(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出しうる癌を有さない患者に、エストロゲン、植物エストロゲンおよびプロゲスチンから選択される少なくとも１つのホルモンを投与することによって生じ得るホルモン依存性癌を予防するための薬剤の調製におけるリコピンならびにフィトエンおよびフィトフルエンの少なくとも１つを含むカロチノイド混合物の使用であって、前記カロチノイド混合物を前記患者に２〜１０ｍｇ／日の量投与することによる前記使用。
【請求項２】
カロチノイド混合物が２〜６ｍｇ／日の量で投与される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
カロチノイド混合物が２ｍｇ／日の量で投与される請求項１に記載の使用。
【請求項４】
カロチノイド混合物が、最大１．５μＭの前記カロチノイドの有効血清濃度を生じるのに充分な量である請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ホルモンが、植物エストロゲン、非ステロイド性エストロゲン、またはそれらの混合物を含む請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ホルモンが、ステロイド性エストロゲン、プロゲスチン、またはそれらの混合物を含む請求項１に記載の使用。
【請求項７】
カロチノイド混合物が、リコピンおよびフィトエンを含む請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
カロチノイド混合物が、リコピンおよびフィトフルエンを含む請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
カロチノイド混合物が、リコピン、フィトエンおよびフィトフルエンを含む請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤が前記ホルモンをさらに含む請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも１つのホルモンが、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、メドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロン、ノルエチステロン、ノルゲストレル、プロゲスチンおよびプロゲステロンから成る群から選択される請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ホルモンの有益な活性を阻害しない請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
生理的有効量の、エストロゲン、植物エストロゲンおよびプロゲスチンから選択される少なくとも１つのホルモンを含み、リコピンならびにフィトエンおよびフィトフルエンの少なくとも１つを含む、前記ホルモンの投与によって生じ得るホルモン依存性癌を予防するのに有効な量のカロチノイド混合物をさらに含む医薬組成物。
【請求項１４】
ヒトに投与するのに好適な医薬組成物であって、生理的有効量の、ステロイド性エストロゲン、エストラジオール、エストロン、メドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロン、ノルエチステロン、プロゲスチン、ノルゲストレルおよびプロゲステロンから成る群から選択される少なくとも１つのホルモンと、リコピンならびにフィトエンおよびフィトフルエンの少なくとも１つを含むカロチノイド混合物とを含んで成り、前記カロチノイド混合物が、前記ホルモンの投与によって生じ得るホルモン依存性癌を予防するのに有効な量である前記医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトに投与するのに好適な医薬組成物であって、生理的有効量の、ステロイド性エストロゲン、エストラジオール、エストロン、メドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロン、ノルエチステロン、プロゲスチン、ノルゲストレルおよびプロゲステロンから成る群から選択される少なくとも１つのホルモンと、リコピンならびにフィトエンおよびフィトフルエンの少なくとも１つを含むカロチノイド混合物とを含んで成り、前記カロチノイド混合物が、前記ホルモンの有益な活性を阻害せずに、前記ホルモンの投与によって生じ得るホルモン依存性癌を予防するのに有効な量である前記医薬組成物。
【請求項１６】
１日に１回でヒトに投与するのに好適な医薬組成物であって、生理的有効量の少なくとも１つの植物エストロゲンを含み、リコピンならびにフィトエンおよびフィトフルエンの少なくとも１つを含む、前記植物エストロゲンの投与によって生じ得るホルモン依存性癌を予防するのに有効な量のカロチノイド混合物をさらに含む前記医薬組成物。
【請求項１７】
１日に１回の投与に好適な請求項１３から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記カロチノイド混合物が２〜１０ｍｇの量である請求項１３から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記カロチノイド混合物が２〜６ｍｇの量である請求項１３から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記カロチノイド混合物が２ｍｇの量である請求項１３から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
カロチノイド混合物が、リコピンおよびフィトフルエンを含む請求項１３から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
カロチノイド混合物が、リコピンおよびフィトエンを含む請求項１３から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
カロチノイド混合物が、リコピン、フィトエンおよびフィトフルエンを含む請求項１３から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
カロチノイド混合物が、最大１．５μＭの前記カロチノイドの有効血清濃度を生じるのに充分な量である請求項１３から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、植物エストロゲンおよびステロイド性エストロゲンのようなホルモンの投与に伴う有害作用を予防する方法および組成物を提供する。
【０００２】
（背景技術）
