(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料からの黄体形成ホルモン(LH)の精製方法であって、
(a)  DEAEセファロース（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーカラムから試料を溶出し；
(b)  Qセファロース（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出し；
(c)  シリカC18逆相HPLCカラムから溶出し；
(d)  シリカC18逆相HPLCカラムから更に溶出し；
(e)  ゲル透過カラムから溶出する、
段階を含んで成る、方法。
【請求項２】
DEAEセファロース（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーからの溶出が、pH8のリン酸ナトリウムバッファー中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Qセファロース（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーカラムからの溶出が、pH7.5の酢酸アンモニウムバッファー中で実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
逆相HPLCの段階(c)が、移動相として２−プロパノール／酢酸アンモニウムを用いて実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
逆相HPLCの段階(d)が、移動相として２−プロパノール／Tris-HClを用いて実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
LHがヒトLHである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
試料がCHO細胞由来の培養液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、黄体形成ホルモン(LH)の精製、特に粗製組換えLHからの組換えLH(r-LH)の精製のための方法であって、イオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーの併用を含んで成る方法に関する。
【０００２】
黄体形成ホルモン(LH)は、下垂体前葉によって、別のゴナドトロピンである、卵胞刺激ホルモン(FSH)と一緒に分泌されるゴナドトロピンである。これらのホルモンは非共有結合型のα及びβサブユニットから成る異種二量体である。
【０００３】
これらのゴナドトロピンは、男性及び女性、その両方おける性腺の正常な機能及び性ホルモンの分泌を刺激する。女性において、卵胞刺激ホルモンは卵胞及び卵子の形成及び成熟を刺激する。卵胞が形成する場合、それはエストロゲンを産生し、これは中間の周期にLHの放出を刺激する量で増大する。これは、排卵による卵胞の破裂を招き、そしてプロゲステロンを分泌する黄体へと卵胞を変化させる。男性において、黄体形成ホルモンは、テストステロンを分泌するように精巣の間質細胞を刺激し、これは次に精細管に直接作用する。黄体形成活性又は卵胞刺激活性あるいはその両方を有する性腺刺激物質は、受精障害において、主に女性において使用されるが、男性においても使用される。その様な物質は、LH活性を有する絨毛性ゴナドトロピン及び、LH及びFH活性を有するヒト閉経期ゴナドトロピンを含む。組換えDNA由来ヒト黄体形成ホルモンは(rechLH)は、絨毛性ゴナドトロピンの代替物として、又はFSHと一緒に投与するために研究されている。
【０００４】
LHを単離し、そして精製するために、様々な方法、例えばイオン交換、ゲル濾過及び免疫親和性クロマトグラフィーが使用されている(Jack, G. W., Blazek, R., James, k., Boyd, J. E. & Mickelm, L. R. The automated production by immunoaffinity chromatography of the human pituitary glycoprotein hormones thyrotropin, follitropin and lutropin. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 39, 45-58, 1987)。
【０００５】
