(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化剤としてガラクトース、シュクロースおよびソルビトールの少なくとも一種とグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩およびヒスチジンの少なくとも１種を含有し、上記ガラクトース、シュクロース、ソルビトールの濃度は１.２５〜２０w/v％であり、上記グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ヒスチジンの濃度は０.１２５〜１０w/v％であることを特徴とする遺伝子組換え技術により製造されたヒト血液凝固第ＸIII因子の安定化された水性液製剤。
【請求項２】
安定化剤としてガラクトース、シュクロースおよびソルビトールの少なくとも一種とグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩およびヒスチジンの少なくとも１種を含有し、上記ガラクトース、シュクロース、ソルビトールの濃度は１０〜２０w/v％であり、上記グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ヒスチジンの濃度は０.５〜２w/v％であることを特徴とする遺伝子組換え技術により製造されたヒト血液凝固第ＸIII因子の安定化された水性液製剤。
【請求項３】
安定化剤としてシュクロースまたはソルビトールとグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩またはヒスチジンを含有する請求項１または２記載の水性液製剤。
【請求項４】
安定化剤としてシュクロースとグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩またはヒスチジンとを含有する請求項１または２記載の水性液製剤。
【請求項５】
安定化剤としてソルビトールとグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩またはヒスチジンとを含有する請求項１または２記載の水性液製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定化剤としてガラクトース、シュクロース、ソルビトール、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩およびヒスチジンの少なくとも１種を含有する遺伝子組換え技術により製造されたヒト血液凝固第XIII因子の安定化された水性液製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血液凝固第ＸIII因子（以下第ＸIII因子と呼ぶ）は、ヒト血漿またはヒト胎盤等に広く存在し、トロンビンおよびＣａ2+によって活性化され、ε−（γ−グルタミル）リジン結合を種々の蛋白質間に形成し、分子同士を架橋結合させる。この活性型凝固第ＸIII因子によるフィブリンγ鎖同士の二量体化およびα鎖の多量体化はフィブリンに強度と弾性を与え、止血機構に関与する。さらに、この活性型第ＸIII因子は、フィブロネクチンのフィブリンα鎖またはコラーゲンへの架橋結合を触媒し、創傷治癒の過程で重要な役割を果たしている（松田、昭和52年、日本血液学会雑誌、第40巻第６号、p.995〜1002）。
【０００３】
第ＸIII因子はヒト胎盤あるいはヒト血漿から抽出、精製分離され、パスツリゼーション（液状加熱、60℃、10時間処理）を施すことにより、各種ウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス、HIV−１等のレトロウイルス等）を不活化して製剤化される。第ＸIII因子は製造過程および保存時に容易にその活性が減じることが一般に知られている。とりわけパスツリゼーション処理時に著しく活性が減じるため安定化剤としてアミノ酸１.０〜３.０Ｍおよび単糖類またはオリゴ糖類２０〜６０w／w％を加えることは知られている（ＵＳ４,２９７,３４４)。液剤のまま保存すると不安定であるので、貯蔵のためにはさらに安定化剤としてヒト血清アルブミンおよびブドウ糖を添加した後、凍結乾燥を行っている。現在は凍結乾燥製剤とその溶解液として日局注射用水が添付される形で市場に出ている。臨床医によって患者に投与する直前に凍結乾燥製剤を注射用水に溶解する手間を必要とするばかりでなく均一な溶液にするための溶解時間が必要なため、急を要する患者に投与する場合大きな問題点となっている。
【０００４】
遺伝子組換え技術により製造された第ＸIII因子は、ウイルスなどの病原菌を含まないので、加熱殺菌の必要はないが、その水溶液は不安定である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、遺伝子組換え技術により製造された第ＸIII因子を凍結乾燥することなく、水性液の形態で長期間保存可能な安定化された水性液製剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は安定化剤としてガラクトース、シュクロース、ソルビトール、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩およびヒスチジンの少なくとも１種を含有することを特徴とする遺伝子組換え技術により製造されたヒト血液凝固第ＸIII因子の安定化された水性液製剤からなる。
【０００７】
