(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子を含有する無血清培地において骨髄、臍帯血または末梢血由来のＣＤ３４陽性および／またはＣＤ１３３陽性細胞をインキュベートして、該細胞から血管内皮前駆細胞を増殖させることを含む、血管内皮前駆細胞の増幅方法。
【請求項２】
ＣＤ３４陽性および／またはＣＤ１３３陽性細胞が単核球である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ３４陽性および／またはＣＤ１３３陽性細胞、および無血清培地に添加される各種因子が、同種動物に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ３４陽性および／またはＣＤ１３３陽性細胞がヒト由来である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
無血清培地が、トランスフォーミング増殖因子β阻害剤をさらに含有する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子を含有する、血管内皮前駆細胞増殖用無血清培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液血管芽細胞の培養方法、及び当該方法により得られる血管内皮前駆細胞などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、虚血性心疾患を対象として、骨髄単核球移植療法や末梢血幹細胞採取による血管内皮前駆細胞（Endothelial progenitor cell；以下、ＥＰＣとも略する）を用いた細胞移植療法が行われるようになった。しかしながら、下記の如きいくつかの問題点が明らかとなっている。
１）現行のいずれの治療法も、全身麻酔、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte colony stimulating factor；Ｇ−ＣＳＦ）投与、アフェレーシス等の患者の身体的負担を伴う。
２）繰り返し移植療法を行うことが困難である。
３）移植に必要な質・量ともに十分な細胞の確保が時として困難であるため、十分な治療効果を得にくい。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、生体外において機能的な未分化血管内皮前駆細胞を増幅させる方法及び当該方法によって得られる細胞移植用の血管内皮前駆細胞の提供を目的とする。
【０００４】
本発明者らは、上記課題に鑑み、生体外において未分化血管内皮前駆細胞が分化・増幅し得る培養条件を検討した。結果、（１）幹細胞因子（Stem cell factor；ＳＣＦ）、（２）インターロイキン６（Interleukin-6；ＩＬ−６）、（３）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（FMS-like tyrosine kinase 3 ligand；ＦＬ）、（４）トロンボポエチン（thrombopoietin；ＴＰＯ）からなる群より選ばれる因子を含む無血清培地において血液血管芽細胞を培養することにより、ＥＰＣを生体外で効率良く増幅できること、ならびに、この培地にさらに（５）血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor；ＶＥＧＦ）、及び／又は（６）トランスフォーミング増殖因子β（transforming growth factor β；ＴＧＦ−β）阻害剤を添加することで、ＥＰＣをより一層効率良く増幅させることなどに成功して本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は下記の通りである：
〔１〕幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド及びトロンボポエチンを含有する無血清培地において血液血管芽細胞をインキュベートすることを含む、血液血管芽細胞の培養方法；
〔２〕血液血管芽細胞のインキュベートにより血管内皮前駆細胞が増幅される血管内皮前駆細胞の増幅方法である、上記〔１〕の方法；
〔３〕血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、上記〔１〕の方法；
〔４〕血液血管芽細胞が単核球である、上記〔１〕の方法；
〔５〕血液血管芽細胞が、ＣＤ３４陽性および／またはＣＤ１３３陽性である、上記〔１〕の方法；
〔６〕血液血管芽細胞、および無血清培地に添加される各種因子が、同種動物に由来する、上記〔１〕の方法；
〔７〕血液血管芽細胞がヒト由来である、上記〔１〕の方法；
〔８〕無血清培地が、血管内皮細胞増殖因子及び／又はトランスフォーミング増殖因子β阻害剤をさらに含有する、上記〔１〕の方法；
〔９〕上記〔２〕の方法により得られる、血管内皮前駆細胞；
〔１０〕上記〔２〕の方法により得られる血管内皮前駆細胞を含み、且つ血管内皮前駆細胞の由来する動物に対して異種の動物由来の生体成分を実質的に含有しない、組成物；
〔１１〕同種移植用である、上記〔１０〕の組成物；
〔１２〕血管内皮前駆細胞がヒト由来である、上記〔１１〕の組成物；
〔１３〕虚血性疾患の予防・治療剤である、上記〔１２〕の組成物；
〔１４〕幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド及びトロンボポエチンを含有する無血清培地；
