(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質部分を有さないタンパク質またはペプチドをＨＯＣｌまたはＮａＯＣｌと反応せしめることによって製造された酸化タンパク質またはペプチドを含む医薬組成物、ここで、該酸化タンパク質またはペプチドは酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡまたは酸化ヒトアルブミンであり、該組成物は血小板を活性化するためのものである。
【請求項２】
脂質部分を有さないタンパク質またはペプチドをＨＯＣｌまたはＮａＯＣｌと反応せしめることによって製造された酸化タンパク質またはペプチドを含む医薬組成物、ここで、該酸化タンパク質またはペプチドは酸化抗トロンビンＩＩＩであり、該組成物はＨＩＶ−１感染を治療または予防するためのものである。
【請求項３】
さらに医薬的に許容し得る充填剤および／または賦形剤を含むことを特徴とする、請求項１または２の医薬組成物。
【請求項４】
局所、皮内、表面、腹膜内、静脈、経口または筋内投与用に処方され、または小胞により投与されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの医薬組成物。
【請求項５】
抗生物質または免疫抑制剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの医薬組成物。
【請求項６】
請求項１または２の医薬組成物を製造するために酸化タンパク質またはペプチドを製造する方法であって、脂質部分を有さないタンパク質またはペプチドをＨＯＣｌまたはＮａＯＣｌと反応せしめることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、酸化タンパク質のＣＤ３６への結合を阻害する物質、またはＣＤ３６と酸化タンパク質との相互作用によって誘導されたＣＤ３６の機能を阻害する物質、およびヒト用および動物用の薬物としてのそれらの使用に関する。
【０００２】
タンパク質の酸化的修飾は、アロテーム性動脈硬化 (動脈硬化)および神経変性疾患から、加齢それ自身のプロセスにわたる多様な疾患の病因に関する重大なステップとみなされている(Holvoet and Collen, 1997 Curr Opin lipidol, Witztum and Steinberg 1991, J Clin Invest 88, 1785-92, Smith MA et al., 1996, Nature, Oxidative damage in Alzheimers, Stadtmann ER, Protein Oxidation and Aging, 1992, Science 257: 1220-24)。血中の高ＬＤＬ濃度は、動脈硬化性血管疾患の発生について主なリスクファクターであると考えられている (Brown MS, Goldstein IL, 1986, Science 232: 34-37)。
【０００３】
しかし、今日、ＬＤＬそれ自身ではなく、その酸化形が、動脈硬化に導く疾患に変化させる決定的な起因物であると考えられる圧倒的な証拠がある(Steinberg D, Circulation 95: 1062-71, 1997)。米国特許出願番号５,７５６,０６７では、進行性動脈硬化についてのリスクマーカーとして、コレステロール、トリグリセリドおよびリポタンパク質の測定は、不充分であることが開示された。これは、動脈硬化を基にした全ての心臓疾患のおおよそ半分が、正常な血漿トリグリセリドおよび正常なコレステロール値を示す患者に存在すること、そして、さらに動脈硬化が、正常な脂質値を有する患者において血管造影法で示され得ることが理由である。そのため、現在までに開示されていないプロセスが、動脈硬化の発生における原因となる役割をはたしている違いない。
【０００４】
ＬＤＬにおける脂質の酸化は、イン・ビトロ（例えば、酸化銅によって誘導された酸化など）またはイン・ビボのいずれかにおいて、反応性アルデヒドの形成を導く(ＷＯ９８／５９２４８)。マクロファージによる酸化ＬＤＬ(oxＬＤＬ)の取込みが、いわゆる泡沫細胞の形成、すなわち動脈硬化の発生における初期ステップとみなされるプロセスをもたらす(ＷＯ９８／５９２４８)。
【０００５】
ＬＤＬの脂質部分の酸化は、このプロセスに関与すると考えられている。そのため、酸化されたＬＤＬは、動脈硬化の形成を研究するために、ほとんどの科学者によってＣｕＳＯ４またはマロンジアルデヒドの添加により誘導される、脂質過酸化の最終産物である。冠動脈の一次的な心臓疾患または移植に関連した冠動脈の心臓疾患の患者の血漿中の酸化ＬＤＬ濃度は、その疾患の進行に密接に対応するが、健康な対照のヒトでは高い酸化ＬＤＬレベルが全く測定され得ない(Holvoet et al., Circulation 98: 1487-94, 1998)。また、慢性腎臓疾患および移植拒絶反応は、高い酸化ＬＤＬレベルと関連する(Holvoet, Collen Thromb Haemost 76(5): 663-9, 1996 + ATVB 18(1) 100-7, 1998)。
【０００６】
また、ＬＤＬのタンパク質部分の酸化は、生理学的/病理学的修飾に導き得る。即ち、脱脂質化ＨＯＣｌ-酸化ＬＤＬは、マクロファージにおいて酸化的バーストを誘導し(Nguyen-Khoa et al., BBRC 263: 804-9, 1999)、ＨＯＣｌ-酸化ＬＤＬが血小板凝集に導く(Volf et al., ATVB 20(8): 2011-18, 2000)。
【０００７】
反応性オキシダントは、食細胞によって身体から放出され得、そして発病性物質、腫瘍モニタリングおよび全ての炎症性プロセスに対する防御において決定的な役割を担う(Babior, NEJMed 298: 659663, 1978, Weiss J, NEJMed 320: 365-376, 1989)。顆粒性白血球および単核白血球のような"専門的な"食細胞に加えて、内皮細胞または平滑筋細胞などの他の細胞もまた反応性オキシダントを産生し、放出する。
【０００８】
これらの酸化性物質の中には、Ｏ２、スーパーオキシド、過酸化水素、過酸化硝酸塩、ＯＨ-ラジカル（類）、過塩素酸ＨＯＣｌ、Ｃｌ２-ガスおよびクロラミンがある。どのプロセスが、これら酸化性物質の発生に詳細に寄与するかは不明瞭なままである。セルロプラスミン、１５-リポキシゲナーゼ(lipooxygenase)、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)および一酸化窒素合成酵素(ＮＯ-Ｓ)が、動物およびヒトにおいて動脈硬化性病変で見出されたし、ＬＤＬの酸化に寄与しているのかも知れない(Carr et al., ATVB 20:1716-23, 2000)。起こり得る酸化経路はＭＰＯを包含する。ＭＰＯ、即ちヘモ-タンパク質酵素は、ハロゲン化物および過酸化物である(Carr et al.,)。ミエロペルオキシダーゼの最もよく記載される生成物は、次亜塩素酸 ＨＯＣｌ-、Ｃｌ− + Ｈ２Ｏ２ ＋ Ｈ＋ → ＨＯＣｌ ＋ Ｈ２Ｏ、である。次亜塩素酸塩-修飾タンパク質、特にＨＯＣｌ-酸化ＬＤＬは、動脈硬化性病変で見出される(Hazell et al., 1996)。タンパク質のＨＯＣｌ修飾は、他の疾患、例えば関節部分の炎症性疾患(Davies et al., Free-Radical-Biol-Med 15(6): 637-43, 1993)、凝集不全(トロンボモジュリンの酸化) (Glaser et al., J Clin Invest 90(6): 2565-73, 1992)、広く炎症反応における顆粒性白血球によって媒介される組織破壊 (Schraufstatter et al., J Clin Invest 85(2): 554-62, 1990)、虚血、再灌流損傷(Samanta et al., Fee Radic Res Commun 7(2): 73-82, 1989)、糸球体腎炎 (Shah et al., J Clin Invest 79(1): 25-31, 1987)および免疫調節(ＮＫ-細胞-アポトーシス) (Hansson et al., J Immunol 156(1): 42-7, 1996) において、ある役割をはたす。
【０００９】
ＣＤ３６は、糖タンパク質ＩＩＩｂ(ＧＰＩＩＩｂ)または糖タンパク質ＩＶ(ＧＢＩＶ)とも呼ばれており、血小板、内皮細胞、単核白血球、赤芽細胞、上皮細胞およびいくつかの腫瘍細胞系、例えば、黒色腫細胞および骨肉腫細胞の主要な糖タンパク質である(Asch et al J. Clin. Invest. 79:1054-1061 (1987), Knowles et al., J. Immunol. 132, 2170-2173 (1984), Kieffer et al., Biochem. J. 262:835-842 (1989))。ＣＤ３６はクラスＢスカベンジャー受容体のファミリーに属している。また、そのファミリーのメンバーは、一体化リソソーム膜タンパク質ＬＩＭＰ-ＩＩ(lyspspmal integral membrane protein II, Vega, et al., 1991)、ＣＬＡ‐１(CD36 and LIMP-II analogous, Calvo and Vega 1993)、含脂肪細胞膜ＦＡＴタンパク質 (Abumrad et al., 1993)、胸部上皮細胞からのＰＡＳＩＶ(Greenwalt et al., 1990 and 1992)およびＳＲ-Ｂ１(Acton et al., (1994)を包含する。
【００１０】
含脂肪細胞のＦＡＴタンパク質は、長鎖脂肪酸の結合および輸送に関与する。ＰＡＳ ＩＶタンパク質は、哺乳期胸部上皮細胞の一体化膜タンパク質であり、舌尖細胞膜に集中している。トリグリセリドの分泌によって、それは、乳汁に達し、乳脂肪小球体膜(ＭＦＧＭ)画分に見出される。ＰＡＳＩＶの配列は、ほとんどＣＤ３６と同じであるが、グリコシル化において異なる。
【００１１】
