(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
運動ニューロン疾患の予防および／もしくは治療のための、リルゾールおよびギャバペンチンもしくはそれらの製薬学的に許容できる塩の１種の組み合わせ剤。
【請求項２】
１０ないし４００重量部分のリルゾールが、３００ないし２４００重量部分のギャバペンチンあたりに使用される、請求項１に記載の組み合わせ剤。
【請求項３】
同時に、別個にもしくは時間にわたり間隔を空けられた使用のための組み合わせられた製剤としての、請求項１および２のいずれかに記載の組み合わせ剤。
【請求項４】
純粋な状態、またはいずれかの適合性かつ製薬学的に許容できる希釈剤もしくはアジュバントの存在下の、請求項１に記載の組み合わせ剤より成る製薬学的組成物。
【請求項５】
運動ニューロン疾患の予防および／もしくは治療のための医薬の製造のための、請求項１ないし３の１に記載の組み合わせ剤の使用。
【請求項６】
筋萎縮性側索硬化症の予防および／もしくは治療のための医薬の製造のための、請求項１ないし３の１に記載の組み合わせ剤の使用。
【請求項７】
進行性脊髄筋萎縮症、乳児脊髄筋萎縮症もしくは原発性側索硬化症の予防および／もしくは治療のための医薬の製造のための、請求項１ないし３の１に記載の組み合わせ剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、リルゾールおよびギャバペンチンもしくはそれらの製薬学的に許容できる塩の１種の組み合わせ剤、ならびに、とりわけ運動ニューロン疾患の予防および／もしくは治療に有用である医薬としてのその使用に関する。
【０００２】
運動ニューロン疾患は、とりわけ、筋萎縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮症、乳児脊髄筋委縮症および原発性側索硬化症を包含する。それらは脊髄中の運動ニューロンの進行性の喪失により引き起こされる。
【０００３】
シャルコー病およびルー・ゲーリッグ病の名称によってもまた知られる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、１８６５年にシャルコーにより初めて記述された。それは最も重要な運動ニューロン疾患である。ＡＬＳは運動ニューロンの変性から生じる致死性疾患である。該疾患は進行性麻痺により付随され、運動および呼吸機能の喪失、ならびにその後、最初の症状の出現後２ないし８年の期間以内に死につながる。
【０００４】
今日まで、リルゾール（２−アミノ−６−トリフルオロメトキシベンゾチアゾール）のみが、筋萎縮性側索硬化症の治療のために名称リルテック［ＲＩＬＵＴＥＫ］（商標）で市販されている。リルゾールは、主として該疾患の進行の速度を落とすことを可能にする。
【０００５】
ギャバペンチンもまた、神経変性性疾患およびとりわけ筋萎縮性側索硬化症の治療に推奨されている（米国特許第５，０４８，４７９号明細書）。ギャバペンチンは現在、癲癇の治療のため名称ニューロンチン［ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ］（商標）で市販されている。
【０００６】
今や、リルゾールおよびギャバペンチンもしくはそれらの製薬学的に許容できる塩の１種の組み合わせ剤が、リルゾール単独もしくはギャバペンチン単独よりかなり運動ニューロンの生存を増大させることを可能にすることが見出された。
【０００７】
該組み合わせ剤の効果は、筋萎縮性側索硬化症に罹っている患者の血清により誘発される精製されたラット運動ニューロンの細胞死について研究されている。
【０００８】
妊娠１４日のラット胚の脊髄から調製された精製された運動ニューロンを、至適濃度の組換え「脳由来神経栄養因子」（ＢＤＮＦ）（運動ニューロンの生存のための主要な神経栄養因子の１種）の存在下で培養する。２２時間後に、リルゾールおよびギャバペンチンを、単独もしくは組み合わせのいずれかで運動ニューロンに添加する。さらなる２時間後に、ＡＬＳに罹っている患者からの透析された血清の希釈物を添加する。翌日、生存する運動ニューロンの数を、位相差顕微鏡下での直接計数により評価する。
方法
化合物
本試験で使用されるリルゾールのストック溶液は、以下の様式で調製する。すなわち、５ｍｇのリルゾールを０．１０５ｍｌの塩酸の溶液（１Ｍ）に添加する。該溶液を攪拌し、そしてその後２．１ｍｌの二重蒸留水を添加する。
【０００９】
