(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子からのトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子であって、5’非翻訳領域の全部、コア蛋白をコードする領域の全部、E1蛋白コード領域の一部、NS2蛋白の後半２箇所の膜貫通領域をコードする領域の全部又は一部、及びNS3蛋白コード領域から3’非翻訳領域の全部を有し、これらの全てが前後の配列同士で連結しており、コア蛋白をコードする領域からNS5B蛋白コード領域までの配列がコア蛋白をコードする領域の翻訳枠を有することで一つながりのポリプロテインをコードしている、ことを特徴とするトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子。
【請求項２】
配列番号１に示されるＣ型肝炎ウイルス遺伝子の核酸配列の1189番目から3000番目の領域、988番目から2988番目の領域、930番目から2972番目の領域、980番目から2999番目の領域、918番目から2921番目の領域、922番目から1067番目および1089番目から2987番目の領域、1200番目から2648番目の領域、1003番目から2994番目の領域、1061番目から2941番目の領域又は1025番目から2965番目の領域が欠失している請求項１に記載のトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子。
【請求項３】
細胞中で自律的に複製する、請求項１又は２に記載の遺伝子を含むレプリコン。
【請求項４】
選択マーカー遺伝子が結合している請求項３に記載のレプリコン。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のレプリコンが複製する細胞（但し、ヒトの生体内の細胞を除く）。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞を用いた薬剤のスクリーニング方法または薬効評価方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の遺伝子を組み込んだベクターを保持し、蛋白質を発現している細胞（但し、ヒトの生体内の細胞を除く）。
【請求項８】
Ｃ型肝炎ウイルスの診断に必要な情報を提供するために、請求項５又は７に記載の細胞、又はその細胞が産生する蛋白質を使用して、Ｃ型肝炎ウイルスを検出又は測定する方法（但し、ヒトの生体内での当該検出又は測定方法を除く）。
【請求項９】
遺伝子の欠失を検出する方法を用いて、Ｃ型肝炎ウイルスの請求項１又は２に記載のトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子を検出する方法（但し、ヒトの生体内での当該検出方法を除く）。
【請求項１０】
配列番号１に示されるＣ型肝炎ウイルス遺伝子の核酸配列の１番から914番及び3001番以降の配列から設計したプライマーを用いてPCRを行い、請求項１又は２に記載のトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子を増幅することによりトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子を検出または定量する方法（但し、ヒトの生体内での当該検出又は定量方法を除く）。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載のトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子及びフルレングスフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子の共通領域の遺伝子の測定と請求項１又は２に記載のトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子の欠失した領域の遺伝子の測定によって存在比を定量する方法（但し、ヒトの生体内での当該定量方法を除く）。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の遺伝子から産生されるＣ型肝炎ウイルスのポリプロテイン、或いは当該ポリプロテインからプロセスされた蛋白質であって、E1とNS2との融合蛋白質を含む蛋白。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、Ｃ型慢性肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」と略記する）のゲノムに関する。
【背景技術】  ＨＣＶはＣ型慢性肝炎の原因因子であり、ＷＨＯの統計によれば、世界中で１．７億人の感染者がいると推定されている。ＨＣＶは、他のウイルス性肝炎と異なり、感染初期には比較的軽微な症状を引き起こすのみであるが、感染者は高頻度に慢性化し、一定期間の無症候性期を経た後、慢性肝炎を発症する。そして感染が長期化するにつれ、肝硬変へと病状が増悪化し、高い頻度で肝がんに至る。肝がんの９５％は肝炎ウイルスが関与しており、そのほとんど（８０％）がＨＣＶの感染によるとされている。
ＨＣＶは血液、血液成分や、低頻度ではあるが体液成分を介して感染する。ＨＣＶの検査法が、献血時のスクリーニングに導入されたことにより、先進国では新規の輸血性Ｃ型肝炎の発症はほとんど無くなった。さらに医療技術の進歩により、医療過誤による伝播も抑えられており、本邦では新規の患者の発生はほぼ抑えられている。しかし疫学調査から、本邦におけるＨＣＶキャリアは１７０万人以上と推定されており、そのほとんどは４０歳代以上でかつ感染が長期化していることが示されている。故に今後肝がんの症例数の増加が大きく懸念される。
肝がんのリスクは、肝繊維化の状態と強く関連しており、繊維化が進むほど肝がんの発生率が高くなる。肝繊維化の状態は、ＴｙｐｅＩＶコラーゲン、ヒアルロン酸の血中濃度の測定、血中血小板数、画像診断（腹部エコー検査）などを組み合わせることにより一般的に行われているが、確定診断のためには肝生検が行われる。しかし肝生検は患者に多大な負担を強いることが大きな問題であり、より患者本位の診断方法が求められている。
ＨＣＶは約９．６００塩基のプラス鎖ＲＮＡをゲノムとする、フラビウイルス科、フラビウイルス属に分類されるウイルスであり、血液や血液成分を介して感染し、肝臓で増殖すると考えられている。遺伝子配列の解析から、少なくとも６種類の遺伝子型が存在していると推定されている。約９６００塩基のゲノムは、感染後、宿主細胞内でｍＲＮＡとして機能し、約３０００アミノ酸長の一つながりのポリプロテインが合成され、宿主のシグナルペプチダーゼ、シグナルペプチジルペプチダーセ、およびＨＣＶゲノムがコードするプロテアーゼによる切断される。その結果ｃｏｒｅ（コア）、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの１０種類のタンパク質が産生される。この翻訳枠（オープンリーディングフレーム）以外に、５’末端、３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）が存在し、翻訳調節、ゲノムの複製調節機能を担っている。
このうちコア、Ｅ１及びＥ２はウイルスを構成する構造タンパク質であり、ウイルスゲノムはコアタンパク質によりパッケージされ、キャプシドを形成し、脂質二重膜にアンカーしたＥ１、Ｅ２タンパク質によって取り囲まれ、ウイルス粒子（ビリオン）を形成すると考えられている。ｐ７についてはその機能は明らかではないが、ウイルスの増殖に必須であることが報告されている。ＮＳ２はメタルプロテアーゼであり、それ自身の切断に必要であるが、それ以外の機能については分かっていない。ＮＳ３からＮＳ５Ｂは複合体を形成し、宿主タンパク質とともに、ＲＮＡ複製装置を形成し、ゲノムＲＮＡの複製を行うと考えられている。
ＨＣＶの感染の診断には、患者生体成分（血液、血清、血漿など）に含まれる、ＨＣＶの作り出すタンパク質に対する抗体を検出する方法が広く用いられているが、抗体の有無のみではＨＣＶが活動しているか否かの判別が出来ないため、血中ウイルス量を測定することが診断には重要である。血中ウイルスの検出または測定には、ＨＣＶのウイルスゲノムを検出、または測定する方法、もしくはＨＣＶの産生するコアタンパク質を測定または検出する方法が用いられる。
Ｃ型慢性肝炎の治療には、広くインターフェロンが用いられている。近年薬剤の改良や、リバビリンとの併用療法など投与方法の改善等により、ＨＣＶが体内から駆除され、完治する割合も徐々に増して来た。しかし未だに完治率は５割程度である。またインターフェロン投与は、重篤な副作用を起こす場合があり、高齢者など用いることが出来ない症例が多くあり、さらに効果的な治療法、薬剤の開発が求められている。
インターフェロン治療とＨＣＶとの関連であるが、血中ウイルス量が高いほど、インターフェロン治療に対する抵抗性が高い傾向が認められている。また遺伝子型によってインターフェロンへの感受性が異なる場合があり、特に遺伝子型２は、比較的治療に高い感受性を示す。しかし、血中ウイルス量と、肝炎の増悪度との間、また遺伝子型と肝炎の重篤度の間に明確な関連は無い。すなわち肝疾患の重篤度を表すウイルスマーカーはない。
ＨＣＶはヒトには、血液または血液成分を介して感染する。ヒト以外の生物では、類人猿（チンパンジー）に感染し、感染により肝炎を発症し、慢性肝炎に至る場合もある。他のより飼育が容易な実験動物で、ＨＣＶに高率に感染するものは知られていない。
一方、ＨＣＶは試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でヒトやサル由来の細胞に感染させ、増殖させることが出来たことが報告されている。しかし感染効率、増殖効率ともに低い。そのため試験管内でＨＣＶを感染、増殖させることは非常に困難である。
近年、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＨＣＶゲノムの一部（サブゲノミックＲＮＡ）と薬剤耐性マーカーを持つＲＮＡを、ヒト肝がん由来の樹立細胞に導入し、薬剤耐性を指標に細胞を選択することにより、非常に低頻度ではあるが、細胞内で自律的にＲＮＡが複製している細胞を単離できることが分かった。多くの研究室で再現し、比較的容易に維持することが出来るため、広く研究に用いられるようになった。よく用いられるレプリコンは、ＨＣＶの構造タンパク質部分を人工的に欠失させたものであり、非構造領域が作り出すタンパク質からなる複製装置がＨＣＶ本来のプラス鎖ＲＮＡの細胞内での複製に必要十分な情報を持つことを示唆している。
ＨＣＶが肝臓で増殖していることは、肝臓に含まれるＨＣＶの産生するタンパク質を検出することや、肝臓に含まれるＲＮＡを検出することにより示されている。またインターフェロン治療によりＨＣＶを一時的、または恒久的に駆除すると、その後の肝炎の症状が緩和されることからも、肝臓での病態の発現にＨＣＶが関与していることは明らかである。しかしＨＣＶが肝臓中でどのような様態を取っているかについては解明されていない点が多い。
そのためＨＣＶの感染によって肝炎を発症し、長期慢性化により病状が増悪化し、最終的に肝がんに至るＨＣＶの病態発現および進展のメカニズムについて未解明である。ＨＣＶの各タンパク質を、遺伝子組換えにより培養細胞中で発現させ、発現細胞の状態を解析することにより、病態発現・増悪化のメカニズムについて仮説を提唱する研究は盛んに行われているが、それを証明するための適切なＨＣＶ感染・増殖モデルが存在しないため、仮説を検証できていない。
【特許文献１】特開２００１−１７１８７
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２７７巻、ｐ５７０−、１９９７
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７６巻、ｐ４００８−４０２１、２００２
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２８５巻、ｐ１１０−、１９９９
【非特許文献４】Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２９０巻、ｐ１９７２−、２０００
【非特許文献５】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第２９巻、ｐ２２３−２２９、１９９９
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７７巻、ｐ２１３４−２１４６、２００３
【非特許文献７】Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．、第１４４巻、ｐ２７５−２７９、１９９３
