(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載のイヌジステンパーウイルスのＨ遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のＨタンパク質のアミノ酸配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性がある６０７個のアミノ酸からなるタンパク質をコードし、制限酵素ＮｄｅＩ又はＰｓｈＢＩで消化すると２種の断片が得られる塩基配列を有するＤＮＡであって、このＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列の第１９番〜第２１番、第１４９番〜第１５１番、第３０９番〜第３１１番、第３９１番〜第３９３番、第４２２番〜第４２４番、第４５６番〜第４５８番、第５８７番〜第５８９番、及び第６０３番〜第６０５番に、糖鎖結合部位を有し、かつ第５８４番〜第５８６番の位置に糖鎖結合部位が存在しないことを特徴とするイヌジステンパーウイルスのＨ遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＨ遺伝子を有することを特徴とするイヌジステンパーウイルス。
【請求項４】
配列表の配列番号２に記載のイヌジステンパーウイルスのＨタンパク質。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載のＨタンパク質のアミノ酸配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性がある６０７個のアミノ酸からなるタンパク質をコードし、制限酵素ＮｄｅＩ又はＰｓｈＢＩで消化すると２種の断片が得られる塩基配列によりコードされるタンパク質であって、アミノ酸配列の第１９番〜第２１番、第１４９番〜第１５１番、第３０９番〜第３１１番、第３９１番〜第３９３番、第４２２番〜第４２４番、第４５６番〜第４５８番、第５８７番〜第５８９番、及び第６０３番〜第６０５番に、糖鎖結合部位を有し、かつ第５８４番〜第５８６番の位置に糖鎖結合部位が存在しないことを特徴とするイヌジステンパーウイルスのＨタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
イヌ等の哺乳動物におけるジステンパーウイルス感染症の予防／治療／検査に有効な新規なＨ遺伝子、Ｈタンパク質及びそれを含む新規なイヌジステンパーウイルスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
パラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科のモルビリウイルス（Morbillivirus）属の一員であるイヌジステンパーウイルス（以下、「ＣＤＶ」ともいう）は、ヒトの麻疹ウイルスおよびウシの牛疫ウイルスと近縁である。ＣＤＶにより引き起こされる病気は数世紀にわたって知られ、イヌならびに大型ネコ科動物等の肉食類における重要な伝染病の一つとして世界中にわたって今もなお存在する（文献３、３４：以下（  ）内の数字は文献ナンバーを表す）。防御免疫を持たないイヌがＣＤＶに感染すると、高い死亡率を有する急性〜亜急性の全身性の病気を起こす。ＣＤＶの感染標的は主に粘膜および体全体にわたるリンパ系組織である。この病気は典型的には発熱、食欲不振、鼻水、結膜炎、および下痢の出現により特徴付けられる。場合によっては、皮膚の膿疱、角化症、それに中枢神経系の病気の症候も見られる。
しかし、弱毒生ＣＤＶワクチンが導入されて以来、この病気はここ数十年沈静化している（１、２および１３に論評）。
【０００３】
ＣＤＶは、Ｍと名付けられた膜タンパク質と、Ｈ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、血球凝集素：ＣＤＶの付着タンパク質）およびＦ（ｆｕｓｉｏｎ、融合）と名付けられた２種類の糖タンパク質とからなるエンベロープを有し、後者の２種類のＨタンパク質とＦタンパク質は、宿主免疫系の主要な標的抗原である。そのＨタンパク質（５）中には高頻度に抗原変異が発見され、このＨタンパク質は文献（１５、２６）で指摘されたように該ウイルスの遺伝的変化をモニターするために最適であると考えられている。
【０００４】
したがって、最近の野外ＣＤＶ分離株（ここでは「新しいＣＤＶ」と称する）のＨ遺伝子（Ｈタンパク質をコードする遺伝子）と、現在利用できる弱毒生ＣＤＶワクチン株、例えばOnderstepoort、Fromm、Rockborn、弱毒化Snyder Hill、およびConvacのＨ遺伝子と比較した場合、著しい遺伝的多様性があることが、欧州各国（６、１４、１５）、米国（１８）および日本（２０）において報告された。これらのワクチン株は１９５０年代と１９６０年代に作られた（ここでは「古いＣＤＶ」と称する）。新しいＣＤＶと古いＣＤＶとの抗原的な差違が中和試験で見いだされたが（１２、１９）、一方で新しいＣＤＶ感染からイヌを保護することに対して現在のワクチンが必ずしも無効ではないという考えもある（１４、１５）。
【０００５】
