(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数が１８ないし２２のいずれかおよび不飽和度が３ないし６のいずれかのω３不飽和脂肪酸、その塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分とする、脂肪毒性の改善剤。
【請求項２】
前記脂肪毒性が膵臓β細胞の機能不全である、請求項１に記載の改善剤。
【請求項３】
前記膵臓β細胞の機能不全がインスリン分泌不全である、請求項２に記載の改善剤。
【請求項４】
前記膵臓β細胞の機能不全が細胞死である、請求項２に記載の改善剤。
【請求項５】
前記有効成分が、α−リノレン酸、イコサペント酸、ドコサヘキサエン酸およびそれらの塩およびエステルからなる群から選ばれる１種以上である、請求項１ないし４のいずれかに記載の改善剤。
【請求項６】
前記有効成分が、イコサペント酸、ドコサヘキサエン酸およびそれらの塩およびエステルからなる群から選ばれる１種以上である、請求項１ないし４のいずれかに記載の改善剤。
【請求項７】
前記不飽和脂肪酸のエステルがイコサペント酸エチルエステルおよび／またはドコサヘキサエン酸エチルエステルである、請求項１ないし６のいずれかに記載の改善剤。
【請求項８】
高遊離脂肪酸血症患者に投与することを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の改善剤。
【請求項９】
前記高遊離脂肪酸血症患者が、インスリン分泌不全を起こしている患者である、請求項８に記載の改善剤。
【請求項１０】
インスリン分泌不全を予防するために投与される、請求項８に記載の改善剤。
【請求項１１】
前記高遊離脂肪酸血症患者が、血漿中の遊離脂肪酸中のパルミチン酸の構成比率が持続的にあるいは繰り返して高い患者である、請求項８ないし１０のいずれかに記載の改善剤。
【請求項１２】
スルホニルウレア系インスリン分泌促進剤と併用される、請求項１ないし１１のいずれかに記載の改善剤。
【請求項１３】
スルホニルウレア系インスリン分泌促進剤との配合剤である、請求項１２に記載の改善剤。
【請求項１４】
前記スルホニルウレア系インスリン分泌促進剤が、トルブタミド、グリメピリド、グリクラジド、グリベンクラミドからなる群から選ばれる１以上である、請求項１２または１３に記載の改善剤。
【請求項１５】
全脂肪酸中における、前記有効成分（炭素数が１８ないし２２のいずれかおよび不飽和度が３ないし６のいずれかのω３不飽和脂肪酸、その塩及びエステル）の含量比が５０重量％以上である、請求項１ないし１４のいずれかに記載の改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪毒性の改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪細胞は大量の遊離脂肪酸を中性脂肪として貯蔵できる点で特化された細胞であり、脂肪細胞以外の細胞（非脂肪細胞）は大量の中性脂肪を貯蔵することはできない。脂肪細胞は、持続的にあるいは特定の刺激に応じて中性脂肪を分解し、ジアシルグリセロールと遊離脂肪酸に変える。遊離脂肪酸は水に不溶な溶血毒だが、アルブミンと結合すると無毒可溶となり、肝臓に運ばれ利用される。脂肪酸−アルブミン複合体は肝臓に入ると脂肪酸が速やかに肝臓に取り込まれ、アルブミンだけが血液に戻る。また、分解により生じた遊離脂肪酸はインスリンの作用により再エステル化される。こうして正常な状態では血漿中の遊離脂肪酸濃度は一定範囲に保たれる。【０００３】
しかしながら、インスリン作用の減弱した状態での持続的な脂肪分解など、何らかの原因で血漿中で持続的に多量の遊離脂肪酸が存在した場合（高遊離脂肪酸血症）、遊離脂肪酸の再分布により、肝臓、心臓、膵臓、腎臓や骨格筋などの非脂肪細胞が機能不全を起こすことがあり、脂肪毒性と呼ばれている。
非脂肪細胞が膵臓β細胞の場合には、脂肪毒性によりアポトーシスやグルコース刺激インスリン分泌障害が起こることが知られている。具体的には、パルミチン酸で培養膵臓β細胞のアポトーシス、増殖抑制およびグルコース刺激インスリン分泌不全が惹起されること、およびステアリン酸で培養膵臓β細胞のアポトーシスが惹起されることが報告されている（例えば非特許文献１〜３参照）。
膵臓β細胞においてグルコース刺激インスリン分泌が低下すると、血糖値が上昇する。【０００４】
また、正常より高い血糖値が慢性的に続くことにより、糖毒性と呼ばれる膵臓β細胞の機能不全を起こすことがある。具体的には、膵臓β細胞において糖毒性によりグルコース感受性が増加し、インスリンが過剰分泌され、膵臓β細胞が疲弊し、グルコース刺激インスリン分泌が低下する。また膵臓β細胞の減少も起こることが知られている（例えば、非特許文献２参照）。
