(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子鋳型に対して相補性を有する可溶性ポリマーの製造方法において、
ａ）異なる機能的モノマーの混合物を供給し、ここで当該機能的モノマーは、エチレン性不飽和モノマー又はアミノ酸であり；
ｂ）分子鋳型を含む重合系において前記混合物の機能的モノマーの鋳型により指令された重合を行い、ここで当該分子鋳型はタンパク質であり、当該分子鋳型との複合体として線状ポリマーを生成し、当該線状ポリマーの少なくとも一部は前記分子鋳型の少なくとも一部に対して相補的であり；そして
ｃ）前記重合系から前記複合体を分離し、分子鋳型を除去し、そして可溶性相補性ポリマーの溶液を調製する、ここで、当該可溶性相補性ポリマーの少なくとも一部は前記鋳型の少なくとも一部に対して相補的である；
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記鋳型としてのタンパク質が糖タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機能的モノマーがアミノ酸である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記重合がアミド−生成縮合剤により行われる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記鋳型の除去が、１又は複数の手段、すなわち溶液のpHの変化、溶液のイオン強度の変化、及び／又は尿素、グアニジン又は前記ポリマーよりも強く前記鋳型と相互反応する物質の添加による前記ポリマーからの前記鋳型の分離を包含する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型の除去が、１又は複数の濾過、電気泳動、クロマトグラフィー分離、洗浄又は遠心分離を用いて行われる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記段階（ｃ）に続いて、（ｄ）配列決定を行う請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記段階（ｄ）に続いて、（ｅ）前記決定された配列及び／又はその変異体のすべて又は一部を有するポリマーの合成を行う請求項７に記載の方法。
【請求項９】
薬剤としての、触媒化学における受容体特異的リガンドとしての、又は生物技法又は医薬又は食品産業における分離の実施への使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により生成されるポリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野：
本発明は、分子インプリント（imprinted）インプリントポリマー（“MIP”）、それらの調製のための鋳型重合方法、及びそれらの使用に関する。好ましい態様においては、MIPは、例えば薬剤、エフェクター、モデュレーター又はインヒビターとして、生物学的に活性である。特にことわらない限り、“ポリマー”とは、ダイマー、オリゴマー及び高級ポリマー、並びに混合物を包含する。
【０００２】
背景技術：
鋳型重合においては、ポリマー受容体（レプリカ又はMIP）の形成は、もう１つのポリマー又は低分子量有機物質（鋳型）の存在下で進行する。重合の開始の前及び重合の間、成分（一般的には、モノマー）は、鋳型のサイズ、極性及び官能性に従って、鋳型分子のまわりでそれら自体、空間的に分布する（自己集成工程）。モノマーは、直鎖又は硬質立体網状構造に重合される。
有機鋳型の存在下での珪酸重縮合の最初の例は、Polyakov 及び共同著者により提供された（文献10−12, 19を参照のこと）。彼らの実験において調製されたシリカゲルは、鋳型分子の構造に対して特異的な構造を保持した。
【０００３】
ビニル又はアクリル酸モノマーに基づく鋳型、又は分子インプリント重合に関する後での実験は、Wolf and Mosbach (文献に2, 5, 13, 16−18を参照のこと)のグループにより実施されている。インプリントポリマーに基づいて溶媒、触媒及びセンサーの調製を記載するいくつかの特許が、最近発行されている（アメリカ特許第5110833号、第5630978号、第5728296号、第5756717号、WO9641173号を参照のこと）。
【０００４】
もう１つのアプローチは、鋳型分子の存在下で、タンパク質、例えば酵素を、それらの性質、例えば特異性及び活性の変更のために改良することを包含する（文献１及びデンマーク特許第19627162号を参照のこと）。
従来のアプローチは、水及び有機溶媒に不溶性である、高く架橋されたインプリントポリマーの生成を包含する。それらの固有の不溶性のために、薬理学及び医薬へのそれらの材料の使用可能性は、制限される。バックグラウンド材料は、次の文献に見出され得る。
【０００５】
１．Dabulis, K., など., “Molecular Imprinting of proteins and other Macromolecules Resulting in New Adsorbents,” Biotechnol. Bioeng., 39 (2): 176-185 (1992).
