(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブと結合性を有し、かつ複数の濃度勾配を有する断片を含む濃度勾配スポット部と、前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本を設置するための標本設置部とを有する基板。
【請求項２】
前記プローブが、核酸、タンパク質、抗原、抗体、ペプチドからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１記載の基板。
【請求項３】
前記プローブが、核酸である請求項１又は２記載の基板。
【請求項４】
前記濃度勾配スポット部が、複数の列で構成されている請求項１記載の基板。
【請求項５】
前記複数の列のうち、一方がセンス鎖、他方がアンチセンス鎖で構成される請求項４記載の基板。
【請求項６】
基板が、ガラスである請求項１〜５項のいずれか１項記載の基板。
【請求項７】
前記標本が、調査したい臓器、組織、器官、細胞、器官系、細胞群からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜６項のいずれか１項記載の基板。
【請求項８】
前記標的物質が、タンパク質、抗原、抗体、核酸からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜７項のいずれか１項記載の基板。
【請求項９】
前記標的物質が、ＭＭＰ、Ｐ５３、カドヘリン、β−カテニン、ｒａｓ、ＶＥＧＦ、ＮＦκＢからなる群から選択される少なくとも１種由来の分子である請求項８記載の基板。
【請求項１０】
プローブと結合性を有し、かつ複数の濃度勾配を有する断片を含む濃度勾配スポット部と、前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本とを設置した基板を用い、前記断片とプローブとをアフィニティー相互作用させることにより得られた濃度と強度の検量線に基づき、前記標本中に存在する前記標的物質を定量することを特徴とする標的物質の定量方法。
【請求項１１】
前記標的物質の定量を、レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、又は蛍光検出器により行う請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
標本が、調査したい臓器、組織、器官、細胞、器官系、細胞群からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
前記標的物質が、タンパク質、抗原、抗体、核酸からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜７項のいずれか１項に記載の基板を用いる請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜９項のいずれか１項に記載の基板を用いて、プローブを、前記複数の濃度勾配を有する断片とアフィニティー相互作用させることにより得られた濃度と強度との検量線を作成し、当該検量線に基づき、前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本中に存在する前記標的物質を定量することを特徴とする標的物質の定量方法。
【請求項１５】
前記プローブと、前記複数の濃度勾配を有する断片及び前記標的物質と、のアフィニティー相互作用を、一体として行う請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、基板、及び遺伝子転写産物など標的物質の定量方法に関し、特に、アフィニティー相互作用を利用した標的物質の定量に用いることが可能な基板、及び定量方法に関する。
【背景技術】  一般的に、遺伝子発現の従来解析として、ノーザンブロット、スロットおよびドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクション定量法、ＲＴ−ＰＣＲなどを挙げることができる。また、一定のアフィニティー相互作用を利用した同定法として、免疫スクリーニング法なども採用されている。
さらに、組織学的および細胞学的試料についてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＩＳＨともいう）は、ＲＮＡ発現の研究や正常および疾病状態における特異的遺伝子の役割を認識するための有益な手段である。
このような例として、細胞内のｍＲＮＡを定量するためのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法がある（特表２００１−５０９６６２）。この方法は、Ａ．少なくとも１つの基材上で、２以上の物理的に区別される細胞の試料を培養し、Ｂ．該細胞の細胞形態内に核酸を保存し保持する固定液と該細胞とを接触させ、Ｃ．それにより、標識化核酸プローブが形態学的に無傷の細胞を透過し、標的核酸配列とハイブリダイズする条件下で、該標識化核酸プローブに固定された細胞を暴露し、ついで、Ｄ．該標的核酸配列にハイブリダイズする該プローブの量を検出する、工程を含むことを特徴とする、形態学的に無傷の細胞において、標的核酸配列の量を定量することを特徴とする。
【特許文献１】特表２００１−５０９６６２
【発明の開示】
しかしながら、上記ノーザンブロット、スロットおよびドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクション定量法、ＲＴ−ＰＣＲなどの技術の各々は、ｍＲＮＡ発現レベルの変化を調べるための扱いにくいプロトコルがあり、定量性の欠如、低感受性および不適切な再現性の欠点を有している。さらに、これらのアプローチの各々には、解析前に標的ｍＲＮＡプールの単離と操作を必要とする。これらの要因は、試料処理量を厳格に限り、解析時間を増加させ、信頼性を減少させるという問題点を有する。
また、上述のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法においては、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロトコルの最新の利用は、多数の遺伝子の調査において、その有効性が限られるという技術的短所を欠点として有している。
上記ＰＣＲは、出発材料がもっとも少量で核酸検出が可能な方法であり、細胞一個一個のレベルでも任意の遺伝子の発現の有無を知る感度を備えている方法であるが、遺伝子産物、転写産物等の量的な比較は通常の方法では難しかった。すなわち、上記特表２００１−５０９６６２などに記載の方法を含め、遺伝子産物、転写産物の定量化の試みはいくつか報告されているが、いずれも相対的な定量方法であって、転写産物が何コピーあるか、遺伝子産物がいくつ存在するかという絶対的な定量方法には程遠かった。さらに、上述の内容は、核酸の定量に用いられることがほとんどであり、核酸のみならず、タンパク質など総合的な標的物質の定量を、絶対的に行う方法が望まれていた。
