(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定で、生物学的に適合性があり、耐用性があり、親水性または誘導体化によって親水性にされた生物学的に活性な化合物を非経口投与するのに適した、その中に含まれる活性な化合物を徐放する油中水マイクロエマルジョンであって、
該マイクロエマルジョンが
ａ）２０％までの治療的に活性な親水性化合物を含む内側の親水性水相、
ｂ）３０〜９８％の疎水性外側相、および
ｃ）５０％までのコサーファクタントと混合したサーファクタント
からなり、
該疎水性外側相がＣ８〜Ｃ２０飽和または不飽和カルボン酸とＣ２〜Ｃ８アルコール残基のエステル、またはＣ８〜Ｃ２０脂肪酸のモノ、ジおよびトリグリセリドから選択され、
該サーファクタントがダイズレシチンであり、
該コサーファクタントがＣ８〜Ｃ２０脂肪酸およびＣ２〜Ｃ１２アルコールから選択され、
該サーファクタント／該コサーファクタントの比が２以上である、
油中水マイクロエマルジョン。
【請求項２】
実験用動物に投与した後に、持続的な潰瘍を誘導せず、注射部位におけるいずれの腫張も可逆性であることを特徴とする、請求項１に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項３】
親水性で生物学的に活性な化合物が、ペプチド、タンパク質、オリゴ糖、または多糖である、請求項１または２に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項４】
生物学的に活性な化合物がペプチドである、請求項３に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項５】
生物学的に活性な化合物が、ＬＨＲＨホルモンペプチドアナログである、請求項４に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項６】
生物学的に活性な化合物が、酢酸リュープロライド、ゴセレリン、トリプトレリン、ナファレリン、ヒストレリン、セトロレリックスまたは対応する酢酸塩である、請求項５に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項７】
生物学的に活性な化合物の徐放を少なくとも３０日間もたらす、請求項５または６に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項８】
生物学的に活性な化合物が、ソマトスタチン、オクトレオチドまたはランレオチドである、請求項４に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項９】
生物学的に活性な化合物の徐放を少なくとも８日間もたらす、請求項８に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項１０】
生物学的に活性な化合物が、オリゴ糖または多糖である、請求項３に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項１１】
生物学的に活性な化合物が、非分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリンである、請求項１０に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項１２】
生物学的に活性な化合物を含む水相が、４．５〜７．５の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項１３】
生物学的に活性な化合物を含む水相が、５〜７の範囲のｐＨを有する、請求項１２に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項１４】
天然アミノ酸を加えることによってｐＨが調整される、請求項１２又は１３に記載の油中水マイクロエマルジョン。
【請求項１５】
リュープロライド、ゴセレリン、トリプトレリン、酢酸ナファレリン、ヒストレリン、セトロレリックス、または対応する酢酸塩または他のＬＨＲＨアナログを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の油中水マイクロエマルジョンを含む、
テストステロンレベルが投与の４８時間後にすでに低下する、１回投与後に少なくとも３０日間テストステロン生成を抑制するための薬剤。
【請求項１６】
