(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインに介在ペプチドリンカーを用いずに直接つながれた可溶性タンパク質を含む融合タンパク質であって、該可溶性タンパク質がエリスロポエチン（ＥＰＯ）であり、該免疫グロブリンドメインは可変領域を含まず、前記融合タンパク質はＥＰＯ依存性細胞アッセイで１０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ50を有する融合タンパク質。
【請求項２】
ＩｇドメインがＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣＨおよびＩｇＧ−ＣＬから成る群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の融合タンパク質を生産する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸で、宿主細胞を形質移入または形質転換する工程と；
（ｂ）宿主細胞を培養する工程と；
（ｃ）宿主細胞によって発現された融合タンパク質を収集する工程と；から成る方法。
【請求項５】
請求項１に記載の融合タンパク質を精製する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の融合タンパク質を含有する組成物を得る工程と；
（ｂ）カラムクロマトグラフイーにより混在物質から融合タンパク質を分離する工程と；
から成る方法。
【請求項６】
サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、金属キレート化クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび固定化染料アフィニティークロマトグラフィーから選択されたカラムクロマトグラフイーにより融合タンパク質を混在物質から分離する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、一般にキメラタンパク質を作成する方法に関し、より詳細には、組換え免疫グロブリン融合タンパク質を作成する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質製剤の循環半減期の延長は、患者およびヘルスケア供給者にとっての関心事である。長期作用型タンパク質治療物質は、注入の回数を少なくすべきであると共に、より短い循環半減期を有するタンパク質よりも低用量で有効であり得る。腎臓によるタンパク質の除去を防止することでタンパク質の有効径を増大させると、その循環半減期が増加し得ることが知られている（Ｋｎａｕｆら、１９８８；Ｍａｈｍｏｏｄ，１９９８）。タンパク質の有効径を増大させるのに使用可能な１つの方法は、組換ＤＮＡ技術を使用して、問題のタンパク質を別のタンパク質に共有結合で融合することである。大きな融合タンパク質は非融合タンパク質よりも長い循環半減期を有していることが多い（Ｃａｐｏｎら、１９８９；Ｚｅｎｇら、１９９５）。融合タンパク質を作成するために頻繁に使用されるタンパク質の１つのクラスは免疫グロブリン（Ｉｇ）であり、免疫グロブリンは血液の主な成分である。免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ（Ｒｏｉｔｔら、１９８９）として知られている様々なクラスで生じる。ヒトＩｇＧはさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４という、様々なタイプに分けることができる。これらのＩｇＧは別個の遺伝子産物である。ＩｇＧ１は血清中で最も一般的な免疫グロブリンであり（ＩｇＧ全体の７０％）、２１日の血清半減期を有する（Ｃａｐｏｎら、１９８９；Ｒｏｉｔｔら、１９８９）。それほど量は多くないが、ＩｇＧ４も２１日という長い循環半減期を有している（Ｒｏｉｔｔら、１９８９）。
【０００３】
ヒトＩｇＧは、２つの重鎖にジスルフィド結合された２つの軽鎖から成る多重ドメイン構造を有している（本明細書では「四量体」と称する；Ｒｏｉｔｔら、１９８９に概説）。各軽鎖および各重鎖は、定常領域とつながれた可変領域を含んでいる。可変領域は、軽鎖と重鎖のＮ末端の端部に位置する。重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインにさらに分けられる。ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは特有の構造へと折り重なる別個のドメインである。ヒンジ領域はかなりの柔軟性を持つ領域である。ヒンジの柔軟性はＩｇＧアイソタイプに依存して変化し得る（Ｏｉら、１９８４；Ｄａｎｇｌら、１９８８）。ＩｇＧ重鎖は通常、ヒンジ領域にあるシステイン残基によってジスルフィド結合した二量体を形成する。様々な重鎖ドメインが、ＩｇＧ遺伝子中の異なるエクソンによってコードされている（Ｅｌｌｉｓｏｎら、１９８１；１９８２）。
【０００４】
これまでにタンパク質は、可変領域と定常領域の接合点で（従って本明細書でＩｇＧ−ＣH融合物と称するＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む）、ＣＨ１とヒンジドメインの接合点で（従って本明細書でＩｇＧ−Ｆc融合物と称するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む）、および重鎖のＣ末端で（本明細書でＩｇＧ−Ｃ末端融合物と称する）ＩｇＧ、ＩｇＧの重鎖の定常領域と融合されている。
【０００５】
ＩｇＧ融合タンパク質は、細胞表面受容体の細胞外ドメインに関して最も頻繁に作成されてきた（ＣｈａｍｏｗおよびＡｓｈｋｅｎａｋｉ、１９９６に概説）。組換ＤＮＡ技術を使用してヒトまたはマウスＩｇＧのＣHまたはＦcのドメインと結合された細胞表面受容体の細胞外ドメインの例としては、ＣＤ４（Ｃａｐｏｎら、１９８９）、腫瘍壊死因子受容体（Ｍｏｈｌｅｒら、１９９３）、ＣＴＬＡ４（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１ａ）、ＣＤ８０（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１ｂ）およびＣＤ８６（モートンら、１９９６）が挙げられる。受容体の細胞外ドメインは他のアミノ酸（つまり受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内のドメイン）に対して融合された時に機能するよう発展したため、細胞外ドメインがＩｇＧドメイン等の他のタンパク質ドメインへ融合された時に細胞外ドメインが自身のリガンド結合特性を保持していることは驚くことではない。にもかかわらず、特定の細胞外ドメインに関するリガンド結合特性の差が示されてきた。例えば、ヒトＩｇＧ１−ＣHに対するＣＤ４の細胞外のドメインから構成された融合タンパク質では、ＣＤ４リガンドｇｐ１２０に対して、非融合ＣＤ４よりも２倍親和性が減小している（Ｃａｐｏｎら、１９８９）。
【０００６】
ＩｇＧドメインに融合されて十分な生物活性を保持する、例えば増殖因子、サイトカイン、およびその同等物のような通常可溶性のタンパク質のさらに少数例がある。可溶性タンパク質は他のタンパク質に融合された時に機能するようには発展しなかったので、可溶性タンパク質が他のタンパク質に融合された時に、生物活性を保持すると予想する論拠はない。実際、多くの公表された例において、融合サイトカイン／増殖因子の生物活性は、非融合サイトカイン／増殖因子に対して大いに減小した。別のタンパク質に融合された時にサイトカイン／増殖因子が適切に機能するかどうかは多くの要因によって左右されるが、それには、サイトカイン／増殖因子のアミノ末端またはカルボキシ末端がタンパク質の表面に露出されているかどうか、そのような領域がサイトカイン／増殖因子の生物活性にとって重要であるかどうか、また、別のタンパク質に融合された時にサイトカイン／増殖因子が適切に折り重なることができるかどうか、ということが挙げられる。まさにその性質により、そのような要因は、非常にタンパク質特異的であり、かつ予測不能である。調べたいくつかの増殖因子／サイトカイン融合タンパク質に関する結果から、融合タンパク質のタンパク質特異的な生物活性がいかなるものであるかが示された。多数のケースでは融合増殖因子／サイトカインの生物活性が劇的に減小するが、少数のケースでは増殖因子／サイトカインの生物活性が十分に保持される。融合タンパク質の生物活性が著しく減小したあるケースにおいて、サイトカイン／増殖因子とＩｇＧドメインの間の接合点でアミノ酸を修飾すると、生物活性が改良された融合タンパク質が得られた（Ｃｈｅｎら、１９９４）。この同じ修飾は、同じＩｇＧドメインに融合された別のサイトカインの生物活性は改良しなかった。［（Ｃｈｅｎら、１９９４）。
【０００７】
これまでにＩｇＧに融合された増殖因子には、ケラチン生成細胞増殖因子（ＫＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびインシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）が含まれる。ＫＧＦマウスＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質が、ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅら（１９９５）により作成された。インビトロバイオアッセイでＢａｌｂ／ＭＫ細胞の増殖を刺激した際、モル基準で、融合タンパク質は、ＫＧＦよりも４〜５倍活性が低かった。また、ＫＧＦ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合物は、ＫＧＦよりも、ＫＧＦ受容体に対する親和性が約１０倍低かった。繊維芽細胞増殖因子−ヒトＩｇＧ−Ｆｃ融合物が、Ｄｉｋｏｖら（１９９８）により作成された。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成を刺激した際、モル基準で、ＦＧＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロアッセイでＦＧＦよりも活性が約３倍低かった。ＳｈｉｎおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９０）は、ＩｇＦ−ＩをＩｇＧのＣ末端に融合し、ＩＧＦ−Ｉ−ＩｇＧ  Ｃ末端融合タンパク質が、ＩＧＦ−Ｉの１％未満のインビトロ生物活性を有することを見出した。
【０００８】
これまでにＩｇＧドメインへ融合されたサイトカインの例には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＧＭ−ＣＳＦが含まれる。Ｌａｎｄｏｌｐｈｉ（１９９１；  １９９４）は、ＩＬ−２のＣ末端とＩｇＧ−ＣHドメインのＮ末端との間に余分なセリンを含む、ＩＬ−２−ＩｇＧｌ−ＣH融合タンパク質について記述した。ＩＬ−２−ＩｇＧｌ−ＣH融合タンパク質はインビトロバイオアッセイにおいてモルベースでＩＬ−２と同程度に活性であると評されているが、いかにタンパク質濃度の量を測定したかに関しての詳細な説明が提供されていなかった（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉ、１９９１；１９９４）。Ｚｅｎｇら（１９９５）はマウスＩＬ−１０をＩｇＧ２ａのＦｃ領域に直接融合させたが、Ｆｃヒンジ領域の第１アミノ酸がＧｌｕからＡｓｐに変更された。Ｚｅｎｇら（１９９５）は、ＩＬ−１０−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質がインビトロバイオアッセイにおいて十分な活性を有すると報告したが、融合タンパク質の２つの濃度だけが調べられたにすぎず、それらはいずれも飽和状態であった。このようにタンパク濃度が高いと、ＩＬ−１０−マウスＩｇＧ２ａ融合タンパク質とＩＬ−１０と間の生物活性の大きな差（例えば１００倍）しか検知することができなかった。生物活性のより小さな差を検出するためには、インビトロバイオアッセイでタンパク質の連続希釈物を分析し、ＥＣ50（最大量の半分の刺激に必要なタンパク質の濃度）またはＩＣ50（最大量の半分の阻害に必要なタンパク質の濃度）を算出する必要がある。ＩＬ−１０−ＩｇＧ２ａおよびＩＬ−１０のＥＣ50は、Ｚｈｅｎｇら（１９９５）によっては報告されなかった。Ｃｈｅｎら（１９９４）もＩＬ−２−ＩｇＧ融合タンパク質を構成し、この融合タンパク質の活性が十分であると報告した。Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９３）も、抗ガングリオシドＩｇＧ抗体のＣ末端にＩＬ−２を融合させて含む十分に活性があるＩＬ−２融合タンパク質の作成を報告した。Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９３）は期せずして同じ抗体とＧＭ−ＣＳＦとの間の融合が野生型ＧＭ−ＣＳＦ生物活性の約２０％を示すにすぎないことを見出した。Ｃｈｅｎら（１９９４）は、抗体分子とＧＭ−ＣＳＦの間に４つのアミノ酸を挿入することにより、十分に活性のあるＩｇＧ  Ｃ末端−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を作成することができた。Ｃｈｅｎらは期せずして、同じ４つのアミノ酸から成るリンカーを使用してＩＬ−４を同じ抗体に融合させた結果、ＩＬ−４タンパク質の生物活性が２５倍減小すると報告した（Ｃｈｅｎ、１９９４ら）。