ＳＲ-Ｂ１は、ＬＤＬのためのスカベンジャー受容体である(Acton et al., 1994)。ＣＤ３６は、還元および非還元条件において、見かけの分子量８８,０００を持つ、一本の重グリコシル化ポリペプチド鎖からなり、４.４〜６.３の範囲の等電点を持つ (McGregor et al., 1980, Clementson 1987)。明確に定義された等電点を測定することができない理由は、シアリル酸の含量が変化し得るからである(McGregor et al.,1981)。２６％の炭水化物部および強い疎水性が、そのタンパク質が膜中に位置する限りプロテアーゼによる分解に対する高い抵抗性をＣＤ３６に与える(Greenwalt et al., 1992)。これは、このタンパク質が、炎症性プロセスが起きる部位では攻撃から保護されるという所見を説明するものである。ＣＤ３６は、Ｎ-およびＯ-結合グリコシド化修飾を持つ。プラセンタｃＤＮＡから誘導されたＣＤ３６に関するアミノ酸配列は、複数の疎水性領域と２つのおそらく膜内外領域を示す(Oquendo et al., 1989)。
【００１２】
ある機能がＣＤ３６について仮定されてきた。それは、コラーゲンに対する受容体として説明されてきた(Tandon et al., 1989)。精製されたＣＤ３６はコラーゲン タイプＩのフィブリルに結合し、そしてＣＤ３６に対するポリクローナル抗体のＦａｂフラグメントはコラーゲン-誘導凝集を阻害する。
【００１３】
しかし、ＣＤ３６を欠く血小板の分析は、ＣＤ３６がコラーゲンによる血小板の活性化に厳密には必要としないことを示す。J.J. Sixma (Utrecht)グループの研究者と我々の合同実験は、ヘパリン血液および生理学的Ｃａ２＋濃度を用いる場合、静止系、または灌流チャンバーにおいて低、中または高の剪断速度の影響下において、ウシまたはヒトコラーゲン タイプＩまたはＩＩＩへの付着にＣＤ３６-欠損血小板と対照血小板は全く違いがないことを示した(Saelman et al., 1994)。
【００１４】
ＣＤ３６欠損血小板は、角コラーゲン、ウマタイプＩおよびタイプＩＩＩコラーゲンの混合物および精製したウシおよびヒトコラーゲンタイプＩおよびＩＩＩと、正常に凝集する (Kehrel et al., 1991 and 1993)。タイプＩまたはＩＩＩコラーゲンによって誘導されたα-顆粒および密集顆粒のこれら分泌は、ＣＤ３６欠損血小板と対照血小板における違いはなかった(Kehrel et al., 1993)。Danielと共同研究者らは、ＣＤ３６欠損血小板および対照血小板におけるコラーゲンタイプＩを用いる活性化後のシグナルトランスダクションが同じであることを示した(Daniel et al., 1993)。
【００１５】
ＣＤ３６は、トロンボスポンジン−１(ＴＳＰ−１)の受容体である(Asch et al., 1987, McGregor et al.,1989)。静止期、血小板ＣＤ３６トレオニン (９２)はリン酸化される。脱リン酸化はトロンボスポンジンの結合を可能にする(Asch, Science 1993)。精製されたＣＤ３６は、特異的にトロンボスポンジンに結合する。この結合は、Ｃａ２＋依存性であり、ＲＧＥペプチドによって阻害され得ない。このモノクローナル抗体ＯＫＭ５は、ＣＤ３６に指向するものでトロンビンによって活性化された血小板へのトロンボスポンジンの結合を阻害する(Asch et al., 1989)。Leungおよび共同研究者はＣＤ３６上の２つのペプチド領域がトロンボスポンジンの結合に影響を与えることを報告している。ペプチド１３９-１５５は、血漿中の血小板凝集を増強するし、これはＡＤＰまたはコラーゲンによって誘導される血小板を多く含む。しかし、ペプチド９３-１１０部分は、コラーゲン誘導凝集を部分的に阻害し、そしてＣＤ３６の固定化トロンボスポンジンへの結合をも阻害する。このペプチドは、自身でトロンボスポンジンに結合できないが、ペプチド１３９-１５５の存在下では可能である(Leung et al., 1992, Pearce et al., 1993)。トロンボスポンジンの配列ＳＶＴＣＧは高い親和性を持ってＣＤ３６と結合する(Li et al., 1993)。Silverstein (1992)らは、"センス"および"アンチセンス" 形質転換黒色腫細胞を用いる実験によるトロンボスポンジン結合に対するＣＤ３６の関連を示した。ＣＤ３６上のトロンボスポンジンに対する結合部位はアミノ酸９３-１２０である(Frieda et al., 1995)。
【００１６】
ＣＤ３６は、また一方では血小板、内皮細胞、単核白血球またはＣ３２黒色腫細胞の間の、そして他方ではマラリア寄生虫 Plasmodium falciparumに感染した赤血球間の結合メディエーターとして記載されている(Barnwell et al., 1989)。感染赤血球のイモムシの内皮細胞への結合、いわゆる腐骨形成は、腐骨形成が脳で起こる場合、熱帯マラリアの致命的末期に対する決定的な意味を持つものである(脳性マラリア)。感染赤血球は、固定化された精製ＣＤ３６(Ockenhouse et al., 1989)に結合する。ＣＤ３６のｃＤＮＡが発現されたＣＯＳ細胞は、マラリア-感染赤血球に結合し得る(Oquendo et al., 1989)。モノクローナル抗-ＣＤ３６抗体ＯＫＭ５に対する抗-遺伝子型抗体、感染赤血球に対する結合パートナーによって、sequestrineが見出された(Ockenhouse et al., 1991)。感染赤血球との接触により、血小板および単核白血球が活性化する(Ockenhouse et al., 1989)。ＣＤ３６-欠損血小板は、Tandonら(1991)によると、感染赤血球に対する結合能を全く示さない。対して、我々はＥＤＴＡの存在下では、結合が分裂されるのみであることを観察した。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋の存在下において、我々は、ロゼッタ様熱帯マラリア感染赤血球およびＣＤ３６-欠損血小板をはっきりと確認することができた（Kronenberg et al., 1992)。
【００１７】
ＣＤ３６に加えて、さらにマラリア感染赤血球についての結合メディエーターが記載されており、それらの中にはトロンボスポンジンがある。トロンボスポンジンは、この機能に対して二価のカチオンを必要とする(Berendt et al., 1989, Roberts et al., 1985)。トロンボスポンジンは、我々によって観察されたＣＤ３６-欠損血小板の感染赤血球への結合を媒介することが可能である。熱帯マラリア感染赤血球のＣＤ３６への結合は、ＣＤ３６ペプチド１４５-１７１および１５６-１８４によって阻害される(Baruch et al., 1999)。また、シグナルトランスダクションにおけるＣＤ３６の役割がしばしば説明される(Shattil and Brugge 1991)。静止血小板由来のＣＤ３６の免疫沈降において、src遺伝子ファミリー、ｐｐ６０ｆｙｎ、ｐｐ６２ｙｅｓおよびｐｐ５４/５８ｌｙｎのチロシンキナーゼが共沈され、これはＣＤ３６との密接な関連を示す (Huang et al., 1991)。この発見の意味するところはいまだ不明確である。ＣＤ３６に対するいくつかの抗体は、血小板および単核白血球を活性化する(Aiken et al., 1990, Schueepp et al., 1991)。ＩｇＭ抗体ＮＬＯ７は、補体システムの助けによって血小板を活性化する（Alessio et al., 1993)。ＣＤ３６のさらなる機能として、血栓症の血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)におけるその役割が説明されている(Lian et al., 1991)。ＴＴＰ患者の血漿中に存在するタンパク質(ｐ３７)は、ＣＤ３６によって媒介された血小板を凝集させる。この知見に関する意味することはいまだ不明確である。トロンボスポンジン由来のペプチドＶＴＣＧは、トロンビンを用いて活性化された血小板におけるホスファチジルイノシトール(３,４)ビスホスフェート合成を阻害する。ＣＤ３６は、ＰＩ-３-キナーゼおよびホスホリパーゼＣの後の活性化を媒介するトロンボスポンジン受容体のうちの一つである (Trumel, Payrastre, Mazarguil, Chap, Plantavid, personal communication)。
【００１８】
ＣＤ３６は、筋肉組織細胞における長鎖脂肪酸のトランスポートに関与する。
【００１９】
トランスジェニックマウスの筋肉細胞中のＣＤ３６の過剰発現は、脂肪酸の細胞性摂取を増強し、伸縮性筋肉によって脂肪酸酸化を増加させ、血漿中のトリグリセリドおよび遊離脂肪酸の濃度の低下を導く。マウスは体重が減少し、特に、対照マウスとの比較では体脂肪が低下した。
【００２０】
ヒトにおけるＣＤ３６の欠損は、心筋、心筋細胞にとっての主なエネルギー源である長鎖脂肪酸の摂取の損失を導き、そして結果として先天的肥大性心筋症の様相を強くする(Fuse et al., 1998)。また、ＣＤ３６-欠損マウスは、細胞中の脂肪酸のトランスポートにおける欠損およびリポタンパク質代謝の妨害を示す(Febrraio et al., 1999)。
【００２１】
ＣＤ３６は、アラキドン酸-媒介血小板凝集(Dutta-Roy et al., 1996)を媒介し、そして細胞膜中の負電価を帯びたリン脂質に結合する(Ryeom et al., 1996)。特に、ホスファチジルコリン(ＰＳ)およびホスファチジルイノシトール(ＰＩ)は、高い親和性を有するＣＤ３６と特異的に結合する(Rigotti et al., 1995)。アポトーシス細胞は、食細胞と接触するホスファチジルコリンをそれらの表面上で発現するため、食細胞との接触はＣＤ３６によって媒介され得る(Fadok et al., 1998, Alberts et al., 1998)。ホスファチジルコリンは、おそらくＣＤ３６の配列１６２-１８３に結合する(Yamaguchi et al., 2000)。ＣＤ３６は、コレステリルヘミスクシナートに結合し、この反応によって容易に精製され得る (Kronenberg et al., 1998)。
【００２２】
ＣＤ３６の主要な機能は、酸化されたＬＤＬに対する受容体としてその役割であろう。当初、この役割は、Endemann(1993）らによって説明された。ヒト マクロファージ様-ＴＨＰ-細胞系においてＣＤ３６をコードするｃＤＮＡクローンを用いるトランスフェクション実験は、Ｃｕ２＋酸化ＬＤＬに対するその細胞の新たな結合能の同定に導いた。モノクローナルＣＤ３６-特異的抗体ＯＫＭ５は、５４％まで血小板へのＣｕ２＋酸化ＬＤＬの結合を阻害する。Ｃｕ２＋酸化ＬＤＬに対する結合部位は、ＣＤ３６配列１５５-１８３の領域にある(Puente et al., 1996)。Nicholsonらは、Ｃu２＋酸化ＬＤＬがその脂質部分によってＣＤ３６におそらく結合するということを示唆した(Nicholson et al., 1995)。単核白血球上のＣＤ３６についての欠損がある血液ドナーからのマクロファージは、対照と比較して酸化ＬＤＬの取込みを著しく低下(−４０％)させる(Nozaki et al., 1995)。
