(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄から採取し株化した骨髄幹細胞を、Transferrin、Insulin、sodium selenite、血清アルブミン、Ascorbic acid、dexamethasone、EGF、Progesterone、及びNicotinamideを添加した培地で培養することによりインスリン発現細胞を取得する、膵臓β細胞を再生する方法。
【請求項２】
骨髄より採取した幹細胞を継代培養して骨髄間質幹細胞株を作製し、この骨髄間質幹細胞株をFBS、Ascorbic acid、及びdexamethasoneを加えた培地で培養し、その後、培地をFBS、Transferrin、Insulin、sodium selenite、BSA、Ascorbic acid、dexamethasone、EGF、Progesterone、及びNicotinamideを加えた培地に変更して培養を行うことによってインスリン発現細胞を取得する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄の幹細胞を培養し分化誘導することによってインスリン産生細胞である膵臓β細胞を高効率に再生する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は２０世紀後半以降急激に増大し、今では、日本における患者人口は予備軍を含めると１３００万人と推定され、大きな国民的問題になりつつある。Ｉ型糖尿病は膵臓のインスリン産生が阻害される疾患で、インスリン注射が必要になる。ＩＩ型糖尿病は糖尿病の９０％以上を占め、インスリンは産生されるものの体細胞がインスリン抵抗性を示す疾患である。ＩＩ型糖尿病においても症状が進むとインスリンの補充が必要になる。【０００３】
糖尿病の主な治療法は、膵臓のインスリン産生の低下を補うためのインスリン注射であるが、最近では経口のインスリン製剤も開発され、またβ細胞（膵臓のインスリン産生細胞）の同種移植や、動物のβ細胞を免疫隔離カプセルへ封入した人工膵島の移植も検討されている。一方、近年、再生医療の進展とともにβ細胞自体を再生させようとする研究も盛んになってきた。β細胞をin vitroで作るための細胞源としては、膵臓、肝臓、腸管、ES細胞、骨髄などが研究されている。【０００４】
膵導管細胞からのβ細胞再生では、レチノイン酸のDDS製剤、アクチビン、ベータセルリン等の増殖因子、pdx-1等の転写因子タンパクの利用、並びにpdx-1遺伝子又はNeuroD遺伝子等の遺伝子導入が検討されており、膵導管上皮細胞から約７０％という高効率でインスリン発現細胞を分化誘導した例がある（β細胞関連転写因子，分化増殖因子発現アデノウイルスベクターの膵管内投与によるインスリン賛成細胞の再生，  及川洋一 他  第3回日本再生医療学会総会（2004年3月））。【０００５】
肝臓からのβ細胞再生では、藤宮らはマウスへウイルスベクターでNeuroD,ベータセルリン遺伝子を導入し、肝臓内へ膵ラ氏島を再生した。血糖値は４ヶ月以上にわたって正常値が維持された。また、in vitroで肝細胞を分化することができた（成体ラット肝幹様細胞を用いた膵内分泌細胞への分化誘導，  山田聡子 他  第3回日本再生医療学会総会（2004年3月））。【０００６】
腸管上皮からのβ細胞再生では、谷口らはマウス腸管上皮細胞を採取し、glucagon様ペプチドを添加して培養することによりインスリン発現細胞へ分化できた（小腸上皮細胞におけるインスリン分泌細胞の分化誘導，  谷口英樹  第3回日本再生医療学会総会（2004年3月））。【０００７】
ES細胞からのβ細胞再生では、城井らはマウスES細胞へnhx2.2遺伝子を導入し、高効率にインスリン産生細胞へ分化誘導できた（nkx2.2遺伝子導入ES細胞からインスリン産生細胞への分化誘導と治療の試み，  城井啓  他  第3回日本再生医療学会総会（2004年3月））。しかし、１ｘ１０6個をマウス腎へ移植したが、血糖値正常化は得られなかった。【０００８】
骨髄の間葉系細胞（以下、MSC）からのβ細胞再生では、中田らはICRマウス骨髄から骨髄細胞を採取し、マウス膵島細胞培養条件下で培養し、bFGF等の増殖因子を用いて分化誘導し、インスリン発現細胞を再生することができた（骨髄細胞からグルコース応答インスリン分泌細胞分化誘導の試み，  中田正範 他  第3回日本再生医療学会総会（2004年3月））。グルコース応答性もみられたが不完全であった。また、分化できたのは骨髄MSCの数％程度と少ない【０００９】
