(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上のプリンオペロンリプレッサータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことにより、該リプレッサータンパク質をコードする遺伝子の転写が低下または消失するように改変されたバチルス属細菌を培地で培養し、培地中にヒポキサンチンおよびグアニンから選択される核酸系物質を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするヒポキサンチンおよびグアニンから選択される核酸系物質の製造法。
【請求項２】
染色体上のプリンオペロンリプレッサータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことにより、該リプレッサータンパク質をコードする遺伝子の転写が低下または消失するように改変され、かつアデニン要求性を付与されたバチルス属細菌を培地で培養し、培地中にイノシンを生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするイノシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵法による核酸系物質の製造法に関する。核酸系物質は、調味料等の原料として産業上有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、発酵法によるイノシン、グアノシン等の核酸及びそれらの塩基（ヒポキサンチン、グアニン等）等の核酸系物質の製造においては、培地中のアデニン系物質の量を制限すると共に、アデニン要求性及び核酸アナログ耐性を付与した変異株（特公昭５５−２９５６号公報、特公昭５５−４５１９９号公報）が用いられている。
【０００３】
通常の変異処理により得られる変異株は、目的の遺伝子以外にも変異が導入されることが多く、また、核酸系物質の生合成経路には複雑な制御機構が存在するために、核酸系物質を著量生産する微生物を得ることは困難である。したがって、従来の菌株育種法によって得られた変異株は、必ずしも満足できるものではなかった。
【０００４】
一方、プリン生合成系に関与する酵素群をコードする遺伝子（プリンオペロン）の発現に関与する配列を改変してプリンオペロンの発現を高めたバチルス属細菌を用いて、イノシンまたはグアノシンを製造する方法が開示されている（特開平３−１６４１８５号公報）。この方法は、プリンオペロンのプロモーター又はオペレーターを改変し、該オペロンの発現量を高め、それによってイノシン又はグアノシンの生産量を高めるというものである。
【０００５】
バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）のプリンオペロン（purEKBC(ORF)QLFMNHD：ORFは機能が未知のオープン・リーディング・フレーム）の発現は、過剰量のアデニンによって抑制され、また、グアニンによるアテニュエーションによっても調節を受けている。さらに、プリンオペロンの５’フランキング領域に結合するリプレッサータンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子（ｐｕｒＲ）が単離されており、ｐｕｒＲ遺伝子を破壊されたバチルス・サチリスは、プリンオペロンに組み込まれたｐｕｒＣ−ｌａｃＺ融合遺伝子の発現のアデニンによる抑制が、約１／１０に低減されたことが示されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7455-7549 (1995)）。
【０００６】
バチルス・サチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、アデニンの生合成に関与するｐｕｒＡ遺伝子やピリミジン生合成に関与するピリミジンオペロンの遺伝子群の発現を調節することが知られている（1997, J. Bacteriol. 179, 7394-7402, H. Zalkin等）。
【０００７】
一方、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）では、プリンオペロンリプレッサーは、プリンオペロンの遺伝子群の他に、５’−ＩＭＰ（イノシン酸）生合成の基質となるグリシンの生合成に関与するｇｌｙＡ遺伝子の発現（1990, J. Bacteriol. 172, 3799-3803, H. Zalkin等）、及びグリシンから供給されるＣ1やＣＯ2の生成に関与するｇｃｖオペロン遺伝子群の発現にも影響することが報告されている（1993, J. Bacteriol. 175, 5129-5134, G. V. Stauffer 等）。
【０００８】
前述のように、プリンオペロンとイノシン又はグアノシンの生産との関係については一部報告されている。しかし、ｐｕｒＲ遺伝子が関与する生合成系は多岐にわたっている。また、バチルス・サチリスのプリンオペロンは１０個の酵素をコードしており、多くの反応に関与している。このように、核酸系物質の生合成系は非常に複雑であり、ｐｕｒＲ遺伝子と核酸系物質の蓄積との関係についてはほとんど知られていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核酸系物質の産業上の重要性から、従来の方法よりもさらに有利に核酸系物質を製造する方法を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、ｐｕｒＲ遺伝子の機能について鋭意検討を行い、その結果、ｐｕｒＲ遺伝子を破壊したバチルス・サチリスが核酸系物質を蓄積することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、
（１）プリンオペロンのリプレッサータンパク質が正常に機能しない微生物を培地で培養し、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とする核酸系物質の製造法、
（２）前記微生物が、染色体上の前記リプレッサータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことにより、該リプレッサータンパク質が正常に機能しないことを特徴とする（１）の方法、
（３）前記微生物がバチルス属細菌である（１）の方法、
（４）前記核酸系物質が核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドである（１）の方法、および