オクトレオチドまたはそのアナログを含む請求項１から４及び８のいずれか１項に記載の油中水マイクロエマルジョンを含む、成長ホルモン生成を少なくとも８日間抑制するための薬剤。
【請求項１７】
非分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリンを含む請求項１から３、１０及び１１のいずれか１項に記載の油中水マイクロエマルジョンを含む、１回投与後に徐放される薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、親水性であるかあるいは適切な誘導によって親水性にされた活性成分を、安定で、生物学的に適合性があり、容易に調製できる油中水マイクロエマルジョン（ｗ／ｏ）の形で、非経口的に投与するための徐放性薬剤組成物に関する。より詳細には、ペプチド活性成分または生物学的に活性なオリゴ糖または多糖は、生物体中に存在する加水分解酵素による即座の攻撃からの保護、および繰り返しの投与を避けるための徐放が望ましく、前記マイクロエマルジョンによって有利に調合される。治療に使用するための前記調合物は、問題および重大な副作用なしで注射することができ、工業的に容易に調製することができ、著しい技術的改良を提供する。
【０００２】
（従来の技術）
一般にマイクロエマルジョンは、光学的に等方性の系として定義することができ、偏光観察下で複屈折性でなく、透明で、熱力学的に安定であり、滴径が５〜２００ｎｍの範囲で非常に小さく、２つの液体間の分離表面の化学的−物理的性質を改変して界面張力をほぼゼロに低下させる乳化剤の存在下で安定化する、２つの混合しない液体の分散によって生成される。油、水、サーファクタント（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）またはテンシド（ｔｅｎｓｉｄｅ）、および任意選択でコサーファクタントまたはコテンシドが、通常はマイクロエマルジョンを形成するために存在する必要がある。油中水（ｗ／ｏ）または水中油（ｏ／ｗ）マイクロエマルジョンを形成する傾向は、水相と油相の相対比、およびサーファクタントの性質に依存する。具体的には、実験データに従って得られ、成分として水、疎水性化合物、およびサーファクタントとコサーファクタントの混合物を有する三成分の相図から、油中水および水中油マイクロエマルジョンが存在し安定である領域を選び出すことが可能である。たとえば、Ａｂｏｏｆａｚｅｌｉら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１１（１９９４）６３−７２）は、コサーファクタント作用を有するさまざまな化合物の油中水マイクロエマルジョンを形成する能力について研究した。この著者らが研究した系は、脂肪酸エステル、１：１レシチン−コサーファクタント、および水のさまざまな割合の混合物からなるものであった。コサーファクタントとして使用した化合物の効率スケールは、次のように定義された：第一級アミン＞アルコール＞脂肪酸。さらに効率は、アルコールおよびそれぞれの脂肪酸のアルキル鎖の長さと関係があることが分かった。すなわち、ブタノール＞ペンタノール＞ヘキサノール＞ペンタン酸＞ヘキサン酸。これらの実験データに基づいて、ブタノールやペンタノールなどのアルコール、ならびに程度は下がるが対応する脂肪酸が、最良の候補のようである。記載した化合物を使用することによって、安定な油中水マイクロエマルジョンを調製することはできるが、特に調合物と皮下または筋肉内組織が数日間さらには数週間も接触し続けるデポー剤を使用する場合は、前記調合物の耐用性が保証されるわけではない。
【０００３】
さらに文献は、コサーファクタントとサーファクタントの比が重要であることを報告している。Ａｂｏｏｆａｚｅｌｉらによって報告されたデータは、この２つの成分間の１：１の比に関するものである。Ａｔｗｏｏｄら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ８４  Ｒ５（１９９２））は、サーファクタントとコサーファクタントの比が約１．７から３に増大している、レシチン／水／脂肪酸エステル／ブタノール混合物の性質を研究した。この著者らは、ブタノールなど非常に効率のよいコサーファクタントを使用するときでも、レシチンを増やしてコサーファクタントの量を減少させると、油中水マイクロエマルジョンの存在が観察される領域が大幅に制限されることを明らかにした。
【０００４】
