(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び、グルコースを構成成分として含有する２糖類、を乾燥状態（ただし、凍結乾燥状態を除く）で共存させるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の安定化方法。
【請求項２】
グルコースを構成成分として含有する２糖類が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた１種又は２種以上の組み合わせである請求項１記載の安定化方法。
【請求項３】
該乾燥状態が風乾によるものである請求項１又は２に記載の安定化方法。
【請求項４】
少なくともニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及びグルコースを構成成分として含有する２糖類、を乾燥状態で共存させるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の保存方法であって、乾燥状態が、風乾または加熱乾燥によるものである、前記保存方法。
【請求項５】
グルコースを構成成分として含有する２糖類が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた１種又は２種以上の組み合わせである請求項４記載の保存方法。
【請求項６】
グルコースを構成成分として含有する２糖類が、トレハロースである請求項４または５に記載の保存方法。
【請求項７】
該乾燥状態が風乾によるものである請求項４乃至６のいずれかに記載の保存方法。
【請求項８】
さらに、クエン酸緩衝液の乾燥物、を共存させる、請求項４乃至７のいずれかに記載の保存方法。
【請求項９】
少なくともニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び、グルコースを構成成分として含有する２糖類、が共存する乾燥された組成物（ただし、凍結乾燥により乾燥されたものを除く）。
【請求項１０】
グルコースを構成成分として含有する２糖類が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた１種又は２種以上の組み合わせである請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
グルコースを構成成分として含有する２糖類が、トレハロースである請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
さらに、クエン酸緩衝液の乾燥物、が共存する請求項９乃至１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
アルカリフォスファターゼを検出するために用いるものである請求項９乃至１２のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリン酸化補酵素の安定化方法であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を共存させることを特徴とする安定化方法、保存方法、あるいは安定化組成物に関する。本発明は、臨床診断、食品検査、生体成分検査等の分野において用いられる。
【背景技術】
【０００２】
これまで補酵素は、生化学臨床検査測定試薬に頻繁に用いられてきた。補酵素として酸化型あるいは還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADHあるいはNAD）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPHあるいはNADP）が用いられてきたが、これら補酵素は安定性に難点があった。補酵素は検査試薬に含まれる微量の酵素により酸化型補酵素であるNADやNADPへ変化するか、あるいは、ADPリボースとそれ以外に分解してしまい、結果として酵素が利用できる構造体が変化し、補酵素の総量が減少することにより、検査試薬の感度を低下させる問題点があった（非特許文献１）。これを解決するために、補酵素を冷凍あるいは冷蔵などのなるべく低い温度条件下に保存し、補酵素を含む試薬を凍結乾燥するか、あるいは溶液状態での安定化剤としてアミン塩基や水酸化ナトリウム、キレート剤、アジ化物、ホウ酸、アルカリ金属、アンモニウムビカーボネートバッファー、活性酸素除去物質などを用いることが知られている。これらの方法はいずれも上述のごとく分解することを避けることで、感度低下を回避しようという意図のもとに考え出されたものである（特許文献１、特許文献２）。【０００３】
また、補酵素は免疫学的な臨床検査測定試薬にも利用されている。例えば、酵素免疫測定法において、リン酸化補酵素であるNADPまたはNADPHを基質にアルカリフォスファターゼ（ALP）標識抗体を検出する方法として補酵素サイクリング法が知られている（特許文献３）。NADPまたはNADPH、アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアフォラーゼ、アルコール、及びテトラゾリウム塩からなる酵素サイクリング試薬を用いて検出する方法が良く知られ、例えば、ALPの基質にNADPを用いた場合、ALPによりNADPからNADが生じ、生じたNADがアルコールデヒドロゲナーゼとアルコールによりNADHへと変化し、次いで、NADHはジアフォラーゼとテトラゾリウム塩により再びNADへ戻り、再びNADからNADHへと反応が進む。このようにNADとNADHとの間でサイクルする反応を通じて、テトラゾリウム塩から生じるフォルマザン色素が反応液中に蓄積し、この色素量を測定することで、ALP活性を測定することができる。
これら試薬においても補酵素の安定性に問題を抱えており、生化学検査薬同様、試薬を長期間保存するために、補酵素を冷凍あるいは冷蔵などのなるべく低い温度条件下に保存し、補酵素を凍結乾燥状態で保存させてきた。また、緩衝液の種類を選択することで安定化させる試みも行われてきた。【０００４】
一方、近年、インフルエンザ抗原検査薬をはじめとする、診療所やベッドサイドにてその場で検査結果を得ることができる簡易検査が普及してきた。これらポイントオブケア（POC）検査薬において、冷蔵以下の保存が必要な場合は、冷蔵庫や冷凍庫などの特別な設備必要であり、保存できるスペースにも限界があるため、大量の試薬を安価に購入して保存できない欠点があったことから、室温保存の試薬が望まれていた。しかし、これらのPOC検査薬において、室温保存可能な、補酵素を用いた検査薬を実用化するために、従来の冷蔵保存よりもさらに過酷な条件下での長期の保存安定性が求められ、上述のごとく、ただでさえ冷蔵保存で補酵素を安定化させるのが困難であったのをさらに過酷な条件下で安定化させなければならず、この分野での補酵素を用いた検査薬の実用化は極めて困難であった。
また、検査薬の分野においては、微量の対象物質を測定するために、測定の高感度化が望まれている。ALPは、酵素免疫測定法で汎用される標識酵素としてよく知られているため、高感度にALPを検出する手法が望まれている。また、高感度化させる技術は、微量を測定する目的にとどまらず、検体の微量化あるいは測定の短時間化のために有効であり、この分野において最も望まれている技術である。【０００５】
【特許文献１】特許第３４７００９９号公報
【特許文献２】特開２００１−６１４９８号公報
【特許文献３】特開平６−３０３９９６号公報
【非特許文献１】蛋白質・酵素の基礎実験法、南江堂、426頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、リン酸化補酵素を、特に室温付近で長期間安定化させる方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決するために特に以下の観点に留意しながら鋭意研究を重ねた結果、室温にて長期間安定に保存可能な補酵素の安定化方法を見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。補酵素を用いたALP活性測定法において、長期間安定に再現良く測定する試薬を実用化することは極めて困難であることから、特に、高感度化された補酵素サイクリング法を用い、室温での長期間保存可能なALP活性測定試薬を実用化するためには、保存時間とともに増大する非特異的発色を低減化させる補酵素の安定化技術が必要であり、従来知られている安定化技術では限界があると考え、新規な安定化方法を見出すことが重要と考えて研究した。【０００８】
