(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列で示されるＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列が１か所または２か所で置換されている、該ＬｕｃＰｐｌＧＲとは異なるアミノ酸配列を有する突然変異甲虫ルシフェラーゼであって、変異が、ＬｕｃＰｐｌＧＲ−Ｒ215Ｇ，Ｒ215Ｔ，Ｒ215Ｍ，Ｒ215Ｐ，Ｖ224Ｌ，Ｖ224Ｈ，Ｖ224Ｇ，Ｉ248Ｎ，Ｈ348Ａ，Ｈ348Ｃ，Ｈ348Ｎ，Ｈ348Ｑ，Ｓ247Ｆ／Ｉ248Ｃ，Ｓ247Ｆ／Ｉ248Ｔ，Ｖ224Ｆ／Ｒ215Ｇ，Ｖ224Ｆ／Ｒ215Ｔ，Ｖ224Ｆ／Ｒ215Ｖ，Ｖ224Ｆ／Ｒ215Ｐ，Ｖ224Ｆ／Ｑ227Ｅ，Ｖ224Ｆ／Ｌ238Ｖ，Ｖ224Ｆ／Ｌ238Ｍ，Ｖ224Ｆ／Ｓ247Ｇ，Ｖ224Ｆ／Ｓ247Ｈ，Ｖ224Ｆ／Ｓ247Ｙ，及びＶ224Ｆ／Ｓ247Ｆからなる群から選択される前記突然変異甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載の突然変異甲虫ルシフェラーゼをコードする配列部分からなるＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全体として、ホタルに由来するような、発光を生起するルシフェラーゼ酵素に係わる。本発明は特に、甲虫類の突然変異体ルシフェラーゼに係わる。本発明の突然変異体ルシフェラーゼは遺伝子操作によって製造され、天然には生じず、いずれにせよ、発光の色の変化を惹起するように改変されている。本発明のルシフェラーゼは対応する天然のルシフェラーゼ同様、様々な物質または現象に関する試験またはアッセイにおいて発光信号を提供するべく用いられ得る。
【背景技術】
【０００２】
分子事象を定性的または定量的に監視するのにリポーター分子またはラベルを用いることは広く行なわれている。リポーター分子またはラベルの使用は、医学的診断のためのアッセイ、工業的環境内で毒素その他の物質を検出するためのアッセイ、並びに生物学、生物医学及び生化学の基礎及び応用研究のためのアッセイにおいて認められる。これらのアッセイには、イムノアッセイ、核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイ、及びリポーター酵素または他のタンパク質が特定プロモーターの制御下での発現によって産生されるアッセイが含まれる。このようなアッセイシステムのリポーター分子またはラベルは、放射性同位体、蛍光物質、酵素及び化学発光物質を包含している。
【０００３】
当該事象の監視または測定に化学発光を利用するアッセイシステムに含まれるものに、生物発光酵素ルシフェラーゼの活性を測定するアッセイが有る。
【０００４】
発光系は、細菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、魚類、多足類、有翅昆虫類（ｆｌｉｅｓ）、菌類、蠕形動物、甲殻類及び甲虫類、特にＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属のコメツキムシ並びにＰｈｏｔｉｎｕｓ属、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ属及びＬｕｃｉｏｌａ属のホタルを含めた多くの発光生物から知られ、かつ単離されている。上記のような生物の多くでは、酵素が一原子酸素添加（ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）を触媒し、その結果生じる自由エネルギーを用いて分子を高エネルギー状態へと励起する。励起された分子が自然に基底状態に戻る時可視光が発せられる。このようにして発せられる光は“生物発光”と呼称される。本明細書では以後この光を、単に“発光”とも呼称する。
【０００５】
天然の生物発光が限定的にしか生起しないことは、ルシフェラーゼ酵素を分子事象監視のためのリポーター分子として用いるうえでの利点となる。天然の生物発光は稀であるので、他の生物学的過程に由来する発光が生物系に導入されたルシフェラーゼの活性を妨害するとは考えにくい。従って、たとえ複雑な環境にあっても、光の検出がルシフェラーゼ活性を明瞭に示すことになる。
【０００６】
