(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD40結合分子と、該CD40結合分子と組み合わせて投与された場合にCTLを活性化する作用を示すペプチドと、アジュバントとを含む、腫瘍の治療用薬剤組成物であって、前記CD40結合分子が、CD40に結合し、CD40を活性化してCD40を介する情報伝達を誘発する抗CD40抗体であり、前記ペプチドが、SGPSNTPPEI（配列番号２）の配列を有する、アデノウイルスから誘導されたE1Aペプチド、又はRAHYNIVTF（配列番号３）の配列を有する、ヒトパピローマウイルスタイプ１６から誘導されたHPV16 E7ペプチドである、治療用薬剤組成物。
【請求項２】
前記抗CD40抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ化又はDeimmunized（商標）抗体である請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項３】
腫瘍に直接投与して用いられる請求項１又は２記載の薬剤組成物。
【請求項４】
CD40結合分子と、該CD40結合分子と組み合わせて発現された場合にCTLを活性化する作用を示すペプチドとをコードする遺伝子構築物、及びアジュバントを含む、腫瘍の治療用薬剤組成物であって、前記CD40結合分子が、CD40に結合し、CD40を活性化してCD40を介する情報伝達を誘発する抗CD40抗体であり、前記ペプチドが、SGPSNTPPEI（配列番号２）の配列を有する、アデノウイルスから誘導されたE1Aペプチド、又はRAHYNIVTF（配列番号３）の配列を有する、ヒトパピローマウイルスタイプ１６から誘導されたHPV16 E7ペプチドである、治療用薬剤組成物。
【請求項５】
前記遺伝子構築物が生体外又は生体内でトランスフェクション又は感染させて用いられる請求項４記載の薬剤組成物。
【請求項６】
前記トランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション又は遺伝子構築物を適当なリポソーム中に組み込むことによって生体外で行われる、生体外トランスフェクション用の組成物である請求項５記載の薬剤組成物。
【請求項７】
前記感染は、前記遺伝子構築物をレトロウイルス、アデノウイルス若しくはパルボウイルスベクターに組み込むことによって生体内若しくは生体外で行われ、又は前記遺伝子構築物若しくはウイルス若しくはプラスミドベクターを有する前記遺伝子構築物を適当なリポソーム中に組み込むことによって生体内又は生体外で行われる、生体外又は生体内感染用の組成物である請求項６記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、薬剤組成物中のCD40結合分子と、腫瘍抗原を包含するCTL活性化ペプチドを包含する。
【０００２】
発明の背景
多くの腫瘍は、我々の免疫系による監視を逃れる。癌患者では、腫瘍細胞を消滅させる、免疫系の特異的メカニズムに量的及び／又は質的な欠陥が明らかに存在する。これらのメカニズムの１つは、ウイルスに感染し又は癌細胞にトランスフォームされた細胞を認識して殺すことができる細胞障害性Ｔ細胞(CTL)により提供される。以前には、樹状細胞(DC)がＴ−ヘルパー細胞を刺激し、次にこれがCTLの活性化を助けるものと推測されていた。本願発明者らは、Ｔ−ヘルパー細胞は、CTLに対し（IL2の分泌によって）直接的にヘルパー信号を提供しているのではなく、Ｔ−ヘルパー細胞が、Ｔ−ヘルパー細胞の非存在下においてCTLを活性化することができる、まだ解明されていない細胞表面及び／又は可溶性分子を誘起する信号をDCに対して出していることを示した。Ｔ−ヘルパー細胞によってＤＣに対して与えられる信号は、CD40L-CD40相互作用により媒介される。この新規な発見により、癌の免疫治療のユニークな機会が提供された。
【０００３】
免疫系は、自己の細胞がウイルスに感染し又は癌細胞にトランスフォームされた時に該細胞を殺すことができる。このような潜在的に危険なメカニズムは、明らかに、厳密な制御下に置かれていなければならない。免疫系のCTLは、不活性な前駆体として循環する。前駆Ｔ−キラー細胞が活性化されるためには、プロフェッショナル(professional) APC上にMHCクラスI分子として現れる特異抗原ペプチドを前駆Ｔ−キラー細胞が認識しなければならない。しかしながら、これらのＴ細胞をプライミング(priming)するために、APCもまた、とりわけ、共刺激表面分子B7.1及びB7.2により、並びにリンフォカインIL-12によって提供される、適正な共刺激的意味合いで抗原を提供する必要がある。
【０００４】
