(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、又は（ｂ）に示すペプチド：
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族化合物アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）、又は（ｂ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族化合物アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド。
【請求項３】
以下の（ａ１）〜（ａ３）から選択される少なくとも１種の遺伝子、及び以下の（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される少なくとも１種の遺伝子を導入して得られる形質転換体であって、ヒドロキシメチル基を有する芳香族化合物を芳香族カルボン酸に変換できる形質転換体。
（ａ１）配列番号３記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする遺伝子
（ａ２）配列番号３記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族化合物アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチドをコードする遺伝子
（ａ３）配列番号２に記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子
（ｂ１）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする遺伝子
（ｂ２）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族化合物アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチドをコードする遺伝子
（ｂ３）配列番号４記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子
【請求項４】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項３に記載の形質転換体。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の形質転換体を、ヒドロキシメチル基を有する芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から芳香族カルボン酸を得ることを特徴とする、芳香族カルボン酸の製造法。
【請求項６】
得られた芳香族カルボン酸が、2-ナフトエ酸、安息香酸、2-メチル安息香酸、3-メチル安息香酸、4-メチル安息香酸、4-ヒドロキシメチル安息香酸、2-ヒドロキシ安息香酸、3-ヒドロキシ安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸、2-メトキシ安息香酸、3-メトキシ安息香酸、4-メトキシ安息香酸、3-クロロ安息香酸、桂皮酸及びバニリン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の芳香族カルボン酸であることを特徴とする請求項５に記載の芳香族カルボン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒドロキシメチル基またはアルデヒド基を持った芳香族化合物を酸化する新規な酵素、それをコードする遺伝子、この遺伝子を導入した微生物に関するものである。また、この遺伝子が導入された微生物を利用した、ヒドロキシメチル基またはアルデヒド基を持った芳香族化合物から芳香族カルボン酸への製造法に関するものである。
【背景技術】  ベンジルアルコールから安息香酸への変換はアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）という二つの酵素で行われている。アルコールデヒドロゲナーゼはベンジルアルコールをベンズアルデヒドに可逆的に変換する酵素で、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）のＴＯＬプラスミドｐＷＷＯにコードされているトルエン代謝系のＸｙｌＢ酵素が最もよく研究されている（Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｒｅｋｉｋ，Ｍ．，Ｗｕｂｂｏｌｔｓ，Ｍ．，Ｒｏｓｅ，Ｋ．，Ｌｅｐｐｉｋ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｔｉｍｍｉｓ，Ｋ．，Ｃｈａｒａｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｐｐｅｒ−ｐａｔｈｗａｙ  ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  ＴＯＬ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＷＷＯ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１（９），５０４８−５０５５，１９８９）。ＸｙｌＢはその酵素活性がＮＡＤ（Ｐ）＋および亜鉛イオンに依存し、ベンジルアルコールだけではなくｏ−，ｍ−，ｐ−メチルベンジルアルコール、ｏ−，ｍ−，ｐ−メトキシベンジルアルコールも基質としてそれぞれのアルデヒド体に変換する。しかし、ｏ−メチルベンジルアルコール及びｏ−メトキシベンジルアルコールを基質とした場合、変換効率は悪かった（Ｓｈａｗ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｃｈｗａｇｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＴＯＬ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＷＷＯ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８３，７８９−７９４，１９９２）。最近、ＮＡＤ（Ｐ）＋および亜鉛イオンに依存しなく、ＴＯＬプラスミドのＸｙｌＢとも相同性の低い４−ニトロベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮｔｎＤ）をコードする遺伝子がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属ＴＷ３株から単離された（Ｊａｍｅｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ａ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｔｎＤ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＮＡＤ（Ｐ）＋−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＴＷ３．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１１），３１３６−３１４１，２０００）。ＮｔｎＤは、ベンジルアルコール、ｍ−，ｐ−ニトロベンジルアルコール、ｏ−，ｍ−，ｐ−メチルベンジルアルコール、ｍ−ヒドロキシベンジルアルコール、ｐ−エチルベンジルアルコール、２，４−、３，４−、３，５−ジメチルベンジルアルコールを基質として利用しそれぞれのアルデヒド体を合成したが、ｏ−ニトロベンジルアルコール、ｏ−，ｐ−ヒドロキシベンジルアルコール、２，５−ジメ���ルベンジルアルコールは変換できなかった。また、アリールエーテル資化菌アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属ＡＤＰ１株から単離された芳香族アルコール（ベンジルアルコール）デヒドロゲナーゼＡｒｅＢはＴＯＬプラスミドｐＷＷＯのＸｙｌＢと高い相同性を持ち、ｏ−，ｍ−，ｐ−メチルベンジルアルコール、ｏ−，ｍ−，ｐ−ヒドロキシベンジルアルコールに対する活性が報告された（Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｍ．．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｌ．Ｓ．，Ｎｅｉｄｌｅ，Ｅ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ａ．，ａｒｅＡＢＣ  ｇｅｎｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ａｒｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，４５６８−４５７５，１９９９）。
芳香族アルデヒドデヒドロゲナーゼはベンズアルデヒドから安息香酸までの反応を触媒する。最もよく知られているのはＴＯＬプラスミドｐＷＷＯにコードされるＸｙｌＣ酵素であり、その酵素活性はＮＡＤ（Ｐ）＋に依存する（上掲のＨａｒａｙａｍａらの論文）。また、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＮＣＩＢ８２５０からもｘｙｌＢとｘｙｌＣ遺伝子が単離され、それらがコードするアミノ酸配列はＴＯＬプラスミドのＸｙｌＢ、ＸｙｌＣと高い相同性を持ち、基質特異性もほぼ同じであった（Ｇｉｌｌｏｏｌｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ａ．Ｇ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｆｅｗｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ＩＩ  ｏｆ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０，１３７５−１３８１，１９９８）。
以上述べてきたように、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼは、芳香族アルコール及び芳香族アルデヒドをそれぞれ、芳香族アルデヒド及び芳香族カルボン酸に変換する酵素である。これら２つの酵素の働きにより、ベンジルアルコールのようなヒドロキシメチル基を有する単環式芳香族化合物がそのカルボン酸に変換されるのである。一方、ヒドロキシメチルナフタレンのような多環式芳香族化合物がそのカルボン酸へ変換される酵素やそれをコードする遺伝子の例は報告されていなかった。
一方、多環式芳香族炭化水素の菌体（細胞）レベルでの代謝経路は、多くの多環式芳香族炭化水素資化細菌において推察されている。たとえば、多環式芳香族炭化水素の１つである２，６−ジメチルナフタレンの代謝経路は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｂａｒｎｓｌｅｙ，Ｅ．Ａ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｂｙ  Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４（２），４２８−４３３，１９８８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−８７（Ｍｉｙａｃｈｉ，Ｎ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｈｏｔｔａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｏｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｉｓｏｍｅｒｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９（５），１５０４−１５０６，１９９３）、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ  Ｆ２９７（Ｇｒｉｆｏｌｌ，Ｍ．，Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ，Ｓ．Ａ．，Ｇａｔｌｉｎ，Ｃ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｃｈａｐｍａｎ，Ｐ．Ｊ．，Ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｎｅ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｏｎ  ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（１０），３７１１−３７２３，１９９５）、及び、Ｓｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ２３２２（Ｄｕｔｔａ，Ｔ．Ｋ．，Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｇｕｎｓａｌｕｓ，Ｉ．Ｃ．，Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓ：ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ｓｔｒａｉｎ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（５），１８８４−１８８９，１９９８）等の文献において報告されている。２，６−ジメチルナフタレンはまず、モノオキシゲナーゼによって２−ヒドロキシメチル−６−メチルナフタレンに酸化される。そして、アルコールデヒドロゲナーゼによって６−メチル−２−ナフタアルデヒドに変換された後、アルデヒドデヒドロゲナーゼの触媒作用で６−メチル−２−ナフトエ酸（６−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）に変換される。最初の反応を触媒するモノオキシゲナーゼ遺伝子はＢｒａｍｕｃｃｉらによってスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＡＳＵ１株（Ｂｒａｍｕｃｃｉ，Ｍ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ｖ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−ｘｙｌｅｎｅ  ａｎｄ  ２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｂｙ  ｘｙｌｅｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｉｓｏｌａｔｅ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９（６），６７９−６８４，２００２）から単離されたが、これ以降の代謝経路を担うアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を単離したと言う報告は存在しない。また、細菌菌体を利用した、２，６−ジメチルナ���タレンから２，６−ナフタレンジカルボン酸への生変換に関する特許がいくつか出願されている（特許第２７１５２６０号公報、特開平５−１５３６５号公報、特開平３−８００９１号公報、特開平８−２８０３８０号公報）。