新しいＣＤＶのさらなる注目できる特徴は、他の麻疹ウイルスについても発見されたように（８、２８、３１、３３）、Ｈ遺伝子の系統分類分析により判明した、地理的に異なる系統の存在である（６、７、１５、１８、２０）。これらの系統または遺伝子型は、ウイルスの宿主の種類によって一般に限定されないが（６、７、１８）、宿主の種類に特異的な系統が存在する可能性もある（１５）。日本では１９８０年代以降、１つの遺伝子型の新しいＣＤＶの存在が認められており、その遺伝子型はヨーロッパとアメリカの新しいＣＤＶのものとは異なることがわかった（２０、２５）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なイヌジステンパーウイルスのＨ遺伝子を提供でき、イヌ等の哺乳動物におけるジステンパーウイルス感染症の予防／治療／検査に有効な新規なＨ遺伝子、それがコードするＨタンパク質及びそれを含む新規なイヌジステンパーウイルスを提供できる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討の結果、新規なＣＤＶの遺伝子型を見いだし、上記本発明の目的を達成した。本発明の構成を以下に示す。
（１）  配列表の配列番号１に記載のＨタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
あるいは
該アミノ酸配列と９５％以上のアミノ酸配列相同性があるポリペプチドをコードし、制限酵素ＮｄｅＩ又はＰｓｈＢＩで消化すると２種の断片が得られる塩基配列
を有することを特徴とするイヌジステンパーウイルスのＨ遺伝子。
（２）  前記Ｈタンパク質のアミノ酸配列の
第１９番〜第２１番、第１４９番〜第１５１番、第３０９番〜第３１１番、第３９１番〜第３９３番、第４２２番〜第４２４番、第４５６番〜第４５８番、第５８７番〜第５８９番、及び第６０３番〜第６０５番に、糖鎖結合部位を有することを特徴とする前記（１）に記載のイヌジステンパーウイルスのＨ遺伝子。
（３）  前記（１）又は（２）に記載のＨ遺伝子を有することを特徴とするイヌジステンパーウイルス。
（４）  配列表の配列番号１に記載のＨタンパク質のアミノ酸配列、
あるいは
該アミノ酸配列と９５％以上のアミノ酸配列相同性があり、アミノ酸配列の第１９番〜第２１番、第１４９番〜第１５１番、第３０９番〜第３１１番、第３９１番〜第３９３番、第４２２番〜第４２４番、第４５６番〜第４５８番、第５８７番〜第５８９番、及び第６０３番〜第６０５番に、糖鎖結合部位を有するアミノ酸配列
を有することを特徴とするイヌジステンパーウイルスのＨタンパク質。
【０００８】
本発明者らは、試験管内（in vitro）でのＣＤＶの培養条件が困難であるため、細胞培養法のかわりに、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により、臨床検査材料中のＣＤＶのＲＮＡを日常的に検査してきた。ＲＴ−ＰＣＲによって陽性であると診断された場合、Ｈ遺伝子の簡便な遺伝子型決定のために、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ；restriction fragment length polymorphism）アッセイもＲＴ−ＰＣＲ産物に適用した。本発明者らは日本においてイヌの間で最近広く認められるＣＤＶの遺伝子型の特徴を上記方法で検査していたところ、新しいＣＤＶ遺伝子型が、イヌジステンパーと臨床診断された子犬から採取された試料中に検出された。Ｈ遺伝子アミノ酸配列の系統分類分析により、その遺伝子型が以前に知られたものとは全く異なることが判明した。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のイヌジステンパーウイルスのＨ遺伝子は、配列表の配列番号１に記載のＨタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは該アミノ酸配列と９５％以上のアミノ酸配列相同性があるポリペプチドをコードし、制限酵素ＮｄｅＩやＰｓｈＢＩで消化すると２種の断片が得られる塩基配列を有する。ここで制限酵素ＮｄｅＩやＰｓｈＢＩは、従来公知のものや市販のものを使用することができる。制限酵素ＮｄｅＩにより消化して得られた２種の断片としては、約１９００ｂｐと７５０ｂｐの組み合わせに、ＰｓｈＢＩでは約１６５０ｂｐと９５０ｂｐの組み合わせになる。また、アミノ酸配列の相同性試験は、ＲＴ−ＰＣＲ法等の方法により得られたＨ遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を得、それと配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を、所定の公知のパソコンソフトを使用して比較することにより実施することができる。
本発明のＨ遺伝子は、それがコードするアミノ酸配列において上記のような特定のところに糖鎖結合部位を有することが好ましい。ここで、糖鎖結合部位とは、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔで表現されるアミノ酸配列を有する部位のことを言い、塩基配列からそのアミノ酸を推定することにより判る。ここで、Ｎは、Ａｓｎ（アスパラギン）を表し、Ｓ／Ｔは、Ｓｅｒ（セリン）もしくはＴｈｒ（トレオニン）を表す。また、Ｘは任意のアミノ酸を表す。また、該アミノ酸配列の第５８４番〜第５８６番の位置には糖鎖結合部位がないことが好ましい。
【００１０】
