(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、または以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質と１種以上のアミノ酸とを水性媒中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
［１］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
【請求項２】
微生物が、以下の［１］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを有する形質転換体である、請求項１記載の製造法。
［１］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１０〜２１のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［５］配列番号１０〜２１のいずれかで表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
微生物がエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である、請求項１または２記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する微生物または形質転換体を用いたジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ペプチドの大量合成法については、化学合成法（液相法、固相法）、酵素的合成法およびＤＮＡ組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、５０残基以上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が用いられ、ジペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。【０００３】  酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法（非特許文献１参照）、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特許文献１〜４参照）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法（非特許文献２、３および特許文献５、６参照）が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある。ＮＲＰＳを利用する方法に関しては、酵素分子が巨大なためにＤＮＡ組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である４’−ホスフォパンテテイン（４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）の供給が必要であり、効率的な製造法とはいえない。【０００４】
一方、酵素分子量がNRPSより小さく、補酵素 である4'-phosphopantetheineを必要としないγ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ-glutamylcysteine synthetase）、グルタチオンシンセターゼ（glutathione synthetase）、D-アラニン−D-アラニン（D-Ala−D-Ala）リガーゼ（D-Ala−D-Ala ligase）、ポリ−γ−グルタミン酸シンセターゼ（poly-γ-glutamate synthetase）等の一群のペプチドシンセターゼも知られている。これらの酵素の殆どはD-アミノ酸を基質に用いる、またはγ位のカルボキシル基でのペプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、L-アミノ酸のα位カルボキシル基でペプチド結合するジペプチドの合成に用いることはできない。
【０００５】  Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質であるバシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン（Ｌ−アラニル−Ｌ−アンチカプシン、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ａｎｔｉｃａｐｓｉｎ）及びＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）を合成する活性を有することが知られていた（非特許文献４および５参照）が、最近、本酵素は多様な組み合わせの同一または異なる遊離のアミノ酸から種々のジペプチドを生成する活性を有することが報告された（特許文献７参照）。【０００６】  しかしながら、上記酵素の基質特異性に起因し、生成効率が十分でないジペプチドもあるため、該酵素とは基質特異性が異なる新たなジペプチド合成酵素が求められている。
ラルストニア・ソラナセラムＧＭＩ１０００の染色体ＤＮＡの塩基配列、および遺伝子の推定塩基配列とも公知である（非特許文献６参照）。しかしながら、該遺伝子中のＲＳＰ１４８６遺伝子にコードされる蛋白質の機能はもちろん、ＲＳＰ１４８６遺伝子が実際に機能を有する蛋白質をコードする遺伝子であるか否かも知られていない。
【特許文献１】特開昭５８−１４６５３９号公報
【特許文献２】特開昭５８−２０９９９１号公報
【特許文献３】特開昭５８−２０９９９２号公報
【特許文献４】特開昭５９−１０６２９８号公報
【特許文献５】米国特許第５７９５７３８号
【特許文献６】米国特許第５６５２１１６号
【特許文献７】国際公開第２００４／０５８９６０号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）
【非特許文献３】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１）
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，２０１−２０８（１９８７）
【非特許文献５】Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２９，４００−４０６（２００１）
【非特許文献６】ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｉｎｇｌｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｐｉｄ＝Ｒｓｏｌ＿ＧＭＩ１０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明の目的は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、およびジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
（２）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ。
［１］上記（１）の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１０〜２１のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１０〜２１のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）上記（２）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。【０００９】  （４）上記（３）の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
（５）形質転換体が微生物を宿主として得られる形質転換体である、上記（４）の形質転換体。
（６）微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である、上記（５）の形質転換体。【００１０】  （７）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（１）の蛋白質の製造法。
（８）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記（４）〜（６）のいずれか１つの形質転換体である、上記（７）の製造法。【００１１】  （９）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記（１）の蛋白質と１種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
（１０）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記（４）〜（６）のいずれか１つの形質転換体である、上記（９）の製造法。
【発明の効果】
【００１２】  本発明によりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いてジペプチドを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はプラスミドｐＲＳＰ１４８６ａの構築過程を示す図である。
【符号の説明】
【００１４】  図中のＲＳＰ１４８６ａは、ラルストニア・ソラナセラムＡＴＣＣ１１６９６株由来のＲＳＰ１４８６ａ遺伝子、ＰＴ７はＴ７プロモーター遺伝子を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
［１］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、および
［３］配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる。【００１６】  上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００１７】  欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。【００１８】  アミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、例えば配列番号１〜９で表されるアミノ酸配列を公知のアライメントソフトウェアを用いて比較したときに、いずれか２つのアミノ酸配列の間で一致していないアミノ酸などをあげることができる。公知のアライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルト値を用いることができる。【００１９】
また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００２０】  以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がジペプチド合成活性を有するためには、配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。【００２１】  アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。【００２２】  また、配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。アミノ酸配列の相同性は、上記したようにＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。【００２３】  本発明の蛋白質が、ジペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質、１種以上のアミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる２種のアミノ酸、並びにＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、
