(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体、または該微生物菌体の処理物を用いて、対応するニトリル化合物の水和反応により得られる生成液であるアミド化合物含有液を酸性条件下で活性炭と接触させることを特徴とするアミド化合物の精製方法。
【請求項２】
アミド化合物が炭素数２〜２０のものである、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
アミド化合物が不飽和結合を有するものである、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
アミド化合物がアクリルアミドまたはメタクリルアミドである、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
微生物菌体が、微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体であることを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項６】
活性炭との接触時のアミド化合物含有液のｐＨが３．５〜６．５である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項７】
酸解離指数３．５〜５．５の有機酸、または該有機酸と塩基を用いてアミド化合物含有液を酸性に調製することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項８】
有機酸がアクリル酸またはメタクリル酸であることを特徴とする、請求項７に記載の精製方法。
【請求項９】
活性炭が、木質またはヤシ殻を原料とした活性炭であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項１０】
活性炭との接触時の温度が１０〜５０℃である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項１１】
アミド化合物含有液を活性炭と接触させた後、活性炭を分離し、残液を飽和温度以下として結晶を析出させることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアミド化合物の精製方法に関する。より詳しくは、アミド化合物の含有液を活性炭を用いて処理することにより、効率的に純度の高いアミド化合物を得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミド化合物、特にニトリル化合物を水和して得られるアミド化合物生成液中にはその製法により種類は異なるものの、通常は高分子物質や界面活性剤、着色分、溶出物、または他の不純物等が存在する。これらを除去するために, 例えば特開昭６１−１１５４９５号公報および特開昭６１−１２２２５３号公報には活性炭による精製処理方法が、特開昭６１−１１５０５８号公報にはイオン交換膜による精製処理方法が、また特開昭６１−１２２２２７号公報には多孔質中空糸膜による精製処理方法が記載されている。
【０００３】
しかしながら、上記イオン交換膜や多孔質中空糸膜を用いた精製方法では特殊な精製装置が必要となる等、その実施において、経済性の面でのデメリットは避けられない。
また、活性炭による精製方法においては、通常は特殊な設備は必要ないものの、得られる製品中にはなお不純物が存在し、効果の点で未だ不十分である。特に、ニトリル水和能を有する酵素であるニトリルヒドラターゼ等を用いてニトリル化合物を直接水和してアミド化合物を製造する場合、上記先行技術の活性炭による精製方法では、反応液中に混入する微生物等に由来する蛋白質の除去が不十分であり、その結果、その量が微量であれば、反応液が発泡し易くなり、また多くなれば反応液が白濁することとなり、製品品質に悪影響を及ぼす。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、アミド化合物含有液中に含まれる不純物を効率的に除去する方法を提供することにある。より具体的には、本発明は、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する際に得られるアミド化合物含有液を、活性炭を用いて処理する場合の、簡便でかつ効率的な精製方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述のアミド化合物含有液の活性炭を用いた精製方法に関して鋭意検討を行なってきたところ、アミド化合物含有液を酸性条件下で活性炭と接触することにより、更には特定なｐＨの領域において活性炭と接触することにより、該アミド化合物含有液中に含まれる不純物、特に蛋白質を、極めて効率的に除去しうることを見出した。
【０００６】
特に従来の知見では、アミド化合物が不飽和結合を持つもの（例えば産業上比較的重要な化合物であるアクリルアミド、メタクリルアミド等）は、酸性領域では重合反応が起こりやすく、化合物が不安定になってしまうことが知られており、これを避けるため、アミド化合物を含む溶液はを中性に保つことが重要とされてきた。このような観点からも、上記条件下による精製処理技術は従来技術から到底予想し得ないことであった。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）アミド化合物含有液を酸性条件下で活性炭と接触させることを特徴とするアミド化合物の精製方法であり、また
（２）アミド化合物含有液が、対応するニトリル化合物の水和反応により得られる生成液である（１）に記載の精製方法であり、また
（３）アミド化合物が炭素数２〜２０のものである、（１）または（２）に記載の精製方法であり、また
（４）アミド化合物が不飽和結合を有するものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の精製方法であり、また
（５）アミド化合物がアクリルアミドまたはメタクリルアミドである、（４）に記載の精製方法であり、また
