(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、電位依存性陰イオンチャネルの機能阻害試薬。
【化１】
式（Ｉ）
0004986335.tif 000010
上記式中、Ｒ１は置換基を有することもあるアリール基若しくはシクロアルキル基、アルキル基、又はアルケニル基を表し、Ｒ２は水素原子又はアシル基を表し、Ｒ３はアシル基、アルキル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルケニルオキシカルボニル基、ヒドロキシアルキルカルボニル基、又はカルボキシアルキルカルボニル基を表す。
【請求項２】
式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体が、Ｌ−スレオ体、ＤＬ−スレオ体、Ｌ−エリトロ体、又はＤＬ−エリトロ体である、請求項１に記載の機能阻害試薬。
【請求項３】
Ｒ１がアリール基である、請求項１又は２に記載の機能阻害試薬。
【請求項４】
アリール基がアルキル、アルコキシ、ヒドロキシおよびニトロからなる群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の置換基で置換されていてもよいフェニル基である、請求項３に記載の機能阻害試薬。
【請求項５】
Ｒ３がアシル基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の機能阻害試薬。
【請求項６】
アシル基が、炭素数１０〜１６のアシル基である、請求項５に記載の機能阻害試薬。
【請求項７】
Ｒ２が水素原子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の機能阻害試薬。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の機能阻害剤からなる、ミトコンドリアからのチトクロームＣの放出抑制試薬。
【請求項９】
以下の工程を少なくとも含む、精製された電位依存性陰イオンチャネル画分の製造方法。
工程１：電位依存性陰イオンチャネルを含有する液相と、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体が固着した固相とを接触させ、電位依存性陰イオンチャネルを当該固相に結合させる工程。
工程２：固相に固着した電位依存性陰イオンチャネルを固相から解離させ、固相と分離する工程。
【化２】
式（Ｉ）
0004986335.tif 000011
上記式中、Ｒ１は置換基を有することもあるアリール基若しくはシクロアルキル基、アルキル基、又はアルケニル基を表し、Ｒ２は水素原子又はアシル基を表し、Ｒ３はアシル基、アルキル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルケニルオキシカルボニル基、ヒドロキシアルキルカルボニル基、又はカルボキシアルキルカルボニル基を表す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノアルコール誘導体及びそれを含有する薬剤、特に電位依存性陰イオンチャネルの機能阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電位依存性陰イオンチャネル（voltage-dependent anion channel；「ＶＤＡＣ」ともいう）は、ミトコンドリア外膜に存在するチャネルタンパク質であり、ミトコンドリアと細胞質間のＡＴＰや呼吸基質などの物質輸送を行っていることが知られている。またＶＤＡＣは、ミトコンドリア膜電位の消失やチトクロームＣ等の放出にも関与していると考えられている（細胞工学 Vol.18, No.12, p1765-1772, 1999）。
またアポトーシスにおいてミトコンドリアが重要な役割を果たしていることが示唆されており、実際、アポトーシスに先行してミトコンドリア膜電位が低下したり、チトクロームＣなどのミトコンドリアタンパク質が細胞質に放出される現象が観察されている。（細胞工学 Vol.18, No.12, p1765-1772, 1999）。
【０００３】
これらのことから、ＶＤＡＣの機能を阻害することによりアポトーシスを防止することができると考えられる。
一方、糖脂質生合成促進作用を有する種々のアミノアルコール誘導体が知られている。このような公知のアミノアルコール誘導体の一例としてＬ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（（１Ｓ，２Ｓ）−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ１−プロパノール）（以下、単に「Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ」という）を挙げることができ、
神経疾患治療剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、ガン転移抑制剤等としての用途が知られている（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／０５１７７、同ＷＯ９５／３４５３０、特開平９−２１６８５６、特開平１０−３２４６７１、特開平１０−３３８６３６等）。
【０００４】
しかし、このようなアミノアルコール誘導体がＶＤＡＣの機能を阻害する作用を有することは知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰやその誘導体をはじめとするアミノアルコール誘導体を有効成分とするＶＤＡＣの機能阻害剤を提供することを目的とする。また本発明は、このようなアミノアルコール誘導体を用いて、精製されたＶＤＡＣ画分の製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰやこの誘導体をはじめとするアミノアルコール誘導体が、(1)ＶＤＡＣと結合性を有すること、および(2)ＶＤＡＣの機能を阻害する作用（ミトコンドリア膜電位の低下を抑制する作用、チトクロームＣの放出を抑制する作用）を有することを見出し、これを薬剤や製造方法に応用することにより本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、ＶＤＡＣの機能阻害剤（以下、「本発明阻害剤」ともいう）を提供する。
【０００８】
【化３】
式（Ｉ）
0004986335.tif 000002
【０００９】
上記式中、Ｒ１は置換基を有することもあるアリール基若しくはシクロアルキル基、アルキル基、又はアルケニル基を表し、Ｒ２は水素原子又はアシル基を表し、Ｒ３はアシル基、アルキル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルケニルオキシカルボニル基、ヒドロキシアルキルカルボニル基、又はカルボキシアルキルカルボニル基を表す。
また本発明は、このようなＶＤＡＣの機能阻害剤からなる、ミトコンドリアからのチトクロームＣの放出抑制剤（以下、「本発明抑制剤」ともいう）を提供する。以下、本発明阻害剤と本発明抑制剤をまとめて「本発明の剤」ともいう。
さらに本発明は、以下の工程を少なくとも含む、精製されたＶＤＡＣ画分の製造方法（以下、本発明製造方法ともいう）をも提供する。