本発明において使用される安定化剤としては、ガラクトース、シュクロース、ソルビトール、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩およびヒスチジンがあげられる。これらは単独であるいは２種もしくはそれ以上を組み合わせて用いられる。グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩は好ましくはそれらのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩またはマグネシウム塩の形態で使用される。ヒト胎盤またはヒ
ト血漿から抽出、精製された天然の第ＸIII因子を加熱殺菌する際に用いられるグリシン、アラニン、ヒドロキシプロリン、グルタミン、α−、β−およびγ−アミノブチル酸やグルコースなどは意外にも遺伝子組換え技術により製造された第ＸIII因子の保存安定化剤としては有効でなかった。
【０００８】
本発明により安定化される第ＸIII因子は遺伝子組換え技術により製造された第ＸIII因子および血液凝固活性を有するその類似体である。このような因子としては、例えば、ドイツ特許 DE 3804890A1に記載の第ＸIII因子があげられる。この第ＸIII因子のアミノ酸配列は、グルンドマンらによりProc. Natl. Acad. Sci. USA（1986), VOL.83, p.8024-8028に報告された第ＸIII因子の第３図に記載されたアミノ酸配列のうち、１番目のＳｅｒから731番目のＭｅｔまでのアミノ酸配列を有し、かつ、８８番目のＬｅｕがＰｈｅに置換されたものである。
【０００９】
このアミノ酸配列をコードとするＤＮＡ配列を酵母用の発現ベクターであるpEMBLyex4（J．K．Selton，Genetic Engineering(1987)，Plenum Publishing Co., vol.9，p.135〜154）のポリリンカーサイトのSstＩからHind IIIの間に挿入し、第ＸIII因子の生産用プラスミドとする。得られた生産用プラスミドにより、酵母宿主であるCL3ABYS86（ドイツ特許DE 3804890A1）を形質転換し、酵母細胞内に組換え第ＸIII因子を産生させ、酵母破壊上清より組換え第ＸIII因子を精製し、生物学的に活性な第ＸIII因子を含む抽出液が得られる。
【００１０】
類似体とは第ＸIII因子のアミノ酸配列がアミノ酸の置換、削除、付加によって修飾されたものをいう。従って、類似体は、これらの第ＸIII因子のアミノ酸配列と均等な配列を持つタンパク質を含むことは当然である。さらに類似体は、これらの第ＸIII因子の主要な性質を保持する程度にこれらのアミノ酸配列の主要な部分を持ったタンパク質とも定義される。
【００１１】
第ＸIII因子製剤は、現在、凍結乾燥製剤として、先天性血液凝固第ＸIII因子を欠乏による出血傾向の改善、血液凝固第ＸIII因子の低下による縫合不全および瘻孔の治療およびシェーンライン・ヘノッホ紫斑病における症状の改善に静脈内投与されている。国内外における２万例以上の使用経験および下記表１の急性毒性試験の結果から見て、通常２０〜５０単位／kg／人／日での使用量では副作用・毒性等の心配は全くない。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
本液剤の投与方法は、凍結乾燥製剤と同様に静脈内投与はもちろんのこと、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮膚外用剤の剤形などあらゆる方法で投与することができる。本液製剤の保存方法は凍結乾燥製剤と同様に冷暗所、好ましくは４℃前後で保存するのが好ましい。
【００１４】
本発明では前述の遺伝子組換え技術により生産された第ＸIII因子（最終力価を100単位
／mlに調整）の水溶液にシュクロース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウムまたはＬ−ヒスチジンをそれぞれ添加後、至適濃度を検討した。その結果をもとに第ＸIII因子（最終力価を100単位／mlに調整）の添加剤として２０％Ｄ−ソルビールを加えた液剤、１５％シュクロースを加えた液剤、０.５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを加えた液剤、１％Ｌ−アスパラギン酸ナトリウムを加えた液剤、１％Ｌ−ヒスチジンを加えた液剤、２０％Ｄ−ソルビールおよび０.５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを加えた液剤、２０％Ｄ−ソルビールおよび１％Ｌ−アスパラギン酸ナトリウムを加えた液剤、２０％Ｄ−ソルビールおよび１％Ｌ−ヒスチジンを加えた液剤、１５％シュクロースおよび０.５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを加えた液剤、１５％シュクロースおよび１％Ｌ−アスパラギン酸ナトリウムを加えた液剤、１５％シュクロースおよび１％Ｌ−ヒスチジンを加えた液剤さらに対照として日局注射用水のみを加えた溶液について各々苛酷試験を行い、第ＸIII因子の活性の変化を測定した。その結果、本発明の安定化剤の添加により第ＸIII因子はほぼ１００％に保たれた。
【００１５】
さらに、本発明では前述の遺伝子組換え技術により生産された第ＸIII因子（最終力価を100単位／mlに調整）に添加剤として０.５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを加えた液剤、１５％シュクロースおよび１％Ｌ−アスパラギン酸ナトリウムを加えた液剤、１５％シュクロースおよび１％Ｌ−ヒスチジンを加えた液剤、さらに対照として日局注射用水のみを加えた溶液について各々加速試験を行い、第ＸIII因子の活性の長期的変化を予測した。その結果、本発明の安定化剤の添加により第ＸIII因子の活性の低下は見られなかった。