２．Haupt, K., Dzgoev A., and K. Mosbach. Assay System for the Herbicide 2, 4-D Using a Molecularly-Imprinted Polymer as an Artificial Recongnition Element. Anal. Chem. 70. 628-631 (1998).
３．Holliger, P., など., “Artificial Antibodies and Enzymes; Mimicking Nature and Beyond,” Trends in Biotechnology, 13 (1): 7-9 (1995).
４．Illman, D., “Polymer Mimics Antibody in Drug Assay,” Chemical & Engineering New, 71 (9): 30-31 (1993).
５．Mosbach, K., “Molecular Imprinting,” Trends in Biochem. Sci., 19(1): 9-14, (Jan. 1994).
【０００６】
６．Noronha-Blob, L. など., “Uptake and Fate of Water-soluble, nondegradable Polymers with Antiviral Activity in Cells and Animals,” J. Med. Chem., 20 (3): 356-359 (1977).
７．Ottenbrite, R.M., など., “Macrophage Activation by a Series of Unique Polyanionic Polymers,” J. Macromol. Sci. Chem., H. K. Frensdorff, ed., A25 (5-7): 873-893 (1988).
８．Ottenbrite, R.M., “Introduction to Polymers in Biology and Medicine,” in Anionic Polymeric Drugs (Polym. Biol. Med.), L.G. Dnaruma, R.M. Ottenbrite, and O. Vogl, eds., John Wiley & Sons, New York, Vol. 1, pp. 1-20 (1980).
９．Piletsky, S.A., など. Optical detection system for triazine based on molecularly-imprinted polymers. Anal. Lett. 30, 445-455 (1997).
１０．Polyakov, M. Adsorption properties and structure of silica gel. Zhur. Fiz. Khim. 2, p. 799. (1931).
【０００７】
１１．Poyakov, M.V., L.P. Kuleshina, and I.E. Meimark. On the dependence of silica gel adsorption properties on the character of its pprosity. Zhur. Fiz. Khim. 10:100-112 (1937).
１２．Polyakov, M.V., P.M. Stadnik, M.W. Paryckij, I.M. Malkin, and F.S. Duchina. On the structure of silica. Zhur. Fiz. Khim. 4, p. 454 (1933).
１３．Ramstrom, O., Ye L., and Mosbach K. Artificial Antibodies to Cortioostaroids Prepared by Molecular Imprinting. Chem. & Biol. 3 (6): 471-477 (1996).
１４．Shea, K.J., など., “Molecular Recognition on Synthetic Amorphous Surfaces. The Influence of Functional Group Positioning on the Effectiveness of Molecular Recognition,” J. Am. Chem. Soc., 108 (5): 1091-1093 (1986).
１５．Tahmassebi, D.C., など., “Molecular Imprinting Synthesis of a 3-Helix Bundle Proteins on Modeified Silica Gel,” Abstr. Pap. Am. Chem. Soc., Vol. 204, No. 1-2: 314, 204th American Chemical Society National Meeting. Washington, D.C. (Aug. 23-28, 1992).
【０００８】
１６．Vlatekis, G., など., “Drug Assay Using Antibody Mimics Made by Molecular Imprinting,” Nature, 361 (18): 645-647 (1993).
１７．Wulff, G., “Molecular Imprinting in Synthetic Polymers, Models for the Receptor Site in Enzymes,” Makromol. Chem., Macromol. Symp., 70/71: 285-288 (1993).
１８．Wulff, G., など., “Enzyme-Analogue Built Polymers, 26: Enantioselective Synthesis of Amino Acids Using Polymers Possessing Chiral Cavities Obtained by an Imprinting Procedure with Template Molecules,” Makromol. Chem., H.-G. Elias, T. Tsuruta, eds., 190 (7): 1727-1735 (1989).
１９．Vysotskii, Z.Z., and M.V. Polyakov. The preparation of specific adsorbents. Zhur. Fiz. Khim. 30: 1901-1902 (1956).
