(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼科手術部位ではない外科手術部位における癒着の形成を軽減するための膜であって、
該膜は、カルボキシポリサッカライド（CPS）と、ポリエーテル（PE）との会合複合体を含んでなる鋳造溶液から形成され、
該鋳造溶液は、７．０未満３．０超のｐＨを有し、
該膜は、生体吸収性、生体付着性、抗血栓形成性、及び抗癒着性から成る群より選択される少なくとも１つの特性を有し、
該膜は、500％〜4000％の水和率を有する、膜。
【請求項２】
前記CPSが、カルボキシメチルセルロース（CMC）、カルボキシエチルセルロース、キチン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、カルボキシメチルキトサン、ペクチン、カルボキシメチルデキストラン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、及びコンドロイチン硫酸から成る群より選択される、請求項１記載の膜。
【請求項３】
前記CPSの分子量が100kd〜10,000kdである、請求項１又は２記載の膜。
【請求項４】
前記PEの分子量が5kd〜8000kdである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の膜。
【請求項５】
前記CPSがCMCである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の膜。
【請求項６】
前記PEがポリエチレンオキシド（PEO）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の膜。
【請求項７】
前記PEに対する前記CPSの比率が、質量で１：９〜質量で１９：１の範囲である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の膜。
【請求項８】
前記CPSの置換度が、０より大きく、３以下の範囲を包含する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の膜。
【請求項９】
さらに薬剤を包含する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の膜。
【請求項１０】
前記薬剤が、抗生物質、抗炎症剤、ホルモン、走化因子、鎮痛薬、及び麻酔薬から成る群より選択される、請求項９記載の膜。
【請求項１１】
前記外科手術部位が、整形外科、胃腸、腹腔、胸部、頭蓋、心血管、婦人科、関節鏡検査、泌尿器科、形成外科、及び筋骨格から成る群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の膜。
【請求項１２】
該膜が種々の性質を示す多層を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の膜。
【請求項１３】
前記鋳造溶液がヒドロゲルである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の膜。
【請求項１４】
前記鋳造溶液が６．０未満３．０超のpHを有する、請求項８記載の膜。
【請求項１５】
以下の工程を含む、膜を製造する方法。
（ａ）100kd〜10,000kdの範囲の分子量を有するCPSの水溶液を調製し、前記CPSの置換度を０より大きく、３．０までの範囲とする工程、
（ｂ）5kd〜8,000kdの範囲の分子量を有するPEの水溶液を調製する工程、
（ｃ）前記CPSの前記溶液及び前記PEの前記溶液を一緒に混合して、前記CPS及び前記PEの鋳造溶液を形成し、前記PEに対する前記CPSの割合を、質量で１：９〜質量で１９：１の範囲とする工程、
（ｄ）前記鋳造溶液のpHを、7.0未満の範囲のpHに調整する工程、
（ｅ）前記鋳造溶液を表面上で乾燥させ、膜を形成する工程、
（ｆ）膜のｐＨを高くする工程。
ただし、該膜は眼科手術には用いない。
【請求項１６】
工程（ｄ）が、前記鋳造溶液のpHを３．０超の範囲のpHに調整する工程を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記CPSをCMC、及び前記PEをPEOとする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｅ）が、前記鋳造溶液を表面上で乾燥させ、500％〜4000％の水和率を有する膜を形成する工程を含む、請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｆ）が、前記膜のpHを中性のｐH値以上に高くする工程を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｆ）が、リン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩水、又はアンモニアを用いて前記膜のpHを高くする工程を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｄ）が、前記鋳造溶液のpHを３．５〜６．０の範囲のpHに調整する工程を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）が、前記CPSの前記溶液及び前記PEの前記溶液を一緒に混合して、前記CPS及び前記PEの鋳造溶液を形成し、前記PEに対する前記CPSの割合を、質量で１：９〜質量で１９：１の範囲とし、前記鋳造溶液がヒドロゲルを形成する、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般的に、カルボキシポリサッカライド／ポリエーテル高分子間複合体を含んでなる膜の製造、及び、手術後の組織間の癒着形成を阻止するための当該膜の使用に関する。膜の特性は、所望の度合の癒着防止、生体吸収、生体付着、及び抗血栓形成効果を達成するように合わせることができる。
発明の背景
癒着は、隣接する体組織層の間又は組織と内臓との間に生じる望ましくない組織の成長である。癒着は、一般に、外科的手術の後治癒する間に形成し、癒着が存在すると、それらに隣接する構造の組織や臓器の正常な動作を妨害する。
医療及び科学界では、高分子量のカルボキシル含有生体高分子を用いて手術後の癒着の形成を軽減する方法を研究してきた。これらの生体高分子は、治癒する間、物理的なバリアとして働き組織を相互に引き離す水和ゲルを形成できるので、正常な隣接構造の間に癒着はできない。実質的に完治すると、バリアはもはや必要でなく、体から除去され、患部組織の正常な機能を可能にすべきである。
この目的のため、数種の生体高分子が使用されてきた。例えば、Balazsらの米国特許第4,141,973号は、癒着防止のためのヒアルロン酸（HA）の使用について開示している。
また、メチルセルロース及びメチルセルロース誘導体も、手術後発生しうる癒着及び瘢痕の形成を減じることで知られている。（Thomas E. Elkinsら、Adhension Prevention by Solutions of Sodium Carboxymethylcellulose in the Rat, Part I, Fertility and Sterility, Vol. 41, No. 6, June 1984:Thomas E. Elkins, M.D.ら、Adhension Prevention by Solutions of Sodium Carboxymethylcullulose in the Rat, Part II, Fertility and Sterility, Vol. 41, No. 6, June 1984）
また、カルボキシル含有生体高分子溶液に加え、ポリエーテル溶液も術後の癒着発生を減少させることができる。Pennellらの米国特許第4,993,585号は、術後の癒着形成を軽減するために15%までの溶液でポリエチレンオキドを使用することについて記載している。Pennellらの米国特許第5,156,839号は、約2.5質量％までのカルボキシメチルセルロースと、濃度が約0.5質量％までのポリエチレンオキドとの混合物で、生理的に許容されるpHの中性混合物の使用について記載している。
Smithらの米国特許第3,387,061号は、pHを3.5以下、好ましくは3.0以下に低くして、生じた沈殿を乾燥、焼成することで製造されるカルボキシメチルセルロースとポリエチレンオキドとの不溶性会合複合体について記載している。これらの膜は癒着軽減のための手術用途については設計されなかった。このような膜は、あまりに不溶性、剛性であり、術後の癒着防止に理想的な膨潤をほとんどしない。さらに、それらの過剰な酸度は組織障害を引き起こすだろう。
このように、本発明にはいくつかの目的がある。
第１の目的は、手術中及び手術後の癒着形成の発生を減じる組成物及び方法を提供することである。これは、最初の又は２回目の手術における新生の癒着形成の防止を包含する。
また、本発明の他の目的は、１回目の処置後に形成した新生の癒着の除去を意図した２回目の処置後の癒着再形成を防止することである。
本発明の概要
本発明の一観点は、カルボキシポリサッカライド（CPS）及び任意的なポリエーテル（PE）の高分子間会合で作られ、手術後の癒着の阻止に有用な組成物である。本発明の他の観点は、所望の物理的性質及び生物学的性質を示すCPSとPEとの複合体の製造方法を包含する。
所望の物理的性質を有する複合体の作製は、ポリマー間の結合度を変化させることにより達成される。この性質の変化は、鋳造溶液(casting solution)のpH（以後、“膜のpH”という）、ポリマーの分子量、ポリマー混合物の百分率組成、及び／又はCPS内のカルボキシル残渣による置換度（d.s.）を変えることによって達成される。膜の性質の付加的な変化は、膜の最初の製造後に膜を調整することによって達成される。また、種々の層を選択して種々の性質を示す多層膜も、本発明の一観点である。
さらに、本発明のいくつかの観点に従い、当該膜に薬剤を含むことができ、薬理学的化合物を直接組織に供給することができる。
材料は生体適合性であり、所望の期間内に体から取り除かれ、その期間を制御することができる。膜を使用して、手術後の癒着の形成を阻止する。
先行技術と異なり、抗癒着組成物は所望の性質を有して製造できる。さらに、製造後に抗癒着膜(anti-adhesion membranes)を調整することにより、本発明の用途に有利な手術後の癒着を軽減するという、予想外の特性が生じた。
【図面の簡単な説明】
図１は、種々のpHにおいて水素結合により生成する、カルボキシポリサッカライドとポリエーテルとの会合複合体の形成理論を示す略図である。
図２は、CMC及びポリエチレンオキシド（PEO）含有の膜を鋳造する(casting)ために作られた溶液のpH滴定の研究結果を示す。
