(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）核酸と細胞とを培地中で接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、０．５Ｍ〜３．０Ｍの塩化カルシウム溶液を前記（ａ）の培地と接触させる工程
を含み、工程（ｂ）の後の培地中の最終塩化カルシウム濃度が７．１ｍＭ〜３０．１ｍＭであり、工程（ｂ）より前に、塩化カルシウム溶液が（ａ）の培地と接触しないことを特徴とする核酸導入法。
【請求項２】
核酸が一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはリボザイムである、請求項１記載の核酸導入法。
【請求項３】
二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡが、直鎖状または環状の形態である、請求項２記載の核酸導入法。
【請求項４】
環状二本鎖ＤＮＡが発現プラスミドの形態である、請求項３記載の核酸導入法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸（２’−ＭＯＥ−修飾核酸）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノ・アンチセンス核酸である、請求項２記載の核酸導入法。
【請求項６】
工程（ａ）の培地と接触させる塩化カルシウム溶液の濃度が０．５Ｍ〜２．０Ｍの範囲内である、請求項１〜５のいずれか記載の核酸導入法。
【請求項７】
工程（ａ）の培地と接触させる塩化カルシウム溶液の量が、工程（ａ）の培地５００μＬ当たり１μＬ〜２０μＬの範囲内である、請求項１〜６のいずれか記載の核酸導入法。
【請求項８】
工程（ａ）の培地と接触させる塩化カルシウム溶液の量が、工程（ａ）の培地５００μＬ当たり２μＬ〜１０μＬの範囲内である、請求項７記載の核酸導入法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な核酸導入法に関する。より詳細には、本発明は、高濃度の金属塩溶液を利用した新規な核酸導入法に関する。
【背景技術】  ゲノムサイエンスの発展により新しい疾患関連遺伝子が数多く発見され、これらの遺伝子の機能解析が急務となっている。現在汎用されている遺伝子の機能解析手法であるＤＮＡマイクロアレイを用いたトランスクリプトームや酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法では、直接培養細胞内における機能を解析することは困難である。このため、治療標的分子の同定および治療創薬への直接的な結びつけを可能とするための、細胞もしくは個体レベルでの遺伝子機能の網羅的な解析技術の確立が望まれている。細胞および固体レベルでの解析では、評価対象とする遺伝子の配列をもとに核酸を利用して遺伝子がコードするｍＲＮＡを細胞内で過剰発現もしくはノックダウンさせ、その結果生じる細胞の機能変化を解析する手法が利用される。近年、細胞の機能をマルチイメージアナライザーにより様々なパラメーターで解析する方法が確立され、これを用いることにより細胞レベルでの網羅的な遺伝子機能解析も可能となっていることから、遺伝子発現を調節する手段の確立は遺伝子の機能解析の重要な課題となっている。
遺伝子の発現を制御する核酸として、遺伝子過剰発現にはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）やウィルスベクターが、遺伝子のノックダウンにはアンチセンスＤＮＡ（ＡＳ−ＤＮＡ）や短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）などが用いられる。これら核酸と細胞膜は共にアニオン性を示し電気的に反発してしまうため、核酸を単独で直接細胞内に導入することは困難である。このため、細胞を用いた遺伝子機能解析では、ウィルスベクター法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法、高分子ミセルベクター法など、これまでに開発された核酸の細胞内導入方法の利用が必要となる。
ウィルスベクター法（Ｍａｈ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２００２；４１（１２）：９０１−９１１）は、ウィルスベクター自体が細胞への感染能力を保持しているため、目的の遺伝子をウィルスベクターに挿入し細胞に添加するだけで遺伝子が細胞に導入され、高効率で目的とする遺伝子を発現することができる。しかし、この方法では感染により細胞内に核酸が導入されるため、感染に対する防御機構などが細胞に生じる結果、本来目的とする遺伝子の機能の検出にノイズが生じる恐れがある。また、ウィルスベクターに挿入可能な遺伝子の大きさに制限があること、遺伝子の導入およびウィルスの増幅と精製作業が煩雑であることなどから、多種類の遺伝子機能の網羅的な解析には適さない。