一般にサーファクタントは、親水−親油平衡（ＨＬＢ）として知られる実験スケールに従って分類され、このスケールでは１〜４０の範囲の値が割り当てられる。一般に、油中水マイクロエマルジョンに適したサーファクタントは低いＨＬＢを有するが、水中油マイクロエマルジョンに適したサーファクタントは高いＨＬＢを有する。界面張力が２×１０-2ｄｙｎ／ｃｍより小さいときは、安定なマイクロエマルジョンを形成することができる。任意選択でコサーファクタントが存在すると、界面流動性を増大させることができる。なぜなら、コサーファクタント分子はサーファクタント分子の間を通り、これによって不均一な表面フィルムを生成するからである。コサーファクタントはまた、水相の親水性を、したがって２相間の界面張力を低下させることもできる。原則として、コサーファクタントを使用することは、マイクロエマルジョンの安定性を高めながら必要なサーファクタントの量を減少させる点で有利であるが、既に前述したように、コサーファクタントの使用を制限することが好ましい。なぜならこれらは、主として担体と皮下組織または筋肉内組織が長時間接触する場合に、潜在的な局所毒性を有するからである。
【０００５】
活性成分の担体としてマイクロエマルジョンを使用することについては、数多くの利点が知られている。
【０００６】
マイクロエマルジョンは、成分の比が特定の条件下で、それを調製するための強力なパワーを必要とせずに、自然に形成することができ、したがって、産業スケールでのその調製は容易であり得る。前記自然形成性マイクロエマルジョンは熱力学的に安定であり、均一かつ透明であり、したがって分光器技術によってこれらを監視することができる。平均径が１００ｎｍ未満のマイクロエマルジョンを調製することができ、このマイクロエマルジョンは、０．２２μｍ膜の商用フィルタによる濾過によって冷滅菌することができる。このマイクロエマルジョンを用いると、可溶性が低い、または安定性が低い薬剤を投与することが可能になる。
【０００７】
さらに、過剰な分散相が存在するとき、あるいは温度変化の結果として、前記の系は相転換する可能性があり、この性質が、まだ明らかになっていないメカニズムによって、活性成分の生物学的利用能に影響を与える可能性がある。
【０００８】
油中水マイクロエマルジョンは、活性成分の放出を調節することができ、あるいは加水分解酵素の作用からの保護によって、生理学的液体中での成分の安定性を延長させることができる。マイクロエマルジョンについては多数の総説が存在し、たとえば「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｅｄ．１９９７は、「Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｉｅｌｄ：ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」という章で、薬剤分野でのマイクロエマルジョンの有用性を取り扱っており、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｅｄ．Ｋｕｍａｒ  Ｍｉｔｔａｌ（１９９９）は、その化学的−物理的な側面に関するものである。
【０００９】
親水性である、あるいは適切な誘導によって親水性にされた活性成分の調節型放出を行うための、媒体としての油中水マイクロエマルジョンの使用は、特許文献中で報告されている。
【００１０】
具体的には、ペプチドなどの生分解性分子について、前記活性成分を含む油中水マイクロエマルジョンの非経口投与が、研究［Ｍ．Ｒ．Ｇａｓｃｏら．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、６２、１１９（１９９０）］の中で報告されており、この研究では、生体適合性であると考えられる成分からなり５００μｇ／ｍｌの活性成分を含むマイクロエマルジョン中で調合したＬＨＲＨホルモンアナログを、体重約２００ｇの成体オスラットに３ｍｇ／Ｋｇの用量で１回の筋肉内注射によって投与して、注射の約３０日後までの期間中テストステロン血漿レベルが低下した。前記レベルは、緩衝溶液中の活性成分１００μｇ／Ｋｇの用量での繰り返しの注射（２８日間中、日に１回）によって治療した、第２グループのマウスで観察されたレベルよりも低かった。
【００１１】
ただし、テストステロン濃度の低下は観察時間中均一であったわけではなく、これは投与から８日後に初めて治療上有効となったことに留意しなければならない。
【００１２】
