(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び／又はＡＡＶ粒子を精製するための、ＡＡＶの構造タンパク質であって、該構造タンパク質が該ウイルスのクロマトグラフィー特性を変化させる突然変異を少なくとも１つ含むことを特徴とし、
突然変異（単数又は複数）が、ＡＡＶ２の、ＹＫＱＩＳ  ＳＱＳＧＡ、ＹＬＴＬＮ  ＮＧＳＱＡ、ＹＹＬＳＲ  ＴＮＴＰＳ、ＥＥＫＦＦ  ＰＱＳＧＶ、ＮＰＶＡＴ  ＥＱＹＧＳ、ＬＱＲＧＮ  ＲＱＡＡＴ、ＮＶＤＦＴ  ＶＤＴＮＧから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後に位置することを特徴とする、
前記構造タンパク質。
【請求項２】
クロマトグラフィー特性の変化が精製の改良を可能にすることを特徴とする、請求項１記載の構造タンパク質。
【請求項３】
突然変異した構造タンパク質が粒子形成することができることを特徴とする、請求項１又は２に記載の構造タンパク質。
【請求項４】
請求項１における突然変異が、点突然変異、複数個のアミノ酸の突然変異、１つ以上の欠失であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項５】
機能的配列のアミノ酸が挿入されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項６】
挿入されるアミノ酸配列が受容体のリガンド若しくはリガンドの受容体、抗体若しくは抗体の一部、特に抗体エピトープ、抗原若しくは抗原エピトープ、ホルモン、ホルモン受容体、酵素、酵素基質、レクチン、糖支持アミノ酸、特にヒスチジン富化ペプチド（Ｈｉｓタグ）、多重荷電ペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴタグ）、抗体のＦｃ部分、免疫グロブリン結合ドメイン、例えばプロテインＡ若しくはプロテインＧ若しくはこれらの一部、レシチン、核酸結合部位、ヘパリン結合部位、特異性リガンド、特異性受容体、インテグリン、サイトカイン又はサイトカイン、インテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体、細胞表面構造に対する抗体、エピトープ及び／又は抗体結合構造から選択されることを特徴とする、請求項５記載の構造タンパク質。
【請求項７】
配列QAGTFALRGDNPQGを有するペプチドが挿入されることを特徴とする、請求項５又は６のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項８】
ＡＡＶ粒子の形態、特にＡＡＶカプシドの形態である、請求項１〜７のいずれかに記載の構造タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー特性の修飾をもたらす少なくとも１つの突然変異を有するアデノ随伴ウイルスの構造タンパク質と、その製造及び使用とに関する。
【０００２】
ＡＡＶウイルスは、パルボウイルスのファミリーに属する。これらは、１８〜３０ｎｍの直径を有し、約５ｋｂの線状一本鎖ＤＮＡを含有する、二十面体の無外被カプシドによって識別される。ＡＡＶの効果的な複製は、ヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスとの宿主細胞の同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスが存在しない場合には、ＡＡＶは潜伏状態に入り、ウイルスゲノムは宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれることができる。宿主ゲノムに組み込まれるというＡＡＶの性質は、哺乳動物細胞のための形質導入ベクター(transduction vector)としてＡＡＶを特に重要にしている。一般に、約１４５ｂｐ長さである２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）はベクター機能に関して充分である。これらは、宿主細胞ゲノム中への複製、パッケージング及び組み込みのために必要な“シス”シグナルを有する。組換えベクター粒子中へのパッケージングのためには、非構造タンパク質（Ｒｅｐタンパク質）の遺伝子と構造タンパク質（Ｃａｐタンパク質）の遺伝子とを有するヘルパープラスミドが、パッケージングに適した細胞、例えばＨｅＬａ又は２９３細胞中へトランスフェクトされ、これらの細胞は次に例えばアデノウイルスによって感染する。数日後に、組換えＡＡＶ粒子を含有する溶解物(lysate)が得られる。適当なヘルパープラスミドは、例えばChiorini et al., (1995) Hum. Gene Ther. 6, 1531-1541 又は Girod et al. (1999), Nat. Med.によって述べられている。
【０００３】
ＡＡＶカプシドは３つの異なるタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から成り、これらの相対的割合は５％  ＶＰ１、５％  ＶＰ２及び９０％  ＶＰ３である。ＡＡＶカプシド遺伝子はＡＡＶゲノムの右手端部に位置され、異なる開始コドンと、２つの異なってスプライスされた転写物(transcript)とを用いて、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列をオーバーラップさせることによって、コードされる。ＶＰ１遺伝子はＶＰ２遺伝子配列全体を含有し、このＶＰ２遺伝子配列は、特異的なＮ末端領域を有するＶＰ３遺伝子配列全体を含有する。オーバーラッピングリーディングフレームが３種類のＡＡＶカプシドタンパク質の全てをコードするという事実が、全てのカプシドタンパク質の、程度の差こそあれ、必須の発現の原因である。
【０００４】
カプシドタンパク質の分子質量は、ＶＰ１が８７ｋＤ、ＶＰ２が７３ｋＤ及びＶＰ３が６２ｋＤである。カプシド遺伝子の配列は、例えば、Srivastava, A. et al. (1983), J. Virol., 45, 555-564; Muzyczka, N. (1992), Curr. Top. Micro. Immunol., 158, 97-129, Ruffing, N. et al. (1992), J. Virol., 66, 69226930 or Rutledge, E. A. et al. (1998) J. Virol. 72, 309-319に述べられている。 ＡＡＶゲノムの物理的及び遺伝的マップは、例えば、Kotin, R.M. (1994), Human Gene Therapy, 5, 793-801に述べられている。
