(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表２に示される配列を有する遺伝子ベクター。
【請求項２】
次の工程からなる、体外で遺伝子を発現する方法：
（１）目的遺伝子を請求項１の遺伝子ベクターに入れる工程；
（２）目的遺伝子を人体細胞のＤ、Ｇ群染色体の標的部位に導入する工程；
（３）目的遺伝子を発現する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術の領域】
本発明は遺伝子の先導配列、その配列によって遺伝子ベクターを構築する方法、またそのベクターによって目的遺伝子をヒトの体内或いは体外の細胞に導入して遺伝子を発現させる方法に関する。
【０００２】
【技術の背景】
ヒトのメンデル性遺伝病の統計資料で、2000年6月30日まで確認された単一遺伝子による疾病が1660種あり、クローン化された疾病の遺伝子は989種ある。その中、劣性の遺伝病の多くは正常の遺伝子を患者の細胞に導入する方法で、遺伝子治療が行える可能性がある。研究が進むにつれて、優性遺伝病及び体細胞の突然変異による腫瘍にも遺伝子治療が採用され始めた。1995年に、アメリカの学者E.Marshallは雑誌Scienceに、新たなベクターの研究と発見が遺伝子治療を研究する核心問題であると発表したが、５年後の今日まで、遺伝子治療のベクター問題はまだ解決されていない。その主な原因は、研究者が今でもウイルス性エレメントでベクターを構築することから抜け出せないことにある。目下使用されているウイルス性ベクターは一般的に以下のような問題がある：
（１）不安定性：遺伝子の挿入効率が高くないので、一部のベクターは付加体の形で細胞の核内に存在し、細胞の分裂に伴って安定に遺伝することができない。それゆえ治療遺伝子は長く安定に発現することができない。
（２）安全性がよくない：例えば、無作為な挿入による突然変異は組み込み部位の正常な遺伝子の機能に影響したり、癌遺伝子を活性化する可能性があり、それによりほかの疾病或いは腫瘍を引き起こす。また、ウイルス性ベクターは複製能力のある野生型の組み換えウイルスを生じる可能性があり、生体に危害を加える可能性がある。近年、アメリカで行われている遺伝子治療の中、アデノウイルスベクターにより患者が死亡したという報道があった。
（３）免疫原性：ウイルス遺伝子による背景蛋白とウイルスベクターの精製過程で混入した蛋白質はどちらも生体に免疫反応を引き起こすことがあり、それにより治療遺伝子の発現に影響する。
【０００３】
80年代の中期、相同性組換えの原理に基づく遺伝子標的ベクターが、部位特異的導入を行うために開発された。このベクターは免疫原性と無作為の組込みを避けることができるが、遺伝子治療および欠陥遺伝子修復に用いられる遺伝子の標的ベクターは、かならずその遺伝子の両側にある特定のＤＮＡ断片を先導配列として用いなければならない。それゆえ、その適用には制限があり、しかも導入の効率が非常に低い。通常は胚性幹（ES）細胞或いは受精卵細胞の遺伝子をノックアウトする（取り除くこと）には適しているが、成熟体細胞の部位特異的組込みには適していない（Galli-Taliadoros LA, Sedgwick JD, Wood SA, et al. J. Immunol. Meth. 1995, 181:1-15; Hasty P, Rivera-Perez J, Chang C, et al. Mol. Cell Biol. 1991, 11(9):4509-4517）。したがって、アメリカ人類遺伝子学会の前会長、エール大学医学部の学長Leon. E. Rosenbergは遺伝子治療の現状に対して、「数百の遺伝子治療実験の中で、今までしっかりした治療効果があるものは一例もない。」という結論を出した。（Rosenberg L E & Schechter A.N. Science, 2000;287:1751）。
【０００４】
したがって、安定に遺伝でき、人体にどんな危害もなく、体外で操作できる遺伝子ベクターを発見、開発することは遺伝子治療にとって早急に解決されるべき問題である。
【０００５】
【発明の内容】
当出願人は1981年に、特別な双サテライト微小染色体(bi-satellite microchromosome)（BM）を持つが、表現形は正常な２家系を発見した。該ＢＭは二つの家系でそれぞれ二世代と三世代の間安定に遺伝し、且つ人体にどんな危害もない。当時、国際的資料を調べたところ、欧米諸国でもこういう家系についての報告が７つあることが分かった。今まで報告されたこのような家系は17あるが、該染色体を材料として、ヒト由来遺伝子ベクターを組み立てようという構想を出した人は一人もいない。当発明人は1991年に該微小染色体のエレメントを分離して、ヒト由来遺伝子ベクターを組み立てようという構想をたて、1994年にプロジェクトを立ち上げ、1995年に具体的にプロジェクトを実施し始めた。研究の中、FISH技術を用い、該ＢＭがヒトのＤ、Ｇ群染色体即ち13、14、15、21、22番染色体の短腕に由来することが明らかになった。Ｄ、Ｇ群染色体短腕は核小体形成領域を有し、リボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）が豊富である。該領域は集団中で長さが多型（即ちｒＤＮＡの含有量が異なる）であって、且つ細胞分裂期には該領域の遺伝子の転写が非常に活発である。したがって、当出願人はＢＭから特異性のあるDNA断片をクローン化したものを目的遺伝子の先導配列にして、目的遺伝子を人体D、Ｇ群染色体短腕の核小体形成領域に部位特異的に導入(定点導入)すれば、該遺伝子の発現は効果的、安定かつ無害であると推測した。その後に続く実験はこれをはっきりと証明した。
