(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）関節炎；（ｂ）哺乳動物における軟骨形成の促進；及び（ｃ）軟骨細胞の細胞増殖の促進よりなる群から選んだ、哺乳動物の処置用の、製薬上許容しうる担体又は希釈剤との混合物での次式（ＩＩ）
【化１】
0004959098.tif 000015
のＮ−アシル化−２−グルコサミン誘導体を含有してなる製薬組成物。
【請求項２】
前記のＮ−アシル化−２−グルコサミン誘導体を製薬上許容しうる担体又は希釈剤と混合することからなる、請求項１に記載の製薬組成物の製造方法。
【請求項３】
前記関節炎は、骨関節症である、請求項１に記載の製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はＮ−アシル化したグルコサミン即ちグルコサミン誘導体に関し； 該誘導体を用いて哺乳動物における関節炎、特に骨関節症及び炎症性関節症を処置し、軟骨形成を促進し、軟骨細胞の細胞増殖及びグリコサミノグリカンの生産を促進する方法に関し；及び前記のＮ−アシル化グルコサミン誘導体を含有してなる製薬組成物に関する。
【０００２】
（背景技術）
糖配合体（glycoconjugates）は多数の生物的プロセスに重要な役割りを演じることは知られている。炭水基は、配座安定性、プロテアーゼ耐性、荷電及び水結合能力の如き重要な物性を付与し；且つ配列多様性が標的のタンパク質及び細胞間の相互作用に信号を与える生物的認識を付与する（ポールソン1989）。結合組織母材の糖配合体は、Ｎ−アセチル化されたヘキソサミンよりなる。然しながら、Ｎ−アセチル部分の機能は知られていない。
【０００３】
哺乳動物における関節炎の2つの主要な形態は、リウマチ様関節炎（RA）の如き炎症性関節炎、及び機械的ストレス、老化、異形成症状及び/又は損傷に副次的に生起することが多い軟骨の進行性で変形性的な減損である骨関節症（OA）である。OAでの疼痛は通常NSAIDS（非ステロイド系の抗炎症性薬剤）で処置される。RAでの炎症及び疼痛はNSAIDSで処置され、新規なCOX−2阻害剤（またNSAIDS）で処置され、しかもまたメトトレキセートの如き抗代謝物で処置される。臨床用途又は試験における他の免疫調節剤にはインターロイキン及びTNF受容体拮抗物質がある。グルコサミンはOAにおける疼痛に対して人気のある、処方箋の要らない、医療（neutraceutical）処置剤である。RA及びOAは異なる病理性を有するので、1方の病理性に対する処置剤が他方の病理性に対する処置剤を生起するとは自明でない。J. Rheumatol.（リウマチ学）（1999）26；11−アナスタシエ−デス T.,の最近の観察が認める処によれば、グルコサミン/OA臨床試験の多数の報告では明白な所見を示しているが、作用機序は解明されていない。
【０００４】
グルコサミンがきわめて多量の投与量でさえヒトに投与される時は、経口投与又は静脈内投与後に血清濃度が検出し得ない時点まで循環から迅速に除去される。
【０００５】
グルコサミン誘導体を有効な治療剤として試験した。グルコサミンと対比した時、Ｎ−アセチルグルコサミン（GluNac）は多価形又は一価の形でヒトに投与した時、より長い半減期を有することが示された（Clin. Ther. (1996)18:1184）が、薬効データは記録されなかった。この文献はGluNacをOAに対する有効な治療剤として提案しているが、血清濃度は別として治療に対する何らの理論的根拠を提案しなかった。
【０００６】
多数の特許例えば米国特許第4,314,999号、米国特許第5,696,098号及び欧州特許第356275号は、即ち共有結合されたオリゴ糖又は多糖の構成成分であるアミノ糖の化学的変性物を論じているが、単糖即ちグルコサミンの如き単一糖分子の化学的変性物である本発明の化合物ではない。
【０００７】
軟骨保護作用の理論にも拘らず、牛の軟骨細胞に生体外で投与した時、グルコサミンは軟骨細胞の成長又は生存さえ支持しなかった。グルコサミンの存在下では、牛の軟骨細胞は培地中でグルコサミンの不在下におけるよりもずっと緩慢に成長し、これはグルコサミンが軟骨保護剤として作用していないことを示唆する。生化学的薬理学（Biochem. Pharmacol.）（1973）22；3018アナスタシア−デスT.が記載する処によればグルコサミンのプロピオニル誘導体は実際上、グリコサミノグリカンの旧式用語であるムコ多糖類中への標識されたグルコサミンの取込みを阻害し、それ故この文献はＮ−プロピオニルグルコサミンは軟骨の形成を阻害することを教示している。
【０００８】
プロテオグリカン（PG）は、長鎖多糖（グリコサミノグリカン、GAGs）が連結した非コラーゲン質のタンパク質核よりなる。PGはその生物力学特性を考慮して軟骨の重要成分である。型式IIのコラーゲンは、軟骨の別の基本成分である。これらの2成分をかくして軟骨合成及び分解用の生体外代用薬マーカーとして単独で又は組合せて用いることが多い。Beekman R. (1998)関節の軟骨細胞；細胞外母材の合成及びMMP−仲介分解。TNO防止及び健康のガウビウス（Gaubius）研究所（オランダ）からの論文（ISN90−9011354−1）。
【０００９】
（発明の開示）
