(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２級アルコールのエナンチオマー混合物を、実質的に単一なエナンチオマーからなる光学活性２級アルコールに変換する光学活性２級アルコールの製造方法であって、下記（１）の性質を有する酸化酵素源と下記（２）の性質を有する還元酵素源の共存下に、酸化型補酵素の再生系、及び、還元型補酵素の再生系を組み合わせて上記変換反応を行うことを特徴とする製造方法：
（１）酸化酵素源は、酸化型補酵素ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋のうち一方に特異性を示し、且つ、２級アルコールのＳ体又はＲ体のうち一方のエナンチオマーを選択的に酸化して、対応するケトン化合物を生成する活性を有する、
（２）還元酵素源は、還元型補酵素ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの一方に特異性を示し（ここで、酸化酵素源がＮＡＤ＋に特異的な場合は、還元酵素源はＮＡＤＰＨに特異的であり、酸化酵素源がＮＡＤＰ＋に特異的な場合には、還元酵素源はＮＡＤＨに特異的である）、かつ、酸化酵素源とは逆のエナンチオ選択性を有し、前記ケトン化合物を還元してＳ体（又はＲ体）の２級アルコールを生成する活性を有する。
【請求項２】
酸化酵素源、酸化酵素が依存する酸化型補酵素の再生系、還元酵素源、及び還元酵素が依存する還元型補酵素の再生系として、当該酸化酵素、当該酸化酵素が依存する酸化型補酵素を再生する能力を有する酵素、当該還元酵素および当該還元酵素が依存する還元型補酵素を再生する能力を有する酵素のすべての酵素遺伝子を同一宿主微生物内に導入した組換え微生物の培養物またはその処理物等を用いる、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
酸化酵素源、酸化酵素が依存する酸化型補酵素の再生系、還元酵素源、及び還元酵素が依存する還元型補酵素の再生系として、それぞれ単一にまたは部分的に精製された、当該酸化酵素、当該酸化酵素が依存する酸化型補酵素を再生する能力を有する酵素、当該還元酵素、及び当該還元酵素が依存する還元型補酵素を再生する能力を有する酵素を用いる、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
酸化酵素源が酸化型補酵素ＮＡＤ＋に特異性を示し、還元酵素源が還元型補酵素ＮＡＤＰＨに特異性を示す請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
上記酸化酵素源として当該酸化酵素を生産する微生物菌体を用い、上記酸化型補酵素の再生に、微生物細胞内のＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の再生能を利用することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
上記酸化酵素を産生する微生物が組換え大腸菌である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
上記酸化型補酵素の再生にＮＡＤＨオキシダーゼ、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、又はアミノ酸デヒドロゲナーゼを用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
上記ＮＡＤＨオキシダーゼが水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼである請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
水生成型のＮＡＤＨオキシダーゼがストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する微生物由来の酵素である請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
ストレプトコッカス属微生物がストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）である請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
ストレプトコッカス・ミュータンスがストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans） ＮＣＩＢ１１７２３である請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
上記還元型補酵素の再生にグルコース脱水素酵素、蟻酸脱水素酵素又はグルコース６−リン酸脱水素酵素を用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
上記グルコース脱水素酵素がＮＡＤＰ＋に特異的なグルコース脱水素酵素である請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
ＮＡＤＰ＋に特異的なグルコース脱水素酵素がクリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物由来の酵素である請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
クリプトコッカス属微生物がクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）である請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
酸化酵素源として、下記の（Ａ）及び（Ｂ）の酵素を同一宿主細胞内で発現させた組換え微生物細胞を用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法：
（Ａ）酸化型補酵素ＮＡＤ＋に特異性を示し、且つ、２級アルコールのＳ体又はＲ体のうち一方のエナンチオマーを選択的に酸化して対応するケトン化合物を生成する活性を有する酵素、
（Ｂ）酸化型補酵素ＮＡＤ＋を再生する能力を有する酵素。
【請求項１７】
酸化型補酵素ＮＡＤ＋を再生する能力を有する酵素がＮＡＤＨオキシダーゼである請求項１６記載の製造方法。
【請求項１８】
ＮＡＤＨオキシダーゼが水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼである請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
還元酵素源として、下記の（Ｃ）及び（Ｄ）の酵素を同一宿主細胞内で発現させた組換え微生物細胞を用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法：
（Ｃ）還元型補酵素ＮＡＤＰＨに特異性を示し、且つ、ケトン化合物を立体選択的に還元してＳ体又はＲ体の２級アルコールを生成する酵素、
（Ｄ）還元型補酵素ＮＡＤＰＨを再生する能力を有する酵素。
【請求項２０】
還元型補酵素ＮＡＤＰＨを再生する能力を有する酵素がグルコース脱水素酵素である請求項１９記載の製造方法。
【請求項２１】
グルコース脱水素酵素がＮＡＤＰ＋に特異的なグルコース脱水素酵素である請求項２０記載の製造方法。
【請求項２２】
酸化酵素源及び還元酵素源として、下記の（Ａ）及び（Ｃ）の酵素を同一宿主細胞内で発現させた組換え微生物細胞を用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法：
（Ａ）酸化型補酵素ＮＡＤ＋に特異性を示し、且つ、２級アルコールのＳ体又はＲ体のうち一方のエナンチオマーを選択的に酸化して対応するケトン化合物を生成する活性を有する酵素、
（Ｃ）還元型補酵素ＮＡＤＰＨに特異性を示し、且つ、ケトン化合物を立体選択的に還元してＳ体又はＲ体の２級アルコールを生成する酵素。
【請求項２３】
前記（Ａ）及び（Ｃ）の酵素に加え、下記（Ｂ）の酵素を同一宿主細胞内で発現させた組換え微生物細胞を用いる、請求項２２記載の製造方法：
（Ｂ）酸化型補酵素ＮＡＤ＋を再生する能力を有する酵素。
【請求項２４】
前記（Ａ）及び（Ｃ）の酵素に加え、下記の（Ｄ）の酵素を同一宿主細胞内で発現させた組換え微生物細胞を用いる、請求項２２記載の製造方法：
（Ｄ）還元型補酵素ＮＡＤＰＨを再生する能力を有する酵素。
【請求項２５】
前記（Ａ）、（Ｃ）の酵素に加え、下記（Ｂ）及び（Ｄ）の酵素を同一宿主細胞内で発現させた組換え微生物細胞を用いる、請求項２２記載の製造方法：
（Ｂ）酸化型補酵素ＮＡＤ＋を再生する能力を有する酵素、
（Ｄ）還元型補酵素ＮＡＤＰＨを再生する能力を有する酵素。
【請求項２６】
下記の(Ａ)、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の酵素を同一宿主細胞内で発現させた組換え微生物：
（Ａ）酸化型補酵素ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋のうち一方に特異性を示し、且つ、２級アルコールのＳ体又はＲ体のうち一方のエナンチオマーを選択的に酸化して、対応するケトン化合物を生成する活性を有する酸化酵素、
（Ｂ）（Ａ）の酸化酵素が依存する酸化型補酵素を再生する能力を有する酵素、
（Ｃ）還元型補酵素ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの一方に特異性を示し（ここで、（Ａ）の酸化酵素がＮＡＤ＋に特異的な場合は、ＮＡＤＰＨに特異的であり、（Ａ）の酸化酵素がＮＡＤＰ＋に特異的な場合には、ＮＡＤＨに特異的である）、かつ、（Ａ）の酸化酵素とは逆のエナンチオ選択性を有し、前記ケトン化合物を還元してＳ体（又はＲ体）の２級アルコールを生成する活性を有する還元酵素、
（Ｄ）（Ｃ）の還元酵素が依存する還元型補酵素を再生する能力を有する酵素。
【請求項２７】
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の各酵素が、それぞれ下記の(Ａ’)、（Ｂ’）、（Ｃ’）及び（Ｄ’）の酵素である請求項２６記載の組換え微生物：
（Ａ’）酸化型補酵素ＮＡＤ＋に特異性を示し、且つ、２級アルコールのＳ体又はＲ体のうち一方のエナンチオマーを選択的に酸化して、対応するケトン化合物を生成する活性を有する酵素、
（Ｂ’）酸化型補酵素ＮＡＤ＋を再生する能力を有する酵素、
（Ｃ’）還元型補酵素ＮＡＤＰＨに特異性を示し、且つ、ケトン化合物を立体選択的に還元してＳ体又はＲ体の２級アルコールを生成する酵素、
（Ｄ’）還元型補酵素ＮＡＤＰＨを再生する能力を有する酵素。
【請求項２８】
酸化型補酵素ＮＡＤ＋を再生する能力を有する酵素がＮＡＤＨオキシダーゼである請求項２７記載の組換え微生物。
【請求項２９】
ＮＡＤＨオキシダーゼが水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼである請求項２７記載の組換え微生物。
【請求項３０】
還元型補酵素ＮＡＤＰＨを再生する能力を有する酵素がグルコース脱水素酵素である請求項２７記載の組換え微生物。
【請求項３１】
グルコース脱水素酵素がＮＡＤＰ＋に特異的なグルコース脱水素酵素である請求項３０記載の組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品中間体として有用な光学活性ジオールを含めた光学活性２級アルコールをそのエナンチオマー混合物から製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、光学活性ジオールを含めた光学活性２級アルコールをそのエナンチオマー混合物から製造する方法としては、以下の様な方法が知られている。
１）微生物を用いて、ラセミの３−クロロ−１，２−プロパンジオールの一方の異性体を分解させることにより、残存する光学活性３−クロロ−１，２−プロパンジオールを取得する方法。（特許文献１）。
２）ラセミ体の１，２−ペンタンジオールにキャンディダ・パラプシロシスの菌体を作用させ、５０％を超える収率で（Ｓ）−１，２−ペンタンジオールを生産する方法（非特許文献１、２）。
３）キャンディダ・パラプシロシス由来の２級アルコール脱水素酵素を生産する大腸菌を用いて、ラセミの１、３−ブタンジオールのＳ体を４−ヒドロキシ−２−ブタノンに酸化させた後、前記菌体を除去する。その後、クライベロマイセス・ラクティス由来の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を生産する大腸菌を上記反応物に加えて、反応物中の４−ヒドロキシ−２−ブタノンをＲ体に還元することにより、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを製造する方法（特許文献２）。【０００３】
しかしながら、１）の方法では、収率は最大でも５０％にとどまる。また、適用できるアルコールの種類も制限される。２）の方法は、収率が５０％を超えることから、エナンチオマーの反転が起きていると推測されている。しかしながら、非特許文献１では、反応に関与する酸化酵素及び還元酵素の詳細は明らかにされておらず、非特許文献２においては、反応に関わる酵素について一部推定がなされているが、いずれの方法も１つの微生物の菌体内でアルコールのケトンへの酸化と、ケトンの逆の立体配置を有するアルコールへの還元が行われることから、酸化酵素と還元酵素の組合せが固定され、この方法を適用できるアルコールの種類が制限される。更に、酸化反応及び／又は還元反応に補酵素再生系を組み合わせて効率的に反応を行うことができない為、生産性も十分ではない。３）の方法は、理論収率は１００％であるが、還元反応を行う前に酸化反応に利用した菌体を除去する必要がある為、工程が煩雑となる。更に、一旦ケトン化合物が蓄積されることにより、ａ）酸化反応が生成物阻害を受ける、ｂ）還元反応が基質阻害をうける、ｃ）酸化酵素及び／又は還元酵素が失活する、ｄ）ケトンが不安定な場合には、ケトンの分解により収率が低下する等の問題も生じる。【０００４】
この様に、いずれの方法においも収率が低い、生産性が低い、工程が煩雑である等、工業的製法としては改善すべき課題を有している。
【特許文献１】特開昭６３−２５１０９８
【特許文献２】特開２００２−３４５４７９
【非特許文献１】Agric. Biol. Chem., 54(7), 1819-1827, 1990
【非特許文献２】Organic Process Research & Development,  8(2),  246-251                    (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記に鑑み、本発明の目的は、医薬品の中間体として有用な光学活性アルコールをそのエナンチオマー混合物から簡便かつ高収率で製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記課題につき鋭意検討を行った結果、特定の性質を有する酸化酵素源及び還元酵素源を併用することにより、２級アルコールのエナンチオマー混合物を、理論収率１００％で且つ簡便に、実質的に単一なエナンチオマーに変換する方法を見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
本発明の概要を以下のスキームに示す。【０００８】
【化１】
0004966189.tif 000002
【０００９】
本発明は、スキーム１に示すように、２級アルコールのエナンチオマー混合物の一方のエナンチオマーを選択的に酸化する能力を有する酸化酵素源と、上記酸化酵素源とは逆のエナンチオ選択性を有し、酸化反応によって生成するケトン化合物を光学活性２級アルコールへと還元する能力を有する還元酵素源の共存下に、２級アルコールのエナンチオマー混合物を理論収率１００％にて実質的に単一なエナンチオマーに変換、即ちデラセミ化することにより、光学活性アルコールを製造する方法である。【００１０】
前記特許文献２のように、酸化反応と還元反応を２段階に分けて実施する方法は知られているが、本発明の方法は、それとは異なり、酸化酵素源と還元酵素源の共存下に実施する、すなわち、酸化反応と還元反応を同時に行うことを特徴とする。【００１１】
ここで、単純に酸化酵素源と還元酵素源を共存させるだけでは、本発明のデラセミ化は達成できないことに注意すべきである。本発明における上記酸化、または還元反応を行う酵素（酸化酵素源、還元酵素源）としてはＥ．Ｃ．１．１．１に分類されるデヒドロゲナーゼなどの酸化還元酵素（Oxidoreductases）が使用されるが、これらの酵素はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋（ＮＡＤＨ））やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋（ＮＡＤＰＨ））などの補酵素を要求し、一般に可逆的に反応を触媒する（酸化反応も還元反応も触媒する）。従って、効率よくデラセミ化を行うために、前記スキーム１において、左から右へと反応が順調に進む条件を設定する必要がある。【００１２】
通常、これらデヒドロゲナーゼを使用して酸化反応を行う場合、使用する補酵素は酸化型（ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋）が還元型（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）に対し過剰に存在する事が望ましく、一方で還元反応を行う場合、補酵素は還元型が酸化型に対し過剰に存在することが望ましい。しかし、スキーム１に示すデラセミ化反応において、酸化酵素と還元酵素補酵素に対する特異性が同一である場合には、両酵素が使用しうる補酵素の酸化型と還元型が反応系に相当量存在するため、目的とする反応（酸化及び還元反応）の逆反応も同時に進行し、その結果、デラセミ化反応は効率的に進行しない。【００１３】
そこで、上記問題点を解決すべく鋭意検討した結果、補酵素に対する特異性が異なる酸化酵素源と還元酵素源を組み合わせて用いることにより、デラセミ化反応が効率的に進行することを見出し、本発明を完成するに至った。ここで、「補酵素に対する特異性が異なる」とは、酸化酵素源がＮＡＤ＋に特異的な場合には還元酵素源がＮＡＤＰＨに特異的であるか、または、酸化酵素源がＮＡＤＰ＋に特異的である場合には、還元酵素源がＮＡＤＨに特異的であることを意味する。【００１４】
即ち、本発明は、２級アルコールのエナンチオマー混合物を、実質的に単一なエナンチオマーからなる光学活性２級アルコールに変換する光学活性２級アルコールの製造方法であって、下記（１）の性質を有する酸化酵素源と下記（２）の性質を有する還元酵素源の共存下に、上記変換反応を行うことを特徴とする製造方法である：