ギャバペンチンのストック溶液は、１７．１ｍｇのギャバペンチンを１ｍｌの二重蒸留水に溶解することにより直接調製する。
【００１０】
かように得られる溶液は、最大２４時間、４℃で保存することができる。
【００１１】
全部の希釈物は、細胞を処理する直前に完全培地中で新たに調製する。
運動ニューロンの精製
妊娠１４日のラット胚（チャールズ  リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）、フランス）は、ＣＯ2麻酔下の母親を、頸を引っ張ることにより殺した後に回収する。これらの胚を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝液（「リン酸緩衝生理的食塩水」、ＰＢＳ）（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中に入れる。
【００１２】
精製された運動ニューロンの均一な集団は、ＨＥＮＤＥＲＳＯＮら［Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．、Ｂｌｏｃｈ−Ｇａｌｌｅｇｏ，Ｅ．とＣａｍｕ，Ｗ．（１９９５）．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ．“Ｎｅｒｖｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｊ．ＣｏｈｅｎとＧ．Ｗｉｌｋｉｎ編）中、ｐｐ．６９−８１。オックスフォード  ユニバーシティ  プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン］およびＡＲＣＥら［Ａｒｃｅ，Ｖ．、Ｇａｒｃeｓ，Ａ．、ｄｅ  Ｂｏｖｉｓ，Ｂ．、Ｆｉｌｉｐｐｉ，Ｐ．、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．、Ｐｅｔｔｍａｎｎ，Ｂ．とｄｅ  Ｌａｐｅｙｒｉeｒｅ，Ｏ．（１９９９）．Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ＬＩＦＲｂｅｔａ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５５、１１９−１２６］により記述された方法を使用して得る。別の方法で述べられない限り、使用される培地の組成はこれらの参考文献で示されたものに同一である。妊娠１４日のラット胚からの脊髄を、滅菌ＰＢＳ中で切開し、そして運動ニューロンを含有する各脊髄の腹側の半分(ventral halves)を下位切開する（ｓｕｂｄｉｓｓｅｃｔｅｄ）。その後、それらを、外科用メスの助けを借りて小片に切断し、そしてカルシウムおよびマグネシウムを含まないＦ１０培地（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中でトリプシン（０．２５重量／容量％）で処理する。１５分後に、トリプシンを、重炭酸塩を含まない完全培地Ｌ１５（ライフ  テクノロジーズ  インク（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）により市販される）で置き換え、そして脊髄ニューロンを、一連のますます活発な摩砕により解離させる。トリプシンおよび細胞破片を、４％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の層を通す遠心分離により分離する。第一の精製段階を６．８％のメトリザミドの勾配上で実施する。運動ニューロンを含有する低密度画分をＢＳＡの層上で遠心分離し、そしてその後、磁性カラム（ミルテニイ  バイオテック  インク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．））の助けを借りて免疫選択により再精製する。この目的上、細胞を、発生のこの段階で運動ニューロンにより特異的に発現される低親和性ニューロトロフィンレセプターｐ７５NTRを認識する抗体１９２の５０μｌと混合された、５０μｌのＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡに再懸濁する。４℃で１０分間インキュベートした後に、運動ニューロンをＢＳＡ上で遠心分離する。細胞を、再度、８０μｌのＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ、および抗マウスウサギ抗体を用いて表面で移植された（ｇｒａｆｔｅｄ）２０μｌの磁性ビーズに懸濁し、そしてその後４℃で１５分間インキュベートする。その後、細胞をＢＳＡ上で再遠心分離し、そして磁性カラム中に移す。溶出される細胞は大型ニューロンであり；それらの８０ないし９０％が、タンパク質Ｉｓｌｅｔ−１（運動ニューロンに特異的なマーカー）を発現することが、免疫標識により示されることが可能である。