（５）前記核酸系物質が、ヒポキサンチン、ウラシル、グアニンまたはアデニンから選ばれる（４）の方法、である。
【００１２】
本発明において、プリンオペロンのリプレッサータンパク質が正常に機能しないとは、プリンオペロンの５’フランキング領域にリプレッサータンパク質が結合し、該オペロンの転写を抑制する機能が、通常に比べて低いか又は実質的に消失していることをいう。
【００１３】
本発明において核酸系物質とは、ヒポキサンチン、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン等の核酸塩基、イノシン、アデノシン、グアノシン、ウリジン、チミジン、シチジン等のヌクレオシド、イノシン酸、アデニル酸、グアニル酸、ウリジル酸、チミジル酸、シチジル酸等のヌクレオチド、又はこれらのヌクレオシドもしくはヌクレオチドのリボースがデオキシリボースに置換されたものをいう。これらの中では、核酸塩基が好ましい。本発明において、核酸系物質には、プリン系物質及びプリミジン系物質のいずれもが含まれる。プリン系物質には、プリン塩基、及びプリン塩基を有するヌクレオシド並びにヌクレオチドが含まれる。また、ピリミジン系物質には、ピリミジン塩基、及びピリミジン塩基を有するヌクレオシド並びにヌクレオチドが含まれる。本発明において、プリン系物質としてはヒポキサンチン、アデニン及びグアニンが好ましい。また、ピリミジン系物質としてはウラシルが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法に用いる微生物は、プリンオペロンのリプレッサータンパク質（以下、単に「リプレッサー」ともいう）が正常に機能しない微生物である。該微生物は、プリン系物質の生合成系酵素の遺伝子がオペロンを形成しており、該オペロンの調節に関与するリプレッサーをコードする遺伝子（ｐｕｒＲ）を有するものであれば特に制限されないが、具体的にはバチルス属等に属する細菌が挙げられる。バチルス属細菌としては、バチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス等が挙げられる。
【００１５】
リプレッサーが正常に機能しない微生物は、ｐｕｒＲ遺伝子が、該遺伝子産物であるリプレッサーの活性が低下又は消失するか、又はｐｕｒＲ遺伝子の転写が低下または消失するように、改変することによって得られる。このような微生物は、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985)）により、染色体上のｐｕｒＲ遺伝子を、正常に機能しないｐｕｒＲ遺伝子（以下、「破壊型ｐｕｒＲ遺伝子」ということがある）で置換することによって行うことができる。
【００１６】
相同組換えは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、破壊型ｐｕｒＲ遺伝子が染色体上の正常なｐｕｒＲ遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
【００１７】
このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたｐｕｒＲ遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、ｐｕｒＲ遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のｐｕｒＲ遺伝子配列と染色体上のｐｕｒＲ遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。
【００１８】
遺伝子破壊に用いる破壊型ｐｕｒＲ遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によるｐｕｒＲ遺伝子の一定領域の欠失、ｐｕｒＲ遺伝子への他のＤＮＡ断片（マーカー遺伝子等）の挿入、または部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)）によって、ｐｕｒＲ遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることにより、コードされるリプレッサーの活性を低下又は消失させるか、又はｐｕｒＲ遺伝子の転写を低下または消失させることにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりｐｕｒＲ遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はｐｕｒＲ遺伝子へ他のＤＮＡ断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。
【００１９】
ｐｕｒＲ遺伝子は、プリンオペロンを持つ微生物の染色体ＤＮＡから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によって取得することができる。また、プリンオペロンを持つ微生物の染色体ＤＮＡライブラリーから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、ｐｕｒＲ遺伝子を取得することができる。バチルス・サチリス１６８  Ｍａｒｂｕｒｇ株では、ｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列が報告されている（GenBank accession No.D26185（コード領域は塩基番号118041〜118898）、DDBJ Accession No.Z99104(コード領域は塩基番号54439〜55296)）。尚、本発明においては、ｐｕｒＲ遺伝子は破壊型ｐｕｒＲ遺伝子の作製に用いるため、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。
【００２０】
ｐｕｒＲ遺伝子の取得に用いる微生物は、該ｐｕｒＲ遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いる微生物のｐｕｒＲ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されないが、通常これらは同じ微生物を用いることが好ましい。
【００２１】
ＰＣＲに用いるプライマーとしては、ｐｕｒＲ遺伝子を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２２】
