(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
GFP遺伝子を含むpCAGGS発現ベクターであって、ミトコンドリアへの移行シグナル配列を有し、該GFPがマウスのミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする、ミトコンドリア局在型GFP発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウス。
【請求項２】
移行シグナル配列がシトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIIIのシグナル配列であることを特徴とする、請求項１に記載のミトコンドリア局在型GFP発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウス。
【請求項３】
ミトコンドリアにおいて特異的にGFPを発現することを特徴とする、請求項１または２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
GFP遺伝子を含むpCAGGS発現ベクターであって、ミトコンドリアへの移行シグナル配列を有し、該GFPがマウスのミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする、ミトコンドリア局在型GFP発現ベクター、または
GFP遺伝子を含むpCAGGS発現ベクターであって、ミトコンドリアへの移行シグナル配列としてシトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIIIのシグナル配列を有し、該GFPがマウスのミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする、ミトコンドリア局在型GFP発現ベクターが導入されたマウス卵細胞。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウス由来の組織または細胞。
【請求項６】
以下の工程：
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウスまたは請求項５に記載のトランスジェニックマウス由来の組織もしくは細胞に被験物質を接触させる工程、及び
（ｂ）ミトコンドリア障害またはアポトーシスが誘導されるか否かを確認する工程、
を含むことを特徴とする、ミトコンドリア障害またはアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
以下の工程：
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウスまたは請求項５に記載のトランスジェニックマウス由来の組織もしくは細胞に被験物質を接触させる工程、
（ｂ）上記トランスジェニックマウスまたは上記細胞をアポトーシス誘導剤で処理する工程、及び
（ｃ）アポトーシスが抑制されるか否かを確認する工程、
を含むことを特徴とする、アポトーシス抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、導入された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子がミトコンドリアで局在的に発現するミトコンドリア局在型ＧＦＰ発現ベクター、及びミトコンドリアにおいて特異的にＧＦＰを発現するトランスジェニック動物に関する。
背景技術
哺乳動物において、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は厳密な母系遺伝を示すことが知られている。本発明者等は先に、高感度のＰＣＲ法を使用して、精子のｍｔＤＮＡが胚形成初期の２細胞期までに胚細胞の細胞質から排除されることを見出した（Ｋａｎｅｄａ，Ｈ．ら，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，４５４２−４５４６；Ｓｈｉｔａｒａ，Ｈ．ら，（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４８，８５１−８５７）。この現象がｍｔＤＮＡの母系遺伝を引き起こすものと考えられる。
胚形成初期の精子のミトコンドリアの細胞内挙動を直接かつ視覚的に観察するために、従来、ミトコンドリア画分、細胞または組織をローダミン１２３またはＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ；ｃａｔ．Ｍ７５１２）によって染色し、蛍光顕微鏡下で観察することが行われている（Ｋａｎｅｄａ，Ｈ．ら，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，４５４２−４５４６；Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９９７）Ｚｙｇｏｔｅ  ５，３０１−３０８；Ｓｕｔｏｖｓｋｙ，Ｐ．ら，（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５，１１９５−１２０５；Ｓｕｔｏｖｓｋｙ，Ｐ．ら，（２０００）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６３，５８２−５９０）。こうした蛍光色素の使用により、染色されたミトコンドリアが精子の中片部で明瞭かつ特異的に染色される。
