(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得られた血液中、血清中、または血漿中のROBO1タンパク質の細胞外領域を検出することを特徴とする癌の検出方法。
【請求項２】
ROBO1タンパク質が細胞から分離したROBO1タンパク質である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
ROBO1タンパク質を認識する抗体を用いることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項４】
以下の工程：
（ａ）  被験者から採取された血液、血清、または血漿を提供する工程；
（ｂ）  提供された血液、血清、または血漿に含まれるROBO1タンパク質の細胞外領域を検出する工程
を含む癌の検出方法。
【請求項５】
ROBO1タンパク質を認識する抗体を用いることを特徴とする請求項４記載の検出方法。
【請求項６】
ROBO1タンパク質と結合する抗体を含有する、肝細胞癌を検出するためのキット。
【請求項７】
抗体がROBO1タンパク質の細胞外領域と結合する抗体である、請求項６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、癌の診断および治療方法、肝炎重篤化のモニター方法、ならびに細胞増殖抑制剤および抗癌剤に関する。
【背景技術】  ショウジョウハエの遺伝的スクリーニング研究において、ＲＯＢＯ１は軸策の正中交差を制御する分子として同定され、その後の研究から、Ｓｌｉｔタンパク質の受容体として働くことが報告されている（Ｋｉｄｄら、Ｃｅｌｌ，９２，２０５−２１５，１９９８、Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ，９６，７７１−７８４，１９９９、Ｋｉｄｄら、Ｃｅｌｌ，９６，７８５−７９４，１９９９、Ｂｒｏｓｅら、９６，７９５−８０６，１９９９）。また、ＲＯＢＯ１と癌との関連に関しては、ヒトＲＯＢＯ１遺伝子が存在する染色体領域３ｐ１２が肺癌において高度に欠損していることや、乳癌や腎癌においてＲＯＢＯ１のプロモーター領域がメチル化されることで発現が抑制されていることなどから、癌抑制遺伝子の可能性が示されている（Ｄａｌｌｏｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，３０２０−３０２８，２０００）。実際に、肺癌患者において認められたＲＯＢＯ１遺伝子における最小の欠損と同様に、マウスにおいてＲＯＢＯ１のＮ末に存在する最初のイムノグロブリン領域を欠損させることで、気管上皮細胞の過形成が認められている（Ｘｉａｎ  Ｊら、ＰＮＡＳ，９８，１５０６２−１５０６６，２００１）。また、ＲＯＢＯ１が癌の新生血管に発現し、かつ癌細胞側にＲＯＢＯ１のリガンドであるＳｌｉｔ２が発現亢進することで癌の血管新生を誘導し、逆に癌の増殖を指示するという報告もある（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，４，１９−２９，２００３）。
一方、ＲＯＢＯ１のリガンドであるＳｌｉｔ２遺伝子も多くの癌種でメチル化等により発現抑制されていることや、Ｓｌｉｔ２を強制発現させること、またはＳｌｉｔ２を添加することで、肺癌細胞、乳癌細胞、および大腸癌細胞において、増殖抑制作用、アポトーシス誘導作用が認められることから、ＲＯＢＯ１のリガンドであるＳｌｉｔ２も同様に癌抑制遺伝子として考えられている（Ｄａｌｌｏｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，５８７４−５８８０，２００２、Ｄａｌｌｏｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３，１０５４−１０５８，２００３）。しかしながら、この報告では、Ｓｌｉｔ２による細胞増殖抑制作用が実際にどの受容体を介しているのか明らかになっておらず、ＲＯＢＯ１と癌との関連性は必ずしも明らかになっていない。
原発性肝細胞癌は、２００１年において日本国内の死亡原因第一である癌死の中において男性において第三位（１３％）、女性において第四位（９．０％）を占める予後の悪い癌種の一つである（厚生労働省大臣官房統計情報部「人口動態統計」抜粋）。ウイルス感染による慢性患者が年々増加し、その多くは肝硬変、そして肝細胞癌に至るケースが多いことから、肝硬変から肝細胞癌における段階の早期診断法、そして肝細胞癌の治療法は非常に強く要望されているものであり、画期的な解決のない場合は、今後１０−１５年間は死亡数の増加傾向をたどると考えられている。
肝細胞癌の診断法に関しては、血清中のＧＯＰ／ＧＴＰ、アルカリ性フォスファターゼ、アルブミン等や腫瘍マーカーであるＡＦＰ（α−フェトプロテイン）の値等の生化学的データ、および画像診断に基づいて総合的に評価した後、必要な場合は、針生検により少量の組織片をとり、病理学的判断に基づき確定診断が行われている。現在、特に肝細胞癌の診断において使用されているのは腫瘍マーカーであり、その中で最も使用されているアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）の肝細胞癌患者の陽性率は６〜７割程度となっているが、慢性肝疾患患者や妊婦でも陽性となることもある。また肝癌腫瘍マーカーであるＰＩＶＫＡ−ＩＩの陽性率は５割弱と低いが肝細胞癌への特異性はＡＦＰよりも高いと考えられ、現在この２検査が主に実施されている。いずれにしても、偽陽性もしくは両陰性の症例が存在することから、特異性の高い腫瘍マーカーの存在が期待されている。
針生検により採取された検体の病理組織検査は、肝疾患の確定診断において重要な検査である。特に採取量が限られることもあり、より確実な診断技術が必要とされている。病理学的特徴のみではなく、早期の肝細胞癌を非癌部組織から識別できるような肝癌特異的発現抗原に対する抗体の開発が望まれている。
肝臓疾患の診断・モニターは、多種類のマーカーによる検査およびバイオプシーによる検査にて炎症、線維化および癌化への移行を診断しているのが現状である。多くの肝癌患者においては、ウイルス感染、肝炎、慢性肝炎、肝硬変そして肝癌へと移行する。従って、肝臓疾患の診断・モニターを簡便に行うことができる方法の開発は、医療経済の上からだけでなく、患者への負担の軽減および的確な医療指針を得るために有用である。
肝細胞癌の治療法に関しては、主に外科的切除、肝動脈塞栓療法、経皮的エタノール注入療法の３療法が中心となる医療施設が多い。いずれの方法も長所・短所があり、比較的応用範囲の広く、延命効果のある肝動脈塞線療法を選択しても、完全治癒率は現在１０％程度と考えられていることから、新規の治療法が非常に望まれている状況である。
肝細胞癌における臨床現場での応用例はまだないが、乳癌あるいはリンフォーマなどにおいては癌特異的な腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体による標的療法により、従来の化学療法剤治療とは異なる作用機作により奏効率をあげている。その抗体医薬品の作用機差として、エフェクター細胞を介した抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）あるいは補体による補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）、そして抗体自身の機能によるアゴニスティック作用、あるいは抗体の中和活性能を利用したものが存在する。分子標的療法は現在、臨床現場において応用し始められたことから、これらの分子標的療法を応用し、肝細胞癌細胞に対する腫瘍特異的発現分子を標的とした抗体医薬品療法は今後非常に期待されるものであると考える。
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：
ＷＯ９９／２０７６４；ＷＯ９８／４８０５１；ＷＯ０１／４６６９７；ＷＯ０３／２９４８８；ＷＯ０１／００８２８；ＷＯ０１／５７２０７；ＷＯ０１／９２５８１；ＷＯ０２／０４５１４；ＷＯ０２／１４５００；ＷＯ０２／２９１０３。
【発明の開示】
本発明は、癌を診断および治療する新規方法、ならびに新規な細胞増殖抑制剤および抗癌剤を提供すること、さらに肝臓疾患の診断およびモニターする方法を提供することを目的とする。
本発明者らはＲＯＢＯ１が肝細胞癌、肺癌、乳癌、子宮癌、胃癌、脳腫瘍、大腸癌などの癌細胞で高発現していることを見出した。さらに、抗ＲＯＢＯ１抗体の補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を測定したところ、抗ＲＯＢＯ１抗体はＲＯＢＯ１発現細胞に対してＣＤＣ活性を有することを見出した。一方、肝臓疾患の重篤化により血中ＲＯＢＯ１濃度が上昇することを見出した。以上の知見により、本発明者らは、抗ＲＯＢＯ１抗体が肝細胞癌をはじめとしたＲＯＢＯ１が発現亢進する癌の診断、予防および治療に有効であること、さらに肝臓疾患の診断およびモニターする方法をを見出して、本発明を完成させた。
本発明は、ＲＯＢＯ１タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。本発明の方法においては、好ましくは、ＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外領域が検出される。また好ましくは、本発明の方法はＲＯＢＯ１タンパク質を認識する抗体を用いて行われる。好ましくは、本発明の方法においては、血液中、血清中、または血漿中のＲＯＢＯ１タンパク質、あるいは細胞から分離したＲＯＢＯ１タンパク質が検出される。
別の態様においては、本発明は、以下の工程：
（ａ）  被験者から試料を採取する工程；
（ｂ）  採取された試料に含まれるＲＯＢＯ１タンパク質を検出する工程
を含む癌の診断方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、ＲＯＢＯ１タンパク質と結合する抗体を含有する、癌を診断するためのキットを提供する。好ましくは、癌は肝細胞癌である。また好ましくは、本発明のキットにおいて、抗体はＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外領域と結合する抗体である。
別の態様においては、本発明は、ＲＯＢＯ１に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、ＲＯＢＯ１に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤を提供する。本発明はまた、ＲＯＢＯ１に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。好ましくは、ＲＯＢＯ１に結合する抗体は細胞障害活性を有する抗体である。また好ましくは、癌は肝細胞癌である。
また別の態様においては、本発明は、異常な細胞増殖に起因する疾患を治療する方法であって、治療を必要とする患者にＲＯＢＯ１に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、癌を治療する方法であって、治療を必要とする患者にＲＯＢＯ１に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、癌は肝細胞癌である。
別の態様においては、本発明は、ＲＯＢＯ１発現細胞とＲＯＢＯ１に結合する抗体とを接触させることによりＲＯＢＯ１発現細胞に細胞障害を引き起こす方法を提供する。本発明はまた、ＲＯＢＯ１発現細胞とＲＯＢＯ１に結合する抗体とを接触させることによりＲＯＢＯ１発現細胞の増殖を抑制する方法を提供する。好ましくは、ＲＯＢＯ１に結合する抗体は細胞障害活性を有する抗体である。また好ましくは、ＲＯＢＯ１発現細胞は癌細胞である。
