(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ｉ）
【化１】
0004954004.tif 000027
で表される、１位の（Ｒ'）が水素原子以外のチミン塩基或いはウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（ＩＩ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化２】
0004954004.tif 000028
若しくは下記構造式（ＩＩＩ）で表されるスルファトエチルスルフォン基
【化３】
0004954004.tif 000029
を介してＲが導入され、
前記Ｒは、色素、蛍光色素、ＲＩ標識物から成る群から選択されるものである
ことを特徴とする核酸誘導体。
【請求項２】
請求項１記載の核酸誘導体において、
前記色素は、ニトロ、アゾ、スチルベン、カルボニウム、キノリン、メチン、アントラキノンから成る群から選択される化合物を発色団として含むことを特徴とする核酸誘導体。
【請求項３】
請求項１記載の核酸誘導体において、
前記核酸誘導体は、核酸分子量マーカーとして用いることを特徴とする核酸誘導体。
【請求項４】
下記構造式（ＩＶ）
【化４】
0004954004.tif 000030
で表される、１位の（Ｒ'）が水素原子以外のチミン塩基及びウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（Ｖ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化５】
0004954004.tif 000031
若しくは下記構造式（ＶＩ）で表わされるスルファトエチルスルフォン基
【化６】
0004954004.tif 000032
を介してＲが結合されているＤＮＡ或いはＲＮＡであり、前記Ｒは、色素、蛍光色素、ＲＩ標識物から成る群から選択されるものであることを特徴とする核酸分子量マーカー。
【請求項５】
請求項４記載の核酸分子量マーカーにおいて、
前記色素は、ニトロ、アゾ、スチルベン、カルボニウム、キノリン、メチン、アントラキノンから成る群から選択される化合物を発色団として含むことを特徴とする核酸分子量マーカー。
【請求項６】
請求項４記載の核酸分子量マーカーにおいて、
前記蛍光色素は、励起光により励起された発色団がエネルギーを放出する過程で発光することができることを特徴とする核酸分子量マーカー。
【請求項７】
Ｒが導入された核酸誘導体を製造する方法であって、
所定の核酸を準備する工程と、
前記核酸のチミン塩基或いはウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（ＶＩＩ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化７】
0004954004.tif 000033
若しくは下記構造式（ＶＩＩＩ）で表されるスルファトエチルスルフォン基
【化８】
0004954004.tif 000034
を介してＲを結合させる工程と
を有し、
前記Ｒは、色素、蛍光色素、ＲＩ標識物から成る群から選択されるものである
ことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、
前記色素は、ニトロ、アゾ、スチルベン、カルボニウム、キノリン、メチン、アントラキノンから成る群から選択される化合物を発色団として含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７記載の方法において、
前記蛍光色素は、励起光により励起された発色団がエネルギーを放出する過程で発光することができることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７記載の方法において、
前記核酸誘導体は、核酸分子量マーカーとして用いることを特徴とする方法。
【請求項１１】
目的核酸の分子量を測定する方法であって、
請求項１記載の核酸誘導体を核酸分子量マーカーとして準備する工程と、
前記目的核酸を準備し、前記目的核酸のチミン塩基或いはウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（ＩＸ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化９】
0004954004.tif 000035
若しくは下記構造式（Ｘ）で表されるスルファトエチルスルフォン基
【化１０】
0004954004.tif 000036
を介してＲを結合させる工程と、
前記目的核酸と、核酸分子量マーカーとをゲル電気泳動に供する工程と、
前記目的核酸の位置と前記核酸分子量マーカーの位置とを比較し、前記目的核酸の分子量を決定する工程と
を有し、前記Ｒは、色素、蛍光色素、ＲＩ標識物から成る群から選択されるものであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
目的核酸の分子量を測定する方法であって、
請求項４記載の核酸分子量マーカーを準備する工程と、
前記目的核酸を準備し、前記目的核酸のチミン塩基或いはウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（ＸＩ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化１１】
0004954004.tif 000037
若しくは下記構造式（ＸＩＩ）で表されるスルファトエチルスルフォン基
【化１２】
0004954004.tif 000038
を介してＲを結合させる工程と、
前記目的核酸と、前記核酸分子量マーカーとをゲル電気泳動に供する工程と、
前記目的核酸の位置と前記核酸分子量マーカーの位置とを比較し、前記目的核酸の分子量を決定する工程と