工程１：ＶＤＡＣを含有する液相と、前記式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体が固着した固相とを接触させ、ＶＤＡＣを当該固相に結合させる工程。
工程２：固相に固着したＶＤＡＣを固相から解離させ、固相と分離する工程。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
＜１＞アミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩
本発明において用いることができるアミノアルコール誘導体は、下記式（Ｉ）で示される化合物である。
【００１１】
【化４】
式（Ｉ）
0004986335.tif 000003
【００１２】
上記式中、Ｒ１は置換基を有することもあるアリール基若しくはシクロアルキル基、アルキル基、又はアルケニル基を表し、Ｒ２は水素原子又はアシル基を表し、Ｒ３はアシル基、アルキル基、アラルキルオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルケニルオキシカルボニル基、ヒドロキシアルキルカルボニル基、又はカルボキシアルキルカルボニル基を表す。
式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体には、以下のような光学対掌体が存在する。カッコ内はＲＳ表記である。
Ｌ−スレオ体  （１Ｓ，２Ｓ）
Ｌ−エリトロ体（１Ｒ，２Ｓ）
Ｄ−エリトロ体（１Ｓ，２Ｒ）
Ｄ−スレオ体  （１Ｒ，２Ｒ）
また本明細書中で、「ＤＬ−スレオ体」とはＬ−スレオ体とＤ−スレオ体の混合物を、「ＤＬ−エリトロ体」とはＬ−エリトロ体とＤ−エリトロ体との混合物を意味する。
【００１３】
これらの光学対掌体の中でも、本発明においてはＬ−スレオ体、ＤＬ−スレオ体、Ｌ−エリトロ体およびＤＬ−エリトロ体を用いることが好ましい。
【００１４】
またＲ１はアリール基であるものが好ましく、なかでもアルキル、アルコキシ、ヒドロキシおよびニトロからなる群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の置換基で置換されていてもよいフェニル基であるものがより好ましい。
【００１５】
またＲ３はアシル基であるものが好ましく、なかでも炭素数１０〜１６のアシル基であるものがより好ましい。またＲ２は水素原子であるものが好ましい。
このようなアミノアルコール誘導体の中でも、下記のアミノアルコール誘導体が好ましい。
Ｌ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ）
Ｌ−スレオ−１−フェニル−２−テトラデカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（以下、単に「Ｌ−スレオ−ＰＭＭＰ」という）
Ｌ−スレオ−１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（以下、単に「Ｌ−スレオ−ＰＰＭＰ」という）
これらの中でも、特にＬ−スレオ−ＰＰＭＰおよびＬ−スレオ−ＰＭＭＰが好ましい。
【００１６】
このようなアミノアルコール誘導体は、例えば出発物質として下記式（II）で示される化合物（２−アミノ−３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパノール）を用いて、公知の方法（例えば、特開平９−２１６８５６号公報等）で製造することができる。また、Ｌ−スレオ体、ＤＬ−スレオ体、Ｌ−エリトロ体、又はＤＬ−エリトロ体等、所望の光学対掌体を得るためには、下記式（II）で示される化合物のこれに対応する光学対掌体を用いれば良い。
【００１７】
【化５】
式（II）
0004986335.tif 000004
【００１８】
（式中、*は不斉炭素を示す）
【００１９】
例えば、式（Ｉ）中のＲ１及び／又はＲ２が所望の基であるアミノアルコール誘導体は、J. Lipid Research 28, p565〜571（1987）、J. Biochem. 111, p191-196（1992）、ＷＯ９５／３４５３０号国際公開パンフレット、特開平９−２１６８５６号公報、特開平１０−３２４６７１号公報、特開平１０−３３８６３６号公報等に記載の方法で製造することができる。
【００２０】
式（Ｉ）中のＲ３がカルボニル基を有する所望の基である誘導体は、式（II）で示される化合物のアミノ基と、置換基Ｒ３に対応するカルボン酸又はその反応性誘導体とを酸アミド結合させることによって製造することができる。酸アミド結合生成反応は自体既知の方法により行うことができ、特に限定されない。
【００２１】
Ｒ３に対応するカルボン酸誘導体に、反応性の高い官能基が含まれる場合は、この官能基をあらかじめ適当な保護基で保護し、所望の酸アミド結合生成反応を行った後、脱保護させてもよい。また、脱保護により得られた反応性官能基（例えばアミノ基、カルボキシル基）に対して自体既知の方法である酸アミド結合生成反応又はエステル化反応を繰り返すことによって、さらに修飾を重ねてもよい。
【００２２】
酸アミド結合生成方法としては、上記Ｒ３に対応するカルボン酸と縮合剤を用いる方法、酸無水物を用いる方法、酸ハロゲン化物を用いる方法等が例示される。具体的には、式（II）で示されるアミノアルコール誘導体又はその酸付加塩（例、塩酸塩）を水、塩化メチレン、ピリジン、エタノール等の溶媒中、上記カルボン酸と縮合剤［例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）や水溶性カルボジイミド(WSC)、より具体的には1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC）］と必要に応じてN-ヒドロキシスクシンイミド等の活性化剤を用いて反応させる方法、酸無水物又は酸ハロゲン化物（例えば、酸塩化物）と塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等の有機塩基、炭酸水素ナトリウムのような無機塩基）を用いて反応させる方法等が例示される。なお、反応の際に使用する溶媒は、酸アミド結合生成反応を阻害せず、上記アミノアルコール誘導体およびカルボン酸誘導体を溶解するものであれば、特に限定されるものではない。
【００２３】
酸アミド結合生成反応は、通常約０〜５０℃、好ましくは室温下（５〜３５℃（ＪＩＳ  Ｋ００５０））、数時間〜数日間、好ましくは１０時間〜２日間行われるが、反応条件は当業者であれば予備実験によって適宜に設定することができる。
【００２４】
酸アミド結合生成反応の後、酢酸エチル、クロロホルム等による溶媒抽出、各種クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）、結晶化等の自体既知の精製手段を適宜に組み合わせて式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体を精製・単離することができる。
【００２５】
本発明化合物の出発物質である式（II）の化合物の製造方法としては、特開平９−２１６８５６号公報に記載されているような公知の方法を適宜採用することができる。
