(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニンγ−リアーゼおよびセレノメチオニンを含む腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
前記リアーゼが、ピー.プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）から単離され得る、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記リアーゼが、タンパク質の形態で提供される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記リアーゼが、該リアーゼのための発現系を含む核酸分子である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記核酸分子が、ウイルスベクターである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
さらに、化学治療剤を含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記化学治療剤が、ＢＣＮＵである、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の交互参照）
本出願は、１９９９年５月１１日に出願された仮出願６０／１３３，６７８に基づく優先権を主張する。この出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞を阻害または破壊するための、リアーゼとセレン含有リアーゼ基質との組合せの使用に関する。より詳細には、本発明は、比較的非毒性の基質から毒性セレン体を生成することができる酵素を、その基質と組み合わせて、提供することに関する。例示的な組合せは、メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）と組合せた、セレノメチオニンである。酵素は、直接供給され得、またはインサイチュで組換え的に産生され得る。
【０００３】
（背景技術）
セレンは、代謝に不可欠の要素であるが、誤った形態および不適切な量では、細胞傷害性である。これは、制癌性の特性の範囲で、有利であり得る。Ｓｐａｌｌｈｏｌｚ，Ｊ．Ｅ．は、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９４）１７：４５−６４において公開された概説記事において、毒性セレン種が代謝セレン化物ＲＳｅ-アニオンであることを提唱している。このアニオンは、この提唱によれば、チオール転移（ｔｒａｎｓｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）反応に関与し得、そしてスーパーオキシド、過酸化水素、そしておそらくは他のカスケード反応のオキシラジカルを生成し得る。同じグループの、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｍ．Ｊ．らによる後の論文、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９９）２６：４２−４８において、触媒的亜セレン酸塩、セレノシスチン、およびセレノシスタミンは、アポトーシスを誘導し、そしてケラチノサイトにおいて細胞毒性であるが、セレノメチオニンは細胞毒性ではなく、そして実験された濃度において細胞のアポトーシスを誘導しなかったことが報告された。セレノメチオニンはまた、癌の化学保護剤として作用することが、Ｉｐら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９０）５０：１２０６−１２１１；Ｅｌ−Ｂａｙｏｕｍｙ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９２）５２：２４０２−２４０７によって示されている。げっ歯類における発癌を阻害することを示すセレン化合物が、Ｙａｎ，Ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．（１９９３）４５：４２９−４３７によって報告されている。明らかに、有機セレン化合物の二セレン化物形態（例えば、セレノシスチンおよびセレノシスタミン）は、毒性体ＲＳｅ-に転換され得る。しかし、哺乳動物細胞は、一セレン化物形態を、容易には、毒性部分に転換しない。それゆえ、セレノメチオニン、セレノホモシステイン（ｓｅｌｅｎｏｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）およびセレノシスチン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）は、比較的、非毒性かつ非制癌性である。