(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記 (a) または (b)の物質を含有してなる、軟骨基質の産生能、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化、あるいは軟骨細胞または軟骨前駆細胞の増殖の異常亢進が関連する骨・関節疾患の予防・治療剤。
(a) 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜347で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはその塩
(b) 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜347で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
【請求項２】
軟骨基質の産生能、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化、あるいは軟骨細胞または軟骨前駆細胞の増殖の異常亢進が関連する骨・関節疾患が、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される請求項１記載の剤。
【請求項３】
下記 (a) または (b) のいずれかの物質を含有してなる、軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患の予防・治療剤。
(a) 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜347で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはその塩に対する中和抗体
(b) 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の複製または発現を阻害する活性を有する、配列番号: 4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸
【請求項４】
軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される請求項３記載の剤。
【請求項５】
下記 (a) または (b) の物質を含有してなる、軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患の診断剤。
(a) 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜347で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはその塩に対する抗体
(b) 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列または15塩基以上のその一部を含む核酸
【請求項６】
軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される請求項５記載の剤。
【請求項７】
被験動物における、配列番号: 4で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜347で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはその塩の発現増加を調べることを含む、軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患に罹患している、または将来罹患する可能性の試験方法。
【請求項８】
軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
配列番号: 4で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜347で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはその塩を用いて、
(a) 軟骨細胞分化マーカーである軟骨基質を産生する能力を有する細胞を、前記タンパク質またはその塩の存在下、あるいは前記タンパク質またはその塩および被験物質の存在下に培養し、両条件下における前記タンパク質またはその塩の活性を比較すること、あるいは、
(d) 軟骨細胞または軟骨前駆細胞を、前記タンパク質またはその塩の存在下、あるいは前記タンパク質またはその塩および被験物質の存在下に培養し、両条件下における細胞増殖を比較すること
を特徴とする、
軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患、あるいは
軟骨基質の産生能、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化、あるいは軟骨細胞または軟骨前駆細胞の増殖の異常亢進が関連する骨・関節疾患
の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
配列番号: 4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列または15塩基以上のその一部を含む核酸、あるいは該タンパク質またはその塩に対する抗体を用いて、
(b) 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における当該タンパク質をコードするmRNAの量を測定、比較すること、あるいは
(c) 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における当該タンパク質量を測定、比較すること
を特徴とする、
軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患、あるいは
軟骨基質の産生能、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化、あるいは軟骨細胞または軟骨前駆細胞の増殖の異常亢進が関連する骨・関節疾患
の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択され、
軟骨基質の産生能、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化、あるいは軟骨細胞または軟骨前駆細胞の増殖の異常亢進が関連する骨・関節疾患が、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される
請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
配列番号: 4で表されるアミノ酸配列中Ｎ末端側に存在するアスパラギン酸の繰り返し残基数における多型であって、軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患に感受性である14個のアスパラギン酸の繰り返しを有するアレル、及び軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患に保護的な13個のアスパラギン酸の繰り返しを有するアレルから選択される多型を検出することを含む、軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の試験方法。
【請求項１３】
軟骨基質の変性、消失または産生能低下、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化能低下、あるいは軟骨細胞増殖能低下が関連する骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、変形性関節症などの骨・関節疾患（ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）に関連する遺伝子および該疾患と相関する該遺伝子内の多型の同定、並びにそれらに基づく骨・関節疾患の予防・治療、該疾患に対する遺伝的感受性の診断などに関する。
【背景技術】  糖尿病・高血圧などの生活習慣病をはじめとする頻度の高いありふれた疾患（いわゆるｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＤ）は、浸透率（ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅ；ある遺伝子に変異を有する個体がある疾患を発症する割合）の低い複数の疾患関連遺伝子の変異と、運動・栄養などの複数の環境因子との相互作用により発症に至る多因子性疾患であると考えられている。ＣＤの疾患関連遺伝子の変異は頻度の高い遺伝子多型（ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ；ＣＶ）であり、健常者にも存在するが、患者における保有率が有意に高いものであるとの仮説（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｃｏｍｍｏｎ  Ｖａｒｉａｎｔ（ＣＤ−ＣＶ）ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）が提唱されている。有名な一例としては、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子ε４における一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）がアルツハイマー病の発症と相関することが知られている。
わが国では、２０００年度から、ミレニアム・ゲノム・プロジェクトの一環として、ヒトゲノムの遺伝子領域にある約２０万個のＳＮＰを同定し（それらはＪＳＮＰデータベースとしてｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／上で公開されている）、これらのＳＮＰについて代表的なＣＤとの相関を解析することにより、ＣＤに対する感受性（易罹患性）を規定する遺伝子群を同定しようとする研究が進められており、既に心筋梗塞や関節リウマチのなり易さに関連する遺伝子が発見されている（非特許文献１，２）。
骨・関節の生活習慣病は、直接命に影響を及ぼすことは少ないが、痛みや歩行障害などのために日常生活動作（ＡＤＬ）に支障をきたすことから、高齢者のＱＯＬを損なう最大の原因となっている。また、これらの疾患は加齢とともに発症頻度が急増し且つ慢性に経過することから、国民医療経済にも重大な負担を課すこととなり、高齢化社会においては社会全体で克服すべき重要な課題である。世界保健機関（ＷＨＯ）も２１世紀の最初の１０年を“骨と関節の１０年（ｔｈｅ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｄｅｃａｄｅ；ＢＪＤ）”と位置付けて骨・関節疾患の制圧に乗り出している。
変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）は慢性の関節炎を伴う骨・関節疾患で、軟骨の退行変性により軟骨の破壊と骨や軟骨の増殖性変化をきたす病気である。その患者数は日本だけでも５００万〜７００万人にのぼり、６０歳以上では、８０％以上が膝・肘・股関節や脊椎に変形性関節症の症状を呈すると言われている、代表的なｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅである。現在のところ、ＯＡの根本的な治療手段はなく、非ステロイド性消炎鎮痛剤やヒアルロン酸、ステロイド剤の投与など、痛みを抑制する対症療法が中心となっている。進行した場合、関節鏡視下手術・骨切り術・人工関節置換などの手術適応となるが、人工関節には寿命があるため５５歳位まではこの手術を避けることが望ましいと考えられている。従って、関節の退行性変化を抑制する治療方法の開発が望まれている。上記のＣＤ−ＣＶ仮説に基づいてＯＡに対する感受性を規定する遺伝子を同定することは、ＯＡの根本的な治療方法を開発する上で有用な情報を提供するものと期待される。
ＯＡ感受性遺伝子の探索は、当初、骨軟骨異形成症に分類される種々の疾患における変異遺伝子（例：ＩＩ型コラーゲンをコードするＣｏｌ２ａ１遺伝子）や骨密度を制御するタンパク質（例：ビタミンＤレセプター）をコードする遺伝子等の、疾患との関連性が予期され得る限られた候補遺伝子を対象とした相関解析（ｒａｎｄｏｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により行われていたが、これらの結果は概して否定的であった。そこで、前もって候補遺伝子を予測せずにゲノム全域での多型解析により体系的に遺伝子マッピングを行う手法（ゲノムワイドスクリーニング）が用いられるようになった。
欧米では、オックスフォード大学のＪ．Ｌｏｕｇｈｌｉｎらのグループをはじめとして、いくつかのグループからゲノムワイド連鎖解析によるＯＡ感受性遺伝子座のマッピングに関する報告がなされている（例えば、非特許文献３を参照）。例えば、Ｌｏｕｇｈｌｉｎらは、２，４，６，１１および１６番染色体上にＯＡ感受性遺伝子座が存在すること、２番染色体上に位置するインターロイキン−１（ＩＬ−１）遺伝子クラスターおよびインターロイキン−４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）α鎖遺伝子内における頻度の高い多型（ＣＶ）が、それぞれ膝関節ＯＡおよび股関節ＯＡと相関することを報告している（非特許文献４，５）。一方で、６番染色体上のＯＡ感受性領域内に存在するＣＯＬ９Ａ１遺伝子（関節軟骨の基質タンパク質ＩＸ型コラーゲンをコードする）およびＢＭＰ５遺伝子（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）遺伝子ファミリーに属する）は、それらの機能からＯＡとの関連が予測されたが、これらの遺伝子内にはＯＡと相関するＳＮＰは見出されなかった。
ＣＡＬＭ１遺伝子はカルモジュリン（ＣａＭ）と呼ばれる細胞内カルシウム結合タンパク質をコードし、軟骨細胞を含む種々の組織でユビキタスに発現している。細胞内カルシウム濃度の上昇が軟骨細胞分化を促進することが知られている（非特許文献６）。主要な軟骨基質の１つであるアグリカンをコードする遺伝子の発現は力学的刺激によって上昇するが、この発現はＣａＭ阻害剤の存在下で抑制されることが報告されている（非特許文献７）。これらの知見に基づいて、ＣａＭがカルシニューリンやＣａＭ依存性キナーゼＩＩを介してアグリカン遺伝子の転写を活性化するとのモデルが提唱されている。また、ＣａＭが軟骨細胞分化のマスター遺伝子であるＳＯＸ９にコードされるタンパク質に結合してその核内移行を制御するとの報告もある（非特許文献８）。
アスポリンはＳｍａｌｌ  Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ（ＳＬＲＰ）ファミリーに属するタンパク質であり、細胞外基質タンパク質の１つである。その生理機能は不明であるが、ＯＡ軟骨で高発現していることが報告されている（非特許文献９）。アスポリンは、ＳＬＲＰファミリーに属する他のプロテオグリカンとは異なり、Ｎ末端側に特徴的なアスパラギン酸の繰り返し（Ｄ−リピート）多型を有する。
アスポリンと同じＳＬＲＰファミリーに属するデコリン，バイグリカンおよびフィブロモジュリンは、軟骨分化の重要な調節因子として知られるＴＧＦ−βと相互作用することが報告されている（非特許文献１０）。
しかしながら、ＣＡＬＭ１遺伝子やアスポリン遺伝子における異常がＯＡの発症もしくは進行に関連しているとの報告は皆無である。
【非特許文献１】Ｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｎｅｔ．，３２：６５０−４（２００２）
【非特許文献２】Ｔｏｋｕｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３５：３４１−８（２００３）
【非特許文献３】Ｊ．Ｌｏｕｇｈｌｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３：２９５−９（２００３）
【非特許文献４】Ｌｏｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４６：１５１９−２７（２００２）
【非特許文献５】Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１１４：３９１−５（２００４）
【非特許文献６】Ｖａｌｈｍｕ  ａｎｄ  Ｒａｉａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３６１：６８９−９６（２００２）
【非特許文献７】Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：４２２１４−８（２００２）
【非特許文献８】Ａｒｇｅｎｔａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：３３８３９−４７（２００３）
【非特許文献９】Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：１２２０１−１１（２００１）
【非特許文献１０】Ｂｕｒｔｏｎ−Ｗｕｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ．Ｃａｒｔｉｌ．，１１：１６７−７６（２００３）
【発明の開示】
本発明の目的は、変形性関節症をはじめとする骨・関節疾患の発症・進行に関与する遺伝子を同定し、その機能を解明することにより、当該疾患の新規且つ根本的な予防・治療手段を提供することである。また、本発明の別の目的は、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の簡便且つ高確度な診断方法を提供することである。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
［１］下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質を含有してなる骨・関節疾患の予防・治療剤；
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を促進する化合物またはその塩
［２］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［１］記載の剤；
［３］哺乳動物における、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を増強することを含む、該哺乳動物における骨・関節疾患の予防・治療方法；
［４］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［３］記載の方法；
［５］骨・関節疾患予防・治療剤の製造のための下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質の使用；
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を促進する化合物またはその塩
［６］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［５］記載の使用；
［７］下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質を含有してなる骨・関節疾患の予防・治療剤；
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体
（ｃ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を抑制する化合物またはその塩
［８］骨・関節疾患が、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される上記［７］記載の剤；
［９］哺乳動物における、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を低減することを含む、該哺乳動物における骨・関節疾患の予防・治療方法；
［１０］骨・関節疾患が、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される上記［９］記載の方法；
［１１］骨・関節疾患予防・治療剤の製造のための下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質の使用；
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体
（ｃ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を抑制する化合物またはその塩
［１２］骨・関節疾患が、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される上記［１１］記載の使用；
［１３］下記（ａ）または（ｂ）の物質を含有してなる骨・関節疾患の診断剤；
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸
［１４］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［１３］記載の剤；
［１５］被験動物における、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現変動を調べることを含む、骨・関節疾患の診断方法；
［１６］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［１５］記載の方法；
［１７］骨・関節疾患の診断剤の製造のための下記（ａ）または（ｂ）の物質の使用；
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸
［１８］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［１７］記載の使用；
［１９］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする骨・関節疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法；
［２０］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸、あるいは該タンパク質もしくは該部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする骨・関節疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法；
［２１］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［１９］または［２０］記載の方法；
［２２］配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号８５で示される塩基（但し、該塩基はチミンである）を含む該塩基配列の部分配列であって、約１５塩基以上の連続した塩基配列を含む核酸；
［２３］配列番号：５で表される塩基配列において、塩基番号８５，１５７６，２４４５および６６４１で示される塩基がそれぞれチミン、シトシン、グアニンおよびチミンであるハプロタイプの塩基配列を含む核酸；
［２４］配列番号：５で表される塩基配列において、塩基番号８５，１５７６，２４４５および６６４１で示される塩基からなる群より選択される１以上の塩基における多型を検出することを含む、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断方法；
［２５］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［２４］記載の方法；
［２６］配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号８５で示される塩基（但し、該塩基はチミンである）およびそれに隣接する塩基からなる塩基配列を含む核酸を含有してなる骨・関節疾患の予防・治療剤；
［２７］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［２６］記載の剤；
［２８］配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号８５で示される塩基（但し、該塩基はチミンである）およびそれに隣接する塩基からなる塩基配列を含む核酸を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における骨・関節疾患の予防・治療方法；
［２９］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［２８］記載の方法；
［３０］骨・関節疾患の予防・治療剤の製造のための、配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号８５で示される塩基（但し、該塩基はチミンである）およびそれに隣接する塩基からなる塩基配列を含む核酸の使用；
［３１］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［３０］記載の使用；
［３２］配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号８５で示される塩基（但し、該塩基はチミンである）およびそれに隣接する塩基からなる塩基配列を含む核酸と、該塩基配列に選択的に結合する転写調節因子とを用いることを特徴とする骨・関節疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法；
［３３］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［３２］記載の方法；
［３４］下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質を含有してなる骨・関節疾患の予防・治療剤；
（ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を促進する化合物またはその塩
［３５］骨・関節疾患が、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される上記［３４］記載の剤；
［３６］哺乳動物における、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を増強することを含む、該哺乳動物における骨・関節疾患の予防・治療方法；
［３７］骨・関節疾患が、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される上記［３６］記載の方法；
［３８］骨・関節疾患予防・治療剤の製造のための下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質の使用；
（ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を促進する化合物またはその塩
［３９］骨・関節疾患が、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される上記［３８］記載の使用；
［４０］下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質を含有してなる骨・関節疾患の予防・治療剤；
（ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸
（ｃ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を抑制する化合物またはその塩
［４１］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［４０］記載の剤；
［４２］哺乳動物における、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を低減することを含む、該哺乳動物における骨・関節疾患の予防・治療方法；
［４３］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［４２］記載の方法；
［４４］骨・関節疾患予防・治療剤の製造のための下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質の物質の使用；
（ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸
（ｃ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現もしくは活性を抑制する化合物またはその塩
［４５］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［４４］記載の使用；
［４６］下記（ａ）または（ｂ）の物質を含有してなる骨・関節疾患の診断剤；
（ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸
［４７］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［４６］記載の剤；
［４８］被験動物における、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現変動を調べることを含む、骨・関節疾患の診断方法；
［４９］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［４８］記載の方法；
［５０］骨・関節疾患の診断剤の製造のための下記（ａ）または（ｂ）の物質の使用；
（ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸
［５１］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［５０］記載の使用；
［５２］配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする骨・関節疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法；
［５３］配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸、あるいは該タンパク質もしくは該部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする骨・関節疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法；
［５４］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［５２］または［５３］記載の方法；
［５５］配列番号：４で表されるアミノ酸配列中Ｎ末端側に存在するアスパラギン酸の繰り返し残基数における多型を検出することを含む、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断方法；
［５６］配列番号：５で表される塩基配列において、塩基番号８５，１５７６，２４４５および６６４１で示される塩基からなる群より選択される１以上の塩基における多型を検出することをさらに含む、上記［５５］記載の方法；および
［５７］骨・関節疾患が、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍および先天性骨系統疾患からなる群より選択される上記［５５］または［５６］記載の方法；
などを提供する。
カルモジュリンは軟骨基質遺伝子の発現を増加させ、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を促進する機能を有することにより、骨・関節疾患、特に軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患に対して予防・治療効果を奏する。また、アスポリンは軟骨基質遺伝子の発現を低下させ、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を抑制する機能を有するので、アスポリンの発現もしくは活性を阻害することにより上記骨・関節疾患の予防・治療効果が得られうる。さらに、ＣＡＬＭ１遺伝子およびアスポリン遺伝子における多型が骨・関節疾患と相関することから、該多型は骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の簡便な判定に利用することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＩＶＳ３−２９３Ｃ＞Ｔを中心とした連鎖不平衡領域の解析結果を示す。グラフの縦軸は連鎖不平衡定数Ｄ’を、横軸は第１４番染色体上のＩＶＳ３−２９３Ｃ＞Ｔ付近の相対位置（左がセントロメア側、右がテロメア側）をそれぞれ示す。また、下の模式図は、グラフの横軸と対応し、遺伝子およびユニジーンの存在位置を示す。矢印は遺伝子の転写方向を示す。ＩＶＳ３−２９３Ｃ＞Ｔと完全連鎖（Ｄ’＝１）するＳＮＰはＣＡＬＭ１遺伝子領域に集中している。
図２は、ＣＡＬＭ１遺伝子のエクソン−イントロン構造およびＳＮＰの存在位置（ａ）、並びにコモンハプロタイプ構造およびそれらの股関節ＯＡ患者、非ＯＡ患者における頻度（ｂ）を示す。図２ａ中、ボックスはエクソン（白抜きは非翻訳領域、黒塗りはコード領域）を、線はイントロンを示し、ＡＴＧおよびＳｔｏｐはそれぞれ開始および終止コドンを示す。下の縦棒は既知のＪＳＮＰ（＊はマイナーアレル頻度が１０％以上であることを示し、５’側よりそれぞれＣＡＬＭ＿１〜ＣＡＬＭ＿１１のＳＮＰ  ＩＤが付されている（図２ｂ））を、矢印は実施例１において発見された新規ＪＳＮＰの位置をそれぞれ示す。ＩＶＳ３−２９３Ｃ＞ＴはＣＡＬＭ＿９に相当する。
図３は、軟骨細胞におけるＣＡＬＭ１の発現解析結果を示す。ＮＨＡＣ−ｋｎは正常ヒト膝関節軟骨細胞ＮＨＡＣ−ｋｎから、ＯＡ軟骨１〜４は人工膝関節置換術時に膝関節ＯＡ患者より切除した関節軟骨から、それぞれ抽出した総ＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色したものである。
図４は、−１６Ｃ＞Ｔの転写活性に及ぼす影響を示すルシフェラーゼアッセイの結果を示す。図４ａは、図４ｂの最上段のコンストラクト（転写開始点の上流１２３１ｂｐおよび５’非翻訳領域２０２ｂｐを含む）を導入したＯＵＭＳ−２７細胞におけるルシフェラーゼ活性の、−１６Ｃアレルと−１６Ｔアレルでの比較を示す（＊＊：ｐ＜０．０１）。図４ｂは、長さの異なるＣＡＬＭ１遺伝子の発現調節領域を含む４種のコンストラクトを導入したＨｕｈ−７細胞におけるルシフェラーゼ活性の、−１６Ｃアレルと−１６Ｔアレルでの比較を示す（＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１）。模式図中、ＴＡＴＡはＴＡＴＡボックスを、５’ＵＴＲは５’非翻訳領域を、Ｌｕｃはルシフェラーゼコード領域をそれぞれ示す。活性比は−１６Ｃアレルの活性を１００％とした相対活性で示している。
図５は、−１６Ｃ＞Ｔおよびその周辺のＣＡＬＭ１遺伝子配列に結合する核内因子の存在を示すゲルシフトアッセイの結果を示す。これらの核内因子は、−１６Ｃアレルよりも−１６Ｔアレルに強く結合する（矢尻）。
図６は、ＡＴＤＣ５細胞の軟骨細胞分化に及ぼすカルモジュリン阻害剤Ｗ−７の影響を示す。図６ａ，ｂおよびｃは、それぞれＩＩ型コラーゲン遺伝子、アグリカン遺伝子およびＸ型コラーゲン遺伝子の発現量の経時変化を示す。縦軸は０日目を基準（＝１）とした相対発現量を、横軸はインスリン添加後の日数をそれぞれ示す。（−〇−）インスリン非添加；（−■−）インスリン添加；（−▲−）インスリンおよびＷ−７添加。
図７は、イオノマイシン刺激後の軟骨基質遺伝子の発現上昇反応におけるカルモジュリンの関与を示す。図７ａおよびｂは、それぞれＩＩ型コラーゲン遺伝子およびアグリカン遺伝子の発現量の変化度（イオノマイシン非添加時の発現量を１とした相対値）を示す。
図８は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析による正常およびＯＡ関節軟骨におけるアスポリンの発現量を比較した結果を示す。縦軸は標準化したシグナル強度を示す。
図９は、第９番染色体上のアスポリン遺伝子およびその周辺遺伝子領域の地図（図９ａ上段）およびアスポリン遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）地図（図９ａ下段）、並びにアスポリン遺伝子およびその周辺遺伝子領域における連鎖不平衡地図（図９ｂ）である。図９ａ上段において、ボックスは遺伝子領域、線は非遺伝子領域を示し、ＡＳＰＮはアスポリン遺伝子を示す。図９ａ下段において、ボックスはエクソンを、線はイントロンを示し、Ｃ＞Ｔ等は一塩基置換を、Ｔ／ｄｅｌは一塩基欠失を示す。Ｄ  ｒｅｐｅａｔはアスポリン遺伝子のアスパラギン酸繰り返し配列を示す。図９ｂ中、Ｄ’は連鎖不平衡定数を示す。
図１０は、アスポリン遺伝子のアスパラギン酸繰り返し多型におけるＤ１４アレル保有者頻度と日本人膝関節ＯＡの重症度との相関を調べた結果を示す。図１０ａは北大分類、図１０ｂはＫｅｌｌｇｒｅｎスコアの各スコアの患者におけるＤ１４アレル保有者頻度（％）をそれぞれ示す。
図１１は、ヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４安定発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１（図１１ａ），ＴＧＦ−β２（図１１ｂ）およびＴＧＦ−β３（図１１ｃ））刺激によるアグリカン遺伝子発現量（ｘ１０−３コピー／μｇ総ＲＮＡ）を測定した結果を示す。
図１２は、ヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４安定発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１（図１２ａ），ＴＧＦ−β２（図１２ｂ）およびＴＧＦ−β３（図１２ｃ））刺激によるＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量（ｘ１０−５コピー／μｇ総ＲＮＡ）を測定した結果を示す。
図１３は、ヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４安定発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１（図１３ａ），ＴＧＦ−β２（図１３ｂ）およびＴＧＦ−β３（図１３ｃ））刺激によるヒトアスポリン遺伝子発現量（ｘ１０−５コピー／μｇ総ＲＮＡ）を測定した結果を示す。
図１４は、ヒトアスポリン一過性発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−β１刺激によるアグリカン（ａ），ＩＩ型コラーゲン（ｂ）およびヒトアスポリン（ｃ）遺伝子発現量（単位：ｘ１０−４コピー／μｇ総ＲＮＡ（ａ）；ｘ１０−６コピー／μｇ総ＲＮＡ（ｂおよびｃ））を測定した結果を示す。白抜きのバーはＴＧＦ−β１非刺激を、黒塗りのバーはＴＧＦ−β１刺激を示す。
図１５は、ヒトアスポリン安定発現ＡＴＤＣ５細胞株の軟骨分化培養過程におけるアグリカン（図１５ａ），ＩＩ型コラーゲン（図１５ｂ）およびヒトアスポリン（図１５ｃ）遺伝子発現量（単位：ｘ１０−４コピー／μｇ総ＲＮＡ（図１５ａおよび図１５ｃ）；ｘ１０−６コピー／μｇ総ＲＮＡ（図１５ｂ））を測定した結果を示す。各グラフ中、白抜きバーはＭｏｃｋ、ハッチ入りバーはＤ１３、黒塗りバーはＤ１４をそれぞれ示し、グラフ横軸の数字は分化誘導後の日数を示す。
図１６は、ヒトアスポリンＤ１３とヒトアスポリンＤ１４との間で、ＴＧＦ−β１刺激時のアグリカン（図１６ａ）およびＩＩ型コラーゲン（図１６ｂ）遺伝子発現の抑制活性を比較した結果を示す。縦軸は、単位アスポリンｍＲＮＡ量あたりの遺伝子発現抑制率（ＴＧＦ−β１刺激時のアグリカンまたはＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量／ＴＧＦ−β１非刺激時のアグリカンまたはＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量）を示す。
図１７は、ヒトアスポリンとＴＧＦ−β１との結合試験の結果を示す。Ｓタグ付きヒトアスポリン成熟体を無細胞合成し、ＴＧＦ−β１と混合した後、Ｓ−プロテインアガロースレジンを用いてアフィニティー精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、アスポリン（上パネル），ＴＧＦ−β１（下パネル）をそれぞれ検出した。
図１８は、大腸菌組換え型マウスアスポリンの部分精製品をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、クマシー染色によりタンパク質を検出した結果（ａ）およびＳ−プロテイン−ＨＲＰを用いたウエスタンブロッティングによりＳタグ付きマウスアスポリンを検出した結果（ｂ）を示す。矢印はアスポリンに相当するバンドを示す。
図１９は、マウスアスポリンとＴＧＦ−β１との結合試験の結果を示す。図１９ａは、ビオチン化デコリンとＴＧＦ−β１との結合阻害を指標とした結合試験の結果を示し、図１９ｂは、Ｓタグ付きマウスアスポリンとＴＧＦ−β１との結合を、Ｓ−プロテイン−ＨＲＰを用いて検出した結果を示す。各図の縦軸は、ビオチン化デコリン（図１９ａ）またはＳタグ付きマウスアスポリン（図１９ｂ）のＴＧＦ−β１固相への結合量を、最大結合量に対する％で示している。
図２０は、Ｎ末にＨＡタグを付与したヒトアスポリンを一過性に発現させたＣＯＳ７細胞株の培養上清（右パネル）および細胞抽出画分（左パネル）に発現したアスポリンを、抗ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
図２１は、アスポリンとＩ型およびＩＩ型コラーゲンとの結合試験の結果を示す（パネルａ）。Ｓタグ付きヒトアスポリン成熟体を無細胞合成し（リジン残基がビオチン化されている）、コラーゲンと混合した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて検出した。パネルｂは、ポジティブコントロールとしてのデコリンおよびネガティブコントロールとしてのバイグリカンと、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンとの結合試験の結果を示す。
図２２は、各種軟骨系細胞株におけるＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子発現の誘導能を調べた結果を示す。縦軸は遺伝子発現量（×１０−５コピー／μｇ総ＲＮＡ）を示し、白抜きのバーはＴＧＦ−β１非刺激を、黒塗りのバーはＴＧＦ−β１刺激を示す。
図２３は、ヒト膝関節ＯＡ軟骨組織およびヒト軟骨系細胞株におけるＴＧＦ−βアイソフォームの遺伝子発現量を比較した結果を示す。図２３ａはリアルタイムＰＣＲでヒト膝関節ＯＡ軟骨組織、図２３ｂはリアルタイムＰＣＲでヒト軟骨系細胞株、図２３ｃはマイクロアレイで正常およびＯＡ関節軟骨組織におけるＴＧＦ−β１（黒塗りバー），ＴＧＦ−β２（ハッチ入りバー）およびＴＧＦ−β３（白抜きバー）遺伝子の発現量（単位：ｘ１０−４コピー／μｇ総ＲＮＡ（図２３ａ）；ｘ１０−６コピー／μｇ総ＲＮＡ（図２３ｂ）；標準化したシグナル強度（図２３ｃ））を比較した結果をそれぞれ示す。
図２４は、分化培地で培養開始後２１日目のヒトアスポリン安定発現ＡＴＤＣ５細胞株をアルシアンブルー染色した結果を示す。図２４ａは実際の染色像を示し、図２４ｂは細胞を６Ｍグアニジン塩酸で処理した抽出液の吸光度（ＯＤ６３０）を示す。
図２５は、大腸菌で発現させた組換え型マウスアスポリン精製物の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクマシーブリリアントブルー染色の結果を示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は精製組換え型マウスアスポリンを示す。
図２６は、精製組換え型マウスアスポリンとＴＧＦ−β１との結合試験の結果を示す。沈殿物中のＳ−タグ付きマウスアスポリンはＳ−プロテインを、ＴＧＦ−β１は抗ＴＧＦ−β１抗体を、それぞれ用いたウエスタンブロッティングにより検出した。
図２７は、ＡＴＤＣ５細胞におけるＴＧＦ−β１刺激によるアグリカン遺伝子（図２７ａ）およびＩＩ型コラーゲン遺伝子（図２７ｂ）の発現上昇に及ぼす精製組換え型マウスアスポリンの抑制作用を示す。図２７ａにおいて、縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子で補正したアグリカン遺伝子発現量（ｘ１０）、横軸は添加した精製マウスアスポリン濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。図２７ｂにおいて、縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子で補正したＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量（ｘ１０２）、横軸は添加した精製マウスアスポリン濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。各図において、白抜きバーはＴＧＦ−β１非刺激、黒塗りバーはＴＧＦ−β１刺激をそれぞれ示す。
図２８は、マイクロプレートアッセイ法を用いたマウスアスポリンとＴＧＦ−βとの結合試験の結果を示す。縦軸は、ＴＧＦ−βを固相化したプレート（ＴＧＦ−β１（＋））またはＴＧＦ−βを固相化していないプレート（ＴＧＦ−β１（−））へのビオチン化アスポリンの結合量をＯＤ４０５ｎｍで示す。横軸は、溶液中へのビオチン化アスポリン（上段）およびアスポリン（下段）の添加濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す。
図２９は、正常ヒト膝関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）における精製組換え型マウスアスポリンのＴＧＦ−β刺激ＩＩ型コラーゲン（ａ）およびアグリカン（ｂ）遺伝子発現抑制作用を調べた結果を示す。縦軸は遺伝子発現量（単位：ｘ１０−５コピー／μｇ総ＲＮＡ）、横軸はマウスアスポリン濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。白抜きのバーはＴＧＦ−β１非刺激を、黒塗りのバーはＴＧＦ−β１刺激を示す。