【０００５】
種々なＡＡＶ血清型も知られており、これらのうちでヒトＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）が最も研究されている。これらの分析は、ＡＡＶウイルスが身体的遺伝子療法のためにウイルスベクターとして有利な性質を有することを示している。本質的な利点は、ヒトに対する病原性が無いこと、細胞ゲノム中へのウイルスＤＮＡの安定な組み込み、非分割細胞(non-dividing cells)を感染させる能力、高タイター（１０13〜１０14粒子／ｍｌ）までの精製を可能にするビリオンの安定性、低い抗原性、及び組換えＡＡＶベクター中にウイルス遺伝子と遺伝子産物とが存在しないこと（これは遺伝子療法に用いるために安全性の見地から有利である）である。ＡＡＶベクター中への遺伝子のクローニングは現在、例えば WO95/23867、Chiorini J.A. et al. (1995),Human Gene Therapy,6,1531-1541又はKotin,R.M.(1994),上記文献に述べられているような、当業者に一般に知られた方法によって行なわれる。
【０００６】
ＡＡＶをウイルス形質導入ベクターとして用いるためには、高タイターの組換えＡＡＶ粒子を有することが一般に必要である。粒子の産生が自然には比較的少ないという事実のために、高タイターを得るための１方法は、粒子の効果的な濃縮である。さらに、特にｉｎ  ｖｉｖｏ用途のための粒子が、細胞成分、ＤＮＡ、タンパク質、ヘルパーウイルス及び培地成分から成ると考えられる不純物ができるだけ含まないことが必要である。したがって、ＡＡＶ粒子のために改良された精製法が使用可能であることも必要である。
【０００７】
クロマトグラフィーは、精製のための基本的な可能性である。この物理的な分離方法は、固定相と移動相とへの分配による物質の分離を必要とする。クロマトグラフィーは物理的プロセスに基づいて２グループ：固定相としての固体による吸着クロマトグラフィーと２つの相互に混合不能な相による分配クロマトグラフィーに分類することができ、通常は混合形態が行なわれる。クロマトグラフィーにおける物質の分離特徴はそのクロマトグラフィー特性、特にそのサイズ、その電荷、その吸着挙動、したがってその特異的アフィニティ、その疎水性等に依存する。これは、クロマトグラフィー特性が修飾によって精製の改良、したがって例えば濃縮又はより高純度を得るための重要な出発点を与え、この場合に、例えば野性型に比べた、純粋な修飾が分離、したがって良好な精製を可能にするために充分であることを意味する。
【０００８】
特にクロマトグラフィーによるＡＡＶ精製方法は、例えば、WO97/08298に述べられているが、ＡＡＶ構造タンパク質の突然変異は述べられていない。さらに、WO96/00587は、カプシド形成を妨害せず、臨床的に有意味な抗原の異種エピトープ(heterologous epitopes)を含有するといわれるＡＡＶカプシド融合タンパク質に関するが、この意図は単に、免疫応答を誘発することであるにすぎない。さらに、この刊行物は融合タンパク質への一般的な言及のみを含有し、可能な実施に関する詳細、特に適当な挿入部位に関する詳細を与えていない。しかし、例えばアフィニティを変えることによって精製を改良するためのクロマトグラフィー特性の変化は述べられていない。
【０００９】
それ故、本発明の目的は、ＡＡＶウイルス、特に構造タンパク質の精製特性を、野性型に比べて、改変することであった。
【００１０】
今回、意外にも、ＡＡＶの構造タンパク質又はカプシドタンパク質を、クロマトグラフィー特性の変化がもたらされるようなやり方で、修飾することができることが発見された。
【００１１】
それ故、本発明の１態様は、ウイルスのクロマトグラフィー特性を変化させる突然変異を少なくとも１つ含むＡＡＶ構造タンパク質である。これに関連して、クロマトグラフィー特性の変化が精製の改良、特にウイルスの、好ましくはウイルス粒子の高タイターまでの濃縮、高純度までの精製及び／又はより高い効率の精製を可能にすることが好ましい。クロマトグラフィー特性の改変によって、例えば、高い粒子タイター、より純粋な粒子又はより高い効率の精製を生じる、精製の一部としてのより高く特異的又は効果的であるウイルス粒子精製工程が達成されうる。組換え粒子のタイターは、例えば、粒子含有溶液の連続希釈物を膜上に置いて、この膜を標識ＡＡＶ  ＤＮＡとハイブリダイズさせることによって測定することができる。ハイブリダイズしたＤＮＡの検出は、粒子濃度についての結論を実験の実施に依存して質的又は量的に引き出すことを可能にする。粒子の純度は構造タンパク質の、又は粒子タンパク質の、該粒子とは異なるタンパク質(proteins foreign to the particles)に対する比率から推定することができる。精製が少ない工程から成り、より迅速に行なわれる、又は特に産業的用途のために費用をかけずに行なわれるならば、本発明の意図において、精製はさらに効果的である。
【００１２】
本発明の意図において、突然変異が単に、クロマトグラフィーカラム上での溶離挙動のシフト、即ち、例えばより低い又はより高い塩濃度へのシフトをもたらすにすぎないとしても、精製の改良に関連したウイルスのクロマトグラフィー特性の変化が存在する。所望の生成物のフラクション（例えば、ウイルス粒子）と、不純物フラクション（他のウイルス、野性型ウイルス、細胞溶解物の残渣、ＤＮＡ、タンパク質、特に血清タンパク質）が、同じ塩濃度の同じフラクションとして溶出することが、クロマトグラフィー精製の一般的な問題である。本発明による標的突然変異とそれに関連した溶離挙動のシフトとは、所望の突然変異ウイルス粒子を含むフラクションを、もはや不純物フラクションと一緒に溶出するのではなく、別の溶出フラクションとして（例えば、電荷に依存して、より高い又はより低い塩濃度で）生じる。場合によっては、必ずしも常にではないが、例えば主として正に又は負に荷電したアミノ酸又はＨｉｓ  ＴＡＧの、カプシドタンパク質中への挿入による高い塩濃度へのシフトは特定の利点を生じる、この理由は、不純物は通常小さい成分であり、慣用的な精製方法では、低い塩濃度で通常溶出するからである。このカプシド変異体は次に、例えばカラム物質により良好に結合し、遅れて、即ち、より高い塩濃度で溶出する。荷電アミノ酸の組み込みに基づく、他の望ましい効果は、高い塩含量のイオン交換体を装填することが可能になることであり、これはカラム物質の必要量を低減することを可能にし、このことが操作を促進し、産業的生産方法の費用を節約する。
