(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子と１−デオキシ−Ｄ−キシロース５−リン酸合成酵素、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素、フィトエン合成酵素、リコペン合成酵素、β−サイクラーゼ、ケトラーゼ、及びカプサンチン・カプソルビン合成酵素から成る群より選択される１種又は２種以上のカロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含有する組換えベクター。
（ａ）配列番号３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチド
【請求項２】
請求項１に記載の組換えベクターを導入した植物細胞。
【請求項３】
配列番号２９に示す塩基配列からなる遺伝子と配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子との融合遺伝子を導入した植物細胞。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子と１−デオキシ−Ｄ−キシロース５−リン酸合成酵素、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素、フィトエン合成酵素、リコペン合成酵素、β−サイクラーゼ、ケトラーゼ、及びカプサンチン・カプソルビン合成酵素から成る群より選択される１種又は２種以上のカロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを特徴とする、黄色系の花弁を有する植物体を作成する方法。
（ａ）配列番号３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花弁有色体に移行する活性を有するペプチド（トランジットペプチド）、及び該ペプチドを用いて黄色系（黄色や橙色、赤色に至る色調）の花弁を有する植物を作成する方法に関する。詳しくは、本発明は、カロテノイド合成系酵素が機能していない、又は該酵素活性が弱いために、花弁の黄色系が無い、又は少ない植物に、花弁有色体に移行するトランジットペプチド配列を連結したカロテノイド合成系に関与する種々の酵素タンパク質をコードする遺伝子を導入することによって、黄色系の花弁を有する植物を作成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
花卉の特性で最も重要な性質は花色である。そのなかでも黄色系（黄色や橙色、赤色に至る色調）の花色は重要である。これまで、鮮やかな黄色系の花色を得るため、交雑による育種が行われてきた。バラでは、従来観賞用に用いられてきたオールド・ガーデン・ローズには黄色系の花色は無く、西アジアに存在したＲｏｓａ ｆｏｅｔｉｄａを導入することにより濃黄色系の花色を得ている［大場秀章，中公新書，バラの誕生（１９９０）］。また、ハナショウブでも、近縁のキショウブを交雑することにより黄色系の花色を得ている［藪谷勤，誠文堂新光社，バイオフォルディ，１，６４−７１（１９９０）］。しかしながら、このような交雑による育種では、交雑可能な黄色の野生種が存在することが必要であり、また、多大の労力と時間が必要である。実際、園芸植物として重要なペチュニアやアスター、リンドウ、サルビアなどでは鮮やかな黄色系を持つものは従来の交雑による育種では得られていない。
【０００３】
黄色系の花色は、主にカロテノイド及びベタレインに由来することが多く、一部はフラボノイドに由来する。その中でも鮮やかな黄色系の花色はカロテノイドに由来する。
【０００４】
カロテノイド（ここでいうカロテノイドは酸素を含む置換基をもつキサントフィルを含めた広義のカロテノイドを指す［斎藤規夫，誠文堂新光社，バイオフォルディ，１，４９−５７（１９９０）］。）のうち、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を経てβ−カロテンに至るまでの上流側のカロテノイド合成に関与する遺伝子として、Ｅｒｖｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来のＧＧＰＰ合成酵素、フィトエン合成酵素、リコペン合成酵素、β−サイクラーゼの各酵素タンパク質をコードする遺伝子が三沢らによって単離された（特許第２９５０８８８号）。これを契機に、様々な微生物や植物からカロテノイドの代謝遺伝子の単離が進んだ（国際公開公報２００３／０１６５０３など）。また、ケトカロテノイド（カンタキサンチン、アスタキサンチンなど）の合成に関与する遺伝子（ケトラーゼ遺伝子）は、三沢らにより微生物（特許第３３７５６３９号）や緑藻（特許第２９６０９６７号）から取得されている。ケトラーゼ遺伝子はまた、酵母Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ（米国特許６，３６５，３８６号）や植物Ａｄｏｎｉｓａｅｓｔｉｖａｌｉｓ（国際公開公報９９／６１６２５号）からも取得されている。さらに、これらの遺伝子を用いた形質転換により微生物（大腸菌）や酵母［三浦ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，１２２６−１２２９（１９９８）］でのケトカロテノイド（カンタキサンチン、アスタキサンチン）の生産に成功している。植物でも、これら遺伝子を用いてカロテノイドの産出・増産が図られ、イネの種子（米）［Ｙｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，３０３−３０５（２０００）］やナタネやシロイヌナズナの種子［Ｓｈｅｗｍａｋｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２０，４０１−４１２（１９９９）；Ｓｔａｌｂｅｒｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，３６，７７１−７７９（２００３）］にカロテノイドを蓄積させる例が報告されている。しかし、これら成功例は種子での蓄積例であり、花弁での増産については成功した報告はない。Ｈｉｒｓｈｂｅｒｇらはタバコで緑藻から取得されたケトラーゼ遺伝子を発現させたが、花弁での発現に失敗し、蜜腺でのみ発現したことを報告している［Ｍａｎｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，８８８−８９２（２０００）］。また、同じくケトカロテノイドとして知られているカプサンチンやカプソルビンを合成する鍵酵素であり、トウガラシの黄色系色素を生成するカプサンチン・カプソルビン合成酵素の酵素タンパク質をコードする遺伝子もクローニングされているが［Ｂｏｕｖｉｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，４５−５４（１９９４）］、花色改変には利用されていない［Ｄａｖｉｅｓら，Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔ．，６２４，４３５−４４７（２００３）］。
【０００５】
カロテノイド合成系を遺伝子導入することによって増産する例は、植物では上記に記載したイネの種子（米）［Ｙｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８７，３０３−３０５（２０００）］やナタネの種子［Ｓｈｅｗｍａｋｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２０，４０１−４１２（１９９９）］にカロテノイドを蓄積させる例が報告されている。微生物や酵母でも幾つかの報告がなされている［Ｋａｊｉｗａｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３２４，４２１−６（１９９７）；Ｓｈｉｍａｄａら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，２６７６−８０（１９９８）；Ｍａｔｔｈｅｗｓら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，３９６−４００（２０００）；Ｋｉｍ  ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，７２，４０８−１５（２００１）］。この際に使用された遺伝子は、カロテンを合成するまでの段階でのさまざまな上流の酵素遺伝子（フィトエン合成酵素遺伝子、リコペン合成酵素遺伝子（フィトエンデサチュラーゼ）、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素、１−デオキシ−Ｄ−キシロース５−リン酸合成酵素）であり、生物種（宿主）それぞれによって異なる遺伝子によって増強されるとされている。これらの結果から示されることは、宿主により大きく代謝経路の律速状況が違うため、カロテノイドを増産するために増強すべき遺伝子は試してみなければ確定は難しいということである。特に花弁でのカロテノイド生産に関する明示的な研究はないことから、様々な上流のカロテノイド合成酵素遺伝子を個々又は２個以上組合わせて導入し、花弁の黄色系化に効果があるかを検討する必要がある。
【０００６】
植物でのカロテノイド合成は一般に色素体で行われる。色素体は、原色素体から葉や茎などの緑色で光合成を行っている細胞では葉緑体に、根など白色の組織の細胞では澱粉やタンパク質を貯蔵する白色体に、花や実などの細胞ではカロテノイドを蓄積する有色体に分化すること、また、これらは電子顕微鏡での形態観察から異なるものであることが知られている。
【０００７】
葉緑体で核ＤＮＡからタンパク質を発現する際はトランジットペプチドが必要である。微生物など葉緑体を持たない生物由来の遺伝子や葉緑体ではないところで発現している遺伝子を葉緑体で発現させるためには、葉緑体へ遺伝子産物を輸送する機能を持つ配列であるトランジットペプチドのｃＤＮＡ配列を、発現させたい遺伝子配列の前につけ、これにより葉緑体へ遺伝子産物が輸送される［Ｋｅｅｇｓｔｒａ，Ｃｅｌｌ，５６，２４７−２５３（１９８９）］。最も一般的に使用される配列は、エンドウのリブロースビスリン酸オキシゲナーゼ／カルボキシラーゼ（ルビスコ）タンパク質小サブユニット由来のトランジットペプチドである［Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４，２５−３２（１９８５）及び三沢ら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４，８３３−８４０（１９９３）］。
【０００８】
