(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において免疫原に対する免疫応答を生じさせるための医薬の製造における、該免疫原および植物レクチンを含む混合物の使用であって、該免疫応答は、該植物レクチンの存在しない場合に該免疫原に対して惹起される免疫応答よりも大きく、該混合物が鼻腔内投与されることを特徴とする、使用。
【請求項２】
前記植物レクチンが、ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩ、ＭＬ−ＩＩＩ、ＷＧＡ、およびＵＥＡ−１からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記哺乳動物が、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトからなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記免疫応答がＴ細胞応答である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｔ細胞応答がＴｈ２応答である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記Ｔ細胞応答がＴ細胞の増殖である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記免疫応答が抗体応答である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記哺乳動物が、ＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体からなる群より選択される抗体を産生する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂからなる群より選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体が血清中に検出可能である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記抗体が粘膜分泌物中に検出可能である、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
前記粘膜分泌物が、腸粘膜、膣粘膜、口腔粘膜、および鼻粘膜からなる群より選択される粘膜より得られる、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記混合物が２以上のレクチンを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記混合物が２以上の免疫原を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
前記免疫原がタンパク質の感染因子である、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
前記感染因子がウイルスである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記免疫原が、２型単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質Ｄ２タンパク質である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
前記混合物が鼻スプレーを使用して投与される、請求項１に記載の
使用。
【請求項１９】
前記混合物を含む液体が滴で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項２０】
少なくとも２用量の前記混合物が投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
前記混合物が、免疫原および植物レクチンを少なくとも１：１の比で含む、請求項１に記載の使用。
【請求項２２】
前記比が少なくとも１０：１である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
抗体力価がＥＬＩＳＡを使用して測定される、請求項７に記載の使用。
【請求項２４】
前記植物レクチンが、２型リボソーム不活性化タンパク質である、請求項１に記載の使用であって、ここで、該２型リボソーム不活性化タンパク質が、ニグリンｂ、塩基性ニグリンｂ、エブリン１、エブリンｒ１、エブリンｒ、エブリンｆ、ニグリンｆ、ＳＮＡ１、ＳＮＡＩ、ＳＮＡＶ、ＳＮＡＶＩ、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ＳＮＬＲＰ１、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ＳＮＬＲＰ２、リシン、トウゴマ属レクチン、Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ  ＲＩＰ、Ｓｉｅｂｏｌｄｉｎ−６、アブリン、アブリン１１、モデシン、ボルケンシン、ＳＳＡ、シナモニン、ポレクチン、ゲロリン、Ｅｖａｎｔｈｉｓ  ｈｙｅｍａｌｉｓ、ＲＩＰ、虹彩アグルチニン、ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩ、およびＭＬ−ＩＩＩからなる群より選択される、使用。
【請求項２５】
前記混合物が微粒子キャリアを使用して投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項２６】
前記混合物が生物接着性ポリマーと組合わせて投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項２７】
哺乳動物において免疫原に対する免疫応答を生じさせるための組成物であって、該組成物は、該免疫原および植物レクチンを含み、該免疫応答は、該植物レクチンの存在しない場合に該免疫原に対して惹起される免疫応答よりも大きく、該組成物が鼻腔内投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項２８】
前記植物レクチンが、ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩ、ＭＬ−ＩＩＩ、ＷＧＡ、およびＵＥＡ−１からなる群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記哺乳動物が、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトからなる群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記免疫応答がＴ細胞応答である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞応答がＴｈ２応答である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記Ｔ細胞応答がＴ細胞の増殖である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫応答が抗体応答である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３４】
前記哺乳動物が、ＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体からなる群より選択される抗体を産生する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂからなる群より選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記抗体が血清中に検出可能である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記抗体が粘膜分泌物中に検出可能である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記粘膜分泌物が、腸粘膜、膣粘膜、口腔粘膜、および鼻粘膜からなる群より選択される粘膜より得られる、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記混合物が２以上のレクチンを含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４０】
前記混合物が２以上の免疫原を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４１】
前記免疫原がタンパク質の感染因子である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４２】
前記感染因子がウイルスである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記免疫原が、２型単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質Ｄ２タンパク質である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記混合物が鼻スプレーを使用して投与される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４５】
前記混合物を含む液体が滴で投与される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４６】
少なくとも２用量の前記混合物が投与される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４７】
前記混合物が、免疫原および植物レクチンを少なくとも１：１の比で含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４８】
前記比が少なくとも１０：１である、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
抗体力価がＥＬＩＳＡを使用して測定される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項５０】
前記植物レクチンが、２型リボソーム不活性化タンパク質である、請求項２７に記載の組成物であって、ここで、該２型リボソーム不活性化タンパク質が、ニグリンｂ、塩基性ニグリンｂ、エブリン１、エブリンｒ１、エブリンｒ、エブリンｆ、ニグリンｆ、ＳＮＡ１、ＳＮＡＩ、ＳＮＡＶ、ＳＮＡＶＩ、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ＳＮＬＲＰ１、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ＳＮＬＲＰ２、リシン、トウゴマ属レクチン、Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ  ＲＩＰ、Ｓｉｅｂｏｌｄｉｎ−６、アブリン、アブリン１１、モデシン、ボルケンシン、ＳＳＡ、シナモニン、ポレクチン、ゲロリン、Ｅｖａｎｔｈｉｓ  ｈｙｅｍａｌｉｓ、ＲＩＰ、虹彩アグルチニン、ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩ、およびＭＬ−ＩＩＩからなる群より選択される、組成物。
【請求項５１】
前記混合物が微粒子キャリアを使用して投与される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項５２】
前記混合物が生物接着性ポリマーと組合わせて投与される、請求項２７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、１９９９年１０月２６日に出願した、仮出願番号６０／１６１，３７１号に対する利益を主張する。これは、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、哺乳動物において免疫応答を増強することに関する。より詳細には、本発明は、植物レクチンをアジュバントとして使用することに関する。
【０００３】
（発明の背景）
