(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は組換え体由来のフォン・ヴィレブランド因子又は第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体の濃縮物を得るための方法であって、
ａ）  最大１２ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｍｌの濃度及び０．４以上のフォン・ヴィレブランド因子／第ＶＩＩＩ因子間比率でＶＷＦを含有するフォン・ヴィレブランド因子又は第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体の溶液の調製、
ｂ）  ０．５バール以下の最大圧力、カルシウムイオンの存在下、かつ５．５超のｐＨにおける、２０ナノメートルの細孔サイズを有するフィルタを介する、ａ）で調製された溶液のナノろ過、
により特徴付けられる方法。
【請求項２】
ナノろ過を受ける溶液中のカルシウムイオンの濃度が０．０５〜０．２Ｍの間で変化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ナノろ過の後に回収されたフォン・ヴィレブランド因子が、１１以上のオーダーのマルチマーを含むマルチマー構造を維持していることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ナノろ過後のフォン・ヴィレブランド因子の回収率が６０％以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ナノろ過後の第ＶＩＩＩ因子の回収率が７０％以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
１ｃｍ2のろ過表面積あたり最大５０ＩＵのフォン・ヴィレブランド因子という積載率が使用されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ａ）で調製された溶液の最大濃度が０．６ＡＵ（ＯＤ280）であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ナノろ過が０．２〜０．４バールの圧力で行われることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標準的ナノろ過流量が１０〜２０リットル／時／ｍ2であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フォン・ヴィレブランド因子又は第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体の治療用濃縮物及び、Ａ型肝炎又はエリスロウイルスＢ１９といったようなエンベロープを伴う及び伴わないウイルスを効果的に除去することのできる３５ｎｍ未満の細孔サイズを通してナノろ過されたフォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）及び血友病Ａの治療に適応した医薬化合物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、さまざまな形態の分子量が、各単量体サブユニットについての約２３００００ダルトン（Ｄａ）からより大きな分子量のマルチマー形態における２千万Ｄａ超までの間で変動し、かくして公知の最大の可溶性タンパク質を形成している、マルチマー構造を有する血漿タンパク質である。その血漿濃度は、およそ５〜１０μｇ／ｍｌ前後［Siedleckiら、Blood、第８８巻、ｎ８、１９９６年；２９３９〜２９５０頁］であり、より小さいサイズの血漿形態は約５０００００Ｄａのサイズをもつ２量体に対応する。
【０００３】
ＶＷＦは、損傷を受けた血管表面に対する血小板の付着ひいてはフィブリン凝集物の形成機序がその上で展開する血小板血栓の形成に関与しており、一次止血において重要な役割を果たす。より高い分子量のマルチマーがさらに効率良く内皮下層に対する血小板付着機序を支援することが示唆され、ＶＷＦ濃縮物の臨床的効能は、より高い分子量のこれらのマルチマーの濃度に関係づけされてきた［Matznerら、Haemopbilia（１９９８年）４，２５〜３２頁］。
【０００４】
これに加えて、天然状態での第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子がＶＷＦのマルチマー形態に接合された形で発見されることから、血漿中においてＶＷＦは、ＦＶＩＩＩの輸送体及び安定化剤の役割を果たす。第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ）は、最大１１５０ｎｍの長さに達する［Furuya Kら、Vox Sanguinis（２００６年）９１、１１９〜１２５頁］。これに加えて、ＶＷＦはそのさらに小さい球形形態でおよそ１４９×７７×３．８ｎｍのサイズを有し、せん断力に応じて、拡張形態又は線形形態へとその構造を変えることができる［Siedleckiら、Blood（１９９６年）８８、２９３９〜２９５０頁］。ＦＶＩＩＩの血漿濃度はおよそ０．０５〜０．１μｇ／ｍｌ前後（すなわちＶＷＦの濃度の約５０分の１〜１００分の１である）。
【０００５】
ＶＷＦ内の量的又は質的な欠陥は、フォン・ヴィレブランド病として知られ出血性障害として現われる一次止血の変化を生み出す。
【０００６】
フォン・ヴィレブランド病の治療においては、機能的ＶＷＦの含有量が高い精製されたＶＷＦ濃縮物及びＦＶＩＩＩ濃縮物が治療目的で使用される。
【０００７】