【非特許文献８】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７５巻、ｐ４６１４−４６２４、２００１
【非特許文献９】ＰＮＡＳ、第２９巻、１４４１６−１４４２１、２００２
【非特許文献１０】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第１４巻、７４３−７４７
【非特許文献１１】Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，第６巻，ｐ３５−４７，１９９９
【非特許文献１２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４３巻，ｐ１５０７−１５２２，１９９７
【非特許文献１３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第８１巻，ｐ１６３１−１６４８，２０００
【発明の開示】
ＨＣＶは肝臓中で複製し、増殖すると考えられているにも関わらず、肝臓中での様態についての解析が行われていない。そのため肝臓中でどのようにＨＣＶが複製しているかについての情報はほとんど無く、ＨＣＶに対する治療薬の標的として、どの分子が適切なものか否かの情報も無い。故にＨＣＶの治療法はトライアンドエラーにならざるを得ない。治療薬を効率的に開発するためには、患者肝臓で活発に複製しているＨＣＶゲノムＲＮＡを特定する必要がある。そこで本発明は肝臓で複製、増殖しているＨＣＶゲノムＲＮＡ関するものであり、治療薬の適切な標的となるＨＣＶゲノムＲＮＡを提供することを目的とする。
ＨＣＶの増殖によって肝炎が重症化しているにも関わらず、肝炎の状態を示すウイルスマーカーが存在しない。肝炎の状態を表す適切なウイルスマーカーが求められている。本発明は肝炎の症状、状態を表すウイルスマーカーを提供することを目的とする。
ＨＣＶは取り扱いの容易な感染動物、および高率に感染し、効率良く複製するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系が存在しないため、効率的な薬剤のスクリーニングを行うことが困難である。これらは、ＨＣＶ特異的な治療薬の開発を困難にしている原因の一つである。例えば、広く用いられているインターフェロン治療は、患者を被検体として直接治療法が開発、改良されてきており、患者に多大な負担を強いてきた。そのため、患者の立場に立った医薬品の開発方法が必要である。この問題を解決するためには、有効な治療薬と治療法の開発に、広く用いることが出来るＨＣＶ感染、増殖モデルが必要である。本発明の目的の一つは、治療薬、治療法の開発、スクリーニング等に用いるＨＣＶ感染、増殖モデルを提供することである。
このような増殖モデルとして、サブゲノミックレプリコンを用いた系が供された。すなわちＨＣＶのサブゲノムと適当な薬剤耐性マーカーをコードする適切な構造を持つＲＮＡをヒト肝がん由来細胞に導入し、薬剤耐性で選択することにより、細胞内で自律的に増殖するＨＣＶサブゲノミックＲＮＡレプリコンを得ることが出来る。このレプリコンと、レプリコンを保持している細胞を用いることにより、ＨＣＶに対する薬剤のスクリーニングが始められている。しかしこの方法には大きな問題がある。
一つは用いているＨＣＶのゲノムは、本来のＨＣＶゲノムＲＮＡとは異なる構造からなっている点である。すなわち、サブゲノムはＨＣＶゲノムの非構造蛋白質からなる情報を持つのみである。この点を改良するため、ＨＣＶ蛋白質のすべての翻訳領域と、薬剤耐性マーカーからなるレプリコンが樹立された。このレプリコンを保持している細胞では、ＨＣＶゲノムにコードされているすべてのタンパク質が産生されるはずであり、ＨＣＶ粒子が細胞外に放出されることが期待された。しかし細胞外にＨＣＶ粒子は放出されなかった。すなわちこのような改良がなされたとしてもＨＣＶの増殖系としては不完全なものであった。
また、上記の非構造領域から成るサブゲノムのレプリコンはＨＣＶの５’非翻訳領域のＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）とコアの一部の遺伝子の下流にネオマイシン耐性遺伝子を持ち、その下流にｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）とＨＣＶの非構造蛋白をコードする領域と３’非翻訳領域を持つ構造である。また改良された、ＨＣＶのすべての翻訳領域を持つレプリコンもサブゲノムのレプリコンの非構造蛋白をコードする遺伝子領域をＨＣＶのすべての翻訳領域をコードする領域と入れ換えたものであり、基本的な構造は同じである。
これらのレプリコンは本来のＨＣＶの構造と異なり、ＨＣＶのＩＲＥＳとＥＭＣＶのＩＲＥＳの２つのＩＲＥＳを有しており、生体内におけるＨＣＶのゲノムの構造とは異なるものである。この構造の違いが、細胞外へのＨＣＶの粒子の放出がない原因の１つである可能性も考えられる。さらにこのような構造のレプリコンは、生体内では複製されているウイルスゲノムと異なる機構で複製されていることも考えられる。
これらのことより、ＨＣＶのレプリコンシステムは本来の生体内のＨＣＶゲノム構造を持つＲＮＡを用いたレプリコンシステムであることが望ましい。本発明は肝臓で実際に複製している配列および構造からなるレプリコンを提供することを目的とする。
さらに大きな問題は適応変異と呼ばれる、サブゲノミックレプリコンの実験系に特有の変異の存在である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能するＨＣＶレプリコンを回収し解析すると、ＮＳ３、ＮＳ５Ａなどに本来存在しなかった複数の変異が生じていた。この変異は効率良い複製に重要であり、複製の効率を左右する。しかし複製に適した変異はＨＣＶの増殖にとってはあってはならない変異であることが分かっている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＨＣＶゲノムを、直接チンパンジーの肝臓に接種することにより、ＨＣＶが感染する。
このｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＨＣＶ  ＲＮＡに、サブゲノミックレプリコンで重要である変異を導入すると、元々の配列が持っていたチンパンジーへの感染性が消失した。さらに、チンパンジーに感染性を示す配列を持つ、試験管内の細胞で複製、増幅する配列も無い。故にｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製するようになった配列は、生体内で複製、増殖する機能を失っており、本来のＨＣＶの持つＲＮＡ複製、増殖能を保持していない。生体でもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも複製、増殖する配列である必要がある。すなわち本発明の提供するＨＣＶゲノムＲＮＡ配列を持つレプリコンは、生体中でもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも複製するものである。
本発明者らは患者肝臓中のＨＣＶゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡを単離し、その全構造を決定した。決定した配列を解析したところ、単離したｃＤＮＡは今までに報告されているＨＣＶゲノムＲＮＡの構造とは全く異なる配列を持つことが判明した。
この新しい構造のゲノムＲＮＡは、既に報告されているＨＣＶゲノムＲＮＡの構造タンパク質領域を一部、または全部欠失していることが特徴であり、さらに欠失した部分の前後の配列は、元のＨＣＶゲノムの翻訳枠（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を維持したまま結合しており、このＨＣＶゲノムは新規の一つながりのポリペプチドをコードしていることが判明した。一つながりのポリペプチドはＨＣＶ本来の構造タンパク質の一部と、非構造蛋白質の全部を発現することができる。
このゲノムにコードされているＨＣＶポリプロテインは、細胞内シグナルペプチダーセによる切断部位、自身のプロテアーゼによる切断配列を保持していることから、プロセッシングを受けることが推定される。事実、配列番号１に示す新規なＨＣＶゲノムｃＤＮＡをほ乳類細胞で発現させ、産物を解析したところ、コア蛋白質は正常にプロセスされ、Ｅ１とＮＳ２蛋白質は融合タンパク質として発現し、ＮＳ３とはプロセスされ、ＮＳ３は本来の大きさの分子にプロセスされた。
このＨＣＶゲノムＲＮＡをトランケートフォーム（ＴＦ）と呼ぶ。それに対し、既に報告されている構造遺伝子をすべて含むＨＣＶ  ＲＮＡをフルレングスフォーム（ＦＬＦ）と呼ぶ。複数の慢性Ｃ型肝炎患者の肝生検、血清を解析した。複数の患者から、共通する特徴を持つＴＦ  ＨＣＶゲノムが検出された。その特徴は、構造タンパク質の一部、または全部の配列を欠失しているが、ＮＳ２の後半以降の配列を保持していること、残されている配列は、ＦＬＦで推定される翻訳枠を保持する形で発現できるような形で欠失していることである。
すなわち本願発明は、
（１）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子において、構造蛋白コード領域の一部分を保持し、１つの翻訳枠を維持しながら、コア蛋白からＮＳ２蛋白をコードする領域の一部分が欠失しているトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子、
（２）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子において、構造蛋白コード領域の一部分を保持し、１つの翻訳枠を維持しながら、少なくともＥ１蛋白とＥ２蛋白のつなぎ目のアミノ酸配列をコードする領域を欠失している、（１）のトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子、
（３）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子においてＥ１蛋白コード領域の一部分、Ｅ２蛋白コード領域、Ｐ７蛋白コード領域およびＮＳ２蛋白コード領域の一部分が翻訳枠を維持しながら欠失しているトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子、
（４）５’ＵＴＲ、および３’ＵＴＲを有する、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の遺伝子、
（５）５’ＵＴＲ、ＮＳ３から下流の蛋白質コード領域及び３’ＵＴＲを有する上記（１）〜（３）いずれか１項に記載の遺伝子を提供する。
Ｃ型肝炎ウイルスゲノムはＲＮＡであるが、本願発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子はＲＮＡでもＤＮＡであっても利用可能である。
言い換えると、本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子において、Ｅ１蛋白コード領域の一部分、Ｅ２蛋白コード領域、Ｐ７蛋白コード領域およびＮＳ２蛋白コード領域の一部分が翻訳枠を維持しながら欠失しているトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子を提供する。
また、５’非翻訳領域から構造蛋白であるコア蛋白をコードする領域の全部又は一部、及び非構造蛋白であるＮＳ２の後半２箇所の膜貫通領域をコードする領域から３’非翻訳領域の全部又は一部を有する上記（ａ）に記載のトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子を提供する。
さらに、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の核酸配列の１番から９１４番の全部又は一部の配列及び３００１番以降の全部又は一部の配列を有する上記（ａ）に記載のトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子を提供する。
一方、サブゲノミックレプリコンの解析からＲＮＡ複製に必要な情報はＮＳ３以降の非構造蛋白質の領域にコードされていることが示されている。故にＴＦゲノムはＲＮＡ複製に必要な非構造蛋白質の情報をすべて保持している。さらに一部の肝生検サンプルでは、ＴＦゲノムが優先に検出されることから、ＴＦゲノムは肝臓で自律的に複製していることが分かる。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＦを含むＲＮＡを細胞に導入すると、細胞内で複製する。すなわちＴＦ  ＨＣＶゲノムＲＮＡはレプリコンとして機能する。これらの結果から、本発明によって提供されるＨＣＶゲノムＲＮＡは、肝臓で複製し、またｉｎ  ｖｉｔｒｏでも複製することが分かった。
従って、本願発明はまた、
