(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＯＧ）の少なくとも０．０１％の最終濃度（重量体積）と；
ポリリン酸ナトリウム（ＨＭＰ）の少なくとも０．０１％の最終濃度（重量体積）と；及び
塩化ルビジウム及び／又は塩化リチウムの少なくとも１ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度（モル／Ｌ）と；
を含むことを特徴とする、細胞の生存能力を維持しながらその細胞への蛍光マーカーの浸透を引き起こすのに有用な細胞透過処理のための組成物。
【請求項２】
塩化リチウムを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
塩化ルビジウムを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
塩化リチウムと塩化ルビジウムとの混合物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
組成物中のＨＭＰの最終濃度が０．１重量％から２重量％の間であることを特徴とする、請求項１から請求項３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項６】
最終組成物中のＨＭＰの濃度が１重量％を超えることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ＮＯＧの最終濃度が０．０３重量％から０．２重量％の間であることを特徴とする、請求項１から請求項６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項８】
塩化ルビジウムの最終濃度が１から２０ｍｍｏｌ／Ｌの間であることを特徴とする、請求項１から請求項７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
塩化リチウムの最終濃度が０．５から２ｍｍｏｌ／Ｌの間であることを特徴とする、請求項１から請求項８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
水溶液中又はＭＯＰＳ、ＭＥＳもしくはＨＥＰＥＳ緩衝液中であることを特徴とする、請求項１から請求項９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝溶液）を含まないことを特徴とする、請求項１から請求項１０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの蛍光性マーカーをさらに含むことを特徴とする、請求項１から請求項１１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
蛍光性マーカーが蛍光性プローブであることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
蛍光性マーカーが蛍光性化合物であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
蛍光性化合物が、ＦＤＡ、６−ＣＦＤＡ、５−ＣＦＤＡ、５／６−ＣＦＤＡ、５−マレイミドＦＤＡ、フルオレセインジラウレート、フルオレセイン二酪酸、５（６）２’，７’−ジクロロ−ＣＦＤＡ、５（６）−スルホ−ＦＤＡ、５（６）２’，７’−ジクロロ−ＦＤＡ、５，６−ＣＦＤＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、フルオレセインジプロピオネート、ジ−β−Ｄ−ガラクトシドフルオレセイン、３−ｏ−メチルフルオレセインホスフェート、２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシ−フルオレセインのペンタアセトキシエステル（ＢＣＥＣＦ／ＡＭ）、２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）−フルオレセインのペンタアセトキシエステル（ＢＣＥＣＦ／ＡＭ）、アジドフルオレセインジアセテート、クロロメチルフルオレセインジアセテート、エオシンジアセテート、カルボキシエオシンジアセテート、４−メチルウンベリフェリルアセテート、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルノナノエート、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、メチル−１−ウンベリフェリルグルコロミド、アラニン−７−アミノ−４−メチルクマリン、グリシン−７−アミノ−４−メチルクマリン、プロリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、バリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、グリシル−Ｌ−プロリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、１，４−ジアセトキシ−２，３−ジシアノベンゼン（ＡＢＤ）、ヒドロエチジン、レゾルフィンアセテートから選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
蛍光性化合物がＣＦＤＡ又はＦＤＡ又はその誘導体であることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
細胞の計数及び／又は同定のための方法における、請求項１から請求項１６の何れか１項に記載の透過処理組成物の使用。
【請求項１８】
生細胞の蛍光検出のための、請求項１から請求項１６の何れか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
グラム陽性又はグラム陰性細菌の計数及び／又は同定のための方法における、請求項１から請求項１６の何れか１項に記載の透過処理組成物の使用。
【請求項２０】
ａ）１以上の生細胞を膜上に沈殿させる段階；
ｂ）膜上に沈殿させた細胞を請求項１から請求項９の何れか１項に記載の透過処理組成物と接触させる段階；
ｃ）同時又は連続的に、微生物の壁を横断できる１以上の蛍光性マーカーに、透過処理された細胞を接触させる段階；
ｄ）微生物の内側に浸透したマーカーを蛍光により検出する段階
を含むことを特徴とする、膜上での生細胞の計数及び／又は同定のための方法。
【請求項２１】
膜を通じた液体又は気体媒質のろ過により、段階ａ）における細胞が膜上に沈殿させられ、そこで細胞が最初に見られることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階ａ）と段階ｂ）との間に、段階ａ）で沈殿させられた細胞が段階ｂ）で細胞の微小コロニーの形態で存在するように、膜上で微生物の培養が行われることを特徴とする、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
段階ｃ）で使用される蛍光性マーカーが蛍光性プローブであることを特徴とする、請求項２１から請求項２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光性プローブが、ハイブリッド形成プローブであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