（１）酸化酵素源は、酸化型補酵素ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋のうち一方に特異性を示し、且つ、２級アルコールのＳ体又はＲ体のうち一方のエナンチオマーを選択的に酸化して、対応するケトン化合物を生成する活性を有する、
（２）還元酵素源は、還元型補酵素ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの一方に特異性を示し（ここで、酸化酵素源がＮＡＤ＋に特異的な場合は、還元酵素源はＮＡＤＰＨに特異的であり、酸化酵素源がＮＡＤＰ＋に特異的な場合には、還元酵素源はＮＡＤＨに特異的である）、かつ、酸化酵素源とは逆のエナンチオ選択性を有し、前記ケトン化合物を還元してＳ体（又はＲ体）の２級アルコールを生成する活性を有する。【００１５】
かくして、本発明の製造法においては、酸化反応と還元反応を同時に行うことが可能であり、還元反応の開始前に酸化酵素を除去する必要が無く、工程が簡略化される。また、生成したケトン化合物は速やかに還元されるため、前述したような、ケトンの蓄積に起因する種々の問題を回避して、極めて効率よく光学活性２級アルコールを製造することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によれば、医薬品中間体として有用な光学活性ジオールを含めた光学活性アルコールを、そのエナンチオマー混合物、とりわけ安価なラセミ体から簡便且つ高収率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】組換えベクターｐＮＴＮＸの作成方法を示す図である。
【図２】オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）  ＫＮＫｃ７１−３由来のデヒドロゲナーゼ遺伝子が組み込まれた組換えベクターｐＴＳＯＢの制限酵素地図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、前述のごとく、２級アルコールのエナンチオマー混合物を、実質的に単一なエナンチオマーからなる光学活性２級アルコールに変換する光学活性２級アルコールの製造方法であって、下記（１）の性質を有する酸化酵素源と下記（２）の性質を有する還元酵素源の共存下に、上記変換反応を行うことを特徴とする製造方法である：
（１）酸化酵素源は、酸化型補酵素ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋のうち一方に特異性を示し、且つ、２級アルコールのＳ体又はＲ体のうち一方のエナンチオマーを選択的に酸化して、対応するケトン化合物を生成する活性を有する、
（２）還元酵素源は、還元型補酵素ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの一方に特異性を示し（ここで、酸化酵素源がＮＡＤ＋に特異的な場合は、還元酵素源はＮＡＤＰＨに特異的であり、酸化酵素源がＮＡＤＰ＋に特異的な場合には、還元酵素源はＮＡＤＨに特異的である）、かつ、酸化酵素源とは逆のエナンチオ選択性を有し、前記ケトン化合物を還元してＳ体（又はＲ体）の２級アルコールを生成する活性を有する。【００１９】
本発明の本質は、いかなる２級アルコールに対しても、そのエナンチオマー混合物から、理論収率１００％で実質的に単一なエナンチオマーからなる光学活性２級アルコールを生成しうる反応システム（デラセミ化反応システム）である。したがって、本発明は、製造する２級アルコールの種類、更には酸化及び還元反応に使用する酵素源の由来並びに形態によって、なんら限定されるものでない。【００２０】
本発明において、「２級アルコールのエナンチオマー混合物」とは、その光学純度が、目的とする用途において要求される水準に満たない２級アルコール全般を意味する。ラセミ体は言うまでもなく、例えば、９０％ｅ．ｅ．の（Ｒ）体が要求される場合には、高光学純度の（Ｓ）体も含め、（Ｒ）体が９０％ｅ．ｅ．に満たない２級アルコールは、全て本発明の範疇に含まれる。通常は、ラセミ体が安価で入手容易であることから、ラセミ体を用いる場合に、本発明の効果が最大限に発揮される。【００２１】
本発明において、「実質的に単一なエナンチオマーからなる光学活性２級アルコール」とは、その光学純度が目的とする用途において要求される水準を満足する２級アルコールを意味し、必ずしも光学純度が１００％ｅ．ｅ．である必要はない。例えば、医薬中間体では、目的とするエナンチオマーの光学純度が９０％ｅ．ｅ．以上、好ましくは９５％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９８％ｅ．ｅ．以上が目安であるが、以降の工程における光学純度向上の可否などの要因によって、要求される水準が変動することは言うまでもない。【００２２】
本発明において、「還元酵素源は、酸化酵素源とは逆のエナンチオ選択性を有する」とは、酸化酵素源が２級アルコールのＲ体を選択的に酸化してケトン化合物を生成する場合に、還元酵素源は、当該ケトン化合物を還元してＳ体の２級アルコールを選択的に生成するか、または、酸化酵素源が２級アルコールのＳ体を選択的に酸化してケトン化合物を生成する場合に、還元酵素源は、当該ケトン化合物を還元してＲ体の２級アルコールを選択的に生成することを意味する。【００２３】
本発明におけるエナンチオ選択的な酸化反応及び還元反応を行う酵素は、前述の通り、Ｅ．Ｃ．１．１．１に分類されるデヒドロゲナーゼなどの酸化還元酵素である。本発明では、これらの酵素を、酸化反応に使用する場合には「酸化酵素（酸化酵素源）」と、また還元反応に使用する場合には「還元酵素（還元酵素源）」と表現する。【００２４】
本発明において、「酸化酵素がＮＡＤ＋（又はＮＡＤＰ＋）に特異的である」とは、ＮＡＤ＋（又はＮＡＤＰ＋）を補酵素とした場合に、他方を補酵素とした場合よりも高い活性を示す（特異性を示す）ことを意味する。特異性を示す補酵素を用いた際の活性と他方の補酵素を用いた際の活性の比率は、通常１００／５０以上、好ましくは１００／１０以上、さらに好ましくは１００／２以上である。【００２５】
本発明において、「還元酵素がＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ）に特異的である」とは、上記と同様の意味を表し、特異性を示す補酵素を用いた際の活性と他方の補酵素を用いた際の活性の比率も、上記と同様である。【００２６】
本発明のデラセミ化反応は、適当な溶媒中に基質である２級アルコールのエナンチオマー混合物、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋（ＮＡＤＨ））、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋（ＮＡＤＰＨ））、上記酸化酵素源、および還元酵素源を添加し、ｐＨ調整下攪拌することにより行うことができるが、補酵素の再生系を組み合わせて反応を行うのが好ましい。【００２７】
通常、デヒドロゲナーゼによる酸化反応及び還元反応には、それぞれ化学量論量の酸化型補酵素及び還元型補酵素を必要とするが、酸化型補酵素ＮＡＤ＋（又はＮＡＤＰ＋）の再生系、及び／又は、還元型補酵素ＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ）の再生系を組み合せることにより、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させることが可能である。従って、上記デラセミ化反応を構成する酸化反応、及び／又は還元反応に補酵素再生系を組み合わせるのが好ましく、酸化反応及び還元反応の両方にそれぞれの補酵素再生系を組み合わせるのがより好ましい。【００２８】
補酵素の再生系としては、まず、微生物菌体、例えば上記酸化酵素を生産する微生物細胞内の補酵素再生能を利用する方法を挙げることができる。酸化型補酵素の再生に、微生物菌体、例えば酸化酵素を生産する組換え大腸菌細胞内の補酵素再生能を利用する場合、アルコールの酸化反応及び酸化型補酵素再生系が細胞膜により外界と分離されているため、還元型補酵素再生系の酵素の補酵素特異性が低い若しくはない場合でも、先に述べたような酸化型補酵素の再生系と還元型補酵素再生系の共役による不具合が生じにくいなどの利点を有する。【００２９】
また、補酵素の再生系としては、デラセミ化反応の酸化酵素及び還元酵素とは別の、酸化型補酵素及び／又は還元型補酵素を再生する酵素を利用する方法が挙げられる。この場合、酸化型補酵素を再生する反応と還元型補酵素を再生する反応とが補酵素を中間体として共役すると、目的とする補酵素の再生が効率的に進行しない。したがって、補酵素再生系に使用する酵素は、それぞれの補酵素に対して高い特異性を示すことが好ましい。即ち、酸化酵素がＮＡＤ＋特異的である場合には、酸化型補酵素再生系の酵素はＮＡＤＨ特異的であり、還元型補酵素再生系の酵素はＮＡＤＰ＋特異的であることが好ましく、同様に、酸化酵素がＮＡＤＰ＋特異的でである場合には、酸化型補酵素再生系の酵素はＮＡＤＰＨ特異的であり、還元型補酵素再生系の酵素はＮＡＤ＋特異的であることが好ましい。【００３０】
酸化型補酵素を再生する能力を有する酵素としては、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼが挙げられ、その中でも、ＮＡＤＨオキシダーゼは、補酵素再生反応ための基質として酸素が利用できること、その多くがＮＡＤＨに特異的であり、また触媒される反応が不可逆的であるなど点において好ましい。なお、ＮＡＤＨオキシダーゼには水を生成するもの（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ）と過酸化水素を生成するもの（過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ）の２種が知られている。過酸化水素は酵素などに悪影響を与えることが知られており、過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いる場合は、反応系にカタラーゼを添加することにより過酸化水素を分解し、その悪影響を低減、除去することが好ましい。過酸化水素の生成自体をさけられることから、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いるのがより好ましい。【００３１】
上記水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの起源となる生物としては特に限定されず、微生物であっても良いし、高等生物であってもよいが、細菌、カビ、酵母などの微生物が好適であり、好ましくは細菌が挙げられる。例えば、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ロイコノストック（Leuconostock）属、エンテロコッカス（Entrococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、メタノコッカス（Methanococcus）属、セルプリナ（Serpulina）属、マイコプラズマ（Mycoplasma）属、又はジアルディア（Giardia）属に属する微生物が挙げられ、好ましくはストレプトコッカス（Streptococcus）属微生物、さらに好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス、特に好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）  ＮＣＩＢ１１７２３が挙げられる。ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）  ＮＣＩＢ１１７２３由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼは、そのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列はすでに報告されている(特開平８−１９６２８１)。【００３２】
還元型補酵素を再生する能力を有する酵素としては、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グルコース６−リン酸脱水素酵素が挙げられ、好ましくはグルコース脱水素酵素、より好ましくはＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素が挙げられる。【００３３】
上記グルコース脱水素酵素の起源となる生物としては特に限定されず、微生物であっても良いし、高等生物であってもよいが、細菌、カビ、酵母などの微生物が好適であり、好ましくは細菌が挙げられる。例えば、バチルス（Bacillus）属微生物、好ましくはバチルス・メアテリウム（Bacillus megaterium）が挙げられる。【００３４】
上記ＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素の起源となる生物としては特に限定されず、微生物であっても良いし、高等生物であってもよいが、細菌、カビ、酵母などの微生物が好適である。例えば、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、又はサッカロミセス（Saccharomyces）属に属する微生物が挙げられる。好ましくは、クリプトコッカス属に属する微生物が挙げられる。クリプトコッカス属微生物としては、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・フミコーラス(Cryptococcus humicolus)、クリプトコッカス・テレウス（Cryptococus terreus）、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）が挙げられ、好ましくはクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）、更に好ましくはクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）  ＪＣＭ３６８７株を挙げられる。【００３５】
なお、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）ＪＣＭ３６８７株は理化学研究所微生物系統保存施設（JMC：Japan Collection of Microorganisms、〒３５１−０１９８  日本国埼玉県和光市広沢２−１）に保存されており、同保存施設から入手する事が出来る。【００３６】
また、酸化酵素遺伝子及びこの酵素が依存する酸化型補酵素を再生する能力を有する酵素（例えばＮＡＤＨオキシダーゼ）の遺伝子を同一宿主細胞内に導入した組換え微生物の培養物またはその処理物等を用いて、上記と同様の反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調製する必要がないため、より低コストで光学活性アルコールを製造することができる。同様に、還元酵素遺伝子及びこの酵素が依存する還元型補酵素を再生する能力を有する酵素（例えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一宿主細胞内に導入した組換え微生物の培養物またはその処理物等を用いて、上記と同様の反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調製する必要がないため、より低コストで光学活性ジオールを製造することができる。【００３７】
また、酸化反応系（アルコールの酸化及び酸化型補酵素再生系）、還元反応系（ケトン誘導体の還元反応及び還元型補酵素再生系）の片方、または双方とも、上記の様に関与する酵素を同一宿主細胞内で発現させれば、酸化および／または還元反応系はそれぞれ宿主細胞膜で分離されることになり、その結果、先に述べたような酸化型補酵素再生系と還元型補酵素再生系の共役による不具合が起こらない、又は起こりにくくなり、その結果、補酵素再生系に関与する酵素の補酵素に対する特異性が低い場合も、反応が良好に進行する場合がある。【００３８】
一方、酸化酵素遺伝子および還元酵素遺伝子を同一宿主微生物細胞内に導入した組換え微生物、さらには、酸化酵素遺伝子および還元酵素遺伝子に加え、還元酵素が依存する還元型補酵素を再生する能力を有する酵素の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した組換え微生物、または酸化酵素遺伝子および還元酵素遺伝子に加え、酸化酵素が依存する酸化型補酵素を再生する能力を有する酵素の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した組換え微生物の培養物またはその処理物等を用いて反応を行うことは、製造プロセスの効率化において好ましい。また、酸化酵素、酸化酵素が依存する酸化型補酵素を再生する能力を有する酵素、還元酵素および還元酵素が依存する還元型補酵素を再生する能力を有する酵素のすべての酵素遺伝子を同一宿主微生物内に導入した組換え微生物の培養物またはその処理物等を用いて反応を行うことは、より好ましい。また、本特許は、このよう組換え微生物を提供することも目的としている。【００３９】
このような組換え微生物は、使用する酸化酵素をコードするＤＮＡ、使用する還元酵素をコードするＤＮＡ、酸化型補酵素再生能力を有する酵素をコードする遺伝子、還元型補酵素再生する能力を有する酵素をコードするＤＮＡからなる群より選ばれる２〜４のＤＮＡを同一のベクターに組込み、これを宿主に導入することにより製造できる。または、これら２〜４種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる複数種のベクターにそれぞれ組込み、それらを同一の宿主に導入することによっても製造できる。【００４０】
本発明に使用する酸化酵素、還元酵素、酸化型補酵素の再生酵素及び還元型補酵素再生系酵素は、単一にまたは部分的に精製された酵素であってもよいし、これら酵素の産生能を有する微生物の培養物またはその処理物を使用することも可能である。ここで「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥微生物菌体、アセトン乾燥微生物菌体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いることができる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。【００４１】
上記酵素の産生能を有する微生物としては、野生株または変異株、あるいは上記酵素のＤＮＡをベクターに組込み、これを宿主内に導入してなる組換え体であってもよい。【００４２】