図３０は、ＡＴＤＣ５細胞における精製組換え型マウスアスポリンのＴＧＦ−β刺激Ｓｍａｄ２リン酸化抑制作用を調べた結果を示す。図中、ａはリン酸化Ｓｍａｄ２を、ｂはＳｍａｄ２をそれぞれ示す。
図３１は、リアルタイムＰＣＲ法により正常（非ＯＡ）およびＯＡ関節軟骨におけるアスポリンｍＲＮＡ発現量を比較した結果を示す（＊：ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ））。縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子で補正したアスポリン遺伝子発現量（ｘ１０）を示す。
図３２は、ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−β１刺激ＩＩ型コラーゲン遺伝子発現に及ぼすヒトアスポリンＤ１６およびＤ１７の一過性発現の効果を調べた結果を示す（＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ））。縦軸はＩＩ型コラーゲン遺伝子の発現量（ｘ１０−６コピー／μｇ総ＲＮＡ）を示す。
図３３は、各種細胞株（ＨｕＨ７（ａ），ＡＴＤＣ５（ｂ）およびＮＨＡＣ（ｃ））培養上清における組換え型ヒトアスポリンの発現を調べた結果を示す。各パネルは抗ＨＡ抗体によるブロットを示す。
図３４は、組換え型マウスアスポリンのＡＴＤＣ５細胞増殖抑制作用を調べた結果を示す。図３４ａは、アスポリンの細胞増殖抑制作用の濃度依存性を示す（＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ））。（−〇−）アスポリン非添加；（−△−）１．９μｇ／ｍｌ；（−□−）３．７５μｇ／ｍｌ；（−●−）７．５μｇ／ｍｌ；（−▲−）１５μｇ／ｍｌ；（−■−）３０μｇ／ｍｌ。図３４ｂ中、左グラフはアスポリン非添加時、右グラフはアスポリン添加（１０μｇ／ｍｌ）時における、ｂＦＧＦの細胞増殖抑制作用を示す。（−〇−）ｂＦＧＦ非添加；（−●−）１ｎｇ／ｍｌ；（−▲−）２ｎｇ／ｍｌ；（−■−）４ｎｇ／ｍｌ；（−◆−）８ｎｇ／ｍｌ；（−×−）１６ｎｇ／ｍｌ。各グラフにおいて、縦軸は細胞増殖をＯＤ５５０ｎｍで示し、横軸はアスポリンまたはｂＦＧＦ添加後の日数を示す。
図３５は、ＡＴＤＣ５細胞におけるｂＦＧＦ刺激ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みに及ぼすマウスアスポリンの作用を調べた結果を示す（＊＊：ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ））。縦軸は、ＢｒｄＵの取り込み量を、アスポリンおよびｂＦＧＦ非添加時における値を１としたときの相対値として示す。
図３６は、マイクロプレートアッセイ法を用いたマウスアスポリンとｂＦＧＦとの結合試験の結果を示す。縦軸は、ｂＦＧＦを固相化したプレート（ｂＦＧＦ（＋））またはｂＦＧＦを固相化していないプレート（ｂＦＧＦ（−））へのビオチン化アスポリンの結合量をＯＤ４０５ｎｍで示す。白抜きのバーはｂＦＧＦ非添加を、黒塗りのバーはｂＦＧＦ添加を示す。
図３７は、ウエスタンブロッティングによる抗アスポリン抗体のヒト（ａ）およびマウスアスポリン（ｂ）との反応性を調べた結果を示す。図中、ａはＨＡタグ付きヒトアスポリン（Ｄ１３またはＤ１４）を発現するＨｕＨ７細胞の培養上清濃縮液を、ｂは精製組換え型マウスアスポリン（１０または１００ｎｇ）をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、３種の抗体（抗マウスアスポリン抗体（２２２９−Ｂ０１）（上パネル），抗ヒトアスポリンペプチド抗体（２２１０−Ｂ０２）（中パネル），抗ヒトアスポリンペプチド抗体（２２１１−Ｂ０２）（下パネル））との反応性を調べた。
図３８は、ヒトアスポリン（Ｄ１３またはＤ１４）安定発現ＡＴＤＣ５細胞株の培養上清中におけるアスポリンタンパク質の発現を調べた結果を示す。抗マウスアスポリン抗体（２２２９−Ｂ０１）による免疫沈降物を、ビオチン化抗ヒトアスポリン抗体（２２１０−Ｂ０２）抗体を用いてウエスタンブロッティングにより検出した。
図３９は、ＮＨＡＣ細胞におけるＴＧＦ−β１の分化作用に対するアスポリンの抑制作用を示す。図中、ａはＴＧＦ−β１無添加で７日間培養後、ｂはＴＧＦ−β１を添加して７日間培養後、ｃはＴＧＦ−β１およびアスポリンを添加して７日間培養後のＮＨＡＣ細胞の顕微鏡像をそれぞれ示す。
図４０は、ＮＨＡＣ細胞におけるＴＧＦ−β１刺激によるＳｍａｄ２リン酸化に対するアスポリンの抑制作用を示す。Ｐ−Ｓｍａｄ２はリン酸化Ｓｍａｄ２に相当するバンドを示す。
図４１は、ＮＨＡＣ細胞におけるＴＧＦ−β１刺激によるＳｍａｄ３特異的遺伝子転写に対するアスポリンの抑制作用を示す（＊：ｐ＜０．０５）。縦軸は、ルシフェラーゼ活性を、Ｓｍａｄ３／４結合配列を含まないルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞におけるアスポリンおよびＴＧＦ−β１非添加時の活性を１とした相対値で示す。白抜きのバーはＴＧＦ−β１非添加を、黒塗りのバーはＴＧＦ−β１添加を示す。
図４２は、ＮＨＡＣ細胞培養上清中における内在性アスポリンの発現を示す。抗マウスアスポリン抗体（２２２９−Ｂ０１）による免疫沈降物を、ビオチン化抗ヒトアスポリン抗体（２２１０−Ｂ０２）抗体を用いてウエスタンブロッティングにより検出した。
図４３は、ＮＨＡＣ細胞における内在性アスポリンの細胞外局在を示す。ａおよびｂは抗マウスアスポリン抗体（２２２９−Ｂ０１）による免疫染色像を、ｃおよびｄは細胞内マーカーであるＳｍａｄ２を検出するための抗Ｓｍａｄ２抗体による免疫染色像をそれぞれ示す。ａおよびｃは界面活性剤による浸透化処理をしていない細胞、ｂおよびｄは該処理を施した細胞である。
図４４は、ＮＨＡＣ細胞におけるアスポリンとＴＧＦ−β１のｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを示す。ａ〜ｄはビオチン化ＴＧＦ−β１を添加した細胞、ｅ〜ｈはビオチン化ＴＧＦ−β１を添加していない細胞における染色像である。ａおよびｅはアスポリンと核の二重染色像を、ｂおよびｆはＴＧＦ−β１の染色像を、ｃおよびｇはアスポリンの染色像を、ｄおよびｈはＴＧＦ−β１とアスポリンの二重染色像をそれぞれ示す。
図４５は、ヒトＯＡ患者膝関節軟骨組織におけるアスポリンとＴＧＦ−β１のｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを示す。ａ〜ｃはアスポリン、ｄおよびｅはＴＧＦ−β１についての免疫染色像である。ａおよびｄは病変部、ｂおよびｅは非病変部の組織をそれぞれ示す。矢頭はアスポリンとＴＧＦ−β１の染色が一致する部分を示す。尚、ｃにおいて、青く染色されている部分が病変部、赤く染色されている部分が非病変部に相当する。
図４６は、ＮＨＡＣ細胞におけるＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子の一過性発現誘導を示す。各グラフにおいて、縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子で補正したアスポリン遺伝子発現量（ｘ１０）、横軸はＴＧＦ−β１添加後の時間（ａ）または日数（ｂ）を示す。（−〇−）ＴＧＦ−β１非添加；（−●−）ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）添加。
図４７は、ＮＨＡＣ細胞におけるＴＧＦ−β１によるアスポリン（図４７ａ），ＴＧＦ−β１（図４７ｂ），ＩＩ型コラーゲン（図４７ｃ）およびアグリカン（図４７ｄ）遺伝子の発現誘導に及ぼすＳＢ４３１５４２の効果を示す（＊：ｐ＜０．０５）。各グラフにおいて、縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子で補正した各遺伝子発現量（単位：ｘ１０（図４７ａおよびｂ）；ｘ１０３（図４７ｃ）；ｘ１０２（図４７ｄ））を示し、横軸上段の数字はＳＢ４３１５４２の添加濃度（μＭ）、下段の数字はＴＧＦ−β１の添加濃度（ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ示す。
図４８は、ＮＨＡＣ細胞におけるＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子の発現誘導に及ぼすシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の効果を示す。縦軸は、ＧＡＰＤＨ遺伝子で補正したアスポリン遺伝子発現量（ｘ１０）を示し、横軸の「時刻」は、ＴＧＦ−β１添加時を基準（時刻０）としたときのＣＨＸ添加時刻（時）を示す。
図４９は、ＮＨＡＣ細胞におけるＴＧＦ−β１刺激によるアスポリン（ａ）およびＴＧＦ−β１（ｂ）遺伝子発現に対するアスポリンの抑制作用を示す。各グラフにおいて、縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子で補正した各遺伝子発現量（単位：ｘ１０）を、横軸はアスポリン添加濃度（μｇ／ｍｌ）をそれぞれ示す。白抜きのバーはＴＧＦ−β１非刺激を、黒塗りのバーはＴＧＦ−β１刺激を示す。
図５０は、ＮＨＡＣ細胞におけるアスポリン（ａ），ＩＩ型コラーゲン（ｂ），アグリカン（ｃ）およびＴＧＦ−β１（ｄ）遺伝子発現に対するアスポリン特異的ｓｉＲＮＡの調節作用を示す（＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１）。各グラフにおいて、縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子で補正した各遺伝子発現量（単位：ｘ１０３（ａ）；ｘ１０４（ｂ）；ｘ１０２（ｃおよびｄ））を示す。
図５１は、ＮＨＡＣ細胞のＴＧＦ−β１に依存した増殖に及ぼすアスポリンの効果を示す（＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１）。縦軸はＯＤ５５０ｎｍを示し、横軸上段の数字はＴＧＦ−β１の添加濃度（ｎｇ／ｍｌ）、下段の数字はアスポリンの添加濃度（μｇ／ｍｌ）をそれぞれ示す。
図５２は、自然発症ＯＡ病態モルモットモデルにおける関節軟骨でのアスポリン遺伝子発現の加齢変化を示す（＊：ｐ＜０．０５（Ｗｅｌｃｈ’ｓ  ｔｅｓｔ））。縦軸は、ＧＡＰＤＨ遺伝子で補正したアスポリン遺伝子発現量（ｘ１０−２）を示し、横軸は月齢を示す。
図５３は、自然発症ＯＡ病態モルモットモデルにおける血清中アスポリン濃度の加齢変化を示す（＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ））。縦軸は血清中アスポリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示し、横軸は月齢を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明で用いられる配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、「カルモジュリン」または「ＣａＭ」と称する場合がある）は、ヒトもしくは他の温血動物（例えば、サル，ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウサギ，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ニワトリなど）の細胞［例えば、肝細胞，脾細胞，神経細胞，グリア細胞，膵β細胞，骨髄細胞，メサンギウム細胞，ランゲルハンス細胞，表皮細胞，上皮細胞，杯細胞，内皮細胞，平滑筋細胞，線維芽細胞，線維細胞，筋細胞，脂肪細胞，免疫細胞（例：マクロファージ，Ｔ細胞，Ｂ細胞，ナチュラルキラー細胞，肥満細胞，好中球，好塩基球，好酸球，単球），巨核球，滑膜細胞，軟骨細胞，骨細胞，骨芽細胞，破骨細胞，乳腺細胞，肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞，幹細胞もしくは癌細胞など］またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官［例えば、脳，脳の各部位（例：嗅球，扁桃核，大脳基底球，海馬，視床，視床下部，大脳皮質，延髄，小脳），脊髄，下垂体，胃，膵臓，腎臓，肝臓，生殖腺，甲状腺，胆嚢，骨髄，副腎，皮膚，筋肉，肺，消化管（例：大腸，小腸），血管，心臓，胸腺，脾臓，顎下腺，末梢血，前立腺，睾丸，卵巣，胎盤，子宮，骨，関節，脂肪組織（例：褐色脂肪組織，白色脂肪組織），骨格筋など］に由来するタンパク質であってもよく、また、後述のように、化学的に、もしくは無細胞タンパク質合成系を用いて生化学的に合成されたタンパク質であってもよい。あるいは、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列を含むタンパク質が配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性を有するような配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ）、水酸基を含むアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
実質的に同質の活性としては、例えば、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化促進活性、具体的には、軟骨細胞の分化マーカー［例：ＩＩ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ２ａ１），アグリカン遺伝子（Ａｇｃ１）等］の発現増強活性などが挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に（例：生理学的に、または薬理学的に）同質であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍）。
カルモジュリン（ＣａＭ）の活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことができる。例えば、後記実施例において詳述するように、軟骨細胞分化モデルにおける上記マーカー遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。
また、本発明で用いられるカルモジュリンとしては、例えば、（１）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、当該タンパク質の活性を損なわない限り、特に限定されない。
本明細書においてアミノ酸配列により特定されるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるカルモジュリンは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ），カルボキシレート（−ＣＯＯ−），アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル，エチル，ｎ−プロピル，イソプロピル，ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル，シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル，α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル，フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例：メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基，アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ，−ＳＨ，アミノ基，イミダゾール基，インドール基，グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基，アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトカルモジュリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００８８１９）などがあげられる。
本発明で用いられるカルモジュリンの部分ペプチドは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記した本発明で用いられるカルモジュリンと実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。また、「実質的に同質の活性」の測定は、上記と同様にして行うことができる。
具体的には、該部分ペプチドとしては、本発明で用いられるカルモジュリンの構成アミノ酸配列のうち少なくとも５０個以上、好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列からなるペプチドなどが用いられる。また、本発明で用いられるカルモジュリンの部分ペプチドは、（１）そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失し、または、（２）そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加し、または、（３）そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入され、または、（４）そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは（５）それらが組み合わされていてもよい。
本発明で用いられるカルモジュリンの部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ），カルボキシレート（−ＣＯＯ−），アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、カルモジュリンについて上記したと同様のものが挙げられる。また、該部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、該カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるカルモジュリンの部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、Ｃ末端のエステルと同様のものが例示される。さらに、該部分ペプチドには、カルモジュリンの場合と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例：メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられるカルモジュリンまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸，有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸，リン酸，臭化水素酸，硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クエン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるカルモジュリンまたはその塩は、前述したヒトや他の温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって調製することができる。具体的には、該動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるカルモジュリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、「カルモジュリン類」と包括的に略記する場合がある）は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法，液相合成法のいずれであってもよい。本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより、目的とするタンパク質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）および（２）に記載された方法に従って行われる。
（１）Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６）
（２）Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｅｂｋｅ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５）
本発明のカルモジュリン類の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂，ヒドロキシメチル樹脂，ベンズヒドリルアミン樹脂，アミノメチル樹脂，４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂，４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂，ＰＡＭ樹脂，４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂，ポリアクリルアミド樹脂，４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂，４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質等の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ，Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、あるいは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルもしくはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に、樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常、約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は、通常、１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には、保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより、十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、並びにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは、公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ，Ｂｏｃ，ｔ−ペンチルオキシカルボニル，イソボルニルオキシカルボニル，４−メトキシベンジルオキシカルボニル，Ｃｌ−Ｚ，Ｂｒ−Ｚ，アダマンチルオキシカルボニル，トリフルオロアセチル，フタロイル，ホルミル，２−ニトロフェニルスルフェニル，ジフェニルホスフィノチオイル，Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル，エチル，プロピル，ブチル，ｔ−ブチル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘプチル，シクロオクチル，２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル，４−ニトロベンジルエステル，４−メトキシベンジルエステル，４−クロロベンジルエステル，ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基，ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基，エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基，テトラヒドロピラニル基，ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ，Ｃｌ２−Ｂｚｌ，２−ニトロベンジル，Ｂｒ−Ｚ，ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ，４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル，ＤＮＰ，ベンジルオキシメチル，Ｂｕｍ，Ｂｏｃ，Ｔｒｔ，Ｆｍｏｃなどが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素，メタンスルホン酸，トリフルオロメタンスルホン酸，トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン，トリエチルアミン，ピペリジン，ピペラジンなどによる塩基処理、また、液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソール，フェノール，チオアニソール，メタクレゾール，パラクレゾール，ジメチルスルフィド，１，４−ブタンジチオール，１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール，１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液，希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物，アジド，活性エステル［アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール，２，４，５−トリクロロフェノール，２，４−ジニトロフェノール，シアノメチルアルコール，パラニトロフェノール，ＨＯＮＢ，Ｎ−ヒドロキシスクシミド，Ｎ−ヒドロキシフタルイミド，ＨＯＢｔ）とのエステル］などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合してアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられるカルモジュリンの部分ペプチドまたはその塩は、上述もしくは後述のいずれかの方法により得られるカルモジュリンまたはその塩を、適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
このようにして得られた本発明のカルモジュリン類は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出，蒸留，カラムクロマトグラフィー，液体クロマトグラフィー，再結晶，これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるタンパク質または部分ペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のカルモジュリン類は、カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養してカルモジュリン類を生成せしめ、得られる培養物からカルモジュリン類を分離・精製することによって製造することもできる。
カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸としては、前述した本発明で用いられるカルモジュリンのアミノ酸配列もしくはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものでもよい。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。
カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ヒトもしくは他の温血動物（例えば、サル，ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウサギ，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ニワトリなど）の細胞［例えば、肝細胞，脾細胞，神経細胞，グリア細胞，膵β細胞，骨髄細胞，メサンギウム細胞，ランゲルハンス細胞，表皮細胞，上皮細胞，杯細胞，内皮細胞，平滑筋細胞，線維芽細胞，線維細胞，筋細胞，脂肪細胞，免疫細胞（例：マクロファージ，Ｔ細胞，Ｂ細胞，ナチュラルキラー細胞，肥満細胞，好中球，好塩基球，好酸球，単球），巨核球，滑膜細胞，軟骨細胞，骨細胞，骨芽細胞，破骨細胞，乳腺細胞，肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官［例えば、脳，脳の各部位（例：嗅球，扁桃核，大脳基底球，海馬，視床，視床下部，大脳皮質，延髄，小脳），脊髄，下垂体，胃，膵臓，腎臓，肝臓，生殖腺，甲状腺，胆嚢，骨髄，副腎，皮膚，筋肉，肺，消化管（例：大腸，小腸），血管，心臓，胸腺，脾臓，顎下腺，末梢血，前立腺，睾丸，卵巣，胎盤，子宮，骨，関節，脂肪組織（例：褐色脂肪組織，白色脂肪組織），骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）およびＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ，プラスミド，コスミド，ファージミドなどいずれであってもよい。
カルモジュリンをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列を含むＤＮＡ、あるいは配列番号：１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、前記した配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性（例えば、軟骨細胞分化促進活性など）を有するタンパク質もしくはペプチドをコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列と約６０％以上，好ましくは約７０％以上，さらに好ましくは約８０％以上，特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
カルモジュリンをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号：１で表される塩基配列を含むヒトＣＡＬＭ１  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６８８８）もしくはそのアレル変異体または他の温血動物（例えば、マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，トリ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジーなど）におけるそのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）等である。
カルモジュリンの部分ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
具体的には、該部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：１で表される塩基配列を含むＤＮＡの部分塩基配列、または
（２）配列番号：１で表される塩基配列を含むＤＮＡとハイトリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性（例：軟骨細胞分化促進活性など）を有するペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１で表される塩基配列を含むＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該塩基配列中の対応する部分と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡなどが用いられる。
カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該タンパク質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を含む合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、カルモジュリンの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションさせることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株）），ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
上記のカルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該タンパク質またはペプチドを製造することができる。
カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、カルモジュリンをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例：ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例：ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例：ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス、ｐＡ１−１１，ｐＸＴ１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲｃ／ＲＳＶ，ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター，ＳＶ４０プロモーター，ＬＴＲプロモーター，ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター，ＨＳＶ−ｔｋプロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶＶプロモーター，ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモーター，Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰ０１プロモーター，ＳＰ０２プロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター，Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子［メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性］、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、ＰｈｏＡ・シグナル配列，ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼ・シグナル配列，サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル配列，ＳＵＣ２・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル配列，α−インターフェロン・シグナル配列，抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌，バチルス属菌，酵母，昆虫細胞，昆虫，動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２・ＤＨ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０：１６０（１９６８）］，ＪＭ１０３［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：３０９（１９８１），ＪＡ２２１［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２０：５１７（１９７８）］，ＨＢ１０１［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４１：４５９（１９６９）］，Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９：４４０（１９５４）］などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ１１４［Ｃ；ｅｎｅ，２４：２５５（１９８３）］，２０７−２１［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５：８７（１９８４）］などが用いられる。
酵母としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞），Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞，Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞，Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞，Ｅｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Ｅｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１），Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１３：２１３−２１７（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる［Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：５９２（１９８５）］。
動物細胞としては、例えば、サル由来のＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター由来のＣＨＯ，ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ（ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−））細胞、マウス由来のＬ，ＡｔＴ−２０，ミエローマ細胞、ラット由来のＧＨ３細胞、ヒト由来のＦＬ，ＨＥＫ２９３，ＨｅｐＧ２，ＨｅＬａ細胞などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７：１０７（１９８２）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、Ｎｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２−１８７（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．），６：４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース，デキストリン，可溶性澱粉，ショ糖などが、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類，硝酸塩類，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などの無機または有機物質が、無機物としては、例えば、塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス，ビタミン類，生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース，カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２］が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行われる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行われる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４５０５（１９８０）］や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地［Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：５３３０（１９８４）］などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行われる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５：７８８（１９６２）］に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２〜６．４である。培養は、通常約２７℃で、約３〜５日間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清を含むＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２：５０１（１９５２）］，ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８：３９６（１９５９）］，ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９：５１９（１９６７）］，１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３：１（１９５０）］などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にカルモジュリン類を生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、カルモジュリン類を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、カルモジュリン類を培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれるカルモジュリン類の単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法，限外ろ過法，ゲルろ過法，およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られるカルモジュリンまたはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該タンパク質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するカルモジュリン類を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン，キモトリプシン，アルギニルエンドペプチダーゼ，プロテインキナーゼ，グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるカルモジュリン類の存在は、特異的な抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、カルモジュリンまたはその部分ペプチドは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート，コムギ胚芽ライセート，大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞タンパク質（転写／）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ”，Ｈａｍｅｓ  Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １７９−２０９（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ  ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ  Ｆ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９：１６０−１６１（１９５７）あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ  Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６：３８−５０（１９９６）等に記載の方法を用いることができる。
タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法［Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）前述］や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム［Ｓｐｉｒｉｎ  Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１１６２−１１６４（１９８８）］、透析法（Ｋｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，第２１回日本分子生物学会，ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３）等を用いることができる。
「配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列またはその一部」、あるいは「該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部」を含む核酸とは、前述のカルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸だけではなく、コドンの読み枠の合わない部分塩基配列をも含む意味で用いられる。該核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。
目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」または「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性または相補性を有することをいう。
カルモジュリンをコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸（以下、「アンチセンスＣＡＬＭ１」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたカルモジュリンをコードする核酸の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、カルモジュリンをコードする遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスＣＡＬＭ１は、カルモジュリンをコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。
アンチセンスＣＡＬＭ１の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてカルモジュリンタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該タンパク質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、カルモジュリンをコードする核酸の５’端ヘアピンループ，５’端６−ベースペア・リピート，５’端非翻訳領域，翻訳開始コドン，タンパク質コード領域，翻訳終止コドン，３’端非翻訳領域，３’端パリンドローム領域および３’端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、カルモジュリンをコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンスＣＡＬＭ１は、カルモジュリンをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるカルモジュリンをコードする遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。
アンチセンス核酸は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を含むその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含むその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含む）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ，１本鎖ＤＮＡ，２本鎖ＲＮＡ，１本鎖ＲＮＡ，さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート，ホスホトリエステル，ホスホルアミデート，カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ，ヌクレアーゼ・インヒビター，トキシン，抗体，シグナルペプチド，ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン，プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属，放射活性をもつ金属，ホウ素，酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含むのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
好ましくは、アンチセンス核酸は、修飾されていてもよいＲＮＡまたはＤＮＡである。修飾された核酸（ＲＮＡ，ＤＮＡ）の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。アンチセンスＣＡＬＭ１は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、標的とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そして、もし毒性があるなら、アンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば、Ｊ．Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，２４７（１９９２），同  Ｖｏｌ．８，３９５（１９９２）；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）などに開示されている。
アンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療において適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド，コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート，コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
カルモジュリンをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスＣＡＬＭ１に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を含むオリゴＤＮＡも、同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では、配列特異的な核酸切断活性を有する限り、ＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。カルモジュリンｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡへリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
カルモジュリンをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な塩基配列を含む二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンスＣＡＬＭ１に包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、カルモジュリンをコードするｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列情報に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社，ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
アンチセンスＣＡＬＭ１の遺伝子発現阻害活性は、カルモジュリンをコードする核酸を含む形質転換体、生体内や生体外のカルモジュリンをコードする遺伝子発現系またはカルモジュリンの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
本発明はまた、カルモジュリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、「抗ＣａＭ抗体」と略記する場合がある）を提供する。抗ＣａＭ抗体は、カルモジュリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対して特異的親和性を有するものであれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。該抗体は、カルモジュリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
［モノクローナル抗体の作製］
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
カルモジュリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩（カルモジュリン類）を、哺乳動物に対して、投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル，ウサギ，イヌ，モルモット，マウス，ラット，ヒツジ，ヤギ等が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
例えば、抗原で免疫された哺乳動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化カルモジュリンと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法［Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）］に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｕ１，ＳＰ２／０，ＡＰ−１などの哺乳動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例：マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したカルモジュリンを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などにより、スクリーニングすることができる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。モノクローナル抗体の選別は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。モノクローナル抗体の選別および育種用培地は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。このような培地としては、例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の胎仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の胎仔ウシ血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１，日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法，アルコール沈殿法，等電点沈殿法，電気泳動法，イオン交換体（例：ＤＥＡＥ）による吸脱着法，超遠心法，ゲルろ過法，抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法］に従って分離精製することができる。
［ポリクローナル抗体の作製］
カルモジュリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するポリクローナル抗体は、自体公知の方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（カルモジュリン類）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体を作製し、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様にして温血動物に免疫を行い、該免疫動物から抗ＣａＭ抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤、例えばグルタルアルデヒドやカルボジイミド，マレイミド活性エステル，チオール基，ジチオビリジル基を含む活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水、母乳など、鳥類の場合は血液、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
カルモジュリンの部分ペプチドまたはその塩を抗原として用いる場合、そのカルモジュリン上の位置は特に限定されないが、例えば、各種温血動物間でよく保存された領域の部分アミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはオリゴペプチドまたはその塩が挙げられる。
上記した（ｉ）カルモジュリン類、（ｉｉ）カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ）、（ｉｉｉ）抗ＣａＭ抗体、（ｉｖ）アンチセンスＣＡＬＭ１は、例えば以下の用途を有する。
後記実施例において示される通り、カルモジュリンをコードするＣＡＬＭ１遺伝子は変形性関節症（ＯＡ）軟骨で発現が上昇し、また、軟骨細胞分化モデルであるＡＴＤＣ５細胞の軟骨細胞への分化（分化マーカー遺伝子の発現）はカルモジュリン阻害剤の存在下で抑制される。これらの事実は、カルモジュリンの発現または活性を調節（促進または阻害）し得る物質が、骨・関節疾患、特に軟骨基質の変性・産生異常や、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化異常が関連する疾患の予防・治療に有効であることを示すものである。ここで「関連する疾患」とは、それに起因するか、あるいは結果としてそのような状態を生じる疾患をいう。
（１）軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患の予防・治療剤
上記のように、カルモジュリンは軟骨基質遺伝子の発現を増加させ、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を促進する機能を有するので、生体内においてカルモジュリンまたはそれをコードする核酸（例：遺伝子，ｍＲＮＡ等）に異常があったり、これを欠損している場合、あるいはその発現量が異常に減少している場合、さらには、他の何らかの要因で軟骨基質の変性・消失が起こり、またその産生能が低下している場合、あるいは軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化が抑制されている場合に、ａ）カルモジュリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩（カルモジュリン類）を患者に投与してカルモジュリンの量を補充したり、ｂ）（ｉ）カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを患者に投与して標的細胞内で発現させることによって、あるいは（ｉｉ）単離した標的細胞にカルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを導入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるカルモジュリンの量を増加させ、軟骨基質遺伝子の発現および／または軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を誘導し、軟骨基質の変性や消失を基盤とする疾患を予防・治療することができる。
したがって、ａ）カルモジュリン類、またはｂ）カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を、上記のような疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］など、好ましくは変形関節症（例：股関節ＯＡ，膝関節ＯＡ）の予防・治療剤として使用することができる。
カルモジュリン類を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を上記予防・治療剤として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
例えば、ａ）カルモジュリン類、あるいはｂ）カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）カルモジュリン類、あるいはｂ）カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン，コーンスターチ，トラガント，アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ，ゼラチン，アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖，乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント，アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油，椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水，ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール，Ｄ−マンニトール，塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール），ポリアルコール（例：プロピレングリコール，ポリエチレングリコール），非イオン性界面活性剤（例：ポリソルベート８０ＴＭ，ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油，大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル，ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液，酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロカインなど），安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール，フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
カルモジュリン類の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（２）軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能の異常亢進が関連する疾患の予防・治療剤
上記のように、カルモジュリンは軟骨基質遺伝子の発現を増加させ、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を促進する機能を有するので、生体内においてカルモジュリンまたはそれをコードする核酸（例：遺伝子，ｍＲＮＡ等）に異常がある（高活性変異体の出現）場合、あるいはその発現量が異常に増加している場合、さらには他の何らかの要因で軟骨の過形成が起こり、また軟骨基質の産生能が異常亢進している場合、あるいは軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化が異常亢進している場合に、ａ）抗ＣａＭ抗体を患者に投与してカルモジュリンを不活性化（中和）したり、ｂ）（ｉ）アンチセンスＣＡＬＭ１を患者に投与して標的細胞内に導入する（および発現させる）ことによって、あるいは（ｉｉ）単離した標的細胞にアンチセンスＣＡＬＭ１を導入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるカルモジュリンの量を減少させ、軟骨基質遺伝子の発現および／または軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を抑制し、軟骨基質の過剰などを基盤とする疾患を予防・治療することができる。
したがって、ａ）抗ＣａＭ抗体、またはｂ）アンチセンスＣＡＬＭ１を、上記のような疾患、例えば先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群など）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患の予防・治療剤として用いることができる。
抗ＣａＭ抗体を上記予防・治療剤として使用する場合、前記したカルモジュリン類を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。また、アンチセンスＣＡＬＭ１を上記予防・治療剤として使用する場合、前記したカルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
抗ＣａＭ抗体の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
アンチセンスＣＡＬＭ１の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（３）骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング
上記のように、カルモジュリンの活性を調節（促進または阻害）し得る物質は、骨・関節疾患、特に軟骨基質の変性・産生異常や、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化異常が関連する疾患の予防・治療に有効である。従って、本発明は、カルモジュリン類を用いてその活性の変動を測定することによる、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、本発明は、
（ａ）軟骨細胞分化マーカーである軟骨基質（例：ＩＩ型コラーゲン，アグリカン等）を産生する能力を有する細胞を、カルモジュリン類の存在下、またはカルモジュリン類および被験物質の存在下に培養し、両条件下におけるカルモジュリン類の活性を比較することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、カルモジュリン類は、前述のいずれかの方法により単離・精製されたものを添加してもよいし、あるいは、軟骨基質を産生する能力を有する細胞が、カルモジュリン類を産生する能力を同時に有していてもよい。カルモジュリンまたはその塩および軟骨基質を産生する能力を有する細胞としては、生来それらを発現しているヒトもしくは他の温血動物細胞またはそれを含む生体試料（例：関節液，関節軟骨等）であれば特に制限はないが、物理的または化学的刺激に応じてカルモジュリンの発現および／または活性化が誘導されるものが好ましく、例えば、ＡＴＤＣ５細胞等が挙げられるが、これに限定されない。非ヒト動物由来の細胞、組織等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体に被験物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。上記の遺伝子工学的手法により、軟骨基質遺伝子を産生する能力を有する細胞にカルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を導入して得られる各種の形質転換体を用いることもできる。
被験物質としては、例えばタンパク質，ペプチド，非ペプチド性化合物，合成化合物，発酵生産物，細胞抽出液，植物抽出液，動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
カルモジュリン類の活性の測定は、軟骨細胞分化マーカーである軟骨基質遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。例えば、一定期間（例えば、５〜２５日程度）培養した細胞から常法により総ＲＮＡを抽出して、定量的ＲＴ−ＰＣＲやノーザンハイブリダイゼーションにより軟骨基質遺伝子［例：ＩＩ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ２ａ１），アグリカン遺伝子（Ａｇｃ１）等］の発現量を定量する。あるいは、細胞から総タンパク質を抽出し、後述のカルモジュリン類の定量と同様の方法により、抗ＩＩ型コラーゲン抗体，抗アグリカン抗体等を用いてこれらの軟骨基質を定量することによっても行うことができる。
上記（ａ）のスクリーニング法において、Ｃｏｌ２ａ１やＡｇｃ１等の軟骨基質遺伝子の発現を増大させた被験物質を「カルモジュリン活性促進物質」、それらの発現を低下させた被験物質を「カルモジュリン活性阻害物質」としてそれぞれ選択することができる。カルモジュリン活性促進物質は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患［例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等））など］、好ましくは変形関節症（例：股関節ＯＡ，膝関節ＯＡ）の予防・治療剤として使用することができる。
一方、カルモジュリン活性阻害物質は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能の異常亢進が関連する疾患［例えば、先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）），骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍など］の予防・治療剤として用いることができる。
カルモジュリン活性促進もしくは阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したカルモジュリン類と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
カルモジュリン活性促進物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
カルモジュリン活性阻害物質の投与量も、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上述のように、カルモジュリンの発現を調節（促進または阻害）する物質もまた、骨・関節疾患、特に軟骨基質の変性・産生異常や、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化異常が関連する疾患の予防・治療に有効である。従って、本発明は、カルモジュリン類を産生する能力を有する細胞におけるカルモジュリン類の発現を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
カルモジュリンの発現量は、カルモジュリンをコードする核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（即ち、前記したカルモジュリンをコードする塩基配列またはその一部を含む核酸（以下、「センスＣＡＬＭ１」ともいう）またはカルモジュリンをコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部（アンチセンスＣＡＬＭ１））を用いてそのｍＲＮＡを検出することにより、転写レベルで測定することもできる。あるいは、該発現量は、前記した抗ＣａＭ抗体を用いてタンパク質（ペプチド）を検出することにより、翻訳レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（ｂ）カルモジュリン類を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるカルモジュリン類をコードするｍＲＮＡの量を、センスもしくはアンチセンスＣＡＬＭ１を用いて測定、比較することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法、および
（ｃ）カルモジュリン類を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるカルモジュリン類のタンパク質（ペプチド）量を、抗ＣａＭ抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング方法において、カルモジュリン類を産生する能力を有する細胞としては、上記（ａ）のスクリーニング方法において用いられるのと同様のものが好ましく用いられる。
例えば、カルモジュリン類のｍＲＮＡ量またはタンパク質（ペプチド）量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物（例えば、マウス，ラット，ウサギ，ヒツジ，ブタ，ウシ，ネコ，イヌ，サル，トリなど）に対して、薬剤あるいは物理的刺激などを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的刺激と同時に被験物質を投与し、投与から一定時間が経過した後、関節液、関節軟骨などを採取する。得られた生体試料に含まれる細胞において発現したＣＡＬＭ１のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＲＴ−ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、カルモジュリンタンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ｉｉ）カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を導入した形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体を常法に従って培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後、該形質転換体に含まれるカルモジュリン類のｍＲＮＡ量またはタンパク質（ペプチド）量を定量、解析することにより行うことができる。
被験物質としては、ペプチド，タンパク質，非ペプチド性化合物，合成化合物，発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
上記（ｃ）のスクリーニング方法におけるカルモジュリン類の量の測定は、具体的には、例えば、
（ｉ）抗ＣａＭ抗体と、試料液および標識化されたカルモジュリン類とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたカルモジュリン類を検出することにより試料液中のカルモジュリン類を定量する方法や、
（ｉｉ）試料液と、担体上に不溶化した抗ＣａＭ抗体および標識化された別の抗ＣａＭ抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中のカルモジュリン類を定量する方法等が挙げられる。
上記（ｉｉ）の定量法においては、２種の抗体はカルモジュリン類の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がカルモジュリン類のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてカルモジュリン類のＣ端部と反応するものを用いることができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素，酵素，蛍光物質，発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［１２５Ｉ］，［１３１Ｉ］，［３Ｈ］，［１４Ｃ］などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ，β−グルコシダーゼ，アルカリフォスファターゼ，パーオキシダーゼ，リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン，フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール，ルミノール誘導体，ルシフェリン，ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
試料液としては、カルモジュリン類が細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、カルモジュリン類が細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液や培養上清からカルモジュリン類を分離・精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。
抗ＣａＭ抗体を用いるカルモジュリン類の定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース，デキストラン，セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン，ポリアクリルアミド，シリコーン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した抗ＣａＭ抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の抗ＣａＭ抗体を反応させた（２次反応）後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のカルモジュリン類を定量することができる。１次反応と２次反応は、逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は、前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は、必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
抗ＣａＭ抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、試料液中のカルモジュリン類と標識したカルモジュリン類とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のカルモジュリン類を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる固相化法（間接法）とが用いられる。
イムノメトリック法では、試料液中のカルモジュリン類と固相化したカルモジュリン類とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のカルモジュリン類と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したカルモジュリン類を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し、試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のカルモジュリン類の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にも、レーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に、当業者の通常の技術的配慮を加えて、カルモジュリン類の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．７０：（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ）），同書  Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ）），同書  Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ）），同書  Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）），同書  Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）），同書  Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ発行）などを参照することができる。
以上のようにして、抗ＣａＭ抗体を用いることによって、細胞におけるカルモジュリン類の生産量を感度よく定量することができる。
上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング法において、カルモジュリン類の発現量（ｍＲＮＡ量またはタンパク質（ペプチド）量）を増加させた物質をカルモジュリン発現促進物質、発現量を減少させた物質をカルモジュリン発現阻害物質としてそれぞれ選択することができる。カルモジュリン発現促進物質は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患［例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等））など］、好ましくは変形関節症（例：股関節ＯＡ，膝関節ＯＡ）の予防・治療剤として使用することができる。
一方、カルモジュリン発現阻害物質は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能の異常亢進が関連する疾患［例えば、先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）），骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍など］の予防・治療剤として用いることができる。
カルモジュリン発現促進もしくは阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したカルモジュリン類の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
カルモジュリン発現促進物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
カルモジュリン発現阻害物質の投与量も、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（４）遺伝子診断剤
カルモジュリンをコードする塩基配列またはその一部を含む核酸（以下、「センスＣＡＬＭ１」ともいう）、あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸（アンチセンスＣＡＬＭ１）は、プローブ等として使用することにより、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）におけるカルモジュリンをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡの損傷もしくは突然変異やｍＲＮＡのスプライシング異常あるいは発現低下、あるいは該ＤＮＡの増幅やｍＲＮＡの発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。カルモジュリンをコードする塩基配列の一部を含む核酸は、プローブとして必要な長さ（例えば、約１５塩基以上）を有する限り特に制限されず、また、カルモジュリンの部分ペプチドをコードしている必要もない。
センスもしくはアンチセンスＣＡＬＭ１を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＤＧＧＥ法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などにより実施することができる。
上記のように、カルモジュリンは軟骨基質遺伝子の発現を増加させ、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を促進する機能を有するので、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患に対して抑制的に作用する。そのため、そのような疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患するリスクが高い状態にあれば、ＣＡＬＭ１遺伝子の発現が正常な状態に比して上昇していると考えられる。従って、例えば、被験温血動物の細胞から抽出したＲＮＡ画分についてのノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＣＡＬＭ１遺伝子の発現上昇が検出された場合は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＣＡＬＭ１遺伝子の発現低下が検出された場合は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能の異常亢進が関連する疾患、例えば、先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
前記した抗ＣａＭ抗体は、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）におけるカルモジュリンまたはその塩の量を測定することができるので、例えば、該タンパク質の発現低下または発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。
抗ＣａＭ抗体を用いる上記の遺伝子診断は、前記した抗ＣａＭ抗体を用いるカルモジュリン発現調節（促進もしくは阻害）物質のスクリーニング方法（（ｃ）のスクリーニング方法）において、カルモジュリン類を産生する能力を有する細胞として、被験温血動物から採取した生体試料（例：関節液，生検など）を用いてイムノアッセイを実施することにより行うことができる。
イムノアッセイの結果、該試料中のカルモジュリンまたはその塩の増加が検出された場合は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、イムノアッセイの結果、該試料中のカルモジュリンまたはその塩の減少が検出された場合は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能の異常亢進が関連する疾患、例えば、先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
後記実施例により示される通り、カルモジュリンをコードするＣＡＬＭ１遺伝子の転写開始点とＴＡＴＡ配列との間（転写開始点の上流１６番目の塩基；配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号８５で示される塩基に相当する）にＳＮＰ（Ｃ＞Ｔ）の存在が新たに見出され、このうちＴアレルは、股関節ＯＡ患者群で頻度の高いＯＡ感受性アレルである。ＣＡＬＭ１遺伝子には１４個のＳＮＰがＪＳＮＰデータベースに既に登録されているが、これらのうちマイナーアレル頻度が１０％以上の１１個のＳＮＰを用いてハプロタイプ構造を推定した結果、３つのコモンハプロタイプ（全ハプロタイプ頻度の約９０％を網羅する）が同定され（図２ｂ参照）、ハプロタイプＢのみが股関節ＯＡと相関を示した。ハプロタイプＢは股関節ＯＡと高い相関を示す３つのＳＮＰ（図２ｂ；ＳＮＰ  ＩＤ：ＣＡＬＭ１＿１，ＣＡＬＭ１＿５，ＣＡＬＭ１＿９；配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号１５７６，２４４５および６６４１にそれぞれ相当する）を含むが、本発明者らが見出した新規ＳＮＰ（−１６Ｃ＞Ｔと記述する場合がある）のＴアレル（−１６Ｔ）はこれらのＳＮＰと完全連鎖の状態にあり、−１６ＴもまたハプロタイプＢに含まれることが明らかとなった。
従って、本発明はまた、
（１）配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号８５で示される塩基（但し、該塩基はチミンである）を含む該塩基配列の部分配列であって約１５塩基以上の連続した塩基配列を含む核酸、および
（２）配列番号：５で表される塩基配列において、塩基番号８５，１５７６，２４４５および６６４１で示される塩基が、それぞれチミン，シトシン，グアニンおよびチミンであるハプロタイプの塩基配列を含む核酸を提供する。
これらの核酸は、後述する骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断方法において、該疾患感受性多型（ハプロタイプ）を検出するためのプローブ等として用いることができる。上記（１）の核酸は、好ましくは約５００塩基以下、より好ましくは２００塩基以下の連続した塩基配列を含むものであり、そのような核酸は、配列番号：５で表される塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて合成することができる。また、上記（２）の核酸は、当該ハプロタイプ構造を有するＣＡＬＭ１遺伝子を保有する動物（好ましくはヒト）の細胞・組織から単離したゲノムＤＮＡより、配列番号：５で表される塩基配列の全部または一部を含む核酸をプローブ等として用いることにより単離することができる。
後記実施例において示される通り、本発明の新規ＳＮＰ（−１６Ｃ＞Ｔ）はＣＡＬＭ１遺伝子の転写活性に影響を及ぼし、Ｔアレル（−１６Ｔ）では転写活性が低下している。従って、上記したカルモジュリンの機能を考慮すると、Ｔアレルは変形性関節症だけでなく、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に対しても感受性を示すことが示唆される。一方、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能の異常亢進が関連する疾患、例えば、先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患に対しては保護的であり得る。
したがって、本発明はまた、配列番号：５で表される塩基配列において、塩基番号８５，１５７６，２４４５および６６４１で示される塩基からなる群より選択される１以上の塩基における多型を検出することを含む、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断方法を提供する。塩基番号１５７６，２４４５および６６４１で示される塩基は、塩基番号８５で示される本発明の新規ＳＮＰと完全連鎖の状態にあるので、これらの塩基のいずれかにおける多型を検出することにより、骨・関節疾患感受性のハプロタイプ（上記ハプロタイプＢ）を保有しているか否かを高確度に判定することが可能である。
上記の各塩基における多型の検出方法としては、公知のＳＮＰ検出方法のいずれも使用することができる。該検出方法としては、例えば、被験動物の細胞から抽出したゲノムＤＮＡを試料とし、上記（１）の核酸をプローブとして用い、例えばＷａｌｌａｃｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，２７８−２８２（１９８３））の方法に従って、ストリンジェンシーを正確にコントロールしながらハイブリダイゼーションを行い、プローブと完全相補的な配列のみを検出する方法や、上記（１）の核酸および上記（１）の核酸において塩基番号８５で示される塩基がシトシンである核酸の一方を標識し、他方を未標識としたミックスプローブを用い、変性温度から徐々に反応温度を低下させながらハイブリダイゼーションを行い、一方のプローブと完全相補的な配列を先にハイブリダイズさせ、ミスマッチを含むプローブとの交差反応を防ぐ方法などが挙げられる。
また、多型の検出は、例えば、特開２００４−０００１１５に記載された種々の方法、例えば、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、およびＥＣＡ法などにより実施することができる。
