(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＦプロモーターである配列番号１の塩基対１〜７３４および発現を上昇するのに適するＡＤＦイントロン１を含んで成る核酸構築物。
【請求項２】
配列番号１の塩基対１〜７３４およびＡＤＦイントロン１が異種核酸配列に操作可能に連結されている、請求項１記載の核酸構築物。
【請求項３】
植物で使用するのに適するＡＤＦプロモーターである配列番号１の塩基対１〜７３４およびＡＤＦイントロン１である配列番号１の８８２〜２１６１を含んでなる核酸構築物。
【請求項４】
ＡＤＦプロモーターである配列番号１の塩基対１〜７３４およびＡＤＦイントロン１である配列番号１の塩基対８８２〜２１６１が異種核酸配列に操作可能に連結されている、請求項３記載の核酸構築物。
【請求項５】
請求項２または４記載の核酸構築物を含有する少なくとも１つの植物細胞を含んで成る形質転換された植物。
【請求項６】
請求項２または４記載の核酸構築物を含んで成る種子または穀物。
【請求項７】
（ａ）請求項２または４記載の核酸構築物を含むベクターを植物細胞に導入する工程、および
（ｂ）該細胞から植物を再生させる工程、
を含んで成る植物の形質転換方法。
【請求項８】
（ａ）請求項２または４記載の核酸構築物を含むベクターを植物細胞に導入する工程、
（ｂ）該細胞から植物を再生させる工程、および
（ｃ）該核酸構築物を子孫に性的に伝達させる工程
を含んで成る種子の製造方法。
【請求項９】
該子孫により生産された種子を集める追加の工程をさらに含む請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
発明の背景
本発明は、植物の遺伝子工学に関する。本発明は、植物において組換え遺伝子の発現を制御するために有用なDNA配列および構築物を提供する。より詳細には本発明はトウモロコシのアクチン脱重合因子（ADF）に由来する新規調節配列を提供する。
発明の背景
植物の遺伝子工学プロジェクトには、導入遺伝子の発現を調節するために使用する種々の遺伝子要素に対する取り組みが必要である。そのような遺伝子要素の２つの例は、プロモーターおよびイントロンである。
【０００１】
転写の開始はプロモーターにより調節される。上記のプロジェクトには典型的には数種の異なるプロモーターの使用が必要である。１つのプロモーターは目的遺伝子を駆動するために使用され、そして例えば選択可能なマーカーを駆動するために異なるプロモーターを使用する。
【０００２】
真核遺伝子は通常、イントロンと呼ばれる非コード配列により中断されている。真核遺伝子の転写の初期生成物はmRNA前駆体であり、これはイントロンに相当する配列を含む。イントロンは翻訳後プロセッシング中に除去され、翻訳されてタンパク質を生成するmRNAを提供する。遺伝子発現の調節におけるイントロンの役割を特徴づける研究では、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の第１イントロン（Adh-1）が嫌気的条件下で発現を上昇させる能力を有することが示された。Callis J.,M.Fromm,and V.Walbot.(1987),Gene Dev.1:1183-1200．またイントロンは、嫌気的条件の不存在でも発現を刺激する（程度は低い）。この強化は、核中のmRNA前駆体の安定化の結果であると考えられている。Mascarenhas et al.は、Adh-1イントロンの使用によりCAT発現の12-倍および20-倍の強化を報告した。Mascarenhas et al.、「トウモロコシにおけるイントロンが媒介する異種遺伝子発現の強化（Intron-Mediated Enhancement of Heterologus Gene Expression in Maize)」、Plant Molecular Biology,15:913-920。遺伝子発現を上昇させる幾つかの他のイントロンがトウモロコシおよび他の単子葉植物から同定された。Vain,P.et al.(1996),Plant Cell Reports 15:489-494.また国際公開第98/5921号明細書も参照にされたい。
【０００３】
トウモロコシADFのcDNA配列は知られているが（GeneBank 寄託番号X97726）、ゲノムADF配列は公開されていない。特にADFプロモーターに関する配列はこれまでに公開されたことも、いかなるADFイントロンが同定されたこともない。配列の簡単な説明
配列番号１は、ADFプロモーターおよびADFイントロン１を含むAP2/BC294 PCR生成物に関するDNA配列である。
【０００４】
配列番号２は、pDAB305に関するDNA配列である。
発明の要約
本発明は、ADFプロモーターおよびADFイントロン１に対応するか、または由来するDNA分子を提供する。
【０００５】
本発明の別の観点では、本発明は5'から3'方向へ操作可能に連結された、
ａ）トウモロコシADFプロモーター；
ｂ）非翻訳リーダー配列
ｃ）イントロン；
ｄ）目的遺伝子；および
ｅ）3'UTR、
を含んで成るDNA構築物を提供する。
【０００６】
好適な態様では、ADFプロモーターは配列番号１のbp１〜734を含んで成り、そしてイントロンはAdh1イントロン１およびADFイントロン１（配列番号１のbp882〜2161）から成る群から選択される。
【０００７】
本発明の別の観点では、本発明は5'から3'方向に
ａ）植物中で機能的なプロモーター；
