(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(1)で示される単糖と、下記一般式(2)で示される単糖とをグリコシド結合反応させる工程、並びにＲ3及びＲ7のそれぞれを水素原子に置換し、次いで当該水素原子を−ＳＯ3Ｍに置換する工程を含み、Ｒ3、Ｒ4及びＲ7の脱離が、Ｒ4の保護基の変換後に溶媒をアルカリ性にすることにより１工程で行われる、下記一般式(3)で示されるオリゴ糖の製造方法。
【化１】
0004913272.tif 000018
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立してアラルキル基を示し、Ｒ3はアシル基を示し、Ｒ4はアミノ基保護基を示し、Ｒ5は脱離基を示す。）
【化２】
0004913272.tif 000019
（式中、Ｒ6およびＲ8はそれぞれ独立してアラルキル基を示し、Ｒ7はアシル基を示し、Ｒ9はアラルキル基、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。ここで、アラルキル基は、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、フェネチル基、３−フェニルプロピル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｏ−ニトロベンジル基、ｐ−ハロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基（トリチル基）、αもしくはβ−ナフチルメチル基、またはα−ナフチルジフェニルメチル基であり、アルキル基は、炭素数１〜２３であり、Ｏ−アルキルグリセロール残基は、ジ−Ｏ−アルキルグリセロール残基であり、Ｏ−アシルグリセロール残基は、ジ−Ｏ−アシルグリセロール残基であり、セラミド中のＮ−アシル基の炭素数は１〜２８であり、リン脂質残基は、グリセロリン脂質残基またはスフィンゴリン脂質残基である。なお、Ｒ9がアラルキル基、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基又はリン脂質残基である場合には、Ｚは酸素原子であり、Ｒ9がビオチン残基またはペプチド残基である場合には、Ｚは−ＮＨＣＯ−である。）
【化３】
0004913272.tif 000020
（式中、Ｒ10およびＲ11はそれぞれ独立して−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す。）を示し、Acはアセチル基を示す。また、Ｒ12は水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。ここで、アルキル基は、炭素数１〜２３であり、Ｏ−アルキルグリセロール残基は、ジ−Ｏ−アルキルグリセロール残基であり、Ｏ−アシルグリセロール残基は、ジ−Ｏ−アシルグリセロール残基であり、セラミド中のＮ−アシル基の炭素数は１〜２８であり、リン脂質残基は、グリセロリン脂質残基またはスフィンゴリン脂質残基である。なお、Ｒ12が水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基又はリン脂質残基である場合には、Ｚは酸素原子であり、Ｒ12がビオチン残基またはペプチド残基である場合には、Ｚは−ＮＨＣＯ−である。）
【請求項２】
上記一般式(1)および(2)が、それぞれ下記式(4)および(5)で示されることを特徴とする、請求項１記載の製造方法。
【化４】
0004913272.tif 000021
（式中、Bnはベンジル基を、Ｒ13はアセチル基又はレブリノイル基を、Phthはフタロイル基を、Ｘはハロゲン原子を示す。）
【化５】
0004913272.tif 000022
（式中、Bnはベンジル基を、Ｒ14はベンジル基、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。Pivはピバロイル基を示す。）
【請求項３】
下記一般式(13)で示されるオリゴ糖。
【化６】
0004913272.tif 000023
（式中、Ｒ16およびＲ17はそれぞれ独立して−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す）を示し、Acはアセチル基を示す。またＲ18は水素原子、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。ここで、アルキル基は、炭素数１〜２３であり、Ｏ−アルキルグリセロール残基は、ジ−Ｏ−アルキルグリセロール残基であり、Ｏ−アシルグリセロール残基は、ジ−Ｏ−アシルグリセロール残基であり、セラミド中のＮ−アシル基の炭素数は１〜２８であり、リン脂質残基は、グリセロリン脂質残基またはスフィンゴリン脂質残基である。なお、Ｒ18が水素原子、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基又はリン脂質残基である場合には、Ｚは酸素原子であり、Ｒ18がビオチン残基またはペプチド残基である場合には、Ｚは−ＮＨＣＯ−である。
【請求項４】
Ｚは酸素原子である、請求項３に記載のオリゴ糖。
【請求項５】
Ｚは酸素原子であり、Ｒ18は水素原子である、請求項３に記載のオリゴ糖。
【請求項６】
Ｚは酸素原子であり、Ｒ18はアルキル基である、請求項３に記載のオリゴ糖。
【請求項７】
Ｚは酸素原子であり、Ｒ18はＯ−アルキルグリセロール残基である、請求項３に記載のオリゴ糖。
【請求項８】
Ｚは酸素原子であり、Ｒ18はコレスタニル基である、請求項３に記載のオリゴ糖。
【請求項９】
請求項５に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬。
【請求項１０】
請求項５に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗アレルギー剤。
【請求項１１】
下記一般式(13)で示されるオリゴ糖又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗アレルギー剤。
【化７】
0004913272.tif 000024
（式中、Ｒ16およびＲ17はそれぞれ独立して−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す）を示し、Acはアセチル基を示す。またＲ18は６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示す。また、Ｚは酸素原子を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オリゴ糖の製造方法に関する。また本発明は、新規オリゴ糖およびそれを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ケラタン硫酸は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の６位がＯ−硫酸化されたＮ−アセチルラクトサミンを基本構造とするグリコサミノグリカンである。この分解物であるケラタン硫酸オリゴ糖には、薬理作用のあるものがあることが報告されている（例えば、国際公開パンフレット第ＷＯ９６／１６９７３号参照）。
【０００３】
ケラタン硫酸に由来する二糖の構造としては図１に示すものが可能性として考えられるが、薬理作用を有する他のケラタン硫酸オリゴ糖の検索は、還元末端にガラクトース残基を有する二糖（GlcNAcβ1→3Gal(式中、Galはガラクトースを、GlcNはグルコサミンを、Acはアセチル基を示す)）であって、ケラタン硫酸と同様に硫酸基を有するケラタン硫酸オリゴ糖を得ることが困難であることから制限されている。例えば、ケラタン硫酸を公知のエンド−β−ガラクトシダーゼで処理しても、還元末端にガラクトース残基を有する二糖（GlcNAcβ1→3Gal）を、硫酸基を保持したまま得ることは困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、還元末端にガラクトース残基を有するケラタン硫酸二糖を容易に製造できる方法を提供することである。
【０００５】
また、本発明の第２の目的は、薬理作用を有する新規なオリゴ糖を提供し、これを医薬として提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グルコサミン中のヒドロキシル基およびアミノ基とガラクトース中のヒドロキシル基とを特定の様式で保護することにより、グリコシド結合反応によって、還元末端にガラクトース残基を有する二糖が得られることを見い出した。また、特定の位置のヒドロキシル基が硫酸化された二糖が優れた薬理活性を有することを見い出した。これらの知見に基づき、本発明は完成された。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記一般式(1)で示される単糖と、下記一般式(2)で示される単糖とをグリコシド結合反応させる工程を少なくとも含む、下記一般式(3)で示されるオリゴ糖の製造方法（以下、本発明製造方法ともいう）を提供する。
【０００８】
【化１６】
0004913272.tif 000002
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立してアラルキル基を示し、Ｒ3はアシル基又はシリル基を示し、Ｒ4はアミノ基保護基を示し、Ｒ5は脱離基を示す。）
【０００９】
【化１７】
0004913272.tif 000003
（式中、Ｒ6およびＲ8はそれぞれ独立してアラルキル基を示し、Ｒ7はアシル基又はシリル基を示し、Ｒ9はアラルキル基、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。）
【００１０】
【化１８】
0004913272.tif 000004
（式中、Ｒ10およびＲ11はそれぞれ独立して水素原子または−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す。）を示し、Acはアセチル基を示す。また、Ｒ12は水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。）
【００１１】
本発明製造方法において、Ｒ10およびＲ11の少なくとも一方が−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す。）であり、上記一般式(1)で示される単糖と、上記一般式(2)で示される単糖とをグリコシド結合反応させる工程の後に、Ｒ3およびＲ7の少なくとも一方を水素原子に置換し、次いで当該水素原子を−ＳＯ3Ｍに置換する工程が含まれることが好ましい。
【００１２】
本発明製造方法の好ましい態様においては、上記一般式(1)〜(3)が、それぞれ下記式(4)〜(6)で示される。
【００１３】
【化１９】
0004913272.tif 000005
（式中、Bnはベンジル基を、Ｒ13はアセチル基又はレブリノイル基を、Phthはフタロイル基を、Ｘはハロゲン原子を示す。）
【００１４】
【化２０】
0004913272.tif 000006
（式中、Bnはベンジル基を、Ｒ14はベンジル基、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。Pivはピバロイル基を示す。）
【００１５】
【化２１】
0004913272.tif 000007
（式中、Acはアセチル基を、Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す。また、Ｒ15は水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。）
【００１６】
本発明製造方法の別の好ましい態様においては、上記一般式(1)〜(3)が、それぞれ下記式(7)〜(9)で示される。
【００１７】
【化２２】
0004913272.tif 000008
（式中、Bnはベンジル基を、Levはレブリノイル基を、Phthはフタロイル基を、Ｘはハロゲン原子を示す。）
【００１８】
【化２３】
0004913272.tif 000009
（式中、Bn、Ｒ14及びＺは前記と同義である。また、Phはフェニル基を、Meはメチル基を示す。）
【００１９】
【化２４】
0004913272.tif 000010
（式中、Ｒ15及びＺは前記と同義である。また、Acはアセチル基を、Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す。）
【００２０】
本発明製造方法のさらに別の好ましい態様においては、上記一般式(1)〜(3)が、それぞれ下記式(10)〜(12)で示される。
【００２１】
【化２５】
0004913272.tif 000011
（式中、Bnはベンジル基を、Levはレブリノイル基を、Phthはフタロイル基を、Ｘはハロゲン原子を示す。）
【００２２】
【化２６】
0004913272.tif 000012
（式中、Bn、Ｒ14及びＺは前記と同義である。また、Phはフェニル基を、Meはメチル基を示す。）
【００２３】
【化２７】
0004913272.tif 000013
（式中、Ｒ15及びＺは前記と同義である。また、Acはアセチル基を、Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す。）
【００２４】
また、本発明は、下記一般式(13)で示されるオリゴ糖（以下、本発明オリゴ糖ともいう）を提供する。
【００２５】
【化２８】
0004913272.tif 000014
（式中、Ｒ16およびＲ17はそれぞれ独立して水素原子又は−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す）を示し、Acはアセチル基を示す。またＲ18は水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。ただし、Ｒ16およびＲ17がいずれも水素原子であり、かつＺが酸素原子でＲ18が水素原子又はコレスタニル基であるもの、並びにＲ16が−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す）でありかつＺが酸素原子でＲ17とＲ18がいずれも水素原子であるものを除く。）
【００２６】
本発明オリゴ糖の好ましい態様は、Ｒ16およびＲ17がいずれも−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す）である。
【００２７】
また、本発明オリゴ糖の別の好ましい態様は、Ｒ16が水素原子であり、かつＲ17が−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す）である。
【００２８】
本発明オリゴ糖において、好ましくは、Ｒ18が水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、Ｏ−アルキルグリセロール残基又はコレスタニル基であり、かつＺが酸素原子である。
【００２９】
本発明はさらに、下記一般式(13)で示される本発明オリゴ糖又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬（以下、本発明医薬ともいう）を提供する。
【００３０】
【化２９】
0004913272.tif 000015
（式中、Ｒ16およびＲ17はそれぞれ独立して水素原子又は−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す）を示し、Acはアセチル基を示す。またＲ18は水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示す。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。ただし、Ｒ16およびＲ17がいずれも水素原子であり、かつＺが酸素原子でＲ18が水素原子又はコレスタニル基であるものを除く。）
【００３１】
特に、Ｒ16が−ＳＯ3Ｍであり、かつＲ17が水素原子又は−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す）を示す本発明オリゴ糖またはその薬学的に許容される塩は、抗アレルギー剤として、Ｒ16およびＲ17が−ＳＯ3Ｍ（Ｍはプロトン又は１価のカチオンを示す）を示す本発明オリゴ糖またはその薬学的に許容される塩は、抗炎症剤として有用である。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
まず、本明細書および図面において共通して用いた略号を、その意味（以下の略号に付した括弧内の記載）と共に以下に示す。
【００３３】
Ac（アセチル基）
Bn（ベンジル基）
Phth（フタロイル基）
Piv（ピバロイル基）
Lev（レブリノイル基）
Ph（フェニル基）
Me（メチル基）
All（アリル(allyl)基）
MP（パラメトキシフェニル基）
Ｍ（プロトン又は１価のカチオン）
Ｘ（ハロゲン原子）
【００３４】
＜１＞本発明製造方法
本発明製造方法は、一般式(3)で示されるオリゴ糖の製造方法であり、一般式(1)で示される単糖と一般式(2)で示される単糖とをグリコシド結合反応させる工程を少なくとも含むことを特徴とする。
【００３５】
一般式(1)〜(3)における置換基は以下のとおりである。
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6およびＲ8は、それぞれ独立して、アラルキル基を示し、アラルキル基の例としては、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、フェネチル基、３−フェニルプロピル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｏ−ニトロベンジル基、ｐ−ハロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基（トリチル基）、αもしくはβ−ナフチルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基などが挙げられる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6およびＲ8は、好ましくはベンジル基である。