しかしながら上記の方法では、いくつかの欠点があることが知られている。すなわち、上記色素は紫外線照射によって容易に退色してしまい、紫外線非照射下においても退色が速いこと、また、遠心分離や再懸濁といった染色作業工程で細胞及びミトコンドリアが障害を受け、精子の受精能が顕著に低下すること、更に、染色後においても色素が容易に解離してしまうこと等である。こうした欠点のために、ミトコンドリアの経時的または反復的観察が困難なものとなっている。
生体染色色素の代わりに、非侵襲性化学発光リポーター分子として広く利用されている緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用い、目的のタンパク質の細胞内区画における局在及び／または移動を可視化することができる。ＧＦＰはまた、細胞内器官のリアルタイムの可視化のためにも利用することが可能である。特に、Ｒｉｚｚｕｔｏら（Ｒｉｚｚｕｔｏ，Ｒ．ら，（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５，６３５−６４２；Ｒｉｚｚｕｔｏ，Ｒ．ら，（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６，１８３−１８８）は、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ前駆体タンパク質のＮ末端をコードするポリヌクレオチドにＧＦＰ  ｃＤＮＡクローンをつないで（ｍｔＧＦＰ）トランスフェクションすることによって、ＧＦＰがＨｅＬａ細胞のミトコンドリア内のみに蓄積することを報告している。蛍光はミトコンドリアで典型的なロッド様の形状として観察され、ＧＦＰの蓄積がミトコンドリアで生じていることを示している。更に、紫外線の反復照射によってミトコンドリアに特異的な生体染色色素であるローダミン１２３の蛍光が劇的に低下するのに対し、ＧＦＰの蛍光は同じ条件下で全く、若しくはほとんど観察されていない。
このように、細胞内器官への移送シグナルと連結したＧＦＰは、細胞内器官をリアルタイムで観察するために広範な応用を有することが期待された。
しかしながら、上記の方法では、株化培養細胞やプライマリーカルチャー可能な組織の細胞等、利用できる細胞が限定され、また個体発生の際のミトコンドリアの挙動や病態形成時の病巣におけるミトコンドリアの動態を観察することは不可能である。
動物個体のあらゆる組織でミトコンドリアに局在化したＧＦＰを発現させるためには、適切なベクターを選択しなければならない。現在までに、組織特異的な発現を可能にするためのプロモーター配列を有する発現ベクター、あるいは全ての組織での発現を可能とするベクターが発明・改良されているが、特に外来遺伝子の発現量という観点からは、十分に満足できる発現ベクターは数少ない。
一方、プログラムされた細胞死とも呼ばれるアポトーシスは、細胞の内容物が放出されるネクローシスと対照的に細胞の内容物が細胞外に放出されず、細胞内において核の凝集・断片化等の特徴的な形態変化やシトクロムＣの流出等のミトコンドリア障害が生じることが知られている。近年、アポトーシスが個体発生や種々の疾患との関連があることが報告されつつあるが、未だ解明されないことも多く残されている。
発明の開示
本発明者等は、上記課題を解決するために種々検討した結果、発現ベクターとしてあらゆる組織において外来遺伝子の強い発現を可能にするｐＣＡＧＧＳ発現ベクターを選択した。そして、ＧＦＰを用いてミトコンドリアを標識するために、ミトコンドリア局在型ＧＦＰ発現ベクターを作製すると共に、ＧＦＰによってミトコンドリアが可視化されたトランスジェニック（Ｔｇ）動物を作製した。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）  緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むｐＣＡＧＧＳ発現ベクターであって、該ＧＦＰがミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする、ミトコンドリア局在型ＧＦＰ発現ベクター。
（２）  ミトコンドリアへの移行シグナル配列を有することを特徴とする、上記（１）に記載の発現ベクター。
（３）  移行シグナル配列がシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩＩのシグナル配列であることを特徴とする、上記（２）に記載の発現ベクター。
（４）  ＧＦＰ遺伝子を含む発現ベクターであって、該ＧＦＰがマウスのミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする、ミトコンドリア局在型ＧＦＰ発現ベクター。
（５）  上記（１）から（４）のいずれかに記載の発現ベクターが導入されたトランスジェニック動物。