【００１６】
第ＸIII因子の活性測定法としては、フィブリン形成法、トランスグルタミナーゼ活性測定法または免疫学的な抗原量の測定法等あるが、本発明では、高感度で活性型第ＸIII因子量を測定することができる西田らのダンシルカダベリン(dansylcadaverine）法（文献：Nishida J., et al. (1984), Thromb. Res., vol. 36, p.123〜131）を用いた。ダンシルカダベリン（ヤトロン社より購入）は第ＸIII因子の基質となる蛍光アミンであり、第ＸIII因子の作用によりカゼインとダンシルカダベリン−カゼイン複合体を形成し、反応後、ゲル濾過で分取した当該複合体の蛍光強度を測定することで、第ＸIII因子の活性を測定できる。なお、第ＸIII因子の活性は単位で表示し、１単位とは、正常人の血漿１ml中に含まれる第ＸIII因子の量を示す。
【００１７】
本発明の製剤において、ガラクトース、シュクロース、ソルビールは１.２５〜４０w／v％、好ましくは１０〜２０w／v％の濃度で使用される。アミノ酸は０.１２５〜１０w／v％、好ましくは０.５〜２w／v％の濃度で使用される。第ＸIII因子は１〜２５００単位／ml、好ましくは６０〜２００単位／mlの濃度で使用される。本発明の製剤にはpH調整剤および等張化の目的で浸透圧調整剤を加えることができる。本発明の製剤のpHは６〜９の範囲がよく特にｐＨ７〜８が好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は第ＸIII因子を有効成分とし、ガラクトース、シュクロース、ソルビトール、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩およびヒスチジンから少なくとも一種類を添加することで、安定なしかも安全な水性液剤を提供する。これにより、生物学的活性を保ったまま液状で長期保存ができ、凍結乾燥品のように再溶解の必要がないので、患者投与時における臨床医の手間を削減できる。
【実施例】
【００１９】
次に、製剤例および実施例を示して本発明の効果を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
本発明安定化剤の至適濃度を検討した。ガラクトース、シュクロース、Ｄ−ソルビール、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウムおよびＬ−ヒスチジンを、ドイツ特許 DE 3804890A1に記載の遺伝子組換え技術により生産された第ＸIII因子（最終力価を日局注射用水で100単位／mlに調整する）に添加し、６０℃の湯浴中で３０分間加温後、第ＸIII因子の活性を測定した。第ＸIII因子溶液を１００単位／mlに力価調整した製剤の第ＸIII因子活性を１００％として第ＸIII因子の活性残存率（％）を算出した。その結果を表２に示す。
【００２１】
ガラクトース、シュクロース、ソルビトールの濃度は１.２５〜４０w／v％が有効であり、特に１０〜２０w／v％が好ましい。アミノ酸の濃度は０.１２５〜２０ｗ／ｖ％が有効であり、特に０.５〜２w／v％が好ましい。この結果を基に下記に示す製剤例を調製した。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
製剤例１
精製した組換え第ＸIII因子溶液を２００単位／mlに力価調整し、４０％Ｄ−ソルビトール溶液と等量ずつ混和し、最終的に第ＸIII因子の力価が１００単位／mlと２０％Ｄ−ソルビトール溶液を含む液剤を得た。
【００２４】
製剤例２〜１３
製剤例１と同様に表３に示す安定化剤を使用し、最終的に第ＸIII因子の力価が１００単位／mlと表３に示す濃度の糖類、糖アルコール類およびアミノ酸溶液を含む液剤を得た。
【００２５】
実施例２  苛酷試験
製剤例１〜１３を６０℃の湯浴中で３０分間加熱後、第ＸIII因子の活性を測定した。組換え第ＸIII因子溶液を日局注射用水で１００単位／mlに力価調整した製剤の第ＸIII因子活性を１００％として第ＸIII因子の活性残存率(％)を算出した。その結果を表３に示す。
６０℃、３０分間加熱による第ＸIII因子の失活は、糖類、糖アルコール類およびアミノ酸類の添加で防止され、ほぼ100％活性が残存した。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
表３に示す結果より、遺伝子組換え技術の使用により製造された生物学的に活性な第ＸIII因子溶液に、本発明の安定化剤の少なくとも一種を添加すると第ＸIII因子残存活性が８４％以上の安定な溶液となった。上記の通り、本発明の安定化剤の少なくとも一種を添加することにより、安定で安全性の高い生物学的に活性な第ＸIII因子を有効成分とする液剤が得られた。
【００２８】
実施例３  加速試験
上述の製剤例３、１０および１１を各々４０℃に保存し、開始時、１ヶ月後、２ヶ月後および３ヶ月後にサンプリングを行い、第ＸIII因子の活性残存率(％)を算出した。その
結果を表４に示した。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
表４に示した通り、遺伝子組換え技術により製造されたヒト血液凝固第ＸIII因子液剤の活性は安定化剤を添加しない対照では、４０℃保存で経時的に活性が低下した。一方、本発明の安定化剤の少なくとも一種類を添加した水性液製剤では、４０℃、３ヶ月後の第ＸIII因子の残存活性が９０％以上であった。