【０００９】
Ｑｉｕら（１９９８）は、３〜７のグリシン残基から成る柔軟なペプチドリンカーを使用して２つのＥＰＯタンパク質をひとまとめに融合したホモ二量体エリスロポエチン（ＥＰＯ）タンパク質について記述した。このペプチドリンカーは、１つのＥＰＯタンパク質のＣ末端を、別のＥＰＯタンパク質のＮ末端につないだ。この融合タンパク質のインビトロ生物活性は、野生型ＥＰＯと比較すると著しく減小した（少なくとも４〜１０倍）（Ｑｉｕら、１９９８）。
【００１０】
従って、上記文献は、増殖因子／サイトカインドメインとＩｇＧドメインとの間の接合点におけるアミノ酸が増殖因子／サイトカインの生物活性に深い影響を及ぼしうることを示している。
【００１１】
人の治療用物質として使用する場合、増殖因子／サイトカイン−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性はできるだけ野生型（つまり非融合タンパク質）に近いことが望ましい。活性の高い融合タンパク質は、特異的活性が低い融合タンパク質よりも低用量でより大きな治療上の利点を生むことが可能である。これは薬のコストを下げ、患者により大きな治療上の利点を与えるだろう。人の治療用物質として使用する場合、タンパク質ができるだけ均質かつ純粋であることも有益である。Ｉｇ融合タンパク質は単量体として合成され、該単量体は融合タンパク質のタイプに依存して、ジスルフィド結合した二量体および四量体を形成するよう組立てることが可能である。単量体、二量体および四量体の相対比率は製造条件に依存して、ロットごとに変更し得る。ロットごとに可変にすると、活性を変えた異種混合生成物を得ることができる。サイズがより大きいため、四量体は二量体や単量体よりも体内で長い循環半減期を有すると予想され、二量体は単量体よりも長い循環半減期を持つと予想される。このため、四量体、二量体および単量体は、インビボで異なる治療効果を生じ得る。四量体、二量体または単量体の精製した均質調製物は、明確な特効のある特異的活性を有するため、治療用物質として好ましい。人の治療用物質として使用する場合、増殖因子／サイトカインドメインをＩｇドメインにつなげる任意のリンカー配列の長さを、リンカー配列中の非天然アミノ酸への免疫応答を発展させる可能性を低減させる最小長さに保つことはさらに有益であり得る。本明細書で「直接融合」と称する、介在リンカー配列を用いない２つのタンパク質の連結は、非天然リンカーに対する免疫応答発展の可能性をなくすため、Ｉｇ融合タンパク質の１つの好ましい形式である。
【００１２】
Ｉｇ融合タンパク質に関する文献は、「直接でない」サイトカイン／増殖因子−Ｉｇ融合タンパク質（つまり増殖因子／サイトカインがペプチドリンカーを介してＩｇドメインにつながれている融合タンパク質）の製造例しか提供していない。ＷＯ第９９／０２７０９号は、ＥＰＯタンパク質をコードするＤＮＡ配列とＩｇドメインタンパク質をコードするＤＮＡ配列をつなげるためにＢａｍＨＩ制限酵素部位を使用することにより、ＩｇドメインにＥＰＯをつなぐ例を提供する。この方法を使用して、リンカーを含むＥＰＯ−Ｉｇ融合タンパク質を作成することが可能である。ＢａｍＨＩは、ＥＰＯまたはＩｇ−Ｆｃ、Ｉｇ−ＣHもしくは軽鎖定常領域の接合点に存在していない特異的ＤＮＡ認識配列であるＧＧＡＴＣＣを有するため、この方法はＥＰＯ−Ｉｇの直接融合物を作成するのに有効ではない。
【００１３】
ＥＰ第０４６４５３３Ａ号は、サイトカインとＩｇドメイン間に３つのアミノ酸から成る特異的リンカー（ＡｓｐＰｒｏＧｌｕ）を含むＩｇ融合タンパク質を作成する例を提供する。ＥＰ第０４６４５３３Ａ号に記述された方法は、融合タンパク質を作成するために、サイトカインおよびＩｇドメインをコードする別個のエクソンをＲＮＡスプライシングすることに基づいている。ＲＮＡスプライシング反応ではスプライス部位に特異的配列が必要であるために、ＡｓｐＰｒｏＧｌｕリンカーがサイトカイン／増殖因子コード領域の終端に必要とされた。ＡｓｐＰｒｏＧｌｕリンカーは、ＲＮＡスプライシングの発生を可能にするヌクレオチドによってコードされる。ＥＰ第０４６４５３３Ａ号はこの方法を使用してＡｓｐＰｒｏＧｌｕリンカーを含むＥＰＯ−Ｉｇ融合タンパク質を作成する例を提供する。ＥＰＯコード領域は、Ａｒｇ１６６を削除し、ＥＰＯコード配列のＡｓｐ１６５の直後にアミノ酸リンカー（ＰｒｏＧｌｕ）を付加するように修飾した。これにより、ＡｓｐＰｒｏＧｌｕリンカー（ＥＰＯコード配列のＡｓｐ１６５はリンカー配列のＡｓｐを提供した）を含むＥＰＯ−Ｉｇ融合タンパク質が作成された。従って、ＥＰ第０４６４５３３Ａによって記述された方法は、Ｉｇの直接融合物またはＡｓｐＰｒｏＧｌｕやＰｒｏＧｌｕリンカーを含まないＩｇ融合物の作成には有効でない。
【００１４】
米国特許第５，３４９，０５３号は、ＩＬ−２とＩｇドメインとの間にＳｅｒリンカーを含むＩＬ−２−ＩｇＧ−ＣH融合タンパク質の作成方法について記述している。米国特許第５，３４９，０５３号に記述された方法は、ＩＬ−２およびＩｇＧ−ＣHドメインをコードする別個のエクソンのＲＮＡスプライシングに基づいている。ＲＮＡスプライシング反応ではスプライス部位に特異的配列が必要であるため、ＩＬ−２コード領域のカルボキシ末端にセリンをコードするＴＣＡを付加するようにＩＬ−２のコード領域を修飾する必要があった。ＴＣＡコドンはイントロンスプライス連結配列が後続するように作成された。これにより、Ｓｅｒリンカーを含むＩＬ−２−ＩｇＧ−ＣH融合タンパク質が作成された。米国特許第５，３４９，０５３号に記述された方法は、サイトカイン／増殖因子−Ｉｇの直接融合物またはＳｅｒリンカーを含まないサイトカイン／増殖因子−Ｉｇ融合物の作成には有効でない。
【００１５】
ＥＰＯ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質を始めとする増殖因子／サイトカイン−ＩｇＧ融合タンパク質が、ＥＰ第０４６４５３３Ａ、ＷＯ第９９／０２７０９号およびＬａｎｄｏｌｐｈｉ（１９９１；１９９４）において想定されている。これらの文献はいずれも、その想定されたＥＰＯ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の発現、精製および生物活性に関するいかなるデータも示していない。Ｌａｎｄｏｌｐｈｉ（１９９１；１９９４）はＩＬ−２−ＩｇＧ１−ＣH融合タンパク質に関する生物活性データを示したが、他のＩｇＧ融合タンパク質に関するものは示さなかった。ＥＰ第０４６４５３３Ａによって想定されたＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＥＰＯコード配列のＡｓｐ１６５とＩｇＧ１−Ｆｃヒンジ領域の開始点との間に２つのアミノ酸から成るリンカー（ＰｒｏＧｌｎ）を含んでいる。ＥＰＯのカルボキシ末端アミノ酸であるＡｒｇ１６６は削除されるだろう。ＥＰ第０４６４５３３Ａ号は、Ｇ−ＣＳＦコード領域がＩｇＧ１−Ｆｃヒンジ領域にどのようにつながれるかに関して何ら情報を提供していない。ＥＰ第０４６４５３３号はいかなるタンパク質に対する生物活性データも提供していない。ＷＯ第９９／０２７０９号はＩｇＧ１−ＦｃマウスＩｇＧ２ａ−Ｆｃ融合タンパク質について記述しているが、ＥＰＯ−ヒトＩｇＧ融合タンパク質については記述していない。ＥＰＯ−マウスＩｇＧ２ａ−Ｆｃ融合タンパク質に対する生物活性データは示されていない。ＷＯ第９９／０２７０９号は、想定融合タンパク質を構成するのに使用したＥＰＯｃＤＮＡやヒトＩｇＧ遺伝子の入手源あるいはＥＰＯをＩｇＧドメインに連結するのに使用される正確なアミノ酸についての詳細を提供していない。ＷＯ第９９／０２７０９号に引用された文献（Ｓｔｅｕｒｅｒら、１９９５）もそのような情報を提供していない。
【００１６】
ＷＯ第９９／０２７０９号は、ＥＰＯをＩｇドメインにつなぐために１〜２０個のアミノ酸から成る柔軟なペプチドリンカーを使用することができると仮定している。しかしながら、ＷＯ第９９／０２７０９号では、柔軟なリンカーを作成するために使用されるアミノ酸が特定されてない。Ｑｉｕら（１９９８）は、３〜７個のグリシン残基から成る柔軟なリンカーによって連結されたＥＰＯ融合タンパク質では、野生型ＥＰＯに対して生物活性が著しく減小する（４〜１０倍）と報告した。
【００１７】
ＷＯ第９９／０２７０９号は、仮説ＥＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質をコードするプラスミドで形質移入したＣＯＳ細胞由来の馴化培地を使用して、マウスのヘマトクリットを増加させる方法を提供する。そのような馴化培地は、単量体および二量体のＥＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質の混合物のみならず、他の多くのタンパク質を含むだろう。ＷＯ第９９／０２７０９号は、教示された方法が有効であることを実証する証拠を提供していない。
【００１８】
このように、相当な努力にもかかわらず、増殖因子／サイトカイン−Ｉｇ融合タンパク質を、直接的にまたはＩｇ融合タンパク質の増殖因子／サイトカインドメインの生物活性を保存する様々なリンカー種を用いて作成する方法が未だ要求されている。本発明はこの要求を満たし、関連する利点を提供する。
【００１９】
（発明の概要）
本発明は、可溶性タンパク質がＩｇドメインに直接つながれるか、もしくはＡｓｐＰｒｏＧｌｕまたはＳｅｒでないアミノ酸リンカーによってつながれる、新規なＩｇ融合タンパク質を開示する。可溶性タンパク質は、増殖因子、サイトカイン、もしくは増殖因子またはサイトカインの変異型である。有用なリンカーは、グリシン残基とセリン残基の混成物、好ましくはＳｅｒＧｌｙおよびＳｅｒ（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）n（配列番号１）を有し、ｎは１〜７である。Ｉｇドメインは好ましくは定常領域を含んでおり、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣHまたはＣLから好ましくは選択される。直接融合としてまたはこれらのリンカー配列を介してＩｇドメインにつながれた時に非融合タンパク質の生物活性を実質的に保持する増殖因子およびサイトカイン、ならびにそれらの活性断片の例としては、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＧＨ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＦｌｔ３リガンドのような超遺伝子ファミリーが挙げられる。
【００２０】
例えば、ＥＰＯ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質およびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質は、モル基準で、非融合ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦと等価な生物活性を有している。ＥＰＯとＧ−ＣＳＦのＩｇＧ−ＣH融合物は、融合していないＥＰＯとＧ−ＣＳＦの２〜４倍のインビトロ生物活性を有している。成長ホルモン−ＩｇＧ−Ｆｃおよび成長ホルモン−ＩｇＧ−ＣH融合タンパク質は、融合していない成長ホルモンの４〜１７倍の生物活性を期せずして有している。同様に、ＩＦＮ−α２およびＩＦＮ−βを用いた生物学的に活性なＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣHおよびＩｇ−ＣL融合構成物も提供される。
【００２１】
ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよび成長ホルモンのＩｇＧ−Ｆｃ融合物は、そのような増殖因子／サイトカインの同じＩｇＧ−ＣH融合物より活性が高い。ＩＦＮ−αのＩｇ−ＣL融合物は、ＩＦＮ−αのＩｇＧ−ＦｃまたはＩｇＧ−ＣH融合物よりも活性が高い。ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣH、ＩｇＧ−ＣL融合タンパク質間の生物活性に差があることも、予期していないことであった。さらに、融合されたＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、成長ホルモン、およびＩＦＮ−αドメインの生物活性を最大にするＥＰＯ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ、成長ホルモン−ＩｇＧ融合タンパク質の構成のための好ましい部位は、本願で同定された。
