(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のタンパク質と同一の薬物代謝活性を示すタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：１若しくは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：１若しくは配列番号：３に記載の塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、請求項１に記載の（ａ）のタンパク質と同一の薬物代謝活性を示すタンパク質をコードするサル由来のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項１に記載のタンパク質を精製することを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項８】
サルとサル以外の哺乳動物とにおいて被検物質の代謝が異なる場合に、
請求項１に記載のタンパク質と前記被検物質とを接触させる工程Ａと、
前記被検物質の代謝に対する、前記請求項１に記載のタンパク質の関与の有無を測定する工程Ｂを含む、
前記被検物質の代謝が異なる原因を評価する方法。
【請求項９】
前記工程Ａで用いる請求項１に記載のタンパク質が、請求項６に記載のタンパク質の製造方法で製造されたものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程Ｂにおいて、請求項１に記載のタンパク質が前記被検物質の代謝に関与している場合、
前記サルとサル以外の前記哺乳動物とにおける被検物質の代謝の差異は、種の違いによるものであると評価する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての代謝、薬効および／または安全性を試験する場合に、
前記医薬品候補化合物の代謝に対する、前記請求項１に記載のタンパク質の関与の有無を測定する工程Ｃと、
前記関与が有った場合に、当該医薬品候補化合物についてのサルをモデル動物とした代謝、薬効および／または安全性の試験結果は、前記医薬品化合物のヒトにおける代謝、薬効および／または安全性と異なることを予測する工程Ｄと、を含む、代謝、薬効および／または安全性試験の評価方法。
【請求項１２】
前記工程Ｃが、in vitroで行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての代謝、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価する方法であって、
請求項１に記載のタンパク質と、前記医薬品候補化合物を接触させる工程Ｅと、
前記医薬品化合物の代謝に対する、前記請求項１に記載のタンパク質の関与の程度を測定する工程Ｆと、を含み
前記関与が所定の程度以上であった場合に、サルをモデル動物として試験することに対して否定的な評価をする、方法。
【請求項１４】
サルをモデル動物とした、ヒト用の医薬品候補化合物についての代謝、薬効および／または安全性を試験の評価に用いられる、請求項１に記載のタンパク質を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルが特異的に有する新規薬物代謝酵素、それをコードする核酸、およびこの新規薬物代謝酵素を用いてサルをモデル動物とした前臨床試験を評価する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、新薬開発の過程では、代謝のパターンがヒトに非常に似ていることから、サルをモデル動物として用いた代謝試験を含む薬物動態試験、薬効試験、安全性試験等が広く行われている。しかしながら、最近一部の薬物については、サルの代謝パターンがヒトの代謝パターンと異なる場合があるとの報告がなされている（非特許文献１〜４）。
薬物の代謝には、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）と呼ばれる酵素が深く関与している。ＣＹＰは遺伝子ファミリーを形成しており、ヒトではこれまでに５０種類を超えるＣＹＰ遺伝子の存在が報告され、他の哺乳動物も多くのＣＹＰ遺伝子を有することが知られている。ＣＹＰは、鉄イオンを配位したヘムタンパク質であり、各ＣＹＰの構造は極めて類似しているが、基質や代謝活性がそれぞれ異なっている。
ＣＹＰは、アミノ酸配列の相同性に基づいて分類され、各ＣＹＰは、例えば「ＣＹＰ１Ａ１」というようにＣＹＰに続けてファミリー名（数字）、サブファミリー名（アルファベット）、固有名（数字）を表記することによって特定される。
各ＣＹＰの基質が異なるとともに、最近では、各ＣＹＰの遺伝子多型ごとに代謝活性や基質特異性が異なることが報告されており（例えば特開２００４−４号公報；特許文献１）、薬効や毒性の発現に見られる個体差、性差、年齢差、種差、人種差の原因の一つとして、ＣＹＰの分子種や多型に関する研究が進められている。
一般に、個人差が大きいＣＹＰ分子種が代謝する化合物は、ヒトによって薬効や副作用が異なってくる可能性が大きく、医薬品としては望ましくないと考えられる。このような化合物を医薬品として開発する場合には、臨床開発の際、治験候補者の分子種の多型を事前に調べ、薬効が得られる多型や、副作用が生じにくい多型等、特定の多型を有する候補者のみを対象とし、副作用が生じやすい多型を有する候補者は除外するなどの対策が必要となる。
【特許文献１】特開２００４−４号公報
【非特許文献１】Nartimatsu S. et al., Chem Biol Interact (2000) 127:73-90
【非特許文献２】Sharer JE. et al., Drug Metab Dispos (1995) 23:1231-1241
【非特許文献３】Stevens JC. et al., Drg Metab Dispos (1993) 21:753-760
【非特許文献４】Weaver RJ. et al., Xenobiotica (1999) 29:467-482
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
モデル動物を使用して代謝試験等を行う場合も、ヒトＣＹＰとモデル動物ＣＹＰとの相違、モデル動物間の多型等を考慮することによって、試験結果の意味をより的確に評価し、有効に活用することができると考えられる。例えば、ヒトとカニクイザルとで代謝パターンが大きく異なり、カニクイザルにおいて大きな副作用を生じさせる医薬品候補化合物があった場合、代謝パターンの相違がヒトとカニクイザルのＣＹＰの違いに起因することが判明し、ヒトにおいて同様の副作用が生じないことを確認することができれば、その化合物の開発を無駄に停止することなく、ヒト用の医薬品として開発を継続、促進できる可能性がある。
上述のように、一般にカニクイザルの代謝パターンはヒトに非常によく似ていることから、薬物代謝酵素の活性もヒトとほぼ同様であると考えられていた。しかしながら、これまでにカニクイザルのＣＹＰｃＤＮＡは６種類しかGenBankに報告されておらず、ヒトＣＹＰとの基質の相違や、サルの各個体間での相違についてはほとんど知られていなかった。
一方で、現に、ヒトとカニクイザルとで、代謝パターンの異なる薬物が存在することが明らかとなっている。
そこで、本発明は、サル以外の哺乳動物には見られず、サル特有の薬物代謝酵素およびそれをコードする遺伝子を見出すことを目的とする。
さらに、本発明は、上述したサル特有の薬物代謝酵素による薬物の代謝活性を測定することにより、サルをモデル動物として用いた薬物動態試験等の結果を的確に評価し、有効に活用する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、カニクイザルの肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトＣＹＰ遺伝子と比較的高い相同性を持つｃＤＮＡについて全長の塩基配列を決定した結果、２１個のカニクイザルのＣＹＰ遺伝子を検出することに成功した。そして、この中に、他のＣＹＰ遺伝子に比較して、ヒト遺伝子と相同性の低いＣＹＰ２Ｃ遺伝子が含まれることを見出し、この遺伝子は、カニクイザルを含む旧世界ザルおよび新世界ザルでは発現していること、ヒトを含む大型類人猿では発現が見られないこと等を確認した。
さらに新規ＣＹＰ２Ｃタンパク質を、大腸菌を用いて発現させ、ヒトＣＹＰ２Ｃや、カニクイザルの他のＣＹＰ２Ｃとの間に、ある種の薬物に対する代謝活性に相違があることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなる薬物代謝酵素であるタンパク質；
〔２〕〔１〕に記載のタンパク質をコードする核酸；
