(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
等張平衡塩溶液と、５０ナノモル〜１５マイクロモル濃度のペントースとを含有する血小板保存媒体。
【請求項２】
前記ペントースがＤ−リボース又はキシルロース−５−ホスフェートである、請求項１に記載の媒体。
【請求項３】
前記ペントースが１００ナノモル〜５マイクロモル濃度で存在する、請求項１に記載の媒体。
【請求項４】
０．５〜２．５ミリモル濃度で存在するマグネシウム塩をさらに含有する、請求項１に記載の媒体。
【請求項５】
前記媒体から、グルコースが排除されている、請求項１に記載の媒体。
【請求項６】
前記平衡塩溶液が血漿である、請求項１に記載の媒体。
【請求項７】
以下のステップ：
（ａ）全血又は血漿から血小板を分離し、
（ｂ）平衡塩溶液中又は血漿中に、１ミリリットル当たり５×１０5〜１０×１０10個の血小板濃度で前記血小板を懸濁させ、そして
（ｃ）前記血小板懸濁液を、血小板懸濁液添加時に５０ナノモル〜１５マイクロモル濃度を形成するために充分な量のペントースを含む捕集バッグに、添加する、
を含む血小板保存方法。
【請求項８】
液体組成物であって、血小板と、等張平衡塩溶液又は血漿と、５０ナノモル〜１５マイクロモル濃度のペントースとを含む液体組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本発明は、1999年12月21日出願の米国特許仮出願第60/171,278号明細書および2000年3月14日出願の米国特許仮出願第60/189,285号明細書の、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
米国内では毎年、およそ８００万人の自発的供血者により、約１，２６０万単位（約６４３，０００件の自己供血を含む）の全血が供与されている。これらの単位は、毎年約４００万人の患者に輸血される。全血と呼ばれる各供血単位は、複数の成分、例えば赤血球、血漿、凝固因子、ガンマ・グロブリンおよび血小板に分離することができる。血液の需要は大きく、毎日、ほぼ３２，０００単位の赤血球が必要とされる。事故被害者、外科手術を受ける者、白血病、癌、または他の疾患、例えば鎌状赤血球病およびサラセミアの治療を受ける患者は全て、血液を利用する。
【０００３】
患者が全血の全ての成分を必要とすることは稀なので、血液銀行においては、血液を各成分に分離し、特定の状態または疾患に応じて患者によって必要とされるその部分だけを輸血するのが通常の措置である。「血液成分治療」と呼ばれるこのような処置は、数人の患者が１つの単位の血液から恩恵を受けることを可能にする。
【０００４】
全血は心臓、動脈、静脈および毛細血管を通って循環する生きた組織であり、栄養、電解質、抗体、熱および酸素を体内組織に運ぶ。全血は、赤血球と、白血球と、血漿と呼ばれるタンパク質状液体中に懸濁された血小板とから成っている。血液が凝固を防止するように処理されて、容器内にあることを可能にさせられる場合、赤血球は容器の底部に沈殿し、血漿は上部に残り、白血球は赤血球の頂部に層を形成することになる。この分離を促進するために遠心分離機が通常使用される。次いで血小板に富んだ血漿が取り出され、さらに例えば血小板、凝固因子、アルブミン、免疫グロブリンなどを分離するための処理を行うために、この血漿は滅菌バッグ内に入れられる。
【０００５】
赤血球は、ヘモグロビン、すなわち複合的な鉄含有タンパク質を含有する。ヘモグロビンは酸素を体内全体に運搬し、血液に赤い色を与える。赤血球から成る血液容積百分率は「ヘマトクリット」と呼ばれる。平均的なヘマトクリットは、成人男性で４７％である。２滴または３滴の血液中には約１０億の赤血球があり、６００個の赤血球毎に、約４０個の血小板および１つの白血球がある。赤血球は骨髄内で製造されて、連続的に産出され、循環系内で平均１２０日後、脾臓によって破壊され、取り除かれる。赤血球は血漿を除去することにより、全血から調製され、患者のヘマトクリットを上昇させる一方、全血増加を最小限に抑えることができる。このことは鬱血性心臓疾患を有するような患者にとって特に重要である。赤血球輸血から最も大きな恩恵を受ける患者の例としては、腎不全、悪性腫瘍、消化管出血のような障害から生じる慢性貧血を有する患者、および、外傷または外科手術から生じるような急性失血を有する患者が挙げられる。赤血球は最大１０年間の長期保存のために処理し、冷凍することができる。