【００２３】
ビタミンＥ(α-トコフェロール) は、ＣＤ３６を阻害することによって、大動脈の平滑筋細胞におけるＣｕ２＋酸化ＬＤＬの取込みを阻害する(Ricciarelli et al., 2000)。酸化ＬＤＬのネズミＣＤ３６への結合は、脂質およびタンパク質部分と関連のある酸化リン脂質によって部分的に阻害される(Boullier et al., 2000)。近年、ＣＤ３６は、Ｃｕ２＋酸化ＬＤＬだけでなく、ＮＯ２-ＬＤＬについての受容体でもあり、そしてＮＯ２-ＬＤＬ-媒介泡沫細胞形成に関与することも明らかである(Podrez et al., 2000)。
【００２４】
この結合は、脂質１‐パルミトイル‐２‐アラキドニル-sn-グリセロ‐３‐ホスホコリンの酸化生成物によって競合的に阻害される。そのため、著者は、ミエロペルオキシダーゼ-触媒による脂質の過酸化は、ＣＤ３６を含有する細胞による食作用に対する標的を含有するリン脂質をマークすることが必要であると推測する。酸化ＬＤＬ、ＣＤ３６に対する受容体としてのその役割と一致して、動脈硬化斑における脂質を負荷されたＣＤ３６は、マクロファージ上において見出され (Nakata et al., 1999)、そして平滑筋細胞がイン・ビボでのＣＤ３６の発現によって泡沫細胞に発達され得る (Ohya et al., 2000)。
【００２５】
ＣＤ３６の欠損は、動脈硬化に対する防御であると思われる。そのため、ＡpoＥタンパク質を欠損したマウスは、同じ食餌の下で動脈硬化斑が進行した。対照相対物を含有するそのＣＤ３６と同じ条件下で、それらのマウスにおけるＣＤ３６遺伝子がノックアウトされると、そのマウスは脂肪過剰な食事下で、大動脈樹枝状における動脈硬化性病変を７６％低下させ、通常食の下で大動脈洞における斑が４５％低下した。
【００２６】
ＣＤ３６およびＡpoＥ-二重ノックアウトマウスのマクロファージは、４０％以下の銅酸化ＬＤＬおよびＮＯ２-ＬＤＬをインターナライズする(Febbraio et al., 2000)。
【００２７】
細胞中の長鎖脂肪酸の重要なＣＤ３６−媒介摂取に同時に影響が、ＣＤ３６の血栓的および動脈硬化機能を阻害することは、血管疾患に対する戦いにおける重要なステップであろう。
【００２８】
この問題は、本発明によって解決される。本発明において、酸化ＬＤＬがＣＤ３６を通して引き起こす細胞機能は、別の物質によっても引き起こされ得るということを見出した。驚くべきことに、これらの別の物質は、脂質部分を持つ必要がない酸化タンパク質である。体内において、タンパク質は、動脈硬化斑、または急性または慢性炎症感染に対する防御のために酸化される。
【００２９】
下記開示において、いくつかの反応を例示的に記述する。これら反応は、酸化ＬＤＬによって引き起こされるだけでなく、別の酸化タンパク質およびＣＤ３６によっても引き起こされる。：
(１）血小板の活性化
→  一方で、血栓症、心臓発作および卒中、他方で鬱血。
(２）内皮細胞の損傷
→  虚血、炎症反応、浮腫形成およびプロスタシクリン放出の妨害
(３）白血球の活性化、例えば:
a)  白血球の内皮細胞への付着増強;
b)  内皮および上皮による白血球の移動に関するサポート;
c)  動脈硬化斑における白血球のホーミング;
d)  食細胞における酸化的バーストの誘発および引き起こし、そして
e)  単核白血球上の組織ファクター発現、特にリポ多糖(ＬＰＳ)によって引き起こされる反応の増加
→  炎症反応、血栓症などによる損傷
(４）平滑筋細胞(ＳＭＣ)の活性化:
a)  ＳＭＣの増殖
b)  動脈硬化斑における脈管内膜膨張
→  バイパス、ステント、ＰＴＣＡ手術後の再閉塞；動脈硬化の発生
（５）juxta-glomerulic 細胞から放出されたレニンの刺激
→  腎臓疾患におけるレニン依存性高血圧
(６）マクロピノサイトーシスによる、共インキュベートＬＤＬの取込みの刺激による泡沫細胞の形成
→  動脈硬化の発生/増加
(７）動脈硬化障害の中心にある血管細胞のアポトーシス
→  ネクローシス、プラーク破壊
（８)内皮細胞におけるマトリクス金属性タンパク質分解酵素の発現に関する刺激
→  動脈硬化斑バーストに関する刺激。
【００３０】
さらに、ＩＤＡＡＴ(免疫防御活性化抗トロンビン、特許出願番号DE 100 45 047.4)は、ＨＩＶＧＰ１２０およびＣＤ４に結合するだけでなく、別の酸化タンパク質にも結合することが、本発明によって示される。 ＨＩＶＧＰ１２０ は、ＣＤ２６ホモログ配列を含む(Crombie et al., 1998)。
【００３１】
本発明によって、ＩＤＡＡＴだけでなく、別の酸化タンパク質が、トロンボスポンジンの細胞様血小板、単核白血球、内皮細胞およびＴ細胞への結合を媒介することが、示されている。即ち、酸化タンパク質が、脈管形成（血管形成）の阻害、ＨＩＶ感染の防御、例えば単核白血球におけるＩＬ−１２のダウンレギュレーションおよびＩＬ-１０のアップレギュレーションによる炎症性プロセスの調節のような、広くトロンボスポンジン媒介細胞反応を誘導すると考えられる、強い理由がある。従って、酸化タンパク質自身が、特定の疾患プロセスにおいて治療上有用な活性を有し得る。
【００３２】
さらに、酸化タンパク質による病理学上の細胞機能が、ＣＤ３６−酸化タンパク質との相互作用を阻害する物質によって阻害され得るか、またはＣＤ３６に結合するＴＳＰに干渉され得ることが本発明中で示される。
【００３３】
かかる物質の例示は、可溶性トロンボスポンジン−１およびモノクローナル 抗-ＣＤ３６抗体クローン３７、１３および７を含む。これらは我々によって製造されたものであり、本明細書中に開示される。
【００３４】
実施例:
１.ヒトトロンボスポンジン−１の単離
血小板からのヒト トロンボスポンジン−１の単離をKehrelら(1991)に記載のように実施した。Kehrel(1991)らの記載は、出典明示により本明細書の一部とする。しかし、その記載とは異なり、血小板をトロンビンによって活性化し、洗浄用緩衝液中のＥＤＴＡは、Ｎａ-クエン酸塩(０.０８ Ｍ)によって置換した。さらに、凝集緩衝液および下記精製ステップのための全緩衝液を、２ｍＭの濃度のＣａ２＋で置換した。
【００３５】
２.モノクローナル抗体の調製のためのハイブリドーマ培養
ＣＤ３６に対するモノクローナル抗体の調製を、Peters and Baumgartner(1990)の指示書に従って広範に実施した。
【００３６】
８−１２週令のBalb/c メスマウスを、精製されたＣＤ３６(５０μｇ/ブースト)を用いて免疫化した。免疫化のために、Baumgartnerら(1990)の長期免疫化プロトコール(４ヶ月)を用いた。計画した融合時点のおおよそ１４日前に、血液を、動物から採取し、マウス血清中のＣＤ３６に対するＩｇＭおよびＩｇＧ力価を測定した。ＩｇＧ力価が依然として、１：１００,０００の稀釈で対照とは著しく異なる場合、脾臓細胞をＡｇ８,６５３細胞と融合した。Ａｇ８,６５３細胞を、０.１３Ｍ ８-アザグアニジンを含有する培養培地中で選択した。脾臓からのリンパ球を調製し、Ａｇ８,６５３を用いて融合した。融合後に直接、融合細胞(１ｘ１０６脾臓細胞／ｍｌ)を細胞培養フラスコ(７５ml)中の選択培地［ヒポキサンチン(２７.２ μｇ/ｍｌ）およびアザセリン(５０μｇ/ｍｌ)］ を添加した培養培地で２４時間インキュベートした。これにより、脾臓由来のマクロファージは、プラスチック表面に結合し、そして９６ウェルプレート中のハイブリドーマの実際の培養と干渉しない。
【００３７】
クローニングステップを、９６ウェルプレートのウェルあたり０.５細胞の種確率で、Wuerzner(1990)の限定−稀釈−クローニングによって実施した。ハイブリドーマの上清を、各々ＩｇＧおよびＩｇＭの産生についてＥＬＩＳＡで試験した。ＩｇＧ 陽性細胞培養上清を、種々の方法を用いてＣＤ３６に対するそれら特異性を試験した。
【００３８】
１９のＣＤ３６特異的クローンを得た。これらは、ＣＤ３６欠損血小板(description: Kehrel et al., 1993, Saelman et al., 1994, Kehrel et al., 1995)と反応しなったが、対照血小板に有意に結合することを示した。これを、フロー・スルー・サイトメトリーおよびドット・ブロット法および免疫沈降によって証明した。試験した全ての抗体は精製ＣＤ３６を認識した。これらのクローン(クローン３７、１３および７)のうちの３つは、ヒト細胞と酸化タンパク質の反応を阻害した(下記参照)。
【００３９】
ＣＤ３６の単離
ＣＤ３６の単離を、我々のグループが記載するように(Kronenberg et al., 1998)、Triton X-114を用いて膜タンパク質の相分離、続くコレステロール-ヘミスクシネートアガロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【００４０】
酸化タンパク質の調製についての態様
タンパク質 (市販入手し得るフィブリノーゲン、ヒトアルブミン、ウシ血漿アルブミン(ＢＳＡ)または抗トロンビン) （３４８μｇ）を、ＥＤＴＡ(０.１ ｍＭ)を添加したリン酸緩衝液生理食塩水(１ｍｌ)中のＮａＯＣｌ(次亜塩素酸ナトリウム,８３２μｇ）を用いて、１０分、氷上でインキュベートした。タンパク質およびオキシダントを、Sepharos25-Coarse (PD-10 column, Amersham Pharmacia)を用いて、４℃でゲルろ過によって反応終了直後に分離した。
【００４１】
本発明の活性についての態様:
１．酸化タンパク質 (酸化(ox)フィブリノーゲン、酸化（ox）抗トロンビンＩＩＩ、酸化(ox)ＢＳＡ、酸化(ox)ヒトアルブミン)は、ＨＩＶＧＰ１２０タンパク質のＣＤ３６ホモログドメインに特異的に結合する (図１を参照)。酸化タンパク質とＨＩＶＧＰ１２０との相互作用を、BIACORE System 2000においてプラズモン共鳴技術によって決定した。
【００４２】
２．酸化タンパク質は血小板を活性化する。血小板の活性化は、酸化タンパク質とＣＤ３６との相互作用を阻害するか、またはＣＤ３６に結合するトロンボスポンジンと干渉する物質によって阻害される。
