(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド配列の相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションする、老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号４のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項２に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項４】
高ストリンジェンシーの条件下に配列番号１のヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列によりコードされる単離された老化誘導リパーゼ。
【請求項５】
アミノ酸配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の老化誘導リパーゼ。
【請求項６】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列の相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションする、老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子；及び
（ｂ）前記ＤＮＡ分子に作用可能に連鎖された調節配列；
を含んでなるベクター。
【請求項７】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子；及び
（ｂ）前記ＤＮＡ分子に作用可能に連鎖された調節配列；
を含んでなるベクター。
【請求項８】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列に対しアンチセンスである少なくとも２０個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴ−又はポリヌクレオチド；及び
（ｂ）当該アンチセンスオリゴ−又はポリヌクレオチドが形質転換すべき植物細胞の中で発現できるよう当該アンチセンスオリゴ−又はポリヌクレオチドに作用可能に連鎖された調節配列、
を含んでなるベクター。
【請求項９】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列に対しアンチセンスである長さ２０〜１００個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴ−又はポリヌクレオチド；及び
（ｂ）当該アンチセンスオリゴ−又はポリヌクレオチドが形質転換すべき植物細胞の中で発現できるよう当該アンチセンスオリゴ−又はポリヌクレオチドに作用可能に連鎖された調節配列、
を含んでなるベクター。
【請求項１０】
調節配列がプロモーター及び転写終止領域を含んでなる、請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１１】
調節配列が構成的プロモーターを含んでなる、請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１２】
調節配列が植物組織特異的プロモーターを含んでなる、請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１３】
調節配列が老化誘導植物プロモーターを含んでなる、請求項８〜又は９に記載のベクター。
【請求項１４】
調節配列がウイルスプロモーターを含んでなる、請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１５】
調節配列が構成的プロモーターを含んでなる、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
配列番号１の内因性老化誘導リパーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列に対しアンチセンスである少なくとも２０個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴクレオチド又はポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記オリゴクレオチド又はポリヌクレオチドが２０〜１００個のヌクレオチドを含んでなる、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴクレオチド又はポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１に記載のヌクレオチド配列の４８〜１３８８のヌクレオチドを含んでなるコード領域を有する、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴクレオチド又はポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記老化誘導リパーゼがカーネーションリパーゼである、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項２０】
内因性老化誘導リパーゼをコードするヌクレオチド配列の５’非コーディング領域に対しアンチセンスである、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項２１】
植物中の内因性老化誘導リパーゼの発現を阻害する方法であって：
（１）請求項８〜１１のいずれか１項に記載のベクターを植物ゲノムに組み込み；そして
（２）当該植物を成長させ、これにより前記アンチセンスオリゴ−又はポリヌクレオチドを転写させて内因性誘導リパーゼ遺伝子に結合させることで当該老化誘導リパーゼの発現を阻害する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションするＤＮＡの部分が５’非コーディング配列を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記阻害が植物の変更された老化を生ずる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記阻害が環境的ストレス誘導老化に対する前記植物の耐性を増加させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
調節配列が植物において活性である構成的プロモーターを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
調節配列が二重３５Ｓプロモーターを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
調節配列が植物において活性である組織特異的プロモーターを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
調節配列が植物において活性である老化誘導プロモーターを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記植物が結実植物、顕花植物及び野菜から成る群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
植物がカーネーションである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
（１）植物の少なくとも１個の細胞ゲノムの中に以下を含んでなるベクターを組込み、
（Ａ）配列番号２の内因性老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子；
（Ｂ）前記ＤＮＡ分子によりコードされる前記内因性老化誘導リパーゼが発現されるように当該ＤＮＡ分子に作用可能に連鎖された調節配列；そして
（２）前記植物を成長させることにより前記内因性老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子を過剰発現させ、当該ＤＮＡ分子の過剰発現が当該内因性老化リパーゼ遺伝子の発現阻害させる；
を含んでなる方法。
【請求項３２】
調節配列が構成的プロモーターを含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（１）カーネーション植物の少なくとも１個の細胞ゲノムの中に以下を含んでなるベクターを組込み、
（Ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる外因性老化誘導リパーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子；及び
（Ｂ）前記ＤＮＡ分子によりコードされる前記外因性老化誘導リパーゼが発現されるように当該ＤＮＡ分子に作用可能に連鎖された調節配列；そして
（２）前記植物を成長させることにより前記外因性老化誘導リパーゼをコードするＤＮＡ分子を過剰発現させ、当該ＤＮＡ分子の過剰発現が当該内因性老化リパーゼ遺伝子の発現阻害させる；
を含んでなる方法。
【請求項３４】
植物中の年齢に関係する老化及び環境的ストレスに関係する老化を変更する方法であって：
（１）請求項８又は９に記載のベクターをカーネーション植物ゲノムに組み込み；そして
（２）当該植物を成長させ、これにより前記アンチセンスオリゴ−又はポリヌクレオチドを転写させて内因性誘導リパーゼ遺伝子に結合させることで当該老化誘導リパーゼの発現を阻害する、
ことを含んでなる方法。
【請求項３５】
種子の加齢を阻害する方法であって：
（１）請求項８又は９に記載のベクターをカーネーション植物ゲノムに組み込み；そして
（２）当該植物を成長させ、これにより前記アンチセンスオリゴ−又はポリヌクレオチドを転写させて内因性誘導リパーゼ遺伝子に結合させることで当該老化誘導リパーゼの発現を阻害する、
ことを含んでなる方法。
【請求項３６】
請求項６〜１５のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された細菌細胞。
【請求項３７】
請求項６〜１５のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された植物細胞。
【請求項３８】
請求項６〜１５のいずれか１項に記載のベクターを含んでなる、請求項６〜１７のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された植物細胞から発生した植物、植物の部分または植物の子孫。
【請求項３９】
請求項６〜１５のいずれか１項に記載のベクターを含んでなるトランスジェニック植物細胞。
【請求項４０】
原核生物の宿主において機能的である複製系と、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを含んでなるプラスミド。
【請求項４１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）において機能的である複製系と、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを含んでなるプラスミド。
【請求項４２】
植物がトマトである、請求項３８に記載の植物及び子孫。
【請求項４３】
植物がカーネーションである、請求項３８に記載の植物及び子孫。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物ポリペプチドをコードしかつ老化誘導発現を示すポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドをアンチセンスの向きで含有するトランスジェニック植物及び植物において老化を制御する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、老化の開始によりその発現が誘導される植物リパーゼ遺伝子、及び植物における老化を制御するためにリパーゼ遺伝子を使用することに関する。