次に、本発明で使用或いは製造する２級アルコールについて説明する。しかし、本発明の本質は、前述の通り、補酵素の特異性が異なり且つエナンチオ選択性の異なる酸化酵素源と還元酵素源を組合せて使用すること、さらには、それら酸化反応と還元反応に効率的に補酵素再生系を組合せて使用することを特徴とした光学活性２級アルコールの製造方法である。【００４３】
従って、本発明で用いる２級アルコールのエナンチオマー混合物としては、前述のとおり２級水酸基を有する化合物であれば特に限定されないが、その代表的なものとして、１，２−ジオール、２−アルカノールを挙げることができる。【００４４】
１，２−ジオールとしては一般式（１）：【００４５】
【化２】
0004966189.tif 000003
【００４６】
（式中、Ｒは置換基を有しても良い炭素数１〜１０のアルキル基、または置換基を有しても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す）で表される１，２−ジオールを挙げることができる。【００４７】
２−アルカノールとしては、一般式（２）：【００４８】
【化３】
0004966189.tif 000004
【００４９】
（式中、Ｒは置換基を有しても良い炭素数１〜１０のアルキル基、または置換基を有しても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す）で表される２−アルカノールを挙げることができる。【００５０】
また、本発明で製造される光学活性２級アルコールとしては、２級水酸基を有する化合物であれば特に限定されないが、一般式（３）：【００５１】
【化４】
0004966189.tif 000005
【００５２】
（式中、Ｒは前記と同じ。＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性１，２−ジオールや一般式（４）：【００５３】
【化５】
0004966189.tif 000006
【００５４】
（式中、Ｒは前記と同じ。＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性２−アルカノールを挙げることができる。前記一般式（３）および（４）において、＊は不斉炭素を表し、その絶対配置は（Ｒ）体であってもよいし、（Ｓ）体であっても良い。【００５５】
即ち一般式（５）：【００５６】
【化６】
0004966189.tif 000007
【００５７】
（式中、Ｒは前記と同じ。）、或いは一般式（６）：【００５８】
【化７】
0004966189.tif 000008
【００５９】
（式中、Ｒは前記と同じ。）で表される光学活性１，２−ジオール、さらには一般式（７）：【００６０】
【化８】
0004966189.tif 000009
【００６１】
（式中、Ｒは前記と同じ。）、或いは一般式（８）：【００６２】
【化９】
0004966189.tif 000010
【００６３】
（式中、Ｒは前記と同じ。）で表される光学活性２−アルカノールおよびそれら誘導体を挙げることができる。【００６４】
前記式（１）〜（８）において、置換基を有しても良い炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル、又はハロメチル基等が挙げられる。ハロメチル基としてはクロロメチル基、ブロモメチル基、又はヨードメチル基が挙げられる。置換基を有しても良い炭素数５〜１５のアリール基としては、フェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−ブロモフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェニル基、又はｐ−メトキシフェニル基等が挙げられる。【００６５】
前記式（１）、（３）、（５）、（６）で示される１，２−ジオールとして具体的には３−クロロ−１，２−ブタンジオール、１，２−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、４−メチル−１，２−ペンタンジオール、１−フェニル−１，２−エタンジオールおよびそれら誘導体を挙げることができる。【００６６】
前記式（２）、（４）、（７）、（８）で示される２−アルカノールとして具体的には、２−ブタノール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、１−フェニルエタノール、３−ヒドロキシ−２−ブタノールおよびそれら誘導体を挙げることができる。【００６７】
次に、本発明で用いる酸化酵素源および還元酵素源について説明する。本発明では、酸化酵素源および還元酵素源として、ＥＣ．１．１．１に分類されるデヒドロゲナーゼを使用する。酸化酵素源と還元酵素源の組合せは、目的とする２級アルコールに応じて適宜選択すればよい。【００６８】
酵素的不斉還元は、光学活性アルコールの合成において最も有用な手法の１つであり、種々の微生物あるいは動物組織由来のデヒドロゲナーゼが、その基質特異性及びエナンチオ選択性とともに報告されている。これらの情報を参考に、本願発明の方法に適したエナンチオ選択性と補酵素に対する特異性を有する酸化酵素源並びに還元酵素源を選択すれば良い。【００６９】
目的の２級アルコールに関して、既知の情報が存在しない場合には、下記のようにして酸化酵素源および還元型酵素源を選択することができる。
１）目的の２級アルコールに対応するケトン化合物、例えば、一般式（９）：【００７０】
【化１０】
0004966189.tif 000011
【００７１】
（式中Ｒは前記と同じ）、或いは一般式（１０）：【００７２】
【化１１】
0004966189.tif 000012
【００７３】
（式中Ｒは前記と同じ）で表されるケトン化合物を入手あるいは調製する。
２）次に、種々の市販のデヒドロゲナーゼあるいは微生物を用いて、当該ケトン化合物を２級アルコールに還元し、エナンチオ選択性を確認する。
３）良好な（Ｒ）選択性を示した酵素源、および、良好な（Ｓ）選択性を示した酵素源をそれぞれ数種ずつ選択し、補酵素に対する特異性を確認する。
４）エナンチオ選択性と補酵素に対する特異性をもとに、酸化酵素と還元酵素の組合せを決定する。【００７４】
以下に、本発明で使用しうる酸化酵素源および還元酵素源について述べる。前述の通り、本発明の本質は、補酵素の特異性が異なり且つエナンチオ選択性の異なる酸化酵素源と還元酵素源を組合せて使用すること、さらには、それら酸化反応と還元反応に効率的に補酵素再生系を組合せて使用することを特徴とした光学活性２級アルコールの製造方法である。したがって、使用する酸化酵素源、還元酵素源によってなんら限定されるものではない。【００７５】
本発明で使用しうる酸化酵素源および還元酵素源として例を挙げると、例えば、前記式（５）で表される１，２−ジオールのエナンチオマーを選択的に酸化する能力を有し、ＮＡＤ＋に特異性を有する酵素源としては、セルロモナス（Cellulomonas）属に属する微生物由来の酵素源が挙げられ、好ましくは、セルロモナス・スピーシズ（Cellulomonas sp.）  ＫＮＫ０１０２由来（ＷＯ０５／１２３９２１）の酵素源が挙げられる。【００７６】
前記式（６）で表される１，２−ジオールのエナンチオマーを選択的に酸化する能力を有し、ＮＡＤ＋に特異性を有する酵素源としては、キャンディダ（Candida）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が挙げられ、好ましくは、キャンディダ・マリス（Candida malis）  ＮＢＲＣ１０００３由来（ＷＯ０１／００５９９６）およびオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）  ＫＮＫｃ７１−３由来の酵素源が挙げられる。【００７７】
前記式（７）で表される２−アルカノールのエナンチオマーを選択的に酸化する能力を有し、ＮＡＤ＋に特異性を有する酵素源としては、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属に属する微生物由来の酵素源が挙げられ、好ましくは、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）  ＫＮＫｃ７１−３由来の酵素源が挙げられる。【００７８】
前記式（８）で表される２−アルカノールのエナンチオマーを選択的に酸化する能力を有し、ＮＡＤ＋に特異性を有する酵素源としては、キャンディダ（Candida）属に属する微生物由来の酵素源が挙げられ、好ましくは、キャンディダ・マリス（Candida malis）  ＮＢＲＣ１０００３由来の酵素源が挙げられる。【００７９】
前記式（９）で表されるケトン化合物を前記式（６）で表される１，２−ジオールのエナンチオマーに還元する能力を有し、ＮＡＨＰＨに特異性を有する酵素源としては、キャンディダ（Candida）属に属する微生物由来の酵素源が挙げられ、好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）  ＮＢＲＣ０７０５由来の酵素源（ＷＯ９８／０３５０２５）が挙げられる。【００８０】
前記式（９）で表されるケトン化合物を前記式（５）で表される１，２−ジオールのエナンチオマーに還元する能力を有し、ＮＡＤＰＨに特異性を有する酵素源としては、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物由来の酵素源が挙げられ、好ましくは、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）  ＮＢＲＣ４１５由来の酵素源（ＷＯ０３／０９３４７７）が挙げられる。【００８１】
前記式（１０）で表されるケトン化合物を前記式（８）で表される２−アルカノールのエナンチオマーに還元する能力を有し、ＮＡＤＰＨに特異性を有する酵素源としては、キャンディダ（Candida）属に属する微生物由来の酵素源が挙げられ、好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）  ＮＢＲＣ０７０５由来の酵素源が挙げられる。【００８２】
前記式（１０）で表されるケトン化合物を前記式（７）で表される２−アルカノールのエナンチオマーに還元する能力を有し、ＮＡＤＰＨに特異性を有する酵素源としては、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物由来の酵素源が挙げられ、好ましくは、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）  ＮＢＲＣ４１５由来の酵素源が挙げられる。【００８３】
本発明に適した酸化酵素源および還元酵素源の組合せについて説明する。
前記式（５）で表される１，２−ジオールをエナンチオ選択的に酸化して前記式（９）で表されるケトン化合物を生成しうる酸化酵素源は、ケトン化合物（９）をエナンチオ選択的に還元して前記式（６）で表される１，２−ジオールを生成する還元酵素源と組み合わせる。同様に、１，２−ジオール（６）をエナンチオ選択的に酸化しうる酸化酵素源は、ケトン（９）をエナンチオ選択的に還元して１，２−ジオール（５）を生成しうる還元酵素源と組み合わせる。【００８４】
前記式（７）で表される２−アルカノールをエナンチオ選択的に酸化して前記式（１０）で表されるケトン化合物を生成しうる酸化酵素源は、ケトン化合物（１０）をエナンチオ選択的に還元して２−アルカノール（８）を生成しうる還元酵素源と組み合わせる。同様に、２−アルカノール（８）をエナンチオ選択的に酸化しうる酸化酵素源は、ケトン（１０）をエナンチオ選択的に還元して２−アルカノール（７）を生成しうる還元酵素源と組み合わせる。【００８５】
上記のいずれの組み合わせにおいても、酸化酵素源と還元酵素源の補酵素特異性が異なることが好ましい。すなわち、酸化酵素源がＮＡＤ＋に特異的な場合は還元酵素源はＮＡＤＰＨに特異的であり、酸化酵素源がＮＡＤＰ＋に特異的な場合は還元酵素源はＮＡＤＨ特異的である。【００８６】
特に、ＮＡＤ＋特異的な酸化酵素源とＮＡＤＰＨに特異的な還元酵素源の組み合わせは、酸化型補酵素再生系にＮＡＤＨオキシダーゼ、還元型補酵素再生系にＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を使用することが出来、好ましい。【００８７】
以下に、酸化酵素源と還元酵素源の組み合わせ例をいくつか挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００８８】
前記式（６）で表される光学活性１，２−ジオールを製造するためには、例えば、セルロモナス（Cellulomonas）属に属する微生物、好ましくは、セルロモナス・スピーシズ（Cellulomonas sp.）  ＫＮＫ０１０２由来の酸化酵素源と、キャンディダ（Candida）属に属する微生物、好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Candidamagnoriae）  ＮＢＲＣ０７０５由来の還元酵素源の組合せを挙げることができる。【００８９】
前記式（５）で表される光学活性１，２−ジオールを製造するためには、例えば、キャンディダ（Candida）属、又はオクロバクトラム（Ochrobactrum）属に属する微生物、好ましくは、キャンディダ・マリス（Candida malis）  ＮＢＲＣ１０００３、又はオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrumsp.）  ＫＮＫｃ７１−３由来の酸化酵素源と、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物、好ましくは、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorulaglutinis）  ＮＢＲＣ４１５由来の還元酵素源の組合せを挙げることができる。【００９０】
前記式（８）で表される光学活性２−アルカノールを製造するためには、例えば、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属に属する微生物、好ましくは、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）  ＫＮＫｃ７１−３由来の酸化酵素源と、キャンディダ（Candida）属に属する微生物、好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Candidamagnoriae）  ＮＢＲＣ０７０５由来の還元酵素源の組合せを挙げることができる。【００９１】
前記式（７）で表される光学活性２−アルカノールを製造するためには、例えば、キャンディダ（Candida）属に属する微生物、好ましくは、キャンディダ・マリス（Candida malis）  ＮＢＲＣ１０００３由来の酸化酵素源と、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物、好ましくは、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorulaglutinis）  ＮＢＲＣ４１５由来の還元酵素源の組合せを挙げることができる。【００９２】
上記微生物のうち、キャンディダ・マリス（Candida malis）  ＮＢＲＣ１００３、キャンディダ・マグノリエ（Candidamagnoriae）  ＮＢＲＣ０７０５、およびロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）  ＮＢＲＣ４１５は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に保存されており、同機関より入手可能である。【００９３】
セルロモナス・スピーシズ（Cellulomonas sp.）  ＫＮＫ０１０２は本発明者らにより土壌から分離・同定されたものであり、その取得方法などはＷＯ０５／１２３９２１に記載されている。【００９４】
なお、本発明に使用する酸化酵素、および還元酵素の産生能を有する微生物としては、野生株または変異株のいずれでもよい。あるいは細胞融合または遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される微生物も用いることができる。遺伝子操作された上記酵素を生産する微生物は、例えば、これらの酵素を単離及び／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいて酵素をコードするＤＮＡ配列を得る工程、このＤＮＡを他の宿主微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して、本酵素を得る工程を含有する方法により得ることができる（ＷＯ９８／３５０２５）。宿主としては細菌、酵母、糸状菌などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。【００９５】
上記の酸化酵素あるいは還元酵素をコードするＤＮＡを有するプラスミドで形質転換された組換え微生物としては、例えば、以下のような組換え微生物を挙げることができる。
ａ）セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）  ＫＮＫ０１０２由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ（以後デヒドロゲナーゼと記載：酸化酵素）遺伝子で形質転換されたEscherichiacoli HB101 (pTSCS)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２４（ＷＯ０５／１２３９２１）。
ｂ）キャンディダ・マリス（Candida malis）  ＮＢＲＣ１０００３由来のデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）遺伝子で形質転換されたEscherichiacoli HB101 (pNTFP)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１６（ＷＯ０１／００５９９６）。
ｃ）オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３由来のデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）で形質転換されたEscherichiacoli HB101 (pTSOB)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６１。