セレノジチオールは、米国特許第５，１０４，８５２号に記載されているように、癌細胞の増殖を阻害するために用いられており、そしてセレニウム化合物は、米国特許第４，５１２，９７７号に記載されているように、十分低濃度で（さもなければ毒性である）治療的に用いられている。標的細胞がプロドラッグを毒性体に転換する手段を備えている場合に、非毒性体のセレンをプロドラッグとして用いる工程を包含する、腫瘍の処置のための特に有効なプロトコルが現在見出されている。プロドラッグそれ自体は、十分に高いレベルでは細胞毒性であり得る。Ｋａｊａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｏ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９０）２６７：７６７−７７４。しかし、これらのレベルは、細胞中で容易にＲＳｅ-を生成し得る化合物の細胞毒性について必要とされるレベルよりも、数オーダー高いレベルである。
【０００４】
（発明の開示）
本発明は、メチオニナーゼのようなＲＳｅ-産生酵素および、そのセレン含有基質、例えば、セレノメチオニンとの組合せによって、癌細胞を選択的に死滅させるための、プロトコルおよび処方に関する。本方法は、種々の癌を処置するための化学療法レジメンで用いられ得る。セレン含有プロドラッグおよび／またはメチオニナーゼはまた、特定の癌細胞型または腫瘍部位に対し、選択的に標的化され得る。メチオニナーゼは、癌細胞によるかまたは他の標的宿主細胞によって発現可能な、酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸として投与され得る。メチオニナーゼおよびセレン含有プロドラッグはまた、可能であれば、または所望であれば、腫瘍部位に直接投与され得る。このプロトコルは、細胞死、または細胞増殖の遅延を引き起こす。
【０００５】
セレン含有プロドラッグは、セレノメチオニンおよび関連の化合物を含む。プロドラッグは、リアーゼによってＣ−Ｓｅ結合で切断されて、活性セレン化物部分を放出する。この部分は、メチルセロニド、または式ＲＳｅ-の関連化合物であると考えられ、ここでＲはヒドロカルビルまたはＨである。
【０００６】
投与される酵素は、セレン含有プロドラッグのリアーゼとして働くものである。セレン含有プロドラッグがセレノメチオニンである場合、メチオニナーゼが適切な選択である。
【０００７】
メチオニナーゼは、組換えで産生され得、あるいは天然の供給源から精製され得る。例えば、米国特許第５，６９０，９２９号を参照のこと。メチオニナーゼの産生のための発現系またはカセットは、所望であれば、酵素の代わりに、あるいは酵素と共に用いられ得る。ベクターは、酵素の選択的発現を可能とし、酵素は、選択された部位または所望の部位に酵素を局在化させる。さらに、メチオニナーゼは、標的化分子、例えば、癌細胞を認識する抗体と複合化され得る。例えば、米国特許第５，０５７，３１３号を参照のこと。セレン含有プロドラッグは、同様に、標的化され得る。それゆえ、１つの局面において、本発明は、腫瘍細胞増殖を阻害する方法に関し、この方法は、上記腫瘍細胞を、この腫瘍細胞増殖を阻害するに十分な量の、セレン含有プロドラッグ、およびこのプロドラッグからセレンの毒性体を遊離する酵素と接触させる工程を包含する。好ましい実施形態において、酵素は、α，γ−リアーゼまたはα，β−リアーゼであり、そしてセレン含有プロドラッグは対応の硫黄含有アミノ酸または対応のアミンである。１つの好ましい実施態様において、リアーゼは、標的とされる腫瘍細胞へ、あるいはこれに隣接する細胞中に、該細胞またはその近隣に適切な発現系を提供することによって、これを内部で産生することにより、供給される。
【０００８】
（発明の実施の形態）
セレンベースの化合物の毒性は、化合物の性質に大きく依存することが理解される。一般式ＲＳｅ-のセレンアニオン（ここでＲは、Ｈまたはヒドロカルビル置換基である）を生成し得る特定のセレン化合物は、非常に毒性である。この毒性部分を生成し得ることが知られているセレンの形態は、無機部分であるセレナイト、および有機二セレン化物化合物（例えば、セレノシスタミンおよびセレノシスチン）を含む。しかし、他の化合物、特に硫黄含有アミノ酸ホモシステイン、システインおよびメチオニンおよびそれらの対応のジカルボキシル化形態のセレン化形態は、哺乳類細胞中でセレンの毒性体を生成しない。
【０００９】