ｐＤＮＡ、ＡＳ−ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入に関しては、上記のエレクトロポレーション法（Ｇｅｈｌ  Ｊ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ，ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．，Ａｃｔａ  Ｐｈｉｓｉｏｌ  ｓｃａｎｄ．２００３；１１７（４）：４３７−４７）、リン酸カルシウム共沈法（Ｂａｔａｒｄ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｒｅｃｔｉｏｎ．，Ｇｅｎｅ，２００１；２７０：６１−６８）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｈｏｌｔｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９８９；１８４（２）：５４６−５５１）、リポフェクション法（Ｒｏｃｈａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．，Ｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；５８（１）：４５−５６）、または高分子ポリマーを用いた方法（Ｄｅ  Ｓｍｅｄｔ  ＳＣ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０００；１７（２）：１１３−２６）などの利用が必要となる。
エレクトロポレーション法は細胞を核酸溶液中に懸濁して直流高電圧のパルスをかけることで細胞の膜透過性を亢進させて導入する方法である。この方法は高効率で核酸を導入することができる反面、細胞へのダメージが大きいことを特徴としており、核酸導入後の細胞機能変化の解析を目的とする場合には適さない。
リン酸カルシウム共沈法は細胞の食作用を利用して核酸を導入する方法である。この方法は再現性が乏しく、また導入効率も悪い。そのため安定した遺伝子導入が必要となる遺伝子の機能解析には適さない。
ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法および高分子ポリマーを用いた方法は、細胞膜との膜融合を利用して核酸を導入する方法である。これらの方法のなかでは、導入効率や簡便性、汎用性、再現性という点でリポフェクション法が最も優れている。しかしリポフェクション法では細胞毒性が高いことが知られているため、細胞のビアビリティが重要である遺伝子の機能解析には問題が残る。またリポフェクション法では、細胞への導入に先立ってリポソーム試薬と核酸を混合して複合体を形成させる必要があるが、再現性が高いとはいえ複合体調製時の微妙な差よって細胞への導入効率が異なってくることから、多数の核酸を取り扱う場合には個々の操作に細心の注意が必要となり、操作が煩雑となる。
以上から、細胞レベルで多数の遺伝子機能を網羅的に解析するためには、低細胞毒性でより簡便にかつ効率的に細胞内に核酸を導入する方法の開発が望まれている状況にあった。
【発明の開示】
本発明の目的は、低細胞毒性で簡便かつ高効率で細胞へ核酸を導入することのできる、新規な核酸導入法を提供することにある。
本発明者らは、核酸（単独）と細胞とを培地中で混合し、その後高濃度の塩化カルシウム溶液を培地に添加したところ、驚くべきことに、核酸が効率よく細胞に導入されその機能を発現できることを見出した。この新たな知見から、本発明者らは、塩化カルシウム、さらには金属塩全般について、新規な核酸導入剤として利用できるとの確信を得た。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、下記に掲げるものである：
（１）  以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む核酸導入法：
（ａ）核酸と細胞とを培地中で接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、高濃度の金属塩溶液を前記（ａ）の培地と接触させる工程、
（２）  核酸が一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはリボザイムである、前記（１）記載の核酸導入法、
（３）  二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡが、直鎖状または環状の形態である、前記（２）記載の核酸導入法、
（４）  環状二本鎖ＤＮＡが発現プラスミドの形態である、前記（３）記載の核酸導入法、
（５）  オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸（２’−ＭＯＥ−修飾核酸）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノ・アンチセンス核酸である、前記（２）記載の核酸導入法、
（６）  核酸が生体内分解性の物質または生体由来物質との複合体若しくは封入体の形態である、前記（１）〜（５）いずれか記載の核酸導入法、
（７）  生体由来物質がアテロコラーゲンである、前記（６）記載の核酸導入法、
（８）  工程（ａ）の培地と接触させる高濃度金属塩溶液の濃度が０．１Ｍ〜３．０Ｍの範囲内である、前記（１）〜（７）いずれか記載の核酸導入法、
（９）  工程（ａ）の培地と接触させる高濃度金属塩溶液の濃度が０．５Ｍ〜２．０Ｍの範囲内である、前記（８）記載の核酸導入法、
（１０）  工程（ａ）の培地と接触させる高濃度金属塩溶液の量が、工程（ａ）の培地５００μＬ当たり１μＬ〜２０μＬの範囲内である、前記（１）〜（９）いずれか記載の核酸導入法、
（１１）  工程（ａ）の培地と接触させる高濃度金属塩溶液の量が、工程（ａ）の培地５００μＬ当たり２μＬ〜１０μＬの範囲内である、前記（１０）記載の核酸導入法、
（１２）  金属塩溶液が二価金属の塩化物溶液である、前記（１）〜（１１）いずれか記載の核酸導入法、
