(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（２）
【化１】
0005090854.tif 000006
(式中、Ａｒは置換基を有していてもよいフェニル、ナフチル又はインドリル基を示し、ｎは１〜４の数を示す)
で表されるアリールアルキルアミンを含有する培地中で、コハク酸アミド合成能を有するシュードモナス属に属する微生物を培養することを特徴とする、一般式（１）
【化２】
0005090854.tif 000007
（式中、Ａｒ及びｎは前記と同じ）
で表されるコハク酸アミド化合物又はその塩の製造法。
【請求項２】
Ａｒがフェニル基又はインドリル基であり、ｎが２である請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物成長調整剤として有用なコハク酸アミド化合物の微生物を利用した製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発根促進活性が高く、植物の成長を促進する成分は、農業及び林業分野において強く望まれており、数多くの研究がなされている。そのような状況下、下記一般式（１）
【０００３】
【化１】
0005090854.tif 000002
【０００４】
(式中、Ａｒは置換基を有していてもよいフェニル、ナフチル又はインドリル基を示し、ｎは１〜４の数を示す)
で表されるコハク酸アミド化合物又はその塩が優れた発根促進作用を有し、植物成長調整剤として有用であることが知られている（特許文献１及び２）。
【０００５】
このコハク酸アミド化合物は特許文献１及び２記載のように化学合成によって得ることもできるが、バチルス属に属する微生物によっても生産されることが知られている（非特許文献１）。
【特許文献１】特開平１−２５５６０７号公報
【特許文献２】特開２００１−１３９４０５号公報
【非特許文献１】副島ら１９９９．新規発根促進物質Ｎ−（フェネチル）コハク酸アミドの精製と単離．植物化学調節学会第34回大会講演要旨集，７５−７６ページ．
【非特許文献２】厚生省生活衛生局（監）１９９０．食品衛生検査指針−微生物編−．社団法人日本食品衛生協会．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、市場に流通している植物成長調整剤のほとんどは化学合成によって製造されているが、消費者の間には物質自体の安全性に疑念をもつ風潮も未だに強い。このことは、有機農産物や減農薬栽培農産物がもてはやされていることからも裏付けられる。この点を鑑みると、植物成長調整剤を含む農薬としては、天然由来のものが好ましく、化学合成により得られるものでなく、微生物によって生産されるものが望まれている。しかしながら、従来技術では典型的な好気性芽胞形成菌であるバチルス属菌を用いているため、取り扱いが難しいという欠点があった。すなわち、バチルス属菌は培養中に形成される内生胞子が熱、乾燥、放射線、化学薬品に対して強い耐性をもつことから、使用後の装置の滅菌が困難であるほか、周辺環境への汚染の危険性も高いという欠点があった（非特許文献２）。
従って、本発明の目的は、植物成長促進剤として有用な上記一般式（１）で表される化合物のバチルス属以外の微生物による新たな製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、一般式（１）の化合物生産能を有する新たな微生物を探索したところ、従来知られているバチルス属とは分類学上全く相違し、芽胞形成能力をまったくもたないシュードモナス属に属する微生物が、アリールアルキルアミンから一般式（１）の化合物を生産する能力を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、一般式（２）
【０００９】
【化２】
0005090854.tif 000003
【００１０】
(式中、Ａｒは置換基を有していてもよいフェニル、ナフチル又はインドリル基を示し、ｎは１〜４の数を示す)
で表されるアリールアルキルアミンを含有する培地中で、コハク酸アミド合成能を有するシュードモナス属に属する微生物を培養することを特徴とする、一般式（１）
【００１１】
【化３】
0005090854.tif 000004
【００１２】
（式中、Ａｒ及びｎは前記と同じ）
で表されるコハク酸アミド化合物又はその塩の製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明方法によれば、シュードモナス属に属する微生物の培養により、植物成長調整剤として有用なコハク酸アミド化合物又はその塩が効率良く得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の製造法に用いられる微生物は、シュードモナス属に属し、かつコハク酸アミド合成能を有する微生物であれば特に限定されないが、例えばシュードモナス  コリーンシス（Pseudomonas koreensis）、シュードモナス フルオレセンス(Psendomonas fluorescens)、シュードモナス  アビエタニフィラ(Pseudomonas abietaniphila)、シュードモナス  アルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス  アガリチ(Pseudomonas agarici)、シュードモナス  アルカリゲネス(Pseudomonas alcaligenes)、シュードモナス  アルカリフィラ(Pseudomonas alcaliphila)、シュードモナス  アミグダリ(Pseudomonas amygdali)、シュードモナス  アンギリセプティカ(Pseudomonas anguilliseptica)、シュードモナス  アスプレニ(Pseudomonas asplenii)、シュードモナス  