(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
勃起不全の予防または治療用医薬組成物の製造のためのイカリン単体の使用。
【請求項２】
イカリン単体の含有量が単位剤型当たり１０−５００ｍｇであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記医薬組成物が、錠剤、丸剤、丹剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、軟膏剤、ドリンク剤または注射剤である請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬組成物が、錠剤またはカプセル剤である請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記医薬組成物が、経口、筋肉および皮下注射、皮膚粘膜、直腸、尿道、膣または静脈に投与する剤型である請求項１または２に記載の使用
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野および従来の技術】
本発明はイカリン（icariin）を有効成分として含有する性機能障害および血管系疾患を予防および治療する用途に関するものである。
男性の性機能は性的欲求、陰茎の勃起、射精および極致感からなっているが、これは神経系、内分泌系および血管系の複合的生理反応によって決定され、このうち一つでも異状があれば性機能障害、すなわちインポテンツの原因となり得る。これら性機能障害としては性欲減退、勃起不全、早漏症、射精障害、勃起解消障害、オルガスムス障害などがあって、これら障害原因は単独にあるいは相互に伴って現れる。
【０００２】
統計によると、成人男性の約30~60％が性機能障害を訴え、年齢の増加につれ発病率も増加する趨勢を示している。このような性機能障害は、最近10年ほど前は大部分心因性原因と考えられてきたが、現代医学の発達によって性機能障害患者の50％以上でインポテンツは血管系、神経系および内分泌系疾患、糖尿病、高血圧、薬物服用などの基質的原因によることが明らかになっている。
【０００３】
男性の性機能は主として種々の刺激を受け、神経―内分泌系の調節下で、血管系の複雑的生理反応が生じ、陰茎が勃起することである。陰茎の勃起は陰茎海綿体の平滑筋の弛緩および陰茎小動脈の拡張し、陰茎海綿体洞が膨張して陰茎内への血流量が一層増加し、海綿体内圧が上昇することによって割合硬い白膜と小孔の間に存在する白膜下静脈が小孔の膨張によって押さえられて静脈血の漏出が塞がれることによって、陰茎内圧が増加する。こうして膣内挿入に十分な陰茎勃起を起こし、オルガスムスおよび射精に到達するまで勃起を維持する。
【０００４】
このような陰茎勃起に際して陰茎海綿体平滑筋の弛緩は基本的働きを起こし、平滑筋を弛緩させる作用を有するものであり、そしてその過程は神経内分泌系に調節されるものである。動物試験によると、種々の局所因子は陰茎勃起に影響を与えるものであり、例えば、ノルアドレナリン（NA）、神経ぺプチド（NPY）、アセチルコリン（Ach）、プロスタブランジン（PGE）、セロトニン（5−HT）などである。
【０００５】
近年の研究は一酸化窒素にフォカスしている。これに関わって、酸化窒素が陰茎勃起に重要な役割を果たすことが動物実験によって明らかになった。性的刺激下に陰茎の副交感神経、非アドレナリン非コリン性（NANC）神経末梢よりまた血管内皮細胞より分泌される酸化窒素の生成が増加される。酸化窒素はグアニレートサイクラーゼ（guanylate cyclase）を活性化し、グアノシントリホスフェート（GPT）をサイクリックグアノシンモノホスフェート（cGMP）に変換が増加する。cGMPは海綿体の平滑筋および陰茎大動脈の弛緩を発生させる信号を提供する。cGMPの濃度はサイクリックヌクレアーゼホスホジエステラーゼ5型（PDE V）アイソザイムで加水分解速度とグアニレートサイクラーゼの合成速度間のバランスを調整する。したがって、cGMP加水分解抑制剤はcGMP信号を増加させることができ、さらに陰茎海綿体の平滑筋の弛緩を増加させることによって、陰茎勃起反応を促進する。
