(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のいずれかのアミノ酸配列を含むエステラーゼ。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その３２５番目のアミノ酸がイソロイシンで置換されているアミノ酸配列。
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その２４０番目のアミノ酸がアラニンで置換されておりかつ２８８番目のアミノ酸がアラニンで置換されているアミノ酸配列。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その４３番目のアミノ酸がセリンで置換されているアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載のエステラーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を含有するプラスミド
【請求項４】
請求項３記載のプラスミドを保有する微生物。
【請求項５】
請求項４記載の微生物を培養し、該微生物に、下記のいずれかのアミノ酸配列を含むエステラーゼを生産させるエステラーゼの製造方法。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その３２５番目のアミノ酸がイソロイシンで置換されているアミノ酸配列。
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その２４０番目のアミノ酸がアラニンで置換されておりかつ２８８番目のアミノ酸がアラニンで置換されているアミノ酸配列。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その４３番目のアミノ酸がセリンで置換されているアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エステル加水分解反応、エステル合成反応、エステル交換反応等に利用可能な耐熱性エステラーゼおよびその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
エステラーゼは、エステル結合を加水分解する酵素であり、エステル合成およびエステル交換反応の触媒能をも有し、近年、例えば医農薬やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用されている。
工業的に利用されるエステラーゼとしては、温度・ｐＨ・溶媒・圧力等に対する安定性が高いことが望ましい。中でも温度に対するエステラーゼの安定性、即ち熱安定性が高いと、反応温度を高くすることができ、反応速度を高めかつ反応中の該酵素の失活を軽減することが可能となる。そこで、反応時間の短縮および反応効率の向上を図るうえで熱安定性に優れたエステラーゼが切望されている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
このような状況下で、本発明者らは、遺伝子の部位特異的変異導入技術を用いて、鋭意検討を行った結果、野生型のアミノ酸配列においてある特定のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を有する変異型エステラーゼが優れた熱安定性を示すことを見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明は、下記のいずれかのアミノ酸配列、または該配列の中の少なくとも耐熱性のエステラーゼ活性の発現に必要なアミノ酸配列を有するエステラーゼ（以下、本発明エステラーゼと記す。）、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その３２５番目のアミノ酸がイソロイシンで置換されているアミノ酸配列
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その２４０番目のアミノ酸がアラニンで置換されておりかつ２８８番目のアミノ酸がアラニンで置換されているアミノ酸配列
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その４３番目のアミノ酸がセリンで置換されているアミノ酸配列、
該エステラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミドを保有する微生物、および、該微生物を培養し、該微生物に本発明エステラーゼを生産させるエステラーゼの生産方法を提供するものである。
【０００４】
【発明の実施の形態】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するエステラーゼ（以下、野生型エステラーゼと記す。）は、特願平5-315497号（特開平7-163364号公報）に記載のChromobacterium SC-YM-1（工業技術院生命工学工業技術研究所  受託番号；ＦＥＲＭ  Ｐ−１４００９）由来のエステラーゼである。該エステラーゼおよび本発明エステラーゼのエステラーゼ活性は、これらのエステラーゼを例えばｐ―ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）と混合して３７℃で保温し、遊離するｐ―ニトロフェノール量を反応液の４１０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。本発明エステラーゼにおいて、「耐熱性のエステラーゼ活性」とは、例えば、７０℃で１２０分間の保温処理を行った後の活性の残存率が、同様に処理した野生型エステラーゼの活性残存率よりも高いことを意味する。
また、本発明エステラーゼにおいて、「少なくとも耐熱性のエステラーゼ活性の発現に必要なアミノ酸配列」とは、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列における少なくとも１番目から３６２番めまでに相当する３６２個のアミノ酸からなるエステラーゼおよびその等価体をあげることができる。
【０００５】