【０００６】
BM染色体を発見し、ヒトＤ、Ｇ群染色体短腕の核小体形成領域と相同性のある特異的ＤＮＡ断片をクローン化することは非常に意義があるものである。
【０００７】
当発明人はまず、顕微解剖法を用いて、ＢＭ特異的pUC19ライブラリーを構築し、それをスクリーニングしてシングルコピーの断片を選び出した。このシングルコピー断片がD、G群染色体短腕に由来することが、蛍光in situ ハイブリダイゼーション（FISH）により明らかになった。さらに、このシングルコピー断片をプローブとして、ヒトのPACゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、約120kbのＢＭ特異的DNA断片（BMSF）を取得した（配列１）。これはFISHでＢＭとD、Ｇ群染色体の短腕からきたことが証明された（図１）。配列決定し、BMSFの配列の特性を分析したところ、重要な生理機能とかかわっている遺伝子は見出されなかった。それゆえ、これは標的部位として安全である。
【０００８】
したがって、当出願人は下記のように考えている：ヒトD、G群染色体の短腕上の重要な生理機能がない遺伝子のDNA 配列、或いは該DNA 配列と５０％またはそれより高い相同性があるDNA 配列から選んだ先導配列を目的遺伝子の先導配列とするのは発明の目的にかなっている。例えば、遺伝子の先導配列を配列表１に示したDNA配列から選ぶ。配列表１に記載されたDNA配列はヒト由来である。
【０００９】
上記の約120kbのDNA断片、或いは上述の特性をもつ約120kbのDNA断片の中からもっと小さくて特異性のよいDNA断片を選んで遺伝子の先導配列とすることができる。例えば、実施例では配列表１から75590位から79448位までの、長さ3.8kbのDNA断片を選んで遺伝子先導配列（GLS）とした。遺伝子ベクターを構築するために、遺伝子ベクター中に正、負のスクリーニング遺伝子を含むことができる。
【００１０】
さらに具体的には、配列表１中75590位から79448位までの、長さ3.8kbのDNA断片を遺伝子の先導配列（GLS）として、ｐＧＥＭ-ＴＫベクターに導入し、TKを負のスクリーニング遺伝子とし、正のスクリーニング遺伝子としてNeo遺伝子をGLSの1500位に挿入し、GLSを1.5kbと2.3kbの両腕に分け、遺伝子ベクターを構築する。遺伝子ベクターを含む菌株は2000年9月29日にすでに中国典型培養物保蔵中心（中国、武漢、武漢大学内、郵便番号430072）に保存された。保存番号：CCTCCM200030、保存機関が指定した分類名：Escherichia coli JM109/JH-4/ｐNS2。図２に示すようにそのDNA配列は配列表２に記載されている。
【００１１】
本発明の提供する、配列表１から選ばれたDNA先導配列はＤ、Ｇ群の染色体短腕の特定部位に由来するので、それによって構築された遺伝子ベクターは目的遺伝子を上述の特定部位に導入することができることに疑いなく、さらに該特定部位のDNA断片は重要な生理機能に関係する遺伝子を含まないので、目的遺伝子の導入は安全である。
【００１２】
上記の発明技術の計画に基づき、当出願人がさらに提出する遺伝子発現方法は次の手順を含む：
（１）ヒトD、Ｇ群染色体の短腕上にあって重要な生理機能に関わらない遺伝子のDNA 配列、或いは該DNA 配列と５０％またはそれより高い相同性があるDNA 配列を、目的遺伝子の先導配列とし、遺伝子ベクターを構築する。
（２）目的遺伝子を上記の遺伝子ベクターに入れる。
（３）目的遺伝子を宿主細胞のD、Ｇ群染色体の核小体形成領域の標的部位に導入する。
（４）目的遺伝子を体外または体内の細胞で発現させる。
【００１３】
上述の手順の中、遺伝子ベクターの構築、目的遺伝子を遺伝子ベクターに入れること、目的遺伝子を宿主細胞に導入すること、及び目的遺伝子の発現過程を実現することは現有の技術によってできる。
【００１４】
その中で、目的遺伝子の先導配列は配列表１に示すDNA配列から選ぶことができる。さらに、目的遺伝子の先導配列は配列表１中の75590位から79448位までである。
【００１５】
上述の遺伝子先導配列を用いて、正と負のスクリーニング遺伝子を含むベクターを構築することができる。
本発明の実施例２、３は上述の過程を説明している：
▲１▼TKを負のスクリーニング遺伝子として、約120kbのBMSF選択特異性の高い3.8kｂのDNA断片をpGEM-TKプラスミドベクターにサブクローニングし、同時に3.8kbのDNA断片の中に正のスクリーニング遺伝子Neoを挿入して、遺伝子ベクターを構築する。
