(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における主大脳動脈の閉塞によって引き起こされる局所虚血性発作の治療用組成物であって、動脈閉塞を除去せずに、大脳血流を増すか、もしくは梗塞のサイズを減じるために有効な量の抗−ＣＤ１８抗体を含み、局所虚血性発作の始まりから１５分ないし２０時間の間に哺乳類に投与されることを特徴とする、局所虚血性発作の治療用組成物。
【請求項２】
哺乳類において大脳血流を増し、かつ梗塞のサイズを減じる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
抗−ＣＤ１８抗体が抗体断片である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
抗−ＣＤ１８抗体断片がＦ（ａｂ’）2である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
抗−ＣＤ１８抗体がヒト化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
ボーラス投与のための、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
静脈投与のための、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
持続的注入のための、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
局所虚血性発作の始まりから４５分ないし５時間の間に哺乳類に投与されることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
抗−ＣＤ１８抗体がヒト化Ｈ５２抗体である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
Ｈ５２抗体がＦ（ａｂ’）2である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
抗−ＣＤ１８抗体断片がサルベージ受容体結合性エピトープに融合されている、請求項３記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳類がヒトである、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
容器と、該容器上のラベルと、該容器内に収容される請求項１ないし１３のいずれか一項記載の組成物とを有してなり、該容器上のラベルが、発作を治療するために該組成物を使用できることを示す、製品。
【請求項１５】
さらに、抗−ＣＤ１８抗体を哺乳類に投与して、局所虚血性発作における大脳血流を増すか、もしくは梗塞のサイズを減じることに関する使用説明書を有する、請求項１４記載の製品。
【請求項１６】
第一の容器と、該容器上のラベルと、該容器内に収容される請求項１ないし１３のいずれか一項記載の組成物と；
医薬上許容される緩衝液を含む第二の容器と；
抗−ＣＤ１８抗体を用いて局所虚血性発作における大脳血流を増すか、もしくは梗塞のサイズを減じることに関する使用説明書とを有してなり；該容器上のラベルが、発作を治療するために該組成物を使用できることを示す、キット。
【請求項１７】
動脈閉塞の除去の不存在下で、主大脳動脈の閉塞によって引き起こされる局所虚血性発作を治療するための医薬の製造品における抗−ＣＤ１８抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、国立衛生研究所によって認可された交付ＮＳ３１００８およびＮＳ２８７０８の下、米国政府の支持を得て開発された。米国政府が本発明に関する一定の権利を有する。
発明の背景
発明の分野
本発明は概して、発作を治療するための抗−ＣＤ１８抗体の使用に関し、詳しくは、大脳血流を増し、かつ／もしくは梗塞のサイズを減じることにより、主大脳動脈の閉塞によって引き起こされる局所虚血性発作の臨床上の成果を改善するための抗−ＣＤ１８抗体の使用に関する。
関連技術の説明
発作とは、血管の疾病によって起こる急性脳損傷に関する一般用語である。これは、米国において毎年、約５０万人の人々が発作から死に至ったり、発作によって永久に障害を持つようになっている社会に重大な問題を提起している。発作は、出血性発作（正常な血管の外部へ血液が漏出することによって起こる）および虚血性発作（血液供給がなされないことによる大脳虚血）の２つの主要なカテゴリーに大別され、本願は主に後者に関するものである。
虚血性発作の３つの主な機構としては、血栓、塞栓および全身性低灌流（結果として虚血や低酸素症を伴う）がある。これら各々のタイプの発作において、そこへの血液供給が不足する結果として壊死する脳領域を梗塞部と呼ぶ。一般的に、大脳動脈壁に形成された血栓によって起こる大脳動脈の閉塞を脳血栓と呼ぶ。脳塞栓では、大脳動脈を遮断する閉塞作用物質が循環の下流に生じる（例えば、塞栓が心臓から大脳動脈に送られる）。発作が血栓によって起こるのか、塞栓によって起こるのか区別するのは困難なので、これら両タイプの発作を含めるために血栓塞栓という用語が用いられる。全身性低灌流は血液レベルの低下、ヘマトクリットの減少、低血圧もしくは心臓が適切に血液を送り出せないことの結果として起こる。
発作が２４時間内継続し、患者が完全に回復した場合、その患者は一過性脳虚血性発作（ＴＩＡ）を受けたと言う。ＴＩＡの症状には、言語、視覚、知覚または運動の一時的な障害がある。ＴＩＡは全規模発作の前兆であると考えられることが多いので、ＴＩＡを患っている患者は例えば、抗血液凝固薬（例えば、クマリンやヘパリン）もしくは抗血小板薬（アスピリンおよびチクロピジンのごとき）を用いた予防的発作治療の候補となる。
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）のごとき血栓薬が血栓塞栓性発作の治療で用いられてきた。これらの分子は虚血を引き起こす血栓を溶解することにより作用する。虚血領域に少なくとも幾分か大脳血流を回復させ、神経活性を持続させるためには、かかる薬剤を急性発作の後できる限り速やかに投じると（好ましくは３時間以内）、最も有用であると考えられている。かかる薬剤は出血を悪化させるという点で、出血性発作におけるそれらの使用は指示されない。
白血球上に存在する接着性糖蛋白質のファミリーは、インテグリンファミリーと呼ばれる。このインテグリンファミリーにはＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）およびｐ１５０，９５（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）が含まれる。最近、このファミリーのさらなるメンバーであるＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８が報告されている（Danilenkoら，J. Immunol. 155:35-44(1995)）。これらヘテロ二量体はそれぞれ特異的なα鎖（ＣＤ１１ａ、ｂ、ｃまたはｄ）および非変異β鎖（ＣＤ１８）を持つ。白血球上に位置するＣＤ１８インテグリンは、導管内皮細胞や他の細胞で発現し、それによって白血球の接着および内皮細胞を渡る移動を仲介する分子内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）に結合し得る。
ＣＤ１１ａおよびＣＤ１８は、虚血性発作もしくはＴＬＡを受けた患者由来の白血球中でアップレギュレーションされることが着目されて来た（Kimら，J. Neurolog. Sci. 128(1):45-50(1995)）。Schroeterら，J. Neurolmmunology 55(2):195-203(1994)は、ラットで中大脳動脈（ＭＣＡ）の恒常的な閉塞によって引き起こされる大脳虚血に続き、血管および白血球上でＩＣＡＭ−１の発現が増すことを見出した。
ラットでは、一過性ＭＣＡ閉塞に続く脳損傷に関する細胞接着性分子の役割が研究されている（Matsuoら，Brain Research 656:344-352(1994)）。Matsuoらは右側ＭＣＡの源泉を閉塞するために、ナイロン糸を外頸動脈（ＥＣＡ）の管腔から右内頸動脈（ＩＣＡ）の管腔に挿入した。該閉塞は一時的であり、１時間後このナイロン糸を除去して右総頸動脈（ＣＣＡ）を介する虚血領域を完全に再灌流させた。抗−ＣＤ１１ａ（ＷＴ１）、抗−ＣＤ１８（ＷＴ３）および抗−ＩＣＡＭ−１（ＩＡ２９）抗体を虚血前と再灌流後直ちに投与した。これらの研究者らは、細胞接着性分子に対する個々の抗体で処理することにより、再灌流に続いて浮腫の形成、梗塞のサイズおよび好中球の集積が減少することを見出した。
他の研究者らは、かかる一過性発作モデルにおける細胞接着性分子に対する抗体の効果を検討した。Zhangら，Brain Research 698:79-85(1995)は、虚血／再灌流障害における抗−ＣＤ１１ｂおよび抗−ＣＤ１８モノクローナル抗体の効果を検討し、そこでは抗体を一時的なＭＣＡ閉塞の際および後に投与した（ＭＣＡの源泉を外科手術用のナイロン繊維で一時的に遮断した）。Moriら，Stroke23(5):712-718(1992)は、可逆的なＭＣＡ閉塞のヒヒモデルで抗−ＣＤ１８  ＩＢ４抗体の効果を検討した。このモデルでは、動脈の閉塞は外来のＭＣＡバルーンを１００μｌまで膨らませることによって達成された。バルーン収縮に続いて再灌流を行った。一過性脳虚血モデルにおける抗−ＣＤ１１ｂ抗体に関するChoppら,Stroke 25(4):869-876(1994)およびChenら,Annals of Neurology 35(4)458-463(1994)も参照のこと。ChoppらおよびChenらは、外科手術用のナイロン糸をＩＣＡ中へ侵入させＭＣＡの源泉を遮断した。再灌流はその末端がＩＣＡ管腔から除去されるまで糸を引き抜くことにより為された。
Takeshimaら,Stroke, 23(2):247-252(1992)は、ネコの一過性局所脳虚モデルで血抗−ＣＤ１８抗体６０．３が重篤な局所虚血および再灌流を防止できないことを見出した。Takeshimaらは微小血管クリップを用いてＭＣＡを閉塞させ、予め配した結紮を結びつけることによりＣＣＡを閉塞させた。
Lindsbergら,J. Neurosurg. 82:269-277(1995)は、ウサギに重篤な脊髄虚血を負わせ（腹部大動脈に導入されたカテーテル末端のバルーンを膨らませることによる）、続いてその後３０分再灌流させた。（１）賦形剤、（２）抗−ＣＤ１８抗体、または（３）抗−ＣＤ１８抗体、および血小板活性化因子（ＰＡＦ）アンタゴニストを該動物に投与した。モーター機能の回復は抗−ＣＤ１８抗体によって向上したが、ＰＡＦアンタゴニストによってはさらなる向上は起こらなかった。
抗−ＣＤ１８抗体は可逆的脊髄モデル（係蹄結紮閉塞装置を含む）で神経学的欠損を減じる一方で、不可逆的微小球モデルではそうできなかったことが確認された（Clarkら，Stroke 22(7):877-883(1991)）。Clarkらは白血球が再灌流損傷を介した脳神経係損傷におけるそれらの影響を増強すると結論付けた。抗−ＣＤ１１ｂ抗体に関してChoppら，Stroke 25(1):267(1994)は、ラットにおける恒常的ではなく一時的なＭＡＣ閉塞の下でかかる抗体の投与による優位性を報告している。Jiangら,Neuroscience Research Communications 15(2):85-93(1994)も参照のこと。Clarkら，J. Neurosurg 75(4):623-627(1991)も、抗−ＩＣＡＭ−１可逆的脊髄虚血モデルにおける神経学的欠損に顕著な減少をもたらした一方で、不可逆的脳虚血モデルではかかる医薬上の利点が見られなかったことを確認した。抗−ＩＣＡＭ−１抗体に関する同様の発見がZhangら，Stroke 26(8):1438-1422(1995)によっても報告されている。