先行技術の説明
老化は植物の寿命における生物学的発生の末期である。それは死の前兆であり、全植物、器官、花及び果実、組織及び個々の細胞を包含する生物学的体制化の種々のレベルにおいて起こる。
【０００２】
細胞膜の劣化は老化の初期の基本的特徴である。脂質、特に膜脂質の代謝は、細胞の老化のいくつかの生化学的発現の1つである。例えば、バラの花弁は、膜機能の喪失を伴う老化が進行するにつれて、アシルヒドロラーゼの増加を持続する（Borochov他、Plant  Physiol.、1982、69、296−299）。細胞膜の劣化は、イオン勾配の喪失及び主要膜タンパク質、例えば、イオンポンプの機能減少の初期の特徴ある特色である（Brown他、Plant  Physiol.：A  Treatise、Vol.  X.  Academic  Press、1991、pp.  227−275）。膜構造及び機能的完全性のこの低下の大部分は、リパーゼ伝達リン脂質代謝に帰属させることができる。脂質リン酸塩の喪失は、花の花弁、葉、子葉及び成熟果実の老化について証明され（Thompson、J.  E.、Senescence  and  Aging  in  Plants、Academic  Press、San  Diego、1998、pp.  51−83）、そしてこれは細胞機能の障害に導く進行する老化とともに膜二層の分子体制化における主要な変更を生ずるように思われる。特に、多数の老化中の植物組織を使用する研究において、膜二層中の脂質代謝物質の蓄積に起因するように思われる、膜における脂質相分離の証拠が得られた（McKersie及びThompson、1979、Biochim.  Biophys.  Acta、508：197−212；Chia他、1981、Plant  Physiol.、67：415−420）。老化組織における脂質の代謝の大部分は、遺伝子発現の老化特異的変化を通して達成されるという増大しつつある証拠が存在する（Buchanan−Wollaston、V.、J.  Exp.  Bot.、1997、307：181−199）。
【０００３】
老化の開始は、内部及び外部の両方の異なる因子により誘導されることができる。例えば、エチレンは多数の植物において種々の植物プロセス、例えば、種子の発芽、実生の発育及び花の老化においてある役割を演ずる。植物におけるエチレンの産生は、また、機械的創傷、化学物質、ストレス（例えば、温度及び水量の変動により生ずる）、及び病気により誘導される外傷に関係づけることができる。エチレンは多数の植物において葉の老化の調節に関係づけられたが、エチレンは老化に対してある作用を有するが、プロセスの必須の調節因子ではないことが、トランスジェニック植物及びエチレン応答突然変異体を使用して得られた証拠により示された。多数の植物において、エチレンは果実の成熟または老化において役割を有するように思われない。例えば、非クリマテリック植物、例えば、イチゴの果実の成熟において、いくつかの花、例えば、ユリ科キスゲ属の植物の老化において及びある植物、例えば、アラアビドプシス（Arabidopsis）における葉の老化において、及び特に、単子葉植物において、エチレンのシグナリングの要件は存在しない（Smart，C.  M.，1994、New  Phytology、126：419−448；Valpuesta他、1995、Plant  Mol.  Biol.、28：575−582）。
【０００４】
老化の早期開始を誘導する外部因子は、環境的ストレス、例えば、温度、乾燥、少ない光または栄養の供給、ならびに病原体の攻撃を包含する。自然の（年齢に関係する）老化の場合におけるように、環境的ストレスが誘導する老化は細胞膜の完全性の喪失により特徴づけられる。詳しくは、環境的ストレスに対する暴露は電解質の漏出を誘導し、これは膜の損傷を反映する（Sharom他、1994、Plant  Physiol.、105：305−308；Wright及びSimon、1973、J.  Exp.  Botany、24：400−411；Wright、M.、1974、Planta、120：63−69；及びEze他、1986、Physiologia  Plantarum、68：323−328）。それらのすべてはリパーゼの作用に帰することができる。環境的ストレスに対して暴露された植物組織は、また、エチレンを産生し、これはストレスエチレンとして普通に知られている（Buchanan−Wollaston、V.、1997、J.  Exp.  Botany、48：181−199；Wright、M.、1974、Planta、120：63−69）。前述したように、エチレンはいくつかの植物において老化を引き起こすことが知られている。
【０００５】
漏出に導く膜劣化はまた種子の加齢の種子の特徴であり、そしてこれはまた膜リン脂質からの脂肪酸の脱エステル化を反映するという証拠が存在する（McKersie、B.  D.、Senarata、T.、Walker、M.  A.、Kendall、E.  J.  及びHetherigton、P.  R.、Senescence  and  Aging  in  Plants、L.  D.  Nooden及びA.  C.  Leoopold編、Academic  Press、1988、pp.  441−464）。
【０００６】
現在、内部または外部の因子、例えば、環境的ストレスにより引き起こされる老化の開始を制御する、広く適用可能な方法は存在しない。現在、老化を制御しかつ新鮮な、腐敗しやすい植物の産物、例えば、果実、花及び野菜の棚持ちを増加する技術は、エチレンの生合成を減少させることに主として頼る。例えば、米国特許第5,824,875号には、3つの1−アミノ−シクロプロパン−1−カルボキシレート（ACC）シンターゼ遺伝子の1つのアンチセンスの向きの発現から生ずるエチレンのレベルを減少させることによって、延長した棚持ちを示す、トランスジェニックフウロソウ植物が開示されている。結局、この技術はエチレン感受性である、制限された範囲の植物にのみ適用可能である。
【０００７】
また、エチレンの生合成を減少させ、これにより成熟をいっそうゆっくり引き起こすことによって、いくつかの果実の棚持ちは延長される。これらの果実の老化は成熟後に誘導されるので、エチレンの生合成の減少の棚持ちに対する効果は間接的である。果実の成熟を遅延させるために使用される他のアプローチは、ポリガラクツロナーゼ、すなわち、成熟の初期段階の間に合成される細胞壁軟化酵素、の細胞レベルを変更することによる。このアプローチは、また、老化に間接的にのみ影響を与え、再び、狭い範囲の植物にのみ適用可能であるということにおいて、エチレンの生合成の制御に類似する。
【０００８】
こうして、広範な種類の植物に適用可能である、植物における老化を制御する方法が必要とされている。したがって、エチレン感受性に無関係に、すべての型の植物に適用可能である、老化をモジュレートする技術を開発することは重要である。
発明の要約
本発明は、カーネーションの老化誘導リパーゼをコードする全長のcDNAクローンの発見及びクローニングに基づく。老化誘導リパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を本明細書において開示する。カーネーションの老化誘導リパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、同様に調節される、いくつかの植物における対応する遺伝子またはRNA転写体を検出するための異種プローブとして使用された。
【０００９】
本発明は、年齢に関係する老化または環境的ストレス誘導老化において、老化の開始を制御する、植物の遺伝的修飾方法を提供する。本発明の老化誘導リパーゼのヌクレオチド配列、それらのフラグメント、またはこのようなフラグメントの組合わせを、逆向きに植物細胞の中に導入して、内因性老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を阻害し、これにより形質転換された植物において内因性老化誘導リパーゼのレベルを減少させ、老化を変更する。
【００１０】
本発明の方法を使用して、トランスジェニック植物を発生させ、成長及び発育についてモニターする。老化誘導リパーゼのレベルの低下のために、植物の成長、花成、果実腐敗の減少、種子の加齢の減少及び／または葉の黄色化に関して延長した寿命または棚持ちを示す植物または植物の分離した部分（例えば、挿木、花、野菜、果実、種子または葉）は、輸送及び貯蔵の間における葉黄色化の減少、花弁切断の減少、果実腐敗の減少を包含する改良された特性を有する所望の産物として選択される。これらのよりすぐれた植物は増殖される。同様に、環境的ストレスに対する耐性の増加、例えば、低温（寒気）、乾燥、感染，及びその他に対する感受性の減少、を示す植物はよりすぐれた産物として選択される。
【００１１】
1つの面において、本発明は、老化誘導リパーゼをコードし、低いストリンジェンシーの条件下に配列番号1とハイブリダイゼーションする単離されたDNA分子、または配列番号1とハイブリダイゼーションする単離されたDNA分子の機能的誘導体に関する。本発明の1つの態様において、この単離されたDNA分子は配列番号1のヌクレオチド配列を有する、すなわち、配列番号1に対して100％の相補性（配列同一性）を有する。本発明のこの面の他の態様において、単離されたDNA分子は配列番号4のヌクレオチド配列を含有する。
【００１２】
本発明の他の態様において、前述のDNA分子によりコードされる単離された老化誘導リパーゼ、またはその機能的誘導体が提供される。好ましいタンパク質は配列番号2を有するアミノ酸配列を有するか、あるいはその機能的誘導体である。
【００１３】
また、本発明において、前述のDNA分子のRNA転写体の少なくとも一部分に対して相補的であるRNA分子をコードするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが提供される。このRNA分子は内因性老化誘導リパーゼの発現が変更されるように前記RNA転写体とハイブリダイゼーションする。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは全長であることができるか、あるいは好ましくは約6〜約100ヌクレオチドを有する。
【００１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは老化誘導リパーゼをコードするDNA分子の1つの鎖の少なくとも一部分に対して実質的に相補的であり、ここで老化誘導リパーゼをコードするDNA分子は配列番号1とハイブリダイゼーションするか、あるいは老化誘導リパーゼをコードするDNA分子によりコードされるRNA配列の少なくとも一部分に対して実質的に相補的である。本発明の1つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列配列番号1の1つの鎖の少なくとも一部分または配列番号1によりコードされるRNA転写体に対して実質的に相補的である。他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは老化誘導リパーゼをコードするDNA分子の1つの鎖の5'非コーディング部分の少なくとも一部分に対して実質的に相補的であり、ここでDNA分子は配列番号1とハイブリダイゼーションする。他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列配列番号4の1つの鎖のオープンリーディングフレームの少なくとも一部分または配列番号4によりコードされるRNA転写体に対して実質的に相補的である。