【００１３】
本発明の構造タンパク質の突然変異がウイルスの感染性の無視できるほどの低下をもたらす、特に感染性を増強させることが好ましい。本発明の意図において、感染性は、細胞に形質導入する能力を意味する。
【００１４】
本発明のさらなる展開は、修飾された構造タンパク質が野性型ＡＡＶに比べて増強した熱安定性を有することである。したがって、熱安定性が増強されるならば、野性型ＡＡＶの場合に比べて、好ましくない他の微生物又はウイルスのより良好な熱不活化が可能になると考えられる。このような構造タンパク質は、非常に多くの変異体をそれらの熱安定性に関して試験することによって、簡単に見出すことができる。
【００１５】
さらに、修飾された構造タンパク質が粒子形成可能である、即ち、特にＡＡＶカプシドとしての二十面体カプシドを形成可能であることも好ましい、この理由は粒子及びカプシドが選択された化合物、例えばｒＡＡＶ形質導入ベクターのキャリヤーとして特に適しているからである。粒子の形成は、例えば、電子顕微鏡によって検出することができる。他の検出方法は、塩化セシウム密度勾配遠心分離中の沈降挙動と、続いての粒子中に存在するウイルスＤＮＡの任意の検出である。
【００１６】
一般に、突然変異はＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶ３構造タンパク質、好ましくはＶＰ１及び／又はＶＰ３構造タンパク質中に存在しうる。さらに、構造タンパク質は全てのＡＡＶ血清型に、特にヒト血清型に、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及び／又はＡＡＶ６に、特にＡＡＶ２、ＡＡＶ３及び／又はＡＡＶ６に由来することができる。
【００１７】
前記突然変異は点突然変異、複数個のアミノ酸の突然変異、１つ以上の欠失、特に１つ以上の挿入又は前記修飾の組み合わせでありうる。
【００１８】
好ましい実施態様では、機能的配列のアミノ酸、好ましくは、アフィニティクロマトグラフィーに適したアミノ酸が挿入される。
【００１９】
アフィニティクロマトグラフィーは、例えば抗原−抗体、酵素−基質等のような、互いに緊密な関係にある特定のパートナーが相互を認識して、相互に相互作用することができる能力に基づくクロマトグラフィー方法を意味する。通常、互いに緊密な関係にあるパートナーの一方がクロマトグラフィー吸着剤にサポートとして固定され、この場合には、特異的に適合する成分がそれに結合する。次に、変化したｐＨ，異なるイオン強度又は、例えば、該適合成分の類似体によって溶離が行なわれる。これはさらに、例えばジスルフィド架橋の形成による共有結合クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用が用いられる疎水性クロマトグラフィーをも包含する。
【００２０】
挿入されるアミノ酸は特に、次の群：受容体のリガンド若しくはリガンドの受容体、抗体若しくは抗体の一部、特に抗体エピトープ、抗原若しくは抗原エピトープ、ホルモン、ホルモン受容体(hormoreceptor)、酵素、酵素基質、レクチン及び／又は糖支持アミノ酸(sugar-bearing amino acid)から選択されることができる。
【００２１】
これらは好ましくは下記のものでありうる：
・ヒスチジン富化ペプチド（Ｈｉｓ  ＴＡＧ）、これは金属キレートアフィニティ媒質上での精製を可能にする；
・複数の電荷を有するペプチド、これはイオン交換クロマトグラフィー中の結合又は溶離挙動を修飾するので、このような精製工程をより特異的又は効果的にする；
・グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ  Ｔａｇ）、これはグルタチオンアフィニティ媒質上での精製を可能にする；
・抗体のＦc部分、これはプロテインＡ又はプロテインＧアフィニティ媒質上での精製を可能にする；
・免疫グロブリン結合ドメイン、例えばプロテインＡ又はプロテインＧ又はこれらの部分、これは抗体又は抗体のＦｃ部分を含むアフィニティクロマトグラフィー媒質上での精製を可能にする；
・特定の抗体エピトープ、これはエピトープに対して特異的である共役抗体(coupled antibodies)を含む媒質上での精製を可能にする；
・レシチン、これは糖タンパク質培地上での精製を可能にする；
・核酸結合部位、これは核酸媒質上での精製を可能にする；
・ヘパリン結合部位、これはヘパリン媒質上での精製を可能にする、野性型ＡＡＶは既に固有のヘパリン結合部位を有するので、付加的な結合部位は結合を単に強化するにすぎない；
・ストレプトアビジン、これはビオチン又はビオチニル化タンパク質を介した精製を可能にする；
・特定のリガンド、これは適当な受容体を含む媒質上での精製を可能にする；又は
・特定の受容体、これは適当なリガンドを含む媒質上での精製を可能にする。
【００２２】
同様に、インテグリン、サイトカイン、又はサイトカイン、インテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体、細胞表面構造に対する抗体、エピトープ及び／又は抗体結合構造が好ましい。
【００２３】