［１］上記１の［１］〜［３］の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［２］配列番号１０〜２１のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、および
［３］配列番号１０〜２１のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。【００２４】  ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。【００２５】  ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。【００２６】  上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。【００２７】  上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、上記したいずれかのＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００２８】  塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、並びに１種以上のアミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる２種のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法によって確認することができる。
３．本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体
本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体としては、本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物および形質転換体であれば特に限定されないが、該微生物としては、好ましくはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属に属する微生物、好ましくはラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に属する微生物、より好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＧＭＩ１０００、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１１６９６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２８２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１３９６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０３、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１５４４、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２３およびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２６をあげることができ、該形質転換体としては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体をあげることができる。【００２９】  なお、上記したＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは独立行政法人農業生物資源研究所ジーンバンクから入手することができる。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体としては、上記２のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体をあげることができ、宿主細胞としては、細菌などの原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞、好ましくは原核細胞、より好ましくは細菌、さらに好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物をあげることができる。
４．本発明のＤＮＡおよび形質転換体の調製
本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号３または４で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属に属する微生物、好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに属する微生物、より好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＧＭＩ１０００、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｃｅａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１１６９６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２８２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１３９６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０３、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１５４４、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２３またはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２６の全ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号１０〜２１のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ属に属する微生物、より好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに属する微生物、さらに好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＧＭＩ１０００またはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１１６９６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２８２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１３９６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０３、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１５４４、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２３またはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２６の全ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。【００３０】  また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１〜９のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡラ��ブラリー等から上記した方法により本発明のＤＮＡ、または本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。【００３１】  取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。【００３２】  塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。【００３３】  上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１０〜２１のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ  ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。【００３４】  宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ１２４３５、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＢＬ２１、エシェリヒア・コリＭＥ８４１５等をあげることができる。【００３５】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば配列番号４で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリ BL21/pRSP1486aをあげることができる。
５．本発明の製造法に用いられる形質転換体および微生物の製造法
本発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００３６】  該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。【００３７】  発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００３８】  発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。【００３９】  プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００４０】  さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。【００４１】  本発明のＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばｐＲＳＰ１４８６ａをあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＢＬ２１、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌ���）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｄ−０１１０、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅ���ｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができる。【００４２】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。【００４３】  プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、キャンディダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。【００４４】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。【００４５】  プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）の遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００４６】  宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはナマルバＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。【００４７】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。【００４８】  昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅＷ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。【００４９】  即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。【００５０】  バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。【００５１】  スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ  ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。【００５２】  植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。【００５３】  宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
