(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号４５〜４７及び配列番号４９〜５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１〜４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５〜４７及び配列番号４９〜５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドからなる医薬。
【請求項４】
配列表の配列番号１〜４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５〜５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有する癌ワクチン。
【請求項５】
配列表の配列番号１〜４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５〜５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有し、膵臓癌、大腸癌、若しくは胃癌の治療に用いられる癌ワクチン。
【請求項６】
配列表の配列番号１〜４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５〜５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項７】
配列表の配列番号１〜４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５〜５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドを使用することを特徴とする人の生体外での細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項８】
配列表の配列番号１〜４７及び配列番号４９〜５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項９】
配列表の配列番号５４〜５６及び配列番号５８〜６２のいずれか１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項１０】
配列表の配列番号５４〜５６及び配列番号５８〜６２のいずれか１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖を含有する組換えベクター。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか１に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖を含有する発現組換えベクター。
【請求項１３】
請求項８〜１０のいずれか１に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖を含有する組換えベクター若しくは発現組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１４】
請求項８〜１０のいずれか１に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖を含有する発現組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項２に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のペプチドまたは請求項２に記載のポリペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１６】
請求項１に記載のペプチド若しくは請求項２に記載のポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチド若しくは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および／または請求項８〜１０のいずれか一に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載のポリペプチド、請求項８〜１０のいずれか一に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、請求項１１若しくは１２に記載の組換えベクター若しくは発現組換えベクター、請求項１３に記載の形質転換体、または請求項１５に記載の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項３に記載の医薬、請求項４若しくは請求項５に記載の癌ワクチン、または請求項６に記載の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤からなる癌疾患治療剤。
【請求項１８】
請求項１に記載のペプチド若しくは請求項２に記載のポリペプチドまたは請求項８〜１０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のペプチド若しくは請求項２に記載のポリペプチドまたは請求項８〜１０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法に使用する試薬キットであって、請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載のポリペプチド、請求項８〜１０のいずれか１に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または請求項１５に記載の抗体を少なくとも１つ以上含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、腫瘍抗原に関し、さらに詳しくは腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドまたはポリペプチド、該ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ペプチドまたは該ポリペプチドに対する抗体、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物、該ペプチドおよび／または該ポリペプチドからなる細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、およびこれらの１種以上を含む医薬組成物、並びに該ポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物のスクリーニング方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドを用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの測定方法、および該測定方法に使用する試薬キットに関する。
背景技術
生体における癌の排除には免疫系、特に細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（以下、ＣＴＬと略称することもある）が重要な役割を果たしている。癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤が認められている（Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．，１２６：２００〜２０５，１９９０）。この腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子（腫瘍抗原）は、メラノーマにおいて初めて発見された。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて８〜１１個のアミノ酸からなるペプチド（腫瘍抗原ペプチド）になり、主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡと腫瘍抗原ペプチドとからなる複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ拘束性に腫瘍抗原ペプチドを認識する。
ＨＬＡは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別されるが、細胞傷害性Ｔ細胞により抗原ペプチドとともに認識されるＨＬＡはクラスＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ等に分類され、それらの遺伝子は多型に富むことが報告されている。ＨＬＡ−Ａ亜領域の多型の１つであるＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、アフリカ黒人の約２３％、中国人の約５３％、日本人の約４０％、北アメリカコーカサス人の約４９％、および南アメリカコーカサス人の約３８％でみられる。
ここにおいて、腫瘍抗原とは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る、腫瘍細胞が有する蛋白質、ポリペプチド、またはペプチドを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導または活性化し得るペプチドを意味する。さらに、腫瘍抗原が有する腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るアミノ酸配列の部位を腫瘍抗原エピトープ（腫瘍抗原決定基）という。
近年、細胞傷害性Ｔ細胞により認識されうる腫瘍抗原をコードする多くの遺伝子が、ヒトの癌細胞のｃＤＮＡから同定されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３〜１６４７，１９９１）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：１１８５〜１１９２，１９９６）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９４〜５００４，１９９９）。これらは、ＨＥＲ／ｎｅｕ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：４３２〜４３６，１９９５）、変異ｃｄｋ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１２８１〜１２８４，１９９５）、そして変異ＣＡＳＰ−８（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：７８５〜７９３，１９９７）等であり、増殖性細胞および悪性形質転換体中に含まれる。
また、腫瘍拒絶抗原遺伝子やＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）等の特異免疫に関与する分子が、過去１０年において、メラノーマ、食道癌、およびその他の癌で同定されてきており、進行癌または転移性癌のペプチドによる特異的免疫療法が検討されてきている。
現在欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法の開発がなされており、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原ｇｐ１００ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を静脈注射投与すると、４２％の患者で腫瘍の縮小が認められている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：３２１，１９９８）。このように腫瘍抗原は、ワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。
しかしながら、同定されている腫瘍抗原はメラノーマ由来のものが多く、発病頻度の高い上皮性の癌や腺癌、例えば膵臓癌についてのこのような特異的免疫療法に関する研究はほとんど報告されていない。膵臓癌は、世界における癌による死因の最たるものの一つであり、米国では年間約２７，０００人、欧州では約５０，０００人が膵臓癌によって死亡している。この膨大な数の死因は、主に、有効な治療法の欠如、診断の困難性、そしてこの癌の活動性によるものである。膵臓癌患者のほんの１〜４％が病気を克服しているにすぎず、発病率と死亡率が実質的に同一である。それゆえ、新治療手法、例えば特異的免疫療法の開発が期待されている。
さらに、癌の多様性を考えた場合、全ての癌細胞において同一の腫瘍抗原が同程度発現されているとは考えられない。もちろん、単一の腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法によっても、該腫瘍抗原を有する癌の治療効果は得られる。しかし、癌の治療において腫瘍抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導・活性化し、かつ癌の多様性に対応して高い治療効果を得るためには、癌の多様性に応じた数多くの新たな腫瘍抗原を発見し利用することが重要である。
発明の開示