好ましい実施態様では、例えば、５〜３０アミノ酸、好ましくは８〜２０アミノ酸、特に１０〜１８アミノ酸を有するペプチドが挿入される。ペプチドは例えば配列QAGTFALRGDNPQG又はこれと高度にホモロジーである配列を有する。この特に好ましいリガンドは、ラミニンファミリーのα鎖のコア配列からの１４アミノ酸の長さを有するペプチドであるＰ１ペプチドである。この配列は例えば、特にウイルス粒子、例えばアデノウイルスのエンドサイトーシスを仲介する、インテグリン受容体を認識するために充分である。Ｐ１ペプチドは、その形態（線状又は環状）に拘わらず、インテグリン受容体に結合する。本発明によると、Ｐ１ペプチドのコーディングＤＮＡ配列は、例えばヘルパープラスミド上に位置される、ＡＡＶの構造タンパク質をコードする遺伝子中に組み込まれる。変異体ヘルパープラスミドによるパッケージングは，カプシド中にＰ１を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ−Ｐ１）を生じる。このペプチドの挿入に関して、これらのＡＡＶ粒子はカチオン交換体から非修飾ＡＡＶ粒子に比べて低い伝導率で溶離されるので、条件に依存して、改良された分離（例えば、野性型から）と精製を可能にすることを示すことができた。
【００２４】
特に好ましい、本発明の構造タンパク質は少なくとも１つの他の突然変異を含む。このことは、構造タンパク質が、ウイルスのクロマトグラフィー特性の修飾をもたらす突然変異のみでなく、ウイルスのクロマトグラフィー特性の修飾を必ずしももたらさない他の突然変異をも含むことを意味する。この場合に、特に好ましい他の突然変異は、ウイルスの感染性を変化させる、好ましくは増強させる突然変異である。
【００２５】
本発明の他の好ましい態様は、該他の突然変異（単数又は複数）が抗原性を低減させるＡＡＶ構造タンパク質である。
【００２６】
本発明の意図において、抗原性とは、免疫系に基づいた抗体の形成と結合の両方の誘発を意味する。この用語はさらに、免疫原性、即ち、免疫応答の誘発をも包含する。それ故、抗原性の低減とは、抗原エピトープの減少と、特定エピトープの抗原効果の低下又は野性型に存在するある一定のエピトープの修飾及び欠失との両方による抗体形成と結合の低減を意味する。修飾された抗原性はさらに、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方に関与する。
【００２７】
他の好ましい実施態様では、該他の突然変異（単数又は複数）は構造タンパク質における１つ以上の欠失及び／又は１つ以上の挿入又は前記修飾の組み合わせを表す。これに関連して、挿入は好ましくは、細胞膜受容体リガンドの挿入、例えばＲｅｐドメインとしてのＲｅｐタンパク質若しくはペプチドの挿入、免疫抑制性タンパク質若しくはペプチドの挿入及び／又は、導入遺伝子(transgene)若しくは異種遺伝子(foreign gene)の二本鎖合成のためのシグナルを有するタンパク質若しくはペプチドの挿入である。これに関連して好ましい例はＰ１ペプチド（QAGTFALRGDNPQG）である（上記参照）。
【００２８】
他の突然変異のための挿入の例は、特に、インテグリン、サイトカイン、又はサイトカイン、インテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、例えばGMCSF, IL-2, IL-12, CD40L, TNF, NGF, PDGF若しくは EGF、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体、いわゆる一本鎖抗体(scFv)、例えば表面受容体CD40, CD40L, B7, CD28 若しくはCD34に結合する一本鎖抗体、又は例えば抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体のような特定の抗体によって若しくは化学物質若しくは例えばカテコールアミンのようなホルモンによって認識されるエピトープ若しくは受容体結合部位である。
【００２９】
該他の突然変異の好ましい実施態様では、例えばプロテインＡ、プロテインＧ又は抗Ｆｃ抗体又はこれらの部分のような抗体結合構造が挿入される。これらに、再び、特定の細胞表面構造に対して（例えば、リンパ細胞の場合にはＣＤ４０に対して又は造血細胞の場合にはＣＤ３４に対して）特異的な抗体が結合する。
【００３０】
突然変異（単数又は複数）は好ましくはウイルス表面に位置される。表面に位置される構造タンパク質領域の決定に関して、本発明によると、意外にも、ＣＰＶとＡＡＶ２の配列及び構造が匹敵するものであることが判明した。それ故、好ましくは、例えばパルボウイルスＢ１９又はＣＰＶ（イヌパルボウイルス）のようなパルボウイルスの既知結晶構造に頼って、ホモロジー比較によって、ウイルス表面に位置するタンパク質ドメインを同定することが可能である。それ故、本発明によると、例えば、ＣＰＶとＡＡＶ２とのコンピューター補助比較、及びパルボウイルスＢ１９とＡＡＶ２とのコンピューター補助比較が、意外にも、配列が変化して、即ち、低いホモロジーを有して、ウイルス表面に位置すると推定される、ＶＰ３中のループの再現可能な同定を生じた。体液性免疫応答に対する抗原は抗体に、したがってウイルス表面にアクセス可能でなければならないので、これらのループは突然変異のための好ましい候補である。このように、ＣＰＶ  ＶＰ２カプシドタンパク質の既知結晶構造（例えば、Luo M. (1988), J. Mol. Biol., 200, 209-211; Wu and Rossmann (1993), J. Mol. Biol., 233, 231-244）は、ウイルスカプシド表面上に暴露され、局部的アミノ酸配列に基づいて例えばペプチド配列の挿入を克服するために充分にフレキシブルである領域を見出すために、タンパク質の二次構造におけるＡＡＶ２  ＶＰ３との大きな類似性に基づいてパターンと見なされた。この場合に、カプシドを不安定化すると考えられる、ＡＡＶ２カプシドタンパク質の二次構造要素を選択しないように注意した。
【００３１】
好ましい実施態様では、突然変異（単数又は複数）は構造タンパク質のＮ末端に位置される、この理由は、例えばパルボウイルスＣＰＶ及びＢ１９では、Ｎ末端が細胞表面に位置されることが判明しているからである。
【００３２】
構造タンパク質の表面に位置する領域を決定するための他の可能性は、異なるＡＡＶ血清型からのカプシドコーディング核酸配列を比較することである。このために、例えばＡＡＶ２の可能なカプシド形態の構造分析のために、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５又はＡＡＶ６のような、異なるＡＡＶ血清型からの既知ＤＮＡ配列を用いることが可能であり、この場合に、最初から、可能な三次構造を算出して、一般に知られたアミノ酸性質に基づいて配列領域を内側又は外側カプシド領域に割り当てることが可能である。したがって、本発明によると、例えば、ペプチドを挿入して、それらをウイルス表面上に発現させることを可能にする、ＡＡＶ２カプシドのＶＰ３領域における可能な挿入部位を見出すことが可能であった（以下参照）。