該Ｈ遺伝子は、野外のＣＤＶ株から分離できるし、ＣＤＶ感染症を発症している宿主動物（犬等）の臓器や口腔や直腸の分泌物からも分離できるし、更に配列表の配列番号１に記載の塩基配列やアミノ酸配列を基に化学合成によって得ることもできる。ここで、野外のＣＤＶ株や宿主動物において、本発明のＨ遺伝子の存在や、該Ｈ遺伝子を有するＣＤＶの存在の有無を検査するには、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、蛍光抗体直接あるいは間接法、補体結合反応、中和試験、ＥＬＩＳＡ法等を用いることができる。
【００１１】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、宿主動物から得られたウイルスを培養しその培養上清から、あるいは分泌物試料の中から全ＲＮＡを単離し、そのＲＮＡを鋳型とし、公知の方法によりｃＤＮＡを合成する。そのｃＤＮＡから適切なプライマーを選択したＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、アガロース電気泳動法等によりＣＤＶＲＮＡを検出することにより実施することができる。ここでＰＣＲに用いるプライマーは、公知のＨ遺伝子のプライマー、即ち文献（１８、２０、３２、３５）等に記載のものを用いることもできる。また、配列表の配列番号１に記載の塩基配列やアミノ酸配列を基に化学合成によって得ることもできる。具体的には、後述の表２に記載のプライマーを用いることができる。
【００１２】
本発明のイヌジステンパーウイルスのＨ遺伝子は、上記のようにＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、それを従来公知の方法により精製し、それを公知のクローニングベクターに挿入し、それを所定の宿主細胞に形質転換してクローニングできる。
また、本発明のＨ遺伝子を有するイヌジステンパーウイルスは、Ｈ遺伝子を有する分離株や宿主の組織及び分泌物から得られるが、上記のように得られたＨ遺伝子を遺伝子組み換え技術により、他の遺伝子型のＣＤＶウイルス株内に導入することもできる。
【００１３】
本発明のイヌジステンパーウイルスのＨタンパク質は、上記のようにして得られたＨ遺伝子を所定の発現ベクターに組み込み、それを所定の宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、その培養物から回収／精製することにより得ることができる。
本発明のＨ遺伝子は、ワクチンの設計に有効に利用できる。例えば、文献（１０）に記載のような組み換えサブユニットワクチン、ＤＮＡワクチン、文献（２１、２７、３０）に記載のような組み換えベクター化ワクチン等に使用できる。また、本発明のＨ遺伝子を有するＣＤＶも、弱毒化生ワクチン等に使用することもできる。また、本発明のＨタンパク質は、それ自体をワクチン等に使用できる。これらのワクチンは、単独であるいは適当なアジュバントを組み合わせることで、細胞性免疫も誘導することができると予想される。本発明のＨ遺伝子、ウイルス及びＨタンパク質は、また、ジステンパーの診断や検査にも有用である。具体的には、本発明のＨ遺伝子、ウイルス及びＨタンパク質は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、蛍光抗体直接あるいは間接法、補体結合反応、中和試験、ＥＬＩＳＡ法等に適用されて、ジステンパーの診断や検査に用いることができる。
【００１４】
（文献一覧）
本願明細書において(    )内に記された番号の文献を以下に示す。
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【００１５】
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【００１８】
【実施例】
以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明の内容がこれらに限定されるものではない。
（ウイルスと臨床試料）
７種類のＣＤＶ株を参照用として用いた；６種類、即ちOnderstepoort、Fromm、DFE-HC、Lederle VR-128、RockbornおよびFXNOの各株は、日本で現在用いられているワクチン株である。残りの１種類として、実験室用野生型Snyder Hill株を用いた。これらの参照用ＣＤＶは、古いＣＤＶであると思われる。滅菌蒸留水で溶解したワクチンと細胞培養液をＲＴ−ＰＣＲのために利用した。
１９９１年の野外の発症事例から分離されたＫＤＫ−１株はＶｅｒｏ細胞培養で継代されている。継代６代目の培養液をＨ遺伝子の配列決定とＲＦＬＰ分析のために用いた。該Ｖｅｒｏ細胞は、１０％トリプトース・フォスフェート・ブロスと８％ウシ胎児血清を加えたＥａｇｌｅの最少必須培地（ＭＥＭ）で培養した。１９９４年にさらに別の４種類のＣＤＶ分離株、すなわちＣ７１０Ｄ、Ｃ７１４Ｄ、Ｃ７１７ＤおよびＣ７２０ＤもＶｅｒｏ細胞培養で１０代継代して用いた。
１１個の口腔スワブと９０個の直腸スワブの合計１０１検体の臨床試料を呼吸器または腸に病気の徴候を示すイヌから採取した。これらの試料は１９９７年／１９９８年の両年に日本の多様な場所の動物病院によって提出され、そのうち、３つの口腔試料と４つの直腸試料がＲＴ−ＰＣＲアッセイによりＣＤＶＲＮＡ陽性と診断された。これらの野外ＣＤＶ分離株とＣＤＶＲＮＡ陽性の臨床試料の特徴を下記表１に要約する。