【００１５】
本発明は、さらに、植物細胞を形質転換するためのベクターに関し、このベクターは、
（a）  （1）老化誘導リパーゼをコードするDNA分子の1つの鎖の少なくとも一部分、ここで前記DNA分子は配列番号1とハイブリダイゼーションする、または（2）老化誘導リパーゼをコードするDNA分子によりコードされるRNA配列の少なくとも一部分、に対して実質的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；及び
（b）  アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがその中に形質転換される植物細胞においてアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが発現されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに作用可能に連鎖された調節配列；
を含んでなる。
【００１６】
調節配列は形質転換された植物細胞において機能的であるプロモーターを含む。必要に応じて、調節配列はポリアデニル化シグナルを含む。
【００１７】
本発明は、また、前述のベクターで形質転換された植物細胞、このような細胞から発生した小植物または成熟植物、またはこのような小植物または植物の植物部分を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、非修飾植物に比較して老化誘導リパーゼのレベルが減少した植物を産生する方法に関し、この方法は、
（1）  植物を前述のベクターで形質転換し、
（2）  植物を少なくとも小植物段階に成長させ、
（3）  形質転換された植物または小植物を、老化誘導リパーゼ活性の変更及び／または老化の変更及び／または環境的ストレス誘導老化の変更及び／またはエチレン誘導老化についてアッセイし、そして
（4）  非形質転換植物に比較して、老化誘導リパーゼ活性の変更及び／または老化の変更及び／または環境的ストレス誘導老化の変更またはエチレン誘導老化を有する植物を選択し、成長させる、
ことを含んでなる。
【００１９】
前述したように産生された植物、または子孫、ハイブリッド、クローンまたは植物部分は、好ましくは、老化誘導リパーゼ発現の減少及び老化の遅延及び／またはストレス誘導老化またはエチレン誘導老化の遅延を示すことが好ましい。
【００２０】
さらに、本発明は、植物細胞中の内因性老化誘導リパーゼの発現を阻害する方法に関し、この方法は、
（1）  植物の少なくとも1つの細胞のゲノムの中にベクターを組込み、前記ベクターは、
（A）  （i）  内因性老化誘導リパーゼをコードするDNA分子の1つの鎖の少なくとも一部分、ここで前記DNA分子は配列番号1とハイブリダイゼーションする、または（ii）前記内因性老化誘導リパーゼ遺伝子によりコードされるRNA配列の少なくとも一部分、に対して実質的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；及び
（B）  前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが発現されるように、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに作用可能に連鎖された調節配列；
を含んでなり；そして
（2）  前記植物を成長させ、それにより前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは転写され、前記内因性RNAに結合し、それにより前記老化誘導リパーゼ遺伝子の発現は阻害される；
ことを含んでなる。
発明の詳細な説明
植物細胞における1または2以上の老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を変更する方法が提供される。植物における老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を変更すると、老化の開始が遅延され、環境的ストレスに対する耐性が改良され、こうして植物の棚持ち及び／または成長期間が延長される。
【００２１】
老化誘導発現を示すカーネーションリパーゼ遺伝子をコードする全長のcDNA配列は、カーネーション（Dianthus  caryophyllus）花の老化中の花弁のRNAから作ったcDNAライブラリーから単離された。単離されたカーネーション花リパーゼcDNA配列ならびに全長のカーネーションリパーゼcDNAの選択した領域に対応するポリヌクレオチドプローブを使用して、老化中のカーネーション葉、成熟トマト果実及び老化中のインゲン（green  bean)葉、ならびに環境的ストレスを受けた（冷却された）トマト葉の中のリパーゼ遺伝子をコードするmRNAの存在を決定した。鋳型としてトマト葉ゲノムDNAを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）生成物を発生させるために、カーネーションリパーゼcDNAから設計したプライマーを使用した。PCR生成物は部分的オープンリーディングフレームを含有し、このオープンリーディングフレームは保存されたリパーゼコンセンサスモチーフ、ITFTGHSLGA（配列番号3）を含む部分的タンパク質配列をコードする。トマトヌクレオチド配列は、カーネーションの老化誘導リパーゼ配列と53.4％の配列の同一性及びアラビドプシス（Arabidopsis）リパーゼ配列と43.5％の同一性を有する。アラビドプシス（Arabidopsis）リパーゼ配列は、相補的ヌクレオチド配列と44.3％の同一性を有する。
【００２２】
細胞質ゾル脂質−タンパク質粒子、すなわち、カーネーションリパーゼ源、に対して発生させた抗体で、老化中のカーネーション花弁から調製されたcDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明の老化誘導リパーゼ遺伝子は単離された。老化誘導リパーゼ遺伝子に対応する陽性全長cDNAクローンが得られ、これを配列決定した。老化誘導リパーゼcDNAクローンのヌクレオチド配列を配列番号1に示す。cDNAクローンは、50.2kDaの計算した分子量を有する447アミノ酸のポリペプチド（配列番号2）をコードする。大腸菌（E.  coli）中のcDNAクローンの発現はアシルヒドロラーゼ活性を示す期待した分子量のタンパク質を生じた、すなわち、発現されたタンパク質はp−ニトロフェニルパルミテート、リン脂質及びトリアシルグリセロールを加水分解する。発育するカーネーション花における酵素の発現パターン及びタンパク質の活性に基づいて、それは老化に関係づけられる。
【００２３】
全長のカーネーションcDNAでプロービングしたカーネーション花弁の全RNAのノザンブロットは、老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が老化開始直前に有意に誘導されることを示す（第4図）。ノザンブロット分析は、また、老化誘導リパーゼ遺伝子が環境的ストレスの条件、例えば、冷却（第12図）及びエチレン（第4図及び第9図）（これは環境的ストレスに応答して産生されることが知られている）により誘導されることを証明する。ノザンブロット分析において、カーネーションの老化誘導リパーゼmRNAの存在は、若い段階I、II及びIIIのカーネーション花弁におけるよりも老化（発育段階IV）において有意に高いことが示される。さらに、エチレンで刺激された段階IIの花は、また、より高い老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を示す。同様に、冷却温度に暴露され、周囲温度に戻された植物は、また、冷却損傷症状（例えば、漏出）の発生と一致する、老化誘導リパーゼ遺伝子の発現の誘導を示す（第11図及び第12図）。種々の植物、例えば、カーネーション、インゲン（green  bean)、トマト、及び種々の植物組織、例えば、葉、果実及び花における遺伝子発現の全体のパターンは、本発明のリパーゼ遺伝子がこれらの植物及び植物組織における老化の開始に関係づけられることを証明する。こうして、植物組織における老化誘導リパーゼ遺伝子の発現を実質的に抑制または変更することによって、劣化及び腐敗を遅延することができ、腐敗しやすい果実、花及び野菜の棚持ちを増加することができることが期待される。これはトランスジェニック植物を産生することによって達成することができ、ここでリパーゼcDNAまたはそのオリゴヌクレオチドフラグメントを果実、花及び野菜においてアンチセンスの配置で発現させる。ここで、構成的プロモーター、例えば、CaMV  35Sプロモーターを使用するか、あるいは組織特異的または老化誘導性プロモーターを使用することが好ましい。
【００２４】
カーネーションの老化誘導リパーゼ遺伝子は単一コピーの遺伝子である。老化誘導リパーゼcDNAのオープンリーディングフレーム内の配列を認識しない種々の制限酵素で切断したカーネーションゲノムDNAのサザンブロット分析を実施した。制限酵素消化ゲノムDNAを３２P−dCTP標識化全長cDNA（配列番号1）でプロービングした。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下に、ただ1つの制限フラグメントがcDNAクローンにハイブリダイゼーションする（ハイブリダイゼーション及び洗浄の両方について68℃；洗浄緩衝液：0.2％×SSC、0.1％SDS）。こうして、カーネーションの老化誘導リパーゼ遺伝子は単一コピーの遺伝子である（第6図）。この遺伝子がカーネーションにおける多重遺伝子族のメンバーでないという事実は、それが他の植物において単一コピーの遺伝子であることを強く示唆する。こうして、カーネーションの老化誘導リパーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列の知識は、種々の他の植物種から老化誘導リパーゼ遺伝子を単離するために十分である。事実、本明細書において証明するように、鋳型としてトマト葉ゲノムDNAを使用するPCRによりトマト葉老化誘導リパーゼ遺伝子フラグメントを発生させるために、カーネーションcDNA配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは首尾よく使用された。
【００２５】
クローニングした老化誘導リパーゼ遺伝子またはその1または2以上のフラグメントは、構成的プロモーター、例えば、フィグ・ワート（fig  wart）モザイクウイルス35Sのプロモーターの制御下に逆向きに導入したとき、植物を遺伝的に修飾し、修飾された植物における老化を変更するために、カリフラワーモザイクウイルスのプロモーターCaMV35SまたはMASプロモーターを使用することができる。カーネーションの老化誘導リパーゼ遺伝子と十分な配列の同一性を共有する他の植物から選択されたアンチセンス配列を使用して、同様な遺伝的修飾を達成することができる。遺伝的修飾の1つの結果は、内因性翻訳可能老化誘導リパーゼ遺伝子をコードするmRNAの量の減少である。結局、植物細胞において産生される老化誘導リパーゼの量は減少し、これにより加齢または環境的ストレスによる細胞膜損傷及び細胞漏出の量が減少する、例えば、葉、果実及び／または花の腐敗が減少する。遺伝的修飾は植物における老化誘導リパーゼのレベルを恒久的に変化させ、自殖または他の生殖的スキームにより子孫植物において増殖することができる。遺伝的に変更された植物を使用して植物の新しい変種または系統を産生し、ここで変更は世代から世代に安定に伝達される。本発明は、広い範囲の異なる植物において老化の安定な遺伝的修飾を達成するために使用することができる、適当なDNA配列を最初に提供する。
【００２６】
