(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疲労回復のための経口投与用の医薬であって、アデノシン５'−三リン酸又は生理学的に許容されるその塩とビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、及びビタミンＢ12の組み合わせとを同時に投与するための組み合わせを含む医薬。
【請求項２】
アデノシン５'−三リン酸又は生理学的に許容されるその塩１重量部に対して、ビタミンＢ1を０．０００３〜２０重量部、ビタミンＢ2を０．０００５〜８重量部、ビタミンＢ6を０．００１〜２０重量部、及びビタミンＢ12を０．００００００３〜０．３重量部の割合で含む請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ビタミンＢ1がチアミンダイサルファイドであり、ビタミンＢ2がリボフラビンであり、ビタミンＢ6が塩酸ピリドキシンであり、ビタミンＢ12がシアノコバラミンである請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
疲労が、身体的負荷に伴う疲労である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肉体疲労及び／又は精神疲労に対して回復作用を有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疲労に悩まされる人口は増加の一途を辿っている。疲労は「身体的または精神的活動の結果として生じる機能的な能力の低下した一時的な状態」と定義されており、一般的には肉体疲労と精神疲労に分類される。これらの疲労はＱＯＬを低下させるのみならず、免疫力の低下などを引き起こして思わぬ疾患等に結びつくこともあることから、優れた疲労回復効果を有する医薬組成物の提供が待ち望まれている状況にある。【０００３】
肉体疲労は運動負荷などの肉体的負荷により直接的に引き起こされるものであり、その回復には十分な休息を要する。一方、精神疲労は、環境ストレス等により惹起される脳をはじめとする中枢神経系における酸化ストレスの蓄積が原因であることが示唆されており、また、酸化ストレスを解消する生体還元系の破綻が、慢性疲労症候群といった疲労の蔓延化を引き起こすことが明らかとなっている（非特許文献１）。精神疲労の回復には、酸化ストレスを軽減し、神経機能を正常な状態に維持することが必要であるとされている（非特許文献２）。【０００４】
vasoactive intestinal polypeptideは神経ペプチドの1つであり、中枢神経系において神経保護作用を有することが報告されている（非特許文献３）。また、このペプチドは酸化ストレスに対して防御的に作用することも報告されている（非特許文献４）。従って、vasoactive intestinal polypeptide遺伝子の発現を促進することにより、酸化ストレスが原因となる精神疲労に対する回復効果が期待できる。【０００５】
肉体疲労及び／又は精神疲労を含む疲労の症状の回復を目的とする医薬組成物としてビタミンＢ群を含有する医薬組成物が提供されている。このような医薬組成物は、肉体疲労、病中病後、食欲不振、栄養障害、又は発熱性消耗性疾患などにおける栄養補給、滋養強壮、及び虚弱体質の改善等を目的として開発されたものであり、より具体的には、末梢血管拡張剤であるヘプロニカートとビタミンＢ群とを含む疲労回復医薬組成物（特許文献１）や、低下した心拍出量の改善作用などを有するユビデカレノンとビタミンＢ1誘導体とを含む肉体疲労回復剤（特許文献２）が知られている。【０００６】
一方、アデノシン５'−三リン酸（以下、本明細書において「アデノシン三リン酸」と略す場合がある。）は高エネルギーリン酸結合を有する化合物であり、アデノシン５'−二リン酸（ＡＤＰ）とリン酸に加水分解される際に大量のエネルギーを放出する性質を有している。このような性質から、アデノシン三リン酸はリン酸供与体として糖質、脂肪、又は蛋白質などの代謝に広く関与しており、アデノシン三リン酸の加水分解反応により生じるエネルギーは生体におけるエネルギー要求性反応の推進力となっている。【０００７】
アデノシン三リン酸の医薬としての利用については、頭部外傷後遺症、心不全、調節性眼精疲労における調節機能の安定化、消化管機能低下のみられる慢性胃炎に対して腸溶錠又は顆粒として経口的に１回４０〜６０ｍｇを１日３回、又はメニエール病及び内耳障害に基づくめまいに対して１回１００ｍｇを１日３回投与する薬物療法が採用されている。しかしながら、アデノシン三リン酸の疲労回復作用については従来知られていない。また、アデノシン三リン酸とビタミンＢ1誘導体とを組み合わせた医薬が眼精疲労に対して治療効果を有することが知られている（特許文献３）。しかしながら、これらの刊行物のいずれにも、アデノシン三リン酸とビタミンＢ群とを組み合わせることにより疲労回復効果に対する相乗作用が奏されること、及びこれらの組み合わせがvasoactive intestinal polypeptide遺伝子の発現を促進して精神疲労に対して高い回復効果を発揮することは示唆ないし教示されていない。
【特許文献１】特開２００３−１１９１３９号公報
【特許文献２】特開平１０−２８７５６０号公報
【特許文献３】特開平１−３０８２３２号公報
【非特許文献１】疲労と未病−疲労の分子神経メカニズム，医学のあゆみ，１９８（３），２００１
【非特許文献２】酸化ストレスと脳の疲労，医学のあゆみ，２０４（５），２００３