【発明の開示】
本発明の課題は、種々のヒドロキシメチル基またはアルデヒド基を有する芳香族化合物を酸化しカルボン酸に変換する酵素をコードする遺伝子を取得することである。そして更に、この遺伝子を導入・発現させた組換え微生物を利用した、種々の芳香族カルボン酸の製造法を提供することである。
本発明者らはすでに、１，４−ジメチルナフタレンを基質として、市販されていない芳香族化合物である１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンを合成する新規の芳香族化合物ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子（ｐｈｎＡ１Ａ２Ａ３Ａ４）を海洋細菌サイクロクラスティカス（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）属より取得していた（特願２００３−３２４１１７）。すなわち、本遺伝子を有する大腸菌は、１，４−ジメチルナフタレンを変換し１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンを製造した。一方で本発明者らは、新潟県石油噴出所の土壌より、１，４−ジメチルナフタレンを唯一の炭素源として利用できるスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌１４ＤＮ６１株を単離した。本発明者らは、上記の１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンを基質として、このスフィンゴモナス属細菌１４ＤＮ６１株由来のＤＮＡを導入した大腸菌と混合培養して１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンを変換できるものをスクリーニングした結果ついに、１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンを４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸に変換するのに必要な鍵となる酸化酵素（デヒドロゲナーゼ）遺伝子を突き止め、本発明を完成するに至った。なお、本発明による遺伝子（ｐｈｎＮと命名）は、芳香族アルデヒドを芳香族カルボン酸に変換する活性を有する芳香族アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしていた。このｐｈｎＮ遺伝子を導入した大腸菌等の微生物は、芳香族アルコールを芳香族カルボン酸に変換することができた。これは全く予想外のことであった。大腸菌等の微生物は、本来的に弱いながらも芳香族アルコールをアルデヒドに変換する自前の芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有しており、ＰｈｎＮ酵素（ｐｈｎＮ遺伝子産物）が共存することにより、自前の芳香族アルコールデヒドロゲナーゼの回転効率がよくなり、一気に芳香族アルコールから芳香族カルボン酸が生産されたと考えざるを得ないからである。また、ｐｈｎＮ遺伝子を発現した大腸菌は、ヒドロキシメチル基を有するナフタレン骨格を持つ芳香族化合物だけでなく、ヒドロキシメチル基を有するベンゼン骨格を持つ芳香族化合物に至るまでの非常に広い範囲の芳香族化合物を芳香族カルボン酸に変換することができた。このことも発明者らの予想、即ち従来の常識を覆すものであった。
一方、本発明者らは、ｏ−キシレン資化細菌ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＴＫＮ１４株由来の芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、ヒドロキシメチル基を分子内に有する様々な芳香族化合物（芳香族ヒドロキシメチル化合物）、たとえば、ベンジルアルコールや種々のベンジルアルコールの置換体、さらには、ヒドロキシメチルナフタレンをそれぞれのアルデヒドに変換する新規の酵素であることを発見した。さらに本発明者らは、この芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子とともに、上記の芳香族アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現した大腸菌が、上記の様々な芳香族ヒドロキシメチル化合物をそれぞれのカルボン酸に変換できることを明らかにした。
本発明は以上のような知見を基に完成されたものである。
即ち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供するものである。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチド：
（ａ）配列番号３記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族化合物アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香族化合物アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド。
（２）以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ａ）配列番号３記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族化合物アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香族化合物アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド。
（３）（２）に記載の遺伝子を導入して得られる形質転換体であって、ヒドロキシメチル基またはアルデヒド基を有する芳香族化合物を芳香族カルボン酸に変換できる形質転換体。
（４）形質転換体が大腸菌であることを特徴とする（３）に記載の形質転換体。
（５）（３）乃至（４）に記載の形質転換体を、ヒドロキシメチル基またはアルデヒド基を有する芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から芳香族カルボン酸を得ることを特徴とする、芳香族カルボン酸の製造法。
（６）得られた芳香族カルボン酸が、４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸、６−メチル−２−ナフトエ酸、１−ナフトエ酸、２−ナフトエ酸、４−メチル安息香酸、３−メチル安息香酸、２−メチル安息香酸、安息香酸、４−ヒドロキシメチル安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−ヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシ安息香酸、４−メトキシ安息香酸、３−メトキシ安息香酸、２−メトキシ安息香酸、４−エチル安息香酸、４−イソプロピル安息香酸、３−クロロ安息香酸及び３−フェニルプロピオン酸から選ばれる少なくとも１種の芳香族カルボン酸であることを特徴とする（５）に記載の芳香族カルボン酸の製造法。
（７）以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチド：
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族化合物アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド。
（８）以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族化合物アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチド。
（９）（８）に記載の遺伝子を導入して得られる微生物であって、ヒドロキシメチル基を有する芳香族化合物を芳香族カルボン酸に変換できる形質転換体。
（１０）微生物が大腸菌であることを特徴とする（９）に記載の形質転換体。
（１１）（９）又は（１０）に記載の形質転換体を、ヒドロキシメチル基を有する芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から芳香族カルボン酸を得ることを特徴とする、芳香族カルボン酸の製造法。
（１２）得られた芳香族カルボン酸が、２−ナフトエ酸、安息香酸、２−，３−，４−メチル安息香酸、４−ヒドロキシメチル安息香酸、２−，３−，４−ヒドロキシ安息香酸、２−，３−，４−メトキシ安息香酸、３−クロロ安息香酸、桂皮酸及びバニリン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の芳香族カルボン酸であることを特徴とする（１１）に記載の芳香族カルボン酸の製造法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２３５４１４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１ａは、ｐｈｎＮ遺伝子を持つ大腸菌による芳香族アルコール化合物の変換例を示す図である。
図１ｂは、ｐｈｎＮ遺伝子を持つ大腸菌による芳香族アルコール化合物の変換例を示す図である。
図２は、ｐｈｎＮ遺伝子を持つ大腸菌による芳香族アルデヒド化合物の変換例を示す図である。
図３は、上段ａ）は１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンのｐＭＡ９−５４の大腸菌ＪＭ１０９形質転換体による変換産物をＴＭＳ化し、ＧＣ−ＭＳで分析した結果を示す図である。下段ｂ）は変換産物の１−ヒドロキシメチルナフトエ酸のＴＭＳ化マススペクトルである。
図４は、７−ｋｂ  ＫｐｎＩ断片の制限酵素マップおよび各遺伝子位置。各サブクローンの１，４−ジヒドロキシメチルナフタレン変換活性は右に示している。＋は変換活性あり、−は変換活性なしである。
図５は、プライマー設計に用いた配列のアライメイトを示しており、
「ａｒｅＢ＿Ａｃｉｎｅｔｏ」はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１株のａｒｅＢ遺伝子を意味し、
「ｘｙｌＢ＿Ａｃｉｎｅｔｏ」はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＮＣＩＢ８２５０のｘｙｌＢ遺伝子を意味し、「ｘｙｌＢ＿ＴＯＬ」はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ  ＴＯＬプラスミドｐＷＷＯのｘｙｌＢ遺伝子を意味する。
図６は、プラスミドｐ１８−３４を各種制限酵素で切断しアガロースゲル電気泳動した写真である。
図７は、ＸｙｌＢおよび関連酵素の系統樹を示し、図中、数字はｂｏｏｔｓｃｒａｐ値である（１０００回テスト）。図中「ＭｙｒＢ＿Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ」はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｍ１株のアルコールデヒドロゲナーゼＭｙｒＢを意味し、；「ＸｙｌＢ＿ＴＫＮ１４」はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ  ＴＫＮ１４株のＸｙｌＢ（本発明によるタンパク質）を意味し、「ＴｅｒｐＤ＿Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ」はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌のＴｅｒｐＤを意味し、「ＸｙｌＢ＿ＡｃｉｎｅｔｏＩＩ」はＡｃｉｎｅｔｏｂａｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＮＣＩＢ  ８２５０のＸｙｌＢを意味し、「ＡｒｅＢ＿Ａｃｉｎｅｔｏ」はＡｃｉｎｅｔｏｂａｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１株のＡｒｅＢを意味し、「ＸｙｌＢ＿ｐＷＷＯ」はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ  ＴＯＬプラスミドｐＷＷＯにコードされるＸｙｌＢ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ，Ｄ６３３４１）を意味し、「ＸｙｌＢ＿ＴＯＬ」はＰｓｅｕｄｏｎｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ  ｍｔ−２株のＴＯＬプラスミドにコードされるＸｙｌＢ（Ｓｈａｗ，Ｊ．Ｐ．，Ｒｅｋｉｋ，Ｍ．，Ｓｃｈｗａｇｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＴＯＬ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＷＷＯ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，１０８４２−１０８５０，１９９３）を意味し、「ＡＤＨ１＿Ｍａｎ」はヒトのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｍａｔｓｕｏ，Ｙ．，Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １  ｇｅｎｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２４３，５７−６０，１９８９）を意味する。