を有し、前記Ｒは、色素、蛍光色素、ＲＩ標識物から成る群から選択されるものであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意の化合物が導入された核酸誘導体とその製造方法、更にはその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸誘導体は、抗癌剤や抗ウイルス剤、脳代謝改善薬などの核酸医薬として幅広く応用されてきた。この核酸誘導体は、機能を持つ任意の化合物を導入するまたは他の官能基などで置換することによって改変された核酸であり、導入する化合物や官能基によって多様な機能を有する核酸分子を合成できたり、目的の塩基配列に特異的な機能性核酸分子を効率良く設計できる、といったメリットを有している。そして現在、これらの核酸誘導体のメリットを利用して、核酸分子量マーカーや核酸プローブなどの基礎生物学実験技術、ＤＮＡマイクロアレイなどのトランスクリプトーム解析技術における応用が検討されている。
【０００３】
一方、生物学実験などにおいて、試料核酸の存在や分子量を確認するために、前記試料核酸を可視化することが必要となる場合がある。このような可視化の方法としては、試料核酸をゲル電気泳動に供し、そのゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）などのインターカレート型の染色剤を用いて染色を行った後、ＵＶ（紫外線）を照射する方法が一般的である。
【０００４】
このような可視化の方法は、試料核酸の調製、ゲル電気泳動、染色、可視化という４つの工程を順に経る必要があり、実験結果を得るまでに時間がかかっていた。また、可視化するためのＵＶ照射器具、及び実験者の皮膚や目を保護するための設備を用意していなくてはならないためコストもかかる。また、インターカレート型の染色剤は発癌性が強いと言われており、取扱いに注意を要する。
【０００５】
さらに、ＥｔＢｒを用いた方法では、ゲル電気泳動を停止後に染色を行う目的の試料核酸の移動度をリアルタイムで観察するためには、ゲルの染色とＵＶ照射を同時に行うことができる機能を有する専用機材が必要となる。そこで、実験の効率を高めるために短時間での可視化を可能にし、簡便且つ安全性の高い核酸の可視化方法が望まれている。
【０００６】
これに対して、現在、試料核酸に標識化物質を結合させて可視化する方法が種々提案されている。例えば、非特許文献１では、有色染色剤であるナイルブルーやメチルグリーン等を予め試料核酸に結合させて、試料核酸を可視化している。
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｔｅｖｅ  Ａｄｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍａｒｇｉｔ  Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ,"Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌｓ  ａｓ  Ｍｉｇｒａｔｉｎｇ  Ｃｏｌｏｒｅｄ  Ｂａｎｄｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｌｓ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｓ",Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４０, １７−２３（１９９６）.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、核酸を可視化するためには上記した方法でも未だ解決すべき課題が残されている。例えば、非特許文献１の方法では、試料核酸と有色染色剤とが弱い静電気的相互作用で結合しているため、ゲル電気泳動のみの使用に限定されており、他の核酸検出方法での使用には適していない。また、複数種類の染色剤とそれぞれ結合させた試料核酸を混合すると各染色剤が混ざってしまい、試料核酸毎に色を染め分けることはできない。
【０００９】
これらの問題に対して、本発明者らは、核酸を様々な場面で効率的且つ安価に可視化するために、試料核酸に標識化物質などの任意の化合物を特異的な付加反応で導入した核酸誘導体を利用することが有効であると考えた。
【００１０】
本発明は上述のような課題に鑑みてなされたものであり、核酸の構成成分であるチミン塩基或いはウラシル塩基特異的に任意の化合物が導入された核酸誘導体とその製造方法、更にはその使用方法を提供することを目的とするものである。  
【課題を解決するための手段】
【００１１】
核酸誘導体は、代謝拮抗剤である抗ガン剤や抗ウイルス剤として広く知られており、その有用性より新規核酸誘導体の研究開発が盛んに行われてきた。例えば、特許第３１４２８７４号においては、抗腫瘍剤として使用できる、核酸の糖部分の３位を置換されたヌクレオシド核酸誘導体が開示されている。
【００１２】
一方、塩基に任意の分子を導入する若しくは官能基で置換する方法としては、以前Ｓｍｉｔｈら（"Ａｄｅｎｉｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｙｍｉｎｅ  Ｇｒａｆｔｓ  ｏｎ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ",Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐａｒｔ  Ａ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,２７（２）５７５−５８２（１９８９））によって、ジメチルホルムアミド中でトリエチルアミンを用い、チミンＮ−１位へビニルスルフォン基を導入する方法が開示されていた。しかしこの方法は、チミン塩基のＮ−１位が水素原子である無水系溶媒（有機溶媒）中で行われており、Ｎ−１位に糖が結合しているＤＮＡ及びＲＮＡ（核酸）の構成成分としてのチミン塩基への修飾は不可能であった。