具体的には次に例示するように、式（III）で表されるキラル化合物を出発物質として使用し、下記工程の反応式に従い順次反応させることにより所望の立体配置を有する化合物として得られる。
【００２６】
【化６】
0004986335.tif 000005
【００２７】
（工程式中、*は不斉炭素を表し、Ｐ1 はアミノ基の保護基であり、例えばベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゼンスルホニル基、フルオレニルメトキシカルボニル基等が挙げられる。Ｙはメタンスルホニル、トリハロゲノメタンスルホニル、Ｐ−トルエンスルホニル、ベンゼンスルホニル、Ｐ−ブロモベンゼンスルホニル基等の脱離基を表す）
【００２８】
このように、式（III）で示されるアミノアルコール誘導体の１級水酸基のみに脱離基（Ｙ）を導入して式（IV）で示される化合物とした後、該化合物にモルホリンを反応させて式（V）で示されるアミノアルコール誘導体となし、該化合物よりＰ1を脱離させることにより、式（II）で示されるキラルなアミノアルコール誘導体を得ることができる。
【００２９】
このようにして得られた式（II）の化合物を前記の反応に付すことにより、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体において，Ｒ１がフェニル基、Ｒ２が水素原子かつＲ３がカルボニル基を有する基である化合物が得られる。
【００３０】
また本発明においては、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体の薬学的に許容される塩を用いることもできる。アミノアルコール誘導体の薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸等の無機酸塩、ギ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、Ｐ−トルエンスルホン酸（トシル酸）等の有機酸塩を挙げることができる。このような塩の製造は、それ自体既知の方法によって行うことができる。例えば式（Ｉ）で示される化合物（遊離型）をアルコール等の適宜な溶媒に溶解し、等モル程度の上記の酸を添加して反応させ、所望により溶媒を留去することにより製造することができる。
上記のようなアミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩は、優れたＶＤＡＣ機能阻害作用およびミトコンドリアからのチトクロームＣの放出抑制作用を有することから、これを用いることにより、優れた作用を有する本発明の剤とすることができる。
【００３１】
＜２＞本発明の剤
本発明の剤は、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するＶＤＡＣの機能阻害剤（本発明阻害剤）、および本発明阻害剤からなるミトコンドリアからのチトクロームＣの放出抑制剤（本発明抑制剤）である。
【００３２】
本明細書における「ＶＤＡＣの機能」とは、「ミトコンドリア膜電位を消失（低下）させる機能や、チトクロームＣ等を放出させる機能をはじめとしたＶＤＡＣが有する諸機能」を意味する。したがって、本明細書において「ＶＤＡＣの機能阻害剤」とは、これらの機能を阻害（抑制）する剤を意味するものである。
【００３３】
本発明阻害剤はＶＤＡＣの機能の阻害が求められている細胞や組織等に、本発明抑制剤はミトコンドリアからのチトクロームＣの放出抑制が望まれている細胞や組織等に、それぞれ適用することができる。
【００３４】
これらの細胞や組織への本発明の剤の適用方法は、本発明阻害剤によるＶＤＡＣ機能の阻害作用、又は本発明抑制剤によるミトコンドリアからのチトクロームＣの放出抑制作用が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明の剤の具体的用途等に応じて適宜選択することができる。例えば、細胞や組織等の実験用試薬として用いる場合には、培養液等に本発明の剤を添加してこれを用いて細胞や組織等を培養してもよいし、細胞や組織等に本発明抑制剤を直接添加してもよい。
【００３５】
また、医薬として用いる場合には、例えば注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、点眼、経鼻、経口、経皮、経直腸、経肺、吸入等の方法により投与することができる。このような投与方法に応じて、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、点眼剤、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、ペッサリー、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等として製剤化することができる。
【００３６】
本発明の剤の製剤化には公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、アミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩に悪影響を与えず、かつ本発明阻害剤や本発明抑制剤の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、矯味剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。
【００３７】
本発明の剤を医薬として用いる場合、その有効成分であるアミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩は、高純度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
【００３８】
また本発明の剤中のアミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩の含量も特に限定されず、後述の投与量等に応じて適宜設定することができる。
なお本明細書中で「医薬」とは、医療に用いられる薬品を意味する。従って、医療に用いられる薬品である限りにおいては、名称の如何にかかわらず、ここでいう「医薬」に包含される。
【００３９】
＜３＞本発明の剤を医療用途に用いる場合の投与対象等
本発明の剤が投与される動物は、脊椎動物、特に哺乳動物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。本発明阻害剤および本発明抑制剤は、それぞれ、これらの動物におけるＶＤＡＣ機能の阻害を目的とした医薬およびミトコンドリアからのチトクロームＣ放出の抑制を目的とした医薬として投与することができる。
このような阻害ないし抑制を目的とする限りにおいて適用可能な症状や疾患等は限定されず、例えばＶＤＡＣ機能の促進及び/又はミトコンドリアからのチトクロームＣ放出の増加が一因となる症状や疾患等が例示される。例えばアポトーシスは、前記の通りＶＤＡＣ機能やミトコンドリアからのチトクロームＣ放出がその一因となっていると考えられることから、本発明の剤はアポトーシスの阻害・抑制や、アポトーシスに起因する疾患等の処置に好ましく適用される。
