(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−５受容体に結合する抗体またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）若しくはＣＤＲを含むペプチドから選ばれるその抗体断片を有効成分として含有する子宮内膜症の治療剤。
【請求項２】
インターロイキン−５受容体がインターロイキン−５受容体α鎖である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
インターロイキン−５受容体がヒトインターロイキン５受容体である請求項１または２記載の治療剤。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項５】
モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項４項に記載の治療剤。
【請求項６】
遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項５記載の治療剤。
【請求項７】
子宮内膜症治療剤の製造のための請求項１〜６のいずれか１項に記載のインターロイキン−５受容体に結合する抗体またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）若しくはＣＤＲを含むペプチドから選ばれるその抗体断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、インターロイキン５（以下、ＩＬ−５と略記する）アンタゴニストを有効成分として含有する子宮内膜症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  子宮内膜症を治療する方法としては主に薬物療法と外科的療法とに分類される。
薬物療法としては、鎮痛剤、経口避妊薬などの対症療法、ホルモン療法などの本症治療薬による投与があげられ、外科的療法としては、保存手術、根治手術などがあげられる（非特許文献１）。しかしながら、外科的療法も不十分な症例があり、また子宮内膜症を根治させる薬剤はこれまでに開発されていない。【０００３】  ヒトＩＬ−５に特異的に反応する抗体としては、ＳＢ−２４０５６３（スミス・クラインビーチャム社）、Ｓｃｈ−５５７００（ＣＤＰ−８３５）（シェーリング・プラウ／セルテック社）などが知られている。ＳＢ−２４０５６３は、軽度の喘息患者に対して末梢血中好酸球数の減少作用を示す（１００ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｍａｒｃｈ／１９９９）。Ｓｃｈ−５５７００もサルのアレルギーモデルにおいて抗原刺激による肺の好酸球増多を抑制することが知られている（非特許文献２）。【０００４】  またヒトＩＬ−５受容体α鎖に反応する抗体としては、ヒト化抗体であるＫＭ８３９９（特許文献１）が知られている。ＫＭ８３９９は、慢性気管支喘息をはじめとするアレルギー疾患治療剤としての有用性が期待されること、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域を有しており、ヒト好酸球特異的にアポトーシスを誘導させ、アポトーシスの誘導が抗体依存性細胞傷害活性によるものであること（特許文献２）などが知られている。【０００５】  しかしながら、上述のヒトＩＬ−５に特異的に反応する抗体およびヒトＩＬ−５受容体に特異的に反応する抗体と、子宮内膜症との関連については知られていない。
【非特許文献１】堂地勉ほか：子宮内膜症の治療法の選択．産婦人科治療７８：１７９−１８２，１９９９
【非特許文献２】Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，４９，７７９（１９９９）
【特許文献１】ＷＯ９７／１０３５４
【特許文献２】ＷＯ０１／６０４０５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  子宮内膜症を治療するための有用な薬剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明は、以下の（１）〜（１３）に関する。【０００８】  （１）インターロイキン−５アンタゴニストを有効成分として含有する子宮内膜症治療剤。【０００９】  （２）インターロイキン−５アンタゴニストがインターロイキン−５とインターロイキン−５受容体との結合を阻害する抗体またはその抗体断片である、上記（１）の治療剤。【００１０】  （３）インターロイキン−５とインターロイキン−５受容体との結合を阻害する抗体が、インターロイキン−５に結合する抗体である上記（２）記載の治療剤。【００１１】  （４）インターロイキン−５がヒトインターロイキン−５である上記（３）記載の治療剤。【００１２】  （５）インターロイキン−５とインターロイキン−５受容体との結合を阻害する抗体が、インターロイキン−５受容体に結合する抗体である上記（２）記載の治療剤。【００１３】  （６）インターロイキン−５受容体がインターロイキン−５受容体α鎖である上記（５）記載の治療剤。【００１４】  （７）インターロイキン−５受容体がヒトインターロイキン５受容体である上記（５）または（６）記載の治療剤。【００１５】  （８）抗体がモノクローナル抗体である、上記（２）〜（７）のいずれか１項に記載の治療剤。【００１６】  （９）モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、上記（８）項に記載の治療剤。【００１７】  （１０）遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群から選ばれる遺伝子組換え抗体である、上記（９）記載の治療剤。【００１８】  （１１）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である上記（２）〜（１０）のいずれか１項に記載の治療剤。【００１９】  （１２）子宮内膜症治療剤の製造のための上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載のインターロイキン−５アンタゴニストの使用。【００２０】  （１３）上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載のインターロイキン−５アンタゴニストを投与することを特徴とする子宮内膜症の治療方法。
【発明の効果】
【００２１】  本発明により、ＩＬ−５アンタゴニストを有効成分として含有する子宮内膜症治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】［図１］は、マウス子宮内膜症モデルにおける抗マウスＩＬ−５受容体抗体の子宮内膜症病変形成抑制作用を示した図である。縦軸は、病変サイズ（ｍｍ２）を示す。
［図２］は、マウス子宮内膜症モデルにおける抗マウスＩＬ−５抗体の子宮内膜症病変形成抑制作用を示した図である。縦軸は、病変サイズ（ｍｍ２）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】  本発明において用いられる、ＩＬ−５アンタゴニストとしては、ＩＬ−５とＩＬ−５受容体との間のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−５の生物学的活性を阻害するものであればいかなるものでもよく、低分子であっても高分子であってもよい。例えばＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害する抗体またはその抗体断片等があげられる。
ＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害する抗体としては、ＩＬ−５に結合し、かつＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害する抗体、ＩＬ−５受容体に結合し、かつＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害する抗体などがあげられる。ＩＬ−５受容体としては、ＩＬ−５受容体α鎖、ＩＬ−５受容体β鎖等があげられる。【００２４】  本発明で使用される上記の抗体または抗体断片は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよいが、好ましくはモノクローナル抗体があげられる。