本発明エステラーゼをコードする遺伝子（以下、本発明遺伝子と記す。）を取得するには、まず、野生型エステラーゼをコードする遺伝子（以下、野生型遺伝子と記す。）を取得するとよい。野生型遺伝子とは、例えば、配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子であり、例えばJ.Ｓambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー  クローニング  第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じてChromobacterium SC-YM-1株から取得することができる。即ち、Chromobacterium SC-YM-1株を例えばＬＢ培地（トリプトン 1.0% 酵母エキス 0.5% NaCl 0.5%）を用いて培養し、得られた菌体を超音波破砕等の通常の方法によって破壊して、プロテアーゼ処理等を行った後、ゲノムＤＮＡを抽出する。得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、例えば、ファージベクターであるλgt11、あるいはプラスミドベクターであるｐＵＣ１９などにリガーゼを用いて挿入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。これを例えば、野生型エステラーゼのアミノ酸配列の一部に対応する合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、野生型エステラーゼの活性を測定する方法等のスクリーニング法によりスクリーニングし、野生型遺伝子を含有するクローンを取得することができる。前記の野生型エステラーゼのアミノ酸配列の一部に対応する合成ＤＮＡプローブとしては、具体的には、例えば、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いるとよい。
【０００６】
野生型遺伝子に部位特異的変異を導入することによって、本発明遺伝子を調製することができる。部位特異的変異導入法としては、例えば、 Olfert Landt ら（Gene 96 125-128 1990）、Smithら（Genetic Engineering 3 1 Setlow,J.and Hollaender,A Plenum:New York）、Vlasukら（Experimental Manipulation of Gene Expression,Inouye,M.:Academic Press,New York）、Hos.N.Huntら（Gene 77 51 1989）の方法等があげられる。
例えば、Olfert Landtら（Gene 96 125-128 1990）の方法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてその３２５番目のアミノ酸がイソロイシンで置換されているアミノ酸配列をコードする本発明遺伝子を調製するには、まず、配列番号２で示される塩基配列を有する野生型遺伝子が組み込まれたプラスミドＤＮＡを、例えばJ.sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー  クローニング  第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング  ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載の方法に準じて調製する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡを鋳型にして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３２５番目のアミノ酸がイソロイシンに置換されている塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行うとよい。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間、次いで５０℃にて２分間、さらに７５℃にて３分間保温する処理を２０サイクル行い、最後に７５℃で８分間保温する。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を、例えば制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った野生型エステラーゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡとライゲーション反応を行うことにより、目的とする本発明遺伝子を得ることができる。
【０００７】
このようにして調製された本発明遺伝子を用いて、通常の遺伝子工学的方法に準じ、本発明エステラーゼを大量に製造し、取得することができる。具体的には、例えば、本発明遺伝子を宿主微生物細胞中で発現させることのできるプラスミドを調製し、これを宿主微生物細胞に導入して宿主微生物細胞を形質転換し、該形質転換体微生物を培養すればよい。
上記のようなプラスミドとしては、宿主微生物細胞中で複製可能であって、宿主からの単離・精製が容易であり、プロモーターおよび検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本発明遺伝子が導入されたプラスミドを好ましくあげることができる。該発現ベクターには市販の各種ベクターを用いることができ、例えば、大腸菌での発現には、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクター（ファルマシアバイオテク等から市販されている）を用いることができる。
【０００８】
宿主微生物細胞としては、真核生物および原核生物のいずれも用いることができ、例えば大腸菌等をあげることができる。該宿主微生物細胞に、通常の遺伝子工学的方法により上記のプラスミドを導入し宿主微生物細胞を形質転換することができる。
この様にして得られる本発明遺伝子を含有するプラスミドを保有する微生物（以下、本発明微生物と記す。）の培養は通常の方法によって行うことができる。例えば、宿主微生物細胞が大腸菌である場合は、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれでも可能であるが、好ましくは、通気撹拌培養方法をあげることができる。
こうして調製された本発明エステラーゼを産生する本発明微生物は、エステル加水分解を行うバイオリアクターとして、例えば医薬品，農薬品の中間体など有用な化合物の生産に利用することが可能である。
