(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程1〜4を含む、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析方法であって、発色試薬がキシレノールオレンジまたはクロマズロールSからであり、
前記発色試薬がキシレノールオレンジである場合には、検体中に含まれるアデノシン三リン酸濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程3で得た混合物が紫を呈し、低いときには黄を呈するように、キシレノールオレンジ濃度及び反応時間を設定し、
前記発色試薬がクロマズロールSである場合には、検体中に含まれるアデノシン三リン酸濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程3で得た混合物が青を呈し、低いときには橙を呈するように、クロマズロールS濃度及び反応時間を設定する方法。
工程１:前記検体とアデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを混合し、所定時間保持する工程、
工程２:工程1で得た混合物の少なくとも一部に酸およびピルビン酸オキシダーゼを加えて所定時間保持する工程、
工程３:工程2で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程、および
工程４:工程3で得た混合物の色からアデノシン三リン酸の濃度を判定する工程。
【請求項２】
工程2および3で用いる酸が塩酸である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程１〜4を室温(10〜30℃)で行う請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
工程3で得た混合物の色を目視観察して、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の濃度が、あらかじめ定めた境界濃度より高いか、低いかを判定する請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
アデノシンモノリン酸として、アピラーゼ処理したアデノシンモノリン酸試薬を用いる請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
以下の試薬1〜3を含み、請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法に用いられる、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析用キット。
1:アデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ、
2:酸およびピルビン酸オキシダーゼ、並びに
3:酸、鉄(II)、および発色試薬、但し、発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールSである。
【請求項７】
境界濃度より高い場合および低い場合の発色の色見本を含む請求項6に記載のキット。
【請求項８】
キットの説明書を含む請求項6または7に記載のキット。
【請求項９】
アデノシンモノリン酸が、アピラーゼ処理したアデノシンモノリン酸試薬である請求項6〜8のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含む請求項6〜9のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
前記容器がマルチタイタープレートである請求項10に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析方法に関する。特に、本発明は、アデノシン三リン酸の濃度を目視で判定する方法に関する。さらに詳細には、食品製造現場などの衛生試験などにおいて、食品に含まれる細菌数を、アデノシン三リン酸を指標物質として測定する際、細菌から抽出したアデノシン三リン酸の濃度レベルの判定に有用な簡易判定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年、食品の安全に関する関心が高まってきており、簡便かつ迅速に検査する方法が求められている。これまでの衛生試験は、採取した細菌を培養したのち、コロニーを計数する方法が用いられてきた。この方法は、培養方法の選択により菌種を同定して、計数することができるが、培養するための設備と技術さらに一日以上の培養時間が必要であった。そのため、試験結果を製造工程に迅速に反映させるためには用いられていなかった。【０００３】  一方、細菌の代わりにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を、ホタル生物発光反応を利用して測定する方法がある。
１．Ｅ．Ｗ．Ｃｈａｐｐｅｌｌｅ，Ｇ．Ｖ．Ｌｅｖｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２  ４１−５２  １９６８  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｅｆｌｙ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ．（非特許文献１）
２．Ａｒｎｅ  Ｌｕｎｄｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３０５，２０００，Ｐａｇｅｓ  ３４６−３７０（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ａｔｐ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｓｓ，ｅｎｚｙｍｅｓ，ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）（非特許文献２）【０００４】  食品製造環境において検出されるＡＴＰは、おもに細菌と食品残さに由来しており、細菌由来のＡＴＰはそのまま食中毒などの原因になる可能性を示し、食品残さ由来のＡＴＰはその食品残さが細菌の繁殖源になる可能性を示す。また、サンプル中の細菌数とＡＴＰ濃度の間には相関があることも知られている。
本間茂，食品と開発，Ｖｏｌ．３１  ｐａｇｅｓ  ２２−２５  １９９７（非特許文献３）
Ｓｔａｎｌｅｙ  ＰＥ，ＭｃＣａｒｔｈｙ  ＢＪ，Ｓｍｉｔｈｅｒ  Ｒ，ｅｄｉｔｏｒｓ．ＡＴＰ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｏｘｆｏｒｄ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；１９８９  ｐａｇｅｓ  １７５−１８１（非特許文献４）【０００５】  この方法を用いると、培養なしに迅速に測定することができるため、ＡＴＰは現在清浄度の指標物質として注目されている。しかし、この方法は、迅速に結果が得られるものの、高価な専用機器が必要であった。また、安価な測定器も提供されているが、微量のＡＴＰを高感度に測定するには感度的に不十分とされていた。【０００６】  実際の現場では、製品がそれに定められた基準値を満たしているかどうかを知るだけでよいことも多く、そのためには必ずしも高価な装置は必要ではない。しかし、上記の方法以外にＡＴＰを測定する方法はなかった。【０００７】  一方、上記測定器よりも安価な測定器として比色計がある。そこで、本発明者らは、ＡＴＰの比色法を開発している。
１．石田晃彦，青島陽子，谷博文，上舘民夫，第６３回分析化学討論会講演要旨集ｐ．９２講演番号２Ｆ０５（非特許文献５）
２．青島陽子，石田晃彦，谷博文，上舘民夫，日本分析化学会第５２年会講演要旨集ｐ．２３０講演番号２Ｋ０１（非特許文献６）