【００１３】
本発明者らは、水系溶媒において、核酸の構成成分である塩基特異的に結合する官能基の検索を行い、ビニルスルフォン基及びビニルスルフォン基の前駆体であるスルファトエチルスルフォン基が、核酸のチミン塩基及びウラシル塩基のＮ−３位に特異的に結合するという新たな知見を得、鋭意検討、実験を重ねた結果、本発明を成すに至ったものである。
【００１４】
すなわち、本発明の第１の主要な観点によれば、下記構造式（Ｉ）
【化１３】
0004954004.tif 000002
で表される、１位の（Ｒ'）が水素原子以外のチミン塩基或いはウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（ＩＩ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化１４】
0004954004.tif 000003
若しくは下記構造式（ＩＩＩ）で表されるスルファトエチルスルフォン基
【化１５】
0004954004.tif 000004
を介して任意の化合物（Ｒ）が導入されていることを特徴とする核酸誘導体が提供される。
【００１５】
なお、このビニルスルフォン基は元来、繊維と染料とが化学的に反応結合する反応染色において、特にセルロース繊維用の染料として使用されていたが、核酸の塩基のＮ−３位に特異的に結合することは今まで知られていなかった。
【００１６】
さらに、このようにして得られた本発明の核酸誘導体は、任意の化合物（Ｒ）を目的に応じて変更することによって、様々な機能を有する機能性核酸誘導体として使用することができる。
【００１７】
本発明の１実施形態によれば、前記任意の化合物（Ｒ）は、他の化合物と特異的に結合することができる化合物から成ることを特徴とする核酸誘導体が提供される。また他の実施形態によれば、前記任意の化合物（Ｒ）は、色素、蛍光色素、ＲＩ標識物から成る群から選択されることを特徴とする核酸誘導体が提供される。好ましくは、前記色素は、ニトロ、アゾ、スチルベン、カルボニウム、キノリン、メチン、アントラキノンから成る群から選択される化合物を発色団として含むものである。また別の実施形態によれば、前記核酸誘導体は、核酸分子量マーカーとして用いるものである。このような構成によれば、核酸を可視化することができる。
【００１８】
また、本発明の第２の主要な観点によれば、下記構造式（ＩＶ）
【化１６】
0004954004.tif 000005
で表される、１位の（Ｒ'）が水素原子以外のチミン塩基及びウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（Ｖ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化１７】
0004954004.tif 000006
若しくは下記構造式（ＶＩ）で表わされるスルファトエチルスルフォン基
【化１８】
0004954004.tif 000007
を介して任意の化合物（Ｒ）が結合されているＤＮＡ或いはＲＮＡであることを特徴とする核酸分子量マーカーが提供される。
【００１９】
本発明の１実施形態によれば、前記任意の化合物（Ｒ）は、他の化合物と特異的に結合することができる化合物から成ることを特徴とする核酸分子量マーカーが提供される。また他の実施形態によれば、前記任意の化合物（Ｒ）は、色素、蛍光色素、ＲＩ標識物から成る群から選択されることを特徴とする核酸分子量マーカーが提供される。好ましくは、前記色素は、ニトロ、アゾ、スチルベン、カルボニウム、キノリン、メチン、アントラキノンから成る群から選択される化合物を発色団として含むものである。また好ましくは、前記蛍光色素は、励起光により励起された発色団がエネルギーを放出する過程で発光することができるものである。このような構成によれば、従来のＥｔＢｒ染色のような染色工程が不要となり、安全性や簡便性の面で非常に優れた可視化された核酸分子量マーカーを提供できる。
【００２０】
本発明の第３の主要な観点によれば、任意の化合物（Ｒ）が導入された核酸誘導体を製造する方法であって、所定の核酸を準備する工程と、前記核酸のチミン塩基或いはウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（ＶＩＩ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化１９】
0004954004.tif 000008
若しくは下記構造式（ＶＩＩＩ）で表されるスルファトエチルスルフォン基
【化２０】
0004954004.tif 000009
を介して任意の化合物（Ｒ）を結合させる工程とを有することを特徴とする方法が提供される。例えば、本発明の方法によってビニルスルフォン基を介してチミン及びウラシル塩基Ｎ−３位へ任意の化合物（Ｒ）を結合させた場合、下記のような構造式となる。
【００２１】
【化２１】
0004954004.tif 000010
【００２２】
さらに、本発明の１実施形態によれば、前記任意の化合物（Ｒ）は、他の化合物と特異的に結合することができる化合物から成ることを特徴とする方法が提供される。また他の実施形態によれば、前記任意の化合物（Ｒ）は、色素、蛍光色素、ＲＩ標識物から成る群から選択されることを特徴とする方法が提供される。好ましくは、前記色素は、ニトロ、アゾ、スチルベン、カルボニウム、キノリン、メチン、アントラキノンから成る群から選択される化合物を発色団として含むものである。また好ましくは、前記蛍光色素は、励起光により励起された発色団がエネルギーを放出する過程で発光することができるものである。また別の実施形態によれば、前記核酸誘導体は、核酸分子量マーカーとして用いるものである。このような構造によれば、可視化された核酸分子量マーカーとして用いることができる核酸誘導体を製造することが可能となる。
