(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）で表される単離されたウィザノンまたはその誘導体
【化７】
0004868403.tif 000020
[式中、Xは酸素、窒素、硫黄原子または、−OCO−、−COO−、−CONH−、−NHCO−、−OCONH−、−NHCOO−、−NHCONH−、−NHCSNH−基を表し、R1、R2は同一又は異なって、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリールを表す]を有効成分として含む、抗変異原性用、抗遺伝毒性用、腫瘍細胞選択的な増殖阻害用、p53活性化用、テロメラーゼ阻害用、もしくはアンチエイジング用の治療用または予防用組成物。
【請求項２】
前記式（１）で表される単離されたウィザノンまたはその誘導体、並びに単離されたウィザフェリンＡ、または２７−デオキシウィザフェリンＡ、１２−ヒドロキシウィザフェリンＡ、１５−ヒドロキシウィザフェリンＡから選択されるいずれかのウィザフェリンＡの誘導体を有効成分として含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
腫瘍からなる疾患に適用される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品または化粧品である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドのハーブであるアシュワガンダ（Ashwagandha）（学名Withania
somnifera)の葉抽出物、前記抽出物を含む抗腫瘍作用を有する食品、栄養補助食品、医薬品などの組成物、およびp53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用を有するアシュワガンダ葉抽出物の成分に関する。
【背景技術】
【０００２】
アシュワガンダ（学名Withania somnifera）は、ナス科ウィザニア属に属する、インド亜大陸の乾燥地帯に普通に見られる常緑の潅木であり、インドの伝承医学であるアユルベーダで慣用されるハーブのひとつである。
アシュワガンダの抽出物を使用することにより、肉体的および精神的な健康増進、各種疾患および有害な環境因子への防御、老化防止といった作用がもたらされるとして古くから使用されてきた。このようなアシュワガンダのヒトの健康に対する様々な有用な作用について、予備実験程度ではあるが、多くの研究がなされており、抗ストレス、抗炎症、抗腫瘍、抗酸化、解熱、鎮痛、抗関節炎、抗鬱、抗凝血、免疫調節、強壮、心臓の保護、若返り、疲労回復などに効果のあることが示されている。【０００３】
アシュワガンダの成分としては、アルカロイド類、ウィザノライド（withanolide）類と呼ばれるステロイド性ラクトンが報告されている。ウィザノライド類は以下の式（Ｉ）の基本骨格を有する。
【化１】
0004868403.tif 000002
【０００４】
ウィザノライド類としては、２０β−ヒドロキシ−１−オキソ−（２２Ｒ）−ウィザ−２，５，２４−トリエノライド、ウィザフェリンＡ（withaferine A）、ウィザノン（withanone）、ウィザノンの構造異性体である12-Deoxywithastramonolide、ウィザノライドＡ（withanolide A）、ウィザノライドＤ、及び１−オキソ−５β、６β−エポキシ−ウィザ−２−エン−２７−エトキシ−オリド等が挙げられる。ウィザフェリンＡはアシュワガンダの根の抽出物の主要な構成成分であり、抗癌作用を有するが、同時に正常細胞への毒性も強いことが知られている。（非特許文献２２〜２４）。いくつかのウィザノライド類化合物の構造を以下に示す。
ウィザフェリンＡ［５β，６β-エポキシ−４β，２７−ジヒドロキシ−１−オキソウィザ−２，２４  ジエノライド］
【化２】
0004868403.tif 000003
12-Deoxywithastramonolide［６α，７αエポキシ−５α，２７−ジヒドロキシ−１−オキソウィザ−２，２４  ジエノライド］
【化３】
0004868403.tif 000004
ウィザノライドＡ［６α，７αエポキシ−５α，２０α−（Ｒ）−ジヒドロキシ−１−オキソウィザ−２，２４  ジエノライド］
【化４】
0004868403.tif 000005
ウィザノン［６α，７α−エポキシ−５，１７−ジヒドロキシ−１−オキソウィザ−２，２４  ジエノライド］
【化５】
0004868403.tif 000006
【０００５】
アシュワガンダの効能の分子的なメカニズムについての研究はあまり多くはないが、例えば、免疫賦活活性はNOS誘導性のタンパク質発現の誘導によるものであろうといわれており（非特許文献５、１２）、抗腫瘍活性は、少なくとも部分的にはp34cdc2の発現のダウンレギュレーションによるものであるといわれており（非特許文献１３）、H2O2で誘導された細胞毒性およびDNA損傷に対する保護効果は、抗酸化、フリーラジカル捕捉および解毒作用によるものとされる（非特許文献１４〜１７）。アシュワガンダの抗腫瘍活性についての根拠や作用メカニズムの多くは未解明である。【０００６】
これらの研究はアシュワガンダの植物体全体あるいは根の部分を用いて行われているものが大部分である。本明細書で記載するようなアシュワガンダの葉の抽出物に関する研究はほとんど行われていない（非特許文献１〜１１）。【０００７】
副作用の少ない、癌だけを殺せるような特異性の高い抗腫瘍薬を見つけるために、腫瘍細胞に特徴的な分子をはっきりさせ、その働きを直接制御できるような治療に結びつけようとする研究動向が国際的にも中心になってきている。【０００８】
正常細胞においては、細胞分裂の回数は動物の種類や細胞の種類によってある程度決まっており、例えば、胎児のヒト線維芽細胞で約50〜80回である。この回数は年齢が高いと少なくなる。また細胞の分裂が停止する頃には細胞の形態も若い時に比べ、扁平で大きな細胞になってしまう。このような状態を細胞の老化と呼んでいる。一方、紫外線や化学物質などで細胞内の遺伝子（ＤＮＡ）が傷つけられると、無限に増殖を続ける不死化細胞となり、悪性化すれば腫瘍（癌）細胞へと形質転換することがある。ＤＮＡ損傷が起こった場合に、細胞周期の進行を停止し、ＤＮＡの修復、アポトーシスや細胞老化の誘導を行って発癌の原因となる遺伝子異常をもった細胞の増殖を抑制することにより、発癌を防止できる。細胞増殖を抑制する働きを持った遺伝子は、細胞の老化に関係する。細胞の老化と不死化若しくは腫瘍化（癌化）現象は密接な関係にある。【０００９】
このような遺伝子の一つがp53である。p53は腫瘍サプレッサー遺伝子の一つであり、ヒト腫瘍細胞において高率に変異が認められる。また、SV40、アデノウィルス、パピローマウィルス等の腫瘍ウィルスの産物は、宿主のp53遺伝子の産物（p53タンパク質）に結合して失活させる。p53は細胞周期の制御やDNA損傷修復に関与するほか、アポトーシスによる細胞死の制御においても重要な役割を果たしている。p53タンパク質は、正常細胞内では低いレベルに規定されているが、DNA損傷等のストレスに応答してその発現が上昇する転写因子で、下流のエフェクター遺伝子（とその機能）には、GADD45(DNA修復促進)、p21WAF1/CIP1(細胞周期のＧ1停止)、BAX(アポトーシスの誘導)、MDM2（p53タンパク質をユビキチン化して分解へ誘導）などがある。癌の約半分でp53の遺伝子変異やp53タンパク質の機能喪失が関与することは広く知られており、p53は癌治療の分子標的の一つとされている。p53腫瘍サプレッサー経路の破綻を修復する、あるいは、p53腫瘍サプレッサー経路を活性化する、すなわち正常なp53遺伝子の発現や正常なp53タンパク質の安定化による蓄積と活性化を促し、そのエフェクターへの作用を活性化することにより、抗腫瘍効果がもたらされると考えられる。【００１０】
正常な野生型p53タンパク質の活性は、複数の因子により調節される。調節因子として、例えばp53タンパク質と結合して相互作用する物質が知られている。例えば、hsp70ファミリータンパク質の一つであるモータリンは、p53タンパク質と結合して、その機能を抑えていることが報告されている。p53タンパク質は細胞核内で機能しているが、モータリンはこのp53タンパク質の核への移行を阻害するようである（非特許文献１８、１９）。抗体を用いてモータリンを検出すると正常細胞では細胞質に広く分布し、不死化細胞と癌細胞では細胞核の周りに集まって存在していることが、ヒトおよびマウスで共通して確認されている。さらに、ヒトの癌ではこのような細胞核周辺に存在するモータリンが過剰に発現していることも報告されている（非特許文献１８、２０）。【００１１】
p53を標的とした癌治療としては、正常なp53遺伝子を癌細胞に戻して癌を治療しようとする試み（遺伝子治療）がある一方、遺伝子治療とは別の観点でp53機能を癌治療に応用しようとする試みもある。上述のように、多くの癌細胞ではp53遺伝子に変異が見られる。そして、変異p53蛋白質は細胞内で高いレベルで存在する。そこで、もし変異したp53蛋白質の構造を正常に戻すことができれば、新たな治療法が期待できる。このようなことから、変異p53蛋白質の機能を正常化する物質がスクリーニングされ、低分子量のペプチドやp53蛋白質に親和性のある化学物質が変異p53機能を正常化することが証明された（非特許文献２５−２７）。【００１２】
ヒトの染色体の末端にはテロメアと呼ばれる約５〜２０ｋｂ長のＴＴＡＧＧＧの６塩基繰り返し配列があり、染色体の安定性を保つために重要な役割を果たしている。正常な体細胞では細胞分裂毎にテロメアが短縮していき、やがて細胞分裂ができなくなり、細胞死に至る。しかし、腫瘍細胞では染色体末端の短縮がみられず、何らかの形でテロメアが修復され細胞死を逃れていることが想像された。テロメラーゼ(telomerase)は、短くなったテロメアを複製・伸長する酵素である。１９９４年、KimらによってPCRを用いたTRAP法(telomere repeat amplification protocol assay)が報告され、テロメラーゼ活性の測定が可能となり、腫瘍細胞ではテロメラーゼが特異的に活性化することが報告された（非特許文献２１）。テロメラーゼは９割以上の癌で検出され、ほとんどの正常な細胞で検出されないことから、これによって腫瘍細胞が不死化していると考えられている。したがって、この酵素テロメラーゼの阻害剤は腫瘍細胞の無限増殖を抑制することが期待される。
【非特許文献１】Archana and Namasivayam, 1999; Antistressoreffect of Withania somnifera. J Ethnopharmacol 64, 91-93.
【非特許文献２】Bhattacharya et al., 2000; Anxiolytic-antidepressantactivity of Withania somnifera glycowithanolides: an experimental study.Phytomedicine 7, 463-469.
【非特許文献３】Bhattacharya and Muruganandam, 2003; Adaptogenicactivity of Withania somnifera: an experimental study using a rat model ofchronic stress. Pharmacol Biochem Behav 75,547-555.
【非特許文献４】Davis and Kuttan, 2002a; Effect of Withaniasomnifera on cell mediated immune responses in mice. J Exp Clin Cancer Res 21, 585-590.
【非特許文献５】Davis and Kuttan, 2002b; Effect of Withaniasomnifera on CTL activity. J Exp Clin Cancer Res 21, 115-118.
【非特許文献６】Dhuley, 2000; Adaptogenic andcardioprotective action of ashwagandha in rats and frogs. J Ethnopharmacol 70, 57-63.
【非特許文献７】Mishra et al., 2000; Scientific basis forthe therapeutic use of Withania somnifera (ashwagandha): a review. Altern MedRev 5, 334-346.
【非特許文献８】Prakash et al., 2002; Withania somniferaroot extract prevents DMBA-induced squamous cell carcinoma of skin in Swissalbino mice. Nutr Cancer 42,91-97.
