(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性生理活性物質のマイクロカプセルの製造法において、
水溶性生理活性物質及び
L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-リジンおよびN-メチルグルカミンよりなる群から選ばれる塩基性物質を含む水溶液を内水相とし、
生体内分解性高分子重合物及び
脂溶性ビタミンを含む均一有機溶媒溶液を油相とする、
ｗ／ｏ型乳化物を形成させ、
ｗ／ｏ型乳化物を水相に分散させてｗ／ｏ／ｗ型乳化物を形成させ、
水中乾燥に付し有機溶媒を除去することを特徴とする、
脂溶性ビタミンの徐放性マイクロカプセル全量に対する最終含有率が３％ないし３０％(w/w)であり、塩基性物質の徐放性マイクロカプセル全量に対する最終含有率が１％ないし８％(w/w)である、徐放性マイクロカプセルの製造法。
【請求項２】
水溶性生理活性物質が、分子量２００から８０,０００のポリペプチドである請求項１記載の製造法。
【請求項３】
水溶性生理活性物質が、インテグリン拮抗物質である請求項１記載の製造法。
【請求項４】
インテグリン拮抗物質が、ＧＰIIb／IIIa 拮抗物質である請求項３記載の製造法。
【請求項５】
ＧＰIIb／IIIa 拮抗物質が、式(I)
【化１】
0004900984.tif 000012
〔式中、Ａ1及びＡ2はそれぞれプロトン受容基又はプロトン受容基に変換し得る基を、Ｄはヘテロ原子及び／又は５もしくは６員環を介していてもよい２ないし６の原子鎖のスペーサー（但し、５もしくは６員環は結合位置により２又は３原子鎖と換算する）を、Ｒ1は水素原子又は炭化水素基を、Ｒ2は水素原子又はα−アミノ酸から−ＣＨ(ＮＨ2)ＣＯＯＨを除いた残基を示すか、又はＲ1とＲ2は結合して５もしくは６員環を形成してもよく、Ｐはヘテロ原子及び／又は５もしくは６員環を介していてもよい１ないし１０の原子鎖のスペーサー（但し、５もしくは６員環は結合位置により２又は３原子鎖と換算する）を、Ｙはエステル化又はアミド化されていてもよいカルボキシル基を、ｎは０ないし８の整数を示す。〕で表される2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体またはその塩である請求項４記載の製造法。
【請求項６】
2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体が、(S)-4-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-3-[3-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-2-オキソピペラジン-1-酢酸である請求項５記載の製造法。
【請求項７】
2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体の塩が、(S)-4-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-3-[3-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-2-オキソピペラジン-1-酢酸塩酸塩である請求項５記載の製造法。
【請求項８】
2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体の塩が、(S)-4-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-3-[3-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-2-オキソピペラジン-1-酢酸２塩酸塩である請求項５記載の製造法。
【請求項９】
生体内分解性高分子重合物が、脂肪族ポリエステルである請求項１記載の製造法。
【請求項１０】
脂肪族ポリエステルが、乳酸・グリコール酸共重合物である請求項９記載の製造法。
【請求項１１】
脂溶性ビタミンが、α−トコフェロールである請求項１記載の製造法。
【請求項１２】
塩基性物質が、L-ヒスチジン、L-アルギニンまたはL-リジンである請求項１記載の製造法。
【請求項１３】
塩基性物質が、L-アルギニンである請求項１記載の製造法。
【請求項１４】
請求項１記載の製造法で製造される徐放性マイクロカプセル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、投与直後の生理活性物質の過剰量の初期放出が抑制され、投与直後から長期に亘って一定量の生理活性物質を安定的に放出する徐放性マイクロカプセルおよびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種の生理活性ポリペプチドや低分子水溶性薬物の徐放性マイクロカプセルについては多くの報告があるが［クリティカル リビュー イン セラピューティック ドラッグ キャリアー システム(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems), 12巻, 1-9頁(1995); 特表平2-503315号公報; EPA 0586238; ジャーナル オブ ファーマシューティカル サイエンス(J.Pharm.Sci.), 75巻, 750-755頁(1986); 特開昭57-118512号公報］、それらの多くが、(1)製造工程において薬物の外水相への漏出が大きく薬物の封入率が低い、(2)得られるカプセルは一般的に多孔質で初期放出が大きい、また、(3)製造工程により生理活性物質が変性し、十分な生物学的利用率が得られない、と云う欠点を有しており、満足すべき長期の徐放性を達成していないのが現状である。
マイクロスフィアの徐放性の改善について、特開昭61-63613号には、ポリ乳酸を基剤とするマイクロスフィアの投与一定時間経過後の活性成分の放出速度の低下を防止する目的で、活性成分を分散させるポリ乳酸の有機溶媒溶液中に、該溶媒に溶解しかつ生体内で消化される脂溶性の添加物（中鎖脂肪酸トリグリセリド、低級脂肪酸トリグリセリド等）を均一に溶解することが記載されている。しかしながら、他の基剤への応用や活性成分の水溶液を用いるマイクロカプセルの調製についての示唆はない。
特開平8-151321号公報には、無晶型水溶性生理活性物質と高分子重合物とを含み、Ｓ／Ｏ／Ｗ型乳化物から製造されるマイクロカプセルが開示されているが、薬物の水溶液を内水相として用いるマイクロカプセルの製造法や水溶性生理活性ペプチドの金属複合体を用いる方法については一切記載されていない。
また、ＥＰ ０７６５６６０号公報には、無晶型２−ピペラジノン−１−酢酸誘導体を含有するマイクロカプセルが記載されており、その製造において、Ｓ／Ｏ／Ｗ型乳化物が用いられている。しかし薬物水溶液を内水相として用いるマイクロカプセルの製造法や水溶性生理活性ペプチドの金属複合体を用いる方法についての記載はない。
一般に、水溶性生理活性物質のマイクロカプセルの製造においては、薬物含量の均質性や操作性の点で、薬物を固体状で用いる例えば、Ｓ／Ｏ型よりもＷ／Ｏ型の方が優れており、工業規模での大量生産においては、Ｗ／Ｏ型で用いることが望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
生体内分解性高分子重合物を用いた徐放性製剤は、生理活性物質の初期放出、特に投与１日以内の過剰量の放出が抑制され、しかも長期に亘って一定量の生理活性物質が安定的に放出されるのが好ましい。このような生理活性物質の生理活性を保持しながら、初期放出が少なく、かつ長期に亘る一定した徐放性を有する均質なマイクロカプセルを簡便に製造しうる製造法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究した結果、水溶性生理活性物質の徐放性マイクロカプセルの製造法において、該生体内分解性高分子重合物の有機溶媒溶液に、あらかじめ油脂類を約3％〜約30％添加した均一有機溶媒溶液を油相として用いることにより、投与直後の生理活性物質の過剰量の初期放出が抑制され、しかも長期に亘って一定した放出性を示す、非常に優れた徐放性マイクロカプセルを製造できることを見出した。これに基づいてさらに鋭意研究した結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は
（1）水溶性生理活性物質のマイクロカプセルの製造法において、水溶性生理活性物質を含む水溶液を内水相とし、生体内分解性高分子重合物及び油脂類を含む均一有機溶媒溶液を油相とするｗ／ｏ型乳化物を形成させ、有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性マイクロカプセルの製造法、
（2）ｗ／ｏ型乳化物を水相に分散させ、水中乾燥法により有機溶媒を除去する上記(1)記載の製造法、
（3）水溶性生理活性物質と塩基性物質とを含む水溶液を内水相とする上記(１)記載の製造法、
（4）水溶性生理活性物質が分子量約２００から約８０,０００のポリペプチドである上記(1)記載の製造法、
（5）水溶性生理活性物質がインテグリン拮抗物質である上記(1)記載の製造法、
【０００５】
（6）インテグリン拮抗物質がＧＰIIb／IIIa 拮抗物質である上記(5)記載の製造法、
（7）ＧＰIIb／IIIa 拮抗物質が、式(I)
【化２】
0004900984.tif 000002
〔式中、Ａ1及びＡ2はそれぞれプロトン受容基又はプロトン受容基に変換し得る基を、Ｄはヘテロ原子及び／又は５もしくは６員環を介していてもよい２ないし６の原子鎖のスペーサー（但し、５もしくは６員環は結合位置により２又は３原子鎖と換算する）を、Ｒ1は水素原子又は炭化水素基を、Ｒ2は水素原子又はα−アミノ酸から−ＣＨ(ＮＨ2)ＣＯＯＨを除いた残基を示すか、又はＲ1とＲ2は結合して５もしくは６員環を形成してもよく、Ｐはヘテロ原子及び／又は５もしくは６員環を介していてもよい１ないし１０の原子鎖のスペーサー（但し、５もしくは６員環は結合位置により２又は３原子鎖と換算する）を、Ｙはエステル化又はアミド化されていてもよいカルボキシル基を、ｎは０ないし８の整数を示す。〕で表される2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体またはその塩である上記(6)記載の製造法、
（8）2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体（I)が(S)-4-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-3-[3-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-2-オキソピペラジン-1-酢酸である上記(7)記載の製造法、
（9）2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体(I)の塩が(S)-4-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-3-[3-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-2-オキソピペラジン-1-酢酸  塩酸塩である上記(7)記載の製造法、