〔１５〕幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび無血清培地（幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンドおよびトロンボポエチンのうち少なくとも１つの因子は、無血清培地中に添加されていない）を含む、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンドおよびトロンボポエチンを含有する無血清培地の作製用キット。
【０００６】
本発明の方法により増幅された細胞を移植することにより虚血性心疾患の心機能（収縮能・拡張能）が改善された。すなわち、本発明の方法は、内皮系細胞を質・量ともに産生する上で有用と考えられ、虚血性心疾患等の血管障害を対象とした細胞移植療法の有用な方法となり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は、本発明の無血清培地（ＴＧＦ−β阻害剤は１μＭ）中で臍帯血由来のＣＤ１３３陽性細胞を１４日間培養した状態を示す。
図２は、本発明の無血清培地中で臍帯血由来のＣＤ１３３陽性細胞を培養した場合の細胞数の増幅の様子を示す。培養開始時、培養７日後、培養１４日後の細胞数を示す。ＴＧＦ−β阻害剤の濃度を変えて４種類の無血清培地を用いて実験を行った。
図３は、本発明の方法によって増幅した細胞についてメチルセルロース培地を用いた質的評価を行う為の具体的手順を示す。本発明の無血清培地中での培養開始時、１週間培養後、２週間培養後の細胞それぞれについて血液系コロニーアッセイとＥＰＣコロニーアッセイを行う。
図４は、メチルセルロース培地を用いた血液細胞コロニーアッセイにより形成される臍帯血由来ＣＤ１３３陽性細胞由来の血液細胞コロニーの像の一例を示す。
図５は、生理活性物質を含有するメチルセルロース培地を用いたＥＰＣコロニーアッセイにより形成される臍帯血由来ＣＤ１３３陽性細胞由来のＥＰＣコロニーの像の一例を示す。培養１４〜１８日において細胞サイズの異なる２種類のＥＰＣコロニーが出現する。
図６は、臍帯血ＣＤ１３３陽性細胞由来のＥＰＣコロニーをａｃＬＤＬ−ＤｉＩ及びＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣで二重染色した結果を示す。ａ、ｃ、ｅは大細胞コロニーを、ｂ、ｄ、ｆは小細胞コロニーを、ａ及びｂは位相差像、ｃ及びｄはａｃＬＤＬ−ＤｉＩによる染色像を、ｅ及びｆはＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣによる染色像を示す。両コロニーともにａｃＬＤＬ−ＤｉＩ及びＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣに染色され、ＥＰＣとしての特徴を示した。
図７は、本発明の無血清培地による増幅培養に伴う血液系コロニー及びＥＰＣコロニーの出現頻度を経時的に測定した結果を示す。なお、ＴＧＦ−β阻害剤の濃度を変えて４種類の無血清培地を用いて実験を行った。本発明の方法を用いた培養では、血液コロニーの頻度が減少しＥＰＣコロニーの出現頻度が上昇した。
図８は、本発明の無血清培地による増幅培養に伴う小細胞ＥＰＣコロニー及び大細胞ＥＰＣコロニーの形成能の推移を測定した結果を示す。なお、ＴＧＦ−β阻害剤の濃度を変えて４種類の無血清培地を用いて実験を行った。小細胞ＥＰＣコロニーは、各濃度のＴＧＦ−β阻害剤にて漸減する傾向にあった。大細胞ＥＰＣコロニーは、逆に１週間後に最高で２週間後にはやや減少する傾向にあった。
図９は、本発明の無血清培地による増幅培養に伴うＥＰＣコロニー形成能の推移を測定した結果を示す。各濃度のＴＧＦ−β阻害剤を含有する無血清培地を用いて培養したところ、２週間培養後、Ｄｉｓｈ当たりのＥＰＣコロニー数、総ＥＰＣコロニー数は１μＭのＴＧＦ−β阻害剤を含有している場合にもっとも多かった。
図１０は、増幅しなかったＣＤ１３３陽性細胞を移植した場合の虚血性心疾患に対する細胞移植療法の有効性を検討した結果を示す。＊は、コントロール（ＰＢＳ単独投与群）に対する有意差（Ｐ＜０．０５％）を示す。
図１１は、本発明の無血清培地中で培養することにより生体外増幅したＥＰＣを移植した場合の虚血性心疾患に対する細胞移植療法の有効性を検討した結果を示す。＊は、コントロール（ＰＢＳ単独投与群）に対する有意差（Ｐ＜０．０５％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、血液血管芽細胞の新規培養方法を提供する。本発明の培養方法は、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ及びＴＰＯからなる群より選ばれる１又は２以上の因子、好ましくは３以上の因子、より好ましくは全ての因子を含有する無血清培地において血液血管芽細胞をインキュベートすることを含む。従って、本発明の培養方法で用いられる無血清培地は、例えば、ａ）ＳＣＦ、ｂ）ＩＬ−６、ｃ）ＦＬ、ｄ）ＴＰＯ、ｅ）ＳＣＦとＩＬ−６との組合せ、ｆ）ＳＣＦとＦＬとの組合せ、ｇ）ＳＣＦとＴＰＯとの組合せ、ｈ）ＩＬ−６とＦＬとの組合せ、ｉ）ＩＬ−６とＴＰＯとの組合せ、ｊ）ＦＬとＴＰＯとの組合せ、ｋ）ＳＣＦ、ＩＬ−６及びＦＬの組合せ、ｌ）ＳＣＦ、ＩＬ−６及びＴＰＯの組合せ、ｍ）ＳＣＦ、ＦＬ及びＴＰＯの組合せ、ｎ）ＩＬ−６、ＦＬ及びＴＰＯの組合せ、あるいはｏ）ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ及びＴＰＯの組合せを含むものであり得る。
【０００９】