In vitroでのβ細胞再生では、泉田らは高血糖モデルラットへ同種のラット大腿骨から採取した骨髄細胞をPKH-26染色で標識したものを尾静脈より移植し、48日後に膵臓を摘出しインスリン染色を行い、移植した骨髄細胞由来のインスリン産生細胞が存在していることを確認した（ラット糖尿病モデルにおける骨髄細胞のインスリン産生細胞への分化誘導に関する検討，  泉田欣彦  第3回日本再生医療学会総会（2004年3月））。しかし、分化誘導は行っていない。【００１０】
胎盤細胞からのβ細胞再生では、松本らは、マウス胎盤由来細胞をEGF、bFGF、Nicotinamideを添加した無血清培地で浮遊培養することによりsphereを形成するインスリン産生細胞を誘導した（胎盤由来インスリン分泌細胞の糖尿病治療への可能性，  松本秀一朗 他  第3回日本再生医療学会総会（2004年3月））。この細胞はIn vitroでは増殖しなかった。【００１１】
以上のようなin vitroでβ細胞を再生してこれを機能が低下している膵臓へ移植することによって治療する方法とは別に、体内の幹細胞へ刺激を加えることによってin vivoでβ細胞を再生させようとする研究も行われている。山口らは、Ｉ型糖尿病モデルラットへall trans retinoic acid DDS製剤を投与し、インスリン分泌能を改善した（ビタミンA活性体及びそのDDS製剤による体性幹細胞の膵β細胞への分化誘導の可能性，  川上麻理子 他  第3回日本再生医療学会総会（2004年3月））。これは体性幹細胞がβ細胞へ分化したものと推測されている（以上、2004年第３回再生医療学会総会より）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
膵臓β細胞の再生を目指した研究の多くは膵臓の細胞やES細胞を元にした再生を目指しているが、これらの細胞源は入手が容易でなかったり、倫理面の問題があるため臨床応用に向いているとはいえない。最も現実的な幹細胞源は骨髄間葉系幹細胞（MSC）であると考えられる（ここでは多能性幹細胞：MAPCも含む）。最近は同等の分化能を有する細胞が脂肪組織や胎盤にも存在することが明らかになってきており、さらに臍帯血や末梢血中での存在も示唆されている。これらの細胞はいずれも非侵襲的に採取できることから、臨床応用に適した細胞源であるといえる。本発明の目的は、細胞移植治療のための膵臓β細胞を、骨髄細胞などの採取容易な細胞から再生する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
骨髄ＭＳＣからのβ細胞誘導も研究されているが、分化できたのは骨髄ＭＳＣのうちの数％程度と非常に少ないのが現状である。本発明は、ＭＳＣからのβ細胞のより効率的な分化誘導方法を提供するものである。本発明者らは、マウスおよびヒトで骨髄細胞の継代培養とコロニーアッセイにより自然株化細胞を得ることに成功した。この株細胞は適当な増殖因子の組み合わせにより、インスリン陽性細胞に１０数％以上の高い効率で分化誘導できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１４】
即ち、本発明によれば、間質から採取した幹細胞を分化誘導因子を添加した培地で培養することによりインスリン発現細胞を取得することを含む、膵臓β細胞を再生する方法が提供される。【００１５】
好ましくは、株化した間質幹細胞を分化誘導因子を添加した培地で培養することによりインスリン発現細胞を取得する。
好ましくは、間葉組織から採取し株化した間質幹細胞を分化誘導因子を添加した培地で培養することによりインスリン発現細胞を取得する。
好ましくは、間葉組織は、骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血、又は胎盤である。【００１６】
好ましくは、間質から採取した幹細胞を、Transferrin、Insulin、sodium selenite、血清アルブミン、Ascorbic acid、dexamethasone、EGF、Progesterone、及びNicotinamideのいずれか１種以上を添加した培地で培養することによりインスリン発現細胞を取得する。【００１７】
