(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において通常発現されることのできる注目の核酸の表現型発現を抑制するための方法であって、下記の作用可能式に連結された要素を含んで成るキメラＤＮＡの導入工程を含んで成る方法：
ａ）前記真核細胞内で機能性であるプロモーター；
ｂ）ＤＮＡ領域、ここで当該領域は転写されると
ｉ．前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一である少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成るセンスヌクレオチド配列；及び
ii．前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの相補体と同一である少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成るアンチセンスヌクレオチド配列；
を含んで成るヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子を生成し、ここで当該ＲＮＡはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、当該アンチセンス配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドと塩基対合を形成するような塩基対合を介して二本鎖ＲＮＡステムを有する人工ヘアーピンＲＮＡ構造を形成することができる、
但し前記方法はｉｎ  ｖｉｖｏでヒト細胞に実施されないものとする、方法。
【請求項２】
前記キメラＤＮＡが転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域をさらに含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ分子が更に前記センス及び前記アンチセンスヌクレオチド配列の間に配されたスペーサーヌクレオチド配列を含んで成る請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記センスヌクレオチド配列が前記核酸の前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも５５０個の連続ヌクレオチドを含んで成り、ここで当該センスヌクレオチド配列は、注目の核酸と１００％の配列同一性を有する少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記注目の核酸が前記真核細胞のゲノムの中に組込まれた遺伝子である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子が内因性遺伝子である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が外来導入遺伝子である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記キメラＤＮＡが前記ＤＮＡのゲノムの中に安定的に組込まれている、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
前記注目の核酸が感染性ウィルスのゲノムの中に含まれている、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
前記感染性ウィルスがＲＮＡウィルスである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記真核細胞が植物細胞である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１２】
前記植物細胞が植物の中に含まれている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
真核細胞において通常発現されることのできる注目の核酸の表現型発現を抑制するための方法であって、
ｉ．前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一である少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成るセンスヌクレオチド配列；及び
ii．前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの相補体と同一である少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成るアンチセンスヌクレオチド配列；
を含んで成るヌクレオチド配列を有する少なくとも一のＲＮＡ領域を含んで成るキメラＲＮＡ分子を導入する工程を含んで成り、
ここで当該ＲＮＡ領域はセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、当該センス配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドと塩基対合を形成するような塩基対合を介して二本鎖ＲＮＡステムを有する人工ヘアーピンＲＮＡ構造を形成することができ、前記方法がｉｎ  ｖｉｖｏでヒト細胞に対して実施されるものでない、方法。
【請求項１４】
通常表現的に発現されることのできる注目の核酸を含んで成る真核細胞であって、更に下記の作用可能式に連結された要素を含んで成るキメラＤＮＡ分子を含んで成る細胞：
ａ）前記真核細胞内で機能性であるプロモーター；
ｂ）ＤＮＡ領域、ここで当該領域は転写されると
ｉ．前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一である少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成るセンスヌクレオチド配列；及び
ii．前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの相補体と同一である少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成るアンチセンスヌクレオチド配列；
を含んで成るヌクレオチド配列を有する少なくとも一のＲＮＡ領域を有するＲＮＡ分子を生成し、ここで当該ＲＮＡはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での塩基対合を介して二本鎖ＲＮＡステムを有する人工ヘアーピンＲＮＡ構造を形成することができる。
【請求項１５】
前期ＤＮＡ分子が、
ｃ）転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域；ここで当該注目の核酸の表現的発現性は有意に抑制されている
を更に含んで成る、請求項１４記載の真核細胞。
【請求項１６】
真核細胞において通常発現されることのできる注目の核酸を含んで成る真核細胞であって、
ｉ．前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一である少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成るセンスヌクレオチド配列；及び
ii．前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの相補体と同一である少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成るアンチセンスヌクレオチド配列；
を含んで成るヌクレオチド配列を有する少なくとも一のＲＮＡ領域を含んで成るキメラＲＮＡ分子を含んで成り、
ここで当該ＲＮＡ領域はセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、有当該センス配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドと塩基対合を形成するような塩基対合を介して二本鎖ＲＮＡ領域を有する人工ヘアーピンＲＮＡを形成することができる、細胞。
【請求項１７】
植物細胞である請求項１４又は１５記載の真核細胞。
【請求項１８】
請求項１７記載の植物細胞を含んで成る植物。
【請求項１９】
植物油の脂肪酸プロファイルを改良するための方法であって、当該植物の細胞の中にキメラＤＮＡを導入する工程を含んで成り、ここで当該キメラＤＮＡは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成る、方法：
ａ）植物発現性プロモーター
ｂ）ＤＮＡ領域、ここで当該領域は転写されると人工ステムループ構造を形成することのできるＲＮＡ領域を含んで成るＲＮＡ分子を生成し、ここで当該ステムループ構造のアニーリングＲＮＡ配列の一つはΔ１２デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも２０個の連続ヌクレオチドから成るヌクレオチド配列を含んで成り、そしてここで当該アニーリングＲＮＡ配列の第二のものはΔ１２デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも２０個の連続ヌクレオチドから成る前記ヌクレオチド配列の相補体と１００％配列同一性を有する少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成る。
【請求項２０】
前記キメラＤＮＡが、
ｃ）転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
を更に含んで成る、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記脂肪酸プロファイルの改良がオレイン酸含有量の増大を含んで成る、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記植物発現性プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記植物がナタネ（oilseed rape）である、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
キメラＤＮＡを含んで成る改良脂肪酸プロファイルを有する油産生性植物であって、ここで当該キメラＤＮＡは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成る、植物：
ａ）植物発現性プロモーター
ｂ）ＤＮＡ領域、ここで当該領域は転写されると人工ステムループ構造を形成することのできるＲＮＡ領域を含んで成るＲＮＡ分子を生成し、ここで当該ステムループ構造のアニーリングＲＮＡ配列の一つはΔ１２デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも２０個の連続ヌクレオチドから成るヌクレオチド配列を含んで成り、そしてここで当該アニーリングＲＮＡ配列の第二のものはΔ１２デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも２０個の連続ヌクレオチドから成る前記ヌクレオチド配列の相補体と１００％配列同一性を有する少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んで成る。
【請求項２６】
前記キメラＤＮＡが、
ｃ）転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
を更に含んで成る、請求項２５記載の植物。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項２５記載の植物。
【請求項２８】
前記植物発現性プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項２５記載の植物。
【請求項２９】
前記植物がなたねである、請求項２５記載の植物。
【請求項３０】
転写されると前記ＲＮＡ分子を生成する前記ＤＮＡ領域がイントロンをさらに含んで成る、請求項１又は２記載の方法。
【請求項３１】
転写されると前記ＲＮＡ分子を生成する前記ＤＮＡ領域がイントロンをさらに含んで成る、請求項１７記載の真核細胞。
【請求項３２】
転写されると前記ＲＮＡ分子を生成する前記ＤＮＡ領域がイントロンをさらに含んで成る、請求項１９記載の方法。
【請求項３３】
転写されると前記ＲＮＡ分子を生成する前記ＤＮＡ領域がイントロンをさらに含んで成る、請求項２５記載の植物。
【請求項３４】
前記センスヌクレオチド配列が前記核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも５０個の連続ヌクレオチドを含んで成り、ここで当該センスヌクレオチド配列は、注目の核酸と１００％の配列同一性を有する少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
前記センスヌクレオチド配列が前記核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１００個の連続ヌクレオチドを含んで成り、ここで当該センスヌクレオチド配列は、注目の核酸と１００％の配列同一性を有する少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
前記センスヌクレオチド配列が前記核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１５０個の連続ヌクレオチドを含んで成り、ここで当該センスヌクレオチド配列は、注目の核酸と１００％の配列同一性を有する少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
前記センスヌクレオチド配列が前記核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも５０個の連続ヌクレオチドを含んで成り、ここで当該センスヌクレオチド配列は、注目の核酸と１００％の配列同一性を有する少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項２０記載の方法。
【請求項３８】
前記センスヌクレオチド配列が前記核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１００個の連続ヌクレオチドを含んで成り、ここで当該センスヌクレオチド配列は、注目の核酸と１００％の配列同一性を有する少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項２０記載の方法。
【請求項３９】