３．石田晃彦，青島陽子，谷博文，上舘民夫，第６５回分析化学討論会講演要旨集ｐ．６８講演番号Ｄ２０２２（非特許文献７）【０００８】  この方法は、まず、ＡＴＰ濃度を、アデニル酸キナーゼとピルビン酸キナーゼの酵素反応により増幅する。これは、ＡＴＰの対象濃度が数十ピコ〜数ナノｍｏｌ／ｌと非常に微量であるのに対して、比色計がもともとそれに十分な感度をもたず、ＡＴＰ自体の吸収も小さいからである。続いて、増幅されたＡＴＰと当量生成するピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼのもとで反応させることにより、過酸化水素を生成させる。次に、過酸化水素と水素供与系呈色試薬（トリンダー試薬）をペルオキシダーゼのもとで反応させ、紫色の色素を生成させる。最終的に、紫色の濃淡を比色計で測定することにより、試料中のＡＴＰ濃度を決定する。しかし、この方法においても、測定装置が必要であり、基準値を満たしているかどうかを簡便に判定するという点では限界があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  そこで本発明は、上記技術のもつ課題を解決すべく、食品衛生検査における有用な指標物質であるＡＴＰを、特別な測定装置なしに一目するだけで簡便に判定できる方法およびこの方法に使用するキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者らは、上記問題点を解決するため判定方法について検討を重ねた結果、発色試薬を適切に選択することにより、特定のＡＴＰ濃度に対して、それよりも濃度が高いか低いかを色別で発色させて、簡便に目視で判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、ＡＴＰ濃度の増加に伴って、色の濃淡が変化するのではなく、あるＡＴＰ濃度を境界にその上下で溶液が、異なる色（色相）を呈することを特徴とする方法である。さらに、色の違いが生じる境界の濃度を試料ごとの基準値となるように、加える試薬濃度等や反応条件により設定可能であることを特徴とする。本発明は、具体的には以下の通りである。【００１１】
本発明は以下の通りである。
[1]以下の工程1〜4を含む、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析方法であって、発色試薬がキシレノールオレンジまたはクロマズロールSからであり、
前記発色試薬がキシレノールオレンジである場合には、検体中に含まれるアデノシン三リン酸濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程3で得た混合物が紫を呈し、低いときには黄を呈するように、キシレノールオレンジ濃度及び反応時間を設定し、
前記発色試薬がクロマズロールSである場合には、検体中に含まれるアデノシン三リン酸濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程3で得た混合物が青を呈し、低いときには橙を呈するように、クロマズロールS濃度及び反応時間を設定する方法。
工程１:前記検体とアデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを混合し、所定時間保持する工程、
工程２:工程1で得た混合物の少なくとも一部に酸およびピルビン酸オキシダーゼを加えて所定時間保持する工程、
工程３:工程2で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程、および
工程４:工程3で得た混合物の色からアデノシン三リン酸の濃度を判定する工程。
[2]工程２および3で用いる酸が塩酸である[1]に記載の方法。
[3]工程１〜4を室温(10〜30℃)で行う[1]または[2]に記載の方法。
[4]工程3で得た混合物の色を目視観察して、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の濃度が、あらかじめ定めた境界濃度より高いか、低いかを判定する[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]アデノシンモノリン酸として、アピラーゼ処理したアデノシンモノリン酸試薬を用いる[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]以下の試薬1〜3を含み、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法に用いられる、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析用キット。
1:アデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ、
2:酸およびピルビン酸オキシダーゼ、並びに
3:酸、鉄(II)、および発色試薬、但し、発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールSである。
[7]境界濃度より高い場合および低い場合の発色の色見本を含む[6]に記載のキット。
[8]キットの説明書を含む[6]または[7]に記載のキット。
[9]アデノシンモノリン酸が、アピラーゼ処理したアデノシンモノリン酸試薬である[6]〜[8]のいずれかに記載のキット。
[10]検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含む[6]〜[9]のいずれかに記載のキット。
[11]前記容器がマルチタイタープレートである[10]に記載のキット。
【００１２】  本発明の方法によれば、微量のＡＴＰを目視で簡便に判定することが可能となるため、コスト的な問題から高価な測定器の導入が難しかった現場でも衛生検査を容易に行うことが可能となり、衛生検査の普及に貢献することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  本発明の検体中に含まれるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の分析方法は、以下の工程１〜４を含む。
工程１：前記検体とアデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを混合し、所定時間保持する工程、
工程２：工程１で得た混合物の少なくとも一部に酸およびピルビン酸オキシダーゼを加えて所定時間保持する工程、
工程３：工程２で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄（ＩＩ）、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程、および
工程４：工程３で得た混合物の色からアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度を判定する工程。【００１４】  これらの各工程について以下の反応スキームを参照して説明する。尚、以下のスキームでは、発色試薬としてキシレノールオレンジを用いた反応を示し、キシレノールオレンジをＸＯと略記する。発色試薬としてキシレノールオレンジの代りに、例えば、クロマズロールＳを用い場合には、（５）および（５’）において単核キシレノールオレンジ−鉄錯体および複核キシレノールオレンジ−鉄錯体の代りに、単核クロマズロールＳ−鉄錯体および複核クロマズロールＳ−鉄錯体が形成される。【００１５】
【化１】
0004940432.tif 000002
【００１６】（工程１）
工程１では、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が所定濃度を超えて含まれているか、あるいは所定濃度を下回っているかを試験すべき検体と、アデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを混合し、所定時間保持する。【００１７】  前記検体は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度から、検体に含まれる細菌数を推定できるものであれば、特に制限はないが、例えば、食品であることができる。食品としては、例えば、乳製品（牛乳，加工乳，クリーム，アイスクリーム）、未加熱処理製品（サラダ，生野菜）、冷凍鮮魚類等を挙げることができる。但し、これらは単なる例示であり、これらに限定される意図はない。また、前記検体は、食品製造用の器具等の汚染物質であることもできる。【００１８】  検体が、例えば、食品の場合、まず、食品を適当な方法で粉砕し溶液状にしたのち、必要に応じて、界面活性剤等を加えてそこに含まれる細菌の細胞膜を溶解し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を細菌内から放出させる。このように得られた試料溶液を検体として使用できる。