ａ）酸化タンパク質 (酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡおよび酸化ヒトアルブミン)は、用量依存的に、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、フィブリン、フィブロネクチンおよびコラーゲンのような付着タンパク質への血小板の付着を増加させる(図２ａを参照)。この付着増加は、可溶性トロンボスポンジン−１によって阻害される(図２ｂを参照)。この付着増加は、モノクローナル抗-ＣＤ３６抗体のクローン３７、１３および７(図２ｃ／dを参照)によっても阻害されるが、トロンボスポンジンのＣＤ３６への結合を阻害するＶＣＴＧペプチドは影響しない(図２ｅを参照)。市販入手し得る抗-ＣＤ３６抗体ＦＡ６/１５２は阻害を示さない(図２ｆを参照)。
【００４３】
ｂ）酸化タンパク質 (酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡ、酸化ヒトアルブミン)は、トロンボスポンジン−１(１０μg／ｍl)の存在下に、用量依存的に、トロンボスポンジンの血小板への結合を誘導する(図３ａを参照)。この活性化は、＞２０μｇ／ｍｌ濃度で可溶性トロンボスポンジン−１によって阻害される(図３ｂを参照)。
この活性化は、ＣＤ３６に対するモノクローナル抗体、即ちクローン３７、１３および７によっても阻害される(図３ｃ‐ｅを参照)。
【００４４】
ｃ）酸化タンパク質 (酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡ、酸化ヒトアルブミン) は、トロンボスポンジン−１(１０μｇ／ｍｌ) の存在下において血小板の凝集を生じる(図４ａを参照)。この凝集は、用量依存的にＣＤ３６に対するモノクローナル抗体、即ちクローン３７、１３および７によって阻害される (図４ｂを参照)。
【００４５】
ｄ）酸化タンパク質 (酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡ、酸化ヒトアルブミン)は、トロンボスポンジン−１(１０μｇ／ｍｌ)の存在下において血小板の前凝集状態を生じ(図５ａ‐ｃを参照)、ミクロ粒子形成を導く(図５ｄを参照)。この活性化は、＞２０μｇ／ｍｌの濃度で可溶性トロンボスポンジン−１によって阻害される(図５ｅを参照)。
この活性化は、用量依存的に、ＣＤ３６に対するモノクローナル抗体、即ちクローン３７、１３および７によっても阻害される (図５ｆおよびｇを参照)。
【００４６】
３．酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡ、酸化ヒトアルブミン)は、単核白血球を活性化する。この活性化は、用量依存的に、ＣＤ３６と酸化タンパク質との相互作用を阻害するか、またはＣＤ３６に結合するトロンボスポンジンと干渉する特定物質、例えば、ＣＤ３６に対する可溶性トロンボスポンジンまたはモノクローナル抗体によって阻害される。
ａ）酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡ、酸化ヒトアルブミン)は、単核白血球におけるＣａ２＋シグナルを誘導する(図６参照)。
ｂ）酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡ、酸化ヒトアルブミン)は、ＰＭＮＬにおける酸化的バーストを誘導する (図７参照)。
ｃ）酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡ、酸化ヒトアルブミン)は、内皮単層(図８ａ参照)を通じて単核白血球、ＰＭＮＬおよびリンパ球の移動増加を誘導する。この反応は、ＣＤ３６の酸化タンパク質、例えば、ＣＤ３６に対する可溶性トロンボスポンジンまたはモノクローナル抗体、即ちクローン３７、１３および７への結合を阻害する物質によって阻害される(図８ｂを参照)。
【００４７】
４．酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビン III, 酸化ＢＳＡ, 酸化ヒトアルブミン)は、動脈硬化の発生における役割を果たす。
ａ）酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ＢＳＡ、酸化ヒトアルブミン）は、動脈硬化斑におけるマクロファージのホーミングを誘導する。ホーミングを、Patelら(1998)に従って実施した。Ｃ５７ＢＬ/６マウスにおいて、単核白血球/マクロファージの腹膜への移動を、チオグリコレートの腹膜内注射によって誘導した。４日後、腹膜を洗浄し、活性化腹膜マクロファージを得た。プローブにおいて、赤血球を溶解した。マクロファージを、RPMI 1640 培地で再縣濁し、細胞培養ディシュに移し、付着させた。蛍光標識したミクロスフェア(２μｍ 黄−緑蛍光ラテックスミクロスフェア、molecular probe)を、マクロファージによる良好な取込みのために、３０分、５０％マウス血清を用いて、オプソニンを作用させ、次いで、プレート化したマクロファージに添加した。付着マクロファージは、ミクロスフェアを貪食した。非付着細胞およびミクロスフェアを、洗浄によってディシュから除去した。マクロファージを、氷上でディシュから取出し、Hanks緩衝塩類溶液(ＨＢＳＳ)に再縣濁した。５０週令のＡpoＥ欠損マウスを、３回、５０μｇの酸化タンパク質、この場合抗トロンビンＩＩＩおよびプラセボ (ＨＢＳＳのみ)を、標識したマクロファージの静脈注射６時間前、マクロファージ注射２時間後、マクロファージ注射１０時間後に各々腹膜内注射した。１０ｘ１０６マクロファージを、０.２〜０.３ ｍｌ ＨＢＳＳに再縣濁し、尾血管に注射した。マクロファージ注射２４時間後、この動物を屠殺した。心臓基節および大動脈上行を、ＯＣＴに埋め込み、−８０℃で貯蔵し、７μｍ 凍結切片を調製した。マウスあたりヴァルサルバ洞(大動脈洞）レベルで大動脈上行の１mm 範囲から１４０の連続切片の蛍光標識したマクロファージを計測した。プラセボ処理したＡpoＥ−／−対照マウスとの比較において、酸化抗トロンビンＩＩＩを用いて処理したマウスの動脈硬化斑への標識したマクロファージの移動は、１００＋１５％(ｎ＝１４)から１５６＋９.２％(ｎ＝５) (ｐ＝０.００８)有意に増加した("代替Ｗelch検定")。この移動は動脈硬化斑の発生、進行およびバーストの危険性に対する成因であるので、この態様は、動脈硬化に関して酸化タンパク質の重要性を説明するものである(図９)。
【００４８】
ｂ) ＣＤ３６および酸化タンパク質の相互作用を阻害するか、またはＣＤ３６に結合するトロンボスポンジンと干渉する物質は、酸化タンパク質の前-動脈硬化活性を防止／減少する。可溶性トロンボスポンジンは、動脈硬化様に変化した内皮細胞へのマクロファージの付着を阻害する。これは、動脈硬化プラーク中へのマクロファージ移動のための必要条件である。ネズミ-固定化した内皮細胞を、ＡpoＥ欠損マウスの血漿からのβ-ＶＬＤＬ(５０μｇ タンパク質/ｍｌ)を用いて６時間刺激し、次いでフロー・スルー・チャンバー中で４００s-１の剪断速度で、１ｍｌあたり２ｘ１０５の腹膜単核白血球/マクロファージと縣濁した。β-ＶＬＤＬは、対照と比較して、２２４＋４４％までローリング白血球の有意な相対的増加を誘導した。可溶性トロンボスポンジン（１０μｇ/ｍｌ）の添加は、この付着増加を完全に阻害し、そして、さらに内皮へのマクロファージの基本的付着を部分的に阻害した(対照と比較して、７５+３７％付着、ｎ＝４−７；p＜０.０１) (図１０ａ参照)。また、β-ＶＬＤＬによって顕著に誘導されたマクロファージの永久的付着は、５分間の洗浄後、トロンボスポンジン−１によって低下した(１００＋２１％対照対３００＋１１９％β-ＶＬＤＬ対１５７＋７０％β-ＶＬＤＬ＋ＴＳＰ−１；ｎ＝４−７；ｐ＜０.０１)。(図１０ｂ参照)。
【００４９】
５．可溶性トロンボスポンジン−１は、炎症反応をイン・ビボで阻害する。Ｂａｌｂ/ｃ‐マウスの耳で、アルチュス反応を、０時点に抗-ＢＳＡの局所注射および腹膜中にＦＩＴＣ結合ＢＳＡの同時性注射によって誘導した。対照動物 (陰性対照)は、腹膜中へのＦＩＴＣ(ＢＳＡを除いた)を用いる注射のみであった。６時間後、抗-ＢＳＡおよびＢＳＡ-ＦＩＴＣで処理した動物は、耳膨張(浮腫)、ＦＩＴＣ取込み、組織中のＰＭＮＬの移動および組織への点状出血を有する進行した炎症反応を明確に示した。１８のマウスを、０、０＋３時間後の時点に、緩衝液(ＰＢＳ)と共にトロンボスポンジン−１(５０μg)をさらに腹膜内に注射した。１６匹の対照マウスは、０＋３時間でＰＢＳのみを受容した。アルテュス反応は、ほぼ完全にトロンボスポンジンによって防止した。トロンボスポンジン-処理マウスは、有意低いＦＩＴＣ取込み、有意に低い耳の厚さ(浮腫の低下)を示し、ＰＢＳ処理した対照動物と比較して、殆ど点状出血はなかった(図１１ａ−ｃ参照)。
【００５０】
６．酸化タンパク質の定量ための態様
タンパク質またはペプチド上のエピトープを認識し、また酸化プロセスによって、間接的または直接的に修飾されるモノクローナル抗体の調製：
ヒトアルブミン、抗トロンビンＩＩＩおよびフィブリノーゲンは、本明細書に記載したようにＨＯＣｌを用いて酸化し、８−１２週令のＢａｌｂ/ｃメスマウスを、それにより免疫化した。ハイブリドーマおよびハイブリドーマ培養を、従来法に従って実施した。ハイブリドーマの上清を、各々ＩｇＧおよびＩｇＭの生成について試験した。ＩｇＧ陽性細胞培養上清を、酸化タンパク質を用いて陽性反応について試験し、同時に変化していない最初のタンパク質を用いて陰性反応について試験した。酸化タンパク質 (酸化ヒトアルブミン、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化フィブリノーゲン)に対する抗体を産生し、同時に非酸化母タンパク質と反応しないクローンを、他の酸化タンパク質およびペプチドを用いる交差反応について試験した。
【００５１】