（１３）  二価金属の塩化物溶液が塩化カルシウム溶液である、前記（１２）記載の核酸導入法、
（１４）  固形金属塩または高濃度金属塩溶液を成分として含有する核酸導入剤、
（１５）  固形金属塩または高濃度金属塩溶液からなる核酸導入剤、
（１６）  前記（１）〜（１３）いずれか記載の核酸導入法のために用いられる、前記（１４）または（１５）記載の核酸導入剤、
（１７）  高濃度金属塩溶液の濃度が０．１Ｍ〜６．０Ｍの範囲内である、前記（１４）〜（１６）いずれか記載の核酸導入剤、
（１８）  高濃度金属塩溶液の濃度が０．５Ｍ〜４．０Ｍの範囲内である、前記（１７）記載の核酸導入剤、
（１９）  金属塩が二価金属の塩化物である、前記（１４）〜（１８）いずれか記載の核酸導入剤、
（２０）  二価金属の塩化物が塩化カルシウムである、前記（１９）記載の核酸導入剤、
（２１）  前記（１４）〜（２０）いずれか記載の核酸導入剤を含有する核酸導入用キット、
（２２）  前記（１４）〜（２１）いずれか記載の核酸導入剤またはキットの、核酸導入における使用、
（２３）  以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む核酸導入法：
（ａ）核酸と細胞とを培地中で接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、高濃度の塩化カルシウム溶液を前記（ａ）の培地と接触させる工程、
（２４）  核酸が一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはリボザイムである、前記（２３）記載の核酸導入法、
（２５）  二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡが、直鎖状または環状の形態である、前記（２４）記載の核酸導入法、
（２６）  環状二本鎖ＤＮＡが発現プラスミドの形態である、前記（２５）記載の核酸導入法、
（２７）  オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸（２’−ＭＯＥ−修飾核酸）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノ・アンチセンス核酸である、前記（２４）記載の核酸導入法、
（２８）  核酸が生体内分解性の物質または生体由来物質との複合体若しくは封入体の形態である、前記（２３）〜（２７）いずれか記載の核酸導入法、
（２９）  生体由来物質がアテロコラーゲンである、前記（２８）記載の核酸導入法、
（３０）  工程（ａ）の培地と接触させる高濃度塩化カルシウム溶液の濃度が０．１Ｍ〜３．０Ｍの範囲内である、前記（２３）〜（２９）いずれか記載の核酸導入法、
（３１）  工程（ａ）の培地と接触させる高濃度塩化カルシウム溶液の濃度が０．５Ｍ〜２．０Ｍの範囲内である、前記（３０）記載の核酸導入法、
（３２）  工程（ａ）の培地と接触させる高濃度塩化カルシウム溶液の量が、工程（ａ）の培地５００μＬ当たり１μＬ〜２０μＬの範囲内である、前記（２３）〜（３１）いずれか記載の核酸導入法、
（３３）  工程（ａ）の培地と接触させる高濃度塩化カルシウム溶液の量が、工程（ａ）の培地５００μＬ当たり２μＬ〜１０μＬの範囲内である、前記（３２）記載の核酸導入法、
（３４）  固形塩化カルシウムまたは高濃度塩化カルシウム溶液を成分として含有する核酸導入剤、
（３５）  固形塩化カルシウムまたは高濃度塩化カルシウム溶液からなる核酸導入剤、
（３６）  前記（２３）〜（３３）いずれか記載の核酸導入法のために用いられる、前記（３４）または（３５）記載の核酸導入剤、
（３７）  高濃度塩化カルシウム溶液の濃度が０．１Ｍ〜６．０Ｍの範囲内である、前記（３４）〜（３６）いずれか記載の核酸導入剤、
（３８）  高濃度塩化カルシウム溶液の濃度が０．５Ｍ〜４．０Ｍの範囲内である、前記（３７）記載の核酸導入剤、
（３９）  前記（３４）〜（３８）いずれか記載の核酸導入剤を含有する核酸導入用キット、ならびに
（４０）  前記（３４）〜（３９）いずれか記載の核酸導入剤またはキットの、核酸導入における使用。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の核酸導入法を用いることにより、ＧＦＰ発現プラスミドを２９３細胞へ導入した結果を示すグラフである。
図２は、予め塩化カルシウム溶液を添加した培地で２９３細胞を懸濁して播種した場合のＧＦＰの発現効率を示すグラフである。
図３は、本発明の核酸導入法を用いることにより、ＧＦＰ発現プラスミドをＨｅＬａ細胞へ導入した結果を示すグラフである。
図４は、本発明の核酸導入法を用いることにより、ｓｉＲＮＡをＮＥＣ８細胞へ導入した結果を示すグラフである。
図５は、本発明の核酸導入法を用いることにより、ＧＦＰ発現プラスミドとアテロコラーゲンとの複合体を２９３細胞およびＨｅＬａ細胞へ導入した結果を示すグラフである。