【０００９】
発明の開示：
第１の観点においては、本発明は、
ａ）分子鋳型の存在下で機能的モノマーの鋳型により指令された重合をもたらし、それにより、前記鋳型の少なくとも一部に対して相補的であるその少なくとも一部のポリマーを生成し；そして
ｂ）前記相補的ポリマーであるか又はそれに由来し、そして前記鋳型の少なくとも一部に対して相補的である少なくとも一部を含んで成る可溶性ポリマーの溶液を調製する段階を含んで成る方法を提供する。
【００１０】
得られる溶液は、鋳型分子に結合するよう適合され得る、ポリマー、オリゴマー及びダイマーから選択された１又は複数の種を含む。
前記鋳型は、分子又はより大きな、一般的に生物学的システムであり得る。それは好ましくは、生物学的受容体、核酸、細胞、ウィルス、微生物、組織サンプル、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、酵素、ステロイド、免疫制御剤、ホルモン、ヘパリン、抗生物質、ビタミン又は薬剤である。それは適切には、200〜3,000,000の絶対分子量を有する。
【００１１】
好ましくは、段階（ｂ）の可溶性ポリマーは、薬剤、エフェクター、モジュレーター又はインヒビターとして、生物活性を有する。好ましくは、ポリマーは、水性媒体において生物学的活性を示すために十分な程度、水溶性である。
可能な機能的モノマーは、ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、炭水化物、フェノール、複素環式化合物、アニリン及びそれらの誘導体を包含する。好ましいモノマーは水溶性である。
重合は、モノマー、例えばエチレン系不飽和モノマーのための遊離基開始剤；アミノ酸のための縮合剤、例えばカルボジイミド；ヌクレオシド及びヌクレオチドのためのポリメラーゼ酵素に適切な条件を用いてもたらされ得る。適切な場合、架橋剤が使用され得る。
【００１２】
段階（ｂ）は、（ｉ）前記鋳型分子及び相補的ポリマーを含んで成る複合体を、前記重合システムから分離し；そして（ii）前記鋳型分子を除去することを含んで成る。複合体の分離は、溶液のpHの変化、溶液のイオン強度の変化、及び/又は尿素、グアニジン、又は前記ポリマーよりも強く前記鋳型と相互反応する物質の添加により達成され得る。
鋳型の除去は、濾過、電気泳動、クロマトグラフィー分離、洗浄又は遠心分離により達成され得る。
溶液の調製は、適切な溶液、及び不溶性粒子からの前記溶液の分離を包含する。従って、溶解され、合成された分子は、例えば遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動又は透析により分別され、そして/又は精製され得る。
【００１３】
好ましい型の態様においては、MIPは、１組の異なった官能モノマー、例えばアミノ酸、又はヌクレオシド又はヌクレオチドから形成された線状ポリマーである。次にMIPの性質は、その配列により決定され得る。段階（ａ）及び（ｂ）に続いて、（ｃ）配列決定、及び任意には、（ｄ）前記決定された配列及び/又はその変異体のすべて又は一部を有するMIPの合成を伴う。
本発明のMIPは、薬理学及び医学における薬剤として、分析化学における受容体特異的リガンドとして、又は生物技法、又は医薬及び食品産業における分離の実施への使用のために使用され得る。
【００１４】
本発明は、鋳型重合を用いての生物学的活性分子（薬剤、エフェクター、モジュレーター、インヒビター）の合成方法、及び分析化学、薬理学、医学、及び食品、生物工学及び医薬産業へのそれらの適用を可能にする。特に、生物学的活性分子は、ａ）生物学的受容体、酵素、核酸、細胞、ウィルス、微生物、組織サンプル又は薬剤のまわりでの機能的モノマーの重合；ｂ）形成されるポリマー鋳型の分離、及び鋳型分子の除去；ｃ）必要なら、合成されたレプリカの溶解により合成され得る。このアプローチは、もう１つの鋳型、通常薬剤、例えばヘパリンの存在下で調製された、生物学的活性の分子が、鋳型−インプリントポリマーの存在下で調製された、WO特許第9640822号及びアメリカ特許第5630978号に記載される方法とは異なる。得られるレプリカは、元の薬剤分子の構造に類似する。この手段で合成された分子の活性は元の鋳型の活性よりもより明白であることは、ほとんど予測されない。
【００１５】
