(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析対象核酸に由来する複数のフラグメントについて、各フラグメント上の隣接しない２箇所の塩基配列と、前記塩基配列に挟まれた領域の長さを測定することにより、前記解析対象核酸の塩基配列を解析する方法であって：
固相化したプライマに１本鎖化した前記フラグメントをハイブリダイズさせ、前記プライマからの伸長反応を行うとともに、前記プライマ下流の塩基配列の少なくとも一部を解析する工程と、
前記伸長反応で生じた２本鎖核酸の長さを測定する工程、
を含むことを特徴とする核酸解析方法。
【請求項２】
解析対象核酸に由来する複数のフラグメントについて、各フラグメント上の隣接しない２箇所の塩基配列と、前記塩基配列に挟まれた領域の長さを測定することにより、前記解析対象核酸の塩基配列を解析する方法であって：
固相化した第１プライマに１本鎖化した前記フラグメントをハイブリダイズさせ、前記第１プライマからの伸長反応を行うとともに、前記第１プライマ下流の塩基配列の少なくとも一部を解析する工程と、
前記第１プライマ伸長鎖を一本鎖化して、第２プライマをハイブリダイズさせ、前記第２プライマからの伸長反応を行うとともに、前記第２プライマ下流の塩基配列の少なくとも一部を解析する工程と、
前記伸長反応で生じた２本鎖核酸の長さを測定する工程、
を含むことを特徴とする核酸解析方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記フラグメントの両方の鎖が同一のプライマにハイブリダイズするものであって、
前記伸長反応で生じた２本鎖核酸の長さが同一である２つの１本鎖フラグメントを選択し、それらが相補鎖をなすものとして前記解析対象核酸の塩基配列を解析することを特徴とする核酸解析方法。
【請求項４】
前記フラグメントがその両末端にタグ配列を付加されたものである、請求項１に記載の核酸解析方法。
【請求項５】
前記プライマが前記タグ配列と少なくとも一部において相補的である、請求項４に記載の核酸解析方法。
【請求項６】
前記伸長反応で生じた２本鎖核酸にインターカレータを反応させ、その発光強度から前記２本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項１に記載の核酸解析方法。
【請求項７】
２本鎖核酸の長さとインターカレータとの発光強度との相関を求めることにより、前記２本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項６に記載の核酸解析方法。
【請求項８】
前記伸長反応を標識された基質を用いて行い、そのシグナル強度から前記２本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項１に記載の核酸解析方法。
【請求項９】
前記標識が蛍光物質によるものであり、その蛍光強度から前記２本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項８に記載の核酸解析方法。
【請求項１０】
前記標識が放射性物質によるものであり、その放射線強度から前記２本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項８に記載の核酸解析方法。
【請求項１１】
前記標識が化学発光基質によるものであり、その化学発光強度から前記２本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項８に記載の核酸解析方法。
【請求項１２】
表面にプライマが配置された基板と、
基板上に核酸試料あるいは試薬を分注するための分注機構と、
核酸の変性、ハイブリダイゼーションを行うための温調機構と、
塩基配列決定及び核酸の長さ測定のための照射検出機構と、
前記機構を制御するための制御機構と、
前記検出結果を解析するための解析機構と、
前記解析結果を出力するための出力機構と、
を有し、
前記解析機構が、解析対象核酸に由来する複数のフラグメントについて、各フラグメント上の隣接しない２箇所の塩基配列と前記塩基配列に挟まれた領域の長さから、前記解析対象核酸の塩基配列を解析することを特徴とする核酸解析装置。
【請求項１３】
表面にプライマが配置された基板と、
基板上に核酸試料あるいは試薬を分注するための分注機構と、
核酸の変性、ハイブリダイゼーションを行うための温調機構と、