さらに別の態様においては、本発明は、ＲＯＢＯ１に結合し、かつＲＯＢＯ１発現細胞に対して細胞障害活性を有する抗体を提供する。
また別の態様においては、本発明は、抗ＲＯＢＯ１抗体を含有する肝炎重篤化をモニターするためのキットを提供する。好ましくは、抗ＲＯＢＯ１抗体はＲＯＢＯ１を特異的に認識する抗体である。好ましくは、本発明のキットは、肝炎または肝硬変から肝癌への移行を予測するものである。好ましい態様においては、本発明のキットは、支持体に固定した第１の抗ＲＯＢＯ１抗体と標識物質で標識された第２の抗ＲＯＢＯ１抗体を含む。
さらに別の態様においては、本発明は、被検試料中のＲＯＢＯ１を測定することを特徴とする肝炎重篤化のモニター方法を提供する。好ましくは、被検試料中のＲＯＢＯ１は抗ＲＯＢＯ１抗体を用いて測定する。好ましくは、抗ＲＯＢＯ１抗体はＲＯＢＯ１を特異的に認識する抗体である。また好ましくは、被検試料は、血液、血清または血漿である。好ましくは、本発明のモニター方法は、肝炎または肝硬変から肝癌への移行を予測するものである。好ましい態様においては、本発明のモニター方法は、支持体に固定した第１の抗ＲＯＢＯ１抗体と標識物質で標識された第２の抗ＲＯＢＯ１抗体とを用いて行われる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３を用いたＲＯＢＯ１遺伝子発現解析の結果を示す。図１ａ：正常組織・非癌部におけるＲＯＢＯ１遺伝子の発現解析、図１ｂ：臨床検体におけるＲＯＢＯ１遺伝子の発現解析、図１ｃ：癌細胞株におけるＲＯＢＯ１遺伝子の発現解析。
図２は、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ９５を用いたＲＯＢＯ１遺伝子発現の解析の結果を示す。
図３は、全長ＲＯＢＯ１遺伝子の一過性発現によるＣＯＳ７細胞およびＨＥＫ２９３細胞のライゼートにおけるウエスタン解析結果、およびその培養上清におけるウエスタン解析結果を示す。
図４は、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体Ａ７２４１Ａを用いた肝癌細胞株ライゼートにおけるウエスタン解析結果を示す。
図５は、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体Ａ７２４１Ａを用いた肝細胞癌パラフィン標本の免疫組織染色解析結果を示す。
図６は、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体Ａ７２４１Ａを用いた患者血清中の可溶型ＲＯＢＯ１のウエスタン解析結果を示す。
図７は、ｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清を用いた、全長ＲＯＢＯ１遺伝子強制発現ＨＥＫ２９３細胞のライゼートにおけるウエスタン解析結果を示す。
図８は、ｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清を用いた、全長ＲＯＢＯ１遺伝子強制発現ＨＥＫ２９３細胞のライゼートにおけるＦＡＣＳ解析結果を示す。
図９は、ｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清を用いた、ＨｅｐＧ２細胞のライゼートにおけるＦＡＣＳ解析結果を示す。
図１０は、ウサギ抗ｓＲＯＢＯ１抗体を用いたエンザイムイムノアッセイによるＲＯＢＯ１測定のスタンダードカーブを示す。
図１１は、ＲＯＢＯ１濃度と肝疾患の重篤度との相関関係を示す。
図１２は、肝疾患患者のＲＯＢＯ１濃度の変化を示す。
図１３は、抗ＲＯＢＯ１抗血清のＲＯＢＯ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対するＣＤＣ活性の測定結果を示す。
図１４は、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体のＲＯＢＯ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
図１５は、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体のＲＯＢＯ１発現Ａｌｅｘａｎｄｅｒ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
図１６は、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体のＲＯＢＯ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す。
発明の詳細な説明
本発明の方法は、ＲＯＢＯ１タンパク質を検出することを特徴とする。ＲＯＢＯ１（Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ１）は、軸索誘導受容体蛋白質であり、そのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、バリアント１についてはＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００２９４１（配列番号９および１０）、バリアント２についてはＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿１３３６３１（配列番号１１および１２）に開示されている。本発明において、ＲＯＢＯ１タンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、ＲＯＢＯ１タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のＲＯＢＯ１タンパク質の機能を有していなくてもよい。断片の例としては、限定されないが、ＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外領域を含む断片が挙げられる。ＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外領域は配列番号１１のアミノ酸配列において１−８５９番目が相当する。又、膜貫通領域は配列番号１１のアミノ酸配列において８６０−８８０番目が相当する（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１，２９−３５，１９９８）。
本発明においては、肝細胞癌において、非常に高頻度でＲＯＢＯ１が遺伝子レベルおよびタンパク質レベルで発現亢進していることが見いだされた。また他癌種の臨床検体および癌細胞株の解析から、肝細胞癌のみならず、肺癌、乳癌、子宮癌、胃癌、脳腫瘍、大腸癌などにおいても発現亢進している可能性が示された。また、ＲＯＢＯ１に特異的なモノクローナル抗体を用いることにより、免疫組織診断が可能であることが示された。さらに、ＲＯＢＯ１が生体内においてシェディングされ、可溶型ＲＯＢＯ１（ｓＲＯＢＯ１）が癌患者血中に存在することが見いだされた。すなわち、ｓＲＯＢＯ１は癌の血清診断マーカーとして有用である。
ＲＯＢＯ１の検出
本発明で検出するＲＯＢＯ１タンパク質はヒトＲＯＢＯ１タンパク質が好ましいが、それに限定されず、イヌＲＯＢＯ１、ネコＲＯＢＯ１、マウスＲＯＢＯ１、ハムスターＲＯＢＯ１などいかなるＲＯＢＯ１でもよい。
本発明において検出とは、定量的または非定量的な検出を含み、例えば、非定量的な検出としては、単にＲＯＢＯ１タンパク質が存在するか否かの測定、ＲＯＢＯ１タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＲＯＢＯ１タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な検出としては、ＲＯＢＯ１タンパク質の濃度の測定、ＲＯＢＯ１タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
被検試料としては、ＲＯＢＯ１タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、または血漿である。又、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
診断される癌は、特に制限されず如何なる癌でもよいが、具体的には、肝癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、腎癌、脳腫瘍、子宮癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などを挙げることができる。好ましいものは肝癌であり、特に好ましいものは肝細胞癌である。
本発明においては、被験試料中にＲＯＢＯ１タンパク質が検出された場合、陰性コントロールまたは健常者と比較して被験試料中に検出されるＲＯＢＯ１タンパク質の量が多いと判断される場合に、被験者が癌であるまたは癌になる可能性が高いと判定される。
さらに、肝疾患を有する患者のＲＯＢＯ１タンパク質濃度を測定することにより、肝疾患の重篤化をモニターすることができる。
本発明の診断方法の好ましい態様としては、細胞から遊離し、血中に存在するＲＯＢＯ１タンパク質を検出することを特徴とする診断方法を挙げることができる。特に好ましくは、血中に存在するＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外領域を含む断片を検出する。
被検試料に含まれるＲＯＢＯ１タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＲＯＢＯ１抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
抗ＲＯＢＯ１抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＲＯＢＯ１抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＲＯＢＯ１抗体とＲＯＢＯ１タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＲＯＢＯ１抗体を介して支持体に結合したＲＯＢＯ１タンパク質を検出することにより、被検試料中のＲＯＢＯ１タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
本発明において抗ＲＯＢＯ１抗体を固定するために用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＲＯＢＯ１抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
抗ＲＯＢＯ１抗体とＲＯＢＯ１タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＲＯＢＯ１タンパク質と抗ＲＯＢＯ１抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
本発明のＲＯＢＯ１タンパク質検出方法においては、ＲＯＢＯ１タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＲＯＢＯ１タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＲＯＢＯ１タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＲＯＢＯ１タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＲＯＢＯ１タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＲＯＢＯ１タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＲＯＢＯ１タンパク質を定量的に検出することも可能である。