関節炎特に骨関節症、炎症性関節症、外傷性関節炎、変形性関節炎及び異形成関節炎を処置する方法を提供するのが本発明の1目的である。
【００１０】
関節硬直及び限定された可動性の関節炎の望ましくない症候を軽減する方法を提供するのが本発明の別の目的である。
【００１１】
軟骨形成を促進する方法を提供するのが本発明の別の目的である。
【００１２】
哺乳動物の軟骨細胞の細胞成長を促進する方法を提供するのが本発明の別の目的である。
【００１３】
哺乳動物におけるグリコサミノグリカンの生産を促進する方法を提供するのが本発明の別の目的である。
【００１４】
Ｎ−アシル化グルコサミン誘導体の促進効果について牛の軟骨（BAC）成長検定の最適化にＮ−アシル化グルコサミン誘導体の使用を提供するのが本発明の別の目的である。
【００１５】
従って1つの要旨において、本発明は一般式（I）
0004959098.tif 000002
（式中Rは式CnH2n+1のアルキル基であり、nは2〜12から選ばれる）のＮ−アシル化−２−グルコサミン誘導体；及びこれの製薬上許容しうる塩、エステル及びグルコシドを有効量で哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物における関節炎、特に骨関節症及び炎症性関節症の処置方法を提供する。
【００１６】
nは2〜5から選ぶのが好ましくは、3であるのがより好ましい。
【００１７】
別の要旨においては、本発明は軟骨細胞の細胞集団を前述の如きＮ−アシル化−２−グルコサミン誘導体の有効量で処置することからなる、軟骨細胞の細胞増殖を促進する方法を提供する。
【００１８】
本明細書において、グルコサミン及びそのＮ−アシル化誘導体についての全ての記載は2−アミノ−2−デオキシ−D−グルコース及びそのＮ−アシル化誘導体（DGlcNs）を意味する。
【００１９】
本明細書において、用語「哺乳動物」はヒト、特に犬を包含するが、これに限定されるものではない。
【００２０】
詳しく言えば、好ましい化合物は次の通りである；
N−ブチリル−D−グルコサミン（2−n−ブタンアミド−2−デオキシ−D−グルコピラノース）（GlcNbu）；
N−バレリル−D−グルコサミン（2−n−ペンタンアミド−2−デオキシ−D−グルコピラノース）（GlcNva）；
N−カプリル−D−グルコサミン（2−n−ヘキサンアミド−2−デオキシ−D−グルコピラノース）（GlcNca）
及びこれの分枝アルキル異性体例えば第2級及び第3級同族体。
【００２１】
最も好ましい化合物は次式II
0004959098.tif 000003
のＮ−ブチリル−D−グルコサミンである。
【００２２】
別の要旨においては、本発明は前述の如きＮ−アシル化−２−グルコサミンの有効量で軟骨細胞を処置することによりグリコサミノグリカンの生産を促進する方法を更に提供する。
【００２３】
なお別の要旨においては、本発明は前述の如きＮ−アシル化−２−グルコサミンの有効量を哺乳動物に投与することにより哺乳動物における軟骨の成長及び形成を促進する方法を提供する。
【００２４】
なお別の要旨においては、本発明は、処置を受ける被検者における軟骨の成長を検出するのに標識されたＮ−誘導化グルコサミンモノマーの使用を包含する診断試験を提供するものであり、本発明で用いる化合物は成長中の軟骨に取込まれるからである。
【００２５】
Ｎ−アシル化誘導体は例えば次の方法の1つにより即ち経口投与、静脈内投与、動脈間投与、経皮的又は皮下投与により哺乳動物に投与できる。
【００２６】
Ｎ−アシル化誘導体は典型的には適当な担体として投与でき、該担体中で有効成分は液体に溶解又は懸濁しており、該担体は血流から又は経皮的に関節炎の部位にＮ−アシル化グルコサミンを供給できる。溶液組成物は典型的にはアルコール溶液、ジメチルスルホキシド溶液又は例えばポリエチレングリコールを含有する水溶液である。かかる担体は技術的に周知であり、作用部位に有効成分を供給する目的に有用である。実施に当って、有効成分は血流の水性雰囲気中では沈澱するような有効成分を沈澱しないように防止する溶剤中に投与せねばならない。溶剤のジメチルスルホキシドはかかる溶剤の1つである。
【００２７】
前述の如き活性なＮ−アシル化グルコサミンは、(a)関節炎の症候を軽減し、(b)哺乳動物における軟骨の形成を促進し、(c)軟骨細胞の細胞増殖を促進し、(d)グリコサミノグリカンの生産を促進し且つ（e)関節が硬直し可動性が限定された関節炎に伴なう症候を緩和するのにそれぞれ有効な量で存在することは当業者に了解されるであろう。
【００２８】
本発明をより良く理解するために、添附図面を参照しながら好ましい具体例を例として以下に記載する。
【００２９】
図1は濾紙上のDGlcNsのクロマトグラフ図である。DGlcNsはn−プロパノール/水/1M酢酸ナトリウム（pH5）（７：２：１容量/容量）溶剤を用いて3mmのワッツマン濾紙上でクロマトグラフ分析した。クロマトグラフにアセチルアセトン及びp−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬を連続的に噴霧し、乾燥させた。レーン1、GlcNca；レーン2、GlcNva；レーン3、GlcNbu；レーン4、GlcNpr；レーン5、GlcNac；レーン6、GlcN。