このため脂肪毒性による血糖値の上昇が糖毒性を惹起し、インスリン作用の減弱は脂肪毒性を惹起する悪循環が起き、耐糖能異常の患者においては耐糖能異常から糖尿病への移行を促進し、糖尿病の患者においてはその症状を増悪させると考えられる。【０００５】
いくつかの脂肪酸、たとえばパルミトレイン酸（炭素数１６、不飽和度１、ω７系）、オレイン酸（炭素数１８、不飽和度１、ω９系）およびリノール酸（炭素数１８、不飽和度２、ω６系）は、脂肪毒性・糖毒性の予防作用を示すことが、ラットまたはヒトの培養膵臓β細胞を使った実験において報告されている。
ラットの膵臓ランゲルハンス島細胞のパルミチン酸（飽和脂肪酸）による脂肪毒性に対し、あらかじめパルミトレイン酸を添加しておくと、膵臓β細胞のアポトーシス、増殖抑制およびグルコース刺激インスリン分泌抑制が改善されたことが開示されている（例えば、非特許文献１参照）。
同様に、ヒトの膵臓ランゲルハンス島細胞のパルミチン酸による脂肪毒性および／またはグルコースによる糖毒性に対し、あらかじめパルミトレイン酸またはオレイン酸を添加しておくと、培養膵臓β細胞のアポトーシス、増殖抑制およびグルコース刺激インスリン分泌抑制が改善されたことが開示されている（例えば、非特許文献２参照）。
ヒトおよびラットの培養膵臓β細胞のパルミチン酸による脂肪毒性に対し、あらかじめパルミトレイン酸、オレイン酸またはリノール酸を添加しておくと、膵臓β細胞のアポトーシスが抑制されたことが開示されている（例えば、非特許文献３参照）。【０００６】
一方、オレイン酸はラットの培養膵臓β細胞においてグルコース刺激インスリン分泌の低下を引き起こし、脂肪毒性を惹起するとの報告もある（例えば、非特許文献４参照）。これらの文献には数種類の脂肪酸の脂肪毒性および／または糖毒性の予防作用について培養細胞を使った実験結果が示されているが、オレイン酸のように矛盾する報告もあり、必ずしも状況が明らかになっているとはいい難い。また、in vivoでの作用については記載がなく、また、改善作用については何ら記載がなく、予防および改善作用の両方を併せ持つものの記載もない。【０００７】
チアゾリジン誘導体は遊離脂肪酸を脂肪細胞に蓄積させることにより、非脂肪細胞を脂肪毒性から保護する働きがあり、ビグアナイド薬は脂肪毒性により障害を受けた膵臓β細胞等の糖利用・酸化を正常化させることが知られている。また、ニコチナマイドやアミノグニジンは誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の阻害薬として脂肪毒性によるアポトーシスを抑制する可能性が示されている。しかしながらこれら薬剤は、副作用があることが知られている。このように、脂肪毒性ひいては糖毒性に対して改善作用を併せ持ち、副作用が少なく、臨床的に十分満足し得る薬剤は存在していないのが現状である。【０００８】
【非特許文献１】メドラー、ケー.（Maedler, K.）等、ダイアベーツ（Diabetes）、２００１年、５０巻、p.６９−７６
【非特許文献２】メドラー、ケー.（Maedler, K.）等、ダイアベーツ（Diabetes）、２００３年、５２巻、p.７２６−７３３
【非特許文献３】エイテル、ケー.（Eitel, K.）、バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical  Research Communications）、２００２年、２９９巻、p.８５３−８５６
【非特許文献４】ブッシュ、エーエヌ.（Busch, A. N.）等、ダイアベーツ（Diabetes）、２００２年、５１巻、p.９７７−９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は脂肪毒性に対して予防ならびに改善作用を持ち、副作用が少ない、臨床的に十分満足し得る薬剤が現状では存在していない状況において、そのような薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意研究を行ったところ、炭素数が１８ないし２２および不飽和度が３ないし６の不飽和脂肪酸およびその誘導体が脂肪毒性予防・改善作用を有することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、
（１）炭素数が１８ないし２２のいずれかおよび不飽和度が３ないし６のいずれかの不飽和脂肪酸もしくはその誘導体またはこれらの混合物を有効成分とする、脂肪毒性の改善剤である。
具体的に、
（２）上記脂肪毒性が膵臓β細胞の機能不全である、上記（１）に記載の改善剤である。
（３）膵臓β細胞の機能不全がインスリン分泌不全である、上記（２）に記載の改善剤である。
