(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラムと、該カラムに充填された、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、イミノ基、４級アンモニウム基、カルボキシル基、硫酸エステル基、スルホン酸基、リン酸基、炭素数６以上のアルキル基及び芳香族基からなる群から選ばれる官能基を有する物質が固定化された水不溶性担体から成る、ハイモビリティーグループタンパクの吸着材と、を含み、全血体外循環が可能である、ハイモビリティーグループタンパク除去用体液浄化カラム。
【請求項２】
前記１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基及び４級アンモニウム基が、下記一般式(I)
【化１】
0004945876.tif 000007
（ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立に、水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基を示す）
で表される請求項１記載の体液浄化カラム。
【請求項３】
前記一般式(I)中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立に、水素原子又は炭素数１若しくは２のアルキル基である、請求項２記載の体液浄化カラム。
【請求項４】
前記一般式(I)中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、全てメチル基である、請求項２又は３記載の体液浄化カラム。
【請求項５】
前記物質が、ポリリジンである、請求項１に記載の体液浄化カラム。
【請求項６】
前記物質が、ヘパリン又は硫酸デキストランである、請求項１に記載の体液浄化カラム。
【請求項７】
前記水不溶性担体が、繊維状の形状を持つ、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の体液浄化カラム。
【請求項８】
前記水不溶性担体が、ビーズ状の形状を持つ、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の体液浄化カラム。
【請求項９】
敗血症治療用である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の体液浄化カラム。
【発明の詳細な説明】
技術分野
【０００１】
本発明は、体液中等のハイモビリティーグループタンパク（以下、「ＨＭＧタンパク」と略すことがある）を吸着する吸着材およびそれを用いた体液浄化カラムに関するものである。本発明は、ヒト血液中のＨＭＧタンパクを除去することにより、敗血症などの病態を改善させる用途に好適に用いられる。
背景技術
【０００２】
ＨＭＧタンパクは、真核細胞内に存在する一群の非ヒストン性のＤＮＡ結合タンパクであり、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２、ＨＭＧ１４、ＨＭＧ１７、ＨＭＧ−Ｉ（Ｙ）等が知られている。ＨＭＧは本来細胞内でＤＮＡに結合して転写の促進や細胞の増殖などの機能に関与すると考えられてきたが、神経細胞の表面に存在して神経突起を伸張させる因子として見いだされたアンフォテリンがＨＭＧタンパクの一つであるＨＭＧ−１であることが示され、ＨＭＧタンパクが幅広い作用を有する可能性が示されている。
【０００３】
最近、このＨＭＧ−１が細胞外に分泌され、全身性炎症反応、敗血症性ショックの強力なメディエーターとして作用するという興味深い報告が出された（Wangら(1999)、Science vol.285、p248）。すなわち、マウスにリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を投与すると８−２４時間後に血清中のＨＭＧ−１濃度が顕著に上昇し、マウスは死に至る。精製したＨＭＧ−１自体をＬＰＳと同時にマウスに投与した場合にも相乗的に作用して致死活性を示し、また抗ＨＭＧ−１抗体を投与するとＬＰＳによる致死作用が抑制されることから、ＨＭＧ−１がエンドトキシンショックの重要なメディエーターであることが示された。ヒトにおいても、敗血症患者血中でＨＭＧ−１濃度が顕著に上昇し、特に死亡例において高いことが示された。ＨＭＧ−１は、出血性ショックにおいても血中濃度の上昇が認められ (Ombrellinoら(1999)、Lancet vol.354、p1446)、さらにはＨＭＧに属する他のタンパクＨＭＧ−Ｉ（Ｙ）も、ＬＰＳ刺激により産生が誘導されることが報告されている。
【０００４】
