反応溶液を室温で５時間撹拌した後、反応液を濾過し、溶媒を減圧除去した。メタノールから４℃で再結晶して濾過後、乾燥してＧｌｕ２Ｃ１６に親水部としてアミノ基およびカルボキシル基保護グルタミン酸を結合させた化合物を白色固体として得た（１．１５ｇ）。この化合物をＴＦＡ  １０ｍＬに溶解し、４℃で２時間撹拌した後、クロロホルムを加え、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、純水で２回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を減圧除去した。ベンゼンに溶解後、凍結乾燥し化合物２８（０．８９ｇ）を白色粉末で得た。
化合物２９は、化合物２７の合成法と同様にし、ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄの代わりにｍｙｒｉｓｔｉｃ  ａｃｉｄを用いた。
0005038128.tif 000024
化合物２８の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．２４（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２６（ｍ，４６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６１（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−）２．２（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２−）；２．３２、２．４１（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕγ−ＣＨ２−）；３．４（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ−ＣＯＮ−）；４．０７、４．１２（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−）；４．５１（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ−ＣＯ−Ｏ−）
化合物２９の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．７１（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｍ，３８Ｈ，−ＣＨ２−，−Ｌｙｓ−β−γ−，ＣＨ２−）；２．２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ−ＣＯ−）；３．２（ｔ，１Ｈ，−Ｌｙｓ−）；４．０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；５．１（ｂ，１Ｈ，−Ｎ−Ｈ−Ｃ−Ｏ−）；７．３（ｓ，１Ｈ，−Ｇｌｕ−ＣＯ−ＮＨ−）
２．リポソームの調製
１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＯＰＣ、２９ｍｇ、３６ｍｍｏｌ）、コレステロール（１８ｍｇ、４８ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（２．１ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の混合脂質と、化合物２８（２６ｍｇ、３６ｍｍｏｌ）を５ｍＬ  ｔ−ブチルアルコールに溶解させて混合した後、凍結乾燥を行った。乾燥後、脂質濃度が２ｗｔ％になるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に室温で１２時間水和後、ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法にて最終孔径０．２２μｍまで透過させた。超遠心分離にて外水相を洗浄後、リン脂質定量値から濃度を調整し、粒径が２５０ｎｍ程度のリポソームを調製した。
３．リポソームの分散安定度測定
調製したリポソームの安定度を、光散乱を用いた粒径測定より行った。その結果、化合物２８の膜含有量によってリポソームの粒径は変化しなかった（表７）。
【表７】
0005038128.tif 000025
４．リポソーム中での化合物２８の低ｐＨによる加水分解
調製したリポソーム（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／（２８）／ＰＥＧ−ＤＰＥ＝３／４／３／０．０３、モル比）を３７℃、ｐＨ４．５のＰＢＳに分散させ、２４時間後に分散液を凍結乾燥した。乾燥させた混合脂質粉末をクロロホルムに溶解し、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）、検出：ヨウ素）にて検出した。検出結果は、図８に示した通りである。
化合物２８のＲｆ＝０．２１のスポットが消失し、新たにＲｆ＝０．０５付近にスポットが見られた。これは化合物２８がｐＨ４．５で加水分解してリゾ体を生成したことによるものと思われる。
５．リポソームの低ｐＨにおける内包分子の放出促進
調製したリポソーム（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／（２８）／ＰＥＧ−ＤＰＥ＝３／４／３／０．０３）のｐＨ応答性を検証するために、内包分子にカチオン性蛍光ＨＰＴＳ（ｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｅｎｅ−３，６，８−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を内包させた小胞体を調製し、蛍光色素の漏出を測定した。測定は、調製したリポソームをそれぞれのｐＨで３７℃のＨＥＰＥＳ緩衝液に添加し、１０分後にｐＨ７．４に戻してから行った（λｅｘ：４１３ｎｍ，λｅｍ：５１２ｎｍ）。ＨＰＴＳは高濃度では消光しており、小胞体から漏出したＨＰＴＳが希釈によって蛍光を発する原理を利用して、膜の透過率（放出率）を以下の式１．１から算出した。
ｒｅｌｅａｓｅｄ％＝（Ｉｘ−Ｉ０）／（ＩＴ×１．１−Ｉ０）        （１．１）
Ｉ０：ｔ＝０（ｈｒ）における蛍光強度
Ｉｘ：ｔ＝ｘ（ｈｒ）における蛍光強度
ＩＴ：１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ３００μＬ加えたときの蛍光強度