【００２３】
さらに本発明の第４の主要な観点によれば、目的核酸の分子量を測定する方法であって、本発明の核酸誘導体を核酸分子量マーカーとして準備する工程と、前記目的核酸を準備し、前記目的核酸のチミン塩基或いはウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（ＩＸ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化２２】
0004954004.tif 000011
若しくは下記構造式（Ｘ）で表されるスルファトエチルスルフォン基
【化２３】
0004954004.tif 000012
を介して任意の化合物（Ｒ）を結合させる工程と、前記目的核酸と、核酸分子量マーカーとをゲル電気泳動に供する工程と、前記目的核酸の位置と前記核酸分子量マーカーの位置とを比較し、前記目的核酸の分子量を決定する工程とを有することを特徴とする方法が提供される。
【００２４】
さらに、本発明の第５の主要な観点によれば、目的核酸の分子量を測定する方法であって、本発明の核酸分子量マーカーを準備する工程と、前記目的核酸を準備し、前記目的核酸のチミン塩基或いはウラシル塩基のＮ−３位に、下記構造式（ＸＩ）で表わされるビニルスルフォン基、
【化２４】
0004954004.tif 000013
若しくは下記構造式（ＸＩＩ）で表されるスルファトエチルスルフォン基
【化２５】
0004954004.tif 000014
を介して任意の化合物（Ｒ）を結合させる工程と、前記目的核酸と、前記核酸分子量マーカーとをゲル電気泳動に供する工程と、前記目的核酸の位置と前記核酸分子量マーカーの位置とを比較し、前記目的核酸の分子量を決定する工程とを有することを特徴とする方法が提供される。このような構成によると、目的核酸の移動度をリアルタイムで見ることができる。
【００２５】
この発明の更なる特徴及び顕著な効果は、次に記載する発明の最良の実施形態の項の記載から当業者にとって明らかになるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
上述したように、本発明によれば、核酸の構成成分であるチミン塩基或いはウラシル塩基特異的に任意の化合物が導入された核酸誘導体とその製造方法、更にはその使用方法が提供される。
【００２７】
また、このようにして得られた本発明の核酸誘導体は、任意の化合物を目的に応じて変更することによって、様々な機能を有する機能性核酸誘導体として使用することができる。
【００２８】
本発明の任意の化合物（Ｒ）は、色素、蛍光色素、ＲＩ標識物、及び他の化合物と特異的に結合することができる化合物のいずれかから選択されるが、これに限定されるものではない。例えば、蛍光色素としては、Ｃｙ（商標）３、Ｃｙ（商標）５、ＦＩＴＣ等でも良く、また他の化合物と特異的に結合することができる化合物としては、ビオチン標識、ＤＩＧ標識等でも良い。好ましくは、前記任意の化合物は、色素及び／若しくは蛍光色素であり、これによって本発明の目的の一つである可視化された核酸誘導体を製造することができる。
【００２９】
より具体的には、本発明の任意の化合物として有色色素などの色素を選択した場合、可視化された核酸分子量マーカーとして使用することができる。このような構成によれば、従来のＥｔＢｒ染色のような染色工程が不要となり、安全性や簡便性の面で非常に優れた可視化された核酸分子量マーカーが提供できる。また、本発明の核酸分子量マーカーは、目的核酸の移動度をリアルタイムで見ることができるため、実験条件を予め設定する必要がなく、目的核酸に応じた電気泳動時間の調節ができるため、実験時間の短縮が可能となる。さらに、前記色素は特異的且つ強固にチミン塩基及び／若しくはウラシル塩基に結合しているため、複数の核酸断片毎に色素の種類を変更した核酸分子量マーカーを製造することができ、簡便で明確に分子量を判定することが可能となる。
【００３０】
重要な生体高分子である蛋白質、ＤＮＡ、及びＲＮＡを検出する方法として、いずれもゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜やナイロン膜に電気的あるいは浸透的に転写し、特異的プローブによって、目的分子を高感度で検出する、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、及びノーザンブロット法と、方位を示す名称で命名された分子生物学研究において重要かつ頻繁に行われる実験操作がある。しかし、この中で可視光下条件においてその電気泳動の状況や膜転写の状況をリアルタイムで確認できる分子量マーカーは、蛋白質のウエスタンブロット法のみに存在し、ＤＮＡとＲＮＡには電気泳動の状況あるいは膜への転写状況を可視光下で直接観察できる分子量マーカーは存在しなかった。
【００３１】
膜転写の実験の場合、分子量により転写の効率は大きく左右されることが知られているが、今までは、転写後にゲル側に残存するＤＮＡやＲＮＡを染色して、間接的に転写の効率を確かめていた。しかし、本発明により、ゲル電気泳動時に、電気泳動を中断することなく容易に、電気泳動の進行状態を可視光下で確認することが可能となり、更に着色したＤＮＡがノーザンブロットあるいはサザンブロット等の膜転写時に、未修飾ＤＮＡやＲＮＡと同様に膜へ転写されかつ強固に膜に固定されることが可能となる。これにより、膜への転写状況を可視光下で容易に観察し確認できるようになる。更に、本発明による転写された着色済みＤＮＡ用あるいはＲＮＡ用分子量マーカーは、プローブとハイブリダイズすることなく、バックグランドとなることはなく、本来のハイブリダイゼーションによる検出を妨害することもないことが見出だされている。
【００３２】
本発明により、ウエスタンブロット法、サザンブロット法そしてノーザンブロット法、全てのブロッティング法に可視光下で視認可能な、分子量マーカーがそろうことになる。