前記センスヌクレオチド配列が前記核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１５０個の連続ヌクレオチドを含んで成り、ここで当該センスヌクレオチド配列は、注目の核酸と１００％の配列同一性を有する少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は真核細胞、特に植物細胞中の注目の核酸配列の表現型発現を、当該細胞に当該注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相同性及び相補性であるヌクレオチド配列を各々含んで成るセンス及びアンチセンスＲＮＡ分子をコードするキメラ遺伝子を同時に供与することにより、抑制するための方法に関連する。このセンス及びアンチセンスＲＮＡ分子は、当該センス及びアンチセンスＲＮＡがスペーサーヌクレオチド配列により連結され、且つ二本鎖ＲＮＡ分子を形成できるようになっていることのある一のＲＮＡ分子として提供されうる。本発明の一の観点において、これらの方法はウィルス感染を抑制し、それ故著しいウィルス耐性を供することを目的とする。別の態様において、これらの方法は植物細胞内の内因性遺伝子の表現型発現の抑制を目的とする。本発明は更に植物細胞内の注目の核酸に基づく表現型の同定のための大量スクリーニング方法に関連する。また、かかるＲＮＡ分子を含んで成る植物細胞、並びにかかる植物細胞から本質的に成る植物を提供する。
【０００２】
２．発明の背景
１９８５年において、Sanford and Johnstonは寄生虫由来の耐性の概念を提唱した。彼らは宿主内において機能不全形態で、過剰で、又は誤まった発育段階で発現される寄生虫に由来する鍵となる遺伝子産物が宿主に対してごくわずかな作用をもって寄生虫の機能を破壊するであろうと仮説をたてている（Sanford & Johnston, 1985）。モデルとしてＱＢバクテリオファージを利用し、彼らは細菌内でのバクテリオファージコートタンパク質もしくは修飾リバーゼ又はＱＢゲノムに相補性であるアンチセンスＲＮＡの発現が全て耐性を授けるものであると提唱している。彼らは更にかかるアプローチが、植物において、植物ウィルスに対して、そして特に修飾植物ウィルスレプリカーゼの利用に有用性であろうとも提唱している。植物ウィルス、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のコートタンパク質のタバコの中での発現が、植物ウィルス耐性についてのこの概念の最初の事実上の確認である。この研究（Powell-Abel ら、1986）はカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下にある導入遺伝子由来ＴＭＶコートタンパク質の発現がＴＭＶに対する耐性を植物に授けたことを示している。このグループ（Powellら、1990）は一般に、より高いレベルでコートタンパク質を発現する植物は低レベル発現性の植物よりもＴＭＶに対して耐性であることを示した。この証明以来、ウィルスコートタンパク質遺伝子で形質転換された非常に多くの耐性を示す植物の例がある（表１）。また、野生型レプリカーゼ（Braun and Hemenway, 1992, Brederodeら、1995）、トランケーション化レプリカーゼ（Carr ら、1992）、修飾レプリカーゼ（Longstaff ら、1993）又はアンチセンスウィルスＲＮＡ（Kawchuckら、1991）を発現する植物における植物ウィルス耐性の数多くの報告がある。
【０００３】
１９９２年において、Dougherty 及びその共同研究者はタバコエッチウィルス（tobacco etch virus)(ＴＥＶ）のコートタンパク質遺伝子の様々な形態を利用して、翻訳不能の「センス」コートタンパク質遺伝子及びアンチセンスコートタンパク質遺伝子を含むいくつかの植物がウィルスに対して強力な耐性（ＥＲ）を示すことを発見した（Lindbo & Dougherth, 1992 a, b)。この耐性は完全植物レベル及び単独細胞レベルにおいて機能的であった。ＴＥＶはＥＲ植物に由来するプロトプラスト内では複製できなかったが、非遺伝子導入タバコ由来のプロトプラストでは高レベルで複製した。Dougherty らは翻訳不能センス構築体についての強力な耐性を構築するメカニズムがよく報告されているコートタンパク質媒介戦略と同じでないものと考えた。彼らは翻訳不能センス構築体のｍＲＮＡがウィルスの負のセンスゲノムとハイブリダイズし、そして負のストランド上の複製複合の進行を妨げると提唱する。彼らは分子内対合を形成できるウィルス配列の利用は、それが標的ウィルスＲＮＡに対してハイブリダイズする能力を妨害しうるため、避けるべきであると提案している。
【０００４】
【表１】
0005015373.tif 000002
Dougherty のグループはその研究を翻訳不能センスポテトウィルスＹ（sense potato virus Y)(ＰＶＹ）コートタンパク質遺伝子を含む植物にまで広げた。彼らはＴＥＶによるものと似た結果を得ており、そしてＥＲを有する植物が高度な導入遺伝子コピー数、高度に活性な導入遺伝子転写、及び低レベルの定常状態のＰＶＹ導入遺伝子由来のｍＲＮＡを有することを示した（Lindboら、1993, Smith ら、1994）。この耐性メカニズムについて下記のモデルが提唱されている：ウィルス導入遺伝子の高レベルな転写は特異的なＲＮＡを排除の標的とする細胞質を基礎とする後転写細胞監視システムを誘引する。この導入遺伝子はウィルス配列を含んで成る転写体をコードするため、このメカニズムは導入遺伝子ｍＲＮＡを分解するだけでなく、ウィルスゲノムＲＮＡ内の同じ配列をも分解する。このモデルにおける重要な点は、高コピー数により供される導入遺伝子の高レベルな転写の必要性にある（3-8; Goodwinら、1996）。他方、このメカニズムを誘引するのに必要なＲＮＡ基準は、早期感染における複製に由来するウィルスＲＮＡにより補助される一層軽い転写レベルにより達成されうる。これは「回復表現型」を供する。それにおいては、植物は当初感染して症状を示すが、ウィルス症状のない新たな成長体を生み出し、そしてそれは感染に対して強力に耐性である。
【０００５】
この説は、非ウィルス導入遺伝子の遺伝子サイレンス化（gene silencing) もＲＮＡレベルで作動する後転写メカニズムに基づく、という発見により裏付けされた（Ingelbrecht ら、1994 ; de Carvalho Niebelら、1995）。
【０００６】
非ウィルス遺伝子サイレンス化とこの病原体由来耐性との連鎖は、ＧＵＳ導入遺伝子が後転写メカニズムによりサイレンス化されることで知られるような遺伝子導入植物にＧＵＳ配列を含むウィルスを接種せしめることにより供される（English ら、1996）。この場合、これらの植物はウィルス感染に対して極めて耐性である。しかしながら、同植物はそれらがＧＵＳ配列を含まないと、ウィルスに対して感受性である。
【０００７】
ウィルス耐性の程度は常にウィルス導入遺伝子の転写のレベルに正比例しているわけではないため（Mueller ら、1995 ; Englishら、1996）、耐性を誘導する別のメカニズムがあるかもしれないことが示唆される。このような矛盾に合わせるため、耐性に影響を及ぼす重要な因子が、導入遺伝子ｍＲＮＡのレベルではなく、そのmＲＮＡの質であるような別のモデルが提案された（Englishら、1996）。このモデルに従うと、導入遺伝子はそれが転写されて「異常ＲＮＡ」を生成するときにだけ耐性を誘導できる（又は遺伝子をサイレンス化する）。後転写的遺伝子サイレンス化及び導入遺伝子のメチル化の数多くの例があり（Hobbs ら、1990 ; Ingelbrechtら、1994）、そして導入遺伝子のメチル化が強力なウィルス耐性のいくつかの例に関係することも見い出されている（Smith ら、1994, English 1996）。提唱のモデルにおいて、導入遺伝子のメチル化は細胞質ＲＮＡ監視システムを誘導する異常ＲＮＡの生成に結びつく。Baulcombe and English はこの誘導法がA. immersus におけるｍｅｔ２のサイレンス化で認められているものと同じでありうることを提唱している。このシステムにおいて、ｍｅｔ２ＲＮＡの転写は内因性遺伝子のメチル化領域において終結し、かくして異常なトランケーションＲＮＡが生み出される。このメチル化は導入遺伝子と内因遺伝子の対応の領域の相同領域との正常な場所ではない相互作用の結果と考えられる（Barry ら、1993）。多重導入遺伝子の存在は正常でない場所での対合の傾向を高め、それ故高コピー数と強力なウィルス耐性との関係と一致する（Mueller ら、1995 ; Goodwinら、1996 ; Pang ら、1996）。
【０００８】
この全体領域は最近再検討され（例えば、Baulcombe (1996) and Stam ら（1997))、そしていくつかのモデルが紹介されている。全てのモデルは高度な配列特異性を要し、その理由は耐性が非常に（株）特異的であり、それ故この導入遺伝子から産生されるＲＮＡとの塩基対相互作用を要するからである。センス導入遺伝子によるウィルス耐性又は遺伝子サイレンス化の誘導についての一の説明は、植物のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが鋳型として導入遺伝子ｍＲＮＡを利用する相補性ＲＮＡを作り出すことにある（Schiebelら、1993 a, b)。この仮説的な相補性ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）は検出されていないが（Baulcombe 1996）、ｃＲＮＡが完全相補体よりも小さく且つヘテロ散在的なＲＮＡであり（Schiebel 1993 a, b ; Baulcombe 1996)、それ故検出しにくいと予想されている。
【０００９】
ウィルス耐性又は遺伝子サイレンス化を媒介するうえでのｃＲＮＡの作用の考えられる方法（Baulcombe ら1996により提唱）は：
１：ｃＲＮＡが導入遺伝子ｍＲＮＡ又はウィルスＲＮＡとハイブリダイズし、そしてその二量体がｄｓＲＮＡの標的となる；
２：ｃＲＮＡが標的ＲＮＡとハイブリダイズして二量体を形成し、それが翻訳を中断し、その結果安定性に対して間接的な作用を及ぼす（Green, 1993)；
３：ｃＲＮＡとウィルスＲＮＡとで形成される二量体がウィルス複製のために必要な補因子の翻訳のハイブリド中断を及ぼす；及び
４：ｃＲＮＡのハイブリダイゼーションがウィルス複製のために必要とされる分子内塩基対合に影響を及ぼす。
【００１０】
従って、ウィルス耐性又は遺伝子サイレンス化についての現行のモデルは高レベルの導入遺伝子転写又は異常一本鎖ｍＲＮＡの産生のいずれかによる細胞質監視システムの誘導を包含する。このシステムが一旦誘引されると、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはこの導入遺伝子ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作る。このようなｃＲＮＡは標的ＲＮＡにハイブリダイズし、その翻訳能力もしくは安定性に近接影響を及ぼすか、又はＲＮＡを分解の標的とする。
【００１１】
米国特許第５，１９０，１３１号及びＥＰ  ０，４６７，３４９Ａ１には細胞における遺伝子発現を、細胞の遺伝子材料にその細胞のこの遺伝子材料により産生されるｍＲＮＡに相補的な及びそれに結合することのできるｍＲＮＡを産生するように転写される非天然核酸配列を組込む又は結合させることにより調節又は阻害する方法及び手段が記載されている。
【００１２】
ＥＰ  ０，２３３，３９９Ａ１には植物において有用な体細胞変化を、標的ＲＮＡストランドに実質的に相補性である負のＲＮＡストランドの植物細胞内での転写を行うことにより引き起こすことが記載されている。この標的ＲＮＡストランドは遺伝子発現において構築されるｍＲＮＡ転写体、ウィルスＲＮＡ、又は植物細胞の中に存在するその他のＲＮＡであってよい。この負のＲＮＡストランドは標的ＲＮＡストランドの少なくとも一部に対して相補性であり、その活性をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する。
【００１３】
ＥＰ  ０，２４０，２０８号には植物細胞ゲノム内でのコード遺伝子の発現を調節する方法が記載され、それは宿主内で機能性なプロモーターの転写制御下にあり、且つそのＤＮＡの転写ストランドが調節を所望する内因性遺伝子から転写されたＤＮＡのストランドに対して相補的である遺伝子の組込みにより達成される。
【００１４】
ＥＰ  ０，６４７，７１５Ａ１並びに米国特許第５，０３４，３２３、５，２３１，０２０及び５，２８３，１８４号には所望の表現型特徴を示す植物を生産するための方法及び手段が記載され、それはプロモーターに作用可能式に連結されたＤＮＡセグメントを含んで成るトランスゲノーツ（transgenotes）を選別することによるものであり、ここでこのセグメントの転写生成物は内因性遺伝子、特に内因性フラボノイド生合成経路遺伝子の対応の転写体に対して実質的に相同性である。
【００１５】
ＷＯ９３／２３５５１には２種以上の標的遺伝子の阻害のための方法及び手段が記載され、それは標的遺伝子各々に対して相同性である異なるＤＮＡ領域を有する単一コントロール遺伝子及びかかる異なる領域から標的遺伝子各々の発現を阻害するＲＮＡが転写されるような適合された植物において機能するプロモーターを植物に導入することを含んで成る。
【００１６】
ＷＯ９２／１３０７０号には核酸の翻訳の調節のための方法が記載され、それはポリペプチドをコードし、且つ更には調節ドメイン、支持体領域及びリボソーム認識配列を含む応答性ＲＮＡ分子を特徴とする。この応答性ＲＮＡ分子は調節ドメイン内にインヒビター領域を有し、その調節ドメインはこの応答性ＲＮＡ分子の支持体領域及びシグナル核酸のアンチインヒビター領域の双方に対して相補性であり、かくしてシグナル核酸の非存在下で、このインヒビター及び支持体領域は塩基対合したドメインを形成し、その形成はシグナル核酸の存在下で観察される−タンパク質−コード領域の翻訳レベルと比べてこの応答性ＲＮＡ分子におけるタンパク質コード領域の一つの翻訳レベルを抑制する。
【００１７】
Metzlaffら、1997にはペチュニアにおけるＲＮＡ媒介ＲＮＡ分解及びカルコーン（chalcone) シンターゼＡサイレンシングについてのモデルが記載され、それは相補性配列間でのＲＮＡ−ＲＮＡ対合、それに続く内性核酸分解ＲＮＡ切断のサイクルを包含し、どのようにしてＲＮＡ分解が促進される傾向にあるかを説明する。Fireら、1998にはCaenorhabditis elegansにおける二本鎖ＲＮＡの実験導入による特異的遺伝子妨害が記載されている。機能性ゲノムについてのこのような発見の重要性が論じられている（Wagner and Sun, 1998)。
【００１８】
Que ら、1998にはペチュニアの花における対立形質センス及びアンチセンスカルコーンシンターゼ導入遺伝子により産生される色素抑制の異なるパターンが記載され、そして更にはセンス及びアンチセンスカルコーンシンターゼ対立形質についてヘテロ接合である植物における花色パターンを分析している。
【００１９】
ＷＯ９８／０５７７０は遺伝子発現を阻害するために用いることのできうる特別な二次構造を有するアンチセンスＲＮＡを開示する。
【００２０】
ＷＯ９４／１８３３７号にはリノレン酸の増加した又は減少した形質転換植物並びにリノール酸デサチュラーゼを発現する植物を開示する。
【００２１】