治療効果のこの遅延は、特に増殖するのにテストステロンが必要なことが知られている前立腺腫瘍の治療においては、それほど有利であるわけではなく、したがってテストステロンの正常な生成が早く止まるほど、治療はより有効となる。
【００１３】
前述の論文は、ペプチドの徐放に関する、オレイン酸エチル（６０．５％）、水（１０．１％）、ホスファチジルコリン（１８．９％）およびカプロン酸（１０．５％）からなる油中水マイクロエマルジョンの有効性を示している。サーファクタント（ホスファチジルコリン）とコサーファクタント（カプロン酸）の比は、１．８である。個別に見た前記マイクロエマルジョンの諸成分について、著者らは生物学的に適合性があるものと考えている。マイクロエマルジョンの全体としての生体適合性、調合物と接触している皮下組織の状態については言及されていない。
【００１４】
前記論文の教示によれば、ＬＨＲＨ活性を有する活性成分として酢酸リュープロライドを含み、オレイン酸エチル（６６．９％）、水（９．７％）、ホスファチジルコリン（１９．４％）およびカプロン酸／酪酸３／１の混合物（３．９％）からなる油中水マイクロエマルジョンを調製した。この論文によれば、サーファクタントとコサーファクタントの比を最小にするためにカプロン酸単独ではなく酪酸混合物を使用した。この場合、この比は１．８ではなく４．９である。生成物をラットに皮下注射することによって行ったｉｎ  ｖｉｖｏでの試験によって、その有効性が確認されたが、驚くべきことに不安を抱かせるような局所的潰瘍、および皮下での肉芽腫の持続的な形成も示された。使用するコサーファクタントの量を減らしたにもかかわらず、薬理学的には許容されないこの結果によって、マイクロエマルジョンの１つの成分の生体適合性は、非経口投与用に使用するとき、マイクロエマルジョンを構成する混合物の生体適合性を保証するほど充分なものではないことが実証された。
【００１５】
同様に、さまざまな特許中、たとえばＷＯ９４／０８６１０に開示され特許請求されている混合物によって、安定性のあるマイクロエマルジョンおよび可能な活性成分の時間制御された放出がもたらされるが、このような副作用を回避しながら親水性活性成分の徐放性を得る方法は当業者に教示されていない。実際、前記マイクロエマルジョンは、通常はさまざまな割合の、水、油性成分、サーファクタント、コサーファクタント、および任意選択で電解質からなる。「ｉｎ  ｔｏｔｏ」でのマイクロエマルジョンの生体適合性は評価されておらず、活性成分とマイクロエマルジョンの安定性および調合物の生体適合性を得るのに必要な、混合物成分と活性成分の比も示されていない。
【００１６】
他方、前記特許は、非経口投与に最も適しており容易な経路である筋肉内（ｉ．ｍ．）および皮下（ｓ．ｃ．）投与に関連する局所的耐性に関する問題点を具体的に考慮していない。
【００１７】
ペプチドを徐放するための、産業レベルで既に使用されている代替技術は、多数の特許、とりわけ米国特許第３，９７６，０７１号に記載され特許請求されている技術であり、同特許では、活性成分がインボジレート（ｉｎｂｏｄｙｒａｔｅ）されている生物侵食性ポリマーを使用することによって、このような放出が実現される。生物侵食性ポリマーの典型例は、グリコール酸および乳酸をベースとするポリマーである。前記技術の欠点は、前に記載したマイクロエマルジョンと比べて比較的高価であり手間がかかること、さらに有機溶媒、特に塩素化溶媒の使用が調製中に必要であり、環境影響および薬剤調合物の安全性の点で問題があることである。
【００１８】
他方では、前記調合物は有利なことに、持続的な肉芽腫形成を引き起こさず、局所的潰瘍を誘導することもない。
【００１９】
（発明の開示）
本発明は、安定な油中水マイクロエマルジョンの形の徐放性薬剤組成物を提供することを目的としており、この組成物は調製するのが容易であり、殺菌することができ、著しい全身的または局所的副作用がなく、親水性である、あるいは適切な誘導によって親水性にされた活性成分を非経口的に、好ましくはｉ．ｍ．またはｓ．ｃ．で投与するのに適しており、そのため知られている技法と比べて著しい技術的改良が得られる。
【００２０】
前述のマイクロエマルジョンで処理した動物の臨床、死後、および組織学的実験からなり、徐放性投与用の任意の調合物の生体適合性を全体的に評価するのに適した手順が発見されている。
【００２１】