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、遺伝子組換え抗体などがあげられる。
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、ミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる所望の抗原特異性を有するモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。【００２５】  遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体をいう。ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。【００２６】  また、ヒト以外の動物とは、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどをいう。
ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいい、ヒト型ＣＤＲ移植抗体ともいう。
本発明のヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）と連結したＶ領域をコードするｃＤＮＡを設計、構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００２７】  ヒト化抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト化抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。【００２８】  ヒト抗体とは、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を単独で培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を生成蓄積させることができる。【００２９】  本発明において好ましく使用できる抗体または抗体断片としては、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ１０９５９（特開平２０００−２１００９７）により生産された、ＩＬ−５に結合し、かつＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害するモノクローナル抗体、ハイブリドーマＫＭ１２５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１３４、ＷＯ９７／１０３５４）、ハイブリドーマＫＭ１４８６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６５１、ＷＯ９７／１０３５４）などにより生産された、ＩＬ−５受容体α鎖に結合し、かつＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害するモノクローナル抗体、ハイブリドーマＢＩＯＮ−１（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２５２５、ＷＯ００／０９５６１）により生産���れた、ＩＬ−５受容体β鎖に特異的に結合し、ＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害するモノクローナル抗体およびそれらの抗体断片などがあげられる。【００３０】  ヒトＩＬ−５受容体に結合し、かつＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害するヒト型キメラ抗体の具体例としては、配列番号１、２および３で示されるアミノ酸配列からなるＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／または配列番号４、５および６で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、を含む抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖キメラ抗体、抗体のＶＨが配列番号７で示されるアミノ酸配列および／またはＶＬが配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖キメラ抗体、抗体のＶＨが配列番号７で示されるアミノ酸配列およびヒト抗体のＣＨがｈＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、抗体のＶＬが配列番号８で示されるアミノ酸配列およびヒト抗体のＣＬがκクラスのアミノ酸配列からなる抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖キメラ抗体などがあげられ、具体的にはＫＭ１３９９（ＷＯ９７／１０３５４）などがあげられる。【００３１】  ＩＬ−５受容体α鎖に結合し、かつＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害するヒト化抗体としては、それぞれ配列番号２４、２５、２６で示されるアミノ酸配列からなるＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号２７、２８、２９で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体、より好ましくは、それぞれ配列番号１８、１９，２０で示されるアミノ酸配列からなるＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号２１、２２および２３で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体、さらに好ましくは、それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号４、５、６で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むヒト化抗体または該抗体断片などがあげられる。【００３２】  これらのヒト化抗体組成物のなかでも、抗体のＶＨが配列番号９で示されるアミノ酸配列、または配列番号９で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４６番目のＧｌｕ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、７９番目のＡｌａ、９５番目のＴｙｒおよび９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体組成物、抗体のＶＬが配列番号１０で示されるアミノ酸配列または配列番号１０で示されるアミノ酸配列のうち、７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、２２番目のＴｈｒ、３７番目のＧｌｎ、３８番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、７７番目のＳｅｒ、８７番目のＴｙｒおよび９８番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体が好ましく、抗体のＶＨが配列番号９で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４６番目のＧｌｕ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、７９番目のＡｌａ、９５番目の���ｙｒおよび９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬが配列番号１０で示されるアミノ酸配列のうち、７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、２２番目のＴｈｒ、３７番目のＧｌｎ、３８番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、７７番目のＳｅｒ、８７番目のＴｙｒおよび９８番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体がより好ましい。