【００２２】
本発明は、重鎖および軽鎖の融合タンパク質の多量体を含む新規な増殖因子／サイトカイン−Ｉｇ融合タンパク質と、単量体の融合タンパク質、凝集物および混在タンパク質が本質的に存在しない二量体の増殖因子／サイトカイン−Ｉｇ融合タンパク質の調製物を調製する方法とをさらに提供する。「本質的に存在しない」とは、本明細書では、９０％以上の純度であることを意味するように使用される。本発明は、２以上のサイトカイン／増殖因子が、直接融合としてまたはアミノ酸リンカーの使用によりつながれる、新規な多量体増殖因子／サイトカインも提供する。
【００２３】
様々な症状を治療する方法であって、有効量の本発明のＩｇ融合タンパク質をその治療を必要とする患者に投与する工程から成る方法も提供される。
（発明の詳細な説明）
本明細書に記述した研究において、増殖因子／サイトカイン−Ｉｇ融合タンパク質の生物活性が増殖因子／サイトカインを取り付けるＩｇＧドメインのアイソタイプに依存して変化し得ること、およびタンパク質がＩｇ軽鎖に取り付けられるかＩｇ重鎖の定常領域に取り付けられるか、が目下で発見されている。これらの結果は文献からは予測されなかった。いかなる特定の理論に拘束されるのも望んでいないが、発明者は、観察した生物活性の可変性が、柔軟性と、融合タンパク質をつなげるのに使用するＩｇドメイン領域の他の物理特性とに関連すると仮定している。これらの知見に基づくと、マウスＩｇドメインを使用して作成された融合タンパク質の生物活性は、ヒトＩｇドメインを使用して作成された融合タンパク質の生物活性を予言するためには使用することができない。
【００２４】
従って、本発明は一般に、Ｉｇドメインにつながれた可溶性タンパク質を含むＩｇ融合タンパク質を構成する方法と、そのような方法によって得られた新規なＩｇ融合タンパク質とに関する。該方法は、可溶性タンパク質を、直接融合としてまたはまたは介在アミノ酸リンカーを用いて、Ｉｇ融合ドメインにつなげることを伴う。
【００２５】
本発明の方法は、ＥＰＯ、成長ホルモン（ＧＨ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子、Ｆｌｔ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターフェロン（特にα、βおよびγ−インターフェロン）を含むがそれらに限定されない１又は複数の増殖因子および／またはサイトカインを含むＩｇ融合タンパク質を構成するのに有効である。該方法が有効な他のタンパク質としては、ＧＨ超遺伝子ファミリーの他のメンバーがある。ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーには、ＧＨ、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、白血病抑制因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、  ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、幹細胞因子およびｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド（Ｂａｚａｎ（１９９０；１９９１；１９９２）；ＭｏｔｔおよびＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９５）；ＳｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎおよびＩｈｌｅ（１９９６）；Ｍａｒｔｉｎら、１９９０；Ｈａｎｎｕｍら、１９９４）が含まれる。この遺伝子ファミリーのさらなるメンバーが遺伝子クローニングと配列決定によって今後同定されることが予想される。ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーは、それらが限られたアミノ酸配列同一性またはＤＮＡ配列同一性を一般に有しているという事実にもかかわらず、類似の二次または三次構造をしている。ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーに共有される構造の特徴がＢａｚａｎ（１９９０；１９９１；１９９２）、ＭｏｔｔとＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９５）およびＳｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎとＩｈｌｅ（１９９６）に記述されているが、この特徴は遺伝子ファミリーの新しいメンバーの容易な同定を可能にする。本明細書に記載した方法は、通常可溶であってかつＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーではないタンパク質によりＩｇ融合タンパク質を作成するのにも有用である。そのようなタンパク質の活性変異型も本発明のＩｇ融合タンパク質を構成するのに使用することができる。用語「活性変異型」とは、全長タンパク質の生物活性を実質的に保持する、以下により詳細に記述される可溶性タンパク質の断片のことを意味する。
【００２６】
本明細書に開示した方法は、リンカーがＡｓｐＰｒｏＧｌｕまたはＳｅｒでない限り、任意のアミノ酸配列から成る任意の長さのリンカーを使用して、Ｉｇドメインに増殖因子／サイトカインをつなぐために使用することができる。好ましいリンカーは、長さ１〜５０のアミノ酸であり、より好ましくは長さ１〜２２のアミノ酸である。好ましくは、リンカーは、増殖因子／サイトカインまたはＩｇドメインの生物活性に悪影響を及ぼさない。好ましいリンカーは、グリシン残基とセリン残基の混成物を含んでいる。有用なリンカーに組み込むことが可能な他のアミノ酸には、スレオニン残基とアラニン残基が含まれる。本明細書に開示した好ましいリンカーの１つは、２つのアミノ酸から成るリンカーＳｅｒＧｌｙである。本明細書に開示する他の好ましいリンカーは、モチーフＳｅｒ（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）n（配列番号１）（ｎは１〜７であり得る）から成るリンカーである。
【００２７】
本発明のＩｇドメインは、例えばＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣH、のような定常領域を含んでいる、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣH、別のＩｇクラス（すなわちＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）由来のＦｃまたはＣHのような定常ドメイン、もしくは軽鎖定常ドメインを包含する。これらのドメインの切断物およびアミノ酸変異型または置換型も、本発明に包含される。
【００２８】
本発明の別の態様において、ＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−ＣH融合タンパク質は、例えば、二量体を形成するよう組み立てることが可能な単量体として合成される。通常、二量体は、ＩｇＧヒンジ領域においてジスルフィド結合によりつなげられる。ＩｇＧ融合タンパク質を分泌する細胞由来の馴化培地は、ＩｇＧ融合タンパク質単量体および二量体の混合物を含み得る。人の治療用物質として使用する場合、２つの形式の混合物ではなく、ＩｇＧ融合タンパク質単量体か二量体のいずれかの均質な集団を使用することが望ましい。二量体の増殖因子／サイトカインＩｇＧ融合タンパク質の本質的に純粋な調製物を得る方法も提供される。該方法は、ＩｇＧ融合タンパク質を発現することが可能な宿主細胞を得る工程と、馴化培地を収集する工程と、単量体の融合タンパク質、凝集物、および混在タンパク質から、カラムクロマトグラフイー法により二量体の融合タンパク質を精製する工程とにより達成される。ＩｇＧ融合タンパク質を発現するのに適した宿主細胞には、酵母、昆虫、哺乳類または他の真核細胞が含まれる。好ましくは宿主細胞は哺乳類の細胞、特にＣＯＳまたはＣＨＯ細胞である。
【００２９】
１実施形態では、ＥＰＯが、Ｉｇ−Ｆｃドメイン（例えばＩｇＧ−Ｆｃドメイン）に直接つながれ、１，０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満、そして最も好ましくは４ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ50を有する。別の実施形態では、ＥＰＯが、２〜７のアミノ酸から成るペプチドリンカーを介してＩｇＧ−ＦｃまたはＩｇＧ−ＣHドメインに好ましくはつながれ、１，０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満、そして最も好ましくは４ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ50を有する。
【００３０】
別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦが、Ｉｇ−Ｆｃドメイン（例えばＩｇＧ−Ｆｃドメイン）に直接つながれ、３００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは３ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは３００ｐｇ／ｍｌ未満のＥＣ50を有する。別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦが、２〜７のアミノ酸から成るペプチドリンカーを介してＩｇＧ−ＦｃまたはＩｇＧ−ＣHドメインに好ましくはつながれ、３００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは３ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは３００ｐｇ／ｍｌ未満のＥＣ50を有する。
【００３１】
別の実施形態では、ＧＨが２〜７のアミノ酸から成るペプチドリンカーを介してＩｇ−ＦｃまたはＩｇ−ＣHドメイン（例えばＩｇＧ−ＦｃまたはＩｇＧ−ＣHドメイン）につながれ、１，０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ50を有する。
【００３２】
別の実施形態では、ＩＦＮ−αが２〜７のアミノ酸から成るペプチドリンカーを介してＩｇ−ＦｃまたはＩｇ−ＣHドメイン（例えばＩｇＧ−ＦｃまたはＩｇＧ−ＣHドメイン）につながれ、１，０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ50を有する。
【００３３】
別の実施形態では、ＩＦＮ−αが２〜７のアミノ酸から成るペプチドリンカーを介して軽鎖定常領域につながれ、融合タンパク質は１００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ未満のＩＣ50を有する。
【００３４】
別の実施形態では、ＩＦＮ−βが２〜７のアミノ酸から成るペプチドリンカーを介してＩｇＧ−ＦｃまたはＩｇＧ−ＣHドメインにつながれ、１０，０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１，０００ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ未満、および最も好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ未満のＩＣ50を有する。
【００３５】
ここで、精製ＧＨ−、ＥＰＯ−、およびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ−ＣH融合タンパク質は、非融合タンパク質およびＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、インビトロ生物アッセイでの特異的活性が減小した。本発明はさらに、生物活性が改良された新規な多量体ＩｇＧ−ＣH／Ｉｇ軽鎖定常ドメイン融合タンパク質に提供する。本発明はさらに、補体を活性化しかつＦｃ受容体と結合するその能力を低下させるようにＩｇＧドメインが変更された増殖因子／サイトカインＩｇＧ融合タンパク質にも関する。この目的でのＩｇＧドメインの変更は、実施例６に以下に記述される。
【００３６】