【００３０】
図2はアニオン交換（アンバーライトIRA−400 OH）カラム上でトリチウムで標識したGlcNbuの溶出分布図である。カチオン交換後に、水で予備洗浄したカラム上にGlcNbuを装填した。カラムを水で溶出し続いてMgCl2勾配（0.1〜1M）で溶出し、1ml/3分のフラクションを収集した。Oは3H放射能を表わし、−はMgCl2濃度を表わす。
【００３１】
図3はMgCl2勾配を用いてアニオン交換カラム（1.5×30cm）上のGlcNbuの溶出分布図である。流速は1ml/10分であり、Oは放射能であり、−はMgCl2濃度を表わす。
【００３２】
図4はMgCl2勾配を用いてアニオン交換（Cl−）カラム上のGlcNbuの溶出図である。Oは放射能であり、−はMgCl2濃度を表わす。
【００３３】
図5はアニオン交換樹脂カラムのヒドロキシル形（A）及びアニオン交換樹脂カラムのクロライド形（B）から凍結乾燥したGlcNbuのBio−Gel P2カラムクロマトグラフィー図である。GlcNbuは主要なピークである。
【００３４】
図6はバイオ−ゲル（Bio−Gel）P2カラム上でGlcNbuの精製図である。カラムを平衡化させ、水で溶出した。流速は1ml/10分である。
【００３５】
図7Aは濾紙上でクロマトグラフにかけたGlcNbuの精製済み試料の写真図である。GlcNbuを濾紙上でクロマトグラフにかけ、アセチルアセトン及びp−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬を連続的に噴霧した。レーン1はカチオン交換後であり；レーン2はアニオン交換（OH−）続いてBio−Gel P2後であり；レーン3はアニオン交換（Cl−）続いてBio−Gel P2後であり；レーン4はBio−Gel P2後であり；レーン5はカチオン交換後であり；レーン6はBio−Gel P2後である。レーン5及び6のGlcNbuは非放射性である。
【００３６】
図7BはGlcNbu試料のクロマトグラフ図である。図6Aのレーン1〜4についてクロマトグラフ用紙の1インチの寸法を起点から開始して切断し、計数した。Aはアニオン交換クロマトグラフィー後に得られたGlcNbuであり；Bはアニオン交換（OH−）及びBio−Gel P2クロマトグラフィー後に得られたGlcNbuであり；Cはアニオン交換（Cl−）続いてBio−Gel P2クロマトグラフィー後に得られたGlcNbuであり；DはBio−Gel P2クロマトグラフィー後に得られたGlcNbuである。
【００３７】
図8は変換成長因子−β（TGFβ；10μg/ml）の存在下に且つ不在下に軟骨細胞の増殖におけるDGlcNs（1mg/ml）の作用を表わす図である。BAC継代培養の6代の細胞をそれぞれの供試材料で処置した；□は対照であり；OはGlcNacであり；●はGlcNprであり；▽はGlcNbuであり；▼はGlcNである。細胞を収穫し、種々の期間（0〜10d）で計数した。
【００３８】
図9は軟骨細胞の細胞増殖における血清及びGlcNbuの作用を表わす図である。BAC継代培養の7代の細胞を、種々の中位血清で種々のGlcNbu濃度で7d間処置した。細胞数は7日目で計数した最終細胞数を表わす。○は10%の血清を表わし、●は20%の血清を表わす。
【００３９】
図10は軟骨細胞の細胞増殖におけるGlcNbu、GlcN及びナトリウム  ブチレートの作用を表わす図である。BAC継代培養の6代の細胞を指命した薬剤で6d間及び12d間処置し、細胞をこれらの日数で計数した。○は6d間のGlcNbuを表わし；●は12d間のGlcNbuを表わし；▽は6d間のGlcNを表わし；▼は12d間のGlcNを表わし；□は6d間のナトリウム  ブチレートを表わし；■は12d間のナトリウム  ブチレートを表わす。
【００４０】
図11は種々の中位のグルコース濃度で軟骨細胞の細胞増殖におけるGlcNbuの作用を表わす図である。培養した細胞を、指示した濃度のGlcNbu及びグルコースで7d間処置し、細胞数を7日目に測定した。上方のパネル及び下方のパネルは初期のBAC継代培養の1代の細胞及び後期のBAC継代培養の8代の細胞に対してそれぞれ細胞数を表わす。Oは0.125mg/mlのグルコースを表わし；●は0.25mg/mlのグルコースを表わし；▽は0.5mg/mlのグルコースを表わす。
【００４１】
図12は初期のBAC継代培養の1代の細胞（上方のパネル）及び後期のBAC継代培養の8代の細胞（下方のパネル）においてグルコース及びGlcNbuの作用の比較を表わす図である。□はグルコースなしを表わし；▽は0.06mg/mlのグルコースを表わし；Oは0.125mg/mlのグルコースを表わす。
【００４２】
図13は種々の期間で軟骨細胞の継代培養の2代及び8代の細胞増殖におけるグルコースの作用を表わす図である。Oは4d間を表わし；●は7d間を表わし；▽は10d間を表わし；▼は14d間を表わす。
【００４３】
図14は牛の関節の軟骨細胞によりグリコサミノグリカン合成におけるGlcNBuの作用の図表を表わす。
【００４４】
（発明を実施するための最良の形態）
実験手法
ヘキソサミン誘導体の合成