【００３３】  具体的には、抗体のＶＨがそれぞれ配列番号９、１１、１２、１３で示されるアミノ酸配列、および配列番号９で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４６番目のＧｌｕ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、７９番目のＡｌａ、９５番目のＴｙｒおよび９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列、および／または抗体のＶＬがそれぞれ配列番号１０、１４、１５、１６、１７で示されるアミノ酸配列、および配列番号１０で示されるアミノ酸配列のうち、７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、２２番目のＴｈｒ、３７番目のＧｌｎ、３８番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、７７番目のＳｅｒ、８７番目のＴｙｒおよび９８番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト化抗体、より具体的にはＶＨが配列番号１３、ＶＬが配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むヒト化抗体、例えば、ＫＭ８３９９（ＷＯ９７／１０３５４）、ＫＭ７３９９（ＷＯ９７／１０３５４）などがあげられる。【００３４】  さらに、ＩＬ−５に結合し、かつＩＬ−５とＩＬ−５受容体との結合を阻害するヒト化抗体としては、メポリズマブ（ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）［ＳＢ−２４０５６３；グラクソ・スミスクライン社製］、レスリズマブ（ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）［Ｓｃｈ−５５７００；シェーリング・プラウ／セルテック社製］などがあげられる。
上述の抗体または抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述の抗体または抗体断片と実質的に同一の活性を有する抗体または抗体断片も本発明で使用される抗体に包含される。【００３５】  欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。【００３６】  上記の抗体のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００３７】  以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン【００３８】  本発明で使用される抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧ型抗体分子を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるＦａｂは、抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００３９】  Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧ型抗体分子を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるＦ（ａｂ’）２は、抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。【００４０】  Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるＦａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００４１】  ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００４２】  ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一とすることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明で使用されるｄｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００４３】  ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明で使用されるｄｓＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００４４】  ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明で使用されるＣＤＲを含むペプチドは、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。【００４５】  以下に、本発明で使用される抗体または抗体断片の作製方法ならびに活性評価について記す。
１．モノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
抗原であるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入、発現させ、組換え型蛋白質を得、これを抗原に用いることができる。あるいは、抗原のポリペプチドの部分アミノ酸配列を有する合成ペプチドを抗原に用いることもできる。【００４６】  抗原用部分ペプチドとしては、５〜３０残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、蛋白質の立体構造において表面に存在している部分アミノ酸配列を抗原ペプチドとして選択する。蛋白質の立体構造を解析する方法としては、ジェネティック・マック（Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ）など市販の蛋白質配列解析ソフトを用いて、親水性の高い部分アミノ酸配列を予測する方法があげられる。蛋白質は、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多い。また、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。【００４７】  部分ペプチドには蛋白質と架橋するために、システインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を部分ペプチドとして選択した場合には、必要に応じてペプチドのＮ末端をアセチル化、Ｃ末端をアミド化する。部分ペプチドは、一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法により、合成することができる（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１９７９；Ｖｏｌ．２，１９８０；Ｖｏｌ．３，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ペプチド合成の基礎と実験、丸善、１９８５；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、廣川書店、１９９１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＆ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ，３５，１６１−２１４，１９９０）。また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社（以下、ＡＢＩ社と表記する）製ペプチド合成機、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．