(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、及び水を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するようなｐＨ値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、有機モディファイアを含まない水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、同じ又はより高いｐＨ値で溶出することを含む方法。
【請求項２】
ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、及び水を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するようなｐＨ値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、有機モディファイアを含まない水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、同じ又はより低いｐＨ値で溶出することを含む方法。
【請求項３】
ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法を含む、純粋なペプチドを生産するための工業的方法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、及び水から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するようなｐＨ値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、有機モディファイアを含まない水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、同じ又はより高いｐＨ値で溶出することを含む方法。
【請求項４】
ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法を含む、純粋なペプチドを生産するための工業的方法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、及び水から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するようなｐＨ値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、有機モディファイアを含まない水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、同じ又はより低いｐＨ値で溶出することを含む方法。
【請求項５】
ペプチドを単離するための方法であって、
ａ）混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、及び水を含む溶液中で、直線もしくはステップ塩成分勾配的又は定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するようなｐＨ値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、有機モディファイアを含まない水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、同じ又はより高いｐＨ値で溶出することを含むカチオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製することを含む方法。
【請求項６】
ペプチドを単離するための方法であって、
ａ）混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、及び水を含む溶液中で、直線もしくはステップ塩成分勾配的又は定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するようなｐＨ値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、有機モディファイアを含まない水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、同じ又はより低いｐＨ値で溶出することを含むアニオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製することを含む方法。
【請求項７】
前記溶出されたペプチドを分析テスト及び／又は更なる精製に供し、前記ペプチドを単離することをさらに含んでなる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記関連する不純物が除去されるように、前記ｐＨ値が、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷よりも低い正の局所的又は全体的実効電荷を有するような範囲である、請求項１、３又は５に記載の方法。
【請求項９】
前記関連する不純物が除去されるように、前記ｐＨ値が、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷よりも低い負の局所的又は全体的実効電荷を有するような範囲である、請求項２、４又は６に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程ａ）の溶液が更に塩成分を含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ａ）の溶液が更に緩衝液を含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程ａ）のｐＨ値が緩衝液で維持される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ｂ）の有機モディファイアを含まない水性溶媒が更に塩成分を含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程ｂ）のｐＨ値が緩衝液で維持される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記関連する不純物が前記ペプチドと異なる局所的又は全体的実効電荷を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記関連する不純物が、トランケートされた形態、全ての種類の伸長した形態、余分のアミノ酸、エステルを含む種々の誘導体等、脱アミド化形態、不正確にホールディングした形態、シアリル化を含む不要なグリコシル化を伴う形態、γ−カルボキシグルタミン酸の欠如した形態から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記精製すべきペプチドが、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、レセプター、ｖｉｒａ、並びにそれらの相同体、アナログ及び誘導体から選択される請求項１〜１６のいずれか一に記載の方法。
【請求項１８】
前記精製すべきペプチドがグルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、第VII因子、第VIIａ因子、第VIIａｉ因子、ＦＦＲ−第VIIａ因子、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２並びにそれらのアナログ及び誘導体から選択される請求項１〜１７のいずれか一に記載の方法。
【請求項１９】
重量パーセントに基づく有機モディファイア：水の比が１：９９〜９９：１である請求項１〜１８のいずれか一に記載の方法。
【請求項２０】
前記有機モディファイアが、Ｃ１−６−アルカノール、Ｃ１−６−アルケノール又はＣ１−６−アルキノール、尿素、グアニジン、グアニジン−ＨＣｌ、Ｃ１−６−アルカン酸（alkanoicacid）、酢酸、Ｃ２−６−グリコール、Ｃ３−７−ポリアルコール、糖及びそれらの混合物から選択される請求項１〜１９のいずれか一に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのイオン交換クロマトグラフィー法、及びこのようなイオン交換クロマトグラフィー法を含む工業的方法に関する。
背景
タンパク質及びペプチドの精製及び分析のために、クロマトグラフィーは公知であり、広く用いられる方法である。いくつかの異なるクロマトグラフィー原理が適用されており、これらの中に、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）がある。ＩＥＣの原理には、２つの異なるアプローチ：イオン交換樹脂上のリガンドの電荷によりアニオン交換及びカチオン交換がある。慣用的なＩＥＣ精製法は、通常、１又は複数のもの：平衡化セクション、適用又はローディングセクション、洗浄セクション、溶出セクション、及び再生セクションがある（cf. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990又はRemington : The Science and Practice of Pharmacy 19th Edition (1995))。
【０００２】
工業的精製工程におけるＩＥＣでの溶出の主要な原理は、ステップ又は直線勾配としての、一定pHでの水性緩衝溶液中の塩成分勾配である（cf. S. Biorn and L. Thim, Activation of Coagulation Factor VII to VIIa, Res. Discl. No. 269, 564〜565, 1986)。無勾配溶出が可能であるが、めったに用いられない。要求される形態に又は溶液中にタンパク質又はペプチドを維持するために、その溶液に有機溶媒又はモディファイアが時折、添加されている（cf. K.H. Jorgensen, Process for Purifying Insulin, US Patent No. 3,907,676, Sept. 23, 1975; and J. Brange, O. Hallund and E. Sorensen, Chemical Stability of Insulin 5. Isolation, Characterisation and Identification of Insulin Transformation Products, Acta Pharm. Nord. 4(4), 223-232, 1992) 。また、標的タンパク質を溶出するためpHの変化を時折、用いることができる（cf. J. Lamy, J. Lamy, J. Weill, Arch. Biochem. Biophys. 193, 140-149, 1979）。
発明の記載
１又は複数の平衡化ステップ、適用又はローディングステップ、洗浄ステップ、溶出ステップ、及び再生ステップからなるいずれかのタンパク質又はペプチドの精製のための上述のＩＥＣ技術と対照的に、本発明は、有機モディファイアを含む溶液中の溶出の、次の同じ又は異なるpHでの水溶液中での溶出、任意に次の再生ステップの組合せである新規溶出技術に関する。平衡化溶液及び適用のためのサンプルは、有機モディファイアを含んでも含まなくてもよい。ペプチドの溶出は（有機モディファイアを含まない溶液中の）非変性条件で行う。更に、ペプチドの溶出は単一ピークで行う。
【０００３】
従って、広い態様において、本発明は、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出すること
を含む方法に関する。
【０００４】
別の広い態様において、本発明は、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出すること
を含む方法に関する。
【０００５】
別の広い態様において、本発明は、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出すること
を含む方法に関する。
【０００６】
別の広い態様において、本発明は、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出すること
を含む方法に関する。
【０００７】