ヒトによるホルモン摂取は、特に、医薬組成物、食品、栄養サプリメント、および機能性食品の摂取によって行われる。そのようなホルモンは、植物エストロゲンまたは非ステロイド性エストロゲン、ステロイド性エストロゲンおよびプロゲスチンを包含する。植物エストロゲンは、例えば、ゲニステイン、ダイゼインおよびグリシテイン、およびそれらの各グルコシド、マロニルグルコシドおよびアセチルグルコシド誘導体を含む。エストロゲンおよびプロゲスチンは、ホルモン置換療法（ＨＲＴ）および避妊薬に使用されることが知られている。エストロゲン、またはエストロゲン／プロゲスチン組合せを使用するＨＲＴは、閉経に伴う症候を治療する一般的な方法である（Ｅｒｎｓｔｅｒ  ＶＬら、（１９８８）Ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋｓ  ｏｆ  Ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｕｓｅ，  Ｐｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  １７：２０１−２２３）。減少したエストロゲン産生を伴う成人女性における閉経の開始は、多くの症候に関連している。これらの症候は、ホットおよびコールドフラッシュ、動悸、目眩、頭痛、変化分泌（ａｌｔｅｒｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）ならびに体重減少および増加を包含する。閉経後の女性の減少したレベルの循環エストロゲンは、骨粗鬆症および冠状動脈心臓疾患のリスク増加にも関連している。エストロゲンだけを使用する治療法は、閉経時に治療を開始した場合に、心臓血管疾患および骨粗鬆症を顕著に減少させる。心臓疾患に対するエストロゲンの保護作用は、循環ＨＤＬのレベルを増加し、ＬＤＬのレベルを減少させるそれの能力に関連している。
【０００３】
この有益な作用と対照的に、エストロゲンの長期使用は、子宮内膜癌発生のリスク増加に明らかに関連している。このリスクは、子宮内膜細胞の過剰増殖を防止するプロゲスチンの共投与によって減少させることができる。従って、エストロゲン／プロゲスチンを組合せたＨＲＴ治療は、健全な子宮を有する女性に推奨される。しかし、この形態の組合せ療法は、血漿脂質プロフィルにおけるエストロゲンの有益な作用を明らかに減少させる（Ｌｏｂｏ  Ｒ．  １９９２．  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｅｓｔｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ａｍ．  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  １６６：１９９７−２００４）。さらに、プロゲスチンの中には、乳癌発生のリスク増加に関連しているものがある（Ｓｔａｆｆａ  Ｊ．  Ａ．ら、１９９１．  Ｐｒｏｇｅｓｔｉｎｓ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ａｎ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ，  ５７：４７３−４９１；Ｋｉｎｇ  Ｒ．  Ｊ．  Ｂ  １９９１．  Ａ  Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｊ．  Ｓｔｅｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏ．  ３９：８１１１−８１１８）。
米国特許第５５１６５２８号に開示されているように、大豆由来イソフラボンであるゲニステインおよびダイゼインのような植物エストロゲンを含有するＨＲＴ製剤が開発された。これらの植物製剤の健康的利益は、大豆を主食とするアジア人において、直示的に大豆および大豆由来製品の高摂取によって、乳癌、子宮癌および他のホルモン依存性癌の発生が相対的に少ないことを示す疫学的データによって最初に示された。
【０００４】
大豆イソフラボンは、インビトロのヒト腺癌および乳癌細胞系において抗増殖作用を有することが示されているが、これらの作用は、相対的に高い、即ち１５モル（Ｍ）濃度で生じるにすぎない（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ，  Ａ．  Ｉ．ら、１９９８．  Ｇｅｎｉｓｔｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｎｕｄｅ  Ｍｉｃｅ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ６８：１４２６ｓ−１４３０ｓ；Ｌｅ  Ｂａｉｌ，  Ｊ．  Ｃ．ら、１９９８．  Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｎ  ＭＣＦ−７  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｆｌａｖｅｎｏｉｄｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  １３０：２０９−２１６）。そのような高濃度の植物エストロゲンによって生じるインビトロの癌細胞系における抗増殖作用は、ＩＣ５０値が、大豆に基づく食事によって得られる血中濃度より少なくとも１の大きさの程度で高いので、臨床適合性を有さない。
【０００５】
約０．１〜１０μＭの植物エストロゲン濃度は、大豆に基づく食事を摂取するアジア人およびヨーロッパ人の健康なヒトに見られる一般的な濃度である（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ，  Ｈ．ら、１９９３．  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏ−ｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｍｅｎ，  Ｌａｎｃｅｔ  ３４２：１２０９−１２１０；Ｇｏｏｄｅｒｈａｍら、１９９６．  Ａ  Ｓｏｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅ  Ｒｉｃｈ  ｉｎ  Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｄａｉｄｚｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，  Ｂｌｏｏｄ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｅｎ，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  １２５：２０００−２００６）。これらの低濃度において、ゲニステイン、クネストロール（ｃｏｕｎｅｓｔｒｏｌ）、ビオチャニンＡ（ｂｉｏｃｈａｎｉｎ  Ａ）、アピゲニン、ルイオリン、カエムプフェル（ｋａｅｍｐｆｅｒｌ）およびエンテロラクトンを包含する種々の植物エストロゲンは、エストロゲン受容体ポジティブにおいて細胞増殖を誘発するが、エストロゲン受容体ネガティブヒト乳癌細胞系においては細胞増殖を誘発しないことが示されており、従って、これらの化合物のエストロゲン作用が明らかである（Ｗａｎｇ，  Ｃ．およびＫｕｒｔｚｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．  １９９７．  Ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｎｕｔｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２８：２３６−２４７）。