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号４５から配列番号５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５から配列番号５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドからなる医薬である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５から配列番号５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有する癌ワクチンである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５から配列番号５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有し、膵臓癌、大腸癌、若しくは胃癌の治療に用いられる癌ワクチンである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５から配列番号５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号４５から配列番号５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１種以上のペプチドまたはポリペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号５４から配列番号６２のいずれか１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号５４から配列番号６２のいずれか１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターである。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する発現組換えベクターである。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター若しくは発現組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する発現組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、前記ポリペプチドの製造方法である。
本発明の一態様は、前記ペプチドまたは前記ポリペプチドを免疫学的に認識する抗体である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチド若しくは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および／または前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、前記組換えベクター若しくは発現組換えベクター、前記形質転換体、または前記抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチド若しくは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および／または前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、前記組換えベクター若しくは前記発現組換えベクター、前記形質転換体、または前記抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法により得られた化合物である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドの少なくとも１つに対するＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、または前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物である。
本発明の一態様は、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖、前記組換えベクター若しくは前記発現組換えベクター、前記形質転換体、前記抗体、および前記化合物のうちの少なくとも１つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物である。
本発明の一態様は、前記医薬、前記癌ワクチン、前記細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、または前記医薬組成物の癌疾患への使用である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法に使用する試薬キットであって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または前記抗体を少なくとも１つ以上含んでなる試薬キットである。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法に使用する試薬キットであって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または前記抗体を少なくとも１つ以上含んでなる試薬キットの癌疾患検査への使用である。
発明を実施するための最良の形態
本発明者は、膵臓癌の特異的免疫療法に使用し得る腫瘍拒絶抗原遺伝子および該遺伝子がコードする腫瘍抗原を同定するために、大腸癌患者からＨＬＡ−Ａ２と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ａ２拘束性・腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を樹立し（以下この細胞をＯＫ−ＣＴＬｐと呼ぶこともある）、この腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に認識され得る腫瘍抗原をコードする遺伝子を、遺伝子発現クローニング法を用いて、ヒト膵臓腺癌細胞株であるＰａｎｃ−１細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離・同定した。また、ＳＥＲＥＸ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１１９１０−１１８１３，１９９５）で腫瘍抗原をコードしている遺伝子として同定されたものから、上記同様にＣＴＬに認識され得るものを同定した。さらに、得られた遺伝子にコードされる腫瘍抗原に基づいて、腫瘍抗原エピトープを有するペプチドを見い出した。
本明細書においては、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドのうち長鎖ペプチドをポリペプチドという。例えばタンパク質も本明細書においてはポリペプチドに含まれる。また、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを、単にペプチドという。
またここで、「認識する（ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ）」とは、認識するものが、認識される対象を他の物質と見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。特に、本明細書において、ＣＴＬが腫瘍細胞あるいは腫瘍抗原ペプチドを認識するとは、ＣＴＬがＨＬＡにより提示された腫瘍抗原ペプチドにＴ細胞受容体を介して結合することを意味する。「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するものまたは状態を、さらに増強するまたは作動させることを意味する。特に、本明細書において、ＣＴＬが活性化するとは、ＣＴＬがＨＬＡにより提示された抗原を認識することにより、ＩＦＮ−γを産生すること、あるいはＣＴＬが認識した標的細胞に対し細胞傷害性を示すことを意味する。「誘導する」とは、ある活性若しくは作用をほとんど持たないものまたは状態から、該活性若しくは該作用を発生させることを意味する。特に、本明細書において、抗原特異的なＣＴＬを誘導するとは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識するＣＴＬを分化および／または増殖させることを意味する。また、本明細書において細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤とは、ある抗原を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在しないあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、該抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用を示す薬剤を意味する。
（腫瘍抗原遺伝子、腫瘍抗原、および腫瘍抗原ペプチドの単離・同定）
本発明においてはまず、上記ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞であるＯＫ−ＣＴＬｐをエフェクター細胞として用い、この細胞を活性化し得る腫瘍抗原を、遺伝子発現クローニング法を用いて単離・同定した。すなわち、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１のｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ０２０７のｃＤＮＡとをＣＯＳ−７細胞に共遺伝子導入し、該導入遺伝子が発現された細胞のうち、ＯＫ−ＣＴＬｐからのＩＦＮ−γ産生を促進するものを選択することにより、ＣＴＬを活性化し得る腫瘍抗原をコードする遺伝子を同定した。具体的な方法は、後述する実施例に示す。その結果、ＯＫ−ＣＴＬｐによりＨＬＡ−Ａ２拘束性に認識される７個のｃＤＮＡクローンが得られた。
また、ヒト膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ−１のｃＤＮＡライブラリーからＳＥＲＥＸ法により検出されて既に報告されている腫瘍抗原をコードする遺伝子（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８１：９３６−９４４，２００１）から、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬを活性化し得る２つの腫瘍抗原をコードする遺伝子、ＫＭ−ＰＡ−２およびＫＭ−ＰＡ−４を上記同様の方法により見い出した。ＳＥＲＥＸ法は腫瘍抗原の検出に用いることができる方法であるが、同方法で検出された１，５００種余りの腫瘍抗原のうち細胞性および液性免疫を惹起し得る腫瘍抗原として同定されたものはＭＡＧＥ−１、チロシナーゼ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１のみである。この様に、ＳＥＲＥＸ法により腫瘍抗原として同定されたものであってもＣＴＬを活性化し得るとは限らない。上記腫瘍抗原遺伝子、ＫＭ−ＰＡ−２およびＫＭ−ＰＡ−４がＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬを活性化し得ることは、本発明において初めて見い出された。
上記のＰａｎｃ−１細胞から得られた７個のｃＤＮＡクローンは全て、完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むものであった。これら遺伝子の塩基配列をサンガー法（チェインターミネーター法）により決定し、該塩基配列からアミノ酸配列を推定した。これらの塩基配列および推定アミノ酸配列について、ＧｅｎＢａｎｋ等の既存のデータベースに対して相同性検索を行ったところ、下記に示すような遺伝子と高い相同性はあるものの、これらは新規な塩基配列を有するｃＤＮＡであった。相同性のある既知遺伝子についても腫瘍抗原としての機能は報告されていない。なお、得られた７個のｃＤＮＡクローン（クローン１〜７）のうちクローン３は、上記遺伝子発現クローニング法で得た当初のクローンがＷｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ２蛋白質（ＷＨＳＣ２）の遺伝子と高い相同性が認められたものの塩基配列が５′末端領域において２５ｂｐ短かったので、その完全長のｃＤＮＡをＰａｎｃ−１細胞のｃＤＮＡライブラリーから、３２Ｐ標識当該クローンをプローブとして用いて標準的コロニーハイブリダイゼーション法で得たものである。以下、上記クローン１〜７が由来したＰａｎｃ−１細胞の遺伝子をそれぞれ遺伝子１〜７と呼ぶ。また、各遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドを遺伝子産物１〜７と呼ぶこともある。これら各遺伝子がコードする推定アミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号４５〜５１に、その塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号５４〜６０に示した。上記遺伝子１〜６は平成１２年６月１２日に、遺伝子７は平成１２年８月２日に、国立遺伝子研究所・日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に登録された（表１）。
ＫＭ−ＰＡ−２およびＫＭ−ＰＡ−４についても、表１に示す相同性の高い遺伝子が既に報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８１：９３６−９４４，２００１）。ＫＭ−ＰＡ−２およびＫＭ−ＰＡ−４の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号５２および配列番号５３に、推定アミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号６１および配列番号６２に示した。
0004900884.tif 000002
遺伝子１の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＡＦ１５５１２０）に登録されたユビキチン結合酵素異型体Ｋｕａ（ＵＢＥ２Ｖ）遺伝子のものと高い相同性が認められた。遺伝子１がコードする推定アミノ酸（ａａ）長は、わずかにＵＢＥ２Ｖ遺伝子のものより長かった（第１０９〜１１１位の３個のａａ）。ＵＢＥ２Ｖの機能については、現在まで報告されていない。
