(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で示される化合物。
（Ｒは水素原子、または炭素数２以上４以下のアルキルカルボニル基である、あるいは前記ＲＯがリン酸残基である。Ｘ-は１価のアニオンを表す。但し、Ｒが負電荷を有する場合にはＸ-は存在しなくても良い。）
0004954165.tif 000016
【請求項２】
前記Ｘ-が、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、水酸化物イオン及び酒石酸イオンのいずれかである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
下記一般式（３）で示される構造を有することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
0004954165.tif 000017
（Ｒ2及びＲ3は、互いに独立して炭素数が１０以上２０以下の飽和又は不飽和のアルキル基を表す。）
【請求項４】
ＮＭＲ用、ＭＲＩ用または質量分析用の診断薬において、下記一般式（１）で示される化合物を有することを特徴とする診断薬。
（Ｒは任意の１価の基であり、Ｘ-は１価のアニオンを表す。但し、Ｒが負電荷を有する場合にはＸ-は存在しなくても良い。）
0004954165.tif 000018
【請求項５】
前記Ｘ-が、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、水酸化物イオン及び酒石酸イオンのいずれかである請求項４に記載の診断薬。
【請求項６】
前記Ｒが水素原子、または炭素数２以上４以下のアルキルカルボニル基である、あるいは前記ＲＯがリン酸残基であることを特徴とする請求項４または５に記載の診断薬。
【請求項７】
前記化合物が下記一般式（３）で示される構造を有することを特徴とする請求項４または５に記載の診断薬。
0004954165.tif 000019
（Ｒ2及びＲ3は、互いに独立して炭素数が１０以上２０以下の飽和又は不飽和のアルキル基を表す。）
【請求項８】
ＰＢＳを含む請求項４乃至７のいずれかに記載の診断薬。
【請求項９】
検体中の化合物を検出する工程を含む核磁気共鳴分析方法において、前記化合物を用意する工程；
前記検体に前記化合物を付与する工程；
前記検体に電磁波を付与する工程；を含み、
前記化合物が請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物であり、
前記化合物の1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合における各核の間での磁気コヒーレンス移動を利用して、前記化合物を検出することを特徴とする核磁気共鳴分析方法。
【請求項１０】
検体中の化合物の存在位置を検出する工程を含む核磁気共鳴イメージング方法において、前記化合物を用意する工程；
前記検体に前記化合物を付与する工程；
前記検体に電磁波を付与する工程；を含み、
前記化合物が請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物であり、
前記化合物の1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合における各核の間での磁気コヒーレンス移動を利用して前記化合物の存在位置を検出することを特徴とする核磁気共鳴イメージング方法。
【請求項１１】
検体中の化合物を検出する質量分析方法において、前記化合物と前記化合物の他の同位体化合物との存在量比を算出する工程を有し、前記化合物が請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物であることを特徴とする質量分析方法。
【請求項１２】
検体中の化合物の存在位置情報を得る質量分析イメージング方法において、  前記化合物と前記化合物の他の同位体化合物との存在量比を算出し、前記化合物が存在する部分をマッピングする工程を有し、前記化合物が請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物であることを特徴とする質量分析イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定同位体原子で標識した化合物に関する。より詳しくは、４級アンモニウムの窒素原子及びこの窒素原子に結合した全てのメチル基の炭素原子をそれぞれの安定同位体原子で置換した標識化コリン及び該標識化コリンを用いて合成された標識化コリン誘導体に関する。また、本発明は、この化合物を有する診断薬に関する。さらに、本発明は、この化合物を用いた、核磁気共鳴分析方法、核磁気共鳴イメージング方法、質量分析方法及び質量分析イメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野や臨床検査の領域において、生理活性物質、伝達物質若しくは栄養素などの生体内物質又は検査試薬等の生体内における動態を追跡検証することの重要性が高まってきている。このような検討を進めるにあたっては、上述の生体内物質や検査試薬の分子構造中における特定の原子をその放射性同位体原子又は安定同位体原子のいずれかの同位体原子で置換した標識化合物を用いるトレーサー法が一般的に使用されている。
【０００３】