イオン交換クロマトグラフィーはこれらのホルモンの単離に使用されているが、この方法は、下垂体組織におけるLHのかなりの電荷の違いによって生じる、複数の相互に関連している問題を有すると思われる。最初に、これらの糖タンパク質及びFSHが重複する電荷を有するので、それらの完全な宇分離は困難であり、そして骨が折れることである。次に、これらのホルモンの単一画分としての精製は困難であると思われる(Stockell Hartree, A., Thomas, M., Furnival, B. E., Burns, T. W. & Langley, P. Thyroid-stimulating and lipolytic activities of purified preparations of human thyroid-stimulating hormone. Journal of Endocrinology 53, 95-100, 1972)。結果として、前記ホルモンのある電荷型は、LHの場合に示唆されているように、精製の間に選択され得る(Storring, P. L. Zaidi, A. A., Mistry, Y. G. Lindberg, M.,Stenning, B. E. & Diczfalusy, E.. A comparison of preparations of highly purified human pituitary luteinising hormone: diferrences in the luteinising hormone potencies as determined by in vivo bioassays, in vitro bioassays and immunoassay. Acta Encocrinologica 101, 339-347, 1982)選択的精製は、更にこれらの異種形態の特徴付け、例えばそれらの炭水化物成分の構造解析を複雑にするだろう。シアリル基及び硫酸基を含む陰イオン性オリゴ糖の含有量の変化は、LHの電荷の異種性の主要な原因と成り得る。
【０００６】
常用の分画法は、生物学的アッセイによる９８２i.u./mgの力価及び放射線免疫アッセイによる１１６６i.u.の力価を有するヒト膀胱黄体形成ホルモン(LH)の調製について記載されている(Donini S. & Donini P. Acta endocr., Copenh. 63,  Suppl. 142, 257-277, 1969)。精製型ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)に対するウサギ抗血清の免疫吸着剤(immunoabsorbent)は、閉経期の尿からの卵胞刺激ホルモン(FSH)の調製の間に得られた主要画分及び副画分から、LHを精製するために使用された(van Hell, H., Schuurs A. H. W. M. & den Hollander, F. C.,  In Symposium on gonadtrophins, New York, 17 June 1971. Eds B. B. Saxena, C. G. Beling & H. M. Gandy. New York: John Wiley & Son, Inc, 1972)。得られた調製物はDonini & Donini(1969)のものより高いLH力価を有していただけでなく、より高いFSH:LH比を有していた。
【０００７】
組換えLHは、他のゴナドトロピンホルモン、例えばFSH及びTSHを含まないという利点を有する。しかしながら、組換えLHの粗製調製物は、その組換え体の産生において使用される細胞の、全ての他のタンパク質及び夾雑物を含んでおり、そして組換え黄体形成ホルモンの絶対的な純度を達成するための方法が非常に望まれる。
【０００８】
本発明の要約
我々は、組換え法後に得られた培養液の試料又は閉経後の尿の粗製濃縮物由来の、LHの粗製調製物が、生じたLHが粗製LH中に含まれるタンパク質及び／又は他の夾雑物を事実上含まない程度にまで精製され得ることを発見した。出発材料に依存して、当該タンパク質及び他の夾雑物は、ヒト起源のもの（出発材料：ヒト閉経期ゴナドトロピン）又は宿主細胞起源のものであり、例えばCHO宿主細胞の場合CHOである。
【０００９】
精製方法は、イオン交換クロマトグラフィー及び逆相HPLCの使用に基づいている。ゲル透過クロマトグラフィーの任意な追加の使用は、純粋なLH調製物由来の残りわずかな任意の夾雑物の除去を可能にする。最適な結果は、二段階のイオン交換クロマトグラフィー及び二段階の逆相HPLCが実施された場合に得られる。
【００１０】
本発明の方法は、組換え法後に得られる培養液の試料から出発する、組換えLHの精製に使用されることがあり、その結果、生じた高度に精製されたLHは、例えば、培養液にしばしば含まれるFBS、組換え法に使用される宿主細胞に存在する核酸又は他の夾雑物を事実上含まない。
【００１１】
本発明の方法は、閉経後の尿の粗製濃縮物から出発する、尿の精製、及び他の種、特に哺乳類、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ラット、マウス及びサルからのLHの精製にも使用され得る。
【００１２】