【非特許文献３】Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ９（５），  ９２３−９２９，  ２００５
【非特許文献４】Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １５，  １３７−１４５，  ２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、肉体疲労及び／又は精神疲労に対して回復作用を有する医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、意外にも、アデノシン三リン酸と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを併用することにより顕著な疲労回復効果が認められること、及びそれらを単独で使用した場合に比べて相乗的な疲労回復効果を達成できることを見出した。さらに、アデノシン三リン酸と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを併用することによりvasoactive intestinal polypeptide遺伝子の発現が促進され、精神疲労に対する回復効果が得られることを見出した。本発明は上記の知見に基づいて完成された。【００１０】
すなわち、本発明により、疲労回復のための医薬であって、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを同時に又は時間を変えて投与するための組み合わせを含む医薬が提供される。本発明の好ましい態様によれば、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを含む医薬組成物の形態の上記医薬、及びアデノシン三リン酸の生理学的に許容される塩がアデノシン三リン酸二ナトリウムである上記医薬が提供される。【００１１】
本発明のさらに好ましい態様によれば、少なくとも２種以上のビタミンＢ類が、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、及びビタミンＢ12からなる群から選ばれる２種以上のビタミンＢ類である上記の医薬；ビタミンＢ1がチアミンダイサルファイド、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硝酸エステル塩、塩酸ジセチアミン、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、シコチアミン、ビスイブチアミン、ビスベンチアミン、フルスルチアミン、及びプロスルチアミンからなる群から選ばれる上記医薬；ビタミンＢ2がリボフラビン、リン酸リボフラビン、及びリボフラビンモノヌクレオチドからなる群から選ばれる上記医薬；ビタミンＢ6が塩酸ピリドキシン、燐酸ピリドキサール、及びピリドキサミンからなる群から選ばれる上記医薬；及びビタミンＢ12がシアノコバラミン、メチルコバラミン、ヒドロキソコバラミン、及びアデノシルコバラミンからなる群から選ばれる上記の医薬が提供される。【００１２】
本発明のより好ましい態様によれば、ビタミンＢ類としてビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、及びビタミンＢ12の組み合わせを含む上記の医薬；及びアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩１重量部に対して、ビタミンＢ1を０．０００３〜２０重量部、ビタミンＢ2を０．０００５〜８重量部、ビタミンＢ6を０．００１〜２０重量部、及びビタミンＢ12を０．００００００３〜０．３重量部の割合で含む上記の医薬が提供される。【００１３】
別の観点からは、上記の医薬の製造のためのアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩及び／又は少なくとも２種以上のビタミンＢ類の使用、並びに疲労回復方法であって、ヒトを含む哺乳類動物にアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩の有効量と少なくとも２種以上のビタミンＢ類の有効量とを同時に又は時間を変えて投与する工程を含む方法、及び疲労の予防及び／又は治療方法であって、ヒトを含む哺乳類動物にアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩の有効量と少なくとも２種以上のビタミンＢ類の有効量とを同時に又は時間を変えて投与する工程を含む方法が提供される。【００１４】