最近まで、CTLを完全に活性化するためには、同一のAPC上の同一の抗原を認識するＴ−ヘルパー細胞が必要であると信じられていた。特異的Ｔ−ヘルパー細胞は、CTLの活性化に必要なIL-2のようなサイトカインを供給するであろう。しかしながら、GuerderとMatzinger (J. Exp. Med.176:553(1992))は、CTLの活性化のための「ライセンシング」モデルを提案した。このモデルでは、Ｔ−ヘルパー細胞が、プロフェッショナルAPC上のその抗原を認識する際に、Ｔ−ヘルパー細胞の存在を必要とすることなく次いでCTLを活性化することができる活性化信号をAPCに対して出すことが示唆された。ごく最近、このライセンシングモデルの分子的メカニズムが明らかにされた。Schoenbergerら(Nature 393:480(1998))は、ライセンシングモデルにおけるCD40L-CD40経路の役割を記述した。CD40-CD40L結合を介するＴ−ヘルパー細胞とＤＣとの間の相互作用がＤＣの活性化をもたらし、それによってＤＣが、ナイーブ(naive)なCTLのプライミングを効率的に行うことが可能になる。
【０００５】
DCは我々の体内の組織を循環し、それによって抗原を回収し、加工し、提供することができる。抗原を回収した後、それらは排出性リンパ節に移動し、ここでそれらはＴ細胞に対する抗原を提供する。DCが至適に作用するためには、活性化される必要があることはよく知られている。静止ＤＣは、僅かな濃度のMHC及び共刺激分子のみを発現し、Ｔ細胞への刺激は弱い。ＤＣは炎症性サイトカイン及び細菌性物質によって活性化されることができ、これによってMHC及び共刺激分子がアップレギュレートされる。完全に成熟したDCへのDCの活性化並びに至適濃度のMHC分子、共刺激分子及びIL-12のようなリンフォカインの発現には、CD40レセプターを介するこれらの細胞のさらなる誘発が必要である。従って、抗原取り込みの部位における炎症性サイトカインと、Ｔ−ヘルパー細胞相互作用におけるCD40L-CD40相互作用との組合せにより、ＤＣをCTL活性化のためにライセンスする至適能力がもたらされる。
【０００６】
多くの腫瘍が特異的CTLメカニズムによる監視から逃れる。もし、DCが非炎症的条件下で腫瘍抗原を集めるのならば、活性化されるＴ−ヘルパー細胞の数は少なすぎ、十分な数のＣＴＬを活性化して適切な抗腫瘍応答を誘起することができない。この概念が、研究者をして、IL-2やIL-12のようなサイトカインを投与してCTL活性を直接的に刺激することによって、あるいは、GM-CSFでトランスフェクションされた腫瘍細胞をトランスフェクトして抗原の提供を増補することによって免疫系を助けることを動機付けた。これらの戦略は、種々の、しかし、勇気づけられる結果をもたらしている。
【０００７】
細胞性及び体液性免疫を包含する防御的な抗腫瘍応答を生成させ及び／又は促進する方法を見出すことが、まだ大いに必要とされていることは明らかである。CD40活性化経路は、一次的な体液性及び細胞性免疫応答を発生させるための主たる免疫調節経路であることが見出された。上述のように、DC上のCD40経路は、抗腫瘍CTL応答の誘起に責任を持つ。さらに、マクロファージ上のCD40経路の活性化は、強力な殺腫瘍活性を刺激する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、薬剤組成物中のCD40結合分子と、腫瘍抗原を包含するCTL活性化ペプチドを包含する。このような組成物は、ペプチド腫瘍ワクチンの抗腫瘍効果を高めるために、あるいは、腫瘍又は感染細胞に対して、活性化されたCTLが作用することができるようにCTLを活性化するために有用である。CD40結合分子は、抗体分子並びにFab, (Fab')2及びFvのような免疫グロブリン断片を包含するその相同、類似、修飾及び誘導形態、並びにCD40に結合してCTL応答を活性化する、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド模倣体及び有機化合物を包含する低分子を包含し得る。CTL-活性化ペプチドは、SGPSNTPPEI（配列番号２）の配列を有する、アデノウイルスから誘導されたE1Aペプチド、又はRAHYNIVTF（配列番号３）の配列を有する、ヒトパピローマウイルスタイプ１６から誘導されたHPV16 E7ペプチドを包含する。
【０００９】
CD40結合分子及びCTL活性化ペプチドは、注射を包含する適当な手段により患者に投与することができる。あるいは、このような分子及びペプチドをコードする遺伝子構築物を投与し、分子及びペプチドがそれによって生体内又は生体外で産生されるようにすることもできる。このような遺伝子治療は、この分野で周知の方法により行うことができる。遺伝子構築物のトランスフェクション又は感染が生体外で行われるならば、感染又はトランスフェクトされた細胞を患者に投与することができる。あるいは、これらの工程を生体内で行い、分子及びペプチドが内発的に生産されるようにすることもできる。トランスフェクション又は感染を生体外で行う場合には、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション又は遺伝子構築物を適当なリポソーム中に組み込む常法により行うことができる。レトロウイルス、アデノウイルス及びパルボウイルス並びにペプチドを包含するベクターを用いて遺伝し構築物を取り込むことができ、次いでそれらは生体内又は生体外で発現される。