図３は、室温で種々のpH、2.0〜4.31で鋳造溶液から作られたCMC／PEO膜の水和又は膨潤の時間経過を示す。
図４は、室温でpH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS)溶液中におけるCMC／PEO膜の水和又は膨潤の時間経過を示す。
図５は、種々の組成及びpHの膜についてのPBS中での溶解度を示す。
図６は、CMC／PEO膜によるPBS溶液の酸性化についての研究結果を示す。
図７は、CMC／PEO膜の水和又は膨潤に対するPEOの分子量変化の効果を示す。
好ましい実施態様の詳細な説明：
定義
発明を詳細に説明する前に、本明細書で使用する以下の用語を定義する。
用語“癒着”(adhesion)は、手術の外傷のような炎症性の刺激の後に形成する組織と臓器間の異常な付着を意味する。用語“癒着防止”(adhesion prevention)及び“抗癒着”(anti-adhesion)は、手術後の瘢痕の形成及び傷ついた組織間の線維帯及び傷ついた組織と傷つかない組織間の線維帯の形成を防止又は阻止することを意味する。
用語“会合複合体”又は“高分子間複合体”は、CPS及び／又はPEを含むポリマー間に形成される分子の網目構造を意味する。
用語“生体付着性”は、生きた組織に付着する能力を意味する。
用語“生体吸収性”は、吸収されて体から除去される能力を意味する。
用語“生体適合性”は、生きた組織及び器官に対して生理学的に許容されることを意味する。
用語“カルボキシメチルセルロース”（“CMC”）は、セロビオース単位の繰り返しから構成され、さらに２個のアンヒドログルコース単位（B-グルコピラノース残渣）から構成され、1、4グルコシド結合によって結合されているポリマーを意味する。
用語“置換度”（“d.s.”）は、１モルのセロビオースに存在するカルボキシル残渣の数の平均を意味する。
用語“椎間板切除術”は、破壊した椎骨板を除去する外科的手術を意味する。
用語“内視鏡”は、腹腔鏡又は関節鏡のような、体内の組織を密接観察するための光ファイバーデバイスを意味する。
用語“線維組識”は、瘢痕又は癒着を意味する。
用語“ヒアルロン酸”（“HA”）は、N-アセチルグルコースアミンとグルクロン酸とのジサッカライド単位の繰り返しから構成されるアニオン性ポリサッカライドを意味する。HAは、結合組織の細胞外マトリックスの天然成分である。
用語“水和”（また“膨潤”）は、ポリマー溶液によって溶媒を取り込むプロセスを意味する。
用語“水和率”（また“膨潤率”）は、水和した膜のウェット質量からドライ質量を減じ、ドライ質量で除し、100倍した％を意味する。
用語“ヒドロゲル”は、多量の水が存在する、親水性ポリマーの三次元網目構造を意味する。
用語“椎弓切除術”は、１以上の椎骨薄板を除去する外科的手術を意味する。
用語“腹腔鏡”は、腹部の刺創を通して挿入される小径の鏡を意味し、最小限の侵襲性の外科的手術法で可視化のために使用される。
用語“膜のpH”は、膜を作る鋳造溶液のpHを意味する。
用語“中皮”は、胸膜腔、心膜腔及び腹膜腔を内張りする上皮を意味する。
用語“腹膜”は、腹腔を内張りし、内臓を囲む漿液膜を意味する。
用語“ポリエチレンオキシド”は、エチレンオキシドモノマーから構成される非イオン性ポリエーテルポリマーを意味する。
用語“組織虚血”は、生きた組織への血流の欠乏を意味する。
本発明の詳細な説明
本発明は、移植可能な、生体吸収性の、カルボキシポリサッカライド（CPS）とポリエーテル（PE）との会合複合体を供給する工程を含む、外科的手術の際及び術後の癒着の形成を軽減する方法に関する。複合体は、一般的に、適切な量及び組成のCPSとPEとを溶液中で混合し、任意に、その溶液を所望のpHに酸性化して酸性化会合複合体を形成し、所望により、その溶液を適切な平らな面に注ぎ、混合物を乾燥させて減圧（＞0.01 Torr）又は大気圧（760 Torr）で、膜を形成することによって製造される。その会合複合体は、創傷を治療する際に癒着を形成するであろう組織間に配置される。その複合体は、その組成、製造方法、及び製造後の調整に依存して異なる期間、その部位に留まる。組織が実質的に治癒すると、その複合体は分解及び／又は溶解して体から取り除かれる。
本発明の膜は、所望の剛度、種々の生体吸収性速度、種々の生体付着度、種々な度合の抗癒着効果及び種々な度合の抗血栓形成性を有して製造できる。
会合複合体形成の正確な機構は、完全には解らないが、ポリサッカライドのカルボキシル残渣と、ポリエーテルのエーテル酸素原子との間に水素結合が生じるということが一つの理論である。Dieckmanら、Industrial and Engineering Chemistry 45(10)：2287-2290（1953）を参照されたい。図１は、この理論を図示している。膜が鋳造されるポリマー溶液（“鋳造溶液”）のpHは、適切な酸を利用して慎重に滴定して酸性のpHにする。最初の中性のアニオン性ポリサッカライドのカルボキシル基は、混合ポリマー鋳造溶液に酸を添加することによって、プロトン化されてカルボン酸基が遊離する。そのプロトン化されたカルボキシル残渣は、実質的にポリエーテルのエーテル酸素原子と静電気的に結合でき、双極子−双極子相互作用タイプの水素結合を形成できる。
鋳造溶液のpHを減少させると、プロトン化されるカルボキル残渣の数が増え、ポリエーテルと水素結合できる数が増える。このためポリマーの網目構造が高まり、その結果、より強く、より硬く、溶解性の低い、かつ生体吸収性の低い膜が生成する。他方、鋳造溶液を中性のpHに近づけると、カルボキシポリサッカライドのカルボキシル基は、より負の電荷を帯びて、相互に反発し、かつPEのエーテル酸素原子と反発して、その結果、ほとんど或いは全く構造的に統合性のない弱い結合のゲルを生じる。
説明の目的のため、このような相互作用は、図１に示されるように、３つの場合に分類することができる。図は、可能な分子間複合体生成の概略を示し、１個のカルボキシポリサッカライド（CPS）鎖から４個のカルボキシメチル基が、１個のポリエーテル（PE）鎖の４個の各エーテル酸素に対抗して配列される。図1aは、pHが約７の場合の状態を示す。中性のpHでは、カルボキシル残渣は解離され、PEのエーテル酸素と負に荷電されたCPSのカルボキシメチル基との間には水素結合複合体が形成されない。図1bは、pHが約２の場合の状態を示す。低pHでは、大部分のカルボキル残渣がプロトン化され、大部分がPEのエーテル酸素原子と水素結合される。図1cは、pHがおよそ3-5の場合の状態を示す。約4.4のCPSのpKaでは、カルボキシル基の半分がプロトン化され、PEの対応するエーテル酸素原子と水素結合される。この中間的なpH領域内で、本発明に従い、架橋の程度を厳密に調整できる（図２）。
図1bに従って作られる膜は、Smithら（1968）によって記載された膜と似ている。それらは、理想的な癒着予防膜のいくつかの主要な特徴を欠いている。低pH膜は、水和に乏しい。また、それらは感触が粗く、成形し難くく、かつ溶解し難い。それらは溶解しないので、短期間では十分に体から除去されない。さらに、鋳造溶液の酸性度が高いため、より中性のpHの膜に比し、組織にかなり多量の酸を運ぶ。組織障害が生じる前に、この酸負荷を中性化するのには生理的機構は困難を伴う。従って、それらは生体適合性に乏しい。
その先行技術と対照的に、上述した本発明の膜は、図1cで概略を示したように、癒着予防膜を与える。これらの膜は、中間的なpHの範囲、典型的にはおよそ3と５の間で製造されるので、架橋の量が多すぎて十分に早くは溶解しないような複合体を生じることも、架橋が少なすぎて、あまりに早く分解してしまうような複合体が生じることもない。さらに、鋳造溶液のpHを変化させると、溶液のレオロジー特性が変わり（表１）、それら溶液から作られる膜の物理的性質が変わる（表２）。
会合複合体の形成についての上述の機構は、本発明には必要ない。CPS及びPEについての我々の研究結果は、構成成分間の会合についての如何なる特定の理論に頼ることなく、本発明を十分に述べている。
CPS／PE鋳造溶液から膜を製造するときは、CPS及びPEの溶液が容易に取扱えるということのみを必要とする。CPSの希釈溶液（約10%質量／体積まで）は、取扱い易く、約2%CPSの溶液はさらに扱い易い。約20%（質量／体積）までのPEOは、作り易く、扱い易く、また約１質量％の溶液は扱い易い。
カルボキシポリサッカライドは、いずれの生体適合性の種類でもよく、限定されるわけではないが、カルボキシメチルセルロース（CMC）、カルボキシエチルセルロース、キチン、ヒアルロン酸、デンプン、グリコーゲン、アルギン酸塩、ペクチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、並びにヘパリン、ヘパリン硫酸、及びコンドロイチン硫酸のようなグリコサミノグリカンを包含する。好ましくは、カルボキシメチルセルロース又はカルボキシエチルセルロースが使用される。さらに好ましくは、カルボキシメチルセルロース（CMC）が使用される。カルボキシポリサッカライドの分子量は、100kd〜10,000kdに変えることができる。600kd〜1000kdの範囲のCPSはよく作用し、700kdのCPSはよく作用し、かつ市販品を入手し易い。
同様に、使用するポリエーテルは重要でない。本発明の好ましいポリエーテルはポリエチレンオキシド（PEO）である。CMCナトリウムはそれ自体抗癒着バリアとしてゲル形態で用いられていたが、CMC／PEO膜は、癒着防止に有用ないくつかの特異の性質を有する。
CMCとPEOから作られる膜は、CMCのみで作られる硬く剛性の膜より柔軟である。従って、手術の際、膜を操作して、種々の組織に密着させるのに必要な形にぴったり合わせることができる。さらに、複合体にPEOを含めるとと、血液タンパク及び血小板の膜への付着を減少させて癒着防止を助ける抗血栓形成特性を与える（Amiji, Biomaterials, 16：593-599（1995）；Merill, E.W., PEO and Blood Contact in Polyethylene Glycol Chemistry-Biotechnical and Biomedical Applications, Harris J.M. (ed), Plenum Press, NY, 1992；Chaikofら、A.I. Ch.E. Journal 36(7)：994-1002(1990)）。PEO含有膜は、フィブリンクロットの組織表面へのアクセスを弱め、CMCのみを含有する膜よりも弱めさえする。引張り強さ又は柔軟性について妥協することなく、CMC／PEOの柔軟性を増加させると、手術時の膜の取扱い特性を改良する。本発明で使用するポリエーテルの分子量の範囲は、5kd〜8000kdに変えることができる。100kd〜5000kdの範囲のポリエーテルは、よく作用し、かつ市販品を入手し易い。