そこで、本発明の目的は、細胞レベルで絶対量として標的物質を定量することを可能とする基板、及び当該定量方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
上記目的を達成するために、発明者らは、アフィニティー相互作用について着目し、鋭意研究を重ねた結果、本発明の基板、及び定量方法を見出すに至った。
すなわち、本発明の基板は、プローブと結合性を有し、かつ複数の濃度勾配を有する断片を含む濃度勾配スポット部と、前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本を設置するための標本設置部とを有することを特徴とする。
また、本発明の基板の好ましい実施態様において、前記プローブが、核酸、タンパク質、抗原、抗体、ペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
また、本発明の基板の好ましい実施態様において、前記プローブが、核酸であることを特徴とする。
また、本発明の基板の好ましい実施態様において、前記濃度勾配スポット部が、複数の列で構成されていることを特徴とする。
また、本発明の基板の好ましい実施態様において、前記複数の列のうち、一方がセンス鎖、他方がアンチセンス鎖で構成されることを特徴とする。
また、本発明の基板の好ましい実施態様において、基板が、ガラスであることを特徴とする。
また、本発明の基板の好ましい実施態様において、前記標本が、調査したい臓器、組織、器官、細胞、器官系、細胞群からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
また、本発明の基板の好ましい実施態様において、前記標的物質が、タンパク質、抗原、抗体、核酸からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
また、本発明の基板の好ましい実施態様において、標的物質が、ＭＭＰ、Ｐ５３、Ｋｉ−６７、ＡＰＣ、ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＩＮＫ４ａ、ｐ１４、カドヘリン、β−カテニン、ｒａｓ、ＶＥＧＦ、ＮＦκＢからなる群から選択される少なくとも１種由来の転写産物であることを特徴とする。
また、本発明の標的物質の定量方法は、プローブと結合性を有し、かつ複数の濃度勾配を有する断片と、当該断片と前記プローブとをアフィニティー相互作用させることにより得られた濃度と強度の検量線に基づき、前記標識プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本中に存在する前記標的物質を定量することを特徴とする。
また、本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、前記標的物質の定量を、レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、又は蛍光検出器により行うことを特徴とする。
また、本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、標本が、調査したい臓器、組織、器官、細胞、器官系、細胞群からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
また、本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、前記標的物質が、タンパク質、抗原、抗体、ペプチド、核酸からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
また本発明の標的物質の定量方法の別の側面において、上記本発明の基板を用いて、プローブと、前記複数の濃度勾配を有する断片とアフィニティー相互作用させることにより得られた濃度と強度との検量線を作成し、当該検量線に基づき、前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本中に存在する前記標的物質を定量することを特徴とする。
また、本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、前記プローブと、前記複数の濃度勾配を有する断片及び前記標的物質とのアフィニティー相互作用を、一体として行うことを特徴とする。
発明の効果
本発明の定量法によれば、細胞一個一個のレベルで、遺伝子産物の定量化が可能であるという有利な効果を奏する。癌組織では、すべての癌細胞が均一ではなく、形態や転移性などの性質を含めて多様性があるものとされている。その多様性は、すべて、遺伝子発現の多様性により規定されていると考えられるため、細胞一個一個のレベルで転写産物を同定できることは大変意義深い。
また、本発明によれば、標本一枚一枚について絶対的な定量化を行うことから、従来の相対的な定量化では難しかった過去の標本における「数値」との比較も可能となるという有利な効果を奏する。これまでは、実験ごとの条件の差により、同じ標本でも得られた蛍光強度が異なるために、過去のデータとの比較は困難であった。本発明の方法によれば、細胞一個につき何コピーの転写産物が含まれるかが数値として同定できるため、時間軸を超えて過去のデータとの絶対的比較も可能となる。
すなわち、従来型の相対的な定量方法においては、１回１回の実験により、実験条件が微妙に異なるので、複数回の実験結果を比較することができない。是に対して、本発明の標的物質の定量方法においては、一枚一枚の標本について検量線（標準曲線）を作成して、絶対量が定量化することができるので、実験条件のばらつきの問題も克服することができる。
【図面の簡単な説明】図１は、ラット精巣におけるａｎｔｉｓｅｎｓｅプローブ（ａ）、ｓｅｎｓｅプローブ（ｂ）を用いたＩＳＨでの２８Ｓ  ｒＲＮＡの検出（写真）を示す。ｂａｒは（１ａ）で１．０ｍｍ、（１ｂ）で０．２ｍｍ。
図２は、ラット精細管におけるａｎｔｉｓｅｎｓｅプローブを用いたＩＳＨでの２８Ｓ  ｒＲＮＡの検出（ａ，ｃ）。それぞれを５段階に分けて表示した画像（ｂ，ｄ）（写真）を示す。ｂａｒは０．１ｍｍ。
図３は、シグナルの定量化を示す。図３ａは、ｒＲＮＡのＩＳＨの結果を示す。ＴＳＡ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎで蛍光発色した。赤線で囲った細胞一個について蛍光強度を測定した。図３ｂは赤線で囲った細胞を抜き出して強拡大にしたものであり、細胞内の蛍光強度は不均一であることが判る。図３ｃのヒストグラムは、横軸にｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（０〜２５５）を縦軸にａｂｓｏｌｕｔｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙを取って表した。図３ｃの下の表で表すように、各ｉｎｔｅｎｓｉｔｙについてｆｒｅｑｕｅｃｎｙを求め赤線で囲んだ範囲すべてを加算した。ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ１２３は、２５ｐｉｘｅｌのｆｒｅｑｕｅｎｃｙがあることが判る。測定条件は以下のようである。アルゴンレーザー；波長４８８ｎｍフィルター；ＢＰ５０５−５５００ｐｔｉｃａｌ  Ｓｌｉｃｅ；１．８μｍＰｉｘｅｌ  ｄｅｐｔｈ；８ｂｉｔ（０−２５５）。
