(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。以下同じ。）、又はその相補配列からなり、且つマイコバクテリウム・カンサシ（Mycobacterium kansasii）遺伝子の核酸配列とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
下記から選択されるマイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー対
（１）配列番号５で表される核酸配列からなるプライマーと配列番号６で表される核酸配列からなるプライマーとのプライマー対、
（２）配列番号１３で表される核酸配列からなるプライマーと配列番号１４で表される核酸配列からなるプライマーとのプライマー対。
【請求項３】
プライマーが標識物質で標識化された、請求項２に記載のプライマー対。
【請求項４】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項３に記載のプライマー対。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４で表される核酸配列、又はその相補配列からなる、マイコバクテリウム・カンサシ検出用プローブ。
【請求項６】
標識物質で標識化された、請求項５に記載のプローブ。
【請求項７】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
請求項２に記載のプライマー対を用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長物を検出することを特徴とする、マイコバクテリウム・カンサシの検出方法。
【請求項９】
更に、配列番号８０で表される核酸配列、又はその相補配列からなるプローブを用いて核酸増幅反応を行う、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
下記工程を包含することを特徴とする、請求項８に記載の検出方法、
（１）請求項２に記載のプライマー対を用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
（２）（１）で得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、その結果からマイコバクテリウム・カンサシを検出する。
【請求項１１】
電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、目的とする塩基対数のプライマー伸長物の画分を確認することにより行う、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、配列番号５３、５７、８０のいずれかで表される核酸配列、又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを、ハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下で行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１３】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
プライマーが標識物質で標識化されており、当該プライマーを用いて試料中の核酸を鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応を行い、得られたプライマー伸長物の標識を測定する、請求項８に記載のマイコバクテリウム・カンサシの検出方法。
【請求項１５】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
ポリメラーゼ連鎖反応を行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長物の標識を測定する、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応を行って得られた反応物中のプライマー伸長物を沈殿させた後、上清を除去することにより遊離の標識プライマーを除く、請求項１６に記載の検出方法
【請求項１８】
ポリメラーゼ連鎖反応を行って得られた反応物をゲルクロマトグラフィーで処理して、遊離の標識プライマーを除く、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１９】
請求項５に記載のプローブを標識物質で標識化したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出することを特徴とする、マイコバクテリウム・カンサシの検出方法。
【請求項２０】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２１】
下記のいずれかの構成である、マイコバクテリウム・カンサシ検出用キット
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４で表される核酸配列、又はその相補配列からなる、マイコバクテリウム・カンサシ検出用プローブ、
（２）配列番号５で表される核酸配列からなるプライマーと配列番号６で表される核酸配列からなるプライマーとのプライマー対、
（３）配列番号５で表される核酸配列からなるプライマーと配列番号６で表される核酸配列からなるプライマーとのプライマー対、並びに配列番号５３で表される核酸配列又はその相補配列からなるプローブ、
（４）配列番号１３で表される核酸配列からなるプライマーと配列番号１４で表される核酸配列からなるプライマーとのプライマー対、
（５）配列番号１３で表される核酸配列からなるプライマーと配列番号１４で表される核酸配列からなるプライマーとのプライマー対、並びに配列番号５７で表される核酸配列又はその相補配列からなるプローブ、
（６）配列番号５で表される核酸配列からなるプライマーと配列番号６で表される核酸配列からなるプライマーとのプライマー対、並びに配列番号８０で表される核酸配列又はその相補配列からなるプローブ。
【請求項２２】
プライマー及び／又はプローブが標識物質で標識化されたものである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
配列番号８０で表される核酸配列又はその相補配列からなるプローブが、５'末端がレポーター蛍光色素で標識化され、３'末端がクエンチャー色素で標識化されたものである、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅およびその検出系を利用した、臨床検査におけるＭ.カンサシ（Mycobacterium kansasii、以下、Ｍ.カンサシと記載する。）を検出及び／又は同定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
非結核性抗酸菌（nontuberculous mycobacterium, NTM）は、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に分類される抗酸性の性質を持つグラム陽性桿菌で、結核菌群及びMycobacterium.leprae以外の抗酸菌の一種である。【０００３】
非結核性抗酸菌のうち、臨床上問題となる菌種としては、Ｍ.カンサシ、Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）、Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）、Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）、Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）、Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）、Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）、Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）、Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）、Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）、等が知られている。特にＭ.カンサシとM.aviumの２種類の菌による感染症で、非結核性抗酸菌症全体の90％以上を占める。【０００４】
通常、非結核性抗酸菌は健常人に対しては無害であると言われているが、まれにヒトに対して感染性を示し非結核性抗酸菌症を引き起こす。特にＡＩＤＳウイルスに感染しているような免疫不全者においては重大な感染起因菌となる。非結核性抗酸菌症は、従来はまれな疾患であったが、近年増加傾向にあるため、結核菌と非結核性抗酸菌を短時間で鑑別する方法の開発が強く望まれている。更に、M.avium及びM.intracellulareの核酸増幅検出・診断法が健康保険の適用となってから全国で急速にしていることからも、その診断上の意義は大きい。【０００５】
非結核性抗酸菌は多くが抗結核薬に対して抵抗性を示すため、患者に抗酸菌感染症の疑いがある場合、結核症か非結核性抗酸菌症かの鑑別診断が、治療方針を決定する上で重要である。また、非結核性抗酸菌による病気は、その菌の種類によって治療法がそれぞれ異なるので、その菌種を決めることも非常に重要である。しかし、非結核性抗酸菌症には特異的な臨床症状がないため、臨床的所見、病理組織学的所見から結核症と非結核性抗酸菌症を鑑別し、更に非結核性抗酸菌の種類を特定することは極めて困難である。そのため、結核症か非結核性抗酸菌症かの診断は菌の同定によってなされなければならない。【０００６】
一般的な診断法としては、まず喀痰塗沫検査を行う。この検査では「抗酸菌陽性」ということが判るだけで、結核菌か非結核性抗酸菌かは鑑別できない。そこで、喀痰塗末検査で陽性だった場合には、小川培地等の培地上で分離培養して菌の培養検査を行い、結核菌か非結核性抗酸菌かを鑑別する。そして、さらに生化学的試験を行い、菌種の同定をする。しかしながら、一般にマイコバクテリウム属は発育が遅いので、培養にはかなりの時間を要する。そのため、従来の基本法である塗抹検査や培養検査を行った場合、結核症か否かの診断結果を得るためには菌の分離培養だけで３〜４週間を要する。そして、菌種を同定するための各種生化学的試験にさらに２〜３週間を要するという問題がある。【０００７】
また、Ｍ.カンサシの同定も、生化学的試験によっておこなわれる。Ｍ.カンサシの生化学的試験による主な同定方法は、細菌が光に露呈されると色素を生産する性質を利用するものであるが、いくつか他のマイコバクテリア属の種もＭ・カンサシと同様な生物化学的特性を示すため、通常、発色性によるＭ.カンサシの同定には問題がある。【０００８】
近年、遺伝子レベルで菌を検出する技術が開発されてきた。例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸増幅技術を利用した診断技術が有用な手段として検討されている。この方法は、感度が高く、数個の菌があれば検出できること、短時間（長くても４日）で検出できるという利点がある。しかし、通常のＰＣＲ法では、生菌でも死菌でも同様に検出してしまう。また菌数の多少に関わらず陽性と判定され、菌数がわからないため、感染性の有無の診断が不確実になる。更に、感度が高すぎるため、偽陽性の判定が出やすい等の問題点を有している。【０００９】
Ｍ.カンサシについては、Ｍ.カンサシのゲノムライブラリからＤＮＡプローブ（pMK1-9）を得たという研究がある(非特許文献１)。このＤＮＡプローブ（pMK1-9）は、Ｍ・カンサシのＤＮＡとの相補的ハイブリッドを形成できるが、他の種のマイコバクテリアとも同様にハイブリッドを形成してしまい、Ｍ.カンサシに特異的ではない。【００１０】
Ｍ.カンサシの同定に、pMK1-9プローブ及びＭ.カンサシのｒＲＮＡ遺伝子と特異的にハイブリッド結合する市販のＤＮＡプローブ(ACCUPROBETM, GenProbe, San Diego,カリフォルニア州)を用いることに注目した研究もある(非特許文献２)。しかし、この研究では、pMK1-9プローブ及び市販のＤＮＡプローブ(ACCU−PROBETM)のいずれとも相当数のＭ.カンサシ株種を検出できなかったことを報告している。【００１１】
さらに、Ｍ.カンサシの検出に市販のＤＮＡプローブ(ACCU−PROBETM)を用いて評価した別の研究もある(非特許文献３)。その研究者らはACCU−PROBETMが１００％種特異的であり、他のマイコバクテリア種に対するクロス反応を示さないが、実験中では、Ｍ.カンサシ株の中の７３％しか検出することができなかった。【００１２】
Ｍ.カンサシ特異的なＤＮＡハイブリッド形成プローブ(p6123) をＭ.カンサシの臨床分離体から精製することができたという報告がある(非特許文献４)。このプローブ(p6123)は実験に用いたすべてのＭ.カンサシ株に対してハイブリッド結合ができ、ロスらのＤＮＡプローブ（pMK1-9）に反応しなかったサブグループをも含む。米国特許第5,500,341号（特許文献２）は、p6123プローブから精製したＭ.カンサシ特異的増殖プライマーを開示している。【００１３】
さらにＢ．ボディングハウスら(B.Boddinghaus et al.)は、特異的に増殖し、マイコバクテリアＤＮＡにハイブリッド結合する、１６ＳのｒＲＮＡから精製分離したマイコバクテリア属特異的オリゴヌクレオチドを開示している(非特許文献５)。【００１４】
更に例えばＭ.カンサシの検出に有効なＤＮＡ領域の同定に関する研究もなされている（例えば特許文献１等）が、未だＭ.カンサシに特異的な診断法は確立されていないのが現状である。【００１５】
以上のことから、新たな非結核性抗酸菌を特異的に検出する方法を確立することが望まれている現状にあった。【００１６】
【特許文献１】特開平11-155589号公報
【特許文献２】米国特許第5,500,341号公報
【特許文献３】特開昭60-281号公報
【非特許文献１】Z. H. Huang et. al., J. Clin. Microbiol., 1991, 29, p.2125
【非特許文献２】B.C.Ross et al.,  J.Clin. Microbiol., 1992, 30, p.2930
【非特許文献３】Tortoli et al., Eur.J Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1994, 13, p.264
【非特許文献４】M. Yang et al., J.Clin. Microbiol., 1993, 31, p.2769
【非特許文献５】B.Boddinghaus et al., J. Clin. Microbiol., 1990, 28, p.1751
【非特許文献６】F.Poly et al., J. Bacteriology, 2004, 186, 14, p.4781-4795
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、診断上の偽陽性を排除した新規なＭ.カンサシ検出用プライマー、及びこれを用いた簡便、迅速且つ精度の高いＭ.カンサシの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は上記課題を解決する目的で成されたもので、以下の構成よりなる。
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。以下同じ。）、又はその相補配列からなり、且つマイコバクテリウム・カンサシ（Mycobacterium kansasii）遺伝子の核酸配列とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（２）配列番号５〜５２で表される核酸配列、又はその相補配列からなり、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー。
（３）配列番号１〜８０で表される核酸配列、又はその相補配列からなり、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・カンサシ検出用プローブ。
（４）請求項２に記載のプライマーを用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長物を検出することを特徴とする、マイコバクテリウム・カンサシの検出方法。
（５）請求項２に記載のプライマー及び／又は請求項５に記載のプローブを含んでなる、マイコバクテリウム・カンサシ検出用試薬キット。
（６）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの、マイコバクテリウム・カンサシ検出に使用するプライマーおよび/又はプローブ設計への使用。
【００１９】
本発明者らは、現在までに決定されたＭ.カンサシとその他の生物の各種遺伝子について、各種間の各遺伝子配列の相同性の理論的検証と実験的検証を重ねた結果、マイクロアレイ法を用いた方法により得られたＭ.カンサシ由来の核酸配列の断片の中に、Ｍ.カンサシの遺伝子配列の特定領域に特異的にハイブリダイズし、Ｍ.カンサシの検出に有用となる塩基配列が存在することを見出した。【００２０】
そこで、これらの知見をもとに更に鋭意研究の結果、Ｍ.カンサシに特異的なオリゴヌクレオチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４で表される核酸配列）を得、これらの核酸配列がＭ.カンサシの検出に有用であることを見出した。そして更にこれらの配列をもとにＭ.カンサシ検出用プライマー及びプローブを開発し、これらを用いたＭ.カンサシの検出方法を確立するに到った。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたＭ.カンサシの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、Ｍ.カンサシの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法でＭ.カンサシの検出を行うことにより、従来のプライマー又は／及びプローブを用いたＰＣＲ法による診断方法に比較して、診断上の偽陽性が排除可能となり、より高精度にＭ.カンサシの検出及び診断を行うことができる。更に、本発明の検出方法を用いることにより、Ｍ.カンサシ菌体の定量も行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】候補クローン１の塩基配列と、設計されたプライマーの所在位置を矢印で示す。
【図２】候補クローン２の塩基配列と、設計されたプライマーの所在位置を矢印で示す。
【図３】候補クローン３の塩基配列と、設計されたプライマーの所在位置を矢印で示す。