米国特許第５，８５０，０２６号は破砕及び抽出後に８６％超のオレイン酸及び２．５％未満のα−リノレン酸を含むブラッシカ（Brassica）種子を開示する。この油は７％未満のリノール酸をも含む。このブラッシカ種子はミクロソームオレイン酸デサチュラーゼ及びミクロソームリノール酸デサチュラーゼ遺伝子発現の種子特異的阻害を含む植物により生産され、ここでその阻害は同時抑制又はアンチセンス技術により構築されうる。
【００２２】
米国特許第５，６３８，６３７号はナタネ由来の植物油及びそれを生産するナタネを開示し、この植物油は総脂肪酸含有量を基準に異常に高い８０〜９０％のオレイン酸含有量を有する。
【００２３】
発明の概要
本発明は通常真核細胞に発現されることのできる注目の核酸の表現型発現を抑制する、特に遺伝子、特に真核細胞のゲノムの中に組込まれた内因性遺伝子もしくは外来導入遺伝子の表現型発現を抑制する、又は感染ウィルスのゲノムの中に含まれている注目の核酸の表現型発現を抑制するための方法であって、真核細胞の核ゲノムの中に、真核細胞の中で発現されることのできるプロモーター、並びに任意的に転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域、更にはそれらの間にあるＤＮＡ領域であって、転写されると注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、特に少なくとも約５５０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列及び当該センスヌクレオチド配列の相補体の１０個のヌクレオチドストレッチと約７５％〜約１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子を生み出すＤＮＡ領域を含んで成るキメラＤＮＡを導入、好ましくは組込むことを含んで成り、ここで当該ＲＮＡはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、当該センス配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の１０個の連続ヌクレオチドと塩基対合して好ましくは人工ヘアーピン構造をもたらすような塩基対合を介して、二本鎖ＲＮＡステムを有する人工ヘアーピンＲＮＡ構造を形成することができる方法を提供する。好ましくは、このキメラＤＮＡはＤＮＡのゲノムの中に安定的に組込まれる。
【００２４】
本発明は更に真核細胞において通常発現されることのできる注目の核酸の表現型発現を抑制するための方法であって、この注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列及びこのセンスヌクレオチド配列の相補体の１０ｎｔのストレッチと約７５％〜約１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するキメラＲＮＡ分子を導入する工程を含んで成り、ここで当該ＲＮＡはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、当該センス配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の１０個の連続ヌクレオチドと塩基対合して（人工）ヘアーピン構造をもたらすような塩基対合を介して、二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる、方法を提供する。
【００２５】
本発明は更に植物細胞における注目の核酸の遺伝子発現を抑制するための方法であって、第一及び第二キメラＤＮＡであって双方のキメラＤＮＡが遺伝子導入植物細胞の核ゲノムの中に一緒に組込まれて一の組換ＤＮＡ上に連結されているものを導入する工程を含んで成る、方法を提供する。ここで当該第一キメラＤＮＡは、植物発現性プロモーター、注目の遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできる第一ＤＮＡ領域、並びに任意的に植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含んで成る。この第二キメラＤＮＡは植物発現性プロモーター、当該センスヌクレオチド配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５％〜約１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできる第二ＤＮＡ領域、並びに任意的に植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含んで成る。このセンス及びアンチセンスＲＮＡ分子は相補性である領域間での塩基対合を介して二本鎖二量体ＲＮＡを形成することができる。
【００２６】
本発明は更にウィルス耐性真核生物、特に植物を獲得するための方法であって、第一及び第二キメラＤＮＡを有する当該生物の細胞を用意し、ここで当該第一キメラＤＮＡはプロモーター、ウィルスのゲノムのヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできる第一ＤＮＡ領域；並びに植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含んで成る、方法を提供する。ここで当該第二キメラＤＮＡはプロモーター、前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできる第二ＤＮＡ領域、並びに植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含んで成る。ここで当該センス及びアンチセンスＲＮＡ分子は相補性である領域間での塩基対合により二本鎖ＲＮＡを形成することができる。
【００２７】
この第一及び第二キメラＤＮＡは形質転換植物細胞の核ゲノムの中に別々に組込まれているか、又は一の組換ＤＮＡ上に連結され、双方のキメラＤＮＡが遺伝子導入植物細胞の核ゲノムの中に一緒に組込まれている。
【００２８】
本発明は更に真核細胞における注目の核酸の発現に関連する表現型を同定するための方法であって、注目のヌクレオチド配列内で、少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの標的配列を選定し、当該選定標的配列の長さに対応し、且つ当該選定標的配列と少なくとも約７５〜１００％の配列同一性を有するセンスヌクレオチド配列を設計し、当該センスヌクレオチド配列の相補体と少なくとも約７５〜１００％の配列同一性を有し、且つ当該センスヌクレオチド配列の一部の相補体と１００％の配列同一性を有する少なくとも約１０個の連続ヌクレオチドのストレッチを含んで成るアンチセンスヌクレオチド配列を設計することを含んで成る。この方法は更に、当該設計したセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の双方を含んで成るＲＮＡ分子を過去に同定されていない表現型を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含んで成る適当な真核宿主細胞に導入し；そして当該表現型を適当な方法により観察する；ことを含んで成る。
【００２９】
本発明は更に、通常表現的に発現されることのできる注目の核酸を含んで成る真核細胞であって、更に前記真核細胞内で発現されることのできるプロモーター、ＤＮＡ領域であって、転写されると前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列及び前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子を生成するＤＮＡ領域を含んで成るキメラＤＮＡ分子を含んで成る細胞を提供し、ここで当該ＲＮＡ分子はセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、当該センス配列の少なくとも前記１０個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の前記１０個の連続ヌクレオチドと塩基対合を形成してヘアーピンＲＮＡ構造、好ましくは人工ヘアーピン構造をもたらすような塩基対合を介して、二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる。かかるキメラＤＮＡ分子は更に転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含んで成る。
ここで当該注目の核酸の表現的発現性は有意に抑制されている。
【００３０】
本発明は更に、通常表現的に発現されることのできる注目の核酸を含んで成る真核細胞であって、更に当該注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列及び当該センスヌクレオチド配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するキメラＲＮＡ分子を含んで成り、ここで当該ＲＮＡはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、当該センス配列の少なくとも前記１０個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の前記少なくとも１０個の連続ヌクレオチドと塩基対合して人工ヘアーピンＲＮＡ構造をもたらすような塩基対合を介して、二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる。
【００３１】
本発明の別の目的は通常表現的に発現されることができる注目の遺伝子を含んで成る真核細胞であって、一の組換ＤＮＡ上で連結された第一及び第二キメラＤＮＡを、当該真核細胞の核ゲノム内に一緒に組込まれて更に含んで成り；ここで当該第一キメラＤＮＡは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成り：当該真核細胞において発現されることのできるプロモーター、前記注目の遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできる第一ＤＮＡ領域、並びに転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域；そしてここで前記第二キメラＤＮＡは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成り：当該真核細胞において機能性であるプロモーター、前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできる第二ＲＮＡ領域；転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域；ここで当該センス及びアンチセンスＲＮＡ分子は相補性である領域間での塩基対合により二本鎖ＲＮＡを形成することができる、細胞、の提供にある。
【００３２】
本発明の更な目的は第一及び第二キメラＤＮＡが細胞の核ゲノムの中に組込まれているウィルス耐性植物の提供にある。ここで当該第一キメラＤＮＡは植物発現性プロモーター、当該植物に感染することのできるウィルスのゲノムのヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできる第一ＤＮＡ領域；並びに当該植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含んで成る。当該第二キメラＤＮＡは植物発現性プロモーター、前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできる第二ＤＮＡ領域；並びに当該植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含んで成る。当該センス及びアンチセンスＲＮＡ分子は相補性である領域間での塩基対合により二本鎖ＲＮＡを形成することができる。この第一及び第二キメラＤＮＡは核ゲノム内の一の遺伝子座又は異なる遺伝子座のいずれかに組込まれている。
【００３３】
本発明は更に植物、好ましくはナタネ由来の油の脂肪酸プロファイルを改良する、好ましくはオレイン酸含有量を高めるための方法であって、当該植物の細胞の中にキメラＤＮＡを導入する工程を含んで成る方法を提供する。ここで当該キメラＤＮＡは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成る：ａ）植物発現性プロモーター、好ましくは種子特異的プロモーター、ｂ）ＤＮＡ領域、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ領域、ここで当該領域は転写されると人工ステムループ構造を形成することのできるＲＮＡ領域を含んで成るＲＮＡ分子を生成し、ここで当該ステムループ構造のアニーリングＲＮＡ配列の一つはΔ１２デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも一部と本質的に類似するヌクレオチド配列を含んで成り、そしてここで当該アニーリングＲＮＡ配列の第二のものは当該Δ１２デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも一部の相補体の少なくとも一部と本質的に類似する配列を含んで成る；並びに任意的にｃ）転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域。上記のキメラ遺伝子を含んで成る改良脂肪酸プロファイル、特に増大したオレイン酸含有量を有する植物も本発明により提供される。また、かかる植物又は種子から得た油も包含される。
【００３４】
本発明の上記の目的、利点、特徴は下記の好適な態様の説明、図面により一層理解されるであろう。
【００３５】
発明の好適な態様の詳細な説明
本発明の目的の一つは決定されたセンス部及び決定されたアンチセンス部を含むヘアーピン構造を含んで成るＲＮＡ分子を有する真核細胞、特に植物細胞を提供することにある。潜在的には、ＲＮＡ分子はいくつかの二次構造を形成することができ、その一部は所望のヘアーピンを含みうる。この細胞中のＲＮＡの真の二次構造は最低の自由エネルギーを有するであろうと予想される。本発明に従うと、細胞内で生産すべきＲＮＡ分子は、細胞内でそれが帯びることができうる少なくともその最低の自由エネルギー状態において、それは所望のヘアーピンを含んで成るであろう。
【００３６】
本明細書で用いる「ヘアーピンＲＮＡ」とは任意の自己アニーリングし合う二本鎖ＲＮＡ分子をいう。その最も簡単な代表例において、ヘアーピンＲＮＡは一本鎖ＲＮＡループで接続したアニーリングＲＮＡストランドから成る二本鎖ステムから成り、そして更には「パン−ハンドルＲＮＡ」とも呼ばれる。しかしながら、「ヘアーピンＲＮＡ」なる語は自己アニーリング二本鎖配列を含んで成るより複雑な二次ＲＮＡ構造、更には内部のふくらみ及びループをも包括する。具備した特異的な二次構造はＲＮＡ分子の自由エネルギーにより決定され、そして適当なソフトウェア、例えばＦＵＬＤＲＮＡ（Zuker and Stiegler, 1981）を利用して様々な状況について予測できうる。
【００３７】