各ｐＨにおける１０分後の放出率を図９に示した。また、各ｐＨにおける経時的な内包分子の放出を測定した結果を図１０に示した。図１０中の記号はそれぞれ、（■）ｐＨ３．５、（△）ｐＨ４．５、（○）ｐＨ５．５、（◇）ｐＨ６．５、（□）ｐＨ７．３、（▲）ｐＨ１１における測定結果を表す。ｐＨ３．５で約２０％の内包蛍光分子が放出したが、ｐＨ６以上ではほとんど放出がされなかった。よって化合物２８を膜成分としたリポソームは、低ｐＨによって化合物２８が加水分解し、加水分解した化合物２８のリゾ体はより親水性が高いために小胞体から遊離することに伴って、二分子膜の分子充填状態が乱れて内包蛍光分子の放出速度が高まったものと考察される。
さらに、化合物２８および２９のそれぞれ１０ｍｏｌ％を膜成分としたリポソームを調製し、そのｐＨ応答性についても検証した。
リポソームの調製は、前記「２．リポソーム調製」と同様にして行い、（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／（２８または２９）／ＰＥＧ−ＤＰＥ＝５／５／１／０．０３、モル比）を得た。その特性は表７に示したとおりである。
内包分子の放出は、前記と同様の方法で蛍光強度を測定し、その測定結果をもとに上記式１．１から算出した。各ｐＨにおける１０分後の放出率を図１１に示した。
化合物２８または２９を膜成分（１０ｍｏｌ％）としたリポソームは、ｐＨ４において内包分子が急激に放出された。低ｐＨにより放出率が増加することから、分解性脂質（化合物２８または２９）の加水分解により、生じたリゾ体が遊離し、その際リポソーム二分子膜の分子充填状態が乱れ、内包分子の放出が促進されたと考えられる。
【実施例６】
【００１１】
１．ジスルフィド脂質の合成
下記のスキームに従い、疎水部にジスルフィド基を有するジスルフィド脂質を合成した。
0005038128.tif 000026
（Ａ）Ｎα，Ｎα’−ｄｉ−Ｂｏｃ−Ｌ−ｃｙｓｔｉｎｅ（（Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ）２）（２．６４ｇ，６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４０ｍＬに溶解させ、ＴＥＡ（７ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）に溶解させたｈｅｘａｄｅｃｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ（１．５５ｇ，６ｍｍｏｌ）を滴下した。４０℃にて２時間反応させ、ジスルフィド結合を形成させた。溶媒除去後、ジエチルエーテルに溶解させ、飽和硫酸水素カリウム、飽和炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムにて分液を行い（ジエチルエーテル層回収）、溶媒を減圧除去後、カラム（中性シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝９／１（容量／容量））による精製を行い、化合物３０を白色固体として得た（４３７ｍｇ，収率１６％）。
化合物３０の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（９／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１７（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８５（ｔ，３Ｈ，−ＣＨ３），１．２３（ｂｒ，２６Ｈ，−ＣＨ２−），１．３８（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ），１．５８（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．６９（ｔ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−），２．９３，３．０６（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−），４．１６（ｔ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
（Ｂ）化合物３０（３７２ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２０ｍＬに溶解させ、ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ（１８８ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．３３ｍＬ，０．８５ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬（４４２ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間反応させ、アミド結合を形成させた。反応終了後、クロロホルムに溶解させ、飽和硫酸水素カリウム、飽和炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムにより分液を行い（クロロホルム層回収）、溶媒を減圧除去後、６０℃メタノールから再結晶を行い、化合物３１を白色粉末として得た（４２０ｍｇ，収率７７％）。
化合物３１の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（９／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．９０（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．２５（ｂｒ，５２Ｈ，−ＣＨ２−），１．４５（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ），１．５９（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．６５（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．７１（ｔ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−），３．０２−３．０４（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−），３．２４（ｔ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−），４．３６（ｔ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