塩基配列決定及び核酸の長さ測定のための照射検出機構と、
前記機構を制御するための制御機構と、
前記検出結果を解析するための解析機構と、
前記解析結果を出力するための出力機構と、
を有し、
前記基板上にサイズマーカが配置されていることを特徴とする核酸解析装置。
【請求項１４】
前記基板上のサイズマーカが長さの異なる２以上の２本鎖ＤＮＡであることを特徴とする請求項１３に記載の核酸解析装置。
【請求項１５】
前記基板上のサイズマーカが固定されている領域は、プライマが固定されている領域から隔離されていることを特徴とする請求項１３に記載の核酸解析装置。
【請求項１６】
前記基板上のサイズマーカが固定されている領域は、プライマが固定されている領域の温調領域範囲外であることを特徴とする請求項１３に記載の核酸解析装置。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡ等の核酸を解析する方法について、核酸上の隣接しない２箇所の塩基配列を解読し、併せて前記塩基配列に挟まれた領域の長さを測定する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列決定法は重要な技術である。通常は、予め配列決定用のＤＮＡ断片又は断片群に蛍光標識した試料を調製し、電気泳動した後又は電気泳動中に分子量分離展開パターンを計測し解析する。具体的には、電気泳動分離に先立ち、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行する。分析すべき試料ＤＮＡの既知の塩基配列部分と相補的な約２０塩基長のオリゴヌクレオチドを合成し蛍光体を標識する。このオリゴヌクレオチドをプライマとし、約１ピコモルの試料ＤＮＡと相補鎖結合させて、ポリメラーゼにより相補鎖伸長反応を実行する。このとき基質として、４種のデオキシヌクレオチド３リン酸、即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びこれらに加えて、例えばｄｄＡＴＰを加える。ｄｄＡＴＰが相補鎖伸長で取り込まれると、それ以上相補鎖が伸長しないため、アデニン（Ａ）で終結する様々な長さの断片が調製される。上記反応でｄｄＡＴＰの代わりに、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰを各々加えた反応を行なう。但し、各反応で用いるプライマは、塩基配列は同じであるが、蛍光を分光して互いに識別できる４種の蛍光体で標識する。以上の４種の反応物を混合すると、試料ＤＮＡに相補的な数１００塩基長までの１塩基ずつ長さが異なる断片が、末端の塩基種に応じて異なる４種の蛍光体で標識されて得られる。これをキャピラリーゲル電気泳動により１塩基の分解能で分離する。試料は分離されながら泳動し、短いものから順にレーザ照射される。発光蛍光を複数のフィルタを用いて分光しながら計測すると、４種の蛍光体の蛍光強度の時間変化から、全ての断片の末端塩基種を短い断片から順に決定できるというものである。
【０００３】
近年、塩基の伸長反応を利用し、反応が進むと同時に配列データを取得する方法として、ＤＮＡの伸長反応に伴ってピロリン酸が放出されることを利用したパイロシークエンス法が実用化されている（非特許文献１）。この方法はビーズ上もしくは基板上に試料ＤＮＡを固定化し、試料ＤＮＡに４種のｄＮＴＰのうち特定の塩基を供給し、伸長反応の有無をピロリン酸の放出の有無で検出し、試料ＤＮＡの配列を決定していく。具体的には放出されたピロリン酸とアデノシン５’−ホスホ硫酸からＡＴＰスルフリラーゼの触媒反応でＡＴＰを生成させ、このＡＴＰがルシフェリン、ルシフェラーゼの存在下で発光反応を引き起こす。発光の有無によりピロリン酸の放出の有無を確認する。
【０００４】
さらに、分析すべき試料ＤＮＡ断片を基板表面にランダムに１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定する方法も提案されている（非特許文献２）。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、かつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行う工程、次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、これを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【０００５】