【００３６】
Ｒ3およびＲ7は、それぞれ独立して、アシル基又はシリル基を示す。アシル基としては、アセチル基、ピバロイル基、レブリノイル基、ベンゾイル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、メトキシアセチル基、プロピオニル基、ｎ−ブチリル基、（Ｅ）−２−メチルブテノイル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾイル基、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基、ｐ−フェニルベンゾイル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル基、ｐ−トルオイル基、ｐ−アニソイル基、ｐ−クロロベンゾイル基、ｐ−ニトロベンゾイル基、α−ナフトイル基などが挙げられる。シリル基としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ジメチルイソプロピリシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、テトライソプロピルジシロキサニル基などが挙げられる。
【００３７】
Ｒ3およびＲ7は、好ましくは、それぞれアシル基であるか、又はＲ3がアシル基でありかつＲ7がシリル基である。アシル基としてはアセチル基、ピバロイル基、レブリノイル基が好ましく、シリル基としてはｔ−ブチルジフェニルシリル基が好ましい。
【００３８】
Ｒ4は、アミノ基保護基を示し、アミノ基保護基の例としては、フタロイル基、アセチル基、アリルオキシカルボニル基などが挙げられる。好ましくはフタロイル基である。
【００３９】
Ｒ5は、脱離基を示す。ここで脱離基とは、一般式(1)で示される単糖と一般式(2)で示される単糖とをグリコシド結合反応させる条件で脱離する基を意味する。脱離基の例としては、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）、イミド基、メチルチオ基、フェニルチオ基などが挙げられるが、ハロゲン原子が好ましく、特にフッ素原子であることが好ましい。
【００４０】
なお式(4)、(7)および(10)中のＸは、脱離基のなかでも好ましいハロゲン原子である。このＸは、上記と同様にフッ素原子であることが好ましい。
【００４１】
Ｒ9は、アラルキル基、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基、又はペプチド残基を示す。ここで、残基とはその化合物の結合に関与する原子又は原子群をその化合物から除いた残りの部分を意味する。
【００４２】
アラルキル基の例、および好ましいアラルキル基については、前記と同様である。
【００４３】
６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基は、通常には、４位の水酸基が除かれた残基である。
【００４４】
アルキル基としては、炭素数１〜２３のものが例示され、炭素数８〜１４のものが好ましい。
【００４５】
グリセロール残基は、通常には、いずれかの水酸基が除かれた残基である。
【００４６】
Ｏ−アルキルグリセロール残基も特に限定されないが、通常にはいずれかの水酸基が除かれた残基であり、ジ−Ｏ−アルキルグリセロール残基が好ましく、２,３−ジ−Ｏ−アルキルグリセロール残基が好ましい。ここでいう「アルキル」としては、炭素数１〜２３のものが例示され、炭素数８〜１４のものが好ましい。
【００４７】
Ｏ−アシルグリセロール残基も特に限定されないが、通常にはいずれかの水酸基が除かれた残基であり、ジ−Ｏ−アシルグリセロール残基が好ましく、２,３−ジ−Ｏ−アシルグリセロール残基が好ましい。ここでいう「アシル」としては、炭素数１〜２３のものが例示され、炭素数８〜１４のものが好ましい。
【００４８】
コレステロール残基は、通常には、シクロペンタフェナントレン環のＣ−３の水酸基が除かれた残基である。
【００４９】
セラミド残基は、通常には、１位の水酸基が除かれた残基である。セラミド中のＮ−アシル基の炭素数は通常には１〜２８であり、炭素数１４〜２３のものが好ましい。
【００５０】
リン脂質残基としては、グリセロリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等）残基や、スフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン等）残基が挙げられる。
【００５１】
ビオチン残基は、通常には、カルボキシル基が除かれた残基である。
【００５２】
ペプチド残基は、通常には、アミノ基及びカルボキシル基のいずれかが除かれた残基である。
【００５３】
Ｚは酸素原子または−ＮＨＣＯ−を示す。−ＮＨＣＯ−の窒素原子及び酸素原子は、いずれがＲ9側となってもよい。
【００５４】
なお、Ｒ9がアラルキル基、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基又はリン脂質残基である場合には、Ｚは酸素原子であることが好ましい。
【００５５】
また、Ｒ9がビオチン残基またはペプチド残基である場合には、Ｚは−ＮＨＣＯ−であることが好ましい。
【００５６】
Ｒ10およびＲ11は、それぞれ独立して、水素原子又は−ＳＯ3Ｍを示す。
【００５７】
Ｒ12は水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基、又はペプチド残基を示す。これらの基及び残基はＲ9について記載したのと同様である。
【００５８】
なお、Ｒ12が水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基又はリン脂質残基である場合には、Ｚは酸素原子であることが好ましい。
【００５９】
また、Ｒ12がビオチン残基またはペプチド残基である場合には、Ｚは−ＮＨＣＯ−であることが好ましい。
【００６０】
グリコシド結合反応させる条件は、用いる脱離基に合わせて適宜選択される。例えば、脱離基としてフッ素原子を選択した場合には、−７０〜６０℃で５分〜５０時間という条件が挙げられる。溶媒は、特に限定されず、１，２−ジクロロエタンなどを使用できる。
【００６１】
アラルキル基、アシル基又はシリル基およびアミノ基保護基は、脱離基が脱離する条件で、遊離しないものが選択される。これらの基は、同一の基となってもよい。
【００６２】
一般式(2)の単糖の製造方法としては、図２に概略を示したような方法が挙げられる。すなわち、化合物２から化合物９までの合成は、ガラクトース（化合物１）から伊藤らの報告している合成経路(Agric. Biol. Chem., 50, 3227(1986))に従って行うことができる。化合物１０から化合物１４までの合成は、以下の合成経路に従って行うことができる。トリクロロアセトイミド基からベンジル基への置き換え（化合物１０）、脱アセチル化（化合物１１）、ベンジル化（化合物１２）、脱アリル化（化合物１３）、ピバロイル化（化合物１４）。これらの工程の条件は、当業者が適宜設定することができる。
【００６３】
一般式(1)の単糖の製造方法としては、図３に概略を示したような方法が挙げられる。すなわち、化合物１６から化合物２０までの合成は、グルコサミン（化合物１５）から仲野らの報告している合成経路(Tetrahedron Lett., 31, 1597(1990))に従って行うことができる。化合物２１から化合物２４までの合成は、以下の合成経路に従って行うことができる。４位および６位の間のベンジリデン基の開環（化合物２１）、アセチル化（化合物２２）、脱メトキシフェニル化（化合物２３）、フッ素化（化合物２４）。これらの工程の条件は、当業者が適宜設定することができる。
【００６４】
一般式(1)の単糖と一般式(2)の単糖とをグリコシド結合反応させた後、アラルキル基およびアシル基又はシリル基を除去し、アミノ基保護基をアセチル基に置き換えることで、一般式(3)のオリゴ糖を得る。グリコシド結合反応、およびこのような基の除去および置換は公知の方法によって行うことができる（例えば、Synthesis, 384 (1989)等）。これらの具体例は、後述の実施例において詳述する。
【００６５】
一般式(3)において、Ｒ10およびＲ11の少なくとも一方が−ＳＯ3Ｍを示す場合には、上記一般式(1)で示される単糖と、上記一般式(2)で示される単糖とをグリコシド結合反応させる工程の後に、Ｒ3およびＲ7（アシル基又はシリル基）の少なくとも一方を選択的に除去して水素原子で置換し（これによりヒドロキシル基が生じる）、次いで当該水素原子を−ＳＯ3Ｍに置換する（硫酸化）。
【００６６】
アシル基又はシリル基の選択的な除去（および水素原子への置換）は、アシル基又はシリル基を、アラルキル基およびアミノ基保護基に対して適切に選択することによって行うことができる。このような組み合わせとしては、アラルキル基としてベンジル基、アミノ基保護基としてフタロイル基、アシル基又はシリル基としてアセチル基又はピバロイル基の組み合わせ等が挙げられる。硫酸化の方法も特に限定されず、公知の方法を用いることができる。これらの具体例は、後述の実施例において詳述する。
【００６７】
具体的には、図４に概略を示したような方法によって一般式(3)のオリゴ糖を得ることができる。すなわち、アセチル基およびピバロイル基の除去（および水素原子への置換）ならびにフタロイル基のアセチル基への置換（化合物２６）、硫酸化（化合物２７）、脱ベンジル化（化合物２８）である。これらの工程の条件は、当業者が適宜設定することができる。
【００６８】
Ｒ10およびＲ11のいずれか一方が−ＳＯ3Ｍを示す場合には、Ｒ3およびＲ7のアシル基又はシリル基のいずれか一方を選択的に除去できるように選択する。例えば、Ｒ3としてレブリノイル基（式(7)又は(10)の単糖）、Ｒ7としてｔ−ブチルジフェニルシリル基（式(8)又は(11)の単糖）を選択する。レブリノイル基を選択的に除去（および水素原子に置換）してから硫酸化を行い、次いでその他のヒドロキシル基の保護基を除去することで、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基のみが硫酸化されたオリゴ糖（式(9)のオリゴ糖）を得ることができ、ｔ−ブチルジフェニルシリル基を選択的に除去（および水素原子に置換）してから硫酸化を行い、次いでその他のヒドロキシル基の保護基を除去することで、ガラクトース残基の６位のヒドロキシル基のみが硫酸化されたオリゴ糖（式(12)のオリゴ糖）を得ることができる。
【００６９】
アシル基又はシリル基の選択的な除去（および水素原子への置換）、これにより生じるヒドロキシル基の硫酸化、アラルキル基の除去、および、アミノ基保護基のアセチル基への置換は、公知の方法によって行うことができる。
【００７０】
一般式(1)の単糖と一般式(2)の単糖とをグリコシド結合反応等させて一般式(3)のオリゴ糖を得る方法の、他の例を図５〜図７に示す。
【００７１】
図５は、一般式(2)中のＲ9がＯ−アルキルグリセロール残基(2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール残基)の例であり、図６は、一般式(2)中のＲ9がアルキル基(オクチル基)の例であり、図７は、一般式(2)中のＲ9がコレスタニル基の例である。これらはいずれも上記と同様の方法で行うことができる。Ｒ9が他の基の場合も同様の方法で行うことができる。
【００７２】
得られる硫酸化されたオリゴ糖は塩となっていてもよく（すなわち該オリゴ糖中のＭが１価のカチオンであってもよく）、塩となっていなくてもよい（すなわち該オリゴ糖中のＭがプロトンであってもよい）。塩としては、後述の＜３＞本発明医薬の説明中に例示したものを挙げることができるが、アルカリ金属塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。また該オリゴ糖は電離した状態であってもよい。
【００７３】
本発明製造方法によれば、上記のオリゴ糖を収率よく、かつ少ない工程で製造することができる。
【００７４】
＜２＞本発明オリゴ糖
本発明オリゴ糖は、一般式(13)で表されるオリゴ糖である。
一般式(13)における置換基は以下のとおりである。
【００７５】
Ｒ16およびＲ17はそれぞれ独立して水素原子又は−ＳＯ3Ｍを示す（ただし、Ｒ16およびＲ17がいずれも水素原子であり、かつＺが酸素原子でＲ18が水素原子又はコレスタニル基であるもの、並びにＲ16が−ＳＯ3ＭでありかつＺが酸素原子でＲ17とＲ18がいずれも水素原子であるものを除く）。
【００７６】
またＲ18は水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を示すが、水素原子、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基、アルキル基、Ｏ−アルキルグリセロール残基又はコレスタニル基が好ましい。これらの基及び残基はＲ9について記載したのと同様である。一般式(13)においてＲ18が水素原子の場合、Ｒ18により構成されるヒドロキシル基はβ位にあってもα位にあってもよい。またＲ18が６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基の場合、そのグリコシド結合はβ−グリコシド結合であることが好ましく、β−１,４グリコシド結合であることがより好ましい。Ｒ18が他の基又は残基の場合はβグリコシド結合であることが好ましい。また、Ｚは酸素原子又は−ＮＨＣＯ−を示す。Ｒ18がビオチン残基又はペプチド残基である場合には、Ｚは−ＮＨＣＯ−であることが好ましく、Ｒ18がそれ以外の基である場合には、Ｚは酸素原子であることが好ましい。
【００７７】
本発明オリゴ糖は塩となっていてもよく（すなわち該オリゴ糖中のＭが１価のカチオンであってもよく）、塩となっていなくてもよい（すなわち該オリゴ糖中のＭがプロトンであってもよい）。塩としては、後述の＜３＞本発明医薬の説明中に例示したものを挙げることができるが、アルカリ金属塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。また該オリゴ糖は電離した状態であってもよい。
【００７８】
Ｒ18が水素原子である本発明オリゴ糖は、上記本発明製造方法によって得ることができる。また、図５〜７に示すように、アルキル基、グリセロール残基、Ｏ−アルキルグリセロール残基、Ｏ−アシルグリセロール残基、コレステロール残基、コレスタニル基、セラミド残基、リン脂質残基、ビオチン残基又はペプチド残基を保持する単糖を他の単糖と結合させたり、Ｒ18が水素原子である本発明オリゴ糖と、グリセロール、コレステロール、セラミド、ビオチン又はペプチドとを公知のグリコシル化法により結合させたりすることによって、Ｒ18が水素原子以外の本発明オリゴ糖を得ることができる。
【００７９】
またＲ18が６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基である本発明オリゴ糖は、例えば公知のケラタン硫酸オリゴ糖に酸加水分解や酵素処理等の処理を施すことによって製造することができる。例えば公知のケラタン硫酸オリゴ糖であるNeuAc〜Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、NeuAcはＮ−アセチルノイラミン酸残基を、6Sは6-O-硫酸エステルをそれぞれ表す。また〜はα2,3結合又はα2,6結合を表す；ＷＯ９６／１６９７３参照）を、0.2Ｎ程度の強酸と共にインキュベートすることによりＮ−アセチルノイラミン酸(シアル酸)残基を除去し、次いでラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）と共にインキュベートすることによってガラクトース残基を除去することにより製造することができる。詳細は後述の実施例において詳述する。
【００８０】
本発明オリゴ糖又はその薬学的に許容される塩は、薬理作用を有し、医薬として使用できる。
【００８１】
＜３＞本発明医薬
本発明医薬は、本発明オリゴ糖又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする。
【００８２】
薬学的に許容される塩とは、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、又はジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
本発明医薬は特に抗アレルギー剤として利用できる。抗アレルギー剤として利用する場合、本発明オリゴ糖のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されている（すなわち一般式(13)におけるＲ16が−ＳＯ3Ｍである）ことが好ましく、ガラクトース残基の６位のヒドロキシル基およびＮ−アセチルグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基の両方が硫酸化されている（すなわち一般式(13)におけるＲ16およびＲ17がいずれも−ＳＯ3Ｍである）ことがより好ましい。
【００８４】
本発明の抗アレルギー剤は、アレルギーが関与するあらゆる疾患に対して有効であり、具体的には、気管支喘息、アレルギ−性間質性肺炎、アレルギ−性鼻炎、アレルギ−性結膜炎、アトピ−性皮膚炎などの予防または治療を目的として適用することができる。
【００８５】
また、本発明オリゴ糖のガラクトース残基の６位のヒドロキシル基およびＮ−アセチルグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基の両方が硫酸化されている場合、本発明医薬は特に抗炎症剤として利用できる。
【００８６】
本発明の抗炎症剤は、炎症が関与するあらゆる疾患に対して有効であり、具体的には、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、変形性脊椎症、変形性関節症、腰痛症、手術後及び外傷後の炎症及び腫張の緩解、肩甲関節周囲炎、顎関節症、腱腱鞘炎、腱周囲炎、上腕骨顆炎（テニス肘）、筋肉痛、角結膜炎などの治療を目的として適用することができる。本発明の抗炎症剤は、その有効成分の作用により、これらの疾患に対して、鎮痛、消炎、解熱等の抗炎症作用を有する。