（10）2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体(I)の塩が(S)-4-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-3-[3-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-2-オキソピペラジン-1-酢酸  ２塩酸塩である上記(7)記載の製造法、
（11）生体内分解性高分子重合物が脂肪族ポリエステルである上記(1)記載の製造法、
（12）脂肪族ポリエステルが乳酸・グリコール酸共重合物である上記(11)記載の製造法、
（13）油脂類が脂溶性ビタミンである上記(1)記載の製造法、
（14）脂溶性ビタミンがα−トコフェロールである上記(13)記載の製造法、
【０００６】
（15）油脂類の徐放性マイクロカプセル全量に対する最終含有率が約３％ないし約３０％(w/w)である上記(1)記載の製造法、
（16）水溶性生理活性物質と塩基性物質とを含む水溶液を内水相とし、生体内分解性高分子重合物と油脂類とを含む均一有機溶媒溶液を油相とするＷ／Ｏ型乳化物を水相に分散させてＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させ、水中乾燥に付し有機溶媒を除去する上記(1)記載の製造法、
（17）塩基性物質が塩基性アミノ酸である上記(3)または(16)記載の製造法、
（18）塩基性アミノ酸がL-アルギニンである上記(17)記載の製造法、
（19）塩基性物質の徐放性マイクロカプセル全量に対する最終含有率が約１％ないし約８％(w/w)である上記(3)または(16)記載の製造法、
（20）水溶性生理活性ペプチドの金属複合体を、生体内分解性高分子重合物と油脂類とを含む均一有機溶媒溶液に分散させたＳ／Ｏ型分散液より有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性マイクロカプセルの製造法、
（21）Ｓ／Ｏ型分散液を水相に分散させてＳ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させ、水中乾燥法により有機溶媒を除去する上記(20)記載の製造法、
（22）水溶性生理活性ペプチドがヒト成長ホルモンである上記(20)記載の製造法、
（23）水溶性生理活性ペプチドの金属複合体がヒト成長ホルモンの亜鉛複合体である上記(20)記載の製造法、
（24）上記(1)記載の製造法で製造される徐放性マイクロカプセル、
（25）上記(20)記載の製造法で製造される徐放性マイクロカプセル、
（26）水溶性生理活性物質を含む水溶液を内水相とし、生体内分解性高分子重合物を含む有機溶媒溶液を油相とするｗ／ｏ型乳化物を形成させ、有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性マイクロカプセルの製造のための油脂類の使用、
（27）水溶性生理活性ペプチドの金属複合体の徐放性マイクロカプセルの製造のための油脂類の使用、などに関する。
【０００７】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基などに関して略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものとし、またアミノ酸に光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
本明細書中マイクロカプセルとは、生理活性物質と高分子重合物を含有する微粒子マイクロスフェア、マイクロパーティクル、ナノパーティクル、ナノスフェア、ナノカプセルの総称を意味する。
本明細書中Ｓ/Ｏ/Ｗ型乳化物およびＷ/Ｏ/Ｗ型乳化物とは、それぞれ固/油/水(水中油中固相)型乳化物および水/油/水(水中油中水相)型乳化物を意味する。
本発明に用いられる水溶性生理活性物質としては水溶性の薬物であれば特に限定されないが、生理活性ポリペプチドあるいは抗血小板剤（例えば、インテグリン拮抗物質）、抗腫瘍剤、抗生物質、解熱鎮痛消炎剤、鎮咳去痰剤、鎮静剤、筋弛緩剤、抗てんかん剤、抗潰瘍剤、抗鬱剤、抗アレルギー剤、強心剤、不整脈治療剤、血管拡張剤、降圧利尿剤、糖尿病治療剤、抗凝血剤、止血剤、抗結核剤、ホルモン剤、麻薬拮抗剤、骨吸収抑制剤、骨形成促進剤、血管新生抑制剤などとして用いられる化合物などが挙げられる。
【０００８】
該水溶性生理活性物質としては、２５℃において水に対する溶解度が０．１％（w/w）以上、好ましくは１％（w/w）以上であるものが具体的に挙げられる。
本発明の構成成分である生理活性ポリペプチドとしては、哺乳動物にとって有用な生理活性を有し、臨床上用いることができる種々のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。該「生理活性ポリペプチド」は、その分子量が、モノマーとして、例えば約２００ないし約２００,０００のものが用いられ、好ましくは約２００ないし約８０,０００のものが汎用される。好ましい生理活性ポリペプチドには、生化学の分野で高次構造を有すると云われるタンパク質に分類される高分子が含まれる。本発明で用いられる生理活性ポリペプチドの種類は、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、その活性の代表的なものとしては、例えば成長因子類、サイトカイン類、酵素類およびホルモン類などが挙げられる。より具体的には、例えば以下のペプチドないしタンパク質などが挙げられる。
【０００９】
（１）成長因子類としては、例えば神経成長因子(ＮＧＦ−１，ＮＧＦ−１など)、神経栄養因子(ＮＴＦ)、上皮細胞成長因子(ＥＧＦ)、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ)、インスリン様成長因子(ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２，ＩＧＦ−３など)、繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ)、骨形成原成長因子（ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−４など)、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＰ)、軟骨誘導因子などが挙げられる。
（２）サイトカイン類としては、例えばインターフェロン類(ＩＦＮ−α，−β，−γなど)、インターロイキン類（ＩＬ−１〜ＩＬ−１１など)、カケクチン、オンコスタチン、コロニー刺激因子類(Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦなど)、トロンボポエチン(ＴＰＯ)，エリスロポエチン(ＥＰＯ)などが挙げられる。
（３）酵素類としては、例えば組織プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔＰＡ)、ウロキナーゼ（ＵＫ）、ストレプトキナーゼ、プロテインＣ、メタロプロテアーゼ類、スーパーオキシド・ディスムターゼ（ＳＯＤ)、第ＶＩＩＩ及びＩＸ因子などが挙げられる。
（４）ホルモン類としては、例えば成長ホルモン（ＧＨ)、成長ホルモン放出因子(ＧＲＦ)、インスリン、グルカゴン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ)、卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、黄体形成ホルモン(ＬＨ)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)、カルシトニンなどが挙げられる。
該生理活性ポリペプチドの好ましい例としては、例えばホルモン類〔例えば、成長ホルモン類（ヒト成長ホルモン類など)、インスリン類（ヒトインスリン類など)など〕、サイトカイン類（例えば、インターフェロン類、インターロイキン類など)などが挙げられる。
【００１０】
本発明で用いられる生理活性ポリペプチドは、天然由来あるいは遺伝子組換えやペプチド合成技術によって人工的に得られた合成品、半合成品、遺伝子組換体〔例えば、遺伝子組換えヒト成長ホルモン（以下、rhＧＨと略称することがある）〕いずれでもよい。これらはその活性に影響のない限り糖鎖を有していてもよく、また糖鎖構造が本来の構造と異なっていてもよい。さらに、これらは任意の生理活性ポリペプチドまたは蛋白のムテイン、誘導体、類縁体および活性フラグメントなども含む。以下において「生理活性ポリペプチド」、「成長ホルモン類」、「インスリン類」、「インターフェロン類」、「インターロイキン類」は、それぞれこれら糖鎖を有しているもの、ムテイン、誘導体、類縁体および活性フラグメントを含む。さらに生理活性ポリペプチドが任意のポリペプチドのムテイン、誘導体、類縁体である場合、その作用機作は作動性あるい拮抗性のいずれでもよい。
また、本発明で用いられる生理活性ポリペプチドは、金属原子と複合体（コンプレックス）を形成していてもよい。ポリペプチドの金属複合体（金属コンプレックス）としては、ポリペプチドの水不溶性または水難溶性多価金属複合体や金属錯体などが挙げられる。かかる金属複合体を形成させる金属としては、生体に悪影響をおよぼさない金属であれば特に限定されないが、水溶性多価金属（２価、３価あるいは４価の金属、例えば鉄、銅、亜鉛等の遷移金属、アルミニウム等のIIIb族金属、錫等のIVb族金属など）が好ましい。また、ポリペプチドの金属複合体としては、生理活性ポリペプチドと水溶性多価金属塩(例えば、前記多価金属と塩酸、硫酸、硝酸、チオシアン酸等の無機酸との塩あるいは前記多価金属と脂肪族カルボン酸（例えば、脂肪族モノ、ジ、トリカルボン酸、好ましくは、炭素数２ないし９の脂肪族カルボン酸など）、芳香族酸（例えば、安息香酸、サリチル酸など）などの有機酸との塩）の接触により得られる生理活性ポリペプチド金属塩が好ましい。該生理活性ペプチド金属塩は、生理活性ポリペプチドと水溶性多価金属塩とを両者の溶解性を極端に下げない範囲で選択されたｐＨに調製された水溶液中で混合することにより生成され得る。この際、生理活性ポリペプチドと水溶性多価金属塩との量比(モル比)は、例えば１：１〜１：１０００、好ましくは１：１〜１：１００、より好ましくは１：１〜１：５０であり、両者の濃度はそれぞれ単独の溶解度範囲内でかつ生成する複合体の溶解度以上である事が望まれる。また水溶液は、必要に応じて弱酸性、中性あるいは弱酸性に調製される。
生理活性ポリペプチドが分子内に酸性基（例、カルボキシル基、スルホ基など）を有する場合、マイクロカプセルへの取り込み率の向上、及び放出性のコントロールの目的で、多価金属との水不溶性または水難溶性複合体とすることは有効である。
【００１１】
