(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）被験化合物が基質ポリペプチドにおけるＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を促進または阻害するかどうかを決定する工程；および（２）該ＬＲＲＫ２ポリペプチドタンパク質キナーゼ活性を促進または阻害する化合物を選別する工程を含んでなり、前記基質ポリペプチドは配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）または（Ｗ／Ｒ）（Ｘ）（Ｘ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｔ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｘ）（Ｒ／Ｔ）（Ｒ）（Ｘ）（ここでＸは任意のアミノ酸を表す）を含んでなる、ＬＲＲＫ２タンパク質キナーゼ活性を促進または阻害するのに有用であると予期される化合物を同定する方法。
【請求項２】
（１）被験化合物が基質ポリペプチドにおけるＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を促進または阻害するかどうかを決定する工程；および（２）該ＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を促進または阻害する化合物を選別する工程を含んでなり、前記基質ポリペプチドは請求項１にて定義されるとおりである細胞におけるＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を促進または阻害するのに有用であると予期される化合物を同定する方法。
【請求項３】
パーキンソン病（ＰＤ）またはパーキンソン症を処置または予防するのに有用であると予期される化合物を同定する請求項1に記載の方法。
【請求項４】
（１）被験化合物がＬＲＲＫ２ポリペプチドによる前記基質ポリペプチドのリン酸化を促進または阻害するかどうかを決定する工程；および（２）該ＬＲＲＫ２ポリペプチドによる基質ポリペプチドのリン酸化を促進または阻害する化合物を選別する工程を含んでなる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドはヒト野生型ＬＲＲＫ２もしくはそのフラグメント、またはヒト野生型ＬＲＲＫ２もしくはそのフラグメントとＧＳＴタグの融合体であって、前記フラグメントはヒト野生型ＬＲＲＫ２の少なくとも１３２６−２５２７を含んでなる請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドがヒト野生型ＬＲＲＫ２の自然発生変異を有するヒトＬＲＲＫ２；もしくはそのフラグメント；またはヒト野生型ＬＲＲＫ２の自然発生変異を有するヒトＬＲＲＫ２とＧＳＴタグの融合体；もしくはそのフラグメントとＧＳＴタグの融合体であって、前記フラグメントはヒトＬＲＲＫ２の少なくとも１３２６−２５２７を含んでなり、前記自然発生変異はヒト野生型ＬＲＲＫ２の番号付けを用いて、Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１９１４Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｉ２０２０Ｔ、Ｔ２３５６Ｉ、Ｇ２３８５Ｒ、Ｋ５４４Ｅ、Ｐ７５５Ｌ、Ｒ７９３Ｍ、Ｑ９３０Ｒ、Ｓ９７３Ｎ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｉ１１２２Ｖ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１４４１Ｈ、Ａ１４４２Ｐ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｍ１８６９ＴまたはＧ２０１９Ｓである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドがヒト野生型ＬＲＲＫ２の自然発生変異を有するヒトＬＲＲＫ２；もしくはそのフラグメント；またはヒト野生型ＬＲＲＫ２の自然発生変異を有するヒトＬＲＲＫ２とＧＳＴタグの融合体；もしくはそのフラグメントとＧＳＴタグの融合体であって、前記フラグメントはヒトＬＲＲＫ２の少なくとも１３２６−２５２７を含んでなり、前記自然発生変異はパーキンソン病（ＰＤ）に関連する変異であるヒト野生型ＬＲＲＫ２の番号付けを用いてＧ２０１９Ｓである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドはＧＳＴ融合ポリペプチドである請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドはＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドは組換え体である請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記基質ポリペプチドは配列ＷＷＫＦＹＴＬＲＲＡ、ＷＷＲＦＹＴＬＲＫＡ、ＲＬＧＷＷＫＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲ、ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＫＡＲＱＧＮＴＫＱＲまたはＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲからなるかまたは含んでなる請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記基質ポリペプチドはＧＳＴ融合ポリペプチドである請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記基質ポリペプチドはＧＳＴ−ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
被験化合物の効果を比較化合物の効果と比較する工程を含んでなる請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記比較化合物はスニチニブ；Ｙ−２７６３２またはＨ−１１５２である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｉ）ＬＲＲＫ２ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよびｉｉ）請求項１から１３のいずれかで定義される基質ポリペプチドまたは請求項１から１３のいずれかで定義される基質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる精製された調製物またはパーツのキット。
【請求項１７】
更に請求項１４または１５で定義される比較化合物を含んでなる請求項１６に記載の精製された調製物またはパーツのキット。
【請求項１８】
組換えＬＲＲＫ２ポリヌクレオチドを含んでなる請求項１６または１７に記載の調製物またはキット。
【請求項１９】
請求項１から１３のいずれかで定義されるＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび基質ポリペプチドを発現可能な組換え細胞。
【請求項２０】
組換えＬＲＲＫ２ポリヌクレオチドおよび基質ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでなる請求項１９に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
請求項１から１３のいずれかで定義されるＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび基質ポリペプチドを含んでなる請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
請求項１９から２１のいずれかに記載の細胞からの調製物を精製する工程を含んでなる請求項１６から１８のいずれかに記載の調製物を作成する方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法により得ることができる調製物。
【請求項２４】
配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）、または（Ｗ／Ｒ）（Ｘ）（Ｘ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｔ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｘ）（Ｒ／Ｔ）（Ｒ）（Ｘ）（Ｘは任意のアミノ酸を表す）を含んでなるペプチド。
【請求項２５】
配列ＷＷＫＦＹＴＬＲＲＡ、ＷＷＲＦＹＴＬＲＫＡ、ＲＬＧＷＷＫＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲ、ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＫＡＲＱＧＮＴＫＱＲまたはＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲからなるかまたは含んでなる請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドはＧＳＴ融合ポリペプチドである請求項２４または２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＧＳＴ融合ポリペプチドはＧＳＴ−ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲである請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２４から２７のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
基質ポリペプチドがＬＲＲＫ２ポリペプチドによりリン酸化される請求項１から１３のいずれかで定義される該基質ポリペプチドをリン酸化する方法。
【請求項３０】
請求項１から１３のいずれかで定義される基質ポリペプチドをリン酸化する方法におけるＬＲＲＫ２ポリペプチドの使用。
【請求項３１】
前記化合物が細胞全体、組織もしくは生物体でのＥＲＭファミリーポリペプチドリン酸化；または生物体でのパーキンソン症もしくはパーキンソン病の特徴を調節するかどうかを評価する工程を含んでなり、またＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化または前記パーキンソン症またはパーキンソン病の特徴を調節する化合物を選別する請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物が細胞全体、組織または生物体でのＥＲＭファミリーポリペプチドのアクチン結合および／または膜構成要素結合を調節するかどうかを評価する工程をさらに含んでなり、またアクチン結合および／または膜構成要素結合を調節する化合物を選別する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
選別された化合物を合成、精製および／または配合する工程をさらに含んでなる請求項１から１３、３１または３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
１）請求項１から１３、３１または３２のいずれかに記載の方法を実施すること；ならびに２）選別された化合物を合成、精製および／または配合することを含んでなるＬＲＲＫ２ポリペプチドの活性を調節する化合物を調製する方法。
【請求項３５】
請求項１から１３のいずれかで定義されるＬＲＲＫ２変異体が基質ポリペプチドをリン酸化する能力を評価する工程を含んでなる、ＬＲＲＫ２変異体を特徴付けする方法。
【請求項３６】
前記ＬＲＲＫ２変異体は、パーキンソン病を患う患者に見出されるＬＲＲＫ２変異体である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
試料が基質ポリペプチドをリン酸化する能力を評価する請求項１から１３のいずれかで定義される工程を含んでなる、試料中のＬＲＲＫ２活性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
最近の発見により、ロイシンリッチリピートタンパク質キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）をコードする遺伝子内の様々な常染色体優性の点変異が一因で、ヒトが特発性ＰＤと区別できない臨床的所見を伴う遅発性パーキンソン病（ＰＤ、ＯＭＩＭアクセッション番号６０９００７）を発症しやすくなるということに大きな関心が持たれてきた［１−４］。今日までに行われた遺伝子分析により、ＬＲＲＫ２における変異は相対的に頻度が高く、家族性ＰＤの５〜１０％を占めるのみならず、散発性ＰＤの症例でも有意な比率で見出されることが示されている［５、６］。ＬＲＲＫ２が細胞においてどのように調節され、その生理学的基質が何なのか、そしてＬＲＲＫ２における変異がどのようにＰＤの危険性を引き起こす、または増大させるのかについてはほとんど知られていない。哺乳動物ではＬＲＲＫタンパク質キナーゼの２つのアイソフォーム、ＬＲＲＫ１（２０３８残基）およびＬＲＲＫ２（２５２７残基）が存在する。これらはＲｏｃｏとも称されてきたタンパク質ファミリーに属する［７］。今までのところ、ＬＲＲＫ１ではなくＬＲＲＫ２における変異がＰＤに連関している。
【０００２】
タンパク質キナーゼのＬＲＲＫ／Ｒｏｃｏクラスは当初は粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）においてＧｂｐＣ（ｃＧＭＰ結合タンパク質Ｃ）と称されるタンパク質として特徴付けされ、Ｒａｓ／ＧＴＰａｓｅスーパーファミリーの非通常的なメンバーを含んでなり、タンパク質キナーゼを含むその他のドメインを保有するが故にその他の小型ＧＴＰａｓｅドメインとは区別された［７、８］。続く研究により、ＧｂｐＣがＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍにおける化学走性および細胞極性を調節することが示唆された［９］が、この酵素に関する生理学的基質は解明されていない。ＬＲＲＫ／Ｒｏｃｏタンパク質の決定的な特色は、それらがロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モチーフ、Ｒａｓ様小型ＧＴＰａｓｅ、複合体のＲａｓのＣ末端（ＣＯＲ：Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｏｆ  Ｒａｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ）ドメインと称されている高度なアミノ酸保存領域、およびタンパク質キナーゼ触媒ドメインを保有することである［７、１０］。ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼドメインはチロシン様セリン／スレオニンタンパク質キナーゼに属し、そして先天的な免疫のシグナル伝達経路において重要な役割を果たすＲｈｏ相互作用タンパク質キナーゼ（ＲＩＰＫ：Ｒｈｏ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ）に最も類似する［１１］。その他のドメインもまたＬＲＲＫキナーゼの特定のメンバーにおいて見出される。例えばＧｂｐＣは哺乳動物ＬＲＲＫ１およびＬＲＲＫ２においては見出されないさらなるＤＥＰドメイン、サイクリックＧＭＰ結合ドメインおよびＲａｓ−ＧＥＦドメインを保有する。ヒトＬＲＲＫ１はそのＮ末端で３つのアンキリンリピートを保有し、一方ＬＲＲＫ２はこれらのドメインを欠如するが、ＬＲＲＫ１において見出されない、Ｃ末端に向かって位置するＷＤ４０リピートを保有する［７］。
【０００３】
ヒトＬＲＲＫ２はロイシンリッチリピート（残基１０１０−１２８７）、小型ＧＴＰａｓｅドメイン（残基１３３５−１５０４）、ＣＯＲドメイン（残基１５１７−１８４３）、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼドメイン（残基１８７５−２１３２）およびＷＤ４０リピートに対して類似性が低いモチーフ（２２３１−２２７６）からなる。今日までに約２０個の単一アミノ酸置換変異が常染色体優性ＰＤに連関しており、そしてこれらが小型ＧＴＰａｓｅ、ＣＯＲ、タンパク質キナーゼおよびＷＤ４０ドメインの保存された残基内にまたはそれらにごく接近して見出されている［３、４］。
【０００４】
欧州において家族性ＰＤ症例の約６％および散発性ＰＤ症例の３％を占めるＬＲＲＫ２の最も優勢な変異体は、キナーゼドメインのサブドメインＶＩＩにおいて保存されたＤＹＧ−Ｍｇ２＋結合モチーフ内に位置するＧｌｙ２０１９のＳｅｒ残基へのアミノ酸置換を含んでなる［３］。最近の報告により、この変異はＬＲＲＫ２の自己リン酸化およびミエリン塩基性タンパク質をリン酸化するその能力を約２〜３倍の中程度に強化することが示唆される［１２、１３］。これらの知見により、ＬＲＲＫ２の過剰活性化がヒトにおいてＰＤを発症しやすくすることを示唆しており、これはＬＲＲＫ２を阻害した薬物を利用していくつかの形態のＰＤの発症を遅延させるか、または処置さえすることができることを意味している。ＬＲＲＫ２の研究は活性な組換え酵素の発現が困難であること、および頑健な定量アッセイがないことにより妨げられてきた。
【０００５】
Ｊａｌｅｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４０５（２）：３０７−３１７（２００７）によりＥＲＭファミリーポリペプチドであるモエシン、エズリン、ラディキシンおよびマーリンを含むＬＲＲＫ２に関する基質が記載されており、そしてパーキンソン病の変異体がどのようにキナーゼ活性に影響を及ぼすかが特徴付けされている。
【０００６】
本明細書における先に公開された文書の列挙または考察は、必ずしも文書が最先端技術の一部であるか、または共通する一般的知識であるという承認として見なすべきではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
我々はＬＲＲＫ２に関するさらなる基質を開発し、それを例えばＬＲＲＫ２活性に及ぼす被験化合物の効果を評価するために有用なＬＲＲＫ２に関する頑健で定量的なアッセイの開発に利用してきた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様は、ＬＲＲＫ２タンパク質キナーゼ活性を調節、例えば阻害するのに有用であると予期される化合物を同定する方法を提供し、その方法は（１）被験化合物が基質ポリペプチドにおけるＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を調節、例えば阻害するかどうかを決定する工程；および（２）該ＬＲＲＫ２ポリペプチドタンパク質キナーゼ活性を調節、例えば阻害する化合物を選別する工程を含んでなり、前記基質ポリペプチドは配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）または（Ｗ／Ｒ）（Ｘ）（Ｘ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｔ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｘ）（Ｒ／Ｔ）（Ｒ）（Ｘ）（ここでＸは任意のアミノ酸を表す）を含んでなる。
【０００９】
配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）（または（Ｗ／Ｒ）（Ｘ）（Ｘ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｔ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｘ）（Ｒ／Ｔ）（Ｒ）（Ｘ））に対する代替として、本発明の全ての態様において、基質ポリペプチドは下線を付したＴ／Ｓ残基以外の残基の１つ、２つまたは３つの保存または非保存置換を伴う配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／ｌ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）を含んでなり得る。故に本発明の全ての態様において３つまでの残基は前記に示された配列と異なり得る。
【００１０】
下線を付した残基はＬＲＲＫ２によりリン酸化されると考えられる残基である。この残基はスレオニン残基であるのが好ましい。その他の残基（リン酸化されたＴ／Ｓ残基に相対して番号付けした）に関して好ましいのは以下のとおりである：
−５：ＷまたはＲ、−４：Ｗ、Ｆ、Ｒ、ＫまたはＩ；−３：Ｒ、ＫまたはＷ；−２：Ｆ、Ｙ、ＨまたはＴ；−１：Ｙ、Ｒ、Ｗ；＋１：Ｌ、Ｖ、ＫまたはＩ；＋２：Ｒ、ＫまたはＴ；＋３：Ｒ。位置−５、−４、−３、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３または＋４のいずれもＤまたはＥではないのが好ましい。位置−２はＲでないのが好ましい。位置−５はＡでないのが好ましい。
【００１１】
スクリーニング方法において調節／評価されるＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性は前記で定義された基質ポリペプチドのリン酸化である。さらに後記でおよび実施例において論じられるものを含む技術により、基質ポリペプチドのリン酸化を評価できる。例えば当業者において周知のように、基質ポリペプチドのリン酸化された（またはリン酸化されていない）リン酸化部位に特異的な抗体を、そのリン酸化部位のリン酸化の評価において使用できる。この教示およびタンパク質リン酸化を評価する多くの公知の方法に基づくさらなる方法は当業者には明白であろう。
【００１２】
インビトロでまたは細胞において基質ポリペプチドリン酸化を評価できる。例えば細胞材料から基質ポリペプチドを免疫沈降させた後に、例えば細胞を３２Ｐ−または３３Ｐ−γ−標識ＡＴＰと共にインキュベートした後に、基質ポリペプチドのリン酸化を評価することができる。
【００１３】
本発明のさらなる態様は細胞におけるＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を調節、例えば阻害するに有用であることが予期される化合物を同定する方法を提供し、その方法は（１）被験化合物が基質ポリペプチドにおけるＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を調節、例えば阻害するかどうかを決定する工程；および（２）該ＬＲＲＫ２ポリペプチドタンパク質キナーゼ活性を調節、例えば阻害する化合物を選別する工程を含んでなり、前記基質ポリペプチドは配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）（または（Ｗ／Ｒ）（Ｘ）（Ｘ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｔ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｘ）（Ｒ／Ｔ）（Ｒ）（Ｘ））（またはそうでなければ、前記で説明したとおり、本発明の第１の態様に関係して定義されたとおりである）を含んでなる。
【００１４】
本発明のさらなる態様はパーキンソン病（ＰＤ）またはパーキンソン症（またはその他の神経変性症状）の処置または防御に有用であると予期される化合物を同定する方法を提供し、その方法は（１）被験化合物が基質ポリペプチドのリン酸化を調節、例えば阻害するかどうかを決定する工程；および（２）基質ポリペプチドのリン酸化を調節、例えば阻害する化合物を選別する工程を含んでなり、前記基質ポリペプチドは配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）（または（Ｗ／Ｒ）（Ｘ）（Ｘ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｔ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｘ）（Ｒ／Ｔ）（Ｒ）（Ｘ））を含んでなる。その方法は、（１）被験化合物がＬＲＲＫ２ポリペプチドによる該基質ポリペプチドのリン酸化を調節、例えば阻害するかどうかを決定する工程；および（２）ＬＲＲＫ２ポリペプチドによる基質ポリペプチドのリン酸化を調節、例えば阻害する化合物を選別する工程を含んでなり得る。基質ポリペプチドのリン酸化を評価する方法の実例は前記および実施例において論じられ、そして前記で論じたリン酸化部位特異的抗体を利用する方法を含む。
【００１５】
前記で論じたように基質ポリペプチドの適当なリン酸ドナーの存在下でＬＲＲＫ２ポリペプチドによるリン酸化を測定することによりＬＲＲＫ２ポリペプチドの活性を測定し得る。基質ポリペプチドのリン酸化を評価する方法の実例を前記に示した。
【００１６】
特定の基質に関するＬＲＲＫ２ポリペプチドのＶｍａｘまたはＫｍ（または双方）の改変によりタンパク質キナーゼ活性を増大または低減し得る。例えばＶｍａｘの増大またはＫｍの低下により活性を増大し得る。ＬＲＲＫ２ポリペプチドが活性化または不活化されているかどうかを決定するために、ＶｍａｘまたはＫｍいずれかの値を決定することは必ずしも必要ではないということは理解されよう。
【００１７】
所定の時間でリン酸化された基質の量として活性を測定し得る；したがって活性の変化を所定の時間でリン酸化される基質の量における変化（例えば単一の濃度で）として検出できる。適切には少なくとも２、好ましくは５、１０、１５、２０、２５、３０または５０倍まで増大または低下するのが好ましい。
【００１８】
例えば（１）基質のＬＲＲＫ２ポリペプチドへの暴露の後に化合物に暴露された場合、（２）基質のＬＲＲＫ２ポリペプチドへの暴露の前に化合物に暴露された場合、および／または（３）ＬＲＲＫ２ポリペプチドに暴露せずに、基質の特性を測定することにより、基質の特性に及ぼす化合物の効果を決定することが必要であり得ることは理解されよう。
【００１９】
タンパク質キナーゼ活性の調節にはタンパク質キナーゼ活性における阻害または増大が含まれる。
【００２０】
本発明の態様で記載されたように、ポリペプチドのリン酸化を生じ得る本発明の方法では、適当なリン酸ドナーの存在が必要とされ得ることは理解されよう。適当なリン酸ドナーは当業者に公知であり、そして実施例に記載するように例えばマグネシウム塩（ＭｇＡＴＰ）のようなＡＴＰを含む。
【００２１】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび基質ポリペプチドの結合に及ぼす被験化合物の効果を評価することは有用であり得る。ポリペプチド：ポリペプチド相互作用を評価する方法は当業者に周知であろう。