ｄ）キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）  ＩＦＯ０７０５由来のデヒドロゲナーゼ（還元酵素）遺伝子で形質転換されたEscherichiacoli HB101 (pNTS1)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８３４（ＷＯ９８／０３５０２５）。
ｅ）ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）  ＮＢＲＣ４１５由来のデヒドロゲナーゼ（還元酵素）遺伝子で形質転換されたEscherichiacoli HB101 (pNTRG)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５７（ＷＯ０３／０９３４７７）。【００９６】
上記の組み換え微生物は、それぞれ前記の受託番号にて独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ：〒305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）に寄託されている。
［寄託日］
Escherichia coli HB101 (pTSCS) FERM BP-10024:２００４年５月１２日
Escherichia coli HB101 (pNTFP) FERM BP-7116：２０００年４月１１日
Escherichia coli HB101 (pTSOB) FERM BP-10461：２００５年１１月３０日
Escherichia coli HB101 (pNTS1) FERM BP-5834：１９９７年２月２４日
Escherichia coli HB101 (pNTRG) FERM BP-7857：２００２年１月２２日【００９７】
また、本発明では、前述のように、酸化酵素、酸化型補酵素を再生する能力を有する酵素、還元酵素、及び還元型補酵素のうちの２〜４酵素を同時に発現する組換え微生物を好適に使用し得る。これら複数の酵素を生産する組換え微生物は、上記ａ）〜ｅ）に挙げた組換え微生物に含まれる、酸化酵素遺伝子、還元酵素遺伝子、あるいはそれらを導入された組換えプラスミドを利用することにより、通常の遺伝子組換え技術で調製し得る。前記のａ）〜ｅ）に挙げた組換え微生物中に含まれる、酸化酵素遺伝子または還元酵素遺伝子、並びに、組換えプラスミドの詳細は、それぞれの項で挙げた参照文献に記載されている。【００９８】
なお、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）  ＫＮＫｃ７１−３は本発明者らにより土壌から分離・同定された微生物である。オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）ＫＮＫｃ７１−３由来のデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）は、図２に示す組換えベクターｐＴＳＯＢとして前記組換え微生物・Escherichia coli HB101 (pTSOB)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６１に導入されている。当業者であれば、常法により当該組換え微生物から組換えベクターｐＴＳＯＢを単離し、更なる遺伝子の導入等に利用することができる。【００９９】
酵素源として用いる微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用することができる。培養は好気的に行い、通常、培養時間は１〜５日間程度、培地のｐＨが３〜９、培養温度は１０〜５０℃で行うことができる。【０１００】
本発明のデラセミ化の反応条件は用いる酵素、微生物またはその処理物、基質濃度等によって異なるが、通常、基質濃度は約０．１〜１００重量％、好ましくは１〜６０重量％であり、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋は基質に対して０．０００１〜１００モル％、好ましくは０．０００１〜０．１モル％、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは基質に対して０．０００１〜１００モル％、好ましくは０．０００１〜０．１モル％。反応温度は１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃であり、反応のｐＨは４〜９、好ましくは５〜８であり、反応時間は１〜１２０時間、好ましくは１〜７２時間で行うことができる。【０１０１】
基質は一括、または連続的に添加して行うことができる。反応はバッチ方式または連続方式で行うことができる。また、酸化型補酵素の再生に酸化酵素を産生する微生物のＮＡＤ＋再生能又はＮＡＤＨオキシダーゼを用いる場合は、反応を空気または比較的純粋な酸素存在下、好気条件にて行うことが好ましい。また、酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振盪あるいは攪拌条件下で行われることが好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応することにより、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより効率的に進む場合もある。【０１０２】
デラセミ化反応で生じた光学活性２級アルコールは、常法により精製することが出来る。例えば、光学活性３−クロロ−１，２−プロパンジオールは、微生物等を用いた場合には必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下に除去し、そして減圧蒸留またはクロマトグラフィー等の処理を行う事により、精製することができる。【０１０３】
以下に、実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０４】
以下に、実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【０１０５】
（実施例１）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（大腸菌菌体を用いた酸化型補酵素の再生系、グルコース脱水素酵素による還元型補酵素再生系を併用）
E. coli HB101 (pTSCS)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２４を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。上記培養液５０ｍｌを遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌに懸濁した。【０１０６】
また、E. coli HB101 (pNTS1)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８３４を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン  １．６％、イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。この培養液５０ｍｌを遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌに懸濁して、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕し無細胞抽出液を得た。【０１０７】
上記E. coli HB101 (pTSCS)の懸濁液１ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール  ２０ｍｇ、上記E. coli HB101 (pNTS1)の無細胞抽出液１ｍｌ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１０Ｕ、ＮＡＤＰ＋  ０．２ｍｇ、及びグルコース４０ｍｇを栓付試験管に添加し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ８．０に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後、反応液を硫酸アンモニウムで飽和させてから、酢酸エチルを加えて抽出を行い、抽出液中に残存する３−クロロ−１，２−プロパンジオール含量をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析し、収率（％）を算出した。また、上記生成物をトリフルオロアセチル化した後、キャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析し、光学純度（％ｅ．ｅ．）を算出した。その結果、収率は９０％、光学純度は９６．１％ｅ．ｅ．（Ｒ）であった。【０１０８】
［含量の分析条件］
カラム：ＨＰ−５  ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．（Agilent Technologies社製）
検出：ＦＩＤ
カラム初期温度：５０℃
カラム最終温度：２００℃
昇温速度：６℃／分
注入温度：１５０℃
検出温度：３００℃
キャリアーガス：ヘリウム（７０ｋＰａ）
スプリット比：１００／１
検出時間：３−クロロ−１，２−プロパンジオール  １０．２分【０１０９】
［光学純度の分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｄｅｘ  Ｇ−ＰＮ（３０ｍ×０．２５ｍｍ）（ＡＳＴＥＣ社製）
カラム温度：９０℃
注入温度：１５０℃
検出温度：１５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）
スプリット比：１００／１
検出時間：Ｒ体  １０．０分、Ｓ体  １０．６分。
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）ｘ１００
（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表し、Ａ＞Ｂである）【０１１０】
（実施例２）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素の再生系、グルコース脱水素酵素による還元型補酵素再生系を併用）
実施例１で得たE. coli HB101 (pTSCS)の培養液５０ｍｌを遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌに懸濁した。その後、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕し無細胞抽出液を得た。【０１１１】
上記E. coli HB101 (pTSCS)の無細胞抽出液１ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール２０ｍｇ、ＮＡＤ＋  ０．２ｍｇ、ＮＡＤＨオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）１Ｕ、カタラーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）２０Ｕ、実施例１で得たE. coli HB101 (pNTS1)の無細胞抽出液１ｍｌ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１０Ｕ、ＮＡＤＰ＋  ０．２ｍｇ、及びグルコース４０ｍｇを栓付試験管に添加し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ８．０に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後、実施例１記載の方法にて分析を行った結果、収率は６７％、光学純度は７１．２％ｅ．ｅ．（Ｒ）であった。【０１１２】
（実施例３）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（大腸菌菌体を用いた酸化型補酵素の再生系、グルコース脱水素酵素による還元型補酵素再生系を併用）
実施例１で得たE. coli HB101 (pNTS1)の培養液５００ｍｌを遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍｌに懸濁した。その後、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕し無細胞抽出液を得た。【０１１３】
実施例１で得たE. coli HB101 (pTSCS)の培養液２ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール  １００ｍｇ、上記E. coli HB101 (pNTS1)の無細胞抽出液２００μｌ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１０Ｕ、ＮＡＤＰ＋  ０．２ｍｇ、及びグルコース８０ｍｇを栓付試験管に添加し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．０に調整しながら、３０℃で２８時間攪拌した。反応終了後、実施例１記載の方法で分析を行った結果、収率９３．２％、光学純度は９８．６％ｅ．ｅ．（Ｒ）であった。【０１１４】
（実施例４）（Ｓ）−１，２−ブタンジオールの合成（大腸菌菌体を用いた酸化型補酵素の再生系、グルコース脱水素酵素による還元型補酵素再生系を併用）
ラセミ体の１，２−ブタンジオールを用いて、実施例３と同様の方法によりデラセミ化反応を行った。反応終了後、反応液を硫酸アンモニウムで飽和させてから、酢酸エチルを加えて抽出を行い、抽出液中に残存する１，２−ブタンジオール含量を実施例１記載の方法により分析し、収率（％）を算出した。また、上記生成物をトリフルオロアセチル化した後、キャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析し、光学純度（％ｅ．ｅ．）を算出した。その結果、収率は８３％、光学純度は９９．２％ｅ．ｅ．（Ｓ）であった。【０１１５】
［光学純度の分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｄｅｘ  Ｇ−ＴＡ（２０ｍ×０．２５ｍｍ）（ＡＳＴＥＣ社製）
カラム温度：６０℃
注入温度：１５０℃
検出温度：１５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）
スプリット比：１００／１
検出時間：１，２−ブタンジオール  Ｒ体５．０分、Ｓ体５．８分。【０１１６】
（実施例５）（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの合成（大腸菌菌体を用いた酸化型補酵素の再生系、グルコース脱水素酵素による還元型補酵素再生系を併用）
ラセミ体の１，３−ブタンジオールを用いて、実施例３と同様の方法によりデラセミ化反応を行った。反応終了後、実施例４記載の方法で分析した結果、収率は７７．２％、光学純度は７２．３％ｅ．ｅ．（Ｓ）であった。【０１１７】
（実施例６）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（大腸菌菌体を用いた酸化型補酵素の再生系、グルコース脱水素酵素による還元型補酵素再生系を併用）
実施例１で得たE. coli HB101 (pTSCS)の培養液１００ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール７ｇ、実施例３で得たE. coli HB101 (pNTS1)の無細胞抽出液１０ｍｌ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５００Ｕ、ＮＡＤＰ＋  １０ｍｇ、及びグルコース１１．４ｇを５００ｍｌマイクロジャーに添加し、３０％水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．０に調整しながら、３０℃で６４時間攪拌した（３５０回転、通気：１ｍｌ／ｍｉｎ）。反応終了後、反応液を硫酸アンモニウムで飽和させ、酢酸エチルを加えて抽出を行い、抽出液を減圧濃縮した後、濃縮物を減圧蒸留して無色透明油状物６．８ｇを得た。実施例１記載の方法で分析した結果、収率は９６％、光学純度は９８．６％ｅ．ｅ．（Ｒ）であった。【０１１８】
（実施例７）（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（大腸菌菌体を用いた酸化型補酵素の再生系、グルコース脱水素酵素による還元型補酵素再生系を併用）
E. coli HB101 (pNTFP)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１６を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。【０１１９】
また、E. coli HB101 (pNTRG)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５７を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。この培養液５０ｍｌを遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．５ｍｌに懸濁した。その後、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕し無細胞抽出液を得た。【０１２０】
上記E. coli HB101 (pNTFP)の培養液２ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール６０ｍｇ、上記E. coli HB101 (pNTRG)の無細胞抽出液２００μｌ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１０Ｕ、ＮＡＤＰ＋  ０．２ｍｇ、及びグルコース８０ｍｇを栓付試験管に添加し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．０に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後、実施例１記載の方法で分析を行った結果、収率９８．７％、光学純度は４３．８％ｅ．ｅ．（Ｓ）であった。【０１２１】
（実施例８）ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターの作成及び組換え大腸菌の作成