【００１９】
【表１】
0004854104.tif 000002
【００２０】
（プライマーの選択）
Ondertepoort株の配列情報にしたがって４組のオリゴヌクレオチドプライマーを本研究に用いた（図１；表２）。
日常診断には、Ｈ遺伝子の内部を標的とした一組のプライマー（ＣＤＶＨ１３およびＣＤＶＨ１８）を利用した。Ｈ遺伝子のＲＦＬＰ分析と配列決定のためのＰＣＲ産物を得るために、２組のプライマーを用いた：一つはＦ遺伝子とＨ遺伝子との間（プライマーＲＨ−３）、およびＨ遺伝子とラージ（Ｌ）タンパク質遺伝子との間（プライマーＲＨ−４）（１８）のそれぞれの非翻訳領域の配列から設計し、もう一つはＦ遺伝子領域（プライマーＣＤＶ−Ｆ８）およびＬ遺伝子領域（プライマーＣＤＶ−Ｒ８）から設計した。ヌクレオキャプシド（Ｎ）遺伝子の検出と配列決定のために、以前に記載された一組のプライマー（ＮＦ１２８７とｐ２）（３５）を利用した。各プライマーの配列を下記表２に示す。
【００２１】
また、図１は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイの概要を示す図である。図１において、中央部にはＣＤＶゲノムの構成を示す。各種のＣＤＶ遺伝子をボックスによって表し、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、融合タンパク質（Ｆ）、血球凝集素タンパク質（Ｈ）およびラージタンパク質（Ｌ）を示す。下部においては、Ｆ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＨ遺伝子の間に設定した、プライマー対およびＲＴ−ＰＣＲ産物の長さを示す。
ｎｔ：ヌクレオチド。
【００２２】
【表２】
0004854104.tif 000003
【００２３】
（逆転写とＰＣＲ増幅）
２５０μｌの感染細胞培養液の上清またはスワブ抽出物から、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ（日本ジーン社製、富山）を製造者の指示にしたがって用いることにより、全ＲＮＡを得、それを２０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。ｃＤＮＡをランダム９量体（random 9 mer）プライマー（宝酒造社製、東京）を用いて合成した。
即ち、１μｌのランダムプライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）を９μｌのＲＮＡ溶液に加えた後、その混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、氷冷した。この混合物に、４μｌの５×reaction buffer（宝酒造社製、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．３、５００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭジチオスレイトールおよび５ｍＭＭｇＣｌ2）、１μｌの１３３Ｕ／μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤（ribonuclease inhibitor）（宝酒造社製）および４μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）を加え、混合物を２５℃で５分間インキュベートし、次に１μｌの３７Ｕ／μｌのＡＭＶ逆転写酵素（Reverse transcriptase）ＸＬ（宝酒造社製）を最後に加えた。次に、合計２０μｌのこの反応混合物を２５℃で１０分間、４２℃で５０分間および７０℃で１０分間インキュベートした。
【００２４】
臨床試料の日常的な診断のために、ＰＣＲを以下のように行った。合計５０μｌの反応混合物として、０．５μｌのｃＤＮＡ、０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）（宝酒造社製）、５μｌの１０×ＰＣＲ  buffer（宝酒造社製、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．３、５００ｍＭＫＣｌ）、３μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ2、４μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、３６．２５μｌの蒸留水（ｄＨ2Ｏ）、およびプライマーＣＤＶＨ１３およびＣＤＶＨ１８（５０ｐｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ０．５μｌを混合することにより作成した。それをＴｒｉｏ−Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社、タンパ、フロリダ州、米国）に置いた。温度サイクリングのプロトコールは、９４℃での変性、５５℃でのプライマーのアニーリング、および７２℃での伸長の各３０秒間の３０サイクルからなった。プライマーＮＦ１２８７およびｐ２（５０ｐｍｏｌ／μｌ）を各０．５μｌを用いることによってＮ遺伝子部分を増幅した。この時の温度サイクリングのプロトコ―ルは、９４℃での変性１分、５５℃でのプライマーアニーリング２分、７２℃での伸長２分の３０サイクルからなった。