ｂ）非翻訳リーダー配列
ｃ）ADFイントロン１；
ｄ）クローニング部位；
ｅ）3'UTR、
を含んで成るDNA構築物を提供する。
【０００８】
本発明の別の観点では、本発明はトウモロコシADFプロモーター、好ましくは配列番号１のbp１〜878、またはトウモロコシADFイントロン１配列、好ましくは配列番号１のbp882〜2161を含んで成るプラスミドを提供する。
【０００９】
本発明の別の観点では、本発明は本発明のDNA構築物を含む少なくとも１つの植物細胞を含んで成る形質転換された植物を提供する。この植物は単子葉植物または双子葉植物でよい。好適な植物はトウモロコシ、イネ、ワタおよびタバコである。
【００１０】
本発明の別の観点では、本発明は本発明のDNA構築物を含む種子および穀物を提供する。
【００１１】
本発明の観点の１つでは、本発明は機能的な植物プロモーターを提供するADFプロモーターの欠失変更体を包含するものとみなす。そのようなプロモーターは、用語「ADFプロモーター」により包含される。実施例５のように試験した時、配列をpDAB621のbp3056〜3790またはpDAB625のbp3962〜4694から置き換えてバックグラウンドより高いレベルの一過性のGUS発現を与える構築物を生成することができるならば、配列はこの出願の目的のための「機能的プロモーター」を提供するとみなす。当業者は配列番号１中でADFプロモーターと同定された733bp配列からの種々の欠失体が、プロモーターとしての配列の機能性を破壊することなく作成できると理解するだろう。欠失実験は当該技術分野の技術範囲内にある。好ましくは本発明のADFプロモーターは、配列番号１のbp１〜734により特定される配列の200個の連続する塩基対と同一の200個の連続する塩基対を含んで成る。より好ましくは、配列番号１のbp１〜734により特定される配列の500個の連続する塩基対に同一の500個の連続する塩基対を含んで成るADFプロモーターである。
【００１２】
同様に、本発明はプロモーターと使用した時、発現を強化するように機能するADFイントロンの欠失変更体も網羅する。用語「ADFイントロン１」は、そのような欠失変更体を包含することを意図する。好ましくは本発明のADFイントロン１は、配列番号１のbp882〜2161により特定される配列の600個の連続する塩基対に同一の600個の連続する塩基対を含んで成る。より好ましくは、配列番号１のbp882〜2161により特定される配列の1000個の連続する塩基対を含んで成るADFイントロンである。
発明の詳細な記述
ADFプロモーターは、目的遺伝子の5'およびプロモーターの3'の非翻訳リーダーに包含されたイントロンを有する構築物中で使用する。適当なイントロンにはADFイントロン１、Adh1イントロン１、ユビキチンイントロン１およびブロンズ（Bronze）２イントロン１を含む。
【００１３】
本発明の構築物中に使用する非翻訳リーダー配列は、任意の適当な起源に由来することができ、そしてmRNAの翻訳を増すために特異的に修飾してよい。5'非翻訳領域はプロモーターの生来のリーダー配列、発現すべきコード領域または遺伝子の生来のリーダー配列、ウイルスRNA、適当な真核遺伝子から得ることができ、あるいは合成配列でもよい。
【００１４】
本発明の構築物に使用する目的遺伝子は、植物中で発現することを所望する任意の遺伝子でよい。特に有用な遺伝子は、除草剤、昆虫またはウイルスに対する耐性を付与する遺伝子、および改善された栄養価または植物の加工特性を提供する遺伝子である。適当な作物学的に有用な遺伝子の例には、昆虫耐性を付与するためのバチルス スリンギエンシンス(Bacillus thuringiensis）に由来する殺昆虫遺伝子、および5'-エノールピルビル-3'-ホスホシキメートシンターゼ（EPSPS）遺伝子、およびグリホセート除草剤に対する耐性を付与するそれらの任意の変異体を含む。当業者には容易に理解されるように、所望の特質を付与する作物学的に重要な遺伝子を使用することができる。
【００１５】
本発明の構築物に使用する3'UTRまたは3'非翻訳領域は、mRNAの効率的なプロセッシングを与えるものであり、情報の安定性を維持し、そして転写されたmRNA配列の3'末端へのアデノシン リボヌクレオチドの付加を支配する。3'UTRはプロモーター領域にとって生来のもの、構造遺伝子に生来のもの、または別の起源に由来するものでもよい。植物宿主中で発現することができる遺伝子から得られる広範な終結領域、例えば細菌性、オパイン、ウイルス性および植物遺伝子が利用可能である。適当な3'UTRには限定するわけではないが：例えばper5 3'UTR（国際公開第98/56921号明細書）、ノパリンシンターゼ（nos）遺伝子の3'UTR、tmL 3'、またはacp 3'を含む。
【００１６】
本発明は一般に、単子葉植物および双子葉植物の両方の構造遺伝子の発現に応用することができる。本発明は特に単子葉植物（単子葉）ファミリーの員、限定するわけではないがトウモロコシ、イネ、オオムギ、エンバク、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、ヤマイモ、タマネギ、バナナ、ヤシおよびチツメヤシを含む。本発明の好適な応用は、トランスジェニックトウモロコシ植物の生産である。本発明はイネ科（Graminaceae）のファミリー、特にトウモロコシ、コムギ、イネ、エンバク、オオムギおよびモロコシに応用することができる。双子葉植物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、テンサイ、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズおよびカノーラ（ナタネ）を含む。