抗ＲＯＢＯ１抗体を介して支持体に結合したＲＯＢＯ１タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＲＯＢＯ１抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗ＲＯＢＯ１抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＲＯＢＯ１タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
抗ＲＯＢＯ１抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＲＯＢＯ１抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
具体的には、抗ＲＯＢＯ１抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＲＯＢＯ１抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＲＯＢＯ１抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＲＯＢＯ１抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
本発明のＲＯＢＯ１タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＲＯＢＯ１抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。
具体的には、抗ＲＯＢＯ１抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＲＯＢＯ１抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＲＯＢＯ１抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＲＯＢＯ１タンパク質を検出する。
本発明のＲＯＢＯ１タンパク質検出方法の他の態様として、ＲＯＢＯ１タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＲＯＢＯ１抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＲＯＢＯ１タンパク質を、一次抗ＲＯＢＯ１抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
本発明のＲＯＢＯ１タンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＲＯＢＯ１抗体を感作した担体を用いてＲＯＢＯ１を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗ＲＯＢＯ１抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＲＯＢＯ１を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
本発明のＲＯＢＯ１タンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマーシャムバイオサイエンス社製）等のバイオセンサーを用いることによりＲＯＢＯ１タンパク質と抗ＲＯＢＯ１抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＲＯＢＯ１抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＲＯＢＯ１抗体に結合するＲＯＢＯ１タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
本発明は、癌の診断のための被検試料中のＲＯＢＯ１タンパク質を検出するための診断薬またはキットの提供をも目的とするが、該診断薬またはキットは少なくとも抗ＲＯＢＯ１抗体を含む。該診断薬またはキットがＥＬＩＳＡ法等のＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬またはキットがラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
抗ＲＯＢＯ１抗体の作製
本発明で用いられる抗ＲＯＢＯ１抗体はＲＯＢＯ１タンパク質に特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明で使用される抗ＲＯＢＯ１抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＲＯＢＯ１抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＲＯＢＯ１を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＲＯＢＯ１を、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＦ０５９１５９（ＮＭ＿１３３６３１）に開示されたＲＯＢＯ１遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、ＲＯＢＯ１をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＲＯＢＯ１タンパク質を公知の方法で精製する。また、天然のＲＯＢＯ１を精製して用いることもできる。
次に、この精製ＲＯＢＯ１タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＲＯＢＯ１の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＲＯＢＯ１のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ＲＯＢＯ１遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることにより得ることもでき、さらに天然のＲＯＢＯ１をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＲＯＢＯ１の領域および大きさは限定されない。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
又、ＲＯＢＯ１を認識する抗体の作製は国際公開ＷＯ０３／１０４４５３に記載された方法を用いて作製してもよい。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうかを決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＯＢＯ１に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＲＯＢＯ１への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＲＯＢＯ１を投与して抗ＲＯＢＯ１抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＲＯＢＯ１に対するヒト抗体を取得してもよい（国際公開ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。具体的には、抗ＲＯＢＯ１抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＲＯＢＯ１抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。目的とする抗ＲＯＢＯ１抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗ＲＯＢＯ１抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開ＷＯ９４／１１５２３参照）。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
キメラ抗体およびヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許公開ＥＰ２３９４００、国際公開ＷＯ９６／０２５７６参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６．）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際公開ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、国際公開ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＲＯＢＯ１に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
抗体の断片は、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９８８，８５，５８７９−５８８３．）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば３−２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
さらに、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はＲＯＢＯ１分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＲＯＢＯ１を認識し、他方の抗原結合部位が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞障害性物質を認識してもよい。この場合、ＲＯＢＯ１を発現している細胞に直接細胞障害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に障害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
医薬組成物
別の観点においては、本発明は、ＲＯＢＯ１に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を特徴とする。又、本発明はＲＯＢＯ１に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤を特徴とする。
本発明において、「ＲＯＢＯ１に結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗ＲＯＢＯ１抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗ＲＯＢＯ１抗体の含有率を制限するものではない。
本発明の細胞増殖抑制剤に含有される抗体はＲＯＢＯ１と結合する限り特に制限はない。好ましくはＲＯＢＯ１と特異的に結合する抗体であり、さらに好ましくは細胞障害活性を有する抗体である。さらに、本発明で使用される抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞障害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、グリコシル化が修飾された抗体（ＷＯ９９／５４３４２など）、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０など））、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖を有する抗体（ＷＯ０２／７９２５５など）などが知られている。