Bowesら,Neurology 45:815-819(1995)は、ウサギ脳塞栓発作モデルでＩＣＡＭ−１およびＣＤ１８に対して向けられたモノクローナル抗体の、血栓溶解効率を増強する能力を評価した。このモデルでは、塞栓形成を達成するため多数の小血餅（組織ホモジナイザーで血餅を断片化することにより形成）をウサギ頸動脈循環中へ注入した。各々の動物における神経学的機能は、塞栓形成に続く１８時間で（１）正常活性、（２）異常活性、もしくは（３）死亡の３点の尺度で評価した。５０％のウサギに恒常的な神経学的損傷をもたらすのに要する血餅の量（ＥＤ50）を各々の処理群について求めた。Bowesらは、抗−ＣＤ１８または抗−ＩＣＡＭ−１の投与を塞栓形成後１５分または３０分に遅らせた場合、神経学的機能における統計学上有意な改善は確認されないことを見出した。ウサギ脳塞栓発作モデルにおける抗−ＩＣＡＭ−１およびｔ−ＰＡについてのこのグループによる初期の研究に関するBowesら,Experimental Neurology 119(2):215-219(1993)も参照のこと。
Bednarら，Strole 23(1):152(1992)は、動脈閉塞（前部脳循環へ送られた自己由来の血餅）が実験中除去されない、ウサギの血栓塞栓性発作モデルを記載している。血栓塞栓形成に続く３０分、ウサギに抗−ＣＤ１８抗体ＩＢ４（１ｍｇ／ｋｇ）もしくは賦形剤の何れかを受容させた。塞栓形成に続いて、この動物を初期４５分の全身性低血圧を含めてトータル４時間調査した。ＩＢ４で処理された動物と賦形剤で処理された動物間で大脳血流（ＣＢＦ）や梗塞のサイズについて統計学上有意な差は認められなかった。しかしながら、このモデルでＩＢ４は頭蓋内の低血圧を緩和させはした。
本発明の目的は、大脳血流を増し、かつ／もしくは梗塞のサイズを減じることにより急性虚血性発作における臨床上の成果を改善するための方法を提供することである。さらには、本発明の目的は、特に、治療を受ける患者がアスピリンを服用している場合、あるいは診断のために発作の始まりから時間が経った場合など血栓溶解療法が推奨されない場合に、血栓塞栓性発作を治療するための血栓溶解療法の別法を提供することである。その他の目的は以下の記載から明らかになるであろう。
発明の概要
本願は、抗−ＣＤ１８抗体が、動脈閉塞を除去することなく、局所虚血性発作において大脳血流の顕著な増大および／もしくは脳の梗塞のサイズの減少をもたし得るという予期しない発見に基づくものである。
従って、本発明は、動物における大脳血流を増し、かつ／もしくは梗塞のサイズを減じるのに有効な量のＣＤ１８アンタゴニストおよび／またはＣＤ１１ｂアンタゴニストを動物に投与する工程を特徴とする、動物の発作（例えば、主大脳動脈の閉塞によって起こる局所虚血性発作）を治療するための方法を提供する。本方法では、動脈閉塞（一般的に単一の血栓または塞栓）を機械的手段（例えば、該塞栓を外科的に除去することによる）、あるいは化学的手段（例えば、血栓溶解薬を用いて動脈閉塞を溶解させることによる）によって除去することはない。さらに、ＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニストの受容者は、Bednarら，Stroke 23(1):152(1992)の場合のごとき方法の間、外因性の全身性低血圧（例えば、制御された放血を介する）に曝されることはない。
好ましくは該アンタゴニストは、ヒト化Ｆ（ａｂ’）2断片のごとき抗−ＣＤ１８抗体である。便宜には、該アンタゴニストは本明細書にさらに詳細に記載されるもののごとき医薬上許容される処方の形態で動物に投与される。
該アンタゴニストの好ましい投与様式はボーラス静脈内投与によるものである。本発明のある具体例において、該アンタゴニストは少なくとも１度、局所虚血性発作の始まりから１５分ないし２０時間の間で投与されてよく、好ましくは３０分ないし約１２時間の間である。１回または複数回投与で与えられてよい。そうでなければ、またはそれに加えて、該アンタゴニストを持続的注入によって投与してもよい。
もう一つの態様では、本発明は、医薬上有効量のＣＤ１１ｂアンタゴニストおよび／またはＣＤ１８アンタゴニストをその動物に投与する工程を特徴とする、動物において全身性低血圧または低酸素症（例えば、心停止やおぼれによって起こる）によって引き起こされる虚血性発作を治療するための方法に関する。この方法に用いるための好ましいアンタゴニストは抗−ＣＤ１８抗体である。好ましくは、この方法は全身性低灌流によって起こる大脳血流の増加および梗塞のサイズの減少という結果を生じる。
さらにもう一つの具体例では、本発明は、医薬上有効量のＣＤ１８および／またはＣＤ１１ｂアンタゴニストを、その動物における局所虚血性発作の兆候から１５分を超え（例えば、３０分を超え）、好ましくは２４時間内の時間で少なくとも１回その動物に投与する工程を特徴とする、主大脳動脈の閉塞によって引き起こされる局所虚血性発作において大脳血流を増し、かつ／もしくは梗塞のサイズを減じるための方法を提供する。本方法では、治療を受ける哺乳類はBednarら，Stroke 23(1):152(1992)に記載されたごとき外因性の全身性低血圧に曝されない。好ましくは該アンタゴニストは、局所虚血性発作の始まりから約３０分ないし１２時間の間の時間で少なくとも１回投与される抗ＣＤ１８アンタゴニストである。
前段落の方法によれば、医薬上有効量の血栓溶解薬（ｔ−ＰＡなど）をＣＤ１１ｂまたはＣＤ１８アンタゴニストの前に、後に、もしくはそれと同時に哺乳類に共に投与してよい。好ましくは、該アンタゴニストを血栓溶解薬の投与に先立って哺乳類に投与する。この方法によれば、血栓溶解薬を虚血性発作の始まり後約３時間以内に（例えば、約３ないし８時間以内、好ましくは約３ないし５時間以内に少なくとも１回）哺乳類に投与してよい。血栓溶解薬は、例えば１回以上のボーラス投与によってまたは持続的注入によって投与してもよい。
また本発明は前記方法で使用するための製品およびキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１に記載したごとき、ＭＨＭ２３（抗−ＣＤ１８）およびｔ−ＰＡ（ｎ＝５）、ＭＨＭ２３単独（ｎ＝５）、ｔ−ＰＡ単独（ｎ＝１０）または生理食塩水対照（ｎ＝１０）での処理に続き、塞栓を形成したウサギにおける脳梗塞のサイズ（％梗塞した半球）を示す棒グラフである（平均＋／−平均の標準誤差）。
図２は、実施例１に記載したごとき、ＭＨＭ２３（抗−ＣＤ１８）およびｔ−ＰＡ（ｎ＝５）、ＭＨＭ２３単独（ｎ＝５）、ｔ−ＰＡ単独（ｎ＝１０）または生理食塩水対照（ｎ＝１０）での処理に続き、塞栓を形成したウサギにおける時間に関する局所的大脳血流（ＣＢＦ；ｃｃ／１００ｇｍ／分）を示す。ＭＨＭ２３または生理食塩水対照は塞栓形成後１時間に投与した。ｔ−ＰＡまたは生理食塩水対照は塞栓形成後３ないし５時間にわたって持続的注入によって投与した。
図３は、実施例１に記載したごとき、ＭＨＭ２３（抗−ＣＤ１８）およびｔ−ＰＡ（ｎ＝５）、ＭＨＭ２３単独（ｎ＝５）、ｔ−ＰＡ単独（ｎ＝１０）または食塩水対照（ｎ＝１０）での処理に続き、塞栓を形成したウサギにおける頭蓋圧（ＩＣＰ、ｍｍＨｇ）を示す。
図４Ａ−Ｂは、抗−ＣＤ１８抗体（配列番号：７）由来Ｆａｂｖ１ｂ変異体と一直線になっているヒトＩｇＧ1  ＣＨ１ドメイン（配列番号：１）、ヒトＩｇＧ2  ＣＨ１ドメイン（配列番号：２）、ヒトＩｇＧ3  ＣＨ１ドメイン（配列番号：３）、ヒトＩｇＧ4  ＣＨ１ドメイン（配列番号：４）、ヒトκＣLドメイン（配列番号：５）、およびヒトλＣLドメイン（配列番号：６）の共通アミノ酸配列関連部分の配列を配列を示す。図４Ａ−Ｂは、サルベージ受容体結合性エピトープとしての使用のためにＦａｂｖ１ｂの配列（すなわち、配列番号：８および９）内で注目する、また最も重要なアミノ酸残基および／または位置をそれぞれ下線およびアステリスクによって示している。
好ましい具体例の詳説
Ｉ．定義
「局所虚血性発作」とは本明細書では、その領域への血液供給の遮断によって引き起こされる脳への損傷と定義される。本明細書で注目する局所虚血性発作は一般的に、二次動脈あるいは小動脈に対して、１以上の「主大脳動脈」（例えば、中大脳動脈、前大脳動脈、後大脳動脈、内頸動脈または脳底動脈）の何れの閉塞によっても引き起こされる。「動脈閉塞」とは、一般的に単一の塞栓または血栓である。従って、本明細書で定義されたごとき局所虚血性発作は、多数の血餅粒子が二次動脈または小動脈を閉塞するBowesら，Neurology 45:815-819(1995)の大脳塞栓性発作から区別される。
「動脈閉塞の除去をしない」という表現は、本願を通じて用いられる限りにおいて、動脈閉塞が、医薬上の利益がＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニストの投与によって達成されるに先立って、機械的手段によって（例えば、前記一過性発作モデルに記載したごとくに閉塞を物理的に除去することによって）、もしくは化学的手段（血栓溶解薬を用いて血栓または塞栓の除去のごとき、Bowesら，Neurology 45:815-819(1995)参照のこと）実質的に除去されないことを意味する。しかしながら、この用語は、内性の血栓溶解分子が血栓／塞栓の一部を溶解する結果として、動脈閉塞の大きさが若干小さくなるが、かかる大きさの減少の後その動脈閉塞の少なくとも幾分かは（例えば、約５０％、好ましくは約８０％）がそのまま残るという場合も含むと考えられる。
「大脳血流が増加する、または梗塞のサイズが減少する」とは、例えば血管イメージングのごとき当該分野で十分公知の技術を用いて求められた、未処理の動物に比べ処理された動物において、統計学上または生理学上有意な大脳血流の増加および／または統計学上または生理学上有意な梗塞のサイズの減少を引き起こすことにより臨床上の成果を改善する働きを意味する。アンタゴニストの投与後２−４時間に求めた大脳血流が、未処理の動物に比べ少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％まで増加していることが好ましい。アンタゴニスト投与後４８時間に測定された梗塞のサイズが未処理の動物のそれより２０％より小さい、好ましくは５０％より小さいことが好ましい。
「ＣＤ１８アンタゴニスト」とは、本明細書で用いられ限りにおいて、ＣＤ１８（好ましくはヒトＣＤ１８）に結合し、かつＣＤ１８の生物学的活性を阻害するか、もしくは実質的に低下させる分子をいう。通常、該アンタゴニストは内皮細胞へ結合するためのその細胞表面でＣＤ１８サブユニットを発現する細胞（例えば、好中球）の活性を（部分的にまたは完全に）阻害すると考えられる。ＣＤ１８アンタゴニストの例としては制限されないが、抗体、蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド様物質、薬剤およびそれらの代謝物、転写および翻訳制御配列などが挙げられる。本発明の好ましい具体例では、ＣＤ１８アンタゴニストは抗体である。
抗−ＣＤ１８抗体の例としては、ＭＨＭ２３（Hildrethら，Eur. J. Immunol 13:202-208(1983)）、Ｍ１８／２（ＩｇＧ2a；Sanches-Madridら，J. Exp. Med. 158:586(1983)）、Ｈ５２（American Type Culture Collection(ATCC) Deposit HB 10160）、Ｍａｓ１９１ｃおよびＩＯＴ１８（Vermot Desrochesら，Scand. J. Immunol. 33:277-286(1991)）およびＮＡ−８（ＷＯ９４／１２２１４）が挙げられる。好ましい抗体はＭＨＭ２３またはＨ５２の何れかが結合するＣＤ１８エピトープと結合するものである。好ましくは該抗体はＣＤ１８ポリペプチドに対して高い親和性を有する。好ましい具体例では、該抗体は約４ｎＭ以下のＣＤ１８抗原に対して親和性を有する。好ましくはこの親和性は約３ｎＭ以下であり、最も好ましくは１ｎＭ以下である。ある具体例では、該抗体はＣＤ１１ｂと会合するＣＤ１８の細胞外ドメイン中の領域と結合していてもよく、また該抗体はα鎖およびβ鎖を解離していてもよい（例えば、該抗体はＭＨＭ２３抗体に関する場合のごとくにＣＤ１１ｂとＣＤ１８複合体を解離していてもよい）。