図６は、本発明の核酸導入法を用いることにより、ｓｉＲＮＡとアテロコラーゲンとの複合体をＰＣ−３Ｍ−Ｌｕｃ−Ｃ６細胞へ導入した結果を示すグラフである。Ａ）はヒトｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｚｅｓｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ２（ＥＺＨ２）に対するｓｉＲＮＡ導入の結果を、Ｂ）はｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３’−ｈｙｄｒｏｘｙｋｉｎａｓｅ  ｐ１１０−ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ｐ１１０−ａｌｐｈａ）に対するｓｉＲＮＡ導入の結果を、それぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、少なくとも以下の工程（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）核酸と細胞とを培地中で接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、高濃度の金属塩溶液を前記（ａ）の培地と接触させる工程、
を含む核酸導入法を提供する。
本発明の核酸導入法において導入に用いられる核酸は、方法の原理上、その種類に制限は無くどのような核酸であっても導入対象として用いることができる。すなわちポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、またはリボザイム等のいずれの核酸であっても良く、また一本鎖・二本鎖およびこれらの類縁体のいずれの形態であっても良い。すなわち本発明の核酸として具体的には、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはリボザイム等が挙げられる。
本発明の核酸が二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡである場合、直鎖状または環状のいずれの形態であっても良い。さらに本発明の核酸が環状二本鎖ＤＮＡの場合、プラスミドの形態とすることができる。当該プラスミドは、発現プラスミドまたは非発現プラスミドのいずれの形態であっても良い。
本発明の核酸が一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡである場合、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれも用いることができる。
本発明の核酸がオリゴヌクレオチドである場合、導入するオリゴヌクレオチドの種類に制限はなく、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドまたはこれらの類縁体のいずれも用いることができる。具体的には、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸（２’−ＭＯＥ−修飾核酸）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）、架僑型核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＬＮＡ；Ｓｉｎｇｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４５５，１９９８）、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＰＮＡ；Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７，１９９１）、またはモルフォリノ・アンチセンス核酸（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，１８７，１９９７）などを例示することができる。
前記核酸は、通常の遺伝子導入に用いられる濃度（０．００１〜１０００μｇ／ｍＬ）で使用することができる。
前記核酸は、細胞培養に支障のない溶媒に溶解して導入に用いることができる。当該溶媒としては、例えば蒸留水、生理的食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマ社）、ＴＲＩＳ緩衝液（シグマ社）、ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、細胞培養培地等を挙げることができる。
前記核酸は、細胞毒性のない生体内分解性の物質や生体由来物質と複合体を形成した形態、あるいはこれらの物質に封入された形態であっても良い。ここで生体内分解性の物質としては、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸およびこれらの共重合体やラクトン系ポリマー、ポリエチレングリコール系ポリマー等を挙げることができる。また生体由来物質としては、例えばキトサン、ゼラチン、コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン（アテロコラーゲン）、またはこれらの修飾物等を挙げることができる。核酸とこれら生体内分解性の物質や生体由来物質との複合体あるいは封入体の作製は、例えば文献、Ｐａｎｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００３；５５（３）：３２９−４７，Ｌｉ  ＸＷ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００３；１６３０（１）：７−１８、ＷＯ  ０３／０００２９７号公報などに従い行うことができる。
前記で生体由来物質としてはコラーゲンあるいは酵素可溶化コラーゲン（アテロコラーゲン）が好ましく、その種類、由来、型等に特に制限はない。種類としては未修飾物あるいはその修飾物を挙げることができる。修飾物としては、側鎖アミノ基、カルボキシル基の化学修飾、あるいは化学的・物理的架橋物を用いることができる。