従って、本発明の目的は、イオン交換クロマトグラフィーと逆相HPLCの併用を含んで成る、試料からのLHの精製のための方法を提供することにある。当該方法は、試料（必要により濃縮したもの）をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、そして溶出液を逆相HPLCにかける段階を含んで成る。当該溶出液をゲル透過クロマトグラフィーに利用する追加の段階も更に実施され得る。
【００１３】
出発調製物の純度に依存して、イオン交換クロマトグラフィー及び逆相HPLCは、好ましくは当該精製法から最適な結果を得るために二回実施される。当該方法は、
(a)  DEAEセファロースイオン交換クロマトグラフィーカラムから試料を溶出し；
(b)  Qセファロースイオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出し；
(c)  シリカC18逆相HPLCカラムから溶出し；
(d)  シリカC18逆相HPLCカラムから再び溶出し（任意に、段階(c)と異なる溶出液を用いる）；そして
(e)  ゲル透過カラムから溶出する、
段階を含んで成ることがある。
【００１４】
本発明の好ましい態様において、DEAEセファロースイオン交換クロマトグラフィーからの溶出は、pH8のリン酸ナトリウムバッファーにおいて実施される。
【００１５】
Qセファロースイオン交換クロマトグラフィーからの溶出は、好ましくはpH7.5の酢酸アンモニウムバッファーにおいて実施される。
【００１６】
逆相HPLCの段階(c)は、移動相として、好ましくは２−プロパノール／酢酸アンモニウムを用いて実施される。
【００１７】
逆相HPLCの段階(d)は、移動相として、好ましくは２−プロパノール／Tris-HClを用いて実施される。
【００１８】
本発明のLHは好ましくはヒトLHであり、そして最も好ましくは、組換え法において使用される哺乳類細胞（好ましくはCHO細胞）の培養液に由来する、組換えヒトLHである。
【００１９】
本発明の更なる目的は、治療として有効な量の、上述の組換え法によって調製される組換えLHを、適当な賦形剤、例えば凍結乾燥産物の安定化に必要なスクロースと一緒に含んで成る医薬組成物を提供することである。組換えLHの当該組成物は、皮下投与に特に適している。
【００２０】
本発明の詳細な説明
本発明は、LHの精製方法、特に組換え過程の培養液中の粗製調製物からの組換えLHの精製方法を提供する。r-hLHは、培養液中に存在する場合ウシ胎児血清(FBS)タンパク質を、そして組換え過程で使用される宿主細胞に含まれる核酸又は他の夾雑物を事実上含まない、高水準の純度及び高い比活性で得られる。
【００２１】
本発明は、生物学的材料、特にLH及び他の夾雑性タンパク質を含む粗製混合物を用いる使用を意図しており、これは本明細書では出発材料試料として言及する。以下の詳細に説明した例は、バイオリアクター由来の培養上清液から得た、r-hLHを含む出発材料試料を使用する。あるいは、当該試料は、ヒト閉経期ゴナドトロピン(hMG)、閉経後の尿の粗製濃縮物、である。
【００２２】
当該試料は、バイオリアクターを透過した細胞培養上清液を新たに回収することによって構成される。それは、好ましくは濾過によって清澄にされる。当該粗製溶液は、続いて濃縮されることがあり、そして必要により限外濾過にかけられ、分子量１０未満の材料が除去される。限外濾過は更に、バッファーをpH8のリン酸ナトリウムに交換せしめる。
【００２３】
予備段階の後、当該試料は、続いてイオン交換クロマトグラフィー及び逆相HPLCにかけられ、これらは好ましくはそれぞれ二回実施される。最初のイオン交換段階は、好ましくはDEAEセファロースで実施される。これは、非LHタンパク質の大部分が排除される、本質的にLHの「フロースルー」段階である。第２のイオン交換段階は、好ましくはQセファロースカラムで実施される。これもまたLHの「フロースルー」段階であり、そして潜在的なDNA及び宿主細胞又は培地のタンパク質夾雑物を除去するために設計される。好ましい態様において、pH7.5の酢酸アンモニウムを用いるこの段階は約５℃で実施される。
【００２４】
シリカC18上での逆相クロマトグラフィーも好ましくは二回実施され、そして微量のFBS、細胞タンパク質及びエンドトキシン夾雑物の除去において有効である。最初のHPLC段階は、移動相として好ましくは２−プロパノール／酢酸アンモニウムを用いて実施される。第２の逆相HPLC段階は、移動相として好ましくは２−プロパノール／Tris-HClを用いて実施される。続いて保持溶液を濃縮し、そしてこれはpH8の炭酸水素アンモニウムで回収され得る。濃縮産物は、好ましくはセファクリルS100HR上でのゲル透過クロマトグラフィーにかけられる。この段階において、分子サイズに基づく分離は、pH8の炭酸水素アンモニウムで溶出することで達成され、そして次に溶出液は好ましくはウイルス性の夾雑物を除去するための濾過、続いてpH8のリン酸ナトリウムバッファー中での、10kDのカットオフ値を有する膜上での限外濾過を受ける。濾過後、精製されたＬＨのバルクは、好ましくは滅菌した瓶において低温で保存される。
【００２５】
例１
試薬
分析用酢酸（氷酢酸）(Ph. Eur.)
