(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質であるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）を有効成分として含む、かつ、ＦＧＦＲ３異常を有しない低身長症患者に該有効成分の血中濃度を上昇させるように投与し、それによって該患者の身長を増加させることを特徴とする、低身長症患者の身長増加用組成物。
【請求項２】
前記身長増加が軟骨性骨の伸長である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び／又は尺骨の伸長である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＣＮＰが配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＣＮＰが、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）を活性化する物質を有効成分として含む身長増加用組成物に関する。具体的には、本発明の組成物は、ＦＧＦＲ３異常を有しない、低身長症患者に対する治療用途又は低身長症患者以外の個体での伸長用途に使用しうる。
本発明はまた、ＧＣ−Ｂを活性化することによる身長増加方法に関する。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標とした身長増加剤のスクリーニング方法に関する。本発明はさらにＧＣ−Ｂを活性化することによりＦＧＦＲ３異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法に関する。
【背景技術】  医学的な低身長症とは、「同性、同年齢の身長の平均値より−２ＳＤ（ＳＤ：標準偏差）以下」と定義され、この基準に該当する場合に低身長症として診断されている。そして低身長症には、成長ホルモンやインシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）分泌不全などに伴う内分泌性低身長症と、家族性低身長、胎内発育不全性低身長、染色体異常などの非内分泌性低身長症、さらに薬物治療や放射線療法による二次性低身長症に大別される。
従来、低身長症の治療として成長ホルモンの投与や、股関節の人工関節置換や脚延長術などの整形外科手術が行われてきた。脚延長術は、１０歳以降に骨を切って特殊な機械（脚延長器）により、半年くらいかけて徐々に身長を伸ばすが、この手術は患者に大きな苦痛を与える。また成長ホルモン療法は幼児期からの定期的な成長ホルモン注射により身長の伸びは改善するが、注射を止めると伸びは止まってしまう。これらのいずれの治療法も病気を治すものではなく、患者のＱＯＬの観点からも理想的ではないと考えられている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９７；７２：７１−７６）；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９９８；１３８：２７５−２８０（非特許文献２））。低身長症のうち内分泌性低身長症は遺伝子組み替え成長ホルモンやＩＧＦ−Ｉなどの薬剤での治療が可能な疾患であるが、非内分泌性低身長症である家族性低身長症、胎内発育不全性低身長症の原因は明らかではなく、成長ホルモンは非内分泌性低身長症には効果が認められていないことから、有効な治療薬は存在しなかった（メルクマニュアル第１７版１９９９年  日経ＢＰ社／日経ＢＰ出版センター）。これらの状況から新しい機序に基づく治療薬の開発が望まれてきた。
グアニルシクラーゼ（ＧＣ）は、ＧＴＰからセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰの合成を触媒する酵素ファミリーに属する膜蛋白質であり、ＧＣ−Ａ，ＧＣ−Ｂ，…，ＧＣ−Ｆが知られている。ＧＣ−Ｂは主に血管内皮細胞に見出され、平滑筋の弛緩に関与すると考えられている。
ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）類は、ＡＮＰ（心房性ナトリウムペプチド）、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）およびＣＮＰ（Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド）の３種類からなり、２種類のグアニリルシクラーゼ共役受容体（ＡＮＰおよびＢＮＰに対するＮＰＲ−Ａ、ＣＮＰに対するＮＰＲ−Ｂ）を介して細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させ、さらに複数のｃＧＭＰエフェクター分子の仲介によって細胞内シグナル伝達が行われると考えられている（Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９１；６０：２２９−２５５）。ＮＰ類は、体液の恒常性の制御や血圧の調節に重要な役割を果たすと報告されているが（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８７；９３：１９１１−１９２１，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；８７：１４０２−１４１２）、心臓血管系以外の様々な組織での発現とその生理活性も知られている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９１；１２９：１１０４−１１０６，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９１；６０：５５３−５７５）。軟骨に関しては、ＢＮＰ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８；９５：２３３７−２３４２）またはＣＮＰの関節部位における過剰発現が、繊維芽細胞増殖因子レセプター３（ＦＧＦＲ３）遺伝子の変異に起因する軟骨無形成症の治療に有効であることが報告されている（Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４；１０（１）：８０−８６；特開２００３−１１３１１６公報）。
本発明の目的は、ＦＧＦＲ３異常を有しない、低身長症患者又は低身長症患者以外の個体において治療又は美容等のために身長を増加させるための組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、ＧＣ−Ｂを活性化することにより、ＦＧＦＲ３異常を有しない、低身長症患者又は低身長症患者以外の個体の身長を増加させる方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ＧＣ−Ｂの活性を指標として身長増加剤をスクリーニングする方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的はＧＣ−Ｂを活性化することによりＦＧＦＲ３異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法に関することである。