抗血小板剤としてはインテグリン拮抗物質、さらにはＧＰIIb／IIIa 拮抗物質が挙げられる。ＧＰIIb／IIIa 拮抗物質としては例えば、蛇毒ペプチド（例、バルブリン（barbourin）、あるいはＡrg−Ｇly−Ａsp 配列を有するペプチド、例えばＡrg−Ｇly−Ａsp−Ｓer、（Ａrg−Ｇly−Ａsp−Ｓer）テトラマー、Ｇly−Ａrg−Ｇly−Ａsp−Ｓer−Ｐro、シクロ−Ｓ,Ｓ−〔Ａc−Ｃys(Ｎα−メチル)Ａrg−Ｇly−Ｄ−Ａsn−ペニシラミン〕−ＮＨ2（ＳＫ＆Ｆ−１０６７６０：ファーマシューティカル リサーチ（Pharm. Res.)，11巻，1358-1390頁 1994年)、さらにＧＰIIb／IIIa 拮抗作用と同様の活性を有する化合物、例えば(Ｓ)−４−〔(４−アミジノベンゾイル)グリシル〕−３−メトキシ−カルボニルメチル−２−オキソピペラジン−１−酢酸、４−(４−アミジノベンゾイルグリシル)−２−オキソピペラジン−１，３−２酢酸・塩酸塩、Ｌ−Ｔyr−Ｎ−(ブチルスルホニル)−Ｏ−〔４−(４−ピペリジニル)ブチル〕モノハイドロクロライド（Ｌ−７００４６２／ＭＫ−３８３：サーキュレーション（Circulation) 88巻，1512-1517頁，1993年)、エチル ３Ｓ−〔４−〔〔４−(アミノイミノメチル)フェニル〕アミノ〕−１，４−ジオキソブチル〕アミノ−４−ペンチノエート 塩酸塩（ＳＣ−５４６８４Ａ：Circulation，91巻，403-410頁，1995年)、〔１−〔Ｎ−(ｐ−アミジノフェニル)−Ｌ−Ｔyr〕−４−ピペリジニル〕酢酸（Ｒo−４４−９８８３：Thromb. Haemostas.，70巻，817-821頁，1993年)、サイクリック〔Ｄ−２−アミノブチリル−Ｎ−２−メチル−Ｌ−Ａrg−Ｇly−Ｌ−Ａsp−３−アミノメチル−安息香酸〕メタンスルフォン酸塩（ＤＭＰ７２８：Circulation，89巻，3-12頁，1994年）、式
【化３】
0004900984.tif 000003
で表される(3S-trans)-5-[[[4'-(アミノイミノメチル)-[1,1'-ビフェニル]-4-イル]オキシ]メチル]-2-オキソ-ピロリジン-3-酢酸 (Fradafiban; BIBU 52: Circulation, 96, 1130-1138, 1997)、2(S)-[(p-トルエンスルホニル)アミノ]-3-[[[5,6,7,8-テトラヒドロ-4-オキソ-5-[2-(ピペリジン-4-イル)エチル]-4H-ピラゾロ[1,5-a][1,4]ジアゼピン-2-イル]カルボニル]アミノ]プロピオン酸 (L-738,167: The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 281, 677-689, 1997)、式
【化４】
0004900984.tif 000004
で表されるイントリフィバン（Intrifiban）[インテグリン（Integrelin）] (Circulation, 94, 2083-2089, 1996)、式
【化５】
0004900984.tif 000005
で表されるＦＫ−６３３(特開平５−１４８２０７)、などが挙げられる。
またＧＰIIb／IIIa 拮抗物質としては例えば、前記式(Ｉ)で表される２-ピペラジノン-1-酢酸誘導体（I）またはその塩が挙げられる。前記式(Ｉ)で表される２-ピペラジノン-1-酢酸誘導体（I）としては、例えば、ＷＯ９６／３３９８２に記載された化合物などが挙げられるが、なかでも、Ａ1及びＡ2がそれぞれ（１）置換基としてＣ2-8アルコキシカルボニルオキシ基またはＣ2-8アルコキシカルボニル基をそれぞれ有していてもよいアミジノ基またはグアニジノ基、（２）オキソ基またはハロゲン化されていてもよいＣ1-4アルキル基で置換されていてもよいオキサジアゾリル基を有していてもよいアミノ基、または（３）オキソ基またはハロゲン化されていてもよいＣ1-4アルキル基で置換されていてもよいオキサジアゾリル基［好ましくは、（１）メトキシカルボニルオキシをそれぞれ有していてもよいアミジノ基またはグアニジノ基または（２）置換基として５−オキソ−１,２,４−オキサジアゾール−３−イルまたは５−トリフルオロメチル−１,２,４−オキサジアゾール−３−イルを有していてもよいアミノ基］であり、Ｄが式
【化６】
0004900984.tif 000006
〔式中、ａは０〜２の整数を示す〕で表される基［好ましくは、フェニレン基］であり、Ｒ1が水素原子であり、Ｒ2が水素原子又はＣ1-4アルコキシ基で置換されていてもよいフェニル基を有していてもよいＣ1-4アルキル基［好ましくは、水素原子又はｐ−メトキシベンジル基］であり、Ｐが式−Ｚ−Ｂ−〔式中、Ｚは結合手、−ＮＨ−または−ＮＨ−ＣＯ−を示し、Ｂは式
【化７】
0004900984.tif 000007
（式中、ｂは０〜１の整数を示し、ｃは１〜５の整数を示す）で表される基を示す〕で表される基［好ましくは、式
【化８】
0004900984.tif 000008
で表される基］であり、Ｙが式−ＣＯ−Ｒ7〔式中、Ｒ7は（１）ヒドロキシ基、（２）置換基としてＣ1-4アルコキシ−カルボニル基または５−メチル−２−オキソ−１,３−ジオキソレン−４−イル基をそれぞれ有していてもよいＣ1-8アルコキシ基またはＣ2-12アルケニリルオキシ基、または（３）式−ＯＣＨ(Ｒ7a)ＯＣＯＲ8（式中、Ｒ7aは水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、Ｒ8はＣ1-6アルキル基またはＣ5-7シクロアルキルオキシ基を示す）で表される基を示す〕で表される基［好ましくは、カルボキシル基］であり、ｎが１〜４の整数［好ましくは、２〜３の整数］である2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体が好ましく、さらに２-ピペラジノン-1-酢酸誘導体としては（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸や（Ｓ)-４-(４-アミジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-アミジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸、あるいはその塩酸塩や酢酸塩などが挙げられる。なかでも、（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸の塩酸塩、とりわけ、（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸モノ塩酸塩または（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸ジ塩酸塩が好ましく用いられ、（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸ジ塩酸塩は、（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸モノ塩酸塩を含有する溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを約１〜２（好ましくは約１．５）に調整することにより製造することができる。また、得られた（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸ジ塩酸塩は、エタノールなどを用いて結晶化することもできる。
【００１２】
前記抗腫瘍剤としては、ブレオマイシン，メソトレキセート，アクチノマイシンＤ，マイトマイシンＣ，硫酸ビンブラスチン，硫酸ビンクリスチン，ダウノルビシン，アドリアマイシン，ネオカルチノスタチン，シトシンアラビノシド，フルオロウラシル，テトラヒドロフリル−５−フルオロウラシル，クレスチン，ピシバニール，レンチナン，レバミゾール，ベスタチン，グリチルリチン，ポリＩＣ，ポリＡＵ，ポリＩＣＬＣなどのポリ核酸類［免疫応答（山村雄一、森沢成司編；1977年発行）１４３頁］などが挙げられる。
上記抗生物質としては、例えばゲンタマイシン，ジベカシン，カネンドマイシン，リビドマイシン，トブラマイシン，アミカシン，フラジオマイシン，シソマイシン，塩酸テトラサイクリン，塩酸オキシテトラサイクリン，ロリテトラサイクリン，塩酸ドキシサイクリン，アンピシリン，ピペラシリン，チカルシリン，セファロチン，セファロリジン，セフォチアム，セフスロジン，セフメノキシム，セフメタゾール，セファゾリン，セフォタキシム，セフォペラゾン，セフチゾキシム，モキサラクタム，チエナマイシン，スルファゼシン，アズスレオナムなどが挙げられる。
【００１３】
前記の解熱，鎮痛，消炎剤としては、サリチル酸，スルピリン，フルフェナム酸，ジクロフェナック，インドメタシン，モルヒネ，塩酸ペチジン，酒石酸レボルファノール，オキシモルフォンなどが挙げられる。
鎮咳去痰剤としては、塩酸エフェドリン，塩酸メチルエフェドリン，塩酸ノスカピン，リン酸コデイン，リン酸ジヒドロコデイン，塩酸アロクラマイド，塩酸クロフェダノール，塩酸ピコペリダミン，クロペラスチン，塩酸プロトキロール，塩酸イソプロテレノール，硫酸サルブタモール，硫酸テルブタリンなどが挙げられる。
鎮静剤としては、クロルプロマジン，プロクロルペラジン，トリフロペラジン，硫酸アトロピン，臭化メチルスコポラミンなどが挙げられる。
筋弛緩剤としては、メタンスルホン酸プリジノール，塩化ツボクラリン，臭化パンクロニウムなどが挙げられる。
抗てんかん剤としては、フェニトイン，エトサクシミド，アセタゾラミドナトリウム，クロルジアゼポキシドなどが挙げられる。
抗潰瘍剤としては、メトクロプロミド，塩酸ヒスチジンなどが挙げられる。
抗うつ剤としては、イミプラミン，クロミプラミン，ノキシプチリン，硫酸フェネルジンなどが挙げられる。
抗アレルギー剤としては、塩酸ジフェンヒドラミン，マレイン酸クロルフェニラミン，塩酸トリペレナミン，塩酸クレミゾール，塩酸ジフェニルピラリン，塩酸メトキシフェナミンなどが挙げられる。
【００１４】
強心剤としては、トランスパイオキソカンファー，テオフィロール，アミノフィリン，塩酸エチレフリンなどが挙げられる。
不整脈治療剤としては、プロプラノール，アルプレノロール，ブフェトロール，オキシプレノロールなどが挙げられる。
血管拡張剤としては、塩酸オキシフェドリン，ジルチアゼム，塩酸トラゾリン，ヘキソベンジン，硫酸バメタンなどが挙げられる。
降圧利尿剤としては、ヘキサメトニウムブロミド，ペントリニウム，塩酸メカミルアミン，塩酸エカラジン，クロニジンなどが挙げられる。
糖尿病治療剤としては、グリミジンナトリウム，グリピザイド，塩酸フェンフォルミン，塩酸ブフォルミン，メトフォルミンなどが挙げられる。
抗凝血剤としては、ヘパリンナトリウム，クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
止血剤としては、トロンボプラスチン，トロンビン，メナジオン亜硫酸水素ナトリウム，アセトメナフトン，ε−アミノカプロン酸，トラネキサム酸，カルバゾクロムスルホン酸ナトリウム，アドレノクロムモノアミノグアニジンメタンスルホン酸塩などが挙げられる。
抗結核剤としては、イソニアジド，エタンブトール，パラアミノサリチル酸などが挙げられる。