ルシフェラーゼは、この酵素を（生物系の特性の解明にリポーター系を用いる）バイオセンシングのためのリポーター分子として特に有用なものとする付加的な特徴を有する。バイオセンサー（生物由来の構成要素を含むセンサー）における信号変換は通常、生物由来の構成要素による信号発生と、電気的構成要素による信号の変換及び増幅とから成る二段階プロセスを含む。信号発生は典型的には、結合または触媒作用によって行なわれる。これらの生化学的事象の電気信号への変換は、典型的には電気化学的検出法または熱量検出法に基づき、これらの検出法は生化学反応の自由エネルギー変化によって制約される。ほとんどの反応において上記変化は、２個のＡＴＰ分子の加水分解のエネルギー、即ち約７０ｋＪ／ｍｏｌより小さい。しかし、ルシフェラーゼによって惹起される発光ははるかに大きいエネルギー量をもたらす。ホタルルシフェラーゼによって触媒された反応から発せられる光子（５６０ｎｍ）は２１４ｋＪ／アインシュタインのエネルギーを有する。そのうえ、ルシフェラーゼによって触媒される反応は、０．９に近い量子収量を有するきわめて効率的な公知の生物発光反応の一つである。従ってこの酵素は、化学エネルギーのきわめて効率的なトランスデューサーである。
【０００７】
ごく初期の研究以来、甲虫類ルシフェラーゼ、特に一般的な北米産ホタル種であるＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓに由来するルシフェラーゼは生物発光理解のための範例として役立ってきた。ルシフェラーゼの基礎知識及び応用は、“ホタルルシフェラーゼ”と呼称されるＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のただ１種の酵素に基づいている。しかし、世界中にはおよそ１８００種の発光甲虫類が存在する。即ち、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼは多種多様な甲虫類ルシフェラーゼ群の単なる一例にすぎない。いずれの甲虫類ルシフェラーゼも同じ基質、即ち高エネルギー分子に変換される多複素環式有機酸のＤ−（−）−２−（６′−ヒドロキシ−２′−ベンゾチアゾリル）−Δ２−チアゾリン−４−カルボン酸（以後、特に断らないかぎり“ルシフェリン”と呼称）の反応を触媒することが知られている。触媒される反応はいずれも同じ機構を伴うと考えられる。
【０００８】
甲虫類の生物発光機構に関連する一般的システムは、ルシフェリンの酸化的脱炭酸後に酸化されたルシフェリンと上記酵素との相互作用によって発光を生起させるものであると考えられる。光の色は明らかに、酸化されたルシフェリンと相互作用する酵素アミノ酸の空間配置によって決定される。
【０００９】
生物発光をもたらすルシフェラーゼ触媒反応（以後、単に“ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応”と呼称）は、ルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び分子状酸素が関与する二段階プロセスとして説明されている。最初の反応では、次の反応式
【化２】
0005090304.tif 000002
〔式中Ｅはルシフェラーゼであり、ＬＨ２はルシフェリンであり、ＰＰｉはピロリン酸である〕に示すようにルシフェリンとＡＴＰとが反応してルシフェリルアデニル酸を形成し、無機のピロリン酸が排除される。ルシフェリルアデニル酸ＬＨ２−ＡＭＰはルシフェラーゼの触媒部位に固く結合したままとなる。この状態の酵素が分子状酸素に暴露されると、酵素に結合したルシフェリルアデニル酸は酸化されて、電子励起状態のオキシルシフェリン（Ｌ＝Ｏ）となる。励起された酸化ルシフェリンは、次の反応式
【化３】
0005090304.tif 000003
に示すように、基底状態に戻る際に光を発する。酸化ルシフェリン１分子につき１個の光量子が発せられる。酸化ルシフェリンの電子励起状態は、甲虫類ルシフェラーゼのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の特徴的状態である。同じルシフェリンを有する様々な甲虫種が異なる色の光を発するという事実によって証明されるように、酸化ルシフェリンが基底状態に戻る際に発せられる光の色（と従ってエネルギーと）は酵素によって決定される。
【００１０】