（６）  ミトコンドリアにおいて特異的にＧＦＰを発現することを特徴とする、トランスジェニック動物。
（７）  ミトコンドリアへの移行シグナル遺伝子及びＧＦＰ遺伝子が導入されていることを特徴とする、上記（６）に記載のトランスジェニック動物。
（８）  上記（１）から（４）のいずれかに記載の発現ベクターが導入された細胞。
（９）  上記（５）から（７）のいずれかに記載のトランスジェニック動物由来の組織または細胞。
（１０）  以下の工程：
（ａ）上記（５）から（７）のいずれかに記載のトランスジェニック動物、または上記（８）または（９）に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、及び
（ｂ）ミトコンドリア障害またはアポトーシスが誘導されるか否かを確認する工程、
を含むことを特徴とする、ミトコンドリア障害またはアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法。
（１１）  以下の工程：
（ａ）上記（５）から（７）のいずれかに記載のトランスジェニック動物、または上記（８）または（９）に記載の細胞に被験物質を接触させる工程、
（ｂ）上記動物または上記細胞をアポトーシス誘導剤で処理する工程、及び
（ｃ）アポトーシスが抑制されるか否かを確認する工程、
を含むことを特徴とする、アポトーシス抑制剤のスクリーニング方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、当分野において使用されるものの何れを使用しても良く、また、蛍光強度をより強めたり、一定期間で蛍光が消失するような遺伝子改変ＧＦＰを用いることもできる。市販品としては、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１／２／３（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、ｃａｔ、＃６０７７、Ｋ６００１−１）等が挙げられる。ＧＦＰは、上記したように非侵襲性であり、また紫外線照射等による退色が見られないという優れた特徴を有するものである。
本発明において使用可能な発現ベクターは、当分野において使用されるものを適宜使用することができ、上記ＧＦＰ遺伝子を導入する細胞または動物の種類等に応じて選択すれば良く、特に限定されるものではないが、組織特異性を有さず、強い発現が期待できるｐＣＡＧＧＳ発現ベクター（Ｎｉｗａ，Ｂ．ら，（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００）が好適に使用できる。尚、細胞または動物への遺伝子の導入の際には、発現ベクターをそのまま導入しても良いが、目的の遺伝子を含む発現カセットを調製して導入しても良く、導入する細胞または動物に応じて適宜選択することができる。従って、本明細書において、「発現ベクター」には、上記発現カセットも含まれる。
導入されたＧＦＰがミトコンドリアで局在的かつ特異的に発現するためには、例えば発現ベクターがＧＦＰ遺伝子の上流側にミトコンドリアへの移行シグナル配列を有することが好ましい。移行シグナル配列としては、例えばシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩＩの移行シグナル配列、シトクロムＣのｃＤＮＡ等が挙げられる。ＧＦＰ遺伝子と上記移行シグナル配列とは隣接しているか、または数十塩基離れていても良いが、読み枠が一致することが必要である。
本発明の発現ベクターには、この他に導入される遺伝子の発現を適切に制御するためのプロモーター、ターミネーター等の調節配列、ＨＡ１等のタグが含まれていても良い。
本発明のトランスジェニック動物は、ミトコンドリアにおいて特異的にＧＦＰを発現することを特徴とし、特に上記発現ベクターが導入されていることを特徴とするものである。
動物の種類は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ミニブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、魚類、ショウジョウバエ等の昆虫類、線虫等を挙げることができるが、ヒト以外であればいずれでも良く、特に限定されるものではない。本発明において、飼育及び操作上の点から、好ましくはげっ歯類、特に好ましくはマウスである。
本発明のトランスジェニック動物は、例えば以下のようにして作製することができる。まず、上記のようにして発現ベクターを作製し、次いで制限酵素切断等により、該発現ベクターから発現カセットを切り出し、全能性細胞に導入する。全能性細胞としては、受精卵、初期胚、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等を用いることができる。全能性細胞への導入は、静電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法等の当分野において通常用いられる手法により行うことができる。