このように、葉緑体へ遺伝子産物を輸送するためのトランジットペプチドについては知られているものの、有色体、とくに花弁でのカロテノイドの合成やタンパク質移行に関するトランジットペプチドの研究はこれまで存在しない。また、トランジットペプチドには基質特異性や器官特異性がないと考えが一般的である［ＪａｒｖｉｓとＳｏｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．，１５４１，６４−７９（２００１）］。従って、三沢らが取得した微生物や緑藻のケトラーゼ遺伝子とを用いてペチュニアやマリーゴールドを形質転換し、それらの花弁での発現が試みられている例はあるものの（米国公開特許公報２００４／０００３４３０）、用いられているトランジットペプチドは、上記の葉緑体への移行シグナルであるエンドウのルビスコタンパク質小サブユニット由来のトランジットペプチドである。また、本文献ではフィトエン合成酵素遺伝子とケトラーゼ遺伝子の各々を別個に導入した形質転換体同士を交配したものではじめて花色の変化を認めている。また、各々を導入した形質転換植物では、同公報のデータ（表１２−１３）を見る限り、形質転換植物の花弁において花色の変化を目視にて検知でき、且つ園芸上価値のある色彩としての満足の行く色素の蓄積が行われているとはいえない。
【０００９】
従って、カロテノイド合成系に関与する種々の酵素タンパク質をコードする遺伝子によ
る花弁での発現技術は確立されておらず、黄色系の花色のない、又は少ない植物に、黄色
系の花色を付与する、又は増強するには至っていない。
【００１０】
よって、本発明は、黄色系の花色のない、又は少ない植物に対し、黄色系の花色を付与
する、又は増強する手段を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、新たに花弁の有色体で機能するトランジットペプチドを見出し、該トランジットペプチドをコードする遺伝子をカロテノイド合成系に関与する種々の酵素タンパク質をコードする遺伝子に連結させて植物に導入したところ、黄色系の花弁を有する植物を得ることができ、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
１）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）配列番号２、４、３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号２、４、３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチド
【００１３】
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２、４、３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号２、４、３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチド
【００１４】
（３）以下の（ｃ）又は（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）配列番号１、３、２９、３１、又は３３のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、３、２９、３１、又は３３のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１、３、２９、３１、又は３３のいずれかに示す塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ
【００１５】
（４）（２）又は（３）に記載の遺伝子と１種又は２種以上のカロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含有する組換えベクター。
（５）カロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質が、１−デオキシ−Ｄ−キシロース５−リン酸合成酵素、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素、フィトエン合成酵素、リコペン合成酵素、β−サイクラーゼ、ケトラーゼ、又はカプサンチン・カプソルビン合成酵素である、（４）に記載の組換えベクター。
（６）（４）又は（５）に記載の組換えベクターを導入した植物細胞。
【００１６】
（７）以下のいずれかの融合遺伝子を導入した植物細胞。
（ｆ）配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子と配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子との融合遺伝子。
（ｇ）列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子と配列番号９に示す塩基配列から遺伝子との融合遺伝子。
（ｈ）配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子と配列番号１４に示す塩基配列からなる遺伝子との融合遺伝子。
【００１７】
（８）花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチドをコードする遺伝子と１種又は２種以上のカロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを特徴とする、黄色系の花弁を有する植物体を作成する方法。
（９）花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチドが、ペチュニアのフィブリリン遺伝子のトランジットペプチド、トウガラシのカプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子のトランジットペプチド、又はアグロバクテリウムのサイトカイニン合成酵素遺伝子のトランジットペプチドである、（８）に記載の方法。
【００１８】
（１０）請求項２又は３に記載の遺伝子と１種又は２種以上のカロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを特徴とする、黄色系の花弁を有する植物体を作成する方法。
（１１）カロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質が、１−デオキシ−Ｄ−キシロース５−リン酸合成酵素、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素、フィトエン合成酵素、リコペン合成酵素、β−サイクラーゼ、ケトラーゼ、又はカプサンチン・カプソルビン合成酵素である、（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
本発明によれば、花弁の有色体に効率的に移行するトランジットペプチドが提供される。該トランジットペプチドを用いてカロテノイド合成系に関与する種々の酵素タンパク質をコードする遺伝子を植物に導入すれば、これまで黄色系（黄色や橙色、赤色に至る色調）の花色のなかった、又は少ない植物に黄色系の花色を付与する、又は増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、発明のペチュニア・フィブリリンのｃＤＮＡ配列から予想されるトランジットペプチド（上段）と、公知のエンドウのトランジットペプチド（下段）のアミノ酸配列とをＤＮＡ解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ（ｖｅｒ４．０、ゼネティックス社）で解析した結果、有意な相同性が見られないことを示す図である。
【図２】図２は、各種の形質転換用ベクターの構造を示す。
【図３】図３は、カロテノイド合成系、及び該合成系に関与する遺伝子を示す（ＤＸＳ：１−デオキシ−Ｄ−キシロース５−リン酸合成酵素遺伝子、ＩＤＩ１：イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）イソメラーゼ遺伝子、ｃｒｔＥ：ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子、ｃｒｔＢ：フィトエン合成酵素遺伝子、ｃｒｔＩ：リコペン合成酵素遺伝子、ｃｒｔＹ：β−サイクラーゼ遺伝子、ｃｒｔＷ：ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓのケトラーゼ遺伝子、ｂｋｔ：Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓのケトラーゼ遺伝子、ＣＣＳ：カプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子）。
【図４】図４は、ｐＫＴ１２３による形質転換体又は非形質転換体の花弁と、日本園芸植物標準色票との比較を示す。
【図５】図５は、ｐＫＴ１３９による形質転換体と非形質転換体の花弁の比較写真を示す。
【図６】図６は、ｉｐｔ遺伝子を含む形質転換用ベクターの構造を示す。
【図７】図７は、ｐＫＴ１８３による形質転換体、ｐＫＴ１２３による形質転換体、及び非形質転換体の花弁の比較写真を示す。左上から反時計回りにｐＫＴ１８３（系統番号：８、２１）、ｐＫＴ１２３（系統番号：３）、非形質転換体。
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年１１月２９日に出願された日本国
特許出願２００４−３４４０５９号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書
及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【００２２】
１．トランジットペプチドとそれをコードする遺伝子
本発明のペプチドは、花弁の有色体へ移行し、該ペプチドに連結した目的タンパク質を花弁の有色体で発現させる機能を有するトランジットペプチドである。
本発明により新たに見出された上記機能を有するトランジットペプチドは、ペチュニアのフィブリリン遺伝子のトランジットペプチド、又はトウガラシのカプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子のトランジットペプチド、又はアグロバクテリウムのサイトカイニン合成酵素遺伝子のトランジットペプチドである。
【００２３】
本発明のトランジッドペプチドは、具体的には、（ａ）配列番号２、４、３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号２、４、３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花弁の有色体へ移行する
活性を有するペプチドである。
【００２４】
更に、このような植物遺伝子配列に内在するＤＮＡ配列はもちろん、他の生物種の遺伝子配列に内在するＤＮＡ配列や人工的に作成されたＤＮＡ配列でも花弁の有色体へ移行する活性を有する限りにおいて本発明のトランジットペプチドとして用いることができる。