〔３〕配列番号：１若しくは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号：１若しくは配列番号：３に記載の塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、薬物代謝酵素であるタンパク質をコードするサル由来のＤＮＡ；
〔４〕〔３〕に記載のＤＮＡを含む組換えベクター；
〔５〕〔４〕に記載の組換えベクターを含む形質転換体；
〔６〕〔５〕に記載の形質転換体を培養し、培養物から〔１〕に記載のタンパク質を精製することを特徴とする、〔１〕に記載のタンパク質の製造方法；
〔７〕〔１〕に記載のタンパク質に対する抗体；
〔８〕サルとサル以外の哺乳動物とにおいて被検物質の代謝が異なる場合に、〔１〕に記載のタンパク質と前記被検物質とを接触させる工程Ａと、前記被検物質の代謝に対する、前記〔１〕に記載のタンパク質の関与の有無を測定する工程Ｂを含む、前記被検物質の代謝が異なる原因を評価する方法；
〔９〕前記工程Ａで用いる〔１〕に記載のタンパク質が、〔７〕に記載のタンパク質の製造方法で製造されたものであることを特徴とする、〔８〕に記載の方法；
〔１０〕前記工程Ｂにおいて、〔１〕に記載のタンパク質が前記被検物質の代謝に関与している場合、前記サルとサル以外の前記哺乳動物とにおける被検物質の代謝の差異は、種の違いによるものであると評価することを特徴とする、〔８〕または〔９〕に記載の方法；
〔１１〕サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての代謝、薬効および／または安全性を試験する場合に、前記医薬品候補化合物の代謝に対する、〔１〕に記載のタンパク質の関与の有無を測定する工程Ｃと、前記関与が有った場合に、当該医薬品候補化合物についてのサルをモデル動物とした代謝、薬効および／または安全性の試験結果は、前記医薬品化合物のヒトにおける代謝、薬効および／または安全性と異なることを予測する工程Ｄと、を含む、代謝、薬効および／または安全性を試験の評価方法；
〔１２〕前記工程Ｃが、in vitroで行われる、〔１１〕に記載の方法；
〔１３〕サルをモデル動物として、ヒト用の医薬品候補化合物についての代謝、薬効および／または安全性を試験することの可否を評価する方法であって、〔１〕に記載のタンパク質と、前記医薬品候補化合物を接触させる工程Ｅと、前記医薬品化合物の代謝に対する、〔１〕に記載のタンパク質の関与の程度を測定する工程Ｆと、を含み前記関与が所定の程度以上であった場合に、サルをモデル動物として試験することに対して否定的な評価をする、方法；
〔１４〕サルをモデル動物とした、ヒト用の医薬品候補化合物についての代謝、薬効および／または安全性を試験の評価に用いられる、〔１〕に記載のタンパク質を含むキット、に関するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明に係るタンパク質および遺伝子は、サル特異的に存在するものであるため、ある薬物の代謝活性に対する本タンパク質の影響を測定することにより、その代謝活性がサル特有のものなのか、ヒト等他の動物にも共通するものなかを予測することができる。また、この予測に基づき、ある薬物の代謝試験等に、モデル動物としてサルを用いることの是非を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明に係るタンパク質は、カニクイザル、アカゲザル、アフリカミドリザル等の旧世界ザルやコモン・マーモセット等の新世界ザルに発現が見られるサル特異的な薬物代謝酵素である。カニクイザルから同定された新規ＣＹＰ２Ｃタンパク質（以下、「新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ」という。）のアミノ酸配列を配列番号：２（図１下段）に示す。
発明者らは、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃを以下の方法によって見出した。
まずカニクイザル肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトＣＹＰ遺伝子に相同性の高いクローンを同定し、そのｃＤＮＡの塩基配列を決定した。これにより、新規なものを含む２１のカニクイザルのＣＹＰ遺伝子が同定された。これらのＣＹＰ遺伝子のほとんどは、対応するヒトのＣＹＰ遺伝子との相同性が９４−９５％であったが、一つだけヒトＣＹＰ２ＣのｃＤＮＡと最大で７９％しか相同性を示さない遺伝子を発見し、これを新規ｍｆＣＹＰ２Ｃとした。
新規ｍｆＣＹＰ２Ｃがサル特異的な遺伝子であるのか、これまでにヒトのホモログが同定されていなかっただけなのかを確認するため、遺伝子特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、他の霊長類における新規ｍｆＣＹＰ２Ｃの有無を調べた。この結果、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子は、測定したすべての旧世界ザルおよび新世界ザル等、ヒトや大型類人猿を除く霊長類には存在するが、ヒトや、チンパンジーおよびオランウータンといった大型類人猿には存在しないことが確認された。また、ヒトおよびチンパンジーのゲノム・データベースを用いてブラスト検索を行っても、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃと９０％以上の相同性を示すＣＹＰ２Ｃ遺伝子は見出されず、このことも、本発明に係るタンパク質がサル特異的であることを支持する結果であった。
また、各組織由来のサンプルから全ＲＮＡを抽出し、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行って、この遺伝子の発現量は肝臓において圧倒的に多いこと、また、他のＣＹＰ２Ｃが通常発現しない心臓、筋肉、脳、精巣等にも少量発現していることを確認した。
さらに、カニクイザル肝臓ｃＤＮＡライブラリー中における各ＣＹＰ遺伝子のコピー数を、全ＣＹＰ遺伝子のコピー数で割ることによって算出した、カニクイザル肝臓で発現している全ＣＹＰに占める新規ｍｆＣＹＰ２Ｃの割合は、２８．０％と非常に高く、また雄と雌で約２倍の発現量の差があることが認められた。
新規ｍｆＣＹＰ２Ｃは、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子を適当なベクターに挿入し、このベクターを用いて宿主を形質転換することによって発現させ、得ることができる。
本発明者らは、こうして得た組換え新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質が、Tolbutamideおよびtestosteroneに対して代謝活性を示し、taxolやS-mephenytoin、に対しては示さないことを確認した。サル特異的な酵素が、ある種の薬物に対する代謝活性を有する場合は、当該薬物に対する代謝パターンが、サルとヒトとにおいて異なる可能性が示唆される。
本発明に係るタンパク質は、それが薬物代謝酵素であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパクと同一の機能を有する限り、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されている等の変異が生じていてもよい。またこれらの変異は、自然に発生したものであってもよく、人為的に改変したものであってもよい。
ここで薬物代謝酵素とは、生体内において体外から摂取または投与された薬物の化学構造を変化させる酵素を意味する。【０００７】
本発明に係る核酸は、本発明に係るタンパク質をコードする核酸であって、ＤＮＡであるかＲＮＡであるかを問わない。上述のように、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されている等の変異が生じているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸も、当該タンパク質が本発明に係るタンパク質である限り、本発明に含まれる。
このような核酸の例として、新規ｍｆＣＹＰ２ＣのｃＤＮＡを配列番号：１（図１上段）に、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ遺伝子の全長を配列番号：３に示す。