図８は、作製したプラスミドの構造を示す図であり、図中、ＳｐはＳｐｈＩを意味し、ＢはＢａｍＨＩを意味し、ＡはＡｐａＩを意味し、ＸｏはＸｈｏＩを意味し、ＥＶはＥｃｏＲＶを意味し、ＥはＥｃｏＲＩを意味し、ＮはＮｏｔＩを意味し、ＰはＰｓｔＩを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明に係るペプチドは、芳香族化合物デヒドロゲナーゼ活性を有しており、例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる芳香族家化合物アルデヒドデヒドロゲナーゼ及び配列番号５に示すアミノ酸配列からなる芳香族アルコールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
ここで、芳香族化合物アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性とは、芳香族アルデヒドを芳香族カルボン酸に酸化する活性を意味する。配列番号３のアミノ酸配列からなる芳香族家化合物デヒドロゲナーゼは、新潟県石油噴出所の土壌より単離された、１，４−ジメチルナフタレンを唯一の炭素源として利用できるスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌１４ＤＮ６１株から単離することができる。なお、配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２に示す。
また、本発明に係るペプチドは、芳香族化合物デヒドロゲナーゼ活性を有している限り、配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなるものであっても良い。ここで、複数個のアミノ酸とは、例えば１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜３５個のアミノ酸、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸を意味する。
さらに、本発明に係るペプチドは、芳香族化合物デヒドロゲナーゼ活性を有している限り、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるものであっても良い。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件下としては、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士（例えば６０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士）がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。具体的に、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションにおける洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
さらにまた、本発明に係るペプチドが芳香族化合物デヒドロゲナーゼ活性を有しているか否かは、例えば、対象のペプチドを含む溶液に２−ナフタルデヒド等の芳香族アルデヒド（基質）を添加し、反応後の溶液に２−ナフトエ酸等の芳香族カルボン酸（反応産物）が含まれるか否かをＧＣ−ＭＳによって検出する。その結果、芳香族アルデヒドが芳香族カルボン酸へ変換されていることが確認できれば、対象のペプチドは芳香族化合物デヒドロゲナーゼ活性を有することとなる。
一方、本発明に係る遺伝子は、上述したペプチドをコードする遺伝子であって、例えば配列番号２の塩基配列からなる。また、本発明に係る遺伝子は、配列番号２の塩基配列に対して６０％以上の相同性、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、上述した芳香族化合物デヒドロゲナーゼ活性を有するペプチドをコードするＤＮＡからなるものであっても良い。ここで、相同性とは、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）等を用いて、例えば、マキシムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる数値である。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。
一方、ここで、芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ活性とは、ヒドロキシメチル基を分子内に有する芳香族アルコール（芳香族ヒドロキシメチル化合物）を芳香族アルデヒド酸に酸化する活性を意味する。配列番号５のアミノ酸配列からなる芳香族アルコールデヒドロゲナーゼは、ｏ−キシレン資化細菌ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＴＫＮ１４株から単離することができる。なお、配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号４に示す。なお、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＴＫＮ１４株は、株式会社海洋バイオテクノロジーからカルチャーコレクション番号「ＭＢＩＣ  ０５５７２」として入手することができる。したがって、上記芳香族アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（配列番号４の塩基配列）は、入手したロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＴＫＮ１４株から定法に従って取得することができる。また、上記芳香族アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号４の塩基配列情報に基づいて化学合成により取得することもできる。
また、本発明に係るペプチドは、芳香族化合物アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有している限り、配列番号５に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなるものであっても良い。ここで、複数個のアミノ酸とは、例えば１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜３５個のアミノ酸、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸を意味する。
さらに、本発明に係るペプチドは、芳香族化合物デヒドロゲナーゼ活性を有している限り、配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるものであっても良い。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件下としては、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士（例えば６０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士）がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。具体的に、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションにおける洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
さらにまた、本発明に係るペプチドが芳香族化合物アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有しているか否かは、例えば、対象のペプチドを含む溶液に２−ヒドロキシメチルナフタレン等の芳香族ヒドロキシメチル化合物（基質）を添加し、反応後の溶液に２−ナフタルデヒド等の芳香族アルデヒド（反応産物）が含まれるか否かをＧＣ−ＭＳによって検出する。その結果、芳香族アルコールが芳香族アルデヒドへ変換されていることが確認できれば、対象のペプチドは芳香族化合物アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有することとなる。
一方、本発明に係る遺伝子は、上述したペプチドをコードする遺伝子であって、例えば配列番号４の塩基配列からなる。また、本発明に係る遺伝子は、配列番号４の塩基配列に対して６０％以上の相同性、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、上述した芳香族化合物アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するペプチドをコードするＤＮＡからなるものであっても良い。ここで、相同性とは、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）等を用いて、例えば、マキシムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる数値である。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。
本発明に係る遺伝子は、通常使用されているベクターに連結（挿入）することにより得られる組換えベクターとすることができる。本発明に係る遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどが挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などの大腸菌宿主用プラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５などの枯草菌用プラスミド、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０などの酵母宿主用プラスミド、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などの植物細胞宿主用プラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージなどが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明に係る遺伝子を挿入するには、まず、本発明に係る遺伝子を有する精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明に係る遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込むことができる。すなわちベクターは、プロモーター、本発明に係る遺伝子、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含むように調製することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを使用することができる。
本発明に係る遺伝子を含む組換えベクターを、当該遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより形質転換体を得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）などのシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）などのリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母が挙げられ、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジンなどから株化した植物細胞や該植物から調製したプロトプラストが挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が挙げられ、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１などの昆虫細胞が挙げられる。
大腸菌などの細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
プロモーターとしては、大腸菌などの宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの大腸菌由来のものやＴ７プロモーターなどのファージ由来のものが用いられる。さらに、ｔａｃプロモーターなどのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０−２１１４（１９７２）］、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ピヒア・パストリスなどが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなどが挙げられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２−１８７（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：１９２９−１９３３（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ，Ｈ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３−１６８（１９８３）］などが挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合は、例えばシロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジンなどから株化した細胞や該植物から調製したプロトプラストが用いられる。この場合、プロモーターとしては植物中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーターなどが挙げられる。