多型を調べた結果、配列番号：５で表される塩基配列において、
塩基番号８５で示される塩基がチミン、
塩基番号１５７６で示される塩基がシトシン、
塩基番号２４４５で示される塩基がグアニン、または
塩基番号６６４１で示される塩基がチミンである場合、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に対して感受性であると判定する。２以上の多型を調べた結果、上記３つのコモンハプロタイプに属さないマイナーハプロタイプであると判定された場合には、塩基番号８５で示される塩基の結果が優先される。
後記実施例において示される通り、本発明の新規ＳＮＰにおいて、Ｔアレル（−１６Ｔ）により選択的に結合する核内因子が存在し、該因子が転写抑制因子として作用していることが示唆される。従って、配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号８５で示される塩基（但し、該塩基はチミンである）およびそれに隣接する塩基からなる塩基配列を含む核酸は、デコイ核酸として機能することにより、ＣＡＬＭ１遺伝子の転写調節領域への該核内因子の結合を阻害して、ＣＡＬＭ１遺伝子の転写活性を増大させることができ、そのため、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患の予防・治療剤として用いることができる。
ここで「隣接する塩基」は、−１６Ｔの５’上流側および３’下流側のいずれであってもよく、その両方であってもよい。−１６Ｔおよびそれに隣接する塩基からなる塩基配列は、好ましくは約５〜約３０塩基、より詳細には−１６Ｔとその５’上流側０〜２０塩基および１６Ｔの３’下流側０〜２０塩基とからなる全長約５〜約３０塩基からなる塩基配列である。
上記デコイ核酸を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したカルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
上記デコイ核酸の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上記のように、本発明の新規ＳＮＰにおいて、Ｔアレル（−１６Ｔ）により選択的に結合する核内因子が存在し、該因子が転写抑制因子として作用していることが示唆されるので、該因子の−１６Ｔおよびその周辺領域への結合を調節（促進もしくは阻害）する物質は、骨・関節疾患、特に軟骨基質の変性・産生異常や、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化異常が関連する疾患の予防・治療に有効である。
従って、本発明はまた、配列番号：５で表される塩基配列中塩基番号８５で示される塩基（但し、該塩基はチミンである）およびそれに隣接する塩基からなる塩基配列を含む核酸と、該塩基配列に選択的に結合する転写調節因子とを用いることを特徴とする骨・関節疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。
例えば、
１）被験物質の存在下における該核酸と該転写調節因子の結合調節を検出する方法、および
２）該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む動物細胞における、被験物質の存在下および非存在下での該遺伝子の発現を比較する方法などが挙げられる。
該核酸と該転写調節因子との結合を指標とする場合、例えば、標識（例：３２Ｐ，ジゴキシゲニン等）した該核酸と該転写調節因子（例えば、ヒトまたは他の温血動物細胞由来の核抽出液の状態で提供され得る。あるいは、該核酸を用いて該抽出液からアフィニティー精製して用いることもできる）とを被験物質の存在下でインキュベートした後、該反応液を非変性ゲル電気泳動に付し、核酸−転写調節因子複合体に相当するバンドのシグナル強度の増減を検出することにより行うことができる。
被験物質としては、例えばペプチド，タンパク質，非ペプチド性化合物，合成化合物，発酵生産物，細胞抽出液，植物抽出液，動物組織抽出液などが挙げられる。
該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指標とする場合、プロモーターとしては、動物細胞内で機能し得るいかなるプロモーターも使用することができ、例えば、ＳＲαプロモーター，ＳＶ４０プロモーター，ＬＴＲプロモーター，ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター，ＨＳＶ−ｔｋプロモーターなどが用いられる。本発明のＤＮＡは、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて該プロモーター内の適当な位置に挿入することができる。あるいは、−１６Ｔを含むＣＡＬＭ１遺伝子プロモーターを使用してもよい。
該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子は、その発現量を容易に測定し得るものであれば特に制限されないが、好ましくはルシフェラーゼ，ＧＦＰ，アルカリホスファターゼ，ペルオキシダーゼ，β−ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子が挙げられる。また、−１６Ｔを含むＣＡＬＭ１遺伝子をそのまま使用することもできる。この場合、該ＣＡＬＭ１遺伝子を生来有する動物（好ましくはヒト）由来の細胞もしくは組織を、「該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む動物細胞」として使用することができる。該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子としてレポーター遺伝子を用いる場合は、該核酸を含む上記プロモーターの下流にレポーター遺伝子を自体公知の遺伝子工学的手法を用いて連結したものを、適当な導入ベクター、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例：ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例：ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例：ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ等のベクター中に挿入し、宿主動物細胞に導入することができる。該導入ベクターは、所望により他のエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子［メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性］、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。
動物細胞は、該転写調節因子を発現し得る細胞であれば特に制限はなく、例えば、Ｈｕｈ−７細胞などを用いることもできるが、これに限定されない。該動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５年）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
被験物質としては、例えばペプチド，タンパク質，非ペプチド性化合物，合成化合物，発酵生産物，細胞抽出液，植物抽出液，動物組織抽出液などが挙げられる。
被験物質の存在下および非存在下に、適当な培地（例：最小必須培地，ダルベッコ改変イーグル培地，ハム培地，Ｆ１２培地，ＲＰＭＩ１６４０培地，ウイリアムＥ培地等）中で一定時間細胞を培養した後、該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を両条件下で比較する。ＣＡＬＭ１遺伝子の発現は、上記抗ＣａＭ抗体を用いたＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ法や、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出・定量することができる。
あるいは、上記の方法に用いられ得る動物細胞を用い、該転写調節因子の細胞内局在性を、例えば、該動物細胞における該因子の細胞質から核への移行の度合いを被験物質の存在下および非存在下で比較することによっても、骨・関節疾患の予防・治療物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、例えば、該転写調節因子に対する蛍光標識した抗体で該細胞を免疫染色することにより、該因子の細胞質から核への移行をモニタリングすることができる。あるいは、該転写調節因子をＧＦＰなどの蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現し得る形質転換体を用いることにより、直接的に該因子の細胞質から核への移行をモニタリングすることもできる（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７８：６５９−６６４（２０００）を参照）。
上記のスクリーニング法において、該核酸と該転写調節因子の結合を阻害した被験物質は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下が関連する疾患［例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等））など］、好ましくは変形関節症（例：股関節ＯＡ，膝関節ＯＡ）の予防・治療剤として使用することができる。
一方、該核酸と該転写調節因子の結合を促進した被験物質は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能の異常亢進が関連する疾患［例えば、先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）），骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍など］の予防・治療剤として用いることができる。
上記の結合促進もしくは阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したカルモジュリン類の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
上記の結合阻害物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上記の結合促進物質の投与量も、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明で用いられる配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、「アスポリン」または「ＡＳＰＮ」と称する場合がある）は、ヒトもしくは他の温血動物（例えば、サル，ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウサギ，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ニワトリなど）の細胞［例えば、肝細胞，脾細胞，神経細胞，グリア細胞，膵β細胞，骨髄細胞，メサンギウム細胞，ランゲルハンス細胞，表皮細胞，上皮細胞，杯細胞，内皮細胞，平滑筋細胞，線維芽細胞，線維細胞，筋細胞，脂肪細胞，免疫細胞（例：マクロファージ，Ｔ細胞，Ｂ細胞，ナチュラルキラー細胞，肥満細胞，好中球，好塩基球，好酸球，単球），巨核球，滑膜細胞，軟骨細胞，骨細胞，骨芽細胞，破骨細胞，乳腺細胞，肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官［例えば、脳，脳の各部位（例：嗅球，扁桃核，大脳基底球，海馬，視床，視床下部，大脳皮質，延髄，小脳），脊髄，下垂体，胃，膵臓，腎臓，肝臓，生殖腺，甲状腺，胆嚢，骨髄，副腎，皮膚，筋肉，肺，消化管（例：大腸，小腸），血管，心臓，胸腺，脾臓，顎下腺，末梢血，前立腺，睾丸，卵巣，胎盤，子宮，骨，関節，脂肪組織（例：褐色脂肪組織，白色脂肪組織），骨格筋など］に由来するタンパク質であってもよく、また、後述のように、化学的もしくは無細胞タンパク質合成系を用いて生化学的に合成されたタンパク質であってもよい。あるいは、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。
配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列を含むタンパク質が、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性を有するような配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ）、水酸基を含むアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
実質的に同質の活性としては、例えば、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化抑制活性、具体的には、軟骨細胞の分化マーカー［例：ＩＩ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ２ａ１），アグリカン遺伝子（Ａｇｃ１）等］の発現阻害活性などが挙げられる。また、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖抑制活性等も好ましい。「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に（例：生理学的に、または薬理学的に）同質であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍）。
アスポリン（ＡＳＰＮ）の活性の測定は自体公知の方法に準じて行うことができる。例えば、後記実施例において詳述するように、軟骨細胞分化モデルにおけるＴＧＦ−β刺激時の上記マーカー遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。また、後記実施例において詳述するように、ＡＴＤＣ細胞株に対する増殖抑制活性をＭＴＴアッセイ等により測定することによっても行うことができる。
また、本発明で用いられるアスポリンとしては、例えば、（１）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、当該タンパク質の活性を損なわない限り、特に限定されない。
本明細書においてアミノ酸配列により特定されるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるアスポリンは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル，エチル，ｎ−プロピル，イソプロピル，ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル，シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル，α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル，フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例：メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基，アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ，−ＳＨ，アミノ基，イミダゾール基，インドール基，グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基，アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含むヒトアスポリン（ＧｅｎＢａｎｋｕ登録番号：ＡＡＫ３５１６１）の成熟体（アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列を含む）などがあげられる。
本発明で用いられるアスポリンの部分ペプチドは、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記した本発明で用いられるアスポリンと実質的に同質の活性を有するものであれば、いずれのものでもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。また、「実質的に同質の活性」の測定は、上記と同様にして行うことができる。
具体的には、該部分ペプチドとしては、本発明で用いられるアスポリンの構成アミノ酸配列のうち少なくとも１００個以上、好ましくは２００個以上、より好ましくは３００個以上のアミノ酸配列を含むペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられるアスポリンの部分ペプチドは、（１）そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失し、または、（２）そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加し、または、（３）そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入され、または、（４）そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは（５）それらが組み合わされていてもよい。
本発明で用いられるアスポリンの部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、アスポリンについて上記したと同様のものが挙げられる。また、該部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、該カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるアスポリンの部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、Ｃ末端のエステルと同様のものが例示される。さらに、該部分ペプチドには、アスポリンの場合と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例：メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられるアスポリンまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸，有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸，リン酸，臭化水素酸，硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クエン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるアスポリンまたはその塩は、前述したヒトや他の温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって調製することができる。具体的には、該動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるアスポリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、「アスポリン類」と包括的に略記する場合がある）は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより目的とするタンパク質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）および（２）に記載された方法に従って行われる。
（１）Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｍｄ  Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６）
（２）Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｅｂｋｅ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５）
本発明のアスポリン類の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂，ヒドロキシメチル樹脂，ベンズヒドリルアミン樹脂，アミノメチル樹脂，４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂，４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂，ＰＡＭ樹脂，４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂，ポリアクリルアミド樹脂，４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂，４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質等の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ，Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護並びに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ，Ｂｏｃ，ｔ−ペンチルオキシカルボニル，イソボルニルオキシカルボニル，４−メトキシベンジルオキシカルボニル，Ｃｌ−Ｚ，Ｂｒ−Ｚ，アダマンチルオキシカルボニル，トリフルオロアセチル，フタロイル，ホルミル，２−ニトロフェニルスルフェニル，ジフェニルホスフィノチオイル，Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル，エチル，プロピル，ブチル，ｔ−ブチル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘプチル，シクロオクチル，２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエスチル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル，４−ニトロベンジルエステル，４−メトキシベンジルエステル，４−クロロベンジルエステル，ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基，エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基，テトラヒドロピラニル基，ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては例えば、Ｂｚｌ，Ｃｌ２−Ｂｚｌ，２−ニトロベンジル，Ｂｒ−Ｚ，ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ，４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル，ＤＮＰ，ベンジルオキシメチル，Ｂｕｍ，Ｂｏｃ，Ｔｒｔ，Ｆｍｏｃなどが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素，メタンスルホン酸，トリフルオロメタンスルホン酸，トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン，トリエチルアミン，ピペリジン，ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソール，フェノール，チオアニソール，メタクレゾール，パラクレゾール，ジメチルスルフィド，１，４−ブタンジチオール，１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は、上記の１，２−エタンジチオール，１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液，希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール，２，４，５−トリクロロフェノール，２，４−ジニトロフェノール，シアノメチルアルコール，パラニトロフェノール，ＨＯＮＢ，Ｎ−ヒドロキシスクシミド，Ｎ−ヒドロキシフタルイミド，ＨＯＢｔ）とのエステル］などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられるアスポリンの部分ペプチドまたはその塩は、上述もしくは後述のいずれかの方法により得られるアスポリンまたはその塩を、適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
このようにして得られた本発明のアスポリン類は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるタンパク質または部分ペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質または部分ペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のアスポリン類は、アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養してアスポリン類を生成せしめ、得られる培養物からアスポリン類を分離・精製することによって製造することもできる。
アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸としては、前述した本発明で用いられるアスポリンのアミノ酸配列もしくはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものでもよい。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。
アスポリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ヒトもしくは他の温血動物（例えば、サル，ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウサギ，マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ニワトリなど）の細胞［例えば、肝細胞，脾細胞，神経細胞，グリア細胞，膵β細胞，骨髄細胞，メサンギウム細胞，ランゲルハンス細胞，表皮細胞，上皮細胞，杯細胞，内皮細胞，平滑筋細胞，線維芽細胞，線維細胞，筋細胞，脂肪細胞，免疫細胞（例：マクロファージ，Ｔ細胞，Ｂ細胞，ナチュラルキラー細胞，肥満細胞，好中球，好塩基球，好酸球，単球），巨核球，滑膜細胞，軟骨細胞，骨細胞，骨芽細胞，破骨細胞，乳腺細胞，肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官［例えば、脳，脳の各部位（例：嗅球，扁桃核，大脳基底球，海馬，視床，視床下部，大脳皮質，延髄，小脳），脊髄，下垂体，胃，膵臓，腎臓，肝臓，生殖腺，甲状腺，胆嚢，骨髄，副腎，皮膚，筋肉，肺，消化管（例：大腸，小腸），血管，心臓，胸腺，脾臓，顎下腺，末梢血，前立腺，睾丸，卵巣，胎盤，子宮，骨，関節，脂肪組織（例：褐色脂肪組織，白色脂肪組織），骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。アスポリンまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、ＰＣＲ法およびＲＴ−ＰＣＲ法によって直接増幅することもできる。あるいは、アスポリンまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
アスポリンをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３で表される塩基配列中塩基番号１１５〜１１５５で示される塩基配列を含むＤＮＡ、あるいは配列番号：３で表される塩基配列中塩基番号１１５〜１１５５で示される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：４に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性（例えば、軟骨細胞分化阻害活性など）を有するタンパク質もしくはペプチドをコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：３で表される塩基配列中塩基番号１１５〜１１５５で示される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３で表される塩基配列中塩基番号１１５〜１１５５で示される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
アスポリンをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号：３で表される塩基配列を含むヒトアスポリンｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ３１６８２４）もしくはそのアレル変異体または他の温血動物（例えば、マウス，ラット，モルモット，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，トリ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジーなど）におけるそのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）等である。
アスポリンの部分ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３４７で示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
具体的には、該部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：３で表される塩基配列中塩基番号１１５〜１１５５で示される塩基配列を含むＤＮＡの部分塩基配列、または
（２）配列番号：３で表される塩基配列中塩基番号１１５〜１１５５で示される塩基配列を含むＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性（例：軟骨細胞分化阻害活性など）を有するペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：３で表される塩基配列中塩基番号１１５〜１１５５で示される塩基配列を含むＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、該塩基配列中の対応する部分塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡなどが用いられる。
アスポリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該タンパク質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を含む合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、アスポリンの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションさせることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
上記のアスポリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該タンパク質またはペプチドを製造することができる。
アスポリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、アスポリンをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例：ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例：ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例：ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス、ｐＡ１−１１，ｐＸＴ１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲｃ／ＲＳＶ，ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター，ＳＶ４０プロモーター，ＬＴＲプロモーター，ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター，ＨＳＶ−ｔｋプロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター，ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモーター，Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター，Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子［メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性］、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル（もしくはプレプロ）配列をコードする塩基配列を、アスポリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に付加［またはネイティブなシグナルコドン（例：配列番号：３で表される塩基配列中塩基番号１９〜６０で示される塩基配列）もしくはプレプロコドン（例：配列番号：３で表される塩基配列中塩基番号１９〜１１４で示される塩基配列）と置換］してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、ＰｈｏＡ・シグナル配列，ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼ・シグナル配列，サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル（プレプロ）配列，ＳＵＣ２・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル（プレプロ）配列，α−インターフェロン・シグナル配列，抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌，バチルス属菌，酵母，昆虫細胞，昆虫，動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２・ＤＨ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０：１６０（１９６８）］，ＪＭ１０３［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：３０９（１９８１）］，ＪＡ２２１［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２０：５１７（１９７８）］，ＨＢ１０１［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４１：４５９（１９６９）］，Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９：４４０（１９５４）］などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ１１４［Ｇｅｎｅ，２４：２５５（１９８３）］，２０７−２１［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５：８７（１９８４）］などが用いられる。
酵母としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞、Ｅｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１３：２１３−２１７（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる［Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：５９２（１９８５）］。
動物細胞としては、例えば、サル由来のＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター由来のＣＨＯ，ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ（ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−））細胞、マウス由来のＬ，ＡｔＴ−２０，ミエローマ細胞、ラット由来のＧＨ３細胞、ヒト由来のＦＬ，ＨＥＫ２９３，ＨｅｐＧ２，ＨｅＬａ細胞などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７：１０７（１９８２）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２−１８７（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．），６：４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース，デキストリン，可溶性澱粉，ショ糖などが、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類，硝酸塩類，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などの無機または有機物質が、無機物としては、例えば、塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス，ビタミン類，生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース，カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２］が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行われる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行われる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４５０５（１９８０）］や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地［Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：５３３０（１９８４）］などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行われる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５：７８８（１９６２）］に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２〜６．４である。培養は、通常約２７℃で、約３〜５日間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清を含むＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２：５０１（１９５２）］，ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８：３９６（１９５９）］，ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９：５１９（１９６７）］，１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３：１（１９５０）］などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にアスポリン類を生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、アスポリン類を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、アスポリン類を培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれるアスポリン類の単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法，限外ろ過法，ゲルろ過法，およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られるアスポリンまたはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該タンパク質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するアスポリン類を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン，キモトリプシン，アルギニルエンドペプチダーゼ，プロテインキナーゼ，グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるアスポリン類の存在は、特異的な抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、アスポリンまたはその部分ペプチドは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、アスポリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞タンパク質（転写／）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液は、Ｐｒａｔｔ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ”，Ｈａｍｅｓ  Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．ｅｄｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １７９−２０９（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ  ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ  Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９：１６０−１６１（１９５７）あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ  Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６：３８−５０（１９９６）等に記載の方法を用いることができる。
タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）前述）や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ  Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（Ｋｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，第２１回日本分子生物学会，ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３）等を用いることができる。
「配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列またはその一部」、あるいは「該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部」を含む核酸とは、前述の（成熟）アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸だけではなく、プレプロ配列を含む前駆アスポリンポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードする核酸、さらにはコドンの読み枠の合わない部分塩基配列をも含む意味で用いられる。該核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。
目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」または「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性または相補性を有することをいう。
アスポリンをコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸（以下、「アンチセンスＡＳＰＮ」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたアスポリンをコードする核酸の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、アスポリンをコードする遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスＡＳＰＮは、アスポリンをコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。