（４）膵臓β細胞の機能不全が細胞死である、上記（２）に記載の改善剤である。【００１１】
また、具体的態様において、
（５）不飽和脂肪酸がω３脂肪酸またはその誘導体である、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の改善剤である。
（６）不飽和脂肪酸がα−リノレン酸、イコサペント酸、ドコサヘキサエン酸およびそれらの誘導体から選ばれる１種以上である、上記（５）に記載の改善剤である。
（７）不飽和脂肪酸の誘導体がイコサペント酸エチルエステルおよび／またはドコサヘキサエン酸エチルエステルである、上記（６）に記載の改善剤である。【００１２】
また具体的に、
（８）高遊離脂肪酸血症患者に投与することを特徴とする上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の改善剤である。
（９）上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の改善剤を投与する病態の改善または予防方法。
（１０）上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の改善剤の製造のための炭素数が１８ないし２２のいずれかおよび不飽和度が３ないし６のいずれかの不飽和脂肪酸またはその誘導体の使用。
【発明の効果】
【００１３】
上記のような炭素数が１８ないし２２および不飽和度が３ないし６の不飽和脂肪酸またはその誘導体を有効成分とする本発明の脂肪毒性の改善剤は、各種原因、疾患、病態における脂肪毒性の予防・改善剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】脂肪毒性による膵臓β細胞のインスリン分泌不全に対する本発明の脂肪毒性の改善剤による抑制（予防）効果を示し、各群のＭｉｎ６細胞をグルコースで刺激したときの、タンパク質１ｍｇあたりのインスリン分泌量を示すグラフである。
【図２】脂肪毒性による膵臓β細胞のインスリン分泌不全に対する本発明の脂肪毒性の改善剤による改善効果を示し、パルミチン酸を負荷したＭｉｎ６細胞に、各種脂肪酸を添加し、グルコースで細胞を刺激したときの、タンパク質１ｍｇあたりのインスリン分泌量を示すグラフである。
【図３】パルミチンを負荷した各群のマウスの血中遊離脂肪酸濃度を示すグラフである。
【図４】パルミチンを負荷した各群のマウスより分離した膵β細胞をグルコースで刺激したときの、ＤＮＡ１μｇあたりのインスリン分泌量を示すグラフである。
【図５】脂肪毒性による膵β細胞のインスリン分泌不全に対する長鎖多価不飽和脂肪酸とインスリン分泌促進剤の併用効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、炭素数が１８ないし２２および不飽和度が３ないし６の不飽和脂肪酸またはその誘導体（以下、これらを特定の不飽和脂肪酸と総称することもある）を有効成分とする、脂肪毒性の改善剤である。本発明において改善剤とは予防剤をも含む。
不飽和脂肪酸誘導体としては、例えばナトリウム塩等の無機塩基との塩、ベンジルアミン塩等の有機塩基との塩、塩基性アミノ酸との塩、エチルエステル等のアルキルエステルやグリセリド等のエステルがある。好ましくはトリグリセリドまたはエチルエステルであり、さらに好ましくはエチルエステルである。【００１６】
本発明において、上記特定の不飽和脂肪酸の好ましい態様例は、ω３脂肪酸またはその誘導体である。
また上記不飽和脂肪酸の好ましい例としては、α−リノレン酸（以下、αＬＡと略記する）、イコサペント酸（以下、ＥＰＡと略記する）、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡと略記する）およびそれらの誘導体から選ばれる１種以上が挙げられる。
ＥＰＡは、炭素数２０で不飽和度が５の不飽和脂肪酸である。本発明で使用されるＥＰＡは、二重結合の位置が５、８、１１、１４、１７ですべてシス型の直鎖不飽和ω３脂肪酸である。ＤＨＡは、炭素数が２２で不飽和度が６の不飽和脂肪酸である。本発明で使用されるＤＨＡは、二重結合の位置が４、７、１０、１３、１６、１９ですべてシス型の直鎖不飽和ω３脂肪酸である。αＬＡは、炭素数が１８で不飽和度３の不飽和脂肪酸で、二重結合の位置が９、１２、１５ですべてシス型の直鎖不飽和ω３脂肪酸である。【００１７】
また、これら好ましい不飽和脂肪酸の誘導体の好ましい態様は、先に示した態様と同様である。
具体的態様として、有効成分として、上記不飽和脂肪酸の誘導体がＥＰＡエチルエステル（以下、ＥＰＡ−Ｅと略記する）および／またはＤＨＡエチルエステル（以下、ＤＨＡ−Ｅと略記する）を含む改善剤が挙げられる。【００１８】
本発明は、上記のような特定の不飽和脂肪酸を有効成分とする、脂肪毒性改善剤を提供する。
