(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン残基に部位特異的に結合した１個のポリエチレングリコール部分と、ここで前記システイン残基はレプチンのアミノ酸配列内の特定アミノ酸位置に導入されている；およびレプチンのＮ末端に部位特異的に結合した１個のポリエチレングリコール部分とを含む、二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートであって、前記レプチンが、２８位のグルタミニル残基を欠くか若しくは欠かないさらにＮ末端にメチオニル残基を持つか若しくは持たない配列番号１のアミノ酸配列からなる、前記二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲート。
【請求項２】
前記レプチンが、Ｎ末端にメチオニル残基を持つ配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲート。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコール部分が２０ｋＤａから４０ｋＤａの分子量を持つ、請求項１に記載の二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲート。
【請求項４】
（ａ）配列番号１で表されるレプチンのアミノ酸配列内の特定アミノ酸位置にシステイン残基を導入し、
（ｂ）前記システイン残基にポリエチレングリコールを複合し、モノポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートを提供すること
（ｃ）前記モノポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートのＮ末端に第二のポリエチレングリコールを複合し、二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートを提供すること；
（ｄ）前記二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートを採集すること
を含む方法によって生成され、前記レプチンが、２８位のグルタミニル残基を欠くか若しくは欠かないさらにＮ末端にメチオニル残基を持つか若しくは持たない配列番号１のアミノ酸配列からなる、二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲート。
【請求項５】
医薬上許容される担体中に請求項１−３のいずれかに記載の二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートを活性物質として含む医薬組成物。
【請求項６】
請求項１−３のいずれかに記載の二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートの有効量を活性物質として含む、個体の肥満、糖尿病および高脂血症の中から選択される状態を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、変異誘発と部位特異的化学複合を通して、２つの特異的に規定されたアミノ酸残基においてタンパク質に化学的に複合された２個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）高分子から成る、特異的で十分に定義された二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートを構築するための新規なアプローチに関する。上述した二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートは実質的に改善された生体効果と生体適合性を示す。
【０００２】
発明の背景
遺伝子工学および細胞工学テクノロジーの最近の進歩により、ｉｎ  ｖｉｖｏで様々な薬理作用を示すことが知られているタンパク質を医薬適用のために大量に生産することができる。そのようなタンパク質は、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン（α、β、γ、コンセンサス）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１レセプタ拮抗物質（ＩＬ−１ｒａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ならびに肥満タンパク質（ＯＢタンパク質）を含む。ＯＢタンパク質は本文中でレプチンとも称されうる。
【０００３】
レプチンは、ｏｂ／ｏｂ変異マウス（ＯＢ遺伝子産物の産生欠損による肥満マウス）ならびに正常な野生型マウスの両方においてｉｎ  ｖｉｖｏで活性である。その生物活性は、特に体重減少として表れる。一般に、Ｂａｒｉｎａｇａ、「「肥満」タンパク質はマウスを減量させる」（“Ｏｂｅｓｅ”  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｌｉｍｓ  Ｍｉｃｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：４７５−４７６（１９９５）およびＦｒｉｅｄｍａｎ、「体重管理のアルファベット」（Ｔｈｅ  Ａｌｐｈａｂｅｔ  ｏｆ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｎａｔｕｒｅ，３８５：１１９−１２０（１９９７）参照。たとえば、ｏｂ／ｏｂ変異マウスにおいて、レプチンの投与は血清インスリンレベルおよび血清グルコースレベルの低下をもたらすことが知られている。また、レプチンの投与が体脂肪の減少を生じさせることも知られている。これはｏｂ／ｏｂ変異マウスならびに非肥満正常マウスの両方で認められた。Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：５４０−５４３（１９９５）；Ｈａｌａａｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：５４３−５４６（１９９５）。同様に、Ｃａｍｐｆｉｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：５４６−５４９（１９９５）（マイクログラム用量のレプチンの末梢および中心投与はｏｂ／ｏｂマウスおよび食餌誘発性肥満マウスの食餌摂取と体重を低下させたが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスにおいては低下を生じなかった。）も参照のこと。哺乳類およびヒトを含めた動物の体重および肥満の制御のためのモジュレーターとしてのＯＢタンパク質、アナログ、誘導体およびそれらの使用は、ＷＯ  ９６／０５３０９号、前出に詳細に開示されている。また、ＰＣＴ国際特許公開ＷＯ  ９６／４０９１２号、ＷＯ  ９７／０６８１６号、ＷＯ  ９７／１８８３３号、ＷＯ  ９７／３８０１４号、ＷＯ  ９８／０８５１２号およびＷＯ  ９８／２８４２７号も参照のこと。ＯＢタンパク質あるいはここで称されるレプチンは、ヒトにおいて体重減少を生じさせる；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、「痩せた被験者と肥満被験者において皮下注射によって投与した組換えメチオニルヒトレプチン（ｒＬ）の予備的安全性と効果」（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｐｔｉｎ（ｒＬ）  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｂｙ  ＳＣ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｅａｎ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｅ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）。イリノイ州シカゴで１９９８年６月１４日に開かれたアメリカ糖尿病学会の第５８回年次総会および学術セッションで発表されたポスター。これらの報告のいずれにおいても、最高用量でも毒性は認められていない。
【０００４】
動物モデルでの予備的なレプチン誘発体重減少実験は、ヒトの肥満を有効に治療するために、高濃度のレプチン製剤と長期投与の必要性を予測する。０．５あるいは１．０ｍｇ／ｋｇ／日のような体重キログラム当りミリグラムタンパク質の範囲の用量が、ヒトなどの大型哺乳類に治療上有効な量を注入するために望ましい。従って、患者にとって不快であったり、あるいは場合によって痛みを伴うこともある、大容量の注入を避けるためには、タンパク質濃度の上昇が必要である。
【０００５】
残念ながら、ヒトへの注入のための医薬組成物の調製にあたって、レプチンのアミノ酸配列は、活性タンパク質約２ｍｇ／液体ミリリットルを越えるような比較的高い濃度では生理的ｐＨで不溶性である。生理的条件下でレプチンの溶解度が低いことは、低いｐＨの製剤中で高用量を投与したとき、注射部位における濃度依存的なレプチン沈着物の形成に寄与すると思われる。認められるレプチン沈着物は、好酸球、マクロファージおよび巨細胞の存在を特徴とする混合細胞浸潤を含む、注射部位における炎症反応に伴うものである。
【０００６】
現在まで、生理的ｐＨにおいて少なくとも約２ｍｇ／ｍｌの濃度で安定なヒトＯＢタンパク質製剤についての報告はなく、さらに、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の活性ヒトＯＢタンパク質の安定な濃度は報告されてない。上述した問題を伴わずに高用量を可能にするレプチン形態の開発は大きな恩恵をもたらすであろう。それ故、タンパク質の部位特異的化学修飾によって改善された形態のレプチンを提供することが本発明の一つの目的である。