本発明における細胞障害活性とは、例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性などを挙げることができる。本発明において、ＣＤＣ活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
抗ＲＯＢＯ１抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３）等）。
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。
（１）エフェクター細胞の調製
ＣＢＡ／Ｎマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で脾臓細胞を分離する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０６／ｍｌに調製し、エフェクター細胞を調製する。
（２）補体溶液の調製
Ｂａｂｙ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を１０％  ＦＢＳ含有培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて１０倍希釈し、補体溶液を調製する。
（３）標的細胞の調製
ＲＯＢＯ１を発現する細胞（ＲＯＢＯ１をコードする遺伝子で形質転換された細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、等）を０．２ｍＣｉの５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とともに、１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を１０％  ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０５／ｍｌに調製して、標的細胞を調製する。
次いで、ＡＤＣＣ活性、又はＣＤＣ活性の測定を行う。ＡＤＣＣ活性の測定の場合は、９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗ＲＯＢＯ１抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または１０μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ  Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定する。細胞障害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％  ＮＰ−４０（半井社製）を加えた試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性（ｃｐｍ）を示す。
一方、ＣＤＣ活性の測定の場合は、９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗ＲＯＢＯ１抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、補体溶液１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または３μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞障害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。
抗ＲＯＢＯ１抗体が増殖を抑制する細胞は、ＲＯＢＯ１が発現している細胞であれば特に限定されないが、好ましくは癌細胞であり、さらに好ましくは肝癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、胃癌細胞、脳腫瘍細胞、大腸癌細胞である。従って、抗ＲＯＢＯ１抗体は、細胞増殖に起因する疾患、例えば肝細胞癌、肺癌、乳癌、子宮癌、胃癌、脳腫瘍、大腸癌などの治療、予防を目的として使用できる。
本発明の細胞増殖阻害剤および抗癌剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、医薬的に許容される担体や添加物を供に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
また、本発明は、ＲＯＢＯ１発現細胞とＲＯＢＯ１に結合する抗体とを接触させることによりＲＯＢＯ１発現細胞に障害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制する方法を提供する。ＲＯＢＯ１に結合する抗体は、本発明の細胞増殖抑制剤に含有されるＲＯＢＯ１に結合する抗体として上述したとおりである。抗ＲＯＢＯ１抗体が結合する細胞はＲＯＢＯ１が発現している細胞であれば特に限定されないが、好ましくは癌細胞であり、さらに好ましくは肝癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、胃癌細胞、脳腫瘍細胞、大腸癌細胞である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００４−１０２８６２号、２００４−２２７８９９号および２００５−００４０２４号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１
各癌種におけるＲＯＢＯ１のｍＲＮＡ発現解析
１−１．Ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐを用いたＲＯＢＯ１遺伝子発現解析
癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索するために、表１に示す各種ＲＮＡならびに各種摘出組織よりＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を用い常法により調製した全ＲＮＡを用い検討した。
【表１】
0004913590.tif 000002
0004913590.tif 000003
上記全ＲＮＡを各１０ｎｇずつ用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｕ−１３３（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社製）に供しＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ＲＯＢＯ１  ｍＲＮＡ（プローブＩＤ：２１３１９４＿ａｔ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）が正常肝（９．１）と比較して、中分化型肝細胞癌（２３６．４）で２６倍、低分化型肝細胞癌（５６３）で６２倍と顕著に発現亢進していることが明らかになった。またＲＯＢＯ１  ｍＲＮＡは大腸癌においても発現亢進しており、正常大腸（２１．４）と比較して原発性大腸癌において８例中５例において２倍以上亢進していた。さらに、大腸癌の転移性肝癌においては、７例中３例において正常肝臓および大腸と比較しても顕著に亢進していた。また、ＲＯＢＯ１は肺小細胞癌においても正常肺と比較し２倍以上亢進している例が１例存在した（図１ａ，ｂ）。
癌細胞株における解析においては、ＲＯＢＯ１の発現は、ヒト脳腫瘍由来細胞株であるＵ２５１、ヒト肝癌細胞株由来のＡｌｅｘａｎｄｅｒ、ＨＬＥ、ＨｕＨ６、ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２、ヒト肺癌細胞株由来のＬｕ１３２０、Ｈ５２２、そしてヒト子宮頸部癌由来のＨｅｌａなどでスコア１００を示し、ＲＯＢＯ１が上記で示した肝細胞癌、大腸癌、そして肺癌のみならず、脳腫瘍や子宮頸部癌など広範な癌において発現亢進している可能性が示された（図１ｃ）。
さらに、肝細胞癌に関して高分化型、中分化型（ＨＢＶ、もしくはＨＣＶウイルス感染に起因するもの）、低分化型肝細胞癌、ならびに非癌部である肝炎部位、肝硬変部位、ならびに正常肝に関して、前述と同様にＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−Ｕ９５Ｂ  Ｔａｒｇｅｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて解析した。それぞれ各３例分の摘出組織より全ＲＮＡを調製し、５μｇずつの全ＲＮＡを３例分混合したものをＧｅｎｅＣｈｉｐ解析に供した。全チップスコアの平均値を１００として標準化した値を示す。
その結果、ＲＯＢＯ１遺伝子（プローブＩＤ：５５４６１＿ａｔ＿ＨＧ−Ｕ９５Ｂ）は正常肝、非癌部で発現量が非常に低いのに対し、高分化型肝細胞癌から低分化型肝細胞癌において顕著な発現上昇が確認され、肝細胞癌で発現が亢進していることが明らかとなった（図２）。
実施例２
１−２．定量的ＰＣＲによるＲＯＢＯ１  ｍＲＮＡ発現解析
正常肝、肝炎部位、肝硬変部位、ならびに肝癌摘出組織、および同一組織の非癌部より調製したＲＮＡを用い定量的ＰＣＲを実施した。すなわち、各組織より調製した全ＲＮＡより逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用い、ｉＣｙｃｌｅｒｉＱリアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）によりＰＣＲ反応を行い、ｍＲＮＡ発現量を定量した。ＲＯＢＯ１のプライマーデザインはＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿１３３６３１）より行った。各２５μＬのＰＣＲ反応液は、５００ｍＭ  ＫＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％  ゼラチン、各１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、１μＬの各１本鎖ｃＤＮＡ、５ｐｍｏｌｅずつのＲＯＢＯ１センスプライマー（配列番号１）、ＲＯＢＯ１アンチセンスプライマー（配列番号２）、０．７５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（１０００倍希釈溶液，宝酒造社製）、０．２５μＬのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＦＧ  Ｐｌｕｔｈｅｒｏ，Ｒａｐｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９３  ２１：４８５０−４８５１．）を含むように調製した後、初めに９４℃で３分間一次変性を行い、９４℃で１５秒、６３℃で１５秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを４０回行なった。各標品中の発現量はｉＣｙｃｌｅｒｉＱリアルタイム解析システム付属ソフトを用いて計算した。また、個々のＲＮＡ中のヒトβ−アクチン遺伝子発現量もヒトβ−アクチンに特異的なセンスプライマー（配列番号３）ならびにアンチセンスプライマー（配列番号４）を用い上記と同様に解析を行い、ＲＯＢＯ１の解析結果をヒトβ−アクチンの解析結果で補正した値（ＲＯＢＯ１／β−アクチンｘ１００）をＲＯＢＯ１ｍＲＮＡ発現量とした。