また、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患、全身性リウマチ性疾患などにおいては，ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２、ＨＭＧ−１４、ＨＭＧ−１７などのＨＭＧタンパクに対する自己抗体が産生されることが認められており、ＨＭＧタンパクはこれらの炎症性疾患への関与も示唆されている(Sobajimaら(1997)、Clin.Exp.Immunol. vol.107、p135など)。さらには、ＨＭＧタンパクが癌の増殖に関与することも報告されている(Taguchiら(2000)、Nature vol.405、p354)。
【０００５】
このように、ＨＭＧタンパクは本来生体に必要な機能を有するものであるが、敗血症のような病態においては細胞外に過剰に分泌されて病態悪化を引き起こし、生体を死に至らしめる物質である。このＨＭＧタンパクにより引き起こされる病態を改善するためには、例えば上述のマウスの実験に示されたように、抗体のようにＨＭＧと結合してその作用を阻害する医薬品を投与する方法が考えられる。しかし、ＨＭＧタンパクが細胞内および細胞表面で生体に必要な機能を有することを考えると、ＨＭＧ活性を阻害する薬剤の投与は、生体に重大な副作用を引き起こす懸念がある。つまり、生体に好ましくない細胞外のＨＭＧタンパクを、選択的に体内から除去する手段が望まれる。
【０００６】
ＨＭＧタンパクと結合しうる物質としては、上述の抗体の他にもヘパリン、ＲＡＧＥ等いくつかの物質が報告されているが(Horiら(1995)、J.Biol.Chem. vol.270、p25752など)、これらのＨＭＧタンパク結合性の物質を体内からのＨＭＧタンパクの除去に用いるという着想はこれまで全くなく、体液中からＨＭＧタンパクを除去しうる材料はこれまで知られていなかった。
発明の開示
【０００７】
従って、本発明の目的は、体液中のＨＭＧタンパクを効率良く除去することができるＨＭＧタンパクの吸着材を提供することである。
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の官能基を有する物質を水不溶性担体に固定化することにより、体液中のＨＭＧタンパクを効率良く除去することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、カラムと、該カラムに充填された、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、イミノ基、４級アンモニウム基、カルボキシル基、硫酸エステル基、スルホン酸基、リン酸基、炭素数６以上のアルキル基及び芳香族基からなる群から選ばれる官能基を有する物質が固定化された水不溶性担体から成る、ハイモビリティーグループタンパクの吸着材と、を含み、全血体外循環が可能である、ハイモビリティーグループタンパク除去用体液浄化カラムを提供する。
【００１０】
本発明の吸着材を体液と接触させることにより、体液中のＨＭＧタンパクが該吸着材に効率良く吸着され、体液からＨＭＧタンパクを除去することができ、生体に好ましくない細胞外のＨＭＧタンパクを除去することができる。
【００１１】
発明を実施するための最良の形態
上記の通り、本発明のＨＭＧタンパクの吸着材は、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、イミノ基、４級アンモニウム基、カルボキシル基、硫酸エステル基、スルホン酸基、リン酸基、炭素数６以上のアルキル基及び芳香族基からなる群から選ばれる官能基を有する物質並びに／又はペプチド、アミノ酸及び多糖類からなる群から選ばれる物質が固定化された水不溶性担体から成る。
【００１２】
カチオン性の官能基のうち、特にアミノ基及び４級アンモニウム基が好ましく、特に好ましいアミノ基及び４級アンモニウム基として下記一般式(I)に示される構造のものを挙げることができる。
【００１３】
【化２】
0004945876.tif 000002
（ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立に、水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基を示す）
【００１４】
なお、本明細書及び請求の範囲において、単に「アルキル基」と言う場合には、直鎖状のものと分枝状のものの両者が包含される。
【００１５】
上記一般式(I)中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、互いに独立に、水素原子又は炭素数１若しくは２のアルキル基であるものがさらに好ましく、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が全てメチル基であるものが特に好ましい。これらの官能基は単独でも組み合わせても採用することができる。