遺伝子２の塩基配列は、異種核リボ核蛋白質Ｌ遺伝子〔ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＮＲＰＬ）遺伝子、アクセッション番号：ＮＭ００１５３３〕のものと高い相同性が認められた。しかし、推定されるアミノ酸長は、Ｎ末端第１〜３１位においてＨＮＲＰＬ遺伝子よりわずかに長かった。ＨＮＲＰＬ遺伝子産物は、異種性の核リボ核蛋白質複合体であり、ｍＲＮＡ前駆体が細胞質内で受けるプロセシングのための基質を提供するものである。
遺伝子３の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＡＫ００１３０４）に登録されたＷｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ２蛋白質（ＷＨＳＣ２）の遺伝子と高い相同性が認められた。このＷＨＳＣ２遺伝子は、第４染色体短腕の部分欠損に起因する精神的・発育的障害によって特定される多発性奇形症候群であるＷＨＳの表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）において、何らかの機能を有するとされている。
遺伝子４の塩基配列は、ｅＩＦ−４Ｅ結合蛋白質１遺伝子（ＥＩＦ４ＥＢＰ１、アクセッション番号：ＮＭ００４０９５）のものと高い相同性が認められた。ＥＩＦ４ＥＢＰ１遺伝子産物は、４Ｅ−ＢＰ１のインシュリン依存性リン酸化を開始する翻訳開始因子として知られ、活性のあるｃａｐ結合性複合体の形成を可能にする。
遺伝子５の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録された部分的に推定されたマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ  キナーゼ  キナーゼ（ｐｐＭＡＰｋｋｋ、アクセッション番号：ＡＪ２４２７２４）遺伝子のものと相同性が認められた。遺伝子５がコードする推定アミノ酸配列は、登録されたｐｐＭＡＰｋｋｋ遺伝子（その機能の報告は未だ無い）のものと比較して、Ｎ末端において２３０ａａそしてＣ末端において２５８ａａ長かった。
遺伝子６の塩基配列は、６，７０７ｂｐからなり、２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素３遺伝子（２−５  ＯＡＳ３遺伝子、アクセッション番号：ＮＭ００６１８７）と相同性が認められたが、第１８位、第１５９位、第２４９位、第２８７位、第２８８位、第３１６位、第３９３−第３９８位、および第９８４位における合計１３ａａが異なっていた。２−５  ＯＡＳ３は、ＩＦＮ誘導蛋白質として知られ、微生物感染に対する免疫防御において重要な機能を有する。
遺伝子７の塩基配列は、Ｈｕｍａｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＰＳＦ、アクセッション番号：Ｕ３７０１２）（ヒトの分裂およびポリアデニル化特異性因子）の第３７０１〜４４６３位と相同性が認められたが、アミノ酸配列が約１２２６ａａ短かかった。
遺伝子ＫＭ−ＰＡ−２の塩基配列は、ＫＩＡＡ０１２４およびｍｏｕｓｅ  ｂｌｏｃｋ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  １（Ｂｏｐ１）のヒトホモログと高い相同性を有していた。ＫＩＡＡ０１２４遺伝子では第１４６６位の塩基がグアニン（Ｇ）であり、そのため第４６５位のアミノ酸残基がヒスチジン（Ｈ）であるが、遺伝子ＫＭ−ＰＡ−２ではそれぞれアデニン（Ａ）およびアルギニン（Ｒ）である。
遺伝子ＫＭ−ＰＡ−４の塩基配列および該遺伝子がコードするアミノ酸配列は、ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＬＰ）と同一であった。
腫瘍抗原をコードする上記９つの遺伝子から腫瘍抗原ペプチドを得るために、上記遺伝子のコードするアミノ酸配列に基づいてペプチドを設計して合成した。遺伝子７については、該遺伝子がより長い塩基配列からなる遺伝子の一部であると考えられるので、該遺伝子と相同性の高い遺伝子（ＣＰＳＦ）がコードするアミノ酸配列由来のペプチドも設計し合成した。ＨＬＡ−Ａ２に結合可能な腫瘍抗原ペプチドには、そのアミノ酸配列にモチーフ（規則的配列）があることが知られている。そこで、まずＨＬＡ−Ａ２に結合し得るモチーフ（規則的配列）を有するペプチドについて文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：１６３，１９９４）（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８，１９９４）検索し、得られたモチーフに適合するそれぞれ異なる９〜１１ｍｅｒのペプチドを上記遺伝子がコードするアミノ酸配列に基づいて設計し合成した。各ペプチドのＣＴＬによる認識は、ＯＫ−ＣＴＬｐまたはこれを限界希釈法によりクローン化して得た数種のＯＫ−ＣＴＬクローンを用い、これらＣＴＬから産生されるＩＦＮ−γを指標として測定した。ＯＫ−ＣＴＬクローンは上記遺伝子１〜７のいずれかを認識する細胞であるが、ＯＫ−ＣＴＬｐは遺伝子１〜７のいずれをも認識することから複数の種類の腫瘍抗原を認識する細胞集団であることが判明した。そこでＯＫ−ＣＴＬクローンを用いてペプチドのＣＴＬ活性化能を検討するときは、検討するペプチドに対して該ペプチドをコードする遺伝子産物を認識するクローンを用いた。合成したペプチドのうち４４個のペプチド（配列表の配列番号１〜４４）（表２および表３）が、ＯＫ−ＣＴＬｐまたはＯＫ−ＣＴＬクローンにより認識され、ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進した。これらのペプチドのうちＰ１〜Ｐ５、Ｐ６〜Ｐ９、Ｐ１０〜Ｐ１３、Ｐ１４およびＰ１５、Ｐ１６〜Ｐ１８、並びにＰ１９は、それぞれ遺伝子１、遺伝子２、遺伝子３、遺伝子４、遺伝子５、並びに遺伝子６がコードするアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドであり、それぞれの遺伝子と相同性の高い遺伝子、ＵＢＥ２Ｖ、ＨＮＰＲＬ、ＷＨＳＣ２、ＥＩＦ４−ＥＢＰ１、ｐｐＭＡＰｋｋｋ、および２−５  ＯＡＳ３にもコードされている。また、Ｐ２５、Ｐ２６、Ｐ２７、Ｐ２８、Ｐ３０およびＰ３１は、遺伝子７および該遺伝子と相同性の高い遺伝子ＣＰＳＦがコードするアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドである。Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３、Ｐ２４、Ｐ２９、およびＰ３２は、ＣＰＳＦに特異的なアミノ酸配列の部分配列からなる。
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これら腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２によって細胞表面に提示されており、ペプチド特異的ＯＫ−ＣＴＬクローン上に発現されているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により認識される。遺伝子１およびＵＢＥ２Ｖ、遺伝子２およびＨＮＰＲＬ、または遺伝子６および２−５  ＯＡＳ３由来のペプチドは、ＴＣＲ・Ｖβ８．１、ＴＣＲ・Ｖβ３．２、またはＴＣＲ・Ｖβ１４を発現しているＯＫ−ＣＴＬクローンにより認識されるものであった。また、遺伝子３およびＷＨＳＣ２、遺伝子４およびＥＩＦ４ＥＢＰ１、または遺伝子５およびｐｐＭＡＰｋｋｋ由来のペプチドは、それぞれＴＣＲ・Ｖβ１３．１、ＴＣＲ・Ｖβ８．１、またはＴＣＲ・Ｖβ１８を発現しているＯＫ−ＣＴＬクローンにより認識されるものであった。
また、遺伝子１およびＵＢＥ２Ｖ、遺伝子２およびＨＮＰＲＬ、並びに遺伝子６および２−５  ＯＡＳ３由来のペプチドを認識するＯＫ−ＣＴＬクローンの各２つは、それぞれ異なった相補性決定領域３（ＣＤＲ３）（ＨＬＡクラスＩ分子の溝上の抗原エピトープへの結合性を担う要素）を有するＴＣＲを発現していた。遺伝子３およびＷＨＳＣ２、遺伝子４およびＥＩＦ４ＥＢＰ１、並びに遺伝子５およびｐｐＭＡＰｋｋｋ由来のペプチドを認識するＯＫ−ＣＴＬクローンもそれぞれ異なったＣＤＲ３を有するＴＣＲを発現していた。
さらに、ＯＫ−ＣＴＬｐによって認識される上記４４個のペプチドはそれぞれ、ＯＫ−ＣＴＬｐを得た大腸癌患者の自己末梢血単核細胞（以下、ＰＢＭＣと略すこともある）、および／またはＨＬＡ−Ａ０２０１＋癌患者（膵臓癌患者、大腸癌患者、および胃癌患者）のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍特異的ＣＴＬをインビトロで誘導した。癌患者末梢血単核細胞から誘導された上記ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞を用量依存的に溶解（ｌｙｓｉｓ）した。しかし、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ並びにＨＬＡ−Ａ＋ではあるが正常細胞由来の自己ＥＢＶ−Ｂ細胞およびＰＨＡで刺激したＴ細胞は溶解しなかった。さらに、上記ＣＴＬは、刺激に用いたペプチドと同じペプチドをパルスしたＴ２細胞に対して用量依存的に細胞傷害性を示した。
上記の検討により、ＯＫ−ＣＴＬｐを活性化することのできる４４個の腫瘍抗原ペプチドが得られ、さらにこれらのペプチドが膵臓癌、大腸癌、および／または胃癌患者由来のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍特異的ＣＴＬを誘導し得ることを確認した。また、膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１と大腸腺癌細胞株ＳＷ６２０の両方が、ＯＫ−ＣＴＬｐおよび上記ペプチドでＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬにより認識されることが判明した。この結果は、膵臓癌および大腸癌が、宿主のＣＴＬによって認識される同じ腫瘍抗原エピトープを共有していることを示唆する。
（ポリペプチドおよびペプチド）
本発明に係るポリペプチドは、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得られた上記遺伝子１〜７またはヒト膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ−１から得られた遺伝子ＫＭ−ＰＡ−２若しくはＫＭ−ＰＡ−４がそれぞれコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、好ましくは配列表の配列番号４５〜５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。これらのポリペプチドは、腫瘍抗原としてＣＴＬを誘導および／または活性化するために使用できる。また、該ポリペプチドは腫瘍抗原エピトープを特定し腫瘍抗原ペプチドを得るための材料として用いることもできる。
本発明に係るペプチドは、上記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、例えばＨＬＡ−Ａ２拘束性モチーフに適合するものを設計し、該設計されたペプチドからＣＴＬにより認識されるもの、例えばＣＴＬを活性化および／または誘導するものを選択することにより得ることができる。本発明においてペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２と結合して抗原提示細胞表面上に提示され、かつＣＴＬにより認識される腫瘍抗原エピトープとしての性質を有するものであればよく、少なくとも約５個以上、好ましくは約７個以上、さらに好ましくは９個乃至１０個のアミノ酸残基からなるペプチドである。特に好ましくは、配列表の配列番号１〜４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。これらのペプチドは、腫瘍抗原ペプチドとして、ＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化するために使用できる。
上記ポリペプチドまたはペプチドは、ＣＴＬを誘導および／または活性化するために単独で使用してもよいし、２つ以上を組み合わせて使用してもよい。上記のようにＣＴＬは種々の抗原を認識する複数の細胞集団であることから、好ましくはこれらを２つ以上組み合わせて用いることが推奨される。
また、このように特定されたポリペプチドまたはペプチドに１乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入等の変異を導入したものであって、少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬにより認識されるポリペプチドまたはペプチドも本発明の範囲に包含される。欠失、置換、付加、または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：６６６，１９８３）を利用することができる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、活性、または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基若しくはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
（ポリヌクレオチド）