ルシフェラーゼは様々なソースから直接単離されている。様々な甲虫種のルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが報告されている。（ｄｅ  Ｗｅｔ等，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７，  ｐｐ．７２５−７３７，  １９８７；  Ｍａｓｕｄａ等，  Ｇｅｎｅ  ７７，  ｐｐ．２６５−２７０，  １９８９；  Ｗｏｏｄ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，  ｐｐ．７００−７０２，  １９８９参照）。甲虫類ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが手近に存在するので、そのようなｃＤＮＡを発現させるように形質転換した細菌（例えば大腸菌）、酵母、哺乳動物の培養細胞等からの単離によって大量のルシフェラーゼを調製することは当業者には全く容易なことである。あるいは他の場合には、上記のような細胞において適当なプロモーターその他の発現制御シグナルの制御下に有るｃＤＮＡを用いて、ルシフェラーゼ、及び究極的にはルシフェラーゼによって触媒される生物発光をプロモーターの活性を示す信号として生じさせ得る。プロモーターの活性はそれ自体、プロモーターの活性を誘導または抑制する物質の濃度などの、監視が求められる別のファクターを反映し得る。甲虫類ルシフェラーゼの製造には、タンパク質をコードする核酸から当該タンパク質を製造するのに最近使用可能となった様々な無細胞系を用いることも可能である。
【００１１】
更に、甲虫類ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡの使用可能性、及びルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒する酵素をコードするｃＤＮＡを迅速にスクリーニングする能力（ｄｅ  Ｗｅｔ等の上掲書及びＷｏｏｄ等の上掲書参照）は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応によって生物発光を触媒する活性を保持する他のルシフェラーゼを当業者が大量に調製及び取得することも可能にする。上記他のルシフェラーゼを調製すること、及びそれらのルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを前段に示したように用いることも可能である。本発明の開示において“甲虫（類）ルシフェラーゼ”または“ルシフェラーゼ”という語は、先に概説したようにルシフェリンの酸化を触媒して生物発光を実現し得る酵素を意味する。
【００１２】
甲虫類ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが容易に使用可能であることにより、そのようなｃＤＮＡの発現と、従って甲虫類ルシフェラーゼの産生とを転写及び翻訳に関連する遺伝子事象に結び付けることによって前記遺伝子事象を告知、監視または測定するべく用いられるアッセイにおいて甲虫類ルシフェラーゼをリポーターとして用いることが可能となる。
【００１３】
ホタルルシフェラーゼは、真核生物におけるプロモーター活性の検出に広く用いられている。この酵素は原核生物でも用いられているが、細菌においてホタルルシフェラーゼを遺伝子リポーターとして用いることは通常認められることではない。甲虫類ルシフェラーゼは遺伝子リポーターとして特に有用であり、なぜならこの酵素は単一遺伝子のモノマー産物であるからである。加えて、酵素活性が翻訳後修飾を必要とせず、また上記酵素は補欠分子族や、結合補因子や、ジスルフィド結合を有しない。ホタルルシフェラーゼの遺伝子を保持する大腸菌からの発光は、増殖培地に基質のルシフェリンを添加することによって惹起され得る。ルシフェリンは直ちに生体膜に浸透するが、大腸菌によって炭素または窒素源として用いられることはあり得ない。生物発光反応に必要なその他の基質の酸素及びＡＴＰは、生きた細胞内に使用可能に存在する。しかし、リポーター（信号発生体）として二つ以上の異なるルシフェラーゼを用いる系にとっては、ルシフェラーゼに起因する測定可能な発光色変化が必要となろう。
【００１４】
生物発光リポーター系では、特に単一の属または種に由来する異なる甲虫類ルシフェラーゼのクローンを一緒に用い得る。上記ルシフェラーゼ同士の間で外因性宿主での発現にさほどの差は無いはずであり、なぜなら互いの配列が相当に類似するからである。即ち、特にコメツキムシルシフェラーゼは、単一の宿主内で二つ以上の異なるプロモーターの活性を監視すること、または異なる細胞集団を同時に観察することを可能にし得る多リポーター系を提供し得る。しかし、混合物中の各ルシフェラーゼをそれらがもたらす発光のスペクトル幅で区別することには限界が有る。
【００１５】
発光色変化の最も著しい例の一つが、カリブ海地方に固有の大型コメツキムシであるＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓにおいて認められる。この甲虫は、前胸背面の１対と、腹部の腹側襞（ｖｅｎｔｒａｌ  ｃｌｅｆｔ）内の単独器官との２組の発光器官を有する。腹部の器官から四つの異なるルシフェラーゼクローンが単離された。これらの酵素によって触媒されるルシフェラーゼ−ルシフェリン反応により、緑色から橙色までの光が発せられる。
