(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的効果を生じ得る物質を含む、粘膜表面へ１回投与で投与するための医薬組成物であって、
前記物質の第１量は９４ｋＤａを超える分子量を有し、結晶化度が７０％以上であり、１．２ｄＬ／ｇ以上の粘度を有するポリマーからなり且つ２０μｍの最大直径を有するミクロスフェア内にカプセル化されており、
前記物質の第２量は組成物中で遊離しているかまたは少なくとも部分的にミクロスフェアの表面上に吸着されている、或いは容易に分散可能なミクロスフェアまたはベシクルでカプセル化されていることを特徴とする前記組成物。
【請求項２】
生物学的効果を生じ得る物質が、該物質の投与を受ける動物において防御免疫応答を生じ得る物質であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項３】
ポリマーが１００ｋＤａ以上の分子量を有することを特徴とする請求の範囲第１項〜第２項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
ポリマーがポリ−（Ｌ−ラクチド）からなることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ミクロスフェアが２〜１５μｍの体積平均径を有することを特徴する請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ミクロスフェアが２〜１０μｍの体積平均径を有することを特徴する請求の範囲第５項に記載の組成物。
【請求項７】
ミクロスフェアが１０μｍの最大直径を有することを特徴する請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
生物活性物質がペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）に対して防御免疫応答を生じ得ることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
生物活性物質がペスト菌のＶ抗原またはその免疫学的活性断片とペスト菌のＦ１抗原またはその免疫学的活性断片の組合せからなることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の組成物。
【請求項１０】
１回投与が１回接種ワクチンからなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項１１】
鼻腔内適用に適していることを特徴とする請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
リン酸緩衝生理食塩水中にミクロスフェアを含む懸濁液からなることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、粘膜表面に対して医薬（例えば、ワクチン）をデリバリーするのに特に有用な組成物、例えば鼻腔内処方物に関する。本発明は更に前記組成物を用いて患者を治療する方法及び前記組成物の製造方法に関する。
【０００２】
ワクチン接種の分野における主な目的は、慣用されている皮下及び筋肉内注射により引き出されるレベルに匹敵するレベルの全身免疫の誘発を促進する非腸管外予防接種処方を開発することである。
【０００３】
気道の鼻咽頭通路及び肺領域はペプチド作動性薬物及びワクチンの全身送達のための有力な標的である。治療薬が比較的容易に吸入または鼻に導入され得ると、この免疫化モードは予想される患者のコンプライアンスの点で魅力的となる。更に、呼吸粘膜は、免疫化、特に進入口としての粘膜表面を冒すまたは利用する病原体に対する免疫化の点で他の非腸管外部位に比して或る形態学的、生理学的及び免疫学的効果を呈する。これは、前記病原体に対する効果的なワクチン化には通常粘膜が分泌ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）アイソタイプの局所産生抗体で十分に保護されなければならないからである。ワクチンを腸管外投与すると粘膜表面は通常ＩｇＡで十分に保護されず、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の免疫応答要素に対して抗原物質がうまく送達されると免疫系の粘膜アームが激しく刺激され得ることが現在明らかである。共通の粘膜免疫系（ＣＭＩＳ）を利用して、単一部位でのワクチンの粘膜投与により幾つかの異種粘膜表面が保護され得ることが実現可能となる。粘膜ワクチン化は、抗原物質が上皮下区画から全身免疫応答組織（例えば、脾臓）へ転位するためにある程度の全身免疫が局所応答に応じて誘導され得るという追加の効果を発揮する。