【非特許文献９】Scartezzini and Speroni, 2000; Review onsome plants of Indian traditional medicine with antioxidant activity. JEthnopharmacol 71, 23-43.
【非特許文献１０】Singh et al., 2003; Adaptogenic activityof a novel withanolide-free aqueous fraction from the roots of Withaniasomnifera Dun. (Part II). Phytother Res 17,531-536.
【非特許文献１１】Tohda et al., 2000; Dendrite extension bymethanol extract of Ashwagandha (roots of Withania somnifera) in SK-N-SH cells.Neuroreport 11, 1981-1985.
【非特許文献１２】Iuvone et al., 2003; Induction of nitricoxide synthase expression by Withania somnifera in macrophages. Life Sci 72, 1617-1625.
【非特許文献１３】Singh et al., 2001; Downregulation ofp34cdc2 expression with aqueous fraction from Withania somnifera for a possiblemolecular mechanism of anti-tumor and other pharmacological effects.Phytomedicine 8, 492-494.
【非特許文献１４】Davis and Kuttan, 2001; Effect ofWithania somnifera on DMBA induced carcinogenesis. J Ethnopharmacol 75, 165-168.
【非特許文献１５】Panda and Kar, 1997; Evidence for freeradical scavenging activity of Ashwagandha root powder in mice. Indian JPhysiol Pharmacol 41, 424-426.
【非特許文献１６】Prakash et al., 2001; Chemopreventiveactivity of Withania somnifera in experimentally induced fibrosarcoma tumoursin Swiss albino mice. Phytother Res 15,240-244.
【非特許文献１７】Russo et al., 2001; Indian medicinal plants asantiradicals and DNA cleavage protectors. Phytomedicine 8, 125-132.
【非特許文献１８】Wadhwa et al., 2002; An Hsp70 familychaperone, mortalin/mthsp70/PBP74/Grp75: what, when, and where? Cell StressChaperones 7, 309-316.
【非特許文献１９】Wadhwa et al., 1998; Inactivation of tumorsuppressor p53 by mot-2, a hsp70 family member. J Biol Chem 273, 29586-29591.
【非特許文献２０】Wadhwa et al. 1993; Differentialsubcellular distribution of mortalin in mortal and immortal mouse and humanfibroblasts. Exp Cell Res 207, 442-448.
【非特許文献２１】Kim et al., 1994; Specific association ofhuman telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 266, 2011-2015.
【非特許文献２２】Ganzera et al., 2003; Quantitative HPLCanalysis of withanolides in Withania somnifera. Fitoterapia 74, 68-76.
【非特許文献２３】Kaur et al., 2003; Effect of 1-oxo-5beta, 6beta-epoxy-witha-2-ene-27-ethoxy-olideisolated from the roots of Withania somnifera on stress indices in Wistar rats.J Altern Complement Med 9,897-907.
【非特許文献２４】ur-Rahman etal., 2003; Withanolides from Withania coagulans. Phytochemistry 63, 387-390.
【非特許文献２５】Bykov, V. J.,Selivanova, G., and Wiman, K. G. (2003) Eur. J. Cancer 39,1828-1834
【非特許文献２６】Bykov, V. J.,and Wiman, K. G. (2003) Ann. Med. 35, 458-465Bykov, V. J., Issaeva, N.,Shilov, A., Hultcrantz, M., Pugacheva, E., Chumakov, P., Bergman, J., Wiman, K.G., and Selivanova, G. (2002) Nat. Med. 8, 282-288
【非特許文献２７】Bykov, V. J.,Issaeva, N., Selivanova, G., and Wiman, K. G. (2002) Carcinogenesis 23,  2011-2018
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、アシュワガンダ葉抽出物の薬理作用を詳しく解明して、その抗腫瘍活性に科学的裏付けを与え、新しい医薬用途もしくは保健用途を探索することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、アシュワガンダ葉抽出物（leaf extract from ashwagandha：以下においてLashと記載することもある）が抗変異原性および抗遺伝毒性、およびヒトの腫瘍細胞に対する選択的な増殖阻害作用を有すること、さらに腫瘍細胞に選択的なp53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用並びに抗老化（アンチエイジング）作用を有することを発見して本発明を完成した。【００１５】
すなわち、本発明により、アシュワガンダ葉抽出物を含む、抗変異原性作用、抗遺伝毒性作用、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用、もしくは抗老化（アンチエイジング）作用が必要とされる症状の治療用または予防用組成物が提供される。また一つの態様において、上記疾患は腫瘍であり、さらなる態様において上記組成物は食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品または化粧品である。【００１６】
また、本発明により、以下のアシュワガンダ葉抽出物が提供される。
以下の（ア）又は（イ）：
（ア）アシュワガンダの葉をアルコールで抽出、濃縮して得られるアルコール抽出物；
（イ）前記アルコール抽出物に水を加えた含水アルコール抽出物をヘキサンで抽出してクロロフィルなどの色素を除いた残渣をジエチルエーテルで抽出、濃縮して得られるエーテル抽出物、のいずれかのアシュワガンダ葉抽出物。【００１７】
アシュワガンダの葉から溶媒抽出される抽出物であって、該抽出物が少なくとも以下の式のいずれか
【化６】
0004868403.tif 000007
【化７】
0004868403.tif 000008
で表される化合物を含む成分を含有することを特徴とする抽出物。
【００１８】
アシュワガンダの葉からアルコールで抽出することのできる抽出物であって、該抽出物が少なくとも以下の式のいずれか
【化８】
0004868403.tif 000009
【化９】
0004868403.tif 000010
で表される化合物を含む成分を含有することを特徴とする抽出物。
【００１９】
上記抽出物が、さらにエーテルで抽出して得られる抽出物であって、該抽出物が少なくとも以下の式のいずれか
【化１０】
0004868403.tif 000011
【化１１】
0004868403.tif 000012
で表される化合物を含む成分を含有することを特徴とする抽出物。【００２０】
さらに、上記のアシュワガンダ葉抽出物又はその成分として、以下のものが提供される：
腫瘍細胞に選択的なp53活性化作用を有するアシュワガンダ葉抽出物又はその成分；
テロメラーゼ阻害作用を有するアシュワガンダ葉抽出物又はその成分；
野生型p53を有する腫瘍細胞の増殖停止を引き起こすアシュワガンダ葉抽出物又はその成分；
変異型p53を有する腫瘍細胞の増殖停止を引き起こすアシュワガンダ葉抽出物又はその成分；
腫瘍細胞の増殖停止を引き起こすアシュワガンダ葉抽出物又はその成分；
腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすアシュワガンダ葉抽出物又はその成分；
変異型p53に野生型p53の機能を与えるアシュワガンダ葉抽出物又はその成分；
生体内におけるウィザフェリンＡの毒性を中和するアシュワガンダ葉抽出物又はその成分；
抗老化（アンチエイジング）作用を有するアシュワガンダ葉抽出物又はその成分。【００２１】
上記のアシュワガンダ葉抽出物の成分は、腫瘍の治療または予防のために用いることができる。従って、本発明は以下も含む。すなわち、上記成分を含有する腫瘍の治療用または予防用組成物；上記成分を用いる腫瘍の治療または予防の方法；腫瘍の治療用または予防用組成物を製造するための上記成分の使用。
また、上記のアシュワガンダ葉抽出物の成分は、正常細胞の抗老化（アンチエイジング）作用を有するため、正常細胞の老化抑制を目的とした治療または予防のために用いることができる。従って、本発明は以下も含む。すなわち、上記成分を含有する正常細胞の老化の予防用組成物；上記成分を用いる正常細胞の老化の予防の方法；正常細胞の老化の予防用組成物を製造するための上記成分の使用。【００２２】
さらに、本発明は以下の組成物も提供する。
以下の式で表されるウィザノンまたはその誘導体
【化１２】
0004868403.tif 000013
[式中、Xは酸素、窒素、硫黄原子または、−OCO−、−COO−、−CONH−、−NHCO−、−OCONH−、 −NHCOO−、−NHCONH−、−NHCSNH−基を表し、R1、R2は同一又は異なって、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリールを表す]
を含む、抗変異原性作用、抗遺伝毒性作用、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用、もしくはアンチエイジング作用が必要とされる症状の治療用または予防用組成物。
ウィザノンまたはウィザノンの誘導体及びウィザフェリンＡまたはウィザフェリンＡの誘導体を含む、抗変異原性作用、抗遺伝毒性作用、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用、もしくはアンチエイジング作用が必要とされる症状の治療用または予防用組成物。
アシュワガンダ抽出物及び１又は２以上の他の化合物を含む、抗変異原性作用、抗遺伝毒性作用、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用もしくはアンチエイジング作用が必要とされる症状の治療用または予防用組成物。
ウィザノン又はウィザノンの誘導体及び１又は２以上の他の化合物を含む、抗変異原性作用、抗遺伝毒性作用、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用もしくはアンチエイジング作用が必要とされる症状の治療用または予防用組成物。【００２３】
また、本発明は以下の方法も提供する。
アシュワガンダの葉をメタノール又はエタノールで抽出してアルコール抽出物を得る工程、前記アルコール抽出物に水を加えて含水アルコール抽出物を得る工程；前記含水アルコール抽出物をヘキサンで抽出してクロロフィルなどの色素を除いた残渣を得る工程；前記残渣をジエチルエーテルで抽出、濃縮する工程を含む、アシュワガンダ葉抽出物の製造方法。【００２４】