オーランチアカ(Pseudomonas aurantiaca)、シュードモナス  アベラナエ(Pseudomonas avellanae)、シュードモナス  アゾチフィゲンス(Pseudomonas azotifigens)、シュードモナス  アゾトフォーマンス(Pseudomonas azotoformans)、シュードモナス  バレアリカ(Pseudomonas balearica)、シュードモナス  ベイジェリンキー(Pseudomonas beijerinckii)、シュードモナス  ボレオポリス(Pseudomonas boreopolis)、シュードモナス  ブラシカセラム(Pseudomonas brassicacearum)、シュードモナス  ブレネリ(Pseudomonas brenneri)、シュードモナス  カナビナ(Pseudomonas cannabina)、シュードモナス  カルボキシドハイドロジナ(Pseudomonas carboxydohydrogena)、シュードモナス  カリカパパイヤ(Pseudomonas caricapapayae)、シュードモナス  セドリナ(Pseudomonas cedrina)、シュードモナス  クロリチディスミュータンス(Pseudomonas chloritidismutans)、シュードモナス  クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)、シュードモナス  チコリ(Pseudomonas cichorii)、シュードモナス  チシコラ(Pseudomonas cissicola)、シュードモナス  シトロネロリス(Pseudomonas citronellolis)、シュードモナス  コルガタ(Pseudomonas corrugata)、シュードモナス  コスタンチーニ(Pseudomonas costantinii)、シュードモナス  クレモリコロラタ(Pseudomonas cremoricolorata)、シュードモナス  デニトリフィカンス(Pseudomonas denitrificans)、シュードモナス  エロンガータ(Pseudomonas elongata)、シュードモナス  エクストレモリエンタリス(Pseudomonas extremorientalis)、シュードモナス  フィクセレクタエ(Pseudomonas ficuserectae)、シュードモナス  フラベセンス(Pseudomonas flavescens)、シュードモナス  フレクテンス(Pseudomonas flectens)、シュードモナス  フラギ(Pseudomonas fragi)、シュードモナス  フレデリクスベルゲンシス(Pseudomonas frederiksbergensis)、シュードモナス  フルバ(Pseudomonas fulva)、シュードモナス  フスコバジネ(Pseudomonas fuscovaginae)、シュードモナス  ゲリディコラ(Pseudomonas gelidicola)、シュードモナス  ゲニキュラータ(Pseudomonas geniculata)、シュードモナス  ゲサルディ(Pseudomonas gessardii)、シュードモナス  グラミニス(Pseudomonas graminis)、シュードモナス  グリモンティ(Pseudomonas grimontii)、シュードモナス  ハロフィラ(Pseudomonas halophila)、シュードモナス  ヒビシコラ(Pseudomonas hibiscicola)、シュードモナス  ヒュッチエンシス(Pseudomonas huttiensis)、シュードモナス  インディカ(Pseudomonas indica)、シュードモナス  ジェッセニ(Pseudomonas jessenii)、シュードモナス  ジンジュエンシス(Pseudomonas jinjuensis)、シュードモナス  キロネンシス(Pseudomonas kilonensis)、シュードモナス  ランセオラタ(Pseudomonas lanceolata)、シュードモナス  リバネンシス(Pseudomonas libanensis)、シュードモナス  リニ(Pseudomonas lini)、シュードモナス  ランデンシス(Pseudomonas lundensis)、シュードモナス  ルテオラ(Pseudomonas luteola)、シュードモナス  マンデリィ(Pseudomonas mandelii)、シュードモナス  マルギナリス(Pseudomonas marginalis)、シュードモナス  メジテラネア(Pseudomonas mediterranea)、シュードモナス  メリエ(Pseudomonas meliae)、シュードモナス  メンドシナ(Pseudomonas mendocina)、シュードモナス  メフィチカ(Pseudomonas mephitica)、シュードモナス  ミグレ(Pseudomonas migulae)、シュードモナス  モンテイリィ(Pseudomonas monteilii)、シュードモナス  モッセリィ(Pseudomonas mosselii)、シュードモナス  ムシドレンス(Pseudomonas mucidolens)、シュードモナス  マルチレシニボランス(Pseudomonas multiresinivorans)、シュードモナス  ニトロレヂュセンス(Pseudomonas nitroreducens)、シュードモナス  オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)、シュードモナス  オリエンタリス(Pseudomonas orientalis)、シュードモナス  オリジハビタンス(Pseudomonas