（６）細胞中で自律的に複製するＣ型肝炎ウイルスのコア蛋白からＮＳ２蛋白をコードする遺伝子の一部の領域を翻訳枠を保持したまま、欠失したトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子または欠失した領域が少なくともＥ１蛋白およびＥ２蛋白をコードする領域に存在するトランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子のレプリコン遺伝子を提供する。
本発明はさらに、
（７）上記（３）のレプリコン遺伝子に選択マーカー遺伝子の結合したレプリコン遺伝子を提供する。
あるいは
（８）上記のレプリコン遺伝子が複製する細胞を提供する。
ＴＦは肝臓でＦＬＦよりも有利に増殖し、当該患者が重篤な肝炎症状を発現している。ＴＦの出現は肝炎症状に強く関係しており、ＴＦの増殖を抑制、または阻害し、駆除することは有効な治療方法となる。すなわち、効果的にＣ型慢性肝炎の症状を抑制、緩和する薬剤は、ＴＦを標的として開発することが好ましい。故にＴＦを利用したレプリコンを用いた医薬品のスクリーニングは、肝炎の重症化を抑制、緩和または駆除するための医薬品開発に適していることは明らかである。
従って、本願発明は更に、
（９）トランケートフォーム遺伝子の複製する細胞を用いた薬剤のスクリーニング方法、薬効評価方法および薬効を評価することにより薬剤を製造する方法を提供する。
（１０）トランケートフォーム遺伝子を組み込んだベクターを保持し、その蛋白質を発現している細胞を提供する。
（１１）トランケートフォーム遺伝子を含むレプリコンが複製している細胞、もしくは細胞が産生するタンパク質を用いたＨＣＶの診断方法も提供する。
このＴＦゲノムは血中にも検出できる。すなわちこのＨＣＶゲノムＲＮＡは肝臓中で複製され、血中にＶＬＰとして存在する。それゆえ、ＴＦゲノムの検出には血液、または血液成分をサンプルとして用いることが出来る。
ＴＦが検出される患者において、ＴＦが肝臓ＲＮＡの中で優先型である例が観察される。このことはＴＦがＦＬＦよりも肝臓内でのＲＮＡ複製に適した配列であることを示している。さらに多数の患者の肝生検、血清を分析し、ＴＦが肝臓で優先型である患者は、重篤な肝炎を発症している例が多く、多くはインターフェロン治療の予後も不良であることが判明した。このことからＴＦ型が肝臓で優先である場合は、肝炎が重症化しており、またインターフェロン治療効果も限定的である。すなわちＴＦを検出、または定量することは、肝炎の状態を示す指標となる。このことからＴＦを検出、定量する方法は、肝炎の状態を診断する方法として適用でき、新規のウイルスマーカーとして利用が可能となる。
従って、本願発明はまた、
（１２）検体中のトランケートフォーム遺伝子を検出する方法を提供する。また、この方法は、すべての遺伝子の欠失を検出する方法を用いて、Ｃ型肝炎ウイルスのトランケートフォーム遺伝子を検出する方法を含む。
また一例として、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の核酸配列の１番から９１４番及び３００１番以降の配列から設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、トランケートフォーム遺伝子を増幅することによりトランケートフォーム遺伝子を検出または定量する方法を提供する。
（１３）トランケートフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子およびフルレングスフォームＣ型肝炎ウイルス遺伝子の混合した検体において、その存在比を定量する方法も提供する。
（１４）トランケートフォーム遺伝子及びフルレングスフォーム遺伝子の共通領域の遺伝子の定量とトランケートフォーム遺伝子の欠失した領域の遺伝子の定量によって存在比を定量する方法も提供する。
また血中のＴＦゲノムはＣ型肝炎ウイルス粒子またはＣ型肝炎ウイルス様粒子として存在していると考えられる。何らかの構造体を形成していなければ、ＴＦゲノムはＲＮＡであるため、速やかに血液中のＲＮａｓｅによって分解され、検出できないためである。
従って、本願発明は、
（１５）トランケートフォーム遺伝子を保持するＣ型肝炎ウイルス粒子またはウイルス様粒子を提供する。
ＴＦゲノムは構造蛋白をコードする領域を欠失している。そのため、欠失した領域にコードされていたペプチドを欠如した新規なＨＣＶポリプロテインを産生することができる。前述したように配列番号１のＨＣＶゲノムｃＤＮＡをほ乳類細胞で発現させた場合、Ｅ１とＮＳ２の融合蛋白が産生された。
そのため、本願発明は更に、
（１６）トランケートフォーム遺伝子から産生されるＣ型肝炎ウイルスのポリプロテインおよびポリプロテインからプロセスされた蛋白を提供する。また
（１７）このタンパク質を特異的に認識する抗体を提供する。
新規なＨＣＶゲノムＲＮＡ（ＴＦ）を用いることにより、生体内で複製しているＲＮＡレプリコンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製することが可能となる。このレプリコンを利用することにより、患者肝臓内で優先的に複製し、肝炎を重症化させる感染細胞モデルが構築できる。このモデルを利用することにより、肝炎の重症化を抑制、阻害する医薬品の開発、スクリーニングを行うことが出来る。
ＴＦを検出、または定量することは、肝炎の状態を把握することに効果的であり、肝炎の状態を表すウイルスマーカーとして有効である。またこのマーカーを用いた診断法により、患者の肝炎の状態、薬剤の効果のモニタリング、薬剤に対する抵抗性を診断することが出来る。
【図面の簡単な説明】  図１は、肝臓組織のＨＣＶゲノムＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって検出されたＴＦゲノムの代表的な電気泳動像を示す。プライマーセット１はｃＤＮＡ合成プライマーが３４８１Ｒ、１ｓｔ  ＰＣＲプライマーがＨＣｌｏｎｇＡ１と３４８１Ｒ、２ｎｄ  ＰＣＲプライマーが８５Ｆと３２９７Ｒ、プライマーセット２はｃＤＮＡ合成プライマーが３９４５Ｒ、１ｓｔ  ＰＣＲプライマーが８３１Ｓと３９４５Ｒ、２ｎｄ  ＰＣＲプライマーが８４１Ｓと３７５９Ｒ、プライマーセット３はｃＤＮＡ合成プライマーが３９４５Ｒ、１ｓｔ  ＰＣＲプライマーが８１３Ｓと３１７４ＡＳ、２ｎｄ  ＰＣＲプライマーが８４１Ｓと３１１１ＡＳを示す。矢印はＴＦゲノムのＰＣＲ産物を示している。
図２は、ＴＦゲノムのみが検出された検体のＴＦゲノムとＤ８９８１５のゲノムとの構造の違いを示す。Ｄ８９８１５の各蛋白をコードしている核酸配列はコアが３４１−９１４、Ｅ１が９１５−１４５４、Ｅ２が１４５５−２０７９、Ｐ７が２５８０−２７７８、ＮＳ２が２７７９−３４１９に存在する。各検体から取得したＴＦゲノムを５’ＵＴＲは実線で、蛋白をコードしている部分は灰色のバーで示している。欠失部分はそれぞれのバーを線で結んで示す。各検体の番号はＤ８９８１５に対応する核酸の位置を示している。
図３は、ＴＦゲノムとＦＬＦゲノムの両方が検出された検体の、ＴＦゲノムとＤ８９８１５のゲノムとの構造の違いを示す。図２と同様に、各検体から取得したＴＦゲノムを５‘ＵＴＲは実線で、蛋白をコードしている部分は灰色のバーで示している。欠失部分はそれぞれのバーを線で結んで示す。各検体の番号はＤ８９８１５に対応する核酸配列の位置を示している。
図４は、実施例６における、抗原量の経時的変化を示すグラフである。
図５は、実施例７において得られた欠失を有する遺伝子の欠失前後の配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本願発明の最良の形態を述べるが、本願発明はこの形態に限定されるものではない。
本発明はＣ型肝炎ウイルスの新規な構造の遺伝子に関するものである。正常なＦＬＦのＣ型肝炎ウイルスの遺伝子は５’ＵＴＲとそれに続いて、ウイルスの構造タンパク質であるコア蛋白、Ｅ１蛋白、Ｅ２蛋白、及びＰ７蛋白、及び非構造タンパク質ＮＳ２蛋白、ＮＳ３蛋白、ＮＳ４Ａ蛋白、ＮＳ４Ｂ蛋白、ＮＳ５Ａ蛋白、ＮＳ５Ｂ蛋白をコードする領域および３’ＵＴＲからなっている。
本願発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子は構造タンパク質であるコア蛋白、Ｅ１蛋白、Ｅ２蛋白又はＰ７蛋白それぞれの全部又は一部及び／または非構造タンパク質であるＮＳ２の一部をコードしている遺伝子を欠失しているＴＦゲノムである。このＴＦゲノムはＦＬＦゲノムの翻訳枠を維持したまま、インフレームで欠失が起こっており、欠失部分以外の領域では正常なＨＣＶのポリプロテインを産生することができる。つまり、本願発明はＣ型肝炎ウイルスのポリプロテインをコードする遺伝子の一部の領域がインフレームで欠失したＣ型肝炎ウイルス遺伝子に関するものであり、その、ＴＦゲノムの構造に特徴がある。
このＨＣＶのＴＦゲノムは５’ＵＴＲを保持しており、少なくともＨＣＶのＦＬＦゲノムの３００１番目以降の遺伝子を保持しているものが多いと考えられる。３００１番目以降の遺伝子にはＮＳ２領域のＣ末側の２箇所の膜貫通領域が存在しており、ＮＳ３以降のＨＣＶのタンパク質をこのＴＦゲノムより正常に細胞の中で産生することができる。（以下の核酸配列の位置を示す番号は全長型の配列であるＧｅｎｅＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ８９８１５のＨＣＶの配列に相当する位置の番号を記載する。）
またこのＴＦゲノムはコア蛋白、Ｅ１蛋白、Ｅ２蛋白の一部又は全部をコードする領域を欠失していることに特徴がある。特にすべてのＴＦゲノムは図２と図３に示したように、Ｅ１及びＥ２領域をコードする遺伝子を完全な形で保持しないことに特徴がある。換言すれば、Ｅ１蛋白及びＥ２蛋白の一部または全部をコードする遺伝子を欠失していることに特徴を持つ遺伝子である。現在取得できているＴＦゲノムではＥ１をコードする１２００位からＥ２をコードする１９９８位を保持しているＴＦゲノムは確認できていない。各ＴＦ遺伝子の連続する欠失は少なくとも６３塩基で、最大で２０４３塩基である。また１つのＴＦ遺伝子の欠失の合計は１４４９〜２０６７塩基である。
最も典型的なＴＦゲノムの構造はＥ１蛋白からＮＳ２蛋白をコードする約２ｋｂの遺伝子を欠失している構造である（図２）。
また、上記の欠失を有し、且つ５’ＵＴＲ、ＮＳ３から下流の蛋白質をコードする遺伝子および３’ＵＴＲを保持している遺伝子が好ましい。
このＴＦ遺伝子はその欠失部分の構造に特徴を持っている。そのため核酸配列はＨＣＶの遺伝子配列であればすべてのものを含む。本願発明では遺伝子型１以外に、遺伝子型２のＴＦ遺伝子も確認しているが、それ以外の遺伝子型３から６の配列のＴＦ遺伝子も含まれる。
このＴＦゲノムはＣ型慢性活動性肝炎の患者の肝臓中で自律的に複製をしている。また患者組織中でＴＦゲノムのみがＰＣＲで増幅される検体がある。このことから、ＴＦゲノムはＦＬＦゲノムより肝組織中で優位に複製しているものと考えられる。
そのため、このＴＦゲノムを肝臓細胞あるいは肝臓由来細胞で複製可能なレプリコンとして利用することができる。ＴＦゲノムそのものが自律複製能を有するため、そのままの構造でレプリコンとして機能する。また、レプリコンを選択するため、薬剤耐性遺伝子を結合させ、薬剤により選択することも可能である。薬剤耐性遺伝子としてはネオマイシンなどが使用できる。レプリコンとして利用可能なＴＦゲノムは、上述した構造領域を欠失したＴＦゲノムのすべてが含まれる。また、それ以外にも、肝臓で複製しているＨＣＶ遺伝子のインフレームの欠失体であるＴＦゲノムならば、どのような構造でも利用可能である。
本願発明の最も好ましいレプリコンはＨＣＶの５’非翻訳領域のＩＲＥＳ、コア領域、Ｅ１領域の一部およびＮＳ２の一部より下流の非構造蛋白をコードする領域と３’ＵＴＲを有するレプリコンであり、生体内で複製しているＴＦゲノムと同じ構造のレプリコンである。またさらにレプリコンの一部、例えばコア領域にネオマイシン耐性の遺伝子を組み込んだものもレプリコンとして有用である。
さらに本願発明は、このレプリコンが複製する細胞を提供する。ＴＦゲノムの構造を持つＨＣＶ−ＲＮＡは実際に肝臓細胞中で複製されており、この構造を利用したＴＦゲノムレプリコンの複製系は肝臓でのウイルス複製系を反映しているものと考えられる。レプリコンが複製する細胞は肝臓由来の継代細胞でもよいし、初代肝細胞でも構わない。また本願発明のレプリコンが複製する細胞であれば、肝臓由来でない細胞でも利用可能である。レプリコンが複製する細胞は恒常的にレプリコンが複製する細胞も含まれる。また一過性にレプリコンが複製する細胞も含まれる。
ＴＦゲノムのレプリコンの複製系はＨＣＶの感染に対する薬剤のスクリーニングに有用である。これは、このＴＦゲノムが実際に肝臓組織中で複製されているからである。このレプリコンが複製している細胞のレプリコン複製系を用いて、ＨＣＶの増殖を抑制する薬剤のスクリーニングができる。レプリコン複製細胞を用い薬剤の薬効を評価する方法も含まれる。このスクリーニング系などは実際に肝臓で複製されているＴＦゲノムのレプリコンをターゲットとしているために、より効果的な薬剤をスクリーニングできることが期待される。スクリーニングされた薬剤の効果を評価する方法としても有効である。この場合、薬剤の評価をこの方法で行うことが重要であり、薬剤の管理に必須であれば、薬剤を製造する方法としても利用できる。