老化誘導リパーゼ遺伝子を同定しかつ単離するために、一般に、プラスミドDNAの調製、制限酵素消化、DNAのアガロースゲル電気泳動、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動、サザンブロット、ノザンブロット、DNA結合及び細菌の形質転換をこの分野においてよく知られている慣用法に従い実施した。例えば、下記の文献を参照のこと：Sambrook  J.  他、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、第2版、Cold  Spring  Harbor  Press、Cold  Spring  Harbor、NY、1989。核酸ハイブリダイゼーションの技術はSambrook（前掲）により開示されている。
【００２７】
本明細書において使用するとき、用語「植物」は、全植物、植物部分、植物細胞または植物細胞のグループを意味する。本発明の方法において使用できる植物の型は下記のものを包含するが、これらに限定されない：例えば、エチレン感受性及びエチレン不感受性植物；結実植物、例えば、アプリコット、リンゴ、オレンジ、バナナ、グレープフルーツ、セイヨウナシ、トマト、イチゴ、アボガド、及びその他；野菜、例えば、ニンジン、エンドウ、レタス、キャベツ、カブ、ジャガイモ、ブロッコリ、アスパラガス、及びその他；花、例えば、カーネーション、バラ、キク；及びその他；及び一般に、本発明のDNA分子を吸収し、発現することができる植物。それは種々の倍数レベルの植物、例えば、一倍体、二倍体、四倍体及び多倍数体を包含することができる。
【００２８】
トランスジェニック植物は、本明細書において、ある方法で遺伝的に修飾された植物として定義され、異種または相同の老化誘導リパーゼDNAまたは修飾されたDNA、あるいは異種老化誘導リパーゼDNAまたは相同老化誘導リパーゼDNAがそのゲノムの中に組込まれた植物を包含するが、これに限定されない。変更された遺伝物質はタンパク質をコードし、調節配列または制御配列を含んでなることができるか、あるいはアンチセンス配列であるか、あるいはアンチセンス配列を含むか、あるいはタンパク質の内因性老化誘導リパーゼDNAまたはmRNA配列またはその一部分に対してアンチセンスであるアンチセンスRNAをコードすることができる。「トランスジーン」または「トランスジェニック配列」は、トランスジェニック植物の中に組込まれた外来遺伝子または部分的配列として定義される。
【００２９】
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書において使用するとき、プローブ配列またはターゲット配列の特質に依存して、当業者にとって容易に明らかなように、適当なストリンジェンシーの条件における核酸のハイブリダイゼーションを意味するために一般に使用される。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件はこの分野においてよく知られており、そして所望のストリンジェンシーに依存する条件の調節はインキュベーションの時間、温度及び／または溶液のイオン強度を変化させることによって容易に達成される。例えば、下記の文献を参照のこと：Sambrook  J.  他、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、第2版、Cold  Spring  Harbor  Press、Cold  Spring  Harbor、New  York、1989。条件の選択は、ハイブリダイゼーションされる配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対的G−C含量及び許容すべき不一致の量により支配される。相補性の程度が低い鎖間の部分的ハイブリダイゼーションを望むとき、低いストリンジェンシーの条件が好ましい。完全または完全に近い相補性を望むとき、高いストリンジェンシーの条件が好ましい。典型的な高いストリンジェンシーの条件について、ハイブリダイゼーション溶液は6×S.S.C.、0.01MのEDTA、1×デンハルト溶液及び0.5％のSDSを含有する。ハイブリダイゼーションは約68℃においてクローニングされたDNAのフラグメントについて約3〜4時間実施し、そして全真核生物のDNAについて約12〜約16時間実施される。低いストリンジェンシーについて、ハイブリダイゼーション温度は二本鎖の溶融温度（TＭ）よりも約12℃低い温度に低下される。TＭはG−C含量及び二本鎖の長さならびに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００３０】
本明細書において使用するとき、用語「実質的な配列の同一性」または「実質的な相同性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が他のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と実質的な構造的または機能的同等性を示すことを意味するために使用される。実質的な配列の同一性または実質的な相同性を有する配列間の構造的または機能的差は最小であろう、すなわち、それらは所望の応用に示されているように配列が機能する能力に影響を与えないであろう。差は、例えば、異なる種間のコドン使用頻度における固有の変動のためであることがある。2またはそれ以上の異なる配列間に有意な量の配列のオーバーラップまたは類似性が存在する場合、または配列の長さまたは構造が異なるときであってさえ、異なる配列が同様な物理学的特性を示す場合、構造的差は最小であると考えられる。このような特性は、例えば、定められた条件下にハイブリダイゼーションする能力、あるいはタンパク質の場合において、免疫学的交差反応性、同様な酵素活性、及びその他を包含する。
【００３１】
さらに、2つのヌクレオチド配列がそれらの間で少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、最も好ましくは少なくとも約90％の配列の類似性を有する場合、それらの配列は「実質的に相補性」である。2つのアミノ酸配列がポリペプチドの活性部分の間で少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％の類似性を有する場合、それらの配列は実質的に相同性である。
【００３２】
核酸（またはポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）の用語「機能的誘導体」は、本明細書において、老化誘導リパーゼをコードする遺伝子またはヌクレオチド配列のフラグメント、変異型、相同体、またはアナローグを意味するために使用される。機能的誘導体は、本発明に従う実用性を可能とする、老化誘導リパーゼをコードするDNAの機能の少なくとも一部分を保持することができる。このような機能は、自然のカーネーションの老化誘導リパーゼまたは老化誘導リパーゼをコードする他の植物からの実質的に相同性のDNAとハイブリダイゼーションする能力、またはそのmRNA転写体とハイブリダイゼーション能力、あるいは、アンチセンスの向きで、植物老化誘導リパーゼmRNAの転写及び／または翻訳、またはその他を阻害する能力を包含することができる。
【００３３】
遺伝子またはDNA配列の「フラグメント」は、分子の任意のサブセット、例えば、より短いポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを意味する。「変異型」は、全遺伝子またはそのフラグメントに対して実質的に類似する分子、例えば、1または2以上の置換されたヌクレオチドを有するが、特定の遺伝子とハイブリダイゼーションする能力または自然DNAとハイブリダイゼーションするmRNA転写体をコードする能力を維持するヌクレオチド置換変異型を意味する。「相同体」は、異なる植物の属または種からのフラグメントまたは変異型配列を意味する。「アナローグ」は、全分子、その変異型またはフラグメントに実質的に類似するか、あるいはそれらに機能的に関係する非天然の分子を意味する。
【００３４】
遺伝子、例えば、老化誘導リパーゼ遺伝子の「変更された発現」または「修飾された発現」は、遺伝子の正常の発現、例えば、非修飾カーネーションまたは他の植物において起こる発現がある方法で変化するプロセスまたは結果を意味する。本発明において意図するように、遺伝子発現の変更は老化誘導リパーゼ遺伝子の発現の完全なまたは部分的減少であるが、また、発現のタイミングの変化、あるいは老化誘導リパーゼ遺伝子の発現が非修飾植物または栽培品種において自然に起こる可能性が最も高い発現と異なる、他の状態を包含することができる。好ましい変更は、非修飾植物における産生に比較して、植物による老化誘導リパーゼの産生が減少する変更である。
【００３５】
本発明に従い遺伝的に変更された植物を産生するとき、所望の特性、一般に老化誘導リパーゼの発現または産生の減少により個々の小植物または植物を選択することが好ましい。老化誘導リパーゼの発現は、例えば、本明細書において記載するように特定の抗体を使用する慣用イムノアッセイ法において、定量することができる。また、老化誘導リパーゼの酵素活性は、本明細書において記載するように、生化学的方法を使用して測定することができる。
【００３６】
新しく挿入された遺伝子またはDNA配列を、発現させて、それがコードするタンパク質を産生させるか、あるいは、アンチセンスDNAの場合において、転写させて、アンチセンスRNA分子を生じさせるために、適切な調節因子を遺伝子またはDNA配列に関して適切な位置または向きで存在させるべきである。調節領域は、プロモーター、5'非翻訳リーダー配列及び3'ポリアデニル化配列ならびにエンハンサー及び他の調節配列を含むことができる。
【００３７】
老化誘導リパーゼ遺伝子と組み合わせて遺伝子のセンスまたはアンチセンス転写体を発生させるために有効なプロモーター調節因子は、一般に任意の植物プロモーター、さらに詳しくは、構成的プロモーター、例えば、フィグ・ワート（fig  wart）モザイクウイルス35Sのプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスのプロモーター、CaMV35Sプロモーター、またはMASプロモーター、または組織特異的または老化誘導プロモーター、例えば、カーネーション花弁GST1プロモーターまたはアラビドプシス（Arabidopsis）SAG12プロモーターを包含する（例えば、下記の文献を参照のこと：J.  C.  Palaqui他、Plant  Physiol.、112：1447−1456（1996）；Morton他、Molecular  Breeding、1：123−132（1995）；Fobert他、Plant  Journal、6：567−577（1994）；及びGan他、Plant  Physiol.、113：313（1997）、引用することによって本明細書の一部とされる。好ましくは、本発明において使用するプロモーターは構成的プロモーターである。
【００３８】
本発明にとって有効であるプロモーターからの発現レベルは、慣用の発現系を使用して、例えば、プロモーター／リポーターが導入されたトランスジェニック植物の葉、花、果実または他の組織の抽出物中のリポーター遺伝子産物、例えば、タンパク質またはmRNAのレベルを測定することによって、試験することができる。
【００３９】
