(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトIgG2重鎖の定常領域において、KabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFからYへの置換、309番目のVからLへの置換および339番目のTからAへの置換から選ばれる少なくとも1つの置換を有するIgG重鎖。
【請求項２】
重鎖定常領域にKabatらによるEUインデックスにより示される331番目のPのSへの置換を含む、請求項１に記載のIgG重鎖。
【請求項３】
請求項１または２に記載のIgG重鎖を含む、モノクローナル抗体。
【請求項４】
ハイブリドーマKM341-1-19（受託番号FERM BP-7759）が産生するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のIgG重鎖。
【請求項５】
請求項４に記載のIgG重鎖およびハイブリドーマKM341-1-19（受託番号FERM BP-7759）が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の21番目から148番目のアミノ酸配列を含むIgG重鎖の可変領域を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載のIgG重鎖。
【請求項７】
請求項６に記載のIgG重鎖および配列番号４で示されるアミノ酸配列の21番目から124番目のアミノ酸配列を含むIgG軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
【請求項８】
配列番号３１で示されるポリペプチドの21番目から474番目のアミノ酸配列からなる請求項２に記載のIgG重鎖。
【請求項９】
請求項８に記載のIgG重鎖および配列番号３３で示されるポリペプチドの21番目から231番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を含むモノクローナル抗体。
【請求項１０】
配列番号３０で示されるポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主から産生される請求項４に記載のIgG重鎖。
【請求項１４】
請求項１３に記載のIgG重鎖及び配列番号３２で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生されるモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
【請求項１５】
ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFからYへの置換、309番目のVからLへの置換および339番目のTからAへの置換から選ばれる少なくとも1つの置換を行なう工程を含む、IgG重鎖の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製造方法を含むモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１７】
配列番号３０で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からIgG重鎖を取得する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。
【請求項１８】
配列番号３０で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号３２で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１９】
配列番号３４で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からIgG重鎖を取得する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。
【請求項２０】
配列番号３４で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号３６で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項２１】
請求項３に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項２２】
ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFからYへの置換、309番目のVからLへの置換および339番目のTからAへの置換から選ばれる少なくとも1つの置換を行なうことを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
【請求項２３】
請求項５、７、９および１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトIgG2およびIgG3重鎖の定常領域に変異を導入することにより得られた、安定性が改善されたIgG2およびIgG3抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、すべての哺乳動物の血清や組織体液中に存在する糖蛋白質で、外来抗原を認識する働きをもっている。抗体の抗原への結合により、補体系の活性化や、細胞表面に存在するFc レセプター（FcR）を介し、細胞の食作用、抗体依存性細胞障害作用、メディエーターの遊離、抗原提示作用の亢進など、エフェクター機能の活性化を介して、生体防御にかかわっている。【０００３】
ヒトの免疫グロブリンには、IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEからなる５つの異なったクラスが存在する。IgGはさらにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる４つのサブクラス、またIgAはさらにIgA1およびIgA2からなる２つのサブクラスに分類することができる。免疫グロブリンの基本構造は、２本の相同な軽鎖（L鎖）と、２本の相同な重鎖（H鎖）から成り立っている。免疫グロブリンのクラスとサブクラスはH鎖によって決定される。【０００４】
それぞれの免疫グロブリンは異なった機能をもつことが解っている。たとえば、補体結合能は、IgM>IgG3>IgG1>IgG2の順で高く、FcレセプターIへの親和性は、IgG3>IgG1>IgG4>IgG2の順で高い。またプロテインAに対して、IgG1、IgG2およびIgG4が結合することが可能である。【０００５】
ヒト抗体は、血液から採取精製されたものが医薬品として使用されているが、近年数多くのモノクローナル抗体に関して臨床試験が実施されており、上市されているものも数多くある。しかし、医薬品用途で上市または臨床開発されているモノクローナル抗体の多くはIgG1サブクラスのものでIgG2、IgG3サブクラスのものはほとんどない。IgG２は補体の活性化において、副経路を活性化できる唯一のIgGであり、インフルエンザなどの感染症との関連が報告されている。IgG2はまた、抗体依存性細胞障害作用がほとんどないことが知られている。一方、IgG3は、抗体依存性補体活性化能、抗体依存性細胞障害作用が非常に強いことが知られている。このような特徴を生かすことにより、新しい活性をもつ抗体医薬品の開発が期待できる。【０００６】
しかし、IgG2、IgG3に関しては、ほとんど医薬品として開発された経験がないために、その製造技術に関して、不確定な部分が多い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本件発明は、ヒトIgG2およびIgG3抗体の、安定性の高い変異体を作製することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、IgG2およびIgG3抗体が低pHにおいて不安定性であること、具体的には低pHにおいて凝集体を作りやすいことを見出した。【０００９】
一般的に、抗体を医薬品として製造する際に、プロテインAを用いて、アフィニティー精製する方法が用いられる。このとき、プロテインAに結合した抗体を溶出するために、低pHの緩衝液を用いる場合が多い。また、ウイルス除去のためにも、一定時間、低pHで処理することが望ましい。この際に生成する凝集体が医薬品に混入することによって、インフユージョンリアクション、補体の活性化あるいは抗体依存性細胞障害作用が亢進することが報告されており、それらが副作用につながることが容易に推定される。このため、凝集体の量をできるだけ低くすることは、非常に重要となる。【００１０】
そこで、IgG2およびIgG3抗体の重鎖定常領域の一部のアミノ酸構造をかえることにより、低pHにおける凝集体生成を抑制できることを見出した。【００１１】
本件発明における、ヒトIgG2およびIgG3抗体の改変についての基本的な考えかたを下記に詳述する。本発明の安定化されたヒトIgG2抗体は、その重鎖定常領域において、少なくともKabatらによるEUインデックス（Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition）により示される300番目のFがYに置換（アルファベットはアミノ酸の一文字表記。数字はKabatらによるEUインデックス、以下同様。）、309番目のVがLに置換または339番目のTがAに置換されている。好ましくは、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFがYに、および309番目のVがLに置換されている。また好ましくは、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFがYに、および339番目のTがAに置換されている。また好ましくは、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される309番目のVがLに、および339番目のTがAに置換されている。更に好ましくは、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFがYに、309番目のVがLに、および339番目のTがAに置換されている。【００１２】
また、本発明の安定化されたヒトIgG2抗体は、その重鎖定常領域において、少なくともCH2ドメインがIgG1重鎖のCH2ドメインに置換されている。例えばCH2ドメインがIgG1重鎖のCH2ドメインに、あるいはCH2およびCH3ドメインがIgG1重鎖のCH2およびCH3ドメインに置換されている。【００１３】
さらに、D270、K322、P329、P331をAに置換するか、あるいは、P331をSやGに変換することによって（アルファベットはアミノ酸の一文字表記。数字はKabatらによるEUインデックス（Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition）を示す）、安定性を改善し、かつCDC活性を低減させることができる。【００１４】
また、さらにL235をE、G237をAに置換することにより、安定性を改善し、かつADCC活性を低減させることができる。また、上記とは逆に、CDC活性および/またはADCC活性を増強させるための変異も適宜導入できる。【００１５】
本発明の安定化されたヒトIgG3抗体は、その重鎖定常領域において、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される392番目のNがKに置換または397番目のMがVに置換されている。好ましくは、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される392番目のNがKに、および397番目のMがVに置換されている。【００１６】
また、好ましくは、上述の392番目および／または397番目の置換に対して、更にKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFがYに置換されている。【００１７】
また、好ましくは、上述の392番目、397番目および300番目の置換に関して、更にKabatらによるEUインデックスにより示される435番目のRがHに置換されている。例えば、上記の392および435番目が置換されているか、397および435番目が置換されているか、392、397および435番目が置換されているか、392、300および435番目が置換されているか、397、300および435番目が置換されているか、あるいは392、397、300および435番目が置換されている。435番目のRのHへの置換は、ヒトIｇG3抗体のProteinAによる精製を可能とすることを目的としている（Ito S et. al., Exp Clin Immunogenet. 1990, 7(2):91-100.）。【００１８】
また、本発明の安定化されたヒトIgG3抗体は、その重鎖定常領域において、少なくともCH3ドメインがIgG1重鎖のCH3ドメインに置換されている。例えばCH3ドメインがIgG1重鎖のCH3ドメインに、あるいはCH2およびCH3ドメインがIgG1重鎖のCH2およびCH3ドメインに置換されている。【００１９】
さらに、上述の置換に対して、CDC活性および／またはADCC活性を低減または増強させるための変異をIgG3重鎖の定常領域に導入することができる。【００２０】
また、本発明は、上述置換を含む抗体の製造方法、あるいは上記置換を含む抗体の凝集抑制方法、あるいは上述の抗体を含有する組成物である。【００２１】
すなわち、本発明は以下の通りである。【００２２】
[１]  ヒトIgG2重鎖の定常領域において、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFがYに置換されているIgG重鎖。【００２３】
[２]  ヒトIgG2重鎖の定常領域において、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される309番目のVがLに置換されているIgG重鎖。【００２４】
[３]  ヒトIgG2重鎖の定常領域において、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される339番目のTがAに置換されているIgG重鎖。【００２５】
[４]  重鎖定常領域のアミノ酸の置換が、KabatらによるEUインデックスにより示される331番目のPのSへの置換を含む、[１]〜[３]のいずれかのIgG重鎖。【００２６】
[５]  [１]〜[４]のいずれかのIgG重鎖を含む、モノクローナル抗体。【００２７】
[６]  ハイブリドーマKM341-1-19（受託番号FERM BP-7759）が産生するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域を有する[１]〜[４]のいずれかのIgG重鎖。【００２８】
[７]  [６]のIgG重鎖およびハイブリドーマKM341-1-19（受託番号FERM BP-7759）が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。【００２９】
[８]  配列番号２で示されるIgG重鎖の可変領域を有する[１]〜[４]のいずれかのIgG重鎖。【００３０】
[９]  [８]のIgG重鎖および配列番号４で示されるIgG軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。【００３１】
[１０]  配列番号３１で示されるポリペプチドからシグナル配列が除かれた部分からなる[４]のIgG重鎖。【００３２】
[１１]  [１０]のIgG重鎖および配列番号３３で示されるポリペプチドからシグナル配列が除かれた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。【００３３】
[１２]  配列番号３０で示されるポリヌクレオチド。【００３４】