分析用酢酸アンモニウム
分析用炭酸水素アンモニウム(B. P.)
分析用第二リン酸ナトリウム
分析用塩酸(Ph. Eur.)
分析用リン酸(Ph. Eur.)
分析用２−プロパノール(Ph. Eur.)
分析用塩化ナトリウム(Ph. Eur.)
分析用第一リン酸ナトリウム
分析用粒状水酸化ナトリウム(Ph. Eur.)
HPLC用トリフルオロ酢酸(TFA)
分析用トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン
注射用水(WFI) (Ph. Eur.)
【００２６】
精製過程の要約したフローダイヤグラム
表１は、各中間段階の作業の原理を概説した、r-hLHの精製過程を要約するフローダイヤグラムである。
【表１】
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【００２７】
収集物の清澄化、濃縮、透析及び濾過（段階Ｉ）
この段階（段階Ｉ）において、バッファーは、制御された組成のものとなるように交換され、そして予備的な濃縮が達成される。この段階は約＋５℃で実施され、そしてバイオリアクターの産生期の間、収集物毎に個別に繰り返される。好ましい温度範囲は５±３℃である。
【００２８】
(i)  収集物の清澄化
バイオリアクター由来の新たに回収した培養液の受け取り次第、材料は、好ましくは濾過による上清溶液の清澄化から出発して処理される。
【００２９】
(ii)  収集物の濃縮／透析
バッチ間においてpH8の0.05M水酸化ナトリウム中で保存された膜を、pHが約８に低下するまでWFIですすぐ。
【００３０】
pH8の0.025Mリン酸ナトリウムの平衡化バッファーで水を交換する。調整した後すぐに、当該バイオリアクター由来の粗製r-hLH溶液を濃縮し、そして分子量10kD未満の材料を除去するために透析した（膜のカットオフ値10kD）。
【００３１】
生じた濃縮物を約−１５℃で保存する。
【００３２】
DEAEセファロースCL-6B上でのイオン交換クロマトグラフィー（段階II）
当該クロマトグラフィー段階は、非r-hLHタンパク質の大部分が排除され、そして溶液が更に濃縮され、そして透析される、r-hLHの「フロースルー」段階である。生成物が当該カラムを通過する当該クロマトグラフィー段階は、低温室で実施される。
【００３３】
(i)  DEAEセファロースCL-6B上でのイオン交換クロマトグラフィー
カラムを、最初にpH8の0.15Mリン酸ナトリウムで平衡化した、弱く荷電した陰イオン交換樹脂であるジエチルアミノエタン(DEAE)セファロースで充填する。好ましいpH範囲は8±0.3である。
【００３４】
次に、カラムをランニングバッファーであるpH8の0.025Mリン酸ナトリウムで調整する。好ましいpH範囲は8±0.3である。
【００３５】
r-hLH溶液を、ガード(guard)としてカラム上に配置したフィルター装置を介して当該カラム上に載せる。
【００３６】
当該カラムにpH8の0.025Mリン酸ナトリウムを供給する。好ましいpH範囲は8±0.3である。当該クロマトグラフィーの過程は、分光光度計によって280nmでモニタリングされる。最初の溶出液は、基準線が５％の吸光度の印を通過するまで廃棄される。r-hLHを含む結合していない画分は、基準線が１０％に低下するまで回収される。
【００３７】
(ii)  限外濾過
0.05MのNaOH中で保存された、100kDのカットオフ値の膜を備えた限外濾過装置を、透過液のpHが約８になるまでWFIですすぐ。
【００３８】
水を平衡バッファーであるpH7.5の0.08Mの酢酸アンモニウムと交換する。好ましいpH範囲は7.5±0.3である。
【００３９】