新規な多量体増殖因子および／またはサイトカイン融合タンパク質も提供される。１実施形態では、２つ以上の増殖因子および／またはサイトカインが、介在ペプチドリンカーを用いずに互いに直接つながれる。別の実施形態では、２つ以上の増殖因子および／またはサイトカインが１〜５０のアミノ酸から成るペプチドリンカーを介して、より好ましくは１〜７のアミノ酸から成るペプチドリンカーを介して、互いにつながれる。この目的のために特に有用なリンカーには、ＳｅｒＧｌｙおよびＳｅｒ（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）n（配列番号１）が含まれ、ｎは１〜７であり得る。
【００３７】
本発明は、対応する全長または野生型のタンパク質または免疫グロブリンの生物学的特性の一部または全部を有するタンパク質および免疫グロブリンドメインの活性変異型を包含する。そのような変異型には、アミノ酸変異物；アミノ酸置換物；切断物；付加物；炭水化物、リン酸化、または天然タンパク質に見出される他の付着基の変化；ならびに本明細書に示した他の変形物が含まれるが、それらに制限されない。ある場合には、変形物が、本来のタンパク質によって共有されていなかった追加の特性（例えば安定性または生物活性の向上）を有し得る。例えば、マークら（１９８４）は、位置１７のシステインがセリンと置換されたＩＦＮ−β突然変異タンパク質を開示している。ＩＦＮ−β（Ｓｅｒ−１７）の安定性は、野生型ＩＦＮ−βのそれと比較して向上している。同様に、ＩＬ−２のシステイン−１２５の置換は、より安定したＩＬ−２タンパク質を生じる（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉ（１９９１；１９９４）。Ｌｕら（１９９２）は、位置１７のシステインがセリンと置換されたＧ−ＣＳＦ突然変異タンパク質を開示している。Ｋｕｇａら（１９８９）、Ｈａｎａｚｏｎｏら（１９９０）およびＯｋａｂｅら（１９９０）は、生物学的特性が増強されたさらなるＧ−ＣＳＦ突然変異タンパク質について記述している。ＥｌｌｉｏｔおよびＢｙｒｎｅ（１９９５）は、生物活性が増強されたＥＰＯの突然変異型について記述している。
【００３８】
Ｉｇ融合タンパク質を生産および精製する方法も提供される。そのような方法は、ＩＬ−１０ではない増殖因子またはサイトカインとＩｇドメインとをコードする少なくとも１つの核酸で形質転換または形質移入した宿主細胞を得ることにより一般に遂行される。宿主細胞は所望の融合タンパク質が発現されるまで培養され、その後、Ｉｇ融合タンパク質は当該技術分野において周知の任意の手段によって、または以下に実施例の箇所で説明するように、精製または単離される。１実施形態では、融合タンパク質を精製する方法は、組換えにより生成されたＩｇ融合タンパク質を含む組成物を得る工程と、カラムクロマトグラフイー法（例えば所望の分子量カットオフを備えたサイジングカラム）を使用して様々な混在物質から所望のＩｇ融合タンパク質を分離する工程とから成る。宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞を含めるがそれらに限定されない当業者に周知のいかなる適切な原核または真核細胞系であってもよい。特に有用な細胞は哺乳類細胞であり、好ましくは真核細胞であり、より好ましくはＣＯＳまたはＣＨＯ細胞である。
【００３９】
本発明の方法によって生産されたＩｇ融合タンパク質は、種々のインビトロまたはインビボの用途に使用することができる。本発明のタンパク質は、それらの野生型、天然型、または以前から知られていた修飾相当物に関する既知の研究、診断、または治療目的に使用することができる。
【００４０】
インビトロの用途には、例えば、他のタンパク質をスクリーニング、検出、および／または精製するためのタンパク質の使用が含まれる。本明細書に説明したＩｇ融合タンパク質は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ならびにα，βおよびγ−インターフェロンに対する受容体を発現している細胞を同定するための診断薬としても有用である。Ｉｇ融合タンパク質は、細胞増殖と分化を研究するためのインビトロ試薬としても有用である。
【００４１】
本明細書に説明したＩｇ融合タンパク質は、非融合タンパク質と同様に、人の同じ症状を治療するために使用することができる。例えば、ＥＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質は、腎不全、化学療法、放射線と薬物の合併症に起因する貧血を治療するために使用することができる。さらにＥＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質は、外科手術に先立ち自身の赤血球数かヘマトクリット値を増強したい正常な個体において、赤血球の形成を刺激するために使用することができる。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質は、化学療法、放射線と薬物による合併症に起因する好中球減少症の治療のために、末梢血前駆細胞移植物の収集用前駆細胞の動態化のために、および重篤な慢性好中球減少症の治療のために、使用することができる。ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質は、低身長および悪液質を治療するために使用することができる。ＩＦＮ−α−ＩｇＧ融合タンパク質はウィルス疾病と癌を治療するために使用することができる。ＩＦＮ−β−ＩｇＧ融合タンパク質は、多発性硬化症、ウィルス疾患および癌を治療するために使用することができる。ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質は、化学療法、放射線と薬物による合併症に起因する好中球減少症の治療のために、末梢血前駆細胞移植物の収集用前駆細胞の動態化のために、および重篤な慢性好中球減少症の治療のために、および癌ワクチン用のアジュバントとして、使用することができる。ＳＣＦ−ＩｇＧおよびＦｌｔ３リガンド−ＩｇＧ融合タンパク質は、末梢血前駆細胞移植物の収集用に造血前駆細胞を動態化するために使用することができる。ＩＬ−１１−ＩｇＧおよびＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質は、血小板減少症の治療のために使用することができる。
【００４２】
本明細書に記述したＩｇ融合タンパク質は、患者の中でより長い循環半減期を有するだろう。これにより融合タンパク質は、非融合タンパク質よりも少ない回数および／またはより低い有効用量で投与される。通常、ＧＨおよびＧ−ＣＳＦは毎日の注射で投与され、ＥＰＯは週に３回の注射で投与される。当業者は適切な用量、回数、および経路を容易に決定することができる。そのような決定を行う際に関わる要因としては、投与するタンパク質の性質および非活性、治療すべき症状、患者の服薬率、患者の年齢および体重、ならびにその同等のものが挙げられる。本発明の化合物は、取り付けられる治療用物質の循環半減期の増強用または体内の特定のターゲットへの送達用の伝達媒体としても使用することができる。
【００４３】
薬学的に許容可能な担体に本発明のＩｇ融合タンパク質を含有させた医薬組成物も提供される。当業者は、生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ液、およびその同等物を含むがそれらに限定されないそのような薬学的に許容可能な担体を容易に認識することができる。薬物、試薬、治療用薬剤を始めとする他の物質も医薬組成物に含有させることができる。
【００４４】
本発明のＩｇ融合タンパク質を構成する詳細な方法を、以下の実施例において説明する。実施例は、本発明を限定するのではなく例証を意図したものである。
（実施例１）
増殖因子／サイトカイン−ＩｇＧ遺伝子融合体の構築
Ａ．一般的戦略
増殖因子／サイトカイン（ＧＦ）−ＩｇＧ遺伝子融合体を、下記のように構築した。これらの構築に利用した一般的戦略をここに概説し、各クローニングステップの特性を以下に詳述する。一般的戦略への追加的な変形例（variation ）に関与するＩｇＧ４−ＣH コード配列のクローニング、及びこれらの変形例を、以下の記載する。ヒト増殖因子遺伝子（ＧＨ、ＥＰＯ、及びＧ−ＣＳＦ）を、以下に詳述する種々のＲＮＡ源からｃＤＮＡとしてクローニングした。これらのクローニングに用いたＰＣＲプライマーは、最も効果的なコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ；Ｋｏｚａｋ、１９９１）及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位を、これらのクローンそれぞれの５′末端に付加させ、Ｂａｍ  ＨＩ制限部位で終結するペプチドリンカーの一部（ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ）（配列番号１）を、これらのクローンそれぞれの３′末端に付加させた。その増殖因子遺伝子を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｂａｍ  ＨＩ断片として哺乳類細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロゲン社、カリフォルニア州サンディエゴ所在（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ））ヘクローニングし、塩基配列決定をした。同時に、ＩｇＧコード配列（ＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ１−ＣH 、ＩｇＧ４−Ｆｃ、ＩｇＧ４−ＣH ）を、ヒト白血球ＲＮＡから生成したｃＤＮＡからクローニングした。これらのクローニングに用いたＰＣＲ順方向プライマーは、これらのクローンそれぞれの５′末端にＢａｍ  ＨＩ制限部位を含有するペプチドリンカーの一部（ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ）（配列番号２）を組み込んだ。逆方向ＰＣＲプライマーは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４  ｍＲＮＡの３′非翻訳領域（翻訳終止コドンの約４０ｂｐ下流）にアニーリングするよう設計しており、Ｘｂａ  Ｉ制限部位を含んでいた。ＩｇＧコード配列を、Ｂａｍ  ＨＩ−Ｘｂａ  Ｉ断片としてｐＣＤＮＡ３．１（＋）に入れてクローニングして、ＤＮＡ塩基配列決定法で確認した。その後、ＩｇＧコード配列をＢａｍ  ＨＩ−Ｘｂａ  Ｉ断片として切り出すことにより融合遺伝子を構築し、Ｂａｍ  ＨＩ及びＸｂａ  Ｉで切断したｐＣＤＮＡ：：ＧＦ組換えプラスミドに、これらの断片を入れてクローニングした。得られたｐＣＤＮＡ３．１構造体の中で、クローニングした融合遺伝子の上流のｐＣＤＮＡ３．１（＋）に存在する強力なサイトメガロウイルス即時プロモータにより、融合遺伝子を転写する。リンカー配列内のＢａｍ  ＨＩ部位を通した２つの断片のライゲーションにより、融合接続部に７つのアミノ酸リンカー（ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ）（配列番号３）がもたらされる。
【００４５】
Ｂ．成長ホルモン、ＥＰＯ及びＧ−ＣＳＦのクローニング
１．ヒト成長ホルモンのクローニング
ヒト成長ホルモン（ＧＨ）をコード化するｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術及びプライマーＢＢ８７（５＞ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＣＧ  ３）（配列番号４）及びＢＢ８８（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡ  ＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣ＞３）（配列番号５）を用いて、ヒト下垂体一本鎖ｃＤＮＡ（クロンテック社、カリフォルニア州パロアルト所在（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ））から増幅させた。プライマーＢＢ８７は、ｈＧＨ分泌シグナルのためのコード配列の５′末端にアニーリングするが、逆方向プライマーＢＢ８８は、ＧＨコード配列の３′末端にアニーリングする。得られた〜６８０ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢａｍ  ＨＩで消化し、ゲル精製して、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢａｍ  ＨＩで消化しアルカリホスファターゼ処理してゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロゲン社、カリフォルニア州カールズバッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ））に入れてクローニングした。正しいＤＮＡ配列を備えたクローン（Ｍａｒｔｉａｌら、１９７９；Ｒｏｓｋａｍ及びＲｏｕｇｅｏｎ、１９７９；Ｓｅｅｂｕｒｇ、１９８２；  ＤｅＮｏｔｏら、１９８１）を、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ＧＨｆｕｓ又はｐＢＢＴ１５９と称した。