[１３]  [１２]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。【００３５】
[１４]  [１３]の発現ベクターを含む宿主。【００３６】
[１５]  [１４]の宿主から産生される[４]のIgG重鎖。【００３７】
[１６]  [１５]のIgG重鎖及び配列番号３２で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生されるモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。【００３８】
[１７]  ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFをYに置換する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。【００３９】
[１８]  ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される309番目のVをLに置換する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。【００４０】
[１９]  ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される339番目のTをAに置換する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。【００４１】
[２０]  [１７]〜[１９]のいずれかのモノクローナル抗体の製造方法を含む製造方法。【００４２】
[２１]  配列番号３０で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。【００４３】
[２２]  配列番号３０で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号３２で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。【００４４】
[２３]  配列番号３４で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からIgG重鎖を取得する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。【００４５】
[２４]  配列番号３４で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号３６で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。【００４６】
[２５]  [５]のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。【００４７】
[２６]  ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFをYに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。【００４８】
[２７]  ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される309番目のVをLに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。【００４９】
[２８]  ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される339番目のTをAに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。【００５０】
[２９]  [７]、[９]、[１１]および[１６]のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含む医薬組成物。【００５１】
[３０]  腫瘍、病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる[２９]の医薬組成物。【００５２】
[３１]  [７]、[９]、[１１]および[１６]のいずれかのモノクローナル抗体を含む組成物。【００５３】
[３２]  ヒトIgG3重鎖の定常領域において、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される397番目のMがVに置換されているIgG重鎖。【００５４】
[３３]  [３２]のIgG重鎖を含む、モノクローナル抗体。【００５５】
[３４]  ヒトIgG3重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される392番目のNをKに置換する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。【００５６】
[３５]  ヒトIgG3重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される397番目のMをVに置換する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。【００５７】
[３６]  [３４]または[３５]のモノクローナル抗体の製造方法を含む製造方法。【００５８】
[３７]  [３３]のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。【００５９】
[３８]  ヒトIgG3重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される392番目のNをKに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。【００６０】
[３９]  ヒトIgG3重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される397番目のMをVに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。【００６１】
[４０]  [３３]、[３６]および[３７]のいずれかのモノクローナル抗体を含む組成物。【００６２】
さらに、本発明は以下の態様を含む。【００６３】
[４１]  ハイブリドーマ2105（受託番号BP-8024）が産生するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域を有する[１]〜[４]のいずれかのIgG重鎖。【００６４】
[４２]  [４１]のIgG重鎖およびハイブリドーマ2105（受託番号BP-8024）が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。【００６５】
[４３]  配列番号６で示されるIgG重鎖の可変領域を有する[１]〜[４]のいずれかのIgG重鎖。【００６６】
[４４]  [４３]のIgG重鎖および配列番号８で示されるIgG軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。【００６７】
[４５]  配列番号３５で示されるポリペプチドからシグナル配列が除かれた部分からなる[４]のIgG重鎖。【００６８】
[４６]  [４５]のIgG重鎖および配列番号３７で示されるポリペプチドからシグナル配列が除かれた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。【００６９】
[４７]  配列番号３４で示されるポリヌクレオチド。【００７０】
[４８]  [４７]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。【００７１】
[４９]  [４８]の発現ベクターを含む宿主。【００７２】
[５０]  [４９]に記載の宿主から産生される[４]のIgG重鎖。【００７３】
[５１]  [５０]のIgG重鎖及び配列番号３６で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生されるモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。【００７４】
[５２]  [４２]、[４４]、[４６]および[５１]のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含む医薬組成物。【００７５】
[５３]  腫瘍、病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる[５２]の医薬組成物。【００７６】
[５４]  [４２]、[４４]、[４６]および[５１]のいずれかのモノクローナル抗体を含む組成物。
【発明の効果】
【００７７】
IgG2重鎖のアミノ酸配列において、300番目のFをYへ、309番目のVをLへ、または339番目のTをAへ置き換えることによって安定性を改善した本発明の抗体は、抗原に対する結合性を保持しつつ、凝集体形成、特に低pHにおける凝集体形成が低減されているという特徴を備えている。従って、本発明の抗体は医薬品として安定的に製造することができる。さらに、被験体に投与した場合、抗体の凝集体の混入によって引き起こされる副作用を回避することが容易になり、安全に用いることができる。【００７８】
IgG3重鎖のアミノ酸配列において、392番目のNをKへ、397番目のMをVへ、または300番目のFをYへ置き換えることによって安定性を改善した本発明の抗体は、抗原に対する結合性を保持しつつ、凝集体形成、特に低pHにおける凝集体形成が低減されているという特徴を備えている。従って、本発明の抗体は医薬品として安定的に製造することができる。さらに、被験体に投与した場合、抗体の凝集体の混入によって引き起こされる副作用を回避することが容易になり、安全に用いることができる。【００７９】
さらに、上記の安定性の改善に加えて331番目のプロリンのセリンへの置換等によって、ADCCおよび/またはCDCが低減された抗体を得ることができ、被検体に投与した場合、ADCCおよび/またはCDCにより引き起こされる副作用を回避することができ、さらに医薬品として安全に用いることができる。【００８０】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-005794号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】抗CD40抗体KM341-1-19の変異体のRamos細胞に対する結合活性（Ramos細胞結合活性）を示す図である。
【図１Ｂ】抗CD40抗体KM341-1-19の変異体のRamos細胞に対する結合活性（Ramos細胞結合活性）を示す図である。
【図１Ｃ】抗CD40抗体KM341-1-19および2105の変異体のRamos細胞に対する結合活性（Ramos細胞結合活性）を示す図である。
【図２Ａ】Ramos細胞における抗CD40抗体KM341-1-19の変異体によるCD95発現促進（Ramos細胞におけるCD95発現誘導活性）を示す図である。
【図２Ｂ】Ramos細胞における抗CD40抗体KM341-1-19の変異体によるCD95発現促進（Ramos細胞におけるCD95発現誘導活性）を示す図である。
【図２Ｃ】Ramos細胞における抗CD40抗体KM341-1-19および2105の変異体によるCD95発現促進（Ramos細胞におけるCD95発現誘導活性）を示す図である。
【図３】抗CD40抗体4D11の変異体のRamos細胞に対する結合活性（Ramos細胞結合活性）を示す図である。
【図４】Ramos細胞における抗CD40抗体4D11の変異体によるCD95発現抑制（アンタゴニスト活性評価）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
１．  IgG2抗体およびIgG3抗体の安定性の改善および物性の改善
IgG重鎖は、抗原への結合特異性を決定する可変領域および抗体のエフェクター機能発現に関与する定常領域の２つの領域からなる。可変領域は、それを構成する遺伝子の組換えと体細胞変異の導入により、抗原結合部位の配列が構造上異なる。このことが、非常に多くの外来抗原を認識することができるという特徴をもたらす。【００８３】
また、抗体は本来外来の微生物、ウイルスや癌に対する生体防御機能をつかさどる分子であるため、抗体が結合した細胞を殺傷して取り除く作用を兼ね備えており、これをエフェクター機能と呼ぶ。この殺傷機能は２種類あり、抗体依存性細胞性細胞傷害活性（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity。以下、ADCCと略記）、及び補体依存性細胞傷害活性（Complement-Dependent Cytotoxicity。以下、CDCと略記）といわれている。ADCCは、Macrophage, NK細胞、好中球などがその表面に発現しているFcRを介して、抗体の定常領域と結合し、細胞が活性化することにより誘導される細胞障害活性のことをいう。一方、CDCは抗体が抗原と結合することによって、活性化された補体系によって引き起こされる細胞障害活性のことを言う。これらの活性は、抗体のサブクラスによって、その活性の強弱が異なることが解っている（Charles A. Janeway et. al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.）。【００８４】
本発明によれば、抗原への特異的結合性を保持しつつ、IgG2およびIgG3抗体の安定性を改善することができる。具体的には、IgG2重鎖のアミノ酸配列において、300番目のFをYへ、309番目のVをLへ、または339番目のTをAへ置き換えることによって抗体の安定性を改善することができる。これらの置換を単独で有していてもよいし、組合せて有していてもよい。また、IgG2重鎖のCH2ドメインをIgG1重鎖のCH2ドメインに、あるいはIgG2重鎖のCH2およびCH3ドメインをIgG1重鎖のCH2およびCH3ドメインに置換することによって抗体の安定性を改善することができる。また、本発明によればIgG3重鎖のアミノ酸配列において、392番目のNをKへ、397番目のMをVへ、または300番目のFをYへ、置き換えることによって抗体の安定性を改善することができる。これらの置換を単独で有していてもよいし、組合せて有していてもよい。また、IgG3重鎖のCH３ドメインをIgG1重鎖のCH３ドメインに、あるいはIgG3重鎖のCH2およびCH3ドメインをIgG1重鎖のCH2およびCH3ドメインに置換することによって抗体の安定性を改善することができる。【００８５】
本発明において、あるサブクラスのドメインを他のサブクラスのドメインに置換した変異抗体をドメインスワップ変異抗体ということがある。【００８６】
本発明において、安定性を改善した抗体とは、酸性条件下すなわち低pH条件下、例えばpH４以下においても抗原への結合能が低下することなく、かつ凝集体を形成しにくい抗体をいう。または、ProteinAまたはProteinG親和カラムを用いて精製した場合、凝集体の含有量が低い抗体をいう。例えばpH3.5で10分間または60分間処理した場合に形成される凝集体の含有率が10％以下、好ましくは５％以下、さらに好ましくは１％以下である抗体をいう。凝集体の含有率は、例えば液体クロマトグラフィーにより測定することができる。【００８７】
また、本発明において物性を改善した抗体とは、安定性に加えて、ADCCおよび/またはCDCを所望の強さに調節した抗体、FcRへの結合能を所望の程度に調節した抗体をいい、ADCCおよび/またはCDCの調節、FcRへの結合能の調節は、抗体に変異を導入することにより行うことができる。【００８８】
安定性を改善した抗体に、更に適当な変異を導入することによって、ADCCおよび/またはCDCを低減または増強させることができる