本発明で用いられる「血液血管芽細胞」とは、血液系細胞及び血管内皮細胞の両方の前駆細胞であって、血液幹細胞、血液前駆細胞を経て血液系細胞（例えば、赤血球、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、巨核球）になり得、また、ＥＰＣを経て血管内皮細胞になり得る未分化な細胞であれば特に限定されない。血液血管芽細胞としては、被検対象の骨髄、臍帯血又は末梢血由来の細胞を使用できる。血液血管芽細胞はまた、単核球であり得る。
【００１０】
血液血管芽細胞はさらに、ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性であり得る。従って、血液血管芽細胞として、ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞のみ予め選別して用いることもまた好ましい。ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞の選別は、当分野で通常行われている細胞選別の手法が用いられ、具体的にはＣＤ３４抗原及び／又はＣＤ１３３抗原に特異的な親和性を有する物質を用いた磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、蛍光細胞分離法（ＦＡＣＳ）等が挙げられる。
【００１１】
ＣＤ３４抗原あるいはＣＤ１３３抗原に特異的な親和性を有する物質としては例えばこれらの蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
【００１２】
本発明で用いられる細胞が由来する動物種は、虚血性心疾患等の疾患に対する細胞移植療法が適用されるヒトを含む哺乳動物一般を意味するが、臨床応用という本発明の目的に鑑みれば、好ましくはヒトである。
【００１３】
本発明で用いられる「無血清培地」は、当分野で通常用いられている培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている無血清培地を用いることができる。無血清培地として用いられる基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が挙げられる。
【００１４】
本発明で用いられる幹細胞因子（ＳＣＦ）は、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、本発明で用いるＳＣＦは血液血管芽細胞の培養に有用である限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。ＳＣＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、例えば１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００１５】
本発明で用いられるインターロイキン６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量２１万の糖タンパク質であり、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。本発明で用いるＩＬ−６は適宜選択されるが、ヒト血液血管芽細胞の培養に用いる場合には、ヒトＩＬ−６が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＩＬ−６の濃度は、用いるＩＬ−６の種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＬ−６の場合であれば、例えば１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００１６】
本発明で用いられるＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）は、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チロシンキナーゼのリガンドとして知られている。いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。本発明で用いるＦＬは、血液血管芽細胞の培養に有用である限り、いずれのタイプのＦＬであってもよい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＦＬの濃度は、用いるＦＬの種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＦｌｔ−３リガンドの場合であれば、例えば１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００１７】
本発明で用いられるトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。本発明で用いるＴＰＯの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯの種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＴＰＯの場合であれば、例えば１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００１８】
本発明で用いられる無血清培地は、血液血管芽細胞の培養により有用である（例えば、ＥＰＣをより効率的に増幅させる、あるいは増幅総細胞数をより増加させる）という観点から、上記ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ及びＴＰＯからなる群より選ばれる１又は２以上の因子に加え、ＶＥＧＦ及び／又はＴＧＦβ阻害剤をさらに含有することもできる。
【００１９】