ホルモン剤としては、プレドニゾロン，リン酸ナトリウムプレドニゾロン，デキサメタゾン硫酸ナトリウム，ベタメタゾンリン酸ナトリウム，リン酸ヘキセストロール，酢酸ヘキセストロール，メチマゾールなどが挙げられる。
【００１５】
麻薬拮抗剤としては、酒石酸レバロルファン，塩酸ナロルフィン，塩酸ナロキソンなどが挙げられる。
骨吸収抑制剤としては、（硫黄含有アルキル）アミノメチレンビスフォスフォン酸などが挙げられる。
骨形成促進剤としては、ビタミンＫ2や副甲状腺ホルモン、あるいは式（II)
【化９】
0004900984.tif 000009
〔式中、環Ａは置換されていてもよいベンゼン環を、Ｒは水素原子または置換されていてもよい炭化水素基を、Ｂはエステル化またはアミド化されていてもよいカルボキシル基を、Ｘは−ＣＨ(ＯＨ)−または−ＣＯ−を、ｋは０または１を、k'は０、１または２を示す〕で表される化合物またはその塩などが挙げられる（特開平３−２３２８８０号、特開平４−３６４１７９号公報）。
【００１６】
血管新生抑制剤としては、血管新生抑制ステロイド［サイエンス(Science), 221巻, 719頁(1983)］、フマギリン［ヨーロッパ特許公開第325199号公報］、フマギロール誘導体［ヨーロッパ特許公開第357061号、同第359036号、同第386667号、同第415294号公報］などが挙げられる。
生理活性物質はそれ自身（遊離体）であっても、薬理学的に許容される塩（例えば、生理活性物質がアミノ基などの塩基性基を有する場合、無機酸、例えば塩酸、硫酸、硝酸、あるいは有機酸、例えば炭酸、コハク酸などとの塩、生理活性物質がカルボキシル基などの酸性基を有する場合、無機塩基、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、あるいは有機塩基化合物、例えばトリエチルアミンなどの有機アミン類、アルギニンなどの塩基性アミノ酸類との塩）であってもよい。生理活性物質の遊離体が水溶性でない場合、水溶性の塩に変換して用いてもよい。
徐放性マイクロカプセルにおいて、生理活性物質の配合量はその種類、所望の薬理効果あるいは効果の持続時間などによって異なるが、例えばマイクロカプセルに対して好ましくは約０.０１％〜約５０％(W/W)が用いられる。さらに好ましくは約０.１％〜約３０％(W/W)が用いられる。
【００１７】
本発明で用いる生体内分解性高分子重合物の具体例としては、ポリ脂肪酸エステル（例、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ乳酸カプロラクトンなど）、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリアルキレンオキサレート（例、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレートなど)、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、あるいはその他のポリカーボネート（例、ポリエチレンカーボネート、ポリエチレンプロピレンカーボネートなど)、ポリアミノ酸（例、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸など)、ヒアルロン酸エステルなどが挙げられる。
これらの高分子重合物は１種（単独重合物）でもよく、また２種以上の共重合物、あるいは単なる混合物でもよく、またそれらの塩でもよい。
【００１８】
これらの生体内分解性高分子重合物の生体内分解性は、例えば高分子重合物を注射剤として投与した場合、高分子重合物から分解生成した水溶性低分子量断片の高分子重合物投与総量に対する割合（w/w％）で定義され、一般に、皮下又は筋肉内投与後の３カ月間で１０％以上、好ましくは、皮下又は筋肉内投与後の１年間で８０％以上である。該生体内分解性高分子重合物は好ましくは脂肪族ポリエステル（脂肪酸ポリエステル）である。該生体内分解性高分子重合物の好ましい具体例としては、脂肪族ポリエステルが挙げられ、とりわけヒドロキシカルボン酸の単独重合物または共重合物あるいはそれらの混合物などが挙げられる。
該ヒドロキシカルボン酸としては特に限定されないが、一般式
【化１０】
0004900984.tif 000010
[式中、Ｒは水素又はアルキル基を示す。]で表わされるヒドロキシカルボン酸が好ましい具体例として挙げられる。
上記式中、Ｒで示されるアルキル基としては、例えば炭素数１から８の直鎖あるいは分枝状のアルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第３級ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等）が好ましい。これらの中で、炭素数１〜３の直鎖あるいは分枝状のアルキル基が特に好ましい。
【００１９】
上記ヒドロキシカルボン酸の好ましい具体例としては、例えばグリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸（例、２-ヒドロキシ酪酸）、２'-ヒドロキシ吉草酸、２-ヒドロキシ-３-メチル酪酸、２-ヒドロキシカプロン酸、２-ヒドロキシイソカプロン酸、２-ヒドロキシカプリル酸などが挙げられる。このうち特に、グリコール酸、乳酸、２-ヒドロキシ酪酸、２-ヒドロキシ-３-メチル酪酸、２-ヒドロキシカプロン酸が好ましい。さらに、グリコール酸、乳酸、２-ヒドロキシ酪酸が特に好ましい。これらのヒドロキシカルボン酸において、Ｄ−体、Ｌ−体及びＤ,Ｌ−体が存在するものは、そのいずれを用いてもよいが、Ｄ,Ｌ−体が好ましい。
該共重合物の共重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトの何れでもよい。これらのグリコール酸共重合物においては、生体内での分解が比較的速やかで単独で用いた場合の放出期間が１ケ月以内のものが好ましい。特に、乳酸・グリコール酸単独重合物または共重合物（以下、どちらか一方の酸の単独重合物及び相方の共重合物を含めて、単に、乳酸・グリコール酸重合物と称する。また、ＰＬＧＡと略記することがある）又はヒドロキシ酪酸・グリコール酸重合物（以下、どちらか一方の酸の単独重合物及び相方の共重合物を含め単にヒドロキシ酪酸・グリコール酸共重合物と称す）が好ましい。
本発明に使用される生体内分解性高分子重合物は、一般的な合成法（例えば、特開昭６１−２８５２１号公報参照）で問題なく合成できる。
【００２０】
本発明に使用されるこれらの生体内分解性高分子重合物の重量平均分子量は、約２,０００ないし約８００,０００のものが好ましく、より好ましくは約５,０００ないし約２００,０００の範囲から選定される。
上記高分子重合物として乳酸・グリコール酸共重合物を用いる場合、乳酸／グリコール酸のモル比は、好ましくは約１００／０ないし約２５／７５、より好ましくは約１００／０ないし約５０／５０である。乳酸・グリコール酸共重合物の重量平均分子量は、好ましくは約５,０００ないし約３０,０００、より好ましくは約５,０００から約２０,０００である。
上記の高分子重合物としてヒドロキシ酪酸・グリコール酸共重合物（例、２−ヒドロキシ酪酸・グリコール酸共重合物）を用いる場合、ヒドロキシ酪酸／グリコール酸のモル比は好ましくは１００／０ないし約２５／７５、より好ましくは約１００／０ないし約５０／５０である。特に、２−ヒドロキシ酪酸／グリコール酸のモル比は好ましくは約６０／４０ないし約３０／７０である。ヒドロキシ酪酸・グリコール酸共重合物の重量平均分子量は好ましくは約５,０００ないし約２５,０００、より好ましくは約５,０００から約２０,０００である。
上記高分子重合物として酪酸・グリコール酸共重合物を用いる場合、酪酸／グリコール酸のモル比は好ましくは約１００／０ないし約２５／７５である。
上記高分子重合物として例えばポリ乳酸（Ａ）とグリコール酸・２−ヒドロキシ酪酸共重合物（Ｂ）との混合物を用いる場合、(Ａ)/(Ｂ)で表わされる混合比が約１０／９０から約９０／１０（重量比）の範囲で使用される。好ましくは約２５／７５から約７５／２５（重量比）の範囲である。
ポリ乳酸の重量平均分子量は約５,０００から約３０,０００のものが好ましい。さらに約６,０００から約２０,０００のものが特に好ましい。
【００２１】
なお、本明細書における重量平均分子量とは、ポリスチレンを基準物質とするゲルパーミェーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した高分子重合物のポリスチレン重量換算の平均分子量をいう。
さらに具体的には、重量平均分子量が１２０,０００、５２,０００、２２,０００、９,２００、５,０５０、２,９５０、１,０５５、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質とし、ＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ×２（昭和電工製）、ＲIモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用、移動相としてクロロホルムを用いたＧＰＣで測定したポリスチレン換算の分子量をいう。
該高分子重合物の多分散性は重量平均分子量／数平均分子量として定義され、一般に１ないし３.５、好ましくは１.５ないし２.５である。
これら生体内分解性高分子重合物の使用量は、生理活性物質の薬理活性の強さと、該物質の放出の速度及び期間などによって決まり、例えば生理活性物質に対して約０.２ないし約１００００倍（重量比）、好ましくは約１ないし約１０００倍（重量比）の量をマイクロカプセル基剤として用いるのがよい。
油相中の生体内分解性高分子重合物の濃度は、約０.５ないし約９０％（W/W）、さらに好ましくは約２ないし約６０％（W/W）から選ばれる。
【００２２】
上記生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に添加する油脂類としては、該有機溶媒液中において相分離を起こすことなく溶解し、かつ生体内で分解・吸収されるものであればいずれでもよいが、脂肪酸またはその塩、グリセリン脂肪酸エステルおよびプロピレングリコール脂肪酸エステルを除く油脂類が好ましく、例えば脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫなど）、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ミグリオールなどの炭素数８〜１２の脂肪酸のトリグリセロール）、コレステロール、リン脂質類などが挙げられる。
上記生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に添加する油脂類としては、脂溶性ビタミン、コレステロール、リン脂質類などが好ましく用いられ、なかでも、脂溶性ビタミンが好ましく、とりわけ、α−トコフェロール（ビタミンＥ）または酢酸トコフェロール（ビタミンＥ酢酸塩）などが好ましく用いられる。
生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液中に添加する油脂類は、徐放性マイクロカプセル全量に対する油脂類の最終含有率が約１％〜約５０％(W/W)、さらに好ましくは約３％〜約３０％(W/W)となる量が用いられる。