【００８７】
なお本発明医薬は、純然とした治療目的のみならず、疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的として適用することができる。
【００８８】
本発明においては、対象となる疾患の性質や進行状況、投与方法などに応じて、任意の剤形を適宜選択することができる。
【００８９】
すなわち、本発明医薬は注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入などにより投与することができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。選択し得る剤形も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。
【００９０】
本発明医薬中の有効成分であるケラタン硫酸オリゴ糖の配合量ならびに本発明医薬の投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重等に応じて個別的に決定されるべき事項であり、特に限定はされない。
【００９１】
アレルギ−性疾患では、気道や肺にあるＩｇＥ抗体をもった感作肥満細胞から抗原に誘導されて化学伝達物質が遊離される。化学伝達物質にはヒスタミンや好酸球走化性因子、ＳＲＳ−Ａなどがある。これらにより喘息では、呼吸困難、咳、発作が起き、また肺疾患では出血性肺炎、浮腫、間質性肺炎、血管炎などの症状がみられる。まれに肉芽腫もみられ、この疾患は後に肺線維症になることが多い。アレルギ−性疾患に対しては抗ヒスタミン剤やステロイド剤、抗アレルギ−剤（化学伝達物質遊離抑制薬）による治療が行われている。しかし、副作用として抗ヒスタミン剤では、脱力感、倦怠感、頭痛、嘔吐、頭重感、食欲不振等が報告されている。気管支喘息においては、抗コリン作用により気道分泌が抑制され、喀痰の喀出を困難とするため、軽症例を除いては使用されない。また緑内障、排尿困難の者にも禁忌である。一方、ステロイド剤の主たる作用は抗炎症作用と考えられ、通常アレルギ−疾患の治療には大量・連続投与が必要である。ステロイド剤は重篤な副作用があるため、一般的な治療方法でコントロ−ルできない場合に用いるのが原則とされている。また抗アレルギ−薬は、肝障害、出血性膀胱炎、胃腸障害を起こすこともあるので、定期的な検査を必要とする。
【００９２】
このように特にアレルギ−疾患の領域では、より副作用の少ない有効な治療法が求められているが、本発明医薬によれば、このような治療法を提供することができる。
【００９３】
なお、本発明医薬（本発明の抗アレルギー剤及び本発明の抗炎症剤を含む）において、一般式(13)における好ましいＲ18及びＺは前記と同様である。
【００９４】
【実施例】
以下に本発明を、実施例により具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。なお、実施例における溶媒の混合液の比率は、特記しない限り、容量比である。
【００９５】
【実施例１】
O-(2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル)-(1→3)-O-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノース二ナトリウム塩の合成図２〜４に概略を示す手順によりO-(2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル)-(1→3)-O-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノース二ナトリウム塩を合成した。なお、以下の実施例における各合成段階で共通して用いた方法は、以下の通りである。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、Kiesegel 60(MERCK)を用いて行った。薄層クロマトグラフィーは HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254 (MERCK)を使用した。1H-NMR スペクトルおよび13C-NMR スペクトルは、JNM-EX-400（日本電子株式会社製）を用いて測定した。測定溶媒 CDCl3, CD3ODにおいてはテトラメチルシランを、またD2Oにおいてはt-ブタノールを内部標準とした。
【００９６】
（１）化合物２から化合物１４の合成
ガラクトースシントン２−９は、ガラクトース（化合物１）から伊藤らの報告している合成経路(Agric. Biol. Chem., 50, 3227(1986))に従い合成を行った。化合物１０〜１４の合成は以下のようにして行った。
なお、以下、物質名の後の番号は、図２〜４における化合物の番号を示す。
【００９７】
(a) ベンジル2,4-ジ-O-アセチル-3,6-ジ-O-アリル-β-D-ガラクトピラノシド(benzyl 2,4-di-O-acetyl-3,6-di-O-allyl-β-D-galactopyranoside)１０
窒素ガス雰囲気下、事前に乾燥したモレキュラーシーブス４Ａ(30.0 g)の入った反応容器にベンジルアルコール(18.4 ml, 178.8 mmol)および化合物９(2,4-ジ-O-アセチル-3,6-ジ-O-アリル-D-ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート(2,4-di-O-acetyl-3,6-di-O-allyl-D-galactopyranosyl trichloroacetimidate)；21.84 g, 44.67 mmol)を加えた後、氷冷下で15分間撹拌した。反応混合物に氷冷下でトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(1.7 ml, 8.93 mmol)を加えた後、同温で4時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、氷冷下、トリエチルアミンを加え中和後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン：酢酸エチル＝6:1)にて精製し、化合物１０(18.6
g, 96%)を得た。
【００９８】
Rf: 0.51 (トルエン：酢酸エチル=3:1)
C23H30O8                  MW: 434.47
400 MHz 1H-NMR (CDCl3,TMS) δ：
2.037(s, 3H, OAc) 2.146(s, 3H, OAc) 4.445(d, 1H, J=7.8 Hz, H-1) 5.461(d, 1H, J=2.9 Hz, H-4) 5.715-5.914(m, 2H, CH2=CH x2) 7.200-7.400(m, 5H, aromatic)
【００９９】
(b) ベンジル3,6-ジ-O-アリル-β-D-ガラクトピラノシド(benzyl 3,6-di-O-allyl-β-D-galactopyranoside)１１
化合物１０(10.84 g, 24.9 mmol)のメタノール溶液(30 ml)にナトリウムメトキシド(134 mg, 2.5 mmol)を加え窒素ガス雰囲気下室温で48時間撹拌した。反応混合物を酢酸にて中和後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン：酢酸エチル＝4:1)にて精製し、化合物１１(6.8 g, 78%)を得た。
【０１００】
Rf: 0.27 (トルエン：酢酸エチル=2:1)
C19H26O6                  MW: 350.40
【０１０１】
(c) ベンジル3,6-ジ-O-アリル-2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシド(benzyl 3,6-di-O-allyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoside)１２
窒素ガス雰囲気および氷冷下、60%水素化ナトリウム(3.8 g, 95.5 mmol)、化合物１１(6.7 g, 19.1 mmol)およびＤＭＦ20 mlの混合物にベンジルブロミド(11.4 ml, 95.5 mmol)を加え18時間撹拌した。反応混合物に氷冷下でメタノールを加え1時間撹拌後、減圧下溶媒を留去した。残渣をジエチルエーテルにて希釈後、水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン：酢酸エチル＝10:1〜9:1)にて精製し、化合物１２(9.1 g, 90%)を得た。
【０１０２】
Rf: 0.27 (トルエン：酢酸エチル=10:1)
C33H38O6                  MW: 530.63
400 MHz 1H-NMR (CDCl3,TMS) δ：
3.424(dd, 1H, J=2.9,9.8 Hz, H-3) 3.829(dd, 1H, J=7.8,9.8 Hz, H-2) 3.861(d, 1H, J=2.9 Hz, H-4) 4.453(d, 1H, J=7.8 Hz, H-1) 5.805-5.984(m, 2H, CH2=CH x2) 7.200-7.450(m, 15H, aromatic)
【０１０３】
(d) ベンジル2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシド(benzyl 2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoside)１３
水素ガス雰囲気下、活性化されたイリジウムコンプレックス[Iｒ(CoD)(PMePh2)2PF6(287 mg, 0.34 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(60 ml)に室温で化合物１２(8.9 g, 16.7 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(80 ml)を加え7時間撹拌した。次いで、水(100 ml)およびヨウ素(8.5 g, 67.1 mmol)を加え15時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルにて希釈後、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を再結晶(エタノール−ジクロロメタン−ジエチルエーテル)し、化合物１３(7.4 g, 97%)を得た。
【０１０４】
Rf: 0.34 (n-ヘキサン:酢酸エチル=1:1)
C27H30O6                  MW: 450.51
【０１０５】
(e) ベンジル2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシド(benzyl 2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranoside)１４
窒素ガス雰囲気下、0℃で、化合物１３(7.3 g, 16.2 mmol)のピリジン溶液(50 ml)にピバロイルクロリド(4.2 ml, 35.7 mmol)を加え70分間撹拌した。反応液にメタノールを加え40分間撹拌した後に減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン：酢酸エチル＝6:1)にて精製し、化合物１４(7.81 g, 90%)を得た。
【０１０６】
Rf: 0.45 (トルエン：酢酸エチル=6:1)
C32H38O7                  MW: 534.62
400 MHz 1H-NMR (CDCl3,TMS) δ：
1.202(s, 9H, OPiv) 2.326(bs, 1H, OH) 3.628-3.708(m, 3H, H-2, H-3 and H-5)3.786(d, 1H, J=3.9 Hz, H-4) 4.142(dd, 1H, J=6.4,10.7 Hz, H-6) 4.352(dd, 1H, J=6.8,11.2 Hz, H-6') 4.448(d, 1H, J=7.3 Hz, H-1) 6.650-7.150(m, 15H, aromatic)
【０１０７】
（２）化合物１６から化合物２４の合成
グルコサミンシントン１６−２０は、グルコサミン（化合物１５）から仲野らの報告している合成経路(Tetrahedron Lett., 31, 1597(1990))に従い合成を行った。化合物２１〜２４の合成は以下のようにして行った。
【０１０８】
(f) p-メトキシフェニル3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシド(p-methoxyphenyl 3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside)２１
窒素ガス雰囲気下、事前に乾燥したモレキュラーシーブス４Ａ(60.0 g)の入った反応容器にボラン-トリメチルアミンコンプレックス(75.0 g, 1028 mmol)、化合物２０(21.0 g, 35.4 mmol)のジクロロメタン溶液(200 ml)、および、ジエチルエーテル(80 ml)を加え15分間撹拌した。反応容器を0℃に冷却し、無水塩化アルミニウム(20.0 g, 150 mmol)を少量ずつ1.5時間で加え、0℃で2.5時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過し、濾液を酢酸エチルで希釈後、1N硫酸水溶液、水、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン：酢酸エチル＝4:1)にて精製し、化合物２１(14.5 g, 69%)を得た。
【０１０９】
Rf: 0.40 (トルエン：酢酸エチル=3:1)
C35H33N1O8              MW: 595.62
400 MHz 1H-NMR (CDCl3+CD3OD,TMS) δ：
3.620-3.662(m, 1H, H-5) 3.706(s, 3H, OMe) 3.783-3.849(m, 2H, H-4 and H-6) 3.939(dd, 1H, J=2.4,12.2 Hz, H-6') 4.351(dd, 1H, J=8.3,10.7 Hz, H-2) 4.435(dd, 1H, J=8.3,10.7 Hz, H-3) 5.693(d, 1H, J=8.3 Hz, H-1) 6.650-7.900(m, 18H, aromatic)
【０１１０】
(g) p-メトキシフェニル6-O-アセチル-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシド(p-methoxyphenyl 6-O-acetyl-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside)２２
窒素ガス雰囲気下、化合物２１(10.5 g, 17.6 mmol)のピリジン溶液(200 ml)に無水酢酸(200 ml)およびDMAP(触媒量)を加え20時間撹拌した。反応液にエタノールを加え20分間撹拌した後に減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン：酢酸エチル＝4:1)にて精製し、化合物２２(9.6 g, 85%)を得た。
【０１１１】
Rf: 0.51 (トルエン：酢酸エチル=4:1)
C37H35N1O9              MW: 637.66
400 MHz 1H-NMR (CDCl3,TMS) δ：
2.062(s, 3H, OAc) 3.680(s, 3H, OMe) 3.759-3.817(m, 2H, H-4 and H-5) 4.296(dd, 1H, J=4.4, 12.2 Hz, H-6) 5.631(d, 1H, J=7.8 Hz, H-1) 6.650-7.900(m, 18H, aromatic)
【０１１２】
(h) 6-O-アセチル-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-2-フタルイミド-D-グルコピラノース(6-O-acetyl-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-D-glucopyranose)２３
化合物２２(9.0 g, 14.1 mmol)をアセトニトリル：水 (4:1; 400 ml)に溶解し、硝酸第二セリウムアンモニウム(20.1 g, 36.7 mmol)を加え室温下、40分間激しく撹拌した。反応混合物を酢酸エチルにて希釈し、水、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄後、硫酸マグネシウムにて乾燥し減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン：酢酸エチル＝2.5:1)にて精製し、化合物２３(6.1 g, 81%)を得た。
【０１１３】
Rf: 0.23 (トルエン：酢酸エチル=2:1)
C30H29N1O8              MW: 531.54
400 MHz 1H-NMR (CDCl3+D2O,TMS)  δ：
2.074(s, 3H, OAc) 3.680(t, 3H, J=9.3 Hz, H-4) 3.739-3.772(m, 1H, H-5) 4.100(dd, 1H, J=8.8,10.8 Hz, H-2) 4.240(dd, 1H, J=3.9,11.2 Hz, H-6) 5.386(d, 1H, J=8.3 Hz, H-1) 6.650-7.900(m, 14H, aromatic)
【０１１４】
(i) 6-O-アセチル-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシルフルオライド(6-O-acetyl-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl fluoride)２４