【００３３】
また、前記任意の化合物として蛍光色素を選択した場合、細胞内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での目的核酸の存在や位置を確認するために使用できる核酸プローブを製造することができる。
【００３４】
さらに、本発明の核酸誘導体は、可視化された核酸としてだけでなく、前記ビニルスルフォン基及び／若しくはスルファトエチルスルフォン基を介して本発明の核酸誘導体を固定層と連結させ、目的核酸の特異的塩基配列を検出するためのハイブリッド形成法にも利用できる。
【００３５】
また、本発明で使用する核酸は、ＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど、特に限定されるものではなく、当業者が用途に応じて適宜選択するものである。
【００３６】
また、本発明で使用する核酸の長さは、当業者が用途に応じて適宜変更することができる。例えば、本発明の核酸分子量マーカーで使用する核酸の長さは、低分子量測定用の場合は５０〜１，０００ｂｐ、高分子量測定用の場合は３００〜１０，０００ｂｐである。
【００３７】
本発明の核酸誘導体の製造方法は、チミン塩基のＮ−１位が水素原子以外である水系溶媒において行われるものである。これにより、天然（生体）に近い実験状態で目的核酸の分子量を決定することができる。また、水系溶媒を用いることで、環境にやさしく、局所排気装置などの特別な設備が要らないという利点がある。更に、高分子ＤＮＡ及び高分子ＲＮＡは、有機溶媒に不溶であり、本方法による水系における反応により化合物導入が容易となるという利点もある。水系溶媒としては、水、炭酸カリウム−塩化カリウム溶液が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の試料核酸は、当業者において公知の方法、例えばＰＣＲ、化学合成、生体からの抽出などを用いて準備されるものである。
【００３９】
本発明で使用されるゲル電気泳動は、目的の核酸に応じて当業者が適宜選択することができるものであり、例えば、変性アクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、変性アガロースゲル電気泳動などである。また、各種ゲル電気泳動法は、当業者に公知の手順・方法であれば特に限定されるものではない。
【００４０】
次に、本発明の効果に関して実施例を示して説明する。しかし、本発明は以下に記載された実施例に限定されるものではなく、様々な変更及び修飾は当業者によって容易になされることが理解されるであろう。
【００４１】
（実施例）
後述する実施例１及び２は、以下の材料及び方法に従って実験した。
（１）ＤＮＡの定量
適当なＨ２Ｏもしくは１ｘＴＥに溶解しているＤＮＡ溶液の２６０ｎｍのＵＶ吸収を測定した。分光光度計は日立社製Ｕ−２８００を用いた。
（２）変性アクリルアミドゲル電気泳動
変性アクリルアミドゲルは７．５Ｍ  Ｕｒｅａ入り１０％、１２．５％および１５％ポリアクリルアミドゲルを用い、泳動バッファーは１ｘ  ＴＢＥを用いた。サンプルバッファーはバイオダイナミクス社製  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＰＡを用い、８０℃、５分間加熱変性し、電気泳動に供した。泳動時間は２００ＶでＢＰＢが適当な位置に泳動してくるまでとした。
（３）アガロースゲル電気泳動
アガロースゲル電気泳動は０．８％  アガロースゲルを用いた。泳動バッファーは１ｘ  ＴＡＥおよび１ｘＴＢＥを用いた。サンプルバッファーはバイオダイナミクス社製６ｘＢＰＢを用い、７５℃、３分間加熱変性し、電気泳動に供した。泳動時間は５ｃｍ／ＶでＢＰＢが適当な位置に泳動してくるまでとした。
（４）変性アガロースゲル電気泳動
変性アガロースゲル電気泳動は２．２Ｍ  ホルムアルデヒド入り１．０％および１．５％のアガロースゲルを用いた。泳動バッファーは１ｘ  ＴＢＥを用いた。サンプルバッファーはバイオダイナミクス社製Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｆ  ＡＧ＋  を用いた。泳動時間は５ｃｍ／ＶでＢＰＢが適当な位置に泳動してくるまでとした。
（５）電気泳動後の確認
電気泳動したポリアクリルアミドゲルおよびアガロースゲルは、エチヂウムブロマイド（ＥｔＢｒ）水溶液もしくはクリスタルバイオレット（ＣＶ）水溶液で染色を行った。ＥｔＢｒ染色は７μｇ／ｍｌのＥｔＢｒ水溶液にゲルを１５分間浸した後、トランスイルミネーター上でＵＶ照射により蛍光発色を観察した。ＣＶ染色は２０μｇ／ｍｌのＣＶ水溶液にゲルを３０分間浸した後、可視光下で目視により観察した。
（６）染料の除去
ＤＮＡ染色反応時の未反応染料の除去にはＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製Ｇ２５  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎを用いた。未使用スピンカラムを２７００ｘｇ、１分間遠心分離し、余剰バッファーを除去後、カラムに染色反応液を５０〜１００μｌ程度アプライし、２７００ｘｇ、２分間遠心溶出を行った。
（７）薄層クロマトグラフィー
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はＭＥＲＣＫ社製Ｓｉｌｉｃａ−Ｇｅｌ−６０Ｆ２５４を用いた。ＴＬＣのスポット検出は２５４ｎｍの波長で行った。発色試薬にはモリブデン酸アンモニウム−セリウム明礬液を用いた。
（８）核磁気共鳴スペクトル
核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）は、日本電子製、ＥＣＡ−５００  ＦＴ−ＮＭＲを用い、１Ｈ−ＮＭＲを５００ＭＨｚで測定した。測定溶媒には重水素化クロロホルムを使用した。基準物質には、トリメチルシラン（ＴＭＳ）を用いた。