また、本発明に係る核酸は、配列番号：１若しくは配列番号：３に記載の塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、薬物代謝酵素であるタンパク質をコードするサル由来の核酸も含む。配列番号：１若しくは配列番号：３に記載の塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列をストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸は、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列と相同性が高く、コードするタンパク質も同一の機能を有する可能性が高いものと考えられる。ストリンジェントな条件とは、例えば、５％Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１％Ｆｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミンを含む）と、０．５％ＳＤＳと、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）中において６５℃で洗浄する条件をいう。ストリンジェンシーは塩濃度（イオン強度）、温度等によって制御することができ、ストリンジェンシーがより高い条件、即ち塩濃度がより低く、温度がより高い条件では、相同性が十分に高いＤＮＡのみがハイブリダイズする。従って、かかる条件下で、配列番号：１若しくは配列番号：３に記載の塩基配列若しくはその一部からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有し、同一の機能を有するものと考えられる。当業者であれば、温度や塩濃度を調整することによって、ストリンジェントな条件を適宜選択することができる。【０００８】
本発明に係るタンパク質および核酸は、そのアミノ酸配列、塩基配列および／または機能により本発明に含まれると解される限り、その由来は限定されないが、好ましくはサル由来であり、さらに好ましくは、カニクイザル、アカゲザル、アフリカミドリザル等の旧世界ザル由来か、コモン・マーモセット等の新世界ザル由来である。
なお、本明細書において「サル」は、旧世界ザル、新世界ザル、原猿類等を含み、大型類人猿を除く霊長類を意味する。【０００９】
また、本発明は、本発明に係るＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明で用いられるベクターは、挿入したＤＮＡを安定に保持するものであれば、特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）等が挙げられる。大腸菌を宿主とする場合は、λファージ系やＭ１３ファージ系などのバクテリオファージがよく用いられる。また、動物細胞を宿主とする場合は、ベクターとして、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルスＤＮＡを用いることができる。
さらに、宿主内で、本発明に係るタンパク質が効率よく発現されるよう、宿主に適した、プロモータ配列、エンハンサー配列、シャインダルガーノ配列、シグナル配列、ポリＡシグナルなどを適宜選択し、ベクターに挿入することができる。
本発明に係るＤＮＡの上記ベクターへの挿入は、例えば、制限酵素を用いてベクターを切断し、リガーゼ反応によって、ＤＮＡを該切断部位に連結することにより行うことができる。【００１０】
本発明は、上記本発明に係るベクターで形質転換させた形質転換体も含む。本発明の形質転換体は、本発明に係るＤＮＡが挿入されたベクターに適した宿主を選択し、この宿主に前記ベクターを導入することにより得られる。宿主としては、例えば大腸菌や緑膿菌などのグラム陰性菌、枯草菌などのグラム陽性菌、放線菌、酵母、糸状菌、動植物培養細胞、昆虫培養細胞などが挙げられ、中でも大腸菌が好ましい。
ベクターの導入方法としては、宿主が大腸菌である場合には塩化カルシウム法、枯草菌を宿主とする場合にはコンピテントセル法や酢酸リチウム法、枯草菌、放線菌、酵母などにはプロトプラスト法、動植物細胞、酵母、細菌などに広く用いられる方法としてリン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストランやポリブレンなどのポリマーと複合体を形成させる方法などから適宜選択することができる。カチオン性脂質のリポソームと複合体を形成させるリポフェクトアミン（Invitrogen社）を用いることもできる。【００１１】
本発明はまた、上記形質転換体を培養して、本発明に係るタンパク質を生成させることを特徴とする、タンパク質の製造方法も含む。形質転換体の培養は、宿主細胞の特性、発現するタンパク質の特性、プロモータの特性などにより選択することができ、例えばＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（Gibco社）等の公知の培地を使用することができる。また、例えば抗生物質耐性を有するプラスミドを用いた場合は、当該抗生物質を培地に添加することにより目的タンパク質の発現を調節することができ、又ラクトース依存性プラスミドを使用した場合はＩＰＴＧを培地に添加して発現を誘導することができる。
このようにして得た形質転換体を培養して発現させた本発明に係るタンパク質は、通常のタンパク質の精製方法を用いて精製することができ、使用した発現系により、例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過法、塩析、浸透圧ショック法、超音波処理などを組み合わせて精製することができる。クロマトグラフィー法としては、例えば、水溶液中で行うイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、有機溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。本発明はこれらの精製方法を用いて精製されたタンパク質も含む。
また、発現させたタンパク質は、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を用いて修飾を加えたり部分的にペプチドを除去したりすることもでき、これらの修飾されたタンパク質も本発明に含まれる。タンパク質修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、プロテインキナーゼやグルコシダーゼなどが挙げられる。尚、当業者は、発現したタンパク質が遊離した状態であれば塩に、塩として得られた場合に遊離した状態に容易に変えることができる。【００１２】
本発明は、また、本発明に係るタンパク質または当該タンパク質の部分ペプチドに結合する抗体をも提供する。本発明にかかる抗体は、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃタンパク質、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃと機能的に同質なタンパク質（配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、薬物代謝酵素であるタンパク質）、またはそれらの部分ペプチドに特異的に結合するものであればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ヒト以外の哺乳動物を本タンパク質で免疫することによって得た抗体のほか、ヒト化抗体や、遺伝子組換えにより得られた抗体も、本発明に係るタンパク質またはその部分ペプチドに特異的に結合する限り本発明に含まれる。本発明にかかる抗体は、自体公知またはそれに準じた方法により製造することができるが、以下に代表的方法を例示する。
まず、ポリクローナル抗体は、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃまたはその部分ペプチドを用いて哺乳動物、好ましくはマウスやラット等のげっ歯目、ウサギ目、サルなどの霊長目の動物を免疫し、血清を得て、この血清を新規ｍｆＣＹＰ２Ｃまたはその部分ペプチドを固定したアフィニティーカラムに通して精製することにより得ることができる。
またモノクローナル抗体は、まず同様に哺乳動物を免疫し、この動物から得た抗体産生細胞と、増殖力の強いミエローマ細胞とを融合させ、個々の融合細胞を分離し、求める抗体の生産能を検定することによって抗原の一つのエピトープに特異的に反応する抗体分子を1種だけ生産する細胞を選択し、この細胞を培養することによって製造することができる。またモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをベクターに挿入し、このベクターを宿主に導入して産生させて遺伝子工学的方法で得ることもできる。ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物を免疫すれば、ヒト抗体を産生することもでき、マウスのモノクローナル抗体の抗原結合部位をコードするｃＤＮＡとヒトのＩｇＧ遺伝子の定常部をコードする遺伝子を連結してこれをＢリンパ球に導入すればキメラ抗体分子を生産させることも可能であり、これらの抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体は、本発明に係るタンパク質または部分ペプチドを特異的に認識して結合する限り、フラグメントや修飾された抗体であってもよい。抗体のフラグメントとしては例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｃフラグメント、またはｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎＦｖなどが挙げられ、修飾された抗体としては例えばポリエチレングリコールなどの化合物と結合された抗体などが挙げられる。本発明の抗体は、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃの精製や検出、定量に用いることができるし、また新規ｍｆＣＹＰ２Ｃの生物学的活性を亢進または抑制する作用を有する場合には、アゴニストまたはアンタゴニストとなりうる。【００１３】