さらに、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを同時に又は時間を変えて投与するための組合せを含むvasoactive intestinal polypeptide遺伝子発現促進剤、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを同時に又は時間を変えて投与するための組合せを含む酸化ストレス低減剤、ヒトを含む哺乳類動物の生体内においてvasoactive intestinal polypeptide遺伝子の発現を促進する方法であって、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩の有効量と少なくとも２種以上のビタミンＢ類の有効量とを同時に又は時間を変えて投与する工程を含む方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の医薬は、疲労回復のための医薬であって、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを同時に又は時間を変えて投与するための組み合わせを含むことを特徴としている。本発明の医薬は、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩を含む単位投与形態の製剤と、少なくとも２種以上のビタミン類をそれぞれ又は一緒に含む単位投与形態の製剤との組み合わせとして提供されるか、あるいはアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミン類とを一緒に含む単位投与形態の医薬組成物として提供される。アデノシン三リン酸と少なくとも２種以上のビタミン類とを一緒に含む単位投与形態の医薬組成物として提供されることがより好ましい。【００１６】
本発明の医薬に用いられるアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩は公知の物質であり、当業者が容易に入手可能である。アデノシン三リン酸の生理学的に許容される塩の種類は特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩若しくはカリウム塩等のアルカリ金属塩、又はマグネシウム塩若しくはカルシウム塩等のアルカリ土類金属塩が挙げられる。これらのうち、アデノシン三リン酸二ナトリウムが特に好ましい。アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩を含む製剤はすでに経口投与形態の製剤又は注射剤として提供されているので、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩を単独で含む製剤を用いて本発明の組み合わせ医薬を提供する場合には、市販のアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩の製剤を用いてもよい（例えば、「アデホス」興和株式会社、「ＡＴＰ」第一製薬株式会社、協和発酵工業株式会社などが市販されている）。【００１７】
本発明の医薬に用いられるビタミンＢ類としては、例えば、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、又はビタミンＢ12などを挙げることができるが、本発明の医薬は少なくとも２種以上の異なるビタミンＢ類（例えばビタミンＢ1及びビタミンＢ2など）を含む必要がある。ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、及びビタミンＢ12からなる群から選ばれる少なくとも２種以上のビタミンＢ類を含むことが好ましく、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、及びビタミンＢ12からなる群から選ばれる少なくとも３種以上のビタミンＢ類を含むことがさらに好ましく、特に好ましいのはビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、及びビタミンＢ12を全てを含む場合である。上記に説明したようにアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩を単独で含む製剤を用いて本発明の組み合わせ医薬を提供する場合には、ビタミンＢ類を含む製剤として、少なくとも２種以上のビタミンＢ類を１つの投与単位に含む製剤を用いてもよく、あるいは少なくとも２種以上のビタミンＢ類のそれぞれを単独で又は組み合わせて含む２種以上の製剤を用いてもよい。【００１８】
ビタミンＢ1としては、ビタミンＢ1の他に、ビタミンＢ1誘導体や生理学的に許容されるそれらの塩を用いてもよい。例えば、チアミンダイサルファイド、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硝酸エステル塩、塩酸ジセチアミン、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、シコチアミン、ビスイブチアミン、ビスベンチアミン、フルスルチアミン、又はプロスルチアミンなどが挙げられる。これらを２種以上組み合わせてビタミンＢ1として用いてもよい。これらのうち、チアミンダイサルファイドが特に好ましい。
ビタミンＢ2としては、ビタミンＢ2の他に、ビタミンＢ2の誘導体や生理学的に許容されるそれらの塩を用いてもよい。例えば、リボフラビン、リン酸リボフラビン、又はリボフラビンモノヌクレオチドなどが挙げられる。これらを２種以上組み合わせてビタミンＢ2として用いてもよい。これらのうち、リボフラビンが特に好ましい。【００１９】
ビタミンＢ6としては、ビタミンＢ6の他に、ビタミンＢ6の誘導体や生理学的に許容されるそれらの塩を用いてもよい。例えば、塩酸ピリドキシン、燐酸ピリドキサール、又はピリドキサミンなどが挙げられる。これらを２種以上組み合わせてビタミンＢ6として用いてもよい。これらのうち、塩酸ピリドキシンが特に好ましい。
ビタミンＢ12としては、ビタミンＢ12の他に、ビタミンＢ12の誘導体や生理学的に許容されるそれらの塩を用いてもよい。例えば、シアノコバラミン、メチルコバラミン、ヒドロキソコバラミン、又はアデノシルコバラミンなどが挙げられる。これらを２種以上組み合わせて用いてもよい。これらのうち、シアノコバラミンが特に好ましい。【００２０】