発明の概要
本発明者らは、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質の１種であるＣ型ナトリウム利尿性ペプチド（ＣＮＰ）が全身で発現し、血中濃度が上昇するＣＮＰトランスジェニックマウスを作製し、身長への影響および成長軟骨への影響を検証した結果、ＣＮＰトランスジェニックマウスでは、身長増加が促進されていることおよび大腿骨成長軟骨が有意に肥厚していること、また、これらのＣＮＰトランスジェニックマウスの性状解析から、ＦＧＦＲ３異常を有しない場合においてＣＮＰが血行性に作用することで身長増加が促進されることを見出した。
したがって、本発明は、下記の発明からなる。
本発明は、第１の態様において、ＧＣ−Ｂを活性化する物質を有効成分として含む、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記組成物がＦＧＦＲ３異常を有しない低身長症患者に使用される。
本発明の別の実施態様において、上記組成物がＦＧＦＲ３異常を有しない低身長症患者以外の個体に使用される。
本発明の別の実施態様において、上記身長増加が軟骨性骨の伸長である。
本発明の別の実施態様において、上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び／又は尺骨の伸長である。
本発明の別の実施態様において、上記物質がペプチドである。
本発明の別の実施態様において、上記ペプチドがＣＮＰ又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明は、第２の態様において、ＧＣ−Ｂを活性化することによって、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記身長増加が軟骨性骨の伸長である。
本発明の別の実施態様において、上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び／又は尺骨の伸長である。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明は、第３の態様において、ＧＣ−Ｂの活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂの活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される。
本発明の別の実施態様において、上記方法が、ヒトＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を被験物質の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、該被験物質の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂを活性化することによりＦＧＦＲ３異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法を提供する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−１０７８７１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＣＮＰトランスジェニックマウス作製用ベクターの構築を示す。図１Ａ：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに組み込まれたマウスＣＮＰのｃＤＮＡをＰｓｔＩで切り出し両末端を平滑化した。図１Ｂ：ｐＳＧ１をＥｃｏ  ＲＩで処理して断端を平滑化した。図１Ｃ：図１Ａで得られたマウスＣＮＰのｃＤＮＡを図１Ｂで得られたｐＳＧ１に組み込んだ。
図２は、インジェクション用ＤＮＡフラグメントを示す。図１ＣのｐＳＧ１−ＣＮＰから、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理した後、ＣＮＰ遺伝子を含む断片（約２．３ｋｂ）を切り出し、インジェクション用のフラグメントとした。
図３は、ＣＮＰトランスジェニックマウスの遺伝子型解析結果を示す。野生型マウス（ＷＴ）では３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）では野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が２本検出された
図４は、ＣＮＰトランスジェニックマウスの成長曲線の推移を示す。雌のＣＮＰトランスジェニックマウス（ＴＧ）は、２週齢以降継続して正常同腹仔（ＷＴ）に対して有意に鼻肛長が長かった（図４Ａ）。雄では、４週齢以降継続して正常同腹仔（ＷＴ）に対して有意に鼻肛長が長かった（図４Ｂ）。＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１  ｖｓ．ＷＴ，対応のないＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定。
図５は、ＣＮＰトランスジェニックマウスの大腿骨成長軟骨の肥厚を示す。ＣＮＰトランスジェニックマウス（ＣＮＰ  ｔｇｍ）は、休止層（Ｒｅｓｔｉｎｇ）、増殖層（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）、肥大層（Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）およびこれらの合計（Ｔｏｔａｌ）のすべてについて正常同腹仔（Ｗｉｌｄ）に対して有意に厚かった。＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１  ｖｓ．野生型，対応のないＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定。
発明の詳細な説明