より具体的な説明は後述する。
【００２５】
上記の「配列番号２、４、３０、３２、又は３４のいずれかに示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から５個、好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２６】
アミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加は、上記ペプチドをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異が導入される。
【００２７】
上記の「花弁の有色体へ移行する活性」とは、花弁の有色体にのみ特異的かつ選択的に移行し、連結した目的タンパク質をコードする遺伝子（以下、「目的遺伝子」という）を花弁の有色体において発現させることのできる活性をいい、「花弁の有色体へ移行する活性を有する」とは、該活性が、配列番号２、４、３０、３２、又は３４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが有する活性と実質的に同等であることをいう。
【００２８】
上記のような変異ペプチドが、実際に花弁の有色体へ移行する活性を有するか否かは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）等の遺伝子を上記ペプチドをコードする遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを用いて従来より周知慣用されている種々の形質転換法（後述）により植物細胞に挿入した後、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認できる。さらに最も良い方法は、カロテノイドを産生するペチュニアに対しケトラーゼ遺伝子やカプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子をレポーター遺伝子として使用して花弁の着色の変化を測定することである。このような測定法は、当該変異ペプチドのみならず、元のトランジットペプチドそのもの
の評価に際しても適用できる。
【００２９】
本法を用いることにより植物遺伝子配列に内在するＤＮＡ配列はもちろん、他の生物種の遺伝子配列に内在するＤＮＡ配列や人工的に作成されたＤＮＡ配列でも容易に花弁へ移行する活性を有するか否かを判定できる。具体的には、例えば以下の方法により、本来トランジットペプチドとして機能していない配列でも花弁の有色体へ移行する活性を有するトランジットペプチドとして同定することができる。他の生物種の遺伝子配列に内在するＤＮＡ配列のうち、酵母の当該配列について述べる。酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の全遺伝子配列は決定されている［Ｇｏｆｆｅａｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，５４６，５６３−７（１９９６）］。６０００弱のタンパク質の配列が予想されており、それらの配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）で公開されている。このタンパク質の配列をＣｈｌｏｒｏＰ［Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，８，９７８−９８４（１９９９）］を使い、トンジットペプチドの活性を持つ可能性のある配列を選び出すことができる。培養した酵母からＤＮＡを抽出し、適切なＤＮＡプライマーでトランジットペプチドの活性を持つ可能性のある配列をＰＣＲにより増幅し、得られたＤＮＡ断片を、例えば、ｐＫＴ１２３中のペチュニア・フィブリリンのトランジットペプチドをコードするｃＤＮＡやｐＫＴ１５０中のカプサンチン・カプソルビン合成酵素のトランジットペプチドやをコードするｃＤＮＡと置き換え、更に、例えばケトラーゼ遺伝子やカプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子等のカロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子に連結した植物形質転換用ベクターを作成し、後記実施例６に従い形質転換植物体を作製する。得られた形質転換体について、例えば、後記実施例７に従い橙色花色評価試験を行い、当該植物体で花の着色変化を測定することで花弁の有色体へ移行する活性を有する配列を適切に選び出すことができる。
【００３０】
最近、微生物であるアグロバクテリウムのＴｉプラスミド上にあるサイトカイニン合成酵素遺伝子（ｉｐｔ遺伝子）は明確なトランジットペプチドを持たないにもかかわらず、宿主植物細胞のプラスチド（色素体）のストロマに局在することが報告された［第４６回日本植物生理学会年会講演要旨集ｐ．１２４、第２３回日本植物分子生物学会京都大会・シンポジウム講演要旨集ｐ．１９］。培養したアグロバクテリウムからＤＮＡを抽出し、適切なＤＮＡプライマーでトランジットペプチドの活性を持つ可能性のある配列をＰＣＲにより増幅し、得られたＤＮＡ断片を、例えば、ｐＫＴ１２３中のペチュニア・フィブリリンのトランジットペプチドをコードするｃＤＮＡやｐＫＴ１５０中のカプサンチン・カプソルビン合成酵素のトランジットペプチドをコードするｃＤＮＡと置き換え、更に、例えばケトラーゼ遺伝子やカプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子等のカロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子に連結した植物形質転換用ベクターを作成し、後記実施例６に従い形質転換植物体を作成する。得られた形質転換体について、例えば、後記実施例７に従い橙色花色評価試験を行い、当該植物体で花の着色変化を測定することで花弁の有色体へ移行する活性を有する配列を適切に選び出すことができる。
【００３１】
本発明の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するトランジットペプチドをコードする遺伝子は、ペチュニア花弁からｍＲＮＡを抽出し、これを鋳型に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲともいう）を行い、増幅することにより得ることができる。また、本発明の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するトランジットペプチドをコードする遺伝子は、トウガラシからゲノムＤＮＡを取得しポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲともいう）を行い、増幅することにより得ることができる。さらに、配列番号３０、３２、又は３４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするｉｐｔ遺伝子は、アグロバクテリウムを培養しゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型にＰＣＲを行い、増幅することにより得ることができる。
【００３２】
本発明のトランジットペプチドをコードする遺伝子は、具体的には、配列番号１、３、２９、３１、又は３３のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡである。
【００３３】
また、本発明のトランジットペプチドをコードする遺伝子には、変異遺伝子も含まれ、例えば、配列番号１、３、２９、３１、又は３３のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチドをコードするＤＮＡが含まれる。
【００３４】
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が、１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５℃〜７０℃、好ましくは
４２℃〜５５℃での条件をいう。
【００３５】
また、本発明のトランジットペプチドをコードする遺伝子には、配列番号１、３、２９、３１、又は３３のいずれかに示す塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、花弁の有色体へ移行する活性を有するペプチドをコードするＤＮＡも含まれる。ここでいう相同性の数値は、塩基配列比較用プログラム：例えばＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ  ｖ３．７（日立ソフトウェアエンジニアリング社）やＧＥＮＥＴＹＸ  ｖｅｒ４．０（ゼネティックス社）を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。
【００３６】
また、上記の変異型遺伝子（変異型ＤＮＡ）は、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法などの公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）など）を用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて作製することができる。上記突然変異誘発法については、遺伝子の塩基配列を参照すれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集，１５，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  ＤＮＡ，１５．３〜１５．１１３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］等の文献の記載に従って、当業者であれば格別の困難性なしに選択し実施することができる。また、当業者であれば、遺伝子の塩基配列を基にして、当該塩基配列から１以上（１又は数個以上）の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を人為的に行う技術（部位特異的突然変異誘発）については、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６（１９８４）；ＷＯ８５／００８１７；Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１−６０５（１９８５）；Ｇｅｎｅ，３４，３１５−３２３（１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，４４３１−４４４２（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９−６４１３（１９８２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１−１４３３（１９８４）等に記載の技術に従って実施することができる。