本方法の上述の態様において、ステップａ）の溶出は、関連する不純物の洗浄ステップも考慮することができる。
【０００８】
ステップｂ）のペプチドの溶出は、（有機モディファイアを含まない溶液中で）非変性条件で行う。これにより、そのペプチドは、水及び任意に塩成分、酸又は塩基、及び／又は緩衝液を含むが、有機モディファイアの存在しない水溶液に溶出される。
【０００９】
本発明の一実施形態において、有機モディファイア：水の比は、重量パーセントベースで、１：９９〜９９：１、例えば１：９９〜８０：２０、２０：８０〜８０：２０、３０：７０〜７０：３０、３５：５０〜５０：３５、又は４０：５０〜５０：４０である。これらの範囲の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
【００１０】
本発明の更なる実施形態において、有機モディファイアは、Ｃ1-6 −アルカノール、Ｃ1-6 −アルケノール又はＣ1-6 −アルキノール、尿素、グアニジン、又はＣ1-6 −アルカン酸（alkanoic acid)、例えば酢酸、Ｃ2-6 −グリコール、Ｃ3-7 −ポリアルコール含有糖、好ましくは、Ｃ1-6 −アルカノール及びＣ2-6 −グリコール、より好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール及びブタノール及びヘキシルグリコール最も好ましくはエタノール及び２−プロパノールから選択される。これらの有機モディファイアの各々は本発明の別の実施形態を構成する。
【００１１】
本発明の更なる実施形態において、ステップａ）の塩成分はいずれかの有機又は無機塩及びそれらの混合物、好ましくはＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＮＨ4 Ｃｌ，ＣａＣｌ2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物、最も好ましくは酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、ＮａＣｌ，ＮＨ4 Ｃｌ，ＫＣｌから選択される。これらの塩成分の各々は、本発明の別の実施形態を構成する。
【００１２】
本発明の更なる実施形態において、ステップａ）における塩成分の勾配は、塩成分のステップ勾配である。
【００１３】
本発明の更なる実施形態において、ステップａ）の塩成分は、０．１mmol／kg〜３０００mmol／kg、好ましくは１mmol／kg〜１０００mmol／kg、より好ましくは５mmol／kg〜５００mmol／kg、最も好ましくは２０mmol／kg〜３００mmol／kgの範囲から選択されるステップ濃度で存在する。これらの範囲の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
【００１４】
本発明の更なる実施形態において、ステップａ）の塩成分勾配は塩成分の直線勾配である。
【００１５】
本発明の更なる実施形態において、ステップａ）の塩成分は、０．１mmol／kg〜３０００mmol／kg、好ましくは１mmol／kg〜１０００mmol／kg、より好ましくは５mmol／kg〜５００mmol／kg、最も好ましくは２０mmol／kg〜３００mmol／kgから選択される直線濃度で存在する。これらの直線濃度の各々は本発明の別の実施形態を構成する。
【００１６】
本発明の更なる実施形態において、ステップａ）に塩成分は存在しない。
【００１７】
本発明の更なる実施形態において、ステップｂ）の塩成分は、いずれかの有機又は無機塩、好ましくはＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＮＨ4 Ｃｌ，ＣａＣｌ2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物、最も好ましくは酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、ＮａＣｌ，ＮＨ4 Ｃｌ，ＫＣｌから選択される。これらの塩成分の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
【００１８】
本発明の更なる実施形態において、ステップｂ）の塩成分は、０．１mmol／kg〜３０００mmol／kg、好ましくは１mmol／kg〜１０００mmol／kg、より好ましくは５mmol／kg〜５００mmol／kg、最も好ましくは２０mmol／kg〜３００mmol／kgの範囲から選択される濃度で存在する。これらの範囲の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
【００１９】
本発明の更なる実施形態において、ステップｂ）に塩成分は存在しない。
【００２０】
本発明の更なる実施形態において、ステップａ）又はｂ）の緩衝液は、独立して、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、アルギニン緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液、アンモニウム緩衝液、グリシン緩衝液、アルキルアミン緩衝液、アミノエチルアルコール緩衝液、エチレンジアミン緩衝液、トリエタノールアミン、イミダゾール緩衝液、ピリジン緩衝液及びバルビツール酸緩衝液並びにそれらの混合物、好ましくはクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、炭酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、炭酸カリウム、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン及びホウ酸並びにそれらの混合物から選択される。これらの緩衝液の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
【００２１】
本発明の更なる実施形態において、ステップａ）の緩衝液は、０．１mmol／kg〜５００mmol／kg、好ましくは１mmol／kg〜２００mmol／kg、より好ましくは５mmol／kg〜１００mmol／kg、最も好ましくは１０mmol／kg〜５０mmol／kgの範囲から選択される濃度で存在する。これらの範囲の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
【００２２】
本発明の更なる実施形態において、ステップｂ）の緩衝液は、０．１mmol／kg〜１０００mmol／kg、好ましくは１mmol／kg〜４００mmol／kg、最も好ましくは５０mmol／kg〜２００mmol／kgの範囲から選択される濃度で存在する。これらの範囲の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
【００２３】
本発明の更なる実施形態において、ステップａ）に緩衝液は存在しない。
【００２４】
本発明の更なる実施形態において、ステップｂ）に緩衝液は存在しない。
【００２５】
本発明の更なる実施形態において、精製すべきペプチドは、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、レセプター、ｖｉｒａ、並びにそれらの相同体、アナログ及び誘導体、好ましくはグルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、アプロチニン、第VII 因子、ＴＰＡ、第 VIIａ因子、ＦＦＲ−第VII 因子、ヘパリナーゼ、ＡＣＴＨ、ヘパリン結合タンパク質、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２、インスリン様成長因子−１、インスリン様成長因子−２、繊維芽細胞成長因子、胃抑制ペプチド、成長ホルモン放出因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリトロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド、ＤＰＰＩＶ、インターロイキン、イムノグロブリン、補体インヒビター、セルピンプロテアーゼインヒビター、サイトカイン、サイトカインレセプター、ＰＤＧＦ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子レセプター、成長因子並びにそれらのアナログ及び誘導体、より好ましくはグルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、アプロチニン、第VII 因子、第 VIIａ因子、ＦＦＲ−第 VIIａ因子、ヘパリナーゼ、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２並びにそれらのアナログ及び誘導体、例えばＶａｌ8 ＧＬＰ−１（７−３７），Ｔｈｒ8 ＧＬＰ−１（７−３７），Ｍｅｔ8 ＧＬＰ−１（７−３７），Ｇｌｙ8 ＧＬＰ−１（７−３７），Ｖａｌ8 ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、Ｔｈｒ8 ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、Ｍｅｔ8 ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、Ｇｌｙ8 ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)、ヒトインスリン、及びＢ２８ＩｓｏＡｓｐインスリンから選択される。これらのペプチドの各々が本発明の別の実施形態を構成する。
【００２６】
本発明を説明する例として、ヒスチジンはpH約６．５未満で支配的な正の実効電荷を有し、これにより、カチオン交換について、有機溶媒又はモディファイアでの洗浄又は溶出セクションをpH６．５未満で行って、ヒスチジンを失ったトランケートされた形態を除去することができ、そして次に水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出をpH６．５超で行うことができる。第２の例として、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基はpH約３．１超や支配的な負の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH３．１超で行ってアミドに伸びた形態を除去することができ、そして次に、水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出はpH３．１超又はそれ未満の両方で行うことができる。第３の例として、アスパラギン酸はpH約４．４超で支配的な負の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換のために、有機溶媒での洗浄又は溶出は、pH４．４超で行って、アスパラギン酸を失ったトランケートされた形態を除去することができ、そして次に、水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出はpH４．４未満で行うことができる。第４の例として、グルタミン酸はpH約４．４超で支配的な負の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換のために、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH４．４超で行って、グルタミン酸を失ったトランケートされた形態を除去することができ、そして次に、水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出はpH４．４未満で行うことができる。第５の例として、γ−カルボキシグルタミン酸はpH約４．４超で支配的な負の実効電荷を有し、アニオン交換のために、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH４．４超で行って特定のグルタミン酸残基の１又は複数のγ−カルボキシル基を失った形態を除去して、そして次に水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出をpH４．４未満で行うことができる。第６の例として、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基はpH約８．