「ＣＤ１１ｂアンタゴニスト」なる用語は、本明細書で用いられる限りにおいて、ＣＤ１１ｂと結合し、かつＣＤ１１ｂの生物学的活性を阻害するか、もしくは実質的に低下させる分子をいう。通常、該アンタゴニストは内皮細胞と結合するその細胞表面でＣＤ１１ｂサブユニットを発現する細胞（例えば、好中球）の活性を（部分的にまたは完全に）阻害すると考えられる。ＣＤ１１ｂアンタゴニストの例としては制限されないが、抗体、蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド様物質、薬剤およびそれらの代謝物、転写および翻訳制御配列などが挙げられる。好ましいＣＤ１１ｂアンタゴニストは抗体、特にヒトＣＤ１１ｂと結合する抗−ＣＤ１１ｂ抗体である。ＣＤ１１ｂ抗体の例としては、ＭＹ９０４（米国特許第４，８４０，７９３号）、ＩＢ６Ｃ（Zhangら，Brain Research 698:79-85(1995)参照）、ＣＢＲＮ１／５およびＣＢＲＭ１／１９（ＷＯ９４／０８６０２）が挙げられる。
「抗体」とは最も広い意味で用いられ、例示すればモノクローナル抗体、ポリエピトープ的特異性を有する抗体組成物、ディアボディー（diabopdies）および一本鎖分子、並びにそれらがＣＤ１１ｂまたはＣＤ１８の生物学的活性を打ち消さない限り抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖ）をも含む。
「モノクローナル抗体」とは、本明細書で用いられる限りにおいて、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体、例えば、少量存在していてもよい自然に起こり得る突然変異除いて、その集団が均質であることを特徴とする個々の抗体をいう。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に対して向けられる。さらには、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特性に加え、該モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンが侠雑しないハイブリドーマ培養によって合成される際に有利である。改良「モノクロナール」は実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特性を示すのであって、何れかの特定の方法による抗体の生産を要求するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら，Nature, 256:495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７参照）によって作製されてもよい。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonら，Nature, 352:624-628(1991)およびMarksら，J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)に記載されている技術を用いてファージライブラリーから単離されてもよい。
本明細書中のモノクローナル抗体には例示すれば、その重鎖および／または軽鎖の一部がある種に由来するか、もしくはある抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の関連配列と同一であるか、もしくは相同であり、一方、残りの鎖が他種に由来するか、もしくは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、並びにそれらが好ましい生物学的活性を発現する限り、かかる抗体の断片に属する抗体の断片中の関連配列と同一であるか、もしくは相同な「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)）。
非−ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化された」形態とは、非−ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2または他の抗体の抗原結合性物質のごとき）である。ほとんどの部分に関してヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのごとき非−ヒト種のＣＤＲ由来残基で置換されているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）は、相当する非−ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体にも外来ＣＤＲやフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、さらに精製し、抗体の性能を最適化するために行われる。一般的にヒト化抗体は、非−ヒト化免疫グロブリンのものに相当するＣＤＲ領域の全てもしくは実質的に全てとＦＲ領域の全てもしくは実質的に全てとがヒト免疫グロブリンのものである少なくとも１、典型的には２の可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また最適にはヒト化抗体は、少なくとも免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。さらに詳細にはJonesら，Nature, 321:522-525(1986);Reichmannら，Nature, 332:323-329(1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体としては、その抗体の抗原結合性領域が、注目する抗原でマカーク猿を免疫感作させることによって産生された抗体に由来する、ＰｒｉｍａｔｉｚｅｄTM抗体が挙げられる。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、それらのドメインが一本鎖ポリペプチド鎖に存在する抗体のＶHおよびＶLドメインを含む。一般的に、ＦｖポリペプチドはさらにＶHとＶLドメインの間に、ｓＦｖが抗原に結合するために望ましい構造を形成できるようにするポリリンカーを含む。ｓＦｖの総論としては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore編，Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994)を参照のこと。
「ディアボディー（diabodies）」とは、その断片が同一のポリペプチド鎖（ＶH−ＶL）で軽鎖可変ドメイン（ＶL）と連結された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む、２つの抗原結合性部位を持つ抗体小断片をいう。同一鎖上にある２つのドメイン間で対合するには短か過ぎるリンカーを用いることにより、該ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合し、次いでニ抗原部位を形成することを余儀なくされる。ディアボディー（diabodies）は例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１およびHollingerら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)にさらに十分に記載されている。
本明細書に記載されるごとき「サルベージ受容体結合性エピトープ」とは、イン・ビボにおけるＩｇＧ分子の血清半減期を増加させる役割を果たすＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3およびＩｇＧ4）のＦｃ領域のエピトープをいう。
「治療」とは、治療学上の治療および予防手段または防止手段の双方をいう。治療を要するものとしては、既に疾患を持っているもの並びに疾患を防止すべきものがある。本願は主として急性虚血性発作を患ったと診断された個体を治療することに関する。
治療の対象としての「哺乳類」とは、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのごとき家畜および飼育動物、並びに動物園動物、競技動物またはペット動物を始めとする哺乳類として分類されている動物の何れもをいう。好ましくは哺乳類とはヒトである。
「血栓溶解薬」とは、血栓を崩壊もしくは溶解させる分子である。血栓溶解薬としては例えば、ストレプトキナーゼ、アシル化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼアクチベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）、ウロキナーゼ、一本鎖ウロキナーゼ−プラスミノーゲンアクチベーター（ｓｃｕ−ＰＡ）、アンクロッドのごときヘビ毒由来トロンビン様酵素（Bell, W. ”Defribinogenating enzymes”In Colmanら編：Hemostasis and Thrombosis Lippincott, Philadelphia(1987) p.886）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）および前記各々の生物学的活性変異体が挙げられる。好ましい血栓溶解薬はｔ−ＰＡである。
本発明の文脈において、「組織プラスミノーゲンアクチベーター」および「ｔ−ＰＡ」という用語は互換的に用いられ、プラスミノーゲンをプラスミンへ変換可能なプラテアーゼドメインおよびフィブリン結合のための役割を果たすと考えられているＮ−末端領域を含む少なくともニ機能的ドメインを有する外来（組織型）プラスミノーゲンアクチベーターを示す。従ってこれらの用語には、それらの供給源や製法に関係なく全体の配列の一部としてのこれらの機能的ドメインを始めとするポリペプチドが含まれる（例えば、これらの用語はＥＰ３５２，１１９に記載されたごとき吸血コウモリｔ−ＰＡを含む。「ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター」および「ヒトｔ−ＰＡ」は互換的に用いられ、野生型ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびそれらの機能的誘導体を示す。ｔ−ＰＡ機能的誘導体の例としては、例えば、ＷＯ９３／２４６３５に記載されたごとき半減期が延長され、かつフィブリン特異性が改良された分子、Ｎ−末端切断ｔ−ＰＡ変異体（ＥＰ３８２，１７４参照）、およびSuzukiら，J. Cardiovasc. Pharmacol. 22:834-840(1993)に記述されているＣ８４Ｓｔ−ＰＡが挙げられる。
II．発明の実施方法
本発明は、血栓塞栓性発作のごとき局所虚血性発作の治療方法を提供する。詳しくは、有効量のＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１８アンタゴニストを発作を患った哺乳類に投与することにより、局所虚血性発作における大脳血流を増し、かつ／もしくは梗塞のサイズを減じることができる。この方法では、本明細書で定義されたごとき治療上の利点の確認に先立って動脈閉塞は除去されず、かかる方法はそれ自体、塞栓／血栓を除去しそれによって大脳血流を増し、かつ／もしくは梗塞のサイズを減じるために哺乳類への血栓溶解薬の事前投与を必要としない。
本発明のＣＤ１１ａまたはＣＤ１８アンタゴニストは、ひと度急性虚血性発作の症状が診断されるか、もしくは神経学的検査の局所欠損によって示唆された場合、できる限り速やかに患者に投与されることを意図したものである。神経学的調査および所望によりコンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）（拡散加重イメージング(diffusion weighted imaging)(DWI)および灌流イメージング（ＰＩ）を含む）、導管イメージング（例えば、二重走査頭蓋横断ドップラー超音波・レーザードップラー）、血管造影（例えば、コンピュータ・デジタル・サブトラクション血管造影（ＤＳＡ）およびＭＲ血管造影）並びに他の侵入的または非侵入的技術のごとき神経イメージングが急性虚血性発作の診断に利用できる。
好ましくは、ＣＤ１８またはＣＤ１１ａアンタゴニストは、発作の始まり後約２４時間直後から何れの時間にでも少なくとも１回、または継続して投与される。ある具体例では、ＣＤ１８またはＣＤ１１ａアンタゴニストを、まず、発作の始まりから約１５分（もしくは３０分または４５分）ないし５時間（もしくは１２時間または２４時間）の間の時点で患者に投与する。アンタゴニストは例えば、発作が診断されると直ちにまずボーラス投与によって、次いでアンタゴニストの二度目のボーラス投与（例えば最初のボーラス投与後５−２４時間）によって投与する。