【００３７】
２．目的遺伝子
本発明における目的遺伝子である花弁に黄色系を付与する遺伝子としては、カロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はされない。ここで、黄色系とは、黄色や橙色、赤色に至る色調をいう。
カロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子としては、β−カロテンケトラーゼ遺伝子、ＦＰＰからＧＧＰＰを経てβ−カロテンに至るまでのカロテノイド合成系における上流側のカロノイド化合物の合成に関与する酵素遺伝子、カプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子を用いることができる。
【００３８】
ここで、β−カロテンケトラーゼ（以下、ケトラーゼという）とは、カロテノイドのβ−イオノン環の４−位の炭素原子にケト（オキソ）基を付与し、カロテノイド合成系における下流側のカロノイド化合物の合成に関与する酵素をいい、例えば、カンタキサンチン合成酵素、アンタキサンチン合成酵素などが挙げられる。本発明においては、ケトラーゼ遺伝子として、具体的には、特許第３３７５６３９号に記載のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのケトラーゼ遺伝子ｃｒｔＷと同じタンパク質をコードするトルラ酵母用に改変されたＳｃｒｔＷ遺伝子（配列番号５）、同じく特許第３３７５６３９号に記載のＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓのケトラーゼ遺伝子であるＡｃｒｔＷ遺伝子（配列番号６）、特許第２９６０
９６７号に記載のＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓのケトラーゼ遺伝子であるｂｋｔ遺伝子（配列番号７）を用いることができ、特にＳｃｒｔＷ遺伝子が好ましい。
【００３９】
ＳｃｒｔＷ遺伝子は、配列番号５に示す塩基配列に従い、適当な長さのＤＮＡを合成し、断片をつなぎあわせることにより作成することができる。ＡｃｒｔＷはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．ＰＣ−１のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、増幅することにより得ることができる。また、ｂｋｔ遺伝子はＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓのｍＲＮＡを抽出し、これを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅することにより得ることができる。
【００４０】
ＦＰＰからＧＧＰＰを経てβ−カロテンに至るまでのカロテノイド合成系における上流側のカロノイド化合物の合成に関与する酵素としては、例えばゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）合成酵素、フィトエン合成酵素遺伝子、リコペン合成酵素遺伝子（フィトエンデサチュラーゼ）、β−サイクラーゼ、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素、１−デオキシ−Ｄ−キシロース５−リン酸合成酵素などが挙げられる。本発明においては、当該酵素遺伝子として、特許第２９５０８８８号に記載のＥｒｖｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来のＧＧＰＰ合成酵素遺伝子（ｃｒｔＥ：配列番号８），フィトエン合成酵素遺伝子（ｃｒｔＢ：配列番号９）、リコペン合成酵素遺伝子（ｃｒｔＩ：配列番号１０）、β−サイクラーゼ遺伝子（ｃｒｔＹ：配列番号１１）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４
，１９１６９−１９１７５（１９８９）に記載されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のイソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）イソメラーゼ遺伝子（ＩＤＩ１：配列番号１２）、ＭａｔｔｈｅｗｓとＷｕｒｔｚｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５３，３９６−４００（２０００）に記載される大腸菌由来の１−デオキシ−Ｄ−キシロース５−リン酸合成酵素遺伝子（ＤＸＳ：配列番号：１３）を用いることができ、特にｃｒｔＢ遺伝子が好ましい。上記の各遺伝子は、それぞれ由来の微生物のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、増幅することにより得ることができる。
【００４１】
カプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子としては、Ｂｏｕｖｉｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，４５−５４（１９９４）に記載されるトウガラシのカプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子（ＣＣＳ：配列番号１４）を使用することができる。ＣＣＳ遺伝子は、トウガラシからゲノムＤＮＡを取得しＰＣＲを行い、増幅することにより得ることができる。
【００４２】
これらカロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子を、１．のトランジットペプチドをコードするｃＤＮＡ断片を連結する。カロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子は、１種でもよく、また２種以上用いてもよい。また、トランジットペプチドをコードする遺伝子とカロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子の組み合わせは、上記に挙げた各遺伝子を用いる限り、特に限定はされないが、ペチュニアのフィブリリン遺伝子のトランジットペプチドをコードする遺伝子とＳｃｒｔＷ遺伝子の組み合わせ、ペチュニアのフィブリリン遺伝子のトランジットペプチドをコードする遺伝子とＣｒｔＢ遺伝子、アグロバクテリウムのサイトカイニン合成酵素遺伝子のトランジットペプチドをコードする遺伝子とＳｃｒｔＷ遺伝子、の組み合わせが好ましい。なお、トウガラシのカプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子の場合には、その上流にトランジットペプチドとしての活性を有するペプチド部分をコードする遺伝子が含まれるので、別個にトランジットペプチドをコードする遺伝子を組合わせることなく使用することができる。これらの遺伝子の組み合わせは、融合遺伝子とすればよく、具体的には、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子と配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子との融合遺伝子、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子と配列番号９に示す塩基配列から遺伝子との融合遺伝子、配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子と配列番号１４に示す塩基配列からなる遺伝子との融合遺伝子、配列番号２９に示す塩基配列からなる遺伝子と配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子との融合遺伝子が利用できる。
【００４３】
なお、カロテノイド合成系に関与する酵素タンパク質をコードする遺伝子は、上記の各塩基配列からなるＤＮＡ以外に、該酵素活性を有する限りにおいて、当該各塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、当該各塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、当該各塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡも含まれる。
【００４４】
３．組換えベクター
本発明の組換えベクターは、上記１．のトランジットペプチドをコードする遺伝子に、上記２．の目的遺伝子を連結した融合遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特にｐＢＩ系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことが可能である［ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１０（３），６９７−７０４（１９９１）］。一方、ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
【００４５】
ベクターに融合遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４６】
上記の融合遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、融合遺伝子の上流、内部、あるいは下流に、プロモーター、イントロン、エンハンサー、翻訳終止コドン、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、５’−ＵＴＲ配列、選抜マーカー遺伝子等の構成要素を含むことができる。これらは、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。
【００４７】
プロモーターとしては、目的遺伝子が花弁で発現されるように、全身発現型プロモーターや花弁で機能することが知られているプロモーターを用いればよい。例えば、全身発現型プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５ＳＰ）、花弁プロモーターとしてはペチュニアのＥＰＳＰ合成酵素プロモーターやｃｈｓＡプロモーターが挙げられる。また、アグロバクテリウムのイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子やノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子のプロモーター、形質転換宿主の対象となる植物のゲノムから高発現遺伝子のプロモーターを取得し、それを利用したプロモーター［Ｇｅｎｓｃｈｉｋら，Ｇｅｎｅ，１４８，１９５−２０２（１９９４）］、これらのプロモーターを複数個組み合わせたキメラ型プロモーターの中でプロモーター活性が著しく上昇したもの［Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，７，６６１−６７６（１９９５）］でもよい。