oryzihabitans)、シュードモナス  パチャストレラ(Pseudomonas pachastrellae)、シュードモナス  パレロニアナ(Pseudomonas palleroniana)、シュードモナス  パラフルバ(Pseudomonas parafulva)、シュードモナス  パーツシノジーナ(Pseudomonas pertucinogena)、シュードモナス  ピクトラム(Pseudomonas pictorum)、シュードモナス  プレコグロッシシーダ(Pseudomonas plecoglossicida)、シュードモナス  シュードアルカリゲネス(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、シュードモナス  フィクロフィラ(Pseudomonas psychrophila)、シュードモナス  プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス  レジノボランス(Pseudomonas resinovorans)、シュードモナス  ロデジエ(Pseudomonas rhodesiae)、シュードモナス  サッカロフィラ(Pseudomonas saccharophila)、シュードモナス  サロモニ(Pseudomonas salomonii)、シュードモナス  サバスタニ(Pseudomonas savastanoi)、シュードモナス  スピノサ(Pseudomonas spinosa)、シュードモナス  ストラミネア(Pseudomonas straminea)、シュードモナス  スタッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス  シンクサンタ(Pseudomonas synxantha)、シュードモナス  シリンゲ(Pseudomonas syringae)、シュードモナス  シジギー(Pseudomonas syzygii)、シュードモナス  タエトロレンス(Pseudomonas taetrolens)、シュードモナス  サーモトレランス(Pseudomonas thermotolerans)、シュードモナス  チベルバレンシス(Pseudomonas thivervalensis)、シュードモナス  トラシー(Pseudomonas tolaasii)、シュードモナス  トレメ(Pseudomonas tremae)、シュードモナス  アンソンゲンシス(Pseudomonas umsongensis)、シュードモナス  バンコベレンシス(Pseudomonas vancouverensis)、シュードモナス  ベロニ(Pseudomonas veronii)、シュードモナス  ビリジフラバ(Pseudomonas viridiflava)、シュードモナス  キサンソマリナ(Pseudomonas xanthomarina)に属する微生物が挙げられ、このうちシュードモナス  コリーンシス及びシュードモナス  フルオレセンスに属する微生物が特に好ましい。
【００１５】
本発明の製造法に用いられる微生物の好ましい具体例としては、シュードモナス  コリーンシス  ＡＲ１５、同  ＪＣＭ１４７６９、シュードモナス  フルオレセンス  ＲＣＨ３８−２、同  ＣＨ１７−１５、同  ＣＨ３４−８、同  ＣＨ３４−１１、同  ＪＣＭ５９６３等が挙げられる。これらの菌株のうち、シュードモナス  コリーンシス  ＪＣＭ１４７６９及びシュードモナス  フルオレセンス  ＪＣＭ５９６３は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室から購入できる菌株である。また、その他の菌株は、土壌から分離されたものである。
【００１６】
これらの微生物を用いて一般式（１）のコハク酸アミド化合物又はその塩を製造するには、培地中に一般式（２）で表されるアリールアルキルアミンを添加する。一般式（１）及び（２）におけるＡｒは、置換基を有していてもよいフェニル基、ナフチル基又はインドリル基であるが、このうちフェニル基又はインドリル基が好ましく、特にフェニル基又は３−インドリル基が特に好ましい。
【００１７】
また、フェニル基、ナフチル基又はインドリル基に置換し得る基としては、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基から選ばれる１〜５個が挙げられる。ここでハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。Ｃ1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。Ｃ1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基等が挙げられる。
【００１８】
一般式（１）及び（２）中、ｎは１〜４の数を示すが、１〜３、特に２が好ましい。
【００１９】
一般式（１）及び（２）中、Ａｒとしてはフェニル基又はインドリル基が特に好ましく、ｎは２が特に好ましい。
【００２０】
培地中のアリールアルキルアミン（２）の含有量は、コハク酸アミド化合物の生産性の点から０．００１〜１０重量％、さらに０．００１〜５重量％、特に０．０１〜５重量％が好ましい。
【００２１】
本発明の製造法において、前記シュードモナス属微生物の培養は、アリールアルキルアミン（２）を培地に添加する以外は、通常のシュードモナス属微生物が増殖する条件で行えばよい。培地には、シュードモナス属微生物の増殖に必要な炭素源、窒素源、ビタミン源、ミネラル源等を添加するのが好ましい。炭素源としては、グルコース、水飴、可溶性デンプンなどが用いられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、アミノ酸液、大豆粕、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を用いることができる。ミネラル源としては、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩などを用いることができる。培地としては、通常液培地を用い、振盪培養、撹拌培養を行えばよい。