また、検体が食品製造用の器具等の汚染物質であり、本発明の方法により、器具等の汚染度を判定する場合は、緩衝液等で湿らせた適当な布またはろ紙で器具を拭い、緩衝液を含む試験管の中で洗うことにより、細菌など汚染物が溶解した試料液を調製することができ、この試料液を検体として使用できる。【００１９】  このように調製した検体を、アデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼと混合し、所定時間保持する。この際、さらにｐＨ緩衝液を用いることができ、このｐＨ緩衝液のｐＨは、アデニル酸キナーゼ、およびピルビン酸キナーゼの活性を考慮して決定され、ｐＨ７．５〜８．０の範囲であることが好ましい。また、工程１で用いるｐＨ緩衝剤は、工程３で鉄（ＩＩ）−ＸＯ系を用いる場合は、鉄イオンと結合しない緩衝剤が望ましい。その例として、限定されるものではないが、グッド緩衝剤（ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）など）があげられる。【００２０】  尚、リン酸およびクエン酸は、工程３において、鉄と結合し発色反応を阻害するため良好な発色が得られない、という実験結果が得られている。そこで、試料中にリン酸やクエン酸が含まれる場合は、アルミニウムイオンなどを添加することでそれらを封鎖することが適当である。【００２１】  アデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼ、ｐＨ緩衝液、およびピルビン酸キナーゼは、検体に加えて室温（例えば、１０〜３０℃）で反応させる。ＡＴＰの増幅反応の開始を制御するという観点からは、例えば、酵素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう一方の酵素を加えるという方法を取ることができる。あるいは、酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう２つの酵素を加えるという方法を取ることもできる。二つの酵素をはじめに試料に加えると、酵素や試料などにそれらの基質が微量に含まれている場合、ＡＴＰの増幅反応が��始してしまうおそれがある。そのため、少なくとも一方の酵素を最後に加えることが適当である。また、酵素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合したもの、あるいは酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものを準備しておくことで、試薬添加の手間を省くこともできる。【００２２】  上記スキーム１に示すように、（１）で示すアデニル酸キナーゼの反応により、ＡＴＰおよびＡＭＰからＡＤＰが合成され、（２）に示すピルビン酸キナーゼの反応により、ＡＤＰとホスホエノールピルビン酸とから、ＡＴＰとピルビン酸が合成される。したがって、検体中にＡＴＰが含まれている場合、上記（１）および（２）の反応により、ＡＴＰの量が増幅され、かつピルビン酸が蓄積される。【００２３】  アデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼ、およびピルビン酸キナーゼの添加量は、後述する参考例８に挙げたパラメーターΔｔ、ｔ１／２およびΔＡを用いて，境界濃度の前後の判別したい二つの濃度の曲線が図１３のように離れるような条件を選ぶことが適当である。Δｔは、吸光度が吸光度差の１／２に到達するまでの時間差であり、ｔ１／２は、ブランク試料（［ＡＴＰ］０＝０Ｍ）の吸光度が吸光度差の１／２に到達するまでの時間であり、ΔＡは、ベースラインと最大吸光度の差である。【００２４】  但し、アデノシンモノリン酸は、例えば、４×１０−５〜１×１０−４Ｍの範囲、
ホスホエノールピルビン酸は、例えば、４×１０−５〜６×１０−５Ｍの範囲、
アデニル酸キナーゼは、例えば、１．５〜２．０Ｕ／ｍｌの範囲、
ピルビン酸キナーゼは、例えば、１．８〜２．０Ｕ／ｍｌの範囲、
とすることができる。【００２５】  （１）および（２）の反応、即ち工程１は、所定時間行うが、この所定時間は、以下のように決定される。参考例８で示すように、異なる濃度のＡＴＰを用いて図１３のような反応曲線を作成し、その図において、はじめて紫色を示す吸光度を通る水平線と境界濃度としようとするＡＴＰ濃度の曲線が交わった点の時間を反応時間とする。工程１の所定時間は、境界濃度によって変化するが、上記方法で適宜決定できる。【００２６】  尚、市販のアデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）試薬には微量のＡＴＰまたはＡＤＰが含まれることがある。このようなＡＭＰをそのまま用いて本発明の方法を実施すると、参考例７で示すように、より低濃度のＡＴＰを測定できない場合がある。そこで、含まれる微量のＡＴＰまたはＡＤＰを分解するために、市販のアデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）試薬をアピラーゼで処理することが好ましい。ＡＭＰ試薬のアピラーゼ処理は、例えば、ＡＭＰ試薬の溶液にアピラーゼを添加し、３７℃でインキュベートし、その後、加熱してアピラーゼを不活性化することで行うことができる。より具体的には、例として、ＡＭＰ溶液２５ｍｌを調製する場合について述べると、ＡＭＰおよびアピラーゼ２０Ｕを約２０ｍｌの水に溶解し、３７℃で２時間インキュベーションする。その後、９５℃で１０分加熱し、次いで、室温まで冷却して、水で２５ｍｌに希釈することで、アピラーゼで処理したＡＭＰ水溶液が得られる。【００２７】（工程２）
工程２では、工程１で得た混合物の少なくとも一部に酸およびピルビン酸オキシダーゼを加えて所定時間保持する。工程２では、スキーム１の（３）で示す反応により、（２）の反応の生成物であるピルビン酸が、ピルビン酸オキシダーゼの作用により、酸素およびＰｉ（リン酸）と反応して、アセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生成する。【００２８】  工程２で用いる酸は、例えば、塩酸であることができるが塩酸以外に、硝酸、硫酸等を用いることもできる。【００２９】  酸の添加量は、工程２でピルビン酸オキシダーゼの活性が最大となるｐＨ５．５〜６．２になるように決定することが適当である。ピルビン酸オキシダーゼの添加量は、工程２の反応が短時間でほぼ終了するような値で、かつ使用量を節約する見地からその中で低濃度のものを選択することが適当であり、ピルビン酸オキシダーゼの量は、例えば、３〜６Ｕ／ｍｌの範囲とすることができる。工程２も室温（例えば、１０〜３０℃）で行うことができる。【００３０】  工程２でもｐＨ緩衝剤を用いることができ、工程１と同様に、工程３で鉄（ＩＩ）−ＸＯ系を用いる場合は、鉄イオンと結合しない緩衝剤が望ましい。その例として、限定されるものではないが、グッド緩衝剤（ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）など）があげられる。工程２における反応ｐＨは、ピルビン酸オキシダーゼが十分な活性を示す５．５〜６．２が好ましい。【００３１】  （３）の反応、即ち工程２は、所定時間行うが、この所定時間は、以下のように決定される。参考例６に示す方法により得られる図１１で示すように、吸光度が最大値に到達した時間とすることが適当である。工程２の所定時間は、通常、例えば、５分間程度とすることができる。【００３２】（工程３）
工程３では、工程２で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄（ＩＩ）、および発色試薬を加えて所定時間保持する。発色試薬は、本発明の特徴とするＡＴＰの濃度の境界値の前後で色の変化を生ずるような試薬であれば、特に限定されないが、例えば、キシレノールオレンジ、クロマズロールＳ、メチルチモールブルーまたはメチルキシレノールブルーであることができる。【００３３】  工程３では、発色試薬としてキシレノールオレンジを用いる場合、スキーム１における（４）、（５）および（５’）の反応が進行する。（４）では、（３）の反応の生成物である過酸化水素と鉄（ＩＩ）［Ｆｅ２＋］が、酸性条件下（Ｈ＋イオンの存在下）で、反応して鉄（ＩＩＩ）［Ｆｅ３＋］が生成する。次いで、鉄（ＩＩＩ）［Ｆｅ３＋］とキシレノールオレンジとが反応し、単核キシレノールオレンジ−鉄錯体が生成し、さらにこの単核キシレノールオレンジ−鉄（ＩＩＩ）［Ｆｅ３＋］とが反応して複核キシレノールオレンジ−鉄錯体が生成する。【００３４】  キシレノールオレンジに代わって、クロマズロールＳを用いる場合には、単核クロマズロールＳ−鉄錯体および複核クロマズロールＳ−鉄錯体が形成される。キシレノールオレンジに代わって、メチルチモールブルーを用いる場合には、単核メチルチモールブルー−鉄錯体および複核メチルチモールブルー−鉄錯体が形成される。キシレノールオレンジに代わって、メチルキシレノールブルーを用いる場合には、単核メチルキシレノールブルー−鉄錯体および複核メチルキシレノールブルー−鉄錯体が形成される。【００３５】  工程３で用いる酸は、例えば、塩酸であることができるが塩酸以外に、硝酸、硫酸等を用いることもできる。また、鉄（ＩＩ）は、例えば、硫酸第一鉄アンモニウム（モール塩）等であることができる。工程３も室温（例えば、１０〜３０℃）で行うことができる。【００３６】（工程４）