【０００７】
有用な治療タンパク質の化学修飾のいくつかの方法が報告されている。たとえば、改善された薬理特性を示す、ポリエチレングリコールで化学修飾されたタンパク質は長い歴史を持つ。それらの特性の中でも特に、長い血清半減期、溶解度の改善および免疫原性の低下が挙げられる。レプチンのＮ末端での１個の２０ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーによる化学修飾は、非修飾天然タンパク質に比べて実質的な用量低下と高い溶解度を示す極めて有効な分子を生じる；Ｎ末端での誘導体化レプチン（その中ではＯＢタンパク質と称されている）の説明については、たとえばＰＣＴ  ＷＯ  ９６／４０９１２号、前出の８ページ以下参照。ＰＥＧポリマーはバイオコンジュゲートの循環半減期を延長させ、免疫原性のある程度の低下をもたらすと考えられるが、高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で定期的に投与したとき腎空胞に蓄積することも認められた。この現象は他のポリエチレングリコール化タンパク質製剤に関しても報告されている；たとえば、Ｃｏｎｏｖｅｒら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ，２１（５）：３６９−３７８（１９９７）；Ｂｅｎｄｅｌｅら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４２：１５２（１９９７）参照。そのような空胞が個体の健康に有害であるかどうかは不明であるが、薬剤の投与は付随する解剖学的異常がないことが好ましい。
【０００８】
そこで、腎による糸球体濾過を免れるのに十分な大きさの、従って腎の空胞形成を誘発する傾向がほとんどあるいは全くない、レプチンコンジュゲートを生成することが本発明のひとつの目的である。そのようなコンジュゲートの生成は、適切な大きさのポリマーによるレプチンの部位特異的二重ポリエチレングリコール化と組み合わせた一連の合理的変異誘発を用いて達成される。重要な点として、タンパク質のポリポリエチレングリコール化のための現在の戦略は、分離することが困難であり、内因性生物活性に変動がある位置アイソフォームの不均質な混合物を生じるが、それと異なって本発明の二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートは、ポリエチレングリコール化タンパク質コンジュゲートの薬物動態上の利点を生かしながらコンジュゲートの内因性生物活性を維持する均質な製剤を提供するように設計された、特異的複合部位を含む。
【０００９】
【発明の要旨】
本発明は、化学修飾されたタンパク質、たとえばレプチンの実質的に均質な製剤およびそのための方法に関する。意外にも、レプチンの部位特異的化学修飾は、他のレプチン種では見られない生物学的利用能と生体適合性における利点を明らかにした。重要な点として、ここで述べる方法は他のタンパク質（あるいはそのアナログ）ならびにレプチンに広く適用できる。それ故、下記に詳細に述べるように、本発明はタンパク質（あるいはそのアナログ）の化学修飾ならびに特異的タンパク質の特異的修飾に関する多くの態様を持つ。
【００１０】
ひとつの態様では、本発明は、二重ポリエチレングリコール化レプチン（あるいはそのアナログ）の実質的に均質な製剤および関連する方法に関する。重要な点として、ここで述べる方法は、もっぱら２つの規定部位で修飾された二重ポリエチレングリコール化タンパク質の高い収量をもたらし、それによって、ランダムな修飾を含む他の種に比べて加工上の利点を提供する。本発明は、未変性天然組換えヒトレプチンと比較して、二重ポリエチレングリコール化組換えヒトレプチンが実質的に改善された生物活性と生体適合性を持つという所見に由来する。
【００１１】
驚くべきことに、そして重要なことに、２０ｋＤａ、３０ｋＤａおよび４０ｋＤａのＰＥＧポリマーから調製した二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートは極めて有効であることを明らかにし、腎空胞形成の傾向をほとんどあるいは全く示さないことが認められた。重要な点として、二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートを単回投与したとき、体重減少が、等しい用量の非修飾レプチンを１日１回７日間投与したときの２倍のレベルで７日間にわたって維持された。以下の作用実施例で使用される組換えヒトレプチンは、最初に選択システイン変異がレプチンタンパク質配列に導入されるように修飾される。得られた組換えヒトレプチンアナログは高収率で回収でき、ついで二重ポリエチレングリコール化バイオコンジュゲートを調製するのに使用される。そこで、ひとつの態様では、本発明は、レプチンタンパク質配列の７２位又は７８位に導入されたシステイン変異を有するヒトレプチンに関する。
【００１２】
本発明はまた、ＰＥＧがレプチンタンパク質配列のＮ末端と７８位で複合されている二重ポリエチレングリコール化ヒトレプチンバイオコンジュゲートに関する。好ましくはＰＥＧは約１０ｋＤａから約１００ｋＤａの分子量を持つ。特に好ましくは、ＰＥＧは各々のポリマー鎖について約２０ｋＤａである。
【００１３】
本発明はさらに、医薬上許容される担体中の、上記のようなすべての二重ポリエチレングリコール化ヒトレプチンバイオコンジュゲートに関する。
【００１４】
本発明はさらに、上記のような二重ポリエチレングリコール化ヒトレプチンバイオコンジュゲートを調製するための工程に関する。二重ポリエチレングリコール化タンパク質の実質的に均質な製剤を作製するための方法の主要な実施態様は次の事柄を含む：
（ａ）前記タンパク質のアミノ酸配列内の特定アミノ酸位置にシステイン残基を導入して、前記タンパク質のアナログを提供する；
（ｂ）前記システイン残基の位置でポリエチレングリコールを前記アナログに複合し、モノポリエチレングリコール化タンパク質コンジュゲートを提供する；
（ｃ）前記コンジュゲートのＮ末端に第二のポリエチレングリコールを複合し、二重ポリエチレングリコール化バイオコンジュゲートを提供する；および
（ｄ）前記二重ポリエチレングリコール化バイオコンジュゲートを分離する。
【００１５】
本発明はまた、上記のような二重ポリエチレングリコール化ヒトレプチンバイオコンジュゲートを用いて個体を治療する方法に関する。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、マウスに０．１−１０ｍｇ／ｋｇタンパク質を皮下投与により７日間毎日投与したモデルでの様々なレプチン用量反応曲線を示すグラフである。曲線は、１日１回７日間の多回投与アッセイからの各用量に関する３つの最大体重減少値の平均を表わす。体重減少％を用量（ｍｇ／ｋｇ）に対してプロットし、体重減少％を被験群と緩衝液対照群との差として算定している。
【００１７】
図２は、マウスに各々の製剤１０ｍｇ／ｋｇを単回皮下注射によって投与したモデルでの、種々のレプチン製剤が単回投与で誘発する体重減少パーセンテージを示すグラフである。体重減少％を日数に対してプロットし、体重減少％を被験群と緩衝液対照群との差として算定している。
【００１８】
図３は、３ｍｇ／ｋｇの単回用量を静脈内注射した後のマウスにおける２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンについての薬物動態プロフィールを示すグラフである。レプチン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を時間（時）に対してプロットしている。
【００１９】
図４は、３ｍｇ／ｋｇの単回用量を皮下注射した後のマウスにおける２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンについての薬物動態プロフィールを示すグラフである。レプチン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を時間（時）に対してプロットしている。
【００２０】
図５は、種々のレプチン製剤に関する腎空胞スコアの比較を示す棒グラフである。１＝２．５ｍｇ／ｋｇを毎日；２＝１０ｍｇ／ｋｇを毎日；３＝１０ｍｇ／ｋｇ単回投与。＊＝緩衝液と統計的な有意差なし。
【００２１】
図６は、０、７、１４および２１（ｘ）日目に種々の用量の様々なレプチンコンジュゲート製剤を用いて皮下投与したあとに得られた体重減少％を示すグラフである。緩衝液対照と比較した体重減少を４４日間にわたってモニターした。
【００２２】
図７は、様々なレプチン製剤に関する腎空胞スコアの比較を示す棒グラフである。１＝二重ポリエチレングリコール化（２５ｍ／ｋｇ）；２＝二重ポリエチレングリコール化（１０ｍｇ／ｋｇ）；３＝二重ポリエチレングリコール化（２．５ｍｇ／ｋｇ）；４＝モノポリエチレングリコール化（２５ｍｇ／ｋｇ）。腎空胞スコアを各々の製剤について種々の時点で（日数）プロットしている。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、化学修飾されたタンパク質の実質的に均質な製剤およびそのための方法に関する。ここで使用する「実質的に均質な」とは、認められる化学修飾されただけのタンパク質がひとつの「修飾因子」（たとえばＰＥＧ）部分を持つものであることを意味する。前記製剤は非反応性（すなわち修飾因子部分を欠く）タンパク質を含みうる。ペプチドマッピングとＮ末端の配列決定によって確認されるように、下記のひとつの実施例は少なくとも９０％の修飾タンパク質と多くとも１０％の非修飾タンパク質を含む製剤を提供する。好ましくは、化学修飾された物質が製剤の少なくとも９５％であり、最も好ましくは化学修飾された物質が製剤の９９％又はそれ以上である。