【００１０】
ここで、CTLのプライミング(priming)のためのＴ−細胞の助けは、CD40-CD40リガンド(CD40L)相互作用を通じて媒介され、CD4+ Ｔ細胞の不存在によるCTLプライミングの欠如は、腫瘍抗原を包含するCTL-活性化ペプチドの存在下における、モノクローナル抗体(mAb)に媒介される骨髄由来APCのCD40活性化により復元させることができることが示された。さらに、CD4+ Ｔ細胞により発現されるCD40Lをブロックすると、CTL免疫性の増大が起きなくなる。この欠陥は、生体内におけるCD40-誘発(triggering)により克服することができる。CD40の生体内での誘発は、ペプチド腫瘍ワクチンの抗腫瘍効果を顕著に高め、あるいは、CTLを活性化して抗腫瘍反応又は抗感染細胞反応をもたらす。
【００１１】
また、CTL-活性化ペプチドは、トレランス生成的(tolerogenic)に成り得る、すなわち、このようなペプチドを発現する細胞に対する宿主反応が、抗CD40の非存在下で阻害されることがわかった。しかしながら、このようなペプチドは、抗CD40抗体と組み合わせると、トレランス化を強力なCTL活性化に転換する。さらに、上記の通り、CD40-連結は、腫瘍担持マウスにおいて、治療的なCTL免疫を誘起する能力を有する、既に防御的な腫瘍特異的ペプチドワクチンを提供し得る。
【００１２】
これらの知見を総合すると、CD40-CD40リガンドペアは、ナイーブな末梢CTLがプライミングされるかトレンランス化されるかを決定するスイッチとして働くことが示された。従って、モノクローナル抗体のようなCD40-結合剤及び他の刺激リガンドは、CTL-活性化ペプチドと組み合わせて効率的に用いることができる。
【００１３】
発明の製造及び使用
本発明のCD40結合分子は、従来の製造及びスクリーニング技術により製造することができる。ラット及びハムスターの抗マウスCD40モノクローナル抗体（「Mabs」）は、それぞれNature 393: 474-77(1998)に記載されており、市販されている(Pharmingen, Inc.カリフォルニア州）。下記実験で用いた、FGK45と命名された抗マウスCD40 Mabは、Rolink. A.らにより、Immunity 5, 319-330(1996)に記載されている。抗ヒトCD40 Mabsは、G. KohlerとC. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497)により記載された、この分野において周知の方法に従って製造することができる。Mabsは、細胞上で発現されているか又はヒト血漿若しくは尿から精製されたネイティブのCD40又は真核若しくは前核系中で発現された組換えCD40若しくはその断片で齧歯動物（例えばマウス、ラット、ハムスター及びモルモット）を免疫することにより生成させることができる。例えば非ヒト霊長類、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウス、ヒトＢリンパ球を移植された重症複合免疫不全(SCID)マウスのような他の動物を免疫化に用いることもできる。ハイブリドーマは、免疫された動物からのＢリンパ球と、ミエローマ細胞（例えばSp2/0及びNS0)を、G. KohlerとC. Milsteinによって記載された常法により融合することによって生成させることができる。さらに、抗CD40Mabsはまた、ファージディスプレイシステムにおけるヒトＢリンパ球からの組換え単鎖Fv又はFabライブラリーをスクリーニングすることによって生成させることもできる。MabsのCD40に対する特異性は、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング又は他の免疫化学的技術により試験することができる。CTL-活性化ペプチドと組み合わせた抗体のCTLの活性化活性は、下記実施例において記載する分析方法を用いて評価することができる。
【００１４】
ヒトを治療するために、抗CD40Mabsは、好ましくは、キメラ性、DeImmunized、ヒト化又はヒト抗体である。このような抗体は、免疫原性を低減させることができ、ひいてはヒト抗マウス抗体(HAMA)応答が避けられる。抗体は、抗体依存性細胞性細胞障害(S.M. Canfield及びS.L. Morrison, J. Exp. Med., 1991:173: 1483-1492)及び補体媒介細胞溶解(Y. Xu et al., J. Biol. Chem., 1994:269:3468-3474; V.L. Pulito et al., J. Immunol. 1996; 156:2840-2850)を補強しないIgG4、IgG2又は他の遺伝的に変異されたＩｇＧ若しくはＩｇＭであることが好ましい。
【００１５】