本発明で用いられ得る血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＥＰＣに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種のＶＥＧＦタンパク質が産生されるが、本発明で用いるＶＥＧＦはＥＰＣのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプのＶＥＧＦでもよい。好ましくはＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００２０】
本発明ではまた、ＴＧＦ−β阻害剤が用いられ得る。ＴＧＦ−βは２５ｋＤａの二量体構造をもつタンパク質で、哺乳動物では構造の類似した３種類のアイソフォーム（ＴＧＦ−β１、β２、β３）が存在することが知られている。多くの細胞の増殖抑制因子として知られている。本発明で用いるＴＧＦ−β阻害剤は、ＥＰＣの生体外増幅を可能にする限りいずれのアイソフォームを阻害するものであってもよいが、好ましくはＳＢ−４３１５４２が用いられ得る。ＳＢ−４３１５４２は、４−（５−ベンゾ［１．３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミドとしても知られる（Molecular Pharmacology 62(1):65-74(2002)参照）。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＴＧＦ−β阻害剤の濃度は、用いるＴＧＦ−β阻害剤の種類によっても異なり、血液血管芽細胞の培養に有用である限り特に限定されないが、ＳＢ−４３１５４２の場合であれば、例えば約０．１〜１０μＭ、好ましくは約０．５〜５μＭ、より好ましくは約１μＭである。
【００２１】
本発明の無血清培地に添加される各種因子はまた、血液血管芽細胞が由来する動物と同種の動物に由来する因子で統一することが好ましい。このように血液血管芽細胞及び各種因子の由来を統一することで、同種異系移植等の同種移植に好適な細胞培養物が得られる。また、細胞移植が意図される個体由来の血液血管芽細胞を用いることで、同種同系移植に好適な細胞培養物を得ることも可能である。このように異種動物由来の成分を一切含有しない環境で血液血管芽細胞の培養が可能であるため、得られる細胞培養物は、移植等に際して感染リスク・拒絶反応を回避できるという利点を有する。
【００２２】
本発明において特に好ましい無血清培地は、約５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍＬのＦＬ、約２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ及び約１０μＭのＴＧＦ−β阻害剤を含有する無血清培地である。
【００２３】
上記した各成分は無血清培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各成分の濃縮液（ストック溶液）を調製し、無血清培地で所定の濃度に希釈することによって本発明の、ＥＰＣを生体外増幅させる為の無血清培地を調製することができる。例えば市販の無血清培地に必要な成分を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の無血清培地に添加、希釈することによって本発明の無血清培を調製することができる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０.２２μｍや０.４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
【００２４】
上述した因子を含有する無血清培地での血液血管芽細胞の培養は、血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液を、上述の因子を含有する無血清培地に添加することにより行われる。細胞懸濁液としてはまた、血液血管芽細胞を含有する体液自体（例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）を用いることもできる。血液血管芽細胞の培養条件は特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で7日間以上（例えば１０日間以上）培養される。血液血管芽細胞の無血清培地中の濃度は、血液血管芽細胞の培養を可能とする限り特に限定されないが、例えば約０．５〜１０×１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは約１〜５×１０５細胞／ｍｌ、最も好ましくは約３〜４×１０５細胞／ｍｌである。
【００２５】
一実施形態では、本発明の培養方法は、血液血管芽細胞又はＥＰＣの増幅方法であり得る。細胞の「増幅」とは、細胞の未分化状態をできる限り維持しつつ、その細胞数を増加させることを意味する。血液血管芽細胞又はＥＰＣの増幅は、上述の因子を例えば上述の濃度で用いて血液血管芽細胞を培養することにより達成できる。本発明の増幅方法によれば、血液血管芽細胞数の増加、及び血液血管芽細胞由来のＥＰＣ数の増加が可能となる。
【００２６】
別の実施形態では、本発明の培養方法は、血液血管芽細胞の血管系細胞（例えば、ＥＰＣ）への分化促進、あるいは血液血管芽細胞の血液系細胞への分化抑制を可能とする。本発明の培養方法によれば、血液血管芽細胞が血管系細胞へとより運命付けられ得る。血液血管芽細胞の血管系細胞への分化促進、あるいは血液血管芽細胞の血液系細胞への分化抑制は、上述の因子を例えば上述の濃度で用いて血液血管芽細胞を培養することにより達成できる。
【００２７】
