(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位である(1)アミノ酸430と433の間、但し、アミノ酸431及び432は欠失、(2)アミノ酸266と267の間、(3)アミノ酸140と141の間及びアミノ酸266と267の間、または(4)アミノ酸56と57の間、アミノ酸140と141の間及びアミノ酸266と267の間に、VEETSFIDA、 VEESGIVDV、IEETTFIES、IEESSFIDA、IEDSSVVTS、またはIEESAIINAで表されるアミノ酸配列からなる、ヒトパピローマウイルスのL2エピトープ群のうちの少なくとも1つのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシド。
【請求項２】
L1-キャプシドワクチンの製造に用いられる請求項１に記載のキャプシド。
【請求項３】
ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位である(1)アミノ酸430と433の間、但し、アミノ酸431及び432は欠失、(2)アミノ酸266と267の間、(3)アミノ酸140と141の間及びアミノ酸266と267の間、または(4)アミノ酸56と57の間、アミノ酸140と141の間及びアミノ酸266と267の間に、VEETSFIDA、 VEESGIVDV、IEETTFIES、IEESSFIDA、IEDSSVVTS、またはIEESAIINAで表されるアミノ酸配列からなる、ヒトパピローマウイルスのL2エピトープ群のうちの少なくとも1つのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質。
【請求項４】
請求項３に記載のキメラ蛋白質を集合させることでキャプシドを形成させることを含む、請求項１に記載のキャプシドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
子宮頸癌の原因となるヒトパピローマウイルス群の感染を予防するためのワクチンとして使い得る抗原に関する。特に本発明は、ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質に、ヒトパピローマウイルスのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質及びこのキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス(HPV)(図1)は、小型のDNAウイルスで、80以上の遺伝子型が存在する。粘膜に感染する型（粘膜指向性HPV）のうち、少なくとも12の型（高リスク型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、68型）が子宮頚癌の原因となることが知られている（図2）。我が国の子宮頸部異形成（癌はこの病変を経て発生する。自然治癒することが多い。）に検出されるHPVも様々な型である（図3）。我が国は集団検診で早期発見に努めているにもかかわらず年間15000人の発症と2500人の死亡が報告されている。さらに、陰茎癌、外陰癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌の一部もHPV感染が原因ではないかと考えられている。WHOでは世界の女性の悪性腫瘍の11％（45万人）にHPV感染が関わっており3億人のHPVキャリアーがいると推定している。【０００３】
ウシやワタノオウサギにも固有のパピローマウイルスが存在する。不活化したウイルス粒子をワクチンとして接種すると、感染予防効果があることが示され、HPV感染もワクチンによって予防できると考えられている。【０００４】
HPV粒子は、L1蛋白質の5量体（キャプソメア）72個とL2蛋白質12分子で構成される正20面体のキャプシドがDNAゲノムを包む構造をしている(図1)。組換えDNA技術を応用してL1蛋白質のみを大量に発現させるとキャプシド様の構造（L1-キャプシド）ができる。L2蛋白質も同時に発現させればウイルス粒子と組成の同じキャプシド（L1/L2-キャプシド）が形成される。L1-キャプシドは、強い免疫原性を持ち、動物に接種するとアジュバント無しに抗体産生と細胞性免疫の両者を誘導することが示されている。この免疫原性はHPVの型に特異的で、16型のL1-キャプシドの免疫では16型に特異的な反応が起こる。【０００５】
HPVの増殖を許す培養細胞系が無いため、HPVの感染をモニターするにはHPVのL1/L2-キャプシドにマーカー遺伝子の発現プラスミド等を組み込んだ感染性偽ウイルスが工夫されている。HPVの感染中和抗体は、この感染性偽ウイルスの感染阻害で測定されている。【０００６】
米国を中心に、HPV16型のL1-キャプシドをワクチン抗原とする臨床試験が行われており、まずL1-キャプシドの筋肉注射がヒトに安全なことが確認され、次いで16型の感染を予防できることを示すデータが集まりつつある（図4）。同時に、このワクチンは16型以外の型のHPVには感染予防効果が無いことも指摘されている。【０００７】
本発明者らはこれまでの検討で、HPV16型L2蛋白質のアミノ酸108-120領域にあるエピトープ（L2-エピトープ）を認識するマウス（BALB/c）単クローン抗体(MAb5、13)及びHPV16型L2蛋白質のアミノ酸108-120領域と同じ配列を持つ合成ペプチドをBALB/cに免疫して得た抗血清は、16型だけでなく6、11、型の感染を阻害することを示してきた（図5及び6並びにKawana. K, et al. : Common neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6. J. Virology., 73, 6188-6190, 1999(非特許文献1)参照）。【０００８】
このL2領域のアミノ酸配列は粘膜指向性のHPV群で良く似ていることから、L2-エピトープを認識する抗体は幅広く粘膜指向性HPV群の感染を防ぐ可能性があることを指摘してきた（図5）。さらに、この合成ペプチドをヒト健常者のボランティアに経鼻接種しても安全で、一部のヒトの血清中に抗体が誘導され、少なくとも16型と52型を中和することを示した（Kawana. K, et al. : Safety and immunogenicity of a peptide containing the cross-neutralization epitope of HPV16 L2 administered nasally in healthy volunteers. Vaccine., 21: 4256-4260, 2003(非特許文献2)参照）。【０００９】
本発明者らは、HPV16型L2蛋白質のアミノ酸108-126領域を蛍光蛋白質につないで4℃で細胞培養液に加えると、この融合蛋白質が細胞に表面に結合すること、37℃に暖めると細胞内に侵入することを見出した（図7：Kawana. Y, et al. : Human papillomavirus type 16 minor capsid protein l2 N-terminal region containing a common neutralization epitope binds to the cell surface and enters the cytoplasm. J. Virology., 75, 2331-2336, 2001 (非特許文献3)参照）。