【０００４】
非腸管外免疫化が好ましい論理的・免疫学的因子にもかかわらず、抗原性タンパク質を例えば胃腸管または気道に単純に粘膜投与することは通常ワクチン化の点で有効でない。酵素または化学的分解と上皮下区画への吸収が弱いために、粘膜投与したワクチンは通常幾つかの形態のアジュバントまたは送達ベシクルを必要とする。１つの方法は、抗原性物質をポリ−ＤＬ−ラクチド（ＰＬＡ）ミクロスフェアのような微粒状ポリマー担体内にカプセル化することである（Ｖａｃｃｉｎｅ，１２：５−１１（１９９４））。この方法は、不安定なワクチンを内腔分解から保護し、粘膜及び全身区画への吸着を高めるのに役立つ（Ｊ．Ｈ．Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３０，１６−２５（１９９３））。マイクロカプセル化は可溶性抗原性分子を粒状物質に変換し、よって抗原提示細胞（ＡＰＣ）（Ｙ．Ｔａｂａｔａら，Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，９４，１０７−１４１（１９９０）；Ｌ．Ｖｉｄａｒｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：２８０９−２８１８（１９９６）；Ｎ．Ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１１，４３６−４３９（１９９０））またはリンパ小胞中のミクロホールド細胞（Ｍ−細胞）（Ｒ．Ｉ．Ｗａｌｋｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１２，３８７（１９９４）；Ｄ．Ｔ．Ｏ’Ｈａｇａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ，７，４２１−４２４（１９８９）；Ｐ．Ｇ．Ｊｅｎｋｉｎｓら，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ，３，７９−８１（１９９５））へのワクチンの取り込みを促進させることにより有用であり得ることは立証されている。
【０００５】
余り研究されていないが、鼻腔内（ｉ．ｎ．）ルートはワクチンの粘膜送達のための魅力的なルートである。鼻上皮は接近しやすく、高分子量分子を余り排除しない。
【０００６】
気道上皮を覆う粘膜表層の厚さは他の粘膜に比して比較的薄く、例えば腸粘膜の５００分の１の厚さである。胃腸管に比べて気道では蛋白分解酵素の濃度が実質的に低く、ｐＨは両端である。
【０００７】
更に、鼻関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）が腸粘膜のように選択的抗原摂取のためにＭ−細胞を含むリンパ上皮を有することは現在知られている（Ｐ．Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ，「肺及び上気道の免疫学(Immunology of the Lung and Upper Respiratory Tract)」，Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ  Ｊ．編，ニューヨークに所在のＭａＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９７４年）出版，ｐ．２８−９５）。ＮＡＬＴは、抗原サーベイランス並びに粘膜及び全身免疫応答の誘導の点で他のＭＡＬＴ、例えば消化管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）と同様の役割を発揮する。
【０００８】
筋肉内投与用破傷風ワクチンのカプセル化において高分子量ポリマーを使用することは公知である（Ｖａｃｃｉｎｅ，１２：４，２９９−３０６（１９９４））。鼻腔内に適用されるリシン毒素を含むマイクロカプセル化ワクチン処方物も公知である（Ｖａｃｃｉｎｅ，１４：１１，１０３１（１９９４））。しかしながら、いずれの場合も、高分子量（９４ｋＤａ）ポリマーミクロスフェアの効果は低分子量（７２ｋＤａ）コポリマーから作成したものよりも劣る。
【０００９】