社（以下、ＡＣＴ社と表記する）製ペプチド合成機などの市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸などを用いて、それぞれの合成プログラムに従って合成することができる。【００４８】  原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社、渡辺化学（株）、ＡＣＴ社またはペプチド研究所（株）などから入手することができる。また、原料となる保護アミノ酸、保護有機酸、保護有機アミンは報告されている合成法に従って、あるいはそれに準じて合成することができる（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１９７９；Ｖｏｌ．２，１９８０；Ｖｏｌ．３，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ペプチド合成の基礎と実験、丸善、１９８５；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、廣川書店、１９９１；Ｉｎｔｅｒｎａ���ｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＆Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，１６１−２１４，１９９０）。【００４９】（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよい。下記に、マウスおよびラットを用いる例について説明する。【００５０】  ３〜２０週令のマウスまたはラットに、上記１（１）で調製した抗原を免疫し、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバントとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどがあげられる。また、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する）やＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、ＫＬＨと表記する）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いることができる。各抗原の投与後３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡなどで確認し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウスまたはラットより公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に準じて脾臓などを摘出し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。【００５１】（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である８−アザグアニン耐性骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）など、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。【００５２】（４）細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングリコール−１００（以下、ＰＥＧ−１０００と表記する）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁する。細胞の洗浄にはＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＭＥＭと表記する）またはＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）などを用いる。また、融合細胞を懸濁する培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地｛通常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地に１．５ｍＭグルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび１０％牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）を加えた培地］に０．１ｍＭヒポキサンチン、１５μＭチミジンおよび０．４μＭアミノプテリンを加えた培地｝を用いる。【００５３】  培養後、培養上清の一部を取り、ＥＬＩＳＡにより抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。次いで、限界希釈法により単一細胞化を行い、ＥＬＩＳＡにより安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。【００５４】（５）ハイブリドーマの選択
抗原に反応する抗体を産生するハイブリドーマの選択は、公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に従い、以下に述べるＥＬＩＳＡにより選択することができる。本方法により、後述するヒト型キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体またはそれらの抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗体あるいは培養上清より精製された抗体の抗原に対する結合活性を測定することができる。【００５５】 ＥＬＩＳＡ
抗原を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体を第一抗体として反応させる。第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体を用いる。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としてはマウス抗体を認識できる抗体を用いる。反応後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。【００５６】（６）モノクローナル抗体の精製
０．５ｍＬのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、１（４）で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５×１０６〜２×１０７細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラムなどを用いて、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。【００５７】  精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質濃度は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられる。【００５８】（７）モノクローナル抗体の活性評価
（７−１）抗原への結合活性評価