従って、L2蛋白質のこの領域はHPVが細胞に結合・侵入する際に重要な役割を担っており、抗体が結合することでHPVの感染が阻害される機構を想定できる（図8）。【００１０】
他に関連のある研究発表は以下のとおりである。
1）Katharina Slupetzkyらは、HIVのgp41蛋白質のB細胞エピトープとされている8アミノ酸の領域を、HPV16型L1蛋白質のアミノ酸286と287の間に挿入、アミノ酸281-287領域を置換、及びC末端に付加の3つの構造を作り、粒子の形成を確認するとともに、アミノ酸282-286領域が抗L1中和抗体のエピトープに関わっていることを報告した(Katharina Slupetzky, et al. : Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops. J. Gen. Virology., 82, 2799-2804, 2001(非特許文献4))。【００１１】
2）Jean-Remy Sadeyenらは、B型肝炎ウイルス（HBV）のコア蛋白質のエピトープとされている6アミノ酸の領域をHPV16型L1蛋白質のアミノ酸56-57、140-141、179-180、266-267、283-284、及び352-353領域に挿入した変異体を作製した。これらはキャプシドを形成し、マウス（C57BL/6C）に免疫して得た抗血清はHPV16型に対する中和能を維持しており、アミノ酸56-57領域の置換体を除いて、抗HBV抗体が誘導されることを示した。266-267領域の置換体を免疫した場合は中和抗体価が低かったことから、この領域がHPVに対する中和抗体の誘導に重要であると推定している(Jean-Remy Sadeyen, et al. : Insertion of a foreign sequence on capsid surface loops of human papillomavirus type 16 virus-like particles reduces their capacity to induce neutralizing antibodies and delineates a conformational neutralizing epitope. Virology., 309, 32-40, 2003(非特許文献5))。【００１２】
3）Arvind Varsaniらは、HPV16型L1蛋白質のアミノ酸81-93、131-143、174-186、414-426、及び431-443領域を、本発明者らが報告したHPV16型L2蛋白質のアミノ酸108-120領域の配列と置き換えた変異体を作り、BALB/cマウスに免疫し、414-426領域の置換体が抗L2抗体を誘導することを報告した(Arvind Varsani, et al. : Chimeric human papillomavirus  type16 (HPV-16) L1 particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16. J. Virology., 77, 8386-8393, 2003(非特許文献6))。
【非特許文献１】Kawana. K, et al. : Common neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6. J. Virology., 73, 6188-6190, 1999
【非特許文献２】Kawana. K, et al. : Safety and immunogenicity of a peptide containing the cross-neutralization epitope of HPV16 L2 administered nasally in healthy volunteers. Vaccine., 21: 4256-4260, 2003
【非特許文献３】Kawana. Y, et al. : Human papillomavirus type 16 minor capsid protein l2 N-terminal region containing a common neutralization epitope binds to the cell surface and enters the cytoplasm. J. Virology., 75, 2331-2336, 2001
【非特許文献４】Katharina Slupetzky, et al. : Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops. J. Gen. Virology., 82, 2799-2804, 2001
【非特許文献５】Jean-Remy Sadeyen, et al. : Insertion of a foreign sequence on capsid surface loops of human papillomavirus type 16 virus-like particles reduces their capacity to induce neutralizing antibodies and delineates a conformational neutralizing epitope. Virology., 309, 32-40, 2003
【非特許文献６】Arvind Varsani, et al. : Chimeric human papillomavirus  type16 (HPV-16) L1 particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16. J. Virology., 77, 8386-8393, 2003
【００１３】
HPVのL1-キャプシドを動物に免疫すると、型に極めて特異的な免疫応答を誘導することが知られている。16型のL1-キャプシドワクチンは16型の感染予防に有効性が示されている一方で、他の型の予防には効果が殆どないと考えられており、ワクチンでHPV感染を阻止するには、少なくとも高リスク型すべてに対応できるワクチン抗原の開発が課題である。
即ち、本発明の目的は、少なくとも高リスク型すべてに対応でき得るワクチン抗原を提供することにある。
【発明の開示】
【００１４】
上記課題を解決する本発明は以下の通りである。
[１]
ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位である(1)アミノ酸430と433の間、但し、アミノ酸431及び432は欠失、(2)アミノ酸266と267の間、(3)アミノ酸140と141の間及びアミノ酸266と267の間、または(4)アミノ酸56と57の間、アミノ酸140と141の間及びアミノ酸266と267の間に、VEETSFIDA、VEESGIVDV、IEETTFIES、IEESSFIDA、IEDSSVVTS、またはIEESAIINAで表されるアミノ酸配列からなる、ヒトパピローマウイルスのL2エピトープ群のうちの少なくとも1つのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシド。