０未満で支配的な正の実効電荷を有し、これにより、カチオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH８．０未満で行って、アシル基が伸びた形態を除去し、そして次に水性溶媒での標的タンパク質又はペプチドの溶出は、pH８．０超又はそれ未満の両方で行うことができる。第７の例として、システインはpH約８．５超で支配的な負の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH８．５超で行って、遊離システイン残基を生ずるほとんど折りたたまれていない形態を除去することができ、そして次に、水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出は、pH８．５未満で行うことができる。第８の例として、チロシンはpH約１０．０超で支配的な負の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH１０．０超で行って、チロシン残基を失ったトランケート化形態を除去することができ、そして次に、水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチド溶出はpH１０．０未満で行うことができる。第９の例として、リシンはpH約１０．０未満で支配的な正の実効電荷を有し、これにより、カチオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH１０．０未満で���って、リシン残基の側鎖中がアシル化された形態を除去し、そして次に水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出はpH１０．０超又はそれ未満で行うことができる。第１０の例として、アルギニンはpH約１２．０未満で支配的な正の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH１２．０未満で行って、アルギニン残基を失ったトランケート化形態を除去することができ、そして次に水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出は、pH１２．０超で行うことができる（これらの例に用いるｐＫA 値は、L. Stryer. Biochemistry, 3rd edition, W.H. Freeman and Company, New York, Table 2-1, page 21からのものである）。
【００２７】
上述の方法の特定のペプチドの例は、カチオン交換クロマトグラフィーによるＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びＡｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)、アニオン交換クロマトグラフィーによるヒトインスリン及びＢ３０ヒトインスリンエチルエステル、アニオン交換クロマトグラフィーによるＢ２８ＩｓｏＡｓｐインスリン及びＤｅｓＢ２３−３０インスリン、アニオン交換クロマトグラフィーによるプロトロンビン及びｄｅｓ−γ−カルボキシ−Ｇｌｙプロトロンビン、アニオン交換クロマトグラフィーによるＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びＡｒｇ34ＧＬＰ−１(10-37) 、カチオン交換クロマトグラフィーによるＬｙｓB29 −（Ｎ−ε（α−テトラデカノイル））−ｄｅｓＢ３０インスリン及びＤｅｓＢ３０インスリン、カチオン交換クロマトグラフィーによるＬｙｓB29 −（Ｎ−ε（α−テトラデカノイル））−ｄｅｓＢ３０インスリン及びＬｙｓB29 −（Ｎ−ε（α−テトラデカノイル））−Ａｌ−（Ｎ−ε−（α−テトラデカノイル））−ｄｅｓＢ３０インスリン、カチオン交換クロマトグラフィーによるアプロチニン及びＤｅｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−アプロチニン、並びにアニオン交換クロマトグラフィーによるグルカゴン(1−29)及びグルカゴン(6-29)の分離である。
【００２８】
それらペプチドは、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、そのペプチドの発現を許容する条件下で好適な栄養培地中でそのペプチドを発現することができる宿主細胞を培養し又は発酵させることを含む方法により生産することができ、その後、得られたペプチドはその培養又は発酵ブロスから回収される。以後、培養は、培養及び発酵等；両方を含むものとして用いられよう。
【００２９】
細胞を培養するのと用いる培地は、宿主細胞を生長させるために適したいずれの慣用的な培地、例えば好適なサプリメントを含む最小又は複合培地であってよい。好適な培地は、商業的供給元から利用でき、又は公開されている方法（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログ）に従って調製することができる。細胞により生産されたペプチドは、次に、任意に細胞を溶解し、遠心又はろ過により培地から宿主細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムを用いて上清又はろ液のタンパク質成分を沈殿させ、慣用的な精製技術、例えばクロマトグラフィー技術により精製し、必要に応じて本発明によるイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、そして次に、分析テスト、例えばＰＡＧＥ，ＩＥＦにかけ、必要に応じて更なる精製にかけ、そして必要に応じて純粋なペプチドを単離することを含む慣用的な手順により培養培地から回収することができる。
【００３０】
培養培地からの得られたペプチドの回収の間、本発明によるイオン交換クロマトグラフィーによる精製の前に、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物は、任意に、慣用的な技術により、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により化学的に修飾することができる。
【００３１】
親ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、好適には、ゲノム又はｃＤＮＡ起源のもの、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによりペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることにより得られるものであり得る（例えば、Sambrook, J. Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989を参照のこと）。そのペプチドをコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859〜1869 により記載されるホスホアミジト法、又はMatthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801〜805 により記載される方法により合成により調製することもできる。そのＤＮＡ配列は、例えばＵＳ４，６８３，２０２又はSaiki et al., Science 239 (1988), 487〜491に記載されるように、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応により調製することもできる。
【００３２】
そのＤＮＡ配列は、いずれかのベクターに挿入することができ、それは、便利には、組換えＤＮＡ法にかけられ、そしてベクターの選択は、しばしば、導入すべき宿主細胞に依存するであろう。これにより、本ベクターは、自己複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在するベクターであって、その複製が染色体複製と独立しているもの、例えばプラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入した時に、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製するものであってもよい。
【００３３】
ベクターは、好ましくは、ペプチドをコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写のために要求される更なるセグメント、例えばプロモーターに作用可能にリンクしている発現ベクターである。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのＤＮＡ配列であってもよく、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。種々の宿主細胞において本発明のペプチドをコードするＤＮＡの転写を指示するための好適なプロモーターの例は当業界、例えばSambrook et al.,前掲において公知である。
【００３４】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、必要に応じて好適なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻訳エンハンサー配列に作用可能に接続される。本発明の組換えベクターは、ベクターが問題の宿主細胞内で複製するのを可能にするＤＮＡ配列を更に含み得る。
【００３５】
ベクターは、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞の欠損を補足する遺伝子又は薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロランフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートに対する耐性を与えるものも含み得る。
【００３６】
ペプチドを宿主細胞の分泌経路に向かわせるために、（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる）分泌シグナル配列を組換えベクターに供することができる。分泌シグナル配列は正確な読み枠内でペプチドをコードするＤＮＡ配列に連結される。分泌シグナル配列はそのペプチドをコードするＤＮＡ配列の５′に共通して位置する。分泌シグナル配列は、そのペプチドに通常、関連するものであっても、別の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
【００３７】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーター、並びに任意にターミネーター及び／又は分泌シグナル配列各々を連結するため、並びに複製のために必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入するために用いる手順は当業者に公知である（例えばSambrook et al.,前掲）。
【００３８】
ＤＮＡ配列又は組換えベクターを導入する宿主細胞は、本ペプチドを生産することができるいずれの宿主細胞であってもよく、細菌、ｖｉｒａ、例えばバキュロウィルス、イースト、真菌、昆虫細胞及び高等真核細胞がある。公知であり、当業界で用いられている好適な宿主細胞の例は、これらに限らないが、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae) 、又は哺乳動物ＢＨＫ又はＣＨＯ細胞系である。
【００３９】
ペプチドのいくつか、特にオリゴペプチドは、慣用的な有機ペプチド合成化学に従って生産することができる。次に、得られた合成混合物は、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により、化学的に修飾して精製し、又はそれ自体として精製してから上述の通り化学的に修飾することができる。
【００４０】
第 VIIａ因子の調製