本発明の方法による血液系細胞の減少及びＥＰＣの増加は、例えば、得られる細胞懸濁液の血液系細胞コロニー形成能及びＥＰＣコロニー形成能を測定することによって確認できる。
【００２８】
血液系細胞コロニー形成能の測定は、通常当分野で実施されている方法により行うことができる。具体的にはステムセルテクノロジー社等から入手可能なメチルセルロースをベースとした造血前駆細胞コロニー測定用の培地（例えばメソカルト）を用いた造血幹細胞のコロニーアッセイによって実施することができる。血液系細胞コロニー形成能の測定用キットとしては、例えばステムセルテクノロジー社製のキット（カタログＮｏ．Ｈ４３３５）が市販されている。
【００２９】
ＥＰＣコロニー形成能の測定は、生理活性物質、具体的には血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する、好ましくは上記因子に加え、さらに幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インスリン成長因子（ＩＧＦ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される１又は２以上、好ましくは３以上、より好ましくは全ての因子、並びにさらに必要に応じて血清および／またはヘパリンを含有するメチルセルロース培地を用いて実施することができる。特に好ましくは、約３０％の血清、約５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、約２Ｕ／ｍＬのへパリン、約５０ｎｇ／ｍＬのｂ−ＦＧＦ、約５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ及び約５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦを含有するメチルセルロース培地で、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で通常１０日以上、例えば１４〜１８日間又はそれ以上培養してＥＰＣコロニーを形成させる。コロニーの形成は目視で確認することができるが、得られるコロニーが本当にＥＰＣで構成されているか否かは、アセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ）の取り込み能やＵＥＡ−１レクチンとの結合能、ＶＥ−カドヘリン、ＫＤＲ、ｖＷＦの発現（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより、あるいは蛍光免疫組織化学的方法により）等を確認することによって行う。例えばＤｉＩで標識したアセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ−ＤｉＩ）及びＦＩＴＣ標識したＵＥＡ−１レクチン（ＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣ）でコロニーを二重染色した場合に、ＥＰＣであれば共に染色される。
【００３０】
また、ＥＰＣの分化の程度を知る為には、直径２０〜５０μｍの細胞を主に含む内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ＥＣ、大細胞コロニーともいう）及び直径２０μｍ以下の細胞を主に含む内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ＥＣ、小細胞コロニーともいう）の大きさの異なる２種類のコロニーを区別して測定する。早い段階で出現する内皮細胞様小細胞コロニーは早期分化段階のＥＰＣコロニーと言え、また遅い段階で出現する内皮細胞様大細胞コロニーは晩期分化段階のＥＰＣコロニーであると言える。ここで「主に」とはコロニーを構成する細胞集団の約３０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約７０％が、直径２０〜５０μｍの細胞（大細胞コロニーの場合）あるいは直径２０μｍ以下の細胞（小細胞コロニーの場合）であることを意味する。
【００３１】
ＥＰＣコロニー形成能の測定はまた、市販のキットを使用して行うこともできる。このようなキットとしては、例えばステムセルテクノロジー社製のキット（カタログＮｏ．Ｈ４２３６）が市販されている。このキットの培地に上述した各因子を添加したものを用いることで、ＥＰＣコロニー形成能の簡便な測定が可能となる。
【００３２】
本発明はさらに、本発明の培養方法により得られたＥＰＣを血管内皮細胞に分化させることを含む、血管内皮細胞の調製方法を提供する。ＥＰＣの血管内皮細胞への分化は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、ＥＢＭ−２、ＥＧＭ２Ｖ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕｏｔｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）、自己血清等を用いる方法が挙げられる。
【００３３】
本発明の方法により得られる血液血管芽細胞、ＥＰＣ、血管内皮細胞等の細胞は、適宜単離及び／又は精製できる。例えば血液血管芽細胞の細胞表面マーカーとしてＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＥＰＣの細胞表面マーカーとしてＫＤＲ、血管内皮細胞の表面マーカーとしてＫＤＲ、血管内皮カドヘリン（Vascular endothelial cadherin）が公知であるので、これらの細胞表面マーカーに対して親和性を有する物質（例えば、抗体）を用いて細胞分離法に付すことで、所望の細胞が分離できる。このような細胞分離法としては、例えば、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、蛍光細胞分離法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【００３４】