すなわち本願発明は、リン酸化補酵素の安定化方法であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を共存させることを特徴とする安定化方法に関するものであり、
（１）リン酸化補酵素の安定化方法であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を共存させることを特徴とする安定化方法、
（２）乾燥状態でのリン酸化補酵素の安定化方法であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を溶液中に共存させた後に、該溶液を乾燥させることを特徴とする安定化方法、
（３）脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び／又は糖アルコールであることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の安定化方法、
（４）脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の安定化方法、
（５）脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する２糖類であることを特徴とする前記（４）記載の安定化方法、
（６）脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする前記（５）記載の安定化方法、
（７）乾燥させる方法が風乾であることを特徴とする上記（２）記載の安定化方法、
（８）リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）であることを特徴とする前記（１）〜（７）記載の安定化方法、
（９）リン酸化補酵素の安定化組成物であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を含有することを特徴とする安定化組成物、
（１０）乾燥されたリン酸化補酵素の安定化組成物であって、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を含有することを特徴とする乾燥された安定化組成物、
（１１）脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び／又は糖アルコールであることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載の安定化組成物、
（１２）脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載の安定化組成物、
（１３）脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する２糖類であることを特徴とする前記（１２）記載の安定化組成物、
（１４）脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする前記（１３）記載の安定化組成物、
（１５）リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）であることを特徴とする前記（９）〜（１４）記載の安定化組成物、
（１６）リン酸化補酵素を長期間安定化するための、脱リン酸化反応を抑制する物質の使用、
（１７）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制するための、グルコースを構成成分として含有する多糖類の使用、
（１８）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質を用いた、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法、
に関する。
また、
（１９）リン酸化補酵素、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質を共存させることを特徴とする酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法、
（２０）リン酸化補酵素、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質のみを共存させることを特徴とする酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法、
（２１）酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法が、32℃、３ヶ月後のリン酸化補酵素が70%以上残存し、且つ、残存リン酸化補酵素中の脱リン酸化補酵素割合が1%未満となる安定化方法である上記（１９）又は（２０）に記載の安定化方法、
（２２）酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法が、32℃、６ヶ月後のリン酸化補酵素が70%以上残存し、且つ、残存リン酸化補酵素中の脱リン酸化補酵素割合が1%未満となる安定化方法である上記（１９）又は（２０）に記載の安定化方法、
（２３）酵素サイクリング用のリン酸化補酵素の安定化方法が、32℃、1年後のリン酸化補酵素が70%以上残存し、且つ、残存リン酸化補酵素中の脱リン酸化補酵素割合が1%未満となる安定化方法である上記（１９）又は（２０）に記載の安定化方法、
（２４）リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類である
上記（１９）〜（２３）のいずれか１つに記載の安定化方法、
（２５）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び／又はチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である上記（２４）に記載の安定化方法、
（２６）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び／又はチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である上記（２５）に記載の安定化方法、
（２７）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び／又はチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である上記（２５）に記載の安定化方法、
（２８）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類である上記（１９）〜（２７）のいずれか１つに記載の安定化方法、
（２９）グルコースを構成成分として含有する多糖類が、グルコースを構成成分として含有する２糖類である上記（２８）に記載の安定化方法、
（３０）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、マルトース、スクロース、ラクトース、及びトレハロースからなる群より選ばれる１種または２種以上の組み合わせである上記（２９）に記載の安定化方法、
（３１）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、マルトース、トレハロース、及びラクトースからなる群より選ばれる１種または２種以上の組み合わせである上記（３０）に記載の安定化方法、
（３２）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、マルトース及び／又はラクトースである上記（３０）に記載の安定化方法、
（３３）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、ラクトース及び／又はトレハロースである上記（３０）に記載の安定化方法、
（３４）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、マルトース及び／又はトレハロースである上記（３０）に記載の安定化方法、