【００１６】
また、上記カルボキシル基、硫酸エステル基及びスルホン酸基は、単独でも組み合わせても採用することができる。
【００１７】
また、炭素数６以上のアルキル基又は芳香族基は、アルキル基の炭素数の上限は特にないが、通常３０程度である。芳香族基の好ましい例としては、フェニル基及びナフチル基、並びにこれらに１又は複数のアルキル基（炭素数は好ましくは１〜３０）が置換したアリールアルキル基及びアラルキル基を挙げることができる。これらの官能基は単独でも組み合わせても採用することができる。
【００１８】
水不溶性担体に固定化される物質は、上記した官能基の１種又は２種以上を有する物質であれば特に限定されるものではなく、低分子合成化合物、合成高分子；アミノ酸、糖などの天然の低分子化合物；オリゴ糖、多糖などの糖質あるいはその誘導体；ペプチド、タンパクあるいはその修飾物；ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸およびその誘導体、その他の生理活性物質、生体高分子、微生物由来の化合物などが用いられる。これら物質の大きさは、滅菌処理に対して安定性の高い分子量２００００以下のものが好ましく、分子量５０００以下のものはさらに好ましい。とりわけ、分子量５０〜５０００程度の範囲ものが好ましい。
【００１９】
例えば、上記した１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、イミノ基又は４級アンモニウム基を有する物質の好ましい例として、リジン、アルギニンのようなアミノ酸およびこれらのアミノ酸から成る、又はこれらのアミノ酸を多く含む（好ましくは３０モル％以上）ペプチド等を挙げることができ、例えば、ポリリジンを挙げることができる。
【００２０】
カルボキシル基、硫酸エステル基、スルホン酸基又はリン酸基を有する物質の好ましい例として、多数の硫酸エステル基を含む硫酸化多糖であるヘパリン及び硫酸デキストラン並びにこれらの誘導体等を挙げることができる。なお、これらにおいて必要なものは硫酸エステル基であるので、ここで言う「誘導体」は、ヘパリン又は硫酸デキストランの硫酸エステル基を維持したあらゆる誘導体が包含される。また、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する物質の好ましい例としてアスパラギン酸、グルタミン酸のようなアミノ酸およびこれらのアミノ酸から成る、又はこれらのアミノ酸を多く含む（好ましくは３０モル％以上）ペプチド等を挙げることができる。
【００２１】
炭素数６以上のアルキル基又は芳香族基を有する物質の好ましい例として、フェニルアラニン、トリプトファンのような疎水性アミノ酸、これから成る、若しくはこれを多く含む（好ましくは３０モル％以上）ペプチド等を挙げることができる。
【００２２】
上記した各官能基の密度は、特に限定されないが、官能基が固定化された水不溶性担体の乾燥重量１ｇ当たりの上記官能基の数（官能基が複数種ある場合にはそれらの合計）は、１μmol〜１mmol程度が好ましく、さらに好ましくは１０μmol〜１mmol程度である。
【００２３】
また、水不溶性担体に、ＨＭＧタンパクに対する抗体を固定化して成る材料もＨＭＧタンパクの吸着材として用いることができる。
【００２４】
本発明に用いられる水不溶性担体の材料は、ポリアミド、ポリイミド、ポリ（芳香族ビニル化合物）、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレンなどの合成高分子や、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサン、デキストランおよびそれらの誘導体を含む天然高分子、などが好適に用いられる。さらに、金属、セラミックス、ガラスなどの無機材料を適当な高分子で被覆したり、表面を直接修飾したものも好適に用いられる。
【００２５】
本発明の材料の形状は、繊維状、中空糸状、ビーズ状、平膜状、粉状などを用いることができるが、特に血球と血漿を分離せずにカラムに循環する全血体外循環にも適した、繊維状、中空糸状あるいはビーズ状のものが好ましく用いられる。吸着率を上げるには、接触面積の大きい多孔性の材料が好ましい。また、ビーズとしては、カラムに充填した際の圧損が少なくかつ表面積の大きいものが良いので、粒径が５０〜１０００μｍのものが好ましく、２００〜７００μｍのものがさらに好ましい。
【００２６】