ほとんどの病原体は、粘膜表面において宿主にコロニー形成しそして侵入することから、この部位での免疫誘発は、本発明にとって合理的かつ魅力的なアプローチである（１）。ワクチンのための粘膜経路は、非侵襲的であり、従って投与は比較的単純かつ安価である。さらに、ある範囲の粘膜を誘発する能力および粘膜ワクチン送達後の全身性免疫応答により、多くの疾患に対して有効な免疫の可能性が可能になる。例えば、特定のＩｇＡのみがインフルエンザでの鼻内感染（２）から、およびＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅでの腸感染から（３）マウスを保護し得る。しかし、非複製性免疫原の粘膜送達は、代表的に、強力な免疫応答は刺激しない。応答が誘導される場合、複数の高用量の送達がしばしば必要である（４）。さらに、免疫源の粘膜送達は、しばしば、全身性の不応答性を生じる（１）。
【０００４】
多数の戦略を使用して、粘膜に送達されるワクチンに対する応答が増強され得る。生の細菌およびウイルスのベクターであって、粘膜にコロニー形成するものを使用して、免疫原が送達され得る（５）。生分解性の微粒子（６）またはリポソーム（７）を付随させて免疫原に微細特性を付与することもまた、粘膜免疫原性を増強し得る。
【０００５】
別のアプローチは、アジュバント特性を伴うレクチン様分子を使用することである。これまでに同定された最も強力な粘膜アジュバントは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（ＣＴ）によって産生されるコレラ毒素、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの腸毒素産生性株からの熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）である（８，９）。ＣＴおよびＬＴは、十分に特徴づけられた粘膜免疫原および共存タンパク質にとってのアジュバントである。コレラの毒素は、別個のＡサブユニットおよびＢサブユニットを含む（それぞれＣＴＡおよびＣＴＢと呼ばれる）。Ｂサブユニットは、細胞表面レセプターに対する結合を媒介する（２０）。ＧＭ１ガングリオシドは、ＣＴにとっての主要なレセプターと考えられている（２１）が、ＣＴＢは、ＧＭ１以外の細胞表面レセプターに結合し得る（２２）。Ｂサブユニットの結合後、Ａサブユニットは、細胞質ゾルに達し、そしてアデニルシクラーゼを活性化し、［ｃＡＭＰ］iの大幅な上昇を生じる（１０，１１）。ＬＴは、構造的および機能的に、ＣＴに類似し、そして全身性または粘膜性のアジュバントとしてＣＴに匹敵する（２３，２４）。マウスにおいて、ＣＴは、粘膜ＩｇＡ産生および細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機能を含む、体液性および細胞媒介性の免疫応答を強力に刺激する（１０）。毒素特異的な局所および全身性の応答の刺激ならびに共投与された免疫原に対する応答は、これらの分子を、粘膜された場合にあまり免疫原性ではないほとんろの可溶性タンパク質と識別する（１０，１１）。しかし、これらの分子の毒性により、臨床適用が妨げられている。
【０００６】
特定の植物レクチンが粘膜上皮に対する分子の特定の標的化のための因子として調査されてきている。植物レクチンは、少なくとも１つの非触媒性ドメインを含み、このドメインは、モノサッカリドまたはオリゴサッカリドに特異的かつ可逆的に結合する（１３）。例えば、Ｇｉａｎｎａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１４）は、誘導をともなう鼻内免疫が特定のＩｇＧ抗体のレクチン免疫原結合体刺激したが、他方、免疫原単独またはレクチンとの混合物は刺激しなかったことを開示する。米国特許第４，４７０，９６７号は、糖タンパク質免疫原とレクチンとの複合体が免疫原に対する免疫応答を増強するアジュバントとして作用し得ることを開示する。同様に、ＷＯ８６／０６６３５は、哺乳動物を含む脊椎動物における免疫応答を惹起するために使用され得る、化学的に改変された免疫原レクチン複合体を開示する。しかし、これらの各々において、レクチンは物理的に免疫源に結合していた。このことは、すくなくとも１つの余計な調製工程が必要であり、実際に、免疫応答が所望される、免疫原のエピトープ（例えば、中和免疫が指向されるエピトープ）を変更し得る。
【０００７】
従って、別の分子との免疫原の複合体化する必要もなく、所望のエピトープのマスクしたり変更したりすることもなく、哺乳動物において、免疫応答、特に粘膜投与後のを増強する、単純で有効でかつ非毒性の方法に対する当該分野における必要性が存在する。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物における免疫応答を増強する方法を提供する。この方法は、免疫原と植物レクチンとを含む混合物を哺乳動物に投与することによる。それにより、哺乳動物は、植物レクチンの非存在下で生じる免疫応答に比較して増加した免疫応答を生じる。
【０００９】
従って、本発明は、哺乳動物における免疫応答を、単純かつ有効に増強する方法を提供する。
【００１０】
（詳細な説明）
本発明の一つの局面は、特定の植物レクチンが、粘膜アジュバントとして働いて、種々の免疫原に対する免疫応答を増強すること（増加された抗体力価ヲ含む）により、単純で、非毒性で、かつ安価なワクチンまたは免疫原性組成物が調製されることを可能にすることである。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、植物レクチンおよび免疫源を含む混合物である。そのような混合物は、哺乳動物（ヒトを含む）に対する粘膜送達に特に適切であり、そして従って獣医学およびヒトの医学目的のために有用である。
【００１１】
本発明の混合物は、植物レクチンおよび免疫原を含む。免疫原およびレクチンは、化学的に結合していなしが、適切な液体媒体（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水または他の等張性生理食塩水溶液）中で単に一緒に混合されているだけである。必要に応じて、混合物は、安定化剤（抗微生物剤、保存剤などを含む）を含み得る。この混合物における免疫原およびレクチンの比率は変動し得、例えば、少なくとも約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１であり、これは、選択した免疫原とレクチンの特定の組合せに依存する。所望の場合、少なくとも２、３、４またはそれを越える異なる免疫原および／またはレクチンが、種々の比率で混合物中に含有され得る。
【００１２】
本発明において有用なレクチンとしては、植物レクチン（例えば、ヤドリギレクチンＩ（ＭＬ−１）、ヤドリギレクチンＩＩ（ＭＬ−ＩＩ）、ヤドリギレクチンＩＩＩ（ＭＬ−ＩＩＩ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、およびＵｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ（ＵＥＡ−１）が挙げられる。有用であり得る他のレクチンとしては、レンズマメレクチン、ナタマメレクチン（コンカナバリンＡ）、およびアスパラガスマメ、ソラマメ、キャメルズフットトリー（ｃａｍｅｌ’ｓ  ｆｏｏｔ  ｔｒｅｅ）、トウゴマ、ソラマメ（ｆａｖａ  ｂｅａｎ）、ヘアリーベッチ、ホースグラム、フジ、トウアズキ（Ｊｅｑｕｉｒｉｔｙ）、スコッチラバナム（Ｓｃｏｔｃｈ  ｌａｂｕｒｎｕｍ）、リママメ（ｌｉｍａ  ｂｅａｍ）、月桂樹、リョクトウ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）、オセージオレンジ、パゴダ状樹木（Ｐａｇｏｄａ  ｔｒｅｅ）、エンドウマメ、ポテト、アカイインゲンマメ（ｒｅｄ  ｋｉｄｎｅｙ  ｂｅａｎ）、シベリアマメの木（Ｓｉｂｅｒｉａｎ  ｐｅａ  ｔｒｅｅ）、ニシキギ、スイトピー、トマト、およびウイングドピー（ｗｉｎｇｅｄ  ｐｅａ）のレクチンが挙げられる。
【００１３】
２型のリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）（例えば、ニグリンｂ、塩基性ニグリンｂ、エブリン１，エブリンｒ、エブリンｆ、ニグリンｆ、ＳＮＡ１、ＳＮＡＩ、ＳＮＡ  Ｖ、ＳＮＡ  ＶＩ、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ、ＳＮＬＲＰ１、ＳＮＬＲＰ２、リチン、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｌｅｃｔｉｎ，、Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ  ＲＩＰ、シエボルディン−６、アブリン、アブリンＩＩ、モデシン、ボルケンシン、ＳＳＡ、シナモニン、ポレクチン、ゲロリン、Ｅｖａｎｔｈｉｓ  ｈｙｅｍａｌｉｓ、ＲＩＰ、アヤメ凝集素、ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−１１、およびＭＬ−ＩＩＩがアジュバントとして特に有用である。そのようなレクチンとしては、リボソーム不活化活性を担うＮ−グリコシダーゼＡサブユニット、およびガラクトース特異的糖結合Ｂサブユニットが含まれる（２９）。ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩ、およびＭＬ−ＩＩＩは、強力な粘膜アジュバントであり、これは、血清および粘膜分泌物において高い抗体力価を刺激し得る。２型ＲＩＰであって、インビボ毒性を示さないもの（例えば、エブリン−１（３２）、ニグリンｂ（３３）および塩基性ニグリンｂ（３４））が特に好ましい。あるいは、レクチンは、部位特異的変異誘発による１つ以上のアミノ酸の改変を行ってレクチンがそのアジュバント特性を保持するが、哺乳動物レシピエントに非毒性になるようにすることによって遺伝子的に「非毒性化」され得る（以下を参照のこと：３５−３９；ＥＰ  ０８８０３６１；ＥＰ  ６２０８５０；ＥＰ  ９５／９０３８８９．４）。
【００１４】
レクチンは、好ましくは非結合の水溶性形態で存在する。本発明の混合物中において使用するための適切なレクチンは、商用供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ）から購入され得る。あるいは、レクチンは、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、結晶化、エレクトロフォーカシング、および調製ゲル電気泳動を含む、当該分野において周知のタンパク質精製プロトコルを用いて精製され得る。
【００１５】
細胞性および／または体液性の応答が植物レクチンアジュバントを用いて増強され得る免疫原としては、感染性因子のタンパク質（例えば、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、プリオンおよび酵母）ならびにホルモン、アレルゲン（例えば、草、雑草、樹木および植物の花粉、動物（例えば、ネコ、イヌ、ラットおよびブタ）の上皮、ハウスダストおよびコムギの籾殻が挙げられる。そのような免疫原ヲ取得する手段は、当該分野において周知である。免疫源は、植物レクチンの非存在下で細胞性および／または体液性の応答を惹起し得る必要はない。
【００１６】
本発明の混合物は、レシピエント哺乳動物に種々の処方物として投与され得る。例えば、混合物はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）のような微粒子中に捕捉され得るかまたはその表面に吸着され得る（３５，米国特許第５，８０４，２１２号、同第６，８７６，７６１号および同第５，６０３，９６０号；ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８）。混合物はまた、生体接着性ポリマー（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１２１０５，ＰＣＴ／ＵＳ９９／１１９０６，ならびに米国特許第５，９５５，０９７号、同第５，８００，８３２号、同第５，７４４，１５５号、および同第５，８１４，３２９号に記載されるポリマー）とともに投与され得る。あるいは、混合物の腸処方物は、経口投与の使用され得る（米国特許第５，９６８，５５４ヲ参照のこと）。
【００１７】
本発明の混合物は、注射（すなわち、皮下、筋肉内または他の非経口の注射（例えば、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）の注射、経口または経鼻）によって哺乳動物に投与され得る。
【００１８】
混合物は、免疫応答を増強することが所望される任意の哺乳動物に投与され得る。そのような動物としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、ウシ、マウス、モルモット、チンパンジー、ヒヒ、およびヒト。
【００１９】