N−アセチルグルコサミン（GlcNac）、N−プロピオニルグルコサミン（GlcNpr）、GlcNbu、N−バレリルグルコサミン（GlcNva）及びN−カプロイルグルコサミン（GlcNca）を包含するDGlcNsは、グルコサミン（GlcN）及び/又は［3H］−GlcN及びそれぞれの炭酸無水物を用いて従来記載した方法（アナスタシア−デスT.,生化学薬理学22：253〜259、1973）の改良により合成された。ヘキソサミン誘導体をカチオン交換樹脂に通送して無機カチオン及び何らかの未反応グルコサミンを除去し、凍結乾燥し、使用するまで−20℃の冷凍庫に貯蔵した。元の［3H］−GlcNからの呈色反応と放射能との両方を用いて生成物の生成工程と精製工程とを評価した（アナスタシア−デスT.,生化学薬理学22：253〜259、1973）。これらの誘導体はカイゼルら（Experienta 49：885〜887、1993）及びパートリッジS. M.（Biochem. J 42：238〜250、1948）の方法を用いて濾紙上でクロマトグラフにかけた。
【００４５】
N−ブチリルグルコサミン（GlcNbu）の精製
カチオン交換カラムからの凍結乾燥したGlcNbuを約3mlの水で再構成し、水で予備洗浄したアニオン交換カラム（アンバーライトIRA−400 OH；1.5×30cm）上に施用した。該カラムを約400mlの水で洗浄し、その後1ml/3分の流速で塩化マグネシウム（MgCl2）勾配（0.1〜1.0M）で溶出した。0.05mlの分量分の放射能を測定した。放射能は、フラクションの分量分を5mlのシンチレーション液（Ecolume, ICN）と混合した後にラックベータ（Rackbeta）の液体シンチレーション計数計（Fisher Scientific社）で測定した。カラム  フラクションの導電率はコール  パーマー（Cole Parmar）の導電率計（シカゴ、米国）を用いて測定した。GlcNbuに対応するカラム  フラクションをプールし、凍結乾燥し、Bio−Gel P2カラム上で脱塩した。
【００４６】
ヒドロキシド形のアンバーライトIRA−400樹脂を塩化ナトリウムの溶液を用いてクロライド形に転化した。これは樹脂を塩化ナトリウムの10%溶液で一夜洗浄し、続いて2d間水で洗浄することにより行ない、該樹脂を使用するまで水中に保持した。3mlの再構成した試料を、水で予備洗浄したBio−Gel P2カラムに施用した。カラムを先ず水で溶出し、続いて1ml/10分の流速でMgCl2勾配（0.05〜0.5Ｍ）で溶出した。GlcNbuに対応するカラム  フラクションをプールし、凍結乾燥し、続いてBio−Gel P2カラム上でクロマトグラフにかけた。
【００４７】
水（2ml）に再構成したGlcNbuを、水で予備洗浄したBio−Gel P2カラム（1.5×70cm）に施用した。カラムを1ml/10分の流速で水で溶出し、フラクションの分量分の放射能を液体シンチレーション計数により測定した。
【００４８】
大規模でのN−（2,4,5−トリヒドロキシ−6−ヒドロキシメチル−テトラハイドロ−ピラン−3−イル）−ブチルアミド（N−ブチリルグルコサミン、GlcNBu）の合成
この方法はイノウエらのJACS 78, 4722(1956)による手法に基いた。
【００４９】
グルコサミン塩酸塩（20g、93ミリモル）を、メタノール（無水、150ml）とナトリウムメトキシド（MeOH中の30重量%溶液、1当量、16.7g、17.39ml）との溶液に添加した。該溶液を5分間温和に混合し、得られる塩化ナトリウム沈澱物は微細な焼結ガラス漏斗の使用で濾去した。
【００５０】
次いで酪酸無水物（1.2当量、111.6ミリモル、17.66g＝18.2ml、アルドリッヒ  ケミカル社から入手）を濾液に急速攪拌しながら1回で添加し、大体5分後に該溶液は混濁し、生成物の沈澱が開始した。次いで反応混合物を一夜攪拌した。次いで反応混合物を0℃で一夜冷却した。次いで粗製のN−ブチリルグルコサミンを濾過し、少量の冷メタノールで洗浄し次いで少量の冷エタノールで洗浄し、最後にジエチルエーテル（200ml）で洗浄した。次いでこの粗製のN−ブチリルグルコサミンをソックスレー抽出器に装填し、エタノールで抽出した。ソックスレー抽出によって溶剤容量を>50%低下させながら完全な洗浄/再結晶を行なった。次いで生成物のエタノール混合物を冷室で一夜冷却し、生成物を濾過により単離した。生成物は冷エタノールの1回の少量分で洗浄し続いてジエチルエーテル（50ml）で洗浄した。これによって大体８０％の全収率で純粋な白色の結晶質粉末としてGlcNBu）を得た。凍結乾燥後に、該化合物は212〜213℃の融点を有した（lit 212℃、イノウエ）。
【００５１】
物性；
212〜213℃の融点（lit 212℃、イノウエ）、未補正
1H NMR 200 MHz, (D2O)δ(ppm); 5.02 d, −0.5H, β−アノマーH, J=3.4Hz; 4.53, d, 〜0.5H, α−アノマーH, J=8.1Hz; 3.8−3.2, m, 6H, 糖−H, CH2−OH; 2.1, td, 2H, CH3CH2CH2−CO−, J=3.1Hz, 6.9Hz; 1.45, 六重項, 2H, CH3CH2CH2−CO−, J=6.9Hz; 0.73, td, 3H, CH3CH2CH2−CO−, J=1.5Hz, 6.9Hz.