【００３３】
好ましい実施態様では、ＶＰ１コーディング核酸のＸｈｏＩ切断部位における１つ以上の挿入によって、他の好ましい実施態様では、ＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ切断部位における１つ以上の挿入によって突然変異（単数又は複数）がもたらされる。本発明の構造タンパク質の他の好ましい実施態様は、ＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断部位間の欠失と、好ましくは該欠失部位における１つ以上の挿入とによって行なわれる。
【００３４】
本発明の他の好ましい実施態様では、６２アミノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ切断部位間の１つ以上の欠失によって、突然変異（単数又は複数）がもたらされる（Hermonat, P.L. et al. (1984), J. Virol., 51, 329-339)。他の好ましい、対応する実施態様では、上記欠失内に位置され、２９アミノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断部位間に、欠失（単数又は複数）が位置される。この欠失はＲｅｐ遺伝子とのオーバーラップを有さないので、パッケージング機構に本質的に影響を及ぼさないという利点を有する。
【００３５】
他の好ましい実施態様では、ＶＰ３構造タンパク質(Rutledge, E.A. et al. (1998) 上記文献) 中の YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT, EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNGから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後に１つ以上の挿入が存在する、この理由はこれらの部位がループの暴露部位に位置され、この場合にはＶＰ３構造が変化する危険性が低いからである。
【００３６】
点突然変異（単数又は複数）、幾つかのアミノ酸の突然変異（単数又は複数）、欠失（単数又は複数）又は挿入（単数又は複数）は、一般に知られた方法に従って、構造タンパク質をコードする遺伝子中の欠失及び挿入によって行なわれる。欠失は例えばＰＣＲ補助突然変異誘発によって、個々の構造タンパク質遺伝子中に導入することができる。挿入は一般に知られた方法に従って、例えば、適当な構造タンパク質遺伝子の制限エンドヌクレアーゼによる加水分解とそれに続くリガーゼ反応とによって導入することができる。その後の突然変異遺伝子の発現が本発明の構造タンパク質を生じる。
【００３７】
本発明の他の態様もまた、ＡＡＶ粒子としての、特にＡＡＶカプシドとしての本発明の構造タンパク質である、この理由は、粒子及びカプシドが選択された化合物、例えばｒＡＡＶ形質導入ベクターのキャリヤーとして特に適しているからである。
【００３８】
本発明の他の態様は、本発明の構造タンパク質をコードする核酸、好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡである。
【００３９】
本発明はまた、本発明の核酸を含む細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞又は２９３細胞に関する。このような細胞は、組換えＡＡＶ粒子を製造するために適している。
【００４０】
それ故、本発明の他の態様は、本発明の構造タンパク質の製造方法、特にＡＡＶ粒子としての本発明による構造タンパク質の製造方法であって、本発明による構造タンパク質をコードする核酸を含む適当な細胞を培養して、適当である場合には、発現された構造タンパク質を単離する前記方法でもある。本発明の構造タンパク質は、例えばクロマトグラフィーによって精製し、単離することができる。
【００４１】
本発明の他の態様は、本発明の構造タンパク質又は本発明の核酸及び／又は本発明の細胞と、適当である場合には、例えば生理食塩溶液、安定剤、プロテイナーゼ阻害剤、ＤＮＡｓｅ阻害剤等のような、適当な賦形剤及び添加剤とを含む薬剤にも関する。
【００４２】
本発明の他の態様は、ＡＡＶ及びＡＡＶ粒子を精製するため、ＡＡＶのトロピズムを変えるため、ＡＡＶの抗原性を変えるため、細胞、特にＡＡＶ感染に対するその感受性がこれまでは低かった細胞、例えば造血細胞を形質転換するため、ゲノムターゲッティングのため、診断のため、活性研究のため及び／又は−適当なｒＡＡＶベクターとして−遺伝子療法のための、本発明の構造タンパク質、本発明の核酸又は本発明の細胞の使用に関する。遺伝子療法とは、エフェクター遺伝子、通常はタンパク質が細胞中への核酸の導入によって発現される療法の形式を意味する。原則として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法とｉｎ  ｖｉｖｏ方法とは区別される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法では、細胞が生物から取り出され、続いて、同じ生物又は他の生物中に再び導入されるために、ベクターによってｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入される。ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法は、例えば腫瘍を制圧するためにベクターが全身的に（例えば、血流によって）又は直接的に（例えば、腫瘍、組織若しくは器官中に）投与されることを包含する。
【００４３】
本発明の本質的な利点は、ＡＡＶ構造タンパク質の本発明による突然変異誘発が、ウイルスのカプシド中の組換えＡＡＶベクターのパッケージング効率を実際に損失させないより特異的な精製方法の新規な可能性を作り出すことを、クロマトグラフィー特性の修飾によって可能にすることである。これは、ＡＡＶ又はＡＡＶ粒子をより高いタイター及び／又はより大きい純度まで精製するための条件を生じて、精製をより大きく効果的及び費用効果的にする。このことは次に、細胞の形質転換及び遺伝子療法のための組換えＡＡＶの産業的用途を商業的規模で可能にする。