運動ニューロンの培養
精製された運動ニューロンを、ポリオルニチン−ラミニンで以前に被覆された１６ｍｍウェルにウェルあたり１０００個の運動ニューロンの密度で接種する。培地は、補充物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）Ｂ２７（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））および２％のウマ血清で補充されるがしかし抗生物質を含まない神経基礎培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）であり、総容量は０．５ｍｌである。運動ニューロンを、神経栄養因子ＢＤＮＦ（１ｎｇ／ｍｌ；シグマ（Ｓｉｇｍａ））の存在下に接種し、そして２２時間沈降で放置し、その間にそれらが支持体に付着しそして神経突起を発生させる。リルゾール（３×１０5Ｍ）およびギャバペンチン（３×１０-5Ｍ）を、別個にもしくは組み合わせ剤のいずれかとして、一連の４個のウェルに添加する。２時間後に、ＡＬＳに罹っている患者からの透析された血清をウェルに添加する。その後、運動ニューロンを、それらの生存を評価する前に、３７．２℃で１日間培養する。
運動ニューロンの生存の定量
培養プレートをインキュベーターから取り出す。運動ニューロンを含有するウェルを、中程度に温かいＬ１５培地（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で完全に満たす。その後、位相差光学装置下で培地の表面全体の観察を可能にする水平のメニスカスを形成するように、それらの蓋を正しい位置にもとへ戻す。各ウェルについて、運動ニューロンの総数を、顕微鏡野の２個の直交する直径（ｘおよびｙ）に沿って計数する。ヒト血清の存在が生存する運動ニューロンの形態学さえ変えるという事実を考えれば、神経突起を担持しかつ培養支持体に付着される全部の細胞が生存していると考えられる。
データの解析
生存値（いわば、ウェル直径あたりの運動ニューロンの数）を、各実験で４個の独立したウェルについての８個の測定値の平均±ＳＥＭとして計算する。
【００１３】
統計学的解析をスチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）検定（ｔ−検定）を使用して実施する。
【００１４】
得られた結果を以下の表に挙げる：
【００１５】
【表１】
0004928697.tif 000002
【００１６】
ＢＤＮＦ（１ｎｇ／ｍｌ）を、一般的技術で挙げられたように全部の実験に添加する。これらの結果は：
ａ−ＡＬＳに罹っている患者からの血清は、神経栄養性の支援の存在下でさえ運動ニューロンの８９％の死を誘発し、従って１１％の生存するニューロンを残す。
ｂ−培地をリルゾール単独で処理する場合、運動ニューロンの生存は１９％である
ｃ−培地をギャバペンチン単独で処理する場合、運動ニューロンの生存は８％である
ｄ−培地をリルゾールおよびギャバペンチンの組み合わせ剤で処理する場合、運動ニューロンの生存は６１％であり、従って２種の分子の間の相乗効果を立証する
ことを立証する。
【００１７】
リルゾールは、米国特許第４，３７０，３３８号明細書に記述される方法に従って製造してよい。
【００１８】
ギャバペンチンは、仏国特許第２，２９４，６９７号および米国特許第４，０２４，１７５号明細書に記述される方法に従って製造してよい。
【００１９】
リルゾールおよびギャバペンチンの製薬学的に許容できる塩として、とりわけ、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸のような無機酸、もしくは酢酸、プロピオン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、フマル酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸、テオフィリン酢酸、サリチル酸、フェノールフタリン酸、メチレンビス−β−オキシナフトン酸のような有機酸との付加塩、またはこれらの誘導体の置換誘導体を挙げることができる。