好ましくは、間質から採取した幹細胞を、Transferrin、sodium selenite、血清アルブミン、Ascorbic acid、dexamethasone、及びProgesteroneのいずれか１種以上を添加した培地で培養することによりインスリン発現細胞を取得する。【００１８】
好ましくは、骨髄より採取した細胞を継代培養して骨髄間質細胞株を作製し、この骨髄間質細胞株をFBS、Ascorbic acid、及びdexamethasoneを加えた培地で培養し、その後、培地をFBS、Transferrin、Insulin、sodium selenite、BSA、Ascorbic acid、dexamethasone、EGF、Progesterone、及びNicotinamideを加えた培地に変更して培養を行うことによってインスリン発現細胞を取得する。【００１９】
本発明の別の態様によれば、体性幹細胞、ES細胞または脱分化させた成熟細胞をTransferrin、Insulin、sodium selenite、血清アルブミン、Ascorbic acid、dexamethasone、EGF、Progesterone、及びNicotinamideのいずれか１種以上を添加した培地で培養することによりインスリン発現細胞を取得することを含む、膵臓β細胞を再生する方法が提供される。【００２０】
本発明のさらに別の態様によれば、体性幹細胞、ES細胞または脱分化させた成熟細胞を培養する密閉された容器と、Transferrin、Insulin、sodium selenite、血清アルブミン、Ascorbic acid、dexamethasone、EGF、Progesterone、及びNicotinamideのいずれか１種以上を時間的に制御された順序かつ制御された量で、該容器へ添加する機構と、制御された時間に培地を交換する機構と、滅菌された空気を循環させる機構と、該容器の温度を制御する機構と、該細胞の培養状態をモニターする機構と、該細胞を該容器へ充填および容器から排出する機構とを備えた、膵臓β細胞の再生装置が提供される。【００２１】
本発明のさらに別の態様によれば、体性幹細胞、ES細胞または脱分化させた成熟細胞を増殖させ、Transferrin、Insulin、sodium selenite、血清アルブミン、Ascorbic acid、dexamethasone、EGF、Progesterone、及びNicotinamideのいずれか１種以上を加えた培地で培養することにより膵臓β細胞を再生し、再生した膵臓β細胞を糖尿病患者に移植することを含む、糖尿病の治療方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による膵臓β細胞を再生する方法は、間質から採取した幹細胞を分化誘導因子を添加した培地で培養することによりインスリン発現細胞を取得することを特徴とする方法である。【００２３】
間質とは、骨髄などに含まれる支持組織であり、一般的には、間質細胞と細胞外基質から構成される。本発明では、間質などの組織中に存在する幹細胞を採取して使用する。採取する幹細胞は好ましくは間葉系幹細胞である。間葉とは、各胚葉の間を埋める疎性結合組織であり、一般には中胚葉由来であるが、外胚葉由来のものもある。間葉系幹細胞を含む組織としては、骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血、胎盤などを挙げることができる。【００２４】
幹細胞とは、外胚葉（歯髄細胞（歯髄線維芽細胞を含む）、上皮細胞（歯）、エナメル上皮基底膜細胞、神経細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞など）、中胚葉（骨芽細胞、軟骨細胞、骨細胞、腎基底膜細胞、血液系細胞）、内胚葉（消化管上皮細胞、消化管実質細胞）などの細胞へと分化しうる又はそれらの修復を促進しうる多能性を有する未分化な細胞である。幹細胞としては、各組織・臓器に含まれ、分化の方向性がある程度決定されている体性幹細胞を使用してもよいし、胚性幹細胞をはじめとする多能性幹細胞を使用してもよい。また、本発明では、幹細胞として、脱分化させた成熟細胞を用いてもよい。【００２５】