しかし、これらの基質を溶解してセレンの毒性体を生成し得る、非哺乳動物供給源から誘導可能な、多くの酵素がある。これらの酵素としては、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ由来のＬ−メチオニンγ−リアーゼ（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｔ．ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）４８：２３６７−２３６９）（これは、メチオニン、エチオニン、ホモシステインおよびアセチルＬ−ホモセリンを基質として利用する）；Ｎａｋａｙａｍａ，Ｔ．ら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）１３８：４２１−４２４に記載の、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のメチオニンγ−リアーゼ（これは、同様の基質スペクトルを有する）；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｖａｌｉｓ由来の、Ｌ−メチオニンγ−リアーゼ（Ｔａｎａｋａ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７７）１６：１００−１０６）が挙げられる。これらの酵素（ＥＣ４．４．１．１１）の詳細な説明は、Ｅｓａｋｉ，Ｎ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１４３：４５９−４６５の論文に見出される。この酵素自体の抗腫瘍活性は、Ｔａｎａｋａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）２：４３９−４４４によって記載されており、そしてＰ．ｐｕｔｉｄａ酵素、ならびに他の対応の酵素をコードする遺伝子がクローニングされている。Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５）１１７：１１２０−１１２５を参照のこと。ＰＣＴ公開ＷＯ  ９９／０５３１１および米国特許第５，８６１，１５４号および５，８６３，７８８号もまた参照のこと。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ由来のメチオニンγ−リアーゼがメチオニン中のメチルチオ部分の置換を触媒して対応のセレン含有形態を得る能力もまた、Ｅｓａｋｉ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８：４０７−４１１に開示されている。この論文に記載されている結果に基づけば、メチル基が、アルキル置換基、あるいはフェニルまたはベンジル置換基によってさえ、置き換えられている、メチオニン以外のアミノ酸が、この酵素の適切な基質であると思われる。
【００１０】
従って、セレン含有プロドラッグは、ＲＳｅ-（ここでＲはＨまたはヒドロカルビル、典型的には、アルキル、フェニルまたはベンジルである）と考えられるセレンの毒性体を生成する、適切な酵素に対する基質として挙動し得る、任意のセレン含有化合物であり得る。この群の性質は、酵素の特異性にのみ依存する。酵素は、典型的には、上記タイプのリアーゼである。しかし、セレン含有プロドラッグを解離して、毒性セレン形態を生成する任意の酵素が、本発明の方法において使用可能である。このような酵素は、本明細書において、「セレンプロドラッグリアーゼ」といわれる。
【００１１】
セレンプロドラッグリアーゼは、タンパク質として供給されてもよく、または、細胞内またはインサイチュで、酵素の発現系を供給することによって生成されてもよい。酵素自体が投与される場合、このようなタンパク質の投与方法は、当該分野で一般的に公知である。例えば、特にメチオニナーゼを、化学療法の情況で投与する方法は、米国特許第５，６９０，９２９号に述べられており、この内容は、本明細書中に参考として援用される。タンパク質は、一般に、注射、代表的には静脈内注射によって、あるいは膜透過投与、例えば、鼻内または坐剤を用いて、投与され得る。他の投与様式もまた可能であり、これには経口投与が含まれるが、ただし、加水分解からの適切な保護が処方中に含まれる。このような方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに記載のように、一般に当該分野で公知である。タンパク質は、それ自体で投与されてもよく、あるいは、タンパク質を腫瘍細胞に特異的に向けるターゲッティング剤を含んでもよい。このようなターゲッティング剤は、例えば、抗体またはその免疫学的に反応性のフラグメント（一本鎖抗体を含む）を含み得、これらは腫瘍細胞に関連する抗原、あるいは腫瘍が存在する器官上に現れる抗原（例えば、前立腺癌の場合、前立腺特異的抗原）に対して免疫特異的である。さらに、ターゲッティング剤は、腫瘍に関連する細胞に特徴的なレセプターに対するリガンドを含み得る。このようなターゲッティング剤に対するカップリングもまた従来通りであり、標準的な結合技術を含み、必要に応じて、市販のリンカー（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）から入手可能なもの、を利用する。