考慮しなければならないもう１つの側面は、ＶＷＦがＦＶＩＩＩの天然の安定剤であることから、例えば、「注入されたＦＶＩＩＩについてのより長い平均インビボ寿命、ＦＶＩＩＩ阻害物質抗体に対する防御効果」［Gensana M.ら、Haemophilia,（２００１年）ｖ．７、３６９〜３７４頁］［Bjorkman S.ら、Clin Parmacokinet,（２００１年）ｖ．４０、８１５〜８３２頁］［Behrmann K.ら、Thromb Haemost,（２００２年）］、ｖ．８８、２２１〜２２９頁］及び「ＦＶＩＩＩ活性を阻害する抗体に関して考えられる発生頻度低下」［Goudemand J.ら、Blood（２００６年）１０７：３６〜５１頁］といった数多くの著者によって指摘されているように、血友病Ａの治療において使用された場合に、高いＶＷＦ含有量をもつＦＶＩＩＩの濃縮物が数多くの利点を有しうる、という点にある。
【０００８】
これらの濃縮物中のＶＷＦの含有量及び活性を特徴づけするための分析技術が確立されてきた。リストセチン補因子としてのＶＷＦ活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）の決定は、ＶＷＦの活性を決定するために広く使用されてきた方法である［Heathら、Thromb Haemost １９９２年；６８：１５５〜１５９頁］。ＶＷＦ抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）の測定［Cejka J. 、Clin Chem. １９８２年；２８：１３５６〜１３５８頁］は、試料中の活性及び不活性の両方のＶＷＦの数量を我々に示す。
【０００９】
ＶＷＦ濃縮物の機能的品質を推定するための適切なパラメータの１つは、ＶＷＦ：ＲＣｏ活性とＶＷＦ：Ａｇ抗原の間の関係である。
【００１０】
ＶＷＦ及び高分子量マルチマーの構造はその臨床的活性及び効能との関係において重要性をもつ可能性があるため、このマルチマー構造の特徴づけは、高いＶＷＦ含有量をもつＶＷＦ濃縮物及びＦＶＩＩＩ濃縮物の有用性を決定する上で欠かせないものである。このマルチマー構造は、ゲル電気泳動によって決定される［Ruggeriら、Blood １９８１年；５７：１１４０〜１１４３頁］。
【００１１】
欧州特許第０４１１８１０号（ＥＰ０４１１８１０）及び欧州特許第０６３９２０３号（ＥＰ０６３９２０３）といった特許又はRistol P.らの刊行物Sangre（１９９６年）４１；１２５〜１３０頁が示すように、ＶＷＦが機能的でありかつＶＷＤにおける治療用生成物としてのその使用にとって充分な濃度を有しているＶＷＦ又はＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を精製するためのさまざまな方法が記述されてきた。
【００１２】
その他のＦＶＩＩＩ精製方法は、ＶＷＦを含まないか又は微量のＶＷＦしか含まない最終生成物を提供する。これらの濃縮物は、ＶＷＤの治療には適さない。同様に、一部のケースでは、これらのＦＶＩＩＩ濃縮物中に存在する残留ＶＷＦは、それを形成するマルチマーの一部分特により大きな分子量のものを失っているため、機能的ではない。これらの濃縮物は、血友病Ａの治療に使用される場合ＶＷＦを富有するＦＶＩＩＩ濃縮物がもつ利点を有さない。
【００１３】
既存のＦＶＩＩＩ濃縮物は、なかでも分画及びウイルス不活性化方法及びそのＶＷＦ含有量及び機能的有効性を規定する、世界血友病連盟（ＷＨＦ）が１９９７年に構築し２００６年に更新した凝固因子濃縮製剤の記録（Kasper, C. K．；Brooker, M, 凝固因子濃縮製剤登録、２００６年１月）の中で報告されている（表２及び３）。
【００１４】
ＦＶＩＩＩのナノろ過された濃縮物の中でも、３５ｎｍ（又はそれより大きい細孔サイズ）を通してナノろ過された濃縮物と、例えばＡ型肝炎ウイルス（約２４ｎｍ）又はＢ１９ウイルス（１８〜２４ｎｍ）といったようなエンベロープをもたないウイルスに対してこのナノろ過が有効でない濃縮物を区別することが必要である。その一方で、３５ｎｍ未満の細孔サイズを有するナノろ過されたＦＶＩＩＩ濃縮物はＶＷＦを全く含有しておらず、ＶＷＦをまさに含有している場合であっても高分子量のマルチマーが欠如しており、その結果としてＶＷＤの治療用には有効ではなく、血友病Ａの治療に使用された場合、ＶＷＦを富有するＦＶＩＩＩ濃縮物がもつ利点を有していない。
【００１５】
生物学的製剤の安全性を確保するためには病原体を除去する強力な能力が不可欠であり、従ってこの目的でさまざまな方法が生産方法内に組込まれる。これらの中でも、脂質エンベロープを伴うウイルスに対し高い有効性をもつ、洗浄剤と結びつけられた有機溶媒の作用に基づく化学的不活性化処理について言及すべきであるが、これらは脂質エンベロープを伴わないウイルスに対しては有効ではない。熱処理といったようなその他の物理的処理は、脂質エンベロープの有無に関わらず有効であるが、その有効性は、処理の厳しさにより左右され、これはそれ自体、加工中のタンパク質の不活性化に対する耐性によって支配される。ウイルス負荷の減少を助長するその他の技術には、沈澱又はクロマトグラフィによる分離が含まれる。
【００１６】
脂質エンベロープが存在するか否かに関わらずウイルスを除去する上で非常に有効であることが証明された１つの方法は、ウイルス粒子を食い止めることのできる細孔サイズをもつフィルタを通してのろ過である（ナノろ過）。この方法は同様に、プリオンといったようなその他の感染性粒子の除去においても有効であることが示されてきた。それにも関わらず、この方法の効能は、使用される細孔サイズにより支配され、このサイズはそれ自体ろ過すべきタンパク質のサイズによって基本的に支配されている。
【００１７】
通常は１５〜７５ナノメートル（ｎｍ）の間の異なる細孔サイズをもつナノフィルタが存在し、一般に細孔サイズが小さくなればなるほど病原菌を保持する上での有効性が大きくなり、３５ｎｍ未満、好ましくは１５〜２０ｎｍの間の細孔サイズのナノフィルタが、エリスロウイルスＢ１９又はＡ型肝炎ウイルス（およそ２４ｎｍ）といったような１８〜２３ｎｍの間の最小サイズのウイルスを阻止するナノフィルタである。その特性のため、これらのフィルタは、工業的生産にとって許容可能な回収率（通常はナノろ過後の回収率は６０％以上でなくてはならない）でろ過可能なより小さなサイズのタンパク質に対してのみ物理的に応用可能である。