その結果、ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析の結果と同様に、正常肝や肝炎部位、ならびに肝硬変部位におけるＲＯＢＯ１  ｍＲＮＡの発現はほとんど認められないのに対し、多くの肝細胞癌部位においてはＲＯＢＯ１  ｍＲＮＡの発現の亢進が確認された。特に、同一組織内での癌部と非癌部との比較においては９例解析したうち８例においては２倍以上の発現亢進が認められた（表２）。
【表２】
0004913590.tif 000004
実施例３
抗ＲＯＢＯ１抗体の作製
抗ＲＯＢＯ１抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗ＲＯＢＯ１抗体の作製を行った。
３−１．抗原の調製
３−１−１．ＲＯＢＯ１  ｃＤＮＡの単離
ＲＯＢＯ１の発現を行うために、まずＲＯＢＯ１のｃＤＮＡを以下のようにして単離した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞より前述の方法に従い一本鎖ｃＤＮＡを調製し、それを鋳型としてプライマーＲＢＶ２Ｆ−ＴＡ（配列番号：５）とＲＢＲ−ＴＡ（配列番号：６）を用いてＰＣＲ法による増幅を行った。プライマーＲＢＶ２Ｆ−ＴＡはＲＯＢＯ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１３３６３１）の５’−端にハイブリダイズするように、そしてＲＢＲ−ＴＡは３’−端にハイブリダイズするようにデザインした。ＰＣＲ法はＬＡ−ＰＣＲキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）のプロトコールに準じて反応液を調製し、初めに９５℃で２分間一次変性を行い、９４℃で１５秒、６３℃で１５秒、７２℃で５分からなるサイクルを３０回行なった後、最後の伸長反応を７２℃で１０分間からなる条件で実施した。その結果、ＲＯＢＯ１予測配列と一致する約５ｋｂｐ付近のバンドの検出に成功した。ＰＣＲ法で得られた特異的増幅断片をＴＡクローニング法によりｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したｃＤＮＡがＲＯＢＯ１であることが明らかとなった。
３−１−２．ＲＯＢＯ１のＮ末部位を発現する組換えバキュロウイルスの作製
ＲＯＢＯ１のＮ末から最初のイムノグロブリン領域（Ｉｇ１）を含む領域に関してバキュロウイルスの膜タンパク質ｇｐ６４との融合タンパク質として発現させた。すなわち、上記のＲＯＢＯ１  ｃＤＮＡを鋳型とし、ＲＢ＿ＢＶＦプライマー（配列番号：７）、およびＲＢ＿ＢＶＲプライマー（配列番号：８）を用いＰＣＲ法にてＲＯＢＯ１のＮ末から最初のイムノグロブリン領域（Ｉｇ１）を含む領域をコードする遺伝子を増幅し、続いてｐＧＥＭ−Ｔｅベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素Ｋｐｎｌを用いて切断した遺伝子断片をｐＢｕｃＳｕｒｆベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、トランスファーベクターＲＯＢＯ１Ｎ／ｐＢＳを構築した。続いて、４μｇのＲＯＢＯ１Ｎ／ｐＢＳを制限酵素ＢｐｌＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）を用い切断し直鎖化した後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の指示書に準じてＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡと共にＳｆ９細胞に導入し、ＲＯＢＯ１−Ｉｇ１とｇｐ６４との融合タンパク質発現組み換えバキュロウイルスを調製した。
上記により調製した組換えウイルスをＳｆ９細胞（２ｘ１０６個細胞／ｍＬ）にＭＯＩが５となるように加え感染させた後、２７℃で３日間培養した。ＲＯＢＯ１−Ｉｇ１とｇｐ６４との融合タンパク質を発現する発芽型バキュロウイルス（ＢＶ）は３日間培養後の培養上清より回収した。すなわち、培養液を８００ｘｇで１５分間遠心し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した後、回収した培養上清を４５，０００ｘｇで３０分間遠心する。沈殿物をＰＢＳに懸濁し、さらに８００ｘｇで遠心することで細胞成分を除去し、上清を再度４５，０００ｘｇで遠心することで得られる沈殿物をＰＢＳで懸濁したものをＢＶ画分とし、抗原として免疫に用いた。
３−２．抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体の作製
上記の方法により調製したＲＯＢＯ１−Ｉｇ１発現ＢＶを抗原として用い抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体を作製した。すなわち、ＰＢＳに懸濁した１ｍｇのタンパク量に相当するＲＯＢＯ１−Ｉｇ１発現ＢＶを２００ｎｇの百日咳毒素とを混合したものをｇｐ６４トランスジェニックマウス（ＷＯ０３／１０４４５３）に皮下注射により初回免疫を行った。以後の免疫では５００μｍｇタンパク量相当のＲＯＢＯ１−Ｉｇ１発現ＢＶのみを皮下注射した。最終免疫として２５０μｇのＲＯＢＯ１−Ｉｇ１発現ＢＶを静脈内に投与し、その３日後にマウスから脾臓細胞を単離し、常法によりマウスＰ３Ｕ１細胞との細胞融合を行い、ハイブリドーマ細胞を樹立した。抗ＲＯＢＯ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択は免疫に用いた抗原であるＲＯＢＯ１−Ｉｇ１発現ＢＶを固層したＥＬＩＳＡにて実施した。ＥＬＩＳＡ法は、ＲＯＢＯ１−Ｉｇ１発現ＢＶを終濃度１０μｇ／ｍｌになるように９６ウェル平底プレート（ファルコン社製）に４℃で一昼夜おき、その後、４０％ブロックエース試薬（大日本製薬社製）を含むＴＢＳ緩衝液を用いてブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を加え、室温で１時間反応させた。次いで、室温にて１時間ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）を反応させ、４回洗浄した後、室温にて１時間、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（Ｓｉｇｍａ製）を反応させた。０．５Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレート・リーダーＭｕｌｔｉｃｋａｎＪＸ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）で４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、ＲＯＢＯ１に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞Ａ７２４１ＡならびにＡ７２２５Ａの樹立に成功した。各モノクローナル抗体は産生ハイブリドーマ細胞の培養上清より硫安沈殿法により調製した。
実施例４
抗ＲＯＢＯ１抗体を用いたＲＯＢＯ１タンパク質分子の検出
上記により調製した抗ＲＯＢＯ１抗体の反応性を確認するために、ＲＯＢＯ１強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いＲＯＢＯ１の検出を行った。初めに、ＲＯＢＯ１強制発現ＨＥＫ２９３細胞を用いウエスタン解析により抗ＲＯＢＯ１抗体Ａ７２４１Ａの反応性を確認した。動物細胞発現ベクターは、前述のＲＯＢＯ１をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した全長ＲＯＢＯ１遺伝子発現ベクター（ＲＯＢＯ１／ｐｃＤＮＡ３．１）を使用した。続いて、１μｇのＲＯＢＯ１／ｐｓＤＮＡ３．１もしくは陰性対照としてｐｃＤＮＡ３．１（Ｍｏｃｋ）を５ｘ１０４個のＣＯＳ７細胞あるいは２ｘ１０５個ＨＥＫ２９３細胞にＦｕＧｅｎｅ６試薬（ロシュダイダイアグノスティック社製）を用いて導入し、ＲＯＢＯ１を一過性発現させた。発現ベクター導入３日後の細胞を回収し、培養細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％  ＮＰ−４０、０．５  ％デオキシコール酸、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））にて可溶化することで細胞ライゼートを調製した。
それぞれ３μｇタンパク質相当量のライゼートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして一次抗体として抗Ｈｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）もしくはＡ７２４１Ａ抗体（１μｇ／ｍＬ）を使用し、二次抗体にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）を用い、ＥＣＬプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、抗Ｈｉｓ抗体と特異的に反応する分子量約２６０ｋｄのバンドが検出された。これは全長のＲＯＢＯ１であると考えられるが、抗ＲＯＢＯ１抗体Ａ７２４１Ａにおいても同様の分子量のバンドが細胞ライゼート中に確認された。以上の結果より、抗ＲＯＢＯ１抗体Ａ７２４１Ａは全長のＲＯＢＯ１タンパク質を特異的に検出可能であることが示された。さらに、Ａ７２４１Ａにおいて分子量の小さいいくつかのバンドも同様に検出されたが、これらのバンドは抗Ｈｉｓ抗体では検出されないことから、Ｃ末部位が欠損した分解物である可能性が考えられ、実際に培養上清中に分子量約１２０ｋｄのバンドが特異的に検出された（図３）。全長ＲＯＢＯ１の推定分子量は１９０ｋｄであるが、糖鎖等の修飾によりプレステイン分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）の２５０ｋｄより上部の位置（約２６０ｋｄ）で検出されると考える。またＨＥＫ２９３細胞のｐｃＤＮＡ３．１を用いたＭｏｃｋ試験でもＲＯＢＯ１と考えられるバンドが検出されているが、これはＲＯＢＯ１が胎児期に発現することから、ヒト胎児腎臓由来のＨＫＥ２９３細胞がＲＯＢＯ１を発現しているためと考える。
続いて、各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタン解析を行った。その結果、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３の解析結果と一致し、ｍＲＮＡ発現スコアが高い細胞株においてのみ分子量約２６０ｋｄの全長のＲＯＢＯ１と考えられるバンドを検出することに成功した（図４）。また、分子量の小さい複数のバンドも同様に検出されたことより、細胞株により糖鎖の結合量が異なる、もしくは分解物やスプライシングに違いにより分子量が異なったＲＯＢＯ１の存在が示唆された。
さらに、ＲＯＢＯ１を発現する癌細胞株においても可溶型のＲＯＢＯ１断片が培養上清中に検出できるか確認したところ、ＲＯＢＯ１を高発現する肝癌細胞株の培養上清中にも強制発現細胞の培養上清と同じ分子量のバンドが抗ＲＯＢＯ１抗体により検出された（図３）。
以上の結果より、ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体Ａ７２４１ＡはＲＯＢＯ１を特異的に検出できること、ならびにＧｅｎｅＣｈｉｐ解析によるｍＲＮＡ発現の程度とＲＯＢＯ１タンパク質の発現の程度が一致することが明らかとなった。さらに、抗ＲＯＢＯ１抗体を用いた検討からＲＯＢＯ１発現細胞の培養上清中に可溶型のＲＯＢＯ１断片が存在することが明らかとなったことより、可溶型ＲＯＢＯ１を検出することで癌細胞の有無を判断できる可能性が強く示唆された。