【００１２】
セレンプロドラッグリアーゼが細胞内またはインサイチュで生成される場合、この酵素をコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸分子が投与される。投与の適切な様式としては、当業者に理解されるように、注射、膜透過または経皮の輸送を増強する薬剤を含む処方での局所投与、または腫瘍細胞の位置および処方の性質に合致した他の任意の適切かつ都合のよい方法が挙げられる。特に好ましい投与様式の１つは、腫瘍への局所投与である。すなわち、核酸分子が、直接、腫瘍組織あるいは腫瘍が存在する部位に投与され得る。本発明の処方は、プロドラッグおよび酵素を含む細胞への細胞毒性効果のみならず、近隣の細胞に対するバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）効果をも提供し得ることから、腫瘍の位置への直接投与は、しばしば、満足すべき結果をもたらす。核酸分子は、代表的にはベクターであり、最も一般的にはウイルスベクターであるが、裸のＤＮＡは、いくつかの例において使用され得る。ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり得、これは急速に増殖する細胞において優先的に複製され、従ってベクターに腫瘍細胞への特異性を与え、あるいは、アデノウイルスベクターまたは他の従来のベクターベースの分子を含み得る。この場合の特異性は、局在化した投与によって、および／または酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を、腫瘍組織中で選択的に作動可能なプロモーターの制御下に置くことにより、与えられ得る。以下の表１は、関連する腫瘍に対して特異的なプロモーターを含む、腫瘍関連ウイルスおよびオンコジーンのリストを示す。これらの遺伝子およびウイルスに関連するプロモーターは、適切な腫瘍における発現を選択的に指向するために用いられ得る。
【００１３】
【表１】
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0005072142.tif 000003
適切なウイルスベクター構築物は、当該分野で公知のものである。例えば、パルボウイルス（米国特許第５，２５２，４７９号および同第５，６２４，８２０号）、サル（ｓｉｍｉａｎ）ウイルス５（ＳＶ５）のようなパラミクソウイルス（米国特許第５，９６２，２７４号）、ＨＩＶのようなレトロウイルス（米国特許第５，７５３，４９９号および同第５，８８８，７６７号）、および核多角体病ウイルスのようなバキュロウイルス（米国特許第５，６７４，７４７号）由来のベクターが用いられ得る。アデノウイルス由来のベクターは広く研究されている（米国特許第５，６７０，４８８号、同第５，８１７，４９２号、同第５，８２０，８６８号、同第５，８５６，１５２号、および同第５，９８１，２２５号、全て本明細書中に参考として援用される）。
【００１４】
核酸分子は、注射によって、遺伝子銃技術によって、あるいは脂質媒介送達技術によって、宿主動物の組織に直接送達され得る。注射は、ニードルまたは他の注射デバイスを通じて行われ得る。遺伝子銃技術は、米国特許第５，３０２，５０９号に開示され、そして脂質媒介送達技術は、米国特許第５，７０３，０５５号に開示されている。
【００１５】
更に他の実施形態において、核酸分子は、エキソビボで宿主動物の細胞に送達され、そして次に、この細胞が、宿主動物の適切な組織に、好ましくは注射または静脈点滴を通じて送達される。
【００１６】
エキソビボ形質導入および動物の全身投与のための一般的な方法としては、Ｃａ3（ＰＯ4）2−ＤＮＡトランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第2版、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、ＤＥＡＥデキストラン−ＤＮＡトランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第2版、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、エレクトロポレーション（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄのプロトコル）、「ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ」TM試薬（例えば、ＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅのプロトコル）、遺伝子銃技術（米国特許第５，３０２，５０９号）、またはウイルス遺伝子送達系（Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９５）が挙げられる。