また本発明において、Ｗ/Ｏ法あるいはＷ/Ｏ/Ｗ法により徐放性マイクロカプセルを製造する場合、生理活性物質を含有する水相にさらに塩基性物質を添加してもよく、生理活性物質が酸性の薬物あるいは薬物の酸性塩（塩酸塩など）（例えば水相の pＨが６以下となる）の場合に添加することが望ましい。塩基性物質としては例えば、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-リジンなどの塩基性アミノ酸や N-メチルグルカミンなどが挙げられる。
生理活性物質の水溶液中に添加する塩基性物質は、徐放性マイクロカプセル全量に対する塩基性物質の最終含有率が約０.１％〜約２０％(W/W)、さらに好ましくは約１％〜約８％(W/W)となる量が用いられる。
【００２３】
本発明製造法においては、有機溶媒の除去に水中乾燥法を適用する場合、外水相に浸透圧調節剤を含有させることが好ましい。該浸透圧調節剤としては、水溶液とした場合、浸透圧を示すものであればいかなる物質であってもよい。
該浸透圧調節剤の具体例としては、例えば水溶性の多価アルコール類、水溶性の一価アルコール類、水溶性の無機物（例、無機塩)、水溶性の単糖類、二糖類、オリゴ糖及び多糖類あるいはそれらの誘導体、水溶性の有機酸又はその塩、水溶性のアミノ酸、水溶性のペプチド、タンパク質あるいはそれらの誘導体などが挙げられる。これらのうち水溶性の多価アルコール類、水溶性の無機物、水溶性の単糖類、二糖類、オリゴ糖及び多糖類あるいはそれらの誘導体、水溶性の有機酸又はその塩が好ましい。さらに、塩類、水溶性の多価アルコール類及び水溶性の無機物が特に好ましい。
上記水溶性の無機塩としては、例えば塩化カリウム、塩化ナトリウム、臭化カリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム等のハロゲン化アルカリ金属、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等のハロゲン化アルカリ土類金属、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム等のアルカリ金属硫酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム等のアルカリ土類金属硫酸塩、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム等のアルカリ金属リン酸塩類などが挙げられる。このうち、塩化ナトリウムが好ましい。
【００２４】
上記水溶性の多価アルコール類としては、例えばグリセリン等の二価アルコール類、アラビトール、キシリトール、アドニトール等の五価アルコール類、マンニトール、ソルビトール等の六価アルコール類などが挙げられる。これらのうち六価のアルコール類が好ましい。
上記水溶性の一価アルコール類としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられる。これらのうちエタノールが好ましい。
上記水溶性の単糖類としては、例えばアラビノース、キシロース、リボース、２−デオキシリボース等の五炭糖類、ブドウ糖、果糖、ガラクトース、マンノース、ソルボース、ラムノース、フコース等の六炭糖類が挙げられる。これらのうち六炭糖類が好ましい。
上記水溶性の二糖類としては、例えば麦芽糖、セロビオース、α−トレハロース、乳糖、ショ糖などが挙げられる。これらのうち乳糖及びショ糖が好ましい。
【００２５】
上記水溶性のオリゴ糖としては、例えばマルトトリオース、ラフィノース等の三糖類、スタキオース等の四糖類などが挙げられる。これらのうち三糖類が好ましい。
上記水溶性の多糖類としては、例えばセルロース、デンプン、グリコーゲン等のグルカン類、ペクチン酸等のガラクツロナン類、アルギン酸等のマンヌロナン類、イヌリン、レバン等のフルクタン類、キチン等のＮ−アセチルグリコサミン重合体類、イネワラのキシラン等のキシラン類、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等のジヘテログルカン類などが挙げられる。これらのうちグルカン類、ジヘテログルカン類が好ましい。
上記水溶性の単糖類、二糖類、オリゴ糖及び多糖類の誘導体としては、例えばグルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、ガラクツロン酸などが挙げられる。
【００２６】
上記水溶性の有機酸又はその塩としては、例えばクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、これらのアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等）などが挙げられる。
上記水溶性のアミノ酸としては、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、システイン、メチオニン等の中性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等が挙げられる。またこれらの水溶性アミノ酸の酸（例、塩酸、硫酸、リン酸等）又はアルカリ（例、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等）との塩を用いてもよい。
水溶性のペプチド、タンパク質あるいはそれらの誘導体としては、例えばカゼイン、グロブリン、プロラミン、アルブミン、ゼラチン、プロタミン、ヒストンなどが挙げられる。
【００２７】
浸透圧調節剤は単独で使用しても、１種以上を混合して使用してもよい。これらの浸透圧調節剤の外水相中での濃度は、浸透圧調節剤が非イオン性物質の場合、約０.００１ないし約６０％(W/W)で、好ましくは約０.０１ないし約４０％(W/W)、より好ましくは約０.０５ないし約３０％(W/W)である。また、浸透圧調節剤がイオン性物質の場合、上記の濃度を全体のイオン価で除した濃度が用いられる。浸透圧調節剤の添加濃度は、その溶解度以下である必要はなく、一部が有機溶媒中で分散状態であってもよい。
以下に、本発明の製造法の各工程について詳述する。
水溶性生理活性物質の水溶液を水相として用いるマイクロカプセルの製造法においては、まず、水溶性生理活性物質（以下、薬物と略することもある）を水に溶解し、これに必要であれば前記の塩基性アミノ酸などの塩基性物質、さらに薬物保持物質（例えば、ゼラチン、寒天、ポリビニールアルコールなど）を加えて溶解し、水相（内水相）を調製する。
内水相における薬物の濃度は、好ましくは約０．１ないし約１５０％（W/V）である。さらに好ましくは約２０ないし約１３０％（W/V）である。特に好ましくは約６０ないし約１２０％（W/V）である。
該水相には、薬物の安定性、溶解性を保つためのｐＨ調整剤として、炭酸、酢酸、シュウ酸、クエン酸、リン酸、塩酸等、水酸化ナトリウム、アルギニン、リジンおよびそれらの塩などを添加してもよい。また、さらに薬物の安定化剤として、アルブミン、ゼラチン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、デキストリン、亜硫酸水素ナトリウム、ポリエチレングリコール等のポリオール化合物などを、あるいは保存剤として、一般に用いられるパラオキシ安息香酸エステル類（メチルパラベン、プロピルパラベンなど)、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チメロサールなどを添加してもよい。
【００２８】
このようにして得られた水相を、生体内分解性高分子重合物（以下、ポリマーと略することもある）および油脂類を含む均一な有機溶媒溶液（油相）中に加え、ついで乳化操作を行い、Ｗ／Ｏ型乳化物を製造する。該乳化操作は、公知の分散法、例えば断続振とう法、プロペラ型撹拌機あるいはタービン型撹拌機などのミキサーによる方法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等により行われる。
上記したポリマー溶液（油相）は、ポリマーを水と実質的に混和しない有機溶媒に溶解したものが用いられる。該有機溶媒の水に対する溶解度は、好ましくは、常温（２０℃）で３％（W/W）以下である。また有機溶媒の沸点は１２０℃以下であることが好ましい。有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン，クロロホルム，クロロエタン，トリクロロエタン，四塩化炭素など）、炭素数３以上のアルキルエーテル類（例、イソプロピルエーテルなど）、脂肪酸のアルキル（炭素数４以上）エステル（例、酢酸ブチルなど）、芳香族炭化水素（例、ベンゼン，トルエン，キシレンなど）等が挙げられる。これらは２種以上適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒は、さらに好ましくはハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン，クロロホルム，クロロエタン，トリクロロエタン，四塩化炭素など）である。有機溶媒は、特に好ましくはジクロロメタンである。
【００２９】
ついで、このようにして製造されたＷ／Ｏ型乳化物から有機溶媒を常法に従い除去する。溶媒の除去方法としては、例えば噴霧乾燥法や水中乾燥法などが挙げられるが水中乾燥法が好ましく用いられる。噴霧乾燥法は、得られたＷ／Ｏ型乳化物をノズル等を用いてスプレードライヤ（噴霧乾燥器）の乾燥室内に噴霧し、極めて短期間内に微粒化液滴内の溶媒を揮発させる方法であり、該ノズルとしては例えば、二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。該水中乾燥法は、Ｗ／Ｏ型乳化物を水相（外水相）中に加え、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させた後、油相中の溶媒を除去することにより行われる。
外水相の体積は、一般的には油相体積の約１ないし約１０,０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２ないし約５,０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５ないし約２,０００倍から選ばれる。