【０００６】
このような成分の保存事情は変化している。過去１５年間にわたる細胞保存解決策の向上により、全血または赤血球の冷蔵保存寿命は２１日から４２日に延びた。血漿はより一層長く冷凍保存することができる。凝固因子のような孤立性タンパク質は、不定の保存寿命に応じてフリーズドライすることができる。
【０００７】
血小板は、種々の条件で凝集するようにプログラムされた、血液の極めて小さな細胞成分である。血小板は骨髄内で産出され、平均９または１０日間循環系内に生存し、その後脾臓により体内から除去される。血小板は生命に不可欠である。なぜならば、血小板は、外傷に起因する大量失血や日常生活において生じる血管漏れを防止するのを助けるからである。
【０００８】
血小板輸血は、出血の危険時に患者を支援する不可欠な部分である。輸血のために使用される血小板は２つの源、すなわち：ランダム供血者凝縮血小板と呼ばれる、全血単位に由来する凝縮血小板、または、血小板フェレーシス、すなわち供血者から血小板を連続的に分離し、同時に血小板を差し引いた血液を供血者に再輸液して戻す技術によって、ただ一人の供血者から得られるアフェレーシス血小板、から生じる。全血の単一単位から分離され、少量の血漿中に懸濁された血小板の濃度として、血小板単位が規定される。許容される単位は４０〜７０ｍｌの血漿中に懸濁された５．５  ｘ  １０10個未満の血小板を含有する。推奨される血小板用量は体重１０キログラム当たり１単位である。このような投与スケジュールは、輸血される１血小板単位当たり、１マイクロリットルにつき５，０００〜１０，０００個の血小板の目標増分をもたらすように、小児、幼児または成人に用いることができる。患者が小さければ小さいほど、相対用量は大きくなる。したがって小児または幼児は、１血小板単位当たり、２５，０００〜５０，０００個への増加を必要とする場合がある。
【０００９】
捕集または使用の様式がいかなるものであれ、血小板保存は、全血または他の成分の保管には見い出されない問題を引き起こす。上述のように、全血、白血球および赤血球は数週間４℃で保存することができる。凝集するようにプログラミングされ、その機能の一部として凝集可能でなければならない血小板は、低温保存中、沈殿可能にされた場合に凝集することになる。したがって標準的な血小板保存は、穏やかに攪拌しながらほぼ２０〜４０℃の室温で行われる。このような条件下でさえ、血小板は５日目までに機能を失う。
【００１０】
付加的な問題は、細菌汚染である。極めて厳しい無菌技術下で血液が引き出されても、不変に少数の細菌が捕集バッグに入ることがある。さらに、白血球は腐食性細菌を有する場合がある。このような白血球が破裂すると、細菌が放出されることがある。報告された生体は、例えば表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、バシラス種、ミクロコッカス種、連鎖球菌種、クレブシエラ菌種、およびサルモネラ菌種である。汚染検出の最も基準になる検査は、２週間のネガティブ・ペトリ培養である。輸血のための全血汚染について報告された罹患率は、１００，０００件当たり４８．５件である。血小板の場合はさらに悪い。すなわち、血小板細菌汚染は血液の場合よりも１０倍大きい。この高い罹患率は、血小板が細菌の成長を助成する室温で保存されるという事実に因ると考えられる。米国ＦＤＡは１９９６年以来、汚染された血小板による３７の死亡例を報告しており、フランス国では、年間約４件の死亡例が発生している。
【００１１】
血小板の生存時間を長くし、かつ細菌汚染を減らす組成物を提供する必要が未だ残っている。
【００１２】
発明の概要
前述の条件下で保存された血小板は、５日目までに約５％の血小板しか機能しなくなるような自発的活性化を受けることにより機能を失う。本発明は、５０ｎＭ〜５０μＭ、より好ましくは１００ｍＮ〜５μＭの範囲の濃度で、保存された血小板にペントースを添加する。このように処理された血小板は、５日間は正常な機能を維持し、１０日間の保存時に顕著な機能を示す。ペントース添加の予期せぬ付加的な利点は、細菌の成長を阻害することである。
【００１３】
血小板機能は、（１）活性化誘発アゴニストによる攻撃に応答する、細胞膜上での内部タンパク質の発現；（２）アゴニストによる攻撃時に凝集する能力；および（３）アデノシントリホスファターゼ分泌、により測定される。