いずれの技術も従来のキャピラリ電気泳動法に比べ、一度に処理可能なサンプル数を圧倒的に多くすることが可能であるため、解析スループットは大幅に向上する。しかしながら１サンプルあたりの解読塩基長が短いため、例えば解読した配列をゲノムデータベースに照らし合わせてその位置情報を解析する際、誤った位置情報を示してしまうという問題がある。
【０００６】
上記問題を解決する手段として、予め約１ｋｂにサイズが決められたフラグメントの、両末端の配列情報を利用する方法が提唱されている（非特許文献３）。この手法は、まず断片化したゲノムＤＮＡをゲル電気泳動により分離し、約１ｋｂのフラグメントを抽出し、前記フラグメントと既知のタグ配列とをライゲーションすることで環状化し、前記タグ配列の両端に配置された制限酵素  ＭｍｅＩサイトを利用して、前記タグ配列とその両外側に前記フラグメントの両端部分が追加された約１３５ｂの断片を切り出す。得られた断片を１μｍのビーズ上でエマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）により増幅し、捕捉用ビーズによって分離・抽出し、基板上に固定した後、シーケンシングタグを利用して配列を解読する。本手法では、約１ｋｂのフラグメントの両端１３ｂを解読することで、配列解析を行っている。
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、  ｖｏｌ．２４２（１）、  ｐｐ８４、  １９９６
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、  ｖｏｌ．１００（７）、  ｐｐ３９６０、  ２００３
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ、  ｖｏｌ．３０９（５７４１）、  ｐｐ１７２８、  ２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前述の約１ｋｂのフラグメントの両末端配列情報を利用する方法は、事前に１ｋｂのフラグメントをゲル電気泳動により分離する作業が必要となるため、一連の操作が煩雑である。また解析対象が１ｋｂのフラグメントのみに限定されており、他のサイズのフラグメントを利用できないため、全ての核酸試料を解析するためには何度も解析を行わねばならずコスト高となる。更にフラグメントをｅＰＣＲによって増幅しているため、ＰＣＲエラーに伴う読み取りエラーの発生率が高い。
【０００９】
本発明の目的は、操作性が良く、安価で、信頼性の高い核酸解析手法及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、解析対象核酸に由来する複数のフラグメントについて、各フラグメント上の隣接しない２箇所の塩基配列と、前記塩基配列に挟まれた領域の長さを測定することにより、前記解析対象核酸の塩基配列を解析する。この方法は、固相化したプライマに１本鎖化した前記フラグメントをハイブリダイズさせ、前記プライマからの伸長反応を行うとともに、前記プライマ下流の塩基配列の少なくとも一部を解析する工程と、前記伸長反応で生じた２本鎖核酸の長さを測定する工程とを含む。
【００１１】
１つの実施形態において、本発明の方法は、２種のプライマを用いてフラグメントの一方の鎖の両末端の配列を解析する。具体的にいえば、この方法は、固相化した第１プライマに１本鎖化した前記フラグメントをハイブリダイズさせ、前記第１プライマからの伸長反応を行うとともに、前記第１プライマ下流の塩基配列の少なくとも一部を解析する工程と、前記第１プライマ伸長鎖を一本鎖化して、第２プライマをハイブリダイズさせ、前記第２プライマからの伸長反応を行うとともに、前記第２プライマ下流の塩基配列の少なくとも一部を解析する工程と、前記伸長反応で生じた２本鎖核酸の長さを測定する工程を含む。
【００１２】
別の実施形態において、本発明の方法は、１種のプライマを用いてフラグメントの両方の鎖の片側末端配列（５’末端配列）を解析する。この方法では、フラグメントの両方の鎖が同一のプライマにハイブリダイズするようになっている。そして、伸長反応で生じた２本鎖核酸の長さが同一である２つの１本鎖フラグメントを選択し、それらが相補鎖をなすものとして前記解析対象核酸の塩基配列を解析する。
【００１３】
本発明の方法において、配列解析には、公知のいずれの方法を用いてもよく、例えば、