▲２▼目的遺伝子を選んで酵素で切断した後、Neo遺伝子の端にある外来遺伝子のクローン部位に連結する。PCRで、各部分の存在と方向を証明する。
▲３▼ｐＧＥＭベクターから単一酵素切断部位を選んで遺伝子ベクターを線状化し、電気穿孔或いはリポソームトランスフェクションの方法で標的細胞に導入する。
▲４▼G418とGCVを使って、形質転換された標的細胞に対して、正と負のスクリーニングを行い、定点組込みの陽性細胞クローンを得る。
▲５▼陽性細胞クローンについて、目的遺伝子の発現を検出して、最終的にD、Ｇ群染色体の短腕への目的遺伝子の定点組込み、安定発現を達成する。
【００１６】
スクリーニングで得られた目的遺伝子の発現が陽性の細胞を皮下包埋或いは静脈注射の方法で患者に体内に導入する、或いは目的遺伝子のベクターをリポソ-ムで包んで直接患者の体内に注入して、目的遺伝子を患者の体内に長く且つ安定に発現させ欠陥遺伝子による臨床症状を直す。
【００１７】
本発明の実施例の中に提供した遺伝子ベクターのDNA配列は配列表２のようである。その中、先導配列が配列表１の75590位〜79448位であり、TKを負のスクリーニング遺伝子として、正のスクリーニング遺伝子をGLSの1500位に挿入し、GLSを1.5kbと2.3kbの２つに分け、遺伝子ベクターを構築する。目的遺伝子の挿入部位は5910位である。本発明の実施例では、目的遺伝子として血栓性疾病の治療に用いられる組織型プラスミノゲンアクチベーター遺伝子（TPA）および血友病Bの凝血因子IX遺伝子（FIX）のHT1080細胞内でのインビトロ発現を公開した。実験はその発現が有効且つ安定であることを証明した。
【００１８】
したがって、本発明が提供する遺伝子の発現方法は応用面で非常に有望である。薬用蛋白質の製造に用いるだけでなく、遺伝子治療の有効な方法を提供するものである。
【００１９】
本発明人は新規な、人体に無害な染色体を独特な材料として、まったく新しい研究路線に出ることになった。該発見は世界ではじめてヒトD、Ｇ群染色体短腕核小体形成領域がヒトの遺伝子治療と遺伝子発現の一番よい標的部位（13、14、15、21、22号の染色体短腕核小体形成領域の10個の標的部位）であることを発見し、一種の目的遺伝子をこれらの標的部位に定点導入することができる新たなベクター―ヒト由来遺伝子ベクター―を構築した。
【００２０】
本発明は従来技術と比べて下記の著しいメリットを持っている：
１．安定性がよい：請求項１或いは２に示したDNA配列を遺伝子の先導配列としてベクターを構築することにより、ヒト由来遺伝子ベクターは目的遺伝子をヒト体細胞のＤ群とＧ群の染色体短腕上に定点挿入でき、目的遺伝子を染色体によって安定に遺伝させることができる。
２．安全性がよい：標的部位に重要な生理機能に関わる遺伝子がないため、該標的部位が安全だということは証明された。同時にFISHでベクターが目的遺伝子を部位特異的に細胞中の安全な標的部位に挿入できることも確認した（図３、４）。これにより無作為の挿入による突然変異を除外し、野生型ウイルスの危害も存在しない。目的遺伝子は標的部位での発現は安全である。本発明は遺伝子の発現方法の臨床証明を提供しなかったが、出願人及び国内外の研究者たちの発見した実例はほかの角度からその安全性を証明した。（実施例４）
３．発現の効率が高い：第一に、本発明の提供した遺伝子ベクターはD、Ｇ群染色体短腕に由来する先導配列を含む。それゆえに、対応して人体細胞の中には10個の標的部位が存在し、挿入効率はほかのベクターより少なくとも5〜10倍高くなる。第二に、先導配列は遺伝子の転写が活発なD、Ｇ群染色体の短腕からきたため、標的部位へ導入された目的遺伝子は効率よく発現される。
４．免疫原性がない：該ベクターはヒト由来なので、人体に用いても免疫原性を生じることはない。
【００２１】
【実施例】
本発明が提供する実施例は本発明を実施する方法の１つであって，本発明を限定するものではない。
【００２２】
実施例１
本発明が提供する遺伝子先導配列の調製：
１．遺伝子先導配列を含むPACクローンの取得
１．１  顕微分割、PCR、マイクロクローニングでBM特異的ｐUC19ライブラリーを構築する（Deng H-X, Yoshiura K, Dirks RW, et al. Hum. Genet. 1992、89：13）
１．２  BM特異的シングルコピーDNAの取得及び鑑定
（１）コロニー点陣膜の調製：２枚のナイロン膜の上に14×14の格子模様を画き、それぞれA、Bと表記し、LB固形培地の入った２枚のシャーレに置く。そして、ライブラリーのシャーレから無作為に白いクローンを14×12個選び、それぞれ座標が同じになるように２枚の膜に移植する。第13行の点には100ｎgのシングルコピーDNAを陽性対照として置き、第14行の点には100 ngのｇDNAを陰性対照としておく。２つのシャーレはそれぞれ37℃で10〜1２時間培養する。B膜は4℃で保存し、A膜はシャーレから取り出し、以下の溶液に浸した濾紙で順次処理する。10％SDS、5分間、0.5NＮaOH/1.5Ｍ NaCl、3分間、1.5M NaCl/0.5M Tris・HCl 、３分間、2×SSC/0.2M Tris・HCl、10分間。 80℃真空の状態で2時間乾燥し、37℃で保存する。