【図４】候補クローン４の塩基配列と、設計されたプライマーの所在位置を矢印で示す。
【図５】実験例１で、Ｍ.カンサシ由来ゲノムを用いて得られたＰＣＲ産物、Ｍ.カンサシのKATS2配列、及び特願2004-129272号明細書で配列番号８として示された配列（本明細書では配列番号８１として示す。）を用いて得られた、Cy3/Cy5の蛍光強度をもとに作製された散布図（スキャッタープロット）である。
【図６】実施例１において得られた電気泳動の結果である。  尚、各レーンの数字は、夫々以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。Ｍ４：分子量マーカー（マーカー４）、ａ：Escherichia coli （大腸菌）、ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）、ｃ：Mycobacterium kansasii（Ｍ.カンサシ）、ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）、ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）、ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）、ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）、ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）、ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）、ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）、ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）、ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）、ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）、ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）、ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）、ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）、ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）、ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）。
【図７】実施例４で行ったリアルタイムＰＣＲ検出結果を示し、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットした検量線である。
【符号の説明】
【００２３】
図５において、各記号は、それぞれ以下を示す。
(1)Ｍ．カンサシに対する特異性が高いと判断された候補クローン、
(2)特開平11-155589号に記載されたＭ.カンサシのKAS配列を用いた結果
(3)特願2004-129272号明細書に記載されたM.tuberculosis由来の配列番号８（本明細書では配列番号８１）を用いた場合の結果
(a) Cy5蛍光強度／Cy3蛍光強度の比率 ≧ 10.0 を示すライン
(b) Cy5蛍光強度／Cy3蛍光強度の比率 ≧ 5.0 を示すライン
(c) Cy5蛍光強度／Cy3蛍光強度の比率 ≧ 2.0 を示すライン
(a') Cy3蛍光強度／Cy5蛍光強度の比率 ≧ 10.0 を示すライン
(b') Cy3蛍光強度／Cy5蛍光強度の比率 ≧ 5.0 を示すライン
(c') Cy3蛍光強度／Cy5蛍光強度の比率 ≧ 2.0 を示すライン。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明に於いて、Ｍ.カンサシ遺伝子とは、Mycobacterium kansasiiの持つ全ゲノム配列における任意の核酸配列単位（領域）をいう。Ｍ.カンサシの全ゲノム配列は、まだ解読されていない。【００２５】
本発明に係るオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる（以下、本発明のオリゴヌクレオチドと略記する場合がある。）。【００２６】
本発明に係る配列番号１で表される核酸配列のオリゴヌクレオチドは517塩基、配列番号２で表される核酸配列のオリゴヌクレオチドは596塩基、配列番号３で表される核酸配列のオリゴヌクレオチドは636塩基、配列番号４で表される核酸配列のオリゴヌクレオチドは、726塩基の大きさである。【００２７】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば、（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、更に好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列のうち、連続する１０塩基以上、好ましくは２０塩基以上からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００２８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、配列番号５〜７９で表される核酸配列の一部若しくは全部を含有し、且つ連続する１０塩基以上を含有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００２９】
配列番号１で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号５〜１２又は配列番号５３〜５６で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられ、配列番号２で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号１３〜２６又は配列番号５７〜６４で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられ、配列番号３で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号２７〜４０又は配列番号６５〜７２で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられ、配列番号４で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号４１〜５２又は配列番号７３〜７９で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。【００３０】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００３１】
上記の、本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の一部若しくは全部を有するオリゴヌクレオチドとは、具体的には、本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドとハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００３４】
本発明に係るＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとは、前記したＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。そのハイストリンジェントな条件及びストリンジェントな条件は、前記したとおりである。【００３５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、「配列番号５〜７９で表される核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドに相補的な配列の一部若しくは全部を含有し、且つ連続する１０塩基以上を含有するもの」が挙げられる。【００３６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号５〜７９で表される核酸配列から選ばれる配列のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００３７】
尚、本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、１若しくは複数のヌクレオチドが欠失、挿入或いは置換されていたり、イノシン（I）のような修飾ヌクレオチドがあってもよい。【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドを得るには、自体公知の化学合成法により調製したものを用いればよい。そのため、クローン化したオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに比べ、容易、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能である。【００３９】
例えば、ＤＮＡの合成に通常行われている、ＤＮＡシンセサイザーを用い、通常のホスホアミダイト法にてオリゴヌクレオチドを合成し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる常法により精製すれば、目的とする本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。【００４０】
その他、本発明の目的を達成し得るオリゴヌクレオチドを探索（スクリーニング）する手段としては、FEMS Microbiology Letters 166: 63-70, 1998 あるいはSystematic and Applied Microbiology 24: 109-112, 2001などに示されているサブトラクション法があり、標的であるゲノムＤＮＡフラグメントから区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡフラグメントと反応したものを差し引く事で、候補配列を濃縮する方法論がある。【００４１】
また、特開平11-155589号公報（特許文献１）に示されているように、標的であるゲノムＤＮＡおよび区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡからの増幅産物のディファレンシャルディスプレイを作成するといったアプローチ、すなわち任意にプライムされたポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）を利用する方法論が考えられる。【００４２】
更に、いわゆるマイクロアレイ法と呼ばれる方法を利用することによっても、本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。それは、例えばＭ.カンサシゲノムＤＮＡのショットガン・クローンを作成し、得られたショットガン・クローン由来の精製ＤＮＡをスライドグラス上に配置したマイクロアレイを作成する。別に、標的であるＭ.カンサシのゲノムＤＮＡフラグメントを蛍光標識（標識１）したものを作成する。一方、区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡフラグメントを蛍光標識（標識２）したものを別途に作成し、対照実験を行う。すなわち、標識１および標識２の各々を同一反応系で用いる競合ハイブリダイゼーション法によって、マイクロアレイ上の配列との反応性（結合性）を検定する。これにより、標的であるＭ.カンサシのゲノムＤＮＡフラグメント（標識１）とより特異的に反応する配列候補群の選定が可能となる（例えば非特許文献６等）ため、これにより目的のオリゴヌクレオチドを選別するというものである。以下にマイクロアレイ法を用いた、本発明のオリゴヌクレオチドの選定方法の一例について詳説する。【００４３】
（１）Whole Genome Shotgun libraryの作製
Venter et al., Science. 2001 Feb 16;291(5507):1304-1351 に記載のWhole Genome Shotgun法を改変して、下記の方法で、Ｍ.カンサシのWhole Genome Shotgun libraryの作製を行う。【００４４】
まず、Ｍ.カンサシ菌株を、常法（例えばオートクレーブ処理とガラスビーズ等を用いた菌体の粉砕処理）によって処理し、更に常法に従って、ＤＮＡの抽出、精製を行う。得られた精製ＤＮＡ試料を、例えば終濃度20%のグリセロール存在下、5kPa〜9kPaの圧力下、ネビュライザーを用いて約1〜5分間処理し、ＤＮＡの断片化処理を行う。この処理により、目的とする500〜1000bpのサイズ分画を効率よく回収する事ができる。得られた分画を市販の抽出カラムを利用して精製する。【００４５】
その後、得られた分画（ＤＮＡ断片）を、常法に従いライゲーションによってベクターＤＮＡに組み込んだ組み換えＤＮＡ（Ｍ.カンサシのWhole Genome Shotgun library）を得る。そのために用いられるベクターＤＮＡとしては、後で形質転換する宿主細胞が大腸菌の場合には、例えば、pBS[例えばpBSII sk+ベクター(Stratagene社)]、pQE-TRIプラスミド (Qiagen社製)、pBluescript、pET、pGEM-3Z、pGEX等のベクターが挙げられる。ライゲーションの前に、予めＤＮＡポリメラーゼによる処理を行って、ＤＮＡ断片の末端を平滑化処理する等は任意である。【００４６】
次いで、得られた組み換えＤＮＡを用いて、適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る。その為に用いられる宿主細胞としては例えば、大腸菌（E.coli）が挙げられ、好ましくはJM109、DH5α、TOP10等が挙げられる。宿主細胞としては、このほかによりプラスミドやファージＤＮＡの導入効率の高い、Competent Cell（コンピテントセル）を用いても良い。例えば、E. coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ社製）等が挙げられる。【００４７】
形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法（Method in Enzymology, 68, 326-331,1979）等により行うことができる。また、市販のCompetent Cellを用いる場合には、その製品プロトコールに従って、形質転換を行えばよい。【００４８】
目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組換えＤＮＡが導入された形質転換体を選別するには、例えば、形質転換のために用いたベクターの性質を利用する方法が挙げられる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含有するベクターを用いれば、アンピシリンを含有する培地上で形質転換体を培養し、得られたクローンを選択することにより、目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組換えＤＮＡが導入された形質転換体（Ｍ.カンサシゲノムのWhole Genome Shotgun クローン）のlibraryが容易に得られる。【００４９】
（２）マイクロアレイ作製
続いて、下記の方法でマイクロアレイを作製する。【００５０】
即ち、上記(1)で得られたＭ.カンサシゲノムのWhole Genome Shotgunクローンから常法に従いＤＮＡを精製し、これをＰＣＲ用反応液に懸濁添加したものをＰＣＲ用試料として用い、適当なプライマー[市販のプライマーでも良い。例えばM13 Primer M1(タカラバイオ社製)及びプライマーM13 Primer RV(タカラバイオ社製)等]を用い、常法に従ってＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物を精製する。次いで常法に従ってＰＣＲ産物をマイクロアレイ用スライドガラス上にスポットし、これに150mJ/cm2のUV照射を行ない、スライドガラス上にＰＣＲ産物（ターゲットのＭ.カンサシ由来ＤＮＡを含む）を固定し、マイクロアレイを作成する。【００５１】
尚、必要に応じポジティブコントロールとして、例えばM.tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）等の結核菌に特異的な配列のＤＮＡや、Ｍ.カンサシゲノムの持つ配列のＤＮＡ等を用い、ネガティブコントロールとして例えば大腸菌由来のＤＮＡ等を用いて夫々同様にＤＮＡの断片化、ベクターへのライゲーション及び大腸菌の形質転換を行い、同様にＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物をスライドグラス上に固定して、夫々のマイクロアレイも作製する。【００５２】
（３）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
別に、Ｍ.カンサシ菌株から抽出、精製したゲノムＤＮＡおよび対照用ゲノム(例えばウシ型結核菌等の結核菌)ＤＮＡを、ヘキシルアミノ-UTPを用いた間接標識法により、夫々Cy3、及びCy5でラベリングする。【００５３】
例えばDeRisi研究室（www.microarrays.org）が発表したプロトコールを改変した間接標識法を例にとって説明する。この方法は、アミノ基をもつαUTP を使い、酵素伸長反応によりこれを分子内に取り込ませたＤＮＡ 鎖を作成する。そしてそのアミノ基に蛍光色素（サクシニイミド体）を化学的に結合させることによってＤＮＡをラベリングしようというものである。【００５４】
まず、出発材料（Ｍ.カンサシ由来ゲノムＤＮＡおよび対照用ゲノムＤＮＡ）を、常法に従い熱変性処理する[BioPrime DNA labeling system（インビトロジェン社製）等の市販キットを用いてもよい]。次いで、DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTPの混合液、dTTP、Ha-dUTP、Klenow酵素を添加し、37℃で3時間程度の伸長反応を行う。得られた反応産物を限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機等を用いて完全に乾燥させる。次に、乾燥させた上記反応産物にNaHCO3 を加えて混合し、2〜3 分常温静置する。【００５５】