この手順によると、投与される用量に応じて多少なりとも顕著な局所的腫張が何らかの形で可逆性であるとき、文献（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ−Ｆ．Ｊ．ＭｃＫｅｌｌｙ  ２０００  ２４５〜２４７ページ）の記載に従って、マイクロエマルジョンは許容できるものと考えられ、他方、生物分解性と考えられる材料についても同様の組織応答が観察され、その応答は、薬剤の徐放性に影響を与える際に明らかに重要である。逆に、持続的な腫瘍形成の形の局所的過敏症は、許容できないものと考えられる。
【００２２】
本発明のマイクロエマルジョンは、２０％までの活性成分を含む内側の親水性の水相、３０〜９８％の疎水性外側相、及び５０％までのコサーファクタントと混合したサーファクタントからなる。マイクロエマルジョンは、３５％以下のサーファクタントおよびコサーファクタントを含むことが好ましく、サーファクタントとコサーファクタントの比は２以上、最も好ましくは３．５以上である。
【００２３】
マイクロエマルジョンの安定性に影響を与えない、他の生物学的に適合性がある補形薬が存在することもできる。
【００２４】
本発明のマイクロエマルジョンに適したサーファクタントは、Ｃ4〜Ｃ20飽和または不飽和カルボン酸の残基を含み、リンエステル部分としてコリン、エタノールアミン、セリン、グリセロールの残基を有する天然または合成グリセロリン脂質、コレステロール、ソルビトール、ガラクトース、グルコース、サッカロースなどの糖類のＣ12〜Ｃ20脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンのＣ12〜Ｃ20脂肪酸エステルから選択される。
【００２５】
任意選択で存在するコサーファクタントはＣ8〜Ｃ20脂肪酸、Ｃ2〜Ｃ14ポリヒドロキシアルカン、特にプロピレングリコール、ヘキサンジオールおよびグリセロール、Ｃ2〜Ｃ12アルコール、乳酸とＣ2〜Ｃ8アルコール残基のエステルから選択される。
【００２６】
疎水性の連続的な相は、単独であるいは混合した以下の化合物：Ｃ8〜Ｃ20飽和または不飽和カルボン酸とＣ2〜Ｃ8アルコール残基のエステル、またはＣ8〜Ｃ20脂肪酸のモノ、ジおよびトリグリセリド、または非経口投与するのに適したダイズ油、ピーナッツ油、ゴマ油、綿実、ヒマワリ油などの植物油から選択される。
【００２７】
本発明のマイクロエマルジョンは、さらに４．５〜７．５、好ましくは５〜７の範囲のｐＨを特徴とし、前記ｐＨがマイクロエマルジョンの組成に固有のものではないときは、その安定性および小滴の平均サイズに影響を与えることなく、適切な量の天然アミノ酸をマイクロエマルジョンに加えることによって得ることが好ましい。
【００２８】
本発明の油中水マイクロエマルジョンは、ペプチド、特に酢酸リュープロライド、ゴセレリン、トリプトレリン、酢酸ナファレリン、ヒストレリン、セトロレリックスまたは対応する酢酸塩などのＬＨＲＨアナログ、またはソマトスタチンなどのペプチド、またはオクトレオチドおよび酢酸ランレオチドなどそのアナログの担体として非常に適している。
【００２９】
さらに本発明のマイクロエマルジョンは、多糖類、特に非分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの担体として非常に適している。
【００３０】
本発明のマイクロエマルジョンは、親水性の活性成分を徐放する調合物を調製することを可能にする。本発明の他の目的である、前記徐放性調合物は局所的な潰瘍を誘導することはなく、持続的な肉芽腫形成を引き起こさず、これらの調合物は薬剤が有効である期間中に再吸収される。ＬＨＲＨタイプのペプチド、特にリュープロライド、ゴセレリン、トリプトレリン、酢酸ナファレリン、ヒストレリン、セトロレリックスまたは対応する酢酸塩の場合、少なくとも３０日間の徐放を行うことができる。ソマトスタチン、オクトレオチドおよびランレオチドの場合、少なくとも８日間の徐放を行うことができる。
【００３１】
本発明はさらに、リュープロライド、ゴセレリン、トリプトレリン、酢酸ナファレリン、ヒストレリン、セトロレリックスまたは対応する酢酸塩を含む本発明によるマイクロエマルジョンの使用であって、テストステロンのレベルが投与の４８時間後に既に低下する、１回投与後に少なくとも３０日間の、テストステロン生成を抑制するための薬剤を調製するための使用に関する。
【００３２】
本発明はさらに、オクトレオチドまたはそのアナログを含むマイクロエマルジョンの使用であって、成長ホルモン生成を少なくとも８日間抑制するための薬剤を調製するための使用に関する。
【００３３】