段階ｃ）で使用される蛍光性マーカーが蛍光性化合物であることを特徴とする、請求項２０から請求項２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
段階ｂ）で使用される前記蛍光性化合物が、ＦＤＡ、６−ＣＦＤＡ、５−ＣＦＤＡ、５−マレイミドＦＤＡ、フルオレセインジラウレート、フルオレセインジブチレート、５（６）２’，７’−ジクロロ−ＣＦＤＡ、５（６）−スルホ−ＦＤＡ、５（６）２’，７’−ジクロロ−ＦＤＡ、５，６−ＣＦＤＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、フルオレセインジプロピオネート、ジ−β−Ｄ−ガラクトシドフルオレセイン、３−Ｏ−メチルフルオレセインホスフェート、２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセインのペンタアセトキシエステル（ＢＣＥＣＦ／ＡＭ）、２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）−フルオレセインのペンタアセトキシエステル（ＢＣＥＣＦ／ＡＭ）、アジドフルオレセインジアセテート、クロロメチルフルオレセインジアセテート、エオシンジアセテート、カルボキシエオシンジアセテート、１−メチルウンベリフェリルグルコロミド、４−メチルウンベリフェリルアセテート、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルノナノエート、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、アラニン−７−アミノ−４−メチルクマリン、グリシン−７−アミノ−４−メチルクマリン、プロリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、バリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、グリシル−Ｌ−プロリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、１，４−ジアセトキシ−２，３−ジシアノベンゼン（ＡＢＤ）、ヒドロエチジン、レゾルフィンアセテートから選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
蛍光性化合物がＣＦＤＡもしくはＦＤＡ又はその誘導体であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
段階ｂ）における検出が、蛍光センサーを用いて行われることを特徴とする、請求項２０から請求項２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞の検出が膜上で直接行われ、細胞が生きていることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞が沈殿させられる膜が主にセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）又はポリエーテルスルホンからなることを特徴とする、請求項２０から請求項２９の何れか１項に記載の方法。
【請求項３１】
細胞が沈殿させられる膜が０．１から１．５ミクロンの間の平均孔径を有することを特徴とする、請求項２０から請求項３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項３２】
細胞が沈殿させられる膜が０．２から０．６ミクロンの間の平均孔径を有することを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
検出される細胞が検出段階ｄ）の終了時に培養されることを特徴とする、請求項２０から請求項３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）少なくとも１つの蛍光性マーカーと、及び
ｂ）請求項１から請求項１１の何れか１項に記載の細胞壁の透過処理のための組成物と、
を含むことを特徴とする、細胞の検出及び／又は計数のためのキット。
【請求項３５】
ａ）ろ過膜と、及び
ｂ）請求項１から請求項１６の何れか１項に記載の細胞壁の透過処理のための組成物と、
を含むことを特徴とする、細胞の検出及び／又は計数のためのキット。
【請求項３６】
ろ過膜が、主にセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）又はポリエーテルスルホンからなる膜であることを特徴とする、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ハイブリッド形成プローブが、オリゴヌクレオチド型又はＰＮＡ型であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＯＧ）と、ポリリン酸ナトリウム（ＨＭＰ）とならびに塩化ルビジウム及び／又は塩化リチウムから選択される塩と、の組み合わせを含み、細胞の生存能力を維持しながら蛍光性マーカーを用いて細胞を標識することを可能にする、細胞透過処理のための新規組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、ろ過膜上で液体又は気体試料に含有される生細胞を検出及び／又は同定するための方法にも関する。
【０００３】
本発明は、とりわけ、例えば食品又は薬品のための生産鎖に侵入する、液体及び気体媒質の微生物品質管理に適用される。
【背景技術】
【０００４】
この分野において、汚染物質は、大量の水又は気体中で希釈された、様々な細胞形態で、特にグラム陽性又はグラム陰性細菌の形態で存在し得る。
【０００５】
しかし、これらの細胞を単純に検出することでは十分ではなく、それらを正確に同定すること及びこれらの媒質中でそれらが生細胞であり、その使用前に空気又は水に対して行われ得る処理の結果として死滅した細胞ではないことを確実にすることも必要である。例えば、塩素又はオゾンでの水の処理によって、媒質中に死んだ細胞が残され得、それは視覚的に検出され得る（結果として汚染源とはならない。）。
【０００６】
ろ過膜上の液体又は気体媒質中で制限時間内に生細胞の存在を検出するために多くの検出方法が先行技術において記載されている。これらの方法は一般に、
ろ過膜を通じて前記液体又は気体媒質をろ過する段階と；
栄養培地と接触させて、数時間、前記膜を温置する（その間に、裸眼では見えない微小コロニーを形成させるように、ろ過により膜上に維持される細胞が分裂する。）段階と；及び
様々な発光又は蛍光技術により、微小コロニーを形成する細胞クローンを検出する段階と、
を含む。
【０００７】