たとえば、L235、D265、D270、K322、P331、P329（アルファベットはアミノ酸の一文字表記。数字はKabatらによるEUインデックス（Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition）を示す。以下同様。）は、ヒトIgGの補体活性化能に重要な役割を果たしていると考えられており、この部位を他のアミノ酸に置換することによって、CDC活性を低減できる（Esohe E. Idusogie et. al. J. Immunol. 2000, 164:4178-4184, Yuanyuan Xu et. al. J. Biol. Chem. 1994, 269:3469-3474, Brekke, O.H. et. al. Eur. J. Immunol. 1994, 24:2542, Morgan, A., et. al., Immunology 1995, 86:319, Lund, J., et. al., J. Immunol., 1996, 157:4963, Tao, M. H., et. al., J. Exp. Med. 1993, 178:661）。具体的には、D270、K322、P329、P331をAに置換することにより可能である。また、P331をSやGに変換することによっても可能である。【００８９】
また、Glu233-Ser239、Gly316-Lys338、Lys274-Arg301、Tyr407-Arg416、Asn297、Glu318、Leu234-Ser239、Asp265-Glu269、Asn297-Thr299およびAla327-Ile332はIgGとFcRの結合に関与していると考えられており（Duncan, A. R., Woof, J. M., Partridge, L. J., Burton, D. R., and Winter, G. (1988) Nature 332, 563-564、Gessner, J. E., Heiken, H., Tamm, A., and Schmidt, R. E. (1998) Ann. Hematol. 76, 231-248、Gavin, A., Hulett, M., and Hogarth, P. M. (1998) in The Immunoglobulin Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity (van de Winkel, J. G.J. , and Hogarth, P. M., eds) , pp. 11-35, Kluwer Academic Publishers Group, Dordrecht, The Netherlands、Sautes, C. (1997) in Cell-mediated Effects of Immunoglobulins (Fridman, W. H. , and Sautes, C., eds) , pp. 29-66, R. G. Landes Co., Austin, TX、Da'ron, M. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234、Canfield, S. M., and Morrison, S. L. (1991) J. Exp. Med. 173, 1483-1491、Chappel, M. S., Isenman, D. E., Everett, M., Xu, Y.-Y., Dorrington, K. J., and Klein, M. H. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 9036-9040、Woof, J. M., Partridge, L. J., Jefferis, R., and Burton, D. R. (1986) Mol. Immunol. 23, 319-330、Wines, B. D., Powell, M. S., Parren, P. W.H.I., Barnes, N., and Hogarth, P. M. (2000) J. Immunol. 164, 5313-5318）、この領域に変異を導入することにより、ADCC活性の低減が可能であると考えられる。具体的にはL235をE、G237をAに置換することにより、FcRとの結合能を低減させることが可能である。【００９０】
また、上述の逆の変異を導入することにより、安定性を改善した抗体の、ADCCおよび/またはCDCを増強することも可能である。本発明の抗体は、ADCCおよび/またはCDCを増強した抗体も包含する。【００９１】
本発明の抗体は、上記のADCCおよび／またはCDC活性の増強または低減させるアミノ酸の変異を１以上、好ましくは１〜20個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個または１もしくは２個有する。【００９２】
IgG2抗体の重鎖の300番目のFがYへ、309番目のVがLへまたは339番目のTがAへ置換された安定性を改善した抗体またはこれらの置換を組合せて有し安定性を改善した抗体には制限はないが、例えば抗CD40抗体が挙げられる。より具体的には、ハイブリドーマKM341-1-19（受託番号BP-7759）が産生する抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体あるいはハイブリドーマ2105（受託番号BP-8024）が産生する抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体が例示される。またIgG3抗体の重鎖の392番目のNがKへ、397番目MがVへ、または300番目のFがYへ置換された安定性を改善した抗体またはこれらの置換を組合せて有し安定性を改善した抗体には制限はないが、例えば抗CD40抗体が挙げられる。【００９３】
２．定義
本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。【００９４】
「CD40」とは、クラークら（E. A. Clark et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986）又はスタメンコビックら（I. Stamenkovic et. al., EMBO J. 8:1403, 1989)により示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、特にB細胞、DC、マクロファージ、内皮細胞、上皮細胞、あるいはそれらの腫瘍細胞表面に発現する抗原ポリペプチドである。【００９５】
「抗CD40抗体」とは、細胞発現CD40、全長CD40又は部分長CD40に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を意味する。好ましくはモノクローナル抗体である。【００９６】
抗CD40抗体が有する「アゴニスト」作用とは、B細胞、腫瘍細胞又は樹状細胞などの細胞表面上に発現するCD40にそのリガンドが結合することを促進する作用、あるいは、CD40リガンドがCD40発現細胞に与える影響の１つ以上を、CD40を発現する細胞に与える作用を意味し、「アゴニスティック抗体」とは、そのような作用を有する抗体を意味する。CD40発現細胞に与える影響の１つとして、例えばB細胞増殖促進あるいは抗体産生促進が挙げられる。【００９７】
抗CD40抗体が有する「アンタゴニスティック」作用とは、B細胞、腫瘍細胞又は樹状細胞などの細胞表面上に発現するCD40にそのリガンドが結合することを阻害する作用、あるいは、CD40リガンドがCD40発現細胞に与える影響の１つ以上を中和する作用を意味し、「アンタゴニスティック抗体」とはそのような作用を有する抗体を意味する。CD40発現細胞に与える影響の１つとして、例えばB細胞増殖抑制あるいは抗体産生抑制が挙げられる。【００９８】
「抗体」とは、イムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域をコードする遺伝子（「抗体遺伝子」と総称する）に由来するものである。本発明の抗体には、いずれのイムノグロブリンクラス及びアイソタイプを有する抗体をも包含する。本発明の抗体が結合する蛋白質（抗原）には制限はなく、例えばCD40が挙げられる。【００９９】
「CH1ドメイン」、「ヒンジドメイン」、「CH2ドメイン」および「CH3ドメイン」とは、抗体重鎖定常領域の一部分を示しており、KabatらのEUインデックス（Kabat et. al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition）に基づいている。CH1ドメインはEUインデックス118から215、ヒンジドメインはEUインデックス216から237、CH2ドメインはEUインデックス238から340、CH3ドメインはEUインデックス341から446の配列からなる部分である。【０１００】
「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。これまでに知られているヒトIgG2としてはJ00230（配列番号６４）、AJ250170（配列番号６５）、AF449616（配列番号６６）、AF449617（配列番号６７）、AF449618（配列番号６８）、Z49802（配列番号６９）またはZ49801（配列番号７０）などが、またヒトIgG3としてはM12958、K01313（配列番号７１）、X16110（配列番号７２）、X99549（配列番号７３）、AJ390236（配列番号７４）、AJ390237（配列番号７５）、AJ390238（配列番号７６）、AJ390241（配列番号７７）、AJ390242（配列番号７８）、AJ390246（配列番号７９）、AJ390247（配列番号８０）、AJ390252（配列番号８１）、AJ390244（配列番号８２）、AJ390254（配列番号８３）、AJ390260（配列番号８４）、AJ390262（配列番号８５）、AJ390272（配列番号８６）、AJ390276（配列番号８７）またはAJ390279（配列番号８８）などが挙げられる（以上の記号は遺伝子のGenBankアクセッション番号である）。配列番号６４から８８に表される配列はそれぞれの塩基配列を示す。【０１０１】
「ヒトIgG重鎖」とは、重鎖可変領域およびヒトIgGの重鎖定常領域からなる重鎖である。例えば「ヒトIgG2重鎖」は重鎖可変領域およびヒトIgG2の重鎖定常領域からなる重鎖である。【０１０２】
「ヒトIgG抗体」とは、ヒトIgG重鎖およびヒト軽鎖からなる抗体である。例えば「ヒトIgG2抗体」はヒトIgG2重鎖およびヒト軽鎖からなる抗体である。【０１０３】
本発明の抗体は、当業者に周知であるハイブリドーマからの抗体遺伝子の単離方法、上記の公知のヒト抗体遺伝子のヒト抗体定常領域の配列情報、遺伝子への部位特異的変異導入方法等を用いることにより適宜作製しうる。【０１０４】
本発明の抗体は、抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み、ベクターを適当な宿主細胞に導入し、細胞もしくは細胞の培養上清から回収、精製することにより得ることができる。【０１０５】
ベクターには、宿主細胞で自律的に増殖し得るか、宿主細胞の染色体に組み込まれ得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドDNAとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。【０１０６】
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。【０１０７】
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入する方法としては、マイクロインジェクション法、ES細胞にエレクトロポレーションやリポフェクション法を使用して遺伝子を導入する方法、核移植法などが挙げられる。【０１０８】
本発明において、「培養物」とは、（a）培養上清、（b）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物、（c）形質転換体の分泌物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養するには、使用する宿主に適した培地を用い、静置培養法、ローラーボトルによる培養法などが採用される。【０１０９】
培養後、目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより抗体を採取する。また、目的抗体が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる各種クロマトグラフィーを用いた一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的の抗体を単離精製することができる。【０１１０】
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて、目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれた動物宿主、例えばトランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックヒツジ又はトランスジェニックブタを作製し、そのトランスジェニック動物から分泌されるミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（Wright, G., et al. （1991） Bio/Technology 9, 830-834）。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地、あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。【０１１１】
３．医薬組成物
また、本発明の抗体の精製された製剤を含有する医薬組成物もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような医薬組成物は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、他の抗体または抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することに理再構成して使用してもよい。投与経路は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的ルートである。【０１１２】
この場合、本発明の抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得るキャリアとの組合せとして投与される有効量は、１回につき体重１kgあたり0.0001mg〜100mgであり、２日から８週間間隔で投与される。【０１１３】
本発明の抗体を含む医薬組成物を使用する場合は、アゴニスティック抗CD40抗体については、免疫賦活化剤（抗ウィルス剤、抗感染症剤）であり、病原体としてはA、B、C、D、またはE型肝炎ウイルス、HIV、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス、パピローマウイルス、クラミジア、マイコプラズマ、トキソプラズマ、マラリア、トリパノソーマ、結核などが例示される。または抗腫瘍剤であり、対象腫瘍としては例えばCD40を発現した癌細胞を含む悪性腫瘍、例えばリンパ腫（例えばホジキンリンパ腫）、白血病、悪性黒色腫、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、頭頸部癌が挙げられる。または自己免疫疾患治療剤であり、対象疾患としてはリウマチが例示される。または、これらの疾患が複数併発してもよい。あるいは、ガン特異的ペプチドなどのワクチンとアジュバントとして併用することもできる。【０１１４】
４．組成物