植物への組換えベクターの導入方法としては、Ａｂｅｌらのポリエチレングリコールを用いる方法［Ａｂｅｌ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：４２１−４２７（１９９４）］やエレクトロポレーション法などが挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどが用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーターなどを用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
以上のようにして得られた形質転換体を、ヒドロキシメチル基又はアルデヒド基を有する芳香族化合物を含む培地で培養することによって、培養物及び／又は形質転換体から芳香族カルボン酸を得ることができる。本発明に係る芳香族アルデヒドデヒドロゲナーゼは、宿主自身が有している芳香族ヒドロキシメチル化合物を芳香族アルデヒドに酸化する芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ活性を高めることができる。したがって、芳香族ヒドロキシメチル化合物を含む培地で形質転換体を培養することによって、宿主自身の芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ活性を高め、結果として、培養物及び／又は形質転換体から芳香族カルボン酸を得ることができる。
また、本発明に係る芳香族アルコールデヒドロゲナーゼは、宿主自身が有している芳香族アルデヒドデヒドロゲナーゼ或いは宿主に導入した芳香族アルデヒドデヒドロゲナーゼの基質となる芳香族アルデヒドを産生することができる。したがって、芳香族ヒドロキシメチル化合物を含む培地で形質転換体を培養することによって、培養物及び／又は形質転換体から芳香族カルボン酸を得ることができる。
特に、本発明に係る芳香族アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及び芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共発現するように形質転換した微生物によれば、各酵素の作用によって培地に含まれる芳香族ヒドロキシメチル化合物を効率良く芳香族カルボン酸に変換することができる。
基質となるヒドロキシメチル基を有する芳香族化合物と、反応産物である芳香族カルボン酸との対応を図１ａ及び図１ｂに示す。また、基質となるアルデヒド基を有する芳香族化合物と、反応産物である芳香族カルボン酸との対応を図４に示す。
なお、図１ａ及び１ｂにおいて１Ａ〜１９Ａは基質を示し、１Ｂ〜１９Ｂはそれぞれ１Ａ〜１９Ａに対応する反応産物を示している。１Ａ〜１９Ａ及び１Ｂ〜１９Ｂの化合物名は以下の通りである：
１Ａ、１，４−ジヒドロキシメチルナフタレン；１Ｂ、４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸；２Ａ、２−ヒドロキシメチル−６−メチルナフタレン；２Ｂ、６−メチル−２−ナフトエ酸；３Ａ、１−ヒドロキシメチルナフタレン；３Ｂ、１−ナフトエ酸；４Ａ、２−ヒドロキシメチルナフタレン；４Ｂ、２−ナフトエ酸；５Ａ、４−メチルベンジルアルコール；５Ｂ、４−メチル安息香酸；６Ａ、３−メチルベンジルアルコール；６Ｂ、３−メチル安息香酸；７Ａ、２−メチルベンジルアルコール；７Ｂ、２−メチル安息香酸；８Ａ、ベンジルアルコール；８Ｂ、安息香酸；９Ａ、キシレン−α−α’−ジオール；９Ｂ、４−ヒドロキシメチル安息香酸；１０Ａ、４−ヒドロキシベンジルアルコール；１０Ｂ、４−ヒドロキシ安息香酸；１１Ａ、３−ヒドロキシベンジルアルコール；１１Ｂ、３−ヒドロキシ安息香酸；１２Ａ、２−ヒドロキシベンジルアルコール；１２Ｂ、２−ヒドロキシ安息香酸；１３Ａ、４−メトキシベンジルアルコール；１３Ｂ、４−メトキシ安息香酸；１４Ａ、３−メトキシベンジルアルコール；１４Ｂ、３−メトキシ安息香酸；１５Ａ、２−メトキシベンジルアルコール；１５Ｂ、２−メトキシ安息香酸；１６Ａ、４−エチルベンジルアルコール；１６Ｂ、４−エチル安息香酸；１７Ａ、４−イソプロピルベンジルアルコール；１７Ｂ、４−イソプロピル安息香酸；１８Ａ、３−クロロベンジルアルコール；１８Ｂ、３−クロロ安息香酸；１９Ａ、３−フェニルプロピルアルコール；１９Ｂ、３−フェニルプロピオン酸。
同様に図２において、１Ａ〜６Ａは基質を示し、１Ｂ〜６Ｂはそれぞれ１Ａ〜６Ａに対応する反応産物を示している。１Ａ〜６Ａ及び１Ｂ〜６Ｂの化合物名は以下の通りである：１Ａ、１−ナフタルデヒド；１Ｂ、１−ナフトエ酸；２Ａ、２−ナフタルデヒド；２Ｂ、２−ナフトエ酸；３Ａ、４−メチルベンズアルデヒド；３Ｂ、４−メチル安息香酸；４Ａ、３−メチルベンズアルデヒド；４Ｂ、３−メチル安息香酸；５Ａ、２−メチルベンズアルデヒド；５Ｂ、２−メチル安息香酸；６Ａ、ベンズアルデヒド；６Ｂ、安息香酸。
上述した形質転換体を用いた芳香族カルボン酸の製造法においては、図１ａ、図１ｂ及び図２に示したヒドロキシメチル基又はアルデヒド基を有する芳香族化合物を含む培地を使用する。ここで、当該芳香族化合物の培地における濃度は、特に限定されないが、例えば１０ｍＭ、好ましくは２ｍＭ、より好ましくは０．５ｍＭとする。
基本となる培地としては、上述した形質転換体の宿主に適したものを使用することができる。例えば、宿主として大腸菌を使用した場合、ＬＢ培地を使用することができる。また一般的には、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
例えば、炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。さらに、培地中には、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を添加してもよい。
培養は、形質転換体の宿主にも依るが通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３０〜３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを含む組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）などを培地に添加してもよい。
なお、培養後、本発明に係るペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより当該ペプチドを抽出することもできる。また、当該ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のペプチドを単離精製することもできる。
以下、実施例により本発明について具体的に説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲は以下の実施例により限定的に解釈されるものではない。なお、実施例１〜１０では本発明に係る芳香族アルデヒドデヒドロゲナーゼについて説明し、実施例１１〜１８では本発明に係る芳香族アルコールデヒドロゲナーゼについて説明する。
【実施例１】  １，４−ジメルナフタレン資化菌の分離と解析
１００ｍｌの無機培地（Ｗ培地）に石油噴出源から採集したサンプル０．１％、１，４−ジメルナフタレン０．２％を添加して３０℃で振盪培養した。Ｗ培地の組成を以下に示す。ＫＨ２ＰＯ４（０．８５ｇ／ｌ），Ｎａ２ＨＰＯ４×１２Ｈ２Ｏ（４．９０ｇ／ｌ），（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．５０ｇ／ｌ），ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／ｌ），ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（９．５０ｍｇ／ｌ），ＭｇＯ（１０．７５ｍｇ／ｌ），ＣａＣＯ３（２．００ｍｇ／ｌ），ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（１．４４ｍｇ／ｌ），ＭｎＳＯ４×４Ｈ２Ｏ（１．１２ｍｇ／ｌ），ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ（０．２５ｍｇ／ｌ），ＣｏＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（０．２８ｍｇ／ｌ），Ｈ３ＢＯ４（０．０６ｍｇ／ｌ），ａｎｄ  ｃｏｎｃ．ＨＣｌ（５．１３×１０−２ｍｌ／ｌ）。増殖した細菌を基質の１，４−ジメルナフタレンを含む新しいＷ培地に１０％植菌し、上と同じ条件で培養した。この操作１０回をくり返して集積培養を行った。最後に菌を寒天プレートに撒き、シングルクローンを選択した。その結果、１４ＤＮ６１株が得られた。１４ＤＮ６１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、データーベース上で検索したところスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）（Ｌａｒａｍｅｅ，Ｌ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｒ，Ｃ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ａ  ｄｉｃｌｏｆｏｐ−ｍｅｔｈｙｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６（２），１３３−１４２，２０００；Ｐｉｎｙａｋｏｎｇ，Ｏ．，Ｈａｂｅ，Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．，Ｎｏｊｉｒｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｏｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｏｖｅｌ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  １−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  Ｐ２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０１（２），３５０−３５７，２００３；Ｗａｎｇ，Ｙ．ａｎｄ  Ｌａｕ，Ｐ．Ｃ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｏｘｉｄｉｚｅｒ，Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ  Ｂ１．Ｇｅｎｅ１６８（１），１５−２１，１９９６）と９９％以上の相同性を示した。従って、１４ＤＮ６１株はスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属と同定した。また、１４ＤＮ６１株は２，６−ジメルナフタレン、アントラセン、フェナンスレン、ｐ−キシレンを資化することも確認された。
【実施例２】  遺伝子操作実験
プラスミドの調製、制限酵素処理、ライゲーション反応、形質転換などの通常の遺伝子操作実験は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９８９，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、または、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，２００１，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ″，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に示された方法、または、試薬のプロトコールに示された方法により行った。
【実施例３】 Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属１４ＤＮ６１株からの染色体ＤＮＡの調製
実施例１で取得したＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属１４ＤＮ６１株を３００ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ）で３０℃、２日間培養した。菌体を集菌後、ＳＴＥ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で二回洗浄し、６８℃で１５分間熱処理をした後、５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）と１００μｇ／ｍｌのＲＮＡａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を含むＩ液（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に懸濁した。３７℃で一時間インキュベートした後、１０ｍｇ／ｍｌになるようにＰｒｏｔｅｎａｓｅ  Ｋ（Ｓｉｇｍａ）を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。さらに最終濃度が１％になるようにＮ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎ・Ｎａを添加し、転倒混和により穏やかに完全に混合した後３７℃で３時間インキュベートした。さらにフェノール／クロロホルム抽出を数回行った後、２倍量のエタノールをゆっくりと添加しながら、析出してきた染色体ＤＮＡをガラス棒で巻きつけ、７０％エタノールでリンスした後、２ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【実施例４】  コスミドライブラリーの作製