【００２２】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドを例えばＬＲＲＫ２が自然に発現される細胞から精製できるが、ＬＲＲＫ２ポリペプチドを組換え体とするのがさらに都合よいかもしれない。さらに後記および実施例に記載するように、例えばＬＲＲＫ２ポリペプチドを自然に発現する細胞からタンパク質キナーゼ活性を保持するＬＲＲＫ２を調製するのに有用である抗体を増加させるか、または選別するのに有用であるＬＲＲＫ２フラグメントが同定されている。故にＬＲＲＫ２ポリペプチドは、そのような抗体を使用して調製されるＬＲＲＫ２ポリペプチドでよい。
【００２３】
ＥＲＭファミリーポリペプチドなる用語は当業者に周知である。ＥＲＭファミリーメンバーにはモエシン、エズリンおよびラディキシンが含まれる。マーリンは別のＥＲＭファミリーメンバーである。Ｊａｌｅｅｌら（２００７）（前出）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（２００８年４月７日出願）にて論じられるように、ＥＲＭファミリーメンバーはＬＲＲＫ２の基質であると考えられる。
【００２４】
ＮＣＢＩデータベースにおけるＥＲＭファミリーポリペプチドに関するアクセッション番号の実例には以下が含まれる：
ＡＡＢ０２８６４、Ｍ８６４５０（ブタモエシン）
ＡＡＡ３９７２８、Ｍ８６３９０．１、ＮＰ  ０３４９６３、ＮＭ  ０１０８３３．２（ハツカネズミモエシン）
ＮＰ  ０２４３５、ＮＭ  ００２４４４．２（ヒトモエシン）
ＮＰ  １０４９０、ＮＭ  ０３０８６３．１（ドブネズミモエシン）
ＮＰ  ００１０３９９４２、ＮＭ  ００１０４６４７７．１（ウシモエシン）
ＮＰ  ０６２２３０、ＮＭ  ０１９３５７．１（ドブネズミエズリン）
ＣＡＡ４３０８６、Ｘ６０６７１．１（ハツカネズミエズリン）
Ｐ１５３１１（ヒトエズリン）
【００２５】
ＮＰ  ００２８９７、ＮＭ  ００２９０６．３（ヒトラディキシン）
ＮＰ  ０３３０６７、ＮＭ  ００９０４１（ハツカネズミラディキシン）
ＮＰ  ００１００５８８９、ＮＭ  ００１００５８８９．２（ドブネズミラディキシン）
ＮＰ  ００１００９５７６、ＮＭ  ００１００９５７６．１（ブタラディキシン）
【００２６】
Ｐ３５２４０（ヒトマーリン）
Ｐ４６６６２（ハツカネズミマーリン）
Ｑ６３６４８（ドブネズミマーリン）
【００２７】
当業者には周知であるように、ＮＣＢＩ  Ｍｅｄｌｉｎｅ（商標）サービスからアクセス可能な配列データベースで哺乳動物および非哺乳動物ＥＲＭファミリーポリペプチド配列の数多くのさらなる実例にアクセスすることができる。
【００２８】
アッセイにおいて使用される基質ポリペプチドは典型的には組換え体でよいか、または化学合成され得る。基質ポリペプチドは例えば細菌により発現されるか、または哺乳動物細胞により発現される基質ポリペプチド（例えば実施例に記載されるような）であり得る。基質ポリペプチドは、例えば実施例に記載するように、例えばＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］またはＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］のようなＬＲＲＫ２ポリペプチドにより、リン酸化される能力を保持する融合ポリペプチド（例えば実施例１に記載されるような）であり得るか、またはそれを含んでなり得る。当業者には周知であるように、融合ポリペプチドは典型的にはタグ例えばＧＳＴタグを伴い得る。代替的に、または加えて、融合ポリペプチドはＥＲＭポリペプチドの全てまたは一部を伴い得る。一例では、ＥＲＭポリペプチドの野生型リン酸化部位を本発明の基質ポリペプチド配列により置き換え得る。
【００２９】
前記で示したように、基質ポリペプチドは配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）（前記で論じたように、場合によっては３つまでの置換を伴う）または（Ｗ／Ｒ）（Ｘ）（Ｘ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｔ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｘ）（Ｒ／Ｔ）（Ｒ）（Ｘ）を含んでなる。例えば基質ポリペプチドは配列ＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡを含んでなり得る。これに代えて基質ポリペプチドは配列ＷＷＫＦＹＴＬＲＲＡまたはＷＷＲＦＹＴＬＲＫＡを含んでなり得る。適当な基質ポリペプチドの実例はＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲである。ＬＲＲＫ２によりリン酸化された残基には下線を付している。この基質ポリペプチドを実施例および図面では「ニクチド（Ｎｉｃｔｉｄｅ）」と称する。以下は適当な基質ペプチドのさらなる実例である：ＲＬＧＷＷＫＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲおよびＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＫＡＲＱＧＮＴＫＱＲ。ペプチドのＬＲＲＫ２基質として作用する能力に適合すると考えられ、コンセンサス配列に反映されたペプチド配列を図２、３、１２、１３および１４にも示す。
【００３０】
前記したとおり、基質ポリペプチドはタグ配列、当業者に周知であるように、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＭｙｃタグを含んでなり得る。故に適当な基質ポリペプチドのさらなる実例は、ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲおよびタグ配列、例えば実施例に記載されるように、例えばＧＳＴタグの融合体である。
【００３１】
基質ポリペプチドは１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７または１６アミノ酸未満のポリペプチドでよく、アミノ酸配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）または（Ｗ／Ｒ）（Ｘ）（Ｘ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｔ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｘ）（Ｒ／Ｔ）（Ｒ）（Ｘ）を含んでなる。基質ポリペプチド配列は典型的には、場合によっては残基の保存または非保存置換を伴って（例えば残基の１０、２０、３０、４０、５０または６０％まで）、自然由来ＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばモエシン、ラディキシンまたはエズリン、例えばヒトモエシン、ラディキシンまたはエズリンの配列から誘導される長さの少なくとも５つのアミノ酸のうちの１つまたはそれより多いアミノ酸配列を含んでなり得る。自然由来ＥＲＭファミリーポリペプチドの配列から誘導されるアミノ酸配列は典型的にはＬＲＲＫ２によりリン酸化されるＥＲＭファミリーポリペプチドの残基、例えばモエシンのＴｈｒ５５８（またはＴｈｒ５２６）に対応する残基を含まない。
【００３２】
前記で示された基質ポリペプチドは、以前に同定された基質配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ（長ＬＲＲＫｔｉｄｅと称される）に存在するが、以前に同定されたより短い配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱ（短ＬＲＲＫｔｉｄｅ）には存在しない配列（ＧＮＴＫＱＲ）を含む。長ＬＲＲＫｔｉｄｅは短ＬＲＲＫｔｉｄｅに相対して５−１０倍低量のペプチドの使用を可能にすると考えられる。配列ＧＮＴＫＱＲはモエシン、エズリンまたはラディキシンにおいて見出される配列である。
【００３３】
Ｊａｌｅｅｌら（２００７）（前出）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（２００８年４月７日出願）（国際公開第２００８／１２２７８９として公開）にて論じられるように、（例えばそれがＦＥＲＭドメイン（例えばヒトモエシンの残基１から２９８）およびＣ末端テール領域（Ｃ−ＥＲＭＡＤドメイン、例えばヒトモエシンの残基４８９から５７５）を含んでなる場合）基質ポリペプチドがインビトロでＬＲＲＫ２ポリペプチドによりリン酸化されるために、基質ポリペプチドを変性する必要があり得る。したがって基質ポリペプチドは機能的ＦＥＲＭドメインを含んでならないことが望ましいかもしれない。
【００３４】
前記で示したように、ＬＲＲＫ２なる用語は当業者に周知であろう。アッセイにおいて使用されるＬＲＲＫ２ポリペプチドは組換え体または非組換え体でよい。後記でさらに論じるように、ＬＲＲＫ２ポリペプチドは例えばＬＲＲＫ２がタンパク質キナーゼ活性を保持し得るＬＲＲＫ２に対する抗体、例えばＬＲＲＫ２のフラグメントを使用して増加させたまたは選別された抗体を使用して調製された組換え体または非組換え体でよい。ＬＲＲＫ２ポリペプチドは例えば細菌により発現された、または哺乳動物細胞により発現されたＬＲＲＫ２ポリペプチド（例えば実施例において、Ｊａｌｅｅｌら（２００７）（前出）にて、または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）にて記載されるように）でよい。基質ポリペプチドと一緒にＬＲＲＫ２ポリペプチドを発現するのが適切であり得る。基質ポリペプチドが、ＬＲＲＫ２と結合または共局在化すると考えられるさらなる部分、例えばＥＲＭファミリーポリペプチド（前記で論じられた）の全てもしくは一部またはＬＲＰ１３０の全てもしくは一部を含んでなることは有用であり得る。ＬＲＲＫ２ポリペプチドは自然由来ＬＲＲＫ２のアミノ酸配列を有し得るか、または融合ポリペプチド（例えば実施例において、またはＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）にて、または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）にて記載されるように）でよいか、もしくはそれを含んでなり得るか、または、本明細書で定義される基質ポリペプチド、もしくは例えばＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）もしくは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）に記載される、例えば前記されたニクチドと称される基質ポリペプチドもしくはＥＲＭファミリーポリペプチドもしくはミエリン塩基性タンパク質をリン酸化する能力を保持する、例えば全長ヒトモエシンのＴｈｒ５５８（またはＴｈｒ５２６）に対応する残基で変性モエシンもしくはそのフラグメントをリン酸化する能力を保持する自然発生ＬＲＲＫ２のフラグメントもしくはバリアントでよい。故にＬＲＲＫ２ポリペプチドは活性なキナーゼドメインを保持するＬＲＲＫ２ポリペプチドである。Ｊａｌｅｅｌら（２００７）（前出）にまたは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）にて論じられるように、触媒的に活性であるために、ＬＲＲＫ２ポリペプチドがＧＴＰａｓｅドメイン、ＣＯＲドメイン、ＷＤ４０様モチーフおよびＣ末端テールに対応する領域を保持することもまた考えられる。ＬＲＲＫ２ポリペプチドは全長ＬＲＲＫ２に存在するロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モチーフを含んでいなくてもよい。実施例において、およびＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）にて、または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）にて記載されるように、ＬＲＲＫ２ポリペプチドはヒト野生型ＬＲＲＫ２の残基１３２６−２５２７または、そのようなフラグメントのＧＳＴ融合体を含んでなるか、またはそれらからなり得る。無傷の（ｉｎｔａｃｔ）キナーゼドメインおよび上記のその他のドメインを含有するが、ＬＲＲＫ２のその他の領域（例えばロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モチーフ）を含有しないＬＲＲＫ２のフラグメントは有用であり得る；ＬＲＲＫ２のこの領域はタンパク質キナーゼ活性を保持するのに十分であるが、全長ＬＲＲＫ２よりも短く、そして活性形態で発現させるのがより容易である。アッセイにおいて使用されるＬＲＲＫ２ポリペプチドはＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）に記載されるもののようにキナーゼ活性がない（キナーゼデッド；ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ）変異体（例えば全長ヒトＬＲＲＫ２の残基Ｄ２０１７に均等な残基が例えばアラニンに変異しているＬＲＲＫ２）ではない。
【００３５】
故にＬＲＲＫ２ポリペプチドはヒト野生型ＬＲＲＫ２もしくはそのフラグメント、またはそのいずれかの融合体でよい。フラグメントはヒト野生型ＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７を含んでなり得る。Ｃ末端での切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、切断されたＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性に有害な影響を及ぼし得るが、一方フラグメントのＮ末端での切断はより良好な許容性を示し得ると考えられる。故に代替的に、ＬＲＲＫ２ポリペプチドのＮ末端を残基１３２６の後、例えば残基１３２６と残基１３３６あたりの間で切断してもよい。
【００３６】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドはヒト野生型ＬＲＲＫ２の自然発生変異を有するヒトＬＲＲＫ２；もしくはそのフラグメント；またはそのいずれかの融合体であり得る。フラグメントは自然発生変異を有するヒトＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７を含んでなり得る。
【００３７】
ヒトＬＲＲＫ２の自然発生変異はパーキンソン病（ＰＤ）に関連する変異であり得る。変異はヒト野生型ＬＲＲＫ２の番号付けを用いてＧ２０１９Ｓでよい。Ｊａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）にて論じられるように、この変異はＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性を強化すると考えられる。
【００３８】
これに代えて変異はヒト野生型ＬＲＲＫ２の番号付けを用いて、Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１９１４Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｉ２０２０ＴまたはＧ２３８５Ｒでよい。変異Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９ＣまたはＴ２３５６Ｉを伴うＬＲＲＫ２は野生型ＬＲＲＫ２に類似のタンパク質キナーゼ活性を有すると考えられる。変異Ｒ１９１４ＨまたはＩ２０１２Ｔを伴うＬＲＲＫ２はほとんど不活性であると考えられる。変異Ｉ２０２０Ｔを伴うＬＲＲＫ２は、野生型ＬＲＲＫ２と変異Ｒ１９１４ＨまたはＩ２０１２Ｔを伴うＬＲＲＫ２の間の中程度の活性を有すると考えられる。変異Ｇ２３８５Ｒを伴うＬＲＲＫ２もまたほとんど不活性であると考えられる。さらなる変異体の活性を国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）の図１７に示す。
【００３９】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドは変異Ａ２０１６Ｔを有するヒトＬＲＲＫ２；もしくはそのフラグメント；またはそのいずれかの融合体でよい。フラグメントはＡ２０１６Ｔ変異を有するヒトＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７を含んでなり得る。実施例４で論じるように、この変異はＨ−１１５２、Ｙ−２７６３２およびスニチニブの化合物による阻害に抵抗性であると考えられる。
【００４０】
１を超えるＬＲＲＫ２ポリペプチドに対する；例えば１を超える変異体ＬＲＲＫ２ポリペプチドに対する化合物を試験することは役立ち得る。これはさらなる化合物を設計および試験することを決定する支援となり得る。
【００４１】
実施例１において、およびＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）にて論じられるように、ＬＲＲＫ２ポリペプチドはＧＳＴ融合ポリペプチドであってよい。例えばＬＲＲＫ２ポリペプチドはＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］であり得る。当業者には周知であるように、代替の融合部を使用することもできる。
【００４２】
必須ではないが、残基Ｔｈｒ５５８もしくはＴｈｒ５２６における全長ヒトモエシンのリン酸化；または、そのような残基を包含するペプチド基質の（例えば前記で論じた；例えばＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱまたはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ）；もしくは前記で定義された本発明の基質ポリペプチド、例えばＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲのリン酸化に関して、ＬＲＲＫ２ポリペプチドが全長ヒトＬＲＲＫ２の酵素活性の少なくとも３０％を有するのがとりわけ好ましい。残基Ｔｈｒ５５８もしくはＴｈｒ５２６における全長ヒトモエシンのリン酸化；または、そのような残基を包含するペプチド基質の；もしくは前記で定義された本発明の基質ポリペプチド、例えばＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲのリン酸化に関して、ＬＲＲＫ２ポリペプチドが全長ヒトＬＲＲＫ２の酵素活性の少なくとも５０％、好ましく少なくとも７０％およびさらに好ましくは少なくとも９０％を有する場合がさらに好ましい。
【００４３】
ＮＣＢＩデータベースにおける哺乳動物ＬＲＲＫ２配列に関するアクセッション番号には以下が含まれる：
ＡＡＶ６３９７５．１  ヒト
ＸＰ  ００１１６８４９４．１  Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）
ＸＰ  ６１５７６０．３  Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ（家畜ウシ）
ＸＰ  ５４３７３４．２  Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）
ＮＰ  ０８０００６．２  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）
ＸＰ  ２３５５８１．４  Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）
【００４４】
当業者には周知であるように、ＮＣＢＩ  Ｍｅｄｌｉｎｅ（商標）サービスからアクセス可能な配列データベースで哺乳動物および非哺乳動物のＬＲＲＫ２ポリペプチド配列の数多くのさらなる実例にアクセスすることができる。
【００４５】
ポリペプチドの「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」には保存または非保存のいずれかの挿入、欠失および置換が含まれる。とりわけ、適切な場合、そのような変化がリン酸化されるタンパク質キナーゼ活性または能力を実質的に改変しないポリペプチドのバリアントが含まれる。当業者は例えば異なる種からの、例えば各ポリペプチドの実例の配列の比較に基づいて、適切なバリアントを容易に設計および試験することができるであろう。当業者はどこに挿入もしくは欠失を行うことができるか；またはどの残基を適切に未変化で残すことができるか；保存置換により置き換えることができるか；もしくは非保存置換により置き換えることができるかを容易に決定することができるであろう。例えば実施例に記載するようにバリアントポリペプチドを容易に試験できる。
【００４６】
「保存置換」とはＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組み合わせを意図する。
【００４７】
前記で定義したように、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の３文字または１文字アミノ酸コードを本明細書では使用し、記号Ｚａａは例外とする。とりわけＸａａは任意のアミノ酸を表す。少なくとも本明細書で定義されるコンセンサス配列に対応するアミノ酸はＬ−アミノ酸であるのが好ましい。
【００４８】
ポリペプチドバリアントが、関連性のあるヒトポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６５％同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましく、関連性のあるヒトポリペプチドのアミノ酸配列とさらに好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％または７４％、なおさらに好ましくは少なくとも７５％、その上なおさらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましいのは少なくとも８５％、なおさらに好ましいのは少なくとも９０％および最も好ましくは少なくとも９５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列を有する場合がとりわけ好ましい。
【００４９】
タンパク質キナーゼバリアントが、ヒトポリペプチドの触媒ドメインのアミノ酸配列と少なくとも６５％同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましく、関連性のあるヒトアミノ酸配列とさらに好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％または７４％、なおさらに好ましくは少なくとも７５％、その上なおさらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましいのは少なくとも８３または８５％、なおさらに好ましいのは少なくとも９０％および最も好ましくは少なくとも９５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列を有するのがとりわけ好ましい。
【００５０】
当業者が例えば後記に記載される配列比較を用いてタンパク質キナーゼ−関連ポリペプチドの触媒ドメインを容易に同定できることは理解されよう。Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ８５：１４９−１５８（１９９６）や、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｒａｄｚｉｏ−Ａｎｄｚｅｌｍ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：３４５−３５５（１９９４）にて概説されるように、タンパク質キナーゼは保存された触媒コアを示す。このコアは大部分が逆平行βシートを含んでなる小型のＮ末端ローブおよびほとんどαらせん状である大型のＣ末端ローブに折り畳まれている。
【００５１】
適当なコンピュータプログラム、例えばウィスコンシン大学遺伝子計算グル―プ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）のＧＡＰプログラムを用いて２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントを決定でき、そしてその配列が最適に整列（アライン；ａｌｉｇｎ）されているポリペプチドに関連して同一性パーセントを計算することは理解されよう。
【００５２】
これに代えてＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）を用いてアラインメントを実行してよい。用いられるパラメータは以下のとおりである：
高速ペアワイズアラインメントパラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナルの数；５
スコアリング方法：ｘパーセント
マルチプルアラインメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５
スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ
【００５３】
これに代えて実施例１にて論じるようにプログラムＴ−Ｃｏｆｆｅｅ［１９］またはＥＭＢＯＳＳ［２０］を用いてアラインメントを実行してもよい。
【００５４】
例えば配列間の一致を最大にする方式でポリペプチドの配列を全長ヒトモエシンの配列とアラインすることにより、例えば全長ヒトモエシンのＴｈｒ５５８に対応する（均等な）残基を同定し得る。目視検査により、および／または適当なコンピュータプログラム、例えばウィスコンシン大学遺伝子計算グル―プのＧＡＰプログラムの使用により、アラインメントを実行でき、それによりポリペプチドの同一性パーセントを計算することが可能になる。アラインプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  ＩＩ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＡＭおよびＧｒｉｆｆｉｎ，ＨＧ編）３６５−３８９頁（１９９４）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（クリフトン））。故にこの様式で同定された残基もまた「対応する残基」である。
【００５５】
（例えば）モエシンの切断された形態またはアミノ酸の単純置換が生じている形態の場合では、「対応する残基」を同定することが簡便である。
【００５６】