また、本発明微生物を培養して得られる菌体から本発明エステラーゼを精製し、これをエンザイムリアクターとして利用することもできる。本発明微生物の培養菌体からのエステラーゼの採取は、蛋白質の通常の単離・精製の方法を適宜組み合わせて実施すれば良く、例えば、培養終了後、本発明微生物の菌体を遠心分離等で集め、破砕または溶菌せしめ、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を組み合わせて本発明エステラーゼを精製すれば良い。
上記のような本発明微生物および本発明エステラーゼは適当な担体に固定化しリアクターとして利用してもよい。
【０００９】
【実施例】
以下に、実施例および参考例をあげ、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１０】
参考例１（野生型遺伝子の調製：ゲノムＤＮＡの調製）
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株を、５ｍｌの前培養用培地（グルコース１％(W/V)、酵母エキス１％(W/V)、Ｋ2ＨＰＯ4０.１％(W/V)、ＭｇＳＯ4０.０２％(W/V)、ｐＨ７.３）で、３０℃  ２４時間振盪培養した後、得られた培養液を１０００ｍｌの本培養用培地（グルコース１％(W/V)、酵母エキス１％(W/V)、Ｋ2ＨＰＯ4０.１％(W/V)、ＭｇＳＯ4０.０２％(W/V)、ｐＨ７.３）に接種し、３０℃で培養した。その際、ＯＤ660が３.４に達した時点で、ペニシリンＧを最終濃度として２ユニット／ｍｌ培養液になるように添加し、ＯＤ660が１０に達するまで培養を継続した。
遠心分離（８０００ｘｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、８０ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）、２５％(W/V)ショ糖溶液に菌体を懸濁し、これに卵白リゾチーム（生化学工業社製）を最終濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。次に１０ｍｌの１０％(W/V)ＳＤＳを添加し、さらにプロテアーゼＫ（ベーリンガー社製）を最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で３時間インキュベートした。その後、等量の０．１Ｍトリス飽和フェノールで３回、エーテルで２回抽出を行った後、水層に２倍容のエタノールを添加し攪拌した後、遠心分離（１２０００ｘｇ、３０分間、４℃）した。得られた沈殿を乾燥後、これを２０ｍｌのトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）に溶解し、ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ平衡密度勾配超遠心分離（２７５０００ｘｇ、１８時間、２５℃）に供してバンド状に収束したＤＮＡを回収し、これをトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）に対し透析し、約５.４ｍｇのゲノムＤＮＡを得た。
【００１１】
参考例２（野生型遺伝子の調製：ゲノムＤＮＡライブラリーの作製）
参考例１で得られたゲノムＤＮＡ１００μｇをＸｈｏＩ（宝酒造社製制限酵素）で消化した。一方、λファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）１μｇを同じくＸｈｏＩで消化後、前記ゲノムＤＮＡ消化物と混合し、リガーゼ（宝酒造社製）を加え、１６℃にて一夜保温した。
つぎにこの反応液に含まれるＤＮＡを、インビトロパッケージングキット（ストラタジーン社製）およびキット付属の大腸菌ＸＬ−１ｂｌｕｅ株を用いてλファージλＺＡＰＩＩにパッケージングし、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１２】
参考例３（野生型遺伝子の調製：ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング）１．合成ＤＮＡプローブの作製およびアイソトープ標識
野生型エステラーゼのＮ末端アミノ酸配列をもとに配列番号３および４で示す塩基配列を有する４４ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成した。該オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ自動合成機（アプライド  バイオシステムズ  モデル３９４Ａ）を用いて行った。
このオリゴヌクレオチド５０ｐｍｏｌに３μｌの０.５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７.６）、０.１Ｍ ＭｇＣｌ2、０.０５Ｍ ＤＴＴ、０.００１Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｕｎｉｔｓ Ｔ４ポリヌクレオチドカイネース（宝酒造社製）、１０μｌ［γ32Ｐ］ＡＴＰ（アマーシャム社製）を混合し、３７℃ ６０分間保温した後、セファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）によるゲルろ過に供することによりアイソトープ標識したＤＮＡプローブを調製した。
２．ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
参考例２で作製したゲノムＤＮＡライブラリーのファージで感染させた大腸菌をプレートに撒いて培養し、ニトロセルロースフィルターを前記プレート表面に密着させた後、静かにはがした。該フィルターを１.５Ｍ ＮａＣｌ-０.５Ｍ ＮａＯＨ溶液に浸し、ついで１.５Ｍ ＮａＣｌ-０.５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８.０）溶液に浸して中和した。その後０.３６Ｍ ＮａＣｌ-２０ｍＭＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７.５）-２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７.５）でフィルターを洗浄した後乾燥させた。