同位体原子として放射性同位体原子を有する標識化合物は、放出される放射線を検出することで、生体内であってもその標識化合物の挙動を感度よく追跡することが可能である。このような標識化合物は、陽電子放射断層法（ＰＥＴ）や単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）として、近年、その重要性が高まってきている。これらの検査法に用いる標識化合物としては、ＰＥＴでは11Ｃ、15Ｏ、13Ｎ、18Ｆ等の放射性同位体原子、またＳＰＥＣＴでは99mＴｃや123Ｉ等の放射性同位体原子により標識化された化合物が使用されている。例えば、ＰＥＴにおいては18Ｆで標識化したグルコース（ＦＤＧ）の体内動態を追跡し、各種疾病の診断に用いる検査手法が既に一般に利用されている。また、ＦＤＧ以外にも、例えば特許文献１及び２に記載されているように、18Ｆで標識化したコリンや11Ｃで標識化したムスカリン性アセチルコリンをＰＥＴの標識化合物として利用する例が挙げられている。
【０００４】
同位体原子によるもう一つの標識化手法として、安定同位体原子を用いる方法が挙げられる。標識として使用できる安定同位体原子としては、例えば重水素（Ｄ：天然存在比＝０．０１５％）、13Ｃ（天然存在比＝１．１％）、15Ｎ（天然存在比：０．３６６％）、17Ｏ（天然存在比＝０．０３８％）などを挙げることができる。これらの安定同位体原子は放射線の放出が無いため、これらを用いて、検出・分析を行うためには、上記したような手法とは別の手法を利用する必要がある。これらの安定同位体原子の特徴として、原子核内の中性子の数が異なることによって、原子自体の質量数が変わること、並びに核スピンが変わることが挙げられる。したがって、これらの安定同位体原子を有する標識化合物を選択的に検出する手法としては、分子量が異なることを利用した質量分析、核スピンが異なることを利用した核磁気共鳴（ＮＭＲ）が挙げられる。また、水素原子Ｈを重水素Ｄに置換した化合物は、分子内の振動モードの変化を赤外線分光やラマン分光により観測することで検出できるため、標識化合物として用いられている。なお、安定同位体原子を用いた標識化合物の体内動態を観察する場合には、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が一般に用いられる。
【０００５】
【特許文献１】特登録０２８０９１４５
【特許文献２】特開平１１−１５２２７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、放射性同位体原子による標識化合物を用いる場合は以下に記載する課題が挙げられる。
【０００７】
放射性同位体原子のうちＦ、Ｔｃ、Ｉ等は元々生体内に全く若しくはほとんど存在しない元素であるため、これらの原子で標識化した化合物自体も生体内には全く若しくはほとんど存在しない物質である。したがって、ある生体内物質の体内動態を追跡するために、放射性同位体原子で標識した化合物を用いてその動態を調査しても、その標識化合物はもともと生体内に存在する生体内物質と同じ挙動を示さない可能性がある。例えば、上述のＦＤＧは、生体内における重要なエネルギー源であるグルコースの標識化合物として利用されており、非標識のグルコースと分子構造が類似しているために生体組織への取り込みは行われるものの、その後の代謝過程が非標識のグルコース自体と異なっていることが既に確認されている。なお、酸素、炭素、窒素は生体物質を構成する基本的な原子であるため、これらの放射性同位体原子（11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ）を用いた標識化合物は、分子構造を元々生体内に存在する化合物と同一にすることが出来れば、標識化合物及び非標識化合物間における体内動態の差を無くすことができる可能性はある。
【０００８】
また、これらの放射性同位体原子を利用する検査・分析手法は高感度である反面、以下に示すような放射性物質の取り扱い上の課題がある。先ず、これらの放射性同位体原子をつくるためにはサイクロトロンのような高額な設備を利用する必要があり、さらに放射性核種としての寿命が短いものも多く、放射性原子を作ってから目的化合物の標識化、検査対象への投与及び測定までの一連の検討にかけられる時間にも制約があった。また、これらの放射性同位体原子から放出される放射線による検査対象者、検査・測定を行う者の被曝といった課題もある。
【０００９】
一方、安定同位体原子による標識化合物を用いる場合は以下に記載する課題や問題点が挙げられる。
【００１０】
安定同位体原子は自然界にある一定の割合で存在するため、水素、炭素、窒素、酸素で構成される分子の質量分析を行った場合、得られるスペクトルは単一ではなく、Ｄ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏの含有量に従ってｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎと呼ばれる複雑なパターンが得られる。そのパターンは生体物質の構成原子数が多くなるほど顕著に複雑になり、解析が困難となる。たとえば、13Ｃ−ＮＭＲは一般に利用さている分析手法である一方で、例えば炭素原子のうち13Ｃの天然存在比は１．１％程度であるので、標識化合物以外の中に存在する13Ｃの影響は無視できない。
【００１１】
また、安定同位体原子による置換で広く利用されているのは、水素原子1Ｈを重水素に置換する方法であるが、重水素置換体においては、下記の課題が挙げられる。まず、置換される位置においては水素−重水素の交換反応が起きる場合があり、特に生体内のようにプロトンが存在する水溶液中ではその交換反応が起きやすいため、重水素による標識化では期待する効果が出ない場合がある。また、一般的にＮＭＲ測定はプロトンＮＭＲ（1Ｈ−ＮＭＲ）での測定モードが中心であり、水素原子1Ｈを重水素化することでプロトンＮＭＲから得られる情報が低減する。更に、質量分析では様々な原理の測定手法があるものの、基本的に測定物質をイオン化させることが必要である。このイオン化においては、プロトンの付加若しくは脱離に頼ることが多いため、測定結果の解析の観点から水素原子以外の原子をその同位体で置換するほうが好ましい。更に、プロトンの付加若しくは脱離による分子量変化の影響や、自然界に存在する安定同位体原子によるピークの複雑化（ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎの範囲）等のことを考えると、質量分析における標識化合物の分子量は、非標識化合物の分子量よりも３マス以上異なっていることが望まれる。