【００２４】
化学修飾物質は生物活性を持つ。ここで提供する本発明の「実質的に均質な」二重ポリエチレングリコール化レプチン製剤は、均質な製剤の利点、たとえばロットごとの薬物動態が予測可能であることによる臨床適用の容易さを発揮するのに十分なほどに均質な製剤である。
【００２５】
本明細書で使用するとき、生物学的に活性な物質は、予防、治療あるいは診断適用のために有用な、ヒトあるいは動物の、組換えあるいは天然に生じるタンパク質をさす。生物活性物質は天然、合成、半合成あるいはそれらの誘導体のいずれでもよい。さらに、本発明の生物活性物質は認知可能でありうる。広い範囲の生物活性物質が想定される。それらは、ホルモン、サイトカイン、造血因子、成長因子、抗肥満因子、栄養因子、抗炎症因子、および酵素を含むがこれらに限定されない（有用な生物活性物質のさらなる例については米国特許第４，６９５，４６３号も参照のこと）。当業者は、所望する生物活性物質を本発明の組成物に容易に適合させることができるであろう。
【００２６】
そのようなタンパク質は、インターフェロン（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，３７２，８０８号、同第５，５４１，２９３号、同第４，８９７，４７１号、および同第４，６９５，６２３号参照）、インターロイキン（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，０７５，２２２号参照）、エリトロポイエチン（図面を含めて参照してここに組み込まれる米国特許第４，７０３，００８号、同第５，４４１，８６８号、同第５，６１８，６９８号、同第５，５４７，９３３号、および同第５，６２１，０８０号参照）、顆粒球コロニー刺激因子（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第４，８１０，６４３号、同第４，９９９，２９１号、同第５，５８１，４７６号、同第５，５８２，８２３号、およびＰＣＴ特許公開第９４／１７１８５号参照）、幹細胞因子（図面を含めて参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第９１／０５７９５号、９２／１７５０５号および９５／１７２０６号参照）、オステオプロテゲリン（図面を含めて参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第９７／２３６１４号参照）、およびレプチン（ＯＢタンパク質）を含むがこれらに限定されない。
【００２７】
本発明の二重ポリエチレングリコール化レプチン製剤のために使用するレプチンの種類は、上記に引用し、その全体が参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ  ９６／０５３０９号に記述されているものから選択されうる。かかる特許公開の図３（その中では配列番号４として引用される）は、ヒトレプチン（ヒト「ＯＢ」タンパク質と称される）に関して誘導した完全な推定アミノ酸配列を開示している。アミノ酸は１−１６７まで番号付けられている。シグナル配列の開裂部位はアミノ酸２１（Ａｌａ）のあとに位置するので、成熟タンパク質はアミノ酸２２（Ｖａｌ）からアミノ酸１６７（Ｃｙｓ）まで伸びる。本発明の開示にあたって、ここでは異なる番号付けを使用しており、１位のアミノ酸は成熟タンパク質の起点であるバリン残基である。ここでは成熟組換えメチオニルヒトレプチンに関するアミノ酸配列を配列番号１として示し、その中では成熟タンパク質の最初のアミノ酸はバリン（１位）であり、メチオニル残基は−１位（下記の配列には含まれない）に位置する。
【００２８】
【化１】
0004854851.tif 000002
しかし、本発明のレプチン成分のいずれについても同様であるように、−１位のメチオニル残基は存在しないと考えられる。
【００２９】
その代わりに、１４５個のアミノ酸を持ち、且つ、配列番号１のｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較して、２８位にグルタミンがない、ヒトレプチンの天然変異体を使用してもよい。
【００３０】
一般に、本文中の人体医薬用途のためのレプチン部分は、人体において治療に使用することができるであろう（下記の動物レプチンも参照のこと）。それ故、いずれのレプチン成分が使用できるかを判定するために活性を実験的に試験してもよい。ＷＯ  ９６／０５３０９号に述べられているように、その天然形態のレプチンタンパク質、あるいは断片（酵素開裂産物のような）あるいは他のトランケートされた形態およびアナログは、すべて生物活性を保持しうる。そのような形態のいずれもが本発明の二重ポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートのためのレプチン成分として使用しうるが、そのような変化した形態は所望する特性を調べるために試験すべきである。その全体が参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ国際特許公開ＷＯ  ９６／４０９１２号、ＷＯ  ９７／０６８１６号、９７／１８８３３号、ＷＯ  ９７／３８０１４号、ＷＯ  ９８／０８５１２号およびＷＯ  ９８／２８４２７号も参照のこと。
【００３１】
マウス配列と異なるアミノ酸に置換することのような、組換えヒト配列中のアミノ酸残基を変化させることによって組換えヒトレプチンのアナログを調製することができる。マウスレプチンは、特に成熟タンパク質として、そしてさらには特にＮ末端において、ヒトレプチンと実質的に相同である。組換えヒトタンパク質はマウスにおいて生物活性を持つことから、そのようなアナログはヒトにおいて活性であると考えられる。たとえば、配列番号１に示すような天然ヒトレプチンのアミノ酸配列において、３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、８９、９７、１００、１０１、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５位のアミノ酸の１つ又はそれ以上をもうひとつ別のアミノ酸で置換することができる。マウスタンパク質の対応する位置のアミノ酸（Ｚｈａｎｇら、１９９４、前出参照）あるいはもうひとつ別のアミノ酸を選択することができる。
【００３２】
さらにラットＯＢタンパク質配列に基づき「コンセンサス」分子を調製することができる。参照してここに組み込まれる、Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０９：９４４−５２（１９９５）参照。ラットＯＢタンパク質は次の位置でヒトＯＢタンパク質と異なる（配列番号１の番号付けを使用する）：４、３２、３３、３５、５０、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８および１４５。これらの相違する位置のアミノ酸の１つ又はそれ以上をもうひとつ別のアミノ酸で置換することができる。下線を付した位置は、マウスＯＢタンパク質ならびにラットＯＢタンパク質がヒトＯＢタンパク質と異なる位置であり、従って変更に特に適している。１つ又はそれ以上の位置で、対応するラットＯＢタンパク質からのアミノ酸あるいはもうひとつ別のアミノ酸に置換することができる。
【００３３】
成熟ヒトＯＢタンパク質と異なるラットおよびマウスの両方のＯＢタンパク質からの位置は、４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５である。対応するラットあるいはマウス配列において認められるアミノ酸のような、もうひとつ別のアミノ酸で置換された上記アミノ酸の１つ又はそれ以上を持つ配列番号１に従ったＯＢタンパク質も有効であると考えられる。
【００３４】
さらに、成熟ヒトＯＢタンパク質とは異なる、アカゲザルＯＢタンパク質において認められるアミノ酸は次の通りである（括弧内にアミノ酸の略語を１文字で示している）：８（Ｓ）、３５（Ｒ）、４８（Ｖ）、５３（Ｑ）、６０（Ｉ）、６６（Ｉ）、６７（Ｎ）、６８（Ｌ）、８９（Ｌ）、１００（Ｌ）、１０８（Ｅ）、１１２（Ｄ）および１１８（Ｌ）。組換えヒトＯＢタンパク質はヒヒ（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）において活性であるので、括弧内のアミノ酸のようなもうひとつ別のアミノ酸で置換されたアカゲザルの相違アミノ酸の１つ又はそれ以上を持つ、配列番号１に従ったヒトＯＢタンパク質は有効であると考えられる。一部のアカゲザル相違アミノ酸が上記のマウスおよびラット種でも認められる（３５、６８、８９、１００、１０８および１１８位）ことに留意しなければならない。そこで、次の位置でもうひとつ別のアミノ酸によって置換されたアミノ酸の１つ又はそれ以上を持つ、マウス／ラット／アカゲザル／ヒトコンセンサス分子（配列番号１の番号付けを使用する）を調製することができる：４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５。下線を付した位置は、３つの種すべてがヒトＯＢタンパク質と異なる位置である。特に好ましいヒトレプチンアナログは、１００位（Ｔｒｐ）あるいは１３８位（Ｔｒｐ）のアミノ酸、より好ましくは両方の位置のアミノ酸がもうひとつ別のアミノ酸、好ましくはＧｌｎで置換されているものである。
【００３５】