さらに本願発明はＴＦゲノムを検出する方法を提供する。ＴＦゲノムは欠失部分を有している。この欠失部分を有する遺伝子を検出する方法であれば、どのような方法でも使用できる。例えば、欠失領域より３’側の外側にプライマーを設定し、ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成する。そのｃＤＮＡより欠失領域をはさむように５’と３’の外側にプライマーを設定し、ＰＣＲを行うことにより、欠失を有するＦＬＦゲノムより短い遺伝子を検出できる。ＰＣＲを行った後に、ノザンブロットにより短いＴＦゲノムを検出することも可能である。
このＴＦゲノムを検出する方法は、上記に記載した方法以外に遺伝子の欠失を検出するすべての方法が含まれる。
また全長のＦＬＦゲノム及びＴＦゲノムの量を定量し、それからＦＬＦゲノムを定量した値を除くことによって、ＴＦゲノムの量を求めることも可能である。
ＦＬＦゲノムおよびＴＦゲノムの欠失のない共通領域にＰＣＲのプライマーを設定しＲＴ−ＰＣＲにより両方の遺伝子の量を測定する。次にＴＦゲノムの欠失領域にＰＣＲのプライマーを設定し、遺伝子の量を測定することにより、ＦＬＦゲノムのみの量を測定することができる。そしてＦＬＦゲノムおよびＴＦゲノムの量とＦＬＦゲノムの量を比較することにより、ＴＦゲノムの量を測定することができる。
ＦＬＦゲノムおよびＴＦゲノムの量を測定するプライマーはＦＬＦゲノムとＴＦゲノムの重複する領域であればどの領域にプライマーを設定してもよい。例えば５’ＵＴＲやＮＳ３以降の非構造蛋白をコードする領域あるいは３’ＵＴＲにプライマーを設定することができる。またＦＬＦゲノムのみの量を測定するプライマーはＴＦゲノムが欠失している領域であればどの領域でもよいが、例えば構造蛋白をコードしている領域である、コア、Ｅ１、Ｅ２の遺伝子領域や、Ｐ７あるいはＮＳ２欠失領域に設定することができる。典型的なＴＦゲノムは核酸の配列番号１１８９から２９２２の遺伝子を欠失しているため、この領域にプライマーを設定することにより、ＦＬＦゲノムのみを検出できる。さらに好ましくは、本願発明の実施例で得られたすべてのＴＦゲノムは１２００から１９９８を欠失しているため、この領域にプライマーを設定することにより、ＦＬＦゲノムのみを検出することが可能である。
ＨＣＶ−ＲＮＡ遺伝子の定量はＲＴ−ＰＣＲ法により行うことができる。例えば、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ−ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ法などを使用することができる。
本願発明はＴＦゲノムから産生されるポリプロテインに関する発明を提供する。ＴＦゲノムはインフレームで欠失がおきており、ポリプロテインをコードしている。このポリプロテインはＣ型肝炎のポリプロテインと比較すると欠失領域にコードされたペプチドを持たないポリプロテインである。また  欠失部分の上流のＮ末側の蛋白と下流のＣ末側の蛋白が融合したＦＬＦゲノムから産生される正常なポリプロテインとは異なる新規なタンパク質である。
本願発明はさらに、上記ポリプロテインからプロセスされた蛋白質を提供する。上記ポリプロテインはペプチダーゼで切断されるが、プロセスによりＥ１とＮＳ２の融合蛋白、Ｅ１とＥ２の融合蛋白、コアとＥ２の融合蛋白などの新規な蛋白が産生される。上記のポリプロテインあるいはプロセスされた蛋白質は、ＦＬＦゲノムからは産生されないため、この蛋白を検出することにより、ＴＦゲノムの検出と同等の効果が得られる。
本発明はＴＦゲノム、またはＴＦゲノムから産生されたポリプロテインを検出、または定量することにより、肝炎の症状を診断する診断法を提供する。
本願発明はさらにＴＦゲノムから産生されたポリプロテインあるいは融合蛋白に対する特異的な抗体を提供する。これらの抗体はポリプロテインあるいは融合蛋白の検出に有用である。
また本願発明はＴＦゲノムを含むウイルス様の構造を有する粒子を提供する。ＴＦゲノムは肝細胞以外の血液から検出される。血液中でＴＦゲノムはコアの蛋白質と関連して存在している。このウイルス粒子またはウイルス様粒子は診断、治療などに利用できる。
【実施例】 実施例１． 短縮型配列の単離と解析
患者肝臓切片ＢＰ２０７（０．５ｍｍ  ｘ  １ｍｍ）を１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ４０，０．１％  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃａｃｋｔａｉｌ［Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］中で破砕し、１０ｋｒｐｍ，５分間の遠心後上清を回収した。この抽出液からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、メーカーの推奨する方法に従い核酸を精製した。精製した核酸にＨＣ９４０５Ｒ−１ｂプライマーを加え、ＭＭＬＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｔｒｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、メーカーの推奨する条件で、４２℃、１時間逆転写反応を行わせ、ｃＤＮＡを得た。
この反応液にＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃、３０分反応させ、ＲＮＡを分解させた。この反応液の一部を用い、ＨＣ−ＬｏｎｇＡ１プライマーとＴ７−ＨＣ９３１３Ｒプライマーの存在下で、ＫｌｅｎＴａｑ  ＬＡ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、９４℃、２０秒、６８℃、９分間からなる３０回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行うことにより、ＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ（ＨＣＶ  ｃＤＮＡ）の増幅を行った。この反応液の一部を用い、さらにＨＣ８５ＦとＨＣ９３０２Ｒプライマーの存在下でＰＣＲを行い、ＨＣＶ  ｃＤＮＡを増幅した。
増幅した断片は、０．７％アガロースゲル電気泳動によって分離し、アガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、メーカーの推奨する方法にてＤＮＡ断片を回収した。回収したＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片は、メーカーの推奨する方法に従いｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）と連結反応させ、ＤＨ５α株を形質転換させた。アンピシリン耐性で、ＩＰＴＧとＸ−ｇａｌを加えた寒天培地上での平板培養で白色コロニーを形成する形質転換体を選び、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌとなるよう加えた２ＹＴ培地にて培養した。培養した菌体からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いｐｌａｓｍｉｄを精製した。
精製したプラスミドに組み込まれているＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列は、ベクターおよびＨＣＶ  ｃＤＮＡに適合する適宜準備したプライマーを用い、ＣＥＱ  ＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（ベックマン・コルター）により、メーカーの推奨する方法に従い反応を行い、ＣＥＱ２０００  ＸＬ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０．０、ベックマン・コールター）により解析した。得られたデータを基に、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１．２、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い配列データの統合、解析を行い、ＨＣＶ  ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。クローンＬＶ２０７−０１９３−１、ＬＶ２０７−０１９３−６、ＬＶ２０７−０１９３−１５の３種類のＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列を決定した。
単離した配列を、公表されているＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列（Ｄ８９８５１）と比較すると、ＰＣＲに用いたプライマーの領域である第８５位から第９３０２位までの配列を含むが、いずれのクローンも第１１８９から第３０００位に相当する配列が欠如していた。予想されるアミノ酸配列を求めると、ＬＶ２０７−０１９３−１の配列は  アミノ酸長の一つながりのアミノ酸をコードするが、Ｅ１の途中からＮＳ２の途中までが翻訳フレームがずれない（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）でつながる形で欠失していた。求めた配列を基に、共通する配列、コンセンサス配列をＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ７）を用いて決定し、得られたＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンの適切な断片を組み合わせることにより、コンセンサス配列を持つＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片を作成した。
具体的にはまずクローン１の断片に、Ｃｌａ＿ｓ，Ｃｌａ＿ａｓプライマーを利用し、Ｑｕｉｃｋ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）を用いメーカーの推奨する方法に従い、配列番号１の第７０９位に位置するＣｌａＩサイトを変異導入した。ＬＶ２０７−０１９３−１から第７０９位のＣｌａＩサイトから、第１０６３位のＡｆｅＩまでの断片、第４１６９位のＨｐａＩサイトから第５５６９位のＳａｃＩサイトまで、および第６６８７位のＳｆｉＩサイトから第７１２３位のＢｇｌＩＩサイトまでを持つ断片を単離し構築に用いた。またＬＶ２０７−０１９３−６からは第１０６３位のＡｆｅＩサイトから第１２６５位のＢｓｉＷＩサイトまでを持つ断片を単離し用いた。
ＬＶ２０７−０１９３−１５からは第１２６５位のＢｓｉＷＩサイトから第４１６９位のＨｐａＩサイトまでの断片、第５５６９位のＳａｃＩサイトから第６６８７位のＳｆｉＩサイトまでを持つ断片、および第７１２３位のＢｇｌＩＩサイトから第７３８６位のＨｉｎｄＩＩＩサイトまでを持つ断片を単離し、構築に用いた。これらの断片を組み合わせ、さらに下記のように患者組織から単離した３’ＵＴＲを含む第７３８３位のＨｉｎｄＩＩＩと第７７８６位のＸｂａＩの断片を組み合わせ、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＣｌａＩサイトからＸｂａＩサイトに組み込むことにより、配列番号１の第７０９位から第７７８６位までの配列を持つｐＬＶＣ＿ＣｌａＸｂａ７．２Ｋを構築した。なお制限酵素、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ、宝酒造、東洋紡、日本ジーンから購入したものを用いた。
一方ＨＣＶ  ｃＤＮＡの末端は以下のように単離した。前述のＲＮａｓｅＨで処理したｃＤＮＡ反応液の一部を、ＨＣＬｏｎｇＨ１およびＨＣ７０５Ｒと、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＲｅｄＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を用い、９４℃、２０秒、５５℃、３０秒、７２℃、１分からなるサーマルサイクルを３５回繰り返すＰＣＲにより、既に報告されているＨＣＶ  ｃＤＮＡの第１位から７０９位に相当する断片を増幅させた。断片のクローニング、解析は常法に従い行った。その結果、配列番号１の第１位から第７０９位までを含むＨＣＶ  ｃＤＮＡ、ｐＬＶ２０７−０００７を得た。これを鋳型にＴ７−Ｈ１Ｖ２プライマーと、ＣｏｒｅＣｌａ＿ａｓプライマーを用いたＰＣＲにより約０．７ｋｂの断片を増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにクローニングすることにより、ｐＴ７＿ＬＶ２０７＿０００７を得た。