窒素ガス雰囲気下、化合物２３(5.95 g, 11.2 mmol)の1,2−ジクロロエタン溶液(50 ml)に氷冷下で、ジエチルアミノサルファートリフルオリド(5.8 ml, 43.9 mmol)を加え2時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルにて希釈し、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄後、硫酸マグネシウムにて乾燥し溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン：酢酸エチル＝4:1)にて精製し、化合物２４(5.9 g, 99%)を得た。
【０１１５】
Rf: 0.68 (トルエン：酢酸エチル=2:1)
C30H28N1O7F1              MW: 533.53
400 MHz 1H-NMR (CDCl3,TMS) δ：
2.097(s, 3H, OAc) 3.859(dd, 1H, J=8.3,9.8 Hz, H-4) 3.800-3.840(m, 1H, H-5) 5.810(d, 0.5H, J=7.8 Hz, H-1β) 5.943(d, 0.5H, J=7.8 Hz, H-1β) 6.800-7.800(m, 14H, aromatic)
【０１１６】
（３）化合物１４および化合物２４からの化合物２８の合成
化合物２５〜２８の合成は以下のように行った。
【０１１７】
(j) ベンジルO-(6-O-アセチル-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシル)-(1→3)-O-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシド(benzyl O-(6-O-acetyl-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranoside)２５
窒素ガス雰囲気下、事前に乾燥したモレキュラーシーブス４Ａ(20.0 g)の入った反応容器にシルバートリフレート(7.23 g, 28.2 mmol)、ハフノセンジクロリド(5.4 g, 14.1 mmol)および1,2−ジクロロエタン(20 ml)を加えた後、氷冷下20分間撹拌した。反応容器を-23℃に冷却し、化合物２４(5.8 g, 10.8 mmol)および化合物１４(5.4 g, 10.0 mmol)の1,2−ジクロロエタン溶液(45 ml)を加え、-23℃で1.5時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し氷冷下、トリエチルアミンを加え20分間撹拌した後にセライトで濾過した。濾液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄後、硫酸マグネシウムにて乾燥し減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン：酢酸エチル＝9:1)にて精製後、再結晶を行い化合物２５(9.3 g, 82%)を得た。
【０１１８】
Rf: 0.39 (トルエン：酢酸エチル=8:1)
C62H65N1O14              MW: 1048.15
400 MHz 1H-NMR (CDCl3,TMS) δ：
1.173(s, 9H, OPiv) 1.986(s, 3H, OAc) 3.859(bd, 1H, J=2.5 Hz, H-4) 4.063(dd, 1H, J=5.9,11.2 Hz) 5.454(d, 1H, J=8.3 Hz, H-1) 6.800-7.800(m, 24H, aromatic)
【０１１９】
(k) ベンジルO-(2-アセトアミド-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル)-(1→3)-O-2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシド(benzyl O-(2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoside)２６
化合物２５(8.0 g, 7.6 mmol)の1-ブタノール溶液(200 ml)に、エチレンジアミン(170 ml)を加え98℃にて46時間撹拌した。反応混合物の溶媒を減圧下留去し、残渣にトルエンおよびメタノールを加え減圧下溶媒を留去した。残渣をピリジン(200 ml)に溶解しＤＭＡＰ(触媒量)と無水酢酸(150 ml)を加え室温で2日間撹拌した。反応混合物の溶媒を留去し、トルエンおよびエタノールにて共沸を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝4:1）にて精製し、2成分の混合物(6.84 g)を得た。さらにこの混合物のメタノール溶液 (100 ml)にナトリウムメトキシド(769 mg, 14.3 mmol)を加え窒素ガス雰囲気下室温で60時間撹拌した。アンバーリスト15で中和し濾過後、濾液を減圧下溶媒留去した。得られた残渣を再結晶(ジクロロメタン−イソプロピルエーテル）し化合物２６(6.0 g, 94%)を得た。
【０１２０】
Rf: 0.33 (トルエン：酢酸エチル=1:3)
C49H55N1O11              MW: 833.94
400 MHz 1H-NMR (CDCl3+CD3OD,TMS) δ：
1.557(s, 3H, NAc) 4.438(d, 1H, J=7.3 Hz, H-1) 4.784(d, 1H, J=8.3 Hz, H-1) 7.200-7.450(m, 20H, aromatic)
100 MHz 13C-NMR  (CDCl3+CD3OD,TMS) δ：22.92(Me-CO) 61.44,61.64(C-6 x2) 101.73(C-1),102.60(C-1) 170.29(Me-CO)
【０１２１】
(l) ベンジルO-(2-アセトアミド-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル)-(1→3)-O-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシド二ナトリウム塩(benzyl O-(2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-2,4-di-O-benzyl-6-O-sulfo-β-D-galactopyranoside disodium salt)２７
窒素ガス雰囲気下、化合物２６(212.5 mg, 0.255 mmol)とサルファートリオキシドトリエチルアミンコンプレックス(184.7 mg, 1.02 mmol)の混合物をDMF(1.0 ml)に溶解し、50℃で1時間撹拌した。反応液をそのままセファデックス LH-20(クロロホルム：メタノール＝1:1)にて精製し、糖画分を濃縮した。得られた残渣をメタノール(4 ml)に溶解後、Dowex 50(Na+, 4 g)を加え12時間撹拌し、対カチオンをナトリウムに変換した。更に得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム：メタノール＝4:1)にて精製した後に、シリカゲルを除く目的でセファデックス LH-20(クロロホルム：メタノール＝1:1)にて精製し、化合物２７(252 mg, 95%)を得た。
【０１２２】
Rf: 0.53 (クロロホルム：メタノール=3:1)
C49H53N1O17S2Na2             MW: 1038.03
400 MHz 1H-NMR (CDCl3+CD3OD,TMS) δ：
1.621(s, 3H, NAc) 7.200-7.450(m, 20H, aromatic)
100 MHz 13C-NMR  (CDCl3+CD3OD,TMS) δ：
22.14(Me-CO) 66.25,66.61(C-6 x2) 102.04(C-1 x2) 170.98(Me-CO)
【０１２３】
(m) O-(2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル)-(1→3)-O-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノース二ナトリウム塩(O-(2-acetamido-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-6-O-sulfo-β-D-galactopyranose disodium salt)２８
化合物２７(236.8 mg,0.228 mmol)のメタノール−水 (2:1, 6 ml)溶液に、20%水酸化パラジウム炭素(268 mg)を加え、反応系内を水素で置換し室温で17時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過し、残渣を水にて洗浄後、濾液と洗浄液を併せて減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をセファデックスG−25(水)にて精製し、化合物２８(131 mg, 98%)を得た。
【０１２４】
Rf: 0.28 (1-ブタノール：エタノール：水=2:2:1)
C14H23N1O17S2Na2             MW: 587.44
400 MHz1H-NMR (D2O, t-BuOH, at 50℃) δ：
2.029(s, 3H, NAc) 4.580(d, 0.55H, J=8.3 Hz, H-1aβ) 4.727(d, 0.55H, J=8.3 Hz, H-1bβ) 4.742(d, 0.45H, J=8.3 Hz, H-1bα) 5.232(d, 0.45H, J=3.4 Hz, H-1aα)
100 MHz 13C-NMR  (D2O, t-BuOH, at 50℃) δ：
25.04(Me-CO) 69.81(C-6 b) 70.70(C-6 aβ) 70.94(C-6 aα) 95.21(C-1aα) 99.21(C-1aβ) 105.39(C-1b) 177.74(Me-CO)
【０１２５】
【実施例２】
O-(2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル)-(1→3)-O-(6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシル)-(1→4)-O-2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノース三ナトリウム塩（以下、Ｇ４Ｌ４のナトリウム塩という）の製造
NeuAc〜Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、NeuAcはＮ−アセチルノイラミン酸残基を、6Sは6-O-硫酸エステルをそれぞれ表す。また〜はα2,3結合又はα2,6結合を表す；ＷＯ９６／１６９７３参照）１ｇを0.1 M 硫酸 10 mlに溶解させ、50℃で22時間保温することによりＮ−アセチルノイラミン酸残基(シアル酸残基)を切断した。反応後の溶液に1 M NaOHを少量加えてpH5に調整した後、0.5 M 酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5を１ml、20％アジ化ナトリウムを25μl加えた。ラクターゼ(ケイアイ化成製) 5000 Uを加えて37℃で22時間保温することによりガラクトース残基を切断した。反応溶液を蒸留水で５倍希釈し、1 M NaClで平衡化したムロマックカラム(室町化学工業)(2.5×24 cm)にアプライした。1 M NaCl(500ml)から2.5 M NaCl(500ml)の塩濃度勾配をカラムに負荷し、溶出液を５mlづつ分取した。溶出画分をキャピラリー電気泳動で分析し、Ｇ４Ｌ４の溶出位置を確認した。Ｇ４Ｌ４を含む画分を集めてロータリーエバポレーターで約10 mlに濃縮した。濃縮溶液を蒸留水で平衡化したセルロファインGCL25sfカラム(生化学工業)(3×60 cm)にアプライし、蒸留水で溶出した。10 mlづつ分取した溶出画分をキャピラリー電気泳動で分析し、Ｇ４Ｌ４の溶出位置を確認した。Ｇ４Ｌ４を含む画分を集めてロータリーエバポレーターで約20 mlに濃縮した。分子量カット10000の限外ろ過膜でろ過してエンドトキシンを除去した後、凍結乾燥して最終サンプルとした。
【０１２６】
最終サンプルはキャピラリー電気泳動で単一ピークを示した。ヘキソース含量と硫酸含量の測定をおこなった結果、理論値１に対して各0.84、0.91の値を得た。
【０１２７】
また、最終サンプルを下記条件で高速液体クロマトグラフィーにかけた結果、保持時間１６．４分に単一ピークを示した。
【０１２８】
カラム：YMC-Pack PolyamineII (4.6×250 mm)((株)ワイエムシイ製)
カラム温度：３５℃
溶出液：150 mMリン酸二水素ナトリウム
流速：１ ml/分
測定波長：210 nm
サンプル：10 mg/mlＧ４Ｌ４(最終サンプル)
【０１２９】
また、最終サンプルのＮＭＲ測定の結果を以下に示す。
【０１３０】
400 MHz 1H-NMR(D2O, t-BuOH, at 22.9℃) δ：
2.024(s, 3H, NAc) 2.030(s, 3H, NAc) 4.526(d, 1H, J1,2=7.8 Hz, H-1b) 4.699(d, 1H, J1,2=8.8 Hz, H-1c) 4.729(d, 0.4H, J1,2=7.8 Hz, H-1aβ) 5.211(d, 0.6H, J1,2=2.5 Hz, H-1aα)
100 MHz 13C-NMR(D2O, t-BuOH, at 26.0℃) δ：
24.74(NHCOCH3), 25.05(NHCOCH3), 69.62(C-6a or b or c), 69.77(C-6b or c or a), 70.57(C-6c or a or b), 93.31(C-1aα), 97.82(C-1aβ), 105.80(C-1b or c), 105.91(C-1c or b)
【０１３１】
【実施例３】
2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール二ナトリウム塩の合成
図５に概略を示す手順により、2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール二ナトリウム塩を合成した。
物質名の後の番号は、図５における化合物の番号を示す。
【０１３２】
(a) 2,4-ジ-O-アセチル-3,6-ジ-O-アリル-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ- O-テトラデシル-sn-グリセロール(2,4-di-O-acetyl-3,6-di-O-allyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol)３
2,3-ジ- O-テトラデシル-sn-グリセロール(500 mg, 1.03 mmol)、シクロペンタジエンハフノニウムダイクロライド(782 mg, 2.68 mmol)、シルバートリフレート(1.06 g, 5.36 mmol)、モレキュラーシーブ4A(1.8 g)を１,2-ジクロロエタン(3.0 ml)に懸濁し、アルゴンガス気流下室温で攪拌後、-15℃に冷却し  化合物１(536 mg, 1.55 mmol)を加え2.5時間攪拌した。反応液をトリエチルアミンを加え中和し、酢酸エチル(AcOEt)で希釈後、セライトでろ過し、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:AcOEt=10:1)にて精製し、化合物３(716.7 mg, 85.8%)を得た。
【０１３３】
Rf     0.58(トルエン:AcOEt=6:1)
C47H85O10     MW : 810.179
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.887 (m, 1H, Allyl),  5.816 (m, 1H, Allyl),  5.500 (d, 1H, J = 2.4Hz, H-4), 5.108 (dd, 1H, J = 8.3, 9.9Hz, H-2), 4.474 (d, 1H, J = 8.3Hz, H-1), 2.165, 2.015 (2s, 6H, 2Ac), 0.912 (t, 6H, J = 6.3Hz, 2CH3)
【０１３４】
(b) 3,6-ジ-O-アリル-2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール(3,6-di-O-allyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol)５
化合物３(430 mg, 0.531 mmol)をメタノールとテトラヒドロフランとの混合液(1:1、4 mL)に溶解し、1 N水酸化ナトリウム溶液(0.8 mL)を加え室温で1日間攪拌後、その反応液をアンバーリスト15E (H+)タイプで中和し、セライトでろ過後、ろ液を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:AcOEt=5:2)にて精製し、化合物４(377.9 mg, 98.0%)を得た。
[Rf     0.43(トルエン:AcOEt=2:1)]
【０１３５】
続いて、化合物４(778 mg, 1.072 mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(3 ml)に溶解し、アルゴンガス気流下-15℃で、水素化ナトリウム(308 mg, 6.99 mmol)を加え攪拌した。続いてベンジルブロマイド(0.84 ml, 6.99 mmol)を加え、徐々に室温にしながら3時間攪拌した。反応液にメタノールを加え中和し、酢酸エチルで希釈後、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:AcOEt=12:1)にて精製し、化合物５(864 mg, 89%)を得た。
【０１３６】
Rf     0.67(ヘキサン:AcOEt=6:1)