本発明の医薬におけるアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類との組み合わせ比率は特に限定されず、そのような比率は本明細書の実施例に具体的に示した試験方法により当業者が適宜選択可能である。例えば、アデノシン三リン酸１重量部に対して、少なくとも２種以上のビタミン類の合計が０．００１〜５０重量部程度の範囲から選択することができるが、この範囲に限定されることはない。より好ましくは、アデノシン三リン酸１重量部に対して、ビタミンＢ1を０．０００３〜２０重量部程度、ビタミンＢ2を０．０００５〜８重量部程度、ビタミンＢ6を０．００１〜２０重量部程度、及びビタミンＢ12を０．００００００３〜０．３重量部程度の範囲で用いることが好ましく、特に好ましいのは、ビタミンＢ類としてビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、及びビタミンＢ12の４種類を用いて、アデノシン三リン酸１重量部に対して、ビタミンＢ1を０．００３〜２重量部程度、ビタミンＢ2を０．００５〜０．８重量部程度、ビタミンＢ6を０．０１〜２重量部程度、及びビタミンＢ12を０．０００００３〜０．０３重量部程度の範囲とする場合である。【００２１】
本発明の医薬は、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。医薬組成物としては、経口投与に適する医薬組成物又は非経口投与に適する医薬組成物のどちらであってもよい。好ましくは経口投与に適する医薬組成物として提供することができる。また、経口投与に適する医薬組成物は、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを１つの単位投与形態に含む固体状、半固体状、又は液状の医薬組成物として提供されることがより好ましい。【００２２】
医薬組成物の調製には、必要に応じて、当業界で通常用いられる製剤用添加物を１種又は２種以上用いてもよい。製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤等を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
賦形剤としては、乳糖、デンプン類、結晶セルロース、蔗糖、マンニトール、又は軽質無水ケイ酸等が挙げられる。結合剤としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、又はプルラン等が挙げられる。崩壊剤としては、カルメロース、カルメロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、トウモロコシ澱粉、又は低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム又はタルク等が挙げられる。着色剤としては、タール色素又は三二酸化鉄等が挙げられる。矯味剤としてはステビア、アスパルテーム、又は香料等が挙げられる。【００２３】
本発明の医薬をアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを含む経口投与可能な医薬組成物として提供するにあたり、医薬組成物の形態は特に限定されない。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、チュアブル錠、フィルムコーティング錠、糖衣錠、ドリンク剤などの溶液剤、軟カプセル剤、硬カプセル剤、又はゼリー剤等の医薬組成物として調製することができ、これらのうち錠剤、チュアブル錠、フィルムコーティング錠、又は糖衣錠の形態の医薬組成物が特に好ましい。【００２４】
本発明の医薬の投与量は特に限定されず、医薬の形態、適用すべき疲労症状の程度、又は患者の年齢等の種々の条件に応じて適宜選択可能である。通常の場合、成人に対してアデノシン三リン酸を６〜３０００ｍｇ／日程度、特に２０〜３００ｍｇ／日程度を投与すればよく、上記のアデノシン三リン酸の投与量に応じて上述した割合により少なくとも２種類のビタミンＢ類の投与量を決定することができる。本発明の医薬の投与方法は特に限定されず、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを同時に又は時間を変えて投与することができるが、好ましくはアデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを同時に投与することが好ましい。アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩と少なくとも２種以上のビタミンＢ類とを時間を変えて投与する場合には、先に投与した有効成分の血中濃度が低下しない時間内に他の有効成分を投与することが望ましい。【００２５】
本発明の医薬は、運動負荷等の身体的負荷に伴う疲労などの肉体疲労、又は環境ストレス等の精神的負荷、酸化ストレスにより惹起される疲労などの精神疲労のいずれに対しても適用可能である。本発明の医薬は、肉体疲労及び／又は精神疲労に対して優れた回復作用を有しており、肉体疲労及び／又は精神疲労に対して優れた予防及び／又は治療効果を発揮することができる。また、その疲労回復作用に基づいて、次の諸症状の緩和：神経痛、筋肉痛、背中の痛み、関節痛（腰痛、肩こり、五十肩など）、手足のしびれ、若しくは関節炎、又は次の不定愁訴：どうき、しびれ、むくみ、めまい、若しくは全身倦怠、あるいは病中病後、食欲不振、栄養障害、若しくは発熱性消耗性疾患などの栄養補給、滋養強壮、又は虚弱体質の改善などの作用を発揮することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