【００１７】
ADFイントロン１は、発現を強化するためにADFプロモーター以外のプロモーターと使用することができる。ADFイントロン１と使用できるプロモーターは、植物中での使用に適する任意のプロモーターであることができる。選択したプロモーターは所望するタンパク質単独の十分な発現を引き起こすことができるべきであるが、特にADFイントロン１と使用した時、効果的な量の所望のタンパク質の生産をもたらすために、植物細胞およびそれらから再生された植物が発現したタンパク質により引き起こされる表現型的な特性を表すようにするべきである。適当なプロモーターは植物または植物DNAウイルスのような種々の起源から得ることができる。好適なプロモーターはADFプロモーター、per5プロモーター、35Tプロモーター（実施例２０および２３でこれから記載する）、およびユビキチンプロモーターである。有用なプロモーターにはカリフラワーモザイクウイルス19Sおよび35S（CaMV19SおよびCaMV35S）転写プロモーターのようなカリモウイルス群から単離されるものを含む。他の有用なプロモーターには、Kat et al.(1987)Science 236:1299-1302に記載された強化されたCaMV35Sプロモーター（eCaMV35S）、およびリボース1,5-ビホスフェートカルボキシラーゼオキシゲナーゼ（RUBISCO）の小さいサブユニットプロモーターを含む。他の適当なプロモーターの例は、イネのアクチンプロモーター；シクロフィリンプロモーター；ユビキチンプロモーター；ADH1プロモーター、Callis et al.,supra,;クラスIパタチンプロモーター、Bevan et al.(1986)Nucleic Acids Res.14(11),4675-4638；ADPグルコースピロホスホリラーゼ プロモーター；ベータ.−コングリシニンプロモーター、Tiemey et al.(1987)Planta 172:356-363；E8プロモーター、Deikman et al.(1988) Embo J.7(11) 3315-3320；2AIIプロモーター、Pear et al.(1989) Plant Mol.Biol.13:639-651；酸性キチナーゼプロモーター、Samac et al.(1990) Plant Physiol.93:907-914である。
【００１８】
ADFプロモーターまたはADFイントロン１を利用する遺伝子カセットの構築は、Sambrook et al.(1989)、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第２版、コールドスプリング；およびAusubel et al.(1987)、カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）、ジョン ウィリー アンド サンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク、ニューヨーク州に記載されるもののような周知な方法を利用して容易に行える。ADFプロモーターをコードするDNAは、周知の技法を使用することにより染色体DNAまたは合成起源のDNAから調製することができる。ゲノムDNAは標準的技法により単離することができる。Sambrook et al.(1989)；Mullis et al.(1987),Meth.Enz.,155:335.Horton et al.(1989),Gene,77:61.Erlich(ed)(1989).PCR法：DNA増幅の原理と応用（PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification）。 オリゴヌクレオチド合成により合成的配列を調製することも可能である。Caruthers(1983)の:DNAおよびRNAの方法論（Methodology of DNA and RNA）（編集）Weissman、およびBeaucage et al.(1981),Tetrahedron Letters,22:1859-1962)を参照にされたい。
【００１９】
また本発明は、DNA配列が発現に対して開示した効果を及ぼすことができるように、具体的に開示した調節配列と実質的な配列相同性を有するDNA配列も含む。
【００２０】
本出願で使用するところの、用語「実質的な配列相同性」とは、ヌクレオチド配列（DNAまたはRNAの場合）あるいはアミノ酸配列（タンパク質またはポリペプチドの場合）が、別のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と実質的な、機能的なまたは構造的な等価性を表すために使用する。実質的な配列相同性を有する配列間の任意の機能的または構造的差異は最少になるだろう：すなわちそれらは本出願で示すように機能するための配列の能力に影響を及ぼさない。本明細書に開示する配列と実質的な配列相同性を有する配列は通常、突然変異のような開示した配列の変異体であるが、合成配列でもよい。
【００２１】
ほとんどの場合で、本明細書に具体的に開示する配列と95％の相同性を有する配列は等価物として機能し、そして多くの場合でかなり低い相同性、例えば75％または80％も許容されるだろう。重要ではないこれらの配列の部分の配置には時間を要するが、当該技術分野では日常的であり、そして十分である。