（９）質量スペクトル
質量スペクトル（ＭＳ）には日立製、Ｍ−２５００  ガスクロ質量分析計を用いた。測定には直接導入ＥＩ法を用いた。
【実施例１】
【００４２】
この実施例においては、ビニルスルフォン基およびスルファトエチルスルフォン基を用いて任意の化合物を導入する実験を行った。
【００４３】
（１）スルファトエチルスルフォン基を有する色素の３０ｍｅｒ  ｐｏｌｙ−ｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＣおよびｄＵへの導入
【００４４】
（方法）
化学合成したＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒ（Ｐｏｌｙ−ｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＣおよびｄＵ）（表１）をＨ２Ｏでそれぞれ０．４μｇ／μｌになるように溶解したＤＮＡ溶液１２．５μｌに、
【００４５】
【表１】
0004954004.tif 000015
【００４６】
スルファトエチルスルフォン基を有する下記５−アセトアミド−４−ヒドロキシ−３−［２−ヒドロキシ−４−（スルホキシ）−スルホニル］−フェニルアゾ｝−２，７−ナフタレンジスルホン酸銅複合体（５−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−［２−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−（ｓｕｌｆｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−ｐｈｅｎｙｌａｚｏ｝−２，７−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｐｐｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を０．２Ｍ  Ｋ２ＣＯ３-０．８Ｍ  ＫＣｌ  ｐＨ１２  で２０μｇ／μｌとなるように溶解した染料溶液１２．５μｌを加え、ヒートブロック上で７０℃、１．５時間反応させた。
【００４７】
【化２６】
0004954004.tif 000016
【００４８】
反応液をＧ２５  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にて精製を行い、溶出溶液を凍結乾燥により濃縮乾固した。得られたペレットに１ｘ  ＴＥ（ｐＨ８）バッファーを加え再溶解後、変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により確認を行った。
【００４９】
（結果）
以上の実験により、スルファトエチルスルフォン基を有する反応性染料分子である５−アセトアミド−４−ヒドロキシ−３−［２−ヒドロキシ−４−（スルホキシ）−スルホニル］−フェニルアゾ｝−２，７−ナフタレンジスルホン酸銅複合体はＰｏｌｙ−ｄＴおよびＰｏｌｙ−ｄＵのみを染め、Ｐｏｌｙ−ｄＡ、Ｐｏｌｙ−ｄＧおよびＰｏｌｙ−ｄＣを染色しないことを確認した（図１）。
【００５０】
このことからスルファトエチルスルフォン基はチミンあるいはウラシル塩基部分に特異的に付加反応し、アデニン塩基、グアニン塩基、シスチン塩基さらにはデオキシリボースやリン酸部分とは付加反応しないことがわかる。このことはスルファトエチルスルフォン基とチミン塩基およびウラシル塩基との特異的付加反応により、これら塩基を含む任意の分子、たとえば天然のＤＮＡやＲＮＡなどに、任意の化合物を導入できることを示す。
【００５１】
（２）ビニルスルフォン基を有する蛍光色素の天然由来二本鎖ＤＮＡへの導入
【００５２】
（方法）
プラスミドＤＮＡ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶ消化物である２９６１塩基対の天然由来直線状二本鎖ＤＮＡをＨ２Ｏで１μｇ／μｌになるように溶解したＤＮＡ溶液５μｌにビニルスルフォン基を有する反応性蛍試薬である下記４−アミノ−Ｎ−（３−［ビニルスルフォニル］フェニル）ナフタルイミド−３，６−ジスルホネートダイリチウム塩（４−Ａｍｉｎｏ−Ｎ−（３−［ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ）ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ−３，６−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｄｉｌｉｔｈｉｕｍ  ｓａｌｔ）を０．２Ｍ  Ｋ２ＣＯ３、  ０．８Ｍ  ＫＣｌ（ｐＨ１２）で４０μｇ／μｌとなるように溶解した染料溶液５μｌを加えヒートブロック上で６５℃、３時間反応させた。
【００５３】
【化２７】
0004954004.tif 000017
【００５４】
３時間後１Ｎ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）を５μｌ加え反応を停止し、反応液をＧ２５  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にて精製を行った。溶出溶液を０．１μｇ  ＤＮＡ／μｌとなるようにＨ２Ｏを加え、５μｌもしくは１μｌをアガロースゲルで電気泳動を行った。
【００５５】
（結果）
以上の実験により、ビニルスルフォン基を有する反応性蛍光試薬４−アミノ−Ｎ−（３−［ビニルスルフォニル］フェニル）ナフタルイミド−３，６−ジスルホネートダイリチウム塩とＤＮＡ中のチミン塩基との本方法によるビニルスルフォン基を介した特異的付加反応によって天然のＤＮＡも蛍光染色できることがわかる。本方法によるビニルスルフォン基とチミン塩基との特異的付加反応が、天然のＤＮＡに蛍光試薬など、新たな任意の化合物を導入する方法として有用であることを示している。