別にCy3（またはCy5）をDMSO に溶かしたものを調製（Cy-dye Solution Cy3、Cy-dye Solution Cy5）する。このCy-dye Solution Cy3を対照用ゲノムＤＮＡを用いて得られた上記反応産物に、Cy-dye Solution Cy5をＭ.カンサシゲノムを用いて得られた上記反応産物に、各々加え、40℃で60 分程度インキュベート（遮光）する。さらに、それぞれの反応産物に4M NH2OH（使う直前に作成する）を加え、攪拌後に15 分程度インキュベート（遮光）することにより、それぞれのゲノムＤＮＡの標識化産物を得る。その後、得られた標識化産物を、限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機で完全に乾燥させる。【００５６】
得られた各々の乾燥状態のゲノムＤＮＡの標識化産物に対して、終濃度が0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液を調製し、これに乾燥状態のゲノムＤＮＡの標識化産物を懸濁混和させる。94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base のゲノムＤＮＡの標識化産物を断片化した生成物を得る（Cy3標識産物、Cy5標識産物）。【００５７】
Cy3標識産物及びCy5標識産物の各々を限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機等で完全に乾燥させる。【００５８】
マイクロチューブに、40μL、salmon sperm DNA（10mg/mL）、0.5μL、formamide  5μLを含有し、ArrayHyb Hybridization buffer（SIGMA社製）で全量を40〜50μlに調整した試薬溶液（後に使用するマイクロアレイのカバーガラスが24×55mm の大きさの場合の組成である）を加え、上記で得たCy3標識産物とCy5標識産物を同一の溶液中で懸濁混和懸濁混和後、95℃で5 分インキュベートし、Cy3Cy5標識産物溶液を調製する。続く(4)のマイクロアレイ・ハイブリダイゼーションに用いるまで70℃に保っておく。【００５９】
（４）マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション（アレイ上でのDNA-DNA hybridization）
前記(2)で作製したマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）上に、上記(3)で調製したCy3Cy5標識産物溶液を全てのせ、気泡が入らないようにカバーガラスをかぶせる。これをハイブリカセットにセットし、タッパーなどに蒸留水で湿らせたキムタオル等をひいて密閉し、65℃で8 時間以上反応させて（遮光）、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをカバーグラスごと2×SSC-0.1%SDS 溶液に室温で浸し、溶液中でマイクロアレイを静かに揺らしてカバーグラスをはずす。1×SSC、0.03％SDS溶液（60℃）で10 分間洗浄、0.2×SSC 溶液（42℃）で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液（室温）で10 分間洗浄後、新しい乾いたラックにマイクロアレイをすばやく移し、すぐに800prm で5 分間遠心を行って乾燥させる。【００６０】
（５）蛍光強度の測定；シグナル検出から数量化まで
蛍光読み取りスキャナーを用いて、上記(4)でマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定し、Cy3及びCy5の、２チャンネルでの蛍光強度を測定して、蛍光検出データを得る。蛍光シグナルの数量化は市販のＤＮＡチップ発現イメージ解析ソフトウェア等を用い、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行えば良い。【００６１】
ハイブリダイゼーションに用いたCy5標識産物は、Ｍ.カンサシ由来ゲノムを標識したものであり、Cy3標識産物は対照用ゲノムＤＮＡを標識したものである。そのため、Cy3とCy5の夫々の蛍光強度を測定した結果、Cy5の蛍光の方が強く検出されれば、対象のマイクロアレイのＰＣＲ産物がＭ.カンサシにハイブリダイズしたということを意味し、Ｍ.カンサシに対する特異性が高いと判断される。一方、Cy3の蛍光の方が強く検出された場合には、対象のマイクロアレイのＰＣＲ産物は、対照用ゲノムＤＮＡとハイブリダイズしたことを意味し、また、同じ程度の強さのCy3及びCy5の蛍光が検出されたり、何れも検出されなかった場合には、Ｍ.カンサシに対する特異性が低いと判断される。【００６２】
尚、マイクロアレイ上にポジティブコントロール（例えばM. tuberculosisに特異的なＤＮＡの断片、Ｍ.カンサシに特異的なＤＮＡの断片等）およびネガティブコントロール（例えば大腸菌由来ＤＮＡの断片等）がスポットされていれば、夫々のCy3Cy5蛍光強度を測定して、その蛍光強度の傾向をみれば、蛍光スキャナー測定における１つのデータ評価基準として利用する事ができる。【００６３】
さらに、Ｍ.カンサシ特異的検出のための候補配列をスクリーニングするために、ＤＮＡチップ上で検出されたCy3/Cy5の蛍光強度比（Ratio）を基に、散布図(スキャッタープロット)を作成して、次のように解析を行う。【００６４】
解析においては、用いたポジティブコントロール配列のうちＭ.カンサシに特異的なＤＮＡ断片のCy3/Cy5 Ratioの数値が特異性評価のための有用な基準値となる。即ち、スクリーニングを行った候補の中から、Cy3/Cy5 Ratioの数値解析の結果、有意にＭ.カンサシ特異的なシグナルが得られ（Cy5の蛍光強度が強い場合）、なおかつ上述のＭ.カンサシに特異的なポジティブコントロールのスポットに比べてRatioの数値が大きいクローンを選択する。【００６５】
更に、例えばABI PRISM310キャピラリーシーケンサー（アプライドバイオ社）等の機器を利用した常法に従い、得られた候補クローンの塩基配列決定を行えばよい。【００６６】
本発明に係るＭ.カンサシ検出用プライマーとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するプライマーが挙げられる（以下、本発明のプライマーと記載する場合がある。）。【００６７】
また、本発明のプライマーは、ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション等の条件に合わせて、配列番号１〜４で表される核酸配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドの中から、解離温度（Ｔｍ値）などを考慮して、適当な領域の適当な長さを選択して使用すればよいが、好ましくはプライマー配列としての特異性を維持するために必要な塩基数と考えられている１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３５塩基、更に好ましくは１８〜２５塩基の長さを有しているものがよい。【００６８】
プライマーの設計方法は、プライマー設計のために一般に用いられているソフトや、例えばプライマーデザイン用のWebツールPrimer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research.)等を用いて設計すればよい。【００６９】
本発明のプライマーに用いられる、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、前記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明に於いて記載したものと同じである。【００７０】
このようなプライマーの具体例としては、例えば配列番号５〜５２で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するものが挙げられる。【００７１】
本発明のプライマーのより好ましい具体例としては、配列番号５〜５２で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するもの、又は配列番号５〜５２で表される核酸配列から選ばれる配列に相補的な配列を含有するものが挙げられる。中でも、配列番号５、６、１３〜１６，２７〜３０，４１〜４４で表される核酸配列から選ばれる配列、又は配列番号５、６、１３〜１６，２７〜３０，４１〜４４で表される核酸配列から選ばれる配列に相補的な配列を含有するプライマーが挙げられる。【００７２】
尚、配列番号５〜１２で表される核酸配列を持つプライマーは、配列番号１で表される核酸配列をもとに設計されたものである。配列番号１３〜２６で表される核酸配列を持つプライマーは、配列番号２で表される核酸配列をもとに設計されたものである。配列番号２７〜４０で表される核酸配列を持つプライマーは、配列番号３で表される核酸配列をもとに設計されたものである。配列番号４１〜５２で表される核酸配列を持つプライマーは、配列番号４で表される核酸配列をもとに設計されたものである。【００７３】
図１に、配列番号１で表される核酸配列上の、配列番号５及び６で表される核酸配列を持つプライマーの所在位置を、1c_plate1_Fw1及び1c_plate1_Rv1 として、夫々矢印で示す。【００７４】
図２に、配列番号２で表される核酸配列上の、配列番号１３、１４、１５及び１６で表される核酸配列を持つプライマーの所在位置を、6c_plate1_Fw1、6c_plate1_Rv1、6c_plate1_Fw2、6c_plate1_Rv2として、夫々矢印で示す。【００７５】
図３に、配列番号３で表される核酸配列上の、配列番号２７、２８、２９及び３０で表される核酸配列を持つプライマーの所在位置を、8d_plate1_Fw1、8d_plate1_Rv1、8d_plate1_Fw2、8d_plate1_Rv2として、夫々矢印で示す。【００７６】
図４に、配列番号４で表される核酸配列上の、配列番号４１、４２、４３及び４４で表される核酸配列を持つプライマーの所在位置を、9c_plate1_Fw1、9c_plate1_Rv1、9c_plate1_Fw2、9c_plate1_Rv2として、夫々矢印で示す。【００７７】
また、配列番号１で表される核酸配列上の、配列番号７〜１２で表される核酸配列を持つプライマーの所在部位は、夫々次の通りである。
配列番号７（1c_plate1_Fw3）：33位〜51位、
配列番号８（1c_plate1_Fw4）：212位〜231位、
配列番号９（1c_plate1_Fw5）：315位〜334位、
配列番号１０（1c_plate1_Rv3）：185位〜204位、
配列番号１１（1c_plate1_Rv4）：411位〜430位、
配列番号１２（1c_plate1_Rv5）：461位〜481位。【００７８】
配列番号２で表される塩基配列上の、配列番号１７〜２６で表される核酸配列を持つプライマーの所在部位は、夫々次の通りである。
配列番号１７（6c_plate1_Fw3）：4位〜21位、
配列番号１８（6c_plate1_Fw4）：48位〜67位、
配列番号１９（6c_plate1_Fw5）：229位〜247位、
配列番号２０（6c_plate1_Fw6）：279位〜296位、
配列番号２１（6c_plate1_Fw7）：380位〜399位、
配列番号２２（6c_plate1_Rv3）：166位〜184位、
配列番号２３（6c_plate1_Rv4）：195位〜214位、
配列番号２４（6c_plate1_Rv5）：368位〜387位、
配列番号２５（6c_plate1_Rv6）：428位〜445位、
配列番号２６（6c_plate1_Rv7）：523位〜542位。【００７９】
配列番号３で表される塩基配列上の、配列番号３１〜４０で表される核酸配列を持つプライマーの所在部位は、夫々次の通りである。
配列番号３１（8d_plate1_Fw3）：5位〜22位、
配列番号３２（8d_plate1_Fw4）：54位〜72位、
配列番号３３（8d_plate1_Fw5）：207位〜226位、
配列番号３４（8d_plate1_Fw6）：289位〜308位、
配列番号３５（8d_plate1_Fw7）：472位〜490位、
配列番号３６（8d_plate1_Rv3）：151位〜169位、
配列番号３７（8d_plate1_Rv4）：220位〜239位、
配列番号３８（8d_plate1_Rv5）：335位〜353位、
配列番号３９（8d_plate1_Rv6）：408位〜427位、
配列番号４０（8d_plate1_Rv7）：616位〜635位。【００８０】
配列番号４で表される塩基配列上の、配列番号４５〜５２で表される核酸配列を持つプライマーの所在部位は、夫々次の通りである。
配列番号４５（9c_plate1_Fw3）：17位〜36位、
配列番号４６（9c_plate1_Fw4）：117位〜135位、
配列番号４７（9c_plate1_Fw5）：405位〜424位、
配列番号４８（9c_plate1_Fw6）：492位〜512位、
配列番号４９（9c_plate1_Rv3）：182位〜201位、
配列番号５０（9c_plate1_Rv4）：263位〜281位、
配列番号５１（9c_plate1_Rv5）：528位〜547位、
配列番号５２（9c_plate1_Rv6）：654位〜673位。【００８１】
尚、上記に於いて配列番号の後の（  ）内に、本発明に於いて命名したプライマーの名称を示した。【００８２】
本発明のプライマーを得る方法は、前記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。【００８３】
また、本発明のプライマーは、標識物質で標識化されていてもよい。【００８４】
本発明のプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。【００８５】
例えば、放射性同位体としては32P，33P，35S等、酵素としてはアルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等、蛍光物質としてはCyanine Dye系のCy3，Cy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、フルオレセイン等、発光物質としてはAcridinium Esterを含む化学発光試薬等が挙げられる。【００８６】
本発明のプライマーを放射性同位体により標識する場合は、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般によく用いられているランダムプライマー法、ニックトランスレーション法、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼによる5'−末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いた3'−末端標識法、ＲＮＡラベリング法等が挙げられる。【００８７】
本発明のプライマーを酵素で標識する場合は、アルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の、この分野に於ける常法である直接標識法を用いればよい。【００８８】
蛍光物質により標識する場合は、例えばフルオレセイン標識したヌクレオチドをこの分野に於ける常法の標識手法によりプライマーに取り込ませればよい。また、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチドの一員として置換する方法（例えば、Nucleic Acids Res.,1986年, 第14巻, p.6115参照）でもヌクレオチドを蛍光物質で標識することができる。その場合、５位にリンカーアームを有するウリジンを特開昭60-500717 号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリゴヌクレオチド鎖に蛍光物質を導入する方法もある。【００８９】
発光物質で標識する方法及びビオチンで標識する方法は、通常この分野で行われているヌクレオチドを発光標識又はビオチン標識する常法に従って行えばよい。【００９０】
本発明に係るＭ.カンサシ検出用プローブとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するプローブが挙げられる（以下、本発明のプローブと記載する場合がある。）。【００９１】
本発明のプローブに用いられる、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、前記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明に於いて記載したものと同じである。【００９２】
本発明のプローブは、ＰＣＲ(リアルタイムＰＣＲを含む)、核酸ハイブリダイゼーション等の条件に合わせて、配列番号１〜４記載で表される核酸配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドから、解離温度（Ｔｍ値）などを計算し、適当な領域の適当な長さを選択して使用すればよい。但し、プローブに十分な特異性を持たせたいのならば、プローブ配列としての特異性を維持するために必要な塩基数を考慮して設計することが望ましい。【００９３】
例えば、核酸ハイブリダイゼーション法（例えばサザン・ハイブリダイゼーション等）等に用いるプローブとしては、１０〜７００塩基、好ましくは１００〜６００塩基、更に好ましくは２００〜５００塩基の長さを有しているものが挙げられる。【００９４】
また、例えばリアルタイムＰＣＲ増幅系（例えばTaqManTM法、Molecular Beacon法等）等に用いるプローブとしては、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜４０塩基、更に好ましくは２０〜３０塩基の長さを有しているものが挙げられる。【００９５】
このようなプローブの具体例としては、例えば、配列番号５〜７９で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するプローブから選ばれるものが挙げられる。【００９６】
本発明のプローブの好ましい具体例としては、配列番号５〜７９で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。中でも、配列番号５、６、１３〜１６、２７〜３０、４１〜４４、５３、５７〜５９、６５〜６７、７３〜７５で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するプローブが好ましい。特に、配列番号５３、５７〜５９、６５〜６７、７３〜７５で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するプローブが好ましい。【００９７】