（３５）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、ラクトース及び／又はスクロースである上記（３０）に記載の安定化方法、
（３６）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、マルトース及び／又はスクロースである上記（３０）に記載の安定化方法、
（３７）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、ラクトースである上記（３０）に記載の安定化方法、
（３８）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、マルトースである上記（３０）に記載の安定化方法、
（３９）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、スクロースである上記（３０）に記載の安定化方法、
（４０）グルコースを構成成分として含有する２糖類が、トレハトースである上記（３０）に記載の安定化方法、
（４１）上記（９）〜（１５）に記載の安定化組成物を用いるアルカリフォスファターゼ活性測定法、
（４２）酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後に、酵素基質が自動的に添加されるように送液装置を設けたフロースルー型の簡易免疫測定装置。
（４３）送液装置が水溶性フィルターを用いることを特徴とする上記（４２）に記載の簡易免疫測定装置、
（４４）送液装置がサイフォンを用いることを特徴とする上記（４２）〜（４３）に記載の簡易免疫測定装置、
（４５）酵素基質が上記（９）〜（１５）に記載の安定化組成物を含有する溶液であることを特徴とする上記（４２）〜（４４）に記載の簡易免疫測定装置、
（４６）酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後と、酵素基質が自動的に添加される前に洗浄液を添加しないことを特徴とする上記（４２）〜（４５）に記載の簡易免疫測定装置、
（４７）微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする上記（４１）記載のアルカリフォスファターゼ活性測定法を利用した酵素免疫測定法、
（４８）微生物がマイコプラズマニューモニア、へモフィルスインフルエンザ、ストレプトコッカスニューモニア、クラミジアニューモニア、クラミジアトラコマーティスレジオネラニューモフィラより選ばれる１種以上である上記（４７）に記載の酵素免疫測定法、
（４９）リボソームタンパクがＬ７／Ｌ１２である上記（４７）〜（４８）に記載の酵素免疫測定法、
（５０）微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする上記（４２）から（４６）に記載の簡易免疫測定装置、
（５１）微生物がマイコプラズマニューモニア、へモフィルスインフルエンザ、ストレプトコッカスニューモニア、クラミジアニューモニア、クラミジアトラコマーティスレジオネラニューモフィラより選ばれる１種以上である上記、上記（４８）記載の酵素免疫測定法を利用した、（５０）に記載の簡易免疫測定装置、
（５２）リボソームタンパクがＬ７／Ｌ１２である、上記（４９）記載の酵素免疫測定法を利用した、上記（５０）〜（５１）記載の酵素免疫測定法、
（５３）上記（１）〜（８）において、さらにクエン酸塩を共存させることを特徴とする安定化方法、
（５４）クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記（５３）に記載の安定化方法、
（５５）上記（９）〜（１５）において、さらにクエン酸塩を共存させることを特徴とする安定化組成物、
（５６）クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記（５５）に記載の安定化組成物、
（５７）上記（１６）、又は（１７）において、さらにクエン酸塩の使用、
（５８）クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記（５７）に記載の使用、
（５９）上記（１８）において、さらにクエン酸塩を用いる、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法、
（６０）上記（１９）〜（４０）において、さらにクエン酸塩を共存させることを特徴とする安定化方法、
（６１）クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記（６０）に記載の安定化方法、
（６２）上記（５５）又は（５６）に記載の安定化組成物を用いるアルカリフォスファターゼ活性測定法、
（６３）酵素基質が、上記（５５）又は（５６）に記載の安定化組成物を含有する溶液であることを特徴とする上記（４２）〜（４４）に記載の簡易免疫測定装置、
（６４）酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後と、酵素基質が自動的に添加される前に洗浄液を添加しないことを特徴とする上記（６３）に記載の簡易免疫測定装置、
（６５）微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする上記（６２）記載のアルカリフォスファターゼ活性測定法を利用した酵素免疫測定法、
（６６）微生物がマイコプラズマニューモニア、へモフィルスインフルエンザ、ストレプトコッカスニューモニア、クラミジアニューモニア、クラミジアトラコマーティスレジオネラニューモフィラより選ばれる１種以上である上記（６５）に記載の酵素免疫測定法、
（６７）リボソームタンパクがＬ７／Ｌ１２である上記（６６）又は（６７）に記載の酵素免疫測定法、
（６８）微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体を用いることを特徴とする上記（６３）又は（６４）に記載の簡易免疫測定装置、
（６９）微生物がマイコプラズマニューモニア、へモフィルスインフルエンザ、ストレプトコッカスニューモニア、クラミジアニューモニア、クラミジアトラコマーティスレジオネラニューモフィラより選ばれる１種以上である上記（６８）に記載の簡易免疫測定装置、
（７０）リボソームタンパクがＬ７／Ｌ１２である上記（５０）〜（５１）に記載の酵素免疫測定法、
に関する。
また、
（７１）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素のみを共存させることを特徴とする上記（１）に記載の安定化方法、
（７２）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素のみを共存させることを特徴とする上記（２）に記載の安定化方法、
（７３）脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び／又は糖アルコールであることを特徴とする前記（７１）又は（７２）に記載の安定化方法、
（７４）脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする前記（７１）又は（７２）に記載の安定化方法、
（７５）脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する２糖類であることを特徴とする前記（７４）に記載の安定化方法、
（７６）脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする前記（７５）記載の安定化方法、
（７７）乾燥させる方法が風乾であることを特徴とする（７２）記載の安定化方法、
（７８）リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）であることを特徴とする前記（７１）から（７７）記載の安定化方法、
（７９）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素のみを含有することを特徴とする上記（９）記載の安定化組成物、
（８０）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素をのみ含有することを特徴とする上記（１０）記載の安定化組成物、
（８１）脱リン酸化反応を抑制する物質が、糖類及び／又は糖アルコールであることを特徴とする前記（７９）又は（８０）記載の安定化組成物、