図４は、ラット精巣でのｔｙｒａｍｉｄｅ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを用いたＩＳＨでの２８Ｓ  ｒＲＮＡの検出（写真）を示す。ａｎｔｉｓｅｎｓｅプローブ（ａ）、ｓｅｎｓｅプローブ（ｂ）。
図５は、ラットの精子形成細胞で検出された２８Ｓ  ｒＲＮＡの定量解析を示す。縦軸は相対的な蛍光強度として発現されたｒＲＮＡの量、すなわちピクセル強度を示している。細胞の発生過程は左から右へ横軸に示している。Ｐ−Ｉはｓｔａｇｅｌでパキテン期の精母細胞を示している。アラビア数字は精子細胞の分化の段階を示している。
図６は、本発明の基板の１実施態様を示す。
図７は、オリゴヌクレオチドにｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを直接ラベルし、種々の濃度（１ｐｍｏｌ／μｌ、５ｐｍｏｌ／μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ、５０ｐｍｏｌ／μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌ）でスライドガラス上にスポットし、マイクロアレイスキャナーで、蛍光強度を計測し、棒グラフにした。スライドガラス上で、スポットの蛍光強度の差が数値として検出できることを示す。さらに、オリゴヌクレオチドの濃度が高くなればなるほど、蛍光強度が大きくなることを示す。
図８は、複数の濃度勾配を有するオリゴヌクレオチド断片と、標識プローブとのアフィニティー相互作用によって得られた標識強度と濃度との相関関係を示す。Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙとは、各スポットの測定範囲の測定画素数（ｐｉｘｅｌ）を示す。４つのスポットは、すべて同じ面積である２２０９ｐｉｘｅｌの正円形の範囲で蛍光強度が測定された。各ｐｉｘｅｌにおける蛍光強度（０〜２５５）を測定し、２２０９ｐｉｘｅｌについてすべて加算した値が、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｘ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙの値となる。１．０μＭのスポットの蛍光強度は、１．０μＭの蛍光強度から０μＭの蛍光強度を引いた値８２０４２−３４４５９＝４７５８３とした（表の右端のカラム）。２．０μＭ、５．０μＭのスポットについても同様に計算し、棒グラフとした。１．０μＭスポットについて計算を進める。１．０μＭスポットの２２０９ｐｉｘｅｌの蛍光強度の平均値は、１ｐｘｅｌあたり４７５８３／２２０９＝２１．５４０５となる、１．０μＭのオリゴヌクレオチドが、２２０９ｐｉｘｅｌの範囲にスポットされているので、１．０μＭ／２２０９＝０．０００４５２６μＭ＝０．４５２６ｎＭ＝４５３ｐＭ／ｐｉｘｅｌとなる。従って、２１．５４０５／ｐｉｘｅｌの蛍光強度は、４５３ｐＭ／ｐｉｘｅｌの濃度の標的オリゴヌクレオチドの蛍光強度であると類推できる。
図９は、スポットの蛍光像（写真）を示す。
図１０Ａは、スポットの各蛍光像（写真）について、蛍光強度を計算によって求めるため、定量化範囲を選択した（赤色の線で囲んだ範囲）。図１０Ａは、ブランクである０μＭのオリゴヌクレオチド・スポットの解析範囲を示す。
図１０Ｂは、１μＭ、のオリゴヌクレオチド・スポットの解析範囲（写真）を示す。
図１０Ｃは、２μＭ、オリゴヌクレオチド・スポットの解析範囲（写真）を示す。
図１０Ｄは、５μＭのオリゴヌクレオチド・スポットの解析範囲（写真）を示す。
各スポットの左隣には、陰性対照であるアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドが同じ濃度でスポットされている。これらはブランクではなく、実験が正しく行われていれば、ａｎｔｉｓｅｎｓｅの標識プローブに対して、あらゆる濃度のａｎｔｉｓｅｎｓｅのスポットはアフィニティー相互作用を示さない。図６の基板の実施形態により濃度勾配スライドを作成した。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の基板は、プローブと結合性を有し、かつ複数の濃度勾配を有する断片を含む濃度勾配スポット部と、前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本を設置するための標本設置部とを有する。複数の濃度勾配を有する断片を含む濃度勾配スポット部は、主として、標本中の標的物質を定量するために機能する。すなわち、この濃度勾配スポット部を利用して、蛍光標識などを使用した標識プローブと種々の濃度勾配を有する断片とをアフィニティー相互作用（プローブが核酸であれば、ハイブリダイゼーション）させることにより、濃度と標識による強度との相関関係を得ることができるので、当該相関関係から、以下に述べるように極めて厳密に標的物質の絶対的定量が可能となる。
濃度勾配は、使用目的、及び用途に応じて、適宜試験者が設定することができる。本基板を標的物質の定量に用いる場合には、標的物質の濃度範囲を包括して含まれるように濃度勾配を設定することが必要である。標的物質の濃度が未知である場合、十分広範な範囲の濃度勾配スポットを準備する必要がある。
ここで「プローブ」（探索子）とは、広義の意味で使用する。通常、核酸から成るものを意味するが、例えば、免疫スクリーニング法などにおいて、使用される抗体、抗原などもプローブに含めて広義に解釈する。つまり、プローブとは、断片又は標的物質と、一定の条件下で可逆的にアフィニティー相互作用するものであれば、特に限定されない。例えば、このような組み合わせ、すなわち、プローブ−断片又は標的物質とアフィニティー相互作用する物質（結合性を有する物質）を例示すれば、酵素−基質、助酵素（補酵素）−酵素、抗原−抗体、リガンド−レセプター、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ、ＰＮＡ−ＲＮＡなど多数挙げることができる。本発明において、これらを使用目的、用途に応じて適宜選択することができる。
また、プローブとして核酸を用いた場合に、具体的に説明すると以下のようである。