HPLC; 逆相HPLC, 250×4.6ｍｍ（5ミクロン）LC 8,300オングストロームのビーズカラム。移動相50%MeOH/50%H2O；流速1.0ml分；UV検出@215nm。生成物の2つのアノマーの保持時間3.264分及び3.407分。
【００５２】
MS(質量分析法)ES+ イオン化による、m/z；288.2（M+K+）、272.1（100%、M+Na+）、250.2（M+H+）。
【００５３】
NMR及びHPLCデータによれば前記反応から得られる最終生成物は１：１の概略比のα−アノマーとβ−アノマーとの混合物であることを示した。
【００５４】
次の化学構造は本発明の実施に用いる好ましい化合物及び最も好ましい化合物を表わす。
【００５５】
0004959098.tif 000004
0004959098.tif 000005
0004959098.tif 000006
0004959098.tif 000007
0004959098.tif 000008
0004959098.tif 000009
前記の化合物はβ−アノマー及び非特定のアノマーについて例として以下に示した反応図式により形成できる。
【００５６】
0004959098.tif 000010
0004959098.tif 000011
0004959098.tif 000012
0004959098.tif 000013
ペーパークロマトグラフィー
水に入れた5マイクロリットルの再形成ヘキソサミン誘導体（100μg/5μl）をワッツマン3MM濾紙上に点描し、下行ペーパークロマトグラフィーを前記のカイゼルら（1993）によって記載の如く実施した。前記のパートリッジ（1948）の方法を適合してグルコサミン誘導体及びヘキソサミン誘導体の存在を具現した。放射能の測定については、クロマトグラムからの1インチ（2.54cm）に切断した紙片をシンチレーション計数により測定した。
【００５７】
細胞培養
軟骨のスライスを牛のヒザ関節から無菌的に取出し、コラゲナーゼで消化して単細胞の軟骨細胞を得た。一次培養と継代培養との両方は前記の方法により確立された（Chan C. 及びAnastassiades T.のBiochem Cell Biol. 74：233〜240（1996）；Howard S.及びAnastassiades T.のJ Rheumatol 20；2083〜2094、（1993））。成長分析については、細胞は、グルコース（1mg/ml）及び血清（10%）を補充したグルコース無含有ダルベッコ改質イーグル培地基質中でそれぞれ24枚及び6枚のくぼみ平板（well plates）につき15,000個の細胞/くぼみ及び33,000個の細胞/くぼみで接種した。これらの細胞は37℃で95%の空気と5%の二酸化炭素との加湿雰囲気中で培養した。次の日に、培地を当該供試材料含有の新鮮な培地と交換した。細胞を或る間隔で収穫し、細胞数はコールター  カウンター（コールター  エレクトロニクス社、米国）を用いて測定した。結果は3回反復したくぼみの平均として表わし、各々のくぼみは2回計数した。データは平均±SEMとして表わす。
【００５８】
結果及び討議
ヘキソサミン誘導体
元のヘキソサミンはDGlcNに100%転化された。合成した5種の相異なるDGlcNsは下降ペーパークロマトグラフィーにより分析した。DGlcNsの各々について2個のスポットが観察された（図1）。上方の主要なスポットはヘキソサミン誘導体を表わし、然るに下方の小さなスポットは不純物である。然しながら、DGlcNsは改質したＮ−アシル側鎖の長さに応じて種々の速度で移動する。GlcNcaは、GlcNva続いてGlcNbu、GlcNpr及びGlcNacよりも速く移動する。小さな製造規模で少数の汚染生成物からアシルヘキソサミンを如何に精製するのが最良であるかについて問題が生ずる。
【００５９】
次いでGlcNbuについて次後の精製工程を評価した。先ず、GlcNbuを、1ml/3分の流速でMgCl2勾配（0.1〜1.0M）でアニオン交換（アンバーライトIRA−400 OH）カラムから溶出した（図2）。カラム  フラクションとして非晶質結晶の溶出が、GlcNbu の最初の数フラクションの溶出前に及び溶出中に観察された。より良い分離を達成するために1ml/10分に流速を低下させると同様な溶出図形を得た（図3）が、非晶質結晶の形成は増大する。1ml/10分の流速で行なった。GlcNbu精製におけるMgCl2濃度の作用を測定する実験では、MgCl2勾配が水−0.5M又は0.05−0.5Mである時に図3に示したのと同様な分布図が観察された（データは示さず）。非晶質の結晶は希塩酸に可溶性であり、かくしてMgCl2とアニオン交換樹脂のヒドロキシド形との間でアニオンの交換により生成した水酸化マグネシウムであり得る。全てのアニオン交換カラムにおいて、MgCl2勾配曲線は急勾配であった。アニオン交換樹脂のヒドロキシル基をクロライドの形で置換した時は、GlcNbuはカラムに結合せず、それ故水で溶出された（図4）。カラムを更にMgCl2勾配（0.05〜0.5M）で溶出した時は第2のピークが得られた。カラム  フラクション中のMgCl2濃度はヒドロキシド形で示される急激な増大とは異なってアニオン交換樹脂のクロライド形では徐々に増大した。アニオン交換樹脂カラムのクロライド形は、水での溶出を比較的容易としながらGlcNbu合成生成物から不純物の除去に有用な工程である。不純物はアニオン交換樹脂に結合し、然るにGlcNbuは溶出される。