【００４８】
但し、花弁で機能することが知られている限り、上記プロモーターに限定されるものではない。なお、これらのプロモーターは、該プロモーターを含むＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによる増幅反応によって得ることができる。ここでＰＣＲに用いることができる鋳型ＤＮＡとしては、カリフラワーモザイクウイルスのゲノムＤＮＡが挙げられる。
【００４９】
また、必要に応じてプロモーター配列と遺伝子との間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）のイントロン［Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１，１１８３−１２００（１９８７）］を導入することができる。
【００５０】
エンハンサーとしては、ウイルス起源の翻訳エンハンサーや植物起源の翻訳エンハンサーを用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４、ブロモモザイクウイルスＲＮＡ３、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルスなどの配列が挙げられる［Ｇａｌｌｉｅら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，８６９３−８７１１（１９８７）］。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Ｇｌｕ）由来の配列［石田功，三沢典彦著，講談社サイエンティフィク編，細胞工学実験操作入門，講談社，ｐ．１１９（１９９２）］、タバコのフェレドキシン結合性サブユニット（ＰｓａＤｂ）由来の配列［Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１２４６６−１２４７０（１９９５）］などが挙げられる。翻訳終止コドンとしてはＴＡＡ，ＴＡＧ，ＴＧＡなどの配列が挙げられる［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ前出等の記載］。
【００５１】
ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された目的遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子のターミネーター（ｎｏｓＴ）、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる［Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４，９８５−９９４（１９９３）；Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（１９８８）］。
【００５２】
また、プロモーター中の転写エンハンサーとして、３５Ｓ遺伝子のエンハンサー部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており［Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１，１４１−１５０（１９８９）］、この部分を組換えベクターの一部として用いることも可能である。
【００５３】
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
【００５４】
これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形で組換えベクターに組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
【００５５】
４．形質転換植物体
上記３．で調製した組換えベクターを用いて、対象植物の細胞を形質転換し、再生することで形質転換植物体を調製することができる。
【００５６】
形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウイルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション［Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（１９８８）］、シリコンニトリドウイスカー、シリコンカーバイドウイスカー［Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，８５，７５−８０（１９９５）；Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３１，１０１−１０４（１９９５）；Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３２，３１−４３（１９９８）］によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。当該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。
【００５７】
一般に、植物に導入した遺伝子は、宿主植物のゲノム中に組み込まれるが、その場合、導入されるゲノム上での位置が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られるので、導入遺伝子の確認が必要である。
【００５８】
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
【００５９】
本発明において形質転換に用いられる植物としては、ユリ、ラン、サトイモ科の観葉植物等の単子葉植物、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン、アスター、サルビア、リンドウ等の双子葉植物などの細胞が挙げられ、特に好ましい植物の種類としては、世界での生産流通消費数量が多い３大花卉であるキク、カーネーション、バラや近年栄養系でも世界的に生産流通消費量が飛躍的に伸びているペチュニアなどが挙げられる。
【００６０】
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等の細胞が挙げられる。
【００６１】
植物細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により行えばよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、「植物細胞培養マニュアル」［山田康之編著、講談社サイエンティフィク、１９８４）等の文献を参照することができる。
【００６２】
具体的には、まず、形質転換された植物細胞を無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
【００６３】
カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞及び組織等）で貯蔵等を行ってもよい。
【００６４】
また、形質転換された植物細胞を前述された各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することによりカルスを経ることなく、形質転換体を再生させることも可能である。
【００６５】
本発明の形質転換植物体は、形質転換処理を施した再分化当代である「Ｔ１世代」のほか、その植物の種子から得られた後代である「Ｔ２世代」、薬剤選抜あるいはサザン法等による解析によりトランスジェニックであることが判明した「Ｔ２世代」植物の花を自家受粉して得られる次世代（Ｔ３世代）などの後代植物やＴ１世代を栄養系で増殖維持した
個体をも含むものとする。
【００６６】
５．花色評価試験
形質転換体植物の花色の評価は、開花時の花の色を日本園芸植物標準色票：ＪＨＳカラーチャート（農林水産省編  財団法人日本色彩研究所発行）と比較することによって行うことができる。また色差計を使用してＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（日本工業規格ＪＩＳ  Ｚ  ８７２９）の色度を測定することによって評価することができる。例えば、ペチュニアにおける花色評価試験は、ペチュニアが開花し、花弁が充分に開ききった状態において、系統ごとに３個体の花弁についてその色度を日本電色工業の簡易型分光色差計（ＮＦ３３３型）で３回測定し、平均値を出すことにより評価する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６７】
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。
なお以下の実施例で使用した「当社育成系統の淡黄色ペチュニア」のインビトロ苗は、麒麟麦酒株式会社の植物開発研究所内にて保存されており、実験材料として分譲要請に応じることができる。連絡先は、〒３２９−１４１４  日本国栃木県さくら市早乙女字申塚３３７７番地（電話；国番号８１−２８−６８６−０５０１、ファクシミリ；国番号８１−２８−６８６−５０６０）である。
【実施例１】
【００６８】
（ペチュニア・フィブリリンｃＤＮＡの取得）
ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ当社育成系統の淡黄色ペチュニア）のインビトロ苗を培養土（組成；赤玉土（小）：腐葉土：バーミキュライト＝６：３：１）に馴化し定法に従って栽培し開花させた。花弁からｍＲＮＡの調製は、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社）を用い、全ｃＤＮＡの合成はスーパースクリプト  ファーストストランド  シス
テム（インビトロジェン社）を用いて行った。
【００６９】