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のようにヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１またはヒト膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ−１から得られた遺伝子１〜７またはＫＭ−ＰＡ−２若しくはＫＭ−ＰＡ−４であって、配列表の配列番号５４〜６２のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。また、該ポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１〜４４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくは配列番号４５〜５３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをそれぞれコードするものまたはその相補鎖であってもよい。さらに、上記ポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列中で腫瘍抗原エピトープをコードする領域に対応する少なくとも約１５個以上、好ましくは約２１〜３０個以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドおよびその相補鎖であってもよい。この有用なポリヌクレオチドの選択および塩基配列の決定は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して、発現ペプチドのＣＴＬ誘導能および／または活性化能の確認を行うことにより可能である。
さらに、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。ポリヌクレオチド分子としてＤＮＡ分子を代表例にとると、「ＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子」は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９）等に記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
上記ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ａ２を有する細胞で発現させたときに、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬを誘導および／または活性化することができる。また、上記ポリヌクレオチドは、その３′末端にポリ（Ａ）〔ｐｏｌｙ（Ａ）〕構造を有しているが、ポリ（Ａ）の数は腫瘍抗原として作用するアミノ酸のコード部位に影響するものではなく、該ポリヌクレオチドの有するポリ（Ａ）の数は特に限定されるものではない。
上記ポリヌクレオチドは、いずれも本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸としての試薬・標準品としても利用できる。
（組換えベクター）
上記ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、組換えベクターを得ることができる。用いるベクターＤＮＡは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等をあげることができる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等を用いることができる。
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等、とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により組み合わせて作製される。前記ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組み込む方法は、自体公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的ポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターを得ることができる。
（形質転換体）
上記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターＤＮＡにより、自体公知の宿主、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、または動物細胞等を自体公知の方法で形質転換することにより形質転換体が得られる。形質転換を行う場合、より好ましい系としては遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法があげられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を用いることができる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載されている標準的な方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等をあげることができる。
（ポリペプチドまたはペプチドの製造）
上記形質転換体に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを提供可能である。上記ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターＤＮＡを導入した形質転換体は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件で培養される。培養は、形質転換体により発現される本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの作用、特に少なくともＣＴＬを誘導および／または活性化する作用あるいは宿主中または宿主外に産生された該ペプチドまたはペプチド量を指標にして行ってもよいし、または培地中の形質転換体量を指標にして継代培養若しくはバッチ培養を行ってもよい。
また、本発明に係るペプチドは、通常のペプチド化学において知られる方法でも製造できる。例えば、ペプチド合成（丸善）１９７５年、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６”が例示されるが、無論既知の方法が広く利用可能である。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの回収は、該ポリペプチド若しくは該ペプチドのＣＴＬ活性化作用を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、またはアフィニティクロマトグラフィー等の方法を組合せて、あるいは硫安やアルコール等を用いる溶解度差に基づく分画手段により精製回収できる。より好ましくは、これらのアミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作製し、得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。
（抗体）
本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドまたはペプチドを抗原として用いて作製される。抗原は上記ポリペプチド若しくはペプチド自体でもまたはその断片でもよく、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成される。上記ポリペプチドまたはペプチドに特異的な抗体を作製するためには、該ポリペプチドまたは該ペプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが望ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも該ポリペプチドまたは該ペプチドのアミノ酸配列と相同である必要はなく、該ポリペプチドまたは該ペプチドの立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、免疫学的に該ポリペプチドまたは該ペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。
抗体を産生するためには、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば本発明に係るポリペプチドまたはペプチドをアジュバントの存在下または非存在下で単独または担体に結合して動物に投与し、体液性免疫および／または細胞性液等を誘導することにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、またはアルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得される。好ましい手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクローナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８細胞等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、上記ポリペプチドまたはペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
かくして得られた上記ポリペプチドまたはペプチドを認識して結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用できる。
（スクリーニングおよび該スクリーニングにより得られた化合物）
上記ポリペプチドまたはペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、またはこれらを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数を組み合せることによってＣＴＬを誘導および／または活性化し得る物質のスクリーニングに有効な手段を提供する。スクリーニング方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。例えば、実施例に示したように、腫瘍抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞によるＣＴＬの活性化をＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生量により測定する実験系を用いて、該実験系に被検物質を加えることにより、ＣＴＬを誘導および／または活性化する物質、並びに誘導および／または活性化を増強する物質等を選別することができる。この実験系はスクリーニング方法の１つを説明するものであり、本発明に係るスクリーニング方法はこれに限定されるものではない。
本発明は、上記スクリーニング方法によって得られた化合物も対象とする。該化合物は、本発明に係るポリペプチド若しくはペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２と相互作用してＣＴＬによる該ポリペプチドまたはペプチドの認識を増強する化合物、または本発明に係るポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物等でありうる。かくして選別された化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、医薬組成物として調製可能である。
（医薬組成物）
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドとして、ＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化するために使用することができる。すなわち、上記ポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とするＣＴＬの誘導方法並びに上記ポリペプチドまたはペプチドを含有するＣＴＬの誘導剤も、本発明の範囲に包含される。
また、本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき作製した組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換させた細胞、または該ポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体、該ポリペプチド若しくはペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２と相互作用してＣＴＬによる該該ポリペプチド若しくはペプチドの認識を増強する化合物、または該ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物を、単独または複数組み合せて利用することによって、これらのうち少なくとも１つを含有する医薬組成物を提供できる。
具体的には、例えば本発明に係るポリペプチドまたはペプチドからなる医薬、さらに本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用することができる。このとき、細胞性免疫の活性化のために、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で用いるかまたは担体に結合して用いる。担体は、それ自体が人体に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。剤形は、自体公知のポリペプチドまたはペプチドを製剤化する手段を応用して適宜選択できる。その投与量は、ＣＴＬによる当該ペプチドの認識の程度により変化するが、一般的には活性本体として０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数月に１回投与する。