（８２）脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する多糖類であることを特徴とする前記（７９）又は（８０）記載の安定化組成物、
（８３）脱リン酸化反応を抑制する物質が、グルコースを構成成分として含有する２糖類であることを特徴とする前記（８２）記載の安定化組成物、
（８４）脱リン酸化反応を抑制する物質が、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれた１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする前記（８３）記載の安定化組成物、
（８５）リン酸化補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）であることを特徴とする前記（７９）〜（８４）記載の安定化組成物、
（８６）上記（７９）〜（８５）記載の安定化組成物を用いるアルカリフォスファターゼ活性測定法、
（８７）酵素基質が上記（７９）〜（８５）記載の安定化組成物を含有する溶液であることを特徴とする上記（４２）〜（４４）記載の簡易免疫想定装置、
（８８）上記（７１）〜（７８）において、さらにクエン酸塩のみを共存させることと特徴とする安定化方法、
（８９）クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記（８８）に記載の安定化方法、
（９０）上記（７９）〜（８５）において、さらにクエン酸塩のみを共存させることと特徴とする安定化組成物、
（９１）クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記（９０）に記載の安定化組成物、
（９２）リン酸化補酵素を長期間安定化するための、脱リン酸化反応を抑制する物質、及びクエン酸のみの使用、
（９３）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制するための、グルコースを構成成分として含有する多糖類、及びクエン酸のみの使用、
（９４）クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムである上記（９２）又は（９３）に記載の使用、
（９５）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質のみを用いた、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法、
（９６）少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びクエン酸塩のみを用いた、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の安定化方法は、例えば、ALP活性測定用等として用いた場合、室温で補酵素を長期間安定化させる効果を示す。従って、POC検査薬等において補酵素を用いた検査薬を実用化するのに非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の、酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後に、酵素基質が自動的に添加されるように送液装置を設けたフロースルー型の簡易免疫測定装置の図である。
【図２】本発明の、酵素標識試薬が抗体または抗原が固定化された膜を透過した後に、酵素基質が自動的に添加されるようにサイフォン式の送液装置を設けたフロースルー型の簡易免疫測定装置の図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本願発明について具体的に説明する。【００１２】
本願発明におけるリン酸化補酵素としては、例えば、NADP、チオNADP、アセチルNADP、デアミノNADP、デアミドNADP、からなる群より選ばれる１種または２種以上の補酵素の組み合わせが好適な例として挙げられる。より好ましくはNADPまたはNADPHが良く、特に好ましくはNADPが挙げられる。補酵素の純度は高ければ高いほど良い。高純度であれば市販品をそのまま用いても良いが、必要に応じて、市販の補酵素粉末を適当な溶媒に溶解させ、カラム精製などにて精製したものを用いてもよい。留意すべき不純物としてはリン酸化されていない補酵素等が挙げられる。本願発明における安定化対象であるリン酸化補酵素の量に対して、不純物である該リン酸化されていない補酵素の量が1%以下が好ましく、0.5%以下が更に好ましく、0.1%以下が特に好ましい。【００１３】
本願発明における脱リン酸化反応を抑制する物質としては、少なくとも上記リン酸化補酵素の構造中に存在するリボースの２位に結合したリン酸基が解離するのを抑制する作用を有する物質であれば何ら限定されないが、その他の作用を併せ持っていてもよい。その他の作用としては、例えば、リボース部分と塩基部分の結合が分解されることを抑制する作用等が挙げられる。具体的な物質としては、糖類及び／又は糖アルコール等が好適な例として挙げられ、特に糖類が好ましい。【００１４】
糖類としては、多糖類が好ましく、例えば、その構造内にグルコースを含有する多糖類が特に好ましい。具体例としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリン、メチル−β−サイクロデキストリン、ヒドロキシプロピルサイクロデキストリン、マルトデキストリン、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオースイソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、パノース、イソパノース、ソホロース、ソホロトリオース、ソホロテトラオース、ソホロペンタオース、ソホロヘキサオース、コージビオース、ラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオース、ニゲロース、ニゲロトリオース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオース、セロヘプタオース、ゲンチオビオース、ゲンチオトリオース、ゲンチオテトラオース、ゲンチオペンタオース、ゲンチオヘキサオース、ネオトレハロース、イソトレハロース、ビシアノース、イソプリメベロース、サンブビオース、プリメベロース、リコテトラオース、ソラビオース、メリビオース、マンニノトリオース、ベルバスコテトラオース、リコビオース、リコトリオース、エピセロビオース、ツラノース、マルツロース、イソケストース、エルロース、ケストース、プランテオース、プランテオテトラオース、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコース、アジュゴース、リクノース、シラビオース、ネオヘスペリドース、ルチノース、カコトリオース、ソラトリオース、フコシドラクトース、ジフコラクトース、ストロファントビオース、ストロファントトリオース、ジギラニドビオース、ジギラニドトリオース、オドロトリオース、トレハロサミン、ラクトＮトリオースＩＩ、ゲンチアノース、ネオケストース、メレチトース、ネオビフルコース、ニストース、ビフルコース、リコリシン、エピゲンチオビオース、イソリクノース、ウンベリフェロース、セサモース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、セロビオウロン酸、ＮアセチルノイラミノラクトースＩ、Ｎ−アセチルノイラミノラクトースＩＩ、ジ−Ｎ−アセチルノイラミノラクトース、ラクトペンタサッカライドａ、ラクトペンタサッカライドｂ、ラクトペンタサッカライドｃ、グルコシルマンニトール、ジグルコシルマンニトール、ガラクトフラノシル−グルコシル−ガラクトフラノシル−ガラクトシル−リビトール、アミロース、グリコーゲン、グルカン、スクレロタン、デキストラン、ニゲラン、プスツラン、プルラン、ラミナラン、リナケン、イヌリン、バクテリア表面多糖抗原等が挙げられる。【００１５】