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｏｔＩとＸｂａＩサイト間にｐＴ７＿ＬＶ２０７＿０００７をＮｏｔＩとＣｌａＩにより切断することにより得ることが出来る約０．７ｋｂの断片と、ｐＬＶＣ＿ＣｌａＸｂａ７．２ＫをＣｌａＩとＸｂａＩで切断することにより得られる約７．２ｋｂの断片を、連結挿入することにより、配列番号１の第１位から第７７８６位までの配列を持つＨＣＶ  ｃＤＮＡの挿入されたプラスミドｐｃＤ−ＬＶ２０７ＴＦを得た。
患者組織からの３’ＵＴＲ遺伝子の分離
慢性肝炎患者の組織より上記と同様の方法で、ＲＮＡを回収した。ＲＮＡ２．５μｌにプライマー８９１３Ｆを５ｐｍｏｌｅ（０．５μｌ）加え、７０℃で３分間保持し、氷中で急冷した。これに５ｘＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μｌ、２０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＫＡＲＡ）２０ｕｎｉｔｓ、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ０．５μｌを加え、全量で１０μｌになるようにジエチルピロカーボネイト処理した滅菌水を加えた。この混合液を４２℃、６０分反応させた。ＲＮＡを破壊するため、ＲＮａｓｅＨ（ＴＡＫＡＲＡ、６０Ｕ／μｌ）を１２Ｕ加え、３７℃で３０分保持し、その後７２℃、３分で失活させ、ｃＤＮＡとして用いた。
このｃＤＮＡ、２ｕｌをプライマー８９１３ＦおよびＲＰ２を用いて上記と同様の方法でＰＣＲを行った。このＰＣＲの産物の一部を用い、８９３９ＦとＲ１のプライマーで２回目のＰＣＲを行い、約６００ｂａｓｅのＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターにクローニングし、核酸配列を上記と同様の方法で決定した。
以下にクローニング及び遺伝子の構築に用いたプライマー配列の一部を示す。
１ｂ１６０Ｂａｍ：  ５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｔ  ｔａｇｔｃｃｔｃｃａ  ｇａａｃｃｃｇｇａｃ  ａｃ−３’  （配列番号：４９）
ｃｈｉｂａ−ａｓ：  ５’−ｔｇｃａｃｇｇｔｃｔ  ａｃｇａｇａｃｃｔ−３’  （配列番号：５０）
ｃｈｉｂａ−ｓ：  ５’−ｔａｇｔｇｇｔｃｔｇ  ｃｇｇａａｃｃｇｇｔ−３’  （配列番号：５１）
ｃｏｒｅ＿ｃｌａ＿ａｓ：  ５’−ｇｃｃｇｃａｔｇｔａ  ａｇｇｇｔａｔｃｇａ  ｔｇａｃｃ−３’  （配列番号：５２）
ｃｏｒｅ＿ｃｌａ＿ｓ：  ５’−ｇｇｔｃａｔｃｇａｔ  ａｃｃｃｔｔａｃａｔ  ｇｃｇｇｃ−３’  （配列番号：５３）
ｅｃｏ＿ｎｐｔ＿ａｓ：  ５’−ｇｃｇａａｔｔｃｔｔ  ａｔｃａｇａａｇａａ  ｃｔｃｇｔｃａａｇａ  ａｇ−３’  （配列番号：５４）
ＨＣ１ｂ９４０５Ｒ：  ５’−ｇｃｃｔａｔｔｇｇｃ  ｃｔｇｇａｇｔｇｔｔ  ｔａｇｃｔｃ−３’  （配列番号：５５）
ＨＣ８５Ｆ：  ５’−ａｔｇｇｃｇｔｔａｇ  ｔａｔｇａｇｔｇｔｃ  ｇｔｇｃａｇｃｃｔ−３’  （配列番号：５６）
ＨＣ７０５Ｒ：  ５’−ａｇｃｃｇｃａｔｇｔ  ａａｇｇｇｔａｔｃｇ  ａｔｇａｃ−３’  （配列番号：５７）
ＨＣ１９８６Ｓ：  ５’−ｔｇｇｔｔｃｇｇｃｔ  ｇｙａｃａｔｇｇａｔ  ｇａａ−３’  （配列番号：５８）
ＨＣ２１９９ＡＳ：  ５’−ｇｇｒｔａｇｔｇｃｃ  ａｒａｇｃｃｔｇｔａ  ｔｇｇｇｔａ−３  （配列番号：５９）
ＨＣ９３０２Ｒ：  ５’−ｔｃｇｇｇｃａｃｇａ  ｇａｃａｇｇｃｔｇｔ  ｇａｔａｔａｔｇｔｃ  ｔ−３’  （配列番号：６０）
ＨＣｌｏｎｇＡ１：  ５’−ａｔｃｇｔｃｔｔｃａ  ｃｇｃａｇａａａｇｃ  ｇｔｃｔａｇｃｃａｔ−３’  （配列番号：６１）
ＨＣｌｏｎｇＨ１：  ５’−ｇｃｃａｇｃｃｃｃｃ  ｔｇａｔｇｇｇｇｇｃ  ｇａｃａｃｔｃｃａｃ  ｃ−３’  （配列番号：６２）
Ｎｄｅ＿ｃｏｒｅ９＿ａｓ：  ５’−ａａｔｃａｔａｔｇｔ  ｃｔｔｔｇａｇｇｔｔ  ｔａｇｇａｔｔｔｇｔ−３’  （配列番号：６３）
Ｎｄｅ＿ｎｐｔ＿ｓ：  ５’−ｇａｃａｔａｔｇａｔ  ｔｇａａｃａａｇａｔ  ｇｇａｔｔｇｃａｃ−３’  （配列番号：６４）
ＳｂｆＨ１：  ５’−ｇｔｃｃｔｇｃａｇｇ  ｃｃａｇｃｃｃｃｃｔ  ｇａｔｇｇｇｇｇｃｇ  ａｃａ−３’  （配列番号：６５）
ＳｂｆＮｐｔ−Ｒ：  ５’−ｇａｃｃｔｇｃａｇｇ  ｔｔａｔｃａｇａａｇ  ａａｃｔｃｇｔｃａａ  ｇａａｇ−３’  （配列番号：６６）
Ｔ７＿Ｈ１Ｖ２：  ５’−ｇｃｃｔｔａａｔｔａ  ａｔａｃｇａｃｔｃａ  ｃｔａｔａｇｇｃｃａ  ｇｃｃｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｇｇｃｇａｃａ−３’  （配列番号：６７）
Ｔ７＿ＨｃｌｏｎｇＨ１：  ５’−ｔｃｔａｇｔｃｇａｃ  ｇｇｃｃａｇｔｇａａ  ｔｔｇｔａａｔａｃｇ  ａｃｔｃａｃｔａｔａ  ｇｇｇｃｇｇｃｃａｇ  ｃｃｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｇｇｃｇａｃａｃ  ｔｃｃａｃｃ−３’  （配列番号：６８）
Ｔ７＿ＨＣ９３１３ｂ：  ５’−ｔｃｔａｇｔｃｇａｃ  ｇｇｃｃａｇｔｇａａ  ｔｔｇｔａａｔａｃｇ  ａｃｔｃａｃｔｃｔａ  ｇｇｇｃｇｇｃｇｇｇ  ｇｔｃｇｇｇｃｗｃｇ  ｎｇａｃａｂｇｃｔｇ  ｔｇａ−３’  （配列番号：８３）
実施例２． 患者からのＴＦ  ＨＣＶゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡの単離と解析
次に慢性活動性肝炎の肝臓の肝生検の２３検体および肝癌患者の手術時の組織検体であるＢＰ１、ＢＰ２、ＢＰ３の３検体よりＴＦのＨＣＶ−ＲＮＡの検出を試みた。
ＲＮＡの抽出
ＲＮＡ用抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン）の「微量試料からのＲＮＡの単離」のプロトコールに準じて、ＲＮＡを抽出した。約０．５ｍｍ  ｘ  １ｍｍの大きさの患者肝臓切片に０．８ｍｌのＩＳＯＧＥＮを加え、１ｍｌのチップの先で組織片をほぐし、ピペッティングにより粉砕した。５分間室温で放置し、０．２ｍｌのクロロホルムを添加し後、３０秒激しく攪拌し、４℃で５分間置いた。冷却微量遠心機１２０００ｇで４℃、１５分遠心し、水相を回収した。
約５ｕｇの酵母ｔＲＮＡを添加し、０．８ｍｌのイソプロパノールを加え４℃で３０分または一昼夜放置した。１２０００ｇで４℃、１５分遠心し、上清を捨て、ペレットとなったＲＮＡを回収した。そのペレットに１ｍｌの７０％エ夕ノールを加え、激しく攪拌し１２０００ｇで４℃、１５分遠心した。上清を捨てて、同様の操作を２回繰り返し、ペレットの洗浄を行った。最後の洗浄後にペレットを１０分間風乾し、ジエチルピロカーボネイト処理した滅菌水５０ｕｌに溶解し、ＲＮＡサンプルとした。サンプルは使用するまで−８０℃に保存した。
ｃＤＮＡ合成
肝生検組織より抽出したＲＮＡサンプルからｃＤＮＡの合成を行ったＢＰ２０７の組織より取得したＴＦゲノムの欠失領域がＨＣＶの遺伝子の核酸番号の１１８９から３０００なので３０００より３’非翻訳領域側にｃＤＮＡ合成のプライマーを数本設定し、ｃＤＮＡ合成を行った。リバーストランスクリプターゼはＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社のＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼを用い、添付のプロトコールに従って、合成した。
ＲＮＡ２．５μｌにプライマーを５ｐｍｏｌｅ（０．５μｌ）加え、７０℃で３分間保持し、氷中で急冷した。これに５ｘＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μｌ、２０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＫＡＲＡ）２０ｕｎｉｔｓ、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ０．５μｌを加え、全量で１０μｌになるようにジエチルピロカーボネイト処理した滅菌水を加えた。この混合液を４２℃６０分反応させた。ＲＮＡを破壊するため、ＲＮａｓｅＨ（ＴＡＫＡＲＡ、６０Ｕ／μｌ）を１２Ｕ加え、３７℃で３０分保持し、その後７２℃３分で失活させ、ｃＤＮＡとして用いた。
尚、ｃＤＮＡ合成用のプライマーは、
５０３５Ｒ：５’−ＡＧＧＣＣＴＧＴＧＡ  ＡＧＡＣＧＣＴＣＴＣ  ＣＣＡＧＡＡＣＴ−３’  （配列番号：６９）
ＨＣ３２９７Ｒ：５’−ＧＧＴＧＡＴＧＡＣ  ＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣ  ＡＴ−３’  （配列番号：７０）
ＨＣ３４８１Ｒ：５’−ＧＣＴＴＡＧＡＧＧＣ  ＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴ  ＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴ  ＡＣ−３’  （配列番号：７１）
ＨＣ３９４５Ｒ：５’−ＧＧＣＧＡＣＣＧＣＡ  ＴＡＧＴＡＧＴＴＴＣ  ＣＡＴＡ−３’  （配列番号：７２）
のいずれかを用いた。どのプライマーを使用したかは表１に記載する。
ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）による増幅
ｃＤＮＡを用いて５’ＵＴＲからＮＳ３コードする領域にかけていくつかのプライマーの組み合わせでＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、添付のプロトコールに準じて反応させた。ｃＤＮＡ２μｌ、１０ｘＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｍｇ２＋  ｆｒｅｅ）２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ、センスプライマー１０ｐｍｏｌｅ、アンチセンスプライマー１０ｐｍｏｌｅ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ０．２５μｌ（５ｕｎｉｔ／μｌ）を加え、これに滅菌水を加えて２５μｌとしＰＣＲを行った。反応はマスターサイクラーグラジィエント（エッペンドルフ・ヤトロン株式会社）を用いた。反応プロファイルは９４℃で２分加熱後、変性９４℃２０秒、アニーリング６２℃３０秒、延長６８℃３分で１０サイクル、その後変性９４℃２０秒、アニーリング５８℃３０秒、延長６８℃３分で２５サイクルで行った。
この一回目のＰＣＲ（１ｓｔ  ＰＣＲ）産物２．５μｌを用い、２回目のＰＣＲ（２ｎｄ  ＰＣＲ）を行った。第１ＰＣＲ産物２．５μｌ、１０ｘＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｍｇ２＋  ｆｒｅｅ）２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ、センスプライマー１０ｐｍｏｌｅ、アンチセンスプライマー１０ｐｍｏｌｅ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ０．２５μｌ（５ｕｎｉｔ／μｌ）を加え、これに滅菌水を加えて２５μｌとし、第１  ＰＣＲと同様の反応プロファイルでＰＣＲを行った。
プライマーは、
ＨＣ８５Ｆ：５’−ＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧ  ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣ  ＧＴＧＣＡＧＣＣＴ−３’  （配列番号：５６）
ＨＣ８１３Ｓ：５’−ＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧ  ＧＣＧＴＧＡＡＣＴＡ  ＴＧＣＡＡＣＡＧＧＧ  ＡＡ−３’  （配列番号：７３）
ＨＣ８４１Ｓ：５’−ＧＧＡＡＣＴＴＧＣＣ  ＣＧＧＴＴＧＣＴＣＴ  ＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴ  ＴＣ−３’  （配列番号：７４）
ＨＣ３２０６Ｒ：５’−ＴＧＧＧＧＣＡＡＧＡ  ＴＧＧＴＴＡＴＡＡＡ  Ｃ−３’  （配列番号：７５）
ＨＣ３１７４ＡＳ：５’−ＧＧＧＧＴＡＡＧＡＴ  ＧＧＴＴＡＴＡＡＡＣ  ＧＴＡＣＧＴＡＣＣＴ  Ｇ−３’  （配列番号：７６）