【００４６】
２．ヒトエリスロポエチンのクローニング
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコード化するｃＤＮＡを、順方向プライマーＢＢ４５（５＞ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧ＞３）（配列番号６）及び逆方向プライマーＢＢ４７（５＞ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴ  ＧＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧ＞３）（配列番号７）を用いたＰＣＲによりクローニングした。ＢＢ４５は、ＥＰＯシグナル配列の開始メチオニン及びアミノ末端部分をコード化するＤＮＡ配列にアニーリングし、クローニング目的でＢａｍ  ＨＩ部位を含有する。ＢＢ４７は、翻訳終止シグナル直後のＥＰＯ  ｍＲＮＡの３′非翻訳領域にアニーリングし、クローニング目的でＥｃｏ  ＲＩ制限部位を含有する。ヒト肝細胞系Ｈｅｐ３Ｂから単離した全体ＲＮＡを、ＰＣＲのための一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成に用いた。細胞全体ＲＮＡの調製のために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル所在）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から入手）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。ＥＰＯ発現は、細胞を１３０μＭデフェロキサミン又は１００μＭ塩化コバルトで１８時間処理することにより誘導した（Ｗａｎｇ及びＳｅｍｅｎｚａ，１９９３）。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（キアゲン社、カリフォルニア州サンタクラリタ所在（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，  ＣＡ））を用い、メーカーの説明書に従って、ＲＮＡを細胞から単離した。ＲＮＡ総量約３２０μｇを、塩化コバルトで処理した細胞１．４ｘ１０7個から単離し、ＲＮＡ総量２７０μｇを、デフェロキサミンで処理した細胞１．４ｘ１０7 個から単離した。
【００４７】
一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成を、ベーリンガーマンハイム社（インディアナ州インディアナポリス所在）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ））の１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）を用いて実行し、ランダムヘキサマーをプライマーとして用いた。第一鎖合成の産物を用いた次のＰＣＲ反応は、プライマーＢＢ４５及びＢＢ４７を用いて実施した。反応産物をアガロースゲルで泳動すると、予測された〜６００ｂｐのＰＣＲ産物が観察された。ＲＮＡ調製物は、どちらもＥＰＯ  ＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物を、Ｂａｍ  ＨＩ及びＥｃｏ  ＲＩで消化して、Ｂａｍ  ＨＩ及びＥｃｏ  ＲＩで切断しアルカリホスファターゼで処理したベクターｐＵＣ１９に入れてクローニングした。ＤＮＡ塩基配列決定法により、ＥＰＯ遺伝子の正しいコード配列を含有するクローンを同定した。このプラスミドを、ｐＢＢＴ１３１と称した。
【００４８】
プラスミドｐＢＢＴ１３１を、プライマーＢＢ８９（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣ  ＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴ＞３）（配列番号８）及びＢＢ９０（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣ＞３）（配列番号９）を用いたＰＣＲ反応で鋳型として用い、ＩｇＧ遺伝子との融合に適した修飾ＥＰＯ  ｃＤＮＡを構築した。プライマーＢＢ８９は、ＥＰＯ分泌シグナルのためのコード配列の５′末端にアニーリングし、逆方向プライマーＢＢ９０は、ＥＰＯコード配列の３′末端にアニーリングする。得られた〜６１０ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢａｍ  ＨＩで消化し、ゲル精製して、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢａｍ  ＨＩで消化しアルカリホスファターゼ処理してゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。正しいＤＮＡ配列を備えたクローン（Ｌｉｎら、１９８５）を、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ＥＰＯｆｕｓ又はｐＢＢＴ１７６と称した。
【００４９】
同様の手順を用いると、Ａｒｇ  １６６が欠失した改変ＥＰＯ  ｃＤＮＡを作製することができる。この場合、その配列（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣ＞３）（配列番号１０）を備えたプライマーを、プライマーＢＢ９０の代わりに用いることができる。
【００５０】
３．ヒト顆粒球コロニー刺激因子のクローニング
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコード化するｃＤＮＡを、ヒト膀胱癌（bladder carcinoma ）細胞系５６３７（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル所在）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から入手）から単離した全体ＲＮＡから、ＰＣＲにより増幅させた。その細胞を、１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地で増殖させた。ＲＮＡを、キアゲン社（カリフォルニア州サンタクラリタ所在（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，  ＣＡ））から購入したＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＲＮＡ単離キットを用い、メーカーの説明書に従って、細胞から単離した。ＲＮＡ総量〜５６０μｇを、４．５ｘ１０7個の細胞から単離した。一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成を、ベーリンガーマンハイム社（インディアナ州インディアナポリス所在）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ））の１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）を用いて実行し、ランダムヘキサマーをプライマーとして用いた。第一鎖合成の産物を用いた次のＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ９１（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣ  ＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧ＞３）（配列番号１１）及び逆方向プライマーＢＢ９２（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ＞３）（配列番号１２）を用いて実施した。プライマーＢＢ９１は、Ｇ−ＣＳＦ分泌シグナルのためのコード配列の５′末端にアニーリングし、逆方向プライマーＢＢ９２は、Ｇ−ＣＳＦコード配列の３′末端にアニーリングする。得られた〜６４０ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢａｍ  ＨＩで消化し、ゲル精製して、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢａｍ  ＨＩで消化しアルカリホスファターゼ処理してゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングした。正しいＤＮＡ配列を備えたクローン（Ｓｏｕｚａら、１９８６；Ｎａｇａｔａら、１９８６ａ、ｂ）を、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：Ｇ−ＣＳＦｆｕｓ又はｐＢＢＴ１６５と称した。
【００５１】
Ｃ．ＩｇＧコード配列のクローニング
１．ＩｇＧ１−Ｆｃコード配列のクローニング
ＩｇＧ１−Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）をコード化するｃＤＮＡを、プライマーＢＢ８３（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧ  ＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴ＞３）（配列番号１３）及びＢＢ８２（５＞ＣＧＣＴＣＴＡＧ  ＡＧＧＴＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＴＣＣＴＣＧ＞３）（配列番号１４）を用いたＰＣＲにより、ヒト白血球一本鎖ｃＤＮＡ（クロンテック社、カリフォルニア州パロアルト所在（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ））から増幅させた。順方向プライマーＢＢ８３は、ＩｇＧ１のヒンジドメインのコード配列の５′末端にアニーリングするが、逆方向プライマーＢＢ８２は、翻訳終止コドンの約４５ｂｐ下流のＩｇＧ１及びＩｇＧ４  ｍＲＮＡの３′非翻訳領域にアニーリングする。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４配列は、ＢＢ８２がアニーリングする２１ｂｐセグメントにわたり同一であった。約７９０ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｂａｍ  ＨＩ及びＸｂａ  Ｉで消化し、ゲル精製して、Ｂａｍ  ＨＩ及びＸｂａ  Ｉで消化しアルカリホスファターゼ処理してゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。２つのクローンを塩基配列決定したが、それぞれはアミノ酸置換変異をもたらす単一塩基対置換を含有した。他の点では、その配列は、発表されたヒトＩｇＧ１ゲノムＤＮＡ配列（Ｅｌｌｉｓｏｎら、１９８２）とマッチした。我々は、２つのクローンの突然変異の相対的位置により、インビトロ組換えを通してｐＣＤＮＡ３．１（＋）の全長ＩｇＧ１−Ｆｃクローンを構築するための、簡便で固有の制限部位（ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターのＩｇＧ１及びＢｇｌ  ＩＩのＣＨ２ドメインのＳａｃ  ＩＩ）を用いることができた。得られたクローンは、正しいＩｇＧ１−Ｆｃ配列を有し、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｆｕｓＩｇＧ１−Ｆｃ又はｐＢＢ１６７と称した。
【００５２】
２．ＩｇＧ４−Ｆｃコード配列のクローニング
ＩｇＧ４−Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）をコード化するｃＤＮＡを、プライマーＢＢ８４（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧ  ＴＧＧＣＴＣＡＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣ＞３）（配列番号１５）及びＧＧ８２（５＞ＣＧＣＴＣＴＡＧ  ＡＧＧＴＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡ  ＴＣＣＴＣＧ＞３）（配列番号１４）を用いたＰＣＲにより、ヒト白血球一本鎖ｃＤＮＡ（クロンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））から増幅させた。順方向プライマーＢＢ８４は、ＩｇＧ４のヒンジドメインのコード配列の５′末端にアニーリングする。逆方向プライマーＢＢ８２は、上に記載している。〜７９０ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｂａｍ  ＨＩ及びＸｂａ  Ｉで消化し、同様に消化したｐＣＤＮＡ３．１（＋）に入れてクローニングした。正しいｃＤＮＡ配列を備えたクローン（Ｅｌｌｉｓｏｎら、１９８１）を、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｆｕｓＩｇＧ４−Ｆｃ又はｐＢＢ１５８と称した。