【００１６】
上記４種のルシフェラーゼによって触媒されるルシフェラーゼ−ルシフェリン反応から得られたスペクトルデータは、緑色（ピーク強度：５４６ｎｍ）、黄緑色（ピーク強度：５６０ｎｍ）、黄色（ピーク強度：５７８ｎｍ）及び橙色（ピーク強度：５９３ｎｍ）の発光に対応するほぼ等間隔の四つの重複ピークを示す。各タンパク質はそれぞれＬｕｃＰｐ１ＧＲ、ＬｕｃＰｐ１ＹＧ、ＬｃｕＰｐ１ＹＥ及びＬｕｃＰｐ１ＯＲと呼称される。これらのルシフェラーゼによる発光のピーク強度波長は５０ｎｍ近くにわたって様々であるが、発光スペクトル同士の間にはピークが５４６ｎｍと５９３ｎｍとである場合でさえなお著しい重複が存在する。即ち、ピーク強度波長の差を増大させることは、２種以上のルシフェラーゼを用いる系において測定精度を高めるうえで有用であろう。
【００１７】
上記腹部器官由来の４種のルシフェラーゼのアミノ酸配列はきわめて類似する。配列同士の比較から、これらのルシフェラーゼは９５〜９９％同等であることが判明している。
【００１８】
多リポーター系に用いるべく甲虫類ルシフェラーゼの有用性を高めるには、ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを突然変異させ、それによって、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において現在使用可能なルシフェラーゼを用いた場合に得られるピーク強度波長差より大きいピーク強度波長差を伴う発光を実現する突然変異体ルシフェラーゼを調製することが望ましい。
【００１９】
甲虫類ルシフェラーゼは上記のような突然変異体ルシフェラーゼの調製に特に適し、なぜなら発光色変化はアミノ酸配列の変化の直接の結果であるからである。
【００２０】
Ｌｕｃｉｏｌａ属のホタルの突然変異体ルシフェラーゼは当業者に公知である。Ｋａｊｉｙａｍａ等の米国特許第５，２１９，７３７号及び同第５，２２９，２８５号。
【００２１】
【表１】
0005090304.tif 000004
0005090304.tif 000005
なお、別途配列表に記載された配列番号１は、LucPp1GRの配列番号１の塩基配列を示し、配列番号２は、その対応するアミノ酸配列を示す。
【００２２】
コメツキムシＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓの、緑色発光を実現するルシフェラーゼＬｕｃＰｐ１ＧＲのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列表に、配列番号１を付して示す。
【００２３】
発明の概要
本発明は、甲虫類の突然変異体ルシフェラーゼ、及び該突然変異体ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、上記突然変異体ルシフェラーゼは対応する野生型ルシフェラーゼとは異なる色の発光を生起し、この色の相違は好ましくは、突然変異体の発光ピーク強度波長が野生型酵素のものと少なくとも１ｎｍ相違することによる。
本発明の突然変異体ルシフェラーゼは対応する野生型ルシフェラーゼから、１個以上の、しかし典型的には２個以下のアミノ酸の置換によって相違する。本発明のルシフェラーゼは、３個のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１個以上を改変してペルオキシソーム標的化を低減することも可能である。
【００２４】
本発明の驚くべき一構成では、それぞれ単独で生物発光の色の変化（ピーク強度波長シフト）を惹起する二つのアミノ酸置換を１個の突然変異体において組み合わせると、突然変異体は単一のアミノ酸置換によって惹起されるシフトのいずれよりも大きいピーク強度波長シフトを惹起するようになることを発見した。
【００２５】
本発明の突然変異体ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡは、対応する野生型酵素または別の突然変異体をコードするｃＤＮＡに関して行なわれる任意の標準的な部位特異的突然変異誘発操作によって容易に取得可能である。本発明の突然変異体ルシフェラーゼは、該ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを原核細胞または真核細胞において発現させる標準的操作によって製造できる。
【００２６】
本発明についての以下の詳細な説明を検討すれば、本発明をより良く理解することができる。
【００２７】
発明の詳細