【００２２】
上記配列に対応する配列は野生型に由来する配列中に１以上の修飾を含むことができるが、それでも各々の要素を本発明の教示に匹敵できるようにすると意図する。例えば上記のように、フラグメントを使用してよい。種々のヌクレオチドの限られた数の付加、欠失または非保存的置換、あるいは多くのヌクレオチドの保存的置換を含む修飾を単離した配列に包含することができる。さらにそのようなDNA分子の構造には、それらの調節制御下におかれた異種遺伝子の発現の強化を付与することを示した供給源を使用することができる。オリゴヌクレオチド配列を修飾するための例示的な技法は、ポリヌクレオチドが媒介する、部位特異的な突然変異誘発法を使用することを含む。Zoller et al.(1984),DNA,3:479;Higuchi et al.(1988),Nucleic Acids Res.,16:7351-7367;Horton et al.(1989),Gene,77:61;およびPCR法：DNA増幅の原理と応用（PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification）、（編集）Erlich(1989)。
【００２３】
生物材料を宿主細胞に導入するための通例の技法には、電気穿孔（Shigekawa and Dower(1988),Biotechniques,6:742;Miller,et al.(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:856-860;およびPowell,et al(1988),Appl.Environ.Microbiol.,54:655-669を参照にされたい)；直接的なDNA取り込みメカニズム（Mandel and Higa(1972),J.Mol.Biol.,53:159-162;Dityatkin,et al.(1972),Biochimica et Biophysica Acta,281:319-323;Wigler,et al.(1979),Cell,16:77;およびUchimiya,et al.(1982),Proc.5th Intl.Cong,Plant Tissue and Cell Cultureで,A.Fujiwara(編集),Jap.Assoc.for Planr Tissue Culture,Tokyo,pp.507-508を参照にされたい)；融合メカニズム（Uchidaz,et al.(1980)、生きている哺乳動物細胞への高分子の導入(Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells）で、Baserga et al.(編集) Wistar Symposium Series,1:169-185を参照にされたい)；感染剤（Fraley,et al.(1986),CRC Crit.Rev.Plant Sci.,4;1-46；およびAnderson(1984),Science,226:401-409を参照にされたい)；マイクロインジェクションメカニズム（Crossway,et al.(1986),Mol.Gen.Genet.,202:179-185を参照にされたい)；および高速発射メカニズム（Miller,Schuchardt,SkokutおよびGould（ダウケミカルカンパニー)への欧州特許第0 405 696号明細書を参照にされたい）。
【００２４】
選択した宿主細胞を形質転換するための適切な手法は、使用する宿主細胞に従い選択することができる。今日までの経験に基づき、いったん細胞に挿入されれば遺伝子の発現にそれほど差異はなく、形質転換の方法自体に起因し得ると思われる。いったん植物組織に導入されれば、構造遺伝子の発現は一過性の発現系でアッセイすることができ、あるいは植物ゲノム内への安定な組込みについて選択した後に測定することができる。
【００２５】
技法は植物組織のインビトロ培養、および多くの場合で全植物への再生について知られている。成熟トランスジェニック植物を作出する適当な手法は、使用する植物種に従い選択することができる。再生は植物の種毎に変動する。効率的な再生は、培地、遺伝型および培養の経過に依存するだろう。いったん全植物が得られれば、それらは少なくとも１つの配列のコピーは繁殖した子孫の細胞に存在する様式で、性的にまたはクローンにより複製することができる。再生した植物に由来する種子は将来の使用に備えて集め、そしてこの種子から植物を生育することができる。元の形質転換した植物から市販されている有用な栽培種への導入された遺伝子を転移させるための手法は、当業者には周知である。
【００２６】
以下の実施例では、すべての分子生物学的操作をモレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.,1982,コールドスプリングハーバーラボラトリー）に記載されている手法に従い行った。
【００２７】
【実施例】
実施例１
ADF 5'フランキング配列
アクチン脱重合因子遺伝子（Zmbap3）の5'フランキング配列は、トウモロコシのゲノムDNA、var.OQ414（ダウ アグロサイエンスの所有している系）から単離した。DNAシークエンシングは、ABI Prism DNA シークエンシングキットを使用してAmpliTaq(商標)ポリメラーゼFSを製造元の記載（パーキン エルマー(Perkin Elmer)／アプライド バイオシステムズ(Applied Biosystems）部門、フォスター市、カリフォルニア州）のように行った。シークエンシング反応はアプライド バイオシステムズ373A DNAシークエンサー（パーキン エルマー／アプライド バイオシステムズ部門）で行った。