本発明の他の目的は、非分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリンを含むマイクロエマルジョンの使用であって、１回の投与で徐放出される薬剤を調製するための使用である。
以下の実施例によって、本発明をさらに例示する。
【００３４】
実施例１  酢酸リュープロライドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
ａ）水相の調製
３５０ｍｇの酢酸リュープロライドを、２００ｍｇのリジンを加えた１０ｍｌの注射用の水中に溶かす。
ｂ）油相の調製
オレイン酸エチル６０ｇ、ダイズレシチン（純度＞９５％）２５ｇ、およびカプリル酸５ｇを、６０〜７０℃で恒温にした適切な容器中で、撹拌しながら別々に混合する。得られた透明で均質な溶液を、室温で冷却する。
ｃ）マイクロエマルジョンの調製
水相（溶液ａ）を油相（溶液ｂ）に撹拌しながら加えて、光学的に透明で、均質なマイクロエマルジョンを得る。水相中で可溶性であるリジンおよびカプリル酸分画の使用量に基づいて、約６のｐＨ値を得た。
前記マイクロエマルジョンを、適切な０．２２μｍ膜を介して滅菌濾過する。
前記マイクロエマルジョンの酢酸リュープロライド含量を、以下の条件でＨＰＬＣ分析によって評価した。
固定相：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８  ５μカラム（２５０×４ｍｍ）
移動相Ａ：  Ｈ2Ｏ＋０．１％ＴＦＡ
Ｂ：  ＣＨ3ＯＨ＋０．１％ＴＦＡ
勾配：      ２０’１００％Ａから１００％Ｂ
流量：      ０．８ｍｌ／分
検出器：    ＵＶ２１４ｎｍ
酢酸リュープロライド含量は、３ｍｇ／ｍｌである。
【００３５】
実施例２  酢酸リュープロライドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
実施例１の手順に従うが、６００ｍｇの酢酸リュープロライドを１０ｍｌの水中に溶かす。
【００３６】
実施例３  酢酸リュープロライドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
実施例１の手順に従うが、２００ｍｇのリジンは加えない。ｐＨ計算値は約３である。
【００３７】
実施例４  酢酸リュープロライドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
実施例１の手順に従うが、９００ｍｇの酢酸リュープロライドを１０ｍｌの水中に溶かす。
【００３８】
実施例５  酢酸リュープロライドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
実施例１の手順に従うが、サーファクタントおよびコサーファクタントの量は、それぞれダイズレシチン１５ｇ、およびカプリル酸３ｇに変える。このようにして、２成分の比を不変（５：１）に保ちながら、サーファクタント／コサーファクタント混合物の合計量を３０％から１８％に変える。
【００３９】
実施例６  オクトレオチドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
実施例１の手順に従うが、３５０ｍｇの酢酸リュープロライドを１０ｍｌの水中に溶かすのではなく、３ｇのオクトレオチドを１０ｍｌの水中に溶かす。
【００４０】
実施例７  ヘパリンを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
実施例１の手順に従うが、３５０ｍｇの酢酸リュープロライドではなく、５０ｍｇの非分画ヘパリンをカルシウム塩またはナトリウム塩の形で１０ｍｌの水中に溶かす。
【００４１】
参考例１  酢酸リュープロライドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
実施例１の手順に従うが、油相の定性−定量組成を次のように変える：オレイン酸エチル（６６．９％）、ホスファチジルコリン（１９．４％）、およびカプロン酸／酪酸３：１混合物（合計で３．９％）。
【００４２】
参考例２  酢酸リュープロライドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
ａ）水相の調製
６０ｍｇの酢酸リュープロライドを、８ｍｇのリジンを加えた０．６ｍｌの注射用の水中に溶かす。
ｂ）油相の調製
オレイン酸エチル２．１ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート２１５ｍｇ、およびダイズレシチン１ｇを、適切な容器中で混合し、撹拌しながら５０℃で加熱する。得られた透明で均質な混合物を、室温で冷却する。