本明細書に記載される方法においては、合成された分子は、元の鋳型の構造に対して相補的な構造を有し、そして適度に高い親和性を伴なってそれを結合する能力を有する。それらの合成分子、特にポリマーは、ランダムに合成されたポリマーの親和性及び特異性よりも卓越した、予測される親和性及び特異性を有し、そして特異的に企画された別々の有機構造体よりも容易に調製され得る（文献６−８を参照のこと）。
【００１６】
本発明に記載のようにして合成された分子（ダイマー、オリゴマー、ポリマー又はそれらの混合物）は、薬理学及び医薬における薬剤として、分析化学（センサー、アッセイ）における受容体−特異的リガンドとして、及び生物工学、医薬及び食品産業における調製のために使用され得る。薬剤企画におけるこれまでの努力は典型的には、多数の化学構造の構造体−活性関係の厄介な研究に基づかれて来た。本発明は、従来の薬剤企画及び発現方法に比較して、高い有益性のものであるべきである生物学的活性物質を企画する、より単純且つ直接的な方法を記載する。
【００１７】
本発明を実施するための態様：
従来の鋳型重合は、小さな有機物質、例えば薬剤のまわりでの硬質ポリマー網状構造の形成を包含する。この手段で調製される分子インプリントポリマー（MIP）は、鋳型として使用される薬剤分子に対して特異的な天然の受容体の合成模倣物に類似する。このアプローチを用いれば、大きな分子、例えばタンパク質及び酵素の使用に起因するポリマーはまた、生物学的活性を欠いている不溶性ポリマー生成物を生成する。
【００１８】
本発明は、鋳型、特に大きな分子、例えば受容体、酵素又は核酸の存在下で調製される可溶性MIPの形成を記載する。MIP調製への従来のアプローチに比較して、この手段で調製されたポリマーは、鋳型のエフェクター（活性化因子、インヒビター又は基質）に類似し、そして生物学的活性を有することができる。例えば、そのようなポリマーは、薬理学及び医学において薬剤として使用され得る。本発明を記載する態様においては、用語“生物学的活性物質”、“レプリカ分子”及び“MIP”とは、同じ意味を有する。
【００１９】
第１の態様は、生物学的受容体、核酸、細胞、ウィルス、微生物、組織サンプル、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、酵素、ステロイド、免疫制御剤、ホルモン、ヘパリン、抗生物質、ビタミン又は薬剤である鋳型の存在下での生物学的活性分子（MIP）の調製を記載する。
通常、適切な溶媒、好ましくは水に溶解性の鋳型が機能的にモノマーと共に混合され、ここで前記モノマーの１つは架橋剤及び開始剤であり得る。重合は、加熱又はUV照射により開始され、そして通常１−24時間を要する。
【００２０】
第２様態は、MIP調製のために使用され得るモノマーを記載し、そして次のものを包含する：ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、炭水化物、フェノール、複素環式化合物、アニリン及びそれらの誘導体。架橋するモノマーはまた、得られるレプリカ分子の構造を、鋳型の構造に対して相補的のまま存在するよう、固定し、又は安定化することが必要である場合にも使用され得る。水に溶解性であるメチレンビスアクリルアミド（BAA）及びN,N’−ビスアクリルピペラジン（BAP）が本明細書において使用され得る。
【００２１】
鋳型及びレプリカ分子間で形成される複合体及びレプリカ分子の分離、及び合成された生物学的活性ポリマー分子の溶解は、ポリマー粉砕により、溶液pHの変化により、イオン強度により、又は尿素、グアニジン、又はレプリカよりも強い鋳型と相互作用する物質の添加、濾過、電気泳動、クロマトグラフィー分離、洗浄、遠心分離透析を通して達成され得る。この段階は、インビトロ又はインビボで、他の分子とのその相互作用を活性化するか又は阻害するために、鋳型に対して高い親和性を有し、そして鋳型と相互作用することができるMIPの水−又は有機溶解性画分を調製するために必要である。
【００２２】
最後の態様は、薬理学及び医学における薬剤としての、分析化学における受容体―特異的リガンドとしての（センサー又はアッセイにおける認識成分としての使用のための）、又は生物工学、医薬及び食品産業における分離のための、合成された、生物学的分子の適用を記載する。本発明は、さらに次の非制限例により記載されるであろう。
【００２３】
実施例
１．D１タンパク質−天然の除草剤受容体に対する特異性を有する水溶性MIPの合成：
ａ）D１タンパク質の調製：
