(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を含有するＳＣＦ複合体および（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、上記（ｉ）のタンパク質複合体と上記（ｉｉ）のタンパク質またはその塩との結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）タンパク質（ｉｉ）を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養する工程、
（２）両条件下での培養物から、ＳＣＦ複合体（ｉ）を沈殿化させる工程、
（３）両条件下において、ＳＣＦ複合体（ｉ）の沈殿物と共沈したタンパク質（ｉｉ）の量を測定する工程、および
（４）試験化合物の非存在下と比較して、ＳＣＦ複合体（ｉ）の沈殿物と共沈するタンパク質（ｉｉ）の量を増加させた試験化合物を、該結合を促進する化合物として選択する工程
を含む方法。
【請求項２】
（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩および（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、上記（ｉ）のタンパク質またはその塩と上記（ｉｉ）のタンパク質またはその塩との結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）タンパク質（ｉｉ）を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養する工程、
（２）両条件下での培養物から、タンパク質（ｉ）を沈殿化させる工程、
（３）両条件下において、タンパク質（ｉ）の沈殿物と共沈したタンパク質（ｉｉ）の量を測定する工程、および
（４）試験化合物の非存在下と比較して、タンパク質（ｉ）の沈殿物と共沈するタンパク質（ｉｉ）の量を増加させた試験化合物を、該結合を促進する化合物として選択する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患の予防・治療剤および診断薬、これらのスクリーニングなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）は進行性痴呆および認知能力の失調を伴う神経変性疾患の代表的なものであるが、これまでに効果的な治療法は見出されていない。アルツハイマー病は高齢化社会を迎えつつある現在において最も重要な疾患の一つであることは言うまでもなく、その治療薬の開発は医療経済的にも極めて大きな意義を有する。
一方、ヒートショックやグルコース飢餓をはじめとする外界からの様々なストレスにより生じた異常タンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム経路により生体内で速やかに分解されることが知られている。生体内で生じた異常タンパク質には、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）から構成された複合酵素系によりユビキチンが連結され、さらにＥ１−Ｅ２−Ｅ３のサイクルを繰り返すことにより、多数のユビキチン分子が枝上に繋がったポリユビキチン鎖が形成される。このポリユビキチン鎖は、２６Ｓプロテアソームへの分解シグナルとなり、異常タンパク質は迅速に破壊される。
近年、アルツハイマー病やパーキンソン病を含む種々の神経変性疾患とユビキチン−プロテアソーム経路異常との関連性が重要視されるようになってきた。例えばアルツハイマー病患者では、変異型ユビキチンの発現が明らかとされており（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９巻，２４２−２４７頁，１９９８年）、この変異型ユビキチンによりプロテアソーム活性が阻害されることが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７巻，９９０２−９９０６頁，２０００年；Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１５７巻，４１７−４２７頁，２００２年）。また、遺伝性のパーキンソン病である常染色体劣性遺伝性若年性パーキンソニズム（ＡＲ−ＪＰ）では、その病因遺伝子としてＰａｒｋｉｎが同定され（Ｎａｔｕｒｅ，３９２巻，６０５−６０８頁，１９９８年）、タンパク質分解系に関与するユビキチンリガーゼであることが報告されている（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ，２５巻，３０２−３０５頁，２０００年）。さらにＰａｒｋｉｎの基質としてＰａｅｌ（Ｐａｒｋｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ）受容体が同定された（Ｃｅｌｌ，１０５巻，８９１−９０２頁，２００１年）。この受容体は高次構造形成が困難なタンパク質の一種であり、このタンパク質の高次構造形成が不完全な場合、通常は速やかにｐａｒｋｉｎの作用で分解されることになる。しかしながら、何らかの異常によりこのタンパク質分解系が抑制されると、高次構造形成が不完全なＰａｅｌ受容体は小胞体に蓄積し、その蓄積により惹起された小胞体ストレスによって細胞は細胞死に陥ることが報告されている。
ユビキチンシステムの特徴として、ユビキチン化が非常に特異的に、かつタイミング良く起こることがあげられる。一方で、細胞内においてユビキチン化される標的タンパク質は膨大な数に及ぶことが知られている。近年、ユビキチン−プロテアソーム経路中のＥ３が分子多様性に富むことがわかり、ヒトゲノムには約１，０００種類の異なるＥ３がコードされていることが明らかになった。すなわち、標的タンパク質の数の多さにはこのＥ３の数で対応していることが示された（医学のあゆみ，２１１巻，５−１１頁，２００４年）。Ｅ３はユビキチン化反応を行う３つの酵素群のなかで、基質タンパク質と直接相互作用し、基質特異性を決定する酵素である。Ｅ３は活性中心となるドメインによって、ＨＥＣＴ型、ＲＩＮＧ型、およびＵ−ｂｏｘ型の３つの大きなグループに分類することができる。ＨＥＣＴ型およびＵ−ｂｏｘ型は単量体でＥ３として機能するが、ＲＩＮＧ型には単量体で機能するものと、Ｒｂｘ１などのＲＩＮＧフィンガードメインを持つタンパク質と複合体を形成して機能するものがあり、後者はスキャフォールドタンパク質としてＣｕｌｌｉｎファミリータンパク質を含んでいることから、Ｃｕｌｌｉｎ−ｂａｓｅｄ  Ｅ３とよばれている。この複合体の一種であるＳＣＦ複合体（Ｓ−ｐｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ａ（Ｓｋｐ１）−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｒｉｎｇ  ｂｏｘ  １（Ｒｂｘ１）複合体）は、Ｓｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ１、Ｒｂｘ１、およびＦ−ｂｏｘタンパク質の４量体を形成することによりＥ３として機能する。このうち、Ｓｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ１、およびＲｂｘ１は不変の共通コンポーネントであるが、Ｆ−ｂｏｘタンパク質は可変コンポーネントであり、ＳＣＦ型ユビキチンリガーゼはＦ−ｂｏｘタンパク質を交換することにより特異的な基質のユビキチン化を促進すると考えられ、現在少なくとも５５種類以上のＦ−ｂｏｘタンパク質の存在が確認されている。Ｆ−ｂｏｘタンパク質はアダプター分子であるＳｋｐ１と結合するＦ−ｂｏｘドメインおよび基質タンパク質との結合ドメインを持っているが、この基質タンパク質との結合ドメインの種類により、（ｉ）ＷＤ４０リピートドメインを有するもの（Ｆｂｗファミリー）、（ｉｉ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を持つもの（Ｆｂｌファミリー）、（ｉｉｉ）それ以外のもの（Ｆｂｘファミリー）の３種に分類されている。一種のＦ−ｂｏｘタンパク質はいくつかの基質タンパク質と結合し、特定の基質タンパク質のユビキチン化にかかわっているものと考えられている。この結合にリン酸化などの修飾が必要な場合もある。ＳＣＦ複合体はＦ−ｂｏｘタンパク質を交換することによって非常に多くの基質タンパク質をユビキチン化することができる多様性をあわせ持っており、その他のＣｕｌｌｉｎ−ｂａｓｅｄ  Ｅ３もＳＣＦ複合体と類似の複合体を形成し、独自のＥ３機能分子として他の基質タンパク質のユビキチン化に関与することが知られている。
Ｆ−ｂｏｘ  ａｎｄ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＦＢＬ２）は、ＳＣＦ複合体の構成成分の一つであり、Ｆ−ｂｏｘタンパク質として機能する。ＦＢＬ２は、脳、精巣に特異的な発現が認められており（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６７巻，４０−４７頁，２０００年）、さらにアルツハイマー病患者脳でこのタンパク質の遺伝子発現が低下することが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１巻，２１７３−２１７８頁，２００４年）。ＦＢＬ２は、Ｃ末端のロイシン−リッチ−リピート領域で特異的な基質と結合しユビキチン化を亢進すると考えられるが、これまでＦＢＬ２に結合する基質については未同定のままであった。
ＷＯ  ０３／０２３４０５号公報には、被験者における神経変性病、特にアルツハイマー病の治療または予防方法であって、（ｉ）Ｆ−ボックスロイシンリッチリピート蛋白質をコードする遺伝子、および／または、（ｉｉ）Ｆ−ボックスロイシンリッチリピート蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、および／または、（ｉｉｉ）Ｆ−ボックスロイシンリッチリピート蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体の活性および／またはレベルに、直接的または間接的に影響を及ぼす薬剤（類）を、治療または予防に効果的な量で、前記被験者へ投与することを含む、前記方法等が記載されている。
Ｙｉｐｐｅｅ−ｌｉｋｅ  １（ＹＰＥＬ１）は、マウスで胎生期の脳顔面頭蓋形成段階で発現する遺伝子として同定され（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，６巻，６１９−６２９頁，２００１年）、これまでにファミリー遺伝子としてＹＰＥＬ１〜５が存在することが報告されている（ＧＥＮＥ，３４０巻，３１−４３頁，２００４年）。ＹＰＥＬファミリー遺伝子のうち、ＹＰＥＬ１は精巣、胎児脳に特異的に発現しているのに対し、ＹＰＥＬ２〜５は多数の臓器で発現が見られる。ＹＰＥＬファミリー遺伝子は核内に局在し、特に中心体に存在することから細胞分裂期に関与している可能性が考えられている。しかしながら、ＹＰＥＬ１をＮＩＨ３Ｔ３細胞のような線維芽細胞に一過性発現すると上皮細胞様の形態変化を起こすという報告があるだけで、機能についての報告はなされていない。
【発明の開示】
【０００３】
安全で優れた神経変性疾患の予防・治療剤が求められている。
本発明者らは、上記の課題を解決するため、ユビキチン−プロテアソーム経路に関与する遺伝子の中から神経変性疾患の創薬標的遺伝子を発掘することが可能と考え、鋭意研究を重ねた結果、ＳＣＦ複合体の構成成分であるＦ−ｂｏｘタンパク質の一種ＦＢＬ２がアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）などに結合すること、ＦＢＬ２の発現調節がβアミロイド（Ａβ）の産生に影響を及ぼすことを見出した。さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤、