【００１８】
ＶＷＦ又はＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体、特により高い分子量のＶＷＦのマルチマー形態はその分子構造のため、基本的に３５ｎｍよりも小さいナノフィルタによりろ過できるとは思われない。これまで、より高い分子量のマルチマー形態を含めたＶＷＦ又はＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の３５ｎｍ未満のナノフィルタによるナノろ過は不可能であった。
【００１９】
上述の世界血友病連盟（ＷＨＦ）の凝固因子濃縮製剤登録に由来する１つのナノろ過されたＦＶＩＩＩ濃縮物（この場合２０ｎｍを使用）は、K. Furuyaらによる刊行物Vox Sanguinis（２００６年）９１、１１９〜１２５頁の中でも記述されている日本赤十字社のCross Eight Mである。この刊行物中ではＦＶＩＩＩ濃縮物の含有ＶＷＦの２０ｎｍによるろ過が達成されたことそしてそのマルチマー構造が改変されなかったことが述べられているという事実にも関わらず、このＷＨＦ登録から、この濃縮物が非機能的ＶＷＦを有することがわかる。Furuyaの刊行物に立ち戻ると、含有ＶＷＦが微量レベルであり［１２３頁目：…ＶＷＦ含有量は通常見出されるものと類似していた（ＦＶＩＩＩ：Ｃ１Ｕあたり０．００７〜０．０１５ＵのＶＷＦ）…］、一方血漿中の比は各々のＦＶＩＩＩ活性単位について１活性単位のＶＷＦ（１：１の割合）であることがわかる。他方で、この残留ＶＷＦのマルチマー構造の特徴づけ（図４、１２３頁）は、１０以下のマルチマーバンドを示しているのに対し、高分子量のマルチマーを有する充分保存されたマルチマー構造は１１以上のバンドを含んでいるはずであるということがわかっている（Metznerら、Haemophilia（１９９８年）４；２７頁、第２段落）。Furuyaが自らの刊行物の中で我々に告げているのは、モノクローナル抗体を用いた親和性クロマトグラフィによって精製されたＦＶＩＩＩ濃縮物のＶＷＦ含有量が微量レベルであること、より低い分子量のマルチマーだけが保存されること、そしてこのＶＷＦ組成物が２０ｎｍでのナノろ過による不利な影響を受けていないこと、である。明らかにこの濃縮物（Cross Eight M）は、ＶＷＤの治療には適しておらず、正常なヒト血漿の中に見られる割合（１：１）でのＶＷＦの存在による恩恵は受けていない。
【００２０】
上述の世界血友病連盟の凝固因子濃縮製剤登録の中で言及されているもう１つのナノろ過されたＦＶＩＩＩ濃縮物は、ＬＦＢのFACTANEである。登録簿によると、この濃縮物は１５ｎｍでナノろ過され、ＶＷＦを含有する。この製品は、１３〜２５ｎｍの間の細孔サイズのふるいを通してナノろ過されたＦＶＩＩＩについて記述している国際公開第２００５０４０２１４号（ＷＯ２００５０４０２１４）という特許に従って得られるものに対応しているが、この特許中では、ウイルス保持効率は、高分子量ＶＷＦ（１０個超のマルチマー）含有量が１５％未満であることに結びつけられており、ここでも又、Furuyaの刊行物中で観察されたこと、つまりより低分子量のＶＷＦマルチマーがＦＶＩＩＩとの関係において低濃度で存在する場合すなわち１とは程遠いＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ比（Furuyaのケースでは０．０１５そしてFactameの特許ＷＯ２００５０４０２１４の場合には０．１５）で存在する場合は、２０ｎｍを通してナノろ過され得ること、が確認されている。換言すると、より大きい分子量のマルチマーがナノフィルタによって保持される。その上、この特許では、同様に保持されるＶＷＦと会合されたＦＶＩＩＩを回収するために、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体が解離する最低濃度である０．２０Ｍより高濃度でＣａＣｌ2を添加することを通して、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の解離がもたらされる。これにも関わらず、全ての例で、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の解離ひいてはＦＶＩＩＩの回収を確実にするため少なくとも０．３５ＭのＣａＣｌ2濃度が使用された。この特許で定義づけされた組成物は、ＦＶＩＩＩの欠損を治療する目的のみをものでありＶＷＤの欠損を治療するためのものではない。同様にこの製品は、それがＶＷＤの治療にとって充分な量でＶＷＦを含有していないことを明白に規定している「フランス保健製品安全保障機関」、［http://afssaps-prd.afssaps.fr/php/ecodex/frames.php?specid=66716833&typedoc=R&ref=R0093176/htm］からの製品認可第４．１節「治療指標」の中で証明されている通り、ＶＷＤ治療には適していない。これに加えて、この製品に関する刊行物［Vox Sanguinis（２００７年）９２，３２７〜３３７頁］の中で、著者らは、該製品（Factane）がＶＷＤの治療用に意図されたものではない（３３５頁）ということを確認している。
【００２１】
要約すると、K. Furuyaら［Vox Sanguinis（２００６年）９１，１１９〜１２５頁］及び、特許国際公開第２００５０４０２１４号（ＷＯ２００５０４０２１４）及びVox Sanguinis（２００７年）９２，３２７〜３３７頁の刊行物によって記述されている手順の目的は、血友病Ａの治療に応用可能ではあるものの、ＶＷＦを富有する濃縮物であれば血友病の治療のために提供するはずの利点の恩恵を受けてはおらず、いかなる状況下でもＶＷＤの治療には適していない、ＶＷＦの乏しい（１５％未満か又は０．１５：１未満のＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ比）ＦＶＩＩＩ濃縮物を得ることにある。