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属１４ＤＮ６１株の染色体ＤＮＡを約３０−４２ｋｂの長さのＤＮＡ断片が回収できるようにＳａｕ３ＡＩによって部分的に切断し、フォスファターゼ（ＣＩＡＰ、ＴＡＫＡＲＡ社製）処理した。ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩによる切断パターンの確認はＴＡＥアガロースゲルを用いた電気泳動で行った。コスミドベクターとしてＳｕｐｅｒＣｏｓ  １（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＸｂａＩ消化した後、フォスファターゼ処理を行った。さらに、このベクターＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した後、上記の染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分分解物とのライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ＴＯＹＯＢＯ社製）を行った。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング（ＬＡＭＢＤＡ  ＩＮＮ，Ｗａｋｏ社製）を行った後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲ株への感染を行った。感染した大腸菌はアンピシリンを含むＬＢプレートによって選択し、約１，０００個の大腸菌クローンを用意した。
【実施例５】  芳香族アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の単離
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属１４ＤＮ６１株は１，４−ジメチルナフタレンをカテコールまで分解した後、カテコールジオキシゲナーゼによって環解裂すると予想した。目的とする遺伝子はカテコールジオキシゲナーゼ遺伝子の周辺にある可能性が考えられる。カテコールジオキシゲナーゼによって分解されたカテコールは黄色になるため、容易にスクリーニングできることから、まずこの遺伝子の単離を試みた。ＬＢプレート上にある約１，０００個の大腸菌クローンのうち数百個を用いて、５０ｍＭのカテコールの水溶液をスプレーし、３７℃にて３０分間を置いた。その結果、一つのクローン（ｐＭＡ１３−１０）が黄色になった。しかしながら、ｐＭＡ１３−１０は１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンの変換能を持っていなかったため、ｐＭＡ１３−１０と重なるクローン（ｐＭＡ９−５４）をライブラリーから新たにコロニーハイブリダイゼーション法で単離した。
コスミドｐＭＡ９−５４を含む大腸菌ＪＭ１０９を３ｍｌのアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、０．５％  ＮａＣｌ）で３０℃にて１２時間培養を行った後、菌体を遠心操作により回収後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、０．２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０１％（ｗ／ｖ）チアミン、１ｍＭのＩＰＴＧを含む３ｍｌのＭ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ４，６ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４，３ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ，０．５ｇ／Ｌ；ＮＨ４Ｃｌ，１ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４，１ｍＭ；ＣａＣｌ２，０．１ｍＭ；ＦｅＳＯ４，０．０１ｍＭ）で菌体を溶かした。この菌液にさらに１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンの１００ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液を最終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、３０℃で２日間共培養を行った。この培養液１００μｌに対し酢酸エチル１５０μｌ、３Ｎ塩酸１０μｌを加えボルテックス攪拌を行い、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清の酢酸エチル相を回収後乾固した。次に、トリメチルシリル化剤（ジーエルサイエンス（株））でトリメチルシリル化してガスクロマトグラフィーマススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）用サンプルとした。ＧＣ−ＭＳは島津のｍｏｄｅｌ  ＱＰ５０５０Ａ、カラムはＪ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＤＢ−５  ｃｏｌｕｍｎ（３０ｘ０．２５ｍｍ）を使用した。カラム温度は最初５０℃で５分間を保った後、３００℃まで１０℃／分の速度で昇温し、３００℃で４分間を保った（１サンプルにつき計３４分の測定条件）。注入温度と検出温度は３００℃であった。分析結果を図３に示す。１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンの変換産物として、保持時間２５．１分のピークが検出され、その分子量は３４６であった。この分子量から計算して４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸と推定した。この化合物の詳細な同定は〔実施例６〕で述べる。以上の結果から、クローン（ｐＭＡ９−５４）が有するコスミドｐＭＡ９−５４内には、１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンを４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸に変換するデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードされていると考えられた。
【実施例６】  １，４−ジヒドロキシメチルナフタレン変換遺伝子のサブクローニングとシークエンス解析
ｐＭＡ９−５４をＫｐｎＩで切断し、その７−ｋｂ  ＫｐｎＩ断片を大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋に挿入し、プラスミドｐＭＡ７Ｋ５および、これと挿入断片が逆方向のプラスミドｐＭＡ７Ｋ１を構築した。これらのＪＭ１０９形質転換体の４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸生成活性を実施例５に記載した方法により調べたところ、両方とも酵素活性が確認された。次に、ｐＭＡ７Ｋ５とｐＭＡ７Ｋ１を様々な制限酵素で切断し、図４に示すように様々なサブクローンを構築した。これらのクローンの４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸生成活性を調べた結果、酵素活性を示す最小断片を持つプラスミドはｐＮＢ２．１８Ｎであった。ｐＮＢ２．１８Ｎは７−ｋｂ  ＫｐｎＩ断片中の２．１８−ｋｂ  ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入して作製したプラスミドである。
次に、７−ｋｂ  ＫｐｎＩ断片のシークエンス解析を行った。シークエンス反応はＴａｋａｒａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ（宝酒造社製）、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を５％添加の条件で、９６℃  ５分、９２℃  １０秒、５０℃  ５秒、６０℃  ４分、２５サイクルで行った。反応生成物はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により解析した。また、解析の結果得られた６，９２１ｂｐの塩基配列を配列番号１に示す。遺伝子配列の相同性の解析、ＯＲＦの検索をＮＣＢＩホームページよりそれぞれＢＬＡＳＴ２．０（ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）、ＯＲＦ  ｆｉｎｄｅｒで行った。２．１８−ｋｂ  ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片の塩基配列からは唯一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）しか見つからず、このＯＲＦが１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンから４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸への変換に関与していると考えられた。この遺伝子にコードされた推定アミノ酸配列はゲノム解析で明らかにされたＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＮＬ１のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＸｙｌＣ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ，Ｔ３１２６５）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｃｈｕｎｇｂｕｋｅｎｓｉｓ  ＤＪ７７（ＰｈｎＮ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ，ＡＦ０７３３５９−５）のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼと９０％の相同性を示した（以後、本発明者が取得したこのＯＲＦをｐｈｎＮ、コードされる酵素をＰｈｎＮと呼称する）。なお、データーベース上で公開された上記の二酵素遺伝子の機能などは解明されていなかった。また、ＰｈｎＮの推定アミノ酸配列はよく研究されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａのＴＯＬプラスミドのＸｙｌＢあるいはＸｙｌＣとの類似性は認められなかった。１４ＤＮ６１株のｐｈｎＮ（配列番号１中の塩基番号３２２２−４７２１）の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号３に示す。データーベース上でＰｈｎＮの推定アミノ酸配列とある程度の相同性を持ちながら機能も明らかにされている酵素はＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＧＪ１０のクロロアセタルデヒドヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＢ）（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｈ．，Ｌａｂｂｅ，Ｄ．，Ｔｕｒｍｅｌ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌａｕ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｎｅａｒ−ｂａｓｅｄ  ａｎｄ  ａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓＧＪ１０．Ｇｅｎｅ２０７（１），９−１８，１９９８）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．ＫＵＣ−１のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄｄｈ）（Ｙａｍａｎａｋａ，Ｙ．，Ｋａｚｕｏｋａ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｄ���，Ｍ．，Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．，Ｏｉｋａｗａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｓｏｄａ，Ｋ．，Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅ，Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．ＫＵＣ−１：ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９８（５），６３２−６３７，２００２）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈａのアセタルデヒドヒドロゲナーゼ（ＡｏｃＤ）（Ｐｒｉｅｆｅｒｔ，Ｈ．，Ｋｒｕｇｅｒ，Ｎ．，Ｊｅｎｄｒｏｓｓｅｋ，Ｄ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ＩＩ（ａｃｏＤ）ｏｆ  Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（３），８９９−９０７，１９９２）などのアルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。また、プロパン代謝に関わるアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ３）との相同性も見つかった（Ｋｏｔａｎｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｙｕｒｉｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｓａｋａｉ，Ｙ．ａｎｄ  Ｋａｔｏ，Ｎ．，Ｐｒｏｐａｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ＮＡＤ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｏｐａｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｂｙ  Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＴＹ−５．Ｊ．Ｂａｃｒｅｒｉｏｌ．１８５（２４），７１２０−７１２８，２００３）。これらの酵素は補酵素としてＮＡＤ＋に依存する。ＰｈｎＮとこれらの酵素のアミノ酸配列をＤＮＡ解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣでアライメントした結果、ＮＡＤ＋結合部位と思われるＰｈｎＮのアミノ酸配列２１６、２１８、２２２番のＧｌｙ、活性中心と思われる２６０番のＧｌｕ、２９４番のＣｙｓ、が保存されていた。以上の結果から今回単離されたｐｈｎＮ酵素遺伝子はＮＡＤ＋依存性デヒドロゲナーゼであることが示唆された。
