(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）からなる反応系を用いた、分子間又は分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質合成方法。
ａ） 目的とするタンパク質をコードする１または複数の鋳型核酸、
ｂ） 存在量および純度がそれぞれ特定されており、かつ、それぞれ精製されている、リボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオシド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類、および水を含むことを特徴とする、タンパク質合成反応基本試薬、
ｃ） 存在量および純度が特定されている一つまたは複数のタンパク質のジスルフィド結合の促進及び／又はジスルフィド結合の異性化を触媒する酵素である酸化還元酵素、
ｄ） 存在量および純度が特定されているジチオスレイトールおよび酸化型グルタチオン、ただし、酸化型グルタチオンとジチオスレイトールとの濃度比（酸化型グルタチオン：ジチオスレイトール）が１ｍＭ：１ｍＭ〜２ｍＭ：１ｍＭである。
【請求項２】
酸化還元酵素がプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）類またはジスルフィドインターチェインジタンパク質類からなることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質合成方法。
【請求項３】
プロテインジスルフィドイソメラーゼの濃度が０μＭ〜１０μＭであることを特徴とする請求項２記載のタンパク質合成方法。
【請求項４】
ジスルフィドインターチェインジタンパク質の濃度が０μＭ〜１０μＭであることを特徴とする請求項２記載のタンパク質合成方法。
【請求項５】
反応系に含まれるチオレドキシンレダクターゼ濃度が１００ｎｇ／ｍｌを越えないことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質合成方法。
【請求項６】
反応系に含まれるグルタチオンレダクターゼ濃度が１００ｎｇ／ｍｌを越えないことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質合成方法。
【請求項７】
以下のａ）、ｂ）及びｃ）からなるキット。
ａ） 存在量および純度がそれぞれ特定されており、かつ、それぞれ精製されている、リボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、リボヌクレオシド３リン酸類、アミノ酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類、および水からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
ｂ） 存在量および純度が特定されている一つまたは複数のタンパク質のジスルフィド結合の促進及び／又はジスルフィド結合の異性化を触媒する酵素である酸化還元酵素、
ｃ） 存在量および純度が特定されているジチオスレイトールおよび酸化型グルタチオン、ただし、酸化型グルタチオンとジチオスレイトールとの濃度比（酸化型グルタチオン：ジチオスレイトール）が１ｍＭ：１ｍＭ〜２ｍＭ：１ｍＭである。
【請求項８】
以下のａ）、ｂ）及びｃ）からなるキット。
ａ） 存在量および純度がそれぞれ特定されており、かつ、それぞれ精製されている、リボソーム、開始因子類、延長因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、リボヌクレオシド３リン酸類、アミノ酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類、および水からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
ｂ） 存在量および純度が特定されている一つまたは複数のタンパク質のジスルフィド結合の促進及び／又はジスルフィド結合の異性化を触媒する酵素である酸化還元酵素、
ｃ） 存在量および純度が特定されているジチオスレイトールおよび酸化型グルタチオン、ただし、酸化型グルタチオンとジチオスレイトールとの濃度比（酸化型グルタチオン：ジチオスレイトール）が１ｍＭ：１ｍＭ〜２ｍＭ：１ｍＭである。
【請求項９】
以下のａ）、ｂ）及びｃ）からなるキット。
ａ） 存在量および純度がそれぞれ特定されており、かつ、それぞれ精製されている、リボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、ＲＮＡポリメラーゼ類、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、リボヌクレオシド３リン酸類、アミノ酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類、および水からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
ｂ） 存在量および純度が特定されている一つまたは複数のタンパク質のジスルフィド結合の促進及び／又はジスルフィド結合の異性化を触媒する酵素である酸化還元酵素、
ｃ） 存在量および純度が特定されているジチオスレイトールおよび酸化型グルタチオン、ただし、酸化型グルタチオンとジチオスレイトールとの濃度比（酸化型グルタチオン：ジチオスレイトール）が１ｍＭ：１ｍＭ〜２ｍＭ：１ｍＭである。
【請求項１０】
以下のａ）、ｂ）及びｃ）からなるキット。
ａ） 存在量および純度がそれぞれ特定されており、かつ、それぞれ精製されている、リボソーム、開始因子類、延長因子類、ＲＮＡポリメラーゼ類、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、リボヌクレオシド３リン酸類、アミノ酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類、および水からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
ｂ） 存在量および純度が特定されている一つまたは複数のタンパク質のジスルフィド結合の促進及び／又はジスルフィド結合の異性化を触媒する酵素である酸化還元酵素、
ｃ） 存在量および純度が特定されているジチオスレイトールおよび酸化型グルタチオン、ただし、酸化型グルタチオンとジチオスレイトールとの濃度比（酸化型グルタチオン：ジチオスレイトール）が１ｍＭ：１ｍＭ〜２ｍＭ：１ｍＭである。
【請求項１１】
コントロール用にコントロールタンパク質をコードする鋳型核酸を含む請求項７〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系による合成方法に関し、更に詳しくは分子間／分子内にジスルフィド結合を持つタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系による効率的な合成方法に関するものである。
【背景技術】  医薬品や試薬として利用可能なタンパク質を遺伝子組換え技術を用いて生産する試みが広く行われている。遺伝子組換え技術では、取扱いの簡便さや効率の面から、現在のところ大腸菌、枯草菌、カビ、又は酵母等の微生物、蚕等の昆虫、ウシ等の哺乳動物、或は培養可能な植物細胞、昆虫細胞、動物細胞が好んで用いられている。遺伝子組換え技術を用いてタンパク質を生産させる方法は汎用されているが、目的のタンパク質の発現量が少ない、発現できても活性を持たない、或は凝集体を形成する等の問題があり、培養条件、生育条件、及び誘導条件の検討や、種々の発現系を試す等の試行錯誤が必要である。そのような種々の条件検討を行っても、生産することが難しいタンパク質も数多く報告されている。
一方、このような生物や細胞を使わない、無細胞タンパク質合成よばれるタンパク質合成方法が知られている。無細胞タンパク質合成系はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系とも呼ばれ、大腸菌、ウサギ網状赤血球、又はコムギ胚芽細胞等から調製した抽出液又はこれらの粗画分を利用することによって、鋳型遺伝子が転写・翻訳されタンパク質が合成される。無細胞タンパク質合成系においては、生物や細胞の機能を乱すようなタンパク質も合成できる可能性が高いこと、９６穴や３８４穴のフォーマットに適応させ多品種なタンパク質を合成したり、多様な合成反応条件を一度にたくさん試すことが可能である等、生物や細胞を用いることによる種々の制限を解除できるという特徴がある。
これら無細胞タンパク質合成系を用いても、合成されたタンパク質が、凝集体を形成する、本来あるべき構造をとらないという問題が従来より知られていた。その原因の一つとして、分子間及び／又は分子内にジスルフィド結合を持つタンパク質が正しくジスルフィド結合を架橋できないということが考えられた。タンパク質には分子間及び／又は分子内にジスルフィド結合を持つものと持たないものとがあるが、細胞の表面や細胞の外へ輸送・分泌されるタンパク質の多くはジスルフィド結合を持っており、このようなタンパク質は特に応用面での有用性が高いと言われている。例えば、現在市販されているタンパク質製剤のうち、インスリン、サイトカインや血球増殖因子等、大半の製剤は分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質を成分としている。
このような分子内／分子間にジスルフィド結合を持つタンパク質についても効率よく生産するため、従来より無細胞タンパク質合成系の改良が行われてきた。例えば、細胞抽出液にミクロソーム画分を添加する方法（非特許文献１：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５４：８０５−８１０（１９８８）、以下従来技術１と記載する）、細胞抽出液を透析する方法、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンを添加する方法、ゲルろ過する方法、又は酸化還元電位を調整する方法（非特許文献２：ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１４：２９０−４（２００２）、非特許文献３：Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：７９−８４（１９９７）、特許文献１：特開２００３−１１６５９０、特許文献２：ＷＯ  ０３／０７２７９６  Ａ１、以下従来技術２と記載する）が行われてきた。