【００５３】
３．ＩｇＧ１−ＣH コード配列のクローニング
ＩｇＧ１−ＣH （ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）をコード化するｃＤＮＡを、ＢＢ８１（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ  ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣ＞３）（配列番号１６）及びＢＢ８２（５＞ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＣ  ＡＴＣＣＴＣＧ＞３）（配列番号１４）を用いたＰＣＲにより、ヒト白血球一本鎖ｃＤＮＡ（クロンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））から増幅させた。順方向プライマーＢＢ８１は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４のＣＨ１ドメインのコード配列の５′末端にアニーリングする。これら２つのエキソンのＣＨ１ドメインの５′末端の配列は、ほとんど同一である（２０個のヌクレオチド中１９個がマッチする）。逆方向プライマーＢＢ８２は、上に記載している。〜１０８０ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｂａｍ  ＨＩ及びＸｂａ  Ｉで消化し、ゲル精製して、同様に消化したｐＣＤＮＡ３．１（＋）に入れてクローニングした。原則として、これらのプライマーは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４配列の両者とも増幅させることができる。ＩｇＧ１は、ＩｇＧ４よりも血清中にかなり豊富にあるため（Ｒｏｉｔｔら、１９８９）、我々はほとんどのクローンがＩｇＧ１をコード化すると予測した。塩基配列決定した最初の２つのクローンは、ＩｇＧ１であったが、それぞれがアミノ酸置換変異をもたらした単一塩基対置換を含有した。他の点では、得られた配列は、発表されたヒトＩｇＧ１ゲノムＤＮＡ配列（Ｅｌｌｉｓｏｎら、１９８２）とマッチした。我々は、２つのクローンの突然変異の相対的位置により、インビトロ組換えを通してｐＣＤＮＡ３．１（＋）の全長ＩｇＧ１−ＣH クローンを構築するための、簡便で固有の制限部位（ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターのＩｇＧ１及びＢｓｔ  Ｂ１のＣＨ１ドメインのＡｇｅ  Ｉ）を用いることができた。正しいＩｇＧ１−ＣH 配列を備えたクローンは、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｆｕｓＩｇＧ１−ＣH 又はｐＢＢＴ１６６と称した。
【００５４】
４．ＩｇＧ４−ＣH コード配列のクローニング
ＩｇＧ１及びＩｇＧ  ＣＨ１ドメインの５′末端をコード化するＤＮＡ配列がほとんど同一であること、及びＩＧ４  ｍＲＮＡが相対的に少ないことにより、ＩｇＧ４−ＣH コード配列をクローニングするための別の戦略が導かれた。ＰＣＲを基にした部位特異的突然変異誘発を用いて、クローニングしたＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのＤＮＡ配列を変化させ、ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列にマッチさせた。ＣＨ１ドメインは、アミノ酸が９８個中８個しか異なっておらず、これらの位置が集中しているため、２つの突然変異誘発性オリゴ（mutagenic oligos）を用いた１サイクルのＰＣＲにより、ＩｇＧ１  ＣＨ１配列をＩｇＧ４  ＣＨ１配列に変換することができる。２サイクル目のＰＣＲは、Ｂａｍ  ＨＩ部位及びリンカー配列をＩｇＧ４  ＣＨ１の５′末端に付加させ、ＩｇＧ４ヒンジドメインからの２１ｂｐの配列を３′末端に付加させた。その後、「重複伸長による遺伝子スプライシング」の技術（Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３；Ｉｎｎｉｓら、１９９０）を利用して、人工的に作製したＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインをＩｇＧ４  Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）配列で組換えた。この技術では、同一配列のセグメントを共有する２つの別個の断片（一端が「重複」）を、図１に示すようにＰＣＲ反応でアニーリングした重複領域を通して伸長させる。
【００５５】
ＩｇＧ４  ＣＨ１配列を構築するために、突然変異誘発性プライマーＢＢ１１９（５＞ＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴ  ＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣ＞３）（配列番号１７）及びＢＢ１２０（５＞ＴＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＧＡＴＣ  ＴＡＣＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＡＡ＞３）（配列番号１８）を、上記のようにクローニングしたＩｇＧ１−ＣH 配列を保有するｐＢＢ１６６と共にＰＣＲ反応に用いた。順方向プライマーＢＢ１１９は、ＣＨ１ドメインのアミノ酸２３個中２個をコード化する配列にアニーリングし、４つのアミノ酸置換物（Ｓ１４Ｃ、Ｋ１６Ｒ、Ｇ２０Ｅ、及びＧ２１Ｓ）をコード化する。逆方向プライマーＢＢ１２０は、ＣＨ１ドメインのアミノ酸９７個中７６個をコード化する配列にアニーリングし、別の４つのアミノ酸置換物（Ｑ７９Ｋ、Ｉ８２Ｔ、Ｎ８６Ｄ、及びＫ９７Ｒ）をコード化する。〜２９０ｂｐのこのＰＣＲ反応の産物をゲル精製し、プライマーＢＢ８１（上記実施例１のＣ３を参照）及びＢＢ１２１（５＞ＴＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴ＞３）（配列番号１９）と共に、ＰＣＲ反応で鋳型として用いた。逆方向プライマーＢＢ１２１は、ＩｇＧ４のＣＨ１ドメインの３′末端にアニーリングし、ＣＨ１ドメインの９８位アミノ酸及びＩｇＧ４のヒンジドメインに伸長する２１ｂｐを付加する。〜３３０ｂｐのこの反応の産物をゲル精製して、ＰＣＲスプライシング反応の鋳型分子の１つとして用いた。スプライシング反応のための別の鋳型を、上記のようにＩｇＧ４  Ｆｃドメインを増幅させるプライマーＢＢ８４及びＢＢ８２による、ｐＢＢＴ１５８（前の実施例１のＣ２に記載）のクローニングＩｇＧ４−Ｆｃ配列のＰＣＲで生成した。得られた〜７９０ｂｐの産物は、ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３配列から構成されている。この断片をゲル精製して、ＰＣＲスプライシング反応での鋳型分子の１つとして用いた。この反応は、プライマーＢＢ８１及びＢＢ８２を利用し、〜１０７５ｂｐの全長「スプライシング」産物を生成した。この産物を確認するために必要なＤＮＡ塩基配列決定を最小限にするために、ＰＣＲ断片をＢａｍ  ＨＩ及びＳａｃ  ＩＩで消化して、〜５３０ｂｐの断片（完全なＣＨ１及びヒンジドメインと、ＣＨ２ドメインの一部とを含有する）を、塩基配列決定のためにｐＢＣ−ＳＫ＋（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にクローニングした。Ｂａｍ  ＨＩ−Ｓａｃ  ＩＩ断片の配列を、「ｐＢＢＴ１８２」という名称の１つのクローンで確認した。その後、以下に記載のように、ｐＢＢＴ１８２のＢａｍ  ＨＩ―Ｓａｃ  ＩＩ断片を用いて、ＧＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃクローンを全長ＧＦ−ＩｇＧ４−ＣH クローンに変換した。
【００５６】
Ｄ．成長ホルモン−、ＥＰＯ−、及びＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合体の構築
ＥＰＯ−、Ｇ−ＣＳＦ−、及びＧＨ−ＩｇＧ遺伝子融合体のほとんど（１２個中９個）は、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）中でクローニングしたＩｇＧコード配列をＢａｍ  ＨＩ−Ｘｂａ  Ｉ断片として切り出し、Ｂａｍ  ＨＩ及びＸｂａ  Ｉで切断したｐＣＤＮＡ：：［ＧＦ］組換えプラスミドにこれらの断片をクローニングすることにより生成した。ＩｇＧ４−ＣH への３種の増殖因子遺伝子の融合体は、ｐＢＢＴ１８２の〜５３０ｂｐのＢａｍ  ＨＩ−Ｓａｃ  ＩＩ断片を切り出して、３種のｐＣＤＮＡ：：［ＧＦ］−ＩｇＧ４−Ｆｃクローンの〜２４０ｂｐのＢａｍ  ＨＩ−Ｓａｃ  ＩＩ断片を、この〜５３０ｂｐのＢａｍ  ＨＩ−Ｓａｃ  ＩＩ断片に置換することにより構築した。得られたプラスミド及びそれらがコード化したＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質は、表１に列挙している。
【００５７】
Ｅ．Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）−ＩｇＧ融合タンパク質
Ｇ−ＣＳＦのシステイン−１７をセリンで置換しているＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合体［Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）］を、以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：Ｃ１７Ｓ−Ｆ（５′ＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧ−３′）（配列番号２０）及びＣ１７Ｓ−Ｒ（５′ＣＡＣＴＴＧＣＴＣＴＡＡＧＧＡＣＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡ−３′）（配列番号２１）を用いたＰＣＲ突然変異誘発により構築することができる。例えば、Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合体は、ｐＢＢＴ１７４を鋳型として用いた２種の別個のＰＣＲ反応を実施することにより構築することができる。１つの反応は、オリゴＣ１７Ｓ−ＦをＢＢ８２と共に用いることができる。２番目のＰＣＲ反応は、オリゴＣ１７Ｓ−ＲをＢＢ９１と共に用いることができる。これらの反応のＰＣＲ産物を、ゲル精製し、混合して、ＢＢ８２及びＢＢ９１を用いて再増幅させることができる。〜１３００ｂｐの産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｆｌＭＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｆｌＭＩバンドをゲル精製して、同様に切断したプラスミドｐＢＢＴ１７４にクローニングすることができる。Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５αの形質転換の後、Ｃ１７Ｓ突然変異を含有するプラスミドクローンを、ＤＮＡ塩基配列決定法により同定することができる。同様の突然変異誘発手順を用いて、適当なヌクレオチド（所望のアミノ酸をコード化するセンス及びアンチセンスヌクレオチド）を、オリゴＣ１７Ｓ−Ｆ及びＣ１７Ｓ−Ｒの下線のヌクレオチドに置換することにより、システイン−１７を別のアミノ酸に変化させることができる。
【００５８】
（実施例２）
ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の発現及び精製
Ａ．ＣＯＳ細胞の少量（small scale ）形質移入
ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の発現及び生物活性を、最初はＣＯＳ細胞の少量形質移入により評価した。エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡを、「Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（キアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．））を用い、販売業者のプロトコールに従い調製して、ＣＯＳ−１細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル所在）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から入手）をトランスフェクトするために用いた。ＣＯＳ−１細胞は、１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭグルタミンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＣＯＳ細胞増殖培地）で増殖させた。最初の形質移入実験は、以下のプロトコールを用いて、Ｃｏｓｔａｒ６穴組織培養プレート（ＶＷＲサイエンティフィック社（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で実施した。要約すると、２〜３ｘ１０5 細胞をＣＯＳ細胞増殖培地２ｍｌの各ウェルに播種して、３７℃、５％ＣＯ2 で一夜インキュベートさせると、その時までに細胞は５０〜６０％集密に達した。各ウェル毎に、プラスミドＤＮＡ０．８μｇを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（ギブコＢＲＬ社  メリーランド州ゲイザーズバーグ所在（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ））１８６μｌ中のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（ギブコＢＲＬ社  メリーランド州ゲイザーズバーグ所在（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ））６μｌと、室温で３０〜４５分間複合させた。ＣＯＳ−１細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１  ２ｍｌ／ウェルで１回洗浄し、その後ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１  １．８ｍｌを各ウェルに添加した。その後、複合体混合物をウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ2 で約４〜５時間放置した。インキュベーション期間の後、混合物をＣＯＳ細胞増殖培地２ｍｌ／ウェルに置換して、３７℃、５％ＣＯ2 で一夜放置した。翌日、細胞をＤＭＥＭ（添加剤なし）２ｍｌ／ウェルで２回洗浄した。洗浄ステップの後、無血清ＣＯＳ細胞増殖培地２ｍｌを各ウェルに添加して、細胞を３７℃、５％ＣＯ2 で放置した。ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質を含有する馴化培地を、７２時間後に採取して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットで分析して、ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の発現を確認した。その親プラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、陰性対照として用いた。形質移入効率は、Ｅ．Ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼを発現するｐＣＭＶβ（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて、約１５％であると推定された。β−ガラクトシダーゼを発現する形質移入細胞は、β−Ｇａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｅｔ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス所在（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ））を用いて同定した。
【００５９】
（所望なら１％β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を添加したＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で馴化培地の試料を調製して、）プレキャストの１４％トリスグリシンポリアクリルアミドゲル（ノベックス社（Ｎｏｖｅｘ））で電気泳動した。適当な抗血清を用いたウェスタンブロットにより、ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質全ての発現が実証された。ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質は、ポリクローナルウサギ抗合成ｈＧＨ抗血清（Ｄｒ．Ａ．  Ｆ．  Ｐａｒｌｏｗ及びナショナル・ホルモン・アンド・ピチューイタリー・プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ）から贈呈された）を用いて検出した。ＥＰＯ−及びＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質は、Ｒ＆Ｄシステムズ社（ミエソタ州ミネアポリス所在）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ））から購入したポリクローナル抗血清を用いて検出した。馴化培地の連続希釈液を、後記の適当なインビトロバイオアッセイで分析した。これらのアッセイにより、馴化培地での有意な活性が実証された。
【００６０】
Ｂ．ＣＯＳ−１細胞の大量形質移入
大量形質移入を、１００ｍｍ組織培養皿又はＣｏｒｎｉｎｇＴ−７５組織培養フラスコ（ＶＷＲサイエンティフィック社（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて実施した。１００ｍｍ皿では、１．６ｘ１０7 個の細胞を、ＣＯＳ細胞増殖培地１０ｍｌ／皿に入れて、３７℃、５％ＣＯ2 で一夜インキュベートした。各１００ｍｍ皿に、エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡ６．７μｇを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１  １．５ｍｌ中のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬５０μｌと、室温で３０〜４５分間複合させた。ＣＯＳ−１細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ１  １０ｍｌ／皿で１回洗浄し、その後ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１  ６．６ｍｌに置換した。複合体形成の後、複合体１．６７ｍｌを各皿に添加して、３７℃、５％ＣＯ2 で４〜５時間放置した。インキュベーション期間の後、反応混合物を血清含有ＣＯＳ細胞増殖培地１０ｍｌ／皿に置換して、３７℃、５％ＣＯ2 で一夜放置した。翌日、細胞をＤＭＥＭ（添加剤なし）１０ｍｌ／皿で２回洗浄した。洗浄ステップの後、無血清ＣＯＳ細胞増殖培地１０ｍｌを各皿に添加して、３７℃、５％ＣＯ2 でインキュベートした。馴化培地を、３日毎に（３、６、９、及び１２日目）日常的に採取して、新鮮な無血清ＣＯＳ細胞増殖培地を細胞に添加した。Ｔ−７５培養フラスコでの形質移入は、以下の例外を除けば１００ｍｌ皿でのプロトコールと同等であった。（各Ｔ−７５フラスコでは、２ｘ１０6 個／フラスコの細胞を入れ、エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡ９．３５μｇを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１  ２．１ｍｌ中のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬７０μｌと複合させた。複合体形成の後、複合体２．３ｍｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ１  ７．７ｍｌを含有する各フラスコに添加した。）形質移入効率は、ｐＣＭＶβを用い、前記のβ−ガラクトシダーゼ発現を染色することより、約１５％と測定された。表１に列挙した１２種のプラスミドを、大量形態で用いるＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトして、精製のためにタンパク質を生成させた。馴化培地を、遠心分離で不純物除去して、後の精製のために−８０℃で保存した。ウェスタンブロットを用いて、ＩｇＧ−融合タンパク質の発現を確認した。
【００６１】
Ｃ．ＧＦ−ＩｇＧ−融合タンパク質の精製
各ＩｇＧ−融合タンパク質毎に形質移入ＣＯＳ−１細胞の馴化培地約３００ｍｌをプールして、Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ細胞と、ＹＭ３又はＹＭ３０  ＤＩＡＦＬＯ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ膜（アミコン社  マサチューセッツ州ベヴァリー所在（Ａｍｉｃｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ））のいずれかとを用いて濃縮した。その後、濃縮したプールを、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で予め平衡にした１ｍｌ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＴｒａｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムに負荷した。Ａ280がベースラインに達するまで、カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウムで洗浄した。結合したタンパク質を、１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出して、十分な１Ｍトリス（ｐＨ９．０）中に回収して、最終的ｐＨを約７．０にした。各融合タンパク質を専用のカラムを用いて精製し、交叉汚染の可能性を回避した。ＩｇＧ融合タンパク質全てを同様にクロマトグラフィーにかけ、溶出ステップで単一ピークを生成させた。カラム分画を、８〜１６％プレキャストトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、ＩｇＧ−融合タンパク質が豊富な分画をプールした。標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて、プールした分画のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（バイオラド・ラボラトリーズ社（カルフォルニア州リッチモンド所在）Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＣＡ））で測定した。
【００６２】
精製したＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質を、還元及び非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、クマシーブルーで染色した。ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質は全て、主に二硫化物結合二量体として回収した（典型的には、回収されたＩｇＧ融合タンパク質の９０％を超える量が二量体であった）。タンパク質の見かけ上の分子量は、非還元条件下では１１５〜１９０ｋＤａ（二硫化物結合二量体）、還元条件下では５０〜７５ｋＤａ（単量体）の範囲であり、表１で予測した分子量と大きく一致した。単量体と二量体のサイズの差により、単量体と二量体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで容易に識別することができた。単量体及び二量体ＧＨ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質の見かけ上の分子量は、それぞれ約５０ｋＤａ及び１１５ｋＤａであった。単量体及び二量体Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質の見かけ上の分子量も、それぞれ約５０ｋＤａ及び１１５ｋＤａであった。二量体ＩｇＧ−ＣH 融合体の見かけ上の分子量は、予測よりも大きかった（ＧＨ−ＩｇＧ−ＣH 及びＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ−ＣH 融合体では約１６０ｋＤａ、ＥＰＯ−ＩｇＧ−ＣH 融合体では約１８０ｋＤａ）。ＥＰＯ−ＩｇＧ−ＣH 融合単量体も、予測よりも大きく、約７４ｋＤａの見かけ上の分子量を保有した。ＥＰＯ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質の分子量も、予測よりも大きかった（見かけ上の単量体及び二量体分子量はそれぞれ６２ｋＤａ及び１３０ｋＤａ）。ＥＰＯ−Ｉｇ融合タンパク質が予測サイズよりも大きいのは、おそらくＥＰＯドメインの広範なグリコシル化によるものであろう。単量体融合タンパク質は、精製したタンパク質全てに存在したが、ＩｇＧ４融合タンパク質の方が豊富であった。主要なＩｇＧ融合タンパク質バンドのサイズは、ウシＩｇＧの分子量とは異なっており、精製したタンパク質に実験で用いた血清のウシＩｇＧが混入していないことが示された。主要なＩｇＧ融合タンパク質バンドは、試料のウェスタンブロットではＧＨ、ＥＰＯ、及びＧ−ＣＳＦに特異的な抗血清とも反応した。ゲルのクマシーブルー染色から、ＩｇＧ融合タンパク質の精製が少なくとも９０％であると推定された。