〔１ａ〕配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進する化合物またはその塩を含有してなる糖尿病の予防・治療剤、
〔２〕プロテアソームによる、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の分解を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤、
〔３〕化合物が、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質と配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物である、上記〔１〕、〔１ａ〕または〔２〕記載の剤、
〔３ａ〕（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質と（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤、
〔４〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質がＳＣＦ複合体である上記〔３〕または〔３ａ〕記載の剤、
〔５〕化合物が、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物である、上記〔１〕、〔１ａ〕または〔２〕記載の剤、
〔５ａ〕（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤、
〔６〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤、
〔７〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子をコードするポリヌクレオチドの発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤、
〔８〕配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔９〕配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、プロテアソームによる、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の分解を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔１０〕（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質および（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（ｉ）のタンパク質と上記（ｉｉ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔１１〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質が、ＳＣＦ複合体である上記〔１０〕記載のスクリーニング方法、
〔１２〕（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（ｉ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と上記（ｉｉ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔１３〕配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔１４〕配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、プロテアソームによる、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の分解を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔１５〕（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、上記（ｉ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と上記（ｉｉ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔１６〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔１７〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔１８〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、神経変性疾患の予防・治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔１９〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、神経変性疾患の予防・治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２０〕配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔２０ａ〕配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進することを特徴とする糖尿病の予防・治療方法、
〔２１〕哺乳動物に対し、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔２１ａ〕哺乳動物に対し、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病の予防・治療方法、
〔２２〕神経変性疾患の予防・治療剤のための配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進する化合物またはその塩の使用、
〔２２ａ〕糖尿病の予防・治療剤のための配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のユビキチン化を促進する化合物またはその塩の使用、
〔２３〕プロテアソームによる、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の分解を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔２４〕哺乳動物に対し、プロテアソームによる、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の分解を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔２５〕神経変性疾患の予防・治療剤のための、プロテアソームによる、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の分解を促進する化合物またはその塩の使用、
〔２６〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔２６ａ〕配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子をコードするポリヌクレオチドの発現を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔２７〕哺乳動物に対し、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔２７ａ〕哺乳動物に対し、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子をコードするポリヌクレオチドの発現を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔２８〕神経変性疾患の予防・治療剤のための、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩の使用、
〔２８ａ〕神経変性疾患の予防・治療剤のための、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子をコードするポリヌクレオチドの発現を促進する化合物またはその塩の使用、
〔２９〕（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔２９ａ〕（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質と（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔３０〕哺乳動物に対し、（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔３０ａ〕哺乳動物に対し、（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質と（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法、
〔３１〕神経変性疾患の予防・治療剤のための、（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩の使用、
〔３１ａ〕神経変性疾患の予防・治療剤のための、（ｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質と（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩の使用などに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明で用いられる配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臟、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いて計算することができる。
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、ＳＣＦ複合体（好ましくはＦＢＬ２）との結合作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、上記活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
上記結合作用の測定は、例えば、本発明のタンパク質とＳＣＦ複合体（好ましくはＦＢＬ２）との結合親和性を測ることにより、測定できる。
具体的には、例えばビアコア装置（ビアコア社）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を測定することにより分子間相互作用を解析する。ＳＰＲはセンサーチップ、マイクロ流路系、ＳＰＲ検出系の３つの技術が統合して分子結合の強さ、速さ、選択性を測定する技術であり、ビアコア装置では標識を使わずにリアルタイムに複数個の分子間での相互作用のモニタリングができる。
例えば、本発明のタンパク質のＳＣＦ複合体との結合親和性を測定する場合、ＳＣＦ複合体をセンサーチップ表面に固定化し、ここに本発明のタンパク質を添加する。これらのタンパク質問の相互作用の様子がセンサーグラムでリアルタイムに観察できるため、得られた結合および解離反応のカーブを比較することで、親和性およびＳＣＦ複合体からの解離係数を測定する。