また、還元状態を維持する酵素の欠失変異株を用いることによって、ジスルフィド結合を形成させる方法が従来より知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１３７０３−１３７０８（１９９９）、以下従来技術３）。この方法ではチオレドキシンレダクターゼ及びグルタチオンレダクターゼが欠損した大腸菌により目的のタンパク質は発現できるが、このような酵素の欠損株は一般的に生育が極端に遅いか、特殊な培養条件が必要であり、産業上利用する上で大きな障害となっていた。この方法は、大腸菌に遺伝子を組換え、タンパク質を発現させる系であるが、前述したように生物を直接用いることによる種々の制限もあった。また、多くの生物にはチオレドキシンレダクターゼ及びグルタチオンレダクターゼ以外にも未同定であるが多くの酸化還元を司る酵素や基質が存在するため（非特許文献４：Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：８３６−８４７（２００２））、このような欠損変異株で外来遺伝子を発現させたり、或は仮にその細胞抽出液を用いて無細胞のタンパク質合成系でタンパク質を合成したとしても、安定してジスルフィド結合を形成させることは困難であると考えられた。このような酵素や基質を不活性化するために、細胞抽出液をヨードアセタミドで処理する方法が従来から知られている（ＵＳ  ６，５４８，２７６  Ｂ２以下従来技術４）。この方法では、グルタチオンレダクターゼやチオレドキシンレダクターゼだけでなく、細胞内の酸化還元を調節している多くの酵素や基質を不活性化することが可能である。しかしながら、ヨードアセタミドはチオール基を非特異的に修飾するため、例えば転写翻訳に関わる因子や酵素群及びリボソーマルタンパク質等も修飾し、結果としてｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成反応の効率や精度が落ちるという問題が考えられた。
一方、生物や細胞を用いて組換え生産させたタンパク質、化学合成により合成したペプチド、又は無細胞タンパク質合成系で合成したタンパク質を、いったん変性剤で完全に変性させた後、再生するという方法が広く行われている（非特許文献５：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：３１２９−３１３４（１９８７）．従来技術５）。従来技術５ではタンパク質は化学合成されるか、或は生物を用いた場合でも一旦不活性な不溶化物として回収されることから、毒性のあるようなタンパク質の生産も可能である。タンパク質を再生する際には細胞を使わないので、試薬や塩類を自由に組み合わせることで、ジスルフィド結合を持つタンパク質に正しいジスルフィド結合を導入することも可能である。しかしながらこの方法では、タンパク質の合成とタンパク質の構造を再生する別々のステップが必要であるということ、タンパク質の構造を再生するステップは長時間（数日〜１週間）を要するという問題点があった。
ジスルフィド結合の促進及び／又はジスルフィド結合の異性化を触媒する酵素の活性測定法としては、基質となるリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）を一旦還元し変性させ、続いて活性を測定する酵素と共にＲＮａｓｅＡをリフォールディングし再生して得られるＲＮａｓｅ活性を指標とすることが従来より知られている（非特許文献６：Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９７６  １５９：３７７−３８４）。
【特許文献１】特開２００３−１１６５９０
【特許文献２】ＷＯ  ０３／０７２７９６  Ａ１
【特許文献３】ＵＳ  ６，５４８，２７６  Ｂ２
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５４：８０５−８１０（１９８８）
【非特許文献２】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１４：２９０−２９４（２００２）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：７９−８４（１９９７）
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：８３６−８４７（２００２）））
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：３１２９−３１３４（１９８７）
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１５９：３７７−３８４（１９７６）
【発明の開示】
［タンパク質合成］
従来からの無細胞タンパク質合成系は、分子間及び／又は分子内にジスルフィド結合を持つタンパク質を製造する場合には、次に記載する通りの問題があった。従来技術１ではすい臓等からホモジナイズ及び遠心分離でミクロソーム画分を調製する手間が必要であること、ミクロソーム画分はジスルフィド結合の形成が細胞内で本来起きる小胞体と呼ばれる細胞小器官が破壊された画分であり、小胞体で形成されるジスルフィド結合とくらべると効率が悪いこと、形成されたジスルフィド結合のパターンが異なりタンパク質に活性がみられない場合があるという問題が考えられる。従来技術２では、ミクロソーム画分を調製する必要はなく、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンの添加もしくは透析といった簡単な方法で細胞抽出液を調製することができるが、反応液の酸化還元状態を再現性よく調整し、効率よくジスルフィド結合を架橋することは困難であった。その原因として、通常用いられる無細胞タンパク質合成系である細胞抽出液には、チオレドキシンレダクターゼ［ＥＣ  １．６．４．５］及びグルタチオンレダクターゼ［ＥＣ  １．６．４．２］を含む還元状態を維持する種々の酵素や基質が存在し（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：８３６−８４７（２００２））、それらの働きにより透析やグルタチオンの添加によっても、酸化還元状態を調整することが難しいことが考えられる。無細胞タンパク質合成系において酸化剤、例えば酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を添加する場合、ＧＳＳＧと還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の酸化還元緩衝液が従来用いられてきた。その比率はおおむね、ＧＳＳＧ：ＧＳＨ＝１：５−１０程度である場合が多い。これは、ＲＮａｓｅＡやリゾチームを一旦還元的に変性させ、リフォールディングし、構造と活性の相関を調べた数々の研究（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９１  ３０：６１３−６１９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７０  ９：５０１５−５０２３））から得られた酸化剤の濃度と比率を模倣しており、必ずしも無細胞タンパク質合成系に適したものとはいえない。また、酸化還元電位とは、可逆的な電子の授受が成り立っている平衡状態において、酸化体と還元体の化学ポテンシャル差により発生する電位を白金等の電極を用いて測定したものであるが、その溶液中の酸化還元に関わる様々な無機・有機化合物（例えば酸素、金属、システイン、ヘム）の酸化還元の平衡状態を、電位としてまとめて観察したものに過ぎず、チオールとジスルフィドの平衡状態を表す指標ではないため、タンパク質の酸化還元状態を表してはいなかった。そのため、従来技術２のように単に酸化還元電位を特定の値に調節したとしても、タンパク質へのジスルフィド結合の形成を調節することは極めて困難であった。
従来法１、２に共通する問題点として、ミクロソームの添加、透析、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンの添加といった本来の細胞内の環境とは異なった処理を細胞抽出液に施すと、タンパク質合成が行われる本来の細胞内の環境とは異なるために、タンパク質の合成効率そのものが低下するという恐れがあり、産業レベルで無細胞タンパク質合成系の利用を著しく困難なものとしていた。
本発明者らは、細胞を用いないｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ転写・翻訳系又はＲＮＡ翻訳系において、反応系を構成するタンパク質成分の一部又は全部が、相互に付着しあう関係の一方でラベルされている方法（特開２００３−１０２４９５号、以下、再構成タンパク質合成系という）、を既に開示している。この方法は、従来の無細胞系やｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成系（以下、無細胞タンパク質合成系という）とは全く異なる方法、すなわち細胞抽出液を使わずにタンパク質合成に関わる様々な成分をそれぞれ精製し、再構成することでタンパク質合成を可能とし、分子内にジスルフィド結合を持たないタンパク質の合成や迅速な精製が可能であるという特徴がある（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：７３２−７３４（２００１））。しかしながら、分子内／分子間にジスルフィド結合を持つタンパク質を本来あるべき構造や活性を持ち、且つ効率よく合成するには様々な成分をどのような濃度で再構成すればよいかについては報告がなされていなかった。
このため、より簡便で、分子内及び／又は分子間にジスルフィド結合を持つタンパク質の高効率製造法が希求されていた。本発明の課題は、ジスルフィド結合を持つタンパク質を、再構成タンパク質合成系で簡便且つ高効率に製造する方法を提供することにある。
［酵素活性測定］
前記従来方法は、ＲＮａｓｅＡを一旦変性させる必要があること、リフォールディングのための時間が長時間必要であるという問題点があった。
［タンパク質合成方法］
本発明者等は、前記課題に鑑みて鋭意検討した結果、分子内／分子間にジスルフィド結合を持つタンパク質を本来あるべき構造や活性を持ち、且つ効率よく合成するには、チオレドキシンレダクターゼ［ＥＣ  １．６．４．５］及びグルタチオンレダクターゼ［ＥＣ  １．６．４．２］を含む還元状態を維持する種々の酵素や基質が存在するために酸化還元状態の調整が難しい細胞抽出液又はその粗画分を用いることに代え、これら酸化還元状態に影響を与える酵素及び基質を除去し、ジスルフィド及びチオールの間の酸化還元の平衡状態を人為的に調整した再構成タンパク質合成系を用いることにより達成できることを見出したものである。
再構成タンパク質合成系としては、９０％以上の純度のリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオシド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水を成分とすることを特徴とすることが特に好適であることを見出し本発明を完成させた。
通常細胞内のタンパク質合成部位では、酸化還元状態が還元側に偏っており、細胞内で合成されたタンパク質は還元状態で存在する。無細胞タンパク質合成系ではこのような細胞内の状態を模倣しているためＤＴＴや他の還元試薬が通常は含まれており、還元試薬が含まれていない場合には抽出液の保存が悪くなったり、翻訳効率が低下することが報告されている（Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：４７８０−４７８６（２００３））。