ヌクレオチド配列に関する本明細書で使う「配列同一性」とは同一のヌクレオチドを有する位置の数を２本の配列のうちの短いもののヌクレオチドの数で除した値をいう。２本のヌクレオチド配列のアラインメントはWilbur and Lipman アルゴリズム（Wilbur and Lipmann, 1983）により、２０ヌクレオチドのウィンドーサイズ、４ヌクレオチドの文字長、４のギャップペナルティーを用いて実施する。上記の配列アラインメントを含む配列データーのコンピューター補助分析及び解釈は、例えばIntelligenetics(商標）Suite (Intelligenetics Inc., CA）のプログラムを用いて簡単に実施できる。配列は、それらが少なくとも約７５％、特に少なくとも約８０％、より特に少なくとも約８５％、かなり特に約９０％、特別には約９５％、より特別には約１００％の配列同一性を有するとき、かなり特別には同一であるとき、「本質的に類似」と表示する。ＲＮＡ配列が本質的に類似である、又はＤＮＡ配列と所定の度合いの配列同一性を有すると言及するとき、ＤＮＡ配列内のチミン（Ｔ）はＲＮＡ配列内のウラシル（Ｖ）と均等と考えることが明らかである。
【００３８】
本明細書でいう「植物発現性プロモーター」とは植物細胞内の転写を制御（開始）することのできるＤＮＡ配列を意味する。これは任意の植物起源プロモーターを含むが、植物細胞において転写を指令することのできる任意の非植物起源プロモーター、即ち、ウィルス又は細菌起源の所定のプロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓ、サブテラニアン・クローバー（subterranean clover）ウィルスプロモーターＮｏ．４もしくはＮｏ．７、又はＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーターも含む。
【００３９】
「遺伝子の発現」とは適当な調節領域、特にプロモーターに作用可能式に連結されたＤＮＡ領域が生物学的に活性なＲＮＡ、即ち、その他の核酸と相互作用できるとか又はポリペプチドもしくはタンパク質へと翻訳されることができるＲＮＡへと転写される過程をいう。遺伝子はこの遺伝子の発現の最終産物が生物学的に活性なＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ、リボザイム又は複製中間体であるとき、ＲＮＡをコードするという。遺伝子はこの遺伝子の発現の最終産物がタンパク質又はポリペプチドであるとき、タンパク質をコードするという。
【００４０】
注目の核酸は、その核酸が適当な宿主細胞、特に植物細胞の中に導入されるとき、その宿主細胞の中で転写して（又は複製して）ＲＮＡを生み出す及び／又は翻訳されてポリペプチドもしくはタンパク質を生み出すとき、「発現されることができる」という。
【００４１】
「遺伝子」なる語は適当な調節領域、例えば植物発現性プロモーターに作用可能式に連結された細胞内でＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ領域（「転写ＤＮＡ領域」）を含んで成る任意のＤＮＡフラグメントを意味する。かくして、遺伝子は複数の作用可能式に連結されたＤＮＡフラグメント、例えばプロモーター、５′リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含んで成る３′領域を含んで成りうる。特定の植物の種に内因性である植物遺伝子（内因性植物遺伝子）はその植物の種の中に天然で見い出される遺伝子又は慣用の育成によりその植物種に導入されうる遺伝子をいう。キメラ遺伝子とは、植物種において通常認められない任意の遺伝子、又はプロモーターが天然では転写ＤＮＡ領域の一部もしくは全体又はこの遺伝子の少なくとも一のその他の調節領域と一体化していない遺伝子である。
【００４２】
本明細書で用いる「注目の核酸の表現型発現」とは、宿主細胞内の核酸の分子性発現に結びついた任意の定量的特徴を意味し、それ故転写もしくは複製されるＲＮＡ分子の量、後転写修飾されたＲＮＡ分子の量、翻訳されたペプチドもしくはタンパク質の量、かかるペプチドもしくはタンパク質の活性が含まれうる。
【００４３】
注目の核酸の表現的発現に結びつく「表現型特徴」とは上記の特徴を含む任意の定量的又は定性的特徴、並びに細胞に媒介される直接もしくは間接的な効果、又はＲＮＡ分子、ペプチドもしくはタンパク質、又は後転写修飾されたペプチドもしくはタンパク質の存在によりその細胞を含む生物を意味する。宿主細胞内での核酸の単なる存在は、たとえそれが定量的又は定性的に追跡できたとしても、その核酸の表現型発現又は表現型特徴とは考えない。細胞又は生物に対して媒介される直接又は間接的な効果の例は例えば農業経営又は産業上有用な特徴、例えば害虫もしくは病気に対する耐性、高度又は改良された油含有量、等である。
【００４４】
本明細書でいう「表現型発現の抑制」とは、本発明のＲＮＡ又はキメラ遺伝子の存在下での真核細胞の注目の核酸の表現型発現の、本発明のＲＮＡ又はキメラ遺伝子の非存在下での注目の核酸の表現型発現との対比に関連する。本発明のキメラＲＮＡの存在下での表現型発現はかくしてその非存在下での表現型発現よりも少なく、好ましくはキメラＲＮＡの非存在下での表現型発現のわずか約２５％、特にわずか約１０％、より特にわずか約５％であり、特にこのキメラＲＮＡ又はかかるＲＮＡをコードするキメラ遺伝子の存在によりこの表現型発現は全ての実用的な目的のため完全に阻害されるべきである。
【００４５】
表現型が定性的な特徴である核酸の表現型発現の抑制とは、本発明のキメラＲＮＡ又は遺伝子の存在下で、表現型特徴が、かかるＲＮＡ又は遺伝子のない状況と比べて異なる別の状態へと変遷するときを意味する。核酸の表現型発現の抑制はそれ故とりわけ、その核酸（の一部）の転写の抑制、核酸（の一部）の翻訳の抑制、又は転写ＲＮＡもしくは翻訳ポリペプチドの存在が真核細胞又は生物に対して有する効果の抑制として測定できることがあり、そして究極的には改変された表現的特徴へと結びつくであろう。注目の核酸の表現的発現の抑制は表現型特徴の増大に付随する又は相関しうることが明らかである。
【００４６】
本明細書でいう「注目の核酸」又は「標的核酸」とは真核細胞、特に植物細胞の中に存在しうる任意の特定のＲＮＡ分子又はＤＮＡ配列を意味する。
【００４７】
本明細書でいう「含んで成る」とは、記載の特徴、事項、工程又は成分の存在を言及するがまま特定されるものと解釈されるか、１又は複数の特徴、事項、工程もしくは成分又はそれらの群の存在又は追加を排除するわけではない。かくして、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含んで成る核酸又はタンパク質は、実際に記載されたものより多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含んで成ってよく、即ち、より大きな核酸又はタンパク質の中に埋設してよい。機能的又は構造的に特定されたＤＮＡ領域を含んで成るキメラ遺伝子は追加のＤＮＡ領域等を含んで成ってよい。
【００４８】
驚くべきことに本発明者により、植物細胞の核ゲノムの中に組込まれた標的遺伝子又はその一部のセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の双方を含んで成るヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子へと転写されることのできるキメラ遺伝子はその標的遺伝子の表現型発現を効率的且つ特異的に抑制できることが発見された。表現型発現の抑制はセンス又はアンチセンスＲＮＡ分子のいずれかをコードするキメラ遺伝子を別々に標的遺伝子を有する類似の細胞に導入したときに観察されるものよりも効率的且つ予測可能であった。
【００４９】
同時に、一の細胞にＲＮＡ分子をコードする独立のキメラ遺伝子をセンス及びアンチセンス各々を含んで成るヌクレオチド配列と同時に導入すると、たとえキメラ遺伝子がより弱いプロモーターから転写されたときでさえも、非常に強いウィルス耐性をもたらした。遺伝子サイレンス化及びウィルス耐性は類似の現象により媒介されうることが周知である。
【００５０】
本発明の一態様において、真核細胞、特に植物細胞において通常発現されることのできる注目の核酸の表現型発現性を抑制するための方法であって、下記の作用可能式に連結された要素を含んで成るキメラＤＮＡの導入工程を含んで成る方法を提供する：
ａ）前記真核細胞内で機能性であるプロモーター、特に植物発現性プロモーター；
ｂ）ＤＮＡ領域、ここで当該領域は転写されると
ｉ．前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０ｎｔ、好ましくは１５ｎｔの連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列；及び
ii．前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも１０、好ましくは１５ｎｔの連続ヌクレオチドの相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０ｎｔ、好ましくは１５ｎｔの連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列；
を含んで成るヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子を生成し、ここで当該ＲＮＡはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での塩基対合を介して二本鎖ＲＮＡを形成して、ヘアーピンＲＮＡ構造をもたらすことができる；並びに
ｃ）適当な真核細胞において機能する、特に植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域。
【００５１】
本発明の好適な態様において、このＲＮＡ分子はキメラ遺伝子から転写されたＲＮＡ分子であり、ヘアーピンＲＮＡから本質的に成る。
【００５２】
このＲＮＡ分子内でのセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の順序は重要でないと考える。
【００５３】
従って、換言すると、このキメラＤＮＡは転写ＤＮＡ領域を有し、それは転写されると、人工ステム構造を形成することのできるＲＮＡ領域を含んで成るＲＮＡ分子を生み出し、ここでこのステム−ループ構造のアニーリングＲＮＡ配列の一方は注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と本質的に類似する配列を含んで成り、そしてここでこのアニーリングＲＮＡ配列の第二のものは注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部の相補体の少なくとも一部と本質的に類似する配列を含んで成る。
【００５４】
このＲＮＡ分子は複数の人工ヘアーピン構造を含んで成ってよく、それは様々な注目の核酸の表現型発現を抑制するように設計できうる。
【００５５】
一の好適な態様において、表現型発現を抑制することを狙いとする注目の核酸は真核細胞、特に植物細胞のゲノムの中に組込まれた遺伝子である。本発明の手段及び方法は天然物として細胞のゲノムに属する遺伝子（内因性遺伝子）の表現型発現の抑制、及び天然物として細胞のゲノムに属することのないが、細胞に導入された遺伝子（導入遺伝子）の表現型発現の抑制のために利用されうる。この導入遺伝子は安定的又は一過性的に導入されてよく、そして細胞の核ゲノムの中に組込まれてよく、又は複製ベクター、例えばウィルスベクター上に存在してよい。
【００５６】
その他の好適な態様において、表現型発現を抑制することを狙いとする注目の核酸はウィルス核酸、特に真核細胞、特に植物細胞に感染することのできるウィルスＲＮＡ分子である。この場合、抑制すべき表現型はウィルスの複製、そして究極的には感染ウィルスにより惹起される病的症状である。
【００５７】
好ましくは、このセンスヌクレオチド配列に対応する標的核酸のヌクレオチド配列は転写されるＤＮＡ領域、特に転写及び翻訳されるＤＮＡ領域の一部（換言すればコード領域）である。特に好ましくは、この標的配列は１又は複数の連続するエクソンであり、より特にはコード領域の単一のエキソン内に配置されているものである。
【００５８】
センスヌクレオチド配列の長さは約１０ヌクレオチド（ｎｔ）から標的核酸の全長（ヌクレオチド）に相当する長さに至るまで様々であってよい。好ましくは、このセンスヌクレオチド配列の全長は少なくとも１０ｎｔ、好ましくは１５ｎｔ、特に少なくとも約５０ｎｔ、より特に少なくとも約１００ｎｔ、特に少なくとも約１５０ｎｔ、より特別には少なくとも約２００ｎｔ、かなり特別には少なくとも約５５０ｎｔである。このセンスヌクレオチド配列の全長は、その標的核酸の全長以外に上限となるものはないと予想される。しかしながら、実用的な理由（例えばキメラ遺伝子の安定性）のため、センスヌクレオチド配列の長さは５０００ｎｔを超えるべきでなく、特に２５００ｎｔを超えるべきでなく、そして約１０００ｎｔにまで制限されうる。
【００５９】
センスヌクレオチド配列の全長が長くなるほど、全長ヌクレオチド配列と標的遺伝子内の対応の配列間での配列同一性についての要件のストリンジェンシーは弱まる。好ましくは、センスヌクレオチド配列全体は対応標的核酸と少なくとも７５％、特に少なくとも約８０％、より特には少なくとも約８５％、かなり特には約９０％、特別には約９５％、より特別には約１００％の配列同一性を有すべきであり、かなり特別には標的核酸の対応部分と同一であるべきである。しかしながら、このセンスヌクレオチド配列は常に標的核酸の対応部分と１００％の配列同一性を有する約１０個の連続ヌクレオチド、特に約２０ｎｔ、より特に約５０ｎｔ、特別には約１００ｎｔ、かなり特別には約１５０ｎｔの配列を含むことが好ましい。好ましくは、配列同一性の計算及び対応のセンス配列の設計のため、ギャップの数は、特に短めのセンス配列の場合、最小限とすべきである。
【００６０】
アンチセンスヌクレオチド配列の長さはセンスヌクレオチド配列の長さによりかなり決定され、そして後者の配列の長さに相当するのが好ましいであろう。しかしながら、長さにおいて約１０％相違するアンチセンス配列を利用することが可能である。同様に、アンチセンス領域のヌクレオチド配列はセンス領域のヌクレオチド配列によりかなり決定され、そしてセンス領域のヌクレオチド配列の相補体と同一であるのが好ましい。しかしながら、特に長いアンチセンス領域だと、センスヌクレオチド配列の相補体と低めの配列同一性、より好ましくはセンスヌクレオチド配列の相補体と少なくとも約８０％、特に少なくとも約８５％、より特に少なくとも約９０％の配列同一性、特別には少なくとも約９５％の配列同一性を有するアンチセンス配列を利用することが可能である。にもかかわらず、このアンチセンスヌクレオチド配列は常にセンスヌクレオチド配列の対応部分の相補体と１００％の配列同一性を有する約１０、好ましくは１５個の連続ヌクレオチド、特に約２０ｎｔ、より特に約５０ｎｔ、特別には約１００ｎｔ、かなり特別には約１５０ｎｔの配列を含むのが好ましい。センスヌクレオチド配列の相補体と１００％の配列同一性を有する連続ヌクレオチドのストレッチの長さはセンスヌクレオチド配列自体の長さより長くなることはできないことが明白である。ここでも、好ましくはギャップの数に、特に短めのアンチセンス配列の場合、最小限とすべきである。更に、このアンチセンス配列は標的配列の相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有することも好ましい。