上記に記載のようなモノクローナル抗体の助けによる酸化タンパク質の定量:かかる定量は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、細胞表面上の定量的フロー・スルー・サイトメトリーのようなプロセス、および類似の常法を用いて、容易に可能である。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる酸化ヒトアルブミンの定量。ヒトアルブミンに対するウサギ由来のポリクローナル抗体 (調製−常法)を、捕捉抗体としてＥＬＩＳＡディッシュ(Nunc-Maxisorb) の底部に結合させる。このディッシュを、ＰＢＳ ｐＨ ７.４、０.５％ Tween 20を用いて、完全に洗浄し、プラスチック表面上の空間を、３％ ＢＳＡで、１時間、室温(ＲＴ)でブロッキングした。該ディッシュを、再度洗浄し、次いで様々に稀釈した血漿、血清、血液産物の上清(例えば、血小板濃縮物、赤血球濃縮物、ＦＦＰ)または緩衝溶液に規定酸化ヒトアルブミン量を、１時間、室温で添加した。プローブ物質および標準溶液を各々取出し、このディッシュを完全に洗浄し、酸化ヒトアルブミンを認識し、ビオチンで標識した上記記載のモノクローナル抗体と、１：１５０００のＰＢＳ、１％ ＮＧＳ(正常ヤギ血清)の稀釈で、インキュベートした。ディッシュを、数回、再び完全に洗浄し、ストレプタビジンペルオキシダーゼと共にインキュベートした(１時間、室温)。再度該ディシュを洗浄後、そのディッシュを基質溶液(１００μg/ウェル)で洗浄した(２０mg オルト-フェニルジアミン、５％ Ｈ２Ｏ２、０.１Ｍ クエン酸(１２.１５ml)および、０.２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ (１２.８５ml）＋ ２５ml Ｈ２Ｏ蒸留の緩衝液中)。４０５ｎＭでの吸光度を、ＥＬＩＳＡ測光器で測定し、酸化ヒトアルブミンの量を示した。反応を、４Ｎ Ｈ２ＳＯ４（５０μｌ/ウェル）で停止させ、吸光度を４９０ｎＭで測定した。
【００５２】
プローブ中のＨＯＣｌ-酸化ヒトアルブミンを連続検定(calibration series)により定量した。ＨＯＣｌ-修飾フィブリノーゲンおよびＨＯＣｌ修飾抗トロンビンＩＩＩを同様に処理した。
【００５３】
７．酸化タンパク質、ＣＤ３６に対する受容体の活性化条件を考証するための態様。
トレオニン(９２）リン酸化ＣＤ３６に対するポリクローナル抗体の調製。
ペプチド(１５ ＡＳ)
(１) Ｌｙｓ, Ｇｌｎ, Ａｒｇ, Ｇｌｙ, Ｐｒｏ, Ｔｙｒ, Ｔｈｒ, Ｔｙｒ, Ａｒｇ, Ｖａｌ, Ａｒｇ, Ｐｈｅ, Ｌｅｕ, Ａｌａ, Ｌｙｓおよび
(２) Ｌｙｓ, Ｇｌｎ, Ａｒｇ, Ｇｌｙ, Ｐｒｏ, Ｔｙｒ, ＰｈｏｓｐｈｏＴｈｒ, Ｔｙｒ, Ａｒｇ, Ｖａｌ, Ａｒｇ, Ｐｈｅ, Ｌｅｕ, Ａｌａ, Ｌｙｓ (トレオニンがリン酸化される以外はペプチド(１)と同じ)
を合成し、ＫＬＨ (Keyhole Limpet Hemocyanin)と結合した。ウサギ由来のポリクローナル抗体を、これら化合物を用いて、結合ペプチドを標準的方法に従って調製した。このために、ウサギ(New Zealand, white)を、２５０μgの ペプチド１-ＫＬＨおよびペプチド２‐ＫＬＨと、各々完全なFreund adjuvans s.c.の添加で基本的に免疫化し、そしてＡｌｕ-Ｇｅｌ-Ｓ(１.３％水酸化アルミニウムの水溶液, SIGMA)の添加の２５０μgのペプチド１-ＫＬＨおよびペプチド２-ＫＬＨの各々３回を用いて免疫強化した。血液を、動物の耳の血管から採取し、血清を調製し、免疫化に用いたペプチドに対する抗体を試験した。リン酸化ＣＤ３６ペプチドに対する抗体を、非-リン酸化ＣＤ３６ペプチドを用いるアフィニティーカラムで交差吸収した。これは、得られる抗体混合物が、リン酸化非活性化ＣＤ３６(ＡＫ ＣＤ３６ Ｐ)を特異的に認識した抗体のみを含有するためである。(トレオニンリン酸化/脱リン酸化ＣＤ３６に対する特異的モノクローナル抗体の調製は、抗-ＣＤ３６タンパク質抗体について記載した調製に関するこれらのペプチドにより可能である。）
【００５４】
両モノクローナル抗血清は、フロー・スルー・サイトメトリー中の血小板表面でＣＤ３６と反応した。リン酸化ＣＤ３６に対して誘導された抗体"ＣＤ３６ Ｐ"は、非活性化血小板上でＣＤ３６を認識するが、抗体"ＣＤ３６ トータル"は非リン酸化ＣＤ３６およびリン酸化ＣＤ３６を認識する。血小板の活性化によって、ＣＤ３６は、脱リン酸化され、抗体 "ＣＤ３６ Ｐ"の結合能を低下させる(参照、図１２)。両抗体を用いる定量的フロー・スルー・サイトメトリーにより、活性化ＣＥ３６の部分計算を可能にした。
【００５５】
８．Ｉ型糖尿病に罹る患者の生物体は酸化タンパク質に特に感受性である:
例えば:Ｉ型糖尿病患者の血小板は、対照健常人の血小板と比較すると、アゴニストとして、酸化タンパク質に対してより敏感に反応する。活性-依存性フィブリノーゲン結合は、対照ヒトの血小板と比較すると、酸化タンパク質の低い濃度で、糖尿病患者の血小板で誘導され得る (図１３を参照されたい)。
【００５６】
９．酸化タンパク質はＨＩＶ感染を阻害する。
酸化タンパク質(酸化抗トロンビンＩＩＩおよび酸化ヒトアルブミンを試験した)は、高い親和性で、 ＨＩＶＧＰ１２０およびその受容体ＣＤ４の両方に結合する。
例：酸化抗トロンビンＩＩＩおよび酸化されたヒトアルブミンの、ＨＩＶＧＰ１２０およびＣＤ４への結合を、BIACORE 2000 システムにより示した。ランニングバッファー: ２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ；１００ ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７.４；１ｍＭ ＣａＣｌ２；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；０.００５％ Surfactant P-20。
【００５７】
タンパク質 ＨＩＶＧＰ１２０：ｃ＝１００μg/ml, ２００μｌ
貯蔵用緩衝液 Ｔris/ＨＣｌ, ＮａＣｌ ｐＨ７.６
タンパク質 ＣＤ４：ｃ＝６３μg/ml, ３１８μｌ
貯蔵用緩衝液：１０ｍＭ Ｔris；３００ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ８)
タンパク質 酸化抗トロンビンＩＩＩ：ｃ＝１mg/ml, １２０μｌ
タンパク質 酸化ヒトアルブミン：ｃ＝１mg/ml, １２０μｌ
Ｃ１-チップ (BIACORE AB)
Amine coupling kit (BIACORE AB)
ＨＩＶＧＰ１２０およびＣＤ４を、Ｃ１センサー表面で固定化するか、この１０ ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ４を、カップリング緩衝液として使用した。
【００５８】
カップリング条件：ＨＩＶＧＰ１２０：２０μｌ；１０ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ４）中のＧＰ１２０（１０μg/ml）；固定化した量：１１５８ＲＵ, ３００pg
ＣＤ４：３０μｌ；１０ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ４)中のＣＤ４(６.３μg/ml)；固定化量: ５６８ＲＵ, １４８pg。
【００５９】
チップ表面をＢＳＡで飽和させ、酸化タンパク質の結合を調べた。このために、例えば、酸化抗トロンビンＩＩＩ（５０μｌ）を、２０μｌ/分間の流速で種々の濃度で注射した。タンパク質溶液を試料用緩衝液で稀釈した。酸化抗トロンビンＩＩＩの濃度を増加させると、得られるシグナルが増加する。図１４は、１２センサーグラム(sensorgrams)オーバーレイ・プロットを示す。これは、酸化抗トロンビンＩＩＩを固定化ＣＤ４への結合および連続的分離を示す。
【００６０】
定量分析により、結合に対する下記値を得た。
ａ)ＨＩＶＧＰ１２０に対する酸化抗トロンビンＩＩＩ:
Ｋｏｎ (１／Ｍｓ)： ６.３８ ｘ １０５
Ｋｏｆｆ (１／s)： ４.４４ x １０―４
ＫＤ[Ｍ] ７.０１ x １０-１０、
ｂ）ＣＤ４に対する酸化抗トロンビンＩＩＩ:
Ｋｏｎ (１／Ｍｓ)： ７.１３ x １０５
Ｋｏｆｆ （１／ｓ)：１.１２ x １０―３
ＫＤ[Ｍ] １.６３ x １０―９、
ｃ）非修飾抗トロンビンＩＩＩは、ＨＩＶＧＰ１２０またはＣＤ４に対していずれも結合しない。酸化ヒトアルブミンは、酸化抗トロンビンＩＩＩとの結合以上に、高い親和性によりＨＩＶＧＰ１２０およびＣＤ４に結合する。非酸化ヒトアルブミンは、ＨＩＶＧＰ１２０またはＣＤ４にいずれも結合しない。酸化タンパク質は末梢血液 (ＰＢＭＣ)由来の単球性のＨＩＶ-１感染を阻害した。
【００６１】
ＰＨＡ-活性化ＰＢＭＣを、陰性ヒト血清１：１００ (陰性対照)、中和Ｖ３-ループ特異的抗体 (陽性対照)、 患者からの酸化タンパク質（１５０μg/ml)およびＣＣＲ５屈性ＨＩＶ-１第一単離物(９０３) と共にインキュベートし、そして５日後のウイルス産物をＰ２４ＥＬＩＳＡによって試験した。このために、新しいＰＨＡ-活性化ＰＢＭＣを、２ x １０６細胞/ｍｌの細胞濃度で、ＲＰＭＩ １６４０培地＋２０ ％ ＦＣＳ＋１００Ｕ/ｍｌ ＩＬ-２に縣濁し、２００,０００ 細胞/ウェル/１００μｌを９６ウェルプレート上で分配した。
【００６２】
阻害用試験物質:
陽性対照：中和ヒト抗-Ｖ３-ループ抗体(１：１００)
陰性対照：陰性ヒト血清１：１００
実験: 酸化タンパク質 (１５０μg/ml)を、ＲＰＭＩ培地中の細胞に添加し、３０分、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。次ぎに、ＨＩＶ-１ウィルスを試料に添加した：２０,０００ ＴＣＩＤ５０ (５０％組織培養感染用量)/ｍｌ ＝(〜) １０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ／ウェルと第一単離物９０３上清(ＣＣＲ５ trop)のＨＩＶ-１の各々１０μｌ/ウェルを含有する。これらの試料を３７℃/５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次の日、細胞をＲＰＭＩ１６４０で、３回洗浄し、新しい培養培地を添加した。感染５日後、Ｐ２４-ＥＬＩＳＡ試験を実施した。
【００６３】
Ｐ２４-ＥＬＩＳＡ:
抗-Ｐ２４抗体(１１-Ｇ７[Niedrig, Berlin]およびＤ７３２０ [Biochrom])は、第一単離物変異体９０３のＰ２４タンパク質を認識した。Maxi-Sorb-ELISA plates (Nunc)を、これらの抗体を用いて一晩重層した。阻害アッセイからのウイルス上清を、１％ Triton X-100によって活性化した。ＰＢＳによる処置細胞の洗浄後、不活性化したウイルス上清およびアルカリホスファターゼ接合体検出抗体(BC1071-AP[Aalto])を、ウェル中で一緒に形質転換し、５時間、３７℃でインキュベートした。ウェルを再びＰＢＳで洗浄し、溶解したアルカリホスファターゼ p‐ニトリル‐ホスフェート(Sigma)についての基質をウェルに添加し、色素発生をＥＬＩＳＡ側光器中４０５ｎｍで２０分間後に測定した。Ｐ２４-ＥＬＩＳＡ中のパラレル値は、共通の平均値に対しておよそ光学濃度（ＯＤ)単位０.０２まで変化した。陰性対照＝非阻害についてのＯＤ４０５ｎｍは０.８であったが、中和抗体(陽性対照)はＯＤを０.１２に低下した。酸化タンパク質（１５０μg/ml）は、ＯＤを０.１０に低下した。酸化タンパク質の添加により、ＰＢＭＣのＨＩＶ-１感染を有効に阻害した。