尚、配列番号５３〜７９で表される核酸配列は、本発明のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅される核酸配列である。フォワードプライマーとリバースプライマーの組合せと、それを用いたＰＣＲにより増幅される核酸配列の配列番号を表１に併せて示す。例えば、配列番号５３で表される核酸配列は、配列番号５で表される核酸配列のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号６で表される核酸配列のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される配列であることを示す。【００９８】
【表１】
0005076894.tif 000002
【００９９】
本発明のプローブを得る方法は、前記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。【０１００】
本発明のプローブは、標識物質で標識化されていてもよい。【０１０１】
本発明のプローブを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。【０１０２】
本発明のプローブを標識する標識物質の具体例及び標識化方法は、本発明のプライマーの標識方法の説明に於いて記載したとおりである。【０１０３】
また、後述するリアルタイムＰＣＲ検出法に於いて用いられる標識プローブとしては、本発明のプローブを、リアルタイム検出法において通常用いられている標識物質で標識化したものが挙げられる。例えば、5'末端がレポーター蛍光物質（カルボキシフルオレセイン（FAM）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、テトラクロロフルオレセイン(TET)等）で標識化され、3'末端がクエンチャー色素[例えばカルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）等の蛍光物質、Black Hole Quencher色素（BHQ），4-((4-(dimethylamino) phenyl)azo)benzoic acid (DABCYL)等の非蛍光物質]で標識化された本発明のプローブが挙げられる。【０１０４】
本発明に係るＭ.カンサシの検出に用いられる試料としては、喀痰、血液、咽頭粘液、胃液、気管支洗浄液、経気管支採取物、胸水などの穿刺液、尿、膿等の各種臨床材料が挙げられる。また、検体から単離、培養された培養菌体、これらより単離、精製された核酸、又は核酸増幅検出系等で増幅された核酸でもよい。【０１０５】
上記試料からＤＮＡを抽出・精製するには、検体からの抗酸菌（結核菌）ＤＮＡ抽出に用いられる常法に従って行えばよい。【０１０６】
例えば菌体を試料とする場合には、例えばSDS等の界面活性剤や、グアニジンチオシアネート（GTC）等の蛋白変性剤で菌体を処理指定結核菌の膜構造を破壊する方法、菌体をガラスビーズ等によって物理的に破砕する方法等が挙げられる。【０１０７】
喀痰を試料とする場合には、前処理として、米国疾病管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention、略称CDC）で推奨しているNALC （N-acetyl-L-cysteine） -NaOH法（Kent PT, Kubica GP, Pubric Health Mycobacteriology, A Guide for the Level III Laboratory, U.S.Department of Health and Human Services, Public Health Service, Center for Disease Control, Atlanta, U.S.A., 1985年, p.31-55）による検体の均質化を行えばよい。【０１０８】
その後、一般的なＤＮＡの調製法（フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿法等  Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin. Microbiol., 1990, Mar;28（3）, 495-503, Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J）によりＤＮＡの抽出及び精製を行えばよい。【０１０９】
検体から単離、培養された培養菌体を、Ｍ.カンサシを検出する試料として用いる場合を例にとって示すと、例えば小川培地上のコロニーを採取し、滅菌蒸留水に懸濁、遠心分離して菌体を集めた後、蒸留水に再懸濁し、オートクレーブ処理した後、菌体の粉砕処理（ガラスビーズによる物理的破砕等）を経て、さらに遠心分離して上清を回収する。得られた上清からＤＮＡを抽出精製すればよい。ＤＮＡの抽出精製には、そのための様々なキットが市販されているので、それを用いてもよいし、この分野に於ける常法（例えば、フェノール・クロロホルム抽出法、エタノールやイソプロパノール等を用いて沈殿させる方法等）に従って行ってもよい。例えば（株）キアゲン製イオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic-tip等を用いてＤＮＡの抽出、精製を行えばよい。【０１１０】
本発明に係るＭ.カンサシの検出方法としては、例えば
（Ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）をプライマーとして用いる方法、
（Ｂ）本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識化したものを標識プローブとして用いる方法、
等が挙げられる。以下に、夫々の方法について説明する。【０１１１】
（Ａ）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる方法
（Ａ）の方法としては、本発明のプライマーを用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長物を検出する方法が挙げられ、具体的には例えば、本発明のプライマーを用いて、これを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、ＤＮＡポリメラーゼ等による核酸増幅[例えばＰＣＲ；特許文献３、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法（Tsugunori Notomi et al., Nucleic Acid Res., 28, e63, 2000）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（臨床病理, 51(11), 1061-1067, 2003, Nov）、LCR(ligase chain reaction)法（特開平4-211399号）、SDA(strand displacement amplification)法（特開平8-19394号）]を行ってプライマー伸長させる方法が挙げられ、これによりＭ.カンサシの核酸配列の特定の領域の配列を増幅させることができるので、得られたプライマー伸長物を測定することにより、Ｍ.カンサシを検出することができる。【０１１２】
ＰＣＲに於いて用いられる本発明のプライマーの具体例は、前記したとおりである。【０１１３】
好ましくは、フォワードプライマーとしては配列番号５、７〜９、１３、１５、１７〜２１、２７、２９、３１〜３５、４１、４３、４５〜４８で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーとしては配列番号６，１０〜１２、１４，１６、２２〜２６、２８、３０，３６〜４０，４２，４４、４９〜５２で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。【０１１４】
より好ましくは、フォワードプライマーとしては配列番号５、７〜９、１３、１５、１７〜２１、２７、２９、３１〜３５、４１、４３、４５〜４８で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられ、リバースプライマーとしては配列番号５，１０〜１２、１４，１６、２２〜２６、２８、３０，３６〜４０，４２，４４、４９〜５２で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。【０１１５】
更に好ましくは、フォワードプライマーとしては配列番号５，１３、１５，２７、２９、４１、４３で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するもの、リバースプライマーとしては配列番号６，１４，１６，２８，３０、４２、４４で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものが特に好ましい。【０１１６】
好ましいフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せとしては、前記表１で示される組合せが挙げられる。【０１１７】
その中でも特に好ましいフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せとしては、
(１)フォワードプライマーが配列番号５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(２)フォワードプライマーが配列番号１３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号１４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(３)フォワードプライマーが配列番号１５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号１６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(４)フォワードプライマーが配列番号１３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号１６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(５)フォワードプライマーが配列番号２７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号２８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(６)フォワードプライマーが配列番号２９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号３０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(７)フォワードプライマーが配列番号２７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号３０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(８)フォワードプライマーが配列番号４１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号４２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(９)フォワードプライマーが配列番号４３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号４４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(10)フォワードプライマーが配列番号４１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号４４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、等が挙げられる。【０１１８】
上記プライマーを用いたＰＣＲの条件、操作法等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。【０１１９】
得られたプライマー伸長物を測定する方法としては、(Ａ−１)ポリメラーゼ連鎖反応を行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、(Ａ−２)リアルタイムＰＣＲ法による方法、(Ａ−３)標識プライマーを用いたＰＣＲを行って得られたプライマー伸長物の標識を測定する方法、等が挙げられる。【０１２０】
以下に、それぞれの方法について説明する。
（Ａ−１）ポリメラーゼ連鎖反応を行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法
この方法としては、例えば
「下記工程
（i）配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシの遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）として用い、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行う、
（ii）上記(i)で得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、その結果に基づいてＭ.カンサシを検出する、
を包含することを特徴とするＭ.カンサシの検出方法」が挙げられる。【０１２１】
電気泳動を行い、その結果からＭ.カンサシを検出する方法としては、例えば（Ａ−１−１）目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長物画分を確認することにより判定する方法、（Ａ−１−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより判定する方法等が挙げられる。【０１２２】
電気泳動法の条件、操作方法等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。【０１２３】
（Ａ−１−１）目的とする塩基対数のプライマー伸長物画分を確認することにより判定する方法
上記の、目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長物画分を確認することにより判定する方法としては、例えば、まずＰＣＲを行い、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行う。ＰＣＲで用いるフォワードプライマーとリバースプライマーから、増幅産物の大きさ（塩基対数）を予測しておき、得られた泳動画分が予測された大きさの増幅産物に該当するか否かを、常法により確認すればよい。例えば、得られた画分をエチジウムブロマイド等で染色して核酸種を視覚化するといった方法で、その増幅産物の特徴的大きさにより検出する等の方法が挙げられる。【０１２４】
（Ａ−１−１）の方法による具体的な判定方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。【０１２５】
（１）フォワードプライマーとして配列番号５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１６７塩基対の画分又は配列番号５３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。
【０１２６】
（２）フォワードプライマーとして配列番号７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号５４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１２７】
（３）フォワードプライマーとして配列番号８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号５５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１２８】
（４）フォワードプライマーとして配列番号９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号５６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１２９】
（５）フォワードプライマーとして配列番号１３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、２１６塩基対の画分又は配列番号５７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３０】
（６）フォワードプライマーとして配列番号１５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１６８塩基対の画分又は配列番号５８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３１】
（７）フォワードプライマーとして配列番号１３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、３３６塩基対の画分又は配列番号５９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３２】
（８）フォワードプライマーとして配列番号１７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３３】
（９）フォワードプライマーとして配列番号１８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３４】
（１０）フォワードプライマーとして配列番号１９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３５】
（１１）フォワードプライマーとして配列番号２０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３６】
（１２）フォワードプライマーとして配列番号２１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３７】
（１３）フォワードプライマーとして配列番号２７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１５６塩基対の画分又は配列番号６５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３８】
（１４）フォワードプライマーとして配列番号２９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１５６塩基対の画分又は配列番号６６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１３９】