また、本発明の抗体を含有する組成物もまた、本発明の範囲内に含まれる。組成物は抗体以外に、他の成分たとえば緩衝剤（pH変化を穏やかにすることを目的とし、例えばグルタミン酸ナトリウムが挙げられる）、安定化剤（抗体の化学的あるいは物理的な安定性を高めることを目的とし、例えばグリシンが挙げられる）、界面活性剤（例えば、ポリソルベートが挙げられる）あるいは防腐剤などを含む。組成物は、例えば、水溶液あるいは凍結乾燥である。当該組成物は、例えば、試薬として抗原の分析に使用することができる。本発明のアミノ酸またはドメイン置換が施された抗体は、それが施されていない抗体に比べて凝集体生成が抑制されているため、収率等の観点から効率的に組成物が製造できる。また、抗原分析での分析溶液中において、抗体の凝集が起こりにくいので、精度の高い結果が得られる。
【実施例】
【０１１５】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【０１１６】
実施例１  抗CD40抗体、IgG1/IgG2定常領域融合体の作製
WO02/088186に記載の抗CD40抗体のうち、ハイブリドーマKM341-1-19（受託番号BP-7759）が産生する抗体（以下、３４１−１−１９抗体）の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体およびハイブリドーマ2105（受託番号BP-8024）が産生する抗体（以下、２１０５抗体）の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体を作製した。ハイブリドーマKM341-1-19（受託番号BP-7759）が産生する抗体およびハイブリドーマ2105（受託番号BP-8024）が産生する抗体はアゴニスティック抗体であることが分かっている。【０１１７】
３４１−１−１９抗体はハイブリドーマKM341-1-19の産生する抗体であり、ハイブリドーマKM341-1-19は、受託番号  FERM BP-7759で、2001年9月27日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。また、２１０５抗体はハイブリドーマ2105の産生する抗体であり、ハイブリドーマ2105は、受託番号  FERM BP-8024で、2002年4月17日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。【０１１８】
341-1-19抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする塩基配列並びに重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。【０１１９】
341-1-19抗体の重鎖塩基配列（配列番号１）における、シグナル配列は50番目のアデニン（A）から始まる。シグナル配列と可変領域の境界は109番目の[アデニン]([A])と110番目のシトシン(C)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は493番目のアデニン(A)と494番目のグアニン(G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１２０】
341-1-19抗体の重鎖アミノ酸列（配列番号２）における、シグナル配列と可変領域の境界は20番目のセリン(S)と21番目のグルタミン(Q)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１48番目のセリン(S)と149番目のアラニン(A)の間に位置する。【０１２１】
以上より、341-1-19抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１における110番目のシトシン(C)から493番目のアデニン(A)までである。また、341-1-19抗体  の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２における21番目のグルタミン(Q)から148番目のセリン(S)までである。【０１２２】
341-1-19抗体の軽鎖塩基配列（配列番号３）における、シグナル配列は、29番目のアデニン（A）から始まる。シグナル配列と可変領域の境界は88番目の[アデニン]([A])と89番目のグアニン(G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は400番目のアデニン(A)と401番目の[シトシン]([C])の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１２３】
341-1-19抗体の軽鎖アミノ酸列（配列番号４）における、シグナル配列と可変領域の境界は20番目のグリシン(G)と21番目のグルタミン酸(E)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は124番目のリジン(K)と125番目の[アルギニン]([R])の間に位置する。【０１２４】
以上より、341-1-19抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号３における89番目のグアニン(G)から400番目のアデニン(A)までである。また、341-1-19抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４における21番目のグルタミン酸(E)から124番目のリジン(K)までである。【０１２５】
341−1−19  重鎖塩基配列（配列番号：１）
GTCGACGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGCCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCAGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGGATCC
341−1−19  重鎖アミノ酸配列（配列番号：２）
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
341−1−19  軽鎖塩基配列（配列番号：３）
ACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG
341−1−19  軽鎖アミノ酸配列（配列番号：４）
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRT
2105抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするDNA並びに重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。【０１２６】
2105抗体  の重鎖塩基配列（配列番号５）における、シグナル配列は70番目のアデニン（A）から始まる。シグナル配列と可変領域の境界は126番目の[チミン]([T])と127番目のグアニン(G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は495番目のアデニン(A)と496番目のグアニン(G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１２７】
2105抗体の重鎖アミノ酸列（配列番号６）における、シグナル配列と可変領域の境界は19番目のシステイン(C)と20番目のグルタミン酸(E)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は142番目のセリン(S)と143番目のアラニン(A)の間に位置する。【０１２８】
以上より、2105抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号５における127番目のグアニン(G)から495番目のアデニン(A)までである。また、2105抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６における20番目のグルタミン酸(E)から142番目のセリン(S)までである。【０１２９】
2105抗体の軽鎖塩基配列（配列番号７）における、シグナル配列は、28番目のアデニン（A）から始まる。シグナル配列と可変領域の境界は87番目の[アデニン]([A])と88番目のグアニン(G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は405番目のアデニン(A)と406番目の[シトシン]([C])の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１３０】
2105抗体の軽鎖アミノ酸列（配列番号８）における、シグナル配列と可変領域の境界は20番目のグリシン(G)と21番目のグルタミン酸(E)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は126番目のリジン(K)と127番目の[アルギニン]([R])の間に位置する。【０１３１】
以上より、2105抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号７における88番目のグアニン(G)から405番目のアデニン(A)までである。また、2105抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８における21番目のグルタミン酸(E)から126番目のリジン(K)までである。【０１３２】
2105  重鎖塩基配列（配列番号：５）
CTGAACACAGACCCGTCGACTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAGCACTGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG
2105  重鎖アミノ酸配列（配列番号：６）
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK
2105  軽鎖塩基配列（配列番号：７）
CTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTG
2105  軽鎖アミノ酸配列（配列番号：８）
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTV
本発明者らは、抗CD40抗体である4D11（IgG4サブクラスを有する）やその変異体である4D11PE（4D11抗体遺伝子の重鎖、軽鎖を含むDNA断片を、BglII、NheIで消化、精製した後、N5KG4PEベクター（IDEC Pharmaceuticals）につなぎ換えて作製した。N5KG4PEはIgG4定常領域に、S228P及びL235E、N5KG4PはS228Pの点変異をそれぞれ含む。）の培養上清をProtein Aカラム（アマシャムバイオサイエンス社）にチャージし0.1Mクエン酸バッファー（pH2.7）により溶出した後37℃で1分間および10分間インキュベートした条件下において、約10％の凝集体が生成するのに対し、4D11の定常領域をIgG1とした4D114D11G1においては、ほとんど凝集体が生じないことを見出している（特願2003−431408）。同様に、IgG2においてもドメインスワップ変異抗体を用いて、低pHにおける凝集体形成抑制にかかわるIgG1の領域を特定するために、ドメインスワップ変異抗体IgG[1/1/2/2]（[1/1/2/2]は、左から順にCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインに関して、CH1ドメインはIgG1由来、ヒンジドメインはIgG1由来、CH2ドメインはIgG2由来およびCH3ドメインはIgG2由来であることを意味している。以下同様に解釈する。）、IgG[2/2/1/1]、IgG[2/2/1/2]、IgG[2/2/2/1]、を以下に述べるように作製した。【０１３３】
IgG[1/1/2/2]は、N5KG1-Val Lark（IDEC Pharmaceuticals:以下N5KG1と略記）を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）、24ch4: AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT（配列番号１０）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、抗体発現ベクターN5KG2（IDEC Pharmaceuticals, US Patent 6001358、「G2」は、重鎖定常領域がIgG２由来であることを示す（以下、同様）。）を鋳型として、プライマー24ch3: AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT（配列番号１１）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI, BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG1122と名づけた。【０１３４】
IgG[2/2/1/1]は、N5KG2を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（（配列番号９）、24ch4: AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT（配列番号１０）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、N5KG1を鋳型として、プライマー24ch3: AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT（配列番号１１）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI, BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG2211と名づけた。【０１３５】
IgG[2/2/1/2]は、上記のように作製したN5KG2211を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）、CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC（配列番号１３）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、N5KG2を鋳型として、プライマーCH3cons: GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACC（配列番号１４）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kit で精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG2212と名づけた。【０１３６】
IgG[2/2/2/1]は、N5KG2を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）、CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC（配列番号１３）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、N5KG1を鋳型として、プライマーCH3cons: GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACC（配列番号１４）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG2221と名づけた。【０１３７】
それぞれの発現ベクターをBglII、NheIで消化し、341-1-19抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を挿入し発現ベクターを完成させた。【０１３８】