大腸菌においてストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作成した。まず水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの構造遺伝子の開始部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終止コドンの直後に新たな終止コドンとＰｓｔＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。合成プライマーprimer-1（gaggatttgcatatgagtaaaatcgttattg：配列番号１）及びprimer-2（atgaaaacatgtgaattcccattgacatatc：配列番号２）の組み合わせ、更に合成プライマーprimer-3（gatatgtcaatgggaattcacatgttttcat：配列番号３）及びprimer-4（tttctgcagttatcatttagcttttaatgct：配列番号４）の組み合わせで、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＳＷ６１（Biosci. Biotech. Biochem., 60(1), 39-43, 1996参照）を鋳型としてＰＣＲを行い、それぞれ二本鎖ＤＮＡ（ａ），（ｂ）を合成した。更に前記合成プライマーprimer-1及びprimer-4を用い、上記で得た二本鎖ＤＮＡ（ａ），（ｂ）の混合物を鋳型にＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＰｓｔＩ消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＮＸをいた。ｐＮＴＮＸの作製法及び構造を図１に示す。本組換えベクターｐＮＴＮＸを用いてE. coli HB101（宝酒造株式会社製）を形質転換し、E. coli HB101 (pNTNX)を得た。【０１２２】
（実施例９）組換え大腸菌による水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの発現
実施例８で得たE. coli HB101 (pNTNX)を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及びグリセリン０．８％（ｗ／ｖ）を含む２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で培養し、集菌後、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕法により破砕し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＮＡＤＨオキシダーゼ活性を以下のように測定した。ＮＡＤＨオキシダーゼ活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＮＡＤＨ  ０．１７ｍＭ、ＥＤＴＡ  ０．２ｍＭ、ＦＡＤ  ０．０２ｍＭ及び酵素液０．０５ｍｌを含む反応液１．０ｍｌの３０℃での波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。その結果、上記無細胞中のＮＡＤＨオキシダーゼの比活性は３０Ｕ／ｍｇタンパクであった。【０１２３】
（実施例１０）バチルス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素とクリプトコッカス・ユニガツラタス由来のグルコース脱水素酵素の補酵素選択性
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）とクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcusuniguttulatus）のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（ＳＩＧＭＡ社製）について、補酵素ＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋に対する活性を調べた。１００ｍＭリン酸緩衝液、７５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を含む反応液９８０μｌにバチルス・メガテリウム（Bacillusmegaterium）由来のグルコース脱水素酵素またはクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のグルコース脱水素酵素を添加し、３０℃で反応を行い、３４０ｎｍの吸収増加を指標に、活性を測定した。その結果を表１に示す。表１から明らかなように、バチルス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素は補酵素に対して非特異的であり、クリプトコッカス・ユニガツラタス由来のグルコース脱水素酵素は、ＮＡＤＰ＋に特異的である。【０１２４】
【表１】
0004966189.tif 000013
【０１２５】
（実施例１１）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系、及びＮＡＤＰ＋特異的／非特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用）
実施例１と同様の方法で得たE. coli HB101 (pTSCS) 培養液、E. coli HB101 (pNTS1)培養液および実施例９で得たE. coli HB101 (pNTNX)の培養液から、遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。その後ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕し、遠心分離により破砕残渣を除去し、それぞれセルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）を調製した。【０１２６】
以下の３種のデラセミ化反応液を調製し、それぞれ１ｍｌを試験管中、２０℃で５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２０時間振盪した。
（１）１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、３０ｍｇラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール、４９ｍｇグルコース、０．７１ｍｇＮＡＤ＋、０．１５ｍｇＮＡＤＰ＋、前記ＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ５０Ｕ（３−クロロ−１，２−プロパンジオール酸化活性として）、前記ＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ３００Ｕ（３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン還元活性として）、及び、前記水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ６０Ｕ（グルコース脱水素酵素添加なし）。
（２）（１）の組成＋バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来の補酵素非特異的グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）  ３５Ｕ。
（３）（１）の組成＋クリプトコックス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（ＳＩＧＭＡ社製）  ３５Ｕ。【０１２７】
［３−クロロ−１，２−プロパンジオール酸化活性の測定条件］
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に３−クロロ−１，２−プロパンジオール１００ｍＭ、ＮＡＤ＋  ０．１７ｍＭ、及び酵素液０．０５ｍｌを含む反応液１．０ｍｌの３０℃での波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。
［３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン還元活性の測定条件］
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン２０ｍＭ、ＮＡＤＰＨ  ０．１７ｍＭ、及び酵素液０．０５ｍｌを含む反応液１．０ｍｌの３０℃での波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。【０１２８】
反応終了後、実施例１記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果を表２に示す。【０１２９】
【表２】
0004966189.tif 000014
【０１３０】
（実施例１２）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（５％仕込み：水生成型ＮＡＤＨオキシダを用いた酸化型補酵素再生系、及びＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用）
３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール５０ｍｇ、グルコース８１ｍｇ、ＮＡＤ＋  ０．７１ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  ０．１５ｍｇ、実施例１１で得たセルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）５０Ｕ（３−クロロ１，２−プロパンジオール酸化活性として）、キャンディダ・マグノリエ（Candidamagnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）３００Ｕ（３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン還元活性として）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）３００Ｕ、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（ＳＩＧＭＡ社製：還元型補酵素を再生する酵素）１００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２２時間反応させた。反応終了後、実施例１記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。  その結果、光学純度１００％の（Ｒ）−３−クロロ１，２−プロパンジオールが収率９５％で生成していた。【０１３１】
（実施例１３）（Ｓ）−１，２−ブタンジオールの合成（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系、及びＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用）
ラセミ体の３−クロロ１，２−プロパンジオールの代わりにラセミの体１，２−ブタンジオールを用いた以外は実施例１２と同様の方法で２３時間の反応を行った。反応終了後、実施例４記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％の（Ｓ）−１，２−ブタンジオールが収率９９．５％で生成していた。【０１３２】
（実施例１４）（Ｓ）−１−フェニルエタノールの合成（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系、及びＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用）
実施例７と同様の方法で得たE. coli HB101 (pNTF)の培養液およびE. coli HB101 (pNTRG)の培養液から、遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。その後ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕し、遠心分離により破砕残渣を除去し、それぞれキャンディダ・マリス（Candida maris）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）、およびロドトルラ・グリチニス（Rhodotorula glutinis）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）を調製した。【０１３３】
３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の１−フェニルエタノール１０ｍｇ、グルコース７．４ｍｇ、ＮＡＤ＋  ０．７１ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  ０．１５ｍｇ、前記ＮＡＤ＋特異的デヒドロゲナーゼ４０Ｕ（１−フェニルエタノール酸化活性として）、前記ＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ７０Ｕ（アセトフェノン還元活性として）、実施例８で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）４０Ｕ、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcusuniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（ＳＩＧＭＡ社製：還元型補酵素を再生する酵素）２０Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ８時間反応させた。反応液１００μｌを硫酸アンモニウムで飽和させた後、酢酸エチル７００μｌにより１−フェニルエタノールを抽出し、本抽出液中の１−フェニルエタノールの光学純度及び収率をＨＰＣＬにより分析した。その結果、光学純度９６．７％の（Ｓ）体−１−フェニルエタノールが収率９８％で生成していた。【０１３４】
［１−フェニルエタノール酸化活性の測定条件］
３−クロロ−１，２−プロパンジオールの代わりに１−フェニルエタノールを用いた以外は、実施例１１記載の酸化活性測定条件と同じ。【０１３５】
［アセトフェノン還元活性の測定条件］
３−クロロ−１−ヒドロキシアセトンの代わりにアセトフェノンを用いた以外は、実施例１１記載の還元活性測定条件と同じ。【０１３６】
［１−フェニルエタノールのＨＰＬＣ分析条件］
カラム：ダイセル化学工業社製、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌｌ  ＯＤ−Ｈ（０．４６×２５ｃｍ）
カラム温度：２５℃
溶離液：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９／１
流速：０．５ｍｌ／分
溶離時間：（Ｒ）体−１２．２分、  （Ｓ）体−１３．３分）。【０１３７】
（実施例１５）クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）ＪＣＭ３６８７株のＮＡＤＰ＋特異的グルコール脱水素酵素で形質転換された組換え大腸菌の調製
（１）酵素の精製
酵母エキス（日本製薬社製）５ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）７ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化アンモニウム１．０ｇ、塩化ナトリウム１．０ｇ、塩化カルシウム２水和物０．３３ｇ、硫酸第一鉄７水和物０．０００５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、スクロース１０ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地に、予め同一培地にて前培養しておいたクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）  ＪＣＭ３６８７株の培養液２ｍｌを無菌的に接種し３０℃で５０時間振とう培養した。得られた培養液５００ｍｌより遠心分離により菌体を集め５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、同緩衝液２００ｍｌに懸濁した。本菌体培養液をミニビードビーダー（ＢＩＯＳＰＥＣ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液２５０ｍｌを取得した。【０１３８】
この無細胞抽出液に氷冷下スターラーで攪拌しながら、所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム７０−１００％飽和で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。得られたタンパク質を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解し、同緩衝液により透析を行った後、これを同緩衝液で予め平衡化したＣＩＭ  ＤＥＡＥ−８（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製）カラムに供し、酵素を吸着させ、０Ｍから１．０Ｍまでの塩化ナトリウム濃度のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。得られた酵素液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により透析を行い、予め同緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラム６ｍｌに供し酵素を吸着させ、０Ｍから０．５Ｍまでの塩化ナトリウム濃度のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。得られた酵素液に硫酸アンモニウムを１．５Ｍになるまで添加し、次いで予め硫酸アンモニウム１．５Ｍを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＰＨＥ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムに供し、素通り画分を活性画分として集めた。【０１３９】