実施例５
肝細胞癌の免疫組織染色
抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体を用い、肝細胞癌の臨床検体の免疫組織染色解析を実施した。
肝細胞癌摘出組織の固定パラフィン包埋標本を４μｍに薄切した切片をスライドガラスに張り付け、３７℃で１６時間程度置くことで十分乾燥させた。１００％キシレンに５分間ずつ３回漬けることで脱パラフィンし、続いて１００％アルコールに５分間を３回、７０％エタノールで５分間漬けることで親水化を行った。その後、５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で５分間、３回洗浄した後、クエン酸バッファー（１０ｍＭ，ｐＨ７．０）中で１２０℃、１０分間反応させ抗原の賦活化を行った。抗原の賦活化後、ＴＢＳ緩衝液を用い５分間ずつ３回の洗浄を行った後、１０μｇ／ｍＬに希釈したＡ７２４１Ａ抗体を室温で１時間反応させた。続いて、０．３％の過酸化水素で１５分間、室温で作用させることで内在性のペルオキシダーゼを失活させた。さらにＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、二次抗体としてＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）を１時間作用させた。ＴＢＳ緩衝液で５分間ずつ３回の洗浄後、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）を用い発色させた。また、核の対比染色にはヘマトキシリンを用いた。
その結果、図５に示すように肝細胞癌が特異的に抗ＲＯＢＯ１抗体により染色されたことより、ＲＯＢＯ１タンパク質が肝細胞癌で特異的に発現亢進することが明らかになった。また、抗ＲＯＢＯ１抗体が肝細胞癌などのＲＯＢＯ１高発現癌の免疫組織化学診断に利用可能であることが明らかとなった。
実施例６
肝細胞癌患者血清中の可溶型ＲＯＢＯ１タンパク質（ｓＲＯＢＯ１）の検出
実施例４の結果よりＲＯＢＯ１タンパク質の断片が遊離し、可溶型ＲＯＢＯ１として存在することが示されたことより、肝細胞癌患者などのＲＯＢＯ１を高発現する癌患者血清中にも可溶型ＲＯＢＯ１タンパク質（ｓＲＯＢＯ１）が存在する可能性が考えられ、診断マーカーとして有用であると考えられる。そこで、肝細胞癌患者２４例および肝硬変患者６例、そして肝炎患者６例の各血清中における可溶型ＲＯＢＯ１の存在を、Ａ７２４１Ａ抗体を用いたウエスタン解析により検討した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにウエスタン解析は上記と同様に行い、患者血清はそれぞれ５μｌずつ用い、陽性対照として肝癌細胞株Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ＡＬＸ）の培養上清を用いた。その結果、図６に示すように２４例中２３例の肝細胞癌患者血清においてｓＲＯＢＯ１が検出されたのに対し、肝硬変および肝炎患者血清においては検出されなかった。以上のことにより、ｓＲＯＢＯ１はＲＯＢＯ１発現癌患者の血清中においても存在することが示されたと共に、ｓＲＯＢＯ１の検出が肝細胞癌などのＲＯＢＯ１発現癌の血清診断マーカーとして非常に有効であることが示された。
実施例７
可溶型ＲＯＢＯ１（ｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓ）の調製
ＲＯＢＯ１の細胞外領域のＣ末にＨｉｓタグを付加した可溶型ＲＯＢＯ１（ｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓ）は以下のようにして調製した。
ＲＯＢＯ１  ｃＤＮＡを鋳型としプライマーＲＢＶ２Ｆ−ＴＡ（配列番号：１３）とプライマーＲＢ＿ＳＨ＿ＴＡ（配列番号：１４）を用いてＰＣＲ法により細胞外領域をコードする遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅＢａｃｋ４．５−ＴＯＰＯベクターに直接挿入し、配列解析を行った後、正しい塩基配列を有するトランスファーベクターｓＲＯＢＯ１／ｐＢＢを作製した。４μｇのｓＲＯＢＯ１／ｐＢＢを用い、実施例３の方法と同様に組み換えバキュロウイルスを作製した。
続いて、ｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓは以下のようにして調製した。すなわち、２ｘ１０６個／ｍＬのＳｆ９細胞にＭＯＩが５となるようにｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓ発現組換えバキュロウイルスを感染させ、２７度で３日間培養し、その培養上清を回収した。培養上清中に含まれるｓＲＯＢＯ１−ＨｉｓはＮｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い添付プロトコールに従い精製した。精製品をＣｅｎｔｉｒｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用い濃縮、ならびにＰＢＳへのバッファー置換を行うことでｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓを調製した。
実施例８
ｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清の評価
８−１．ウエスタン解析によるＲＯＢＯ１タンパク質分子の検出
ニュージーランドホワイト種ウサギ（１０週齢雌、日本クレア社製）に、ＰＢＳに縣濁したｓＲＯＢＯ１精製抗原１００μｇ／０．５ｍＬ／匹をフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）０．５ｍＬと混合してエマルジョンにしたものを、皮下注射により投与して初回免疫を行った。以後２週間間隔で、ＰＢＳに縣濁したｓＲＯＢＯ１精製抗原１００μｇ／０．５ｍＬをフロイント不完全アジュバント０．５ｍＬと混合してエマルジョンにしたものを、皮下注射により投与して、合計４回免疫を行った。免疫前および３回，４回目免疫後に各々採血を行い、ｓＲＯＢＯ１に対する抗体価上昇をＥＬＩＳＡ法で確認した。すなわち、ｓＲＯＢＯ１をＥＬＩＳＡ用ポリスチレンプレートに固相化し、ウサギ抗血清の希釈列を反応させた後、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（カペル社製）と反応させ、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン試薬（ＴＭＢ試薬；サイテック社製）で発色させて抗体力価を検定した。抗体価の上昇を確認した後、全採血を行い、抗ＲＯＢＯ１ウサギ抗血清を得た。
ｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清を用いて、ウエスタン解析による全長ＲＯＢＯ１分子の検出を行った。前述の通り全長のＲＯＢＯ１を強制発現させたＨＥＫ２９３細胞よりＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製した細胞ライゼートの１０μｇタンパク質相当量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに供し、タンパク質を分離した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして一次抗体としてｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清を１００倍希釈で使用し、二次抗体にＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、ＥＣＬプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、陽性対照であるＡ７２４１Ａ抗体と同様に全長ＲＯＢＯ１分子と考える分子量約２６０ｋｄのバンドを検出できた（図７）。以上の結果より、ｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清はウエスタン解析で全長ＲＯＢＯ１分子を検出できることが明らかとなった。
８−２．ＦＡＣＳ解析によるＲＯＢＯ１タンパク質の検出
ＲＯＢＯ１強制発現ＨＥＫ２９３細胞を用いてｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清が細胞表面のＲＯＢＯ１を検出できるかどうか評価するため、ＦＡＣＳ解析を実施した。すなわち、ＲＯＢＯ１強制発現ＨＥＫ２９３細胞あるいは陰性対照であるＨＥＫ２９３細胞をＦＡＣＳ溶液（１％アルブミン、０．１％  ＮａＮ３入りＰＢＳ）に懸濁した。細胞懸濁液にｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清を加えて、４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＦ（ａｂ）２抗体（ＤＡＫＯ社製）を加えて、４℃で３０分間反応させた。そしてＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、使用説明書に準じてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社製）によるＦＡＣＳ解析を実施した。今回の実験の陽性対照として抗Ｖ５タグ抗体（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、その二次抗体にはＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）を使用した。Ｖ５タグはＲＯＢＯ１細胞内領域のＣ末端に付加したため、抗体が細胞内のＶ５タグを検出できるよう一次抗体添加時に０．１％サポニンを含むＦＡＣＳ溶液を用いた。
その結果、図８に示すように、陽性対照の抗Ｖ５抗体でのピークのシフトと同様に、ｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血においてもＲＯＢＯ１強制発現ＨＥＫ２９３細胞においてのみ特異的なピークのシフトが検出された。
また、ＲＯＢＯ１を元々発現している肝癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞においても上記と同法にてＦＡＣＳ解析をした結果、図９に示すように、ｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清において特異的なピークのシフトが認められたことより、細胞表面上の本来の構造を有するＲＯＢＯ１分子をも検出できることが明らかとなった。
実施例９
抗ヒトＲＯＢＯ１ウサギポリクローナル抗体の精製
上記のｓＲＯＢＯ１免疫ウサギ血清より作製した抗ヒトＲＯＢＯ１ウサギ・ポリクローナル抗体を、以下のようにしてＲＯＢＯ１を固相化したアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行った。すなわち、添付文章に従いＣＮＢｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＃１７−０４３０−０２）を用いて、添付文書に従いゲル１ｍＬ当りに対し、０．７ｍｇの精製ｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓ抗原を固定化し、ｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓアフィニティーカラムを作製した。続いて、常法に従い実施例８で得たウサギ血清から抗ＲＯＢＯ１ウサギ・ポリクローナル抗体を精製した。