アポトーシスに起因する疾患としては、例えば、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、糸球体硬化症、狼瘡等に分類される糸球体腎炎；腎芽細胞腫；中毒や虚血による尿細管障害；エイズ（ＡＩＤＳ）、免疫抑制剤や抗ガン剤の投与による胸腺細胞の障害、末梢Ｔ細胞の減少、免疫不全症等の免疫関連疾患；血管狭窄、虚血等の循環器疾患；薬剤やウイルス感染による肝障害等の肝臓疾患；消化器疾患；脳虚血による神経細胞の障害、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病やパーキンソン病等の神経細胞の変性性疾患、神経細胞発達性疾患（精神病）等の神経疾患；扁平苔癬；扁平疣贅；臓器移植や組織移植に伴う拒絶反応；細菌毒素，植物毒素や動物毒素による障害；萎縮性脱毛症；形態異常；組織形成不全；組織の萎縮等が例示される。本発明阻害剤および本発明抑制剤は、それぞれ、このような疾患におけるＶＤＡＣ機能の阻害や、ミトコンドリアからのチトクロームＣ放出の抑制を目的として投与することができる。
【００４０】
本発明抑制剤を医薬として用いる場合、その投与は純然とした治療目的のみならず、疾患の予防、進行抑制（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的とすることもできる。
【００４１】
本発明抑制剤におけるアミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩の配合量、１回あたりの投与量、投与間隔等は、本発明抑制剤の投与方法、投与形態、使用目的等、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり特に限定されないが、アミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩の臨床量として０．２５〜２００mg/kg程度 、好ましくは０．５〜１００mg/kg 程度を、１日１回あるいはそれ以上に分けて投与することができる。
【００４２】
＜本発明製造方法＞
本発明製造方法は、以下の工程を少なくとも含む、精製されたＶＤＡＣ画分の製造方法である。
工程１：ＶＤＡＣを含有する液相と、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体が固着した固相とを接触させ、ＶＤＡＣを当該固相に結合させる工程。
工程２：固相に固着したＶＤＡＣを、固相から解離させ、固相と分離する工程。
ＶＤＡＣを含有する液相の種類は特に限定されず、例えば細胞抽出液等を例示することができる。
【００４３】
ＶＤＡＣを含有する液相として細胞抽出液を用いる場合には、ＶＤＡＣを比較的多く含む画分を含有する液相を用いることが好ましい。ＶＤＡＣはミトコンドリア外膜に存在するチャネルタンパク質であることから、界面活性剤により可溶化したミトコンドリア膜画分を含有する液相を用いることがより好ましい。
また、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体の説明は前記の通りであるが、本発明製造方法においてはＬ−スレオ体、特にＬ−スレオ-2-(9-カルボキシノナノイル)アミノ-3-モルホリノ-1-フェニル-1-プロパノールを用いることが好ましい。このアミノアルコール誘導体は公知の方法によって固相に固着させることができる。
【００４４】
固相に式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体を固着（結合）させる方法は特に限定されず、例えば共有結合させることにより固着させてもよく、共有結合以外の結合（例えば、疎水結合等）により固着させてもよいが、安定に固着できる点で共有結合させることにより固着することが好ましい。
【００４５】
共有結合の様式も特に限定されず、例えば酸アミド結合、エステル結合、アミノアルキル結合等が例示されるが、簡便性・容易性等の点で酸アミド結合が好ましい。酸アミド結合による固着は、例えば以下の通り行うことができる。
【００４６】
まず、式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体にカルボキシル基等を有する化合物を用意する。このような化合物として、例えば式（Ｉ）中のＲ３で示される基の末端にカルボキシル基を有する化合物を挙げることができる。Ｒ３で示される基の末端にカルボキシル基を有する化合物は、例えばＬ−スレオ−２−アミノ−３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパノール（前記式（II）で示される化合物のＬ−スレオ体）のアミノ基に、カルボン酸又はその反応性誘導体を酸アミド結合させることにより製造することができる。例えばこの化合物にカルボン酸の一種である無水セバシン酸を反応させると、カルボキシル基等を有する化合物Ｌ−スレオ２−(9-カルボキシノナノイル)アミノ−３−モルホリノ１−フェニル−１−プロパノールを製造することができる。
【００４７】
このようなカルボキシル基を有する化合物を用い、固相として遊離のアミノ基を有する固相を採用することによって、簡便かつ容易に両者を結合させることができ、両者間に安定な酸アミド結合（共有結合）を形成させることによって固相に固着させることができる。
【００４８】
このような固相としては、例えばスペーサーを介して遊離の第１級アミノ基が結合したゲル等が挙げられる。このようなゲルは、例えばCNBr法やエポキシ活性化法等によってアガロースゲルに1,6-ジアミノヘキサンを結合させることにより調製することもできるし、例えばファルマシア(Pharmacia)社から商品名「ＥＡＨ−セファロース４Ｂ(EAH-Sepharose 4B)」、「ＡＨ−セファロース４Ｂ(AH-Sepharose 4B)」として市販されているもの等をそのまま利用することもできる。
【００４９】
上記のようなカルボキシル基を有する化合物を上記のようなアミノ基を有する固相に結合させる方法も特に限定されず、カルボジイミドカップリング法等の公知の方法を採用することができる。
【００５０】
固相の形状はゲルに限定されず、ビーズ、メンブレン等を用いることもできる。また固相の材質もアガロースに限定されず、他の材質のものを用いることもできる。
【００５１】
本発明製造方法の工程１は、前記した液相と、上記のように調製された固相（式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体が固着した固相）とを接触させることにより、当該液相中のＶＤＡＣを、固相に固着したアミノアルコール誘導体に結合させることによって固相に結合させる工程である。これは、式(Ｉ)で示されるアミノアルコール誘導体とＶＤＡＣとの特異的親和性を利用したものである。
固相と液相との接触方法は、固相に固着した式（Ｉ）で示されるアミノアルコール誘導体の分子と、液相中のＶＤＡＣ分子とが接触して、ＶＤＡＣ分子が固相に捕捉される限りにおいて特に限定されず、バッチ法、カラム法のいずれをも用いることができる。このような方法で固相と液相とを接触させることにより、液相中のＶＤＡＣが固相に固着したアミノアルコール誘導体に特異的に結合する。この後、固相を洗浄して、アミノアルコール誘導体に吸着しなかった物質を除去することが好ましい。
【００５２】
工程２は、固相に固着したアミノアルコール誘導体を介して固相に結合したＶＤＡＣを、当該アミノアルコール誘導体から解離させることによって固相から解離させ、固相と分離する工程である。
【００５３】