【００６０】
図5AはBio−Gel P2カラムでのGlcNbu（アニオン交換樹脂カラムのヒドロキシド形から得られた）の溶出分布を示す。アニオン交換工程の最初のクロライド形後に、Bio−Gel P2カラムでGlcNbuを精製すると主要なピークを示した（図5B）。アニオン交換後、続いてBio−Gel P2クロマトグラフィー後のGlcNbuの収率は大体80%である。
【００６１】
Bio−Gel P2カラムのみを用いてのGlcNbuの精製は3個のピークを示す（図6）。第3のピークは大体90%の収率でGlcNbuに相当する。Bio−Gel P2カラムで得られた純度は、アニオン交換樹脂の塩化物形で得られる純度と同じ位良好である。ペーパークロマトグラフィーから得られた結果が示す処によれば、Bio−Gel P2カラムクロマトグラフィーはアニオン交換クロマトグラフィーと対比して高度に精製したGlcNbuを入手するより良い方法であることを約束する（図7A及び7B）。それ故、Bio−Gel P2カラムは、細胞の成長分析について非放射能GlcNbuを精製するのにも用いた（図7A）。
【００６２】
培養物中のBAC成長におけるDGlNsの作用
最初の研究は、グルコース（0.5mg/ml）、TGF−β（10μg/ml）及び血清（10%）を補充した培地中に維持した軟骨細胞(BAC継代培養6代)の増殖における1mg/mlのGlcN、GlcNac、GlcNpr及びGlcNbuの作用を検査した。GlcNbuは細胞の成長を有意な程に促進したが、然るにGlcNac及びGlcNprは細胞の成長にずっと低下した作用を有した（図8）。DGlcNsと同じ濃度ではGlcNは対照と比較して細胞の成長を阻害した（図8）。種々の血清及びGlcNbu（0.4〜10mM）濃度では、GlcNbu及びグルコース（1mg/ml）の存在下では10%血清よりも20%血清で細胞成長が更に増大した（図9）。10%より低い血清濃度では細胞はかろうじて成長する（データは示さず）。
【００６３】
成長促進がブチレート基に困るものであり得るか又はGlcNbuに単独で左右されるメカニズムに困るものであり得るかどうかを測定するのに別の実験を実施した。この場合には、グルコース（1mg/ml）、血清（20%）および種々の濃度（0〜6mM）のナトリウム  ブチレート、GlcNbu及びGlcNの存在下に軟骨細胞(BAC継代培養6代)を培養物中に維持した。GlcNbuは細胞の成長を増大したが、GlcN及びナトリウム  ブチレートは細胞の成長を低下させた（図10）。これはGlcNbuがGlcN及びブチレートに代謝転換されることなく細胞に完全なまま関与することを示唆し、細胞膜内でその輸送に問題はない。それ故、観察される成長促進はGlcNbuに困るものである。種々のグルコース中位濃度（0〜0.5mg/ml）でGlcNbuの作用は初期及び後期の継代培養した軟骨細胞を用いて評価した。初期と後期との両方の継代培養した軟骨細胞の細胞成長のGlcNbu促進はグルコースの不在下で又はごく低いグルコース濃度でより高い（図11及び図12）。種々の期間で細胞成長におけるグルコースの作用に対する投与量応答曲線は、グルコース濃度の増大と共に細胞数の低下を示した（図13）。これは軟骨細胞がそれらの代謝作用にはグルコースを殆んど又は全く必要とせず、従って他の栄養源を利用し得ることを示唆する。
【００６４】
牛の関節軟骨細胞によりグリコサミノグリカン合成におけるGlcNBuの作用を測定するのに別の実験を実施した。
【００６５】
牛の関節軟骨細胞を35mmのくぼみ中で融合するまで成育させ、種々の濃度のGlcNBuの存在下に4日間35Ｓで標識した。グリコサミノグリカン（GAG）を培地から単離し、単離したGAGに取込まれた放射能を測定した。
【００６６】
図14を参照するに、結果は1個のくぼみ当りの基準で表わし、4個の反復くぼみからの平均値及び標準偏差を表わす。縦軸はGAGに取込まれた放射能の量を示す。横軸は各々の処理につきGlcNBuの濃度（0.1+10mM）を示す。対照（GlcNBuの0mM濃度）は82,000CPMを示している左側の第1の個所であり、GlcNBuの最低濃度は112,000CPMを示している0.1mMである。
【００６７】
ラットの炎症性関節炎モデルへのGlcNBu投与
この研究ではGlcNBuをGlcNと対比してラットにおいて実験的に誘発した炎症性関節炎における相対的な作用を測定した。
【００６８】
GlcNBuは次式（II）；
0004959098.tif 000014
を有する。
【００６９】
実験的な関節炎はルイス種ラットの腹腔内に連鎖球菌の細菌の細胞壁を注射することにより誘発した。得られる関節炎は注射したラットにおいて軟骨及び骨の破壊を生起する。この実験モデルはヒトの炎症性、破壊性関節症の進展に最も有用な洞察力の若干を提供すると考えられる。
【００７０】