【００２２】
ＶＷＦは、高いせん断力（高いせん断応力）を発生させる流量条件下でその３次元構造を変え、これによりインビボで血小板付着機序が発生し得ることになる、ということが述べられてきた（Siedleckiら、Blood、第８８巻、ｎ．８、１９９６年；２９３９〜２９５０頁）。この構造変化は、分子が球形構造からより線形の形態へと変わるという結果をもたらす。この点において、K. Furuyaらは、その刊行物（Vox Sanguinis（２００６年）９１，１１９〜１２５頁）の中ですでに、許容可能なＦＶＩＩＩ収量を得るためには２０ｎｍを通したそのＦＶＩＩＩ濃縮物のろ過を高圧（０．８バール）で実施しなければならないということ、そして恐らくこのことは、より低い圧力では存在するＶＷＦがその構造を変えるのに充分なほどの流量効果がなくかくしてろ過が困難になるという事実に起因すると思われるということを記していた。規定された条件（０．８バール）の下で、彼らは又、ナノろ過の前の出発値が非常に低いものであることを念頭において、存在する低分子量のＶＷＦマルチマーの良好な回収率をも達成した。
【００２３】
引用された文献は、ＶＷＤの治療のための使用の可能性を与えるか又は血友病Ａの治療に使用した場合にＶＷＦ富有濃縮物について記述された利点を維持する機能的な高分子量マルチマーを含有するＶＷＦ又はＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ複合体（０．４以上の比）に対する、例えば２０ｎｍといった３５ｎｍ未満を通したナノろ過の応用の可能性を開示していない。さらに、ＷＯ２００５０４０２１４は当業者に対して明らかに、この細孔サイズが高分子量ＶＷＦの通過を妨げるということを示している。
【００２４】
治療薬としてのＶＷＦのナノろ過が現在３５ｎｍを通したナノろ過に制限されている技術的現状は、欧州特許第１６３２５０１号（ＥＰ１６３２５０１）によって実証されている。この特許は、明細書の第２３段落及び実施例１、第３７段落で記されているような３５ｎｍの細孔サイズをもつフィルタを通したナノろ過によるウイルス除去段階を含む、ＦＶＩＩＩ（０．０６未満のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＶＷＦ：ＲＣｏ比）含有量の低いＶＷＦ濃縮物を得るための方法を開示している。この特許から、ＶＷＦのサイズの分子のナノろ過が３５ｎｍ未満の細孔サイズを有するナノフィルタにとって実現不可能なものであることがわかる。
【００２５】
上述のとおり、現在のところ、２０ｎｍを通してナノろ過されたフォン・ヴィレブランド病の治療を適応症とする治療用濃縮物は全く存在しない。これに加えて、この技術的現状は、高分子量のＶＷＦマルチマーが存在しＶＷＦとＦＶＩＩＩの間の割合が０．１５超である場合ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ分子複合体の場合と同様、２０ｎｍを通した高分子量マルチマーを含むＶＷＦのこのナノろ過が不可能であることを示している。
【００２６】
通常ヒト血漿の中で遭遇するものにより類似したＦＶＩＩＩとＶＷＦ高分子複合体の２つの構成要素間の割合（ＦＶＩＩＩ一単位について一単位のＶＷＦ）を有し、なおかつ天然のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の利点の全てを有しかつＶＷＤ及び血友病Ａの治療に適している、２０ｎｍを通してナノろ過されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦの調製は、今なお未解決の問題である。
【００２７】
ヒト血漿からＶＷＦ又はＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を得るための方法は通常、クレオプレシピテート画分から出発し、選択的沈澱又より最近では基本的にイオン交換及び／又は親和性を用いるクロマトグラフィ技術による精製を行なう。
【００２８】
現在（モノクローナル抗体を用いた）免疫親和性クロマトグラフィに基づいているＦＶＩＩＩの精製のための方法は、非常に高い比活性度をもつＦＶＩＩＩを提供するが、機能的ＶＷＦが欠如している［K. Furuyaら、Vox Sanguinis（２００６年）９１、１１９〜１２５頁］。
【００２９】
上述のとおり、ＶＷＦ又はＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を得るためのこれらの方法には、ウイルス不活性化又は除去の特異的な段階が１以上関与している。
【００３０】
この発明においては、ＶＷＦの活性は、血小板凝集を誘発するその能力における抗生物質リストセチンのための補因子（ＶＷＦ：ＲＣｏ）としてのＶＷＦの役割に基づいている（欧州薬局方第０７／２００６：２０７２１号）。この活性は、国際単位（ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ）で表され、その濃度はＩＵ／ミリリットル（ＩＵＶＷＦ：ＲＣｏ／ｍｌ）で表現される。
【００３１】
ＦＶＩＩＩの活性は、ＦＩＸａ、カルシウムイオン及びリン脂質の存在下でのＦＸの活性化における補因子としてのＦＶＩＩＩの役割に基づくＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）の凝固活性に関するものである（欧州薬局方第０７／２００６：２０７０４号）。これは、発色性基質について定量化されて、国際単位（ＩＵ  ＦＶＩＩＩ）で表され、その濃度はＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ミリリットル（ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌ）で表わされる。