アンチセンスＡＳＰＮの標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてアスポリンタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該タンパク質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、アスポリンをコードする核酸の５’端ヘアピンループ，５’端６−ベースペア・リピート，５’端非翻訳領域，翻訳開始コドン，タンパク質コード領域，翻訳終止コドン，３’端非翻訳領域，３’端パリンドローム領域，および３’端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、アスポリンをコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンスＡＳＰＮは、アスポリンをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるアスポリンをコードする遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。
アンチセンス核酸は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を含むその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含むその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含む）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ，１本鎖ＤＮＡ，２本鎖ＲＮＡ，１本鎖ＲＮＡ，さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート，ホスホトリエステル，ホスホルアミデート，カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ，ヌクレアーゼ・インヒビター，トキシン，抗体，シグナルペプチド，ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン，プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属，放射活性をもつ金属，ホウ素，酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含むのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
好ましくは、アンチセンス核酸は、修飾されていてもよいＲＮＡまたはＤＮＡである。修飾された核酸（ＲＮＡ，ＤＮＡ）の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。アンチセンスＡＳＰＮは次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、標的とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そして、もし毒性があるなら、アンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば、Ｊ．Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，２４７（１９９２），同  Ｖｏｌ．８，３９５（１９９２）；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）などに開示されている。
アンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療において適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド，コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート，コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アスポリンをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスＡＳＰＮに包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では、当該酵素活性部位の塩基配列を含むオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では、配列特異的な核酸切断活性を有する限り、ＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。アスポリンｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡへリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
アスポリンをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な塩基配列を含む二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンスＡＳＰＮに包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、アスポリンをコードするｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列情報に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社，ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
アンチセンスＡＳＰＮの遺伝子発現阻害活性は、アスポリンをコードする核酸を含む形質転換体、生体内や生体外のアスポリンをコードする遺伝子発現系またはアスポリンの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
本発明はまた、アスポリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、「抗ＡＳＰＮ抗体」と略記する場合がある）を提供する。抗ＡＳＰＮ抗体は、アスポリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対して特異的親和性を有するものであれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。該抗体は、アスポリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩（アスポリン類）を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
［モノクローナル抗体の作製］
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
アスポリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩を、哺乳動物に対して、投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル，ウサギ，イヌ，モルモット，マウス，ラット，ヒツジ，ヤギ等が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
例えば、抗原で免疫された哺乳動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化アスポリンと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法［Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）］に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｕ１，ＳＰ２／０，ＡＰ−１などの哺乳動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例：マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したアスポリンを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などにより、スクリーニングすることができる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。モノクローナル抗体の選別は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。モノクローナル抗体の選別および育種用培地は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。このような培地としては、例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の胎仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の胎仔ウシ血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１，日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法，アルコール沈殿法，等電点沈殿法，電気泳動法，イオン交換体（例：ＤＥＡＥ）による吸脱着法，超遠心法，ゲルろ過法，抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法］に従って分離精製することができる。
［ポリクローナル抗体の作製］
アスポリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するポリクローナル抗体は、自体公知の方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（アスポリン類）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体を作製し、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様にして温血動物に免疫を行い、該免疫動物から抗ＡＳＰＮ抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤、例えばグルタルアルデヒドやカルボジイミド，マレイミド活性エステル，チオール基，ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水、母乳など、鳥類の場合は血液、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
アスポリンの部分ペプチドまたはその塩を抗原として用いる場合、そのアスポリン上の位置は特に限定されないが、例えば、各種温血動物間でよく保存された領域の部分アミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはオリゴペプチドまたはその塩が挙げられる。
上記した（ｉ）アスポリン類、（ｉｉ）アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ）、（ｉｉｉ）抗ＡＳＰＮ抗体、（ｉｖ）アンチセンスＡＳＰＮは、例えば以下の用途を有する。
後記実施例において示される通り、アスポリン遺伝子は変形性関節症（ＯＡ）軟骨で発現が上昇し、また、アスポリンは、デコリンなどの他のＳＬＲＰファミリーに属するプロテオグリカンと競合的に軟骨細胞分化のｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒであるＴＧＦ−βに結合し、ＴＧＦ−βによる軟骨細胞分化（分化マーカー遺伝子の発現）の誘導を阻害する。更に、アスポリンはＴＧＦ−β特異的なシグナルを抑制し、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖を阻害等する。これらの事実は、アスポリンの発現または活性を調節（促進または阻害）し得る物質が、骨・関節疾患、特に軟骨基質の変性・産生異常や、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化異常、あるいは軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖異常が関連する疾患の予防・治療に有効であることを示すものである。ここで「関連する疾患」とは、それに起因するか、あるいは結果としてそのような状態を生じる疾患をいう。
（１）軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能・軟骨細胞増殖の異常亢進が関連する疾患の予防・治療剤
上記のように、アスポリンは軟骨基質遺伝子の発現を低下させ、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を抑制する機能を有し、また軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖を抑制する機能を有するので、生体内においてアスポリンまたはそれをコードする核酸（例：遺伝子，ｍＲＮＡ等）に異常があったり、これを欠損している場合、あるいはその発現量が異常に減少している場合、さらには、他の何らかの要因で軟骨の過形成が起こり、また軟骨基質の産生能が異常亢進している場合、あるいは軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化が異常亢進している場合、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖が異常亢進している場合に、ａ）アスポリンもしくはその部分ペプチドまたはその塩（アスポリン類）を患者に投与してアスポリンの量を補充したり、ｂ）（ｉ）アスポリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを患者に投与して標的細胞内で発現させることによって、あるいは（ｉｉ）単離した標的細胞にアスポリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを導入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるアスポリンの量を増加させ、軟骨基質遺伝子の発現および／または軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化および／または軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）増殖の異常亢進を抑制し、軟骨基質の過剰などを基盤とする疾患を予防・治療することができる。
したがって、ａ）アスポリン類、またはｂ）アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を、上記のような疾患、例えば先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患の予防・治療剤として用いることができる。
アスポリン類を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を上記予防・治療剤として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
例えば、ａ）アスポリン類、あるいはｂ）アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）アスポリン類、あるいはｂ）アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにする
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン，コーンスターチ，トラガント，アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ，ゼラチン，アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖，乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント，アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油，椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水，ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール，Ｄ−マンニトール，塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール，ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例：ポリソルベート８０ＴＭ，ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油，大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル，ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液，酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール，フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
アスポリン類の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（２）軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患の予防・治療剤
上記のように、アスポリンは軟骨基質遺伝子の発現を低下させ、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を抑制する機能を有し、また軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖を抑制する機能を有するので、生体内においてアスポリンまたはそれをコードする核酸（例：遺伝子，ｍＲＮＡ等）に異常がある（高活性変異体の出現）場合、あるいはその発現量が異常に増加している場合、さらには、他の何らかの要因で軟骨基質の変性・消失が起こり、またその産生能が低下している場合、あるいは軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化が抑制されている場合、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖が抑制されている場合に、ａ）抗ＡＳＰＮ抗体を患者に投与してアスポリンを不活性化（中和）したり、ｂ）（ｉ）アンチセンスＡＳＰＮを患者に投与して標的細胞内に導入する（および発現させる）ことによって、あるいは（ｉｉ）単離した標的細胞にアンチセンスＡＳＰＮを導入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるアスポリンの量を減少させ、軟骨基質遺伝子の発現および／または軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化および／または軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖を促進し、軟骨基質の変性や消失を基盤とする疾患を予防・治療することができる。
したがって、ａ）抗ＡＳＰＮ抗体、またはｂ）アンチセンスＡＳＰＮを、上記のような疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］など、好ましくは変形関節症（例：股関節ＯＡ，膝関節ＯＡ）の予防・治療剤として使用することができる。
抗ＡＳＰＮ抗体を上記予防・治療剤として使用する場合、前記したアスポリン類を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。また、アンチセンスＡＳＰＮを上記予防・治療剤として使用する場合、前記したアスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
抗ＡＳＰＮ抗体の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
アンチセンスＡＳＰＮの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（３）アスポリンとｂＦＧＦとの併用剤
また、後述の実施例にて詳述するように、アスポリンはｂＦＧＦに結合することによりｂＦＧＦの作用を増強し、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化誘導条件下でのｂＦＧＦの軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）増殖抑制効果や、分化非誘導条件下でのｂＦＧＦの軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）増殖促進効果を増強する。
したがって、ａ）アスポリン類、またはｂ）アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸と、ｃ）ｂＦＧＦもしくはその部分ペプチドまたはその塩（ｂＦＧＦ類）、またはｄ）ｂＦＧＦまたはその部分ペプチドをコードする核酸とを適量配合して、あるいは適量併用して使用することにより、骨・関節疾患の予防・治療剤とすることができる。
即ち、本発明は以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を組み合わせてなる、骨・関節疾患の予防・治療剤を提供する。
（Ｉ）ａ）アスポリン類、またはｂ）アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸、および
（ＩＩ）ｃ）ｂＦＧＦ類、またはｄ）ｂＦＧＦまたはその部分ペプチドをコードする核酸
ここで、「ｂＦＧＦ」は、ヒトその他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）のｂＦＧＦと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を意味する。「実質的に同一のアミノ酸配列」、「部分ペプチド」の定義は、アスポリンにおける定義と同様である。
アスポリンはｂＦＧＦの作用を増強し、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化誘導条件下でのｂＦＧＦの軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）増殖抑制効果を増強する。従って、一態様において、上述の（Ｉ）および（ＩＩ）を組み合わせてなる、骨・関節疾患の予防・治療剤は、軟骨基質遺伝子の発現および／または軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化および／または軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）増殖の異常亢進を抑制し、軟骨基質の過剰などを基盤とする疾患、例えば先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患の予防・治療剤として用いることができる。
また、アスポリンはｂＦＧＦの作用を増強し、特に軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化の非誘導条件において、ｂＦＧＦの軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）増殖促進効果を増強する。従って、別の態様において、上述の（Ｉ）および（ＩＩ）を組み合わせてなる、骨・関節疾患の予防・治療剤は、軟骨基質遺伝子の発現および／または軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化および／または軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖を促進し、軟骨基質の変性や消失を基盤とする疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患の予防・治療剤として用いることができる。
上述の（Ｉ）と（ＩＩ）との併用に際しては、（Ｉ）と（ＩＩ）の投与時期は限定されず、（Ｉ）と（ＩＩ）とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。（Ｉ）および（ＩＩ）の投与量は、本発明の併用剤において用いられた際に上述の疾患の予防・治療を達成し得る範囲で特に限定されず、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することができる。
上述の（Ｉ）と（ＩＩ）の投与形態は、特に限定されず、投与時に、（Ｉ）と（ＩＩ）とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）上述の（Ｉ）と（ＩＩ）とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）上述の（Ｉ）と（ＩＩ）とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）上述の（Ｉ）と（ＩＩ）とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）上述の（Ｉ）と（ＩＩ）とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）上述の（Ｉ）と（ＩＩ）とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、（Ｉ）→（ＩＩ）の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等が挙げられる。以下、これらの投与形態をまとめて、本発明の併用剤と略記する。
本発明の併用剤は、上記（１）の予防・治療剤と同様に、薬理学的に許容される担体と混合して、常套手段に従って製剤化することができる。
本発明の併用剤において、ｂＦＧＦまたはその部分ペプチドをコードする核酸を使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
上述の（Ｉ）と（ＩＩ）とを同時に製剤化して単一の製剤として使用する場合、本発明の併用剤における（Ｉ）の含有量は、製剤の形態や、（Ｉ）として含まれるものがアスポリン類か、アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸なのかによって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
また、本発明の併用剤における上述の（ＩＩ）の含有量は、製剤の形態や、（ＩＩ）として含まれるものがｂＦＧＦ類か、ｂＦＧＦまたはその部分ペプチドをコードする核酸なのかによって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
本発明の併用剤において、上述の（Ｉ）および（ＩＩ）以外の成分の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．２〜９９．８重量％、好ましくは約２〜９８重量％、好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
本発明の併用剤における上述の（Ｉ）と（ＩＩ）との配合比は、投与対象、投与ルート、疾患等により適宜選択することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
本発明の併用剤の投与量は、上述の（Ｉ）および（ＩＩ）の種類、投与ルート、症状、患者の年令等によっても異なり、適宜選択することが出来る。
本発明の併用剤における（Ｉ）の投与量は、上記（１）の予防・治療剤と同様である。
本発明の併用剤におけるｂＦＧＦの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明の併用剤におけるｂＦＧＦまたはその部分ペプチドをコードする核酸の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上述の（Ｉ）および（ＩＩ）をそれぞれ別々に製剤化する場合も同様の含有量でよい。
上述の（Ｉ）と（ＩＩ）をそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、上述の（Ｉ）を含有する医薬組成物と上述の（ＩＩ）を含有する医薬組成物とを同時期に投与してもよいが、（ＩＩ）を含有する医薬組成物を先に投与した後、（Ｉ）を含有する医薬組成物を投与してもよいし、（Ｉ）を含有する医薬組成物を先に投与し、その後で（ＩＩ）を含有する医薬組成物を投与してもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、（ＩＩ）を含有する医薬組成物を先に投与する場合、（ＩＩ）を含有する医薬組成物を投与した後１分〜３日以内、好ましくは１０分〜１日以内、より好ましくは１５分〜１時間以内に（Ｉ）を含有する医薬組成物を投与する方法が挙げられる。（Ｉ）を含有する医薬組成物を先に投与する場合、（Ｉ）を含有する医薬組成物を投与した後、１分〜１日以内、好ましくは１０分〜６時間以内、より好ましくは１５分から１時間以内に（ＩＩ）を含有する医薬組成物を投与する方法が挙げられる。
（４）骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング
上記のように、アスポリンの活性を調節（促進または阻害）し得る物質は、骨・関節疾患、特に軟骨基質の変性・産生異常や、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化異常、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖異常が関連する疾患の予防・治療に有効である。従って、本発明は、アスポリン類を用いてその活性の変動を測定することによる、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、本発明は、
（ａ）軟骨細胞分化マーカーである軟骨基質（例：ＩＩ型コラーゲン，アグリカン等）を産生する能力を有する細胞を、アスポリン類の存在下、またはアスポリン類および被験物質の存在下に培養し、両条件下におけるアスポリン類の活性を比較することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、アスポリン類は、前述のいずれかの方法により単離・精製されたものを添加してもよいし、あるいは、軟骨基質を産生する能力を有する細胞が、アスポリン類を産生する能力を同時に有していてもよい。アスポリンまたはその塩および軟骨基質を産生する能力を有する細胞としては、生来それらを発現しているヒトもしくは他の温血動物細胞またはそれを含む生体試料（例：関節液，関節軟骨等）であれば特に制限はないが、物理的または化学的刺激に応じてアスポリンの発現および／または活性化が誘導されるものが好ましい。非ヒト動物由来の細胞、組織等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体に被験物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。上記の遺伝子工学的手法により、軟骨基質遺伝子を産生する能力を有する細胞にアスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を導入して得られる各種の形質転換体を用いることもできる。
被験物質としては、例えばタンパク質，ペプチド，非ペプチド性化合物，合成化合物，発酵生産物，細胞抽出液，植物抽出液，動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
アスポリン類の活性の測定は、軟骨細胞分化マーカーである軟骨基質遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。例えば、一定期間（例えば、５〜２５日程度）培養した細胞から常法により総ＲＮＡを抽出して、定量的ＲＴ−ＰＣＲやノーザンハイブリダイゼーションにより軟骨基質遺伝子［例：ＩＩ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ２ａ１），アグリカン遺伝子（Ａｇｃ１）等］の発現量を定量する。あるいは、細胞から総タンパク質を抽出し、後述のアスポリン類の定量と同様の方法により、抗ＩＩ型コラーゲン抗体、抗アグリカン抗体等を用いてこれらの軟骨基質を定量することによっても行うことができる。
上記（ａ）のスクリーニング法において、Ｃｏｌ２ａ１やＡｇｃ１等の軟骨基質遺伝子の発現を低下させた被験物質を「アスポリン活性促進物質」、それらの発現を増大させた被験物質を「アスポリン活性阻害物質」としてそれぞれ選択することができる。アスポリン活性促進物質は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能・軟骨細胞増殖能の異常亢進が関連する疾患［例えば、先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）），骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍など］の予防・治療剤として用いることができる。
一方、アスポリン活性阻害物質は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患［例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等））など］、好ましくは変形関節症（例：股関節ＯＡ，膝関節ＯＡ）の予防・治療剤として使用することができる。
アスポリン活性促進もしくは阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したアスポリン類と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
アスポリン活性促進物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
アスポリン活性阻害物質の投与量も、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上述のように、アスポリンの発現を調節（促進または阻害）する物質もまた、骨・関節疾患、特に軟骨基質の変性・産生異常や、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化異常、軟骨細胞増殖異常が関連する疾患の予防・治療に有効である。従って、本発明は、アスポリン類を産生する能力を有する細胞におけるアスポリン類の発現を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
アスポリンの発現量は、アスポリンをコードする核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（即ち、前記したアスポリンをコードする塩基配列またはその一部を含む核酸（以下、「センスＡＳＰＮ」ともいう））またはアスポリンをコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部（アンチセンスＡＳＰＮ）を用いてそのｍＲＮＡを検出することにより、転写レベルで測定することもできる。あるいは、該発現量は、前記した抗ＡＳＰＮ抗体を用いてタンパク質（ペプチド）を検出することにより、翻訳レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（ｂ）アスポリン類を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるアスポリン類をコードするｍＲＮＡの量を、センスもしくはアンチセンスＡＳＰＮを用いて測定、比較することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法、および
（ｃ）アスポリン類を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるアスポリン類のタンパク質（ペプチド）量を、抗ＡＳＰＮ抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング方法において、アスポリン類を産生する能力を有する細胞としては、上記（ａ）のスクリーニング方法において用いられるのと同様のものが好ましく用いられる。
例えば、アスポリン類のｍＲＮＡ量またはタンパク質（ペプチド）量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物（例えば、マウス，ラット，ウサギ，ヒツジ，ブタ，ウシ，ネコ，イヌ，サル，トリなど）に対して、薬剤あるいは物理的刺激などを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的刺激と同時に被験物質を投与し、投与から一定時間が経過した後、関節液、関節軟骨などを採取する。得られた生体試料に含まれる細胞において発現したアスポリンのｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＲＴ−ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、アスポリンタンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ｉｉ）アスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を導入した形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体を常法に従って培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後、該形質転換体に含まれるアスポリン類のｍＲＮＡ量またはタンパク質（ペプチド）量を定量、解析することにより行うことができる。
被験物質としては、ペプチド，タンパク質，非ペプチド性化合物，合成化合物，発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
上記（ｃ）のスクリーニング方法におけるアスポリン類の量の測定は、具体的には、例えば、
（ｉ）抗ＡＳＰＮ抗体と、試料液および標識化されたアスポリン類とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたアスポリン類を検出することにより試料液中のアスポリン類を定量する方法や、
（ｉｉ）試料液と、担体上に不溶化した抗ＡＳＰＮ抗体および標識化された別の抗ＡＳＰＮ抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中のアスポリン類を定量する方法等が挙げられる。
上記（ｉｉ）の定量法においては、２種の抗体はアスポリン類の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がアスポリン類のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてアスポリン類のＣ端部と反応するものを用いることができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素，酵素，蛍光物質，発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［１２５Ｉ］，［１３１Ｉ］，［３Ｈ］，［１４Ｃ］などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ，β−グルコシダーゼ，アルカリフォスファターゼ，パーオキシダーゼ，リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン，フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール，ルミノール誘導体，ルシフェリン，ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
試料液としては、アスポリン類が細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、アスポリン類が細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液や培養上清からアスポリン類を分離・精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。
抗ＡＳＰＮ抗体を用いるアスポリン類の定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース，デキストラン，セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン，ポリアクリルアミド，シリコーン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した抗ＡＳＰＮ抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の抗ＡＳＰＮ抗体を反応させた（２次反応）後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のアスポリン類を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
抗ＡＳＰＮ抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、試料液中のアスポリン類と標識したアスポリン類とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のアスポリン類を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる固相化法（間接法）とが用いられる。
イムノメトリック法では、試料液中のアスポリン類と固相化したアスポリン類とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のアスポリン類と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したアスポリン類を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のアスポリン類の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に、当業者の通常の技術的配慮を加えて、アスポリン類の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．７０：（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ）），同書  Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ）），同書  Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ）），同書  Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）），同書  Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）），同書  Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ発行）などを参照することができる。
以上のようにして、抗ＡＳＰＮ抗体を用いることによって、細胞におけるアスポリン類の生産量を感度よく定量することができる。
上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング法において、アスポリン類の発現量（ｍＲＮＡ量またはタンパク質（ペプチド）量）を増加させた物質をアスポリン発現促進物質、発現量を減少させた物質をアスポリン発現阻害物質としてそれぞれ選択することができる。アスポリン発現促進物質は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能・軟骨細胞増殖能の異常亢進が関連する疾患［例えば、先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）），骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍など］の予防・治療剤として用いることができる。
一方、アスポリン発現阻害物質は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患［例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等））など］、好ましくは変形関節症（例：股関節ＯＡ，膝関節ＯＡ）の予防・治療剤として使用することができる。
アスポリン発現促進もしくは阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したアスポリン類の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
アスポリン発現促進物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば、骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
アスポリン発現阻害物質の投与量も、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、本発明は、