製剤例１
３錠中に以下の成分及び分量を含む錠剤を通常の打錠法により調製した。
アデノシン三リン酸二ナトリウム        ６０．０ｍｇ
チアミンダイサルファイド              ２４．０ｍｇ
リボフラビン                            １．５ｍｇ
塩酸ピリドキシン                      ２４．０ｍｇ
シアノコバラミン                          ６０μｇ
乳糖                                ３０１．５ｍｇ
低置換度ヒドロキシプロピルセルロース  ２２．５ｍｇ
ポリビニルピロリドンＫ３０            １３．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                ３．０ｍｇ
合計        ４５０．０ｍｇ（１５０．０ｍｇ／錠）【００２７】
製剤例２
１日量中
アデノシン三リン酸二ナトリウム                  ６０．０ｍｇ
硝酸チアミン                                    １０．０ｍｇ
リボフラビン                                      ４．０ｍｇ
塩酸ピリドキシン                                １０．０ｍｇ
コハク酸ｄｌ‐α‐トコフェロールカルシウム      ２０．７ｍｇ
アスコルビン酸ナトリウム                      １１２．６ｍｇ
ニコチン酸アミド                                ２５．０ｍｇ
エゾウコギ乾燥エキス（原生薬換算量３００ｍｇ）  １２．０ｍｇ
オウギ乾燥エキス（原生薬換算量２４０ｍｇ）      ３０．０ｍｇ
塩酸アルギニン                                  ５０．０ｍｇ
無水カフェイン                                  ５０．０ｍｇ
硬化油                                          ３０．０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                    ２４．０ｍｇ
結晶セルロース                                １２５．７ｍｇ
カルメロース                                    ３０．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ６．０ｍｇ
合計                                          ６００．０ｍｇ【００２８】
アデノシン三リン酸二ナトリウム４５０ｇ、硝酸チアミン７５ｇ、リボフラビン３０ｇ、塩酸ピリドキシン７５g、コハク酸ｄｌ‐α‐トコフェロールカルシウム１５５．２５ｇ、アスコルビン酸ナトリウム８４４．５ｇ、ニコチン酸アミド１８７．５ｇ、エゾウコギ乾燥エキス９０ｇ、オウギ乾燥エキス２２５ｇ、塩酸アルギニン３７５ｇ、無水カフェイン３７５ｇ、硬化油２２５ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース１８０ｇ、結晶セルロース９４２．７５ｇ、カルメロース２２５ｇを高速攪拌造粒機（パウレック：ＦＭ−ＶＧ−２５型）に投入して混合後、エタノール６００ｇを加えて練合した。この練合物を流動層乾燥機（フロイント産業：ＮＦＬＯ−５型）を用いて乾燥後、整粒機（岡田精工：ＮＤ−１０Ｓ型）を用いて整粒した。この整粒物４４５５ｇ、ステアリン酸マグネシウム４５ｇを混合機（コトブキ技研工業：ＰＭ−５０）に投入して混合後、直径８ｍｍ、曲率半径１０ｍｍの杵を取り付けた打錠機（畑鉄工所：ＨＴ−ＡＰ１８ＳＳ型）で１錠２００ｍｇの錠剤を得た。【００２９】
製剤例３
１日量中
アデノシン三リン酸二ナトリウム                  １２０．０ｍｇ
ベンフォチアミン                                １３８．３ｍｇ
リボフラビン                                      １２．０ｍｇ
塩酸ピリドキシン                                  ５０．０ｍｇ
シアノコバラミン                                      ６０μｇ
ガンマ−オリザノール                              １０．０ｍｇ
コハク酸ｄｌ‐α‐トコフェロールカルシウム      １０３．６ｍｇ
Ｄ−マンニトール                                １０６．０ｍｇ
結晶セルロース                                  １２０．１ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                      ３７．５ｍｇ