更に好ましくはその構造内にグルコースを含有する２糖類が挙げられ、最適にはラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースからなる群より選ばれる１種又は２種以上の組み合わせが好ましい。特に、ラクトースが好ましい。また、別の態様としてはトレハロースが好ましい場合もある。さらに別の態様としてはマルトースが好ましい場合もあり、スクロースが好ましい態様もある。組み合わせ例では、ラクトースまたはトレハロースと、それ以外の構造内にグルコースを含有する２糖類との組み合わせが良く、例えば、ラクトースに、トレハロース、マルトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上を組み合わせた糖を添加するか、あるいは、トレハロースに、ラクトース、マルトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上を組み合わせた糖を添加するのが良い。組み合わせる場合の比率は所望の効果を発揮すれば特に限定されないが、簡便さの観点からは、片方を１としてもう一方を重量、体積量、或いはモル量の１〜１００から選ばれる整数倍用いることが好ましく、１〜１０から選ばれる整数倍用いることがより好ましく、１〜５から選ばれる整数倍用いることがさらに好ましく、１〜３から選ばれる整数倍用いることが特に好ましく、１倍或いは２倍が大変に好ましく、１倍（＝同量）が最も好ましい。
保存する際の脱リン酸化反応を抑制する物質の濃度範囲は特に規定されず、上限値としては飽和溶解濃度以下であれば何でも良い。下限値としては、0.1％以上が好ましく、0.5%以上がさらに好ましく、1%以上が特に好ましい。【００１６】
本発明におけるリン酸化補酵素の安定化としては、保存期間中にリン酸化補酵素が高い純度を維持する状態を意味する。具体的には、保存期間中にアルカリフォスファターゼ基質として必要十分な量が含まれ、かつ、バックグラウンドの上昇が低く抑えられるようにリン酸化補酵素が高い純度で維持する状態を意味する。より具体的には、例えば、リン酸化補酵素の量が70％以上であり、かつ、保存開始時のリン酸化補酵素の量に対してリン酸化されていない補酵素の増加割合が1%以下の状態が長期間維持することが挙げられ、リン酸化補酵素の量が80％以上であり、かつ、保存開始時のリン酸化補酵素の量に対してリン酸化されていない補酵素の増加割合が1%以下の状態が長期間維持することがさらに好ましい態様として挙げられる。該長期間としては、３ヶ月以上、６ヶ月以上、又は１２ヶ月以上が好ましい期間として挙げられ、中でも６ヶ月以上が特に好ましい期間として挙げられる。【００１７】
本発明のリン酸化補酵素の安定化方法は、少なくともリン酸化補酵素と脱リン酸化反応を抑制する物質を共存させることに特徴がある。リン酸化補酵素と脱リン酸化反応を抑制する物質の共存時の割合としては、リン酸化補酵素が所望の保存条件で充分に安定化され、かつ、所望の検体測定条件でリン酸化補酵素の働きを阻害しない割合であれば特に規定はされないが、例えば、リン酸化補酵素１分子に対して、脱リン酸化反応を抑制する物質が１０7分子から０．００１分子の比率が良く、好ましくは１０6分子から０．００１分子の比率が良く、最適には１０6分子から０．００２分子の比率が良い。【００１８】
また、添加剤として適当な緩衝液を用いる安定化方法が挙げられる。該緩衝液に、リン酸化補酵素を適当濃度添加すると良く、その濃度範囲は特に規定されるものではないが、下限値としては、0.1mM以上が好ましく、0.5mM以上がより好ましく、1mM以上が特に好ましい。また上限値としては、1M以下が好ましく、500mM以下がより好ましく、200mM以下が特に好ましい。緩衝液は特に規定されず、何を用いても良いが、例えば、シュウ酸緩衝液、エチレンジアミン４酢酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、アスパラギン酸緩衝液、リン酸緩衝液、アスパラギン緩衝液、グリシン緩衝液、ピルビン酸緩衝液、ピロリン酸緩衝液、マロン酸緩衝液、フタル酸緩衝液、フマル酸緩衝液、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液、フランカルボン酸緩衝液、β−アラニン緩衝液、β：β'−ジメチルグルタル酸緩衝液、ギ酸緩衝液、乳酸緩衝液、γ−アミノ酪酸緩衝液、バルビツール酸緩衝液、安息香酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ε−アミノカプロン酸緩衝液、酢酸緩衝液、プロピオン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、ピリジン緩衝液、ヒスチジン緩衝液、カコジル酸緩衝液、炭酸緩衝液、ヒドロキシイミダゾール緩衝液、グリセロールリン酸緩衝液、エチレンジアミン緩衝液、イミダゾール緩衝液、ヒ酸緩衝液、2,4,6−コリジン緩衝液、1−、2−、又は4−メチルイミダゾール緩衝液、N−エチルモルホリン緩衝液、ベロナール緩衝液、バルビタール緩衝液、2,4−ジメチルイミダゾール緩衝液、モルホリン緩衝液、N−エチルモルホリン緩衝液、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール緩衝液、2−アミノ−2−エチル−1,3−プロパンジオール緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、4−アミノピリジン緩衝液、セリン緩衝液、ホウ酸緩衝液、アンモニア緩衝液、エタノールアミン緩衝液、エフェドリン緩衝液、ヒドロキシプロリン緩衝液、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール緩衝液、ロイシン緩衝液、トリメチル緩衝液、α−アラニン緩衝液、n−プロピルアルコール緩衝液、メチルアミン緩衝液、エチルアミン緩衝液、n−ブチルアミン緩衝液、トリエチルアミン緩衝液、ジメチルアミン緩衝液、ヘキサメチレンジアミン緩衝液、ピペリジン緩衝液、p−トルエンスルホン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、ＧＴＡ緩衝液、また、Ｇｏｏｄ緩衝液として、ＭＥＳ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳＯ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＤＩＰＳＯ緩衝液、ＴＡＰＳＯ緩衝液、ＰＯＰＳＯ緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液等が挙げられ、好ましくはクエン酸緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、1−、2−、又は4−メチルイミダゾール緩衝液、ベロナール緩衝液、バルビタール緩衝液、2,4−ジメチルイミダゾール緩衝液、２−アミノ−2−エチル−1,3−プロパンジオール緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリエチルアミン緩衝液、ジメチルアミン緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液殻選ばれる、１種または２種以上の組み合わせが良く、最適には、クエン酸緩衝液、またはジエタノールアミン緩衝液が好ましい。緩衝液のｐHは還元型のリン酸化補酵素の場合、中性からアルカリが良く、好ましくはｐH7から12が良く、最適にはｐH7.5から11が良い。また、酸化型のリン酸化補酵素の場合は中性から酸性が良く、好ましくはｐH2からｐH7.5が良く、最適にはｐH3から7が良い。【００１９】
本発明の安定化方法に、さらに一般的な保存性を向上させる目的でアジ化ナトリウムやプロクリンなどの防腐剤を添加する方法も好適な方法として挙げられる。これら溶液を乾燥させることにより、乾燥した保存用組成物を得る方法が挙げられる。
本発明のリン酸化補酵素の安定化組成物としては、前記の安定化方法に従って、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質、及びリン酸化補酵素を含有する組成物とした調製したものであればよい。該組成物に、さらに前記緩衝液、前記防腐剤等を含有させた組成物も好ましい。該組成物は液状であっても乾燥状であってもよいが、乾燥状が好ましい。乾燥状組成物は、乾燥品を混合して得てもよいが、一度溶液状に調製した後、これを乾燥させたものが好ましい。乾燥方法は特に規定されるものではないが、例えば凍結乾燥、風乾、加熱乾燥、減圧乾燥等が挙げられ、好ましくは凍結乾燥、風乾が挙げられ、特に好ましくは風乾が挙げられる。乾燥時の温度はリン酸化補酵素が分解しない条件下であれば特に規定されず、−80℃から100℃であれば良く、好ましくは−50℃から80℃が良く、最適には、−50℃から70℃が良い。また、乾燥時間は、乾燥条件に応じて、水分の乾燥度合いを指標として適宜設定すればよい。水分の乾燥度合いの指標としては、その含水量が低ければ低いほど良いが、好ましくは10%以下であるのが良く、さらに好ましくは5%以下が良く、最適には3%以下が良く、1%以下が大変に好ましい。【００２０】