粘膜投与（特に、一方または両方のいずれかの鼻孔への鼻内投与）が好ましい。用量は、１以上の小滴またはスプレー（例えば、エアゾールもしくは非エアゾールスプレー）を用いて送達され得る。所望の場合、混合物の複数回の投与を用いて特定の免疫原に対する抗体力価を上昇させ得る。複数回投与の間の間隔は、混合物中の特定の免疫原および／またはレクチンに依存して、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日もしくは７日、またはそれを超える日数か、あるいは少なくとも２週間、３週間もしくは４週間またはそれを超える週数であり得る。投与されるべき混合物の容量は、投与形態および哺乳動物の大きさに従って変動する。鼻内投与のための代表的な容量は、１鼻内用量あたり、少なくとも５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、２００または２５０μｌから、少なくとも５００またはそれを超えるμｌで変動する。
【００２０】
混合物中の免疫原の濃度もまた、特定の免疫原および選択される投与の経路に従って変動する。鼻内投与について、例えば、混合物中の免疫原の濃度は、少なくとも０．０３３μｇ／μｌ、０．０６７μｇ／μｌ、０．１μｇ／μｌ、０．２μｇ／μｌ、０．３３μｇ／μｌ、０．５μｇ／μｌ、０．６７μｇ／μｌ、０．７５μｇ／μｌ、１μｇ／μｌ、２μｇ／μｌ、２．５μｇ／μｌ、５μｇ／μｌ、７．１μｇ／μｌ、１０μｇ／μｌ、１２．５μｇ／μｌ、１５μｇ／μｌ、１７．５μｇ／μｌ、２０μｇ／μｌまたは２５μｇ／μｌの間を変動する。
【００２１】
本発明の混合物は、好ましくは、抗体産生およびＴ細胞応答を増強する。これには、サイトカイン産生、標的細胞殺傷、マクロファージ活性化、Ｂ細胞活性化、およびリンホカイン産生が含まれる。本発明の混合物は好ましくは、職部連れクチンの非存在下で単独で免疫原に対そのような応答に比較して、Ｔ細胞応答または抗体力価を少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％または１００％またはそれを超える程度増加させる。
【００２２】
Ｔ細胞応答を測定する方法は、当該分野において周知である。例えば、以下を参照のこと：Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９７，ＩＭＭＵＮＯＢＩＯＬＯＧＹ：ＴＨＥ  ＩＭＭＵＮＥ  ＳＹＳＴＥＭ  ＩＮ  ＨＥＡＬＴＨ  ＡＮＤ  ＤＩＳＥＡＳＥ，３ｄ  ｅｄ．，ｐｐ．２：３１−２−３３；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，３ｄ  ｅｄ．，ｐｐ．２５０−２７７、ｐｐ．２９０−２９３）。
【００２３】
本発明に従って、混合物中の免疫原に対して指向される抗体が産生され得る。免疫現に特異的に結合する抗体は、代表的に、免疫化学アッセイ（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ，放射免疫アッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降または当該分野において公知の他の免疫化学アッセイ）において使用される他のタンパク質で提供される検出シグナルよりも、少なくとも５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、特定の免疫現に特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにおける他のタンパク質を検出せず、溶液から免疫原を沈降させ得る。
【００２４】
抗体力価は、好ましくは、以下の実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡによって測定される。免疫原に対して指向される、ＩｇＧ（ＩｇＧサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３）ならびにＩｇＡ抗体は、血清、唾液、および粘膜分泌物（膣内洗浄液、鼻洗浄液、および腸洗浄液を含む）において測定され得る（実施例１を参照のこと）。
【００２５】
この開示において引用されるすべての特許および特許出願のすべての内容は、明示的に本明細書において援用される。
【００２６】
以下の実施例は、例示の目的でのみ提供され、そして本発明の範囲を制限する意図はない。これは、上記に広い意味で記載してきた。
【００２７】
（実施例１：材料および方法）
免疫原およびレクチン。コレラ毒素（ＣＴ）、オボアルブミン（ＯＶＡ、Ｖ型、鶏卵）およびＷＧＡを、Ｓｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から入手した。インゲンマメは、以前に記載のように（１５）調製した。ＵＥＡ−ＩおよびＬＥＡを、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ＭＬ−Ｉを、以前に記載のように分離した（１６）。
【００２８】
動物。８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｏｌａｃ，Ｂｉｃｅｓｔｅｒ，ＵＫ）に自由に市販の食餌および水に対するアクセスを与えた（Ｌａｂｓｕｒｅ，Ｍａｎｅａ，ＵＫ）。
【００２９】
粘膜免疫スケジュール。マウスのグループ（ｎ＝１０）から、最初の免疫前１週間に採血した。１日目、１４日目、２８日目および４２日目に、マウスを、以下のもので鼻内免疫した：ＰＢＳ、ＯＶＡ（１０μｇ）単独またはＣＴ（１ＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−１（１μｇ）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）もしくはＵＥＡ−Ｉ（１０μｇ）とＯＶＡ（１０μｇ）との混合物。別の例において、マウスを、５μｇの単純ヘルペスウイルス２型の糖タンパク質Ｄ２（ｇＤ２）で、１日目、１４日目、２８日目および４９日目に、単独または１μｇのＣＴ、ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩまたはＭＬ−ＩＩＩとともに鼻内免疫した。マウスに３０μｌの各々の調製物（１鼻孔あたり１５μｌ）を、ピペットに付着したファインチップを通じて与えた。
【００３０】
血液および粘膜の分泌物の収集物。血液サンプルを各々の免疫の１日前に、３７℃での１０分間のインキュベーション後に尾静脈から採血することによって収集した。最終免疫後２週間で、動物を最終麻酔して（ヒプノリンおよびジアゼパム）唾液および膣の分泌物の収集を可能とした。ついで、マウスを、麻酔の過剰投与によって殺傷し、ついで放血した。血液をすぐに収集し、そして遠心分離し、そして血液を−２０℃で格納した。
【００３１】
吸着性セルロースウイック（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＫ）を、以前に記載されるように（１７）唾液および膣液の収集のために用いた。洗浄流体（氷冷、０．０１Ｍ  ＰＢＳ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌアプロチニン）をウイックからの抗体の溶出に、ならびに鼻および腸洗浄のために用いた。唾液を、ウイックチップを２分間口に挿入することによって収集した（１７）。抗体を、ウイックから４００μｌの粘膜洗浄流体から抽出した。膣液を、５０μｌの洗浄液の反復フラッシングおよび吸引ならびにウイックの２分間の挿入によって収集した。抗体を、ウイックから４００μｌの洗浄液へと抽出した。
【００３２】
鼻気管洗浄液を、０．５ｍｌの粘膜洗浄液を気管からバックフラッシュすることによって断頭した動物から収集した。腸洗浄液を、１０ｍｌの氷冷洗浄液で小腸をフラッシュすることによって得た。すべての分泌物を、分析に必要となるまで−２０℃で格納した。
【００３３】
ＥＬＩＳＡによる特定の抗体の検出。ＥＬＩＳＡを設定して、ＯＶＡ、ＣＴおよび植物レクチンに対する特定のＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＧサブクラスを測定可能にした。血清（１；１００から）および粘膜分泌物（１：２から）を、適切な希釈緩衝液中で力価測定した。マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ４，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、炭酸重炭酸緩衝液ｐＨ９．６中の１ウェルあたり７５μｌの免疫原でコーティングし（ＣＴ／レクチンについて１μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ（ＯＶＡに対する応答を測定するとき）および２μｇ／ｍｌ（ｇＤ２に対する応答を測定するとき））、そして４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、プレートを２％ゼラチン／希釈緩衝液でブロッキングし、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてサンプルを添加し、連続希釈し、そして３７℃で１時間インキュベートした。
【００３４】
希釈緩衝液中のビオチン化抗血清を添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。さらなる洗浄後、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）（希釈緩衝液中１：７５０希釈）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、そして５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（１−Ｃ），Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加えた。プレートを、暗がりで３７℃で３０分間振盪しながらインキュベートした。この反応を、１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4の添加により停止し、そして吸光度を４５０ｎｍで読んだ。
【００３５】
ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液は以下のとおりであった：ＣＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ））、ＯＶＡ（ＰＢＳＴ）、ＷＧＡ（１００ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミン／ＰＢＳＴ）、ＰＨＡ（０．１％  フェチュイン／ＰＢＳＴ）、ＵＥＡ−Ｉ（３０ｍＭ  Ｌ−フコース／ＰＢＳＴ）、ＬＥＡ（キチン加水分解物（１：２００）（Ｖｅｃｔｏｒ）／ＰＢＳＴ）、ＭＬ−１（１００ｍＭ  Ｄ−ガラクトース／ＰＢＳＴ）。抗ＩｇＧ（１：８０００）およびＩｇＡ（１：２６００）のビオチン化捕捉血清（Ｓｉｇｍａ）の作業希釈液を、予備免疫し、そしてプールした陽性血清での予備的アッセイの後に決定した。ＩｇＧのサブクラス抗血清の作業希釈液（Ｓｅｒｏｔｅｃｔ）を、製造業者が推奨するとおりであった（ＩｇＧ１（１：４０００）、ＩｇＧ２ａ（１：４０００）、ＩｇＧ２ｂ（１：２０００）、ＩｇＧ３（１：２０００））。末端点の力価を、血清または粘膜のサンプルの希釈として決定し、これは、同じ希釈でのコントロールサンプルの平均よりも０．１単位大きなＯＤを与えた。
【００３６】
総ＩｇＡを、以下の改変を用いて特異的ＩｇＡとして定量した：プレートを、ヤギ抗マウスＩｇＡ（１：８０００；ａ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）でコーティングした。ＰＢＳＴを希釈液として用い、そしてＰＢＳＴ中の２％ゼラチンをブロッキング溶液として用いた。総ＩｇＡレベルを、ＩｇＡ（ＩｇＡκ、Ｓｉｇｍａ）標準曲線の直線領域から算出した。総ＩｇＡの末端点力価は、サンプルの希釈として決定し、これは、緩衝液単独よりも０．１単位大きなＯＤを与えた。
【００３７】
統計：データを、平均±標準偏差として表す。ついになっていない両側ｔ検定を用いてグループの間の有意性を試験した。標準偏差がグループ間で有意に異なった場合、非母数検定（Ｄｕｎｎの多数比較事後検定（ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ）でのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）を行った。Ｄｕｎｎの多数比較事後検定でのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ日母数検定はまた、総ＩｇＡデータの有意性を評価するためにも用いた。