【００６１】
キメラＤＮＡの転写に由来するＲＮＡ分子はセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の間に配置されたスペーサーヌクレオチド配列を含んで成ってよい。かかるスペーサー配列の非存在下で、このＲＮＡ分子は二本鎖ＲＮＡを、特にセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列が約１０ヌクレオチドより大きく、且つセンス及び／又はアンチセンスヌクレオチドの一部がループを形成するのに用いられ、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での塩基対合及び二本鎖ＲＮＡの形成を可能とするであろう。スペーサー領域に関連する長さの制限や配列の要件は、これらのパラメーターがセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有するＲＮＡ領域の二本鎖ＲＮＡを形成する能力を損わない限り、ないものと予想される。好適な態様において、このスペーサー領域は長さにおいて４〜約２００bpで変動し、しかしながら前述の通り、それはなくてもよい。
【００６２】
好適な態様において、センス及びアンチセンス領域、並びに適宜スペーサー領域により形成されるヘアーピンＲＮＡは人工ヘアーピンＲＮＡである。「人工ヘアーピンＲＮＡ」又は「人工ステムループＲＮＡ構造」とはヘアーピンが天然では起こらないものを意味し、なぜなら上記のセンス及びアンチセンス領域は自然には一のＲＮＡ分子内になく、又はセンス及びアンチセンス領域は標的遺伝子との関係で異種であるスペーサー領域によって隔てられているからである。特にスペーサーのヌクレオチド配列はセンスヌクレオチド配列の終点の５′又は３′の対応の位置において標的配列のヌクレオチド配列と７５％未満の配列同一性を有する。ヘアーピンＲＮＡは、それが通常一体化しているＲＮＡ分子内に含まれていないなら、人工物としても記載できうる。本発明に従い、転写が天然ヌクレオチド配列（それは本来、本明細書に記載の限定に合致する）とのヘアーピンＲＮＡ構造をもたらすキメラＤＮＡを使用することが、このヘアーピンＲＮＡが周囲のＲＮＡ（ヘアーピン構造形成に関与しない）を欠くことを条件に、想倒つくであろう。
【００６３】
ヘアーピンＲＮＡを含んで成るＲＮＡ分子がイントロン配列を更に含まないことが好ましいが、かかるＲＮＡをコードするキメラＤＮＡ遺伝子はその転写領域の中に１又は複数のイントロンを含んで成ってよいことが明らかである。
【００６４】
事実、本発明者は驚くべきことに、ヘアーピンＲＮＡを含んで成るＲＮＡ分子をコードするキメラＤＮＡ遺伝子内、好ましくはスペーサー領域内、且つ好ましくはセンス方向での合体が、標的核酸の発現の抑制の効率を高めることを発見した。効率の増大はサイレンス化が起こる植物の頻度の上昇又は表現型特徴の抑制レベルの上昇として示されうる。特に好適な態様において、イントロンはフラベリア・トリネルビア・ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ２イントロン２と配列が本質的に同一であり、より特にはそれがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列を含んで成る。
【００６５】
標的核酸の表現的発現を抑制するためのアンチセンス又はセンスヌクレオチド配列のいずれかを単独で用いる方法に反して（これは一般にセンス又はアンチセンス分子の投与に依存し、それ故センス及びアンチセンス分子をコードするキメラ遺伝子は比較的強力なプロモーターのコントロール下にある必要がある）、本発明の方法はセンス及びアンチセンス領域の双方を含んで成るＲＮＡの転写的生産を駆動するのにかかる強力なプロモーター領域の存在を頼りとしないことが観察された。換言すれば、プロモーター全域、特に植物発現性プロモーターが本発明のキメラ遺伝子の転写を指令するのに有用である（例えば、Harpsterら、1988）。当業者に公知の通り、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの変異体の存在との関係で、本発明の目的はこのような別のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及び変異体を利用することにより同等に達成されうる。また、その他の植物発現性プロモーター、特に構成プロモーター、例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium)Ｔｉ−又はＲｉ−プラスミドのオパインシンターゼプロモーター、特にノパリンシンターゼプロモーター、又はサブテラニアン・クローバーウィルスプロモーターが類似の効果を得るために用いられる。また、本発明により考慮されるのは、宿主細胞が対応のＲＮＡポリメラーゼをも活性形態で含んで成ることを条件に、単独のサブユニットバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター、例えばＴ７又はＴ３特異的プロモーターのコントロール下にある細胞内での核酸の表現型発現を抑制するキメラ遺伝子である。
【００６６】
本発明の更なる目的は、本発明のキメラ遺伝子を組織特異的又は器官特異的プロモーターのコントロール下に配することにより特定の細胞、特に特定の植物細胞内での核酸の表現型発現を抑制するための方法の提供にある。かかる組織特異的又は器官特異的プロモーターは当業界において周知であり、そして限定することなく種子特異的プロモーター（例えばＷＯ８９／０３８８７）、器官−始原特異的プロモーター（Anら、1996）、幹特異的プロモーター（Kellerら、1988）、葉特異的プロモーター（Hudspethら、1989）、葉肉特異的プロモーター（例えば光誘導性ルビスコ（Rubisco)プロモーター）、根特異的プロモーター（Kellerら、1989）、塊根特異的プロモーター（Keilら、1989）、脈管組織特異的プロモーター（Peleman ら、1989）、おしべ特異的プロモーター（ＷＯ８９／１０３９６、ＷＯ９２／１３９５６）、裂解帯特異的プロモーター（ＷＯ９７／１３８６５）等が挙げられる。
【００６７】
本発明の別の態様において、標的核酸の表現型発現を抑制するためのキメラ遺伝子の発現は、適当な化学誘導因子の適用により、本発明のキメラ遺伝子の転写ＤＮＡ領域の発現が化学化合物により誘導されるプロモーター、例えばヨーロッパ特許公開（「ＥＰ」）０，３３２，１０４に開示の遺伝子プロモーター又はＷＯ９０／０８８２６に開示の遺伝子プロモーターへの作用可能式連結によりコントロールされうるであろう。
【００６８】
真核細胞、特に植物細胞における注目の核酸の表現型発現における類似の抑制は転写可能ＤＮＡをコードするセンス及びアンチセンスＲＮＡを独立の導入遺伝として、好ましくは一の遺伝子座に配されたもの、特に一の対立遺伝子に配されたものとして供与することにより得ることができることが見い出された。
【００６９】
従って、本発明の別の態様において、真核細胞、特に植物細胞において通常発現されることのできる核酸の表現型発現を抑制するための方法であって、一の組換ＤＮＡ上で連結された第一及び第二キメラＤＮＡを、遺伝子導入植物細胞の核ゲノム内に双方のキメラＤＮＡが一緒に組込まれるように導入することを含んで成り；ここで当該第一キメラＤＮＡは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成り：
ａ）植物発現性プロモーター、特に植物発現性プロモーター；
ｂ）前記注目の遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個、好ましくは１５個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできるＤＮＡ領域；及び
ｃ）対応の真核細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域；そして
ここで前記第二キメラＤＮＡは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成り：
ａ）植物発現性プロモーター、特に植物発現性プロモーター；
ｂ）前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも１０個、好ましくは１５個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個、好ましくは１５個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチセンスＲＮＡ分子へと転写されることのできるＤＮＡ領域；並びに
ｃ）対応の植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域；
ここで当該センス及びアンチセンスＲＮＡ分子は相補性である領域間での塩基対合により二本鎖ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。
【００７０】
この方法の様々な構造及び機能特性、例えばセンス、アンチセンス及びスペーサー領域の長さ及び配列の好適な態様は本明細書に記載されている。
【００７１】
当該キメラ遺伝子の転写により生成されるヘアーピン構造を形成できるセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るＲＮＡ分子は標的核酸の表現型発現を抑制するため、特に標的化内因性遺伝子又は標的化導入遺伝子の表現型発現を抑制するために植物細胞に直接導入してもよい。かかるＲＮＡ分子は、例えば、
１．注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列及び当該センスヌクレオチド配列のこの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチドを含んで成るヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子へと転写されることのできるＤＮＡ領域（ここでこのＲＮＡは当該センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間でのヘアーピン構造をもたらしめる塩基対合を介して二本鎖ＲＮＡを形成することができる）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる認識のために適当なプロモーター、例えば限定することなく、Ｔ７−ポリメラーゼ特異的プロモーターのコントロール下にクローニングし；
２．とりわけ適当なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ及び当該ＲＮＡ分子を作製するのに必要な試薬を添加することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行う；そして
３．このＲＮＡ分子を単離する；
ことにより製造できる。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写方法及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ製造のためのその他の方法は当業界において周知であり、そして市販のキットが入手できる。植物細胞へのＲＮＡの直接導入のための方法も当業者に知られ、そして例えば限定することなく、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、等が挙げられる。
【００７３】
細胞内の注目の標的核酸の表現型発現の抑制のためのキメラ遺伝子は一過性式に導入してよく、又は細胞の核ゲノムの中に安定的に組込んでよい。一の態様において、このキメラ遺伝子は真核細胞、特に植物細胞内で複製できるウィルスベクター上に配置する（例えば、ＷＯ９５／３４６６８及びＷＯ９３／０３１６１）。
【００７４】
宿主細胞内の注目の核酸の表現型発現を抑制するためのキメラ遺伝子を含んで成る組換ＤＮＡには、特に宿主細胞のゲノム内への導入遺伝子の安定的な組込みを企画している場合、キメラマーカー遺伝子が付随していてよい。このキメラマーカー遺伝子は注目の宿主細胞内で機能するプロモーター、特に植物発現性プロモーター、好ましくは構成プロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、又は光誘導性プロモーター、例えばルビスコの小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーターに５′末端において作用可能式に連結され、そしてその３′末端において適当な植物転写３′末端形成（formation)及びポリアデニル化シグナルに作用可能式に連結されている。例えば、マーカーＤＮＡは形質転換植物細胞に識別可能な着色を施すタンパク質をコードすることができ（例えばＡ１遺伝子（Mayer ら、1987））、形質転換植物細胞に除草剤耐性力を授けることができ（例えばホスフィノトリシンに対する耐性をコードするｂａｒ遺伝子（ＥＰ  ０，２４２，２４６））、又は形質転換細胞に抗生物質耐性力を授けることができる（例えば、ゲンタマイシンに対する耐性をコードするａａｃ（６′）遺伝子（ＷＯ９４／０１５６０））。
【００７５】
注目の遺伝子の表現型発現を抑制するためのキメラ遺伝子を含んで成る組換ＤＮＡは植物の細胞の核ゲノムの中に安定的に組込むことができる。遺伝子の導入は本発明のキメラ遺伝子を含んで成るディス・アームドＴｉ−プラスミドであるベクターにより実施してよく、そしてアグロバクリウムにより実施される。この形質転換は例えばＥＰ  ０，１１６，７１８に発表された手順を利用して実施できる。
【００７６】
他方、例えば直接遺伝子導入（例えばＥＰ  ０，２３３，２４７に記載）、花粉媒介形質転換（例えば、ＥＰ  ０，２７０，３５６、ＷＯ８５／０１８５６及びＵＳ  ４，６８４，６１１に記載）、植物ＲＮＡウィルス媒介形質転換（例えば、ＥＰ  ０，０６７，５５３及びＵＳ  ４，４０７，９５６に記載）、リポソーム媒介形質転換（例えば、ＵＳ  ４，５３６，４７５に記載）、等の方法を適用することにより、植物細胞を形質転換するのにあらゆるタイプのベクターが利用できる。
【００７７】
その他の方法、例えばFromm ら（1990）及びGordon-Kamm ら（1990）よりトウモロコシについて発表されているマイクロプロジェクチル・ボンバードメントも適当である。単子葉植物、例えば大半のシリアルの細胞は、コンパクトな体細胞胚増殖カルスを形成することのできる傷害及び／もしくは酵素分解化コンパクト体細胞胚増殖組織、又はＷＯ９２／０９６９６に記載の傷害及び／もしくは分解化未熟胚を利用して形質転換することもできる。得られる形質転換植物細胞は慣用の手段で形質転換植物を再生するのに利用できる。