【００１２】
また、安定同位体原子による標識化合物を利用した場合の他の課題として、放射性同位体を利用した手法に比べて、一般に、検出感度が低いことが挙げられる。したがって、生体内、生体組織中における標識化合物の存在量が微量である場合は、その存在の確認が困難になる。標識化合物の検出感度を向上させるために生体内物質や検査試薬の原子を自然界に存在する安定同位体の比率を大幅に超えるように置換することは有効であり、実際、アミノ酸や核酸塩基、グルコースの炭素や窒素原子を13Ｃや15Ｎに置換した化合物は市販されている。しかし、例えば、13Ｃ置換のアミノ酸を用いたとして、微量の13Ｃ置換アミノ酸が検出できたとしても、天然に存在する安定同位体原子13Ｃを含有していたアミノ酸であるのか、検査試薬として投与した13Ｃアミノ酸なのか判別が困難であるという課題があった。
【００１３】
このような、感度に関する課題に対しては、投与量で感度の不足を補う考え方もある。例えば、ＰＥＴで使用している18ＦＤＧのＦ原子を核スピンを有する19Ｆに変えた19ＦＤＧとすることで、原理的には核磁気共鳴での検出が可能となるが、現在の核磁気共鳴検出に必要な量を生体内に投与することはＦＤＧの毒性の影響が懸念される。一方、安定同位体原子13Ｃ、15Ｎ又は17Ｏにより標識した生体内物質を検査試薬とすれば、ＦＤＧのような毒性の課題は低減できる。しかし、実際にＮＭＲや質量分析で分析・検査可能な量を投与できる生体内物質として、17Ｏ置換の水や酸素分子（特許文献３）、13Ｃ置換のグルコース（特許文献４）や、13Ｃ置換のデオキシグルコソン誘導体（特許文献５）等の限られた化合物しかないのが現状である。
【００１４】
また、安定同位体原子で置換した生体内物質であっても投与できる量は限られており、許容投与量が、ＮＭＲや質量分析法の検出感度を満たすことが出来る化合物が少ないのも実情である。更に、許容投与量が検出感度を満たす生体内物質があったとしても、それが体内動態を検査・分析する意義のある化合物はごく限られていた。
【特許文献３】特開２０００−０４４９１号公報
【特許文献４】特開２００６−２５６９６２号公報
【特許文献５】特登録２７２７２８９
【００１５】
以上をまとめると、本発明が解決しようとする課題は、（１）検査・分析する意義のある生体内物質を選択すること、（２）選択した生体内物質について、被爆のおそれや取扱時間の制約がある放射性同位体原子ではなく、安定同位体原子を用いて標識化合物を製造すること、（３）その標識化合物は、選択した生体内物質の自然界に存在する安定同位体原子の置換化合物と分離して感度良く測定可能であること、である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
そこで、本発明者らは前記課題について鋭意検討したところ、調査対象としてコリンを選択し、４級アンモニウム基の窒素原子と４級アンモニウム基に結合している全ての炭素原子を全てそれぞれの安定同位体原子15Ｎ及び13Ｃで置換してコリンを標識化することにより、該標識化コリンと非標識のコリンとを選択的に分離して検出することができることを見出した。また、該標識化コリンより得られる標識化コリン誘導体を新規に合成し、安定同位体標識化合物として用いることができることを見出した。これらの標識化合物では、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの３元素間での磁気コヒーレンス移動を利用したＮＭＲの多重共鳴測定により標識化合物を確実に検出することができる。また、質量分析法を用いても、４つの原子を置換しているため、非標識の化合物と自然界に存在する安定同位体原子の置換化合物とを確実に分離して検出することができる。
【００１７】
そこで、本発明に係る化合物は、下記一般式（１）で示される化合物である。
【化１】
0004954165.tif 000002
一般式（１）中、Ｒは任意の１価の基である。なお、Ｒが水素原子である場合には、この化合物は標識化コリンであり、Ｒが水素原子以外の場合には、この化合物は標識化コリン誘導体である。
【００１８】
標識化コリンは、一般式（１）で示され、メチル基の炭素原子と４級アンモニウム基の窒素原子の全てがそれぞれの同位体13Ｃ及び15Ｎであることを特徴とする。
【００１９】
また、一般式（１）中、Ｘ-は１価のアニオンである。Ｘ-はカウンターアニオンとして機能する。Ｘ-の具体例としては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、水酸化物イオン、酒石酸イオンを挙げることができる。なお、Ｒが負電荷を有している場合には、カウンターアニオンは不要となるので、Ｘ-は存在しなくてもよい。
【００２０】
また、本発明に係る診断薬は、一般式（１）で示される化合物を当該化合物の同位体化合物群における天然存在比を超えて含有する診断薬である。
【００２１】
また、本発明に係る核磁気共鳴方法は、
一般式（１）で示される化合物の1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合における各核の間での磁気コヒーレンス移動を利用して、該化合物の存在を確認することを特徴とする核磁気共鳴分析方法である。
【００２２】
また、本発明に係る質量分析方法は、