ＨＣ３１１１ＡＳ：５’−ＡＴＡＡＴＧＡＣＣＣ  ＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴ  ＴＣＣＧＣＡＣＴＡＡ  Ｃ−３’  （配列番号：７７）
ＨＣ３２９７Ｒ：５’−ＧＧＴＧＡＴＧＡＣ  ＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣ  ＡＴ−３’  （配列番号：７０）
ＨＣ３４８１Ｒ：５’−ＧＣＴＴＡＧＡＧＧＣ  ＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴ  ＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴ  ＡＣ−３’  （配列番号：７１）
ＨＣ３７５９Ｒ：５’−ＴＧＡＣＡＴＣＡＧＣ  ＡＴＧＴＣＴＣＧＴＧ  ＡＣＣＡ−３’  （配列番号：７８）
ＨＣＬＯＮＧＡ１：５’−ＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡ  ＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣ  ＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴ−３’  （配列番号：６１）
ＨＣ３９４５Ｒ：５’−ＧＧＣＧＡＣＣＧＣＡ  ＴＡＧＴＡＧＴＴＴＣ  ＣＡＴＡ−３’  （配列番号：７２）
のいずれかのプライマーを組み合わせて用いた。用いた１ｓｔおよび２ｎｄ  ＰＣＲのプライマーの組み合わせは表１に記載した。
ＰＣＲ産物の解析
反応終了後のＰＣＲ産物を電気泳動で解析した。１％アガロースゲルを用い、１ｘＴＡＥバッフー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ４０ｍＭ、氷酢酸  ４０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ）でサブマリン型の電気泳動槽で泳動した。ＰＣＲ産物にゲルローディングバッファーを加え、電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線下でＰＣＲ産物を観察した。
４検体のＲＮＡより３組のプライマーでＨＣＶの遺伝子を増幅させた電気泳動の結果を図１に示す。２ｎｄ  ＰＣＲのプライマーがＨＣ８５ＦとＨＣ３２９７Ｒの組み合わせでは約３．１ｋｂ、８４１Ｓと３７５９Ｒの組み合わせでは約２．９ｋｂ、８４１Ｓと３１１１ＡＳの組み合わせでは２．２ｋｂのＦＬＦのＨＣＶ−ＲＮＡが検出されるはずである。番号１の検体（ＢＰ２７４）はどのプライマーの組み合わせでもＦＬＦの長さのＰＣＲ産物のみが検出された。番号２の検体（ＢＰ２９５）はＨＣ８５ＦとＨＣ３２９７Ｒの組み合わせでは約３．１ｋｂのＦＬＦと２ｋｂのＴＦ、８４１Ｓと３７５９Ｒの組み合わせでは約２．９ｋｂのＦＬＦ、８４１Ｓと３１１１ＡＳの組み合わせでは２．２ｋｂのＦＬＦが検出された。
番号３の検体（ＢＰ３２５）はＨＣ８５ＦとＨＣ３２９７Ｒの組み合わせでは約３．１ｋｂのＦＬＦ、８４１Ｓと３７５９Ｒの組み合わせでは約２．９ｋｂのＦＬＦ、８４１Ｓと３１１１ＡＳの組み合わせでは２．２ｋｂのＦＬＦと３００ｂｐのＴＦが検出された。番号４の検体（ＢＰ３７３）はＨＣ８５ＦとＨＣ３２９７Ｒの組み合わせでは約１．２ｋｂのＴＦ、８４１Ｓと３７５９Ｒの組み合わせでは約１ｋｂのＴＦ、８４１Ｓと３１１１ＡＳの組み合わせではＰＣＲ産物は検出されなかった。検体とプライマーの組み合わせで異なるが、ＦＬＦのみが検出される検体、ＦＬＦとＴＦが検出される検体、ＴＦのみが検出される検体があった。２６検体について、それぞれのｃＤＮＡ合成プライマー、１ｓｔ  ＰＣＲ、２ｎｄ  ＰＣＲのプライマーの組み合わせで得られたＰＣＲ産物を表１に示す。
【表１】
0005072361.tif 000002
配列の決定
得られたＦＬＦおよびＴＦと思われるＰＣＲ産物をプラスミドに組み込み、配列を決定した。
ＰＣＲ産物を、電気泳動したアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し４０μｌの滅菌水に抽出した。ＤＮＡ  ５μｌとｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．５μｌ、に１０  ｘ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １μｌ、滅菌水２．５μｌを加え、１６℃で１時間反応させ、ＤＮＡとベクターを結合させた。井上らの方法（Ｇｅｎｅ、ｖｏｌ  ９６、１９９０、ｐ２３−２８）で作成した大腸菌ＤＨ５αのコンピタントセルにＤＮＡを加え、定法に従って形質転換させた。
出現したコロニーを２ｘＹＴ培地で一昼夜培養し、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）でミニプレし、プラスミドＤＮＡを回収した。ＰＣＲ産物が組み込まれたプラスミドＤＮＡをＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社のＣＥＱ  ２０００ＸＬ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍで解析して配列を決定した。ＣＥＱ２０００  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従い、反応させ、解析した。シークエンスプライマーはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙのプライマー及びＨＣＶの配列に適したものを適宜選択した。配列の解析はＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）およびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で解析した。
検出されたＴＦゲノムの核酸配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を配列表に示す。検体ＢＰ２０３は配列番号９〜１２に、ＢＰ２０４は配列番号１３と１４に、ＢＰ２０８は配列番号１５と１６に、ＢＰ２９５は配列番号１７と１８に、ＢＰ３２５は配列番号１９と２０に、ＢＰ３６８は配列番号２１と２２に、ＢＰ３７３は配列番号２３から２８に、ＢＰ１は配列番号２９から３４にＢＰ２は配列番号３５から３８に、それぞれ記載した。配列の決定により、いずれかのプライマーの組み合わせでＦＬＦが検出されたもの、ＴＦが検出されたものをまとめて表２に示した。
【表２】
0005072361.tif 000003
ＴＦのみが検出されて検体が６検体、ＦＬＦとＴＦが検出された検体が５検体、ＦＬＦのみが検出された検体が６検体、残りの検体はどちらも検出できなかった。どちらも検出できなった検体はほとんどが、遺伝子型２であり、使用したｃＤＮＡ合成プライマー、１ｓｔ  ＰＣＲ、２ｎｄ  ＰＣＲのプライマーは遺伝子型１の配列をもとに合成したため、遺伝子型２のＨＣＶ−ＲＮＡの配列とは一致しない部分があり、ＰＣＲ産物が得られない検体が多かったものと考えられる。
ＴＦゲノムの解析
得られたＨＣＶ−ＲＮＡのＴＦの配列をＮｏ．Ｄ８９８１５のＨＣＶの配列の構造と比較検討した。図２はＴＦのみが検出されたＢＰ２０７、ＢＰ３６８、ＢＰ３７３、ＢＰ１、ＢＰ２、およびＢＰ２０３の構造を示している。欠失部分は約２ｋｂであるが、ＢＰ２０７と全く同じ領域が欠失しているものはなく、それぞれの患者で欠失の領域が異なっていた。ＢＰ２０３は遺伝子型２の検体で唯一ＴＦが検出された検体であるが、同じような欠失が見られ、欠失部分は核酸番号の９８８から２９８８位に存在していた。
これらのＨＣＶ−−ＲＮＡに共通しているのはＢＰ２０７と同様にｉｎ−ｆｒａｍｅで欠失が起こっており、欠失部分を除いてはＨＣＶのポリプロテインを合成していると考えられる。特にコア蛋白をコードする遺伝子を正常な形で保持しておりコア蛋白も正常に合成されうること、ＮＳ２のＣ末端側の２箇所の膜貫通領域を欠失したものはなく、ＮＳ３以降のタンパク質も正常に発現できることが示唆される。さらにＥ１とＮＳ２の蛋白をコードする領域がｉｎ−ｆｒａｍｅで結合しているため、Ｅ１とＮＳ２の融合蛋白が産生されているものと考えられる。
次にＴＦとＦＬＦの両方のタイプが検出された検体についてＴＦの配列の構造を比較した（図３）。ＢＰ２０４、ＢＰ３２５、ＢＰ２９５、ＢＰ２８８の配列を確認した。ＴＦのみが検出された検体と異なり、コア蛋白をコードする領域に該当する遺伝子が取得できているＢＰ２０４、ＢＰ２９５では、コア領域の一部または全部が欠失していた。また欠失領域の後半部分もＮＳ２を保持し、Ｅ２領域の一部を欠失しているものがあった。
但し、これらの検体のＨＣＶ−ＲＮＡもＢＰ２０７と同様にｉｎ−ｆｒａｍｅで欠失が起こっており、欠失部分を除いては、ＨＣＶのポリプロテインを合成しているものと考えられる。
ＴＦとＦＬＦのＨＣＶ−ＲＮＡの配列の検討
慢性活動性肝炎の患者でＴＦとＦＬＦのＨＣＶ−ＲＮＡが取得された検体について、その重複部分の核酸配列と推定されるアミノ酸配列を比較した。ＴＦの長さのＰＣＲ産物を同様の方法でｖｅｃｔｏｒにクローニングし、核酸配列を決定した。ＢＰ２０４、ＢＰ３２５、ＢＰ２０８のＦＬＦの配列はそれぞれ配列番号３９と４０、４１と４２、４３と４４に示す。核酸、アミノ酸の配列を比較するとＢＰ３２５は核酸で９６．７％、アミノ酸で９７．５％、ＢＰ２８８は核酸で９７．３％、アミノ酸で９７．７％％で同じｑｕａｓｉｓｐｅｃｅｓに属するウイルスと考えられた。一方、ＢＰ２０４は核酸で８２．６％、アミノ酸で８３．６％でＴＦとＦＬＦの配列は乖離していた。
【表３】
0005072361.tif 000004
血清中からのＴＦ−ＨＣＶ−ＲＮＡの分離
肝組織からＴＦ−ＨＣＶ−ＲＮＡが検出された検体について、血清からＴＦ−ＨＣＶ−ＲＮＡの分離を試みた。肝生検と同時に採血された血清からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて抽出した。血清２００μｌより添付のプロトコールに従って、ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μｌに抽出した。ここで肝生検の検体であるＢＰ３６８に対応する血清は、以下Ｓ３６８と記載する。
ＲＮＡ２．５μｌを用いて、肝生検のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲを行った方法と同様の方法で、ＰＣＲ産物を取得した。Ｓ３６８についてｃＤＮＡ合成を３２９７Ｒプライマー、第１  ＰＣＲをＨＣＬＯＮＧＡ１と３２９７Ｒ、２ｎｄＰＣＲを８５Ｆと３１７４ＡＳで行った場合に１．２ｋｂのＴＦのＰＣＲ産物と思われるものが取得できた（表４）。
【表４】
0005072361.tif 000005
次に、５’ＵＴＲ領域でのＨＣＶ−ＲＮＡの定量で比較的ＲＮＡ量の多かったＳ２０４、Ｓ２０７、Ｓ３６８について、その他のプライマーの組み合わせでｃＤＮＡ合成からＰＣＲを行った。その結果、Ｓ２０７とＳ３６８はＴＦの長さのＰＣＲ産物が、Ｓ２０４からはＦＬＦの長さのＰＣＲ産物が取得された（表５）。このＰＣＲ産物を同様に、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、配列を決定した。Ｓ２０７、Ｓ３６８の決定した配列は、それぞれ配列番号４５と４６、配列番号４７と４８に示す。ＢＰ２０７とＳ２０７およびＢＰ３６８とＳ３６８の重複部分について核酸及びアミノ酸の配列相同性を比較すると、ＢＰ２０７とＳ２０７でそれぞれ９９．４％と９９．３％、Ｐ３６８とＳ３６８で９８．８％と９７．３％であり、同じｑｕａｓｉｓｐｅｃｅｓに属するウイルスと思われる（表６）。このことは肝臓中で複製されたＴＦ−ＨＣＶ−ＲＮＡが何らかのシステムで血清中に放出されているものである。
【表５】
0005072361.tif 000006
【表６】
0005072361.tif 000007
実施例３． ＨＣＶ  ＲＮＡレプリコンの作成
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＸｈｏＩとＸｂａＩサイト間に、ＸｈｏＸ−Ｘｂａ−ｓオリゴマーとＸｈｏＸ−Ｘｂａ−ａｓオリゴマーをアニーリングさせて得られるリンカー断片を挿入することにより、ｐＢＳＩＩＳＫ（＋）ΔＸＸを構築した。またｐＬＶ２０７−０００７をＳｂｆ＿Ｈ１プライマーとＣｌａ＿ａｓプライマーを用いたＰＣＲに供することにより、約０．７ｋｂの断片を増幅させ、これをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにクローニングすることにより、ｐＬＶＣ−０００７Ｓｂｆを得た。ｐＢＳＩＩＳＫ（＋）ΔＸＸのＮｏｔＩとＸｂａＩのサイト間に、ｐＬＶＣ−０００７ＳｂｆをＮｏｔＩとＣｌａＩで切断することによって得ることが出来る約０．７ｋｂの断片と、ｐＬＶＣ＿ＣｌａＸｂａ７．２ＫをＣｌａＩとＸｂａＩで切断することにより得られる約７．２ｋｂの断片を、連結挿入することにより、ｐＳｂｆ−ＬＶ２０７ＴＦを得た。