ペスト菌に対する免疫応答を生じさせる際に使用するためのミクロスフェアの作製において高分子量ポリマー（ＰＬＡ１００ｋＤａ）を使用することは既にＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９２，Ｓｕｐｐｌ．１，５６（１９９７）及びＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９，Ｓｕｐｐｌ，４，８５（１９９７）に記載されている。しかしながら、この場合組成物は複数回鼻腔内投与されていた（すなわち、初期投与後１回以上追加投与された）。
【００１０】
ワクチンのような医薬の追加投与の必要性を最小限とするかまたは排除することが望ましい。これは、反復投与は患者にとって不都合であり、費用がかかるからである。
【００１１】
アジュバントを使用してワクチン組成物のような医薬組成物の効果を高める試みもなされてきた。米国特許第５，６４３，６０５号明細書は、主にアジュバントを低粘度ポリマーでカプセル化して約２０〜１００μｍの平均直径を有するミクロスフェアを形成する方法及び組成物を記載している。すなわち、この組成物は直径２０μｍ以上のミクロスフェアを含んでいる。
【００１２】
本発明者らは、特定のマイクロカプセル化処方物が粘膜表面に適用したときに高レベルの効果を生ずることを知見した。例えば、ワクチンの場合、ワクチンはアジュバントを使用せずに通常１回投与で投与され得る。
【００１３】
「１回投与(single dose)」は追加投与せずに医薬、特にワクチンを適用することを意味する。
【００１４】
従って、本発明は生物学的効果を生じ得る物質を含み、前記物質の第１量が９４ｋＤａを超える分子量を有するポリマーからなり且つ２０μｍの最大直径を有するミクロスフェア内にカプセル化されており、前記物質の第２量は前記第１量よりも高いバイオアベイラビリティを有する形態を有していることを特徴とする粘膜表面へ適用するための医薬組成物を提供する。
【００１５】
好適な生物学的効果はワクチンのような防御免疫応答を生ずるものであるが、他の医薬活性化合物も使用し得る。特に、他の好適な生物活性化合物はＣＮＳ活性薬物、鎮痛薬（例えば、中枢作用性鎮痛薬）、疼痛緩和薬（例えば、モルヒネ類似体）及びホルモン（例えば、インスリン）のような医薬である。
【００１６】
活性物質の第２量の高いバイオアベイラビリティとは、前記物質を投与したときにレシピエントの器官系に非常に速やかに取り込まれることを意味する。従って、迅速且つ高い免疫応答を達成するのに役立ち、ミクロスフェアからの物質のゆっくりとした放出により強化される。高分子量ポリマーミクロスフェアは、カプセル化されている物質の放出を遅らせる傾向にある。
【００１７】
好適には、前記物質の第２量は組成物中で遊離状態である。或いは、少なくとも部分的にミクロスフェアの表面上に吸着しているかまたは前記表面に弱く結合している。
【００１８】
或いは、第２量は本発明の組成物の一部をなす高い分子量ポリマーミクロスフェアを包囲しているかまたはミクロスフェアから分離している容易に分散可能なミクロスフェアまたはベシクルに包囲されていてもよい。
【００１９】
好適には、ポリマーは１００ｋＤａ以上の分子量を有する。好適なポリマーは、ミクロスフェアのような構造物を形成し得る水不溶性ポリマーである「構造ポリマー」からなる。前記ポリマーはマトリックス材料に構成され得、有機溶媒にのみ溶解し得る。本発明の組成物に使用するのに特に適したポリマーはポリ−（Ｌ−ラクチド）、すなわちＰＬＡであるが、ポリ（乳酸／グリコール酸）、すなわちＰＧＬＡのような他の高分子量ポリマー材料も使用し得る。高い結晶化度（例えば、７０％以上の結晶化度）を有する構造ポリマー、特にＰＬＡが好ましい。前記ポリマーは高い粘度、例えば１．２ｄｌ／ｇ以上、より好ましくは１．５ｄｌ／ｇ以上の粘度を有する。
【００２０】
しかしながら、ミクロスフェアは上記した高分子量ポリマーを好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９５％含む。特に、使用するポリマーは１００％高分子量ポリマーＰＬＡである。
【００２１】
場合により、ミクロスフェアは更にポリビニルアルコールまたはメチルセルロースのようなエマルションを安定化させる物質、好ましくはポリビニルアルコールを含み得る。
【００２２】
好適には、ミクロスフェアは上記した低分子量ＰＬＡまたはＰＧＬＡのような低分子量構造ポリマーを含まない。