成熟グリーンピース葉を集め、そして蒸留水により洗浄し、フィルター紙上で乾燥し、そして液体窒素下で凍結した。凍結された葉を、0.4Mのサッカロース、50mMのトリス−HCl、pH8.0、10mMのNaClを含む冷単離緩衝液を含む50mlの遠心分離管に配置した。葉を、Psyscotronホモジナイザーを用いて、高速での３〜５秒の破壊により均質化した。この均質物を、絞らないで、２種の篩（メッシュ番号32、20）を通して濾過し、そして1000gで15分間、4℃で遠心分離した。
【００２４】
ペレットを、洗浄−緩衝液（50mMのトリス−HCl, pH8.0, 10mMのNaCl）に再懸濁し、そして同じ条件下で遠心分離した。この段階を２度、反復し、次にクロロプラスト膜を含むペレットを、少量の洗浄−緩衝液により均質化し、そして予備冷却された超音波槽において30分間、十分な出力で音波処理した。その懸濁液を混合し、そして等体積の冷ｎ−ブタノール（−20℃）と共に振盪した。相を、1000gでの５分間の遠心分離により分離した。タンパク質を含む水相を集めた。タンパク質及び脂質の分離を、この段階を３度、反復することによって改良した。
【００２５】
粗D1タンパク質をさらに、逆相クロマトグラフィーにより精製した。クロマトグラフィー処理を、50mMのトリス−HCl（pH8.0）中、イソプロパノール（0−30％）の線状グラジエントによりC18カラム上で行った。D1タンパク質を、高濃度のイソプロパノールで溶出し、凍結乾燥し、そして12−20℃で貯蔵した。
【００２６】
ｂ）MIP合成：
凍結乾燥されたD1タンパク質10mgを、1mlのヘキサンにより３度抽出し、除去剤−結合部位からプラストキノンを除去し、194mgのビスアクリロイルピペラジン（BAP）又は60mgのメチレンビスアクリルアミド（BAA）、6.9mgのウロカニン酸、10mgの過硫酸アンモニウムと共に混合し、水200μlに溶解した。重合を、30％TEMED溶液２μlの添加により開始し、そして80℃で12時間、進行せしめた。次に、得られるポリマーを、0.1MのHCｌにより鋳型から洗浄し、注意にして粉砕し、そしてガラスフィルターを通して濾過した。
【００２７】
濾液を集め、そして回転蒸発器を用いて遠心分離した。対照（ブランク）ポリマーを同じ手段（但し、D1タンパク質の不在下で）で調製した。濃縮されたポリマー溶液を、マクロフィルター（Ultra−Spin Mocrofilter, Roth, Germany）を通して遠心分離し、５kDa以下、５−10Kda及び10kDa以上の分子量を有する分子を分離した。すべての溶液の工学密度を260nmで測定し、そして蒸留水により、分析のための等値に調節した。
【００２８】
２．ポリマーの親和性の分析：
ａ）固定されたD１タンパク質による親和性カラムの調製（D1−カラム）：
遊離カルボキシル基を有する5gのCH−Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals) を、0.01Mのリン酸緩衝液（pH7.5）にソーキングした。抽出されたプラストキノンを有するD1タンパク質100mgを、1mMのモノホリンエタンカルボジイミド及び0.1mMのN−ヒドロキシスクシンイミドを含む同じ緩衝液に溶解し、セファロースに添加し、そして＋4℃で一晩、放置した。固定されたD1タンパク質を有するカラムを、５体積の25mMのリン酸緩衝液（pH7.5）により洗浄し、そして使用の前、＋4℃で貯蔵した。
【００２９】
ｂ）D1−カラム上でのBAP−基材のBIPのクロマトグラフィー処理：
カラムを、室温で0.3ml/分の流速で流れる流出液（25mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5）により平衡化した。溶出液におけるポリマー溶液をカラム中に注入し、そして保持時間及びピークの領域を測定した。D1−カラム上でのMIP及びブランクポリマーの溶出プロフィールを図２に示す。非相互作用サンプル−BAPの溶出を9分で観察した。ブランク及びインプリントされたポリマーについての用量因子は下記の通りである：
【００３０】
KBlank＝0.56（300μl）；５日後、KBlank＝0.71（30μl）
KMIP＝1.11 （300μl）：５日後、KMIP＝1.0（30μl）。