ＶＤＡＣをアミノアルコール誘導体から解離させる方法は、本製造方法によって得られるＶＤＡＣの使用目的等に応じて適宜選択することができる。製造されるＶＤＡＣが変性していても良い場合には、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等の溶液をＶＤＡＣが結合した固相に接触させればよく、製造されるＶＤＡＣを変性させずに得たい場合には、１M程度のNaCl溶液やpH2.5程度の酸性溶液等の溶液をＶＤＡＣが結合した固相に接触させればよい。このような溶液を固相に接触させることにより、ＶＤＡＣがアミノアルコール誘導体から解離する。
【００５４】
解離したＶＤＡＣを固相と分離する方法は、通常の固液分離手段により行うことができる。例えば、固相と液相との接触をバッチ法によって行った場合には、沈殿、遠心、ろ過等により固相と液相とを分離して、当該液相を回収することによりＶＤＡＣを固相から分離することができる。固相と液相の接触をカラム法によって行った場合には、カラムから溶出してくる液相を回収するだけでよいことから、簡便・迅速に操作することができる。この点で、固相と液相との接触は、カラム法により行うことが好ましい。
【００５５】
このようにして得られた液相をさらに本発明製造方法や他の公知の精製方法に付してもよく、これによってより高純度のＶＤＡＣを製造することができる。
【００５６】
また本発明製造方法の出発物となる液相（ＶＤＡＣを含有する液相）がＶＤＡＣ以外の不純物を比較的多く含有するものである場合には、当該液相を予めＤ−スレオ−２−(9-カルボキシノナノイル)アミノ−３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパノール等を用いて上記の要領で固着させた固相に接触させ、接触後に得られる液相を用いることが好ましい。なお、Ｄ−スレオ−２−(9-カルボキシノナノイル)アミノ−３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパノールは、Ｄ−スレオ−２−アミノ−３−モルホリノ１−フェニル−１−プロパノールを用いて前記と同様に製造することができる。
この接触後、当該固相から分離した液相を出発物（ＶＤＡＣを含有する液相）として用いることにより、Ｄ−スレオ体のアミノアルコール誘導体に結合する物質や、固相に非特異的に結合する物質を予め除去することができる。
【００５７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、これらによって本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
＜アミノアルコール誘導体又はその薬学的に許容される塩＞
本実施例では以下のアミノアルコール誘導体を用いた。これらはJ. Lipid Research 28, p565〜571（1987）およびJ. Biochem. 111, p191-196（1992）に記載された方法によって製造した。
Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ
Ｌ−スレオ−ＰＭＭＰ
Ｌ−スレオ−ＰＰＭＰ
【００５８】
＜薬効薬理試験＞
１．Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰに結合する細胞内タンパク質の探索
(1)実験材料及び方法
(1−1)細胞の培養
Ｈ１２細胞（マウスニューロブラストーマ・ラットグリオーマ雑種細胞株NG-108-15細胞のサブクローン）は、10％仔ウシ胎仔血清（FCS）を含むダルベッコの改変イーグル培地（DMEM培地）を使用し、37℃、5％CO2の条件下で培養した。
(1−2)各種緩衝液の組成
リン酸緩衝生理食塩水（PBS） : 137 mM NaCl、2.68 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.76 mM KH2PO4
緩衝液１：  20 mM Tris HCl (pH 7.5)、20 mM β-グリセロリン酸、5 mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1 mM ピロリン酸ナトリウム, 1 mM バナジン酸、2 mM ジチオトレイトール（DTT）、0.5％ アプロチニン、1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）
緩衝液２：  1 M NaClを含有する緩衝液１
緩衝液３：  1 ％ Triton X-100（商品名）を含有する緩衝液１
SDS-PAGE用サンプルバッファー：  0.05M Tris-HCl (pH 6.8)、1.6％ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、８％ グリセロール、0.0008％ ブロモフェノールブルー（BPB）、5％ β-メルカプトエタノール
泳動用緩衝液：  25mM Tris、192 mM グリシン、0.1 ％ SDS
TBS-T：  137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) , 0.05 ％ Tween 20（商品名）
ブロッキング用緩衝液：  ５％スキムミルク／TBS-T
転写用緩衝液：  25mM Tris、192 mM グリシン、20 ％ メタノール
【００５９】
(1-3)ＶＤＡＣを含有する液相（細胞画分）の調製
PBSで洗浄した１ｘ10８個のＨ１２細胞を、5mL の緩衝液１に懸濁し、ポリトロン（キネティクス社）でホモジナイズした。その細胞破砕液を２℃下、100,000ｘｇで１時間遠心分離し、得られた液相を上清１（細胞質画分）とした。
上清１を除去して残った沈殿に5 mLの緩衝液２を加え、ポリトロンでホモジナイズした後に同様に遠心分離を行い、得られた液相を上清２（膜結合画分）とした。
上清２を除去して残った沈殿に5 mLの緩衝液３を加え、ポリトロンでホモジナイズした後同様に遠心分離を行い、得られた液相を上清３（膜画分）とした。
【００６０】
(1-4)Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰが固着した固相（ビーズ）の調製
(1-4-1)Ｌ−スレオ−２−(9-カルボキシノナノイル)アミノ−３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパノールの合成
Ｌ−スレオ−２−アミノ−３−モルホリノ−１−フェニル−１−プロパノール（前記式（II）で示される化合物のＬ−スレオ体）316.2mg（1.34mmol）に塩化メチレン 10ml、トリエチルアミン 190μl（1.37mmol）、無水セバシン酸 292.4mg（1.59mmol）を加え5時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝20：1 およびクロロホルム：メタノール＝9：1）で精製し、無色油状の標記物質 171.1mg（収率30.4％）を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 7.36-7.25(5H,m,aromatic)，6.50(1H,d,J=7.82Hz,NH), 4.94(1H,d,J=3.91Hz,H-1),4.37(1H,m,H-2)，3.80-3.69(4H,m,(CH2)2O), 2.77-2.63(6H,m,CH2N(CH2)2), 2.30(2H,m,COCH2), 2.09(2H,m,COCH2), 1.61(2H,m,COCH2-CH2), 1.48(2H,m,COCH2-CH2), 1.30-1.16(8H,m,CH2(CH2)4CH2)