培養上清中あるいは培養上清から精製されたモノクローナル抗体の抗原に対する結合活性は、上記１（５）のＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９−２４０，１９９１）などにより測定することができる。また、抗原ペプチドまたはその部分ペプチドを用いた競合ＥＬＩＳＡにより、抗原との反応性および抗原エピトープを解析することができる。抗体が抗原である蛋白質の立体構造を認識しているか否かは、通常行われる立体構造的解析法、あるいは種々の免疫学的測定法を組み合わせることにより、推測することができる。立体構造解析法としては、例えば、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴法などがあげられる。種々の免疫学的測定法を組み合わせる方法としては、例えば、非変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法と変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法を組み合わせる方法があげられる。このとき、非変性状態の抗原にのみ反応性を示す抗体は、抗原の立体構造を認識している可能性が高いものと推測できる。非変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法とは、液層中で非変性抗原と抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法などがあげられる。変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法としては、抗原がもとの立体構造を保持していない状態で抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法であればいずれでもよく、例えば、疎水性の反応プレート上に直接固定化した抗原や、適当な長さに消化した部分ペプチドなどに対するＥＬＩＳＡ法があげられる。【００５９】２．抗原に対するヒト以外の動物のポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体は、上記１．（２）に示された方法で免疫を施した動物のうち、その血清が十分な抗体価を示した動物の血清から調製することができる。【００６０】  即ち、該動物から回収した血液から遠心分離法により分画した血清、あるいは該血清から常法に従って免疫グロブリン画分を精製し、ポリクローナル抗体を調製することができる。該ポリクローナル抗体の活性は、上記１．（７）に記載の方法により、抗原に対する結合活性を評価することができる。【００６１】３．ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製
（１）ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体発現用ベクター（以下、両者をまとめてヒト化抗体発現用ベクターという）としては、ヒト抗体のＣＨおよび／またはＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであればいかなるものでもよい。ヒト化抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。【００６２】  ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）などがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。【００６３】  動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３−２３２，１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７８，１５２７−１５３１，１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３−１８０，１９９０）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１４９，９６０−９６８，１９８７）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９−４８７，１９８５）とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７−７２８，１９８３）などがあげられる。【００６４】  ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト型キメラ抗体発現ベクターおよびヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８，１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９−５６７，１９９８）などがあげられる。【００６５】  構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の動物細胞での発現に使用できる。【００６６】（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。【００６７】  ハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用いて、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。【００６８】  ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３−２８，１９８７）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。【００６９】  ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）、あるいは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭＰｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。【００７０】  ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８−６１，１９９２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４，１９８９）、λ  ＺＡＰ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９，１９８５）、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２８０−２８９，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９，１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。【００７１】  ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，２７１−２８９，１９９２）、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９，１７７−１９０，１９６８）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８−７８２，１９８３）、ＮＭ５２２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，１−１��，１９８３）、Ｋ８０２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１１８−１３３，１９６６）およびＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，２７５−２７６，１９８５）などが用いられる。【００７２】  ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。【００７３】  上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７４，５４６３−５４６７，１９７７）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（ＡＢＩ社製）などを用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。【００７４】  決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌のためのシグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することによって見出すことができる。