キメラ性抗体は、周知の組換えＤＮＡ技術により生産され、動物の可変領域とヒト定常領域とを有する。ヒト化抗体は、キメラ性抗体よりもヒトペプチド配列の割合が高い。ヒト化抗体では、抗原結合及び特異性を司る相補性決定領域(CDR)のみが動物由来で動物抗体に対応するアミノ酸配列を有しており、分子の残りの実質的に全ての部分（ある場合には、可変領域内のフレームワーク領域の小さな部分を除く）がヒト由来で、アミノ酸配列においてヒト抗体に対応する。L. Riechmann et al., Nature, 1988; 332: 323-327; G. Winter, 米国特許第5,225,539; C. Queen et al.,米国特許第5,530,101参照。
【００１６】
DeImmunised抗体は、国際出願PCT/GB98/01473に記載されているように、Ｔ及びＢ細胞エピトープが排除されている抗体である。それらが生体内で適用された場合、免疫原性は実質的に減少されている。
【００１７】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(Stratagene Corp.,カリフォルニア州ラ  ジョラ）を用いてヒト抗体の断片(VH, VL, Fv, Fd, Fab又は(Fab')2)を生産し、キメラ性抗体を製造するのに用いられる技術と同様な技術を使用し、これらの断片を用いて全ヒト抗体を構築することを含む、数種類の異なる方法により生産することができる。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウス中で生産することもできる。このようなマウスは、カリフォルニア州フレモントのAbgenix, Inc.及びニュー  ジャージー州アナンデールのMedarex Inc.から市販されている。
【００１８】
また、Ｈ鎖及びＬ鎖Fv領域が結合された、単一ペプチド鎖結合分子を創製することもできる。単鎖抗体（「ScFv」）及びその構築方法は、米国特許第4,946,778号に記載されている。あるいは、Fabは同様な手段により構築し、発現させることができる(M.J. Evansら、J. Immunol. Meth, 1995; 184:123-138)。全体的又は部分的な全てのヒト抗体は、全体的なマウスMAbsよりも免疫原性が低く、断片及び単鎖抗体もまた免疫原性がより低い。従って、これらのタイプの抗体の全ては免疫又はアレルギー応答を引き起こしにくい。従って、全体的な動物抗体よりもヒトに投与することにより適している。特に、抗体を繰り返しまたは長期間に亘って投与しなければならない場合にそうである。さらに、抗体断片のサイズがより小さいことにより、組織のバイオアベイラビリティが改善されるかもしれず、これは腫瘍治療のような、急性疾患におけるより高い投与量蓄積にとって重要である。
【００１９】
抗CD40mAbsの可変領域又は公知のCTL-活性化ペプチドの分子構造に基づき、分子モデリング及び合理的分子設計を用いて、該抗体又はペプチドの結合領域の分子構造を模倣し、CTLを活性化する分子を生成しスクリーニングすることができる。小さな分子は、ペプチド、ペプチド模倣体、オリゴヌクレオチド又は他の有機化合物であり得る。模倣分子は、癌及び感染症の治療に用いることができる。あるいは、化合物のライブラリーから、適当な分子を単離する分野で一般的に用いられている大規模スクリーニング操作を用いることもできる。
【００２０】
本発明の分子の用量は、後述するインビトロの試験及び分析、又は動物実験若しくはヒト臨床試験からの外挿により容易に決定することができる。本発明の分子が抗体又はタンパク質である場合には、本発明の分子は、優先的に注射により投与される。もっとも、ある種の低分子は、経口投与に適しているかもしれない。本発明の有効性を示す分析及び試験を以下に記載する。
【００２１】
実施例１：  CD40を介する信号発信は、CTLプライミングにおけるCD4+ヘルパーＴ細胞を代替する
生体内におけるCD8+ CTL応答の一次活性化のためのＴ細胞ヘルプのメカニズムを探る、よく特徴付けられたモデル系を用いた。ヒトアデノウイルスタイプ５初期領域１を発現する同種BALB/c (H-2d)マウス胎児細胞(MECs)(Ad5EI-BALB/c MECs)で免疫化されたC57BL/6(主要組織適合性複合体(MHC)H-2b)を有する）は、アデノウイルスEIBタンパク質(EIB192-200)のH-2Db限定エピトープに対して強いCTL応答を生成した（図１ａ）。Ad5EI-BALB/c MECsにより発現される同種H-2d MHC分子は、H-2b-限定宿主CTLsをプライミングできないので、E1B-特異的CTLsを生成させるためには、交差プライミング、すなわち、宿主APCsによる抗原の取り込みとH-2b限定再提示が必要になる。EIB-特異的CTLsの交差プライミングは、厳密にヘルパー依存的である（図１ｂ）。なぜなら、免疫化の前にCD4+ Ｔ−ヘルパー(Th)細胞を枯渇させたマウスは、もはやEIB-特異的CTL応答を開始しなかったからである。