図面を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明者らが後述の実施例２に記載のように作製したＣＮＰ−トランスジェニックマウス（ＣＮＰＴｇｍ）についてサザンブロット法を用いて遺伝子型解析を行ったところ、図３に示されるように、野生型マウスでは３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、ＣＮＰＴｇｍでは野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来の２本のシグナル（トランスジーン）が検出された。ＣＮＰＴｇｍでのＣＮＰの発現を検討するため、導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓および血漿でのＣＮＰの濃度を調べたところ、ＣＮＰ  Ｔｇｍは野生型に対し、肝臓で約１０倍、血漿で約２４倍のＣＮＰ濃度を示しており、統計学的に有意にＣＮＰペプチドが過剰発現されていることが確認された（実施例４の表１）。
さらに雌雄のＣＮＰＴｇｍおよびその正常同腹仔の鼻肛長を、２〜９週間にわたり経時的に測定した結果、雌雄ともにＣＮＰＴｇｍは鼻肛長が正常同腹仔よりも大きく、身長が増加していることが判明した（図４；Ａ：雌、Ｂ：雄）。従って血中のＣＮＰ濃度を上昇させることで身長増加が促進されることが確認された。
ＣＮＰＴｇｍの成長軟骨の厚さを組織学的に解析する目的で、大腿骨膝蓋面の成長軟骨の休止層、増殖層、肥大層の厚さの平均値および成長軟骨の厚さとして前記３層の合計値を用いて解析を行ったところ、ＣＮＰＴｇｍにおいては、休止層、増殖層、肥大層およびその合計のすべてについて統計学的に有意に厚いことが確認された（図５）。ＣＮＰは、大腿骨の軟骨性骨以外にも、例えば脛骨、橈骨、尺骨等の他の軟骨性骨の休止層、増殖層、肥大層各層を厚くすることによっても動物の身長増加を促進することが示された。
従って、本発明は、ＧＣ−Ｂを活性化する物質を有効成分として含む、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物を提供する。
本発明において、「ＦＧＦＲ３異常」とは、ＦＧＦＲ３（繊維芽細胞増殖因子レセプター３）遺伝子の変異による軟骨の成長抑制に起因する軟骨無形成症及び軟骨形成不全症や、ＦＧＦＲ３遺伝子の変異によるＦＧＦＲ３の機能亢進を含み、さらにはＦＧＦＲ３の機能抑制不全、又はＦＧＦＲ３遺伝子の発現亢進などを原因とする軟骨無形成症及び軟骨形成不全症を意味する（特開２００３−１１３１１６、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４，１０（１）：８０−８６、国際公開ＷＯ０２／０７４２３４）。
本発明の実施態様において、上記組成物はＦＧＦＲ３異常を有しない低身長症患者に使用される。本発明において「低身長症」として、ＦＧＦＲ３異常を除いた低身長症をいい、例えば（１）成長ホルモン分泌不全性低身長症（下垂体性小人症）、甲状腺機能低下症、副腎皮質機能亢進症等による内分泌性低身長症、（２）家族性低身長、胎内発育不全性低身長、染色体異常（ターナー症候群、プラーダー・ヴィリ症候群など）などによる非内分泌性低身長症、並びに（３）薬物治療や放射線療法による二次性低身長症を包含する。
本発明の別の実施態様において、上記組成物はさらにＦＧＦＲ３異常を有しない、低身長症患者以外の個体にも使用されうる。本発明において、ＦＧＦＲ３異常を有しない低身長症患者以外の個体での使用又は伸長用途としては、美容医療分野及びスポーツ分野、さらには身長増加を望むヒトでの使用を包含する。
本発明で使用を意図する個体は、ヒトを含む哺乳動物、例えばヒト、ブタ、ウシなどを含むが、これらの特定例によって制限されない。好ましい個体は、ヒトである。
本発明の別の実施態様において、上記身長増加は軟骨性骨の伸長である。
本発明のさらに別の実施態様において、上記身長増加は大腿骨、脛骨、橈骨及び／又は尺骨の伸長である。
本発明においてグアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）とは、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）と同義の用語として使用する。
本発明においてＧＣ−Ｂ活性とは、グアニルシクラーゼ活性と同義の用語として使用する。
本発明において、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質又はＧＣ−Ｂ活性化物質は、ＣＮＰの受容体として知られるＧＣ−Ｂと結合してこれを活性化するペプチド又は非ペプチド性低分子化合物であり、好ましくはＣＮＰペプチド又はその誘導体である。ここでペプチドは、複数の（Ｌ−、Ｄ−及び／又は修飾）アミノ酸のアミド結合連鎖からなる物質を指し、この中にはポリペプチド及び蛋白質も包含される。ＧＣ−Ｂ活性化物質は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂ受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分間）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；２５２：１２０−１２３）によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標としてＧＣ−Ｂ活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。
本発明の実施態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質はペプチドであり、好ましくはＣＮＰ又はその誘導体である。好ましいＣＮＰは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択されるものであり、さらに好ましくは、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰ誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。あるいは、上記ＣＮＰ誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を有する配列を含みかつＣＮＰ活性を有するものである。
本明細書中で使用される「１〜数個」という用語は、通常１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の任意の整数を表す。また、２つのアミノ酸配列間の「％同一性」は、当業者に公知のＢＬＡＳＴタンパク質検索などの手法を用いて決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）。
本発明で使用可能なＣＮＰには、ヒトを含む哺乳類由来ＣＮＰ（ＣＮＰ−２２：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０；１６８：８６３−８７０，国際公開ＷＯ９１／１６３４２、ＣＮＰ−５３：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０；１７０：９７３−９７９，特開平４−７４１９８号公報、特開平４−１３９１９９号公報、特開平４−１２１１９０号公報）、鳥類由来ＣＮＰ（特開平４−１２００９４号公報）、両生類由来ＣＮＰ（特開平４−１２００９５号公報）、並びに、特開平６−９６８８号公報、国際公開ＷＯ０２／０７４２３４に開示されるＣＮＰ類似体ペプチドのようなＣＮＰ誘導体が含まれる。