また、マーカー遺伝子としては、スペクチノマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。スペクチノマイシン耐性遺伝子は、バチルス  ジェネチック  ストック  センター（ＢＧＳＣ）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ１０１株から、プラスミドｐＤＧ１７２６を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。
【００２３】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のｐｕｒＲ遺伝子の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、ｐｕｒＲ遺伝子破壊株が得られる。染色体上のｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやＰＣＲ法により、染色体上のｐｕｒＲ遺伝子又はマーカー遺伝子を解析することによって、確認することができる。前記スペクチノマイシン耐性遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれたことの確認は、スペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅することができるプライマー（例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を用いたＰＣＲにより、行うことができる。
【００２４】
上記のようにして得られるリプレッサーが正常に機能しない微生物を好適な培地で培養することによって、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめることができる。
【００２５】
本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能なものならばよい。
【００２６】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００２７】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００２８】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００２９】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養条件は、用いる微生物の種類によるが、例えばバチルス・サチリスでは、発酵温度２０〜５０℃、ｐＨを４〜９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが低下する場合にはアンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして４０時間〜３日間程度培養することにより、培養液中に核酸系物質が蓄積される。
【００３０】
培養終了後、培養液中に蓄積された核酸系物質を採取する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、沈殿法、またはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
【００３１】
また、本発明に用いる微生物は、さらにヌクレオシダーゼやヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を欠損させれば、各々に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドを蓄積させることができ、又アデニンやグアニンの要求性を付与すれば、これらの生合成系経路上の前駆体及びその関連物質を蓄積させることができる。
【００３２】
さらに、本発明の方法により製造された核酸塩基に、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させることにより、該塩基に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドが得られる。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。
【００３４】
【実施例１】
＜１＞ｐｕｒＲ遺伝子のクローニング
バチルス・サチリス１６８  Ｍａｒｂｕｒｇ株（ＡＴＣＣ６０５１）のｐｕｒＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、該細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得した。
【００３５】
染色体ＤＮＡは、次のようにして調製した。バチルス・サチリスＡＴＣＣ６０５１株を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００３６】
ＰＣＲ用のプライマーには、バチルス・サチリス１６８  Ｍａｒｂｕｒｇ株の既知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列（GenBank accession No.D26185（コード領域は塩基番号118041〜118898）、DDBJ Accession No.Z99104(コード領域は塩基番号54439〜55296)）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（日本バイオサービス（株）に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩの制限酵素認識配列を有する。
【００３７】
前記染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９４℃、１分、アニーリング：４５℃、１分、伸長反応：７２℃、１分からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行なった。
【００３８】
上記反応産物及びプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株））を、ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩで消化し、ライゲーション・キット（宝酒造（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換した。形質転換株を、クロラムフェニコール（Ｃｍ）３０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、クロラムフェニコール耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、ｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲと命名した（図１）。