上記処理を行った全能性細胞を仮親の卵管に移植し、産仔を出生させ、その産仔の中からＧＦＰ遺伝子が有する個体を選抜する。ＧＦＰ遺伝子を有する個体であるか否かは、ＧＦＰ遺伝子に特異的なプローブやプライマーを用いたサザンブロッティングやＰＣＲによる従来法によっても確認できるが、本発明の場合には、発現したＧＦＰを視覚的に観察して判断することもできる。
また、本発明により、上記ミトコンドリア局在型ＧＦＰ発現ベクターが導入された細胞も提供される。
本発明の細胞は、上記トランスジェニック動物由来の細胞に限定されるものではなく、ミトコンドリアを有する真核生物の細胞であればいずれでも良い。例えば植物細胞、酵母、ショウジョウバエ等が挙げられる。これら細胞への本発明の発現ベクターの導入は、当分野で通常使用される手法により行うことができる。
本発明のトランスジェニック動物、組織及び細胞において、ＧＦＰに由来する蛍光はミトコンドリアに局在し、特異的に発現する。従って、本発明のトランスジェニック動物により、例えば胚形成初期における精子のミトコンドリアの状況を非侵襲的に観察することが可能となる。本発明のトランスジェニック動物の蛍光は強くかつ安定しており、共焦点レーザー走査型顕微鏡下における反復的観察を実施できるものである。
上記のように、本発明に係るトランスジェニック動物において、ＧＦＰの発現はミトコンドリアに局在する。しかしながら、ミトコンドリア障害またはアポトーシス誘導剤等の処理によってその局在は細胞質全体へと変化する。本発明者等は、本発明のトランスジェニック動物から得られた細胞を用いて、ミトコンドリア障害またはアポトーシス誘導剤によってＧＦＰ局在パターンが変化することを確認した。すなわち、本発明のトランスジェニック動物や細胞を用いて、そのＧＦＰの局在を調べることにより、アポトーシスを起こしているか否かを簡単に判別することが可能となり、例えばアポトーシスのメカニズム等を調べるためのモデル動物として利用することができる。
更に、種々の疾患の病態形成・進展にミトコンドリアの障害（アポトーシスを含む）の関与が想定されているものは数多く知られている。従って、本発明において得られたトランスジェニック動物を用い、種々の病態モデル（脳虚血モデル、心筋虚血モデル等）を作製することにより、各種病態におけるミトコンドリア障害の部位や程度を知ることができ、病態の解明やモデルの特徴付けが可能となる。また、本発明に係るトランスジェニック動物、または該トランスジェニック動物由来の細胞を使用することにより、ミトコンドリア障害抑制剤あるいは誘発剤等のスクリーニングを行うことが可能となる。
すなわち、本発明のトランスジェニック動物、または細胞に被験物質を接触させ、ミトコンドリア障害またはアポトーシスが誘導されるか否かを確認することにより、ミトコンドリア障害またはアポトーシス誘導剤のスクリーニングを行うことができる。
更に、従来知られているアポトーシス誘導剤、例えばスタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、Ｆａｓ抗体や、上記スクリーニングによって得られるアポトーシス誘導剤を用い、本発明のトランスジェニック動物、または細胞に被験物質を接触させた後、アポトーシス誘導剤による処理を行い、アポトーシスが抑制されるか否かを確認することにより、アポトーシス抑制剤のスクリーニングを行うこともできる。
本発明のトランスジェニック動物及び細胞を使用すれば、アポトーシスの誘導及び抑制はＧＦＰの蛍光により視覚的に簡単に知ることができるが、上記スクリーニング方法においては、アポトーシスの誘導または抑制を確認するために、上記被検物質と接触させていない以外は同じ条件の対照動物または対照細胞と比較するか、被検物質との接触前、あるいはアポトーシス誘導剤処理前の状態と比較することが好ましい。
上記のスクリーニング方法において、被験物質は特に限定されず、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液等が挙げられる。
上記スクリーニング方法において、被験物質との接触は、細胞を用いる場合にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させれば良いが、トランスジェニック動物を用いる場合には、経口投与、あるいは皮下注射、腹腔内注射等の注射を含む非経口投与の従来知られている局所または全身投与の方法の何れを用いても良く、用いる動物の種類や病態、標的とする組織の有無等に応じて適宜選択することができる。
以上のスクリーニング方法によって得られるアポトーシス誘導剤は、例えば癌等の細胞増殖性疾患の治療等に用いることができる。また、上記のスクリーニング方法によって得られるアポトーシス抑制剤は、例えばアルツハイマー病、虚血性疾患等の細胞死に起因する疾患の治療等に用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］  発現ベクターの構築
シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩＩ（ＣＯＸ８、ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｕ１５５４１）のシグナル配列を、５’−ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＣＣ−３’（配列番号１）及び５’−ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＡＡＣ  Ｃ−３’（配列番号２）をプライマーとして使用し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応によって増幅した。この場合、配列番号２のプライマーにはＨＡ１の塩基配列（ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＡＴＡ：配列番号２の１０〜３６番の塩基）が含まれており、従ってＰＣＲ反応によって得られた増幅産物にはＨＡ１の塩基配列が組み込まれている。ＥＧＦＰ（配列番号１０）のコード領域は、５’−ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＧ−３’（配列番号３）及び５’−ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＣＧ−３’（配列番号４）をプライマーとし、組み換えプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を鋳型としてＰＣＲ反応によって増幅した。双方のＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによって切断し、ＥｃｏＲＩで切断したｐＣＡＧＧＳ発現ベクター（Ｎｉｗａ，Ｂ．ら，（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００）中にライゲートした。
上記の手順によって構築した発現ベクターの主要部の構成を図１、全配列を配列番号９に示す。
［実施例２］トランスジェニックマウスの作製
トランスジェニック動物作製のために用いるＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ及びＳｔｕＩによる二重切断によって取得し（図１）、クローニングベクターからアガロースゲル電気泳動によって分離し、これを次いでＱＩＡＥＸ  ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡ）によって精製した。精製したＤＮＡ断片を受精したマウス（Ｂ６）卵細胞の前核中に標準的手法（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら，（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って注入した。トランスジェニックマウスの同定のために、耳穿孔片（ｅａｒ−ｐｕｎｃｈｅｄ  ｐｉｅｃｅｓ）からゲノムＤＮＡを調製した。すなわち、穿孔片をＰＣＲ緩衝液／非イオン性界面活性剤及びプロテイナーゼＫ（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ８）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ゼラチン、０．４５％  ＮＰ−４０、０．４５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、及び１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中に入れ、３７℃で一晩インキュベートした。プロテインキナーゼＫを失活させるために、９５℃で１５分間インキュベートし、得られた溶液をＤＮＡ試料とした。
次いで、調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、合成した２対のプライマーペア（Ａ）５’−ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＡＣＣ−３’（配列番号５），５’−ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’（配列番号６）及びＢ）５’−ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＡＧＣ−３’（配列番号７），５’−ＴＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＡＡＧ−３’（配列番号８））を用い、導入遺伝子配列に特異的なＰＣＲ断片（２５８ｂｐ）を増幅した（図２）。
［実施例３］  トランスジェニックマウス個体におけるＧＦＰ発現の確認
実施例２によって得られたトランスジェニックマウスにおけるＧＦＰ発現を確認するために、出生直後のマウス個体の前肢を蛍光顕微鏡で観察した。
ＥＧＦＰの蛍光は、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓレーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０）で可視化した。ＥＧＦＰ蛍光は４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー線で励起し、５０５−５３０ｎｍバンドパス放出フィルターを通して画像化した。