[２]
L1-キャプシドワクチンの製造に用いられる［１］に記載のキャプシド。
[３]
ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位である(1)アミノ酸430と433の間、但し、アミノ酸431及び432は欠失、(2)アミノ酸266と267の間、(3)アミノ酸140と141の間及びアミノ酸266と267の間、または(4)アミノ酸56と57の間、アミノ酸140と141の間及びアミノ酸266と267の間に、VEETSFIDA、 VEESGIVDV、IEETTFIES、IEESSFIDA、IEDSSVVTS、またはIEESAIINAで表されるアミノ酸配列からなる、ヒトパピローマウイルスのL2エピトープ群のうちの少なくとも1つのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質。
[４]
［３］に記載のキメラ蛋白質を集合させることでキャプシドを形成させることを含む、［１］に記載のキャプシドの製造方法。
【００１５】
本発明によれば、粒子構造が強い免疫誘導活性を持つことと併せ、HPVのL2-エピトープを強力に抗原提示できる新たな抗原を提供できる。その結果、少なくとも高リスク型すべてに対応でき得るL1-キャプシドワクチンを提供することも可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
(L1-キャプシド)
本発明のL1-キャプシドは、ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルスのL2エピトープ群のうちの少なくとも1つのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドである。【００１７】
前述のようにHPV粒子は、5分子のL1蛋白質が集合したキャプソメアが72個集まって正20面体のキャプシドを形成する。L1蛋白質を細胞で高発現させると、L1蛋白質は核に集まって、自律的にキャプシドを形成する。L1蛋白質のみで形成されるキャプシドをL1-キャプシドまたはウイルス様粒子（virus-like particle: VLP）と呼ぶ。L1蛋白質とL2蛋白質を同時に発現させると12分子のL2蛋白質がL1-キャプシドに取り込まれてL1/L2-キャプシド（またはL1/L2-VLP）ができる。但し、L1-キャプシドとL1/L2-キャプシドは、電子顕微鏡では識別できない。【００１８】
本発明のL1-キャプシドは、HPV16型のL1-キャプシドをベースとするキャプシドである。HPVは遺伝子型が多いので、一般にHPV16やHPV58等の表示で型とともに記載する。ここではHPV16型のL1-キャプシドは16L1-キャプシド、HPV52型のL1/L2-キャプシドは52L1/L2-キャプシドのように記載する。【００１９】
本発明のL1-キャプシドは、HPV16型L1蛋白質に、HPVのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体である。以下、キメラ蛋白質とは、「ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルスのL2エピトープ群のうちの少なくとも1つのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質」を意味し、本発明は、このキメラ蛋白質も包含する。【００２０】
本発明のキメラ蛋白質を作るためにL1蛋白質に挿入されるL2エピトープは、9個のアミノ酸からなる。
本発明者らは、HPV16型のL2蛋白質のアミノ酸108-120領域にL2-エピトープが含まれることを先に報告した(Kawana. K, et al.: Common neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6. J. Virology., 73, 6188-6190, 1999 )。そして、16型のL2-エピトープは、16型だけでなく6、11、52型の感染を阻害することを示した。尚、本発明においては、蛋白質のアミノ末端から順にアミノ酸残基に番号を付け、例えば50番目のアミノ酸をアミノ酸50と記載した。【００２１】
上述のように、このL2領域のアミノ酸配列は高リスク型を含む粘膜指向性のHPV群で良く似ていることから、L2-エピトープを認識する抗体は幅広く粘膜指向性HPV群の感染を防ぐ可能性がある。そこで、HPV16型L1-キャプシドにL2-エピトープを挿入し、キャプシドの強い免疫誘導能を利用して、L2-エピトープに対する抗体産生を効率よく誘導できる抗原の作製をめざした。【００２２】
しかし、上記領域は13アミノ酸の長さがあり、L1蛋白質へ挿入するには長すぎると本発明者らは考えた。実際に試してみると、アミノ酸108-120領域を挿入した複数のL1蛋白質はみな凝集塊を形成し、L2-エピトープを抗原として提示できなかった(結果は実施例で示す)。そこで、さらに検討を重ね、最終的にアミノ酸109-117が適切であることを突きとめた。この領域のアミノ酸配列は粘膜指向性のHPV群で良く似ている（図9）。そこで、本発明では、挿入すべきL2-エピトープとして、図9に示す粘膜指向性のHPV群のL2-エピトープを含めた。即ち、本発明においては、L2エピトープ群は、具体的には、図9に示すものを挙げることができる。【００２３】
特に、本発明においては、L2エピトープ群は、VEETSFIDA(配列番号2)、 VEESGIVDV(配列番号3)、IEETTFIES(配列番号4)、IEESSFIDA(配列番号5)、IEDSSVVTS(配列番号6)、またはIEESAIINA(配列番号7)で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群からなることが好ましい。VEETSFIDA(配列番号2)は、HPV群の16型L2エピトープであり、特に好ましい。【００２４】
また、VEESGIVDV(配列番号3)は、HPV群の31型L2エピトープであり、IEETTFIES(配列番号4)は HPV群の52型L2エピトープであり、IEESSFIDA(配列番号5)はHPV群の58型L2エピトープであり、IEDSSVVTS(配列番号6)はHPV群の18型L2エピトープであり、IEESAIINA(配列番号7)は6及び11型L2エピトープである。【００２５】
HPVの系統樹をみると、高リスク型は16型を含むグループと18型を含むグループに大別される（図2）。我が国の前癌病変(CIN)に検出される頻度（図3）が高いことから、16型グループから16型、52型を選んだ。日本に住む中国人が多いので、中国で多いとされる58型を選んだ。日本では18型はあまり多くないので、18型グループからは18型のみを選んだ。高リスク型のL2エピトープの中心にある113番目のアミノ酸が、31型のみグリシンであることに注目して31型を選んだ。6・11型は、コンジロームの原因として最も高頻度に検出されることから、高リスクではないものの、本発明ではL2エピトープに加えた。【００２６】