（６）アミド化合物が、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体、または該微生物菌体の処理物を用いて合成されたものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の精製方法であり、また
（７）微生物菌体が、微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体であることを特徴とする（６）に記載の精製方法であり、また
（８）活性炭との接触時のアミド化合物含有液のｐＨが３．５〜６．５である、（１）〜（７）のいずれかに記載の精製方法であり、また
（９）酸解離指数３．５〜５．５の有機酸、または該有機酸と塩基を用いてアミド化合物含有液を酸性に調製することを特徴とする、（１）〜（８）のいずれかに記載の精製方法であり、また
（１０）有機酸がアクリル酸またはメタクリル酸であることを特徴とする、（９）に記載の精製方法であり、また
（１１）活性炭が、木質またはヤシ殻を原料とした活性炭であることを特徴とする、（１）〜（１０）のいずれかに記載の精製方法であり、また
（１２）活性炭との接触時の温度が１０〜５０℃である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の精製方法であり、また
（１３）アミド化合物含有液を活性炭と接触させた後、活性炭を分離し、残液を飽和温度以下として結晶を析出させることを特徴とする、（１）〜（１２）のいずれかに記載の精製方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明におけるアミド化合物含有液は特に限定されるものではなく、具体的には炭素数が２〜２０程度のニトリル化合物を水和し、得られるアミド化合物含有生成液であるものが挙げられる。水和反応に供されるニトリル化合物としては、広い範囲のニトリル、たとえば脂肪族ニトリル、芳香族ニトリルなどが含まれる。脂肪族ニトリルとしては、炭素数２〜６の飽和または不飽和ニトリル、たとえば、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレルニトリル、イソバレロニトリル、カプロニトリルなどの脂肪族飽和モノニトリル類；マロノニトリル、サクシノニトリル、アジポニトリルなどの脂肪族飽和ジニトリル類；アクリルニトリル、メタアクリロニトリル、クロトノニトリルなどの脂肪族不飽和ニトリルなどが挙げられる。芳香族ニトリルとしては、ベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，およびｐ−クロロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，およびｐ−フルオロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，およびｐ−ニトロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，およびｐ−トルニトリル、ベンジルシアナイド等が挙げられる、特に、アクリロニトリルやメタクリロニトリル等のような、不飽和結合を持つニトリル化合物を水和することにより得られる、アクリルアミドやメタクリルアミドを含む水溶液に対して、本発明の精製方法は好適である。
【０００９】
本発明において、処理の対象とされるアミド化合物含有液に関しては、既知のいずれの水和方法により得られたものであっても構わない。すなわち、硫酸による水和法や、ラネー銅触媒等の金属銅を含む触媒による接触水和法、ニトリル化合物を水和する能力を有する酵素（ニトリルヒドラターゼ）およびこれを含有する微生物菌体、それらの酵素および微生物菌体処理物等を用いて水和したもの等、いずれであっても構わない。
【００１０】
なかでも、ニトリル化合物を水和する能力を有する酵素であるニトリルヒドラターゼ、ニトリルヒドラターゼの処理物、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体、あるいは該微生物菌体の処理物等を用いて得られるアミド化合物含有液は、本発明の精製方法に好適である。
なお、上記におけるニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力をもつ酵素をいう。
【００１１】
ここで、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物としては、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力を有するニトリルヒドラターゼを産生し、かつ３０重量％のアクリルアミド水溶液中でニトリルヒドラターゼの活性を保持している微生物であれば、特に制限されるものではない。具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム( Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物を好適な例として挙げることができる。
【００１２】
また、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も本発明でいう微生物に含まれる。なお、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている）が挙げられる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も、本発明でいう微生物に含まれる。
【００１３】
上記したような微生物を用い、アミド化合物を製造するに際しては通常、該微生物の菌体あるいは菌体処理物を用いる。菌体は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい）で生育させ、続いて、該微生物を遠心分離によって培養液より分離、回収して得る方法が挙げられる。
【００１４】