本発明は、カーネーションの老化誘導リパーゼをコードする遺伝子に対して相補的であるか、あるいは低い乃至高いストリンジェンシーの条件下にカーネーションの老化誘導リパーゼとハイブリダイゼーションする、他の植物からの遺伝子または遺伝子フラグメントに対して相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを提供する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションの最小の特異性を提供するために少なくとも約6ヌクレオチドの長さであり、そして老化誘導リパーゼをコードするDNAまたはmRNAの1つの鎖に対して相補的であるか、あるいは老化誘導リパーゼ遺伝子の発現の調節に関係するゲノムDNA中のフランキング配列に対して相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは100ヌクレオチド程度に大きいことができ、それがアンチセンスである完全なコーディング配列までかつそれを越える長さに伸長することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAまたはそれらのキメラ混合物または誘導体または修飾されたバージョン、一本鎖または二本鎖であることができる。
【００４０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用は、細胞中の老化誘導リパーゼ遺伝子の変更、一次的阻害を生ずることができる。アンチセンスの一般的論考については、下記の文献を参照のこと：Alberts他、Molecular  Biology  of  the  Cell、第2版、Garland  Publishing，Inc.、New  York、New  York（1989、特にpp.  195−196、引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、老化誘導リパーゼ遺伝子の任意の部分に対して相補的であることができる。1つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは6〜100ヌクレオチド長さであることができ、そして、例えば、老化誘導リパーゼ配列の5'非コーディング配列に対して相補的であることができる。5'非コーディング配列に対して主として相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写因子をコードする遺伝子の発現に対して有効なインヒビターであることが知られている。Branch、M.  A.，Mol.  Cell  Biol.、13：4284−4290（1993）。
【００４２】
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、老化誘導リパーゼをコードするmRNAの一部分に対して実質的に相補的である。例えば、老化誘導リパーゼをコードする全長のcDNAクローンをアンチセンスの向きで植物の中に導入すると、老化誘導リパーゼ遺伝子の発現の首尾よい変更を生ずることが期待される。そのうえ、老化誘導リパーゼ遺伝子の特定の部分をターゲットとした、部分的配列の導入は等しく有効である。
【００４３】
本発明により要求される相同性の最小量は、特異的ターゲットRNAまたはDNAを認識しかつその翻訳または機能を阻害または減少すると同時に他のRNAまたはDNA分子の機能及び他の遺伝子の発現に影響を与えないために十分な相補性を生ずるために十分な量である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは老化誘導リパーゼ遺伝子のRNA転写体の少なくとも一部分に対して相補的である配列を含んでなるが、絶対的相補性は好ましいが、必要ではない。ハイブリダイゼーションする能力はアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存することがある。一般に、ハイブリダイゼーションする核酸が長くなるほど、それが含有しかつなお安定な二本鎖を形成することができる老化誘導リパーゼターゲット配列との塩基の不一致はより多くなる。当業者は標準的手順を使用して、例えば、ハイブリダイゼーションした複合体の溶融温度を測定することによって、不一致の許容可能な程度を確かめることができる。
【００４４】
外因的に導入された核酸配列からの転写により、アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを細胞内で発生させることができる。プロモーターを包含する適当な調節因子に作用可能に連鎖されたアンチセンス老化誘導リパーゼ配列をコードするDNAが組込まれたベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスを使用する形質転換またはトランスフェクションまたは感染により、アンチセンス分子を細胞に送達することができる。細胞内で外因性DNA配列は発現され、老化誘導リパーゼ遺伝子のアンチセンスRNAを産生する。
【００４５】
ベクターは好ましくはプラスミドであることができるか、あるいは植物細胞または細菌細胞中でその上にコードされた遺伝子を複製しかつ発現することがこの分野において知られているベクターまたは他のウイルスであることができる。ベクターは転写されて所望のアンチセンス老化誘導リパーゼRNAを調製できるように、染色体的に組込まれるようになる。このようなプラスミドまたはベクターのベクターは、この分野において標準的である組換えDNA技術の方法により構築することができる。例えば、ベクターは原核生物の宿主中で機能的である複製系と、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを含有するプラスミドベクターであることができる。あるいは、ベクターはアグロバクテリウム（Agrobacterium）中で機能的である複製系と、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを含有するプラスミドであることができる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）中で複製することができるプラスミドはこの分野においてよく知られている。下記の文献を参照のこと：Miki他、Procedures  for  Introducing  Foreign  DNA  Into  Plants、Methods  in  Plant  Molecular  Biology  and  Biotechnology、B.  R.  Glick及びJ.  E.  Thompson編、CRC  Press（1993）、pp.  67−83。
【００４６】
カーネーションリパーゼ遺伝子を、下記の方法において、プラスミドベクターの中にアンチセンスの向きでクローニングした。pUC18バックボーンから構築されかつカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）からの35Sプロモーター及び引き続いて多重クローニング部位及びオクタピンシンターゼ終結配列を含有するpCDプラスミドを、カーネーションリパーゼ遺伝子のクローニングのために使用した。pCdのHind3部位及びEcoR1部位の中に全長のカーネーションリパーゼ遺伝子アンチセンスの向きでサブクローニングすることによって、pCd−リパーゼ（アンチセンス）プラスミドを構築した。同様に、まずpCdベクターのBamH1及びSal1部位の中にカーネーショングルタチオンSトランスフェラーゼ1（GST1）プロモーターのPCR増幅したフラグメント（−703〜＋19bp）をサブクローニングすることによって、pCD△35S−GST1−リパーゼ（アンチセンス）プラスミドを構築した。次いで、この構築物のHind3部位及びEcoR1部位の中に全長のカーネーションリパーゼ遺伝子をアンチセンスの向きでサブクローニングした。まずpCdベクターのBamH1及びSal1部位の中にカーネーショングルタチオンS−トランスフェラーゼ1（GST1）プロモーターのPCR増幅したフラグメント（−703〜＋19bp）をサブクローニングすることによって、他のプラスミド、pCD△35S−GST1−GUSプラスミドを構築した。次いで、この構築物のSal1及びEcoR1部位の中にリポーター遺伝子ベータ−グルタチオン（GUS）をサブクローニングした。まずpCdベクターのSma1及びHind3部位の中に二重35Sプロモーター（CaMV  35Sプロモーターの2コピーを縦列で含有する）をサブクローニングすることによって、pCd−35S２−リパーゼ（アンチセンス）プラスミドを構築した。次いで、この構築物のHind3及びEcoR1部位の中にアンチセンスの向きで全長のカーネーションリパーゼ遺伝子をサブクローニングした。
【００４７】
好ましくは約6〜約100ヌクレオチド長さでありかつ老化誘導リパーゼのターゲット配列に対して相補的である、オリゴヌクレオチドは、
組換えヌクレオチド技術により製造することができるか、あるいは、例えば、モノヌクレオチドまたは短いオリゴヌクレオチドから合成することができる。自動化合成装置を使用して、本発明のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを化学的に合成することができる。本発明による組換えヌクレオチド分子を構築する手法は下記の文献に記載されている：Sambrook他、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、第2版、Cold  Spring  Harbor  Press、Cold  Spring  Harbor、N.  Y.（1989）、これは引用することによって本明細書の一部とされる。老化誘導リパーゼ配列に対して相補的老化誘導アンチセンスRNAをコードするオリゴヌクレオチドは、この分野においてよく知られている方法により製造することができる。このような方法は下記の文献に詳述されている：Maniatis、T.  他、Molecular  mechnisms  in  the  Control  of  Gene  expression、Nierlich他、編、Academic  Press、N.  Y.（1976）。
【００４８】
本発明の別の態様において、内因性植物老化誘導リパーゼの発現の阻害は、植物細胞の中に導入された外因性老化誘導リパーゼ遺伝子または遺伝子フラグメントの過剰発現による共抑制の結果である。センス向きにおいて老化誘導リパーゼをコードするベクターを、アンチセンス分子について本明細書において記載するのと同一方法により、細胞の中に導入する。好ましくは、老化誘導リパーゼは、強い構成的プロモーター、例えば、フィグ・ワート（fig  wart）モザイクウイルスのプロモーターまたはCaMV35Sに作用可能に連鎖される。
【００４９】
本発明に従い作られるトランスジェニック植物は、この分野において知られている植物形質転換方法により製造することができる。植物形質転換法は下記の方法を包含する：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium  tumefaciens）を使用する植物、組織または細胞の直接的同時培養または直接的感染（Miki他、Meth.  in  Plant  Mol.  Biol.  and  Biotechnology、（1993）、pp.  67−83）；プロトプラストの中への直接的遺伝子転移またはプロトプラストの吸収（Paszkowski他、EMBO  J.、12：2717（1984）；エレクトロポレーション（Fromm他、Nature、319：719（1986）；粒子衝撃（Klein他、BioTechnology、6：559−563（1988）；実生及び植物の分裂組織の中への注入（De  LaPena他、Nature、325：274−276（1987）；培養した細胞及び組織のプロトプラストの中への注入（Reich他、BioTechnology、4：1001−1004（1986））。
【００５０】