【００２３】
このようなミクロスフェアは最大直径２０μｍで非常に小さく、良好な流動特性を有する。好適には、ミクロスフェアが少なくとも２μｍ、好ましくは２〜１５μｍ、より好ましくは２〜１０μｍ、最も好ましくは４〜１０μｍの平均直径を有する。特定実施態様では、ミクロスフェアは約６μｍの平均直径を有する。粒子の最大直径は好適には１０μｍ、好ましくは７μｍ、より好ましくは６μｍである。
【００２４】
組成物中に使用される物質の第１量及び第２量の比は、使用する特定物質に応じて異なるが、通常１：２〜２：１、好ましくは約１：１である。
【００２５】
前記組成物は通常医薬の投与において有効であるが、投与を受ける動物（特に、哺乳動物）において防御免疫応答を生じ得る生物活性物質を投与するために特に有効である。前記物質の例には、抗原性ポリペブチドの他前記ポリペプチドをコードし得、“ＤＮＡ”ワクチンとして公知の核酸配列が含まれる。
【００２６】
好適なポリペフチドはサブユニットワクチン等、例えばジフテリア毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素ＦＨｃ及び炭疽菌防御抗原（ＰＡ）である。
【００２７】
本明細書中、用語「ポリペプチド」はタンパク質またはその抗原決定断片を含む。
好適なポリペプチドはサブユニットワクチンである。
【００２８】
好ましい実施態様において、本発明の組成物はペスト菌に対して防御免疫応答を生じ得る生物活性物質を含む。前記物質としては、例えば国際特許出願公開第９６／２８５５１号パンフレットに記載されているようなサブユニットワクチンが好適である。前記特許明細書に記載されているワクチンはペスト菌のＶ抗原、その免疫学的に活性な断片またはその変異体とペスト菌のＦ１抗原、その免疫学的に活性な断片またはその変異体の組合せからなる。
【００２９】
本明細書中、用語「断片」は少なくとも１つの抗原決定基を含む塩基配列の一部を指す。これらは欠失突然変異体であり得る。配列の１つ以上の抗原決定領域が一緒に結合されていてもよい。
【００３０】
用語「変異体」は、配列中の１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている点で誘導元の塩基配列とは異なる核酸配列を指す。アミノ酸置換は、アミノ酸が大体類似の性質を有する別のアミノ酸で置換されている「保存的」と見做され得る。アミノ酸を異なる種類のアミノ酸で置換した非保存的置換もある。概して、ポリペプチドの生物学的活性を変更することなく数個を非保存的置換することも可能である。好適には、変異体は塩基配列に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％相同である。
【００３１】
特に、生物活性物質はペスト菌のＶ抗原とペスト菌のＦ１抗原またはその免疫学的活性断片の組合せからなる。好適には、前記した両抗原は組成物内の第１量及び第２量中に、好ましくは等しい比率で存在する。
【００３２】
特に好ましい実施態様では、マウスに対するミクロスフェア調製物の各投与は前記抗原の各々を３０〜５０μｇ、最も好ましくは約４０μｇ含む。好ましくは、ヒト及び動物に対する用量はｍｇ／ｋｇ換算で同一のオーダーである。
【００３３】
本発明のワクチン組成物は投与する生物活性物質に対する免疫応答を高めるためにアジュバントを含み得るが、アジュバントは必須でないことが判明し、組成物にアジュバントを配合しないことが好ましい。使用する場合、好適なアジュバントには医薬的に許容され得るアジュバント、例えばフロインド不完全アジュバント、アルヒドロゲル、アルミニウム化合物、及び好ましくは粘膜応答を上向きに調節することが公知のアジュバント（例えば、ＣＴＢ、コレラ毒素（ＣＴ）の非毒性ペンタマーＢサブユニットまたは大腸菌の突然変異非耐熱性毒素（ｍＬＴ））が含まれる。
【００３４】
他の種類のアジュバントは国際特許出願公開第００／５６２８２号パンフレット、同第００／５６３６２号パンフレット及び同第００／５６３６１号パンフレットに記載されている。
【００３５】
本発明の組成物は鼻腔内適用するのに特に適している。前記組成物は、場合により例えば凍結乾燥により保存されるミクロスフェアそのものであっても、またはミクロスフェアを医薬的に許容され得る担体または賦形剤と混合してもよい。好適な担体の例には、当業界で公知のように固体または液体担体が含まれる。本発明の特に好ましい実施態様では、組成物は液体担体、特にリン酸緩衝食塩液中にミクロスフェアを含む懸濁液からなる。