サンガー法、パイロシークエンス法、一塩基伸長反応法等を利用することができる。また、解析するプライマ下流の塩基配列は必ずしも３’末端からの配列でなくてもよく、好ましくは５〜２０塩基長程度、より好ましくは２０〜１００塩基長程度である。
【００１４】
本発明の方法では、プライマを解析対象核酸に応じて設計しなくてもよいように、各フラグメントの両末端には共通のタグ配列を付加しておくことが望ましい。これにより、タグ配列と少なくとも一部が相補的である共通の１種又は２種のプライマを用いて、各フラグメントの片側又は両末端の配列解析を行うことが可能となる。
【００１５】
本発明の方法において、２本鎖核酸の長さは、例えばインターカレータを用いて実施できる。インターカレータとしては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＰｉｃｏＧＲＥＥＮ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ  ｒｅａｇｅｎｔ等を利用することができる。長さの測定は、あらかじめサイズマーカを用いて検量線を作成し、２本鎖核酸の長さとインターカレータの発光強度との相関から求めることができる。インターカレータは通常ＤＮＡを含む溶液濃度の決定に用いられるが、単分子観察の場合１分子のインターカレータが結合する塩基数がほぼ一定であるため、インターカレータの発色強度と核酸の長さは比例する。
【００１６】
あるいは、伸長反応を標識された基質（ｄＮＴＰ）を用いて行い、そのシグナル強度から前記２本鎖核酸の長さを測定することもできる。基質の標識は、蛍光物質、放射性物質、あるいは化学発光基質を用いて行なうことができる。利用可能な蛍光物質としては、例えば、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ誘導体、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ誘導体、各種Ｃｙ系色素等が、利用可能な放射性物質としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ等が、利用可能な化学発光物質としては、ペルオキシダーゼ基質、アルカリフォスファターゼ基質等を挙げることができる。
【００１７】
また本発明は、前記核酸解析方法を実施するための核酸解析装置を提供する。この装置は、表面にプライマが配置された基板と、基板上に核酸試料あるいは試薬を分注するための分注機構と、核酸の変性、ハイブリダイゼーションを行うための温調機構と、塩基配列決定、核酸の長さ測定のための照射検出機構と、前記機構を制御するための制御機構と、前記検出結果を解析するための解析機構と、前記解析結果を出力するための出力機構とを有する。
【００１８】
インターカレータを用いて核酸の長さを測定する場合、前記基板上にはサイズ決定のためのサイズマーカが配置されていることが好ましい。このサイズマーカは長さの異なる２以上の２本鎖ＤＮＡであることが好ましい。サイズマーカは高温で変性されないよう、その固定領域が、プライマ固定領域から隔離されているか、プライマ固定領域の温調範囲外にあることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、核酸配列解析において、ゲル電気泳動やＰＣＲ等の煩雑な前処理が不要となり、従来法と比較して操作性が向上する。また、種々のフラグメントサイズからなる核酸試料を同時に解析可能であるため、従来法と比較して解析コストが低減する。また、ＰＣＲによる試料増幅が不要であるため、ＰＣＲエラーに伴う読み取りエラー率を除外でき、従来法と比較して信頼性が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１：
図１は、本発明を利用したＤＮＡ解析方法を示したものである。以下、実際の計測手順に従って配列決定法を説明する。
【００２２】
まず試料となるゲノムＤＮＡ等の核酸を超音波等によって切断し、種々の長さからなる断片を得る。ｄＡＴＰを添加し、ターミナルトランスフェラーゼ活性を持つ酵素を反応させ、断片の３’末端にＡを１塩基付加した核酸試料１を作成する。例えば酵素はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼで、反応条件は６０℃・１０分間である。配列表の配列番号１に示される塩基配列を有する３’末端にＴが１塩基突出した２本鎖ＤＮＡタグ２を準備し、タグ：核酸試料＝２：１の割合でライゲーション反応を行い、（タグ）−（核酸試料）−（タグ）と構成されるフラグメント３を作成する。