【００７５】  さらに、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどに対してＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。【００７６】（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、５’末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを増幅し、それぞれを上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。【００７７】（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト化抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲを行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。【００７８】  また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記３（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、上記３（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。【００７９】（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１２，５３５−５４２，１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１−１５０７，１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。【００８０】  ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて上記３（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について上記３（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。【００８１】（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、上記３（４）および（５）で構築したヒト化抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。【００８２】  例えば、上記３（４）および（５）でヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。【００８３】（７）ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記３（３）および（６）に記載のヒト型キメラ抗体発現ベクターおよびヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などがあげられる。【００８４】  発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などにより測定できる。【００８５】（８）ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の安定発現
上記３（３）および（６）に記載のヒト型キメラ抗体発現ベクターおよびヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）などがあげられる。ヒト型キメラ抗体発現ベクターおよびヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）などがあげられる。【００８６】  発現ベクターの導入後、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。【００８７】  ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ８，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）やウェスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１２，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などで測定することができる。【００８８】（９）ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体と抗原との結合活性評価
ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体と抗原との結合活性評価は、上記に記載のＥＬＩＳＡを用いて行うことができる。【００８９】４．抗体断片の作製
抗体断片は、上記１および３に記載の抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。【００９０】  遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。【００９１】  抗体断片として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドの製造法について以下に具体的に説明する。【００９２】（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。【００９３】  また、Ｆａｂは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１−１０４３，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。【００９４】（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、下記４（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢ［５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）］で処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，１９９６）。【００９５】（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、上記４（２）に記載のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１０，１６３−１６７，１９９２）などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラムなどを用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，１９９６）。【００９６】（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＆Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８−５６，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，１９９６）。【００９７】（５）ｄｉａｂｏｄｙの作製
ｄｉａｂｏｄｙは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶＨとＶＬをリンカーがコードするアミノ酸残基が８残基以下となるように連結したＤＮＡを作製し、ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターにクローニングし、ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製することができる。ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターとしては、ｄｉａｂｏｄｙのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｄｉａｂｏｄｙを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｉａｂｏｄｙとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，１９９６）。【００９８】（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにｄｓＦｖを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。【００９９】（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＣＤＲペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。【０１００】（８）抗体断片と抗原との結合活性評価