【発明の概要】
【００３２】
本発明は、３５ｎｍと同等未満の小さい細孔サイズのふるいを通してナノろ過された、フォン・ヴィレブランド因子又は第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体の治療用濃縮物において、得られた生成物が０．４以上のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比ならびに高分子量マルチマ（１１バンド超）を内含するＶＷＦのための保存されたマルチマー構造を有し、さらにフォン・ヴィレブランド病及び血友病Ａの治療を適応症とする医薬化合物の調製に有用な治療用濃縮物、及びそれを獲得する方法について記述する。
【００３３】
ＶＷＦが高分子量マルチマーを含有する保存されたマルチマー構造を有しているＶＷＦ又は第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体のナノろ過について行なわれた調査に基づいて、発明者らは、驚くべきことに、ＶＷＦ又はＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体及びカルシウムイオンを含有する溶液の場合、０．５バール未満そして好ましくは０．２〜０．４バールの間の最大圧力で３５ｎｍ未満、好ましくは２０ｎｍ未満の公称細孔サイズをもつナノフィルタを通してろ過を行なうことが可能である、ということを実証した。
【００３４】
ナノろ過すべき溶液は、１２ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｍｌ以下と同等である０．６吸光度単位（ＡＵ280）の最大濃度を有する。溶液のタンパク質組成物は、それ自体のＶＷＦ及びＦＶＩＩＩ含有量に加えて、例えばフィブリノーゲン又はフィブロネクチンといったその他のタンパク質をも含むことができ、ＶＷＦの比活性度（タンパク質１ｍｇあたりのＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ）は１以上で標準的には１０以上である。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体のナノろ過の場合のＦＶＩＩＩの比活性度（タンパク質１ｍｇあたりのＩＵ  ＦＶＩＩＩ）は同様に１以上であり、標準的には１０以上である。
【００３５】
ナノろ過しなくてはならない溶液は、０．０５〜０．２０Ｍの間のカルシウム（塩化物）及び２０〜３０ｍＭの間の好ましくはヒスチジンであるタンパク質安定化剤としての少なくとも１つの塩基性アミノ酸を含有していてよい。ろ過しなくてはならない溶液のｐＨは、変性を防ぐため５．５超でなくてはならない。
【００３６】
ろ過しなくてはならないタンパク質の生物活性として表現される積載率は、１ｃｍ2あたり０．５ｍｇのＶＷＦと等価であるろ過表面積１ｃｍ2あたり５０ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏに達し得る。
【００３７】
規定の条件下で、ろ過表面積１ｍ2あたり最大１２０リットルの溶液をろ過し、使用された材料のものの少なくとも８０％であるＶＷＦ：ＲＣｏ／ＦＶＩＩＩ比及び保存されたＶＷＦマルチマー構造（１１個超のマルチマー）と合わせて７０％超のＦＶＩＩＩ活性回収率及び６０％超のＶＷＦ活性の回収率を得ることができる。
【００３８】
ろ過しなければならない溶液は、０．４以上そして標準的には１〜３の間であり、従って、より大きなサイズのマルチマー分子であるＶＷＦが方法の制限要素であることを考えるとＦＶＩＩＩ無しのＶＷＦ溶液及びＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体溶液の両方に等しく適用可能であるＶＷＦ：ＲＣｏ／ＦＶＩＩＩ活性比を有することを特徴とする。
【００３９】
規定の条件下で、標準ろ過流量は最大３０リットル／時／ｍ2、そして標準的には１０〜２０リットル／時／ｍ2であり、ろ過時間は１２時間以下である。これにより工業的利用が可能となり、高いコストを理由としてこれが方法を制限する要因であることからナノろ過表面積を変動させることによりこれらのパラメータを変更又は最適化できるということは明白である。
【００４０】
好ましい実施形態においては、３５ｎｍ未満の細孔サイズを通したナノろ過に先立ち３５ｎｍと１００ｎｍの間の細孔サイズのナノフィルタを用いて予備ろ過が実施される。前置フィルタとナノフィルタ（＜３５ｎｍ）の面積比は、１：２と１：４の間にある。
【００４１】
２０ｎｍを通した２重ナノろ過（２０ｎｍ＋２０ｎｍ）を実施することも又可能であり、これはナノろ過生成物についての安全性の追加という利点を増大させる。
【００４２】
この発明を通して、１００ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｍｌ超のＶＷＦ活性及び０．４以上のＶＷＦとＦＶＩＩＩ間の活性比を有し、かつＶＷＦのマルチマー構造に高分子量のマルチマー（１１個超のバンド）が含まれている、ＶＷＤ及び血友病Ａの治療に適した高純度の医薬品を調製できるようにするナノろ過されたＶＷＦ又はＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ナノろ過段階を伴う及びそれを伴わない異なる最終生成物ロット内のＶＷＦのマルチマー構造を示している。ナノろ過された材料に対応するレーン内の少なくとも１６のバンドを、オリジナルの写真の中で計算することができる。
【実施例】
【００４４】