13C-NMR(CDCl3)δ: 178.3, 174.1, 140.7, 128.4, 127.7, 126.0, 75.1, 66.2, 59.3, 53.9, 51.0, 36.5, 34.4, 28.9, 28.8, 25.4, 24.9, 24.8
(1-4-2)  EAH-セファロース４B(ファルマシア社；ゲル体積50 mL)をグラスフィルター上に移し、0.5 M NaCl で洗浄後(100 mL×4)、ビーカーに移し、ゲル込みで液量150 mLの懸濁液とした。このものに上記で製造したＬ−スレオ2-(9-カルボキシノナノイル)アミノ-3-モルホリノ-1-フェニル-1-プロパノールの水溶液50 mL(505mg, 1.2mmol, 0.5 M NaCl 含有)を加え、振盪撹拌した。次に、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩1.9g (10 mmol)を加え、室温下にて24時間振盪撹拌した。反応開始24時間後、ゲルをグラスフィルター上に移し、脱イオン水、酢酸緩衝液(pH 4)、トリス緩衝液(pH 8.6)、それぞれ100 mLで順次洗浄し、酢酸緩衝液とトリス緩衝液による洗浄をさらに2回繰り返した。最後に、ゲルを脱イオン水200 mLで洗浄した後、20％エタノール70 mLに懸濁し、4℃で保存した。これにより、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰが直接固着したに等しい固相を得ることができる。
【００６１】
(1-5)Ｄ−スレオ−ＰＤＭＰが固着した固相（ビーズ）の調製
EAH-セファロース４B(ファルマシア社；ゲル体積50 mL)をグラスフィルター上に移し、0.5 M NaCl で洗浄後(100 mL×4)、ビーカーに移して0.5 M NaCl 30 mLの懸濁液とした。このものに上記と同様に調製したＤ−スレオ2-(9-カルボキシノナノイル)アミノ-3-モルホリノ-1-フェニル-1-プロパノールの水溶液70 mL(682.2 mg, 1.62mmol, 0.5 M NaCl 含有)を加え、振盪撹拌した。次に、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩1.946g (10.15 mmol) を加え、室温下にて24時間振盪撹拌した。反応開始24時間後、ゲルをグラスフィルター上に移し、脱イオン水、酢酸緩衝液(pH 4)、トリス緩衝液(pH 8.6)それぞれ100 mLで順次洗浄し、酢酸緩衝液とトリス緩衝液の洗浄をさらに2回繰り返した。最後に、ゲルを脱イオン水200 mLで洗浄した後、20％エタノール70 mLに懸濁し、4℃で保存した。これにより、Ｄ−スレオ−ＰＤＭＰが直接固着したに等しい固相を得ることができる。
【００６２】
(1-6)Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質の調製
前記の上清１〜３のそれぞれから、Ｄ−スレオ−ＰＤＭＰやEAH-セファロース 4B自体に結合するタンパク質等を除くために、まず以下の操作を行った。
１mLの上清１〜３それぞれ1mLに対して、予めPBSで洗浄したＤ−スレオ−ＰＤＭＰビーズをゲル体積としてそれぞれ60μL加え、4℃で2時間インキュベートした。その後遠心分離して上清を回収した。同様の操作をさらに4回繰り返した。
回収された上清１〜３のそれぞれに、あらかじめPBSで洗浄した60μLのＬ−スレオ−ＰＤＭＰビーズを加え、4℃で一晩インキュベートした。その後遠心分離してビーズを回収した。タンパク質が結合したビーズは、上清１〜３に対応してそれぞれ1 mLの緩衝液１〜３で３回洗浄し、200μL の8M 尿素 を含んだ緩衝液１〜３ を加え、４℃で２時間溶出した。その後遠心分離して上清（Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液）を回収し、SDS-PAGEに付した。
またアミノ酸配列決定のため、同様の方法でＬ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液を1 mL調製した。溶液を限外ろ過フィルターで100μLに濃縮し、33μLのSDS-PAGE用サンプルバッファーを加え2分間煮沸して加熱変性処理を行った。その後後述の方法でSDS-PAGEを行い、クマシーブリリアントブルー（CBB）染色した。アミノ酸配列決定に付する目的のタンパク質のバンド(Ｌ３)をゲルから切り出した。
【００６３】
(1-7)ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料の加熱変性は、SDS-PAGE用サンプルバッファーを試料の１/３量加え２分間煮沸することによって行った。4％ポリアクリルアミドの濃縮ゲルおよび10％ポリアクリルアミドの分離ゲルを用い、緩衝液として泳動用緩衝液を使用した。
【００６４】
(1-8)銀染色
シルバーステインキット(ATTO社) を用いて銀染色を行った。
【００６５】
(1-9)断片ペプチドの調製
アミノ酸配列決定に付するタンパク質の断片化は、in-gel digestion 法（Rosenfeld J, Capdevielle J, Guillemot JC, Ferrara P.,  Anal Biochem 203(1), 173-179 (1992)）を一部改変して行った。ゲル片を、50％アセトニトリル/200mM 炭酸アンモニウム(pH 8.9)を用いて30℃、20分間の条件で2回洗浄した後に、室温にて半乾きにした。ゲル片に200mM 0.02％ Tween-20を含む炭酸アンモニウム(pH 8.9)を加え、0.025％ トリプシンを含むトリス緩衝液（pH 8.0）を加えて35℃, 20時間の処理を行った。その後、溶液の全量を逆相ＨＰＬＣに付して、断片ペプチドを分離した(逆相HPLCカラム: TSKgel ODS-80TS QA (TOSOH社)、溶媒A : 0.1 ％ TFA（トリフルオロ酢酸）、溶媒B - 0.09 ％ TFA in 90 ％ アセトニトリル,  検出 : 210 nm、280 nm)。対照としてバンドのないゲル部分を切り出し同様に処理を行った。
【００６６】
(1-10)アミノ酸配列の決定
Ｎ末端プロテインシークエンサー (G1005A, ヒューレットパッカード) を使用して、分析プログラム Routine 3.1 でアミノ酸配列を分析した。
【００６７】
(1-11)ウエスタンブロット