精製した抗体断片と抗原との結合活性評価は、上記１（７）に記載のＥＬＩＳＡを用いて行うことができる。【０１０１】５．本発明の治療剤
本発明の子宮内膜症の治療剤としては、ＩＬ−５アンタゴニストを有効成分として含む医薬であればいかなるものでもよいが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。【０１０２】  本発明の治療剤の投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができるは、静脈内投与が好ましい。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。【０１０３】  非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該アンタゴニストそのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該アンタゴニストを微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該アンタゴニストおよび用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。【０１０４】  本発明の治療剤の投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
以下に本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【０１０５】  ラット子宮内膜症自家移植モデルに対する抗ＩＬ−５受容体抗体および抗ＩＬ−５抗体の抑制作用
ラット子宮内膜症自家移植モデルを用いた抗ＩＬ−５受容体抗体および抗ＩＬ−５抗体の抑制効果について、以下の実験を行った。
方法としては、公知の方法［ファーティリティ・アンド・ステリリティ（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）、４４巻、６８４〜６９４ページ（１９８５年）］を改変して行った。【０１０６】  ラットにおいて性成熟するとされる８週齢以上のＳＤ系雌性ラット（日本チャールス・リバー社製）を購入し、性周期をラット用膣インピーダンス・チェッカ（ＭＫ−１０Ｂ、室町機械社製）を用いて毎日測定した。４〜５日周期の性周期が２回以上観察されたラットのうち、発情前期にあるラットを選別し、以下のようにして子宮内膜組織の自家移植を行った。
被験薬物をラットに静脈内投与した後、ペントバルビタール（ソムノペンチル（Ｒ）、武田シェリング・プラウアニマルヘルス社製）の腹腔内投与により全身麻酔したラットの腹部を剃毛し、正中線に沿って約６センチメートル開腹した。双角に存在する子宮のうち、右側の子宮の根元部位より約１センチメートル上部ならびに卵巣より約２センチメートル下部を結索し、その間にある子宮を摘出した。摘出子宮（管状）はペニシリン・ストレプトマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を含有するダルベッコ・モディファイド・イーグル・メディウム（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）中で洗いながら、縦に開列しシート状にした。このシートから約２ミリメートル四方の子宮内膜片を作製した。作製した子宮内膜片は、左右腹膜にそれぞれ滅菌糸付縫合針（外科用弱弯角針Ｎｏ．１２−黒ナイロンＮｏ．６−０、夏目製作所製）を用いて自家移植した。この際、子宮内膜面が腹膜に接するように移植した。また、対照として、子宮内膜片と同サイズの脂肪組織を同一個体から摘出し、腹膜に同様に自家移植した。最後に、移植部位ならびに子宮摘出部位をミクロノマイシン（サガミシン（Ｒ）注射液、協和発酵工業社製）を含有する生理食塩水で洗い、直ちに腹膜および皮膚を滅菌糸付縫合針により丁寧に縫合した。【０１０７】  自家移植の１週間後に、エーテル麻酔下で放血致死させ、腹部を開腹して、子宮内膜病変の肉眼的評価（移植片のサイズ測定）を実施した。移植片のサイズは金型ノギスを用いて縦・横それぞれの直径を測定した（最小目盛り０．５ｍｍ）。試験は一群５匹で実施した。また、必要に応じて、移植部位の病理標本を定法に従って作製し、病理組織学的な解析を行った。【０１０８】  被験薬物として１ｍｇ／ｋｇ抗マウスＩＬ−５受容体抗体および抗マウスＩＬ−５抗体（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３（２）：１３５−９，１９９１）を、コントロール抗体として１ｍｇ／ｋｇラットＩｇＧ抗体（ＩＣＮ社製）をそれぞれ用いた。抗体はいずれも滅菌したリン酸緩衝液（ＩＣＮ社製）で希釈して使用した。
移植片サイズについての結果を表１に示した。移植片サイズは縦径と横径を乗じて算出した値とし、左右の移植片サイズを平均して示した。【０１０９】  表１に示したように、移植１週間後に増大する移植片のサイズが、抗ＩＬ−５抗体および抗ＩＬ−５受容体抗体を投与することにより、縮小した（抑制率；抗ＩＬ−５抗体：１４％、抗ＩＬ−５受容体抗体：１５％）。【０１１０】
【表１】
0004954709.tif 000002
【実施例２】
【０１１１】  ラット子宮内膜症自家移植モデルに対する抗ＩＬ−５受容体抗体の癒着抑制
ラット子宮内膜症自家移植モデルを用いて、抗ＩＬ−５受容体抗体が子宮内膜の癒着を抑制していることを確認するために、以下の実験を行った。実験方法は、実施例１に記載された方法に準じて行った。【０１１２】  ラットにおいて性成熟するとされる８週齢以上のＳＤ系雌性ラット（日本チャールス・リバー社製）を購入し、性周期をラット用膣インピーダンス・チェッカ（ＭＫ−１０Ｂ、室町機械社製）を用いて毎日測定した。４〜５日周期の性周期が２回以上観察されたラットのうち、発情前期にあるラットを選別し、以下のようにして、子宮内膜組織の自家移植を行った。
被験薬物をラットに静脈内投与した後、ペントバルビタール（ソムノペンチル（Ｒ）、武田シェリング・プラウアニマルヘルス社製）の腹腔内投与により全身麻酔したラットの腹部を剃毛し、正中線に沿って約６センチメートル開腹した。双角に存在する子宮のうち、右側の子宮の根元部位より約１センチメートル上部ならびに卵巣より約２センチメートル下部を結索し、その間にある子宮を摘出した。摘出子宮（管状）はペニシリン・ストレプトマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を含有するダルベッコ・モディファイド・イーグル・メディウム（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）中で洗いながら、縦に開列しシート状にした。このシートから約２ミリメートル四方の子宮内膜片を作製した。作製した子宮内膜片は、左右腹膜にそれぞれ滅菌糸付縫合針（外科用弱弯角針Ｎｏ．１２−黒ナイロンＮｏ．６−０、夏目製作所製）を用いて自家移植した。この際、子宮内膜面が腹膜に接するように移植した。また、対照として、子宮内膜片と同サイズの脂肪組織を同一個体から摘出し、腹膜に同様に自家移植した。最後に、移植部位ならびに子宮摘出部位をミクロノマイシン（サガミシン（Ｒ）注射液、協和発酵工業社製）を含有する生理食塩水で洗い、直ちに腹膜および皮膚を滅菌糸付縫合針により丁寧に縫合した。【０１１３】  自家移植の１週間後に、エーテル麻酔下で放血致死させ、腹部を開腹して、子宮内膜病変の肉眼的評価（癒着スコア）を実施した。癒着は以下の基準に従いスコア化した。