保持時間は、ポリマー配座変化又は部分ポリマー加水分解のいずれかのために、時間と共に変化する。MIP及びブランクポリマーについての分離因子は、それらの実験において、α＝1.98からα＝1.4まで変化する。すべての場合、インプリントポリマーは、ブランクポリマーに対してよりもD1−カラムに対してより強い親和性を有した。
【００３１】
ｃ）D1−カラム上でのBAA−基材のMIPのクロマトグラフィー処理：
カラムを、室温で0.3ml/分の流速で流れる流出液（25mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5）により平衡化した。溶出液におけるポリマー溶液をカラム中に注入し、そして保持時間及びピークの領域を測定した。D1−カラム上でのMIP及びブランクポリマーの溶出プロフィールを図３に示す。非相互作用サンプル−BAPの溶出を10分で観察した。ブランク及びインプリントされたポリマーについての用量因子は下記の通りである：
KBlank＝0.6（300μl）；KMIP＝0.8（300μl）。
ポリマーについての溶出時間の変化は観察されなかった。MIP及びブランクポリマーについての分離因子は、それらの実験において、α＝1.33として決定された。再び、インプリントポリマーは、ブランクポリマーに対してよりもD1−カラムに対してより強い親和性を有した。
【００３２】
３．合成されたポリマーの生物学的活性の分析。チラコイド膜の活性に対するポリマーの影響：
チラコイド膜を、緩衝液（0.35Mのサッカロース、10mMのNaCl、50mMのトリス−HCl、pH7.5、１％のBSA）により、30μgのクロロフィル/mlに希釈した。スクロース（0.35M）及びBSA（１％）を含むチラコイド膜溶液（プローブ中、１μgのクロロフィル）30μlを含むサンプルを、マイクロプレートウェルにおいて、ポリマー溶液（20μl）、及びトリス−HCl緩衝液（0.1M、pH7.5）中、DPIP（100μl、0.3mM）と共に混合した。サンプルを、100ワットランプにより10分間、照射し、そして吸光度を、Dinatechリーダー（Germany）を用いて、530nmで測定した。チラコイド膜調製物の活性を、還元されたDPIPの量、クロロフィルムの濃度及び照射の時間に基づくデータから計算された。
【００３３】
MIPがチラコイド活性における明白な上昇（30μg/mlのポリマー濃度に関して45％まで）を付与することが示された（図４及び５）。実質的な効果は、ブランクポリマー及び個々のモノマーに関して観察されなかった。前記効果は、除草剤−D1の合成インヒビターにより示されるそれらの効果に対抗する（図５）。異なったサイズを有する画分が異なった活性を有することは、興味あることである。生物学的活性を有するために、MIPが最適サイズを有すべきであることを示す最良の結果が、５−10kDaの画分に関して得られた。小さ過ぎるか又は大き過ぎる粒子は、生物学的効果を示すことはできないであろう。
【００３４】
４．グリコシル化されたヘモグロビンに対して特異的なペプチドリガンドの合成及び調査：
50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）2ml中、精製された、グリコシル化されたヘモグロビン（HbA1C, 4mg）を、20個の天然のアミノ酸（それぞれ2mM）の溶液2.5mlと共に混合した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の220mM溶液0.5mlを、個々の反応容器に添加した。鋳型の存在下でのアミノ酸重合を４時間、行った。ブランクポリマーを調製するために、同じ反応を、ヘモグロビンの不在下で行った。EDC、非反応アミノ酸及び低親和性ペプチドを除去するために、反応混合物を、50kDaの透過性Amicon膜（Centriplus YM-50, Millipore）を通して濾過した。フィルター上で濃縮されたヘモグロビンを、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液により２度、洗浄した。
【００３５】
塩酸を用いて、インプリントされたヘモグロビンからペプチドを除去した。５MのHCl 10μlを、2mlのヘモグロビン溶液に添加し、pHを3.0に変えた。その混合物を、10分間、音波処理し、そして50kDaのAmicon膜を通して再び濾過した。この時点で膜を通過したペプチドを集めた。溶液を、4mの水酸化ナトリウム5μlによりpH7.5に調節した。