本発明に用いるために適したヒト精製第 VIIａ因子は、好ましくは、例えばHagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412〜2416に記載されるような、又は欧州特許第２００．４２１号（Zymo Genetics)に記載されるような、ＤＮＡ組換え技術によって作られる。組換え技術により生産された第 VIIａ因子は、真の第 VIIａ因子又は多少改変された第 VIIａ因子であり得る。但し、このような第 VIIａ因子は、真の第 VIIａ因子と実質的に同じ血液凝固についての生物活性を有する。このような改変された第 VIIａ因子は、既知の手段により、例えば部位特異的変異誘発により天然のＦVII をコードする核酸内のアミノ酸コドンを変化させることにより、又はアミノ酸コドンのいくつかの除去により、第VII 因子をコードする核酸配列を改変することにより生産することができる。
【００４１】
第VII 因子は、Broze and Majerus. J. Biol. Chem 255(4) : 1242〜1247, 1980及びHedner and Kisiel, J. Clin. Invest 71 : 1836〜1841, 1983に記載される方法によっても生産することができる。これらの方法は、検出可能な量の他の血液凝固因子なしに第VII 因子を作り出す。なお更に精製された第VII 因子調製物は、最終精製ステップとして更なるゲルろ過を含めることにより得ることができる。次に、第VII 因子は、既知の手段により、例えばいくつかの異なる血漿タンパク質、例えば第ＸIIａ，ＩＸａ又はＸａ因子により活性化ＦVIIａ に変換される。あるいは、Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564〜565）に記載されるように、第VII 因子は、それを、イオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばＭｏｎｏ  Ｑ（登録商標)(Pharmacia fine Chemicals）等に流すことにより活性化することができる。
【００４２】
改変又は不活性化ＦVIIａ（ＦVIIａｉ）は、以下の方法により生産することができる：
国際出願ＷＯ９２／１５６８６は、改変第 VIIａ因子、改変第 VIIａ因子の生産のためのポリ核酸及び哺乳動物細胞系、並びに血液凝固を阻害するための改変第 VIIａ因子を含む組成物に関する。
【００４３】
改変第VII 因子は、ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のプレプロペプチド及びｇｌａドメイン、並びにｇｌａドメインのない第VII 因子タンパク質を各々コードする２つの作用可能にリンクした配列コーティング領域を含むポリヌクレオチド分子によりコードされ得る。発現に基づき、そのポリヌクレオチドは血漿第Ｘ又はＩＸ因子を有意に活性化せず、組織因子に結合することができない改変第VII 因子をコードする。
【００４４】
第 VIIａ因子の触媒活性は、触媒中心又は３つ組の化学的誘導化により阻害することができる。誘導化は、第VII 因子を、不可逆的インヒビター、例えば有機リン化合物、スルホニルフルオライド、ペプチドハロメチルケトンもしくはアザペプチドと反応させることにより、又は例えばアシル化により行うことができる。好ましいペプチドハロメチルケトンには、ＰＰＡＣＫＣＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチル−ケトン；引用により本明細書に組み込まれる米国特許第４，３１８，９０４号を参照のこと）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ及びＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＦＲ−ｃｍｋ）；及びＤＥＧＲｃｋ（ダンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン）がある。
【００４５】
第 VIIａ因子の触媒活性は、アミノ酸を置換、挿入又は削除することによっても阻害することができる。好ましい実施形態において、アミノ酸置換は、第 VIIａ因子触媒部位に寄与するアミノ酸を含む領域として本明細書で定義される第VII 因子触媒３つ組のアミノ酸配列内に行われる。触媒３つ組内の置換、挿入又は欠失は、一般に、触媒部位を形成するアミノ酸で、又はそれに隣接する。ヒト及びウシ第VII 因子において、触媒“３つ組”を形成するアミノ酸は、Ｓｅｒ344 ，Ａｓｐ242 、及びＨｉｓ193 （添字のナンバリングは配列中の位置を示す）。他の哺乳動物種からの第VII 因子中の触媒部位は、とりわけ、タンパク質単離及びアミノ酸分析を含む現在利用できる技術を用いて決定することができる。触媒部位は、配列を他のセリンプロテアーゼ、特にその活性部位が先に決定されている引用により本明細書に組み込まれるSigler et al., J. Mol. Biol., 35 : 143〜164 (1968)キモトリプシンの配列とアラインすることによって決定することもでき、そのアラインメントから類似活性部位残基を決定することからも決定することができる。
【００４６】
ヒト及びウシ第VII 因子の好ましい実施形態において、活性部位残基Ｓｅｒ344 は改変され、Ｇｌｙ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ、又はより好ましくはＡｌａで置換される。このような置換は、別個に、又はＨｉｓ193 及びＡｓｐ242 を含む触媒３つ組内の他の部位の置換と組み合わせて行うことができよう。
【００４７】
第VII 因子内の触媒部位を形成するアミノ酸、例えばヒト及びウシ第VII 因子内のＳｅｒ344 ，Ａｓｐ242 、及びＨｉｓ193 は、置換されても削除されてもよい。本発明において、単一のアミノ酸のみを変化させ、これにより分子の抗原性を増加させ又は組織因子に結合する能力を阻害する可能性を最小にすることが好ましいが、２又はそれ超のアミノ酸変換（置換、付加又は欠失）を行うことができ、そして置換、付加及び削除の組合せも行うことができる。ヒト及びウシ第VII 因子のための好ましい実子形態において、Ｓｅｒ344 は、好ましくはＡｌａで置換されるが、Ｇｌｙ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ又は他のアミノ酸を置換することもできる。ＡｓｐをＧｌｕで置換し、そしてＨｉｓをＬｙｓ又はＡｒｇで置換することが好ましい。一般に、置換は、出来る限りタンパク質３次構造を破壊しないよう選択される。引用により本明細書に組み込まれるDayhoff et al.のモデル（Atlas of Protein Structure 1978, Nat'l Biomed. Res. Found., Washington, D.C.）は、他のアミノ酸置換を選択することにおいてガイドとして用いることができる。ヒト、ウシ又は他の種の好適な第VII 因子配列の触媒部位に上述の残基変化を導入し、得られたタンパク質を、触媒活性の阻害の要求されるレベル及び本明細書に記載されるような生ずる抗凝固活性についてテストすることができる。改変された第VII 因子について、その触媒活性は、一般に、対応する種の野生型第VII 因子の触媒活性の約５％未満、より好ましくは約１％未満、実質的に阻害されよう。
【００４８】
改変された第VII 因子は、組換えＤＮＡ技術の使用を介して生産することができる。
【００４９】
アミノ酸配列変化は、種々の技術により行うことができる。ＤＮＡ配列の改変は、部位特異的変異誘発によるものであってよい。部位特異的変異誘発のための技術は当業界で公知であり、例えばZoller and Smith (DNA 3 : 479〜488, 1984）に記載される。これにより、第VII 因子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を用いて、選択された変化を導入することができる。改変された第ＦVIIａ 因子は、化学的方法によって生産することもできる。
ＦＦＲ−ＦVIIａ（即ちＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＦVIIａ)
ＦＦＲクロロメチルケトンの例
ＦＦＲクロロメチルケトンでのＦVIIａ の活性部位の遮断
クロロメチルケトンでの活性部位セリン及びヒスチジンの遮断は、セリンプロテアーゼの不可逆的不活性化のための公知の方法である。所定のプロテアーゼの遮断を最適化するために、その活性部位と迅速なオン・レートで特異的に反応するクロロメチルケトン誘導体を選択することが重要である。このような誘導体は、問題の特定のセリンプロテアーゼの基質結合ポケットと相互作用するオリゴペプチドのクロロメチルケトン基への結合により開発することができる。
【００５０】
グルタミル−グリシル−アルギニンクロロメチルケトン（ＥＧＲ−ｃｋ又はそのダンシル誘導体、ＤＥＧＫ−ｃｋ）(S. Higashi, H. Nishimura, S. Fujii, K Takada, S. Iwanaga, (1992) J. Biol. Chem. 267, 17990)又はプロリル−フェニル−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＦＲ−ｃｋ）(J.H. Lawson, S. Butenas, K. Mann, (1992), J. Biol. Chem. 267, 4834; J. Contrino, G.A. Hair, M.A. Schmeizl, F.R. Rickles, D.L. Kreutzer (1994) Am. J. Pathol. 745, 1315)がＦVIIａ の活性部位インヒビターとして適用されている。これらのクロロメチルケトンと比べてＦＦＲｃｋの適用は１０〜７０倍の比率の増加を示す。
【００５１】
ＦVIIａ のＦＦＲ−クロロメチルケトン誘導体との反応の特異性は、ＨＰＬＣ及びペプチドマッピングにより検査した。それは、ＦVIIａ がＦＦＲ−クロロメチルケトンと、１：１の比で、ヒスチジン１９３で誘導化された予想産物として９８％超を回収することができたことを示した。
【００５２】
種々のクロロメチルケトンによるＦVIIａ の不活性化：
３μＭ  ＦVIIａ を１２μＭのクロロメチルケトン誘導体と、５０mM  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１００mM  ＮａＣｌ、５mM  ＣａＣｌ2 、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−８０、pH７．４中でインキュベートした。サンプルを、示されるように種々の時間間隔で採取し、１mM  Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む５０mM  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１００mM  ＮａＣｌ、５mM  ＣａＣｌ2 、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−８０、pH７．４中での活性測定のために２０倍に希釈した。残存ＦVIIａ 活性を、４０５nmの吸光度の増加により測定した。
【００５３】
通常、本発明によるイオン交換クロマトグラフィーにより精製すべきペプチド及び関連する不純物を含む混合物は、アミノ酸、小ペプチド、大ペプチド、未関連タンパク質、反応物、細胞デブリス、ＨＣＰ、エンドトキシン、及び／又はｖｉｒａも、組換えＤＮＡ法及び／又は化学修飾法が用いられたか否か、又は有機ペプチド合成化学法が用いられたか否かに依存して含むであろう。
【００５４】
これにより、本発明によるＩＥＣ法を含む、純粋なペプチドを生産するための、工業的方法のようないずれの方法も、本願の一態様である。
【００５５】
従って、本発明は、更なる態様において、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法を含む、純粋なペプチドを生産するための工業的方法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出すること
を含む方法に関する。
【００５６】
本発明は、更なる態様において、ペプチドを単離するための方法であって、
ａ）混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出すること