また、本発明における微生物の菌体処理物は、上記微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られれる後分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物、磨砕物、後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらがニトリルヒドラターゼの活性を有している限りは本発明の菌体処理物に相当する。
【００１５】
本発明が精製の対象とするアミド化合物において、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体、あるいはその微生物菌体の処理物を用い、ニトリル化合物を水和してアミド化合物を得る場合の反応形式は、対応するニトリル化合物を回分反応に供する方法でもよいし、連続反応であってもよい。また、反応の形式も特に限定はなく、例えば懸濁床として行なってもよいし、固定床であってもよい。この際の反応液中での触媒、例えば微生物の菌体または菌体処理物の濃度は、水性媒体とニトリル化合物の混合に支障をきたさない限り、特に制限されるものではない。
【００１６】
上記において、ニトリル化合物を反応開始時に添加する場合のニトリル化合物の濃度は、該ニトリル化合物の飽和濃度以上であればよい。一方、その濃度の上限は特に限定されるものではなく、想定する反応終了時のアミド化合物濃度およびニトリル化合物濃度により任意に決定すればよい。
【００１７】
また、未反応のニトリル化合物は、反応後に蒸留等の手段により反応液より除去することもできる。よって、想定する反応終了時のアミド化合物濃度に達した時点でもニトリル化合物が過剰となるようにニトリル化合物を添加することもできる。
具体的には、例えばニトリル化合物がアクリロニトリルである場合、水に対する本化合物の飽和濃度は２０℃で約７重量％であるので、約７重量％以上が好適である。また、メタクリロニトリルまたはクロトンニトリルがニトリル化合物である場合、水に対するこれらの化合物の飽和濃度は２０℃で約２重量％であるので、約２重量％以上が好適である。
【００１８】
上記におけるアミド化反応は通常は常圧下で行われるが、水性媒体中へのニトリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。また、反応温度は、水性媒体の凝固点以上であれば特に制限はされないが、触媒がニトリルヒドラターゼを含む場合は、好ましくは０〜５０℃、より好ましくは１０〜３０℃の範囲内で行われる。
【００１９】
また、上記におけるアミド化反応時の反応液のｐＨは、ニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限されるものではないが、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ７〜９の範囲である。
【００２０】
本発明におけるアミド化合物の精製は、アミド化合物を含有する液を酸性下に、好ましくはｐＨ２以上、より好ましくはｐＨ３．５〜６．５の範囲にて活性炭と接触させることにより行う。
【００２１】
本発明において、アミド化合物含有液を酸性とするには通常、該アミド化合物含有液に酸を添加する必要があるが、その酸の種類としてはアミド化合物の安定性に影響を与えるものでなければ広い範囲のものが使用でき、例えば硫酸や硝酸等のような鉱酸、あるいは酢酸やアクリル酸のような有機酸等が挙げられ、二種以上が用いられても構わない。これらのうちでも、本発明では、よりｐＨ調製が容易でかつ安定し、しかもより高い精製効果およびアミド化合物の安定性を得る上から弱酸の使用が効果的であり、更にはｐＨ緩衝効果をも持たせる上から、弱酸と塩基との両方を用いて上記ｐＨ範囲に調製することが、非常に好ましい。
【００２２】
好ましく用いられる弱酸としては、ｐＨ制御範囲を考慮すると、酸解離指数（ｐＫａ；２５℃、水中）が２．０〜６．０のものが好ましく、更には３．５〜５．５であるものがより好ましい。これら酸の代表的なものとしては酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、吉草酸等の脂肪族飽和モノカルボン酸、アクリル酸、クロトン酸、メタクリル酸等の脂肪族不飽和モノカルボン酸、シュウ酸、アジピン酸、コハク酸、マレイン酸等の脂肪族ポリカルボン酸、安息香酸等の芳香族カルボン酸等が挙げられる。また、上記塩基としては強塩基であるものが好ましく、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等が挙げられる。
【００２３】
また本発明において、処理の対象とするアミド化合物が、特に不飽和結合を持つようなものである場合は、精製後にそれが重合反応に供される際に、得られた重合物中に酸が残存、あるいは遊離したりする不都合を生ずることになる。このため、上記のような不飽和結合を有するアミド化合物が精製対象となる場合は、酸としては不飽和結合を有するものであってかつ、当該アミド化合物と共重合することが可能なもの、具体的にはアクリル酸やメタクリル酸、あるいはクロトン酸等を使用することが好ましい。
【００２４】
本発明において、上記酸、または上記酸と塩基の濃度は、アミド化合物含有液の性状および用いる酸のｐＫａにもよるが、酸換算でアミド化合物含有液に対し、通常１０重量ｐｐｍ〜５重量％の範囲である。
【００２５】
また、本発明では上記した酸性条件下に該アミド化合物含有液を活性炭と接触させるが、活性炭と接触している際にアミド化合物含有液が酸性となっている、あるいは酸性とする形態であれば特に限定はなく、活性炭の添加と同時にアミド化合物含有液を酸性下に調製する方法であっても何ら構わない。
【００２６】
本発明で使用する活性炭については特に限定はなく、粉状および粒状のいずれであっても使用することができる。また、精製処理を行う装置においても、用いる活性炭の粒度に適したものを用いればよい。例えば粉状活性炭を用いる場合は、液の攪拌が可能な槽において、回分式および連続式のいずれでも実施することができる。また、粒状活性炭を用いるような場合は、上記形式の他に、充填塔形式による連続処理も可能である。