タンパク質アミノ酸配列の一部を欠失させることによって他のアナログを調製することができる。たとえば、成熟タンパク質はリーダー配列（−２２から−１）を欠く。次のようなヒトＯＢタンパク質分子のトランケートされた形態を調製することができる（配列番号１の番号付けを使用する）：
（ｉ）アミノ酸９８−１４６；
（ｉｉ）アミノ酸１−９９および１１２−１４６（に連結する）；
（ｉｉｉ）アミノ酸９９から１１２の間に連続的に位置するアミノ酸１００−１１１の１つ又はそれ以上を持つアミノ酸１−９９および１１２−１４６（に連結する）。
【００３６】
さらに、トランケートされた形態はまた、ヒトＯＢタンパク質とは異なる（マウス、ラットあるいはアカゲザルＯＢタンパク質において）変化した１つ又はそれ以上のアミノ酸を有していてもよい。さらに、変化は、ペプチドミメティックあるいはＤアミノ酸のような変化したアミノ酸の形態であってもよい。
【００３７】
酸性、電荷、疎水性、極性、サイズあるいは前記技術において既知の他の何らかの特性に従って「保存的」であるアミノ酸置換を有する、上述したようなタンパク質も含まれる。それらを下記の表１に示す。一般には、参照してここに組み込まれる、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、タンパク質、各所（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８４）；Ｆｏｒｄら、「タンパク質の発現と精製」（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）２：９５−１０７（１９９１）。
【００３８】
【表１】
0004854851.tif 000003
【００３９】
それ故、本発明の二重ポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートは
（ａ）任意に２８位のグルタミニル残基を欠き、さらに任意にＮ末端にメチオニル残基を持つ、配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の位置の１つ又はそれ以上において置換された異なるアミノ酸を持つ（ａ）項のアミノ酸配列；
（ｃ）１００および１３８位のアミノ酸がＧｌｎで置換されている（ｂ）項のアミノ酸配列；
（ｄ）（ｉ）アミノ酸９８−１４６
（ｉｉ）アミノ酸１−９９および１１２−１４６
（ｉｉｉ）アミノ酸９９から１１２の間に連続的に位置するアミノ酸１００−１１１の１つ又はそれ以上を持つアミノ酸１−９９および１１２−１４６；
（ｉｖ）もうひとつ別のアミノ酸で置換されたアミノ酸１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１つ又はそれ以上を持つ（ｉ）項のトランケートされたレプチンアナログ；
（ｖ）もうひとつ別のアミノ酸で置換されたアミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１つ又はそれ以上を持つ（ｉｉｉ）項のトランケートされたレプチンアナログ；
（ｖｉ）もうひとつ別のアミノ酸で置換されたアミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１つ又はそれ以上を持つ（ｉｖ）項のトランケートされたレプチンアナログ；
（ｖｉｉ）Ｎ末端にメチオニル残基を持つ（ｉ）−（ｖｉ）項のいずれかのトランケートされたレプチンアナログ；
の中から選択される、トランケートされたレプチンタンパク質アナログ；
（ｅ）１つ又はそれ以上の保存されたアミノ酸置換を持つ（ａ）−（ｄ）項のいずれかのレプチンタンパク質
の中から（本文中配列番号１に示すアミノ酸配列に従って）選択されうる。
【００４０】
レプチンタンパク質、アナログおよび関連分子は次の公表文献においても報告されている：しかし、報告されているいずれの組成物についても活性に関する記述は為されていない：
米国特許第５，５２１，２８３号；同第５，５２５，７０５号；同第５，５３２，３３６号；同第５，５５２，５２２号；同第５，５５２，５２３号；同第５，５５２，５２４号；同第５，５５４，７２７号；同第５，５５９，２０８号；同第５，５６３，２４３号；同第５，５６３，２４４号；同第５，５６３，２４５号；同第５，５６７，６７８号；同第５，５６７，８０３号；同第５，５６９，７４３号；同第５，５６９，７４４号；同第５，５７４，１３３号；同第５，５８０，９５４号；同第５，５９４，１０１号；同第５，５９４，１０４号；同第５，６０５，８８６号；同第５，６１４，３７９号；同第５，６９１，３０９号；同第５，７１９，２６６号（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；ＰＣＴ  ＷＯ９６／２３５１３号；ＷＯ９６／２３５１４号；ＷＯ９６／２３５１５号；ＷＯ９６／２３５１６号；ＷＯ９６／２３５１７号；ＷＯ９６／２３５１８号；ＷＯ９６／２３５１９号；ＷＯ９６／２３５２０号；ＷＯ９６／２３８１５号；ＷＯ９６／２７３８５号；ＷＯ９６／３４１１１号；ＷＯ９６／３７５１７号；ＷＯ９７／００８８６号；ＥＰ  ７２５０７９号；ＥＰ  ７４４４０８号；ＥＰ  ７４５６１０号；ＥＰ  ７２５０７８号；ＥＰ  ８３５８７９号（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／２２３０８号（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／３１５２６号（Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／３４８８５号；ＷＯ９７／４６５８５号（Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＰＬＣ）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／３５７８７号（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；
ＰＣＴ  ＷＯ９７／１６５５０号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；
ＰＣＴ  ＷＯ９７／２０９３３号（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
ＥＰ  ７３６５９９号（Ｔａｋｅｄａ）；
ＥＰ  ７４１１８７号（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ）。
【００４１】
これらの参考文献が有用なレプチンタンパク質又はアナログ、あるいは関連する組成物又は方法が提供するかぎりにおいて、そのような組成物および／あるいは方法は、同時投与（選択される投与スケジュールで、一緒に又は別個に）のためなどに、本発明の二重ポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートと組み合わせて使用しうる。上記を条件として、これらの公表文献は参照してここに組み込まれる。
【００４２】
さらに、生物学的に活性な物質は、インスリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、モチリン、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＮＦ−ｂｐ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）のような骨成長因子、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、巨核球由来成長因子（ＭＧＤＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、トロンボポエチン、血小板由来成長因子（ＰＧＤＦ）、コロニー刺激成長因子（ＣＳＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよびカリクレインを含みうるが、これらに限定されない。ここで使用する「タンパク質」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、コンセンサス分子、それらのアナログ、誘導体あるいは組合せを含む。
【００４３】
使用するタンパク質（あるいはそのアナログ）にかかわりなく、選択システイン変異をタンパク質配列に導入するように前記タンパク質を修飾する。システイン点変異の目的は、Ｎ末端に特異的なＰＥＧ複合のための既存のテクノロジーを補足する第二の複合部位を提供することである。これらの「システイン」タンパク質アナログは、前記技術で周知の従来の方法を用いて容易に調製することができる。
【００４４】