例えば、濃度勾配スポット部の核酸は合成オリゴヌクレオチド、天然由来のオリゴヌクレオチドなど種々のものを用いることができる。化学合成したＲＮＡ鎖を使うことも可能である。通常、ＤＮＡの場合、合成できるのは、１２０ｂａｓｅ程度まで、ＲＮＡの場合もっと短くなるので、この範囲のプローブを用いることが可能である。もし、それより長いものをスポットするには、自前のｔｅｍｐｌａｔｅから、ＲＮＡを酵素反応によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎするか、ＤＮＡの場合は、プラスミドの形で増やして、制限酵素で断片を直線化することにより、行うことができる。
化学合成するのも、また酵素で切り出したり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎする際に使う、ｔｅｍｐｌａｔｅも、プローブをＤＩＧラベリングする際につかうｔｅｍｐｌａｔｅそのものを使用する場合が多いので、スポット部に使用する核酸などの断片と標識プローブとは、同一であることが原則である。この範囲のプローブを用いることが可能である。ただし、同一といっても、ＲＮＡの場合、合成オリゴヌクレオチドの場合は、ｓｅｎｓｅ、ａｎｔｉｓｅｎｓｅの違いがあるので、同一とは、厳密には「相補的」を意味する。また、２本鎖ＤＮＡの場合は、ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎして、１本鎖にする必要がある。
敢えて、異なった配列を合成し、スポットすると言うケースが想定されるのは、例えば、プローブにしている分子Ａと、ｈｏｍｏｌｏｇｙのある分子を探す目的で、ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙを下げて、ハイブリダイズするケースであるが、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、そのようなケースは稀である。
したがって、本発明においては、スポットに使用する断片と（標識）プローブとは、原則的に同一、または相補的な配列をもったもの、または、一部配列が異なっているものでも適応することができる。
そして、プローブと結合性を有する断片又は標的物質とは、上述の組み合わせに記載したように、プローブが酵素であれば、断片又は標的物質は基質、プローブが抗体であれば、断片又は標的物質は抗原タンパク質又は抗原ペプチド、プローブが、ＲＮＡであれば、断片又は標的物質は、ＲＮＡ、ＤＮＡ（一本鎖に解いたもの）などを挙げることができる。好適には、前記プローブが、核酸、タンパク質、抗原、抗体、リガンド、レセプター、酵素、基質、補酵素からなる群から選択される少なくとも１種である。プローブが、核酸であれば、標本からの組織切片などに含まれる転写産物の定量が可能となる。すなわち、もしプローブとして、ＲＮＡを用いれば、その標的転写産物の定量が可能となる。例えば、標的転写産物としては、ＭＭＰ、Ｐ５３抑制癌遺伝子、Ｋｉ−６７、ＡＰＣ、ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＩＮＫ４ａ、ｐ１４、カドヘリン、β−カテニン、ｒａｓ、ＶＥＧＦ、ＮＦκＢからなる群から選択される少なくとも１種由来の転写産物などを挙げることができる。
また、転写産物とは、ｍＲＮＡはもちろんのこと、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡもすべて含むという意味である。さらに言えば、ｍａｔｕｒｅｄ  ＲＮＡが形成される前の、いわゆるイントロンの部分も付いたプロセッシングされるまえのものをも包含する。特に、ｒＲＮＡを陽性のプローブとして使用すれば、ｐｏｌｙ  Ａなどと同様に、ほぼすべての細胞種で大量に検出できるという観点から、好適である。
以上、核酸を主として説明したが、スポットに用いる断片は、核酸ではなく、合成タンパク質、合成ペプチドを使ってもよい。この場合、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、免疫組織化学染色にすれば、組織中で検出できる蛋白質抗原の定量化も可能である。
また、標的物質としては、ＭＭＰ、Ｐ５３抑制癌遺伝子、Ｋｉ−６７、ＡＰＣ、ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＩＮＫ４ａ、ｐ１４、カドヘリン、β−カテニン、ｒａｓ、ＶＥＧＦ、ＮＦκＢからなる群から選択される少なくとも１種の分子（上記転写産物のほか、当該分子由来のタンパク質等を含め）を挙げることができる。
ここで、標本とは、特に限定されるものではなく、例えば、調査したい臓器、組織、器官、細胞、器官系、細胞群などの切片はもちろん、動物、植物個体そのものでもよい。例えば、細菌、カビなど比較的小さいものから、マウス一匹のほか、植物をも含まれる。植物としては、例えば果物や、稲、麦などの農業生産物などを挙げることができる。標本設置部は、上記標本をある程度固定化させるためのものである。本発明の基板においては、このように、濃度勾配スポット部と、標本設置部とを有しているが、当該基板を定量方法に用いた場合に、これ濃度勾配スポット部及び標本設置部とが同一面（平面である必要はない）上にあれば、後述するように、断片及び標的物質の、（標識）プローブとの反応を、ほぼ同一の反応条件下で行うことができ、より精密な絶対的定量を確実にすることができる。
また、本発明の基板の実施態様において、前記濃度勾配スポット部が、複数の列で構成されている。複数列で構成されていると、より精密な定量を可能とする。このような列として、実験系が正常に動作していることをより正確に確認するという観点から、例えば、前記複数の列のうち、一方がセンス鎖、他方がアンチセンス鎖で構成されることが、好ましい。この場合、アンチセンス鎖のプローブについては、アンチセンス鎖のスポットでは、濃度が高いところでも蛍光強度は限りなくゼロに近くなる。
基板自体についても特に限定されず、例えば、チタン製などの金属製、ガラス製、プラスチック製のもの、シラン処理されたものなど、細胞接着作用を有するものを挙げることができる。例えば、アミノシランは、ガラス表面のＯＨ基と共有結合によりコート膜が形成され、ガラス表面に化学的に安定なアミノ基による正電荷が付与される。その正電荷により組織切片や細胞を強力に接着させることができる。シラン処理のほか、ＭＡＳコート、ポリーＬ−リジン・コートなどを使用することができる。細胞標本の微細形態を蛍光顕微鏡で観察する場合に、なるべく蛍光が散乱しない基板を用いるという観点から、基板としては、ガラスを挙げることができる。
次に、本発明の標的物質の定量方法について説明する。
すなわち、本発明の標的物質の定量方法は、複数の濃度勾配を有する断片と、当該断片と標識プローブとをアフィニティー相互作用させることにより得られた濃度と強度の検量線に基づき、前記標識プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本中に存在する前記標的物質を定量する。
ここで、「複数の濃度勾配を有する断片」、「標的物質」、「標本」など定量方法で用いられる用語の定義、説明については、上記の本発明の基板において説明したものをそのまま本定量方法において用いることができる。