【０００６】
従って、植物エストロゲンはＨＲＴ製剤の有益な成分として示されているが、健康な人に一般に見られる濃度の植物エストロゲンの存在は、ホルモン依存性癌の発生のリスクを増加させることが分かった。
【０００７】
カルチノイドアスタキサンチンは、齧歯類動物モデルにおいて、インビボにおける抗腫瘍発生作用を有することが示されている（Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．ら、１９９５．  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒａｔ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｄｉｅｔａｒｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｓ  ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ  ａｎｄ  ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １６：２９５７−２９６３；Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．ら、１９９５．  Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｏｒａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ  ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｓ，  ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ  ａｎｄ  ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ．  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ５５：４０５９−４０４６）。
【０００８】
カルチノイドフィトエンも、抗癌活性を示す。フィトエンシンターゼをコードする遺伝子を、通常はこの遺伝子を欠いている哺乳動物細胞に導入した後に、フィトエンの癌予防活性が示された。これらの細胞は、活性癌遺伝子のトランスフェクションによって賦課された悪性形質転換に対する耐性を獲得した（Ｎｉｓｈｉｎｏ，  Ｈ．  １９９８．  Ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ，  Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．  ４０２：１５９−１６３）。
【０００９】
β−カロチンは、抗癌特性を有することが示された最初のカロチノイドである（Ｐｅｔｏら、１９８１．  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：２０１−２０８）。しかし、癌におけるβ−カロチンの作用の易学的研究において、矛盾する結果が生じている。いくつかの試験は、β−カロチンが発癌のリスクを増加させることを示しているが（Ｏｍｅｎｎら、１９９６．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  ｏｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ  ３３４：１１５０−１１５５）、他の細胞培養および動物試験は、極めて一致して、β−カロチンが抗発癌作用を有することを示している。
【００１０】
トマトに検出されるカロチノイドであるリコピンは、抗酸化活性および抗癌活性に極めて関連している。インビトロの乳癌細胞におけるリコピンの抗増殖作用は、ＩＧＦ−Ｉ受容体信号経路および細胞周期進行を妨害することによって媒介されることが示されている（Ｋａｒａｓら、２０００．  Ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎｕｔｒ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ３６：１０１−１１）。ＩＧＦ−Ｉは、乳房組織の悪性形質転換に必須の増殖因子であり、血漿中のそれの濃度は、乳房（ＬｅＲｏｉｔｈ，  Ｄ．，  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｈ．，  Ｂｅｉｔｎｅｒ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｄ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，  Ｃ．Ｔ．，  Ｊｒ．  １９９５．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  １６：１４３−５９；Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ  Ｓ．Ｅ．ら、１９９８．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：１３９３−６）および前立腺（Ｃｈａｎ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｓｔａｍｐｆｅｒ，  Ｍ．Ｊ．  Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ，  Ｅ．，  Ｇａｎｎ，  Ｐ．Ｈ．，  Ｍａ，  Ｊ．  １９９８．  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：５６３−６６）の両方の癌の危険因子を決定する。
【００１１】