ポリサッカライドとポリエーテルとの比率を変化させると、溶液の粘性が変化し（表４，５）、異なった程度の癒着予防及び抗血栓形成効果が生じる。CPSの割合を増やすと、生体付着性が高まるが、抗血栓形成効果が低くなる。一方、PEの割合を増やすと、抗血栓形成効果が高まるが、生体付着性が低くなる。カルボキシポリサッカライドの割合は、質量で、10%〜100%でよく、好ましくは50%〜90%、最も好ましくは90%〜95%である。逆に、ポリエーテルの割合は、0%〜90%でよく、好ましくは5%〜50%、また最も好ましくは約5%〜10%である。
CPSとPEとの会合複合体の会合の強さ及びそれによる物理的性質は、綿密に調整されうる。会合複合体のpHを小さくすると、水素の架橋の量が増加する。同様に、膜のカルボキシポリサッカライドの置換度を高めると、いずれのpHにおいても会合複合体内の架橋が増加して、溶解性が減少することで複合体の生体吸収性ひいては生体適合性が低くなる。低pHのポリマー溶液から作られた膜は、高pHを有する溶液から又はヒドロゲルで作られた膜より、一般的により硬く剛性であり、溶解が遅く、それゆえ組織内での滞留時間が長い。低pH膜は、一般的に、癒着形成時間が長い状況で、或いはゆっくり治る組織内で有用である。このような状況は、靭帯及び腱の手術からの回復において生じ、組織は特徴的にゆっくり治る。従って、持続性膜は、それらの組織間での癒着形成を最少化できる。しかし、低pH膜は、触感が粗く、折れ曲がるとクラックが生じ易く、粉砕し易い。
対照的に、高pHの溶液から作られた膜は、低pHの溶液から作られた膜より柔軟で使用しやすい。それらは、低pHで作られた膜より生体付着性であり、速く生分解するので、癒着形成時間が短い場合に有用である。これらの膜は、感触が滑らかで、成形しやすく、かつ低pHの溶液から作られた膜に比し、ずっとクラックを生じ或いは粉砕することなく、折り曲げることができる。
本発明の会合複合体のpHは、1〜7であり、好ましくは2〜７，さらに好ましくは3〜7、さらに好ましくは3.5〜6.0である。特定用途では、pHは約4.1が好ましく、本発明で想定した用途の大部分において、生体付着性、抗癒着特性、生体吸収速度及び生体適合性のバランスが好ましい。
生体付着は、高分子の生体組織への付着として定義される。生体付着は、その潜在的なバリアは手術部位に配置された後そこから滑ってはいけないので、手術の癒着防止において重要である。CMC及びPEOは両方とも個々に生体付着性である（例えば、Bottenbergら、J. Pharm. Pharmacol. 43：457-464（1991）参照）。水にさらされると膨潤することで知られる他のポリマーのように、CMC／PEO膜も生体付着性である。
水和は、膜の生体付着に寄与する（Gurneyら、Biomaterials 5：336-340（1984）；Chenら、Compositions Producing Adhension Through Hydration, In；Adhension in Biological Systems, R.S. Manly(Ed.)Acad. Press NY(1970)、Chapter 10）。この現象の理由としては、水和が増すと、CMC上の電荷がより露出されて組織タンパクに結合し易くなるということが考えられる。しかし、過剰な水和は生体付着にとって有害である。従って、膜の生体付着を調節する方法は、膜の水和特性を調節することである。
本発明の膜は、PBS溶液中で速く水和する（図３）。この挙動は、手術の時湿性組織に配置される膜の挙動を模している。膜の水和はそのバリアの厚みと柔軟性の両方を増加させ、これにより、癒着形成しうる期間、膜を組織の形態と一致させて切り離すことができる。最適な癒着防止のために好ましい水和率（％水の吸収による質量の増加）は、500%〜4000%、さらに好ましい比率は700%〜3000%、また、癒着軽減に最も好ましい水和率は、約2000%である（図４）。
会合複合体のpHを減じることに加え、カルボキシル置換の程度を高めたCPSを使用して、高分子間会合の増加が達成される。CPS上のプロトン化されうるカルボキシル残渣の密度を高くすることによって、かなり高いpHにおいてさえ、水素結合の形成が増加しうる。置換の程度は、０より大きくなければならない。すなわち、いくらかの水素結合を形成しうるカルボキシル残渣がなければならない。しかし、理論的に、セルロース誘導体に対して上限は３であり、サッカライドの１モルに対して３モルのカルボキシル残渣が存在する。従って、本発明の最も広い適用では、該d.s.は０より大きく３以下である。好ましくは該d.s.は0.3〜２である。0.5〜1.7の間のd.s.を有するCPSはよく作用し、約0.65〜1.45のd.s.を有するCPSはよく作用し、かつ市販品を入手し易い。
本発明の複合体は、体内での滞留時間が有限とされる。手術部位に配置されると、乾燥膜は即座に水和してゲル様のシートになり、限定された期間バリアとして機能するように設計される。実質的に治癒するとすぐに、該抗癒着バリアは自然に分解し、その成分は体から除去される。体から除去するのに要する時間は、食品及び薬の規制が増すので、好ましくは29日を超えないべきである。デバイスの投与は、体内に30日以上残存するものである。
CMC／PEO複合体の生体吸収の機構は、よくは解っていない。しかし、生体吸収過程の初期段階は、CMCとPEOとの網目構造の溶解である。従って、複合体の溶解性を高めると、組織からの構成成分除去の容易性が高まる（図５）。CMC及びPEOは溶解すると、循環器系に拡散して肝臓及び腎臓に運ばれ、代謝され又は別の方法で体から除去される。さらに、酵素作用も炭水化物を分解できる。好中球及び他の炎症性細胞に含まれる酵素は、ポリマーの網目構造を分解してその構成成分を体から除去する速度を増すことができる。
膜の分解及び溶解速度と分解速度は、会合複合体形成時のpHの厳密な調節、CPS／ＰＥ比を変化させること、またCPSの適切な置換度及びPEとCPSの分子量を選択することによって、操作される。CPSの分子量を少なくすると、その溶解性が増す。（Kulickeら、Polymer 37(13)：2723-2731(1996)）。膜の強度は手術用途に合わせることができる。例えば、特定の手術用途（例えば、脊椎又は腱）は、他の場合（腹腔内用途のような）より、強く、耐久性の膜を必要とする。上述の実験変数の操作によって、体内での滞留時間が異なる製品及び用途を得ることができる。
本発明の複合体の生体適合性はその酸性度の関数である。高い酸性度の複合体は、より中性の複合体より全体でかなり多くの酸負荷を組織に与える。さらに、水素イオンが複合体から速く解離するほど、生理機構はより速く酸負荷を緩衝し、希釈しまた他の除去機構によって補填しなければならない。生体内の膜により除去される速さ及び酸の総量を模倣するため、PBS溶液に膜を入れてPBSの酸性化の程度を測定する。膜のpHに加え、膜の組成も体に送達される酸負荷に影響を与える。図６及び表３、表６は、膜による組織への酸の送達を模倣するために設計した研究結果を示す。
膜の製造後、膜を変更して使用者の特定の要求に合わせてもよい。例えば、比較的生体吸収性の膜は、限定するわけではないが、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸又は硝酸で例示される酸を含有する溶液で処理する、“酸性”法によって、より不溶性にすることができる。
逆に、比較的吸収性でない酸性膜は、アンモニアのようなアルカリで（“アルカリ”法）、又はリン酸緩衝液（PB）若しくはリン酸緩衝食塩水（PBS；“緩衝”法）のような緩衝溶液で、それを調節してより生体吸収性及び生体付着性にすることができる。pH7.4のPBSの10mM溶液は、リン酸緩衝液の生体適合性のため好ましい。さらに、膜のpHは、低pHで作られた膜の利点をなくさないように、緩衝させることができる。従って、最初の酸性膜は、そのpHがアルカリ又は緩衝処理で高くなったとしても、ゆっくり水和し、比較的長い滞留時間を有する。
表７は、CMC／PEO膜の特性におけるアンモニア処理の効果を示す。高酸性の最初の膜（pH 2.03）は、最初pH7.40のPBS緩衝溶液を酸性化してそのpHを4.33にする。この膜をPBS溶液に浸漬すると、それは水和してその最初の乾燥質量の2.5倍以上になり、PBS中で４日後には、この膜はその最初の質量の約29%を失った。同じ膜で、0.5Nアンモニア溶液中で１分間インキュベーションすると膜は実質的に中和され、緩衝溶液にほとんど水素イオンを遊離せず、PBS溶液のpHはほとんど中性（pH 7.29）のままであった。
表８は、CMC／PEO膜の特性におけるリン酸緩衝液処理の効果を示す。漸次的な長い滞留時間のために50mMリン酸緩衝液で処理された膜は、PBS溶液への酸の遊離が減少することで判るように、ますます中性のpHになった。同様に、PBS（10mMリン酸緩衝液）は膜中の酸を中和した（表９）。従って、組織に生理的に適合する膜が作られ、さらに、会合複合体を生じる酸性の最初のpHで作られるので、膜は最初の複合体の所望の特性を保持している。
さらに、多層膜を製造し、例えば、高pHで作られた外側の膜で囲まれた低pHの内側の膜を取り入れることができる。この構成により、内膜の長期間の安定性と低速の生体吸収性を有する膜を導入することができ、組織障害や炎症反応のような低pH膜の副作用を最少化する。さらに、高pHの外側部分は、低pH膜より生体付着性が高く、このような膜をよりしっかりと部位に留めておくことができる。
また、多層膜は１層として純粋なCPS又はPE膜を含んでもよい。このような膜は、CPS及びPEの混合物である側の柔軟性、抗癒着性、及び溶解性を有し、一方で純粋な材料の特性を有する。例えば、生体付着性はCPSの特性であり、純粋なCPSは高度な生体付着性を有するだろう。代替的に、純粋なPE膜は最も高い抗血栓形成特性を有するだろう。従って、各構成成分の所望の特性を取り入れた膜を作ることができる。
手術部位に運ばれる薬剤を取り入れた膜を作ることができる。膜に薬剤を取り入れることは、Schiraldiらの米国特許第4,713,243号に記載されている。その取入れは、製造段階で、又は後に挿入前の膜の調整段階であってもよい。癒着形成を阻止しうる薬剤は、ヘパリン又は組織のプラスミノーゲン活性剤のような抗血栓形成剤、アスピリン、イブプロフェン、ケトプロフェン、又は他の非ステロイド系抗炎症剤のような薬剤を含む。さらに、ホルモン、走化因子、鎮痛剤又は麻酔薬を、製造時又は調整時のいずれにおいても膜に加えてよい。膜の構成成分及び膜の製造に適合するいずれの薬剤又は物質を、本発明で使用できる。
本発明の組成物が使用できる手術のタイプは限定されない。外科手術処置の例としては、腹腔、眼科、整形外科、胃腸、胸部、頭蓋、心血管、婦人科、関節鏡検査、泌尿器科、形成外科又は筋骨格の処置がある。