プローブと、複数の濃度勾配を有する断片とは、両者がアフィニティ相互作用することが前提となる。（標識）プローブと複数の濃度勾配を有する断片との例については、上述したとおり、すなわち、例えば、酵素−基質、助酵素−酵素、抗原−抗体、リガンド−レセプター、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ、ＰＮＡ−ＲＮＡなど多数挙げることができる。
標識プローブとは、プローブを標識化したものであり適当な標識物質などを用いて、標識化することができ、特に限定されることはない。標識物質としては、フルオレセイン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、アイソトープ、Ｃｙ３、Ｃｙ５などの蛍光物質を挙げることができる。その後の最終的な蛍光発色として、ローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５４６等を用いることができる。
また、本発明の標的物質の定量方法において、好適には、前記標的物質の定量を、レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、又は蛍光検出器により行う。このような定量をレーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、又は蛍光検出器により行うことで、必ずしもアイソトープを使用する必要がなく、低コスト化を達成し、例えば、病院などにおいても利用することが可能である。また、これらを最終的に用いることにより、定量化される細胞が、組織上のどの位置に存在する細胞であるかといった２次元位置情報を含めたデータを得ることができる点、有利である。これは、病理標本の診断においても使用することができる。
また、本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、標本が、調査したい臓器、組織、器官、細胞、器官系、細胞群からなる群から選択される少なくとも１種を挙げる。これらの標本に関する説明等についても、上記本発明の基板における説明を参照することができる。また、好ましい実施態様において、前記標的物質が、タンパク質、抗原、抗体、ペプチド、核酸、標的転写産物からなる群から選択される少なくとも１種である。標的物質についても、上述の本発明の基板において説明したものをそのまま適用することができる。
本発明の標的物質の定量方法の別の側面において、上記本発明の基板を用いて、標識プローブを、前記複数の濃度勾配を有するプローブとアフィニティー相互作用させることにより得られた濃度と強度との検量線を作成し、当該検量線に基づき、前記標識プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本中に存在する前記標的物質を定量することができる。「本発明の基板」については、上記説明を参照されたい。本発明の基板を使用すること以外は、上記本発明の標的物質の定量方法における説明をそのまま適用することができる。
好ましい実施態様において、前記標識プローブと、前記複数の濃度勾配を有する断片、及び前記標的物質とのアフィニティ相互作用（核酸の場合には、ハイブリダイゼーション）を、一体として行うことができる。このように一体として行うことにより、ほぼ同一の条件下で、検量線用のアフィニティー相互作用と、標的物質と標識プローブとのアフィニティー相互作用とを行うことができ、これによって、より精密な定量を実現する。
また、上述のように本発明の基板を標的物質の定量方法に用いた場合には、例えば、核酸をプローブとして用いた場合、ハイブリダイズの条件を揃えることが大変難しいので、スポット部と組織を同じ条件で、ハイブリダイズし、同じ条件で、共焦点レーザー顕微鏡でみることが、より正確な定量を行う観点から望ましい。というのは、顕微鏡の方の調節も揃えるのは簡単ではないことに加え、レーザーは、日に日に、その明るさを減じていくので、厳密には、同日同時刻に観察することが条件を一定にするという観点から望ましいからである。
以上、プローブとして核酸を用いた場合の例を挙げて、本発明の標的物質の定量方法の一実施態様を説明すると以下のようである。
（１）まず、予め調査したい遺伝子（ここでは遺伝子Ａとする）の遺伝子配列（ｃＤＮＡ配列）のうち、一部分、概ね２０〜５０ｂａｓｅの長さのもの（他の遺伝子と相同性のない、特異性の高い部分）を化学合成し、種々濃度で、スライドガラスにスポットする。これを濃度勾配スポット部と呼ぶことができる。
（２）濃度勾配スポットの近傍に、組織標本を貼り付ける。その組織標本と、スポットを一体として、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションする。通常のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、組織標本に対して行う。通常のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、細胞一個一個についで、遺伝子Ａを検出ためのプローブにハイブリする標的遺伝子（ここでは通常、遺伝子Ａのみ）の発現の有無、つまり、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの有無を検出し、ｍＲＮＡ（転写産物）が多い場合は濃く染まり、少ない場合は薄く染まるようになっている。
（３）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの遺伝子発現の有無を検出する最後の発色を、蛍光発色に変更し、たとえば、共焦点レーザー顕微鏡で、その蛍光強度を測定することで、一つ一つの細胞ごと、あるいはデジタル情報測定の最小単位（いわゆるドット）ごとの、強度を数値として得ることが出来る。
（４）同じ操作をスポットについて行えば、各スポットごとの強度も得ることが出来、そのスポットは予め濃度（つまり、何本の合成した遺伝子が、そのスポットに存在するか）が判るので、細胞一個一個あたり、あるいは、その細胞の中のドットあたりの、存在する標的遺伝子の数（絶対量）が判明する。
【実施例】  以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
実施例１
以前の基礎研究から、ブアン固定液で固定し、ＤＩＧ標識プローブでハイブリさせた標本（図１−１ａ）の取得画像を“ｐｏｓｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ”することにより、簡単にＩＳＨシグナル強度の定量化の解析を行うことができた（図２）。
プローブとハイブリしたｒＲＮＡの量は初期の第１次精母細胞で最も多く、以後パキテン期の第１次精母細胞、そしてディプロテン期の精母細胞、終期の第２次精母細胞、精子細胞と続く。減数分裂の中期、後期、終期、そして初期のｓｔｅｐ１精子細胞で最低レベルに達し、そして精子形成の間でわずかに増加した。ＩＳＨでｒＲＮＡを染色することは、組織切片におけるｍＲＮＡの定量的解析やハイブリできるＲＮＡ量を評価するのに有効なパラメーターであった。