米国特許第５８２７９００号は、ホルモン依存性子宮内膜癌および乳癌を包含する癌の、インビトロおよびインビボにおける増殖を阻害するための、リコピンの使用を開示している。米国特許第５８２７９００号は、非常に高いカロチノイドの投与量レベルを必要とする。前記米国特許は、１日当たり７ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇを例示的リコピン投与量として示している。従って、前記米国特許の方法は、体重７０ｋｇ（１５４ｌｂｓ．）のヒトについて、１日当たり４９０ｍｇ〜１４００ｍｇのリコピンを必要とする。
【００１２】
食物サプリメントにおけるリコピンと大豆イソフラボンとの組合せは、米国特許第５９０４９２４号に開示されている。前記米国特許は、大豆イソフラボン（植物エストロゲン）およびリコピンを含む栄養粉末組成物を開示している。前記米国特許は、エストロゲン依存性の癌のリスクを減少させる植物エストロゲンの能力だけに言及している。前記特許は、植物エストロゲンの食事摂取が不利な健康作用のリスクを生じ、そのようなリスクをカロチノイドの不随摂取によって減少しうることを開示していない。
【００１３】
食物サプリメントにおける植物エストロゲンの使用は、米国特許第５８３０８８７号および第５８０７５８６号に開示されている。女性用の食物サプリメントにおける、カロチノイド混合物、ビタミンＡおよび植物エストロゲンの組合せは、米国特許第５８０７５８６号に開示されている。前記米国特許に開示されているビタミンＡおよび混合カロチノイドの投与量は、約４００〜約２０００μｇレチノール当量（ＲＥ）である。１ＲＥは、６μｇのβ−カロチンおよび約１２μｇのα−カロチンまたはクリプトキサンチンに相当する。従って、前記米国特許に開示されている投与量範囲は、約２．４〜１２ｍｇのβ−カロチンおよび約４．８〜２４ｍｇのα−カロチンまたはクリプトキサンチンにほぼ相当する。リコピンおよびルテインは、実質的なプロビタミンＡ活性を示さないので、これらのカロチノイドのＲＥは計算できない。しかし、前記米国特許に開示されている投与量レベルは、ＲＥ単位でのみ示されている。従って、前記米国特許の開示は、実質的なプロビタミンＡ活性を示さないカロチノイド、例えばリコピンおよびルテインの投与量レベルを限定していない。
【００１４】
本発明は、エストロゲン、植物エストロゲンおよびプロゲスチンのようなホルモンを含む、医薬組成物、食品、栄養サプリメントまたは機能性食品の摂取に伴う有害作用を予防するのに有用な方法および組成物に関する。そのような有害作用は、種々の癌のリスク増加を包含するが、それに限定されない。植物エストロゲンの投与は、癌発生のリスクを減少させるのに有利であることが以前に示された。しかし、植物エストロゲンの摂取は、ホルモン依存性癌の発生のリスク増加を生じることが見出された。
【００１５】
従って、植物エストロゲン、ステロイド性エストロゲンおよび／またはプロゲスチンを含む、食品、医薬組成物、栄養サプリメントおよび機能性食品の摂取に伴う有害作用を予防するのに有用な方法および組成物が必要とされている。ステロイド性エストロゲンおよびプロゲスチンのようなホルモンを含有する医薬組成物の投与に伴う有害作用を、そのようなホルモンの有益な活性を阻害せずに防止するのに使用しうる組成物も必要とされている。
【００１６】
従って、本発明の目的は、植物エストロゲンおよびプロゲスチンを含む食品または食物サプリメントの摂取に伴う有害作用を抑制する方法を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、植物エストロゲンおよびプロゲスチンを含む食品または食物サプリメントの摂取に伴う有害作用を予防するのに有用な組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、ホルモンが有する有害作用に関連した副作用を減少させ、従って、先行技術によって既知の医薬組成物の短所を有さない、新規ホルモン含有医薬組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、下記の説明によって明らかである。
【００２０】
（発明の概要）
本発明は、検出しうる癌を有さない患者に少なくとも１つのホルモンを投与することに伴う有害作用を予防する方法であって、少なくとも１つのカルチノイドをそのような患者に投与することを含む方法を提供する。本発明の方法は、例えば癌発生のリスク増加を包含する、ホルモン投与に伴う種々の有害作用を予防するのに使用することができる。本発明の方法は、ホルモンの有益な活性を阻害せずに、そのような有害作用を予防する。
【００２１】
従って、本発明の方法の目的は、ホルモン置換療法におけるエストロゲンおよび／またはプロゲスチンの投与に伴う有害作用を、そのようなホルモンの有益な活性を阻害せずに予防することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、植物エストロゲンの投与に伴う有害作用を予防する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、植物エストロゲンの投与に伴う有害作用を、そのようなホルモンの有益な活性を阻害せずに予防することである。
【００２３】
本発明はさらに、ホルモンの投与に伴う有害作用を予防するのに有用な組成物も提供する。本発明の組成物は、ヒトに１日に１回で投与するのに好適な単位投与形態にすることができる。
【００２４】
本発明の目的は、植物エストロゲンの投与に伴う有害作用を予防する組成物を提供することである。
【００２５】
本発明の他の目的は、ステロイド性ホルモンまたはプロゲスチンの投与に伴う有害作用を予防する組成物を提供することである。
【００２６】
本発明のさらに他の目的は、植物エストロゲン、ステロイド性ホルモンまたはプロゲスチンの投与に伴う有害作用を予防するのに有効であり、そのようなホルモンの有益な活性を阻害しない組成物を提供することである。
【００２７】
（図面の簡単な説明）
図１は、イソフラボンおよび大豆抽出物による、ＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞増殖の刺激を示す図である。
【００２８】
図２は、リコピンが、ホルモン依存性悪性細胞のゲニステイン−およびエストラジオール−誘発刺激の両方を阻害することを示す図である。
【００２９】
図３は、ゲニステインおよびＩＧＦ−Ｉの存在下に培養された乳癌細胞における、リコピンの作用を示す図である。
【００３０】
図４は、種々のカロチノイドが、ＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞のエストラジオール−およびゲニステイン−誘発増殖を阻害することを示す図である。
【００３１】
図５は、リコピンが、ＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞のエストラジオール−およびゲニステイン−誘発増殖を、用量依存的に阻害することを示す図である。