一方、ＨＣＶ抗体陽性の血清、Ｇ１４から精製したＲＮＡに、Ｔ７−ＨＣ９３１３ｂプライマーを加え、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、メーカーの推奨する方法にてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡ反応液の一部を用い、Ｔ７−ＨＣｌｏｎｇＨ１プライマーと１ｂ１６０Ｂａｍプライマーの存在下のＥＸ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いたＰＣＲ（１サイクルが９５℃、３０秒、５５℃、１分、７４℃、１分からなる反応を３５サイクル）により、ＨＣＶ  ｃＤＮＡを増幅した。アガロースゲル電気泳動にて増幅した断片を分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｋｉｔを用いてアガロースゲルからＤＮＡを精製した。精製した断片はｐＴ７−ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７７Ａを用い、マーカーの推奨する試薬、条件で配列を決定した。
次に、ＨＣＶ  ｃＤＮＡをＴ７−Ｈ１Ｖ２プライマーとｎｄｅ＿ｃｏｒｅ９＿ａｓプライマーを用いＰＣＲにて増幅した。一方ｐｃＤＮＡ３．１（＋）をテンプレートにｎｄｅ＿ｎｐｔ＿ＳとＥｃｏＮｐｔ＿ａｓプライマーでＰＣＲを行い、ネオマイシン耐性遺伝子断片を増幅した。これらの断片をＮｄｅＩの制限酵素部位で連結させたものをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）にクローニングすることにより、ＨＣＶ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲとｃｏｒｅの最初の９アミノ酸とネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンリン酸転移酵素、ＮＰＴ−ＩＩ）との融合断片を構築した。この断片を持つプラスミドをさらにＴ７−Ｈ１Ｖ２プライマーとＳｂｆ＿Ｎｐｔ＿Ｒプライマーとを用いたＰＣＲを行い、５’末端にＰａｃＩの３’末端にＳｂｆＩのサイトを持つ断片を調製した。これをｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙにクローニングすることによりｐＧ１４ＵＴＲｃＮＥＯを得た。
ｐＧ１４ＵＴＲｃＮＥＯからＮｏｔＩとＳｂｆＩで切断することにより得ることが出来る約１．２ｋｂの断片を、ｐＳｂｆ−ＬＶ２０７ＴＦのＮｏｔＩとＳｂｆＩサイト間に挿入することにより、ｐＬＶ２０７ＴＦＲｅｐＧ１４を得た。このｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡをＸｂａＩとＮｏｔＩで切断したものを鋳型に、Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮＡを合成した。メーカの推奨する方法にてＲＮＡを精製した。
ヒト肝がん細胞（Ｈｕｈ７、ＪＣＲＢ０４０３）はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ，ＩＷＡＫＩ）に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ５０Ｕ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌとなるように加えたものを培養液として、５％二酸化炭素付加、３７℃で培養を行った。コンフルエントになる前の細胞をトリプシン、ＥＤＴＡ処理により培養皿から剥離させ、血清添加培地に再懸濁することによりトリプシンを不活化する。ＰＢＳで２回洗浄後、１．２５％  ＤＭＳＯを添加したＣｙｔｏｍｉｘ（１２０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，１０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．１５ｍＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，ｐＨ７．６）に再懸濁し、ギャップ０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移す。
適当量のＲＮＡを細胞に加えた後、５分間氷上で十分冷却する。エレクトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、９６０ｕＦ、２７０Ｖにてパルスを加える。直ちに８ｍｌの培地に再懸濁し、一部をプレートに播く。一定時間培養した後、細胞を０．１％  ＥＤＴＡ、ＰＢＳにて剥離させ、遠心分離により沈殿させ、回収した。回収した細胞から、Ｉｓｏｇｅｎ（日本ジーン）を用いて、メーカーの推奨する条件に従いＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡに含まれるＨＣＶ  ＲＮＡ量は定量的ＲＴ−ＰＣＲ法にて解析した。
マイナス鎖の定量方法
ＨＣＶ  ＲＮＡの複製が起こっていることは、細胞中にＨＣＶ  ＲＮＡの５’ＵＴＲ領域のマイナス鎖が検出できるか否かで調べた。マイナス鎖の特異的な定量法は公開番号０８−１８７０９７の公開特許に記載のマイナス鎖ＲＮＡの特異的検出法と同様の方法で行った。
ｐＬＶ２０７ＴＦＲｅｐＧ１４を鋳型にｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＲＮＡをエレクトロポレーションで導入した細胞から、有意な量のマイナス鎖が検出でき、ＨＣＶ  ＲＮＡが複製できたことが確認された。
実施例４． 全ＲＮＡ中の短縮型ＲＮＡ量比とＨＣＶ関連疾患との相関
患者検体から回収したＲＮＡに含まれるＨＣＶ  ＲＮＡの定量は以下のように行った。５’ＵＴＲを標的にしたＲＮＡの定量を行う場合には、Ｃｈｉｂａ−Ｓ、Ｃｈｉｂａ−ＡＳプライマーを用いた。ＱａｕｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、メーカーの推奨する条件で反応液を調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に移し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にセットし、反応を行わせＰＣＲ産物を経時的にモニターした。適切に希釈したｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＨＣＶ  ５’ＵＴＲを含む既知濃度のＲＮＡを標準物質として用いた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖ３．５．３）を利用して解析を行なった。
ＲＮＡの定量をＥ２の領域を標的に行う場合は、ＨＣ１９８６ＳプライマーとＨＣ２１９９−ａｓプライマーを用いた。ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、メーカーの推奨する反応条件にて逆転写反応を行わせた。この反応液を、等量の同じプライマーを含むＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で調製した反応液を加え、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に移し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にセットした。ＰＣＲ反応を行わせ、産物を経時的にモニターした。適切に希釈したｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＨＣＶ  ５’ＵＴＲを含む既知濃度のＲＮＡを標準物質として用い、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して定量値を求めた。
実施例５． 短縮型配列をコードするｃＤＮＡのほ乳類細胞での発現とＨＣＶ蛋白質の解析
ｐｃＤＮＡ３．１のＮｏｔＩ、ＸｂａＩにｐＬＶ２０７ＴＦＲｅｐＧ１４をＮｏｔＩ、ＸｂａＩで切断して得られる約８．５ｋｂの断片を挿入することにより、ｐｃＤ−ＬＶＴＲＧを得た。このプラスミドＤＮＡをヒト腎臓由来培養細胞、２９３ＴＲｅｘにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。ＤＮＡトランスフェクト後４時間目に培地を交換し、さらに細胞を１８時間培養した。細胞をプレートから回収し、遠心分離により沈殿、回収した。細胞をＲＩＰＡ緩衝液中でピッペッティングすることにより破砕し、遠心分離法にて上清を回収した。回収した上清に１／３量の３ｘ  ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１８７．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、６％  ＳＤＳ、１２５ｍＭ  ＤＴＴ、３０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、９５℃、５分間熱処理した。
ポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品）にアプライし、メーカーの推奨する方法にて電気泳動を行った。泳動終了後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にＳｅｍｉ−Ｄｒｙ  ｂｌｏｔｔｅｒ（ザルトリウス社）を用いて常法に従い転写した。転写した膜は、ＴＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄後、１０倍希釈したブロッキング剤（Ｍｉｌｋ  Ｄｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）中で室温２時間反応させた。ここに終濃度０．３ｕｇ／ｍｌとなるように希釈した一次抗体を加え、室温１．５時間、振盪しながら反応させた。反応液を捨て、ＴＴＢＳにて３回洗浄後、４０，０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗体を加え、室温１時間、振盪しながら反応させた。
反応液を捨て、ＴＴＢＳにて３回洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて室温、５分間反応させた。生じた化学発光は、ＬＡＳ１０００（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）を用い検出するか、シグナルが不十分な場合は、ＢｉｏＭａｘ  Ｆｉｌｍ（Ｋｏｄａｋ）を露光させることにより検出した。ｐＬＶ２０７ＴＲＧのＨＣＶ  ｃＤＮＡにより、成熟型のコア抗原一致する位置に、ＮＳ３抗原が成熟型ＮＳ３抗原の分子量に一致する位置に、それぞれ抗コアモノクローナル抗体、抗ＮＳ３ウサギ抗血清により検出された。
さらに抗Ｅ１モノクローナル抗体と反応させると、分子量約３５ｋｄの正常なものに近い分子量のものが検出されるが、ＥｎｄｏＨ処理後に分析し反応させた場合は、分子量２４ｋｄに変化した。この分子量は、ＬＶ２０７のＨＣＶ  ｃＤＮＡの予想されるアミノ酸配列の、Ｅ１とＮＳ２との融合タンパク質のアミノ酸配列から算出される分子量にほぼ一致する。このことからＥ１とＮＳ２は融合タンパク質として存在し、糖鎖修飾を受けることが分かった。これらのことからＬＶ２０７のＨＣＶ  ｃＤＮＡによってコードされるＨＣＶポリプロテインは、ＦＬＦ型のポリプロテインと同じ切断部位で切断されていることが分かった。
実施例６． ＨＣＶ  ＲＮＡレプリコンの作成と細胞での複製
薬剤耐性マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を持たないＴＦタイプのレプリコンを作成した。実施例３で構築したｐＳｂｆ−ＬＶ２０７ＴＦのプラスミドをＮｏｔＩとＣｌａＩで切断し約０．７ｋｂの断片を得た。この断片を、実施例３で構築したプラスミドｐＬＶ２０７ＴＦＲｅｐＧ１４のＮｏｔＩとＣｌａＩサイト間に挿入することにより、プラスミドｐＬＶ２０７ＴＦを構築した。
このプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩとＸｂａＩで切断したものを鋳型として、Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮＡを合成した。このＲＮＡをメーカーの推奨する方法にて精製し、細胞へのトランスフェクションに用いた。