そこで、本実験において、まず、ＩＳＨシグナルの定量的解析にはｔｙｒａｍｉｄｅ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｊａｐａｎ）を用いて蛍光顕微鏡によるシグナル検出を行った。
今回のモデル実験では、パラフィン切片上でハイブリダイズする標的ＲＮＡとしてｒＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）を選んだ。
《Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ》
組織標本の作製
Ａｄｕｌｔの雄性Ｗｉｓｔａｒラット（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ：Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）に１３０ＩＵ／ｋｇのヘパリンを腹腔内に投与し、その後ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。１５分後、ブアン固定液（３７５ｍｌ飽和ピクリン酸、１２５ｍｌ  ３７％ｗ／ｗホルムアルデヒド、２５ｍｌ氷酢酸）で左心室から灌流固定した。精巣を注意深くはずし、同じ固定液（ブアン固定液）で６時間以上浸漬固定した。標本はエタノールで脱水し、ベンゼンで置換し、パラフィンで包埋した。パラフィン切片（５μｍ厚）はシランコートのスライドガラス上に貼布・伸展させた。
プローブの作製
ラットの２８Ｓ  ｒＲＮＡのＤＮＡ配列中、完全に保存された部分（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号＃Ｖ０１２７０；ヌクレオチド番号６０３５−６０６８，５’−ｇｃｃｇｃｃｇｃａｇｇｔｇｃａｇａｔｃｔｔｇｇｔｇｇｔａｇｔａｇｃａ−３’，全３４ｍｅｒ）を、Ｙｏｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）（Ｙｏｓｈｉｉ  Ａ，Ｋｏｊｉ  Ｔ，Ｏｈｓａｗａ  Ｎ，Ｎａｋａｎｅ  ＰＫ（１９９５）．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡｓ  ｉｓ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：３２１−３２７．）によって以前報告されたｒＲＮＡの検出に用いた。上記の２８Ｓ  ｒＲＮＡに対応する相補的なｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは、５’末端をｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎで標識しｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅ（３４−ｍｅｒ）とした。本品はＴａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎに合成を依頼して得た。ここではこれをＤＩＧ  ｐｒｏｂｅと呼ぶことにする。
対照実験として、３４ｍｅｒでランダムな配列の標識していないｐｒｏｂｅやＤＩＧ標識したｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを用いた。
もうひとつ別のＤＩＧ標識ｐｒｏｂｅは、以前我々が報告したｍｕｌｔｉｌａｂｅｌｉｎｇ法（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１）を用いて次のとおりに準備した。ＥｃｏＲ１もしくはＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識部位を突出した終末（全４０−ｍｅｒ）につけたｓｅｎｓｅ（５’ｐ−ａａｔｔｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｇｇｔｇｃａｇａｔｃｔｔｇｇｔｇｇｔａｇｔａｇｃａ−ａ−３’）およびａｎｔｉｓｅｎｓｅ（５’ｐ−ａｇｃｔｔ−ｔｇｃｔａｃｔａｃｃａｃｃａａｇａｔｃｔｇｃａｃｃｔｇｃｇｇｃｇｇｃ−ｇ−３’）の配列をもつｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅで５’末端をリン酸化し、さらにアニールした２本鎖ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを作成した。これは凍結乾燥製品として業者に合成を依頼して得た。これらをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＫＳ（−）に結合させｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＫＳ（−）にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換後、目的とするプラスミドをもつ大腸菌株をサブクローニングし、プラスミドを単離精製した。］サブクローニングした。この操作で得たｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡは、制限酵素ＥｃｏＲＩもしくはＨｉｎｄＩＩＩで線状にでき、これをラベルするｓｅｎｓｅおよびａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｒｉｂｏｐｒｏｂｅの合成のためのｔｅｍｐｌａｔｅ［鋳型］として使った。Ｒｏｃｈｅ社製のＲＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤＩＧ−ＵＴＰ存在下でＲＮＡ合成酵素Ｔ３／Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、ＤＩＧ標識ｒｉｂｏｐｒｏｂｅをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写することにより合成した。ＤＮａｓｅ処理後、生成物をｅｔｈａｎｏｌ沈殿させ、沈殿物であるＤＩＧラベル・プローブをＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ混合液の中で再懸濁した。ＤＮａｓｅ処理後の加水分解は、ｐｒｏｂｅが１００−ｍｅｒよりも短いので省略した。これらのｐｒｏｂｅをここではＭＬ  ｐｒｏｂｅと呼ぶ。