当該コラーゲン溶液の濃度は０．００００１％〜３％（０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ）の範囲で使用することができ、好ましくは０．０００１％〜０．３％、より好ましくは０．０００５％〜０．１％の範囲で使用することができる。
前記生体内分解性の物質や生体由来物質と複合体あるいは封入体を形成することにより核酸は安定化されかつ徐放化されることから、当該複合体あるいは封入体を細胞内に導入することにより、核酸の効果の持続を図ることができる。
本発明の核酸導入法において用いられる細胞は、方法の原理上、適応細胞種に制限はない。具体的には、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経芽細胞、リンパ芽球、浮遊細胞、星状膠細胞、円形細胞、紡錘細胞、アメーバ様細胞などに対して本発明の核酸導入法を適用することができる。
本発明の核酸導入法において用いられる培地は、細胞が死滅せず、かつ本発明の核酸導入法による細胞内への核酸の取り込みに支障をきたさないような培地であれば、如何なる培地であっても良い。具体的には、通常の細胞培養に用いられる培養用培地、緩衝液、または血清をさらに含有する培養用培地や緩衝液が挙げられる。
ここで培養用培地としては、各々の細胞に合った培養用培地であればどのような培地であっても良い。例えばＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＥＡＧＬＥ  ＭＥＤＩＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＭＩＮＩＭＵＭ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＭＥＤＩＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが例示される。
また緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマ社）、ＴＲＩＳ緩衝液（シグマ社）、ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが例示される。
また血清としては、ウシ胎児血清、ウシ血清、仔ウシ血清、ウマ血清などが例示される。培地中の血清の濃度は、細胞培養に適した濃度であればどのような濃度であっても良い。好ましくは０〜２０％（ｖ／ｖ）の範囲が挙げられ、より好ましくは５〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲が挙げられる。
本発明の核酸導入法において用いられる「金属塩溶液」は、細胞培養に影響しない範囲内であれば、如何なる金属塩溶液を用いても良い。細胞培養に影響するか否かは、細胞培養液に金属塩溶液を添加した場合としない場合とで細胞増殖速度（細胞密度）等を比較することにより、容易に調べることができる。
ここで金属塩とは、具体的には、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、マンガン、鉄、銅、または亜鉛等の金属の塩が挙げられる。当該金属の塩として、より具体的には、例えば前記金属の塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、炭酸塩、または硝酸塩等が挙げられる。好ましくは前記金属の塩酸塩が挙げられ、より好ましくは二価金属の塩化物が挙げられる。
ここで二価金属の塩化物としては、具体的には塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、塩化鉄、塩化マンガン等が例示され、好ましくは塩化カルシウムが挙げられる。すなわち本発明の最も好ましい金属塩溶液は塩化カルシウム溶液である。
以上に示した金属塩は、単独で、若しくは２種以上を組み合わせることにより、本発明の金属塩溶液の成分とすることができる。
本発明の核酸導入法において用いられる金属塩溶液（好ましくは塩化カルシウム溶液）は、高濃度の金属塩溶液である。ここで「高濃度」とは、０．１Ｍ以上の濃度であることを指す。具体的には０．１Ｍ〜３．０Ｍの範囲が挙げられ、好ましくは０．３Ｍ〜３．０Ｍの範囲が、より好ましくは０．５Ｍ〜３．０Ｍの範囲が、さらに好ましくは０．５Ｍ〜２．５Ｍの範囲が、特に好ましくは０．５Ｍ〜２．０Ｍの範囲が、最も好ましくは１．０Ｍ〜２．０Ｍの範囲が挙げられる。
前記金属塩を溶解する溶媒は、細胞培養に支障のない溶媒であれば如何なるものでもよいが、例えば蒸留水、生理的食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマ社）、ＴＲＩＳ緩衝液（シグマ社）、ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、細胞培養培地等を用いることができる。
次に、本発明の核酸導入の方法について具体的に説明する。
まず、導入用の核酸と導入対象となる細胞とを培地中で接触させる。接触は、通常の細胞培養に適した培養容器中で行われる。ここで培養容器としては、細胞培養用ディッシュ、フラスコ、マルティプルウェルプレートなどが挙げられる。
核酸と細胞との接触方法としては、例えば、細胞懸濁培地に核酸を添加して細胞培養容器に播く方法、核酸を添加した培地で細胞を懸濁して細胞培養容器に播く方法、細胞を培養培地で懸濁して細胞培養容器に播き、その上に核酸を加える方法、核酸を予め細胞培養容器に添加しておき、その上に細胞を懸濁した培養培地を加える方法、核酸水溶液を予め細胞培養容器に添加して乾固又は吸着させ、その上に細胞を懸濁した培養培地を加える方法等がある。