【００１７】
プロドラッグおよびセレンプロドラッグリアーゼは同時に送達され得るが、酵素を最初に供給し、次いでセレン含有プロドラッグを投与することが好ましい。これは、細胞を、セレンの毒性体を生成するように予め調整するためである。少なくとも、処置される腫瘍は、毒性応答を誘導するために、リアーゼおよびプロドラッグの両方に対して近位でなければならない。
【００１８】
セレン含有プロドラッグおよびプロドラッグリアーゼに加えて、化学治療剤もまた、適切な治療プロトコルにおいて使用され得る。５−ＦＵ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ＢＣＮＵ、メトトレキサートおよび他の薬物のような薬剤が、本発明のプロトコルと共に使用され得る。これらの薬物の効力は、リアーゼおよびプロドラッグによって増強される。
【００１９】
処置される腫瘍は、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、膵臓癌、肝臓癌などのような固形腫瘍を含むか、あるいは、リンパ腫または他の白血病、あるいは固形腫瘍の転移物であり得る。ベクターおよび発現のための制御配列の両方の観点からの適切な発現系の選択は、標的とされる腫瘍の性質に依存する。酵素をコードするヌクレオチド配列はまた、酵素の直接投与の場合、標的特異性を与える融合アミノ酸配列と共に提供され得る。
【００２０】
以下の実施例は例示を意図し、本発明の限定を意図しない。
【００２１】
（実施例１）
（メチオニナーゼ産生ベクターの構築）
図１は、腫瘍細胞のウイルス感染、およびＰ．ｐｕｔｉｄａ由来のメチオニナーゼの発現を提供するために構築される、ベクターの概略図である。酵素をコードするヌクレオチド配列を、ＣＭＶ−５プロモーターおよびエンハンサー制御下に置く。骨格ベクターは市販されている。得られるベクターを、標準的な技法に従って、アデノウイルス中で増殖させる。
【００２２】
ベクターを調製するために、Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９５）１１７：１１２０−１１２５に記載のように、Ｐ．ｐｕｔｉｄａからクローニングされたメチオニナーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅し、そして１．２ｋｂの遺伝子を、移入ベクターｐＱＢＩ−Ａｄ  ＣＭＶ  ５ＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａから入手）中のＣＭＶ−５プロモーターの下流のＢｇｌＩＩ／ＰｍｅＩ部位にライゲートした。得られたベクターを図１に示す。ベクターを、リン酸カルシウム法を用いて、ＣｌａＩ（Ｑｕａｎｔｕｍ）で切断したＡｄ  ＣＭＶ  Ｌａｃ  ＺΔＥ１／Δ３ウイルスＤＮＡと共に、２９３Ａ細胞（Ｑｕａｎｔｕｍ）中に同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を１．２５％Ｓｅａ  Ｐｌａｑｕｅアガロース（（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）で被覆し、そして３７℃で１４−２１日間、インキュベートした。
【００２３】
初代プラークを単離し、そしてこれを用いて２９３Ａ細胞に感染させて、初代粗ウイルス溶解物を生成した。ウイルス溶解物中のメチオニナーゼ遺伝子発現は、酵素的アッセイによって確認された。二次プラーク精製の後、単一のプラークを２９３Ａ細胞中で増幅した。Ａｄ  ＣＭＶ  ５ＧＦＰ  ΔＥ１／ΔＥ３をコントロールベクター（−ｒＡＤ）として用いて、Ｑｕａｎｔｕｍから購入した。コントロールｒＡｄは２９３Ａ細胞中で増殖し、そして塩化セシウム遠心分離と、それに続くＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５での分画によって精製した。上記のｒＡＤ−ＭＥＴの構築は、Ｍｉｋｉ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（印刷中）で報告されており、本明細書中に参考として援用される。
【００２４】
（実施例２）
（セレノメチオニン存在下での、種々の腫瘍細胞株に対する、変化させたメチオニナーゼの影響）