本明細書における脂肪毒性とは、何らかの原因で血漿中、特に門脈血漿中で持続的にあるいは繰り返して多量の遊離脂肪酸が存在した場合、肝臓、心臓、膵臓、腎臓や骨格筋などの非脂肪細胞が機能不全を起こすことである。非脂肪細胞が膵臓β細胞の場合の脂肪毒性としては、膵臓β細胞のアポトーシス、増殖抑制およびグルコース刺激インスリン分泌不全の惹起が挙げられる。さらに膵臓β細胞においてグルコース刺激インスリン分泌が低下すると、血糖値が上昇する。
脂肪毒性を起こす脂肪酸の代表的な例としてはパルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。【００１９】
したがって本発明の具体的態様の一例は、脂肪毒性が膵臓β細胞の機能不全である、脂肪毒性の改善剤である。
膵臓β細胞は膵臓のランゲルハンス島にあるインスリンを分泌する細胞である。インスリンは膵臓β細胞の粗面小胞体で生合成前駆体であるプロインスリンとして合成され、インスリンに転換後、膵臓β細胞内に貯蔵され、分泌刺激に応じて血中に放出される。分泌は主としてグルコースにより促進される。インスリンの主な生理作用としては血糖降下作用がある。膵臓β細胞の機能不全にはインスリン分泌不全、増殖抑制および細胞死（ネクローシス、アポトーシス）が含まれる。【００２０】
また本発明は、具体的に、膵臓β細胞の機能不全がインスリン分泌不全である、脂肪毒性の改善剤である。
また本発明は、具体的に、膵臓β細胞の機能不全が細胞死である、脂肪毒性の改善剤である。本発明における細胞死にはネクローシス、アポトーシスのいずれも含まれる。【００２１】
本発明に係る脂肪毒性改善剤は、具体的に、高遊離脂肪酸血症患者に投与することを特徴とする。高遊離脂肪酸血症は、血漿中、特に門脈血漿中で持続的にあるいは繰り返して多量の遊離脂肪酸が存在する状態をいう。高遊離脂肪酸血症は、非脂肪細胞の機能不全、すなわち脂肪毒性を惹起することがある。【００２２】
本発明の改善剤は、有効成分として上記した特定の不飽和脂肪酸の少なくとも１つを含み、この不飽和脂肪酸の単品であることはもちろん、これらの混合物であってもよい。
本発明の改善剤の有効成分である不飽和脂肪酸の含量は特に規定されないが、全脂肪酸重量に対して好ましくは２０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、さらに好ましくは８５重量％以上、さらに好ましくは９５重量％以上、とりわけ好ましくは他の脂肪酸成分を実質的に含まない。
本発明の改善剤の有効成分としては、ω３多価不飽和脂肪酸、特にＥＰＡおよび／またはＤＨＡが好ましく、誘導体としてＥＰＡ−Ｅおよび／またはＤＨＡ−Ｅが更に好ましい。【００２３】
本発明の改善剤に使用する不飽和脂肪酸は、天然物からの抽出および精製または化学合成など、公知の方法によって調製することができる。この得られた不飽和脂肪酸のエステル化処理の方法は当業者には知られている。
本発明の改善剤として、天然に存在する不飽和脂肪酸を用いることが好ましく、具体的にはイワシ油、イカ油、タラ肝油、メンハーデン油、オキアミ油、ニシン油、サンマ油、サバ油などを脱酸、脱色、脱臭、脱ガム、脱ロウなど公知の精製方法で処理し、必要に応じて溶剤分画法、尿素付加法、分子蒸留法などを行うことで、ＥＰＡと、ＤＨＡ等の他の脂肪酸とを所定量まで濃縮した混合物として使用することができる。【００２４】
本発明の改善剤は、有効成分として上記特定の不飽和脂肪酸のみを投与するか、あるいは該不飽和脂肪酸を一般的に用いられる適当な担体または媒体の類、例えば賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、香味剤、必要に応じて滅菌水や植物油、さらには無害性有機溶媒あるいは無害性溶解補助剤（例えばグリセリン、プロピレングリコール）、乳化剤、懸濁化剤（例えばツイーン８０、アラビアゴム溶液）、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、無痛化剤などと適宜組み合わせて適当な組成物または医薬用製剤に調製することができる。
また、本発明の改善剤は、不飽和脂肪酸およびその誘導体以外の有効成分として、赤色ブドウ樹葉の水性抽出物またはその有効成分であるフラボノイド、フランス海岸松樹皮抽出物またはその有効成分であるピクノジェノール、ウマグリ抽出物、ハシバミ抽出物などを含んでいてもよい。また不飽和脂肪酸およびその誘導体の吸収を高めるための成分、例えばレシチンなどを含んでいてもよい。【００２５】
また、本発明の改善剤は、膵臓β細胞のインスリン分泌促進作用を有する薬剤、例えばトルブタミド、グリメピリド、グリクラジドやグリベンクラミド等のスルホニルウレア系インスリン分泌促進剤、ナテグリニドグやミチグリニド等の速効型インスリン分泌促進剤、メトフォルミンやブホルミン等のビグアナイド系薬剤と併用することが望ましい。