【００２０】
該組み合わせ剤は、同時にもしくは別個に、または時間にわたり空間を空けられたかのいずれかで、経口、非経口もしくは直腸経路により使用してよい。
【００２１】
本発明はまた、純粋な状態、あるいは１種もしくはそれ以上の適合性かつ製薬学的に許容できる希釈剤および／もしくはアジュバントとの組み合わせ剤、ならびに／または場合によっては別の製薬学的に適合性かつ生理学的に有効な成分との組み合わせ剤の形態の、リルゾールおよびギャバペンチンもしくはそれらの製薬学的に許容できる塩の１種の組み合わせ剤を含んで成る製薬学的組成物にも関する。
【００２２】
経口投与のための固体組成物として、錠剤、丸剤、散剤（ゼラチンカプセル剤、カシェ剤）もしくは顆粒剤を利用してよい。これらの組成物において、有効成分を、デンプン、セルロース、ショ糖、乳糖もしくはシリカのような１種もしくはそれ以上の不活性希釈剤とアルゴン流下で混合する。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、１種もしくはそれ以上の、ステアリン酸マグネシウムもしくはタルクのような滑沢剤、着色剤、コーティング（糖衣錠）もしくは光沢（ｇｌａｚｅ）もまた含んでよい。
【００２３】
経口投与のための液体組成物として、水、エタノール、グリセロール、植物油もしくはパラフィン油のような不活性希釈剤を含有する製薬学的に許容できる溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ剤およびエリキシル剤を利用してよい。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば湿潤生成物、甘味料、増粘剤、着香料もしくは安定剤を含んでよい。
【００２４】
非経口投与のための滅菌組成物は、好ましくは水性もしくは非水性である溶液、懸濁剤または乳剤であってよい。溶媒もしくはベヒクルとして、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、とりわけオリーブ油、注入可能な有機エステル、例えばエチルオレエートもしくは他の適する有機溶媒を利用してよい。これらの組成物は、アジュバント、とりわけ湿潤剤、等張剤、乳化剤、分散剤および安定剤もまた含有してよい。滅菌はいくつかの方法で、例えば無菌濾過、該組成物中に滅菌剤を組み込むこと、照射もしくは加熱により実施してよい。それらはまた、使用の時点で滅菌水もしくはいずれかの他の注入可能な滅菌媒体に溶解することができる滅菌の固体組成物の形態でも製造してよい。
【００２５】
直腸投与のための組成物は、有効成分に加えて、カカオバター、半合成グリセリドもしくはポリエチレングリコールのような賦形剤を含有する坐剤もしくは直腸カプセル剤である。
【００２６】
本発明はまた、運動ニューロン疾患、およびとりわけ筋萎縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮症、乳児脊髄筋萎縮症もしくは原発性側索硬化症の予防および／もしくは治療に有用な医薬の製造のための、リルゾールおよびギャバペンチンもしくはそれらの製薬学的に許容できる塩の１種の組み合わせ剤の使用にも関する。
【００２７】
本発明はまた、患者に、リルゾールおよびギャバペンチンもしくはそれらの製薬学的に許容できる塩の１種の組み合わせ剤を、同時にもしくは別個にまたは時間にわたり間隔を空けられたかのいずれかで投与することに存する、運動ニューロン疾患、およびとりわけ筋萎縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮症、乳児脊髄筋萎縮症もしくは原発性側索硬化症に罹っている患者の予防および／もしくは治療方法にも関する。
【００２８】
用量は、所望の効果、治療の持続期間および使用される投与経路に依存し；それらは、一般に、１０から２００ｍｇまでのリルゾールの範囲にわたる単位用量を伴い成人について経口経路により１日あたり１０から４００ｍｇまで、また、１００ないし４００ｍｇのギャバペンチンの単位用量を伴い成人について経口経路により１日あたり１００から２４００ｍｇまでである。
【００２９】
一般に、医師が、年齢、体重、および治療されるべき被験体に特定の全部の他の因子に従って、適切な投薬量を決定することができる。
【００３０】
本発明はまた、１０ないし４００重量部分のリルゾールが３００ないし２４００重量部分のギャバペンチンあたりに使用される組み合わせ剤にも関する。