以下の説明及び実施例において方法実施及び濃度測定は、特に記載のない限りは室温（約２０℃〜２５℃）及び大気圧で行った。
【００２８】
本明細書において参照される全てのアミノ酸は、非鏡像構造グリシンを除き、特に記載のない限りはＬ−アミノ酸である。アミノ酸は、下記の表ＩＩに示す１文字または３文字の記号を使用して参照することができる。
【表２】
0005090304.tif 000006
【００２９】
“Ｘ”は、表ＩＩに挙げた２０個のアミノ酸のいずれか１つを意味する。
【００３０】
ペプチドまたはポリペプチド配列は、番号“１”が付される最初のメチオニンからカルボキシ末端アミノ酸に向かって書かれ、番号付けされる。
ポリペプチド中のある位置での置換は、［元のアミノ酸の記号］位置番号［置換アミノ酸の記号］で表わされる。
例えば、ポリペプチドの位置１００にあるアラニンがグルタミン酸で置換されていることは、Ａｌａ１００ＧｌｕまたはＡ１００Ｅと表わされる。通常は、置換表示の前にそれが生じたポリペプチドを表示する。例えば、“Ｌｕｃｋ”と名付ける仮想タンパク質に置換Ａ１００Ｅが存在する場合、置換はＬｕｃｋ−Ａｌａ１００ＧｌｕまたはＬｕｃｋ−Ａ１００Ｅと表わされる。ポリペプチド中に２つ以上の置換がある場合、置換表示はスラッシュ（／）によって区切られる。例えば、仮想タンパク質“Ｌｕｃｋ”において、位置１００のアラニンがグルタミン酸で置換され、位置１５０のリシンがアスパラギンで置換されている場合、置換を有するポリペプチドはＬｕｃｋ−Ａｌａ１００Ｇｌｕ／Ｌｙｓ１５０ＡｓｎまたはＬｕｃｋＡ１００Ｅ／Ｋ１５０Ｎと表わされる。ポリペプチド中の１つの位置に異なる置換があることを示すためには、置換アミノ酸の記号をコンマ（，）で区切る。例えば仮想タンパク質が、位置１００でアラニンに代わってグルタミン酸、グリシンまたはリシンで置換されている場合、表示はＬｕｃｋ−Ａｌａ１００／Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，ＬｙｓまたはＬｕｃｋ−Ａ１００／Ｅ，Ｇ，Ｋとなる。
【００３１】
標準的な１文字コード“Ａ”、“Ｃ”、“Ｇ”及び“Ｔ”は、本明細書においてはそれぞれヌクレオチド  アデニル酸、シチジル酸、グアニル酸及びチミジル酸に対して使用される。当業者は、ＤＮＡにおいてはヌクレオチドは２’−デオキシリボヌクレオチド−５’−リン酸（または５’末端には三リン酸）であり、ＲＮＡにおいてはヌクレオチドはリボヌクレオチド−５’−リン酸（または５’末端には三リン酸）であって、Ｔの代わりにウリジル酸（Ｕ）が存在することを理解しよう。“Ｎ”は４種のヌクレオチドのうちのいずれか１つを意味する。
【００３２】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は５’末端から３’末端に向かって書かれる。
【００３３】
「突然変異（体）ルシフェラーゼ」なる用語は本明細書においては、天然には存在せず、天然ルシフェラーゼとは異なるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを指して使用される。
【００３４】
その態様の１つにおいて本発明は、対応する野生型ルシフェラーゼによって生成される生物発光のピーク強度の波長から少なくとも１ｎｍはピーク強度の波長がシフトしており、１か所または２か所で置換されていることで対応する野生型ルシフェラーゼとは異なるアミノ酸配列を有する、生物発光を生じる（即ち生物発光を生じるべくルシフェリンの酸化を触媒する）突然変異甲虫ルシフェラーゼであって、１か所に置換がある場合、その位置はＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列における位置２１４、２１５、２２３、２２４、２３２、２３６、２３７、２３８、２４２、２４４、２４５、２４７、２４８、２８２、２８３及び３４８からなる群から選択される位置に対応し、２か所に置換がある場合は、その少なくとも一方の位置は、ＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列における位置２１４、２１５、２２３、２２４、２３２、２３６、２３７、２３８、２４２、２４４、２４５、２４７、２４８、２８２、２８３及び３４８からなる群から選択される位置に対応しており、また突然変異体は必要によってはカルボキシ末端にペルオキシソーム標的回避配列を有する突然変異甲虫ルシフェラーゼに係わる。
【００３５】
本発明の突然変異ルシフェラーゼの例としては下記のものがある：
【化４】
0005090304.tif 000007
【００３６】
下記の表ＩＩＩは、上記及び他の突然変異ルシフェラーゼの例のスペクトル特性を示す。