一方、チオール基をジスルフィド結合させるには、還元状態は望ましくないので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系では、タンパク質にジスルフィド結合を形成させるために、還元剤であるＤＴＴを透析等で除去するか、添加量を低く抑える試みがなされてきた。しかしながら、上述のように、その効果は限定的なものであった。
他方、本発明による方法では、再構成タンパク質合成系にジスルフィド及びチオール間での平衡に影響を与える成分の存在量が特定されているので、ＤＴＴを数μＭから更に１ｍＭ迄添加しても良く、またＤＴＴを全く添加しないことも可能である。
更に驚くべきことには、従来のＤＴＴを除去した無細胞タンパク質合成系を用いる方法ではタンパク質にジスルフィド結合を形成させることができたとしても、該条件下ではタンパク質自体の合成量は低下し目的とする活性を持ったタンパク質の合成効率は低下すると一般的に考えられていたが、本発明の様に、再構成タンパク質合成系を用いるとタンパク質の合成量は変わらないか、むしろ増加する場合があり、より効率的にタンパク質を合成することが可能であった。
すなわち本発明は、従来法とは異なり、細胞抽出液を使わずに、酸化還元状態に影響を与える不純物を含まない、存在量及び純度がそれぞれ特定されているリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオシド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水をタンパク質合成基本試薬として再構成し、この再構成タンパク質合成系においてジスルフィド及びチオールの間の酸化還元の平衡状態を人為的に調整することでジスルフィド結合を有するタンパク質の高効率な合成方法を提供する。
なお、好適には、上記の再構成したタンパク質合成基本試薬は、高度に精製された９０％以上の純度のリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオシド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水を、それぞれ予め決められた量だけ含有するように再構成されている。タンパク質合成基本試薬としては、たとえば、ＤＴＴを除いたピュアシステム（ポストゲノム社製）を利用することができる。前記タンパク質の合成方法において、ジスルフィド及びチオール間の酸化還元平衡状態の人為的調整は、前記タンパク質合成基本試薬に（イ）酸化還元状態を調節する試薬を添加する、及び／又は（ロ）酸化還元を触媒する酵素を添加することにより行うことができる。これらの添加は、反応開始前、反応中、反応後のいずれに添加しても良い。
更に具体的には、（イ）酸化還元状態を調節する試薬としては、ＤＴＴ、酸化型グルタチオン等を挙げることができる。又、（ロ）酸化還元を触媒する酵素としては、プロテインジスルフィドイソメラーゼ類、ジスルフィドインターチェインジタンパク質類を挙げることができる。
なお、本発明のタンパク質合成方法をタンパク質製造方法と呼ぶこともある。
［タンパク質活性測定法、及びそれを利用したタンパク合成方法］
さらに本発明は、製造されるタンパク質の活性度、酸化還元を触媒する酸化還元酵素試薬の添加量、および酸化還元試薬の添加量の３者の相関を測定する試験方法を提供する。存在量及び純度がそれぞれ特定されているリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオシド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水は、それぞれ予め決められた特定の量を再構成して、タンパク質合成基本試薬とする。該タンパク質合成基本試薬に、酸化還元を触媒する酸化還元酵素試薬濃度、および酸化還元試薬濃度を変化させることができることが好ましい。このようにして酸化還元の平衡状態を変化させることのできる試薬群を再構成タンパク質合成系に所望の最終濃度となるように添加することにより、製造されるタンパク質のジスルフィド結合架橋を形成させたり、逆に形成をさせないようにしたりすることを可能とした。
すなわち本発明により所望のジスルフィド結合架橋形態のタンパク質を製造するのに必要な条件を、再構成タンパク質合成系において正確に知ることができるようになった。このようにして得られた情報は、前記タンパク質合成の条件として用いることが可能である。
酸化還元酵素試薬および酸化還元試薬の添加は、反応開始前、反応中または反応後のいずれの時点において行なっても良い。
酸化還元酵素試薬としては、ＤＴＴ、ＧＳＳＧ等を挙げることができる。酸化還元試薬としては、プロテインジスルフィドイソメラーゼ類、ジスルフィドインターチェインジタンパク質類を挙げることができる。
複数濃度の試薬をあらかじめ作製しておいて、それぞれの反応系に対して、反応開始前（鋳型核酸添加前）、反応開始後、又は反応終了後に添加することが可能である。
［酵素活性測定法］
活性の測定法の詳細は、前述したタンパク質合成系、活性を測定したいジスルフィド結合の促進や異性化を触媒する酵素を翻訳と同時または翻訳後に添加する以外は、全て同じ方法で行えば良い。基質として用いるタンパク質はそれをコードする鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡとして添加される。基質として用いるタンパク質の種類は特段の制限はないが、構造が既知であることが好ましく、酵素であることがより好ましい。このような基質の例として、リゾチームやアルカリフォスファターゼ等を例示することができる。また、この方法ではジスルフィド結合の促進及び／又はジスルフィド結合の異性化を触媒する酵素の活性を測定できるが、逆にその活性を阻害する物質をスクリーニングする目的でも使用可能である。この場合、ジスルフィド結合の促進や異性化を触媒する酵素と共に被検物質を用いることで、スクリーニングを行うことができる。
［キット］
さらに本発明は、以下の（１）ａ）及びｂ）、（２）ａ）及びｃ）、又は（３）ａ）、ｂ）及びｃ）からなるキットが包含される。
ａ）  存在量および純度がそれぞれ特定されている成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
ｂ）  存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する酸化還元酵素、
ｃ）  存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節する酸化還元試薬。
具体的には、ａ）  存在量および純度がそれぞれ特定されているリボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオシド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本試薬、ｂ）  存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する酸化還元酵素、及びｃ）  存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節する酸化還元試薬、からなるキットを提供する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−１３６５２０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、リボソーム粗抽出液の６〜３６％のショ糖密度勾配による分画を示す。
図２は、Ｈｉｓ−Ｔａｇが付されたアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｌａＲＳ）、アルギニンｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｒｇＲＳ）、アスパラギンｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｓｎＲＳ）、アスパラギン酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｓｐＲＳ）、システインｔＲＮＡシンテターゼ（ＣｙｓＲＳ）、グルタミンｔＲＮＡシンテターゼ（ＧｌｎＲＳ）及びグルタミン酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧｌｕＲＳ）の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ・クマシーブリリアントブルー染色後の写真を示す。
図３は、ヒトリゾチームの合成  電気泳動写真（矢印は合成されたヒトリゾチームを示す）を示す。
図４は、合成されたヒトリゾチームの比活性を示す。
図５は、合成されたｍＩＬ６のタンパク質の量を示す。
図６は、合成されたＤＨＦＲのタンパク質の量を示す。
図７は、合成されたヒトリゾチームの比活性（ＰＤＩ濃度による影響）を示す。
図８は、合成されたヒトリゾチームの比活性（０．１３μＭ  ＰＤＩの存在下でのＤＴＴ濃度による影響）を示す。
図９は、合成されたアルカリフォスファターゼの活性（０．１３μＭ  ＰＤＩ及び１ｍＭ  ＤＴＴ存在下におけるＧＳＳＧ濃度による影響）を示す。
図１０は、合成されたアルカリフォスファターゼの活性（ＰＤＩ存在下でのＤＴＴ濃度変化による影響）を示す。
図１１は、合成されたリゾチームの活性（ＤｓｂＣ添加または添加なしによる影響）を示す。
図１２は、合成されたアルカリフォスファターゼの活性（本発明による方法と細胞抽出液を用いた方法との比較）を示す。
図１３はＥＦ−Ｔｕの溶出画分の電気泳動写真を示す。
図１４は精製したＤｓｂＡ（レーン１）及びＤｓｂＣ（レーン２）の電気泳動写真を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
本発明におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ転写・翻訳系又はＲＮＡ翻訳系は、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ等の目的とするタンパク質をコードする鋳型を添加することでタンパク質を合成させるための基本的成分からなるタンパク質合成基本試薬、並びにジスルフィド及びチオール間の酸化還元平衡状態の人為的調整をするための（イ）酸化還元状態を調節する試薬、及び／又は（ロ）酸化還元を触媒する酵素からなる。
［分子間又は分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質合成方法］
本発明の方法は、（１）下記ａ）及びｂ）からなる反応系、（２）下記ａ）、ｂ）及びｃ）からなる反応系、（３）下記ａ）、ｂ）及びｄ）からなる反応系、又は（４）下記ａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）からなる反応系を用いた、分子間又は分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質合成方法を包含している。
ａ）  目的とするタンパク質をコードする１または複数の鋳型核酸、
ｂ）  存在量および純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、タンパク質合成反応基本試薬、