上述したように、本発明に係る新規ｍｆＣＹＰ２Ｃは、サル特有のタンパク質であるため、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃが代謝に関与する化合物については、サルと大型類人猿（ヒト、チンパンジー、オランウータン等）において代謝パターンが異なる可能性が高い。
従って、ある医薬品候補化合物の代謝試験、薬効試験、安全性試験を行う前に、in vitroで、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃが当該候補化合物の代謝に関与するかどうかを確認することにより、サルをモデル動物として試験することの可否を評価することができる。例えば、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃが、代謝に深く関与していれば、当該候補化合物のヒトにおける代謝はサルと大きく異なる可能性が示唆され、サルをモデル動物として試験を行うことは望ましくないものと評価される。一方、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃが当該候補化合物の代謝に関与していない場合は、当該候補化合物はヒトと相同性の高い別の代謝酵素によって代謝される可能性が示唆され、サルをモデル動物とした試験の結果を利用して、ヒトにおける代謝を類推することが可能と考えられる。
このように新規ｍｆＣＹＰ２Ｃを用いることによって、無駄な試験を省略し、試験を迅速化することも可能である。【００１４】
また、これまでに、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃ以上にヒトＣＹＰとの相同性が低いサルＣＹＰ遺伝子は見出されていないため、ヒトとサルにおいて代謝パターンが異なる薬物は、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃがその代謝に関与している可能性が高いことが推測される。そこで、ヒトとサルにおいて代謝パターンが異なる薬物を新規ｍｆＣＹＰ２Ｃと接触させ、適当な条件でインキュベートし、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃの当該薬物代謝への関与を測定することによって、この代謝パターンの相違の原因を評価することが可能である。
このような方法により、代謝パターンの相違が新規ｍｆＣＹＰ２Ｃに起因することがわかれば、サルをモデル動物とした試験結果に拘束されて試験を無駄に停止することなく、試験を継続、迅速化することが可能である。【００１５】
本発明はさらに、サルをモデル動物とした、ヒト用の医薬品候補化合物についての代謝、薬効および／または安全性を試験の評価に用いられる、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃを含むキットも提供する。かかるキットは、新規ｍｆＣＹＰ２Ｃが基質を代謝するのに必要な試薬、容器、装置等を含んでいてもよい。このようなキットは、サルをモデル動物とした試験結果と略同様の結果がヒトにおける試験でも得られるかどうかの推測や、ヒトとサルとにおいて試験結果が異なる場合の原因の究明、あるいは、サルをモデル動物として試験をすることの是非の検討等に用いることができる。
【実施例】
【００１６】
〔組織サンプルの調製およびRNAの抽出〕
組織サンプルは、6匹のカニクイザル（雄雌各3匹）、2匹のアカゲザル（雄）、2匹のコモン・マーモセットから採取した。
また、オランウータンとチンパンジーの組織サンプルも用意した。
RNA分解を防ぐため、すべてのサンプルは採取直後に液体窒素により凍結させ、液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いてすりつぶし、粉状にした。
続いて、Polytron PT1200E（Kinematica社）を用いて、粉状になった組織をTRIzol（Invitrogen社）中でホモジナイズし、製品の指示書に従って全RNAを抽出した後、電気泳動によってRNAサンプルの完全性（integrity）を確認した。抽出した全RNAは、DNase I（Takara社）で処理した後、GenElute Mammalian Total RNA Mini Kit（Sigma-Aldrich社）により精製した。
一方、アフリカミドリザルのサンプルとしてのCOS1細胞（ATCCより入手）、及び、ヒト肝細胞のサンプルとしてのHepG2細胞（理化学研究所より入手）は、サイトウらの方法（Saito et al., J Biol Chem, (2001) 276:38010-38022）によって培養した。細胞からのRNA抽出と、それに続くDNase I処理は、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用い、製品の指示書に従って行った。
〔カニクイザルCYP2CのcDNAの単離〕
まず、カニクイザルの肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングにすることにより、ヒトCYPに相同的の高いクローンを同定した。同定したクローンについて、インサートの全長をPCRにより増幅した。PCRは、以下を含む全量20μlの反応液中で行った。
・プライマー（各0.4μM）
FW:5'-TCAGTGGATGTTGCCTTTAC-3'  （配列番号：４）
RV:5'-TGTGGGAGGTTTTTTCTCTA-3'  （配列番号：５）
・dNTP（0.22μM）
・MgCl2(2mM)
・AmpliTaq Gold Taq polymerase（Applied Biosystems社）(1 unit)
反応条件は、最初の変性を95℃10分で行った後、95℃20秒、55℃20秒、72℃3分のサイクルを35回繰り返し、最終伸長を72℃10分とした。
1％アガロースゲル上で解析した後、PCR産物を精製し、ABI Prism BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）による塩基配列解析に用いた後、ABI-3730 DNA Analyzer（Applied Biosystems社）を使用して電気泳動を行った。
〔配列解析〕
得られた配列データを配列解析のためにDNASIS Pro（Hitachi Software社）にインポートした。ベクターの配列をトリミングした後、すべてのデータを視覚的に精査し、配列の質が不適切な領域を除去してから、各配列を統合した。
ホモロジー・サーチは、BLAST program（National Center for Biotechnology Information）によって行った。相同性の高いCYPcDNA配列を識別するために、cDNAおよびアミノ酸配列についてClustral Wを用いたマルチプル・アライメントを実行した。
発明者らが見出した21のカニクイザルのCYPのうち、mfCYP2C9v1、mfCYP2C9v3および新規mfCYP2C、ならびに公知のカニクイザルCYP遺伝子であるmfCYP2C20のマルチプル・アライメントの結果を図２に示す。上段からmfCYP2C20（配列番号：６）、mfCYP2C9v1（配列番号：７）、mfCYP2C9v3（配列番号：８）、新規mfCYP2C（配列番号：９）である。
尚、新規mfCYP2C、mfCYP2C9v1、及びmfCYP2C9v3は、the Committee on Standardized P450 Nomenclatureにより、それぞれCYP2C76、CYP2C43、及びCYP2C75と名付けられ、GenBankに、accession number DQ074806、DQ074805、DQ074807としてそれぞれ登録された。
新規mfCYP2CのcDNAの塩基配列（配列番号：１）を図１に示す。