本発明の安定化組成物の保存温度は目的に応じて設定すれば特に規定されるものではないが、上限温度としては、50℃以下が好ましく、40℃以下がより好ましく、37℃以下がさらに好ましく、32℃以下が特に好ましく、30℃以下が最も好ましい。下限温度としては、特別な規定は不要であるが、実用上の観点からは−20℃以上が好ましく、−10℃以上がより好ましく、0℃以上がさらに好ましく、4℃以上が特に好ましく、10℃以上が最も好ましい。本願発明の安定化方法の特徴としては、常温、例えば、−20℃以上40℃以下、4℃以上37℃以下、10℃以上32℃以下の範囲で安定に保存できる点に特徴がある。【００２１】
このように常温にて長期保存可能な補酵素を用いることで初めて、同様に常温にて長期保存可能な高感度なALP活性測定法を提供することが可能となる。ALP活性測定法としては、例えば、緩衝液中に溶解した、１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアフォラーゼ、コール酸、ニトロブルーテトラゾリウムを含む反応液にて、乾燥状態で保存させておいたNADPを再溶解させて、その反応液に測定したいALPを添加し、一定時間室温もしくは37℃でインキュベートする。溶液中に増加する色素量を、単位時間あたりの増加量や、蓄積した絶対量を分光光度計で測定したり、目視にて判定すると良い。このようなALP活性測定の利用法としては、前述のごとく、あらゆる検査分野において、検出試薬や該検出試薬を含んでなる検出キット等で汎用できる。ほんの一例として挙げるならば、室温保存可能な大腸菌Ｏ１５７の検出試薬等が挙げられる。さらにはキットとしては、試薬として室温保存可能な、Ｏ１５７遺伝子プローブ固定化プレート、検体抽出液、ジゴキシゲニン標識核酸、抗ジゴキシゲンALP標識抗体、洗浄液、ALP検出用NADP乾燥品、ALP検出用酵素乾燥品、ALP検出試薬溶解液からなるキットが挙げられる。【００２２】
方法を簡単に述べると、大腸菌Ｏ１５７遺伝子を検出するためのプローブ核酸をプラスチックプレートに予め固定化しておいたＯ１５７遺伝子プローブ固定化プレートに、サンプルである大腸菌Ｏ１５７から核酸を検体抽出液にて得、これをプレートへ分注して一定時間室温か37℃でインキュベートする。プレートを洗浄液で、洗浄し、次に大腸菌Ｏ１５７遺伝子に相補的な配列でかつプレート固相上のプローブとは異なる領域の、ジゴキシゲニン標識核酸を添加し、一定時間室温か37℃でインキュベートする。プレートを洗浄し、抗ジゴキシゲンALP標識抗体を添加し、室温か37℃で一定時間インキュベートする。プレート洗浄後、固相上に形成した抗ジゴキシゲンALP標識抗体−ジゴキシゲニン−核酸複合体を検出するために、１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアフォラーゼ、コール酸、ニトロブルーテトラゾリウムを含むALP検出用酵素乾燥品と、ALP検出用NADP乾燥品をALP検出試薬溶解液にて再溶解させたALP検出用反応液を一定量プレートに添加し、室温か37℃で一定時間インキュベートする。プレート上で発色したフォルマザン色素の量をプレートリーダーなどの光学機器で読み取るか、目視で判定し、サンプル中の大腸菌Ｏ１５７の存在を確認する。存在する場合はＯ１５７遺伝子に裏付けられたALP活性により強度に発色し、逆に存在しない場合は、発色はしないか、極めて小さなものとなる。【００２３】
さらには、リン酸化補酵素を長期安定化するために脱リン酸化反応を抑制する物質を使用すること、少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制するためにグルコースを構成成分として含有する多糖類を使用すること、及び少なくともリン酸化補酵素の脱リン酸化反応を抑制する物質を用いた、リン酸化補酵素の長期安定な保存方法も本発明の範囲内である。【００２４】
このように安定化された本発明の補酵素を、酵素サイクリング法を用いた簡易型免疫測定装置に適用でき、該簡易型免疫測定装置も本発明の範囲内である。簡易型免疫測定装置の原理としてはイムノクロマト法やフロースルー法が挙げられるがフロースルー法が好ましい。簡易型免疫測定装置としては、例えばフロースルー法を例に取ると予め測定対象となる物質と結合能力を持つ抗体などを膜上に固定化し、その膜を吸水能力のある材料の上に載せておき、測定対象物質を膜上に捕捉するために、例えば、測定対象物との結合能を持つ別の酵素標識抗体と測定対象物質を予め反応させておいた液を膜上に滴下して抗原抗体反応を行わせるか、あるいは、測定対象物質を含有する溶液滴下し、続いて、液が吸水されて膜状の液が実質的になくなった後、酵素標識抗体液を滴下して行う。次に、液が膜状から実質的になくなった後、洗浄操作として洗浄液の滴下を行い、さらに同様に膜上の洗浄液がなくなった後、酵素基質溶液を添加する。膜上に形成された複合体に含まれる酵素と酵素基質が反応し、膜上に色素の形成を確認するのが一般的である。
このとき、膜上に酵素標識抗体を含む複合体を効率よく形成させるために、酵素標識抗体液が膜との接触時間は長いほど良く、一方洗浄液や酵素基質液は操作性の観点から、より短い時間にて膜を透過するのが望ましい。そのため、測定対象物質、酵素標識抗体は一定の時間をおいて添加し、洗浄液、酵素基質液等は余り時間をおかずに順に添加する方法が普通で、この方法は操作性の観点から問題があった。【００２５】
本発明においては、このように時間間隔を置いた複数の操作を改善する方法として、簡易型免疫測定装置へ複数の液を実質的に同時に添加し、装置内部に組み込まれた自動送液装置によって膜上へ順に液が添加されるようにするものである。特に、酵素標識抗体と酵素基質液が膜上で混合されると、測定対象物質の存在の有無に関わらずに発色し、非特異的なバックグラウンドになることから、これを避けるために、両者の接触を極力避けるようにする自動送液装置を組み込んだ簡易型免疫測定装置を発明したものである。酵素標識抗体液と酵素基質液を同時に装置へ添加すると、酵素標識抗体液が最初に一定時間かけて膜を透過し、実質的に透過が終了した後で酵素基質液が添加されるように時間差を設ける自動送液装置であり、時間差を設けることができれば何でも用いることができるが、例えば、酵素基質液が添加されたとき、膜に液が到達する前に水溶性フィルターなどで液を遮蔽しておき、水溶性フィルターが溶解する一定時間の後酵素基質液が膜へ添加される方法がある。【００２６】
水溶性フィルターとは、酵素基質液が水溶性フィルターを溶解させて一定時間は液が流れず、ある時点で流れ出すもので、実質的に酵素反応に影響を及ぼさなければ何でも用いることができ、例えば、水溶性の性質を持つフィルム状のフィルターが良い。
水溶性の性質を持つフィルム状のものとしてはポリビニルアルコール膜、プルラン膜、ヒドロキシプロピルセルロース膜などが挙げられ、好ましくはポリビニルアルコール膜が良い。これら水溶性フィルターを筒状の酵素基質溶液添加槽下部に設け、酵素基質溶液が添加されると、水溶性フィルターを溶解させながら、一定時間は液が流れず、その後に液が流れ出す。液の流れない時間は１０秒から１０分の間が良く、好ましくは３０秒から５分の間が望ましい。【００２７】