または、患者の末梢血より単核細胞画分を採取し、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドと共に培養し、ＣＴＬが誘導および／または活性化された該単核細胞画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果を得ることができる。培養するときの単核細胞濃度、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの濃度等の培養条件は、簡単な実験により決定することができる。また、培養時、インターロイキン２（ＩＬ−２）等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。
癌ワクチンとして本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを使用する場合、１つのポリペプチドまたはペプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、複数の種類の上記ポリペプチドまたはペプチドを組み合せて使用することもできる。癌患者のＣＴＬは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であるため、１種類のポリペプチドまたはペプチドを癌ワクチンとして使用するより複数を組み合せて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られるときがある。
上記医薬、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、癌ワクチン、および医薬組成物は、いずれも癌疾患の治療、例えば膵臓癌、大腸癌または胃癌の治療において有用である。
また、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖も、癌疾患の、例えば膵臓癌、大腸癌、または胃癌の遺伝子治療のために有用である。これらポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入する方法またはヒトから細胞を採取したのち体外で導入する方法があるが、いずれも利用できる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が知られているが、レトロウイルス系が推奨される。無論これらウイルスは複製欠陥性である。その投与量は、ＣＴＬによる該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの認識の程度により変化するが、一般的には本発明に係る腫瘍抗原ペプチドをコードするＤＮＡ含量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数月に１回投与する。
（診断のための測定方法および試薬）
本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、並びに該ポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。また本発明は、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたはポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの発現または活性に関連した疾患の診断手段は、例えば当該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドとの相互作用や反応性を利用して、相応する核酸の存在量を決定すること、および／または当該ポリペプチドまたはペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、および／または当該ポリペプチドまたはペプチドの存在、個体由来の試料中の存在量を決定することによって行われる。すなわち、本発明に係るポリペプチド若しくはペプチドまたはこれらをコードしている核酸を診断マーカーとして定性的にあるいは定量的に測定する。試料中の当該ポリペプチド若しくはペプチドまたはこれらをコードしている核酸の定量的または定性的な測定法は当業者に周知の方法を利用することができる。このような測定法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。また、核酸は、例えば増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルでの検出および定量することができる。
測定される試料として、個体由来の細胞、例えば血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等を挙げることができる。また、測定される核酸は、上記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲ若しくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検出することができる。増幅ＤＮＡを標識した上記ポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定することができる。
上記測定法により本発明に係るポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡの変異、減少、増加を検出することで、当該ポリペプチドが関連する疾患、例えば膵臓癌、大腸癌、または胃癌等の診断が可能となる。
実施例
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの樹立）
ＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球株は、大腸癌患者（ＨＬＡ−Ａ０２０７／３１０１、ＨＬＡ−Ｂ４６／５１、ＨＬＡ−Ｃｗ１）の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から樹立した（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８１：４５９−４６６，１９９９）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９７−５００４，１９９９）。まず、大腸癌患者から得たＴＩＬを１００Ｕ／ｍｌの組換えヒト・インターロイキン２（ＩＬ−２）を添加して５０日以上長期培養した。培養７日毎にＩＬ−２活性化ＴＩＬの一部を採取し、種々の腫瘍細胞または正常細胞と共に培養して、産生されたＩＦＮ−γの測定および該癌細胞からの５１Ｃｒ遊離試験によってそのＣＴＬ活性を検定した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９７−５００４，１９９９）。ＩＦＮ−γの測定は、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）により行った。培養５８日目に、ＨＬＡ−Ａ２拘束性かつ腫瘍特異的にＣＴＬ活性を示すサブラインの１つであるＯＫ−ＣＴＬｐが得られた。得られたＯＫ−ＣＴＬｐは、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋の表現型を有する８０％の細胞と、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−の表現型を有する２０％の細胞とからなる細胞集団であった。このＯＫ−ＣＴＬｐをエフェクター細胞として用い、腫瘍細胞等の各種細胞を標的細胞として共に培養し、該標的細胞に対する細胞傷害性を５１Ｃｒ遊離試験により、またＯＫ−ＣＴＬｐの活性化をＩＦＮ−γの産生を指標にしてそれぞれ測定し、その結果をそれぞれ図１および図２に示した。
得られたＯＫ−ＣＴＬｐは図１および図２に示すように、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋Ｐａｎｃ−１膵臓腺癌細胞およびＳＷ６２０大腸腺癌細胞、ＨＬＡ−Ａ０２０６＋ＫＥ３食道鱗状細胞癌（ＳＣＣ）細胞、並びにＨＬＡ−Ａ０２０７＋ＣＡ９−２２口部ＳＣＣ細胞を認識して、ＩＦＮ−γを産生し、かつ十分な細胞傷害性を示した。しかし、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞であるＱＧ５６肺腺癌細胞、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＣ肺腺癌細胞、ＣＯＬＯ３２０大腸腺細胞、並びに正常細胞由来の自己エプスタインバーウイルス形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球化自己Ｔ細胞（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＰＨＡ−ｂｌａｓｔｏｉｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ）に対しては細胞傷害性を示さなかった。また、ＯＫ−ＣＴＬｐは試験した全てのＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０１＋のＲ２７乳腺癌細胞、ＨＡＫ−２原発性肝細胞癌細胞、ＳＫ−ＭＥＬ−５メラノーマ細胞、およびＳＦ１２６星状細胞腫細胞、ＨＬＡ−Ａ０２０６＋のＰＣ９肺腺癌細胞、並びにＨＬＡ−Ａ０２０７＋の１−８７肺腺癌細胞およびＯＭＣ−４頚部ＳＣＣ細胞）を溶解した。そのＣＴＬ活性は、抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＣＤ８ｍＡｂまたは抗ＨＬＡ−Ａ２ｍＡｂによって阻害されたが、他のｍＡｂによっては阻害されなかった（図２）。このことから、ＯＫ−ＣＴＬｐがＨＬＡ−Ａ２拘束性に上記腫瘍細胞を認識して細胞傷害性を示すことが確認された。
なお、上記腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の遺伝子型は、既報（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９７−５００４、１９９９）に開示されている。また上記患者のＨＬＡクラスＩの抗原型は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて従来の方法で決定した。さらに、ＨＬＡ−Ａ２サブタイプは、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ法と直接ＤＮＡ配列決定法（ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって決定した。ＯＫ−ＣＴＬｐの表面表現型は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した抗ＣＤ３ｍＡｂ、抗ＣＤ４ｍＡｂ、または抗ＣＤ８ｍＡｂ（ニチレイ）、または抗ＴＣＲαβｍＡｂ（ＷＴ３１、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による直接免疫蛍光分析によって分析した。また、ＯＫ−ＣＴＬｐのＨＬＡ拘束性および特異性を検定するために用いた抗体は、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡ−Ａ２ｍＡｂ（ＢＢ７．２、ＩｇＧ２ｂ）、抗ＣＤ８ｍＡｂ（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡクラスＩＩｍＡｂ（Ｈ−ＤＲ−１、ＩｇＧ２ａ）、および抗ＣＤ４ｍＡｂ（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ、ＩｇＧ１）である。抗ＣＤ１３ｍＡｂ（ＭＣＳ−２、ＩｇＧ２ａ）および抗ＣＤ１４ｍＡｂ（ＪＭＬ−Ｈ１４，ＩｇＧ１）は、アイソタイプ適合コントロールｍＡｂとして使用した。
実施例２
（腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡクローンの単離・同定）
ＯＫ−ＣＴＬｐによって認識されるＰａｎｃ−１腫瘍細胞の腫瘍抗原をコードする遺伝子は、既知の遺伝子発現クローニング法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９７−５００４，１９９９）に準拠して単離・同定した。まず、Ｐａｎｃ−１腫瘍細胞のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに転換してＳａｌＩアダプターにライゲーションし、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。
ＨＬＡ−Ａ０２０７、ＨＬＡ−Ａ２４０２、またはＨＬＡ−Ａ２６０１のｃＤＮＡを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって得て、真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローン化した。