このｃＤＮＡに対し、トウガラシ［Ｄｅｒｕｅｒｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，６，１１９−１３３（１９９４）］とキュウリ［Ｖｉｓｈｎｅｖｅｔｓｋｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，１１１１−１１１８（１９９６）］のフィブリン遺伝子の文献情報を基に作成したプライマー［Ｆｉｂ５−１：ＣＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＣＴＡ（配列番号１５）、Ｆｉｂ３−１：ＧＴＡＡＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＴ（配列番号１６）］を用いてＰＣＲ（条件：９５℃５分、（９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分）を３０回、７２℃１０分）を行った。ＰＣＲ用酵素には以降の実験も同様に宝酒造製のＥｘＴａｑを用いた。増幅産物は１％アガロースゲルを用い１００Ｖで２０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。予想される約５００ベースの分子量にＤＮＡ断片が増幅していることが分かった。得られた増幅産物をｐＧＥＭ  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（［ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７）］し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定した。塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、相同性を検討した結果、ペチュニア・フィブリリンｃＤＮＡの一部の配列であることが確認できた。ＺＡＰ−ｃＤＮＡＴＭＬｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）を用いて全ｍＲＮＡから作成したペチュニアｃＤＮＡライブラリーを、得られたフィブリリン部分配列を使ってハイブリダイゼーション法でスクリーニングすることにより、ペチュニア花弁で機能しているフィブリリンのｃＤＮＡ全長を含むクローンＰｅｔＣａｒＰ４が得られた。同クローンはＡＢＩ３１０を用いて塩基配列を決定した。
【実施例２】
【００７０】
（ペチュニア・フィブリリンのトランジットペプチドｃＤＮＡの取得）
ペチュニア・フィブリリンのｃＤＮＡ配列から予想されるトランジットペプチドのアミノ酸配列は、葉緑体のトランジットペプチドとして最もよく使われているエンドウのトランジットペプチドのアミノ酸配列［Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４，２５−３２（１９８５）］とは相同性が全く無いことに着目し、そこには有色体へのタンパク質への効率的な移行に関する情報があると考えられた（図１）。
【００７１】
そこでクローンＰｅｔＣａｒＰ４のＤＮＡを鋳型にプライマー［Ｕ３８３：ＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＡＣＴＣＴＴＧ（配列番号１７）、Ｕ３８４：ＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＴＴＴＣＣＴＣＴＣ（配列番号１８）］を用いてＰＣＲ（条件：９５℃５分、（９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分）を３０回、７２℃１０分）を行った。ＰＣＲ産物はｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（インビトロジェン社）を用いてＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇしプラスミドｐＴＰ１を得、塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示す。また、該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【実施例３】
【００７２】
（ケトラーゼ遺伝子を使用した植物形質転換用ベクターの作製）
ケトラーゼ遺伝子として、Ｍｉｕｒａら［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，１２２６−９（１９９８）］により報告される、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのケトラーゼ遺伝子であるｃｒｔＷをトルラ酵母用に改変されたＳｃｒｔＷ遺伝子（配列番号５）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．ＰＣ−１のケトラーゼ遺伝子（ＡｃｒｔＷ遺伝子：配列番号６）、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓのケトラーゼ遺伝子（ｂｋｔ遺伝子：配列番号７）を用いた。
【００７３】
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５ＳＰ）、ＳｃｒｔＷ、ｎｏｓターミネーター（ｎｏｓＴ）の構成を含むプラスミドｐ３５ＳＰ−ＳｃｒｔＷの３５ＳプロモーターとＳｃｒｔＷの間にあるＸｂａＩ部位に、ｐＴＰ１からＸｂａＩとＳｐｅＩで切り出したペチュニア・フィブリリンのトランジットペプチド（ｐｔ／ｔｐ）のｃＤＮＡを結合することにより、３５Ｓプロモーター（３５ＳＰ）、フィブリリンのトランジットペプチドのｃＤＮＡ、ＳｃｒｔＷ、ｎｏｓターミネーター（ｎｏｓＴ）の順に並ぶ発現カセットの構成を含むプラスミドｐ３５ＳＰ−ｐｔ／ｔｐ−ＳｃｒｔＷを得た。アグロバクテリウムと大腸菌で増幅可能なバイナリー型ベクターであるｐＫＴ１１（特開２００１−１６１３７３号公報）を基本ベクターとして、このＧｕｓ遺伝子部分を前記発現ベクターのｐｅｔ／ｔｐ−ＳｃｒｔＷ  ｃＤＮＡと置き換えることにより、ｐＫＴ１２３を構築した。また、同時にトランジットペプチドのｃＤＮＡの無いプラスミド（ｐＫＴ１２４）、フィブリリンのトランジットペプチド（ｐｅｔ／ｔｐ）に代わりにエンドウのルビスコ遺伝子由来［Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４，２５−３２（１９８５）］のトランジットペプチド（ｐｅａ／ｔｐ）を持つプラスミド（ｐＫＴ１１２）を作製した。
【００７４】
同様に、ペチュニア・フィブリリンのトランジットペプチドのｃＤＮＡに、ＳｃｒｔＷの代わりにｂｋｔ遺伝子（配列番号７）を連結したプラスミド（ｐＫＴ１３３）、ＳｃｒｔＷの代わりにＡｃｒｔＷ遺伝子（配列番号６）を連結したプラスミド（ｐＫＴ１４６）を作製した（図２）。
【実施例４】
【００７５】
（カロテノイド合成系の上流側のカロテノイド化合物の合成に関与する遺伝子を使用した植物形質転換用ベクターの作製）
カロテノイドの合成系（図３）において、ＦＰＰからＧＧＰＰを経てβ−カロテンに至るまでのカロテノイド合成系における上流側のカロノイド化合物の合成には各種の酵素遺伝子が関与している。これらの酵素遺伝子として、ｃｒｔＥ遺伝子（配列番号８）、ｃｒｔＢ遺伝子（配列番号９）、ｃｒｔＩ遺伝子（配列番号１０）、ｃｒｔＹ遺伝子（配列番号１１）、ＩＤＩ１遺伝子（配列番号１２）、ＤＸＳ遺伝子（配列番号１３）を用いた。
【００７６】
実施例３のｐＫＴ１２３を基本ベクターとして、ＳｃｒｔＷ遺伝子をｃｒｔＩ遺伝子（配列番号１０）、ｃｒｔＢ遺伝子（配列番号９）、ｃｒｔＥ遺伝子（配列番号８）、ＩＤＩ１遺伝子（配列番号１２）、ｃｒｔＹ遺伝子（配列番号１１）と置き換えることにより、植物形質転換用ベクターとして、それぞれ、ｐＫＴ１３８，ｐＫＴ１３９，ｐＫＴ１４０，ｐＫＴ１４１，ｐＫＴ１４９を構築した。
【００７７】
また、ＤＸＳ遺伝子（配列番号１３）の発現ベクター（ｐ３５ＳＰ−ＤＸＳ）はロンドン大学フレーザー博士より供与されたものを使用した。
【実施例５】
【００７８】
（カプサンチン・カプソルビン合成遺伝子を使用した植物形質転換用ベクターの作製）
市販に供されている日光トウガラシからゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ（キアゲン社）を用いて取得した。ゲノムＤＮＡを鋳型とし、５’非翻訳領域とトランジットペプチドを含む遺伝子断片を得るためにプライマー［Ｕ４２３：ＡＧＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＴＡＧＡＴ（配列番号１９）、Ｕ４２４：ＡＣＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣ（配列番号２０）］を用いてＰＣＲ（条件：９５℃５分、（９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分）を３０回、７２℃１０分）を行った。ＰＣＲ産物はｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（インビトロジェン社）を用いてＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇし、プラスミドｐＴＯＰＯＣＣＳを得、塩基配列を決定したところ、既報［Ｂｏｕｖｉｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，４５−５４（１９９４）］と完全に一致した（配列番号１４）。ＣｈｌｏｒｏＰ［Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，８，９７８−９８４（１９９９）］により推定したトランジットペプチドとしての機能を有する部分のアミノ酸配列を配列番号４に、また、該ペプチドをコードする塩基配列を配列番号３（配列番号１４の１番目〜１１７番目の塩基配列に対応）に示す。
【００７９】
実施例３のｐＫＴ１２３を基本ベクターとして、ｐｅｔ／ｔｐ−ＳｃｒｔＷ遺伝子をｃａｐ／ｔｐ−ＣＣＳ遺伝子と置き換えることにより、ｐＫＴ１５０を構築した（図２）。
【実施例６】
【００８０】
（ペチュニア形質転換植物体の作製）
実施例３、４、５で作製したベクターをエレクトロポレーション法（ＧｅｌｖｉｎとＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒ編，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃ２，１−３２（１９９４），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＧＬ０株に導入した。各ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＧＬ０株を、５０ｐｐｍのカナマイシンを含むＹＥＢ液体培地［５ｇ／ｌビーフエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌスクロース、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ｐＨ７．２）］にて２８℃、１２時間振とう培養した。培養液１．５ｍｌを１０，０００ｒｐｍ、３分間遠心して集菌後、カナマイシンを除くために１ｍｌのＬＢ培地で洗浄した。更に１０，０００ｒｐｍ、３分間遠心して集菌後、１．５ｍｌのＹＥＢ培地に再懸濁し、感染用菌液とした。