癒着が認められないもの；スコア０
癒着が認められるが軽度のもの；スコア１
強い癒着が認められるが剥離性であるもの；スコア２
強い癒着が認められ非剥離性であるもの；スコア３
試験は一群５匹で実施した。また、必要に応じ、移植部位の病理標本を定法に従って作製し、病理組織学的な解析を行った。【０１１４】  被験薬物として抗マウスＩＬ−５受容体抗体（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．，３（２）：１３５−９，１９９１）を用いた。ラットＩｇＧ抗体（ＩＣＮ社製）をコントロール抗体として使用した。抗体はいずれも滅菌したリン酸緩衝液（ＩＣＮ社製）で希釈して使用した。
病変部位における癒着スコアについての結果を表２に示した。癒着スコアはそれぞれを点数とし、左右の移植片の癒着スコアを平均化して示した。【０１１５】
【表２】
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【０１１６】  表２に示したように、本ラット子宮内膜自家移植モデルでは臨床で観察される子宮内膜症患者病変部に観察される癒着が明らかに認められた。その癒着スコアに対し、抗ＩＬ−５受容体抗体投与群で抑制する傾向が示された（抑制率２９％）。なお、対照として脂肪組織を移植した場合には癒着はほとんど観察されなかった。
【実施例３】
【０１１７】  マウス子宮内膜症モデルにおける抗マウスＩＬ−５受容体抗体の子宮内膜症病変形成抑制作用
抗ＩＬ−５受容体抗体の子宮内膜症に対する有効性を検証するために、以下の実験を行った。
方法としては、公知の方法［ヒューマン・リプロダクション（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、１４巻、２９４４〜２９５０ページ（１９９９年）］を改変して行った。【０１１８】  マウスにおいて性成熟するとされる８週齢以上のＢａｌｂ／ｃ系雌性マウス（日本チャールス・リバー社）を実験に供した。購入後１週間の馴化期間の後、性ホルモン環境を均一にするため、全ての個体に左右卵巣摘出術を施したのち、エストロジェンを外因性に投与した。すなわち、ペントバルビタール（ソムノペンチル（Ｒ）、武田シェリング・プラウアニマルヘルス社製）５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与により全身麻酔したマウスの背部皮膚を正中線に沿って約１ｃｍ切開し、そこから左右卵巣のある位置の腹膜に切り込み（約３ｍｍ）を入れた。その切り込みより、両側卵巣を摘出したのち、速やかに背部皮膚を縫合し、飼育ケージに戻した。その後、エストロジェン（プロギノン（Ｒ）・デポー１０ｍｇ、日本シェーリング、吉草酸エストラジオール注射液）１００μｇ／ｋｇを左後肢筋肉内に注射した。この処置により、マウスでは４日周期で認められる性周期のうち高エストロジェン期である発情前期のマウス子宮と同程度の重量まで子宮が膨大することを確認した。【０１１９】  次いで、卵巣摘出の１週間後、全ての個体をドナーマウスとレシピエントマウスに１：２の構成比で分け、ドナーマウスの子宮を摘出して調製した子宮内膜片をレシピエントマウスの腹腔内に播種した。すなわち、放血致死させたドナーマウスから摘出した左右の子宮から、周囲の脂肪組織や子宮頸部を取り除き、内膜が含まれる子宮体部を小型手術用ハサミで細切して調製した。子宮内膜片は抗生物質を含む滅菌ＨＢＳＳ液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、シグマ社製）に浮遊させ、全ドナーマウス分をプールした。この、子宮内膜片浮遊液０．８ｍＬ（子宮内膜片として約５０ｍｇ相当）をペントバルビタール４０ｍｇ／ｋｇで全身麻酔したレシピエントマウスに１９Ｇ注射針（テルモ社製）をつけたシリンジにより腹腔内投与して播種した。子宮内膜片浮遊液のシリンジへの充填ならびに投与は、浮遊液をよく撹拌し、不均一にならぬよう実施した。その後、陽性対照群ならびに薬物評価群にはエストロジェン１００μｇ／ｋｇを、陰性対照群にはエストロジェンの溶媒であるゴマ油を週１回筋肉内投与した。【０１２０】  子宮内膜片播種の３週間後、放血致死させたのち開腹し、子宮内膜病変の肉眼的評価（形成される嚢胞サイズの測定）を実施した。病変サイズは金型ノギスを用いて縦・横それぞれ直径を測定し（最小目盛り０．５ｍｍ）、縦径と横径を乗じて算出した面積として評価した。病変が複数形成される場合には、その総和を総面積として評価し、試験は一群１０匹で実施した。また、必要に応じて、病変部位の病理標本を定法にしたがって作製し、病理組織学的な解析を行った。【０１２１】  被験薬物として、抗マウスＩＬ−５受容体抗体（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３（２）：１３５−９，１９９１、１０ｍｇ／ｋｇ、週１回投与）を使用した。また、陽性対照群にはコントロール抗体としてラットＩｇＧ抗体（ＩＣＮ社製、１０ｍｇ／ｋｇ、週１回投与��を用いた。抗体はいずれも滅菌生理食塩注射液（大塚製薬工業社製）で希釈して使用した。
病変サイズについての結果を図１に示した。【０１２２】  子宮内膜片播種３週間後において、陽性対照群では１００％の病変発症率であったが、陰性対照群では１匹の個体でのみ発症が認められた。また、形成された病変は、いずれも子宮内膜上皮で内張りされている嚢胞であり、子宮内膜症病変であることを病理組織学的に確認した。すなわち、本実験モデルはエストロジェン依存性に成長するとされる子宮内膜症を反映している有用なモデルであると考えられた。【０１２３】  本モデルにおいて、抗マウスＩＬ−５受容体抗体は、図１に示すように、陽性対照群に比べ有意な抑制作用を示した。なお、子宮内膜片のかわりに同重量の小腸粘膜片を播種した場合には、エストロジェンの投与によっても病変は全く形成されなかった。
【実施例４】
【０１２４】  マウス子宮内膜症モデルにおける抗マウスＩＬ−５抗体の子宮内膜症病変形成抑制作用
実施例３に記載された方法に準じ、抗ＩＬ−５抗体の子宮内膜症に対する有効性を検証した。【０１２５】  実験方法は、被験薬物として抗マウスＩＬ−５受容体抗体の代わりに、抗マウスＩＬ−５抗体（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３（２）：１３５−９，１９９１、１および１０ｍｇ／ｋｇ、週１回投与）を使用する以外は、実施例３に記載された方法と同様に行った。
病変サイズについての結果を図２に示した。【０１２６】  抗マウスＩＬ−５抗体は１０ｍｇ／ｋｇ投与群において陽性対照群に比べ有意な抑制作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】  本発明により、インターロイキン−５アンタゴニストを有効成分として含有する子宮内膜症治療剤を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】配列番号９−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１０−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１１−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１２−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１３−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１４−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１５−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１６−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号１７−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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