上記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般に安定なＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成できるものであればいずれでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤（オレイン酸ナトリウム，ステアリン酸ナトリウム，ラウリル硫酸ナトリウムなど）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル〔ツイーン（Tween）８０，ツイーン（Tween）６０，アトラスパウダー社〕，ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体〔HCO-60，HCO-50，日光ケミカルズ〕など），ポリビニルピロリドン，ポリビニルアルコール，カルボキシメチルセルロース，レシチン，ゼラチン，ヒアルロン酸などが挙げられる。乳化剤は、好ましくはポリビニルアルコールである。これら乳化剤の中の１種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は、約０.００１から約２０％（W/W）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０.０１から約１０％（W/W）の範囲で用いられる。特に好ましくは約０.０５から約５％（W/W）の範囲で用いられる。
また、外水相中に前記した浸透圧調節剤を加えてもよい。
【００３０】
本発明の製造法において、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させる際にＷ／Ｏ型乳化物の粘度を約１５０センチポアズ(ｃｐ)ないし約１０,０００ｃｐに調整することが好ましい。粘度を調整する方法としては、例えば（１）油相の生体内分解性高分子重合物の濃度を調整する、（２）水相と油相との量比を調整する、（３）Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する、（４）外水相の温度を調整する、（５）Ｗ／Ｏ型乳化物を外水相に注入する際に、例えばラインヒーター、クーラーなどでＷ／Ｏ型乳化物の温度を調整するなどの方法が挙げられ、これらの方法は単独でも、組み合わせて使用してもよい。
上記方法においては、要は、Ｗ／Ｏ型乳化物がＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物になる時のＷ／Ｏ型乳化物の粘度が約１５０ｃｐないし約１０,０００ｃｐになるようにしさえすればよい。
上記（１）において、油相の生体内分解性ポリマーの濃度を調整する場合の濃度は、生体内分解性ポリマーの種類、有機溶媒の種類等で変化するので一義的に決定されるものではないが、好ましくは約１０ないし約８０％（W/W）である。上記（２）において、水相と油相との量比を調整する場合の量比は、薬物の種類および量、油相の性質によって一義的に決定されるものではないが、好ましくはＷ／Ｏ＝約１％ないし約５０％（Ｖ／Ｖ）である。
【００３１】
上記（３）において、Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する場合の温度は、例えば約−２０℃ないし有機溶媒の沸点の範囲、好ましくは約０℃ないし約３０℃、更に好ましくは約１０℃ないし約２０℃である。
Ｗ／Ｏ型乳化物の粘度の調整の時期は、上記（１）および（２）の場合は、Ｗ／Ｏ型乳化物を製造する時点で行うことができる。
また、上記（４）において、例えば外水相にＷ／Ｏ型乳化物を添加する際に外水相の温度をあらかじめ調整しておくことにより、上記（３）と同様の結果となるようにすればよい。外水相の温度は、例えば約５℃ないし約３０℃、好ましくは約１０℃ないし約２５℃、更に好ましくは約１２℃ないし約２０℃である。
有機溶媒を除去する方法は、自体公知の方法に従って行うことができる。例えばプロペラ型撹拌機あるいはマグネチックスターラーなどで撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧にして有機溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーターなどを用いて真空度を調節しながら有機溶媒を蒸発させる方法などが挙げられる。
【００３２】
一方、水難溶性の生理活性ペプチドの金属塩を生理活性物質として用いる場合には、生理活性ペプチド金属塩を生体内分解性高分子重合物と油脂類とを含有する有機溶媒液に分散させて得られた分散液をよく混合して、生理活性ペプチド金属塩が有機溶媒液中において実質的に均一に分散・懸濁している分散安定性の高い有機溶媒分散液（以下、便宜上S/O型乳化物と称することがある）を得る。
上記有機溶媒としては、前記Ｗ／Ｏ型乳化物の調製において生体内分解性高分子重合物と油脂類とを含有する油相の調製に用いられるのと同様の有機溶媒が用いられる。
上記s／o型乳化物の調製には、公知の分散法が用いられる。該分散法としては、例えば、断続振とう法、プロペラ型撹拌機あるいはタービン型撹拌機などのミキサーによる方法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法などが挙げられる。この場合、所望により水不溶性溶媒と共に水溶性溶媒を用いることも有効である。該水溶性溶媒は、水溶性を有し、上記水不溶性溶媒と混合し得るものであればいかなるものでもよい。該水溶性溶媒の具体例としては、例えばアルコール類(例、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等)、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。ｓ／ｏ型乳化物の調製においては、生理活性物質をより細かく微粒化して分散させることが好ましく、微粒子の粒径は通常約１nmないし約３０μm、好ましくは約１nmないし約５μm、最も好ましくは約１nmないし約１μmである。
【００３３】
次いで、このようにして製造されたＳ／Ｏ型乳化物は、前記Ｗ／Ｏ型乳化物の場合と同様の手法により有機溶媒除去に付されるが、好ましくは水中乾燥法に付す。好ましくは、外水相中に上記濃度の浸透圧調節剤を含有させて行う。すなわち、該油相をさらに浸透圧調節剤を含有した第２相目の水相中に加え、Ｓ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させた後、油相中の有機溶媒を除去させ、マイクロカプセルを製造する。
Ｓ／Ｏ／Ｗ型水中乾燥法における外水相に乳化剤を加えてもよく、その例としては、前記Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成する際に用いられるものと同様の乳化剤が用いられる。
【００３４】
油相中の有機溶媒の除去は、通常用いられる方法が採用される。該方法としては、プロペラ型撹拌機、あるいはマグネチックスターラーなどで撹拌しながら徐々に減圧して行うか、ロータリーエバポレーターなどを用いて、真空度を調節しながら除去する。この場合、高分子重合物の固化がある程度進行し、内層から生理活性物質の放出による損失が減少した時点で、溶媒の除去をより完全にする目的で、Ｓ／Ｏ／Ｗ型乳化物を徐々に加温して行うと所要時間を短縮することができる。また、温度以外の方法で増粘化及び固化を行う場合は、単にＳ／Ｏ／Ｗ型乳化物を撹拌下放置するか、加温するか、窒素ガスなどを吹き付けるか、することなどによって除去してもよい。この溶媒の除去過程は生理活性物質の放出をコントロールするマイクロカプセルの表面構造を大きく左右する重要な過程である。例えば、除去の速度を速く行うことによって、表面に多くの細孔を生じ、またより大きな細孔となり、生理活性物質の放出速度を高める。
【００３５】
このようにして得られたマイクロカプセルは遠心分離あるいは濾過して分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している遊離の生理活性物質、該生理活性物質の保持物質などを、蒸留水で数回繰り返し洗浄し、必要であれば加温し減圧下でマイクロカプセル中の水分の除去及びマイクロカプセル剤中の溶媒の除去をより完全に行う。
得られたマイクロカプセルは、通常蒸留水などに再分散後、凍結乾燥して保管されるが凍結乾燥の際に、凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトールなどの水溶性多糖類、澱粉類（例、コーンスターチなど）、無機塩類、アミノ酸、タンパク質などが挙げられる。これらのうち好ましくはマンニトールである。マイクロカプセルと凝集防止剤との混合比（重量比）は、約５０：１ないし約１：１、好ましくは約２０：１ないし約１：１、更に好ましくは約１０：１ないし約５：１である。
洗浄中の粒子同士の凝集を防ぐために、洗浄液である蒸留水に凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール，ラクトース，ブドウ糖，などの水溶性多糖、グリシン等のアミノ酸、フィブリン，コラーゲン等のタンパク質、塩化ナトリウム，リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが挙げられる。凝集防止剤は、好ましくはマンニトールである。
【００３６】
また、凍結乾燥の後、所望により、減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行ってもよい。加熱温度が基剤として用いた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度未満では、生理活性ペプチドの過剰量の初期放出性改善の効果がなく、また高温過ぎるとマイクロカプセルの融着，変形，生理活性物質の分解，劣化等の危険性が増大する。加熱温度は一概にいえないが、基剤として用いた生体内分解性ポリマーの物性（例、分子量，安定性等），生理活性ペプチド，マイクロカプセルの平均粒子径，加熱時間，マイクロカプセルの乾燥程度，加熱方法等を考慮し適宜決定することができる。
好ましくは、基剤として用いた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度以上で、該マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。より好ましくは、基剤として用いた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度範囲内で加熱乾燥する。ここにおいて、ガラス転移温度とは、示差走査熱量計を用い、加温速度毎分１０または２０℃で昇温した際に得られる中間点ガラス転移温度をいう。
【００３７】
加熱乾燥時間も加熱温度，処理するマイクロカプセル量などによって異なるが、一般的にはマイクロカプセル自体の温度が所定の温度に達した後、約２４ないし約１２０時間が好ましい。さらに約４８ないし約１２０時間が好ましい。
加熱方法は特に限定されないが、マイクロカプセルが均一に加熱される方法であればいかなる方法を用いてもよい。
上記で得られたマイクロカプセルは、必要であれば軽く粉砕した後、篩過して、大きすぎるマイクロカプセル部分を除去する。マイクロカプセルの粒子径は、徐放性の程度により懸濁剤として使用する場合には、その分散性、通針性を満足させる範囲であればよく、例えば、平均径として約０.５〜４００μmの範囲が挙げられ、より好ましくは約２〜２００μmの範囲にあることが望まれる。
マイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線を滅菌する方法、防腐剤を添加する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００３８】