【００２３】
（２）ｇDNAプローブの調製
ｇDNA を50〜75ng取り、無菌水を加えて11mlにし、100℃で10分間沸騰させて変性させる。下記の系でランダムプライマー標識反応を行う。
2mM dNTP(dATP-)            3 μl
プライマー混合物           2 μl
クレノウ酵素               1 μl
α-32p-dATP                 3 μl
均一に混ぜて、37℃で30分インキュベートする。停止混合物（Stopmixture）を8μl加え、G−50カラムを通してプローブを精製し、1/10を取って液体シンチレーションを測定する。
【００２４】
（３）交雑(ハイブリダイゼーション)：
コロニー点陣膜を2×SSCの中に10分間浸して、そっと表面のコロニー残渣をふき取る。そして、65℃の状態で5mlの交雑液中30分以上予備交雑する。液体シンチレーション値によって、1.2×106 cpm/ml交雑液となるような量のプローブ液を取って、100℃の状態で10分間沸騰させ変性させる。それから、新鮮な交雑液5mlを加え、65℃の状態で、コロニー点陣膜と12時間以上交雑する。以下の条件で膜を洗う：２×SSC/0.1％SDS、室温10分間、２×SSC/0.1％SDS、65℃の状態で10分間、0.1×SSC/0.1％SDS、65℃の状態で10分間、-70℃でオートラジオグラフィ―を行う。交雑の信号がない、或いは弱い場合は一応シングルコピーだと考えられる。
【００２５】
（４）配列の測定およびサザンハイブリダイゼーション検定：
交雑信号のないクローンをB膜の対応位置からとり，少量を増殖させてプラスミドDNAを抽出して配列を決定する。それをGenBankデータベースと比べて、類似性がないならシングルコピーだと思われる。最後に、EcoRI酵素で挿入DNAを切り出して、ランダムプライマー法によりα-32P-dATP標識してEcoRI消化したgDNAとナイロン膜転移交雑させる。方法は上記と同じである。交雑帯が1本か2本あるものを、シングルコピーとする。
【００２６】
１．３  BM及びD、Ｇ群染色体短腕特異的PACクローンの取得と鑑定：
（１）ヒトPACｇDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンの番号を得る
260bpのシングルコピーのプローブP8-7をランダムプライマー法によりα-32Ｐ-dATPで標識する→G-50カラム(中粒度)で精製→4℃に保つ→７枚のPAC膜を2×SSCの中に10分間浸す→55℃で、3時間予備交雑をする→プローブを100℃で10分間変性させる。→4.6×10５cpm/mlになるよう50mlの市販の交雑液を加え、PAC膜と65℃で一時間交雑させる→膜の洗浄：2×SSC、室温で10分間１回、2×SSC/0.1％SDS、65℃で10分間2回→X線フィルムをのせ-70℃で12時間オートラジオグラフィーをする→X線フィルムを現像する→取り扱い説明書によって陽性のクローンの番号を読み取る。
【００２７】
（２）５つの別々のプレートから無作為に陽性のクローンの番号を選び出し、それらのPACクローンを購入する。
１．４  PACDNAとＭ期細胞のFISH交雑は、Ｄ、Ｇ群染色体短腕由来であることを証明する。図１参照。
上記の実験の方法は《分子クローニング実験ガイドブック》(J. Sambrook et al. Molecular Cloning  Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)を参照。
【００２８】
２．遺伝子先導配列DNAの取得
主要材料：β-アガロース(Bio-Labs)  NotI アガロース
▲１▼    Not I酵素でPAC169プラスミドを切断。
▲２▼    PFGEで約120Kbの挿入DNAを分離する。
バルス電気泳動の条件：電極の緩衝液：0.5×TBE、高強度分析用アガロース: (Bio-Rad, 低融点アガロース LMP)1%、切り替え時間:2〜15秒；電気泳動の時間:18時間；電圧：6V/cm；角度：120°温度：14℃
▲３▼    電気泳動が終わった後、EBで30分間染色する(0.2 μｇ/ml)。マーカーに基づいて、無菌の安全かみそりで約120kbのバンドを切り取る。
▲４▼    切り出したゲルをβ-アガラーゼで処理し、エチルアルコールで沈殿させる。
【００２９】
実施例２
本発明が提供する遺伝子ベクターの調製：
１．遺伝子ベクターの構築及び目的遺伝子の導入
１．１．  ベクターの構築
１．１．１  NsiIとStuI(平滑末端酵素)でPAC DNAを切る。普通のアガロースゲルを用いて3.8kbのDNA断片を回収する。電気溶出し精製する。
１．１．２  HindIII酵素でｐGEM-TKのベクターDNAを切る。クレノウ酵素で平滑にする。平滑末端が１つできる。