一般式（１）で示される化合物と該化合物の他の同位体化合物との存在量比を算出することを特徴とする質量分析方法である。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、コリン及びコリン誘導体について、ＮＭＲや質量分析により確実に検出することができる安定同位体原子を用いた標識化合物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明者らは、許容体内投与量、体内での蓄積量並びに非放射線系の検出装置による検出感度に関し、様々な生体内材料について鋭意検討を行った結果、コリンに注目することとした。先ず、コリンはビタミンＢ複合体の一つで、遊離形のみならず、ジヘキサデシルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）等のホスファチジルコリンや、スフィンゴミエリンといったリン脂質、またはアセチルコリンといった形で動植物組織に広く分布している。このように、生体内においてコリン単独だけではなく何種類ものコリン誘導体という形で存在することは、生体組織に取り込まれたコリンが重要な役割を担う形で生体内にある程度の時間留まることを意味し、コリン及びコリン誘導体を検出できる可能性があること、並びにその動態を追跡する意義があることを示す。なお、コリンは下記一般式（４）で示される。
【００２５】
【化２】
0004954165.tif 000003
Ｘ-は１価のアニオンである。Ｘ-の具体例としては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、水酸化物イオン、酒石酸イオンを挙げることができる。 SHAPE  \* MERGEFORMAT
【００２６】
また、コリンとコリンの水酸基のＨが置換したコリン誘導体とを併せて表示すると下記一般式（５）のようになる。
【００２７】
【化３】
0004954165.tif 000004
【００２８】
コリン自体の作用としては、脂肪代謝の調整や血圧降下作用、胃液分泌促進作用等の種々の作用があることが知られている。
【００２９】
ホスファチジルコリンは、哺乳類では食物由来のコリンを利用する経路から合成される。具体的には、コリンはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によりリン酸化されてホスホリルコリンとなり、これがシチジン三リン酸（ＣＴＰ）と反応してＣＤＰ−コリンとなる。更に、ＣＤＰ−コリンのホスホリルコリン部分はジアシルグリセロールに転移され、ホスファチジルコリンとなる。このホスファチジルコリンは、レシチンとも呼ばれ真核生物では最も含有量の高いリン脂質であり、脂質２重膜を形成し細胞膜の主要構成成分である。
【００３０】
さらに、ホスファチジルコリンとセラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン）が反応することにより、スフィンゴミエリンとなる。このスフィンゴミエリンは、動物の臓器、特に脳や神経組織に多く分布しており、脳、神経系の代謝と機能に重要な役割を担う。
【００３１】
また、コリンから合成される別の誘導体として、アセチルコリンが知られている。アセチルコリンは、生体組織、特に神経組織に多く存在し、アドレナリンとともに重要な神経刺激の化学的伝達物質であり、アルツハイマー病の原因にアセチルコリンの脳内濃度の低下が考えられている。アセチルコリンは、生体内においてはアセチルＣｏＡとコリンから、アセチル基転移酵素により生産される。
【００３２】
以上のように、コリンはその主要部分構造を維持した状態で生体内において、誘導体としても多く存在しており、投与されたコリンが生体内、生体組織に留まる確率が高いことから、検出感度が低い分析装置においても生体組織内で検出できる可能性がある。更に、コリン誘導体は、上述のように生体において様々な重要な役割を担っており、コリン並びにコリン誘導体を生体内、生体組織中で検出する意義は高いと考えられる。例えば、異常な細胞分裂を繰り返す腫瘍細胞では、コリンキナーゼ活性が亢進し、コリンやその誘導体（ホスホコリンやホスホエタノールアミン）の細胞内濃度が増加していることが知られている。すなわち、ホスファチジルコリンを主とする細胞膜リン脂質の合成が活発化している。コリン代謝の亢進は、前立腺腫瘍、脳腫瘍、乳ガンなどで確認されていることからも、腫瘍を検出する診断薬としての可能性は大きい。
【００３３】
また、コリン自体は食物由来であり、また細胞膜の原料であることから容易に細胞内に取り込まれる。コリン単独の形態での生体内存在が知られており、安全性の観点からある程度の許容投与量があるものと考えられる。
【００３４】
以上の考察から、コリン及びコリン誘導体を安定同位体原子で置換して標識することで、放射線を利用しない検出手法により、高感度で高分解能の検出を行うことに関して、本発明者らは鋭意検討をおこなった。
【００３５】
先ず、核磁気共鳴（ＮＭＲ）による検出を考えた場合、同一存在量の場合において最も感度よく検出できる元素は1Ｈである。従って、安定同位体による置換を鑑みた場合、1Ｈを重水素に置換するという選択肢は有効ではない。更に、質量分析による分析を考えた場合は、測定中のイオン化プロセスにおいてプロトンや水素原子の付加ないしは脱離反応を伴うことが多いため、1Ｈを重水素で置換すると、測定結果の解析が複雑化する可能性があった。また、水素原子は結合する場所により生体内において容易にプロトン交換という形で置換されてしまう現象も起こりうる。従って、質量分析や核磁気共鳴による検出を前提にした場合、安定同位体原子による標識において、水素原子：1Ｈを重水素Ｄに置換する意義は薄いという判断に至った。
【００３６】
次に、炭素原子における12Ｃから13Ｃへの置換について検討した。各々の元素の質量数の違いより、13Ｃ炭素への置換数に応じてコリンの分子量が大きくなる。また、分子中の炭素原子は生体内において容易に別の炭素原子に置き換わることはない。従って、ある程度の数（例えば３つ）の炭素原子を13Ｃに置換することにより、質量分析を用いて元々存在していたコリンと区別することが可能となる。また、13Ｃの天然存在比は約１％であるため、３つの炭素原子が13Ｃに置換された分子が存在する確率は約１／１００万となり、自然界に存在する確率はかなり低い。しかし、投与した標識化コリンの生体内での目的部分における集積度が低い場合には、天然に存在するコリンであって標識化コリンと同じ部位に13Ｃを有しているものとのコントラストが十分でない可能性がある。