前記L2エピトープ群は、前記アミノ酸配列、即ち、図9に示すアミノ酸配列、特にVEETSFIDA、 VEESGIVDV、IEETTFIES、IEESSFIDA、IEDSSVVTS、またはIEESAIINAで表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドに元となるL2エピトープを有するHPVの抗原性と同様の抗原性を付与するアミノ酸群からなることもできる。【００２７】
即ち、L2エピトープ群は、VEETSFIDAで表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドにHPV16型の抗原性を付与するアミノ酸配列を有するL2エピトープの変異体を含むことができる。
同様に、L2エピトープ群は、VEESGIVDV で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドにHPV31型の抗原性を付与するアミノ酸配列を有するL2エピトープの変異体を含むことができる。
同様に、L2エピトープ群は、IEETTFIES、で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドにHPV52型の抗原性を付与するアミノ酸配列を有するL2エピトープの変異体を含むことができる。【００２８】
同様に、L2エピトープ群は、IEESSFIDA、で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドにHPV58型の抗原性を付与するアミノ酸配列を有するL2エピトープの変異体を含むことができる。
同様に、L2エピトープ群は、IEDSSVVTSで表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドにHPV18型の抗原性を付与するアミノ酸配列を有するL2エピトープの変異体を含むことができる。
同様に、L2エピトープ群は、IEESAIINAで表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドにHPV6/11型の抗原性を付与するアミノ酸配列を有するL2エピトープの変異体を含むことができる。【００２９】
本発明のキメラ蛋白質において、L2エピトープが挿入されるL1蛋白質は、L1蛋白質のループ部位である。L1蛋白質のループ部位は、例えば、L1蛋白質のアミノ酸52-62、85-97、133-152、171-183、266-294、315-325、346-360、及び426-446領域である。特に、L2エピトープが挿入されるL1蛋白質のループ部位は、アミノ酸56と57の間、アミノ酸140と141の間、アミノ酸266と267の間、及びアミノ酸430と433の間の少なくとも一カ所であることが好ましい。HPV16型L1蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号1に示す。【００３０】
本発明者らは、HPV16L1蛋白質の構造解析、中和抗体エピトープの分布、及びキャプシド形成に必須なシステイン残基の位置等の観点から、L1蛋白質の外側にあって、抗原として認識されうる領域は、アミノ酸52-62、85-97、133-152、171-183、266-294、315-325、346-360、及び426-446領域であると推定した。【００３１】
本発明者らは、HPV16型、18型、6型L1蛋白質のアミノ酸配列を並べて比較し、型間で共通な部分は構造に関わる可能性が高いと考え、L2エピトープの挿入には不適切とした。型によってアミノ酸配列が大きく異なる領域はキャプシドの形成そのものに必須ではないと予想し、L2エピトープの挿入候補領域とした。さらに、HPV16型L1蛋白質のアミノ末端から10アミノ酸を除いた蛋白質の集合で形成されるL1-小型粒子（キャプシドより小型の正二十面体粒子）の構造解析（引用文献2）と、中和抗体エピトープの分布（引用文献3）、及びキャプシド形成に必須なシステイン残基の位置（引用文献4）を参考にし、L1タンパク質の外側にあって、L2エピトープの挿入が可能で、かつ抗原として認識されうる領域は、アミノ酸52-62 (HPV16型のL1-小型粒子においてBCループ)、85-97(CDループ)、133-152(DEループ)、171-183(EFループ)、266-294(FGループ)、315-325(GHループ)、346-360(HIループ)、及び426-446(カルボキシ末端)領域であると推定した。尚、引用文献は実施例の最後にリストを付す。【００３２】
さらに、下記の理由から挿入部位を絞り込み、L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質を作出してキャプシド形成を調べた。【００３３】
部位1：アミノ酸52-62領域では、アミノ酸56と57のあいだにB型肝炎ウイルスのエピトープを挿入した報告（引用文献3）が参考になった。アミノ酸50はフェニルアラニン、51はプロリン、52はイソロイシンと疎水性のアミノ酸が続いた後に、53と54はリジン、56、57、58はアスパラギン、59はリジンとほぼ全て親水性アミノ酸が続き、60はイソロイシンと疎水性になるので、56と57の間に挿入されたL2エピトープは表面にでると推定し、挿入部位に選定した。【００３４】
部位2：アミノ酸133-152領域では、アミノ酸140と141のあいだにB型肝炎ウイルスのエピトープを挿入した報告（引用文献3）が参考になった。この領域は親水性アミノ酸残基を多く含むので、挿入されたL2エピトープは表面にでると推定した。146番目のシステイン残基のすぐそばを避け、アミノ酸140と141の間に挿入することとした。【００３５】
部位3：アミノ酸266-294領域では、267のバリン、269のグルタミンがL2エピトープのアミノ末端のバリン、3番目のグルタミンと一致したため、266と267の間に挿入した。すこしでもL1蛋白質のアミノ酸配列に合えば、キャプシドを形成しやすいと考えたからである。同時にB型肝炎ウイルスのエピトープを挿入した報告（引用文献3）も参考にした。【００３６】
部位4：アミノ酸426-446領域では、428のシステイン残基がキャプシド形成にかかせないことが知られている（引用文献4）ので、428を避けた。431と432のアミノ酸は、HPV16、18、6型L1蛋白質でアミノ酸がまちまちであり、L2エピトープを挿入してもキャプシド形成に影響が少ないと考え、アミノ酸430と433の間に挿入した。【００３７】
そして、実際にキャプシドの形成を試みたところ、部位3へL2エピトープを挿入したキメラL1蛋白質（16L1-266VA）と部位4へL2エピトープを挿入したキメラL1蛋白質(16L1-430VA)は、キャプシドを形成した。
部位2と部位3に同時にL2エピトープを挿入したキメラL1蛋白質(16L1-140/266VA)は、キャプシドを形成した。
部位1と部位2と部位3に同時にL2エピトープを挿入したキメラL1蛋白質(16L1-56/140/266VA)は、キャプシドを形成した。【００３８】