新規mfCYP2CのcDNAは、アミノ酸数が489であるオープン・リーディング・フレームを有しており、これまでに知られているヒト及びサルのすべてのCYP2Cよりも一残基少なかった。塩基配列から推測されるアミノ酸配列は、疎水性が非常に高いN末端や、ヘム結合領域、6つの基質認識部位等（Gotoh, (1992), J. Biol Chem 267:83-90）、他のCYP2C分子に共通するアミノ酸配列を含んでいた。
cDNAの塩基配列を用いて、ヒト及びチンパンジーゲノムに対して、mfCYP2CホモログのBlat検索（UCSC Genome Bioinformatics）も行った。
相同性検索の結果を表１に示す。【００１７】
【表１】
0004972413.tif 000002
mfCYP2C9v1およびmfCYP2C9v3は、ヒトCYP2Cのアミノ酸に対して約92％の相同性を示し、これはCYP2C20等、公知のカニクイザルのCYP2C遺伝子と同じレベルであった。
しかしながら、新規mfCYP2Cのアミノ酸は、いずれのヒトCYP2Cのアミノ酸に対しても相同性が約71％しかなく、またGenBankデータベースにおいてもこれ以上の相同性を示すヒトcDNAは存在しなかった。
塩基配列の結果は、デフォルト・パラメータによるPHYLIPを使用して分子進化系統樹を描くためにも用いた。分子進化系統樹を図３に示す。この結果、新規mfCYP2C（CYP2C76）は、全てのヒトCYP2C及び他のカニクイザルCYP2Cから、離れたクレードに属することがわかった。
〔他の霊長類における新規mfCYP2Cに対応するcDNAのクローニング〕
そこで、新規mfCYP2Cが、サルに特異的に存在する遺伝子なのか、従来ヒトのホモログが見出されていないだけなのかを確認するため、いくつかの遺伝子特異的プライマーを用いてRT-PCRを行い、他の霊長類における、新規mfCYP2Cのorthologus遺伝子の有無を調べた。
他種のサルからの新規mfCYP2Cホモログは、肝（アカゲザル、コモン・マーモセット、オランウータンおよびチンパンジー）またはCOS1細胞（アフリカミドリザル）由来のRNAサンプルを用いて、RT-PCRにより同定した。RT反応は、M-MLV reverse transcriptase（Toyobo社）を用い、1μgの全RNAとオリゴ（dT）プライマーまたはランダムプライマーを使用して、37℃で1時間行った。得られたRT産物は、25倍に希釈してPCRに供した。ヒトについては、市販の肝RT産物（BD Biosciences社）を使用した。いくつかのプライマーペアを試したところ、アカゲザル、ミドリザルおよびコモン・マーモセットのCYP2CホモログのcDNAは、それぞれ以下の塩基配列を有するプライマーペアにより増幅することができた。
アカゲザル
FW: mfCYP2C (5rt2) 5'-CCCAGCAATGGATCTCTTCA-3'  （配列番号：１０）
RV: mfCYP2C (3polyA2a) 5'-TGCCTAGACAGGTAGATAGGAGTG-3'  （配列番号：１１）
アフリカミドリザル
FW: mfCYP2C (5rt2) 5'-CCCAGCAATGGATCTCTTCA-3'  （配列番号：１０）
RV: mfCYP2C (3ex4b) 5'-GAAAAGTGGGATCACAGGGA-3'  （配列番号：１２）
コモン・マーモセット
FW: mfCYP2C (5ex2a) 5'-GTATTTTCTGGCCGAGGGAG-3'  （配列番号：１３）
RV: mfCYP2C (3ex4a) 5'-ACAGGGAACACAACCCAGAA-3'  （配列番号：１４）
増幅は、KOD Plus DNA polymerase（Toyobo社）を使用してMJ Research thermal cycler（MJ Research社）によって行い、最初の変性を95℃2分で行った後、95℃20秒、55℃20秒、72℃2分のサイクルを30回繰り返し、最終伸長を72℃10分とした。
3'A-overhangを付加した後、PCR産物を、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社）を用いてベクターにクローニングした。続いて、ABI Prism BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）を用いて、インサートの塩基配列解析を行い、ABI PRISM 3730 DNA Analyzer（Applied Biosystems社）により電気泳動を行った。
この結果、増幅産物は、旧世界ザル（カニクイザル、アカゲザル、アフリカミドリザル）および新世界ザル（コモン・マーモセット）には見られ、これらのサルが新規mfCYP2Cのホモログを有しており、互いに99％以上の相同性を有することが確認された。この結果は、これらのサルが進化系統的に近い種であることを示している。
結果を図４〜６に示す。図４および５はそれぞれ新規mfCYP2CのcDNAの塩基配列を示し、上段から、カニクイザル（配列番号：１５）、アカゲザル（配列番号：１６）、アフリカミドリザル（配列番号：１７）およびコモン・マーモセット（配列番号：１８）である。図６は新規mfCYP2Cタンパク質のアミノ酸配列を示し、上段から、カニクイザル（配列番号：２）、アカゲザル（配列番号：１９）、アフリカミドリザル（配列番号：２０）およびコモン・マーモセット（配列番号：２１）である。
一方、ヒトや、チンパンジーおよびオランウータン等の大型類人猿由来のサンプルからは検出可能なバンドが得られなかった（data not shown）。さらに、Blastによるヒトおよびチンパンジーのゲノム・データベース検索でも、新規mfCYP2Cに90％以上の相同性を有する遺伝子が発見されないことから、新規mfCYP2Cは、サル特異的であることが示された。
〔新規mfCYP2Cの遺伝子構造〕
エクソンとイントロンの構造を決定するため、4種類のmfCYP2C（mfCYP2C9v1、mfCYP2C9v3、CYP2C20および新規mfCYP2C)のcDNAの塩基配列を比較して、遺伝子特異的プライマーを各エクソン上に設計し、すべてのイントロンをlong PCRによって増幅した。PCRは、LA Taq PCR kit（Takara社）を使用し、5p moleのフォワードおよびリバースプライマー（表２）、0.5mMのdNTP、2mMのMgCl2、1単位のLA Taq polymerase（Takara株式会社）を用いて全量20μlとして行った。【００１８】
【表２】
0004972413.tif 000003
PCRは、95℃2分で変性させてから、95℃20秒、55℃30秒、72℃5分のサイクルを35回繰り返し、最終伸長を72℃20分として行った。0.8％アガロースゲル上で電気泳動した後、PCR産物はゲル精製し、TOPO TAまたはXL cloning kit（Invitrogen社）を使用して、製品の指示書に従ってベクターにクローニングし、配列解析した。
配列解析は上述の方法に従って行い、initial sequencingには、以下のM13フォワードおよびリバースプライマーを用いた。
プライマー
FW: M13FW 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'  （配列番号：３８）
RV: M13RV 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' （配列番号：３９）
すべてのイントロンの塩基配列はプライマーウォーキング法により完全に決定され、当該配列は、DNASIS Pro（Hitachi Software社）により、各イントロンの全長に統合された。
この結果、新規mfCYP2Cは約19.6kbにおよび（配列番号：３）、すべてのヒトCYP2Cと同様に9つのエクソンを有する遺伝子であることが確認された（図７）。エクソンおよびイントロンのサイズは、それぞれ142-693bp、937-4307bpであった。表３に示すように、エクソン（小文字）−イントロン（大文字）の境界のほとんどは、GU-AC則に従っていたが（太字）、イントロン8の5'スプライス部位はGUがGCに置換されていた。【００１９】
【表３】
0004972413.tif 000004
〔サルCYP2C遺伝子座のゲノム構造〕
新規mfCYP2Cの種特異性を確認するために、サルのCYP2C BACクローンを用いて、ゲノムにおける新規mfCYP2C遺伝子座を解析した。カニクイザルのBACライブラリーは入手不可能であったため、代わりにアカゲザルのBACライブラリーを使用した。