【００６４】
１０．酸化タンパク質は細胞に結合するＴＳＰを誘導した。
酸化タンパク質(例えば、酸化ヒトアルブミン、酸化抗トロンビンＩＩＩおよび酸化フィブリノーゲンを使用した)は、ＴＳＰ−１のＣＤ３６含有細胞への特異的にかつ用量依存的結合を誘導した(参照、図１５ａｄ)。
【００６５】
従って、本発明の一つの目的は、酸化タンパク質のＣＤ３６への結合を阻害するか、またはＣＤ３６の酸化タンパク質との相互作用によって誘導されたＣＤ３６の機能を阻害する物質を含有する薬物である。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様において、この薬物は、酸化タンパク質のＣＤ３６への結合を阻害する抗体、特に好ましくは抗体フラグメント様Ｆ(ａｂ)２、Ｆ(ａｂ)または抗体認識のための領域を含む抗体を含む。
【００６７】
さらに好ましい態様において、該薬物は、ＣＤ３６の酸化タンパク質への結合を阻害するか、または、ＣＤ３６と酸化タンパク質との相互作用によって誘導されたＣＤ３６の細胞機能を阻害する、ＣＤ３６のペプチド、ペプチド擬体またはペプチドアナログを含む。好ましくは、これら物質を、本発明に開示されたモノクローナル抗ＣＤ３６抗体によって同定し、選択する。特に、それらは、クローン３７、１３または７と反応するか、酸化タンパク質/ペプチドのＣＤ３６への結合を阻害するか、または実施例に記載の機能に限定しないが、そのような機能として酸化タンパク質/ペプチドによって誘導されたＣＤ３６の特徴的機能を阻害する。
【００６８】
さらに好ましい態様において、薬物は、ＣＤ３６の酸化タンパク質への結合を阻害するか、またはＣＤ３６に結合するトロンボスポンジンと干渉するタンパク質またはタンパク質成分を包含する。特に好ましい態様において、かかるタンパク質は可溶性トロンボスポンジンである。
【００６９】
さらに好ましい態様において、該薬物は、ＣＤ３６に結合し、それによってＣＤ３６と酸化タンパク質との相互作用を阻害するペプチドまたはペプチド擬体を包含する。かかるペプチドまたはペプチド擬体は、例えば、いわゆる "ファージディスプレイ" 方法を用いて、容易に同定され得る。
【００７０】
一方、本発明の目的は、特に炎症性疾患での血栓症を予防するため、抗血栓症の治療をサポートするため、移植拒絶反応を防止するため、移植関連動脈硬化を防止するため、腎臓疾患における高血圧を防止するため、特にレニン関連高血圧、動脈硬化 (アテローム性動脈硬化)疾患の発生および進行を防止するため、慢性炎症反応の処置のため、バイパス手術、ステント、ＰＴＣＡなどの手術後の初期血管再閉塞を防止するため、バイパス手術、ステント、ＰＴＣＡなどの手術後の血管再発狭窄症を防止するため、再灌流損傷（例えば、心筋虚血、臓器移植、卒中、外科手術後の末梢閉塞疾患に限定しないが）、および／または成功した連続的な蘇生後多臓器不全を防止するため、血管損傷、特に糖尿病患者における血管損傷を防止するため、ＣＤ３６/ＴＳＰ−１による酸化タンパク質によって誘導された内皮増殖および脈管形成の阻害を防止するため、そして損傷の治癒をサポートするために本発明の薬物を使用することである。
【００７１】
さらに、本発明の別の目的は、炎症反応が関与する疾患、例えば、下記に限定するものではないが、動脈硬化、糖尿病性血管障害、リウマチ性関節炎、Goodpasture症候群、敗血症、潰瘍性大腸炎、対宿主性移植片疾患、天疱瘡癌、神経皮膚炎、ＨＩＶ感染、ＡＲＤＳ、糸球体腎炎、再灌流損傷を診断するため、および血液産物の質的制御もするため、本発明の薬物についての個々の適応を評価するために、酸化タンパク質(特に、酸化抗トロンビンＩＩＩ、酸化ヒトアルブミンまたは酸化フィブリノーゲン)を個々にまたは併せて、定量する方法である。
【００７２】
別の目的は、ＣＤ３６のリン酸化状態を測定することによって、炎症反応が関与する疾患、例えば、下記に限定するものではないが、動脈硬化、糖尿病性血管障害、リウマチ性関節炎、Goodpasture症候群、敗血症、潰瘍性大腸炎、対宿主性移植片疾患、天疱瘡癌、神経皮膚炎、ＨＩＶ感染、ＡＲＤＳ、糸球体腎炎、再灌流損傷についての診断物質として、または本発明の薬物を用いるＣＤ３６/酸化タンパク質阻害治療を追跡するための診断物質として、酸化タンパク質に対する受容体であるＣＤ３６の活性化状態を特徴解明することである。
【００７３】
本発明のさらに別の対象は、酸化タンパク質/複数の酸化タンパク質、酸化ペプチド、酸化構造アナログまたはそれらの構造擬体を含む薬物である。本発明の薬物は、さらに医薬的に許容し得る充填剤および/または賦形剤を含有し得るということも特徴とする。本発明の薬物は、局所、内皮局所、腹膜内、静脈、経口または筋内投与に適切であるのが好ましいが、または小胞として適用されることも可能である。さらに、本発明の薬物は、さらに、例えば、抗生物質、免疫抑制剤または体内における酸化タンパク質の相互作用パートナーのような物質を含むのが好ましい。かかる物質の添加によって、本発明の薬物の活性は、さらにサポートおよび補助される。
【００７４】
本発明において、酸化タンパク質またはペプチドは、本発明に従って、好ましくは、ＨＯＣｌまたは過酸化亜硝酸との反応によって生成される。
【００７５】
本発明の薬物、特に酸化タンパク質/ペプチドまたはアナログまたはそれらの擬体を含む薬物のさらなる使用は、急性感染症の予防または治療、脈管形成の阻害、鬱血の改善のためである。そのため、薬物は、ＨＩＶ感染の予防または治療のために使用されるのが好ましい。別の好ましい態様において、酸化タンパク質を含有する本発明の薬物の使用により、ＣＤ３６に結合するＴＳＰの誘導によって腫瘍脈管形成を阻害する。
【００７６】
さらなる別の好ましい態様において、薬物は、鬱血、特に、抗凝集治療または血栓症予防下で、先天的または後天的血液凝集不全症、または先天的または後天的血小板減少症の患者に、または心臓肺用機器で外科手術において使用される。
【００７７】
酸化タンパク質がＴＳＰ結合を誘導したので、請求項２１の薬物は、必然的に細胞表面に結合するＴＳＰの間接的影響、例えば、脈管形成の阻害(図１６ａを参照)またはＨＩＶ感染の阻害のような間接的影響を誘導する。一方で、酸化タンパク質およびＣＤ３６の相互作用の阻害は、ＴＳＰを結合する反応鎖酸化タンパク質-ＣＤ３６細胞によって誘導されるという機能の減退を結果的に誘導する。また、請求項１５の阻害剤は、それによって、脈管形成の阻害として、ＴＳＰ-媒介プロセスを阻害し、前脈管形成する(図１６ｂを参照)。
【００７８】
（図面の説明）
図１:ＨＩＶ-１ＧＰ１２０タンパク質中のＣＤ３６ホモログドメインに結合する酸化タンパク質。
１）１２センサーグラム・オーバーレイ・プロットは、酸化抗トロンビンＩＩＩの固定化ＨＩＶＧＰ１２０への結合および酸化抗トロンビンＩＩＩの解離を示す。ＨＩＶＧＰ１２０を固定化(３００ pg)する;酸化抗トロンビンＩＩＩの濃度を変えた(０から最高まで: ０ｎＭ；１ｎＭ；５.１ｎＭ；１０.２ｎＭ；１７ｎＭ；２０.４ｎＭ；２３ｎＭ；３４ｎＭ；４０.８ｎＭ；５１ｎＭ；８５ｎＭ；１１９ｎＭ)。酸化ＡＴ ＩＩＩの濃度を増加すると、得られるシグナルも増加する。
【００７９】
図２：酸化タンパク質は止血性/血栓性である−血小板付着の増加/この反応の阻害。
２ａ）酸化タンパク質は、コラーゲン タイプＩへの血小板付着を増加させる。血小板の付着を、Santoroら（1994）に従って実施した。９６ウェル細胞培養プレートを、コラーゲン タイプＩ(２５μg/ml；１００μｌ/ウェル ）で、一晩、４℃で被覆し、プレートをＢＳＡでブロッキングした。ヒト血小板を、血漿タンパク質から、２ｍＭ Ｍｇ２＋、１ｍＭ Ｍｎ２＋、０.９％グルコースおよび０.３５％ ＢＳＡを添加したＨＥＰＥＳ‐Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（ｐＨ７.４）中のゲルろ過によって精製した。１００μｌのゲルろ過した血小板（３０００００/μｌ)を、酸化タンパク質の添加および非添加のウェルにおいて、加湿チャンバー内、１時間、室温でインキュベートした。非接着血小板を完全に洗い流した。Triton X-100を用いて血小板溶解後に接着血小板の数、およびリソソーマル(lyzosomal)酵素のヘキソスアミン酵素を測定した。付着アッセイの検定のため、既知の血小板数を段階的に増加させたシリーズを、ミクロタイタープレート上につくり、基質Ｐ-ニトロフェニル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコサミドの消失を血小板数に関して測定した。酸化抗トロンビンＩＩＩは、用量依存的に血小板付着を増加した。
【００８０】
２ｂ）血小板を上記の付着アッセイに使用し、酸化ＡＴＩＩＩ(５０μg/ｍｌ)を用いて活性化した。可溶性精製トロンボスポンジンの添加は、用量依存的に、酸化ＡＴＩＩＩによって媒介される血小板付着の増加を阻害した。
【００８１】
２ｃ）血小板を、上記記載の付着アッセイに使用し、酸化したＡＴＩＩＩを用いて活性化した。酸化タンパク質のＣＤ３６への結合を阻害する抗体、クローン３７、１３および７などは、酸化ＡＴＩＩＩの活性を阻害した。血小板機能に対する抗体の影響を測定するための全ての実験を、Ｆｃ受容体の影響を避けるために、ＦｃＲＩＩＡ受容体(クローンＩＶ.３)に対する抗体のＦabフラグメントを飽和する、完全なブロッキング濃度の存在下で実施した。
【００８２】
２ｄ）この影響は、用量依存性である。
２ｅ）可溶性トロンボスポンジン−１による血小板付着の阻害は、ＣＤ３６(ペプチドＶＴＣＧ)上のその結合部位によって直接媒介されない。ＶＴＣＧは、酸化タンパク質(本明細書中の酸化ＡＴＩＩＩ)による血小板付着の増加に影響しないことを示した。
【００８３】
２ｆ）しかし、クローンＦＡ６／１５２のような、ＣＤ３６の酸化タンパク質への結合を阻害しないＣＤ３６に対する抗体は、有意な阻害を全く誘導しない。血小板機能に対する抗体の影響を測定するための全ての実験は、Ｆｃ受容体の影響を避けるために、ＦｃＲＩＩＡ受容体(クローンＩＶ.３)に対する抗体のＦabフラグメントを飽和する、完全なブロッキング濃度の存在下で実施した。
【００８４】
図３：酸化タンパク質は、止血性/血栓性である血小板に結合するフィブリノーゲンの増加／この反応の阻害。