このような方法は、例えば、明細書ＷＯ０１／５９１５７に記載されている。この方法は、「Ｍｉｌｌｆｌｅｘ  Ｒａｐｉｄ」（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の名称により知られる、生細胞の検出のためのユニバーサルキットの開発の主題である。この方法において、細胞を検出する段階は、そのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）含量を放出させるために、ろ過され、ろ過膜上で温置される細胞を溶解することからなる。放出されたＡＴＰは、生細胞（ＡＴＰ−バイオ発光）を同定し、定量するためのマーカーとして使用され、これは、化学発光反応を生じさせることができる酵素（ルシフェラーゼ）に対する基質となる。この化学発光反応は、光シグナルを生じ、これは、ビデオインターフェース（ＣＣＤカメラ）を通じて捕捉され、次いで、合成画像の形態で保存される。この合成画像により、寒天培地中でペトリ皿で行われる従来の計数と同様に、インシトゥで微生物が発生した膜の部位を視覚化することが可能になる。
【０００８】
ＡＴＰは全ての生きている生物において豊富に存在する分子であるため、この技術は、生細胞を普遍的に検出するという長所がある。そのため、この技術によって、試験される試料に存在する多くの汚染物の信頼できる指標を得ることが可能となる。
【０００９】
一方、ＡＴＰの抽出には、細胞溶解、従って細胞を死滅させることが必要であり、このため、その性質を調べるために、即ちその種を調べるために、続いて微生物を培養することができない。
【００１０】
従って、混入に関して得られる情報は、定量的であり、定性的なものではない。
【００１１】
膜上の細胞を検出するための別の方法は、特許出願ＦＲ２２８９９８４に記載されている。この方法において、ろ過膜に維持された細胞を検出する段階は、特異的なハイブリッド形成プローブを用いて行われる。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びエタノールを組み合わせる透過処理組成物を用いることによって、細胞壁が検出プローブにとって浸透可能になり、次に、これらのプローブが細胞の内側に入ったら、そのプローブは、細胞内側に存在するゲノムＲＮＡ又はＤＮＡ配列と特異的にハイブリッド形成させられる。これらのプローブは、一般にポリヌクレオチドであり、混入物の１以上の種を標的とするように核酸と特異的にハイブリッド形成することができるように選択される。蛍光又は発光剤で標識されているプローブは、洗浄段階後、細胞を膜上で見出すことを可能にするカメラを用いて、検出される。
【００１２】
より特異的ではあるが、この検出方法によって、生細胞と死んだ細胞とを明確に区別することはできない。実際に、プローブのハイブリッド形成は、生細胞と死んだ細胞の両方で起こり得、従って、偽陽性となる。さらに、透過処理組成物は一般に、細胞壁の完全性を維持することができるにしても、その様々な段階での方法によって、特に、セルロース膜上での細胞の固定段階ゆえに、細胞を生きた状態に維持することができない。
【００１３】
明細書ＷＯ２００４／０５０９０２は、膜上での検出の別の系を記載するが、この系によって微生物混入血液試料の存在を検出することが可能となる。この方法は、微生物の溶解を引き起こすことを回避するように設計されている。この系の具体的な性質は、微生物の検出が、ろ過前の微生物への標識剤の浸透により行われ、一方、微生物が液体培地中に依然として存在するという事実にある。この点で、膜上でろ過され、細胞が検出される前に、試験されるべき液体試料は、標識剤及び透過処理試薬を含む透過処理溶液中で希釈される。
【００１４】
使用される標識剤は、小さい分子、特に、シアニン誘導体、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ又は臭化エチジウムなどのＤＮＡ挿入化合物である。これらの化合物は、比較的容易に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジギトニン、ノネンシン、ポリミクシン又は塩化ベンザルコニウムなどの当業者にとって公知の透過処理試薬の作用を介して、微生物の壁を横切って浸透する。これらの挿入剤は、即ち試料に含有される生細胞によって独占的に、ＤＮＡの転写又は複製中に核酸の内側に結合させられる。
【００１５】
この方法によって、細胞の生存能を維持しながら生細胞を普遍的に標識することができるようになる。しかし、膜上でのろ過前に細胞が液体媒質中で標識されるということから、得られる最終的な計数結果に関して不明瞭な点が出てくる。実際に、細胞の標識中に液相中で細胞が分裂する場合、膜上で検出される細胞数は、最初に存在する細胞数の２倍となり得る。さらに、透過処理及び標識組成物による液体試料の希釈により、最終的な結果に非常に大きな誤差が持ち込まれ、その誤差範囲は、検出を首尾よく行うために必要とされる液体操作に関連する偶発的な混入の可能性により大きくなる。
【００１６】
さらに、この状況において、標識細胞をろ過し、膜上で個々に、即ち細胞ごとに検出する。その結果は、細胞それぞれに対し、低い検出シグナルである。この問題は、とりわけ、蛍光マーカーが使用される場合に起こる。実際に、使用される膜（通常はＰＶＤＦ又はセルロース製）は、それ自身、細胞由来の弱い蛍光シグナルを隠蔽する、ある程度の蛍光を生じる。
【００１７】
いわゆる「蛍光性」マーカーが、過去数年にわたり開発されてきた。これらのマーカーは、酵素によってそれらが前もって活性化された場合に蛍光領域でのみ放射するという特徴を有する。これらの複合体分子は、通常、光エネルギーを吸収し、特徴的な蛍光放射スペクトルの形態でこのエネルギーを復元することができるフルオロフォア基及び、それ自身を顕在化することから前記フルオロフォアの蛍光を隠蔽又は妨害することができる別の基を含む。酵素は、第一のものの蛍光を検出することができるように、この第二の基を修飾する効果を有する。
【００１８】
これらの蛍光マーカーは、例えばＷＯ９８／５５８６１に記載のようなサイトメトリーによる生細胞のカウントに特に有用であることが分かっている。しかし、この明細書が強調するように、蛍光性物質で標識された細胞の場合、蛍光シグナルは、膜上で個別に検出するには弱すぎることが多く、これは、ＤＮＡ挿入剤（蛍光性である。）を用いて上記で直面する問題と同様である。
【００１９】
ＷＯ９６／１４４３１は、微生物を検出するための、とりわけ、コリフォーム細菌の検出のための技術を記載しており、蛍光性マーカー：β−グルクロニダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼを活性化する可能性がある酵素をこれらのグラム陰性細菌が産生する能力に基づく。使用される、対応する蛍光性基質は、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、４−トリメチルフルオロメチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＴＦＭＵ−ｇａｌ）及び４−トリメチルフルオロメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコロニド（ＴＦＭＵＧ）である。この技術は、上述の方法と同じ原理に基づき、この場合、コリフォーム細菌が存在する液体又は気体試料を最初にろ過し、次に、細菌をろ過膜上で温置し、上記の蛍光性基質を用いて、形成される微小コロニーを検出する。
【００２０】
しかし、この技術にはある種の欠点がある。
【００２１】