【００３２】
図６は、ＥＣＣ細胞のゲニステイン誘発増殖における、リコピンおよびフィトエンの共同作用を示す図である。
【００３３】
（本発明の好ましい実施形態の詳細な説明）
下記の説明は、本発明の好ましい実施形態を例示するものである。以下の説明は、限定するものとして理解すべきではく、当業者は、本発明の多くの明らかな改変法を実施しうると理解すべきものとする。
【００３４】
本明細書において使用される「ホルモン」は、高等植物に由来するステロイド性エストロゲン、プロゲスチンおよび非ステロイド性エストロゲン（植物エストロゲン）ならびにそれらの化学的改質誘導体、合成同等物および混合物を意味する。
【００３５】
本明細書において使用される「ステロイド性エストロゲン」または「エストロゲン」は、エストラジオール、エストロン、エストリオール、それらの合成同等物、化学的改質誘導体および混合物を意味する。
【００３６】
本明細書において使用される「プロゲスチン」は、プロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロン、ノルエチステロン、ノルゲストレル、それらの合成同等物、化学的改質誘導体および混合物のような、プロゲステロン作用を生じる薬剤を意味する。
【００３７】
本明細書において使用される「植物エストロゲン」は、大豆タンパクイソフラボン、フラボン、ならびにグルコシド、マロニルグルコシドおよびアセチルグルコシド誘導体、それらの合成同等物、化学的改質誘導体および混合物を意味する。例示的植物エストロゲンは、例えば、ダイゼイン、ゲニステインおよびグリシテインを包含する。
【００３８】
本明細書において使用される「投与」または「投与する」という用語は、経口摂取、皮膚、膣、子宮、筋肉または静脈注射を包含する種々の経路の１つまたはそれ以上によって患者に導入することを意味する。
【００３９】
本発明に有用なカロチノイドは、リコピン、α−カロチン、β−カロチン、ζ−カロチン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、アスタキサンチンおよびそれらの混合物を包含するが、それらに限定されない。本明細書において使用されるカロチノイドは、天然または合成源に由来するか、または遺伝子的に改質された有機体に由来する。
【００４０】
本発明は、検出しうる癌を有さない患者への少なくとも１つのホルモンの投与に伴う有害作用を予防する方法であって、そのような有害作用を予防するのに有効な量の少なくとも１つのカロチノイドを、そのような患者に投与することを含む方法を提供する。カロチノイドは、ホルモンを含まない組成物において、またはホルモンをさらに含む組成物において、投与することができる。
【００４１】
単独カロチノイドならびにそれらの組合せおよび混合物を、本発明の方法によって投与することができる。驚くべきことに、リコピン、フィトエンおよびフィトフルエンの種々の組合せは、ホルモン投与に伴う有害作用の予防において、有利な相乗作用を示すことが見出された。従って、リコピンおよびフィトエン；リコピンおよびフィトフルエン；および、リコピン、フィトエンおよびフィトフルエン；のカロチノイド混合物を、本発明の方法において投与することができる。
【００４２】
植物エストロゲン含有製品を摂取した際に、患者の血清におけるこれらの植物エストロゲンの生理的濃度は、０．４〜４μＭのレベルに達しうる。図１のグラフＡは、そのような濃度範囲における、植物エストロゲン、ゲニステインまたはダイゼイン、または大豆抽出物において生じるその２つの混合物の存在下の、ＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞の培養は、細胞増殖速度の顕著な増加を誘発することを示す（ｃｐｍによって示す、１分当たりのカウント）。従って、これらの植物エストロゲン濃度に達した患者は、ある種の癌、特に子宮内膜癌および乳癌のリスクが増加する。
【００４３】
図２は、リコピンの存在および不存在の両方において、増加する濃度の植物エストロゲン、ゲニステインおよびエストラジオールの存在下に培養した癌細胞の細胞増殖速度を比較することによって、この作用を示している。ゲニステインによって誘発された細胞増殖の増加した速度は、リコピンの存在によって実質的に阻害されることが明らかである。同じ作用は、子宮内膜癌細胞（図２、上方のグラフ）および乳癌細胞（図２、下方のグラフ）の両方において見られる。この阻害作用は図４にも示され、前記図において、リコピンだけでなく、アスタキサンチン、フィトエンおよびβ−カロチンのようなカロチノイドも、植物エストロゲンのゲニステインによって誘発された細胞増殖の有効な阻害剤であることが明らかである。
【００４４】
約１０μより高いレベルの植物エストロゲンの生理的濃度は、植物エストロゲンを含む食品または食物サプリメントの摂取後直ぐに生じうる。そのようなレベルは植物エストロゲンを摂取したヒトにおける植物エストロゲンの定常状態生理的濃度範囲の０．４〜４μＭより高い。図１、グラフＢは、植物エストロゲンのそのような一時的に高い濃度は、細胞増殖を誘発することができ、従って、癌のリスクを増加させることを示している。図１、グラフＢは、４０μＭの、ダイゼインまたはゲニステイン、または大豆抽出物において生じるようなその２つの混合物を使用したＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞の培養は、培養の第一日めに細胞増殖を顕著に増加させることを示している。植物エストロゲンの阻害作用は、培養の第二日めから顕著になるにすぎない。本発明の方法は、植物エストロゲンを含有する製品または組成物の摂取後直ぐに生じうるそのような高レベルのエストロゲンの有害作用を予防するように作用する。
【００４５】
本発明の実施形態によれば、検出できる癌を有さない患者への少なくとも１つの植物エストロゲンの投与に伴う有害作用を、そのような有害作用を予防するのに有効な量の少なくとも１つのカロチノイドを共投与することによって予防する。本発明の方法は、前記植物エストロゲンの有益な活性を阻害せずに、そのような有害作用を予防することを包含する。
【００４６】
カロチノイドは、約２ｍｇ〜約１０ｍｇ／日、好ましくは約２ｍｇ〜約６ｍｇ／日、最も好ましくは約２ｍｇ／日の量で投与される。実質的なプロビタミンＡ活性を示さないカロチノイド、例えば、ζ−カロチン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンおよびリコピンは、約２ｍｇ／日の量で投与するのが好ましい。
【００４７】
本発明の方法が、α−カロチン、β−カロチンおよびクリプトキサンチンから成る群から選択される少なくとも１つのカロチノイドを患者に投与することを含む場合、前記カロチノイドを約２ｍｇ／日の量で投与するのが好ましい。
【００４８】