上記した本発明の吸着材は、ＨＭＧタンパクを含む血清を吸着処理に供した場合に、ＨＭＧタンパクの吸着率が５０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であり、血清中のアルブミンの吸着率が２０％以下、好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下である、ＨＭＧタンパクを選択的に吸着するものが特に好ましい。このようなＨＭＧタンパク選択吸着性の吸着材は、上記した好ましい官能基を上記した好ましい範囲の密度で水不溶性担体に固定化することにより得ることができ、具体的な例が下記実施例に複数記載されている。
【００２７】
なお、ここで、ＨＭＧタンパク及びアルブミンの「吸着率」とは、正常ヒト血清に対してウシＨＭＧ−１タンパクを６００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した試料溶液０．４ｍｌに対して、吸着材５０μｌを添加し、３７℃で２時間振盪させた場合に、試料溶液中のウシＨＭＧ−１タンパクの何％が吸着されるか、及び試料溶液中の血清アルブミンの何％が吸着されるかを意味する。
【００２８】
上記した各官能基を有する物質を水不溶性担体に共有結合で固定化する方法は、臭化シアンにより活性化した担体との反応、カルボジイミドによる縮合、アミノ基、チオール基と反応する２価性反応試薬による架橋、グルタルアルデヒドによる架橋などの公知の方法により行うことができる。
【００２９】
なお、上記から明らかなように、上記官能基を有する物質を水不溶性担体に共有結合により結合させて固定化したものも本発明で言う「物質を固定化した水不溶性担体」に包含される。また、上記官能基を水不溶性担体の合成段階から導入又は含んで成るものも「物質を固定化した水不溶性担体」に包含される。
【００３０】
本発明の吸着材を、カラムに充填し、ＨＭＧタンパク除去用体液浄化カラムとすることができる。吸着材のカラムへの充填方法は、繊維状材料であれば、織物、編物、不織布など布状の形態にして積層充填して、あるいは孔のあいた中空の中心パイプの周りに巻き付けて液を内側から外側に透過させる方法などが用いられる。
【００３１】
本発明の吸着材をカラムに充填し，患者の血液または血漿などのＨＭＧタンパクを含む体液を体外循環の方法で透過させることにより、敗血症などの疾患の治療を行うことができる。本発明のカラムは、細菌成分を吸着する体液浄化カラムと合わせて用いることにより、特に高い敗血症の治療効果を得ることが期待できる。さらには本発明の吸着材は、癌、自己免疫疾患などの治療にも好適に用いられ得る。
実施例
【００３２】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。
【００３３】
（測定方法）
（１）ＨＭＧ−１の吸着率
各実施例における反応の前後の溶液中のＨＭＧ−１濃度をＥＬＩＳＡ法で定量し、実施例４においては以下の式で吸着率を算出した。
吸着率(%)＝｛1−吸着後の濃度(ng/ml)÷吸着前の濃度(ng/ml)｝×100
【００３４】
また、実施例１〜３においては含水率の高い吸着体を添加することによる溶液量の増加を考慮し、以下の式で近似的に吸着率を算出した。
吸着率（％）＝｛1-｛吸着後の濃度(ng/ml)×0.45(ml)｝÷｛吸着前の濃度(ng/ml)×0.4(ml)｝×100。
（注：0.45＝吸着後の反応液量(ml)、0.4＝吸着前の反応液量(ml)）
【００３５】
（２）アルブミンの吸着率
反応前後の血清アルブミン濃度を自動血液生化学分析装置（富士フィルム社製富士ドライケム５５００）を用いて測定し、ＨＭＧ−１の吸着率と同様にしてアルブミンの吸着率を算出した。
【００３６】
実施例１    各種官能基を有するビーズによるＨＭＧ−１の吸着
正常ヒト血清に対してウシＨＭＧ−１タンパクを６００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した溶液０．４ｍｌに対して、以下に示す各種の官能基を含有する架橋アガロースビーズ５０μｌを添加し、３７℃で２時間振とう反応した。
【００３７】
吸着体(1)-N＋(CH3)3、(2)-N＋(C2H5)2H、(3)-SO3−、(4)-COO−、(5)-(CH2)7-CH3、(6)-C6H5。
【００３８】
コントロールとして、ビーズを添加しない溶液を同様に２時間振とう反応した。反応前後の血清中のＨＭＧ−１およびアルブミン濃度を測定し、吸着率（％）を算出した。結果を表１に示す。
【００３９】
これら官能基を有する不溶性担体のなかで、カチオン性の官能基(1)、(2)およびアニオン性の官能基(3)、(4)が高い効率でＨＭＧ−１を吸着した。また、疎水性の官能基(5)、(6)によっても吸着が認められた。一方、これらの吸着体によるアルブミンの吸着は少ないことが示された。
【００４０】
【表１】
0004945876.tif 000003
【００４１】
実施例２    生理活性物質固定化ビーズによる吸着