上記プラスミドＤＮＡプールまたはＰａｎｃ−１細胞ｃＤＮＡライブラリーのクローン２００ｎｇと、ＨＬＡ−Ａ０２０７ｃＤＮＡの２００ｎｇとを、１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で３０分間混合した。この混合物の５０μｌをＣＯＳ−７細胞（５×１０３）に加え９６ウエルＵ底型マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ社製）中で６時間インキュベーションして共遺伝子導入した。次いで１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて２日間培養し、ＯＫ−ＣＴＬｐ（５×１０４細胞）を各ウエルに添加した。さらに１８時間インキュベーションした後、上清の１００μｌを採り、産生されたＩＦＮ−γの測定をＥＬＩＳＡ法により行った。この時、遺伝子導入をしていないＣＯＳ−７細胞を標的としてＯＫ−ＣＴＬｐによるＩＦＮ−γ産生を検討し、産生されたＩＦＮ−γの値をバックグランドとして各測定値から減算した。その結果、ＯＫ−ＣＴＬにより認識されて該ＯＫ−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進する７個のｃＤＮＡクローンが得られた。
得られた７個のｃＤＮＡクローンの塩基配列決定は、ＤＮＡシークエンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ３７７ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、ジデオキシヌクレオチドシークエンシング法により行った。さらに、各クローンがコードするアミノ酸配列を塩基配列により推定した。また、これらのクローンの塩基配列について、ＧｅｎＢａｎｋを用いて相同性検索を行った。その結果は上記表１に示した。なお、得られた７個のｃＤＮＡクローン（クローン１〜７）のうちクローン３は、上記遺伝子発現クローニング法で得た当初のクローンの塩基配列が相同性の高いＷＨＳＣ２遺伝子と比較して５′末端領域において２５ｂｐ短かったので、その完全長のｃＤＮＡをＰａｎｃ−１細胞のｃＤＮＡライブラリーから、３２Ｐ標識当該クローンをプローブとして用いて標準的コロニーハイブリダイゼーション法で得たものである。
図３（Ａ）および図３（Ｂ）に示したように、クローン１〜７はそれぞれＯＫ−ＣＴＬにより認識され、ＯＫ−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進した。しかし、ＨＬＡ−Ａ０２０７ｃＤＮＡと陰性コントロールとして使用したｃＤＮＡクローンとを共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞、またはｃＤＮＡクローン１〜７のいずれか１つとＨＬＡ−Ａ２４０２若しくはＨＬＡ−Ａ２６０１のｃＤＮＡとを共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞は、ＯＫ−ＣＴＬｐに認識されず、ＩＦＮ−γは産生されなかった。また、ｃＤＮＡクローン１〜６の濃度を変えて、１００ｎｇのＨＬＡ−Ａ０２０７またはＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡとＣＯＳ−７細胞に共遺伝子導入したところ、用量依存的にＯＫ−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生が観察された〔図４の（Ａ）〜（Ｆ）〕。
また、これら遺伝子のｍＲＮＡ発現をノーザンブロット分析により検討したところ、遺伝子５を除いて同様の発現パターンがみられた。これら遺伝子は、癌細胞でも正常細胞でも普遍的に発現されているが、Ｐａｎｃ−１細胞、ＳＷ６２０細胞、およびＣＡ９−２２細胞等の腫瘍細胞での発現レベルはＰＨＡで刺激したＴ細胞やエプスタインバーウイルスで形質転換されたＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ）等の正常細胞での発現より有意に高かった。遺伝子５のｍＲＮＡ発現が本実験条件で殆ど検知できなかったのは、３２Ｐ標識したクローン５を用いたコロニーハイブリダイゼーションによっても約１×１０６ｃＤＮＡライブラリーから３個のクローンしか得られないように、遺伝子５の発現が稀であるためと考えられる。
実施例３
（ＯＫ−ＣＴＬクローンの樹立）
腫瘍抗原を認識して活性化されるＣＴＬは、複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であると考えられるので、上記のＯＫ−ＣＴＬｐを限界希釈培養（０．３、０．５、１、２および４細胞／ウエル）によりクローン化してＯＫ−ＣＴＬクローンを得た（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９７−５００４，１９９９）。これらのクローンは、上記７個のｃＤＮＡクローンのいずれかの１００ｎｇ／ウエルとＨＬＡ−Ａ０２０７ｃＤＮＡの１００ｎｇ／ウエルとを共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞または腫瘍細胞と、細胞比１：１で培養し、そのＩＦＮ−γ産生能を測定することによりＣＴＬ活性を有するクローンを選択したものである。まず、親株ＯＫ−ＣＴＬｐから、限界希釈培養によって３００個のＣＴＬクローンを得た。そのうち８０個のＣＴＬクローンが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍特異的ＣＴＬ活性を示し、かつＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋およびＴＣＲαβ＋の表現型を発現するＣＴＬクローンであった。それらのうち、２個、３個、１個、３個、２個、および４個のＣＴＬクローンが、それぞれクローン１、クローン２、クローン３、クローン４、クローン５、およびクローン６を発現したＣＯＳ−７細胞に対して反応性を示した。すなわち、ＣＴＬクローンにより、認識する腫瘍抗原が異なることがわかった。表４に典型的な１５個のＣＴＬクローンについてデータを示した。このことから、ＯＫ−ＣＴＬｐ、すなわち癌患者のＣＴＬは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることが示唆された。
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実施例４
（腫瘍抗原ペプチドの調製およびそのＣＴＬ誘導活性）
実施例２で得られたＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬを誘導し得る７つの腫瘍抗原遺伝子由来の腫瘍抗原ペプチドを得るために、ＨＬＡ−Ａ２に結合し得るモチーフ（規則的配列）を有するペプチドについて文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：１６３，１９９４）（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８，１９９４）検索し、得られたモチーフに基づいて、上記遺伝子１〜７がコードするアミノ酸配列並びにこれらと高い相同性を有するＵＢＥ２Ｖ、ＨＮＲＰＬ、ＷＨＳＣ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ｐｐＭＡＰｋｋｋ、２−５  ＯＡＳ３、およびＣＰＳＦのアミノ酸配列から、それぞれ異なる９〜１１ｍｅｒのペプチドを設計し、自体公知の方法で合成した。得られたペプチドの純度はいずれも７０％以上であった。
ＨＬＡ−Ａ０２０１分子へのペプチドの結合活性は、Ｔ２細胞変異株を用いて試験した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：１０７１−１０７６，１９９４）。Ｔ２細胞は、ＴＡＰ欠損のため、ＨＬＡ−Ａ２分子がペプチドと結合しない形で細胞表面に発現している。まず、合成したペプチド（１０μＭ）とＴ２細胞とを２６℃で３時間インキュベーションし、次いで５％ＣＯ２−９５％Ａｉｒの条件下３７℃で３時間インキュベーションして、該ペプチドがＨＬＡ−Ａ２により細胞表面上に表出されたＴ２細胞を得た。この細胞を抗ＨＬＡ−Ａ２ｍＡｂ（ＢＢ７．２）とインキュベーションし、Ｒ−フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）を結合したＦ（ａｂ′）２ウサギ抗マウス・イムノグロブリン（Ｉｇ）（ＤＡＫＯ社製）で染色し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で発現パターンを分析することにより、ペプチドの結合したＨＬＡ−Ａ０２０１分子が細胞表面上に発現されていることが確認できた。
ＣＴＬによるペプチドの認識を試験するために、それぞれのペプチド（１０μＭ）で予めパルスしたＴ２細胞を標的細胞（Ｔ）として用い、ＯＫ−ＣＴＬｐ若しくはＯＫ−ＣＴＬクローンをエフェクター細胞（Ｅ）として用いて、標的細胞とエフェクター細胞とを１８時間インキュベーションして上清を回収し、上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した。エフェクターとしてＯＫ−ＣＴＬｐを用いるときはＥ／Ｔ比を１０：１とし、ＯＫ−ＣＴＬクローンを用いるときは２：１として試験を行った。また、ＯＫ−ＣＴＬクローンを用いてペプチドのＣＴＬ活性化能を検討するときは、検討するペプチドに対して該ペプチドをコードする遺伝子産物を認識するクローンを用いた。ペプチドをパルスしていないＴ２細胞に対するＯＫ−ＣＴＬｐまたはＯＫ−ＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生をバックグランドとして各測定値から減算し、結果を図５〜図１０に示した。図５、図６、図７、図８、図９、および図１０はそれぞれ、遺伝子１およびＵＢＥ２Ｖ、遺伝子２およびＨＮＲＰＬ、遺伝子３およびＷＨＳＣ２、遺伝子４およびＥＩＦ４ＥＢＰ１、遺伝子５およびｐｐＭＡＰｋｋｋ、並びに遺伝子６および２−５  ＯＡＳ３由来のペプチドについての結果を示す。
さらに、Ｔ２細胞とインキュベーションするときの各ペプチドの濃度を変えてＣＴＬクローン活性化能を検討し、各ペプチドが用量依存性にＣＴＬクローンを活性化し得ることを見い出した。遺伝子１およびＵＢＥ２Ｖ、遺伝子２およびＨＮＲＰＬ、遺伝子３およびＷＨＳＣ２、遺伝子４およびＥＩＦ４ＥＢＰ１、遺伝子５およびｐｐＭＡＰｋｋｋ、並びに遺伝子６および２−５  ＯＡＳ３由来のペプチドの代表的な例をそれぞれ図１１の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）に示す。また、遺伝子７およびＣＰＳＦ由来のペプチドについては表５に示す。表５おいてＥＢＶ由来のペプチドおよびインフルエンザウイルス由来のペプチドは、ＣＴＬを活性化し得る陽性コントロールである。
これらの結果、上記表２に示すペプチドがＯＫ−ＣＴＬｐおよび／またはＯＫ−ＣＴＬクローンを活性化してＩＦＮ−γを産生させ得ることが判明した。
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実施例５
（ペプチドによる癌患者末梢血単核細胞からのＣＴＬ誘導）
実施例４において、ＯＫ−ＣＴＬｐまたはＯＫ−ＣＴＬクローンからＩＦＮ−γ産生を促進し得たペプチドのうちＰ１〜Ｐ１９について、癌患者末梢血単核細胞からのＣＴＬ誘導能を検討した。ペプチドでＣＴＬを誘導する方法は、既知の方法に準じた（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：２７７−２８８，１９９８）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：４０５６−４０６３，１９９９）。まず、ＯＫ−ＣＴＬｐを得た大腸癌患者由来の自己末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をペプチド（１０μＭ）と共にインキュベーションした。この細胞を、培養７日目および１４日目に、同じペプチド１０μＭで２時間パルスして放射線照射（３０グレイ）した自己ＰＢＭＣを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて再刺激した。培養２１日目に、細胞を回収して、表面表現型について試験した。さらにこの細胞の種々の標的細胞に対する認識を、該標的細胞と共に培養したときに産生されるＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定し、これを指標として検討した。標的細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞であるＳＷ６２０細胞、ＣＡ９−２２細胞、およびＰａｎｃ−１細胞を用いた。結果を表６に示す。
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１９個のペプチドのうち、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１７、またはＰ１８を用いてインビトロで刺激したＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞であるＳＷ６２０細胞、ＣＡ９−２２細胞、およびＰａｎｃ−１細胞を認識して有意なレベルのＩＦＮ−γを産生した。しかし、当該ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞をほとんど認識しなかった。また、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ７、Ｐ１２、Ｐ１６も、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞のいずれかを認識するＣＴＬを誘導した。Ｐ１９で刺激したＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２を発現する腫瘍細胞のみでなく他のＨＬＡを発現する腫瘍細胞をも認識した。これらＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂ、抗ＣＤ８ｍＡｂ、または抗ＨＬＡ−Ａ２ｍＡｂによって阻害されたが、他のｍＡｂでは阻害されなかった。さらに、２人のＨＬＡ−Ａ０２０１＋患者（膵臓癌患者および大腸癌患者）の血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製して、ペプチドによるＣＴＬ誘導の検討を行ったところ、同様の結果が得られた。すなわち、上記のペプチドは患者末梢血単核細胞からＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導し得ることが判明した。