カルメロースカルシウム                            ４５．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                            ７．５ｍｇ
合計                                            ７５０．０ｍｇ【００３０】
アデノシン三リン酸二ナトリウム７２０ｇ、ベンフォチアミン８２９．８ｇ、リボフラビン７２ｇ、塩酸ピリドキシン３００ｇ、ガンマ−オリザノール６０ｇ、コハク酸ｄｌ‐α‐トコフェロールカルシウム６２１．６ｇ、Ｄ−マンニトール６３６ｇ、結晶セルロース７２０．６ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース２２５ｇ、カルメロースカルシウム２７０ｇを高速攪拌造粒機（パウレック：ＦＭ−ＶＧ−２５型）に投入して混合後、予めシアノコバラミン３６０ｍｇを溶解したエタノール５００ｇを加えて練合し、更に整粒機（岡田精工：ＮＤ−１０Ｓ型）を用いて破砕造粒した。この造粒物を流動層乾燥機（フロイント産業：ＮＦＬＯ−５型）を用いて乾燥後、整粒機（岡田精工：ＮＤ−１０Ｓ型）を用いて整粒した。この整粒物４４５５ｇ、ステアリン酸マグネシウム４５ｇを混合機（朝日工業：Ｂ２／１０９型）に投入して混合後、直径８．５ｍｍ、曲率半径１２ｍｍの杵を取り付けた打錠機（畑鉄工所：ＨＴ−ＡＰ１８ＳＳ型）で１錠２５０ｍｇの錠剤を得た。【００３１】
製剤例４
１日量中
アデノシン三リン酸二ナトリウム                    １２０．０ｍｇ
塩酸フルスルチアミン                              １００．０ｍｇ
塩酸ピリドキシン                                  １００．０ｍｇ
シアノコバラミン                                    １５００μｇ
ガンマ−オリザノール                                １０．０ｍｇ
コハク酸ｄｌ‐α‐トコフェロールカルシウム        １０３．６ｍｇ
パントテン酸カルシウム                              ３０．０ｍｇ
硬化油                                              ６０．０ｍｇ
結晶セルロース                                    １８１．１ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                        ３２．４ｍｇ
カルメロース                                        ６４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                              ６．６ｍｇ
合計                                              ８１０．０ｍｇ【００３２】
アデノシン三リン酸二ナトリウム７２０ｇ、塩酸フルスルチアミン６００．０ｇ、塩酸ピリドキシン６００g、ガンマ−オリザノール６０ｇ、コハク酸ｄｌ‐α‐トコフェロールカルシウム６２１．６ｇ、パントテン酸カルシウム１８０ｇ、硬化油３６０ｇ、結晶セルロース１０８６．６ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース１９４．４ｇ、カルメロース３８８．８ｇを高速攪拌造粒機（パウレック：ＦＭ−ＶＧ−２５型）に投入して混合後、予めシアノコバラミン９ｇを溶解したエタノール６００ｇを加えて練合し、更に整粒機（岡田精工：ＮＤ−１０Ｓ型）を用いて破砕造粒した。この造粒物を流動層乾燥機（フロイント産業：ＮＦＬＯ−５型）を用いて乾燥後、整粒機（岡田精工：ＮＤ−１０Ｓ型）を用いて整粒した。この整粒物４８２０．４ｇ、ステアリン酸マグネシウム３９．６ｇを混合機（朝日工業：Ｂ２／１０９型）に投入して混合後、直径８．５ｍｍ、曲率半径１４ｍｍ及び４ｍｍの杵を取り付けた打錠機（畑鉄工所：ＨＴ−ＡＰ１８ＳＳ型）で１錠２７０ｍｇの錠剤を得た。【００３３】
試験例１
下記の方法に従って運動負荷実験を行った。
＜試験方法＞
５週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系雄性マウスを、３４℃に維持した水を７Ｌ／分の速度で循環させた水槽内に入れ、水中に連続して７秒間沈むまで運動負荷した。続いて被験物質を動物に経口投与して３０分間休息させた後、再び運動負荷を行い、水中に連続して７秒間沈むまでの時間（最大遊泳時間。以下同じ。）を測定した。
被験物質としては、アデノシン三リン酸二ナトリウム（以下、実施例において「ＡＴＰ」と略す。）６０ｍｇ、ビタミンＢ類（以下、実施例において「ＶＢｓ」と略す、）としてチアミンダイサルファイド２４ｍｇ、リボフラビン１．５ｍｇ、塩酸ピリドキシン２４ｍｇ、及びシアノコバラミン６０μｇの組み合わせ、ＡＴＰとＶＢｓとの組み合わせ（以下、実施例において「ＡＴＰ+ＶＢｓ」と略す）を用い、これらを０．５％メチルセルロース（以下、実施例において「ＭＣ」と略す。）に懸濁又は溶解して試験に供した。【００３４】
＜実験結果＞
結果を表１に示した。
【表１】
0005032310.tif 000002
【００３５】