【００４４】
下記図面と実施例は、本発明を限定せずに詳細に例示するように意図される。
【００４５】
【実施例】
実施例１：
下記突然変異はＰＣＲ補助突然変異誘発と、制限酵素ＸｈｏＩ、ＢｓｒＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる切断とによって生じた：
【００４６】
ＶＰ１における突然変異
（ａ）ＶＰ−１のＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ切断部位間の欠失（ΔＸｈｏ；６２アミノ酸、ＡＡ）(Hermonat et al. (1984) Journal of Virology 51, 329-339)、
（ｂ）上記欠失（ａ）内に位置され、２９ＡＡを含む、ＶＰ−１のＢｓｒＢＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断部位間の欠失（ΔＢＨ）；
（ｃ）ＢｓｒＢＩとＨｉｎｄＩＩ間の欠失と、リガンド（Ｐ１ペプチド）の挿入（ΔＢＨ＋Ｌ）；及び
（ｄ）ＢｓｒＢＩ切断部位におけるリガンド（Ｐ１ペプチド）の純粋な挿入（Ｂ＋Ｌ）。
【００４７】
ＶＰ３における突然変異
【化１】
0004938189.tif 000002
【００４８】
（ＡＡＶ２のＶＰ−１におけるＮ末端の始点からのアミノ酸（ＡＡ）後に数えられるＡＡ数に応じて名付けられ、各場合にそのＮ末端に位置される５アミノ酸とそのＣ末端に位置される５アミノ酸とによって隣接される；その後に挿入が導入されるＡＡは、太字で示される）。
【００４９】
同様に、太字のＡＡの次の位置される、直接隣接する５ＡＡ中に挿入を導入することも可能である、この理由はこれらがＡＡＶ２カプシド中のループ内に同様に位置されるからである。
【００５０】
実施例２：
カプシド変異体の特徴付け
ＡＡＶ２ゲノム中で突然変異を実施し、突然変異したウイルスをＬａｃＺレポーター遺伝子でパッケージングした後に、物理的ベクタータイターをドット−ブロットによって、カプシドタイターをＡ２０抗体ＥＬＩＳＡによって測定し、最初の感染試験をＨｅＬａ細胞上で実施した。したがって、突然変異がＶＰタンパク質の構造又は種々なＶＰタンパク質間の相互作用を、パッケージングが損傷される又は抑制されるように、損傷するかどうかを判定することが可能であった（表１）。
【００５１】
【表１】
0004938189.tif 000003
【００５２】
ゲノムウイルスタイター（ドット−ブロット）とカプシドタイター（Ａ２０カプシドタイター）とを示す。濃度は粒子数／ｍｌで表す。
【００５３】
４ＶＰ１変異体の全てに関して、突然変異がパッケージング効率に影響を及ぼさず、全ての突然変異ウイルスが突然変異しないカプシドを含むベクターのタイターと同様に良好なタイター（１０11〜１０13ゲノム粒子数／ｍｌ）を有してパッケージングされうることを示すことができた。ＶＰ３領域に突然変異を有するＡＡＶベクターが上首尾にパッケージングされることもできた（１０10〜１０12ゲノム粒子数／ｍｌ）。
【００５４】
実施例３：
ＶＰ３におけるＰ１突然変異
出発点は、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．）のＢａｍＨＩ切断部位中にｐＡＶ２（ＡＴＣＣ３７２６１，ｒｅｆ．５３）の４．８ｋｂ  ＢｇｌＩＩフラグメントをサブクローニングすることによって製造されたプラスミドｐＵＣ−ＡＶ２であった。該プラスミド中の一定の部位において当業者に知られたＰＣＲ補助突然変異誘発によって突然変異を生じさせた。これは、ラミニンフラグメントのＲＧＤ結合モチーフ(Aumailly et al. (1990) FEBS Lett. 262, 82-86)を含有するＡＡ配列 QAGTFALRGDNPQGを含む１４ＡＡ ペプチド、Ｐ１をコードする配列をヌクレオチド２９８５、３５４３及び３９６３の後に挿入することを包含した。これは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質におけるアミノ酸２６１、４４７及び５８７（ＡＡＶ２のＶＰ−１におけるＮ末端の始点からのアミノ酸（ＡＡ）後に数えられるＡＡ数に応じて名付けられる）後の挿入に相当する。その後のＰＣＲでは、各場合に２つの突然変異特異性プライマーが用いられ、キャップ遺伝子のみを含有し、ｐＵＣ−ＡＶ２から２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＭＩフラグメントを切り取って、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ切断部位にそれを挿入することによって形成されるプラスミド、ｐＣａｐが鋳型として用いられる。続いて、ＰＣＲ産物を細菌中で増幅し、配列決定して、Ｐ１を含有する１．４ｋｂのＥｃｏＮＩ−ＸｃｍＩフラグメントを、対応する野性型キャップ配列が切り取られているｐＵＣ−ＡＶ２中にサブクローニングする。その結果として、ＡＡ挿入後に部位ｐＩ−２６１、ｐＩ−３８１、ｐＩ−４４７及びｐＩ−５８７と名付けられるプラスミド（変異体）は完全なＡＡＶ２ゲノムを含有した。対応する突然変異タンパク質はＩ−２６１、Ｉ−３８１、Ｉ−４４７及びＩ−５８７と呼ばれる。
【００５５】
実施例４：
ＡＡＶ２粒子の産生
ＨｅＬａ細胞（ヒト頚部上皮細胞系）を実施例１のプラスミドによってトランスフェクトし、約２０時間インキュベートしてから、アデノウイルス型５によって感染させた。感染後７２時間に、細胞を破壊して、ＡＡＶ２粒子をＣｓＣｌ勾配で精製した。
【００５６】
実施例５：
実施例３のカプシド変異体の特徴付け
これらの実験の意図は、カプシド変異体がウイルスゲノムをパッケージして、完全なカプシドを形成することができるかどうかを確認することであった。実施例４による変異体のＡＡＶ２粒子がウイルスゲノムを有するかどうか、もし有するならば、如何に多くの粒子がウイルスゲノムを有するのか、及び如何に多くのＤＮＡがカプシド変異体中にパッケージされているかを知るために、実施例４による変異体のＡＡＶ２粒子を試験した。このために、実施例４で精製したウイルス粒子（変異体と野性型）をＤＮＡｓｅで処理し、ブロッティングして、Ｒｅｐプローブとハイブリダイズさせた。