これらの欠点の第一は、この検出法がβ−グルクロニダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼを合成するある種のグラム陰性細菌（コリフォーム）にのみ適用可能であることである。
【００２２】
第二の欠点は、細胞により産生されるβ−グルクロニダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの定量が、通常、検出可能シグナルを得るには低すぎることである。従って、満足のいく感度を得るために、イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）などの、β−グルクロニダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの発現の合成誘導剤で細胞を処理する必要がある。
【００２３】
検出シグナルの強度が直接依存する別の欠点は、蛍光性マーカーの細胞への浸透に関する。この浸透が困難であるのは、マーカーの大きさ及びその蛍光性マーカーが流出機構により細胞から放出される傾向を有するという事実による。
【００２４】
細胞へのマーカーの浸透を促進するために、先行技術は、リゾチームと組み合わせて抗生物質ポリミキシンＢ及びコリスチンなどの細胞透過処理試薬を使用し、４０℃で細胞を温置することを教示する。しかし、この透過処理は、コリフォーム細菌に対しては十分であることを証明し得る一方、探索される病原体である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）などのグラム陽性細菌に対しては満足するには程遠い。さらに、透過処理試薬としてのポリミキシンＢ及びコリスチンなどの抗生剤の使用によって、細菌の生存能を維持することができない（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｊ．Ｐ．ら（２００６）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｃｈｅｍ．５７：５７３−５７６）。
【００２５】
従って、上述の方法は、コリフォーム細菌の検出に限定されているだけでなく、細胞を生きたままにしておくこともできない。
【００２６】
結果として、先行技術の方法によって、様々な種由来（生細胞の普遍的検出）の媒質中の細胞数を評価するのに有用な定量的情報及び存在する前記種の特徴を調べることを可能にする定性的情報の二重の要件を十分に満たすことはできない。
【００２７】
従って、依然として、広いスペクトルを有する、即ち、より脆弱なものに対して攻撃的過ぎることなく、様々なタイプの多くの細胞種を透過処理できるようにする、透過処理組成物を得ることができることが必要である。
【００２８】
例えば、ペプチドグリカン（ペプチド及び多糖鎖からなるポリマー）からなる厚い外層がある一重膜を有するグラム陽性微生物は、その壁がより脆弱な二重膜（ここでは、ペプチドグリカンがより少なく、より分散している。）からなるグラム陰性細菌と同じ構成を呈さず、結果として、同時にこれらの２種類の微生物の透過処理を行うことは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】国際公開第０１／５９１５７号パンフレット
【特許文献２】仏国特許出願第２２８９９８４号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０５０９０２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９８／５５８６１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９６／１４４３１号パンフレット
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｊ．Ｐ．他、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｃｈｅｍ．５７、２００６年、ｐ．５７３−５７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明の目的は、特に、総じて生細胞の蛍光標識化に関するグラム陽性及びグラム陰性細菌の透過処理に関して、上述の既存の検出系の問題に取り組むことである。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
驚くべきことに、発明者らは、ＮＯＧ、ＨＭＰ及び塩化ルビジウム及び／又は塩化リチウムの組み合わせによって、膜上で、グラム陽性及び陰性細菌の満足できる透過性を得ることができるようになることに気付いた。
【００３３】
この透過処理には、検出細胞の生存能を維持でき、従って、特にその特徴を調べる目的のために、検出細胞を続いて培養することができるという有利な点がある。
【００３４】
本発明は、有効量で、ＮＯＧ（既知の透過処理試薬である。）とＨＭＰ（強力な界面活性剤であり、これは、細胞壁における保護作用よりむしろ破壊的作用を有すると予想される。）を組み合わせることの重要性を強調する。
【００３５】
本発明はまた、塩化ルビジウム及び塩化リチウムの使用によって、ＮＯＧ及びＨＭＰの組み合わせを含む透過処理組成物の効率を十分に向上させることができるということも強調する。
【００３６】
本発明の主題である透過処理組成物によって、とりわけ、蛍光性化合物又はプローブによる膜上での細胞の標識のための方法の使用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明による蛍光標識細胞の検出の原理。
【図２】表１でまとめた組成物１から７を用いて得られた検出結果の図面での説明。ｙ軸は、使用した各組成物に対して得られた平均蛍光強度を指す。ｘ軸は、前記組成物（それぞれをＥ．コリ及びＳ．アウレウスに対して試験）を並置する。ＬｉＲｂ、ＮＯＧ、ＨＭＰ、ＬｉＲｂ／ＮＯＧ、Ｃｈｌ／ＨＭＰ、ＮＯＧ／ＨＭＰという表現及び組成物１から７に対応する処方はそれぞれ表１でまとめる。
【図３】組成物１１及び１２での細胞（Ｅ．コリ、ＡＴＣＣ８７３９）の透過処理後に５／６−ＣＦＤＡで標識することによって蛍光を生じた微小コロニーの写真。  Ａ：塩化ルビジウムを含まない組成物１１で透過処理した細胞のコロニー。  Ｂ：塩化ルビジウムを含む本発明による組成物１２で透過処理した細胞のコロニー。  これらの写真において、組成物１２によって、組成物１１よりも細胞をより明確に検出できるようになることが明らかである。
【図４】組成物１１及び１２で処理されたコロニー周囲の蛍光強度の位相的分布。  Ａ：塩化ルビジウムを含有しない本発明による組成物１１で透過処理した細胞のコロニー。  Ｂ：塩化ルビジウムを含む組成物１２で透過処理した細胞のコロニー。  この分析から、塩化ルビジウムを含む本発明による組成物１２を使用した場合に、蛍光がより強くなり、局在化が促進されることが明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の第一の態様は、その細胞へのマクロ分子の浸透を引き起こすのに有用な細胞透過処理のための組成物からなる。
【００３９】
マクロ分子は、一般に分子量が１０００ダルトンを超え、殆どの場合、５０００ダルトンを超える、タンパク質、核酸、多糖類など、いくつかの同様又は異なる化学基の共有結合による集合の結果得られる複合分子である。