一般に、完全な植物は形質転換法から得られる。植物はプロトプラスト、カルス、組織部分または外植体、及びその他から再生される。老化誘導リパーゼの発現が変更された再生された植物から得られた植物部分、例えば、葉、花、果実、種子及びその他は、本明細書において使用する「植物」の定義の中に含まれる。再生された植物の子孫、変異型及び突然変異体もまた「植物」の定義の中に含まれる。
【００５１】
本発明は、また、本発明のcDNA分子によりコードされるカーネーションの老化誘導リパーゼタンパク質、及びカーネーションタンパク質に対する抗体と交差反応するタンパク質を提供する。このようなタンパク質は、第1図に示す配列番号2に記載するアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号2に記載するタンパク質に対する抗体との交差反応性を共有する。
【００５２】
カーネーションの老化誘導リパーゼタンパク質またはその機能的誘導体は、必要に応じて化学的合成法と組み合わせた、組換え技術により産生されることが好ましい。本発明の1つの態様において、老化誘導リパーゼはマルトース結合性タンパク質と融合した老化誘導リパーゼから成る融合タンパク質として発現される。組換え融合タンパク質をコードするクローンの発現は期待される分子量の融合タンパク質を生じ、この融合タンパク質はp−ニトロフェニルパルミテート、リン脂質及びトリアシルグリセロールを加水分解し、リパーゼ活性のインジケーターである。組換え老化誘導リパーゼタンパク質は、カーネーションの老化誘導リパーゼに対する抗体でイムノブロット後、ウェスタンブロット分析において優勢なバンドを示す。遊離老化誘導リパーゼ（50.2kda）は、融合タンパク質をプロテアーゼ、因子Xa、で処理することによって解放され、また、ウェスタンブロット分析において老化誘導リパーゼ抗体と反応する（第3図）。老化誘導リパーゼのアミノ酸配列のモチーフの検索は、アミド結合を介するミリステートの共有結合ための、潜在的N−ミリストイル化部位（第1図）の存在を示す（下記の文献を参照のこと：Johnson他、Ann.  Rev.  Biochem.、63：869−914（1994）；Towler他、Ann.  Rev.  Biochem.、57：67−99（1988）；及びR.  J.  A.  Grand、Biochem.  J.、258：625−638（1989）。また、タンパク質モチーフの検索において、カーネーションの老化誘導リパーゼが、保存されたリパーゼコンセンサス配列である、配列、ITFAGHSLGA（配列番号4）を含有することが示された（表1）。種々の植物からの保存されたリパーゼコンセンサス配列を下記表に示す。
【００５３】
【表１】
0004885359.tif 000002
【００５４】
本発明の老化誘導リパーゼタンパク質は、in vitro及びin  situの両方のアッセイにおいてリパーゼ活性を有することが示された。in vitro測定のために、p−ニトロフェニルパルミテート及び大豆リン脂質（40％のホスファチジルコリン及び60％の他のリン脂質）を基質として使用し、そしてそれぞれ反応生成物、p−ニトロフェノール及び遊離脂肪酸を分光光度測定的に測定した（Pencreac'h及びBaratti、1996；Nixon及びChan、1979；Lin他、1983）。また、Nixon及びChan（1979）及びLin他（1983）が記載する方法の変法を使用するガスクロマトグラフィーにより、リパーゼ活性をin vitroにおいて測定した。反応混合物は100mMのTris−HCl（pH8.0）、2.5mMの基質（トリリノレイン、大豆リン脂質またはジリノレイルホスファチジルコリン）及び酵素タンパク質（100μg）を100μlの最終体積で含有した。基質を5％のアラビアゴム中で乳化した後、反応混合物に添加した。これを達成するために、基質をクロロホルム中に溶解し、アラビアゴム溶液に添加し、超音波処理装置により30秒間乳化した。乳化後、クロロホルムをN２流により蒸発させた。反応を25℃において2時間までの変化する時間の間実施した。次いで、反応混合物を脂質抽出し、遊離脂肪酸をTLCにより精製し、誘導体化し、GCにより定量した（McKegney他、1995）。
【００５５】
Furukawa他（1983）が記載しかつTsuboi他（1996）が変更した方法により、脂肪分解アシルヒドロラーゼ活性をin  situ測定した。この後者のアッセイにおいて、老化誘導リパーゼをコードする全長のcDNAクローンで形質転換した大腸菌（E.  coli）を、唯一の炭素源としてTween  40またはTween  60（それらの両方は長鎖脂肪酸エステルである）を補充した最小塩培地中で成長させた。こうして、脂肪酸エステルがリパーゼにより加水分解される場合にのみ、細菌成長のための炭素は利用可能であった。老化誘導リパーゼcDNAで形質転換した大腸菌（E.  coli）は、初期の誘導期後にTween  40及びTween  60基底測定中で成長したが、形質転換しなかった大腸菌（E.  coli）の対照培養物は成長せず、コードされた組換えタンパク質のリパーゼ活性が確証される（第5図）。すなわち、老化誘導リパーゼはステアレート（Tween  60）及びパルミテート（Tween  40）を解放して、成長に必要な炭素が得られる。
【００５６】
本明細書において記載する老化誘導リパーゼタンパク質の「機能的誘導体」は、老化誘導リパーゼ活性または老化誘導リパーゼに対して特異的な抗体との免疫学的交差反応性の少なくとも一部分を保持する、老化誘導リパーゼのフラグメント、変異型、アナローグ、または化学的誘導体である。老化誘導リパーゼタンパク質のフラグメントは、この分子の任意のサブセットを意味する。直接的化学的合成により、例えば、この分野においてよく知られている方法を使用して、変異型ペプチドを作ることができる。老化誘導リパーゼのアナローグは、全タンパク質またはそのフラグメントに実質的に類似する非天然タンパク質を意味する。老化誘導リパーゼの化学的誘導体は、通常ペプチドの一部分またはペプチドのフラグメントではない、追加の化学的部分を含有する。選択した側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化因子と、ペプチドのターゲッテッドアミノ酸残基を反応させることによって、老化誘導リパーゼのペプチドまたはそのフラグメントの中に修飾を導入することができる。
【００５７】
本発明のヌクレオチド配列（センス向きにおいて）で形質転換した細胞を培養し、細胞がタンパク質を合成するようにし、次いで培地または細胞抽出物から、使用するクローニングプロトコルに依存して、遊離タンパク質または融合タンパク質として、タンパク質を単離することによって、本発明による老化誘導リパーゼのタンパク質またはペプチドを製造することができる。あるいは、タンパク質は無細胞系において製造することができる。Ranu他、Meth.  Enzymol.、60：459−484。
【００５８】
一般的に本発明を記載したが、下記の実施例を参照すると、本発明はいっそう容易に理解されるであろう。下記の実施例は例示であり、本発明を限定することを意図しない。
実施例1
カーネーションのリパーゼcDNAの単離に使用した植物材料
温室内で成長させ、維持したカーネーション植物（Dianthus  caryophyllus  L.  cv.  Improved  white  Sim）を使用して、老化誘導リパーゼ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を単離した。老化中の花弁の形態の花組織（異なる発育段階から）を緩衝液の中に収集するか、あるいは使用するまで−70℃において貯蔵した。
【００５９】
老化の開始直前に収穫したカーネーション花弁から、細胞質ゾル脂質粒子を単離した。カーネーション花弁（25g／150mlの緩衝液）を4℃において均質化緩衝液（50mMのEpps−0.25MのソルビトールpH7.4、10mMのEDTA、2mMのアミノ−n−カプロン酸及び4％のポリビニルポリピロリドン）中でオムニマイザー（Omnimizer）において45秒間均質化し、そしてポリトロン（Polytron）ホモジナイザーにおいてさらに1分間均質化した。ホモジネートを4層のチーズクロスを通して濾過し、そして濾液を10,000g、4℃において20分間遠心した。上清を250,000gにおいて1時間遠心してミクロソーム膜を単離した。Hudak及びThompson、（1997）、Physiol.  Plant、114：705−713の方法による浮遊遠心後、ミクロソーム後上清から脂質粒子を得た。上清をスクロースで10％（w／v）とし、23mlの上清を60Tiベックマン遠心管の中に注ぎ、1.5mlの単離緩衝液をオーバーレイし、305,00g、4℃において12時間遠心した。粒子を単離緩衝液オーバーレイアーからパスツールピペットで取出した。無菌のPBS（10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5＋0.85％の塩化ナトリウム）と平衡化したセファローズG−25上に、3mlの粒子懸濁液を負荷し、上清を無菌のPBSで溶離した。粒子を含有する空隙体積を溶離し、セントリコン−10フィルター（Amiconから入手可能である）を使用して600μgのタンパク質濃度に濃縮した。次いで脂質粒子を使用して、300μgの粒子を接種したウサギ中で抗体を発生させた。ウェスタンブロット分析により、血液のIgG力価を試験した。
メッセンジャーRNA（mRNA）の単離
本質的に下記の文献に記載されているように、全RNAを段階I、II、IIIまたはIVのカーネーションの花の花弁から単離した：Chomczynski及びSachi、Anal.  Biochem.、162：156−159（1987）。簡単に述べると、15gの花弁組織を液体窒素中で凍結させ、4Mのグアジニウムチオシアネート、25mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0、0.5％のサルコシル及び0.1Mのβ−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中で30秒間均質化した。150mlの水飽和フェノール、30mlのクロロホルム及び15mlの2MのNaOAc、pH4.0を均質化試料に添加した。試料を10,000gにおいて10分間遠心し、水性相を除去し、核酸をそれから150mlのイソプロパノールで沈降させる。試料を5,000gにおいて10分間遠心し、ペレットを30mlの4MのLiClで1回洗浄し、30mlのクロロホルムで抽出し、30mlの0.2MのNaOAc、pH5.0を含有するイソプロパノールで沈降させた。RNAをDEPC処理水中に溶解し、−70℃において貯蔵した。
【００６０】
プロメガ（Promega）から入手可能なポリA＋トラクトmRNAを使用して、全RNAからポリA＋mRNAを単離した。ストラタジーン（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）から入手可能なZAP  ExpressＲ  cDNA合成系を使用してcDNA合成のために、ポリA＋mRNAを使用した。
カーネーション花弁cDNAライブラリーのスクリーニング
段階IVカーネーション花弁から単離したmRNAを使用して作ったcDNAライブラリーをほぼ5×10６PFU／mlに希釈し、脂質粒子抗血清で免疫スクリーニングした。陽性cDNAクローンをExAssistＲ  Helper  Phage／SOLR系統株で回収し、pBluescriptＲファージミド（Stratagene）中で再環化させた。また、段階IIIカーネーション花弁cDNAライブラリーを３２P標識化19塩基対のプローブ（5'−ACCTACTAGGTTCCGCGTC−3'）（配列番号5）でスクリーニングした。陽性cDNAクローンをファージから切除し、製造業者の使用説明書中の方法を使用して、pBK−CMVＲ（Stratagene）ファージミドの中に再循環させた。全長のcDNA（1.53kbのフラグメント）をpBK−CMVベクターの中に挿入した。