次に、これらのフィルターと、上記のようにして調製した野生型エステラーゼのＮ末端アミノ酸配列に対応するアイソトープ標識したＤＮＡプローブを用いて、以下の方法によりプラークハイブリダイゼーションを行った。すなわち、フィルターを４ｘＳＳＣ，１％(W/V)ＳＤＳ、１０ｘデンハルト（０.２％(W/V)フィコール、０.２％(W/V)ポリビニルピロリドン、０.２％(W/V)ウシ血清アルブミン）を含む溶液中で６０℃、３０分間保温した後、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト、１００μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で、６０℃、５時間保温した。ハイブリダイゼーションは、プラスティックバックに５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト、１００μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液とフィルターを入れ、これにアイソトープ標識したＤＮＡプローブをフィルター１枚当たり約５ｘ１０5ｃｐｍ 添加して、６０℃で一夜保温した。
このようにしてハイブリダイゼーションを行ったフィルターは、１）２ｘＳＳＣ、０.５％(W/V)ＳＤＳを含む溶液中で６０℃にて１５分間、２）２ｘＳＳＣ、０.５％(W/V)ＳＤＳを含む溶液中で２５℃にて３０分間、３）２ｘＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ(W/V)を含む溶液中で６０℃にて１５分間、順次保温することにより洗浄した後、風乾し、Ｘ線フィルム（ＦＵＪＩ  ＲＸ）と増感紙をあて、−８０℃  一夜オートラジオグラムをとった。この結果、ポジティブシグナルを与えるプラークを得た。J.Sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー  クローニング  第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年等に記載される通常の方法を用いて、目的プラーク、ヘルパーファージ、大腸菌を混合し、３７℃で４時間培養後、７０℃にて２０分間保温した。上澄液を大腸菌に感染させ培養することにより、アンピシリンを含んだ培地で生育する形質転換体が得られた。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その塩基配列をダイデオキシ法により決定した結果、得られたクローン株は、エステラーゼ遺伝子の全長をコードしてはいなかった。そこでその配列の一部を有するＤＮＡ断片をプローブとして使用し、再度プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。その際ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（宝酒造社製制限酵素）で部分消化し、λファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）に連結して作製したライブラリーを使用した。その結果、ポジティブシグナルを与えるプラークを得た。該プラークから上記と同様の方法でプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を決定した結果、エステラーゼ遺伝子の全長をコードしていた。このようにしてプラスミドｐＣＣ６（図１）を得た。
【００１３】
参考例４  （野生型遺伝子を含有する発現プラスミド）
野生型遺伝子の開始コドン周辺とその５’上流側の塩基配列を大腸菌での遺伝子発現に適した配列に変換するため、配列番号５〜１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをアプライド社ＤＮＡ合成機モデル３９４Ａを用いて合成した。
ＬＰ−１  （配列番号５）
ＬＰ−２  （配列番号６）
ＥＳ−３  （配列番号７）
ＥＳ−４  （配列番号８）
ＥＳ−５  （配列番号９）
ＥＳ−６  （配列番号１０）
ＥＳ−７  （配列番号１１）
オリゴヌクレオチドＬＰ−２，ＥＳ−３，ＥＳ−５，ＥＳ−６およびＥＳ−７断片の５’末端をリン酸化後、ＬＰ−１、ＥＳ−５とともにライゲーションし、アニーリングを行って、下記の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ）を調製した。該２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ）は、その両端をリン酸化した。
【００１４】
0004916602.tif 000002
【００１５】
一方、ｐＣＣ６中のＳａｃＩ断片（約３.５ｋｂｐ）をｐＵＣ１１８（宝酒造社製）へサブクローニングし、ｐＣＣ３０を作製した。このｐＣＣ３０をＥｃｏ５２Ｉ、およびＳａｃＩで消化することによりエステラーゼ遺伝子の翻訳領域をコードするＤＮＡ断片（約１.２Ｋｂｐ）を切り出した。一方ｌａｃプロモーターを有するｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位の間に、前記ＤＮＡ断片（ＳＤ）および、本発明遺伝子翻訳領域を含むＥｃｏ５２Ｉ−ＳａｃＩ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結することにより（図２）、ｐＣＣ１０１（図３）を作製した。
【００１６】
実施例１  （本発明遺伝子の作製）
１．変異プライマーの調製
アミノ酸置換Ａｓｎ４３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ２４０Ａｌａ、Ｖａｌ２８８Ａｌａ、Ｖａｌ３２５ＩｌｅまたはＡｌａ３６３Ｔｅｒｍ（終始コドン）を導入するための変異プライマーとして、図４および配列番号１２〜２２で示すように、各アミノ酸に対応する塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチド（変異プライマーＮ４３Ｓ、Ｔ２４０Ａ、Ｖ２８８Ａ、Ｖ３２５Ｉ、Ａ３６３Ｔｅｒｍ、ＲＶ−Ｇ、ＲＶ−Ｃ、ＲＶ−Ｄ、ＭＹ−２、ＭＹ−３、ＭＹ−６）を作製した。これらの変異プライマーはアプライドバイオシステムズ社製ＤＮＡ合成機３９４型を用いて合成した後、同社製のオリゴヌクレオチド精製カートリッジにて精製した。
【００１７】
２．部位特異的変異の導入
変異エステラーゼを、 Olfert Landtら（Gene 96 125-128 1990） の方法に準じて調製した。
2-1)ｐＣＣＮ４３Ｓの作製
参考例４で得たｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１７で示される変異プライマ−ＲＶ−Ｇ （１００ｐｍｏｌ）および配列番号１２で示される変異プライマーＮ４３Ｓ（１００ｐｍｏｌ）を用いて、GeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造社製）によりＤＮＡ断片を増幅した（１ｓｔＰＣＲ）。得られたＰＣＲ産物（１９０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣ−０２（宝酒造社製）カラムを使用して精製した。