スクリーニングにおいて使用されるポリペプチドは哺乳動物、好ましくはヒト（または農業において、もしくは家畜もしくは愛玩動物として有用な種、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ）であり、自然発生対立遺伝子バリアント（スプライシングバリアントを含む）を含むのが好ましい。当業者に公知のように、または実施例に記載するようにスクリーニングに使用されるポリペプチドはＧＳＴ部分を含んでなり得るか、またはビオチン化もしくはそうでなければ例えば６Ｈｉｓ、ＨＡ、ｍｙｃもしくはその他のエピトープタグでタグ化され得る。これはポリペプチドの精製および／または検出に有用であり得る。
【００５７】
例えば化合物の不在下および、例えば約１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭおよび／または０．００１μＭの濃度での存在下のように、様々な濃度の化合物の存在下でＬＲＲＫ２ポリペプチドによる基質ポリペプチドのリン酸化の速度または程度を比較することにより化合物の効果を決定できる。
【００５８】
本発明の方法により同定された化合物は、様々な基質、例えばモエシン、ラディキシンもしくはエズリンまたはペプチド基質ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲをＬＲＲＫ２ポリペプチドがリン酸化する能力を調節すると考えられる。調節の程度は異なる基質に関して異なり得る。故に、例えば内因性ポリペプチド、例えばモエシン、ラディキシンまたはエズリンといった目的のポリペプチドをＬＲＲＫ２ポリペプチドがリン酸化する能力に及ぼす、本発明の方法により同定された化合物の効果を試験することは望ましいが、必須ではないであろう。
【００５９】
ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性またはＬＲＲＫ２によるＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を調節、例えば阻害する化合物の同定において方法は有用である。ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性またはＬＲＲＫ２によるＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を調節、例えば阻害する化合物はパーキンソン病（例えば特発性パーキンソン病または遅発性パーキンソン病）またはパーキンソン症の処置において有用であり得る。
【００６０】
ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性またはＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばモエシンのリン酸化を調節、例えば阻害する化合物はその他の神経変性症状にも有用であり得る。
【００６１】
化合物はＬＲＲＫ２ポリペプチドと基質ポリペプチドとの間の接触領域に又はその近くに結合するものであってよく、または別の領域に結合し、そして例えば複合体を安定化（または不安定化）する；もしくはその形成を促進（または阻害）する立体構造的もしくはアロステリックな変化を誘起するものであってよい。化合物はＬＲＲＫ２ポリペプチドまたは基質ポリペプチドに結合して、アロステリック効果によりＬＲＲＫ２ポリペプチドタンパク質キナーゼ活性を増大し得る。このアロステリック効果はＬＲＲＫ２ポリペプチドの活性の自然の調節に関与するアロステリック効果であり得る。
【００６２】
前記方法において同定された化合物はそれ自体薬物として有用であり得るか、またはそれらはさらに有効な化合物の設計および合成のためのリード化合物を表し得る。
【００６３】
化合物は薬物様化合物、または化合物を同定する前記の方法の各々に関する薬物様化合物の開発のためのリード化合物であり得る。当業者に周知であるように、前記方法は医薬用化合物または薬物の開発におけるスクリーニングアッセイとして有用であり得ることは理解されよう。
【００６４】
「薬物様化合物」なる用語は当業者に周知であり、そして薬物療法において、例えば医薬品中の活性成分としての使用に適するようにできる特徴を有する化合物の意味を含み得る。故に例えば薬物様化合物は有機化学の技術により、あまり好ましくないが分子生物学または生化学の技術により合成できる分子であってよく、そして好ましくは低分子であり、それは５０００ダルトン未満でよい。薬物様化合物は加えて特定の（１または複数の）タンパク質との選択的相互作用を呈し、そして生物学的に利用可能であり、および／または細胞膜を通過できるといった特色を示すが、これらの特色が必須ではないことは理解されよう。
【００６５】
「リード化合物」なる用語は同様に当業者に周知であり、そして化合物がそれ自体は薬物としての使用に適していない（例えばそれはその意図された標的に対して弱い効力しかない、その作用において非選択的である、不安定である、合成が困難である、または生物学的利用能が乏しいために）が、さらに望ましい特徴を有し得るその他の化合物の設計の出発点を提供し得るという意味を含み得る。
【００６６】
インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でタンパク質キナーゼの活性を調節し得る化合物を同定するのが望ましいであろうということは理解されよう。故に例えばＬＲＲＫ２ポリペプチドと基質ポリペプチドとの間の相互作用が、ヒトＬＲＲＫ２と内因性ヒト基質ポリペプチド、例えばヒトＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばモエシン、ラディキシンまたはエズリンポリペプチドとの間と実質的に同じであるように本方法において使用される試薬および条件を選び得ることは理解されよう。化合物がＬＲＲＫ２ポリペプチドに結合し得るか、または基質ポリペプチドに結合し得ることは理解されよう。
【００６７】
化合物がタンパク質キナーゼ、例えばＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を調節する能力を測定できるアッセイのスクリーニング方法において、またはその他のアッセイにおいて試験される化合物は、分子モデリング技術を用いて、例えばコンピュータ技術を用いて選別および／または設計（改変を含む）されている化合物でよい（しかし、そうでなければならないということではない）。選別または設計された化合物を合成し（既に合成されていない場合）、そしてＬＲＲＫ２ポリペプチドに及ぼすその効果、例えばタンパク質キナーゼ活性に及ぼすその効果に関して試験し得る。化合物を本発明のスクリーニング方法において試験し得る。
【００６８】
試験される化合物はタンパク質キナーゼの活性を調節できる可能性があると既に考えられている化合物であってよいか；またはタンパク質キナーゼの活性を調節する可能性があることに基づいて選別されていない化合物であってよい。故に試験される化合物は一般的な、選別されていない化合物バンクの少なくとも一部を形成する化合物でよいか；またはこれに代えて予め選別された化合物バンク、例えばタンパク質キナーゼの活性を調節する可能性があると考えられていることに基づいて予め選別された化合物のバンクの少なくとも一部を形成する化合物でよい。
【００６９】
ハイスループット操作が可能であるスクリーニングアッセイがとりわけ好ましいであろうということは理解されよう。例えば基質ポリペプチドのリン酸化形態に結合するが、非リン酸化形態には結合しない（逆もまた同じ）抗体を使用するアッセイが適当であり得る。実例には細胞基盤のアッセイおよびタンパク質−タンパク質結合アッセイが含まれ得る。さらなる実例は当業者に周知なように、ＳＰＡ基盤（シンチレーション近接アッセイ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）系である。例えばシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）および基質ポリペプチド、例えば前記で論じられたＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲを含んでなるビーズを調製できる。ビーズを３２Ｐ−または３３Ｐ−γ−標識されたＡＴＰ、ＬＲＲＫ２ポリペプチドを含んでなる試料と、および被験化合物と混合してもよい。これを９６ウェル形式で行うのが都合よい。次いで適当なシンチレーションカウンターを使用して、３２Ｐ−または３３Ｐ−ＳＰＡアッセイに関する公知のパラメータを用いてプレートを計数する。シンチラントに近接する３２Ｐ−または３３Ｐ−のみ、すなわちビーズに結合している基質に結合している３２Ｐ−または３３Ｐ−のみが検出される。例えば基質ポリペプチドが抗体または抗体フラグメントへの結合を介してシンチラントビーズに固定されている、そのようなアッセイの変法を用いることもできる。ハイスループットタンパク質キナーゼ活性アッセイは当業者に周知であり、そしてＬＲＲＫ２ポリペプチドによる本発明の基質ポリペプチドのリン酸化に関して本明細書にて提供される情報に鑑みて容易に適合させることができる。
【００７０】
スクリーニング方法はさらに、化合物が細胞全体、組織または生物体においてＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばモエシンのリン酸化（またはその他のパラメータ、例えばＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）にて論じられるように、アクチン結合もしくは膜構成要素結合または細胞特徴）を調節するかどうかを評価する工程；およびリン酸化（またはその他のパラメータ）を調節する化合物を選別する工程を含んでなり得る。前記で論じられたように、パーキンソン病に連関するＬＲＲＫ２変異を有するか；またはそうでなければＬＲＲＫ２を過剰発現する、細胞全体、組織または生物体において化合物を試験し得る。例えば神経細胞系において化合物を試験し得る。故にＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばモエシンのリン酸化に及ぼす化合物の効果を神経細胞系において評価し得る。
【００７１】
当業者には明白であるように、化合物がその他のタンパク質キナーゼにどのような効果を有するのかを評価することが望ましいかもしれない。ＬＲＲＫ２とＲＯＣＫの阻害剤とを区別するために、例えばその他のタンパク質キナーゼの基質、例えばＲｏｃｋＩＩの基質のリン酸化に及ぼす化合物の効果を評価することが望ましいかもしれない。例えば国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）の、例えば図２０および２２にて示されるか、またはそこの説明文にて論じられるように、ＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋ−ＩＩの基質選択性は異なる。実例としては、ＬＲＲＫ２はＭＹＰＴをリン酸化しないが、ＲｏｃｋＩＩはＭＹＰＴをリン酸化する。
【００７２】
スクリーニング方法は被験化合物の効果を比較化合物の効果と比較する工程を含んでなり得る。例えば実施例で論じるように、スニチニブはＬＲＲＫ２を阻害するがＲＯＣＫを阻害しないと考えられ；そしてＹ−２７６３２およびＨ−１１５２はＲＯＣＫおよびＬＲＲＫ２の二重阻害剤であると考えられる。ＬＲＲＫ２を阻害するがＲＯＣＫを阻害しない化合物はスニチニブと類似の効果を示し得る。
【００７３】
スクリーニング方法は化合物が細胞全体、組織または生物体におけるＬＲＲＫ２の活性を調節するかどうかを評価する、および選択された活性を調節する化合物を選別する工程を含んでなり得る。この方法はさらに細胞全体、組織または生物体における被験化合物の効果を比較化合物と比較する工程をさらに含んでなり得る。ＬＲＲＫ２を阻害するがＲＯＣＫを阻害しない化合物はスニチニブと類似の効果を示し得て、そしてＹ−２７６３２およびＨ−１１５２とは異なる効果を示し得る。
【００７４】
本明細書にて記載されるスクリーニング方法を用いて同定される化合物を試験するのにさらに適切であり得る、ＰＤモデル、バイオマーカーおよび評価技術に関する情報を、例えば以下のリンクで見出すことができ、これらは当業者に利用可能な情報の代表的なものである。
【００７５】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ  ｎｉｎｄｓ／ｐｌａｎｓ／ｎｉｈｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ  ａｇｅｎｄａ．ｈｔｍ＃Ｍｏｄｅｌｓ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄａｉｌｙ．ｃｏｍ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２００６／０７／０６０７２９１３４６５３．ｈｔｍ（ミトコンドリア障害を伴うマウスモデル）
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄａｉｌｙ．ｃｏｍ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２００４／１０／０４１００５０７４８４６．ｈｔｍ（胚性幹細胞モデル）
ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ
【００７６】
ＰＤ動物モデルには６−ヒドロキシドーパミン処置げっ歯類およびＭＰＴＰ処置霊長類が含まれる。双方はドーパミン作動性脳細胞（およびいくつかのその他の型）の毒性破壊に基づき、そして通常若年の、そうでなければ健康な動物を用いる。これらのモデルはパーキンソン病のいくつかの重要な特色を再現するので、それらは出現する新しい治療法を試験するのに有用であると考えられる。
【００７７】
当業者に周知であるように、化合物をその他の試験、例えば毒性または代謝試験に供することもし得る。
【００７８】
本発明のスクリーニング方法は選別された化合物を合成、精製および／または配合する工程を含んでなり得る。
【００７９】
本発明はまたＬＲＲＫ２の活性を調節する化合物を調製する方法をも提供し、その方法は１）本発明の適切なスクリーニング方法を実施すること；２）選別された化合物を合成、精製および／または配合すること；を含んでなる。
【００８０】
化合物を医薬用のために、例えば動物またはヒトにおいてインビボ試行で使用するために配合できる。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、本発明のスクリーニング方法により同定された、または同定可能な化合物を提供する。
【００８２】
本発明のなおさらなる態様は薬物療法において使用するための本発明の化合物である。本発明のなおさらなる態様はパーキンソン病（例えば特発性パーキンソン病または遅発性パーキンソン病）またはパーキンソン症を処置するための本発明の化合物である。
【００８３】
化合物を希釈剤および担体の標準的な滅菌、非発熱性配合にて、適当な方式で、通常非経口的に、例えば静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内または膀胱内に投与し得る。化合物を局所的に投与することもできる。化合物を例えば注射により限局的な様式で投与することもできる。処置は単回投与またはある期間にわたる複数回投与からなり得る。化合物はパーキンソン病またはパーキンソン症を伴う、またはその危険性のある患者を処置するのに有用であり得る。
【００８４】
本発明の化合物を単独で投与することは可能であるが、それを１以上の許容される担体と一緒に医薬用製剤として提示するのが好ましい。担体は本発明の化合物と適合し、そしてその受容者に対して有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には担体は、滅菌され発熱性物質を含まない水または生理食塩水であろう。
【００８５】
故に本発明はまた、本発明のスクリーニング方法により同定された、または同定可能な化合物および医薬的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００８６】
組成物はまた、適切な場合、パーキンソン病またはパーキンソン症またはその他の神経変性症状を処置するのに有用なさらなる化合物を含んでなるかまたはそれと共に投与され得る。
【００８７】
したがって本発明は、医薬的に許容される担体とともに、本発明のスクリーニング方法により同定された、または同定可能な化合物、および、場合によってはその他の治療用成分を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００８８】
本発明のさらなる態様はＬＲＲＫ２ポリペプチド（例えば前記で論じられる）もしくはポリヌクレオチド（すなわちＬＲＲＫ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）または例えば上述および後述の簡単に論じられる、ＬＲＲＫ２を調製するのに有用な抗体；および上記で定義される本発明の基質ポリペプチド（または本発明の基質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）；および場合によってはスニチニブ；Ｙ−２７６３２またはＨ−１１５２のような比較化合物を含んでなる精製された調製物またはパーツのキットを提供する。調製物またはキットは例えば組換えＬＲＲＫ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび組換え体または化学合成された基質ポリペプチドを含んでなり得る。キットはさらにＥＲＭファミリーポリペプチドまたはＥＲＭファミリーポリペプチド由来のフラグメント、例えばモエシン、ラディキシンまたはエズリンを含んでなり得、それはモエシンのＴｈｒ５５８残基に対応する残基およびこの残基を含む周囲の配列の少なくとも一部、例えばこの残基の少なくとも２、３、４、５、６または７残基Ｃ末端およびＮ末端；例えばポリペプチドＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ；またはアミノ酸配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲを含んでなる１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７もしくは１６アミノ酸未満のポリペプチドを包含し、前記で論じたように、各々Ｔ／Ｓ残基以外の残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までの保存もしくは非保存置換を伴うかまたは伴わない。
【００８９】
調製物またはキットは本発明の第１、第２または第３の態様のアッセイにおいて有用であり得る。
【００９０】
キットはさらに特異的結合パートナー、典型的には本発明の基質ポリペプチドのリン酸化可能な残基を包含するエピトープにリン酸化状態に感受性の様式で結合する抗体を含んでなり得る。「リン酸化状態に感受性の様式で結合する」とは、リン酸化可能な部分でリン酸化されている場合、特異的結合パートナーがエピトープ（またはエピトープを含んでなる基質ポリペプチド）に結合することが可能であるが、そのエピトープのリン酸化可能な部分でリン酸化されていない場合、エピトープ（またはエピトープを含んでなる基質ポリペプチド）に結合することが不可能であるという意味を含む。故にリン酸化された、およびリン酸化されていない基質ポリペプチドに関する親和性において、特異的結合パートナーが少なくとも５倍、好ましくは１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００または５０００倍の差異を有するのが好ましい。実際には当分野において公知の方法を用いて調製および精製／選別された（例えば国際公開第０３／０８７４００号参照；例えばリン酸化されたペプチド親和性カラムおよびリン酸化されていないペプチド親和性カラムを使用して親和性精製された）特異的結合パートナーは、必要とされる親和性および結合の特異性を有すると予期される。これらの技術を用いて調製される、そのような抗体の実例は図８およびそこの説明文で記載／使用される。
【００９１】
「抗体」なる用語には、抗原結合部位を保持する、合成抗体およびフラグメントおよび抗体全体のバリアント（例えば前記で論じられた）が含まれる。抗体はモノクローナル抗体でよいが、ポリクローナル抗体調製物、その１つのもしくは複数の部分（例えばＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２）または合成抗体もしくはその一部であってもよい。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントを全て大腸菌中で発現させ、そしてそこから分泌させることができ、故に多量の前記フラグメントの簡便な生成が可能になる。「ＳｃＦｖ分子」とは、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが曲がりやすい（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）オリゴペプチドを介して連結されている分子を意味する。ＩｇＧクラス抗体が好ましい。
【００９２】
公知の技術、例えば「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｈ．Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ＪＧＲ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２）に開示されたような公知の技術を上述のように修正して、選別された抗原に対する適当なモノクローナル抗体を調製し得る。細胞融合により、一価のフラグメントの再会合により、または抗体全体の化学的架橋により二重特異性抗体を調製し得る。二重特異性抗体を調製する方法はＣｏｒｖａｌｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４：１２７−１３２および１３３−１３７および１３８−１４３（１９８７）に開示されている。
【００９３】
その特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な概説はＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１）に見出されるであろう。
【００９４】
「精製された」とは、調製物が少なくとも部分的に、その存在下においてその調整物が形を成していたその他の構成要素、例えば組換え細胞のその他の構成要素から分離されていることを意味する。使用できる精製の方法の実例は、実施例またはＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）に記載される。
【００９５】
調製物は実質的に純粋でよい。「実質的に純粋」とは前記ポリペプチドが実質的にその他のタンパク質を含まないことを意味する。故に我々は前記ポリペプチドとしてタンパク質含量の少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０または３０重量％を含む任意の組成物を含め、タンパク質含量の好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、なおさらに好ましくは少なくとも９０％および最も好ましくは少なくとも９５％は前記ポリペプチドである。
【００９６】
故に本発明はまた前記ポリペプチドおよび混入物質を含んでなる組成物をも含み、前記混入物質は組成物の９６、９５、９４、９０、８５、８０または７０重量％未満、好ましくは組成物の５０重量％未満、さらに好ましくは組成物の３０重量％未満、なおさらに好ましくは組成物の１０重量％未満、および最も好ましくは組成物の５重量％未満を含んでなる。
【００９７】
本発明はまた生体外で（ｅｘ  ｖｉｖｏ）その他の構成要素と組み合わされる場合、実質的に純粋な前記ポリペプチドを含み、前記その他の構成要素は前記ポリペプチドが見出される細胞内に見出される構成要素の全てではない。
【００９８】
本発明のさらなる態様はＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび本発明による基質ポリペプチドを発現することが可能な組換え細胞を提供する。細胞は組換えＬＲＲＫ２ポリヌクレオチドおよび組換え基質ポリペプチドポリヌクレオチドを含んでなり得る。基質ポリペプチドはタグ、またはＬＲＲＫ２と結合もしくは共局在化すると考えられるさらなる部分、例えば前記で論じられたＥＲＭファミリーポリペプチドまたはフラグメントを含んでなり得る。例えば転写活性化因子の配列特異的ターゲティングの技術を用いて、細胞が前記ポリペプチドをコードする内因性配列からＬＲＲＫ２ポリペプチドを過剰発現することは可能であり得る。故にそのように改変（ｍｏｄｉｆｙ）されていない細胞と比較してＬＲＲＫ２ポリペプチドの発現量が増大することを意図した方法で細胞を改変してもよい。細胞は原核または真核細胞であってよい。例えばそれは真核細胞、例えば昆虫、酵母または哺乳動物細胞、例えばヒト細胞であってよい。適当な細胞の実例は例えば実施例またはＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）に記載される。
【００９９】
組換え核酸は好ましくはコードされたポリペプチドを発現するのに適当である。組換え核酸は発現ベクターの形態であってよい。所定のポリペプチドを発現するのに適当な組換えポリヌクレオチドは当業者に周知であり、そして実例は実施例およびＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）に記載される。
【０１００】
本発明のさらなる態様はＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび本発明の基質ポリペプチドを含んでなる組換え細胞を提供する。細胞は典型的には組換えＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび組換え基質ポリペプチドを含んでなる。細胞は本発明の先の態様による細胞でよい。細胞は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドを過剰発現するか、または組換えＬＲＲＫ２ポリペプチドを発現するために改変（ｍｏｄｉｆｙ）されていない同等の細胞よりも少なくとも１．１、１．２、１．５、２、３、５、１０または２０倍多いＬＲＲＫ２ポリペプチドを含んでなり得る。
【０１０１】
「発現に適当な」とはポリヌクレオチドが、ポリペプチドを形成するように翻訳され得るポリヌクレオチド、例えばＲＮＡであるか、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（それは好ましくはＤＮＡ）がプラスミドのような発現ベクターに、発現のために相応しい配向で、および正確な読み枠で挿入されていることを意味する。望まれる任意の宿主により認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列にポリヌクレオチドを連結でき；そのような制御を発現ベクターに組み込むことができる。