前記方法での使用のために好ましいアンタゴニストは、ヒト化Ｈ５２抗体（ｈｕＨ５２）であり、特にｈｕＨ５２（ａｂ’）2抗体断片が好ましい。
ｈｕＨ５２  Ｆａｂの重鎖の配列は：
0004864175.tif 000002
（配列番号：１０）である。
ｈｕＨ５２  Ｆａｂの軽鎖の配列は：
0004864175.tif 000003
（配列番号：１１）である。
他の具体例では、全長ＩｇＧ2  ｈｕＨ５２抗体は選択された分子であってよい。全長ＩｇＧ2  ｈｕＨ５２抗体の重鎖の配列は：
0004864175.tif 000004
（配列番号：１２）である。
全長ＩｇＧ2  ｈｕＨ５２抗体の軽鎖の配列は：
0004864175.tif 000005
（配列番号：１３）である。
好ましいアンタゴニスト（すなわち、抗体）、半減期の長いアンタゴニスト、医薬処方、投与様式、並びに請求範囲の方法で用いるためのキットおよび製剤の製造については下記に記載する。また、半減期の長いアンタゴニスト、医薬処方および投与様式に関する記載は、本発明のある具体例における血栓溶解約の使用にも関連する。
Ａ．抗体の製造
本発明の好ましい具体例に従えば、ＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニストは抗体である。さらに、本明細書で定義されるごとき発作の治療に使用するための抗−ＣＤ１８または抗−ＣＤ１１ｂ抗体の製造について下記に記載する。
（ｉ）ポリクローナル抗体
一般的にポリクローナル抗体は、適切な抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹膜内（ｉｐ）注射によって動物中で作製される。それは、二機能性薬または誘導薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホ琥珀酸イミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミド（リシン残基を介す）、グルタルアルデヒド、無水琥珀酸、ＳＯＣｌ2、またはＲおよびＲ1が異なるアルキル基であるＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて、免疫感作される種において免疫原性を持つ蛋白質、例えば、鍵穴カサガイヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはソラマメトリプシン阻害剤に適切な抗原に結合させるのに有用であり得る。
１ｍｇまたは１μｇのペプチドまたは複合体（各々ウサギ、もしくはマウスに対する）を３容量のフレンドの完全アジュバントと結合させ、次いで該溶液を複数の箇所に注射することにより、動物を抗原、免疫原性を持つ複合体または誘導体に対して感作させる。１ヶ月後、複数箇所の皮下注射により、フレンドの完全アジュバント中、元の量の１／５ないし１／１０の量のペプチドまたは複合体を動物に追加投与する。７ないし１４日後動物から採血し、その血清を抗体力価について分析する。力価プラトーまで動物に追加投与を行う。好ましくは、同一の抗原の複合体の他、異なる蛋白質に結合させたもの、および／または異なる架橋剤を介して結合させたものを動物に追加投与する。また複合体は蛋白質融合体のごとき組換え細胞培養でも作製できる。また、明礬のごとき凝集薬も免疫反応を増強するのに適宜に用いられる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体の集団、すなわち少量存在してもよい自然に起こりうる突然変異を除き、集団が同質であることを特徴とする個々の抗体から得られる。かくして、修正「モノクロナール」は別個の抗体の混合物ではない、その抗体の特性を示す。
例えば、該モノクローナル抗体はKohlerら，Nature, 256:495(1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製してもよいし、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７）によって作製してもよい。
ハイブリドーマ法では、マウスまたはハムスターのごとき他の適当な宿主動物を本明細書で前記したごとくに免疫感作させて、免疫感作のために用いられる蛋白質と特異的に結合すると考えられる抗体を産生するか、もしくは産生することができるリンパ球を誘導する。別法として、イン・ビトロでリンパ球を感作させてもよい。次いでリンパ球をポリエチレングリコールのごとき適切な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103(Academic Press, 1986)）。
かくして調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含む適切な培地に植え付け、増殖させる。親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損しているならば、該ハイブリドーマのための培地は典型的には、その物質がＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を阻害するヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
好ましいミエローマ細胞としては効率よく融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の産生を安定した高レベルに維持し、かつＨＡＴ培地のごとき培地に感受性を持つものである。これらのうち好ましいミエローマ細胞株は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calfornia USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍細胞、およびAmerican Type Culture Collection, Rockvill, Maryland USAから入手できるＳＰ−２のごときマウスミエローマ株である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の生産のために記載されている（Kozhor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeurら，Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pp.51-63 (Marcel dekker編，New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が増殖する培地をその抗原に向けられたモノクローナル抗体の産生に関して分析する。好ましくは、免疫沈降によって、もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のごときイン・ビトロ結合アッセイによって、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を決定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら，Anal. Biochem.,107:220(1980)のスキャッチャード分析によって求める。
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性および／または活性を持つ抗体を産生することを確認した後、希釈手段を制限することによりサブクローニングし、次いで標準法によって増殖させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103(Academin Press, 1986)）。この目的のための適切な培地としては例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに動物の腹水腫瘍として該ハイブリドーマ細胞をイン・ビボで増殖させてもよい。
例えば、蛋白質Ａ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーのごとき通常の免疫グロブリン精製法によって、サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を培地、腹水、または血清から適宜分離する。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは定法（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され、配列決定される。該ハイブリドーマ細胞はかかるＤＮＡの好ましい供給源としての役割を持つ。ひと度単離されれば、該ＤＮＡは、次いでイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別法では免疫グロブリン蛋白質を産生しないミエローマ細胞のごとき宿主細胞中へトランスフェクトされる発現ベクター中に置き、該組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させてもよい。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え体発現に関する総論としては、Skerraら,Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
さらなる具体例では、McCaffertyら，Nature, 348:552-554(1990)に記載された技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから抗体または抗体断片を単離できる。それに次ぐ発表では、鎖の組換えによる高親和性（ｎＭレンジ）ヒト抗体の集団について（Marksら，Bio/Technology, 10:779-783(1992)）、並びに非常に大きなライブラリーを構築するための戦略として組み合わせ感染やイン・ビボでの組換えについて（Waterhouseら，Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266(1993)）記載されている。かくして、これらの技術はモノクローナル抗体の単離のための従来のモノクロナール抗体ハイブリドーマ技術に対する実施可能な代替技術である。
また、例えば、相同ネズミ配列をヒト重鎖および軽鎖不変ドメインに対するコーディング配列で置換することによるか（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら，Proc. Natul. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)）、または非−免疫グロブリンポリペプチドに対するコーディング配列の全てまたは一部の配列をコードする免疫グロブリンと共有結合させることによって、該ＤＮＡを修飾してもよい。
典型的にはかかる非−免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の不変ドメインの代わりに置き換えるか、または抗体の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置き換えて、抗原に対して特異性を持つある抗原結合部位と異なる抗原に対して特異性を持つ別の抗原結合部位を含むキメラ性二価抗体を作出する。
また、キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を含むものを始めとする、合成蛋白質化学の公知の方法を用いてイン・ビトロで調製してもよい。例えば、ジスルフィド交換反応を用いるか、またはチオエーテル結合を形成することによってイムノトキシンを作り出してもよい。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
（ｉｉｉ）ヒト化およびヒト抗体