（ｄ）軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）を、アスポリン類の存在下、またはアスポリン類および被験物質の存在下に培養し、両条件下における細胞増殖を比較することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、アスポリン類は、前述のいずれかの方法により単離・精製されたものを添加してもよいし、あるいは、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）が、アスポリン類を産生する能力を同時に有していてもよい。軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）としては、ヒトもしくは他の温血動物細胞またはそれを含む生体試料（例：関節液，関節軟骨等）であれば特に制限はないが、物理的または化学的刺激に応じてアスポリンの発現および／または活性化が誘導されるものが好ましい。非ヒト動物由来の細胞、組織等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体に被験物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。上記の遺伝子工学的手法により、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）にアスポリンまたはその部分ペプチドをコードする核酸を導入して得られる各種の形質転換体を用いることもできる。
被験物質としては、例えばタンパク質，ペプチド，非ペプチド性化合物，合成化合物，発酵生産物，細胞抽出液，植物抽出液，動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖は常法に従い測定することができる。例えば、一定期間（例えば、１〜２５日程度）細胞を培養した後に、目視による細胞数計測、ＭＴＴアッセイ、ＢｒｄＵの取り込み、３Ｈ−チミジンの取り込み等により、細胞増殖を測定する。
軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の培養を、インシュリン等の添加により軟骨細胞分化誘導条件下で行うことも、また好ましい。
アスポリン類は、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖を抑制する活性を有するので、上記（ｄ）のスクリーニング法において、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖低下をより増強させた被験物質を「アスポリン活性促進物質」、該細胞増殖低下を減弱させた被験物質、または細胞増殖を増大させた被験物質を「アスポリン活性阻害物質」としてそれぞれ選択することができる。アスポリン活性促進物質は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能・軟骨細胞増殖能の異常亢進が関連する疾患［例えば、先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）），骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍など］の予防・治療剤として用いることができる。
一方、アスポリン活性阻害物質は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患［例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患（例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等））など］、好ましくは変形関節症（例：股関節ＯＡ，膝関節ＯＡ）の予防・治療剤として使用することができる。
アスポリン活性促進もしくは阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したアスポリン類と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
アスポリン活性促進物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば骨軟骨腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
アスポリン活性阻害物質の投与量も、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（５）遺伝子診断剤
アスポリンをコードする塩基配列またはその一部を含む核酸（以下、「センスＡＳＰＮ」ともいう）、あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸（アンチセンスＡＳＰＮ）は、プローブ等として使用することにより、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）におけるアスポリンをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡの損傷もしくは突然変異やｍＲＮＡのスプライシング異常あるいは発現低下、あるいは該ＤＮＡの増幅やｍＲＮＡの発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。アスポリンをコードする塩基配列の一部を含む核酸は、プローブとして必要な長さ（例えば、約１５塩基以上）を有する限り特に制限されず、また、アスポリンの部分ペプチドをコードしている必要もない。
センスもしくはアンチセンスＡＳＰＮを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＤＧＧＥ法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などにより実施することができる。
上記のように、アスポリンは軟骨基質遺伝子の発現を低下させ、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を抑制し、軟骨細胞（または軟骨前駆細胞）の増殖を抑制する機能を有することから、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患の発症・進行に関与する。そのため、そのような疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患するリスクが高い状態にあれば、アスポリン遺伝子の発現が正常な状態に比して上昇していると考えられる。従って、例えば、被験温血動物の細胞から抽出したＲＮＡ画分についてのノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果、アスポリン遺伝子の発現上昇が検出された場合は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによりアスポリン遺伝子の発現低下が検出された場合は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能・軟骨細胞増殖能の異常亢進が関連する疾患、例えば、先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
前記した抗ＡＳＰＮ抗体は、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）におけるアスポリンまたはその塩の量を測定することができるので、例えば、該タンパク質の発現低下または発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。
抗ＡＳＰＮ抗体を用いる上記の遺伝子診断は、前記した抗ＡＳＰＮ抗体を用いるアスポリン発現調節（促進もしくは阻害）物質のスクリーニング方法（（ｃ）のスクリーニング方法）において、アスポリン類を産生する能力を有する細胞として、被験温血動物から採取した生体試料（例：関節液，生検など）を用いてイムノアッセイを実施することにより行うことができる。
イムノアッセイの結果、該試料中のアスポリンまたはその塩の増加が検出された場合は、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、イムノアッセイの結果、該試料中のアスポリンまたはその塩の減少が検出された場合は、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能・軟骨細胞増殖能の異常亢進が関連する疾患、例えば、先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
後記実施例において示される通り、アスポリンのＮ末端側に存在するアスパラギン酸の繰り返し（以下、「Ｄ−リピート」ともいう）における多型が、股関節ＯＡおよび膝関節ＯＡと相関する。即ち、１４個のアスパラギン酸の繰り返しを有するアレル（Ｄ１４アレル）の保有者頻度はＯＡ患者群において有意に高く、１３個のアスパラギン酸の繰り返しを有するアレル（Ｄ１３アレル）はＯＡ患者群において有意に低い（その他の繰り返し多型ではＯＡ患者群と対照群とで有意な差はみられない）。従って、Ｄ１４アレルはＯＡ感受性アレルであり、Ｄ１３アレルはＯＡ保護性（難罹患性）アレルであるといえる。
実際、アスポリンのＤ−リピートにおける多型は、ＴＧＦ−βによる軟骨基質遺伝子発現誘導に対する影響に差異を生じる。即ち、Ｄ１４アレルはＤ１３アレルに比べてＴＧＦ−βの上記作用をより強く阻害する。
上記したアスポリンの機能を考慮すると、Ｄ１４アレルは変形性関節症だけでなく、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に対しても感受性を示すことが示唆される。一方、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能・軟骨細胞増殖能の異常亢進が関連する疾患、例えば、先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患に対しては、Ｄ１４アレルはむしろ保護的であり得る。
これに対し、Ｄ１３アレルは、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に対しては保護的であり、他方、軟骨基質の産生能・軟骨細胞分化能・軟骨細胞増殖能の異常亢進が関連する疾患、例えば、先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の亢進している骨系統疾患（例：多発性外骨腫，片側肥大，オリエール病，マフッチ症候群等）］，骨軟骨腫，骨腫瘍，軟骨腫瘍などの疾患に対しては、むしろ感受性であり得る。
したがって、本発明はまた、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中Ｎ末端側に存在するアスパラギン酸の繰り返し残基数における多型を検出することを含む、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断方法を提供する。
上記多型の検出方法としては、公知の検出方法のいずれも使用することができる。例えば、被験動物の細胞から抽出したゲノムＤＮＡを試料とし、アスポリン遺伝子のＤ−リピートをコードする領域の塩基配列を含む核酸をプローブ等として用いて、例えば、特開２００４−０００１１５に記載された種々の方法［例：ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法およびＥＣＡ法など］を行うことにより実施することができる。
その結果、Ｄ１４アレルを保有する場合、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に対して感受性であると判定することができ、Ｄ１３アレルを保有する場合、上記の疾患に対して保護的であると判定することができる。
後記実施例９に示される通り、上記ＣＡＬＭ１遺伝子における骨・関節疾患感受性アレルと、ＡＳＰＮ遺伝子におけるＤ１４アレルの両方を保有する場合、それらの一方を保有する場合に比べて、骨・関節疾患の発症リスクが相乗的に増大する。このことは、ＣＡＬＭ１とＡＳＰＮが協奏的に骨・関節疾患の発症に関与することを示唆している。従って、本発明はまた、配列番号：５で表される塩基配列において、塩基番号８５，１５７６，２４４５および６６４１で示される塩基からなる群より選択される１以上の塩基における多型と、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中Ｎ末端側に存在するアスパラギン酸の繰り返し残基数における多型とを検出することを含む、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断方法を提供する。
上記多型の検出方法としては、各遺伝子の多型の検出に関して例示したものが同様に使用され得る。
その結果、配列番号：５で表される塩基配列において、塩基番号８５で示される塩基がチミン、塩基番号１５７６で示される塩基がシトシン、塩基番号２４４５で示される塩基がグアニン、または塩基番号６６４１で示される塩基がチミンであり、且つ配列番号：４で表されるアミノ酸配列中Ｎ末端側に存在するアスパラギン酸の繰り返し残基数が１４である場合、軟骨基質の変性・消失・産生能低下、軟骨細胞分化能低下、軟骨細胞増殖能低下が関連する疾患、例えば、骨粗鬆症，変形性関節症，慢性関節リウマチ，関節炎，滑膜炎，代謝性関節症，スポーツによる関節障害，先天性骨系統疾患［例えば、軟骨形成の低下している骨系統疾患・変形性関節症を合併する先天性骨系統疾患（例：軟骨無形成症，多発性骨端異形成症，脊椎骨端異形成症，骨幹端異形成症，Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群，偽性軟骨無形成症等）］などの疾患に対する感受性がより高いと判定することができる。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ          ：アブニン
Ｔ          ：チミン
Ｇ          ：グアニン
Ｃ          ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ  ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］
ヒトＣＡＬＭ１  ｃＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：２］
ＣＡＬＭ１遺伝子にコードされるヒトカルモジュリンタンパク質のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：３］
ヒトアスポリンｃＤＮＡ（Ｄ１３）の塩基配列を示す。
［配列番号：４］
ヒトアスポリンタンパク質（Ｄ１３）のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：５］
ヒトＣＡＬＭ１遺伝子の塩基配列を示す［マイナーアレル頻度が１０％以上の１２のＳＮＰ部位（塩基番号：８５，１５７６，２０１１，２１９０，２２７６，２４４５，２５４３，３０７４，５１７０，６６４１，９２３３，１０５２６）は、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成１４年７月）の付属書２、表１に示される択一的記号により表記している］。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】  大規模相関解析
対象は全て日本人である。相関解析は、日本人のＳＮＰデータベースであるＪＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／）からランダムに選出した８１，３９８個のＳＮＰについて行った。第一に、スクリーニングとして股関節ＯＡ患者群９４人および対照群６５８人から抽出したゲノムＤＮＡに対して、Ｏｈｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４６：４７１（２００１））の方法に従い、インベーダー法によってジェノタイピングを行い、χ２検定もしくはフィッシャーの正確な検定を行った。これらの検定でＰ値が０．０１を下回った２，２１９個のＳＮＰについて、前述の検体と重複しない股関節ＯＡ患者群３３５人および対照群３７５人についてジェノタイピングを行い、同様の検定を行った。その結果、１４番染色体上（１４ｑ２４−ｑ３１）のＣＡＬＭ１  ＩＶＳ３−２９３Ｃ＞Ｔ（図２ｂ，左表中のＳＮＰ  ＩＤ：ＣＡＬＭ１＿９、並びに配列番号：１の塩基番号６６４１に相当）が股関節ＯＡとの高い相関を示した（表１）。
【表１】
0005076058.tif 000002
続いて、この領域における股関節ＯＡ感受性遺伝子を同定するため、ＩＶＳ３−２９３Ｃ＞Ｔと連鎖不平衡にある領域の決定を行った。このＳＮＰを中心とした４００−ｋｂの領域に存在するマイナーアレル頻度１０％以上のＪＳＮＰを、股関節ＯＡ患者３３５人についてインベーダー法もしくはＴａｑＭａｎ法によってジェノタイピングを行い、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６８：６７４（２００１））の方法に従って、ＩＶＳ３−２９３Ｃ＞Ｔとの連鎖不平衡定数Ｄ’を計算した。その結果、ＩＶＳ３−２９３Ｃ＞Ｔと高い連鎖（Ｄ’＝１）を示すＳＮＰは、ＣＡＬＭ１およびＨｓ．４０７６４０内に限局していた（図１）。
【実施例２】  ハプロタイプ解析
ＣＡＬＭ１には１４個のＪＳＮＰが既に登録されている。ＣＡＬＭ１における股関節ＯＡ感受性アレルを同定するため、股関節ＯＡ患者１６名のゲノムＤＮＡを用いてＣＡＬＭ１遺伝子の５’−フランキング領域、エクソン、およびエクソン−イントロン接合部に対してＡＢＩ３７００キャピラリーシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）によるダイレクトシークエンスを行い、新規ＳＮＰの探索を行った。その結果、ＪＳＮＰデータベースに登録されているＣＡＬＭ１の１４個のＳＮＰ（図２ａ，縦棒）以外に、ＣＡＬＭ１の５’−フランキング領域、エクソン１、イントロン１およびエクソン７に、それぞれ１つずつ新規ＳＮＰを検出した（図２ａ，矢印）。ＣＡＬＭ１に存在するマイナーアレル頻度が１０％以上の１１個のＳＮＰ（図２ａ，アスタリスク）のジェノタイプデータを用いて、アレルキンソフトウェアによってハプロタイプ構造を推定した。その結果、この領域には全ハプロタイプ頻度の約９０％を網羅する３つのコモンハプロタイプが存在することが推定された（図２ｂ，ハプロタイプＡ−Ｃ）。そのうちハプロタイプＢは、χ２検定の結果、股関節ＯＡと相関を示した（図２ｂ，右表）。ハプロタイプＢには、股関節ＯＡと高い相関を示すＳＮＰが３つ存在している（ＩＶＳ１＋１２７１Ｃ＞Ａ，ＩＶＳ１−６９２Ｇ＞ＣおよびマーカーＳＮＰであるＩＶＳ３−２９３Ｃ＞Ｔ、それぞれ図２ｂ，左表中のＳＮＰ  ＩＤ：ＣＡＬＭ１＿１，５および９に相当）。この３つのＳＮＰは互いに完全連鎖の関係にあり、マーカーＳＮＰと全く同様に股関節ＯＡと高い相関を示した。新規に検出した４つのＳＮＰに対して、股関節ＯＡ患者を用いてダイレクトシークエンスによるジェノタイピングを行ったところ、−１６Ｃ＞ＴはハプロタイプＢ上の３つのＳＮＰと完全連鎖の関係にあった。このことは、−１６Ｃ＞Ｔもこれら３つのＳＮＰと全く同様に、股関節ＯＡの感受性多型であることを示す。
【実施例３】  軟骨細胞におけるＣＡＬＭ１発現解析
正常ヒト膝関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ−ｋｎ，Ｔａｋａｒａ）は、アルジネートビーズ中に包埋し、添付の分化培地（ＣＤＭ）で２週間培養したものを使用した。ＯＡ関節軟骨は、人工膝関節置換術を行う患者（ｎ＝４）から、インフォームド・コンセントを得て取得した。総ＲＮＡの抽出はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて行い、ｃＤＮＡはＭｕｌｔｉ  Ｓｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５００ｎｇの総ＲＮＡから合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、表４に記載のヒトＣＡＬＭ１遺伝子増幅用プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、最終容量２０μＭ［逆転写反応液１μｌ，１０ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ）２μｌ，２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液１．６μｌ，Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）０．１μｌ，１０μＭフォワードプライマー０．４μｌ，１０μＭリバースプライマー０．４μｌ，核酸分解酵素１４．５μｌ］の系で行った。ＰＣＲ増幅産物は、２％アガロースゲルにて分離し、エチジウムブロマイドにて検出した。その結果、培養ヒト膝関節軟骨細胞およびＯＡ膝関節軟骨でＣＡＬＭ１が発現していることを確認した（図３）。
【実施例４】  ルシフェラーゼレポーターアッセイ
−１６Ｃ＞ＴのＣＡＬＭ１転写活性に与える影響を、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって評価した。ＣＡＬＭ１の−１６Ｃもしくは−１６Ｔアレルを有するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣＡＬＭ１のプロモーター領域および５’−非翻訳領域（ｎｔ−１２３１  ｔｏ＋２０２）を表２に示すプライマーセットを用いてＰＣＲにて増幅し、ルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ部位に、５’−３’の方向性を保持したまま組み込むことによって、ＣＡＬＭ１遺伝子の発現調節領域をルシフェラーゼ遺伝子の前に結合したレポーターコンストラクトを、−１６ＴアレルおよびＣアレルについて作成した。
【表２】
0005076058.tif 000003
これらのコンストラクトを、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）および抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）で培養した軟骨様細胞ＯＵＭＳ−２７細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは、以下の手順で行った。トランスフェクションの前日、ＯＵＭＳ−２７細胞を５ｘ１０４個／ウェルとなるように２４マルチウェルプレートに播種した。翌日、Ｆｕｇｅｎｅ−６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、１ウェルあたり、レポーターコンストラクト２００ｎｇ、およびトランスフェクション効率を補正する内部標準としてのｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）４ｎｇをトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を可溶化し、ピッカジーン・デュアル・シーパンジーシステム（東洋インキ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、Ｔアレルにおけるルシフェラーゼ活性は、Ｃアレルの約２分の１であった（図４ａ）。全く同様のアッセイをＨｕｈ−７細胞（胎児肝癌由来）について行ったところ、Ｔアレルにおけるルシフェラーゼ活性は、Ｃアレルの約２分の１であった（図４ｂ，最上段）。
次に、２アレル間の転写活性の差を引き起こすのに十分な領域を絞り込むため、同様の方法で、−１６Ｃ＞Ｔを含むが、長さの異なる３つのレポーターコンストラクトを表３に示すプライマーを用いて作成した（図４ｂ，左模式図の２，３および４段目）。これらのコンストラクトをＨｕｈ−７細胞にトランスフェクションし、ＴアレルおよびＣアレルのルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、いずれのコンストラクトにおいても、Ｔアレルにおけるルシフェラーゼ活性は、Ｃアレルの約２分の１であった（図４ｂ）。この結果は、２アレル間における転写活性の差を引き起こすには、−１６Ｃ＞Ｔ周辺の領域（６１ｂｐ，ｎｔ．−５３  ｔｏ＋８）で十分であることを示唆する。
【実施例５】  ゲルシフトアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果、ＴアレルとＣアレル間の転写活性の差を生じるには、そのアレル周辺の配列で十分であることが分かった。このことから、この配列に結合し、転写活性の差を引き起こす核内タンパク質の存在が示唆される。そこで、本発明者らは、この仮説を検証するため、−１６Ｃ＞Ｔを含むＣＡＬＭ１遺伝子調節領域の部分配列からなるＤＮＡと、Ｈｕｈ−７細胞の核抽出物とを用いてゲルシフトアッセイを行った。Ｈｕｈ−７細胞の核抽出タンパク質は、Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：２４９９（１９９１））の方法に従って調製した。オリゴヌクレオチドのアニーリングとＤＩＧラベリングは、ＤＩＧゲルシフトキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。使用したオリゴヌクレオチドの配列を表３に記す。
【表３】
0005076058.tif 000004
ＤＩＧラベルしたプローブを、Ｈｕｈ−７細胞核抽出物と混合して２０分間室温でインキュベーションし、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成させた。形成したＤＮＡ−タンパク質複合体は、０．５％Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー中で、６％ポリアクリルアミドゲルによって分離した。ＤＩＧラベルしたプローブと非標識プローブの競合実験に際しては、ラベルしたプローブと核抽出物の混合に先立って、ラベルしたプローブの１２５倍量の非標識プローブを添加した。泳動後、ＤＮＡ−タンパク質複合体をニトロセルロース膜に転写し、ＵＶによって架橋した後、化学発光検出システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）で標識プローブ由来のシグナルを検出した。
その結果、−１６Ｔまたは−１６Ｃを含む配列からなるＤＮＡとＨｕｈ−７細胞核抽出物とを混合したレーンにおいて、複数のバンドが確認された（図５）。このことは、−１６Ｃ＞Ｔ周辺配列と直接結合する核内因子が存在することを示唆する。これらのバンドはＣアレルよりもＴアレルにおいてシグナル強度が高いことから、これらの核内因子は、Ｔアレルに比較的強固に結合することが示唆された（図５，矢尻）。レポーターアッセイの結果では、Ｔアレルは転写活性の低下を引き起こすアレルである。従って、Ｔアレルに強固に結合する核内因子は、ＣＡＬＭ１の転写に対してサプレッサーとして働いている可能性を示唆する。
【実施例６】  軟骨細胞分化実験
胚性腫瘍由来クローン化細胞株ＡＴＤＣ５は、インスリンの存在下で、軟骨細胞の初期分化から終末分化に至る全ての分化段階を再現可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨細胞分化モデルである。本発明者らは、軟骨細胞分化におけるカルモジュリン（ＣａＭ）の役割を解析するため、ＡＴＤＣ５をＣａＭ阻害剤であるＷ−７の存在下で培養し、軟骨細胞の分化マーカーであるＩＩ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ２ａ１）、アグリカン遺伝子（Ａｇｃ１）およびＸ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１０ａ１）の発現量を定量した。通常培養には、５％  ＦＢＳおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）を用いた。分化実験は以下の手順で行った。細胞を３ｘ１０４  ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように１２マルチウェルプレートに播種した。細胞がコンフルエントに達した後、培養培地を分化培地（５％  ＦＢＳ，抗生物質，１０μｇ／ｍｌウシインスリン，１０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリンおよび３ｘ１０−８  Ｍ亜セレン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）に置換した。また、ＣａＭ阻害群の分化培地には、ＣａＭ阻害剤であるＷ−７（２０μＭ、和光）を添加した。培地交換は１日おきに行い、分化培地への交換日から数えて、最長で２２日間培養した。ＡＴＤＣ５細胞からの総ＲＮＡ抽出は、ＩＳＯＧＥＮを用いて行った。抽出した総ＲＮＡ５００ｎｇに対して、Ｍｕｌｔｉ  Ｓｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＰＣＲ反応は、最終容量２０μｌ［逆転写反応液１μｌ，ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ）１０μｌ，１０μＭフォワードプライマー０．６μｌ，１０μＭリバースプライマー０．６μｌ，核酸分解酵素除去水６．８μｌ］の系で行った。反応プログラムは［９４℃１５分，（９４℃１５秒，６０℃１５秒，７２℃３０秒）ｘ４０サイクル］とした。各サンプルにおける標的遺伝子のコピー数は、系列希釈したコピー数既知の標的遺伝子ＤＮＡを用いて作成した検量線から算出した。各遺伝子の発現量は、Ｇａｐｄｈの発現量を指標として算出した総ＲＮＡ量で補正した。各標的遺伝子に対するプライマーの配列を表４に記す。
【表４】
0005076058.tif 000005
インスリン存在下で培養したＡＴＤＣ５では、インスリン非存在下条件と比較して、軟骨細胞の主要な基質遺伝子であるＣｏｌ２ａ１およびＡｇｃ１の発現量が、インスリン添加後６日目から上昇し、それぞれ、１４日目、１８日目に最大となった（図６ａ，ｂ）。これらの遺伝子の発現上昇は、Ｗ−７の存在下で約２分の１まで抑制された。一方、肥大軟骨細胞のマーカーであるＣｏｌ１０ａ１の発現量は、２２日目まで上昇しつづけ、Ｗ−７の添加によってさらに上昇した（図６ｃ）。これらの結果から、ＣａＭは軟骨細胞分化過程において、Ｃｏｌ２ａ１やＡｇｃ１の発現上昇に関わるシグナルを仲介していることが示唆された。また、ＣａＭは軟骨細胞でのＣｏｌ１０ａ１の発現を抑制すること、即ち軟骨細胞の肥大化を抑制することが示唆された。
【実施例７】  軟骨前駆細胞株ＲＣＪ３．１Ｃ５．１８を用いたイオノマイシン刺激実験
ＲＣＪ３．１Ｃ５．１８細胞は、軟骨前駆細胞としての形質を有し、細胞内カルシウム濃度を上昇させる試薬であるイオノマイシン刺激によって、ＩＩ型コラーゲン遺伝子およびアグリカン遺伝子の発現が上昇する細胞である。本発明者らは、この反応におけるＣａＭの関与を、ＣａＭ阻害剤であるＷ−７を用いて解析した。通常培養には１０％  ＦＢＳおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。刺激実験は以下の手順で行った。細胞を１ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように１２マルチウェルプレートに播種した。細胞がコンフルエントに達した後、実験条件に応じた濃度のイオノマイシン（０または２μＭ）およびＷ−７（０〜１０μＭ）を含む培地に置換した。培地置換から２４時間後にＩＳＯＧＥＮを用いてＲＮＡを回収した。抽出した総ＲＮＡ５００ｎｇに対して、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＰＣＲ反応は、最終容量２０μｌ［逆転写反応液１μｌ，ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ）１０μｌ，１０μＭフォワードプライマー０．６μｌ，１０μＭリバースプライマー０．６μｌ，核酸分解酵素除去水６．８μｌ］の系で行った。反応プログラムは［９４℃１５分，（９４℃１５秒，６０℃１５秒，７２℃３０秒）ｘ４０サイクル］とした。各サンプルにおける標的遺伝子のコピー数は、系列希釈したコピー数既知の標的遺伝子ＤＮＡを用いて作成した検量線から算出した。各遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量を指標として算出した総ＲＮＡ量で補正した。標的遺伝子に対するプライマーの配列は表５に記す。
【表５】
0005076058.tif 000006
イオノマイシンの添加によって発現上昇したＩＩ型コラーゲン遺伝子およびアグリカン遺伝子は、Ｗ−７の存在下で用量依存的に抑制された（図７ａおよびｂ）。このことは、軟骨前駆細胞におけるカルシウムシグナルは、ＣａＭを介して軟骨基質遺伝子の発現を誘導することを示唆する。
【実施例８】  ＲＮＡディファレンスプロット法を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアレル間のＣＡＬＭ１発現量比較
−１６Ｃ＞ＴのＣＡＬＭ１転写調節に対する作用をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するため、−１６Ｃ＞Ｔのヘテロ接合体から採取した軟骨細胞におけるＣＡＬＭ１の発現量を、ＲＮＡディファレンスプロット法［Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９：６３５−６４１（２００４）］を用いて各アレルごとに定量、比較した。方法を以下に示す。表６に示す蛍光標識したプライマーを用いて、−１６Ｃ＞Ｔのヘテロ接合体から採取した軟骨細胞由来のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。プライマーはＣＡＬＭ１のエクソン１内に存在する＋１１４Ｇ＞Ａを含む領域を増幅するように設計した。使用したサンプルにおける−１６−＋１１４のハプロタイプはＣ−ＧおよびＴ−Ａであることを当該領域のクローニングにより確認した。ＰＣＲ産物をフォルムアミドで変性した後、ＳＦ５２００オートシークエンサー（日立）にて電気泳動を行った。各アレルのシグナル強度はＡｌｌｅｌｅ  Ｌｉｎｋｓ（日立）を用いて解析した。この実験は、ＰＣＲを独立に９回行った。各アレルの発現量は、ｃＤＮＡを鋳型とした場合の値を、ゲノムＤＮＡを鋳型とした場合の値で補正した。
【表６】
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その結果、＋１１４Ａに対する＋１１４Ｇ（それぞれ−１６Ｔと−１６Ｃに対応）の発現比は１．０９（９９％信頼区間：１．０４−１．１５）であった。このことは、−１６Ｔ由来のＣＡＬＭ１発現量は−１６Ｃ由来のＣＡＬＭ１発現量よりも低いことを意味する。
【実施例９】  ＣＡＬＭ１とＡＳＰＮの組み合わせ解析
アスポリン遺伝子（ＡＳＰＮ）は、後記実施例に示される通り、変形性股関節症および変形性膝関節症と高い相関を示す。我々は、ＣＡＬＭ１とＡＳＰＮが共同して変形性股関節症の発症リスクを高めるかについて検討した。方法を以下に示す。変形性股関節症３２３人および対照３７４人を、ＣＡＬＭ１  ＩＶＳ３−２９３Ｃ＞ＴとＡＳＰＮのアスパラギン酸繰り返し多型の組み合わせによって２ｘ３表に分配した（表７）。その２ｘ３表に基づき、非疾患感受性アレルのホモ接合体の組み合わせに対するオッズ比を計算した。ＣＡＬＭ１およびＡＳＰＮの疾患感受性アレルはそれぞれＴおよびＤ１４である。
【表７】
0005076058.tif 000008
オッズ比は、ＣＡＬＭ１の疾患感受性アレルのホモ接合体とＡＳＰＮのＤ１４アレルの組み合わせで最も高い値を示した。このことはＣＡＬＭ１とＡＳＰＮが共同して変形性股関節症の発症リスクを高める可能性を示唆する。
【実施例１０】  オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析による正常およびＯＡ関節軟骨におけるアスポリンの発現量の比較
アスポリンの発現解析は約６万種類のターゲット配列に対するオリゴヌクレオチドプローブから構成されるマイクロアレイセット（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｕ９５およびＵ１３３，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて行った。ビオチン化ｃＲＮＡの調製とアレイハイブリダイゼーションなどの一連の操作はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｍａｎｕａｌに準じて行った。ＯＡ軟骨および正常関節軟骨のＲＮＡは、武田薬品工業（株）の社内倫理委員会の承認の下にＤｉｒｅｃｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｃｃｅｓｓ社より購入した。まずＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５−１０μｇを鋳型とし、Ｔ７−ｐｏｌｙ  Ｔ  ｐｒｉｍｅｒとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。得られた二本鎖ｃＤＮＡを用いてビオチン化ＵＴＰとＣＴＰ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（Ａｍｂｉｏｎ）を行った。Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．１），１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭ酢酸マグネシウムを含むバッファー中、９４℃で３０分間インキュベートすることによりビオチン化ｃＲＮＡを断片化し、アレイハイブリダイゼーションを行った。洗浄および染色は専用のＦｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて行った。シグナルは専用のＣｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）を用いて検出した。アレイハイブリダイゼーションシグナルはＧｅｎｅＣｈｉｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅによって“ｐｒｅｓｅｎｃｅ”と判定された全遺伝子のシグナル値の中央値を１として標準化した。上記の方法により、膝関節ＯＡ患者由来関節軟骨（ｎ＝５）、股関節ＯＡ患者由来軟骨（ｎ＝５）、正常膝関節軟骨（ｎ＝３）、および正常股関節軟骨（ｎ＝３）より抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡから作製したビオチン化ｃＲＮＡを用いてアスポリンのマイクロアレイ解析を行った結果、膝関節ＯＡと股関節ＯＡの両方において各々の関節由来正常軟骨と比べてアスポリンｍＲＮＡ発現量が有意に増加していることがわかった（ｐ＜０．０１，図８）。すなわち、アスポリンがヒトＯＡ関節軟骨で発現量が上昇する遺伝子であることが明らかとなった。
【実施例１１】  アスポリン遺伝子のアスパラギン酸繰り返し多型のタイピング
日本人一般集団、および三重県宮川村コホート（ｃｏｈｏｒｔ）集団を用いて、変形性関節症の相関解析を行った。日本人一般集団は、膝関節ＯＡ患者３９３人、股関節ＯＡ患者５９３人、および非ＯＡ患者（対照）３７４人により構成された。三重県宮川村コホートは、膝関節ＯＡ患者１３７人、非ＯＡ患者（対照）２３４人により構成された。これらの患者より得た末梢血より調製したＤＮＡサンプルを用いて、アスポリンＮ末にあるアスパラギン酸繰り返し多型（塩基配列：ＧＡＴ）の繰り返し数のタイピングを以下の方法により行った。繰り返し多型の領域をはさむ蛍光プライマーペア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、すなわち６−ＦＡＭラベル化センス鎖プライマー（ＡＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＣＴＧ；配列番号：３１）およびテイルドアンチセンス鎖プライマー（ＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＴＧＴ；配列番号：３２）を各々３ｐｍｏｌ，１０×ＥｘＴａｑバッファー１．５μｌ，２．５ｍＭデオキシリボヌクレオチド溶液１．２μｌ，ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１．５μｌ，ＥｘＴａｑ（宝酒造）０．３μｌ，２．５ｎｇ／μｌ  ＤＮＡ溶液１．５μｌを含む混合液１５μｌを調製し、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９４℃で８分置いた後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして３５サイクル各反応を繰り返し、さらに７２℃で７分間反応させるというプログラムでＰＣＲを行った。反応終了後、１０５μｌの蒸留水を加え、ボルテックスミキサーで１秒ｘ３回混合した。１ｍｌのＨｉ−Ｄｉホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）あたり４０μｌのＧＥＮＥＳＣＡＮ−５００［ＲＯＸ］（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、ボルテックスミキサーで混合した後、Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に１０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。その中に、蒸留水で希釈したＰＣＲ反応液を１．５μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、９５℃で５分間加熱した後、氷中５分以上静置した。このようにして調製した反応液をＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてキャピラリー電気泳動を行った後、ＧｅｎｅＳｃａｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＧｅｎｏｔｙｐｅｒ  ３．７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＤ（ＧＡＴ）の繰り返し数のタイピングを行った。その結果、繰り返し数はＤ１０からＤ１９まで観察され、Ｄ１４だけが、すべてのＯＡ患者サンプルにおいて、一般集団およびコホート非ＯＡ患者よりも頻度が高い傾向が認められた（表８）。一方、Ｄ１３は、ＯＡ・非ＯＡを問わず、最も高頻度に認められるアレルであるが、ＯＡでは頻度が低い傾向が認められた。以上の結果から、Ｄ１４が疾患アレル、Ｄ１３が保護アレルであることがわかった。
【表８】
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【実施例１２】  アスポリン遺伝子のアスパラギン酸繰り返し多型と日本人における膝関節ＯＡとの相関解析
実施例１１で得られた結果に基づき、ケース−コントロール相関解析を以下のようにして行った。すなわち、日本人一般集団膝関節ＯＡ患者（ｎ＝３９３）をケース、非ＯＡ患者（ｎ＝３７４）をコントロールとし、両集団におけるＤ１４アレルの頻度の差、およびＤ１４アレル保有者（ヘテロまたはホモ）頻度の差をχ二乗法により検定した。その際、Ｄ１４に対する比較の対象は、Ｄ１４以外のすべてのアレルを用いた。その結果、日本人一般集団膝関節ＯＡでＤ１４アレルの頻度およびＤ１４アレル保有者頻度が非ＯＡと比べて有意に高いことがわかった（表９）。
【表９】
0005076058.tif 000010
次に、上記の集団とは異なる集団を用いてケース−コントロール相関解析を以下のようにして行った。すなわち、三重県宮川村コホートにおける膝関節ＯＡ患者（ｎ＝１３７）をケース、非ＯＡ患者（ｎ＝２３４）をコントロールとし、両集団におけるＤ１４アレルの頻度の差、およびＤ１４アレル保有者（ヘテロまたはホモ）頻度の差をχ二乗法により検定した。その際、Ｄ１４に対する比較の対象は、Ｄ１４以外のすべてのアレルを用いた。その結果、膝関節ＯＡでＤ１４アレルの頻度およびＤ１４アレル保有者頻度が非ＯＡと比べて有意に高いことがわかった（表６）。以上の結果から、独立した２つの集団でアスポリン遺伝子のアスパラギン酸繰り返し多型が日本人膝関節ＯＡと有意に相関することが明らかとなった。
さらに、上記の一般集団とコホートとを併せたときのケース−コントロール相関解析を以下のようにして行った。すなわち、日本人膝関節ＯＡ患者（ｎ＝５３０）をケース、非ＯＡ患者（ｎ＝６０８）をコントロールとし、両集団におけるＤ１４アレルの頻度の差、およびＤ１４アレル保有者（ヘテロまたはホモ）頻度の差をχ二乗法により検定した。その際、Ｄ１４に対する比較の対象は、Ｄ１４以外のすべてのアレルを用いた。その結果、一般集団とコホートを併せることによりＤ１４アレルの頻度およびＤ１４アレル保有者頻度がより有意に高くなることがわかった（表９）。
また、疾患アレルであるＤ１４との比較の対象を保護アレルであるＤ１３として上記と同様に一般集団、コホート、一般集団＋コホートの場合においてケース−コントロール相関解析を行ったところ、いずれの集団を用いた場合もＤ１４以外のすべてのアレルを比較の対象とした場合よりも、ケース−コントロール間でのＤ１４アレル頻度の差の有意差がより顕著になることがわかった（表９）。したがって、アスポリンＤ１４とアスポリンＤ１３との間に膝関節ＯＡになりやすい（なりにくい）体質を作り得るような何らかの機能的な差があることが示唆された。
【実施例１３】  アスポリン遺伝子のアスパラギン酸繰り返し多型と日本人における股関節ＯＡとの相関解析
実施例１１で得られた結果に基づき、ケース−コントロール相関解析を以下のようにして行った。すなわち、日本人一般集団股関節ＯＡ患者（ｎ＝５９３）をケース、非ＯＡ患者（ｎ＝３７４）をコントロールとし、両集団におけるＤ１４アレルの頻度の差、およびＤ１４アレル保有者（ヘテロまたはホモ）頻度の差をχ二乗法により検定した。その結果、日本人一般集団股関節ＯＡでＤ１４アレルの頻度およびＤ１４アレル保有者頻度が非ＯＡと比べて有意に高いことがわかった（表９）。以上の結果から、アスポリン遺伝子のアスパラギン酸繰り返し多型が日本人における股関節ＯＡと有意に相関することが明らかとなった。
次に、疾患アレルであるＤ１４との比較の対象を保護アレルであるＤ１３としたときの、両集団におけるＤ１４アレルの頻度の差をχ二乗法により検定した。その結果、Ｄ１４以外のすべてのアレルを比較の対象とした場合よりも、ケース−コントロール間でのＤ１４アレル頻度の差の有意差がより顕著になることがわかった（表９）。したがって、アスポリンＤ１４とアスポリンＤ１３との間に股関節ＯＡになりやすい（なりにくい）体質を作り得るような何らかの機能的な差があることが示唆された。
【実施例１４】  アスポリン遺伝子の連鎖不平衡解析