【００８１】
当社育成系統の淡黄色ペチュニアの無菌植物体より若い葉を採取し、アグロバクテリウム感染用の葉とした。この葉を１片が０．５−１ｃｍになるようにメスで無菌的に切断し、上記のアグロバクテリウムの菌液上に葉の裏を上にして置き、５分間静かに振とうした後、滅菌済みの濾紙上に葉を置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内のＭＳ培地（ベンジルアデニン１．０ｐｐｍ、インドール酪酸０．１ｐｐｍ、及び寒天０．８％を含む）［Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５，４７３−４９７（１９６２）］上に、ワットマンＮｏ．１濾紙（Φ７．０ｃｍ）を置き、この濾紙に裏を上にして葉を置いた。シャーレをパラフィルムでシールし、培養は２５℃、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。ついでカナマイシン１００ｐｐｍ、クラフォラン２５０ｐｐｍ、ベンジルアデニン０．３ｐｐｍ、ナフタレン酢酸０．１ｐｐｍ、を含む１／２ＭＳ培地上に移した。この間に葉片の周囲がカルス化し、シュート原基が生じた。更に培養後、伸張したシュートをクラフォラン２５０ｐｐｍ及びカナマイシン１００ｐｐｍを含み、植物生長調節物質を含まないＭＳ培地に置床した。発根したシュートをカナマイシン耐性の生長した植物体の中から外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）遺伝子を含有する個体を、ＰＣＲを行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、ＮＰＴＩＩ遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマーとして、ＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴ（配列番号２１）、及びＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴ（配列番号２２）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で５分間の加熱後、９４℃（３０秒）−５５℃（１分）−７２℃（１分）のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間反応させた。この反応では、酵素としてＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。
【００８２】
以上から、各遺伝子を含むベクター（ｐＫＴ１１２，ｐＫＴ１２３，ｐＫＴ１２４，ｐＫＴ１３２，ｐＫＴ１３３，ｐＫＴ１４６，ｐＫＴ１５０，ｐＫＴ１３８，ｐＫＴ１３９，ｐＫＴ１４０，ｐＫＴ１４１，ｐＫＴ１４９，ｐ３５ＳＰ−ＤＸＳ）が別個に導入された１３種類のペチュニア植物体が、それぞれ６６、７５、５４、３７、４６、３８、３９、４７、５２、３６、３５、３２、３７株取得できた。
【実施例７】
【００８３】
（橙色花色評価試験）
実施例６で得られた各種形質転換ペチュニアのうち、ベクター：ｐＫＴ１１２，ｐＫＴ１２３，ｐＫＴ１２４，ｐＫＴ１３２，ｐＫＴ１３３，ｐＫＴ１４６，ｐＫＴ１５０で別個に形質転換し得られた各全個体と、非形質転換体ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ当社育成系統の淡黄色ペチュニア）１０個体を培養土（組成；赤玉土（小）：腐葉土：バーミキュライト＝６：３：１）を入れたポット（径９ｃｍ）に移植し、定法に従って栽培し、バイオハザード温室で開花させた。形質転換ペチュニアの花色の評価は、開花時の花の色をＪＨＳカラーチャート：日本園芸植物標準色票（農林水産省編  財団法人日本色彩研究所発行）と比較と、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系（日本工業規格ＪＩＳ  Ｚ  ８７２９）における色度の測定によって行った。Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系（日本工業規格ＪＩＳ  Ｚ  ８７２９）における色度の測定は、形質転換ペチュニアが開花し、花弁が充分に開ききった状態の全個体から各系統につき３つずつ花弁を採取し、その色度を日本電色工業の簡易型分光色差計（ＮＦ３３３型）で３回測定し、それらの平均値を出すことにより行った。開花数におけるレベル分けは、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ（日本工業規格ＪＩＳ  Ｚ  ８７３０）を基準に、非形質転換体に対して−：色調の変化なし（ΔＥ＜５）、＋：やや橙色（５≦ΔＥ＜２０）、＋＋：橙色（２０≦ΔＥ＜３５）、＋＋＋：濃い橙色（３５≦ΔＥ）とした。
【００８４】
各ベクターで形質転換した植物における橙色花色個体の出現を表１に示す。
【００８５】
【表１】
0004885736.tif 000002
【００８６】
ｐＫＴ１２３（トランジットペプチド：ｐｅｔ／ｔｐ、導入遺伝子：ＳｃｒｔＷ）で形質転換したものはｐＫＴ１１２（トランジットペプチド：ｐｅａ／ｔｐ、導入遺伝子：ＳｃｒｔＷ）で形質転換したものより濃い橙色の花弁をもつものが多く得られた。即ち、開花数に占める橙色の個体数として最高レベル（＋＋＋）の開花数に占める橙色個体数の割合がより多い結果となった。またその最も濃い花色（＋＋＋）は、ｐＫＴ１１２で得られた中で最も濃い花色より濃く、日本園芸植物標準色票（ＪＨＳカラーチャート）では、非形質転換体のチューブ（花筒）部分の色が７Ｙ−２７０６（緑黄：ｓｔｒｏｎｇ  ｇｒｅｅｎｉｓｈ  ｙｅｌｌｏｗ）であるのに対し、ｐＫＴ１２３で形質転換し得られた個体ｎｏ．３３は３ＹＲ−１３０７（濃橙：ｄｅｅｐ  ｏｒａｎｇｅ）であった（図４）。
【００８７】
ここで、例えば７Ｙ−２７０６や３ＹＲ−１３０７等のコードは、観察された色の表現型を記述するための代替的な手段であり、認識された色の指標としてみなされるべきものであり、得られうる潜在的な色を限定するものではない。なお同票にあるｘｙｚ表色系の数値からＬ＊ａ＊ｂ＊表色系では７Ｙ−２７０６はＬ＊＝８１．３５，ａ＊＝−９．６８，９４．００、３ＹＲ−１３０７はＬ＊＝５６．６６，ａ＊＝３７．４９，ｂ＊＝６３．５９と換算される。
【００８８】
また、ｐＫＴ１３３（トランジットペプチド：ｐｅｔ／ｔｐ、導入遺伝子：ｂｋｔ）、ｐＫＴ１４６（トランジットペプチド：ｐｅｔ／ｔｐ、導入遺伝子：ＡｃｒｔＷ）による形質転換体も、４６％と７９％の個体で橙色の発現を確認した。さらに、ｐＫＴ１５０（トランジットペプチド：ｃｃｓ／ｔｐ、導入遺伝子：ＣＣＳ）による形質転換体もまた、開花数に占める橙色の個体数が高いことが示された。
【００８９】
表２は、ｐＫＴ１２３で形質転換し、得られた＋＋＋の評価の１４個体のうちの３個体（系統番号：５、６５、６７）の各１花弁の表色を簡易型分光色差計（ＮＦ３３３型）で直接測定し、非形質転換体（１個体）と比較した結果を示す。数値は３回測定しそれらの平均値を出した。なお、表色測定は観察された色の表現型を記述するための代替的な手段であり、認識された色の指標としてみなされるべきものであり、得られうる潜在的な色を
限定するものではない。
【００９０】
【表２】
0004885736.tif 000003
【００９１】
以上の結果から、従来最もよく使用されてきたエンドウ・ルビスコ遺伝子のトランジットペプチド（ｐｅａ／ｔｐ）より、本発明のペチュニア・フィブリンのトランジットペプチド（ｐｅｔ／ｔｐ）を使用すると、いずれのケトラーゼ酵素遺伝子を組み合わせても橙色の個体数発現が大きいが、特にＳｃｒｔＷ遺伝子と組み合わせた場合にその効果が顕著であることがわかった。
【００９２】
また、カプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子（ＣＣＳ遺伝子）でも、同様な効果が得られたことから、ペチュニア花弁とトウガラシ果実の有色体の構造に類似性があり、トウガラシ果実の有色体で機能するトランジットペプチドもペチュニア花弁の有色体で機能することを示している。
【実施例８】
【００９３】
（黄色花色評価試験）
実施例６で得られた各種形質転換ペチュニアのうち、β−カロテンまでの各上流遺伝子を別個に組み込んだベクター：ｐＫＴ１３８，ｐＫＴ１３９，ｐＫＴ１４０，ｐＫＴ１４１，ｐＫＴ１４９，ｐ３５ＳＰ−ＤＸＳで形質転換して得られた、それぞれ４７、５２、３６、３５、３２、３７株について、実施例７と同様に栽培し、開花させ、花色評価試験を行った。色調変化の評価は、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥを基準に非形質転換体に対して−：色調の変化なし（ΔＥ＜５）、＋：やや橙色（５≦ΔＥ＜１０）、＋＋：橙色（１０≦ΔＥ）とした。また、色調変化部分の面積の評価は、−：色調の変化なし（面積変化＜１０％）、＋：やや増大（１０％≦面積変化＜５０％）、＋＋：大きく増大（５０％≦面積変化）とした。結果を表３に示す。
【００９４】
【表３】
0004885736.tif 000004
【００９５】
ｐＫＴ１３９、すなわちフィトエン合成酵素が最も黄色の濃色化、さらに黄色部分の面積拡大に効果があることが示された。ｐＫＴ１３９による形質転換体と非形質転換体の花弁写真を図５に示す。
【００９６】
表４は、ｐＫＴ１３９で形質転換し、得られた＋＋の評価の１３個体のうちの３個体（系統番号：１０、２０、２３）の各１花弁の表色を簡易型分光色差計（ＮＦ３３３型）で直接測定し、非形質転換体（１個体）と比較した結果を示す。数値は３回測定しそれらの平均値を出した。なお、表色測定は観察された色の表現型を記述するための代替的な手段であり、認識された色の指標としてみなされるべきものであり、得られうる潜在的な色を限定するものではない。
【００９７】
【表４】
0004885736.tif 000005
【実施例９】
【００９８】
（酵母ゲノム配列から予想されるタンパク質のトランジットペプチド活性を持つ可能性のある配列の抽出）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）で公開されているタンパク質配列からＣｈｌｏｒｏＰ［Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，８，９７８−９８４（１９９９）］に記載の方法を用いてトランジットペプチド活性を持つ可能性のある配列を抽出した結果、５８７２種の予想されるタンパク質配列に対して７２１種の配列が抽出された。ペチュニア・フィブリリンのトラジットペプチド（５９アミノ酸）、カプサンチン・カプソルビン合成酵素のトラジットペプチド（３９アミノ酸）の長さから、トランジットペプチドは３５個から６５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものと考