【００３７】
一方、核磁気共鳴での検出を考えたときも同様に、13Ｃ置換することで13Ｃの核スピンを利用した13Ｃ−ＮＭＲ測定が行える可能性がある。また、更に置換した13Ｃに1Ｈが結合している場合は、1Ｈ−13Ｃ間の磁気コヒーレンス移動を利用した多重共鳴による検出も可能である。この多重共鳴の場合は、13Ｃに結合している1Ｈ自体を検出することで検出感度としては1Ｈ−ＮＭＲとほぼ同等の感度が期待できる。しかし、同様に13Ｃの天然存在比を鑑みると、たとえ1Ｈ−13Ｃ間の多重共鳴を利用するにしても、13Ｃにより標識化したコリンの存在量が低い状態なのか、天然に存在する13Ｃを含有しているコリンなのかは区別がつかない可能性がある。
【００３８】
次に、コリンを構成する元素のうち、窒素原子に注目した。窒素原子も安定同位体原子：15Ｎが存在し、また15Ｎの核スピンもＩ＝１／２であることからＮＭＲによる検出も、原理的には可能であるが、15Ｎ−ＮＭＲ自体の感度は高くない。また、15Ｎ置換によるコリンの分子量の変化は約１マスでしかなく、超高分解能の装置を利用して、13Ｃ若しくはＤ置換による分子量変化と15Ｎ置換による分子量変化を区別できる装置を用いる以外は、有効に15Ｎ置換コリン標識化合物を天然に存在する13Ｃ若しくはＤ置換コリンと区別することは困難である。
【００３９】
以上より、安定同位体において単一の元素のみを置換した標識化合物では、ＮＭＲ若しくは質量分析において、天然に存在する安定同位体原子を含有していたコリンとの区別が困難である可能性があることが考えられた。
【００４０】
そこで、本発明者らは更に検討した結果、コリンの４級アンモニウム基の窒素原子及びこの窒素原子に結合しているメチル基の炭素原子を全てそれぞれの安定同位体に置換することで、標識化合物の選択的な高感度検出が可能となることを見出した。
【００４１】
具体的には、コリンの４級アンモニウム基の窒素原子及びこの窒素原子に結合した３つのメチル基の炭素原子を全て、選択的にそれぞれの安定同位体である15Ｎ及び13Ｃに置換した標識化コリン、並びに該標識化コリンより得られる標識化コリン誘導体を標識化合物として用いることにより、該標識化合物の高感度な検出が可能となることを見出した。これらの化合物では、４原子の安定同位体原子が導入されており、天然存在比的にこれと同じ元素組成をもつ可能性を著しく低減せしめることが可能となった。これにより、質量分析において天然に存在する安定同位体を含有するコリンやコリン誘導体と、標識化したコリンや標識化コリン誘導体との分離検出が容易になった。
【００４２】
更に、この４原子置換の場合、つまり、コリン又はコリン誘導体における４級アンモニウム基の窒素原子と該窒素原子に結合するメチル基の炭素原子とを全て選択的にそれぞれの安定同位体原子15Ｎ及び13Ｃに置換した化合物（標識化コリン又は標識化コリン誘導体）では、核スピン：Ｉ＝１／２を有する元素（1Ｈ、13Ｃ、15Ｎ）が連続して結合している構造を有することになり、核磁気共鳴による選択的な検出が可能となる。この原子配列の場合に、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合間における各核スピン間での磁気コヒーレンス移動による３重共鳴を起こすことが可能となる。しかも、1Ｈは全てメチル基に結合している等価な水素原子で、その数もコリン一分子当たり９個存在する。従って、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合間の３重共鳴を利用して1Ｈを検出することで、天然に存在する安定同位体原子を含有するコリンやそのコリン誘導体と確実に区別して、高感度に標識化コリン及び標識化コリン誘導体を検出できることを見出した。
【００４３】
以上述べてきた本発明の安定同位体原子による標識化コリン及び標識化コリン誘導体、並びにそれらを標識化合物として利用した核磁気共鳴若しくは質量分析手法により、生体内や組織中の標識化コリン及び標識化コリン誘導体の有無を調べることが可能となる。また、非標識のものと標識したものとの存在量比も調べることができる。
【００４４】
ここで、本発明に係る標識化コリン及び標識化コリン誘導体は、下記一般式（１）で示される化合物である。
【００４５】
【化４】
0004954165.tif 000005
式（１）中、Ｒは任意の１価の基であり、Ｘ-は１価のアニオンを表す。Ｘ-はカウンターアニオンとして機能する。Ｘ-の具体例としては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、水酸化物イオン、酒石酸イオンを挙げることができる。但し、Ｒが負電荷を有する場合にはＸ-は存在しなくても良い。
【００４６】
また、本発明に係る標識化コリンは、下記一般式（２）で示される化合物である。
【００４７】
【化５】
0004954165.tif 000006
【００４８】
また、本発明に係る標識化コリン誘導体は、前記一般式（１）で示される化合物であって、Ｒが水素原子以外のものである。
【００４９】
標識化コリン誘導体の具体例としては、下記一般式（６）で示されるエステル構造を有する化合物を挙げることができる。
【００５０】
【化６】
0004954165.tif 000007
一般式（６）においては、Ｒ1が炭素数２以上４以下のアルキルカルボニル基であるか、Ｒ1Ｏがリン酸残基である。
【００５１】
なお、この一般式（６）で示される化合物は、前記一般式（１）で示される化合物であって、前記Ｒが炭素数２以上４以下のアルキルカルボニル基であるもの、あるいは前記ＲＯがリン酸残基であるもの、を示している。