プラスミドDNAの単離、DNAスクリーニング
Sambrook他（前掲）が記載するアルカリ性溶解方法を使用して、プラスミドDNAを単離した。全長の陽性cDNAクローンをジデオキシ配列決定法により配列決定した。Sanger他、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、74：5463−5467。オープンリーディングフレームを収集し、BLASTサーチ（GenBank、マリイランド州ベセスダ）で分析し、そしてコード化遺伝子の誘導されたアミノ酸配列を有する5つの最も相同性のタンパク質のアラインメントを下記の方法により達成した：BCM  Serch  Laucher：Multiple  Sequence  Alignments  Pattern−Induced  Multiple  Alignments  Method（下記の文献を参照のこと：F.  Corpet、Nuc.  Acids  Res.、16：10881−10890（1987））。誘導されたアミノ酸配列の中に存在する機能的モチーフをマルチファインダー（MultiFinder）により同定した。
融合タンパク質としてリパーゼの発現
全長の老化誘導リパーゼを含有するファージミドpBK−CMVをEcoRI及びXbaIで消化し、これは1.53kbのリパーゼフラグメントを解放し、これをEcoRI及びXbaI消化融合タンパク質、pMalc（New  England  Biolabs）の中にサブクローニングした。老化誘導リパーゼを含有するpMalcベクター（pMLipと表示する）を使用して、大腸菌（E.  coli）BL−21（DE3）細胞を形質転換した。
【００６１】
pMLipによりコードされる融合タンパク質（老化誘導リパーゼ及びマルトース結合性タンパク質の融合体）を、下記の文献に記載されているように、単離し、精製した：Sambrook他、（前掲）及びAusubel他、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Green  Publishing  Associates  and  Wiley  Interscince、New  York（1987）、16.4.1−16.4.3。簡単に述べると、8μlの50mMのPMSF及び80μlの20mg／mlのリゾチーム／gの細胞を含有する3ml／gライゼイト緩衝液（50mMのTris、pH8.0、100mMのNaCl及び1mMのEDTA）の中にpMLipで形質転換した大腸菌（E.  coli）BL−21（DE3）細胞を再懸濁させ、室温において震盪しながら20分間インキュベートした。次いで、80μlの5％のデオキシコリン酸及び40単位のDNアーゼIを添加し、細胞が完全に溶解するまで細胞を室温において震盪した。細胞デブリを遠心によりペレット化し、2体積のライゼイト緩衝液＋8Mの尿素及び0.1mMのPMSFの中に再懸濁させた。1時間後、7体積の緩衝液（50mMのKH２PO４、1mMのEDTA及び50mMのNaCl、pH7.0）を添加して懸濁液を中和した。細胞懸濁液をHClでpH8.0に調節し、細胞デブリをペレット化した。上清を4℃において20mMのTris緩衝液、pH8.0、100mMのNaCl及び1mMのEDTAに対して一夜透析した。マルトース結合性タンパク質−リパーゼ融合タンパク質（Malip）をアミロースカラム（New  England  Biolabsから入手可能である）で精製した。融合タンパク質を含有する画分をプロテアーゼ因子Xa（1μg／100μgの融合タンパク質）で切断して、融合タンパク質からリパーゼを分離した。融合タンパク質及び切断したリパーゼをSDS  PAGE電気泳動及びノザンブロットで分析した。pMalcによりコードされるマルトース結合性タンパク質を対照として使用した。結果を第3図に示す。
カーネーションRNAのノザンブロットハイブリダイゼーション
10μgの段階I、II、III、IVにおける花遊離単離した全RNAを1％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離し、ナイロン膜上に固定化した。ランダムプライマーキット（Boereinger）を使用して３２P−dCTPで標識化した1.53kbのEcoRI−XbaIリパーゼフラグメントを使用して、フィルター（7×10７cpm）をプロービングした。フィルターを1×SSC、0.1％のSDSで室温において1回洗浄し、0.2×SSC、0.1％のSDSで65℃において3回洗浄した。フィルターを乾燥し、−70℃においてX線フィルムに一夜露出した。結果を第4図に示す。
ゲノムDNAの単離及びサザンブロットハイブリダイゼーション
新しく切断したカーネーション花弁を液体窒素中の凍結させ、粉末に粉砕し、抽出緩衝液（0.1MのTris、pH8.2、50mMのEDTA、0.1MのNaCl、2％のSDS、及び0.1mg／mlのタンパク質キナーゼK）で均質化（2ml／g）してゲノムDNAを単離した。均質化材料を37℃において10分間インキュベートし、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（25：24：1）で抽出した。DNAをNaOAc及びイソプロパノールで沈降させた。DNAペレットを1×TE、pH8.0中に溶解し、フェノールで再抽出し、再沈降させ、1×TE、pH8.0中に再懸濁させた。
【００６２】
遺伝物質DNAを制限エンドヌクレアーゼ（BamH1、XbaI、XhoI、EcoRI、HindIII及びSalI）で別々に消化し、消化したDNAを1％のアガロースゲル上で分画した。分離したDNAをナイロン膜上にブロットし、３２P−dCTP標識化した1.53kbのリパーゼフラグメントを使用してハイブリダイゼーションを実施した。ストリンジェンシーの条件（68℃）（6×SSC、2×デンハルト試薬、0.1％のSDS）ならびに低いストリンジェンシーの条件（ハイブリダイゼーション及び洗浄について42℃）（6×SSC、5×デンハルト試薬、0.1％のSDS）下に、ハイブリダイゼーション及び洗浄を実施した。結果を第6図に示す。理解できるように、リパーゼcDNAプローブはただ1つのゲノムフラグメントを検出し、カーネーションリパーゼ遺伝子が単一コピーの遺伝子であることを示す。
リパーゼ酵素アッセイ
外因性基質としてp−ニトロフェニルパルミテート及び大豆リン脂質を使用して、精製したリパーゼ融合タンパク質の脂肪分解アシルヒドロラーゼ活性を分光光度測定的にアッセイした。対照として働く、マルトース結合性タンパク質単独について、基質としてリン脂質を使用して検出可能なリパーゼ活性は存在しなかった（表2）。p−ニトロフェニルパルミテートを基質としてマルトース結合性タンパク質単独とともに使用したとき、少量のp−ニトロフェノール、すなわち、リパーゼ反応の期待した産物が検出可能であり、p−ニトロフェニルパルミテートの商業的製造におけるp−ニトロフェノールのバックグラウンドのレベルを反映した（表2）。しかしながら、精製したリパーゼ融合タンパク質の存在下に、リン脂質からの遊離脂肪酸及びp−ニトロフェニルパルミテートからのp−ニトロフェノールの解放として発現された強いリパーゼ活性が明らかであった（表2）。
【００６３】
表2
大腸菌（E.  coli）中で発現され、アミロースカラムクロマトグラフィーにより精製されたマルトース結合性タンパク質及びリパーゼ融合タンパク質の脂肪分解アシルヒドロラーゼ活性の分光光度測定。
【００６４】
2つの基質、p−ニトロフェニルパルミテート及び大豆リン脂質を使用した。
【００６５】
活性は形成した産物（p−ニトロフェニルパルミテートからのp−ニトロフェノール及び大豆リン脂質からの遊離脂肪酸）により表す。
【００６６】
n＝3の複製について平均±SEを示す。
【００６７】
【表２】
0004885359.tif 000003
【００６８】
他の実験において、リパーゼ融合タンパク質の酵素活性をガスクロマトグラフィーによりアッセイした。ガスクロマトグラフィーは、基質から解放された遊離脂肪酸の定量及び同定を可能とする技術である。トリリノレイン、大豆リン脂質及びジリノレイルホスファチジルコリンを基質として使用し、そしてガスクロマトグラフィーにより分析する前に、脱エステル化脂肪酸を薄層クロマトグラフィーにより精製した。分光光度測定アッセイと一致して（表2）、マルトース結合性タンパク質単独を大豆リン脂質またはジリノレイルホスファチジルコリンとともに使用したとき、リパーゼ活性は検出されず、これらの基質は脱エステル化脂肪酸を本質的に含まないことが示される（表3）。しかしながら、リパーゼ融合タンパク質を酵素源として使用したとき、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸が大豆リン脂質抽出物から脱エステル化され、そしてジリノレイルホスファチジルコリンからリノール酸が脱エステル化された（表3）。リン脂質の基質と対照的に、検出可能なレベルの遊離リノール酸がトリリノレインの中に存在するが、遊離リノール酸のレベルリパーゼ融合タンパク質の存在下に有意に増加し、リパーゼはその上トリアシルグリセロールから脂肪酸を脱エステル化することができることが示される（表3）。
【００６９】
表3
大腸菌（E.  coli）中で発現され、アミロースカラムクロマトグラフィーにより精製されたマルトース結合性タンパク質及びリパーゼ融合タンパク質の脂肪分解アシルヒドロラーゼ活性のGC測定。
【００７０】
【表３】
0004885359.tif 000004
【００７１】
１  反応を2時間進行させ、そしてこの期間にわたって連続線分ではなかった。
【００７２】
２  n＝3複製について平均±SEを示す。
【００７３】
３  単一実験。
【００７４】
４  検出不可能。
【００７５】
大腸菌（E.  coli）におけるリパーゼcDNAの発現により得られたタンパク質のリパーゼ活性を、下記の文献に記載されているように、in  vivoで測定した：Tsuboi他、Infect.  Immunol.、64：2936−2940（1996）；Wang他、Biotech.、9：741−746（1995）；及びG.  Sierra、J.  Micorbiol.  and  Serol.、23：15−22（1957）。pMalで形質転換された大腸菌（E.  coli）BL−21細胞の単一コロニー及びpMLipで形質転換された他の大腸菌（E.  coli）BL−21コロニーを下記の塩を含有する（g／l）基底塩培地（pH7.0）の中に接種した：K２HPO４（4.3）、KH２PO４（3.4）、（NH４）SO４（2.0）、MgCl２（0.16）、MnCl２・4H２O（0.001）、FeSO４・7H２O（0.0006）、CaCl２・2H２O（0.026）、及びNa２MoO４・2H２O（0.002）。基質、Tween  40（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）またはTween  60（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）を1％の濃度で添加した。600nmにおける吸収を測定することによって、震盪しながら37℃における細菌細胞の成長をモニターした（第5図）。第5図において見ることができるように、pMLipで形質転換された大腸菌（E.  coli）細胞は、初期の誘導期間後、Tween  40／Tween  60補充基底培地中で成長することができた。しかしながら、pMalで形質転換された大腸菌（E.  coli）細胞は、Tween補充基底培地中の成長しなかった。
実施例2
カーネーションの老化誘導リパーゼ遺伝子のエチレン誘導