また、ハイブリドーマKM341-1-19（受託番号BP-7759）が産生する抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体およびハイブリドーマ2105（受託番号BP-8024）が産生する抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体として341G2Serおよび2105G2Serを作製した。【０１３９】
341G2Serの重鎖塩基配列（配列番号１５）における、シグナル配列と可変領域の境界は60番目の[アデニン]([A])と61番目のシトシン（C）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は444番目のアデニン(A)と445番目のグアニン (G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１４０】
341G2Serの重鎖アミノ酸列（配列番号１６）における、シグナル配列と可変領域の境界は20番目のセリン(S)と21番目のグルタミン(Q)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は148番目のセリン(S)と149番目のアラニン(A)の間に位置する。【０１４１】
以上より、341G2Serの重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１５における61番目のシトシン（C）から444番目のアデニン(A)までである。また、341G2Serの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１６における21番目のグルタミン(Q)から148番目のセリン(S)までである。【０１４２】
341G2Ser重鎖全塩基配列（配列番号：１５）
ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
341G2Sser重鎖全アミノ酸配列（配列番号：１６）
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
341G2Serの軽鎖塩基配列（配列番号１７）における、シグナル配列と可変領域の境界は60番目の[アデニン]([A])と61番目のグアニン(G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は372番目のアデニン(A)と373番目の[シトシン]([C])の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１４３】
341G2Serの軽鎖アミノ酸列（配列番号１８）における、シグナル配列と可変領域の境界は20番目のグリシン(G)と21番目のグルタミン酸(E)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は124番目のリジン(K)と125番目の[アルギニン]([R])の間に位置する。以上より、341G2Serの軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１７における61番目のグアニン(G)から372番目のアデニン(A)までである。また、341G2Serの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１８における21番目のグルタミン酸(E)から124番目のリジン(K)までである。【０１４４】
341G2Ser軽鎖全塩基配列（配列番号：１７）
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
341G2Ser軽鎖全アミノ酸配列（配列番号：１８）
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2105G2Serの重鎖塩基配列（配列番号１９）における、シグナル配列と可変領域の境界は57番目の[チミン]([T])と58番目のグアニン（G）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は426番目のアデニン(A)と427番目のグアニン(G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１４５】
2105G2Serの重鎖アミノ酸列（配列番号２０）における、シグナル配列と可変領域の境界は19番目のシステイン(C)と２0番目のグルタミン酸(E)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は142番目のセリン(S)と143番目のアラニン(A)の間に位置する。【０１４６】
以上より、2105G2Serの重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１９における58番目のグアニン（G）から426番目のアデニン(A)までである。また、2105G2Serの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２０における20番目のグルタミン酸(E)から142番目のセリン(S)までである。【０１４７】
2105G2Ser重鎖全塩基配列（配列番号：１９）
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
2105G2Ser重鎖全アミノ酸配列（配列番号：２０）
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2105G2Serの軽鎖塩基配列（配列番号２１）における、シグナル配列と可変領域の境界は60番目の[アデニン]([A])と61番目のグアニン(G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は378番目のアデニン(A)と379番目の[シトシン]([C])の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１４８】
2105G2Serの軽鎖アミノ酸列（配列番号２２）における、シグナル配列と可変領域の境界は20番目のグリシン(G)と21番目のグルタミン酸(E)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は126番目のリジン(K)と127番目の[アルギニン]([R])の間に位置する。以上より、2105G2Serの軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号２１における61番目のグアニン(G)から378番目のアデニン(A)までである。また、2105G2Serの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２２における21番目のグルタミン酸(E)から126番目のリジン(K)までである。【０１４９】
2105G2Ser軽鎖全塩基配列（配列番号：２１）
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
2105G2Ser軽鎖全アミノ酸配列（配列番号：２２）
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
実施例２  ドメインスワップ変異抗CD40抗体、及び、アミノ酸置換変異体抗体の発現・精製
実施例１で作製した発現ベクターDNAをEndoFree Plasmid Kit（キアゲン社）にて調製し、FreeStyleTM 293 Expression System（インビトロジェンライフテクノロジー社）を用いて、メーカー指定のプロトコールに従って発現ベクターを浮遊性293細胞（インビトロジェンライフテクノロジー社）に導入して、一過性発現により各抗体を含む培養上清を得た。孔径0.22μmのメンブランフィルター（MILLIPORE製）で濾過した培養上清（IgGとして約500μg）を抗体精製用アフニティーカラムであるHiTrap rProtein A FF（カラム体積１ml）（アマシャムバイオサイエンス社）にチャージし、PBS(-)で洗浄後20mMクエン酸バッファー（pH3.4）により溶出し、200mMリン酸バッファー（pH7.0）を含むチューブに回収した。【０１５０】
実施例３  抗体溶液の凝集体の含有率の測定
抗体溶液の凝集体含有率は、高速液体クロマトグラフ装置（島津社製）及びTSK−G3000 SWカラム（東ソー社製）と、溶媒として20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl pH7.0を用いて分析を行った。溶出位置をゲルろ過HPLC用分子量マーカー（オリエンタル酵母社）(Cat No.40403701)と比較することで、抗体蛋白の単量体とそれ以上の凝集体のピークを同定して、それぞれのピーク面積から凝集体の含有率を算出した。【０１５１】
実施例４  ドメインスワップ変異抗CD40抗体の安定性の評価
実施例２に示す方法で精製完了した各抗体サンプルの凝集体の含有率は、実施例３の方法で測定したところ、全試料とも0％であった。それら精製した抗体サンプル300μlに対し、200mMクエン酸ナトリウム、50mM NaClから成るバッファー（pH2.7）60μlを添加してpH3.5に調整し、37℃で10分間あるいは60分間インキュベートした後、その低pH処理溶液150μlに対して500mMリン酸ナトリウムバッファー（pH8.0）を37.5μl加えることにより中和した。低pH処理後の抗体溶液の凝集体含有率は、実施例３に示す方法で測定した。【０１５２】
その結果、少なくともCH2ドメインがIgG1由来（IgG[2/2/1/1]或はIgG[2/2/1/2]）であれば、定常領域全体がIgG1である場合と同程度に低pHで安定であることが判明した（表１）。表１は、IgG2/IgG1ドメインスワップ変異抗体の低pHにおける安定性を示す。
【表１】
0004986633.tif 000002
【０１５３】
実施例５  IgG2のCH2ドメインの１アミノ酸変異体の作製
実施例４で341-G2Ser抗体の定常領域のCH2ドメインをIgG1としたドメインスワップ変異抗体IgG[2/2/1/2]において、ほとんど凝集体が生じないことを見出したので、更に凝集体形成抑制に寄与しているアミノ酸残基を絞り込むために、341G2Ser抗体のCH2ドメイン内に存在するIgG1とIgG4間で異なるアミノ酸残基６箇所（KabatらによるEUインデックスにより示される274、296、300、309、327、339番目）に注目して、IgG2のアミノ酸残基からIgG1のアミノ酸残基に変換した各変異体（341-G2Ser[Q274K]（274番目のGln残基をLysへ変換、以下同様）、341-G2Ser[F296Y]、341-G2Ser[F300Y]、341-G2Ser[V309L]、341-G2Ser[G327A]、341-G2Ser[T339A]）を作製した。抗CD40抗体の341-G2Ser発現ベクター（N5KG2Ser-341）のDNAを鋳型として、GeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System（プロメガ社）を用いた部位特異的変異導入法により、定常領域のアミノ酸置換体をコードする各種の変異DNAを調製した。変異導入用オリゴヌクレオチド（5’末端リン酸化済み）としては、Q274K：AGACCCCGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT G（配列番号２３）、F296Y：CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTTCC（配列番号２４）、F300Y：AGTTCAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGC（配列番号２５）、V309L：GCGTCCTCAC CGTTCTGCAC CAGGACTGG（配列番号２６）、G327A：AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCTCC（配列番号２７）、T339A：GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC C（配列番号２８）の各オリゴヌクレオチドを用いた。目的の変異導入用オリゴヌクレオチドと上記キット付属のSelection Oligonucleotideを鋳型DNAとアニーリングさせて変異導入鎖を合成した後、GeneEditorTM Antibiotic Selection Mix存在下では変異体のみが増殖することを利用して変異体を選択した。より具体的には、dsDNAテンプレートをアルカリ条件下（0.2M NaOH、0.2mMEDTA（最終濃度））室温で5分間インキュベートした後、２M酢酸アンモニウム（pH4.6）を10分の１容量加えて中和してからエタノール沈殿により回収した。６種類に変異体ごとに別のチューブ中で、アルカリ変性処理した鋳型DNAに、変異導入用オリゴヌクレオチドと新しい抗生物質耐性獲得用Selection Oligonucleotide（Top Select Oligo、5’末端リン酸化）、及び、キット添付のアニーリングバッファーを加えた後、75℃で5分間保温し、37℃にゆっくり下げることによりアニーリングを行なった。次に、変異鎖の合成と連結のために、キット付属のSynthesis 10×buffer、T4 DNA Polymerase、及びT4 DNA ligaseを加えて、37℃で90分反応を行なった。GeneEditorTM Antibiotic Selection Mix存在下でコンピテントセルBMH 71-18 mutSに形質転換して培養した形質転換体大腸菌よりプラスミドDNAを調製し、更にそのDNAによりコンピテントセルJM109を形質転換後、GeneEditorTM Antibiotic Selection Mixを含むLBプレートに播種した。各変異体について、プレートに生じた形質転換体を培養して、プラスミドDNAを精製してDNA塩基配列を解析した。DNA塩基配列の結果、目的とするアミノ酸変異が導入された６種類の抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。それら抗CD40抗体の１アミノ酸置換変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG2Ser-341-Q274K、N5KG2Ser-341-F296Y、N5KG2Ser-341-F300Y、N5KG2Ser-341-V309L、N5KG2Ser-341-G327A、N5KG2Ser-341-T339Aと命名した。【０１５４】
実施例６  １アミノ酸変異体の凝集体形成抑制評価
実施例５の１アミノ酸変異体の抗体発現ベクターを用いて、実施例２に従って発現、精製し、実施例４に従って低pH処理を行い、実施例３に従って、凝集体の含有率を測定した。【０１５５】
その結果、１アミノ酸変異により、IgG1やIgG[2/2/1/2]のレベルまで低pHにおける凝集体の生産が抑制される変異体は見出されなかったが、341-G2Ser[F300Y]、341-G2Ser[V309L]、及び341-G2Ser[T339A]では完全ではないが、一部抑制されることが確認された（表２）。表２は、IgG2のCH2ドメインにIgG1の１アミノ酸置換を導入した時の低pHにおける安定性を示す。
【表２】
0004986633.tif 000003
【０１５６】
実施例７  