１．１．３  さらに、ｐGEM-TK/HindIII平滑化産物をNsiI酵素で切る。
１．１．４  3.8kb/NsiI+StuI精製産物とｐGEM-TK/HK+NsiI酵素切断産物とを16℃で17時間連結させる。
【００３０】
１．１．５  連結産物でJM109コンピテント細菌を形質転換し、アンピシリンシャーレで37℃、18時間培養する。
１．１．６  無作為にシングルクローンを選び、NsiI及びNheIの酵素で切断して、陽性のクローンを鑑定する。
１．１．７  XbaIとNheIの２酵素でpCDN-GPRプラスミドを切り、Neo/XbaI+NheIを取得する。
１．１．８  Neo/XbaI+NheIをpGEM-TK-3.8kb/NheIに連結し、PNS2遺伝子のベクターを構築する。
【００３１】
２．１  TPA/FIXの導入：
２．１．１  TPA/FIX(CDS)をpcDNA3.1(-)にクローニングする。
２．１．２  プライマーTPCFとTPCRを設計し、TPA/FIX遺伝子及び発現エレメント(CMVプロモーターとBGH ポリＡシグナル)を増幅し、両脇にAvrII酵素の切断部位を導入する。プライマーの配列は：
TpcF:ATgCATCCTAggggAggTCgCTgAgTAgTg
AvrII
TpcR:TgCATgCCTAggTACCCCCTAgAgCCCAg
AvrII
【００３２】
２．１．３  AvrII酵素で遺伝子TPA/FIX及び発現エレメント(CMVプロモーターとBGH  poly A 信号)を切る。それをNheI酵素で切断したpNS2ベクターに連接する。
上記の実験の方法は《分子クローニング実験ガイドブック》に詳しい。(J. Sambrook et al. Molecular Cloning. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)
【００３３】
２．遺伝子ベクターＤＮＡの抽出
２．１  材料
２．１．１  QIAGEN  Plasmid  Maxi  Kit
２．１．２  培地：ＬＢ液体培地
トリプトン      ５ｇ
イーストエキス  ２．５ｇ
ＮａＣｌ        ２．５ｇ
ｄｄＨ２Ｏで５００ｍｌに
高圧蒸気滅菌
【００３４】
２．１．３  アンピシリン（AMP）:100mg/ml  (1000×)
２．２  方法：
１）陽性シングルクローンを選び３ｍｌのＬＢ（Ａｍｐ＋）で３７℃、２５０ｒｐｍで1時間培養する。
２）上記の初代培養物を100μl取り、100mlLB(Amp+)の中に入れ、37℃、250rpmで16時間培養する。
３）  4℃で、6000×gで15分間遠心し、細菌を取得する。
４）  10mlのバッファーP1に菌体を再懸濁する。
５）  10mlのバッファーP2を入れ、軽く6回反転し、均一に混合させる。室温で５分間放置。
６）  氷上で予備冷却したバッファーP3を10ml入れ、軽くて6回反転し、均一に混合させる。氷上で20分間。
７）  4℃で、20000×gで30 分間遠心する。
８）  上澄み液をもう一つの40ml高速遠心管に速やかに移し、4℃、20000×gで再び遠心する。
９）  10mlのバッファーQBT でQIAGEN tip 500を平衡化する。
１０）  上澄み液をQIAGEN tip 500に移し、カラムを通過させる。
１１）  2×30mlのバッファーQCでカラムを洗う。
１２）  15mlのバッファーQFで溶出し、溶出液を集める。
１３）  溶出液に(0.7倍の容積の)10.7mlのイソプロパノ-ルを入れ、均一に混合させる。
１４）15000×g、4℃で30分間遠心する。
１５）  上澄み液を取り除いて、DNA沈殿物に5mlの70％エチルアルコールを入れて洗浄，15000g、4℃で10分間遠心する。
１６）  70％エチルアルコールを取り除いて、空気の中で10分間乾燥した後、適量のTEでDNA沈殿を溶解する。
【００３５】
実施例３
実施例２で得た目的遺伝子TPAとFIXを有するベクターを利用して、それぞれ宿主細胞に目的遺伝子を導入し、in vitroで細胞に発現させる。
１．材料：
１．１  細胞：HT1080
培地：(高濃度糖含有)DMEM+10％FBS(HT1080)EMEM+10％FBS
１．２  電気穿孔機：Bio-Rad社
【００３６】
２．方法：
１）  75cm２の培養瓶の内で、底が70％〜80％まで覆われる(集密になる)まで細胞を増殖させる。
２）  細胞を取り出してHeBsの緩衝液で2回洗い、細胞の数を計算する。
３）  15000 rpm、4℃で10分間遠心する。
４）  適量のHeBsに再懸濁し、細胞の濃度を10６〜10７/mlとする。
５）  0.4mlの電気穿孔用キュベットに細胞懸濁液を０．8mlとベクターDNA約10μgを入れる。
【００３７】
６）電気穿孔機で電気ショックを与える。電圧260V、電気容量550μF、時間11〜13msという電撃条件を設定する。
７）  電撃された細胞を75 cm２の培養瓶に移し、２種の抗生物質を含んでいる培地14ml入れ、37℃で、5％CO2中24〜48時間培養する。