また、本発明のタンパク質としては、例えば、（ｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記の本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記の本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２０で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２１で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（ｉ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ｉｉ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール  ２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。また、市販品を用いてもよい。
本発明で用いる配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、ＦＢＬ２と称することもある）としては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臟、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いて計算することができる。
ＦＢＬ２の製造は、本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の製造法と同様に行えばよい。
ＦＢＬ２をコードするポリヌクレオチドとしては、ＦＢＬ２をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
ＦＢＬ２をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２４または配列番号：３５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２４または配列番号：３５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：２３または配列番号：３４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２４または配列番号：３５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２４または配列番号：３５で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３５で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ＦＢＬ２をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、上記本発明のタンパク質のクローニング手段と同様に行えばよい。
本発明のタンパク質（本発明のタンパク質、その部分ペプチドおよびその塩を含む）は、ユビキチンシステムの中のＣｕｌｌｉｎ−ｂａｓｅｄ  Ｅ３複合体の一種であるＳＣＦ複合体（Ｓ−ｐｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ａ（Ｓｋｐ１）−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｒｉｎｇ  ｂｏｘ  １（Ｒｂｘ１）複合体）に対する基質となり、さらにはこのＳＣＦ複合体の構成成分であるＦ−ｂｏｘタンパク質の一種、ＦＢＬ２と結合することにより、ユビキチン化されると考えられる。よって、（ａ）本発明のタンパク質のユビキチン化を促進する化合物またはその塩、（ｂ）プロテアソームによる、本発明のタンパク質の分解を促進する化合物またはその塩、（ｃ）ＦＢＬ２と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物またはその塩、（ｄ）ＳＣＦ複合体（好ましくはＦＢＬ２を含有する複合体）と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物またはその塩、（ｅ）ＦＢＬ２の発現または該タンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）など〕などの安全な予防・治療剤として使用することができる。また、本発明のタンパク質、ＦＢＬ２およびその遺伝子は、例えば、神経変性疾患の予防・治療剤のスクリーニング試薬として有用である。
なかでも、（ａ）本発明のタンパク質（本発明のタンパク質、その部分ペプチドおよびその塩を含む）のユビキチン化を促進する化合物またはその塩は、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）など〕、糖尿病（例、ＩＩ型糖尿病）などの安全な予防・治療剤として使用することができる。また、本発明のタンパク質は、例えば、糖尿病（例、ＩＩ型糖尿病）の予防・治療剤のスクリーニング試薬としても有用である。
（１）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
（１ａ）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、該タンパク質のユビキチン化を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法
例えば、（ｉ）本発明のタンパク質のユビキチン化活性と、（ｉｉ）本発明のタンパク質と試験化合物の混合物のユビキチン化活性との比較をすることにより、本発明のタンパク質のユビキチン化を促進する化合物またはその塩をスクリーニングする。
具体的には、例えば、（ｉ’）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合、および（ｉｉ’）試験化合物存在下、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合において、培養後、細胞を破砕し、破砕液より本発明のタンパク質を回収し、回収された本発明のタンパク質に結合したユビキチン量を公知の方法（例、ユビキチンに特異的なＥＬＩＳＡの使用）に従ってそれぞれ測定し、比較する。結合ユビキチン量を増大させる試験化合物を、ユビキチン化を促進する化合物として選択する。
例えば、上記（ｉｉ）の場合におけるユビキチン化活性を上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、本発明のタンパク質のユビキチン化を促進する化合物として選択することができる。
（１ｂ）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、プロテアソームによる、該タンパク質の分解を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法
例えば、（ｉ）本発明のタンパク質の分解残存量と、（ｉｉ）本発明のタンパク質と試験化合物の混合物中における本発明のタンパク質の分解残存量との比較をすることにより、本発明のタンパク質の分解を促進する化合物またはその塩をスクリーニングする。
具体的には、例えば、（ｉ’）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合、および（ｉｉ’）試験化合物存在下、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合において、培養後、細胞を破砕し、破砕液より本発明のタンパク質を回収し、回収された本発明のタンパク質の残存量を、公知の方法（例、本発明のタンパク質を特異的に定量化できるＥＬＩＳＡシステムの使用）に従ってそれぞれ測定し、比較する。ここで、上記（ｉｉ’）が上記（ｉ’）に比して、本発明のタンパク質残存量を減少せしめた場合、この減少がプロテアソーム阻害剤（例、ＭＧ１３２）で阻害されるか否かを公知の方法に従って、検討する。プロテアソーム阻害剤（例、ＭＧ１３２）で阻害された場合は、試験化合物を、プロテアソームによる該タンパク質の分解を促進する化合物として選択することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における分解活性を上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、プロテアソームによる、本発明のタンパク質の分解を促進する化合物として選択することができる。
（１ｃ）ＦＢＬ２および本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、ＦＢＬ２と該タンパク質との結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法
例えば、（ｉ）本発明のタンパク質のＦＢＬ２との共沈量と、（ｉｉ）本発明のタンパク質および試験化合物の混合物中における本発明のタンパク質のＦＢＬ２との共沈量との比較をすることにより、ＦＢＬ２と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物またはその塩をスクリーニングする。
具体的には、例えば、（ｉ’）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合、および（ｉｉ’）試験化合物存在下、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合において、公知の方法（例、ＦＢＬ２に特異的な抗体などの使用）に従って、ＦＢＬ２を沈殿化させ、その沈殿物とともに共沈した本発明のタンパク質量を、公知の方法（例、本発明のタンパク質を特異的に定量化できるＥＬＩＳＡシステムの使用）に従って、測定し、比較する。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における共沈量を上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、ＦＢＬ２と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物として選択することができる。
（１ｄ）ＳＣＦ複合体（好ましくはＦＢＬ２を含有する複合体）および本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、ＳＣＦ複合体と該タンパク質との結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法
例えば、（ｉ）本発明のタンパク質のＳＣＦ複合体（好ましくはＦＢＬ２を含有する複合体）との共沈量と、（ｉｉ）本発明のタンパク質および試験化合物の混合物中における本発明のタンパク質のＳＣＦ複合体（好ましくはＦＢＬ２を含有する複合体）との共沈量との比較をすることにより、ＳＣＦ複合体と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物またはその塩をスクリーニングする。