【００１４】
内部タンパク質の発現は、分子を蛍光染料と複合させ、次いで蛍光細胞ソータに保存することにより測定することができる。一般的に、２つのモノクローナル抗体、すなわち発現させられた細胞表面分子と結合する第１の抗体と、活性化後にのみ発現させられる細胞表面分子と結合する第２の抗体とを使用するのが好ましい。それぞれのモノクローナル抗体は、異なる色の染料に複合させられる。この染料は分光蛍光分析により区別することができる。好ましい実施態様の場合、正常に発現させられる細胞表面分子は、ＧＰＩＩｂＩＩＩａであり、活性化後に発現させられる細胞表面分子はＰ-セレクチンである。タンパク質に対するモノクローナル抗体を製造することは当業者には良く知られている。Freilich他に1995年に発行された米国特許第5,470,738号明細書は、ＧＰＩＩＩａに対するモノクローナル抗体を製造する方法の一例である。別の抗血小板モノクローナル抗体は、Gralnischに1993年に発行された米国特許第5,231,025号明細書によって開示されたような、ＧＰ  ＩＶに対する抗体である。しかし、Becton-Dickinson(フィラデルフィア）のような企業から商業的に抗体を購入するのが最も便利である。
【００１５】
自発的活性化を基礎測定し、次いで細胞をアゴニストにより攻撃する。活性化のために攻撃された細胞と、基礎測定値との差が、細胞機能の尺度である。好ましい実施態様の場合、アゴニストは１０ｍＭのトロンビンである。
【００１６】
血小板機能の別のパラメータは、アゴニストにより攻撃された場合に凝集する能力である。血小板懸濁液は濃密であり乳白色である。凝集および引き続き行われるこの凝集体の沈殿は視覚的に評価するか、または、濃度計で測定することができる。
【００１７】
血小板機能のさらに別の尺度は、ＡＴＰの分泌である。良好に機能可能な血小板は、ＡＴＰを分泌することができるのに対し、既に活性化させられた、または他の形式で機能を失った細胞はＡＴＰを分泌することはできない。
【００１８】
本発明を説明するために、以下の用語は次の意味を有する：
「アゴニスト」は、血小板の細胞表面タンパク質に結合し、血小板機能を活性化させることになるリガンドを意味する。アゴニストは例えばトロンビン、エピネフリン、ＡＤＰおよびコラーゲンである。
【００１９】
「ペントース」は、Ｄ−リボース、キリルロースである五炭糖、またはリボースの五炭前駆体を意味する。アルコールキシリトールに関連するペントースもまた、ペントースの定義に含まれる。
【００２０】
「標準的な血小板保存状態」は、最小７の初期ｐＨを有する平衡等張塩類溶液中に、１ミリリットル当たり約１０  ｘ  １０5〜１０  ｘ  １０10個の血小板濃度で存在する懸濁液が、通気性のある保存バッグ内で穏やかに攪拌または回転されられ、室温で維持されている状態を意味する。
【００２１】
発明の詳細な説明
血小板は、巨核球と呼ばれる大きな骨の骨髄細胞から摘み取られた徐核細胞片である。血小板は徐核されているので、消耗されたタンパク質を再生するメカニズムを有してはいない。したがって、血小板は一旦活性化されるか、または機能を失ってしまうと、無機能のままになる。細胞再生のためのタンパク質を合成することはできないものの、血小板は、単位細胞集団当たりで他の殆どの細胞よりも多くのグリコーゲンを含有している。図１に示すように、血小板はまた、ミトコンドリア、すなわち、ＡＴＰ合成を引き起こす酸化的リン酸化を行う細胞小器官を含有している。保存容器は通気性を有することにより、酸化的リン酸化が解糖を介して助成されるようになっていなければならない。この解糖は乳酸塩の産出とｐＨの低下とを引き起こす。さらに、血小板は、アデノシントリホスフェートを含有する高密度顆粒を有している。したがって血小板は、血小板機能を発揮するのに必要なエネルギーと、エネルギー生成基質と、細胞小器官とを良好に備えている。図１はまた、血小板機能を調整する役割を果たす多くの細胞表面受容体のうちのいくつかと、活性化に従って細胞表面上に発現させられる内部タンパク質のうちのいくつかとを示している。実験的に活性化を誘発するのに特に役立つアゴニストは、トロンビン、エピネフリン、ＡＤＰおよびコラーゲンであるが、他のアゴニストを本発明に使用することもできる。同様に、細胞表面受容体はいずれも血小板の総数を評価するのに使用することができるが、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体が便利なマーカーである。同様に、アゴニスト活性後に血小板表面上に表示される（発現させられる）あらゆる内部タンパク質も、活性化された細胞の百分率を評価するのに使用することができるが、Ｐ−セレクチンが特に役立つ。活性化は、図２に示すように形態学上の変化をもたらす。