ｃ）  存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する酸化還元酵素、
ｄ）  存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節する酸化還元試薬。
［１−１  タンパク質合成基本試薬］
タンパク質合成基本試薬は、その成分として、リボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオシド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水をそれぞれ予め決められた純度の成分を決められた量だけ含むことを特徴とするが、全ての成分が必要でなく、成分は適宜選択することができる。
系を構成するこれらの成分は、細胞抽出液又はその粗画分を用いないことはもちろんであるが、タンパク質のジスルフィド結合形成に影響を与える物質濃度を計算可能であることが望ましい。
本発明の再構成タンパク質合成系は、系を構成する全ての成分を再構成するため、このような成分を特定し、その含有量を計算することは容易である。
本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬は、ＤＮＡからの転写・翻訳、或は、ＲＮＡの翻訳を行わせるタンパク質合成のための反応系として使用できる。本発明に言うタンパク質とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを言い、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。本発明に言うＲＮＡは化学合成されたＲＮＡ及びｍＲＮＡを含み、ＤＮＡは、合成されたＤＮＡ、ＤＮＡベクター、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ産物及びｃＤＮＡを含む。
本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬において、存在量および純度がそれぞれ特定されている成分を含むとは、それぞれの成分について、個々に精製され、その純度が測定可能であり、かつ定量可能であることを意味している。本発明では、存在量および純度がそれぞれ特定された複数の成分とは、予め塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、溶解度の差、再結晶、遠心等の物質の精製法により、それぞれが精製された物質であって、クロマトグラフィー、電気泳動、質量分析、遠心等の分析方法により、それぞれの純度がおおむね８０％以上、好適には９０％以上である物質を言う。例えば、タンパク質であれば、主にクロマトグラフィーにより精製され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により純度が決定され、リボソームであれば、主に超遠心法により精製され、超遠心分離による沈降分析により純度が決定される。リボソームは複数のＲＮＡ分子（原核生物では、２３Ｓ，５Ｓ，及び１６Ｓの３つ、真核生物では２８Ｓ，５．８Ｓ，５Ｓ，１８Ｓの４つのＲＮＡ分子）と複数のリボソーマルタンパク質（原核生物では約５０個、真核生物では約８０個のタンパク質）とからなる分子量数百万の集合体分子であるが、沈降分析によって集合体分子として分子を同定し純度を測定することが可能である。ｔＲＮＡ類はほとんどが７４から９４ヌクレオチドから成り、複数の塩基配列をもつ分子であるが、電気泳動などにより分子を分離・同定し、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度測定により純度を測定することが可能である。その他、アミノ酸や塩等の低分子の物質はいずれもクロマトグラフィー、融点測定、元素分析、質量分析等の常法により、物質を同定し純度を測定することが可能である。
タンパク質合成基本試薬としての転写／翻訳のための因子・酵素としては、大腸菌等の原核細胞由来のものに限らず、真核細胞由来のものも使用でき、（１）ＲＮＡからの翻訳の場合は、リボソーム、開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、ｔＲＮＡ類、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ），グアノシン３リン酸（ＧＴＰ），アミノ酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水であり、大腸菌等の原核細胞由来の反応系である場合は更にメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類を含む；（２）ＤＮＡからの転写／翻訳の場合は、（１）に加えウリジン３リン酸（ＵＴＰ），シチジン３リン酸（ＣＴＰ）及びＲＮＡポリメラーゼ類、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む。
本発明の反応系を構成する各種因子・酵素は、大腸菌、カビ、酵母、及び培養細胞等全ての生物が本来備えているものであるから、これをそれぞれ高度に精製し、成分として用いることもできるが、各タンパク質が多量に得られ、未知の不要又は阻害成分が反応系内に持ち込まれる可能性が低くなることから、組換え生産されたものを用いることがより好ましい。
具体的には開始因子類、延長因子類、終結因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、又はＲＮＡポリメラーゼ類をコードする遺伝子を適切なベクターにつなぎ、大腸菌、枯草菌、カビ、又は酵母等に形質転換し、発現誘導を行い、該タンパク質を精製し、本発明の反応系を構成する成分とすることができる。組換え体により、各種因子・酵素を生産する場合、インタクトな状態でそのタンパク質を発現させても良いが、融合タンパク質として発現しても良い。そのような融合タンパク質として、ヒスチジンタグ（以下Ｈｉｓ−Ｔａｇ）、ストレプトタグ、ＧＳＴタグ、及びＦＬＡＧタグ等を例示することができる。（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（５）：５２３−５３３（２００３））
一例として、Ｈｉｓ−Ｔａｇとニッケルカラムを利用した、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付したタンパク質成分の精製方法の概略を示せば次の通りである。これ以外にも様々なバリエーションが知られており、適宜選択して使用できる。
１．遺伝子工学的手法により、目的タンパク質のＮ末にＨｉｓ−Ｔａｇ（６個のＨｉｓよりなる）を結合させた融合タンパク質を得る。
２．タグをつけたタンパク質が発現している細胞を氷中で超音波処理し、ローディングバッファー（３００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ８．０）に懸濁させる。
３．細胞の溶解物を遠心分離する（３０，０００ｇ、４℃で３０分間）。
４．上記で得られた上清に、氷で冷やしたローディングバッファーの中で平衡化した５０％のＮｉ２＋−ＮＴＡ  ｓｌｕｒｒｙ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を加える。４℃で１時間撹拌する。
５．樹脂をカラムにロードし、カラム容量の２０倍のローディングバッファーで、４℃でカラムの洗浄を行う。
６．カラム容量の２０倍のローディングバッファー（１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０を含む）で、４℃でカラムの洗浄を行う。
７．カラム容量の２０倍のローディングバッファーを用いて、ｉｍｉｄａｚｏｌｅの濃度勾配を１０から２５０ｍＭになるように設定し、カラムから目的タンパク質の溶出を行わせ、１ｍｌずつフラクションを集める。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的タンパク質を確認する。
また、反応系を構成する各種因子・酵素として、直接タンパク質の合成反応には関わらないが、クレアチンキナーゼ類、ミオキナーゼ類又はヌクレオシドジフォスフェートキナーゼ類といったエネルギー再生に関わる酵素、及び無機ピロフォスファターゼ類といった、転写・翻訳反応で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素類も、同様な方法で該タンパク質を精製し、本発明の反応系に加えることがより好ましい。
塩類としては、転写・翻訳に必須な陽イオン・陰イオンを含むことが必須であり、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム等が通常使用される。なお、上記以外にも適宜選択して使用できることは言うまでもない。水はイオンや微生物類、酵素類を含まないもので、例えばミリポア社製のミリＱ水製造装置によって製造される水や市販の純水を挙げることができる。
リボソームは、ペプチド合成の場であり、ｍＲＮＡと結合し、アミノアシルｔＲＮＡをＡ部位に、フォルミルメチオニルｔＲＮＡ又はペプチジルｔＲＮＡをＰ部位にそれぞれ配位してペプチド結合を形成させる反応を行う（Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９：９２０−９３０（２０００））。本発明においては、かかる機能を有するものであれば、由来を問わず使用することが可能である。例えば、大腸菌由来のリボソームが使用されるが、真核細胞由来のものも使用できる。本発明において用いられるリボソームの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ａ１９株、ＭＲＥ６００株から得られるものを挙げることができる。
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成系で使用される開始因子類には、翻訳開始複合体の形成に必須であるか、又は、これを著しく促進する因子であり、大腸菌由来のものとして、ＩＦ１、ＩＦ２及びＩＦ３が知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９：５８８１−５８８９（１９９０））。開始因子ＩＦ３は、翻訳の開始に必要な段階である、７０Ｓリボソームの３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットへの解離を促進し、また、翻訳開始複合体の形成の際に、フォルミルメチオニルｔＲＮＡ以外のｔＲＮＡのＰ部位への挿入を阻害する。開始因子ＩＦ２は、フォルミルメチオニルｔＲＮＡと結合し、３０ＳリボソームサブユニットのＰ部位へフォルミルメチオニルｔＲＮＡを運び、翻訳開始複合体を形成する。開始因子ＩＦ１は開始因子ＩＦ２，ＩＦ３の機能を促進する。本発明において用いられる開始因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。