水溶液を油性混合物に、ゆっくりと少しずつ撹拌しながら加えて、光学的に透明で１．５％の酢酸リュープロライドを含むマイクロエマルジョンを得る。
【００４３】
参考例３  酢酸リュープロライドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
ａ）水相の調製
６０ｍｇの酢酸リュープロライドを、４．１ｍｇのリジンを加えた０．２ｍｌの注射用の水中に溶かす。
ｂ）油相の調製
オレイン酸エチル１．２ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート０．５ｇ、およびカプリル酸０．１ｇを、適切な容器中で混合し、撹拌しながら５０℃まで加熱する。得られた透明で均質な混合物を、室温で冷却する。
水溶液を油性混合物に、ゆっくりと少しずつ撹拌しながら加えて、光学的に透明で３ｍｇ／ｍｌの酢酸リュープロライドを含むマイクロエマルジョンを得る。
【００４４】
実施例８  酢酸オクトレオチドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
ａ）水相の調製
２０ｍｇの酢酸オクトレオチドを、０．２ｇのプロピレングリコールおよび４ｍｇのリジンを含む注射用の０．２ｍｌの水中に溶かす。
ｂ）油相の調製
オレイン酸エチル０．９８ｇ、ダイズレシチン０．５ｇ、およびカプリル酸０．１ｇを、適切な容器中で混合し、撹拌しながら５０℃まで加熱する。得られた透明で均質な混合物を、室温で冷却する。
水溶液を油性混合物に、撹拌しながらゆっくりと少しずつ加える。得られた光学的に透明であるマイクロエマルジョンは、１０ｍｇ／ｍｌの酢酸オクトレオチドを含む。
【００４５】
実施例９  酢酸オクトレオチドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
ａ）水相の調製
１０ｍｇの酢酸オクトレオチドを、２ｍｇのリジンを加えた注射用の０．１ｍｌの水中に溶かす。
ｂ）油相の調製
オレイン酸エチル０．５９ｇ、ダイズレシチン０．２５ｇ、およびカプリル酸０．０５ｇを、適切な容器中で混合し、撹拌しながら５０℃まで加熱する。得られた透明で均質な混合物を、室温で冷却する。
水溶液を油性混合物に、撹拌しながらゆっくりと少しずつ加える。得られた光学的に透明なマイクロエマルジョンは、１％の酢酸オクトレオチドを含む。
【００４６】
実施例１０  酢酸オクトレオチドを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
オレイン酸エチル０．５９ｇ、ダイズレシチン０．２５ｇ、およびカプリル酸０．０５ｇを、適切な容器中で混合し、撹拌しながら５０℃まで加熱する。得られた透明で均質な混合物を、室温で冷却する。２ｍｇのリジンを含む注射用の０．１ｇの水を、撹拌しながら徐々に油性溶液に加える。得られた光学的に透明なマイクロエマルジョンに、１０ｍｇの酢酸オクトレオチドを撹拌しながら加える。活性成分を、前記マイクロエマルジョン中に数秒内にインボジレートさせる。このマイクロエマルジョンを、０．２２μｍのポリスルホンフィルタを介して濾過する。結果として生じる光学的にクリアなマイクロエマルジョンは、ＨＰＬＣで分析すると、６．３５ｍｇ／ｍｌという酢酸オクトレオチド含量を示す。
【００４７】
実施例１１  ミオグロビンを含む油中水マイクロエマルジョンの調製
ａ）水相の調製  ５．５ｍｇのミオグロビンを、１０ｍｇのリジンを加えた注射用の１．５ｍｌの水中に溶かす。
ｂ）油相の調製
オレイン酸エチル２ｇ、ダイズレシチン１．２ｇ、およびカプリル酸０．２５ｇを、適切な容器中で混合し、５０℃まで加熱する。得られた透明で均質な混合物を、室温で冷却する。
水溶液を油性混合物に、撹拌しながらゆっくりと少しずつ加える。得られた光学的に透明なマイクロエマルジョンは、１．３ｍｇ／ｍｌのミオグロビンを含む。
【００４８】
実施例１２  実施例１および２に記載したように調製した、酢酸リュープロライドを含むマイクロエマルジョンの有効性のｉｎ  ｖｉｖｏでの評価
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙのオスのラットの３グループ（それぞれのグループ当たり１０匹）を５日間ハウスに収容し、処理前に水および食料を任意に与えた。