【００５２】
また、より具体的には、下記一般式（３）で示されるリン酸エステル構造を有する標識化コリン誘導体を挙げることができる。下記一般式（３）は、上記一般式（６）でＲ1Ｏがリン酸残基である場合をより具体化したものである。
【００５３】
【化７】
0004954165.tif 000008
（Ｒ2及びＲ3は、互いに独立して炭素数が１０以上２０以下の飽和又は不飽和のアルキル基を表す。）
【００５４】
これらの標識化コリン誘導体の具体例としては、アセチルコリン、ホスフォコリン、ジヘキサデシルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）やジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）等のホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等の４級アンモニウム基の窒素原子及び該窒素原子に結合しているメチル基の炭素原子の全てをそれぞれの安定同位体15Ｎ又は13Ｃで置換した化合物などが挙げられる。
【００５５】
これらの化合物は、核磁気共鳴や質量分析を利用した診断における診断薬として利用することが可能である。すなわち、本発明に係る化合物を含有する組成物を診断薬として利用することが可能である。診断薬の具体例としては、ＭＲ造影剤や質量分析用診断薬を挙げることができる。
【００５６】
診断薬として機能を発揮するためには、診断薬中の一般式（１）で示される化合物の同位体化合物群における存在比が天然存在比を超えていることが必要である。言い換えると、診断薬中でのコリンあるいはコリン誘導体（これらは、上記一般式（５）で示される化合物である）のうち、標識化コリンあるいは標識化コリン誘導体（これらは、上記一般式（１）で示される化合物である）の占める割合が、天然存在比を上回っていなければ、バックグラウンドと区別することができない。また、診断薬としての機能をさらに向上させるという観点からは、測定系内における一般式（１）で示される化合物の存在量が多ければ多いほど良い。測定系内における一般式（１）で示される化合物の存在量を多くするための一つの手法としては、前記診断薬中に含まれる一般式（５）で示される化合物の量（分子数）に対する一般式（１）で表される化合物の量（分子数）の割合を可能な限り高くすることが考えられる。たとえば、診断薬中の一般式（５）で示される化合物の分子数が、該化合物の他の同位体化合物すべての該診断薬中に含まれる分子数の合計よりも大きいことが、好ましい。また、診断薬中の一般式（１）で示される化合物の同位体化合物群における存在量（分子数）が９０％以上であることがより好ましい。
【００５７】
これらの診断薬を利用した診断に用い得る方法としては、以下の方法を挙げることが出来る。
・上記化合物の1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合における各核の間での磁気コヒーレンス移動を利用  して、該化合物の存在を確認することを特徴とする核磁気共鳴分析方法
・上記化合物の1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合における各核の間での磁気コヒーレンス移動を利用  した核磁気共鳴分析手法を用いることにより、試料検体中における該化合物の存在位置  を確認することを特徴とする核磁気共鳴イメージング方法
・上記化合物と該化合物の他の同位体化合物との存在量比を算出することを特徴とする質  量分析方法
・上記化合物と該化合物の他の同位体化合物との存在量比を算出することにより、試料検  体中における上記化合物の存在位置情報を得ることを特徴とする質量分析イメージング  方法
【００５８】
なお、本発明の化合物は治療薬として利用できる可能性もある。
【００５９】
更に、本発明者らは鋭意検討を行い、これらの標識化コリンや標識化コリン誘導体の存在する場所を生体内又は生体組織中で特定する技術について検討を重ねた。
【００６０】
その結果、例えば質量分析手法においては試料検体としての生体試料切片を試料台に置き、そこにレーザー若しくはＧａイオン等のイオンを照射し、照射面から脱離したイオン種を分析する事が可能であることがわかった。したがって、標識化コリンや標識化コリン誘導体が存在する部分をマッピングすることで、標識化合物の試料検体中の存在位置を特定することができる質量分析イメージング手法を提供できることがわかった。
【００６１】
また、核磁気共鳴分析手法においては、生体に対してスライス磁場をかけながら、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合における磁気コヒーレンス移動を利用した多重共鳴測定を行うことで、標識化コリン又は標識化コリン誘導体の存在場所を可視化できる核磁気共鳴イメージング手法（所謂ＭＲＩ）が、理論的には可能となる。
【００６２】
特にＭＲＩにおいては、一般的にその感度は高くないが、本発明では、多重共鳴との組合せにより13Ｃ及び15Ｎの磁気回転比が小さい元素の存在を1Ｈという磁気回転比の大きな元素で検出できるため、高感度で標識化合物を検出することができる。更に、本発明の標識化コリンや標識化コリン誘導体の場合は、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの３元素間での多重共鳴が可能な1Ｈの数が１分子中９個も存在することから、これまで一般に市販されている標識化合物に比べて高感度で検出することができる可能性がある。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
下記のスキームに従って、メチル基の炭素原子とアンモニウム基の窒素原子の全てが13Ｃ及び15Ｎで置換された標識化コリンを合成した。
【００６４】
【化８】