L1蛋白質に挿入されるL2エピトープは、1つのL1蛋白質に1つであることができるが、同一のL2エピトープが2つ以上1つのL1蛋白質の異なるループ部位に挿入されることもでき、あるいは、種類の異なる少なくとも2種類のL2エピトープが1つのL1蛋白質の異なるループ部位に挿入されることもできる。【００３９】
(L2エピトープを含むペプチドの作製)
L2ペプチド(アミノ酸107-122)の作製は、常法により、96カラム自動ペプチド合成装置でのFmoc固相法により合成した。なお、このペプチドは抗体作製を目的としたため、KLH接合されており、このKLHによるペプチド領域のマスキングを防ぐためにN末にシステイン残基を付加してある。【００４０】
(L2エピトープの挿入されたL1蛋白質(キメラ蛋白質)の作製)
キメラL1遺伝子を作製し、これをバキュロウイルスベクターを用いて発現させて、キメラL1蛋白質、キメラキャプシドを作製した。キメラL1遺伝子の作製は、PCRによった。詳細は以下の通りである(図23参照)。【００４１】
(A)挿入したい部分を持つプライマー対を作成した。
(B)挿入部分を持つプライマーの一方とプライマー１またはプライマー２を組み合わせてPCRを行い、
(C)片側に挿入断片を持つDNAを2つ合成した。それぞれの相補部分をアニールさせ、伸長反応を行い、
(D)挿入DNAを持つキメラ遺伝子を作成した。
(E)このDNAを鋳型にプライマー１とプライマー２を用いてPCRを行い、
(F)挿入遺伝子を持つDNAを増幅した。【００４２】
本発明は、本発明のキメラ蛋白質を集合させることでキャプシドを形成させることを含むキャプシドの製造方法を包含する。上述の様に、キメラL1遺伝子を作製し、これをバキュロウイルスベクターを用いて発現させて、キメラL1蛋白質を作製する。そして、キメラL1蛋白質が作製されると、自律的にキメラキャプシド(本発明のキャプシド)が形成される。バキュロウイルスベクターを用いる発現は、常法で行うことができるが、キメラキャプシドの自律的な形成を促進するという観点から、条件を設定することが好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
尚、リン酸緩衝液に0.14モルの食塩を溶かしたものをPBS(phosphate buffered serine)とした。【００４４】
HPV16 L1キメラ遺伝子の作製
HPV16L1キメラ遺伝子は、L2-エピトープ領域の塩基配列を持つプライマーを用いたPCRによって作製した。プロトタイプHPV16DNAの6240番目の塩基GをCに置換してL1-キャプシドを形成するように改変したもの（引用文献１）をpCMV plasmid vecter(BD Bioscience Clontech, Palo,CA)にクローニングし、PCRのテンプレートに用いた。【００４５】
L2エピトープを挿入する場所は、これまでに16型L1-キャプシドの免疫によって誘導される中和抗体が認識すると推定されている領域（引用文献２）、B型肝炎ウイルス中和エピトープを挿入した引用文献の情報（引用文献３）、またキャプシドの形成に必要なシステイン残基の位置等（引用文献４）から、以下の領域を選んだ。即ち、16型L1蛋白質のアミノ酸56と57のあいだ、アミノ酸140と141のあいだ、アミノ酸266と267のあいだ、アミノ酸430と432のあいだにL2エピトープを挿入した。【００４６】
L2-エピトープは、HPV16型L2蛋白質のアミノ酸108-120領域内のどこに相当するのか不明だったため、アミノ酸108-120、105-126、107-122、109-117、108-117領域に相当するペプチドを挿入したキメラ遺伝子を試作した。上記のL1蛋白質の挿入部位と挿入するL2-ペプチドの組み合わせをもつキメラ遺伝子を順次作製した。【００４７】
HPV16 L1キメラ蛋白質の発現と精製
16L1キメラ遺伝子は組み換えバキュロウイルス系で発現させた。Bac-to-Bac baculovirus expression system(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)用いて組み換えウイルスを作り、sf9細胞（夜盗蛾由来細胞）で発現させた。16L1キメラ遺伝子をpFastbac1 vectorのNot IサイトにクローニングしてpFsatbac1/L1chimeraを得た。次にpFsatbac1/L1chimeraをDH10BAC大腸菌(Max Efficiency competent cell containing baculovirus DNA and helper plasmid, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)に導入してBacmidを作成した。 Bacmid DNAをEffectene Transfection Reagent(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)を用いてsf9に導入し、16L1キメラ蛋白質を発現する組み換えバキュロウイルスを得た。【００４８】
組み換えバキュロウイルスをsf9に感染させ72時間後に細胞を回収した。感染細胞を0.5%NP40溶液に縣濁し、10分間室温放置後、遠心(9000rpm、15分、4℃)して核分画（沈殿）と細胞質分画に分けた。核分画を1.28g/mlの塩化セシウム-PBS溶液に縣濁し、超音波(Sonifier250, Branson)破砕後、SW50.1 roter (Beckman Coulter Inc., Fulleron, CA)で超遠心（34000rpm、20時間、20℃）を行った。塩化セシウム勾配中で比重1.28g/ml付近に集まった蛋白質を回収し、0.5M NaCl-PBSで透析したものを、16L1キメラ蛋白質溶液とした。【００４９】
各16L1キメラ蛋白質溶液中に実際に含まれる16L1キメラ蛋白質は、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動後(SDS-PAGE)、Western Blottingで検出した（図10）。マウス抗HPV16型L1モノクローナル抗体（HPV16L1MAb、Pharmingen, CA）を1:4000に希釈して一次抗体とし、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗血清(SC-2031, SantaCruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)を1:5000に希釈して二次抗体とした。発色はECL plusペルオキシダーゼ検出キット(Amersham Bioscience Inc.)を用いた。【００５０】
HPV16 L1キメラキャプシドの形態
各16L1キメラ蛋白質溶液中のキメラ蛋白質が集合して形成する形態は、5%から45%のショ糖密度勾配溶液（ショ糖をPBSで溶かしたもの）での沈降速度によって検討した。キメラ蛋白質溶液をショ糖勾配液の上に重層し、SW50.1 (Beckman Coulter Inc.)ローターを用いた31000rpm、4℃、2.5時間超遠心した。この条件では、キャプシドはショ糖濃度40%前後の分画に集まるが、凝集した蛋白質はショ糖層を突き抜けて沈査となる。そこで、試料を超遠心した後、底部より約200μlずつ分画し、SDS-PAGE、Western Blotting法でL1キメラ蛋白質がどの分画に含まれるかを調べた。L1キメラ蛋白質がショ糖濃度40%前後の分画に集まった場合は（図11）、透過型電子顕微鏡(Hitachi model H-7600)を使い、陰性染色法で形態を観察した（図12）。【００５１】