本発明において併用とは、配合剤として投与する方法、個別の製剤として同時投与する方法、あるいは、いずれかを投与した後にもう一方を逐次投与する方法のいずれも含まれる。
併用により、脂肪毒性改善作用が増強されるのみならず、耐糖能異常から糖尿病境界域や糖尿病への進展抑制作用が期待される。また、両剤の投与量、投与回数あるいは投与期間を減らすことができ、副作用の軽減等患者のクウォリティー・オブ・ライフを向上させることが期待される。【００２６】
本発明の改善剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、経口用液体製剤、ゼリー剤、坐剤、シロップ剤、吸入剤、点眼剤、軟膏、注射剤（乳濁性、懸濁性、非水性）、あるいは用時乳濁または懸濁して用いる固形注射剤の形で、経口および静脈内あるいは動脈内、吸入、点眼、直腸内、腟内あるいは外用を問わず患者に投与されるが、とりわけカプセル、例えば、軟カプセルやマイクロカプセルに封入しての経口投与が好ましい。また注射剤（乳濁性、懸濁性、非水性）、あるいは用時乳濁または懸濁して用いる固形注射剤での静脈内あるいは動脈内投与が好ましい。
なお、高純度ＥＰＡ−Ｅ含有軟カプセル剤であるエパデールおよびシームレスカプセル剤であるエパデールＳ（いずれも持田製薬社製）は副作用の発現が少ない安全な閉塞性動脈硬化症に伴う潰瘍、疼痛および冷感の改善および高脂血症治療薬として既に日本で市販されており、本発明の改善剤はこれらを使用することもできる。【００２７】
本発明の改善剤は、各種原因、疾患、病態における脂肪毒性の予防・改善に用いることができる。本発明の改善剤の投与対象としては、肥満者、過食者、運動不足者、高脂肪食者、特に獣肉を主として摂取する欧米的食生活者、高脂血症、高血糖、耐糖能異常、高インスリン血症、糖尿病、肝不全、肝性脳症、肝硬変、黄疸、腹水、肝炎、膵炎、膵機能不全、腎不全、ネフローゼ症候群、腎炎、尿毒症、心不全、心筋症、横紋筋融解症等において高遊離脂肪酸血症、特に門脈血漿中で持続的あるいは繰り返して高遊離脂肪酸を呈する患者が挙げられ、脂肪毒性の予防・改善に用いることができる。【００２８】
特に、上記高脂血症患者のうち高トリグリセリド血症患者、さらに食後一過性に繰り返し血漿中トリグリセリド濃度が上昇する食後高トリグリセリド血漿患者、および高血糖、耐糖能異常、糖尿病境界域や糖尿病における脂肪毒性の予防・改善に好適に用いることができる。【００２９】
本発明の改善剤は、高遊離脂肪酸血症、特に門脈血漿中で高遊離脂肪酸を呈する患者においてパルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸あるいはオレイン酸濃度が高い患者および／または遊離脂肪酸中のパルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸あるいはオレイン酸の構成比率が高い患者に対して更に好適に用いることができ、これらの指標をモニターしながら投与計画を立てたり、予防・改善状況を判断することもできる。【００３０】
特に、上記好ましい適応疾患・病態における高遊離脂肪酸を呈する患者においてパルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸濃度あるいはオレイン酸が高い患者および／または遊離脂肪酸中のパルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸の構成比率あるいはオレイン酸の構成比率が高い患者に対して更に好適に用いることができる。【００３１】
本発明の改善剤の投与量は、対象となる作用を現すのに十分な量とされるが、その剤形、投与方法、１日あたりの投与回数、症状の程度、体重、年齢等によって適宜増減することができる。例えば、改善剤として経口投与する場合、ＥＰＡとして０.１ないし９ｇ／日、好ましくは０.５ないし６ｇ／日、さらに好ましくは１ないし３ｇ／日投与する。投与する際は、必要に応じて全量を１回で投与してもよく、あるいは数回に分けて投与してもよい。ただし、数回、具体的には３回程度に分けて投与することが好ましい。経口投与する場合は食後６０分以内、好ましくは食直後に投与する。静脈内あるいは動脈内投与の場合は、ＥＰＡとして１ないし２００ｍｇ、好ましくは５ないし１００ｍｇ、さらに好ましくは１０ないし５０ｍｇ投与することが好ましい。投与する際は、全量を１回で投与してもよく、あるいは数回に分けて投与してもよい。また、必要に応じて、点滴あるいはインフュージョンポンプ等を用いて数時間から数日にかけて持続的に投与することもできる。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。なお、実験例１および実験例２においては、各種脂肪酸は脂肪酸のナトリウム塩（シグマ（Sigma）製）を使用して実験を行った。【００３３】