【００２３】
フラグメント３を熱変性等によって一本鎖化した一本鎖合成核酸４を、固相５上に固定された、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有する第１のプライマ６にハイブリダイズさせる。反応は例えば６０℃・１０分間で行う。プライマ６の配列は、配列番号２に限定されるものではなく、前記２本鎖ＤＮＡタグ２の短鎖と少なくとも一部が相補的であればよい。なおプライマ６のハイブリダイゼーション効率を鑑みて、塩基長は１０以上であることが望ましい。
【００２４】
次に標識されたｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを逐次添加しながら塩基伸長反応を行い、第１のプライマ下流の塩基配列７を解読する。例えば、まずＣｙ３−ｄＡＴＰ及び、ＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液（２０ｎＭ  Ｃｙ３−ｄＡＴＰ、  ０．１Ｕ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を、固相上のフラグメントと５分間反応させる。次に洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）によって、未反応のＣｙ３−ｄＡＴＰを除去する。波長５３２ｎｍのＹＡＧレーザを励起光として蛍光観察を行い、２次元ＣＣＤで蛍光を検出し、取り込みが行われたフラグメントを特定し、配列を決定する。励起光強度は、例えば１０００ｍＷ／ｍｍ２で、ＣＣＤの露光時間は１００ｍｓｅｃであるが、この条件は使用するＣＣＤの性能によって変化する。なおＣｙ３分子は励起光の照射で消光するため、観察時にはより低い励起光強度で観察を行うことが望ましい。消光を抑制する手段としては、脱酸素剤の添加も有効である。これはＣｙ３分子の消光が、溶液中の溶存酸素との反応に起因するためである。脱酸素剤は、例えばペルオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼなどである。Ｃｙ３蛍光を観察後、強い励起光を照射するなどして、既に取り込まれたＣｙ３−ｄＡＴＰ由来の蛍光が次工程で生じないようにする。以上の一連の反応工程をｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰの順に行う。この操作を８０サイクル行うことで、各フラグメントの固相側のおよそ２０〜３０塩基が解読できる。
【００２５】
なお、本実施例では１種類の蛍光色素を用い、逐次反応による塩基配列解読を行っているが、別の方式を用いても構わない。例えば４種類のｄＮＴＰの３’−ＯＨ基に対し、ニトロベンジル基を介して異なる４種類の蛍光色素を結合させた標識ｄＮＴＰを用いる場合、本実施例のようにｄＮＴＰを１種類ずつ反応させなくても良い。すなわち、３’−ＯＨ基の蛍光色素が保護基となり、取り込みが行われた段階でその後の伸長反応が進まなくなる。このことを利用して、塩基配列の解読を行う。例えば、４種類の蛍光標識ｄＮＴＰ及び、ＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液（２０ｎＭ  蛍光標識ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、  ０．１Ｕ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を、固相上のフラグメントと５分間反応させる。次に洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）によって、未反応の蛍光標識ｄＮＴＰを除去する。励起光を照射し２次元ＣＣＤで前記４種類の蛍光を観察し、各蛍光標識ｄＮＴＰの取り込みが行われたフラグメントを特定し、配列を決定する。４種類の蛍光色素としては、例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８を用いることができる。蛍光のクロスコンタミネーションを防ぐため、なるべく蛍光波長帯が離れているものを選択することが好ましい。励起光は、それぞれの蛍光色素の波長特性に適した励起光源を用いるか、バンドパスフィルタ等を用いて多波長光から目的の波長成分を分離して用いる。蛍光も同様に、それぞれの蛍光色素の波長特性に適したバンドパスフィルタ等を用いて、目的の波長成分を分離して蛍光観察を行う。観察後、化学的又は物理的手段によって蛍光色素を切り離し、直前に取り込まれた蛍光標識ｄＮＴＰの３’−ＯＨ基を解放する。切り離す手段は、例えば波長３６０ｎｍ以下のＵＶ照射などである。切り離した蛍光色素を洗浄バッファーにより除去する。以上の一連の操作を複数回行うことで、塩基配列の解読が可能である。