ＭＣを投与したコントロール群との比較において、ＡＴＰ又はＶＢｓの単独投与群では最大遊泳時間の延長は認められなかったが、本発明の医薬の投与群（ＡＴＰ＋ＶＢｓ）においては顕著な最大遊泳時間の延長が認められた。コントロールに対して最大遊泳時間の延長の割合は、ＡＴＰ投与群において１．１４、ＶＢｓ投与群において０．９５であり、それらの積（１．０８）はＡＴＰ＋ＶＢｓの２．１８より小さく、バルジの方法により本発明の医薬に含まれるＡＴＰ及びＶＢｓは相乗効果を発揮していると判定された。上記の結果より、本発明の医薬は、運動負荷に伴う肉体疲労及び水中環境における環境ストレスにより惹起される精神疲労に対して、ＡＴＰ及びＶＢｓの組み合わせによる相乗的な疲労回復効果を有することが明らかとなった。【００３６】
試験例２
酸化ストレスを負荷する遊泳モデル（Basic and Cli. Pharmacol. Toxicol., 97, pp.218-221, 2005、Gen. Physiol. Biophys., 23, pp.241-249, 2004）を用いて、下記方法により、精神疲労に対する本発明の医薬の効果をマイクロアレイを用いて検証した。
(a)ストレス負荷マウスの作製及び脳の採取
予め水温３４℃に調整された温水を７Ｌ／minの流速で循環させた水槽内にBALB/cマウス（雄、５週齢（投与時））を投入し、水中に７秒間沈むまで遊泳させて負荷を与えると共に最大遊泳時間を測定した。遊泳終了直後に被験物質または対照物質を経口投与して３０分間休息させ、再度水槽内にマウスを投入した。最大遊泳時間の５０％に相当する時間、マウスを遊泳させた後、水槽より引き上げた。炭酸ガスで気絶させた後に断頭放血後、脳（中央部約５ｍｍ角）の採取を行った。【００３７】
被験物質としては、マウスの体重あたりアデノシン三リン酸二ナトリウム６０ｍｇ／ｋｇ、ビタミンＢ類としてチアミンダイサルファイド２４ｍｇ／ｋｇ、リボフラビン１．５ｍｇ／ｋｇ、塩酸ピリドキシン２４ｍｇ／ｋｇ、及びシアノコバラミン６０μｇ／ｋｇの組み合わせ（以下、実施例において「ＡＴＰ＋ＶＢｓ」と略す。）を用い、これを０．５％メチルセルロースに懸濁又は溶解して経口投与した。対照物質として０．５％メチルセルロース（以下、実施例において「ＭＣ」と略す。）を投与した。また、流速は流速計を用いて一定となるように調整した。【００３８】
(b)Total RNAの抽出並びに蛍光標識
Total RNAの抽出にはRNeasy Lipid Tissue Mini kit (QIAGEN社製)を用いた。すなわち、採取した組織をチューブに入れ、QIAzol Lysis Reagentを２００ μｌ添加し、ホモジナイザー（２２６AXG、有限会社アイ．エス．オー）を用いて破砕後、QIAzol Lysis Reagentを８００ μｌ添加して混合した。室温で５分間静置した後、クロロホルムを２００μｌ添加して１５秒間激しく攪拌し、室温で２分間静置した後、１２０００ rpm（１２０００×g）、４℃、１５分（Kendro，SORVALL fresco、以下、本試験例における遠心分離はすべて同機器を使用）の条件で遠心分離し、３層のうち上層を回収した。回収したサンプルに７０%エタノールを６００μｌ添加し、激しく攪拌することにより完全に混合した。混合液を、コレクションチューブをセットしたRNeasy カラム（以下カラムとする）に添加し、１２０００ rpm（１２０００×g）、２０℃、１５秒の条件で遠心分離した。混合液を通したカラムにBuffer RW１を７００μｌ添加し、チューブのふたを閉めて１２０００ rpm（１２０００×g）、２０℃、１５秒の条件で遠心分離した。カラムを新しいコレクションチューブに移し、Buffer RPEを５００ μｌ添加した。チューブのふたを閉めて１２０００ rpm（１２０００×g）、２０℃、１５秒の条件で遠心分離した。再度Buffer RPEを５００μｌ添加し、チューブのふたを閉めて１２０００ rpm（１２０００×g）、２０℃、２分の条件で遠心分離した。カラム内のメンブレンが乾燥していること確認した後、カラムを１．５ mLマイクロチューブに移し、RNaseフリー水を３０μL添加した。１分間静置した後、１２０００ rpm（１２０００×g）、２０℃、１分の条件で遠心分離することによりtotal RNAを溶出した。本溶出操作はカラムあたり２回行った。得られたtotal RNAサンプルについて、NanoDrop（ND-１０００、NanoDrop社製）を用いて濃度測定を行った。total RNA濃度は波長２６０ｎｍ（以下A２６０とする）の吸光度を基に下記の式で算出した。
total RNA濃度（ｎｇ/μｌ）=（各サンプルのＡ２６０−対照のＡ２６０）×４０【００３９】