実験例１  脂肪毒性による膵臓β細胞のインスリン分泌不全に対する長鎖多価不飽和脂肪酸の抑制（予防）効果
（１）Ｍｉｎ６細胞への脂肪酸負荷
マウス膵臓β細胞由来Ｍｉｎ６細胞（大阪大学宮崎先生より供与されたもの）をＤＭＥＭ培地（ギブコ（GIBCO）製、岩井科学から購入）中で２４穴プレートに１ウェルあたり１.５×１０５個で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートした。
０.５％（ｖ／ｖ）脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する）および５.５ｍＭ  グルコースを含むＤＭＥＭ培地（シグマ製）に交換し、各ウェルへ、０.４ｍＭ  パルミチン酸（パルミチン酸群）、５０μＭ  ＥＰＡ（ＥＰＡ群）、０.４ｍＭ  パルミチン酸および５０μＭ  ＥＰＡ（パルミチン酸＋ＥＰＡ群）を添加して、または脂肪酸を添加せずに（対照群）、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間インキュベートした。【００３４】
（２）インスリン分泌量測定
＜グルコース刺激＞
（１）の細胞の培養上清を除去し、リン酸生理食塩緩衝液（以下、ＰＢＳ（−）と略記する）で２回洗浄し、０.５％（ｖ／ｖ）脂肪酸非含有ＢＳＡおよびグルコース２.８ｍＭを含むクレブス−リンガー−炭酸−ヘペス（Krebs-Ringer-Bicarbonate-Hepes）緩衝液（以下、ＫＲＢＨ緩衝液と略記する）を５００μＬ加えて、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。
その後、上清を除去し、０.５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡおよびグルコース２.８ｍＭを含むＫＲＢＨ緩衝液を５００μＬ加えて、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートし、上清を２.８ｍＭグルコース刺激サンプルとして回収した。
次に、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、０.５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡおよびグルコース２０ｍＭを含むＫＲＢＨ緩衝液で５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートし、上清を２０ｍＭグルコース刺激サンプルとして回収した。【００３５】
＜測定＞
回収したサンプルのインスリン濃度をレビスインスリン測定キット（シバヤギ製、中山商事より購入）により、タンパク質濃度をローリー（Lowry）法（ＢＣＡキット）により測定し、タンパク質１ｍｇあたりのインスリン量を定量した。結果を図１に示す。
いずれの群においても、２.８ｍＭグルコース刺激サンプルのインスリン分泌量に差は認められなかった。２０ｍＭグルコース刺激サンプルのインスリン分泌量は、対照群で３８３６ｎｇ（１００％とする）であったのに対し、パルミチン酸群では９１０ｎｇ（２３.７％）に減少していた。ＥＰＡ群では３６６４ｎｇ（９５.５％）であり、パルミチン酸＋ＥＰＡ群は２０９６ｎｇ（５４.６％）であった。よって、ＥＰＡは単独ではインスリン分泌量に影響を示さないが、脂肪毒性によるインスリン分泌不全に対する抑制効果を有することが明らかになった。【００３６】
実験例２  脂肪毒性による膵臓β細胞のインスリン分泌不全に対する長鎖多価不飽和脂肪酸の改善効果
（１）Ｍｉｎ６細胞への脂肪酸負荷
（1-1）Ｍｉｎ６細胞をＤＭＥＭ培地（ギブコ製）中で２４穴プレートに１ウェルあたり１.５×１０５個播種し、５％ＣＯ２、３７℃で終夜インキュベートした。
（1-2）各ウェルに、パルミチン酸を０.４ｍＭ、および脂肪酸非含有ＢＳＡを、０.５％（ｖ／ｖ）の濃度になるようにそれぞれ添加し、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間インキュベートした。
（1-3）細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地（シグマ製）中でパルミチン酸（パルミチン酸群）、オレイン酸（オレイン酸群）、ＥＰＡ（ＥＰＡ群）またはＤＨＡ（ＤＨＡ群）をそれぞれ５０μＭ添加して、または脂肪酸の非存在下（対照群）で、５％ＣＯ２、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。【００３７】