実施例６に示したように、341G2Ser抗体のCH2ドメインの１アミノ酸置換体を用いた検討から、凝集体の生成が一部分抑制される変異体（341-G2Ser[F300Y]、341-G2Ser[V309L]、及び341-G2Ser[T339A]）が見出せたので、更に凝集体形成抑制を促進するために、その3箇所の１アミノ酸変異のいずれか２つ、或は全て組み合わせて有する変異体を作製した。作製した変異体は、341-G2Ser[F300Y/V309L]（300番目のアミノ酸残基であるFをY、更に309番目のVをLへ変換、以下同様）、341-G2Ser[F300Y/T339A]、341-G2Ser[V309L/T339A]、341-G2Ser[F300Y/V309L/T339A]（300番目のFをY、309番目のVをL、及び339番目のTをAへ変換）の4種類である。変異体発現ベクターの作製法は、複数箇所の変異導入を行なうために、新たに作製したより長い変異導入用オリゴヌクレオチド、或はそれらオリゴヌクレオチドを２つ以上同時に鋳型となるベクターDNAにアニーリングさせた以外は、実施例５のGeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System（プロメガ社）による部位特異的変異導入法に従って実施した。変異導入用オリゴヌクレオチドとしては、341-G2Ser[F300Y/V309L]作製にはF300YV309L：AGTTCAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TCTGCACCAG GACTGG （配列番号２９）を、341-G2Ser[F300Y/T339A]作製には実施例５で用いたF300Y及びT339Aを、341-G2Ser[V309L/T339A]作製にはV309L及びT339Aを、341-G2Ser[F300Y/V309L/T339A]作製にはF300YV309L及びT339Aを使用した。実施例５で示した部位特異的変異導入法を行い、得られた各変異抗体発現ベクターの候補プラスミドDNAについてDNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された４種類の抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。それら抗CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG2Ser-341-F300Y/V309L、N5KG2Ser-341-F300Y/T339A、N5KG2Ser-341-V309L/T339A、N5KG2Ser-341-F300Y/V309L/T339Aと命名した。【０１５７】
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の重鎖をコードする塩基配列並びに重鎖のアミノ酸配列を以下に示す。【０１５８】
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]  重鎖塩基配列（配列番号：３０）
ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号３０における、シグナル配列と可変領域の境界は６０番目のアデニン(A)と６１番目のシトシン(C)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１５９】
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]  重鎖アミノ酸配列（配列番号：３１）
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号３１における、シグナル配列と可変領域の境界は２０番目のセリン(S)と２１番目のグルタミン(Q)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１６０】
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の軽鎖をコードする塩基配列並びに軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。【０１６１】
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]  軽鎖塩基配列（配列番号：３２）
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号３２における、シグナル配列と可変領域の境界は６０番目のアデニン(A)と６１番目のグアニン(G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１６２】
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]  軽鎖アミノ酸配列（配列番号：３３）
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号３３における、シグナル配列と可変領域の境界は２０番目のグリシン(G)と２１番目のグルタミン酸(E)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１６３】
実施例８  341G2Serの変異体の凝集体形成抑制評価
実施例７の341G2Serの変異体発現ベクターを用いて、実施例２に従って発現、精製し、実施例４に従って低pH処理を行い、実施例３に従って凝集体の含有率を測定し低pHにおける安定性を評価した。【０１６４】
その結果、341-G2Ser[F300Y/V309L/T339A]において最も低pHにおける凝集体の生産が抑制されることが確認された（表３）。
【表３】
0004986633.tif 000004
【０１６５】
実施例９  2105G2Serの低pHによる凝集体形成抑制の検証
341G2Serと同じく2105G2Serについても、CH2ドメインの３つのアミノ酸をIgG1のアミノ酸に変換したF300YV309LT339Aの変異を持つIgG2の定常領域を持たせた場合、低pH条件下での凝集体形成が抑制可能であるか検討した。N5KG2Ser-341-F300Y/V309L/T339Aの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むDNA断片をBglII、NheIで消化することにより切り出し、その代わりに2105の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を挿入した。得られた2105抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG2Ser-2105-F300YV309LT339Aと命名した。【０１６６】
2105-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]のH鎖全長をコードするDNA並びにH鎖のアミノ酸配列を以下に示す。【０１６７】
2105-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]  重鎖塩基配列（配列番号：３４）
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号３４における、シグナル配列と可変領域の境界は５７番目のチミン(T)と５８番目のグアニン(G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１６８】
2015-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]  重鎖アミノ酸配列（配列番号：３５）
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号３５における、シグナル配列と可変領域の境界は１９番目のシステイン(C)と２０番目のグルタミン酸(E)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１６９】
2105-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の軽鎖をコードする塩基配列並びに軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。【０１７０】
2105-G2Ser[F300YV309LT339A]  軽鎖塩基配列（配列番号：３６）
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号３６における、シグナル配列と可変領域の境界は６０番目のアデニン(A)と６１番目のグアニン(G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１７１】
2105-G2Ser[F300YV309LT339A]  軽鎖アミノ酸配列（配列番号：３７）
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号３７における、シグナル配列と可変領域の境界は２０番目のグリシン(G)と２１番目のグルタミン酸(E)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１７２】
同発現ベクター、及び、対象としてN5KG2Ser-2105とN5KG1-2105の各発現ベクターを用いて、実施例２の方法で抗体を発現・精製し、実施例４及び実施例３の方法で、低pHの安定性を調べた。【０１７３】
その結果、2015抗体においては定常領域がIgG1の抗体でさえ凝集体の生成が高く341G2Serの場合ほどの効果はみられなかったが、2105-G2Serとその変異体である2105-G2Ser[F300YV309LT339A]を比較すると、後者で安定性が高まることを確認した（表４）。
【表４】
0004986633.tif 000005
【０１７４】
実施例１０  抗CD40抗体のRamos細胞に対する結合活性
実施例２で作製したドメインスワップ変異抗体および実施例５で作製した変異体抗体が、もとの抗体と同等の結合活性を示すかどうか調べるために、CD40を発現するRamos[ATCC]細胞への結合活性を測定した。【０１７５】
2x106/mlの濃度でRamos細胞株を0.1%NaN3、2%FCS含有PBSの染色バッファー（SB）に浮遊させた。細胞浮遊液（100μl／ウェル）を96-well丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。各々のハイブリドーマの培養上清（50μl）を加え、氷温下30分間インキュベートした。陰性コントロールとしてヒト血清アルブミンに対するヒトIgG1抗体を用い、ハイブリドーマ培養培地で2μg/mlの濃度に調製し、50μl添加後氷温下15分間インキュベートした。SBで洗浄した後、250倍希釈したR-PE蛍光標識抗ヒト抗体(Southern Biotechnology社製)50μlを加え、氷温下15分間インキュベートした。SBで２回洗浄した後、300〜500μlのFACS緩衝液に懸濁し、FACS（FACSort、FACScan、ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。【０１７６】
その結果、ドメインスワップ変異抗体および変異体抗体で結合性は変化無かった(図１A、B、C)。図１A、B、Cにおいて、縦軸の抗体結合の単位は平均蛍光強度である。図１A、BおよびCにおけるisotype controlの値はそれぞれ7.15、7.15および5.01である。【０１７７】
実施例１１  Ramos細胞における抗CD40抗体によるCD95発現促進
341-1-19、2105はアゴニスト抗体として知られている。抗体の持つアゴニスト活性が、定常領域の構造変化による影響を調べた。Ramos細胞は、CD40リガンドを添加することにより、CD95の発現上昇が観察される。この細胞に、抗体を添加することにより、CD95の発現が上昇するかを指標に、抗体のアゴニスト活性を評価した。【０１７８】
1.0x106個/mlのRamos細胞懸濁液を96ウエルプレートに50μl/wellで播種した。培養上清又は精製抗体を、96ウエルプレートに100μl/well添加した。一晩培養後、細胞を集めR-PE標識抗CD95抗体（Pharmingen NJ）を用い、FACSを使って解析した。【０１７９】
その結果、定常領域の構造変化によって、抗体のアンタゴニスト活性に変化は見られなかった（図２A、B、C）。図２A、B、Cにおいて、縦軸のCD95発現量の単位は平均蛍光強度である。図２A、BおよびCにおけるisotype controlの値はそれぞれ7.58、7.58および6.29である。【０１８０】
実施例１２  抗CD40抗体、IgG1/IgG３定常領域融合体の作製
WO02/088186に記載の抗CD40抗体のうち、4D11抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を用いて抗体を作製した。なお、これら2つの抗体はアンタゴニストとして作用することが分かっている。【０１８１】
4D11抗体はハイブリドーマ4D11の産生する抗体であり、ハイブリドーマ4D11は、受託番号  FERM BP-7758で、2001年9月27日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。【０１８２】
4D11抗体の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列並びに重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。【０１８３】
4D11抗体の重鎖核酸配列（配列番号３８）における、シグナル配列と可変領域の境界は93番目の[シトシン]([C])と94番目のシトシン（C）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は456番目のアデニン(A)と457番目のグアニン(G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１８４】
4D11抗体の重鎖アミノ酸列（配列番号３９）における、シグナル配列と可変領域の境界は26番目のセリン(S)と27番目のグルタミン(Q)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は147番目のセリン(S)と148番目のアラニン(A)の間に位置する。【０１８５】
以上より、4D11抗体の重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号３８における94番目のシトシン(C)から456番目のアデニン(A)までである。また、4D11の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３９における27番目のグルタミン(Q)から147番目のセリン(S)までである。【０１８６】
4D11抗体の軽鎖核酸配列（配列番号４０）における、シグナル配列と可変領域の境界は124番目の[チミン]([T])と125番目のグアニン(G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は442番目のアデニン(A)と443番目の[シトシン]([C])の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０１８７】
4D11抗体の軽鎖アミノ酸列（配列番号４１）における、シグナル配列と可変領域の境界は22番目のシステイン(C)と23番目のアラニン(A)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は128番目のリジン(K)と129番目の[アルギニン]([R])の間に位置する。【０１８８】
以上より、4D11抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号４０における125番目のグアニン(G)から442番目のアデニン(A)までである。また、4D11の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４１における23番目のアラニン(A)から128番目のリジン(K)までである。【０１８９】
4D11  重鎖塩基配列（配列番号：３８）
ATATGTCGACGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