具体的には、例えば、（ｉ’）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合、および（ｉｉ’）試験化合物存在下、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合において、公知の方法（例、ＳＣＦ複合体に特異的な抗体などの使用）に従い、ＳＣＦ複合体を沈殿化させ、その沈殿物とともに共沈した本発明のタンパク質量を、公知の方法（例、本発明のタンパク質を特異的に定量化できるＥＬＩＳＡシステムの使用）に従って、それぞれ測定し、比較する。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における共沈量を上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、ＳＣＦ複合体と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物として選択することができる。
（１ｅ）ＦＢＬ２を用いることを特徴とする、該タンパク質の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、およびＦＢＬ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法
例えば、（ｉ）ＦＢＬ２を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｉｉ）試験化合物の存在下、ＦＢＬ２を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、ＦＢＬ２のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、ＦＢＬ２を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号：２４もしくは配列番号：３５またはその一部分を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号：２４もしくは配列番号：３５またはその一部分を含有する核酸を用いるＰＣＲ法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における発現量を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上増加させる試験化合物を、ＦＢＬ２の発現または該タンパク質の遺伝子の発現を促進する化合物として選択することができる。
上記（１ａ）〜（１ｅ）のスクリーニングにおいて、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養することによって製造されたものなどが用いられる。さらには、前記細胞の培養液、その上清、細胞破砕物などを用いてもよい。
本発明のタンパク質またはＦＢＬ２を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質またはＦＢＬ２をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質またはＦＢＬ２を細胞外に分泌させる、または細胞内に発現させる形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質またはＦＢＬ２を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
上記（１ａ）〜（１ｅ）のスクリーニングにおいて、ＳＣＦ複合体についても、上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質もしくは本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞、または（および）ＦＢＬ２もしくはＦＢＬ２を産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれ、神経変性疾患の予防・治療作用を有する。
該化合物の塩としては、前記した本発明の試験化合物の塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる、プロテアソームによる、本発明のタンパク質の分解を促進する化合物またはその塩、ＦＢＬ２と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物またはその塩、ＳＣＦ複合体と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物またはその塩、ＦＢＬ２の発現または該タンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）など〕などの予防・治療作用を有する。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる本発明のタンパク質のユビキチン化を促進する化合物またはその塩は、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）など〕、糖尿病（例、ＩＩ型糖尿病）などの予防・治療作用を有する。
（ｉ）本発明のタンパク質のユビキチン化を促進する化合物またはその塩、
（ｉｉ）プロテアソームによる、本発明のタンパク質の分解を促進する化合物またはその塩、（ｉｉｉ）ＦＢＬ２と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物またはその塩、（ｉｖ）ＳＣＦ複合体と本発明のタンパク質との結合を促進する化合物またはその塩、（ｖ）ＦＢＬ２の発現または該タンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩などを、上記の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療の目的で、上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の投与量は対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療の目的で、上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの化合物またはその塩を注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（２）ＦＢＬ２の定量
ＦＢＬ２に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、ＦＢＬ２を特異的に認識することができるので、被検液中のＦＢＬ２の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
上記抗体を用いるＦＢＬ２の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化したＦＢＬ２のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別のＦＢＬ２のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＦＢＬ２のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
サンドイッチ法によるＦＢＬ２のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられるＦＢＬ２のモノクローナル抗体は、ＦＢＬ２の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ＦＢＬ２のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどは、公知の方法に従って行えばよい。
さらには、上記ＦＢＬ２に対する抗体を用いてＦＢＬ２の濃度を定量することにより、ＦＢＬ２の濃度の増加または減少が検出された場合、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）など〕などである、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
（３）遺伝子診断薬
ＦＢＬ２をコードするＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）におけるＦＢＬ２のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多または減少が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）など〕などである可能性が高いと診断することができる。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
ＡＳｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ＣＴＦαタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ＣＴＦβタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ＡＰＰタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例１および実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例２で用いられたｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例２で用いられたｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
ＣＴＦαタンパク質をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
ＣＴＦβタンパク質をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ＡＰＰタンパク質をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
ヒトＦＢＬ２（ｈＦＢＬ２）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
ヒトＦＢＬ２（ｈＦＢＬ２）をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
マウスＦＢＬ２（ｍＦＢＬ２）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３５〕
マウスＦＢＬ２（ＩｎＦＢＬ２）をコードする塩基配列を示す。
【実施例】
【０００５】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
実施例１
ＦＢＬ２のＡβ産生に及ぼす影響
ヒト型ＦＢＬ２（ｈＦＢＬ２）遺伝子の増幅のため、合成プライマー（配列番号：１９および配列番号：４）、酵素としてｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラ）、鋳型としてｑｕｉｃｋ  ｃｌｏｎｅ  ｈｕｍａｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ（クロンテック）を用い、（１）〜（３）の条件でＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を得た。
（１）９４℃  ５分
（２）９４℃  ３０秒−５６℃  ３０秒−７２℃  ２分を３５回
（３）７２℃  ７分
得られたＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（インビトロジェン）へクローニングし、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。得られたコロニーと、合成プライマー（配列番号：５および配列番号：６）および酵素としてＥｘＴａｑ（タカラ）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物中の基質をＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（アマシャムファルマシア）により分解後、これをテンプレートとしてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＡＢＩ）を用いてシークエンス反応を行い、シークエンス産物を３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ）で解析した。配列の正しいコロニーをＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＧＥＮ  ｅｎｄｏｆｒｅｅ  ｍａｘｉ  ｋｉｔ（キアゲン）を用いてベクターを回収した。
このｈＦＢＬ２遺伝子発現ベクター（以下、ｈＦＢＬ２発現ベクターと称する）３μｇと６９５アミノ酸からなるアミロイド前駆体タンパク質（Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、ＡＰＰ６９５と称する）遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３．１ベクター（以下、ｈＡＰＰ６９５発現ベクターと称する）２μｇをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ）を用いて、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞（ＡＴＣＣより購入）へ形質導入した。対照としてｈＦＢＬ２発現ベクターの代わりにＧＦＰ発現ベクター（ｐＱＢＩ−２５−ｆＡ：和光純薬）を用いて上記と同様にＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞へ形質導入した。
各形質導入細胞をタイプＩコラーゲンコート２４穴プレート（ＩＷＡＫＩ）へ３０万個／ウェルで播種し、１晩培養後、培地交換を行い、さらに１晩培養した。培養上清１００μｌを被験試料として用い、以下の方法でＡβ量の測定を行なった。
ＷＯ  ９４／１７１９７号公報の実施例７に記載の方法に準じ、β−アミロイド（１１−２８）をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫することにより、マウスモノクローナル抗体ＢＮＴ−７７ａ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４巻，１０２７２−１０２７８頁，１９９５年）を得た。
ＢＮＴ−７７ａを１５μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６溶液）を、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。ウェルの余剰の結合部位を、ＰＢＳで４倍希釈したブロックエース（大日本製薬）３００μｌを加え、４℃で２４時間放置することにより不活化し、ＢＮＴ−７７ａ（１次抗体）固定化プレートを得た。
Ａβｘ−４０量の測定は、ＢＮＴ−７７ａ固定化プレートに、バッファーＥＣ〔１０％ブロックエース、０．２％ＢＳＡ，０．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＣＨＡＰＳ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％ＮａＮ３を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７〕で希釈したＡβ１−４０（ペプチド研究所）の希釈系列および被験試料１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、２次抗体としてバッファーＣ〔１％ＢＳＡ，０．４Ｍ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７〕で１０００倍に希釈したＢＡ−２７ａ−ＨＲＰ（ＷＯ  ９４／１７１９７号公報の実施例８記載）を１００μｌ加え、室温で６時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、ＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ  ＆  ＰＥＲＲＹ  ＬＡＢ，ＩＮＣ）１００μｌを加え、室温で１０分間反応させた。１Ｍリン酸１００μｌ添加により反応を停止させた後、プレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ１９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）で４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、固相上の酵素活性を求めた。
Ａβｘ−４２量の測定は、ＢＮＴ−７７ａ固定化プレートに、バッファーＥＣで希釈したＡβ１−４２（ペプチド研究所）の希釈系列および被験試料１００μｌを加え、２次抗体としてＢＣ−０５ａ−ＨＲＰ（ＷＯ  ９４／１７１９７号公報の実施例８記載）を用いることにより、上記Ａβｘ−４０量の測定と同様に測定した。
結果を以下に示す。
対照（ＧＦＰとＡＰＰ６９５発現ベクターを導入した細胞）の培養上清中のＡβ４０およびＡβ４２量は、それぞれ９２．４±８．９ｐＭ、および７．７±１．０ｐＭであった。これに対し、ｈＦＢＬ２とＡＰＰ発現ベクターを導入した細胞の培養上清中のＡβ４０およびＡβ４２量は、それぞれ７２．１±１．８ｐＭ、および６．６±１．０ｐＭであった。
これより、ｈＦＢＬ２遺伝子の発現により、Ａβ４０量およびＡβ４２量が低下することがわかる。
実施例２
ｓｉＲＮＡによるｈＦＢＬ２遺伝子発現を抑制した場合のＡβ産生に及ぼす影響
ｈＦＢＬ２遺伝子を発現抑制できるｓｉＲＮＡ（配列番号：７）をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ）を用い、ヒト神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２細胞（ＡＴＣＣより購入）へ形質導入した。対照としてＧＦＰ遺伝子を発現抑制できるｓｉＲＮＡ（配列番号：８）をＩＭＲ−３２細胞へ形質導入した。
各形質導入細胞をタイプＩコラーゲンコート２４穴プレート（ＩＷＡＫＩ）へ６６万個／ウェルで播種し、１晩培養後、培地交換を行い、さらに２４〜７２時間培養した。培養上清１００μｌを用いて実施例１の方法に従い、培養上清中Ａβ量の測定を行なった。
結果を以下に示す。
対照として用いたＧＦＰ−ｓｉＲＮＡでは、２４、４８および７２時間後のＡβ４０量は、それぞれ４６．６±０．６ｐＭ、６７．５±１．０ｐＭ、および８０．９±１．６ｐＭであり、Ａβ４２量は、それぞれ２．９５±０．０５ｐＭ、５．６１±０．０２ｐＭ、および１１．５０±０．４４ｐＭであった。これらに対し、ｈＦＢＬ２−ｓｉＲＮＡを導入した細胞では、２４、４８および７２時間後のＡβ４０量は、それぞれ５２．７±１．５ｐＭ、６８．０±０．３ｐＭ、および９８．４±３．０ｐＭであり、Ａβ４２量は、それぞれ４．４０±０．０２ｐＭ、７．４４±０．１８ｐＭ、および１４．１２±１．０９ｐＭであった。
これより、細胞に恒常的に発現しているｈＦＢＬ２遺伝子の発現をｓｉＲＮＡによって抑制すると、Ａβ量が増加することがわかる。
実施例３
ｈＦＢＬ２タンパク質とＡＰＰタンパク質との結合
Ｎ末端にＦｌａｇタグを導入したｈＦＢＬ２発現ベクター作製のため、合成プライマー（配列番号：４および配列番号：９）、酵素としてｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラ）、鋳型として実施例１で作製したｈＦＢＬ２発現ベクターを用い、（１）〜（３）の条件でＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を得た。
（１）９４℃  ５分
（２）９４℃  ３０秒−５５℃  ３０秒−７２℃  ２分を２５回
（３）７２℃  ７分
得られたＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（インビトロジェン）へクローニングし、実施例１と同様の方法を用いて発現プラスミドを単離した。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞をタイプＩコラーゲンコート６ｃｍシャーレ（ＩＷＡＫＩ）に８０万個／シャーレで播種し、３７℃で１８時間培養した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ギブコ）０．５ｍｌにリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を２２μｌ加え、室温で５分静置後、ｈＡＰＰ６９５発現ベクター（実施例１）および上記で得られたＦｌａｇタグ導入ｈＦＢＬ２発現ベクターを、それぞれ５μｇずつ加えたＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地０．５ｍｌと混合し、室温で２０分間反応させた。対照にはｐＣＭＶ２Ｂ−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（ストラタジーン）を使用した。反応後、細胞を播種したシャーレに添加し３７℃で４時間培養し、培地交換後さらに１８時間培養した。ユビキチン−プロテアソーム経路による分解を阻害するため、終濃度１５μＭとなるようにプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を添加し、３７℃で３時間培養した。培地を除去し、５ｍｌのＰＢＳで２回細胞を洗浄した後、１ｍｌの細胞破砕バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％ＮＰ−４０，１ｍＭ  β−メルカプトエタノール，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロッシュ），１０μＭ  ＭＧ１３２）を加え細胞破砕を行なった。遠心により回収した上清に、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化したａｎｔｉ−Ｆｌａｇ  ａｇａｒｏｓｅ（シグマ）を２０μｌ加え、４℃で２２時間回転させながら反応させた。１ｍｌのｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄した後、１００μｌのサンプルバッファー（第一化学）を加え、９５℃で５分間処理した。処理した試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）に転写し、室温で１．５時間ブロッキング（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５％スキムミルク，０．１％Ｔｗｅｅｎ）した後、１次抗体〔抗ＡＰＰ抗体（２２Ｃ１１：ケミコン、１／１０００希釈）、抗ＡＰＰ抗体（ＣＴ６９５：ザイメット、１／１０００希釈）、および抗Ｆｌａｇ抗体（シグマ、１／１０００希釈）〕を加え、４℃で２０時間反応させた。１次抗体反応後、ＴＴＢＳバッファー〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ〕で３回洗浄し、２次抗体〔抗マウス−ＨＲＰ抗体（アマシャムファルマシア）および抗ラビット−ＨＲＰ抗体（サンタクルーズ）：１／２０００希釈〕を加え、室温で１．５時間反応させた。反応後、ＴＴＢＳバッファーで３回洗浄し、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ試薬（アマシャムファルマシア）を用いて検出した。