ここで用いる核酸は、前述のように生体内分解性物質や生体由来物質との複合体あるいは封入体の形態であっても良い。特に、核酸水溶液を細胞培養容器に添加して乾固又は吸着させる方法において、当該複合体あるいは封入体が好適に用いられる。
具体的には、例えば核酸溶液とアテロコラーゲン水溶液との複合体溶液をマルティプルウェルプレートに添加して乾固させ、その上に細胞を懸濁した培養培地を加える方法が例示される。
接触させる核酸の量（濃度）および細胞数（密度）は、通常の遺伝子導入に用いられる程度であれば特に制限は無い。また接触の温度としては、０℃〜４２℃の範囲が、より好ましくは室温〜３７℃の範囲が挙げられる。
次に、前記核酸と細胞とを接触させた培地（以下、「工程（ａ）の培地」と称することもある）に対し、高濃度の金属塩溶液（好ましくは高濃度の塩化カルシウム溶液）を接触させる。接触方法としては、例えば、工程（ａ）の培地を含有する培養容器中に高濃度金属塩溶液を添加する方法や、高濃度金属塩溶液を予め細胞培養容器に添加しておき、そこに前記工程（ａ）の培地を添加する方法等が挙げられる。
高濃度金属塩溶液の接触（添加）の時期は特に制限されないが、細胞と核酸を接触後２時間以内、好ましくは３０分以内、より好ましくは１０分以内に高濃度金属塩溶液を接触させることが適当である。
高濃度金属塩溶液（好ましくは高濃度塩化カルシウム溶液）の接触（添加）量は、細胞への核酸導入が良好に行われる限り特に制限されないが、工程（ａ）の培地５００μＬ当たり高濃度金属塩溶液１μＬ〜２０μＬを接触（添加）することが好ましい。また、工程（ａ）の培地５００μＬ当たり高濃度金属塩溶液２μＬ〜１０μＬを接触（添加）することがより好ましく、工程（ａ）の培地５００μＬ当たり高濃度金属塩溶液５μＬ〜１０μＬを接触（添加）することがさらに好ましい。
より具体的には、例えば２４穴ウェルにおいては、１ウェルあたり５００μＬ程度の工程（ａ）培地を含有するのが一般的であるため、１μＬ〜２０μＬ／ウェル、より好ましくは２μＬ〜１０μＬ／ウェル、さらに好ましくは５μＬ〜１０μＬ／ウェルの高濃度金属塩溶液を添加することが適切である。
高濃度金属塩溶液を添加した後、金属塩が均一に工程（ａ）培地に混合されるように培養容器を攪拌し、１時間〜１日程度培養する。培養の条件は、細胞への核酸導入に支障をきたさない限り特に限定されないが、５％ＣＯ２存在下、０℃〜４２℃の範囲で、好ましくは室温〜３７℃の範囲で、より好ましくは３７℃にて行われる。
以上の操作により、核酸の導入が達成される。
前記本発明による核酸導入法は、細胞レベルでの遺伝子能解析の他、遺伝子組換え細胞株の作出や、ｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療における細胞への核酸導入にも適用することができる。
本発明は、前記本発明の核酸導入法のために用いられる核酸導入剤を提供する。
本発明の核酸導入剤は、固形金属塩または高濃度の金属塩溶液を成分として含有することを特徴とする。具体的には、固形金属塩または高濃度の金属塩溶液からなる核酸導入剤が例示される。
ここで「金属塩」とは、細胞培養に影響しない範囲内であれば、如何なる金属塩溶液を用いても良い。細胞培養に影響するか否かは、細胞培養液に金属塩溶液を添加した場合としない場合とで細胞増殖速度（細胞密度）を比較することにより、容易に調べることができる。
具体的には、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、マンガン、鉄、銅、または亜鉛等の金属の塩が挙げられる。当該金属の塩として、より具体的には、例えば前記金属の塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、炭酸塩、または硝酸塩等が挙げられる。好ましくは前記金属の塩酸塩が挙げられ、より好ましくは二価金属の塩化物が挙げられる。
ここで二価金属の塩化物としては、具体的には塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、塩化鉄、塩化マンガン等が例示され、好ましくは塩化カルシウムが挙げられる。すなわち本発明の核酸導入剤の好ましい例として、本発明は、固形塩化カルシウムまたは高濃度塩化カルシウム溶液を成分として含有する核酸導入剤を提供する。より具体的には、固形塩化カルシウムまたは高濃度塩化カルシウム溶液からなる核酸導入剤が例示される。
以上に示した金属塩は、単独で、若しくは２種以上を組み合わせることにより、本発明の核酸導入剤の成分とすることができる。
本発明の核酸導入剤が高濃度の金属塩溶液を成分として含有する場合、その濃度は、０．１Ｍ以上であれば如何なる濃度であっても良い。
前記したように、工程（ａ）の培地と接触させる金属塩溶液の濃度としては０．１Ｍ〜３．０Ｍの範囲が挙げられ、好ましくは０．３Ｍ〜３．０Ｍの範囲が、より好ましくは０．５Ｍ〜３．０Ｍの範囲が、さらに好ましくは０．５Ｍ〜２．５Ｍの範囲が、特に好ましくは０．５Ｍ〜２．０Ｍの範囲が、最も好ましくは１．０Ｍ〜２．０Ｍの範囲が挙げられる。従って本発明の核酸導入剤における金属塩の濃度は、希釈により若しくはそのまま使用することにより前記の濃度となるように調製されている必要がある。
従って本発明の核酸導入剤が高濃度の金属塩溶液（好ましくは高濃度の塩化カルシウム溶液）を成分として含有する場合、その濃度は、０．１Ｍ以上であれば良く、好ましくは０．１Ｍ〜６．０Ｍの範囲が挙げられ、より好ましくは０．１Ｍ〜４．０Ｍの範囲が、さらに好ましくは０．５Ｍ〜４．０Ｍの範囲が挙げられる。