【０１０２】
哺乳動物／真核細胞における複製に適当なベクターの特徴は当業者に周知であり、そして後記で実例を挙げる。ベクターは原核および真核細胞の双方における複製に適当であり得ることは理解されよう。
【０１０３】
ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに操作できるように、例えば相補的付着末端を介して連結する種々の方法が開発されている。適当な方法はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）（１９８９）に記載されている。
【０１０４】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変（ｍｏｄｉｆｙ）する望ましい方式は、ＳａｉｋｉらＳｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８）により開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。この方法を用いて例えば適当な制限部位で操作することにより、ＤＮＡを適当なベクターに導入できるか、またはそれを用いて当分野において公知であるその他の有用な方式でＤＮＡを改変できる。
【０１０５】
この方法では酵素的に増幅されるべきＤＮＡは、それ自体増幅されたＤＮＡに組み込まれることになる２つの特異的なプライマーにより挟まれている。前記特異的プライマーは、当分野において公知の方法を用いて発現ベクターにクローニングするために使用することができる制限酵素認識部位を含有し得る。
【０１０６】
ＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）は次いで適当な宿主において発現されて本発明の化合物を含んでなるポリペプチドを生成する。故に、本明細書に含まれる教示に鑑みて適宜改良した公知の技術に従って本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターを構築でき、次いでそれを用いて本発明のポリペプチドを発現および生成するために適切な宿主細胞を形質転換する。そのような技術には、１９８４年４月３日にＲｕｔｔｅｒらに対して発行された米国特許第４，４４０，８５９号、１９８５年７月２３日にＷｅｉｓｓｍａｎ対して発行された第４，５３０，９０１号、１９８６年４月１５日にＣｒｏｗｌ対して発行された第４，５８２，８００号、１９８７年６月３０日にＭａｒｋらに対して発行された第４，６７７，０６３号、１９８７年７月７日にＧｏｅｄｄｅｌに対して発行された第４，６７８，７５１号、１９８７年１１月３日にＩｔａｋｕｒａらに対して発行された第４，７０４，３６２号、１９８７年１２月１日にＭｕｒｒａｙに対して発行された第４，７１０，４６３号、１９８８年７月１２日にＴｏｏｌｅ，Ｊｒらに対して発行された第４，７５７，００６号、１９８８年８月２３日にＧｏｅｄｄｅｌらに対して発行された第４，７６６，０７５号および１９８９年３月７日にＳｔａｌｋｅｒに対して発行された第４，８１０，６４８号（その全てを参照により本明細書の一部とする）において開示されたものが含まれる。
【０１０７】
適切な宿主内に導入するためにポリペプチドをコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）を多様なその他のＤＮＡ配列に結合させることができる。コンパニオンＤＮＡは宿主の性質、宿主内へのＤＮＡの導入の様式、およびエピソーム維持または組み込みが望ましいかどうかに依存するであろう。
【０１０８】
一般にＤＮＡを発現のために相応しい配向でおよび正確な読み枠でプラスミドのような発現ベクターに挿入する。必要により、望まれる任意の宿主により認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列にＤＮＡを連結できるが、そのような制御は一般に発現ベクターにおいて利用可能である。次いで標準的な技術によりベクターを宿主に導入する。一般に全ての宿主がベクターにより形質転換されるわけではない。したがって形質転換された宿主細胞を選別することが必要であろう。１つの選別技術は発現ベクターに任意の必要な制御エレメントと共に抗生物質抵抗性のような形質転換された細胞において選別可能な形質をコードするＤＮＡ配列を組み込むことを伴う。これに代えて、そのような選別可能な形質に関する遺伝子は、望まれる宿主細胞を同時形質転換するために用いられる別のベクター上にあってもよい。
【０１０９】
本発明の組換えＤＮＡにより形質転換されている宿主細胞を次いで十分な時間、および、その後回収されるポリペプチドの発現を可能にするために本明細書に開示される技術に鑑みて当業者に公知の適切な条件下で培養される。
【０１１０】
細菌（例えば大腸菌および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｕｂｔｉｌｕｓ））、酵母（例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｒｏｍｙｃｅｓ・ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む多くの発現系が公知である。
【０１１１】
たとえベクターがその他の非原核生物性の細胞型における発現に使用されることになっていても、ベクターはＣｏｌＥ１  ｏｒｉのような原核生物における増殖のための原核生物レプリコンを含む。ベクターはまた、それとともに形質転換される大腸菌のような細菌宿主細胞における遺伝子の発現（転写および翻訳）を指示することが可能な原核生物プロモータのような適切なプロモータを含むこともできる。
【０１１２】
プロモータはＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を生じさせることが可能であるＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。例示された細菌宿主と適合するプロモータ配列は典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含有するプラスミドベクター内で提供される。
【０１１３】
典型的な原核生物ベクタープラスミドはＢｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（リッチモンド、カリフォルニア州、米国）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ならびにファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）から入手可能なｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。
【０１１４】
典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドはファルマシア社（ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）から入手可能なｐＳＶＬである。このベクターはＳＶ４０後期プロモータを使用して、クローン化された遺伝子の発現を駆動し、ＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原生成細胞では最高レベルの発現が見出されている。
【０１１５】
哺乳動物発現誘導ベクターの実例はこれもまたファルマシア社から入手可能なｐＭＳＧである。このベクターはマウス乳癌ウイルス長末端反復配列のグルココルチコイド誘導プロモータを用いてクローン化された遺伝子の発現を駆動する。
【０１１６】
有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、そして一般にストラタジーン・クローニング・システム社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ラジョーラ、カリフォルニア州９２０３７、米国）から入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組み込みプラスミド（Ｙｅａｓｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄｓ：ＹＩｐｓ）であり、そして酵母選別マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ）である。
【０１１７】
宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれかでよい。細菌細胞は好ましい原核生物宿主細胞であり、そして典型的には例えばベセスダ・リサーチ・ラボラトリ社（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）（ベセスダ、メリーランド州、米国）から入手可能な大腸菌株ＤＨ５および米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（ロックビル、メリーランド州、米国）から入手可能なＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）のような大腸菌の株である。好ましい真核生物宿主細胞には酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽細胞系からのもののような脊椎動物細胞が含まれる。酵母宿主細胞にはＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が含まれ、それらは一般にストラタジーン・クローニング・システム社（ラジョーラ、カリフォルニア州９２０３７、米国）から入手可能である。好ましい哺乳動物宿主細胞にはヒト胚性腎２９３細胞（実施例１参照）、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手可能なサル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞が含まれる。好ましい昆虫細胞はバキュロウイルス発現ベクターで遺伝子導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）することができるＳｆ９細胞である。
【０１１８】
適切な細胞宿主のＤＮＡ構築物での形質転換は、典型的には使用されるベクターの型に依存する周知の方法により達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えばＣｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０（１９７２）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）（１９８９）を参照されたい。酵母細胞の形質転換はＳｈｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）（１９８６）に記載される。Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：１０４−１０９（１９７８）の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、そのような細胞を遺伝子導入するのに有用な試薬、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤はストラタジーン・クローニング・システム社またはライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）（ゲイサーズバーグ、メリーランド州２０８７７、米国）から入手可能である。
【０１１９】
エレクトロポレーションもまた細胞を形質転換および／または遺伝子導入するのに有用であり、そして酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞の形質転換に関する分野で周知である。
【０１２０】
例えばＬｕｃｈａｎｓｋｙら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：６３７−６４６（参照により本明細書の一部とする）に記載される方法により多くの細菌種を形質転換し得る。２５：ＦＤで１ｃｍあたり６２５０Ｖを用いて２．５倍ＰＥＢ中に懸濁されたＤＮＡ−細胞混合物のエレクトロポレーションの後、最大数の形質転換体が一貫して回収される。
【０１２１】
エレクトロポレーションによる酵母の形質転換の方法はＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２（１９９０）に開示される。
【０１２２】
形質転換が成功した細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含有する細胞を周知の技術により同定することができる。例えば、本発明の発現構築物の導入の結果得られた細胞を成長させて本発明のポリペプチドを生成することができる。細胞を収集し、そして溶解させ、そして、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５）またはＢｅｒｅｎｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：２０８（１９８５）により記載されるもののような方法を用いて、細胞のＤＮＡ内容物内に本発明のＤＮＡが存在するかに関して試験することができる。
【０１２３】
組換えＤＮＡがタンパク質を発現させることが可能である場合、組換えＤＮＡの存在に関して直接的に検定することに加えて、形質転換の成功を周知の免疫学的方法により確認することができる。例えば発現ベクターで形質転換が成功した細胞は適切な抗原性を示すタンパク質を生成する。形質転換されていることが疑われる細胞の試料を収集し、そして適当な抗体を使用してタンパク質に関して検定する。
【０１２４】
故に形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明はまたこれらの細胞の培養物、好ましくは栄養培地中のモノクローナル（クローン的に均一な）培養物またはモノクローナル培養物から誘導される培養物を企図する。
【０１２５】
本発明の調製物を作成する本発明の方法のさらなる態様は、本発明に従って細胞からの調製物を精製する工程を含んでなる。宿主細胞を育成し、そして組換えタンパク質を単離する方法は当分野において周知である。適当な精製技術の実例は実施例、またはＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１（前出）号において記載される。当業者には周知であるように、そして実施例またはＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）において記載されるように、例えば精製を補助するために、親和性試薬を使用して調製物の１以上の構成要素はタグ化されていてもよい。
【０１２６】
例えば実施例、またはＪａｌｅｅｌら（２００７）（前出）または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号（前出）において記載されるように、クロマトグラフィー技術もまた用いてもよい。
【０１２７】
本発明のさらなる態様は、本発明の先の態様の方法により得られた、または得ることができる調製物を提供する。調製物は例えばタグ化されたＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび本発明の基質ポリペプチドを含んでなり得る。
【０１２８】
本発明の第１、第２または第３の態様の方法を、本発明の調製物の形態のＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび基質ポリペプチド；または前記で示されたような方法により得られたもしくは得ることができる調製物もしくは複合体を用いて；または本発明の細胞において実施し得る。
【０１２９】
前記のポリペプチドを、当分野において周知の方法により、ならびに後記におよび実施例に記載するように、例えば分子生物学的方法または自動化された化学的ペプチド合成法を用いて作成し得る。
【０１３０】
ペプチド擬似化合物もまた有用であり得ることは理解されよう。故に「ポリペプチド」または「ペプチド」には、我々はアミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合により結合している分子のみならず、ペプチド結合が逆転している分子もまた含めている。例えばＭｅｚｉｅｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３２３０−３２３７（１９９７）（参照により本明細書の一部とする）に記載されるもののような当分野において公知の方法を用いてそのようなレトロインベルソペプチド擬似物質を作成できる。この研究法は、側鎖の配向ではなく骨格を伴う変化を含有する擬ペプチドを作成することを伴う。Ｍｅｚｉｅｒｅら（１９９７）は、少なくともＭＨＣクラスＩＩおよびＴヘルパー細胞応答に関してこれらの擬ペプチドが有用であることを示している。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロインバース（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ）ペプチドはタンパク質分解に対してさらにいっそう抵抗性である。
【０１３１】
同様に、アミノ酸残基のＣＩ原子の間の間隔を保持する適切なリンカー部を用いる場合、ペプチド結合を完全になくすることができる。特にリンカー部がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布、および実質的に同じ平面性を有する場合に、とりわけ好ましい。
【０１３２】
エキソ型のタンパク質分解性消化に対する感受性の低減を助けるために、ペプチドをそのＮまたはＣ末端で都合よく遮断できることは理解されよう。
【０１３３】
故にＬＲＲＫ２またはさらに好ましくは基質ポリペプチドがペプチド擬似化合物であり得ることは理解されよう。
【０１３４】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドおよび基質ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでなる本発明のパーツのキットは、例えば本発明の第１、第２または第３の態様のスクリーニング方法において有用であり得る調製物または複合体を形成するのに有用であり得る。組換えポリヌクレオチドは発現ベクター（例えば前記で論じられたような）中にあるか、または（あまり望ましくない）インビトロ発現に有用であり得る。
【０１３５】
本発明のさらなる態様は配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）、または（Ｗ／Ｒ）（Ｘ）（Ｘ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｔ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｔ）（Ｘ）（Ｒ／Ｔ）（Ｒ）（Ｘ）（ここでＸはアミノ酸を表す）（またはこれに代えてＴ／Ｓ残基以外の残基の、１つ、２つもしくは３つの保存または非保存置換を伴う配列（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｗ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｆ／Ｗ／Ｈ／Ｒ）（Ｙ／Ｗ／Ｒ）（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｙ）を含んでなる）を含んでなるポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドは前記で論じられたようなＬＲＲＫ２に対する基質であると考えられる。基質ポリペプチドに好ましいのは前記で示したようなものである。
【０１３６】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１３７】
ポリヌクレオチドは哺乳動物／真核細胞におけるポリペプチドの複製および／または発現に適当なベクターであってもよい。本発明のなおさらなる態様は、本発明のポリペプチドの発現に適当な組換えポリヌクレオチドである。典型的には組換えポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。
【０１３８】
ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであってよい。ポリヌクレオチドはコード配列にイントロンを含有し得るか、またはしなくてもよい；好ましくは、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであるか、またはｃＤＮＡを含んでなる。
【０１３９】
本発明のさらなる態様は、本発明の基質ポリペプチドをリン酸化する方法を提供し、前記基質ポリペプチドはＬＲＲＫ２ポリペプチドによりリン酸化される。前記方法によりリン酸化される基質ポリペプチドは部分的にまたは十分に脱リン酸化された基質ポリペプチドでよい。
【０１４０】
本発明のさらなる態様は、本発明の基質ポリペプチドをリン酸化する方法におけるＬＲＲＫ２ポリペプチドの使用を提供する。基質ポリペプチドは典型的には下線を付したスレオニンまたはセリン残基上でリン酸化される。
【０１４１】
基質ポリペプチドが既にリン酸化されている場合、さらなるリン酸化は可能でないかもしれないことは理解されよう。細胞から単離された基質ポリペプチド（例えば組換えポリペプチドとして）はそのリン酸化状態に関して不均一であり得ることはさらに理解されよう。例えば単一の細胞または細胞の群／培養物中に、十分にリン酸化された、十分に脱リン酸化された、および／または部分的にリン酸化された分子である基質ポリペプチドが存在し得る。
【０１４２】
本発明のさらなる態様はＬＲＲＫ２変異体、例えばパーキンソン病の患者において見出されるＬＲＲＫ２変異体を特徴付けする方法を提供し、その方法はＬＲＲＫ２変異体が本発明の基質ポリペプチドをリン酸化する能力を評価する工程を含んでなる。その方法は、本発明の基質ポリペプチドに関してＬＲＲＫ２変異体のＫｍおよび／またはＶｍａｘを決定する工程を含んでなり得る。そのような特徴付けはパーキンソン病またはパーキンソン症の根底にあるメカニズムを調査するのに有用であり得る。
【０１４３】
本発明のさらなる態様は試料中のＬＲＲＫ２活性を評価する方法を提供し、その方法は試料が本発明の基質ポリペプチドをリン酸化する能力を評価する工程を含んでなる。その方法は、本発明の基質ポリペプチドに関して試料のＫｍおよび／またはＶｍａｘを決定する工程を含んでなり得る。その方法は試料が本発明の基質ポリペプチドをリン酸化する能力を阻害するＬＲＲＫ２阻害剤の能力を評価する工程を含んでなり得る。ＬＲＲＫ２阻害剤は例えばスニチニブまたはＹ−２７６３２またはＨ−１１５２であってもよい。当業者には周知であるように、試料は例えば患者から得られた試料でよいか、または細胞培養物からの試料もしくはＬＲＲＫ２精製プロトコールの間に採取された試料でよい。試料は例えば患者、細胞培養からまたは精製プロトコールの間に得られた材料から、例えば本明細書に記載するようにＬＲＲＫ２がタンパク質キナーゼ活性を保持することを可能にするＬＲＲＫ２に対する抗体を用いて調製された免疫沈降物でよい。
【０１４４】
基質ポリペプチドのリン酸化を評価する方法の実例は前記および実施例において論じられ、そして前記されたようなリン酸化特異的抗体を使用する方法を含む。
【０１４５】
本発明のさらなる態様は抗体の調製における、ＬＲＲＫ２の残基１００から４９８（または５００）もしくはそのフラグメントまたはそのいずれかとＬＲＲＫ２由来の配列を備えるもの以外との融合体（例えば図１１で示されるような、例えば約１０アミノ酸未満の配列との融合体）からなるポリペプチドの使用を提供する。
【０１４６】
抗体は典型的にはＬＲＲＫ２に結合可能であり、例えばＬＲＲＫ２を細胞材料から免疫沈降することができ、そしてＬＲＲＫ２がタンパク質キナーゼ活性を保持することを可能にする。故に抗体を用いて免疫沈降したＬＲＲＫ２は典型的にはタンパク質キナーゼ活性を保持する。当業者には明白であるように、実施形態では、ポリペプチドを免疫原として使用できるか、または抗体の選別もしくは精製に使用できる。抗体に関係する方法論の用語および実例は前記で論じた。後記の実施例３は免疫原として試験されたＬＲＲＫ２のフラグメントを示す。図１１に示されるようなＬＲＲＫ２（１００−５００）に対して増加させた抗体のみがタンパク質キナーゼ活性を保持するＬＲＲＫ２を免疫沈降するのに有用であることが見出された。
【０１４７】
本発明のさらなる態様は、ＬＲＲＫ２の残基１００から４９８（または５００）もしくはそのフラグメントまたはそのいずれかとＬＲＲＫ２由来の配列を備えるもの以外との融合体（例えば図１１で示されるような、または前記で論じられたような）からなるポリペプチドに対する抗体を増加させる、またはそれに対する結合に基づいて抗体を選別する工程を含んでなる、ＬＲＲＫ２に結合することが可能な抗体を調製する方法を提供する。
【０１４８】
本発明のさらなる態様は、本発明の先の態様の方法により得られた、または得ることができる抗体を提供する。本発明のさらなる態様はＬＲＲＫ２の残基１００から４９８（または５００）もしくはそのフラグメントまたはそのいずれかとＬＲＲＫ２由来の配列を備えるもの以外との融合体（例えば図１１で示されるような、または前記で論じられたような）からなるポリペプチドに結合する抗体を提供する。
【０１４９】
本発明のこれらの態様に関して、前記フラグメントはＬＲＲＫ２の残基１００−１９０ではないことが好ましいかもしれない。
【０１５０】
本発明のさらなる態様はＬＲＲＫ２を調製、検定または検出する方法における本発明の抗体の使用を提供する。そのような使用の実例を前記および実施例にて言及する。
【０１５１】
本発明のさらなる態様はＬＲＲＫ２またはＲＯＣＫ２に関する基質を調査または同定する方法におけるスニチニブ；Ｙ−２７６３２またはＨ−１１５２の使用を提供する。前記および実施例にて記されるように、スニチニブはＬＲＲＫ２を阻害するが、ＲＯＣＫ２を阻害しないと考えられる。実施例にて示すように、そして当業者には明白であるように、ＬＲＲＫ２の基質のリン酸化はスニチニブ、Ｙ−２７６３２およびＨ−１１５２により抑制されるはずであるが；一方ＲＯＣＫ２の基質のリン酸化はＹ−２７６３２およびＨ−１１５２により抑制されるが、スニチニブにより抑制されないはずである。