実施例１０
ＥＬＩＳＡ系によるＲＯＢＯ１測定系の確立ならびに血中ＲＯＢＯ１の検出
実施例９で得られた抗ＲＯＢＯ１ウサギポリクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ検出系を構築した。すなわち、抗ＲＯＢＯ１ウサギポリクローナル抗体をＰＢＳ中に５μｇ／ｍＬの濃度で希釈し、９６ウエルのイムノプレートに１ウエル当たり５０μＬずつ分注した。２〜８℃で一夜放置後、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、１ウエル当たり１５０μＬのＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（ＡＢＩ  ＃１０−６０１−００１）で１時間オーバーコートを行った。その後、溶液を捨てて、３７℃で２時間乾燥を行い、抗ＲＯＢＯ１抗体固相化プレートとした。検出に用いるビオチン標識抗ＲＯＢＯ１抗体は、ｐＨ８．５の５０ｍＭ炭酸緩衝液を用いて、抗ＲＯＢＯ１ウサギポリクローナル抗体およびＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１３３５）が、それぞれ０．１２ｍｇ／ｍＬおよび４６μｇ／ｍＬとなるよう調製し、室温で２時間放置した。未反応のビオチン試薬はＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＃１７−０８５１−０１）を用いて除き、ビオチン標識抗ＲＯＢＯ１抗体は、１μｇ／ｍＬとなるように、３０％の子牛血清を含むＰＢＳで希釈し調製した。更に、ビオチン標識抗ＲＯＢＯ１抗体は３０％の子牛血清を含むトリス緩衝生理食塩水中に３μｇ／ｍＬとなるよう希釈したストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＃ＳＡ−５００４）を用いて検出し、ペルオキシダーゼの検出の基質としてＴＭＢ試薬（サイテック  ＃ＴＭ４９００４１）および基質反応の停止剤としてＴＭＢ停止剤（サイテック  ＃ＴＳＢ９９９）を用いた。
続いて健常者７２例、肝癌患者７９例、肝硬変／慢性肝炎患者６７例およびその他癌患２２例の血清中のＲＯＢＯ１濃度を測定した。ＲＯＢＯ１濃度測定の際のスタンダードとしては、精製ｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓを用いた。血清またはｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓをそれぞれ２０％ウサギ血清、１％  ＢＳＡを含むトリス緩衝液で９０倍に希釈し、上記の抗体固相化プレートの各ウエルに１００μＬずつ分注した。室温で２時間インキュベーションした後、各ウエルに２５μＬずつのビオチン標識抗ＲＯＢＯ１抗体を分注した。更に、室温で２時間インキュベーションした後、各ウエルの反応液を除去し、１００μＬずつのストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ試薬を分注した。室温で３０分インキュベーションした後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。各ウエルに１００μＬのＴＭＢ試薬を分注し、室温で３０分インキューベーションした後、１００μＬのＴＭＢ停止剤を加え、ＥＩＡプレートリーダー（コロナ電子  ＃ＭＴＰ−１２０）により、４５０ｎｍの波長の吸収を測定した。なお、６３０ｎｍの波長を対照として用いた。
その結果、ｓＲＯＢＯ１−Ｈｉｓを用いた場合に濃度依存的な吸収値の増加が認められ、さらにスタンダード各濃度の吸収値から回帰により（図１０）、各血清中の濃度を求めた。結果を表３、４、５および６に示す。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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健常者血清７２例のＲＯＢＯ１濃度測定において、平均値および標準偏差は３６ｎｇ／ｍＬおよび８ｎｇ／ｍＬであったことより、平均値＋（６ｘ標準偏差）の８１ｎｇ／ｍＬをカットオフ値とした。その結果、健常者血清検体は全例がこのカットオフ値以下であったのに対し、肝癌患者検体、肝硬変／慢性肝炎患者検体およびその他癌患者検体においてはそれぞれ４６％（７９例中３６例）、２２％（６７例中１５例）および９％（２２例中２例）でカットオフ値以上の値を示し、ＲＯＢＯ１陽性であると考えられた。一方、肝癌の診断法として一般的に用いられているＡＦＰの陽性率は、肝癌患者検体および肝硬変／慢性肝炎患者検体でそれぞれ４６％（５９例中２７例）および１５％（５２例中８例）であったことから、肝癌診断における感度および特異性はＡＦＰとＲＯＢＯ１とでほぼ同等であった。しかしながら、ＡＦＰ陰性の肝癌患者検体３２例中において、ＲＯＢＯ１陽性検体が１０例あり、さらにそれら１０例のうち５例はＰＩＶＫＡも陰性であったことから、ＲＯＢＯ１を用いることで既存の診断法で肝癌と診断できなかった症例においても診断可能となると考えられた。実際に、ＡＦＰ単独での検出では４６％であった陽性率が、ＲＯＢＯ１を併用することにより６３％に上がった。
以上より、肝癌の診断において、ＲＯＢＯ１測定系は現行で用いられているＡＦＰ測定系とほぼ同等の性能があり、更に既存の癌マーカーとの併用により、感度および特異性が高い癌診断法を確立できた。
さらに、表３、４、５および６に示される値を疾患別にプロットした結果を図１１に示す。健常者（ＮＨＳ）、慢性肝炎（ＣＨ）、肝硬変（ＬＣ）および肝癌（ＨＣＣ）における血清中ＲＯＢＯ１濃度は、平均値でそれぞれが３４．８、３９．３、７４．０および８４．４ｎｇ／ｍＬであった。この結果から、健常者、慢性肝炎、肝硬変および肝癌患者各群における血清中ＲＯＢＯ１濃度が肝疾患の重篤化に比例して上昇することが明らかとなった。
次に、各個人の経時的な測定においても、ＲＯＢＯ１濃度が変化するか否かを確認するため、肝癌発症前の採血検体におけるＲＯＢＯ１濃度の測定を実施した。その結果、３例中２例において重篤化に比例し血中ＲＯＢＯ１濃度が上昇していることが認められた（図１２）。１例においては、重篤化に比例した上昇は認められなかったが、健常者３０〜４０ｎｇ／ｍＬより高値であることから、最大値に達したものと推察される。
これらの結果は、肝疾患血清中ＲＯＢＯ１濃度を経時的に測定することにより、すなわちモニターすることにより、肝癌の診断のみならず患者の肝疾患の程度を管理することが可能であることを示している。
実施例１１
補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）の測定
ヒトアルブミン・ベロナール・バッファ（ＨＡＶＢ）の作製
ＮａＣｌ（特級、和光純薬工業株式会社）１２．７５ｇ、Ｎａ−バルビタール（特級、和光純薬工業株式会社）０．５６２５ｇ、バルビタール（特級、和光純薬工業株式会社）０．８６２５ｇをミリＱ水に溶解し２００ｍＬとした後、オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）を行った。オートクレーブ処理した１００ｍＬの温ミリＱ水を加え、ｐＨ７．４３を確認した（推奨ｐＨ７．５）。これを５×ベロナールバッファとした。ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（特級、純正化学株式会社）０．２２０５ｇを５０ｍＬミリＱ水に溶解し０．０３ｍｏｌ／Ｌとし、ＣａＣｌ２溶液とした。ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（特級、純正化学株式会社）１．０１６５ｇを５０ｍＬミリＱ水に溶解し０．１ｍｏｌ／Ｌとし、ＭｇＣｌ２溶液とした。５×ベロナールバッファ１００ｍＬ、ヒト血清アルブミン（ブミネート（登録商標）２５％、ヒト血清アルブミン濃度２５０ｍｇ／ｍＬ、バクスター株式会社）４ｍＬ、ＣａＣｌ２溶液２．５ｍＬ、ＭｇＣｌ２溶液２．５ｍＬ、ＫＣｌ（特級、純正化学株式会社）０．１ｇ、グルコース（Ｄ（＋）−グルコース、ブドウ糖無水、特級、和光純薬工業株式会社）０．５ｇをミリＱ水に溶解し５００ｍＬとした。これをＨＡＶＢとした。ろ過滅菌後、設定温度５℃にて保存した。
標的細胞の調製
ＲＯＢＯ１強制発現ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ）と０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を添加したＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ）で培養し、細胞剥離緩衝液（ＧＩＢＣＯ）を用いてディッシュから剥離して、９６ウェルＵ底プレート（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、一晩培養した。培養後、５．５５ＭＢｑのクロム−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃１時間培養し、この細胞をＨＡＶＢで２回洗浄し、５０μＬのＨＡＶＢを加え標的細胞とした。
幼令ウサギ補体の調製
試験時に用時調製した幼令ウサギ補体（ＢＡＢＹ  ＲＡＢＢＩＴ  ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ、ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ）を、１バイアルあたり１ｍＬの注射用蒸留水（扶桑薬品工業株式会社）に溶解し、補体溶液とした。
クロム遊離試験（ＣＤＣ活性）
抗ＲＯＢＯ１抗血清（抗ＲＯＢＯ１ウサギポリクローナル抗体）をＨＡＶＢで希釈して５０倍，５００倍の抗体溶液とした。標的細胞に抗体溶液を５０μＬずつ添加し、氷上で１５分静置した。続いて各ウェルに補体溶液を１００μｇ／ｍＬずつ添加し（抗体の最終希釈率２００倍，２０００倍）、５％炭酸ガスインキュベーター中に３７℃で９０分間静置した。プレートを遠心分離後、各ウェルより上清を１００μＬずつ回収し、ガンマカウンターにて放射活性を測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）：（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは標的細胞に２％  ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、ＨＡＶＢを５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞にＨＡＶＢを１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験は三重に行い、ＣＤＣ活性（％）について平均値および標準偏差を算出した。
その結果を図１３に示す。抗ＲＯＢＯ１抗血清、すなわち抗ＲＯＢＯ１ポリクローナル抗体がＲＯＢＯ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対し用量依存的にＣＤＣ活性を示すことが明らかとなった。なお、ウサギｐｒｅ血清を用いた場合は抗体非添加と同様にＣＤＣ活性を示さなかった。
実施例１２
ＲＯＢＯ１の細胞外領域と結合するモノクローナル抗体の作製
１２−１．ＲＯＢＯ１のＮ末部位を発現する組換えバキュロウイルスの作製