ウィザノン又はウィザフェリンＡの製造方法であって、アシュワガンダの葉をメタノール又はエタノールで抽出してアルコール抽出物を得る工程；前記アルコール抽出物に水を加えて含水アルコール抽出物を得る工程；前記含水アルコール抽出物をヘキサンで抽出してクロロフィルなどの色素を除いた残渣を得る工程；前記残渣をジエチルエーテルで抽出、濃縮してエーテル抽出物を得る工程；前記エーテル抽出物を分離、精製する工程を含む、前記方法。【００２５】
また、次に示すウィザノライド（Withanolide）類（ウィザノン及びウィザノンの誘導体を包含する）を有効成分として含有する食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品または化粧品も本発明の範囲に含まれる。
（１）前述の式（I)で示されるウィザノライド骨格を基本構造とするウィザノライド類。
（２）式（I）中、１位の炭素原子に＝Ｏが結合し、２位と３位の炭素原子間の結合が二重結合を示すウィザノライド 骨格を基本構造とするものである、ウィザノライド 類。
（３）式（I）中、５位の炭素原子に−ＯＨが結合したウィザノライド骨格を基本構造とするものである、ウィザノライド類。
（４）式（I）中、６,７位の炭素原子にエポキシが結合したウィザノライド骨格を基本構造とするものである、ウィザノライド類。
（５）式（I）中、５位の炭素原子にα位に−ＯＨが結合したウィザノライド 骨格を基本構造とするものである、ウィザノライド類。
（６）式（I）中、６,７位の炭素原子のa方向にエポキシが結合したウィザノライド 骨格を基本構造とするものである、ウィザノライド類。
（７）下記式(II)
【化１３】
0004868403.tif 000014
[式中、Xは酸素、窒素、硫黄原子または、−OCO−、−COO−、−CONH−、−NHCO−、−OCONH−、 −NHCOO−、−NHCONH−、−NHCSNH−基を表し、R1、R2は同一または異なって、プロトン、アルキル、アリール、ヘテロアリールを表す]で示されるウィザノン（withanone）またはその誘導体。
【００２６】
さらに、次に示すウィザノライド（Withanolide）類（ウィザフェリンＡまたはウィザフェリンＡの誘導体を包含する）を有効成分として含有する食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品または化粧品も本発明の範囲に含まれる。
（１）前述の式（I)で示されるウィザノライド骨格を基本構造とするウィザノライド （Withanolide）類。
（２）式（I）中、１位の炭素原子に＝Ｏが結合し、２位と３位の炭素原子間の結合が二重結合を示すウィザノライド骨格を基本構造とするものである、ウィザノライド （Withanolide）類。
（３）式（I）中、４位の炭素原子に−ＯＨが結合したウィザノライド骨格を基本構造とするものである、ウィザノライド（Withanolide）類。
（４）ウィザフェリンＡ（Withaferin A）、２７−デオキシウィザフェリンＡ（27-Deoxywithaferin A）、１２−ヒドロキシウィザフェリンＡ（12-Hydroxywithaferin A）、１５−ヒドロキシウィザフェリンＡ（15-Hydroxywithaferin A）、ウィザノライド Ｄ（Withanolide D）、１４−ヒドロキシウィザノライド Ｄ（14-Hydroxywithanolide D）、２７−ヒドロキシウィザノライド Ｄ（27-Hydroxywithanolide D）、２７−ヒドロキシウィザノライド B（27-Hydroxywithanolide B）、４−ヒドロキシウィザノライド Ｅ（4-Hydroxywithanolide E）、ウィザノライド A（Withanolide A）、ウィザノライド Ｏ（Withanolide O）、ウィザノライド Ｕ（Withanolide U）、ウィザングラチン（Withangulatin）、ウィザクニスチン（Withacnistin）、ウィザペルビンＢ（Withaperuvin B）、フィサプベノライド（Physapubenolide）、フィサロラクトンＣ（Physalolactone C）、イクソカルパラクトンＡ（Ixocarpalactone A）、４，７−ジヒドロキシ−１−オキソウィザ２，５，２４−トリエノライド（4,7-Dihydroxy-1-oxowitha-2,5,24-trienolide）、４，２７−ジヒドロキシ−１−オキソウィザ２，５，２４−トリエノライド（4,27-Dihydroxy-1-oxowitha-2,5,24-trienolide）、４，７，２０−トリヒドロキシ−１−オキソウィザ２，５，２４−トリエノライド（4,7,20-Trihydroxy-1-oxowitha-2,5,24-trienolide）、および４，７，２１−トリヒドロキシ−１−オキソウィザ２，５，２４−トリエノライド（4,7,21-Trihydroxy-1-oxowitha-2,5,24-trienolide）の中から選ばれる１種または２種以上である、ウィザノライド（Withanolide）類。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＭＮＮＧ処理によるタマネギ根端細胞の染色体異常の代表例を示す（実施例２、なおLash処理の効果については、表１に示す）。ａ：染色体分離障害(chromatin bridges)及び染色体の迷走(vagrantchromosome)；ｂ：後期の遅れ（delayed anaphase）；ｃ：セントロメアの破壊（centromere break）；ｄ：染色体切断(multiple chromosomal break)；ｅ：染色体の移動の遅れ（lagging chromosome）；ｆ：付着(stickness)。
【図２】通常の培地（control）及びLash並びに他の薬剤（H2O2、5'-Aza）を含む培地で培養された、ヒトの正常細胞（TIG-1）および腫瘍由来細胞（Saos-2、U2OS、MCF-7）の形態を示した顕微鏡写真である。（実施例３）
【図３】通常の培地（control）及びLash並びに他の薬剤（H2O2、5'-Aza）を含む培地で培養された、ヒトの正常細胞（TIG-1）および腫瘍由来細胞（Saos-2、U2OS、MCF-7）の増殖カーブである。（実施例３）
【図４】通常の培地（control）及びLashを含む培地で培養された、ヒトの腫瘍由来細胞（Saos-2、U2OS、MCF-7）のコロニー形成アッセイの結果を示す。（実施例３）
【図５】通常の培地（０）及びLashを添加した（１２、２４、４８μｇ／ｍｌ）培地で培養したヒトの正常細胞（TIG-1）および腫瘍由来細胞（Saos-2、U2OS、MCF-7）の細胞増殖アッセイの結果を示す。腫瘍由来細胞は増殖が阻害されているが、正常細胞の細胞数は減少していない。（実施例３）
【図６】Lash並びに他の薬剤（H2O2、5-'Aza）で処理された、ヒトの正常細胞（TIG-1）および腫瘍由来細胞（U2OS、MCF-7）のｐ５３及びｐ２１タンパク質についてのウエスタンブロッティングの結果を示す。（実施例４）
【図７】通常の培地（control）及びLash並びに他の薬剤（H2O2、5'-Aza）を含む培地で培養されたヒトの正常細胞（TIG-1）および腫瘍由来細胞細胞（U2OS、MCF-7）の、モータリン及びp53に対する蛍光抗体染色を示す顕微鏡写真である。モータリン（赤）は細胞質、ｐ５３(緑)は核における染色として示されている。（実施例４）
【図８】腫瘍由来細胞（U2OS、Saos-2）における、モータリン（赤）及びHoescht dye（核の青色の染色）の蛍光抗体染色を示す顕微鏡写真である。（実施例４）
【図９】TRAPアッセイの結果を示す。（実施例５）ａ：Lash並びに他の薬剤（H2O2、5'-Aza）で処理されたMCF-7細胞のTRAPアッセイｂ：Lash並びに他の薬剤（H2O2、5'-Aza）で処理されたMCF-7細胞のTRAP−ELISAc：MCF-7細胞のTRAP活性に対するLash処理による経時変化
【図１０】ヌードマウスを用いたin vivoでの腫瘍抑制効果を示す。（実施例７）Lashを注射されたマウス（Lash）では、腫瘍の進行が顕著に抑制された。
【図１１】ヌードマウスを用いたin vivoでの腫瘍抑制効果を示す。（実施例７）Lashを注射することにより、腫瘍の進行が顕著に抑制された。
【図１２】野生型p53あるいは変異型p53を持つ癌細胞の増殖停止効果を示す。（実施例８）
【図１３】変異型p53を持つ癌細胞の増殖停止効果を示す。図中、破線がコントロールであり、実線がLash２４μｇ／ｍｌで処理された細胞である。（実施例８）
【図１４】野生型p53を持つ癌細胞の増殖停止効果、及び変異型p53を持つ癌細胞のアポトーシスを示す。（実施例９）
【図１５】癌細胞における変異型p53タンパク質の減少、及び下流のエフェクター（MDM2,p21,BAX）の増加を示す。（実施例１０）
【図１６】変異型p53の野生型ｐ５３への転換を示す。（実施例１０）
【図１７】変異型p53所持細胞における、野生型p53の活性を示す。（実施例１１）
【図１８】腫瘍の抑制に関するウィザフェリンＡとLashの作用の比較。（実施例１２）
【図１９】Lashの経口供与による生体内での腫瘍抑制。（実施例１３）
【図２０】Lashの構成成分の分析逆相ＨＰＬＣのチャートである。（実施例１４）
【図２１】Lashの構成成分の癌細胞増殖に対する効果を示す。（実施例１５）
【図２２】Lashの構成成分の癌細胞増殖に対する効果を示す。（実施例１５）
【図２３】Lashの構成成分の癌細胞増殖に対する効果を示す。（実施例１５）
【図２４】Lashの構成成分の癌細胞増殖に対する効果を示す。（実施例１５）
【図２５】Lashの構成成分の癌細胞増殖に対する効果を示す。（実施例１５）
【図２６】Lash及びピーク２１処理による、p53機能の誘導を示す。（実施例１６）
【図２７】Lash及びピーク２１処理したU2OS細胞のp53染色像である。（実施例１６）
【図２８】Lash、ピーク２１、ウィザフェリンＡ処理時のテロメラーゼ活性を示す。（実施例１７）
【図２９】Lash及びピーク２１処理によるp21WAF1発現を示す。（実施例１８）
【図３０】モータリンとp53の染色像である。（実施例１８）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（１）アシュワガンダ葉抽出物
アシュワガンダとしては学名Withania somniferaを用いる。アシュワガンダ葉抽出物とは、アシュワガンダの葉を抽出して得られる抽出物である。アシュワガンダの葉は採取したままの新鮮葉、それを乾燥させたもの、または焙煎させたものいずれでもよいが、乾燥させたものが望ましい。原料とするアシュワガンダは天然に生育するものに限定されず、in vitroで培養したものであってもよいが、アシュワガンダ葉に含有される成分の組成はアシュワガンダの産地や樹齢等により若干の差があると考えられるため、本発明のアシュワガンダ葉抽出物を得るためには、インド国内で種から栽培した２〜４年目の植物を用いることが望ましい。【００２９】
本発明におけるアシュワガンダ葉抽出物としては、アシュワガンダの葉をアルコール（水性アルコール）で抽出、濃縮して得られるアルコール抽出物、およびここで得られるアルコール抽出物からクロロフィルなどの色素を除いた残渣をジエチルエーテルで抽出、濃縮して得られるエーテル抽出物、又はこれらの抽出物の成分を用いる。
アルコール抽出物を得るのに使用される水性アルコールとしては、炭素数１〜３の脂肪族アルコールが望ましく、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。【００３０】
エーテル抽出物を得るには、上記のようにして得られたアルコール抽出物に水を加えた含水アルコール抽出物をさらに適当な溶媒（例えばヘキサン）で抽出してクロロフィルその他の色素を除いた残渣をジエチルエーテルで抽出、濃縮して得るのが適当である。
本発明におけるアシュワガンダ葉抽出物としては、上記で得られたエーテル抽出物をさらにカラムクロマトグラフィーなどにより精製した画分を用いてもよい。クロマトグラフィーとしては逆相が適当である。【００３１】
エーテル抽出物を逆相に付した場合、次に示す式I（ウィザフェリンＡ）、式II（12-Deoxywithastramonolide）、式III（ウィザノライドＡ）、式IV（ウィザノン）に対応する複数のピークを得ることができる。このように、本発明のアシュワガンダ葉抽出物としては、最終的に得られたピークを示す成分を精製することにより単離することができる化合物を用いることもできる。
【化１４】
0004868403.tif 000015
【化１５】
0004868403.tif 000016
【００３２】
本発明におけるアシュワガンダ葉抽出物としてエーテル抽出物を逆相クロマトグラフィーにより精製した画分を用いる場合、特に有用であるのは本明細書の実施例１４で得られたピーク２１の成分を精製して得られた化合物（以下、単にピーク２１と称することもある）である。