え、上記の配列の中からさらに３８５種の配列を抽出した。さらに、指標であるｓｃｏｒｅがペチュニア・フィブリリンのｓｏｃｒｅ（０．５６３）以上である４６種の配列を最終的に抽出することができた。
【００９９】
以下にそのタンパク質の読み枠であるＯＲＦコードを示す。
ＹＭＲ１２２Ｗ−Ａ，ＹＯＬ１４８Ｃ，ＹＬＲ３１０Ｃ，ＹＣＬ０２７Ｗ，ＹＥＲ０９３Ｃ，ＹＥＲ０６９Ｗ，ＹＭＬ０１６Ｃ，ＹＰＬ２５３Ｃ，ＹＤＲ０７７Ｗ，ＹＧＬ０９２Ｗ，ＹＤＲ０９７Ｃ，ＹＨＲ１１６Ｗ，ＹＪＬ０９５Ｗ，ＹＤＲ１５９Ｗ，ＹＮＬ２８８Ｗ，ＹＧＲ１１９Ｃ，ＹＭＲ０７５Ｗ，ＹＤＲ５２４Ｃ−Ｂ，ＹＣＲ００８Ｗ，ＹＮＬ１５４Ｃ，ＹＥＲ０８８Ｃ，ＹＬＲ１８７Ｗ，ＹＰＬ１３７Ｃ，ＹＬＬ０２９Ｗ，ＹＯＲ１６２Ｃ，ＹＮＬ１６９Ｃ，ＹＤＲ００６Ｃ，ＹＤＲ５３８Ｗ，ＹＭＬ０５９Ｃ，ＹＮＬ１９７Ｃ，ＹＮＬ２７１Ｃ，ＹＰＬ１５９Ｃ，ＹＫＬ１４１Ｗ，ＹＬＲ１４４Ｃ，ＹＤＲ２２３Ｗ，ＹＪＲ１４４Ｗ，ＹＯＲ２３２Ｗ，ＹＨＲ０３１Ｃ，ＹＥＲ１６７Ｗ，ＹＬＲ３３２Ｗ，ＹＰＬ２４２Ｃ，ＹＰＲ０１９Ｗ，ＹＯＲ０９８Ｃ，ＹＯＲ２４７Ｗ，ＹＨＬ０３３Ｃ，ＵＪＲ１３８Ｗ
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のＳ２８８Ｃ（ＩＦＯ  １１３６）の菌株を培地（組成：２％トリプトン、１％酵母エクストラクト、２％グルコース）で定法に従って培養し、ＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ製）でＤＮＡを抽出した。
【実施例１０】
【０１００】
（カプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子のトランジットペプチドを検定するためのベクター作成）
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ｐＫＴ１５０のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
５’−ＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＴＣＴＡＡＡＧＣＣ−３’（配列番号２３）
５’−ＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号２４）
増幅したＤＮＡ（ｃｃｓ／ｔｐ）を、一旦、ＴＯＰＯＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）を使ってベクターにクローニングし、ＡＢＩ３１０を用いて塩基配列を確認した。実施例３のｐＫＴ１２３を基本ベクターとして、ｐｅｔ／ｔｐをｃｃｓ／ｔｐに置き換えることにより、ｐＫＴ１８２を構築した（図６）。実施例６に記載する方法を用いてｃｃｓ／ｔｐ遺伝子を含むベクター（ｐＫＴ１８２）が別個に導入された３種類のペチュニア植物体が、それぞれ３７株ずつ取得できた。
【実施例１１】
【０１０１】
（アグロバクテリウムのサイトカイニン合成酵素遺伝子のトランジットペプチドを検定するためのベクター作成）
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａ２８１株のＴｉプラスミドにあるｉｐｔ遺伝子配列はＤＤＢＪに登録されている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｘ１４４１０）。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａ２８１株菌体より抽出した全ＤＮＡ（特開平１１−６９９７９）を鋳型としてＰＣＲを行った。
【０１０２】
プライマーＡ１：５’−ＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＴＣＴＡＡＴＴＴＴ−３’（配列番号２５）
プライマーＡ２：５’−ＡＣＴＡＧＴＧＣＴＡＡＣＴＣＧＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡ−３’（配列番号２６）
プライマーＡ３：５’−ＡＣＴＡＧＴＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＴＴＣＣＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号２７）
プライマーＡ４：５’−ＡＣＴＡＧＴＴＴＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＴＧＴＧＣＡＣ−３’（配列番号２８）
【０１０３】
プライマーＡ１（配列番号２５）とプライマーＡ２（配列番号２６）を用いたＰＣＲでは、配列番号３０に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド（ｉｐｔ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のアミノ酸番号１のＭｅｔから１２６のＡｌａに相当）をコードするＤＮＡ（ｉｐｔ１２６ｔｐ）；プライマーＡ１（配列番号２５）とプライマーＡ３（配列番号２７）を用いたＰＣＲでは、配列番号３２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド（ｉｐｔ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のアミノ酸番号１のＭｅｔから５９のＬｅｕに相当）をコードするＤＮＡ（ｉｐｔ５９ｔｐ）；プライマーＡ１（配列番号２５）とプライマーＡ４（配列番号２８）を用いたＰＣＲでは、配列番号３４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド（ｉｐｔ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のアミノ酸番号１のＭｅｔから８９のＡｌａまでに相当）をコードするＤＮＡ（ｉｐｔ８９ｔｐ）増幅した。一旦、ＴＯＰＯＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）を使ってベクターにクローニングし、ＡＢＩ３１０を用いて塩基配列を確認した。ｉｐｔ１２６ｔｐ、ｉｐｔ５９ｔｐ、ｉｐｔ８９ｔｐ遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号２９、３１、３３に示す。
【０１０４】
実施例３のｐＫＴ１２３を基本ベクターとして、ｐｅｔ／ｔｐをｉｐｔ１２６ｔｐ、ｉｐｔ５９ｔｐ、ｉｐｔ８９ｔｐに置き換えることにより、それぞれｐＫＴ１８３（ｉｐｔ１２６ｔｐを含む），ｐＫＴ１９２（ｉｐｔ５９ｔｐを含む），ｐＫＴ１９３（ｉｐｔ８９ｔｐを含む）を構築した（図６）。実施例６に記載する方法を用いて各遺伝子を含むベクター（ｐＫＴ１８３，ｐＫＴ１９２，ｐＫＴ１９３）が別個に導入された３種類のペチュニア植物体が、それぞれ２４、３４株（うち現在まで開花２株）、３６株取得できた。
【実施例１２】
【０１０５】
（カプサンチン・カプソルビン合成酵素遺伝子とアグロバクテリウムのサイトカイニン合成酵素遺伝子における有色体トランジットペプチド活性の検出）
橙色花色評価試験に従い、ベクター：ｐＫＴ１８２、ｐＫＴ１８３、ｐＫＴ１９２、で別個に形質転換し得られた各全個体と、非形質転換体ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ当社育成系統の淡黄色ペチュニア）１０個体を培養土（組成；赤玉土（小）：腐葉土：バーミキュライト＝６：３：１）を入れたポット（径９ｃｍ）に移植し、定法に従って栽培し、バイオハザード温室で開花させた。形質転換ペチュニアの花色の評価は、開花時の花の色をＪＨＳカラーチャート：日本園芸植物標準色票（農林水産省編  財団法人日本色彩研究所発行）と比較と、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系（日本工業規格ＪＩＳ  Ｚ８７２９）における色度の測定によって行った。Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系（日本工業規格ＪＩＳ  Ｚ  ８７２９）における色度の測定は、形質転換ペチュニアが開花し、花弁が充分に開ききった状態の全個体から各系統につき３つずつ花弁を採取し、その色度を日本電色工業の簡易型分光色差計（ＮＦ３３３型）で３回測定し、それらの平均値を出すことにより行った。開花数におけるレベル分けは、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ（日本工業規格ＪＩＳ  Ｚ  ８７３０）を基準に、非形質転換体に対して−：色調の変化なし（ΔＥ＜５）、＋：やや橙色（５≦ΔＥ＜２０）、＋＋：橙色（２０≦ΔＥ＜３５）、＋＋＋：濃い橙
色（３５≦ΔＥ）とした。
【０１０６】
各ベクターで形質転換した植物における橙色花色個体の出現を表５に示す。
【０１０７】
【表５】
0004885736.tif 000006
【０１０８】
驚くべきことにｐＫＴ１８３（トランジットペプチド：ｉｐｔ１２６ｔｐ、導入遺伝子：ＳｃｒｔＷ）で形質転換したものは、ｐＫＴ１２３形質転換したものより濃く、しかも、やや色調に赤みがかるものが多かった。このことからｉｐｔ遺伝子産物の有色体移行能が非常に高いことが示された。ｐＫＴ１９２は調査できた個体数が少ないためと予想されるが、有色体移行能活性は確かに認められ現在までのところ中程度の移行能を示している。表６は、ｐＫＴ１８３で形質転換し、得られた＋＋＋の評価の３個体のうちの２個体（系統番号：８、２１）の各１花弁の表色を簡易型分光色差計（ＮＦ３３３型）で直接測定し、非形質転換体（１個体）と比較した結果を示す。数値は３回測定しそれらの平均値を出した。ａ＊の数値の増大は色調に赤の因子が大きくなっていることを示している。なお、表色測定は観察された色の表現型を記述するための代替的な手段であり、認識された色の指標としてみなされるべきものであり、得られうる潜在的な色を限定するものではない。
【０１０９】
また、ｐＫＴ１８３（系統番号：８、２１）による形質転換体、ｐＫＴ１２３による形質転換体（系統番号：３）、および非形質転換体の花弁の比較写真を図７に示す。
【０１１０】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明のトランジットペプチド、及びこれを用いる植物作成方法は、花卉植物の黄色系花色の幅を広げることができ、観賞用植物の開発に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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