開腹術及び腹腔鏡検査のうち67%〜93%で、癒着形成が起こる。特有な腹腔の処置としては、腸、虫垂、胆嚢切除、ヘルニアの修復、腹膜の癒着溶解、腎臓、膀胱、尿道、及び前立腺の手術がある。
婦人科の処置は、卵巣、ファロピウス管及びフィムブリエに付着した癒着による両側の卵管疾病に起因する不妊症治療のための手術を含む。このような手術は、卵管開口術、卵管剥離術及び卵巣剥離術を含む。さらに、婦人科の手術は、子宮内膜症の除去、新生の癒着形成の防止、子宮外妊娠の処理、子宮又は底の筋腫摘出術及び子宮摘出術筋を包含する。
筋骨格の手術は、腰椎椎弓切除術、腰椎椎間板切除術、屈筋腱手術、脊椎の固定、関節の交換又は修復を含む。
胸骨切除術を含む胸部手術は、最初の手術後に、心臓と大動脈との間の癒着形成のため危険性がある。胸部手術は、バイパス吻合及び心臓弁の交換を含む。
多くの頭蓋手術の手順は、一を超える処置を必要とするので、頭蓋骨、硬膜及び皮質を含む癒着のために二回目の処置を複雑にする。
眼球手術用途は、斜視の手術、緑内障のフィルタリング手術、及び流涙のドレナージ系の処置を含む。
抗癒着膜の試験及び評価の一般的方法
膜の水和率
膜の水和速度及び水和率を測定するため、数片の好ましくは160mgの乾燥膜を１枚ずつガラスびんに入れ、20mlのリン酸緩衝食塩水溶液（PBS、10mM、pH 7.4、Sigma Chemical Company、St. Louis、MO）を添加した。膜は水和してヒドロゲルの柔らかいシートを生成した。一定時間（通常、１時間又は５日）後、水和した膜の各々をその試験びんから取り出し、ポリスチレンのシャーレに入れた。ディスポーザブルピペットを使用して膜をティッシュペーパーで吸い取って過剰の水を除去した。そして、各膜を秤量し、水和率を下式に従って決定した：
0004986311.tif 000002
CPS／ＰＥ膜の溶解性
CPS／ＰＥ膜の溶解性を決定するため、膜の化学的成分の関数として、膜の水中での相対的な溶解度及びその水溶液の安定性を測定した。膜の水中での溶解度は、膜の生体内吸収時間に関連する。
通常、試験は、上述した水和の測定と組み合わせて行う。しかし、水和試験の際、膜はPBSに曝されるので塩を取り込む。この塩が加わるため人為現象的に乾燥質量が多くなる。そこで、水和率測定後、脱イオン水（30ml、30分間）に膜を浸漬させてポリマー網目構造に取り込まれた塩を除去した。水をデカントして新しい30mlアリコートの脱イオン水を加えた。膜をさらに30分間浸漬し、シャーレから取り出して、吸い取り、乾燥し、50℃の自然対流式オーブンに入れて乾燥した。
乾燥時間は膜によって吸収された水の量に寄った。水和率の高いゲル様の膜は乾燥するのに24時間までかかったが、水和が不十分な膜は数時間程度で乾燥した。膜の過剰な水をの除去した後、膜を1-2時間室温で平衡化してから秤量した。一定の質量が得られるまで秤量を繰り返した。一般に、この間に空気中の湿気を吸収して膜が再び水和するものもあった。
上記の脱塩化プロセスの後、30mlの脱イオン水を含有するシャーレに膜を入れ、20分から５日の期間で水和させた。予備的な試験では、pHが６以下の範囲の膜は１時間の脱塩化の間には分解しないことがわかった。
膜の溶解性（Ｓ）は、下式を用いて計算した：
0004986311.tif 000003
浸漬前の乾燥質量は脱塩化後の質量であり、浸漬後の乾燥質量は水中での水和段階後の質量である。
膜によって送達される酸負荷の決定：
この試験は、上述の水和及び溶解度試験と組み合わせて行った。この試験により、動物又はヒトの被検体に膜が移植されたときに膜が組織に送達しうる酸負荷の指標を得る。製造後、膜をPBS溶液に入れると、複合体は経時的にプロトンを解離し、その結果、PBS溶液のpHかなり減少した。
酸負荷試験は、モデル40 pHメーター（Beckman Instruments,Fullerton,CA）を使用して行った。160mgの乾燥膜をガラスびんに入れて20mlのPBSを添加した。PBS溶液のpHの初期値は7.40であった；この溶液のpHは、膜のポリマーが部分的に溶解してプロトン化されたカルボキシル残渣をさらすにつれて、徐々に減少した。高度に水和した膜（pH 4-7）では、水和プロセスで生じる静水力によってポリマー鎖が引き離されるので、このプロセスが促進された。
実施例：
以下の実施例で、カルボキシポリサッカライド／ポリエーテル膜を、典型的なカルボキシポリサッカライドとしてCMCについて、典型的なポリエーテルとしてPEOについて記載する。他のカルボキシポリサッカライド及びポリエーテルの会合複合体を作ることができ、同様に使用できることが分かる。従って、本発明は、これらの実施例に限定されず、本発明から逸脱することなく、如何なる均等の方法でも実施できるものである。
実施例１：中性のCMC／PEO膜
タイプ7HF PH（MW約700 kd；ロットFP 10 12404）カルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC）をAqualon Division of Hercules（Wilmington、DE）から得た。約900kdのMWを有するPEOをUnion Carbide（Polyox WSR-1105 NF、ロットD 061、Danbury CT）から得；約1000kdのMWを有するPEOをRITA Corporation（PEO-3、ロット0360401、Woodstock、Illinois）から得た。
以下のように、65%ＣＭＣ及び35%PEOの組成の膜を作った：6.5gのＣＭＣ及び3.5gのPEOを秤量皿内でドライブレンドした。モデル850実験室ミキサー（Arrow Engineering、PA）を使用して500mlの脱イオン水をボルテックスに入れて約750RPMで撹拌した。この撹拌した水に、CMCとPEOのドライブレンドを約2分間かけて徐々に分散させた。ポリマーが溶解するにつれて、ポリマー溶液の粘度が上昇し、撹拌速度はだんだん遅くなった。約15分後、撹拌速度は60〜120RPMになり、撹拌を約5時間続け、何らの凝集塊も見られない、2%の総ポリマー濃度（wt/wt）を含有する均一な溶液を得た。
CMC及びPEOを予備ブレンドしないで、膜の鋳造溶液を生成する代わりの方法は、ポリマーを個々に溶解させることである。そして、アニオン性ポリマー、CMCは、適量のHClを添加して酸性化することができる。例えば、10.0gのCMC7HFを500mlの脱イオン水に溶かして調製した2%CMCの500mlバッチに、2700μlの濃HClを加えてpH2.6に酸性化した（“溶液A”）。別に、2%PEOのバッチを作った（w/v 900,000MW、“溶液B”）。そして、実施例１の実験室スターラーを用いて、60RPMで、溶液AとBを特定の比率で完全に混合した。実施例1-2においては、総ポリマー濃度を2%に維持した。
20gの溶液を100×15mmの円形のポリスチレンシャーレ（Fisher Scientific、Santa Clara、CA）に注いで溶液から膜を鋳造した。シャーレを40℃−45℃に設定した実験室用自然対流式オーブンの中に入れ、760Torrで一晩中乾燥させた。生成した膜を、Exactoナイフを用いて慎重にポリスチレン表面からはがした。
より大きな膜用には、243×243×18mmのポリスチレンシャーレ（Fisher Scientfic）を使用した。円形膜と同様な面積比の質量を用いて（この場合、220gの鋳造溶液を使用した）、乾燥質量約4.5gの膜を得た。膜は、均一で滑らかであり、かつ柔軟性を示した。この膜の160mgを20mlのPBS溶液（pH 7.4）に入れても溶液のpHは変化しなかった。乾燥引張り強さ及び％破断点伸びは、酸性化鋳造溶液から作られた対応する膜よりわずかに高かった（表２）。脱イオン水又はPBSに入れると、膜は過剰に膨潤し、急速に（10分以内に）そのシート構造を失い、ゲル様の物質を形成して、最終的にはポリマー溶液に均一に分散した。
実施例２：適度に酸性化されたCMC／PEO膜及びヒドロゲル
中間のpH域（2.5＜pH＜7）に酸性化された膜の製造方法は、最初は実施例１で述べた方法に従う。実施例１で特定したポリマーを含む中性のポリマーブレンド溶液に、60-120RPMで1時間撹拌しながら濃塩酸（HCl、37.9%、Fisher Scientific、Santa Clara、CA）を添加して酸性にした。最初は、溶液中に白色の沈殿物が形成し；その沈殿物は徐々に分散して安定した溶液になった。一般的に、安定した鋳造溶液の所望の濃度を得るためには、2%の総ポリマー濃度が有効であることがわかった。より高いポリマー濃度からは、粘度が高すぎて注ぎ難いポリマー溶液が生じた。より低いポリマー濃度の場合は、同様の膜質量のためには鋳造溶液を多く必要とし、同等の膜に対して乾燥時間がかなりかかった。実施例１の65%CMC／35%PEOポリマーブレンド500mlでは、鋳造溶液のpHを3.1にするためには1500μlの濃塩酸を必要とする。この酸性化プロセスによって、最初のポリマー溶液の粘度は、少なくとも50%下がった。
種々のポリマーブレンド（100%CMC及び100%PEOも同様に）についての滴定曲線を図２に示す。図２は、CMC／PEO混合物の組成に依存する所望のpHの鋳造溶液を調製するのに必要なHClの量を示す。100%CMC（■）から得られる膜は、他の組成よりも同程度に酸性にするためには多くの酸を必要とする。PEOの濃度を増やすと（CMCの濃度を減らすと）、鋳造溶液を所望のポイントに酸性化するのに必要な酸の量が減少する。PEOの濃度を20%に増やしても、PEOの分子量が200k（●）か1000kd（▲）に関係なく、効果が少ない。PEOの濃度を40%（＋）又は100%（□）に増やすと、所望の鋳造溶液のpHを達成するのに必要な酸の量はさらに減少する。
ヒドロゲルの粘度
ヒドロゲルの抗癒着特性は、その粘度に依存するので、鋳造溶液のpHとヒドロゲルの粘度の関係を測定した。BrookfieldTM粘度計を使用して22℃におけるPCS／PE溶液の粘度を測定した。使用した方法は、小冊子Cellulose Gum、Hercules. Inc.、Wilmington、DE、（1988）、28ページに発表した。手短に言えば、試験する溶液の組成を選択し、Cellulose Gumの29ページの表XIを参照してスピンドル番号とスピンドルの回転速度を選択する。粘度測定は、溶液攪拌後２時間以内に行う。スピンドルを溶液に接触させ、３分間スピンドルを回転させた後、Brookfieldデジタル粘度計（モデルDV-II）で直接センチポアズの値を読みとる。我々は、7HF PH CMCと1000kdPEO（RITA）からpH7.5で調製した65%CMC／35%PEO溶液を研究した。他の65%CMC／35%PEO溶液をpH3.1で調製した。