【００２２】
Ｐ−セレクチンは活性化後に血小板表面上に発現させられる内部タンパク質である。一旦活性化されると、血小板は再び活性化することはできない、すなわち、血小板は無機能になる。凝集した血小板も同様に無機能である。トロンビンによる活性化前後のＰ−セレクチンを測定することにより、活性化されるべき血小板の能力の尺度が得られる。
【００２３】
例１．  Ｐ−セレクチン発現の検定
１０ｎＭのトロンビンの攻撃に対応するＰセレクチン発現は、フロー・サイトメトリ技術を用いて血小板機能を評価するための高精度の計量的手法である。血小板ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体（Becton-Dickinson)に対するモノクローナル抗体を、緑色蛍光と複合し、緑色検出によって全ての血小板をマーキングする。赤色ＰＥ複合モノクローナル抗体（Becton-Dickinson)を添加し、活性化されて血小板の膜上にＰ−セレクチンを発現させた血小板だけを染色する（残りの活性化されていない血小板は、その表面上で発現させられたＰ−セレクチンを有しておらず、従って抗体にアクセス可能である）。Ｐ−セレクチン発現に関して、約１０，０００〜２５，０００個の血小板をカウントして測定し、Ｐ−セレクチンを発現させる活性化された血小板として、陽性細胞の百分率を定める。活性化された血小板が二度活性化されることは不可能である；すなわち、これらの血小板は本質的に無機能である。
【００２４】
例２．血小板保存のためのリボース濃度の検出
保存された全血には１５ｍＭの濃度のリボースが有益であることがDawsonによって数年前に提案された（Transfusion 21:215-218 (1981))。米国特許第6,159,942号明細書に詳細に論じられているように、細胞のエネルギーレベルを上昇させることによって、リボースが機能すると想定された。この特許明細書中でリボースを与えられた検体は、不都合な影響を受けることなしに毎日３０グラムのリボースの接種を許容した。しかしこの場合注意しなければならないのは、この血小板保存の環境が厳格な環境であり、無傷の生体の腎臓、肺および肝臓のホメオスタティック・メカニズムおよび緩衝メカニズムを欠くことである。血小板保存のための最適レベルを見極めるために、種々のＤ−リボース濃度をテストした。全血保存のためにDawsonにより使用された１５ｍＭは出発点であったが、しかし、このレベルのＤ−リボースは、低ｐＨを伴う乳酸塩の高産出を引き起こした。約６を下回るｐＨの低下は血小板に毒性を与えるので、低濃度をテストした。供血者から捕集後２時間以内に地方輸血センターから、血小板濃縮バッグを得た。血小板にＤ−リボースカクテルを直接バッグ内に補完するか、または、血小板を１０個のチューブ列に分けて各チューブ列に２ｍｌの血小板を添加した。ＡＴＰ分泌、血小板凝集、Ｐ−セレクチン発現、血小板のカウントおよびｐＨによって、血小板機能を評価した。血小板機能は２４時間毎に測定した。バッグおよびチューブは、実験中、室温で回転ホイール上に配置した。
【００２５】
濃度テストのために、種々のレベルのリボースを用いて、またはリボースを用いずに、室温で穏やかに攪拌しながら、標準的な血小板保存溶液中に５日間、血小板を保存した。５日目にＰ−セレクチン発現テストを実施した。図Ｉから明らかなように、活性化の保持には、１．５μＭ〜１５０μＭのリボースが最適であった。
【００２６】
【表１】
0004927282.tif 000002
【００２７】
リボースなしで５日間保存された血小板は、トロンビン攻撃を伴うＰセレクチン発現により見極められるように、無機能であった。１．５ｍＭおよび１５０ｎＭのＤ−リボースは、血小板が約６０％のＰ−セレクチン発現活性を保持することを可能にした。これに対して１５０ｐＭのＤ−リボースは機能を保持する効果を有さなかった。
【００２８】