【００２５】
ＫＤＫ−１株のＨ遺伝子配列決定のためのＰＣＲ産物を得るために、プライマーＲＨ−３およびＲＨ−４（５０ｐｍｏｌ／μｌ）の各０．５μｌを合計４９μｌの上記反応混合物に加えた。９４℃での変性（３０秒）、５５℃でのプライマーのアニーリング（１分）、および７２℃での伸長（１分）の反応を２５サイクルおよびその後の１０分間の７２℃での最終伸長段階からなる温度サイクリングのプロトコールにより増幅を行った。
【００２６】
直腸試料９８−００２のＲＦＬＰ分析およびＨ遺伝子の配列決定のためのＰＣＲ産物を得るために、プライマーＣＤＶ−Ｆ８とＣＤＶ−Ｒ８（５０ｐｍｏｌ／μｌ）の各０．５μｌを、０．５μｌのｃＤＮＡ、０．２５μｌのＥｘＴａｑポリメラーゼ（５μｌ／μｌ）（宝酒造社製）、および５μｌの１０×Ex Taq buffer（宝酒造社製、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．３、５００ｍＭＫＣｌおよび２０ｍＭＭｇＣｌ2）、４μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ  mixture、および３９．７５μｌの蒸留水（ｄＨ2Ｏ）からなる合計４９μｌの反応混合物に加えた。９４℃での１分間の変性、５０℃での２分間のプライマーのアニーリング、および７２℃での２分間の伸長の３５サイクル、その後の７２℃での２分間の最終伸長段階からなる温度サイクリングのプロトコールにより増幅を行った。
【００２７】
（配列の決定）
ＫＤＫ−１株および直腸試料９８−００２から調製されたＰＣＲ産物をWizard PCR Preps DNA  Purification system（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マジソン、ウイスコンシン州、米国）を用いて精製した。次に、精製したＰＣＲ産物を、Regular pT7Blue(R)T-Vector（Promega社製、マジソン、ウイスコンシン州、米国）にインサートし、Epicurian Coli XL2-Blue MRF' Competent Cell（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、ラジョラ、カリフォルニア州、米国）に形質転換してクローニングした。各試料について、ＰＣＲ産物を含有する１０個のプラスミドをWizard MiniPreps DNA Purification System（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マジソン、ウイスコンシン州、米国）を用いて精製し、AutoRead Sequencing Kit（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製、東京）のＣｙ５で標識されたｍ１３プライマーを用い、さらに得られた配列から設計されたＣｙ５で標識されたプライマーを用いて配列決定した。
【００２８】
（ＰＣＲ増幅産物のＲＦＬＰ分析）
ＣＤＶ−Ｆ８とＣＤＶ−Ｒ８プライマーを用いて得られたＰＣＲ産物をWizard PCR Preps DNA Purification Systemを用いて濃縮し、得られたものを制限酵素ＦｂａＩとＮｄｅＩ（宝酒造社製）のそれぞれで消化した。そのうちの８μｌを製造業者の推薦する条件下で３７℃で２時間、１．２単位のＦｂａＩと１．０単位のＮｄｅＩで消化した。得られた制限断片を２％のアガロースゲル電気泳動で分離し、それらのバンドをエチジウムブロマイドによる染色後に可視化した。
【００２９】
（系統分類分析）
得られた塩基配列をGenetyx-Mac Ver.８．５（ソフトウエア開発株式会社製、東京）を用いて、アミノ酸配列に翻訳した。このデータと既知のＣＤＶのデータをClustal W Ver.１．７４（34）に入力し、アライメントの作成、ブートストラップ解析を行った。このデータをPHYLIP  Ver.３．５（１１）に入力し、アウトグループを指定せずに系統樹を作成した。
【００３０】
「遺伝子型」という言葉がＣＤＶの分類でしばしば用いられてきたが（６、１５）、公式な定義はまだない。ここでは、遺伝子型はＨ遺伝子アミノ酸配列の系統分類的な性質により定義した。すなわち、９５％を超えるアミノ酸相同性を示す同一クレード中の系統が同一の遺伝子型に属するとみなされる。
【００３１】
（ヌクレオチド配列のDDBJ/EMBL/GenBankにおけるアクセッション番号）
ここで使用されたＨ遺伝子配列の参照およびデータのアクセッション番号は下記の通りである：  Snyder Hill（１５）、ワクチン／Onderstepoort（４，９）［AF014953、D00758］、ワクチン／Convac（２２）［Z35493］、中国ヒョウ／A92-27／4（１８）［Z54156］、黒ヒョウ／A92-6（１８）［Z54166］、イヌ／US89（６）［Z47762］、ヒョウ／US91（６）［Z47763］、  アライグマ／US89（６）［Z47765］、ペッカリー／US89（６）［Z47765］、イヌ／DK91、B+C（６）［Z477661］、ミンク／DK86（６）［Z47759］、イヌ／GR88（６）［Z47760］、イヌ／404（１５）［Z77671］、イヌ／2544（１５）［Z77672］、イヌ／4513（１５）［77673］、シベリアアザラシ／PDV-2（２３）［X84998］、フェレット／1493／Han89（２３）［X84999］、イヌ／5804／Han90（２３）［X85000］、イヌ／Ueno（２０）［D85753］、イヌ／Hamamatsu（２０）［D85754］、イヌ／Yanaka（２０）［D85755］、およびタヌキ／Tanu96［AB016776］。