本発明の方法は、検出できる癌を有さない患者へのエストロゲンおよびプロゲスチンのようなホルモンの投与に伴う有害作用を予防するのにも使用することができる。そのような方法は、例えばホルモン置換療法に使用することができ、前記方法において、そのようなホルモンの投与に伴う有害作用を予防するのに充分な量の少なくとも１つのカロチノイドと一緒にホルモンを投与する。カロチノイドは、そのようなホルモンを含まない組成物において、またはそのようなホルモンをさらに含む組成物において、投与することができる。
【００４９】
本発明の方法は、ホルモン置換療法に特に有用である。エストロゲン単独でのホルモン置換療法、またはエストロゲン置換療法は、子宮内膜癌の発生のリスクを生じうる。このリスクを減少させるために、エストロゲン／プロゲスチンの組合せ投与から成るホルモン置換療法を使用する場合が多い。しかし、この形態の療法は、エストロゲンの有益な作用を減少させる。さらに、プロゲスチンの中には、乳癌発生のリスク増加を伴うものもある。本発明の方法は、エストロゲンおよびプロゲスチンの投与に伴う有害作用を予防することができ、従来のホルモン置換療法で生じるような、そのようなホルモンの有益な活性の阻害を生じずに、予防することができる。他の実施形態において、本発明の方法を使用して、ＩＧＦ−Ｉの高レベルによって生じる付加的有害作用を予防する。ＩＧＦ−Ｉは、正常な、健康なヒトの血清に自然に生じる。しかし、高レベルのＩＧＦ−Ｉの発生は、乳癌および前立腺癌の有意な危険因子となる。従って、ホルモン投与に伴う発癌のリスクは、高ＩＧＦ−Ｉレベルを有するヒトにおいて増加する。高ＩＧＦ−Ｉレベルとホルモン摂取との組合せによって生じた付加的有害作用は、そのような有害作用を予防するのに充分な量の少なくとも１つのカロチノイドを投与することによって予防される。
【００５０】
さらに他の実施形態において、本発明の方法を使用して、ホルモンの不存在下の高レベルのＩＧＦ−Ｉに伴う有害作用を予防する。高レベルのＩＧＦ−Ｉの存在は、ホルモンの不存在下でさえ、ある種の癌の有意な危険因子となる。高ＩＧＦ−Ｉレベルによって生じる発癌のリスクを包含するこれらの有害作用は、そのような有害作用を予防するのに充分な量の少なくとも１つのカロチノイドを投与することによって予防することができる。
【００５１】
本発明は、ホルモンの投与に伴う有害作用を予防するのに有用な組成物を提供する。そのような有害作用は、例えば、増加した発癌のリスクを包含する。本発明の組成物は、ヒトへの投与に好適な単位投与形態である。組成物は、生理的有効量の少なくとも１つのホルモン、および有害作用を予防するのに有効な量の少なくとも１つのカロチノイドを含む。本発明の組成物は、そのようなホルモンの有益な活性を阻害せずに、ホルモンの投与に伴う有害作用を予防することができる。
【００５２】
単独カロチノイドならびにそれらの組合せおよび混合物を、本発明の組成物に使用することができる。意外なことに、リコピン、フィトエンおよびフィトフルエンの種々の組合せは、ホルモン投与に伴う有害作用の予防において、有益な相乗作用を示すことが見出された。従って、リコピンおよびフィトエン；リコピンおよびフィトフルエン；および、リコピン、フィトエンおよびフィトフルエン；のカロチノイド混合物を、本発明の組成物に使用することができる。そのような混合物を投与する場合、リコピンとフィトエンとの混合物が好ましい。
【００５３】
本発明の組成物は、植物エストロゲンを含有する製品または組成物の摂取後直ぐに生じる高レベルの植物エストロゲンの有害作用を予防するように作用する（図１および２参照）。
【００５４】
植物エストロゲン摂取患者への、約２ｍｇ／日の量の少なくとも１つのカロチノイドの共投与は、植物エストロゲンの摂取に伴う癌のリスクを減少させる。本発明は、生理的有効量の少なくとも１つの植物エストロゲン、および好ましくは約２ｍｇの量の、少なくとも１つのカロチノイドを含む、ヒトに１日に１回で投与するのに好適な単位投与形態を包含する。カロチノイドは、最大約１．５μＭの前記カロチノイドの有効血清濃度を生じるのに充分な量であるのが好ましい。
【００５５】
本発明の組成物が少なくとも１つの植物エストロゲンを含む場合、カロチノイドは、実質的なプロビタミンＡ活性を示さないカロチノイドであるのが好ましい。実質的なプロビタミンＡ活性を示さないカロチノイドは、例えば、リコピン、ζ−カロチン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチンおよびアスタキサンチンである。カルチノイドが、カロチノイドの混合物から成る場合、そのような混合物は、好ましくは、リコピンおよびフィトフルエン；より好ましくはリコピン、フィトフルエンおよびフィトエン；最も好ましくはリコピンおよびフィトエン；を含む。
【００５６】
本発明の他の実施形態は、ヒトに１日に１回で投与するのに好適な単位投与形態であって、生理的有効量の、ステロイド性エストロゲン、エストラジオール、エストロン、メドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロン、ノルエチステロン、プロゲスチン、ノルゲストレルおよびプロゲステロンから成る群から選択される少なくとも１つのホルモン、およびそのようなホルモンの投与によって生じる有害作用を予防するのに有効な量で存在する少なくとも１つのカロチノイドを含む単位投与形態である。この単位投与形態は、そのようなホルモンの有益な作用を阻害せずに、そのようなホルモンの投与に伴う有害作用を予防することができる。カロチノイドは、好ましくは約２から約１０ｍｇ、より好ましくは約２から約６ｍｇ、最も好ましくは約２ｍｇの量である。カロチノイドは、最大約１．５μＭの前記カロチノイドの有効血清濃度を生じるのに充分な量であるのが好ましい。カロチノイドがカロチノイドの混合物から成る場合、そのような混合物は、好ましくはリコピン、フィトエンおよびフィトフルエン；より好ましくはリコピン、フィトフルエンおよびフィトエン；を含む。
【００５７】
少なくとも１つのステロイド性エストロゲンまたはプロゲスチンを含む本発明の組成物は、女性における閉経を治療するのに使用されるホルモン置換療法に特に有効である。閉経を治療する従来のホルモン置換療法は、ある種の癌の発生のリスクを増加させる。本発明の組成物は、ホルモン置換療法に使用することができ、それと同時に、ステロイド性エストロゲンまたはプロゲスチンの投与に伴う発癌のリスクのような有害な作用を予防することもできる。本発明の組成物は、ホルモンの有益な活性を阻害せずに、そのような有害作用を予防することができる。
【００５８】