本発明製造法により製造されたマイクロカプセルは、経口的および非経口的に投与できる。例えば、筋肉内、皮下、血管、臓器、あるいは関節腔、腫瘍などの病巣に容易に注射剤及び埋め込み剤として投与することができる。また、種々の製剤に成型して投与することもでき、そのような製剤を製造する際の原料物質としても使用され得る。
上記製剤としては、注射剤、経口投与製剤（例、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤）、経鼻投与製剤、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤）などが挙げられる。
これらの製剤は、常法に従って製造することができる。
例えば、本発明のマイクロカプセルを注射剤とするには、本発明のマイクロカプセルを分散剤（例、ツイーン（Ｔween）８０、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベジールアルコール、クロロブタノールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖など）などと共に水性懸濁剤に、あるいはオリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコールなどに分散して油性懸濁剤に成形され、徐放性注射剤とする。
さらに、上記のマイクロカプセルの徐放性注射剤は、懸濁剤として、上記の組成以外に、賦形剤（例、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖など）を加えて、再分散した後、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥して固型化し、用時に、注射用蒸留水あるいは適当な分散剤を加えると、より安定した徐放性注射剤が得られる。
【００３９】
本発明製造法により得られるマイクロカプセルを例えば錠剤にするには、一般に公知の製法に準じて行うことができる。例えば賦形剤（例、乳糖、結晶セルロース、白糖、トウモロコシデンプン等のデンプン類など）、崩壊剤（例、トウモロコシデンプン等のデンプン類、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例、結晶セルロース、アラビアゴム、デキストリン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなど）又は滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形する。
【００４０】
本発明製造法により得られるマイクロカプセルを例えば経鼻投与製剤にするには、固状、半固状又は液状のものに成形され、いずれも一般に用いられる製法で行うことができる。例えば、上記固状のものとしては、該マイクロカプセルをそのまま、あるいは賦形剤（例、グルコース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロースなど）、増粘剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合物など）などを添加、混合して粉状の組成物とする。上記液状のものとしては、注射剤の場合とほとんど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とする。半固状の場合は、水性又は油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらはいずれも、pＨ調節剤（例、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなど）などを加えてもよい。
【００４１】
本発明製造法により得られるマイクロカプセルを坐剤とするには、油性又は水性の固状、半固状あるいは液状のものをそれぞれ油性基剤又は水性基剤として用いて、自体公知の方法で製造しうる。上記組成物に用いる油性基剤としては、マイクロカプセルを溶解しないものであればよく、例えば高級脂肪酸のグリセリド[例、カカオ脂、ワイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社）など]、中鎖脂肪酸トリグリセリド[例、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社）など]、あるいは植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油など）などが挙げられる。また、水性基剤としては、例えばポリエチレングリコール類、プロピレングリコール、水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体などが挙げられる。
【００４２】
本発明製造法により得られるマイクロカプセルは、初期バーストが抑制されかつ一定した薬物量を長期に亘って放出するため、低毒性で一定した薬効が得られ、安全で効能の高い徐放剤となり得る。しかも、慢性疾患の治療に応用することによりこれまで頻回投与を余儀なくされた患者に対しては、その肉体的負担をなくしコンプライアンスを得ることが出来る。
例えば下垂体小人症の場合には、成長ホルモンの投与はかかせないものであり、従来乳幼児あるいは若年患者に対しては数カ月から10年以上の長期に亘り連日あるいは隔日に皮下あるいは筋肉内投与されているが、本発明製造法により得られる徐放性マイクロカプセルにおいては数週間から数カ月に一度の投与で十分な薬効が得られるため、これらの患者のコンプライアンスの改善に大いに寄与できる。
また例えば水溶性生理活性物質が、抗血栓剤である本発明の徐放性マイクロカプセルを血栓症の治療に用いる場合には、通常の投与法では抗血栓作用の副作用として出血傾向が懸念されるが、本発明の徐放性マイクロカプセルでは副作用を発現しない薬効濃度領域内に血中濃度を長期に亘って安定的に維持できるため、長期に亘る当該慢性疾患の治療だけでなく、その予防にも積極的に使用できる。このように、本発明のマイクロカプセルは、副作用や毒性が低いので（例えば、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウシ、ヒトなどの温血哺乳動物）に安全に投与できる。
【００４３】
徐放性マイクロカプセルの投与量としては、主薬である生理活性物質の種類と含量、剤形、薬物放出の持続時間、投与対象動物、投与目的により種々異なるが、該主薬の有効量であればよい。
例えば生理活性ペプチドあるいはその塩の徐放性マイクロカプセルが１週間型製剤である場合、好ましくは、成人１人当たり約０.０００１ないし１０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０.０００５ないし１mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回、あるいは１ケ月に１回など、該生理活性ペプチドの種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾患、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、例えばヒト成長ホルモンで、２週間型製剤を下垂体性小人症の患者に投与する場合には、有効成分として通常、約０.０１ないし約５mg／kg体重、好ましくは約０.０３ないし約１mg／kg体重の範囲から適宜選び、２週間に１回投与するのがよい。また生理活性物質がインスリンの場合、糖尿病患者に対する投与量は、有効成分として通常、約０.００１ないし約１mg／kg体重、好ましくは約０.０１ないし約０.２mg／kgの範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。
【００４４】
例えば抗血小板薬である前記一般式（Ｉ)で表わされる２-ピペラジノン-１-酢酸誘導体又はその塩の徐放性マイクロカプセルを、不安定狭心症患者、ＰＴＣＡ（経皮的冠動脈内血管形成術）又は冠動脈血栓溶解療法施行時の虚血性合併症又は冠動脈の再閉塞もしくは再狭窄発症患者に経口投与する場合、成人（体重５０kg）に１回当たりの投与量として、マイクロカプセルの適量が約１mgないし１０ｇ、好ましくは約１mgないし２ｇの範囲（通常、主薬である化合物（I）として１回につき約１ないし５００mg、好ましくは約１０ないし２００mgになる範囲）から、適宜選択することができる。又、不安定狭心症患者、ＰＴＣＡ又は冠動脈血栓溶解療法施行後の虚血性合併症又は冠動脈の再閉塞もしくは再狭窄発症患者に非経口投与する場合、例えば上記注射剤として投与する場合の懸濁溶液の容量は、約０.１ないし５ml、好ましくは約０.５ないし３mlの範囲（通常、成人（体重５０kg）の１回当たりの投与量が、主薬である化合物（I）として、約０.０５〜５０mg、好ましくは１〜２０mgになるような範囲）から適宜選ぶことができる。
本発明製造法により得られる徐放性マイクロカプセルは、常温あるいは冷所に保存されるが、好ましくは冷所である。ここでいう常温あるいは冷所とは日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５ないし２５℃、冷所とは１５℃以下を意味する。
【００４５】
【発明の実施の形態】
以下に実施例および試験例を挙げて、さらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
実施例１
(Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-1-酢酸（以下、化合物Ａと略称する）の塩酸塩５００mg及びＬ−アルギニン１５０mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量８,０００）３８５０mg及びビタミンＥ５００mgを塩化メチレン７.５mlに溶解し油相とした。油相を内水相に加え、小型ホモジナイザー（ポリトロン）で乳化しＷ/Ｏ型乳化物を得た。このＷ/Ｏ乳化物を１５℃に冷却した２.７％ＮａＣｌ含有０.１％ＰＶＡ水溶液８００ml（外水相）中でホモミキサーを使用して乳化し、Ｗ/Ｏ/Ｗ型乳化物とした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機を用いて捕集した。捕集したマイクロカプセルは、精製水で水洗後、凍結乾燥に供した。
マイクロカプセル２０mgをアセトニトリル／蒸留水の２：１混液３mlに溶解後、０.５Ｎ ＫＯＨ−エタノール溶液３mlを添加して２５℃で２０時間加水分解した。窒素ガス気流下で蒸発乾固した残渣を０.５Ｎ ＨＣｌで中和後、最終アミノ酸濃度約２００nmol/mlとなるように０.０１Ｎ ＨＣｌを用いて希釈し、アミノ酸分析計（日立L-8500A）に供してアルギニンを定量した。
マイクロカプセル中アルギニン含量は１．６％で、また、後述の実施例５に記載の方法で定量したマイクロカプセル中ビタミンＥ含量は１０％であった。
【００４６】
実施例２