【００２６】
第１のプライマ下流の塩基配列を解読後、通常の塩基伸長反応によって相補鎖８を形成する。反応は、例えば、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ及びターミナルトランスフェラーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液で、５５℃で１分間伸長反応を行う。ＤＮＡポリメラーゼは、例えばＥｘＴａｑＴＭ  （ＴａＫａＲａ）等である。
【００２７】
合成した２本鎖の長さを測定する。測定にはインターカレータ９を添加して蛍光観察を行い、その蛍光強度から２本鎖の塩基長を求める。インターカレータ９は、例えばＰｉｃｏＧＲＥＥＮ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等を用い、波長４８８ｎｍのＡｒレーザーを励起光として蛍光観察を行い、図２に示すような検量線をもとにフラグメントの長さを測定する。励起光強度は例えば１ｍＷ／ｍｍ２で、ＣＣＤの露光時間は１００ｍｓｅｃである。本実施例では、５００ｂｐラダーマーカを基板上のプライマとは別の領域に固定し、ＰｉｃｏＧＲＥＥＮ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ溶液を添加し、前記条件下で蛍光観察を行い、蛍光強度とＤＮＡサイズの相関を取り、検量線を作成した。本実施例では長さの測定にインターカレータを使用しているが、それ以外の手法を用いても構わない。例えば前工程で相補鎖８を合成する工程において、標識されたｄＮＴＰを用いることで長さの測定が可能である。例えば蛍光標識ｄＮＴＰであれば蛍光観察によって、またＲＩ標識ｄＮＴＰであればＲＩ強度測定によって、２本鎖の長さを測定可能である。また例えばペルオキシダーゼ基質が修飾されたｄＮＴＰを用いて２本鎖合成を行い、ペルオキシダーゼの添加による化学発光から長さを測定できる。
【００２８】
長さを測定後、インターカレータ９を含む固相上の２本鎖フラグメント１０に対し熱変性操作を行い、１本鎖化すると同時に、インターカレータ９を遊離させる。洗浄バッファーを用いて、遊離した１本鎖フラグメントとインターカレータ９を除去する。以上の操作により、固相上には先程配列を解読した塩基配列を含むフラグメントの相補鎖１１が残る。
【００２９】
第１のプライマと同じ配列を含む第２のプライマ１２（配列番号２）をハイブリダイズさせ、先程と同様に蛍光標識されたｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを逐次添加しながら塩基伸長反応を行い、第２のプライマ下流の塩基配列１３を解読する。本実施例では、第１のプライマ６と第２のプライマ１２は同じ配列であるが、これは両者が２本鎖ＤＮＡタグ２にハイブリダイズするように設計されているからである。例えば両者がそれぞれ別の配列にハイブリダイズする場合、それぞれがハイブリダイズするタグ配列をもとにプライマの配列が決定される。また本実施例では核酸試料の両末端にプライマをハイブリダイズさせているが、プライマが核酸試料の末端以外にハイブリダイズする場合、相補鎖８を合成する工程の後に長さの測定を行わず、第２のプライマ下流の塩基配列１３を解読後、２本鎖形成のための伸長反応を行い、そこで長さの測定を行う。
【００３０】
以上の操作により、核酸上の隣接しない２箇所の塩基配列を解読し、併せて前記塩基配列に挟まれた領域の長さを測定する。本実施例の手法を用いて、例えば２５ｂの解読された塩基配列に挟まれた長さ１ｋｂの核酸試料をゲノムデータベースに照会した結果、連続した５０ｂｐの塩基配列をもとに解析するときの結果よりも、ゲノム上の位置を一意に特定する確率は高くなることが確認された。
【００３１】