本発明の組成物は、植物エストロゲンの存在下の、高レベルの増殖因子ＩＧＦ−Ｉホルモン摂取によって誘発される細胞増殖における、付加的有害作用を予防するのに使用することができる。ＩＧＦ−Ｉは、正常なヒトの血清に自然に存在するが、高レベルでのそれの存在は、乳癌および前立腺癌の発生のリスクを顕著に増加させる。図３、グラフＡは、ゲニステイン（約０．４〜４μＭ）およびＩＧＦ−Ｉ（３０ｎＭ）の両方を使用したホルモン依存性ＭＣＦ−７乳癌細胞の培養は、ゲニステインだけで刺激した対照培養物と比較して、細胞増殖速度を顕著に増加させることを示している。３〜５μＭのリコピンの添加は、ＩＧＦ−Ｉおよびゲニステインの両方の存在によって刺激された細胞増殖を阻害する。従って、少なくとも１つの植物エストロゲンおよび少なくとも１つのカロチノイドを含む本発明の組成物を、高ＩＧＦ−Ｉレベルを有する患者に投与して、そのような高いＩＧＦ−Ｉレベルによって生じる付加的有害作用を予防することができる。
【００５９】
本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない下記の実施例において、本発明をさらに説明する。
【００６０】
（実施例）
一般手順
カロチノイド源および溶液
米国特許第５８２７９００号のように、リコピン（＞９７％）を５％のトマトオレオレジンから抽出した。合成リコピンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｉｓｒａｅｌ）から入手し、アスタキサンチンおよびβ−カロチンも同様であった。フィトエンは、Ｌｙｃｏｒｅｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，  Ｂｅｅｒ  Ｓｈｅｖｅ，  Ｉｓｒａｅｌにおいて、トマト抽出物から抽出された。
【００６１】
０．２５％のブチル化ヒドロキシトルエンを含有するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を、酸化防止剤として、精製カロチノイドに添加した。カラオチノイドを２ｍＭの濃度でＴＨＦに溶解し、−７０℃で保存した。使用の直ぐ前に、保存溶液を融解し、窒素下に細胞培地に添加し、次に、勢いよく撹拌した。形成した沈殿物を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過することによって除去した。米国特許第５８２７９００号のように、２−プロパノールおよびｎ−ヘキサン：ジクロロメタンで抽出した後に、分光測光法によって、培地における最終カロチノイド濃度を求めた。
【００６２】
０．５％の最終ＴＨＦ濃度は、測定したパラメーターにおける有意な作用を有さなかった。全ての手順を、薄暗い照明下で行った。
【００６３】
ホルモン、増殖因子および他の細胞培養物質
エストラジオール、ゲニステインおよびダイゼインは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。１５％のゲニステイン、１５％のダイゼインおよび１％のグリシテインを含有する大豆抽出物は、キッコーマン（千葉県、日本国）から入手した。ヒト組換えＩＧＦ−ＩはＧｒｏＰｅｐ（Ａｄｅｌａｉｄｅ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。ダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびＣａ２＋／Ｍｇ２＋−不含燐酸緩衝溶液（ＰＢＳ）は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ，  Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。
【００６４】
細胞系
ヒト子宮内膜癌（エストロゲン依存性）細胞系ＥＣＣ−１は、Ｄｒ．  Ｐ．  Ｇ．  Ｓａｔｙａｓｗａｒｏｏｐ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ＰＡ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．によって開発され、Ｄｒ．  Ｒ．  Ｏｒｅｇａｎ，  Ｎｏｒｗｅｓｔｅｒｎ  Ｎｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．によって寛大に我々に提供された。ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７（エストロゲン依存性）およびＭＤＡ−２３１（ホルモン非依存性）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。
【００６５】
細胞培養および細胞増殖アッセイ
ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ナイスタチン（１２．５μｇ／ｍＬ）、インシュリン（０．６μｇ／ｍＬ）および１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭにおいて、細胞を培養した。Ｖｉｇｎｏｎら（１９８７，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ，  １４６：１５０２−８）の方法によって、フェノールレッドを含有せず、１０％、次に３％の木炭剥離（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ＦＣＳを含有する培地における連続継代によって、細胞から内因性ステロイドを除去した。３％の木炭剥離ＦＣＳを含有するＤＭＥＤ中の細胞を、９６穴の多穴皿に接種した（１穴につき５０００細胞）。１日後、培地を、可溶化カロチノイドまたはＴＨＦのみを含有する培地に交換した。培地を毎日交換して、カロチノイドの連続供給を確実にした。
【００６６】
培養した後、米国特許第５８２７９００号に記載のように、細胞数および細胞増殖速度を、細胞ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの取り込みによって推定した。トリプシン化およびＩｓｏｔｏｎｅ−ＩＩでの稀釈後に、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターでの直接的細胞計数（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，  Ｌｕｔｏｎ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）によっても細胞増殖を測定した。２つの方法において、高い相関が見られた。
【００６７】
実施例１
イソフラボノイドによるＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞増殖の刺激