また、上記（1-1）で培養したＭｉｎ６細胞を、０.４ｍＭのパルミチン酸を添加せずにＤＭＥＭ培地（シグマ製）で上記（1-2）と同様に４８時間インキュベートし（正常群）、上記（1-3）の対照群と同様に、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地（シグマ製）で脂肪酸の非存在下で５％ＣＯ２、３７℃でさらに４８時間インキュベートしてサンプルを作成した（正常群）。【００３８】
（２）インスリン分泌量測定
実験例１（２）と同様にグルコース刺激した、２.８ｍＭグルコース刺激サンプルおよび２０ｍＭグルコース刺激サンプルを回収し、タンパク質１ｍｇあたりのインスリン量を定量した。結果を図２に示す。
０.４ｍＭのパルミチン酸を負荷することで、２０ｍＭグルコース刺激サンプル中のインスリン分泌量は、５００７ｎｇ（正常群：１００％とする）から２４８１ｎｇ（対照群：４９.６％）に減少した。ＥＰＡ群では４２７８ｎｇ（８５.４％）であり、ＤＨＡ群では４０７３ｎｇ（８１.４％）であった。一方、パルミチン酸群では７４２ｎｇ（１４.８％）であり、オレイン酸群では６５９ｎｇ（１３.２％）であった。
よって、パルミチン酸およびオレイン酸は脂肪毒性によるインスリン分泌不全をさらに悪化させるのに対して、ＥＰＡおよびＤＨＡは脂肪毒性によるインスリン分泌不全に対する改善効果を有することが明らかになった。【００３９】
実験例３  パルミチン酸負荷マウスにおける血中遊離脂肪酸増加および脂肪毒性による膵臓β細胞のインスリン分泌不全に対する長鎖多価不飽和脂肪酸の抑制効果
雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、８週齢、日本クレアより購入）を1週間魚粉抜きＦ１飼料（船橋農場製）で飼育した後、１群９〜１０匹の４群に分け、（１）魚粉抜きＦ１飼料（対照群）、（２）２０重量％トリパルミチン酸添加−魚粉抜きＦ１飼料（パルミチン酸群）、（３）２０重量％トリパルミチン酸＋５重量％ＥＰＡ−Ｅ添加−粉抜きＦ１飼料（パルミチン酸＋ＥＰＡ群）、および（４）５重量％ＥＰＡ−Ｅ添加−魚粉抜きＦ１飼料（ＥＰＡ群）をそれぞれ２８日間自由摂取で飼育した。【００４０】
実験開始前、１４日目および最終日にマウスを１６時間絶食後、眼窩静脈叢より採血して血清を分離し、血中遊離脂肪酸を酵素法（ＮＥＦＡテストワコー、和光純薬）を用いて測定した。結果を図３に示す。また、コラゲナーゼ処理した膵臓からランゲルハンス島を密度勾配法により単離し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（岩井科学より購入）、１重量％ペニシリンストレプトマイシン含有ＲＰＭ１１６４０培地（シグマ製）中で５％ＣＯ２、３７℃で２時間培養後、実験例１−（２）に記載した手順に準じてグルコース刺激インスリン分泌能を評価した。結果を図４に示す。【００４１】
ランゲルハンス島をＰＢＳ（−）で洗浄し、２０μＬのＴＮＥ緩衝液（０．１Ｍ  トリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で激しく振とうして溶解し反応液とする。発光液（１．２μＬのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８（和光純薬製）をＴＮＥ緩衝液１ｍＬに添加）１００μＬにこの反応液２０μＬを添加して室温で８時間以上反応後、励起波長３５０ｎｍ、測定波長４５０ｎｍで測定した。ウシ胸腺ＤＮＡ（シグマ製）を用いて同様に測定して検量線を作成し、ＤＮＡ量を定量した。ランゲルハンス島のＤＮＡ１μｇあたりのインスリン量を定量した。【００４２】
図３は、各脂肪酸の血中遊離脂肪酸に対する作用を示し、パルミチン酸群では、対照群に比べて経時的に血中遊離脂肪酸濃度が上昇した。ＥＰＡ群およびパルミチン酸＋ＥＰＡ群では、対照群と同様の血中遊離脂肪酸濃度の推移を示した。よって、ＥＰＡは単独では血中遊離脂肪酸濃度に影響を示さないが、パルミチン酸負荷による血漿遊離脂肪酸増加に対する抑制効果を有することが明らかになった。【００４３】
図４は、インスリン分泌不全に対する作用の結果を示す。
いずれの群においても、２.８ｍＭ  グルコース刺激サンプルのインスリン分泌量に差は認められなかった。２０ｍＭ  グルコース刺激サンプルのインスリン分泌量は、対照群で７.３ｎｇ（１００％とする）であったのに対し、パルミチン酸群では４.６ｎｇ（６３％）に減少していた。ＥＰＡ群では８.９ｎｇ（１２１％）であり、パルミチン酸＋ＥＰＡ群は８.２ｎｇ（１１１％）であった。よって、ＥＰＡは単独ではインスリン分泌量に影響を示さないが、脂肪毒性によるインスリン分泌不全に対する抑制効果を有することが明らかになった。【００４４】