【００２２】
CD40を介する信号発信が、CTLプライミングにおいてCD4+ヘルパーＴ細胞を代替するか否かを調べるために、マウスにAd5EI-BALB/c MECsを免疫化する前に生体内のCD4+ T細胞を枯渇させた。免疫１日後、マウスに活性化抗体である抗マウスCD40mAb FGK45又はこれとアイソタイプが同一のコントロール抗体を１回注射した。CD4が枯渇した、免疫されたマウスにFGK45を投与することにより、E1B-特異的CTL応答が効率的に回復した（図２ａ）が、コントロール抗体を投与した場合にはこれは起きなかった（図２ｂ）。FGK45のみで処理したナイーブなマウスでは、E1B-特異的CTLsのプライミングは検出されなかった（図示せず）。FGK45の効果が、抗CD4抗体での処理によって枯渇されなかった残存D4+細胞を介するものであるという可能性に対するために、成熟機能的CD4+末梢Ｔ細胞が欠損したB6 I-AbノックアウトマウスをAd5EI-BALB/c MECsで免疫化した。これらのマウスにおける免疫化に対する応答は、E1B特異的CTLsがCD40-活性化抗体を投与したマウスでのみ検出可能であり（図２ｃ）、コントロール抗体を投与したマウスでは検出されなかった（図２ｄ）という点で、CD4-枯渇マウスにおいて観察された結果と同じであった。
【００２３】
CD4-枯渇マウスにおけるCTLsのプライミングにおける、抗CD40抗体の必要性が、前炎症性サイトカインの有能な誘起剤である細菌性リポ多糖(LPS)(50μｇ静脈内）によって、又はAd5E1-BALB/c MECsでの免疫化に続くIL-2の投与(不完全フロインドのアジュバント中に1 x 105単位、皮下）によって代替することができるか否かも試験した。FGK45で処理されたCD4-枯渇マウスは強力なE1B-特異的CTL活性を示したが、LPS又はIL-2投与は検出可能なCTLプライミングをもたらさなかった（図示せず）。
【００２４】
CD40がB細胞に結合することにより、それらの共刺激活性がアップレギュレートされることは、CD40活性化抗体で処理することによるCTLプライミングの回復におけるこれらの細胞の役割を示唆している。この疑問に答えるために、成熟Ｂ細胞を欠如するB6 MTマウスを同種Ad5EI-BALB/c MESsで免疫化した。E1B-特異的CTLsの交差プライミングは、成熟Ｂ細胞を必要としなかった（図３ａ）。しかしながら、CD4+細胞を枯渇させた場合には、Ｂ細胞欠損マウスはE1B-特異的CTL応答を生成しなかった（図３ｂ）。CD40を介したFGK45モノクローナル抗体での活性化により、CD4-枯渇MTマウスの、E1B-特異的CTLsをプライミングする能力は完全に回復された（図３ｃ）。従って、Ｂ細胞は、このモデル系における交差プライミングのためのAPCs又は補助細胞として必要とはされず、また、CD4+ヘルパーＴ細胞の非存在下におけるCTLsの交差プライミングのCD40-媒介回復のためにも必要とされない。これらの結果は、CD40を介する骨髄由来APCの活性化が、E1B-特異的CTLsの交差プライミングにおけるCD4+  Ｔ−ヘルパー細胞の必要性をバイパスできることを示している。
【００２５】
実施例２：  CD40L-CD40経路を介してAPCと相互作用する、CD4+ヘルパーＴ細胞の能力をブロックすると、正常マウスにおける抗原特異的CTL応答が妨害される
もし、CD40L-CD40相互作用が、CD4+ヘルパーＴ細胞がCTLsを助けるために用いられる生理的経路を表すのであれば、CD4+ Ｔ細胞がCD40L-CD40相互作用を介してAPCと相互作用する能力をブロックすることにより、正常マウスにおいて、E1B-特異的CTL応答のプライミングが消失するものと予想される。Ｂ６マウスをAd5E1-BALB/c MECsで免疫し、次いでCD40L-ブロッキング抗体MR1又はコントロール抗体で処理した。CD40Lをブロックすると、コントロール抗体を投与されたマウスにおいて見られる効率的なCTLプライミング（図４ｂ）と比べ、E1B-特異的CTL応答が劇的に減少した（図４ａ）。CD40Lのブロッキングにより誘起されたプライミング欠陥は、FGK45によるCD40信号発信に続いて完全に回復された（図４ｃ）。従って、CD40Lのブロッキングにより誘起されるCTL-プライミングにおける欠陥は、ＴH細胞がCD40L-媒介信号を、受け取ることにではなく、伝達することに失敗することに起因している。
【００２６】
実施例３：  ペプチド投与後のE1A-特異的CTL非応答性