【０００６】
陰茎勃起の生理現象が次第に明らかになるにつれ、陰茎海綿体の弛緩作用に影響を及ぼす薬物に対する研究がなされ、これを勃起不全の診断と治療に使用されている。たとえばパパベリン（papaverine）、ペントールアミン（phentolamine）およびプロスタグランジンE1（prostaglandin E1）などが海綿体注射療法において臨床的に広く使用されている。パパベリンは阿片アルカロイドであって、尿管および血管の平滑筋を弛緩させる。ペントールアミンはアドレナリン性抑制剤である。しかしながら、これら薬剤は患者治療において疼痛、勃起持続症および陰茎海綿体繊維化などの副作用によって制限性を有する。経口薬剤としてはトラゾドン（trazodone）、ヨヒンビン（yohimbin）などが知られているが、薬剤の治療メカニズムが明らかではなく、治療効果が高くなく、副作用が多い。
【０００７】
最近、ホスホジエステラーゼV（phosphodiesterase V）抑制剤であるシルデナフィル（sildenafil）が性機能障害の治療において大きな関心を集めているが、こうした治療法は化学薬品を用いて一時的な勃起を誘発する方法のため、価格が高く、頭痛、血圧増加、心臓問題などの副作用が多い。特に心臓病を加重して死亡することが報告されている。したがって、これら薬剤の使用は臨床的に制限されている。
【０００８】
したがって、人体の本能的な勃起機能を増強させる安全且つ有効な性機能障害治療剤を開発しなければならない実情にあり、最近の趨勢は陰茎海綿体平滑筋細胞の酸化窒素（nitric oxide（NO））およびcGMPの生成および活性を増加して海綿体に強い弛緩作用のある性機能障害治療剤を研究開発することに関心が集められている。
【０００９】
伝統医学において滋養強壮剤として使用され、性機能障害を治療するための生薬複合剤処方が多く紹介されているが、実際に治療メカニズムに対する医学的な実験研究はなされていない実情である。それぞれ生薬の単一成分を分離して薬学組成物に製剤化しているが、性機能障害治療についての薬理学的研究および臨床効果に対する研究はまだ不十分な実情である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明者は入手可能な関連先行技術文献を広範囲に調べ、性機能障害問題を解決するための研究と実験を積重ねた結果、特定の生薬淫羊霍（Epimedii herba）より分離した有効成分であるイカリンを薬剤学的組成物に剤型化すれば性機能障害および血管系疾患を効果的にしかも安全に予防および治療できることを科学的な動物実験および臨床試験を通じて明らかにした。本発明はこのような発見に基づいて完成されている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は有効成分としてイカリンを治療学的に有効量含有する性機能障害および血管疾患の予防および治療用薬剤学的組成物に関するものである。
【００１２】
イカリン（C33H40O15、分子量676.67、融点２２５−２３０℃）は伝統的によく滋養強壮剤として使用されている淫羊霍より分離したフラボノイド（flavonoid）である。イカリンは淫羊霍の主要な有効成分であると考えられる。少量の他の成分、たとえばマグノフロリン（magnoflorine）、クエレクチン（querectin）、エピメジン（epimedin）A、BおよびCもまた淫羊霍よりHPLCを通じて最近検出された。イカリンは標準試験薬剤として主に使用されている。疲労回復、免疫機能増進、老化防止、肝機能向上に関するイカリンの一部薬理学的研究が最近報告されているが、性機能改善のためのイカリンの具体的な治療メカニズムおよび作用効果については今まで研究がなされていない実情である。
【００１３】