ＨＬＡ−Ａ０２０１分子へのペプチド結合親和性は、ＨＬＡ−Ａ２分子の比平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）として表した。陽性または陰性コントロールのＭＦＩは、各々８９８または４９０であった。ペプチドのＨＬＡ−Ａ０２０１分子への結合親和性は、ペプチドによるＣＴＬの誘導とは相関していないと考えられる。
さらに、これら１９個のペプチドについて、それらのＣＴＬ活性化能を５１Ｃｒ遊離試験による標的細胞に対する傷害性を指標として直接的に確認した。まず、上記ＣＴＬが誘導されたＰＢＭＣをさらに、自己のＡＰＣ、ＩＬ−２、および対応するペプチドの存在下で再培養して増殖させた。再培養の約２１〜２８日目にＰＢＭＣを回収し、その細胞傷害性をＩＦＮ−γの測定と６時間の５１Ｃｒ遊離試験とにより再試験した。結果を図１２〜図１７に示す。これらのペプチドで刺激した癌患者のＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞を溶解した（ｌｙｓｉｓ）。しかし、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ並びにＨＬＡ−Ａ２を発現しているが正常細胞由来の自己ＥＢＶ−Ｂ細胞およびＰＨＡで刺激したＴ細胞は溶解しなかった。ただし、ペプチドＰ１４、Ｐ１５、およびＰ１７で刺激したＰＢＭＣは、自己ＥＢＶ−Ｂ細胞に対する細胞傷害性も示した。また、Ｐ１９で刺激したＰＢＭＣは、自己ＥＢＶ−Ｂ細胞に対する傷害性が高かった。さらに、これらのペプチドで刺激したＰＢＭＣは、ＰＢＭＣの刺激に用いたペプチドと同一のペプチドをパルスしたＴ２細胞に対してペプチドの用量依存的に細胞傷害性を示した。代表的な例を図１８の（Ａ）〜（Ｅ）に示す。これらのことから、上記ペプチドが癌患者の末梢血単核細胞からＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性を示すＣＴＬを誘導し得ることが判明した。
実施例６
（ペプチドによる癌患者末梢血単核細胞からのＣＴＬ誘導）
実施例４で得た腫瘍抗原ペプチドのうち、遺伝子７およびＣＰＳＦ由来のペプチドＰ２０〜Ｐ３２のうち、純度が９５％以上の６個のペプチド（Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２４、Ｐ２６、Ｐ３０、およびＰ３２）についてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのインビトロでのＣＴＬ誘導能を、ＩＦＮ−γ産生を指標にして検討した。用いたＰＢＭＣは、１６人のＨＬＡ−Ａ２陽性の癌患者（膵臓癌４人、胃癌７人、および大腸癌５人）並びに６人の健常人の末梢血からそれぞれ常法通り調製した。まず、ＰＢＭＣの１×１０５個を９６ウエルＵ底型マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルに加え、１０μＭの上記各ペプチドと共に２００μｌの培養培地中でインキュベーションした。培地は４５％ＲＰＭＩ−１６４０、４５％ＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌのヒト・インターロイキン−２、および０．１μＭ  ＭＥＭ  ノンエッセンシャル・アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からなる。培養４日目および７日目に半量の培地を除き、対応する各ペプチドを含む上記組成の培地と交換した。培養１０日目に細胞を回収して洗浄し、対応する各ペプチドをパルスしたＴ２細胞と反応させ、産生されるＩＦＮ−γ量を測定した。
また、ペプチドで刺激して１０日間培養した上記細胞をさらに１０日間培養し、得られた細胞のＰａｎｃ−１膵臓腺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２）に対する細胞傷害性を、Ｅ／Ｔ比１０：１における標準的な６時間の５１Ｃｒ遊離試験で測定し、得られた結果を％特異的溶解で表した（表７）。同時にＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞であるＳＳＴＷ−９腫瘍細胞に対する細胞傷害性を測定してバックグランドとし、上記結果から減算した。
その結果、Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３、Ｐ２６、Ｐ３０、およびＰ３２によるＰＢＭＣからの各ペプチドに特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ誘導が、上記１６人の癌患者のうちそれぞれ３１％（５／１６）、３８％（６／１６）、２５％（４／１６）、３１％（５／１６）、４４％（７／１６）、および７％（１／１６）の患者で認められた。また、Ｐ２１およびＰ２２により、健常人ＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導が、それぞれ５０％（３／６）および３３％（２／６）で認められたが、他のペプチドは健常人のＰＢＭＣからはＣＴＬを誘導しなかった（表７）。また、ペプチドを用いて癌患者ＰＢＭＣから誘導された上記ＣＴＬは、Ｐａｎｃ−１膵臓腺癌細胞の他にも、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞であるＳＷ６２０大腸腺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２／Ａ２４）およびＫＷＳ胃腺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２）に対する細胞傷害性を示したが、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞であるＳＳＴＷ９胃腺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４）やＨＬＡ−Ａ２を発現していても腫瘍細胞ではないＰＨＡ芽球化Ｔ細胞およびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞は溶解しなかった。上記ＣＴＬによる腫瘍細胞の認識は、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂ、抗ＣＤ８ｍＡｂ、または抗ＨＬＡ−Ａ２ｍＡｂによって阻害されたが、他のｍＡｂでは阻害されなかった。
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実施例７
（腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡクローンの単離・同定）
膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ−１のｃＤＮＡライブラリーからＳＥＲＥＸ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１１９１０−１１８１３，１９９５）により検出され既に報告されている腫瘍抗原をコードする遺伝子（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８１：９３６−９４４，２００１）から、実施例２と同様の方法で、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬを活性化し得る２つの腫瘍抗原遺伝子、ＫＭ−ＰＡ−２およびＫＭ−ＰＡ−４を見い出した。まず、ＫＭ−ＰＡ−２、ＫＭ−ＰＡ−４、ＫＭ−ＰＡ−５、ＫＭ−ＰＡ−１４、ＫＭ−ＰＡ−１５、およびＫＭ−ＰＡ−１８をコードするｃＤＮＡクローンをそれぞれＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターに組込み、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ２に挿入した。これらｃＤＮＡを濃度を変えてそれぞれＨＬＡ−Ａ０２０７またはＨＬＡ−Ａ２４０２とともにＣＯＳ−７細胞に共発現させた。このＣＯＳ−７細胞を標的細胞として、ＯＫ−ＣＴＬｐとともにインキュベーションした。その結果、ＫＭ−ＰＡ−２またはＫＭ−ＰＡ−４とＨＬＡ−Ａ０２０７とを共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞が、ＯＫ−ＣＴＬｐからのＩＦＮ−γ産生を遺伝子の用量依存的に誘導した〔図１９の（Ａ）および（Ｂ）〕。ＳＥＲＥＸ法は、腫瘍抗原の検出に用いることができる方法であるが、同方法で検出された１，５００種余りの腫瘍抗原のうち細胞性および液性免疫を惹起し得る腫瘍抗原として同定されたものはＭＡＧＥ−１、チロシナーゼ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１のみである。従って、ＳＥＲＥＸ法により同定された腫瘍抗原をコードする遺伝子であってもＣＴＬを活性化し得るとは限らない。上記腫瘍抗原遺伝子、ＫＭ−ＰＡ−２およびＫＭ−ＰＡ−４がＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬを活性化し得ることは、本発明において初めて見い出された。
実施例８
（腫瘍抗原ペプチド調製および癌患者ＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導活性）
実施例７で得られた腫瘍抗原遺伝子ＫＭ−ＰＡ−２およびＫＭ−ＰＡ−４由来の腫瘍抗原ペプチドを得るために、ＫＭ−ＰＡ−２およびＫＭ−ＰＡ−４がコードするアミノ酸配列に基づいて実施例４と同様にそれぞれ異なる９〜１０ｍｅｒのペプチドを設計して自体公知の方法で合成した。
合成したペプチドについて、ＯＫ−ＣＴＬｐを得た大腸癌患者末梢血単核細胞からのＣＴＬ誘導能を実施例６と同様に検討した。その結果、図２０の（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＫＭ−ＰＡ−２由来のペプチドＰ３３〜Ｐ４１（配列表の配列番号３３〜４１）およびＫＭ−ＰＡ−４由来のペプチドＰ４２〜Ｐ４４（配列表の配列番号４２〜４４）のいずれかを用いてインビトロで刺激したＰＢＭＣは、該ＰＢＭＣの刺激に用いたペプチドに対応するペプチドをパルスしたＴ２細胞〔図２０（Ａ）および（Ｂ）の左図〕、またはＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞であるＰａｎｃ−１細胞〔図２０（Ａ）および（Ｂ）の右図〕を認識してＩＦＮ−γを産生した。しかし、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞にはほとんど反応しなかった。これらのことから、上記１２個のペプチドはいずれも癌患者ＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２拘束性に抗原特異的なＣＴＬを誘導し得ること、また誘導されたＣＴＬはＨＬＡ−Ａ２拘束性に上記ペプチドを認識してＩＦＮ−γを産生することが判明した。さらに、ペプチドにより誘導されたこれらＣＴＬの細胞傷害性を５１Ｃｒ遊離試験により実施例６と同様に直接的に確認した。その結果の代表例を図２１に示す。図２１に示したようにＰ３５、Ｐ３９、またはＰ４０により癌患者ＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞であるＰａｎｃ−１細胞およびＹＰＫ−３細胞を溶解した（ｌｙｓｉｓ）。しかし、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞ＰａＣａ−２、ＥＢＶ−Ｂ細胞株ＯＫＡＢ２、およびＰＨＡで刺激したＴ細胞は溶解しなかった。すなわち、上記のペプチドが癌患者の末梢血単核細胞からＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性を示すＣＴＬを誘導できることが確認できた。また、ＯＫ−ＣＴＬｐを得た大腸癌患者以外の癌患者、例えば膵臓癌患者から得たＰＢＭＣからも、上記ペプチドによりＣＴＬが誘導された。
実施例９
上記ペプチドを認識するＣＴＬクローンの細胞表面に発現しているＴＣＲの表現型（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を決定するため、実施例３で得た各ＣＴＬクローン５×１０６個からＲＮＡｚｏｌＴＭＢ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ社製）を用いてそれぞれの全ＲＮＡを得た。ｃＤＮＡを、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して調製した。一本鎖ｃＤＮＡを、２２種類の異なったＶβプライマー（Ｖβ１〜２０）と３’Ｃβプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。ＰＣＲは９４℃で１分間の変性、５８℃で２分間のアニーリング、７２℃で３分間の伸長を１サイクルとして３５サイクル行った。ＰＣＲ産物は、プラスミドｐＣＲ２に挿入し、ＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して大腸菌に形質転換し、コロニーの選択を行い、得られたコロニーからプラスミドを調製してｃＤＮＡの配列決定を行った。