延長因子ＥＦ−Ｔｕは、ＧＴＰ型とＧＤＰ型の２種類があり、ＧＴＰ型はアミノアシルｔＲＮＡと結合してこれをリボソームのＡ部位へ運ぶ。ＥＦ−Ｔｕがリボソームから離れる際にＧＴＰが加水分解され、ＧＤＰ型へ転換する。（ＥＭＢＯＪ．１７：７４９０−７４９７（１９９８））。延長因子ＥＦ−Ｔｓは、ＥＦ−Ｔｕ（ＧＤＰ型）に結合し、ＧＴＰ型への転換を促進する（ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ３４８：１５７−１６２（１９９７））。延長因子ＥＦ−Ｇは、ペプチド鎖伸長過程において、ペプチド結合形成反応の後の転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）反応を促進する（Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：６４３−６４７（１９９９），ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３：３１７−３３３（１９９９））。本発明において用いられる延長因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。
終結因子は蛋白質合成の終結、翻訳されたペプチド鎖の解離、更に次のｍＲＮＡの翻訳開始へのリボソームの再生に必須である。これを含まない反応系でタンパク合成を行った場合は、終始コドンの手前で反応が止まり、リボソーム・ペプチド・ｍＲＮＡの安定な３者複合体の形成が容易に行われる（ポリソームディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、インビトロバイラス法）。またペプチド鎖への非天然アミノ酸の導入は、ＲＦ１及び／又はＲＦ２を反応系から省くことにより行われる。即ち、ＲＦ１を省いた場合はＵＡＧコドン、ＲＦ２を省いた場合はＵＧＡコドンへの非天然アミノ酸の導入が高い効率で行われる。
終結因子ＲＦ１及びＲＦ２は、リボソームのＡ部位に終止コドン（ＵＡＡ，ＵＡＧ，ＵＧＡ）が来た時、Ａ部位に入ってペプチジルｔＲＮＡ（Ｐ部位にある）からのペプチド鎖の解離を促進する。ＲＦ１は終止コドンのうちＵＡＡ，ＵＡＧを認識し、ＲＦ２はＵＡＡ，ＵＧＡを認識する。終結因子ＲＦ３は、ＲＦ１，ＲＦ２によるペプチド鎖の解離反応後の、ＲＦ１，ＲＦ２のリボソームからの解離を促進する。リボソーム再生因子（ＲＲＦ）は、蛋白質合成の停止後、Ｐ部位に残っているｔＲＮＡの脱離と、次の蛋白質合成へのリボソームの再生を促進する。本発明においては、ＲＲＦも終結因子類の一つとして取扱うことにする。なお、終結因子ＲＦ１，ＲＦ２，ＲＦ３及びＲＲＦの機能については、ＥＭＢＯＪ．１６：４１２６−４１３３（１９９７）、ＥＭＢＯＪ．１６：４１３４−４１４１（１９９７）に解説されている。本発明において用いられる終結因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ＡＴＰの存在下でアミノ酸とｔＲＮＡを共有結合させ、アミノアシルｔＲＮＡを合成する酵素である（ＲＮＡ  ３：９５４−９６０（１９９７），蛋白質核酸酵素３９：１２１５−１２２５（１９９４））。本発明において用いられるアミノアシルｔ  ＲＮＡシンテターゼの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。また、非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（特許２６６８７０１号）を用いることもできる。
メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）は原核生物におけるタンパク質合成においてメチオニルｔＲＮＡのアミノ基にフォルミル基がついたＮ−フォルミルメチオニル（ｆＭｅｔ）ｔＲＮＡを合成する酵素である。即ち、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼは、Ｎ１０−フォルミルテトラヒドロ葉酸のフォルミル基を、開始コドンに対応するメチオニルｔＲＮＡのＮ末端に転移させ、ｆＭｅｔ−ｔＲＮＡにする（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：８７５−８８０（１９９９））。付加されたフォルミル基は開始因子ＩＦ２により認識され、タンパク質合成の開始シグナルとして作用する。真核生物の細胞質における合成系にはＭＴＦはないが、真核生物のミトコンドリア及び葉緑体における合成系には存在する。本発明において用いられるＭＴＦの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものである。
ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写する酵素であり、様々な生物に存在することが知られている。その一例として、Ｔ７ファージ由来の、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを挙げることができ、このポリメラーゼはＴ７プロモーターと呼ばれる特異的なＤＮＡ配列に結合してその下流のＤＮＡ配列をＲＮＡに転写する酵素である。本発明者等は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端にヒスタグを付加して、融合タンパク質として大腸菌ＢＬ２１株において大量発現を行い、ニッケルカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製を行った。本発明においては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ以外にも種々のＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。例えば、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが市販されており、これ等を利用することもできる。
アミノ酸類としては天然型又は非天然型アミノ酸、天然型又は非天然型アミノ酸でチャージされたｔＲＮＡが挙げられる。非天然アミノ酸でチャージされたｔＲＮＡを用いることで、タンパク質に非天然アミノ酸を導入することが可能となる。
ｔＲＮＡ類としては、大腸菌、酵母等の細胞から精製したｔＲＮＡを用いることができる。またアンチコドンやその他の塩基を任意に変更した人工ｔＲＮＡも用いることができる（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：３４−４０（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１７７−１８２（２００２））。例えば、ＣＵＡをアンチコドンとして持つｔＲＮＡに非天然のアミノ酸をチャージすることで、本来終止コドンであるＵＡＧコドンを非天然アミノ酸に翻訳することが可能である。この方法ではタンパク質に点特異的に非天然アミノ酸を導入することができる。
その他、緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液、（ｐＨ７．３）が通常使用される。
［１−２  ジスルフィド結合形成に影響を与える物質］
ジスルフィド結合形成に影響を与える物質の例として、ジスルフィド結合の酸化還元を触媒する酵素である酸化還元酵素及び／又はジスルフィド結合の酸化還元状態を調節する試薬である酸化還元試薬が挙げられる。より具体的には、ジスルフィド結合形成に影響を与える酵素及び又は試薬として、（イ）酸化還元を触媒する酵素：グルタチオンレダクターゼ類、チオレドキシンレダクターゼ類、プロテインジスルフィドイソメラーゼ類、ジスルフィドインターチェインジタンパク質類、チオレドキシン様タンパク質等のタンパク質及び／又は（ロ）酸化還元状態を調節する試薬：還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール及びチオレドキシン等の低分子化合物を例示することができる。本発明における酸化還元試薬とはジスルフィドを還元しチオールにしたり、逆にチオールを酸化しジスルフィドを形成させることのできる試薬を言う。
ジスルフィド結合形成に影響を与える物質の例としての、（イ）酸化還元酵素（酸化還元を触媒する酵素）及び／又は（ロ）酸化還元試薬（酸化還元状態を調節する試薬）は、タンパク質のジスルフィド結合の架橋を促進・調整する酵素類及び／又はその基質を用いることが望ましい。なお、（イ）酸化還元を触媒する酵素及び／又は（ロ）酸化還元状態を調節する試薬は、必ずしも翻訳反応中に加える必要はなく、翻訳終了後に加えても良い。翻訳終了後に添加する場合には、添加後更に数十分から１時間程度３７℃に静置するのが好ましい。
酸化還元状態を調節する試薬として、ＤＴＴを用いる場合は濃度が０〜１ｍＭ、好適には０．００１〜０．５ｍＭであることが好ましい。更に好適には、０．０６０〜０．５ｍＭであることが好ましい。
酸化還元状態を調節する試薬として、酸化型グルタチオンを用いる場合は濃度が０〜８ｍＭ、好適には、０．１〜４ｍＭであることが好ましい。更に好適には１〜４ｍＭであることが好ましい。
前記タンパク質の合成方法おいて、ジスルフィドインターチェインジタンパク質類はＤｓｂＡ及び／又はＤｓｂＣであることが好ましい。
プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．４．１．）は真核生物の小胞体内膜に存在する約５５ｋＤａのジスルフィド結合の形成や異性化・還元反応を触媒する酵素であり、シャペロン様の活性も持つと言われている。このタンパク質は前述の通り、生物から精製し、成分として用いることもできるが、組換え生産されたものを用いてもよい。ウシの肝臓から精製したプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＩＲデータベース  アクセッション番号ＩＳＢＯＳＳ）、酵母のプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子を大腸菌に組換え発現させ、精製したタンパク質等を用いることができる。
その他にプロテインジスルフィドイソメラーゼ類として下記のタンパク質知られており、本発明のプロテインジスルフィドイソメラーゼ質類として使用可能である。
ヒトのｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＰＩＲデータベース  アクセッションナンバーＩＳＨＵＳＳ
ヒトのｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー４７５８３０４
酵母のｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ＰＩＲデータベースＡ４４４８３
ジスルフィドインターチェインジタンパク質類は、ジスルフィドインターチェインジタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（ＤｓｂＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）の４種のタンパク質が大腸菌等で知られている。ＤｓｂＡは、２１ｋＤａのチオレドキシン様フォールド構造を持つ、ジスルフィド結合の形成を触媒すると考えられている酵素である。ＤｓｂＢは４個の膜貫通部位と、２個のペリプラズムドメインを持つ２０ｋＤａのタンパク質で、ＤｓｂＡを酸化型に維持すると言われている。ＤｓｂＣはホモ２量体を形成するペリプラズムタンパク質であり、チオレドキシン様のフォールドを持ち、主にジスルフィド結合の異性化を担う酵素であると言われているが、他にシャペロンとしての働きもあると考えられている。ＤｓｂＤは分子量５９ｋＤａのタンパク質で２つのペリプラズムドメイン、８個の膜貫通領域からなるタンパク質で、ＤｓｂＣの活性中心のシステインを還元型に維持する働きを持っていると考えられる。