前記金属塩を溶解する溶媒は、細胞培養に支障のない溶媒であれば如何なるものでもよいが、例えば蒸留水、生理的食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマ社）、ＴＲＩＳ緩衝液（シグマ社）、ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、細胞培養培地等を挙げることができる。
以上のような本発明の核酸導入剤は、核酸導入用のキットの一成分とすることができる。当該キットは、前記本発明の核酸導入剤のみからなるキットであっても、また本発明の核酸導入剤と他の成分とを含むキットであっても良い。当該キット中の他の成分としては、蛍光標識オリゴヌクレオチド、ポジティブコントロールｓｉＲＮＡなどが挙げられる。また当該キットが固形金属塩を成分として含有する場合は、これを溶解する溶媒として、蒸留水、生理的食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマ社）、ＴＲＩＳ緩衝液（シグマ社）、ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、細胞培養培地等をさらに含有していても良い。
【実施例】  以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
［実施例１］
核酸導入法の検討（１）
２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに１００μｇ／ｍＬのＧＦＰ発現プラスミド水溶液を１００μＬ添加し、冷風を吹きかける方法で乾燥した。ヒト副腎由来上皮細胞である２９３細胞（ＡＴＣＣ：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を１０％ウシ血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、１ウエルあたり２．５Ｘ１０４個（５００μＬ）播種した。細胞播種後直ちに１．７Ｍ塩化カルシウム水溶液を０，１．５，２．５，３．５，５．０，６．５，８．０μＬ添加し、均一となるようにプレートを攪拌した。なお、培地中の最終塩化カルシウム濃度は１．８ｍＭ，７．１ｍＭ，１０．２ｍＭ，１４．２ｍＭ，１９．５ｍＭ，２４．８ｍＭ，３０．１ｍＭとなる。細胞播種後２日目に蛍光顕微鏡で細胞を観察してＧＦＰを発現している細胞数を計測し、導入効率を算出した。
結果を図１に示す。図１より明らかなように、高濃度（１．７Ｍ）の塩化カルシウムを添加することにより、効率良く細胞に遺伝子導入できることが示された。また細胞の形態変化や細胞死は認められなかった。用いた２４ウェルプレートでは、各ウェルに添加する１．７Ｍ塩化カルシウム溶液の量が２．５〜８．０μＬで優れた遺伝子発現効率が得られた。
［実施例２］
核酸導入法の検討（２）
予め塩化カルシウム溶液を添加した培地で細胞を懸濁しウェルに播種する以外は実施例１と同様にして、遺伝子導入効率の検討を行った。２４ウェル細胞培養プレートに１００μｇ／ｍＬのＧＦＰ発現プラスミド水溶液を１００μＬ添加し、冷風を吹きかける方法で乾燥した。塩化カルシウム濃度がそれぞれ１．８ｍＭ，７．１ｍＭ，１０．２ｍＭ，１４．２ｍＭ，１９．５ｍＭ，２４．８ｍＭ，３０．１ｍＭとなるように培地に予め塩化カルシウム溶液を添加しておき、それぞれの培地を用いて２９３細胞を懸濁し、１ウェルあたり２．５Ｘ１０４個（５００μＬ）播種した。細胞播種後２日目に蛍光顕微鏡で細胞を観察してＧＦＰを発現している細胞数を計測し、導入効率を算出した。
結果を図２に示す。実施例１の結果（図１）と異なり、予め塩化カルシウム溶液を添加した培地で細胞を懸濁しプレートに播種した場合は、遺伝子を導入することが出来なかった。これら実施例１および実施例２の結果から、細胞内への遺伝子導入促進効果は培地中の塩化カルシウム濃度の増加ではなく、塩化カルシウム溶液の加え方に起因することが示された。すなわち、細胞と遺伝子とをあらかじめ混合した後に高濃度の塩化カルシウムと接触させることが重要であることが明らかとなった。
［実施例３］
本発明の核酸導入法を用いたＨｅＬａ細胞への遺伝子導入
実施例１と異なる細胞においても本発明の遺伝子導入法が適用できるかどうか検討した。
２４ウェル細胞培養プレートに１００μｇ／ｍＬのＧＦＰ発現プラスミド水溶液を１００μＬ添加し、冷風を吹きかける方法で乾燥した。ヒト子宮頸癌由来上皮細胞であるＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、１ウエルあたり１．５Ｘ１０４個（５００μＬ）播種した。細胞播種後直ちに１．７Ｍ塩化カルシウム水溶液を０，１．５，２．５，３．５，５．０，６．５，８．０μＬ添加し均一となるようにプレートを攪拌した。細胞播種後４日目に蛍光顕微鏡で細胞を観察してＧＦＰを発現している細胞数を計測し、導入効率を算出した。
結果を図３に示す。ＨｅＬａ細胞においても１．７Ｍの塩化カルシウム溶液を細胞播種後にウェルに添加することにより遺伝子を効率よく細胞に導入できた。また細胞の形態変化や細胞死も認められなかった。このことから、本発明の方法が細胞種に依らないことが示された。
［実施例４］
本発明の核酸導入法を用いたｓｉＲＮＡの導入
発現プラスミド以外の核酸も本発明の遺伝子導入法により導入できるかどうか検討した。