4D11  重鎖アミノ酸配列（配列番号：３９）
MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTVSSAS
4D11  軽鎖塩基配列（配列番号：４０）
AGATCTTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTACGCGGGGAGACCCACTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG
４D11  軽鎖アミノ酸配列（配列番号：４１）
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRT
IgG2抗体と同様に、IgG3抗体においてもドメインスワップ変異抗体を用いて、低pHにおける凝集体形成抑制にかかわるIgG1の領域を特定するために、ドメインスワップ変異抗体IgG[1/1/3/3]（[1/1/3/3]は、左から順にCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインに関して、CH1ドメインはIgG1由来、ヒンジドメインはIgG1由来、CH2ドメインはIgG3由来およびCH3ドメインはIgG3由来であることを意味している。以下同様に解釈する。）、IgG[3/3/1/1]、IgG[3/3/1/3]、IgG[3/3/3/1]、を以下に述べるように作製した。【０１９０】
IgG[1/1/3/3]は、N5KG1-Val Lark（IDEC Pharmaceuticals:以下N5KG1と略記）を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）、13ch1-R: GTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCA(配列番号４２)で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、抗体発現ベクターN5KG3（IDEC Pharmaceuticals, US Patent 6001358、「G3」は、重鎖定常領域がIgG3由来であることを示す（以下、同様）。）を鋳型として、プライマー13ch1: TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC（配列番号４３）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG1133と名づけた。【０１９１】
IgG[3/3/1/1]は、N5KG3を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）13ch1-R: GTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCA(配列番号４２)で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、N5KG1を鋳型として、プライマー13ch1: TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC（配列番号４３）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3311と名づけた。【０１９２】
IgG[3/3/1/3]は、上記のように作製したN5KG3311を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）、CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC（配列番号１３）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、N5KG3を鋳型として、プライマーCH3cons: GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACC（配列番号１４）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3313と名づけた。【０１９３】
IgG[3/3/3/1]は、N5KG3を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）、CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC（配列番号１３）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、N5KG1を鋳型として、プライマーCH3cons: GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACC（配列番号１４）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3331と名づけた。【０１９４】
それぞれの発現ベクターをBglII、NheIで消化し、4D11の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を挿入し発現ベクターを完成させた。【０１９５】
実施例１３  IgG3のCD40抗体の発現・精製、及び精製品の凝集体含有率の測定
作製した発現ベクターDNAを実施例２に従って発現を行い、得られた培養上清（IgGとして約300μg）を抗体精製用アフニティーカラムであるHiTrap rProtein G HP（カラム体積１ml）（アマシャムバイオサイエンス社）にチャージし、PBS(-)で洗浄後20 mMクエン酸バッファー（pH2.7）により溶出し、200mMリン酸バッファー（pH7.0）を含むチューブに回収した。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表５に示した。4D11-G3抗体は凝集体の含量が20％以上であるのに対して、定常領域のCH3領域をIgG1に変換したドメインスワップ変異抗体（4D11-G[3311]、及び4D11-G[3331]）においては、凝集体の割合が非常に少なく、IgG1レベルまで改善することが見出された。
【表５】
0004986633.tif 000006
【０１９６】
実施例１４  IgG3とIgG1のドメインスワップ変異抗CD40抗体の低pH安定性の評価
4D11-G[3331]において抗体精製用アフニティーカラム精製後の凝集体の生成が顕著に抑制されることが示されたので、さらに低pH安定性を調べる目的で、実施例１３の4D11-G[3331]及び4D11-G[3311]ドメインスワップ変異抗体の精製抗体を用いて、実施例４に従って低ｐH処理後、実施例３に従って凝集体の含有率を測定した。【０１９７】
その結果、4D11-G[3311]ドメインスワップ変異抗体は、低pH処理条件においても定常領域全体がIgG1である場合と比較して同等以上に安定であることが判明した（表６）。また、4D11-G[3331]についても60分間のインキュベーション処理においても3％以下の凝集体含量に抑えられており、低pHでの安定性が確認された。表６は、IgG3/IgG1ドメインスワップ変異抗体の低pHにおける安定性を示す。
【表６】
0004986633.tif 000007
【０１９８】
実施例１５  IgG3のCH3定常領域１アミノ酸変異体の作製
ドメインスワップ変異体を用いた解析結果から、ProteinGを用いたアフィニティー精製においてはIgG3の凝集形成に関与するのは、主にCH3であることが解ったため、CH3ドメイン内に存在するIgG1とIgG3間で異なるアミノ酸残基６箇所（KabatらによるEUインデックスにより示される356、358、392、397、422、435番目）に注目して、IgG3のアミノ酸残基からIgG1のアミノ酸残基に変換した各変異体（4D11-G3[E356D]（356番目のE残基をDへ変換、以下同様）、4D11-G3[M358L]、4D11-G3[N392K]、4D11-G3[M397V]、4D11-G3[I422V]、4D11-G3[R435H]）を作製した。【０１９９】
IgG3[E356D]は、N5KG３を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）E356D-r: CTTGGTCATCTCATCCCGGGATGGGGG（配列番号４４）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、抗体発現ベクターN5KG３を鋳型として、プライマーE356D: CCCCCATCCCGGGATGAGATGACCAAG（配列番号４５）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3−E356Dと名づけた。【０２００】
IgG3[M358L]は、N5KG3を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）M358L-r: CTGGTTCTTGGTCAGCTCCTCCCGGGA（配列番号４６）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、抗体発現ベクターN5KG3を鋳型として、プライマーM358L: TCCCGGGAGGAGCTGACCAAGAACCAG（配列番号４７）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3−M358Lと名づけた。【０２０１】
IgG3[N392K]は、N5KG3を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）N392K-r: GGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTC（配列番号４８）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、抗体発現ベクターN5KG3を鋳型として、プライマーN392K: GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC（配列番号４９）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3−N392Kと名づけた。【０２０２】
IgG3[I422V]は、N5KG３を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）I422V -r: GGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTG（配列番号５０）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、抗体発現ベクターN5KG３を鋳型として、プライマーI422V: CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC（配列番号５１）、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc（配列番号１２）を用いて、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、２つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を５回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3−I422Vと名づけた。【０２０３】
IgG3[R435H]は、N5KG3を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag（配列番号９）R435H: CCCGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTG（配列番号５２）で98℃１秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を30回行った。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3−R435Hと名づけた。【０２０４】
それぞれの発現ベクターをBglII、NheIで消化し、4D11の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を挿入し発現ベクターを完成させた。【０２０５】
4D11-G3[M397V]については、実施例５に示したGeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System（プロメガ社）を用いた部位特異的変異導入法により、N5KG3-4D11のDNAを鋳型として変異DNAを調製した。変異導入用オリゴヌクレオチド（5’末端リン酸化済み）としては、M397V：CACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGAC（配列番号５３）のオリゴヌクレオチドを用いた。部位特異的変異導入法により得られた変異抗体発現ベクターの候補プラスミドDNAについて、DNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された変異体の発現ベクターを取得した。この発現ベクターをN5KG3−M397Vと名づけた。【０２０６】
実施例１６  4D11-G3の変異体の凝集体形成抑制評価
IgG3のアミノ酸残基からIgG1のアミノ酸残基に変換した各変異体（4D11-G3[E356D]、4D11-G3[M358L]、4D11-G3[N392K]、4D11-G3[M397V]、4D11-G3[I422V]、4D11-G3[R435H]）について、各発現ベクターDNAを実施例２に従って発現を行い、得られた培養上清（IgGとして約500μg）から、実施例１３に従って精製を実施した。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表７に示した。表７に示すように、4D11-G[N392K]、及び4D11-G[M397V]）においては、4D11-G3抗体、及び、他の１アミノ酸残基変異体の凝集体の含量が20％以上であるのに対して、10％前後と凝集体の割合が減少することが見出された。
【表７】
0004986633.tif 000008
【０２０７】
実施例１７  4D11-G3の変異体の凝集体形成抑制評価（２）
実施例１６に示したように、IgG3抗体の定常領域の１アミノ酸置換体を用いた検討から、凝集体の生成が一部分抑制される変異体（4D11-G3[N392K]及び4D11-G3[M397V]が見出せたので、更に凝集体形成抑制効果を高めることを目的に、この２箇所のアミノ酸変異をあわせ持つ変異体（4D11-G3[N392KM397V]）を作製した。変異体発現ベクターの作製法は、実施例５のGeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System（プロメガ社）による部位特異的変異導入法に従って、変異導入用オリゴヌクレオチド（5’末端リン酸化済み）としては、N392KM397V：GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCC（配列番号５４）のオリゴヌクレオチドを用いた。得られた変異抗体発現ベクターの候補プラスミドDNAについてDNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。抗CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG3-4D11-N392KM397Vと命名した。【０２０８】
実施例１８  4D11-G3の変異体の凝集体形成抑制評価（３）