【００３８】
（実施例２：血清および分泌物における総ＩｇＡレベルに対する免疫の効果）
マウスを、１日目、１４日目、２８日目および４２日目に、ＰＢＳ、ＯＶＡ（１０μｇ）単独またはＯＶＡ（１０μｇ）とＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）もしくはＵＥＡ−１（１０μｇ）とをともにもちいて鼻内経路により免疫した。サンプルを、最後の免疫の２週間後に収集した。結果を図１に示す。データは、平均±ＳＤをあらわす。
【００３９】
ＣＴ＋ＯＶＡでの４回の鼻内免疫後、総鼻気管洗浄ＩｇＡ（ｐ＜０．０１）の濃度は、すべての他のグループと比較して有意に増加していた。ＣＴとＯＶＡとの同時投与は、血清においても他のサンプリングした粘膜分泌物においても総ＩｇＡ濃度において有意な増加を生じなかった。分泌物または血清のいずれかにおける総ＩｇＡレベルにおける植物レクチンのいずれかでの免疫の有意な効果はなかった。
【００４０】
（実施例３：植物レクチンの、ＯＶＡ特異的血清抗体応答に対するアジュバント効果）
マウスを、鼻内で１日目、１４日目、２８日目、および４２日目に、ＯＶＡ（１０μｇ）単独、またはＯＶＡ（１０μｇ）単独またはＯＶＡ（１０μｇ）とＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）もしくはＵＥＡ−１（１０μｇ）とをともにもちいて鼻内経路により免疫した。血清を、各々の免疫の１日前および研究の停止の前に収集した。図２Ａ−Ｄは、この実験の結果を示す。点は、個々のデータを示し、そしてシンボル（−）は平均力価を示す。
【００４１】
単回免疫後２週間で、ＯＶＡ特異的血清ＩｇＧは、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫されたマウス中で５／１０で、およびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫されたマウスの１／１０中で検出されたが、ＯＶＡ特異的ＩｇＧは、他のグループでは検出されなかった。第二の投与の後、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫したすべてのマウスにおいて（平均力価４０３２１）、およびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスの９／１０（平均力価１１０９０）において、より高い応答が検出可能な抗体を用いて測定された。他のグループのなかでは、特異的ＩｇＧは、ＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいてのみ検出された（平均力価９１）。
【００４２】
４回の投与の後、最高の平均ＩｇＧ力価は、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいて存在した。これは、ＯＶＡ単独を受けたマウスよりもおよそ２８６倍高かった。ＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したグループにおける平均力価は、約ＯＶＡ単独を受けたマウスにおけるよりも１１８倍高かった。ＰＨＡ＋ＯＶＡで免疫下マウスにおける力価は、ＯＶＡ単独で投与したマウスにおける力価に類似していた。ＬＥＡ＋ＯＶＡの投与は、ＯＶＡ単独に比較して平均力価の少量の増加を生じた（５倍）。ＯＶＡとＷＧＡおよびＵＥＡ−Ｉとの送達は、ＯＶＡ単独に比較して、平均血清ＩｇＧ抗ＯＶＡ力価におけるそれぞれ４１倍および５１倍の増加を生じた。
【００４３】
ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡを受けたグループとは対照的に、ＷＧＡまたはＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したグループにおける応答は、かなり変動性であった。結果として、最終投与後には、ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡグループのみ（相違はグループ間で有意ではなかった）は、ＯＶＡ単独グループよりも有意に高い（ｐ＜０．００１）平均ＯＶＡ特異的ＩｇＧ力価を有した。これらのグループにおける力価はまた、ＰＨＡ＋ＯＶＡグループ（ｐ＜０．００１）よりも有意に高かった。
【００４４】
高レベルの特異的ＩｇＧとは対照的に、非常に低い力価のＯＶＡ特異的血清ＩｇＡが検出された。事実、最終投与後、有意なレベルのＯＶＡ特異的血清ＩｇＡは、ＣＴ＋ＯＶＡ（平均力価、２２０）およびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡ（平均力価、８０）で免疫したマウスにおいてのみ検出された。
【００４５】
（実施例４：ＯＶＡ特異的ＩｇＧサブクラスパターン）
マウスを、１日目、１４日目、２８日目および４２日目に、ＯＶＡ（１０μｇ）単独またはＯＶＡ（１０μｇ）とＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）もしくはＵＥＡ−１（１０μｇ）とをともにもちいて鼻内経路により免疫した。サンプルを、最終免疫後２週間で収集した。図３は、この実験の結果を示す。ここのデータに当たる点およびシンボル（−）は、平均力価を表す。
【００４６】
ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体のサブクラスプロファイルの分析は、非常に偏重のかかった応答を示した。ＩｇＧ１力価は、ほとんどのグループにおけるＯＶＡ特異的ＩｇＧの力価に類似した。ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡでそれぞれ免疫したマウスにおいて、その平均力価は、ＯＶＡ単独で面益したマウスよりもそれぞれ約４５０倍および２５５倍高かった。ＣＴ＋ＯＶＡグループにおける力価は、ＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡ（ｐ＜０．０５）を除いてすべての郡において有意に高かった。ＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡグループにおける力価は、ＯＶＡ単独を受けたグループよりも、ＰＨＡ＋ＯＶＡを受けたグループよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
【００４７】
ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａは、それぞれ８／１０および２／１０のＣＴ＋ＯＶＡ（平均力価５６１）およびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡ（平均力価３３１）で免疫したマウスにおいて検出された。特定のＩｇＧ２ａは、他のグループにおいて検出されなかった。特異的なＩｇＧ２ｂは、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫したマウスの２／１０においてのみ検出され、他のグループではなんら検出されなかった。特異的なＩｇＧ３は、検出されなかった。これらのデータは、これらのマウスにおけるＣＴ特異的ＩｇＧアイソタイプ応答に対して驚くほど異なり、ここで、比較的高力価の特異的ＩｇＧ２ａおよび有意なレベルのＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３が検出された（表１）。
【００４８】
（実施例５：ＯＶＡ特異的粘膜ＩｇＡ応答に対する植物レクチンのアジュバント効果）
マウスをＯＶＡ（１０μｇ）単独、またはＣＴ（１μｇ）ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）、またはＵＥＡ−Ｉ（１０μｇ）と共にＯＶＡ（１０μｇ）で、１日目、１４日目、２８日目、および４２日目に鼻内免疫した。力価を最終免疫の２週間後に測定した。結果を図４Ａ〜Ｄに示す。点は、個々のデータを参照し、そして記号（−）は、平均力価を表す。
【００４９】
特異的ＩｇＡは、ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいてサンプリングした全ての粘膜部位で検出された。２つの群の間には、有意な差異はなかった。ＯＶＡ特異的唾液ＩｇＡは、ＯＶＡ単独、ＬＥＡ＋ＯＶＡまたはＰＨＡ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいては検出されず、ＷＧＡ＋ＯＶＡおよびＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡでそれぞれ免疫したマウスでは、１０匹のうちそれぞれ２匹および４匹において検出された。逆に、特異的唾液ＩｇＡは、ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡでそれぞれ免疫したマウスでは、１０匹のうちそれぞれ９匹および１０匹において測定され、これはＣＴ＋ＯＶＡ群における平均力価の２倍以上である。
【００５０】
膣洗浄では、ＯＶＡ特異的ＩｇＡは、ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡのそれぞれで免疫したマウスにおいて、１０匹のうち９匹および７匹で検出された。平均力価は、ＣＴ＋ＯＶＡ群において４倍高かったが、これは、大きくは、１つの高い応答者の結果であった。ＯＶＡ特異的膣洗浄液ＩｇＡは、ＰＨＡ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいて検出されず、ＯＶＡ単独、ＬＥＡ＋ＯＶＡ、またはＷＧＡ＋ＯＶＡのいずれかで免疫したマウスにおいて１０匹のうち１匹において検出され、そしてＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいては１０匹のうち３匹において検出された。
【００５１】
ＯＶＡ特異的ＩｇＡの高い力価は、ＣＴ＋ＯＶＡまたはＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫した全てのマウスからの経鼻気管洗浄液で検出された。これは、ＣＴ＋ＯＶＡ群においておよそ５倍高い力価であった。ＯＶＡ特異的経鼻気管洗浄液ＩｇＡ力価は、ＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡを除く全ての群においてよりも、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいて有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【００５２】
顕著なことに、これらの群におけるＯＶＡ特異的経鼻気管洗浄液ＩｇＡ力価は、血清ＩｇＡ力価に匹敵した。ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡでそれぞれ免疫したマウス由来の血清中の総ＩｇＡ力価は、それぞれ経鼻気管洗浄液において３３倍および７３倍高かった。特異的ＩｇＡは、ＯＶＡ単独で免疫したマウスにおいて１０匹のうち１匹の経鼻気管洗浄液で検出されたが、ＰＨＡ＋ＯＶＡで免疫したマウスでは検出されなかった。ＯＶＡ特異的経鼻気管洗浄液ＩｇＡは、ＷＧＡ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいては１０匹のうち７匹で測定され、そしてＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡまたはＬＥＡ＋ＯＶＡのそれぞれで免疫したマウスにおいては１０匹のうち５匹で測定された。
【００５３】
ＯＶＡ特異的ＩｇＡは、ＣＴ＋ＯＶＡまたはＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫した全てのマウスからの腸洗浄液において検出され、ＣＴ＋ＯＶＡ群においておよそ４倍高い力価であった。これらの群における力価は、互いには有意に異ならないが、他の全ての群におけるよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。他の群の間では、ＯＶＡ特異的腸洗浄液ＩｇＡは、１：２の最大力価で散発的にのみ検出された。
【００５４】
（実施例６：ＣＴ／植物レクチン特異的応答）