本活性画分を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ単一バンドを形成した。また、本酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量５８０００に相当する単一のバンドを形成した。【０１４０】
（２）グルコース脱水素酵素のクローニング
精製したクリプトコッカス・ユニグツラタスＪＣＭ３６８７株のグルコース脱水素酵素を８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片の配列をエドマン法により決定した。このアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を考慮し、ＰＣＲプライマー２種、primer-5（gagaagcagc acaagatyaargayca：配列番号５）及びprimer-6（catgtgrgcr agngargtraaytg：配列番号６）を合成した。【０１４１】
上記２種のプライマーを各５０ｐｍｏｌ、染色体ＤＮＡを８００ｎｇ、ｄＮＴＰ各２０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社製）２．０Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液１００μｌを調製し、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、１分）を２５サイクル行い、得られた約７５０塩基の増幅断片をpT7Blue-2 Vector（ノバジェン社製）にサブクローニングし、その配列を決定した（配列番号７）。【０１４２】
次に、グルコース脱水素酵素をコードするｃＤＮＡの全塩基配列等を決定するために、ここで決定した塩基配列（配列番号７）をもとに遺伝子配列特異的プライマー２種、primer-7（agttggccgagtacgttcagggagcgtatga：配列番号８）及びprimer-8（ggaaagcctc atcctcgtcatacgctccctg：配列番号９）を合成した。【０１４３】
前記（１）の項で示した培地６０ｍｌにあらかじめ同一培地にて前培養しておいたクリプトコッカス・ユニグツラタスＪＣＭ３６８７株の培養液３ｍｌを無菌的に接種し３０℃で６時間振とう培養した。培養菌体より、RNAgents Total RNA Isolation System（プロメガ社製）によって全ＲＮＡ  ４２４μｇを得た。得られた全ＲＮＡをOligotex-dT30カラム（タカラバイオ株式会社製）により精製しｍＲＮＡ  ４μｇを得た。得られたｍＲＮＡ  ２００ｎｇを用いてGeneRacer Kit（インビトロジェン社製）によりプロトコールに記載の方法でｃＤＮＡを調製した。【０１４４】
得られたｃＤＮＡ溶液２．５μｌ、前記primer-7、及び、GeneRacer Kit付属のGeneRacer3’ nestedプライマー（primer-9、cgctacgtaacggcatgacagtg：配列番号１０）各５０ｐｍｏｌ、又は、前記primer-8及びGeneRacer Kit付属のGeneRacer5’ nestedプライマー（primer-10、ggacactgacatggactgaaggagta：配列番号１１）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各２０ｎｍｏｌ、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）２．５Ｕを含むPyrobest DNA Polymerase用緩衝液１００μｌを調製し、熱変性（９６℃、２０秒）、アニーリング及び伸長反応（７２℃、９０秒）を４サイクル行い、引き続き熱変性（９６℃、２０秒）、アニーリング及び伸長反応（７０℃、９０秒）を４サイクル行い、更に引き続き熱変性（９６℃、２０秒）、アニーリング（５８℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、９０秒）を２０サイクル行い、４℃まで冷却後アガロースゲル電気泳動によりそれぞれの増幅ｃＤＮＡを確認した。増幅されたｃＤＮＡを各々QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）により抽出し、pCR4Blunt-TOPOベクター（インビトロジェン社製）にサブクローニングし、増幅ＤＮＡの配列決定を行い、該グルコース脱水素酵素をコードするｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。全塩基配列及び該DNAがコードする推定アミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号１２及び１３に示す。【０１４５】
（３）グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えベクターの作製
大腸菌においてグルコース脱水素酵素を発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ベクターに挿入する遺伝子を以下のように調製した。上記（２）の項で決定した塩基配列に基づき、グルコース脱水素酵素構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したprimer-11（acagacctgcccatatgtcgagca：配列番号１４）および終止コドン直後にＸｂａＩ部位を付加したprimer-12（ggacggcgtctagatttactgcaaa：配列番号１５）を合成した。【０１４６】
上記２種のプライマーを各５０ｐｍｏｌ、鋳型として上記（２）の項で調製したｃＤＮＡ溶液２．５μｌ、Pyrobest DNA Polymerase ２．５Ｕを含むPyrobest DNA Polymerase用緩衝液１００μｌを調製し、熱変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５７℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、３分）を２５サイクル行い、得られた増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）のｌａｃプロモーター下流のＮｄｅＩ及びＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＮＴＧＤＨ−Ｊ３６８７と命名した。【０１４７】
（４）組換え大腸菌の調製
前記プラスミドにより、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む２ｘＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ  ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で培養した後、遠心分離により菌体を集め５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁後、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液をＳＤＳ処理してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、分子量５８０００の位置に該酵素タンパク質のバンドを確認できた。【０１４８】
得られた組換え大腸菌をEscherichia coli HB101 (pNTGDH-J3687)と称する。なお、Escherichia coli HB101 (pNTGDH-J3687)は、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３７４の受託番号にて、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ：〒305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）に寄託されている（寄託日：２００５年１月２１日）。【０１４９】
（実施例１６）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系、及びＪＣＭ３６８７株由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用）
実施例１５で得たEscherichia coli HB101 (pNTGDH-J3687)  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３７４をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクトトリプトン  １．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス  １．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ  ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）に植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で、３０℃、３０時間培養した。遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに懸濁し、超音波破砕法により破砕し、無細胞抽出液を得、これをＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素源として、以下の反応に使用した。【０１５０】
３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール５０ｍｇ、グルコース８１ｍｇ、ＮＡＤ＋  ０．７１ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  ０．１５ｍｇ、実施例１１で得たセルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）５０Ｕ（３−クロロ１，２−プロパンジオール酸化活性として）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）３００Ｕ（３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン還元活性として）、実施例９と同様な方法で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）３００Ｕ、及び上記クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）  ＪＣＭ３６８７由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（還元型補酵素を再生する酵素）５０Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２０時間反応させた。反応終了後、実施例１記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。  その結果、光学純度１００％の（Ｒ）−３−クロロ１，２−プロパンジオールが収率９６％で生成していた。【０１５１】
（実施例１７）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系、及びＪＣＭ３６８７株由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用：小型培養装置中での反応）
３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール１２ｇ、グルコース１６ｇ、ＮＡＤ＋  １２ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １２ｍｇ、実施例１１と同様な方法で得たセルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）３６００Ｕ（３−クロロ１，２−プロパンジオール酸化活性として）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）１２０００Ｕ（３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン還元活性として）、実施例９と同様な方法で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）４８０００Ｕ、及び実施例１６と同様にして得たクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）  ＪＣＭ３６８７由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（ＳＩＧＭＡ社製：還元型補酵素を再生する酵素）３６００Ｕを含む反応液１２０ｍｌを２５０ｍｌ容の小型培養装置（三ツワ理化学工業（株））中で、２０℃、通気（１ｖｖｍ）、攪拌（９００ｒｐｍ）条件下、７．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整しながら、３４時間反応させた。その結果、光学純度１００％の（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールが収率９６％で生成していた。【０１５２】
（実施例１８）セルロモナス・スピーシーズ由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ遺伝子、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクター、及び組換え大腸菌の作成（２酵素共生産菌）
セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）の２酵素を大腸菌において共生産するために、形質転換に用いる組換えベクターを作成した。【０１５３】
まず、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの構造遺伝子の開始部分にＢａｍＨＩ部位とShine-Dalgarno配列（以下ＳＤ配列と略す）を付加し、かつ終止コドンの直後に新たな終止コドンとＰｓｔＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。【０１５４】
primer-13（cgcggatcctaaggaggttaacaatgagtaaaatcgttattgttggagc：配列番号１６）およびprimer-14（gcatgcctgcagttatcatttagcttt：配列番号１７）を用い、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を含有する実施例８で得たプラスミドｐＮＴＮＸを鋳型としてＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを得た。この二本鎖ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳＣＳ（ＷＯ０５／１２３９２１参照）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＴＳＣＳＮＸを得た。本組換えベクターｐＴＳＣＳＮＸをE. coli HB101（宝酒造株式会社製）を形質転換し、セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のデヒドロゲナーゼ、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの２酵素共生産菌E. coli HB101 (pTSCSNX)を得た。【０１５５】
（実施例１９）キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ遺伝子、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）ＪＣＭ３６８７由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素遺伝子を含むベクターの作成、及び組換え発現菌の作成（２酵素共生産菌）
キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的なグルコース脱水素酵素（還元型補酵素を再生する酵素）の２酵素を大腸菌において共生産するために、形質転換に用いる組換えベクターを作成した。【０１５６】
まず、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素遺伝子の開始部分にＸｂａＩ部位とＳＤ配列を付加し、かつ終止コドンの後ろにＨｉｎｄIII部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。primer-15（tgtctagacacacaggaaacacatatgtcgagcaccg：配列番号１８）およびprimer-16（agtaagcttatttactgcaaaccagccgtgtatccaaac：配列番号１９）を用い、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴＧＤＨ−Ｊ３６８７（実施例１５参照）を鋳型としてＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを得た。この二本鎖ＤＮＡをＸｂａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴＳ１（ＷＯ９８／０３５０２５参照）のＸｂａＩ、ＨｉｎｄIII部位に挿入することにより、組換えベクターｐＮＴＳ１Ｇ―Jを得た。本組換えベクターｐＮＴＳ１Ｇ―JをE. coli HB101（宝酒造株式会社製）を形質転換し、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のデヒドロゲナーゼおよびクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素の２酵素共生産菌E. coli HB101 (pNTS1G-J)を得た。【０１５７】
（実施例２０）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（２酵素共生産菌を組合せ使用）