ＲＯＢＯ１の細胞外領域に存在するファイブロネクチンＩＩＩ領域（ＦｎＩＩＩ）を、バキュロウイルスの膜タンパク質ｇｐ６４との融合タンパク質として発現させた。すなわち、上記のＲＯＢＯ１  ｃＤＮＡを鋳型とし、ｇｐ４Ｆプライマー（配列番号：１５）、およびｇｐ４Ｒプライマー（配列番号：１６）を用いＰＣＲ法にてＲＯＢＯ１の３番目のファイブロネクチン領域をコードする遺伝子を増幅し、続いてｐＧＥＭ−Ｔｅベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素ＫｐｎＩを用いて切断した遺伝子断片をｐＢｕｃＳｕｒｆベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、トランスファーベクターＲＯＢＯ１ｇｐ４／ｐＢＳを構築した。続いて、４μｇのＲＯＢＯ１ｇｐ４／ｐＢＳを制限酵素ＢｐｌＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）を用い切断し直鎖化した後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の指示書に準じてＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡと共にＳｆ９細胞に導入し、ＲＯＢＯ１のＦｎＩＩＩとｇｐ６４との融合タンパク質発現組み換えバキュロウイルスを調製した。
配列番号１５：ＧＧＴＡＣＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧ
配列番号１６：ＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧ
上記により調製した組換えウイルスをＳｆ９細胞（２ｘ１０６個細胞／ｍＬ）にＭＯＩが５となるように加え感染させた後、２７℃で３日間培養した。ＲＯＢＯ１−ＦｎＩＩＩとｇｐ６４との融合タンパク質を発現する発芽型バキュロウイルス（ＢＶ）は３日間培養後の培養上清より回収した。すなわち、培養液を８００ｘｇで１５分間遠心し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した後、回収した培養上清を４５，０００ｘｇで３０分間遠心する。沈殿物をＰＢＳに懸濁し、さらに８００ｘｇで遠心することで細胞成分を除去し、上清を再度４５，０００ｘｇで遠心することで得られる沈殿物をＰＢＳで懸濁したものをＢＶ画分とし、抗原として免疫に用いた。
１２−２．抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体の作製
上記の方法により調製したＲＯＢＯ１−ＦｎＩＩＩ発現ＢＶを抗原として用い抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体を作製した。すなわち、ＰＢＳに懸濁した１ｍｇのタンパク量に相当するＲＯＢＯ１−ＦｎＩＩＩ発現ＢＶを２００ｎｇの百日咳毒素と混合したものをｇｐ６４トランスジェニックマウス（ＷＯ０３／１０４４５３）に皮下注射により初回免疫を行った。以後の免疫では５００μｍｇタンパク量相当のＲＯＢＯ１−ＦｎＩＩＩ発現ＢＶのみを皮下注射した。最終免疫として２５０μｇのＲＯＢＯ１−ＦｎＩＩＩ発現ＢＶを静脈内に投与し、その３日後にマウスから脾臓細胞を単離し、常法によりマウスＮＳ−１細胞との細胞融合を行い、ハイブリドーマ細胞を樹立した。抗ＲＯＢＯ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択は免疫に用いた抗原であるＲＯＢＯ１−ＦｎＩＩＩ発現ＢＶを固層したＥＬＩＳＡにて実施した。ＥＬＩＳＡ法は、ＲＯＢＯ１−ＦｎＩＩＩ発現ＢＶを終濃度１０μｇ／ｍＬになるように９６ウェル平底プレート（ファルコン社製）に４℃で一昼夜おき、その後、４０％ブロックエース試薬（大日本製薬社製）を含むＴＢＳ緩衝液を用いてブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を加え、室温で１時間反応させた。次いで、室温にて１時間ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）を反応させ、４回洗浄した後、室温にて１時間、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（Ｓｉｇｍａ製）を反応させた。０．５Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレート・リーダーＭｕｌｔｉｃｋａｎＪＸ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）で４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、ＲＯＢＯ１に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞Ｂ２３１８Ｃの樹立に成功した。モノクローナル抗体は産生ハイブリドーマ細胞の培養上清より硫安沈殿法により調製した。
実施例１３
補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）の測定
ヒトアルブミン・ベロナール・バッファ（ＨＡＶＢ）の作製、標的細胞の調製、ならびに幼令ウサギ補体の調製は、実施例１１と同様にして行った。
Ｂ２３１８Ｃ抗体（抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体）をＨＡＶＢで希釈し、標的細胞に５０μＬずつ添加して、氷上で１５分静置した。続いて各ウェルに補体溶液を１００μｇ／ｍＬずつ添加し（抗体の最終濃度は１μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬに調製）、５％炭酸ガスインキュベーター中に３７℃で９０分間静置した。プレートを遠心分離後、各ウェルより上清を１００μＬずつ回収し、ガンマカウンターにて放射活性を測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは標的細胞に２％  ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、ＨＡＶＢを５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞にＨＡＶＢを１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験は三重に行い、ＣＤＣ活性（％）について平均値および標準偏差を算出した。
その結果を図１４に示した。Ｂ２３１８Ｃ抗体、すなわち、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体がＲＯＢＯ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対し、容量依存的にＣＤＣ活性を示すことが明らかとなった。
また同様に肝癌細胞株であるＡｌｅｘａｎｄｅｒ（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）細胞に対するＣＤＣ活性試験を試みたところ、ＲＯＢＯ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対する効果と同様に、Ｂ２３１８Ｃ抗体、すなわち、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体が容量依存的にＣＤＣ活性を示すことが明らかとなった（図１５）。
実施例１４
マウス骨髄由来エフェクター細胞を用いたＡＤＣＣ活性の測定
１４−１．マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液の調製
ＳＣＩＤマウス（日本クレア・オス・１０週齢）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０培地中５×１０５個／ｍＬとなるよう懸濁し、マウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびヒトＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）をそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃で５日培養した。培養後スクレーパーではがして培地で１回洗浄し、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０培地中５×１０６／ｍＬとなるよう懸濁し、マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液とした。
１４−２．標的細胞の調製
ＲＯＢＯ１強制発現ＨＥＫ２９３細胞は１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ社製）および５００ｎｇ／ｍＬＧｅｎｅｔｉｃｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）にて維持継代し、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてディッシュから剥離し、９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、一晩培養した。培養後、５．５５ＭＢｑのクロム−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃で４時間培養し、この細胞を培地で３回洗浄し、５０μＬの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地を加え標的細胞とした。
１４−３．クロム遊離試験（ＡＤＣＣ活性）
Ｂ２３１８Ｃ抗体（抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体）溶液を標的細胞に５０μＬを添加し、氷上で１５分反応させた後に、マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル）を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃で４時間培養した（抗体の最終濃度は１μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬに調製）。その後、プレートを遠心分離し、培養上清１００μＬ中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｂは標的細胞に２％  ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞に１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験は三重に行い、ＡＤＣＣ活性（％）について平均値および標準偏差を算出した。
その結果を図１６に示した。Ｂ２３１８Ｃ抗体、すなわち、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体がＲＯＢＯ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対し、容量依存的にＡＤＣＣ活性を示すことが明らかとなった。
以上より、抗ＲＯＢＯ１モノクローナル抗体を用いたＲＯＢＯ１発現癌細胞に対する治療の有効性が示された。
【産業上の利用可能性】  本発明は、癌の診断および治療、ならびに肝炎重篤化のモニターに有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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