化合物Ａの塩酸塩５００mg及びL-アルギニン１５０mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量８,０００）４１００mg及びビタミンＥ２５０mgを塩化メチレン８mlに溶解し油相とした。油相を内水相に加え、小型ホモジナイザー（ポリトロン）で乳化しＷ/Ｏ型乳化物を得た。このＷ/Ｏ乳化物を１５℃に冷却した２.７％ＮａＣｌ含有０.１％ ＰＶＡ水溶液８００ml（外水相）中でホモミキサーを使用して乳化し、Ｗ/Ｏ/Ｗ型乳化物とした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機を用いて捕集した。捕集したマイクロカプセルは、精製水で水洗後、マンニトール４４０mgを加えて凍結乾燥した。
【００４７】
実施例３
化合物Ａの塩酸塩７５０mg及びL-アルギニン１５０mgを蒸留水２mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量９,０００）３６００mg及びビタミンＥ５００mgを塩化メチレン１０mlに溶解し油相とした。以下、実施例２と同様にＷ/Ｏ型乳化物、さらにＷ/Ｏ/Ｗ型乳化物を調製しマイクロカプセル凍結乾燥品を得た。得られたマイクロカプセル中のアルギニン及びビタミンＥの含量はそれぞれ１.５％（w/w）及び１０％（w/w）であった。
実施例４
化合物Ａの塩酸塩５００mg及びL-アルギニン１５０mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量９,０００）４１００mg及びビタミンＥ２５０mgを塩化メチレン８mlに溶解し油相とした。以下、実施例２と同様にＷ/Ｏ型乳化物、さらにＷ/Ｏ/Ｗ型乳化物を調製しマイクロカプセル凍結乾燥品を得た。得られたマイクロカプセル中のアルギニン含量及びビタミンＥの含量はそれぞれ１.８％（w/w）及び５.２％（w/w）であった。
【００４８】
比較例１
化合物Ａ２００mgを蒸留水０.５mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量９,０００）１８００mgを塩化メチレン２mlに溶解し油相とした。以下、実施例３と同様にＷ/Ｏ型乳化物、さらにＷ/Ｏ/Ｗ型乳化物を調製しマイクロカプセル凍結乾燥品を得た。〔表１〕に実施例４および比較例１で得られたマイクロカプセルの特性を示す。
【表１】
0004900984.tif 000011
〔表１〕の結果より、化合物Aの塩酸塩を用いて内水相に３％アルギニンを、油相に５％ビタミンＥを添加してマイクロカプセルを調製することにより、マイクロカプセル中への薬物封入率が向上し、in vitro溶出試験での初期放出（１日放出量）を抑制することが可能となった。
【００４９】
試験例１
前記実施例１及び比較例１で得られたそれぞれのマイクロカプセルを、ＳＤラット（雄性、６週齢）に薬物量として２０mg/kgで皮下投与し、投与後の血漿中濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。得られた結果を〔図１〕に示す。
〔図１〕においては、実施例１によるマイクロカプセルを曲線Ａ、比較例１によるマイクロカプセルを曲線Ｂで示す。投与１時間後の薬物血漿中濃度は、実施例１および比較例１のマイクロカプセルにおいて、それぞれ６８９ng/mlおよび２９２６ng/mlであった。化合物Ａの塩酸塩を用いて内水相に３％アルギニンを、油相に１０％ビタミンＥを添加して調製したマイクロカプセルにおいては、投与後初期の薬物濃度の上昇が抑制され、その後の血漿中濃度の変動も少なく、約２週間有効血漿中濃度を安定して持続させることが可能となった。
【００５０】
参考例１
アミノ末端にメチオニン付加した組換え型ヒト成長ホルモン（特開昭６２−１７１６９９号公報の参考例１４に記載の方法に準じて製造した。以下、Ｍet-ｈＧＨ と略記する）水溶液(７１０mg/３５５ml ５mＭ ＮＨ4ＨＣＯ3, pＨ７.８)に、Ｚｎ(ＯＡc)2 ２Ｈ2Ｏ (７１mg/５ml Ｈ2Ｏ)溶液３.５ml (Ｍet-ｈＧＨ：Ｚｎ=１:７ モル)を撹拌しながら徐々に滴下した。生成した不溶性Ｍet-ｈＧＨ/Ｚｎ複合体を２,５００rpmで２０分間遠心分離し、上清を除去した後、蒸留水１００mlを加えて再分散し 凍結乾燥した。
【００５１】
実施例５
乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量１５,０００ 和光純薬製）１２７５mg及びビタミンＥ １５０mgを塩化メチレン ２.０mlとアセトニトリル ０.４mlとの混液に溶解し油相とした。この油相に参考例１で得たＭet-ｈＧＨ/Ｚｎ複合体 ７５mgを分散し、まず超音波照射にて５分間、さらに小型ホモジナイザー（ポリトロン）を用いて１５,０００ rpmで１分間微粒化した。このＳ/Ｏ分散液を１５℃に冷却した１０％マンニトール含有０.１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＡ）水溶液８００mlに添加し、ホモミキサーを用いて乳化しＳ/Ｏ/Ｗ型乳化物を得た。次いで通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共に生成するマイクロカプセルを遠心分離機を用いて捕集し、精製水で水洗後、凍結乾燥に供した。
得られたマイクロカプセル２０mgに５mlの酢酸エチルと１mlの０.１Ｍ酢酸緩衝液（pＨ=４)を加えて１０分間振盪し、２，５００rpm, １０分間遠心分離した。得られた酢酸エチル層の紫外線（UV）吸収（２９４nm）を吸光度計（Beckman DU 7400）で測定し、マイクロカプセル中ビタミンＥ含量を定量した。
マイクロカプセル中ビタミンＥ含量は１０％であった。
【００５２】
実施例６
乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量１５,０００）１３５０mg及びビタミンＥ ３００mgを塩化メチレン２.０mlとアセトニトリル ０.４mlとの混液に溶解し油相とした。この油相に参考例１で得たｈＧＨ/Ｚｎ複合体 ７５mgを分散し、まず超音波照射にて５分間、さらに小型ホモジナイザー（ポリトロン）を用いて１５,０００rpmで１分間微粒化した。以下、実施例５と同様にＳ/Ｏ分散液、さらにＳ/Ｏ/Ｗ型乳化物の調製を経て、マイクロカプセル凍結乾燥品を得た。また、実施例５に記載の方法で定量したマイクロカプセル中のビタミンＥ含量は１７％であった。
【００５３】
比較例２
乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量１５，０００）１４２５mgを塩化メチレン２.０mlとアセトニトリル０.４mlとの混液に溶解し油相とした。この油相に実施例１で得たＭet-ｈＧＨ/Ｚｎ複合体７５mgを分散し、まず超音波照射にて5分間、さらに小型ホモジナイザー（ポリトロン）を用いて１５,０００rpmで１分間微粒化した。以下、実施例６と同様にＳ/Ｏ分散液、さらにＳ/Ｏ/Ｗ型乳化物の調製を経て、マイクロカプセル凍結乾燥品を得た。
【００５４】
試験例２
実施例５、６及び比較例２で得られたマイクロカプセルをＳＤラット(雄性、６週齢)に皮下投与し(ｈＧＨとして１５mg/kg)、血清中濃度をＲＩＡにより測定した。得られた結果を〔図２〕に示す。
〔図２〕に示すように、比較例２のマイクロカプセルを曲線Ａ、実施例５および６のマイクロカプセルをそれぞれ曲線ＢおよびＣで示す。投与１時間後のｈＧＨ血漿中濃度は、比較例２、実施例５および６のマイクロカプセルにおいて、それぞれ８１３ng/ml, ６３３ng/mlおよび８４４ng/mlであった。投与２週後までの血中薬物濃度時間曲線下面積(ＡＵＣ）から算出した生物学的利用能(ＢＡ)は、ｈＧＨ溶液の静脈内投与に比較してそれぞれ４２％, ５６％および５７％であった。また投与２週後までのＡＵＣに対する投与１日後までのＡＵＣの割合を初期バースト率(ＩＢ)とした時、それぞれ８３％, ７９％および７２％であった。
油相に１０％ビタミンＥを添加して調製された実施例１のマイクロカプセルでは、投与後初期（１時間後）のｈＧＨ血漿中濃度（Ｃ１h）の上昇が抑制され、その後２週に亘り高い血清中濃度を維持し、ＢＡの増大とＩＢの抑制が達成された。
また油相に１７％ビタミンＥを添加して調製された実施例１のマイクロカプセルでは、Ｃ１ｈに大きな変化はないが、その後２週間に亘り高い血清中濃度を維持し、同様にＢＡの増大とＩＢの抑制が達成された。
【００５５】
実施例７
化合物Ａの２塩酸塩５００mg及びＬ−アルギニン３００mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量８,０００）３９５０mg及びビタミンＥ２５０mgを塩化メチレン７.５mlに溶解し油相とした。油相を内水相に加え、小型ホモジナイザー（ポリトロン）で乳化しＷ/Ｏ型乳化物を得た。このＷ/Ｏ乳化物を１５℃に冷却した２.７％ＮａＣｌ含有０.１％ＰＶＡ水溶液８００ml（外水相）中でホモミキサーを使用して乳化し、Ｗ/Ｏ/Ｗ型乳化物とした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機を用いて捕集した。捕集したマイクロカプセルは、精製水で水洗後、凍結乾燥に供した。
マイクロカプセル中、薬物封入率は９０％であった。
【００５６】
実施例８
化合物Ａの２塩酸塩５００mg及びＬ−アルギニン３００mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量１０,０００）３１６０mg及び乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量７,０００）７９０mgの２種類の乳酸・グリコール酸共重合体３９５０mgとビタミンＥ２５０mgとを塩化メチレン１５mlに溶解し油相とした。油相を内水相に加え、小型ホモジナイザー（ポリトロン）で乳化しＷ/Ｏ型乳化物を得た。このＷ/Ｏ乳化物を１５℃に冷却した２.７％ＮａＣｌ含有０.１％ＰＶＡ水溶液８００ml（外水相）中でホモミキサーを使用して乳化し、Ｗ/Ｏ/Ｗ型乳化物とした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機を用いて捕集した。捕集したマイクロカプセル中、薬物封入率は９１％であった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明において、生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に相分離を起こすことなく溶解する油脂類を添加することにより、生理活性物質を高含量に含有し、かつ初期放出の少ない安定した放出性を示すマイクロカプセルを調製できる。このマイクロカプセルを使用することにより、生理活性物質の副作用を軽減させつつ長期にわたる投与が可能となり、また投与回数の減少により患者のコンプライアンスの向上が図れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１で用いたマイクロカプセル投与後の薬物血中濃度の経時変化を示す。
【図２】試験例２で用いたマイクロカプセル投与後の薬物血漿中濃度の経時変化を示す。
【図１】
0004900984.tif 000013
【図２】
0004900984.tif 000014