増加する濃度のイソフラボン、ゲニステインおよびダイゼイン（大豆製品における２つの主要イソフラボン）、および大豆抽出物を使用して、ＥＣＣ−１細胞を培養した。３日後に、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの取り込みによって、細胞増殖を測定した（図１、グラフＡ）。ゲニステイン、ダイゼインおよび大豆抽出物は全て、大豆を補給されたヒトの血漿に見られる範囲の０．４〜４μＭの濃度において、細胞増殖を刺激した。より高い非生理的濃度（＞１０μＭ）においては、ゲニステインおよび大豆抽出物は、培養において３日後に細胞増殖を阻害したが、ダイゼインは阻害しなかった（図１、グラフＡ）。これらの結果は、ゲニステインは子宮内膜癌細胞増殖において二相作用を有するが、ダイゼインは刺激作用だけを有することを示している。
【００６８】
さらに、単一の高濃度（４０μＭ）のゲニステイン、ダイゼイン、および大豆抽出物を使用して、ＥＣＣ−１細胞を培養し、細胞増殖を３日間にわたって毎日分析した。図１、グラフＢに示す結果は、１日間の培養後に、この高濃度のイソフラボンも細胞増殖を刺激するが、ゲニステインの阻害作用は、培養の２日目までだけに観察されることを示している。これらの結果は、細胞増殖阻害に一般に関連しているレベルに一時的に増加したレベルのイソフラボン、特にゲニステインは、実際に、大豆補給されたヒトに刺激性になりうることを示している。
【００６９】
実施例２
リコピンは、ホルモン依存性悪性細胞のゲニステイン刺激およびエストラジオール刺激の両方を阻害する
ホルモン依存性細胞系のＭＣＦ−７乳癌およびＥＣＣ−１子宮内膜癌の増殖における、エストラジオール補給およびゲニステイン補給の比較作用を試験した（図２）。これらの各細胞系において、ゲニステインは、実施例１で示したように、増殖における二相作用を示し、低濃度において刺激し、高濃度において阻害する（図２）。試験した各濃度のエストラジオール（１ｎＭおよび１０ｎＭ）は、細胞増殖に刺激性であるだけである（図２）。これらの結果は、ゲニステインの刺激作用が、そのエストロゲン作用によることを示している。
【００７０】
前記のように、ゲニステインまたはエストラジオールで刺激した細胞培養物に、リコピンをさらに補給し、３日間の培養後に細胞増殖を分析した。図２に示すように、３〜５μＭのリコピン補給は、試験したホルモン依存性癌細胞系の両方において、基礎増殖（ｂａｓａｌ  ｇｒｏｗｔｈ）およびエストロゲン誘発（ゲニステインまたはエストラジオール誘発）増殖の両方を顕著に阻害する。
【００７１】
実施例３
リコピンは、ホルモン依存性およびホルモン非依存性乳癌細胞のＩＧＦ−Ｉ刺激増殖を阻害する
図３は、ホルモン依存性ＭＣＦ−７乳癌細胞（グラフＡ）およびホルモン非依存性ＭＤＡ−２３１乳癌細胞（グラフＢ）の両方へのＩＧＦ−Ｉ（３０ｎＭ）の補給は、細胞増殖を顕著に刺激することを示している。ＭＣＦ−７細胞において、ゲニステインの刺激作用は、ＩＧＦ−Ｉの存在下にさらに増加する（図３、グラフＡ）。ＭＤＡ−２３１は、ＩＧＦ−Ｉによって刺激されるが、ゲニステインによって刺激されない。従って、ゲニステインだけがホルモン依存性癌細胞増殖を刺激するのではなく、ＩＧＦ−Ｉならびに他の増殖因子もこの作用をさらに増加させる。
【００７２】
前記のように補給された細胞培養物に、さらにリコピンを３から５μＭの濃度で補給した。図３に示すように、リコピンは、ホルモン依存性およびホルモン非依存性乳癌細胞系におけるＩＧＦ刺激を阻害する。ＭＤＡ−２３１細胞の場合、細胞増殖が、対照の細胞増殖より低いレベルに減少した。
【００７３】
実施例４
種々のカロチノイドが、ＥＣＣ−１細胞のエストラジオールおよびゲニステイン誘発増殖を阻害する
ＥＣＣ−１ホルモン依存性細胞系を、エストラジオール（１０ｎＭ、図４）またはゲニステイン（１μＭ、図４）によって刺激し、被験培養物に、種々のカロチノイドを付加的に補給した。結果は、明らかに、試験した全てのカロチノイド（リコピン、β−カロチン、アスタキサンチン、およびフィトエンとフィトフルエンとの混合物）が、エストラジオールおよびゲニステイン誘発細胞増殖を効果的に阻害することを示している。
【００７４】
実施例５
リコピンは、ＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞のエストラジオールおよびゲニステイン誘発増殖を、用量依存的に阻害する
ホルモン依存性子宮内膜癌細胞系ＥＣＣ−１を、エストラジオール（１０ｎＭ、図５）またはゲニステイン（１μＭ、図５）によって刺激し、被検培養物に、種々の濃度のリコピンを付加的に補給した。結果は、明らかに、リコピン濃度が増加すると共に、より強い阻害を生じるが、試験した全てのリコピン濃度はエストラジオールおよびゲニステイン誘発細胞増殖の両方を阻害するのに有効であったことを示している。試験した最も低いリコピン濃度（０．９μＭ）は、ヒト血清に見られる生理的範囲である。
【００７５】
実施例６
ＭＣＦ−７乳癌細胞を、ゲニステイン（４μＭ）によって刺激し、被検培養物に、リコピンまたはフィトエンまたは両方の組合せを、生理的濃度（図６、グラフＡ）、または生理的濃度より１の大きさの程度で高い濃度（図６、グラフＢ）で、付加的に補給した。結果は、非生理的高濃度の各カロチノイドが、植物エストロゲン誘発細胞増殖を顕著に阻害するのに有効であり、２つの組合せがさらに有効であることを示している（図６、グラフＢ）。生理的低濃度において、リコピンは、植物エストロゲン誘発細胞増殖を阻害するのに極僅かに有効であり、フィトエンは有効でなかった。しかし、リコピンとフィトエンの組合わせは、植物エストロゲン誘発細胞増殖を顕著に阻害するのに有効であった。
【００７６】
本発明の実施形態を例として記載したが、本発明の意図または特許請求の範囲を逸脱せず、多くの改質、変更および適応を加えて本発明を実施しうることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  イソフラボンおよび大豆抽出物による、ＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞増殖の刺激を示す図である。
【図２】  リコピンが、ホルモン依存性悪性細胞のゲニステイン−およびエストラジオール−誘発刺激の両方を阻害することを示す図である。
【図３】  ゲニステインおよびＩＧＦ−Ｉの存在下に培養された乳癌細胞における、リコピンの作用を示す図である。
【図４】  種々のカロチノイドが、ＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞のエストラジオール−およびゲニステイン−誘発増殖を阻害することを示す図である。
【図５】  リコピンが、ＥＣＣ−１子宮内膜癌細胞のエストラジオール−およびゲニステイン−誘発増殖を、用量依存的に阻害することを示す図である。
【図６】  ＥＣＣ細胞のゲニステイン誘発増殖における、リコピンおよびフィトエンの共同作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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