６．本発明の蛋白質の製造法
上記５の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００５４】  本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。【００５５】  上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００５６】  炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００５７】  無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【００５８】  また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００５９】  動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、イーグル（Ｅａｇｌｅ）のＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。【００６０】  培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。【００６１】  培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００６２】  培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。【００６３】  本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。【００６４】  すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【００６５】  さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００６６】  動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。【００６７】  植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。【００６８】  本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。【００６９】  該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００７０】  また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【００７１】  本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００７２】  このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【００７３】  また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。【００７４】  上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
７．本発明のジペプチドの製造法
上記３の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記１の本発明の蛋白質と１種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取することにより、ジペプチドを製造することができる。
（１）本発明の蛋白質を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、好ましくは１または２種のアミノ酸としては、アミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸、Ｇｌｙおよびβ−アラニン（β−Ａｌａ）からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばＬ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−フェニリルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリン（Ｌ−Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ｌ−α−ＡＢ）、Ｌ−アザセリン（Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、Ｌ−テアニン（Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ）、４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Ｌ−４−ＨＹＰ）、３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Ｌ−３−ＨＹＰ）、Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）、Ｌ−シトルリン（Ｌ−Ｃｉｔ）およびＬ−６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン（Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）などをあげることができる。【００７５】  上記製造法に用いられる、より好ましいアミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種または２種のアミノ酸、さらに好ましいアミノ酸としては、Ｌ−ＡｌａとＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＧｌｎとＧｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種とのアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＧｌｕとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、ＧｌｙとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＶａｌとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−ＡｓｎおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＬｅｕとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＩｌｅとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸との���み合わせ、Ｌ−ＰｒｏとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＰｈｅとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＴｒｐとＬ−Ｃｙｓの組み合わせ、Ｌ−ＭｅｔとＬ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＳｅｒとＬ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＴｈｒとＬ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｈｉｓおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＣｙｓとＬ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＡｓｎとＬ−Ｈｉｓとの組み合わせ、Ｌ−ＬｙｓとＬ−Ｈｉｓとの組み合わせ、Ｌ−ＡｒｇとＬ−Ｈｉｓとの組み合わせ、Ｌ−ＨｉｓとＬ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、より好ましくはＬ−ＡｌａとＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＳｅｒおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＣｙｓとＬ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＰｈｅおよびＬ−Ｓｅｒから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＨｉｓとＧｌｙ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｖａｌから選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、Ｌ−ＰｈｅとＬ−ＰｈｅまたはＬ−Ｖａｌとの組み合わせ、Ｌ−ＧｌｎとＬ−Ｖａｌとの組み合わせをあげることができる。【００７６】  上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ添加する。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源としてＡＴＰを用いることができ、ＡＴＰは、０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いることが好ましい。【００７７】  上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。