非−ヒト抗体をヒト化するための方法は当該技術分野で十分公知である。一般的に、ヒト化抗体は、非−ヒトである供給源からそれへ導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これら非−ヒトアミノ酸残基はしばしば「外来」残基と呼ばれ、それは典型的には「外来」可変ドメインに由来する。ヒト化は実質的にはWinterおよび共同研究者の方法（Jonesら，Nature, 321:522-525(1986); Riechmannら，Nature, 332:323-327(1988); Verhocyenら，Science, 239:1534-1536(1988)）に従い、ヒト抗体の相当配列にをＣＤＲｓまたはＣＤＲ配列で置換することにより行うことができる。従って、かかる「ヒト化」抗体とは、全ヒト可変ドメインより実質的に小さいドメインが非−ヒト由来のその関連配列によって置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはいくつかのＣＤＲ残基および恐らくはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体のアナローグ由来残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体を作製する際に用いられるヒト可変ドメイン、軽鎖および重鎖双方の選択は、抗原性を減じるために非常に重要である。いわゆる「最も適合する」方法に従い、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して選抜する。次いで齧歯類の配列に最も近いヒト配列がヒト化抗体に関するヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容される（Simら，J. Immunol., 151:2296(1993)）; Chothiaら，J. Mol. Biol., 196:901(1987)）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグルーブの全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同一のフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体のために用いられてよい（Carterら，Proc. Natul. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992); Prestaら，J. Immunol., 151:2623(1993)）。
抗体が抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性の維持をもってヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するため、好ましい方法に従い、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを用いて親配列の分析および種々の概念的ヒト化産物のプロセスによってヒト化抗体を調製する。通常、３次元免疫グロブリンモデルが利用でき、当業者に公知である。選択された候補となる免疫グロブリン配列のあり得る３次元コンホメーション構造を図示し表示するコンピュータプログラムが利用できる。これらのディスプレイの閲覧により、候補となる免疫グロブリン配列の作用の際のその残基の可能な役割を分析すること、すなわち、候補となる免疫グロブリンのその抗原と結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。かくのごときに、ＦＲ残基が選択され、受容者および重要配列から結合し、標的抗原に対する親和性を増大させるなど所望の特性が達成される。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合性に影響を与えるに直接、およびほとんど実質的に関与する。
別法として今や免疫感作において内生免疫グロブリン産生なしに、全範囲のヒト抗体を産生することができる形質転換動物（例えば、マウス）を作出することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪH）遺伝子の相同な欠損が、結果として内生抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。かかる生殖系統突然変異マウスにおけるヒト生殖系統免疫グロブリン遺伝子配列の移入は、結果として抗原攻撃時のヒト抗体の産生を生じる。例えば、Jakobovisら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551(1993); Jakobovisら，Nature, 362:255-258(1993); Bruggermannら，Year in Immuno., 7:33(1993)参照。またヒト抗体はファージ−表示ライブラリーから誘導してもよい（Hoogenboomら，J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marksら，J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)）。
（ｉｖ）二重特異性抗体
二重特異性（ＢｓＡｂｓ）は少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を持つ抗体である。例示すればＢｓＡｂｓはＣＤ１８抗体の２つの異なるエピトープと結合してもよいし、またはＣＤ１８およびＣＤ１１ｂの双方に結合してもよい。かかる抗体は全長抗体または抗体断片から誘導し得る（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二重特異性抗体）。
二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野で公知である。従来の全長二重特異性抗体の製造は、その２本の鎖が異なる特異性を持つ２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいている（Millsteinら，Nature, 305:537-539(1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クワッドローマ）は、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する１０の異なる抗体分子の可能性ある混合物を生産する。通常アフィニティークロマトグラフィーの工程によってなされる正しい分子の精製はむしろ煩わしく、かつその産物の収率は低い。同様の手段が１９９３年５月１３日に公表されたＷＯ９３／０８８２９およびTrauneckerら，EMBO J. 10:3655-3659(1991)に記載されている。
異なる、またより好ましい試みに従い、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を持つ抗体可変ドメインを免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。好ましくはこの融合は、少なくともヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖不変ドメインを伴う。該融合体に少なくとも１つ存在する、軽鎖が結合するために必要な部位を含む第１重鎖不変領域（ＣＨ１）を持つことが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは別個の発現ベクターに挿入され、適切な宿主器官へ同時にトランスフェクトされる。最適収率を供する構成において一様でない比率の３つのペプチド差が用いられる場合、このことは、具体例において、３つのポリペプチド断片の相互比率を調製する際に高度な柔軟性を提供する。しかしながら、同じ比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が結果として高い収率をもたらすか、あるいは比率が特に有意でない場合には、１つの発現ベクターに２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖に関するコーディング配列を挿入することができる。
本試みの好ましい具体例では、二重特異性抗体は、一方の腕に第一の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を供する）とから構成される。免疫グロブリン軽鎖が二重特性分子の２分の１しか存在しないことが容易な単離方法をもたらすので、この非対象構造は、所望されない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物の分離を容易にする。この試みは１９９４年３月３日に公表されたＷＯ９４／０４６９０に記載されている。さらに詳細な二重特異性抗体の作製については、例えば、Sureshら，Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照のこと。かかる方法を用いて、本明細書で定義されたごとき発作の治療に用いるために、ｔ−ＰＡのごとき血栓溶解薬と抗−ＣＤ１８または抗−ＣＤ１１ｂ抗体が結びついている二重特異性抗体が調製できる。
二重特異性抗体としては、架橋抗体または「ヘテロ複合体」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロ複合体の抗体のあるものはアビチンと結合でき、他のものはビオチンと結合できる。かかる抗体は、例えば免疫系細胞から所望されない細胞までを標的とするために提案され（米国特許第４，６７６，９８０号）、またＨＩＶ感染の治療として提案されてきた（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３およびＥＰ０３０８９）。ヘテロ複合体抗体は都合のよい何れの架橋法を用いて作製されてもよい。適切な架橋剤は当業者に公知であり、また多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号で開示されている。
また、抗体断片から二重特異性抗体を作製する技術は論文にも記載されている。また必ずしも二重特異性でない二価の抗体断片の産生のためには下記の技術を用いることもできる。例えば、イー・コリ（E. coli）から回収したＦａｂ’断片をイン・ビトロで化学的に結合させて二価抗体を形成することができる。Shaladyら，J. Exp. Med. 175:217-225(1992)参照。
組換え細胞培養から直接二価の抗体断片を作製および単離する種々の技術も記載されている。例えば、二価ヘテロ二量体はロイシンジッパーを用いて生産されて来た（Kostelnyら，J. Immunol., 148(5):1547-1553(1992)）。ＦｏｓおよびＪｕｎ蛋白質由来のロイシンジッパーは遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’蛋白質に結びつけられた。該抗体ホモ二量体はヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、次いで再び酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成した。Hollingerら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)によって記載されたディアボディー（diabody）技術は、二重特異性／二価抗体断片を作製するための別のメカニズムを提供する。該断片は同一鎖上の２つのドメイン間で対合するには短過ぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶL）に連結させた重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。従って、ある断片のＶHおよびＶLドメインは、別の断片の相補的ＶHおよびＶLドメインと対合することを余儀なくされ、それにより２つの抗原結合部位を形成する。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性／二価抗体断片を作製するためのもう一つの戦略も報告されている。Gruberら，J. Immunol., 152:5368(1994)参照。