0004954165.tif 000009
以下に、具体的な合成手順を示す。
【００６５】
＜15Ｎ−グリシンメチルエステル塩酸塩の合成＞
塩化ナトリウム ( 31.097 g, 532 mmol ) に濃硫酸（30 ml）を加えて発生させた塩化水素を氷冷した乾燥メタノール（100 ml）に吹き込んだ。これに15Ｎ−グリシン (76.07 mg, 1.00 mmol) を加え、アルゴン雰囲気下1時間加熱還流した。溶媒を減圧下に留去し、白色固体状の15Ｎ−グリシンメチルエステル塩酸塩 (1.24 g, 9.78 mmol, 98%) を得た。
【００６６】
【化９】
0004954165.tif 000010
【００６７】
＜15Ｎ−エタノールアミンの合成＞
上記手順で合成した15Ｎ−グリシンメチルエステル塩酸塩( 1.24 g, 9.78 mmol ) と炭酸水素ナトリウム ( 1.92 g, 19.2 mmol ) をテトラヒドロフラン（250 ml）に懸濁し、室温で30分間攪拌した。ついで、水素化リチウムアルミニウム (376 mg, 9.91 mmol) を加え、常温で10時間攪拌した。その後、蒸留水（4 ml） をゆっくり加え、過剰の水素化リチウムアルミニウムを失活させた。生成した沈殿物を濾過により除き、乾燥メタノールで洗浄後、濾液と洗浄液から減圧下に溶媒を留去した。残渣に乾燥メタノール（20 ml）を加え、残った固体を再度除去した。濾液から溶媒を減圧下に留去し、無色透明オイル状の15Ｎ−エタノールアミン (ほぼ定量的) を得た。
【００６８】
【化１０】
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【００６９】
＜13Ｃ3−15Ｎ−コリンヨウ化物の合成＞
上記手順で合成した15Ｎ−エタノールアミン (607 mg, 9.78 mmol) を乾燥メタノール（25 ml）に溶解し、13Ｃ−ヨウ化メタン (5.00g, 34.9 mmol) と炭酸カリウム (5.2g 37.62 mmol) を加えてアルゴン雰囲気下常温で10時間攪拌した。不溶の無機塩を濾過により除いた後、溶媒を減圧下に留去し、13Ｃ3−15Ｎ−コリン ヨウ化物を淡黄色固体として得た（ほぼ定量的）を得た。
【００７０】
【化１１】
0004954165.tif 000012
【００７１】
＜13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物の合成＞
上記手順で得た13Ｃ3−15Ｎ−コリン ヨウ化物(2270 mg, 9.78 mmol) をメタノール（30 ml）に溶解し、酸化銀 (4.69 g, 20.2 mmol) を加え15分間攪拌した後、濾過により固体を除いた。濾液に0.5 M塩酸水溶液をpHが4になるまで滴下した後、溶媒を減圧下に留去した。残渣に乾燥エタノール（30 ml）を加え、濾過により不溶の固体を除いた。濾液から溶媒を減圧下に留去し、13Ｃ3−15Ｎ−コリン 塩化物を淡黄色固体として得た (387 mg, 2.70 mmol, 27%) を得た。
1H NMR (500MHz, δppm, D2O )：2.91, 3.19 (ともにt、ともに4.5H、CH3), 3.35-3.39 （m、2H, HOCH2CH2）, 3.90-3.93（m、2H, HOCH2CH2）  （図１参照）; MS ( FAB ) m/z 108 (M＋H+)
【００７２】
【化１２】
0004954165.tif 000013
【００７３】
合成した標識化コリンについて1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの３元素間での磁気コヒーレンス移動を利用した多重共鳴測定を行ったところ、メチル基由来のプロトンを選択的に検出することが出来た（図２）。
【００７４】
さらに、合成した標識化コリンについて、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ測定を行ったところ、組成式：Ｃ213Ｃ3Ｈ1415ＮＯに対応するｅｘａｃｔ  Ｍａｓｓ：１０８．１２１７（計算値：１０８.１１４６）を確認し、非標識のコリン（ｅｘａｃｔ  Ｍａｓｓ：１０４．１１８１（計算値：１０４.１０７５））との比較より、目的とする同位体標識が行われた事を確認した（図３）。
【００７５】
（実施例２）
以下のスキームに従って、標識化コリン誘導体である標識したアセチルコリンを合成した。
【００７６】
【化１３】
0004954165.tif 000014
塩化アセチル（10 ml） に、実施例１で合成した13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物（27.9 mg, 0.194 mmol）を加え、アルゴン雰囲気下で1時間加熱還流した。溶媒を減圧下に留去し、13Ｃ3−15Ｎ−アセチルコリン塩化物を淡黄色固体として得た（16.8 mg, 0.091 mmol, 47%）。
1H NMR (500MHz, δppm, D2O )：2.00（s、3H, CH3COO）, 2.93, 3.22 （ともにt、ともに4.5H、CH3）, 3.59-3.60 （m、2H, HOCH2CH2）, 4.40-4.43（m、2H, HOCH2CH2）; MS ( FAB ) m/z 150 (M＋H+)
【００７７】
合成した標識化アセチルコリンについて、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの３元素間での磁気コヒーレンス移動を利用した多重共鳴測定を行い、メチル基由来のプロトンを高強度で検出することが出来た（図４）。
【００７８】
合成した標識化アセチルコリンについて、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ測定により、組成式：Ｃ413Ｃ3Ｈ1615ＮＯ2に対応するｅｘａｃｔ  Ｍａｓｓ：１５０．１３を確認し、非標識のアセチルコリン（比較）との分子量の差を確認した。