本実施例によれば、核酸配列の解析において、ゲル電気泳動やＰＣＲ等の煩雑な前処理が不要となり、従来法と比較して操作性が向上する。また、種々のフラグメントサイズからなる核酸試料を同時に解析可能であるため、従来法と比較して解析コストが低減する。また、ＰＣＲによる試料増幅が不要であるため、ＰＣＲエラーに伴う読み取りエラー率を除外でき、従来法と比較して信頼性が向上する。
【００３２】
実施例２：
実施例１では核酸試料の両末端側の配列を解読したが、解析は片側末端側の配列のみでも実現できる。実施例１と同様に、同一のタグ配列を両末端に有する（タグ）−（核酸試料）−（タグ）を調製する。このフラグメントを熱変性し、生じた２本の相補的な１本鎖フラグメントは、いずれも同一配列のタグ部を有しており、固相上に固定しているプライマ（タグと相補的配列を有する）とハイブリダイズする。実施例１と同様に固相に固定化したプライマを基点としたシーケンス反応を行うことで、あるフラグメントの５’末端側の塩基配列と、前記フラグメントと相補的なフラグメントの５’末端側の塩基配列とが、それぞれ基板上の異なる位置において解読される。次いで、通常の塩基伸長反応によって相補鎖を形成することで、基板上の各フラグメントの長さを測定する。前記２本の相補的な１本鎖フラグメントは、その長さが同じである。それ以外の核酸試料はランダムな長さで調製されているため、同じ長さのフラグメント同士を相補鎖をなすものとして選択することにより、核酸試料の両末端の塩基配列情報と、その長さ情報を取得できる。
【００３３】
実施例３：
図３は、本発明の解析方法を使ったＤＮＡ解析装置の構成図である。装置は正立型の顕微鏡様の装置構成であり、基板１４に捕捉するＤＮＡ分子の伸長状態を蛍光検出にて測定する。なお倒立型の顕微鏡様の装置構成にすることも可能である。なお、本操作は単分子蛍光検出法に基づく場合、測定はＨＥＰＡフィルタを介したクリーンルーム様の環境にて行う。
【００３４】
一連の反応は１４の反応基板上で行う。基板１４は透明材質でできており、材質としては例えば合成石英などが使用できる。基板には第１のプライマ６（配列番号２）が複数固定されている。例えば第１のプライマ６の５’末端がビオチン化されており、基板表面がアビジン化されており、ビオチン−アビジン結合を利用して基板１４表面に固定されている。第１のプライマは基板上にランダムに配置されていても構わないが、観察時の効率を考慮し、規則的に配置されていることが望ましい。また基板上には、図４に示すように、核酸試料１の長さを測定する際の検量線作製用のサイズマーカが、上記プライマが固定されている領域１４ａとは別の領域１４ｂに固定されている。サイズマーカは長さの異なる２本鎖ＤＮＡ分子であることが好ましい。固定化方法は、第１のプライマ６と同様、ビオチン−アビジン結合を利用する。基板上での反応の温度コントロールは、温調ユニット１５で行う。なお温調ユニット１５は、基板１４のプライマが固定されている領域１４ａのみに作用し、サイズマーカが固定されている領域１４ｂに影響を与えないものとする。
【００３５】
各種試薬、バッファーは試薬保管ユニット１６に保管し、分注ユニット１７を介し、送液チューブ１８を通じて基板に送られる。試薬保管ユニット１６には、試料液容器１６ａ、４種の標識ｄＮＴＰ溶液容器１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ、プライマ溶液容器１６ｆ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ溶液容器１６ｇ、ポリメラーゼ溶液容器１６ｈ、インターカレータ溶液容器１６ｉ、洗浄液容器１６ｊ等が用意される。反応後の試薬は廃液チューブ１９を通じて廃液容器２０に溜まる。
【００３６】
配列解析のデータは基板１４上方に取り付けられた２次元センサカメラ２１を通じて制御ＰＣ２２に取り込まれ、モニタ２３で観察できる。試薬の送液、基板の温度は制御ＰＣ２２を通じてコントロールする。
【００３７】
本実施例ではｄＮＴＰの標識としてＣｙ３を用いているが、本発明に用いる標識分子はこれに限るものではない。また、例えば４種のｄＮＴＰに対し、異なる４種の蛍光体で標識することも可能である。
【００３８】