【００３６】
合成されたペプチドの親和性を、Surface Plasmon Resonanse (SPR) の技法を用いて測定した。HbA1C及びHbA0を、CM5 Biacoreチップ（Biacore，Uppsala, Sweden） と共にEDC/NHS化学を用いて、ペプチド縮合を通して連結した。ヘモグロビン免疫化のレベルは、相応じて100RU及び7000RUであった。免疫化レベルの有意な差異にもかかわらず、MIPは、HbA1C表面に対して有意に強い親和性を有することが示された（データは示されていない）。
【００３７】
グリコシル化されたヘモグロビンについてのMIPの特異性を改良するために、3mgのHbA0を、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中、ペプチド溶液2mlに添加して室温で１時間インキュベートした。結合されたペプチドを有するHbA0を、50kDaのAmicon膜を用いての濾過により除去し、HbA1Cに対して非特異的であるペプチドを排除した。HbA1Cのみに対しての親和性を有するペプチドを含む画分を、Biocoreを用いて分析した。
【００３８】
HbA1C, HbA0及びBSAを、たぶん等しい固定レベル（110RU, 1050RU及び1020RU）で、CM5 Biocore チップ上に固定し、抽出されたMIPペプチドの選択性を評価した。結合分析は、HbA1Cに関しての後−スクリーンされた画分の親和性がプレ−スクリーンされた画分の親和性に比較して、高められたことを明確に示す（図７を参照のこと）。HbA1C表面との結合は、12.5RUとして評価され、そしてHbA0に関しては5.9RUであり、そしてBAAに関しては0であった。
【００３９】
その結果は、アミノ酸がインプリント重合においてモノマーとして使用され得ることを示す。合成されたMIPは、ランダム合成された（ブランク）ポリマーに比較して、鋳型に対して増強された特異性及び親和性を有する。
【００４０】
５．酵母に対して特異的なペプチドリガンドの合成及び調査：
50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）2ml中、4mgの精製された酵母膜（スポロボロマイセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus））を、20個の天然のアミノ酸（それぞれ2mM）の溶液2.5mlと共に混合した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の220mM溶液0.5mlを、反応容器に添加した。鋳型の存在下でのアミノ酸重合を４時間、行った。ブランクポリマーを調製するために、同じ反応を、鋳型の不在下で行った。EDC、反応されなかったアミノ酸及び低親和性ペプチドを除去するために、反応混合物を、50kDaの透過性Amicon膜（Centriplus YM-50, Millipore）を通して濾過した。フィルター上で濃縮された細胞膜を、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液により２度、洗浄した。
【００４１】
塩酸を用いて、酵母膜上に吸着されたペプチドを除去した。５MのHCl10μlを、2mlの酵母膜溶液に添加し、pHを3.0に変えた。その混合物を10分間、音波処理し、そして50kDaのAmicon膜を通して再び濾過した。この時点で膜を濾過したペプチドを集めた。その溶液を、4Mの水酸化ナトリウム5μlによりpH7.5に調節した。
【００４２】
合成されたペプチドを、0.6, 6, 25, 50, 100μg/mlの濃度での酵母と共に地に添加した。酵母増殖を、405nmで培養物の光学密度を測定することによってモニターした。増殖工程に対する合成されたペプチドの影響が図８に示される。MIPペプチドについて観察される障害は、それらの生物学的活性の明白な表示である。この現象の性質は、MIPペプチドによる膜表面上に暴露される受容体の特異的障害により説明され得る。この効果が、その特異性を示すE.コリ又はバチルス種に比較して、酵母膜の場合、より明白であったことは重要である。酵母増殖における変化は、ブランクペプチドの存在下では観察されなかった。
【００４３】
６．トリプシンの存在下で調製されたペプチドリガンドの合成及び調査：