段階IIのカーネーションの花及びカーネーションの切断物を、密閉したチャンバー内で0.5ppmのエチレンで15時間処理した。エチレンで処理した段階IIの花弁及び処理した切断物から、ならびに未処理のカーネーションの花及び切断の花及び葉から、次のようにして、RNAを抽出した。
【００７６】
花または葉（1つの花及び5gの葉）を液体窒素中で粉砕した。粉砕した粉末を30mlのグアニジニウム緩衝液（4Mのグアニジニウムイソチオシアネート、2.5mMのNaOAc  pH8.0、0.8％のβ−メルカプトエタノール）と混合した。この混合物を4層のチーズクロスを通して濾過し、10,000g、4℃において30分間遠心した。次いで上清を塩化カルシウム密度勾配で26,000gにおいて20時間遠心した。ペレット化RNAを75％のエタノールですすぎ、600μlのDEPC処理水の中に再懸濁させ、−70℃において0.75mlの95％のエタノール及び30μlの3MのNaOAcでRNAを沈降させた。10μgのRNAを1.2％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分画し、ナイロン膜に移した。ランダムにプライミングした３２P−dCTP標識化した全長のカーネーションリパーゼcDNA（配列番号1）を使用して、膜を42℃において一夜プロービングした。次いで膜を1×SSC、0.1％のSDSで室温において15分間1回洗浄し、次いで各回0.2×SSC、0.1％のSDSで65℃において15分間3回洗浄した。この膜を−70℃においてX線フィルムに一夜露出した。
【００７７】
結果を第9図に示す。理解できるように、カーネーションリパーゼの転写は花及び葉においてエチレンにより誘導される。
実施例3
カーネーションリパーゼプライマーを使用するトマトPCR生成物の発生
カーネーションの老化誘導リパーゼ配列から設計した1対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するネステッドPCRにより、トマトの葉から得られたトマトゲノムDNAからの部分的長さの老化誘導リパーゼ配列を発生させた。5'プライマーは配列、5'−CTCTAGACTATGAGTGGGT（配列番号7）を有する19マーである；3'プライマーは配列、CGACTGGCACAACCTCCA−3'（配列番号8）を有する18マーである。ゲノムトマトDNAを使用するPCRを次のようにして実施した。
【００７８】
反応成分：
ゲノムDNA                             100ng
dNTP（各々10mM）                      1μl
MgCl２（5mM）＋10×緩衝液              5μl
プライマー1及び2（各々20μM）       0.5μl
Taq  DNAポリメラーゼ                  1.25U
反応体積                              50μl
反応パラメーター：
94℃、3分間
94℃／1分、48℃／1分、72℃／2分、45サイクルについて
72℃、15分間。
【００７９】
PCRにより得られたトマトの部分的長さの配列は、ヌクレオチド配列、配列番号6、及び第10図に記載する推定されたアミノ酸配列を有する。部分的長さの配列は2つのコーディング配列の間に介在するイントロン（第10図、小文字）を含有する。トマト配列は保存されたリパーゼコンセンサス配列、ITFTGHSLGA（配列番号3）を含有する。
【００８０】
トマト配列はカーネーションの老化誘導リパーゼ配列と53.4％の配列の同一性を有し、そしてアラアビドプシス（Arabidopsis）リパーゼと43.5％の配列の同一性を有し、後者はカーネーション配列と44.3％の配列の同一性を有する。
実施例4
トマト植物における細胞膜の完全性に対する冷却の効果
トマト植物を7℃〜8℃に48時間冷却し、次いで室温に24時間戻した。電解質の漏出（μMhos）の量を測定することによって、葉に対する冷却の効果を評価した。
【００８１】
詳しくは、1gの葉組織を50mlの管の中に切断して入れ、蒸留水で急速にすすぎ、40mlの脱イオン水を添加した。管に蓋をし、室温において24時間回転した。電解質の漏出を反映する導電性（μMhos）を、対照及び冷却した葉組織について6及び24時間の間隔で測定した。第11図から明らかなように、冷たい損傷した葉組織において再加温期間の間に、膜の損傷を反映する電解質の漏出は発生する。
冷却したトマト葉から得られたRNAのノザンブロット分析
冷却しないトマト植物（対照）及び0、6及び24時間の間室温に戻した冷却したトマト植物の15gの葉から、全RNAを単離した。実施例3に記載されているように、RNAを抽出した。各試料からの10μgのRNAを1.2％の変性ホルムアルデヒドゲル上で分離し、ナイロン膜に移した。膜を３２P−dCTP標識化プローブ（配列番号3）でプロービングし、次いで実施例3に記載するのと同一の条件下に洗浄した。結果を第12図に示す。
【００８２】
オートラジオグラフ（第12B図）から理解できるように、トマトのリパーゼ遺伝子の発現は冷却により誘導され、そして遺伝子の誘導パターンは冷たい損傷した葉における電解質の漏出の増加と相関する（第11図）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  カーネーションの花のcDNAライブラリーから得られた老化誘導リパーゼcDNAクローン（配列番号1）によりコードされる、誘導されたアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列内のコンセンサスモチーフは次の通りである：1本の下線、アミド化部位；点線の下線、タンパク質キナーゼCリン酸化部位；二重下線、N−ミリストイル化部位；ボックスのボーダー、cAMPリン酸化部位；陰影を施したボックス、カゼインキナーゼIIリン酸化部位；クロスハッチのボックス、リパーゼファミリーのコンセンサス配列；及び点線のボックス、N−グリコシル化部位。
【図２】  リパーゼ様タンパク質の部分的配列とアライニングさせた、誘導された完全なカーネーション花弁の老化誘導リパーゼアミノ酸配列を示す。carlip、カーネーション花弁の老化誘導リパーゼの全長の配列（配列番号11）；arlip、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis  thaliana）からのリパーゼ様タンパク質の部分的配列（遺伝子バンク受け入れ番号AL021710）（配列番号12）；ipolip、イポメア（Ipomea）からのリパーゼ様配列の部分的配列（遺伝子バンク受け入れ番号U55867）（配列番号13）；arlipi、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis  thaliana）からのリパーゼ様タンパク質の部分的配列（遺伝子バンク受け入れ番号U93215）（配列番号14）。3または4つの配列の間の同一アミノ酸はボックスで囲まれている。
【図３】  大腸菌（E.  coli）において発現されたカーネーションリパーゼから得られた、融合タンパク質発現産物のウェスタンブロット分析を示す。ウェスタンブロットを老化誘導リパーゼタンパク質に対する抗体でプロービングした。レーン1、マルトース結合性タンパク質；レーン2、タンパク質分解（因子Xa）切断部位を通してマルトース結合性タンパク質cDNAに融合された、カーネーションリパーゼから成る融合タンパク質；レーン3、遊離リパーゼタンパク質（50.2kDa）及び遊離マルトース結合性タンパク質に因子Xaで部分的に切断された、融合タンパク質。
【図４】  異なる発育段階におけるカーネーション花弁から単離されたRNAのノザンブロット分析である。第4A図は全RNAの臭化エチジウム染色ゲルである。各レーンは10μgのRNAを含有した。第4B図は、３２P−dCTP標識化された全長のカーネーションの老化誘導リパーゼcDNAでプロービングした、ノザンブロットのオートラジオグラフである。
【図５】  脂肪分解アシルヒドロラーゼのin  situ  デモンストレーション、すなわち、大腸菌（E.  coli）においてカーネーションの老化誘導リパーゼcDNAの過剰発現により得られたタンパク質産物のリパーゼ活性である。mal、基底塩培地中にマルトース結合性タンパク質単独を含有する大腸菌（E.  coli）細胞；mLip、基底塩培地中にマルトース結合性タンパク質と融合したカーネーションの老化誘導リパーゼから成る融合タンパク質を含有する大腸菌（E.  coli）細胞；40mal／40mLip、Tween  40を補充した基底塩培地中にマルトース結合性タンパク質単独［mal］またはリパーゼ−マルトース結合性タンパク質融合産物［mLip］を含有する大腸菌（E.  coli）細胞；60mal／60mLip、Tween  60を補充した基底塩培地中にマルトース結合性タンパク質単独［mal］またはリパーゼ−マルトース結合性タンパク質融合産物［mLip］を含有する大腸菌（E.  coli）細胞。
【図６】  第6A図は、カーネーションの老化誘導リパーゼのオープンリーディングフレームの制限酵素地図を示す。番号はオープンリーディングフレーム中のヌクレオチドを意味する。
第6B図は、種々の制限酵素で消化し、カーネーションの老化誘導リパーゼcDNAでプロービングした、カーネーションのゲノムDNAのサザンブロット分析である。
【図７】  カーネーションの老化誘導リパーゼcDNAクローンのヌクレオチド配列である。実線の下線、老化誘導リパーゼcDNAの非コーディング配列；下線が引かれていない配列はオープンリーディングフレームである。
【図８】  カーネーションの老化誘導リパーゼcDNAのアミノ酸配列である（配列番号2）。
【図９】  第9A図は、0.5ppmのエチレンに15時間暴露した段階IIの花弁におけるカーネーションリパーゼの発現を示すノザンブロット分析である。第9A図は臭化エチジウム染色ゲルであり、レーンの各々が一定量のカーネーションRNAが負荷されていることを示す（花弁：レーン1及び2；葉：レーン3及び4；＋、エチレン処理した；−、未処理）。第9B図は、標識化された全長のカーネーション花弁老化誘導リパーゼcDNAでプロービングした、第9A図中のゲルのノザンブロットのオートラジオグラムである。
【図１０】  第10図は、トマト葉ゲノム老化誘導リパーゼの部分的ヌクレオチド配列（配列番号6）及び対応する推定されたアミノ酸配列である。保存されたリパーゼコンセンサスモチーフは陰影が施されている；ゲノムフラグメントを発生させるために使用したプライマーの配列の各々には下線が引かれている。
【図１１】  膜漏出に対する冷却の効果を示す棒グラフである。トマト植物を8℃に48時間冷却し、次いで室温に再加温した。冷却しなかった対照、及び6及び24時間冷却したプレートについて、葉ディスクからの拡散物の漏出（μMohs）を測定した。
【図１２】  8℃に48時間冷却し、周囲温度に24時間再加温した植物から単離された、トマト葉RNAのノザンブロット分析である。第12A図は、全葉RNAの臭化エチジウム染色ゲルである。第12B図は、３２P−dCTP標識化全長カーネーションの老化誘導リパーゼcDNAでプロービングしたノザンブロットのオートラジオグラフである。
【図１３】  64アミノ酸領域にわたってカーネーションの老化誘導リパーゼと55.5％同一である、アラビドプシス（Arabidopsis）EST（遺伝子バンクAcc＃N38227）の部分的ヌクレオチド配列（配列番号15）及び対応する推定されたアミノ酸配列（配列番号16）である。保存されたリパーゼコンセンサスモチーフは陰影が施されている。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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