SDS-PAGE後のゲルを転写用緩衝液中で５分間振盪して平衡化した。次にセミドライ型転写用装置(Trans-Blot SD, BioRad社)を用いて、10 V,30分間の条件でゲル中のタンパク質をPVDF膜 (MILLIPORE社) 上に転写した。転写後のPVDF膜をブロッキング用緩衝液中で１時間ブロッキングした。次に、１次抗体としてブロッキング用緩衝液で100倍に希釈した 抗-VDAC1(N18) (sc-8828, Santa Cruz社) を用いて4℃で一晩反応させた。TBS-Tで洗浄（５分間ｘ５回）し、２次抗体としてTBS-Tで10000倍に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)標識ロバ 抗-ヤギ IgG (sc-2304, Santa Cruz社) を用いて室温で45分間反応させた。TBS-Tで洗浄（５分間ｘ５回）し、ECL Plus ウエスタンブロッティング検出試薬(Amersham Pharmacia)を用いて抗体の検出を行った。
【００６８】
(2)結果
(2-1)Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質の検出
上清１（細胞質画分）、上清２（膜結合画分）および上清３（膜画分）のそれぞれの細胞画分について、Ｄ−スレオ−ＰＤＭＰビーズに結合したタンパク質、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰビーズに結合したタンパク質（いずれも8M 尿素で溶出）をSDS-PAGEに付し、銀染色によって検出した。その結果、上清１（細胞質画分）及び上清２（膜結合画分）には、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰビーズにのみ特異的に結合するタンパク質のバンドは確認できなかった。一方、上清３（膜画分）には、約34 kDa付近にＬ−スレオ−ＰＤＭＰビーズにのみ結合するタンパク質のバンド(以下、「Ｌ３」という)が確認された。
【００６９】
(2-2)Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質の内部アミノ酸配列の決定
Ｌ３の内部アミノ酸配列を決定するために、(1-6)に記載の方法でゲルから切り出したＬ３のバンドを、(1-9)に記載の方法で逆相ＨＰＬＣに付し、精製された４種類のペプチド断片についてそれぞれアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列（配列１〜４）を以下に示す。
配列１  WNTDNTLGTE ITVED
配列２  LTFDSSF
配列３  TDEFQLHTNV
配列４  KLETAVNLAW
また、マウスのVDAC1のアミノ酸配列（配列５）を以下に示す。配列５中の下線部は、配列１〜４と一致する部分を示す。
配列５
AVPPTYADLG KSARDVFTKG YGFGLIKLDL KTKSENGLEF TSSGSANTET TKVNGSLETK
YRWTEYGLTF TEKWNTDNTL GTEITVEDQL ARGLKLTFDS SFSPNTGKKN AKIKTGYKRE
HINLGCDVDF DIAGPSIRGA LVLGYEGWLA GYQMNFETSK SRVTQSNFAV GYKTDEFQLH
TNVNDGTEFG GSIYQKVNKK LETAVNLAWT AGNSNTRFGI AAKYQVDPDA CFSAKVNNSS
LIGLGYTQTL KPGIKLTLSA LLDGKNVNAG GHKLGLGLEF QA
以上の結果より、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質から得られた４種類のペプチド断片のアミノ酸配列は、全てマウスのVDAC1のアミノ酸配列と一致した。また同様に、ヒトのVDAC1、ウサギのVDAC1、ウシのVDAC1および野生イノシシのVDAC1とも100％一致した。
【００７０】
(2-3)ウエスタンブロットによるＬ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質の同定
Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液及びＤ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液について、抗VDAC1抗体を用いてウエスタンブロットしたところ、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ結合タンパク質溶液にのみVDAC1に相当するバンドが検出された。以上の結果より、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰに特異的に結合するタンパク質はVDAC1であることが示された。
【００７１】
２．Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰの作用
(1)実験材料及び方法
(1-1)各種緩衝液の組成
緩衝液Ａ：  0.3 M マンニトール、10 mM Hepes/K+ (pH 7.4)、0.2 mM EDTA/K+ (pH 7.4)、0.1％ ウシ血清アルブミン（BSA；脂肪酸フリー）
緩衝液Ｂ：0.3 M マンニトール、10 mM Hepes/K+ (pH 7.4)、1mM KPB（リン酸カリウム緩衝液） (pH 7.4)、0.1％ BSA (脂肪酸フリー)
呼吸用緩衝液：緩衝液Ｂ、0.2 mM EDTA/K+ (pH 7.4)、0.2 mM EGTA/K+ (pH 7.4)、1 mM MgCl2
【００７２】
(1-2)ミトコンドリアの精製
ラット(SD系、８週令くらいのオス)をエーテル麻酔後開腹し、肝臓を摘出した。すみやかに 100 mLの緩衝液Ａに入れ、はさみで細切した。その間緩衝液Ａを4回交換した。テフロンホモジナイザー（井内）を用いてホモジナイズした後テフロン製遠沈管に分注し、750 ×gで10分間遠心分離した。その上清を新しいテフロン製遠沈管に移し、5,000×gで8分間遠心分離し、次いで10,000×g、5 分間遠心分離を行った。上清を捨て、沈殿物に緩衝液Ｂを10 mL加えた後脱脂綿でほぐした。その後、750×gで10分間遠心分離し、上清を新しいテフロン製遠沈管に移した。さらに9,000×gで10分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に緩衝液Ｂを1 mL 加えて脱脂綿でほぐし、精製ミトコンドリア溶液とした。遠心操作は全て0℃で行った。
【００７３】
BCA protein assay kit (PIRECE社)を使用して、精製ミトコンドリア溶液のタンパク質量を測定した。精製ミトコンドリアを0.5 N NaOH で10、20、50又は100倍に希釈し、それぞれ25μLに対してBCA protein assay kitに添付されている反応溶液を500mL加え、37℃で30分間インキュベートした後、562 nmの吸光度を測定した。同時に牛血清アルブミン(BSA)を標準として検量線を作成し、タンパク質量を定量した。
【００７４】
また、精製ミトコンドリア溶液中のミトコンドリアが実験に使用可能なものかどうかを判定するために、ミトコンドリアの酸素消費速度を測定した。酸素電極としては生物研究用酸素モニターDOE-SET（RANK BROTHES 社製）を、解析ソフトとしてはPCカード型データ収集システムNR110/150（KEYENCE社製）を使用した。
【００７５】