また、本発明における自動送液装置にはサイフォンを用いる方法が挙げられる。本発明におけるサイフォンとは、酵素基質溶液添加槽下部に開口部を持つ管であって、管は開口部から上方へ伸び、後再び下方へ降り、管のもう一方の開口部が確認窓へ通ずる部位にある構造を有し、酵素基質溶液添加槽下部と上端との間に酵素基質液の流速調整用フィルターを備えたものであれば良い。サイフォン構造をもつ酵素基質溶液添加槽に酵素基質液を添加すると、流速調整用フィルターによって液が酵素基質溶液添加槽下部へ徐々に貯留され、貯留量が増大するに従いその液面の高さに合わせて、管に液が満たされる。やがて管の最も高い位置よりも貯留した液の水面が高くなると、貯留していた液が管を通って一気に確認窓へと流れる。従って、酵素基質溶液添加槽へ酵素基質溶液が添加されると、一定時間は液が流れず、その後に一気に液が流れ出す。流速調整用フィルターは、酵素基質を酵素基質溶液添加槽へ添加した後で添加槽下部へ緩和に流れ出すものであれば何でも使うことができ、濾紙に水溶性物質を乾燥させたものが望ましい。濾紙の材質は水溶性物質が再溶解した後に液が透過する能力があれば何でも用いることができ、例えば、紙、ガラス、ポリエステル、ポリスチレン、ナイロンが挙げられるが、好ましくは紙またはガラスが良い。水溶性物質としては、糖、タンパク質、合成ポリマーなどが挙げられ、糖としては、デキストラン、プルラン、寒天などの高分子多糖、やスクロース、ラクトース、マルトース等の２糖類やグルコースやガラクトースなどの単糖類が挙げられ、好ましくは高分子多糖が好ましく、より好ましくはデキストランが好ましい。タンパク質としては、アルブミンやグロブリンなどが挙げられ、合成ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。液の流速は水溶性物質の乾燥時の濃度で適宜調整すると良く、液の流れない時間は１０秒から１０分の間が良く、好ましくは３０秒から５分の間が望ましい。
これらを用いることで、酵素基質液が確認窓へ添加される前に洗浄液を同様に添加することも簡単であるが、必ずしも必要ではなく、測定対象物質が存在しないときに認められるバックグラウンドと必要とされる感度に合わせて設定すると良いが、操作性やコストの面から洗浄液を添加しないで用いるのが好ましい。【００２８】
更に具体的に説明すると、例えばインフルエンザに感染した患者に対して、鼻腔より綿棒などにてぬぐい液を採取し、その綿棒に付着したインフルエンザ抗原を、インフルエンザ抗原抽出液を兼ねた界面活性剤、適当な緩衝液および塩類などが含まれたアルカリフォスファターゼ標識抗インフルエンザ抗体液に浮遊させ、インフルエンザ抗原浮遊液を得る。
インフルエンザ抗原浮遊液を簡易型免疫測定装置の確認窓へ適当量滴下し、間を置かずに酵素サイクリング反応液を酵素基質溶液添加槽へ添加し、数分後に確認窓にて抗原の有無を色素の沈着にて目視判定するだけでよく、インフルエンザ抗原浮遊液と酵素サイクリング反応液の添加以後、特別の操作が無くとも判定できる。【００２９】
また、インフルエンザとは別に微生物の検出としてＷＯ００／０６６０３号公報に記載される、微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体と酵素サイクリング法を組み合わせて用いることにより、特異性と検出感度に優れた、簡易型免疫測定方法もまた提供できる。リボソーム蛋白質としてはＬ７／Ｌ１２を用いるのが良い。特に高い特異性と高い結合力が要求されるマイコプラズマニューモニア、へモフィルスインフルエンザ、ストレプトコッカスニューモニア、クラミジアニューモニア、クラミジアトラコマーティス、レジオネラニューモフィラにおいて有効であり、マイコプラズマニューモニアあるいはレジオネラニューモフィラが好ましく、さらに好ましくはマイコプラズマニューモニアに対する抗体を用いるのが好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例、比較例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら制限されるものではない。
［実施例１］【００３１】
（１）補酵素の保存
5%ラクトースを含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）中に、補酵素としてNADP（オリエンタル酵母社製）を1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液を調製した。またコントロールとして、20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）中に、NADPを1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液を調製し、合計５種類の溶液を調製した。この溶液をマイクロチューブ中にて20μlずつ分注し、30℃湿度15%の条件下で5時間乾燥させた。乾燥後、マイクロチューブごと、乾燥剤を入れたアルミ袋にて、4℃、25℃、32℃、37℃、42℃にて保存した。【００３２】
（２）バックグラウンドの測定
酵素サイクリング反応液として、100mMジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、0.0125％ニトロブルーテトラゾリウム、1mMコール酸、50mM塩化ナトリウム、1mM塩化マグネシウム、Bacillus megaterium由来ジアフォラーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）6.6U/mlを含む溶液を調製した。この溶液1mlをNADPが乾燥保存されていたマイクロチューブに添加し、NADPを攪拌して再溶解させた。再溶解させたNADPを含むサイクリング反応液500μlを試験管中にて37℃3分間加温し、10mM PIPES (pH8.5)に溶解した1777.6U/mlのBacillus sphaericus由来１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）を5μl添加して37℃５分間反応させた。0.5%のドデシル硫酸ナトリウム溶液を250μl添加して反応を停止させ、反応液を550nmの吸光度を測定した。【００３３】
（３）アルカリフォスファターゼ活性の測定
（２）にて再溶解させたNADPを含むサイクリング反応液500μlを試験管中にて37℃３分間加温し、10mM PIPES (pH8.5)に溶解した1777.6U/mlのBacillus sphaericus由来１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）を5μlと50mU/mlの小牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（ロシュ社製）5μlを同時に添加して37℃5分間反応させた。0.5%のドデシル硫酸ナトリウム溶液を250μl添加して反応を停止させ、反応液の550nmの吸光度を測定した。得られた測定値からそれぞれの実験条件で得られた（２）でのバックグランドの値を差し引き、アルカリフォスファターゼ反応によって得られた活性値とした。【００３４】
（４）NADP量の測定
乾燥させて保存したNADPに、10mMのPIPES（ｐＨ８）1mlを添加して再溶解させ、このうちの一部をとり蒸留水にて１０倍希釈した。（２）で調製した酵素サイクリング反応液に小牛小腸由来のアルカリフォスファターゼを8U/mlとなるように調製した溶液1mlに、先に調製しておいた希釈したNADPの再溶解液20μlを添加し37℃５分間反応させた。0.5%のドデシル硫酸ナトリウム溶液を250μl添加して反応を停止させ、反応液を550nmの吸光度を測定し、NADPの保存開始時の測定値を100%として、残存%を計算した。【００３５】
その結果、表１−１および表１−２に示すようにラクトースの添加によって、３ヶ月保存後のバックグラウンドが実験コントロールに比べて低減でき、かつALP活性を測定できた。また、表１−３に示すようにNADPの残存量も実験コントロールに比べて保持されていた。【００３６】
【表１−１】
0004986281.tif 000002
【００３７】
【表１−２】
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【００３８】
【表１−３】
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【００３９】
［実施例２］
実施例１記載の5%ラクトースの代わりに10%トレハロース、10%マルトース、10%スクロースをそれぞれ含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）中に、補酵素としてNADP（オリエンタル酵母社製）を1.25ｍＭとなるように溶解させて調製した溶液３種を調製し、同様に実験した。【００４０】