【００７８】
得られる形質転換植物は、同じ特徴を有するより多くの形質転換植物を生産するために、又は本発明の注目の核酸の表現型発現の抑制のためのキメラ遺伝子をその植物の他の品種もしくは近縁の種、又はハイブリド植物に導入するために慣用の生育スキームで利用できる。この形質転換植物から得た種子は本発明のキメラ遺伝子を安定ゲノムインサートとして含む。
【００７９】
本発明の更なる目的は、本明細書に記載の標的核酸の表現型発現の抑制のためのキメラ遺伝子を含んで成る真核細胞、好ましくは植物細胞及び生物（好ましくは植物）の提供にある。
【００８０】
本発明の更なる目的は通常表現的に発現されることのできる注目の核酸を含んで成る植物細胞の提供にあり、それは更に
ｉ．注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５〜１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列；及び
ii．当該センスヌクレオチド配列のこの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５〜１００％の配列同一性を有し、且つ当該センスヌクレオチド配列との結合により二本鎖ＲＮＡを形成することのできる少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列；
を含むヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子を含んで成り、
ここでこの注目の核酸の表現型発現は、このＲＮＡ分子の非存在下での注目の核酸の表現型発現と比べたとき、当該ＲＮＡ分子の存在により有意に抑制される。このＲＮＡ分子はキメラＤＮＡによりコードされうる。特に長さ及び配列を考慮したこのセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の好適な態様は本明細書に記載してある。
【００８１】
本明細書に記載の方法及び手段は大量スクリーニング（ＨＴＳ）方法、真核細胞、特に植物細胞における今までに同定されていない核酸配列の発現に係る表現型の同定もしくは確認のためにも利用できる。
【００８２】
かかる方法は下記の工程を含んで成る：
１．同定されていない又は確認されていない発現機能／表現型を有する注目の核酸配列内の標的配列を選定する。好ましくは、この核酸が複数の推定オープンリーディングフレームを有するなら、この標的配列はこれらのオープンリーディングフレームのうちの一つの少なくとも一部を含んで成るべきである。標的ヌクレオチド配列の長さは約１０ヌクレオチドから、未同定機能を有する注目の核酸の（ヌクレオチド）長さと等しい長さまで様々であってよい。
【００８３】
２．本発明に係るセンスヌクレオチド配列及びアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るＲＮＡ分子を設計する。
【００８４】
３．この標的配列を基準に設計したセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の双方を含んで成るＲＮＡ分子を今まで同定されていない表現型を有するヌクレオチド配列をもつ核酸を含んで成る適当な宿主細胞、特に植物細胞に導入する。このＲＮＡは直接導入してもよく、又は注目の宿主細胞において機能性であるプロモーター、特に植物発現性プロモーター、並びに宿主細胞において機能する適当な３′末端形成及びポリアデニル化シグナルとして機能するＤＮＡ領域、並びにその間にある当該センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るＲＮＡ分子を生成するように転写されうるＤＮＡ領域を含んで成るキメラＤＮＡを介して導入できる。このキメラＤＮＡは一過性式に導入するか、又は核ゲノムの中に組込んでよい。このキメラＤＮＡはウィルスベクター上に載せてもよい（例えば、ＷＯ９５／３４６６８及びＷＯ９３／０３１６１を参照のこと）。
【００８５】
４．適当な方法によりこの表現型を観察する。予測される表現型に応じて、この表現型は単独の細胞において観察又は測定するのに十分でありうるが、（統合した）多細胞レベルを得るように又は遺伝子導入生物、特に遺伝子導入植物を再生するように細胞を培養する必要がある場合もある。
【００８６】
最も簡単な態様において、本発明の方法のために適当である注目の核酸の少なくとも一部に対するセンス及びアンチセンス配列の双方を含んで成るＲＮＡ分子は選定の標的配列を反転リピート方向で有するＤＮＡ領域の２つのコピー（好ましくは、転写終止シグナルを含まず、且つスペーサー配列をコードする短いＤＮＡ領域により隔てられている）を適当なプロモーターのコントロール下でクローニングすることにより得られうる。このキメラＤＮＡを次にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写方法において鋳型ＤＮＡとして用い、宿主細胞の中に導入したＲＮＡ分子を作り出すか、又はキメラＤＮＡ自体を宿主細胞の中に導入する。
【００８７】
本発明の方法及び手段はかくして真核細胞又は生物、特に植物細胞又は植物における核酸の表現型発現を抑制し、シャッター耐性を得る（ＷＯ９７／１３８６５）、改良花色パターンを得る（ＥＰ  ５２２８８０、ＵＳ  ５，２３１，０２０）、線虫類耐性植物を得る（ＷＯ９２／２１７５７、ＷＯ９３／１０２５１、ＷＯ９４／１７１９４）、果実の成熟を遅らす（ＷＯ９１／１６４４０、ＷＯ９１／０５８６５、ＷＯ９１／１６４２６、ＷＯ９２／１７５９６、ＷＯ９３／０７２７５、ＷＯ９２／０４４５６、ＵＳ  ５，５４５，３６６）、雄性不稔を得る（ＷＯ９４／２９４６５、ＷＯ８９／１０３９６、ＷＯ９２／１８６２５）、生物内の不要な（副次的な）代謝物、例えば植物中のグルコシノレート（ＷＯ９７／１６５５９）又はクロロフィル含有量（ＥＰ  ７７９，３６４）の存在を減らす、代謝工学により、例えば炭水化物代謝（ＷＯ９２／１１３７５、ＷＯ９２／１１３７６、ＵＳ  ５，３６５，０１６、ＷＯ９５／０７３５５）もしくは脂質生合成（ＷＯ９４／１８３３７、ＵＳ  ５，５３０，１９２）に関与する特定の遺伝子の発現を抑制することにより真核細胞又は生物において合成された代謝物のプロファイルを改変する、老化を遅らせる（ＷＯ９５／０７９９３）、植物におけるリグニン化を改変する（ＷＯ９３／０５１５９、ＷＯ９３／０５１６０）、綿の繊維質を改変する（ＵＳ  ５，５９７，７１８）、ポリフェノールオキシダーゼを減らすことによりポテトの傷害耐性を強める（ＷＯ９４／０３６０７）、等に利用できる。
【００８８】
本発明の方法は慣用のセンス又はアンチセンスヌクレオチド配列を利用する方法と比べより良い結果及び／又は高い効率に結びつき、そして標的核酸の表現型発現を調節するその他の配列特異性メカニズムが本明細書に記載の二本鎖ＲＮＡ分子の存在に関与及び／又は誘導されうるものと信じられている。
【００８９】
アンチセンス又はセンス方法によるとりわけ植物細胞における導入遺伝子の表現型発現の抑制についての特定の用途は雄性不稔の復活について発表されており、それは雄性不稔ＤＮＡを含んで成る導入遺伝子の導入により得られている（ＷＯ９４／０９１４３、ＷＯ９１／０２０６９）。注目の核酸は雄性不稔ＤＮＡに特異的である。繰り返すが、本発明に記載の方法及び産物は雄性不稔のより効率的な復活の達成のためにこのような方法に適用できる。
【００９０】
本発明の方法及び手段、特にヘアーピンＲＮＡを含んで成り、且つキメラ遺伝子をコードするＲＮＡ分子を包含するそれらは植物、特に種子中の油含有物の組成の改質のために極めて適当であることが実証された。特に好適な植物は油生産のために利用される穀類（ｃｒｏｐ）植物、例えば限定することなくネタネ（ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea)、napus, rapa, deracea, campestris）、トウモロコシ、綿、ピーナッツ、ヒマワリ、ヒマの種子、亜麻、ココナッツ、亜麻に、ダイズである。好適な標的遺伝子はデサチュラーゼ遺伝子、特にΔ１２デサチュラーゼコード遺伝子、例えばＦａｄ２遺伝子によりコードされるもの、特にそのヌクレオチド配列がGenbank Databaseにおいて受託番号ＡＦ１２３４６０（ブラッシカ・カリナタ（Brassica carinata)）、ＡＦ１２０４２８４１（ブラッシカ・ラパ（B. rapa)) 、Ｌ２６２９６（アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana))又はＡ６５１０２（コリルス・アベラナ（Corylus avellana))で見い出せる遺伝子である。当業者は開示されたｆａｄ２遺伝子と相同性である遺伝子を例えばハイブリダイゼーション及び／又はＰＣＲ技術により得ることができることが明白である。
【００９１】
長さ及び配列を特に考慮に入れたセンス及びアンチセンスヌクレオチドの形態についての好適な態様は本明細書に記載してある。また、プロモーター要素を特に考慮に入れたヘアーピン含有ＲＮＡ分子をコードするキメラ遺伝子についての好適な態様も本明細書に記載してある。この用途に関し、プロモーターが種子特異的プロモーターであることが特に好ましい。
【００９２】
好適な態様において、ＲＮＡ分子を構成する人工ヘアーピンＲＮＡはかくしてセンス方向におけるΔ１２デサチュラーゼコードＯＲＦの一部及びアンチセンス方向における類似の部分を、好ましくはスペーサー配列により隔離されて含んで成る。特に好適な態様において、この人工ヘアーピンＲＮＡ（又はそれをコードするキメラ遺伝子）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のヌクレオチド配列を含んで成るか、又は上記のブラッシカｆａｄ２遺伝子をもとに似たようにして構築されたヌクレオチド配列を含んで成る。
【００９３】
好ましくは、人工ヘアーピンＲＮＡをコードするキメラ遺伝子は種子特異的プロモーターのコントロール下、特に本明細書を記載のＦＰＩプロモーターのコントロール下で転写される。
【００９４】
油含有植物におけるΔ１２デサチュラーゼの発現の抑制はオレイン酸の増大並びにリノレン酸及びリノール酸の同時減少につながる。オレイン酸の増大並びにリノレン酸及びリノール酸の同時減少が顕著である油を有する植物の高度な頻度は、一般の同時抑制（cosuppression)構築体を担持する遺伝子導入植物よりも本発明の手段及び方法を利用して認められる。更に、上記の増大及び減少の各々は、一般の同時抑制構築を担持する遺伝子導入植物よりも各々大きい及び小さかった。
【００９５】
本発明の手段及び方法は、かくして破砕及び抽出後の組成が増大したオレイン酸含有量（総脂肪酸組成の％として表示）、特にコントロール植物と比べて３倍上昇したオレイン酸含有量を有する油を含んで成る植物及び種子を得ることが可能である。
【００９６】
本発明の方法及び手段を利用し、オレイン酸含有量が総脂肪酸含有量の９０％を超える油をその種子が含んで成る遺伝子導入ブラッシカ植物が得られうる。
【００９７】
本発明の方法及び手段は真核細胞又は生物、特に植物細胞及び植物においてウィルス耐性、特に極めて強いウィルス耐性を得るために特に適するであろう。植物をそれに対して耐性にすることができるウィルスの非限定的なリストを表１に示す。
【００９８】
本発明の方法及び手段は更に、一般に利用されているコートタンパク質遺伝子又はレプリカーゼ遺伝子の他にウィルス耐性植物を得るために今まで利用されていなかったウィルス遺伝子の利用を可能にする。かかる異なるウィルス遺伝子はウィルス耐性植物を得るための標的核酸配列としてプロテアーゼコード遺伝子（Ｐｒｏ）、ゲノム連鎖タンパク質（Ｖｐｇ）コード遺伝子、細胞質封入体コード遺伝子（ＣＩ）を含む。
【００９９】
本発明は多重遺伝子科に属する遺伝子の表現型発現の抑制のために極めて適切であろう。
【０１００】
本発明の方法及び手段は単子葉植物であろうと双子葉植物であろうと全ての植物の全ての植物細胞における核酸の表現型発現の抑制に適し、特に穀物植物、例えばトウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、植物（例えばチコリー、ブラッシカ植物、レタス、トマト）、タバコ、ポテト及びテンサイ、更には園芸、花卉栽培又は植林において利用される植物にも適する。本発明の手段及び方法は複雑なゲノムを有する植物、例えば倍数性植物に極めて適するであろう。
【０１０１】
本明細書に記載のキメラ遺伝子の転写により生成されるキメラＲＮＡ分子は植物に全身的に広がることができ、それ故本発明のキメラ遺伝子を含んで成る遺伝子導入ストック上にグラフティングした非遺伝子導入つぎ穂の細胞内の核酸の表現型発現を抑制することが可能である（その逆もまた真なりである）。かかる方法は園芸、花卉栽培又は果実の生産において重要でありうる。
【０１０２】
下記の非限定実施例は真核細胞における注目の核酸の表現型発現の抑制のためのキメラ遺伝子の構築及びかかる遺伝子の利用を述べている。実施例に何らかのことわりのない限り、全ての組換ＤＮＡ技術はSambrookら（1989）Molecular Cloning : A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY及びAusubelら（1994）Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1及び2, Current Protocols, USA に記載の標準プロトコールに従って実施した。植物分子研究についての標準の材料及び方法はPlant Molecular Biology Labfax (1993), R.D.D. Croy又はBIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UKに記載されている。
【０１０３】
本明細書全体を通じて、下記の配列について言及している：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：ウィルス耐性を得るため、様々なセンス及びアンチセンス構築体の構築のために利用したＮｉａ遺伝子のポテトウィルスＹフラグメントの配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：実施例１のＧｕｓｄ  ＣｏＰ構築体のコード領域の配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：ジョンソングラス（Johnsongrass）モザイクウィルス由来の修飾５′非翻訳領域（５′ＵＴＲ）の配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：Ｓ７エンハンサーを有するサブテラニアン・クローバーウィルスプロモーターＮｏ．４の配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：サブテラニア・クローバーウィルス二重エンハンサープロモーターＮｏ．４の配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：Δ１２デサチュラーゼ遺伝子発現阻害のためのＣｏＰ構築体の配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：フラベリア・トリネルビア（Flaveria trinervia)ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼイントロンの配列。