イオン交換クロマトグラフィー段階で得られたr-hLH溶液は、100kDの膜を介して限外濾過され、そして透過液の画分が回収される。
【００４０】
限外濾過膜をpH7.5の0.08Mの酢酸アンモニウムのアリコートで洗浄し、そして洗浄した画分の全てを当該透過溶液にまとめる。
【００４１】
(iii)  濃縮／透析
0.05MのNaOH中で保存された、10kDのカットオフ値の膜を備えた限外濾過装置を、透過液のpHが約８になるまでWFIですすぐ。水を平衡バッファーであるpH7.5の0.08Mの酢酸アンモニウムと交換する。
【００４２】
r-hLH溶液を濃縮する。pH7.5の0.08Mの酢酸アンモニウムを保持液に加え、そして当該溶液を濃縮する。透析は、保持液のpH及び伝導性が、新たに入ってくるバッファーのものと同一になるまで続けられる。生じた保持液を回収する。
【００４３】
Qセファロースファストフロー上でのイオン交換クロマトグラフィー（段階III）  この段階もr-hLHの「フロースルー」段階であり、潜在的なDNA及び宿主細胞又は培養液のタンパク質夾雑物を除去するために設計される。
【００４４】
(i)  カラムの平衡化
カラムの調整は、ランニングバッファーであるpH7.5の0.08M酢酸アンモニウムで調整する。好ましいpH範囲は7.5±0.3である。
【００４５】
(ii)  Q-セファロースFF上でのr-hLHの精製段階
r-hLH溶液を、ガードとしてQセファロースカラム上に配置したフィルター装置を介して載せる。
【００４６】
当該カラムを、pH7.5の0.08Mの酢酸アンモニウムで更に洗浄する。
【００４７】
最初の溶出液は、基準線が５％の吸光度の印を通過するまで廃棄される。
【００４８】
r-hLHを含む結合していない画分は、基準線が１０％に低下するまで回収される。
【００４９】
段階III由来のr-hLH溶液は、次の使用のために凍結保存され得る。−１５℃以下の温度で保存される場合、r-hLHの中間物は＋５±３℃で、典型的に逆相HPLC（段階IV）の開始前２４±８時間かけて融解される。
【００５０】
１回目の予備的逆相HPLC（段階IV）
室温で実施されるこの段階は、微量のFBS/CHOタンパク質及びエンドトキシン夾雑物を除去するのに有効である。
【００５１】
(i)  カラムの充填及び樹脂の活性化
カラムをC18ワイドポアシリカで充填し、そしてこれが新しいものであるならば、C18樹脂を２−プロパノールで調整する。
【００５２】
(ii)  カラムの平衡化
カラムを、12.4%w/wの２−プロパノール／pH7の0.05M酢酸アンモニウムバッファーで平衡化する。好ましいpH範囲は７±０．２である。
【００５３】
(iii)  段階III由来のr-hLH溶液のpH及び体積の調整
r-hLH溶液を濃酢酸でpH7に調整する。好ましいpH範囲は７±０．２である。
【００５４】
r-hLH溶液の体積を、12.4%w/wに等しい２−プロパノールの終濃度を得るために、２−プロパノールの添加によって調整する。
【００５５】
(iv)  調整されたr-hLH溶液の濾過
0.22μmのフィルターを備えた濾過装置を12.4%w/wの２−プロパノール／pH7の0.05M酢酸アンモニウムバッファーで洗浄する。好ましいpH範囲は７±０．２である。
【００５６】
調整したr-hLH溶液を濾過する。
【００５７】
濾過されたものを、12.4%w/wの２−プロパノール／pH7の0.05M酢酸アンモニウムバッファーのアリコートですすぎ、濾過し、そしてすすぎ液をr-hLH溶液としてまとめる。好ましいpH範囲は７±０．２である。
【００５８】
(v)  １回目のC18 RP-HPLCカラム上でのr-hLHの精製段階
r-hLH溶液をカラムに載せ、そして当該クロマトグラフィーをUV分光光度計によって280nmでモニタリングする。