得られたtotal RNAのうち、遊泳負荷を与えていない無処置の群については１例を、ＡＴＰ＋ＶＢｓ投与群、及びＭＣ投与群についてはそれぞれ２例を解析に使用した。各動物から得られたtotal RNA ４００ ｎｇを用いて、Low RNA Input リニア増幅＆ラベル化キット（Agilent社製）によるラベリングを行った。すなわち、total RNAを４００ｎｇ、T７ promoter プライマーを１．２μｌ、Nuclease-free waterを混合して合計１１．５μｌとした後、６５℃で１０分間インキュベーションし、５分間氷冷後、予め６５℃で加温した５×First strand bufferを４μｌ、０．１ M DTTを２μｌ、１０ ｍＭ dNTP mixを１μｌ、MMLV-RTを１μｌ、RNaseOUTを０．５μｌ添加して４０℃で２時間インキュベートした。６５℃で１０分間インキュベートすることにより反応を停止した後、５分間氷冷した。氷冷後、Nuclease-free waterを１５．３μｌ、４×Transcription bufferを２０μｌ、０．１M DTTを６μｌ、NTP mixを８μｌ、予め４０℃で加温した５０％ PEGを６．４μｌ、RNaseOUTを０．５μｌ、Inorganic pyrophosphataseを０．６ μｌ、T７ RNA polymeraseを０．８μｌ添加し、混合した。混合後、無処置の群のサンプルについてはCyanine-３-CTP(以下Cy３) を、ＡＴＰ＋ＶＢｓ投与群、ＭＣ投与群のサンプルについてはCyanine-５-CTP(以下Cy５)をそれぞれ２．４μｌ添加し、４０℃で２時間、遮光下でインキュベートした。反応終了後、RNeasy mini kit（QIAGEN社製）を用いて反応物（以下ラベル化cRNAとする）の精製を行った。すなわち、サンプルにBuffer RLTを３５０μｌ、１００％ エタノールを２５０ μｌ添加し、混合後カラムに供し、１００００×g、３０秒の条件で遠心分離した。カラムにRPE bufferを５００ μｌ添加し１００００×g、３０秒の条件で遠心分離することでカラムを洗浄した。本洗浄操作は２回行った。RNase-free waterを３０μｌ添加し、１分間静置した後１００００×g、３０秒の条件で遠心分離することによりラベル化cRNAを溶出した。本溶出操作は２回行った。【００４０】
(c)ハイブリダイゼーション及び解析
得られたラベル化cRNAを用いて、In situ hybridization kit plus（Agilent社製）によるmouse microarray oligo(以下マウスオリゴ)とのハイブリダイゼーションを行った。すなわち、Cy３ ラベル化cRNA ０．７５μｇ相当とCy５ラベル化cRNA ０．７５μｇ相当、１０×コントロールターゲットを５０μｌとNuclease-free waterを混合して合計２１５μｌ（以降、２×ターゲットソリューションとする）とし、２×ターゲットソリューションを２１５μｌ、２５×フラグメンテーションバッファを９μｌ添加し、６０℃で３０分間、遮光下でインキュベートした。２×ハイブリダイゼーションバッファを２２５μｌ添加して反応停止させた後、マイクロアレイ用チャンバー内でマウスオリゴにアプライし、６０℃で１７時間ハイブリダイゼーションを行った。反応終了後、マウスオリゴを０．００５％ TritonX-１０２含有６×SSC並びに０．００５％ TritonX-１０２含有０.１×SSCで洗浄し、窒素ガスで乾燥させた。乾燥したマウスオリゴをマイクロアレイスキャナー（Agilent社製）に供して画像を取り込んだ後、画像化ソフトFeature Extractionを用いてスポットの画像化並びにシグナル強度の数値化を行った。得られた数値について、Microsoft EXCEL並びにGeneSpring（Silicon Genetics社製）にて解析を行った。【００４１】
＜試験結果及び考察＞
マウスオリゴに搭載されているプローブのうち、コントロールプローブ並びにノイズにより測定値の信頼性が低いプローブを除去し、残りの約２００００遺伝子について解析を行った。無処置の群とＭＣ投与群の比較から、ストレス負荷により発現量が２倍以上増加した遺伝子が２７遺伝子、逆に発現量が１／２以下に減少した遺伝子が６８遺伝子確認された。また、無処置の群とＡＴＰ＋ＶＢｓ投与群の比較から、ＡＴＰ＋ＶＢｓの投与後、ストレス負荷を行ったことにより発現量が２倍以上に増加した遺伝子が６９遺伝子、逆に発現量が１／２以下に減少した遺伝子が１１２遺伝子確認された。これらのうち、ストレス負荷時並びにＡＴＰ＋ＶＢｓ投与後ストレス負荷時に発現量が２倍以上増加した遺伝子にvasoactive intestinal polypeptide遺伝子が含まれていた。各群におけるvasoactive intestinal polypeptide遺伝子のシグナル値、及び、ＭＣ投与群とＡＴＰ＋ＶＢｓ投与群のシグナル値の、無処置の群のシグナル値に対する比率（対control比）を表２に示す。【００４２】
【表２】
0005032310.tif 000003
【００４３】
vasoactive intestinal polypeptide遺伝子の発現増加割合は、無処置の群の発現量を１とした場合、ＭＣ投与群で２．０４、ＡＴＰ＋ＶＢｓ投与群で４．６１であり、ＭＣ投与群と比較して、ＡＴＰ＋ＶＢｓ投与群においてその発現量の顕著な増加が認められた。このことから、ＡＴＰ＋ＶＢｓの投与により、酸化ストレスに対して防御的に作用するvasoactive intestinal polypeptide遺伝子の発現が促進されることが明らかとなり、本発明の医薬は、vasoactive intestinal polypeptide遺伝子の発現を促進すること、及びこれにより酸化ストレスに起因する精神疲労に対して回復効果を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の医薬は、アデノシン三リン酸又は生理学的に許容されるその塩及び少なくとも２種以上のビタミンＢ類の相乗作用により極めて優れた疲労回復作用を有している。また、本発明の医薬は、vasoactive intestinal polypeptide遺伝子の発現を促進する作用を有している。従って、肉体疲労及び／又は精神疲労に対して優れた回復作用を発揮できる。