【００４０】
本明細書において、細胞は、膜により境界が定められる細胞質を含み、核酸の形態で遺伝物質を含有する、小サイズの生物学的存在として定義される。
【００４１】
「微生物」という用語は、本発明の目的に対して、藻類、単細胞性菌類、原生動物、真菌、細菌又は配偶子などの、顕微鏡的サイズである、即ち０．５から５ミクロンの間のサイズである、代謝能及び再生能を有する細胞に関する。
【００４２】
探索される微生物は、とりわけ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ミコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）又はエアロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の病原性のグラム陽性又は陰性細菌；ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、シクロスポラ属（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ）の原生動物；マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）及びウレアプラスマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）のマイコプラズマ；サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）又はペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌である。
【００４３】
本発明の目的は、とりわけ、細胞の生存能を維持しながら、いわゆる蛍光性マーカーの細胞への浸透を引き起こすことである。
【００４４】
本発明の目的に対して、細胞の生存能は、細胞を栄養培地に移した後の細胞の分裂能によって調べる。
【００４５】
本発明の目的に対して、蛍光性マーカーは、光エネルギーを吸収し、特徴的な蛍光発光スペクトルの形態でこのエネルギーを保持することができるフルオロフォア基を含む巨大分子である。フルオロフォア基は、特異的酵素の作用による巨大分子の立体構造の変化によって、予想される波長での蛍光発光が調節されるように、巨大分子中に位置する。一般に、この活性化を起こすことができる酵素は、巨大分子中の特定の結合に向けられたエステラーゼ活性を有する。従って、これは、特定の酵素の存在下でのみ検出することができる蛍光マーカーである。この酵素は細胞中に存在し、標識されるためには細胞が生きていることが必要であることを意味する。
【００４６】
２種類の蛍光性マーカー：蛍光性化合物及び蛍光性プローブを本発明により区別することができる。
【００４７】
蛍光性化合物は、上記で定義されるような蛍光性マーカーである。これらによって、これらが浸透するあらゆる生細胞を検出することが可能になる（ただし、それらの活性化を可能にする酵素がそこに存在する場合。）。これらの蛍光性化合物は、好ましくは、ＦＤＡ（フルオロセインジアセテート）、６−ＣＦＤＡ（６−カルボキシフルオレセインジアセテート）、５−ＣＦＤＡ、５／６−ＣＦＤＡ、５−マレイミドＦＤＡ、フルオレセインジラウレート、フルオレセインジブチレート、５（６）２’，７’−ジクロロ−ＣＦＤＡ、５（６）−スルホ−ＦＤＡ、５（６）２’，７’−ジクロロ−ＦＤＡ、５，６−ＣＦＤＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、フルオレセインジプロピオネート、ジ−β−Ｄ−ガラクトシドフルオレセイン、３−ｏ−メチルフルオレセインホスフェート、２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシ−フルオレセインのペンタアセトキシエステル（ＢＣＥＣＦ／ＡＭ）、アジドフルオレセインジアセテート、クロロメチルフルオレセインジアセテート、エオシンジアセテート、カルボキシエオシンジアセテート、４−メチルウンベリフェリルアセテート、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルノナノエート、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、メチル−１−ウンベリフェリルグルコロミド、アラニン−７−アミノ−４−メチルクマリン、グリシン−７−アミノ−４−メチルクマリン、プロリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、バリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、グリシル−Ｌ−プロリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、１，４−ジアセトキシ−２，３−ジシアノベンゼン（ＡＢＤ）、ヒドロエチジン、レゾルフィンアセテートから選択される。
【００４８】
これらの化合物は当業者にとって周知である（Ｍａｎａｆｉ、Ｍ．、「Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｉｎｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｓ」（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３１：４５−５８）。
【００４９】
蛍光性プローブは、蛍光性化合物（好ましくは上記で列挙されるもののうち１つ）と、細胞中に含有される核酸のハイブリッド形成によって特異的な検出を可能にするプローブとを組み合わせた化合物である。最も一般的な特異的プローブは、微生物のＤＮＡ又はＲＮＡ中に含有されるものと相補的な配列を形成する通常１０から４０ヌクレオチドの間の長さを有するオリゴヌクレオチド断片を含む。このタイプのプローブに対する好ましい標的ＲＮＡは細胞の１６Ｓ  ＲＮＡであり、これは、通常、一般に探索される病原微生物に特異的な配列を含む。
【００５０】
ＰＮＡ（ペプチド核酸）タイプのプローブもまた、このタイプの検出において有利なプローブを構成し得るが、これは、これらが、細胞中に存在する分解酵素に対して感受性が低いペプチド骨格を有するからである（Ａｒｇｈｙａら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）：ｉｔｓ  ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ」Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ．１４、２０００年、ｐ．１０４１−１０６０）。
【００５１】