実施例１３及び実施例１４において、IgG3重鎖のCH3ドメインをIgG1重鎖のCH3ドメインに、あるいはIgG3重鎖のCH2ドメインおよびCH3ドメインをIgG1重鎖のCH2ドメインおよびCH3ドメインに、置換することによって抗体の安定性を改善することができることが確認できたことから、更に凝集体形成抑制に寄与しているアミノ酸残基を絞り込むために、IgG3抗体のCH2ドメイン内に存在するIgG1とIgG3間で異なるアミノ酸残基の中で、さらに実施例６で示したIgG2の凝集体形成抑制に関与することが判明したアミノ酸残基２箇所（KabatらによるEUインデックスにより示される300、309番目）に注目して、4D11-G[3331]のアミノ酸残基からIgG1のアミノ酸残基に変換した各変異体を作製した。作製した変異体は、4D11-G[3331][F300Y]（ドメインスワップ変異体4D11-G[3331]の300番目のアミノ酸残基であるFをYへ変換、以下同様）、4D11-G[3331][T339A]、4D11-G[3331][F300YT339A]（300番目のFをY、及び339番目のTをAへ変換）の３種類である。変異体発現ベクターの作製法は、4D11-G[3331][F300YT339A]の場合に２種類のオリゴヌクレオチドを同時に鋳型となるベクターDNAにアニーリングさせた以外は、実施例５のGeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System（プロメガ社）による部位特異的変異導入法に従って実施した。変異導入用オリゴヌクレオチドとしては、4D11-G[3331][F300Y]作製にはG3_F300Y：CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC（配列番号５５）を、4D11-G[3331][T339A]作製にはG3_ T339A ：GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGACAGCC C（配列番号５６）を、341-G2Ser[V309L/T339A]作製にはG3_F300Y及びG3_ T339Aを使用した。実施例５で示した部位特異的変異導入法を行い、得られた各変異抗体発現ベクターの候補プラスミドDNAについてDNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された３種類の抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。それら抗CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG[3331]-4D11-F300Y、N5KG[3331]-4D11-T339A、N5KG[3331]-4D11-F300YT339Aと命名した。【０２０９】
実施例１９  アミノ酸置換変異体抗体の発現・精製、及び精製品の凝集体含有率の測定
実施例１７及び１８で作製した発現ベクターDNAを実施例２に従って発現を行い、得られた培養上清（IgGとして約300μg）から、実施例１３で示した抗体精製用アフニティーカラムであるHiTrap rProtein G HPによる精製を実施した。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表８に示した。4D11-G3抗体は凝集体の含量が30％程度であるのに対して、いずれの変異体とも凝集体は検出されなかった。
【表８】
0004986633.tif 000009
【０２１０】
実施例２０  アミノ酸置換変異体抗体の低pH安定性の評価
4D11-G[3331]にCH2ドメイン内にアミノ酸置換を加えた変異体３種類について、低pH安定性を確認した。実施例１９の精製抗体を用いて、実施例４に従って低pH処理後、実施例３に従って凝集体の含有率を測定した。【０２１１】
その結果、4D11-G[3331]のアミノ酸置換体は、精製後の凝集体精製が抑制されるだけでなく、低pH処理条件においても凝集体の生成が抑制されており、安定性が改善されることが確認された。表９は、IgG3/IgG1ドメインスワップ変異抗体の低pHにおける安定性を示す。
【表９】
0004986633.tif 000010
【０２１２】
実施例２１  IgG3の定常領域アミノ酸変異体の作製
IgG3とIgG1のドメインスワップ変異抗体と各種アミノ酸変異体の安定性改善に関する解析結果を総合的に考慮して、IgG3抗体の安定性を最も改善できる抗体として4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]を作製し、その評価を行なった。4D11-G3 [N392KM397V][R435H]は、IgG3抗体の392番目のアミノ酸残基であるNをKに、397番目のアミノ酸残基であるMをVに、そして435番目のアミノ酸残基であるRをHに変換した３アミノ酸残基の変異体である。また、4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]は、4D11-G3 [N392KM397V][R435H]に加えて、更に300番目のアミノ酸残基のFをYに変換した４アミノ酸残基変異体である。ただし、両変異体ともR435Hのアミノ酸残基の変異は、抗体蛋白質のProteinAによる精製を可能とするために導入した（Ito S et. al., Exp Clin Immunogenet. 1990, 7(2):91-100.）。変異体発現ベクターの作製法は、実施例１２に示したN5KG3−R435H発現ベクターDNAを鋳型とした以外は、実施例５のGeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System（ プロメガ社）による部位特異的変異導入法に従って実施した。変異導入用オリゴヌクレオチドとしては、4D11-G3 [N392KM397V][R435H]作製にはN392KM397V：GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCC（配列番号５７）を、4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]作製にはG3_F300Y：CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC （配列番号５８）及びN392KM397Vの複数のオリゴヌクレオチドを同時に鋳型となるベクターDNAにアニーリングさせた。実施例５で示した部位特異的変異導入法を行い、得られた各変異抗体発現ベクターの候補プラスミドDNAについてDNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された２種類の抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。それら抗CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG3-4D11-[N392KM397V][R435H]、N5KG3-4D11-[F300Y][N392KM397V][R435H]、と命名した。【０２１３】
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]の重鎖をコードする塩基配列並びに重鎖のアミノ酸配列を以下に示す。【０２１４】
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]  重鎖塩基配列（配列番号：５９）
ATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGTTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGATACCCTTATGATTTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCTGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号５９における、シグナル配列と可変領域の境界は７８番目のシトシン(C)と７９番目のシトシン(C)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０２１５】
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]  重鎖アミノ酸配列（配列番号：６０）
MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKLREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号６０における、シグナル配列と可変領域の境界は２６番目のセリン(S)と２７番目のグルタミン(Q)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０２１６】
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]の軽鎖をコードする塩基配列並びに重鎖のアミノ酸配列を以下に示す。【０２１７】
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]  軽鎖塩基配列（配列番号：６１）
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号６１における、シグナル配列と可変領域の境界は６６番目のチミン(T)と６７番目のグアニン(G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０２１８】
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]  軽鎖アミノ酸配列（配列番号：６２）
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号６２における、シグナル配列と可変領域の境界は２２番目のシステイン(C)と２３番目のアラニン(A)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2）を使用）。【０２１９】
実施例２２  4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]抗体の精製品の凝集体形成抑制評価
4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]について、発現ベクターDNAを実施例２に従って発現を行い、得られた培養上清（IgGとして約400μg）から、実施例２に示した方法でHiTrap rProtein A FFを用いて精製を行なった。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表１０に示した。実施例１０や実施例１３に示したように、4D11-G3抗体の凝集体の含量が２０％以上であるのに対して、これら変異体においては、IgG1抗体並に凝集体の割合が１％以下に減少し、大幅に凝集体の生成が抑制されることが見出された。
【表１０】
0004986633.tif 000011
【０２２０】
実施例２３  4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]抗体の低pH安定性の評価
4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]抗体について、低pH安定性を確認した。実施例15の精製抗体を用いて、実施例４に従って低pH処理後、実施例３に従って凝集体の含有率を測定した。【０２２１】
その結果、これらのアミノ酸置換体は、精製後の凝集体生成が抑制されるだけでなく、低pH処理条件においても凝集体の生成が抑制されており、安定性が改善されることが確認された。表１１は、IgG3/IgG1ドメインスワップ変異抗体の低pHにおける安定性を示す。
【表１１】
0004986633.tif 000012
【０２２２】
実施例２４  抗CD40抗体のRamos細胞に対する結合活性
実施例１２および１３で作製したドメインスワップ変異抗体および１アミノ酸置換変異体抗体が、もとの抗体と同等の結合活性を示すかどうか調べるために、CD40が発現するRamos[ATCC]細胞への結合活性を測定した。【０２２３】
2x106/mlの濃度でRamos細胞株を0.1%NaN3、2%FCS含有PBSの染色バッファー（SB）に浮遊させた。細胞浮遊液（100μl／ウェル）を96-well丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。各々のハイブリドーマの培養上清（50μl）を加え、氷温下30分間インキュベートした。陰性コントロールとしてヒト血清アルブミンに対するヒトIgG1抗体を用い、ハイブリドーマ培養培地で２μg/mlの濃度に調製し、50μl添加後氷温下15分間インキュベートした。SBで洗浄した後、250倍希釈したR-PE蛍光標識抗ヒト抗体(Southern Biotechnology社製)50μlを加え、氷温下15分間インキュベートした。SBで２回洗浄した後、300〜500μlのFACS緩衝液に懸濁し、FACS（FACSort、FACScan、ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。【０２２４】
その結果、ドメインスワップ変異抗体および変異体抗体で結合性は変化無かった(図３)。図３中、縦軸の抗体結合量の単位は平均蛍光強度である。isotype controlの値は5.01である。【０２２５】
実施例２５  Ramos細胞における抗CD40抗体によるCD95発現抑制
4D11およびKM281-1-10はアンタゴニスト抗体として知られている。抗体の持つアンタゴニスト活性が、定常領域の構造変化による影響を調べた。Ramos細胞は、CD40リガンドを添加することにより、CD95の発現上昇が観察される。このとき、抗体を添加することにより、CD95の発現上昇が抑制できるかどうかを指標に、抗体のアンタゴニスト活性を評価した。【０２２６】
1.0x106個/mlのRamos細胞懸濁液を96ウエルプレートに50μl/wellで播種した。培養上清又は精製抗体を２μg/mlに培地で調整し、96ウエルプレートに100μl/well添加した。可溶性CD40リガンド（ALEXIS CORPORATION）を４μg/mlと抗FLAG抗体（M2、シグマ）４μg/mlとを培地に添加し、96ウエルプレートに50μl/well添加した。一晩培養後、細胞を集めR-PE標識抗CD95抗体（Pharmingen NJ）を用い、FACSを使って解析した。【０２２７】
その結果、定常領域の構造変化によって、抗体のアンタゴニスト活性に変化は見られなかった（図４）。図４中、縦軸のCD95発現量の単位は平均蛍光強度である。isotype controlおよびCD40(-)の値は、それぞれ27.17および6.59である。【０２２８】
ヒトIgG3重鎖定常領域には多型が存在し、以下がコンセンサス配列である。本発明の変異を下記コンセンサス配列（配列番号６３）に適用した重鎖定常領域を有する抗体も本発明に含まれる。下記配列中、例えば下線を付した300番目のF、399番目のT、392番目のN、397番目のMおよび435番目のRを変異させることにより、本発明の安定化抗体を得ることができる。【０２２９】
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０２３０】
配列番号９〜１４、２３〜２９および４２〜５８  プライマー
【図１Ａ】
0004986633.tif 000013
【図１Ｂ】
0004986633.tif 000014
【図１Ｃ】
0004986633.tif 000015
【図２Ａ】
0004986633.tif 000016
【図２Ｂ】
0004986633.tif 000017
【図２Ｃ】
0004986633.tif 000018
【図３】
0004986633.tif 000019
【図４】
0004986633.tif 000020
【配列表】
0004986633000001.app