【００３９】
＜２＞破壊型ｐｕｒＲ（ΔｐｕｒＲ）を含むプラスミドの作製
バチルス  ジェネチック  ストック  センター（ＢＧＳＣ）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ１０１株から、プラスミドｐＤＧ１７２６を調製した。該プラスミドは、スペクチノマイシン耐性（Ｓｐr）遺伝子をカセットで取り出すことができる。
【００４０】
ｐＤＧ１７２６及び＜１＞で得たｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲを、各々ＨｉｎｃII及びＥｃｏＲＶの制限酵素で完全切断（図２）及び部分切断した後、フェノール処理した。各ＤＮＡをライゲーション・キットで連結した後、該ライゲーション溶液を用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌ及びスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養した。得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、ｐｕｒＲ遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子の挿入によって破壊されたプラスミドｐＨＳＧ３９８ΔＢＳＰＲ：Ｓｐrを得た（図３）。
【００４１】
＜３＞ｐｕｒＲ遺伝子破壊株の取得
上記＜２＞で得たプラスミドｐＨＳＧ３９８ΔＢＳＰＲ：Ｓｐrを用いて、バチルス・サチリスＳＢ１１２（ＢＧＳＣ  １Ａ２２７）を形質転換した。形質転換は、Ishiwaらの方法（Ishiwa H. et al., 1986, Jpn.J, Genet. 61 515-528）に従って、コンピテントセルを調製して行なった。プラスミドｐＨＳＧ３９８ΔＢＳＰＲ：Ｓｐrは、バチルス・サチリスの細胞中ではＤＮＡ複製ができない。しかし、該プラスミドはスペクチノマイシン耐性遺伝子の５’側及び３’側に、染色体ｐｕｒＲと相同な領域を有するため、染色体ｐｕｒＲ遺伝子と２重交差組み換えにより、遺伝子置換を行うことができる。
【００４２】
上記形質転換株をスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、生育する株を選択することにより、染色体ｐｕｒＲ遺伝子がΔＢＳＰＲ：Ｓｐr遺伝子により置換された株を取得した。目的どおりの遺伝子置換が生じていることは、候補株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記ｐｕｒＲ遺伝子用プライマー（配列番号１及び２）、及び、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するＳｐr遺伝子用プライマー（日本バイオサービス（株）に委託合成した。）を用いたＰＣＲを行い、ΔｐｕｒＲ：Ｓｐr部分の大きさとスペクチノマイシン耐性遺伝子の挿入により確認した。こうして得られた遺伝子置換株の１つを、バチルス・サチリス  ＳＢ１１２Ｋと名づけた。
【００４３】
＜４＞ｐｕｒＲ欠損株による核酸の生産
上記＜３＞で作製したバチルス・サチリスＳＢ１１２Ｋ株、及び親株のバチルス・サチリスＳＢ１１２を、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ及びＬＢ寒天培地で３７℃１晩培養した後、表１に示した生産培地２０ｍｌに、各３白金耳を接種し、３２℃で７２時間培養した。
【００４４】
【表１】
0004913929.tif 000002
【００４５】
培養終了後、培養液中のヒポキサンチン、ウラシル、グアノシン、グアニン、アデノシン、アデニンの蓄積量を、高速液体クロマトグラフィーで測定した。その結果を表２に示す。ｐｕｒＲ欠損株、ＳＢ１１２Ｋは、約６００ｍｇ／Ｌという著量のヒポキサンチンを蓄積し、親株に比べて約２０倍の蓄積量の増加を示した。また、ウラシルは親株に比べて５倍以上蓄積量が増加した。さらに、親株では蓄積が認められなかったアデニン及びグアニンも、ｐｕｒＲ欠損株では蓄積が認められた。
【００４６】
【表２】
0004913929.tif 000003
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、核酸系物質又はその原料を効率よく製造することができる。
【００４８】
【配列表】
0004913929.tif 000004
【００４９】
0004913929.tif 000005
【００５０】
0004913929.tif 000006
【００５１】
0004913929.tif 000007
【００５２】
0004913929.tif 000008
0004913929.tif 000009
0004913929.tif 000010
【００５３】
0004913929.tif 000011
0004913929.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミドｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲの構造を示す図。太線はバチルス・サチリスＳＢ１１２由来のｐｕｒＲ遺伝子を示す。カッコ内の数値はコーディング領域の最初を１としたときの位置を示す。細線はプラスミッドｐＨＳＧ３９８である。
【図２】  ｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲをＨｉｎｃII及びＥｃｏＲＶで完全切断して得た断片を示す図。
【図３】  ｐｕｒＲ遺伝子破壊用プラスミドｐＨＳＧ３９８ΔＢＳＰＲ：Ｓｐrの構造を示す図。太線はバチルス・サチリスＳＢ１１２の破壊型ｐｕｒＲ遺伝子（ΔｐｕｒＲ）を示す。カッコ内の数値はコーディング領域の最初を１としたときの位置を示す。細線はスペクチノマイシン耐性遺伝子、点線はプラスミドｐＨＳＧ３９８である。
【図１】
0004913929.tif 000013
【図２】
0004913929.tif 000014
【図３】
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