ジスルフィドインターチェインジタンパク質類として下記のタンパク質が知られており、本発明のジスルフィドインターチェインジタンパク質類として使用可能である。
Ｅ．ｃｏｌｉのＤｓｂＡ  ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｐ２４９９１
Ｅ．ｃｏｌｉのＤｓｂＣ  ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｐ２１８９２
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｄｓｂＡ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ＰＩＲデータベース  アクセッションナンバーＳ３２８９５
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのｔｈｉｏｌ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｓｂＡ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ＮＭＢ０２７８  ＰＩＲデータベース  アクセッションナンバーＣ８１２１７
Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓのｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｉｓｏｆｏｒｍ  Ｉ  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  アクセッションナンバー  ＡＡＢ９４６４７
Ｄａｔｉｓｃａ  ｇｌｏｍｅｒａｔａのｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  アクセッションナンバーＡＡＤ２８２６０
これらジスルフィドインタージェインジタンパク質類は前述の通り、生物から精製し、成分として用いることもできるが、組換え生産されたものを用いてもよい。
酸化還元酵素としてプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を用いる場合、濃度が０μＭ〜１０μＭであることが好ましい。好適には０．００１〜５μＭであることが好ましい。更に好適には０．００１μＭ〜２μＭであることが好ましい。酸化還元酵素としてジスルフィドインターチェインジタンパクを用いた場合、０μＭ〜１０μＭであることが好ましい。好適には０．０１から１０μＭであることが好ましい。更に好適には０．１μＭ〜１０μＭであることが好ましい。
なお、グルタチオンレダクターゼ類、チオレドキシンレダクターゼ類については、できるだけ含まないことが望ましく、タンパク質合成系を構成する成分におけるチオレドキシンレダクターゼ及び／又はグルタチオンレダクターゼの含量が１００ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
また、上記された各成分の純度については、測定法を以下に例示する。
上記した開始因子類、延長因子類、終結因子類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、並びにＤｓｂＡ及びＤｓｂＣなどタンパク質からなる成分は、例えば、前記した、Ｈｉｓ  ｔａｇとニッケルカラムを利用した、Ｈｉｓ  ｔａｇを付したタンパク質成分の精製方法により精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的タンパク質を確認し、各レーンの泳動パターンをデンシトメーターで読み取って算出することができる。
精製したリボソームは、ショ糖密度勾配による分析で純度を測定できる。
ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類及びＦＤ、その他緩衝液、ＤＴＴ，酸化型グルタチオンなど通常試薬として市販されている試薬は、市販試薬の純度で使用可能である。なお、市販の試薬はいずれも、純度はいずれも８０％以上であった。
［試験方法、及びそれを利用した合成方法］
本発明の試験方法は、上記した［分子間又は分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質合成方法］の反応系を用いることができる。
本発明の酸化還元酵素、酸化還元試薬濃度及び１個のジスルフィド結合による架橋形成が可能でその架橋形成様式により活性が支配される１または複数のペプチド鎖からなる合成されたタンパク質の活性の３者の相関を測定する試験方法は、次のａ）〜ｄ）のから成る反応系、具体的には、（１）ａ），ｂ）及びｃ）、（２）ａ）、ｂ）およびｄ）、または（３）ａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）からなる反応系によることができる。
ａ）  １または複数の鋳型核酸、
ｂ）  存在量および純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、タンパク質合成反応基本試薬、
ｃ）  存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する酸化還元酵素、
ｄ）  存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節する酸化還元試薬。
以上の反応系で合成されたタンパク質の活性を測定し、添加したｃ）酸化還元酵素及びｄ）酸化還元試薬との相関を求める。ここで測定されるタンパク質の活性は酵素活性に限らず、例えばレセプターとタンパク質の結合活性、細胞の増殖活性、これらの比活性等を含む。
より具体的には、まず濃度を様々に変化させたｃ）酸化還元酵素及びｄ）酸化還元試薬を準備する。その際、ｃ）及びｄ）はそれぞれ単独の物質でも良いが、複数の物質の混合物であっても良い。このような酸化還元酵素の例として、プロテインジスルフィドイソメラーゼ類、ジスルフィドインターチェインジタンパク質類、或はそのホモログ酵素等を例示することができる。酸化還元試薬としては、ＤＴＴ、ＧＳＳＧ、ＧＳＨ、チオレドキシン等を例示することができる。続いて、タンパク質の合成反応を開始するが、ｃ）及びｄ）はタンパク質の合成反応の最初に加えても良いが、合成反応の途中で加えても良く、更に合成反応が終了してから加えても良い。合成反応が終了してから加える場合には、添加後更に数十分から１時間程度３７℃に静置するのが好ましい。このようにして合成したそれぞれの場合について、反応液中の合成されたタンパク質の活性を測定する。ここで合成されるタンパク質は分子内及び／又は分子間に少なくとも１つのジスルフィド結合の架橋形成が可能であるタンパク質であれば特に制限はなく、複数のタンパク質を同じ反応液中で合成しヘテロオリゴマー等を形成させ活性を測定することも可能である。
このようにして、タンパク質の活性と、ｃ）酸化還元酵素及び／又はｄ）酸化還元試薬の濃度との相関関係を明らかにすることができる。
こうして得た、相関関係を利用し、予め決められた値の活性（所望の活性値）を得るために必要なｃ）酸化還元酵素及び／又はｄ）酸化還元試薬の濃度を決定し、当該所望の活性を奏する濃度になるようにｂ）タンパク質合成反応基本試薬にｃ）酸化還元酵素及び／又はｄ）酸化還元試薬を添加した、更にａ）目的タンパク質をコードする鋳型核酸を添加した反応系で、効率的に目的タンパク質を生産することができる。
以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、もとよりこれらは例示であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】リボソーム調製
対数増殖期中期のＥ．ｃｏｌｉ  Ａ１９株の細胞３００ｇをアルミナ破砕した。破砕した細胞を緩衝液Ａ（ｐＨ７．６の１０ｍＭヘペス−水酸化カリウム（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、５０ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）、１ｍＭ  ＤＴＴに懸濁し、アルミナと細胞破砕物を遠心分離（３０，０００ｇ、４℃で１時間）して除いた。得られた上清画分に終濃度が１μｇ／ｍｌになるようにデオキシリボンクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を加えた後、遠心（１００，０００ｇ，４℃で４時間）した。ペレットを緩衝液Ａに懸濁しリボソームの粗抽出液とした。このリボソーム粗抽出液を６〜３６％（ｗ／ｖ）のショ糖密度勾配遠心にかけ，図１に示した画分を分取した。このリボソーム画分を１００，０００ｇで遠心分離し、そのペレットをリボソーム緩衝液（ｐＨ７．６の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、６ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、３０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、７ｍＭ  β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ））に懸濁し精製リボソームを調製した。精製したリボソームの一部を６〜３６％（ｗ／ｖ）のショ糖密度勾配で分析したところ、単一のピークを形成し、その純度は９０％以上であった。
【実施例２】アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）高発現用プラスミドの構築と形質転換体の作成
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ１９株より抽出したゲノムを鋳型としてアラニルｔＲＮＡシンテターゼをコードする遺伝子配列をＰＣＲ法により増幅し、５′端にＳｐｈＩ、３′端にＨｉｎｄＩＩＩが認識する配列を持ったＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をあらかじめＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断したプラスミドｐＱＥ３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）に挿入し、Ｎ末端にＨｉｓ−Ｔａｇが融合したアラニルｔＲＮＡシンテターゼを高発現させるためのベクターを得た。得られたベクターでＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＲＥＰ４を形質転換した。その他のＡＲＳを高発現するベクターも同様の手法で構築した。表１に使用したベクター、制限酵素、Ｈｉｓ−Ｔａｇの位置を示す。なお、表１におけるプラスミドのｐＱＥシリーズはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＲＥＰ４の、ｐＥＴシリーズはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ＤＥ３の形質転換にそれぞれ用いられた。