天然由来ＣＮＰとして、２２及び５３アミノ残基からなるＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３が知られており、鳥類及びヒトを含む哺乳類由来の各ＣＮＰを比較すると種を超えて配列相同が高いため、本発明においては、鳥類又はヒトを含む哺乳類由来のＣＮＰ、好ましくはヒトを含む哺乳類由来のＣＮＰ、さらに好ましくはヒト由来のＣＮＰが使用されうる。ヒトＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３のアミノ酸配列は、下記の配列番号１及び配列番号２：
Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ（ヒトＣＮＰ−２２：配列番号１）；
Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ（ヒトＣＮＰ−５３：配列番号２）
として示される配列を有しており、いずれも分子内ジスルフィド結合を有し、すなわちヒトＣＮＰ−２２では６位のシステイン残基と２２位のシステイン残基との間で、またヒトＣＮＰ−５３では３７位のシステイン残基と５３位のシステイン残基との間でそれぞれ分子内ジスルフィド結合を有し、環状ペプチド構造を形成している。
ブタＣＮＰ−２２及びラットＣＮＰ−２２は、ヒトＣＮＰ−２２と同一のアミノ酸配列を有するが、一方、ブタＣＮＰ−５３及びラットＣＮＰ−５３では１７位及び２８位のアミノ酸残基がそれぞれＨｉｓ及びＧｌｙであるのに対しヒトＣＮＰ−５３ではそれぞれＧｌｎ及びＡｌａであり、２つのアミノ酸が相違する（特開平４−１３９１９９号公報、特開平４−１２１１９０号公報、特開平４−７４１９８号公報）。さらにまた、ニワトリＣＮＰ−２２は、９位のアミノ酸残基ＶａｌのみがヒトＣＮＰ−２２と異なる以外は同じ一次構造を有している（特開４−１２００９４号公報）。
本発明で使用しうる上記ＣＮＰは、天然からの精製ＣＮＰ、既知の遺伝子工学的手法で製造された遺伝子組換えＣＮＰ、既知の化学合成法（例えばペプチド合成機を用いる固相合成法）で製造されたＣＮＰを含み、好ましくは遺伝子工学的手法で製造されたヒトＣＮＰ−２２およびヒトＣＮＰ−５３である。遺伝子工学的手法によるヒトＣＮＰの製造は、例えば、ヒトＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３のＤＮＡ配列（特開平４−１３９１９９号公報）をプラスミド、ファージなどのベクターに組み込み、大腸菌や酵母などの原核もしくは真核生物宿主細胞に形質転換したのち、適する培地中で発現し、好ましくは細胞外にＣＮＰペプチドを分泌させ、産生したＣＮＰペプチドを回収し精製する各工程を含む。また、目的ＤＮＡの増幅のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。
遺伝子組換え技術、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ技術などの基本的な手法は当業者には公知であり、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９８）などに記載されており、そこに開示される技術を本発明のために利用することができる。またベクターとしては、市販のベクターあるいは刊行物記載のベクターが使用できる。
本発明で使用しうるＣＮＰ誘導体は、ＣＮＰ活性を有するとともに、ヒトＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３と同一の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合による環状ペプチド構造を有するものであって、上記ＣＮＰのフラグメント、上記ＣＮＰ又はそのフラグメントの構成アミノ酸の少なくとも１つをその他のアミノ酸に置換したペプチド、上記ＣＮＰそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸の少なくとも１つを欠失したペプチド、及び上記ＣＮＰそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸に１つ以上のアミノ酸を付加したペプチドを含む。アミノ酸の置換、欠失、付加とは、ＣＮＰ活性を損なわない限り、部位特異的突然変異誘発法などの周知の方法にてアミノ酸の置換、欠失又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されることを意味する。このようなＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３の誘導体は例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
アミノ酸の置換については、一般的に保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸は、例えば極性度（または疎水性度）や電荷の種類によって分類されることができる。例えば、非極性の非電荷型アミノ酸にはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンなど、芳香族アミノ酸にはフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、極性の非電荷型アミノ酸にはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンなど、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミン酸、正電荷アミノ酸にはリジン、アルギニン、ヒスチジンが、それぞれ含まれる。
本明細書中で使用される「ＣＮＰ活性」とは、ＧＣ−Ｂに作用してグアニルシクラーゼ活性を上昇させる活性あるいは身長を有意に増加させる活性をいう。ＣＮＰ活性は、細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定することによること、あるいはマウス、ラットなどの動物に一定期間ＧＣ−Ｂ活性化物質を投与したのち、後述の実施例５に記載されるように鼻肛長を測定すること、によって決定しうる。
ＣＮＰ−２２類似ペプチドには、例えば特開平６−９６８８号公報や国際公開ＷＯ０２／０７４２３４に記載されるような下記の環状ペプチドが含まれる（なお、配列中の下線はヒトＣＮＰ−２２からの変異を表す）。
Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ（配列番号３）
Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ（配列番号４）
Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ（配列番号５）
Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ（配列番号６）
Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ（配列番号７）
Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ（配列番号８）
Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ（配列番号９）
Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ Ｘｂｂ ＸｃｃＡｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘｄｄ Ｘｅｅ  Ｓｅｒ  Ｘｆｆ Ｘｇｇ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ
（ここで、Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ；Ｘｂｂ＝Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；Ｘｃｃ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｖａｌ；Ｘｄｄ＝Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ；Ｘｅｅ＝Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ；Ｘｆｆ＝Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｌｅｕ；Ｘｇｇ＝Ｌｅｕ，Ｍｅｔである。）（配列番号１０）
また、ＣＮＰ−５３類似ペプチドには、上記のＣＮＰ−２２類似ペプチドに対応するアミノ酸の同様の変異を含む環状ペプチドが含まれる。
本発明はまた、ＧＣ−Ｂを活性化することによって、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法を提供する。この発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体の身長を増加するという知見に基づくものである。具体的には、上記身長増加は軟骨性骨の伸長であり、さらに具体的には、大腿骨、脛骨、橈骨及び／又は尺骨の伸長である。ＧＣ−Ｂ活性化物質の具体例は、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体である。ＣＮＰは、好ましくは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３であり、さらに好ましくは、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。また、ＣＮＰ誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものを含む。他のＧＣ−Ｂ活性化物質は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂ受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分間）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；２５２：１２０−１２３）によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標としてＧＣ−Ｂ活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法を提供する。本発明の実施態様により、ＧＣ−Ｂは、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体によって活性化されうる。ＧＣ−Ｂは、グアニルシクラーゼ活性によりＧＴＰからセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰの合成を触媒することが知られているので、ＧＣ−Ｂの活性は、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定されうる。
本発明の実施態様において、上記スクリーニング方法はＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含む。
本発明の実施態様において好ましくは、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として身長増加について候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含む。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂ受容体を発現させ、培地に被験物質を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分間）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；２５２：１２０−１２３）によって身長増加剤をスクリーニングすることができる。
本発明はさらにＧＣ−Ｂを活性化することによりＦＧＦＲ３異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法を提供する。本発明の実施態様においては、ＧＣ−Ｂを活性化することによりｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏにて軟骨性骨の伸長を促進することができる。本発明の実施態様においては好ましくは培養骨、培養軟骨の培養時においてＧＣ−Ｂを活性化する物質を添加することによりＦＧＦＲ３異常を有しない軟骨性骨の伸長を促進する方法を含む。
本発明の組成物は、有効成分としての上記定義のＧＣ−Ｂ活性化物質を、製薬上許容可能な担体、賦形剤、添加剤などと組み合わせて、経口投与用又は非経口投与用に製剤化される。