種々の腫瘍系の細胞（４×１０3）を９６ウェルプレートに接種した。２４時間後、メチオニナーゼ発現ベクター（ｒＡｄ−ＭＥＴ）、またはメチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列を含まないコントロールベクター（ｒＡＤ）の系列希釈物を、２０μＭのセレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）（２０μＭ）と共に、あるいは無しで、ウェルに加えた。プレートを３日間インキュベートした後、培地を０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴで２時間置換し、そしてマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、標準的なＭＴＴアッセイで分析した。結果を、生存細胞の割合として記録した。
【００２５】
試験された細胞株は、ヒト癌系ＯＶＣＡＲ−８（卵巣癌）、Ａ５４９およびＥＫＶＸ（肺癌）、Ｈｅｐ−２（頭部および頸部癌）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２およびＢｘＰＣ−３（膵臓癌）、ヒト横紋筋肉腫細胞株Ａ２０４およびヒト前立腺細胞株ＰＣ−３であった。ＯＶＣＡＲ−８細胞株および細胞株Ａ２０４、およびＰＣ−３に関しての結果を、図２、３および４にＸ／Ｙグラフで示した。図５は、Ａ５４９細胞株に関する結果の棒グラフである。各ケースにおいて、ＳｅＭｅｔは、ｒＡｄ−ＭＥＴベクターについてのＩＣ50を劇的に低下させた。結果をさらに表１にまとめる。
【００２６】
【表２】
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この表からわかるように、ＳｅＭｅｔの存在下でのＩＣ50値は、非存在下に比べて、全ての細胞株について、約２オーダー低い。ｒＡＤ−ＭＥＴは、予想されるように、ＳｅＭｅｔ非存在下でさえも、いくらかの効果を有する。
【００２７】
（実施例３）
（メチオニナーゼ存在下での変化させたＳｅＭｅｔの影響）
細胞株を、種々の濃度のＳｅＭｅｔに対するその応答についてもまた、評価した。これらのプロトコルにおいて、細胞を上記のように９６ウェルプレートに接種し、そして４×１０5ｐｆｕのｒＡＤ−ＭＥＴまたはコントロールｒＡｄで感染させた。２４時間後、ＳｅＭｅｔの系列希釈物を加え、そして３日後、細胞毒性を、実施例２で記載したように、ＭＴＴアッセイで評価した。結果をＯＶＣＡＲ−８細胞について図６に示す。これからわかるように、ＳｅＭｅｔについてのＩＣ50は、ｒＡｄ−ＭＥＴの存在下で、コントロールｒＡＤと比べて、千倍低い。多数の細胞株についてのＩＣ50値の要約を表２に示す。
【００２８】
【表３】
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事実上、全ての細胞株は、ｒＡｄ−ＭＥＴの存在下で、ＳｅＭｅｔのＩＣ50の劇的な低下を示した。
【００２９】
（実施例４）
（Ａ５４９細胞に対する、ｒＡＤ−ＭＥＴおよびＳｅＭｅｔの組み合わせのバリエーション）
実施例２および３で記載した実験を、Ａ５４９ヒト肺癌細胞に対して、０〜４０μＭで変化させたＳｅＭｅｔの濃度と、０〜８×１０5ｐｆｕで変化させたウイルスｒＡｄ−ＭＥＴ力価とを用い、ｒＡｄをコントロールとして用いて、行った。生存細胞の割合を、再度、効力の指標として用いた。
【００３０】
図７に示すように、コントロールベクターを使用した場合、ウイルス力価は、実質的に結果と関係がない。セレノメチオニン自体は２０〜４０μＭでわずかに毒性を示した。
【００３１】
しかし、図８に示されるように、ｒＡＤ−ＭＥＴを提供すると、ウイルス力価が５，０００ｐｆｕでさえも、２０〜４０μＭのＳｅＭｅｔは生存率を劇的に低下させる。ウイルス力価が４×１０5のとき、２．５μＭのＳｅＭｅｔでさえ、細胞のわずか５０％しか生き延びないような毒性を与える。８×１０5ｐｆｕでは、ベクター単独で十分に細胞毒性であるが、ＳｅＭｅｔの濃度が５μＭまたはそれ以上では実質的に生き延びる細胞はなかった。
【００３２】
（実施例５）
（バイスタンダー効果）
ｒＡｄ−ＭＥＴまたはコントロールｒＡｄ（ＭＯＩ  ５０）で形質導入されたＡ５４９ヒト肺癌細胞を、２０μＭのＳｅＭｅｔの存在下、種々の比率で、非形質導入細胞と混合した。細胞毒性を、上記のＭＴＴアッセイで３日後に分析した。図９は、感染細胞の割合の関数として結果を示す。
【００３３】
図示されるように、ｒＡｄで形質導入された細胞は、ＳｅＭｅｔの非存在下、あるいはＳｅＭｅｔの存在下のいずれでも、そしてｒＡｄ−ＭＥＴで形質導入した細胞は、ＳｅＭｅｔの非存在下で、バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）細胞を死滅させる能力を示さなかった。他方、ｒＡｄ−ＭＥＴで形質導入された細胞は、培養中に１％という低い比率で存在している場合でさえ、ＳｅＭｅｔの存在下でバイスタンダー細胞を有意に破壊した。培養中に３．１％存在すると、これらは非形質転換細胞の８０％を死滅させた。
【００３４】
（実施例６）