【００３６】
更に、本発明は医薬組成物の製造方法を提供し、その方法は医薬活性物質を高分子量（特に、１００ｋＤａ以上の分子量）を有するポリマー材料でカプセル化して２０μｍの最大直径を有するミクロスフェアを形成した後、前記ミクロスフェアをより高いバイオアベイラビリティ形態の更なる量の前記物質と混合することを含む。
【００３７】
カプセル化は好適には二重エマルション溶媒蒸発法(double emulsion solvent evaporation method)を用いて実施される。この方法は医薬活性物質及び構造ポリマーを用いて第１エマルションを形成し、これを水性相（好適には、構造ポリマーを含まない）と混合して第２エマルションを形成し、溶媒を蒸発させ、小ミクロスフェアを単離することを含む。特に、医薬活性成分を場合によりＰＶＡのような乳化剤を含む水溶液中に溶解または懸濁させる。存在させる場合、乳化剤は低濃度（例えば、５％ｗ／ｖ未満）で含有させる。次いで、前記溶液または懸濁液を、ジクロロメタンのような有機溶媒中に高分子量構造ポリマーを含む溶液と混合する。その後、特に混合物を超音波処理することにより第１エマルションを形成する。次いで、第１エマルションを、好ましくは乳化剤を含む第２水性相に激しく撹拌しながら添加する。その後、溶媒を好ましくは蒸発させる。蒸発は室温で実施するのが有利である。その後、ミクロスフェアを例えば遠心し、凍結乾燥することにより回収し得る。
【００３８】
特に、本発明の方法は予防用または治療用ワクチンの製造方法であり、その方法は防御免疫応答を生じ得る物質を高分子量（特に、１００ｋＤａ以上の分子量）を有するポリマー材料でカプセル化して２０μｍ未満の最大直径を有するミクロスフェアを形成した後、前記ミクロスフェアをより高いバイオアベイラビリティ形態の更なる量の前記物質と混合することを含む。
【００３９】
ミクロスフェアの形成方法は当業界で公知である。この方法には、乳化方法及び噴霧乾燥方法が含まれる。
【００４０】
本発明のミクロスフェアは好適には二重エマルション溶媒蒸発法を用いて作成される。簡単に説明すると、（好適には、凍結乾燥状態の）生物活性物質をポリビニルアルコール（ＰＶＡ）やメチルセルロースのようなポリマーの水溶液に懸濁させる。ジクロロメタンのような有機溶媒中に高分子量ポリマーを含む溶液を激しく撹拌しながら添加する。次いで、生じたエマルションをポリマー（ＰＶＡ等）を含む第２水性相に激しく撹拌しながら滴下する。添加後、有機溶媒を蒸発除去し、得られたミクロスフェアを分離する。
【００４１】
好適には、組成物は単位量剤型の形態を有する。これは、使用する活性物質の種類、患者の種類、治療する状態及び他の臨床因子に応じて変わる。しかしながら、本発明の組成物は通常約２〜１０重量％の活性成分を含む。組成物中の高分子量ポリマーの量は７０〜９８重量％のオーダーである。
使用に際し、鼻腔投与のための妥当な用量は０．０５〜０．２ｇのオーダーである。
【００４２】
本発明の組成物にはワクチン組成物、特に１回投与ワクチン組成物が含まれる。
【００４３】
更なる態様として、本発明は治療を要する哺乳動物の粘膜表面（特に、鼻粘膜表面）に対して上記した組成物の形態の生物活性物質を有効量投与することからなる哺乳動物の治療方法を提供する。
【００４４】
特に、本発明の方法は哺乳動物を感染から防御する方法であり、その方法は哺乳動物の粘膜表面（特に、鼻粘膜表面）に対して上記した組成物の形態の防御免疫応答を生じ得る生物活性物質の有効量を１回投与することを含む。
【００４５】
本出願人は、本発明の組成物の形態の組合せサブユニットワクチンを１回鼻腔内投与することにより実験動物をペスト菌での吸入攻撃から防御し得ることを立証した。本発明の組成物において使用される高分子量ポリマーは鼻腔内デリバリーに特に適しているようである。
【００４６】
以下、本発明を例を用いて特に説明する。
【００４７】
実施例１：ワクチン組成物の製造
ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）のＶ抗原を大腸菌においてグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させた。Ｖタンパク質を融合タンパク質から因子Ｘａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＵＫ  Ｌｔｄ）を用いて２２℃で１８時間開裂し、組み換えＶタンパク質をＳ．Ｌｅａｒｙら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２５５：１９３−１９８（１９９５））に記載されているようにアフィニティー吸着により精製した。化学的に調整した培地（ｐＨ７．４）で３７℃で培養したペスト菌の上清から４０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムを添加してＦ１抗原を沈降させ、ｐＨ８の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにおいてペレットを繰り返し再懸濁・遠心して精製した。
【００４８】
実施例２：サブユニットのマイクロカプセル化
二重エマルション溶媒蒸発法（Ｙ．Ｏｇａｗａら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６：１０９５−１１０３（１９８８））の改変方法において分子量１００ｋＤａのポリ−Ｌ−ラクチド（米国のＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いた。簡単に説明すると、Ｖ（４．２ｍｇ）及び凍結乾燥したＦ１抗原（５．９ｍｇ）をポリビニルアルコール（ＰＶＡ）１３−２２ｋＤａ（加水分解率８８％）の２．５％水溶液（０．５ｍｌ）に懸濁した。この懸濁液を、ＨＰＬＣ等級ジクロロメタン（ＤＭＣ）（５ｍｌ）に溶解した分子量１００ｋＤａのポリ−Ｌ−ラクチド（２５０ｍｇ）と混合し、混合物を氷上において６０Ｗで２分間音波処理した。生じた第１エマルションを５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ  １３−２３ｋＤａ（加水分解率８８％）を含有する第２水性相（７５ｍｌ）に添加し、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザー（英国のＳｉｌｖｅｒｓｏｎ）を用いて最高速度で８分間激しく撹拌した。次いで、溶媒を周囲温度で蒸発させ、生じたミクロスフェア（ＭＤＶＦ）を超遠心により回収した後凍結乾燥した。凍結乾燥したミクロスフェアを標準的手順を用いて特定した。
【００４９】
このようにすると、Ｆ１タンパク質及びＶタンパク質は共に各スフェアにカプセル化されており、スフェア１ｍｇは１８〜２０μｇの各タンパク質（ミクロスフェア１ｍｇあたり最大４０μｇのタンパク質）を含んでいた。
【００５０】
実施例３：ミクロスフェアの特性付け
ミクロスフェアの形態を走査型電子顕微鏡（英国のＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｅｒｅｏｓｃａｎ  ９０）を用いて調べた。粒径はレーザー回折（英国シュロップシャーに所在のＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）により測定した。処方した粒子は６μｍの体積平均径を有していることが判明した。走査型電子顕微鏡で目視するとミクロスフェアは滑らかな球であった。
【００５１】
実施例４：マイクロカプセル化したＦ１＋Ｖの１回鼻腔内デリバリーはマウスをペスト菌での攻撃から防御する
実施例２のＭＤＶＦミクロスフェアを滅菌食塩液中に含む懸濁液に遊離のＦ１タンパク質及びＶタンパク質を添加した。各タンパク質１８〜２０μｇ（最大タンパク質４０μｇ）を含有するスフェア及び遊離タンパク質各２０μｇを含む投与単位を作成した。
【００５２】
デリバリーされるＦ１及びＶの総用量は動物１匹あたり４０μｇであった。
マウスに対してリン酸緩衝食塩液５０μｌ中に上記ミクロスフェアを含む懸濁液を１回だけ鼻腔内投与した。
【００５３】
対照動物には、マウス１匹あたり４０μｇのＦ１＋４０μｇのＶの総用量を与えるように十分な遊離Ｆ１及びＶタンパク質と「空」スフェアの混合物を投与した。「空」スフェアはタンパク質のカプセル化を実施しない以外は上記と同様にして作成したものである。
【００５４】
免疫化したマウスを、１回初回投与してから６０日目に１０４ｃｆｕの毒性ペスト菌、７４日目に１０６ｃｆｕのペスト菌を皮下注射して攻撃した。免疫化したマウスの生存を下表に示す。
【００５５】
【表１】
0004944335.tif 000002
本発明の組成物がＦ１＋Ｖ免疫原の初期バーストを送達し、その後良好な生存率を確保するのに有効なカプセル化タンパク質をより徐々に調整放出するという効果を有することが明らかであった。