C57H93O8     MW : 906.354
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.845 (m, 1H, Allyl),  5.771 (m, 1H, Allyl), 4.859 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.816 (d, 1H, J = 10.8 Hz, Bn), 4.665 (d, 1H, J = 10.7 Hz, Bn), 4.572 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn),  4.272 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1), 3.773 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H-4), 3.660 (dd, 1H, J = 7.8, 9.8 Hz, H-2), 0.801 (t, 6H, J = 6.4 Hz, 2CH3).
【０１３７】
(c) 2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール(2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol)６
イリジウムコンプレックス (1,5-シクロオクタジエンビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウムヘキサフルオロホスフェート) (112 mg, 0.096 mmol)をテトラヒドロフラン(5 mL)に懸濁し、H2気流下攪拌し活性化させた。その溶液に化合物５(864 mg, 0.95 mmol)をテトラヒドロフラン(5 mL)に溶解させて加え、アルゴンガス気流下室温で2時間攪拌後、ヨウ素(484 mg)、水(24.7 mL)、テトラヒドロフラン(15 mL)を加えさらに2時間室温で攪拌した。反応液をクロロホルムで希釈後、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:EtOAc=5:2) にて精製し、化合物６(686.6 mg, 87.1%)を得た。
【０１３８】
Rf     0.32(トルエン:AcOEt=2:1)
C51H85O8     MW: 826.225
1H-NMR (CDCl3) δ：
4.991 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.834 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.658 (d, 2H, J = 11.2 Hz, 2Bn), 4.385 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1), 3.778 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H-4), 0.881 (t, 6H, J = 6.8 Hz, 2CH3)
【０１３９】
(d) 2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ- O-テトラデシル-sn-グリセロール(2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di- O-tetradecyl-sn-glycerol)７
化合物６(687 mg, 0.831 mmol)をピリジン(12 mL)を加え溶解させ、その溶液にピバロイルクロライド(130μL, 1.08 mmol)を加え-5℃にて1時間攪拌後、さらにピバロイルクロライド(130μL, 1.08 mmol)を加え-5℃にて1時間攪拌した。反応液を、酢酸エチルで希釈後、セライトでろ過し、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:AcOEt=10:1)にて精製し、化合物７(716.6 mg, 94.7%)を得た。
【０１４０】
Rf     0.57(トルエン:AcOEt=6:1)
C56H93O9     MW : 910.342
1H-NMR (CDCl3) δ：
4.991 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.855 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.650 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.646 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.365 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1), 4.302 (dd, 1H, J = 6.8, 11.8 Hz, H-6), 4.109 (dd, 1H, J = 6.4, 11.2 Hz, H-6'), 3.775 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H-4), 1.179 (s, 9H, piv), 0.879 (t, 6H, J = 6.8 Hz, 2CH3)
【０１４１】
(e) 3-O-アセチル-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール(3-O-acetyl-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol)８
化合物７(10.8 mg, 11.9μmol)をピリジン(1 mL)を加え溶解させ、その溶液に無水酢酸(0.5 mL)を加え室温で1時間攪拌した。溶媒をトルエンで共沸後、残渣をセファデックスLH-20(CHCl3:MeOH=1:2)にて精製し、化合物８(11.3 mg, qu.)を得た。
【０１４２】
Rf     0.46(トルエン:AcOEt=8:1)
C58H95O10     MW : 952.379
1H-NMR (CDCl3) δ：
4.900 (dd, 1H, J = 3.4, 10.3 Hz, H-3), 4.882 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.634 (d, 2H, J = 12.2 Hz, 2Bn), 4.543 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.437 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1), 4.299 (dd, 1H, J = 6.8, 11.2 Hz, H-6), 4.087 (dd, 1H, J = 6.8, 11.2 Hz, H-6'), 3.850 (d, 1H, J = 2.9 Hz, H-4), 3.765 (dd, 1H, J = 7.8, 10.3 Hz, H-2), 1.926 (s, 3H, Ac), 1.188 (s, 9H, piv), 0.881 (t, 6H, J = 6.8 Hz, 2CH3)
【０１４３】
(f) 3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-6-O-レブロイル-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール(3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-6-O-levloyl-2-phtalimido-β-D-gulcopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol)９
化合物７(685 mg, 0.752 mmol)、シクロペンタジエンハフノニウムダイクロライド(571 mg, 1.96 mmol)、シルバートリフレート(771 g, 3.91 mmol)、モレキュラーシーブ4A(2.5 g)を１,2-ジクロロエタン(10 ml)に懸濁し、アルゴンガス気流下室温で攪拌後、-15℃に冷却し化合物２(563 mg, 0.98 mmol)を加え1時間攪拌した。反応液をトリエチルアミンを加え中和し、酢酸エチルで希釈後、セライトでろ過し、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:AcOEt=9:1)にて精製し、化合物９(1.01 g, 91.5%)を得た。
【０１４４】
Rf     0.44(トルエン:AcOEt=6:1)
C89H124O17N     MW : 1479.949
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.461 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-1b), 4.941 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.874 (d, 1H, J = 10.7 Hz, Bn), 4.789 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.648 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.536 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.460 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.414 (d, 2H, J = 11.7 Hz, 2Bn), 4.223 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1a), 3.897 (d, 1H, J = 3.2 Hz, H-4a), 2.130 (s, 3H, CH3), 1.153 (s, 9H, piv), 0.881 (t, 6H, J = 6.6 Hz, 2CH3)
【０１４５】
(g) 2-アセトアミド-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール(2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-β-D-gulcopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol)１０
化合物９(977.4 mg, 0.667 mmol)をエタノール(33.5 mL)に懸濁し、ヒドラジン水和物(3.35 mL)を加え、110℃で18時間攪拌した。溶媒を留去し、得られたアミノ体をピリジン (6.0 mL)に溶解し、無水酢酸(5.0 mL)を加え室温で17時間攪拌後、溶媒を留去した。残渣をメタノールとテトラヒドロフランとの混合液(1:1、20.0 mL)に溶解し、ナトリウムメトキシド(108 mg, 2.0 mmol)を加え、60℃で1時間攪拌した。その反応液をアンバーリスト15E (H+)タイプで中和し、セライトでろ過後、ろ液を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:アセトン:CHCl3=5:2:1)にて精製し、さらにセファデックスLH-20(CHCl3:MeOH=2:3)による精製を行い、化合物１０(756 mg, 94.8%)を得た。
【０１４６】
Rf     0.18(トルエン:アセトン:CHCl3=6:2:1)
C73H110O13N     MW : 1209.666
1H-NMR (CDCl3) δ：
4.823 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-1b), 4.354 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-1a), 1.497 (s, 3H, NHAc), 0.881 (t, 6H, J = 6.4 Hz, 2CH3)
13C-NMR (CDCl3+CD3OD) δ：
173.06 (Me-CO), 105.51, 104.01 (C-1x2), 62.80, 62.51 (C-6x2)
【０１４７】
(h) 2-アセトアミド-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール二ナトリウム塩(2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-gulcopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol disodium salt)１１
化合物１０(200 mg, 0.165 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(1.5 mL)に溶解し、(C2H5)3NSO3(300 mg, 1.65 mmol)を加え、50℃で0.5時間攪拌した。その反応液を直接セファデックスLH-20(CHCl3:MeOH=2:3)にて精製した。その溶媒をある程度留去し、残渣に水(2.0 mL)及びDowex-50 (Na+)タイプを加え、一昼夜攪拌し、セライトでろ過後、ろ液を留去した。残渣をDowex-50 (Na+)タイプのカラム(CHCl3:MeOH:H2O=5:10:3)にて精製し、化合物１１(215 mg, 92.2%)を得た。
【０１４８】
Rf     0.38(CHCl3:MeOH=6:1)
C73H108O19NS2Na2     MW : 1413.74
1H-NMR (CDCl3+CD3OD) δ：
4.403 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1a), 1.593 (s, 3H, NHAc), 0.889 (t, 6H, J = 6.4 Hz, 2CH3)
13C-NMR (CDCl3+CD3OD) δ：
172.93 (Me-CO), 105.24, 104.01 (C-1x2), 68.13, 68.00 (C-6x2)
【０１４９】
(i) 2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシル-(1→1)-2,3-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセロール二ナトリウム塩(2-acetamido-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-gulcopyranosyl-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol disodium salt)１２
化合物１１(200 mg, 0.141 mmol)をメタノールと水との混合液(3:1、15 mL)に溶解し、水酸化パラジウム-カーボン(200 mg)を加え、水素ガスで置換し室温で4時間接触還元を行った。反応液をセライトでろ過し、ろ液を留去した。残渣をセファデックスLH-20(CHCl3:MeOH:H2O=5:10:3)のカラムにて精製した。さらにDowex-50 (Na+)タイプのカラム(CHCl3:MeOH:H2O=1:3:1)による精製を行い、最後にセファデックスLH-20 (CHCl3:MeOH:H2O=5:10:3)による再カラム精製を行い、化合物１２(119.6 mg, 80.5%)を得た。
【０１５０】
Rf     0.52(CHCl3:MeOH:H2O=12:8:1)
C45H84O19NS2Na2     MW : 1053.24
1H-NMR (DMSO+D2O)δ：
4.666 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-1b), 4.162 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1a), 4.067 (b.dd, 1H, H-6b), 4.006-3.924 (b.dd, 1H, H-6a), 1.882 (s, 3H, NHAc), 0.861 (t, 6H, J = 6.8 Hz, 2CH3)
13C-NMR (DMSO+D2O)δ：
171.32 (Me-CO), 103.49, 102.37 (C-1x2), 65.91, 65.85 (C-6x2)
【０１５１】
【実施例４】
オクチル 2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシド二ナトリウム塩の合成
図６に概略を示す手順により、オクチル 2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシド二ナトリウム塩を合成した。
物質名の後の番号は、図６における化合物の番号を示す。
【０１５２】
(a) オクチル 2,4-ジ-O-アセチル-3,6-ジ-O-アリル-β-D-ガラクトピラノシド(octyl 2,4-di-O-acetyl-3,6-di-O-allyl-β-D-galactopyranoside)１３
オクタノール(300 mg, 2.30 mmol)、シクロペンタジエンハフノニウムダイクロライド(1.75 g, 5.99 mmol)、シルバートリフレート(2.36 g, 12.0 mmol)、モレキュラーシーブ4A(2.3 g)を１,2-ジクロロエタン(5.0 ml)に懸濁し、アルゴンガス気流下室温で攪拌後、-15℃に冷却し化合物１(1.2 g, 3.47 mmol)を加え2.5時間攪拌した。反応液をトリエチルアミンを加えて中和し、酢酸エチルで希釈後、セライトでろ過し飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:AcOEt=10:1)にて精製し、化合物１３(0.8 g, 76%)を得た。
【０１５３】
0004913272.tif 000016