アカゲザルBACライブラリー（BACPAC）を、CYP2C9v3及び新規mfCYP2CのcDNAをプローブとしてスクリーニングし、CYP2Cを含むBACクローンを単離した。ライブラリー・フィルターとのハイブリダイゼーションは、BACPACの指示書に従って行い、プローブは、［α］32P-dCTP（Amersham Biosciences社）の存在下で、RadPrime DNA labeling system（Invitrogen社）を用いて合成した。同定されたBACクローンをBACPACより入手し、BAC DNAをDNA PhasePrepTM BAC DNA Kit（Sigma-Aldrich社）により精製した。各BAC DNAに含まれるCYP2C遺伝子を同定するため、精製されたDNAをテンプレートとして、AmpliTaq Gold DNA p
olymerase（Applied Biosystems社）及び各遺伝子の5'及び3'末端に特異的なプライマーを用いて、PCRを行った。
プライマーペアは、各遺伝子のエクソン1及び9で設計し、位置は、macaqueのcDNAとヒトのCYP2C遺伝子とを比較して決定した。相同性の高いCYP2C9v1及びCYP2C9v3では、設計したプライマーは遺伝子特異的な増幅パターンを示さなかった。そこで、macaqueゲノムデータを検索してこれらの遺伝子の遺伝子特異的indelを同定し、それらのindel（insertion/deletion）を認識するプライマーを設計した。
使用したプライマーを表４に示す。Grayらの方法（Gray IC et al., Genomics, (1995) 28:328-332）に従い、増幅パターンを用いてゲノムにおけるCYP2C遺伝子のアレンジメントを決定した。同様の目的で、BACPACの指示書に従い、DNAは、BAC end sequencing及びBamHIまたはEcoRIによる制限酵素マッピングにも用いた。
【表４】
0004972413.tif 000005
この実験の過程で、アカゲザルのゲノムの一部の配列が明らかにされ、ヒトCYP2C18遺伝子の塩基配列と非常に相同性が高い遺伝子が存在することがわかった。そこで、このCYP2C18様遺伝子に特異的なプライマーを設計して、BACクローンの増幅に使用した。
各遺伝子の増幅パターンから、5つのCYP2C遺伝子は、サルゲノムでは一つのクラスタ内に存在することがわかった（図８）。さらに、BAC end sequencing及び制限酵素マッピングにより、新規mfCYP2C（図中CYP2C76で表される）がそのクラスタの末端、即ち、ヒトゲノムにおけるCYP2Cクラスタとそれに隣接する遺伝子の間の領域に位置することが確認された。この結果は、新規mfCYP2C遺伝子が種特異的に存在することを強く裏付けるものである。
〔遺伝子発現の組織分布解析〕
新規mfCYP2C、CYP2C20、CYP2C9v1、及びCYP2C9v3の遺伝子発現の組織分布を決定するため、脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、空腸、精巣、卵巣及び子宮由来のRNAを用いて、リアルタイムRT-PCRを行った。
各遺伝子に特異的なプライマー及びTaqMan（登録商標）MGBプローブは、Primer Express sftware（Applied Biosystems社）を用いて設計し、Applied Biosystems社で合成された。各プライマー及びプローブの塩基配列を表５に示す。
【表５】
0004972413.tif 000006
プローブは、5'末端をFAM fluorescence reporter dyeにより標識した。RT反応は、ランダムプライマーを用いて行い、得られた反応産物を25倍に希釈してPCRに供した。PCRは、全量25μlとしてTaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用い、ABI Prism 7700 sequence detection system（Applied Biosystems社）により行った。各プライマーの最終濃度は、CYP2C20、及びCYP2C9v1は0.3μM、CYP2C9v3は0.9μM、新規mfCYP2Cは0.1μMとした。全CYP2Cに対し、プローブの最終濃度は0.25μMとした。サーマルサイクラーの条件は、50℃で2分、95℃で10分の後、95℃15秒、60℃1分を40サイクルとした。
すべてのCYP2C遺伝子に対し、アッセイの特異性の確認は、予想されたサイズの目的PCR産物が単一のバンドとしてゲル上にあらわれること、及び、標的遺伝子のcDNAプラスミドが、他のCYP2C遺伝子に対し少なくとも500倍増幅されることを確かめることにより、行った。各遺伝子の相対的な発現レベルは、Applied Byiosystems社製のキットにより、18SリボソームRNAレベルを測定することにより標準化した。各遺伝子について、少なくとも3回の増幅を行った。
結果を図９に示す。新規mfCYP2C（図中CYP2C76で表される）、肝臓における発現が圧倒的に多かったが、他の組織でも発現が見られた。また、追加の解析により、心臓、筋肉、脳等、通常P450が発現しない種々の組織においても新規mfCYP2Cの発現が見られ、また雄と雌では約2倍の発現量の差があることが認められた（図１０）。
〔新規mfCYP2C遺伝子のためのレポーター・プラスミドの構築および配列解析〕
Inverse PCRにより、5'フランキング領域を同定した。以下に、方法を説明する。まず、各カニクイザル由来のゲノムDNAの1μgをPstI存在下、37℃で一晩消化した。この生成物を、フェノール：クロロホルム（1：1）の溶媒で抽出精製した後、エタノール沈殿を行った。得られたDNAをLigation high（Toyobo社）を用いて16℃でセルフライゲーションさせた後、同様の方法で精製した。精製したDNAは、KOD plus DNA polymerase（Toyobo社）および新規mfCYP2C cDNA配列の5'末端をもとに設計した以下に示す2つのプライマーと共に、PCRに供した。
プライマー
FW: mfCYP2C (5inv3) 5'-TCCTCTCCCCGTTATTGGAA-3'  （配列番号：８８）
RV: mfCYP2C (3inv2) 5'-CACCAGGATGATGAAGAGATCC-3'  （配列番号：８９）
増幅したDNAを1％アガロースゲルでゲル精製した後、mfCYP2C（5inv3）を用いてシーケンスを行い、5'フランキング領域の最末端の塩基配列を決定した。この配列に基づき、2つのプライマーをさらに設計した。
プライマー
FW: mfCYP2C (5flk1aK) 5'-CGGGGTACCGCAGGCCAACATTCAAATTC-3'（配列番号：９０）
RV: mfCYP2C (3flk1aH) 5'-CCCAAGCTTGCTGGGCTCTTTGAAAAC-3'（配列番号：９１）
PCRは上述の方法で行い、PCR産物はpGL3-basicベクター（Promega社）にクローニングした。インサートの全長の塩基配列を決定した後、決定した配列では、TRANSFACを使用した調節エレメント探索を行い、構築物は、レポーターアッセイに用いた。
TRANSFACプログラムによる解析では、主要な肝臓の転写因子の結合部位が見出された（threshold score≧75.0）（図１１）。各結合部位の位置（location）は、転写開始部位をゼロとして示されている。
〔新規mfCYP2C遺伝子の5'フランキング領域のレポーターアッセイ〕
HepG2細胞を独立行政法人理化学研究所から購入し、Dulbecco's modified Eagle's Medium（日水製薬株式会社）に、10％のウシ胎児血清（Cambrex Bioscience Walkersville社）、非必須アミノ酸（ICN社）および1mMのピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）を添加した培地で、37℃5％CO2供給下で培養した。12ウェルのプレートに、2×105個/ウェルとなるように移した後、24時間インキュベートした。
次に、これらの細胞を、レポーター構築物（0.45μg）、pRL-SV40（0.05μg；Promega社；内部標準）により形質転換した（FuGENE6（Roche Diagnostics社）を使用）。アッセイの際、必要に応じて、肝臓の主要な転写因子であるHNF1α、HNF3βおよびHNF4αのoverexpression vectorを加えた。
48時間後、これらの細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、製品の指示書に従ってdual-luciferase assay（Promega社）に供した。
結果を図２２に示す。
すべての転写因子が新規mfCYP2Cの発現を著しく亢進させ、中でもHNF1αによる効果が最も大きかった。これらの結果は、新規mfCYP2C遺伝子の発現調節にこれらの転写因子が重要な機能を果たすことを示す。また、新規mfCYP2Cが、RT-PCRで解析した組織の中で、肝臓において高く発現していた結果と一致する。