本発明において幹細胞は、当該細胞を有する任意の間質から採取することができるが、好ましくは骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血、又は胎盤などから採取することができる。多量の細胞が採取可能であること及び採取が容易であるという観点から、大腿骨、脛骨又は骨盤（腸骨）から採取することが好ましい。骨髄由来の間葉系幹細胞の採取方法は当業者に公知であり、例えば医療において用いられている通常の採取方法を用いることができる。具体的には、ヒトに対しては、患者に対するインフォームドコンセントのもとに、ヒト大腿骨、腸骨、顎骨、末梢血管等の幹細胞が存在する組織および器官より、注射器や穿刺針などを用いて骨髄や末梢血を無菌的に必要量採取し、そのまま、培養容器に播種し浮遊系細胞と接着系細胞を分離することで使用するか、フローサイトメトリー、または密度勾配遠心法などの手法を用いることで、幹細胞を採取分離することができる。ヒト以外の哺乳動物の骨髄から間葉系幹細胞を採取する際には、例えば骨（大腿骨、脛骨）の両端を切断し、間葉系幹細胞の培養に適する培地で骨内を洗浄して、洗い出された該培養液から間葉系幹細胞を取得することができる。【００２６】
間葉系幹細胞の初代培養及び／又は継代培養を行うには、採取分離した細胞を適当な培地（例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）培地、又はα−ＭＥＭ培地など）を用い、組織培養用培養皿に細胞を播種して初代培養及び継代培養する。培養に用いる血清としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いることができる。【００２７】
細胞の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温から37℃の温度；5％CO2インキュベーター内など）の下で行なうことができる。培養の形態は特に限定されないが、例えば、静置培養で行なうことができる。【００２８】
本発明において、幹細胞からインスリン産生細胞である膵臓β細胞への分化誘導培養は、初代培養及び継代培養した幹細胞を、分化誘導培地を用いて培養し、細胞を分化誘導することにより行うことができる。ここで分化誘導培地とは、以下に説明する分化誘導因子を添加した培地のことを言う。【００２９】
本発明で用いる分化誘導因子としては、幹細胞をインスリン発現細胞へと分化させることができる因子であれば、その種類は特に限定されない。分化誘導因子としては、具体的には、トランスフェリン（Transferrin）、インスリン（Insulin）、亜セレン酸ナトリウム（sodium selenite）、血清アルブミン、アスコルビン酸（Ascorbic acid）、デキサメタゾン（dexamethasone）、EGF（上皮増殖因子）、プロゲステロン（Progesterone）、及びニコチンアミド（Nicotinamide）などを用いることができる。本発明では、上記９種の分化誘導因子のいずれか１種以上を用いることができ、好ましくは、上記９種の分化誘導因子のうちの２種類以上（さらに好ましくは３種類以上）を組み合わせて使用することができ、特に好ましくは上記９種の全ての分化誘導因子を使用することができる。また別の好ましい実施態様によれば、トランスフェリン（Transferrin）、亜セレン酸ナトリウム（sodium selenite）、血清アルブミン、アスコルビン酸（Ascorbic acid）、デキサメタゾン（dexamethasone）、及びプロゲステロン（Progesterone）の６種の分化誘導因子を組み合わせて使用することができる。【００３０】
トランスフェリン（Transferrin）を使用する場合、トランスフェリンの培地中の濃度は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には、５〜５００μg/mlであり、好ましくは１０〜２００μg/mlである。【００３１】
インスリンを使用する場合、インスリンの培地中の濃度は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には、０．５〜５０μg/mlであり、好ましくは１〜２０μg/mlである。【００３２】
亜セレン酸ナトリウムを使用する場合、亜セレン酸ナトリウムの培地中の濃度は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には、０．５〜５０ng/mlであり、好ましくは１〜２０ng/mlである。【００３３】
血清アルブミンを使用する場合、血清アルブミンの培地中の濃度は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には、０．１〜１０mg/mlであり、好ましくは０．２〜５mg/mlである。【００３４】