本発明者は淫羊霍成分のうち、イカリンが陰茎海綿体平滑筋において強い弛緩作用を有して性機能を向上させるのみならず、平滑筋および動脈血管においても弛緩作用を有し、その作用機転は酸化窒素の生成および活性化を増強させ、PDE V型酵素に対する抑制作用によって平滑筋細胞のcGMP濃度を増加させて陰茎勃起を促進し、さらに性機能障害治療の際、副作用が殆どなく、糖尿病、高血圧を伴う患者も安全且つ有効に使用できることを見出した。
【００１４】
本発明による薬剤学的組成物は有効成分としてイカリンを通常用いられる薬剤学的担体または賦形剤（たとえば、澱粉、乳糖、有機溶媒など）と結合し、公知の方法によって製剤化して単位投与量形態にしても良い。医薬組成物の単位容量形態に形成する時には、イカリン成分を1錠当たり10〜500mg含有させるのが好ましい。この範囲を脱すると製剤化および薬効に影響を及ぼすことがあり得る。
【００１５】
本発明の医薬的組成物は錠剤、丸剤、丹剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、軟膏剤、ドリンク剤および注射剤形態に剤型化することができる。さらに本発明の医薬組成物の投与形態には経口、筋肉および皮下注射、皮膚粘膜、直腸、尿道、陰道、静脈などが含まれるが、他の便利な投与方法も使用することができる。イカリン化合物は1日1〜4回投与するのが有利である。
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に何ら制限されるものではない。
【００１６】
実施例1  イカリンの調製
抽出方法（１）
淫羊霍地上部分の乾燥物500gにメタノール10リットルを入れて3日間ずつ3回で加熱抽出した。抽出物を濾過してから、溶媒を減圧下で濃縮し、抽出物エキスを得た。メタノール抽出物エキスを水に懸濁し、同量のヘキサンで4回抽出し、水層を1/3量まで濃縮した。この水層に5％クエン酸を入れて懸濁し（pH＝５．５）、同量のCHCl3で抽出して、更に適当量のアンモニア水で懸濁し（ｐＨ＝１０）、同量のCHCl３で抽出した。抽出過程を3回繰返し、最終のアルカリ性の水層を同量のブタノールで3回で抽出し、イカリン分画（icariin rich fraction、IRF）を得た（HPLCで測定し、イカリンの含有量は8％である）。
【００１７】
抽出方法（２）
淫羊霍地上部分の乾燥物500gにエタノール１０リットルにて80℃で1時間ずつ3回で回流抽出した。抽出液を濾過し、減圧下でエタノールを回収し、スラリー状の抽出物を得た。抽出物に4倍量の蒸留水で懸濁し、3時間放置したクロロフィル又はワックスなどを除いてから、ブタノールで4回抽出し、濾液を濾過して濃縮し、４０〜６０メッシュのポリアミドカラムに吸着させて、30％エタノールで無色まで溶出し、溶出液を減圧下で濃縮し、さらに70％エタノール（１：２０）を20倍量加えた。混合物を8時間放置して濾過し、粗イカリントータルグリコサイドを得た。この粗イカリントータルグリコサイドを無水エタノール（１：１５）で繰返再結晶し、粗イカリントータルグリコサイドを得た（イカリン含量52％）。
【００１８】
イカリンの単離
上記抽出工程で得られたイカリン分画（icariin rich fractionあるいは粗イカリントータルグリコサイド）をメタノールに溶解し、シリカゲルに吸着乾燥した。次いでにシリカゲルカラム（８×６０ｃｍ）にてカラムクロマトグラフィーしてイカリンを分離した。得られた物質をシリカゲルカラム（８×６０ｃｍ）に加え、CHCl3/ MeOH =5：1、4：1、3：1および2：1の順で溶出し、それぞれの溶出分画を濃縮してメタノール／水の混合液に入れて黄色結晶を析出した。
【００１９】
この結晶はUVで発色し、パウリ（Pauly）試薬に陽性であって、TLCでRf値が0.6である淡黄色結晶であった。融点は239℃であるこれは純粋なイカリンであることが確認された（ＨＰＬＣで測定し、その純度は99．8％である）。
【００２０】
実験１  安全性試験