その結果、Ｆｌａｇタグ導入ｈＦＢＬ２を発現させた免疫沈降画分にのみ、ＡＰＰに相当するバンドが検出された。さらに、ＡＰＰよりα−セクレターゼおよびβ−セクレターゼによって切断されて生じるＣ末端断片α（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−α；ＣＴＦα）およびＣ末端断片β（ＣＴＦβ）に相当するバンドも、Ｆｌａｇタグ導入ｈＦＢＬ２を発現させた免疫沈降画分にのみ検出された。
これより、ｈＦＢＬ２タンパク質は、ＡＰＰタンパク質、ＣＴＦαタンパク質およびＣＴＦβタンパク質と結合することが明らかとなった。
実施例４
ｈＦＢＬ２に対する特異的な基質の同定
Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍに使用するｈＦＢＬ２発現ベクター作製のため、合成プライマー（配列番号：１０および配列番号：１１）、酵素としてｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラ）、鋳型として実施例１で作製したｈＦＢＬ２発現ベクターを用い、以下の（１）〜（３）の条件でＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を得た。
（１）９４℃  ５分
（２）９４℃  ３０秒−５５℃  ３０秒−７２℃  ２分を２７回
（３）７２℃  ７分
得られたＰＣＲ産物を、ＧＦＸカラム（アマシャムファルマシア）で精製した。この精製したＰＣＲ産物とｐＧＢＫＴ７ベクター（クロンテック）を制限酵素ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ（タカラ）で処理した後、両者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２（タカラ）を用いて接合し、大腸菌ＤＨ５αに形質変換した。以下、実施例１と同様な方法により、発現ベクターを単離した。
このベクターをＹｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック）を用い、キットに添付された実験手引き書に従いＡＨ１０９株（クロンテック）に形質転換した。Ｐｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテック）を用い、添付の実験手引き書に従い接合を行なった後、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンを含まないＳＤ寒天培地上で３０℃、９日間培養した。育成したコロニーをさらにアデニン、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンを含まずＸ−α−ｇａｌ（クロンテック）を含むＳＤ寒天培地上で３０℃、１６日間培養した。青色に変色したＸ−α−ｇａｌ陽性のクローンを、再度同様のＳＤ寒天培地に画線培養し、Ｘ−α−ｇａｌ活性を再確認した。陽性クローンは、ＲＰＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ）を用いてプラスミドを単離し、これを鋳型として合成プライマー（配列番号：１２）、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＡＢＩ）を用いてシークエンス反応を行い、シークエンス産物を３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ）で解析した。シークエンス解析で得られた配列をホモロジー検索した結果、これらの陽性クローンは、Ｓ−ｐｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ａ（Ｓｋｐ１）およびｙｉｐｐｅｅ−ｌｉｋｅ  １（ＹＰＥＬ１）であった。
これらのタンパク質が、細胞内でｈＦＢＬ２と結合するか調べるために、以下の実験を行なった。
ヒト型Ｓｋｐ１（ｈＳｋｐ１）遺伝子の増幅のため、合成プライマー（配列番号：１３および配列番号：１４）、酵素としてｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラ）、鋳型としてｑｕｉｃｋ  ｃｌｏｎｅ  ｈｕｍａｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ（クロンテック）を用い、以下の（４）〜（６）の条件でＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を得た。
（４）９４℃  ５分
（５）９４℃  ３０秒−５５℃  ３０秒−７２℃  １分を３５回
（６）７２℃  ７分
得られたＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（インビトロジェン）へクローニングし、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。以下、実施例１と同様の方法で発現ベクターを単離した。
ヒト型ＹＰＥＬ１（ｈＹＰＥＬ１）遺伝子の増幅のため、合成プライマー（配列番号：１５および配列番号：１６）、酵素としてｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラ）、鋳型としてｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  ｐａｎｅｌ  １：クロンテック）を用い、以下の（７）〜（９）の条件でＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を得た。
（７）９４℃  ５分
（８）９４℃  ３０秒−５５℃  ３０秒−７２℃  ２分を４０回
（９）７２℃  ７分
得られたＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（インビトロジェン）へクローニングし、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。以下、実施例１と同様の方法で発現ベクターを単離した。さらにＮ末端にＭｙｃタグを導入したｈＹＰＥＬ１発現ベクター作製のため、合成プライマー（配列番号：１７および配列番号：１８）、酵素としてｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラ）、鋳型として上記に示したｈＹＰＥＬ１発現ベクターを用い、以下の（１０）〜（１２）の条件でＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を得た。
（１０）９４℃  ５分
（１１）９４℃  ３０秒−５５℃  ３０秒−７２℃  １分を２７回
（１２）７２℃  ７分
得られたＰＣＲ産物を、ＧＦＸカラム（アマシャムファルマシア）で精製した。この精製したＰＣＲ産物とｐＣＭＶ３Ｂベクター（ストラタジーン）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ（タカラ）で処理した後、両者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２（タカラ）を用いて接合し、大腸菌ＤＨ５αに形質変換した。以下、実施例１と同様な方法で発現ベクターを単離した。
ＣＯＳ７細胞を６ｃｍシャーレ（ファルコン）に２０万個／シャーレで播種し、３７℃で１８時間培養した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ギブコ）０．５５ｍｌにリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を２７．５μｌ加え室温で５分静置した後、Ｆｌａｇタグ導入ｈＦＢＬ２発現ベクター（実施例３）５．５μｇおよびｈＳｋｐ１発現ベクター５．５μｇ、またはＦｌａｇタグ導入ｈＦＢＬ２発現ベクター（実施例３）５．５μｇおよびＭｙｃタグ導入ｈＹＰＥＬ１発現ベクター５．５μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地０．５５ｍｌとそれぞれ混合し、室温で２０分間静置させた。細胞を播種したシャーレに該混合物を添加し３７℃で４時間培養し、培地交換後さらに１８時間培養した。対照としてＦｌａｇタグ導入ｈＦＢＬ２発現ベクターの代わりにｐＣＭＶ２Ｂ−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（ストラタジーン）を用いて上記と同様の方法でＣＯＳ７細胞に形質導入した。
ユビキチン−プロテアソーム経路による分解を阻害するため、終濃度１５μＭとなるようにＭＧ１３２（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を添加し、３７℃で３時間培養した。培地を除去し、５ｍｌのＰＢＳで２回細胞を洗浄した後、１ｍｌの細胞破砕バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％ＮＰ−４０，１ｍＭ  β−メルカプトエタノール，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロッシュ），１０μＭ  ＭＧ１３２）を加え細胞破砕を行なった。遠心により回収した上清にｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化したａｎｔｉ−Ｆｌａｇ  ａｇａｒｏｓｅ（シグマ）を２０μｌ加え、４℃で２２時間回転させながら反応させた。１ｍｌのｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄した後、１００μｌのサンプルバッファー（第一化学）を加え、９５℃で５分間処理した。処理した試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）に転写し、室温で１．５時間ブロッキング（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５％スキムミルク，０．１％Ｔｗｅｅｎ）した後、１次抗体〔抗Ｓｋｐ１抗体（Ｈ−１６３：サンタクルーズ、１／５００希釈）および抗Ｍｙｃ抗体（Ａ−１４：サンタクルーズ、１／５００希釈）〕を加え、４℃で２０時間反応させた。１次抗体反応後、ＴＴＢＳバッファー〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ〕で３回洗浄し、２次抗体〔抗ラビット−ＨＲＰ抗体（サンタクルーズ）：１／２０００希釈〕を加え室温で１．５時間反応させた。反応後、ＴＴＢＳバッファーで３回洗浄し、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ試薬（アマシャムファルマシア）を用いて検出した。
その結果、Ｆｌａｇタグ導入ｈＦＢＬ２を発現させた免疫沈降画分にのみ、ｈＳｋｐ１およびｈＹＰＥＬ１に相当するバンドが検出された。
これより、ｈＦＢＬ２は、ｈＳｋｐ１およびｈＹＰＥＬ１と結合することが明らかとなった。
実施例５
マウス初代神経細胞でのＦＢＬ２によるＡβ産生低下作用
（１）Ｆｌａｇタグ導入ｍＦＢＬ２発現ベクターの作製
マウス型ＦＢＬ２（ｍＦＢＬ２）遺伝子増幅のため、合成プライマー（配列番号：２５および配列番号：２６）、酵素としてｐｆｕｔｕｒｂｏ（タカラ酒造）、鋳型としてｍｏｕｓｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  ｐａｎｅｌＩ（ＢＤバイオサイエンス）を用い、（１）〜（３）の条件でＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を得た。