一般に、蛍光性プローブは、プローブがその標的と特異的にハイブリッド形成するということ又は、あるいは、プローブが細胞ゲノムにその複製中に組み入れられているということに蛍光発光が依存するように設計される。これらのプローブは、消光剤（いわゆる、ハイブリッド形成又は細胞のゲノムへのプローブの組み入れがない場合に第一のフルオロフォアの蛍光を吸収する第二のフルオロフォア基）を含むことが多い。このようなプローブ（ＢｅａｃｏｎＴＭプローブなど）は当業者にとって公知である（Ｓａｌｖａｔｏｒｅ  Ａ．Ｅ．ら「Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ」（２００５）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）。
【００５２】
特に膜上での微生物に関して、細胞を検出するための蛍光性マーカーの使用には、上記で想起されるいくつかの欠点（特に、細胞壁に永久的に損傷を与えることなく、十分な数で、これらの分子（通常、サイズが大きい。）の浸透を引き起こすことが困難であること）がある。
【００５３】
本発明は、次のもの：
Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＯＧ）の少なくとも０．０１％の最終濃度（重量体積）と；
ポリリン酸ナトリウム（ＨＭＰ）の少なくとも０．０１％の最終濃度（重量体積）と；及び
塩化ルビジウム及び／又は塩化リチウムの少なくとも１ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度（モル／Ｌ）
を含む組成物を提供することによって、この問題を克服することに成功している。
【００５４】
本願の実験部分で与えられる様々な実験から、ＮＯＧ、ＨＭＰ及び塩化リチウム又は塩化ルビジウムを組み合わせると、その結果、蛍光性マーカーによって、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の両方の微生物の広いスペクトルを検出することを可能にする透過処理組成物が得られることが明らかである。
【００５５】
この組成物は、検出段階後に細胞を培養することができるように、細胞を死滅させることなく蛍光性マーカーを浸透させるという驚くべき効果を有する。
【００５６】
Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｃ１４Ｈ２８Ｏ６）（ＣＡＳ：２９８３６−２６−８）は、先行技術においてグラム陰性細菌で透過処理効果を有することが知られる膜タンパク質可溶化剤である。しかし、下記の結果が示すように、グラム陽性細菌を透過処理するのには適切ではないと考えられる。
【００５７】
好ましくは、ＮＯＧの最終濃度は、約０．０３から０．２％の間であり、より好ましくは、約０．０５から０．２％（組成物の総重量）の間である。
【００５８】
ポリリン酸ナトリウム（ＨＭＰ）は、一般組成（ＮａＰＯ３）６（ＣＡＳ５０８１３−１６−６）のポリメタリン酸ナトリウム（ＣＡＳ５０８１３−１６−６）に基づく塩の混合物である。これらの塩は、モノ−オルトホスフェートを融解させ、次いで急冷することにより調製される。この結果得られるものは、トリメタリン酸ナトリウム及びオルトリン酸ナトリウムの形態で加水分解される、水によく溶ける結晶性構造（Ｃａｌｇｏｎ  Ｓ）である。ＨＭＰは、分散剤及び界面活性剤として使用される。時として、この能力において、これは、細胞透過処理のための組成物に入り得る。しかし、これを含有する組成物は、細胞に対して攻撃的であり、これにより細胞の生存能を維持することはできない。下記の結果が示すように、ＨＭＰ単独の使用は、グラム陰性細菌の透過処理に関して十分ではない。
【００５９】
ＨＭＰの最終濃度は、通常、０．１重量％から２重量％の間であり、より一般的には約０．５重量％から１．５重量％の間であり、好ましくは１％を超える。
【００６０】
塩化リチウム（ＬｉＣｌ）及び塩化ルビジウム（ＲｂＣｌ）は、一般に塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（非常に安価であり、この使用はより広く普及している。）と同じ特性を有するので、微生物学においてあまり使用されない塩である。
【００６１】
しかし、驚くべきことに、塩化リチウム及び塩化ルビジウムによって、本発明に関連して、及び非常に様々な割合で、特に膜上で微小コロニーを標識する場合、蛍光性化合物の検出を促進することができる。これらの塩の使用によって、特に蛍光検出器により妨害されるシグナルをより明確にすることができる。この効果は図３で与えられる合成画像で認知可能であるが、これは、細胞壁がより脆弱になるという事実に関連して、微小コロニー周辺の蛍光性マーカーの拡散度がより低いことによるものであり得る。図４で示されるように、微小コロニーのレベルでの蛍光分布プロファイルの比較により、標識された細胞のレベルで蛍光強度がより高くなり、局在化が促進されることが明らかである。
【００６２】
好ましくは、塩化ルビジウムの最終濃度は、約１から２０ｍｍｏｌ／Ｌの間である。適切であれば、塩化ルビジウムの最終濃度は、約１０から１５ｍｍｏｌ／Ｌの間である。
【００６３】
好ましくは、塩化リチウムの最終濃度は、約０．５から２ｍｏｌ／Ｌの間であり、より好ましくは、約１から２ｍｏｌ／Ｌの間である。
【００６４】
記載の実験において最適であることが証明された２種類の塩の混合物として、本発明の好ましい態様による透過処理組成物は、混合物の形態で、塩化リチウム及び塩化ルビジウムを含む。この混合物中の塩化リチウムと塩化ルビジウムとの間の比は、好ましくは、１０から１０００の間、好ましくは、５０から２００の間である。
【００６５】
これらの化合物：ＮＯＧ、ＨＭＰ及び塩化リチウム及び塩化ルビジウムから選択される塩の組み合わせが、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の両方の壁を透過処理するのに特に適切である理由は正確には分からない。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態によると、上記で定義されるような透過処理組成物は、水溶液中又はＭＯＰＳ、ＭＥＳもしくはＨＥＰＥＳ緩衝液中である。実際に、組成物がＰＢＳ型（リン酸緩衝食塩水）の緩衝液を含有しないことは有利である。ＰＢＳ型の緩衝溶液は、本発明による好ましい蛍光性マーカーである、ＣＦＤＡ又はＦＤＡなどの多くの蛍光性化合物の多くと適合しなかったことが分かった。
【００６７】
本発明による組成物は、上記で定義されるような少なくとも１つの蛍光性マーカーを含み得る。しかし、蛍光性マーカーはまた個別に保存され得、例えばいわゆる標識溶液に組み込まれ、透過処理細胞の検出時に直接適用され得る。
【００６８】
本発明は、特に、細胞の計数及び／又は同定のための方法において、上記で定義されるような透過処理組成物の使用に関する。
【００６９】
前記組成物は、特にグラム陽性及びグラム陰性微生物両方において、特に様々なタイプの細胞を同時に探索しようとする場合、（蛍光による？）蛍光の生細胞の検出に対して特に有利である。
【００７０】
従って、本発明の主題は、とりわけ、次の段階：
ａ）１以上の生細胞を膜上に沈殿させる段階；
ｂ）膜上に沈殿させた細胞を請求項１から請求項９の何れか１項に記載の透過処理組成物に接触させる段階；
ｃ）同時又は連続的に、微生物の壁を横断できる1以上の蛍光性マーカーに、透過処理された細胞を接触させる段階；
ｄ）細菌の内側に浸透したマーカーを蛍光により検出する段階
を含むことを特徴とする、膜上での生細胞の計数及び／又は同定のための方法である。