ヒトＦＧＦ−４のｍＲＮＡを特異的に抑制するｓｉＲＮＡ（以下ｈＥｘ３−１と称する）を導入用核酸として用いた。またヒトＦＧＦ−４タンパクを強発現する細胞株であるヒト精巣腫瘍由来上皮細胞ＮＥＣ８（ＡＴＣＣ：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を導入用細胞として用いた。
６ウェル細胞培養プレートに１０μｇ／ｍＬのｈＥｘ３−１水溶液を３５０μＬ添加し、冷風を吹きかける方法で乾燥した。ＮＥＣ８細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、１プレートあたり３．７５Ｘ１０５個（１．５ｍＬ）播種した。細胞播種後直ちに１．７Ｍ塩化カルシウム水溶液を２０μＬ添加し、プレートを攪拌して均一とした。対照群としてｈＥｘ３−１を塗布乾燥していないウェルで同様の操作を行った。細胞播種後３日目に培地を回収して培地中のＦＧＦ−４濃度をＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−４  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で定量した。またウェル中の細胞を回収してタンパク量をＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ；ＢｉｏＲａｄ）で定量した。培地中のＦＧＦ−４濃度を得られたタンパク量で徐して、各ウェル中でのＦＧＦ−４産生量を算出した。
結果を図４に示す。ｈＥｘ３−１の導入により培地中へのＦＧＦ−４の産生が抑制された。すなわちＮＥＣ８細胞内にｓｉＲＮＡが効率よく導入され、ｓｉＲＮＡが目的とする作用を良好に発揮することが示された。この結果から本発明の核酸導入法が核酸の種類に依らないことが示された。
［実施例５］
本発明の核酸導入法を用いた遺伝子−生体由来物質複合体の導入
遺伝子の安定化効果および徐放効果を持つ生体由来物質と遺伝子との複合体が本発明の核酸導入法により導入できるか検討した。
生体由来物質としてはアテロコラーゲン（（株）高研）を用いた。
２００μｇ／ｍＬのＧＦＰ発現プラスミド水溶液と０．０１６％のアテロコラーゲン水溶液を等量で混合し、複合体溶液を調製した。２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに複合体溶液を１００μＬ添加し、冷風を吹きかける方法で乾燥した。ヒト副腎由来上皮細胞である２９３細胞およびヒト子宮頸癌由来上皮細胞であるＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を１０％ウシ血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、１ウエルあたり２．５Ｘ１０４個（５００μＬ）播種した。細胞播種後直ちに１．７Ｍ塩化カルシウム水溶液を５．０μＬ添加し、均一となるようにプレートを攪拌した。細胞播種後２日目に蛍光顕微鏡で細胞を観察してＧＦＰを発現している細胞数を計測し、導入効率を算出した。
結果を図５に示す。図５から明らかなように、１．７Ｍの塩化カルシウム溶液を細胞播種後にウェルに添加することにより細胞にアテロコラーゲン複合体を導入できた。このことは複合体として核酸を導入することにより核酸の作用持続が図れることを示すものである。
［実施例６］
本発明の核酸導入法を用いたｓｉＲＮＡ−生体由来物質複合体の導入
ヒトｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｚｅｓｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ２（ＥＺＨ２）又はｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３’−ｈｙｄｒｏｘｙｋｉｎａｓｅ  ｐ１１０−ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ｐ１１０−ａｌｐｈａ）に対するｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の３００ｎＭ水溶液と、０．０１６％アテロコラーゲン水溶液を等量で混合し、複合体溶液を調製した。６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに複合体溶液を２５０μＬ添加し、冷風を吹きかける方法で乾燥した。ヒト前立腺がん由来細胞である、ＰＣ−３Ｍ−Ｌｕｃ−Ｃ６細胞（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を１ウェルあたり５Ｘ１０４個播種した。細胞播種直後直ちに１．７Ｍ塩化カルシウム水溶液を２０μＬ添加した。細胞播種後４日目にＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成を行い、標的遺伝子のｍＲＮＡの発現量を、定量的ＰＣＲ法にて解析した。なお結果は、内部標準として用いたＧＡＰＤＨの発現量で補正した。
結果を図６に示す。図６から明らかなように、１．７Ｍの塩化カルシウム溶液を細胞播種後にウェルに添加することにより、細胞にｓｉＲＮＡを導入することができた。
【産業上の利用可能性】  本発明により、新規な核酸導入法が提供される。本発明の核酸導入法は簡便かつ低細胞毒性で導入効率が高く、しかもローコストである。また細胞や核酸の種類を問わず、幅広く用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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