イカリンの急性毒性を調べるためにイカリンをSD系ラットに各群当たり、雌雄各５匹を一群にし４組にし、第１組経口投与群３ｇ/ｋｇ、第２組２ｇ/ｋｇ、第３組１ｇ/ｋｇ、第４組０．５ｇ/ｋｇ試験薬物を投与し、７日間観察した結果よりLD５０は雄１．８８ｇ/ｋｇ、雌１．９５ｇ/ｋｇと観察された。
【００２１】
実験２  薬効又は薬理的作用のメカニズム
実験原理
男性の性機能は主として種々の刺激を受け、神経―内分泌茎の調節下で、血管系の複雑的生理反応が生じ、陰茎が勃起することである。陰茎の勃起は陰茎海綿体の平滑筋の弛緩および陰茎小動脈の拡張し、陰茎海綿体洞が膨張して陰茎内への血流量が一層増加し、海綿体内圧が上昇することによって割合硬い白膜と小孔の間に存在する白膜下静脈が小孔の膨張によって押さえられて静脈血の漏出が塞がれることによって、陰茎内圧が増加する。こうような陰茎勃起に際してして陰茎海綿体平滑筋の弛緩は基本的働きを起き、平滑筋の弛緩させる作用が有する薬物は陰茎勃起に作用が有することが考えられる。陰茎海綿体平滑筋の弛緩も非アドレナリン非アセチルコリン性（NANC）神経また内皮細胞弛緩因子（EDRF）に調節させるものである。このEDRF中では、一酸化窒素（NO）重要な働きを有するものである。NO又はNOを含有する物質は平滑筋細胞内に拡散し、グアニレートサイクラーゼ（guanylate cyclase）を活性化し、グアノシントリホスフェート（GPT）をサイクリックグアノシンモノホスフェート（cGMP）への変換が増加する。cGMPは海綿体の平滑筋の弛緩を発生させる、。cGMPの濃度はサイクリックヌクレアーゼホスホジエステラーゼ5型（PDE V）アイソザイムで加水分解速度とグアニレートサイクラーゼの合成速度間のバランスを調整する。したがって、cGMP加水分解抑制剤はcGMP信号を増加させることができ、さらに陰茎海綿体の平滑筋の弛緩を増加させることによって、陰茎勃起反応を促進する。
【００２２】
本発明者は淫羊霍成分のうち、イカリンが陰茎海綿体平滑筋において強い弛緩作用を有して性機能を向上させるのみならず、平滑筋および動脈血管においても弛緩作用を有し、その作用機転は酸化窒素の生成および活性化を増強させ、PDE V型酵素に対する抑制作用によって平滑筋細胞のcGMP濃度を増加させて陰茎勃起を促進し、さらに性機能障害治療の際、副作用が殆どなく、糖尿病、高血圧を伴う患者も安全且つ有効に使用できることを見出した。
【００２３】
2．１：イカリンの陰茎海綿体平滑筋および腹部大動脈血管の弛緩作用
雄ウサギの陰茎海綿体平滑筋を分離し、インビトロでイカリン分画（icariin rich fraction）と純粋なイカリンに対する陰茎海綿体平滑筋弛緩作用を評価するため、NANA性神経遮断薬としてアトロピン、プロスタグランジンE１抑制剤インドメタシン、NOの生合成又はその活性を抑制する試薬Nω―nitric−L−アルギニン（L−NNA）など、グアニレートサイクラーゼ活性抑制剤メチレンブルーなどの影響をしらべ、併せてウサギ大動脈を用いてイカリンが動脈運動に及ぼす影響を評価した。
【００２４】
実験方法
実験動物は生後3〜5ヵ月程度の雄ニュージーランド白兎（New Zealand white rabbit） 60匹（体重：2.5〜3.0kg）を使用した。ウサギ耳殻静脈を通じてソジウムペントバルビタル（sodium pentobarbital）（30〜50mg/kg）で麻酔した。ウサギの陰茎全体と腹部大動脈を切除した後、混合ガス（95％ O2＋5％ CO2）が持続的に供給されるタイロード（Tyrode）溶液入り容器にて解剖用顕微鏡下に陰茎海綿体を分離し、2×2×6mm大きさの切片を作製し、4mm幅の腹部大動脈環形切片を作製して実験に用いた。
【００２５】
分離された陰茎海綿体切片はタイロード溶液入りの10ml オルガン槽（organ bath）に固定し、force displacement transducer（TSD105、Biopac systems、 Santa barbara、CA、USA）に連結し、腹部大動脈環形切片は二つのステンレススチールフック（stainless steel hook）を用いて同じ方法によってオルガン槽に連結した。オルガン槽の二重壁の間を保温水で続けて循環し、槽内の溶液温度を37℃に保持し、95％の酸素と5％の炭酸ガスの混合気体を持続的に供給し、陰茎海綿体と腹部大動脈の緊張度を測定してコンピューターによるポリグラフ（MP100WS；Biopac systems、Santa Barbara、CA、USA）で記録した。