アスコルビン酸を使用する場合、アスコルビン酸の培地中の濃度は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には、５〜５００μg/mlであり、好ましくは１０〜２００μg/mlである。【００３５】
デキサメタゾンを使用する場合、デキサメタゾンの培地中の濃度は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には、１〜１００ｎＭであり、好ましくは２〜５０ｎＭである。【００３６】
EGFを使用する場合、EGFの培地中の濃度は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には、０．２〜２０ng/mlであり、好ましくは０．５〜１０ng/mlである。【００３７】
プロゲステロンを使用する場合、プロゲステロンの培地中の濃度は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には、２．５〜２５０ng/mlであり、好ましくは５〜１００ng/mlである。【００３８】
ニコチンアミドを使用する場合、ニコチンアミドの培地中の濃度は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には、１〜１００mMであり、好ましくは２〜５０mMである。【００３９】
上記した本発明の方法に従って幹細胞を培養して、これを分化誘導することによって、インスリン産生細胞を取得することができる。分化誘導された細胞におけるインスリンの発現の有無については、mRNAレベルの発現についてはRT-PCR又はノザンブロット、あるいはin situ hybridizationなどにより確認でき、タンパク質レベルの発現についてはウェスタンブロット、免疫染色などにより確認できる。RT-PCR及びノザンブロット、in situ hybridizationは、インスリン遺伝子を特異的に検出できるプライマー又はプローブ（プロインスリンを検出するためのプライマー又はプローブを使用してもよい）を用いて、当業者の公知の常法により行うことができる。また、ウェスタンブロット及び免疫染色は、抗インスリン抗体を用いて、当業者の公知の常法により行うことができる。また、Pdx1遺伝子（膵臓の発生にかかわる重要な遺伝子であり、インスリン産生細胞の発生及び機能維持の役割も担っていると考えられている）の発現の有無を指標とすることによって、膵臓β細胞の再生を確認することもできる。【００４０】
本発明の方法で再生した膵臓β細胞は、インスリンを発現することができ、糖尿病患者に移植することによって糖尿病を治療することができる。【００４１】
さらに本発明は、体性幹細胞、ES細胞または脱分化させた成熟細胞を培養する密閉された容器と、Transferrin、Insulin、sodium selenite、血清アルブミン、Ascorbic acid、dexamethasone、EGF、Progesterone、及びNicotinamideのいずれか１種以上を時間的に制御された順序かつ制御された量で、該容器へ添加する機構と、制御された時間に培地を交換する機構と、滅菌された空気を循環させる機構と、該容器の温度を制御する機構と、該細胞の培養状態をモニターする機構と、該細胞を該容器へ充填および容器から排出する機構とを備えた、膵臓β細胞の再生装置に関する。【００４２】
採取された細胞から膵臓β細胞を再生する一連の工程を自動的に行うための培養装置の一例を図４に示す。体性幹細胞、ES細胞または脱分化させた成熟細胞を選別、希釈または濃縮などの必要な措置を施した後、細胞容器１から装置の中へ注入する。注入口から配管２を通って細胞は培養容器３へ導かれる。Transferrin、Insulin、sodium selenite、血清アルブミン、Ascorbic acid、dexamethasone、EGF、Progesterone、Nicotinamideのいずれか、あるいは複数の組み合わせを備えた分化誘導因子リザーバー群４から時間的に制御された順序で、制御された量が培養容器３へ添加される。また、培地のリザーバー５から制御された時間に培地が培養容器３へ供給され、老廃物を含んだ培地が排出される。分化誘導因子と培地の供給、排出はコンピュータ６で制御されたポンプ機構７によって行われる。培養容器へは、循環機構８によって滅菌された空気と二酸化炭素が供給される。培養容器の温度は温度センサーと加熱・冷却機構９によって制御される。培養容器内の細胞の形状や数、増殖速度は光学的モニター系１０によりモニターされる。培地のｐＨやグルコース濃度は廃液流路で化学センサー１１によりモニターされる。必要な数に増殖したβ細胞は酵素処理などにより剥離後、ポンプ系７により容器１２の中へ排出される。【００４３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１