ｒＲＮＡの検出に用いたラットの２８Ｓ  ｒＲＮＡの生物種間でよく保存された部分（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＃Ｖ０１２７０；６０３５−６０６８，５’−ｇｃｃｇｃｃｇｃａｇｇ−ｔｇｃａｇａｔｃｔｔｇｇｔｇｇｔａｇｔａｇｃａ−３’，ｔｏｔａｌ  ３４−ｍｅｒ）は、以前Ｙｏｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｙｏｓｈｉｉ  Ａ，Ｋｏｊｉ  Ｔ，Ｏｈｓａｗａ  Ｎ，Ｎａｋａｎｅ  ＰＫ（１９９５）．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡｓ  ｉｓ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：３２１−３２７．）に報告されている。ＤＩＧ標識したリボプローブは、使用したＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の製品に同封されている使用説明書に従って、ＤＩＧ−ＵＴＰの存在下でＴ３，Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎにより合成した。ＤＮａｓｅ処理後、生成物をエタノール沈殿し、ペレットをｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅに再溶解した。
ハイブリダイゼーション
切片をｔｏｌｕｅｎｅおよびｅｔｈａｎｏｌで脱パラフィンし、続けて０．２Ｎ  ＨＣｌ処理、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を加えたＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）中で１μｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを添加したものによるタンパク分解処理、続いてＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＰＢＳに２ｍｇ／ｍｌ  ｇｌｙｃｉｎｅを添加したもので処理をし、ｐｒｏｂｅの非特異的結合を防ぐため０．１Ｍ  ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ｐＨ８．０）に０．２５％  ａｃｅｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅを添加したものでアセチル化した。スライドを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）で洗浄し、５０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅおよび２×ＳＳＣ含有液中で４５℃、１時間以上あらかじめＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎは５０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、２×ＳＳＣ、１ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ超音波処理したｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ、２ｍｇ／ｍｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、１０％  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ、ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（〜２μｇ／ｍｌ）を含むＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ混合液２０μＬをスライドに載せ、湿箱内で４５℃、１６時間行った。次に、２×ＳＳＣおよび５０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅで４５℃、２０分間３回それぞれ洗浄した。さらに１×ＳＳＣでスライドを洗浄した後、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ結合ａｎｔｉ−ＤＩＧ（１：２５００）を切片に載せ、室温で２時間おいた。スライドをさらに洗浄してから、キットの説明書通りに５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよびｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔで酵素触媒色調変化を一晩行った。切片をｍｅｔｈｙｌ  ｇｒｅｅｎで対比染色し、光学顕微鏡で観察した。
ラット精巣における精子形成過程の細胞の分化の分類のため、連続切片をＰｅｒｉｏｄｏｃ  Ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）−ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ染色した。
ハイブリ後、スライドガラスをＲＮａｓｅ溶液、ＴＮＢ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで処理した。その後Ａｎｔｉ−ＤＩＧ−ＰＯＤ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１：１５００）を切片上にかけて４℃でｏｖｅｒｎｉｇｈｔ反応させた。ＴＮＴ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで十分スライドを洗った後、Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｒｅ−ｔｙｒａｍｉｄｅ（ＴＳＡ）を室温で１５分反応させ、洗浄した後、ａｎｔｉ−ｆａｄｅで封入した。ラット精巣の精子形成過程の分類のために連続切片をＰＡＳ−ヘマトキシリンで染色した。
シグナルの定量
染色した切片はＰｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕｏｒ  ４０×／０．７５レンズを用いたＺｅｉｓｓ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ顕微鏡（ＬＳＭ５１０）で観察した。それぞれの精子形成細胞（第１次、第２次精母細胞と精子細胞）の細胞質のシグナル強度はＬＳＭ５１０用のソフトウェアで測定した。シグナル強度のヒストグラムは着目した精子形成細胞の細胞質の領域から得た。領域を囲んで範囲を限定し（図３ａ）、抽出し（図３ｂ）、そして表に換算し（図３ｃ）、それからＥｘｃｅｌのｓｐｒｅａｄ  ｓｈｅｅｔに移しかえた。シグナル強度を計算し、ピクセル強度の平均として算出された（０−２５５）。ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｇａｉｎは最大の強度を示すピクセルがないように充分に低下させた。
《Ｒｅｓｕｌｔ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ》
図４ａはｒＲＮＡのａｎｔｉｓｅｎｓｅプローブでハイブリさせたラット精巣を示している。図４ｂはｒＲＮＡのｓｅｎｓｅプローブでハイブリさせたラット精巣を示していて、特異的なシグナルは観察されなかった。