Ｂ．半減期の長いアンタゴニスト
本発明のある具体例において、それとともに処理した哺乳類の血清中での半減期が延長されるように設計されたＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニストを用いることが望ましい。例えば、このことは、（ｉ）その循環半減期を延長するがその生物学的活性を破壊しないようにＩｇＧのＦｃ領域のサルベージ受容体結合性エピトープを該アンタゴニストに組み込むか、または（ｉｉ）該アンタゴニストに非蛋白質性性ポリマーを共有結合させることによって達成されてよい。これらの典型的な技術を簡単に以下に記載する。
（ｉ）アンタゴニスト−サルベージ受容体結合性エピトープ融合体
サルベージ受容体結合性エピトープの該アンタゴニストへの組み込みは、注目するアンタゴニストの適切な領域を突然変異させてＦｃ領域を擬態することにより、または該エピトープをペプチド標識中に組み込み、次いで末端または中央で該アンタゴニストと融合させることにより、またはＤＮＡもしくはペプチド合成によるなど、何れの方法によっても起こり得る。
延長されたイン・ビボ半減期を有するかかるアンタゴニスト変異体を調製する合成法はいくつかの工程からなる。最初の工程は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のサルベージ受容体結合性エピトープの配列およびコンホメーションを同定することに関する。ひと度このエピトープが同定されれば、注目するアンタゴニストの配列は、同定された結合性エピトープの配列およびコンホメーションを含むように修飾される。配列が突然変異を起こした後は、該アンタゴニスト変異体がもとのアンタゴニストのそれよりも長いイン・ビボ半減期を有するかどうかを確かめるために試験を行う。該アンタゴニスト変異体が試験においてより長いイン・ビボ半減期を有しない場合には、同定された結合性エピトープの配列およびコンホメーションを含むようにその配列をさらに改変する。改変したアンタゴニストをイン・ビボの半減期の長さに関して試験し、より長いイン・ビボ半減期を示す分子が得られるまでこの工程を続ける。
かくして注目するアンタゴニストに組み込まれたサルベージ受容体結合性エピトープは、先に定義したごとき何れかの適切なエピトープであり、その性質は例えば修飾されいるアンタゴニストのタイプに依存する。注目するアンタゴニストがＣＤ１１ｂまたはＣＤ１８の生物学的活性と依然として拮抗し得るように転移を行う。
注目するアンタゴニストが抗体である場合、それはＩｇドメインまたはＩｇ様ドメインを含み、サルベージ受容体結合性エピトープは、それがこのＩｇドメインまたはＩｇ様ドメイン内に位置するように配置される。さらに好ましくは、該エピトープは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループに由来する1以上のアミノ酸残基の何れかが、該抗体のＩｇドメインまたはＩｇ様ドメインの類似する位置に転移している領域を構成する。さらにより好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループに由来する３つ以上のアミノ酸残基が転移されていることである。一層好ましくは、該エピトープをＦｃ領域の（例えばＩｇＧの）ＣＨ２ドメインから採り、ＩｇのまたはＩｇ様ドメインに対するＣＨ１、ＣＨ３、もしくはＶH領域、または２以上のかかる領域に転移することである。別法として、該エピトープをＦｃ領域のＣＨ２ドメインから採り、注目するアンタゴニストのＩｇのまたはＩｇ様ドメインに対するＣＬ領域もしくはＶＬ領域、または双方に転移させる。
例えば、注目するポリペプチドが抗体である変異体を考察するために、参照を図４Ａ−Ｂに示し、ここでは種々のＩｇの適切な共通一次構造、すなわちヒトＩｇＧ1  ＣＨ１ドメイン、ヒトＩｇＧ2  ＣＨ１ドメイン、ヒトＩｇＧ3  ＣＨ１ドメイン、ヒトＩｇＧ4  ＣＨ１ドメイン、ヒトκＣLドメイン、およびヒトλＣLドメイン、ならびにＦａｂｖ１ｂの特異的配列、本明細書で好ましい抗−ＣＤ１８Ｆａｂ変異体を図示している。さらに、図４Ａ−Ｂは、注目するかつ最も重要なＦａｂｖ１ｂの残基を示す。好ましい具体例では、重要な残基は図４Ａ−Ｂでアステリスクを付けたもの、すなわちＦａｂｖ１ｂのあるループではＣ−末端からＭＩＳに間にＴ残基１アミノ酸を持つＭＩＳ、およびＦａｂｖ１ｂのもう１つのループではＣ−末端からＨＱＮまでの間にＤ残基２アミノ酸とＣ−末端からＤ残基までにＫ残基１アミノ酸を有するＨＱＮである。
１つの最も好ましい具体例では、該サルベージ受容体結合性エピトープは配列（５’から３’）：ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号：８）を含み、さらに所望により、特に注目するアンタゴニストがＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2であるＩＩＱＳＬＧＴＱ（配列番号：１４）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号：９）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号：１５）、またはＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号：１６）からなる群から選択される配列を含む。
（ｉｉ）アンタゴニスト−ポリマー複合体
本目的のために選ばれた非蛋白質性ポリマーは、通常親水性の合成ポリマー、すなわちさもなければ天然では見られないポリマーである。しかしながら、天然に存在し、組換え体またはイン・ビトロでの方法によって作製されるポリマーは、天然の供給源から単離されたポリマーであるので有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンが本発明の範囲中に含まれる。特に有用なのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごときポリアルキレンエーテル類、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンのごときポリエルキレン類、並びにポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロック共重合体類（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ポリメタクリレート類、カルボマー類、Ｄ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクトロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースなど単糖類およびラクトース、アミロペクチン、デン粉、ヒドロキシエチルデン粉、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンのごときホモ多糖およびヘテロ多糖を含むノイラミン酸、または酸ムコ多糖類の多糖サブユニット、例えばヒアルロン酸を含む分枝または分枝していない多糖、ポリソルビトールおよびポリマンニトールのごとき糖アルコールのポリマー類、ヘパリンまたはヘパロンである。架橋前のポリマーは水溶性である必要はないが、水溶性であることが好ましく、最終的な複合体は水溶性でなければならない。さらに、該ポリマーは、複合体の形で高い免疫原性があってはならず、静脈内点滴または注射に不適合な粘度を、かかる経路によって投与しようとする場合には、有してはならない。
該ポリマーは反応性のある単一基のみを含むことが好ましい。このことは蛋白質分子の架橋を妨げるのに役立つ。しかしながら、反応条件を最適化して架橋を少なくしたり、または実質的に均一な誘導体を回収するためにゲル濾過またはクロマトグラフィー的ふるいを通して反応生成物を精製したりするすることは本発明の範囲内である。
該ポリマーの分子量は、望ましくは約１００ないし５００，０００までの範囲であってよく、好ましくは約１，０００ないし２０，０００である。選択された分子量は、ポリマーの性質および置換度に依存する。一般に、ポリマーの親水性が大きくなれば、また置換度が大きくなれば、分子量のより低いものが使用できる。最適な分子量は慣例の実験によって決定される。
一般的に該ポリマーは、該ポリマーおよび結合すべきアンタゴニストの1つ以上のアミノ酸または糖残基と反応する多機能性架橋剤を介してアンタゴニストと共有結合している。しかしながら、誘導されたポリマーをハイブリッドと反応させることによって該ポリマーを直接架橋することは本発明の範囲内であり、その逆もまた同様である。
アミノ基との共有結合は、シアヌル酸クロリド、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基（ＰＥＧアルコキシドおよびブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール、ＰＥＧプラスＤＭＳＯおよび無水酢酸、または塩化ＰＥＧおよび４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性エステル類、活性化ジチオカルボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホーメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホーメート活性化ＰＥＧ）に基づく公知の化学によって達成される。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いてＰＥＧ−アミンを結合させることによって誘導される。
化学薬品、例えばメタ過ヨウ素酸エステル、または酵素、例えばグルコースまたはガラクトースオキシダーゼを用いた酸化によって、ポリマーをオリゴ糖基に結合させ、（これらのうち何れかが炭水化物のアルデヒド誘導体を形成し）、次いでHeitzmannら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:3537-41(1974)またはBayerら，Methods in Enzymology 62:310(1979)により記載されたものと同様の方法で、ビオチンまたはアビジンでオリゴ糖をラベリングするために、ヒドラジンまたはアミノ誘導ポリマーと反応させる。さらに、一般に誘導体形成に関してアミノ酸位よりも置換が少なくなれば、かくしてオリゴ糖生成物はより均一になるので、オリゴ糖を結合させるために、これまで用いられてきた他の化学的または酵素的方法は特に有利である。またオリゴ糖置換基は所望により、ポリマー誘導体形成に先立ち酵素的消化によって、例えばノイラミニダーゼ消化によって改変して糖を除去してもよい。
該ポリマーは、アミノ酸側鎖、または結合したアンタゴニストのＮ−もしくはＣ−末端と直接反応するか基か、または多機能性架橋剤と反応する基を有する。一般に、かかる反応基を有するポリマーは、固定化蛋白質の調製において公知である。ここでかかる化学を用いるためには、これまで蛋白質の固定化に用いられてきた不溶性ポリマーと同様の方法で別に誘導した水溶性ポリマーを使用すべきである。臭化シアン活性化は、多糖を架橋する際に使用する特に有用な方法である。
出発ポリマーに関して“水溶性”とは、結合に用いられるポリマーまたはその反応中間体が誘導体形成反応に参加するに十分に水溶性であることを意味する。ポリマー複合体に関して“水溶性”とは、該複合体が血液のごとき生理的流体に可溶であることを意味する。
かかるポリマーでの置換度は、アンタゴニスト上の反応部位の数、アンタゴニストの全てが使われているか、また断片が使われているか、アンタゴニストがヘテロ蛋白質との融合体（例えば、サルベージ受容体結合性エピトープと融合した抗−ＣＤ１８抗体）であるかどうか、分子量、親水性および該ポリマーの他の特性、および選ばれた特定のアンタゴニスト誘導化部位に依存して変化すると考えられる。一般に、該複合体は約１個ないし１０個までのポリマー分子を含み、一方で、いかなるヘテロ配列も、所望の活性が逆の影響をあまり受けない限り、実質的に無限の数のポリマー分子で置換されてよい。最適な架橋度は、所望の方法で複合体の能力を決定した後、時間、温度および他の反応条件を変化させて置換度を変化させる実験マトリックスによって容易に決定される。