【表３】
0005090304.tif 000008
0005090304.tif 000009
0005090304.tif 000010
0005090304.tif 000011
【００３７】
ＬｕｃＰｐｌＧＲ以外のルシフェラーゼにおける「対応位置」は、当分野において既知であるアミノ酸レベルでの一致（ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）（例えばＷｏｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，７００−７０２（１９８９）；Ｄｅｖｉｎｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１７３，１２１−１３２（１９９３））から、または、同一または保存性をもって置換されている残基を最も多く一致するようにアミノ酸レベルで単純に並べ、ＬｕｃＰｐｌＧＲ配列中のアミノ酸１９５〜２０５は全ての甲虫ルシフェラーゼにおいて極めて高度に保存されており、全ての甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列においてその高度に保存されている１１−ｍｅｒ以降の３００を超える位置にギャップはないことに特に留意することにより決定し得る。
【００３８】
「カルボキシ末端にあるペルオキシソーム標的回避配列」とは、（１）対応野生型ルシフェラーゼの３つのカルボキシ末端アミノ酸が突然変異体からは完全に欠失している、または（２）対応野生型ルシフェラーゼの３つのカルボキシ末端アミノ酸が、Ｓｏｍｍｅｒら（前出）によれば、ペルオキシソーム標的到達を少なくとも５０％低下させる１、２または３つのアミノ酸からなる配列で置換されていることを意味する。突然変異体において野生型ルシフェラーゼの３つのカルボキシ末端アミノ酸が３つのアミノ酸からなるペルオキシソーム標的回避配列で置換されており、突然変異体のその配列をＸ１Ｘ２Ｘ３（ここでＸ３はカルボキシ末端である）とするならば、Ｘ１は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｔ及びＳを除く上記２０個のアミノ酸のうちのいずれかであり、Ｘ２は、Ｈ、Ｍ、Ｎ，Ｑ，Ｒ、Ｓ及びＫを除く上記２０個のアミノ酸のうちのいずれかであり、Ｘ３は、Ｉ、Ｍ、Ｙ及びＬを除く上記２０個のアミノ酸のうちのいずれかである。更に、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３のうちの任意の１つもしくは２つ、または３つ全部が突然変異体に存在せずともよい（即ち該位置に対応するアミノ酸はない）。最も好ましいペルオキシソーム標的回避配列はＩＡＶ（ここでＶはカルボキシ末端にある）である。
【００３９】
別の態様においては本発明は、細胞中（真核細胞または原核細胞）、溶液中（遊離状態または、抗体、抗体フラグメント、核酸プローブなどにリポーターとして結合した状態）、必要によっては抗体、抗体フラグメントまたは核酸を介して固体表面に固定され、且つ溶液に暴露された状態のルシフェラーゼの組合せであって、少なくとも一方のルシフェラーゼは突然変異体であり、両ルシフェラーゼは、生物発光を生じることにおいて活性を維持しており、ルシフェラーゼのアミノ酸配列がＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列の位置２１４、２１５、２２３、２２４、２３２、２３６、２３７、２３８、２４２、２４４、２４５、２４７、２４８、２８２、２８３及び３４８に対応する位置の少なくとも１つで異なるが故に、ルシフェラーゼの生物発光のピーク強度の波長が異なり、ルシフェラーゼの一方または両方は必要によってはペルオキシソーム標的回避配列を有するルシフェラーゼの組合せに係わる。
【００４０】
別の態様においては本発明は、本発明の突然変異甲虫ルシフェラーゼをコードする配列を有するセグメントを含む、真核細胞または原核細胞発現ベクターとなり得るＤＮＡ分子に係わる。
【００４１】
本発明のＤＮＡのなかで最も好ましいのは、好ましい本発明突然変異ルシフェラーゼをコードするセグメントを含むものである。
【００４２】
上述の本発明の説明から、当業者には本発明の範囲内で上述したものの多数の変更及び変形が認識されるであろう。そのような変更及び変形も本発明の一部として理解されるものとする。
【００４３】
【表４】
0005090304.tif 000012
0005090304.tif 000013
0005090304.tif 000014
【配列表】
0005090304000001.app