【００２７】
また、活性炭には一般的には、原料として石炭、木、およびヤシ殻等を用いたもの等があるが、吸着能を有するものであれば特段の限定はなく、いずれのものであっても使用することが可能である。
しかしながら、処理の対象とするアミド化合物が特に不飽和結合を有するものである場合は、該アミド化合物の保存安定性や重合し易さ等を考慮すると、活性炭としては金属分含有量の少ないものを使用することが好ましく、原料が木質のもの、またはヤシ殻のものを使用することがより好ましい。
【００２８】
本発明において、アミド化合物を精製処理する際に使用する活性炭量は、あまり少ない場合は十分な精製効果を得ることが困難であり、またあまり多く使用しても不経済となることから、その使用量としてはアミド化合物含有液に対して、通常０．０１〜２０重量％の範囲、より好ましくは０．０５〜１０重量％の範囲である。
また、活性炭として特に粉状のものを用いる場合、該活性炭はアミド化合物含有液中にそのまま直接添加してもよく、または一旦、活性炭を水等の媒体中に分散させ、スラリー状としたものをアミド化合物含有液に添加、あるいは供給するようにしてもよい。
【００２９】
本発明において、活性炭によりアミド化合物含有液を精製処理する際の温度は、アミド化合物の結晶が析出せずに、かつその安定性に影響のない範囲であれば特に制限はないが、通常は０〜８０℃の範囲で行われる。特にアクリルアミドやメタクリルアミド含有液のような、不飽和結合を有するアミド化合物含有液を精製処理する場合は、重合反応生起によるゲル化を防止するために６０℃以下、更には１０〜５０℃の範囲にて、活性炭と接触させることが好ましい。また、活性炭との接触処理に要する時間は、処理形式や活性炭の量にもよるが、通常は０．５〜２０時間の範囲である。
【００３０】
次いで、本発明では上記接触処理したアミド化合物含有液から活性炭を分離し、該アミド化合物含有液の精製液を得る。活性炭を分離する方法としては、一般に用いられる固液分離装置を用いる方法であれば特に限定はなく、例えば加圧濾過器、減圧濾過器、または遠心分離器等があげられ、更には回分式および連続式のいずれであっても構わない。
また、本発明においては上記活性炭を分離した後のアミド化合物含有液を冷却し、液中より目的のアミド化合物を晶析させるという方法を採用することにより、更なる精製されたアミド化合物を得ることも可能である。
【００３１】
また、本実施例ではニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得を部位特異的な変異によって行っている。しかし、実施例においてい開示される変異点と置換される塩基の種類に基づいて、部位特異的な変異以外の方法で組替えプラスミドを構築し、それを宿主細胞に導入しても、本実施例と同様の結果を得ることが可能である。
例えば、実施例において開示される変異点に相当する領域のＤＮＡの塩基配列がアミノ酸置換後の配列となるような塩基配列を有するＤＮＡフラグメントをＤＮＡシンセサイザー等で合成し、得られたフラグメントと別途分離しておいたｐＰＴ−ＤＢ１の該フラグメントに相当する領域とを置換することにより、目的とする組替えプラスミドを取得することができる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。
以下において、反応液のＨＰＬＣ分析は、カラムとしてＵＬＴＲＯＮ  ８０ＨＧ（５０×８φｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として行い、アクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出する。また、本発明の効果を確認するために、得られたアミド化合物含有液中に含まれるタンパク質を分析した。タンパク質濃度は、アミド化合物含有液に含まれるアミド化合物を半透膜により透析除去した後、バイオラット社製タンパク質分析キットを用いて定量し、タンパク質除去率を求めた。
【００３３】
実施例１
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃、２０分間、オートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５）を一白菌耳植菌し、３７℃、１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
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【００３４】
上記で得られた湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの０．３ｍＭ-ＮａＯＨ水溶液に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを３６ｇを一括添加して、１０℃にて攪拌を行いながら反応した。反応開始から２４時間後にＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝３５重量％）しており、アクリロニトリルは認められなかった。この反応液のｐＨは８．０であった。
この反応液を、１０％硫酸水溶液でｐＨ５に調整し、反応液に対し２重量％の活性炭（三倉化成（株）製  粉末活性炭ＰＭ−ＳＸ）を添加し、２５℃で５時間攪拌を行ったあと、濾紙にて濾過を行った。得られた濾液中のタンパク質濃度を測定したところ除去率９９％以上であった。また、この濾液液１０ｍｌにメタノール１００ｍｌを加えても白濁せず、重合物は全く認められなかった。
【００３５】
実施例２
実施例１で得られた反応液に対し、１０％アクリル酸水溶液でｐＨを５に調整した以外は、実施例１と同様の処理を行い濾液を得た。濾液中のタンパク質濃度を測定したところ除去率９９％以上であった。また、この濾液１０ｍｌにメタノール１００ｍｌを加えても白濁せず、重合物は全く認められなかった。
【００３６】
実施例３
ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得
αサブユニットの６番目のＬｅｕをＭｅｔに置換するために、特開平９−２７５９７８で得られたｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を用いた部位特異的な変異導入を行った。以後、「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を単にキットと呼ぶ。以下の実施例では、基本的にキットの原理および操作方法を踏襲した。
【００３７】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例１と同様にＭＴ−１０８２２株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００３８】
ｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマーおよびｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μｌの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μｌずつ含む全量４７．５μｌのアニーリング溶液（組成はキットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。アニーリング処理液にＴＡＫＡＲＡＬＡ  Ｔａｑを０．５μｌ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μｌとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、アガロースゲルから約２．０ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対して常法に従ってフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。精製した約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。同様に、ｐＰＴ−ＤＢ１上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIIIによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだ��たアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物とｐＰＴ−ＤＢ１断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、大腸菌バンクを調製した。
【００３９】
３０ｍｌの試験管に４０μｇ／ｍｌの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コバルト・二水和物を含む１０ｍｌのＬＢ液体培地（以後、活性発現培地と呼ぶ）を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンを各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。該菌体を２００μｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、これに１重量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で２分間反応させた。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を実施例２と同様のＨＰＬＣ分析により測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。
【００４０】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたプライマーエクステンション法により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１（表１）に示したクローンＮｏ．１においてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに置換されていた。
【００４１】
【表１】
0004959059.tif 000003
【００４２】
続いて、 αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒに置換するために、クローンＮｏ．１のプラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
すなわち、３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、得られたクローンＮｏ．１株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００４３】
このクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．４は、配列表の配列番号５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．５は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．４と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．４およびＮｏ．５の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。
【００４４】
該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。