２日間培養を行なった、ヒト肝がん細胞Ｈｕｈ７に、精製したＲＮＡをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。細胞をトリプシン、ＥＤＴＡ処理し剥離させ、血清添加培地に再懸濁し、トリプシンを不活化する。ＰＢＳで２回洗浄後、１．２５％ＤＭＳＯを添加したＣｙｔｏｍｉｘ（１２０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，１０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．１５ｍＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，ｐＨ７．６）に再懸濁し、約４×１０６の細胞をギャップ０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移した。
１０μｇのＲＮＡをキュベットに加え、５分間氷上で十分冷却する。エレクトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で９６０ｕＦ，２７０Ｖにてパルスを加える。直ちに８ｍｌの培地に再懸濁し、１２ｗｅｌｌのプレート（直径２２．１ｍｍ）に播いた。４時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間に細胞を０．１％ＥＤＴＡ−ＰＢＳで剥離し遠心分離にて回収した。細胞ペレットを５０μｌ  ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＮＰ４０，０．１％  Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％  ＳＤＳ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に溶解し、１０ｋｒｐｍで５分間遠心により上清を回収した。上清１０μｌをＨＣＶコア抗原のキット（冨士レビオ、ルミパルス）を使用し測定した。
図４に示すように、コア抗原の測定値は２４時間までは検出限界以下であるが、４８時間から上昇し、９６時間後も増加していた。このことは本願発明のＴＦタイプのレプリコンが細胞中で複製し、コア蛋白質を複製していることを示している。肝臓で複製している構造と同じＴＦゲノムが、Ｉｎ−ｖｉｔｒｏで複製可能であることを示したものである。
実施例７．遺伝子型２のＨＣＶ検体からのトランケートフォーム遺伝子の取得
実施例２で慢性肝炎患者のバイオプシー検体からＲＴ−ＰＣＲ法により、トランケートフォーム遺伝子を検出したが、遺伝子型２の検体からは、ＢＰ２０３の検体を除いて、トランケートフォーム遺伝子は検出できなかった。この原因は検出に用いたプライマーの配列が、遺伝子型１の配列に基づいてデザインされたためであると考えられた。
そのため、遺伝子型２の配列に基づき、プライマーをデザインし、そのプライマーにより、遺伝子型２の慢性肝炎患者のバイオプシー検体より、トランケートフォーム遺伝子の検出を試みた。
使用するプライマー以外は実施例２の方法に従い、表１に示した遺伝子型２について、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、ＰＣＲフラグメントのクローニング、塩基配列の決定を行った。ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲのプライマーの組み合わせは、次に示す２組の組み合わせで行った。Ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ＡはｃＤＮＡ合成が２ａ＿ＨＣ３２９３Ｒ、１ｓｔ  ＰＣＲが２ａ＿８０７Ｓ及び２ａ＿３２１６Ｒ、２ｎｄ  ＰＣＲが２ａ＿ＨＣ８３５Ｓ及び２ａ＿ＨＣ３２０３Ｒで、Ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ＢはｃＤＮＡ合成が２ａ＿ＨＣ３１５６Ｒ、１ｓｔ  ＰＣＲが２ａ＿８０７Ｓ及び２ａ＿３１４４Ｒ、２ｎｄ  ＰＣＲが２ａ＿ＨＣ８３５Ｓ及び２ａ＿ＨＣ３１０８Ｒである。それぞれのプライマーの配列を下記に示す。
２ａ＿ＨＣ３２９３Ｒ：ＴＣＴＣＣＡＴＴＧＧＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣ（配列番号８４）
２ａ＿ＨＣ３２１６Ｒ：ＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＧ（配列番号８５）
２ａ＿ＨＣ３２０３Ｒ：ＣＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡ（配列番号８６）
２ａ＿ＨＣ３１４４Ｒ：ＣＴＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＡＣＡＣＡ（配列番号８７）
２ａ＿ＨＣ３１０８Ｒ：ＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＣＴＧＡＣＧＡＡＧＴＡＴＧＧ（配列番号８８）
２ａ＿ＨＣ８３５Ｓ：ＧＧＡＡＴＣＴＡＣＣＣＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＣＴＴＣ（配列番号８９）
２ａ＿ＨＣ８０７Ｓ：ＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＡＴＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＡＣＡＧＧＧＡＡ（配列番号９０）
表６に示すように、Ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ａで９検体中６検体において、Ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｂで９検体中２検体において、欠失を有する遺伝子が、検出された。これらの遺伝子の配列を決定したところ、ＢＰ２０３は９８７−２９９９ｎｔ、ＢＰ２３５は１０６０−２９４５、ＢＰ２９７は１０２４−２９６６に約２ｋｂの欠失を有し、ｉｎ−ｆｒａｍｅで結合している典型的なトランケートフォーム遺伝子であった。欠失部分の配列を図５に示す。
【表６】
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実施例８．慢性活動性肝炎患者及び肝癌患者の肝臓組織からのトランケートフォーム遺伝子の検出率について
実施例２及び実施例７の結果をまとめると、ＢＰ２０７を含めた２４検体の慢性活動性肝炎患者の肝臓組織のうちＢＰ２０７、ＢＰ２０３、ＢＰ３２５、ＢＰ２９７、ＢＰ３６８、ＢＰ３７３の６検体から、Ｅ１からＮＳ２にかけての約２ｋｂの遺伝子がｉｎ−ｆｒａｍｅで欠失している典型的なトランケートフォーム遺伝子が検出された。一方、３検体の肝癌組織からは、ＢＰ１とＢＰ２から同様の典型的なトランケートフォーム遺伝子が検出された。それぞれの検出率は慢性肝炎患者で２５％（６／２４）、肝癌患者で６６．６％（２／３）であり、慢性肝炎から肝癌へ進行するにつれて、検出率が高くなった。
さらに、無症候性キャリアの血漿から２０検体から、トランケートフォーム遺伝子の検出を試みたが、典型的なトランケートフォーム遺伝子は検出できなかった。この結果は、慢性肝炎、肝硬変、肝癌とＣ型肝炎ウイルスの感染による病状の進行とトランケートフォーム遺伝子の存在が何らかの関連を持っていることを示している。つまり、トランケートフォーム遺伝子の検出は、病状の進行の予測因子として有用であると考えられる。
実施例９．劇症肝炎患者からのトランケートフォーム遺伝子の取得
劇症肝炎患者の血清からトランケートフォーム遺伝子の取得を試みた。患者血清からＲＮＡの抽出試薬であるＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用い、添付の指示書に従って、ＲＮＡを抽出した。
このＲＮＡから実施例１でＢＰ２０７より遺伝子を取得したのと同様の手順で、第８５位から９３０２位までの、ＨＣＶ遺伝子を取得した。ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにクローニングした１１クローンの配列を決定したところ、１０クローンは９２２位から１０６２位、１０９６位から１１３１位および１２０９位から２９９７位までが欠失した典型的なトランケートフォーム遺伝子であった。また残りの１クローンは１０９６位から１１３１位の欠失はなかったが、９２２位から１０６２位および１２０９位から２９９７位までが欠失した典型的なトランケートフォーム遺伝子であった。
さらに、この患者のＲＮＡより実施例１に記載の方法で５’非翻訳領域と３’非翻訳領域のｃＤＮＡの取得を行った。
次に、５’非翻訳領域の末端の配列を決定するため、５’ＲＡＣＥ法により末端配列の取得を試みた。患者ＲＮＡより、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のキットを用い、添付の指示書に従って、ＨＣＶの５’非翻訳領域の末端を取得した。ｃＤＮＡ合成のためのアンチセンスプライマーは、Ｃｈｉｂａ−ａｓを使用した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅでｃＤＮＡを合成し、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．ｃｏｌｕｍｎで精製後、ｃＤＮＡにＴｄＴ−ｔａｉｌｉｎｇ反応を行い、ｄＣＴＰを付加した。このｃＤＮＡを、キットに添付の５’ＲＡＣＥ  Ａｂｒｉｄｇｅｄ  Ａｎｃｈｏｒプライマー及びＫＹ７８プライマー：５’−ＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＣＣＡＧＴ−３’  （配列番号：９１）で、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、１ｓｔ  ＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を鋳型に、キットに添付のＵＡＰプライマーとＫＭ２プライマー：５’−ＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＴＡＴＣ−３’  （配列番号：９２）で、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにクローニングし、配列を決定した。その結果、このトランケートフォーム遺伝子は、通常のフルレングスのＨＣＶの遺伝子と同様に、第１位の配列から５’非翻訳領域を有していた。
さらに、３’非翻訳領域の末端の配列を決定するため、３’ＲＡＣＥ法により末端の配列の取得を試みた。まず患者のＲＮＡにＰｏｌｙ（Ａ）Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、添付の指示書に従い、Ｐｏｌｙ（Ａ）を付加した。このＰｏｌｙ（Ａ）の付加されたＲＮＡより、ｄＴ−Ａｄｐプライマー：５’−ＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’  （配列番号：９３）を用いて実施例１に記載のｃＤＮＡ合成の手順と同様にｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、３ＵＴＲ−１Ｆプライマー：５’−ＡＴＣＴＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣ−３’  （配列番号：９４）及びＡｄｐプライマー：５’−ＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ−３’  （配列番号：９５）で１ｓｔ  ＰＣＲを、ＸＲ５８Ｆ：５’−ＣＴＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡ−３’  （配列番号：９６）及びＡｄｐプライマー（配列番号：９５）で２ｎｄ  ＰＣＲをＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。このＰＣＲ産物をこのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにクローニングし、配列を決定した。その結果、このトランケートフォーム遺伝子の３’末端は、通常のフルレングスのＨＣＶの遺伝子と同様の３’末端を有していた。
【産業上の利用可能性】  本発明の活用例として、レプリコン複製系はＣ型肝炎ウイルスの治療薬の開発のための薬剤スクリーニングに利用できる。この系は治療薬の薬効評価、製造にも利用可能である。またＴＦゲノムの検出系はＣ型肝炎の病態マーカーとしても利用可能であり、診断薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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