工程４では、工程３で得た混合物の色からアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度を判定する。工程３における（４）、（５）および（５’）の反応により、検体に含まれていたＡＴＰ濃度に応じて、発色試薬がキシレノールオレンジの場合、単核キシレノールオレンジ−鉄錯体および複核キシレノールオレンジ−鉄錯体の生成量が決まる。これにより、検体中のＡＴＰ濃度があらかじめ定めた境界濃度よりも高いとき紫、低いとき黄と、異なる色を呈し、これを目視観察することで検体中のＡＴＰ濃度レベルを判定することができる。さらにそれにより、検体中の細菌量を把握することもできる。【００３７】  発色試薬としてクロマズロールＳを用いた場合、検体に含まれていたＡＴＰ濃度に応じて、単核クロマズロールＳ−鉄錯体および複核クロマズロールＳ−鉄錯体の生成量が決まる。そして、検体中のＡＴＰ濃度があらかじめ定めた境界濃度よりも高いとき青、低いとき橙と、異なる色を呈し、これを目視観察することで検体中のＡＴＰ濃度レベルを判定することができる。さらにそれにより、検体中の細菌量を把握することもできる。【００３８】  発色試薬としてメチルチモールブルーまたはメチルキシレノールブルーを用いた場合にも、検体中のＡＴＰ濃度があらかじめ定めた境界濃度よりも高いときと低いときとで、異なる色を呈し、これを目視観察することで検体中のＡＴＰ濃度レベルを判定することができる。さらにそれにより、検体中の細菌量を把握することもできる。【００３９】  本発明の方法においては、検体中に含まれるアデノシン三リン酸濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときと低いときとで、工程３で得た混合物が呈する色が異なるように、条件を設定する。より具体的には、主に、（３）により生成する過酸化水素の濃度と工程３で用いる発色試薬の濃度を設定する。したがって、工程３における酸は、工程３におけるｐＨを調節するために加え、そのｐＨは生成する鉄（ＩＩＩ）イオンが加水分解を受けずに安定して存在でき、かつ錯体が生成できる条件を考慮して決定する。詳細は、後述する参考例１に記述する。鉄（ＩＩ）の量は、参考例４に詳述するが、少なくとも発色試薬（キシレノールオレンジ）の２倍とする。発色試薬がキシレノールオレンジの場合、２倍以上にしないと紫色が現れない。【００４０】  発色試薬の決定方法は、参考例２に詳細に記述するが、第１には、図５または６に示すように、過酸化水素濃度と発色試薬の間に直線的相関がある範囲に限定される。さらに、発色が濃すぎ、薄すぎない濃度で行う。具体的には、発色試薬との直線的相関がある範囲（例えば、２×１０−６〜６×１０−５Ｍ）になるように設定することが適当である。（図５及び６参照）【００４１】  発色試薬がキシレノールオレンジである場合についてより具体的に説明する。境界値を挟んで異なる色への発色は、判別しようとする濃度のＡＴＰから反応式（３）により生成する過酸化水素の濃度とキシレノールオレンジの濃度を等濃度に設定することで達成できる。【００４２】  キシレノールオレンジ濃度は、生成する過酸化水素の濃度に応じて設定するが、１×１０−４Ｍ以下が好ましい。それ以上では、それと等濃度の過酸化水素がキシレノールオレンジに対する酸化によって発色を妨害する。キシレノールオレンジ濃度は、好ましくは２×１０−６〜６×１０−５Ｍの範囲である。です。また、境界濃度は、検査対象により、上下させることが可能であり、境界濃度はＡＴＰ５×１０−１０Ｍ以上で設定可能である。【００４３】  さらに、境界濃度を上下する方法について以下に具体的に説明する。境界濃度を上下する方法には、主に、以下の２通りがある。【００４４】１．キシレノールオレンジ濃度を固定し，反応時間を設定する方法
まず、キシレノールオレンジを上記の適用可能な範囲で設定する。さらに、設定したキシレノールオレンジ濃度に対して、過酸化水素濃度が増加したとき初めて紫色になるときの吸光度を求める。測定波長は，紫色の吸収に相当する波長５８５ｎｍとする。続いて、境界濃度とすべきＡＴＰ濃度で工程１の反応を行わせる。工程１の反応液の一部を５〜１５分ごとに採取し、工程２〜３を行って吸光度を測定する。このときの波長も５８５ｎｍとする。反応時間に対して吸光度をとって、図１８（あるいは図２０）のような曲線を作成する。作成した曲線から、紫色に相当する吸光度に達するまでに要した時間を決定し、これを工程１における反応時間とする。なお、様々なＡＴＰ濃度で同様にして曲線を作成しておくと、容易に反応時間を設定することができる。【００４５】２．反応時間を固定し、キシレノールオレンジ濃度を設定する方法
まず、様々なＡＴＰ濃度で工程１の反応を特定の時間行ったのち、工程２を行う。続いて、すべてのＡＴＰ濃度について、工程２で発生する過酸化水素濃度を工程３による方法または別の方法（比色法、電気化学的測定など）で測定する。ＡＴＰ濃度と過酸化水素濃度の関係を、図２１に示すようなグラフにする。このグラフから、境界濃度とすべきＡＴＰ濃度に対応する過酸化水素濃度を求める。過酸化水素濃度とキシレノールオレンジが等しいとき紫になるので、その過酸化水素濃度と等しくなるようにキシレノールオレンジ濃度を設定する。ただし、求める過酸化水素濃度が上述の適用可能な過酸化水素濃度の範囲内にあるように反応時間を調節する。いくつかの反応時間において、同様のグラフを作成しておくと、適用可能な過酸化水素濃度範囲に入る反応時間を容易に定めることができる。【００４６】  キシレノールオレンジと鉄（ＩＩ）イオンの濃度比の設定は、明瞭な発色のために重要であり、具体的には、キシレノールオレンジ：鉄（ＩＩ）イオンのモル比が５０〜２００の範囲であることが適当であり、特に１：１００であることが好ましい。なお、発色は、反応（５）および（５’）において、過酸化水素に酸化されて生じた鉄（ＩＩＩ）イオンとキシレノールオレンジが結合することで起きる。キシレノールオレンジに１個の鉄（ＩＩＩ）イオンが結合したとき赤色を呈し、２個結合したとき紫色を呈する。紫色への変化は、鉄（ＩＩＩ）イオンの濃度がキシレノールオレンジ濃度とほぼ等濃度になったとき起きる。【００４７】  発色試薬がクロマズロールＳ、メチルチモールブルー、またはメチルキシレノールブルーである場合、各発色試薬と鉄（ＩＩ）イオンとのモル比の関係は、キシレノールオレンジと同程度である。【００４８】  さらに工程３において、酸の使用量は、ｐＨが２前後となるとすることが適当である。【００４９】  工程３における反応ｐＨは、２前後が好ましい。ｐＨ３以上では、鉄（ＩＩ）イオンが加水分解して発色に関与できなくなるので、ｐＨをあげることは好ましくない。また、工程１〜４のすべての工程において、ｐＨ調節を用いることができ、その場合、鉄（ＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）イオンと錯体を形成しないｐＨ緩衝剤を用いる。そのようなｐＨ緩衝剤としては、例えば、グッド緩衝剤（ＭＥＳ、ＡＣＥＳなど）が好ましい。【００５０】  （４）、（５）および（５’）の反応、即ち工程３は、所定時間行うが、この所定時間は、以下のように決定される。後述する参考例５に示す図１０のように、紫色の吸収に相当する５８５ｎｍでの吸光度と時間の曲線を作成し、吸光度がほぼ最大値に到達した時間を選ぶ。すなわち、この時間は錯体形成のための時間であるので、錯体形成がほぼ終了する時間とする。工程３の所定時間は、５分以上（例えば、５〜２０分）が適しているが、判定時間を短縮する観点からは５分が好ましい。