続いて、同様にｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２１で示される変異プライマーＭＹ−３（５０ｐｍｏｌ）および先に精製した１９０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmpTM PCR ReagentキットによりＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造社製）で電気泳動後、約３７０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
一方、ｐＣＣ１０１  ３μｇをＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ１０１のＮｄｅＩ−Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片（４.２Ｋｂｐ） と先に調製して得られた変異の導入されたＮｄｅＩ-Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片（２４０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＣＣＮ４３Ｓを作製した（図５）。
【００１８】
2-2)ｐＣＣＴ２４０Ａの作製
参考例４で得たｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２２で示される変異プライマーＭＹ−６ （１００ｐｍｏｌ）および配列番号１３で示される変異プライマーＴ２４０Ａ（１００ｐｍｏｌ）を用いて、GeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造社製）によりＤＮＡ断片を増幅した（１ｓｔＰＣＲ）。得られたＰＣＲ産物（２８０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣー０２（宝酒造社製）カラムを使用して精製した。
続いて、同様にｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８で示される変異プライマーＲＶ−Ｃ（５０ｐｍｏｌ）および先に精製した２８０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmpTM PCR ReagentキットによりＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素Ｂｐｕ１１０２ＩおよびＢｓｔＰＩで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造社製）で電気泳動後、約５９０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
一方、ｐＣＣ１０１  ３μｇをＢｐｕ１１０２ＩおよびＢｓｔＰＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ１０１のＢｐｕ１１０２Ｉ−ＢｓｔＰＩ断片（３．８Ｋｂｐ） と先に調製した変異の導入されたＢｐｕ１１０２Ｉ−ＢｓｔＰＩ断片（５９０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＣＣＴ２４０Ａを作製した（図６）。
【００１９】
2-3)ｐＣＣＶ２８８Ａの作製
参考例４で得たｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２２で示される変異プライマ−ＭＹ−６ （１００ｐｍｏｌ）および配列番号１４で示される変異プライマーＶ２８８Ａ（１００ｐｍｏｌ）を用いて、GeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造社製）によりＤＮＡ断片を増幅した（１ｓｔＰＣＲ）。得られたＰＣＲ産物（１３０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣー０２（宝酒造社製）カラムを使用して精製した。
続いて、同様にｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１８で示される変異プライマーＲＶ−Ｃ（５０ｐｍｏｌ）および先に精製した１３０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmpTM PCR ReagentキットによりＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素Ｂｐｕ１１０２ＩおよびＢｓｔＰＩで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造社製）で電気泳動後、約５９０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
一方、ｐＣＣ１０１  ３μｇをＢｐｕ１１０２ＩおよびＢｓｔＰＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ１０１のＢｐｕ１１０２Ｉ−ＢｓｔＰＩ断片（３．８Ｋｂｐ） と先に調製して得られた変異の導入されたＢｐｕ１１０２Ｉ−ＢｓｔＰＩ断片（５９０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＣＣＶ２８８Ａを作製した（図７）。
【００２０】
2-4)ｐＣＣＶ３２５Ｉの作製
参考例４で得たｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２０で示される変異プライマ−ＭＹ−２（１００ｐｍｏｌ）および配列番号１５で示される変異プライマーＶ３２５Ｉ（１００ｐｍｏｌ）を用いて、GeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造社製）によりＤＮＡ断片を増幅した（約２８０ｂｐ）。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造社製）で電気泳動後、約２２０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