マウスを、ＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）、またはＵＥＡ−Ｉ（１０μｇ）と共にＯＶＡ（１０μｇ）で１日目、１４日目、２８日目、および４２日目に鼻内免疫した。結果を図５Ａ〜Ｆに示す。データは平均±ＳＤで示す。データは、免疫原の最終投与の２週間後に測定された特異的血清ＩｇＧの力価である。
【００５５】
ＣＴ特異的血清ＩｇＧは、ＣＴ＋ＯＶＡの一回の投与後に全ての動物において検出され、そして力価は、この後の各投与で増大した。全ての４つのＩｇＧサブクラスの特異的抗体は、４回の投与後の血清中で検出された（表１）。最も高い力価は、ＩｇＧ１であった。一方、ＣＴ特異的ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３もまた検出された。最終投与後、ＣＴ特異的血清ＩｇＡは、全てのマウスにおいて検出され、平均力価は４４８１であった。
【００５６】
特異的ＩｇＡはまた、唾液、膣洗浄液、経鼻気管洗浄液、および腸洗浄液においては全ての動物において検出された。唾液ＩｇＡ力価は、動物間で比較的一致していた（血清中よりもおよそ１０倍低い平均力価）。これらのマウス由来の唾液中の全ＩｇＡ力価は、血清中よりも１３４０倍低かった。膣ＩｇＡ力価は、非常に可変性であり、単一の高い応答者が平均力価を増大した。ＣＴ特異的ＩｇＡの高い力価は、全ての動物からの経鼻気管洗浄液において測定され、平均力価は、血清ＩｇＡ力価に匹敵した。特異的ＩｇＡはまた、全てのマウスの腸洗浄液においても検出されたが、サンプリングされた他の粘膜部位でよりも低い平均力価であった。
【００５７】
単回用量のＭＬ−１＋ＯＶＡの鼻内送達は、１０匹のマウスのうち３匹においてＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＧの産生を刺激した。二回目の投与およびその後の投与後に、高い力価の特異的ＩｇＧが全てのマウスにおいて検出された（図５）。ＭＬ−Ｉ特異的血清ＩｇＧサブクラスの分析は、高い力価のＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＧ１を見出した（表１）。ＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂもまた検出されたが、特異的ＩｇＧ３は検出されなかった。ＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＡは、血清中、および４回投与後にサンプリングした全ての粘膜部位で、全てのマウスにおいて検出された。唾液中の力価は、全ての動物について一致したが、単一の非常に高い応答者が、膣洗浄液の平均力価を増大した。高ＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＡ力価が、全ての動物の経鼻気管洗浄液において測定された。ＣＴを用いるのと同様に、経鼻気管洗浄液における平均ＭＬ−Ｉ特異的力価は、血清ＩｇＡ力価と匹敵し（およそ２倍低い）、これは、経鼻気管洗浄液における全ＩｇＡ力価がこれらのマウスに由来の血清中におけるよりも７３倍低いので顕著なことであった。特異的ＩｇＡはまた、全ての動物からの腸洗浄液においても検出された。
【００５８】
ＬＥＡ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいては、ＬＥＡ特異的血清ＩｇＧは、１回の投与後に１０匹のマウスのうち９匹で検出された。力価は、その後の各投与後に、最終免疫後の比較的高いレベルにまで増大した（図５）。ＩｇＧサブクラスの分析は、高い力価のＬＥＡ特異的ＩｇＧ１および低い平均ＩｇＧ２ａ力価を見出した（表１）。特異的血清ＩｇＡは、４回の投与後に１０匹のマウスのうち７匹において、低いレベルであるが検出された。特異的ＩｇＡはまた、試験した４つの全ての粘膜分泌物において検出されたが、ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡ群におけるデータに比較して、力価は非常に可変性であった。
【００５９】
ＰＨＡ特異的血清ＩｇＧは、ＰＨＡ＋ＯＶＡの一回の投与後に１０匹のマウスのうち１匹で検出された。その後の投与後に、力価は増加し、そして特異的ＩｇＧは、最終の投与後に１０匹の動物のうち８匹において存在した（図５）。ＩｇＧサブクラスのうち、特異的ＩｇＧ１のみが検出された（表１）。全ての動物において、低い力価の特異的血清ＩｇＡが検出された。ＰＨＡ特異的ＩｇＡは、唾液においても膣洗浄液において検出されなかったが、経鼻気管洗浄液においては、１０匹のマウスのうち５匹において、腸洗浄液においては１０匹のマウスのうち１匹において検出された。
【００６０】
最も低い力価の特異的抗体は、ＷＧＡ＋ＯＶＡの４回の投与後であってもＷＧＡに対して惹起された（図５）。特異的ＩｇＧ１は、１０匹のマウスのうち２匹において検出され、そして他のＩｇＧサブクラスは、検出されなかった（表１）。特異的ＩｇＡは、４回の投与後に、最大力価の１：１００であるが、多数のマウスにおいて検出された。低い力価の特異的ＩｇＡが、唾液、膣洗浄液、および経鼻気管洗浄液において、少数のマウスにおいて測定された。これらのデータは、この群（ここでは、比較的高いレベルのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧが多数のマウスで検出された）からのＯＶＡ特異的データと対照的である。
【００６１】
ＵＥＡ−Ｉ特異的血清ＩｇＧは、ＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡの１回の投与後に検出されなかったが、その後の投与後では検出され、そして最終投与後には１０匹のマウスのうち８匹において検出された（図５）。特異的ＩｇＧ１は、最終の投与後に１０匹のマウスのうち９匹のマウスにおいて検出された（表１）が、特異的ＩｇＧ２ａは、１０匹のマウスのうち１匹で、そしてＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３は検出されなかった。特異的血清ＩｇＡは、最終投与後に１０匹のマウスのうち３匹において検出された。比較的低いレベルのＩｇＡが、唾液、膣洗浄液、および経鼻気管洗浄液において検出された。
【００６２】
本データは、アジュバントに対しておよび免疫原に対して惹起される応答のタイプが異なり得ることを示す。高い力価の特異的ＩｇＧ１が、ＯＶＡおよびＣＴの両方に対して検出されたが、比較的高い力価のＣＴ特異的ＩｇＧ２ａが測定される一方、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａはほとんどまたは全くなかった。ＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡの送達は、同様の結果に至ったが、一方ＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＧ２ａ力価は比較的低かった。以前の研究は、ＯＶＡ＋ＣＴの送達後にＩｇＧ２ａ力価よりも高いＯＶＡ特異的ＩｇＧ１を見出したが、同じマウスにおいてＩｇＧ１よりも高い力価のＣＴ特異的ＩｇＧ２ａが見いだされた（２４）。ＣＴ＋キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）をマウスに供給することは、ＣＴに対して高い応答者であるマウスにおいて強いＫＬＨ特異的分泌ＩｇＡ応答を刺激し、乏しい応答者においてはずっと小さい効果であった（２９）。従って、ＣＴの経口アジュバント効果は、ＣＴそれ自体に対する強い免疫応答に依存した。しかし、ＷＧＡおよびＵＥＡ−Ｉは、ＯＶＡに対する血清ＩｇＧ応答を増大し（有意ではないが）、高度に免疫原性ではなかった。近年の研究は、いくつかの食物レクチン（ＰＨＡを含む）が、ヒト好塩基球を誘発してＩＬ−４およびＩＬ−１３を放出し得たことを見出した。例えば、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ−Ｅは、ＩＬ−４レベルを抗ＩｇＥ抗体での刺激により得られるレベルと同程度に高くに誘導した。高レベルのＩＬ−４を刺激したレクチンはまた、おそらくＩＬ−４（これは、Ｔｈ２タイプ応答に転換するのに必要である（３０））を誘導することにより、ＩＬ−１３およびヒスタミンの放出を誘導した。
【００６３】
ＣＴまたはＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおけるＯＶＡに対する抗血清ＩｇＧ力価の誘導にも関わらず、血清ＩｇＡは、わずかに検出可能であった。以前の研究は、免疫原特異的血清ＩｇＡは、Ｖ．  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｚｏｔタンパク質またはＬＴ＋ＯＶＡでの２回の鼻内免疫後、マウスにおいて検出されなかったことを見出した（１９）。同様に、ＬＴ＋ＴＴの経口送達は、ＴＴに対する高レベルの血清ＩｇＧ抗体を刺激したが、一方、抗ＴＴ血清ＩｇＡは検出されなかったことが見いだされた（２３）。ＣＴおよびＭＬ−Ｉは、全ての粘膜分泌物において抗ＯＶＡ  ＩｇＡを有効に刺激したが、レベルは、経鼻気管洗浄液および唾液において最も高かった。ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおける全血清ＩｇＡ力価はそれぞれ、経鼻気管洗浄液において３３倍および７３倍高く、そして唾液において１３４０倍および１１７６倍高かったので、これらの部位でのＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価は、局所応答の誘導を示す。膣洗浄液における抗体力価は、非常に可変性であったが、これは、ホルモン影響を反映し得る（３１）。
【００６４】
【表１】
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（実施例７：欧州ヤドリギ（Ｖｉｓｃｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来の３つの異なるレクチン（ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩ、およびＭＬ−ＩＩＩ）は、鼻内投与後のｇＤ２特異的血清ＩｇＧ抗体の力価を増大させる）
これらの３つのレクチンの各々の１μｇを、５μｇの単純ヘルペスウイルス２型由来糖タンパク質Ｄ２（ｇＤ２）と混合し、そして上記のように１日目、１４日目、２８日目および４９日目にマウスに鼻内送達した。他のマウスを、５μｇ  ｇＤ２単独または１μｇ  ＣＴと混合した５μｇ  ｇＤ２で鼻内免疫した。血清を、各免疫の１日前、および研究の終了時に採集した。ｇＤ２特異的血清ＩｇＧ抗体の力価を上記のように測定した。
【００６５】
結果を図６Ａ〜Ｄに示す。点は、個々のデータを参照し、そして記号（−）は、平均力価を表す。この３つのヤドリギレクチンの各々は、ＣＴによって示されるのに匹敵するアジュバント活性を示した。
【００６６】
（実施例８：鼻内投与後のｇＤ２特異的血清ＩｇＧサブクラス抗体の力価の増加）
マウスを、１日目、１４日目、３５日目、および４９日目に、ｇＤ２単独（５μｇ）またはＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１μｇ）、もしくはＭＬ−ＩＩＩ（１μｇ）と共にｇＤ２  （５μｇ）のいずれかで鼻内免疫した。サンプルを最終免疫の２週間後に採集した。データは、最終免疫の２週間後に測定した力価である。図７Ａ、ＩｇＧ１；図７Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図７Ｃ、ＩｇＧ２ｂ；図７Ｄ、ＩｇＧ３。点は、個々のデータを参照し、そして記号（−）は、平均力価を表す。括弧内のｐ値は、ｇＤ２のみ群と比較したデータの有意性を参照する。
【００６７】
血清特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂ抗体の力価は、３つのヤドリギレクチンの各々で処置したマウスにおいて増大した。
【００６８】
（実施例９：ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩ、およびＭＬ−ＩＩＩは、鼻内免疫後にマウスにおいてｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価を増大する）
ｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価は、１日目、１４日目、３５日目、および４９日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独またはＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１μｇ）もしくはＭＬ−ＩＩＩ（１μｇ）と共にｇＤ２（５μｇ）のいずれかで鼻内免疫したマウスの分泌において測定された。データは、図８において、最終免疫の２週間後に測定した力価である。図８Ａ、唾液；図８Ｂ、膣洗浄液；図８Ｃ、鼻内気管洗浄液；図８Ｄ、腸洗浄液。点は、個々のデータを参照し、そして記号（−）は、平均力価を表す。括弧内のｐ値は、ｇＤ２のみ群と比較したデータの有意性をいう。
【００６９】
ヤドリギレクチンの各々は、試験した分泌物の各々におけるｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体の力価を増大した。
【００７０】
表２は、ｇＤ２（５μｇ）を単独またはＣＴ／植物レクチン（１μｇ）と共に用いて鼻内免疫したマウスにおけるレクチン特異的抗体応答を示す。マウス（ｎ＝１０）を０日目、１４日目、２８日目、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６日目および５７日目に採集した。
【００７１】
【表２】
0005072159.tif 000003
（実施例１０  非毒性ＩＩ型ＲＩＰおよび関連する分子の粘膜免疫原性およびアジュバント活性）
非毒性型ＩＩ型ＲＩＰ（ニグリンＢ、塩基性ニグリンＢ、エブリンｒＩ）およびそれらのＢ型サブユニットに関連する分子（ＳＮＡ  ＩＩ、ＳＥＬｆｄ）の粘膜（鼻腔内）免疫原性およびアジュバント活性を、ＭＬ−１およびＣＴのそれと比較した。マウスを、ｇＤ２（５μｇ）単独および植物レクチンまたはコレラトキシン（ＣＴ）（１μｇ）とともに鼻内免疫した。マウスを
、０、２１、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６および５７日目に収集した。レクチン特異的応答およびバイスタンダー抗原であるｇＤ２に対する応答を、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【００７２】
図９は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、またはｇＤ２（５μｇ）を１μｇのＣＴ、ＭＬ−１、ニグリンＢ、塩基性ニグリンＢ、エブリンｒＩ、ＳＮＡ  ＩＩ、またはＳＥＬｆｄを用いて、鼻腔内に免疫したマウスからのｇＤ２特異的な総血清ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラス力価を示す。血清を研究の終わりに収集した。個々のデータおよびシンボル（−）に言及する点は、平均力価を表す。カッコ内のｐ値は、ｇＤ２のみのグループと比較したデータの有意性をいう。
【００７３】
図１０は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、またはｇＤ２（５μｇ）を１μｇのＣＴ、ＭＬ−１、ニグリンＢ、塩基性ニグリンＢ、エブリンｒＩ、ＳＮＡ  ＩＩまたはＳＥＬｆｄを用いて、鼻腔内免疫したマウスの分泌液において測定したｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価を示す。データは、（ａ）唾液、（ｂ）膣内洗浄、（ｃ）経鼻洗浄、（ｄ）腸洗浄における最終免疫の２週間後に測定した力価である。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル（−）は、平均の力価を表す。カッコ内のｐ値は、ｇＤ２のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。
【００７４】
表３は、ＩＩ型  ＲＩＰおよび関連する分子の免疫原性を示す。抗体応答は、ｇＤ２（５μｇ）単独、またはＣＴ／レクチン（１μｇ）とともに用いて鼻腔内免疫したマウスにおいて測定した。マウスのグループ（ｎ＝１０）を、０、１４、２８、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６および５７日目に収集した。
【００７５】
【表３】
0005072159.tif 000004
図１１は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、またはｇＤ２（５μｇ）と１μｇのＣＴ、ＭＬ−１、またはＵＥＡ−１とを用いて経鼻免疫したマウスにおいて測定されたｇＤ２特異的血清ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体力価を示す。データは、最終免疫の２週間後に測定された力価である。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル（−）は、平均力価を表す。カッコ内のｐ値は、ｇＤ２のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。
【００７６】
図１２は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、またはｇＤ２（５μｇ）と１μｇのＣＴ、ＭＬ−１、またはＵＥＡ−１とを用いて経鼻免疫したマウスにおいて測定したｇＤ２特異的サブクラス抗体力価を示す。データは、最終免疫の２週間後に血清において測定された力価である。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル（−）は、平均力価を表す。カッコ内のｐ値は、ｇＤ２のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。
【００７７】
図１３は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、またはｇＤ２（５μｇ）を１μｇのＣＴ、ＭＬ−１またはＵＥＡ−１を用いて、鼻腔内免疫したマウスの分泌液において測定したｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価を示す。データは、（ａ）唾液、（ｂ）膣内洗浄、（ｃ）経鼻洗浄、（ｄ）腸洗浄における最終免疫の２週間後に測定した力価である。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル（−）は、平均の力価を表す。カッコ内のｐ値は、ｇＤ２のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。
【００７８】
図１４は、ＩＬ−５、ＩＬ−４、およびＩＦＮ生産の平均濃度、および、ｇＤ２、ＭＬ−１、またはＵＥＡ−１を用いて、またはｇＤ２をＭＬ−１、ＵＥＡ−１、またはＬＴＫ６３とともに用いての、３回の免疫（０日目、２１日目、４２日目）の８週間後の、（ａ）脾臓細胞および（ｂ）子宮頚管リンパ節におけるＴ細胞増殖アッセイについての１分あたりの計数を示す。脾臓細胞および子宮頚管リンパ節細胞を単離し、そしてインビトロでｇＤ２（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、または５μｇ／ｍｌ）または１：１０００もしくは１：５０００に希釈してラテックスビーズに結合させたｇＤ２、またはＰＭＡ／ｃｄ３で刺激した。
【００７９】
図１５は、１日目、１４日目、２８日目、および４９日目に、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、またはＯＶＡ（５ｍｇ）とＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）、またはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）とを一緒に用いて、強制飼養によって免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ抗体力価を示す。血清を、各免疫の１日前および研究の終わりに収集した。図１５Ａ、１用量後の血清ＩｇＧ力価（１３日目）；図１５Ｂ、２用量後の血清ＩｇＧ力価（２７日目）；図１５Ｃ、３用量後の血清ＩｇＧ力価（４８日目）；図１５Ｄ、最終用量後の血清ＩｇＧ力価（６２日目）。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル（−）は、平均力価を表す。
【００８０】
図１６は、１日目、１４日目、３５日目、および４９日目に、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、またはＯＶＡ（５ｍｇ）とＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）、またはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）とを一緒に用いて、強制飼養によって免疫したマウスにおいて測定したＯＶＡ特異的血清ＩｇＧサブクラスおよびＩｇＡ抗体力価を示す。サンプルを最終免疫の２週間後に収集した。データは、最終免疫の２週間後に測定した力価である。図１６Ａ、ＩｇＧ１；図１６Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図１６Ｃ、ＩｇＧ２ｂ；図１６Ｄ、ＩｇＧ３。点は、個々のデータを表し、そしてシンボル（−）は、平均力価を表す。
【００８１】
図１７は、強制飼養によって免疫したマウスの分泌物中において、１日目、１４日目、３５日目、および４９日目に、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、またはＯＶＡ（５ｍｇ）とＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）、またはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）とを一緒に用いて、測定したＯＶＡ特異的ＩｇＡ抗体力価を示す。データは、最終免疫の２週間後に測定した力価である。図１７Ａ、唾液；図１７Ｂ、膣洗浄；図１７Ｃ、経鼻洗浄；図１７Ｄ、腸洗浄。点は、個々のデータを表し、そしてシンボル（−）は、平均力価を表す。
【００８２】
表４は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、または０．５ｍｌの重炭酸ナトリウム中において投与されるレクチン（１０μｇ）とともに用いて、強制飼養によって免疫したマウスにおけるＯＶＡ特異的抗体応答を示す。マウスのグループ（ｎ＝１０）を、０、１４、２８、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６日目および５７日目に収集した。
【００８３】
【表４】
0005072159.tif 000005
表５は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、またはレクチン（１０μｇ）とともに免疫したマウスにおけるＯＶＡ特異的抗体応答を示す。マウスに、０．１ｍｌ  ＰＢＳ中において強制飼養によって、または食餌ペレット中に組み込んで免疫した抗原（±ＭＬ１）を投与した。マウスのグループ（ｎ＝５）を、０日目、１４日目、２８日目、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６日目および５７日目に収集した。
【００８４】
表６は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、またはレクチン（１０μｇ）とともに経口免疫したマウスにおけるＭＬ１特異的抗体応答を示す。マウスに、０．１ｍｌ  ＰＢＳ中において強制飼養によって、または食餌ペレット中に組み込んだ抗原（±ＭＬ１）を投与した。マウスに、０日目、１４日目、２８日目、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６日目および５７日目に収集した。
【００８５】
【表５】
0005072159.tif 000006
【００８６】
【表６】
0005072159.tif 000007
（実施例１１）
（経皮経路で抗原とともに送達された場合の、ＩＩ型ＲＩＰ（ＭＬ１，エブリンＲＩ）のアジュバントとしての効力）
粘膜アジュバントとしてのヤドリギレクチンの効力を実証した研究からの続きで、これらの研究を、経皮投与された場合のアジュバントとしての、ＩＩ型ＲＩＰのアジュバントとしての能力を評価するために行った。最近の研究は、ＣＴがこの経路でアジュバントとして使用された場合の、免疫応答の効果的な誘導を実証している（Ｇｌｅｎｎら、１９９８、１９９９）。ＭＬ  １に加えて、ＣＴを陽性コントロールとしておよびエブリンｒＩを使用した。なぜなら、それは、鼻腔内投与された場合に、非毒性ＩＩ型ＲＩＰの最も免疫原性のものであったからである。