（１５）フォワードプライマーとして配列番号２７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、３５８塩基対の画分又は配列番号６７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４０】
（１６）フォワードプライマーとして配列番号３１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４１】
（１７）フォワードプライマーとして配列番号３２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４２】
（１８）フォワードプライマーとして配列番号３３で表されるオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４３】
（１９）フォワードプライマーとして配列番号３４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４４】
（２０）フォワードプライマーとして配列番号３５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４５】
（２１）フォワードプライマーとして配列番号４１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１６３塩基の画分又は配列番号７３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４６】
（２２）フォワードプライマーとして配列番号４３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、１５８塩基対の画分又は配列番号７４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４７】
（２３）フォワードプライマーとして配列番号４１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、３８７塩基対の画分又は配列番号７５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４８】
（２４）フォワードプライマーとして配列番号４５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１４９】
（２５）フォワードプライマーとして配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号５０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１５０】
（２６）フォワードプライマーとして配列番号４７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号５１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１５１】
（２７）フォワードプライマーとして配列番号４８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号５２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１５２】
以上の中でも(1)、(5)〜(7)、(13)〜(15)、(21)〜(23)の方法が好ましい。【０１５３】
（Ａ−１−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより判定する方法
標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより判定する方法としては、例えば電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、本発明のプローブを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在の有無を、該標識プローブの標識を検出することによって確認したものを陽性と判定する方法が挙げられる。【０１５４】
用いられるプローブ及びプローブを標識する標識物質の具体例、並びにプローブの標識化方法は、前記したとおりである。【０１５５】
（Ａ−１−２）の方法による具体的な判定方法としては、例えば下記の方法が挙げられる。【０１５６】
（１）フォワードプライマーとして配列番号５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、得られた画分について配列番号５３で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１５７】
（２）フォワードプライマーとして配列番号７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号５４で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１５８】
（３）フォワードプライマーとして配列番号８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号５５で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１５９】
（４）フォワードプライマーとして配列番号９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号５６で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６０】
（５）フォワードプライマーとして配列番号１３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号５７で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６１】
（６）フォワードプライマーとして配列番号１５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号５８で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６２】
（７）フォワードプライマーとして配列番号１３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号１６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号５９で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６３】
（８）フォワードプライマーとして配列番号１７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６０で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６４】
（９）フォワードプライマーとして配列番号１８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６１で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６５】
（１０）フォワードプライマーとして配列番号１９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６２で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６６】
（１１）フォワードプライマーとして配列番号２０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６３で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６７】
（１２）フォワードプライマーとして配列番号２１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６４で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６８】
（１３）フォワードプライマーとして配列番号２７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６５で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１６９】
（１４）フォワードプライマーとして配列番号２９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６６で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７０】
（１５）フォワードプライマーとして配列番号２７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６７で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７１】
（１６）フォワードプライマーとして配列番号３１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６８で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７２】
（１７）フォワードプライマーとして配列番号３２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号６９で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７３】
（１８）フォワードプライマーとして配列番号３３で表されるオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７０で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７４】
（１９）フォワードプライマーとして配列番号３４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７１で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７５】
（２０）フォワードプライマーとして配列番号３５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７２で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７６】
（２１）フォワードプライマーとして配列番号４１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７３で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７７】
（２２）フォワードプライマーとして配列番号４３で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７４で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７８】
（２３）フォワードプライマーとして配列番号４１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４４で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７５で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１７９】
（２４）フォワードプライマーとして配列番号４５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号４９で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７６で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１８０】
（２５）フォワードプライマーとして配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号５０で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７７で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１８１】
（２６）フォワードプライマーとして配列番号４７で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号５１で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７８で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１８２】
（２７）フォワードプライマーとして配列番号４８で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号５２で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、配列番号７９で表される核酸配列の一部又は全部を含有する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。【０１８３】
以上の中でも(１)、(５)〜(７)、(13)〜(15)、(21)〜(23)の方法が好ましい。【０１８４】
本発明に係るＭ.カンサシの検出方法の詳細を、例えばフォワードプライマーとして配列番号５で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ、及び電気泳動を行った後、目的とする塩基対数のプライマー伸長物画分を確認する方法によって検出する場合（上記の（Ａ−１−１）の(１)の方法）を例に挙げて説明すると、以下の通りである。【０１８５】
まず、前記した方法に従い、Ｍ.カンサシの有無を検出すべき試料中から精製ＤＮＡ試料を得る。別に、前記した方法で、本発明に係るヌクレオチドから、ＤＮＡシンセサイザーを用いてホスホアミダイト法にて、配列番号５で表される配列を持つオリゴヌクレオチド（以下、Ic_plate1_Fw1と記載する。）及び配列番号６で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチド（以下、Ic_plate1_Rv1と記載する。）を合成する。【０１８６】
Ic_plate1_Fw1及びIc_plate1_Rv1、1.0〜4.0mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、夫々0.1〜0.6mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよび10〜80単位/mlのTaq DNA ポリメラーゼを含有する10mM Tris-HCl（pH8.9）緩衝液を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。【０１８７】
ＰＣＲ用反応液に精製ＤＮＡ試料を添加したものをＰＣＲ用試料として用い、ＤＮＡサーマルサイクラーにて、20- 40回ＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ後の反応液を、１.５％アガロースゲル電気泳動する。次いでエチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出する。また、分子量マーカーも反応液と同時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたＤＮＡ断片の長さを算出する。フォワードプライマーとしてIc_plate1_Fw1、及びリバースプライマーとしてIc_plate1_Rv1を用いたＰＣＲでは、Ｍ.カンサシの核酸配列中の167塩基対のＤＮＡ断片（配列番号５３）が複製されると予測される。そこで、167塩基対の蛍光バンドが確認されたものを陽性と判定すればよい。【０１８８】
(Ａ−２)リアルタイムＰＣＲ法による方法
本発明のＭ.カンサシの検出方法には、リアルタイム増幅検出系（例えば米国特許第5210015号、米国特許第5538848号の記載参照）も用いることができる。【０１８９】
リアルタイム増幅検出系による検出系の例として、例えばリアルタイムＰＣＲ検出系が挙げられる。【０１９０】
例えば、TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第5538848号の記載参照）、MGB Eclipse Probe System法（例えば米国特許第5,801,155号の記載参照）、Molecular Beacons Probe Technology法（例えば米国特許第5925517号の記載参照）、LUX Fluorogenic Primer法（Invitrogen Corporation）、Quenching probe-PCR（QP）法（例えば米国特許第6,492,121号の記載参照）など、様々なリアルタイムＰＣＲ検出法が本発明のＭ.カンサシの検出方法に用いることができる。【０１９１】
より具体的には、5'末端を例えばFAM等の蛍光色素（レポーター）で、3'末端をたとえばTAMRA等のクエンチャー色素で標識したプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第5538848号の記載参照）により、目的の微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できる。【０１９２】
即ち、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）として用い、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の5'末端がレポーター蛍光色素で標識化され、3'末端がクエンチャー色素で標識化されたものを標識プローブとして用いて、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、該標識プローブから遊離された標識物質を検出することにより行うである。【０１９３】
上記のリアルタイムＰＣＲ法の原理は以下の通りである。