【００２８】
ADF 5'フランキング配列を公開されたcDNA配列と比較し、そしてATG出発コドンに対して直ぐ3'のイントロンの存在により異なることが分かった。
【００２９】
以下の表は、AP2/BC294 PCR生成物（配列番号１）の特徴を示す：
AP2/BC294 PCR生成物の特徴
配列番号１のbp           特徴
0004911850.tif 000002
イントロンの最初の２つおよび最後の２つの塩基は、イントロンに対して内側のコンセンサスイントロンスプライス配列である。イントロンから直ぐに外側の配列もほぼコンセンサスである。
【００３０】
以下の実施例では、ADFプロモーターおよびADFイントロンをプラスミドpDAB305に基づく発現ベクターを使用して評価した。pDAB305は、カリフラワーモザイクウイルス35Sエンハンサー(35S)の直列コピーを含有するプロモーター、Adh1イントロン１の欠失変更体、およびuidA遺伝子に融合したトウモロコシ条斑モザイクウイルスコートタンパク質に由来する非翻訳リーダー、これに続いてnos3'UTRを含む5796bpのプラスミドである。pDAB305に関する配列を、配列番号２に与える。配列の特徴を以下の表に記載する。
【００３１】
pDAB305の特徴
0004911850.tif 000003
【００３２】
0004911850.tif 000004
実施例２
pDAB620の構造
プラスミドpDAB620は本質的にpDAB305であるが、ADFプロモーターでCaMV 35S二重強化プロモーターおよびADHイントロン１／MSVイントロンリーダーを置き換えた。GUSコード領域の後ろにイントロンを含まないADFプロモーターのクローニングのために、ADFプロモーターは5'HindIII部位および3'NcoI部位を付加するように設計されたプライマーを用いて増幅させた。PCR増幅は、100μlの全用量中に70ngの鋳型DNA（PCR（商標）2.1-Topo ベクター中にクローン化された配列番号１)、GeneAmp(商標)10×PCRバッファー（パーキン エルマー／アプライド  バオシステムズ部門）、50ピコモルの各プライマー、および５単位のAmpliTaqGold(商標)ポリメラーゼ（パーキン エルマー／アプライド  バオシステムズ部門）を使用して行った。増幅はGeneAmp(商標)PCR システム9600（PE/ABI)を使用して、以下の循環条件を使用して行った：96℃で10分間、94℃で１分間、55℃で２分間、72℃で３分間を20循環、続いて72℃での延長を７分間。生成した906bpのPCR生成物をPCR(商標）2.1-Topo（インビトロゲン：Invitrogen）にクローン化した。個々のコロニーは上記のようにDNA抽出およびシークエンシングのために選択した。ADFプロモーターをpDAB305へクローニングするために、ADFプロモーターフラグメントを組換え体PCR(商標）2.1-Topo（インビトロゲン）コロニーから、NcoIおよびHindIII制限酵素（ニューイングランドバイオラボズ社：New England Biolabs Inc.、ビバリー、マサチューセッツ州）を用いた消化によりHindIIIおよびNcoIフラグメントとして単離した。このADFフラグメントは調製用アガロースゲルで精製し、そしてDNAはGenElute Agaroseスピンカラム（スペルコ社:Supelco Inc.、ベルホンテ、ペンシルバニア州）を使用して抽出した。プラスミドpDAB305は、HindIIIおよびNcoI（ニューイングランドバイオラボズ社）を用いた消化により調製して、存在するプロモーターおよびイントロンを滴下した。消化したプラスミドは調製用アガロースゲル（FMC)で泳動し、フラグメントをゲルから切り出し、そしてDNAはGenElute Agaroseスピンカラム（スペルコ社）を使用してアガロースから抽出した。ADF HindIII／NcoIプロモーターフラグメントを欠失したpDAB305ベクターと合わせ、そして高速DNAライゲーションキット（以前はベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim)であったロッシュダイアグノスティクス(Roche Diagnostics）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、製造元の指示に従い連結した。Subcloning Efficiency DH5α（商標）コンピテント細胞（ギブコ／BRL、ゲヂスバーグ、メリーランド州）は、細胞に含まれるプロトコールに従いライゲーション混合物を用いて形質転換し、そして75μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地上にまいた。プレートを37℃で一晩インキューベーションした。個々のコロニーは記載したようにDNA抽出およびDNAシークエンシングのために選択した。CaMVプロモーター／ADHイントロンI／MSVリーダーフラグメントを置き換えたADFプロモーターフラグメントを含有するこのようなプラスミドをpDAB620と名付けた。
【００３３】