本発明の組成物は、上記定義のＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含み、さらに通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤又は丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水及び注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することが出来る。
本発明の治療剤又は予防剤は、医薬に一般に使用されている経口投与方法又は非経口投与方法のいずれかによって投与される。好ましくは非経口投与方法、例えば注射による投与（皮下注射、静脈注射、筋肉注射、腹腔内への注射などによる投与）、経皮投与、経粘膜投与（経鼻投与、経直腸投与など）、経肺投与などであるが、経口投与方法による投与も可能である。
本発明の製剤中に含まれる有効成分であるＧＣ−Ｂ活性化物質、好ましくは上記定義のＣＮＰ又はその誘導体、の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般に０．００５μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができるが、０．０２μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与することが好ましい。しかしながら本発明のＧＣ−Ｂ活性化物質を含有する医薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明として以下の事項を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物。
（２）低身長症患者に使用される、上記（１）に記載の組成物。
（３）低身長症患者以外の個体に使用される、上記（１）に記載の組成物。
（４）上記身長増加が軟骨性骨の伸長である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び／又は尺骨の伸長である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）上記物質がペプチドである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）上記ペプチドがＣＮＰ又はその誘導体である、上記（６）に記載の組成物。
（８）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（７）に記載の組成物。
（９）上記ＣＮＰが配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（７）に記載の組成物。
（１０）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（７）に記載の組成物。
（１１）ＧＣ−Ｂを活性化することによって、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法。
（１２）上記身長増加が軟骨性骨の伸長である、上記（１１）に記載の身長増加方法。
（１３）上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び／又は尺骨の伸長である、上記（１１）又は（１２）に記載の身長増加方法。
（１４）上記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される、上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の身長増加方法。
（１５）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（１４）に記載の身長増加方法。
（１６）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（１４）に記載の身長増加方法。
（１７）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、（１４）に記載の身長増加方法。
（１８）ＧＣ−Ｂの活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法。
（１９）ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、（１８）に記載のスクリーニング方法。
（２０）上記ＧＣ−Ｂの活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される、上記（１８）又は（１９）に記載のスクリーニング方法。
（２１）ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を被験物質の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、該被験物質の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（１８）〜（２０）に記載のスクリーニング方法。
（２２）ＧＣ−Ｂを活性化することによりＦＧＦＲ３異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法。
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示を目的としたものであって、本発明を制限するものではない。それゆえ、本発明は、これらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例１】ＣＮＰトランスジェニックマウス作製用ベクターの構築
図１Ａに示すように、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にマウスＣＮＰ  ｃＤＮＡ（５２６ｂｐ；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２７６：２０９−２１３，１９９０）をサブクローニングさせたものをＰｓｔ  Ｉで切断し、断端を平滑化してマウスＣＮＰ  ｃＤＮＡを調製した。ｐＳＧ  Ｉベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製；図１Ｂ）をＥｃｏ  ＲＩで切断し断端を平滑化して、図１ＣのようにマウスＣＮＰ  ｃＤＮＡをｌｉｇａｔｉｏｎし、ＳＡＰ−ｍＣＮＰベクター（ｐＳＧ１−ＣＮＰ）を作製した。
【実施例２】ＣＮＰトランスジェニックマウスの作製
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、次のようにして調製した。まずＣＮＰ遺伝子を挿入したＳＡＰ−ｍＣＮＰベクター（ｐＳＧ１−ＣＮＰ；図１Ｃ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理した後、ＣＮＰ遺伝子を含む断片（約２．３ｋｂ）を切り出した。この断片を、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により回収し、３ｎｇ／μｌになるようにＰＢＳ−で希釈してインジェクション用ＤＮＡフラグメント（図２）とした。
ＤＮＡフラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まずＣ５７ＢＬ／６雌マウス（日本クレア）に５ｉ．ｕの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）を腹腔内投与、さらに４８時間後５ｉ．ｕのヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を潅流してマウス前核期卵を回収した。
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社），１９０−２０７，２０００）。ＤＮＡフラグメントを６６０個のＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚へ注入し、翌日、２細胞期に発生していた胚５６１個を、偽妊娠１日目の受容雌の卵管に片側当たり１０個前後（１匹あたり２０個前後）を移植した。
分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し里親に哺育させた。１３６例の産仔が得られ、そのうちの５例がＣＮＰ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウス（以下、Ｔｇｍと記載する）であった。以下、最初に得られたマウスをＦｏｕｎｄｅｒと記載する。
Ｆｏｕｎｄｅｒは全て雄マウスで、これら５ラインの内４ラインから、次世代（Ｆ１マウス）の産仔が得られた。
【実施例３】ＣＮＰトランスジェニックマウスの遺伝子型解析
遺伝子型解析は下記に示す手順に従ってサザンブロット法によって行った。
３週齢になったマウスの尾（約１５ｍｍ）を採取してｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理（５５℃、１００ｒｐｍで１昼夜振盪）して溶解液を得た。この溶解液を核酸自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯＮＡ−１０００）にかけてゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ１５μｇをＰｖｕ  ＩＩ（２００Ｕ）で処理してからフェノール・クロロホルム処理によって制限酵素を除いた後にエタノール沈殿でＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを２５μＬのＴＥに溶解して０．７％アガロースゲル電気泳動（５０Ｖ定電圧）にかけ、泳動終了後、ゲルを０．２５Ｍ  ＨＣｌ溶液で１５分間処理してＤＮＡを切断し、水洗してから０．４Ｍ  ＮａＯＨ溶液でナイロンメンブレンに一晩ブロッティングした。その後、メンブレン上のＤＮＡをＵＶクロスリンク法で固定した。メンブレンをハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、０．５  ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％  ＳＤＳ、５ｘ  ＳＳＰＥ）で処理（４２℃、２時間）してから、ＣＮＰのｃＤＮＡ（約０．５ｋｂ）を鋳型としてＢｃａＢＥＳＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）で調製した３２Ｐ標識プローブを加えて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。その後、洗浄溶液（２  ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ）で５５℃、２０分間処理してからＩｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）に一晩露光し、導入遺伝子のシグナルをＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）で検出した（図３）。野生型マウス（ＷＴ）では３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）では野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が２本検出された。
【実施例４】ＣＮＰトランスジェニックマウスにおけるＣＮＰの発現
ＣＮＰ濃度の測定には、ＣＮＰ−２２  ＥＩＡ測定キット（ＰＨＯＥＮＩＸ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ  ＩＮＣ．社製）を用いた。
７週齢の雌雄ＣＮＰトランスジェニックマウスおよび雌雄の正常同腹マウス各３例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させた。
導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓を採取し、肝重量０．１ｇに対して、上記測定キットのＥＩＡ  ａｓｓａｙバッファー１ｍＬを加え氷冷した。ワーリングブレンダー（ヒスコトロン社製）でホモジナイズし、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、５分間）した上清をＣＮＰ−２２濃度測定サンプルとした。
採取した血液に、１ｍｇのエチレンジアミン４酢酸・４ナトリウム塩（純正化学社製）と２トリプシン阻害単位のアプロチニン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して攪拌して血漿を分離し、ＣＮＰ−２２濃度測定サンプルとした。
測定結果を表１に示した。
【表１】
0004972403.tif 000002
ＣＮＰトランスジェニックマウスは野生型に対する平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）の比較では肝臓で約１０倍、血漿で約２４倍のＣＮＰ−２２濃度を示しており、いずれも統計学的に有意な差であった。これらの結果より、ＣＮＰトランスジェニックマウスにおいて、ＣＮＰペプチドが過剰発現されていることが確認された。
【実施例５】ＣＮＰトランスジェニックマウスにおける成長曲線
雌雄のＣＮＰトランスジェニックマウスおよびその正常同腹仔の鼻肛長（ｎａｓｏ−ａｎａｌ  ｌｅｎｇｔｈ，ｃｍ）を、２〜９週間にわたり経時的に測定した（図４）。その結果、雌雄ともにＣＮＰトランスジェニックマウスは鼻肛長が正常同腹仔よりも大きく、身長増加が促進されていることが判明した。また、この結果は、血中のＣＮＰ濃度を上昇させることで身長増加が促進されることも同時に示すものである。