本発明者らは、ピーク２１が前記式IVの化合物であるウィザノンに対応することを見出した。よって、抗変異原性、抗遺伝毒性、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用、もしくはアンチエイジング作用を有するようなウィザノン及びウィザノンの誘導体も本発明におけるアシュワガンダ葉抽出物の範囲に含まれる。ウィザノン及びウィザノンの誘導体の製造方法は特に限定されるものではなく、アシュワガンダ葉から単離されるほか、単離化合物の化学的変換または合成等によっても製造することができる。かかる化学的変換または合成等の方法は、例えば”Natural Product Reports”(8(4), 415(1991))その他に記載されるような当業者に周知の適当な方法によることができる。【００３３】
ウィザノン又はその誘導体として適切なものを以下の式で示す。
【化１６】
0004868403.tif 000017
上記式において、Xは酸素、窒素、硫黄原子または、−OCO−、−COO−、−CONH−、−NHCO−、−OCONH−、 −NHCOO−、−NHCONH−、−NHCSNH−基を表し、R1、R2は同一または異なって、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリールを表す。
【００３４】
本発明において「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のものを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。当該「アルキル」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、トリメチルシリルを挙げることができ、これらが１〜３個置換されている。
本発明において「アリール」としては、例えば、炭素数６〜１２のものを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニルを挙げることができる。当該「アリール」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されている。
本発明において「ヘテロアリール」としては、窒素、酸素、又は硫黄原子を含む１〜２環性の複素環を表す。当該「ヘテロアリール」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されている。
本発明におけるアシュワガンダ葉抽出物として、ピーク２１（ウィザノン）あるいはその誘導体を他のアシュワガンダ葉抽出物の成分等その他の化合物と組合わせて用いることもできる。【００３５】
（２）組成物
本発明はさらに、アシュワガンダ葉抽出物を含む抗変異原性、抗遺伝毒性、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用もしくは抗老化作用を有する組成物を提供し、組成物は食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品または化粧品の形でありうる。
腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用を有するとは、腫瘍細胞（形質転換細胞）の増殖を特異的に阻害するが正常細胞（不死化若しくは腫瘍化（癌化）していない細胞）の増殖には影響を与えないことをいう。p53活性化とは、p53腫瘍サプレッサー経路の活性化を意味する。
本発明の組成物が医薬用組成物であるときの投与方法は特に限定されるものではなく、経口、経鼻、非経口、経肺、経皮、経粘膜などが可能である。本発明の医薬用組成物は種々の剤形とすることができる。例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができるが、これらに限定されない。また、製剤には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤、ビタミンＣ、抗酸化剤を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の医薬用組成物の投与量は、一般的には、アシュワガンダ葉抽出物に換算して成人１日用量として１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇを使用する。もちろん個別的に、投与されるヒトの年齢、体重、症状、投与経路、投与期間、治療経過等に応じて変化させることもできる。１日あたりの量を数回に分けて投与することもできる。また、他の抗腫瘍剤や治療法と組み合わせて投与することもできる。
本発明の組成物は、食品又は栄養補助食品の形態とすることもできる。例えば、アシュワガンダ葉抽出物を原材料に配合することにより、麺類、パン、キャンディー、ゼリー、クッキー、スープ、健康飲料、焼酎などのアルコール飲料等の形態とすることができる。このような食品、栄養補助食品にはアシュワガンダ葉抽出物の他に、鉄、カルシウム等の無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖、キトサン等の食物繊維、大豆抽出物等のタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖、乳糖等の糖類を加えることができる。
本発明の組成物は、アシュワガンダ葉抽出物を原材料に配合することにより、医薬部外品または化粧品の形態とすることもできる。本発明の組成物を医薬部外品または化粧品とするときは、本発明の効果を損なわない範囲で、アシュワガンダ葉抽出物に加えて、通常医薬部外品や化粧品に用いられる他の成分、例えば油分、湿潤剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、保湿剤、香料、水、アルコール、増粘剤等を必要に応じて適宜配合することができる。【００３６】
（３）本発明の組成物が有用な症状
本発明の組成物は抗変異原性、抗遺伝毒性、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用もしくはアンチエイジング作用を有する。従って、本発明の組成物はこれらの作用が有用である症状に有効である。
本発明の組成物が有用である症状には各種腫瘍が含まれるが、これに限定されない。
なお、抗変異原性作用、抗遺伝毒性作用、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、テロメラーゼ阻害作用もしくはアンチエイジング作用を有するかどうかについては、以下に記載する実施例に記載の各方法を用いることができるが含まれるが、これに限定されない。
本発明のアシュワガンダ葉抽出物は、正常細胞に影響を与えず、腫瘍細胞に選択的に増殖阻害作用を及ぼす。腫瘍細胞への選択性は、抗腫瘍作用を有すると伝えられる薬草であるニンニク（Allium sativum）及びニガウリ（Momordica charantia）の抽出物と比べても顕著なものであった。従って、疾患が腫瘍であるときには、本発明の組成物は腫瘍細胞の増殖の抑制を目的として、正常細胞には作用せず、副作用の少ない組成物として利用することができる。
さらに、本発明のアシュワガンダ葉抽出物は、腫瘍細胞に選択的なp53活性化作用を有する。また、本発明のアシュワガンダ葉抽出物は、テロメラーゼ阻害作用を有する。テロメラーゼは９割以上の癌で検出されるが、ほとんどの正常な細胞で検出されない。また、本発明のアシュワガンダ葉抽出物は、抗酸化作用や脱メチル化作用を有さないようである。理論に拘束されるわけではないが、本発明者らは、本発明のアシュワガンダ葉抽出物による腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用は、p53活性化作用あるいはテロメラーゼ阻害作用に関連付けられる可能性があると考えている。従って、疾患が腫瘍であるときには、本発明の組成物は、腫瘍細胞に選択的なp53活性化作用あるいはテロメラーゼ阻害作用を目的として、正常細胞には作用せず、副作用の少ない組成物として利用することができる。
細胞分裂の停止やアポトーシスは、発癌の原因となる遺伝子異常を有した細胞の増殖を抑制し、癌の発生を抑制するメカニズムであり、p53はこのメカニズムが機能する上で重要な役割を果たす。癌細胞においてはp53が変異していることが多く、このメカニズムがうまく機能しないために細胞の異常増殖を止めることができない場合がある。
本発明のアシュワガンダ葉抽出物又はその成分は、p53が変異している腫瘍細胞において、p53の機能を正常化させる効果を有する。本発明者らは、p53のミスセンス変異を有するセルライン（ＰＣ１４、ＳＫＢＲ３、ＨＳ５７８Ｔ、ＨＴ１０８０、Ｕ２ＯＳ）を用いた実験によりこのことを実証した。これらのセルラインではｐ５３タンパク質のコンフォーメーションが変化してＤＮＡ結合性に影響を与えており、ｐ５３腫瘍サプレッサー経路が正常に機能していないが、本発明のアシュワガンダ抽出物又はその成分には変異p53蛋白質の機能を正常化する働きがあると思われる。
本発明のアシュワガンダ葉抽出物又はその成分は、野生型p53のみならず変異型p53を有する腫瘍細胞（形質転換細胞）に対しても増殖阻害作用を有する。さらに、本発明のアシュワガンダ葉抽出物又はその成分は、変異型p53を有する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。一方、本発明のアシュワガンダ葉抽出物又はその成分は、正常細胞の生存や増殖には影響を及ぼさない。
さらに、本発明のアシュワガンダ葉抽出物又はその成分は、腫瘍細胞の変異型p53に野生型の機能を与えることができるようである。つまり、Lashで処理された腫瘍細胞においては、変異型p53タンパク質が減少し、野生型の正常な機能を有するp53タンパク質へと転換され、このp53タンパク質が機能し、下流のエフェクタータンパク質が発現している可能性がある。
上記より、本発明のアシュワガンダ葉抽出物又はその成分は、p53が変異している腫瘍細胞においても、p53の機能を正常化させる効果を有し、腫瘍細胞の増殖停止やアポトーシスを引き起こすことができるため、腫瘍の治療や予防のために非常に有用である。
また、本発明のアシュワガンダ葉抽出物又はその成分として、ピーク２１を単離して用いた場合、ピーク２１は抗変異原性、抗遺伝毒性、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用、p53活性化作用、もしくはテロメラーゼ阻害作用を有する。一方、ウィザフェリンＡは正常細胞と腫瘍細胞の両方に増殖阻害作用を及ぼし、腫瘍細胞に選択的ではない。しかし、ピーク２１をウィザフェリンＡと共に使用すると、腫瘍細胞の増殖阻害効果としてより強い活性（相乗効果）が発揮され、さらにピーク２１はウィザフェリンＡの正常細胞への毒性を中和する作用を有する。また、ウィザフェリンＡ単独ではテロメラーゼ阻害作用を有さないが、ウィザフェリンＡとピーク２１を組合わせて使用するとテロメラーゼ阻害作用を発揮する。したがって、ウィザフェリンＡとピーク２１の組合わせも腫瘍の治療や予防のために非常に有用である。
また、ピーク２１は加齢細胞に対して非毒性であり、アンチエイジング効果をも有する。癌の発生は細胞及び個体の老化や高齢化と関連する。したがって、ピーク２１を含む組成物は腫瘍の治療や予防、正常な加齢に対するアンチエイジング効果の発揮に有用である。
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００３７】
実施例１  アシュワガンダ葉抽出物の調製
インド北部で種から栽培した３年目の植物（ｉｎ vivo  植物）から、１０月に、アシュワガンダ(Withania somnifera)の葉を採取した。流水で洗浄し、空気乾燥してから細かい粉末状に破砕した。この粉末状となった葉を、改変ソックスレー法により抽出した(Lavie et al., 1968)。温メタノール（６０℃）を用いて、ソックスレー装置で４〜５日間、葉の粉末を徹底的に抽出した。得られたメタノール抽出物をさらにヘキサンで抽出してクロロフィルおよび他の色素を除き、次いで、ジエチルエーテルで抽出し、エバポレーションによりエーテル抽出物を得た。抽出手順のフローチャートを以下に示す。
【化１７】
0004868403.tif 000018
この調製法を用いることにより、アシュワガンダの葉の粉末４０ｇから１．４ｇの葉抽出物が得られた。【００３８】
実験室でアシュワガンダ(Withania somnifera)のin vitro培養を行う場合は、無菌的に発芽させた幼植物の茎端からin vitroで苗木を育てた。
腋生の茎基部のカルスから栽培した苗条を、６−ベンジルアデニン（ＢＡ、２ｍｇ/ｌ）あるいはＮ６（２−イソペンテニル）アデノシン単独（２−ｉＰ、４ｍｇ/ｌ）、あるいはこれら２つの組合わせ（ＢＡ、１ｍｇ/ｌおよび２−ｉＰ、１ｍｇ/ｌ）を添加したＭＳ培地（Murashige
and Skoog's medium）で栽培した。これらの植物生長調節物質を用いて栽培された葉を、３０日目、６０日目、９０日目で採取し、空気乾燥して上述の方法で抽出した。【００３９】