８）  培地に最終濃度300μlのG418を入れてスクリーニングする。2〜3日経ってから液を取り替える。そして再度G418を入れる。同時に正常の細胞を対照として用いる。
９)  約7〜10日後には正常細胞はすべて死んだ。トランスフェクション細胞で残っているクローンの数を計算する。そして維持量のG418150μg/mlを使用する。
10）続いて最終濃度500ｎｇ/mlのGCVでトランスフェクション細胞をスクリーニングする。
１１）7〜10日を経って大部分のクローンは死に、生き残っている細胞に維持量のGCV250μg/mlを使用する、或いは加えない。スクリーニングを受けた細胞を底の70〜８０％まで覆うように増殖させ、導入された遺伝子の発現活性を測定する。
【００３８】
３．結果：
該ベクターを利用し、電気穿孔の方法で、TPAとFIX遺伝子をそれぞれHT1080細胞に導入する。正のスクリーニングと負のスクリーニングによって、陽性細胞株を取得した。定点に挿入されることをFISHで確認した（図３、図４参照）。TPA活性の測定結果は詳しくは表１を見よ。
【００３９】
HT1080細胞の陰性対照のTPA活性は０U/10６細胞/24時間で、導入後のTPA活性は408U/10６細胞/24時間である。形質転換95日後の発現量は407で、発現は非常に安定である。表1参照。FIX活性も陰性対照の0.5μｇ/mlから2.5 μｇ/mlに上がり、形質転換109日後でも発現量がまだ2.6μｇ/mlである。表２参照。二つの発現産物はすべてウェスタンハイブリダイゼーションによって証明された。（図５、図６）。TPAの発現産物はすでに純化されている。
【００４０】
【表１】
TPAで形質転換された陽性細胞とTPA活性の測定（μg/10６細胞/24時間）
0004944349.tif 000002
(T1とT15はともにTPA陽性細胞株である。)
【００４１】
【表２】
FIX活性の測定（μg/10６細胞/24時間）
0004944349.tif 000003
【００４２】
実施例４
ヒトでの安全性の実例：
夏家輝は1973年から人類遺伝学と医学細胞遺伝学についての研究をしており、全国から189個所の実験室の470人の臨床細胞遺伝学者が報告した732種の世界で初めて報告された核型のうち、41種の核型がD、Ｇ群の染色体の短腕に関連し、D、Ｇ群染色体の短腕に転位した断片が１−22番のどの染色体からきたかにかかわらずあるいは同じ番号の染色体に由来してもサイズが違い、含まれた遺伝子が一つから千以上であるにもかかわらず、保有者本人の表現型は正常であることを見出し鑑定した。このことはD、Ｇ群染色体の短腕に転位した遺伝子が正常に発現できることを示した。したがって、D、Ｇ群染色体の短腕は遺伝子治療の標的部位としては安全である。
【００４３】
１．核型：46,XX,t(1;12;22;15;11;8)(1qter→1p11::8p23→8pter;12pter→     12qll::1p11→1pter;  22qter→22p11::12q11→12qter;  15pter→15q15::22p11→22pter;  11pter→11q21::15q15→15qter;  8qter→8p23::11q21→11qter).
表現型：  女、28歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：  呉素彬、広東省広州市、中山医科大学付属一院産婦人科の細胞遺伝室、郵便番号:510080
【００４４】
２．核型：46、XY、t（1;13）（1pter→1q32::13p11→13pter;13qter→13p11::1q32→1qter）.
表現型：女、24歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：  肖晟、ハルビン医科大学生物教研室、郵便番号：150086
【００４５】
３．核型：46、XX、t(2;15)(2pter→cen→15qter;  2qter→cen→15pter).
表現型：女、２６歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：郭裕萍等、江西省南昌市、江西省産婦人科病院の細胞遺伝室、郵便番号：330006
【００４６】
４．核型：46、XY、t（2;21）（２pter→cen→21pter; 2qter→cen→21qter）.
表現型：男、32歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：  康過秦等、山西省太原市、山西医学院付属二院遺伝研究室、郵便番号：030001
【００４７】
５．核型：46、XY、t（３;22）（3qter→cen→22pter; 3pter→cen→22pter）.
表現型：男、26歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：  高永、山東省濱州市医学院毒理室、郵便番号：256603
【００４８】
６．核型：46、XY、t（３;22）（3pter→cen→22qter; 3qter→cen→22pter）.