【００５１】  本発明では、前記のように、目視での判定が可能である。しかし、工程３で得た混合物の色を比色計や色彩測定器を用いて測定することで、数値データとして記録することも可能である。このようにして得られる測定値はＡＴＰ濃度と相関がある。【００５２】  本発明の方法は、食品製造現場において、製造途中の���品、器具の洗浄度のスクリーニング的検査に利用できる。すなわち、境界濃度よりも大きな試料を製造過程から排除するのに利用できる。【００５３】  試料ごとの手順としては、食品であれば、まず、適当な方法で粉砕し溶液状にしたのち、界面活性剤等を加えてそこに含まれる細菌の細胞膜を溶解し、ＡＴＰを細菌内から放出させる。また、器具の汚染度を判定する場合は、緩衝液等で湿らせた適当な布またはろ紙で器具を拭い、緩衝液を含む試験管の中で洗うことにより、細菌など汚染物が溶解した試料液を調製する。これらの試料を多穴プレートに移し、本発明の方法にしたがって試薬を順に滴下し、最終的に現れる発色を目視観察することで、その試料の汚染度あるいは洗浄度を判定する。ただし、試料によって、汚染の許容値あるいは基準値が異なるので、試薬濃度または反応条件によりそれらを調節しておく必要がある。【００５４】  検査結果を記録する必要がある場合は、デジタルカメラでその発色を撮影するか、吸光光度計や色彩測定器を利用することにより、検査結果を記録保存することができる。【００５５】［分析用キット］
本発明は、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析用キット包含し、このキットは、少なくとも以下の試薬１〜３を含む。
１：アデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ、
２：酸およびピルビン酸オキシダーゼ、並びに
３：酸、鉄（ＩＩ）、および発色試薬【００５６】  試薬１は、上記分析方法の工程１に使用される試薬である。前述のように、ＡＴＰの増幅反応の開始を制御するという観点からは、例えば、酵素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう一方の酵素を加えるという方法、または酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう２つの酵素を加えるという方法を取ることができるので、本発明のキットにおいては、試薬１は、酵素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合したものと、他方の酵素の２つの試薬、または、酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものと２つの酵素の混合物の２つの試薬からなることができる。これらの試薬は、例えば、ｐＨ緩衝液に溶解または分散したものであることが適当である。ｐＨ緩衝液用の緩衝剤としては、例えば、グッド緩衝剤（ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）など）を用いることができる。また、ｐＨ緩衝液のｐＨは前述の方法で示したと同様にすることが適当である。【００５７】  試薬２は、上記分析方法の工程２に用いる試薬であり、酸およびピルビン酸オキシダーゼからなり、酸は、塩酸、硝酸または硫酸であることができる。酸は、適当な濃度に希釈したものであることが適当である。また、ピルビン酸オキシダーゼは、そのまま、または、試薬１と同様のｐＨ緩衝液に溶解または分散したものであることができる。【００５８】  試薬３は、上記分析方法の工程３に用いる試薬であり、酸、鉄（ＩＩ）、および発色試薬からなる。酸は、塩酸、硝酸または硫酸であることができる。酸は、適当な濃度に希釈したものであることが適当である。鉄（ＩＩ）は、例えば、硫酸第一鉄アンモニウム（モール塩）等であることができる。また、発色試薬はキシレノールオレンジ、クロマズロールＳ、メチルチモールブルーまたはメチルキシレノールブルーであることができる。酸、鉄（ＩＩ）、および発色試薬（例えば、キシレノールオレンジ）は、あらかじめ混合しておくことができる。【００５９】  本発明のキットは、上記試薬類に加えて、境界濃度より高い場合および低い場合の発色の色見本を含むことができる。発色の色見本の色は、鉄（ＩＩ）および発色試薬の種類に応じて適宜選択できる。【００６０】  本発明のキットは、上記試薬類に加えて、キットの説明書を含むこともできる。【００６１】  本発明のキットに用いるアデノシンモノリン酸は、アピラーゼ処理したアデノシンモノリン酸試薬であることが、より低濃度のＡＴＰを測定できるという観点から好ましい。【００６２】  本発明のキットは、検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含むことができ、そのような容器としては、マルチタイタープレートを挙げることができ、例えば、９６穴のマルチタイタープレートであることができる。但し、マルチタイタープレートは、発色を肉眼で観察しやすいという観点から、色は白色であることが好ましい。
【実施例】
【００６３】  以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。【００６４】参考例１
工程３の反応条件について、おおよその目安をつける目的で、工程３のみで検討を行った。まず、工程３すなわち過酸化水素−鉄（ＩＩ）−ＸＯ系での発色特性を調べた。ＸＯ濃度および鉄（ＩＩ）溶液を一定にして、０〜４×１０−５Ｍの範囲で過酸化水素濃度を変化させたときの吸収スペクトルを図１左に示す。このときのｐＨは、生成する鉄（ＩＩＩ）イオンが加水分解を受けずに安定して存在でき、かつ錯体が生成できる条件を考慮して、２．０とした。工程３では、酸化されて生成する鉄（ＩＩＩ）イオンとＸＯが錯体を形成するため、原理的には工程３と同様の条件と考えられる鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ系を図１右に示す。ＸＯ濃度を一定にして、鉄（ＩＩＩ）濃度を変えて測定した。いずれの場合の極大吸収波長も４３３ｎｍおよび５８５ｎｍであり、それぞれの吸収極大波長はそれぞれ黄色および紫系統の色の吸収に対応する。５８５ｎｍにおける吸光度は、鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ錯体系では６×１０−５Ｍ以上のとき最大一定値０．７５をとるのに対して、過酸化水素−鉄（ＩＩ）−ＸＯ系では過酸化水素濃度２×１０−５Ｍ以上のとき最大一定値０．５となった。過酸化水素−鉄（ＩＩ）−ＸＯ系で吸光度が低くなった原因は、過酸化水素と鉄イオンの反応、すなわちフェントン反応がＸＯや錯体に対して影響しているものと推察される。したがって、本発明を実施するときは、この影響が強く出ない範囲（過酸化水素濃度）で行うのが好ましい。【００６５】  また、過酸化水素−ＸＯ−鉄（ＩＩ）系および鉄（ＩＩＩ）−ＸＯの色調については、紫色側で両者の色調で異なった。結果を図２および３に示す。図２に示す鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ系では青紫色であったが、図３に示す過酸化水素−ＸＯ−鉄（ＩＩ）系では紫色であった。しかし、この色調の差異は、色の違いで判別することに関しては問題とはならなかった。【００６６】参考例２