本発明はまた、本発明の方法により得られる細胞を提供する。本発明の方法により得られる細胞としては、例えば、血液血管芽細胞、ＥＰＣ、血管内皮細胞が挙げられる。本発明の方法で用いられる血液血管芽細胞及び各種因子の由来を統一することで、異種動物由来の生体成分を実質的に含有しない組成物（細胞培養物）が得られる。ここで、異種動物由来の生体成分を「実質的に」含有しない組成物とは、異種動物由来の生体成分を用いずに細胞を培養することで達成可能となった程度の品質を意味するものとする。また、細胞移植が意図される個体由来の血液血管芽細胞を用いることで、同種同系移植に好適な組成物を得ることも可能である。従って、本発明の細胞は、移植等に際して感染リスク・拒絶反応を回避できるという利点を有する。
【００３５】
本発明の方法により得られるＥＰＣ、血管内皮細胞は、細胞移植により血管障害の治療に用いることができる。このような血管障害としては、例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症等の下肢虚血、バージャー（Ｂｕｒｇｅｒ）病）、血管損傷が挙げられる。また、皮膚潰瘍等の創傷を治癒するため、あるいは人工血管の作製に使用できる。細胞移植後の効果は、自体公知の方法により確認できる。例えば、血管障害が虚血性心疾患である場合には、移植後の心機能を、例えば収縮能と拡張能とを調べることによって評価することができる。心臓の収縮能や拡張能の測定は当分野で実施されている種々の方法によって行うことができる。例えば収縮能の測定は僧帽弁逆流波形から算出される＋ｄｐ／ｄｔ値（収縮能が低下するにつれて値が下がる）や左室駆出率（％ＥＦ、収縮能が低下するにつれて値が下がる）等を、拡張能の測定であれば同様に僧帽弁逆流波形から算出される−ｄｐ／ｄｔ値（拡張能が低下するにつれて値が上がる）や拡張末期内径（ＥＤｄ）等を測定することなどによって行うことができる（例えば、FASEB Journal,18:1392-1394(2004)参照）。
【００３６】
本発明はさらに、上述した因子を含有する無血清培地、及びこの無血清培地を含む血液血管芽細胞の培養用試薬を提供する。
【００３７】
本発明はまた、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ、ＴＰＯおよび無血清培地を含むキットを提供する。本発明のキットは、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ、ＴＰＯのうち少なくとも１つの因子が、無血清培地から隔離された形態（例えば、異なる容器中に格納された形態）で提供される。また、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ、ＴＰＯに加え、ＶＥＧＦ及び／又はＴＧＦβ阻害剤が、無血清培地から隔離された形態で、又は無血清培地中に添加された形態で提供されてもよい。本発明のキットは、例えば本発明の無血清培地の作製に有用であり得る。
【００３８】
本発明のキットはさらに、血液血管芽細胞又はその分化細胞（例えば、ＥＰＣ、血管内皮細胞）の細胞表面マーカーに特異的な親和性を有する物質（例えば、抗体）、並びに／あるいは血液血管芽細胞又はその分化細胞の分化誘導因子（例えば、ＥＰＣから血管内皮細胞への分化の誘導因子）を含んでいてもよい。かかるキットは、本発明の培養方法に好適に用いられる。
【００３９】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１：臍帯血ＣＤ１３３陽性細胞からの増幅
（１）本発明の無血清培地の調製
無血清培地（ＳＴＥＭＳＰＡＮ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃ．）を用いて表１に示す組成に基づいて本発明の無血清培地を作成した。即ち、表１に示す各成分を所定の濃度となるように無血清培地に無菌的に添加した。
【００４１】
【表１】
表１
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【００４２】
表１中、「ｈ」はヒト由来であることを示す。「ｒ」は組換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。
上記無血清培地にさらにＴＧＦ−β阻害剤を０μＭ、０．１μＭ、１μＭあるいは１０μＭそれぞれ添加した無血清培地を調製した。ＴＧＦ−βとしては、キリンビールより供与されたＳＢ−４３１５４２（ＴＧＦβ１型レセプターキナーゼ活性阻害剤）を用いた。
（２）ＥＰＣの生体外増幅
血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液としては臍帯血由来の単核球を含有する細胞懸濁液を用いた。先ず、採血した血液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に重層し、密度勾配遠心分離法にて単核球を分離した。分離した単核球をＰＢＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、血小板除去後の単核球を採取し、緩衝液中に懸濁して細胞懸濁液を調製した。