実験例４  脂肪毒性による膵臓β細胞のインスリン分泌不全に対する長鎖多価不飽和脂肪酸とインスリン分泌促進剤の併用効果
実験例３に準じて雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、８週齢、日本クレアより購入）膵臓からランゲルハンス島を単離培養後、実験例１に準じて０．４ｍＭパルミチン酸による２０ｍＭグルコース刺激インスリン分泌抑制および３０ｍＭ  ＫＣｌ刺激インスリン分泌抑制に及ぼす５０μＭ  ＥＰＡ単独（パルミチン酸＋ＥＰＡ群）、５ｍＭトルブタミド単独（パルミチン酸＋トルブタミド群）および５０μＭ  ＥＰＡと５ｍＭトルブタミドとの併用（パルミチン酸＋併用群）の効果を評価した。実験例３に準じてランゲルハンス島のＤＮＡ１ｎｇあたりのインスリン量を定量した。結果を図５に示す。
２０ｍＭグルコース刺激サンプルのインスリン分泌量は、対照群で１０２９ｐｇ（１００％とする）であったのに対し、パルミチン酸群では５７２ｐｇ（５５．６％）に減少していた。パルミチン酸＋ＥＰＡ群では８２３ｐｇ（８０．０％）、パルミチン酸＋トルブタミド群では６７３ｐｇ（６５．４％）およびパルミチン酸＋併用群では９２８ｐｇ（９０．２％）であった。３０ｍＭ  ＫＣｌ刺激サンプルのインスリン分泌量は、対照群で５８３ｐｇ（１００％とする）であったのに対し、パルミチン酸群では２２９ｐｇ（３９．３％）に減少していた。パルミチン酸＋ＥＰＡ群では４２２ｐｇ（７２．４％）、パルミチン酸＋トルブタミド群では３１６ｐｇ（５４．２％）およびパルミチン酸＋併用群では６８８ｐｇ（１１８．０％）であった。
よって、ＥＰＡおよびトルブタミドは各々単独で脂肪毒性によるインスリン分泌不全に対する抑制効果を有し、両剤の併用によりその効果は増強することが明らかになった。【００４５】
以下に、本発明に係る脂肪毒性の改善剤の製剤形態の実施例をいくつか示す。
実施例１  軟質カプセル剤
軟質ゼラチンカプセル（約０.５ｍＬ容）を滅菌し、エチル化および精製した魚油、すなわちＥＰＡ−Ｅ９０.６重量％、アラキドン酸エチルエステル２.３重量％、オクタデカテトラエン酸エチルエステル２.２重量％、ω−３−イコサテトラエン酸エチルエステル０.７重量％を含む組成物にα−トコフェロールを０.２重量％となるように加えて、ＥＰＡ−Ｅとして３００ｍｇとなるように満たし、次いで封じた。【００４６】
実施例２  軟質カプセル剤
ＥＰＡ２８％含有精製魚油１０ｋｇ、α−トコフェロール０.１ｋｇを攪拌槽に入れて、均一化するまで混合攪拌して原料混合液状物とする。一方、ゼラチン２.６ｋｇ、グリセリン０.９ｋｇ、水１.８ｋｇを混合し、フィルム状にした後、内容量３００ｍｇのカプセル状（楕円球状）に射出成形した容器に原料混合液状物３００ｍｇ注入し、注入口を加熱密封し、総重量４６０ｍｇのカプセル状のＥＰＡ含有製剤３３，６００カプセルを作製した。１カプセルあたりのＥＰＡ含量は１８.１重量％であった。【００４７】
実施例３  軟質カプセル剤
軟質ゼラチンカプセル（約１ｍＬ容）を滅菌し、エチル化および精製した魚油１０００ｍｇ（多価不飽和脂肪酸エチルエステル９００ｍｇ（ＥＰＡ−Ｅ４６５ｍｇ、ＤＨＡ−Ｅ３７５ｍｇを含む））およびα−トコフェロール４ｍｇを含む組成物を満たし、次いで封じた。【００４８】
実施例４  マイクロカプセル剤
エチル化および精製した魚油、すなわちＥＰＡ−Ｅ９０.６重量％、アラキドン酸エチルエステル２.３重量％、オクタデカテトラエン酸エチルエステル２.２重量％、ω−３−イコサテトラエン酸エチルエステル０.７重量％を含む組成物にα−トコフェロールを０.２重量％加えた油状物を同心二重円筒式自動軟カプセル機の充填物配給タンクに入れ、一方、被覆剤供給タンクにはゼラチン３７.８重量％、グリセリン９.４重量％、Ｄ−ソルビトール５.７重量％、精製水４７.２重量％を混合して別途調製された被覆用液を入れ、該機械における内管ノズルの充填用油状物質移動速度９.７ｇ／分、外管ノズルの被覆用液移動速度２.３ｇ／分となるよう設定したのち、オリフィスの下部に２００Ｈｚの振動を与え、冷却媒体液移動速度を調製しながら、粒径約１.９ｍｍ、被覆率１９％、重量３.１ｍｇの球状シームレスマイクロカプセルを得た。窒素ガス雰囲気下で、このマイクロカプセルを４１０ｍｇずつ厚さ０.２ｍｍのラミネートアルミニウム箔（防湿セロファン＋アルミニウム箔＋ポリエチレン）に分包した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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