【００５６】
また、本方法で蛍光修飾されたＤＮＡはアガロースゲル電気泳動上で未修飾時のインタクトなＤＮＡとほぼ同じ約３０００塩基の位置に電気泳動されている（図２）。
【００５７】
（３）ビニルスルフォン基を持つ物質のチミン塩基への導入
【００５８】
（方法）
ＤＮＡおよびＲＮＡの構成成分であるチミン塩基、ウラシル塩基のモデルとして以下の構造式で表す１−メチルチミン（１−Ｍｅｔｙｌｔｈｙｍｉｎｅ）を用い、
【化２８】
0004954004.tif 000018
また、ビニルスルフォン基を持つ化合物として、以下の構造式で表すｐ−トリルビニルスルフォン（ｐ−Ｔｏｌｙｌ  ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）を用いた。
【００５９】
【化２９】
0004954004.tif 000019
【００６０】
２０．５ｍｇの１−メチルチミン（ＭＷ＝１４０．１４）を０．１Ｍ  Ｋ２ＣＯ３−０．４Ｍ  ＫＣｌ（ｐＨ１２）に懸濁し、４０．０ｍｇのｐ−トリルビニルスルフォン（ＭＷ＝１８２．２４）を加え、ヒートブロック上で７０℃、１ｈｒ反応させた。反応終了後クロロホルムを加え攪拌後、有機層を分離した。水層はクロロホルムで１回抽出し、得られた有機層は０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下濃縮した。得られた結晶は薄層シリカゲルクロマトグラフィーで（Ｅｔ２Ｏ：ＡｃＯＮａ＝１：１）で精製し、目的物である以下の構造式の（１−メチル−３−（ｐ−トリルスルフォニルエチル）チミン（１−Ｍｅｔｈｙｌ−３−（ｐ−ｔｏｌｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｅｔｈｙｌ）ｔｈｙｍｉｎｅ）Ｒｆ＝０．３６  Ｅｔ２Ｏ：ＡｃＯＮａ＝１：１）を３５．２ｍｇ、収率７５％で得た。
【００６１】
【化３０】
0004954004.tif 000020
【００６２】
得られた結晶について、１Ｈ−ＮＭＲおよびＭＳスペクトルにより構造決定した。
（結果）
以上の実験により、１−メチル−３−（ｐ−トリルスルフォニルエチル）チミンは、ＭＳスペクトルでｍ／ｚ＝３２２に［Ｍ］＋が観測されたこと、表２に示すように１Ｈ−ＮＭＲで１．８４ｐｐｍ、２．４２ｐｐｍ、３．３０ｐｐｍ付近に３つのメチル基のシグナルが観測されたこと、３．４５ｐｐｍおよび４．２５ｐｐｍ付近に相関関係にある２つのメチレンのシグナルが観測されたことが示された。８．２５ｐｐｍ付近の１−メチルチミン由来のＮ−３位プロトンのブロードなシグナルが消失していることにより、得られた物質は１−メチルチミンとｐ−トリルビニルスルフォンがカップリングしたものであり、その結合様式は１−メチルチミンのＮ−３位にエチルスルフォンを介してｐ−トリル基が結合しているものと決定した。
【００６３】
【表２】
0004954004.tif 000021
【００６４】
この反応はチミン塩基とスルファトエチルスルフォン基を有するビニルスルフォン系反応染料もしくは、ビニルスルフォン基を有する蛍光色素の結合様式の模式であり、ＤＮＡおよびＰｏｌｙ−ｄＴ、Ｐｏｌｙ−ｄＵの可視化あるいは蛍光の染色は、反応染料のビニルスルフォン基が、チミン塩基および反応点の構造が類似しているウラシル塩基のＮ−３位へ付加することによって起こることを示している。
【００６５】
本方法が、チミンあるいは類似の構造であるウラシル塩基を有する任意の物質に温和な条件で高収率かつ高い特異性をもって、エチルスルフォンを介して任意の化合物を導入する有用な方法であることを示している。
【実施例２】
【００６６】
この実施例においては、ゲル電気泳動上での分子量の指標としての染色核酸鎖の有用性を検証した。
【００６７】
（１）化学合成Ｐｏｌｙ−ｄＴを用いた可視化ＤＮＡラダーの作製
【００６８】
（方法）
化学合成したＰｏｌｙ−ｄＴ鎖（５０、４０、３０および２０塩基）（表３）をＨ２Ｏでそれぞれ１μｇ／μｌになるように溶解した溶液５μｌに、
【００６９】
【表３】
0004954004.tif 000022
【００７０】
下記２−アントラセン−スルホン酸，１−アミノ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−４−（（３−（（２−（スルホキシ）エチル）スルホニル）フェニル）アミノ）−，ジナトリウム塩（２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，１−ａｍｉｎｏ−９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄｉｏｘｏ−４−（（３−（（２−（ｓｕｌｆｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）−，ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）を０．２Ｍ  Ｋ２ＣＯ３（ｐＨ１２）で２０μｇ／μｌとなるように溶解した溶液５μｌを加え、ヒートブロック上で７０℃に加熱した。
【００７１】
【化３１】
0004954004.tif 000023
【００７２】
３０分後さらに０．１Ｍ  Ｋ２ＣＯ３（ｐＨ１２）で２０μｇ／μｌとなるように溶解した染料溶液５μｌを加え３０分加熱した。これを２回繰り返し、合計１．５ｈｒ反応させた。反応後、反応液をＧ２５  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにて精製を行った。溶出溶液を凍結乾燥により濃縮乾固し、得られたペレットに２．８μｇ  ＤＮＡ／μｌ  となるように１ｘ  ＴＥ  （ｐＨ８）  バッファーを加え再溶解後、下記（表４）の組成で混合し、変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により確認を行った（図３）。