方法：炎症性関節炎は、Brahm E.の「リウマチ様関節炎の動物モデル。病因及び処置への手掛り」Clin Orthop. 1991、4月；（265）；42〜53に記載される如く連鎖球菌壁のペプチー多糖抗原の腹腔内注射1回によりルイス種のラットに誘発された。Van den Broek MF, Van Bruggen MC, Simpson SA, Severijnen AJ, Van de Putte LB, Van den Berg WB.「ルイス種及びF344種ラットにおける連鎖球菌細胞壁で誘発した関節炎の発赤反応；Tリンパ球の役割」Clin Exp Immunol. 1990 2月；79(2)；297〜306。Chen W, Jin W, Cook M, Weimer HL, Wahl SM.「グループAの連鎖球菌細胞壁の経口供給は循環性TGF−ベータを増大し、連鎖球菌細胞壁の関節炎を抑制する」J Immunol. 1998 12月1；161(11)；6297〜304を考察されたい。注射と同じ日に、ラットに400mlの水に5mg又は50mgのGlcN又はGlcNBuの何れかを補充した飲料水を与えた。前記群の各々に3匹のラットを用いた。ラットは制限を受けない方法で前記化合物を含有する水を飲用した。飲料水は飲干した時補充し、こうしてラットは実験観察期間に亘って同じ濃度の化合物を飲用した。各々のラットは群の各々につき毎日大体20〜30mlの水を消費した。実験観察の18日後に、関節炎の発生の臨床評価のためラットの後ろ足を肉眼で見て検査した。
【００７１】
結果：飲料水中に5mgのGlcNで処置されたGlcN L経口（Oral）2とここで同定されるラットは後ろ足下方部の両方に腫脹と発赤とを有しながら十分に発達した関節炎を示した。5mgのGlcNBuで処置された匹敵しうる動物であるGlcNBu L経口2と同定されるラットは正常な後ろ足下方部を示し、関節炎の臨床的な徴候は示さなかった。
【００７２】
飲料水に50mgのGlcNで処置されたGlcN H経口1と同定されるラットは右後ろ足で腫脹と発赤とを有し左後ろ足では余りそうでない十分に発達した関節炎を示した。50mgのGlcNBuで処置された匹敵しうる動物であるGlcNBu H経口1と同定されるラットは右後ろ足で最小の腫脹と恐らくは正常な左後ろ足とを示した。
【００７３】
犬の研究−1
方法
1匹につき500mgに設定した毎日の投与量で異形成関節炎の犬に1週間投与した。日誌及びビデオの記録を保持した。
【００７４】
検体
検体（患者）は、先の左前十字靭帯損傷（以前の裂傷は今や回復している）に因る骨関節炎を有する9才令の雌のコリー雑種犬であった。コリー犬は脚の損傷から認め得る程の跛行を示した。コリー犬は現在1日につき500mgのグルコサミンで処置されている。
【００７５】
フェーズ（段階）1  グルコサミンでの処置を中止した時に、その代りに1週間の期間1日につき500mgで以下ではMGDと呼ぶGlcNBuを食物上にそそいだ溶液として投与した。
【００７６】
フェーズ2  1週間のMGD投与後に、MGDを引込め、1週間追加の薬剤（nutraceutical）（グルコサミン又はMGD）を与えることなくコリー犬を観察した。
【００７７】
フェーズ1とフェーズ2との両方について、2回又は3回のコリー犬の運動期間の数分間のビデオ日記と時折りに観察した日誌とを保持した。
【００７８】
日誌の記入表題は次の通りである；
1.  グルコサミンと対比して一般的な可動性/硬直が増大するか/減少するか/あるいは同じ状態のままであるか。
これは日毎の基準でグルコサミンと対比してMGDの有効性を評価するものである。
【００７９】
2.  経過する日毎に一般的な可動性/硬直が増大するか/減少するか/又は同じ状態のままであるか。
これは前日と対比して可動性及び硬直を評価するものであり、即ちMGDの何らかの累積作用を入手するよう試みるものである。
【００８０】
3.  気性：増大する/減少する/同じ状態のままである。
気性の一般的な増大は苦痛の減少及び/又は可動性の増大と係合し得るか、逆もまた同様である。
【００８１】
4.  食餌/飲料挙動：正常/異常
これはコリー犬に対するMGDの美味性を評価するものである。
【００８２】
ビデオ日誌の記入事項は次の通り行なった；
フェーズ1  日##      時      日      時      日      時
フェーズ2  日##      時
結  論
日誌の証拠
MGDを投与するこの1週間の研究では、MGDはグルコサミンと少なくとも同じ濃度で耐容される。更には、その保護作用はグルコサミンと少なくとも同じ程度に良好であると思われる。飼い主によって完成した日誌には、グルコサミンと対比してMGDの保護作用の減少を示さない。フェーズ2においてMGDを中断した時は、コリー犬を観察するとフェーズ2の7日目にコリー犬のわずかな跛行の再発を示した。この跛行は飼い主によって報告される通り「予期されない」ものであり、かくしてMGDでの非処置の直接的な結果として見られた。
【００８３】
ビデオの証拠
フェーズ1からのビデオクリップは基線（グルコサミンで処置したコリー犬の第1のビデオクリップ）からの認め得る程の差異を示さなかった。フェーズ1の間の1つのビデオクリップは早晩よりもむしろ朝に録画され、飼い主が知らせる処によれば、コリー犬はグルコサミンを摂取した時でさえ朝には硬直しており、ビデオの証拠はこの観察を反映している。
【００８４】
フェーズ2の7日目に録画したビデオクリップ（全体で14日目）はずっと硬直した歩行とわずかな跛行とを示した。飼い主はこれはコリー犬には異常な挙動であると述べている。
【００８５】
他の観察
MGDはコリー犬には快適であり、不利な反応は観察されなかった。コリー犬の気性は研究期間中平穏なままであり、食餌及び飲料挙動は変化しなかった。