C24H40O8     MW : 456.572
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.855 (m, 1H, Allyl), 5.784 (m, 1H, Allyl), 5.472 (d, 1H, J = 3.4 Hz, H-4), 5.086 (dd, 1H, J = 7.8, 9.8 Hz, H-2), 4.394 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1), 2.125, 2.066 (2s, 6H, 2Ac), 0.879 (t, 3H, J = 6.8 Hz, CH3)
【０１５４】
(b) オクチル 3,6-ジ-O-アリル-2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシド(octyl 3,6-di-O-allyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoside)１５
化合物１３ (0.8 g, 1.75 mmol)をメタノールとテトラヒドロフランとの混合液(1:1、5 mL)に溶解し、1N-水酸化ナトリウム溶液(1.0 mL)を加え室温で1日間攪拌後、その反応液をアンバーリスト15E (H+)タイプで中和し、セライトでろ過後、ろ液を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:AcOEt=5:2)にて精製し、化合物１４(585 g, 89.7%)を得た。
[Rf     0.32(トルエン:AcOEt=2:1)]
【０１５５】
続いて、化合物１４(585 mg, 1.57 mmol)、N,N-ジメチルホルムアミド(3 ml)に溶解し、アルゴンガス気流下-15℃で、水素化ナトリウム(451 mg, 10.2 mmol)を加え攪拌した。続いてベンジルブロマイド(1.22 ml, 10.2 mmol)を加え、徐々に室温にしながら3時間攪拌した。反応液にメタノールを加え中和し、酢酸エチルで希釈後、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:AcOEt=15:1)にて精製し、化合物１５(811 mg, 93.5%)を得た。
【０１５６】
Rf     0.79(ヘキサン:AcOEt=6:1)
C34H48O6     MW : 552.747
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.947 (m, 1H, Allyl), 5.849 (m, 1H, Allyl), 4.959 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.915 (d, 1H, J = 10.7 Hz, Bn), 4.765 (d, 1H, J = 10.7 Hz, Bn), 4.660 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.346 (d, 1H, J = 7.6 Hz, H-1), 0.887 (t, 3H, J = 6.4 Hz, CH3)
【０１５７】
(c) オクチル 2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシド(octyl 2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoside)１６
イリジウムコンプレックス (1,5-シクロオクタジエンビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウムヘキサフルオロホスフェート) (172 mg, 0.15 mmol) をテトラヒドロフラン(5 mL)に懸濁し、H2気流下攪拌し活性化させた。その溶液に化合物１５(811 mg, 1.47 mmol)をテトラヒドロフラン(5 mL)に溶解させて加え、アルゴンガス気流下室温で1時間攪拌後、ヨウ素(745 mg)、水(38 mL)及びテトラヒドロフラン(15 mL)を加えさらに1時間室温で攪拌した。反応液をクロロホルムで希釈後、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:EtOAc=5:2) にて精製し、化合物１６を(589 mg, 82.1%)得た。
【０１５８】
Rf     0.35(トルエン:AcOEt=2:1)
C28H40O6     MW : 472.618
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.000 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.843 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.674 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.662 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.360 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1), 3.776 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-4), 0.868 (t, 3H, J = 6.8 Hz, CH3)
【０１５９】
(d) オクチル 2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシド(octyl 2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranoside)１７
化合物１６(569 mg, 1.20 mmol)をピリジン(17 mL)を加えて溶解させ、その溶液にピバロイルクロライド(188μL, 1.57 mmol)を加え-5℃にて1時間攪拌後、さらにピバロイルクロライド(188μL, 1.57mmol)を加え-5℃にて1時間攪拌した。反応液を、酢酸エチルで希釈後、セライトでろ過し飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:AcOEt=10:1)にて精製し、化合物１７(648 mg, 96.7%)を得た。
【０１６０】
Rf     0.56(トルエン:AcOEt=6:1)
C33H48O7     MW : 556.735
1H-NMR (CDCl3) δ：
4.986 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.838 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.664 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.653 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.332 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1), 4.316 (dd, 1H, J = 6.8, 11.7 Hz, H-6), 4.113 (dd, 1H, J = 6.7, 11.0 Hz, H-6'), 3.772 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H-4), 1.180 (s, 9H, piv), 0.867 (t, 3H, J = 6.8 Hz, CH3)
【０１６１】
(e) オクチル 3-O-アセチル-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシド(octyl 3-O-acetyl-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranoside)１８
化合物１７(10 mg, 18.0μmol)をピリジン(1 mL)を加えて溶解させ、その溶液に無水酢酸(0.5 mL)を加え室温で2時間攪拌した。溶媒をトルエンで共沸後、残渣をセファデックスLH-20(CHCl3:MeOH=1:2)にて精製し、化合物１８(11 mg, qu.)を得た。
【０１６２】
Rf     0.58(トルエン:AcOEt=8:1)
C35H50O8     MW : 598.772
1H-NMR  (CDCl3) δ：
4.903 (dd, 1H, J = 3.2, 10.0 Hz, H-3), 4.883 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.645 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.638 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.545 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.405 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1), 4.311 (dd, 1H, J = 6.8, 10.8 Hz, H-6), 4.087 (dd, 1H, J = 6.8, 10.7 Hz, H-6'), 3.847 (d, 1H, J = 2.9 Hz, H-4), 3.769 (dd, 1H, J = 7.8, 10.3 Hz, H-2), 1.937 (s, 3H, Ac), 1.188 (s, 9H, piv), 0.870 (t, 3H, J = 6.8 Hz, CH3)
【０１６３】
(f) オクチル 3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-6-O-レブロイル-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシド(octyl 3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-6-O-levloyl-2-phtalimido-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranoside)１９
化合物１７(624 mg, 1.12 mmol)、シクロペンタジエンハフノニウムダイクロライド(850 mg, 2.91 mmol)、シルバートリフレート(1.15 g, 5.82 mmol)、モレキュラーシーブ4A(3.2 g)を１,2-ジクロロエタン(10 ml)に懸濁し、アルゴンガス気流下室温で攪拌後、-15℃に冷却し  化合物２(838 mg, 1.46 mmol)を加え1時間攪拌した。反応液をトリエチルアミンを加え中和し、酢酸エチルで希釈後、セライトでろ過し飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:AcOEt=10:1)にて精製し、化合物１９(1.03 g, 82.9%)を得た。
【０１６４】
Rf     0.47(トルエン:AcOEt=6:1)
C66H79O15N     MW : 1126.342
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.475 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-1b), 4.189 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1a), 3.874 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H-4a), 2.133 (s, 3H, CH3), 1.153 (s, 9H, piv), 0.826 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH3)
【０１６５】
(g) オクチル 2-アセトアミド-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシド(octyl 2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoside)２０
化合物１９(1.0 g, 0.899 mmol)をエタノール(45 mL)に懸濁し、ヒドラジン水和物(4.5 mL)を加え、110℃で18時間攪拌した。溶媒を留去し、得られたアミノ体をピリジン (5.0 mL)に溶解し、無水酢酸(4.0 mL)を加え室温で17時間攪拌後、溶媒を留去した。残渣をメタノールとテトラヒドロフランとの混合液(1:1、20.0 mL)に溶解し、ナトリウムメトキシド(146 mg, 2.7 mmol)を加え、60℃で1時間攪拌した。その反応液をアンバーリスト15E (H+)タイプで中和し、セライトでろ過後、ろ液を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:アセトン=2.3:1)にて精製し、さらにセファデックスLH-20(CHCl3:MeOH=2:3)による精製を行い、化合物２０(739 mg, 96%)を得た。
【０１６６】
Rf     0.49(トルエン:アセトン=3:2)
C50H65O11N     MW : 856.06
1H-NMR  (CDCl3) δ：
4.840 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-1b), 4.329 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-1a), 1.515 (s, 3H, NHAc), 0.848 (t, 3H, J = 6.8 Hz, CH3)
13C-NMR (CDCl3+CD3OD) δ：
173.17 (Me-CO), 105.32, 104.01 (C-1x2), 62.82, 62.55 (C-6x2)
【０１６７】
(h) オクチル 2-アセトアミド-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシド二ナトリウム塩(octyl 2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-sulfo-β-D-galactopyranoside disodium salt)２１
化合物２０(150 mg, 0.175 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(1.5 mL)に溶解し、(C2H5)3NSO3(319 mg, 1.75 mmol)を加え、50℃で0.5時間攪拌した。その反応液を直接セファデックスLH-20(CHCl3:MeOH=2:3)にて精製した。溶出液の溶媒をある程度留去し、残渣に水(2.0 mL)、Dowex-50 (Na+)タイプを加え、一昼夜攪拌し、セライトでろ過後、ろ液を留去した。残渣をDowex-50 (Na+)タイプのカラム(CHCl3:MeOH:H2O=5:10:3)にて精製し、化合物２１(185 mg, 99.6%)を得た。
【０１６８】
Rf     0.23(CHCl3:MeOH=6:1)
C50H63O17NS2Na2     MW : 1060.134
1H-NMR (CDCl3+CD3OD) δ：
4.382 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1a), 1.634 (s, 3H, NHAc), 0.854 (t, 3H, J = 6.8 Hz, CH3)
13C-NMR (CDCl3+CD3OD) δ：
173.03 (Me-CO), 105.10, 103.99 (C-1x2), 68.18 (C-6x2)
【０１６９】
(i) オクチル 2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシド二ナトリウム塩(octyl 2-acetamido-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranoside disodium salt)２２
化合物２１(170 mg, 0.160 mmol)をメタノールと水との混合液(3:1、15 mL)に溶解し、水酸化パラジウム-カーボン(180 mg)を加え、水素ガスで置換し室温で4時間接触還元を行った。反応液をセライトでろ過し、ろ液を留去した。残渣をセファデックスLH-20 (CHCl3:MeOH:H2O=5:10:3)のカラムにて精製した。さらにDowex-50 (Na+)タイプのカラム(CHCl3:MeOH:H2O=1:3:1)による精製を行い、最後にセファデックスLH-20 (CHCl3:MeOH:H2O=5:10:3)による再カラム精製を行い、化合物２２(101.4 mg, 90.6%)を得た。
【０１７０】
Rf     0.30(CHCl3:MeOH:H2O=12:6:1)
C22H39O17NS2Na2     MW : 699.636
1H-NMR (DMSO+D2O)δ：
4.655 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-1b), 4.136 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1a), 4.053 (dd, 1H, J = 2.0, 11.7 Hz, H-6b), 3.956-3.851 (b.dd, 1H, H-6a), 1.869 (s, 3H, NHAc), 0.861 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH3)
13C-NMR (DMSO+D2O)δ：
171.19 (Me-CO), 102.98, 102.30 (C-1x2), 66.09, 65.87 (C-6x2)
【０１７１】
【実施例５】