以下の実施例において、アシュワガンダの葉抽出物（Lash）としては、in vivo植物から上記方法で調製したエーテル抽出物をジメチルスルホキシド（DMSO）中に溶解したものを用いて実験を行った。【００４０】
実施例２  抗変異原性および抗遺伝毒性
タマネギの根端細胞を用いて、Lashの抗変異原性および抗遺伝毒性を評価した。タマネギの根端細胞は、抗変異原性および抗遺伝毒性の評価系として簡便で確立された材料である。【００４１】
試験方法
タマネギを水道水で満たしたcouplinジャー上に置いて２６℃で発芽させた。新しく生えた根をつけた球根を、異なる濃度のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNNG）を含有する水で満たしたcouplinジャー上に置いて、MNNG処理（0.025、0050、0.075、および0.10％）を行った。MNNGは変異原性を有する強力なメチル化剤で、突然変異の誘発に広く用いられている物質である。
前（Ａ）、後（Ｂ）および同時（Ｃ）の3種類の処理を行った。前処理では、Lash処理（0.25、0.50、0.75、1.0％で２時間）の後でMNNG処理（0.1％MNNGで２時間）を行った。後処理では、MNNG処理の後でLash処理を行った。同時処理では、異なる濃度のLashをMNNG（0.1％）と共に加えた。MNNG（0.1％）およびLashの溶解用溶媒であるDMSO（1.0％）を対照として用いた。
処理された根を、流水で完全に洗浄し、必要に応じて、コルヒチン処理（0.25％、６〜８℃で１〜２時間）により細胞を分裂中期で停止させ、Farmer液（氷酢酸：エタノール、1：3）中２４時間の処理で固定し、７０％エタノールに移して６〜８℃で保存した。
染色体の分析のために、押しつぶし標本を作製した。根端を、60℃の１NのHCｌに１分間浸し、１NのHCｌと酢酸オルセイン（１：９）の入った時計皿に移し、間歇的に３〜５分間加熱した。先端部分を切断し、スライドグラスに載せ、45％酢酸を滴下してカバーグラスをかぶせ、マッチ棒でたたいて押しつぶし、DPXで封入して顕微鏡で観察した。
分裂周期の異なる段階で、細胞数を計数し、各種タイプの染色体異常を記録した。８〜１０の根端からの約３００の分裂中の細胞を各処理毎に計数した。Lash有りと無しのものについて染色体異常発生の割合を計算した。【００４２】
結果
MNNG（0.25〜0.1％）処理により、図１に示すような染色体異常（10〜30％）が生じた。染色体異常は、生理的な異常と染色体異常誘発性の異常に分類された。生理的な異常としてC-有糸分裂（C-mitosis）、付着(stickness)、後期の遅れ（delayed
anaphase）、染色体の移動の遅れ（lagging chromosome）、染色体の迷走(vagrant chromosome)が見られ、染色体異常誘発性の異常として染色体分離障害(chromatin
bridges)、染色体切断(chromosomal break)、セントロメアの破壊（centromere break）等が見られた。
Lashによる前（Ａ）、後（Ｂ）、および同時（Ｃ）処理の結果、MNNGの遺伝毒性に対する用量依存性の保護効果が観察された。結果をまとめたものを以下に表１として示す。１％Lash処理により最大92％の割合で染色体異常の発生が阻止された。
【表１】
0004868403.tif 000019
以上の結果から、Lashが、抗変異原性および抗遺伝毒性の活性を有する成分を含むことが明らかとなった。【００４３】
実施例３  腫瘍細胞に対する選択的な増殖阻害作用
ヒトの正常細胞および腫瘍由来細胞をLashで処理する実験を行って、腫瘍細胞に対する効果を検討した。【００４４】
試験方法
正常な二倍体の繊維芽細胞（TIG-1)、骨肉腫（Saos-2およびU2OS）、および乳癌（MCF7)の細胞を、１０％ウシ胎児血清（FBS)を加えたダルベッコの改変イーグル最小培地（DMEM、Gibco 11885-084）で、加湿インキュベータ内（３７℃、５％CO2)で培養した。細胞（約５０〜６０％コンフルエント）をLash（3〜24μｇ/ｍｌ）で、所定の時間、連続あるいは間歇的に処理した。
Lashの細胞生存率に対する効果を調べるために、テトラゾリウム塩WST-1を発色基質とするWSTキット(WST-1、Roche)を用いて細胞増殖アッセイを行った。生細胞のミトコンドリアによりWST-1が分解されて水溶性ホルマザン塩が生成する。細胞数と生成するホルマザンの量は直線的な比例関係にあるため、ホルマザンの発色を吸光度で測定することにより、容易に生細胞数を計測することができる。
まず、細胞を９６穴プレートに蒔き、４０〜５０％コンフルエントまで培養し、異なる濃度のLashで処理した。Lashなしの培養を対照とした。細胞をWST-1を加えた培地中で１時間、３７℃のCO2インキュベーター内に置き、マイクロプレートリーダーを用いて４５０nmの吸光度でホルマザンの発色を測定した。
比較のために、H2O2（30-300μMで2時間、その後通常の培地で24〜72時間培養）、あるいは１〜１０μMの５’−アザ−２’−デオキシシチジン（5'-Aza）（24〜72時間）による処理も行った。これらは、それぞれ酸化ストレスおよび脱メチル化により、細胞に老化様の増殖阻害を起こすことが知られている物質である。
対照群は、溶媒のみを加えた培地で培養した。【００４５】
結果
１）形態変化
細胞を約40%コンフルエントの時に処理し24時間毎に観察した。図２に細胞の形態の顕微鏡写真を示す。対照（Control）の培養は腫瘍由来細胞（Saos-2、U2OS、MCF7)および正常細胞（TIG-1）のいずれも48時間後にコンフルエントとなった。腫瘍由来細胞は、H2O2または5'-AzaまたはLashでの処理により、明らかに増殖が抑制された。細胞の形態面においても、処理群の腫瘍細胞は肥大し、扁平となり、未処理対照群の細胞とは異なっていた。正常細胞は、H2O2または5'-Aza処理によって増殖が遅れたが、Lash処理によっては形態および増殖速度において影響を受けなかった。
２）増殖アッセイ
各処理群の細胞数をNeubauer血球計算版でカウントした。同数の細胞を６穴ディッシュ中に蒔き、対照および処理に供した。24時間おきに96時間まで、対照および処理群からそれぞれ１デッシュずつ採取し、細胞数をカウントした。対照および処理群での各時点における細胞数をプロットして増殖カーブとした。
各種細胞の増殖カーブを図３に示す。24時間処理後の細胞数の落ち込みにより示されるように、腫瘍由来細胞はLashで処理された場合に顕著な増殖の遅れをみせた。他方、正常細胞では処理後48時間および72時間で３つの独立した実験においてやや遅れをみせたが、処理後24時間時点では何も影響がなかった。
H2O2および5'-Aza処理による実験の結果、(i)正常細胞は腫瘍由来細胞よりもH2O2に対して感受性であり、(ii)5'-Azaは腫瘍由来細胞に対しては若干の増殖阻害を起こしたが、正常細胞に対しては本実験の条件ではほとんど影響を与えなかった。
３）コロニー形成アッセイ
Lashによる腫瘍由来細胞の増殖阻害作用を示す結果がコロニー形成アッセイにおいても得られた。1000個の細胞を10cmシャーレに蒔き、対照および処理群で、コロニー形成を2週間観察した。図４に結果の写真を示す。腫瘍由来細胞のコロニー形成能はLashによって明らかに阻害された。
図５に、通常の培地及びLashを添加した培地で培養した細胞のWSTアッセイの結果を示す。グラフ縦軸（WST Assay-Absorbance）は、ホルマザンの発色を測定した吸光度を示し、生細胞数とは直線的な比例関係にある。Lashにより、腫瘍由来細胞の細胞数は減少したが、正常細胞の細胞数は変化しなかったことがわかる。
以上のデータから、Lashは正常細胞にはほとんど影響を与えず、腫瘍由来細胞に選択的に作用する増殖阻害活性を有することが明らかとなった。【００４６】
実施例４  腫瘍由来細胞に選択的なp53腫瘍サプレッサー経路の活性化
野生型のp53タンパク質を有する正常（TIG-1）および腫瘍由来（骨癌由来のU2OSおよび乳癌由来のMCF-7）ヒト細胞において、異なる処理に対するp53タンパク質のレベル及び活性の変化を調べた。また、p53と相互作用するタンパク質であるモータリンの細胞内分布を観察することにより、p53−モータリン相互作用に対するLashの影響を調べた。【００４７】
試験方法
Lash、H2O2および5'-Azaで４８時間処理された細胞を集め、p53およびその下流のエフェクターであるp21WAF1のレベルを、特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングにより調べた。
１）ウエスタンブロッティング
SDSポリアクリルアミドゲル上に分離されたタンパク質試料（20μg）を、セミドライトランスファーブロッターを用いてエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜（BA85,Schleicher and Schuell）上に移した。抗モータリン、抗アクチン（Chemican International）、抗p21WAF-1（C-19、Santa Cruz)、および抗p53（DO-1、Santa Cruz）抗体によるイムノアッセイを行った。形成された抗体複合体を、抗ウサギ免疫グロブリンG（IgG）と結合した西洋わさびペルオキシダーゼにより可視化した（ECL kit, Amersham Pharmacia Biotech）。
２）抗体染色
１２穴培養皿中に置いたカバーグラス上で細胞を培養し、処理を行った。処理の最後に、カバーグラスを冷やしたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、予め冷やしておいたメタノール／アセトン（1/1、v/v）混合液により５分間氷上で固定した。固定された細胞をPBSで洗浄し、0.2%のTriton X-100を含むPBS中で１０分間処理し、２％ウシ血清アルブミン（BSA)を加えたPBSで２０分間ブロックした。細胞を抗p53抗体（DO-1, Santa Cruz）、モノクローナル抗モータリン抗体（Affinity Bioreagents MA3-028）あるいはポリクローナル抗モータリン抗体 (Wadhwa et al., 1993)で染色した。抗体染色は、ヤギ抗ウサギIgG（Alexa-594-結合）（Molecular
Probes)及び抗マウスモノクローナルIgG（Alexa-488-結合）（Molecular Probes)を用いた二次染色により可視化された。0.1％のTriton X-100を含むPBS中で６回洗浄した後、細胞の上にFluoromount（Difco）を滴下してカバーグラスを載せた。細胞を蛍光装置を備えたCarl Zeiss顕微鏡で観察した。Metamorophイメージングソフトウェアを使用して像を処理し（Universal Imaging）、TIFFファイルとして保存し、Adobe Illustratorにインポートして整理した。【００４８】
結果
図６にウエスタンブロッティングの結果を示す。腫瘍由来細胞（MCF-7、U2OS）及び正常細胞（TIG-1）をH2O2、Lash、5'-Azaで処理し、p53及びp21WAF1タンパク質の発現レベルを調べた。ローディング量検討用対照としてアクチンを用いた。
p53タンパクのレベルは、U2OS（腫瘍細胞）およびTIG-1（正常細胞）の両方で、Lash処理により顕著に増加した。MCF7（腫瘍細胞）においては、p53タンパクのレベルのはっきりとした上昇はみられなかった。
p53の転写活性はp21WAF1タンパク質のレベルにより検出される。Lash処理により、p21WAF1タンパク質のレベルは、U2OSおよびMCF-7細胞の両方において未処理対照よりも上昇したが、TIG-１(正常）細胞においては変わらなかった。この結果は、Lashがp53の転写活性を腫瘍細胞において選択的に活性化するということを示す。
しかしながら、上述の結果より、Lashは、MCF7細胞内においてp53タンパクのレベルのはっきりとした上昇を伴わずにその活性化を亢進させるようにみえたので、p53の活性が別に何らかの形で調節されている可能性があると考え、Lashとp53−モータリン相互作用との関連を調べた。
モータリンは腫瘍細胞において野生型p53と結合することによりp53を細胞質へ保持させ、p53活性を抑制する。従って、モータリンとp53の結合を妨げることにより、p53が活性化されると考えられる。
p53とモータリンの二重染色を図７に示す。明らかに多数のLash処理されたMCF-7細胞がp53（緑色の染色）を核内に有することが示された。興味深いことに、モータリン（赤色の染色）の染色パターンとして、核周辺が染色されることが未処理の腫瘍細胞に特徴的であったが、Lash処理された腫瘍細胞ではこれが細胞質全体のパターンへと変化する様子が観察された。モータリンの細胞内分布として、細胞質全体に見られるということは正常細胞のマーカーとしての特徴とされており、腫瘍細胞は核周辺型の（細胞質全体ではない）染色パターンを示す。ローダシアニン色素（MKT-077）またはブロモオキシウリジン(Brdu)での処理によって老化様の増殖阻害を誘導された腫瘍細胞は、核周辺型から細胞質全体型の染色パターンへの変化をみせたことが報告されている