図３に示すように、本発明のトランスジェニックマウス（Ｔｇ）においては前肢全体においてＧＦＰの発現による蛍光が観察され、明視野における写真と比較して明らかなように、輪郭もはっきりと見ることができた。これに対して野生型（ＷＴ）では蛍光は全く観察されなかった。
［実施例４］  トランスジェニックマウス組織におけるＧＦＰ発現の確認
マウス精巣は１２週齢のｍｔＧＦＰ−Ｔｇマウスから単離し、液体窒素で凍結し、ディープフリーザー（−８０℃）で保存した。１０μｍ厚の切片を作製するために、この凍結した精巣を−２０℃でｃｒｙｏｓｔａｔによってスライスし、スライドガラス上に載せた。蛍光観察は蛍光顕微鏡を用いて行った。
図４に示すように、本発明のトランスジェニックマウスにおいてはＧＦＰの発現による蛍光が観察され、明視野における写真と比較して明らかなように、輪郭もはっきりと見ることができた。これに対して野生型（ＷＴ）では蛍光は全く観察されなかった。
［実施例５］  トランスジェニックマウスの繊維芽細胞におけるＧＦＰ発現の確認
繊維芽細胞の初代培養は外植片培養法（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＳＭら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．Ｃ．ら編）（１９８０）２１：２０７−２２７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）に従って行った。培養した繊維芽細胞を、５００ｎＭ  Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ；ｃａｔ．Ｍ７５１２）を含有するＤＭＥＭ中、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、染色された繊維芽細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡を使用して観察した。
ＥＧＦＰまたはＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓの蛍光は、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓレーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０）で可視化した。ＥＧＦＰ蛍光は４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー線で励起し、５０５−５３０ｎｍバンドパス放出フィルターを通して画像化した。Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓの蛍光は、５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーで励起し、５６０ｎｍロングパス放出フィルターを通して画像化した。
図５に示すように、ＧＦＰによる蛍光及びＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒによる蛍光はほとんど一致していた。
［実施例６］  精子由来ミトコンドリアの初期発生過程における動向
精子、卵子及び胚は本発明者等が先に記載したようにして（Ｋａｎｅｄａ，Ｈ．ら，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，１１３３１−１１３３８）回収した。精子は、成体マウスから精巣上体尾部を摘出し、ＴＹＨ培地（Ｔｏｙｏｔａ，Ｈ．ら，（１９７１）Ｊｐｎ  Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１６，１４７−１５１）に入れて精子懸濁液として調製した。未受精卵は、妊娠した雌の血清ゴナドトロピン及びヒト絨毛膜ゴナドトロピンによって過剰排卵させたマウスの卵管から採取した（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら，（１９８６）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）。初期の胚は自然交配したマウスの卵管または子宮から採取した。単一の精子または卵子は位相差顕微鏡のもとでマイクロインジェクション用キャピラリーを用いて希釈した精子または卵子の懸濁液から単離し、１０μｌの蒸留水中に入れ、−８０℃で保存した。
図６は、マウス初期発生過程における精子由来ミトコンドリアの検出を示す。ａ及びｂは受精前の精子と卵であり、精子中片部のミトコンドリアが緑色の蛍光として観察される（ａ，蛍光、ｂ，明視野）。ｃ（蛍光）及びｄ（明視野）は受精直後の胚、ｅ（蛍光）及びｆ（明視野）は前核期胚を示す。ｇ（蛍光）及びｈ（明視野）は２細胞期胚であり、精子由来ミトコンドリアの蛍光は観察されない。しかし、蛍光が残っている胚も低率ながら観察された（ｉ，蛍光、ｊ，明視野）。ｋ（蛍光）及びｌ（明視野）は４細胞期胚であり、雄（精子）由来の導入遺伝子によりＧＦＰが発現している。