以前に記載されたモデルシステムを用いた(Toes et al., J. Immunol. 156:3911(1996))。IFA中Ad5E1A-誘導CTLエピトープSGPSNTPPEI（配列番号２）を皮下投与によりワクチン接種すると、マウスがAd5E1A-発現腫瘍の成長を制御することが妨げられる。このことは、E1A/IFAワクチンがE1A-特異的CTL免疫性の誘導ではなく抑制を誘起したことを示している。さらに、E1A-特異的CTLクローンのTCRα及びβ鎖を発現するＴ細胞レセプター(TCR)-トランスジェニックマウスにE1A/IFAワクチンを投与すると、腫瘍特異的CTL-媒介免疫性が強力に抑制された。これらの実験は、モノクローナルCTL集団に対するペプチド投与の効果を調べたものである。E1A-ペプチドワクチン皮下接種が、ポリクローナルCTLレベルにおいてE1A-特異的CTLトレランスをも誘起するのか否かを調べるために、野生型(wt)C57BL/6マウスにE1A-ペプチド（図５ａ及び５ｂ）又はコントロールペプチド図５ｃ及び５ｄ）を注射した。１日後、表面にE1A-ペプチドを高濃度に発現している同種セルラインをブーストした（図５ｂ及び５ｄ）。コントロールペプチドでプライミングされたマウスにこのセルラインを注射すると、E1A-特異的免疫性が容易に誘起された（図５ｄ）。しかしながら、E1A/IFAワクチン注射後、マウスのE1A-特異的CTL応答は阻害された（図５ｂ）。これらのデータは、E1A-ペプチドの注射により、TCR-トランスジェニックマウスにおいてのみではなく、ポリクローナルE1A-特異的Ｔ細胞レパートリーを発現するマウスにおいてもE1A-特異的トレランスが引き起こされることを示している。
【００２７】
E1A/IFAワクチンの皮下注射が全身的CTLトレランスを引き起こすので、E1A-ペプチドが全身的に分散され、末梢中の前駆CTLに対して提供されるのか否かを調べた。すなわち、IFA中に懸濁されたE1A-ペプチド又はヒトパピローマウイルス(HPV)16 E7-由来コントロールペプチドをマウスに皮下注射した。１６時間後にこれらのマウスから脾細胞を単離し、インビトロにおけるE1A-特異的CTLクローンの刺激細胞(stimulator cells)として用いた。E1A-ペプチドを皮下投与されたマウスからの脾細胞は特異的増殖を誘起したが、E7-ペプチドを皮下投与されたマウスからの脾細胞はこれを誘起しなかった（図６）。さらに、コントロールCTLクローンは、E1A-注射マウス由来脾細胞上で増殖しなかった（データ示さず）。従って、これらのデータは、皮下投与されたIFA中E1A-ペプチドが、とりわけ、脾細胞により、末梢中で全身的に提供されることを示している。
【００２８】
E1A-ペプチドワクチンの上記したトレランス化効果に鑑み、生体内におけるCD40誘発が、CTLの末梢トレンランス化を妨げ、CTLプライミングを回復させるのに十分か否かという疑問がある。従って、生体内CD40誘発と組み合わされたトレランス化ペプチドが、腫瘍特異的CTL免疫性に導く末梢CTLトレランスの誘起を妨げることができるか否かを調べた。
【００２９】
実施例１及び２において、CD40の生体内誘発が、ヘルパー依存性CTL応答のプライミングにおけるCD4+Ｔ細胞媒介ヘルパー細胞の必要性を代替することができることが示された。CD4+Ｔ細胞媒介ヘルパー活性が、末梢CTLトレランス誘起の阻害において示唆されているので、本願発明者らは、生体内でのCD40誘発が、末梢E1A-特異的CTLトレランス化を妨げるのに十分か否かという疑問について調べた。この目的のために、E1A/IFAワクチンを、活性化抗CD40 mAb FGK-45と組み合わせてマウスに注射した。この組合せを投与されたマウスは、強力なE1A-特異的CTL応答を開始した（図７ｂ及び７ｅ）が、E1A/IFAワクチン（図７ｅ）又はmAbのみを投与されたマウス（図示せず）ではこのようなことが起きなかった。E1A/IFAワクチンと抗CD40 mAbとの組合せは、CD40-欠損マウスにおいてCTLを惹起することができなかった（図７ｃ及び７ｄ）。さらに、E1A/IFAワクチンを、アイソタイプが同一のコントロールmAb（図６ａ）又はIL-2と共に注射しても、E1A/IFAワクチンにより誘起されるCTLトレランスをCTLプライミングに転換することはできなかった（図示せず）。E1A-ペプチドのみで、又はE1A-ペプチド＋抗CD40でワクチン接種された動物におけるE1A-エピトープに対する応答の範囲と変異が図７ｅに示されている。このように、全身的なCD40の活性化は、ペプチド−誘起末梢CTLトレランスを、ペプチド及び腫瘍特異的CTL媒介免疫性に戻すことができる。
【００３０】
E1A-特異的免疫性は、E1A-ペプチド(Db/E1A)を含むPE-結合H-2-Db-テトラマーで染色される、ワクチン接種マウスの脾臓中のCD8+ T細胞の存在と強く関連している。E1A-ペプチド及び抗CD40 mAbを注射したマウスでは、ワクチン接種後１０日以内に、Db/E1Aテトラマーで染色されるCD8+ Ｔ細胞がフローサイトメトリーで検出されるが、E1A-ペプチドのみを注射されたマウスではこのようなことは起きなかった（図示せず）。E1A-ペプチドを注射したマウスでは、Db/E1Aテトラマーで染色されるCD8+ Ｔ細胞のパーセンテージは約３％であった。有能なE1A-特異的免疫性を誘起する全アデノウイルスをワクチン接種したマウスでは、同程度の量のDb/E1Aテトラマー反応性CD8+脾細胞が検出された。これらの結果は、E1A/IFAワクチンを抗CD40 mAbと組み合わせて投与されたマウスにおけるE1A-特異的CD8+ Ｔ細胞の増殖は実質的なものであり、ウイルスをワクチン接種された動物において見出されるのと同程度であることを示している。