（１）９４℃  ５分
（２）９４℃  ３０秒−５６℃  ３０秒−７２℃  ２分を３５回
（３）７２℃  ７分
得られたＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５／ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）へクローニングし、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。得られたコロニー、合成プライマー（配列番号：５および配列番号：２７）および酵素としてＥｘＴａｑ（タカラ酒造）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。実施例１と同様の方法により、得られたＰＣＲ産物より発現ベクターを単離した（以下、ｍＦＢＬ２発現ベクターと称する）。ｍＦＢＬ２発現ベクターのＮ末端にＦｌａｇタグを導入するため、合成プライマー（配列番号：２８および配列番号：２９）、酵素としてｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラ酒造）、および鋳型としてのｍＦＢＬ２発現ベクターを用い、（４）〜（６）の条件でＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を得た。
（４）９４℃  ５分
（５）９４℃  ３０秒−５５℃  ３０秒−７２℃  １分３０秒を２７回
（６）７２℃  ７分
得られたＰＣＲ産物を、ＧＦＸカラム（アマシャムバイオサイエンス）で精製した。この精製したＰＣＲ産物およびｐＣＭＶ２Ｂベクター（ストラタジーン）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（タカラ酒造）で処理した後、両者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２（タカラ酒造）を用いて接合し、大腸菌ＤＨ５αに形質変換した。実施例１と同様の方法により、得られたＰＣＲ産物より発現ベクターを単離した（以下、Ｆｌａｇタグ導入ｍＦＢＬ２発現ベクターと称する）。
（２）ｍＦＢＬ２発現レンチウイルスベクターの作製
ｍＦＢＬ２発現レンチウイルスベクターは以下の方法で作製した。  合成プライマー（配列番号：３０および配列番号：３１）、酵素としてＰｆｕｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン）、および鋳型としてＦｌａｇタグ導入ｍＦＢＬ２発現ベクターを用い、以下の条件（７）〜（９）でＰＣＲを行った。
（７）９５℃  ２分
（８）９５℃  ３０秒−５８℃  ３０秒−７２℃  ２分を３５回
（９）７２℃  ７分
増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約１２００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡを、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）に付属されているｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）へプロトコールに従ってクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをカナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選択し、形質転換体を得た。個々のクローンをカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ  ８  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これをＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステム）を用いてシークエンス反応を行い、シークエンス産物を３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム）で解析した。構築したベクターをｍＦＢＬ２−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯと命名した。
ｍＦＢＬ２−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯおよびレンチウイルス発現用ベクターＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ（理化学研究所バイオリソースセンター）を、各々制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ（いずれもタカラ酒造）で消化し、切り出された目的のバンドをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。ｍＦＢＬ２断片およびＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ（ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化済み）をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ２．１のプロトコールに従い、連結した。これを大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選択し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ  ８  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡをＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステム）を用いてシークエンス反応を行い、シークエンス産物を３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム）で解析した。得られたベクターは、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ｍＦＢＬ２ベクターと命名した。
（３）ＬａｃＺ発現レンチウイルスベクターの作製
ＬａｃＺ発現レンチウイルスベクターは以下の方法で構築した。
合成プライマー（配列番号：３２および配列番号：３３）、酵素としてＰｆｕｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン）、および鋳型としてキットに添付のｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（インビトロジェン）ベクターを用い、以下の条件（１０）〜（１２）でＰＣＲを行った。
（１０）９５℃  ２分
（１１）９５℃  ３０秒−５６℃  ３０秒−７２℃  ３分を３５回
（１２）７２℃  ５分
上記（２）のｍＦＢＬ２−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター作製と同様の方法を用い、ＬａｃＺ−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターを得た。ＬａｃＺ−ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターおよびレンチウイルス発現用ベクターＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳを、各々制限酵素ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ（いずれも宝酒造社製）で消化後、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ｍＦＢＬ２ベクター作製と同様の方法により、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＬａｃＺベクターを得た。
（４）ＦＢＬ２およびＬａｃＺ発現レンチウイルスの作製
レンチウイルスの作製は以下の方法で行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をポリＬリジンコート１０ｃｍシャーレ（ＩＷＡＫＩ）に５０００万個／シャーレで播種し、３７℃で１８時間培養した。上記（２）で作製したＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ｍＦＢＬ２ベクター１７μｇ、パッケージングプラスミドｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐベクター１０μｇ、およびエンベローププラスミドｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖベクター１０μｇを含んだ全量４５０μｌの水溶液を作製した。陽性対照として、上記（３）で作製したＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＬａｃＺベクターをＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ｍＦＢＬ２ベクターのかわりに使用した。これらのＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ｍＦＢＬ２水溶液およびＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＬａｖＺ水溶液にそれぞれ２．５Ｍ  ＣａＣｌ２  ５０μｌを加えた後、２ｘＢＢＳ（５０ｍＭ  ＢＥＳ、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）５００μｌを加え混合し、室温で２０分反応させた。得られた混合液を、細胞播種済の１０ｃｍシャーレに添加し、３７℃、３％ＣＯ２下で１６時間培養した後、１０μＭフォルスコリン（シグマ）を含んだＤＭＥＭ培地７．５ｍｌに交換し、さらに３７℃、１０％ＣＯ２下で４８時間培養した。培養上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、１９，４００ｒｐｍ、２０℃、２時間超遠心分離して得られた沈殿物をＨＢＳＳに溶解させ、ｍＦＢＬ２発現レンチウイルスおよびＬａｃＺ発現レンチウイルスを得た。
（５）Ａβ量の測定
胎生１４日齢のＩＣＲマウス（日本チャールズリバー）の大脳皮質から初代神経細胞を調製し、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地（ギブコ）で２０万個／ｍｌに懸濁しポリＬリジンコート２４ウエルプレートに１ｍｌずつ播種し、３７℃で８日間培養した。培養上清５００μｌを交換し、上記で得られたｍＦＢＬ２発現レンチウイルス、対照としてＬａｃＺ発現レンチウイルスをそれぞれＭｏｉ５になるように添加し、３７℃で４日間培養した。培養上清を全量除去し、１ｍｌの培地を新たに加え３７℃で３日間培養した後、培養上清１００μｌを用いて実施例１の方法に従い、培養上清中Ａβ量を測定した。
結果を以下に示す。
対照（ＬａｃＺ発現レンチウイルスを添加した細胞）の培養上清中のＡβ４０およびＡβ４２量は、それぞれ３４２．２±５２．０５ｐＭ、および５０．１２±５．２０ｐＭであった。これに対し、ｍＦＢＬ２発現レンチウイルスを添加した細胞の培養上清中のＡβ４０およびＡβ４２量は、それぞれ２６７．７±２３．６６ｐＭ、および４０．８６±２．４０ｐＭであった。