【０１５２】
本発明のさらなる態様は、ＬＲＲＫ２に関する基質を調査または同定する方法における、変異Ａ２０１６Ｔを有するヒトＬＲＲＫ２；もしくはそのフラグメント；またはそのいずれかの融合体の使用を提供する。フラグメントはＡ２０１６Ｔ変異を有するヒトＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７を含んでなり得る。実施例４にて論じるように、この変異体はＨ−１１５２、Ｙ−２７６３２およびスニチニブのような化合物による阻害に対して抵抗性であると考えられる。すなわち野生型およびＡ２０１６Ｔ変異体が同時に行う細胞培養において過剰発現される場合、次いでＡ２０１６Ｔ変異体を過剰発現する細胞において任意の標的基質のリン酸化はＨ−１１５２、Ｙ−２７６３２またはスニチニブによる阻害に対して感受性が低いはずである。
【０１５３】
本明細書に参照される全ての書類を参照により本明細書の一部とする。誤解を避けるために、Ｊａｌｅｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４０５（２）：３０７−３１７（２００７）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号を参照により本明細書の一部とする。
【０１５４】
以下の非限定的な図面および実施例を参照して、本発明をここでさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】Ｊａｌｅｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）に記載されるように、遺伝子導入されたＨＥＫ２９３細胞からＧＳＴタグ化された、１３２６−エンドの組換えＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓを精製した。Ｈｕｔｔｉら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００４）に記載されるように、この酵素はＬｅｗｉｓ  Ｃａｎｔｌｅｙの研究室（ハーバードメディカルスクール）によりペプチド基質選択性の決定に使用された。反応生成物のデジタル定量から残基選択性が導き出され、その値を（Ｂ）に示す。
【図２】キナーゼデッド調製物を用いて対照反応を実施した。
【図３】（Ａ）リン酸化部位に相対する位置の上方に１文字アミノ酸記号の比例表現により半定量的にＬＲＲＫ２残基選択性を示す。導き出されたコンセンサス配列を前記位置の下方に示す。    （Ｂ）好ましいＬＲＲＫ２残基が置換されている新しいペプチド（以後ニクチド（Ｎｉｃｔｉｄｅ）と称する）を伴う、ＬＲＲＫ２、ＬＲＲＫｔｉｄｅおよび長ＬＲＲＫｔｉｄｅに関して以前に使用されたペプチド基質配列のアラインメントである。    （Ｃ）左のパネルは５分の反応時間でニクチド対長ＬＲＲＫｔｉｄｅの濃度依存的リン酸化を示す。計算されたＫｍ値はニクチドに関して６μＭである。右のパネルは５μＭペプチド濃度での１５分でのＬＲＲＫｔｉｄｅ、長ＬＲＲＫｔｉｄｅおよびニクチドの比較を示す。
【図４】組換えタンパク質との融合体として示されるニクチドの改変。ＧＳＴ、または、ＧＳＴとモエシンのカルボキシ末端（アミノ酸５００−エンド）、ＬＲＲＫｔｉｄｅもしくはニクチドの配列との融合タンパク質を細菌から調製した。これらの組換えタンパク質をＧＳＴタグ化されたＬＲＲＫ２  １３２６−エンドＧ２０１９Ｓの基質として、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰの存在下に１０分間おいた。反応生成物を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてクーマシーブルー染色（ＣＢ）およびオートラジオグラフィ（３２Ｐ）により可視化した。
【図５】ヒツジにおいて免疫原として組換えタンパク質を使用してＬＲＲＫ２のアミノ末端５００アミノ酸に対して抗体を増加させた（図１１参照）。組換えタンパク質での陽性選別により特異的抗体を単離した。全長Ｆｌａｇタグ化されたＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物１ｍｇを、プロテインＧセファロース１０μＬに抱合された漸増量の抗体および対照として抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を用いる免疫沈降に供した。長ＬＲＲＫｔｉｄｅを用いるキナーゼアッセイにおいて免疫複合体を使用した。溶解物からのＬＲＲＫ２の免疫除去（イムノデプリーション；ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）および抗ｆｌａｇを使用する免疫沈降物のイムノブロット分析を示す。
【図６】（Ａ）抗ＬＲＲＫ２  １−５００抗体はマウス脳の溶解物およびヒトリンパ芽球の溶解物から内因性タンパク質を免疫沈降する。ＬＲＲＫ２抗体をＮＩＨ３Ｔ３溶解物１３ｍｇの免疫沈降において使用した。（Ｂ）免疫沈降物を試料バッファで溶出し、そして４−１２％Ｎｏｖｅｘゲル上で分離し、そしてコロイダルブルーで染色した。バンド１および２を切り取り、そして質量分析による分析に供した。バンドはＬＲＲＫ２に関して１６ペプチドの一致を含有したが、一方でバンド２はＬＲＲＫ２に一致するペプチドを含有しなかった。
【図７】漸増量のＮＩＨ３Ｔ３溶解物を使用してＬＲＲＫ２を免疫沈降し、そしてニクチドに対する活性に関して検定した。抗ＬＲＲＫ２反応を黒色の棒で、そして免疫前反応を灰色の棒で表す。
【図８】ホスホ−ニクチド抗原に対して増加させた抗体を使用してニクチドのリン酸化を評価した。野生型ニクチド配列またはアラニンに変異したリン酸化部位のいずれかとのＧＳＴ融合タンパク質を細菌において生成した（ＧＳＴ−ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲまたはＧＳＴ−ＲＬＧＷＷＲＦＹＡＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲ）。これらのタンパク質をＬＲＲＫ２（２９３細胞で発現された、ＧＳＴタグ化された１３２６−エンドＧ２０１９Ｓ）またはバッファを含有するキナーゼ反応に供した。６６または３３０ｎｇのＧＳＴ融合体を含有するこれらの反応物の滴定を、ホスホニクチド抗原に対して増加させた抗体でプロービングした。１０μｇ／ｍＬデホスホニクチドの存在下でイムノブロットを実施した。
【図９】ヒトＥＲＭファミリーポリペプチド配列のアラインメント。
【図１０】ＬＲＲＫ２によるモエシンのリン酸化の分析。（Ａ）エズリン、ラディキシンおよびマーリンのＣ末端領域の配列アラインメント。アスタリスクはモエシンのＴｈｒ５５５に相当するＴｈｒ残基を示す。黒色および灰色で影を付けた残基は各々同一および相同の残基を表す。
【図１１】ＬＲＲＫ２への結合およびＬＲＲＫ２の免疫沈降に有用な抗体を増加させるのに使用されたヒトＬＲＲＫ２残基１００−４９８の融合体。
【図１２】ＬＲＲＫ２に関する基質としてＲＯＣＫ基質の比較。（Ａ−上方のパネル）ＲＯＣＫ２［２−５４３］およびＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］を、ＬＲＲＫｔｉｄｅに対して同一の活性を保有する濃度まで希釈し、そして次にＭｇ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰの存在下で２μＭ  ＭＢＰ−ＭＹＰＴ［７１４−１００４］または熱処理したＧＳＴ−エズリン［全長］［９］と共にインキュベートした。酵素を連続的に２倍で減少させ、三角形の負勾配により表した。１５分後、試料バッファの添加により反応を終止させ、そして生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。コロイダルブルー（ＣＢ）での染色によりゲルを分析し、そしてオートラジオグラフィによりリン酸化をモニタリングした。示された抗体を用いてイムノブロッティングをも行った。（Ａ下方パネル）ペプチド間の類似性をあまり示さないＴｈｒ８５０−ＭＹＰＴおよびＴｈｒ５６７−エズリンを取り囲むアミノ酸配列の比較。（Ｂ）ＲＯＣＫ／ＬＲＲＫ２リン酸化部位を取り囲む、示された種のＥＲＭタンパク質の配列アラインメント。同一の残基には影を付けた。以下のアクセッション配列を使用した：ヒトモエシン［アクセッション番号ＮＰ  ００２４３５］、ヒトエズリン［アクセッション番号ＮＰ  ０３３７０］、ヒトラディキシン［アクセッション番号ＮＰ  ００２８９７］、ハツカネズミ［アクセッション番号ＮＰ  ０３４９６３］、ゼブラフィッシュ［アクセッション番号ＮＰ  ００１００４２９６］、キイロショウジョウバエ（Ｄｍ）［アクセッション番号ＮＰ  ７２７２９０］、エレガンス線虫（Ｃｅ）［アクセッション番号ＮＰ４９１５５０］。（Ｃ）ＬＲＲＫｔｉｄｅにおける基質認識決定因子の分析。ＬＲＲＫｔｉｄｅ基質（ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ）の−６から−５までの残基を太字で示された残基に変異させた。ＨＥＫ２９３細胞から精製されたＧＳＴＬＲＲＫ２  １３２６−２５２７［Ｇ２０１９Ｓ］またはバキュロウイルスから精製されたＲＯＣＫ２（アミノ酸２−５４３）によりリン酸化される能力に関してこれらのペプチドを分析した。ＮＰは、ペプチドのリン酸化が非常に乏しかったために速度論的な解析が実現不能であったことを表す。５００μＭを超えるＫｍ値に関して「〜」なる記号を付して、これらの値が１ｍＭよりも低いペプチド濃度で行われた速度論的な解析から推定されたことを強調している。類似の結果が少なくとも２つの実験で得られた。
【図１３】ＬＲＲＫ２に関する好ましい基質リン酸化配列の決定。（Ａ）組換えＨＥＫ２９３で精製したＬＲＲＫ２（１３２６−２５２７）［Ｇ２０１９Ｓ］酵素およびＬＲＲＫ２（１３２６−２５２７）［Ｄ２０１７Ａ］を使用して、個々のキナーゼアッセイにおいて１８９ビオチン化ペプチドライブラリからなるポジショナルスキャニングペプチドライブラリをスクリーニングした。反応生成物をストレプトアビジンコーティングされた膜に結合し、そして洗浄後、燐光画像（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）によりリン酸化を可視化した。（Ｂ）ｅｎｏｌｏｇｏｓ（登録商標）に入力された（Ａ）からの実験データからＬＲＲＫ２リン酸化部位のロゴを得た。１文字表記のアミノ酸の積み重ねの高さは部位のエントロピーを示し、そして各文字の大きさは−５と＋４の間のリン酸化部位に相対した位置でのその選択性を示す。ロゴの各位置での最大の文字は、ロゴの下に示されたＬＲＲＫｔｉｄｅ基質ペプチドのより長い型の残基の代わりに置換されるために選ばれ、ニクチドを誘導した。（Ｃ）ＬＲＲＫｔｉｄｅ、より長いＬＲＲＫｔｉｄｅ、モエシンのカルボキシ末端（５００−５７７）およびニクチド基質の示されたペプチド配列とのＧＳＴ融合タンパク質を指示された時間、ＨＥＫ２９３精製ＬＲＲＫ２（１３２６−２５２７）［Ｇ２０１９Ｓ］によるリン酸化に供した。試料バッファの添加により反応を停止させ、そして生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。コロイダルブルー（ＣＢ）での染色によりゲルを分析し、そしてオートラジオグラフィ（３２Ｐ）によりリン酸化をモニタリングした。２検体ずつの実験で類似の結果が得られた。
【図１４】ニクチド基質の速度論的解析。（Ａ）Ｎｉｃｔｉｄｅ基質（ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲ）の−５から＋５までの残基を太字で示された残基に変異させた。これらのペプチドを、ＨＥＫ２９３細胞から精製されたＧＳＴ−ＬＲＲＫ２  １３２６−２５２７［Ｇ２０１９Ｓ］またはＧＳＴ−ＬＲＲＫ２  １３２６−２５２７［野生型］によりリン酸化されるその能力に関して分析し、そして〔材料および方法〕に記載するように非線形回帰分析によりＫｍおよびＶｍａｘ値を導出した。類似の結果が少なくとも３つの実験で得られた。（Ｂ）ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２  １３２６−２５２７［Ｇ２０１９Ｓ］に関してＡのデータが導出された代表的な実験からの平均値。（Ｃ）ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２  １３２６−２５２７［野生型］を用いる以外はＢと同様である。
【図１５】ＬＲＲＫ２阻害剤としてのＲＯＣＫ阻害剤の特性評価。（Ａ）パネル１−８はこの研究で利用された阻害剤の化学構造を示す。（Ｂ）１００μＭ  ＡＴＰの存在下で、示された濃度の示された阻害剤の存在下または不在下で、ＬＲＲＫ２  １３２６−２５２７［野生型］および［Ｇ２０１９Ｓ］およびＲＯＣＫ２［２−５４３］を検定した。賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）対照の存在下で測定された対照と比較したキナーゼ活性のパーセンテージとして結果を表す。結果は少なくとも１の他の実験で類似の結果が観察された少なくとも２検体ずつの反応の平均値である。阻害剤は以下のように表される：黒色線および丸によるＨ８９；灰色線四角によるファスジル；灰色線および三角によるヒドロキシファスジル；灰色線および逆三角によるＹ−２７６３２；灰色菱形によるＨ−１１５２；ならびに灰色三角によるスニチニブ。（Ｃ）（Ｂ）のグラフから導出されたＩＣ５０値をμＭで示し、そして表形式で示す。
【図１６】ＬＲＲＫ２阻害剤脱感作変異体の設計。（Ａ）ＬＲＲＫ２、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）およびＲＯＣＫ２に関するサブドメインＶＩＩのＡｓｐを取り囲むアミノ酸の配列アラインメント。同一のアミノ酸に黒色で影を付け、そして類似のアミノ酸に灰色で影を付ける。末端アミノ酸残基に番号付けする。（Ｃ）ＬＲＲＫ２（１３２６−２５２７）［Ｇ２０１９Ｓ］およびＬＲＲＫ２（１３２６−２５２７）［Ｇ２０１９Ｓ／Ａ２０１６Ｔ］を示された濃度の阻害剤の存在下または不在下で、１００μＭ  ＡＴＰの存在下で検定し、そして賦形剤単独の存在下で実施された対照反応のパーセントとして表現した。ＬＲＲＫ２（１３２６−２５２７）［Ｇ２０１９Ｓ］反応を黒丸で表し、そしてＬＲＲＫ２（１３２６−２５２７）［Ｇ２０１９Ｓ／Ａ２０１６Ｔ］反応を白丸で表す。カラースキームは図１５Ｂと同じである。
【図１７】ＬＲＲＫ２およびＲＯＣＫの阻害剤のインビボでの有効性の試験。（Ａ）ＧＦＰタグ化された常時活性型のＧ１４Ｖ−Ｒｈｏを宿すＦｌｐ−ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ細胞は培養培地中１  ｇ／ｍＬドキシサイクリンを含めることにより、誘起されないままであるか、または誘起されるかのいずれかであった。誘起後７時間に、細胞を１０μＭ  Ｈ−１１５２およびＹ−２７６３２で１時間処理した。細胞を直接ＳＤＳ−溶解バッファ中で溶解し、そして４−１２％Ｎｏｖｅｘゲル上で分離し、そして示された抗体を用いるイムノブロット分析に供した。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を使用した以外は（Ａ）と同様に。
【図１８】内因性ＬＲＲＫ２の分析。（Ａ）Ｄ２０１７ＡおよびＧ２０１９Ｓの変異体を含有する全長ｆｌａｇ−タグ化ヒトＬＲＲＫ２およびＬＲＲＫ２を過剰発現するドキシサイクリン誘起ＨＥＫ２９３細胞を〔材料および方法〕に記載するように作成した。抗ＬＲＲＫ２［１００−５００］Ｓ３４８Ｃ抗体を使用して組換えタンパク質を回収した。ＬＲＲＫｔｉｄｅを使用して沈降物をキナーゼ活性に関して検定し、そして抗ＦＬＡＧおよびＳ３７４Ｃ抗ＬＲＲＫ２を用いてイムノブロットした。（Ｂ）示された細胞系の抽出物を、示された抗体を用いる免疫沈降およびＬＲＲＫ２［２４９８−２５１４］抗体を用いるイムノブロットの後、ＬＲＲＫ２タンパク質の存在に関してスクリーニングした。（Ｃ）抗ＬＲＲＫ２［１００−５００］および対照ＩｇＧを６０ｍｇ  Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３溶解物の免疫沈降に使用した。ＬＲＲＫ２の予測される分子量に対応する特異的バンドを切り取り、そして質量分析によりトリプシンペプチドを同定した。（Ｄ）免疫沈降の後にＳｗｉｓｓ３Ｔ３およびＲＡＷ細胞においてニクチド基質に対するＳ３４８Ｃ抗ＬＲＲＫ２［１００−５００］免疫沈降物からの内因性ＬＲＲＫ２キナーゼ活性を測定した。（Ｅ）示された濃度の示された阻害剤の存在下でＳｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞系からの免疫沈降物をニクチド基質に対して検定した。免疫複合体のキナーゼアッセイが３検体ずつで実行され、そして少なくとも２つの別個の実験を代表する。
【発明を実施するための形態】
【０１５６】
表１．ＬＲＲＫ２およびＲＯＣＫ阻害剤のキナーゼプロファイリング
阻害剤が取り除かれている対照インキュベーションと比較したキナーゼ活性のパーゼンテージとして結果を提示する。〔材料および方法〕のセクションで記載するようにタンパク質キナーゼを検定した。結果は３検体の測定値の平均値±標準偏差である。本文で定義されていない略語：ＡＭＰＫ、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ；ＢＲＳＫ、脳特異的キナーゼ；ＢＴＫ、ブルトン型チロシンキナーゼ；ＣａＭＫ１、カルモジュリン依存性キナーゼ；ＣａＭＫＫ、ＣａＭＫキナーゼ；ＣＤＫ、サイクリン依存性キナーゼ；ＣＨＫ、チェックポイントキナーゼ；ＣＫ１、カゼインキナーゼ１；ＣＳＫ、Ｃ末端Ｓｒｃキナーゼ；ＤＹＲＫ、二重特異性チロシンリン酸化および調節キナーゼ；ＥＲＫ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ；ＥＦ２Ｋ、伸長因子２キナーゼ；ＥＰＨ、エフリン；ＦＧＦ−Ｒ、線維芽細胞成長因子受容体；ＧＣＫ、胚中心キナーゼ；ＧＳＫ３、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３；ＨＩＰＫ、ホメオドメイン相互作用タンパク質キナーゼ；ＨＥＲ４、Ｖ−ｅｒｂ−ａ赤芽球性白血病ウイルス発癌遺伝子相同体１；ＩＲＡＫ、インターロイキン１受容体関連キナーゼ４；ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１受容体；ＩＫＫ、阻害性  Ｂキナーゼ；ＩＲ、インスリン受容体；ＩＲＲ、インスリン関連受容体；ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ；Ｌｃｋ、リンパ球細胞特異的タンパク質チロシンキナーゼ；ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ、ＭＡＰＫ−活性化タンパク質キナーゼ；ＭＡＲＫ、微小管親和性調節キナーゼ；ＭＥＬＫ、母系胚性ロイシンジッパーキナーゼ；ＭＫＫ１、ＭＡＰＫキナーゼ１；ＭＬＣＫ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ；ＭＮＫ、ＭＡＰＫ−組み込みタンパク質キナーゼ；ＭＬＫ、混合系統キナーゼ；ＭＩＮＫ、奇形様（Ｍｉｓｓｈａｐｅｎ−ｌｉｋｅ）キナーゼ；ＭＳＫ、マイトジェンおよびストレス活性化タンパク質キナーゼ；ＭＳＴ、哺乳動物相同体Ｓｔｅ２０様キナーゼ；ＮＥＫ、ＮＩＭＡ（ｎｅｖｅｒ  ｉｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ：アスペルギルス・ニデュランスで有糸分裂しない）関連キナーゼ；ＮＵＡＫ１、ＳＮＦ１様キナーゼ１；ＰＡＫ、ｐ２１活性化タンパク質キナーゼ；ＰＨＫ、ホスホリラーゼキナーゼ；ＰＩＭ、モロニーマウス白血病ウイルスのプロウイルス組み込み部位；ＰＫＡ、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ；ＰＤＫ１、３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１；ＰＫＢ、タンパク質キナーゼＢ；ＰＫＣ、タンパク質キナーゼＣ；ＰＫＤ、タンパク質キナーゼＤ；ＰＬＫ、ポロ様キナーゼ；ＰＲＡＫ、ｐ３８調節活性化キナーゼ；ＰＲＫ、タンパク質キナーゼＣ関連キナーゼ；ＲＳＫ、リボソームＳ６キナーゼ；Ｓ６Ｋ、ｐ７０リボソームＳ６キナーゼ；ＳＧＫ１、血清およびグルココルチコイドキナーゼ１；ＳＲＰＫ、セリン−アルギニンタンパク質キナーゼ；ＳＹＫ、脾臓チロシンキナーゼ；ＴＢＫ１、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１；ＴＴＫ、タウチューブリンキナーゼ；ＶＥＧＦＲ、血管内皮成長因子受容体；ＹＥＳ１、ヤマグチ肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体１；ｎ．ｄ．、未決定。
【０１５７】
【表１】
0005002730.tif 000002
【実施例１】
【０１５８】
方法を図の説明文で記載する。
一般的な免疫沈降およびキナーゼアッセイプロトコール
１）溶解バッファ（１０ｃｍ皿用に５００μＬ）中に掻き取ることにより細胞を収集
溶解バッファ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５
１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１ｍＭ  ＮａＶ
５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム
５０ｍＭ  ＮａＦ
０．２７Ｍ  スクロース
１ｍＭ  ＥＧＴＡ
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
使用前に還元剤（０．１％  β−メルカプトエタノール）および阻害剤（１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を添加する。
２）溶解物を１３０００ｒｐｍ、４℃で２５分間遠心し、そして上澄みを保持する。
３）タンパク質アッセイを実施する。
４）プロテインＧセファロース（試料あたり５０％スラリー１０μＬ）に結合したＬＲＲＫ２  １００−５００抗体５μｇを使用して全タンパク質溶解物１〜２ｍｇから免疫沈降させる。
５）溶解物およびビーズに結合した抗体を４℃で２時間混合する。
６）ビーズを遠沈し（１３０００ｒｐｍ、１分）、そして溶解物を除去する。
７）０．５Ｍ  ＮａＣｌを添加した溶解バッファ５００μＬ中にビーズを再懸濁する。
８）ビーズを遠沈し、バッファを除去し、そして０．５Ｍ  ＮａＣｌを加えた溶解バッファでさらに１回、次いでＮａＣｌを加えていない溶解バッファでさらに２回、次いで１倍キナーゼアッセイバッファでさらに１回洗浄を繰り返す。
９）遠沈し、そして全ての上澄みを除去する。ウェスタンブロット用にＳＤＳ  ＰＡＧＥ試料バッファ２０μＬをビーズに添加し、７０℃で１０分間加熱し、そしてゲルに流す。
１０）キナーゼアッセイ用にビーズをキナーゼアッセイバッファ５０μＬに再懸濁し、そして３０℃で２０分間インキュベートする。
１１）キナーゼバッファ４０μＬを１．５ｃｍ角のＷｈａｔｍａｎ  ｐ８１紙にスポットし、そして５０ｍＭリン酸中に入れてキナーゼ反応を終止させる。
１２）ｐ８１紙を５０ｍＭリン酸中で３回×１５分間洗浄する。乾燥させそして計数する。
【０１５９】
キナーゼアッセイバッファ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５
０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ
０．１ｍＭ  ３２Ｐ  ＡＴＰ（およそ３００ｃｐｍ／ピコモル）
０．１％  Ｂ−メルカプトエタノール
２０μＭ  ニクチド基質
【０１６０】
〔材料および方法〕
材料  プロテアーゼ−阻害剤カクテル錠をロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）から入手した；Ｐ８１ホスホセルロース紙はＷｈａｔｍａｎのものであった；［γ３２Ｐ］−ＡＴＰおよび全てのタンパク質クロマトグラフィー溶媒をアマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入した。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）はインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のものであった。プレキャストＳＤＳポリアクリルアミドＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルはインビトロジェン社のものであった；組織培養試薬はライフ・テクノロジーズ社のものであった；Ｍｉｉｌｉｐｏｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐはフィッシャー・サイエンチフィク社（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のものであった。シグナル伝達治療ユニット部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｎｉｔ）（ダンディー大学）によりバキュロウイルスにおいて活性ラットＲＯＣＫＩＩ［残基２−５４３］を発現させた。ＬＲＲＫｔｉｄｅペプチド（ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ）はブリストル大学のＧｒａｈａｍ  Ｂｌｏｏｍｂｅｒｇ博士により合成された。
【０１６１】
抗体  抗ＧＳＴをヒツジにおいてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質に対して増加させた。イムノブロットに使用される西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた二次抗体をピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）から入手した。
【０１６２】
一般的な方法  組織培養、遺伝子導入、イムノブロット、制限酵素消化、ＤＮＡライゲーションおよびその他の組換えＤＮＡ手順は標準的なプロトコールを用いて実施した。全ての変異誘発をＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発法（ストラタジーン社）を用いて実施した。遺伝子導入に使用されるＤＮＡ構築物を大腸菌ＤＨ５αからキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）製プラスミドＭｅｇａまたはＭａｘｉキットを製造者のプロトコールに従って使用して精製した。ダンディー大学生命科学部シークエンシングサービス（スコットランド、英国）によりアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）自動ＤＮＡシークエンサーでＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターケミストリー（アマシャム・バイオサイエンス社）を用いて実施されたＤＮＡシークエンシングにより全てのＤＮＡ構築物を検証した。