【００２６】
実験結果、イカリン分画とイカリン単一成分は陰茎海綿体と腹部大動脈で濃度依存的な弛緩効果があり、イカリン分画の陰茎海綿体および腹部大動脈におけるEC50（half effective concentration）はそれぞれ4.08mg/ml、22.40mg/mlであり、イカリンの実際含量（8％）で換算する場合、EC50はそれぞれイカリンとして0.33mg/ml（4.87×10−4M）、1.79mg/ml（2.64×10−3M）であった。この結果はイカリン単一成分の陰茎海綿体および腹部大動脈における弛緩効果のEC50；4.67×10−4M（0.32mg/ml）、2.71×10−3M（1.83mg/ml）に近似したため、淫羊霍の平滑筋弛緩効果はイカリンが主に作用をする成分であることを確認することができる。
【００２７】
したがって、イカリン分画とイカリン単一成分の陰茎海綿体におけるEC50は腹部大動脈においてのEC50に比べて有意に低く、陰茎海綿体における弛緩作用は腹部大動脈に比べてそれぞれ5.49、5.72倍強かったが、人体の臓器は組織別に神経伝達物質あるいは薬物に対する反応が相異し得ることがあって、淫羊霍が陰茎海綿体において腹部大動脈に比べて強く作用することを確認することができ、イカリンは陰茎勃起に増進作用のあることが立証された。
【００２８】
ａ．イカリンのウサギ陰茎海綿体平滑筋に対する反応
試験動物組織の準備
陰茎海綿体平滑筋の初期緊張度は2mgで固定し、組織を1.5〜2時間平行化して澄張性収縮を誘導した。フェニルエトリン（PHE；5×10−6M）に対する最大収縮反応を観察した。次いで組織をタイロード溶液で30分間繰返洗浄し、ベースラインテンションに戻した。澄張性収縮は収縮の幅が以前の3個の連続収縮の10％以内である時に測定した。各組織切片に対する毎回試験はタイロード溶液で3回洗浄し、30分間平衡させた後、さらに行なった。
【００２９】
オルガン槽実験
海綿体のベース状態でイカリンの効果を評価するため、ベース平行状態で筋肉切片を処理した後、相互増加する時、10−10Mでイカリンの澄張性テンション変化を記録した。PHE（5×10−6M）で収縮を誘発した後、筋肉切片を安定化した時、海綿体に対するイカリンの弛緩効果を評価するため、10−10Mで濃度を増加させながらイカリンを投与し、等張性テンション変化を記録した。
【００３０】
海綿体に対するイカリンの弛緩作用メカニズムを調べるため、イカリンの反応は海綿体の内皮細胞筋肉切片で研究し、酸化窒素スキャベンジャー（scavenger）Nω−ニトリック−L−アルギニン（L−NNA）（10−4M）、グアニルテサイクラーゼ拮抗剤メチレンブルー（10−4M）、グアニラーレサイクリック抑制剤ピロガロール（10−4M）、および可溶性グアニラーレサイクリック抑制剤H−[1,2,4]オキサジアゾロ[ODQ]（10−4M）で前処理した後、イカリンの弛緩効果に及ぼす影響を観察した。海綿体に対するイカリンの弛緩効果はプロスタグランジン抑制剤インドメタシン（10−4M）およびムスカリン水溶体拮抗剤アトロピン（10−6M）で前処理に及ぼす影響も観察した。
【００３１】
内皮細胞の破壊は親指と人差し指で乾燥ペーパータオルにて海綿体を約10分間擦ることによって行われた。内皮細胞の除去はアセチルコリン（10−5M）に対する海綿体切片の弛緩反応がない時または調節状態の10％範囲内に弛緩した時に確認された。L−NNA、メチレンブルー、H−[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3−a]キノキサリン−1−オン（ODQ）、インドメタシンおよびアトロピンなど試製はPHE（10−6M）で海綿体平滑筋の収縮を誘発した後、上記試製をそれぞれ投与して20分経過した後、イカリンの弛緩作用に及ぼす影響を観察した。ピロガロール（10−4M）をPHE（10−6M）で収縮を誘発した後、イカリンの弛緩作用に及ぼす影響を観察した。
【００３２】
試験物質および溶媒
フェニルエフリンハイドロクロライド、アセチルコリンクロライド、アトロピンスルフェート、ピロガロール、Nω−ニトリック−L−アルギニン、インドメタシンおよび1H−[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3−a]キノキサリン−1−オンをシグマケミカルカンパニー（St. Louis, MO, USA）より入手し、メチレンブルーはマリンドトケミカルカンパニー（St. Louis, MO, USA）より入手した。タイロード溶液（mEq/l）の組成物はNa+（153.6）、K+（5.3）、Ca++（3.0）、Mg++（1.2）、Cl−−（157.2）、Ｈ２ＰＯ４−−―（0.6）、SO4−−（1.2）、HCO3−（7.1）およびブドウ糖（11.4）を含む。
【００３３】
統計的分析
データはコンピューター（Acknowledge 3.2 program, Biopac systems, USA）で分析し、全ての弛緩反応は所定の実験で追跡する時、PHE−誘発最大収縮点とchleop下方屈折間の距離である最大弛緩百分率で表わした。統計分析はt−testで行ない、薬濃度による平滑筋テンション変化を算定回帰分析を用いて分析した。0.05未満のp値は統計的有意を示す。値は平均の平均±標準偏差および弛緩百分率として表わした。
【００３４】
Ｃ．実験結果
イカリンは海綿体および動脈切片のベース平行状態で収縮または弛緩を誘発しなかったが、ＰＨＥにて予備収縮した海綿体で濃度関連弛緩反応を示した。イカリン分画がＰＨＥ（５×１０−６Ｍ）で収縮を誘発したウサギ陰茎海綿体平滑筋および動脈血管弛緩作用（％）は次の表１に示した。
【００３５】
【表１】
0004864259.tif 000002
【００３６】
算定回帰分析を用いてイカリン分画の陰茎海綿体平滑筋および動脈血管の半分有効濃度（ＥＣ５０）はそれぞれ４．０８ｍｇ／ｍｌおよび２２．４ｍｇ／ｍｌであった。
【００３７】
イカリンがＰＨＥ（５×１０−６Ｍ）で収縮を誘発したウサギ陰茎海綿体平滑筋および動脈血管弛緩作用（％）は次の表２に示した。
【表２】
0004864259.tif 000003
【００３８】
算定回帰分析を用いて陰茎海綿体平滑筋および動脈血管に対するイカリンの半分有効濃度（ＥＣ５０）は４．６７×１０−４Ｍ、２．６３×１０−３であった。
このような試験結果はイカリン分画およびイカリンは陰茎海綿体および動脈血管に濃度依存的な弛緩作用があって、イカリン分画のイカリン含量８％を鑑みてその弛緩効果とイカリンの弛緩効果を比較して分析した結果、イカリンは淫羊霍成分のうち、陰茎海綿体および動脈血管弛緩作用の主成分であることが分かり、陰茎海綿体において動脈血管に比べて強い弛緩作用のあることがわかる。
【００３９】
陰茎海綿体に対するイカリンの弛緩効果はアトロピン（１０−６Ｍ）で前処理して１３．９８％抑制し、プロスタグランジン抑制剤インドメタシン（１０−４Ｍ）で前処理して６．８１％抑制した。しかしイカリン（１０−４）の弛緩効果はアトロピン（１０−４Ｍ）とインドメタシン（１０−４Ｍ）によって有意的に抑制されなかった（ｐ＞０．０５）。海綿体に対するイカリンの弛緩効果は脱内皮細胞化によって有意的に抑制された（３２％、ｐ＜０．０１）。海綿体に対するイカリンの弛緩効果は酸化窒素スキャベンジャーピロガロール（１０−４Ｍ）およびＮＯ合成抑制剤Ｌ−ＮＮＡ（１０−４Ｍ）で前処理の際、それぞれ１９．７２％および２５．９５％と有意的に抑制された（ｐ＜０．０５）。