（Ｃ）化合物３１（４１５ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）をＴＦＡ２０ｍＬに溶解させ、４℃、１時間にてＢｏｃ基の脱保護を行った。反応終了後、炭酸水素飽和ナトリウム、水にて分液を行い（クロロホルム層回収）、溶媒を減圧除去後、カラム（中性シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝３０／１（容量／容量））による精製を行い、化合物３２を白色粉末として得た（２５２ｍｇ，７１％）。
化合物３２の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（９／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．６８（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．２５（ｂｒ，５２Ｈ，−ＣＨ２−），１．５０（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．６７（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．７０（ｔ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−），３．２３（ｔ，２Ｈ−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−），３．２９，３．３１（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−），３．６８（ｔ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
（Ｄ）化合物３２（２５０ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１５ｍｌに溶解させＤＩＥＡ（０．４５ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１４０ｍｇ，０，４６ｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬をジクロロメタンと共に室温で１０時間反応させ、アミド結合を形成した。反応終了後、クロロホルムに溶解させ、飽和硫酸水素カリウム、飽和炭酸水素ナトリウム、水にて分液を行い（クロロホルム層回収）、溶媒を減圧除去後６０℃メタノールから再結晶を行い、化合物３３を白色粉末として得た（３１７ｍｇ，収率８５％）。
化合物３３の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（９／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．８４（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．２５（ｂｒ，５２Ｈ，−ＣＨ２−），１．４４，１．４６（ｓ，１８Ｈ，Ｂｏｃ），１．５２（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．６６（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．８５，２．１７（ｄｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．３３（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯＯ），２．７１（ｔ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−），３．０７（ｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−），３．２４（ｔ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−），４．２５（ｔ，１Ｈ，Ｂｏｃ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−），４．６７（ｔ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
（Ｅ）化合物３３（１１７ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）にＴＦＡ１０ｍＬを加え、４℃にて２．５時間、Ｂｏｃ基、ＯｔＢｕ基の脱保護を行った。反応終了後、飽和炭酸ナトリウム、水にて分液を行い（クロロホルム層回収）、カラム（中性シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝９／１（容量／容量））により精製を行い化合物３４（Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６）を白色粉末として得た（６５ｍｇ収率６９％）。
化合物３４の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１１（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：
０．８０（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．１８（ｂｒ，５２Ｈ，−ＣＨ２−），１．４２（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．５８（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．０２，２．０９（ｄｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．４０（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯＯ），２．６２（ｔ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−），２．８５，３．１５（ｄｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−），３．０１（ｔ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−），３．５２（ｔ，１Ｈ，ＮＨ２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−），４．５０（ｔ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