マウス（C57B1/6, 雄性,６週齢）から採取した骨髄細胞を継代培養し、自発株化による骨髄間質細胞株を得た（２株）。骨髄間質細胞株を得るには、クローニングリングを用いたシリンダー法を行った。薄蒔きにシャーレに播種した骨髄間質細胞の中から、任意の一個の細胞をクローニングリングで囲い、そこで剥離した一個の細胞を24穴プレートに継代した。24穴プレートの中で、一個の細胞からコンフルエントに達した細胞を、やや培養面積の広い6穴プレートに継代し、その中でコンフルエントになるまで培養した。さらに、6穴プレートでコンフルエントに達した細胞を、さらに培養面積の広いT-75フラスコに継代し、培養を続けることで、一個の骨髄間質細胞由来の細胞を得ることができた。また、この細胞を半年から1年程度培養し、公知の方法により培養前と培養後で分化能や増殖能が安定していることを確認し、骨髄間質細胞株として使用することとした。【００４５】
上記で得た骨髄間質細胞株を継代後、10％FBS、50μg/ml Ascorbic acid、10nM dexamethasoneを加えたα−MEM培地で12時間培養した。その後、培地を5％FBS、50μg/ml Transferrin、5μg/ml Insulin、5ng/ml sodium selenite、1mg/ml BSA、50μg/ml Ascorbic acid、10 nM dexamethasone、2ng/ml EGF、25ng/ml Progesterone、10mM Nicotinamideを加えたDMEM培地に変更した。【００４６】
培地交換後７〜１０日後に、第１図に示すように細胞が密集するコロニーが形成され、細胞質内に多数の顆粒が形成された。遺伝子発現を以下の８つの遺伝子について調べた。即ち、配列番号１から１０に記載した塩基配列を有するプライマーをそれぞれ使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を調べた。ＲＴ−ＰＣＲは以下の通り行った。【００４７】
培養した細胞より、RNA採取キット（TRIzol Reagent: Invitrogen）を用いて、Total RNAを採取。cDNA合成キット（Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR: Invitrogen）を用いて2μgのTotal RNAからcDNAを合成した。次に、サンプルチューブ1本あたり、cDNA 1μl, 滅菌水11.3μl, 10×PCR buffer（タカラバイオ製）2μl, dNTP（タカラバイオ製）1.6μl, センスプライマー（終濃度 0.5μM 、下記参照）2μl, アンチセンスプライマー（終濃度 0.5μM、下記参照）2μl, Taqポリメラーゼ（タカラバイオ製）を混和し、総量20μlのサンプルを調整した。調整したサンプルをサーマルサイクラーにセットし、検出目的の遺伝子に応じて20〜35サイクルでPCR反応を実施、最後に電気泳動法により目的の遺伝子を検出した。【００４８】
1. Proinsulin 1 (gttggtgcac ttcctacccc tg（配列番号１） 及び gtagagggag cagatgctgg tg（配列番号２）、300bp)
2. Proinsulin 2 (gtggatgcgc ttcctgcccc tg（配列番号３） 及び gtagagggag cagatgctgg tg（配列番号４）、300bp)
3. Glucagon (tcatgacgtt tggcaagtt（配列番号５） 及び cagaggagaa ccccagatca（配列番号６）、202bp)
4. Somatostatin (gacctgcgaa ctagactgac（配列番号７） 及び tttgggggag agggatcag（配列番号８）、294bp)
5. Pax 4（gctttgtacc caggacaagg ct（配列番号９）及び gaggtgtcac tggaacatct ac（配列番号１０）、552bp）