【表１】
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【実施例３】その他のタンパク質因子・酵素の高発現プラスミドの構築
実施例２と同様な方法で次に示すタンパク質因子・酵素の高発現プラスミドを構築した。ＭＴＦ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦ３、ＥＦ−Ｇ，ＥＦ−Ｔｕ，ＥＦ−Ｔｓ及びＲＦ１。なお、表１に記載していないタンパク質因子・酵素についても同様な方法でプラスミドを構築した。なお、ベクターはｐＱＥシリーズまたはｐＥＴシリーズを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＲＥＰ  ４またはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ＤＥ３の形質転換にそれぞれ用いられた。
【実施例４】  タンパク質因子・酵素の高発現と精製
Ｈｉｓ−Ｔａｇが付されたアラニルｔＲＮＡシンテターゼを高発現させるために、実施例２で得られた形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＲＥＰ４細胞を６リットルのＬＢ培地で６６０ｎｍの吸光度が０．７になるまで培養した。この培養液に終濃度が０．１ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に３７℃で４時間培養した。この培養液を遠心分離し、得られた細胞を懸濁緩衝液（ｐＨ７．６の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３ｍｇ／ｍｌ卵白リゾチーム、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、６ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理し、細胞を破壊した。超音波処理した懸濁液を遠心分離（１００，０００ｇ，４℃で１時間）し、細胞破砕物を除いた。得られた上清画分をＮｉ２＋でプレチャージされた１０ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（ファルマシア社製）に供し、１０ｍＭのイミダゾールを含む１００ｍｌのＨＴ緩衝液（ｐＨ７．６の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で洗浄した。ＨＴ緩衝液に含まれるイミダゾール濃度を１０から４００ｍＭまで直線的に勾配をつけて、Ｈｉｓ−Ｔａｇが付されたアラニルｔＲＮＡシンテターゼをカラムから溶出した。精製されたタンパク質を含む画分を合わせて、Ｓｔｏｃｋ緩衝液（ｐＨ７．６の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ））で透析した。精製したＨｉｓ−Ｔａｇが付されたアラニルｔＲＮＡシンテターゼの濃度はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を基準に作成した検量線から算出した。精製したＨｉｓ−Ｔａｇが付されたアラニルｔＲＮＡシンテターゼは１ｍｌずつ小分けして液体窒素で急冷凍した後−８０℃で保存した。その他のＨｉｓ−Ｔａｇが付されたアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｌａＲＳ）、アルギニンｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｒｇＲＳ）、アスパラギンｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｓｎＲＳ）、アスパラギン酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｓｐＲＳ）、システインｔＲＮＡシンテターゼ（ＣｙｓＲＳ）、グルタミンｔＲＮＡシンテターゼ（ＧｌｎＲＳ）及びグルタミン酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧｌｕＲＳ）も同様の手法で精製を行った。Ｈｉｓ−Ｔａｇが付された因子の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離（クマシーブリリアントブルーで染色）を図２に示す。デンシトメーターで純度を算出したところ、いずれの因子も、純度は９０％以上であった。なお、図２に示していない表１のその他の因子・酵素も、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離し、デンシトメーターで純度を算出する同様な方法で調べたこところ、いずれも純度は９０％以上であった。
【実施例５】翻訳実験（一般的方法）
タンパク質合成反応基本試薬５０μｌあたりの組成は以下のとおりである。２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＧＴＰ、１ｍＭ  ＣＴＰ，１ｍＭ  ＵＴＰ，１０ｍＭクレアチンリン酸（ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２．８  Ａ  ２６０ｕｎｉｔ  ｔＲＮＡ  ｍｉｘ、０．５μｇＦＤ、０．１ｍＭ各アミノ酸、９ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ７．３の５ｍＭリン酸カリウム、９５ｍＭグルタミン酸カリウム、５ｍＭ塩化アンモニウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭスペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、８ｍＭプトレッシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ），１２ｐｍｏｌリボソーム、１μｇ  ＩＦ１、２μｇ  ＩＦ２、０．７５μｇ  ＩＦ３、１μｇ  ＥＦ−Ｇ、２μｇ  ＥＦ−Ｔｕ、１μｇ  ＥＦ−Ｔｓ、０．５μｇ  ＲＦ１、０．５μｇ  ＲＦ３、０．５μｇ  ＲＲＦ、３０−３００ｕｎｉｔｓ各ＡＲＳ及びＭＴＦ、０．２μｇクレアチンキナーゼ（ＣＫ；ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）、０．１５μｇミオキナーゼ（ＭＫ；ｍｙｏｋｉｎａｓｅ）、０．０５４μｇヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ；ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ），１．７８ｕｎｉｔｓ  ＰＰｉａｓｅ及び０．５μｇ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。このタンパク質合成反応基本試薬に、１ｐｍｏｌの鋳型ＤＮＡを加え、３７℃で１時間反応を行った。
なお、反応後、リボソームを除去する必要がある時は、１００ｋＤａ以下の物質を通す限外ろ過膜に通し、リボソームを除去した。
なお、上記組成のうち、リボソーム及び表１記載のものは、実施例１及び実施例４で調製され、純度が測定された。その他の成分は市販の精製試薬を使用した。
また、本組成を以下の実施例６から１２において利用する場合も、表１に記載のもの、リボソーム、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣは、実施例１，４及び１３で調製され純度が測定された。それ以外の成分は市販の精製試薬を利用した。
【実施例６】ヒトリゾチームの合成
リゾチームは本来分子内に４本のジスルフィド結合を持つタンパク質であり、４つのうち２つ以上のジスルフィド結合が架橋しなければ活性を示さないことが報告されており（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５１：３１４７−３１５３（１９７６）  ）、古くから構造と活性の相関を調べるためのモデルタンパク質として広く使用されている。ここでは、本発明による方法及び従来法でヒトリゾチームを合成しタンパク質の合成量と比活性を調べた。
ヒトリゾチームのｃＤＮＡクローン（ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）より、次の２つのプライマーを用いＰＣＲ法により約０．４２ｋｂｐの成熟型ヒトリゾチームに相当する遺伝子を増幅した。
フォワードプライマーの配列は次の通り：ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧ。
リバースプライマーの配列は次の通り：ＧＧＡＴＴＡＧＴＴＡＴＴＣＡＴＴＡＣＡＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＡＣＡＴ。
次にＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡの配列を持つフォワードプライマー及び上記リバースプライマーを用い、ＰＣＲ法により、Ｔ７プロモーター領域を含む約０．５１ｋｂｐの鋳型ＤＮＡを増幅した。鋳型ＤＮＡの配列を配列表、配列番号４に示した。
実施例５に記載したタンパク質合成反応基本試薬（本発明による方法）及びその反応試薬に１ｍＭ  ＤＴＴを添加した反応液５０μｌ（従来法）に、作成した鋳型ＤＮＡ１ｐｍｏｌをそれぞれ添加し、タンパク質合成反応を行った。
合成されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（アマシャムファルマシア社製）で染色した。分子量１７０００のヒトリゾチームのバンドを、既知濃度のＢＳＡと比較し、合成されたヒトリゾチームの濃度を求めた。ヒトリゾチームの活性は、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ４６９８株の凍結乾燥菌末（ＳＩＧＭＡ社製）を用い、４５０ｎｍの吸光度を１分当たり０．００１低下させる量を１ｕｎｉｔとして測定した（Ｉｍｏｔｏ  Ｔ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｌ．Ｎ．，Ｎｏｒｔｈ  Ａ．Ｔ．Ｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｄ．Ｃ．，Ｒｕｐｌｅｙ  Ｊ．Ａ．，Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，７，６６５−８６８（１９７２））。図３に合成されたタンパク質の電気泳動写真を、図４に比活性をそれぞれ示した。図３及び図４から明らかなように、従来法では電気泳動で合成されたタンパク質は確認できるものの活性は全く認められないが、本発明による方法では約３００ｕｎｉｔｓ／ｍｇの比活性が認められ、本発明による方法でジスルフィド結合を本来有するタンパク質が正しくフォールディングされることが分かった。なお、ジスルフィド結合を持つほかのタンパク質についても調べたところ、ほぼ同様な結果が得られた。