【００５７】
これから生ずるタイターは野性型との量的又は質的な差異を示さなかった（表２参照）。ウイルスはゲノムをパッケージする能力を保持した。
さらに、カプシドも形成されることを電子顕微鏡分析によって確認することができた。
【００５８】
それ故、正確なフォールディング、カプシド構築又はゲノムのパッケージングのために重要である領域では、突然変異は行なわれなかった。本発明のＡＡＶ粒子の機能は損なわれない。
【００５９】
突然変異カプシドが完全に形成され、抗原性の変化を示さないかどうかを察知することができるために、Ａ２０モノクローナル抗体（Ａ２０  ＭＡｂ）をさらなる実験においてＥＬＩＳＡに用いた。Ａ２０ＭＡｂは野性型の完全に構築されたＡＡＶ２カプシドと特異的に反応する（Wistuba et al., (1997), J.Virol. 71, 13411352)。この場合にも、結果を表２に示す。これから、カプシド形成が変異体Ｉ−４４７及びＩ−５８７中の挿入によって損なわれないが、Ａ２０モノクローナル抗体は変異体Ｉ−２６１の場合にはもはや結合しない、しかし、電子顕微鏡下での検査はカプシドがそれにも拘わらず形成されることを示すので、このことは抗原性の修飾に帰因することができる。
【００６０】
【表２】
0004938189.tif 000004
【００６１】
ゲノムウイルスタイター（ドット−ブロット）とＡ２０カプシドＥＬＩＳＡによるタイターとを示す。濃度は粒子数／ｍｌで記載する。“ｎ．ｍ．”は“測定不能”を意味する。
【００６２】
実施例６：
カプシド変異体の修飾された溶離挙動
組換え野性型ＡＡＶ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2中）を０．８ｍｌのＰＯＲＯＳ  ２０ＨＳカチオン交換体カラム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ）に負荷させた。Ａｅｋｔａ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｌａｃｕｎａ）６．８中の１００〜７００ｍＭ  ＮａＣｌの３０カラム量の勾配を適用した。ウェスタン・ブロット分析は、ＡＡＶがフラクション１２と１３中に溶出したことを示した、これは３０ｍＳ／ｃｍ（＝約３００ｍＭ  ＮａＣｌ）における野性型ＡＡＶの溶離に相当する（図１参照）。
【００６３】
ＡＡＶのカプシド変異体（実施例３からのＩ−５８７）（Ｐ１ペプチドQAGTFALRGDNPQGがアミノ酸５８７後に挿入される；ＰＢＳ，ｐＨ６．８中）を同じ０．８ｍｌのＰＯＲＯＳ  ２０ＨＳカチオン交換体カラムに負荷させた（上記参照）。Ａｅｋｔａ系において２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．８中の５０〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌの３０カラム量の勾配を溶離のために用いた。ウェスタン・ブロット分析によると、ＡＡＶ変異体はフラクション６と７中に存在した。このことは約２２ｍＳ／ｃｍ（＝約２２０ｍＭ  ＮａＣｌ）の溶離に相当する（図２参照）。
【００６４】
このことは、QAGTFALRGDNPQGペプチドの挿入が、同じｐＨにおいて突然変異粒子が野性型粒子よりも低い塩濃度において溶離するように、ＡＡＶ粒子の溶離挙動を変えることを示す。これによって、ウイルスフラクションは変化することになり、事情によっては不純度のより低い、又は他の点でより適した他のフラクション方向にシフトされる。それ故、カプシドタンパク質の挿入、欠失又は他の修飾によってＡＡＶ粒子のクロマトグラフィー特性を変えることが可能である。特に、上記挿入の１変形では、主として正電荷を有するアミノ酸を、例えば実施例に挙げた挿入部位に導入することによって、野性型（幅広い、不純度の低いピークで溶出する）に比べて、高い塩濃度で溶出する本発明のカプシド変異体を構築することができる。カラム物質に対する変異体のアフィニティはこれによって強化されるので、塩濃度が高くなるまで、即ち、より小さい異種(foreign)タンパク質によって通常はより低い程度に汚染される範囲になるまで溶離は行なわれない。
【００６５】
実施例７：
実施例３の変異体による感染試験
カプシド変異体Ｉ−２６１、Ｉ−３８１、Ｉ−４４７及びＩ−５８７のトロピズム(tropism)を試験するために、細胞系Ｃｏ−１１５とＢ１６Ｆ１０を突然変異ウイルスによって感染させた。Ｃｏ−１１５細胞を用いて、ビリオンの野性型受容体トロピズムを試験した、この理由は後者は野性型ＡＡＶ２によって形質導入されることができ、Ｐ１ペプチドに結合しないからである。Ｂ１６Ｆ１０細胞系を実施例９に既に挙げた理由から用いた。感染後３日目に、ウイルスＲｅｐタンパク質が発現したかどうかを知るために、細胞を抗Ｒｅｐ抗体を用いて免疫蛍光測定によって調べた（Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 69, 5311-5319)。細胞を顕微鏡スライド上で７０％集密度まで増殖させ、無血清培地中でアデノウイルス５と一緒に、種々な濃度の本発明のウイルス製剤と共にインキュベートした。３日間後に、免疫蛍光アッセイにおいてＲｅｐタンパク質合成のｉｎ  ｓｉｔｕ検出によって、ウイルス製剤のタイターを測定した（Ｒｅｐタイター）。この場合に、Ｗｉｓｔｕｂａ等の方法(Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 69, 5311-5319)によって、ＡＡＶ２感染細胞に関して免疫蛍光染色を行なった。顕微鏡スライドをＰＢＳによって１回洗浄し、メタノール中で固定し（５分間、４℃）、次に、アセトンによって処理した（５分間、４℃）。次に、ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質と反応するモノクローナル抗体７６−３と共に、これらの細胞を室温において１時間インキュベートした。これに続いて、洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中での１：５０の希釈度において、ローダミン結合抗マウス二次抗体と共に１時間インキュベートした。蛍光陽性細胞に達したウイルスストック溶液の最後に限定した希釈度からタイターを算出した。