該ポリマー、例えばＰＥＧは、ＰＥＧのごとき非蛋白質性性ポリマーで蛋白質を共有結合を改変するための、それ自体公知の種々の方法によって架橋される。
本発明の半減期の長い複合体は、ゲル濾過によって未反応の出発物質から単離される。該複合体のヘテロ種は、同様の方法でお互いから精製される。また該ポリマーも疎水性ゲル同様、水に不溶であってもよい。
Ｃ．医薬処方
ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１８アンタゴニストの治療処方は、所望により医薬上許容される担体、賦形剤または安定剤（Remington’s Pharmaceutical Science 16版、Osal, A.Ed(1980)）を含んでもよい所望の純度を有するアンタゴニストを混合することによって、凍結乾燥した処方かまたは水溶液の形で保存用に調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で受容者に毒性がなく、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸類のごとき緩衝剤、アスコルビン酸を始めとする抗酸化剤、低分子量（約１０残基より小さい）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのごとき蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンのごときアミノ酸類、単糖類、二糖類およびグルコース、マンノース、トレハロースまたはデキストリンを始めとする他の炭水化物類、ＥＤＴＡのごときキレート剤、マンニトールまたはソルビトールのごとき糖アルコール類、ナトリウムのごとき塩形成カウンターイオン、および／またはＴｗｅｅｎ、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓまたはＰＥＧのごとき非イオン性界面活性剤を含む。
また有効成分も、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、それぞれコロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおける、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル中にトラップされてもよい。かかる技術は、Remington’s Pharmaceutical Science 16版,Osol, A.Ed(1980)に開示されている。
イン・ビボ投与のために用いられる処方は無菌でなければならない。このことは、凍結乾燥および再構成の前または後に、除菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
放出を持続させる調製法が採られてよい。放出を持続させる調製法の適切な例としては、ＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは造形品、例えば被膜、またはマイクロカプセルの形態である。放出を持続させるマトリックスの例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸γエチルの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、Ｌｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔTM（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）のごとき分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のごときポリマーは１００日にわたって分子の放出が可能であるが、あるヒドロゲル類はより短い期間で蛋白質を放出する。カプセル化抗体が長時間体内に残っている場合には、３７℃で湿気に曝された結果として変性または凝縮し、その結果生物学的活性の欠失および免疫原性に変化が起こる可能性がある。関連機構に基づく安定化のための合理的な戦略を考案できる。例えば、凝縮機構がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適当な添加物を用いて特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
また放出を持続したＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニスト組成物としては、リポソームにトラップされたアンタゴニストが挙げられる。ＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニストを含むリポソームは、Epsteinら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82:3688(1985); Hwangら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030(1980); および米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されているごとき、当該技術分野で公知の方法によって調製される。通常、該リポソームは、その脂質含量が約３０モル％コレステロールより高く、その選択比率がＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニスト治療のために調製される小さな（約２００〜８００オームストロング）単層タイプである。
Ｄ．投与方法
本発明のＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニストは、ボーラスとしての静脈内投与もしくは一定期間にわたる持続的注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、包膜内、経口、局所もしくは吸入経路のごとき公知の方法に従って哺乳類、好ましくはヒトに投与される。該アンタゴニストの静脈内投与が好ましい。
ＣＤ１８もしくはＣＤ１１ｂアンタゴニストの適切な投与量は、治療される発作の本質、重篤度および発作の経過、該アンタゴニストが予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、既往療法、患者の臨床病歴およびＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニストに対する反応、および診察する医師の判断に依存するであろう。該ＣＤ１８またはＣＤ１１ｂアンタゴニストは、単回もしくは一連の治療にわたって患者に適切に投与され、また、診断された時点から、いつでも患者に投与されてよい。例えば、該アンタゴニストは発作の始まりから約１５、３０、もしくは４５分から約５時間、１２時間もしくは２４時間の間の時点で投与されてよい。好ましい具体例では、最初の投与に次いで少なくとも１回の投与（例えば、最初の投与後５ないし２４時間）が行われる。ある状況下においては、ＣＤ１１ｂアンタゴニストおよびＣＤ１８アンタゴニストは、哺乳類に同時に投与される。
アンタゴニストが抗体の場合、患者に投与するための最初の候補となる投与量は、抗−ＣＤ１８抗体もしくは抗−ＣＤ１１ｂ抗体の約１００μｇ／ｋｇないし約２０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは約５００μｇ／ｋｇないし約５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇないし約３ｍｇ／ｋｇであり、いずれにせよ、例えば単回もしくは複数回の分割投与、もしくは持続的注入により投与される。しかしながら、他の投薬養生法も有用であろう。本治療法の経過は、常法および本明細書に詳しく述べられている分析法によって容易に監視できる。
Ｅ．キットおよび製品
本発明のもう一つの具体例では、製品および、大脳血流量を増しおよび／もしくは梗塞のサイズを減じることにより発作における臨床上の成果を改善するために有用な材料を含むキットが提供される。該製品はラベル付き容器を有する。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、試験管が挙げられる。該容器はガラスもしくはプラスチックのごとき種々の材料でつくられてよい。該容器は、本明細書に定義されたごとき発作を治療するために有効な組成物を収容しており、無菌の入り口穴を有しているであろう（例えば、容器は皮下注射針により突き刺せる栓を有する静脈内投与溶液バッグもしくはバイアルであってよい）。該組成物中の有効薬はＣＤ１１ｂまたはＣＤ１８アンタゴニストである。容器のラベルは、該組成物が前記したごとき発作の治療に使用されることを表しており、また、前記したごとくにイン・ビボ用途のための指示も表してよい。
本発明のキットは、前記容器と、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液のごとき、医薬上許容される緩衝液を含む第二の容器とから構成される。
さらに、他の緩衝液、希釈液、フィルター、注射針、シリンジおよび使用上の注意を記載したパッケージ内の印刷物を含む、商業的観点および使用者の観点から所望される他の材料も含まれてよい。
以下の実施例は例示のためのに提供するものであり、制限されるものではない。本明細書におけるすべての引用の開示は、明らかに出典明示して本明細書の一部とみなされる。
実施例
本研究はウサギ血栓塞栓性発作モデルにおける抗−ＣＤ１８抗体（ＭＨＭ２３）およびｔ−ＰＡの効果を検討したものである。このモデルにおいて、一つの血餅が中大脳動脈および後交通動脈（それらは“主大脳動脈”である）へ導入された。動脈閉塞（すなわち血餅）は実験を通して（それがｔ−ＰＡにより酵素学的に除去されるまで）適所にとどまった。以下のウサギモデルは人間における血栓塞栓性発作の生理学的進行とよく相関すると考えられた。
材料および方法
本研究において使用されたウサギ血栓塞栓性発作モデルは、従前に詳細に記載されている（Bednarら，Neurol. Res., 16:129-132(1994); Grossら，Stroke, 24:558-562(1993); Kohutら，Stroke, 23:93-97(1992); Wiosonら，Neurosurgery, 31:929-934(1992)）。Grossら，Neurosurgery, 36(6):1172-1177(1955)も参照。
要約すると、ニュージーランド白色種ウサギ（Charles River,CA）（雌雄とも；３．０−３．５ｋｇ）をケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ；Aveco Co., Fort Dodge, LA）、アセプロマジン（２０ｍｇ、Aveco Co.）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ；Mobay Corp., Shawnee, KS）溶液を用いて麻酔し、溶液は無痛外科手術（平均動脈圧および足をつねられた時の反応を始めとする、種々の生理学的および自律性刺激に対する反応によって判定される）を行うに十分な麻酔を維持するために引き続き使用した。右大腿三角を切開して大腿静脈および大腿動脈を露出させた後、該大腿動脈にプラチナ−イリジウム電極を取り付けたＰＥ−９０カテーテル（BD Co. Parsippany, NJ）を挿入した。このカテーテル−電極は、平均動脈圧の継続的測定および動脈血ガス（ＡＢＧ）（ｐＨ，ＰＣＯ2，ＰＯ2）、ヘマトクリットおよびグルコースの測定、水素クリアランス法（Young, Stroke, 11:552-564(1980)）によるｒＣＢＦを評価する水素流失の測定のための血液サンプリングを可能にする。薬物注入のために大腿静脈にＰＥ−９０チューブを挿入した後、中線頭皮切開を行なって頭蓋冠を露出させた。両側性の頭蓋骨局部切除術を行い、以下のものを取り付けた；局所的大脳血流量（ｒＣＢＦ）を監視するための３０−ゲージプラチナ−イリジウム電極；光ファイバーの硬膜外頭蓋内圧（ＩＣＰ）モニター（Princeton Medical Corp., Hudson, NH）；および脳の温度を計測するための温度センサー（Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH）。大脳の全ての機器は、凝固の早いエポキシ樹脂によって注意深く適所に固定した。頚部中線切開を通して、該動物の気管を切開し、機械的に換気した。換気の深さと速度はともに、ＡＢＧｓを生理学的範囲に維持するのに必要とされるごときにに調節した。