(Wadhwa et al., 2000)。
本実験結果により、Lashは、p53−モータリン相互作用を妨げ、腫瘍サプレッサーであるp53を活性化することによって腫瘍細胞において老化様の増殖阻害を起こすのではないかということが示唆された。Lash処理されたU2OSおよびp53を欠損するSaos-2細胞におけるモータリンの細胞内分布についても同様に、細胞質全体型の染色パターンへの変化が観察された（図７および図８：図８においては、モータリンが赤色、核が核染色剤であるHoescht dyeにより青に染色されている）。H2O2および5'-Aza処理（これらは老化を起こす物質として知られる）された細胞においても、Lash処理と同様のモータリン分布の細胞質全体型の染色パターンへの変化がみられた。
これらのデータは、(i)H2O2や5'-Azaと同様に、Lashも腫瘍細胞におけるモータリンの細胞内分布の変化を引起すこと、(ii)Lashが腫瘍細胞において選択的にp53を活性化すること、を示す。【００４９】
実施例５  テロメラーゼ阻害活性
実施例３の結果から、p53を欠損するSaos-2細胞もLash処理によって増殖が抑制されることが判明した。したがって、p53-p21WAF-1経路とは別個の経路も、Lashによる腫瘍細胞に選択的な増殖阻害に関与しているのではないかということが示唆された。
そこで、対照およびLash処理された腫瘍細胞において、テロメラーゼ活性を調べた。【００５０】
試験方法
テロメラーゼ陽性であるMCF-7細胞をLash、H2O2、または5'-Azaで処理し、以下に記載するTRAPアッセイに供した。
テロメア繰り返し配列増幅法（Telomere Repeat Amplification Protocol: TRAPアッセイ）
Kim et al., 1994（非特許文献２１）の記載に従って、PCRに基づくTRAPアッセイを用いてテロメラーゼ活性を調べた。MCF-7細胞を５０％コンフルエントまで培養し、Lash（24μg/ｍｌ）で４８時間処理した。0.01％トリプシンを用いて細胞を集め、氷冷したPBSで洗浄し、細胞抽出用緩衝液中で溶解処理し、TRAPアッセイに供した（Telo
TAGGG Telomerase PCR ELISA, Roche）。PCR産物を、12％ポリアクリルアミドゲル上でSYBR-Gold核酸ゲル染色剤による染色で可視化した（S-11494,Molecular Probes, USA）。【００５１】
結果
図９ＡにH2O2、Lashおよび5'-Azaで処理されたMCF-7細胞におけるTRAPアッセイの結果を示す。対照（Con.）は未処理の細胞であり、さらに比較のため、PCR反応にLashを添加した結果をCon.+Lashとして示す。
Lashで処理された細胞は、テロメラーゼ活性を明らかに喪失していたが、H2O2および5'-Azaで処理された細胞においては何も変化が見られなかった。
PCR反応にLashを添加してもテロメラーゼ活性に影響はなく、Lashは細胞内におけるテロメラーゼの機能そのものに影響を及ぼすことが強く示唆された。
図９Ｂに、Lash並びに他の薬剤（H2O2、5-Aza）で処理されたMCF-7細胞のTRAP−ELISAの結果を示す。Controlのレーンは未処理の細胞抽出物のTRAP活性である。Control+Lashのレーンは、未処理の細胞抽出物に対してPCR反応中にLashを加えた結果である。Negative controlは、正常ヒト細胞においてTRAP活性が存在しないことを示す。
図９ＣにMCF-7細胞のTRAP活性に対する各種濃度のLash処理の経時変化を示す。Lashは、用量依存的にテロメラーゼ活性を阻害したことがわかる。
以上の結果は、Lashによる腫瘍細胞の選択的増殖阻害のメカニズムの一つは、テロメラーゼ阻害作用によるものであることを示す。【００５２】
実施例６  抗酸化及び脱メチル化活性
細胞を高濃度グルコース培地で培養するか、H2O2で処理することにより酸化ストレスを発生させると共にLashで処理した。しかしながら、LashはH2O2あるいは高濃度グルコースのいずれにより引き起こされた酸化損傷に対しても、明らかな保護（抗酸化活性）を示さなかった。
5'-Azaによる細胞の増殖阻害は、脱メチル化活性及びp16INK4A発現の誘導の結果であるとされてきた。そこで、Lashも何らかの脱メチル化活性を有するか否か、メチル化によってp16INK4AをサイレンシングさせたU2OS細胞を用いて調べた。その結果、Lashによるp16INK4A発現の誘導は見られず、Lashは脱メチル化活性を有さないことがわかった（データは示さない）。【００５３】
実施例７  in vivoでの腫瘍抑制作用
悪性腫瘍であるヒト線維肉腫細胞由来のHT1080細胞を移植したヌードマウスを用いて、Lashのin vivoでの腫瘍抑制作用を調べた。図１０及び図１１に結果を示す。
図１０の実験においては、まず、HT1080細胞（106個）を３匹のヌードマウスに注射した。翌日（day 1）に、３匹のうち２匹のマウスにLash（DMEM中、10〜15μg）を注射した。その後１２日間、腫瘍の進行を観察した。Lashを注射された２匹のマウスではいずれも腫瘍の形成及び進行が顕著に抑制された。
図１１の実験においては、HT1080細胞（106個）をヌードマウスに注射し、小さな腫瘍塊の形成が見られた時（day 4）に、Lash（DMEM中、10〜15μg）を注射した。その後１１日間、腫瘍の進行を観察した。Lashを注射した後は、腫瘍の進行が抑制され、さらに腫瘍塊が縮小した。
このように、Lashと腫瘍由来細胞を一緒に注射した場合も、腫瘍塊が肉眼で確認できるようになった段階でLashを注射した場合も、いずれもin vivoでの腫瘍の形成及び進行が抑制されたということは注目に値する。この結果は、Lashが癌の治療に有用な成分を含むことを強く示唆するものである。
【００５４】
実施例８  野生型あるいは変異型P53を持つ形質転換細胞の増殖停止
正常細胞（TIG-1）と、野生型P53を持つ形質転換細胞（MCF7）、変異型P53を持つ形質転換細胞（PC14,SKBR3,HS578T）をLashで処理した。生存している細胞の割合をＷＳＴアッセイで測定した。結果を図１２に示す。生存率（％survival）は、コントロール（DMSO）に対する生存細胞数の割合で表している。
正常細胞の生存がLash処理によって影響を受けていないのに対して、いずれの形質転換細胞も増殖停止していた。データは、Lashが、野生型P53と変異型P53のどちらを持つ癌細胞にも効果があることを示した。
また、変異型P53を持つ形質転換細胞（HT1080,HS578T,SKBR3,PC14）をLash（２４μｇ／ｍｌ）で処理し、細胞数を毎日集計することで生存率を調べた。結果を図１３に示す。図中、破線がLash処理していないコントロールであり、実線がLash処理された細胞である。
ここで留意すべきは、変異型P53を持つ形質転換細胞が増殖停止していることである。【００５５】
実施例９  変異型P53を持つ形質転換細胞のアポトーシス
ヒト癌由来細胞（HeLa、野生型p53）とSKBR3（変異型p53）にLashを処理し、TUNEL染色（細胞のアポトーシスのマーカである）について調べた。結果を図１４に示す。Lashは野生型p53を持つ形質転換細胞に増殖停止を引き起こし、変異型ｐ５３を持つ形質転換細胞にはアポトーシスを引き起こした（PI：propidium iodideは核の染色）。
ここで留意すべきは、突然変異型ｐ５３を持つ細胞だけにTUNEL染色が見られたことである。データは、Lashが野生型ｐ５３または突然変異型ｐ５３を所持する癌細胞に、異なったメカニズムで作用することを示唆する。つまり、Lashが野生型p53を活性化する結果、野生型p53を所持する癌細胞が増殖停止するのに対して、変異型p53所持癌細胞はアポトーシスを起こす。【００５６】
実施例１０  癌細胞の変異型p53の減少及びLashによる突然変異型ｐ５３の野生型ｐ５３への転換
変異型p53を所持する癌細胞にLashを処理し、p53タンパク質及びp53の下流の因子（MDM2、p21WAF1、BAX）を指標としてウェスタンブロッティングで解析した。結果を図１５に示す。Lash処理有り（+）または無し（−）のサンプルにおけるタンパク質量を比較するため、サンプルを電気泳動する量のコントロールのためにアクチンを使用した。
留意すべきは、Lash処理した各レーン（+）において（SKBR3を除いて）、総じて、変異型p53タンパク質の量が減少していたことである。使用した抗p53抗体（DO-1、Santa Cruz）は、野生型と変異型のいずれのp53も認識するが、Lash（+）のレーンにおけるp53量の減少は変異型の野生型への変化を示す。(注意：セルライセート中の正常型p53の半減期は２０分と短いのに対し、変異型p53の半減期は２時間と安定であり、従って、野生型と変異型のいずれのp53も認識可能な抗p53抗体は、実験の過程で安定に存在する変異型p53を主に検出する。)さらに留意すべきは、最も著しく変異型p53が減少しているレーン（PC14）では、指標とするすべての下流因子（MDM2,p21WAF1,BAX）が発現され、正常なp53の機能が発現していることを強く示唆することである。
また別の実験で、突然変異型ｐ５３所持細胞にLashを処理し、野生型p53タンパク質に特異的な抗体（Ab-5、Calbiochem）で免疫沈降した。結果を図１６に示す。
留意すべきは、Lash処理したサンプルにおいてだけ、野生型p53が沈降していることである。これは、培養細胞中で、Lashにより変異型p53が野生型p53へと変化し、野生型p53が存在することを示す。
以上の結果は、Lashが変異型p53の機能を回復させて野生型の正常な機能を与えることを示唆している。すなわち、Lashにより変異型p53が野生型p53へと変化し、核内移行後、野生型p53サプレッサー経路が活性化され、下流にあるBAX、p21WAF1、MDM2などが発現されると考えられる。なお、BAX、p21WAF1、MDM2のいずれが野生型p53サプレッサー経路によってスイッチオンとなるかは、セルラインに依存する。【００５７】
実施例１１  Lash処理した変異型p53所持細胞における、野生型p53の活性
野生型p53に特異的なルシフェラーゼリポータを指標として、Lash処理した変異型p53所持細胞（HT1080、U2OS、PC14）が野生型の機能を持つようになるかどうか調べた。
正常型p53のみが結合して転写活性を発揮するプロモーターの下流にレポーター遺伝子となるルシフェラーゼ遺伝子をつないだベクターを用意し、これを、各セルラインにトランスフェクションしたものをLashで処理した。結果を図１７に示す。
グラフに示されるように、Lash処理をしていないコントロール(Control）に比べ、Lash処理後のルシフェラーゼ活性（縦軸：p53 dependent reporter (luciferase) activity）が明らかに高くなっていた。
この結果は、Lashにより変異型p53所持細胞が野生型の機能を持つようになることを示し、実施例10の結果と一致していた。【００５８】
実施例１２  in vivoでの腫瘍抑制作用に関するウィザフェリンＡとLashの比較
ヌードマウスにHT1080細胞（5×10５）を注射した後、Lash（４８μｇ/ｍｌを０．２ｍｌ、４日間毎）またはウィザフェリンＡ（２μＭを０．２ｍｌ、４日間毎）を注射してin
vivoでの腫瘍抑制作用を調べた。結果を図１８に示す。
ウィザフェリンＡは生体内での腫瘍の増殖を抑制しないが、Lashは腫瘍の増殖を抑制した。
ここで留意すべきは、Lashが腫瘍増殖抑制に効果があったのに対し、ウィザフェリンＡは効果がなかったことである。実際には、ウィザフェリンＡはいくらかマウスに毒性があった。ウィザフェリンＡを与えられたマウスは活力に欠けており、体重が減少してやせていた。【００５９】
実施例１３  Lashの経口投与によるin vivoでの腫瘍抑制
ヌードマウスにHT1080細胞（5×10５）を注射した後、マウスにLash（300mg/KG BW、100 mg/KG BW）を経口で与え、in vivoでの腫瘍抑制作用を調べた。比較のためにウィザフェリンＡ（10 mg/KG BW、2 mg/KG BW）も経口で与えた。腫瘍増殖の進行を２０日間観察した。結果を図１９に示す。
写真のように、コントロール(Control)やウィザフェリンＡ(Withaferin A)を与えたマウスには大きな腫瘍が見られるのに対して、Lashを与えたマウスの腫瘍芽は著しく小さかった。Lashには毒性は全く見られなかった。ウィザフェリンＡを与えたマウスは、活力にかけて痩せていた。【００６０】
実施例１４  Lashの構成成分の分析
実施例１の方法でin vivo植物から得たLashのエーテル抽出物を逆相ＨＬＰＣに付し、構成成分を分析した。
ＨＬＰＣは次の条件で行った。
カラム：YMC-Pack Pro C-18 (4.6 mm × 150mm)
移動相：A液；１％ MeOH水溶液