過酸化水素による鉄（ＩＩ）イオンの酸化反応の量論関係を検討した。そのために、ＸＯ濃度および鉄（ＩＩ）濃度を一定とし過酸化水素濃度を０〜６×１０−５Ｍに変化させて、５８５ｎｍの吸光度を測定した。また、比較のため、鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ系において、ＸＯ濃度を一定として、鉄（ＩＩＩ）標準液を０〜７×１０−５Ｍの範囲で変化させて５８５ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果を図４に示す。鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ系では、［Ｆｅ（ＩＩＩ）］／［ＸＯ］＝１．６付近で屈曲し、過酸化水素−鉄（ＩＩ）−ＸＯ系では、［Ｈ２Ｏ２］／［ＸＯ］＝０．８付近で屈曲した。屈曲点が整数でないのは、用いた発色試薬の純度が低いためである。したがって、純度が高ければ、それぞれ２及び１で屈曲するはずである。屈曲点以降では、いずれもすべて紫または青紫色となった。このことは、いずれの系においても屈曲点で、すべてのＸＯが複核錯体ＦｅＩＩＩ２（ｘｏ）錯体を生成したことを示している。さらに、過酸化水素が鉄（ＩＩ）を鉄（ＩＩＩ）に酸化するため、過酸化水素と鉄（ＩＩ）の反応比は１：２であるといえる。この結果は、（４）の反応式を支持している。過酸化水素−ＸＯ−鉄（ＩＩ）系で最大一定となる吸光度が、鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ系でのそれよりも低くなったのは、上述したようにフェントン反応がＸＯや錯体に対して影響しているためと推察される。【００６７】  図４にあらわれる屈曲点は、その点で紫色への色変化が初めて生じたため、色変化の境界条件となる。この屈曲点を与える過酸化水素濃度は、［Ｆｅ（ＩＩ）］／［ＸＯ］＝２を保ちながらＸＯ濃度を変えると、それに応じて変化する。そこで、［Ｆｅ（ＩＩ）］／［ＸＯ］＝２となるような様々なＸＯおよびＦｅ（ＩＩ）濃度で、屈曲点を与える過酸化水素濃度（境界過酸化水素濃度）を決定した。また、このとき調製した溶液を目視観察し、初めて紫色と認めたときの過酸化水素濃度を、目視観察による境界濃度とした。各ＸＯ濃度に対する境界過酸化水素濃度の関係を図５および６に示す。あるＸＯ濃度において、グラフの線より下側の過酸化水素濃度では黄色、上側では紫色である。【００６８】  目視観察および吸光度測定のいずれにおいても、ＸＯ濃度が１×１０−４Ｍまでは、ＸＯと過酸化水素の濃度の間には傾き１の相関があった。１×１０−４ＭよりＸＯ濃度が高くなると、不規則に変化した。不規則な変化は、目視観察および吸光度測定ともにほぼ同じ形状であるため、測定方法に依存するものではないといえる。以上から、判定に適しているのは、ＸＯと過酸化水素濃度に相関のある０〜１×１０−４Ｍまでである。ただし、色の変化が明瞭で、鮮やかな発色が得られるのは、ＸＯ濃度が２×１０−６Ｍ以上のときであった。【００６９】  さらに、ＸＯ濃度と発色の鮮やかさまたは色の濃さの関係を溶液の吸光度をもとに検討した。結果を図７に示す。ここでの吸光度は、各ＸＯ濃度での屈曲点の吸光度（測定波長５８５ｎｍ）である。吸光度が高いほど、発色が鮮やかであるため、この吸光度から発色の鮮やかさが評価できる。ＸＯ濃度が０〜１．７５×１０−４Ｍでは、濃度が高くなるほど吸光度が高くなり、ＸＯ濃度が１．７５×１０−４Ｍ以上では、吸光度が減少した。吸光度が減少したの��、過酸化水素によりＸＯおよびＦｅ（ＩＩＩ）−ＸＯ錯体が分解されたためである。しかし、吸光度が高い場合でも、色が濃くなりすぎるため、色の判別がしにくくなった。したがって、ＸＯ濃度は、６×１０−５Ｍまでが好ましい。以上から、ＸＯ濃度は、２×１０−６〜６×１０−５Ｍが好ましい。【００７０】  工程３の反応に必要な時間を調べた。［Ｆｅ２＋］＝４×１０−５Ｍ、［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍとして、４種類の過酸化水素濃度で測定した反応曲線を図８に示す。鉄（ＩＩＩ）とＸＯとの反応は迅速であるため、この経時変化は、おもに過酸化水素による鉄（ＩＩ）の酸化反応を反映していると考えることができる。過酸化水素濃度が高い（２×１０−５Ｍ以上）と、最高吸光度に達する時間は短くなった。２×１０−６Ｍでは、およそ１２００秒で吸光度が一定となった。ただし、９００秒でも発色は十分と判断できたことから、工程３を単独で行う場合の時間は１５分以上とした。【００７１】  上述の検討をもとに、工程１から３までを組み合わせた反応系で工程３の条件をあらためて検討した。操作は下記のスキームのように行った。
【化２】
0004940432.tif 000003
【００７２】参考例３
工程１および工程２で用いるｐＨ緩衝剤について検討した。リン酸およびクエン酸は、工程３において、鉄と結合し発色反応を阻害するため良好な発色が得られなかった。鉄と結合しないＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）を用いたときは良好に結果を得ることができた。以上から、工程１および２で用いるｐＨ緩衝剤は、工程３で鉄（ＩＩ）−ＸＯ系を用いる場合は、鉄イオンと結合しない緩衝剤が望ましい。その例として、限定されるものではないが、グッド緩衝剤（ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）など）があげられる。また、試料中に上記のリン酸やクエン酸が含まれる場合は、アルミニウムイオンなどを添加することでそれらを封鎖することが必要である。
なお、工程１における反応ｐＨは７．５〜８．０が好ましく、工程２における反応ｐＨは、ピルビン酸オキシダーゼが十分な活性を示す５．５〜６．２が好ましい。【００７３】参考例４
工程３において、［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍとして、工程１〜３の一連の反応を行ったとき、上述の鉄（ＩＩ）濃度では、良好な発色が得られなかった。増幅反応によりもたらされるＡＴＰ、ＡＭＰ、および酵素が、鉄（ＩＩ）イオンまたは鉄（ＩＩＩ）イオンと結合することで発色に必要な鉄イオンが不足して、発色を妨害したり、過酸化水素による鉄（ＩＩ）の酸化反応を妨害したりすることが予想される。そこで、鉄（ＩＩ）濃度の最適化を行うために、工程１〜３までのすべて反応構成物が存在する条件で、鉄（ＩＩ）濃度を１×１０−４〜４×１０−３Ｍの範囲で、５８５ｎｍの吸光度を測定した。その結果を、図９に示す。図９に示されるように、吸光度は２×１０−３Ｍで最大となった。鉄（ＩＩ）濃度は、１×１０−３〜４×１０−４Ｍの範囲であればよいが、実施例では、２×１０−３Ｍを適用した。なお、この鉄（ＩＩ）濃度は、キシレノールオレンジの５０〜２００倍である。【００７４】参考例５
次に、上記の定めた鉄（ＩＩ）濃度で発色反応時間の検討をした。そのために、工程１でホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）が１００％ピルビン酸に変換されたと仮定し、工程１の反応液として、ＰＥＰの代わりにそれと同濃度のピルビン酸を加えた溶液を調製した。これを用いて、工程２及び３を行い、５８５ｎｍの吸光度を測定した。このとき、工程２の反応時間を５分とした。結果を図１０に示す。図１０に示すように、吸光度は約３００秒以上で最大一定となった。工程３のみの実験ではこの反応時間は２０分であったが、鉄イオン濃度を高くしたために反応速度が大きくなり、反応時間が短くなった。以上から、工程１〜３の一連の操作を行うときの工程３の反応時間は５分とした。【００７５】参考例６
次に、工程２におけるピルビン酸オキシダーゼによる反応時間を検討した。実験は、吸光度測定に十分なほどにＡＴＰが増幅されたとみなせる５０分間増幅させたのち、さまざまな時間で工程２の反応を行った。ＡＴＰ初期濃度は５×１０−５Ｍとした。吸光度は、反応時間が５分でほぼ最大値に到達したため、工程２における反応時間は５分とした。結果を図１１に示す。【００７６】参考例７
ＡＭＰのアピラーゼ処理
市販のＡＭＰには微量のＡＴＰまたはＡＤＰが含まれることが知られている。このＡＭＰをそのまま用いた場合、ＡＴＰ濃度を０Ｍと５×１０−８Ｍ、５×１０−７Ｍでとして実験すると、図１２（Ａ）のように［ＡＴＰ］＝０Ｍと５×１０−８Ｍで曲線が重なる。より低濃度のＡＴＰを測定することは不可能である。そこで、この微量のＡＴＰまたはＡＤＰを分解するために、ＡＭＰをアピラーゼで処理した。ＡＭＰのアピラーゼ処理を行うと、図１２（Ｂ）のように［ＡＴＰ］＝０Ｍと［ＡＴＰ］＝５×１０−８Ｍとで反応速度に違いをみることができた。【００７７】参考例８
ＡＭＰ濃度
ＡＭＰ濃度の最適化を行った。ＡＭＰ濃度を変えると、反応速度を変化させ、増幅曲線の形状を制御することができる。このとき、特定の濃度以上のＡＴＰを判別するには、増幅曲線が以下の条件を備える必要がある。
（１）ベースラインと最大吸光度の差（ΔＡ）が大きいこと。吸光度差が大きいほど、発色が鮮明で、測定誤差を小さくすることができる。発色の変化の大きさを評価でき、吸光度差が大きいほど判定しやすいことになる。
（２）二つのＡＴＰ濃度において、それぞれの吸光度が吸光度差の１／２に到達するまでの時間差（Δｔ）が大きいこと。２本の増幅曲線が離れているほど、精度よく判別することができる。
（３）ブランク試料（［ＡＴＰ］０＝０Ｍ）の吸光度が吸光度差の１／２に到達するまでの時間（ｔ１／２）が長すぎないこと。