市販のナノフィルタのうち、再生セルロースから製造されPlanova（登録商標）３５Ｎの場合には約３５±２ｎｍ、そしてPlanova（登録商標）２０Ｎの場合には１９±１ｎｍという細孔サイズを有する日本の旭化成株式会社製のPlanova（登録商標）ナノフィルタが、本発明の実施例を提供するのに使用された。このタイプのフィルタは、デッドエンドモード及び接線方向モードのろ過を可能にする。以下の実施例において、Planova（登録商標）を用いたナノろ過はデッドエンドモードで実施されたが、本発明の目的では、当業者にとって公知であるその他の市販の銘柄及び組成のナノフィルタの使用がそうであるように、接線方向モードの使用も適している。本発明が関係しているナノフィルタが無欠であることを保証する試験と作業の方法そしてアセンブリの両方については、メーカーの取扱説明書中に全て規定されている。
【００４５】
実施例１：出発材料の取得
ナノろ過前のヒト血漿由来のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の溶液は、例えば、欧州特許第０４１１８１０号（ＥＰ０４１１８１０）に示されているように、ポリエチレングリコールでの沈澱とそれに続く親和性クロマトグラフィでの精製により可溶化されたクリオプレシピテートから得ることができる。ナノろ過された溶液は、その後、欧州特許第０６３９２０３号（ＥＰ０６３９２０３）に示されているように、例えばグリシンでの沈澱により高純度生成物を得るべく精製可能である。代替的には、トランスジェニック細胞又は動物において組換え型ＤＮＡ技術を用いた生合成により、ＦＶＩＩＩ又はＶＷＦ又はその両方を得ることができる［Wood W. I.ら、Nature（１９８４年）３１２：３３０〜３３７頁］；［Toole, JJ.ら、Nature（１９８４年）３１２：３４２〜３４７頁］。
【００４６】
実施例２：ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体のナノろ過
０．１２ｍ2のPlanova３５Ｎフィルタ及び０．３ｍ2のPlanova２０Ｎフィルタを通した連続ろ過を、６．７７のｐＨ及び２０±５℃の温度で２５ｍＭのヒスチジン及び０．１４Ｍのカルシウムの存在下で、０．２３５ＡＵ280ｎｍと等価の５．６９ＩＵ／ｍｌのＶＷＦ：ＲＣｏ濃度及び１０．４ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ＡＵ280ｎｍの比活性度を有する部分的に精製されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の溶液１４．７リットルを用いて実施した。３．３時間という時間内に完了した全ての溶液のろ過全体を通してPlanova２０Ｎ内で０．２０〜０．３０バールの間の圧力差を維持しながら、約１４Ｌ／時／ｍ2の恒常な流量でろ過を実施した。面積及び時間単位あたりの生産性は、３．６ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｃｍ2／時、８．２ＩＵ  ＶＷＦＲＣｏ／ｃｍ2／時（ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比＝２．３）及び９．８ＩＵ  ＶＷＦ：Ａｇ／ｃｍ2／時であった。活性回収率は、ＦＶＩＩＩ９４％、ＶＷＦＲＣｏ９５％であった。
【００４７】
実施例３：Planova２０Ｎを通してナノろ過されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の特性
実施例２に例示された要領で、７つの異なる出発材料ロットを加工した。１０ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ＡＵ280ｎｍに近いか又はそれを超える比活性度及び０．３±０．２ＡＵ280ｎｍのタンパク質濃度をもつＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を、６．８±０．２のｐＨ及び２０±５℃の温度で、２５ｍＭのヒスチジン及び０．１４Ｍのカルシウムの存在下で、出発材料として使用した。０．１μｍを通した清澄化とそれに続いてPlanova３５Ｎ及びPlanova２０Ｎを通した連続ナノろ過を実施した。ろ過を１０〜２０リットル／時／ｍ2の間の恒常な流量に維持した。Planova２０Ｎフィルタ内の作動圧力を、全てのケースにおいてろ過を通して０．２〜０．４バールに維持した。
【００４８】
得られた結果（表１）は、規定の条件下で２０ｎｍの細孔サイズを通したＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体のナノろ過が、得られたナノろ液の活性及び純度（比活性度）に対し全く影響を及ぼさない、ということを示している。
【００４９】
ナノろ過前後の材料中で得られたＶＷＦ：ＲＣｏ／ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比（表１）の比較分析により、規定条件下で、リストセチンの補因子としてのＶＷＦの機能性に影響を及ぼすことなく２０ｎｍの細孔サイズのふるいを通してＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ濃縮物中に存在するＶＷＦをろ過することができるということを実証することが可能である。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
実施例４：１１個超のバンドを有するより高い分子量のマルチマーを含むマルチマー構造の保存を実証する、ゲル電気泳動により得られるＶＷＦのマルチマー構造。
図１は、ナノろ過段階を伴う及びそれを伴わない異なる最終生成物ロット内のＶＷＦのマルチマー構造を示している。ナノろ過された材料に対応するレーン内の少なくとも１６のバンドを、オリジナルの写真の中で計数することができる。
【００５２】
実施例５：ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体のナノろ過に対する圧力差の効果、