【００６６】
Ｒｅｐ陽性ＣＯ１１５細胞は、野性型ＡＡＶ２及び変異体Ｉ−２６１、Ｉ−４４７及びＩ−５８７による感染後に、検出可能であった。Ｃｏ１１５細胞の場合に、Ｉ−２６１、Ｉ−４４７及びＩ−５８７の感染性は野性型の感染性よりも２〜３桁低かった（表３）。Ｉ−４４７によるＢ１６Ｆ１０細胞のトランスフェクションは野性型ウイルスによると丁度同じに非効率的であった（表３）。これとは明確に対照的に、Ｒｅｐ陽性Ｂ１６Ｆ１０細胞はＩ−５８７による感染後に検出可能であり、Ｉ−５８７ウイルスによる感染に関して測定されたタイターは１ｘ１０6Ｒｅｐ  ＥＦＵ／ｍｌであった（表３）。
【００６７】
変異体Ｉ−５８７によるＢ１６Ｆ１０細胞のトランスフェクションが、突然変異カプシドの表面上のＰ１配列とＢ１６Ｆ１０細胞の表面上のインテグリン受容体との間の相互作用によって特異的に仲介されるのかどうかを調べるために、細胞をウイルスによる感染前に２００μｍｏｌの濃度において競合ＲＧＤＳ又は不活性ＲＧＥＳペプチドのいずれかと共にインキュベートした。ＲＧＤＳペプチドの付加はＢ１６Ｆ１０細胞に対するＩ−５８７の感染性を中和したが（表３）、対照ペプチドＲＧＥＳは効果を有さなかった。
【００６８】
【表３】
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【００６９】
野性型感受性ＣＯ１１５細胞及び野性型耐性Ｂ１６Ｆ１０細胞のタイターを示す。これらのタイターは野性型に関してと同様にＩ−４４７及びＩ−５８７に関してはＲｅｐ  ＥＦＵ／ｍｌで表され、ｒＡＡＶ／ＬａｃＺ及びｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺに関してはＬａｃＺ  ＥＦＵ／ｍｌで表される。ＥＦＵは発現形成単位（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）を意味し、ｎｄは“測定せず”を意味し、“ｎ．ｍ．”は“測定不能”を意味する。
【００７０】
実施例８
ガラクトシダーゼによる実施例３の変異体の感染アッセイ
実施例６に基づくもう１つの実験では、野性型（ｒＡＡＶビリオン）又はＩ−５８７（ｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）ビリオン）のいずれかを含有するｒＡＡＶベクターをＬａｃＺリポーター遺伝子によって産生させた。これらのウイルス製剤はｒＡＡＶ／ＬａｃＺ及びｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺと呼ばれ、Ｂ１６Ｆ１０細胞及びＣＯ１１５細胞（対照）の感染のために用いられた。
【００７１】
感染した細胞を感染後３日目にＸ−Ｇａｌ染色によってβ−ガラクトシダーゼ発現に関して分析した。これは細胞化学的染色のためにｉｎ  ｓｉｔｕアッセイにＸ−Ｇａｌ  の使用を必要とした（ＬａｃＺタイター）。この後に、β−ガラクトシダーゼ発現を分析するために、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄してから、１．５％グルタルアルデヒドによって固定した。次に、細胞をＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド）によってＣｈｉｏｒｉｎｉ等（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６，１５３１−１５４１に既述されているように処理した。β−ガラクトシダーゼ産生細胞に達したウイルスストック溶液の最後に限定した希釈度から、タイターを算出した。
【００７２】
両方のビリオンがＣＯ１１５対照細胞に対して感染性であったが、ｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺは２桁だけ低く有効であった。Ｂ１６Ｆ１０型に関しては−予想されたように−ｒＡＡＶ／ＬａｃＺによる感染後にβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞は検出されなかった。これとは対照的に、ｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺによる感染後には、意外にも、著しく多数のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞が発見された。ｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺに関して測定されたタイターは５ｘ１０4ＬａｃＺ  ＥＦＵ／ｍｌであった。Ｂ１６Ｆ１０細胞に対するｒＡＡＶベクターの感染性は、本発明による突然変異によって４桁より大きく改良された（表３）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳカチオン交換カラムを通しての１回ランにおける野性型ＡＡＶサンプルのクロマトグラムを示す。貫流量を伝導率（左手Ｙ軸）に対してと２８０ｎｍにおける吸収性(absorption)（右手Ｙ軸）に対してプロットする。ＡＡＶ粒子はフラクション１２と１３中に溶出し、これは３０ｍＳ／ｃｍ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ）の平均伝導率に相当する（太い水平線参照）。
【図２】  図２は、ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳカチオン交換カラムを通しての１回ランにおける突然変異ＡＡＶ粒子（アミノ酸５８７後のペプチドQAGTFALRGDNPQGの挿入；実施例３におけるＩ−５８７）から成るＡＡＶサンプルのクロマトグラムを示す。貫流量を伝導率（左手Ｙ軸）に対してと２８０ｎｍにおける吸収性(absorption)（右手Ｙ軸）に対してプロットする。修飾されたＡＡＶ粒子はフラクション６と７中に溶出し、これは２２ｍＳ／ｃｍ（２２０ｍＭ  ＮａＣｌ）の平均伝導率に相当する（太い水平線参照）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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