【実施例６】ＣＮＰトランスジェニックマウス成長軟骨の組織学的解析
成長軟骨の厚さを組織学的に解析する目的で、９週齢のＣＮＰトランスジェニックマウスおよび同腹の正常マウスの雌５例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させ、大腿骨を２０％ホルマリンにより１週間固定した。その後２０％ＥＤＴＡ−４Ｎａ（純正化学社製）水溶液（ｐＨ７．４）に浸漬して脱灰した後、大腿骨膝蓋面を正中矢状断して常法に従いパラフィン包埋し、パラフィンブロックを作製した。厚さ４μｍの切片をミクロトームを用いて薄切してパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色した。成長軟骨の厚さは、対物レンズ１０倍での１視野を画像解析ソフト（ＩＰＡＰ，住化テクノサービス社製）に取り込み、同ソフトを用いて視野中の５点について、休止層、増殖層、肥大層の厚さを計測して平均値を算出し、その個体の各層の厚さとした。また、上記３層の合計値をその個体の成長軟骨の厚さとした。これら項目について、正常同腹仔とＣＮＰトランスジェニックマウスの間で平均値および標準偏差を算出し（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２０００，マイクロソフト社製）、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって統計学的解析を行った（ＳＡＳ  ｖｅｒ．６．１２，ＳＡＳインスティチュートジャパン社製）。
ＣＮＰトランスジェニックマウス（ＣＮＰ  ｔｇｍ）においては、正常マウス（野生型）に比して休止層（Ｒｅｓｔｉｎｇ）、増殖層（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）、肥大層（Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）およびその合計（Ｔｏｔａｌ）のすべてについて統計学的に有意に成長軟骨層が厚いことが判明した（図５）。これらの結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質の１種であるＣＮＰは成長軟骨の各層を厚くすることにより、哺乳動物の身長増加を促進することが判明した。
【産業上の利用可能性】本発明の、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む組成物は、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体における内分泌性低身長症、非内分泌性低身長症及び二次性低身長症などの低身長症を治療することを可能にする。この組成物は、成長ホルモンやインシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の注射や骨切り術などの整形外科手術と比べて患者の負担、苦痛が少なく、患者のＱＯＬに配慮した優れた治療剤となりうる。本発明の組成物はまた、ＦＧＦＲ３異常を有しない、低身長症患者以外の個体での伸長用途に用いることができる。本発明はまたＧＣ−Ｂを活性化することによりｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏにてＦＧＦＲ３異常を有しない軟骨性骨を伸長させることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】配列番号１の説明：６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成されている。
配列番号２の説明：３７−Ｃｙｓと５３−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成されている。
配列番号３の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号４の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号５の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号６の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号７の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、７−Ｃｙｓと２３−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号８の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号９の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号１０の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、４−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ；５−Ｘａａ＝Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；６−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｖａｌ；１１−Ｘａａ＝Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ；１２−Ｘａａ＝Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ；１４−Ｘａａ＝Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｌｅｕ；１５−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｍｅｔ。また、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成されている。）。
【図１Ａ】
0004972403.tif 000003
【図１Ｂ】
0004972403.tif 000004
【図１Ｃ】
0004972403.tif 000005
【図２】
0004972403.tif 000006
【図３】
0004972403.tif 000007
【図４Ａ】
0004972403.tif 000008
【図４Ｂ】
0004972403.tif 000009
【図５】
0004972403.tif 000010
【配列表】
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