【００７９】
さらに、合成した標識化アセチルコリンについて、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ測定を行ったところ、組成式：Ｃ213Ｃ4Ｈ1615ＮＯに対応するｅｘａｃｔ  Ｍａｓｓ：１５０．１２２４（計算値：１５０.１２５２）を確認し、非標識のアセチルコリン（ｅｘａｃｔ  Ｍａｓｓ：１４６．１２７７（計算値：１４６.１１８１））との比較より、目的とする同位体標識が行われた事を確認した（図５）。
【００８０】
（実施例３）
以下のスキームに従って、標識化コリン誘導体である標識したホスフォコリンを合成した。
【００８１】
【化１４】
0004954165.tif 000015
【００８２】
＜リン酸化13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物の合成＞
塩化ホスホリル (175.5 mg, 1.15 mmol)にクロロホルム（180 μl）と蒸留水（20 μl）を加え、室温で15分間攪拌した。ここに実施例１で合成した13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物（20.1 mg, 0.141 mmol）を加え、室温で15時間攪拌した。反応後、蒸留水（150 μl）を加え、水相を分取した。これに水酸化カルシウムをpHが10になるまで加え、固体を濾別した後、濾液を減圧下に留去し、リン酸化13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物をカルシウム塩として得た（ほぼ定量的）。
1H NMR (500MHz, δppm, D2O )：2.93, 3.22（ともにt、ともに4.5H、CH3）, 3.41-3.46（m、2H, POCH2CH2 ）, 4.01-4.05（m、2H, POCH2CH2）
【００８３】
合成した標識化ホスフォコリンについて、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの３元素間での磁気コヒーレンス移動を利用した多重共鳴測定を行い、メチル基由来のプロトンを選択的に検出することが出来た（図６）。
【００８４】
合成した標識化ホスフォコリンについて、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ測定により、組成式：Ｃ213Ｃ3Ｈ1515ＮＯ4Ｐに対応するｅｘａｃｔ  Ｍａｓｓ：１８８．０８を確認し、非標識のホスフォコリン（比較）との分子量の差を確認した。
【００８５】
（実施例４）
実施例１で合成した13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物を、下記手順に従い癌細胞を担持させたマウスに投与し、核磁気共鳴法による測定で各器官における13Ｃ3−15Ｎ−コリン化合物の有無を確認した（図７〜１０）。
【００８６】
（ｉ）担癌マウスの作製
腹空にmeth-A細胞を飼っているBALB/cマウスにシリンジで生理食塩水 (50 ml) を加え、meth-A細胞を回収した。遠心分離で細胞を沈殿させた後、上澄み液を除去し、PBS (50ml) に溶解させた。細胞数をカウントして、2.0×107 個/mlになるように調整し、これを新しく用意したBALB/cマウスの左足の皮下に100 ml投与した。
【００８７】
（ｉｉ）二重ラベル化コリンの投与・解剖・NMR解析
二重ラベル化コリンPBS溶液（2 mg/ml, 100 ml）を担癌マウスに、尻尾の静脈から投与した。1時間経過後、マウスを開切し、必要な臓器 (血液(200ml)・肝臓・腎臓・癌) を順に取り出して、それぞれエッペンチューブに回収した。これに1×Lysis buffer (500 ml) を加え、ビーズを用いて各臓器をすり潰し、遠心分離(4℃, 14000rpm, 30min)で不溶物を沈殿させた後、上澄み液を回収して1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの３元素間での磁気コヒーレンス移動を利用した多重共鳴NMR解析を行なった。
【００８８】
その結果、3.0ppmにコリンのメチル基由来のシグナルが、肝臓・腎臓・癌で検出することができた。
【００８９】
（比較）
＜ＮＭＲ測定＞
市販のコリン（非標識）に関して、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの３元素間での磁気コヒーレンス移動を利用した多重共鳴測定を行ったが、メチル基由来のプロトンを検出することはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】標識化コリンの一次元プロトンＮＭＲスペクトル
【図２】標識化コリンの三重共鳴ＮＭＲスペクトル
【図３】標識化及び非標識化コリンのＭＳスペクトル
【図４】標識化アセチルコリンの三重共鳴ＮＭＲスペクトル
【図５】標識化及び非標識化アセチルコリンのＭＳスペクトル
【図６】標識化ホスフォコリンの三重共鳴ＮＭＲスペクトル
【図７】担癌マウスの血液の三重共鳴ＮＭＲスペクトル
【図８】担癌マウスの肝臓の三重共鳴ＮＭＲスペクトル
【図９】担癌マウスの腎臓の三重共鳴ＮＭＲスペクトル
【図１０】担癌マウスの癌組織の三重共鳴ＮＭＲスペクトル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図４】
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【図６】
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