たとえば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）は、構造上レプチンに非常に類似した四重らせん束タンパク質である。ＧＣＳＦは還元的アルキル化によってＮ末端で容易にモノポリエチレングリコール化されるが、追加的なアミン特異的ポリエチレングリコール化は４個のリシン残基（Ｌｙｓ１６、Ｌｙｓ２３、Ｌｙｓ３４およびＬｙｓ４０）のいずれかでランダムに起こる。これは、少なくとも４つの異なる位置アイソフォームの混合物から成るジポリエチレングリコール化ＧＣＳＦの不均質な製剤を生じる。困難ではあるが、これらの位置アイソフォームは分離することができ、極めて多様な度合の残留活性を示した。アラニンスキャニングによりＧＣＳＦ活性部位のトポグラフィーマップを作成するという試みによって、らせんＮｏ．１とＮｏ．４に位置する少なくとも６個の残基（Ｌｙｓ１６、Ｇｌｕ１９、Ｌｙｓ２３、Ｇｌｕ４６、Ａｓｐ１０９およびＡｓｐ１１２）が同定され、これらは、アラニンへの変異を生じたとき、５倍を越えるＧＣＳＦ活性の喪失を生じさせた（Ｙｏｕｎｇら、Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，６：１２２８−１２３６（１９９７）。これは、Ｌｙｓ１６あるいはＬｙｓ２３でのポリエチレングリコール化がＧＣＳＦ活性の低下をもたらすという所見を裏付けるであろう。二重ポリエチレングリコール化のテクノロジーをＧＣＳＦに適用するためには、システイン残基を、活性部位とＮ末端の両方から遠位の部位に導入しなければならない。そのようなシステイン変異は、過度の接触を生じることなく溶媒を分子間のジスルフィド形成に暴露する、二次構造の要素の表面上に位置付ける。このアプローチの例として、それぞれらせんＮｏ．２、Ｎｏ．３およびＮｏ．５上のＳｅｒ５３→Ｃｙｓ５３、Ｇｌｙ８７→Ｃｙｓ８７およびＳｅｒ１５５→Ｃｙｓ１５５の変異が提案される。しかしながら他のいかなる位置も、ＧＣＳＦ活性を保存しており、分子間タンパク質架橋を抑制しながら有効なＰＥＧ複合を促進し、さらに高収率で産生することができれば、適当と判断しうることに留意しなければならない。
【００４５】
一部のタンパク質の場合には、ポリエチレングリコール化の１つの部位として天然配列中に既に存在するシステイン残基を代替的に使用し、それによってＮ末端のポリエチレングリコール化を避けることもできる。さらに、２つの選択システイン変異を天然タンパク質配列に導入し、それらのシステイン残基の各々を二重ポリエチレングリコール化複合において使用して、やはりＮ末端のポリエチレングリコール化を回避することができる。
【００４６】
本発明において調製するレプチンアナログは、選択システイン変異、Ａｒｇ７２→Ｃｙｓ７２あるいはＳｅｒ７８→Ｃｙｓ７８を含む。これらの変異は、レプチンの三次元モデルに対するトポグラフィーマップ上の小さな化学修飾に基づき、それらの修飾をタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ活性に対する作用に関連づける。かかる部位は、レプチンの内因性生物活性を保存し、且つ２つの部位（すなわちＮ末端と第二のシステイン部位）を識別することができる、二者択一的であるが適合性の化学を可能にするように選択され、従って各々の部位でＰＥＧサイズとコンフォメーションの独立した変形を提供する。変異をＮ末端から遠位に、そして架橋化学を促進するように溶媒に暴露された表面上に位置付けるという追加的な配慮を払った。
【００４７】
Ａｒｇ７２→Ｃｙｓ７２の変異は、溶媒の接触可能性を高めるためにフレキシブルループに位置し、一方Ｓｅｒ７８→Ｃｙｓ７８の変異は、再折りたたみの初期に天然システイン（Ｃｙｓ９７およびＣｙｓ１４７）から離れて並置することにより再折りたたみの回収率を高めうるＣらせんの底部で起こる。新しいＣｙｓ７８複合部位は、Ｎ末端と推定上のレセプタ結合界面の両方から遠位である。そのように位置付けたＣｙｓ７８は、コンジュゲートの流体力学容積を最大限にしながら、第二ポリマー複合とレセプタ結合の両方による立体干渉を最小限に抑えるのを助けると仮定した。さらに、Ｃｙｓ７８部位はＣらせんにおけるその位置の故に選択したが、そのことから、自然発生的な分子間あるいは分子内ジスルフィド形成に抵抗し、従ってアナログの安定性と工程の回収率を改善すると考えられる。この仮説は、同時に産生されたＡｒｇ７２→Ｃｙｓ７２アナログによって支持される。Ａｒｇ７２→Ｃｙｓ７２部位は隣接するフレキシブルループ内にあり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたとき、高いレベルの凝集物と折りたたみ誤りにより、ほとんど回収不能であった。
【００４８】
２つの複合化学は相互に適合性であり、比較的部位特異的であるので、生じるコンジュゲートは、典型的には高い度合の均一性を持ち、従来のクロマトグラフィー法によって容易に精製される。
【００４９】
その後、上述した「システイン」タンパク質アナログを使用して、二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートを調製する。本発明において調製する二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートは、簡単な二段階合成においてＳｅｒ７８→Ｃｙｓ７８レプチンアナログを使用して、所望する二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートを生成する。生じるバイオコンジュゲートは、Ｃｙｓ７８およびＮ末端での部位特異的結合により四重らせん束の反対側の末端でポリエチレングリコール化されたレプチンアナログを持つ。
【００５０】
使用するポリマー分子は水溶性ポリマーの中から選択されうる。（還元的アルキル化工程のためには、ポリマーは単一反応性アルデヒドを有していなければならない。）結合するタンパク質が、生理環境のような水性環境において沈澱しないように、選択するポリマーは水溶性でなければならない。還元的アルキル化のためには、選択するポリマーは、本発明の方法で規定するように重合の度合を制御できるように、単一反応性アルデヒドを有していなければならない。好ましくは、最終産物製剤の治療用途のために、ポリマーは医薬上許容される。当業者は、ポリマー／タンパク質コンジュゲートを治療に使用するかどうか、そしてその場合には所望する用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性などの配慮、およびその他の配慮に基づいて所望するポリマーを選択することができる。水溶性ポリマーは、たとえばポリエチレングリコール、デキストランあるいはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオルおよびポリビニルアルコールから成る群から選択されうる。
【００５１】
下記に論じるような至適化のための配慮の下に、ポリマーはいかなる分子量のものでもよく、また分枝していてもあるいは分枝していなくてもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は約１０ｋＤａから約１００ｋＤａの間であり（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの製剤中、一部の分子が明言された分子量を上回り、一部が下回ることを表わす）。所望する治療プロフィール（たとえば所望する持続放出の期間、存在する場合には生物活性への作用、取り扱いの容易さ、抗原性の度合あるいは抗原性の欠如、および治療タンパク質あるいはアナログへのポリエチレングリコールの他の既知の作用）に依存して、様々なサイズが使用できる。
【００５２】
ポリエチレングリコール分子をタンパク質に結合するために様々な手段が用いられてきた。一般には、タンパク質上に認められる反応基を通してポリエチレングリコール分子をタンパク質に連結する。リシン残基上あるいはＮ末端にあるもののようなアミノ基がそのような結合に好都合である。たとえば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許第４，００２，５３１号、前出）は、ポリエチレングリコール分子を酵素に結合するために還元的アルキル化を用いることを述べている。Ｗｒｉｇｈｔの１９９３年４月２８日公開の特許願ＥＰ  ０  ５３９  １６７号、「Ｐｅｇイミデートおよびそのタンパク質誘導体」（Ｐｅｇ  Ｉｍｉｄａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ）は、遊離アミノ基を持つペプチドと有機化合物をＰＥＧの直接誘導体あるいは関連水溶性有機ポリマーで修飾することを述べている。Ｓｈａｗの１９９０年２月２７日発行の米国特許第４，９０４，５８４号は反応性アミン基を通してポリエチレングリコール分子を結合するためのタンパク質中のリシン残基の数の変更に関するものである。ＰＣＴ  ＷＯ  ９６／４０９１２号、前出の８ページ以降は、レプチン（その中ではＯＢタンパク質と称されている）をＮ末端で誘導体化する方法を説明している。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様では、システイン残基でのＰＥＧ分子のタンパク質への結合は、リシンアミンに対してＣｙｓ７８チオールへのマレイミドの選択性を最大にするため〜ｐＨ６．５での反応を使用して（このｐＨは同時にチオールの酸化を最小限に抑える）、ＰＥＧ分子をシステイン残基に結合することを含む；タンパク質のＮ末端への第二のＰＥＧ分子の結合は、レプチン上の他の位置のアミン基はプロトン化されるがアミノ末端のアミンはプロトン化されないような十分に酸性のｐＨで、アミン結合を形成するための還元条件下でＰＥＧ分子をレプチン成分に結合することを含む。
【００５４】
一般に、投与のために必要な医薬上許容される希釈剤、防腐剤、溶解補助剤、乳化剤、アジュバントおよび／あるいは担体と共に、有効量の化学修飾されたタンパク質あるいは誘導体産物を含有する医薬組成物は、本発明に包含される。（参照してここに組み込まれるＰＣＴ  ９７／０１３３１号参照）。所望する生物学的に活性な物質のための至適医薬剤型は、投与経路と所望する用量に依存して当業者により決定されるであろう。例示的な医薬組成物は、「レミントンの医薬化学」（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１８版、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４３５−１７１２（１９９０））。本発明の医薬組成物は、経口および非経口製剤（たとえば筋肉内、皮下、経皮、内臓、ＩＶ（静脈内）、ＩＰ（腹腔内）、関節内、耳内への設置、ＩＣＶ（大脳室内）、ＩＰ（腹腔内）、動脈内、クモ膜下腔内、関節包内、眼窩内、経肺、経鼻、直腸、および子宮−経粘膜製剤）によって投与しうる。