［実施例７］  マウス繊維芽細胞におけるアポトーシス誘導と観察
１）細胞の調製
作製したトランスジェニックマウス（ｍｔＧＦＰ−Ｔｇマウス）の出生個体腹部皮膚片より、実施例５と同様に外植片培養法に従って繊維芽細胞の培養を開始した。まず出生個体腹部皮膚片を約１ｍｍ四方にした後、プラスチックシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ  ３００１）上に置き、３７℃、５％  ＣＯ２条件下に１５−３０分間インキュベートした。その後１０％  ＮＣＳ−ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、フェノールレッドなし）を添加した。
培養開始後７−１０日目に０．２５％トリプシンを用いて細胞をはがし、７００−８００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。沈殿を１０％  ＮＣＳ−ＤＭＥＭに再懸濁し、カバーガラス（Ｍａｔｕｎａｍｉ）上に植え込み、１日後にアポトーシス誘導実験に使用した。
２）アポトーシス誘導法
１０％  ＮＣＳ−ＤＭＥＭ及びアポトーシス誘導剤であるスタウロスポリンを５μＭ含有する培地に交換した。
３−５時間後に蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社アキシオフォト；ＦＩＴＣフィルターセット）を用いて観察した。また、蛍光ＤＮＡ染色試薬であるヘキスト３３３４２（終濃度２００μＭ）を加えて核の様子を観察した。
スタウロスポリン添加前（０ｈｒ）と添加後２．５時間経過（２．５ｈｒ）のトランスジェニックマウス由来線維芽細胞を観察した（図７）。位相差顕微鏡下ではスタウロスポリン添加後に細胞が小さく形態変化を起こした様子が観察された。更にこの細胞の核の形態をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色により観察すると、アポトーシスを起こした細胞核に特徴的なクロマチン凝集が観察された。このとき、ＧＦＰ標識したミトコンドリアは細胞質に一様に存在しているように観察される。
配列表フリーテキスト
配列番号３：ＰＣＲのためのプライマー
配列番号４：ＰＣＲのためのプライマー
配列番号５：ＰＣＲのためのプライマー
配列番号６：ＰＣＲのためのプライマー
配列番号７：ＰＣＲのためのプライマー
配列番号８：ＰＣＲのためのプライマー
配列番号９：発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＣＯＸ８−ＥＧＦＰ
配列番号１０：コドン最適化のために改変を行ったオワンクラゲ由来のＥＧＦＰコード領域
産業上の利用の可能性
本発明によって得られるトランスジェニック動物は、蛍光によって観察できるＧＦＰがミトコンドリアにおいて特異的に発現するため、煩雑な染色工程をとることなく細胞・組織・個体におけるミトコンドリアの動向を視覚的に捉えることが可能となった。また、従来使用されていた色素と比較して退色が顕著に少ないことから、従来不可能であった経時的観察が可能となった。更に、本発明のトランスジェニック動物はＧＦＰを全身で発現しているため、ミトコンドリア局在型ＧＦＰを有する種々の細胞の供給源とすることができる。
本発明によってまた、例えば病態モデル動物を含む各組織及び細胞におけるミトコンドリアの局在、精子由来ミトコンドリアの初期発生過程における動向、及びアポトーシス過程におけるミトコンドリアの動態等の種々の解析が可能となる。
更に、本発明のトランスジェニック動物または細胞を用いたスクリーニング方法により、アポトーシス誘導剤及び抑制剤を簡便にスクリーニングする新規な方法が提供される。このように本発明は、分子生物学及び医療分野において、極めて応用範囲の広いものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のミトコンドリア局在型ＧＦＰ発現ベクターの一例を示す。
図２は、ＰＣＲ法による導入遺伝子の検出を示す写真である。Ｍ；マーカー（φ×１７４／ＨａｅＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ）、Ｂ６；Ｂ６由来総ＤＮＡ、ＴＧ；Ｂ６由来総ＤＮＡと導入遺伝子（ＳａｌＩ／ＳｔｕＩ断片）、＃２０；＃２０系統由来総ＤＮＡ、＃４０；＃４０系統由来総ＤＮＡ、＃４９；＃４９系統由来総ＤＮＡ
図３は、トランスジェニックマウス個体におけるＧＦＰ発現を示す写真である。
図４は、トランスジェニックマウス組織におけるＧＦＰ発現を示す写真である。
図５は、トランスジェニックマウスの細胞におけるＧＦＰ発現を示す写真である。
図６は、マウス初期発生過程における精子由来ミトコンドリアの検出を示す写真である。
図７は、アポトーシス誘導時のマウス線維芽細胞におけるミトコンドリアの動態を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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