【００７８】  ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で２〜１５０時間、好ましくは６〜１２０時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、アミノ酸同士、好ましくはＬ−アミノ酸、Ｇｌｙおよびβ−Ａｌａから選ばれるアミノ酸同士、より好ましくはＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−Ｃｉｔ、Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ、Ｇｌｙおよびβ−Ａｌａから選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチド、さらに好ましくは、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（ただし、Ｒ１がＬ−Ａｌａのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｇｌｎのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｇｌｎのとき、Ｒ２はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸、Ｒ１がＧｌｙのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｖａｌのとき、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−ＡｓｎおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｌｅｕとき、Ｒ２はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｉｌｅのとき、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｐｒｏのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｐｈｅのとき、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｔｒｐのとき、Ｒ２はＬ−ＰｈｅまたはＬ−Ｃｙｓであり、Ｒ１がＬ−Ｍｅｔのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｓｅｒのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓおよびβ−Ａｌａから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｔｈｒのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｈｉｓおよびβ−Ａｌａから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｃｙｓのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ａｓｎのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｌｙｓのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ａｒｇのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｈｉｓのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐおよびβ−Ａｌａから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ａｓｐのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がβ−Ａｌａのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれるアミノ酸である）で表される２つのアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチド、特に好ましくは、式（Ｉ）（ただし、Ｒ１がＬ−Ａｌａのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−ＰｈｅおよびＬ−Ｔｙｒから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｃｙｓのとき、Ｒ２はＬ−Ｃｙｓであり、Ｒ１がＬ−Ｇｌｎのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−ＣｙｓまたはＬ−Ｖａｌであり、Ｒ１がＬ−Ｈｉｓのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＴｈｒおよびＬ−Ｖａｌから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｍｅｔのとき、Ｒ２はＬ−ＡｌａまたはＬ−Ｍｅｔであり、Ｒ１がＬ−Ｐｈｅのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−ＣｙｓおよびＬ−Ｖａｌから選ばれるアミノ酸であり、Ｒ１がＬ−Ｓｅｒのとき、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−ＳｅｒおよびＬ−Ｃｙｓから選ばれるアミノ酸である）で表される２つのアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチドをあげることができる。
（２）微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において酵素源として用いられる微生物または形質転換体の培養物としては、該微生物または形質転換体を上記６の培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該微生物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などをあげることができる。【００７９】  形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸としては、上記（１）と同様のアミノ酸をあげることができる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり湿菌体重量として５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。【００８０】  基質として用いるアミノ酸は、上記（１）と同じように水性媒体中に添加することができる。上記（１）と同様、ＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
水性媒体としては、上記（１）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。【００８１】  ジペプチドの生成反応の反応条件は、上記（１）と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、上記（１）と同様のジペプチドをあげることができる。
上記（１）および（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。【００８２】  以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８３】ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの取得と該蛋白質を発現する組換え株の造成
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＧＭＩ１０００の染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号３で表される塩基配列を有する、機能未知蛋白質をコードするＲＳＰ１４８６遺伝子の塩基配列情報（ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｉｎｇｌｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｐｉｄ＝Ｒｓｏｌ＿ＧＭＩ１０００、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｓｃｏｐｅ．ｃｎｓ．ｆｒ／ｅｘｔｅｒｎｅ／Ｅｎｇｌｉｓｈ／Ｐｒｏｊｅｔｓ／Ｐｒｏｊｅｔ＿Ｙ／Ｙ．ｈｔｍｌ）に基づき、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１１６９６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２８２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１３９６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０３、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１５４４、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２３およびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２６の全ＤＮＡ（染色体ＤＮＡおよびメガプラスミドＤＮＡ）から、それぞれＲＳＰ１４８６遺伝子の相同遺伝子を以下のようにして取得した。【００８４】  まず、上記した菌株を、それぞれＹＰＧＡ培地［７ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、７ｇ／ｌバクトペプトン（ディフコ社製）、７ｇ／ｌグルコース、１．５ｇ／ｌ寒天］に塗布して３０℃で一晩静置培養した。生育した菌体１白金耳を３ｍｌのＹＰＧ培地［７ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、７ｇ／ｌバクトペプトン（ディフコ社製）、７ｇ／ｌグルコース］に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により集菌した菌体からＤｎｅａｓｙ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて染色体ＤＮＡとメガプラスミドの混合物をそれぞれ調製した。【００８５】  パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２２および２３で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、ラルストニア・ソラナセラムＧＭＩ１０００株の染色体ＤＮＡのＲＳＰ１４８６遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＮｄｅＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＢは、ＲＳＰ１４８６遺伝子のＮ末端アミノ酸配列を含むＤＮＡ配列と相補的な塩基配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。【００８６】 ＲＳＰ１４８６遺伝子の相同遺伝子断片の増幅には上記のプライマーＡおよびプライマーＢ、鋳型として上記したラルストニア・ソラナセラムの各々の菌株の全ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの全ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／ｌの各プライマー、２ｕｎ��ｔｓのＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、５μＬのＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（東洋紡社製）、各２００μｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液５０μＬを調製し、９５℃で２分間加温した後、９５℃で１５秒間、５３℃で３０秒間、６８℃で１分間の工程を３０回繰り返し、さらに６８℃で２分間加温することにより行った。【００８７】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、該ＰＣＲによりＲＳＰ１４８６遺伝子の相同遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からＧＦＸ−ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャム社製）を用いて該ＤＮＡ断片を精製し、２０μｌのＴＥに溶解した。