【００８７】
（プロトコル）
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）のグループを、０日目および２１日目に免疫し、そして血清サンプルを、０日目、２０日目、および３５日目にＥＬＩＳＡによる分析のために採取した。３つの異なるバイスタンダー抗原、ＢＳＡ、ＤＴ、およびｇＤ２を調査した。抗原（５０μｇ）を、単独で、またはレクチン／トキシン（５０μｇ）と混合して、マウスに投与した。特異的な抗体応答を、ＥＬＩＳＡによって決定した。さらに、ＣＴおよびレクチンに対する応答を測定して、それらの免疫原性を、経皮経路で評価した。マウスの背をｎｏ．４０のクリッパーで剃り、そして動物を４８時間休ませた。マウスに、免疫化手順の間、ｈｙｐｎｏｒｍジアゼパムで麻酔した。その皮膚を、溶液を適用する１分前にエタノールで拭いた。免疫化溶液（１００μｌ）を、剃った皮膚に２ｃｍ2の範囲にわたって適用した。３０分後、さらに１００μｌの蒸留水を適用し、そしてマウスを９０分間放置した。マウスを生温かい水道水で十分に洗浄し、たたいて乾燥し、そして再び洗浄した。
【００８８】
（研究グループ）
Ｉ．ＢＳＡ
１．ＢＳＡ  ５０μｇ
２．ＢＳＡ  ５０μｇ＋ＣＴ  ５０μｇ
３．ＢＳＡ  ５０μｇ＋ＭＬＩ  ５０μｇ
４．ＢＳＡ  ５０μｇ＋エブリン  ｒＩ  ５０μｇ
ＩＩ．ジフテリア毒素（ＤＴ）
１．ＤＴ  ５０μｇ
２．ＤＴ  ５０μｇ＋ＣＴ  ５０μｇ
３．ＤＴ  ５０μｇ＋ＭＬＩ  ５０μｇ
４．ＤＴ  ５０μｇ＋エブリンｒＩ  ５０μｇ
ＩＩＩ．単純ヘルペスウイルス２糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）
１．ｇＤ２  ５０μｇ
２．ｇＤ２  ５０μｇ＋ＣＴ  ５０μｇ
３．ｇＤ２  ５０μｇ＋ＭＬＩ  ５０μｇ
４．ｇＤ２  ５０μｇ＋レクチンＩＩ  ５０μｇ
表７は、１および２経皮用量のＢＳＡ（５０μｇ）単独、またはＣＴ／植物レクチン（５０μｇ）と一緒に投与した後に測定した、ＢＳＡ特異的血清抗体力価を示す。
【００８９】
【表７】
0005072159.tif 000008
表８は、ＤＴ（５０μｇ）単独でまたはＣＴ／植物レクチン（５０μｇ）を伴ったＤＴの、１回および２回の経皮用量の後に測定したＤＴ特異的血清抗体力価を示す。
【００９０】
【表８】
0005072159.tif 000009
表９は、ｇＤ２（５０μｇ）単独でまたはＣＴ／植物レクチン（５０μｇ）を伴ったｇＤ２の、１回および２回の経皮用量の後に測定したｇＤ２特異的血清抗体力価を示す。乏しい応答に起因して、血清ＩｇＧａおよびＩｇＧ１レベルを決定しなかった。
【００９１】
【表９】
0005072159.tif 000010
表１０は、ＣＴ／ＭＬ１／Ｅｂｕｌｉｎ  ｒ１（５０μｇ）を伴った１回および２回の経皮的用量の後に測定したＣＴおよびレクチン特異的血清抗体力価を示す。
【００９２】
【表１０】
0005072159.tif 000011
（実施例１２）
マウスにおいて経口送達したレクチンの結合、取り込みおよび転移（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ））
（レクチンの投与および組織の回収）  雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、実験前には自由給水にして通常の仕入れ飼料で維持した。マウスを、一晩絶食させ、そして２４匹のマウスの群に、弯曲した経口投薬針（２０ｇ×２５ｍｍ）を用いて胃管栄養法によりレクチンを送達した（１００μｌの生理食塩水中１ｍｇレクチン／マウス）。水は、自由給水とした。８匹の動物の群を、ハロタン麻酔により屠殺し、続いて１時間後、６時間後および２４時間後に瀉血した。血液を心臓穿刺により採取した。マウスを解剖し、そして腸全体を取り出し、そして胃、２つの部分の小腸、および大腸に分けた。腸の内容物を１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで洗い出して、存在している非結合レクチンの量の指標を与えた。腸組織をポリエチレンバッグに入れ、そして液体窒素中で急速冷凍した。腸の切片を、各場合において採取し、そして組織学によるレクチン結合の試験のために４％ホルマリンで固定した。全ての腸組織および洗浄物を、分析が必要になるまで−２０℃で保存した。さらに、肝臓、秘蔵および腎臓を動物から採取した。
【００９３】
（組織からのレクチンの抽出）  レクチンまたはコントロールの生理食塩水を投与した動物由来の組織を、ジアミノプロパンの２０ｍＭ溶液中でホモジナイズすることにより抽出した。組織片を、抽出溶液（９９５μｌ  ２０ｍＭ  ジアミノプロパン＋５μｌの５ｍｇ／ｍｌ  アプロチニン（Ｓｉｇｍａ））に入れ、そして氷上で２分間２４０００ｒｐｍでホモジナイズした（Ｊａｎｋｅ  ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ  ＩＫＡ（登録商標）−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（登録商標））。ホモジナイザーのヘッドを、蒸留水で洗浄し、抽出溶液１ｍｌ中で、そしてサンプルの間に再び蒸留水で洗浄した。サンプルを、２０分間２℃で１８６００ｇで遠心分離した（Ｊｏｕａｎ，ＭＲＩ２２）。上清を回収し、そして分析が必要になるまで−２０℃で保存した。
【００９４】
（腸洗浄物の処理）  腸に存在するフリー（非結合）レクチンの量の指標を提供するために、腸の洗浄物に存在するレクチンの量を分析した。洗浄物（５００μｌ）を、希釈緩衝液（４９５μｌ）＋プロテアーゼインヒビターであるアプロチニン（５ｍｇ／ｍｌを５μｌ）に添加し、そして１０分間８０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  １２Ｓ，Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｕ  Ｐｏｎｔ）。
【００９５】
（血液サンプルの処理）  採取の後、血液サンプルを室温で１時間放置し、そして６分間７０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  １２Ｓ，Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｕ  Ｐｏｎｔ）。血漿を回収し、そして分析が必要になるまで−２０℃で保存した。
【００９６】
（腸への植物レクチンの結合のＥＬＩＳＡ分析）  ＥＬＩＳＡアッセイを設定して、抽出した組織サンプルおよび洗浄物中のＷＧＡの定量を可能とした。マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ４，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、ウェルあたり炭酸−炭酸水素緩衝液（ｐＨ９．６）で１：６４０００希釈した７５μｌのウサギ抗ＷＧＡでコーティングし、そして４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、プレートをＰＢＳＴ／２％ゼラチン／２００ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミンでブロッキングし、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し；標準物質およびサンプルを添加し、希釈緩衝液（ＰＢＳＴ／２００ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミン）で段階希釈し、そして３７℃で１時間インキュベートした。１０ｎｇ／ｍｌ〜７８ｐｇ／ｍｌのＷＧＡ溶液を力価測定することにより、ＷＧＡの標準曲線を構築した。希釈緩衝液で１：１６０００希釈したビオチン化抗ＷＧＡを添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、希釈緩衝液で１：１０００希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色溶液（ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（１−Ｃ）Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＵＳＡ）を添加し、そして遮光して、３７℃で３０分間振盪しながらインキュベートした。１Ｍ  Ｈ2ＳＯ４（５０μｌ／ウェル）を添加することにより反応を停止させ、そして吸光度を４５０ｎｍで読み取った。標準曲線の線形領域からＷＧＡレベルを計算した。
【００９７】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを泳動し、そしてタンパク質を、セミドライ転写装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、膜を２．５％カゼイン溶液中で３０分間室温でブロッキングした。膜を洗浄し、そして一次抗体（ビオチン標識抗レクチン）を１．２％カゼイン溶液で１：２５００希釈して添加した。室温で一晩攪拌しながらインキュベートした後、膜をＰＢＳで徹底的に洗浄し、そしてＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）ペルオキシダーゼを１．２％カゼインで１：５０００希釈して添加した。室温で１時間インキュベートした後、膜をＰＢＳおよび蒸留水で徹底的に洗浄した。過剰な液体を膜から除去し、そして発色溶液を添加し（Ｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ検出キット）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）、そして遮光して５分間放置した。過剰な液体を膜から乾燥させ、そして膜をフィルムに露出し（Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＬＳ（Ｓｉｇｍａ））、そして処理した。
【００９８】
（結果）
（経口胃管栄養法後のマウス腸における植物レクチンの安定性および結合）
レクチン（ＰＨＡ、ＷＧＡおよびＵＥＡ−１）は、胃管栄養法後、６時間までの間、マウス消化管において安定であった（表１１および１２；図１８および１９）。小腸において、レクチンは、ポジティブコントロールのサブユニットＭＷで検出されたに過ぎなかった。胃においては、ＰＨＡおよびＵＥＡ−１の場合、６時間および２４時間後にレクチン凝集の指標があった。しかし、胃で検出されたレクチンの大部分は、やはりインタクトであった。腸に結合するレクチンの分析により、送達して１時間および６時間後に、結合したレクチンの位置に差異が見出された。ＰＨＡ（およびＷＧＡ（示さず））は、小腸の近位に結合したが、ＵＥＡ−１はこの領域において検出されなかったが、小腸の遠位に結合した（表１１）。結合のパターンは、レクチン投与して１時間および６時間後のパターンと類似であった。送達の２４時間後に、レクチンはホモジナイズした腸組織において検出されなかった。このことは、レクチンが腸から解離し、そして再結合するのではなく、解離した後に分泌されるようであることを示した。
【００９９】
表１１は、胃管栄養法によりＰＨＡ（アイソタイプＥ２Ｌ２）を１ｍｇ送達して１時間、６時間および２４時間後の、マウス消化管におけるＰＨＡの検出を示す。＋記号は、レクチンがウェスタンブロッティングで検出されたことを示し、そして陽性シグナルを有するマウスの数（各場合で８匹のうち）を括弧に入れて示す。ポジティブコントロールのＰＨＡサブユニット分子量は、２９．５ｋＤａであった。
【０１００】
表１２は、胃管栄養法によりＵＥＡ１を１ｍｇ送達して１時間、６時間および２４時間後の、マウス消化管におけるＵＥＡ１の検出を示す。＋記号は、レクチンがウェスタンブロッティングで検出されたことを示し、そして陽性シグナルを有するマウスの数（各場合で８匹のうち）を括弧に入れて示す。ポジティブコントロールのＵＥＡ１のみかけのサブユニット分子量は、３４．７ｋＤａであった。
【０１０１】
【表１１】
0005072159.tif 000012
【０１０２】
【表１２】
0005072159.tif 000013
（内部器官および血液におけるレクチンの検出）  鋭敏な化学発光ウェスタンブロットアッセイを用いて、レクチン取り込みを決定した。３つ全てのレクチンについて、肝臓および腎臓への取り込みを測定した（表１３、図２０および２１）。図２０は、腎臓組織において検出されたＵＥＡ１がポジティブコントロールよりより高い分子量で存在することを示す。コントロール腎臓組織とは交差反応性が存在する。しかし、レクチンを投与した動物由来のマウス組織においてさらなるバンドが見える。これらのバンドは、コントロールより高い分子量で存在する。