２．リポソームの調製
ＤＰＰＣ、コレステロール、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６、ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１６をモル比３／４／３／０．０３にて混合させ、クロロホルムに若干のメタノールを添加して、最終濃度５ｗｔ％となるように溶解させた。溶解後、溶媒の除去、真空乾燥を経て混合脂質粉末を得た。カルセイン内包リポソームを得るため、混合脂質を１００ｍＭカルセイン水溶液（２ｗｔ％）にて水和（ｒ．ｔ．，６ｈｒ）後、高圧押出し法（フィルター孔径；５０００ｎｍ，６５０ｎｍ，４５０ｎｍ，２２０ｎｍ×２回）にて粒径制御（φ＝２６８±１０３ｎｍ）した。未内包カルセインはＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５カラムにて除去した。
濃度を変化（終濃度１０，５，１．０，０．５，０．１ｍＭ）させた還元剤（システインまたはグルタチオン）水溶液に、調製したカルセイン内包リポソーム（総脂質濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、１時間振とう後、ｐＨ７．４にて蛍光測定（λｅｘ：４８８ｎｍ，λｅｍ：５１７ｎｍ）を行い、カルセイン放出率を以下の式から算出した。
カルセイン放出率「％」＝（Ｆｘ−Ｆ０）／（Ｆ１００−Ｆ０）×１００
Ｆｘ＝還元後における蛍光強度
Ｆ１００＝リポソームの完全可溶化後の蛍光強度
Ｆ０＝ＰＢＳにて３７℃１ｈｒ静置後の蛍光強度
結果を図１２に示す。図１２中、−○−はシステイン添加系を示し、−□−はグルタチオン添加系を示す。図１２に示されるとおり、膜成分としてＧｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６を混合したリポソームは還元剤の存在によりカルセインの放出が促進された。特にシステイン添加系では各濃度にて高い放出率を示したのに対し、グルタチオン添加系では濃度依存的に放出率は増大した。これは、システインの方が小胞体膜に対して高い膜透過性と還元速度定数を持つため、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６のリゾ化がより早く進行し、リゾ体のリポソーム膜からの脱離に伴って内包カルセインが放出されたものと考えられる。またカルセインの放出率が７０％に留まったのは、すべてのＧｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６がリゾ体となって脱離した後安定な小胞体としてカルセインを保持したためと思われる。
【実施例７】
【００１２】
１．マルトペンタオーゼ（ＭＰ）結合脂質の合成
下記のスキームに従い、マルトペンタオーゼ結合脂質を合成した。
0005038128.tif 000027
ＭＰ（０．２５ｇ、０．３０２ｍｍｏｌ）、Ｇｌｕ２Ｃ１８（０．０９８ｇ、０．１５１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、７０℃で１２時間攪拌した。ニンヒドリンによりＧｌｕ２Ｃ１８のアミンのスポットが消失したことを確認し、反応溶液をアセトンでの再沈殿と水洗いにより精製し、ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を白色粉末で得た（０．１４５ｇ、収率６６％）。
ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８の分析結果：
ＴＬＣ（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール／水（３／４／１）（ｖ／ｖ／ｖ）：Ｒｆ：０．８５（モノスポット）．ＩＲ（ｃｍ−１）：１７３６［νＣ＝Ｏ（ａｍｉｄｅ）］；１６７６［νＣ＝Ｏ（ａｍｉｄｅ）］；１５５３［δＮ−Ｈ（ａｍｉｄｅ）］．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８（６Ｈ）；１．２（６０Ｈ）；１．５（４Ｈ）；２．０（２Ｈ）；２．３（２Ｈ）；２．８〜５．６（５６Ｈ）；７．９（１Ｈ）．
２．ＭＰ担持リポソームとコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）との複合体形成現象
ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８をＤＰＰＣ／ｃｈｏｌｃｓｔｅｒｏｌ／ＤＨＳＧ＝５／５／１（モル比）に対し、０，０．３，１，２，１０ｍｏｌ％導入し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（１ｍＭ  Ｃａ２＋，ｐＨ７．４）にて調製したリポソーム溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）に、Ｄ−グルコースやＤ−マンノースの認識部位を４つ持つレクチンＣｏｎＡ水溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加して、水溶液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を測定した。図１３は、種々のＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率のリポソーム分散液に対してＣｏｎＡ溶液を添加した際の分散液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を示したグラフである。図１３中、○はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率０モル％、●はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率０．