（アポトーシスの確認）
Ａ５４９細胞（１×１０6）をｒＡＤ−ＭＥＴ（ＭＯＩ  ２０）で形質導入した。２４時間後、２０μＭのＳｅＭｅｔを加えた。種々の時間において、細胞を採集し、そして７０％エタノールで固定し、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで染色した。染色された細胞のＤＮＡ含量をＦＡＣＳで評価した。図１０に示すように、ＳｅＭｅｔへの曝露の１２時間後に、Ｇ0集団において蛍光標識の増加が観察された。このことは、アポトーシス細胞の存在を示す。これらの細胞の割合は、ＳｅＭｅｔへの２４時間曝露後に増加した。アポトーシス効果を、６、１２、２４時間後に抽出したＤＮＡを電気泳動することによって確認した。電気泳動の結果、ヌクレオソームＤＮＡの断片化が示され、この結果が確認された。これはまた、ｒＡｄ−ＭＥＴで感染した細胞の細胞質ゾル中へはチトクロムＣの放出が示され、ｒＡｄで感染した細胞では示されないことからも、確認される。
【００３５】
（実施例７）
（ＲＯＳ生成）
セレンの細胞毒性は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成によって仲介されると考えられる。これは、上で引用したＹａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９３）４５：４２９−４３７によって記載されているような、ルシゲニン依存性化学発光を用いる標準的手法によって測定され得る。
【００３６】
Ａ５４９細胞を、測定の２４時間前にｒＡｄ−ＭＥＴでＭＯＩ５０で形質導入した。細胞（１×１０6）を、１ｍｌのＲＰＭＩ中で、ＳｅＭｅｔの存在下、１０単位のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）有りまたは無しで、３０分間インキュベートした。測定の直前に、ルシゲニン（５０μｇ）を細胞懸濁液に加え、そして積分化学発光を、１０秒間で３回、ＴＤ２１ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）を用いて測定した。化学発光レベルはＳｅＭｅｔ濃度に依存し、そしてＳＯＤによって阻害された。図１１に示すように、１６０μＭのＳＭｅｔの存在下での化学発光は、コントロールおよびＳＯＤで阻害されたものより、１００倍上回った。４０μＭでは、これはコントロールおよびＳＯＤで阻害されたものの２０倍であった。
【００３７】
高レベルの酸化は、また、ＧＳＨ含量の測定によっても、確認できる。細胞（２×１０6）を、２０μＭのＳｅＭｅｔでの処理の２４時間前に、ｒＡｄ−ＭＥＴまたはコントロールｒＡＤでＭＯＩ２０で感染させた。この細胞を次に溶解し、そして次に０．０５％のｏ−フタルアルデヒドと共に１５分間インキュベートし、そして３５０ｎｍの励起と４２０ｎｍの発光を用いて、ＧＳＨ含量をフルオロメトリーで測定した。コントロールｒＡｄで形質導入された細胞中のグルタチオン含量は２４時間にわたって実質的に一定に保たれていたが、ｒＡｄ−ＭＥＴで形質導入された細胞は、０時間で約１１０ｍｇＧＳＨ／ｍｇタンパク質から６時間後には８０ｍｇ／ｍｇ、１２時間後には６０ｍｇ／ｍｇ、そして２４時間後には１０ｍｇ／ｍｇ未満と、ＧＳＨレベルの低下を示した。
【００３８】
（実施例８）
（ミトコンドリアの浸透性）
セレンの毒性が酸化によって仲介されることをさらに確認するために、酸化剤がミトコンドリアの膨潤と膜電位の低下を引き起こすという既知の現象を利用した（Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８１：１３０９−１３１２；Ｃａｉ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｏｃｔａ（１９９８）１３６６：１３９−１４９を参照のこと）。細胞をｒＡＤ−ＭＥＴ（ＭＯＩ５０）で感染させ、その後２０μＭのＳｅＭｅｔで処理した場合、２４時間のインキュベーションの後、ミトコンドリア膜は破裂した。ミトコンドリア膜電位変化を蛍光色素ＭｉｔｏｓｅｎｓｏｒTMでモニターした。これは、通常、ミトコンドリア中に取り込まれ、そこで凝集体を形成して、強い赤色蛍光を示す。記載のように処理された細胞において、ＭｉｔｏｓｅｎｓｏｒTMは、ミトコンドリア中に蓄積せず、細胞質中に残り、そこで緑色の蛍光を発する。
【００３９】
更なる実験において、ＭＯＩ２０を用いる以外、細胞を上記のように処理した。そして、カスパーゼ３、カスパーゼ８およびカスパーゼ９のレベルを、種々の時間で測定した。図１２に示すように、カスパーゼ８は比較的一定であるが、溶解物中のカスパーゼ３およびカスパーゼ９は、時間の経過と共に、処理細胞中で増加した。
【００４０】
さらに、記載のように処理された細胞中のミトコンドリアの膨潤を電子顕微鏡で可視化した。２４時間後、ほとんどのミトコンドリアは非常に膨潤していた。