表現型：男、29歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人幼児の病院遺伝室、郵便番号：121000
【００４９】
７．核型：46、XX、t（4;15）（4qter→4P13::15p13→15pter;15qter→15p13::4p13→4pter）.
表現型：女、28歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：周玲など、湖北省武漢市、武漢市児童病院遺伝実験室、郵便番号：430016
【００５０】
８．核型：46、XY、t（4;21）（4qter→4P15::21p11→21pter;21qter→21p11::4p15→4pter）.
表現型：男、2５歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：  徐競芳等、上海市第六人民病院遺伝室、郵便番号：200000
【００５１】
９．核型：46、XY、t（4;14）（4pter→4q31::14p11→14pter;14qter→14p11::4q31→4qter）.
表現型：男、表現型が正常な保有者
資料提供者：  周明君等、河志省許昌市中心病院、郵便番号：161000
【００５２】
10．核型：46、XY、t（4;14）（4pter→4q35::14p11→14pter;14qter→14p11::4q35→4qter）.
表現型：男、27歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：張秀泉等、広東省佛山市、佛山市婦人幼児保健院、郵便番号：528000
【００５３】
11．核型：46、XX、t（5;22）（5pter→5q13::22p11→22pter;22qter→22p11::5q13→5qter）.
表現型：女、32歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：曹建萍 、河南省安陽市婦人児童保健院遺伝室、郵便番号：455000
【００５４】
12．核型：46、XY、t（6;22）（6pter→cen6→22qter;6qter→cen22→22pter）
表現型：男、25歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：祝新霞等、山東省泰安市、山東第８８病院産婦人科細胞遺伝室、郵便番号：271000
【００５５】
13．核型：46、XY、t（6;22）(6 qter→6p21 ::22p11.2→22pter;22qter22p11.2::6p21→6pter)
表現型：男、33歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：楊蘭青、  山東省濱州市濱州医学院付属病院産婦人科、郵便番号：256603
【００５６】
14．核型：45、XX、t(7;21)（7qter→7p22::21p12→21qter）
表現型：女、23歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：孫吉慶等、湖北省武漢市、湖北省武漢市児童病院遺伝実験市室、郵便番号：430016
【００５７】
15．核型：46、XY/46、XY、t(7;14)(7pter→7q11::14p11→14pter;14qter→14p11::7q11→7qter)
表現型：男、28歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研究室  郵便番号：410078
【００５８】
16．核型：46、XY、t(8;14)(8qter→8P21::14P12→14pter;14qter→14p12::8p21→8pter)
表現型：男、27歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人幼児病院遺伝室、郵便番号：121000
【００５９】
17．核型：46、XY、t(9;14)(9pter→cen→14pter;9qter→cen→14qter)
表現型：男、28歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：程秋雲等、衡陽医学院附一生殖医学研究室、郵便番号：421001
【００６０】
18．核型：46,XY,t(9;22)(9pter→9p13::22p12→22pter;22qter→22p12::9p13→9pter)mat
表現型：女、3１歳、その母、妹一人、弟一人、息子一人も同じ核型が有し、同じく表現型が正常な保有者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研究室  郵便番号：410078
【００６１】
19．核型：46,XY,t(9;14)(9pter→9q12::14p12→14pter;14qter→14p12::9q12→9qter)
表現型：女、32歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：孫艶陽等、黒龍江省ハルビン市、ハルビン医科大学生物教研室、郵便番号：150086
【００６２】
20．核型：46,XY,t(9;15)(9pter→9q21::15p12→15pter;15qter→15p12:;9q21→9qter)mat
表現型：女、36歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：朱桂珍等、山東省泰安市、山東第８８病院産婦人科細胞遺伝室、郵便番号：271000
【００６３】
21．核型：46,XX,t（10;13）(10pter→10q24::13p11→13pter;  13qter→13p11::10q24→10qter).
表現型：女、28歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：厳敦清、青島医学院付属病院産婦人科研究室、郵便番号：266033
【００６４】
22．核型：46,XX,t（10;13）(10pter→10q24::13p12→13pter;  13qter→13p12::10q24→10qter).
表現型：女、29歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：張影如等、広東省広州市、中山医科大学付属一院神経科、郵便番号：510080
【００６５】
23．核型：46,XX,t（11;14）(11pter→cen →14pter;11qter→cen→14qter).
表現型：女、2歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：王志勇、河南省 柘城県、柘城県人民病院遺伝室、郵便番号：476200
【００６６】
24．核型：46,XX,t（11;21）(11pter→11ｐ11::21ｐ11→21pter;21qter→21ｐ11::11ｐ11→11ｐter).
表現型：女、26歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：鄭軍等、陝西省西安市、陝西省婦人児童保健院医学遺伝実験室、郵便番号：710003
【００６７】
25．核型：46,XY,t（11;15）(11pter→11ｑ13::15ｐ12→15pter;15qter→15ｐ12::11q13→11qter).
表現型：女、23歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：楊瑞芳等、山東医科大学付属病院囲産医学センター、郵便番号：250012
【００６８】
26．核型：46,XX,t（12;14）(12pter→cen →14pter;12qter→cen→14qter).