実施例１８及び１９で得た２酵素共生産菌E. coli HB101 (pTSCSNX)および、E. coli HB101 (pNTS1G-J)をそれぞれ５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３０℃で３６時間振とう培養した。上記E. coli HB101 (pTSCSNX)および、E. coli HB101 (pNTS1G-J)の培養液５０ｍｌを遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌに懸濁した。【０１５８】
上記E. coli HB101 (pTSCSNX)および、E. coli HB101 (pNTS1G-J)菌体懸濁液８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール７０ｍｇ、グルコース１１４ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２０時間反応させた。反応終了後、実施例1記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールが収率９７％で生成していた。【０１５９】
（実施例２１）セルロモナス・スピーシーズ由来グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子、キャンディダ・マグノリエ由来デヒドロゲナーゼ遺伝子、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えベクター、及び組換え大腸菌の作製（３酵素共生産菌）
セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的なグルコース脱水素酵素（還元型補酵素を再生する酵素）の３酵素を大腸菌において共生産させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作成した。【０１６０】
まず、セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のデヒドロゲナーゼの構造遺伝子の開始部分にＥｃｏＲＩ部位とＳＤ配列を付加し、かつ終止コドンの直後に新たな終止コドンとＸｂａＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。primer-17（aagccgaattctaaggaggttaacaatgtccgaggttcccgtccg：配列番号２０）及びprimer-18（ttgcgtctagattatcagtgggcggtgtgcttga：配列番号２１）を用い、セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳＣＳ（ＷＯ０５／１２３９２１参照）を鋳型としてＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを得た。この二本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴＳ１（ＷＯ９８／０３５０２５参照）のＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＮＴＳ１ＣＳを得た。【０１６１】
次に、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素の構造遺伝子の開始部分にＸｂａＩ部位とＳＤ配列を付加し、かつ終止コドンの直後にＨｉｎｄIII部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。primer-19（aagcctctagataaggaggttaacaatgtcgagcaccgaatttca：配列番号２２）及びprimer-20（ttgcgaagcttttagggaagcgtgtagccac：配列番号２３）を用い、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴＧＤＨ−Ｊ３６８７（実施例１５参照）を鋳型としてＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを得た。この二本鎖ＤＮＡをＸｂａＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、上述のｐＮＴＳ１ＣＳのＸｂａＩ、ＨｉｎｄIII部位に挿入することにより、組換えベクターｐＮＴＳ１ＣＳＧＰを得た。【０１６２】
本組換えベクターｐＮＴＳ１ＣＳＧＰを用いてE. coli HB101（宝酒造株式会社製）を形質転換し、３酵素共生産菌E. coli HB101 (pNTS1CSGP)を得た。【０１６３】
（実施例２２）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（３酵素共生産菌と水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系を併用）
実施例２１で得た３酵素共生産菌E. coli HB101 (pNTS1CSGP)を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３０℃で３６時間振とう培養した。上記培養液５０ｍｌを遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌに懸濁した（１２．５倍濃縮菌体）。【０１６４】
上記濃縮菌体８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール７０ｍｇ、グルコース１１４ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、及び実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ３００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２1時間反応させた。反応終了後、実施例１記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールが収率１００％で生成していた。【０１６５】
（実施例２３）（Ｓ）−１，２−プロパンジオールの合成（３酵素共生産菌と水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系を併用）
実施例２２で得た濃縮菌体８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の１，２−プロパンジオール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、及び実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ３００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２1時間反応させた。反応終了後、反応液を硫酸アンモニウムで飽和させてから、酢酸エチルを加えて抽出を行い、抽出液中に残存する１，２−プロパンジオール含量をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析し、収率を算出した。また、上記生成物をトリフルオロアセチル化した後、キャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析し、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−１，２−プロパンジオールが収率９８％で生成していた。【０１６６】
［含量の分析条件］
カラム：ＨＰ−５  ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．（Agilent Technologies社製）
検出：ＦＩＤ
カラム温度：７０℃
注入温度：１５０℃
検出温度：１５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（１５０ｋＰａ）
スプリット比：１００／１
［光学純度の分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｄｅｘ  Ｇ−ＰＮ（３０ｍ×０．２５ｍｍ）（ＡＳＴＥＣ社製）
カラム温度：７０℃
注入温度：１５０℃
検出温度：１５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）
スプリット比：１００／１【０１６７】
（実施例２４）（Ｓ）−１，２−ブタンジオールの合成（３酵素共生産菌と水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系を併用）
実施例２２で得た濃縮菌体８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の１，２−ブタンジオール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、及び実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ３００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ５時間反応させた。反応終了後、実施例２３記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−１，２−ブタンジオールが収率９８％で生成していた。【０１６８】
（実施例２５）（Ｓ）−１，２−ペンタンジオールの合成（３酵素共生産菌と水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系を併用）
実施例２２で得た濃縮菌体８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の１，２−ペンタンジオール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、及び実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ３００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２時間反応させた。反応終了後、実施例２３記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−１，２−ペンタンジオールが収率９６％で生成していた。【０１６９】
（実施例２６）（Ｓ）−１，２−ヘキサンジオールの合成（３酵素共生産菌と水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系を併用）
実施例２２で得た濃縮菌体８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の１，２−ヘキサンジオール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、及び実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ３００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ５時間反応させた。反応終了後、実施例２３記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−１，２−ヘキサンジオールが収率９８％で生成していた。【０１７０】
（実施例２７）（Ｓ）−４−メチル−１，２−ペンタンジオールの合成（３酵素共生産菌と水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系を併用）
実施例２２で得た濃縮菌体８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の４−メチル−１，２−ペンタンジオール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、及び実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ３００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２７時間反応させた。反応終了後、実施例２３記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度８１．３％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−４−メチル−１，２−ペンタンジオールが収率１００％で生成していた。【０１７１】
（実施例２８）（Ｓ）−１−フェニル−１，２−エタンジオールの合成（３酵素共生産菌と水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系を併用）
実施例２２で得た濃縮菌体８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の１−フェニル−１，２−エタンジオール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、及び実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ３００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２７時間反応させた。反応終了後、実施例２３記載と同様の方法（含量分析：カラム温度  １５０℃、光学純度分析：カラム温度  ８０℃）で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度９３.３％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−１−フェニル−１，２−エタンジオールが収率１００％で生成していた。【０１７２】
（実施例２９）（Ｓ）−４−フェニル−１，２−ブタンジオールの合成（３酵素共生産菌と水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系を併用）
実施例２２で得た濃縮菌体８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の４−フェニル−１，２−ブタンジオール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、及び実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ３００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２７時間反応させた。反応終了後、実施例２３記載と同様の方法（含量分析：カラム温度  １８０℃、光学純度分析：カラム温度  １１５℃）で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−４−フェニル−１，２−ペンタンジオールが収率９７％で生成していた。【０１７３】
（実施例３０）（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系、及びＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用）
E. coli HB101 (pTSOB)  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６１、及びE. coli HB101 (pNTGDH-J3687)   ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３７４（実施例１５参照）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）でそれぞれ培養し、集菌後１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。その後ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕し、遠心分離により破砕残渣を除去してオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を調製した。【０１７４】
３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール７０ｍｇ、グルコース１１４ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、前記オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）７Ｕ（３−クロロ−１，２−プロパンジオール酸化活性として）、実施例１４で得たロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）６００Ｕ（３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン還元活性として）、実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）３００Ｕ、及び前記クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（還元型補酵素を再生する酵素）２５Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２９時間反応させた。反応終了後、実施例１記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度９９．２％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−３−クロロ１，２−プロパンジオールが収率９２％で生成していた。【０１７５】
（実施例３１）（Ｒ）−２−ペンタノールの合成（ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系、及びＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用）