理研内部で保有している全８疾患（股関節ＯＡ，膝関節ＯＡ，心筋梗塞，糖尿病性腎症／網膜症，肥満，慢性関節リウマチ，喘息，慢性肝疾患）患者ＤＮＡサンプルより得られたＳＮＰタイピングデータを用いて、以下の方法により連鎖不平衡マッピングを行った。すなわち、アスポリン遺伝子およびその周辺遺伝子を含む約５００ｋｂの領域内より、マイナーアレル頻度が２０％以上である１５個のＳＮＰを選択し、連鎖不平衡定数Ｄ’を用いて連鎖不平衡マップを作製した。その結果、アスポリン遺伝子は一つの連鎖不平衡ブロック内に完全に含まれていることがわかった（図９ａ，ｂ）。以上の結果から、アスポリン遺伝子内でアスパラギン酸繰り返し多型を上回る有意な相関を示す多型がないことを示すためには、アスポリン遺伝子全体から多型を探す必要があることがわかった。
【実施例１５】  アスポリン遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）と三重県宮川村コホートサンプル中の膝関節ＯＡとの相関解析
日本人一般集団膝関節ＯＡおよび宮川村コホートの中でＤ１４をホモまたはヘテロで保有する人から調製したＤＮＡサンプルを用いて、アスポリン遺伝子の５’上流５ｋｂ，全ｅｘｏｎ，３’下流領域，並びにｅｘｏｎ−ｉｎｔｒｏｎ  ｊｕｎｃｔｉｏｎについてシークエンスを行い、多型探索を行った。その過程で見つかった中で比較的高頻度に認められた７つの多型（６  ＳＮＰｓと１欠失；図９ａ，下段）を選び、宮川村コホートサンプルを用いてｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇを行った。相関解析の結果，有意な相関を示すものはなかった（表１０）。
【表１０】
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【実施例１６】  アスポリン遺伝子のアスパラギン酸繰り返し多型におけるＤ１４アレル保有者頻度と日本人膝関節ＯＡの重症度との相関
実施例１１で得られた結果に基づき、膝関節ＯＡの重症度とＤ１４アレル保有者頻度との関係を日本人一般集団膝関節ＯＡおよびコホートについて調べた。その結果、両集団とも疾患の重症度が高いほどＤ１４保有者頻度が高い傾向が認められた（図１０）。したがって、遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）と表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）とが相関することがわかった。
【実施例１７】  ヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４安定発現ＡＴＤＣ５細胞株の取得
ヒトアスポリンをマウス軟骨幹細胞株であるＡＴＤＣ５細胞に安定発現させるためのプラスミドＤＮＡを以下のようにして調製した。まず、以下に記す方法により、ヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４の全長ｃＤＮＡを取得した。ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）を用い、添付プロトコールに記載された方法に従って反応液を調製した。プライマーは２５μｌの反応液当り、開始コドンと制限酵素Ｘｈｏ  Ｉサイトを含むセンス鎖プライマーとアスポリンの終止コドンと制限酵素ＢａｍＨ  Ｉサイトを含むアンチセンス鎖プライマーを各々７．５ｐｍｏｌずつを使用し、鋳型として、アスポリンのアスパラギン酸繰り返し多型のＤ１３アレルとＤ１４アレルをヘテロで保有するＯＡ患者の膝関節軟骨から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡより調製したｃＤＮＡ溶液を１μｌ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡとして１０ｎｇ）使用した。反応は、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９４℃で２分置いた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１．５分を１サイクルとして３５サイクル各反応を繰り返し、さらに７２℃で７分間反応させるというプログラムでＰＣＲ反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した後、制限酵素Ｘｈｏ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで処理を行った。この反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、アスポリンの全長サイズ（１．１ｋｂ付近）に相当するバンドを切り出して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。このＤＮＡ断片をあらかじめＸｈｏ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで消化してリニア化したｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（インビトロゲン）とＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて連結させた。このプラスミドＤＮＡを大腸菌コンピテントセルＪＭ１０９（宝酒造）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地にまいた。出現したコロニーよりプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。正しい塩基配列を持つ挿入ＤＮＡ断片を含むクローンをＤ１３とＤ１４についてそれぞれ選択し、該クローンよりアスポリンＤ１３全長ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１３）およびアスポリンＤ１４全長ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１４）を取得した。
ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１３およびｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１４をＦｕＧＥＮＥ−６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて添付プロトコール記載の方法にしたがって、ＡＴＤＣ５細胞株に導入した。培地１−１（５％  ＦＢＳ，ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ），ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ），ＩＴＳ（シグマ）および５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（プロメガ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロゲン））中で、生き残った細胞から限界希釈法によりヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４安定発現ＡＴＤＣ５細胞株クローンを取得した。
【実施例１８】  ヒトアスポリン安定発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−βアイソフォーム（ＴＧＦ−βｓ：ＴＧＦ−β１，β２およびβ３）刺激アグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現抑制作用
ヒトアスポリン安定発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−βｓ刺激によるアグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現の定量は以下の方法で行った。実施例１７で作製したヒトアスポリン安定発現ＡＴＤＣ５細胞株を培地１−１で培養し、コンフルエントに達した時点でＦＢＳを０．２％にした培地１−１に交換し、１２時間前培養した。次に、ＴＧＦ−βｓ（いずれも１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらに２４時間培養した後、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの精製はＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて、キット添付のプロトコールに準じて行った。ｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＡＢＩ）を用いてｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒを鋳型にして合成した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲはＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて反応を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００を用いて検出、定量した。このような方法で、ヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４安定発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−βｓ刺激によるアグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量を測定した結果、両方の株においてｍｏｃｋと比べてＴＧＦ−β１刺激によるアグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量の上昇が抑制された（図１１，図１２）。これらの株ではヒトアスポリン遺伝子が確かに高発現していることを確認した（図１３）。これらの結果より、アスポリンはＡＴＤＣ５細胞においてＴＧＦ−β１刺激による軟骨マーカー遺伝子発現上昇を抑制する作用を有することがわかった。
【実施例１９】  ヒトアスポリン一過性発現ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−β１刺激アグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現抑制作用
ＡＴＤＣ５細胞を０．５ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２−ｗｅｌｌプレートに蒔き、培地１−２（５％  ＦＢＳ，ＩＴＳ（シグマ），ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で培養した。その２４時間後にＦｕＧＥＮＥ−６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１３およびｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１４を導入させ、２４時間培養した。次に、ＦＢＳを０．２％にした培地１−２に交換して１２時間培養した後、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらに１８時間培養した後、実施例１８と同様にしてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出、精製、ｃＤＮＡ合成、およびＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。その結果、アスポリンＤ１３およびＤ１４を一過性に発現させたＡＴＤＣ５細胞においてｍｏｃｋと比べて、ＴＧＦ−β１刺激時におけるアグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量の上昇が抑制された（図１４）。これより、アスポリンはＡＴＤＣ５細胞において安定発現株と一過性発現株の両方でＴＧＦ−β１刺激による軟骨マーカー遺伝子発現上昇を抑制する作用を有することがわかった。
【実施例２０】  ヒトアスポリン安定発現ＡＴＤＣ５細胞株の軟骨分化培養過程における軟骨初期分化マーカー遺伝子発現抑制作用
実施例１７で作製したヒトアスポリン安定発現ＡＴＤＣ５細胞株を０．３ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２−ｗｅｌｌプレートに蒔き、培地１−１で５，９，１５および２１日間培養した後、実施例１８と同様にしてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出、精製、ｃＤＮＡ合成、およびｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。その結果、ｍｏｃｋでは培養９日目にアグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現上昇がピークに達したが、ヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４発現株ではこれらの軟骨分化マーカーの発現上昇がみられなかった（図１５）。これらの結果より、アスポリンはＡＴＤＣ５細胞における軟骨細胞の分化を抑制する作用を有することがわかった。
【実施例２１】  ヒトアスポリンＤ１３およびヒトアスポリンＤ１４を一過性に発現させたＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−β１刺激によるアグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現の抑制活性の比較
実施例１９の結果を基に、アスポリンＤ１３とＤ１４の、ＴＧＦ−β１刺激時の軟骨分化マーカー遺伝子発現抑制作用の強さを、以下の方法により評価した。まず、ＭｏｃｋにおいてＴＧＦ−β１刺激により上昇したアグリカン遺伝子発現量を（ＡＭ）、そのときのＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量を（ＣＭ）とする。次に、アスポリンＤ１３の強制発現により抑制されたＴＧＦ−β１刺激時のアグリカン遺伝子発現量を（Ａ１３）、そのときのＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量を（Ｃ１３）とする。同様に、アスポリンＤ１４の強制発現により抑制されたＴＧＦ−β１刺激時のアグリカン遺伝子発現量を（Ａ１４）、そのときのＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量を（Ｃ１４）とする。このとき、アスポリンＤ１３発現株におけるＴＧＦ−β１刺激時のアグリカン遺伝子発現抑制率は（Ａ１３）／（ＡＭ）、ＩＩ型コラーゲン遺伝子発現抑制率は（Ｃ１３）／（ＣＭ）と表せる。同様に、アスポリンＤ１４発現株におけるＴＧＦ−β１刺激時のアグリカン遺伝子発現抑制率は（Ａ１４）／（ＡＭ）、ＩＩ型コラーゲン遺伝子発現抑制率は（Ｃ１４）／（ＣＭ）と表せる。さらに、これらをＴＧＦ−β１刺激時のヒトアスポリンｍＲＮＡ量で割って補正することにより、ヒトアスポリンｍＲＮＡ量当りのアグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現抑制率を算出した。アスポリンＤ１３とＤ１４におけるこれらの値の平均値の差をＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより有意差検定を行った。その結果、アスポリンＤ１４はＤ１３よりもＴＧＦ−β１刺激時のアグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現抑制作用が有意に強いことがわかった（図１６）。以上の結果から、アスポリンＤ１３とＤ１４とは機能的な差があることが明らかとなった。アスポリンＤ１４はＤ１３よりも軟骨分化抑制作用が強いことから、Ｄ１４を持つ人の方が持たない人よりも軟骨が生得的に脆弱であり、そのことがＯＡになりやすい体質をつくる原因となっているのかもしれない。
【実施例２２】  プルダウンアッセイ法を用いたヒトアスポリンとＴＧＦ−βとの結合試験
以下に記す方法により、ヒトアスポリン成熟体の全長ｃＤＮＡを取得した。ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いて、添付プロトコールに記載された方法に従って反応液を調製した。プライマーは２５μｌの反応液当り、ヒトアスポリン成熟体のＮ末端とＫｐｎ  Ｉサイトを含むセンス鎖プライマーとアスポリンの終止コドンと制限酵素Ｘｈｏ  Ｉサイトを含むアンチセンス鎖プライマーを各々７．５ｐｍｏｌずつを使用し、鋳型として実施例１７で作製したｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１３およびｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１４を１μｌ使用した。反応は、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９４℃で２分置いた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１．５分を１サイクルとして２０サイクル各反応を繰り返し、さらに７２℃で７分間反応させるというプログラムでＰＣＲ反応を行った。このＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した後、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ＋Ｘｈｏ  Ｉ処理を行った。この反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、ヒトアスポリン成熟体の全長サイズ（１ｋｂ付近）に相当するバンドを切り出して、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。このＤＮＡ断片をあらかじめＫｐｎ  ＩとＸｈｏ  Ｉで消化してリニア化したｐＥＴ２９ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）とＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてインフレームになるように連結させた。このプラスミドＤＮＡを大腸菌コンピテントセルＪＭ１０９（宝酒造）に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地にまいた。出現したコロニーよりプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。正しい塩基配列を持つ挿入ＤＮＡ断片を含むクローンを選択し、該クローンよりヒトアスポリン成熟体の全長ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ２９ｂ−ＡＳＰ１３およびｐＥＴ２９ｂ−ＡＳＰ１４）を取得した。
このようにして作製したｐＥＴ２９ｂ−ＡＳＰ１３およびｐＥＴ２９ｂ−ＡＳＰ１４を鋳型として、Ｓ−タグ付きヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４をＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ）を用いてＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ  Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡの存在下で反応を行うことにより調製した。Ｓ−タグ付きヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４を含む反応液（１０μｌ）とＴＧＦ−β１（０．１μｇ）を、バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ））中、４℃で１時間混合した後、Ｓ−プロテインアガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ，１２．５μｌ）を加え、さらに室温で３０分間インキュベートした。沈澱させたレジンをバッファーＡで５回洗浄した後、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。沈殿物中のＳ−タグ付きヒトアスポリンはストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＴＧＦ−β１はビオチン化抗ＴＧＦ−β１抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。以上の方法により、ヒトアスポリンとＴＧＦ−βとの結合を調べた結果、Ｓ−タグ付きヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４を含む沈殿物中にはＴＧＦ−β１のバンドが検出された（図１７）。以上の結果より、Ｓ−タグ付きヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４は、ＴＧＦ−β１とｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合することがわかった。
【実施例２３】  大腸菌組換え型マウスアスポリンの部分精製
以下に記す方法により、マウスアスポリン成熟体の全長ｃＤＮＡを取得した。ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いて、添付プロトコールに記載された方法に従って反応液を調製した。プライマーは２５μｌの反応液当り、マウスアスポリン成熟体のＮ末端とＢａｍＨ  Ｉサイトを含むセンス鎖プライマーとアスポリンの終止コドンと制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトを含むアンチセンス鎖プライマーを各々７．５ｐｍｏｌずつを使用し、鋳型としてマウスＡＴＤＣ５細胞株から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡより調製したｃＤＮＡ溶液を１μｌ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡとして１０ｎｇ）使用した。反応は、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９４℃で２分置いた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１．５分を１サイクルとして３５サイクル各反応を繰り返し、さらに７２℃で７分間反応させるというプログラムでＰＣＲ反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した後、制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ処理を行った。この反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、マウスアスポリン成熟体の全長サイズ（１ｋｂ付近）に相当するバンドを切り出して、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。このＤＮＡ断片をあらかじめＢａｍＨ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化してリニア化したｐＥＴ２９ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）とＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてインフレームになるように連結させた。このプラスミドＤＮＡで大腸菌コンピテントセルＪＭ１０９（宝酒造）を形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地にまいた。出現したコロニーよりプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。正しい塩基配列を持つ挿入ＤＮＡ断片を含むクローンを選択し、該クローンよりマウスアスポリン成熟体の全長ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ２９ｂ−ＭＡＳＰ）を取得した。このｐＥＴ２９ｂ−ＭＡＳＰで、さらに、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で生育した大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ２９ｂ−ＭＡＳＰ）を取得した。
この大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ２９ｂ−ＭＡＳＰ）を用いて、カナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃でＯＤ６００値が０．５になるまで培養した後、終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で６時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して集菌し、その菌体をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に懸濁し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）処理を室温で２０分間行った。この反応液を１０，０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離した後の上清を可溶性画分とした。タンパク量はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて測定した。この可溶性画分のバッファー交換を行うため、バッファーＳ（４Ｍグアニジン塩酸，５０ｍＭマレイン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０），０．０５％  ＣＨＡＰＳ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に置換した。次に、このタンパク溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １０，０００ＭＷＣＯを用いて濃縮した後、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ  １００（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に取り付けたＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたゲル濾過をバッファーＳ中で行うことにより分画した。Ｓ−プロテイン−ＨＲＰを用いたウエスタンブロッティングによりＳタグ付きマウスアスポリンの溶出位置を確認し、Ｓタグ付きマウスアスポリンを含むフラクションを再度ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−４  １０，０００ＭＷＣＯを用いて濃縮した後、再度ゲル濾過を行った。この操作をもう一度繰り返して得られたフラクションを透析によりＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ）を含むＰＢＳに交換した。このようにして得られたタンパク溶液をＦｒ．１８−２１とした。このフラクショシについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシー染色でタンパクのバンドを検出したところ、Ｓタグ付きマウスアスポリンの分子量に相当するバンド以外にまだ数本のバンドが検出された（図１８ａ）。また、このフラクション中にＳタグ付きマウスアスポリンが含まれることはＳ−プロテイン−ＨＲＰを用いたウエスタンブロッティングにより確認した（図１８ｂ）。このようにして得られたＦｒ．１８−２１をＳタグ付きマウスアスポリンの部分精製品として、以下の結合実験に使用した。
【実施例２４】  マイクロプレートアッセイ法を用いたマウスアスポリンとＴＧＦ−βとの結合試験
マイクロプレートアッセイ法を用いたマウスアスポリンとＴＧＦ−βとの結合試験をビオチン化デコリンとＴＧＦ−βとの結合阻害度を指標として以下のようにして行った。Ｎｕｎｃ社Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６−ｗｅｌｌマイクロプレートに０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）で調製した１μｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で一晩コーティングした。ＴＧＦ−β−ｃｏａｔｅｄ  ｗｅｌｌを２００μｌ／ｗｅｌｌの結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２％  ＢＳＡ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中、３７℃で３時間ブロッキングした。ｗｅｌｌを４００μｌ／ｗｅｌｌの結合バッファーで１回洗浄した後、ｗｅｌｌ当り全量が１００μｌになるように結合バッファーで調製したビオチン化デコリンと非ラベル化タンパクを添加し、３７℃で６時間インキュベートした。ｗｅｌｌを４００μｌ／ｗｅｌｌの結合バッファーで３回洗浄した後、結合バッファーで２００倍希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を１００μｌ−／ｗｅｌｌずつ加え、室温で２０分間インキュベートした。ｗｅｌｌを４００μｌ／ｗｅｌｌの結合バッファーで３回洗浄した後、ＴＭＢ  ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）添付の発色試薬を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、３７℃で１５分間インキュベートした。１Ｍリン酸を直接１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加して反応を停止させ、Ｕｌｔｒａｍａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて４１５ｎｍ（対照：７５０ｎｍ）の吸光度を測定した。Ｓ−タグ付きマウスアスポリンのＴＧＦ−β１固相との結合評価は、標識体としてＳ−プロテイン−ＨＲＰを用い、ウェルの洗浄と標識体の希釈をＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８），０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で行った以外は上記と同様にして行った。トロンビン消化は４μｇのＦｒ．１８−２１を含む１００μｌの反応系にビオチン化トロンビン０．５Ｕを添加し、室温で一晩反応させることにより行った後、ストレプトアビジンアガロース（５０％スラリー）を２０μｌ加え、室温で３０分間撹拌した後遠心することにより、ビオチン化トロンビンを除去した。このときの上清を結合実験に用いた。
その結果、Ｆｒ．１８−２１にはタンパク量依存的にビオチン化デコリンのＴＧＦ−β１との結合を阻害する活性が認められた（図１９ａ）。すなわちＦｒ．１８−２１にはＴＧＦ−β１中のデコリン結合部位と同じ場所に特異的に結合するタンパクが含まれることがわかった。次に、この活性がＳ−タグ付きマウスアスポリンによるものであるかどうかを調べるために、結合アッセイの際の検出を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて行った。その結果、Ｓ−タグ付きマウスアスポリンの結合が認められた（図１９ｂ）。さらに、この結合は、トロンビン消化により消失したことから、Ｆｒ．１８−２１中に認められたデコリン−ＴＧＦ−β１結合阻害活性がＳ−タグ付きマウスアスポリン中のアスポリン部分とＴＧＦ−β１との結合を介するものであることがわかった（図１９ｂ）。
【実施例２５】  ヒトアスポリンを一過性に発現させたＣＯＳ７細胞株における培養上清中および細胞抽出画分におけるアスポリンタンパクの検出
細胞におけるヒトアスポリンタンパクの発現を確認する目的で、アスポリン成熟体のＮ末にＨＡタグを付与したＨＡタグ付きアスポリンを発現させるためのプラスミドＤＮＡを以下のようにして調製した。まず、実施例２２で作製したｐＥＴ２９ｂ−ＡＳＰ１３およびｐＥＴ２９ｂ−ＡＳＰ１４を制限酵素Ｋｐｎ  ＩとＸｈｏ  Ｉで消化し、この反応液をアガロースゲル電気泳動し、予想サイズに相当するバンドを切り出して、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。これらのＤＮＡ断片とＨＡタグカートリッジ（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩを５’末端に、Ｋｐｎ  Ｉを３’末端に含むように作製したもの）をあらかじめＨｉｎｄ  ＩＩＩとＸｈｏ  Ｉで消化してリニア化したｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクター（インビトロゲン）とＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて連結させた。このプラスミドＤＮＡで大腸菌コンピテントセルＪＭ１０９（宝酒造）を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地にまいた。出現したコロニーよりプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。正しい塩基配列を持つ挿入ＤＮＡ断片を含むクローンをＤ１３とＤ１４についてそれぞれ選択し、該クローンよりＨＡタグ付きアスポリン成熟体Ｄ１３を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＨＡ−ＡＳＰ１３）およびＨＡタグ付きアスポリン成熟体Ｄ１４を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＨＡ−ＡＳＰ１４）を取得した。このようにして取得したプラスミドを以下の実験に使用した。
ＣＯＳ７細胞を０．５ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２−ｗｅｌｌプレートに蒔き、１０％  ＦＢＳ，ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。２４時間後にＦｕＧＥＮＥ−６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＨＡ−ＡＳＰ１３およびｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＨＡ−ＡＳＰ１４を導入させ、２４時間培養した。培地を無血清のＤＭＥＭに交換し、さらに２４時間培養を継続した。上清を回収し、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−４  １０，０００ＭＷＣＯを用いて１００倍に濃縮した。細胞抽出液は、細胞にＭ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、ピペッティングすることにより調製した。このようにして得られたサンプルを用いてＨＡ−ＨＲＰを用いたウエスタンブロッティングを行った結果、ヒトアスポリン成熟体の分子量に相当する位置にバンドが検出された（図２０）。以上の結果から、ヒトアスポリンはＣＯＳ７細胞においてタンパクとして培養上清および細胞抽出液中に発現することがわかった。
【実施例２６】  アスポリンとコラーゲンとの結合試験
アスポリンとコラーゲンとの結合試験を以下に示す方法により行った。コラーゲンは、酸可溶性ＩＩ型コラーゲン溶液（ＫＯＫＥＮ，３ｍｇ／ｍｌ）および酸可溶性Ｉ型コラーゲン溶液（Ｉ−Ｃ：新田ゼラチン，３ｍｇ／ｍｌ）を用いた。酸可溶性コラーゲン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）５μｌ、実施例１３に示す方法により調製したＳ−タグ付きヒトアスポリン反応液を５μｌ、および９０μｌのＰＢＳを含む反応液を調製し、３７℃で５時間インキュベートした。この反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，５分間，４℃）した後、沈澱をＰＢＳで３回洗浄した。洗浄した沈澱を２０μｌのサンプルバッファー（２−メルカプトエタノールを１μｌ含む）に溶解した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果、Ｓ−タグ付きヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４はＩＩ型コラーゲンとＩ型コラーゲンの両方と結合した（図２１ａ）。ポジティブコントロールとして用いたデコリンはＩＩ型コラーゲンとＩ型コラーゲンの両方と結合し、ネガティブコントロールであるバイグリカンはいずれのコラーゲンとも結合しなかった（図２１ｂ）。以上の結果から、ヒトアスポリンはＩＩ型コラーゲンとＩ型コラーゲンの両方と結合することがわかった。
【実施例２７】  各種軟骨系細胞株におけるＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子発現の誘導
各種軟骨系細胞株についてＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子発現の誘導能を以下の方法により調べた。ＯＵＭＳ−２７は１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭで、ＣＳ−ＯＫＢは１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で、正常ヒト膝関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ−ｋｎ，Ｐ７，ｍｏｎｏｌａｙｅｒ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）はＣｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＧＭ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を用いて培養した。ＡＴＤＣ５は実施例１３に記載した培地１−２を用いて培養した。軟骨系細胞株における誘導実験は、上記の培地中で細胞がコンフルエントに達するまで培養した後、０．２％  ＦＢＳを含む培地に交換して１２時間培養し、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えてさらに２４時間培養した。ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲは実施例１２に記載した方法で行った。その結果、ＮＨＡＣ−ｋｎおよびＯＵＭＳ−２７でＴＧＦ−β１刺激による有意なアスポリン遺伝子発現の上昇がみられた（図２２）。一方、軟骨幹細胞であるＡＴＤＣ５では、アスポリンの発現はＴＧＦ−β１刺激によりやや抑制傾向が認められた（図２２）。これらの結果から、ＮＨＡＣ−ｋｎおよびＯＵＭＳ−２７でＴＧＦ−β１刺激によりアスポリン遺伝子の発現が誘導されることがわかった。
【実施例２８】  ヒト膝関節ＯＡ軟骨組織およびヒト軟骨系細胞株におけるＴＧＦ−β１、β２およびβ３遺伝子発現量の比較
ヒト膝関節ＯＡ軟骨組織（２例）およびヒト軟骨系細胞株（正常ヒト膝関節軟骨細胞：ＮＨＡＣ−ｋｎ，ＯＵＭＳ−２７およびＣＳＯＫＢ）におけるＴＧＦ−β１、β２およびβ３遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで調べた。また、膝関節ＯＡ（１例）、股関節ＯＡ（５例）、正常膝関節（１例）および正常股関節（１例）について、実施例１に記載の方法でオリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析によるＴＧＦ−β１、β２およびβ３遺伝子の発現量を調べた。その結果、調べたすべての関節軟骨組織ではＴＧＦ−β１＞ＴＧＦ−β３＞ＴＧＦ−β２の順に発現量が多く、調べたすべての軟骨系細胞においてＴＧＦ−β１＞ＴＧＦ−β２＞ＴＧＦ−β３の順に発現量が多かった（図２３）。すなわち、正常軟骨、ＯＡ軟骨および軟骨系細胞のいずれにおいても、ＴＧＦ−β１が最も多く発現していることがわかった。
【実施例２９】  ヒトアスポリン安定発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株の取得
ヒトアスポリン安定発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、上記実施例１１で調製したプラスミドＤＮＡを用いて以下の方法により取得した。すなわち、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１３およびｐｃＤＮＡ３．１−ＡＳＰ１４を、ＦｕＧＥＮＥ−６（Ｒｏｃｈｅ）を用い、添付のプロトコールに記載の方法に従って、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に導入した。培地２−１（１０％  ＦＢＳ，ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ），ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（プロメガ）を含むＨａｍ’ｓ−Ｆ１２培地（インビトロゲン））中で、生き残った細胞から限界希釈法によりヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４安定発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株クローンを取得した。
【実施例３０】  ヒトアスポリン安定発現ＡＴＤＣ５細胞株における細胞外プロテオグリカン蓄積低下作用
実施例１７で作製したヒトアスポリン安定発現ＡＴＤＣ５細胞株を実施例２０に記載した方法で培養を行い、培養開始後２１日目の細胞を用いてアルシアンブルー染色を以下のようにして行った。まず、培地を吸引して除き、冷ＰＢＳで細胞表面を３回洗浄した後、メタノール固定を４℃で２分間行った。メタノールを吸引で除去し、蒸留水で細胞を１回リンスした後、０．１％アルシアンブルー８ＧＸ（Ｓｉｇｍａ）／３％酢酸溶液を用いて４℃で２日間細胞を染色した。染色液を除去し、蒸留水で３回洗浄した後、顕微鏡下で観察し、写真撮影を行った。その後、細胞を６Ｍグアニジン塩酸水溶液で処理することにより染色されたプロテオグリカンを抽出した後、６３０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、アルシアンブルーによる染色度はｍｏｃｋ＞Ｄ１３＞Ｄ１４の順に有意に強かった（図２４ａ，ｂ）。以上の結果から、アスポリンはＡＴＤＣ５細胞におけるプロテオグリカン蓄積量を低下させる作用を持つことが明らかとなった。
【実施例３１】  大腸菌組換え型マウスアスポリンの精製
実施例２３に記載した方法で取得した大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ２９ｂ−ＭＡＳＰ）を用いてカナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃でＯＤ６００値が０．５になるまで培養した後、終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３７℃で２時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して集菌し、その菌体をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に懸濁し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）処理を室温で２０分間行った。この反応液を１０，０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離した後の沈殿物を、蒸留水で１０倍希釈したＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてさらに３回洗浄したものを不溶性画分とした。この不溶性画分をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてキット添付のプロトコールに準じて可溶化および透析を行った。さらに、この透析後のタンパク溶液をＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ  １００（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に取り付けたＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたゲル濾過により分離した。以上の操作で調製したタンパク溶液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシブリリアントブルー染色を行った結果、組換え型マウスアスポリンの分子量に相当する単一のバンドが得られた（図２５）。よって、上記の方法により大腸菌で発現させた組換え型マウスアスポリンを精製できることがわかった。
【実施例３２】  精製組換え型マウスアスポリンのＴＧＦ−β１結合活性
実施例３１に記載した方法で精製した組換え型マウスアスポリンを用いて実施例２２に記載した方法（プルダウンアッセイ法）によりＴＧＦ−β１との結合能を調べた結果、精製マウスアスポリンの沈殿物中にＴＧＦ−β１が検出されることを確認した（図２６）。以上の結果より、精製マウスアスポリンがＴＧＦ−β１とｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合することがわかった。
【実施例３３】  精製組換え型マウスアスポリンのＡＴＤＣ５細胞におけるＴＧＦ−β１刺激アグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現抑制活性