ＦＩＴＣ-接合したフィブリノーゲンおよび１０μg/ｍｌトロンボスポンジン を、ＨＥＰＥＳ-Ｔｙｒｏｄｅ-ＢＳＡ緩衝液でゲルろ過した血小板(５００００/μg)に添加した。試料の一部分を、高濃度の酸化タンパク質と共に添加した。３０分、室温でのインキュベーション後、フィブリノーゲンの結合をフロー・スルー・サイトメトリーで測定した。
【００８５】
３ａ）酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン、酸化ヒトアルブミンおよび酸化抗トロンビンＩＩＩ)は、血小板へのフィブリノーゲンの結合を増加させる。
３ｂ）可溶性トロンボスポンジン−１は、用量依存的に、酸化タンパク質によって誘導されたフィブリノーゲン結合を阻害した。
【００８６】
３ｃ）ＣＤ３６への酸化タンパク質の結合を阻害する抗体は、用量依存的に、酸化タンパク質によって誘導された血小板へのフィブリノーゲンの結合を阻害する。
酸化タンパク質：酸化ＡＴＩＩＩ；
抗体：抗-ＣＤ３６抗体、クローン３７
３ｄ）酸化タンパク質：酸化フィブリノーゲン；
抗体：抗-ＣＤ３６抗体、クローン３７
【００８７】
３ｅ）酸化タンパク質：酸化ヒトアルブミン
抗体：抗ＣＤ３６抗体、クローン３７
血小板機能に対する抗体の影響を測定するための全ての実験は、Ｆｃ受容体の影響を避けるために、ＦｃＲＩＩＡ-受容体(クローンＩＶ.３)に対する抗体のＦａｂフラグメント濃度を飽和する、完全なブロッキング濃度の存在下に実施した。
【００８８】
図４：酸化タンパク質は、止血性/血栓性/血小板凝集の誘導/この反応阻害に作用する。
４ａ）酸化タンパク質は血小板凝集を誘導する。血小板凝集を、Born（1962）に従って実施した。１００μg/ml フィブリノーゲンと共にＨＥＰＥＳ‐Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（ｐＨ ７.４）で、ゲルろ過した血小板(２００００/μｌ)に、ＴＳＰ−１(２５ μg/ml)を、凝集用キュベットにピペットで移した。可溶性ＴＳＰ−１単独では凝集を誘導しなかった。酸化タンパク質 (例えば、酸化されたフィブリノーゲンまたは酸化抗トロンビンＩＩＩ)の同時添加により、強い凝集形成を導いた。可溶性トロンボスポンジンは、高濃度＞５０μg/mlで酸化タンパク質によって誘導された凝集を阻害する。
【００８９】
４ｂ）酸化タンパク質のＣＤ３６への結合を阻害する抗体は、用量依存的に、 酸化タンパク質によって誘導された血小板凝集を阻害した。血小板機能に対する抗体の影響に関する全ての実験を、Ｆｃ受容体の影響を避けるために、ＦｃＲＩＩＡ受容体(クローンＩＶ.３)に対する抗体のＦabフラグメントを飽和する、完全なブロッキング濃度の存在下で実施した。
【００９０】
図５：酸化タンパク質は止血性/血栓性に作用する−血小板および微粒子形成の凝集状態の誘導/この反応の阻害。
【００９１】
５ａ)酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン)は、ファクターＶ/Ｖａの血小板への結合を誘導する。ファクターＶ/Ｖａ結合をDoermannら(1998)の記載に従って、実施した。
【００９２】
５ｂ)酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン)は、ファクターＸ/Ｘａの血小板への結合を誘導する。ファクターＸ/Ｘａ結合をDoermannら(1998) の記載に従って実施した。
【００９３】
５ｃ)酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン)は、膜中のリン脂質のフリップ−フロップとアネキシンＶの血小板への結合を誘導する。結合アネキシンＶの結合を、Doerrmannら(1998)の記載に従って実施した。
【００９４】
５ｄ)酸化タンパク質(例えば、酸化フィブリノーゲン)は、血小板の微粒子形成を誘導する。ゲルろ過した血小板（５００００/μl)を、酸化タンパク質を用い、３０分間、室温で、若干攪拌し、インキュベーションした。次いで、血小板から得た血小板および微粒子を、３０分、抗-ＧＰＩＸ-ＰＥ抗体と共にインキュベートし、得られる微粒子の数がフロー・スルー・サイトメーターで５０００計測粒子までの割合で測定した。
【００９５】
５ｅ)可溶性トロンボスポンジンは、酸化タンパク質によって誘導された微粒子形成を阻害する。この実験的態様において、血小板由来の微粒子形成を、酸化ヒトアルブミンによって誘導した。ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液(ｐＨ ７.４)で、ゲルろ過した血小板を、各々酸化ヒトアルブミン(５０ｇ/ｍｌ)と共に、１時間、室温で活性化した。活性化前に、血小板懸濁液を記載の濃度で可溶性ＴＳＰに添加した。微粒子形成を５ｄ)に記載のように分析した。可溶性トロンボスポンジンは、用量依存的に、微粒子形成を阻害した。
【００９６】
５ｆ)抗-ＣＤ３６クローン３７は、血小板の前凝集状態の酸化タンパク質-誘導形成を阻害する。血小板の前凝集膜表面の形成に対する指標としてのアネキシンＶ結合を、５ｃ)に記載のように測定した。酸化タンパク質のＣＤ３６への結合を阻害する、血小板と抗ＣＤ３６抗体(３０分、室温)とのプレインキュベーションは、酸化タンパク質(例えば、酸化フィブリノーゲン)によってこれら血小板の二次的活性化を阻害した。血小板機能に対する抗体の影響に関する全ての実験を、Ｆｃ受容体の影響を避けるために、ＦｃＲＩＩＡ受容体(クローンＩＶ.３)に対する抗体のＦabフラグメントを飽和する、完全なブロッキング濃度の存在下で実施した。
【００９７】
５ｇ)抗-ＣＤ３６クローン３７は、血小板の微粒子形成を誘導した酸化タンパク質を阻害する。微粒子形成を５ｄ)下に記載のように測定した。抗ＣＤ３６抗体と血小板とのプレインキュベーション(３０分、室温)は、酸化タンパク質のＣＤ３６への結合を阻害し、酸化タンパク質(例えば、酸化したフィブリノーゲン)による活性化前に微粒子形成を阻害する。
【００９８】
図６：酸化タンパク質は白血球を活性化する−Ｃａ２＋シグナル。
酸化タンパク質(例えば、酸化抗トロンビンＩＩＩ)は、単核白血球でのＣａ２＋シグナルを誘導する。Ｃａ２＋測定を、Sozzaniら(1993)に従って実施した。溶出した単核白血球(５x１０６/ml)を、室温で、ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液(ｐＨ７.４)を用いて洗浄し、次いで、１５分、３７℃で１μＭ Ｆｕｒａ２/ＡＭで標識し、Ｃａ２＋を含まないＨＥＰＥＳ‐Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で２回洗浄し、次いで１ｍＭ Ｃａ２＋を含むＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で縣濁した。Ｃａ２＋シグナルは、酸化タンパク質および陽性または陰性対照として有効な物質によって誘導されたＣａ２＋シグナルを、Hitachi F-2000で蛍光測定した。酸化抗トロンビンＩＩＩ(１００μg/ml)は、単核白血球を活性化し、Ｃａ２＋シグナルを明確に誘導した。
【００９９】
図７：酸化タンパク質は白血球を活性化する−酸化的バースト。
酸化タンパク質は、用量依存的に、ＰＭＮＬの酸化的バーストに対するｆＭＬＦの活性化効果を増加し、さらにそれらは、自主的、独立的アゴニストとして、酸化的バーストを誘導する。酸化的バーストの誘導を、フロー・スルー・サイトメトリーを用いて、Orpegen (Heidelberg)の食細胞/バースト試験を用いて当業者の指示に従って実施した。しかし、ＰＭＮＬは、最初に基質ＤＨＲ１２３を用いてインキュベートし、次いでＰＭＮＬを活性化した。 酸化抗トロンビンＩＩＩは、ｆＬＭＦの活性化効果を増加させ、それ自身酸化的バ−スト反応を誘導した。
【０１００】
図８：酸化タンパク質は、白血球を活性化する−内皮からの移動/この反応の阻害。
８ａ)トランスウェル細胞培養チャンバー(Costar, Bodenheim)において、ミクロ細孔のポリカーボネート膜で分けた(panned)トランスウェル挿入物を、各々２４ウェル上に静置した。５μｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜をフィブロネクチンで被覆し、ヒト微小血管内皮細胞(ＨＭＥＣ−１)を群集するまで培養した。密度勾配遠心分離によって単離されたヒト単核白血球(ＤＭＥＭ中２ x １０７細胞/ml、末梢血液由来)(２００μｌ)を、３７℃、７％ＣＯ２で、ＨＭＥＣ−１単層をインキュベートした。移動速度に対する程度として、低いトランスウェル挿入物の下の下部トランスウェル区分中の単核白血球数を測定した。様々な酸化タンパク質、トロンボスポンジンまたは抗ＣＤ３６抗体の影響を調査するために、試験物質を、上部トランスウェルチャンバー中の培地に添加するか、または内皮細胞を１０分試験物質と共にインキュベートし、洗浄した。移動時間４７時間後、挿入物を注意深く取出し、細胞培養プレートを、氷上に３０分置き、付着単核白血球を除き、移動単核白血球を計測した。酸化タンパク質(本明細書中酸化ＡＴＩＩＩ)は、ＨＭＥＣ−１単層からの単核白血球の移動を増進するが、非酸化親タンパク質は、この反応を示さなかった(移動時間、４時間)。
【０１０１】
８ｂ)ＴＳＰ−１と内皮層との１０分間のプレインキュベーションおよび移動実験中のＴＳＰ‐１の細胞培養培地への添加は、各々単核白血球の移動を顕著に阻害し得た(移動期間、７時間)。
【０１０２】
図９：酸化タンパク質は動脈硬化を促進するプロセスを誘導する。
酸化抗トロンビンＩＩＩは、動脈硬化斑でのマクロファージのホーミングを増加させる。具体的な実験は実施例で詳細に説明した。
【０１０３】
図１０：トロンボスポンジンは前動脈硬化プロセスを阻害する。
【０１０４】
トロンボスポンジンは、動脈硬化様に変化した内皮細胞へのマクロファージの付着を阻害する。具体的な実験は実施例で詳細に説明した。
【０１０５】
１０ａ)トロンボスポンジン−１は、動脈硬化様に変化した内皮へのマクロファージのローリングによって特徴付けられるマクロファージの一過性付着を阻害する。
１０ｂ)トロンボスポンジンは、動脈硬化様に変化した内皮へのマクロファージの永久的に安定な付着を阻害する。
図１１：トロンボスポンジンはイン・ビボでの炎症性プロセスを阻害する。
可溶性トロンボスポンジン−１は、Ｂａｌｂ/ｃマウスの耳でのアルテュス(Arthus)反応を阻害する。
１１ａ)各々５０μgＴＳＰ−１ i.p.で、０時および０時＋３時間の時点で２回処理したマウスは、左耳においてアルテュス反応を阻害する。