これより、マウス大脳皮質由来初代神経細胞でｍＦＢＬ２遺伝子の過剰発現により、Ａβ４０量およびＡβ４２量が低下することが明らかとなった。
実施例６
ＦＢＬ２による細胞内Ａβ産生低下作用
１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で８万個／ｍｌに懸濁したｓｗｅｄｉｓｈ型変異を導入したＡｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）遺伝子を過剰発現するＮｅｕｒｏ２ａ安定発現株（東京大学より入手）を、５ｍｌずつ６ｃｍシャーレ（ファルコン）に播種し、同時に実施例５で作製したｍＦＢＬ２発現レンチウイルスをＭｏｉ１０になるように加え３７℃で３日間培養した。対照として、ＬａｃＺ発現レンチウイルスをｍＦＢＬ２発現レンチウイルスの代わりに使用して同様に培養をした。これらの培養液の上清を除去し、細胞を５ｍｌ  ＰＢＳで３回洗浄した後、５５０μｌのＲＩＰＡバッファー（０．５％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％ＳＤＳ，１％ＮＰ４０，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  β−メルカプトエタノール，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロッシュ））を加え、超音波処理により細胞を破砕した。遠心により得られた上清１００μｌを用いて実施例１の方法に従い、細胞内Ａβ量を測定した。さらに上清中のタンパク質量をｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（バイオラド）を用いて測定し、得られたタンパク質量を用いて細胞内Ａβ量を補正した。
結果を以下に示す。
対照（ＬａｃＺ発現レンチウイルスを添加した細胞）の細胞内Ａβ４０量は、２７．４０±３．８７ｆｍｏｌ／ｍｇであった。これに対し、ｍＦＢＬ２発現レンチウイルスを添加した細胞の細胞内Ａβ４０量は、１９．２６±０．８４ｆｍｏｌ／ｍｇであった。
これより、ｓｗＡＰＰ過剰発現Ｎｅｕｒｏ２ａ安定発現株でｍＦＢＬ２遺伝子の過剰発現により、細胞内Ａβ４０量が低下することが明らかとなった。
実施例７
ＦＢＬ２によるＡＰＰ−ＣＴＦユビキチン化促進作用
１０％ＦＢＳおよび非必須アミノ酸を含むＤＭＥＭ培地で１８万個／ｍｌに懸濁したＨＥＫ２９３Ａ細胞を、５００μｌずつタイプＩコラーゲンコート２４ウエルプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種し、３７℃で１８時間培養した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ギブコ）５０μｌにリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を２μｌ加え、室温で５分静置後、ｈＡＰＰ６９５発現ベクター（実施例１）およびｈＦＢＬ２発現ベクター（実施例１）をそれぞれ０．５μｇずつ加えたＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地５０μｌと混合し、室温で２０分間反応させた。陽性対照にはｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５／Ｈｉｓ−ＬａｃＺベクター（インビトロジェン）をｈＦＢＬ２発現ベクターの代わりに使用し、同様にリポフェクトアミン２０００を加えたＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地と混合し、室温で２０分間反応させた。反応後、細胞を播種したプレートに上記で作製した混合液を添加し３７℃で４時間培養し、全量培地交換後さらに１８時間培養した。ユビキチン−プロテアソーム経路による分解を阻害するため、終濃度１５μＭとなるようにプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を添加し、３７℃で５時間培養した。培地を除去し、５００μｌのＰＢＳで細胞を洗浄した後、１２０μｌの細胞破砕緩衝液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，１ｍＭ  β−メルカプトエタノール，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロッシュ），２５μＭ  ＭＧ１３２〕を加え超音波処理により細胞を破砕した。遠心分離により回収した３ウエル分の上清に、細胞破砕緩衝液で平衡化したｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ザイメッド）を２５μｌ、および抗ＡＰＰ抗体２μｇ（ＣＴ６９５：ザイメッド）を加え、４℃で３時間回転させながら反応させた。１ｍｌの細胞破砕緩衝液で４回洗浄した後、８０μｌのサンプル緩衝液（第一化学）を加え、９５℃で５分間処理した。処理した試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）に転写し、室温で１．５時間ブロッキング〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５％スキムミルク，０．１％Ｔｗｅｅｎ〕した後、１次抗体〔抗ユビキチン抗体（Ｐ４Ｄ１：サンタクルーズ、１／５００希釈）または抗ＡＰＰ抗体（ＣＴ６９５：ザイメット、１／１０００希釈）〕を加え、４℃で２０時間反応させた。１次抗体反応後、ＴＴＢＳバッファー〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ〕で３回洗浄し、２次抗体〔抗マウス−ＨＲＰ抗体（アマシャムバイオサイエンス）または抗ラビット−ＨＲＰ抗体（サンタクルーズ）：１／２０００希釈〕を加え、室温で１．５時間反応させた。反応後、ＴＴＢＳバッファーで３回洗浄し、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ試薬（アマシャムバイオサイエンス）を用いて検出した。
その結果、ＦＢＬ２を過剰発現させた免疫沈降画分で、陽性対照であるＬａｃＺを過剰発現させた免疫沈降画分に比べユビキチン化タンパク質量の増加が見られた。さらにＦＢＬ２を発現させた免疫沈降画分でのみ、ＣＴＦの高分子領域にバンドが検出され、このバンドはＦＢＬ２の導入により増加したユビキチン化タンパク質のバンドと分子量が一致することから、ＦＢＬ２がＣＴＦのユビキチン化を促進することが明らかとなった。
実施例８
細胞免疫染色法によるＦＢＬ２蛋白質量の検出
胎生１７日齢のＳＤラット（日本クレア）の大脳皮質から初代神経細胞を調製し、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地（ギブコ）で１０万個／ｍｌに懸濁し、ポリＬリジンコート９６ウエルプレート（住友ベークライト）に１５０μｌずつ播種し、３７℃で７日間培養した。ｍＦＢＬ２発現レンチウイルス（実施例５）をＭｏｉ１、５および１０になるようにそれぞれ加え、３７℃で４日間培養した。培養後の細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを加え室温で１０分間固定を行った。ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含むＰＢＳを加え、室温で３０分間ブロッキングを行った。抗ＦＢＬ２ウサギポリクローナル抗体（ヒト型ＦＢＬ２組換え体タンパク質を抗原に使用：ＭＢＬ社に作製依頼）を１％ＢＳＡおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含むＰＢＳで１／５００倍に希釈し、上記固定細胞に添加し、室温で２時間反応後、ＰＢＳで３回洗浄した。ついで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ  ５４６  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（モレキュラープローブ）を１％ＢＳＡ，および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含んだＰＢＳ溶液で１／５００倍希釈して加え、室温で１時間静置し、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１（モレキュラーデバイス）により蛍光像を取得し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（モレキュラーデバイス）を用いて陽性染色部位の総蛍光強度（Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を出力し解析した。
結果を以下に示す。
ｍＦＢＬ２発現レンチウイルス非導入細胞では、総蛍光強度が２９８３．５６であるのに対し、ｍＦＢＬ２発現レンチウイルスをＭｏｉ１、５および１０になるように添加した細胞では、それぞれ１７４９３．２７、３４０２１．３５および４６５９３．５８であった。この結果から、抗ＦＢＬ２抗体を用いた細胞免疫染色法でＦＢＬ２タンパク質の発現増加を検出することが可能であることが明らかとなった。これより、この系を用いてＦＢＬ２の発現を促進する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングを行うことが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
（ｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（本発明のタンパク質）のユビキチン化を促進する化合物またはその塩、（ｉｉ）プロテアソームによる、本発明のタンパク質の分解を促進する化合物またはその塩、（ｉｉｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質（例、ＳＣＦ複合体）と、本発明のタンパク質との結合を促進する化合物またはその塩、（ｉｖ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（例、ＦＢＬ２）の発現を促進する化合物またはその塩、（ｖ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド（例、ＦＢＬ２）の遺伝子をコードするポリヌクレオチドの発現を促進する化合物またはその塩などは、例えば神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）など〕などの低毒性で安全な予防・治療剤として使用することができる。
（ｖｉ）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（本発明のタンパク質）、（ｖｉｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（例、ＦＢＬ２）、（ｖｉｉｉ）配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するタンパク質（例、ＳＣＦ複合体）などは、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）など〕などの予防・治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングに有用である。
［配列表］
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