また、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｃｈｕｎｇｂｕｋｅｎｓｉｓ  ＤＪ７７のａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子（ｐｈｎＩ）、４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｖａｌｅｒａｔｅ  ａｌｄｏｒａｓｅ遺伝子（ｐｈｎＪ）、及び４−ｏｘａｌｏｓｒｏｔｏｎａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ遺伝子（ｐｈｎＫ）（Ｈｗａｎｇ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｋ．，Ｋｉｍ，Ｙ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｙ．Ｃ．，Ｔｈｅ  ｐｈｎＩＪ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ａｃｙｌａｔｉｎｇ）ａｎｄ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｖａｌｅｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＤＪ７７  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５６（３），４６９−４７３，１９９９）とそれぞれ７７％、９０％、８０％の相同性を持つ配列も見つかった（我々の遺伝子も同様にそれぞれｐｈｎＩ、ｐｈｎＪ及びｐｈｎＫと名づけた）。
【実施例７】  ４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸の構造決定
４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸の構造は以下のように決定した。ｐＮＢ２．１８Ｎを含む大腸菌ＪＭ１０９を１Ｌのアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で３０℃にて１２時間培養を行った後、菌体を遠心操作により回収後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、０．２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０１％（ｗ／ｖ）チアミン、１ｍＭのＩＰＴＧを含むＭ９培地１Ｌで菌体を溶かした。この菌液にさらに１，４−ジヒドロキシメチルナフタレンの１００ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液を最終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、３０℃で２日間共培養を行った。この培養液を塩酸でｐＨ３にした後、１Ｌの酢酸エチルで二回抽出を行った。酢酸エチル相をエバポレーターで乾固の状態にし、ＮＭＲ分析を行った。１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲの測定結果は以下の通り。１Ｈ  ＮＭＲ（測定機器：Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ７５０、７５０ＭＨｚ、溶媒：重メタノール、外部標準としてテトラメチルシランを０ｐｐｍとした。）δ５．１１（ｓ）、δ７．５６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．５８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、δ７．６２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、δ８．１１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、δ８．１５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、δ８．９２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（測定機器：Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ５００、１２５ＭＨｚ、溶媒：重メタノール、外部標準としてテトラメチルシランを０ｐｐｍとした。）δ６３．２、δ１２４．２、δ１２４．８、δ１２７．３、δ１２７．５、δ１２８．１、δ１２８．８、δ１３０．８、δ１３２．７、δ１３２．８、δ１４３．４、δ１７１．１。また、本化合物をトリメチルシリル化後、ＧＣ−ＭＳにて分子量を測定したところ分子量３４６を検出した。以上、１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、ＧＣ−ＭＳの測定結果より本化合物が４−ヒドロキシメチル−１−ナフトエ酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）であることが明らかとなった。
【実施例８】  ｐＮＢ２．１８Ｎを含む大腸菌ＪＭ１０９形質転換体の細胞抽出物を用いた酵素活性測定
ｐＮＢ２．１８Ｎを含む大腸菌ＪＭ１０９形質転換体を３ｍｌのアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で３０℃にて１２時間培養を行った後、２００ｍｌのアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃にてＯＤ（６００ｎｍ）が０．５になるように培養した。次に、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、４時間を誘導した。菌体を遠心操作により回収後、１０ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶かした。菌体は大岳製作所のフレンチプレス（１，５００ＭＰａ）で二回破壊し、１５０００ｒｐｍで遠心後上清を細胞抽出物とした。細胞抽出物のたんぱく質の濃度測定はＢｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４，１９７６）の方法にしたがって行った。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の測定は１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に最終濃度５０μＭのＮＡＤ＋、１ｍｇのｐＮＢ２．１８Ｎの大腸菌ＪＭ１０９形質転換体の細胞抽出物、基質として５０μＭの２−ナフタルデヒドを添加した。３０℃にて１時間反応させた後、〔実施例５〕の方法に従って酢酸エチルで抽出し、ＧＣ−ＭＳで反応産物を解析した。その結果、２−ナフタルデヒドからの反応産物として２−ナフトエ酸および２−ヒドロキシメチルナフタレンが検出された。同様の実験で補酵素のＮＡＤ＋を添加しない場合、約２０％の２−ナフタエ酸しか検出されなかった。このことはＰｈｎＮがＮＡＤ＋に依存していることを示唆し、〔実施例６〕で記述したＰｈｎＮの推定アミノ酸配列にＮＡＤ＋結合部位が保存されていることと一致した。また、２−ヒドロキシメチルナフタレンが検出されたことはアルコールデヒドロゲナーゼの逆方向の酵素活性によるものと考えられる。
アルコールデヒドロゲナーゼ活性の測定は１ｍｌのグリシン／ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９．４）に最終濃度５０μＭのＮＡＤ＋、１ｍｇのｐＮＢ２．１８Ｎの大腸菌ＪＭ１０９形質転換体の細胞抽出物、基質として５０μＭの２−ヒドロキシメチルナフタレンを添加した。３０℃にて１時間反応させた後、〔実施例５〕の方法に従って酢酸エチルで抽出し、ＧＣ−ＭＳで反応産物を解析した。その結果、２−ヒドロキシメチルナフタレンからの反応産物として２−ナフトエ酸が検出された。以上の実験結果により、ＰｈｎＮを発現した大腸菌はアルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼ両方の酵素活性を持つことが証明された。
【実施例９】  ＰｈｎＮタンパク質の精製
ｐｈｎＮ遺伝子を含む１．８ｋｂ  ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＴｒｃＨｉｓＡのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入して、プラスミドｐＴｒｃＮ１を作製した。ｐＴｒｃＮ１を含む大腸菌ＪＭ１０９形質転換体の細胞抽出物は〔実施例８〕に従って調製した。細胞抽出物をＡｍｅｒｓｈａｒｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＨｉｓＴｒａｐＴＭ  ＨＰカラムで精製した。吸着バッファーは２０ｍＭリン酸、３０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、溶出バッファーは２０ｍＭリン酸、５００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌを用いた。溶出したサンプルは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を用いて透析し、Ａｍｅｒｓｈａｒｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＭｏｎｏ  Ｑ５／５ＨＲで更に精製した。吸着バッファーは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、溶出バッファーは吸着バッファーに１Ｍ  ＮａＣｌを添加したものを使用した。溶出したサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果、ほぼ単一バンドであった。
精製酵素を用いたアルコールデヒドロゲナーゼ活性の測定は、２−ヒドロキシメチルナフタレンを基質として〔実施例８〕の方法に従って行った。その結果、酵素活性は検出されなかった。また、精製酵素を用いたアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の測定は、２−ナフタルデヒドを基質として〔実施例８〕の方法に従って行った。その結果、酵素活性は検出された。以上の結果から、ＰｈｎＮはアルデヒドデヒドロゲナーゼであること、およびｐｈｎＮ遺伝子を発現した大腸菌形質転換体による芳香族アルコールからカルボン酸への変換は、大腸菌の持つアルコールデヒドロゲナーゼとＰｈｎＮのアルデヒドデヒドロゲナーゼの共同作用で行われたことが明かとなった。
【実施例１０】  アルコールおよびアルデヒド芳香族化合物の変換反応
ｐＮＢ２．１８Ｎを含む大腸菌ＪＭ１０９を３ｍｌのアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で３０℃にて１２時間培養を行った後、菌体を遠心操作により回収後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、０．２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０１％（ｗ／ｖ）チアミン、１ｍＭのＩＰＴＧを含むＭ９培地３ｍｌで菌体を溶かした。この菌体液を基質の数と同じように用意した。菌体液にそれぞれの基質１００ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液を基質の最終濃度が０．５ｍＭになるように添加し栓つき試験管に移し、蓋を密閉して３０℃で二日間培養を行った。この培養液それぞれ１００μｌを酢酸エチルで実施例５に記載した方法で抽出し、酢酸エチル相をＧＣ／ＭＳにて実施例５に記載の条件で分析を行った。市販の標準品とのマスパターンおよび保持時間の比較から、２−ヒドロキシメチル−６−メチルナフタレンから６−メチル−２−ナフトエ酸、１−，２−ヒドロキシメチルナフタレンからそれぞれ１−，２−ナフトエ酸、２−，３−，４−メチルベンジルアルコールからそれぞれ２−，３−，４−メチル安息香酸、ベンジルアルコールから安息香酸、キシレン−α−α’−ジオールから４−ヒドロキシメチル安息香酸、２−，３−，４−ヒドロキシベンジルアルコールからそれぞれ２−，３−，４−ヒドロキシ安息香酸、２−，３−，４−メトキシベンジルアルコールからそれぞれ２−，３−，４−メトキシ安息香酸、４−エチルベンジルアルコールから４−エチル安息香酸、４−イソプロピルベンジルアルコールから４−イソプロピル安息香酸、３−クロロベンジルアルコールから３−クロロ安息香酸、３−フェニルプロピルアルコールから３−フェニルプロピオン酸への変換反応が確認された。ただし、最初の変換産物の６−メチル−２−ナフトエ酸のみ市販品が無かったため、Ｂｒａｍｕｃｃｉ，Ｍ．ら（背景技術と同じ文献：Ｂｒａｍｕｃｃｉ，Ｍ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ｖ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−ｘｙｌｅｎｅ  ａｎｄ  ２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｂｙ  ｘｙｌｅｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｉｓｏｌａｔｅ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９（６），６７９−６８４，２００２）が報告したもののマススペクトルと比較して同定した。