その結果、ＵＢＥ２Ｖおよび遺伝子１由来のペプチド、ＨＮＰＲＬおよび遺伝子２のペプチド、並びに２−５  ＯＡＳ３および遺伝子６由来のペプチドに反応する各２つのＣＴＬクローンが、それぞれＴＣＲ・Ｖβ８．１、ＴＣＲ・Ｖβ３．２、およびＴＣＲ・Ｖβ１４を発現していた。また、ＷＨＳＣ２および遺伝子３由来のペプチド、ＥＩＦ４ＥＢＰ１および遺伝子４由来のペプチド、並びにｐｐＭＡＰｋｋｋおよび遺伝子５由来のペプチドを認識するＣＴＬクローンは、それぞれ、ＴＣＲ・Ｖβ１３．１、ＴＣＲ・Ｖβ８．１、およびＴＣＲ・Ｖβ１８を発現していた（表８−１および表８−２）。
また、ＵＢＥ２Ｖおよび遺伝子１由来のペプチド、ＨＮＰＲＬおよび遺伝子２のペプチド、並びに２−５  ＯＡＳ３および遺伝子６由来のペプチドを認識する各２つのＣＴＬクローンは、それぞれ異なった相補性決定領域３（ＣＤＲ３）（ＨＬＡクラスＩ分子の溝上の抗原エピトープへの結合性を担う要素）を有するＴＣＲを発現していた。ＷＨＳＣ２および遺伝子３由来のペプチド、ＥＩＦ４ＥＢＰ１および遺伝子４由来のペプチド、並びにｐｐＭＡＰｋｋｋおよび遺伝子５由来のペプチドを認識するＣＴＬクローンもそれぞれ異なったＣＤＲ３を有するＴＣＲを発現していた。各ＣＤＲ３のアミノ酸配列は表６に下線で示したアミノ酸配列である。
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産業上の利用の可能性
本発明により、ＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞を誘導せしめることができ、膵臓癌、大腸癌、および胃癌等の特異的免疫療法が可能となる。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、アフリカ黒人の２３％、中国人の５３％、日本人の４０％、北アメリカコーカサス人の４９％、および南アメリカコーカサス人の３８％でみられる。従って、本発明は、癌治療において多大な貢献を期待し得る。また、本発明は、膵臓癌細胞、大腸癌細胞、および胃癌等のＴ細胞による認識に関する分子の基礎的研究にも多大に寄与するものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＯＫ−ＣＴＬｐ（ＨＬＡ−Ａ０２０７／Ａ３１０１）がＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍細胞を溶解することを示す。
図２は、ＯＫ−ＣＴＬｐによるヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１の認識とその結果としてのインターフェロン−γ産生が、ＨＬＡ−Ａ２拘束性であることを示す。
図３は、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得たｃＤＮＡクローン１〜６〔図中（Ａ）〕およびクローン７〔図中（Ｂ）〕をそれぞれＨＬＡ−Ａ２と共に発現させたＣＯＳ７細胞を、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＯＫ−ＣＴＬｐが認識することを示す。
図４は、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得たｃＤＮＡクローン１〜６が、用量依存的にＯＫ−ＣＴＬｐに認識されることを示す。図中、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）はそれぞれ、ＵＢＥ２Ｖ、ＨＮＲＰＬ、ＷＨＳＣ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ｐｐＭＡＰｋｋｋ、および２−５  ＯＡＳ３と高い相同性を有するｃＤＮＡクローン１〜６をそれぞれＨＬＡ−Ａ２と共に発現させたＣＯＳ７細胞を、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＯＫ−ＣＴＬｐが認識することを示す。また、図中の記号−■−は上記各腫瘍抗原遺伝子と共にＨＬＡ−Ａ０２０７遺伝子を標的細胞で発現させたときのＯＫ−ＣＴＬｐにより産生されたインターフェロンγ量を示し、−◇−は上記各腫瘍抗原遺伝子と共にＨＬＡ−Ａ２４０遺伝子を標的細胞に発現させたときのＯＫ−ＣＴＬｐにより産生されたインターフェロンγ量を示す。
図５は、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得たＵＢＥ２Ｖと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子１の遺伝子産物に由来する５つのペプチドを、ＯＫ−ＣＴＬｐまたはＯＫ−ＣＴＬクローンが認識することを示す。
図６は、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得たＨＮＲＰＬと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子２の遺伝子産物に由来する４つのペプチドを、ＯＫ−ＣＴＬｐまたはＯＫ−ＣＴＬクローンが認識することを示す。
図７は、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得たＷＨＳＣ２と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子３の遺伝子産物に由来する４つのペプチドを、ＯＫ−ＣＴＬｐまたはＯＫ−ＣＴＬクローンが認識することを示す。
図８は、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得たＥＩＦ４ＥＢＰ１と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子４の遺伝子産物に由来する２つのペプチドを、ＯＫ−ＣＴＬｐまたはＯＫ−ＣＴＬクローンが認識することを示す。
図９は、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得たｐｐＭＡＰｋｋｋと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子５の遺伝子産物に由来する３つのペプチドを、ＯＫ−ＣＴＬｐまたはＯＫ−ＣＴＬクローンが認識することを示す。
図１０は、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得た２−５  ＯＡＳ３と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子６の遺伝子産物に由来する１つのペプチドを、ＯＫ−ＣＴＬｐまたはＯＫ−ＣＴＬクローンが認識することを示す。
図１１は、ヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１から得た腫瘍抗原遺伝子産物由来の腫瘍抗原ペプチドが用量依存的にＯＫ−ＣＴＬクローンに認識されることを、代表的なペプチドについて示した図である。図中、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）はそれぞれ、ＵＢＥ２Ｖ、ＨＮＲＰＬ、ＷＨＳＣ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ｐｐＭＡＰｋｋｋ、および２−５  ＯＡＳ３と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子１〜６の遺伝子産物由来のペプチドがＯＫ−ＣＴＬｐに認識されることを示す。
図１２は、ＵＢＥ２Ｖと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子１の遺伝子産物に由来する３つのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するＣＴＬを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。図中の記号−■−はヒト膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ−１（ＨＬＡ−Ａ０２０１／１１０１）を、−◆−はヒト大腸腺癌細胞株ＳＷ６２０（ＨＬＡ−Ａ０２０１／２４０２）を、−○−はＨＬＡ−Ａ２−肺腺癌細胞株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ（ＨＬＡ−Ａ１１０１／１１０１）を、−△−はＥＢＶ形質転換自己Ｂ細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０７／３１０１）を、−□−はＰＨＡ芽球化自己Ｔ細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０７／３１０１）を示す。これらの記号の説明は、下記図１３から図１７の説明に援用される。
図１３は、ＨＮＲＰＬと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子２の遺伝子産物に由来する２つのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するＣＴＬを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図１４は、ＷＨＳＣ２と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子３の遺伝子産物に由来する２つのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するＣＴＬを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図１５は、ＥＩＦ４ＥＢＰ１と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子４の遺伝子産物に由来する２つのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するＣＴＬを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図１６は、ｐｐＭＡＰｋｋｋと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子５の遺伝子産物に由来する１つのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するＣＴＬを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図１７は、２−５  ＯＡＳ３と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子６の遺伝子産物に由来する１つのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するＣＴＬを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図１８は、腫瘍抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に且つペプチド用量依存的に細胞傷害活性を示すＣＴＬを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。図中、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、および（Ｅ）はそれぞれ、ＵＢＥ２Ｖ、ＨＮＲＰＬ、ＷＨＳＣ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、およびｐｐＭＡＰｋｋｋと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子１〜６の遺伝子産物由来のペプチドが癌患者末梢血単核細胞からＨＬＡ−Ａ２拘束性に該ペプチドを認識するＣＴＬを誘導することを示す。図中の記号−■−は腫瘍抗原ペプチドを発現させたＴ２細胞、−◇−はＰＨＡ芽球化自己Ｔ細胞を示す。
図１９は、ヒト膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ−１から得た腫瘍抗原遺伝子ＫＭ−ＰＡ−２〔図中（Ａ）〕およびＫＭ−ＰＡ−４〔図中（Ｂ）〕の遺伝子産物が、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＯＫ−ＣＴＬｐにより認識されることを示す。
図２０は、ヒト膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ−１から得た腫瘍抗原遺伝子ＫＭ−ＰＡ−２およびＫＭ−ＰＡ−４由来のペプチド〔図中それぞれ（Ａ）および（Ｂ）〕が、該ＰＢＭＣの刺激に用いたペプチドに対応するペプチドをパルスしたＴ２細胞〔図中（Ａ）および（Ｂ）ともに左側の図〕およびＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞Ｐａｎｃ−１〔図中（Ａ）および（Ｂ）ともに右側の図〕に対する細胞傷害性を有するＣＴＬを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図２１は、ヒト膵臓腺癌細胞株ＣＦＰＡＣ−１から得た腫瘍抗原遺伝子ＫＭ−ＰＡ−２由来のペプチドにより癌患者末梢血単核細胞から誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍細胞を溶解することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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