を含むカチオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製し、
そして次に、必要に応じて、分析テスト及び／又は更なる精製にかけ、そして慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること
を含む方法に関する。
【００５７】
本発明は、更なる態様において、ペプチドを単離するための方法であって、
ａ）混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出すること
を含むカチオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製し、
そして次に、必要に応じて、分析テスト及び／又は更なる精製にかけ、そして慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること
を含む方法に関する。
【００５８】
本発明は、更なる態様において、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法を含む、純粋なペプチドを生産するための工業的方法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出すること
を含む方法に関する。
【００５９】
本発明は、なお更なる態様において、ペプチドを単離するための方法であって、
ａ）混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出すること
を含むアニオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製し、
そして次に、必要に応じて、分析テスト及び／又は更なる精製にかけ、そして慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること
を含む方法に関する。
【００６０】
本発明は、なお更なる態様において、ペプチドを単離するための方法であって、
ａ）混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出すること
を含むアニオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製し、
そして次に、必要に応じて、分析テスト及び／又は更なる精製にかけ、そして慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること
を含む方法に関する。
【００６１】
本明細書に記載される２又はそれ超の実施形態のいずれの可能な組合せも本発明の範囲に含まれる。
【００６２】
本明細書に用いる用語“有機モディファイア”は、有機溶媒もしくは水に可溶性である有機化合物又はそれらの混合物を含むことを意図し、そのモディファイアは、１又は複数の不要な関連する不純物及びペプチド並びにイオン交換体の間の有利な及び変化した選択性を誘導する。選択されたモディファイアがこの選択性を誘導するか否かは、通常、１又は複数の不純物に依存するであろうし、試行錯誤によりテストすることができる。有機モディファイアには、これらに限らないが、Ｃ1-6 −アルカノール、Ｃ1-6 −アルケノール又はＣ1-6 −アルキノール、尿素、グアニジン・ＨＣｌ、又はＣ1-6 −アルカン酸（alkanoic acid)、例えば酢酸、Ｃ2-6 −グリコール、Ｃ3-7 −ポリアルコール含有糖、又はそれらの混合物がある。
【００６３】
単独で又は組み合わせて本明細書に用いる用語“Ｃ1-6 −アルカノール”、“Ｃ1-6 −アルケノール”又は“Ｃ1-6 −アルキノール”は、ヒドロキシル（−ＯＨ）が連結した直鎖、分枝鎖又は環形態の示される長さのＣ1-6 −アルカン、Ｃ1-6 −アルケン又はＣ1-6 −アルキンを含むことを意図する（cf. Morrison & Boyd, Organic Chemistry, 4th ed）。直鎖アルコールの例は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、アリルアルコール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール及びｎ−ヘキサノールである。分枝鎖アルコールの例は２−プロパノール及びｔｅｒｔ−ブチルアルコールである。環式アルコールの例はシクロプロピルアルコール及び２−シクロヘキセン−１−オールである。
【００６４】
本明細書に用いる用語“Ｃ1-6 −アルカン酸”は、式：Ｒ′ＣＯＯＨ（式中、Ｒ′は、Ｈ又はＣ1-5 アルキルである）の基、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸、メチル酪酸又は吉草酸を含むことを意図する（cf. Morrison & Boyd, Organic Chemistry, 4th ed.)。
【００６５】
本明細書に用いる用語“Ｃ1-5 −アルキル”は、１〜５の炭素原子を有する分枝鎖又は直鎖アルキル基を含むことを意図する。典型的なＣ1-5 −アルキル基には、これらに限らないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル等がある（cf. Morrison & Boyd, Organic Chemistry, 4th ed.)。
【００６６】
本明細書に用いる用語“Ｃ2-6 −グリコール”は、隣接してもしなくてもよい異なる炭素原子上に２つのヒドロキシル基を含むＣ2-6 −アルカンを含むことを意図する。典型的なＣ2-6 −グリコールには、これらに限らないが、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、又は２−メチル−２，４−ペンタンジオールがある（cf. Morrison & Boyd, Organic Chemistry, 4th ed.)。
【００６７】
本明細書に用いる用語“Ｃ2-6 −アルカン”は、２〜６の炭素原子を有する分枝鎖又は直鎖アルカン基を含むことを意図する。典型的なＣ2-6 −アルカン基には、これらに限らないが、エタン、プロパン、ｉｓｏ−プロパン、ブタン、ｉｓｏ−ブタン、ペンタン、ヘキサン等がある（cf. Morrison & Boyd, Organic Chemistry, 4th ed.)。
【００６８】
本明細書に用いる用語“Ｃ3-7 −ポリアルコール含有糖”は、式：ＨＯＣＨ2 （ＣＨＯＨ）n ＣＨ2 ＯＨ（式中、ｎは１〜５の整数である）の基、及びモノサッカライド、例えばマンノース、グルコースを含むことを意図する（cf. Morrison & Boyd, Organic Chemistry, 4th ed.)。
【００６９】
本明細書に用いる用語“ペプチド”は、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、並びにそれらの相同体、アナログ及び誘導体を含むことを意図し、これらは、慣用的な組換えＤＮＡ技術及び慣用的な合成法により生産することができる。このようなペプチドには、これらに限らないが、グルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、アプロチニン、第VII 因子、ＴＰＡ、第 VIIａ因子（Novo Seven（登録商標）、Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmarkから市販）、第 VIIａｉ因子、ＦＦＲ−第 VIIａ因子、ヘパリナーゼ、ＡＣＴＨ、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２、インスリン様成長因子−１、インスリン様成長因子−２、胃抑制ペプチド、成長ホルモン放出因子、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリトロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケフェリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド、ＧＩＰ、エキセンジン（exendins）、ペプチドヒスチジン−メチオニンアミド、ヘロスペクチン（helospectins）、ヘロデルミン（helodermin）、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド関連ペプチド、血管作用性小腸ペプチド及びそれらのアナログがある。ここで、アナログは、親ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基により置換されているペプチド、及び／又は親ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基が付加されているペプチドを示すのに用いる。このような付加は、親ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端又は両方で行うことができる。誘導体は、本明細書において、親ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基が、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により、化学的に修飾されているペプチドを示すのに用いる。
【００７０】
本明細書に用いる用語“塩成分”は、いずれかの有機又は無機塩、例えばこれらに限らないが、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＮＨ4 Ｃｌ，ＣａＣｌ2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物を含むことを意図する（cf. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton. PA, 1990、又はRemington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995)、又はAmersham-Pharmacia Biotech からのハンドブック）。
【００７１】
本明細書に用いる用語“緩衝液”は、いずれかの緩衝液、例えばこれらに限らないが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、アルギニン緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液、アンモニウム緩衝液、グリシン緩衝液、アルキルアミン緩衝液、アミノエチルアルコール緩衝液、エチレンジアミン緩衝液、トリエタノールアミン、イミダゾール緩衝液、ピリジン緩衝液及びバルビツール酸緩衝液、並びにそれらの混合物を含むことを意図する（cf. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990、又はRemington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995)、又はAmersham-Pharmacia Biotechからのハンドブック）。
【００７２】
出発pH、緩衝液及びイオン強度の選択は、公知技術、例えば慣用的なテスト−チューブ法、例えばAmersham-Pharmacia Biotechからのハンドブックに従って行われる。クロマトグラフィーのイオン交換樹脂は、精製すべき特定のペプチド及び用いる条件、例えばpH、緩衝液、イオン強度等に依存して選択されるが、それらは、当業者に知られており（即ち典型的にはカチオン交換樹脂についてペプチドの等電点（pI）未満のpH、アニオン交換樹脂についてペプチドのpI超のpH、要求されるpHを維持するのに十分な緩衝液強度、及び塩濃度により誘導され得るのに十分に低いイオン強度）、これらに限らないが、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ樹脂、及びＳｏｕｒｃｅ樹脂、ＢｉｏＳｅｐｒａからのＨｙｐｅｒＤ樹脂、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ樹脂、及びＳｐｈｅｒｏｓｉｌ樹脂、ＴｏｓｏＨａａｓからのＴＳＫｇｅｌ樹脂及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂、ＭｅｒｃｋからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ樹脂、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ樹脂、ＢｉｏＲＡＤからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ樹脂、ＷｈａｔｍａｎからのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ樹脂等がある。