【００７３】
【表４】
0004954004.tif 000024
【００７４】
（結果）
以上の実験により、染色Ｐｏｌｙ−ｄＴラダー（５０、４０、３０および２０  塩基）の見かけ分子量はポリアクリルアミドゲル濃度非依存的であり、一本鎖ＲＮＡマーカー（バイオダイナミクス社製、ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  ＲＮＡ  Ｌｏｗ）の各バンドとの相対的位置関係はほとんど変化していないことが示された。このことはチミン塩基を含む一本鎖核酸が、本方法によりスルファトエチルスルフォン基を介した色素導入によって、一本鎖であるＲＮＡの可視光下で視認可能な、またはであるところの電気泳動用分子量マーカーとなることを示している。
【００７５】
（２）プラスミドＤＮＡを用いた可視化ＤＮＡラダーの作製
【００７６】
（方法）
プラスミド由来の制限酵素消化物（３０００、１５００および７００塩基対）をＨ２Ｏで１μｇ／μｌになるように溶解したＤＮＡ溶液５μｌに、下記２，７−ナフタレンジスルホン酸，３，６−（ビス（４−（（２−ヒドロキシエチル）スルホニル）フェニル）ビス（アゾ））−５−アミノ−４−ヒドロキシ−，ジ（硫酸水素塩）エステル，テトラナトリウム塩（２，７−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，３，６−（ｂｉｓ（４−（（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｂｉｓ（ａｚｏ））−５−ａｍｉｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−，ｄｉ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）ｅｓｔｅｒ，ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）（図１３）を０．２Ｍ  Ｋ２ＣＯ３、０．８Ｍ  ＫＣｌ（ｐＨ１２）で４０μｇ／μｌとなるように溶解した染料溶液５μｌを加えヒートブロック上で７０℃、３時間反応させた。
【００７７】
【化３２】
0004954004.tif 000025
【００７８】
３時間後反応液をＧ２５  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにて精製を行った。溶出溶液を凍結乾燥により濃縮乾固し、得られたペレットに２．０μｇ  ＤＮＡ／μｌとなるように１ｘＴＥ  バッファーを加え再溶解した。染色したそれぞれのＤＮＡフラグメントおよびバイオダイナミクス社製  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＧ＋を以下の表５のように混合し、３０００、１５００、７００塩基の染色ラダーを作製した。これを変性アガロースゲルでバイオダイナミクス社製ＲＮＡマーカー（ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  ＲＮＡ  Ｈｉｇｈ）と泳動比較した（図４）。
【００７９】
【表５】
0004954004.tif 000026
【００８０】
（結果）
以上の実験により、スルファトエチルスルフォン基を有する反応性色素２，７−ナフタレンジスルホン酸，３，６−（ビス（４−（（２−ヒドロキシエチル）スルホニル）フェニル）ビス（アゾ））−５−アミノ−４−ヒドロキシ−，ジ（硫酸水素塩）エステル，テトラナトリウム塩と天然由来ＤＮＡ中のチミン塩基との本方法によるスルファトエチルスルフォン基を介した特異的付加反応によって、天然由来のＤＮＡにも可視光色素が導入できることがわかる（図４）。
【００８１】
スルファトエチルスルフォン基とチミン塩基との本方法による特異的付加反応が、天然のＤＮＡに可視光色素など、新たな任意の化合物を導入する手法として有用であることが示された。
【００８２】
しかも、可視光色素を導入した天然由来の３０００、１０００、７００塩基の染色ＤＮＡラダーは見かけ分子量がアガロースゲル濃度非依存的であり、一本鎖ＲＮＡマーカー（バイオダイナミクス社製、ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  ＲＮＡ  Ｈｉｇｈ）と泳動比較すると、その見かけ分子量は常に一本鎖ＲＮＡの対応する３０００、１０００、７００塩基の位置と同じである。前述の化学合成Ｐｏｌｙ−ｄＴ染色ＤＮＡラダーにおける実験結果から見ても、本方法で得られる染色ＤＮＡラダーは電気泳動における分子量の指標として機能する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、Ｐｏｌｙ−ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ及びｄＣの５−アセトアミド−４−ヒドロキシ−３−［２−ヒドロキシ−４−（スルホキシ）−スルホニル］−フェニルアゾ｝−２，７−ナフタレンジスルホン酸銅複合体染色物の電気泳動像を示したものである。
【図２】図２は、ｐＢｌｕｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶ消化物（２９６１塩基対）の４−アミノ−Ｎ−（３−［ビニルスルフォニル］フェニル）ナフタルイミド−３，６−ジスルホネートダイリチウム塩染色を示したものである。
【図３】図３は、染色ラダーのＲＮＡマーカーとの泳動比較を示したものである。
【図４】図４は、天然由来染色ＤＮＡラダーと一本鎖ＲＮＡマーカーとの泳動比較を示したものである。
【図１】
0004954004.tif 000039
【図２】
0004954004.tif 000040
【図３】
0004954004.tif 000041
【図４】
0004954004.tif 000042