次いで、細胞懸濁液を抗ＣＤ１３３抗体を用いたＭＡＣＳに付してＣＤ１３３陽性細胞を回収した。詳細には、ＣＤ１３３陽性細胞単離キット（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製、カタログＮｏ．１３０−０５０−８０１）を用いて、添付文書のプロトコルに準じて行った。
得られたＣＤ１３３陽性細胞（ＣＤ１３３＋細胞ともいう）を上記（１）で作成した本発明の無血清培地１．５ｍＬあたり５×１０４個の濃度で３５ｍｍ径のＰｒｉｍａｒｉａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１４日間培養した。途中、７日後に培地を交換した。１μＭのＴＧＦ−β阻害剤を添加して調製した無血清培地中で１４日間培養した細胞の様子を図１に示す。さらに０、０．１、１及び１０μＭのＴＧＦ−β阻害剤を添加して調製した無血清培地中でそれぞれ７日間、１４日間培養した後の細胞の数を図２に示す。１ウェルあたりの細胞数及び培養開始時（Ｄａｙ０）に対する増幅倍数で示した。
いずれも顕著な細胞増幅が観察された。
【００４３】
実施例２：臍帯血ＣＤ１３３陽性細胞由来ＥＰＣの生体外分化・増幅及びその評価
実施例１で調製した種々の濃度でＴＧＦ−β阻害剤を含有する本発明の無血清培地を用いて臍帯血ＣＤ１３３陽性細胞由来ＥＰＣを生体外増幅させ、且つ分化させた。増幅の程度はコロニー数を計測することにより、分化の程度は血液系細胞のコロニー数とＥＰＣコロニー数とを区別して計測することにより評価した。またＥＰＣコロニーについてはＥＰＣ総コロニー数を計測するとともに大細胞コロニーと小細胞コロニーとを区別して計測した。具体的な手順を図３に示す。
臍帯血由来単核球の採取及び無血清培地中での培養は実施例１と同様にして行った。無血清培地中での培養開始時点、１週間培養後、さらにもう１週間培養後（計１４日間）の細胞を用いて血液系細胞のコロニー形成能を測定するためのアッセイ（以下単に血液系コロニーアッセイ）とＥＰＣのコロニー形成能を測定するためのアッセイ（以下単にＥＰＣコロニーアッセイ）を行った。無血清培地での培養は、まずＭＡＣＳカラムにて単離したＣＤ１３３陽性細胞を本発明の無血清培地１．５ｍＬあたり５×１０４個の濃度で３５ｍｍ径のＰｒｉｍａｒｉａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１週間培養し、さらに得られた増幅細胞を回収し、本発明の無血清培地１．５〜２．０ｍＬあたり１．２５×１０５個の濃度で３５ｍｍ径のＰｒｉｍａｒｉａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に再度播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にてさらに１週間培養した。
（血液系コロニーアッセイ）
各経過時点での細胞を１ｍＬあたり５００個の濃度で３５ｍｍ径のＰｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１２日間培養した。１２日後にｄｉｓｈ上に観察されるコロニー数をカウントした。赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭ）等の数種類のコロニーが混在していた。ＢＦＵ−Ｅコロニー、ＣＦＵ−ＧＭコロニー、ＣＦＵ−ＧＥＭコロニーの３種についてのコロニー像を図４に示す。
（ＥＰＣコロニーアッセイ）
まずアッセイに用いる生理活性物質含有メチルセルロース培地を調製した。メチルセルロース培地（Ｈ４２３６，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃ．）を用いて表２に示す組成に基づいて生理活性物質含有メチルセルロース培地を作成した。即ち、表２に示す各成分を所定の濃度となるようにメチルセルロース培地に無菌的に添加した。
【００４４】
【表２】
表２
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【００４５】
表２中、「ｈ」はヒト由来であることを、「ｒ」は遺伝子工学的に製造された組換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。
次に、本発明の無血清培地で培養した、各経過時点での細胞を１８日間、上記した生理活性物質含有メチルセルロース培地で培養した。その後メチルセルロース培地を除去し、非付着性の細胞をＰＢＳで洗い流した。培養皿に付着した細胞のコロニーを観察したところ個々の細胞サイズの異なる２種類のＥＰＣコロニーが出現していた。小さい細胞のコロニーを内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ＥＣ）と、大きい細胞のコロニーを内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ＥＣ）と便宜上称する。図５は各コロニーの位相差顕微鏡による観察像である。これらのコロニーをａｃＬＤＬ−ＤｉＩ及びＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣで二重染色した。詳細には、メチルセルロース除去後、ＥＧＭ−ＭＶ添加ＥＢＭ−２（５％ＦＣＳ培地）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社，Ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕｏｔｓキット）を１ｍｌ加えた。次いで、ａｃＬＤＬ−ＤｉＩを１０μｌ加え、３時間培養した。ＰＢＳにて２回洗浄後、上記培地及びＦＩＴＣ標識−ＵＥＡ１レクチン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．２μｇ／ｍｌの濃度になるように培地に加え、３時間培養した。２回洗浄後、培地を交換し、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図６に示す。両コロニーともに、ａｃＬＤＬ−ＤｉＩ及びＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣに染色され、ＥＰＣとしての特徴を示した。