【００５９】
当該カラムは、結合していない画分が捨てられてA280が基準線に戻るまで、12.4%w/wの２−プロパノール／pH7の0.05M酢酸アンモニウムバッファーを供給される。
【００６０】
続いて、r-hLHの溶出は、移動相の２−プロパノール／pH7の0.05M酢酸アンモニウムバッファーを用いて、14.7%〜20.7%w/wの直線勾配が終わるまで実施される。
【００６１】
r-hLHは、A280が増加し始めるまで分画される。高さが最大測定限界の２０％以上である、r-hLHのピークの全画分が回収される。
【００６２】
２回目の予備的逆相HPLC（段階V）
室温で実施されるこの段階は、微量のFBS/CHOタンパク質及びエンドトキシン夾雑物を除去するのに有効である。
【００６３】
(i)  カラムの充填及び樹脂の活性化
カラムをC18ワイドポアシリカで充填し、そしてこれが新しいものであるならば、C18樹脂を２−プロパノールで調整する。
【００６４】
(ii)  カラムの平衡化
カラムを、14.7%w/wの２−プロパノール／pH7の0.5MTris-HClバッファーで平衡化する。好ましいpH範囲は７±０．２である。
【００６５】
(iii)  段階IV由来のr-hLH溶液の体積及びpHの調整
pH7の2M Tris-HClバッファーをr-hLH試料に加え、２−プロパノール濃度をカラムの平衡化バッファー(14.7% w/w)とほぼ同じ程度まで低下させる。
【００６６】
r-hLH溶液を12M HClでpH7に調整する。好ましいpH範囲は７±０．２である。
【００６７】
(iv）  ２回目のC18 RP-HPLCカラム上でのr-hLHの精製段階
r-hLH溶液をカラムに載せ、そして当該クロマトグラフィーをUV分光光度計によって280nmでモニタリングする。
【００６８】
当該カラムは、14.7%w/wの２−プロパノール／pH7の0.5MTris-HClバッファーを供給される。好ましいpH範囲は７±０．２である。結合していない画分は捨てられる。
【００６９】
続いて、r-hLHの溶出は、移動相の14.7%w/wの２−プロパノール／pH7の0.5MTris-HClバッファーを用いて、14.7%w/w〜20.7%w/wの２−プロパノールの直線勾配が終わるまで実施される。
【００７０】
r-hLHは、A280が増加し始めるまで分画される。高さが最大測定限界の２０％以上である、r-hLHのピークの全画分が回収される。
【００７１】
(v)  透析
２回目のC18 RP-HPLC段階由来のr-hLH溶液をWFIで希釈する。好ましくは８倍量のWFIが使用される。
【００７２】
希釈したr-hLH溶液は、10kD膜（段階VIを参照のこと）上でのWFIに対する限外濾過によって透析される。続いて、pH8の0.5Mの炭酸水素アンモニウムのアリコートを加え、そして炭酸水素アンモニウムの特徴が活かされるまで透析を続ける。
【００７３】
保持溶液を約１Ｌの最終体積まで濃縮し、そして回収する。限外濾過膜をpH8の0.5Mの炭酸水素アンモニウムで洗浄し、そして限外濾過の洗浄液を保持液と一緒にまとめ、そして任意に更に濃縮する。この追加の濃縮は、次の段階、すなわち段階VIで使用するカラムのサイズに依存する。
【００７４】
セファクリルS100 HR上でのゲル透過クロマトグラフィー及び限外濾過（段階VI）
この段階において、分子サイズに基づく分離が達成され、そして溶液は限外濾過を受ける。この段階で実行される全ての作業が、約＋５℃で実施される。好ましい温度範囲は＋５℃±３である。
【００７５】
(i)  セファクリルS100 HR上でのゲル透過クロマトグラフィー
カラムをセファクリルS100 HRで充填し、そして最初にWFIで平衡化する。
【００７６】