一方、ｐＣＣ１０１  ３μｇをＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ１０１のＢｓｔＰＩ−ＸｂａＩ断片（４.２Ｋｂｐ） と先に調製して得られた変異の導入されたＢｓｔＰＩ−ＸｂａＩ断片（２２０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＣＣＶ３２５Ｉを作製した（図８）。
【００２１】
2-5)ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍの作製
参考例４で得たｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２０で示される変異プライマ−ＭＹ−２ （１００ｐｍｏｌ）および配列番号１６で示される変異プライマーＡ３６３ｔｅｒｍ（１００ｐｍｏｌ）を用いて、GeneAmpTM PCR Reagent キット（宝酒造社製）によりＤＮＡ断片を増幅した（１ｓｔＰＣＲ）。得られたＰＣＲ産物（１５０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣー０２（宝酒造社製）カラムを使用して精製した。
続いて、同様にｐＣＣ１０１  ５００ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１９で示される変異プライマーＲＶ−Ｄ（５０ｐｍｏｌ）および先に精製した１５０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmpTM PCR ReagentキットによりＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ宝酒造社製）で電気泳動後、約２２０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
一方、ｐＣＣ１０１  ３μｇをＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣ１０１のＢｓｔＰＩ−ＸｂａＩ断片（４.２Ｋｂｐ） と先に調製して得られた変異の導入されたＢｓｔＰＩ−ＸｂａＩ断片（２２０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍを作製した（図９）。
【００２２】
３．多重変異の導入
3-1)ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍの作製
2-1)で得られたｐＣＣＮ４３Ｓ １０μｇをＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化して３７０ｂｐの断片を得た。一方、ｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍ ３μｇをＮｄｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍのＮｄｅＩ−Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片（４．２ＫｂＰ）と先に調製して得られたＮｄｅＩ−Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片（３７０ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、多重変異本発明遺伝子を含有するプラスミドｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを得た（図１０）。
【００２３】
3-2)ｐＣＣＴ２４０ＡＶ２８８Ａの作製
2-2)で得られたｐＣＣＴ２４０Ａ １０μｇをＣｌａＩおよびＭｌｕＩで消化して２００ｂｐの断片を得た。一方、ｐＣＣＶ２８８Ａ ３μｇをＣｌａＩおよびＭｌｕＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＣＣＶ２８８ＡのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片（４．４Ｋｂｐ）と先に調製して得られたＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片（２００ｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、多重変異本発明遺伝子を含有するプラスミドｐＣＣＴ２４０ＡＶ２８８Ａを得た（図１１）。
【００２４】
実施例２  （形質転換体微生物による本発明エステラーゼの生産）
実施例１で得られた３種類の本発明エステラーゼ発現プラスミドが導入された組換え体大腸菌（ＪＭ１０９／ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ、ＪＭ１０９／ｐＣＣＴ２４０ＡＶ２８８Ａ、ＪＭ１０９／ｐＣＣＶ３２５Ｉ）および野生型エステラーゼ発現ベクターが導入された組換え体大腸菌（ＪＭ１０９／ｐＣＣ１０１）の計４株をアンピシリン１００μg/mlを含むＬＢ培地（トリプトン１w/v％，酵母エキス０.５w/v％，ＮａＣｌ０.５w/v％）５０ｍＬ（５００ｍＬフラスコ）に接種後、３７℃で振とう培養し、対数増殖期（培養開始約２時間後）にＩＰＴＧ（イソプロピルーβーＤーチオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになる様に添加した後さらに４時間培養した。
遠心分離（８０００xｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、その一部（培養液５μｌ相当）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、４種すべてのサンプルにおいて、本発明エステラーゼの分子量に相当する位置に蛋白質が主バンドとして認められた。
【００２５】
実施例３  （本発明エステラーゼの精製）