【００８６】
犬の研究−2
方法
500mgに設定した毎日の投薬量で関節炎/異形成の犬に1週間投与した。日誌及びビデオの記録を犬の研究−1に記載の如く保持した。
【００８７】
検体
検体（患者）は、年令によるかあるいは9才の年令時に受けた損傷により両後肢に明らかな腰異形成を有する16才令の雌のラブラドール雑種犬である。ラブラドール犬は現在グルコサミン又は別の化合物で処置されておらず、認め得る程に硬直した歩行と散歩時に制限された動きとを示した。
【００８８】
フェーズ1  食物にそそいだ溶液として1週間の期間1日につき500mgでMGDを投与した。
【００８９】
その週間が進行するにつれて、ラブラドール犬について余計な独断的意見を述べる隣人が気付いたように、飼い主もラブラドール犬に幾つかの明白な変化に気付いた。ラブラドール犬は「より元気の良い」状態であって「階段をはね上がる」ことができると思われ、「より遊び好き」であり起き上がり等の如き「よりきつい動き」を行い得る。全般的に飼い主は「改善の単離した例」に気付いている。
【００９０】
フェーズ2  1週間のMGD投与後に、MGDを取り止め、ラブラドール犬は更なる医薬処置なしに1週間の期間観察した。
【００９１】
結  論
GlcNBu投与の2日目から話の種となる証拠は犬に或る期間の改良を示した。飼い主は異常な出来事が生起することを知らせており、これによって犬は行使の期間中及び期間後、より可動性である（飼い主の言葉では「更新した」）と思われる。GlcNBu処置の3日目には、特性に対して犬の増大した保護挙動の証拠がまた存在し、この点に関して他の犬に従がい且つ対決するのにずっとより熱心である。正常な挙動は、従がい且つ対決する真の衝動なしに発声だけである。
【００９２】
この開示は本発明の或る好ましい具体例を記載し且つ説明するけれども、本発明はこれらの特定の具体例に限定されるものではない。むしろ、本発明は、記載し且つ説明された特定の具体例及び特徴の機能的又は機械的均等物である全ての具体例を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  濾紙上のDlcNsのクロマトグラフ図である。
【図２】  アニオン交換（アンバーライトIRA−400 OH）カラム上でトリチウムで標識したGlcNbuの溶出分布図である。
【図３】  MgCl2勾配を用いてアニオン交換カラム（1.5×30cm）上のGlcNbuの溶出分布図である。
【図４】  MgCl2勾配を用いてアニオン交換（Cl−）カラム上のGlcNbuの溶出図である。
【図５Ａ】  アニオン交換樹脂カラムのヒドロキシル形（A）及びアニオン交換樹脂カラムのクロライド形（B）から凍結乾燥したGlcNbuのBio−Gel P2カラムクロマトグラフィー図である。
【図５Ｂ】  アニオン交換樹脂カラムのヒドロキシル形（A）及びアニオン交換樹脂カラムのクロライド形（B）から凍結乾燥したGlcNbuのBio−Gel P2カラムクロマトグラフィー図である。
【図６】  Bio−Gel P2カラム上でGlcNbuの精製図である。
【図７Ａ】  濾紙上でクロマトグラフにかけたGlcNbuの精製済み試料の写真図である。
【図７Ｂ】  GlcNbu試料のクロマトグラフ図である。
【図８】  変換成長因子−β（TGFβ；10μg/ml）の存在下に且つ不在下に軟骨細胞の増殖におけるDGlcNs（1mg/ml）の作用を表わす図である。
【図９】  軟骨細胞の細胞増殖における血清及びGlcNbuの作用を表わす図である。
【図１０】  軟骨細胞の細胞増殖におけるGlcNbu、GlcN及びナトリウム  ブチレートの作用を表わす図である。
【図１１】  種々の中位のグルコース濃度で軟骨細胞の細胞増殖におけるGlcNbuの作用を表わす図である。
【図１２】  初期のBAC継代培養の1代の細胞（上方のパネル）及び後期のBAC継代培養の8代の細胞（下方のパネル）においてグルコース及びGlcNbuの作用の比較を表わす図である。
【図１３】  種々の期間で軟骨細胞の継代培養の2代及び8代の細胞増殖におけるグルコースの作用を表わす図である。
【図１４】  牛の関節の軟骨細胞によりグリコサミノグリカン合成におけるGlcNBuの作用の図表である。
【図１】
0004959098.tif 000016
【図２】
0004959098.tif 000017
【図３】
0004959098.tif 000018
【図４】
0004959098.tif 000019
【図５Ａ】
0004959098.tif 000020
【図５Ｂ】
0004959098.tif 000021
【図６】
0004959098.tif 000022
【図７Ａ】
0004959098.tif 000023
【図７Ｂ】
0004959098.tif 000024
【図８】
0004959098.tif 000025
【図９】
0004959098.tif 000026
【図１０】
0004959098.tif 000027
【図１１】
0004959098.tif 000028
【図１２】
0004959098.tif 000029
【図１３】
0004959098.tif 000030
【図１４】
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