【０１０４】
下記のフリーテキストが配列リストの中に含まれている：
<223> fragment of the NIa ORF
<223> Description of Artificial Sequence : coding region of the Gusd C
oP construct
<223> deficient Gus coding region
<223> antisense to the 5' end of the Gus coding region
<223> Description of Artificial Sequence : 5' UTR of Johnson mosaic vi
rus
<223> Description of Artificial Sequence : subterannean clover virus S
4 promoter with S7 enhancer
<223> Description of Artificial Sequence : subteranean clover virus pr
omoter S4 with S4 enhancer
<223> Description of Artificial Sequence : coding sequence of the desa
turase CoP construct
<223> corresponding to the 5' end of the delta12-desaturase (fad2) cod
ing region, in sense orientation
<223> corresponding to the 5' end of the delta12-desaturase (fad2) cod
ing region, in anti sense orientation
<223> Description of Artificial Sequence : intron 2 of the Flaveria tr
inervia puryvate orthophosphate dikinase
【０１０５】
以下の実施例により本発明の好適な態様をより詳しく説明するが、それらは本発明を限定するものではない。
【０１０６】
実施例１
実験手順
遺伝子構築
キメラ遺伝子を作るのに標準の遺伝子クローニング方法（Sambrookら、1989）を利用した。使用した構築体の模式図を図１Ａ及び１Ｂに示す。
【０１０７】
このような構築体の成分は以下の通りとした：
*Ｃａｂｂ−ＪＩ単離体（３５Ｓ）由来のカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ
プロモーター（Harpsterら、1988)
*オクトパインシンターゼターミネータ（ｏｃｓ−ｔ）(MacDonaldら、1991）
*サブテラニアン・クローバーウィルスプロモーターＮｏ．４（Ｓ４）（ＷＯ９
６０６９３２）
*サブテラニアン・クローバーウィルスターミネーターＮｏ．４（Ｓ４ｔ）（Ｗ
Ｏ９６０６９３２）
*サブテラニアン・クローバーウィルス二重エンハンサープロモーターＮｏ．４
（Ｓ４Ｓ４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
*サブテラニアン・クローバーウィルスプロモーターＮｏ．４とＳ７エンハンサ
ー（Ｓ７Ｓ４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
*メイズ・ユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ）（Christensen and Quail, 1996)
*アグロバクテリウム腫瘍形態１遺伝子ターミネーター（ｔｍ１′）（Zheng ら
、1991）
*ポテトウィルスＹのオーストラリア株のＮｉａ遺伝子（Ｎｉａ）（ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：１）
*機能不全β−グルクロニダーゼオープンリーディングフレームコードＤＮＡ（
Ｇｕｓｄ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１５８１
）
*ジョンソングラス・モザイクウィルス由来の修飾５′非翻訳領域（５′ＵＴＲ
）（ＪＧＭＶ５′）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
【０１０８】
これはＡＴＧ開始コドンにおいてのＮｃｏＩ部位の挿入、それに続くフレーム内の３つの停止コドン、及びＰｓｔＩ部位（図１Ａの構築体４及び５のようにイントロンの挿入のため）を含む。図１Ａのベクター構築体２及び６において、ＧｕｓｄオープンリーディングフレームをＮｃｏＩ部位に挿入し、停止コドンを除く。図１Ａのその全の構築体全てにおいて、それはＰｓｔＩ部位の下流に挿入する。
*Wongら（1997）により改良されたヒマ種子カタラーゼイントロン（Ohtaら、19
90）（「intron」）
【０１０９】
キメラ遺伝子は図１Ａ又は図１Ｂは模式的に示すように様々な要素を作用可能式に組立て、そして得られるキメラ遺伝子をＴ−ＤＮＡベクターｐＡＲＴ２７及びｐＡＲＴ７ベクター（Gleave, 1992）の中に左Ｔ−ＤＮＡボーターとキメラ植物発現性ｎｅｏ遺伝子との間に挿入することにより構築した。
【０１１０】
機能不全β−グルクロニダーゼオープンリーディングフレーム（ＧＵＳｄ）をコードするＤＮＡはｇｕｓコード領域から２つのＥｃｏＲＶ制限部位の間にある配列を除くことにより得た。β−グルクロニダーゼ遺伝子に対するセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の双方を含んで成るＲＮＡ分子をコードするキメラ遺伝子の構築のため、配列をＧｕｓｄ遺伝子に加えて５′末端を５５８塩基にわたり塩基対合させ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す配列を得た。この配列をメイズユビキチンプロモーターとｔｍ１′ターミネーターとの間にクローニングし、そしてＴ−ＤＮＡベクターの中に挿入した。
【０１１１】
第一及び第二キメラウィルスを含んで成るＴ−ＤＮＡベクターを構築した。この第一キメラ遺伝子は以下から成る：
１．ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列（これは次のものに連結されている）
２．センス方向における、
・Ｖｐｇタンパク質（例えばGenbank 寄託番号Ｎｏ．ＺＺ９５２６ヌクレオチド１０１３〜ヌクレオチド１５８３参照）又は
・ＣＩタンパク質の一部（例えばGenbank 寄託番号Ｎｏ．Ｍ９５４９１ヌクレオチド３６８８〜ヌクレオチド４２１５参照）又は
・プロテアーゼ（Ｐｒｏ）（例えばＥＭＢＬ寄託番号Ｎｏ．Ｄ００４４１ヌクレオチド５７１４〜ヌクレオチド７００９）
のいずれかをコードするＰＶＹ由来のヌクレオチド配列、それに続く
３．上記のサブテラニアン・クローバーモザイクウィルス由来のＳ４ターミネーター。
【０１１２】
第二キメラ遺伝子は以下から構成されている：
１．上記のＳ４プロモーター（これは次のものと結合している）
２．アンチセンス方向において、
・Ｖｐｇタンパク質、又は
・ＣＩタンパク質、又は
・プロテアーゼ
のいずれかをコードするＰＶＹ由来のヌクレオチド配列、それに続く
３．上記のオクトパインシンターゼターミネーター。
【０１１３】
一のＴ−ＤＮＡベクター内のセンス及びアンチセンス配列は同ＰＶＹコード領域に由来する。
【０１１４】
また、Ｔ−ＤＮＡベクターを、油中の脂肪酸組成を改変するために構築した（図２参照）。それは以下を含んで成る：
１．Stalbergらに記載の−３０９〜＋１の間の配列を含むＦＰ１プロモーター（トランケーション種子特異的ナビンプロモーター）（これは次のものに連結されている）
２．６２３bpのスペーサー配列と連結した、センス方向及びアンチセンス方向におけるアラビドプシス・タリアナ（Ｆａｄ２）由来のΔ１２デサチュラーゼをコードするＯＲＦ内に５′側に配置された４８０bpを含んで成るＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のヌクレオチド配列；それに続く
３．ノパリンシンターゼ遺伝子由来のターミネーター。
【０１１５】
更に、Ｔ−ＤＮＡベクターを、ＣｏＰ構築体をコードするキメラ遺伝子内でのイントロン配列の存在の影響を検討するために構築した。従って、以下を含んで成る構築体を作製した：
１．ＣａｍＶ３５Ｓプロモーター、それに続く
２．センス方向におけるＰＶＹ（上記参照）由来のプロテアーゼをコードするＯＲＦ；
３．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列（フラベリア・トリネルビアピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼイントロン２をコード）；
４．アンチセンス方向におけるＰＶＹ由来のプロテアーゼをコードするＯＲＦ；及び
５．オクトパインシンターゼ遺伝子ターミネーター。
【０１１６】
植物形質転換
ニコチアナ・タバカム（Ｗ３８）組織をLandsman ら（1988）に本質的に記載の通りにして形質転換し、そして完全植物へと再生した。イネ（オリザ・サチバ（Oryza sativa))をWangら（1997）に本質的に記載の通りにして形質転換した。
【０１１７】
イネ超形質転換
ＧＵＳ及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）活性を発現するイネ植物由来の成熟胚を成熟種子から取り出し、そしてカルス誘導培地の上に７日間載せた。この培養物からカルスを回収し、様々なバイナリーベクターを含むアグロバクテアと２日間インキュベーションし、次いでヒグロマイシン、ビアラフォス（bialaphos)及びTimentin（商標）を含むカルス形成培地上に載せた。それから４週間の間でヒグロマイシン及びビアラフォス耐性カルスが発育した。これらのカルス系をヒグロマイシン及びビアラフォス含有培地上に更に２ヶ月維持し、それからＧＵＳ活性についてアッセイした。
【０１１８】
ＧＵＳアッセイ
イネのカルスをJefferson ら（1987）は本質的に記載してある通りにして組織化学染料Ｘ−グルクロニド又は蛍光色素基質４−メチル−ウンベリフェロングルクロニド（ＭＵＧ）を利用してＧＵＳ活性について試験した。
【０１１９】
実施例１．組込まれたβ−グルクロニダーゼ遺伝子の表現型発現の抑制のためのアンチセンスのみ、センスのみ、又はセンス及びアンチセンス（相補性ペアー（ＣｏＰ））の双方を含んで成るキメラ遺伝子の比較
単一の導入遺伝子に由来するβ−グルコニダーゼ（ＧＵＳ）（及びｈｐｈ遺伝子由来のヒグロマイシン耐性）を発現する遺伝子導入イネ組織（系Ｖ１０−２８及びＶ１０−６７）をホスフィノトリシン耐性を授けるｂａｒ遺伝子並びに不活化（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）ＧＵＳ（ＧＵＳｄ）遺伝子由来の様々なセンス、アンチセンス及びＣｏＰ構築体（図１Ａ参照）を含むベクターを用いて超形質転換した。この超形質転換組織をヒグロマイシン及びビアラフォス選択培地上で３週間維持し、次いで、ＧＵＳ活性についてアッセイした。不活性ＧＵＳ遺伝子を使用したのは、この遺伝子由来の発現が内因性ＧＵＳ活性と重ならないようにするためである。
【０１２０】
表２の中の数値は４５５nmでの吸収、３６５nmでの励起、２００μｌの反応容量中で１．５μｇの総タンパク質により測定したＭＵの生成速度を示す。この速度は３７℃で３０分かけて測定した。非遺伝子導入イネカルスについての測定値は０．１６２であった。導入構築体の説明に続くかっこ内の数値は図１Ａに言及してある。
【０１２１】
結果（表２）はＧＵＳｄ遺伝子のないｂａｒ遺伝子を含むバイナリーベクターによる超形質転換が内因性ＧＵＳ活性に対してサイレンシング効果を有さないことを示した。イントロン又は早期停止コドンを有する又は有しないセンス又はアンチセンス方向におけるＧＵＳｄによる超形質転換は内因性ＧＵＳ活性のある程度の抑制（分析したカルスの約２５％において）を示した（表２の最後の２列を参照のこと。それは２．００未満のＭＵＧアッセイ測定値を有する分析カルスの％を示す）。しかしながら、ＣｏＰ構築体による超形質転換は分析したカルスの約７５〜１００％において、内因性ＧＵＳの活性の低下を供した。このＣｏＰ構築体は生成されるｍＲＮＡの３′末端が転写体の５′末端との二量体を形成し、「パンハンドル」構造を供するように設計した。
【０１２２】
これらのデーターは相補性ベアーが自己アニーリング転写体を利用して作ることができ、この設計が慣用のセンス又はアンチセンス構築体よりもはるかに効率的であり、そしてこのアプローチが植物細胞中に存在する遺伝子の表現型発現を抑制するのに利用できうることを示した。
【０１２３】
【表２】
0005015373.tif 000003
【０１２４】
実施例２．遺伝子導入植物においてウィルス耐性を得るためにアンチセンス遺伝子のみ、センス遺伝子のみ、又は両遺伝子を同時に含んで成るキメラ遺伝子を利用する効率の比較
ＰＶＹプロテアーゼコード配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をセンス方向、アンチセンス方向及び相補性ペアー（ＣｏＰ）方向において用いて遺伝子構築体を作った。ここでそのＴ−ＤＮＡはセンス及びアンチセンスキメラ遺伝子の双方をそれら自身のプロモーターのコントロール下でそれぞれ含んで成る。３つのアレンジメント全てにおいて、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを使用した。５種類のバージョンのＣｏＰ構築体を作り、それにおいて第二のプロモーターはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｓ４プロモーター、二重Ｓ４プロモーター、Ｓ７増強Ｓ４プロモーター、又は脈管特異的ｒｏＩＣプロモーターである（図１Ｂ参照）。
【０１２５】
これらの構築体をタバコに形質転換し（アグロバクテリウム媒介ＤＮＡ移入を介し）、そして約２５の独立の形質転換植物が一のキメラ遺伝子構築体当りで回収された。この遺伝子導入植物を土壌に移し、そして温室の中で維持した。土壌に移してから約１ヶ月経過後、それらの植物に標準の適用方法を利用してポテトウィルスＹを人的に接種した。２及び４週間後、植物をウィルス症状について採点した。これらの結果（表３）は１ヶ月後、センス遺伝子だけを含んで成る２７の植物のうち２つ及びアンチセンス遺伝子だけを含んで成る２５の植物のうちの１つが症状を全く示さないことを示した。
【０１２６】