マウス抗血清
16L1キメラ蛋白質溶液を、ジエチルエーテルで麻酔したBalb/cマウス(6週令、雌)に皮下ないし経鼻接種した。皮下接種はTiter Max Gold (TiterMax USA, Inc.)をアジュバンドとし、アジュバンドと混合することでほぼ等張とした。1回の接種量は蛋白質10μg程度とし、初回接種後、2W、４W、6Wめに追加接種し、4W、6W、8Wに下大静脈より全採血した。経鼻接種では、16L1キメラ蛋白質溶液を滅菌水で希釈して等張とし、一方の鼻腔より滴下した。1回の接種量は蛋白質12μg程度とし、初回投与から毎週4回投与し、初回投与から4週、６週、8週、10週時に下大静脈より全採血を行った。【００５２】
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
16L1/L2-キャプシド、16L1-キャプシド、52L1/L2-キャプシド、52L1-キャプシド、58L1/L2-キャプシド、58L1-キャプシド、複数のHPV16のL2蛋白質の断片を抗原とした。キャプシドは、組み換えバキュロウイルス系（Bac-to-Bac baculovirus expression system(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA))で発現させ、16L1キメラ蛋白質と同様に精製した。L2蛋白質の断片は、カルボキシ末端側にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を融合させた構造とし、このtagを使ってアフィニティカラムによる精製を行った。16L2(61-140)-GSTはHPV16L2蛋白質のアミノ酸61から142の領域を含み、16L2Δ-GSTは、16L2(61-140)-GSTのL2部分よりアミノ酸105から126部分（この領域内にL2-エピトープが存在）を欠失させた蛋白質である。16L2(18)-GST、16L2(31)-GST、16L2(6)-GST 、16L2(33)-GST、16L2(35)-GST、16L2(52)-GST、16L2(58)-GSTは、それぞれHPV18、31、6、33、35、52、58型L2蛋白質のアミノ酸105から126を16型L2蛋白質のアミノ酸105から126と置換した蛋白質である。【００５３】
PBSで希釈したキャプシドを1μg、または50mM炭酸緩衝液(pH9.6)で希釈した16L2-GST、16L2(18)-GST、16L2(31)-GST、16L2(6)-GST、16L2(33)-GST、16L2(35)-GST、16L2(52)-GST、16L2(58)-GSTまたは16L2Δ-GSTを2μgを96穴イムノアッセイプレート(Immulon2, Dynatech Laboratories)の各ウェルに入れ、4℃、over nightのインキュベーションで結合させた。翌日、ウェル内の抗原溶液を除き、5%スキムミルクPBS-T(0.1% Tween20)溶液を加え、37℃で2時間ブロッキングしたのち、セラウオッシャー（バイオテック、東京）を用いてPBS-Tで3回洗浄した。【００５４】
マウス血清を5%スキムミルクPBS-Tで40倍ないし必要に応じてさらに段階的に希釈した後、50μlを各ウェルに加え、室温で60分反応させた。セラウオッシャーにて9回洗浄後、5%スキムミルクPBS-Tで2000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGヤギ血清(SC-2031, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)50μlを加え、室温で30分反応させた。PBSで9回洗浄したのち、o-フェニレンジアミン、過酸化水素水を添加した0.1Mクエン酸ナトリウム溶液(pH4.7)を加え、ペルオキシダーゼ活性による発色をELISAオートリーダー(iEMS Reader  LABSYSTEMS)を用いて、450nmの吸光度として測定した。免疫前血清を同様に測定して得られた吸光度との差を特異的吸光度とした。【００５５】
中和活性の測定法(1)
川名らの方法（引用文献５）に従って、マウス血清の中和活性を測定した。即ち、精製した16L1/L2-キャプシドを2-メルカプトエタノール(2-ME)で還元処理した後、pSV/β-galプラスミドDNA(Promega Corp., Madison, WI)存在下で、2-MEを透析除去し、形成された感染性偽ウイルスを塩化セシウム平衡密度遠心で精製した。感染性偽ウイルスと希釈した血清を1時間室温で反応させた後、2.5mMEDTAで培養プレートからはがしたCOS-1細胞浮遊液に加え、4℃で、60分混和してから培養プレートに播いた。48時間培養してから、β-gal発現細胞を染色した。発色した細胞数を数え、免疫前血清を用いて得られた発色細胞数と比較した。【００５６】
中和活性の測定法(2)
抗体の中和活性をPastranaらの方法（Diana V. Pastrana, et al. : Reactivity of human sera in a sensitive, high throughput pseudovirus based papillomavirus neautralization assay for HPV16 and HPV18. Virology 321, 205-216, 2004.）を用いて測定した。測定方法の概略を以下に示す。HPV16型L1発現プラスミド、HPV16型L1L2発現プラスミド、分泌型アルカリフォスファターゼ発現プラスミドを混合し、293TT細胞に導入し、48時間後に細胞を回収した。細胞内で生じたHPV16型感染偽ウイルスを、細胞から界面活性剤Brij 58を含む緩衝液で抽出し、Opti Prepを担体とする密度勾配遠心法によって精製した。精製した感染性偽ウイルスを0、 0.01、 0.05、 0.1、 1μlずつ用い、それぞれに最終希釈が 1:10、 1:50、 1:100の濃度になるように抗体を加えた100μlの緩衝液を1時間、4℃に放置した。この溶液を、30000個の293TT細胞培養にかけ、72時間後に培養上清中のアルカリフォスファターゼ活性をルミノメーターで定量した。それぞれの実験は３回繰り返し行いその平均値を求めた。血清成分がアルカリフォスファターゼ活性や感染性偽ウイルスの感染性に影響を与えるために、血清からProtein Gカラムを用いてIgGのみを精製し、抗体として使用した。【００５７】
結果
1.  HPV16型L2蛋白質のアミノ酸109-117領域（VAと呼ぶ）を、L1蛋白質のアミノ酸266と267の間、アミノ酸430と433の間（431と432は失われた）、及びアミノ酸56と57の間、140と141の間、266と267の間の3カ所に挿入したキメラは、キャプシド様構造を形成する（図11及び12）。これらのキメラL1蛋白質をそれぞれ、16L1266VA、16L1430VA、及び16L156/140/266VAと呼ぶ。【００５８】