該ＤＮＡの塩基配列を公知の方法で決定したところ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１１６９６からは、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７０からは、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７２からは、配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２８２からは、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１３９６からは、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０２からは、配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＡＴＣＣ  ＭＡＦＦ２１１４０３からは、配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１５４４からは、配列番号７で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２０からは、配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１８で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２２からは、配列番号９で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２３からは、配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号２０で表される塩基配列を有するＤＮＡ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２６からは、配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号２１で表される塩基配列を有するＤＮＡを単離できたことがわかった。配列番号１で表されるＲＳＰ１４８６蛋白質のアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列を比較したところ、両者は９４．７％の同一性を有していることがわかった。【００８８】  次に、上記で得られたＤＮＡ溶液５μｌを用い、それぞれのＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ＧＦＸ−ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ＲＳＰ１４８６遺伝子の相同遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
０．２μｇの発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）（ノバジェン社製）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により約５．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。【００８９】  上記で得られたＲＳＰ１４８６遺伝子の相同遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片および上記で取得した発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株（タカラバイオ社製）を、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。【００９０】  生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、Ｎ末端にＨｉｓタグ配列が付加されたＲＳＰ１４８６遺伝子の相同遺伝子がＴ７プロモーター下流に連結された発現ベクターであることを確認し、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１１６９６由来のＲＳＰ１４８６遺伝子の相同遺伝子をＲＳＰ１４８６ａ遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクターをｐＲＳＰ１４８６ａと命名した（図１）。【００９１】  ｐＲＳＰ１４８６ａを用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｐＲＳＰ１４８６ａが保持されていることを確認した。
【実施例２】
【００９２】ジペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
実施例１で得られたｐＲＳＰ１４８６ａを保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＰ１４８６ａ）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地が入った試験管に接種し、３７℃で６時間振盪培養した。得られた培養液のうち１００μｌを１００ｍＬのＬＢ培地が入った５００ｍｌ三角フラスコに接種した。３７℃で３時間振盪培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに２８℃で１５時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。【００９３】  該湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、ＨｉｓＴｒａｐ（Ｈｉｓタグ付加蛋白質精製キット、アマシャム社製）を用いてＨｉｓタグが付加した蛋白質を精製した。
【実施例３】
【００９４】Ｈｉｓタグ付加蛋白質を用いたジペプチドの生産
実施例２で得られた精製Ｈｉｓタグ付加蛋白質を６５μｇ／ｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１２．５ｍｍｏｌ／ｌの硫酸マグネシウム、１２．５ｍｍｏｌ／ｌのＡＴＰ、１２．５ｍｍｏｌ／ｌの表２の第１行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種Ｌ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａからなる反応液を調製し、３０℃で１１時間反応を行った。反応終了後、反応液中に遊離したリン酸量をデタミナーＬ  ＩＰ（協和メディックス社製）を用いて定量することにより、反応の進行を確認した。さらに反応生成物をＦＭＯＣ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）で誘導体化した後、ＨＰＬＣ分析したところ、表１に示すジペプチドが生成していることが確認された。【００９５】  ＦＭＯＣ誘導体化は、上記反応液３０μｌに２７０μｌの０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液（水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調整）を加えて混合した後、３００μｌの１．５ｍｇ／ｍｌのＦＭＯＣアセトン溶液を加え、室温にて４０分間反応させることに行った。反応終了後、反応液に６００μｌの２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液（ｐＨ５．５の０．２５ｍｏｌ／ｌのホウ酸緩衝液）を加えてＨＰＬＣ分析の試料とした。
ＨＰＬＣ分析は、基本的に以下の条件で行ったが、検出するジペプチドに応じて適宜、下記の溶液ＡのｐＨや濃度勾配スケジュールを多少変更した。
分離カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５（野村化学社製）
移動層：溶液Ａ［２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸水素アンモニウム溶液（アンモニア水でｐＨ６．５に調整）：メタノール＝８５：１５］および溶液Ｂ（アセトニトリル：水＝９：１）を用い、分析開始から２分までは、溶液Ａ：溶液Ｂ＝７５：２５、２から２１分までは、２１分になったときに溶液Ａ：溶液Ｂ＝５５：４５になるように直線的に溶液Ｂの割合を増やし、２１から３６分までは、３６分になったときに溶液Ａ：溶液Ｂ＝４５：５５になるように直線的に溶液Ｂの割合を増やし、３６から３７分までは、３７分になったときに溶液Ａ：溶液Ｂ＝１：９９になるように直線的に溶液Ｂの割合を増やし、３７から３９分までは、溶液Ａ：溶液Ｂ＝１：９９で保持し、３９から４４分までは、４４分になったときに溶液Ａ：溶液Ｂ＝８２：１８になるように直線的に溶液Ｂの割合を減少させ、４４から５０分までは、溶液Ａ：溶液Ｂ＝７５：２５とした。
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
検出：２５４ｎｍの励起光による、６３０ｎｍの発光を検出した。【００９６】
【表１−１】
0004881854.tif 000002
【００９７】
【表１−２】
0004881854.tif 000003
【００９８】
【表１−３】
0004881854.tif 000004
【００９９】  表中○は、ＨＰＬＣによる構造特定はできなかったが生成物が確認されたことを示し、空欄は未実施を示す。
表１にあるとおり、本発明の蛋白質は、１種または２種のアミノ酸をペプチド結合で結合させ、種々のジペプチドを生成する活性を有することがわかった。
上記と同様に、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２７２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１２８２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１３９６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１４０３、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ２１１５４４、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＭＡＦＦ３０１５２３およびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍＭＡＦＦ３０１５２６由来のＲＳＰ１４８６遺伝子の相同遺伝子がコードする蛋白質をそれぞれ精製し、ジペプチド生成反応を行ったところ、いずれの遺伝子産物も表１に示すＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１１６９６由来のジペプチド合成酵素と同じ基質特異性を有するジペプチド合成活性を有する蛋白質であることが確認された。
【実施例４】
【０１００】
ジペプチドの構造解析
実施例３で生成したジペプチドのうち、表２に示すジペプチドについて、MS分析、NMR分析、およびCE-MS分析を行い、その構造を確認するとともに、その生成量をNMR分析の際に内部標準として用いた1mmol/lのTSP（[2,2,3,3-D4] sodium 3-3-(trimethylsilyl) propanoate）の積分値から計算した。
【０１０１】
【表２】
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【０１０２】  表２の第１行目と最左列に記載の２種類（もしくは１種類）のＬ−アミノ酸またはＧｌｙを基質として反応した場合に生成したジペプチドを枠内にその生成量（ｍｍｏｌ／ｌ）をジペプチドの名称の下に記載した。なお空欄は実験未実施であり、ジペプチドの名称の下に生成量の記載がないものはジペプチドの構造は確認したが生成量は未測定であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】  本発明により、種々のジペプチドを安価に製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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