以上のパラメーターを図１３のように定義して、様々なＡＭＰ濃度で測定した増幅曲線をもとにグラフを作成した。【００７８】  図１４に吸光度差ΔＡとＡＭＰ濃度の関係を示す。ブランクと［ＡＴＰ］０＝５×１０−４Ｍで比較した。吸光度差は、５×１０−５Ｍで一番大きくなり、その後ほぼ一定となった。【００７９】  図１５に、時間差ΔｔとＡＭＰ濃度の関係を示す。ブランクとＡＴＰを含む曲線が離れているほど、精度よく測定できる。ＡＭＰ濃度が低いほうが時間差は大きくなった。【００８０】  図１６に反応時間とＡＭＰ濃度の関係を示す。ＡＭＰ濃度が１×１０−４Ｍ以降では、ほぼ一定で、ＡＭＰ濃度が高いほうが反応時間は短くなった。【００８１】  以上から、ＡＭＰの最適濃度は１×１０−４Ｍ付近が好ましいと判断した。そこで、この濃度付近でさらにＡＭＰ濃度について検討した結果、ブランクとの開き、再現性から実施例では５×１０−５Ｍ  ＡＭＰを採用した。【００８２】参考例９
ＰＥＰ濃度
ＡＭＰ濃度の最適化と同様の手法で、ＰＥＰ濃度の最適化を行った。そのために、ＡＭＰ濃度を５×１０−５Ｍ一定とし、ＰＥＰ濃度を１×１０−４Ｍ〜１×１０−３Ｍの範囲で変化させて反応曲線を測定した。結果を図１７に示す。ＰＥＰ濃度が１×１０−４Ｍのとき、１２０分間増幅しても、増幅反応特有の立ち上がりは観察されなかったが、２．５×１０−４Ｍ以上では反応曲線が観察された。得られた反応曲線については、どれも吸光度差（ΔＡ）はほぼ一定であった。また、二つのＡＴＰ濃度の時間差（Δｔ）については、図１７に示すように、５×１０−４Ｍで最大値をとった。以上から、ＰＥＰの最適濃度を５×１０−４Ｍとした。【００８３】実施例１
以上の結果に基づいて、ＡＴＰの初期濃度を変えて増幅曲線を測定した。
ＡＴＰ濃度０、または２．０×１０−１０Ｍ、５．０×１０−１０Ｍ、５．０×１０−９Ｍの溶液５００μｌに２．０×１０−２Ｍアデノシンモノリン酸５００μｌ、０．０１Ｍホスホエノールピルビン酸５００μｌ、３７．２Ｕ／ｍｌアデニル酸キナーゼ５００μｌ、０．２Ｍ  ｐＨ緩衝剤７．５ｍｌ、３７．３Ｕ／ｍｌピルビン酸キナーゼ５００μｌを加えて、２５℃で４５分間反応させてＡＴＰを増幅した。この混合液の１ｍｌを分取し、これに２Ｍ塩酸５８μｌ、６．４Ｕ／ｍｌピルビン酸オキシダーゼ９４２μｌを加えて、５分間反応させた。そののち、０．０３５Ｍ塩酸、４×１０−３Ｍ鉄（ＩＩ）イオン、４×１０−５Ｍキシレノールオレンジを含む混合溶液２ｍｌを加えて５分間反応させた。その結果、ＡＴＰ濃度０Ｍの試料では黄色、２．０×１０−１０Ｍでは赤、５×１０−１０Ｍ以上では紫色を呈した。【００８４】  すなわち、この反応条件を用いたとき、５×１０−１０ＭのＡＴＰ濃度を境界値として、色の違いで微量のＡＴＰ濃度を判定することが可能であった。所定の時間ごとに５８５ｎｍの吸光度を測定して得られた反応曲線を図１８に示す。ＡＴＰの初期濃度に応じて明瞭に曲線が離れていることがわかる。【００８５】  図１９に、ＡＴＰを増幅したときの反応時間ごとの発色を示す。ＡＴＰの増幅反応時間が４５分のとき、［ＡＴＰ］＝０Ｍでは黄色、［ＡＴＰ］＝５×１０−１０Ｍ以上では紫色を呈した。このことは、初期ＡＴＰ濃度５×１０−１０Ｍを境界濃度として目視判定ができることを示している。【００８６】  測定値の再現性を検討した。ＡＴＰが０Ｍと５×１０−９Ｍでは、変動係数はそれぞれ１５％、１３％となり、多くの反応を組み合わせていることを考慮すると、妥当な再現性であると考える。【００８７】
【表１】
0004940432.tif 000004
【００８８】実施例２
ミネラルウォーター（フランス産）に既知濃度の大腸菌（ＫＴ１００８株）を添加した試料を用いてＡＴＰ分析を行った。試料を以下のように３種類調製した。
１．０．２Ｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝剤を含むミネラルウォーター
２．工程１の反応混合物中で菌濃度が５×１０５個／ｍｌとなるように大腸菌を１に添加したもの
３．工程１の反応混合物中で菌濃度が１×１０６個／ｍｌとなるように大腸菌を１に添加したもの【００８９】  試料調製に際しては，まず大腸菌を対数増殖期まで培養したあと、培養液を除きｐＨ緩衝液に懸濁した。懸濁液中の大腸菌濃度は約１×１０９個／ｍｌである。この懸濁液を全量２ｍｌとなるようにミネラルウォーターに添加したものを試料とした。試料に含まれる大腸菌の細胞破砕のために，ソニケーターで試料を超音波処理した。これをＡＴＰ溶液の代わりに用いて実施例１と同条件で反応を行った。その結果を図２２に示す。試料１では黄色、試料２ではうす紫、試料３では紫色を呈した。【００９０】
超音波処理によりほぼ完全に細胞が破砕されたと仮定して、工程1における試料１および、２、３のATP濃度を大腸菌濃度から見積もると、それぞれ0、および、5×10-10 M、1×10-9 Mである。各試料の呈色はATP標準を用いた実施例１と同様であるから、この結果は大腸菌から抽出したATPにおいても本発明により判定できることを示している。
【００９１】実施例３
既知濃度の大腸菌を添加した牛乳を試料として、実施例２と同様の実験を行った。試料を以下のように３種類調製した。
１．牛乳のみ
２．工程１の反応混合物中で菌濃度が５×１０５個／ｍｌとなるように大腸菌を牛乳に添加したもの
３．工程１反応混合物中で菌濃度が１×１０６個／ｍｌとなるように大腸菌を牛乳に添加したもの【００９２】  試料調製に際しては、実施例２と同様にまず大腸菌懸濁液（約１×１０９個／ｍｌ）を調製した。この懸濁液と牛乳を混合し全量１ｍｌとしたものを試料とした。これに２５％トリクロロ酢酸溶液０．５ｍｌを添加して、大腸菌の細胞破砕および牛乳の除タンパクを行った。５分間静置したのち、遠心分離（１００００×ｇ、５分）を行った。上清０．２ｍｌに水酸化ナトリウム溶液とｐＨ緩衝液を加えてｐＨ７付近に調整したのち、全量を２ｍｌとした。この溶液のＡＴＰ分析を行った。ただし、本例においては、工程１で実施例１の約２倍の反応時間が必要であった。これはトリクロロ酢酸による酵素阻害のためと推測される。【００９３】
実験結果は図23に示す。試料１、２、３でそれぞれ黄色、紫、紫色を呈した。ほぼ完全に細胞が破砕されたと仮定して、試料１および、２、３を用いたときのATP濃度を見積もると、それぞれ0、および、5×10-10 M、1×10-9 Mである。したがって、本例においてもATP濃度に応じた呈色が得られたと判断できる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】  本発明の方法は、細菌を含む様々な食品関連試料の検査に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】過酸化水素−鉄（ＩＩ）−ＸＯ系（左）および鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ系（右）の吸収スペクトル。過酸化水素−鉄（ＩＩ）−ＸＯ系：［ＸＯ］＝２×１０−５；［Ｆｅ２＋］＝４×１０−５；Ｈ２Ｏ２濃度（５８５ｎｍにおいて下から順に）：０、１×１０−６Ｍ、２×１０−６Ｍ、６×１０−６Ｍ、８×１０−６Ｍ、１×１０−５Ｍ、２×１０−５Ｍ、２．５×１０−５Ｍ、３×１０−５Ｍ、４×１０−５Ｍ、６×１０−５Ｍ、ｐＨ２．０．鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ系：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；Ｆｅ（ＩＩＩ）濃度０、４×１０−６Ｍ、６×１０−６Ｍ、１×１０−５Ｍ、１．５×１０−５Ｍ、２×１０−５Ｍ、２．５×１０−５Ｍ、３×１０−５Ｍ、４×１０−５Ｍ、ｐＨ２．０．
【図２】鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ系の色変化。鉄（ＩＩＩ）濃度（左から）：０、４×１０−６Ｍ、６×１０−６Ｍ、１×１０−５Ｍ、１．５×１０−５Ｍ、２×１０−５Ｍ、２．５×１０−５Ｍ、３×１０Ｍ−５Ｍ、４×１０−５Ｍ。
【図３】過酸化水素−ＸＯ−鉄（ＩＩ）系の色変化。過酸化水素濃度（左から）：０Ｍ、４．０×１０−６Ｍ、６．０×１０−６Ｍ、１．０×１０−５Ｍ、１．５×１０−５Ｍ、２．０×１０−５Ｍ、２．５×１０−５Ｍ、３．０×１０−５Ｍ、４．０×１０−５Ｍ、６．０×１０−５Ｍ。
【図４】各反応系の化学量論。［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；［Ｆｅ２＋］＝４×１０−５Ｍ；ｐＨ２．０．（●）過酸化水素−ＸＯ−鉄（ＩＩ）系、（○）鉄（ＩＩＩ）−ＸＯ系．