酸素電極のベッセルに呼吸用緩衝液を入れ（精製ミトコンドリア溶液を加えた際に2 mLになるように）、酸素濃度の測定を開始した。波形が安定した事を確認した後、1 mgのタンパク質(0.5 mgタンパク質/mL)に相当する精製ミトコンドリア溶液を加えた。約1分後、10 μL の1 M こはく酸/K+ (pH 7.4) (50 mM) を、さらにその約1分後に 3 μL の0.1 M ADP (アデノシン-ジ-リン酸；0.15 μM) を加え、波形を観察した。ADPを加えた後の酸素消費速度を「状態３」、しばらくして波形が緩やかになった時の酸素消費速度を「状態４」とした。呼吸調節率(状態３ / 状態４)を算出した結果、４以上であったことから、精製ミトコンドリア溶液中のミトコンドリアは呼吸作用を保持しており、以下の実験に使用可能と判断された。
【００７６】
(1-3) ミトコンドリア膜電位の測定
キュベットに、7.5μLの 1 Mこはく酸/K+(pH 7.4) (50 mM)、15μL の1mMローダミン123、および緩衝液 B (精製ミトコンドリア溶液を加えた際に1.5 mLになるように)を加えた。キュベットを蛍光光度計にセットし、1.5 mgのタンパク質 (1 mgタンパク質/mL)に相当する精製ミトコンドリア溶液を加えた後、直ちにこの反応液について励起波長504 nm、測定波長535 nm で測定を開始した。約30秒後、75μL の1 mM CaCl2 (終濃度50μM) を添加することにより刺激し、経時的に波形の変化を観察した。
【００７７】
ミトコンドリアの膜電位が低下すると、ミトコンドリアに取込まれたローダミン123が放出され、これにより液相中のローダミン123の蛍光強度が増加する。よって液相中の蛍光強度の変化は、ミトコンドリア膜電位の変化の指標とすることができる。
(1-4)ミトコンドリアからのチトクロームＣの放出量の測定
48穴マルチウェルプレートに反応溶液(緩衝液Ｂ、50 mM こはく酸、10 mM KPB)を入れ、精製ミトコンドリア溶液を加え、次いでCaCl2 (終濃度50μM)を添加することにより刺激した後、反応液を０分、１５分および３０分目に80 μLずつチューブに採取した。採取後速やかに4℃、1500 rpm、2分間遠心分離し、上清と沈澱を回収した。上清には20μLのSDS-PAGE用サンプルバッファーを加え、沈殿物には100μLの4倍に希釈したSDS-PAGE用サンプルバッファーを加え、それぞれをよくピペッティングした後５分間煮沸することにより加熱変性を行った。採取したサンプルは、5％ポリアクリルアミドの濃縮ゲルおよび15％ポリアクリルアミドの分離ゲルを用いて前記と同様にSDS-PAGEを行った。泳動後のゲルを用いて前記と同様の方法でウエスタンブロット（１次抗体：抗-チトクロームＣ (7H8.2C12, PharMingen社)、２次抗体：ヤギ 抗-マウス IgG HRP (sc-2005, Santa Cruz社)）を行った。
【００７８】
(2)結果
(2-1) ミトコンドリア膜電位の測定
上記(1-3)に記載の方法において、反応液中に20μM 又は40μMのＬ−スレオ−ＰＤＭＰを存在させたときの、液相の蛍光強度の結果を図１に示す。
図１より、ミトコンドリアにＬ−スレオ−ＰＤＭＰを共存させることにより、
コントロール（Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ無添加）に比してミトコンドリア膜電位が消失する時間が顕著に遅延することが示された。この作用はＬ−スレオ−ＰＤＭＰの濃度依存的であった。
【００７９】
また、40μMのＬ−スレオ−ＰＭＭＰ、40μMのＬ−スレオ−ＰＰＭＰについても同様に実験した。結果を図２に示す。
【００８０】
図２より、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰのみならず、Ｌ−スレオ−ＰＭＭＰやＬ−スレオ−ＰＰＭＰ等のアミノアルコール誘導体にも、ミトコンドリア膜電位の消失時間を顕著に遅延させる作用があることが示された。この作用は、Ｌ−スレオ−ＰＰＭＰ、Ｌ−スレオ−ＰＭＭＰ、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰの順に顕著であった。ガングリオシドＧＤ３は、ミトコンドリアに直接作用してアポトーシスをひき起こすことが知られている。そこで、ＧＤ３によるミトコンドリアの膜電位消失に対するＬ−スレオ−ＰＤＭＰの効果を検討した。実験は、上記(1-3)に記載の方法において、40μMのＧＤ３のみを共存させたもの、20μMのＧＤ３のみを共存させたもの、20μMのＧＤ３と20μMのＬ−スレオ−ＰＤＭＰとを共存させたもの、20μMのＧＤ３と40μMのＬ−スレオ−ＰＤＭＰとを共存させたもの、およびコントロール（ＧＤ３およびＬ−スレオ−ＰＤＭＰ無添加）について行った。結果を図３に示す。
【００８１】
図３より、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰを共存させたものは、ＧＤ３によるミトコンドリア膜電位消失の時間が顕著に延長した。
【００８２】
以上の結果から、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰをはじめとするアミノアルコール誘導体は、ＶＤＡＣの機能（ミトコンドリア膜電位を低下させる機能）を阻害することが示された。
【００８３】
(2-2) ミトコンドリアからのチトクロームＣの放出量の測定
上記(1-4)に記載の方法において、反応溶液中に20μMのＬ−スレオ−ＰＤＭＰを存在させたときの上清中のチトクロームＣの量を測定し、これをミトコンドリア外へ放出されたチトクロームＣの量とした。
その結果、コントロール（Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ無添加）では経時的にミトコンドリア外に放出されたチトクロームＣの量が増加していったのに対し、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰ存在下ではチトクロームの放出は顕著に抑制された。
この結果から、Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰをはじめとするアミノアルコール誘導体は、ＶＤＡＣの機能（ミトコンドリアからチトクロームＣを放出させる機能）を抑制することが示された。
【００８４】
【発明の効果】
本発明の剤（本発明阻害剤および本発明抑制剤）は、優れたＶＤＡＣ機能阻害作用（ミトコンドリア膜電位の低下を抑制する作用、チトクロームＣの放出を抑制する作用）を発揮することから、ＶＤＡＣの機能阻害が望まれている細胞や組織の処置等に極めて有用である。
また本発明製造方法は、簡便・迅速かつ容易に精製されたＶＤＡＣ画分を製造することができ、極めて有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰによる、ミトコンドリア膜電位の消失時間の遅延を示す図である。
【図２】  各種アミノアルコール誘導体による、ミトコンドリア膜電位の消失時間の遅延を示す図である。
【図３】  Ｌ−スレオ−ＰＤＭＰによる、ＧＤ３によって起こるミトコンドリア膜電位の消失時間の遅延を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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