実験を通して、脳と中心部の温度、平均動脈圧、ＩＣＰを継続的に測定した。それに加え、以下のパラメータを塞栓形成前（ベースライン）、塞栓形成時および塞栓形成後１時間に測定した；ｒＣＢＦ，ヘマトクリット、グルコースおよびＡＢＧ。平均動脈圧は、実験を通して５０ないし６０ｍｍ Ｈｇの間に維持した。輸液（リンガーの乳酸塩もしくはパック細胞）を必要に応じて静脈内投与（およそ２−４ｍｌ／ｋｇ／ｈ）し正常水分量を維持させた。中心部と脳の温度は、加温毛布および加温ランプを用いてベースラインから１℃までの範囲内に維持した。
自己由来の血餅は全血（１ｍｌ）を５０ｍｇの錫顆粒と混合することにより調製した。該血餅をトロンビンで前処理したＰＥ−９０チューブ中に導入し、室温で熟成させた。
気管切開術の後、総頚動脈の分岐領域を確認し、次いで３０ないし６０分間平衡化し、その間にベースライン値を得た。全ての外科的手術は２時間以内に完了した。一度全てのベースライン値が得られたら、近位内頚動脈および遠位総頚動脈を一時的に血液循環から分離した。次いで動脈切開術を行い、近位内頚動脈へと伸びたカテーテルを通して、自己由来血餅塞栓を脳の動脈循環へと送達した。塞栓が形成されると、再び近位内頚動脈および遠位総頚動脈の双方を循環から分離し、１０−０間隔ナイロン縫合糸を用いて動脈縫合を行った。フィリップの歯科用Ｘ線機械を用い、錫標識血餅の位置を確認する頤下−頭頂Ｘ線写真を得た。閉塞した血餅は中大脳動脈および後交通動脈に認められた。
塞栓形成後３−５時間の間に、総投与量６．３ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡもしくは生理食塩水（０．９％生理食塩水）を持続注入により静脈内に投与した。ＭＨＭ２３（２ｍｇ／ｋｇ）は塞栓形成後１時間にボーラス投与した。各々の例では、実験は塞栓形成後７時間継続した。頤下−頭頂Ｘ線写真は、塞栓形成後および実験終了時に撮影した。塞栓形成後直ちにｒＣＢＦを再度計測した；実験は、塞栓が形成されている半球の３個の電極のうち何れかのｒＣＢＦが≦１５ｍｌ／１００ｇ／分である限り継続させた（Jonesら，J. Neurosurg., 54:773-782(1981)）。
実験終了時に該動物をペントバルビタールナトリウム（１５０ｍｇ／ｋｇ）過剰投与によって屠殺した。この方法は、米国獣医学協会（American Veterinary Medical Association）の安楽死ガイドラインに準拠し、容認できかつ無痛であると認められている。バーモント大学動物保護および利用委員会により概略が述べられた方法に従って、両側性の開胸術を行った。脳を速やかに摘出して、残存する血餅の存在およびその位置の肉眼的検査を行った。脳は、パンを切る様式で２ｍｍの切片を作製し、脳梗塞のサイズを決定するために塩化トリフェニルテトラゾリウム染色液中でインキュベートした（Boseら，Stroke, 19:28-37(1988)）。この方法は、我々のウサギモデルの脳梗塞のサイズを求めるための方法として容認され、ヘマトキシリンおよびエオジン染色とよく相関する（Bednarら，Neurol. Res., 16:129-132(1994)）。後日、梗塞のサイズを面積定量するために、各脳切片を注意深く、透明なアセテートシート上にトレースした。この定量にはＩＢＭ画像分析器を用いた。梗塞のサイズはLinら，Stroke, 24:117-121(1993)により記載されたものの改良法に従い定量した。この方法において梗塞の領域は、塞栓が形成されていない半球の全容積から、塞栓が形成されている半球の非梗塞部分の容積を差し引くことによって求められる。この改良法では、脳梗塞部の容積が付帯する腫脹によって過大評価され得ることを考慮に入れている。
反復計測のための分散分析を用いて、対照群と処理群におけるヘマトクリット、グルコース、ＡＢＧ、ｒＣＢＦおよびＩＣＰ値の分析を行った。もし有意差が認められた場合、これらの変数のｔ−ＰＡおよび／もしくはＭＨＭ２３投与直前の値をスチューデントのｔ−検定を用いて比較した。必要な場合は、等分散分析を用いて対照群と処理群の比較を行った。有意な処理−時間相互作用が認められたときは、個々の対照を用いて各時点における処理手段を比較した；すなわち、もし有意な処理−時間相互作用が認められた場合、処理の効果が各時点において調査される。梗塞のサイズと脳の固有比重をスチューデントのｔ−検定で比較（処理群VS対照群）した。全ての結果は両側検定および危険率０．０５％で評価した。
結果
前記実験の結果を図１−３に示した。図１および２に示した通り、抗−ＣＤ１８抗体単独の投与は、対照群と比較して大脳血流量の有意な増加、並びに梗塞のサイズの有意な減少をもたらした。図３は、抗−ＣＤ１８抗体単独、ｔ−ＰＡ単独、もしくはこれら２つの薬剤の併用が、６−７時間の頭蓋内圧（ＩＣＰ）を減少させる傾向にあることを示している。さらに該実験では、抗−ＣＤ１８抗体がｔ−ＰＡに匹敵し、血餅を大脳循環中に導入した後３−５時間に投与すれば、ｔ−ＰＡの成果が改善されることが示された。
前記実験において認められた大脳血流量の増加および梗塞のサイズの減少は、標準的な発作の尺度により評価される臨床学的成果の改善を予測するものと考えられる。従って、本願は、本明細書で定義されたごとき発作を患っている患者における臨床上の成果を改善するための方法を提供する。
本実施例に記載されたモデルは、実験において動物が外因性全身性低血圧（動物の平均動脈圧を放血を制御することにより３０ｍｍＨｇまで減少させることによる）の状態に曝されないという点で、Bednarら，Stroke 23(1):152(1992)に従前に記載されたものとは異なる。また、抗−ＣＤ１８抗体が血栓塞栓形成後３０分以上経てから投与され、かつ投与量も異なっている。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人：Genentech,Inc.
University of Vermont and State Agricultural College
(ii)発明の名称：発作に関する抗−ＣＤ１８抗体
(iii)配列の数：16
(iv)相当する住所
(A)住所：Genentech,Inc.
(B)通り：460 Point San Bruno Blvd
(C)都市名：South San Francisco
(D)州：California
(E)国名：USA
(F)郵便番号：94080
(V)コンピューターが読み込むことのできる形態
(A)媒体腫：3.5インチ、1.44Mb フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換機
(C)オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：WinPatin(Genentech)
(vi)現出願の情報
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人の情報
(A)名前：Lee, Wendy M.
(B)登録番号：40,378
(C)委託/事件番号：P0978PCT
(ix)通信情報
(A)テレフォーン：415/225-1994
(B)テレファックス：415/952-9881
(C)テレックス：910/371-7168
(2)配列番号(SEQ ID NO):1の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：98アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
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(i)配列の特徴
(A)長さ：98アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
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(2)配列番号(SEQ ID NO):3の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：98アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
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(2)配列番号(SEQ ID NO):4の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：98アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：SEQ ID NO:4：
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(2)配列番号(SEQ ID NO):5の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：107アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
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(2)配列番号(SEQ ID NO):6の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：105アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
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(2)配列番号(SEQ ID NO):7の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：100アミノ酸
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(i)配列の特徴
(A)長さ：11アミノ酸
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(i)配列の特徴
(A)長さ：8アミノ酸
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(i)配列の特徴
(A)長さ：232アミノ酸
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(i)配列の特徴
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(2)配列番号(SEQ ID NO):12情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：450アミノ酸
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(i)配列の特徴
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(i)配列の特徴
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(i)配列の特徴
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(2)配列番号(SEQ ID NO):16の情報：
(i)配列の特徴
(A)長さ：8アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：SEQ ID NO:16：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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