【図５】目視観察により決定したＸＯと境界過酸化水素の濃度関係。
【図６】吸光度により決定したＸＯと境界過酸化水素の濃度関係。
【図７】ＸＯ濃度と吸光度の関係。ｐＨ２．０．［Ｆｅ２＋］＝２×［ＸＯ］
【図８】各種過酸化水素濃度における吸光度の時間変化。［Ｆｅ２＋］＝４×１０−５Ｍ；［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；ｐＨ２．０．
【図９】反応構成物の存在下での鉄（ＩＩ）濃度と吸光度の関係。酵素反応：［Ｐｙｒｕｖａｔｅ］＝５×１０−４Ｍ；ＰＶＯＤ、３Ｕ／ｍｌ；ｐＨ５．８；５ｍｉｎ；２５℃．発色反応：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；ｐＨ２．０、２５℃；１５ｍｉｎ．［ＡＴＰ］＝５×１０−４Ｍ；［ＡＭＰ］＝１０μＭ；ＡＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；［ＡＣＥＳ］＝０．１５Ｍ；ＰＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；ｐＨ７．８．
【図１０】発色反応における吸光度の時間変化。工程１：［ＡＭＰ］＝１×１０−４Ｍ、［Ｐｙｒｕｖａｔｅ］＝５×１０−５Ｍ、ＡＫ１．９Ｕ／ｍｌ、ＰＫ１．９Ｕ／ｍｌ、［ＡＣＥＳ］＝０．１５Ｍ、［ＡＴＰ］０＝５×１０−５Ｍ、ｐＨ７．８．工程２：［ＰＶＯＤ］＝６．０Ｕｍｌ−１、５ｍｉｎ、２５℃、ｐＨ５．８。工程３：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ、［Ｆｅ２＋］＝２×１０−３Ｍ、２５℃、ｐＨ２．０、０−１２００ｓ
【図１１】ピルビン酸オキシダーゼによる酵素反応。工程１：［ＡＭＰ］＝１×１０−４Ｍ；［Ｐｙｒｕｖａｔｅ］、５．０×１０−５Ｍ；ＡＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；ＰＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；［ＡＣＥＳ］＝０．１５Ｍ；［ＡＴＰ］０＝５．０×１０−５Ｍ；ｐＨ７．８；５０ｍｉｎ。工程２：ＰＶＯＤ、６．０Ｕ／ｍｌ；０ｍｉｎ、２ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ５．８．工程３：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；［Ｆｅ２＋］＝２×１０−３Ｍ；２５℃；ｐＨ２．０；５ｍｉｎ．
【図１２】ＡＭＰをアピラーゼで処理しないときとしたときのＡＴＰの増幅曲線。右ＡＭＰをアピラーゼで処理しないとき工程１：［ＡＭＰ］＝１×１０−３Ｍ；［ＰＥＰ］＝５×１０−４Ｍ；ＡＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；ＰＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；［ＡＣＥＳ］＝０．１５Ｍ；ｐＨ７．８．［ＡＴＰ］０：○、０Ｍ；△、５×１０−８Ｍ；□、５×１０−７Ｍ．工程２：ＰＶＯＤ、６．０Ｕ／ｍｌ、５ｍｉｎ、２５℃、ｐＨ５．８．工程３：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；［Ｆｅ２＋］＝２×１０−３Ｍ；５ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ２．０．右ＡＭＰをアピラーゼで処理したとき工程１：［ＡＭＰ］＝５×１０−５Ｍ、［ＰＥＰ］＝５×１０−４Ｍ、ＡＫ、１．９Ｕ／ｍｌ、ＰＫ１．９Ｕ／ｍｌ、［ＡＣＥＳ］＝０．１５Ｍ、［ＡＴＰ］０＝０Ｍ、０−７５ｍｉｎ、ｐＨ７．８．［ＡＴＰ］０：○、０Ｍ；△、５×１０−８Ｍ；□、５×１０−７Ｍ．工程２：［ＰＶＯＤ］＝６．０Ｕ／ｍｌ、５ｍｉｎ、２５℃、ｐＨ５．８．工程３：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ、［Ｆｅ２＋］＝２×１０−３Ｍ、５ｍｉｎ、２５℃、ｐＨ２．０．
【図１３】増幅曲線のモデル。（１）、吸光度差（ΔＡ）；（２）、時間差（Δｔ）；（３）、反応時間ｔ１／２。
【図１４】吸光度差ΔＡとＡＭＰ濃度の関係。工程１：［ＡＴＰ］０＝５×１０−４Ｍ；［ＰＥＰ］＝５×１０−４Ｍ；ＡＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；ＰＫ１．９Ｕ／ｍｌ、［ＡＣＥＳ］＝０．１５Ｍ；［ＡＴＰ］０＝０Ｍ、５×１０−４Ｍ；０−７５ｍｉｎ；ｐＨ７．８．工程２：ＰＶＯＤ、６．０Ｕ／ｍｌ；５ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ５．８．工程３：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；［Ｆｅ２＋］＝２×１０−３Ｍ；５ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ２．０．
【図１５】時間差ΔｔとＡＭＰ濃度の関係。
【図１６】反応時間ｔ１／２とＡＭＰ濃度の関係。
【図１７】時間差ΔｔとＰＥＰ濃度の関係。工程１：［ＡＭＰ］＝５×１０−５Ｍ；ＡＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；ＰＫ１．９Ｕ／ｍｌ、［ＡＣＥＳ］＝０．１５Ｍ；［ＡＴＰ］０＝０Ｍ、５×１０−４Ｍ；０−７５ｍｉｎ；ｐＨ７．８．工程２：ＰＶＯＤ、６．０Ｕ／ｍｌ；５ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ５．８．工程３：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；［Ｆｅ２＋］＝２×１０−３Ｍ；５ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ２．０．
【図１８】実施例１で得られたＡＴＰの増幅曲線。工程１：［ＡＭＰ］＝５×１０−５Ｍ；［ＰＥＰ］＝５×１０−４Ｍ；ＡＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；ＰＫ１．９Ｕ／ｍｌ、［ＡＣＥＳ］＝０．１５Ｍ；［ＡＴＰ］０＝０Ｍ；０ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、７５ｍｉｎ；ｐＨ７．８．工程２：ＰＶＯＤ、６．０Ｕ／ｍｌ；５ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ５．５．工程３：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；［Ｆｅ２＋］＝２×１０−３Ｍ；５ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ２．０．
【図１９】各反応時間での０Ｍ（上）と５×１０−１０Ｍ（下）の発色。工程１：反応時間（左から右へ）：０ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、７５ｍｉｎ；ｐＨ７．８．［ＡＭＰ］＝５×１０−５Ｍ；［ＰＥＰ］＝５×１０−４Ｍ；ＡＫ、１．９Ｕ／ｍｌ；ＰＫ、１．９Ｕ／ｍｌ、［ＡＣＥＳ］＝０．１５Ｍ．工程２：ＰＶＯＤ、６．０Ｕ／ｍｌ；５ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ５．５．工程３：［ＸＯ］＝２×１０−５Ｍ；［Ｆｅ２＋］＝２×１０−３Ｍ；５ｍｉｎ；２５℃；ｐＨ２．０．
【図２０】異なるＡＴＰ濃度における反応時間と吸光度との関係を示す。
【図２１】ＡＴＰ濃度と過酸化水素濃度の関係を示す。
【図２２】大腸菌を添加したミネラルウォーター中のＡＴＰ分析結果。大腸菌濃度（上から順に）：試料１，０個／ｍｌ；試料２，５×１０５個／ｍｌ；試料３，１×１０６個／ｍｌ
【図２３】大腸菌を添加した牛乳中のＡＴＰ分析結果。大腸菌濃度（上から順に）：試料１，０個／ｍｌ；試料２，５×１０５個／ｍｌ；試料３，１×１０６個／ｍｌ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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