表現型：女、28歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：韓維田等、遼寧省計画生育科研所優生研究室、郵便番号：110031
【００６９】
27．核型：46,XX,t（13;16）(13qter→13p11::16ｐ11.2→16pter;16qter→16ｐ11.2::13p11→13pter).
表現型：女、27歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：  安松蘭、遼寧省大連市、大連市産婦人科病院遺伝室、郵便番号：110078
【００７０】
28．核型：46,XY/45,XY,t（13;13）（13qter→13p12::13p12→13qter）.
表現型：男、39歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研究室  郵便番号：410078
【００７１】
29．核型：46,XY,t（14;18）(14pter→cen→18pter;14qter→cen→18qter).
表現型：男、30歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：王素桂等、北京計画生育技術指導所、郵便番号：100006
【００７２】
30．核型：46,XX,t（14;15）(14pter→14q13::15ｐ13→15pter;15qter→15ｐ13::14q13→14qter).
表現型：女、28歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研究室  郵便番号：410078
【００７３】
31．核型：45,XX,t(15qter→cen→22qter).
表現型：女、27歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室  郵便番号：410078
【００７４】
32．核型：46,XY,t(15;18)（15pter→cen→18pter;15qter→cen→18qter）.
表現型：男、30歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：任国慶等、北京市計画生育技術指導所、郵便番号：100006
【００７５】
33．核型：46,XX,t(15;20)（15pter→cen→2pter;15qter→cen→2qter）.
表現型：女、26歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：王新等、湖南医科大学付属二病院産婦人科遺伝科室、郵便番号：410011
【００７６】
34、核型：46,XX,t（15;22）(15pter→15q11::22ｐ13→22pter;22qter→22ｐ13::15q11→15qter).
表現型：女、27歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：符生苗、海南省海口市、海南省人民病院遺伝室、郵便番号：570011
【００７７】
35．核型：46,XX,t（15;22）(15pter→15q22::22ｐ11→22pter;22qter→22ｐ11::15q22→qter).
表現型：女、29歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李牧尭等、新疆ウルムチ、新疆医学院医学遺伝室、郵便番号：830054
【００７８】
36．核型：：46,XY,t（16;21）(16pter→16q21::21ｐ11→21pter;21qter→21ｐ11::16q12→16qter).
表現型：男、29歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：張恵芳等、広東省計画生育科学技術研究所、  郵便番号：510080
【００７９】
37．核型：46,XX,t(18;21)（18qter→cen→21qter;18pter→cen→21pter）.
表現型：女、表現型が正常な保有者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人児童病院遺伝室、  郵便番号：121000
【００８０】
38．核型：46,Xx,t（18;21）(18pter→18q11::21ｐ12→21pter;21qter→21ｐ12::18q11→18qter).
表現型：女、26歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李修林等、遼寧省沈陽市、中国医科大学付属一院小児科遺伝室、  郵便番号：110001
【００８１】
39．核型：45 ,X,dic(Y;13)(Ypter→Yq1200::13p11→cen→13qter)
表現型：男、4歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室  郵便番号：410078
【００８２】
40、核型：46,XY,t(Y;15)(15qter→15p12::Yq12→Ypter)pat.
表現型：男、新生児、表現型が正常な保有者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室  郵便番号：410078
【００８３】
上述の染色体の異常な保有者はすべて何らかの異常な身体の特徴も発見されていない。したがって、核小体形成領域が外来遺伝子を受け取れることだけでなく、外来遺伝子を正常に発現させることも証明されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は120kbＰＡＣクローンDNAのFISH定位図である。
【図２】  図２は本発明が提供する一種の遺伝子ベクターの構造図である(遺伝子ベクター配列の全長：11162bp)、その中pGEM−7(8267-11162)はベクターの複製エレメント及び原核細胞用のスクリーニングシステムである；TK（1-2840）は真核細胞用の負のスクリーニング遺伝子でTKプロモーターとＴＫpolyAシグナルを用いる、；Neo（4342−5910）は真核細胞用の正のスクリーニング遺伝子で、ｓｖ40プロモーターとsv40のpolyA シグナルを用いる；GLS（2841−4341、5911-8267）は目的遺伝子の先導配列である；クローニング部位(5910)は目的遺伝子の挿入部位である。
【図３】  図３は外来性tPA遺伝子の陽性細胞クローン中でのFISH定位であり、該ベクターによりtPAがD、Ｇ群染色体の短腕に定点導入されたことを示す。
【図４】  図４は外来性FIX遺伝子の陽性細胞クローン中でのFISHによる位置決めであり、該ベクターがtPAをD、Ｇ群の染色体短腕に定点導入できたことを示す。
【図５】  図５は精製ｔPAのウェスタンブロットの結果であり、レーン1〜4が精製ｔPAで、“−”は陰性対照である。
【図６】  図６はFIX陽性細胞のウェスタンブロットの結果である。F3〜F23は６つの異なる陽性細胞株であり、“−”は陰性対照である。
【配列表】
0004944349.tif 000004
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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