0004986311.tif 000004
表１は、鋳造溶液の酸性化による粘度の変化を示す。pHを7.5〜3.1に減少させると、半分以上鋳造溶液の粘度が下がった。ヒドロゲルの粘度は癒着防止能力に関係するので、長時間一カ所に留まる能力のため、より高いpHのゲルは、より高い抗癒着特性を有するだろう。さらに、鋳造溶液は、pHと共に粘度によっても特徴づけられる。従って、pHの測定が困難又は信頼できない場合は、粘度を測定すると好ましい。膜の製造のため、弱く水素結合した分子間PEO-CMC複合体を含有する酸性化鋳造溶液を、次にポリスチレンのシャーレに注ぎ、実施例１で記載したように乾燥する。乾燥後、物理的性質を測定した。
CMC／PEO膜の物理的性質
膜の引張り強さ及び伸びは、幅12.7mmの狭い点のある“イヌの骨”の形をした膜片について測定する。そして、膜を１トンのロードセルを備えたInstronTM試験機に取り付ける。クロスヘッド速度を5.0mm／分に設定する。膜の厚み、引張り強さ、及び伸び（膜の％破断点伸び）を測定した。所望の試験領域で失敗した試料についての結果を報告する。試料の半径又はグリップについて失敗した試料は、不適当の試験と考え、それら試験結果は捨てた。
0004986311.tif 000005
膜は、すべて厚み0.1mm未満である。膜のpHを中性から減少させると、引張り強さが減少し、破断点における弾性（％伸び）が減少する。同様に、PEO濃度を低くすると、膜の引張り強さ及び伸びが減少する。
PBS中でのCMC／PEO膜の水和
膜の生体付着性を評価するために、以下に述べる方法に従って、CMC／PEO膜の水和の速度及び程度を測定した。
図３は、本発明のCMC／PEO膜の水和の時間経過を示す。pH4.31で80%CMC／20%PEO（m.w. 900kd）から製造した膜は、急速に水和した（●）。PBS中で２時間後、その水和率（（ウェット質量−ドライ質量）／ドライ質量；％膨潤）は6000%以上に増加した。PBS中で５時間後、この膜の水和率はほぼ8000%であった。この高度に水和した膜は、その粘着性を失い、その後実質的に分解した。膜のpHを3.83以下に減少させると、膜は２時間以内でほとんど平衡点まで水和し、少なくとも40時間水和の程度及び粘着性を維持した。水和の程度は、高度に膨潤する能力のある最も酸性度の低い膜を有する膜のpHに依存した。3.83のpHにおいて（▲）、膜はほぼ6000%の水和率を有し、一方、2.0のpHにおいては（□）、水和率は300%未満であった。pHが3.2〜4.3の範囲内で、水和の程度はpHに影響されやすい。
図４は、CMC／PEO膜の水和における膜の組成及びpHの効果について、他の研究のまとめを示す。水和は、PBS中で少なくとも６時間後で、水和の程度がそれぞれの膜についてほぼ同等に達した時に測定した（図３参照）。調べた各組成について、膜のpHを高くすると、膜の水和率は増加した。100%CMCの膜（■）は、その水和率が膜のpH1.7における約100%から膜のpH3.4における1300%以上に増加した。80%CMC／20%PEOから得られた膜については、PEOの分子量が水和にわずかに影響した。900kdのPEOで作られた膜（▲）は、200kdのPEOで作られた膜（●）より、所定のpHにおいてわずかに多く水和した。さらに、高度に置換されたCMCで作られた膜（d.s.=1.2；▲＋▼）は、置換度0.84の100%CMCで作られた膜（■）と同様に水和した。最終的に、50%CMC／50%PEO（900kd）で作られた膜は、膜のpHが低い（＜2.5）ものを除き、他の膜のいずれよりも水和が少なかった。
CMC／PEO膜の溶解性
CPS／PEポリマーの生分解性は溶解性に関係するので、以下に述べる方法に従って、PBS中で少なくと４日後の膜の溶解度を測定した。図５は、PBS溶液中の膜の溶解性における膜のpH及び組成の効果を示す。膜を種々のCMC／PEO組成及び種々の膜pHで作った。すべての膜で、膜のpHが高いと、PBS中での溶解度が高かった。100%CMCの膜（■）は、最も溶解しなかった。PEOを含有する膜はより溶解しやすく、900kd PEOから作られた膜(▲)は、200kd PEOから作られた膜（●）より溶解しなかった。また、PEOの百分率を50%に増やすと（＋）、膜の溶解度がさらに高くなった。CMCの分子量を小さくすると（7MF；＊）、溶解度が増した。また、CMCの置換度を0.84から1.12に高めると（▲＋▼）、一様に膜の溶解度が高まった。さらに、高い置換度に対しては、膜の溶解性に及ぼすpHの効果が大きくなった。他の膜についは、pHを高める効果は、膜の組成とは関係なく同程度を示した。従って、直線の傾きは同様であった。これらの結果は、膜の組成に関係なく、膜の溶解性は、膜のpHを高めることによって増すことを示している。さらに、生体吸収性は可溶化が必要なので、より溶解性の高い膜は、低溶解性の膜よりも早急に体から取り除かれるだろう。
CMC／PEO膜の生体適合性
生体適合性は、組織に送達される酸負荷に関係するので、以下に述べるような好適なインビトロモデルとして、PBS溶液にCMC／PEO膜によって送達される酸負荷を測定した。まず、種々の組成のCMC／PEO膜にさらしたPBS溶液の酸性化の時間経過を測定した。
0004986311.tif 000006
表３は、本発明のCMC／PEO膜によるPBS溶液の酸性化についての速度論を示す。PBS溶液に添加されると、膜は酸を溶液に遊離するので、溶液のpHは低くなる。このプロセスは、高分子量のPEOと結合するものを含む膜については、最初の１時間で約１pH単位で溶液のpHが減少しながら、ゆっくりと起こる。これは、よりpHの高いポリマー溶液と同様に、よりpHの低いポリマー溶液から鋳造された膜についても真実である。pHの残りの減少は、続く20時間の間に起こり、その時間で溶液のpHはほぼ一定になった。PBS中で45時間までに、pHは6.0以下に下がった。
さらに、PEOの分子量を少なくするにつれて、高分子量のPEOから作られた膜より、溶液のpHは早くかつ大きく減少した。この結果は、CMCの酸性カルボキシル残渣を遮蔽する高分子量のPEOの能力により、カルボキシルの水素イオンの解離を減少させるからだろう。
これらの結果は、高分子量のPEOは、酸の組織への送達を遅延させ、過剰な酸性化から組織を保護することを示唆している。さらに、プロトンは生体内で遊離されるので、それらは細胞外の領域で希釈され、生理的緩衝液で緩衝され、最終的にリンパ系及び循環系によって組織から取り除かれるだろう。プロトンが遊離される間のかなりの長時間に渡って、生理的希釈、緩衝、及び分離機構は、酸負荷を除去し、組織のpHを許容される範囲に維持する。従って、これらの膜は、送達される大きな酸負荷に起因する過剰な組織破壊を引き起こすことなく生体内に移植するのに好適である。
図６は、PBS溶液のpHを、膜pH及び膜の組成の関数として変化させた場合の研究結果を示す。膜をPBS溶液中に、酸性化が平衡に達するまで４〜５日間置いた（表３）。最も酸性化が低かった膜の組成は、プレ調整した80/20/300kの膜であった（○）。これらの膜は、PBS中に膜を浸漬してそれらを再乾燥する工程を付加する以外は、上述と同様に作った（実施例7-9参照）。PBS中で鋳造された80/20/200kの膜（＋）は、次に少ない酸負荷を送達し、50/50CMC／PEO（900k）系の膜(△)は三番目に少ない酸負荷をPBS溶液に送達した。100%CMCから作られた膜：(■)、80/20/200kの膜（●）、及び80/20/900kの膜（▲）は、次第に多くの酸をPBSに送達し、置換度1.12のCMCで作られた80/20/300k系の膜は、最も多く酸をPBS溶液に送達した。
また、図６は、PBS中に浸漬することで調整した膜は、PBS溶液に送達される酸負荷を最も減少させることを示している。例えば、最初のpHが3.4で鋳造されたプレ調整膜は、PBS溶液のpHを7.4から7.0に減少させただけであった。従って、長期間の存続が必要な用途においては、酸性化が最少である場合を除き、PBS中で酸性膜をプレ調整することが望ましい。
実施例３：種々のPEO／CMC比の膜
8.0gのCMCと2.0gのPEOを500mlの脱イオン水に溶かして、80/20 CMC／PEO膜の500mlバッチを得た（CMC及びPEOの原料、及び溶液処理は実施例１と同様）。低速(60RPM)で撹拌しながら、このポリマー溶液200gを1500μlの5 N HCl（LabChem、Pittsburgh、PA）で酸性化すると、pH3.17で平衡になった。次いで、その酸性化ポリマー溶液をポリスチレンシャーレに注ぎ、実施例１で述べた同様の方法で乾燥した。CMCとPEOの相対量を変化させることによって、種々の組成の膜を得た。100%CMC膜は、PEO含有膜よりも脆弱で柔軟性がなかった。我々の目的のためには、70%以上のPEOを含む膜は水性環境下では不安定なので、一般的に好ましくない。
0004986311.tif 000007
表４は、溶液の粘度におけるCMC／PEO比の効果を示す。２つの異なったpHで、PEO（m.w.：1,00,000）の種々の百分率について膜を作った。CMCを高率で含む溶液は、CMCの含有率が少ない溶液より粘性であった。さらに、より弱酸性の溶液はより強酸性の溶液より粘度が高かった。この関係は、100%CMC溶液を除き、すべての溶液について維持された。pH2.6における粘度は、pH4.0における粘度より僅かに高かった。これは、低pHにおけるCMC分子間の会合に起因するだろう。
２つの溶液を混合すると、予想以上の粘度減少が得られた。例えば、溶液A（pH2.6）及びBを50/50比で混ぜた場合、85%の粘度減少を達成した。スピンドルRPM2.5で、原料2%CMC溶液（w/v）、pH2.6の溶液は、42,400cpsの粘度であり、2%PEO溶液は280cpsの粘度であった。従って、混合物の粘度が構成成分の粘度の平均であるとすれば、50/50 CMC／PEO溶液は、(42400＋280)／2＝21300cps（CMCのみの粘度から約50%の粘度が減少））と予想できる。しかし、実際のCMC／PEO（50/50）溶液は、たった4,800cpsの粘度であった。同様な、予想以上の粘度減少が、Ohnoら(Makromol. Chem., Rapid Commun. 2, 511-515, 1981)のデキストランとイヌリンとのPEOブレンドについて報告されている。
さらに、100%CMCとCMC／PEO混合物についての酸性化によって生じる粘度の相対的な減少を比較することによって、CMCとPEOの分子間の複合体生成についての証拠が示される。表４は、2.5rpmにおいて、pHが4.0から2.6に低くなったとき、CMC溶液の粘度は本質的に変化しないままであることを示す。しかし、CMC／PEO混合物については、酸性化は粘度の大きな減少の原因になった。減少は、66%/33%、50%/50%、33%/66%、及び25%/75%のCMC／PEOの混合物について、それぞれ、69%、63%、53%、及び42%であった。