【００５５】
本発明の組成物の治療用途は使用する生物活性物質に依存する。当業者は、所望する生物活性物質をその意図する治療用途のために本発明に容易に適合させることができるであろう。そのような物質の治療用途は、図面を含めて参照してここに組み込まれる下記の公表文献中で詳細に述べられている。治療用途は、インターフェロン（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，３７２，８０８号、同第５，５４１，２９３号参照）、インターロイキン（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，０７５，２２２号参照）、エリトロポイエチン（図面を含めて参照してここに組み込まれる米国特許第４，７０３，００８号、同第５，４４１，８６８号、同第５，６１８，６９８号、同第５，５４７，９３３号、および同第５，６２１，０８０号参照）、顆粒球コロニー刺激因子（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第４，９９９，２９１号、同第５，５８１，４７６号、同第５，５８２，８２３号、同第４，８１０，６４３号、およびＰＣＴ特許公開第９４／１７１８５号参照）、幹細胞因子（図面を含めて参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第９１／０５７９５号、９２／１７５０５号および９５／１７２０６号参照）、およびＯＢタンパク質（図面を含めて参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第９６／４０９１２号、９６／０５３０９号、９７／００１２８号、９７／０１０１０号および９７／０６８１６号参照）のようなタンパク質のための使用を含むがこれらに限定されない。さらに、本発明の組成物はまた、生物活性物質が治療することを意図する状態の治療あるいは改善のための１つ又はそれ以上の薬剤の製造のためにも使用しうる。
【００５６】
当業者は、投与と所望する治療効果の観察によって有効用量を確認することができるであろう。好ましくは、コンジュゲートの製剤は、約０．０１μｇレプチン成分／ｋｇ体重／日から１０ｍｇレプチン成分／ｋｇ体重／日の用量が所望する治療効果を生じるような製剤である。有効用量は経時的な診断ツールを用いて決定しうる。たとえば、血液中（あるいは血漿中あるいは血清中）のレプチンの量を測定するための診断を最初に使用してレプチンタンパク質の内因性レベルを調べることができる。そのような診断ツールは、抗体サンドイッチアッセイのような抗体アッセイの形態でありうる。最初に内因性レプチンタンパク質の量を定量し、基線を決定する。内因性および外因性レプチンタンパク質成分（すなわち、自己産生されたかあるいは投与された、体内で認められるタンパク質、アナログあるいは誘導体）の定量を治療期間を通じて継続しながら治療用量を決定する。それ故、用量は治療期間を通じて変化し、たとえば最初に治療の恩恵が認められるまでは比較的高い用量を使用し、治療効果を維持するためにはより低い用量を使用することができる。
【００５７】
二重ポリエチレングリコール化レプチンの治療用途は、体重調節、糖尿病の治療あるいは予防、血中脂質の低下（および関連する状態の治療）、脂肪なし体重の増加ならびにインスリン感受性の上昇を含む。
【００５８】
体重調節。本発明の組成物および方法は体重減少のために使用しうる。もうひとつ別の見地からは、本発明の組成物は所望する体重あるいは肥満レベルの維持のために使用できる。マウスモデルで明らかにされたように（下記参照）、本発明の二重ポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートの投与は体重減少をもたらす。失われるボディマスは主として脂肪組織あるいは脂肪である。そのような体重損失は下記に述べるもののような随伴状態の治療に結びつけることができ、それ故治療適用を構成する。さらに、体重調節が単に外観の改善だけを目的とする場合の化粧品用途をここで提供する。
【００５９】
糖尿病の治療。本発明の組成物および方法は、ＩＩ型糖尿病の予防あるいは治療において使用しうる。ＩＩ型糖尿病は肥満と相関しうるので、体重を低減する（あるいは所望する体重を維持する、あるいは肥満レベルを低減又は維持する）ために本発明を使用することは、同時に糖尿病を軽減する、あるいは糖尿病の発現を予防することができる。さらに、体重減少をもたらすのに十分な用量が存在しない場合でも、本発明の組成物は糖尿病を予防あるいは軽減するために使用することができる。
【００６０】
血中脂質調節。本発明の組成物および方法は血中脂質レベルの調節において使用しうる。高脂血症（脂肪血症、血中脂質異常とも称される）は、循環血液中に異常に多量の脂質が存在する状態である。理想的には、単に血中脂質レベルの低下だけを所望する、あるいは血中脂質レベルの維持を所望する状況においては、体重減少をもたらすには不十分な用量を用いる。従って、肥満患者の治療初期には、体重減少と随伴する血中脂質レベルの低下が達成される用量を投与することができる。ひとたび十分な体重減少が達成されれば、体重の回復を防ぐのに十分であるが、所望する血中脂質レベル、あるいはたとえばここで述べるような他の状態を維持するのに十分な用量を投与することができる。レプチンタンパク質の作用は可逆性であるので、これらの用量は経験的に決定することができる。たとえば、Ｃａｍｐｆｉｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４６−５４９（１９９５）の５４７。それ故、体重減少を所望しないときに、ある用量が体重減少をもたらすことが認められれば、所望する血中脂質レベルを達成し、且つ所望する体重を維持するためにより低い用量を投与する。たとえば、参照してここに組み込まれるＰＣＴ特許公開ＷＯ  ９７／９６８１６号参照。
【００６１】
脂肪なし体重あるいはインスリン感受性の上昇。理想的には、脂肪なし体重の増加だけを所望する状況においては、体重減少をもたらすには不十分な用量とする。従って、肥満者の治療の初期には、体重減少と随伴する脂肪組織の減少／脂肪なし体重の増加が達成される用量を投与することができる。ひとたび十分な体重減少が達成されれば、体重の回復を防ぐのに十分であるが、所望する脂肪なし体重の増加（あるいは脂肪なし体重の軽減の予防）を維持するのに十分な用量を投与することができる。インスリンに対する個人の感受性を高めるためには、同様の用量上の配慮を考慮することができる。個人が糖尿病の治療のために投与されるインスリン（あるいは潜在的に、アミリン、アミリン拮抗物質あるいは作用物質、あるいはチアゾリジンジオン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、あるいは他の潜在的糖尿病治療薬）の量を低減するのに十分な、体重減少を伴わない脂肪なし体重の増加を達成することができる。全体的な強さを高めるために、同様の用量上の配慮を行うことができる。随伴する全体的強度の上昇を伴った脂肪なし体重の増加は、体重減少をもたらすには不十分な用量で達成されうる。赤血球数（および血液中の酸素）の増加および骨吸収又は骨粗しょう症の低下のような他の恩恵も、体重減少を伴わずに達成されうる。たとえば、参照してここに組み込まれるＰＣＴ特許公開第ＷＯ  ９７／１８８３３号参照。
【００６２】
併用治療。本発明の組成物および方法は、食事療法や運動のような他の治療と組み合わせて使用することができる。他の薬剤は、糖尿病の治療に有用なもの（たとえばインスリンおよび場合によってはアミリン、それらの拮抗物質あるいは作用物質、チアゾリジンジオン（たとえば、参照してここに組み込まれるＰＣＴ特許公開第ＷＯ  ９８／０８５１２号参照）、あるいは他の潜在的糖尿病治療薬）、コレステロールおよび血圧低下薬剤（血中脂質レベルを低下させるものあるいは他の心臓血管薬剤）、活性上昇薬剤（たとえばアンフェタミン）、利尿薬（液体排泄のため）、ならびに食欲抑制薬（神経ペプチドＹレセプタあるいはセロトニン再取込み阻害因子に作用する物質など）を含む。そのような投与は同時あるいは順次に行うことができる。さらに、本発明の方法は、身体の全体的外観を変えるためにデザインされた美容整形（たとえば脂肪吸引法あるいはボディマスを低減するためにデザインされたレーザー手術あるいはボディマスの外観を増加させるためにデザインされたインプラント手術）のような手術処置と組み合わせて使用することができる。動脈斑のような脂肪沈着による血管の遮断によって引き起こされる有害な状態を軽減するためにデザインされたバイパス手術あるいは他の手術のような心臓手術の健康上の恩恵を、本発明の組成物および方法の併用によって高めることができる。超音波あるいはレーザー法のような胆石を除去するための方法も、本発明の治療法の前、その期間中あるいはその後のいずれかに使用することができる。さらに、本発明の方法は、骨折、筋肉損傷のための手術又は治療、あるいは脂肪なし組織重量の増加によって改善される他の治療の補助として使用しうる。
【００６３】
さらに、本発明の組成物は、上記の状態を治療あるいは改善するための１つ又はそれ以上の薬剤の製造のために使用することができる。
【００６４】
下記の実施例は本発明をより詳細に例示するために提供するものであり、その範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００６５】
実施例１
この実施例は、Ａｒｇ７２→Ｃｙｓ７２レプチンアナログおよびＳｅｒ７８→Ｃｙｓ７８レプチンアナログの調製を述べる。
【００６６】