pDAB620の特徴
0004911850.tif 000005
実施例３
pDAB621の構造
プラスミドpDAB621は、ADH/MSVイントロンリーダーをADFプロモーターに対して3'に直ちに含む点で実施例２のpDAB620と異なる。修飾されたADHイントロン１／MSVリーダーの前のADFプロモーターをクローニングするために、PCR増幅を使用してADFプロモーターの5'および3'末端にそれぞれHindIIIおよびBamHI部位を包含するようにプライマーを設計した。ADFプロモーターのPCR増幅は、以下の条件を使用してRobocycler(商標)グラジエント96温度循環器（ストラタジーン）を使用して行った：PCR(商標)2.1-Topoベクター)にクローン化された70ngのDNA（配列番号１）、GeneAmp(商標)XL PCRキット（パーキン エルマー／アプライド バイオシステムズ部門）からの15μlの3.3×XLバッファーII、50ピコモルの各プライマー、１mM酢酸マグネシウム、0.2mMの各dNTP、1.5μlのrTth DNA ポリメラーゼ（パーキン エルマー／アプライド バイオシステムズ部門）。生成物をPCR(商標)2.1-Topo（インビトロゲン）にクローン化した。個々のコロニーを選択し、そしてDNAをアルカリ溶解法を使用して抽出した。ADFフラグメントを調製用アガロースゲルで精製し、そしてDNAはGenElute Agarose スピンカラム（スペルコ社）を使用して抽出した。ADFプロモーターをpDAB30にクローニングするために、ADFプロモーターを組換え体PCR(商標)2.1-Topo（インビトロゲン）クローンからHindIIIおよびBamHIフラグメントとして単離した。プラスミドpDAB305は、HindIIIおよびBamHI（NEB）で消化することにより調製し、存在するプロモーターを滴下した。ADF HindIII／BamHIプロモーターフラグメントを欠失したpDAB305と合わせ、そして高速DNAライゲーションキット（以前はベーリンガーマンハイムであったロッシュダイアグノスティクス、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結した。Subcloning Efficiency DH5α（商標）コンピテント細胞（ギブコ／BRL）はライゲーション混合物を用いて形質転換し、そして細胞は75μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地上にまいた。プレートを37℃で一晩インキューベーションした。個々のコロニーは記載したようにDNA抽出およびDNAシークエンシングのために選択した。CaMVプロモーターを置き換えたADFプロモーターフラグメントを含有するこのようなプラスミドはをpDAB621と名付けた。
【００３４】
pDAB621の特徴
0004911850.tif 000006
実施例４
pDAB625の構造
プラスミドpDAB625は、ADFイントロン１をADFプロモーターに対して3'に直ちにクローン化した点で本質的にプラスミドpDAB620とは異なる。ADFプロモーター／ADFイントロンベクターを作成するために、プロモーターおよびイントロン配列は、PCRスプライス重複延長法（PCRプロトコール：方法および応用のガイド(PCR Protocol:A Guide to Methods and Application）、Innis,M.;Gelfand,D,;Sninsky,J.;White,T.編集、1990,アカデミック出版(Academic Press）を使用して融合した。ADFプロモーターおよびADFイントロンは、適当なプライマーを使用して別の反応で増幅した。反応条件は以下の通りであった：100μlの全容量中に10ngの鋳型DNA（PCR（商標）2.1-Topo ベクター中にクローン化された配列番号１)、10μlのGeneAmp(商標)10×PCRバッファー（PE／ABI）、100ピコモルの各プライマー、５単位のAmpliTaq Gold(商標)ポリメラーゼ（PE／ABI）。循環は以下のプロフィールにプログラムしたGeneAmp(商標)PCR システム9600熱循環器で行った：95℃で10分間、(94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で１分間）を15循環、72℃で５分間。プロモーターフラグメントおよびイントロン生成物は、以下の成分を含むPCR反応で融合した：50μlの最終容量中に50ngの各PCR生成物、30μlの3.3×XLバッファー（PE/ABI)、４μlの25mM 酢酸マグネシウム、10μlの２mM dNTPs、100ピコモルの各プライマー、６単位のrTth DNAポリメラーゼ（PE/ABI)。反応は以下の循環プロフィールを使用してRoboCycler(商標)グラジエント96温度循環器（ストラタジーン）で行った：94℃で１分間、［94℃で30秒間、70℃で4分間]を20循環、72℃で10分間。生成した2184bpのPCR生成物は調製用アガロースゲル(FMC)で泳動した。フラグメントを切り出し、そしてDNAはGenElute Agarose スピンカラム（スペルコ社）を使用して抽出した。2184bpフラグメントが別のPCR反応で嵩を増し、そしてこの反応生成物をPCR(商標）2.1-Topo（インビトロゲン）にクローン化した。個々のコロニーは上記のようにDNA抽出およびシークエンシングのために選択した。