【００２２】
培養条件としては好気的条件で、８〜４５℃、pH３．２〜９．５が好ましい。培養時間は、２４〜２４０時間でよい。
【００２３】
前記培養により、培養液中にコハク酸アミド化合物（１）又はその塩が蓄積するので、常法によりコハク酸アミド化合物（１）又はその塩を採取すればよい。この培養液は、そのまま植物成長調整剤や肥料として用いることもできるが、当該培養液からコハク酸アミド化合物（１）又はその塩を精製してもよい。精製法としては、培養液の濃縮、沈殿化、有機溶媒による抽出、各種クロマトグラフィー等を採用することができる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
５００mL容バッフル付き三角フラスコに０．１％フェネチルアミンを添加したPotato Dextrose Broth（Ｄｉｆｃｏ社製、以下ＰＤＢ）を３００mL×１０本準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＰＤＢで前培養したPseudomonas koreensis  ＡＲ−１５株（岩手県土壌由来）を接種した。温度２７℃、回転数８０rpmで１０日間振とう培養した。
【００２６】
得られた培養液は以下の通り粗精製した。培養液を６，５００rpm、３０分で遠心分離し、上澄みを塩酸でpH３．０に調整した。別途、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０をメタノールで洗浄した後、カラム（内径１８mm×長さ３００mm）に充填し、pH３．０酢酸水を通液して調整した。本カラムに上記上澄み液を流すことによって、Ｎ−フェネチルコハク酸アミド（以下ＰＥＳＡ）を吸着した。カラムは１０％イソプロパノール１Ｌで洗浄した後、３０％イソプロパノール１ＬでＰＥＳＡを溶出した。溶出液はエバポレータで約５００mLに濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH８．０に調整して、酢酸エチルで３回抽出を行い、酢酸エチル層は棄却した。残った水相は塩酸を用いてpH２．５とし、酢酸エチル抽出を３回行った。得られた酢酸エチル層は無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣は少量の１Ｎ酢酸水で溶解し、洗浄後、１Ｎ酢酸水を通液して調整したSepPak  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に通過させることにより、ＰＥＳＡを吸着した。カートリッジは６０％メタノール２０mLで溶出し、溶出液は減圧下、乾固した。
【００２７】
このサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１％酢酸含有４０％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１〜１４分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＸＴｅｒｒａ  ＲＰ１８  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；移動相、１％酢酸含有４５％メタノール；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間９〜１２分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＸＴｅｒｒａ  ＲＰ１８  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；移動相、１％酢酸含有２５％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１〜１４分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、SymmetryShield  ＲＰ１８  内径４．６mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；カラム温度、４０℃；移動相、１％酢酸含有２０％アセトニトリル；流速、０．８mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１〜１３分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｐｈ  内径４．６mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；カラム温度、４０℃；移動相、１％酢酸含有４０％メタノール；流速、０．８mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１．５〜１４分）を単一ピークとして分取した。得られた画分は減圧下で濃縮後、五酸化二リン存在下、デシケータ内で減圧乾燥した結果、ＰＥＳＡの結晶１ｍｇを得た。この結晶についてグリセロールを用いた質量分析（ＭＳ−ＦＡＢ）によって分析したところ、（Ｍ＋Ｈ）＋が２２２．１、（Ｍ＋Ｎａ）＋が２４４．８として検出され、化学合成品と一致した。さらに、1Ｈ−ＮＭＲでの帰属も化学合成品と一致した（表１）。これらの結果から、本菌株は培養液中に０．３３mg／ＬのＰＥＳＡを生産していたことが証明された。
【００２８】
【表１】