【０１０３】
レクチンを、投与して１〜２４時間後に肝臓組織において検出した。しかし、反応性バンドのＭＷは、予測したサブユニットＭＷよりかなり高かった。実際に、３つのレクチンのうちいずれも、予測したサブユニットＭＷで内部器官において検出されなかった。レクチン取り込みの程度の指標を得るために、サンドイッチＥＬＩＳＡを設定して、ＷＧＡを定量した。このことは、腸および内部器官におけるレクチンの測定を可能にした（表１３）。レクチンは、送達して６時間までの間、投与したレクチンのおよそのレベルで腸ホモジネートにおいて検出された。２４時間では、ホモジネート中にレクチンは検出されなかった。内部器官のうち、最高レベルのレクチンは、肝臓組織において検出された。この部位でのレクチンのレベルは、１〜２４時間まで増加した。しかし、検出されたレクチンの最高量（２８９．３ｎｇ）は、送達した用量のわずかな割合を示した。非常に低レベルのＷＧＡは、血球もしくは血清、または脾臓において検出された。肝臓および腎臓における最高レベルのレクチンの検出は、ウェスタンブロットの結果と一致する。ここで、このレクチンは、肝臓および腎臓組織において検出可能であったが、血液または他の器官においては検出可能でなかった。
【０１０４】
（ネイティブかつ吸収されたレクチンのトリプシンによるタンパク質分解に対する安定性）  ネイティブなレクチンの特性を保持して、吸収されたレクチンが肝臓および腎臓において検出されたか否かを決定するために、ネイティブなおよび組織抽出したＰＨＡ、ＷＧＡおよびＵＥＡ−１を、トリプシンの溶液とともに１時間インキュベートした。３つのレクチン全てが、それらのネイティブな形態でこの酵素に対して非常に安定であった。しかし、肝臓および腎臓組織において検出した改変されたレクチンは、酵素により分解された（図２２）。このことは、肝臓および腎臓における細胞が、タンパク質分解に対して感受性の形態に植物レクチンを改変しうることを示す。これは、消化管において残存し、かつ吸収される、消化された植物レクチンの分解についての機構であり得る。
【０１０５】
表１３は、０．１ｍｌのＰＢＳ中の１ｍｇのレクチン（１回の用量）を用いたマウス群（ｎ＝８）の経口胃管栄養法後の、組織におけるＷＧＡの検出を示す。このレクチンを、定量的サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定し、そしてデータを器官あたりまたは血液１ｍｌあたりのμｇレクチンとしてあらわす。
【０１０６】
【表１３】
0005072159.tif 000014
【０１０７】
【表１４】
0005072159.tif 000015
【０１０８】
【表１５】
0005072159.tif 000016
【０１０９】
【表１６】
0005072159.tif 000017
【０１１０】
【表１７】
0005072159.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、４回の免疫原の鼻内投与の後のマウスの鼻気管洗浄液において測定された総ＩｇＡレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図２】  図２Ａ−Ｄは、植物レクチンのアジュバント効果を示すプロットである。鼻内免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ抗体力価。図２Ａ、１回の投与の後の血清ＩｇＧ力価（１３日目）。図２Ｂ、２回の投与の後の血清ＩｇＧ力価（２７日目）。図２Ｃ、３回投与の後の血清ＩｇＧ力価（４１日目）。図２Ｄ、最後の投与の後の血清ＩｇＧ力価（５６日目）。
【図３】  図３は、鼻内免疫したマウスにおいて測定したＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ１抗体力価を示すプロットである。
【図４】  図４Ａ−Ｄは、鼻内免疫したマウスの分泌物において測定されたＯＶＡ特異的ＩｇＡ抗体力価を示すプロットである。図４Ａ、唾液；図４Ｂ、膣洗浄液；図４Ｃ、鼻気管洗浄液；図４Ｄ、腸洗浄液。
【図５】  図５Ａ−Ｆは、鼻内免疫したマウスにおいて測定したＣＴ／植物レクチン特異的血清ＩｇＧ抗体力価である。図５、ＣＴ；図５Ｂ、ＬＥＡ；図５Ｄ、ＰＨＡ；図５Ｅ、ＷＧＡ；図５Ｆ、ＵＥＡ−Ｉ。
【図６】  図６Ａ−Ｄは、鼻内免疫したまうすからのｇＤ２特異的血清ＩｇＧ抗体力価を示すプロットである。図６Ａ、１４日目；図６Ｂ、２８日目；図６Ｃ、４１日目；図６Ｄ、５５日目。
【図７】  図７Ａ−Ｄは、ｇＤ２特異的血清ＩｇＧサブクラス抗体力価を示すプロットである。図７Ａ，ＩｇＧ１；図７Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図７Ｃ、ＩｇＧ２ｂ；図７Ｄ、ＩｇＧ３。
【図８】  図８Ａ−Ｄは、分泌物において測定したｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価を示すプロットである。図８Ａ、唾液；図８Ｂ、膣洗浄液；図８Ｃ、鼻気管洗浄液；図８Ｄ、腸洗浄液。
【図９】  図９は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ５（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−Ｉ、ニグリンＢ、塩基性ニグリンＢ、エブリンｒ１、ＳＮＡＩＩまたはＳＥＬｆｄとともに用いて鼻内免疫したマウスからのｇＤ２特異的総血清ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスの力価である。図９Ａ，ＩｇＧ；図９Ｂ、ＩｇＧ１；図９Ｃ、ＩｇＧ２ａ；図９Ｄ、ＩｇＧ２ｂ。
【図１０】  図１０は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ５（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−Ｉ、ニグリンＢ、塩基性ニグリンＢ、エブリンｒ１、ＳＮＡＩＩまたはＳＥＬｆｄとともに用いて鼻内免疫したマウスからのｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価である。図１０Ａ、唾液；図１０Ｂ、膣洗浄液；図１０Ｃ、鼻気管洗浄液；図１０Ｄ、腸洗浄液。
【図１１】  図１１は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ２（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−ＩまたはＵＥＡ−１とともに用いて鼻内免疫したマウスにおいて測定されるｇＤ２特異的血清ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体力価である。図１１Ａ、血清ＩｇＡ；図１１Ｂ、血清ＩｇＧ。
【図１２】  図１２は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ２（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−ＩまたはＵＥＡ−１とともに用いて鼻内免疫したマウスにおいて測定されるｇＤ２特異的ＩｇＧサブクラス抗体力価である。図１２Ａ，ＩｇＧ１；図１２Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図１２Ｃ、ＩｇＧ２ｂ。
【図１３】  図１３は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ２（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−ＩまたはＵＥＡ−１とともに用いて鼻内免疫したマウスにおいて測定されるｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価である。図１３Ａ、唾液；図１３Ｂ、膣洗浄液；図１３Ｃ、腸洗浄液；図１３Ｄ、鼻気管洗浄液。
【図１４】  図１４は、ＩＬ−５、ＩＬ−４およびＩＦＮ産生の平均濃度およびＴ細胞増殖アッセイについて１分当たりの計数である。図１４Ａ、脾臓細胞おけるＩＬ−５産生；図１４Ｃ、脾臓細胞におけるＩＬ−４産生；図１４Ｅ、脾臓細胞におけるＩＦＮ産生；図１４Ｂ、頸部リンパ節におけるＩＬ−５産生；図１４Ｄ、頸部リンパ節におけるＩＬ−４産生；図１４Ｆ、頸部リンパ節におけるＩＦＮ産生；図１４Ｇ、脾臓細胞におけるＴ細胞増殖。応答は、ｇＤ２、ＭＬＩもしくはＵＥＡ−１で、またはｇＤ２＋ＭＬＩ、ＵＥＡ−ＩまたはＬＴＫ６３での３回免疫（０日目、２１日目、４２日目）の後第８週において測定した。脾臓細胞および頸部リンパ節細胞を単離し、そしてｇＤ２（０μｇ、１μｇまたは５μｇ）またはラテックスビーズと結合させたｇＤ２（１：１０００または１：５０００希釈）またはＰＭＡ／ｃｄ３でインビトロ刺激した。
【図１５】  図１５は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独またはＯＶＡ（５ｍｇ）とともにＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）もしくはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）のいずれかで、１日目、１４日目、２８日目および４９日目に胃管栄養により免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ抗体力価である。図１５Ａ、１回用量後（１３日目）の血清ＩｇＧ力価；図１５Ｂ、２回用量後の血清ＩｇＧ力価（２７日目）；図１５Ｃ、３回用量後の血清ＩｇＧ力価（４８日目）；図１５Ｄ、最終用量後の血清ＩｇＧ力価（６２日目）。
【図１６】  図１６は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独またはＯＶＡ（５ｍｇ）とともにＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）もしくはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）のいずれかで、１日目、１４日目、２８日目および４９日目に胃管栄養により免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧサブクラスおよびＩｇＡ抗体力価である。図１６Ａ，ＩｇＧ１；図１６Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図１６Ｃ、ＩｇＧ２ｎ；図１６Ｄ、ＩｇＧ３。
【図１７】  図１７は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独またはＯＶＡ（５ｍｇ）とともにＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）もしくはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）のいずれかで、１日目、１４日目、２８日目および４９日目に胃管栄養により免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＡ抗体力価である。図１７Ａ、唾液；図１７Ｂ、膣洗浄液；図１７Ｃ、鼻気管洗浄液；図１７Ｄ、腸洗浄液。
【図１８】  図１８は、１ｍｇのＷＧＡの単回用量で胃管洗浄した後６時間でのマウスから収集された腸ホモジネートにおけるＷＧＡを示すウェスタンブロットである。
【図１９】  図１９は、１ｍｇのＰＨＡの単回用量で胃管洗浄した後１時間でのマウスから収集された胃および小腸のホモジナイズした洗浄液のウェスタンブロットである。
【図２０】  図２０は、１ｍｇのＵＥＡ−１の単回用量で胃管洗浄した後２４時間でのマウスから収集された抽出されたマウス腎臓組織おけるＵＥＡ１を示すウェスタンブロットである。
【図２１】  図２１は、１ｍｇのＷＧＡの単回用量で胃管洗浄した後２４時間でのマウスから収集されたマウス肝臓組織におけるＷＧＡを示すウェスタンブロットである。
【図２２】  図２２は、トリプシンによる分解に対する、ネイティブおよび腎臓抽出されたＵＥＡ−１の感受性を示すウェスタンブロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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