本実験には組換えメチオニルヒトレプチン（ｒｍｅｔＨｕ−レプチン）を使用した。ここで使用するレプチン成分は原核あるいは真核細胞において作製しうるが、下記の実施例で用いるレプチン成分については、工業的製造を容易にするため細菌が好ましい。さらに、所望のタンパク質をコードする内因性遺伝子の調節に影響を及ぼす天然あるいは導入調節要素を制御することによって作製されるもののような、ヒト細胞において産生されるレプチンを使用してもよい。
【００６７】
不対システイン残基を含むヒトレプチンの２つのアナログを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から発現させ、精製して、ポリエチレングリコール化反応における基質として使用した。これらはＡｒｇ７２→Ｃｙｓ７２レプチンアナログおよびＳｅｒ７８→Ｃｙｓ７８レプチンアナログ（配列番号１のアミノ酸位置に関する変異）であった。アナログは、標準ＰＣＲ手法を用いて配列番号１の部位特異的変異誘発によって構築した。使用した変異誘発性オリゴヌチドを下記の表２に示す：
【００６８】
【表２】
0004854851.tif 000004
【００６９】
各対からのアンチセンスプライマー（Ａｒｇ７２→Ｃｙｓ７２については１７３５−４７；Ｓｅｒ７８→Ｃｙｓ７８については１７３５−４９）をベクターｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）万能センスプライマー１２１６−５２によるＰＣＲ反応において使用し、所望する変異を含むレプチン遺伝子の５’末端を作製した。各対からのセンスプライマー（Ａｒｇ７２→Ｃｙｓ７２については１７３５−４６；Ｓｅｒ７８→Ｃｙｓ７８については１７３５−４８）をベクターｐＡＭＧ２１万能アンチセンスプライマー１２００−５４によるＰＣＲ反応において使用し、所望する変異を含むレプチン遺伝子の３’末端を作製した。半分の分子２個を万能プライマーだけを用いる第三のＰＣＲ反応において結合させ、各々の変異を含む完全長の産物を作製した。各ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化し、やはりＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化したベクターｐＡＭＧ２１にライゲーションした。
【００７０】
結合したＤＮＡを大腸菌株２５９６のコンピテント宿主細胞に形質転換した。大腸菌宿主株２５９６はＡｍｇｅｎ菌株３９３（ＡＴＣＣ番号２０２１７３はこの菌株のｈｓｄＲバージョンである）から誘導される大腸菌Ｋ−１２系統である。早期ｅｂｇ領域における温度感受性λリプレッサーと後期ｅｂｇ領域（６８分）におけるｌａｃＩＱリプレッサーの両方を含むように改変した。
【００７１】
組換えタンパク質産物を産生し、正しいヌクレオチド配列を持つ遺伝子を担う能力に関してクローンをスクリーニングした。Ａｒｇ７２→Ｃｙｓ７２変異を含む１個のそのようなクローンを選択してＡｍｇｅｎ菌株３５５９と称し、Ｓｅｒ７８→Ｃｙｓ７８変異を含むもうひとつのクローンをＡｍｇｅｎ菌株３５６１と称した。レプチンアナログの組換え発現は、たとえば、参照してここに組み込まれるＷＯ  ９６／４０９１２号に述べられているように実施した。
【００７２】
実施例２
この実施例は、二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートの調製を述べる。実施例１で述べたように調製したＳｅｒ７８→Ｃｙｓ７８レプチンアナログから出発し、次の二段階の工程を使用する：
段階１。ＮａＨＰＯ４緩衝液２０−５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ５ｍＭ、ｐＨ６．５中にアナログを２−３ｍｇ／ｍｌにとる。次にメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＰＥＧＡ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を１−３倍モル過剰に加え、４℃で２−２４時間反応させてＣｙｓ７８部位に複合する。
【００７３】
段階２。ステップ１からの反応混合物のｐＨをｐＨ４−６に低下させ、５−７倍過剰のメトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧＢ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を十分量のシアノホウ水素化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）と共に加えてＮａＢＨ３ＣＮ  １５ｍＭを生成する。撹拌しながらこの反応を４℃でひと晩進行させる。完了後、反応物をＮａＯＡｃ  ２０ｍＭ、ｐＨ４に透析し、＜１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈して、ｐＨをｐＨ３．５に調整する。次にこの物質を、ＮａＯＡｃ  ２０ｍＭ、ｐＨ４中、高速セファロースＳＰ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより０−２００ｍＭ  ＮａＣｌ勾配で精製する。
【００７４】
弁別複合化学により、各々の部位に結合するポリマーを独立して変化させることが可能である。これまでに、２０ｋＤａと３０ｋＤａの線状ＰＥＧおよび４０ｋＤａの分枝ＰＥＧが評価されており、特にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、光散乱法、ペプチドマッピング、ｉｎ  ｖｉｔｒｏレセプタ結合アッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏバイオアッセイによって特性付けられている。
【００７５】
実施例３
二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートによって達成される用量低下を、０．１−１０ｍｇ／ｋｇタンパク質を皮下投与によりマウスに７日間毎日投与して評価した。所定用量の各コンジュゲートについて、７日間の試験期間中に達成された３つの最大体重減少の数値を平均した。次いでこの平均体重減少値を、試験した各用量についての用量関数としてプロットした（図１）。図１のデータは、二重ポリエチレングリコール化レプチンが１３−２０倍の用量低下をもたらすことを明らかにしている。図１はいくつかの試験からのデータを含むため、合成用量反応曲線と定義される。各コンジュゲートに関するデータを対数曲線に適合させると、それを解くことによって一定のパーセンテージの体重減少を実現するために必要な用量を予測することができる線形方程式が得られる。この場合には、４％がデータによく表わされている中間範囲の体重減少値である。４％体重減少について方程式を解くと、下記の表３に示す予測用量と天然レプチンに比べての用量低下を生じる。
【００７６】
【表３】
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【００７７】
実施例４
二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を、野生型マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇを単回皮下投与し、緩衝液対照と比較して体重減少をモニターすることによって試験した。対照として非修飾ｒｈｕ−レプチンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与した。２０ｋＤａモノＰＥＧ−レプチン群についての体重減少は３日後に１２％のピークに達し、５日目までに回復した（図２）。２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンは６日目までに１３％の体重減少を誘発し、１０日目までに回復した。さらに良好であった３０ｋＤａの二重ポリエチレングリコール化レプチンは７日目までに１６％の体重減少を誘発し、１４日目まで回復しなかった。図２のデータは、レプチンの二重ポリエチレングリコール化が実質的に高い効果を促進し、その効果は単回投与から１４日間持続されることを明らかに示している。これは二重ポリエチレングリコール化レプチンの意外且つ極めて有用な特性であり、天然レプチンより〜１０倍低い総用量の物質を週１回の注入投与するだけでよいという可能性を提供する。
【００７８】
実施例５
２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンの薬物動態プロフィールを、正常マウスにおいて単回３ｍｇ／ｋｇ用量の皮下あるいは静脈内投与後に検討した。規則正しい間隔をおいて採取した血清サンプル中の２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンの濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。静脈内投与に関しては、２０ｋＤａ二重ＰＥＧ−レプチンコンジュゲートは速やかに〜１０４ｎｇ／ｍｌの最大濃度に達し、７日間にわたって持続して、７日目でもなお〜２００ｎｇ／ｍｌで検出可能である。皮下投与に関しては、２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートは〜１５時間後に〜４×１０３ｎｇ／ｍｌの最大濃度に達し、少なくとも６日間持続する（図４）。それと共に、これらのデータは、天然ｒｈｕ−レプチンと比較して二重ポリエチレングリコール化レプチンによって達成されるｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物動態半減期の極めて大きな上昇を示している。さらに、このバイオコンジュゲートは、皮下投与したとき良好な生物学的利用能を持つと思われる。