〔E.Coliにおける4つのサルCYP2Cタンパク質の発現〕
新規mfCYP2C、mfCYP2C9v1、mfCYP2c9v3およびCYP2C20のcDNAを用いて、Iwataらの方法（Iwata, H. et al., Biochem Pharmacol (1998) 55:1315-1325）に従って各タンパク質を発現させた。タンパク質の発現レベルを上昇させるために、各cDNAのオープン・リーディング・フレーム（ORF）を、表６に示すプライマーとKOD Plus DNA polymerase（Toyobo社）を用いて増幅することにより、N末端の8残基を、ウシCYP17のN末端の8残基であるMALLLAVFに置換した（Barnes, HJ et al., Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88:5597-5601）。【００２０】
【表６】
0004972413.tif 000007
NdeI認識部位とXbaI認識部位をそれぞれ含むフォワードおよびリバースプライマーを用いることにより、PCR産物を、Iwataらが、ヒト・レダクターゼcDNAと共発現させるようにpCWベクター（Barnes, HJ., Methods Enzymol (1996) 272:3-14）をもとに作製したベクターに直接クローニングした。本発明者らは、この構築物をそれぞれのcDNAの由来に因んで、pCW-CYP2C20/OR、pCW-mfCYP2C9v1/OR、pCW-mfCYP2C9v2/ORおよびpCW-新規mfCYP2C/ORと名付けた。
DH5α competent cells（Invitrogen社）を形質転換した後、インサートの塩基配列と配向性をシーケンシングにより確認した。バクテリアは、100μg/mlのアンピシリンを含むLuria-bertani broth中で一晩培養した後、Iwataらの方法（1998）に従って調整した。Terrific Brothで100倍に希釈し、200μg/mlのアンピシリン存在下、30℃で6時間から12時間、OD600が約0.6〜0.8になるまで培養した。
続いてイソプロピル-B-D-チオガラクトシド(IPTG)を最終濃度が1.5mMとなるように培養液に添加した。16時間から20時間後、公知の方法（Omura, T. et al., J Biol Chem (1964) 239:2379-2385）に従い、U-3000 spectrophotometer（Shimadzu社）を使用して、培養物のP450スペクトルを求めた。結果を図１３に示す。
P450の発現を確認した後、培養した細胞を採取し、細胞膜画分を調製した。そして、Iwataらの方法（1998）に従って、P450およびNAPDH-P450レダクターゼの濃度を測定した。
〔4つのサルCYP2Cの代謝活性〕
すべて組換えCYP2Cタンパク質を用いて、4つの基質、taxol、tolbutamide、S-mephenytoinおよびtestosteroneに対する新規mfCYP2C、CYP2C20、CYP2C9v1、及びCYP2C9v3の代謝活性を解析した。
反応混合物は、以下のように調製した。まず、14C-taxol (6μM)、14C-tolbutamide (100μM)、14C-testosterone (50μM)、14C-S-mephenytoin (50μM)と、サル肝ミクロゾーム若しくは精製した組換えCYP2Cとを、チューブに用意し、37℃で5分、インキュベートした。続いて、代謝反応を開始させるため、1.3mMのNADP+、3.3mMのグルコース-6-リン酸、0.4U/mlのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、および3.3mMの塩化マグネシウを溶解させた100mMリン酸ナトリウム緩衝液を含むNADPH再生系を添加した。最終濃度は、1mg protein/mL、または200pmol P450/mLであった。
taxolとtestosteroneについては37℃で15分、S-mephenytoinについては45分、tolbutamideについては60分インキュベートした後、等量のメタノールを加えて反応を停止させた。組換えmfCYP2Cタンパク質の場合は、いずれの化合物についてもインキュベーションは30分とした。反応終了後、サンプルは、遠心分離され、各アリコットは、乾燥するまで上清を蒸発させ、残渣を15μlのメタノールに溶解させた。
6α-hydroxytaxolと3-hydroxytaxolの分析は、藤野らの方法（Fujino, H. et al., J Chromatogr B Biomed Sci Appl (2001) 757:143-150）に従って行った。各上清2μlずつを、TLCプレート(Silicagel 60F254, 20x20 cm, Merck)にスポットし、展開溶媒（トルエン‐アセトン‐ギ酸(60:39:1,v/v/v)）と共に、溶媒蒸気で飽和させた水平なTLC展開槽に12cm展開した。
6β-hydroxytestosteroneの場合は、展開溶媒をジクロロメタン−アセトン（4:1,v/v）とし、16cm展開した。
4-hydroxytolbutamideは、Ludwigらの方法（Ludwig, E. et al., J Chromatogr B Biomed Sci Appl (1998) 707:347-350）に従って、展開溶媒をトルエン−アセトン−ギ酸(60:39:1,v/v/v)とし、10cm展開した。
S-mephenytoin 4-hydroxylase活性は、Shimadaらの方法（Shimada, T. et al., Anal Biochem (1985) 147:174-179）に従って測定し、展開溶媒をクロロホルム−メタノール−28％アンモニア(90:10:1,v/v/v)とし12cm展開した。
TLCプレートを乾燥し、phosphor imaging plate (IP)に接触させて12時間静置した。化合物と代謝産物の量の変化は、BAS-2500（富士フイルム社）を使用して測定した。放射性を示す代謝産物のRf値が、標識なしの標準に比較して明確に識別された。
結果を図１４に示す。レーン1はサルの肝ミクロゾーム、レーン2はCYP2C20、レーン3はCYP2C9v1、レーン4はCYP2C9v3、レーン5は新規mfCYP2Cである。
新規mfCYP2Cは、4つの基質のうち、tolbutamideとtestosteroneを代謝することが確認された。
これに対し、mfCYP2C20は、taxolを代謝したが、他の化合物に対しては代謝活性を有しなかった。また、mfCYP2C9v3はtolbutamide、S-mephenytoin、testosteroneを、mfCYP2C9v1は、S-mephenytoinとtestosteroneを代謝することが確認された。
新規mfCYP2C、mfCYP2C9v1、mfCYP2C9v3は、いずれもtestosteroneを基質とした代謝活性を示したが、代謝産物は同一ではなかった。
以上から、サル特異的な新規mfCYP2Cタンパク質が、ある種の薬物に対して代謝活性を示すことが確認された。このことは、新規mfCYP2Cがサルとそれ以外の霊長類における代謝パターンの相違の一因となっていることを示唆するものである。
〔抗新規mfCYP2C抗体の作製及びイムノブロッティング〕
新規mfCYP2Cに対するポリクローナル抗体は、このタンパク質の特異的なアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、このペプチドでウサギを免疫することによって、NeoMPS社（SanDiego,CA）で産生された。まず、4つのmfCYP2Cの配列を比較することによって選択した特異的なアミノ酸配列をもとに以下の2つのペプチドを合成した。
（A） H-CQLNTKNISKSISMLA-NH2  （配列番号：９８）
（B） H-CLYNAFPHLRVL-NH2  （配列番号：９９）
合成したペプチドは精製し、C末端のシステイン残基のチオール基を介してKeyhole Limpet Hemocyanin（キャリアタンパク質）に結合させ、New Zealand White Rabbitを免疫し、ウサギ抗新規mfCYP2C抗体を得た（図１５）。