【００３１】
実施例４：  CD40誘発は、ペプチド系抗癌ワクチンの有効性を強力に高める
上記発見は、CD40誘発を介してヘルプを提供することは、トレンランス生成ペプチドワクチンの投与後のCTL-トレランス化を妨げるのに十分であることを示しているが、それらは、正常にはトレランスではなく防御的免疫性を誘起する抗癌ワクチンの有効性がCD40の活性化によって高められるか否かという疑問には答えていない。生体内でのCD40誘発が、HPV16 E7由来ペプチドでのワクチン接種の結果に対して有益か否かを調べた。このペプチドでのワクチン接種は、HPV16でトランスフォームされた腫瘍細胞による攻撃に対して、防御的CTL-媒介免疫性を誘起した。さらに、このペプチドは、インビトロで活性化されたＤＣ上にロードされた際に治療的セッティング(setting)に用いることができ、このことは、活性化ＤＣにより提供された際に抗腫瘍応答の強さが高められることを示唆している。
【００３２】
E7-ペプチドをCD40誘発と組み合わせて投与されたマウスは、E7-ペプチドのみを投与されたマウスに比べてより強力なCTL応答を開始した（データ示さず）。このことは、CD40誘発がまた、EPV16 E7-ペプチドワクチンの有効性を高めるものであることを示しており、E1Aペプチドについて上記した知見を確認するものである。さらに、CD40-陰性HPV16 E6/E7でトランスフォームされた腫瘍細胞の皮下注射６日後にHPV16 E7-ペプチドのみで処理されたマウス（白抜き四角）は、腫瘍の増殖を遅らせることができたが、ほとんどの動物は最終的には腫瘍のために死んだ（図８）。しかしながら、HPV 16 E7-ペプチドワクチン接種を抗CD40 mAbの注射と組み合わせた場合には腫瘍の増殖は顕著に抑制され、１０匹のマウスのうち７匹までは腫瘍を撃退した。これに対し、コントロールペプチドと抗CD40 mAbとを注射された動物は、腫瘍の成長を制御することができなかった。これらの結果は、免疫化を生体内でのCD40誘発と組み合わせると、ワクチン接種の効果が顕著に高められることを示している。
【００３３】
上記の記述、用語、表現及び実施例は例示的にのみ示すものであって限定的なものではない。本発明は、公知のものも未知のものも含めて、上記の具体例の全ての均等物を包含する。本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定され、この書類の他のあらゆる部分又は他のあらゆるソースにおけるあらゆる陳述によって限定されるものではない。
【００３４】
【配列表】
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【００３５】
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【００３６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１：E1B-特異的CTLsの交差プライミングは、CD4+Ｔヘルパー細胞を必要とする
Ad5E1-BALB/c MECsで免疫した(a)正常マウス又は(b)CD4-枯渇B6マウスからの脾細胞について、種々のエフェクター／標的比で、ヒトアデノウイルスから誘導され配列VNIRNCCYI（配列番号１）を有するE1B192-200ペプチド（実線）又はDd-限定コントロールペプチドHPV16 E749-57（破線）をロードされた同種MEC標的細胞の溶解を試験した。各線は１匹のマウスを示す。図示のデータは、同様な結果が得られた３回の実験のうちの１回の結果を示す。
【図２】図２：CD40活性化はCD4+Ｔヘルパー細胞を代替する
CD4-枯渇(a,b)又はクラスII-欠損I-Ab-ノックアウト(KO)(c,d)B6マウスからの脾細胞を、Ad5E1-BALB/c MESsで免疫し、CD40-活性化抗体(Ab)FGK45(a,c)又はアイソタイプコントロール抗体(b,d)で処理した。これらの脾細胞について、E1B192-200ペプチド（実線）又はHPV16 E749-57コントロールペプチド（破線）をロードした同種MEC標的細胞上でのE1B-特異的CTL活性を試験した。各線は１匹のマウスを示す。図示のデータは、２つの独立した実験からのものである。E/T比：エフェクター／標的比。
【図３】図３：  Ｂ細胞は、交差プライミングAPCsとして又は交差プライミングの抗CD40-媒介回復のために必須的ではない