【００７３】
本明細書に用いる用語“有機モディファイア、水、任意に塩成分、及び任意に緩衝液から本質的になる溶液”は、１又は複数の有機モディファイア、水を含み、１又は複数の塩成分を含むか又は塩成分を含まず、１又は複数の緩衝液を含むか又は緩衝液を含まず、そして任意に、当業者が慣用的なイオン交換クロマトグラフィー法に従って添加を考えるであろう１又は複数の更なる慣用的な成分を含む溶液を意味することを意図する。
【００７４】
本明細書に用いる用語“関連する不純物”は、ペプチドと異なる局所的又は全体的実効電荷を有する１又は複数の不純物、例えばそれらがペプチドの前に溶出する限り、トランケートされた形態、全ての種類の伸長した形態（余分のアミノ酸、エステルを含む、種々の誘導体等）、脱アミド化形態、不正確にホールディングした形態、シアリル化を含む不要なグリコシル化を伴う形態、“γ−カルボキシグルタミン酸の欠如”等を意味することを意図する。
【００７５】
“pH値で”、“同じ又はより低いpH値で”、及び“同じ又はより高いpH値で”とあわせて本明細書で用いられる用語“pH値”は、ステップａ）のpH値が一定であっても、又は典型的には３pH単位内で変化し得、そして次にステップｂ）のpH値がステップａ）と同じく一定であるかもしくはpH値を変化させ得、又は一定であるかもしくは典型的には３pH単位内で変化し得る異なるpH値であり得ることを意味することを意図する。このようなpH値は、典型的には、緩衝液及び／又は無機もしくは有機酸又は塩基、例えばＨＣｌ，ＮａＯＨ，Ｈ2 Ｏ、酢酸、ＮＨ3 ，ＫＯＨ，Ｈ2 ＳＯ4 、クエン酸の添加により維持され又は変化され得る。
【００７６】
ペプチドの負の（又は正の）実効電荷より低い局所的又は全体的な負の（又は正の）実効電荷を有する関連する不純物と合わせて本明細書に用いられる用語“より低い”は、関連する不純物の局所的又は全体的な実効電荷の数値が前記ペプチドの局所的又は全体的な実効電荷の数値より低いことを意味することを意図する。
【００７７】
本発明は以下の態様にも関する：
態様１。ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出すること
を含む方法。
【００７８】
態様２。ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法であって、
ａ）前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出すること
を含む方法。
【００７９】
態様３。重量パーセントに基づく有機溶媒：水の比が１：９９〜９９：１である態様１又は２に記載の方法。
【００８０】
態様４。前記有機モディファイアが、Ｃ1-6 −アルカノール、Ｃ1-6 −アルケノール又はＣ1-6 −アルキノール、尿素、グアニジン、又はＣ1-6 −アルカン酸、Ｃ2-6 −グリコール、又はＣ3-7 −ポリアルコール含有糖から選択される態様１〜３のいずれかに記載の方法。
【００８１】
態様５。ステップａ）の塩成分が、いずれかの有機又は無機塩、好ましくはＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＮＨ4 Ｃｌ，ＣａＣｌ2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物から選択される態様１〜４のいずれか一に記載の方法。
【００８２】
態様６。ステップａ）に塩成分が存在しない態様１〜４のいずれか一に記載の方法。
【００８３】
態様７。ステップａ）の塩成分勾配がステップ又は直線塩成分勾配である態様１〜５のいずれか一に記載の方法。
【００８４】
態様８。前記塩成分が０．１mmol／kg〜３０００mmol／kgの範囲から選択される濃度で存在する態様７に記載の方法。
【００８５】
態様９。ステップｂ）の塩成分が、いずれかの有機又は無機塩、好ましくはＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＮＨ4 Ｃｌ，ＣａＣｌ2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物から選択される態様１〜８のいずれか一に記載の方法。
【００８６】
態様１０。ステップｂ）において、前記塩成分が０．１mmol／kg〜３０００mmol／kgの範囲から選択される濃度で存在する態様１〜９のいずれかに記載の方法。
【００８７】
態様１１。ステップｂ）に塩成分が存在しない態様１〜８のいずれか一に記載の方法。
【００８８】
態様１２。ステップａ）又はｂ）の緩衝液が、独立して、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、アルギニン緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液、アンモニウム緩衝液、グリシン緩衝液、アルキルアミン緩衝液、アミノエチルアルコール緩衝液、エチレンジアミン緩衝液、トリエタノールアミン、イミダゾール緩衝液、ピリジン緩衝液及びバルビツール酸緩衝液及びそれらの混合物から選択される態様１〜１１のいずれか一に記載の方法。
【００８９】
態様１３。ステップａ）の緩衝液が、０．１mmol／kg〜５００mmol／kgの範囲から選択される濃度で存在する態様１〜１２のいずれか一に記載の方法。
【００９０】
態様１４。ステップｂ）の緩衝液が０．１mmol／kg〜１０００mmol／kgの範囲から選択される濃度で存在する態様１〜１３のいずれか一に記載の方法。
【００９１】
態様１５。ステップａ）に緩衝液が存在しない態様１〜１１のいずれか一に記載の方法。
【００９２】
態様１６。ステップｂ）に緩衝液が存在しない態様１〜１１のいずれか一に記載の方法。
【００９３】
態様１７。ペプチドを単離するための方法であって、
ａ）混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ塩成分勾配的又は定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出すること
を含むカチオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製し、
そして次に、必要に応じて、分析テスト及び／又は更なる精製にかけ、そして慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること
を含む方法。
【００９４】
態様１８。ペプチドを単離するための方法であって、
ａ）混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ塩成分勾配的又は定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持したpH値で溶出し、
ｂ）次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出すること
を含むアニオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製し、
そして次に、必要に応じて、分析テスト及び／又は更なる精製にかけ、そして慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること
を含む方法。
【００９５】
態様１９。精製すべきペプチドが、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、レセプター、ｖｉｒａ、並びにそれらの相同体、アナログ及び誘導体、好ましくはグルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、アプロチニン、ＦVII ，ＴＰＡ，ＦVIIａ ，ＦＦＲ−ＦVIIａ 、ヘパリナーゼ、ＡＣＴＨ、ヘパリン結合タンパク質、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２、インスリン様成長因子−１、インスリン様成長因子−２、繊維芽細胞成長因子、胃抑制ペプチド、成長ホルモン放出因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリトロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド、ＤＰＰＩＶ、インターロイキン、イムノグロブリン、補体インヒビター、セルピンプロテアーゼインヒビター、サイトカイン、サイトカインレセプター、ＰＤＧＦ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子レセプター、成長因子ＧＩＰ、エキセンジン、ペプチドヒスチジン−メチオニンアミド、ヘロスペクチン、ヘロデルミン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド関連ペプチド、血管作用性小腸ポリペプチド並びにそれらのアナログ及び誘導体、より好ましくはグルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、アプロチニン、ＦVII ，ＦVIIａ ，ＦＦＲ−ＦVIIａ 、ヘパリナーゼ、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２並びにそれらのアナログ及び誘導体例えばＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)、ヒトインスリン、及びＢ２８ＩｓｏＡｓｐインスリンから選択される態様１〜１８のいずれか一に記載の方法。
実施例
本発明は、以下の例により更に説明されるが、それらは、保護の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。先の記載及び以下の例において開示される特徴は、別個に、及びいずれかの組合せにおいてその多様な形態で本発明を認識するための材料となり得る。
【００９６】
実施例１：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、例えばＷＯ９８／０８８７１に記載されるように、慣用的な組換えＤＮＡ技術によりイースト（Sacch. cerevisiae)で発現させた。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)発酵ブロスを、慣用的な逆相クロマトグラフィー捕獲ステップにより精製し、次に、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)のpI（等電点）で沈殿させた。そのＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びいくつかの不純物の１つとしてヒスチジン及びアラニン残基を失ったトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿２ｇを１００mLの水に懸濁し、pHを８．２に調節することにより溶解させた。得られた混合物をpH３．４に調節し、ろ過した。そのろ液２１mLを、１００mLの２０mmol／kgクエン酸、７５mmol／kg  ＫＣｌ、４５％ｗ／ｗエタノール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、６０mLの２０mmol／kgクエン酸、８７．５mmol／kg  ＫＣｌ、４５％ｗ／ｗエタノール、pH３．５により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの２００mmol／kgトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、pH８．５のステップ勾配により単一ピークで溶出した。クロマトグラムを図１に示す。
【００９７】