遺伝子組換えP450タンパク質として、サルCYP2CからCYP2C20、CYP2C9v1、CYP2C9v3、及び新規mfCYP2C、またヒトCYP2CからCYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、及びCYP2C19（各1.0pmol）を10％SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Hybond-P filter（Amersham Biosciences社）上に移行した。このフィルターを用いて、ウサギ抗新規mfCYP2C抗体（1:250）、及びホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたロバ抗ウサギIgG抗体（SantaCruz Biotechnology社）を用いたイムノブロッティングを行った。製品の指示書に従い、ECL Western Blotting detection reagent（Amersham Biosciences社）により可視化したところ、抗体（Ａ）を使用した場合のみ、新規mfCYP2C（CYP2C76）に相当するバンドが1つのみ得られ、免疫特異性が確認された（図１６（Ａ））。
また、ヒト、チンパンジー、オランウータン、カニクイザル、及びアカゲザルの5種類の霊長類から調製した肝ミクロソームを使用した抗新規mfCYP2C（CYP2C76）抗体によるイムノブロッティングも行った。期待されたサイズのバンドが、カニクイザル及びアカゲザルのサンプルにおいてのみ確認され、新規mfCYP2C遺伝子の発現パターンと一致した結果が得られた（図１６（Ｂ））。
〔免疫組織化学〕
カニクイザルの肝臓の切片を用いて、標準的方法に従い、抗新規mfCYP2C抗体による免疫組織化学染色を行った。一次抗体は50倍に希釈し、切片に接触させて4℃で一晩放置した。結合した抗体を、EnVision+System及びliquid diaminobenzidine（いずれもDakoCytomation社）を用い、製品の指示書に従って検出した。スライドを、harris hematoxylinにより対照染色した。ネガティブ・コントロールとして、ウサギのpreimmune血清を一次抗体の代わりに使用した。免疫組織化学特異性を検証するために、抗体は、過剰量の新規mfCYP2C特異的ペプチド（0.05mg/ml）と共に4℃で一晩プレインキュベートし、一次抗体の代わりに使用した。この結果、肝細胞は強く染色されたが、胆管や血管の細胞は染色されなかった。ブロッキングペプチドまたは免疫前血清の存在下では、染色は見られず（図１７）、染色が新規mfCYP2Cに特異的であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１上段は、新規mfCYP2CのcDNAの塩基配列（配列番号：１）を、下段は新規mfCYP2Cタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。枠で囲まれているのは、ヘム結合領域と推定される領域である。Alternative polyadenylationにより長い3'非翻訳領域をもつtranscript variantにおける延長部分（281塩基）には下線が引かれている。破線の引かれたアミノ酸配列は、抗新規mfCYP2C抗体を産生する際に用いたペプチドの配列である。cDNAは1666塩基長からなり、489アミノ酸残基のオープン・リーディング・フレームを含んでいる。
【図２】4種のサルCYP2Cタンパク質のアミノ酸配列のマルチプル・アライメントである。上段から、CYP2C20（配列番号：１１）、mfCYP2C9v1（配列番号：１２）、mfCYP2C9v3（配列番号：１３）、新規mfCYP2C（配列番号：１４）のアミノ酸配列を示す。新規mfCYP2Cは489アミノ酸残基を有し、他のサルCYP2Cタンパク質およびヒトCYP2Cタンパク質より1残基短い。
【図３】ニワトリ(c)、ヒト(h)、ブタ(pig)、イヌ(dog)、ウサギ(rab)、マウス(m)、カニクイザル（mf）、ラット(r)、のCYP2Cのアミノ酸配列を使用して描いた分子進化系統樹である。新規mfCYP2Cの配列は、ヒトよりも他の動物種のものに、より類似することが示された。
【図４】他のサルにおける新規mfCYP2CホモログのcDNAのマルチプル・アライメントである。上段から、カニクイザル（配列番号：１の一部）、アカゲザル（配列番号：１５）、アフリカミドリザル（配列番号：１６）、コモン・マーモセット（配列番号：１７）のcDNAの塩基配列を示す。配列の種差により、コード領域を完全に増幅できたのはアカゲザルだけであり、アフリカミドリザルおよびコモン・マーモセットについては、それぞれエクソン1-4およびエクソン2-4が増幅された。種間において、数個の残基が異なるのみであり、100％に近い相同性が見られた。
【図５】図１５の続きであり、他のサルにおける新規mfCYP2CホモログのcDNAのマルチプル・アライメントを示す。
【図６】他のサルにおける新規mfCYP2Cホモログのタンパク質のアミノ酸配列のマルチプル・アライメントである。上段から、カニクイザル（配列番号：２）、アカゲザル（配列番号：１８）、アフリカミドリザル（配列番号：１９）、コモン・マーモセット（配列番号：２０）の新規mfCYP2Cタンパク質ホモログのアミノ酸配列を示す。
【図７】各エクソン上で設計された遺伝子特異的プライマーを使用してlong-distance PCRを行い、全イントロンの配列を解析することにより決定した、新規mfCYP2Cのエクソン−イントロン構造である。新規mfCYP2C遺伝子は、ヒトCYP2C遺伝子と同様に、9つのエクソンを含んでいることが確認された。
【図８】CYP2C BACクローンのPCR増幅パターン、制限酵素マッピング、end-sequencingにより決定されたサルCYP2C遺伝子の構造を示す。尚、CYP2C9v1及びCYP2C9v3（図中それぞれCYP2C43及びCYP2C75と表される）は相互に相同性が高く、ゲノム上の位置が決定できなかったため、仮の順序で描かれている。サル特異的な新規mfCYP2C（図中CYP2C76と表される）は、CYP2Cクラスタの末端に位置するが、この位置は、ヒトのゲノムの対応する領域においては遺伝子と遺伝子の間の領域である。破線は明確な増幅が起こらなかったBACクローンを示す。
【図９】サルCYP2C遺伝子発現の組織分布を示す。10種類の組織サンプルから得た全RNAを使用して、リアルタイムRT-PCRを行った。すべてのCYP2Cについて肝臓での発現がもっとも高く、新規mfCYP2C（CYP2C76）の発現がもっとも顕著であった。
【図１０】雄と雌における新規mfCYP2Cの発現量の差を測定した結果である。雄の発現量は、雌の約2倍であった。
【図１１】TRNASFACプログラムによって同定された（threshold score≧75.0）、主な肝臓特異的転写因子（HNF1α、HNF3β、HNF4α）に対するDNA結合エレメントである。各エレメントの位置は、転写開始点をゼロとして計算されている。
【図１２】約1kbの5'フランキング領域をルシフェラーゼアッセイにより分析した。アッセイは、HepG2細胞中のpGL-1kb構築物を使用して行い、必要に応じて転写因子を加えた。全ての因子、特にHNF1αは、新規mfCYP2Cの発現を著しく亢進させた。
【図１３】大腸菌における組換え新規mfCYP2Cタンパク質の発現を確認するCO-difference spectraである。P450タンパク質に特有のピーク(450nm)が確認できる。
【図１４】E.Coli中で発現させたサルCYP2Cの代謝活性を示す。レーン1〜5は、それぞれサル肝ミクロゾーム、CYP2C20、CYP2C9v1、CYP2C9v3、及び新規mfCYP2Cを示す。
【図１５】図１に示されるアミノ酸配列を有する合成ペプチドでウサギを免疫して作製した抗体である。図２５Ａは、ペプチドH-CQLNTKNISKSISMLA-NH2（配列番号：２９）を抗原として、同図Ｂは、ペプチドH-CLYNAFPHLRVL-NH2（配列番号：３０）を抗原として得られた抗体である。
【図１６】Ａ．抗新規mfCYP2C抗体を使用したイムノブロッティングの結果を示す。サル及びヒトの8種類のP450を電気泳動後PVDFフィルターに移行させ、抗新規mfCYP2C抗体を結合させた。新規mfCYP2C（CYP2C76）のバンドのみが検出できた。Ｂ．Ａと同様の方法で、複数の動物の肝ミクロゾームにおける新規mfCYP2Cのホモログを探索した。コントロールとしてのPDIタンパク質は、全てのサンプルにおいて検出されたが、新規mfCYP2Cタンパク質は、カニクイザルとアカゲザルのみでしか検出されなかった。
【図１７】肝における新規mfCYP2Cタンパク質の免疫組織化学染色の結果を示す。（Ａ）は、抗新規mfCYP2C抗体による免疫染色、（Ｂ）は、ペプチドブロッキングによる前処理を行った場合、（Ｃ）は、免疫前染色を行った場合の結果を示す。肝細胞における強い染色が確認されたが、胆管（矢印）及び静脈（三角）の上皮細胞では確認されなかった。（Ｂ）および（Ｃ）ではほとんど染色されなかった。実線のスケールは100μmを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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