【００６３】
試料を非還元条件下で分析した場合には、ＧＦ−ＩｇＧ−ＣH 融合体全てが、ゲル上部に移動する大きな凝集体を含有した。試料を還元条件下で分析した場合には、この凝集体は消失し、主要なＧＦ−ＩｇＧ−ＣH バンドの分子量のタンパク質量が、比例して増加するように思われた。その凝集体は、種々の増殖因子に特異的な抗血清とも反応した。これらのデータから、凝集体がＧＦ−ＩｇＧ−ＣH 融合タンパク質の二硫化物結合多量体であることが示唆される。縮小したＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下では、ＧＦ−ＩｇＧ−ＣH 融合体全てが、主なＧＦ−ＩｇＧ−ＣH バンドよりも約２０ｋＤａ大きな、広がったバンドを示している。このバンドは、増殖因子に対する抗血清と反応し、その凝集体に関係する可能性がある。
【００６４】
【表１】
0004944324.tif 000002
（実施例３）
精製ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質のインビトロ生物活性
Ａ．一般的戦略
ＩｇＧ融合タンパク質のインビトロ生物活性を測定するために細胞増殖アッセイを開発した。このアッセイでは、テトラゾリウム塩ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−３−カルボキシフェニル］−２−（４−スルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］の取り込みと生体内還元が測定される。メト硫酸フェナジン（ＰＭＳ）などの電子結合体が存在すると、ＭＴＳは、組織培養培地に溶解することができ、かつ４９０ｎｍで直接測定することができるホルマザン生成物に転化される。細胞数は約２までの吸光度と直線関係にある。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦについては、既存の細胞系を使用してバイオアッセイを開発することができた。ＧＨでは、ＧＨに応答して増殖する細胞系を作成する必要があった。このような細胞系を、マウス白血病細胞系をウサギＧＨ受容体により安定に形質転換することにより作成した。
【００６５】
一般に、バイオアッセイは、適当な細胞を培地（添加物無し）で３度洗浄し、その細胞を添加物含有培地（各細胞系に対し使用した培地は以下に示す）中に０．７−１×１０3／ｍｌの濃度で再懸濁させることにより開始される。５０μｌ（３．５−５×１０3／ｍｌ細胞）の細胞懸濁液を、平底９６ウェル組織培養プレートの試験ウェル毎にアリコートに分けて入れた。試験するタンパク質サンプルの連続希釈物を血清含有培地で調製した。５０μｌの希釈タンパク質サンプルを試験ウェルに添加し、プレートを加湿５％ＣＯ2組織培養インキュベータ中、３７℃でインキュベートした。タンパク質サンプルを３連のウェルで分析した。６０−７２時間後、２０μｌのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン所在（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））を各ウェルに添加し、組織培養インキュベータ中３７℃で１−４時間プレートをインキュベートした。微量プレート読み取り装置を用いてウェルの吸光度を４９０ｎｍで読み取った。対照標準ウェルは培地は含んだが細胞は含まなかった。３つの対照標準ウェルの平均吸光度値を試験ウェルに対し得られた平均値から差し引いた。最大刺激の半分に必要なタンパク質の量であるＥＣ50を各サンプルに対して計算し、それを用いてタンパク質の生物活性を比較した。一貫性を維持するためにモル比計算においてはグリコシル化されていない分子量を使用した。ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＨに対し、グリコシル化されていない分子量はそれぞれ、１８，９３６、１８，９８７、２２，１２９であると仮定した。ＩｇＧ融合タンパク質に対する計算に単量体分子量を使用した。ＳＤＳゲルから推定された単量体融合タンパク質（５０−７０ｋＤａ）の分子量およびＥＰＯに対する３５ｋＤａおよびＧ−ＣＳＦに対する１９．７ｋＤａのグリコシル化された分子量（ＧＨはグリコシル化されていない）を使用すると、同様の活性比が得られた。
【００６６】
Ｂ．ＥＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性
ヒトＵＴ７／ｅｐｏ細胞系を、ハーバード大学医学部、マサチューセッツ州ボストン所在（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のＦ．Ｂｕｎｎ博士から入手した。この細胞系はＥＰＯに応答して増殖し、細胞生存についてはＥＰＯに依存する（Ｂｏｉｓｓｅｌら、１９９３年）。細胞を１０％のＦＢＳ、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１単位／ｍｌの組換えヒトＥＰＯ（ＣＨＯ細胞発現；Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が追加されたイスコブの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｅｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉａ）に維持した。バイオアッセイを上記手順を用いて細胞維持培地中で行った。組換えＣＨＯ細胞発現ヒトＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の連続希釈物を同時に分析した。
【００６７】
ＵＴ７／ｅｐｏ細胞系は、細胞数および吸光度値の用量依存的増加により証明されるように、ｒＥＰＯに対し強い増殖応答を示す。ｒＥＰＯが存在しないと、ＵＴ７／ｅｐｏ細胞の大部分が死亡し、吸光度値は０．１未満となる。市販のＣＨＯ細胞発現ｒＥＰＯはバイオアッセイで約０．６ｎｇ／ｍｌの平均ＥＣ50を示した（表２）。この値はＲ＆Ｄシステムズ仕様書において報告されたＥＣ50値（０．０５−０．１単位／ｍｌまたは約０．４−０．８ｎｇ／ｍｌ）と一致する。ＥＰＯ−ＩｇＧ１−ＦｃおよびＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質はバイオアッセイにおいて約１．３ｎｇ／ｍｌの同じＥＣ50を示した（表２）。モルを基準とすると、ＣＨＯ細胞発現ｒＥＰＯおよびＥＰＯ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合物のＥＣ50は区別できなかった（約３０ｐＭ、表２）。ＥＰＯ−ＩｇＧ−ＣH融合タンパク質は３．１ｎｇ／ｍｌまたは６０ｐＭのＥＣ50を示し（表２）、これはＥＰＯ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質および非融合ｒＥＰＯに対する比活性の２倍の減少を示している。ＥＰＯ−ＩｇＧ４−ＣH融合タンパク質は２．０５ｎｇ／ｍｌの平均ＥＣ50を有していた。
【００６８】
【表２】
0004944324.tif 000003
Ｃ．Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性
マウスＮＦＳ６０細胞系をテネシー大学医学部、テネシー州メンフィス所在（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｍｅｍｐｈｉｓ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）のＪ．Ｉｈｌｅ博士から入手した。この細胞系はヒトまたはマウスＧ−ＣＳＦまたはＩＬ−３に応答して増殖する（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、１９８６年）。細胞を１０％のＦＢＳ、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１７−１７０単位／ｍｌのマウスＩＬ−３（Ｒ＆Ｄシステムズ）を追加したＲＰＭＩ  １６４０培地中で維持した。上記手順を用いて１０％のＦＢＳ、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ  １６４０培地中でアッセイを行った。組換えヒトＧ−ＣＳＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ発現、Ｒ＆Ｄシステムズ）の連続希釈物を同時に分析した。
【００６９】
ＮＦＳ６０細胞系は、細胞数および吸光度値の用量依存的増加により証明されるように、ｒｈＧ−ＣＳＦに対し強い増殖応答を示す。ｒｈＧ−ＣＳＦはバイオアッセイで１８ｐｇ／ｍｌの平均ＥＣ50を示した（表３）。この値はＲ＆Ｄシステムズ仕様書において報告されたＥＣ50値（１０−３０ｐｇ／ｍｌ）と一致する。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−ＦｃおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質はそれぞれ、バイオアッセイにおいて３８および５７ｐｇ／ｍｌの平均ＥＣ50を示した（表３）。モルを基準とすると、ｒｈＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合物のＥＣ50は類似し（約０．９ｐＭ、表３）、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質のＥＣ50はわずかに減少した（１．２５ｐＭ）。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−ＣH融合タンパク質は１８２ｐｇ／ｍｌまたは３．２ｐＭの平均ＥＣ50を示し（表３）、これはＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質および非融合ｒｈＧ−ＣＳＦに対し比活性の３倍の減少を示している。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−ＣH融合タンパク質は１８２ｐｇ／ｍｌまたは３．９ｐＭの平均ＥＣ50を示した（表３）。
【００７０】
【表３】
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Ｄ．ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性
ＧＨ−Ｒ４細胞系はＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１において説明されている。この細胞系はウサギＧＨ受容体により安定に形質転換されるマウスＦＤＣ−Ｐ１細胞系の誘導体である。この細胞系はｈＧＨに応答して増殖する。１０％ウマ血清、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８、２−５ｎＭの下垂体ｈＧＨを含むＲＰＭＩ  １６４０培地で細胞系を維持する。１０％ウマ血清、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を追加したＲＰＭＩ培地を用いて、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４４９７およびＰＣＴ／ＵＳ００／００９３１において説明されているようにＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質サンプルのアッセイを行った。上記２つの文献については参照により明細書に組み込むものとする。全てのアッセイはヒト下垂体ＧＨ標準を含んでいた。下垂体ＧＨはