(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
清酒酵母、焼酎酵母、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母に属する少なくともひとつの二倍体酵母を１回変異処理した後、セルレニン１ｐｐｍ及び５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン１９０ｐｐｍを含有する培地を用いて３０℃で培養し、香気成分のうちカプロン酸エチルと酢酸イソアミルの双方を多く生成する二倍体酵母を１回の操作で選択すること、を特徴とする香気成分高生産性酵母の育種方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって育種、分離された、カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの双方を高生産する香気成分高生産性酵母Ｋ１００１−３５０（ＦＥＲＭ Ｐ−１８０６６）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の育種に関し、更に詳細には香気成分のうち特にカプロン酸エチルと酢酸イソアミルの両香気成分を高生産する酵母の育種に関する。また、本発明は、清酒の香気成分であるカプロン酸エチル及び酢酸イソアミルが共に高生成するアルコール飲料又はパンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、香りはアルコール飲料や食品の品質を決定する上で重要な要素となっている。特に清酒醸造において、吟醸香の主要香気成分である酢酸イソアミルとカプロン酸エチルの２つは果実香様の非常に好ましい成分である。従来、酢酸イソアミル高生成酵母、カプロン酸エチル高生成酵母の育種は知られているが、両香気成分を同時に高生成する酵母の育種に成功した例は報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
飲食品に香気成分を付与しようとする場合、別途、香気成分を抽出しておきあるいはこれを化学合成しておき、これを飲食品に添加することが広く行なわれている。しかし、抽出には多大なコストを要するし、化学合成した香料は安全性指向や天然物指向の現代の消費者のニーズに必ずしも適合したものではない。
【０００４】
本発明は、このような業界の要望に応えるため、特に発酵食品にあって、従来の性質に更に香気成分を高生成する性質を有する酵母の有用性に着目し、しかもそのうえ、重要な香気成分であるカプロン酸エチルと酢酸イソアミルを同時に生成するだけでなく多量に生成する新規な変異酵母を育種し、これを用いて高品質のアルコール飲料やパン類を製造する目的でなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものであって、各方面から検討の結果、突然変異処理に着目しただけでなく、その選択方法にも着目した。そして、酵母を変異処理した後、セルレニンと５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシンの双方を含有した培地で培養したところ、全く予期せざることに、コロニーが生成しただけでなく、生じたコロニー中にカプロン酸エチルと酢酸イソアミルの双方を同時に生成し且つそれらを多量に生成する変更酵母が多数存在するという新規にして有用な知見を得た。
【０００６】
そして更に、このようにして育種、分離した酵母を用い、常法にしたがって清酒、パン等の発酵食品を製造したところ、香気にすぐれ、高品質の製品が得られることもはじめて確認し、これらの新知見に基づき更に研究を行い、遂に本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【０００７】
本発明を実施するには、酵母を変異処理した後（自然変異も包含される）、セルレニン及びロイシンアナログ含有選択培地を用いて培養し、生育した菌株（つまり、セルレニン及びロイシンアナログの双方に耐性を有する菌株）から、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルの双方を高生成する菌株をスクリーニングすればよい。
【０００８】
選択の具体的態様としては、はじめにセルレニン含有培地を用いてセルレニン耐性菌を得た後、次にロイシンアナログ含有培地を用いてロイシンアナログ耐性菌を得（あるいはその逆の処理によって）、両方の薬剤に耐性を有する菌株を選択することにより、目的とする香気成分高生成酵母、すなわちカプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを同時に高生成する酵母を得ることができる。また、選択培地としては、セルレニンとロイシンアナログの双方を含有した培地も使用可能であり、その場合は一度の処理で目的酵母を得ることができる。
【０００９】
本発明において変異酵母を得るには変異方法としては、いかなる方法でも良い。変異の物理的方法としては、紫外線照射、放射線照射などがあり、化学的方法としては、変異剤、例えば、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトログアニジン、亜硝酸、アクリジン系色素などの溶液に懸濁させる変異方法がある。また、取得頻度は低くなるが、自然変異においても目的とする変異酵母を取得することができる。
【００１０】
本発明においては、これらの変異方法が適宜使用できるが、変異酵母の選別に特色を有するものであって、選択培地としてセルレニン含有培地、ロイシンアナログ含有培地、又は両薬剤含有培地を使用し、両薬剤耐性酵母を選別する必要がある。したがって、両薬剤を同時に含有した培地を使用する場合には、両薬剤耐性菌を１回の操作で得ることが可能であるが、１種類の薬剤を含有する培地を使用する場合には、セルレニン耐性菌を得た後、ロイシンアナログ耐性菌を得ること（あるいはこの順序を逆にすることも可能である）が必要であり、２回の操作を必要とする。なお、これらの選択処理は、必要に応じてくり返したり、選択培地の組み合わせを自由に変更したりすることが可能である。
【００１１】
はじめに、セルレニン含有培地を用いるカプロン酸エチル高生成酵母の育種について述べる。本発明者らは、カプロン酸エチル生成の律速がカプロン酸であることを見出し、脂肪酸合成酵素に変異を有し、カプロン酸の量が多い変異酵母を新規に育種する方法を検討した結果、セルレニン含有培地を使用することにより、カプロン酸を多量に生成する変異酵母を選択することに成功し、そのうえ更に、この変異酵母を用いることにより、香りの高いアルコール飲料等を製造することにも成功した。
【００１２】
セルレニンは脂肪酸合成酵素を阻害する抗生物質として知られており、セルレニンに対して耐性を獲得したということは脂肪酸合成酵素もしくはその機能に変化が生じたということを意味している。
そこで、このセルレニン耐性株の性質を検討したところ、カプロン酸を含む中級脂肪酸が親株よりも増加した株が多数存在することを見出した。
セルレニンの添加は、固体培養、液体培養のいずれでもよく、１０〜１００μＭ、好ましくは１５〜３５μＭ、更に好ましくは２５μＭ程度添加して使用するのが好ましい。
また、変異酵母の生育培地に添加する薬剤としてはセルレニンに限定することなく、脂肪酸合成酵素を阻害する他の薬剤で、カプロン酸を高生産させる能力のあるものならいずれでもよい。
処理酵母としては、清酒酵母、焼酎酵母、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母などの何れの酵母でもセルレニン耐性株を得ることが出来る。
【００１３】
実施するにあたっては、各種酵母を変異処理した後、セルレニン含有培地に移し、３０℃、１週間程度培養して生育した菌株を分離し、これから、カプロン酸をよく生成する酵母を採用すればよい。
ここで得られる変異酵母は、清酒酵母、焼酎酵母、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母のいずれにおいてもカプロン酸をよく生成するようになっているので、これらを用いて清酒、焼酎、ビール、ワイン、パンなどを製造すれば、カプロン酸エチルの多いそれぞれの製品を製造することが出来る。
【００１４】
次に、ロイシンアナログ含有培地を用いる酢酸イソアミル高生成酵母の育種について述べる。本発明者らは、酢酸イソアミル生成の律速がイソアミルアルコールであることを見出し、更に次の知見を得た。すなわち、イソアミルアルコールは酵母がロイシンを生合成する経路の途中から生成されるが、ロイシンが蓄積すると、このロイシンによりロイシン生合成経路が阻害されるので、イソアミルアルコールの生合成も抑えられることになる。そこで、本発明者らは、ロイシンが蓄積してもロイシン生合成経路が阻害しない突然変異株を求め、鋭意検討した結果、ロイシンアナログ含有培地を使用することにより、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール等の香気成分を多量に生成する変異酵母を選択することに成功し、そのうえ更に、この変異酵母を用いることにより、芳香性豊かなアルコール飲料又はパン類等を製造することに成功した。
【００１５】
この方法を実施するにあたっては、上記したセルレニン耐性酵母の育種と同様の方法を行なえばよいが、選別培地に５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシンを含有させなければならない。５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシンは固体培地、例えばＹＮＢ寒天培地には０．０１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜５ｍＭ、更に好ましくは１ｍＭ程度添加しておけば十分である。
また、変異酵母の選択培地に添加する薬剤としては５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシンに限定することなく、ロイシンアナログであって、イソアミルアルコール、酢酸イソアミルを増加させる事のできるものならば何でも良い。
処理酵母は上に述べたのと同様に、いずれの酵母でもよい。
【００１６】
目的酵母を育種するには、各種酵母は、変異処理された後、５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン含有固体培地に添加され、３０℃で２日間程度培養して、生じたコロニーを分離し、これからイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルをよく生成する酵母を採用すればよい。
ここに得られる酵母は酢酸イソアミルをよく生成するので、上記いずれの酵母においてもそれぞれ芳香豊かなアルコール類又はパンを製造することが出来る。
【００１７】
本発明に係る酵母を育種するには、セルレニン耐性酵母又はロイシンアナログ耐性酵母のように片方の薬剤のみに耐性を有する酵母を選択するだけでは不十分であって、双方の薬剤に耐性を有する酵母を選択することが必要である。
【００１８】
これら２種類の変異について、例えばセルレニン耐性をつけた酵母にさらに変異処理を行ない、例えば５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン耐性をさらに付与してもよく、また、逆に例えば５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン耐性をつけた酵母にさらに変異処理を行い、例えばセルレニン耐性を付与してもよい。もちろん、変異酵母に対して、５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシンとセルレニンを両方含有する培地で培養し、両薬剤耐性を有する酵母を選択することもできる。
【００１９】
また、別の方法として、５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン耐性変異株と、セルレニン耐性変異株を得た後に、それぞれの薬剤耐性変異株について四分子分離を行い、それぞれの薬剤に対する耐性を持った胞子を得て、それらを接合させて両耐性を持つ二倍体を得るという方法もある。もちろん、それぞれの薬剤耐性変異株を取得する時に、それぞれ接合型の異なった一倍体を用いてそれぞれの薬剤に耐性を持つ変異株を取得し、後に接合して二倍体を作成するという方法も可能である。
【００２０】
その他最終的にセルレニン等の薬剤耐性と５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン等の薬剤耐性を併せ持つ変異株が取得できれば、その方法に限定はない。醸造特性などを考慮すると、取得する変異株は二倍体の方が好ましいと考えられるが、一倍体でも構わない。
【００２１】
処理酵母としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する酵母であればすべての酵母が使用可能であり、例えば、清酒酵母（協会７号酵母、協会９号酵母、協会１０号酵母等）、焼酎酵母（日本醸造協会焼酎用２号酵母等）、ワイン酵母（ブドウ酒１号酵母（日本醸造協会ブドウ酒１号酵母）、ブドウ酒３号酵母、ブドウ酒４号酵母等）、ビール酵母、パン酵母等の実用酵母、その他アルコール発酵に常用される酵母を含めサッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する酵母であればすべての酵母が使用でき、いずれの酵母でも目的とする耐性を得ることができる。
【００２２】
このようにして目的としたカプロン酸エチル及び酢酸イソアミルの双方を高生成する酵母を取得することができ、その内のひとつをＫ１００１−３５０と命名して、これを産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１８０６６として寄託した。
【００２３】
本発明により育種、分離された香気成分高生成変異株を使用することによって、カプロン酸エチル、酢酸イソアミルその他の香気成分が多く、高品質のアルコール飲料、パンを製造することができる。本発明において、アルコール飲料としては、清酒、焼酎、ブランデー、ビール、発泡酒、ブドウ酒その他のアルコールを含有した飲料がすべて包含される。
【００２４】
本発明に係る新規変異酵母は、香気成分生成能が高く、香気成分中でも特に、カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの双方を同時に高めた製品を得ることができ、清酒もろみの場合、カプロン酸エチルを２．５ｐｐｍ以上、好ましくは３．５ｐｐｍ以上、それと同時に、酢酸イソアミルを４ｐｐｍ以上、好ましくは７ｐｐｍ以上、更に好ましくは９ｐｐｍ以上含有する製品を得ることができる。
【００２５】
【実施例１】
５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン及びセルレニン耐性株
日本醸造協会１０号泡無し酵母（以下Ｋ−１００１と略記する）をＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース５％）５ｍｌに植菌し、一日振盪培養した後、これを遠心分離し、２％グルコース０．２Ｍリン酸緩衝液で洗浄し、遠心分離した。この洗浄菌体に０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．０）４．５ｍｌ、４０％グルコース０．２５ｍｌ、エチルメタンスルホネート０．２５ｍｌを加え、３０℃で３０分から４５分ゆっくりと撹拌しながら変異処理を行い、２％グルコース０．２Ｍリン酸緩衝液で洗浄した菌体を５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン１９０ｐｐｍ、セルレニン１ｐｐｍを含む０．６７％Difco yeast nitrogen base W/O amino acids、２％グルコース、２％寒天培地で３０℃、４〜１０日培養後、生育してきたコロニーを選抜した。
【００２６】
これらの株について総米１５０ｇ（アルコール脱水麹３５ｇ、アルコール脱水α米１１５ｇ、汲水２７０ｇ）の一段仕込み１５℃一定の条件で小仕込試験を行い、目的株を選抜した。このようにして得た変異株のうち、好適なものの一つであるＫ１００１−３５０株を産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１８０６６として寄託した。
【００２７】
【実施例２】
実地での仕込み試験
得られたＫ１００１−３５０株を用いて実地での仕込み試験を行った。総米５００ｋｇ、麹歩合２０％、汲水歩合１２３％の三段仕込みで酒母歩合は６％、酒母は高温糖化もとを用いた。使用した米は６０％精白の五百万石で、吟醸仕込みを行った。対照株としてＫ−１００１を用いた。
【００２８】
その結果、Ｋ１００１−３５０の醗酵経過は対照のＫ−１００１号酵母と遜色なく推移した。また、アミノ酸度、滴定酸度は対照もろみと比較してほとんど変わらなかった（表１）。香気成分としては、イソアミルアルコール及び酢酸イソアミルが対照の２〜３倍、カプロン酸エチルは約２倍で、両成分とも有意に高く、付与されたトリフルオロロイシン耐性とセルレニン耐性が吟醸仕込みにおいても期待通りの役割を果たしていることが判明した（表２）。
【００２９】
0004900746.tif 000002
【００３０】
0004900746.tif 000003
【００３１】
【実施例３】
パンの製造
市販パン酵母及びＫ１００１−３５０株を使用して、表３に示す配合でパンを製造した。表３の配合に、培養酵母を、湿菌体重量として２ｇ加え、３０℃で４時間醗酵させた後、このパン生地を、１８０℃のオーブンで２５分間焼き、パンを製造した。
【００３２】
本発明に係る香気高生産性酵母をイーストとして製造した食パンは、市販酵母を用いて製造した食パンに比べ、特に香気が増強され、官能的に明らかな相違が認められた。そこで市販の食パンとの官能検査を２０名のパネラーによって行い、下記のような結果を得た（表４）。
【００３３】
0004900746.tif 000004
【００３４】
0004900746.tif 000005
【００３５】
上記の結果から明らかなように、本発明の酵母を用いた食パンの方が好まれ、本発明の酵母使用による効果がパンにおいても奏されていることが確認された。
【００３６】
【発明の効果】
５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン耐性とセルレニン耐性の両方を持つ株を取得することにより、清酒の吟醸香の主成分であるカプロン酸エチル、酢酸イソアミルが共に親株より顕著に高い株を取得することが出来た。また、醸造試験により、カプロン酸エチル、酢酸イソアミルが共に親株より顕著に高い清酒を製造することができた。パンの製造においても市販のパンに比べて香味の増加したパンを製造することができた。