次に、当該カラムをpH8の0.5Mの炭酸水素アンモニウムで平衡化する。
【００７７】
当該カラムにpH8の0.5Mの炭酸水素アンモニウムを流す。当該クロマトグラフィー段階を、分光光度計によって280nmでモニタリングする。
【００７８】
A280が増加し始めるまでr-hLHを分画する。高さが最大測定限界の２０％以上である、r-hLHのピークの全画分が回収される。
【００７９】
次に、セファクリルS100 HRから溶出したr-hLH溶液は、ウイルス夾雑物を除去するために、好ましくはフィルター、例えばVirosolve（商標）を通過される。
【００８０】
(ii)  r-hLHの透析及び濃縮
精製の実施の間に0.05M水酸化ナトリウム中で保存した膜（限外濾過膜10kD）を、pHが８に低下するまでWFIですすぐ。
【００８１】
希釈したr-hLH溶液は、WFIに対して透析される（10kDの限外濾過膜による）。続いて、pH8の0.01Mのリン酸ナトリウムバッファーのアリコートを加え、そしてリン酸ナトリウムバッファーの特徴が活かされるまで透析を続ける。
【００８２】
必要に応じて保持溶液を約500mlの最終体積まで濃縮し、そして回収する。限外濾過膜をpH8の0.01Mのリン酸ナトリウムバッファーで洗浄し、そして限外濾過の洗浄液を保持液と一緒にまとめる。
【００８３】
追加の任意なLHを濃縮する段階は、保存のために選択される条件に依存して実施され得る。
【００８４】
r-hLH溶液を濾過し、そして濾液を滅菌容器に回収する。
【００８５】
精製したr-hLHのバルクは、好ましくは滅菌瓶において約−１５℃で保存される。
【００８６】
試薬、バッファー、溶出剤及び化学薬品
クロマトグラフィー樹脂
次のクロマトグラフィー樹脂は、当該精製方法において現在利用される。同等の樹脂も精製方法において利用され得る。
段階II：DEAEセファロースCL-6Bカラム                          (Pharmacia)
段階III：Qセファロースファストフロー                         (Pharmacia)
段階IV：C18シリカRP-HPLC                                     (Waters)
段階Ｖ：C18シリカRP-HPLCカラム                               (Waters)
段階VI：セファクリルS100 HR                                  (Pharmacia)
【００８７】
業者は、
Amersham Pharmacia Biotech (Bjorkgatan 30 S-751 84, Uppsala, Sweden)
Waters Corporation (34 Maple Street, Milford, MA01757, USA)、
である。
【００８８】
結果
生物学的活性
本発明の方法を用いる精製後の異なるバッチにおける生物学的活性を表２において報告する。タンパク質濃度（1ml当たりのLHタンパク質のmg）は、アミノ酸配列解析に基づいた実験的に導いた吸光係数、a=0.812を用いて、分光光度計によって276.5nmで決定された。
【００８９】
r-LH調製物の平均比活性は特に高く、約25.000IU/mg（LHのタンパク質のもの）に達する。
【表２】
0004959898.tif 000003
【００９０】
製剤
凍結乾燥製剤は、本発明の高度に精製した組換えLHを用いて開発された。
【００９１】
典型例として、75IUの強度の凍結乾燥生成物が、賦形剤（表３）として４℃での数ヶ月間の安定をもたらすスクロースを用いて、DIN 2Rの容器内で調製された。
【表３】
0004959898.tif 000004