ＲＮＡシグナルを定量することは精細管の中でシグナルにムラのないことが最も重要である。隣接した同じ発生段階の精子形成細胞が、同じｒＲＮＡ量を発現することが要求される。我々は今までの研究において同じ前処理のいくつかの切片で再現性のある結果を得ている。精祖細胞や第１次精母細胞でのｒＲＮＡの総量の解析は、細胞数も少なく細胞のサイズが小さすぎるため行わなかった。それぞれの細胞質におけるピクセルあたりの強度の平均値を得ることができ、その結果については図５に示している。それぞれの精子形成細胞の細胞質でのシグナル強度は、ピクセルあたりの強度の平均値を表している。第１次精母細胞で１４７−１６６、ディプロテン期の精母細胞で１２５、第２次精母細胞で１０８、精子細胞で５３−１３５であった。減数分裂の中期、後期、終期、そして初期のｓｔｅｐ１精子細胞では６８−７０であった。これらの精子形成細胞でのｒＲＮＡ量は今回の研究で、以前のデータと一致した。組織切片でのｍＲＮＡの定量化には種々の克服しなければならない問題があった。第１の問題としてはプローブ濃度とＩＳＨのシグナル強度に連続的な関連性（比例関係）があるかどうかである。次の問題としては単位面積あたり、または細胞あたりのプローブの分子数が正確に細胞質のｍＲＮＡ量を反映しているかどうかである。そしてその他にも細胞の体積や組織の体積、そしてラベルされた細胞数の変化の正確な測定が、与えられた組織の遺伝子発現の変化をも正確に評価しているかどうかと言う点を吟味することが必要不可欠であった。蛍光検出システムを用いた今回のモデル実験は、これらの組織切片でのシグナル定量化のためのさまざまな根本的問題を解決するための新しい見解をもたらすかもしれない。
実施例２
上記実施例１の結果から、プローブ濃度とシグナル強度との間に何らかの相関関係があることが示唆されたので、このような観点から、再度検討を加えた。
まず、本発明の基板を作成した。基板としてスライドガラスを用いた。
既存のマイクロアレイ・スライド作成の要領で、調査したい遺伝子について、濃度条件を振った希釈系列のＤＮＡ、ＲＮＡ，オリゴヌクレオチドを、スポッターにより、スライドガラス上にスポットする。同じ大きさ（直径２２０μｍ）の円形状に１ｎＬ狂いなくスポットできるので、スポット上に、核酸分子が何コピー含まれるかを計算することができる。
次に、希釈系列スポットを作成した同じスライドガラスの半面を、定法によりシランコートし、調査したい臓器、組織、器官のパラフィン切片、又は凍結切片を貼り付ける。濃度勾配スポット部には、センス鎖及びアンチセンス鎖の複数列を採用した。結果を図６に示す。図６は、本発明の基板の１実施態様を示す。
希釈系列スポットと、切片を一体として、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行う。調査したい遺伝子について、ＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎラベルのｃＲＮＡプローブを作成し、ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄと、ＴＳＡ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＴＳＡ−Ａｌｅｘａ等の蛍光発色を行う。
切片、及び希釈系列スポットの蛍光強度は、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，ＬＳＭ５１０等）で行う。希釈系列スポットの蛍光強度と比較することにより、組織切片上の知りたい細胞の蛍光強度を比較し、それぞれの細胞が、何コピーの転写産物を有しているか同定する。図７は、複数の濃度勾配を有する断片であって、標識化した断片の標識強度と濃度との間の相関関係を示す。このような検量線を用いて上記切片上の１の細胞の蛍光強度を比較検討することができる。
実施例３
次に、実際に複数の濃度勾配を有する断片と、標識プローブとのアフィニティー相互作用により検量線を得て、これによって、標的物質の定量を行った。
図８が、複数の濃度勾配を有する断片と、標識プローブとのアフィニティー相互作用により得られた検量線を示す。
図１０は、スポットの各蛍光像について、蛍光強度を計算によって求めるため、定量化範囲を選択した（赤色の線で囲んだ範囲）。図１０（１）は、ブランクである０μＭのオリゴヌクレオチド・スポットの解析範囲を示す。図１０（２）は、１μＭ、図１０（３）は、２μＭ、図１０（４）は、５μＭのオリゴヌクレオチド・スポットの解析範囲を示す。各スポットの左隣には、陰性対照であるアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドが同じ濃度でスポットされている。これらはブランクではなく、実験が正しく行われていれば、ａｎｔｉｓｅｎｓｅの標識プローブに対して、あらゆる濃度のａｎｔｉｓｅｎｓｅのスポットはアフィニティー相互作用を示さない。図６の基板の実施形態により濃度勾配スライドを作成した。これらの結果、次のようなことが可能となった。
すなわち、癌細胞などの標本の一個一個の転写産物の定量については、手術や生検によって得られた癌組織の切片を作成し、癌の悪性度を示すと考えられる、ＭＭＰやカドヘリン、Ｐ５３抑制癌遺伝子の発現量を細胞レベルで絶対量として定量化し、予後を推測したり、テーラーメイド医療の一環としての治療法の決定にも用いることができる。
特に、この定量化が組織切片上でできるということは、従来の病理組織的診断に加えて、任意の遺伝子の転写産物を定量化できる利点があり、病理組織学的悪性度と、遺伝子産物のコピー数を対応させることが出来る。
つまり、病理専門医の手にゆだねられてきた癌の悪性度の診断が、遺伝子産物の定量化という数値で表すことができる。つまり、病理診断医のトレーニングなしに悪性度を判定することができる。
【産業上の利用可能性】  病理学的検査は、癌の検査に留まらず、自己免疫疾患等、現在でも多くの難病の診断に欠かせない技術である。しかしながら、病理医の数は少なく、病理診断に多くの時間と労力を要している。本発明の方法の普及により、病理医の組織診断に加えて、「数値」として、病態に関わる遺伝子の発現状況が細胞レベルで表せれば、社会的にも大変意義深いと考えられる。
また、農林水産物の品質検定において、養殖魚、家畜は、同じ種であっても、月週齢の差や、与えられた餌の違いにより、個体や臓器の大きさが異なるために、従来の方法で遺伝子産物の定量化により品質検定を行うことが難しかった。しかし、本発明においては、個体や組織の大きさが異なっても、同じ種であれば、細胞一個一個の大きさは同じであるので、組織切片を作成し、細胞一個一個のレベルで任意の遺伝子産物の絶対量の差を定量化できるので、極めて有利である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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