コレスタニル 2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシド二ナトリウム塩、およびコレスタニル 2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-β-D-ガラクトピラノシドの合成
図７に概略を示す手順により、コレスタニル 2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシド二ナトリウム塩、およびコレスタニル 2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-β-D-ガラクトピラノシドを合成した。
物質名の後の番号は、図７における化合物の番号を示す。
【０１７２】
(a) コレスタニル 2,4-ジ-O-アセチル-3,6-ジ-O-アリル-β-D-ガラクトピラノシド(cholestanyl 2,4-di-O-acetyl-3,6-di-O-allyl-β-D-galactopyranoside)２３
コレスタノール(700 mg, 1.80 mmol)、シクロペンタジエンハフノニウムダイクロライド(1.37 g, 4.68 mmol)、シルバートリフレート(1.85 g, 9.37 mmol)、モレキュラーシーブ4A(2.7 g)を１,2-ジクロロエタン(7.0 ml)に懸濁し、アルゴンガス気流下室温で攪拌後、-10℃に冷却し、化合物１(936 mg, 2.70 mmol)を加え2.5時間攪拌した。反応液を、トリエチルアミンを加えて中和し、酢酸エチルで希釈後、セライトでろ過し、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:AcOEt=10:1)にて精製し、化合物２３(970 mg, 75.3%)を得た。
【０１７３】
Rf     0.57(トルエン:AcOEt=6:1)
C43H70O8     MW : 715.018
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.880 (m, 1H, Allyl), 5.802 (m, 1H, Allyl), 5.480 (d, 1H, J = 3.4 Hz, H-4), 5.072 (dd, 1H, J = 8.3, 10.3 Hz, H-2), 4.510 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-1), 2.150, 2.095 (2s, 6H, 2Ac), 0.922 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3), 0.890 (d, 3H, J = 6.8 Hz, CH3), 0.885 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3), 0.800, 0.667 (2s, 6H, 2CH3)
【０１７４】
(b) コレスタニル 3,6-ジ-O-アリル-2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシド(cholestanyl 3,6-di-O-allyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoside)２５
化合物２３(0.98 g, 1.37 mmol)をメタノールとテトラヒドロフランとの混合液 (1:1、10 mL)に溶解し、1 N 水酸化ナトリウム溶液(1.0 mL)を加え室温で1日間攪拌後、さらにナトリウムメトキサイド (74 mg, 1.37 mmol) を加え室温で2時間攪拌した。その反応液をアンバーリスト15E (H+)タイプで中和し、セライトでろ過後、ろ液を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:AcOEt=5:2)にて精製し、化合物２４(0.83 g, 96%)を得た。
[Rf     0.33(トルエン:AcOEt=2:1)]
【０１７５】
続いて、化合物２４(838 mg, 1.32 mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(8 ml)に溶解し、アルゴンガス気流下0℃で、水素化ナトリウム(378 mg, 8.58 mmol)を加え攪拌した。続いてベンジルブロマイド(1.02 ml, 8.58 mmol)を加え、徐々に室温にしながら3時間攪拌した。さらに水素化ナトリウム(378 mg, 8.58 mmol)及びベンジルブロマイド(1.02 ml, 8.58 mmol)を加え、18時間攪拌した。反応液にメタノールを加え中和し、酢酸エチルで希釈後、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:AcOEt=13:1)にて精製し、化合物２５(0.94 g, 88.1%)を得た。
【０１７６】
Rf     0.72(ヘキサン:AcOEt=6:1)
C53H78O6     MW : 811.193
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.935 (m, 1H, Allyl), 5.836 (m, 1H, Allyl), 4.931 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.903 (d, 1H, J = 10.7 Hz, Bn), 4.739 (d, 1H, J = 10.7 Hz, Bn), 4.639 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.438 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1), 3.829 (d, 1H, J = 2.9 Hz, H-4), 3.719 (dd, 1H, J = 7.8, 9.8 Hz, H-2), 3.397 (dd, 1H, J = 2.9, 9.8 Hz, H-3), 0.893 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3), 0.862 (d, 3H, J = 6.8 Hz, CH3), 0.858 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3), 0.799, 0.641 (2s, 6H, 2CH3)
【０１７７】
(c) コレスタニル 2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシド(cholestanyl 2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoside)２６
イリジウムコンプレックス (1,5-シクロオクタジエンビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウムヘキサフルオロホスフェート) (136 mg, 0.12 mmol) をテトラヒドロフラン(5 mL)に懸濁し、H2気流下攪拌し活性化させた。その溶液に、化合物２５(940 mg, 1.16 mmol)をテトラヒドロフラン(5 mL)に溶解させて加え、アルゴンガス気流下室温で1時間攪拌後、ヨウ素(588 mg)、水(30 mL)及びテトラヒドロフラン(15 mL)を加えさらに1.5時間室温で攪拌した。反応液をクロロホルムで希釈後、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:アセトン=6:1)にて精製し、化合物２６を(748 mg, 88.2%)得た。
【０１７８】
Rf     0.49(トルエン:アセトン=4:1)
C47H70O6     MW : 731.064
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.006 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.823 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.678 (d, 1H, J = 10.7 Hz, Bn), 4.650 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.476 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-1)
【０１７９】
(d) コレスタニル 2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシド(cholestanyl 2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranoside)２７
化合物２６(647 mg, 0.885 mmol)をピリジン(13 mL)に溶解させ、その溶液にピバロイルクロライド(138μL, 1.15 mmol)を加え-5℃から0℃にて0.5時間攪拌後、さらにピバロイルクロライド(138μL, 1.15 mmol)を加え-5℃から0℃にて1時間攪拌した。反応液を、酢酸エチルで希釈後、セライトでろ過し飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:AcOEt=10:1)にて精製し、化合物２７(663 mg, 91.9%)を得た。
【０１８０】
Rf     0.56(トルエン:AcOEt=6:1)
C52H78O7     MW : 815.181
1H-NMR (CDCl3) δ：
4.993 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.821 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.667 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.642 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.450 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1), 4.293 (dd, 1H, J = 6.8, 11.2 Hz, H-6), 4.083 (dd, 1H, J = 6.3, 10.8 Hz, H-6'), 3.746 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-4), 1.176 (s, 9H, piv)
【０１８１】
(e) コレスタニル 3-O-アセチル-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシド(cholestanyl 3-O-acetyl-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranoside)２８
化合物２７(10 mg, 12.3μmol)をピリジン(1 mL)に溶解させ、その溶液に無水酢酸(0.5 mL)を加え室温で1時間攪拌した。溶媒をトルエンで共沸後、残渣をセファデックスLH-20(CHCl3:MeOH=1:2)にて精製し、化合物２８(9 mg, 85.4%)を得た。
【０１８２】
Rf     0.65(トルエン:AcOEt=8:1)
C54H80O8     MW : 857.218
1H-NMR (CDCl3) δ：
4.889 (dd, 1H, J = 2.7, 10.5 Hz, H-3), 4.885 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.647 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.625 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.533 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.518 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1), 4.289 (dd, 1H, J = 6.8, 11.2 Hz, H-6), 4.061 (dd, 1H, J = 6.3, 11.2 Hz, H-6'), 3.766 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H-4), 3.753 (dd, 1H, J = 7.3, 10.3 Hz, H-2), 1.924 (s, 3H, Ac), 1.185 (s, 9H, piv)
【０１８３】
(f) コレスタニル 3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-6-O-レブロイル-2-フタルイミド-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-ピバロイル-β-D-ガラクトピラノシド(cholestanyl 3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-6-O-levloyl-2-phtalimido-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranoside)２９
化合物２７(737 mg, 0.904 mmol)、シクロペンタジエンハフノニウムダイクロライド(686 mg, 2.35 mmol)、シルバートリフレート(927 mg, 4.70 mmol)及びモレキュラーシーブ4A(2.5 g)を１,2-ジクロロエタン(10 ml)に懸濁し、アルゴンガス気流下室温で攪拌後、-15℃に冷却し  化合物２(676.5 mg, 1.18 mmol)を加え1時間攪拌した。反応液を、トリエチルアミンを加えて中和し、酢酸エチルで希釈後、セライトでろ過し飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:AcOEt=10:1)にて精製し、化合物２９(982.1 mg, 79.3%)を得た。
【０１８４】
Rf     0.58(トルエン:AcOEt=6:1)
0.07(ヘキサン:AcOEt=6:1)
C85H109O15N     MW : 1384.788
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.475 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-1b), 4.453 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1a), 3.852 (d, 1H, J = 2.9 Hz, H-4a), 2.133 (s, 3H, CH3), 1.146 (s, 9H, piv)
【０１８５】
(g) コレスタニル 2-アセトアミド-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-2,4-ジ-O-ベンジル-β-D-ガラクトピラノシド(cholestanyl 2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoside)３０
化合物２９(668 mg, 0.488 mmol)をエタノール(24.5 mL)に懸濁し、ヒドラジン水和物(2.45 mL)を加え、110℃で18時間攪拌した。溶媒を留去し、得られたアミノ体をピリジン (5.0 mL)に溶解し、無水酢酸(4.0 mL)を加え室温で17時間攪拌後、溶媒を留去した。残渣をメタノールとテトラヒドロフランとの混合液(1:1、10.0 mL)に溶解し、ナトリウムメトキシド(78.8 mg, 1.46 mmol)を加え、60℃で1時間攪拌した。その反応液をアンバーリスト15E (H+)タイプで中和し、セライトでろ過後、ろ液を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:アセトン=3:1)にて精製し、さらにセファデックスLH-20(CHCl3:MeOH=2:3)による精製を行い、化合物３０(534.2 mg, 99.6%)を得た。
【０１８６】
Rf     0.34(トルエン:アセトン=3:1)
C69H95O11N     MW : 1114.506
1H-NMR (CDCl3) δ：
5.044 (d, 1H, J = 12.2 Hz, NH), 4.875 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.851 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1b), 4.809 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.740 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.696 (d, 1H, J = 11.7 Hz, Bn), 4.672 (d, 1H, J = 12.2 Hz, Bn), 4.642 (d, 1H, J = 10.7 Hz, Bn), 4.571 (d, 1H, J = 11.2 Hz, Bn), 4.562 (d, 1H, J = 12.2 Hz, Bn), 4.439 (d, 1H, J = 6.4 Hz, H-1a), 1.524 (s, 3H, NHAc), 0.892 (d, 3H, J = 6.3 Hz, CH3), 0.860 (d, 3H, J = 6.8 Hz, CH3), 0.856 (d, 3H, J = 6.8 Hz, CH3), 0.760, 0.635 (2s, 6H, 2CH3)
13C-NMR (CDCl3+CD3OD) δ：
173.00 (Me-CO), 103.79, 103.06 (C-1x2), 62.77, 62.40 (C-6x2)
【０１８７】