表２に示す各種の生理活性物質を固定化した架橋ビーズを用いて、実施例１と同様に正常ヒト血清中のＨＭＧ−１の吸着実験を行った結果、表２に示すように、(2)ヘパリン、(4)ポリＬリジン、(5)硫酸デキストランおよび(7)ヒスタミンを固定化した材料により、血清中のＨＭＧ−１が高い効率で吸着除去され、生体に必要な物質であるアルブミンの吸着は少ないことが示された。
【００４２】
なお、各吸着材は、具体的には次のようにして製造した。臭化イオンで活性化した架橋アガロースビーズ１ｇに対して、それぞれの生理活性物質を５ｍｇ／ｍｌで溶解した0.5 M塩化ナトリウムを含む0.1 M炭酸水素ナトリウム溶液１０ｍｌを混合し、４℃で２４時間反応させた。その後0.1 Mのエタノールアミンを室温で２時間反応させて未反応の活性基をブロッキングした後、蒸留水で洗浄し、吸着実験に用いた。
【００４３】
【表２】
0004945876.tif 000004
【００４４】
実施例３    アミノ酸固定化ビーズによる吸着
表３に示すアミノ酸を固定化した架橋アガロースビーズを用いて、実施例１と同様に正常ヒト血清中のＨＭＧ−１の吸着実験を行った結果、表３に示すように、(2)アルギニン固定化材料が高い吸着を示し、(1)リジン、(2)トリプトファン固定化材料によっても吸着が認められた。これら材料によりるアルブミンの吸着は少なかった。
【００４５】
なお、各吸着材は、具体的には次のようにして製造した。臭化イオンで活性化した架橋アガロースビーズ１ｇに対して、それぞれのアミノ酸を５ｍｇ／ｍｌで溶解した0.5 M塩化ナトリウムを含む0.1 M炭酸水素ナトリウム溶液１０ｍｌを混合し、４℃で２４時間反応させた。その後0.1 Mのエタノールアミンを室温で２時間反応させて未反応の活性基をブロッキングした後、蒸留水で洗浄し、吸着実験に用いた。
【００４６】
【表３】
0004945876.tif 000005
【００４７】
実施例４    ヘパリン固定化繊維状担体による吸着
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなるアメリカ特許4,661,260記載の海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数：１６）を５０ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、４００ｇのニトロベンゼン、４００ｇの９８％硫酸、０．８５ｇのパラホルムアルデヒドの混合溶液と２０℃で１時間反応させた。そして、繊維をニトロベンゼンで洗浄し、水中に入れて反応を停止させた。その後、繊維をメタノールおよび温水で再び洗浄することによって、クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下ＡＭＰＳｔ繊維と略す）を得た。
【００４８】
ＡＭＰＳｔ繊維３００ｍｇに対して１％ｖ／ｖのエチレンジアミン０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液８ｍｌを３７℃３時間反応させ、繊維へのアミノ基の導入を行った。得られたアミノ化繊維を洗浄後、６．７ｍｇ／ｍｌのヘパリン水溶液６ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３，３ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩２ｍｌを添加し、室温で２１時間反応を行うことでヘパリン化繊維を調製した。これを吸着体Ａとする。
【００４９】
一方、ＡＭＰＳｔ繊維３００ｍｇに対して、１ｍｇ／ｍｌのヘパリン−アルブミン結合標品（シグマ社）の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６）溶液８ｍｌを３７℃１６時間反応させ、その後繊維の未反応活性基を最終濃度０．１Ｍのトリス塩酸を反応させてブロックすることで、ヘパリン−アルブミン化繊維を調製した。これを吸着体Ｂとする。
【００５０】
正常ヒト血清に対して、ウシＨＭＧ−１タンパクを６００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した溶液０．４ｍｌに対して、上述の方法で作製した吸着体Ａまたは吸着体Ｂ２０ｍｇを加えて、３７℃で２時間振とう反応した。コントロールとして、繊維を添加しない溶液を同様に２時間振とう反応した。反応前後の血清中のＨＭＧ−１およびアルブミン濃度を測定し、吸着率（％）を算出した結果を表４に示す。これらヘパリンを固定化した繊維状の材料により、血清中のＨＭＧ−１が吸着除去されることが示された。また、これら材料によるアルブミンの吸着は少なかった。
【００５１】
【表４】
0004945876.tif 000006