海綿体に対するイカリンの弛緩効果はピロガロール（１０−４Ｍ）、Ｎω−ニトリック−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ；１０−４Ｍ）、脱内皮細胞化（Ｄｅ−ｅｎｄｏ）、メチレンブルー（ＭＢ；１０−４Ｍ）および１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾロ｛４，３−ａ｝キノキサリン−１−オン（ＯＤＱ；１０−４Ｍ）で前処理の際、それぞれ４１．８２％および８７．７６％と有意的に抑制された。イカリンの陰茎海綿体平滑筋弛緩作用が内皮細胞を除去した場合、アトロピン（１０−６Ｍ）、インドメタシン（１０−４Ｍ）、ピロガロール（１０−４Ｍ）およびＮＯ合成抑制剤Ｌ−ＮＮＡ（１０−４Ｍ）で前処理に及ぼす影響（％）は次の表３に示した。
【００４０】
【表３】
0004864259.tif 000004
【００４１】
多様な濃度でＯＤＱ（１０−７Ｍ−１０−４Ｍ）のイカリンの陰茎海綿体平滑筋弛緩作用に及ぼす影響は次の表４に示した
【表４】
0004864259.tif 000005
【００４２】
実験３ イカリンのホスホジエステラーゼ活性に対する影響
実験方法
１．人体血小板中のホスホジエステラーゼ分離
陰茎海綿体および血小板中にはホスホジエステラーゼＶ型が多く分布されているため、薬理効果試験の際、通常的に血小板でＰＤＥ  Ｖ型酵素を分離して試験薬物の反応を測定する。人体血液３６０グラムを１０分間遠心分離（３６０ｇ）して血小板が豊富な血漿（ＰＲＰ）を得た後、さらにＰＲＰを１０分間遠心分離（１４００ｇ）して血小板を沈殿させた。沈殿した血小板１ｍｌの氷冷均質化緩衝液（Ｈｅｐｅｓ  ２０ｎＭ，スクロース  ０．２５Ｍ，ＥＤＴＡ  １ｍＭ，フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）１ｍＭ，ｐＨ７．２）で浮遊させた後、超音波振とう器（Ｃｅｌｌ  ｄｉｓｔｕｐｔｏｒ、Ｂｕｒｋａｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｕｘｂｒｉｄｇｅ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＵＫ）を用いて細胞膜を破壊した。細胞溶解物（ｌｕｓａｔｅ）を１０分間放置し、６０分間連続遠心分離（１６５．０００ｇ）して得られた上層液をＰｈａｍａｃｉａ  ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒａｍａｃｉａ  ＬＴＤ．，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，ＵＫ）を用いて酵素を分離した。
【００４３】
分離した酵素はモノ−Ｑイオン交換クロマトグラフィー（ｍｏｎｏ−Ｑ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて精製し、得られた酵素に対しＰＤＥ活性度を測定して活性のある酵素を選んで液体窒素の中に保管した後、使用した。
【００４４】
２．ＰＤＥ酵素活性抑制物質の測定
ホスホジエステラーゼの活性検定を最終反応容量０．５ｍｌについて行い、測定のための全準備過程は氷上で進行した。検定緩衝液（Ｔｒｉｓ  ４０ｍＭ  ｐＨ８．０，ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ，ＢＳＡ  ０．１２５ｍｇ／ｍｌ，２−メルカプトエタノール  ３．７５ｍＭ）は常に新しいものを作って使用し、酵素被作用物質である［２Ｈ］ｃＧＭＰ（約２８  ｃｉ／ｍｍｏｌ；約１００，０００ｃｐｍ／１００μＬ）は検定緩衝液で予め用意した後に使用した。試験管に［３Ｈ］ｃＧＭＰ２００μＬを入れて試験物質（イカリン１０−１０−１０−４Ｍ）それぞれ１００μｌを入れた後、精製されたＰＤＥ酵素と検定緩衝液を加えて３０℃で２０分間反応した。酵素反応の中止は沸騰水に４５〜６０秒間漬けて終了し、変換された［３Ｈ］アデノシンはＡＧ１−Ｘ２ｒｅｓｉｏｎ（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ）でＮａＯＨ（０．１Ｎ）を用いてイオン交換クロマトグラフィーで溶出して得られた試料の放射線活性を測定する方法でホスホジエステラーゼＶの活性を測定した。
【００４５】
３．実験結果
本実験結果によれば、イカリンはＰＤＥ酵素活性度の抑制効果（％）は濃度依存的抑制作用を示した（１０−８Ｍ、０．０６％；１０−７Ｍ、３２．７％；１０−６Ｍ、５６．２％；１０−５Ｍ、８３．７％；１０−４Ｍ、９９．９％）、ＥＣ５０  約０．４３μＭ。結果は以下の表の通りである。
【表５】
0004864259.tif 000006
【００４６】
この実験結果によれば、イカリンは陰茎海綿体で大動脈血管に比べて強い弛緩作用があり、このような弛緩作用は平滑筋内皮細胞と関連性があってＥＤＲＦおよびＮＯの生成及び活性化に作用し、イカリンの陰茎海綿体平滑筋の弛緩作用は陰茎海綿体平滑筋細胞のホスホジエステラーゼの活性化を抑制してｃＧＭＰ酵素の加水分解を抑制し、海綿体平滑筋のｃＧＭＰ濃度を増加して海綿体平滑筋の弛緩作用を増強させ、陰茎勃起に増進効果のあることが立証された。
【００４７】
実験例４：臨床効果
イカリンの臨床効果を調べるために国際的に通用される性機能評価設問紙（International index of erectile function, IIEF-5）を用いて56名の性機能障害を訴える志願者を対象にしてランダムに2群に分けてコントロール薬二重盲検法を用いて予備臨床試験を行なった。患者の平均年齢は39±6.1才で発病期間は5.4±3.7年であった。対象患者のうち、糖尿病患者が17名、高血圧患者9名、心臓病患者8名であった。試験薬物とコントロール薬は包装を同様にし、投薬者と患者は薬物に対する情報を認知していない状態でランダムに試験薬物（イカリン錠50mg／錠、2錠／回、3回／日）およびコントロール薬をそれぞれ1ヶ月間服用した。全患者は試験薬物を投与する前に性機能評価設問紙を用いて性機能を評価し、試験薬物服用後、性機能評価設問紙を用いて性機能の変化を再評価し、その評価結果を比較分析した。
【００４８】
IIEF評価表を用いたイカリン錠の性機能障害患者に対する臨床効果は次の表6に示した。
【表６】
0004864259.tif 000007
【００４９】
上記結果よりわかるように、薬物を投与する前に性機能を評価した評点の中、陰茎勃起および勃起維持に対する自信感1.82±0.54、陰茎が膣内挿入の可能な勃起頻度1.89±0.67、性交時、陰茎が膣内挿入後に勃起維持できる頻度 1.82±0.65、性交時に勃起および勃起維持のできない頻度1.89±0.61、性生活に対する満足度1.79±0.62であった。投与後、陰茎勃起および勃起維持に対する自信感をイカリン錠3.32±0.39、コントロール薬2.04±0.63、性交時陰茎が膣内挿入の可能な勃起頻度はイカリン錠3.11±0.32、コントロール薬約2.07±0.88、性交時に陰茎が膣内挿入後に勃起維持できる頻度はイカリン錠3.18±0.47、コントロール薬2.17±0.97、性交時に勃起および勃起維持のできない頻度はイカリン錠3.25±0.43、コントロール薬2.18±0.92、性生活に対する満足度はイカリン錠3.36±0.47、コントロール薬2.14±0.95であった。これらの結果は、臨床的効果が統計学的に有意に増加した（p＜0.01）ことを証明している。全臨床有効性はイカリン錠75.4％、コントロール薬35.4％であった。4名の患者で軽微な胃腸反応を示した他は、特殊な副作用は観察されずに糖尿病、高血圧及び心臓病の患者での臨床効果や副作用で有意な差は観察されなかった。
【００５０】
【発明の効果】
上述のように、イカリン化合物は平滑筋および動脈血管においても弛緩作用を有しているのみならず、陰茎海綿体において強い弛緩作用を有して性機能を向上させる。さらにイカリンは性機能障害治療の際、副作用が殆どなく、糖尿病、高血圧および心臓病を伴う患者も安全且つ有効に使用することができる。したがって、イカリンを含有する本発明の薬剤学的組成物は性機能障害および血管系疾患の予防および治療のための薬剤として安全で効果的に使用することができる。