B液；MeOH:EtOH:i-PrOH=52.25:45.30:2.45
Gradient:35%B→45%B (25min)
検出：UV: 220nm
カラム温度：50 ℃
流速：1ml / min
図２０中の左側のチャートが、この抽出物のものである。標準試料と比較することにより、ピークのうちの３つはウィザフェリンＡ（Withaferin A：溶出時間16.7mins）、ウィザノライドＡ若しくはＤ（Withanolide A or D：19.3mins）、12-deoxywithastramonolide（18.8mins）と同定された。次に、一つのメジャーなピークであるピーク２１（Peak 21：21.9mins）の化合物を単離し（図２０中の右側のチャート）、以下の実施例１５〜１８の実験に用いた。（以下、単にピーク２１とも称することがある）
また、ピーク２１をＭＡＳＳとＮＭＲとに供し、以下の化合物として同定した。実施例１でin vivo植物から得られたLashエ-テル抽出物300mgをシリカゲル薄層クロマトグラフィー（Merck、シリカゲル60F254、ジクロロメタン：メタノール＝10：1、Rf=0.43）にて精製し、淡緑色化合物を得た。これをジクロロメタン-メタノールにて、白色粉末18mgを得た。ESI-MASSの結果は、[M+Na]+=493.2であった。1H-NMR及び13C-NMRのケミカルシフト測定値を以下に示す。
1D-NMR
１H-NMR (５００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３)：d ０．８６（Ｓ，３Ｈ，Ｈ−１８）,１．０４（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ,
Ｈ−２１），１．１８（Ｓ，３Ｈ，Ｈ−１９）,１．２６−１．４０（ｍ，３Ｈ，Ｈ−１１，１５），１．５３−１．６２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−９，Ｈ−１２），１．６７−１．８０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−８，Ｈ−１２），１．８８（Ｓ，３Ｈ，Ｈ−２７），１．９４（Ｓ，３Ｈ，Ｈ−２８），１．８８−１．９５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１６），１．９８−２．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１４），２．３０−２．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２０），２．４２−２．５６（ｍ，４Ｈ，１７−ＯＨ，Ｈ−４，２３），２．６７−２．７１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），２．８０−２．８４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１１），３．０５（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６），３．１５−３．１６（ｍ，１Ｈ，５−ＯＨ），３．３１−３．３３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−７），４．５９−４．６３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２２），５．８５（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），６．５８−６．６１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）
１3C-NMR(１２５ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３)：d  ９．５（Ｃ−２１），１２．３（Ｃ−２７），１４．７（Ｃ−１９），１５．１（Ｃ−１８），２０．５（Ｃ−２８），２１．６（Ｃ−１１），２２．９（Ｃ−１５），３２．５（Ｃ−１２），３２．８（Ｃ−２３），３５．２（Ｃ−９），３６．０（Ｃ−８），３６．７（Ｃ−１６），３６．８（Ｃ−４），４２．９（Ｃ−２０），４５．９（Ｃ−１４），４８．７（Ｃ−１３），５１．０（Ｃ−１０），５６．３（Ｃ−６），５７．２（Ｃ−７），７３．２（Ｃ−５），７８．７（Ｃ−２２），８４．６（Ｃ−１７），１２１．４（Ｃ−２５），１２９．０（Ｃ−２），１３９．７（Ｃ−３），１５０．４（Ｃ−２４），１６７．１（Ｃ−２６），２０３．１（Ｃ−１）
以上より、ピーク２１は既知化合物のウィザノン(Withanone)であることが判明した。【００６１】
実施例１５  Lashの構成成分の癌細胞増殖に対する効果
正常なヒト線維芽細胞（MRC5及びTIG-1）及び癌細胞（U2OS、MCF7）をLash（24μｇ／ｍｌ）及びその成分であるウィザフェリンＡ（0.05μＭ）、ウィザノライドＡ（8μＭ）、12-deoxywithastramonolide（8μＭ）、及びピーク２１（25μg/ml）で処理した。４８時間の処理の後、細胞数を計数した。結果を図２１のグラフで示す。
グラフからわかるように、Lashとピーク２１は選択的に癌細胞の増殖を抑制したが、正常細胞は普通に増殖した。ウィザフェリンＡは正常細胞に対して毒性であった。ウィザノライドＡと12-deoxywithastramonolideは細胞増殖に何ら影響を与えなかった。また、ピーク２１をウィザフェリンＡと共に加えた場合、ウィザフェリンＡの正常細胞への毒性が幾分か中和されたことは留意すべきである。
また、別の実験で、ヒト正常細胞（ＭＲＣ５）及び癌細胞（Ｕ２ＯＳ）を、ピーク２１（20、50μg／ｍｌ）で４８時間処理した。ポジティブコントロールとしてLashを用いた。結果を図２２に示す。
ピーク２１の存在下で、Lashの場合と同様に、癌細胞は増殖停止する一方で正常細胞は普通に増殖した。
さらに別の実験で、ヒト正常細胞（ＭＲＣ５）及び癌細胞（Ｕ２ＯＳ）を、Lash（24μｇ／ｍｌ）、ウィザフェリンＡ（0.05μＭ）、ピーク２１（25μｇ／ｍｌ）、ウィザフェリンＡ（0.05μM）とピーク２１（25μｇ／ｍｌ）の組合わせ、で３６時間処理した。結果を図２３に示す。
ピーク２１は癌細胞のみに増殖停止を引き起こし、ウィザフェリンＡは正常細胞と癌細胞の両方を殺した。ウィザフェリンＡとピーク２１を一緒に加えた場合には、より強い効果（相乗効果）が癌細胞のみにおいて観察された。正常細胞においては、これら２つの成分を一緒に加えて処理すると、ウィザフェリンＡ単独と比較してよい生残率を示した。
以上の結果が示唆するのは、ピーク２１が、正常細胞に対するウィザフェリンＡの毒性を中和するということである。よって、癌細胞において、ウィザフェリンＡとピーク２１の組合わせも細胞増殖の停止に有効であることが判明した。
また別の実験で、ウィザフェリンＡの正常細胞への毒性に対するピーク２１の効果を調べた。結果を図２４に示す。
正常細胞（TIG-1）をLash及び種々濃度のピーク２１（12.5、25、50μｇ／ｍｌ）で処理した場合、細胞の増殖は普通であった。つまり、増殖の停止は観察されなかった。これは図２２及び図２３のＭＲＣ５細胞の場合と同様の結果である。一方、ウィザフェリンＡ（0.05μＭ）で処理した正常細胞は増殖停止を示したが、ピーク２１（12.5、25、50μｇ/ｍｌ）を共に加えると細胞の増殖停止は回復した。
この結果も、ピーク２１が正常細胞へのウィザフェリンＡの毒性の中和作用を有することを示すものである。
さらに別の実験では、PD50（PD:Population Doubling）の老化した正常ヒト繊維芽細胞（WI38）へのLash及びピーク２１の効果を調べた。結果を図２５に示す。
Lashとピーク２１は、実験したいずれもの濃度において、非毒性であった。一方、ウィザフェリンＡは増殖停止と細胞損傷を引き起こした。留意すべきは、ウィザフェリンＡとピーク２１で一緒に処理された細胞は、形態においてより良い状態と見受けられることである。この結果は、図２１においてTIG細胞やMRC5細胞で観察された結果と一致する。
古い細胞に対して非毒性であるということは、ピーク２１が高齢者の細胞に対して安全性が高いということを示唆する。また、前の実験において、ピーク２１はウィザフェリンＡに供された正常細胞の生残率を向上させた。よって、ピーク２１は単独あるいは他の成分と組合わせた場合のいずれにおいても、抗老化（アンチエイジング）因子（又は抗加齢因子）としても作用し得ると考えられる。この作用については、後述の実施例１８（図２９、３０）においてさらに確認した。【００６２】
実施例１６  正常型p53機能の誘導
正常細胞（TIG-1）及び癌細胞（U2OS）における野生型p53機能の誘導について、p53とp21WAF1（p53下流のエフェクター）を指標としたウェスタンブロットにより調べた。結果を図２６に示す。図上段に示す通り、細胞をLash、ウィザフェリンＡ及びピーク２１で処理した。
Lashとピーク２１のいずれによっても、p53及びp21WAF1の両方が癌細胞（U2OS）において増加した（レーン１に対してレーン２と３を比較）。正常細胞（TIG-1）においては、Lashで処理してもp53とp21WAF1の量は変化しなかった（レーン４と６の比較）。
留意すべきは、(i)ピーク２１がp53とp21WAF1発現量を減少させたこと（レーン４と５の比較）、及び(ii)ピーク２１がウィザフェリンＡにより誘導されたp21WAF1発現量を減少させていたこと（レーン７、８、９の比較）である。この結果は、ピーク２１及びウィザフェリンＡ（0.05μＭ）で処理された細胞はウィザフェリンＡ単独処理の細胞よりも健康であったという、図２１（生存率）及び図２３−２５（細胞の形態）における結果と一致する。つまり、図２１−２６に示された結果は次のことを示唆する。Lashと同様に、ピーク２１は癌細胞に選択的にp53機能の誘導を起こす。しかも、ピーク２１は抗毒性作用を有する。さらに、ピーク２１は細胞をより健康にする。
また、図２７は、Lashまたはピーク２１で処理したU2OS細胞のp53に対する抗体染色の像である。Lash及びピーク２１のいずれで処理されたものにおいても、p53による強力な核染色が見られる細胞数が増加したことがわかる。【００６３】
実施例１７  テロメラーゼ活性
Lash、ピーク２１、ウィザフェリンＡ等でMCF7細胞を処理（36時間）した時のテロメラーゼ活性を調べた。結果を図２８に示す。
Lash（24μｇ/ｍｌ）及びピーク２１（25、35、50μｇ/ｍｌ）によりテロメラーゼ活性が阻害された。一方、ウィザフェリンＡそれ自体ではテロメラーゼに対して影響が無く、ウィザフェリンＡとピーク２１を組合わせて処理すると阻害的に作用した。
この結果により、次のことが示唆される。つまり、ピーク２１は単独及びウィザフェリンＡと併用した場合に、テロメラーゼ阻害活性を有する。しかも、正常細胞はテロメラーゼ活性を有さないので、ピーク２１（ウィザフェリンＡ等の他の化合物と併用する場合も含む）は癌細胞に選択的に作用する。この活性は抗癌作用として有用であると思われる。【００６４】
実施例１８  Lash及びピーク２１のアンチエイジング作用
癌細胞（U2OS）、及び老化した正常ヒト線維芽細胞（WI38、MRC5）に対してLash及びピーク２１処理を行った。p21WAF1発現レベルを指標としたデータを図２９に示す。
p21WAF1のレベルは癌細胞では増加しているのに対し、正常細胞（WI38、MRC5）では減少した。p21WAF1は細胞老化のマーカであることから、老化した正常細胞におけるp21WAF1の減少は、老化した正常細胞の生存可能性の上昇（実施例１５）と整合する結果といえる。
また、老化した正常細胞（WI38）をLash又はピーク２１で処理（60時間）して、モータリンとp53について抗体染色した結果を図３０に示す。この写真はPhotomerics
Synsys monochrome CCDカメラを装着したCarl Zeiss顕微鏡で撮影したものである。２つのタンパク質（モータリンとp53）染色を重ね合わせた像をMetamorphソフトウェアを使用して解析した。
留意すべきは以下の点である。(i)Lashとピーク２１で処理された培養細胞では小さくて若く見える細胞（小さくてスピンドル形状）が存在する（ii）加齢細胞（フラットで大きく不規則な形状）はp53ポジティブであり、Lashやピーク２１処理をしてもさらにp53の核染色は増大していない。これは図２７において癌細胞でp53の核染色が増大したのとは対照的である。
以上の結果は、Lashとピーク２１は、腫瘍細胞殺傷を目的としたp53活性の誘導に関して老化したヒト正常細胞に対する安全性が高いのみならず良好な抗老化作用（アンチエイジング作用）を発揮することを示唆する。【００６５】
参考文献
Archana, R., and Namasivayam, A. (1999). Antistressor effect of Withania somnifera. J Ethnopharmacol 64, 91-93.