３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の２−ペンタノール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、実施例３０で得たオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）７Ｕ（３−クロロ−１，２−プロパンジオール酸化活性として）、実施例１１で得たキャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）１００Ｕ（３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン還元活性として）、実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）３００Ｕ、及び実施例３０で得たクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（還元型補酵素を再生する酵素）３０Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２時間反応させた。反応終了後、実施例２３記載と同様の方法（含量分析、光学純度分析：カラム温度  ３０℃）で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−ペンタノールが収率１００％で生成していた。【０１７６】
（実施例３２）（Ｒ）−１−フェニルエタノールの合成（ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系、及びＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用）
３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の１−フェニルエタノール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、実施例３０で得たオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）７Ｕ（３−クロロ−１，２−プロパンジオール酸化活性として）、実施例１１で得たキャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）１００Ｕ（３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン還元活性として）、実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）３００Ｕ、及び実施例３０で得たクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（還元型補酵素を再生する酵素）３０Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２時間反応させた。反応終了後、実施例１４記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度９９．７％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−１−フェニルエタノールが収率９８％で生成していた。【０１７７】
（実施例３３）（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの合成（ＮＡＤＨオキシダーゼを用いた酸化型補酵素再生系、及びＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素を用いた還元型補酵素再生系を併用）
３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の１，３−ブタンジオール１０ｍｇ、グルコース４０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、実施例３０で得たオクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）７Ｕ（３−クロロ−１，２−プロパンジオール酸化活性として）、実施例１１で得たキャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）１００Ｕ（３−クロロ−１−ヒドロキシアセトン還元活性として）、実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）３００Ｕ、及び実施例３０で得たクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素（還元型補酵素を再生する酵素）３０Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ８時間反応させた。反応終了後、実施例４記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度７６．８％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−１，３−ブタンジオールが収率７０％で生成していた。【０１７８】
（実施例３４）オクロバクトラム・スピーシーズ由来デヒドロゲナーゼ遺伝子、ロドトルラ・グルチニス由来デヒドロゲナーゼ遺伝子、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えベクター、及び組換え大腸菌の作製（３酵素共生産菌）
オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的なグルコース脱水素酵素（還元型補酵素を再生する酵素）の３酵素を大腸菌において共生産させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作成した。【０１７９】
まず、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）由来のデヒドロゲナーゼの構造遺伝子の開始部分にＢａｍＨＩ部位とＳＤ配列を付加し、かつ終止コドンの直後に新たな終止コドンとＸｂａＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。配列primer-21（aagccggatcctaaggaggttaacaatgcccgcagcaaagactta：配列番号２４）及びprimer-22（ttgcgtctagattactaccacggcacggtcttgc：配列番号２５）を用い、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）由来のデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴＲＧ（ＷＯ０３／０９３４７７参照）を鋳型としてＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを得た。この二本鎖ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、オクロバクトラム・スピーシーズ（Ochrobactrum sp.）由来のデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳＯＢ（図２参照）のＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＴＳＯＢＲＧを得た。【０１８０】
次に、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素の構造遺伝子の開始部分にＸｂａＩ部位とＳＤ配列を付加し、かつ終止コドンの直後にＳｐｈＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。前記primer-19（配列番号２２）及びprimer-23（ttgcggcatgcttactgcaaaccagccgtgt:配列番号２６）を用い、クリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的グルコース脱水素酵素遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴＧＤＨ−Ｊ３６８７（実施例１５参照）を鋳型としてＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを得た。この二本鎖ＤＮＡをＸｂａＩ及びＳｐｈＩで消化し、上述のｐＴＳＯＢＲＧのＸｂａＩ、ＳｐｈＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＴＳＯＢＲＧＧＰを得た。本組換えベクターｐＴＳＯＢＲＧＧＰを用いてE. coli HB101（宝酒造株式会社製）を形質転換し、３酵素共生産菌E. coli HB101 (pTSOBRGGP)を得た。【０１８１】
（実施例３５）（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（三３酵素共生産菌と水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを併用）
実施例３４で得た３酵素共生産菌E. coli HB101 (pTSOBRGGP)を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３０℃で３６時間振とう培養した。上記培養液５０ｍｌを遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌに懸濁した（１２．５倍濃縮菌体）。【０１８２】
上記濃縮菌体８０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール７０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １ｍｇ、及び実施例９で得たストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ３００Ｕを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２７時間反応させた。反応終了後、実施例１記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度９９．８％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールが収率１００％で生成していた。【０１８３】
（実施例３６）セルロモナス・スピーシーズ由来グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子、ストレプトコッカス・ミュータンス由来ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子、キャンディダ・マグノリエ由来デヒドロゲナーゼ遺伝子、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えベクター、及び組換え大腸菌の作製（４酵素共生産菌）
セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）由来のＮＡＤ＋特異的なグリセロールデヒドロゲナーゼ（酸化酵素）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（酸化型補酵素を再生する酵素）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoriae）由来のＮＡＤＰＨ特異的なデヒドロゲナーゼ（還元酵素）、及びクリプトコッカス・ユニグツラタス（Cryptococcus uniguttulatus）由来のＮＡＤＰ＋特異的なグルコース脱水素酵素（還元型補酵素を再生する酵素）の４酵素を大腸菌において共生産させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作成した。【０１８４】
まず、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの構造遺伝子の開始部分にＨｉｎｄIII部位とＳＤ配列を付加し、かつ終止コドンの直後に新たな終止コドンとＨｉｎｄIII部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。合成プライマーprimer-24（aagccaagctttaaggaggttaacaatgagtaaaatcgttattgt：配列番号２７）及びprimer-25（ttgccaaaataagtttctcatagcttt：配列番号２８）の組み合わせ、更にprimer-26（aaagctatgagaaacttattttggcaa：配列番号２９）及びprimer-27（ttgcgaagcttttatcatttagcttttaatgctg：配列番号３０）の組み合わせで、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴＮＸを鋳型としてＰＣＲを行い、それぞれ二本鎖ＤＮＡ（ｃ），（ｄ）を合成した。更に前記primer-16（配列番号１９）及び前記primer-19（配列番号２２）を用い、上記で得た二本鎖ＤＮＡ（ｃ），（ｄ）の混合物を鋳型にＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄIIIで消化し、実施例２１に記載のプラスミドｐＮＴＳ１ＣＳＧＰのＨｉｎｄIII部位に挿入することにより、組換えベクターｐＮＴＳ１ＣＳＧＰＮＸを得た。本組換えベクターｐＮＴＳ１ＣＳＧＰＮＸを用いてE. coli HB101を形質転換し、４酵素共生産菌E. coli HB101 (pNTS1CSGPNX)を得た。【０１８５】
（実施例３７）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（４酵素共生産菌を使用）
実施例３６で得た４酵素共生産菌E. coli HB101 (pNTS1CSGPNX)を５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３０℃で３６時間振とう培養した。上記E. coli HB101 (pTSCSNX)および、E. coli HB101 (pNTS1G-J)の培養液５０ｍｌを遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌに懸濁した。【０１８６】
上記E. coli HB101 (pNTS1CSGPNX)菌体懸濁液１２０μｌ、３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール７０ｍｇ、グルコース１１４ｍｇ、ＮＡＤ  ＋１ｍｇ、ＮＡＤＰ  ＋１ｍｇを含む反応液１ｍｌを試験管中で２０℃で振盪し、５Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整しつつ２０時間反応させた。反応終了後、実施例1記載の方法で分析し、収率、光学純度を算出した。その結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールが収率９５％で生成していた。【０１８７】
（比較例１）（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（酸化反応）
実施例２で得たE. coli HB101 (pTSCS)の無細胞抽出液１ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール１０ｍｇ、及びＮＡＤ＋  ３５ｍｇを栓付試験管に添加し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ８．０に調整しながら、３０℃で９２時間攪拌した。反応終了後、実施例１と同様の方法で分析を行った結果、収率は６０％、光学純度は４８．６％ｅ．ｅ．（Ｒ）であった。【０１８８】
（比較例２）酸化型補酵素の再生に大腸菌のＮＡＤ再生能を利用した、（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（酸化反応）
実施例１で得たE. coli HB101 (pTSCS)の培養液１ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール１０ｍｇを栓付試験管に添加し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ８．０に調整しながら、３０℃で９２時間攪拌した。反応終了後、比較例１と同様の方法で分析を行った結果、収率４１％、光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．（Ｒ）であった。【０１８９】
（比較例３）酸化型補酵素の再生にアミノ酸脱水素酵素を利用した、（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（酸化反応）
実施例２で得たE. coli HB101 (pTSCS)の無細胞抽出液１ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール１０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １．０ｍｇ、ロイシン脱水素酵素（ＳＩＧＭＡ社製）１０Ｕ、α−ケトイソ吉草酸ナトリウム１５．２ｍｇ、及び塩化アンモニウム５．３ｍｇを栓付試験管に添加し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ８．０に調整しながら、３０℃で９２時間攪拌した。反応終了後、比較例１と同様の方法で分析を行った結果、収率３７％、光学純度は９７．１％ｅ．ｅ．（Ｒ）であった。【０１９０】
（比較例４）酸化型補酵素の再生にＮＡＤＨオキシダーゼを利用した、（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成（酸化反応）
実施例２で得たE. coli HB101 (pTSCS)の無細胞抽出液１ｍｌ、ラセミ体の３−クロロ−１，２−プロパンジオール１０ｍｇ、ＮＡＤ＋  １．０ｍｇ、過酸化水素生成型ＮＡＤ  Ｈオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）１Ｕ、及びカタラーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）２０Ｕを栓付試験管に添加し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ８．０に調整しながら、３０℃で９２時間攪拌した。反応終了後、比較例１と同様の方法で分析を行った結果、４１％、光学純度は６４．９％ｅ．ｅ．（Ｒ）であった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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