３モル％、△はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率１モル％、▲はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率２モル％、□はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率１０モル％における経時変化を示す。ＣｏｎＡ水溶液の添加直後から溶液濁度の上昇が観察された。これは添加したＣｏｎＡがリポソーム表面の糖鎖末端Ｄ−グルコースを認識し、リポソー厶間を架橋したためと考えられる。また、図１４は、図１３の０．５分後、５分後の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）変化をＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率に対してプロットしたグラフである。図１４中、○は０．５分後の濁度変化を示し、●は５分後の濁度変化を示す。リポソーム表面のＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入量に依存して濁度の上昇が観察され、導入量２ｍｏｌ％以上で急激な濁度上昇が見られた。
３．ＭＰ担持リポソームとコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）との複合体解離現象
図１５は、２ｍｏｌ％ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入リポソームに１ｍｏｌ％ＰＥＧ脂質（Ｐ１２５−２Ｃ１４）を導入した系を、希釈倍率を変化させて希釈し、この系にＣｏｎＡ溶液を添加した際の分散液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を示したグラフである。ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８をＤＰＰＣ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＤＨＳＧ＝５／５／１（モル比）に対し２ｍｏｌ％導入し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（１ｍＭ  Ｃａ２＋，ｐＨ７．４）にて調製したリポソーム分散液（０．５ｍｇ／ｍｌ）に、ＣｏｎＡ水溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加すると、図１５中の○で示すように、水溶液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）が増加した。ここに５ｍＭのＥＤＴＡを添加すると、図１５中の●で示したとおり、濁度上昇が完全に抑制されることがわかった。このことから、ＣｏｎＡの糖認識にＣａ２＋が必須であることが示唆された。
次に、１ｍｏｌ％ＰＥＧ脂質（Ｐ１２５−２Ｃ１４）溶液をリポソーム分散液の外水相に添加してリポソーム表面をＰＥＧ鎖にて修飾すると、図１５中の△に示したとおり、濁度上昇が抑制されたことから、ＰＥＧ鎖の排除体積効果によりリポソーム表面ＭＰの認識障害が起き、機能が阻害された。この系を希釈率２０倍（図１５中の▲）、１００倍（図１５中の□）、２００倍（図１５中の▽）に希釈してから超遠心分離にてリポソームを分離し、再分散した溶液にＣｏｎＡを同様に添加したところ、希釈倍率の上昇に伴う濁度の上昇が観察された。これはマスキングしたリポソーム表面からのＰＥＧ脂質の脱離により、ＭＰに対するＣｏｎＡの認識能が発現したためと考えられる。
【実施例８】
【００１３】
１．Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅの調製
１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ，５ｍｇ，６．９μｍｏｌ）をクロロホルム／メタノール混合溶媒（８／１（ｖ／ｖ））に溶解後、ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（１０．４μｍｏｌ）添加し攪拌させた（ｒ．ｔ．，１０ｍｉｎ）。さらに、Ｎ−（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ（ＥＭＣＳ，２１．３ｍｇ，６９μｍｏｌ）を添加し攪拌させた（ｒ．ｔ．，１時間）。１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＰＰＣ，２５３．２ｍｇ，３５０μｍｏｌ）、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（１０６．５ｍｇ，２８０μｍｏｌ）、ＤＨＳＧ（４８ｍｇ，６９μｍｏｌ）を溶解させ、薄膜乾燥を経て、真空乾燥にて溶媒を除去した。純水１５ｍＬで水和・攪拌後、押出法にて粒径制御し（φ．０．８，０．６，０．４５，０．２２μｍ）、遠心分離（１００，０００ｇ，３０ｍｉｎ）にて未反応ＥＭＣＳや副生成物を除去、マレイミド基導入リン脂質小胞体（ＭＡＬ−ｖｅｓｉｃｌｅ）を得た（４ｗｔ％，６ｍＬ）。Ｎ末端にあらかじめシステインを導入したドデカペプチド（Ｈ１２，１００ｍＭ，１００μＬ）をＭＡＬ−ｖｅｓｉｃｌｃに添加し、振とうさせた（ｒ．ｔ．，１２時間）。遠心分離（１００，０００ｇ，３０ｍｉｎ）にて未結合Ｈ１２を除去し、Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅを得た。
小胞体表面のＨ１２結合量は，未結合Ｈ１２をＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＰＷＸＬｃｏｌｕｍｎ，７．８ｍｍ  ｏ．ｄ．ｘ  ３００ｍｍ  ｈ，１ｍＬ／ｍｉｎ，３６％（ｖ／ｖ）アセトニトリル，０．１％（ｖ／ｖ）トリフフルオロ酢酸）にて定量し、逆算した。
２．ＰＥＧ導入Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ（ＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ）の調製
Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ分散液（１７ｍＭ，５ｍＬ）にＰＥＧ脂質（Ｐ１２５−２Ｃ１４）水溶液（１７．０μＭ，１５．８ｍＬ）を混合後３７℃にて２時間撹拌した。さらに超遠心分離（３３，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）にて未導入ＰＥＧ脂質を除去後、ＰＥＧ脂質導入小胞体（ＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ）を得た。
３．Ｈ１２−Ｖの活性化血小板への特異的結合並びにＰＥＧ鎖修飾による結合抑制（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
［方法］
洗浄ヒト血小板（１．０×１０５／μＬ，５０μＬ）にＤｉＯＣ１８標識した検体（ｖｅｓｉｃｌｅ、ＰＥＧ−ｖｅｓｉｃｌｅ、Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ、ＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅ、ｆ．ｃ．［ｌｉｐｉｄ］＝０．５ｍｇ／ｍＬ）を混合し、トロンビン（ｆ．ｃ．３Ｕ／ｍＬ）にて血小板を活性化させ，３７℃にて１０分間振とうし、ホルムアルデヒド（ｆ．ｃ．１％（ｖ／ｖ））にて固定した。血小板分画の蛍光陽性率から、血小板へのＨ１２−ｖｅｓｉｃｌｅの結合率を観察した。
［結果］
結果を図１６に示した。ＤｉＯＣ１８標識Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ存在下、トロンビン刺激させた活性化血小板の蛍光陽性率をフローサイトメトリーにて測定したところ、８５．６％であり、Ｈ１２−Ｖは活性化血小板へ結合することを確認した。また、トロンビン未刺激時（２．１％）、ＰＡＣ−１（活性化血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するＨ１２の結合を阻害する抗体）存在下（３．１％）では結合は抑制され、ｖｅｓｉｃｌｅ存在下（２．３％）も同様であった。従って、Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅは活性化血小板と特異的に結合することが明らかとなった。
ＰＥＧを後導入させたＰＥＧ（Ｈ１２）−Ｖで同様の実験を行ったところ、活性化血小板への結合率は、３．４％へ減少した。これは、ＰＥＧの排除体積効果により、Ｈ１２の機能が阻害されたためと考えられる。
４．ＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅのＰＥＧ脂質の脱離に伴う活性化血小板への結合（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
［方法］
ＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ分散液をＰＢＳにて０、６、３００倍に希釈し、振とうさせた（ｒ．ｔ．，１時間）。遠心分離（１００，０００ｇ，３０ｍｉｎ）にて濃縮し、希釈倍率を変えた３種類のＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ（［ｌｉｐｉｄ］＝３ｍｇ／ｍＬ）を得た。
洗浄血小板（１．０×１０５／μＬ，５０μＬ）にＤｉＯＣ１８標識したそれぞれのＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ（ｆ．ｃ．［ｌｉｐｉｄ］＝０．５ｍｇ／ｍＬ）を混合し、トロンビン（ｆ．ｃ．３Ｕ／ｍＬ）にて血小板を活性化させ，３７℃にて１０分間振とう、ホルムアルデヒド（ｆ．ｃ．１％（ｖ／ｖ））にて固定した。ポジティブコントロール群はＰＥＧ未導入のＨ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ添加時とし、ネガティブコントロール群はｖｅｓｉｃｌｅとした。血小板分画の蛍光陽性率から、血小板へのＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅの結合率を観察した。結果を図１７に示した。
［結果］
ＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅ（図１７ではＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅ）の活性化血小板への結合率は１１．０％であった。ＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅの希釈倍率の増大に伴い結合率は増大し、３００倍希釈後にはＨ１２−ｖｅｓｉｃｌｅのそれとほぼ同等であった。このことから、希釈によるＰＥＧ脂質の脱離が促進され、Ｈ１２の機能が発現したと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明の薬物運搬体は、外部環境の変化によって薬物動態を制御することができるので、各種疾患の予防・治療用の製剤として極めて有用である。
【図１Ａ】
0005038128.tif 000030
【図１Ｂ】
0005038128.tif 000031
【図２】
0005038128.tif 000032
【図３】
0005038128.tif 000033
【図４】
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【図５】
0005038128.tif 000035
【図６】
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【図７】
0005038128.tif 000037
【図８】
0005038128.tif 000038
【図９】
0005038128.tif 000039
【図１０】
0005038128.tif 000040
【図１１】
0005038128.tif 000041
【図１２】
0005038128.tif 000042
【図１３】
0005038128.tif 000043
【図１４】
0005038128.tif 000044
【図１５】
0005038128.tif 000045
【図１６】
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【図１７】
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