【００７１】
一般に、段階ａ）での細胞は、膜を通じた液体又は気体媒質のろ過により膜上に沈殿しており、この膜において細胞が最初に見られる。
【００７２】
液体又は気体媒質という表現は、本明細書において、平均孔径が通常０．１から１．５のミクロン、好ましくは０．１５から０．８ミクロン、より好ましくは０．２から０．６ミクロンの膜の両側で圧力差をかけることによりろ過され得る何らかの流体を意味するものと理解されたい。このような流動体は、滅菌製品の製造に入る純粋な溶液だけでなく、飲料水、飲料、医学的体液（血清、尿、羊水など）などの複合溶液からなり得る。
【００７３】
本方法は、従って、動物又は患者から得られた液体試料の分析のための診断分野において適用があり得る。
【００７４】
「膜」という表現は、本願において、２つの面があり、その平均孔径が既知である合成支持体を指す。
【００７５】
本発明に関連して使用される膜は、通常、高い表面／体積比及び好ましくは１０から２００ミクロンの間の一定の厚さを有する。
【００７６】
このような膜は、単層又は多層の形態であり得る。これは、通常、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ（ビニリデン）フルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、アセチルセルロース及びニトロセルロースから選択される１以上の材料からなる。
【００７７】
この材料は、好ましくは、使用される溶媒（特に本方法の様々な段階で使用され得るアルコール及びアルデヒド）と適合するように選択される。
【００７８】
微生物が検出される膜は、好ましくは、主に、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）又はＮｙｌｏｎ（Ｒ）からなる。より好ましくは、これは、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘという商標及び参照番号ＭＸＨＶＷＰ１２４又はＲＭＨＶＭＦＸ２４のもとＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｒ）から市販されているタイプのＰＶＤＦ膜フィルターである。ろ過は、行われる場合、例えば、「Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）」の名称により知られるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｒ）ろ過モジュールにより行い得る。
【００７９】
微生物をろ過し、膜上に保持したら、段階ａ）と段階ｂ）との間に、その方法において、適切な培地と接触させて微生物を培養する任意段階が含まれ得る。この培地は、好ましくは寒天培地であり、この上にろ過後に膜を置く。任意であるこの段階によって、最初にろ過した各微生物のコロニーを得ることが可能となり、検出される細胞の数が増加する。
【００８０】
本発明によると、次に、上述のような本発明による透過処理組成物に微生物を段階ｂ）において接触させる。この段階は、好ましくは、膜の表面に薄膜を形成する少量の溶液中で行われる。あるいは、本透過処理組成物は、例えば、含浸パッド又は寒天など、膜が置かれる固体支持体中に含有され得、これによって、膜の表面での液体の移動、及び、従って微生物の混合の可能性が限定される。これは、約５から６０分間、２０℃から４５℃の間の温度で行われる。
【００８１】
段階ｃ）において、場合によって、蛍光性マーカーが透過処理組成物に組み込まれる。あるいは、透過処理細胞を続いて前記マーカーに接触させる（即ち、前記マーカーを含む標識溶液と細胞を接触させることによる。）。次に、透過処理組成物を希釈する又は標識溶液で置き換える。
【００８２】
蛍光性マーカーが特異的プローブからなる場合、標的化方式で、プローブの選択に依存して、いくつかのタイプの細胞又は微生物を検出することが可能である。
【００８３】
標準的条件下で行われる蛍光センサーを用いて、蛍光の測定によって、検出の段階ｄ）を行う。蛍光は通常、画像処理ソフトウェアを用いて、暗チャンバー中でＣＣＤカメラにより捕捉され、これによって、画像処理ソフトウェアを用いて、蛍光性化合物により発光される光エネルギーを測定することが可能になる。
【００８４】
本発明による方法は、膜上で直接細胞（細胞は生きている。）検出を行うことができるようになるという点で有利である。従って、この方法によって、検出段階ｄ）の終了時に、適切な培地中で、特に、試験した微生物の特徴をより詳細に調べるために、検出細胞を培養することが可能となる。このようにして、存在する細胞種を検証することができる。
【００８５】
本発明の別の態様は、細胞の検出及び／又は計数のために上述の方法を行うことを可能にするキットからなる。このようなキットは、通常、上記で定義されるような細胞壁の透過処理のための組成物及び、場合によって、蛍光性マーカー又はろ過膜などのさらなる成分を含む。
【００８６】
好ましくは、ろ過膜は、主にセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）又はポリエーテルスルホンからなる膜である。
【００８７】
続く実施例は、本発明を説明するものであり、本発明はこれら実施例に何ら限定されない。
【実施例】
【００８８】
１．１様々な透過処理組成物を用いて行われる蛍光検出
Ｅ．コリ（グラム陰性細菌）ＡＴＣＣ８７３９及びＳ．アウレウス（グラム陽性細菌）ＡＴＣＣ６５３８又はＢ．サブチリス（グラム陽性細菌）ＡＴＣＣ６６３３の試験株を、コレクションから得た凍結乾燥株から調製され、−８０℃で凍結されたクライオチューブ（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、参照番号０２８０４９）中で保存した。
【００８９】
クライオチューブの製造については、チューブの調製日に、ＴＳブロス（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、参照番号４１１４６）の１００ｍＬボトルに接種し、３５−３７℃で温置する。増殖については、分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、参照番号６１３１０００．０１２）を用いて、一定間隔で６００ｎｍでのＯＤ測定を行う。ＯＤが０．５に到達したら増殖を停止させる。各クライオチューブに、凍結保護剤（Ｓｉｇｍａ、グリセロール入りの細胞凍結、参照番号Ｃ６０３９）６００μＬ及び培養液６００μＬを入れる。このチューブを混合し、次いで−８０℃に置く。
【００９０】
１０−５及び１０−６希釈液を平板接種することにより、ブロス及び非凍結クライオチューブの計数を行う。ペプトン水の９ｍＬボトル（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、参照番号４２１１１）中でこれらの希釈液を調製する。ＴＳＡ寒天（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、参照番号４３０１１）上で、スクレーパーを用いて、各希釈液の１００μＬを平板接種し、３５℃で２４時間温置する。この操作を３回繰り返す。翌日、クライオチューブを凍結融解し、同様にして計数する。ＡＰＩギャラリー（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）によって、調製したクライオチューブの同定及び純度の確認を行うことができる。