１１ｂ）対照緩衝液 i.p.で、０時および０時＋３時間の時点で２回処理したマウス−左耳におけるアルテュス反応。
１１ｃ) ＴＳＰ−１および対照緩衝液で処理したマウスにおけるアルテュス反応に対する測定値として耳に導入されたＢＳＡ-ＦＩＴＣ−左耳におけるアルテュス反応。
【０１０６】
図１２：ゲルろ過したヒト血小板を、ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液(ｐＨ ７.４）で５００００/μｌまで稀釈し、室温で活性化した。抗体による血小板に対するＦｃ受容体の影響を避けるために、実験を、ＦｃＲＩＩＡ受容体(クローンＩＶ.３)に対する抗体のＦabフラグメントを飽和する、完全なブロッキング濃度の存在下で実施した。活性化後、血小板を、０.１％ パラホルムアルデヒドを含むＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液(ｐＨ７.４)で、３０分固定し、洗浄した。固定、休止、活性化の血小板を、抗-ＣＤ３６「ＡＫ３６Ｐ」および抗-ＣＤ３６「ＡＫ３６-トータル」と、各々飽和濃度で、一晩インキュベートし、この血小板を洗浄し、ＦＩＴＣ-標識した抗体(ヤギ抗-ウサギＩｇＧ-ＦＩＴＣ、"ヒトＩｇＧとの最小Ｘ反応")を、１時間、室温で二次的にインキュベートした。血小板を、再洗浄し、抗-ＣＤ３６の結合"ＡＫ３６Ｐ"および抗-ＣＤ３６"ＡＫ３６-トータル" 抗体の各々を、フロー・スルー・サイトメーター(FACScan-Becton Dickinson)を用いてＦＩＴＣ蛍光によって定量した(Doermann et al., 1998に従う)。活性化による抗-ＣＤ３６ "ＡＫ３６Ｐ"の血小板への結合の低下。
【０１０７】
図１３：Ｉ型糖尿病患者と対照のヒトから血液を採血し、この血液をクエン酸と共に凝集した。血小板を多く含む血漿(ＰＲＰ)を遠心分離によって調製した。患者および対照の正常人のＰＲＰを、ＦＩＴＣと結合したフィブリノーゲン(１５０μg/ml）と混合し、血小板を、３０分間で濃度を増加させて、酸化タンパク質によって活性化した(本明細中では、酸化ヒトアルブミン)。フィブリノーゲン結合を、上記で詳細に説明したようにフロー・スルー・サイトメーターで測定した。図は、対照と比較して、Ｉ型糖尿病患者ＰＲＰによる活性化の同時測定の特徴的な態様を示す。Ｉ型糖尿病患者の血小板は、酸化タンパク質による活性化に対して特に感受性である。
【０１０８】
図１４：酸化タンパク質およびＨＩＶ受容体ＣＤ４の相互作用は、BIACORE system 2000中のプラズモン共鳴技術によって、実施例で詳細に記載したように測定した。
１２センサーグラムのオーバーレイ・プロットは、固定化ＣＤ４への酸化された抗トロンビンＩＩの結合および酸化抗トロンビンＩＩＩの解離を示す。ＣＤ４を固定化(１４８pg)した；酸化抗トロンビンＩＩＩの濃度を変化させた(０から最高: ０ｎＭ；１ｎＭ；５.１ｎＭ；１０.２ｎＭ；１７ｎＭ；２０.４ｎＭ；２３ｎＭ；３４ｎＭ；４０.８ｎＭ；５１ｎＭ；８５ｎＭ；１１９ｎＭ)。酸化ＡＴＩＩＩの濃度の増加に伴って、得られるシグナルは増加する。
【０１０９】
図１５：
１５ａ)酸化タンパク質は、血小板に結合するＴＳＰ−１を媒介する。
ゲルろ過したヒト血小板を、ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液(ｐＨ７.４)で５００００/μｌまで稀釈し、ＦＩＴＣ-結合精製されたトロンボスポンジン−１(５０μg/ml)を添加した。該血小板を、酸化タンパク質 (例えば、酸化フィブリノーゲン)とともに、１時間、室温でインキュベートし、そして血小板に結合するＴＳＰ−１を、フロー・スルー・サイトメトリーで測定した。酸化タンパク質は血小板に結合するＴＳＰ−１を誘導する。
【０１１０】
１５ｂ）酸化タンパク質 (例えば、酸化抗トロンビンＩＩＩ)は、トロンボスポンジンの内皮細胞への結合を誘導する。
ヒト微小血管の内皮細胞 (ＨＭＥＣ−１)を、標準的手法に従って、細胞培養プレートから溶解させ、懸濁液を、各々酸化タンパク質および酸化タンパク質＋ＴＳＰ−１添加により、１時間、室温でインキュベーションした。細胞を洗浄し、結合したＴＳＰ−１をフィコエリトリン(ＰＥ)と結合したｍＡＫ抗-ＴＳＰ−１(クローン Ｐ１０)で標識し、フロー・スルー・サイトメーターで定量した。酸化タンパク質は、内皮細胞と結合するＴＳＰ−１を誘導した。
【０１１１】
１５ｃ）精製したＴＳＰ−１を添加しない場合、そして酸化抗トロンビンＩＩＩを添加しない場合、溶出単核白血球の約１％のみの場合を、フロー・スルー・サイトメーターにおいて、細胞表面上のＴＳＰ−１を認識する抗体(クローンＰ１０)によって検出し、精製したＴＳＰ−１(１０μg/ml)の添加によって、おおよそ５％まで量が増加した。酸化ＡＴＩＩＩの添加(外因性ＴＳＰ−１を添加せずに）を、内在性ＴＳＰ−１の単核白血球との結合を媒介する。約１８％の単核白血球はＴＳＰ−１陽性であった。ＴＳＰ−１および酸化ＡＴＩＩＩの同時添加により、ほとんどの末梢血液単核白血球はＴＳＰ−１に対して強い陽性であった。
【０１１２】
１５ｄ）酸化タンパク質はＴＳＰ−１のＴ細胞への結合を誘導する。培養ヒトＴ細胞(Jurkat 細胞)を、酸化タンパク質(例えば、酸化抗トロンビンＩＩＩ) または酸化タンパク質＋ＴＳＰ−１添加(２５μg/ml)を用いて、１時間、室温でインキュベートした。Ｔ細胞に結合するＴＳＰ−１を、モノクローナルＰＥ結合抗-ＴＳＰ抗体(クローン Ｐ１０)によって標識し、フロー・スルー・サイトメーターで測定した。酸化タンパク質は、内在的および外因的に添加されたＴＳＰのＴ細胞への結合を誘導する。
【０１１３】
図１６：
この図は、請求項１５および請求項２１の薬物が、トロンボスポンジンとＣＤ３６(例、脈管形成)との反応によって誘導される機能を、阻害もしくは媒介する、メカニズムを示す。N. Bouckらの研究グループは、腫瘍脈管形成の潜在的内在性阻害剤として、トロンボスポンジン−１およびそれらの誘導体を同定し、この反応がＣＤ３６によって媒介されることを示した(Dawson et al., 1997; Jimenez et al., 2000)。
【０１１４】
ｐ３１
１６ａ）酸化タンパク質がトロンボスポンジンのＣＤ３６への結合を媒介することが、本発明によって示された。即ち、請求項２１の薬物は、例えば脈管形成の阻害、腫瘍処置のために使用され得るプロセスのような、この結合によって媒介される反応を誘導する。
【０１１５】
１６ｂ）本発明において、ＣＤ３６と酸化タンパク質の相互作用を阻害する物質、およびＣＤ３６と酸化タンパク質によって体内で誘導されるプロセスが、開示される。請求項１５の薬物は、これらの反応を阻害し、反応鎖の酸化タンパク質によって誘導される脈管形成の阻害(ＣＤ３６-立体構造変化-トロンボスポンジンのＣＤ３６-ＣＤ３６との脈管形成阻害についてのシグナル)を防止する。
【０１１６】
この反応は、脈管形成が所望される場合、例えば、発作発生の際の心筋において、治療的に使用され得る。
【０１１７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、酸化タンパク質がＨＩＶ-１ＧＰ１２０タンパク質中のＣＤ３６ホモログドメインに結合することを示す。
【図２】  図２は、酸化タンパク質は止血性/血栓性である−血小板付着の増加/この反応の阻害を示す。
【図３】  図３は、酸化タンパク質が止血性/血栓性である血小板に結合するフィブリノーゲンの増加／この反応の阻害を示す。
【図４】  図４は、タンパク質が、止血性/血栓性/血小板凝集の誘導/この反応阻害に作用することを示し、４ａ）酸化タンパク質は血小板凝集を誘導することを示す。
【図５】  図５は、酸化タンパク質は止血性/血栓性に作用する−血小板および微粒子形成の凝集状態の誘導/この反応の阻害を示す。
【図６】  図６は、酸化タンパク質は白血球を活性化する−Ｃａ２＋シグナルことを示す。
【図７】  図７は、酸化タンパク質は白血球を活性化する−酸化的バーストを示す。
【図８】  図８は、酸化タンパク質が、白血球を活性化する−内皮からの移動/この反応の阻害を示し、
【図９】  図９は、酸化タンパク質は動脈硬化を促進するプロセスを誘導することを示す。
【図１０】  図１０は、トロンボスポンジンは前動脈硬化プロセスを阻害することを示す。
【図１１ａ】  図１１ａは、トロンボスポンジンはイン・ビボでの炎症性プロセスを阻害することを示し、図１１ａは、各々５０μgＴＳＰ−１ i.p.で、０時および０時＋３時間の時点で２回処理したマウスは、左耳においてアルテュス反応を阻害することを示す。
【図１１ｂ】  図１１ｂは、対照緩衝液 i.p.で、０時および０時＋３時間の時点で２回処理したマウス−左耳におけるアルテュス反応を示す。
【図１１ｃ】  図１１ａは、ＴＳＰ−１および対照緩衝液で処理したマウスにおけるアルテュス反応に対する測定値として耳に導入されたＢＳＡ-ＦＩＴＣ−左耳におけるアルテュス反応を示す。
【図１２】  図１２は、活性化による抗-ＣＤ３６ "ＡＫ３６Ｐ"の血小板への結合の低下を示す。
【図１３】  図１３は、対照と比較して、Ｉ型糖尿病患者ＰＲＰによる活性化の同時測定の特徴的な態様を示す。
【図１４】  図１４は、酸化タンパク質およびＨＩＶ受容体ＣＤ４の相互作用を示す。
【図１５ａ】  図１５ａは、酸化タンパク質は、血小板に結合するＴＳＰ−１を媒介することを示す。
【図１５ｂ】  図１５ｂは、酸化タンパク質 (例えば、酸化抗トロンビンＩＩＩ)は、トロンボスポンジンの内皮細胞への結合を誘導することを示す。
【図１５ｃ】  図１５ｃは、ほとんどの末梢血液単核白血球はＴＳＰ−１に対して強い陽性であることを示す。
【図１５ｄ】  図１５ｄは、酸化タンパク質はＴＳＰ−１のＴ細胞への結合を誘導することを示す。
【図１６ａ】  図１６は、請求項１５および請求項２１の薬物が、トロンボスポンジンとＣＤ３６(例、脈管形成)との反応によって誘導される機能を、阻害もしくは媒介する、メカニズムを示し、図１６ａは、酸化タンパク質がトロンボスポンジンのＣＤ３６への結合を媒介することを示す。
【図１６ｂ】  図１６ｂは、ＣＤ３６と酸化タンパク質の相互作用を阻害する物質、およびＣＤ３６と酸化タンパク質によって体内で誘導されるプロセスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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