ADFプロモーター／ADFイントロン融合物をpDAB305へクローニングするために、融合生成物は組換え体PCR(商標）2.1-Topo（インビトロゲン）コロニーから、HindIIIおよびNcoIフラグメントとして、HindIIIおよびNcoI制限酵素（ニューイングランドバイオラボズ社）を用いた消化により単離した。プラスミドpDAB305は、HindIIIおよびNcoI（NEB）を用いた消化により調製して、存在するプロモーターおよびイントロン／リーダーを滴下した。ADFプロモーター／ADFイントロンHindIII／NcoIプロモーターフラグメントを、HindIII／NcoI欠失pDAB305と合わせ、そして高速DNAライゲーションキット（以前はベーリンガーマンハイムであったロッシュダイアグノスティクス、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結した。Subcloning Efficiency DH5α（商標）コンピテント細胞（ギブコ／BRL）は、ライゲーション混合物を用いて形質転換し、そして75μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地上にまいた。プレートを37℃で一晩インキューベーションした。個々のコロニーは記載したようにDNA抽出およびDNAシークエンシングのために選択した。CaMVプロモーター／ADHイントロンを置き換えたADFプロモーター／ADFイントロンフラグメントを含有するこのようなプラスミドをpDAB625と名付けた。
【００３５】
pDAB625の特徴
0004911850.tif 000007
実施例５
ADF-GUS構築物の一過性試験
II型カルスのカルチャーを、遺伝型“Hi-II"の未熟な接合胚から開始した（Armstrong et al.(1991) Maize Genet.Coop.News Lett.65:92-93）。胚は、Hi-II親ＡおよびHi-II親ＢまたはHi-II植物の自家-または兄妹-受粉に由来するＦ2胚間の交配から温室で育てた雌穂から単離した。未熟胚（1.5〜3.5mm）は、N6塩およびビタミン類（Chu et al,(1978) N6培地およびその穀類作物の葯培養への応用（The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops.)、Proc.Symp.Plant.Tissue Culture)、ペキン(Peking)出版、43〜56)、1.0mg/L 2,4-D、25mM L-プロリン、100mg/Lカゼイン 加水分解物、10mg/L AgNO3、2.5g/L GELRITE（シュバイツァーハル（Schweizerhall)、サウスプレインフィールド、ニュージャージー州）、および20g/L シュクロース、pH5.8から成る15Ag10カルス開始培地で培養した。４〜６週間後、カルスを維持培地（AgNO3が除かれ、そしてL-プロリンが６mMに減らされた開始培地）にサブクローン化した。II型カルスの選択は、約12〜16週間行った。
【００３６】
各試験GUS構築物を、金粒子上にpDeLux（Nos 3'UTRを持つルシフェラーゼを駆動する35S修飾プロモーターを含む）と以下のプロトコールに従い共沈殿させた。等モル量のGUSプラスミドを使用した。全部で70μgのDNA、35μgの試験DNAを加えた35μgのpDeLux、および必要な時にはBluescript(商標)DNA（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）を、滅菌水で150μlに希釈した。DNAおよび水を30mgの表面を滅菌した1.0μmの球状の金粒子（バイオ−ラッド ラボラトリーズ：Bio-Rad Laboratories、ヘリキュラス、カリフォルニア州）に加えた。混合物をボルテックスで簡単に混合（約15秒間）した後、37μLの2.5M 塩化カルシウムおよび15μLの0.1M スペルミジン（遊離塩基）を加えた。30秒間ボルテックス混合した後、DNAおよび金を溶液から沈殿させた。上清を除去し、そして１mLのエタノールを加えた。DNA／金混合物を形質転換に使用する前に１：４に希釈した。
【００３７】
II型カルスを約16時間、浸透培地で前処理した。浸透培地は0.2M ソルビトールおよび0.2M マンニトールを含む維持培地から成った。その後、カルスはヘリウムブラスティングのために２％寒天で固化した60×20mmプレートに置いた。飛散および組織の損失を防ぐために、104μmメッシュスクリーンのカゴで各標的（500〜600mgのカルス）を覆った。標的はダウ アグロサイエンス ヘリウム ブラストデバイス 1.0（米国特許第5,141,131号）を使用して個々にDNA／金混合物を用いてブラスティングした。25インチHgの部分的真空下で、10cmの射撃距離および1500psiの圧で、DNA／金混合物を各標的に向けて４回加速し、１回の射撃あたり20μLを送達した。標的を各ブラスト後に180゜回転させた。ブラストしていないカルスを露出するために、手順の中間点で組織も混合した。ブラスティングを完了した時、標的は暗中26℃で一晩インキューベーションするために、元の浸透培地に置いた。
【００３８】
４つのII型カルス細胞系を各実験に選択した。構築物毎に各系からの２つの標的を使用した。また、すべての４つの系からプールした組織から成る２つの非形質転換対照（NTC）を含めた。対照は上記のプロトコールに従い浸透およびブラスティング培地に移したが、ヘリウムブラスティングは行わなかった。