Ad5E1-BALB/c MECsで免疫された、未処理(a)又はアイソタイプコントロール抗体(b)若しくはCD40-活性化抗体FGK45(c)を投与したCD4-枯渇Ｂ細胞欠損B6 MTマウス(b,c)から脾細胞を採取した。これらの脾細胞について、E1B192-200ペプチド（実線）又はHPV16 E749-57コントロールペプチド（破線）をロードした同種MEC標的細胞上でのE1B-特異的CTL活性を試験した。各線は１匹のマウスを示す。図示のデータは、同様な結果が得られた２回の実験のうちの１回の結果を示す。
【図４】図４：CD40Lのブロッキングは、E1B-特異的CTLsの交差プライミングを阻害する
Ad5E1-BALB/c MECsで免疫し、CD40L-ブロッキング抗体MR-1(a)若しくはコントロール抗体(b)で処理したB6マウス、又は免疫２４時間後にCD40-活性化抗体FGK45(c)と組み合わせてCD40L-ブロッキング抗体MR-1で処理したマウス(c)から脾細胞を採取した。これらの脾細胞について、E1B192-200ペプチド（実線）又はHPV16 E749-57コントロールペプチド（破線）をロードした同種MEC標的細胞上でのE1B-特異的CTL活性を試験した。各線は１匹のマウスを示す。図示のデータは、同様な結果が得られた３回の実験のうちの１回の結果を示す。
【図５】図５：  E1A-ペプチドを皮下注射されたマウスは、もはやE1A-特異的CTLを開始することができない
C57BL/6マウスに２０μｇのIFA中E1A-ペプチド(a,b)又はコントロールペプチド(c,d)を２回（１週間間隔）皮下注射し、１日後、E1A-ペプチドを大量に発現しているセルラインであるSAMB7(b,d)を腹腔内投与して攻撃した。これらのマウスから誘導されたバルク培養物について、E1A-ペプチド(-■-)又はHPV16 E7-ペプチド(-○-)でパルス化した標的細胞に対するE1A-特異的細胞障害性を調べた。異なるエフェクター対標的(E/T)比における代表的バルク培養物の特異的溶解を示す。この実験は４回行い、同様な結果が得られた。
【図６】図６：  トレランス化E1A-ペプチドは、IFA中皮下注射後、迅速に全身的に分配される
未処理のC57BL/6マウス(-)又は１６時間前に１００μｇの、IFA中E1A-若しくはHPV16 E7-ペプチドを皮下注射したマウスからの脾細胞を、E1A-特異的CTLクローンに対する刺激細胞として用いた。[3H]-チミジン取り込み(cpm)±S.E.M.を、異なるエフェクター対刺激物濃度比について、バックグランドのカウントを差し引くことなく示す。結果は、５回の独立した実験の代表的なものである。
【図７】図７：  CTL-トレランス誘起は、生体内でのCD40誘発後、CTL-プライミングに戻る
野生型C57BL/6マウス(a,b)及びH-2b CD40-/-マウス(c,d)に２０μｇの、IFA中E1A-ペプチドを、これのみ(c)、ラットIgG2aコントロール抗体と組み合わせて(a)、又はCD40 mAb FGK-45(b,d)と組み合わせて皮下注射した。これらのマウスからのバルク培養物について、E1A-ペプチド(-■-)、HPV16 E7-ペプチド(-○-)又はAd5e1でトランスフォームされた腫瘍細胞(-◆-)でパルス化した標的細胞に対するE1A-特異的細胞障害性を調べた。異なるE/T比における代表的バルク培養物の特異的溶解を示す。この実験はそれぞれ１８回（Ｂ６マウス）又は２回（CD40-/-マウス）繰り返し、同様な結果が得られた。(e)には、IFA中E1A-ペプチドのみ（左）、又は抗CD40 mAbと組み合わせて（右）注射したB6マウスからの、E/T６０における、それぞれ２３又は３７のバルクCTL培養物の特異的溶解の％が示されている。各群の平均プラス標準偏差が示されている(E1A対E1A+抗CD40: p<0.01,スチューデントのｔ−検定）。
【図８】（図７の続き）
【図９】図８：  ペプチドと生体内CD40誘発の組合せ処理による、HPV16 E6及びE7でトランスフォームされた細胞の治療
マウスに25000のHPV16でトランスフォームされた同種細胞(TC-1)を皮下注射した。C57BL/6マウスは、未処理のまま残す(-○-)か、又は６日後に、１００μｇの、IFA中HPV16 E7-ペプチドを腹腔内投与(-□-)、１００μｇの、IFA中HPV16 E7-ペプチドを抗CD40 mAb FGK-45と組み合わせて腹腔内投与(-■-)、若しくはコントロールペプチドを抗CD40 mAb FGK-45と組み合わせて腹腔内投与(-●-)した。(a)には、異なる処理群(n=10)について、腫瘍担持マウスのパーセンテージを図示した。HPV16-ペプチド＋抗CD40mAbで処理した群と他の３つの群との差は統計学的に有意であった(p<0.01)(Log-Rank検定）。(b)には、生存動物のパーセンテージが示されている（E7-ペプチド処理群対E7-ペプチド＋抗CD40処理群：  p=0.002, Log-Rank検定）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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