従って、CMCとPEOの間には分子間会合があり、我々は、PEO分子がCMC分子の間に分散し、CMC分子間の分子間結合を妨げるものと考える。このような理論は観察を説明できるが、本発明を何ら分子間の一理論に限定するものではない。他の理論で観察を説明してもよい。
次に、種々のCMC／PEO比の膜の製造後、我々は、上述の方法を用いて、膜の水和、酸負荷、及び溶解性について研究した。
0004986311.tif 000008
表５は、水の取り込み、酸性、及び質量減少の％についてのCMC-PEO膜におけるPEO濃度を増加させることの効果を示す。膜のPEO含量を増加させると、水和率及び溶解性は増加し、PBSに送達される酸負荷は減少した。これらの結果は、膜のCMCの総量が減少するにつれ、酸負荷が減少することを示している。
さらに、種々のCMC／PEO比の効果を図５（溶解度対膜のpH）、及び図６（膜の酸性度対PBS溶液のpH）に示した。
実施例４：種々の分子量のPEOの膜
種々の分子量のPEOの膜を2%（w/v）PEO溶液と、2%（w/v）CMC（Aqualon Division of Hercules（Wilmington、DE）から入手したタイプ7HF PH（ロットFP 10 12404））とを混合して製造した。分子量8000（8K）のPEOは、Dow Chemical、Midlands、MichiganからPolyglycol E8000NFとして入手した。分子量300,000（300K）、900,000（900K）、及び5,000,000（5M）のPEOは、すべてUnion Carbideから入手した。実施例１で使用した方法に従い、300mlの脱イオン水に6.0gのPEOを溶かして、PEOの2%溶液を作った。同様に、CMC原液は、10.0gのCMCを500mlの脱イオン水に溶かして作った。CMC原液に2100μlの濃HClを添加して鋳造溶液のpHを3.37に減じた。
50%CMC／50%PEO（8K）膜は、40.07gのCMC原液と40.06gのPEO（8K）原液を混ぜて作った。その鋳造溶液を酸性化してpH3.46にした。50%CMC／50%PEO（300K）膜は、39.99gのCMC原液と40.31gのPEO（300K）原液を混ぜ、HClを添加してpHを3.45に減じた。50%CMC／50%PEO（900K）膜は、39.22gのCMC原液と39.63gのPEO（900K）原液を混ぜ、HClを添加してpHを3.56に減じた。50%CMC／50%PEO（5M）膜は、38.61gのCMC原液と40.00gのPEO（5M）原液を混ぜ、HClを添加してpHを3.55に減じた。
これら種々の酸性化CMC／PEO混合物を実施例１の方法に従い、鋳造し乾燥した。図７は、生成した膜の水和率に対するPEOの分子量の効果を示す。その結果、PEOの分子量を増やすと、水和率が増加するが、PEO分子量を900Kから5000kdに増やしてもほとんど水和の増加は見られないことがわかる。さらに、種々の分子量のPEOから作られる膜の違いは、図4-6に示したデータから観察できる。
実施例５：種々の分子量のCMCの膜
50%CMC／50%PEO膜は、CMC（Aqualon Division of Hercules（Wilmington、DE）から入手したタイプ7MF PH；ロットFP 10 12939）と、分子量900,000のPEO（Union Carbide）とから作った。“高粘度”のタイプ7HF CMCとは対照的に、７MF CMCは溶液の粘度がかなり低い。タイプ7MFの平均分子量は、7HFタイプのCMCが700kdであるのに対して約250kdである。実施例１の方法に従い、5.0gのCMCと5.0gのPEO（900K）を予備ブレンド乾燥し、500mlの脱イオン水に溶解した。その溶液を950μlの濃HClで酸性化し、pHを3.48に減じた。20.0gの鋳造原液から膜を作った。さらに原液を使用して、より酸性の膜を作った（pHが3.07、2.51、及び1.96の鋳造溶液を用いて）。膜を鋳造し、これらの酸性化溶液から乾燥した。乾燥後、上述のように、水和率、質量減少、及び酸負荷を測定した。表６を参照されたい。
0004986311.tif 000009
PBS溶液に５日間置くと（“酸負荷”試験、上記参照）、各膜はPBS溶液のpHを低くした。３つの高pHの膜は、シート様の構造を失い、無定形な、拡散ゲルになった。最も酸性の膜だけが、その構造の統合性を維持した。この膜を他の膜と比較すると（図５）、pH2.0では、より低分子量のCMCからなる膜が最も溶けやすいことがわかる。このように、会合複合体の強度はCMCの分子量に依存する。
実施例６：種々の置換度のCMCを有するCMC／PEO膜
CMC／PEO膜を、タイプ99-12M31XPのCMC（ロットFP 10 12459、置換度（d.s.）1.17、Aqualon Division of Hercules、Wilmington、DEから入手）と、分子量300,000のPEO（Union Carbide）とから作った。200mlのブレンドポリマー溶液を600μlの濃HClで酸性化して、pH4.07の原液を得た。この鋳造溶液20.7ｇをシャーレに注ぎ；実施例１に記載したように膜を乾燥した。原液の残りを使用して酸性度の高い膜を作った。それら膜の鋳造溶液のpHは、それぞれ、3.31、3.03、2.73、2.44、及び2.17であった。
図4〜6は、CMC及びPEOの異なった組成の膜と比較した、これらの膜の特性を示す。図４は、置換度1.12のCMC（▲＋▼）の水和率は、PBS溶液に４日間入れたときに836%の水の水和率を有する他のCMC／PEO膜の水和率と同様であることを示している。しかし、他の測定された特性には相違がある。図５は、高置換度のCMCから作った膜は、他の膜に比し、最も溶解しやすい膜を生成することを示している。図６は、高置換CMC製の膜は、PBSに最も大きい酸負荷を送達する膜を生成することを示す。このことは、如何なるpHにおいても、より高い置換度で作られたこれらの膜で、より水素イオンが解離し易いという見解と一致する。
実施例７：アンモニア調整の膜
CMC／PEO膜についてのアルカリ調整の効果を調べるため、３種の乾燥膜（約160mg、組成：80%CMC（7HF PH）／20%PEO（300K又は5000kd））をシャーレに入れた。30mlの0.5N水酸化アンモニウム（5 Nアンモニア、LabChem、Pittsburgh、PAを10倍に希釈して得た）を加えて膜を浸した。完全に浸すととすぐに、１分或いは５分で膜に十分染み込んだ。そして、膜をアンモニア溶液から取り出し、過剰のアンモニアをろ紙で吸い取り、45℃の自然対流式オーブンに膜を入れて乾燥させた。乾燥及び室温での予備平衡化の後、膜の質量を測定した。乾燥後、膜の水和率、酸負荷、及び溶解性を測定した。その結果を表７に示す。
0004986311.tif 000010
表７は、アンモニア処理が実質的にPBS溶液に送達する酸負荷を減らすことを示している。拡大解釈すれば、この効果は生体内で組織に送達される酸負荷を減少させることでもある。また、PBSの他の溶液に同じ酸負荷を送達する他の膜と比較すると、アンモニア調整の膜は、溶解性が低いので、生体内残留時間が長い。従って、組織,に剰余の酸をほとんど送達しない長滞留時間の抗癒着膜を導入することができる。一方、調整されない膜は、pHが約7.0で急速に分解し、手術の癒着防止についてほとんど有用でない。
最初の製造後に膜を処理すると、膜の酸負荷が減少した。対照（アンモニアに浸漬せず）に比し、すべての場合に、調整処理で、約４から中性のpH値以上にpHが高くなった。また、対照に比し、調整処理は膜の水和率をも高めた。この水和の増加は酸性膜の２種については比較的少ないが、最も酸性の（pH 3.1の80% CMC／20% PEO（5M））膜は高度に膨潤した。従って、この処理の効果は、膜の最初の条件に依存する。２つの場合の（80%CMC／20%PEO（300kd）、pH2.03膜について）アンモニア調整に起因する全質量の減少は、対照の減少よりわずかに少ない。この予想外の結果は、アンモニア溶液中の塩の初期減少に次いで、PBSに浸漬している間に塩が消耗された膜中に塩を取り込むことに寄るのだろう。
実施例８：リン酸緩衝液を使用した調整膜
実施例７と同様に、製造後、膜をリン酸緩衝液（50mM、pH7.40）で調整した。１片の乾燥膜（0.163g；80%CMC（7 HF PH）／20% PEO（5000kd）、pH3.1）をシャーレに入れた。その膜を30mlのリン酸二水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液（50mM、pH 7.40；Fisher Scientific）に、5分間浸した。５分後、膜をその溶液から取り出し、過剰の緩衝液をろ紙で吸い取り、その膜を45℃の自然対流式オーブンに入れた。乾燥及び室温での予備平衡化の後、膜の質量は1.42gであった（すなわち、13%の質量減少）。他の膜は、乾燥前に20分又は60分間緩衝液に浸漬させた。乾燥後、膜を上述のように試験した。これら膜の各々について水和率、酸負荷、及び溶解性（PBS中で４日後）を測定し、その結果を表８に示した。
0004986311.tif 000011
表８は、アンモニア調整と同様に、リン酸緩衝液調整により、PBS溶液に送達される酸負荷を中和すること示している。さらに、リン酸緩衝液にさらす時間を増やすと、膜の酸性を漸進的に中性化した。１時間のインキュベーション後、pHは、約4.3から7.30に高まった。これらの膜は、少なくとも３日間そのままPBS中で維持された。対照的に、最初のpH7.0でかつ上記のように作られた膜は、急速に水和し、完全に溶解し、数時間以内に統合性を失った。このように、アルカリ又は中性のリン酸緩衝液で調整した酸性膜は、生体適合性pHを高度に維持しながら、膜の溶解性を減じること（生体内での滞留時間の増加）ができる。さらに、他の中性又はアルカリ性溶液（例えば、pH9.0のホウ酸−KCl、NaOH、0.1M；Fisher Scientific）に浸漬しても、最初の膜の酸性度を減じる効果があると予測できる。
実施例９：PBSを使用した調整膜
等張性のリン酸緩衝液生理食塩水が膜によって送達される酸負荷を減じることができるかどうかを決定するため、緩衝液としてPBSを使用すること（10mM、pH 7.4、３回洗浄、それぞれ20分）以外は、実施例８と同様の上記実験を繰り返した。１片の乾燥膜（質量0.340g；組成：80%CMC（7 HF PH）／20% PEO（300kd）、pH 3.1）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（10mM、pH 7.40；Sigma Chemical Company、St. Louis、MO）を含有するシャーレに入れ、20分間浸させた。溶液を膜からデカントし、新たにPBSを添加することによって、浸漬操作をさらに２回繰り返した。次に、膜をPBS溶液から取り出し、上述のように吸い取り、乾燥させた。乾燥及び室温での予備平衡化の後、その膜の質量は0.274g（19.4%の質量減少）であった。乾燥後、上述と同様に水和率、酸負荷、及び溶解性を測定した。その結果を表９に示す。