2. HPV16型L2蛋白質のアミノ酸107-122領域に相当する合成ペプチドをウサギに免疫して得た抗血清は、16L1266VA、16L1430VA、及び16L156/140/266VA で形成されるキャプシド様粒子に結合するので、これらの粒子表面にVAが提示されていることがわかった（表1）。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
3.  16L1266VA、16L1430VA、または16L156/140/266VAをマウスに免疫して得た抗血清は、16L1/L2-キャプシド、16L1-キャプシド、52L1/L2-キャプシド、52L1-キャプシド、58L1/L2-キャプシド、58L1-キャプシド及び6L1/L2-キャプシドに結合し（表2）、16L2(61-140)-GSTに結合するが16L2Δ-GSTには結合しなかった（表2及び表3）。さらに、表2の実験3の結果は、16L1-キャプシド、52L1-キャプシド、または58L1-キャプシドをマウスに免疫して得た抗血清は、各型のキャプシドと高い特異性を示した。
また、16L1430VA、または16L156/140/266VAをマウスに免疫して得た抗血清は、16L2(18)-GST、16L2(31)-GST、16L2(6)-GST、16L2(33)-GST、16L2(35)-GST、16L2(52)-GST、16L2(58)-GSTにも結合した(表3）。【００６１】
【表２】
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【００６２】
【表３】
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【００６３】
4.  16L156/140/266VAをマウスに免疫して得た抗血清は、western blottingで、16L1/L2-キャプシド、52L1/L2-キャプシド、及び6L1/L2-キャプシドに含まれるL2蛋白質と反応した（図13）。
5.  16L156/140/266VAをマウスに免疫して得た抗血清は、HPV16型の感染性偽ウイルスの感染を阻害した（図14）。【００６４】
HPVL1蛋白質の立体構造は、すでに推定されている（図15）。表面ループへの挿入を中心に複数の構造を試作し、HPV16型L1蛋白質のアミノ酸56-57、140-141、及び266-267領域へHPV16型L2蛋白質のアミノ酸109-117領域を挿入したキメラ蛋白質（16L156/140/266VA）を、組換えバキュロウイルスを利用してsf9細胞で発現させると、自律的に集合し、野生型L1-キャプシドに似た粒子を形成することを本発明者らは明らかにした（図16）。【００６５】
HPV16型L2蛋白質のアミノ酸108-120領域の配列を持つ合成ペプチドをウサギに免疫して得た抗血清は16L156/140/266VAの粒子を認識した（図17）。従って、挿入したL2蛋白質の領域が粒子表面にでており、中和活性を持つ抗体と反応できることが示された。【００６６】
16L156/140/266VA粒子をマウス（BALB/c）に免疫して得た血清は、HPV16型L2蛋白質のアミノ酸61-142領域と結合した。アミノ酸105-126領域を欠失させると結合しなくなり、抗体の結合はアミノ酸105-126領域を標的とすることがわかった（図18）。この成績は、挿入したL2領域（アミノ酸109-117）が抗原として認識されていることを示している。さらに、HPV16、52、及び6型のL1/L2-キャプシドとも反応した（図19）。HPV16型L1-キャプシドに対する抗血清は、52や6型L1/L2-キャプシドと反応しないことから、L2-エピトープに結合する抗体が52、6型L1/L2-キャプシドのL2蛋白質と結合したと考えられる。これまでの検討から、L2-エピトープに抗体が結合すると感染を阻害することが知られているので、この抗血清は、少なくともHPV16、52、6型に対して中和活性を持つと考えられる。【００６７】
実際に調べると、抗16L156/140/266VAマウス抗血清は、HPV16型感染性偽ウイルスの感染を阻害した(中和活性の測定法(1)による)（図20）。また、Pastranaらの方法(中和活性の測定法(2))を用いても、抗56/140/266VAマウス抗体は、HPV16型偽ウイルスの感染を阻害した（図21）。【００６８】
360分子のL1蛋白質によってキャプシドが形成されることから、3つのL2-エピトープを挿入した16L156/140/266VAによって形成される粒子は、3X360=1080個のL2-エピトープを持つ（図22）。粒子構造が強い免疫誘導活性を持つことと併せ、L2-エピトープを強力に抗原提示できる新たな抗原を作製した。【００６９】
考察
これまで、HPV16型L2蛋白質のアミノ酸108-120領域に結合する抗体は、HPV52型偽ウイルスとHPV11型HPVの感染阻害活性が示されていることから、L2蛋白質のこの領域に抗体が結合すれば、感染阻害が起こると考えられる。（引用文献６、７）【００７０】
16L1266VA、16L1430VA、及び16L156/140/266VAの免疫で得られた抗体は、HPV16、18，31，33，35，52，58，及び6型L2蛋白質のアミノ酸105から126領域に結合した。VA領域が16型のアミノ酸109から117領域なので、抗体はこの領域に結合するはずである。粘膜指向性HPV群のうち発がんの原因とされる高リスクHPV（16、35，31，33，35，52、33、58、51、56、18、45、39、68型）と尖型コンジローマの原因となるHPV（6、11型）のL2蛋白質の16型L2蛋白質アミノ酸109-117に相当する領域のアミノ酸配列を図9に示した。この領域のアミノ酸が、実際に抗体との結合が示されたHPV16、18，31，33，35，52，58，及び6型のアミノ酸のどれかであれば、やはり抗体が結合できると仮定すると、図9に示した全てのL2蛋白質と結合できることになる。アミノ酸配列の組み合わせによって蛋白質の構造が異なる可能性があるが、この領域がHPV感染初期化過程で細胞表面分子との結合に関わるとすれば（引用文献８）、むしろ構造は共通だと推定されるので、これらの抗体が図9に示した全てのL2蛋白質と結合する可能性は高い。
【００７１】
従って、16L1266VA、16L1430VA、及び16L156/140/266VAの免疫で得られた抗体は、少なくともHPV16型、18型、31型、33型、35型、52型、58型及び6型の感染を阻害でき、おそらく図9に示した全てのHPV型の感染も阻害できると思われる。
16L1266VA、16L1430VA、及び16L156/140/266VAは複数のHPV感染を予防するためのワクチン抗原の候補である。
【００７２】
実施例で引用した引用文献は下記の通りである。
引用文献
１）Matsumoto. K, et al. : Antibodies to human papillomavirus 16, 18, 58, and 6b major capsid proteins among Japanese females. Jpn. J. Cancer Res., 88, 369-375,1997.