要約すると、フロー・サイトメトリ・データは、Ｄ−リボースが保存中の血小板の老化を防止することを示し、アゴニスト攻撃に対する応答は、これらの条件下で時間と共に減少することはない。簡単に換言すると、血小板はＤ−リボースで処理された第１日目におけるのと同じ活性を、第５日目にも有する。
【００２９】
４．  ３日間保存された血小板におけるＰ−セレクチンの発現
血小板を標準的な血小板保存カクテル中に懸濁し、上述のように処理した。1989年にMurphyに発行された米国特許第4,828,976号明細書、および、1984年にRockに発行された同第4,447,415号明細書は、本発明に有益な、共通に使用されたいくつかの平衡塩類溶液を開示している。いずれの溶液もこれが等張ならば（約３１０〜１４０ｍＯｓｍ）、最小７．０のｐＨを有し、マグネシウムイオンを含有する。代表的なカクテルは次の通りである：
【００３０】
【表２】
0004927282.tif 000003
【００３１】
上記表から判るように、これら３つの血小板保存溶液の溶質組成物は極めてよく似ている。マグネシウムが成分であり、溶液が等張であり、かつｐＨが最小７であるならば、上述のいずれかまたは他を本発明に使用することができる。リボースが添加される溶液として、血漿が使用されてもよい。金属塩は典型的には、塩化物、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩または硫酸塩である。クエン酸塩は一般的には、血液捕集からのキャリー・オーバーに基づいて存在する。この場合クエン酸塩は抗凝結剤として存在する。
【００３２】
基礎値を与えるために、Ｐ−セレクチン発現に関して血小板をテストした。図３からわかるように、２．２％の血小板がすでに２時間で活性化されている。１０ｎＭのトロンビンを添加することにより活性化される場合、８０．９％の細胞が、図４に示すように活性化可能である。
【００３３】
標準的な条件下での３日間の保存後には、図５に示すように６１．２％の血小板が活性化されており、すなわち本質的に無機能となった。分離したアリコートをトロンビンで攻撃すると、付加的な活性は見られなかった。対照的に、１５３ｎＭのＤ−リボースと共に保存された細胞は、５％の陽性（活性化された）細胞しか示さず、トロンビンによる活性化は、３日間の保存後にも７８．８％の活性を保持することを示した。
【００３４】
長期間の研究は、１５０ｎＭのＤ−リボースと共に保存された血小板が、８日間の保存時にも７５％を上回る活性を保持し、１０日間の保存時にも５０％を上回る活性を保持することを示した。
【００３５】
５．  ＡＴＰ分泌
図１に示した血小板高密度顆粒は、血小板アゴニスト、例えばトロンビン、コラーゲンまたはアデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）に応答して放出されるＡＴＰを含有している。血小板からの放出反応は、血小板機能をモニタする別の方法として役立つ。ＡＴＰの分析する方法は数多くある。よく知られたルシフェリン／ルシフェラーゼ反応（Sigma Chemical,セントルイス）が便利な方法である。このような検定は、蛍の光生成系から導き出される。基質ルシフェリンはＡＴＰの存在において、酵素ルシフェラーゼによって劈開され、これには発光が伴う。この発光は光電倍増管によって測定される。
【００３６】
４０μｌ中に約３５０単位を含有する血小板懸濁液を、１０μｌのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬と混合した。アゴニストを注入した。血小板高密度顆粒がＡＴＰを放出するにしたがって、生物発光反応が発生する。この反応を光電倍増管によって測定する。図９は、反応および測定設定のダイヤグラムを示す。反応速度を記録し、血小板機能が減衰すると、速度も遅くなる。細胞をトリトンと溶解し、ＡＴＰ含量を検出することにより、総ＡＴＰを測定した。表ＩＩＩに示した結果は、手を加えていないＡＴＰ分泌速度として表される。
【００３７】
【表３】
0004927282.tif 000004
【００３８】