対照的に、センス及びアンチセンス遺伝子の双方を含む２４のうちの１１（３５Ｓ−Ｎｉａ／Ｓ４−アンチセンスＮｉａ構築体）、２５のうちの７（３５Ｓ−Ｎｉａ／ＲｏｌＣ−アンチセンスＮｉａ構築体）、２７のうちの１０（３５Ｓ−Ｎｉａ／３５Ｃ−アンチセンスＮｉａ）、２６のうちの７（３５Ｓ−Ｎｉａ／Ｓ４Ｓ４−アンチセンスＮｉａ構築体）及び２５のうちの７（３５Ｓ−Ｎｉａ／Ｓ７Ｓ４−アンチセンスＮｉａの構築体）植物が各々症状を示さなかった。症状を示さない植物はＰＶＹに対する強力な耐性を示すと考える。それらは更に２ヶ月の追跡にわたり症状を示さないであり続けた（表３では強力耐性（ＥＲ）として示す）。いくつかのその他の植物、特にＣｏＰ構築体を含むものは症状の遅延及び抑制を示した。これらは接種して２週間後に症状を示さなかったが、４週間後には一部の植物において若干のささいな損傷を示した。これらの植物は非遺伝子導入又は感受性タバコよりもＰＶＹによる影響をはるかに受けにくく、そして耐性として採点した（表３ではＥＲと表示）。
【０１２７】
【表３】
0005015373.tif 000004
【０１２８】
データーはセンス又はアンチセンス構築のいずれかのみを利用するものよりもはるかに高い頻度の強力な耐性及び耐性を有する遺伝子導入植物をもたらしたことを示す。
【０１２９】
次に、このウィルス耐性遺伝子導入植物における導入遺伝子のコピー数を決定した。従って、強力な耐性及び耐性を示す全ての遺伝子導入植物からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをサザン分析を利用して遺伝子コピー数を調べた。データー（表４）は強力な耐性を示すＣｏＰ植物のいくつかのゲノム、特に３５Ｓ−Ｎｉａ／Ｓ４−アンチセンスＮｉａ植物のゲノムが遺伝子構築体の単一のコピーだけを含むことを示した。
【０１３０】
【表４】
0005015373.tif 000005
【０１３１】
実施例３．実施例２由来の植物における強力耐性の遺伝性
実施例２由来の植物を自己受粉させ、そしてそれらの種子を集めた。強力な耐性並びに低コピー数のＣｏＰ構築体３５Ｓ−Ｎｉａ／Ｓ４−アンチセンスＮｉａ及び３５Ｓ−Ｎｉａ／３５Ｓ−アンチセンスＮｉａを示す植物由来の種子、並びに強力耐性を示すセンス及びアンチセンス植物由来の種子を温室の中で発芽及び成長させた。２つの感受性ＣｏＰ系、２つの感受性センス遺伝子のみの系、及び２つの感受性アンチセンス遺伝子のみの系から集めた種子からも植物を成育させた。各系由来の２０の植物をサイズ及び発育段階の全体的な均質性に基づき選別し、個別の鉢に植え、１週間かけて回復させ、次いでＰＶＹを接種した。これらの植物を接種して２，４及び７週間後にウィルスについて評価した。結果（表５）は、１又は２の遺伝子コピーを含む３５Ｓ−Ｎｉａ／Ｓ４−アンチセンスＮｉａ及び３５Ｓ−Ｎｉａ／３５Ｓ−アンチセンスＮｉａの８の植物系全てが約３：１の強力耐性：感受性の分離比を示すことを示した。単一アンチセンス遺伝子のみの系の子孫はＴ0において所定の強力な耐性を有し、そして一の遺伝子コピーを含む強力耐性センス植物の子孫は異常な分離比（２：１８；ＥＲ：感受性）を示した。強力な耐性を示し、且つ６の遺伝子コピーを含む一のセンス植物の子孫は約３：１の比（ＥＲ：感受性）を示した。感受性Ｔ0植物細胞の全ての子孫がＰＶＹに対する完全な感受性を示した。
【０１３２】
これらのデーターはＣｏＰ構築体由来の強力な耐性がメンデルの法則で遺伝される耐性の安定な発現を供することを示す。このことは、これらの系において、ＰＶＹ  ＣｏＰ遺伝子座は強力耐性を供与するのに〜１００％有効であり、一方アンチセンス系、及び２つのセンス系のうちの一方における導入遺伝子座は強力耐性を供与するのにある程度しか有効でないことも示す。
【０１３３】
【表５】
0005015373.tif 000006
【０１３４】
実施例４．遺伝子導入植物における種々の遺伝子座における種々の成分（センス遺伝子及びアンチセンス遺伝子）による強力ウィルス耐性遺伝子導入タバコ
センス導入遺伝子（これは孤立の導入遺伝子コピーを含む；表６参照）を含むＰＶＹ感受性植物をアンチセンス導入遺伝子（これはサザン分析によりコピー数についても分析済み；表６参照）を含むＰＶＹ感受性植物と交配させた。一回交配当り得られる子孫２０個を温室の中で繁殖させ、次いでＰＶＹを接種し、そして実施例２に記載の通りにしてウィルス感染について評価した。交配（孤立遺伝子／座・含有植物間）由来の子孫は下記の比にあると予測されるであろう：１／４センス遺伝子のみ、１／４のアンチセンス遺伝子のみ、１／４のセンス及びアンチセンス遺伝子双方を含んで成るもの、及び１／４の遺伝子を全く含まないもの。結果（表４）は、予測通り、有効な交配全てに由来する子孫が所定の比率で強力な耐性を示し、一方で自己センス又は自己アンチセンス植物由来の子孫はいずれも強力な耐性を示さなかった。強力耐性を示さない一の交配体は８コピーのアンチセンス遺伝子を含む親植物アンチセンス２（Ａｓ２）に由来した。センス１（Ｓ１）（雄性）×アンチセンス１（Ａｓ１）（雌性）及びセンス３（Ｓ３）（雌性）×アンチセンス４（Ａｓ４）（雄性）の交配由来の２０個の子孫植物全てをサザン分析により調べた。結果は、双方の交配において、強力な耐性（又は一のケースでは耐性）を示す植物はセンス及びアンチセンス遺伝子の双方を含み、一方で導入遺伝子なし（無后）又はセンスもしくはアンチセンス遺伝子のみを有する植物は全てＰＶＹに対して感受性であることを示した。植物と強力耐性との間での相補性ペアー（センスとアンチセンス遺伝子）の存在の絶対的な関係を確認するため、強力耐性を示す子孫植物全てをサザンブロットにより分析した。これらの結果は全ての強力耐性又は耐性植物がセンス及びアンチセンス遺伝子の双方を含むことを示した。
【０１３５】
これらのデータは相補性ペアーが、たとえセンス及びアンチセンス遺伝子をコードする遺伝子がゲノムの中に一緒に配置されていなくても、耐性又は強力耐性を供することを示した。この「相補性ペアー現象」は単に導入遺伝子量の増大になるものではなく、なぜなら自己子孫の１／４がホモ接合性であり、それ故二重の遺伝子量を有しても感受性であるからである。
【０１３６】
【表６】
0005015373.tif 000007
【０１３７】
強力な耐性植物は７週間後もＰＶＹ感染の症状を示さなかった。耐性植物はＰＶＹ感染して７週間後に非常にわずかな損傷を示した。Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４及びＳ５は３５Ｓ−センスＮｉａ遺伝子構築体を含んで成るＰＶＹ感受性遺伝子導入タバコ植物であり、全て１コピーの導入遺伝子が組込まれたものである。
【０１３８】
Ａｓ１，Ａｓ２，Ａｓ４及びＡｓ５は各々１．８，２及び１コピーの導入遺伝子が組込まれた３５Ｓ−アンチセンスＮｉａ遺伝子構築体を含んで成るＰＶＹ感受性遺伝子導入タバコ植物である。
【０１３９】
実施例５．強力な耐性遺伝子の獲得における標的核酸配列としての種々のウィルス遺伝子の利用の評価
本明細書に記載のＰＶＹ由来のプロテアーゼ、Ｖｐｇ又はＣｌタンパク質をコードする領域に由来する配列を基礎とする第一及び第二キメラウィルス耐性遺伝子を含んで成るＴ−ＤＮＡベクターを、後にＰＶＹを負荷せしめる形質転換化タバコ植物を得るために用いた。その結果を以下の表にまとめる：
【０１４０】
【表７】
0005015373.tif 000008
【０１４１】
実施例６．イントロン塩強化サイレンシング
ＰＶＹ由来のＯＲＦをコードするプロテアーゼ（本明細書に記載）に対応するセンス及びアンチセンス配列間にセンス方向又はアンチセンス方向のいずれかにおいてイントロン（フラベリア・トリネルビアピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼイントロン２）の挿入されたＣｏＰ構築体をコードするキメラ遺伝子を含んで成るＴ−ＤＮＡベクターを、その後にＰＶＹを負荷せしめる形質転換タバコ植物を得るために用いた。その結果を以下の表にまとめる：
【０１４２】
【表８】
0005015373.tif 000009
【０１４３】
実施例７．アラビドプシスにおけるＣｏＰ構築体を利用する油プロファイルの改変
本明細書に記載の破砕種子から抽出した油中の脂肪酸組成を改良するためのＴ−ＤＮＡベクターを、アラビドプシス・タリアナにおけるΔ１２デサチュラーゼ遺伝子（Ｆａｄ１２）の発現を抑制するためのＣｏＰ構築体をコードするキメラ遺伝子（図２Ａ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６参照）を導入するために用いた。
【０１４４】
効率性の比較のため、遺伝子導入アラビドプシス植物を作った。それにおいて、Ｆａｄ２遺伝子の発現はアラビドプシス・タリアナ中のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子（Ｆａｄ１２）由来の完全ＯＲＦに結合したＦＰ１種子特異的プロモーター及びノパリンシンターゼプロモーター（図２Ｂ参照）を含んで成るわかり易い同時抑制構築体により抑制されている。
【０１４５】
コントロール植物として、無関係のＴ−ＤＮＡ構築体により形質転換された遺伝子導入アラビドプシスを利用した。
【０１４６】
種子を回収し、破砕し、抽出し、そして油中の主要脂肪酸の％を当業界公知の方法により決定した。２回の測定の平均値である結果を表９にまとめる。
【０１４７】
【表９】
0005015373.tif 000010
【０１４８】
【表１０】
0005015373.tif 000011
【０１４９】
【表１１】
0005015373.tif 000012
【０１５０】
【表１２】
0005015373.tif 000013
【０１５１】
結果の分析は、ＣｏＰ構築体を担持する遺伝子導入植物（表中、「ヘアーピンＸ．Ｘ」と表示）は、オレイン酸の増大並びにリノレン酸及びリノール酸の同時減少が同時抑制構築体を担持する遺伝子導入植物におけるものよりも有意である植物を高頻度で有した。更に、上記の増大、上記の減少のそれぞれ絶対レベルは、同時抑制構築体を担持する遺伝子導入植物よりもそれぞれ大きい及び小さかった。
【０１５２】
実施例７．ブラッシカにおけるＣｏＰ構築体を利用する油プロファイルの改変
実施例６に記載のＣｏＰ構築体をコードするキメラ遺伝子を担持するＴ−ＤＮＡベクターをブラッシカナタネ種子に導入した。遺伝子導入ブラッシカ種から回収した種子を破砕し、そして油抽出し、そして油中の脂肪酸の組成を分析した。
【０１５３】
ＣｏＰ構築体を担持する遺伝子導入ブラッシカ種由来の油は有意に増大したオレイン酸含有量及び減少したリノレン酸及びリノール酸含有量を有した。実施例６に記載のものと類似するが、Δ１２デサチュラーゼコードＯＲＦに対応するセンス及びアンチセンス領域の配列がブラッシカ種由来の相同性ＯＲＦを基礎とするＣｏＰ構築体をコードするキメラ遺伝子を担持するＴ−ＤＮＡベクターを構築し、そしてブラッシカナタネ種子を導入した。
【０１５４】
アラビドプシス由来のΔ１２デサチュラーゼコードＯＲＦに相同性であるブラッシカ種ＯＲＦの配列はGenbank データーベースから受託番号ＡＦ０４２８４１及びＡＦ１２４３６０で入手できる。
【０１５５】
遺伝子導入ブラッシカ種から回収した種子を破砕し、そして油抽出し、そして油中の脂肪酸の組成を分析した。ＣｏＰ構築体を担持する遺伝子導入ブラッシカ由来の油は有意に増大したオレイン酸含有量並びに減少したリノール酸及びリノレン酸含有量を有した。
【０１５６】
実施例８．亜麻における内因性さび病耐性遺伝子の抑制
内因性さび病耐性遺伝子の抑制のためのＣｏＰ構築体は
１．ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（次のものに作用可能式に連結）
２．センス方向における亜麻由来の内因性さび病耐性遺伝子（ｎ）の一部（長さ約１５００bp）（次のものにライゲーションされている）
３．アンチセンス方向における亜麻由来の内因性さび病耐性遺伝子の類似の部（長さ約１４５０bp）、かくしてスペーサー配列抜きで完全な反転リピートが作られ、各リピートは長さ約１４５０bpである；それに続く
４．ｎｏｓターミネーター
から成る。
【０１５７】
わかり易いアンチセンス構築体を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びｎｏｓターミネーター間に挿入された上記のｓｕｂ３に記載したものと類似のフラグメントを用いて作った。
【０１５８】
ｎ遺伝子（これは亜麻の株にさび病に対する耐性を供する）を含む亜麻植物をこれらのＣｏＰ及びアンチセンス構築体により形質転換した抑制が生じたら、植物はさびに対して感受性な株となる。この構築体は何ら効果を有さず、形質転換植物はさびに耐性な株であり続けた。
【０１５９】
結果
ｎｇｃ−ｂセンス／アンチセンス                ７のうち３が抑制
ｎｇｃ−ｂアンチセンス                        １２のうち０が抑制
【０１６０】
【表１３】
0005015373.tif 000014
【表１４】
0005015373.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  ウィルス耐性の獲得及び遺伝子導入Ｇｕｓ遺伝子の表現型発現を抑制するために用いる種々のセンス及びアンチセンス構築体並びにいわゆるＣｏＰ（相補性ペアー）構築体の模式図。
【図１Ｂ】  ウィルス耐性の獲得及び遺伝子導入Ｇｕｓ遺伝子の表現型発現を抑制するために用いる種々のセンス及びアンチセンス構築体並びにいわゆるＣｏＰ（相補性ペアー）構築体の模式図。
【図２Ａ】  アラビドプシスにおけるΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の表現型発現を抑制するために用いたいわゆるパンハンドル構築体及びＣｏＰ構築体の模式図（Ｎｏｓ  Ｐｒｏ：ノパリンシンターゼ遺伝子プロモーター；ｎｐｔIIネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード領域；Ｎｏｓ  ｔｅｒｍ：ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター；ＦＰ１：トランケーション化種子特異的ナピンプロモーター；４８０bp：センス方向におけるアラビドプシス・タリアナのＦａｄ２遺伝子の５′末端；６２３bp：スペーサー；４８０bp：アンチセンス方向におけるアラビドプシス・タリアナのＦａｄ２遺伝子の５′末端。
【図２Ｂ】  アラビドプシス・タリアナにおけるΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の表現型発現を抑制するための一般の同時抑制構築体の模式図。
【配列表】
0005015373.tif 000016
0005015373.tif 000017
0005015373.tif 000018
0005015373.tif 000019
0005015373.tif 000020
0005015373.tif 000021
【図１Ａ】
0005015373.tif 000022
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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