また、ｐＮＢ２．１８Ｎを含む大腸菌ＪＭ１０９は、１−，２−ナフタルデヒドからそれぞれ１−，２−ナフトエ酸、２−，３−，４−メチルベンズアルデヒドからそれぞれ２−，３−，４−メチル安息香酸、ベンズアルデヒドから安息香酸への変換反応も示した。以上の生成産物はベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫのみを含む大腸菌ＪＭ１０９を用いた変換実験では、ほとんど検出されなかった。大腸菌内で合成されたＰｈｎＮ酵素が、毒性のある芳香族アルデヒド化合物を高率よくカルボン酸に変換できることによって、元々大腸菌が有していたアルコールデヒドロゲナーゼ活性も高められたと考えられた。以上の結果から、今回単離されたＰｈｎＮ酵素は基質特異性の広いアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を持っていることが明らかとなった。しかも、ＰｈｎＮ酵素は大腸菌等の微生物と相性がよく、ｐｈｎＮ遺伝子を発現した大腸菌の形質転換体はベンジルアルコールのような単環化合物からヒドロキシメチルナフタレンのような多環化合物に至る非常に広い範囲の芳香族化合物をカルボン酸に変換できたことから、本酵素は新規でかつ産業上有用な酵素だと考えられた。
【実施例１１】  遺伝子操作実験
以下に説明するプラスミドの調製、制限酵素処理、ライゲーション反応、形質転換などの通常の遺伝子操作実験は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９８９，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、または、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，２００１，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ″，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に示された方法、または、核実験系に使用した試薬に添付されたプロトコールに示された方法により行った。
【実施例１２】 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ  ＴＫＮ１４株からの染色体ＤＮＡの調製
目的とする遺伝子群の供給源となった土壌細菌ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＴＫＮ１４株は、岩手県釜石市の土壌から、ｏ−キシレンで優占化するｏ−キシレン資化細菌として、発明者らが所属する（株）海洋バイオテクノロジー研究所により釜石土壌より単離されたものである（特開２００２−２３８５５１号公報）。本ＴＫＮ１４株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡやｇｙｒＢ遺伝子の配列の分析により、ロドコッカス属細菌に分類されたものである。一般に土壌中で、ｍ−キシレンやｐ−キシレンと比べて、ｏ−キシレンは非常に分解しにくい物質として知られており、ｏ−キシレン分解細菌や分解系遺伝子の知見はほとんど存在していなかった。なお、本発明者は、本ＴＫＮ１４菌が、ｏ−キシレンの分解において、そのベンゼン環の直接酸化ではなく、その側鎖のメチル基の酸化により代謝することを確かめていた。Ｒ． ｏｐａｃｕｓ  ＴＫＮ１４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１９５、受託日：平成１３年２月２日）。なお、本菌株は、当初「ＴＫＮ１４株」ではなく、「ＫＮ１４株」と呼んでいたため、前記寄託センターにおいては、「Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＮ−１４」という名称で寄託されている。ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＴＫＮ１４株は、株式会社海洋バイオテクノロジーからカルチャーコレクション番号「ＭＢＩＣ  ０５５７２」として入手することができる。
Ｒ． ｏｐａｃｕｓ  ＴＫＮ１４株を３００ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ）で３０℃、２日間培養した。菌体を集菌後、ＳＴＥ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で二回洗浄し、６８℃で１５分間熱処理をした後、５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）と１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を含むＩ液（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に懸濁した。３７℃で一時間インキュベートした後、１０ｍｇ／ｍｌになるようにＰｒｏｔｅｎａｓｅ  Ｋ（Ｓｉｇｍａ）を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。さらに最終濃度が１％になるようにＮ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎ・Ｎａを添加し、転倒混和により穏やかに完全に混合した後３７℃で３時間インキュベートした。さらにフェノール／クロロホルム抽出を数回行った後、２倍量のエタノールをゆっくりと添加しながら、析出してきた染色体ＤＮＡをガラス棒で巻きつけ、７０％エタノールでリンスした後、２ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【実施例１３】  コスミドライブラリーの作製
ＴＫＮ１４株の染色体ＤＮＡを約３０−４２ｋｂの長さのＤＮＡ断片が回収できるようにＳａｕ３ＡＩによって部分的に切断し、フォスファターゼ（ＣＩＡＰ、Ｔａｋａｒａ社製）処理した。ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩによる切断パターンの確認はＴＡＥアガロースゲルを用いた電気泳動で行った。コスミドベクターとしてＳｕｐｅｒＣｏｓ  １（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、ＸｂａＩ消化した後、フォスファターゼ処理を行った。さらに、このベクターＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した後、上記の染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分分解物とのライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ＴＯＹＯＢＯ社製）を行った。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング（ＬＡＭＢＤＡ  ＩＮＮ，Ｗａｋｏ社製）を行った後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲ株への感染を行った。感染した大腸菌はアンピシリンを含むＬＢプレートによって選択した。
【実施例１４】  ＰＣＲ法によりＴＫＮ１４株のｘｙｌＢ遺伝子の部分配列増幅
３つのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１株のａｒｅＢ（Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｍ．．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｌ．Ｓ．，Ｎｅｉｄｌｅ，Ｅ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｐ．Ａ．，ａｒｅＡＢＣ  ｇｅｎｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ａｒｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，４５６８−４５７５，１９９９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ  ＴＯＬプラスミドｐＷＷＯのｘｙｌＢ（Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｒｅｋｉｋ，Ｍ．，Ｗｕｂｂｏｌｔｓ，Ｍ．，Ｒｏｓｅ，Ｋ．，Ｌｅｐｐｉｋ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｔｉｍｍｉｓ，Ｋ．Ｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｐｐｅｒ−ｐａｔｈｗａｙ  ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  ＴＯＬ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＷＷＯ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１，５０４８−５０５５，１９８９）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのｘｙｌＢ（Ｇｉｌｌｏｏｌｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ａ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｆｅｗｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ＩＩ  ｏｆ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０，１３７５−１３８１，１９９８）のアライメントから相同性の高い部分を用いて２つのプライマー（ｘｙｌＢ２Ｆ；５’−ＧＴＶ  ＹＴＷ  ＧＧＮ  ＣＡＹ  ＧＡＲ  ＧＧ−３’及び、ｘｙｌＢ３Ｒ；５’−ＣＡＡ  ＡＳＧ  ＡＲＧ  ＭＹＴ  ＧＳＳ  ＣＡＡ  Ａ−３’）を設計した（図５）。
ＴＫＮ１４株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、設計したプライマーでＰＣＲを行った。その結果２１４ｂｐの断片が増幅しＴＡクローニングによりベクターにクローニングした。クローニングした２１４ｂｐの断片の塩基配列はベクターのＴ７プロモーターを用いて決定した。決定した塩基配列を配列番号６に示す。
【実施例１５】  ２１４ｂｐ増幅ＤＮＡ断片のプローブの作製
ＴＫＮ１４株のｘｙｌＢ遺伝子の全長を含むクローンを遺伝子ライブラリーから単離するため、実施例１４でクローニングした２１４ｂｐ増幅ＤＮＡ断片を含むベクターのＴ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列からＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプローブ配列をＲＮＡに転写してプローブを下記のように作製した。鋳型ＤＮＡ溶液１４μｌにＳｏｌ．１（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ，２．０μｌ；ＤＩＧ  ＲＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅ，２．０μｌ；Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１．０μｌ）を６μｌ加えた。３７℃で９０分加温した。この溶液２μｌを電気泳動し転写産物を確認した。上の溶液の残り１８μｌにＤＮａｓｅＩ  １μｌ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １μｌを加え、３７℃で３０分間加温した。ＤＥＰＣ処理水８０μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）１０μｌ、１００％エタノール２５０μｌを加え−８０℃で１〜２時間エタノール沈澱した。１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、上澄みを捨て冷１００％エタノールで沈澱を洗浄した。沈澱を乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水２０μｌに溶解させた。プローブのラベルはＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（ロシュ社製）を用いて行った。
【実施例１６】  コロニーハイブリダイゼーションおよびサブクローニング