実施例２で示した方法で培養を行った組換え組換え体大腸菌４種類を各々超音波破砕（２０ＫＨｚ、１５分間、４℃）した後、遠心分離（１２０００xｇ、３０分間、４℃）を行い、その上清を得た。得られた上清１５０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔｆｌｏｗ  ファルマシア社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。０.１５ＭＮａＣｌ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）でカラムを洗浄した後、０.１５ー０.３５ＭＮａＣｌ直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。溶出画分の活性測定はエステラーゼの一般的な基質であるｐ-ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）を用いて行った。具体的には、溶出画分を含む１．０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）に、アセトニトリルに溶解した基質５ｍＭを加え、３７℃で保温し、４１０ｎｍの吸光度の増加を測定した。エステラーゼ活性のある画分を集め、該画分を疎水性樹脂（ＢｕｔｙｌーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。１０％(W/V)の（ＮＨ4）2ＳＯ4 ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）でカラムを洗浄した後、１０ー０％(W/V) 飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。エステラーゼ活性のある画分を集め、精製酵素とした（以下、本発明エステラーゼＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ、Ｔ２４０ＡＶ２８８Ａ、およびＶ３２５Ｉ、および野生型エステラーゼＷＴと記す。）。
【００２６】
実施例４  （本発明エステラーゼの熱安定性測定）
実施例３で得られた４種の精製酵素について、下記の手順によりその熱安定性を測定した。
上記の精製酵素１０μｇ／ｍｌが添加された１．０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）を７０℃で１２０分間保温した後、本発明エステラーゼの活性を測定した。活性測定はエステラーゼの一般的な基質であるｐ-ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）を用いて行った。具体的には、上記保温後の検液に、アセトニトリルに溶解した基質５ｍＭを加え、３７℃で保温し、４１０ｎｍの吸光度を測定した。７０℃１２０分間の保温前の活性に対する保温後の活性の割合を表１に示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
【発明の効果】
本発明により、医農薬やその中間体を製造する為の有機合成反応に利用され得る熱安定性に優れたエステラーゼが提供可能となる。
【００２９】
[配列表フリーテキスト]
配列番号３
設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号４
設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号５
エステラーゼ遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号６
エステラーゼ遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号７
エステラーゼ遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号８
エステラーゼ遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号９
エステラーゼ遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１０
エステラーゼ遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１１
エステラーゼ遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００３０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】野生型エステラーゼをコードする遺伝子がサブクローニングされたプラスミドｐＣＣ６の制限酵素地図を示す図である。
【図２】野生型エステラーゼをコードする遺伝子を含有する発現プラスミドｐＣＣ１０１の構築工程を示す図である。
【図３】野生型エステラーゼをコードする遺伝子を含有する発現プラスミドｐＣＣ１０１の制限酵素地図を示す図である。図中白抜きは、Chromobacterium  SC-YM-1(FERM P-14009)由来のＤＮＡを、黒塗り部は野生型エステラーゼの翻訳領域を示す図である。
【図４】野生型エステラーゼの４３番目のアミノ酸、２４０番めのアミノ酸、２８８番目のアミノ酸、３２５番目のアミノ酸および３６３番目のアミノ酸に特異的変異を導入するために使用される合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図である。
【図５】本発明遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＣＣＮ４３Ｓの構築工程を示す図である。
【図６】本発明遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＣＣＴ２４０Ａの構築工程を示す図である。
【図７】本発明遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＣＣＶ２８８Ａの構築工程を示す図である。
【図８】本発明遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＣＣＶ３２５Ｉの構築工程を示す図である。
【図９】本発明遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＣＣＡ３６３ｔｅｒｍの構築工程を示す図である。
【図１０】本発明遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍの構築工程を示す図である。
【図１１】本発明遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＣＣＴ２４０Ｖ２８８Ａの構築工程を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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