すなわち、5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャー色素によってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からDNAポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。DNAポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが5'端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。【０１９４】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ検出系に用いられる5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識したプローブに用いられるプローブとしては、前記した本発明のプローブであればよい。実際には、選択したフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せでリアルタイムＰＣＲを行った場合に得られる増幅産物の塩基配列を持つプローブ、又は更にその配列から設計される塩基配列を持つプローブが用いられる。例えば、配列番号５と配列番号６のプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行う場合に用いられるプローブは、そのリアルタイムＰＣＲで増幅されると予想される配列暗号５３の塩基配列を持つヌクレオチドか、配列番号５３の塩基配列から設計される配列（例えば配列番号８０）を持つオリゴヌクレオチドが挙げられる。【０１９５】
また、5'末端を標識するレポーター蛍光物質としてはFAM、HEX、TET、Cy5，VIC等が挙げられるが、中でもFAMが好ましい。3'末端を標識するクエンチャー色素としては、TAMRA等の蛍光物質、BHQ（例えばBHQ2），DABCYL等の非蛍光物質が挙げられるが、中でもTAMRAが好ましい。【０１９６】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ検出系に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、前記のＰＣＲ法において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましい組合せも前記したとおりである。【０１９７】
リアルタイムＰＣＲ検出系に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常のリアルタイムＰＣＲで用いられているものを用いればよく、リアルタイムＰＣＲの手法は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、リアルタイムＰＣＲの一般的なプロトコルに従って行えばよい。【０１９８】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ検出系によるＭ.カンサシの検出方法の一例を説明すると、以下の通りである。【０１９９】
まず、前記した方法に従い、Ｍ.カンサシを検出すべき試料中から精製ＤＮＡ試料を得る。別に、ＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号５に示される配列（Ic_plate1_Fw1）、配列番号６に示される配列（Ic_plate1_Rv1）のオリゴヌクレオチドを合成する。【０２００】
また、Ic_plate1_Fw1およびIc_plate1_Rv1をプライマーとして用いたＰＣＲで増幅される配列番号５３の核酸配列から、プローブとして利用するための配列（例えば配列番号８０）を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成する。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素のFAMを、3'末端にレポーター消光体のTAMRAを常法により結合し、蛍光標識プローブを得る。【０２０１】
上記で調製したIc_plate1_Fw1をフォワードプライマーとして、Ic_plate1_Rv1をリバースプライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムＰＣＲを行う。【０２０２】
即ち、各１μMのプライマーIc_plate1_Fw1、及びプライマーIc_plate1_Rv1、100〜1000nMの蛍光標識プローブ、1.0〜4.0mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%TritonX-100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位/mlのTaq DNA ポリメラーゼを含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、反応液とする。反応液20μｌに精製ＤＮＡ試料1ngを加えたものをＰＣＲ用試料とし、これを９６穴反応プレートのウェルに入れ、適当なリアルタイムＰＣＲ検出装置等を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定する。【０２０３】
Ｍ.カンサシの判定においては、レポーター色素の発光量が測定された場合に、Ｍ.カンサシ陽性と判定すればよい。【０２０４】
また、リアルタイムＰＣＲ法では、検量線を作成することができるので、試料中のＭ.カンサシのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を得ることがでる。また、その数はＭ.カンサシの数に比例するので、試料中のＭ.カンサシの数も得ることができる。検量線の作成方法は、リアルタイムＰＣＲ法において通常行われている常法に従えばよい。例えば、標準としてコピー数既知のＭ.カンサシのゲノムＤＮＡ試料を用い、希釈系列の濃度（コピー数）のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を調製する。次いで各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を用いて上記方法に従いリアルタイムＰＣＲを行い、レポーター色素の発光量を測定する。各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲの各サイクル数（ｘ軸）に対する、測定した発光量の測定値(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成する。次いで、発光量が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引く。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の増幅曲線が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とする。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。【０２０５】
試料中のＭ.カンサシのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を定量するには、先ずＭ.カンサシを検出すべき試料中からＤＮＡを分離精製した後、得られたＤＮＡ試料についてリアルタイムＰＣＲを行い、同様に増幅曲線を作成する。検量線を作成したときのThと得られた増幅曲線が交差したCt値を得る。そのCt値を検量線に当てはめることにより、試料中のＭ.カンサシのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。【０２０６】
また本発明は、核酸増幅工程において、ＲＮＡ転写産物を利用した検出法を適用する事ができる。例えば、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）法（特許第2650159号）、３ＳＲ（self-sustained sequence replication）法（特公平7-114718号）、ＴＡＳ（transcription based amplification system）法（特表平2-500565号：国際公開WO88/10315号）、ＴＭＡ（transcription mediated amplification）法（特開平11-46778号）などが挙げられるが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させる。）を利用する一定温度核酸増幅法が測定系の自動化には適する。【０２０７】
(Ａ−３)標識プライマーを用いたＰＣＲを行って得られたプライマー伸長物の標識を測定する方法、
この方法としては、本発明のプライマーを前記した方法で標識化した標識プライマーを用いて試料中の核酸を鋳型としたＰＣＲを行い、得られたプライマー伸長物の標識を測定することによって、標識を検出できた場合には、Ｍ.カンサシ陽性と判定する方法が挙げられる。この方法に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、前記のＰＣＲ法において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましい組合せも前記したとおりである。【０２０８】
上記方法の場合、ＰＣＲを行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長物の標識を測定し、標識を検出できた場合に、Ｍ.カンサシ陽性と判定すればよい。【０２０９】
遊離の標識プライマーを除く方法としては、ＰＣＲ反応を行って得られた反応物中のプライマー伸長物を、核酸を沈殿させる常法（エタノール沈殿法、イソプロパノールを用いた沈殿法等）により沈殿させた後、沈殿しなかった遊離の標識プライマーを含有する上清を除去する方法等が挙げられる。【０２１０】
また、ＰＣＲ反応を行って得られた反応物を適当な条件下、ゲルクロマトグラフィーで処理して、プライマー伸長物と遊離の標識プライマーを分離する方法、電気泳動法により分離する方法等も挙げられる。【０２１１】
（Ｂ）本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識化したものを標識プローブとして用いる方法、
更に、本発明のＭ.カンサシの検出方法として、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）を標識物質で標識化したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出する方法が挙げられる。【０２１２】
具体的には、例えば
（Ｂ−１）本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に結合して、捕捉プローブとして用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、試料中のＭ.カンサシ由来の核酸を固相上に固定化させる検出法、（例えば、特開昭62-265999号の記載参照）、
（Ｂ−２）(B-1)の捕捉プローブと、本発明のプローブを標識した標識プローブを用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、固相担体上に補足プローブとＭ.カンサシ由来の核酸と標識プローブの複合体を形成させて、標識プローブの標識を測定するサンドイッチアッセイ（例えば、特開昭58-40099号の記載参照）を行う方法、
（Ｂ−３）ビオチンで標識した本発明のプローブを用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーション後、試料中のＭ.カンサシ由来の核酸をアビジン結合担体で捕捉する方法等が、挙げられる。【０２１３】
尚、本発明のＭ.カンサシの検出方法に用いられる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を阻害しないものを用いることができる。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。【０２１４】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。【０２１５】
また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などが用いられる。【０２１６】
本発明に係るＭ.カンサシ検出用試薬キットとしては、「配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）又は／及びプローブ（本発明のプローブ）として含んでなるＭ.カンサシ検出用試薬キット。」が挙げられる。プライマーは標識物質で標識化されたものであってもよい。その標識物質の具体例は前記したとおりである。【０２１７】
本発明のプライマーを含んでなるキットには、フォワードプライマーとリバースプライマーの一組のプライマーを含む組成も含まれる。その好ましい実施態様としては、たとえば下記のものが挙げられる。
（１）配列番号５で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号６で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
（２）配列番号１３で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号１４で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
（３）配列番号１５で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号１６で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
（４）配列番号１３で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号１６で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
（５）配列番号２７で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号２８で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
（６）配列番号２９で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号３０で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
（７）配列番号２７で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号３０で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
（８）配列番号４１で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号４２で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
（９）配列番号４３で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号４４で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
（10）配列番号４１で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号４４で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つＭ.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。【０２１８】
上記キットは、更に、本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識化したものを標識プローブとして含んでいてもよい。【０２１９】
更に、「本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして含んでなるＭ.カンサシ検出用試薬キット。」が挙げられる。該プローブは標識物質で標識化されたものであってもよい。【０２２０】
これらのキットを構成する構成試薬の好ましい態様及び具体例は前記したとおりである。【０２２１】
尚、本発明のＭ.カンサシの検出用試薬キットには、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。【０２２２】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。【０２２３】
また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などを含んでいてもよい。【０２２４】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。【０２２５】
尚、実施例で用いられる細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。
【実施例】
【０２２６】
実験例１．Ｍ.カンサシゲノム由来のクローンの選択
（１）ＤＮＡ試料の調製
まず、小川培地上で培養したＭ.カンサシ（Mycobacterium kansasii）のコロニーを精製水に懸濁し、オートクレーブ処理（１２０℃・２気圧、２０分）した後、菌体の粉砕処理（直径2mmガラスビーズによる物理的破砕）を経て、遠心分離し、上清を得た。得られた上清から、(株)キアゲン製のイオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic-tipを用いてＤＮＡの抽出、精製を行い、Ｍ.カンサシ由来のゲノムＤＮＡを得た。【０２２７】
得られた精製ＤＮＡを、最終400ng／μl（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、ＤＮＡ試料とした。【０２２８】
別に、ポジティブコントロールとして特開平11-155589号に記載されたＭ.カンサシのKATS2、及び特願2004-129272号明細書に配列番号８として記載されたM.tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）に特異的な配列（本明細書では配列番号８１として示す。）、ネガティブコントロールとして大腸菌のＤＮＡ抽出方法の常法に従いＤＮＡを抽出、精製した大腸菌由来のＤＮＡを用いて同様にＤＮＡ試料を調製し、同様に以下の処理を行った。【０２２９】
（２）Whole Genome Shotgun libraryの作製
上記(1)で得られたＤＮＡ試料24μgを材料として、以下の方法（Science. 2001 Feb 16;291(5507):1304-51 Venter et al.に記載のWhole Genome Shotgun法を改変）で、Whole Genome Shotgun libraryの作製を行った。【０２３０】