【００４１】
（実施例９）
（インビボでの処理）
Ｎ１Ｓ１ラット肝癌腫瘍細胞（１×１０6細胞）を、雌性ヌードマウスの腹膜腔内に移植した。移植の２日後、コントロールｒＡｄまたはｒＡｄ−ＭＥＴ（５×１０8ｐｆｕ）のいずれか、または偽コントロールを、１日毎に全部で５回注射した。マウスをまた、１μＭのＳｅＭｅｔまたは通常の食塩水で、３日目から１３日目まで毎日、ＩＰで処置した。腹水腫瘍の増殖を体重増加によって評価した。図１３は、２５日間にわたる結果を示す。図示されるように、この期間でさえも、ｒＡｄ−ＭｅｔおよびＳｅＭｅｔで処理されたマウスは、体重の顕著な増加を示さなかった。これは、観察によって、そして図１４において、図示されるように、生存しているマウスの数によって、確認される。
【００４２】
（実施例１０）
（ＳｅＭｅｔと化学療法剤との組合せの効果）
ｒＡｄ−ＭＥＴでトランスフェクトされたＡ５４９細胞を２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で、８μＭのＳｅＭｅｔと共に、あるいは無しで、培養した。各ケースにおいて、二つ組の試料を、ＢＣＮＵ無しで、および３００μＭのＢＣＮＵの存在下で、培養した。細胞の生存を、＿時間後に決定した。未処理の場合、１００％の細胞が生存していた。ＳｅＭｅｔが単独で存在する場合、８０％の細胞が生存した。ＳｅＭｅｔが存在しないが、ＢＣＮＵが存在する場合、５５％の細胞生存率が得られ、８μＭのＳｅＭｅｔおよび３００μＭのＢＣＮＵの存在下では、１０％未満の細胞が生存した。このように、ＳｅＭｅｔはＢＣＮＵの効果を劇的に増強する。
【００４３】
同様の実験において、ｒＡｄ−ＭｅｔでトランスフェクトされたＡ５４９細胞を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で、４μＭのＳｅＭｅｔの存在下または非存在下で、０．４μＭのドキソルビシン有りまたは無しで、培養した。ドキソルビシン単独の存在下では、７５％の細胞生存率が得られた。ＳｅＭｅｔが単独で存在する場合は、６０％の細胞存在率が得られた。しかし、これらの化合物の組合せの結果は、わずか１０％の細胞生存であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、インサイチュでのメチオニナーゼの産生のために用いられるベクター、ｐＱＢＩ−Ａｄ  ＣＭＶ  ５ＭＥＴの概念図を示す。
【図２】  図２は、細胞の生存に対するメチオニナーゼ供給ウイルスの種々のウイルス力価の効果を、ＯＶＣＡＲ−８細胞を用いて、ＳｅＭｅｔの存在または非存在下で示す。
【図３】  図３は、細胞の生存に対するメチオニナーゼ供給ウイルスの種々のウイルス力価の効果を、Ａ２０４細胞を用いて、ＳｅＭｅｔの存在または非存在下で示す。
【図４】  図４は、細胞の生存に対するメチオニナーゼ供給ウイルスの種々のウイルス力価の効果を、ＰＣ−３細胞を用いて、ＳｅＭｅｔの存在または非存在下で示す。
【図５】  図５は、細胞の生存に対するメチオニナーゼ供給ウイルスの種々のウイルス力価の効果を、Ａ５４９細胞を用いて、ＳｅＭｅｔの存在または非存在下で示す。
【図６】  図６は、ｒＡｄ−ＭＥＴで形質導入されたＯＶＣＡＲ−８細胞に対する、ＳｅＭｅｔ濃度の効果を示す。
【図７】  図７は、Ａ５４９細胞についての細胞生存に対しての、種々の濃度のＳｅＭｅｔと種々の力価のコントロールｒＡＤとの組合わされた効果を示す。
【図８】  図８は、Ａ５４９細胞の細胞生存に対しての、ＳｅＭｅｔの濃度およびｒＡＤ−ＭＥＴについてのウイルス力価との組合わされた効果を示す。
【図９】  図９は、Ａ５４９細胞に対する、組み合わされたｒＡｄ−ＭＥＴおよびＳｅＭｅｔのバイスタンダー効果を示す。
【図１０】  図１０は、Ａ５４９細胞に対する、ｒＡＤ−ＭＥＴとＳｅＭｅｔとの組合せによるアポトーシスの誘導を示す。
【図１１】  図１１は、ルシゲニンの化学ルミネセンス（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって検出されるように、ＳｅＭｅｔと組み合わされたｒＡｄ−ＭＥＴによる酸化剤の生成を示す。
【図１２】  図１２は、Ａ５４９細胞の溶解産物中のカスパーゼ濃度に対する、ＳｅＭｅｔとｒＡｄ−ＭＥＴとの組合せの効果を示す。
【図１３】  図１３は、インビボでの腹水腫瘍増殖に対する、ｒＡｄ−ＭＥＴとＳｅＭｅｔとの組合せの効果を示す。
【図１４】  図１４は、腹水腫瘍を有するヌードマウスの生存に対する、ｒＡｄ−ＭＥＴとＳｅＭｅｔとの組合せの効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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