ＥＰＣコロニーと確認されたコロニーの数を測定した。総コロニー数、小細胞コロニー数、及び大細胞コロニー数を区別して測定した。
（結果）
血液系コロニーとして、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭ）の４種類のコロニーのコロニー数を合計しその出現頻度を経時的に調べた。ＥＰＣコロニーとして、小細胞コロニー及び大細胞コロニーのコロニー数を合計して出現頻度を経時的に調べた。また総コロニー数として、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ、小細胞コロニー、大細胞コロニーのコロニー数を合計した。血液系コロニーは、無血清培地中での培養開始時の臍帯血由来のＣＤ１３３陽性単核球から形成されるコロニー数に対する、培養開始７日後、あるいは１４日後の細胞から形成されるコロニー数の割合を％で表示した。ＥＰＣコロニーは、無血清培地中での培養開始時、培養開始７日後、培養開始１４日後の各時点での総コロニー数に対するＥＰＣコロニー数の割合を％で示した。結果を図７に示す。
本発明の方法を用いた培養方法によれば血液系コロニーの頻度が減少する一方、ＥＰＣコロニーの出現頻度が上昇する。
さらにＥＰＣコロニーについて、小細胞ＥＰＣコロニーと大細胞ＥＰＣコロニーのコロニー数をそれぞれ計測した。結果を図８に示す。小細胞ＥＰＣコロニーは、無血清培地中での培養とともに漸減する傾向にあったが大細胞ＥＰＣコロニーは、培養１週間後にピークとなり２週間後にはやや減少する傾向にあった。
また、各無血清培地中に添加されるＴＧＦ−β阻害剤の濃度によってＥＰＣコロニー数に影響があるかどうか調べた。結果を図９に示す。アッセイに用いた培養皿あたりのＥＰＣコロニーの数、総増幅細胞から形成される総ＥＰＣコロニーの数で示した。本発明の無血清培地中で２週間培養した後、Ｄｉｓｈ当たりのＥＰＣコロニー数においても、総ＥＰＣコロニー数においても１μＭのＴＧＦ−β阻害剤を含有する無血清培地で培養した場合が最も多くのＥＰＣコロニーを形成した。
【００４６】
実施例３：細胞移植療法における有効性の検討
増幅・分化誘導を行わないＣＤ１３３陽性細胞及び本発明の方法により増幅・分化誘導を行ったＥＰＣ細胞をそれぞれ虚血性心疾患に対する細胞移植療法に用い、その有効性について調べた。有効性の検討は収縮能と拡張能を調べることによって行った。
（１）増幅・分化誘導を行わなかったＣＤ１３３陽性細胞を用いた細胞移植
実施例１（２）と同様の手順により、ＣＤ１３３陽性細胞を回収した。次いで、虚血心筋モデルラットを用意した。詳細には、ヌードラットをネンブタール麻酔下に、左第３又は第４肋間開胸後、心外膜を剥離した。引き続き、露出した心臓の左前下行枝環状動脈の左心耳直下部を結紮することにより得られたヌードラットを虚血心筋モデルとして使用した。上述の通り得られたＣＤ１３３陽性細胞を１×１０５細胞／１００μＬ  ＰＢＳ／匹、あるいは５×１０５細胞／１００μＬ  ＰＢＳ／匹の用量でこのヌードラットの梗塞辺縁部３箇所に移植し、移植４週間後に心機能を評価した。
（２）増幅・分化誘導を行ったＥＰＣ細胞を用いた細胞移植
上記（１）と同様にして単離したＣＤ１３３陽性細胞を本発明の無血清培地１．５ｍＬあたり５×１０４個の濃度で３５ｍｍ径のＰｒｉｍａｒｉａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１週間培養し、さらに得られた増幅細胞を本発明の無血清培地１．５〜２．０ｍＬあたり１．２５×１０５個の濃度で３５ｍｍ径のＰｒｉｍａｒｉａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に再度播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にてさらに１週間培養した。
無血清培地は、実施例１で調製した各種濃度のＴＧＦ−β阻害剤を含有する本発明の無血清培地を用いた。
得られた生体外増幅・分化させたＥＰＣ細胞を１×１０５細胞／１００μＬ  ＰＢＳ／匹、あるいは５×１０５細胞／１００μＬ  ＰＢＳ／匹の用量でヌードラット（上述と同様）の梗塞辺縁部３箇所に移植し、移植４週間後に心機能を評価した。
（３）結果
増幅・分化誘導を行わないＣＤ１３３陽性細胞を移植した場合の結果を図１０に、増幅・分化誘導を行ったＥＰＣ細胞を移植した場合の結果を図１１に示す。
本発明の方法により増幅された細胞を用いた細胞移植は虚血性心疾患の心機能、特に収縮能を改善した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法により増幅された細胞を移植することにより虚血性心疾患の心機能（収縮能・拡張能）が改善された。すなわち、本発明の方法は、内皮系細胞を質・量ともに産生する上で有用と考えられ、虚血性心疾患等の血管障害を対象とした細胞移植療法の有用な方法となり得る。
【００４８】
本出願は、日本で出願された特願２００５−０４７８１６（出願日：２００５年２月２３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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