0004986311.tif 000012
リン酸緩衝液と同様に、PBSで調整した酸性膜は、低pHで最初に存在していたポリマー間の強い会合を完全に破壊することなく、膜のpHを高める。従って、PBS緩衝法を使用して実質的にPBSに入れて調整した場合、最初の膜のpH3.14がpH 6.02になる。PBS中で同じpHを生じる未調整の膜は、最初は3〜4の範囲のpHを有するだろう。さらに、２以下のpHの場合を除き、調整された膜は、未調整の膜よりも高率で水和する。このように、調整さらた膜は、最初の酸性膜のいくつかの特性を保持したまま、溶液中で送達される酸負荷を軽減するため、より生体適合性に優れる。
実施例10：多層化CMC／PEO膜
さらに変わった性質の膜を提供するため、中性膜からなる２つの層の間に酸性化膜を積層することにより膜を製造した。後者は、酸性化膜として同一のCMC／PEO比であってもそうでなくてもよい。まず、部分乾燥した１枚の中性膜を積層膜用の乾燥面として用いる乾燥した平らな面の上に置いた。その中性膜の上に、わずかに小さい面積の部分乾燥した１枚の酸性化膜を慎重に置いた。次に、その酸性化膜上に、部分乾燥したもう１枚の膜を慎重に置いて、２枚の中性膜の縁を合わせ、酸性化膜の縁が２枚の中性膜の縁を越えることのないようにした。３枚のシートすべてを正確に整列させ、シートが互いにずれないように注意しながら、シャーレに脱イオン水をゆっくり入れた。すべてのシートが湿ったら、その湿った積層シートの上に、ナイロンフィルター媒体のような非吸収性の多孔性の薄膜を慎重に置いて、その上をほんのわずかにプレスした。そして、このアセンブリを乾燥するまで破壊しないようにし、その多孔性膜を慎重に取り除き、平らな面から積層膜を取り除いた。
代わりの２層膜を同様の方法で作った。２層膜は、各面で異なった性質を示す。低pHの面は生体付着性に乏しく、高pHの面よりも組織上をすべり易い。高pHの面は、組織に密着してより強固に付着して組織内の間隙に適合して膜を適所によく保持させる。このような膜は、可動性の組織が、より固定的な組織に対して正常に自由に動くことができるような状況で有用である。
部分乾燥した膜（CMC：PEOの比率＝95：5、pH 3.0、15gmの2%ポリマー溶液から鋳造）をシャーレに入れ、その部分乾燥した膜の表面上に、CMC／PEO（CMC：PEOの比率＝95：5、pH 5.5、10gmの2%ポリマー溶液から鋳造）混合物を注ぐことによって、もう一つの２層膜を作った。そして、その混合物と部分乾燥した膜を一緒に乾燥して最終的な２層膜を形成した。同様な方法で、PEO組成を変えた２層膜、例えば、２層が異なったPEO含量の膜を作った。層のPEO含量が高いほど、その層の表面がより滑りやすくなる。他の層、よりPEO含量の低い層は、組織に強固に付着する。
一実施例は腹腔の手術であり、腸膜は、相互に又周囲の腹膜に対して自由に動く。さらに実施例として胸部の手術があり、肺は周囲の腹膜に対して自由に動けなければならない。膜の高pH面を壁側腹膜に対して配置すると、適所に膜を保持するが、内臓性腹膜を肺に付着させて自由に動かすことができる。同様に、心臓手術では、心膜に、２層膜の高pH面を配置すると、膜を適所に保持し、低pH面は心臓の組織、例えば心筋上を自由に滑る。同様に、整形外科手術では、固定組織、例えば骨又は骨膜に、膜の高pH面を配置すると、それらの位置に膜をしっかり付着させ、靭帯、腱、又は筋肉のようなより固定度の低い組織を自由に動かすことができる。
実施例11：鋳造溶液の安定性に及ぼすCMC／PEO濃度の効果
鋳造溶液の安定性に及ぼすCMC／PEO濃度の効果を測定するため、16gのCMC d.s.=1.2及び4gのPEO（300kd）を、50mlのイソプロパノールに加えてスラリーを作り、それを450mlの水に加えた。この結果、かなり均一で実施例１〜10よりも高粘性の鋳造溶液が生じた。一連の膜は、鋳造溶液を酸性化して漸次的にpHを減じて作った。11gずつの鋳造溶液を10cmのシャーレに注いで乾燥した。
pHが約3.3以上で膜は均一であったが、低pHでは鋳造溶液から会合複合体が析出した。膜のpHが低いと、生成する膜は不均一領域及び穴を有し、表面が粗かった。
膜は、10質量％程度のCMCと、20質量％程度の溶液から作ることができる。
実施例12：CMC／PEO膜の抗血栓形成効果
CMC（7 HF PH）及びCMC／PEO（5000kd）膜を、80%/20%、65%/35%、及び50%/50%のCMC／PEO比で作った。付着性プレート用の観察チャンバーを、１枚のポリマーコートスライドガラスと、２枚のポリエチレンスペーサーと、１枚のカバーガラスから組み立てた。インフォームドコンセント後、健康な大人のボランティアから入手したヒト血液を、ヘパリン含有真空容器（VacutainersTM、Becton-Dickinson、Rutherford、NJ）に収集した。ヘパリン化血液を100gで10分間遠心分離にかけ、血小板リッチの血漿（PRP）を得た。
200μlのPRPを血小板観察チャンバーに滴下した。PRP中の血小板は、室温で１時間でポリマー表面に付着し活性化された。PBSでチャンバーを洗浄して、付着しない血小板及び血漿タンパクを除去した。付着した血小板をPBS中１時間、2.0%（w/v）グルタルアルデヒド溶液で固定化した。PBSによる洗浄後、0.1%（w/v）Commassieブリリアントブルー（Bio-Rad、Hercules、CA）染料液によって1.5時間で染色した。Nikon LabophotTMII光学顕微鏡を使用して、その染色血小板を40倍に拡大して観察した（Melville NY）。付着血小板の画像は、Mamamatsu CCDTMカメラ（浜松市、日本）を使用してSony TrinitronTMビデオディスプレイに移した。Hamamatsu Argus-10TM画像プロセッサーを使用して、観察したすべての領域について、表面積25,000μm2毎の血小板の数を数えた。血小板の活性化の程度は、付着血小板の拡散の仕方から定性的に決定した。活性化血小板の画像は、Polaroid ScreenShooterTMカメラ（Cambridge、MA）を使用してSony TrinitronTMビデオディスプレイ画面から得た。
付着血小板の数及び血小板の活性化の程度は、血液含有医用材料の血栓形成性の初期的な指標と考えられる。血小板の活性化は、ポリマー表面に対する血小板の拡散の範囲によって定性的に決定した。血小板の拡散の範囲は、表10に示されるように、１（最低の反応性）から５（最高の反応性）で判定した。
0004986311.tif 000013
0004986311.tif 000014
表11は、100%CMC製の膜上に有意な数の血小板が付着し活性化されたことを示す。平均的には、25,000μm2毎に95以上の活性化血小板が存在した。付着血小板の数及び活性化の程度は、膜のPEO含量を増やすと減少した。CMC／PEO50%／50%膜は、最も血小板の数が少なかった。平均的には、たった5.0個の接触-付着血小板しかこれらの膜上には存在しなかった。
この研究の結果は、付着血小板の数及びこれらの表面上における血小板の活性化度の減少に基づき、CMC／PEO膜、特に50%／50% CMC／PEO膜は、抗血栓形成性が高いことを示している。このように、膜のPEO含量を増やすと、抗血栓形成性が高まる。
CMC及びPEOが生体内の血液凝固に副作用を及ぼすかどうかを測定するため、ウサギにCMC／PEO混合物を注射してプロトロンビン時間を測定する一連の研究を行った。
４匹のウサギ（2.4〜2.8kg）を、ケタミン（40mg/kg）及びキシラジン（8mg/kg）で麻酔し、0.20mlの臨床グレード2%CMC、0.05%PEO、50%の水及び47.9%の平衡塩類溶液（ロット#SD011089）を、27−ゲージの1/2インチ針を用いて低脊髄性領域に注入した。５番目の注射しないウサギ（2.8kg）を対照として使用した。投与後０（注入前）、2、6、24、48、及び96時間に、血液の試料（約1.6ml）を採取した。収集した血液1.6mlに、0.2mlの3.8%クエン酸ナトリウム溶液を添加した。混合後、その試料を2000rpmで3〜5分間臨床用遠心分離器で遠心分離して、血漿を調製した。血漿をピペットで個々にラベルした試験管に入れて氷上に放置した。その試料を凍結させ、California Vaterinary Diagnostics, Inc., West Sacramento, CAに送り、プロトロンビン時間の測定を、FDAの優良実験室規範に従って行なった。
表12は、種々の採取時間におけるウサギの血漿についての各試料のプロトロンビン時間を示す。ウサギの血液は、ヒトの血液よりも早く凝固する（Didisheimら、J. Lab. Clin. Med. 53, 866-1959）；従って、これらのウサギから収集した試料のいくつかは、分析前に凝固した。しかし、分析した試料は、ウサギ番号３が過渡的な増加を示したが、４日までに回復したのを除き、プロトロンビン時間についてはCMC／PEO混合物の影響は示されなかった。
0004986311.tif 000015
実施例13：CMC／PEO膜の生体付着性の測定
膜の生体付着性は、一般的に、以下に述べる剥離試験で測定した。CMC（7HF PH）及びPEO（分子量5000kd）から構成され、酸性度を変化させた数種の膜を、インビトロ試験で相対的な生体付着性を調べて決定した。膜の被着体としてローカルストアで購入した新鮮な、芯抜きポークチョップを使用した。６個の薄くカットしたポークチョップをポリスチレンのバイオアッセイ皿（243×243×18mm）に入れ、その皿にいくらかの水を入れて比較的湿気のある環境を維持した。ポークチョップの露出面から如何なる過剰な水も吸い取るように注意した。６種の膜を質量120-130mgの長方形の形態にカットし、膜の滑らかな面を下にして、６片それぞれの肉の上に置いた。膜の滑らかな面は、乾燥工程でポリスチレンの表面に付着された面である。空気に露出された、膜のもう一方の面は、通常わずかに粗い面になる。ポリスチレンの上蓋を皿の上に置き、室温で３時間、膜を水和させて肉に付着させた。同様な方法で、他のバイオアッセイ皿を使用して他の膜を調べた。