【００３２】
（実施例の結果）
（参照用ＣＤＶ株およびＣＤＶＲＮＡ陽性臨床試料に由来するＨ遺伝子のＲＦＬＰ分析）
最初に、参照用ＣＤＶ株およびＫＤＫ−１株を比較して調べた。図２において、レーンＭ、１００ｂｐの段階的なサイズのマーカー；レーン１〜５、野外分離株のＫＤＫ−１、Ｃ７１０Ｄ、Ｃ７１４Ｄ、Ｃ７１７ＤおよびＣ７２０Ｄ；レーン６〜１０、臨床試料の９８／００１、９８／００３、９８／００５、９８−００１、および９８−００２；レーン１１〜１７、参照用株のOnderstepoort、Fromm、DFE-HC、Lederle VR-128、Rockborn、FXNOおよび野生型Snyder Hillを各々示す。
【００３３】
図２の結果に示されているように、すべての７種類の参照用ＣＤＶ株をＦｂａＩで消化して、約１，８００、６００および２００ｂｐの大きさの３断片が得られたが、約２，４００および２００ｂｐの大きさの２断片だけがＫＤＫ−１株に関して得られた。ＮｄｅＩを用いた場合（図３、各レーンの説明については図２を参照）、ＫＤＫ−１は約１，５００、３００および７５０および１００ｂｐの大きさの４断片に消化されたが、参照用ＣＤＶ株はまったく消化されなかった。これらの結果は１９９１年に分離されたＫＤＫ−１株が参照用の古いＣＤＶとは遺伝子的に異なることを示した。
【００３４】
ＲＴ−ＰＣＲによってＣＤＶＲＮＡ陽性であると診断された合計で７つの臨床試料のうち、３つの口腔試料と２つの直腸試料がＨ遺伝子領域のＲＦＬＰ分析に進められた。２つの直腸試料（９７−０５０および９７−０６３）の場合、非特異的なＰＣＲ産物の干渉バックグランドのために、分析に適当なＰＣＲ産物は得られなかった。したがって、４つのＣＤＶ分離株と５つの臨床試料を分析した（表１、および図２と３）。ＣＤＶ分離株のＣ７１０Ｄ、Ｃ７１４Ｄ、Ｃ７１７Ｄ、およびＣ７２０Ｄ、口腔試料の９８／００２および９８／００３、それに直腸試料の９８−００１はＫＤＫ−１株のものに類似するＲＦＬＰパターンを示した。同じ犬から採取された口腔試料９８／００１と直腸試料９８−００２のＲＦＬＰパターン（表１）は、ＦｂａＩで消化された場合にＫＤＫ−１株に類似したが、ＮｄｅＩで消化された場合には異なり、約１，９００と７５０ｂｐの２種類の断片が観察された（図３）。
【００３５】
（ＫＤＫ−１と直腸試料９８−００２のＨ遺伝子のアミノ酸配列分析）
ＫＤＫ−１：  新しい日本のＣＤＶ分離株を代表するものとして、ＫＤＫ−１株のＨ遺伝子の配列を決定し、その推定されるアミノ酸配列を決定した。そのＨ遺伝子は、１，８２４ｂｐ、および６０７アミノ酸をコードすることのできる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなった。発表されたワクチン株OnderstepoortおよびConvac、それにおよび野生型Snyder Hill株（１５）に対するアミノ酸相同性はそれぞれ８９．６％、９０．３％および９０．９％であった。一方、日本の新しいCDV Ueno、Yanaka、およびHamamatsu（２０）に対しては最大の相同性（９８．５％〜９８．７％）が見いだされ、他の地域から報告された新しいＣＤＶ、およびシベリアアザラシmorbillivirus PDV-2株に対する相同性はやや低かった（９３．１％〜９５．９％）。合計で８箇所の糖鎖結合部位が第１４９番〜第１５１番、第３０９番〜第３１１番、第３９１番〜第３９３番、第４２２番〜第４２４番、第４５６番〜第４５８番、第５８４番〜第５８６番、第５８７番〜第５８９番および第６０３番〜第６０５番の位置で認められた。
現在まで報告されている日本のすべてのＣＤＶに共有されている９つの糖鎖結合部位のうち（２０）、ＫＤＫ−１株においては第１９番〜第２１番の位置の糖鎖結合部位が欠損していたが、残りは、保存されていた。
【００３６】
９８−００２：  ＲＦＬＰ分析は口腔試料９８／００１および直腸試料９８−００２がほどんど同一であるかのように示したので、９８−００２をＨ遺伝子の配列決定のために利用した。その結果得られた塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１の第１番〜第１８２４番（塩基配列）に示した。
【００３７】