ＦＶＩＩＩの比活性度が約１０ＩＵ／ＡＵ280nmである０．１〜０．３ＡＵ280nmの範囲の濃度のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦの部分的に精製された溶液を、実施例２及び実施例３で記述された条件下でPlanova３５Ｎを通してろ過した。ナノろ過を高圧（０．８バール）及び低圧（０．３バール）用にセットし、表２に示された結果を得た。
【００５３】
【表２】
0004976366.tif 000003
【００５４】
同様にして、Planova３５Ｎを通して予備ろ過されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体のこの溶液を、実施例２で記述された条件に基づいてPlanova２０Ｎを通してろ過した。ナノろ過を高圧（０．８バール）及び低圧（０．３バール）用にセットし、以下の結果を得た。
【００５５】
【表３】
0004976366.tif 000004
【００５６】
高圧でのPlanova３５Ｎを通したろ過において、流量の大幅な低下が存在し、１時間のナノろ過の後に観察されたのは初期流量の１０．６％及び１４．６％にすぎず、１つのケースでは３時間で初期流量のわずか７．９％であった。０．３バールの圧力差でのPlanova３５Ｎを通したろ過においては、流量は３時間のナノろ過の後でさえ８８．６％にとどまった。
【００５７】
出発材料としてPlanova３５Ｎを通して予備ろ過したＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の溶液を用い０．８バールの圧力差でのPlanova２０Ｎを通したろ過においては１時間のナノろ過の後４０％の流量比が得られ、フィルタの目詰まりを理由として３時間経過以前にろ過を停止した。０．３バールの圧力差でのPlanova２０Ｎを通したろ過においては、３時間のナノろ過の後でさえ流量は７５．７％にとどまった。
【００５８】
以上の実施例から、３５ｎｍ以下の細孔サイズのためのろ過において低圧条件を維持することによって流量の突然の下降の発生が回避されるということは明白である。その結果として、最大２０００００００Ｄａのサイズに達するＶＷＦのマルチマー形態といったようなＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ溶液中に存在する高分子量の分子の被着に起因するフィルタ膜の気孔の一部分の閉塞は、これらの圧力条件下では全く観察されなかった。
【００５９】
実施例６：ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体のナノろ過に対する使用材料の濃度の効果
約２というＦＶＩＩＩ活性との関係におけるＶＷＦ（ＶＭＦ：ＲＣｏ：ＦＶＩＩＩ）で約１０ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ＡＵ280nmの比ＦＶＩＩＩ活性度を有しかつ０．１〜０．６５ＡＵ280nmの範囲内の濃度を含む部分的に精製されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の異なる溶液を用いて、約０．５バールの圧力差でかつ実施例１及び２で記述されたものと同様の方法（ただし濃度は除く）及び生成物組成条件の下でPlanova２０Ｎを通してろ過を実施した。
【００６０】
得られた結果は、表４に示されている：
【００６１】
【表４】
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【００６２】
ナノろ過中に観察された流量の低下は、負荷材料の濃度に正比例する。かくして、１時間のナノろ過の後に観察された流量は、それぞれ０．１０６ＡＵ、０．１７ＡＵ、０．３１４ＡＵ、０．３４３ＡＵ及び０．６４８ＡＵの濃度について初期流量との関係において８０．７％、６３．６％、６０．７％、５２．９％及び１６．２％である。３時間のナノろ過の後に観察された流量に関しては、初期流量の約３０．５％の値より低い下降は、ナノろ過が方法の上限に相当する圧力条件下で実施されたという事実にその原因を帰すことができる。
【００６３】
０．３ＡＵに近い負荷濃度について、最適な生産性値（４６．８ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏ／ｃｍ2と等価の７．８ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏ／ｃｍ2／ｈ）及びタンパク質回収率（表参照）が得られた。負荷材料の濃度が最大（０．６４８ＡＵ）である場合、ろ過の開始時点からフィルタの目詰まりが見られ、生産性及び回収率の値は、２ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏ／ｃｍ2／時及び４６．８％の合計タンパク質回収率より低い値まで大幅に下降し、これはこの濃度におけるナノろ過を不可能とする結果である。
【００６４】
これらの結果から、およそ１０ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ＡＵ280ｎｍの比活性度を有するＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ溶液のナノろ過のための実行可能な濃度範囲が０．６ＡＵ以下であり、これは６ＩＵ／ｍｌ以下のＦＶＩＩＩ及び１２ＩＵ／ｍｌ以下のＶＷＦ：ＲＣｏとほぼ等価であることを実証することができる。
【００６５】
実施例７：ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体のナノろ過に対するカルシウム濃度の効果。