【００３９】
ブラスティングから約20時間後、200〜400mgの各標的を1.5mLのサンプル管（コンテス:Kontes、ビンランド、ニュージャージー州）に移した。タンパク質の抽出のために、カルスは“90"に設定した0.35アンペア、40ワットのモーター（モデル102、ラエ コーポレーション:Rae Corporation、マッケンリー、イリノイ州)により駆動したステンレス鋼製のコンテス ペレット ペステルを使用して均質化した。ルシフェラーゼ アッセイ キット（プロメガ:Promega、マジソン、ウィスコンシン州）からの細胞培養溶解試薬を抽出バッファーとして使用した。プロテアーゼ阻害剤、フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）およびロイペプチンヘミサルフェート塩を、それぞれ１mMおよび50μMの濃度で溶解バッファーに加えた。挽く前に、１mgの組織あたり0.5μLの溶解バッファーをサンプル管に加えた。カルスは、各挽き時間の後に10-秒間の氷上でのインキューベーションを含む４回の25秒間の間隔で均質化した。その後、１mgの組織あたり1.0μLの溶解バッファーを、氷上に置かれたサンプルにすべてのサンプルの挽きが完全になるまで加えた。次いでサンプルは５℃で７分間、最速で２回遠心した（エッペンドルフ：Eppendirf、遠心モデル 5415）。第１回の遠心後、各管からの上清を取り出し、そしてペレットを捨てた。カルス抽出物（上清）は、２回目の遠心後にも集め、そしてGUSおよびLUS分析のために氷上に維持した。
【００４０】
LUSアッセイキットから、LUSアッセイバッファーは製造元の指示に従い調製した。このバッファーを室温に暖め、そして自動発光光度計（モデル1251 ルミノメーターおよびモデル1291 ディスペンサー、バイオ−オービット：Bio-Orbit、フィンランド）の分配ポンプに置いた。各サンプルは、20μLの抽出物を３個のポリプロピレンルミノメーターバイアルに加えることにより３連で試験した（ワラック:Wallac、ゲチスバーグ、メリーランド州）。バイアルあたり100μLのアッセイバッファーを分配し、そして発光を45秒の積分期間にわたり検出した。カルス抽出物ではなく20μLの抽出バッファーを含む「ブランク反応」も、各実験で測定した。
【００４１】
GUS活性の分析のために、GUS-Light（商標）アッセイキット（トロピックス:Tropix、ベットフォード、マサチューセッツ州)を使用した。ここでも各サンプルはルミノメーターのバイアルあたり20μLの抽出物を使用して３連で試験した。GUS-Light（商標）反応バッファーは、製造元の指示に従いアッセイキットから調製した。このバッファーを室温に暖め、そして180μLのアリコートを10-秒間の間隔で各ルミノメーターバイアルに加えた。室温で１時間インキューベーションした後、300μLのGUS-Light（商標）発光促進バッファーを加え、そして発光を５-秒間の積分時間にわたり検出した。カルス抽出物ではなく20μLの抽出バッファーを使用した「ブランク反応」も、GUSアッセイに含めた。
【００４２】
GUSおよびLUSの結果は、相対的な光単位（RLU）で報告した。「ブランク」およびNTCの読み取りの両方は、サンプルのRLUレベルから引いた。１つのGUS構築物を別の構築物と比較するために、GUSの読み取りは各々の平方根を使用してLUSデータに標準化し、試験した各サンプルについてGUS/LUS比を算出した。次に構築物あたりすべてのサンプルに関する比率を平均し、そして平均は統計的有意性を分析するためにＴ−試験を使用して比較した。修飾した35Sプロモーター(35S)/GUS/Nos ポリＡ構築物（pDAB305）を各実験の対照として使用した。試験構築物の発現レベルは、pDAB305活性のパーセントとして報告した。
【００４３】
プラスミドpDAB620は、35T対照に対してバックグラウンドよりも高い発現を示さなかった。しかし繰り返した実験では、pDAB621およびpDAB625はそれぞれ標準の平均62％および82％となった。pDAB621は対照よりも有意に低いレベルで一貫して発現した。一方pDAB625は、幾分より変動し、そして場合によってはpDAB305ほどよい発現をもたらした。
【００４４】
実施例６
トウモロコシにおける安定な発現
ADFプロモーター活性は、選択剤を含有する媒質の存在下でプラスミドpDAB630（ADFプロモーター／ADFイントロン／PAT／nosA）で形質転換したトウモロコシ組織のカルス形成の頻度により特徴付けた。イネのアクチンプロモーターの制御下にPATを含むトランスジェニックトウモロコシの発生（event）も作成して内部対照として役立てた。全部で15の並んだ実験では、ADF構築物は除草剤耐性の単離物の回収に関して、イネのアクチンプロモーターADF構築物と同様の性能であるか、またはそれを凌ぐかのいずれかであった。すべての生じたADFの発生において、サザン分析でPAT遺伝子の存在を確認した。
【００４５】
実施例７
トランスジェニックトウモロコシ
プラスミドpDAB625で形質転換した２つの発生からのトランスジェニック植物を、葉の組織中のGUS発現について分析した。定量的アッセイでは、全抽出可能なタンパク質の0.02％に等しいGUSレベルが観察された。
【配列表】
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