【００４５】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２（表２）に示したクローンＮｏ．２においてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【００４６】
【表２】
0004959059.tif 000004
【００４７】
続いて、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒに置換するために、クローンＮｏ．２のプラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
すなわち、３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、得られたクローンＮｏ．２株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００４８】
このクローンＮｏ．２のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．６は、配列表の配列番号６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．７は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．６と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．６およびＮｏ．７の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。
【００４９】
該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。
【００５０】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３（表３）に示したクローンＮｏ．３においてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒに置換されていた。
【００５１】
【表３】
0004959059.tif 000005
【００５２】
このクローンＮＯ．３の菌体を実施例１と同様に培養し、反応に必要な菌体を得た。
更に、得られた湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの０．３ｍＭ-ＮａＯＨ水溶液に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを６０ｇ一括添加して、１０℃にて攪拌を行いながら反応した。反応開始から２４時間後にＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝５０重量％）しており、アクリロニトリルは認められなかった。この反応液のｐＨは８．０であった。
この反応液を、１０％硫酸水溶液でｐＨ５に調整し、反応液に対し２重量％の活性炭（三倉化成（株）製  粉末活性炭ＰＭ−ＳＸ）を添加し、２５℃で５時間攪拌を行ったあと、濾紙にて濾過を行った。得られた濾液中のタンパク質除去率を測定したところ、除去率９９％以上であった。また、この濾液１０ｍｌにメタノール１００ｍｌを加えても白濁せず、重合物は全く認められなかった。
【００５３】
実施例４
実施例３で得られた水和反応液に対し、１０％硫酸水溶液でｐＨを３に調整した以外は、実施例１と同様の処理を行い濾液を得た。濾液中のタンパク質除去率を測定したところ除去率７５％であった。また、この濾液１０ｍｌにメタノール１００ｍｌを加えても白濁せず、重合物は全く認められなかった。
【００５４】
比較例１
実施例３で得られた水和反応液に対し、１０％硫酸水溶液でｐＨを７に調整した以外は、実施例１と同様の処理を行い濾液を得た。濾液中のタンパク質除去率を測定したところ除去率２５％であった。
【００５５】
【発明の効果】
以上の説明、特に上記実施例および比較例の結果からも明らかなように、本発明の方法によれば、従来の活性炭による精製方法に比べ、酸性下で活性炭と接触させることにより、遙かに効果的にアミド化合物の精製を行うことができる。特に、本発明の方法により精製されたアクリルアミドを重合したとき、高分子量で、保存安定性に優れ、また、高い水溶性を有するポリアクリルアミドを得ることができる。
【００５６】
【配列表】
＜１１０＞Ｍｉｔｓｕｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．＜１２０＞Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ａｍｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ＜１３０＞３１００００７８＜１５０＞ＪＰ  Ｐ２０００−００７９９３＜１５１＞２０００−１−１７＜１６０＞６＜２１０＞１＜２１１＞１８＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞１aacatcatgc gcaagtcg 18＜２１０＞２＜２１１＞１７＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞２caggaaacag ctatgac 17＜２１０＞３＜２１１＞２０＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞３ggccagtgcc tagcttacat 20＜２１０＞４＜２１１＞１７＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞４gttttcccag tcacgac 17＜２１０＞５＜２１１＞１８＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞５aactggtaca aggagccg 18＜２１０＞６＜２１１＞１８＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞６ccgaactaca gcgtctac 18