蛍光励起用のレーザ装置２４（ＹＡＧレーザ、５３２ｎｍ）からのレーザ光２４ａをλ／４波長板２６を通して円偏光とし、ミラー２７、ダイクロイックミラー２８、ミラー２７を介して全反射照明用の石英製プリズム２９に入射し、基板１４の裏側から照射する。石英製プリズム２９と基板１４は無蛍光グリセリンを介して接触させており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板１４に導入される。基板内でのレーザ光の入射角は約６６度〜６８度（角度は基板の屈折率と試料溶液の屈折率によって変化する）で基板１４表面で全反射し、エバネッセント照明となる。これにより、高いＳ／Ｎで蛍光測定が可能になる。レーザの照射領域は約２ｍｍ径とした。また、レーザ装置２４とは別にレーザ装置２５（Ａｒレーザ光２５ａ、４８８ｎｍ）を配置し、レーザ光２４ａと同軸にして照射できるようにした。本レーザは、基板上の２本鎖ＤＮＡのサイズを測定するために添加するインターカレータを励起するためのものである。
【００３９】
蛍光３０は、集光レンズ（対物レンズ）３１で集められ、フィルタユニット３２で必要な波長の蛍光を取り出し、結像レンズ３３で、２次元センサカメラ２１で蛍光像を検出する。フィルタユニット３２には検出する蛍光に対応したフィルタが複数保持されており、その制御は制御ＰＣ２２が行う。例えば４種の蛍光色素が付加されたｄＮＴＰを使う場合は、フィルタユニット３２で該当する４種の蛍光体用のフィルタを切り替えて蛍光像を検出することなどで対応できる。２次元センサカメラ２１の露光時間の設定、蛍光画像の取り込みタイミングなどの制御は、２次元センサカメラコントローラ３４を介して制御ＰＣ２２が行う。２次元センサカメラ２１は、例えば画素サイズが１６×１６μｍで、画素数５１２×５１２画素のＥＭ−ＣＣＤカメラである。その他一般的な冷却ＣＣＤカメラの他、Ｃ−ＭＯＳエリアセンサなどの撮像カメラなどを使うことができる。センサは冷却型が望ましく、−２０℃程度以下にすることで、センサの持つダークノイズを低減出来、測定の精度を高めることができる。
【００４０】
以上、各実施の形態に沿って本発明を説明したが、本発明はこれらのみに制限されるものではない。その他、種々の変更、改良、組み合わせが可能なことは当業者に自明であろう。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、核酸解析、特にゲノム解析における単分子シークエンスに有用である。したがって、生物、化学、医療等を含むライフサイエンス分野において幅広く利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、実施例１における、反応工程の説明図である。
【図２】図２は、実施例１における、フラグメントサイズ測定のための検量線である。
【図３】図３は、実施例３における、ＤＮＡ解析装置の説明図である。
【図４】図４は、実施例３における、ＤＮＡ解析装置の基板の説明図である。
【符号の説明】
【００４３】
１…核酸試料、２…２本鎖ＤＮＡタグ、３…フラグメント、４…１本鎖化したフラグメント、５…固相、６…第１のプライマ、７…第１のプライマ下流の解読した配列、８…伸長により合成した相補的フラグメント、９…インターカレータ、１０…インターカレータを含む２本鎖フラグメント、１１…１本鎖化したフラグメント、１２…第２のプライマ、１３…第２のプライマ下流の解読した配列、１４…反応基板、１４ａ…プライマ固定領域、１４ｂ…サイズマーカ固定領域、１５…温調ユニット、１６…試薬保管ユニット、１６ａ…試料液容器、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ…標識ｄＮＴＰ溶液容器、１６ｆ…プライマ溶液容器、１６ｇ…ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ溶液容器、１６ｈ…ポリメラーゼ溶液容器、１６ｉ…インターカレータ溶液容器、１６ｊ…洗浄液容器、１７…分注ユニット、１８…送液チューブ、１９…廃液チューブ、２０…廃液容器、２１…２次元センサカメラ、２２…制御ＰＣ、２３…モニタ、２４…ＹＡＧレーザ装置、２４ａ…ＹＡＧレーザ、２５…Ａｒレーザ装置、２５ａ…Ａｒレーザ、２６…λ／４波長板、２７…ミラー、２８…ダイクロイックミラー、２９…プリズム、３０…蛍光、３１…集光レンズ、３２…フィルタユニット、３３…結像レンズ、３４…２次元センサカメラコントローラ
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号１−人工配列の説明：タグ配列
配列番号２−人工配列の説明：プライマ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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