コロニーをメンブレンにトランスファーした後、メンブレンを８０℃で５分間乾燥した。乾燥後のメンブレンをアルミに包み８０℃で２．５時間固定した。メンブレン１００ｃｍ２につき２０ｍｌのプレハイブリ溶液をメンブレンとバックに入れた後バッグを密閉し、３７℃で２時間プレハイブリを行った。プローブをハイブリ溶液で希釈しプレハイ溶液を捨てたハイブリバッグにプローブを含むハイブリ溶液を加え、３７℃で３時間ハイブリを行った。ハイブリ終了後メンブレンを０．２×ＳＳＣ（ＳＳＣの組成；０．３クエン酸３ナトリウム、３Ｍ塩化ナトリウム）で２回洗浄し、ハイブリされなかったプローブを除去した。メンブレンを０．１×ＳＳＣで洗浄し洗浄に使用したバッファーで１分間平衡化しブロッキング溶液で６０分間振盪した。抗体希釈液を入れ室温で３０分間浸透した後洗浄バッファー１００ｍｌで１５分間２回洗浄を行った。検出用のバッファーを入れ２分間メンブレンを平衡化させ、検出バッファーで１００倍に希釈したＣＳＰＤをメンブレンにアプライした。メンブレンを気泡が入らないようにハイブリバッグに入れシールし３７℃で１５〜３０分加温した。加温後のメンブレンを暗室内でＸ線フィルム上に置き感光用の下線とのフタを締めて１０〜１５秒間感光させた。感光したフィルムを現像し目的のバンドの検出を行った。以上のようにシグナルを示す一つのクローンを単離した（１８−３４と命名）。
大腸菌の陽性クローン１８−３４から、プラスミド（ｐ１８−３４と命名）ＤＮＡを調製し、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩでそれぞれ切断し０．６％アガロースゲルで電気泳動した後（図６）。メンブランに転写し、２１４ｂｐの増幅ＤＮＡ断片のプローブでサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、３．９ｋｂのＳｐｈＩ断片がｘｙｌＢ遺伝子をコードしていることが明らかとなった。この３．９ｋｂのＳｐｈＩ断片をゲルから切り出しｐＵＣ１８のＳｐｈＩサイトに挿入してプラスミド（ｐＸｙｌＢ−Ｆ１４と命名）を作製した。
【実施例１７】  ＴＫＮ１４株のｘｙｌＢ遺伝子のシークエンス解析
プラスミドｐＸｙｌＢ−Ｆ１４の３．９ｋｂ  ＳｐｈＩ断片のシークエンス解析を行った。シークエンシング反応はＴａｋａｒａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ（宝酒造社製）、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を５％添加の条件で、９６℃  ５分、９２℃  １０秒、５０℃  ５秒、６０℃  ４分、２５サイクルで行った。反応生成物はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により解析した。また、解析の結果得られた３，８７４ｂｐの塩基配列を配列番号７に示す。遺伝子配列の相同性の解析、ＯＲＦの検索をＮＣＢＩホームページよりそれぞれＢＬＡＳＴ２．０（ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）、ＯＲＦ  ｆｉｎｄｅｒで行った。３，８７４ｂｐの塩基配列から二つのＯＲＦが見つかった。一つのＯＲＦ（配列番号４）がコードするアミノ酸配列（配列番号５）はこれまで知られたＸｙｌＢ［前述した、Ｐ． ｐｕｔｉｄａのＴＯＬプラスミドにコードされるＸｙｌＢやＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来のＸｙｌＢ（ＡｒｅＢ）］のアミノ酸配列と３３〜４４％の相同性（同一性：ｉｄｅｎｔｉｔｙ）持っていたので、ｘｙｌＢ遺伝子と命名した。
Ｒ． ｏｐａｃｕｓ  ＴＫＮ１４株のｘｙｌＢ遺伝子産物は、触媒機能が異なる２種のアルコールデヒドロゲナーゼとも相同性を有した。すなわち、ＴＫＮ１４株のＸｙｌＢは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｍ１株のβ−ｍｙｒｃｅｎｅ（モノテルペン；イソプレノイドの一種）代謝系のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＭｙｒＢ）（Ｉｕｒｅｓｃｉａ，Ｓ．，Ｍａｒｃｏｎｉ，Ａ．Ｍ．，Ｔｏｆａｎｉ，Ｄ．，Ｇａｍｂａｃｏｒｔａ，Ａ．，Ｐｅｔｅｒｎｏ，Ａ．，Ｄｅｖｉｒｇｉｌｉｉｓ，Ｃ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｚｅｎｎａｒｏ．，Ｅ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  β−ｍｙｒｃｅｎｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ  Ｍ１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５，２８７１−２８７６，１９９９）、及び、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の〈−ｔｅｒｐｉｎｅｏｌ（モノテルペン；イソプレノイドの一種）代謝に関わるアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｔｅｒｐＤ）（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｌｕ，Ｊ．−Ｙ．，Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒ，Ｊ．，Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｓ，．Ｃａｒｍｏｎａ，Ｃ．，Ｗｉｔｎｅｙ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０ｔｅｒｐ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｏｐｅｒｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１４１９３−１４２０３，１９９２）と４９％の相同性（同一性）を持っていた。
以上の結果から、Ｒ． ｏｐａｃｕｓ  ＴＫＮ１４由来のｘｙｌＢ遺伝子にコードされる芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ（配列番号５）は既存のものとは４９％以下の相同性（同一性）しか有さない新規なタンパク質であることが明らかとなった。本ＴＫＮ１４株のＸｙｌＢ、及びこれまで報告されている芳香族アルコールデヒドロゲナーゼの系統樹を図７に示した。驚いたことに系統樹上では、ＴＫＮ１４株のＸｙｌＢは、これまでよく研究されてきた芳香族化合物代謝に関わるＴＯＬプラスミド上にコードされるＸｙｌＢのグループとは分かれ、イソプレノイドの代謝に関わるアルコールデヒドロゲナーゼであるＭｙｒＢ，ＴｅｒｐＤと同じグループに分類されることが示された。したがって、今回単離されたＴＫＮ１４株由来のｘｙｌＢ遺伝子（配列番号４）は全く新規な芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子であると言える。
一方、もう一つのＯＲＦ（配列番号８）がコードするアミノ酸配列（配列番号７）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のシトクロムＰ−４５０ｔｅｒｐ（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｌｕ，Ｊ．−Ｙ．，Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒ，Ｊ．，Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｓ，．Ｃａｒｍｏｎａ，Ｃ．，Ｗｉｔｎｅｙ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０ｔｅｒｐ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｏｐｅｒｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１４１９３−１４２０３，１９９２）と４６％の相同性（同一性）を持っていた。
【実施例１８】 ｘｙｌＢ遺伝子を持つ大腸菌の芳香族アルコールの変換活性
ｘｙｌＢ遺伝子を含む１，８４４ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ断片を３．９−ｋｂ  ＳｐｈＩ  ＤＮＡ断片から切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  ＩＩのＸｈｏＩ−ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＸｙｌＢ８を作製した（図８）。また、ｘｙｌＢ遺伝子を含む１．７ｋｂのＸｈｏＩ−ＳｐｈＩ断片を、実施例６で調整したプラスミドｐＮＢ２．１８ＮのＸｈｏＩ−ＳｐｈＩサイトに挿入してｐＰｈｎＮ−ＸｙｌＢを作製した（図８）。プラスミドｐＮＢ２．１８Ｎは、ｐｈｎＮ遺伝子を含む２．１８−ｋｂ  ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入されたプラスミドである。本実施例で作製したプラスミドｐＰｈｎＮ−ＸｙｌＢを持つ大腸菌は、芳香族アルデヒドからカルボン酸への変換がスムーズになり、カルボン酸の生成量を定量することによってｘｙｌＢ遺伝子産物の活性が評価できると考えられる。なお、本実施例では上述したようにしてｘｙｌＢ遺伝子を取得したが、ｘｙｌＢ遺伝子は配列番号４の塩基配列情報に基づいて化学合成により取得することもできる。
プラスミドｐＰｈｎＮおよびｐＰｈｎＮ−ＸｙｌＢ  Ｃのいずれか一方を含む大腸菌ＪＭ１０１を１０ｍｌのアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で３０℃にて１２時間培養をそれぞれ行った後、菌体を遠心操作により回収後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、０．２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０１％（ｗ／ｖ）チアミン、１ｍＭのＩＰＴＧを含むＭ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ４，６ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４，３ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ，０．５ｇ／Ｌ；ＮＨ４Ｃｌ，１ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４，１ｍＭ；ＣａＣｌ２，０．１ｍＭ；ＦｅＳＯ４，０．０１ｍＭ）３ｍｌで菌体を溶かした。この菌体液を基質の数と同じように用意した。菌体液にそれぞれの基質１００ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液を基質の最終濃度が０．５ｍＭになるように添加し栓つき試験管に移し、蓋を密閉して３０℃で二日間培養を行った。この培養液それぞれ２００μｌを等量にメタノールと混ぜて遠心分離後、ＨＰＬＣの分析に供した。ＨＰＬＣはＷａｔｅｒｓのＡｌｌｉａｎｃｅ、カラムはオクタデシルシリカ逆相カラム（ｌｅｎｇｔｈ，１０ｃｍ；ｄｉａｍｅｔｅｒ，４．６ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ）。流速は１ｍｌ／ｍｉｎ。サンプル注入後溶媒Ａ（０．１％  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ）で２分間流した後、溶媒Ｂ（０．１％  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎ  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）で７０％までのグラジエントをかけた。７０％の溶媒Ｂで５分間流した。検出には２３０から２８０ｎｍのマキシマルを測定した。
結果を表１に示す。
【表１】
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プラスミドｐＰｈｎＮ−ＸｙｌＢを持つＥ． ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１は、２−ヒドロキシメチルナフタレンから２−ナフトエ酸、ベンジルアルコールから安息香酸、２−，３−，４−メチルベンジルアルコールからそれぞれ２−，３−，４−メチル安息香酸、キシレン−α−α’−ジオールから４−ヒドロキシメチル安息香酸、２−，３−，４−ヒドロキシベンジルアルコールからそれぞれ２−，３−，４−ヒドロキシ安息香酸、２−，３−，４−メトキシベンジルアルコールからそれぞれ２−，３−，４−メトキシ安息香酸、３−クロロベンジルアルコールから３−クロロ安息香酸、シナミルアルコールから桂皮酸、ヴァニルアルコールからバニリン酸への変換反応が確認された。カルボン酸の生成量はプラスミドｐＰｈｎＮを持つＥ． ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１のよりはるかに高いことから、ＸｙｌＢが機能した結果であることは明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、単環化合物から多環化合物に至る非常に広い範囲の芳香族化合物をカルボン酸に変換できる芳香族デヒドロゲナーゼ活性を有する新規なペプチド及び当該ペプチドをコードする遺伝子を提供することができる。また、本発明により、ヒドロキシメチル基またはアルデヒド基を有する芳香族化合物を芳香族カルボン酸に変換できる有用な形質転換体を提供することができる。さらに、本発明により、上記形質転換体を利用した、ヒドロキシメチル基またはアルデヒド基を有する芳香族化合物から芳香族カルボン酸を製造する方法を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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