その結果、表２−１から表２−３に示すように、10%トレハロース、10%マルトース、10%スクロースのいずれの条件も実験コントロールに比較して良好な安定性を示した。【００４１】
【表２−１】
0004986281.tif 000005
【００４２】
【表２−２】
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【００４３】
【表２−３】
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【００４４】
［実施例３］
実施例１記載の5%ラクトースの代わりに、0.1%、1%、5%、10%、30%、60%の濃度で調製したトレハロースをそれぞれ含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）中に、補酵素としてNADP（オリエンタル酵母社製）を1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液６種を調製し、同様に実験した。
その結果、表３−１から表３−３に示すように、トレハロースの濃度が0.1％から60%の間において、実験コントロールと比較して良好な安定性が得られた。【００４５】
【表３−１】
0004986281.tif 000008
【００４６】
【表３−２】
0004986281.tif 000009
【００４７】
【表３−３】
0004986281.tif 000010
【００４８】
［実施例４］
実施例１記載の5%ラクトースの代わりに、0.1%、0.5%、1%、5%、15%の濃度で調製したラクトースをそれぞれ含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）中に、補酵素としてNADP（オリエンタル酵母社製）を1.25mMとなるように溶解させて調製した溶液5種を調製し、同様に実験した。
その結果、表４−１から表４−３に示すように、ラクトースの濃度が、0.1％から15%の間において、実験コントロールと比較して良好な安定性が得られた。【００４９】
【表４−１】
0004986281.tif 000011
【００５０】
【表４−２】
0004986281.tif 000012
【００５１】
【表４−３】
0004986281.tif 000013
【００５２】
［実施例５］
実施例１記載の5%ラクトースの代わりに、条件１：10%ラクトースと20%トレハロース、条件２：10%ラクトースと20%マルトース、条件３：20%トレハロースと20%マルトース、条件４：10%ラクトースと20%トレハロースと20%マルトース、をそれぞれ含有する20mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）中に、補酵素としてNADP（オリエンタル酵母社製）を1.25ｍＭとなるように溶解させて調製した溶液４種を調製し、同様に実験した。
その結果、表５−１から表５−３に示すように、いずれの組み合わせ条件においても、実験コントロールと比較して良好な安定性が得られた。【００５３】
【表５−１】
0004986281.tif 000014
【００５４】
【表５−２】
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【００５５】
【表５−３】
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【００５６】
［実施例６］
実施例１記載の５％ラクトース、実施例2記載の１０トレハロースをそれぞれ含有する20mＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐH６．５）中に、補酵素としてNADP（オリエンタル酵母社製）を1.25mＭとなるように溶解させて調製した溶液を2種調製し、この溶液をμチューブ中にて20μlずつ分注し、30℃湿度15％の条件下で5時間乾燥させた。乾燥後、マイクロチューブごと、乾燥剤を入れたアルミ袋にて、4℃、25℃、35℃にて6ヶ月間保管した後のバックグラウンド、ALP活性、及びNADP残存量を測定した。
その結果、表６−１から表６−３に示すように、5％ラクトース、１０％トレハロースともにいずれの条件も実験コントロールに比較して良好な安定性を示した。【００５７】
【表６−１】
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【００５８】
【表６−２】
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【００５９】
【表６−３】
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【００６０】
［実施例７］
抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクロナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）２種類のうち１種類を25mm  ×  30mmのニトロセルロース膜（ワットマン社製）に２mg/mlの抗
体溶液1μlをスポットし、42℃３０分乾燥させた。乾燥させたニトロセルロース膜を吸水パッド上にのせ、スポット部が蓋に予め開口させておいた確認窓と一致するように上蓋をした。図１に示すポリビニルアルコールを材質とした水溶性フィルターＫＣ４０（アイセロ化学社製）を酵素基質溶液添加槽の下部に取り付け、酵素基質注入口を簡易免疫測定装置の上蓋開口部に取り付け簡易免疫測定装置を作成した。
抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクロナル抗体の別の１種類0.15mgを市販のアルカリフォスファターゼ標識キットにて標識し、抗Ａ型インフルエンザウイルス酵素標識抗体を得た。この標識抗体を、2％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH7.5）にて４０００倍希釈し、酵素標識抗体希釈液を調製した。
Ａ型インフルエンザウイルス抗原Ｈ３Ｎ２型0.75mg/ml（ＨｙＴｅｓｔ社製）を0.2％ＢＳＡ、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳにて0.1μg/mlとなるように希釈し、この５０μＬを綿棒に染み込ませて模擬的な検体とした。実験対照として希釈液50μＬを染み込ませた綿棒を用いた。【００６１】
インフルエンザ抗原が染み込んだ綿棒を酵素標識抗体希釈液0.2ｍＬに入れ、良く攪拌した後、先に作成した簡易免疫測定装置の確認窓へ全量を添加した。間を置かず、実施例１の酵素サイクリング反応液500μＬを酵素基質溶液添加槽へ添加した。添加１０分後、ニトロセルロースメンブラン上に青い色素の有無を目視にて確認した。
結果
目視判定
Ｈ３Ｎ２抗原添加          ＋
実験対照                  −
以上のとおり、インフルエンザ抗原を添加した場合にのみ陽性と判定され、図１に示す簡易免疫測定装置を用いて簡便に検査できることが実証された。【００６２】
［実施例８］
実施例６に従い、抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクロナル抗体をニトロセルロースメンブランへ固定化し上蓋をした。酵素基質溶液添加槽として、図２に示すサイフォン構造の上流部に、40％スクロース溶液を染み込ませて乾燥させた濾紙を取り付け、酵素基質注入口を簡易免疫測定装置の上蓋開口部に取り付け簡易免疫測定装置を作成した。以後の操作を実施例６と同様に行い、ニトロセルロースメンブラン上に青い色素の有無を目視にて確認した。
結果
目視判定
Ｈ３Ｎ２抗原添加          ＋
実験対照                  −
以上のとおり、インフルエンザ抗原を添加した場合にのみ陽性と判定され、図２に示    す簡易免疫測定装置を用いて簡便に検査できることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、リン酸化補酵素を特に室温付近で安定化させる方法を提供し、臨床診断、食品検査、生体成分検査等の分野において好適に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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