９８−００２のＨ遺伝子断片（配列表の配列番号１の第１番〜第１８２４番）のヌクレオチド長も１，８２４ｂｐであり、６０７個のアミノ酸をコードすることが可能な単一のＯＲＦが同定された。古いＣＤＶ株であるOnderstepoortとConvac、およびSnyder Hillに対するアミノ酸相同性は低かった（８９．２％〜９０．１％）。しかし、ＫＤＫ−１株等の他の日本のＣＤＶに対する相同性（９３．２％〜９３．４％）のみならず他の地理的地域からの新しいＣＤＶに対する相同性（９２．６％〜９３．９％）はＫＤＫ−１株の分析で見られたよりも低かった。他の日本のＣＤＶ（２０）とは異なり、合計で８箇所の糖鎖結合部位がＨ遺伝子アミノ酸配列中の第１９番〜第２１番、第１４９番〜第１５１番、第３０９番〜第３１１番、第３９１番〜第３９３番、第４２２番〜第４２４番、第４５６番〜第４５８番、第５８７番〜第５８９番、及び第６０３番〜第６０５番の位置で認められ、アミノ酸の置換は遺伝子全体にわたって分散していることがわかった。古いＣＤＶ等の他の地域からのＣＤＶによっては共有されていないが、ＫＤＫ−１株等のすべての日本のＣＤＶにより共有されている第５８４番〜第５８６番の位置の糖鎖結合部位は９８−００２にはなかった。
【００３８】
ＫＤＫ−１株および試料９８−００２の両方において、システイン残基は、アミノ酸配列中の第１３９番、第１５４番、第１８８番、第２８３番、第２９６番、第３７７番、第３８２番、第３９０番、第４９０番、第５６６番、第５７５番および第６０７番の１２箇所の位置で完全に保存され、これらの位置はデータベース中のすべてのＣＤＶのものと同一である。
尚、各株及び各試料間のＨ遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列の相同性（％）を下記表−３に示す。
【００３９】
【表３】
0004854104.tif 000004
【００４０】
【表４】
0004854104.tif 000005
【００４１】
（Ｈ遺伝子のアミノ酸配列の系統分類分析）
図４は、Ｈ遺伝子のアミノ酸アライメントに基づいた、試料９８−００２等の新旧のＣＤＶ間の推測された系統分類の関係を示す。
この系統樹はClustal Wバージョン１．７４（２２）およびPHYLIPバージョン３．５モジュール（２３）を用いて作った。ＣＤＶ株のＫＤＫ−１および９８−００２の配列が本研究で初めて明らかにされた。ワクチン株、Onderstepoort［AF014953、D00758］、Convac［Z35493］；アメリカの分離株、中国ヒョウ／A92-27／4［Z54156］、黒ヒョウ／A92-6［Z54166］、イヌ／US89［Z47762］、ヒョウ／US91［Z47763］、  アライグマ／US89［Z47765］、ペッカリー／US89［Z47765］；ヨーロッパの分離株、イヌ／DK91、B+C［Z477661］、ミンク／DK86［Z47759］、イヌ／404［Z77671］、イヌ／2544［Z77672］、イヌ／4513［77673］、フェレット／1493／Han89［X84999］、イヌ／5804／Han90［X85000］；アジアの分離株、シベリアアザラシ／PDV-2［X84998］；グリーンランドの分離株、イヌ／GR88［Z47760］；日本起源、イヌ／Ueno［D85753］、イヌ／Hamamatsu［D85754］、イヌ／Yanaka［D85755］、およびタヌキ／Tanu96［AB016776］の配列はデータベースから抜粋した。Snyder Hill株のデータは参考文献（１５）から挙げた。
【００４２】
図４をみると、Onderstepoort、ConvacおよびSnyder Hill株等の古いＣＤＶは独立したクレードを形成している一方で、新しいＣＤＶは古いＣＤＶとは独立した幾つかの分離されたクレードに分類された。ＫＤＫ−1株は、独立したクレードを作る日本の新しいＣＤＶ分離株の群に加わった。アメリカの分離株は１クレード中にあるように思え、以前に記載されたように（６、１５、１８）、ヨーロッパの分離株間には幾つかの系統が存在する。高いブートストラップ値を示すこの系統樹は、９８−００２が日本のクレードの祖先から分岐して、公知のいずれのＣＤＶクレードとも一致しないことを示している。
【００４３】
（９８−００２試料が得られたイヌの臨床的特徴）
ワクチン接種歴のない、下痢、発咳および抑鬱の臨床的病歴を有する二ヶ月齢の雄「シーズー」が千葉（日本）の獣医師に診断された。この雄イヌは１０日前にペットショップから購入し、購入後の二日後から水様性下痢を有した。発熱、鼻汁、扁桃炎、および過剰な唾液分泌も入院中に観察され、中枢神経系の徴候が最終日に現れた。この雄イヌはイヌジステンパーと臨床診断され、入院させたが、積極的な加療にもかかわらず改善を見ずに３日後に死んだ。検死は行われなかったが、口腔（９８／００１）スワブと直腸（９８−００２）スワブがウイルス検査のために提出された（表１）。イヌのパルボウイルス、ロタウイルス、コロナウイルスは直腸スワブ試料中に検出されず、さらにいかなるウイルスも口腔スワブ試料から回収されなかった。しかし、両試料においてＲＴ−ＰＣＲアッセイでＣＤＶＲＮＡ陽性と判定され、両試料はＲＦＬＰ分析によって確定的ではないが同一ウイルスを混入しているとみなされた（図２と図３）。
【００４４】
（直腸試料９８−００２からのＮタンパク質遺伝子の検出と配列）
推定された大きさの約４２０ｂｐが増幅され、ヌクレオチド配列が得られた。
その増幅された領域は４１９ｂｐからなり、Onderstepoort株の公知の配列に対する、プライマー領域以外の３７２ｂｐ長の相同性は９２．２％であった。
【００４５】