6. Pax 6（aaccagagaa gacaggccag（配列番号１１） 及び aggttcactc ccgggaagaa（配列番号１２）、420bp）
7. PDX1（ggccacacag ctctacaagg（配列番号１３） 及び ttccacttca tgcgacggtt（配列番号１４）、582bp）
8. G3PDH（accacagtcc atgccatcac（配列番号１５） 及び tccaccaccc tgttgctgta（配列番号１６）、452bp）【００４９】
結果を図２に示す。Proinsulin 1、Proinsulin 2およびPDX-1のmRNAの発現が明瞭に認められた。また、タンパクの発現をWestern Blotにより調べた結果を図３に示す。Western Blotは以下の通り行った。培養した細胞について、培地を除去し、タンパク質溶解剤（Cytobaster Novagen製など）を用いてタンパク質を回収した。ソニケーターで懸濁・加温し、タンパク質濃度1mg/mlに調整したものをサンプルとし、サンプルを10％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。電気泳動したゲルに含まれるタンパク質分画をPVDFメンブレンに転写し、最後に抗インスリンの１次抗体およびペルオキシダーゼ標識した抗1次抗体の2次抗体で目的のタンパク質を検出した。【００５０】
一次抗体：Goat anti-Insulin抗体（Santa Cruz sc-7838, 1:200）
二次抗体：Horseradish peroxides-conjugated anti-Goat IgG抗体（Pierce 31402, 1:5000）
とした。図３に示す通り、Insulinの発現が認められた。【００５１】
分化した細胞の割合について顕微鏡の目視で確認した結果、本発明の方法ではインスリン陽性細胞が高い割合であった。【００５２】
骨髄間質細胞株を分化誘導することにより、膵臓発生のマスター遺伝子pdx-1やProinsulin 1、Proinsulin 2の発現が見られ、さらに、Insulinタンパクの発現が見られたことから、この細胞はβ細胞へ分化したことが確認できた。細胞株からの分化誘導であるため、この実験では周囲に存在していた膵臓細胞との細胞融合の可能性はない。また、培地へ添加したInsulinが細胞内へ取り込まれたものを検出した可能性があるが、分化した細胞内に顆粒が観察され、ProinsulinのmRNAの発現が見られたことから、培地のInsulin以外の寄与が認められる。【００５３】
以上、骨髄間質細胞からの株化細胞について述べたが、脂肪組織、胎盤、臍帯血や末梢血中の細胞にも骨髄間質細胞と近似した分化能を有する細胞が存在することから、同様の処理によりβ細胞へ分化可能であることが予想される。さらに一般の体性幹細胞やES細胞または脱分化させた成熟細胞を同様の処理によりβ細胞へ分化させることも可能と予想される。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の方法によれば、骨髄間質などの採取が容易な間葉系幹細胞から膵臓β細胞を再生することができるので、本発明の方法で再生した膵臓β細胞は、糖尿病に対するβ細胞の移植治療のための細胞源として有効である。また、本発明では株化細胞を用いるので、継代を繰り返すことにより大量の細胞を得ることができる。また保存しておき必要時に再度分化させて移植することもできる。本発明の方法では、遺伝子導入や特殊なタンパク質やサイトカインを用いないことから、臨床応用が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、再生したβ細胞を示す。
【図２】図２は、再生したβ細胞のｍＲＮＡ発現を示す。
【図３】図３は、再生したβ細胞のタンパク発現を示す。
【図４】図４は、β細胞の分化・培養装置図を示す。１  細胞容器、２  配管、３  培養容器、４  分化誘導因子リザーバー群、５  培地のリザーバー、６  コンピュータ、７  ポンプ機構、８  循環機構、９  加熱・冷却機構、１０  光学的モニター系、１１  化学センサー、１２  容器
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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