図ＩＩＩの結果から、未処理の血小板に比べて、Ｄ−リボースで処理した血小板のＡＴＰ分泌データが、他の保存剤では見出されない著しい効果を示すことが判る。対照血小板が保存の日毎に活性を失うことが判り、このことは第５日目までに平均速度が１５％未満となり、総ＡＴＯがベースラインの２５％未満になったことを意味する。最適量のＤ−リボースで処理した血小板に関しては、第５日目の平均活性は、まだベースラインの９０％にあり、一方、第７日目の活性はなおも８０％を越えていた。ＡＴＰ分泌は用量に依存する。１５ｍＭは効果を有しておらず（しかもこの用量は血小板に対して毒性を有する）、引き続く８回の連続稀釈後、濃度は１．５ｎＭとなり、保存効果は見られない。したがって、このテストは１５０ｎＭの濃度のＤ−リボースにおいて行った。なお、処理済細胞の総ＡＴＰ含量は１０％を上回る値だけ上昇した。
【００３９】
６．  血小板の凝集
血小板におけるリボース効果の第２の尺度として、血小板凝集を評価した。血小板の凝集は、血小板活性の重大な機能である；凝集できない血小板は本質的に無機能である。血小板を上述のように保存した。懸濁液の最適な密度をトロンビン攻撃の前後に測定した。このテストでは、１．５ｍＭまたは１５０ｐＭのＤ−リボースに保存された血小板が、攻撃中に凝集を示すことはなかったのに対し、１５μＭのＤ−リボースは極めて弱い効果を示した。１５０ｍＭのＤ−リボース中に保存された血小板はトロンビンによる攻撃中に強い凝集を示した。
【００４０】
血小板の凝集を血小板凝集計（Chronolog, Inc, Irvine, CA)で測定した。血小板に富んだ、濁った懸濁液をキュベット内で攪拌し、サンプルを通る、血小板の少ないブランクに対する光透過率を記録する。凝集剤を添加すると、露出したフィブリノゲン受容体（ＧＰＩＩｂＩＩＩａ）で活性化された血小板同士が、カルシウムおよびフィブリノゲンを含有する媒体中で、互いに密に接触させられ、徐々に大きな血小板凝集体を形成し、これに濁度の減小が伴う。次いで、光学密度の変化を機器によって凝集百分率に翻訳する。簡単に述べるならば、血小板が凝集するにつれて、より多くの光がキュベットを通過するようになる。
【００４１】
１０ｎＭのトロンビンに応答する第３日目の血小板凝集は、対照血小板の場合、５つのうち１つしか攻撃的な凝集応答を有さないことを示し、これに対して、Ｄ−リボースで処理された血小板サンプルは５つ全てが、第３日目に攻撃的な応答を示した。第５日目には５つのＤ−リボース血小板サンプルのうちの４つが応答し、第７日目には、５つのＤ−リボース血小板サンプルのうちの３つが、トロンビン攻撃に応答して凝集可能であった。
【００４２】
７．  ｐＨ
血小板濃縮物のｐＨを毎日モニタした。標準的な輸血の知識では、ｐＨが一旦６．４を下回ると、その血小板は廃棄されることが指示されている。Ｄ−リボースの添加は、乳酸塩産出を増大させる場合がある。乳酸塩産出の増大はｐＨ低下をもたらすおそれがある。高レベル（１５ｍＭ）のＤ−リボースによって処理されたサンプルは典型的には、保存４日間までにｐＨ６．０への低下を示す。しかしながら約１５０ｎＭの好ましい濃度では、乳酸塩は増大させられるものの、ｐＨはコンスタントなままである。
【００４３】
８．  他のペントース
リボースに細胞内変換すること、または直接的な効果を介して、他のペントースがＤ−リボースと同様の効果を有することができることが知られている。例１〜６の方法に従って、保存された血小板の活性保持に関してテストした。
【００４４】
（Ａ）  リブロース−５−ホスフェート
Sigma Chemical（セントルイス）からリブロース−５−ホスフェートを購入し、これを標準ＣＰＤ血小板保存溶液に添加した。機能の以下のパラメータをテストした：１０ｎＭのトロンビンに応答するＡＴＰ分泌；血小板凝集；トロンビン攻撃に応答するＰ−セレクチン発現；ｐＨ変化；および血小板カウント。捕集から数時間以内に輸血センターから血小板凝集体バッグを得た。血小板バッグからアリコートをサンプリングし、１．５ｍＭ〜１５０ｐＭの最終濃度を得るように、リブロース−５−ホスフェートを添加した。リブロース−５−ホスフェートなしの対照を比較のため分析した。血小板機能に関して２４時間毎にサンプルを分析した。上述の測定パラメータのいずれに関しても、対照との差異は観察されなかった。
【００４５】
（Ｂ）  キシルロース−５−ホスフェート