0005090854.tif 000005
【００２９】
実施例２
培地を０．１％トリプタミンを添加したＰＤＢに置換し、培養本数を３００mL×２本とし、その他の点については実施例１と同様に培養、粗精製を行った。
このサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１％酢酸含有５０％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、Ｎ−［［２−（３−インドリル）エチル］コハク酸アミド］（以下、ＩＥＳＡ）保持時間相当画分（保持時間１１．０〜１４．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｐｈ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１％酢酸含有５０％メタノール；流速、３．０mL／分）で精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間９〜１２分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、SymmetryShield  ＲＰ１８  内径４．６mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；カラム温度、４０℃；移動相、１％酢酸含有４０％メタノール；流速、０．８mL／分）で分析した。ピークは１１．８５分に認められ、これは化学合成したＩＥＳＡとほぼ一致した（図１）。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２８１nmに吸光極大が認められ、化学合成したＩＥＳＡと一致した。２８０nmで測定したピーク面積を化学合成したＩＥＳＡによって作成した検量線と比較したところ、得られたＩＥＳＡは０．０５８mgと算出された。この結果から、本菌株は培養液中に０．０９５mg／ＬのＩＥＳＡを生産していたことが証明された。
【００３０】
実施例３
菌株をPseudomonas koreensis  ＪＣＭ１４７６９株に置換し、その他の点については実施例１と同様に培養、粗精製を行った。
このサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１％酢酸含有５０％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１．５〜１４．０分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｐｈ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１％酢酸含有５０％メタノール；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間９〜１１．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＸＴｅｒｒａ  ＲＰ１８  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；移動相、１％酢酸含有３０％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間８．０〜１０．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、SymmetryShield  ＲＰ１８  内径４．６mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；カラム温度、４０℃；移動相、１％酢酸含有４０％メタノール；流速、０．８mL／分）で分析した。ピークは１１．８８分に認められ、これは化学合成したＰＥＳＡとほぼ一致した。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２６０nmに吸光極大が認められ、化学合成したＰＥＳＡと一致した。２６０nmで測定したピーク面積を化学合成したＰＥＳＡによって作成した検量線と比較したところ、得られたＰＥＳＡは０．３０ｍｇと算出された。この結果から、本菌株は培養液中に０．１mg／ＬのＰＥＳＡを生産していたことが証明された。
【００３１】
実施例４
菌株をPseudomonas fluorescens  ＲＣＨ３８−２株（北海道土壌由来）に置換し、培養本数を３００mL×２本とし、その他の点については実施例３と同様に培養、粗精製、分析を行った。
ピークは１１．５０分に認められ、これは化学合成したＰＥＳＡとほぼ一致した。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２５９nmに吸光極大が認められ、化学合成したＰＥＳＡと一致した。２６０nmで測定したピーク面積を化学合成したＰＥＳＡによって作成した検量線と比較したところ、得られたＰＥＳＡは０．４５mgと算出された。この結果から、本菌株は培養液中に０．７５mg／ＬのＰＥＳＡを生産していたことが証明された。
【００３２】
実施例５
菌株をPseudomonas fluorescens  ＪＣＭ５９６３株に置換し、培地量を４．２Ｌとし、その他の点については実施例３と同様に培養、粗精製、分析を行った。
ピークは１１．６５分に認められ、これは化学合成したＰＥＳＡとほぼ一致した。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２５９nmに吸光極大が認められ、化学合成したＰＥＳＡと一致した。２６０nmで測定したピーク面積を化学合成したＰＥＳＡによって作成した検量線と比較したところ、得られたＰＥＳＡは１．２２mgと算出された。この結果から、本菌株は培養液中に０．２９mg／ＬのＰＥＳＡを生産していたことが証明された。