ＡＴＤＣ５細胞を１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２−ｗｅｌｌプレートに蒔き、培地１−２（５％  ＦＢＳ，ＩＴＳ（シグマ），ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で２日間培養した。細胞にＦＢＳを０．２％にした培地１−２で希釈した精製マウスアスポリンを添加し、さらに１２時間培養した後、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらに１８時間培養した後、実施例１８と同様にしてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出、精製、ｃＤＮＡ合成、およびｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。このとき、アグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現量はグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現量で補正した。その結果、精製マウスアスポリンの添加量に依存してＴＧＦ−β１刺激アグリカンおよびＩＩ型コラーゲン遺伝子発現を抑制する活性が認められた（図２７）。これより、精製マウスアスポリンがＡＴＤＣ５細胞においてＴＧＦ−β１刺激による軟骨マーカー遺伝子の発現上昇を抑制する活性を有することがわかった。
【実施例３４】  マイクロプレートアッセイ法を用いた精製組換え型マウスアスポリンとＴＧＦ−βとの結合試験
実施例２４に記載した方法を一部改変して以下のようにして行った。Ｎｕｎｃ社Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６−ｗｅｌｌマイクロプレートに０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）で調製した１μｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃，一晩コーティングした。ＴＧＦ−βでコーティングしたｗｅｌｌを、２００μｌ／ｗｅｌｌのブロックエース中で３７℃，３時間ブロッキングした。次にｗｅｌｌ当りｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅが１００μｌになるようにブロックエースで希釈したマウスアスポリンとビオチン化マウスアスポリンを添加し、４℃で一晩インキュベートした。ｗｅｌｌを４００μｌ／ｗｅｌｌのＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＢＳＴで１０００倍希釈したストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。ｗｅｌｌを４００μｌ／ｗｅｌｌのＴＢＳＴで５回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ基質キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて発色させ、Ｕｌｔｒａｍａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。以上の方法でアッセイを行うことにより、精製マウスアスポリンがＴＧＦ−β１と濃度依存的にかつ特異的に結合することがわかった（図２８）。
【実施例３５】  精製組換え型マウスアスポリンの正常ヒト膝関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）におけるＴＧＦ−β刺激ＩＩ型コラーゲンおよびアグリカン遺伝子発現抑制作用
Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入したＮＨＡＣをキット添付の増殖培地（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ，ＣＧＭ）で１０ｃｍシャーレで培養した後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで細胞をはがし、１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるようにまいた翌日に、培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０．２％  ＦＢＳに交換し、その５時間後にアスポリンを添加した。さらに１２時間培養した後、ＴＧＦ−β１（４０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間培養した後の細胞から実施例１２に記載した方法に従って、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製、ｃＤＮＡ合成、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。その結果、マウスアスポリンはＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１刺激によるＩＩ型コラーゲンおよびアグリカン遺伝子の発現を濃度依存的に抑制した（図２９）。したがって、アスポリンは正常ヒト膝関節軟骨細胞において軟骨特異的マトリックスの発現を低下させる作用を持つことがわかった。
【実施例３６】  精製組換え型マウスアスポリンのＡＴＤＣ５細胞におけるＴＧＦ−β特異的シグナル抑制作用
ＡＴＤＣ５を１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに蒔き、実施例１９に記載した培地１−２を用いてコンフルエントになるまで培養した後、ＦＢＳを０．２％にした同じ培地に交換し、４時間後にアスポリンを添加した。さらに１２時間後にＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、その５分後にＭ−ＰＥＲ試薬（ＰＩＥＲＣＥ）で細胞を溶解した。この細胞抽出液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社抗体製品に添付されたプロトコールに従ってウエスタンブロッティングを行った。リン酸化Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ２タンパク質の検出のための一次抗体はＰｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−Ｓｍａｄ２（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をそれぞれ用いた。二次抗体は抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた。その結果、マウスアスポリンはＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）刺激によるＳｍａｄ２リン酸化を濃度依存的に抑制した（図３０）。これより、アスポリンはＴＧＦ−β特異的シグナルを抑制する作用を示すことがわかった。
【実施例３７】  リアルタイムＰＣＲ法による正常およびＯＡ関節軟骨におけるアスポリンｍＲＮＡ発現量の比較
ＯＡ関節軟骨は膝関節ＯＡ患者（ｎ＝８）の膝より採取した。非ＯＡ関節軟骨は大腿骨頚部骨折（ｆｅｍｏｒａｌｎｅｃｋ  ｆｒａｃｔｕｒｅｓ，ＦＮＦ）患者（ｎ＝９）の大腿骨頭より採取した。これらのＦＮＦ患者には関節疾患の発症歴およびレントゲン所見上でのＯＡの徴候は認められなかった。採取した軟骨組織はただちに液体窒素で凍結させた後、−８０℃で保管した。次いで、凍結組織をＣＲＹＯ−ＰＲＥＳＳ（マイクロテック・ニチオン）を用いて粉砕し、ただちにＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を加えて混合し、４℃で２日間ｓｈａｋｉｎｇすることにより、ＲＮＡを抽出した。抽出後は実施例１５に記載した方法に従って、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲを行った。その結果、ＯＡ関節軟骨では非ＯＡ関節軟骨と比べて約２０倍アスポリンｍＲＮＡ量が高かった（図３１）。したがって、アスポリンがＯＡ関節軟骨で著しく発現上昇する疾患感受性遺伝子であることがわかった。
【実施例３８】  ＡＴＤＣ５細胞株におけるＴＧＦ−β１刺激ＩＩ型コラーゲン遺伝子発現に及ぼすヒトアスポリンＤ１６およびＤ１７の一過性発現の効果
実施例２１に記載した方法に基づき、Ｄ−リピート数が１６（Ｄ１６）および１７（Ｄ１７）であるアスポリンの一過性発現によるＴＧＦ−β１刺激ＣＯＬ２Ａ１発現抑制作用をＤ１４と比較した。その結果、Ｄ１６とＤ１７の活性は有意にＤ１４よりも弱かった（図３２）。これより、アスポリンの活性はＤ１４にユニークであり、Ｄ−リピートの長さに依存しないことが分かった。
【実施例３９】  各種細胞株培養上清における組換え型ヒトアスポリンの発現
実施例２５に記載した方法に基づき、ＨＡタグ付きアスポリンＤ１３およびＤ１４成熟体発現ベクターを各種細胞株に導入したときの培養上清における発現をウエスタンブロッティングで調べた。その結果、ヒト肝臓癌細胞株ＨｕＨ−７、マウス軟骨前駆細胞株ＡＴＤＣ５、および正常ヒト膝関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ，Ｃａｍｂｒｅｘ社）においてＨＡタグ付きアスポリンのバンドを確認した（図３３）。以上の結果から、この方法によりヒトアスポリンを非軟骨系、軟骨系を問わず、種々の細胞の培養上清中に発現させることができることがわかった。
【実施例４０】  組換え型マウスアスポリンのＡＴＤＣ５細胞増殖抑制作用
ＡＴＤＣ５を０．４×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに蒔き、実施例１９に記載した培地１−２を用いて２４時間培養した後、アスポリンとｂＦＧＦを添加し、経時的にＭＴＴアッセイを以下のようにして行った。すなわち、培地を吸引により除去し、１ｍｇ／ｍｌになるようにＤＭＥＭ／Ｆ１２に溶かしたＭＴＴ試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ）を１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター中で１時間インキュベートした。上清を吸引により除去し、溶解試薬（８６％  イソプロパノール，４０ｍＭ  ＨＣｌ，１％  ＳＤＳ）を０．２ｍｌ／ｗｅｌｌずつ入れ、室温で５分間抽出した。この抽出液を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、プレートリーダーを用いてＯＤ５５０を測定した。その結果、アスポリンは濃度依存的にＡＴＤＣ５細胞の増殖を抑制することがわかった（図３４ａ）。
また、この条件でｂＦＧＦは濃度依存的にＡＴＤＣ５細胞の増殖を抑制するが、さらにアスポリン（１０μｇ／ｍｌ）を添加することにより増殖抑制効果が増強された（図３４ｂ）。以上の結果から、アスポリンはＡＴＤＣ５細胞の増殖を抑制する作用を持つことが明らかとなった。
【実施例４１】  組換え型マウスアスポリンのＡＴＤＣ５細胞におけるｂＦＧＦ刺激ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み促進作用
実施例４０と同様にして蒔いたＡＴＤＣ５細胞がサブコンフルエントに達した時点で無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２で細胞を２回洗浄し、１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２を入れ、２４−４８時間培養した。そこにアスポリンとｂＦＧＦを添加してさらに２０時間培養後にＢｒｄＵ取り込みアッセイをＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅアッセイ用にプロトコールを以下のように改変して行った。すなわち、細胞に終濃度１μＭになるようにＢｒｄＵを添加し、３７℃、４時間培養した後、培養液を吸引除去し、固定液（ＦｉｘＤｅｎａｔ）を１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加してから室温３０分間静置した。固定液を吸引除去し、ＢｒｄＵ抗体−ＨＲＰ（ｘ１０００）を０．５ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加して室温１時間静置した後、ＴＢＳＴで４回洗浄し、基質液を０．３ｍｌ／ｗｅｌｌずつ入れ、室温で３０分間、十分発色するまで反応させた。１Ｍリン酸０．３ｍｌ／ｗｅｌｌずつ入れて反応を停止させ、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、プレートリーダーを用いてＯＤ４１５を測定した。その結果、アスポリンはｂＦＧＦ非存在下ではＢｒｄＵ取り込みに変化は与えず、ｂＦＧＦ存在下でのみＢｒｄＵ取り込み上昇をさらに増強させる活性を示した（図３５）。したがって、アスポリンはＡＴＤＣ５細胞におけるｂＦＧＦ作用のｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒであることがわかった。
【実施例４２】  マイクロプレートアッセイ法を用いたマウスアスポリンとｂＦＧＦとの結合試験
マイクロプレートに１μｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１の代りにｂＦＧＦ溶液をコーティングする点以外は、実施例３４と同様にして行った。その結果、精製マウスアスポリンはｂＦＧＦと濃度依存的かつ特異的に結合することがわかった（図３６）。
【実施例４３】  アスポリン抗血清の調製
免疫源として用いたペプチドの合成および免疫はペプチド研究所（株）に外注した。すなわち、ヒトアスポリン成熟体のＮ末から２１番目から３３番目のアミノ酸で構成されるペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２２１０：ＮＳＬＦＰＴＲＥＰＲＳＨＦ）（配列番号：３３）、およびＮ末から２６４番目から２７９番目のアミノ酸で構成されるペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２２１１：ＥＮＮＫＬＫＫＩＰＳＧＬＰＥＬＫ）（配列番号：３４）のそれぞれのＣ末にＣｙｓを付与してさらにそのＣ端をアミド化したものを合成し、化学的にＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｙｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）との複合体を形成させた。これらの複合体をウサギ２羽ずつに免疫し、初回免疫から４９日後に全採血した。精製マウスアスポリンの免疫はタンパクをそのまま投与し、初回免疫から４９日後に同様に全採血した。これらのウサギ抗血清はいずれも抗原として用いたペプチドおよびタンパクと良好な反応性を示すことを確認した。
【実施例４４】  アスポリン抗体のアフィニティ精製
実施例４３で得た５種類の抗血清、すなわちＰｅｐｔｉｄｅ−２２１０に対する抗血清２種類（２２１０−Ｂ０１，２２１０−Ｂ０２）、Ｐｅｐｔｉｄｅ−２２１１に対する抗血清２種類（２２１１−Ｂ０１，２２１１−Ｂ０２）、およびマウスアスポリンに対する抗血清（２２２９−Ｂ０１）のそれぞれをアフィニティ精製するため、それぞれの抗原ペプチドおよびタンパクを添付プロトコールに従って、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定化した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で平衡化した固定化カラムに抗血清を通し、吸着画分を０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ３）で溶出し、その１／１０容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）の入ったチューブに回収した。コントロールＩｇＧは免疫前ウサギ抗血清をＨｉＴｒａｐｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通してアフィニティ精製したものを使用した。
【実施例４５】  アスポリン抗体のウエスタンブロッティングによるヒトおよびマウスアスポリンとの反応性
作製した抗体のヒトおよびマウスアスポリンとの反応性をウエスタンブロッティングにより比較した。ブロッキングにはブロックエースを用い、抗体の希釈および洗浄にはＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた。一次抗体反応は室温１時間で行い、検出は抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて行った。その結果、ＨＡタグ付きヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４との反応性は２２２９−Ｂ０１抗体と２２１１−Ｂ０２抗体とは強く、２２１０−Ｂ０２とは弱かった（図３７）。マウスアスポリンとの反応性は２２２９−Ｂ０１抗体が最も強く、２２１０−Ｂ０２と２２１１−Ｂ０２は同程度であった。以上の結果から、いずれの抗体もヒトおよびマウスアスポリンをウエスタンブロッティングで検出できることがわかった。
【実施例４６】  ヒトアスポリンＤ１３およびＤ１４を安定発現させたＡＴＤＣ５細胞株の培養上清中におけるアスポリンタンパクの検出
アスポリンを安定的に発現させたＡＴＤＣ５細胞（１０ｃｍシャーレ３枚分）の無血清培養上清（４５ｍｌ）をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００００ＭＷＣＯを用いて４００μｌまで濃縮し、以下の方法により免疫沈降を行った。すなわち、５００μｌのブロックエース（大日本製薬）、２０μｌの抗マウスアスポリン抗体（２２２９−Ｂ０２）、および５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と混合し、一晩４℃でｓｈａｋｉｎｇした。ビーズに結合したタンパク複合体をＢｕｆｆｅｒ  ＳＮＰ（１％  ＮＰ−４０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を用いて５回洗浄した後、結合タンパク質を０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ３．０）を用いて溶出させた。溶出させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした後、膜をブロックエース中にて３０分間ブロッキングした。一次抗体反応はビオチン化２２１０−Ｂ０２を用いて室温３０分間ｓｈａｋｉｎｇすることにより行った。検出にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを用いた。その結果、Ｄ１３発現株およびＤ１４発現株とも、アスポリンタンパクの発現を培養上清中に認めた（図３８）。さらに、Ｍｏｃｋでもわずかなバンドが検出されたことから、ＡＴＤＣ５細胞自身が内在性にマウスアスポリンを発現していることもわかった（図３８）。
【実施例４７】  正常ヒト関節軟骨細胞（ＮＨＡＣ）におけるアスポリンの関節軟骨細胞としての分化度抑制（脱分化促進）作用
ＮＨＡＣをＣａｍｂｒｅｘ社製軟骨細胞分化培地（ＣＤＭ）を用いて添付プロトコールにしたがい、アルジネートビーズ培養を２週間行って再分化させた。この再分化後の細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に蒔き、５％  ＦＢＳ、ＩＴＳ（Ｓｉｇｍａ）およびＴＧＦ−β１（４０ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加してその分化度を維持させた時の、細胞形態と細胞外プロテオグリカンの蓄積に及ぼすアスポリン（２０μｇ／ｍｌ）の添加効果を調べた。チャンバースライドに蒔いてからＴＧＦ−β１無添加で７日間培養すると、細胞の形態は線維芽細胞様を示し、細胞外プロテオグリカンを反映するサフラニン−Ｏの染色性は陰性であった（脱分化，図３９ａ）。ＴＧＦ−β１添加時では、細胞の形態は卵型を示し、サフラニン−Ｏ染色性は陽性で、軟骨細胞としての分化度が維持されていた（図３９ｂ）。ところが、ＴＧＦ−β１とアスポリンを両方添加すると、細胞の形態は線維芽細胞様を示し、サフラニン−Ｏ染色性は低下し、軟骨細胞としての分化度を喪失した（図３９ｃ）。これらの結果から、アスポリンは、ＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１による軟骨細胞様細胞形態の維持作用、および細胞外プロテオグリカン産生作用を抑制し、細胞を脱分化させることがわかった。
【実施例４８】  ＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１によるＳｍａｄ２リン酸化のアスポリンによる抑制作用
ＮＨＡＣを１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまき、１０％  ＦＢＳとｐｅｎｉｓｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養し、ほぼコンフルエントに達した時点で血清０．２％の同培地に交換した。その１２時間後にアスポリン（２０μｇ／ｍｌ）を添加し、その更に１２時間後にＴＧＦ−β１（４０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、その１０分後にＭ−ＰＥＲ試薬（ＰＩＥＲＣＥ）で細胞を溶解した。この細胞抽出液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社抗体製品に添付されたプロトコールに従ってウエスタンブロッティングを行った。リン酸化Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ２タンパク質の検出のための一次抗体は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−Ｓｍａｄ２（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をそれぞれ用いた。二次抗体は抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた。その結果、アスポリンはＴＧＦ−β１刺激によるＳｍａｄ２リン酸化を抑制した（図４０）。これより、アスポリンはＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１によるＳｍａｄ  ２シグナルを抑制する作用を示すことがわかった。
【実施例４９】  アスポリンのＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１によるＳｍａｄ３特異的遺伝子転写抑制作用
ＮＨＡＣを２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２．５ｘ１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように蒔き、１０％  ＦＢＳとｐｅｎｉｓｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で２４時間培養し、ＳＢＥ４−Ｌｕｃ（Ｓｍａｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｘ４−ルシフェラーゼ）プラスミドと内在性コントロールとして用いたｐＲＬ−ＴＫベクターをトランスフェクションした。その４８時間後にアスポリン（４０μｇ／ｗｅｌｌ）を添加し、さらにその１２時間後にＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｗｅｌｌ）を添加して２４時間インキュベートした。細胞中のルシフェラーゼ活性はＰＧ−ＤＵＡＬ−ＳＰレポーターアッセイシステム（東洋インク）を用いて測定した。その結果、アスポリンはＳＢＥ４−Ｌｕｃを導入した細胞でのＴＧＦ−β１によるルシフェラーゼ活性の上昇を有意に抑制した（図４１）。よって、アスポリンはＴＧＦ−β１によるＳｍａｄ３特異的遺伝子の転写を抑制する作用を示すことが分かった。
【実施例５０】  免疫沈降法によるＮＨＡＣ培養上清中におけるアスポリンの発現の検出
ＮＨＡＣの培養上清中における発現を以下のようにして免疫沈降法により調べた。ＮＨＡＣを１７５ｃｍ２シャーレに蒔き、２日間培養することにより調製した無血清培養上清液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００００ＭＷＣＯを用いて４００μｌまで濃縮し、５００μｌのブロックエース（大日本製薬）、２０μｌの抗マウスアスポリン抗体（２２２９−Ｂ０２，５００μｇ／ｍｌ）、および５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と混合し、一晩、４℃でｓｈａｋｉｎｇした。ビーズに結合したタンパク質複合体をＢｕｆｆｅｒ  ＳＮＰ（１％  ＮＰ−４０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を用いて５回洗浄した後、結合タンパクを０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ３．０）を用いて溶出させた。この溶出させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした後、膜をブロックエース中にて３０分間ブロッキングした。一次抗体反応はビオチン化２２１０−Ｂ０２を用いて室温３０分間ｓｈａｋｉｎｇすることにより行った。検出にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを用いた。その結果、ＮＨＡＣの培養上清中にアスポリンタンパクの発現を認めた（図４２）。すなわち、内在性のアスポリンがＮＨＡＣの培養上清中に分泌されていることがわかった。
【実施例５１】  細胞免疫染色法によるＮＨＡＣにおけるアスポリンの細胞外局在の確認
ＮＨＡＣにおいてアスポリンが細胞外に局在するかどうかを以下に記載する細胞免疫染色法により調べた。細胞の培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液中で室温１５分処理することにより固定した。ＰＢＳで５分ｘ３回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬）中で室温１時間ブロッキングした（なお、抗体を細胞内に浸透化させやすくするため、ブロッキングの前に０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温１５分処理し、ＰＢＳで５分ｘ３回の洗浄を行った）。抗マウスアスポリン抗体（２２２９−Ｂ０１）または抗Ｓｍａｄ２抗休（Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１時間、室温で反応させた後、ＰＢＳで５分ｘ３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と１時間、室温で反応させた。ＰＢＳで５分ｘ３回洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ）を滴下して標本を作製した。その結果、浸透化処理（−）の方が、浸透化処理（＋）よりもアスポリンの染色度はより強かった（図４３ａ，ｂ）。細胞内マーカーとして用いたＳｍａｄ２は、予想通り浸透化（＋）の方でがより強く染色された（図４３ｃ，ｄ）。したがって、ＮＨＡＣにおいて内在性のアスポリンが細胞外に局在していることがわかった。
【実施例５２】  蛍光免疫二重染色によるＮＨＡＣにおけるアスポリンとＴＧＦ−β１の局在一致の確認
ＮＨＡＣの細胞外でアスポリンとＴＧＦ−β１の局在が一致するかどうかを以下に記載する蛍光免疫二重染色により調べた。細胞の培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞にビオチン化ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β１  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｆｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ）を添加して、４℃、１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液中で室温１５分処理することにより細胞を固定した。ＰＢＳで５分ｘ３回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬）中で室温１時間ブロッキングした。抗マウスアスポリン抗体（２２２９−Ｂ０１）を１時間室温で反応させた後、ＰＢＳで５分ｘ３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、およびアビジン−ＦＩＴＣと１時間、室温で反応させた。ＰＢＳで５分ｘ３回洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ）を滴下して標本を作製した。その結果、内在性アスポリンとビオチン化ＴＧＦ−β１の局在が一致することを示す染色像が得られた（図４４ｄ）。この結果から、内在性のアスポリンとＴＧＦ−β１が細胞外で非常に近接して存在することがわかった。
【実施例５３】  ヒトＯＡ患者膝関節軟骨組織におけるアスポリンとＴＧＦ−β１の局在
ヒトＯＡ患者膝関節軟骨組織を採取後すみやかにホルマリン固定し、厚さ６μｍの組織学的検索用切片を作製した。この切片について脱パラフィン処理を行った後、蒸留水で洗浄し、３％過酸化水素水で室温１０分間の処理を行った。１．５％ヤギ正常血清を用いて３０分間室温でブロッキングした後、ウサギ抗マウスアスポリンポリクローナル抗体（２２２９−Ｂ０１）またはウサギ抗ＴＧＦ−β１ポリクローナル抗体（ｓｃ−１４６，サンタクルズ）を用いて、４℃で一晩反応させた。検出は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ＥｌｉｔｅＫｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ）とＤＡＢ（フナコシ）染色を用いて行った。また、サフラニン−Ｏ−ファストグリーン試薬で染色されなかった部位を病変部と、染色された部位を非病変部と定義した。その結果、アスポリンとＴＧＦ−β１はいずれもＯＡ軟骨の非病変部と比べて病変部の細胞でより強く染まっており（図４５）、基質中での染色も弱いながら認められた。また、ＴＧＦ−β１と染色が一致する部分も観察された（図４５矢頭）。これらの結果から、アスポリンとＴＧＦ−β１はｉｎ  ｖｉｖｏでＯＡの病態と深く関わっていることが示唆された。
【実施例５４】  ＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子の一過性発現誘導
ＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子の発現のタイムコースを以下のようにして調べた。細胞を１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように蒔き、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中でコンフルエントになるまで培養した。培地を０．２％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に交換して２４時間培養した後、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、経時的にｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、アスポリン、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を調べた。その結果、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下で１２時間培養したときにアスポリン遺伝子の発現量は最大となり、その後、経時的に発現量は低下した（図４６）。ＴＧＦ−β１存在下で３日間培養した時点では、非誘導時（対照）よりもアスポリンの発現量は下回った。以上の結果から、ＮＨＡＣにおけるアスポリン遺伝子の発現はＴＧＦ−β１により初期には誘導され、時間の経過につれて、著しく抑制されることがわかった。
【実施例５５】  ＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１によるアスポリン、ＩＩ型コラーゲン、アグリカンおよびＴＧＦ−β１遺伝子発現の誘導に及ぼすＳＢ４３１５４２の効果
実施例５４に記載した方法で示したＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子発現の誘導実験の系において、ＴＧＦ−βタイプ１受容体リン酸化の阻害剤であるＳＢ４３１５４２（シグマ）（１０μＭ）をＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）添加の３０分前に添加したときの、アスポリン、ＩＩ型コラーゲン、アグリカンおよびＴＧＦ−β１遺伝子発現の誘導（１２時間）に及ぼす効果を調べた。その結果、ＳＢ４３１５４２は、ＴＧＦ−β１によるこれらの遺伝子発現の誘導を阻害した（図４７）。よって、これらの遺伝子発現の誘導はＴＧＦ−βタイプ１受容体を介していることがわかった。
【実施例５６】  ＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子発現の誘導に及ぼすシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の効果
実施例５４に記載した方法で示したＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子発現の誘導実験の系において、タンパク合成阻害剤であるＣＨＸ（シグマ）（１０μＭ）をＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）添加の３０分前、同時、２時間後、または６時間後に添加したときの、アスポリン遺伝子発現の誘導（１２時間）に及ぼす効果を調べた。その結果、ＣＨＸをＴＧＦ−β１添加の３０分前および同時添加した時には、ＴＧＦ−β１によるアスポリンの誘導が阻害された（図４８）。ところが、ＴＧＦ−β１添加の２時間後以降でのＣＨＸの添加では、ＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子発現の誘導が観察された。この結果より、ＴＧＦ−β１によるアスポリン遺伝子発現は何らかのタンパク質合成を介する間接的な誘導作用によることが示唆された。
【実施例５７】  アスポリンのＮＨＡＣにおけるＴＧＦ−β１刺激アスポリンおよびＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制作用
実施例３５に記載した方法で調製したｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲによりアスポリンおよびＴＧＦ−β１遺伝子の発現を調べた。その結果、ＴＧＦ−β１刺激によりアスポリンおよびＴＧＦ−β１遺伝子の発現は上昇し、その上昇はいずれもアスポリンの添加により抑制された（図４９）。これより、アスポリンが、ＴＧＦ−β１存在下でアスポリンとＴＧＦ−β１遺伝子の両方の発現を負に制御していることが明らかとなった。
【実施例５８】  ＮＨＡＣにおけるアスポリン特異的ｓｉＲＮＡのＩＩ型コラーゲン、アグリカンおよびＴＧＦ−β１遺伝子発現上昇作用
アスポリン特異的ｓｉＲＮＡ（Ｓｉ９：ＵＣＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＣＣＡＧＡＴＴ；配列番号：３５）は宝酒造ホームページ内ｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｒｎａｉ／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍ）を用いて設計した。コントロールｓｉＲＮＡ（Ｓｉ１Ｎ：ＣＣＵＡＣＧＵＣＣＡＧＡＵＡＡＵＵＣＧＴＴ；配列番号：３６）はアスポリンやそれ以外の遺伝子のいずれともマッチしない配列を設計して使用した。細胞を１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように蒔き、１０％  ＦＢＳ，ＩＴＳ，１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１およびｐｅｎｉｓｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で２４時間培養し、ｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（宝酒造）を用いてトランスフェクションした。２４時間培養後の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＩＩ型コラーゲン、アグリカン、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を調べた。その結果、アスポリン特異的ｓｉＲＮＡはＮＨＡＣにおけるＩＩ型コラーゲン、アグリカンおよびＴＧＦ−β１遺伝子の発現を有意に上昇させた（図５０）。したがって、内在性のアスポリンはＮＨＡＣにおける軟骨基質の発現およびＴＧＦ−β１の発現を負に制御していると考えられた。これは、アスポリンの発現や作用を抑制する化合物が関節軟骨における軟骨基質の量を増加させることで、変形性関節症治療薬となる可能性があることを示唆する。
【実施例５９】  ＮＨＡＣにおけるアスポリンのＴＧＦ−β１による細胞増殖抑制作用
ＮＨＡＣを１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように蒔き、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２にＴＧＦ−β１（４０ｎｇ／ｍｌ）およびアスポリン（５または２０μｇ／ｍｌ）を添加し、５日間培養した後、以下に述べるＭＴＴアッセイ法により細胞増殖の程度を調べた。すなわち、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ，同仁化学研究所）を１ｍｇ／ｍｌになるようにＤＭＥＭ／Ｆ１２に溶解し、あらかじめ培地を吸引除去した細胞に加え、３７℃で１時間培養した。その後、ＭＴＴを含む培地を捨て、細胞を溶解試薬（８６％イソプロパノール，４０ｍＭ塩酸，１％  ＳＤＳ）を用いて抽出した。この細胞溶解液を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、マイクロプレートリーダーを用いて５５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＮＨＡＣの増殖度は、ＴＧＦ−β１の添加により増加したが、ＴＧＦ−β１とともにアスポリンを添加すると、濃度依存的に細胞増殖を抑制した（図５１）。以上の結果から、アスポリンはＴＧＦ−β１に依存したＮＨＡＣの細胞増殖を抑制する作用を示すことが明らかとなった。
【実施例６０】  モルモット自然発症病態ＯＡモデルにおける関節軟骨でのアスポリンの発現
Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモットは、加齢とともに関節軟骨に変性が認められることから、自然発症病態ＯＡモデルとして用いられる。そこで、該動物における関節軟骨でのアスポリンの発現について検討した。実験には、モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ系，雄性，日本エスエルシー，静岡より購入）を、２および１６月齢時点で、炭酸ガス存在下で屠殺した後、両膝の脛骨関節軟骨の内側部分をサージカルナイフ（ＦＥＡＴＨＥＲ）で剥ぎ取った。その後、可及的速やかにＲＮＡ抽出試薬のＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）に浮遊させて、ホモジナイザー機（ＮＩＴＩ−ＯＮ）を用いて組織を細分し、ＲＮＡを回収した。得られた総ＲＮＡサンプルを鋳型として、Ｓｕｐｅｒ  ｓｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。このＤＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００）を行った。反応液は、ｃＤＮＡサンプル４０ｎｇ，ＥｘＴａｑ  ０．２５μｌ，１０ｘ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ，ｄＮＴＰ  ４μｌ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）、各プライマー５００ｎｍｏｌ／ｌ，全量５０μｌで混合した。反応は、９４℃で２分反応した後、９４℃１分，５５℃２分，７２℃１分の条件で４０サイクル行った。その後、サンプルを１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ）にローディングして、４０分間電気泳動を行った。データは、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によるバンドの数値化で示した。なお、標的遺伝子に対するプライマーとしては下記の配列を使用した。
フォーワードプライマー：ＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡ（配列番号：３７）
リバースプライマー：ＡＧＣＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＧ（配列番号：３８）
２月齢モルモットと比較し、１６月齢モルモットはアスポリンｍＲＮＡの発現が有意に亢進していることがわかった（図５２）。
本実験結果から、病変部分でアスポリンの発現が亢進していたので、ＯＡ病態におけるアスポリンの解明に、本動物モデルは、有用であることが示唆された。
【実施例６１】  モルモット自然発症病態ＯＡモデルにおける血清アスポリン濃度の測定
Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモットにおける血清アスポリン濃度を、抗アスポリン抗体を用いて検討した。実験には、モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ系，雄性，日本エスエルシー，静岡）を購入して使用した。１，３，６および１８月齢のモルモットから、採血して血清を分離し、アスポリンの含量をＥＬＩＳＡ法により測定した。すなわち、９６−ｗｅｌｌプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に抗マウスアスポリン抗体（２．５μｇ／ｍｌ，２００μｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）を播種し、室温で一晩反応させた。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）で洗浄後、２５％ブロックエース溶液（大日本製薬）で２時間ブロッキング、洗浄した後にサンプルを１００μｌ添加した。２時間室温で放置して洗浄後、ビオチン化２２２９−Ｂ０１（１０，０００倍希釈；１００μｌ）を加えて２時間反応させた。洗浄後、アビジン−ＨＲＰ（２，５００倍希釈；１００μｌ）を添加し、３０分放置した。洗浄後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）基質（１００μｌ）を加え、２０分後に０．２５ｍｏｌ／ｌ硫酸（１００μｌ）を加えて反応を停止し、吸光光度計にてＯＤ４５０ｎｍを測定した。
その結果、血清中のアスポリン濃度は、加齢とともに増大し、１月齢時点に比して６月齢から有意な亢進が確認された（図５３）。
本実験結果から、アスポリンは、ＯＡ病態動物モデルでの軟骨破壊と関係する生化学的パラメターとして有用なマーカーであることが示唆された。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性を容易に判定することができる。また、カルモジュリン、アスポリン、それらに対する抗体、それらをコードする核酸、それらのアンチセンス核酸、その他それらの発現もしくは活性を調節し得る物質は、骨・関節疾患の予防・治療剤として使用することができる。
本出願は日本で出願された特願２００４−２２８７４５（出願日：２００４年８月４日）、特願２００４−３２４３７２（出願日：２００４年１１月８日）および特願２００５−０７０１０３（出願日：２００５年３月１１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２６】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４０】
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【図４１】
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【図３９】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４８】
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【図４７ａ】
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【図４７ｂ】
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【図４７ｃ】
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【図４７ｄ】
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【図４９】
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【図５１】
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【図５０】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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