【０１６３】
バッファ  溶解バッファは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１（重量／容量）％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭβ−グリセロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  フッ化ナトリウム、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２７Ｍスクロース、０．１（容量／容量）％２−メルカプトエタノールおよび完全プロテイナーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍＬ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含有した。バッファＡは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび０．１（容量／容量）％２−メルカプトエタノールを含有した。抽出バッファは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５（容量／容量）％グリセロール、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０３（容量／容量）％Ｂｒｉｊ−３５、完全プロテイナーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍＬ）を含有した。試料バッファは１容量％２−メルカプトエタノールを含有する１倍ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料バッファ（インビトロジェン社）であった。
【０１６４】
プラスミド  ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＶ６３９７５に対応するＬＲＲＫ２をコードする全長ｃＤＮＡクローンはＭｉｃｈｅｌ  Ｇｏｅｄｅｒｔ博士（ケンブリッジ大学分子生物学研究室）からの寛大なる贈呈であった。この研究で利用されたＬＲＲＫ２遺伝子の全長およびフラグメントを標準的なＰＣＲ法に従ってＫＯＤポリメラーゼ（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））を使用してＬＲＲＫ２  ｃＤＮＡフラグメントから増幅した。得られたＰＣＲ産物を哺乳動物ｐＥＢＧ２ＴおよびｐＣＭＶ５発現ベクターにＢａｍｈ１−Ｎｏｔ１フラグメントとしてサブクローニングした。ジーンサービス社（Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅ）から注文したＥＳＴ（ＩＭＡＧＥクローン４９０８５８０）からＰＣＲによりヒトモエシン（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ  ００２４３５）の全長およびＣ末端フラグメントをコードするｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物を異なる発現ベクターにＮｏｔ１−Ｎｏｔ１フラグメントとしてライゲートした。
【０１６５】
ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２の発現および精製  典型的には１０から１００個の直径１０ｃｍの皿のＨＥＫ２９３細胞を培養し、そしてポリエチレンイミン法［１５］を用いてＬＲＲＫ２の野生型または異なる変異形態をコードするｐＥＢＧ−２Ｔ構築物５μｇで各皿を遺伝子導入した。細胞をさらに３６時間培養し、そして氷冷溶解バッファ０．５ｍＬ中で溶解し、溶解物をプールし、そして２６，０００×ｇで４℃にて１０分間遠心した。ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン−セファロースのアフィニティクロマトグラフィーにより精製し（２９３細胞の皿あたり１０μＬ）、そして２０ｍＭグルタチオンおよび０．２７Ｍスクロースを含有するバッファＡで溶出した。酵素を小アリコートで瞬間凍結し、そして−８０℃で保存した。
【０１６６】
大腸菌におけるヒトモエシンの発現および精製
ヒトモエシンの野生型および変異形態をコードするｐＧＥＸ発現構築物を大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換し、そして１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬｕｒｉａブロス中で培養物１Ｌを３７℃で、６００ｎｍでの吸光度が０．８になるまで増殖させた。１００μＭイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシドを添加することによりタンパク質発現の誘起を実行し、そして細胞を２６℃でさらに１６時間培養した。細胞を遠心により単離し、氷冷溶解バッファ１５ｍＬに再懸濁し、そして凍結／解凍の１ラウンドで溶解し、続いて超音波処理によりＤＮＡを断片化した。溶解物を２６，０００×ｇで４℃にて３０分間遠心し、そして組換えタンパク質をグルタチオン−セファロース０．２ｍＬで親和性精製を行い、そして２０ｍＭグルタチオンおよび０．２７Ｍスクロースを含有するバッファＡ０．４ｍＬ中に溶出した。
【０１６７】
Ｇ２０１９Ｓ  ＬＲＲＫ２によりリン酸化されたモエシン上の部位のマッピング
モエシン（４μｇ）を６５℃で１５分間処理し、そして次に１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００μＭ［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（１０，０００ｃｐｍ／ピコモル）を含有するバッファＡを全反応物容量５０μＬでＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］１．５μｇと共に３０℃でインキュベートした。４０分後に試料バッファを、ＬＤＳ−１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）最終濃度１（重量／容量）％まで添加することにより反応を終止させ、そして試料を１００℃で１分間加熱し、そして氷上で冷却した。４−ビニルピリジンを５０ｍＭの濃度まで添加し、そして試料を振盪台上に室温で３０分間放置してシステイン残基をアルキル化した。試料をＢｉｓＴｒｉｓ４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に供し、それをコロイダルブルーで染色し、そして次にオートラジオグラフィにかけた。リン酸化されたモエシンバンドを切り取り、さらに小片に切断し、振動台上で以下のもの１ｍＬで１５分間逐次的に洗浄した：水、水およびアセトニトリルの１：１混合物、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム、０．２Ｍ炭酸水素アンモニウムおよびアセトニトリルの１：１混合物ならびに最後にアセトニトリル。ゲル片をｓｐｅｅｄｉ−ｖａｃにより乾燥させ、そして５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム０．１ｍＬ、質量分析等級のトリプシン（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））１μｇを含有する０．１（重量／容量）％ｎ−オクチル−グルコシド中でインキュベートした。１６時間後、アセトニトリル０．１ｍＬを添加し、そして混合物を振盪台上で１０分間インキュベートした。上澄みを除去し、そしてゲル片を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム０．３ｍＬおよび０．１（容量／容量）％トリフルオロ酢酸中１０分間さらに洗浄した。９０％を超える３２Ｐ放射活性を含有する混合した上澄みを、０．１（容量／容量）％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡にしたＶｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５２１５  Ｃ１８カラム（セパレーションズグループ社（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、エスペリア、カリフォルニア州）のクロマトグラフィーにかけた。カラムをアセトニトリルの線形勾配（斜線）で流速０．２ｍＬ／分で展開し、そして０．１ｍＬの分画を収集した。Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｅｌｅｃｔ樹脂（シグマ社）の固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によりホスホペプチドをさらに精製した。
【０１６８】
ホスホペプチド配列分析
単離されたホスホペプチドをアプライドバイオシステムズ４７００プロテオミクス分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ）でマトリックスとして５μｇ／ｍＬアルファシアノ桂皮酸を使用して分析した。リフレクトロンおよびリニアの双方のモードでスペクトルを獲得し、そして選別された質量でＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳを実施することによりホスホペプチドの配列を確認した。親ホスホペプチドからのリン酸（Ｍ−９８Ｄａ）の特徴的な喪失およびホスホセリンに関するデヒドロアラニン（Ｍ−６９ｋＤａ）またはホスホスレオニンに関するデヒドロアミノ酪酸（−８３）の中間的な消失を用いてリン酸化部位の位置を割り当てた。全ての３２Ｐ標識されたペプチドのリン酸化の部位を、以前に記載されたように［１６］Ｓｅｑｕｅｌｏｎ−ＡＡ膜（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ）に結合したペプチドのアプライドバイオシステムズ４９４Ｃシークエネーターでの固相Ｅｄｍａｎ分解により決定した。
【０１６９】
基質としてモエシンまたはＭＢＰを使用するＬＲＲＫ２のアッセイ
ＬＲＲＫ２の野生型または変異形態のいずれか０．５〜０．７μｇ、１μＭモエシン（全長または示された変異体、アッセイ前に氷上に放置されていたか、または６５℃で１５分間インキュベートされていた）または１μＭミエリン塩基性タンパク質、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（３００ｃｐｍ／ピコモル）を含有するバッファＡ全容量２５μＬでアッセイを設定した。３０℃で３０分間インキュベートした後、ＬＤＳ−試料バッファを添加することにより反応を停止させた。４〜１２％ポリアクリルアミドゲルでの試料の電気泳動および乾燥したクーマシーブルー染色ゲルのオートラジオグラフィの後に、リン酸のモエシンまたはＭＢＰ基質への組み込みおよびＬＲＲＫ２自己リン酸化を決定した。またリン酸化された基質をゲルから切り取り、そして３２Ｐの組み込みをチェレンコフ計数により定量化した。
【０１７０】
基質としてＬＲＲＫｔｉｄｅを使用するＬＲＲＫ２のアッセイ
３００μＭまたは示された濃度のＬＲＲＫｔｉｄｅ（ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ）ペプチド基質の存在下、野生型または変異形態のＬＲＲＫ２のいずれか０．５〜０．７μｇ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（３００ｃｐｍ／ピコモル）を含有するバッファＡ全容量５０μＬでアッセイを設定した。３０℃で３０分間インキュベートした後、反応混合物４０μＬをＰ８１ホスホセルロース紙に加えることにより反応を終止させ、そしてＰ８１ホスホセルロースを５０ｍＭリン酸中で洗浄し、そしてチェレンコフ計数した後、ＬＲＲＫｔｉｄｅのリン酸化を定量化した。ＬＲＲＫ２活性の１単位（Ｕ）を、１ナノモルの３２ＰのＬＲＲＫｔｉｄｅへの組み込みを触媒する酵素の量として定義した。種々濃度のＬＲＲＫｔｉｄｅを使用して前記で記載されたアッセイを実施することによりＫｍおよびＶｍａｘパラメータを決定した。ＫｍおよびＶｍａｘパラメータをＧｒａｐｈ−Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて計算した。
【０１７１】
イムノブロッティング
試料を試料バッファ中７０℃で５分間加熱し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そしてニトロセルロース膜に移した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０（重量／容量）％脱脂粉乳を含有する０．２（容量／容量）％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴバッファ）中で膜を３０分間ブロックした。５（重量／容量）％脱脂粉乳を含有するＴＢＳＴバッファ中１μｇ／ｍＬ抗ＧＳＴ抗体で４℃にて１６時間膜をプロービングした。西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体および化学発光増強試薬を用いて検出を行った。
【実施例２】
【０１７２】
化合物スクリーニングに適当なアッセイ形式
ＬＲＲＫ２ポリペプチドの基質としての本発明の基質ポリペプチドの同定に鑑みて、当分野において公知のタンパク質キナーゼスクリーニングアッセイ形式を適合させて使用できる。
【０１７３】
例えば実施例１または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１号にて用いられる技術を化合物のスクリーニングに用いることができる。国際公開第０３／０８７４００に記載されるものに類似するアッセイを用いることができる。ハイスループット操作が可能であるスクリーニングアッセイを用いることができる。例えば本発明の基質ポリペプチドを使用する、例えばペプチドのリン酸化形態に結合するが非リン酸化形態には結合しない抗体（またはその逆）を使用するアッセイが適当であり得る。
【０１７４】
例えば、細胞容積の応答に及ぼす化合物の効果を評価する場合、細胞に基づくアッセイを用いることができる。
【０１７５】
当業者に周知であるように、例えば表面プラスモン共鳴基盤の技術またはチップ基盤の結合アッセイを用いるタンパク質−タンパク質結合アッセイを用いることができる。
【０１７６】
当業者に周知であるようにＳＰＡ基盤（シンチレーション近接アッセイ；アマシャム・インターナショナル社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））アッセイを用いることができる。例えばシンチラントおよび本発明の基質ポリペプチドを含んでなるビーズを調製できる。ビーズを３２Ｐ−または３３Ｐ−γ−標識されたＡＴＰ、ＬＲＲＫ２ポリペプチドを含んでなる試料と、および被験化合物と混合できる。これを９６ウェル形式で行うのが都合よい。次いで適当なシンチレーションカウンターを用いて、３２Ｐまたは３３Ｐ  ＳＰＡアッセイに関する公知のパラメータを用いてプレートを計数する。シンチラントに近接する３２Ｐまたは３３Ｐのみ、すなわちビーズに結合した基質に結合するもののみが検出される。例えば基質ポリペプチドが抗体または抗体フラグメントへの結合を介してシンチラントビーズに固定されているようなアッセイの変法を用いることもできる。
【０１７７】
小型薬物様化合物ライブラリのスクリーニングに適当な非放射活性アッセイをＥＬＩＳＡ形式で用いることができる。
【０１７８】
例えばウェスタンブロッティングで使用するために抗ホスホペプチド抗体をヒツジにおいて増加させることができる。それらをＥＬＩＳＡ形式での使用のために評価する。例えばＧＳＴタグを介する吸着または捕捉による、基質ポリペプチドのマイクロタイタープレートへの固定は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドが基質ポリペプチドをリン酸化する能力に影響しないと予期される。
【０１７９】
ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）３８４透明プレートでアッセイを実施することができる。基質ポリペプチド３０ｎｇ／ウェルはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）中、４℃で一晩コーティングされる。過剰の結合部位を０．２％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）含有ＴＢＳ中の５％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックし、そして次にＴＢＳＴで３回洗浄する。反応バッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０１％ＢＳＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中のＬＲＲＫ２（１〜１０００ｎｇ）１５μＬをウェルに添加し、そして１１％ＤＭＳＯに溶解した化合物２μＬを添加し、そして３０分間インキュベートした。ＡＴＰ（１〜１０００μＭ）／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５μＬの添加により反応を開始させ、そして室温で２５分間インキュベートする。０．５Ｍ  ＥＤＴＡ２０μＬの添加により反応を停止させる。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した後、抗ホスホポリペプチド抗体（２０μｇ／ｍＬ遮断ペプチド含有ＴＢＳＴで１：３７００倍希釈）２２μＬを添加した。１時間後、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、そして次に抗ヒツジペルオキシダーゼ抱合体（１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで１：５０００希釈）２２μＬを各ウェルに添加し、そしてさらに１時間インキュベートする。最後にＴＢＳＴで４回洗浄を実施した後、５０ｍＭ酢酸、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０００９％Ｈ２Ｏ２中のペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンＴＭＢ２２μＬを添加する。１５分間発色させ、そして１Ｍ  ＨＣｌ  ５μＬの添加により停止させる。４５０ｎｍの吸光度リーダーでプレートを読む。
【０１８０】
異なる色の検出を可能にする、代替の市販により入手可能なペルオキシダーゼ基質を使用できる。例えばオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）（４９２ｎｍで読む）またはジアンモニウム２，２’−アジノ−ビス（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホナート）（４０５ｎｍで読む）。１０−アセチル−３，７，ジヒドロキシフェノキサジンまたは発光用のルミナールに基づく基質のような蛍光基質を使用する代替の検出テクノロジーを適用することもできる。
【０１８１】
アッセイは広範なＡＴＰ濃度（１〜１０００μＭ）および１％ＤＭＳＯ（化合物保存溶媒）に耐容性を示すと考えられる。それはいくつかの洗浄工程を伴い不均一であるので、自己蛍光、クエンチングまたは吸収による化合物緩衝は最小化されると考えられる。
【実施例３】
【０１８２】
ＬＲＲＫ２に対する抗体の作成
表２に示される免疫原配列を使用してＬＲＲＫ２に対する抗体をヒツジにおいて作成した。ＬＲＲＫ２（１００−５００）（図１１に示される免疫原）に対して増加させた抗体のみが、タンパク質キナーゼ活性を保持するＬＲＲＫ２を免疫沈降するのに有用であると考えられ、そしてしたがってタンパク質キナーゼアッセイにおいて有用であった。ＬＲＲＫ２（２０７８−２０９９）に対して増加させた抗体Ｓ２２４ＣはＬＲＲＫ２を免疫沈降したが、キナーゼ活性に対して阻害性であった。抗体ＬＲＲＫ２（１２４５−１２５９）はイムノブロッティングにおいて有用であると考えられるが、免疫沈降において有用ではないと考えられる。
【０１８３】
【表２】
0005002730.tif 000003
【０１８４】
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【実施例４】
【０１８５】
パーキンソン病変異タンパク質キナーゼＬＲＲＫ２の基質特異性および阻害剤
ロイシンリッチリピートタンパク質キナーゼ−２（ＬＲＲＫ２）は有意な数のパーキンソン病患者において変異しているが、その調節および機能についてはほとんど知られていない。Ｇｌｙ２０１９をＳｅｒに変える共通する変異は触媒活性を強化し、これは小型分子阻害剤がパーキンソン病を処置するのに有用性があり得ることを示唆している。種々の研究方法を利用してＬＲＲＫ２の基質特異性の要件を探索し、そしてニクチドと称されるペプチド基質を製作し、それは広く配備されているＬＲＲＫｔｉｄｅ基質よりも２０倍低いＫｍおよび２倍に近く高いＶｍａｘを有した。ＬＲＲＫ２がＳｅｒよりもＴｈｒのリン酸化に著明な選択性を有することを実証する。Ｙ−２７６３２およびＨ−１１５２のようないくつかのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤が、ＲＯＣＫ２を阻害するのと類似の効力でＬＲＲＫ２を抑制することもまた観察した。正常には活性であるが、Ｈ−１１５２、Ｙ−２７６３２およびスニチニブに耐性があり、その他の化合物とは対照的にＬＲＲＫ２をも抑制するが、ＲＯＣＫを抑制しない構造的に関連性のないマルチキナーゼ阻害剤である変異体ＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ］もまた同定した。内因性ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性を測定する最初のアッセイもまた開発した。最後に、基質がＬＲＲＫ２によりリン酸化されるかどうかを検証する薬理学的研究法を記載し、そしてこれを用いてＬＲＲＫ２が提示された基質モエシンのリン酸化の律速ではないであろうという証拠を提供する。この研究で報告した我々の知見はＬＲＲＫ２キナーゼの調査を補助するであろう。
【０１８６】
ロイシンリッチリピートタンパク質キナーゼ−２（ＬＲＲＫ２）をコードする遺伝子内の常染色体性優性の点変異はヒトをパーキンソン病（ＰＤ）に罹りやすくする［１、２］。ＬＲＲＫ２変異を伴う患者は一般に特発性ＰＤと区別できない臨床的所見および臨床症状を伴い通常年齢６０−７０歳でＰＤを発症する［３］。ＬＲＲＫ２における変異は家族性ＰＤの４％を占め、そして散発性ＰＤ患者の１％で観察される［３］。どのようにＬＲＲＫ２が調節され、その基質は何なのか、そしてどのように変異がＰＤを引き起こすのかについてはほとんど知られていない。
【０１８７】
ＬＲＲＫ２はロイシンリッチリピート（残基１０１０−１２８７）、ＧＴＰａｓｅドメイン（残基１３３５−１５０４）、ＣＯＲドメイン（残基１５１７−１８４３）、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼドメイン（残基１８７５−２１３２）およびＷＤ４０リピート（２２３１−２２７６）からなる２５２７残基の大きなマルチドメインタンパク質キナーゼである［４］。これまでのところ主にアミノ酸置換を含んでなる４０を超える変異が報告されている［５］。最も頻繁な変異はキナーゼドメインのサブドメインＶＩＩ−ＤＦＧモチーフ内に位置する高度に保存されたＧｌｙ２０１９のＳｅｒ残基へのアミノ酸置換を含んでなる［５］。いくつかの研究によりこの変異がＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性を２から３倍に強化することが報告されており、それはＬＲＲＫ２阻害剤がＰＤの治療に対する有用性を有し得ることを示唆している［６］。非特異的／マルチキナーゼタンパク質キナーゼ阻害剤スタウロスポリン（ＩＣ５０  ２ｎＭ）、Ｋ２５２（ＩＣ５０  ４ｎＭ）、Ｓｕ−１１２４８／スニチニブ（ＩＣ５０  １５ｎＭ）［７，８］以外に選択的ＬＲＲＫ２阻害剤はこれまでのところ報告されていない。
【０１８８】
以前に活性化されたＰＤ  ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異体によりリン酸化されたタンパク質を同定するためにラット脳抽出物でＫＥＳＴＲＥＬスクリーニングを行った。これによりアクチン−細胞骨格を細胞膜に繋留するＥＲＭタンパク質のメンバーであるモエシンが、以前にインビボで同定された、モエシンがアクチンに結合する能力を調節するリン酸化部位であるＴｈｒ５５８でＬＲＲＫ２により効率よくリン酸化されるという観察に至った［９］。ＬＲＲＫ２はまたモエシンに関係するその他のＥＲＭタンパク質、エズリンおよびラディキシンをＴｈｒ５５８に均等な残基で、およびＴｈｒ５５８を包含するペプチド（ＬＲＲＫｔｉｄｅ）をリン酸化した［９］。以前の業績により、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）もまたインビトロで、および細胞において過剰発現されたときの双方でモエシンのＴｈｒ５５８に均等な残基でＥＲＭタンパク質をリン酸化できることが示唆されていた［１０−１２］。ＬＲＲＫ２が細胞においてＥＲＭタンパク質をリン酸化することを実証する証拠は公開されていない。
【０１８９】
ＬＲＲＫ２の機能的特徴付けを補助するために、ＬＲＲＫ２の基質特異性を分析し、そして広く配備されているＬＲＲＫｔｉｄｅ基質よりも２０倍低いＫｍおよび２倍に近く高いＶｍａｘを有するペプチド基質ニクチドを製作した［９］。いくつかの以前に報告されたＲＯＣＫ阻害剤もまたＲＯＣＫを阻害するのと類似の効力でＬＲＲＫ２を阻害することも観察した。さらにＬＲＲＫ２を阻害するが、ＲＯＣＫを阻害しない対照化合物としてスニチニブを配備できることも実証する。正常には活性であるが、ＬＲＲＫ２阻害剤による阻害には２０倍感受性が低いＬＲＲＫ２の阻害剤抵抗性変異体を作成した。内因性ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性を定量化することを可能にする最初の頑健なアッセイを開発し、そしてＬＲＲＫ２基質を認証するために配備され得る薬理学的戦略を提示する。本研究で提示される知見はＬＲＲＫ２の調節および機能を精査するのを助けるであろう。