３時間のインキュベーション後、透明性（色、透明度）、膜の構造特性、膜の形態（肉上での折れ曲がり）、分岐、強い生体癒着の結果としての波状について、定性的方法で、膜と肉を慎重に検査した。gm.での癒着力は、まずクリップを膜の縁に取り付け、次にそのクリップをばね秤（0-10gm又は0-250gmの範囲）に取り付け、そのばね秤を垂直に上昇させて肉から膜をゆっくり引き離すことによる剥離試験で定量的に測定した。膜を肉から完全に引き離す、或いは場合によっては膜を引き裂くのに必要な、gm.での力を記録した。
0004986311.tif 000016
表13で示される結果から、CMC／PEO膜間の癒着力は膜のpHに関係することがわかる。特定のPEO百分率について最も高い癒着性を示すpHは、約3.30であったが、このレベルからpHが増加しても減少しても癒着力は減少した。さらに、癒着力は、膜の％PEOに関係した。PEO百分率が最高の膜は、最も癒着性が低かった。PEO百分率が高くなると、5% PEOに達するまでは癒着性が増加したが、さらにPEO濃度を高めると、癒着力は減少した。
実施例14：CMC及びPEOの生体内クリアランス
CMC及びPEOの生体内クリアランスを測定するため、放射標識したCMC及びPEO（2% CMC、0.05% PEO、50% H2O及び47.9%平衡塩類溶液）でラットに注射する一連の実験を行った。試験は、優良実験室規範下で行った。
[14C]カルボキシメチルセルロース（CMC）及び[14C]ポリエチレンオキサイド（PEO）を含有する配合剤を、６匹のラット（３匹のオス、３匹のメス）の４グループの低脊髄性領域に注射した；２グループは３日後に犠牲にし、残りの２グループは７日後に犠牲にした。これらのラットから毎日尿及び糞を収集して放射能の排泄傾向を検査した。さらに、これらのラットに残された放射能レベルについて、代表的な臓器を調べた。６匹のラットの別々の２セットに同様に注射して、血液の試料を、注射後、０時間（注射前）、8、24、48、72、96、及び168時間における放射能を調べた。
両化合物は、主に尿中に排泄された。尿中のほとんどの排泄は、最初の24時間で起こった。７日試験では、尿及び糞中の14C-CMC排泄の半減時間は、最初約0.2日(5時間)、次いで約1.6日の長い排泄半減時間であった。対応する14C-PEOについての値は、それぞれ0.2日（5時間）及び1.7日であった。臓器試験については、肝臓及び腎臓が最高レベルの放射能を含んでいた。肝臓の注入投与量の割合は、14C-CMCと14C-PEOで同様であったが、腎臓では、14C-PEOの注射後が、14C-CMCの注射後の少なくとも６倍高かった。
14C-CMC投与後の血中の放射能レベルは、約１日の半減時間で減少したが、14C-PEOの血中半減時間は、約４日であった。注射部位を加えた死骸に残された投与量の割合は、14C-PEOについてよりも14C-CMCについてが高かった。投与量の全体の回復の平均は、両化合物について80＋％であった。14C-CM又は14C-PEOの注射により何の副作用も観察されなかった。
実施例15：CMC／PEO膜の生体吸収性
CMC／PEO膜の生体吸収性は、ラットの後ろ足に外科的切開を施し、筋肉層に１片のCMC／PEO膜を置くことによって測定した。組成又は架橋度の異なる数種の膜を各動物に挿入し、その後切り口を閉じる。各タイプの膜について十分な数の動物を使用して評価する。その後、毎日動物を犠牲にし、切り口を再び開き、残存膜の無傷の程度、及びその場所について調べた。膜を取り除き、過剰の水を吸い取って除去し、ウェット状態で秤量し、再乾燥して再秤量した。吸収された液体量、残っている固体量、及び膜の外観を記録する。生体内原位置での時間の長さ、組織の場所、膜の組成、挿入前調整、及び吸収性について比較する。本発明の膜は、生体吸収性を所望の程度に合わせて作る。
実施例16：CMC／PEO膜の抗癒着特性の測定
癒着形成を阻止するCMC／PEO膜の能力は、Harrisら、Surgery 117(6)：663-669、(1995)の標準法に従って測定する。成熟ラットを使用する。ラットを深い知覚麻痺が達成するまで、腹腔内用ペントバルビタールナトリウム（43mg/kg）で麻酔し、手足の挟持に対する痛み応答及び眼瞼反射なしで測定する。ラットの腹側を上にして置き、腹腔の毛を除去し、ヨードフォア磨きで皮膚を清浄し、70%アルコールですすいだ。
無菌状態の下、6cm長さの腹部正中線切開をして皮膚を収縮させる。腹腔壁内に4cm長さの正中線切開をし、右の腹腔壁を反射させる。その正中線切り口の１cm外側の内在性筋肉の浅板を含め、１×２cmの壁側腹膜を切除する。そして、盲腸が縫合で腹腔壁に接触するように、盲腸を上昇させる。盲腸いくつかの領域を無菌の外科用メスで軽く擦過して点状出血の均一面を作る。また、反応した腹腔壁を擦過して、擦過領域を10分間空気にさらす。
盲腸の並べる部分及び腹腔壁を相互に接触させて配置し、或いはそれらの間に配置される標準量の抗癒着膜と共に相互に並べる。擦過領域を覆った後、切り口を閉じる。３日から４週間後、その動物を過剰の麻酔薬で犠牲にして、手術部位を露出する。
癒着は、Beckerら、J. Amer. Coll. Surgeons 183(4)：297-306(1996)に従い、０〜３で評価し、０は癒着が検出されない場合、１は薄膜の厚み、無血管性であり、グレード２は適度な厚みで限界的な血管分布を有し、グレード３は濃厚な厚みを有しかつよく血管新生化されている場合である。癒着性を評価する他の方法を用いてもよい。（E.g., Diamond, Fertility and Sterility 66(6)：904-910(1996)；Interceed（TC7）Adhension Study Group, Fertility and Sterility 51(6)：933(1989)。
膜の生体吸収性は、犠牲にしたときに手術部位を触診し、また無傷の膜があるか或いは無いかを判定して決定する。無傷の膜が存在する場合は、それを部位から取り除き、ウェット質量及びドライ質量を測定する。本発明の膜は、所望の抗癒着特性を示すように合わせて作られる。
手術のタイプ
本発明の膜の使用によって、外科的手法のいずれのタイプも利益を得る。以下に例示するが、限定するものではない。
実施例17：頭蓋手術
開頭術用途のため、本発明の膜は、頭蓋骨穿孔及び頭蓋切除後の硬膜置換移植片として使用される。膜を露出した皮質上に置く。骨、軟部組織及び頭皮を交換して手術を完成する。膜は頭皮と頭蓋骨の間の癒着形成に対するバリア及び頭蓋の回復に必要な初期内殖に効果を及ぼす骨組みを形成する。
実施例18：眼球手術
眼球用途は緑内障のフィルタリングの手術を含む。成功した緑内障のフィルタリング手術は、前眼房から外科手術的に作られた瘻管を経て水性体液が結膜下腔に通過し、その結果フィルタリング小疱の形成を生じるということで特徴づけられる。小疱形成の失敗は、ほとんど線維芽細胞の増殖及び結膜下線維症に原因がある。この線維症を防止するため、手術後に小疱内の結膜下腔に本発明の膜を配置することができ、膜を線維芽細胞内に配置することもできる。
実施例19：筋骨格の手術
腱の屈筋の修復は、本発明の膜を使用することによって強化することができる。腱の修復では、線維芽細胞によって分泌されるコラーゲンが腱の末端を結合させる。癒着形成は、通常、腱を他の組織構造に結合させ、腱と腱鞘の間の正常なスペースを閉塞し、それによって滑らかな動きに必要な滑機能を妨害する。腱と腱鞘の間の癒着形成を防止するため、再結合される縫合腱の端部の周囲を本発明の膜で包み、及び／又は本発明のハイドロゲル形態をその外筒内に注入する。
腰部の椎弓切除及び椎間板切除術のため、棘状突起の球状先端部のちょうど外側の腰背筋膜に正中線切開を施す。その傍棘状の筋膜を開いて患部の椎間板の層間領域を露出する。椎弓切除は、開かれた黄色靭帯を露出し、硬膜を露出して行う。硬膜を中程度に収縮させて神経根を確認して収縮させる。椎間板領域を露出して神経フックで検査する。その環のテクスチャー、その環内の膨隆量、ヘルニアの存在又は穴の存在を調べる。椎間板の除去は、通常、環内の小さい穴を通して行う。手術後の癒着は、手術の最後に閉じる前に、本発明のハイドロゲル形態を、環、神経根、硬膜及び椎弓切除欠失の周りのスペースに注入することによって防ぐ。
実施例20：腹部手術
従来の開腹術患者の93％までに、手術後の癒着が報告されている。開腹術は、大腸及び小腸の処置、胃、食堂、及び十二指腸の処置、胆嚢摘出術及び女性の生殖系に関する手術のため、腹部へのアクセスを増やす必要がある。1992年に健康統計学センターが、米国における腹膜癒着溶解に関する344,000の手術について報告した。腹膜癒着は、解剖学的に腹部臓器を歪ませると病理的になり、腸捻転及び腸閉塞から不妊症に及ぶ種々の罹患を引き起こす。不幸なことに、癒着の手術分裂後の癒着の再形成及び再発は、かなり一般的である。
新生の癒着形成又は癒着の再形成を防止するため、手術部位上に本発明の膜を直接配置し、又はその部位の周囲を本発明の膜で包んで、この部位を網（omentum）から引き離す。閉じるときは、正中線切り口の下の筋膜と腹膜間に、本発明の膜を配置する。腹腔鏡検査法では、本発明のハイドロゲル形態を用いて手術部位及び套管針挿入領域を被覆する。
実施例21：婦人科の手術：開腹術又は腹腔鏡検査による筋腫摘出術
子宮を露出し、切開して線維腫を除去する。吸収性縫合糸で子宮を閉じる。後側子宮切開は、底部又は前側子宮切開よりも多くかつ程度の高い付属器癒着を付随する。後側切開のため、後側子宮切り口の上及び前側腹部壁切り口の下に本発明の膜を施して、子宮と周りの組織間の癒着形成を防止する。前側切り口は、さらに一般的に膀胱と子宮の前側壁との間の癒着形成を生じさせる。本発明の膜を、前側切り口の上及び子宮と膀胱との間に配置させる。
実施例22：胸部手術：心臓の処置
再手術による心臓の外科的処置はより一般的になり、手術後の縦隔癒着及び心膜癒着の軽減又は防止が必要になっている。胸骨正中切開は、正中線心膜切開に先行する。心膜は浮遊しているので、心臓及び心膜腔は広く露出されている。切開を行う。バイパスを作るため、末端の吻合を内乳動脈、橈骨動脈、胃大網動脈又は伏在静脈移植片を用いて作製する。癒着形成を防ぐため、その吻合の周囲を本発明の膜で包み、閉じる前に心膜と胸骨間に本発明の膜を配置する。
本発明の他の特徴、観点及び目的は、図及び請求の範囲のレビューから得ることができる。すべての引用は、その全体が本明細書に参照文献として取り込まれている。
本発明の他の実施態様は発展させることができ、かつ本発明の精神と範囲及び請求の範囲内であると理解すべきである。
【図１】
0004986311.tif 000017
【図２】
0004986311.tif 000018
【図３】
0004986311.tif 000019
【図４】
0004986311.tif 000020
【図５】
0004986311.tif 000021
【図６】
0004986311.tif 000022
【図７】
0004986311.tif 000023