【００７９】
実施例６
２０ｋＤａモノポリエチレングリコール化レプチンの投与により、近位微小管上皮内の腎空胞の蓄積が認められ、これは用量依存的である。空胞形成を誘発するのに必要な用量は治療用量を大きく上回っており、重度の空胞形成でも腎機能障害を引き起こすことはないと思われるが、この明らかな毒性は有害であるとみなされる。二重ポリエチレングリコール化レプチンのデザインに適用されるひとつの仮説は、レプチンの反対側の末端にある２個の独立したポリマーの力学特性が、コンジュゲートの総流体力学容量を増加させ、ポリマーの崩壊、従って腎微小管の浸透に抵抗するというものであった。
【００８０】
この試験では、体重１８−２１ｇの成体（８−１２週齢）雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに緩衝液（ＰＢＳ）、２０ｋＤａモノＰＥＧ−レプチン、２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンあるいは３０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンのいずれかを投与した。各々の製剤を２．５ｍｇ／ｋｇ／日あるいは１０ｍｇ／ｋｇ／日の皮下注射によって７日間投与するか、あるいは１０ｍｇ／ｋｇを単回投与してその後７日間の回復期間をおいた。７日目に各投与群から３匹の動物を剖検し、コンジュゲートが誘発する空胞形成の度合を評価するため腎臓を組織学的検査に供した。図５は、二重ポリエチレングリコール化レプチンが、有効用量より３０−４５倍高いレベルでも、２０ｋＤａモノポリエチレングリコール化レプチン対照と比較して腎空胞を誘発する傾向が劇的に低いことを示している。この所見は、二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートが実際にはモノポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートの２−３倍のＰＥＧ総量／投与を供給送達することを考慮すると特に著明である。さらに、図３および４に示されている、二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートに関して認められた薬物動態の延長は、これらのコンジュゲートがモノポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートに比べて毎日の投与スケジュールにおいてかなりの蓄積を生じることを示唆する。
【００８１】
実施例７
この実施例は、二重ポリエチレングリコール化レプチンとモノポリエチレングリコール化レプチンを週に１回の投与レジメンで比較した試験について述べる。０、７、１４および２１日目に２５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇの２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチン、あるいは２５ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇの２０ｋＤａモノポリエチレングリコール化レプチンをマウスに皮下投与した。緩衝液対照と比較した体重減少を４４日間にわたってモニターした。
【００８２】
図６のデータは、週に１回の投与レジメンで適用したとき、モノポリエチレングリコール化レプチンと比べて二重ポリエチレングリコール化レプチンに関する約１０倍の用量低下を示している。これらのデータは図３および４に示す薬物動態データと一致し、また二重ポリエチレングリコール化レプチンが実質的な体重減少（〜２０％）を誘発し、維持できることを明らかにしている。
【００８３】
実施例８
この実施例は、モノポリエチレングリコール化レプチン製剤と比較して二重ポリエチレングリコール化レプチン製剤に関連した腎病変をさらに評価するためにデザインされた試験を述べる。
【００８４】
体重１８−２１ｇの成体（１２週齢）雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、対照群を除いて、週に１回３週間にわたってレプチン製剤の皮下注射を実施し、対照群にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を与えた。
【００８５】
最後の注射の日に剖検を行い、その際肝と腎を肉眼的異常について検査して、その後中性緩衝１０％ホルマリンに液浸した。固定後、腎臓、肝臓、リンパ節および脾臓を段階的アルコール中で脱水し、キシレンで浄化して、パラフィンに包埋した。各々の器官について、各群から３匹のマウスについて１個の組織ブロックを一緒に処理して、各動物につき１つの切片を作製した。
【００８６】
６μｍの厚さの切片をヘマトキシリンとエオシン（ＨＥ）で染色し、多数の領域を４０×、１０×および４００×の倍率で検査した。肝、リンパおよび脾マクロファージならびに腎微小管上皮における細胞質空胞変性の重症度を、５段階スケールを用いて半定量的に等級づけた：±＝疑わしい（非常にまれ、ごくわずかな細胞に小さな空胞）；１＋＝極微（まれ、一部の細胞に小さな空胞）；２＋＝軽度（直径〜３μｍの控え目な数の空胞）；３＋＝中等度（直径〜３μｍから〜５μｍの多数の空胞）；あるいは４＋＝著明（直径＞５μｍの大きな無数の融合した空胞）。まれなケースとして、空胞が存在するが極めてまれである場合には、疑わしい（±）等級を適用した。このスケールは、組織切片全体での病変の度合と、個々の機能単位（たとえば１つの尿細管）についての病変の重症度の評価を結合するものである。
【００８７】
試験の結果を図７に示す。２０ｋＤａモノポリエチレングリコール化レプチン（陽性対照）の初回投与は、多数の近位尿細管の大部分の上皮細胞において中等度（３＋）の病変（無数の小さな透明の細胞質空胞から成る）を生じさせた。この変性の重症度は、その後の注射と共に著明（４＋）へと上昇した。１又は３週間の回復期間後、腎上皮は、数はわずかに少ないがはるかに大きな空胞を含んでいた。
【００８８】
すべての用量の２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンが、実験期間中のいくつかの時点で近位尿細管において非常な極微（±）から軽度（２＋）の空胞形成を生じさせた。３週間の治療期間中、空胞は一般に小さく、細胞内に単独で又は対として、通常は先端の位置に発生した。大部分が核上細胞質に位置しており、正常な生理的構造として多くの腎細管細胞中に存在するごく小さな空胞（おそらくエンドサイトーシスによって）の先端線からは分離されていた。空胞形成の度合はどの時点においても用量依存的であった。１０ｍｇ／ｋｇ用量に関してはすべての時点で極微（１＋）数の空胞が認められたが、２．５ｍｇ／ｋｇ用量については３回目の注射後にのみ極めて小さな病変（±）が発生した。軽度（２＋）の分類は２５ｍｇ／ｋｇ用量に関して２回目の注射後に認められ、試験の残りの期間を通じて持続した。２．５ｍｇ／ｋｇ用量では、病変は１週間以内に完全に後退した。１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ用量では、回復期間中に空胞の数がわずかに減少して個々の空胞が大きくなり、空胞とそれらの内容物がより大きな空胞あるいは沈着物へと癒合したことを示唆している。
【００８９】
図７のデータは、二重ポリエチレングリコール化レプチンがモノポリエチレングリコール化レプチンに比べて有意に少ない腎空胞蓄積を示すことを明らかにしている。
【００９０】
いずれのレプチン化合物も（陽性対照物質を含めて）、２．５、１０あるいは２５ｍｇ／ｋｇ用量での３週間にわたる週１回投与後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓、リンパ節あるいは脾臓のマクロファージにおいて空胞を誘発しなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  マウスに０．１−１０ｍｇ／ｋｇタンパク質を皮下投与により７日間毎日投与したモデルでの様々なレプチン用量反応曲線を示すグラフである。
【図２】  マウスに各々の製剤１０ｍｇ／ｋｇを単回皮下注射によって投与したモデルでの、種々のレプチン製剤が単回投与で誘発する体重減少パーセンテージを示すグラフである。
【図３】  ３ｍｇ／ｋｇの単回用量を静脈内注射した後のマウスにおける２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンについての薬物動態プロフィールを示すグラフである。
【図４】  ３ｍｇ／ｋｇの単回用量を皮下注射した後のマウスにおける２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンについての薬物動態プロフィールを示すグラフである。
【図５】  種々のレプチン製剤に関する腎空胞スコアの比較を示す棒グラフである。
【図６】  ０、７、１４および２１（ｘ）日目に種々の用量の様々なレプチンコンジュゲート製剤を用いて皮下投与したあとに得られた体重減少％を示すグラフである。
【図７】  様々なレプチン製剤に関する腎空胞スコアの比較を示す棒グラフである。
【配列表】
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0004854851.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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