１０ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ＡＵ280超の比活性度及び４ＩＵ／ｍｌのＶＷＦ：ＲＣｏとほぼ等価である３ＩＵ／ｍｌ前後のＦＶＩＩＩ活性を有するアルブミンを用いて処方されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の異なる溶液を用いて、７．３±０．１のｐＨで０．１Ｍのアルギニン、２５ｍＭのヒスチジン及び０．０５ｍＭのカルシウムの存在下で２０ｎｍの細孔サイズを有するフィルタを通してろ過を実施した。およそ０．５バールというPlanova２０Ｎを横断した圧力差を維持してろ過を実施した。表５は、２つの別々の生成物ロットを用いて実施した試験において得られた最も適切なパラメータを示す。
【００６６】
【表５】
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【００６７】
これらの結果は、カルシウムが実質的に不在で（０．０５ｍＭ）アルギニン（０．１Ｍ）により置換されていることによって、生産性が両方のケースにおいて１．６ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｃｍ2／時及び２．０ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｃｍ2／時の値にまで著しく降下し、これらの値が、出発材料中の類似のＦＶＩＩＩ活性で実施例２にて観察された値（３．６ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｃｍ2／時及び８．２ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｃｍ2／時）よりもはるかに低いものであるということを示している。
【００６８】
同様にして、２つの試験において観察されたＦＶＩＩＩ活性の回収率はそれぞれ４３．３％及び４６．６％の値まで下降した。それでも、これらの条件下でさえ、自然界で遭遇するものに類似したＶＷＦとＦＶＩＩＩの活性間の割合（１：１）をもつＦＶＩＩＩとＶＷＦの高分子複合体のナノろ過は、実行可能である。
【００６９】
実施例８：工業的規模でナノろ過されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦロットの生産
３０００リットル超の血漿に由来し１５．６ＩＵＦＶＩＩＩ／ＡＵ280の比活性度をもつＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の部分精製された溶液から出発して、ｐＨ６．８０で２５ｍＭのヒスチジン及び０．１４Ｍのカルシウムの存在下にて公称細孔サイズ３５ｎｍで４ｍ2の１基のフィルタ（Planova３５Ｎ）及び公称細孔サイズ２０ｎｍで４ｍ2の２基のフィルタ（Planova２０Ｎ）を通して連続的ろ過を実施した。Planova２０Ｎ１ｍ2あたり１２０．２ｋｇの適用負荷（生成物溶液＋後洗浄）で、０．２０〜０．３５バールの間の圧力差をPlanova２０Ｎを横断して維持しながら、およそ１０７Ｌ／時の恒常な流量でろ過を実施した。単位面積あたりの適用された合計活性は８．９ＩＵＦＶＩＩＩ／ｃｍ2及び１９．１ＩＵＵＷＦ：ＲＣｏ／ｃｍ2であった。ナノろ過からの活性回収率は、ＦＶＩＩＩが７０．４％、ＶＷＦ：ＲＣｏが７７．３％であった。後洗浄を含み、得られたナノろ過済み生成物の濃縮の後、観察された活性回収率は、ＦＶＩＩＩが９７．５％、ＶＷＦ：ＲＣｏが８６．８％であった。
【００７０】
（欧州特許第０６３９２０３号（ＥＰ０６３９２０３）に従い）塩化ナトリウムとグリシンをその後沈澱させることで、高純度のナノろ過されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ濃縮物が得られた。
【００７１】
得られた高純度のナノろ過されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ濃縮物を安定化させ、生成物をびんの中に計量する前にその強度を調整した。
【００７２】
精製方法全体にわたるＶＷＦ：ＲＣｏ／ＦＶＩＩＩ比として表現したＦＶＩＩＩ含有量との関係における相対的ＶＷＦ含有量を、下表６に示す：
【００７３】
【表６】
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【００７４】
これらの結果は、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を精製する方法においてナノろ過を使用することが、高純度生成物を導く後続する精製段階に基本的に影響を及ぼさないということを示している。従ってこれは、２０ｎｍの細孔サイズのふるいを通したＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ濃縮物のナノろ過のために設定された条件が、より高い分子量のＶＷＦのマルチマー形態の割合に対する不利な影響を与えないということを示しており、これはかかる変化があった場合沈澱によるその後の精製に対し不利な影響を及ぼす可能性があるはずだからである。
【００７５】
ナノろ過されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ濃縮物は、ＶＷＤにおける治療薬としての使用に充分なものである相対的ＶＷＦ濃縮、及び血友病Ａの治療にもそれを使用できるようにするＦＶＩＩＩ含有量を有しており、これにはさらに、以前に言及した血友病Ａの治療における有益な特性をもつ、自然の中に見られるものと類似のＶＷＦ（ＦＶＩＩＩの天然の安定化剤）が大量に存在するという追加の利点が付随している。
【００７６】
本発明について、その好ましい実施形態及び例示された実施例に基づいて記述してきたが、開示された材料に基づいて当業者であれば多数の変形形態を本発明の実施形態に導入することができ、これらの変形形態は、以下のクレーム及び同等の内容を考慮して、大部分が本発明の中に内含されるものである。
【図１】
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