Bhattacharya, S. K., Bhattacharya, A., Sairam, K., and Ghosal, S. (2000). Anxiolytic-antidepressant activity of Withania somnifera glycowithanolides: an experimental study. Phytomedicine 7, 463-469.
Bhattacharya, S. K., and Muruganandam, A. V. (2003). Adaptogenic activity of Withania somnifera: an experimental study using a rat model of chronic stress. Pharmacol Biochem Behav 75, 547-555.
Davis, L., and Kuttan, G. (2001). Effect of Withania somnifera on DMBA induced carcinogenesis. J Ethnopharmacol 75, 165-168.
Davis, L., and Kuttan, G. (2002a). Effect of Withania somnifera on cell mediated immune responses in mice. J Exp Clin Cancer Res 21, 585-590.
Davis, L., and Kuttan, G. (2002b). Effect of Withania somnifera on CTL activity. J Exp Clin Cancer Res 21, 115-118.
Dhuley, J. N. (2000). Adaptogenic and cardioprotective action of ashwagandha in rats and frogs. J Ethnopharmacol 70, 57-63.
Ganzera, M., Choudhary, M. I., and Khan, I. A. (2003). Quantitative HPLC analysis of withanolides in Withania somnifera. Fitoterapia 74, 68-76.
Iuvone, T., Esposito, G., Capasso, F., and Izzo, A. A.(2003). Induction of nitric oxide synthase expression by Withania somnifera in macrophages. Life Sci 72, 1617-1625.
Kaur, P., Sharma, M., Mathur, S., Tiwari, M., Divekar, H. M., Kumar, R., Srivastava, K. K., and Chandra, R. (2003). Effect of 1-oxo-5beta, 6beta-epoxy-witha-2-ene-27-ethoxy-olide isolated from the roots of Withania somnifera on stress indices in Wistar rats. J Altern Complement Med 9, 897-907.
Kim, N. W., Piatyszek, M. A., Prowse, K. R., Harley, C. B., West, M. D., Ho, P. L., Coviello, G. M., Wright, W. E., Weinrich, S. L., and Shay, J. W. (1994). Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 266, 2011-2015.
Lavie, D., kirson, I., and Glotter, E. (1968). Constituents of Withania Somnifera Dun. Part X. The structure of withanolide D. Isr Journal of Chemistry 6, 671-678.
Mishra, L. C., Singh, B. B., and Dagenais, S. (2000). Scientific basis for the therapeutic use of Withania somnifera (ashwagandha): a review. Altern Med Rev 5, 334-346.
Panda, S., and Kar, A. (1997). Evidence for free radical scavenging activity of Ashwagandha root powder in mice. Indian J Physiol Pharmacol 41, 424-426.
Prakash, J., Gupta, S. K., and Dinda, A. K. (2002). Withania somnifera root extract prevents DMBA-induced squamous cell carcinoma of skin in Swiss albino mice. Nutr Cancer 42, 91-97.
Prakash, J., Gupta, S. K., Kochupillai, V., Singh, N.,Gupta, Y. K., and Joshi, S. (2001). Chemopreventive activity of Withania somnifera in experimentally induced fibrosarcoma tumours in Swiss albino mice. Phytother Res 15, 240-244.
Russo, A., Izzo, A. A., Cardile, V., Borrelli, F., and Vanella, A. (2001). Indian medicinal plants as antiradicals and DNA cleavage protectors. Phytomedicine 8, 125-132.
Scartezzini, P., and Speroni, E. (2000). Review on some plants of Indian traditional medicine with antioxidant activity. J Ethnopharmacol 71, 23-43.
Singh, B., Chandan, B. K., and Gupta, D. K. (2003). Adaptogenic activity of a novel withanolide-free aqueous fraction from the roots of Withania somnifera Dun. (Part II). Phytother Res 17, 531-536.
Singh, D. D., Dey, C. S., and Bhutani, K. K. (2001). Downregulation of p34cdc2 expression with aqueous fraction from Withania somnifera for a possible molecular mechanism of anti-tumor and other pharmacological effects. Phytomedicine 8, 492-494.
Tohda, C., Kuboyama, T., and Komatsu, K. (2000). Dendrite extension by methanol extract of Ashwagandha (roots of Withania somnifera) in SK-N-SH cells. Neuroreport 11, 1981-1985.
ur-Rahman, A., Dur e, S., Naz, A., and Choudhary, M. I. (2003). Withanolides from Withania coagulans. Phytochemistry 63, 387-390.
Wadhwa, R., Kaul, S. C., Mitsui, Y., and Sugimoto, Y.(1993). Differential subcellular distribution of mortalin in mortal and immortal mouse and human fibroblasts. Exp Cell Res 207, 442-448.
Wadhwa, R., Sugihara, T., Yoshida, A., Nomura, H.,Reddel, R. R., Simpson, R., Maruta, H., and Kaul, S. C. (2000). Selective toxicity of MKT-077 to cancer cells is mediated by its binding to the hsp70 family protein mot-2 and reactivation of p53 function. Cancer Res 60,6818-6821.
Wadhwa, R., Taira, K., and Kaul, S. C. (2002). An Hsp70 family chaperone, mortalin/mthsp70/PBP74/Grp75: what, when, and where? Cell Stress Chaperones 7, 309-316.
Wadhwa, R., Takano, S., Robert, M., Yoshida, A., Nomura, H., Reddel, R. R., Mitsui, Y., and Kaul, S. C. (1998). Inactivation of tumor suppressor p53 by mot-2, a hsp70 family member. J Biol Chem 273, 29586-29591.
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明により、アシュワガンダ葉抽出物の抗腫瘍作用及び抗老化作用（抗加齢作用）が科学的に明らかとなり、その新しい医薬用途もしくは保健用途もしくは医薬部外品用途もしくは化粧品用途の開拓に資することが可能となった。例えば、アシュワガンダ葉抽出物は、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用が関連する疾患の治療用または予防用組成物の生産に利用することができる。この細胞増殖阻害作用は腫瘍細胞に特異的であり、正常細胞には作用しないため、副作用のない新たな抗がん剤の開発に利用可能である。また、アシュワガンダ葉抽出物は、老化した正常細胞を健康にする抗老化作用が関連する抗老化医療の治療用または老化予防用組成物の生産に利用することができる。また、アシュワガンダ葉抽出物は、老化した正常細胞を健康にする抗老化作用が関連する医薬部外品もしくは化粧品などの生産にも利用可能である。また、アシュワガンダ葉抽出物は、抗老化作用または抗腫瘍作用を有する食品、栄養補助食品などの生産にも利用可能である。
また、本発明により、アシュワガンダ葉抽出物から単離した成分の抗腫瘍作用及び抗老化作用が科学的に明らかとなり、その新しい医薬用途もしくは保健用途もしくは医薬部外品用途もしくは化粧品用途の開拓に資することが可能となった。例えば、その単離成分に該当する化合物それ自身またはその他の化合物と混ぜたものは、腫瘍細胞に選択的な増殖阻害作用が関連する疾患の治療用または予防用組成物の生産に利用することができる。この細胞増殖阻害作用は腫瘍細胞に特異的であり、正常細胞には作用しないため、副作用のない新たな抗がん剤の開発に利用可能である。また、その単離成分に該当する化合物それ自身またはその他の化合物と混ぜたものは、老化した正常細胞を健康にする抗老化作用が関連する抗老化医療の治療用または老化予防用組成物の生産に利用することができる。また、その単離成分に該当する化合物それ自身またはその他の化合物と混ぜたものは、老化した正常細胞を健康にする抗老化作用が関連する医薬部外品もしくは化粧品などの生産にも利用可能である。また、その単離成分に該当する化合物それ自身またはその他の化合物と混ぜたものは、抗老化作用または抗腫瘍作用を有する食品、栄養補助食品などの生産にも利用可能である。
【図１】
0004868403.tif 000021
【図２】
0004868403.tif 000022
【図３】
0004868403.tif 000023
【図４】
0004868403.tif 000024
【図５】
0004868403.tif 000025
【図６】
0004868403.tif 000026
【図７】
0004868403.tif 000027
【図８】
0004868403.tif 000028
【図９】
0004868403.tif 000029
【図１０】
0004868403.tif 000030
【図１１】
0004868403.tif 000031
【図１２】
0004868403.tif 000032
【図１３】
0004868403.tif 000033
【図１４】
0004868403.tif 000034
【図１５】
0004868403.tif 000035
【図１６】
0004868403.tif 000036
【図１７】
0004868403.tif 000037
【図１８】
0004868403.tif 000038
【図１９】
0004868403.tif 000039
【図２０】
0004868403.tif 000040
【図２１】
0004868403.tif 000041
【図２２】
0004868403.tif 000042
【図２３】
0004868403.tif 000043
【図２４】
0004868403.tif 000044
【図２５】
0004868403.tif 000045
【図２６】
0004868403.tif 000046
【図２７】
0004868403.tif 000047
【図２８】
0004868403.tif 000048
【図２９】
0004868403.tif 000049
【図３０】
0004868403.tif 000050