【００９１】
全ての試験について、ペプトン水のチューブ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、参照番号４２１１１）中に細菌株を希釈する。所望の希釈が得られるまで、ペプトン水のチューブの９ｍＬに対して、使用した株のクライオチューブの１ｍＬを添加することにより、連続希釈を行う。試料あたり平均３０個の細菌を得るために、濃度を調整した。寒天培地上での従来のカウント試験によって、ペトリ皿上でこの濃度を確認した。
【００９２】
０．４５μｍの気孔率を有するセルロースエステル又はＰＶＤＦ膜付きのＭｉｌｌｉｆｌｅｘ漏斗（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照番号ＭＸＨＶＷＰ１２４）においてＭｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｐｌｕｓ  Ｖａｃｕｕｍポンプ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照番号ＭＸＰ  ＰＬＵＳ０１）を用いてろ過を行う。生理食塩水０．９％ＮａＣｌ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、参照番号００６６５７０Ｅ）の５０−１００ｍＬに細菌を添加する。
【００９３】
微生物が微小コロニーを形成するのに必要な時間、３２．５℃±２．５℃の恒温器中で、固体培地、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｔｒｙｐｃａｓｅ−ｓｏｙ  ａｇａｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照番号ＭＸＳＭ  ＣＴＳ４８）又はＲ２Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照番号ＭＸＳＭ  ＣＲＡ  ４８）のカセット上で膜を温置する。
【００９４】
温置後、寒天培地から膜を離し、室温又は３５℃で３０分間、密封された支持体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ液体培地用のカセットの吸収パッド、参照番号ＭＸＬＭ  ＣＯ１２０）上で透過処理溶液２ｍＬと接触させる。
【００９５】
次の透過処理溶液を試験した：
組成物１
ＮａＡｃ  ５０ｍＭ
ＬｉＣｌ  １．１３Ｍ
ＲｂＣｌ  １０ｍＭ
水
組成物２
ＮａＡｃ  ５０ｍＭ
ＮＯＧ  ０．１０％
水
組成物３
ＮａＡｃ  ５０ｍＭ
ＨＭＰ  １％
水
組成物４
ＮａＡｃ  ５０ｍＭ
ＬｉＣｌ  １．１３Ｍ
ＲｂＣｌ  １０ｍＭ
ＮＯＧ  ０．１０％
水
組成物５
ＮａＡｃ  ５０ｍＭ
ＬｉＣｌ  １．１３Ｍ
ＲｂＣｌ  １０ｍＭ
ＨＭＰ  １％
水
組成物６
ＮａＡｃ  ５０ｍＭ
ＮＯＧ  ０．１０％
ＨＭＰ  １％
水
組成物７
ＮａＡｃ  ５０ｍＭ
ＬｉＣｌ  １．１３Ｍ
ＲｂＣｌ  １０ｍＭ
ＮＯＧ  ０．１０％
ＨＭＰ  １％
水
組成物８
ＬｉＣｌ  １．１３Ｍ
ＲｂＣｌ  １０ｍＭ
ＮＯＧ  ０．１０％
ＨＭＰ  １％
ＨＥＰＥＳ緩衝液  ２０ｍＭ
組成物９
ＬｉＣｌ  １．１３Ｍ
ＲｂＣｌ  １０ｍＭ
ＮＯＧ  ０．１０％
ＨＭＰ  １％
ＭＯＰＳ緩衝液  ０．１Ｍ
組成物１０
ＬｉＣｌ  １．１３Ｍ
ＲｂＣｌ  １０ｍＭ
ＮＯＧ  ０．１０％
ＨＭＰ  １％
水
組成物１１
ＮａＡｃ  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  １．１３Ｍ
ＮＯＧ  ０．１０％
ＨＭＰ  １％
水
組成物１２
ＮａＡｃ  ５０ｍＭ
ＲｂＣｌ  １０ｍＭ
ＮＯＧ  ０．１０％
ＨＭＰ  １％
水
【００９６】
１００μｇ／ｍＬの最終濃度にするために、ＤＭＳＯで希釈したユニバーサル蛍光性マーカー（即ち５／６−カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ）（Ｓｉｇｍａ  ２１８７９−１００ＭＧ）を透過処理組成物に添加する。３５℃で３０分間、マーカー基質と膜を接触させておく。次に、標識溶液から膜を取り出し、５２０から５３０ｎｍの間で発光される蛍光を測定するために、カメラを備えたイルミネーターに置く。
【００９７】
下記表１から３でまとめられた蛍光強度の結果は、Ｓｈｅｒｌｏｃｋ画像分析ソフトウェア（Ｉｎｓｏｓｙｓ  Ｉｎｃ．）を用いてＣＣＤカメラにより捕捉され、最も近いピクセルに記録された光エネルギー（発光）に対応する。示される値は、０から２５５の間のスケールでの絶対的な測光値（測定発光とバックグラウンドノイズとの間の発光比）である。
【００９８】
このソフトウェアは、値０が細胞非存在下での膜のみの蛍光に対応するように、パラメータ化される。測定の誤差の範囲は、±１．５と推定される。言及される様々な透過処理組成物は、上記で詳述する組成物１から７に相当する。
【００９９】
【表１】
0004986178.tif 000002
【０１００】
【表２】
0004986178.tif 000003
【０１０１】
【表３】
0004986178.tif 000004
【０１０２】
【表４】
0004986178.tif 000005
【０１０３】
１．２結果の解釈
組成物１から７で得られた比較の結果（図２及び図３）から、同じ透過処理組成物（本発明による組成物７）におけるＨＭＰ、ＮＯＧ及び塩化ルビジウム及び／又はリチウムの組み合わせによって、Ｅ．コリ（グラム陰性）及びＳ．アウレウス（グラム陽性）の両方を十分に検出することができるようになることが示される。
【０１０４】
組成物８、９及び１０で得られる結果から、リン酸塩、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ又はＨＥＰＥＳなしの緩衝液が、まさに水のように、本発明による組成物に非常に適切であり、先行技術において使用されるＰＢＳ緩衝液に取って代わり得ることが示される。
【０１０５】
図３及び４において説明されるように、組成物１１及び１２の使用から、蛍光の強度及び局在化における塩化ルビジウムの正の効果が示唆される。図３（写真）から、本発明による組成物１２で細胞を処理した場合、標識がより明確になることが示される。この効果は、裸眼で見ることができる（蛍光をよりよく視覚化することができるろ紙によって）。図４は、標識化微小コロニーのレベルで局在化測定が行われた場合に得られる蛍光強度差を与える。
【０１０６】
上記表４で報告される回収結果（これは、無処理の同じ細胞で比較した、本発明による組成物７を用いる細胞処理終了時の、生存能のある細菌数に対応する。）から、使用した微生物（グラム＋及びグラム−）に関して細胞の生存能が維持されることが示される。
【図１】
0004986178.tif 000006
【図２】
0004986178.tif 000007
【図３】
0004986178.tif 000008
【図４】
0004986178.tif 000009