収集されたピークの同定／確認のためのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を、５μｍ粒子を伴うＣ18−置換化１２０Åシリカ（ＹＭＣ）４．０×２５０mmカラムで行った。緩衝液Ａは７．８％アセトニトリル、pH２．５中０．１５Ｍ（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 からなり、緩衝液Ｂは６３．４％アセトニトリルを含む。１２分の３７〜４１％のＢ、次に１５分の４１〜１００％のＢの直線勾配を、１mL／分の流速で行った。クロマトグラフィー温度は６０℃に維持し、ＵＶ検出は、２１４nmで行った。分析結果は以下の通りであった：
【００９８】
【表１】
0004959871.tif 000002
【００９９】
実施例２：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)発酵ブロスをカチオン交換クロマトグラフィーにより精製し、実施例に記載されるように沈殿させた。
【０１００】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び１つの不純物として、そのトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿２ｇを懸濁し、１００mLの２０mmol／kgグリシン、pH９．０に溶かして８．４の最終pHとした。得られた混合物をpH３．５に調節し、ろ過した。そのろ液５２mLを、６０mLの２０mmol／kgクエン酸、７５mmol／kg  ＫＣｌ、４５％ｗ／ｗエタノール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、６０mLの２０mmol／kgクエン酸、８７．５mmol／kg  ＫＣｌ、４５％ｗ／ｗエタノール、pH３．５のステップ勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの２００mmol／kgグリシン、pH９．０のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。収集されたピークの同定／確認のためのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施例１に記載されるように行った。その分析結果は、エタノールを含む洗浄ステップによるトランケートされた形態の選択的除去、及びカチオン交換クロマトグラフィー法を用いることによる水性溶出液中のトランケートされた形態の高い削減を示す。
【０１０１】
実施例３：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)発酵ブロスを、慣用的なカチオン交換クロマトグラフィー捕獲ステップ、次に慣用的なＲＰ−ＨＰＬＣ精製ステップにより精製した。Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてトランケート化形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むＲＰ−ＨＰＬＣプールに４容量の水を加えた。得られた溶液１７５mLをpH３．５に調節し、１００mLの２０mmol／kgクエン酸、７５mmol／kg  ＫＣｌ、４５％ｗ／ｗエタノール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのカラムを２０mLの平衡化溶液で洗い、そのトランケートされた形態を、７５から１００mmol／kgのＫＣｌ（２０mmol／kgクエン酸、４５％ｗ／ｗエタノール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの１００mmol／kg  Ｎａ2 ＣＯ3 、pH９．５のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図４に示す。
【０１０２】
実施例４：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を発現させ、カチオン交換により捕獲し、そして実施例３に記載されるようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
【０１０３】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及び不純物としてトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含むＲＰ−ＨＰＬＣプールに１容量水を加えた。得られた溶液８６mLをpH３．５に調節し、１００mLの２０mmol／kgクエン酸、７５mmol／kg  ＫＣｌ、４５％ｗ／ｗエタノール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのカラムを２０mLの平衡化溶液で洗い、そのトランケートされた形態を、７５から１００mmol／kgのＫＣｌ（２０mmol／kgクエン酸、４５％ｗ／ｗエタノール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの１００mmol／kg  Ｈ3 ＢＯ3 、１００mmol／kg  ＮａＣｌ、pH９．５のステップ勾配により溶出した。
【０１０４】
実施例５：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、慣用的な逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、そして実施例１に記載されるように沈殿させた。
【０１０５】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びいくつかの不純物の１つとしてトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿１０ｇを５００mLの水に懸濁し、８．３にpH調節することにより溶解して、約１．６mg／mLのＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度にした。得られた溶液５mLをpH３．５に調節し、６０mLの０．４２％ｗ／ｗクエン酸、３４％ｗ／ｗエタノール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、０から１．２９％ｗ／ｗのＫＣｌ（０．４２％ｗ／ｗクエン酸、３４％ｗ／ｗエタノール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの２００mmol／kgグリシン、pH９．５のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図５に示す。
【０１０６】
実施例６：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、慣用的な逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、実施例１に記載される通り沈殿させた。
【０１０７】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びいくつかの不純物の１つとしてトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿１０ｇを５００mLの水に懸濁し、８．３へのpH調節により溶解して約１．６mg／mLのＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度にした。得られた溶液５mLをpH３．２に調節し、６０mLの０．４２％ｗ／ｗクエン酸、２９％ｗ／ｗエタノール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、０から１．９６％ｗ／ｗ  ＫＣｌ（０．４２％ｗ／ｗクエン酸、２９％ｗ／ｗエタノール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの２００mmol／kgグリシン、pH９．５のステップ勾配により溶出した。
【０１０８】
実施例７：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、慣用的な逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、実施例１に記載される通り沈殿させた。
【０１０９】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びいくつかの不純物の１つとしてトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿１０ｇを５００mLの水に懸濁し、８．３へのpH調節により溶解して約１．６mg／mLのＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度にした。得られた溶液５mLをpH３．５に調節し、６０mLの０．４２％ｗ／ｗクエン酸、５１％ｗ／ｗエタノール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、０から１．００％ｗ／ｗ  ＫＣｌ（０．４２％ｗ／ｗクエン酸、５１％ｗ／ｗエタノール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの２００mmol／kgグリシン、pH９．５のステップ勾配により溶出した。
【０１１０】
実施例８：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、慣用的な逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、実施例１に記載される通り沈殿させた。
【０１１１】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びいくつかの不純物の１つとしてトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿１０ｇを５００mLの水に懸濁し、８．３へのpH調節により溶解して約１．６mg／mLのＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度にした。得られた溶液５mLをpH３．５に調節し、６０mLの０．４２％ｗ／ｗクエン酸、７１％ｗ／ｗエタノール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、０から０．４８％ｗ／ｗ  ＫＣｌ（０．４２％ｗ／ｗクエン酸、７１％ｗ／ｗエタノール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの２００mmol／kgグリシン、pH９．５のステップ勾配により溶出した。
【０１１２】
実施例９：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、慣用的な逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、実施例１に記載される通り沈殿させた。
【０１１３】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びいくつかの不純物の１つとしてトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿１０ｇを５００mLの水に懸濁し、８．３へのpH調節により溶解して約１．６mg／mLのＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度にした。得られた溶液５mLをpH３．５に調節し、６０mLの０．４２％ｗ／ｗクエン酸、４０％ｗ／ｗ  ２−プロパノール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、０から０．６１％ｗ／ｗ  ＫＣｌ（０．４２％ｗ／ｗクエン酸、４０％ｗ／ｗ  ２−プロパノール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの２００mmol／kgグリシン、pH９．５のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図６に示す。