２）Xiaojiang S. Chen, et al. : Structure of small virus-like particles assembled from the L1 protein of human papillomavirus 16. Mol. Cell., 5, 557-567, 2000.
３）Jean-Remy Sadeyen, et al. : Insertion of a foreign sequence on capsid surface loops of human papillomavirus type 16 virus-like particles reduces their capacity to induce neutralizing antibodies and delineates a conformational neutralizing epitope. Virology., 309, 32-40, 2003.
４）Ishii. Y, et al, : Mutational analysis of human papillomavirus type 16 major capsid protein L1: the cysteines affecting the intermolecular bonding and structure of L1-capsids. Virology., 308, 128-136, 2003
５）Kawana. K, et al. : In vitro construction of pseudovirions of human papillomavirus type 16: incorporation of plasmid DNA into reassembled L1/L2 capsids. J. Virology., 72, 10298-10300, 1998.
６）Kawana. K, et al. : Common neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6. J. Virology.,  73, 6188-6190, 1999.
７）Kawana. K, et al. : Safety and immunogenicity of a peptide containing the cross-neutralization epitope of HPV16 L2 administered nasally in healthy volunteers. Vaccine., 21: 4256-4260, 2003.
８）Kawana. Y, et al. : Human papillomavirus type 16 minor capsid protein l2 N-terminal region containing a common neutralization epitope binds to the cell surface and enters the cytoplasm. J. Virology., 75, 2331-2336, 2001.
９）Katharina Slupetzky, et al. : Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops. J. Gen.  Virology., 82, 2799-2804, 2001.
１０）Arvind Varsani, et al. : Chimeric human papillomavirus type16  (HPV-16) L1 particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16. J. Virology.,  77, 8386-8393, 2003.
【産業上の利用可能性】
【００７３】
例えば、56/140/266-VAによって形成される粒子(キャプシド)は、子宮頚癌を中心に世界の女性の悪性腫瘍の11％（45万人）の原因とされる高リスクHPVの感染を予防するワクチンとなる可能性が高い。HPVワクチンの研究者が求めている複数の高リスク型HPVの感染予防ワクチン抗原となると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ヒトパピローマウイルス(HPV)の模式図。
【図２】HPVの系統樹。
【図３】日本においてCIN病変に検出されるHPVの型。
【図４】L1-キャプシドをワクチンの臨床試験の説明図。
【図５】HPV16粒子に結合する抗HPV16 L2単クローン中和抗体の説明図。
【図６】抗L1及び抗L2の中和活性。
【図７】HPV16型L2エピトープ領域と細胞表面分子との結合についての説明図。
【図８】HPV16型L2エピトープの108-126領域の機能の予想図。
【図９】HPV の各型のL2エピトープのアミノ酸配列。
【図１０】16L1キメラ蛋白質のWestern Blottingによる検出結果。
【図１１】ショ糖密度勾配遠心による沈降度の解析結果。
【図１２】電気顕微鏡観察結果。
【図１３】抗56/140/266VA抗体と16、52、6型L2蛋白質の結合試験(Western Blotting)結果。
【図１４】抗56/140/266VA抗体の中和活性結果。
【図１５】HPVL1蛋白質の立体構造の推定図。
【図１６】56/140/266-VAの電子顕微鏡写真。
【図１７】56/140/266-VAのL2エピトープの抗HPV16L2 P108-120抗体による認識試験結果。
【図１８】56/140/266-VAをBALB/cマウスに免役して得た抗血清の反応性試験結果。
【図１９】56/140/266-VAをBALB/cマウスに免役して得た抗血清の反応性試験結果。
【図２０】56/140/266-VAマウス抗血清の中和活性結果（中和活性の測定法(1)による）。
【図２１】56/140/266-VAマウス抗血清の中和活性結果（中和活性の測定法(2)による）。
【図２２】天然のキャプシドが形成されるまでの説明図及び3つのL2-エピトープを挿入した56/140/266-VAによって形成されるL1キメラ蛋白質からキャプシドが形成されるまでの説明図。
【図２３】PCRを用いた挿入変異の作成方法の説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２２】
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【配列表】
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