酢酸リュープロライドの濃度が異なる、すなわち３ｍｇ／ｍｌ（実施例１）および６ｍｇ／ｍｌ（実施例２）である、実施例１および２に記載のように調製した２つのマイクロエマルジョン調合物を、１回の投与でラットのグループそれぞれに、０．７５０ｍｇ／ｋｇに相当する活性用量で投与した。
コントロールの動物（グループ当たり３匹）には、食塩溶液を与えた。
血液サンプルを採取した後のテストステロン血漿レベルを、１、２、３、４、７、１４、２１、２８、４２および５６日目に評価した。血液サンプルを遠心分離し、血清テストステロンをＥＩＡキットによって測定した。
血清テストステロンレベルは、投与後６０日まで評価した。
その結果を図１に記載する。
以下の表１に、治療した動物の器官重量に関するデータを要約して示す。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
本発明の調合物は、マイクロエマルジョン中の活性物質の濃度とは無関係に、実質的な全身的または局所的副作用がなく、少なくとも３０日間の活性成分の徐放、および注射の４８時間後に既に治療的効果をもたらす。
その効果は、生物浸食性ポリマーをベースとする、市販のデポー剤調合物「Ｅｎａｎｔｏｎｅ」を使用するときに得られる効果に匹敵する。
【００５１】
実施例１３  マイクロエマルジョンの皮下での耐性の評価
皮下での耐用性の評価に関する試験を、少なくとも９匹のラットのグループに、１回の投与で以下の表２に報告するマイクロエマルジョンを注射することによって行った。
臨床、死後、および組織学的実験を、投与の４８時間後、７日後、および１４日後に行った。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
この試験は、持続的な潰瘍を誘導しない生物学的適合性がある調合物を考慮したものであり、一方で腫張の存在は、Ｈｏｗａｒｄ他によってＩｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１６（１９８３）３１−３９に記載されたように、注射される生成物の量と、皮下組織からオレイン酸エチルが除去される速度の関数である。
【００５４】
実施例１４  酢酸オクトレオチドを含むマイクロエマルジョンの有効性のｉｎ  ｖｉｖｏでの評価
６ｍｇ／ラットに相当する用量の、実施例８に記載のように調製したオクトレオチドを含むマイクロエマルジョンを、約１７５〜２００ｇの重量の６匹のオスのラットに投与した。化合物の投与前、処理の０．５時間後、２４時間後、４、６および８日後に血漿サンプルを得た。
オクトレオチドを血漿から抽出し、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ装置および検量曲線で分析した。血漿レベルを、以下の表３で報告する。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
処理の８日後までに、有意なオクトレオチド血漿レベルが見出された。
【００５７】
実施例１５  酢酸リュープロライドを含むマイクロエマルジョンの用量／有効比の評価
実施例２に記載したように調製した酢酸リュープロライドを含む調合物を、２．２５ｍｇ／ｋｇという１回の用量でラットに投与した（エグザンプル）。コントロールの動物には、相当用量の食塩溶液を与えた（コントロール）。
血液サンプルのテストステロン血漿レベルを０、１、２、３、５、７、１４、２１、２８、４２および５６日目に評価した。血液サンプルを遠心分離し、血清テストステロンをＥｌｉｓａキットによって測定した。
結果を図２に示す。
処理した動物の器官重量に関するデータを、以下の表４に要約する。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
テストステロン血漿レベルおよび生殖器官重量の低下が、マイクロエマルジョンの投与後５６日目には明らかに実証される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１および２のマイクロエマルジョン調合物の、ラットのテストステロン血清レベルに対する影響を示す図である。
【図２】  実施例２記載の調製法で調製された酢酸リュープロライドを含む調合物のラットのテストステロン血清レベルに及ぼす影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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