【０１９０】
〔材料および方法〕
試薬および一般的な方法
組織培養試薬はライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのものであった。グルタチオンセファロース４Ｂはアマシャム・バイオサイエンス社からのものであり、そして［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰおよび［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰはパーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）からのものであった。Ｐ８１ホスホセルロース紙はワットマン社（Ｗｈａｔｍａｎ）製であった。ＬＲＲＫｔｉｄｅおよびその誘導体はペプシューテジカルズ社（Ｐｅｐｃｅｕｔｉｃａｌｓ）により合成された。Ｆｌｐ−ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘシステムはインビトロジェン社からのものであり、そして安定した細胞系は製造者の説明書どおりに、ハイグロマイシンでの選別により作成した。制限酵素消化、ＤＮＡライゲーションおよびその他の組換えＤＮＡ手順は標準的なプロトコールを用いて実施した。全ての変異誘発をＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン社）を使用して実行した。遺伝子導入に使用されるＤＮＡ構築物を大腸菌ＤＨ５  からキアゲン社製またはインビトロジェン社製プラスミドＭａｘｉキットを製造者のプロトコールに従って使用して精製した。ＤＮＡシークエンシングをダンディー大学生命科学部シークエンシングサービス（スコットランド、英国）によりアプライドバイオシステムズ自動ＤＮＡシークエンサーでＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーター化学（アマシャム・バイオサイエンス社）を用いて実施したＤＮＡシークエンシングにより全てのＤＮＡ構築物を検証した。
【０１９１】
バッファ
溶解バッファは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１（重量／容量）％１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭβ−グリセロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２７Ｍスクロース、１ｍＭベンズアミジンおよび２ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有し、そしてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または０．５（容量／容量）％ＮＰ−４０のいずれかで上述のように１５０ｍＭまで補充された。バッファＡは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび０．１（容量／容量）％２−メルカプトエタノール、ならびに０．２７Ｍスクロースを含有した。図６で細胞溶解に用いられたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶解バッファは、１％ＳＤＳおよび０．１％２メルカプトエタノールで補充され、そしてｐＨ６．８に調整された溶解バッファであった。
【０１９２】
細胞培養、処理および細胞溶解
１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび１倍抗真菌剤／抗菌剤溶液を補充したダルベッコ変法イーグル培地中でＨＥＫ−２９３細胞を培養した。１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミン、１倍抗真菌剤／抗菌剤溶液、ならびに１５μｇ／ｍＬブラストサイジンおよび１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを補充したＤＭＥＭ中でＴ−ＲＥｘ細胞系を培養した。ポリエチレンイミン法により細胞遺伝子導入を実施した［１４］。示された時間、培養培地中に１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを含めることにより培養物を誘起して示されたタンパク質を発現させた。阻害剤を利用する場合、それらをＤＭＳＯに溶解し、そして示された濃度で使用し、均等な容量のＤＭＳＯを対照として使用した。培養培地中のＤＭＳＯの最終濃度は決して０．１（容量／容量）％を超えなかった。溶解の６０分前に阻害剤を培養培地に添加した。示された界面活性剤を補充した溶解バッファ１５ｃｍ皿あたり１．０ｍＬで細胞を溶解し、そして１６，０００×ｇで４℃にて１０分間遠心することにより清澄化した。誘導および阻害剤処理の後、Ｔ−ＲＥｘ−ＧＦＰ  Ｒｈｏ発現細胞をＰＢＳで洗浄した後、室温にてＳＤＳ溶解バッファで溶解した。ＳＤＳ溶解物を煮沸し、そして超音波処理して粘性を低減した。全ての溶解物上澄みを液体窒素中で瞬間凍結し、そして用時まで−８０℃で保存した。標準としてＢＳＡを用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１９３】
組換えタンパク質の精製
溶解バッファが０．５（容量／容量）％ＮＰ−４０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有した以外は［９］に記載されるように組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＬＲＲＫ２  １３２６−２５２７およびそのバリアントを調製した。以下の組換えタンパク質をシグナル伝達治療部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ）（ダンディー大学）にて作成した：ラットＲＯＣＫ２（アミノ酸２−５４３）、ニワトリマルトース結合タンパク質−ＭＹＰＴ（アミノ酸７１４−１００４）、ＧＳＴ−エズリン（アミノ酸１−５８６）、ＧＳＴ−モエシン（アミノ酸１−５７７）およびＧＳＴ−ＬＲＲＫ２（アミノ酸１００−５００）。ペプチド基質をｐＧＥＸ−６ＰベクターにおいてＧＳＴ融合体として表示した。ＧＳＴ−ＬＲＲＫｔｉｄｅおよびＧＳＴ−ニクチドの発現を誘起するために、大腸菌ＢＬ２１形質転換体を３７℃でＯＤ６００  ０．５まで培養し、そして１６℃でイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを最終濃度１ｍＭまで添加することにより誘起した。１（容量／容量）％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶解バッファ中で超音波処理により細胞を溶解した。可溶性分画を１５０００×ｇで２０分間遠心することにより回収した。グルタチオンセファロースクロマトグラフィーにより組換えタンパク質を精製し、そしてタンパク質を２０ｍＭグルタチオン、１ｍＭベンズアミジンおよび２ｍＭ  ＰＭＳＦを含むバッファＡで溶出した。
【０１９４】
抗体
アミノ酸のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を細菌において発現させ、そしてグルタチオンセファロースクロマトグラフィーにより精製した。ＧＳＴタグの切断の後、ＬＲＲＫ２［１００−５００］を免疫原として使用してポリクローナル抗体（Ｓ３４８Ｃ）を増加させた。ＬＲＲＫ２［１００−５００］タンパク質免疫原を使用して抗血清から抗体を親和性精製した。以前に記載されたもの［１５］に類似する、アミノ酸２４９８−２５１４（キーホールリンペットヘモシアニン［ＫＬＨ］に結合させるためにＮＨ２システインを伴うＣＩＮＬＰＨＥＶＱＮＬＥＫＨＩＥＲ）を包含するペプチド免疫原に対してＬＲＲＫ２に対する抗体（Ｓ３７４Ｃ）を増加させた。抗体をペプチドに対する親和性により精製した。精製された全長タンパク質をヒツジに注射し、続いて抗体を抗原に対する親和性により精製することにより抗モエシン（Ｓ１３５Ｃ）および抗エズリン抗体（Ｓ２４５Ｃ）を作成した。ＫＬＨ抱合ホスホペプチドＣＤＫＹＫＴｐＬＲＱＩをヒツジに注射することによりパンホスホＥＲＭ抗体（Ｓ２９ＢＣ）を作成し、そしてホスホおよび脱ホスホペプチドに対して各々陽性および陰性選別することにより親和性精製した。ヒツジポリクローナル抗体（Ｓ６６２Ｂ）をＭＢＰ−ＭＹＰＴニワトリアミノ酸（７１４−１００４）に対して増加させた。ＭＹＰＴホスホスレオニン８５０に対するウサギポリクローナル抗体はアップステート社（Ｕｐｓｔａｔｅ）（＃３６−００３）製であった。抗ＧＦＰ抗体（Ｓ２６８Ｂ）を組換えＧＦＰタンパク質に対して増加させ、そして抗原に対する親和性により精製した。ＥＲＫ１／２に対する抗体（Ｓ２２１Ｂ）をＧＳＴ−ＥＲＫ１タンパク質に対して増加させた。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体および親和性マトリックスはシグマ社（Ａ２２２０）製であった。
【０１９５】
特異性キナーゼパネル
全てのアッセイをタンパク質キナーゼプロファイリング国立センター（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｉｎａｓｅ−ｓｃｒｅｅｎ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／）で以前に記載されたように実施した［１６］。簡単には全てのアッセイをロボット制御で室温にて（およそ２１℃）実行し、そして用いられた条件下で時間および酵素濃度に関して線形であった。Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｍｉｃｒｏ試薬ディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いてアッセイを９６ウェル形式で３０分間実施した。各キナーゼに関する略語を表１に対する説明文で定義する。アッセイ中の酢酸マグネシウムの濃度は１０ｍＭであり、そして各酵素に関してＡＴＰに関するＫｍになるかまたはそれを下回るために、［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ（約８００ｃｐｍ／ピコモル）をＣＫ２α、ＤＹＲＫ３、ＥＦ２Ｋ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ８、ＧＳＫ３β、ＨＩＰＫ２、ＨＥＲ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＲＲ、ＭＡＲＫ３、ＭＫＫ１、ｐ３８γＭＡＰＫ、ｐ３８δＭＡＰＫ、ＰＡＫ４、ＰＩＭ２、Ａｋｔ１、ＰＬＫ１、ＰＫＣおよびＰＲＫ２に関して５μＭで；Ａｕｒｏｒａ  Ｂ、ＣａＭＫＫβ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＫ１δ、ＣＳＫ、ＥＰＨ−Ｂ３、ＦＧＦ−Ｒ１、ＧＣＫ、ＩＲＡＫ４、ＩＲ、ＪＮＫ１α１、ＪＮＫ２α２、ＬＫＢ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＬＫ１、ＭＬＫ３、ＭＳＫ１、ＭＳＴ２、ＭＳＴ４、ｐ３８βＭＡＰＫ、ＮＵＡＫ、ＰＫＡ、ＰＡＫ５、ＰＡＫ６、ＰＤＫ１、ＰＩＭ１、ＰＩＭ３、ＰＫＣα、ＲＯＣＫＩＩ、ＰＲＡＫ、Ｓ６Ｋ１、ＳＧＫ１、ＳＹＫ、ＴＴＫ、ＶＥＧＦＲおよびＹＥＳ１に関して２０μＭで；またはＡＭＰＫ、ＢＲＳＫ２、ＢＴＫ、ＣａＭＫ１、ＤＹＲＫ１ａ、ＤＹＲＫ２、ＥＰＨ−Ａ２、ＥＲＫ２、ＩＫＫβ、ＩＫＫε、ＬＣＫ、ＭＥＬＫ、ＭＩＮＫ１、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＮＥＫ２Ａ、ＮＥＫ６、ｐ３８α、ＰｈＫγ１、Ａｋｔ２、ＰＫＤ１、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＳＲＰＫ１  ＳｒｃおよびＴＢＫに関して５０μＭで使用した。
【０１９６】
ペプチドキナーゼアッセイ
示された濃度のペプチド基質の存在下で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（約５００〜１０００ｃｐｍ／ピコモル）中、組換えキナーゼまたはプロテインＧセファロースに結合した免疫複合体として表示されたキナーゼを伴って全量４０μＬでペプチドキナーゼアッセイを設定した。キナーゼ阻害剤を検定する反応では阻害剤をジメチルスルホキシドに溶解し、そして反応容量の０．１％であった。３０℃で１５分間のインキュベーションの後、反応混合物３５μＬをＰ８１ホスホセルロース紙に適用し、そして５０ｍＭリン酸中に浸漬することにより反応を終止させた。しっかりと洗浄した後、反応生成物をＣｅｒｅｎｋｏｖ計数により定量化した。ＬＲＲＫ２活性の単位（Ｕ）を、１ナノモルの３２ＰのＬＲＲＫｔｉｄｅへの組み込みを触媒する酵素の量として定義した。種々濃度のＬＲＲＫｔｉｄｅまたはニクチドを使用して前記で記載されたアッセイを実施することによりＫｍおよびＶｍａｘパラメータを決定した。ＫｍおよびＶｍａｘパラメータをＧｒａｐｈ−Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて計算した。図１ＣではＫｍおよびＶｍａｘ値は四捨五入されて、ペプチドアッセイの性質による値を推定する必要性を反映し、ここで高濃度のペプチドはキナーゼに対して阻害性になった。Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて非線形回帰分析を用いてＩＣ５０値を計算した。
【０１９７】
タンパク質基質キナーゼアッセイ
２μＭの基質を伴って５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（約５００ｃｐｍ／ピコモル）中組換えキナーゼまたはプロテインＧセファロースに結合した免疫複合体として表示されたキナーゼを伴って全量２５μＬでアッセイを設定した。３０℃で１５分間のインキュベーションの後、Ｌａｅｍｅｌｌｉ試料バッファの添加により反応を停止させた。反応生成物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離した。リン酸のタンパク質基質への組み込みをオートラジオグラフィおよび／またはリン酸特異的抗体でのイムノブロッティングにより決定した。
【０１９８】
免疫学的手順
細胞溶解物（１０〜３０μｇ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲルまたはノベックス（Ｎｏｖｅｘ）４〜１２％グラジエントゲル上で電気泳動により分離し、そしてニトロセルロース膜に電気ブロッティングした。膜を５（重量／容量）％Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１（容量／容量）％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴバッファ）でブロックした。ホスホＭＹＰＴ抗体に関しては、一次抗体をＴＢＳＴ中５％ＢＳＡで希釈して１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。１０μｇ／ｍＬ  ＬＲＲＫｔｉｄｅの存在下でホスホＥＲＭ抗体をＴＢＳＴ中５（重量／容量）％脱脂粉乳で希釈して１μｇ／ｍＬで使用した。全てのその他の抗体をＴＢＳＴ中５（重量／容量）％脱脂粉乳中１μｇ／ｍＬで使用した。西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体（ピアス社）および化学発光増強試薬を使用して免疫複合体の検出を実施した。免疫沈降のために、抗体をプロテインＧ−セファロースにビーズμＬあたり抗体１μｇの比率で非共有結合的に結合させるか、または抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２−アガロースを利用した。示された量の細胞溶解物をビーズ容量５μＬの結合抗体と共に１時間インキュベートした。免疫複合体を０．５Ｍ  ＮａＣｌで補充された溶解バッファで２回洗浄し、そしてバッファＡで２回洗浄した。沈降物はキナーゼの供給源として使用されるか、またはイムノブロットにより即座に分析された。
【０１９９】
内因性ＬＲＲＫ２の単離およびマスフィンガープリント同定
ＩｇＧまたはＬＲＲＫ２いずれかの前記された抗体抱合体２０μＬを、プロテインＧセファロースと共に４℃で２．５時間インキュベートすることにより予め清澄化されていたＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００可溶性Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３溶解物６０ｍｇと共にインキュベートした。ビーズを０．１５Ｍ  ＮａＣｌで補充された溶解バッファで４回、そしてバッファＡで２回洗浄した。沈降物を１０ｍＭ  ジチオスレイトールで還元し、そして次に５０ｍＭヨードアセタミドで室温にて３０分間アルキル化した。試料を４〜１２％Ｎｏｖｅｘゲル上で分離し、そしてコロイダルブルーで染色した。およそＬＲＲＫ２の大きさのコロイダルブルーで染色されたバンドを切り取り、そしてゲル内消化されたトリプシンペプチドのマスフィンガープリントを行った。ＬＲＲＫ２バンドおよびＩｇＧ対照免疫沈降物の対応する領域を切り取り、さらに小片に切断し、振動台上で以下のもの０．５ｍＬで１５分間逐次的に洗浄した：水およびアセトニトリルの１：１（容量／容量）混合物、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムおよびアセトニトリルの１：１（容量／容量）混合物ならびに最後にアセトニトリル。ゲル片をｓｐｅｅｄ−ｖａｃで乾燥させ、そして次に０．５μｇ／ｍＬの質量分析等級のトリプシン（プロメガ社）を含有する２５ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム中で再水和した。１６時間後、等容量のアセトニトリルを添加し、そして混合物を振盪台上で１０分間インキュベートした。上澄みを乾燥させ、そしてゲル片中の残留ペプチドを５０％アセトニトリル／２．５％ギ酸０．１ｍＬでさらに抽出した。試料をＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析器（テルモ社（Ｔｈｅｒｍｏ））で分析した。質量をＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘマウスデータベースを用いてｍａｓｃｏｔ  ｓｅｒｖｅｒ（ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）で検索した。
【０２００】
コンピュータ分析
オートラジオグラフィフィルムおよびイムノブロットフィルムをｅｐｓｏｎ４９９０スキャナーでスキャンし、そして画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで処理した。タンパク質配列アラインメントをログ期待値による多重配列比較（ＭＵＳＣＬＥ：ＭＵｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｙ  Ｌｏｇ−Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）ＥＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｕｓｃｌｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で実施し、そしてＪａｌＶｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｌｖｉｅｗ．ｏｒｇ／）で処理した。酵素速度論分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで実施した。Ａｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒで図を作成した。
【０２０１】
結果
ＬＲＲＫ２およびＲＯＣＫの基質特異性の比較
組換えＲＯＣＫ２およびＬＲＲＫ２がエズリンおよびＭＹＰＴ（十分に特徴付けされたＲＯＣＫ基質［１７］）をリン酸化する速度を最初に比較した。等モル濃度のＭＹＰＴおよびエズリンが存在する条件下でＲＯＣＫ２はＭＹＰＴをリン酸化したが、エズリンをほとんどリン酸化しなかった（図１２Ａ）。対照的に、ＬＲＲＫ２はエズリンをリン酸化したが、ＭＹＰＴをリン酸化しなかった（図１２Ａ）。Ｔｈｒ８５０（ＭＹＰＴにおける主要なＲＯＣＫリン酸化部位［１８］）およびＴｈｒ５６７（エズリンにおけるＬＲＲＫ２リン酸化部位［９］）を取り囲む残基の比較により、これらのペプチド全体が位置−３（ＲＭＹＰＴ／Ｋエズリン）のみで類似しないで相同性を保有することが明らかになった（図１２Ａ、下パネル）。エズリンのＬＲＲＫ２リン酸化部位を取り囲むヒト配列はモエシンおよびラディキシンで同一であり、そしてまたショウジョウバエおよびエレガンス線虫ＥＲＭ相同体でもまた際だって保存されている（図１２Ｂ、下方パネル）。ＬＲＲＫ２の基質特異性決定因子を調査するために、異なる残基の変異がＴｈｒ５６７ＥＲＭリン酸化モチーフを包含するＬＲＲＫｔｉｄｅペプチドのＬＲＲＫ２リン酸化の反応速度にどのように影響したかを立証した（図１２Ｃ）。ＬＲＲＫ２は２００μＭのＫｍおよび１４Ｕ／ｍｇのＶｍａｘで野生型ＬＲＲＫｔｉｄｅペプチドをリン酸化した。以下のＡｌａへの変異は、Ｋｍ値を上昇させリン酸化を抑制した：−５Ａｒｇ（２．５倍）、−２Ｔｙｒ（２．４倍）、＋２Ａｒｇ（４．５倍）および＋５Ａｒｇ（４倍）残基。−２ＴｙｒのＧｌｕへの変異によりＫｍは４．４倍増大したが、一方そのＡｒｇへの変異はＫｍをわずかに低下し、この位置での芳香族残基が必須ではないことを示唆している（図１２Ｃ）。ペプチドの＋２および＋５残基のＰｒｏまたはＧｌｕへの変異はＡｌａ変異に類似してＫｍを増大させた。−４（Ａｓｐ）のＡｌａへの変異のみがＫｍを２．３倍低下することによりペプチドリン酸化を中程度に強化した（図１２Ｃ）。以下を含むいくつかの変異はまたＶｍａｘ値を著明に低下させた：−２Ｔｙｒ（２から１０倍）、＋１Ｌｅｕ（２倍）、＋２Ａｒｇ（４から２８倍）および＋５Ａｒｇ（Ｇｌｕへの変異４倍）。ＬＲＲＫｔｉｄｅにおける変異がＲＯＣＫ２によるリン酸化にどのように影響を及ぼすかをも調査した。ＬＲＲＫ２とは対照的に、いくつかの変異がＫｍ値を低下することによりペプチドリン酸化を実質的に改善することを観察した。最も劇的な変化は−２ＴｙｒのＡｒｇ残基への変異を伴い、それはたいていのＲＯＣＫ基質において見出された。これはＫｍ値を６０倍超に低下し、そしてＶｍａｘを５倍超に増大させた。＋１Ｌｅｕ残基のＡｌａへの変異はＲＯＣＫ２によるリン酸化を無効にしたが、ＬＲＲＫ２リン酸化には影響を及ぼさなかった（図１２Ｃ）。
【０２０２】
最適なＬＲＲＫ２ペプチド基質の製作
ＬＲＲＫ２に関する最適なリン酸化モチーフをさらに調査および改善するために、ポジショナルスキャニングペプチドライブラリ研究法［１９、２０］を利用した。このアッセイは１９８のビオチン化ペプチドライブラリを利用する。各ライブラリは中央の位置でセリンおよびスレオニンの１：１混合物を含有し、そして１つのさらなる位置を２０個のアミノ酸のうちの１つ、ホスホスレオニンまたはホスホチロシンに固定した。リン酸化事象を刺激する要件を保有するキナーゼの同定を可能にするためにホスホスレオニンおよびホスホチロシンを含めた。全てのその他の位置は等モル濃度の自然アミノ酸（セリン、スレオニンおよびシステインを除く）の変性混合物を含有する。組換えＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］またはキナーゼ不活性ＬＲＲＫ２［Ｄ２０１７Ａ］を使用して溶液中μ−３２Ｐ−ＡＴＰを使用して１９８のペプチドライブラリを全て同時にリン酸化し、そしてビオチン化ペプチドをストレプトアビジンコーティングされた膜上に捕捉した。ホスホイメージングの後、３２Ｐ放射活性の組み込みを定量することにより各位置での各アミノ酸に関する相対選択性を決定した（図３Ａ）。ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］スクリーニングの定量結果もまたマトリックスとしてｅｎｏＬＯＧＯＳプログラムに入力し［２１］、そして各アミノ酸に関する相対的選択性を図１３Ｂに示す。ＬＲＲＫ２がリン酸化部位に相対して複数の部位で、−５（Ｔｒｐ、Ａｒｇ）、−２（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＨｉｓおよびＴｈｒ）、−１（Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ）、＋２（ＡｒｇおよびＴｈｒ）および＋３（Ａｒｇ）位置に関する強い選択性を伴って好ましい配列特異性を呈することを見出した。これは図１２で示した速度論的な研究と合致し、これらの残基の変異はＫｍ値を増大し、そしていくつかの事例ではまたＶｍａｘ値を低下することを実証する。ＡｓｐまたはＧｌｕ残基はペプチドの任意の位置でＬＲＲＫ２リン酸化を低減した（図１３Ａ）。キナーゼ不活性ＬＲＲＫ２［Ｄ２０１７Ａ］で行われた実験に関して、観察されたリン酸化の全体的なレベルはよりはるかに低レベルであったが、それにもかかわらず、−３および−２位置でＡｒｇに関する選択性を伴ういくつかの混入キナーゼ活性が依然見出された。２９３細胞から誘導された組換えキナーゼ不活性ＧＳＴ−ＩκＢキナーゼ−βを用いる以前の研究でも類似の結果が報告された［２２］。この微量レベルのタンパク質キナーゼ活性は恐らく２９３細胞抽出物からのＧＳＴ精製キナーゼを混入するタンパク質キナーゼから生じる。
【０２０３】
ニクチドＬＲＲＫ２基質の製作
ポジショナルスキャニングペプチドライブラリからのデータにより、−５と＋４位置との間の最適なＬＲＲＫ２リン酸化モチーフはＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡであることが示された。ＬＲＲＫ２に関する改善された基質を作成するために、ＬＲＲＫ２ｔｉｄｅペプチドが誘導されたモエシン配列にこのモチーフを置換した。＋５残基ほど離れた配列はＬＲＲＫｔｉｄｅリン酸化の反応速度に影響を及ぼし（図１２Ｃ）、そしてＬＲＲＫｔｉｄｅペプチドは＋６位置で終止するので、モエシンのさらに６残基を包含する、ＬＲＲＫｔｉｄｅペプチドのより長いバリアントにＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡモチーフを組み込むことに決定した。得られた配列ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲをニクチド（この研究の２人の主執筆者の名前を反映している）と称した。元来のＬＲＲＫｔｉｄｅ配列に融合されたＧＳＴ、より長い型のＬＲＲＫｔｉｄｅ、モエシンの全Ｃ末端（残基５００−５７７）およびニクチドのＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］によるリン酸化を最初に比較した。これにより、ＬＲＲＫ２によりＧＳＴ−ニクチドがその他のＧＳＴ−融合タンパク質よりも有意に大きな程度までリン酸化されたことが明らかになった（図１３Ｃ）。Ｔｈｒ残基の変異はＬＲＲＫ２リン酸化部位を含んでなることを予測し、実際にＧＳＴ融合タンパク質のリン酸化を無効にした。我々の結果はまた、伸長したＬＲＲＫｔｉｄｅ配列が元来のより短いバリアントよりもＬＲＲＫ２によりさらに効率よくリン酸化されたことを実証する（図１３Ｃ）。