50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）2ml中、トリプシン4mgを、20種の天然のアミノ酸（それぞれ、2mM）の2.5ml溶液と共に混合した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の220mM溶液0.5mlを、反応容器に添加した。鋳型の存在下でのアミノ酸重合を、４時間、行った。ブランクのポリマーを調製するために、同じ反応を、鋳型の存在下で行った。EDC、反応されなかったアミノ酸及び低親和性ペプチドを除去するために、反応混合物のpHを、塩酸アリコートを添加することによって3.0に調節した。
【００４４】
すぐに、その混合物をHPLC中に注入し、そして10mMのリン酸ナトリウム緩衝溶液（pH7.4）によりSuperdex Peptideカラムを用いて分離した。トリプシン活性に対するペプチド画分の影響を分析した（図９）。最初の３個の画分のみが、溶液に存在するトリプシンの残留量に起因する酵素活性を有したことは重要である。画分の残りは、それら自体、トリプシン酵素活性を有さないが、しかしそれらは、それらに添加されたトリプシンを実質的に活性化することができた。この効果は、インプリントペプチドの存在下でトリプシン構造の部分的安定化により説明され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、鋳型−受容体の存在下での鋳型重合のスキームを示す。鋳型−特異的ポリマーMIPは、１）受容体表面のまわりでのモノマーの自己アッセンブリー；２）ラジカル重合、アニオン又はカチオン重合、又は重縮合によるモノマーの重合；３）鋳型−ポリマー複合体の分離及びレプリカ可溶化（データは示されていない）の３種の段階で形成される。
【図２】  図２は、25mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中、固定されたD1タンパク質を有する、BAP−基材のポリマーカラムからのクロマトグラフィー対応を示す。流速−0.3ml/分。注入−濃度1mg/mlでのポリマー溶液300ml。ブランク−非インプリントポリマー：MIP−インプリントポリマー。
【図３】  図３は、24mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中、D1−カラム上でのBAA−基材のポリマーからのクロマトグラフィー応答を示す。0.3ml/分。注入−濃度1mg/mlでのポリマー溶液300ml。ブランク−非インプリントポリマー；MIP−インプリントポリマー。
【図４】  図４は、インビトロ  クロロプラスト活性に対するBAP−基材のポリマーの影響を示す。反応混合物（300μlの体積）は、クロロプラスト懸濁液（１μgのクロロフィルム）及び0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中、９μgのDPIPを含む。
【図５】  図５は、インビトロ  クロロプラスト活性に対するBAA−基材のポリマーの影響を示す。反応混合物（300μlの体積）は、クロロプラスト懸濁液（１μgのクロロフィルム）及び0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中、９μgのDPIPを含む。
【図６】  図６は、クロロフラスト活性に対する、ポリマー画分（BAP基材のポリマー）及びモノマーBAP及びウロカニン酸（UA）のサイズの影響を示す。ブランク−サイズ５−10kDaを有するブランクポリマーの画分。反応条件は上記と同じである。
【図７】  図７（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれ、グリコシル化された及びグリコシル化されていないヘモグロビン及びBSAに対するMIPペプチドの結合を示す表面プラスモン共鳴スペクトルである。
【図８】  図８は、ブランクペプチド、又は酵母膜に対して相補的なペプチドMIPの存在下での酵母の増殖を示す。光学密度−対−時間のグラフである。
【図９】  図９は、分別されたMIPペプチドにより影響される場合のトリプシン活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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