数種類の培養可能な株のみが試験管内実験に応用できただけであったためにＣＤＶ株間の比較研究を試みることは長い間困難であった。しかし、１９９０年代に、イヌならびに野生動物に由来するＣＤＶの特に遺伝子的な性質を記載した幾つかの論文が現れた（６、７、１２、１４、１５、１７〜２０、２３）。そうした研究では、通常ウイルスは細胞培養によって継代され、結果としてウイルス遺伝子の変化をもたらしうる。しかし、本研究ならびに他の研究において（７、１７、２５）、臨床試料についての分子的研究が直接的になされ、試料９８−００２により代表される新しいＣＤＶ遺伝子型が、本発明において予想もできずに発見された。実際、本発明者らは、スワブ抽出物からウイルスの分離を試みたが、成功しなかった（２４）。したがって、この直接的な方法は、特にウイルス分離のために新鮮且つ十分な試料が入手できない場合に、正確なＣＤＶの疫学および分子ウイルス学を解明するためにより適当であるように思われる。
【００４６】
現在の日本のＣＤＶ分離株は類似する１つのクレードに存在し（図４）、既に記載されているように（２０）、ヨーロッパおよびアメリカ起源の新旧のＣＤＶから明らかに離れている。ＣＤＶ株のＫＤＫ−１はこのクレードに対して最も近い関係を示し、９８．５％以上のアミノ酸の相同性を示して、それが同じ遺伝子型に属することを示している。他のＣＤＶ分離株、および９８／００１と９８−００２以外のすべての臨床試料から増幅されたＨ遺伝子は、ＲＦＬＰ分析によりＫＤＫ−１と同じ遺伝子型に属することもわかった。これらの結果は、日本において１９８０年代以来、イヌの間に広がっているほとんどのＣＤＶは本研究のＫＤＫ−１株と同じ遺伝子型に属するとした日本での最近の研究の発見（２５）を裏付けている。しかし、新しい９８−００２試料の異なるＨ遺伝子の性質を見いだしたことにより、日本国内においては、別の起源または遺伝子型のＣＤＶが存在することが明らかになった。
【００４７】
９８−００２試料におけるＨ遺伝子がＣＤＶ起源であるのかどうか、もしくはウイルスが抽出物から回収されず、電子顕微鏡によってもそれを抽出物中に見ることができなかったことからＣＤＶが我々のスワブ抽出物に実際に存在したのかどうかが疑問となるかもしれない。９８−００２配列に対する相同性に関してＦＡＳＴＡプログラムを用いてホモロジー検索を行った結果、類似性の高い順に上位２０個の配列はＣＤＶ起源であることがわかり、この９８−００２試料はＣＤＶ起源であることを強く示唆している。さらに、我々は、Ｎタンパク質遺伝子部分を表していることが示された４１９ｂｐ生成物を、直腸スワブ抽出物９８−００２から増幅することに成功した。このことはＨ遺伝子だけでなく、実際のＣＤＶウイルスが試料中に存在していた可能性がかなり高いことを示している。
【００４８】
組換えサブユニット（１０）、実験的ＤＮＡ（２９）、実験的および市販組換えベクター化ワクチン（２１、２７、３０）等の最近記載されたような新しいタイプのＣＤＶワクチンを作るためには、理論的には少なくともｃＤＮＡとクローニングされた９８−００２のＨ遺伝子で十分である。これらのワクチンはイヌジステンパーの予防のために必須な細胞性免疫を誘導することが期待される。
尚、本発明のＨ遺伝子、Ｈタンパク質及び該Ｈ遺伝子を有するＣＤＶのワクチンとしての有効性を検査するためには、例えば本発明のＨタンパク質に対する免疫を犬に付与（例えば、Ｈタンパク質を含むワクチンをイヌに非経口投与）し、その後、野外の強毒ＣＤＶにより強制感染実験（所謂、攻撃試験）を行うことが挙げられる。しかしながら、その強毒ＣＤＶを作成するin vivo系がいまだ開発されておらず、臨床的なイヌジステンパーを実験的に再現することが難しい。このことはよく知られている（１０、１８）。従って、現時点で、上記のような強制感染実験はこの分野ではできない。しかしながら、本発明の有効性が、上述のように顕著であることは明らかである。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、新規なイヌジステンパーウイルスのＨ遺伝子を提供でき、イヌ等の哺乳動物におけるジステンパーウイルス感染症の予防／治療／検査に有効な新規なＨ遺伝子、それがコードするＨタンパク質及びそれを含む新規なイヌジステンパーウイルスを提供できる。
【００５０】
【配列表】
0004854104.tif 000006
【００５１】
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0004854104.tif 000008
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【００５２】
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0004854104.tif 000013
0004854104.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲアッセイの概要を示す図である。
【図２】ＦｂａＩにより消化されたＣＤＶＨ遺伝子の制限酵素切断パターンを示す電気泳動の結果を示す図である。
【図３】ＮｄｅＩで消化されたＣＤＶＨ遺伝子の制限酵素切断パターンを示す電気泳動の結果を示す図である。
【図４】ＣＤＶＨタンパク質のコード領域のアミノ酸配列の系統分類分析した結果得られた系統樹を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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