【０１１４】
実施例１０：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、慣用的な逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、実施例１に記載される通り沈殿させた。
【０１１５】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びいくつかの不純物の１つとしてトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿１０ｇを５００mLの水に懸濁し、８．３へのpH調節により溶解して約１．６mg／mLのＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度にした。得られた溶液５mLをpH３．５に調節し、２４mLの０．４２％ｗ／ｗクエン酸、５１％ｗ／ｗエタノール、pH３．５で平衡化した８mL  Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ（PE Biosystems)カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、０から１．３４％ｗ／ｗ  ＫＣｌ（０．４２％ｗ／ｗクエン酸、５１％ｗ／ｗエタノール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、４０mLの２００mmol／kgグリシン、pH９．５のステップ勾配により溶出した。クロマトグラムを図７に示す。
【０１１６】
実施例１１：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、慣用的な逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、実施例１に記載される通り沈殿させた。
【０１１７】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びいくつかの不純物の１つとしてトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿１０ｇを５００mLの水に懸濁し、８．３へのpH調節により溶解して約１．６mg／mLのＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度にした。得られた溶液５mLをpH３．５に調節し、２４mLの０．４２％ｗ／ｗクエン酸、４０％ｗ／ｗ  ２−プロパノール、pH３．５で平衡化した８０mL  Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ（PE Biosystems)カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、０から１．３４％ｗ／ｗ  ＫＣｌ（０．４２％ｗ／ｗクエン酸、４０％ｗ／ｗ  ２−プロパノール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、４０mLの２００mmol／kgグリシン、pH９．５のステップ勾配により溶出した。
【０１１８】
実施例１２：
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、慣用的な逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロスから単離し、実施例１に記載される通り沈殿させた。
【０１１９】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)及びいくつかの不純物の１つとしてトランケートされた形態、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(9-37)を含む沈殿１０ｇを５００mLの水に懸濁し、８．３へのpH調節により溶解して約１．６mg／mLのＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)濃度にした。得られた溶液５mLをpH３．５に調節し、６０mLの０．４２％ｗ／ｗクエン酸、４０％ｗ／ｗ  ２−メチル−２，４−ペンタンジオール、pH３．５で平衡化した２０mL  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、０から０．６０％ｗ／ｗ  ＫＣｌ（０．４２％ｗ／ｗクエン酸、４０％ｗ／ｗ  ２−メチル−２，４−ペンタンジオール、pH３．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を、１００mLの２００mmol／kgグリシン、pH９．５のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図９に示す。
【０１２０】
実施例１３：
７．７mg／mLヒトインスリン及び０．８mg／mLヒトインスリンエチルエステル（Ｂ３０）の混合物を、他所に記載（cf. I. Mollerup, S.W. Jensen, P. Larsen, O. Schou, L. Snel : Insulin, Purification, in M.C. Flickinger, S.W. Drew : Encyclopedia of Bioprocess Technology : Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, John Wiley & Sons, 1999)されるように慣用的な方法により得た。その混合物は、４mmol／Ｌ  ＥＤＴＡ、１６％ｗ／ｗエタノール、pH７．５を含んだ。その混合物２mLを、４０mLの０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、４２．５％ｗ／ｗエタノール、pH７．５で平衡化した２０mL  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｑ−５ＰＷ（ＴｏｓｏＨａａｓ）カラムに適用した。ヒトインスリンエチルエステル不純物を、０から１．１４％ｗ／ｗのクエン酸ナトリウム３水和物（０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、４２．５％ｗ／ｗエタノール、pH７．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的タンパク質、ヒトインスリンを、６０mLの２．７２％ｗ／ｗクエン酸ナトリウム３水和物、０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、pH７．５のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図１０に示す。
【０１２１】
実施例１４：
ヒトインスリン及びヒトインスリンエチルエステル（Ｂ３０）の混合物を実施例１３に記載される通り得た。その混合物２mLを、４０mLの０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、４２．５％ｗ／ｗエタノール、pH７．５で平衡化した２０mL  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｑ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ）カラムに適用した。ヒトインスリンエチルエステル不純物を、０から０．９０％ｗ／ｗのクエン酸ナトリウム３水和物（０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、４２．５％ｗ／ｗエタノール、pH７．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的タンパク質、ヒトインスリンを、６０mLの１００mmol／Ｌクエン酸、pH３のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図１１に示す。
【０１２２】
実施例１５：
ヒトインスリン及びヒトインスリンエチルエステル（Ｂ３０）の混合物を実施例１３に記載される通り得た。その混合物２mLを、４０mLの０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、７１％ｗ／ｗエタノール、pH７．５で平衡化した２０mL  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｑ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ）カラムに適用した。ヒトインスリンエチルエステル不純物を、０から１．６３％ｗ／ｗのクエン酸ナトリウム３水和物（０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、７１％ｗ／ｗエタノール、pH７．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的タンパク質、ヒトインスリンを、６０mLの２．７２％ｗ／ｗクエン酸ナトリウム３水和物、０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、pH７．５のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。
【０１２３】
実施例１６：
９．０mg／mLヒトインスリン及び０．６mg／mLヒトインスリンエチルエステル（Ｂ３０）の混合物を実施例１３に記載される通り得た。その混合物は、９mg／mLのヒトインスリン濃度で、４mmol／ＬのＥＤＴＡ、pH７．５を含んだ。その混合物２mLを、４０mLの０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、８１％ｗ／ｗエタノール、pH７．５で平衡化した２０mL  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｑ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ）カラムに適用した。ヒトインスリンエチルエステル不純物を、０から２．１８％ｗ／ｗのクエン酸ナトリウム３水和物（０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、８１％ｗ／ｗエタノール、pH７．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的タンパク質、ヒトインスリンを、６０mLの２．７２％ｗ／ｗクエン酸ナトリウム３水和物、０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、pH７．５のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図１２に示す。
【０１２４】
実施例１７：
ヒトインスリン及びヒトインスリンエチルエステル（Ｂ３０）の混合物を実施例１６に記載される通り得た。その混合物２mLを、４０mLの０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、５１％ｗ／ｗエタノール、pH７．５で平衡化した２０mL  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｑ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ）カラムに適用した。ヒトインスリンエチルエステル不純物を、０から１．０９％ｗ／ｗのクエン酸ナトリウム３水和物（０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、５１％ｗ／ｗエタノール、pH７．５）の直線勾配により溶出／洗い落とした。標的タンパク質、ヒトインスリンを、６０mLの２．７２％ｗ／ｗクエン酸ナトリウム３水和物、０．１５％ｗ／ｗトリエタノールアミン、pH７．５のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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