【実施例７】マウスインターロイキン６（ｍＩＬ６）の合成
マウスｃＤＮＡラブラリーを用い実施例６と同様の方法でｍＩＬ６を作成した。また、大腸菌ゲノムＤＮＡを用い実施例６と同様の方法で大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の鋳型ＤＮＡを作成した。実施例５のタンパク質合成反応基本試薬に１ｍＭのＤＴＴを添加した反応溶液（従来法）、実施例５のタンパク質合成反応基本試薬、実施例５の基本試薬に最終濃度２，４，８ｍＭのＧＳＳＧをそれぞれ添加した計５種類の反応溶液を用意し、そのそれぞれに１ｐｍｏｌの鋳型ＤＮＡを添加し、それぞれのタンパク質を合成した。ＤＨＦＲを合成した場合は、合成後に限外ろ過膜を通過した溶液を、ｍＩＬ６を合成した場合は合成反応液をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄによりタンパク質を蛍光染色した。染色パターンをフルオロイメージャーで解析し、ｍＩＬ６とＤＨＦＲの染色濃度より、溶液中のタンパク質の量を計算した。図５に求めたｍＩＬ６のタンパク質の量を、図６にＤＨＦＲのタンパク質の量をそれぞれ示した。図５及び図６から明らかなように、分子内にジスルフィド結合を持たないＤＨＦＲを合成した場合は従来法による生産量が最も多く、本発明による方法ではタンパク質合成量が低下しているが、逆に分子内にジスルフィド結合を持つｍＩＬ６を合成した場合には、従来法よりも、本発明による方法が生産されたタンパク質の量が多いことが判明した。なお、ｍＩＬ６の鋳型ＤＮＡに代えて、他のジスルフィド結合を持つタンパク質の鋳型ＤＮＡを用いて同じ実験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【実施例８】プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の影響
実施例５のタンパク質合成反応基本試薬に２ｍＭのＧＳＳＧを添加した反応溶液を用意した。この反応溶液を４本用意した。この反応溶液に更にウシ由来ＰＤＩ（タカラバイオ社製）を最終濃度０μＭ，０．０３２５μＭ，０．１３μＭ，０．５２μＭとなるようにそれぞれ添加した。これらの反応溶液それぞれ５０μｌにヒトリゾチームの鋳型ＤＮＡを１ｐｍｏｌ添加しタンパク質を合成した。実施例６と同様の方法でリゾチームの比活性を求めた。図７には反応系に添加したＰＤＩの濃度と合成されたヒトリゾチームの比活性の関係を示した。この図から明らかなように、ＰＤＩを０．０３２５μＭ以上添加することで、ジスルフィド結合を持つタンパク質の比活性がより高くなることが分かった。また、本発明の方法を使って、ＰＤＩの活性が測定できることが分かった。なお、ウシのＰＤＩに代えて他種のＰＤＩ及びジスルフィドインターチェインジタンパク質類を使った場合も、ほぼ同様な結果が得られた。
【実施例９】ジチオスレイトール（ＤＴＴ）濃度の影響
実施例５のタンパク質合成反応基本試薬に０．１３μＭのＰＤＩを添加した反応溶液を６本作成した。この反応溶液に更に最終濃度１０００μＭ，５００μＭ，２５０μＭ，１２５μＭ，６２．５μＭ，０μＭのＤＴＴをそれぞれ添加した。これらの反応溶液それぞれ５０μｌにヒトリゾチームの鋳型ＤＮＡを１ｐｍｏｌ添加しタンパク質を合成した。２実施例６と同様の方法でリゾチームの活性を求めた。図８に結果を示した。この図から明らかなように、ＤＴＴの濃度が１２５μＭ以下であれば、リゾチームが強い活性を示すことが明らかとなった。
【実施例１０】アルカリフォスファターゼの合成
アルカリフォスファターゼは分子内に２つのジスルフィド結合を持つタンパク質で、ジスルフィド結合の形成とその酵素活性との関係について古くから良く調べられているモデルタンパク質である。ここではアルカリフォスファターゼを合成した。
大腸菌ゲノムＤＮＡ及び大腸菌アルカリフォスファターゼに特異的なＰＣＲプライマーを用いて、実施例６と同様の方法で大腸菌アルカリフォスファターゼの鋳型ＤＮＡを作成した。実施例５のタンパク質反応基本試薬に１ｍＭ  ＤＴＴ及び０．１３μＭ  ＰＤＩを添加した反応溶液を５本用意し、０，１，２，３，４ｍＭのＧＳＳＧをそれぞれ添加した。
この反応溶液それぞれ５０μｌにアルカリフォスファターゼ遺伝子の鋳型ＤＮＡを１ｐｍｏｌ添加しタンパク質を合成した。合成されたタンパク質濃度は実施例５と同様の方法により求めた。合成されたアルカリフォスファターゼはｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを基質として用い、４０５ｎｍの吸光度を測定することで活性を測定した（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２５８：１７８−８７（１９７２）。図９にアルカリフォスファターゼの相対活性を示した。図９から明らかなように、アルカリフォスファターゼは従来法、すなわち１ｍＭ  ＤＴＴ及び０．１３μＭ  ＰＤＩを添加したタンパク質反応基本試薬では全く活性を示さないのに対し、本発明による方法，すなわちＧＳＳＧを１ｍＭまたは２ｍＭ添加した反応溶液では活性が認められた。ＤＴＴが系に１ｍＭ存在していても、アルカリフォスファターゼが活性を示し、合成されたタンパク質が正しくフォールディングしていることが明らかとなった。また、実施例５の反応液に１０００μＭ，５００μＭ，２５０μＭ，１２５μＭ，０μＭのＤＴＴを添加した反応液をそれぞれ作成した。上記と同様に鋳型ＤＮＡを添加し、タンパク質を合成後、アルカリフォスファターゼの活性を測定した。その結果を図１０に示した。ＰＤＩ非存在下で、ＤＴＴのみ濃度を変化させたところ、５００μＭ以下でアルカリフォスファターゼが活性を示すことが明らかとなった。
【実施例１１】ＤｓｂＣの影響
大腸菌のＤｓｂＣをＰＣＲにより増幅し、５′端にＢａｍＨＩ、３′端にＨｉｎｄＩＩＩが認識する配列を持ったＤＮＡ断片を得た点を除き、実施例２と同様の方法にてｄｓｂＣを高発現させるベクターを構築し、得られたベクターでＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＲＥＰ４を形質転換した。実施例４と同様な方法で、精製したＤｓｂＣを得た。タンパク質の純度は９０％以上であった。実施例５のタンパク質合成基本試薬に１ｍＭ  ＤＴＴ及び２ｍＭＧＳＳＧを添加した反応溶液５０μｌを３本作成した。これら反応溶液にそれぞれ０，０，０．５μＭのＤｓｂＣ及び０，１，１ｐｍｏｌの実施例６のヒトリゾチーム遺伝子の鋳型ＤＮＡをそれぞれ添加した。実施例６と同様の方法で合成されたタンパク質の量とリゾチームの活性を測定した。図１１に比活性を示した。図１１から明らかなように、ＤｓｂＣを添加することで、リゾチームの比活性は大幅に上昇するが明らかとなった。なお、ＤｓｂＣに代えて、他のジスルフィドインターチェインジタンパク質を用いた場合、及び複数種類のジスルフィドインターチェインジタンパク質を同時に用いた場合もほぼ同様な結果が得られた。
【実施例１２】本発明のタンパク質合成基本試薬と従来の細胞抽出液との比較
大腸菌の細胞抽出液を使うｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成系（Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １００；ロッシュ社製）を用いて、ＧＳＳＧを最終濃度０，１，２，３ｍＭになるように添加した点を除き、製品の説明書に従い、大腸菌のアルカリフォスファターゼを合成した。また、実施例１０と同様に、本発明の方法で大腸菌のアルカリフォスファターゼを合成した。合成したアルカリフォスファターゼの比活性を図１２に示した。図１２から明らかなように、大腸菌の細胞中抽出液を使うシステムでは、アルカリフォスファターゼの活性はＧＳＳＧをさまざまな濃度で添加しても全く認められないのに対し、本発明の合成方法では高い活性が認められた。
【実施例１３】ＥＦ−Ｔｕ、並びにＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの純度の確認
ＥＦ−ＴｕにＨｉｓタグをつけたタンパク質が発現している細胞を氷中で超音波処理し、ローディングバッファー（３００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ８．０）に懸濁させ、細胞の溶解物を遠心分離した（３０，０００ｇ、４℃で３０分間）。上記で得られた上清に、氷で冷やしたローディングバッファーの中で平衡化した５０％のＮｉ２＋−ＮＴＡ  ｓｌｕｒｒｙ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を加えた。４℃で１時間撹拌した。樹脂をカラムにロードし、カラム容量の２０倍のローディングバッファーで、４℃でカラムの洗浄を行った。カラム容量の２０倍のローディングバッファー（１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０を含む）で、４℃でカラムの洗浄を行った。カラム容量の２０倍のローディングバッファーを用いて、ｉｍｉｄａｚｏｌｅの濃度勾配を１０から２５０ｍＭになるように設定し、カラムから目的タンパク質の溶出を行わせ、１ｍｌずつフラクションを集めった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的タンパク質を確認した。各レーンの泳動パターンをデンシトメーターで読み取って純度を算出した。図１３にＥＦ−Ｔｕの溶出画分の電気泳動写真を示した。レーンの泳動パターンをデンシトメーターで読み取り、純度９０％以上のＥＦ−Ｔｕ画分を集めた。
また、図１４には、精製したＤｓｂＡ（レーン１）及びＤｓｂＣ（レーン２）の電気泳動写真を示した。いずれの酵素も、純度は９０％以上であった。
【産業上の利用可能性】［タンパク質合成方法］
本発明による方法では、従来反応液から除去したほうが良いとされていたＤＴＴを数μＭから更に１ｍＭ迄添加しても良く、またＤＴＴを全く添加しないことも可能である。
更に、従来のＤＴＴを除去した無細胞タンパク質合成系を用いる方法ではタンパク質にジスルフィド結合を形成させることができても、該条件下ではタンパク質自体の合成量は低下し目的とする活性を持ったタンパク質の合成効率は悪くなると一般的に考えられていたが、本発明の様に、再構成タンパク質合成系を用いるとタンパク質の合成量は変わらないか、むしろ増加する場合があり、より効率的にタンパク質を合成することが可能であった。
［酵素測定法］
本発明による活性測定法では、基質はタンパク質合成反応によりジスルフィド結合を持たない一本鎖のポリペプチドとして合成されるため還元し変性させるステップが必要なく、合成と同時又は合成後に活性を測定する酵素を添加しフォールディングされたタンパク質の活性や構造を指標とする。そのため必要なステップと時間が従来法に比べて大幅に少ないという特徴がある。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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