【０２０４】
次に合成ニクチドを作成し、そしてそれがＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］によりＫｍ１０μＭ（ＬＲＲＫｉｄｅよりも２０倍低い）およびＶｍａｘ２６Ｕ／ｍｇ（ＬＲＲＫｔｉｄｅよりも１．７倍高い）でリン酸化されることを見出した。ニクチドは野生型ＬＲＲＫ２により同様のＫｍであるが、約２倍低いＶｍａｘでリン酸化され、Ｇｌｙ２０１９Ｓｅｒ変異がＬＲＲＫ２活性を刺激することを示す以前の業績と合致した［６］。次にＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］および野生型ＬＲＲＫ２によるリン酸化に及ぼすニクチドの個々の残基を変異する効果を研究した（図１４）。変異は野生型ＬＲＲＫ２およびＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］に類似して影響を及ぼした。たいていの変異は中程度にＫｍ値に影響し、最大の効果は−５ＴｒｐのＡｌａへの変異であり、Ｋｍ値を３倍増大させた。その他の変異はリン酸化のＶｍａｘ値を２から５倍低下させた（−４ＴｒｐをＡｌａに、および＋２ＡｒｇをＡｌａに）（図１４）。いくつかの変異（−５ＴｒｐをＡｌａに、−４ＴｒｐをＡｌａに、および−１ＴｙｒをＡｌａに）Ｋｍ値を２から３倍増大させたが、ＬＲＲＫ２リン酸化のＶｍａｘを約２倍強化した。またＶｍａｘを強化する−５、−４および−１変異を合わせ、そして高Ｖｍａｘ値は維持されるが、Ｋｍ値はニクチドと比較して５から２０倍まで実質的に増大することを見出した。興味深いことに、ＬＲＲＫ２によりリン酸化されるＴｈｒ残基のＳｅｒへの変異はＬＲＲＫ２によるペプチドのリン酸化をほとんど無効にした（図１４）。驚くべきことに、＋１ＬｅｕのＰｒｏ残基への変異は非ＣＭＧＣプロリン指向性キナーゼによるたいていの基質のリン酸化を阻害するが、Ｋｍに影響を及ぼすことなく、ＬＲＲＫ２リン酸化のＶｍａｘのみを、２倍を下回って低下させた。これはＬＲＲＫ２が、ＣＭＧＣキナーゼファミリーに属さないにもかかわらず、Ｐｒｏ残基に続くＳｅｒ／Ｔｈｒ残基をリン酸化する潜在能力を有することを示唆する。ポジショナルスキャニングペプチドライブラリデータにより、−２および＋２位置でＴｈｒ残基の選択性が存在し得ることも示された（図１３Ａ）。その他のキナーゼスキャニングペプチドライブラリスクリーニングにおいても−２および＋２位置のＴｈｒに関する類似の選択性が観察されており（「リン酸化依存性シグナリングに関する直線モチーフアトラス」Ｍｉｌｌｅｒら、Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  １：ｒａ２（２００８））、−２または＋２位置のいずれかでＴｈｒを導入することに決定し、そしてこれが中程度にＫｍを増大させ、そしてＶｍａｘ値を低減させることを見出した（図１４）。−２および＋２位置双方でのＴｈｒ残基の導入は１０倍を超えてＫｍ値を増大させ、これはこれらの位置でＴｈｒはあまり耐容性を示さないことを示唆している。
【０２０５】
ＬＲＲＫ２選択的阻害剤の小型分子ツールの同定
ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］およびＲＯＣＫ２の基質特異性を比較する過程で、共通して配備された数種のＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２［２３］、ヒドロキシファスジル［２４］、Ｈ−１１５２［２５］）もまたＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］を阻害することを観察した（図１５ＡおよびＢ）。Ｙ−２７６３２はＲＯＣＫ２（ＩＣ５０  ０．７μＭ）に対するのと類似の効力でＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］（ＩＣ５０  １μＭ）を阻害した。ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］はヒドロキシファスジル（ＩＣ５０  ６．８μＭ）およびＨ−１１５２（ＩＣ５０  ０．１５μＭ）により約３倍ＲＯＣＫよりも弱く阻害された（図１５Ｂ）。Ｈ−１１５２およびヒドロキシファスジルは、十分に研究された一連のイソキノリンスルホンアミドに属するが［２６］、一方Ｙ−２７６３２は構造的に関連性がない（図１５Ａ）。その他のイソキノリンスルホンアミドがＲＯＣＫすなわちＨ８９を阻害すると報告され［２７］、そしてファスジル［２８］はＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］を弱く阻害しただけであった（図１５Ｂ）。構造的に関連性がないスニチニブは、以前の報告［７，８］に類似する効力でＬＲＲＫ２を阻害した（ＩＣ５０  約１９ｎＭ）が、Ｙ−２７６３２およびＨ−１１５２とは対照的に、スニチニブはＲＯＣＫを弱く阻害しただけであった（ＩＣ５０  約３７００ｎＭ）。Ｈ−１１５２、Ｙ−２７６３２およびスニチニブのＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］および野生型ＬＲＲＫ２に関する効力を比較して、野生型ＬＲＲＫ２が活性型変異体よりもこれらの薬物に対する感受性が中程度に少ないことを観察した。野生型ＬＲＲＫ２の阻害の半数阻害濃度（ＩＣ５０）はＨ−１１５２およびＹ−２７６３２に関して２倍、そしてスニチニブに関して４倍増大した（図１５Ｂ）。
【０２０６】
ＬＲＲＫ２ツール化合物の選択性プロファイル
Ｙ−２７６３２、Ｈ−１１５２およびファスジル（ＨＡ−１０７７）の相対的選択性プロファイルをスニチニブと比較するために、これらの阻害剤をＡＴＰのＫｍ定数に近似するＡＴＰ濃度で８５タンパク質キナーゼのパネルに対してプロファイリングした（表１）。これにより、Ｙ−２７６３２が選択的であり、そして１０μＭでＲＯＣＫ２阻害に加えてただＰＲＫ２およびＭＮＫ１の活性を５倍超に抑制したことが明らかになった。ＲＯＣＫに加えてＨ−１１５２（１μＭ）はＡｕｒｏｒａ  ＢおよびＢＲＳＫ２を５倍超に阻害した。ファスジル、ヒドロキシファスジルおよびスニチニブは選別性が低かった。ファスジル（１０μＭ）はＲＳＫ１、Ｓ６Ｋ１、ＰＲＫ２、ＭＳＫ１、ＭＮＫ１、ＭＥＬＫ、ＭＳＫ１、ＭＥＬＫを５倍超に阻害した。ヒドロキシファスジル（１０μＭ）はＲＳＫ１、Ｓ６Ｋ１、ＰＲＫ２、ＭＳＫ１を阻害した。スニチニブ（１μＭ）はプロファイリングされた８５のキナーゼのうち１２のキナーゼを各々有意に阻害した（表１）。
【０２０７】
阻害剤抵抗性変異体の開発
以前の業績により、ＲＯＣＫにおけるＡｌａ２１５残基は、Ｈ−１１５２との２つのファンデルワールス相互作用を形成することによりＨ−１１５２との相互作用の特異性を制御するのに重要な役割を果たすことが示されている［３１］。ＬＲＲＫ２の事例では、Ａｌａ２１５に均等な残基はＡｌａ２０１６である（図１６Ａ）。ＬＲＲＫ２およびＲＯＣＫ１の双方におけるこの残基はサブドメインＶＩＩ−ＤＦＧモチーフの直前にある。ＰＫＡはＨ−１１５２により約５０倍さらに弱く阻害され、均等な位置にＴｈｒ１８３を有する。ＰＫＡにおけるＴｈｒ１８３のＡｌａへの変異は基礎活性に影響を及ぼさなかったが、Ｈ−１１５２によるその阻害を４倍強化した［３２］。したがってＬＲＲＫ２におけるＡｌａ２０１６をＴｈｒ残基に変異させ、そしてこの変異がＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］基礎活性を阻害しないが、Ｈ−１１５２による阻害のＩＣ５０を約２０倍増大することを見出した（図１６Ｂ）。またＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ］変異体はＹ−２７６３２およびスニチニブによる阻害に対して各々１３および約１２倍さらに抵抗性であることを観察した（図１６Ｂ）。ＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ］変異体では、Ｔ２０１６側鎖はＨ−１１５２のこれらの原子と衝突し、恐らくそれは回転し、そしてあまり好ましくない配向での結合をＡＴＰ部位で強いられるのであろう。これが野生型ＬＲＲＫ２と比較して変異体に対してその活性が低減したことの可能性のある説明である。またＡｌａ２０１６をその他の残基に変異させたが、これらの変異は固有のＬＲＲＫ２活性を著明に阻害することを見出した（データは示していない）。
【０２０８】
細胞におけるＲＯＣＫおよびＬＲＲＫ２阻害剤の評価
次にＨＥＫ２９３細胞においてスニチニブ、Ｈ−１１５２およびＹ−２７６３２がＭＹＰＴおよびＥＲＭタンパク質のリン酸化に及ぼす効果を調査した。Ｔｈｒ８５０でのＭＹＰＴ、およびエズリンにおけるＴｈｒ５６７に均等な部位でのＥＲＭタンパク質の有意な基礎リン酸化を観察した（図１７Ａ）。ＲＯＣＫを活性化するために、ＭＹＰＴおよびエズリン双方のリン酸化を約３倍増大する、構成的に活性化されたＧ１４Ｖ−Ｒｈｏ変異体の安定した発現を誘起した（図１７Ａ）。１０μＭスニチニブでの細胞の処理により、Ｈ−１１５２およびＹ−２７６３２に類似の程度までのＴｈｒ８５０でのＭＹＰＴのリン酸化を排除せず、このリン酸化を媒介するＲＯＣＫと合致した。しかしながら、同じ抽出物では、Ｇ１４Ｖ−Ｒｈｏの存在下または不在下のいずれかで、スニチニブ、Ｈ−１１５２またはＹ−２７６３２のいずれもＥＲＭタンパク質リン酸化を阻害しなかった（図１７Ａ）。
【０２０９】
内因性ＬＲＲＫ２の免疫沈降およびアッセイ
内因性ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性を測定するために（それはこれまでの経験では達成されていなかった）、数多くのＬＲＲＫ２抗体を作成し、そして組換え全長Ｆｌａｇ−ＬＲＲＫ２を免疫沈降およびイムノブロットするその能力を評価した。これにより、アミノ酸１００−５００を包含するＬＲＲＫ２のフラグメントに対して増加させた抗体は抗Ｆｌａｇ抗体と類似の効率でＦｌａｇ−ＬＲＲＫ２を免疫沈降およびイムノブロッティングすることが明らかになった（図１８Ａ）。さらに過剰発現したＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２はＬＲＲＫ２［１００−５００］抗体で免疫沈降され、そしてＦｌａｇ抗体で免疫沈降した酵素と類似の活性を保有したが、これはＬＲＲＫ２［１００−５００］抗体がＬＲＲＫ２タンパク質キナーゼ活性を阻害しないことを示している（図１８Ａ）。次にＬＲＲＫ２［１００−５００］抗体を使用して細胞系のパネルから誘導された抽出物から内因性ＬＲＲＫ２を免疫沈降することを試みた。これにより、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３線維芽細胞およびＲＡＷマクロファージは検出可能なレベルの内因性ＬＲＲＫ２タンパク質を発現することが明らかになった（図１８Ｂ）。Ｓｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞から誘導されたＬＲＲＫ２［１００−５００］免疫沈降物をポリアクリルアミドゲルの電気泳動に供した。コロイダルブルーでの染色により、分子量約２８０ｋＤａのタンパク質が遊走することが明らかになり、それは質量分析法によりＬＲＲＫ２を含んでなることが確認された（図１８Ｃ）。次にＳｗｉｓｓ３Ｔ３およびＲａｗ細胞から誘導されたＬＲＲＫ２および対照免疫沈降物を、ニクチドを基質として使用するタンパク質キナーゼアッセイに供した。これにより、ＬＲＲＫ２免疫沈降物では有意なタンパク質活性が明らかになったが、対照免疫沈降物ではなかった。さらにＬＲＲＫ２免疫沈降物で検出されたタンパク質キナーゼ活性はＨ−１１５２およびスニチニブにより抑制された。
【０２１０】
考察
我々のデータにより、リン酸化する基質内の具体的なアミノ酸に関して強い要件を有するいくつかのその他のタンパク質キナーゼと比較して、ＬＲＲＫ２はその基質における広範囲のアミノ酸に耐容性を示すことが明らかになった（図１２および１３）。有意な基質特異性選択性は−５（Ｔｒｐ、Ａｒｇ）、−２（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ）、−１（Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ）、＋２（Ａｒｇ）および＋３（Ａｒｇ）位置である。重要なことに、またはデータにより、ニクチドにおいてリン酸化されるＴｈｒのＳｅｒへの変異は、実際にＬＲＲＫ２によるペプチドのリン酸化を無効にしたので、ＬＲＲＫ２がＴｈｒのリン酸化に関して強い選択性を有することが示唆される（図１４）。ポジショナルスキャニングペプチドライブラリ分析により、ＬＲＲＫ２はリン酸化部位を取り囲む全ての位置で酸性ＧｌｕまたはＡｓｐ残基に耐容性が乏しいことも示唆された（図１３Ａ）。ＬＲＲＫｔｉｄｅのみが単一の酸性残基（−４Ａｓｐ）を保有し、そして試験したＬＲＲＫ２リン酸化を改善した唯一の変異はこの残基のＡｌａへの変異であった（図１２Ｃ）。ＬＲＲＫ２の基質特異性についてのこの知識は、ＬＲＲＫ２基質および／または同定された基質内の潜在的リン酸化部位の同定の助けとなり得ることは可能である。この分析により、ＬＲＲＫ２を検定するために広く配備されているＬＲＲＫｔｉｄｅペプチドと比較して、非常に改善された基質であるニクチドペプチドを作成することも可能になる。ニクチドの重要な利点は、それをキナーゼアッセイにおいて非常に低濃度で使用できるということである。ニクチドを使用して、実際に対照免疫沈降で観察されるバックグラウンド活性を伴わずに内因性ＬＲＲＫ２の活性を検定することができるようになっている（図１８Ｅ）。これまでの経験では、内因性ＬＲＲＫ２の活性が評価されているのは初めてである。ＬＲＲＫｔｉｄｅを３００μＭ（Ｋｍ値）の濃度で用いて内因性ＬＲＲＫ２の活性を検定しようとした場合、前免疫の免疫沈降において有意なバックグラウンド活性を観察した（ＮＤ、データは示されていない）。内因性ＬＲＲＫ２の活性の評価は、ＰＤ患者由来の細胞／組織におけるＬＲＲＫ２活性を研究する道を開くことになるので重要である。それはＬＲＲＫ２タンパク質キナーゼ活性が細胞外アゴニストにより制御されるかどうかの評価を可能にし、そしてＬＲＲＫ２に関する阻害剤のスクリーニングを助けることもできる。またニクチドをＧＳＴに融合することにより、大腸菌において高度に発現されるタンパク質（４ｍｇ／リットル）を生じ、それはインビトロでＧＳＴエズリン［５０５−５８６］またはＧＳＴ−ＬＲＲＫｔｉｄｅよりも大きな初期速度でＬＲＲＫ２により効率よくリン酸化されることを観察した（図１３Ｃ）。ＧＳＴ−ニクチドは将来的な研究で同定されるＬＲＲＫ２基質のリン酸化の効率を評価する場合に良好な陽性対照として役立つであろう。
【０２１１】
我々の分析により、ＬＲＲＫ２の基質特異性はＲＯＣＫ２とは全く区別されることが明らかになる。ＬＲＲＫ２はＭＹＰＴをリン酸化せず、そしてＲＯＣＫ２はエズリンを十分にリン酸化はしない。さらにＬＲＲＫｔｉｄｅにおける変異はＬＲＲＫ２およびＲＯＣＫ２によるリン酸化に異なる方式で影響を及ぼした。例えばＬＲＲＫｔｉｄｅペプチドの＋１位置のＬｅｕからＡｌａへの変異はＬＲＲＫ２リン酸化に影響を及ぼすことなくＲＯＣＫリン酸化を無効にした。多くのＬＲＲＫｔｉｄｅ変異はＲＯＣＫによるリン酸化を強化したが、ＬＲＲＫ２によるリン酸化を阻害した。インビトロでエズリンを十分にリン酸化はしないＲＯＣＫ２と合致して、インビボで種々のＲＯＣＫ阻害剤がＭＹＰＴリン酸化を抑制する条件下で、それらがＥＲＭリン酸化を阻害できないことをも見出した。これはＹ−２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤がＥＲＭリン酸化を抑制しないことが見出された、その他の研究と合致する［３３、３４］。まとめると、このデータはＥＲＭタンパク質がＲＯＣＫアイソフォームにより生理学的にリン酸化されるという以前の示唆に疑いを投げ掛ける。Ｈ−１１５２、Ｙ−２７６３２およびスニチニブがＥＲＭリン酸化を抑制できなかったという知見により、ＬＲＲＫ２が２９３細胞においてＥＲＭをリン酸化しないか、またはＥＲＭタンパク質をリン酸化するキナーゼはＬＲＲＫ２だけではないかのいずれかであることが示される。２９３細胞において内因性ＬＲＲＫ２の有意なレベルを検出することができなかったので（図１８）、ＬＲＲＫ２およびＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］を２９３細胞において過剰発現させたが、これはまたＥＲＭタンパク質のリン酸化を誘起することができなかった（ＪＮ、データは示していない）。まとめると、これにより、ＥＲＭタンパク質はインビトロでＬＲＲＫ２により効率よくリン酸化されるが、ＥＲＭタンパク質がＬＲＲＫ２に関する生理学的基質を含んでなるという強力な証拠はないことが示唆される。ショウジョウバエ［３５、３６］および初代マウスリンパ球［３７］における最近の研究により、ＳＩＬＫ／ＬＯＫ  ＳＴＥ２０タンパク質キナーゼがＥＲＭリン酸化の制御における中心的存在であり得ることが示唆されている。これに合致して、ＳＬＫ／ＬＯＫノックアウトマウス由来のリンパ球ではＥＲＭリン酸化は低減されるが、無効にならない［３７］。１９９４年にＳＩＬＫはＲ−Ｒ／Ｋ−Ｆ−Ｇ−Ｓ／Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｆ／Ｉの最適なモチーフを有し［３８］、それはＥＲＭ部位Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｋ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｑ−Ｉにかなり良好に適合しており、そしてまたＬＲＲＫ２、Ｗ−Ｒ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ａの最適な基質特異性に著明に類似することが示された。ＳＬＫ／ＬＯＫノックアウト細胞において観察された残基のＥＲＭリン酸化がさらにスニチニブおよびＹ−２７６３２のＬＲＲＫ２阻害剤での処理によりさらに低減されるかどうかを試験することもまた興味深いであろう。別の最近の研究では、Ｍｓｔ４キナーゼと称される別のＳＴＥ２０ファミリーキナーゼが極性化上皮細胞においてＬＫＢ１腫瘍サプレッサにより制御される経路でエズリンをリン酸化できることが示されている［３９］。ＭＳＴ４は我々のキナーゼプロファイリングパネ��に存在し、そしてＨ−１１５２、Ｙ−２７６３２またはスニチニブにより阻害されなかった（表１）。
【０２１２】
ＬＲＲＫ２およびＲＯＣＫ２は密接に関係するキナーゼではないので、広く利用されるＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（１４００を超える研究論文で使用される）ならびにＨ−１１５２およびヒドロキシファスジルは組換えおよび内因性ＬＲＲＫ２を、それらがＲＯＣＫ２を標的とするのと類似の効力で阻害するという知見は予期されなかった。ＬＲＲＫはヒトキノームのチロシン様キナーゼ内にあるが、一方ＲＯＣＫ２は明確に異なるＡＧＣ分派に属する［４０］。したがってこれらのＲＯＣＫ阻害剤で観察された生理学的効果のいくつかはＲＯＣＫアイソフォームよりもむしろＬＲＲＫ２の阻害の結果であり得るという可能性がある。ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異体が野生型ＬＲＲＫ２よりも２から４倍Ｈ−１１５２、Ｙ−２７６３２およびスニチニブ感受性が高かったという知見により、パーキンソン病の変異体に対してより大きな効力を有する化合物を開発することが可能であり得ることもまた示される。活性が上昇しているＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］およびＬＲＲＫ２［Ｉ２０２Ｔ］変異体はまた非選択的キナーゼ阻害剤のパネルに対して中程度にさらに鋭敏であったこともまた報告されている［４１］。ＬＲＲＫ２のパーキンソン病の変異形態を特異的に阻害する化合物を製作できる場合、それらの副作用は低く、そして野生型ＬＲＲＫ２の正常な機能を抑制しないであろう。ＬＲＲＫ２阻害剤を同定するために行われている創薬スクリーニングでは、ＬＲＲＫ２の変異体および野生型の双方の形態に対して化合物をスクリーニングすることが有益であろう。ＬＲＲＫ２のキナーゼドメインの分子モデリングおよびそれをその他のキナーゼの構造と比較することにより、ＬＲＲＫ２がどのようにＨ−１１５２と相互作用し得るかのモデルが明らかになった。Ｈ−１１５２への結合に重要であるＲＯＣＫの活性部位におけるいくつかの残基もまたＬＲＲＫ２において保存されている。これには阻害剤への結合を媒介するのに重要な役割を果たすＲＯＣＫ２におけるＡｌａ２１５の均等物であるＡｌａ２０１６が含まれる［３１］。ＬＲＲＫ２におけるＡｌａ２０１６のＴｈｒ残基への変異は、Ｈ−１１５２により弱く阻害されるＰＫＡにおけるＴｈｒ１８２に均等であり、ＬＲＲＫ２基礎活性に影響を及ぼさなかったが、Ｈ−１１５２およびその他のＲＯＣＫキナーゼ阻害剤によるＬＲＲＫ２の阻害を著明に抑制した。阻害剤に抵抗性であるＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ］変異体はＬＲＲＫ２の生理学的役割を探索する補助となり得る。野生型およびＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ］変異体を細胞において過剰発現でき、そして任意の標的のリン酸化は、薬物抵抗性変異体を過剰発現する細胞においてＨ−１１５２、Ｙ−２７６３２またはスニチニブによる阻害に感受性が低いはずである。
【０２１３】
我々の知見はまた同定されたＬＲＲＫ２基質のリン酸化を検証できる薬理学的戦略をも提供する。ＬＲＲＫ２基質のリン酸化はＹ−２７６３２およびＨ−１１５２（ＲＯＣＫおよびＬＲＲＫ２の二重阻害剤）ならびにスニチニブ（ＬＲＲＫ２を阻害するが、ＲＯＣＫを阻害しない）により抑制されるはずである。対照的にＲＯＣＫ媒介過程はＹ−２７６３２およびＨ−１１５２に感受性なはずであるが、スニチニブにより阻害されないはずである。これに合致して、スニチニブはＴｈｒ８５０でのＭＹＰＴのリン酸化を、このリン酸化がＹ−２７６３２およびＨ−１１５２により阻害される条件下で阻害しない（図１７）。
【０２１４】
結論として、ＬＲＲＫ２基質特異性のいくつかの基礎分析を行い、そしてその活性を単離および評価する改善されたアッセイを開発した。これはどのようにＬＲＲＫ２が調節されるかを評価するのを補助するであろうし、そしてパーキンソン病の処置のための潜在能力を有し得るＬＲＲＫ２阻害剤の同定を促すこともできる。またＹ−２７６３３２またはＨ−１１５２およびスニチニブを利用してＬＲＲＫ２キナーゼの役割を探索する計画をも開発している。
【０２１５】
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【実施例５】
【０２１６】
ＧＳＴ−ニクチド
先の実施例にて使用されたようなＧＳＴ−ニクチドおよびＧＳＴ−ニクチドを発現するのに有用なプラスミドを後記に示す。
【０２１７】
プラスミド名：GEX6-LRRK2-TIDE (nic-tide)
タンパク質：GST-LRRK2-TIDE
種：Artificial
親プラスミド：Gex6-P1
インサート供給源：
使用された制限部位：Bamh1-Not1
【０２１８】
【表３】
0005002730.tif 000004
【０２１９】
ＧＳＴ−ニクチドのＤＮＡ配列：
ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCAGACTAGGTTGGTGGAGATTTTATACACTACGACGGGCCAGGCAGGGCAATACAAAGCAGAGATAGCGGCCGC
【０２２０】
Ｇｅｘ６−ＧＳＴ−ニクチドベクターのＤＮＡ配列：
ACGTTATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCAGACTAGGTTGGTGGAGATTTTATACACTACGACGGGCCAGGCAGGGCAATACAAAGCAGAGATAGCGGCCGCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATAAATTCCGACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTCAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTGGAATT
【図１（Ｂ）】
0005002730.tif 000005
【図３（Ａ）】
0005002730.tif 000006
【図３（Ｂ）】
0005002730.tif 000007
【図３（Ｃ）】
0005002730.tif 000008
【図９】
0005002730.tif 000009
【図１（Ａ）】
0005002730.tif 000010
【図２】
0005002730.tif 000011
【図４】
0005002730.tif 000012
【図５】
0005002730.tif 000013
【図６】
0005002730.tif 000014
【図７】
0005002730.tif 000015
【図８】
0005002730.tif 000016
【図１０】
0005002730.tif 000017
【図１１】
0005002730.tif 000018
【図１２】
0005002730.tif 000019
【図１３（Ａ）】
0005002730.tif 000020
【図１３（Ｂ）】
0005002730.tif 000021
【図１３（Ｃ）】
0005002730.tif 000022
【図１４（Ａ）】
0005002730.tif 000023
【図１４（Ｂ）】
0005002730.tif 000024
【図１４（Ｃ）】
0005002730.tif 000025
【図１５】
0005002730.tif 000026
【図１６】
0005002730.tif 000027
【図１７】
0005002730.tif 000028
【図１８】
0005002730.tif 000029
【配列表】
0005002730000001.app