(h) コレスタニル 2-アセトアミド-3,4-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-2,4-ジ-O-ベンジル-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシド二ナトリウム塩(cholestanyl 2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-sulfo-β-D-galactopyranoside disodium salt)３１
化合物３０(150 mg, 0.136 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(1.5 mL)に溶解し、(C2H5)3NSO3(247 mg, 1.36 mmol)を加え、50℃で0.5時間攪拌した。その反応液を直接セファデックスLH-20(CHCl3:MeOH=2:3)にて精製した。溶出液の溶媒をある程度留去し、残渣に水(2.0 mL)、Dowex-50 (Na+)タイプを加え、一昼夜攪拌し、セライトでろ過後、ろ液を留去した。残渣をDowex-50 (Na+)タイプのカラム(CHCl3:MeOH:H2O=5:10:3)にて精製し、化合物３１(175 mg, 97.3%)を得た。
【０１８８】
Rf     0.22(CHCl3:MeOH=8:1)
C69H93O17NS2Na2     MW : 1318.58
1H-NMR (CD3OD) δ：
4.523 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1a), 4.384 (dd, 1H, J = 2.0, 10.8 Hz, H-6b), 4.290 (dd, 1H, J = 4.4, 10.7 Hz, H-6a), 1.645 (s, 3H, NHAc), 0.910 (d, 3H, J = 6.8 Hz, CH3), 0.873 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3), 0.868 (d, 3H, J = 6.8 Hz, CH3), 0.730, 0.658 (2s, 6H, 2CH3)
13C-NMR (CDCl3+CD3OD) δ：
102.97, 102.55 (C-1x2), 68.47, 67.22 (C-6x2)
【０１８９】
(i) コレスタニル 2-アセトアミド-2-デオキシ-6-O-スルホ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-6-O-スルホ-β-D-ガラクトピラノシド二ナトリウム塩(cholestanyl 2-acetamido-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranoside disodium salt)３２
化合物３１(170 mg, 0.129 mmol)をメタノールと水との混合液(3:1、15 mL)に溶解し、水酸化パラジウム-カーボン(180 mg)を加え、水素ガスで置換し室温で4時間接触還元を行った。反応液をセライトでろ過し、ろ液を留去した。残渣をセファデックスLH-20 (CHCl3:MeOH:H2O=5:10:3)のカラムにて精製した。さらにDowex-50 (Na+)タイプのカラム(CHCl3:MeOH:H2O=1:3:1)による精製を行い、最後にセファデックスLH-20 (CHCl3:MeOH:H2O=5:10:3)による再カラム精製を行い、化合物３２(109.4 mg, 88.6%)を得た。
【０１９０】
Rf     0.47(CHCl3:MeOH:H2O=12:8:1)
C41H69O17NS2Na2     MW : 958.08
1H-NMR (CDCl3) δ：
4.727 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1b), 4.310 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1a), 4.093 (b.dd, 1H, H-6b), 4.010-3.924 (b.dd, 1H, H-6a), 1.926 (s, 3H, NHAc), 0.945 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3), 0.909 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3), 0.905 (d, 3H, J = 6.8 Hz, CH3), 0.827, 0.689 (2s, 6H, 2CH3)
13C-NMR (DMSO+D2O)δ：
170.88 (Me-CO), 102.21, 100.73 (C-1x2), 65.85, 65.65 (C-6x2)
【０１９１】
(j) コレスタニル 2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-β-D-ガラクトピラノシド(cholestanyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-galactopyranoside)３３
化合物３０(230 mg, 0.209 mmol)をメタノールと水と酢酸エチルとの混合液(4:1:1、25 mL)に溶解し、水酸化パラジウム-カーボン(230 mg)を加え、水素ガスで置換し室温で20時間接触還元を行った。反応液をセライトでろ過し、ろ液を留去した。残渣をセファデックスLH-20 (CHCl3:MeOH=1:1)のカラムにて精製し、化合物３３(126.1 mg, 81.5%)を得た。
【０１９２】
Rf     0.51(CHCl3:MeOH=3:1)
C41H71O11N     MW : 754.008
1H-NMR (C5D5N+D2O)δ：
5.383 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-1b), 4.825 (d, 1H, J = 7.3 Hz, H-1a), 2.059 (s, 3H, NHAc)
【０１９３】
【実施例６】
安全性試験および薬効薬理試験
本実施例においてはケラタン硫酸オリゴ糖として、Ｌ４のナトリウム塩、２つのＬ４がβ１−３結合により結合したケラタン硫酸４糖（Ｌ４Ｌ４）のナトリウム塩、Ｋ４のナトリウム塩（実施例１の化合物２８）、Ｋ２のナトリウム塩、及びＧ４Ｌ４のナトリウム塩を使用した（略号により示すオリゴ糖の構造については図８参照）。Ｌ４およびＬ４Ｌ４は、国際公開パンフレット第ＷＯ９６／１６９７３号に記載の方法により得た。
【０１９４】
なおＫ２のナトリウム塩は、以下の方法により得た。
牛角膜由来のケラタン硫酸１０ｇを１２０ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH 7.5)に溶解した。この液にシュードモナス(Pseudomonas sp.)由来ケラタナーゼ(生化学工業株式会社製)を１，０００ユニット加えて３７℃で５０時間分解を行った。反応終了後、１．３倍量のエタノールを加えて攪拌し、室温で一晩放置した。翌日、遠心分離（10,000rpm、２０分）により上清と沈殿を分離し、上清を減圧濃縮し、濃縮液を凍結乾燥して、乾燥物９ｇを得た。得られた凍結乾燥物を少量の蒸留水に溶解し、セルロファインＧＣＬ−９０ｍ(チッソ株式会社製)(4.5cmｘ125cm)を用い、食塩濃度０．２Ｍ液を溶出溶媒としてゲルクロマトグラフィーを行い、Ｋ２を含む画分を分取した。得られたＫ２画分を減圧濃縮し、セルロファインＧＣＬ−２５ｍ(チッソ株式会社製)(4.0cmｘ120cm)を用い蒸留水を溶出溶媒とし、ゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩し、凍結乾燥した。
【０１９５】
このＫ２を含む画分を少量の蒸留水に溶解し、予め蒸留水で平衡化したムロマック 1x4(200-400)(室町化学工業(株)製)(2.0cmｘ32cm)を用い、溶出溶媒に食塩を用い、食塩濃度を直線的に０から２Ｍに上昇させ、さらに精製したＫ２画分を分離溶出させた。得られたＫ２画分を減圧濃縮後、セルロファインＧＣＬ−２５ｍ(4.0cmｘ120cm)を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩し、凍結乾燥し、Ｋ２の乾燥物を１．９ｇを得た。
【０１９６】
（１）安全性試験
１．マウスを用いた単回投与毒性試験
正常マウス（１群５匹）にＫ４またはＧ４Ｌ４を２，０００ｍｇ／ｋｇの用量で単回静脈内投与し、１４日間一般症状を観察した。
【０１９７】
雌雄各群に死亡例は認められなかった。Ｋ４またはＧ４Ｌ４投与により雌雄の全例に投与直後から麻痺性歩行がみられたが、投与後約３分には全例が正常に回復した。体重では投与翌日に雄の投与群に軽微な体重減少がみられたが、その後は全例とも順調な体重増加を示した。剖検では全例ともＫ４またはＧ４Ｌ４投与に起因した異常は認められなかった。以上の結果から、Ｋ４およびＧ４Ｌ４の単回静脈内投与における最小死亡用量は２，０００ｍｇ／ｋｇ以上であると考えられる。従って、Ｋ４およびＧ４Ｌ４の単回静脈内投与におけるＬＤ50値は、雌雄ともに２，０００ｍｇ／ｋｇを超えるものである。
【０１９８】
２．モルモットを用いた抗原性試験
モルモットの背部皮下にＫ４またはＧ４Ｌ４を単独、あるいは免疫補助剤であるフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）との乳化物を３回注射して感作した。最終感作から１２日後にＫ４またはＧ４Ｌ４を静脈内投与して能動的全身性アナフィラキシー反応を惹起した。また、陽性対照として卵白アルブミン（ＯＶＡ）についても同様に試験した。
【０１９９】
以上の結果を投与量とともに表１に示した。Ｋ４またはＧ４Ｌ４で惹起したモルモットにアナフィラキシー反応は認められなかった。また試験系の陽性対照である卵白アルブミンではアナフィラキシー反応が認められた。以上の結果より、Ｋ４およびＧ４Ｌ４はモルモットにおける能動的全身性アナフィラキシー反応を誘発しないと考えられる。
【０２００】
【表１】
0004913272.tif 000017
【０２０１】
（２）薬効薬理試験
１．Ｃａ-イオノフォアーで誘発される血管透過性亢進に対する効果の検討
エーテル麻酔下でラットの背部を剃毛後、２％ＤＭＳＯに溶解したＣａ-イオノフォアー（A23187、和光純薬）溶液（１０μｇ／ｍｌ）０.１ｍｌを皮内の１カ所に投与した。陰性対照(control)として２％ＤＭＳＯ溶液０.１ｍｌを皮内の１カ所に投与した。被験物質は、Ｃａ-イオノフォアー溶液に溶解し、その０.１ｍｌを皮内の数カ所に投与した。直後に０.５％エバンスブルー１ｍｌを静脈内投与し、その３０分後にエーテル麻酔下で放血致死した。皮膚を剥離し、エバンスブルー漏出部位をトレパンで打ち抜き、これを色素漏出量の測定に供した。色素漏出量は Katayamaらの方法（Microbiol. Immunol., 22, 89-101 (1978)）に従って行った。すなわち採取した皮膚に１ＮＫＯＨを加えて一晩加水分解し、その後０.６ＮＨ3ＰＯ4含有アセトン溶液（５:１３の割合で混合）を加えて中和し遠心分離後、上清の吸光度（６２０ｎｍ）から色素漏出量を求めた。
【０２０２】
Ｌ４、Ｌ４Ｌ４、Ｋ４およびＫ２を被験物質としたときの結果を図９に示す。またＬ４およびＧ４Ｌ４を被験物質としたときの結果を図１０に示す。
【０２０３】
Ｌ４Ｌ４、Ｋ４およびＫ２は用量依存的に血管透過性の亢進を抑制し、それぞれ２.５〜１０ｍｇ／部位(site)、０.６３〜５ｍｇ／site、１.２５〜５ｍｇ／siteの濃度で有意な抑制効果を示した。抑制効果はＫ４が最も強く、次いでＫ２、Ｌ４Ｌ４の順であった。また、Ｇ４Ｌ４も血管透過性亢進の有意な抑制効果を示した。一方、Ｌ４は本モデルにおいて血管透過性の亢進をほとんど抑制しなかった。この結果から、Ｋ４、Ｋ２、Ｌ４Ｌ４およびＧ４Ｌ４は、血管透過性の亢進を抑制することにより抗アレルギー作用を発揮することが示唆される。特に、Ｋ４は優れた作用を発揮することが示唆される。
【０２０４】
本試験において、Ｌ４Ｌ４、Ｋ４、Ｋ２およびＧ４Ｌ４がＣａ-イオノフォアーによる血管透過性の亢進を有意に抑制したことから、その活性発現にはＫ２構造が重要で、さらにＫ４構造ではその作用が増すことが示唆された。またＬ４は抑制効果を示さなかったことから、本モデルではＬ４構造はあまり重要でないことが示唆された。一方、Ｌ４Ｌ４は２つのＬ４構造がβ-（１-３）結合したものだが、Ｋ４構造を有しているため本モデルにおいて抑制効果が認められたものと推察された。Ｌ４Ｌ４、Ｋ４、Ｋ２およびＧ４Ｌ４は膜安定化によるＣａ2+の細胞内への流入、もしくは脱顆粒化を阻害したことにより、または肥満細胞から分泌されたヒスタミン等を抑制したことにより、血管透過性の亢進を抑制することが示唆された。
【０２０５】
２．ＦＭＬＰ（N-ホルミル-Met-Leu-Phe）刺激によるモルモット好中球Ｏ2-産生に対する効果の検討
生理食塩液に溶解したグリコーゲンの０.２％水溶液を高圧蒸気滅菌後、ハートレー系雌性モルモットの腹腔内に２０ｍｌ投与した。１６時間後脱血死させ、ヘパリン１０Ｕ／ｍｌを含む生理食塩液２０ｍｌを腹腔内に注入し、腹腔浸出液を回収した。回収液を卓上遠心機を用いて１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈査に精製水を加えて３０秒間溶血させ、２倍濃度のハンクス液で等張にもどし、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈査をハンクス液に再懸濁し、遠心分離の操作を２回繰り返し好中球を得た。採取したモルモット好中球をハンクス液に懸濁し、血球測定装置（Sysmex K-2000）を用いて白血球数を測定し、ハンクス液で２×１０6個／ｍｌに希釈したものを細胞浮遊液として実験に用いた。
【０２０６】
細胞浮遊液１ｍｌと既知濃度の被験物質の溶液１０μｌ（対照(control)としては、ケラタン硫酸オリゴ糖を加えないものを用いた）とを混和し、３７℃で１時間プレインキュベートした後、１.６ｍＭのチトクロームＣ液５０μｌおよび０.１ｍＭのＦＭＬＰ１００μｌを順次加え混和した。これを３７℃で１０分間インキュベートし、氷冷して反応を停止し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清の吸光度を波長５５０ｎｍで測定した。なお上記の操作はインキュベートを除いて全て氷冷下で行った。
【０２０７】
Ｌ４、Ｌ４Ｌ４、Ｋ４およびＫ２を被験物質としたときの結果を図１１に示す。またＬ４およびＧ４Ｌ４を被験物質としたときの結果を図１２に示す。
【０２０８】
Ｌ４Ｌ４、Ｋ４およびＧ４Ｌ４は、０.０１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＦＭＬＰ刺激による好中球からのＯ2-産生(O2- generation)を顕著に抑制した。１ｍｇ／ｍｌでの抑制率は、それぞれ対照に対して５０.６％、４４.７％および５７.１％であった。Ｌ４とＫ２ではＯ2-産生抑制効果はほとんど認められなかった。この結果から、Ｌ４Ｌ４、Ｋ４およびＧ４Ｌ４は、好中球の活性酸素の産生を抑制することにより、抗炎症作用を発揮することが示唆される。
【０２０９】
本試験において、Ｌ４とＫ４は電荷、組成式および構成糖が等しいにもかかわらず、Ｋ４で抑制効果が認められ、さらにＬ４Ｌ４が抑制効果を示すのに対して構成糖であるＬ４では活性は認められなかった。Ｌ４Ｌ４、Ｋ４およびＧ４Ｌ４がＦＭＬＰ刺激によるモルモット好中球Ｏ2-産生を有意に抑制したことから、その活性発現にはＫ４構造が重要であることが示唆された。またＫ２は抑制効果を示さなかったことから、本モデルでは硫酸化の程度が重要であることが示唆された。Ｋ４構造を有するＬ４Ｌ４、Ｋ４およびＧ４Ｌ４はＧＴＰ結合蛋白質あるいはホスホリパーゼＣ等の刺激伝達系を阻害しているか、あるいはＦＭＬＰレセプターに直接拮抗して作用を発現している可能性が示唆された。
【０２１０】
【発明の効果】
本発明によれば、還元末端にガラクトース残基を有するケラタン硫酸オリゴ糖を効率よく製造することができる。特に、ガラクトース残基及び／又はＮ−アセチルグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されたケラタン硫酸オリゴ糖を提供できる。還元末端に、６位のヒドロキシル基が硫酸化されたガラクトース残基を有するケラタン硫酸オリゴ糖等は、優れた薬理効果を有し、安全で有効な新規医薬組成物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ケラタン硫酸の構造から予想されるケラタン硫酸二糖の構造を示す。
【図２】本発明のオリゴ糖の製造における出発材料の製造方法の一例の概略を示す。
【図３】本発明のオリゴ糖の製造における出発材料の製造方法の一例の概略を示す。
【図４】本発明のオリゴ糖の製造方法の一例の概略を示す。
【図５】本発明のオリゴ糖の製造方法の一例の概略を示す。
【図６】本発明のオリゴ糖の製造方法の一例の概略を示す。
【図７】本発明のオリゴ糖の製造方法の一例の概略を示す。
【図８】ケラタン硫酸オリゴ糖の構造を示す。
【図９】ケラタン硫酸オリゴ糖の血管透過性亢進に対する効果を示す。
【図１０】ケラタン硫酸オリゴ糖の血管透過性亢進に対する効果を示す。
【図１１】ケラタン硫酸オリゴ糖の好中球Ｏ2-産生に対する効果を示す。
【図１２】ケラタン硫酸オリゴ糖の好中球Ｏ2-産生に対する効果を示す。
【図１】
0004913272.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004913272.tif 000031
【図８】
0004913272.tif 000032
【図９】
0004913272.tif 000033
【図１０】
0004913272.tif 000034
【図１１】
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【図１２】
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