まず、ネビュライザー（インビトロジェン社製）を利用し、終濃度20%のグリセロール存在下、5kPa〜9kPaの圧力下で約10分間処理して、ＤＮＡ試料を断片化し、目的とする500〜1000bpのサイズ分画を効率よく回収する事ができた。得られた分画を(株)キアゲン製の抽出カラムを利用して精製した。【０２３１】
次に、タカラバイオ社製のDNA Blunting Kitを用い、T4 DNA Polymeraseの5'→3'polymerase活性と3'→5'exonuclease活性を利用して、得られたＤＮＡ断片の末端を平滑化した。これを平滑末端処理済みpBSII sk+ベクター(Stratagene社)とのライゲーション反応を行い、ＤＮＡ断片をpBSII sk+ベクター（ampｒ）に組み込んだ組み替えＤＮＡを作製した。【０２３２】
タカラバイオ社製E. coli JM109 Competent Cellsを用い、その製品プロトコールに従って、上記で得られた組み換えＤＮＡを用いてE. coli JM109 Competent Cellsの形質転換を行い、得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリン、0.2 mM IPTG、40μg/ml X-Galを含むLB-寒天培地にプレート培養した後、白色コロニーをピックアップし、目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組み換えＤＮＡが導入された形質転換体（Ｍ.カンサシゲノムのWhole Genome Shotgun クローン）のlibraryを得た。【０２３３】
（３）マイクロアレイ作製
下記の方法で、上記(2)で得られたＭ.カンサシゲノムのWhole Genome Shotgunクローンを用いてＰＣＲを行い、スライドガラス上に固定するプローブ材料を調製した。【０２３４】
各１μMのプライマーM13 Primer M1(タカラバイオ社製)及びプライマーM13 Primer RV(タカラバイオ社製)、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% Triton X-100（トリトンX-100、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社商品名）、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０２３５】
上記(1)で得られたＭ.カンサシゲノムのWhole Genome Shotgunクローンから常法に従いＤＮＡを精製し、これをＰＣＲ用反応液20μlに懸濁添加したものをＰＣＲ用試料（テンプレートとなる）として用い、MJ Research社のＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）にて、下記の反応条件で30サイクル ＰＣＲを行った。【０２３６】
ＰＣＲ反応条件：
熱変性： ９４℃、０．５分
アニーリング：５５℃、１分
重合反応： ７５℃、０．５分。【０２３７】
得られたＰＣＲ産物を精製後、固定化Buffer（終濃度3x SSC）と混合した。【０２３８】
タイピング用装置（GTMAS Stamp II; 日本レーザ電子社製）を使用し、スポットされるＰＣＲ産物の終濃度が300ng/μLとなるように調整し、装置内の湿度を55%に設定して、スライドガラス（CMT GAPS-II; Corning社製）上に、得られたＰＣＲ産物をスポットした（スポット径150-250μm）。スポットが終了したスライドグラスをUVクロスリンカー（UV Stratalinker1800; Stratagene社製）に移し、150mJ/cm2のUV照射を行なって、ＰＣＲ産物（目的のＤＮＡ）を固定化し、マイクロアレイを作成した。【０２３９】
（４）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識とマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション
ｉ）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
まず、BioPrime DNA labeling system（インビトロジェン社製）を利用し、Ｍ.カンサシ（ATCC12478）由来ゲノムおよび、対照用ゲノム(ウシ型結核菌、ATCC19274))ＤＮＡの各々2μgに対してそれぞれ製品中のrandom primer solution；20μLを混合し、熱変性（９５℃、5分間）処理を行った。【０２４０】
ついで、それぞれの熱変性処理物に、0.1M DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP（各5ｍM）の混合液 2μl、2.5ｍM dTTP 0.8μl、5ｍM Ha-dUTP 1.6μl、Klenow酵素(40U/μL) 1μlを添加し、total volume=50μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、37℃で3時間の伸長反応を行った。マイクロコンYM-30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5ml チューブにセットし、上記反応産物をカラムにのせ14000rpm で4 分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。【０２４１】
得られた乾燥反応産物に50ｍM NaHCO3 を10μl 加え混合し、2〜3 分常温で静置した。【０２４２】
別に、１mg のCy3（アマシャムバイオサイエンス株式会社）またはCy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を105μl のDMSO に溶かしたものを調製した。このCy-dye Solution Cy3 10μl を対照用ゲノム(ウシ型結核菌)を用いて得られた上記反応産物に加え、Cy-dye Solution Cy5 10μl をＭ.カンサシゲノムを用いて得られた上記反応産物に加え、それぞれ40℃で60 分インキュベート（遮光）を行った。【０２４３】
さらに、それぞれの上記反応産物に4M NH2OH（使う直前に作成する）を10μl 加え、攪拌後、15 分インキュベート（遮光）を行い、夫々の標識化産物、即ちCy3標識対照用ゲノム(ウシ型結核菌)ＤＮＡ及びCy5標識Ｍ.カンサシゲノムＤＮＡを得た。【０２４４】
得られた標識化産物を、マイクロコンYM-30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5ml チューブにセットし、上記で得られたゲノムＤＮＡの標識化産物をカラムにのせ14000rpm で4 分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。【０２４５】
iｉ）標識化産物の断片化工程
上記(4) i)で得られた乾燥状態のゲノムＤＮＡの標識化産物に対して、終濃度が0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液40μLを調製したものを加え、懸濁混和させた。次いで94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base の、ゲノムＤＮＡの標識化産物で断片化した生成物を得た。【０２４６】
なお、BcaBEST DNA Polymerase（タカラバイオ社製）及びrBst DNA Polymerase（EPICENTRE社製）を用いてラベル化効率（base／dye）を調べた結果、対照用ゲノム(ウシ型結核菌)ＤＮＡの約20塩基にdye 1分子が取り込まれ、Ｍ.カンサシゲノムＤＮＡの約10塩基にdye 1分子が取り込まれている事を確認している。【０２４７】
Cy3標識産物溶液およびCy5標識産物溶液の各々をマイクロコンYM-10（ミリポア社製）の限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。次いでマイクロチューブに以下の試薬を加え（後に使用するマイクロアレイ用のカバーガラスが24×55mm の場合）、上記で得たCy3標識産物とCy5標識産物を同一の溶液中で懸濁混和させた。【０２４８】
ArrayHyb Hybridization buffer（SIGMA社製）；40μL
salmon sperm DNA（10mg/mL）            ；0.5μL
formamide                               ；5μL
Total 40〜50μL
懸濁混和後、95℃で5 分インキュベートし、ハイブリダイゼーションまで70℃に保っておいた。【０２４９】
iii）マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション
前記(3)で得られたマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）上に、上記(4)ii)で得られたCy3標識産物とCy5標識産物の混合溶液を全てのせ、気泡が入らないようにカバーガラスをかぶせた。これをハイブリカセットにセットし、タッパーに蒸留水で湿らせたキムタオルをひいいたものの上に載せて密閉し、65℃で8 時間以上反応させてハイブリダイゼーションを行った（遮光）。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップをカバーグラスごと2×SSC-0.1%SDS 溶液に室温で浸し、溶液中でＤＮＡチップを静かに揺らしてカバーグラスをはずした。次いで1×SSC、0.03％SDS溶液（60℃）で10 分間洗浄、 0.2×SSC 溶液（42℃）で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液（室温）で10 分間洗浄した後、新しい乾いたラックにＤＮＡチップをすばやく移し、すぐに800prm で5 分間遠心を行って乾燥させた。【０２５０】
（５）蛍光強度の測定：シグナル検出から数量化まで
蛍光読み取りスキャナー（Protein Array Scanner；日本レーザ電子社製）を用いて、上記4)iii)で得られたマイクロアレイ上の蛍光強度を測定し、2ch(Cy3、Cy5)での蛍光検出データを得た。蛍光シグナルの数量化は日立ソフト社製のDNASISTM-Array（ＤＮＡチップ発現イメージ解析ソフトウェア）を用い、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行った。また、信頼性限界ラインを定め、それ以下の領域のデータは扱わない事で正規化され信頼性のある蛍光強度比を求めた。【０２５１】
尚、マイクロアレイ上には、ポジティブコントロール（M.tuberculosisに特異的なＤＮＡの断片、Ｍ.カンサシのKATS2配列の断片）及びネガティブコントロール（大腸菌由来のＤＮＡの断片）がスポットされている。【０２５２】
さらに、Ｍ.カンサシ特異的検出のための候補配列をスクリーニングするために、ＤＮＡチップ上で検出されたCy3/Cy5の蛍光強度比（Ratio）を基に、散布図(スキャッタープロット)解析を行った。結果を図５に示す。【０２５３】
比較として、特開平11-155589号に記載されたＭ.カンサシのKATS2配列、及び特願2004-129272号明細書に記載されたM.tuberculosis由来の配列番号８（本明細書では配列番号８１）を用いて、同様に処理し、Cy3及びCy5の蛍光を検出した結果も図５に併せて示す。【０２５４】
図５には、散布図の全体と、プロットが集中した（点線で丸く囲んだ）一部を拡大したものとを示している。散布図は、横軸のCy3の蛍光強度に対するCy5の蛍光強度を縦軸に、両対数グラフで示している。図５に於いて、(2)及び(3)以外のスポットは、各マイクロアレイ上のＰＣＲ産物を用いた結果を示し、(2)として丸く囲んで示したスポットは、特開平11-155589号に記載されたＭ.カンサシのKAS配列を用いた結果であり、(3)として丸く囲んで示したスポットは、特願2004-129272号明細書に記載されたM.tuberculosis由来の配列番号８（本明細書では配列番号８１）を用いた場合の結果を夫々示す。【０２５５】
また、図５上の各ラインの意味は、以下の通りである。【０２５６】
(a) Cy5蛍光強度／Cy3蛍光強度の比率 ≧ 10.0 を示すライン
(b) Cy5蛍光強度／Cy3蛍光強度の比率 ≧ 5.0 を示すライン
(c) Cy5蛍光強度／Cy3蛍光強度の比率 ≧ 2.0 を示すライン
(a') Cy3蛍光強度／Cy5蛍光強度の比率 ≧ 10.0 を示すライン
(b') Cy3蛍光強度／Cy5蛍光強度の比率 ≧ 5.0 を示すライン
(c') Cy3蛍光強度／Cy5蛍光強度の比率 ≧ 2.0 を示すライン【０２５７】
即ち、(a)の線より上にあるスポットは、Cy5の蛍光強度がCy3の蛍光強度に比較して10倍以上強いことを示し、(b)の線より上にあるスポットは、Cy5の蛍光強度がCy3の蛍光強度に比較して５〜10倍強いことを示し、(c)の線より上にあるスポットは、Cy5の蛍光強度がCy3の蛍光強度に比較して２〜５倍強いことを夫々示す。また、(a')の線より下にあるスポットは、Cy3の蛍光強度がCy5の蛍光強度に比較して10倍以上強いことを示し、(b')の線より下にあるスポットは、Cy3の蛍光強度がCy5の蛍光強度に比較して５〜10倍強いことを示し、(c')の線より下にあるスポットは、Cy3の蛍光強度がCy5の蛍光強度に比較して２〜５倍強いことを夫々示す。【０２５８】
図５から明らかな如く、(3)のスポットはライン(b')とライン(c')の間にあるので、Cy3の蛍光強度がCy5の蛍光強度よりも５〜10倍強いことを示し、このスポットはウシ型結核菌ゲノムＤＮＡとハイブリダイズしたことがわかる。一方、(2)のスポットはライン( c)とライン(b)の間にあるので、Cy5の蛍光強度がCy3の蛍光強度よりも２〜５倍強いことを示し、このスポットは、Ｍ.カンサシのゲノムＤＮＡとハイブリダイズしたことがわかる。【０２５９】
尚、ネガティブコントロールとして大腸菌のゲノムＤＮＡを用いた場合は、散布図上のスポットはCy5蛍光強度／Cy3蛍光強度の比率が1付近で蛍光強度の非常に低い位置にあるため、図５には示していない。【０２６０】
ここで、図５に於いて、スクリーニングを行った各マイクロアレイのＰＣＲ産物の中から、(1)として丸く囲んで示した８つのスポットは（スポットが重なっているので５つのように見えるが、実際は８つのスポットがある。）、(2)よりも更に強いCy5の蛍光が検出されたことから、(2)（特開平11-155589号に記載されたＭ.カンサシのKATS2配列）よりもＭ.カンサシに対する特異性が高いと判断された。そこで、この８クローンを候補クローンとして選択した。【０２６１】
（６）候補クローンの塩基配列決定
上記(5)で選択された、候補８クローンについて、下記の方法で塩基配列決定を行った。【０２６２】
即ち、Big Dye Terminatorキット（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、製品プロトコールに従い以下の手順でシークエンス解析を行った。【０２６３】
候補ＤＮＡ（候補クローン）      ；2μL(100ng)
M13 Primer M1              ；1μL(5pmol)
premix                       ；8μL
上記の混合物に、総volume=20μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、MJ Research社のＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）にて、下記の反応条件で30サイクルのシークエンス反応を行った。
96℃ 2 min → (96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min)×25 →4℃【０２６４】
得られたシークエンス反応産物をQIAGEN社製ゲルろ過カラムで精製後、MJ Research社製のシークエンサー（BaseStation）を用い、機器付属の手順書に従い候補配列すべてのシークエンス解読を完了した。【０２６５】
得られた結果をデータベース（NCBI BLAST）で検索した結果、Ｍ.カンサシがゲノム配列未解読の生物種であるにも起因するが、データベース上では候補の８クローン全てが、未登録の新規な配列であった。【０２６６】
実施例１．候補クローンのＭ.カンサシ特異性評価
実験例１で得られた候補８クローンについてＰＣＲ増幅系を利用したアガロースゲル電気泳動検出による評価実験を実施し、これらの候補クローンが、遺伝子増幅検出系を用いたＭ.カンサシの特異的検出系に利用できるかどうかを調べた。【０２６７】
（１）ＰＣＲプライマーの合成
まず、決定された候補クローン１のシークエンスの解析結果に基づき、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてＰＣＲ増幅検出のためのプライマー配列を設計した。設計した「CGGCCATTGTTCTACAGTCT」（配列番号５，以下、1c_plate1_Fw1と呼ぶ）および「TAGAGATCCATCGCTTTGGT」（配列番号６、以下、1c_plate1_Rv1と呼ぶ）を用い、下記の通りＰＣＲを行った。ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、設計したオリゴヌクレオチドを合成した。合成手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液を５５℃で一夜加熱することにより実施した。次いでファルマシア社製ＦＰＬＣを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、合成オリゴヌクレオチドを精製した。【０２６８】
尚、シークエンスの解析結果から得られた、候補クローン１の塩基配列は、配列番号１で示されるものである。【０２６９】
（２）試料の調製
以下に示す細菌を用い、下記の方法でＤＮＡを抽出・精製し、ＤＮＡ試料を得た。細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。【０２７０】
ａ：Escherichia coli （大腸菌）
ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）
ｃ：Mycobacterium kansasii（Ｍ.カンサシ）
ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）
ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）
ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）
ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）
ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）
ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）
ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）
ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）
ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）
ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）
ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）
ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）
ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）
ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）
ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）
ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）【０２７１】
まず、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌については、小川培地上のコロニーを精製水に懸濁し、オートクレーブ処理（１２０℃・２気圧、２０分）した後、菌体の粉砕処理（直径2mmガラスビーズによる物理的破砕）を経て、遠心分離し、上清を得た。得られた上清から、(株)キアゲン製のイオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic-tipを用いてＤＮＡの抽出、精製を行った。また、大腸菌については、大腸菌のＤＮＡ抽出方法の常法に従い、ＤＮＡを抽出、精製した。【０２７２】
得られた精製ＤＮＡを、最終１ng／μl（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、ＤＮＡ試料とした。【０２７３】
（３）ＰＣＲ
候補クローンの塩基配列（配列番号１）をもとに、上述の方法で設計、合成したプライマー配列である1c_plate1_Fw1および1c_plate1_Rv1を用い、下記の通りＰＣＲを行った。尚、候補クローン１の塩基配列上の、各プライマーの所在位置は図１に示した通りである。【０２７４】
まず、各１μMのプライマー1c_plate1_Fw1及びプライマー1c_plate1_Rv1、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% Triton X-100（トリトンX-100、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社商品名）、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０２７５】
ＰＣＲ用反応液20μlにＤＮＡ試料１ngを添加したものをＰＣＲ用試料として用い、MJ Research社のＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）にて、下記の反応条件で30サイクル ＰＣＲを行った。【０２７６】
ＰＣＲ反応条件：
熱変性： ９４℃、０．５分
アニーリング：５５℃、１分
重合反応： ７５℃、０．５分。【０２７７】
（４）電気泳動
上記(3)で得られたＰＣＲ後の反応液５μｌを、１.５％アガロースゲル電気泳動した。電気泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、３０分行った。操作方法並びに他の条件はバイオ実験イラストレイテッド2巻, p53-63（秀潤社、中山広樹 著）に記載の一般的に用いられる方法に従った。次いでエチジウムブロマイド染色した後、ＵＶサンプル撮影装置FAS-IIIシステム（東洋紡績(株)製）を用いて紫外線での蛍光を検出した。また、分子量マーカーも反応液と同時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたＤＮＡ断片の長さを算出した。尚、分子量マーカーは、Ｘ１７４／HaeIII digest（マーカー４、(株)ニッポン・ジーン製）を使用した。【０２７８】
得られた電気泳動の結果を図６に示す。【０２７９】
図６に於いて、各レーンの数字は、夫々以下の試料を用いた場合の結果を夫々示す。
Ｍ４：分子量マーカー（マーカー４）
ａ：Escherichia coli （大腸菌）
ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）
ｃ：Mycobacterium kansasii（Ｍ.カンサシ）
ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）
ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）
ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）
ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）
ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）
ｉ：Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）
ｊ：Mycobacterium intracellulare（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ）
ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）
ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）
ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）
ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）
ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）
ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）
ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）
ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）
ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）【０２８０】
フォワードプライマー1c_plate1_Fw1、及びリバースプライマー1c_plate1_Rv1を用いたＰＣＲにより、Ｍ.カンサシゲノム中に位置する候補配列１の167塩基対のＤＮＡ断片（配列番号５３）が複製されると予測される。そこで、167塩基対の蛍光バンドが確認されたものを陽性と判定した。【０２８１】
図６の結果から明らかな如く、本発明のプライマー1c_plate1_Fw1、及びプライマー1c_plate1_Rv1を用いてＰＣＲを行った結果、Ｍ.カンサシを試料とした場合（c）のみに167塩基対の蛍光バンドが確認でき、陽性と判定できた。これに対し、その他のマイコバクテリウム属細菌や他の属の細菌である大腸菌の試料を試料とした場合（ａおよびb、d〜ｓ）には、該当する蛍光バンドが確認できず、すべて陰性と判定できた。【０２８２】
以上のことから、候補クローン１は、Ｍ.カンサシに特異的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドであり、これをもとに設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行う方法により、Ｍ.カンサシを特異的に検出することができることが判った。また、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、細菌を単離する必要がなく、臨床材料をそのまま検出に用いることが可能であるため、従来の細菌を培養してから検出する方法では培養に数週間かかっていたＭ.カンサシの検出を、長くても１日以内に終わらせることができる。【０２８３】
実施例２．本発明のプライマーを用いたＭ.カンサシの検出１
実験例１(6)で得られた候補クローン２について、その塩基配列をもとに実施例１(１)と同様の方法でフォワードプライマーとして6c_plate1_Fw1（候補配列１３）及びリバースプライマーとして6c_plate1_Rv1 （候補配列１４）のプライマーを設計し、合成を行った。次いで、実施例１(２)〜(４)と同様の試料及び試薬を用いて、同様の方法でＰＣＲ、及び電気泳動を行った。【０２８４】
尚、シークエンスの解析結果から得られた、候補クローン２の塩基配列は、配列番号２で示されるものであり、候補クローン２の塩基配列上の、設計された各プライマーの所在位置は図２に示した通りである。【０２８５】
フォワードプライマー6c_plate1_Fw1、及びリバースプライマー6c_plate1_Rv1 を用いたＰＣＲにより、Ｍ.カンサシゲノム中に位置する候補配列２の216塩基対のＤＮＡ断片（配列番号５７）が複製されると予測される。そこで216塩基対の蛍光バンドが確認されたものを陽性と判定した。【０２８６】
その結果、この場合もＭ.カンサシを試料とした場合（c）のみに216塩基対の蛍光バンドが確認でき、陽性と判定できた。これに対し、その他のマイコバクテリウム属細菌や他の属の細菌である大腸菌の試料を試料とした場合（ａおよびb、d〜ｓ）には、該当する蛍光バンドが確認できず、すべて陰性と判定できた。【０２８７】
以上のことから、候補クローン２も、Ｍ.カンサシに特異的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドであり、これをもとに設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行う方法により、Ｍ.カンサシを特異的に検出することができることがわかった。【０２８８】
実施例３．本発明のプライマーを用いたＭ.カンサシの検出２
実験例１(6)で得られた候補クローン３〜８について、その塩基配列をもとに実施例１(１)と同様の方法でプライマーの設計、合成を行い、夫々のプライマーを用いる以外は実施例１(２)〜(４)と同様の試料及び試薬を用いて、同様の方法でＰＣＲ、及び電気泳動を行った。【０２８９】
その結果、Ｍ.カンサシに対する特異性を考慮した場合には、候補配列３及び４が、Ｍ.カンサシに対する特異性が高く、その判定に有効であることがわかった。【０２９０】
尚、シークエンスの解析結果から得られた、候補クローン３の塩基配列は、配列番号３で示されるものであり、候補クローン３の塩基配列上の、設計された各プライマーの所在位置は図３に示した通りである。【０２９１】
また、シークエンスの解析結果から得られた、候補クローン４の塩基配列は、配列番号４で示されるものであり、候補クローン４の塩基配列上の、設計された各プライマーの所在位置は図４に示した通りである。【０２９２】
実施例４．リアルタイムＰＣＲ増幅系によるＭ.カンサシの検出【０２９３】
（１）Ｍ.カンサシ検出用ＰＣＲプライマーの合成
実施例１（1）と同じ機器を用い、同様の操作で1c_plate1_Fw1（配列番号５）、及び1c_plate1_Rv1（配列番号６）のオリゴヌクレオチドを合成した。【０２９４】
（２）Ｍ.カンサシ検出用プローブの作製
1c_plate1_Fw1および1c_plate1_Rv1をプライマーとして用いたＰＣＲで増幅される配列番号５３のオリゴヌクレオチド配列（167塩基対）から、プローブとして利用するための配列「ACTCAATGCCCTTCGATCCCGGCGAAC」を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した（以下、KAN1c_F1R1_FAMTAMと記載する。配列番号８０）。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素FAMを、3'末端にレポーター消光体のTAMRAを結合し、標識オリゴヌクレオチドプローブ（TaqManTMフルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を得た。【０２９５】
（３）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
実験例１(1)で調製したＭ.カンサシ試料から得られたＤＮＡ試料について、吸光度を測定して試料中のＤＮＡ量を測定した。得られたＤＮＡ量を、既知のＭ.カンサシのゲノムＤＮＡ量と比較することにより、試料中のゲノムＤＮＡ量（ゲノムコピー数）を決定した。10８コピー／μlのゲノムＤＮＡが得られた。
次いで10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9を用いてＤＮＡ試料を105, 104, 103, 102, 10, 5, 2コピー/μLの希釈系列に希釈したものを調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。【０２９６】
（４）リアルタイムＰＣＲ
上記(1)で調製した1c_plate1_Fw1をフォワードプライマーとして、1c_plate1_Rv1をリバースプライマーとして用い、下記の通りリアルタイムＰＣＲを行った。【０２９７】
即ち、各１μMのプライマー1c_plate1_Fw1、及びプライマー1c_plate1_Rv1、195nMの上記(2)で調製した蛍光標識プローブKAN1c_F1R1_FAMTAM、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、反応液とした。【０２９８】
反応液20μlに各希釈系列のＤＮＡ試料１μL を加えたものをＰＣＲ用試料とし、これを９６穴反応プレート（ マイクロアンプ・オプチカル・９６ ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、TaqManTM PCR 専用サーマルサイクラー・検出器（ABI7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応は、95℃ で10分間保温の後、95℃で15秒間、60℃で１分間の反応を50サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定した。尚、発光量は、測定に用いたサーマルサイクラーの、測定に供した９６穴反応プレート１プレート毎に相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。【０２９９】
（５）結果
得られた実験データから、リアルタイムＰＣＲ法において行われている常法に従って、検量線を作成した。【０３００】
即ち、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲのサイクル数（ｘ軸）に対するレポーター色素の発光量(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成した。次いで、発光量が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引いた。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の発光量が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とした。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とした。得られた検量線を図７に示す。
ｙ＝−３.３４８ｘ＋３２.６１
Ｒ２＝０.９９５【０３０１】
以上のことより、リアルタイムＰＣＲで発光が検出されたことから、本発明によるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲに用い、その増幅領域となる配列から標識プローブを設計し、リアルタイムＰＣＲを行う事でＭ.カンサシが検出できることが判った。【０３０２】
また、検量線が作成できたことより、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法によれば、Ｍ.カンサシの定量が可能であることが判った。更に、図７より、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法では、Ｍ.カンサシのゲノムＤＮＡが初期量として２コピー存在する条件でもＭ.カンサシの検出が可能である事がわかる。【０３０３】
更に、リアルタイムＰＣＲ法を利用した場合では、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングするので、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができ、Ｍ.カンサシの検出に有効である。
【産業上の利用可能性】
【０３０４】
本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたＭ.カンサシの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、Ｍ.カンサシの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法でＭ.カンサシの検出を行うことにより、従来のプライマー又は／及びプローブを用いたＰＣＲ法による診断方法に比較して、診断上の偽陽性が排除可能となり、より高精度にＭ.カンサシの検出及び診断を行うことができる。更に、本発明の検出方法を用いることにより、Ｍ.カンサシ菌体の定量も行うこともできるという効果を奏する。
【図１】
0005076894.tif 000003
【図２】
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【図３】
0005076894.tif 000005
【図４】
0005076894.tif 000006
【図５】
0005076894.tif 000007
【図６】
0005076894.tif 000008
【図７】
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【配列表】
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