Sigmaからキシルロース−５−ホスフェートを購入し、これをＣＰＤ血小板保存溶液に添加した。例８（Ａ）に従って、実験処置を実施した。キシルロース−５−ホスフェートと共に保存され、ＡＴＰ分泌により測定された血小板は、第５日目において基礎値の６４．５％の保持率を示した。血小板凝集は第５日目に弱くなり、これに対して対照血小板は凝集しなかった。キシルロース−５−ホスフェートで処理された血小板の第５日目におけるＰ−セレクチンの自発的発現は、対照血小板では６４．１％であるのに対し、３７．５％であった。１０ｎＭのトロンビン攻撃に応答して、Ｐ−セレクチンの発現は６７．７％に増大した。
【００４６】
（Ｃ）  キシリトール
驚くべきことに、ペントース関連のアルコールキシリトールは、血小板機能の保持に利点を示した。しかしながらこれらの傾向は一貫性がなく、簡潔な結論は得られない。
【００４７】
９．  細菌汚染の低減
驚くべきことに、保存カクテルへのＤ−リボースの添加が細菌汚染の発生を低下させることが判った。テスト溶液と共に保温されている標準ペトリ皿におけるコロニー・カウントにより、細胞汚染を測定した。大部分の血小板保存溶液中のミリモル規模のグルコース濃度が、細菌の成長に関与すると想定される。上述のように、Murphy（表ＩＩ）は、血小板の保存のための、グルコースを含有しない溶液について開示している。グルコースを排除するか、またはグルコースレベルをミリモル規模からマイクロモル規模へ低下させることにより、細菌汚染の低減に著しい効果が得られるが、しかし、ＡＴＰ分泌およびＰ−セレクチン発現により測定された第５日目の血小板機能は貧弱であった。１５０ｎＭの好ましい濃度のＤ−リボースが溶液に添加される一方、血小板機能が、グルコースの存在において保存された血小板で実施された上述の例１〜６に見出されるのと同様のものであるならば、グルコースを排除するか、またはマイクロモル濃度に低下させることが可能であることが判った。
【００４８】
１０．  Ｄ−リボースの血小板機能保持メカニズム
ＡＴＰの産出によるリボースの生理学的機能の増強のために提案された標準的なメカニズムのいずれも、血小板保存に効力を発揮するようには見えない。ナノモル範囲での極めて低い最適容量は、エネルギー産出にとっては取るに足らないものに見えるであろう。血小板は、特に室温に保存された場合に極めて高い代謝率を有する。血小板は高レベルのグリコーゲン、すなわち、嫌気的解糖のためのエネルギー源と、酸化的リン酸化を実施できるミトコンドリアとを含有している。解糖が乳酸塩の産出を引き起こすので、血小板が出来る限り最善の生存のために酸素を必要とすることが注目されている。しかしそれでもなお、本発明はＲ−リボースが血小板保存のための保存剤であることを明示する。
【００４９】
本発明をある一定の実施例に関して説明してきた。本出願の教示内容にしたがって、本発明の本質および範囲から逸脱することなしに実施例を代替例と差し替え、実施例に変更を加えることは当業者ならば容易に可能である。したがってこのような代替例および変更例は添付の請求の範囲内にある。本明細書で言及した全ての文献を参考のためここに引用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は血小板の形態学的特性を示す図である。
【図２】  図２は、活性化前後の血小板の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】  図３は、血小板捕集の２時間後の基礎Ｐ−セレクチン出現を、（ａ）総血小板および（ｂ）活性化された血小板に関して示す。
【図４】  図４は、血小板捕集の２時間後の基礎セレクチン出現を、（ａ）総血小板および（ｂ）トロンビンにより活性化された血小板に関して示す。
【図５】  図５は、ペントースなしで３日間保存された血小板を、（ａ）総血小板および（ｂ）活性化された血小板に関して示す。
【図６】  図６は、ペントースなしで３日間保存された血小板を、（ａ）総血小板および（ｂ）トロンビンにより活性化された血小板に関して示す。
【図７】  図７は、リボースを用いて３日後の基礎Ｐ−セレクチン出現を示す。
【図８】  図８は、トロンビン活性化後、リボースと共に３日間保存された場合のＰセレクチン出現を示す。
【図９】  図９は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ検定を概略的に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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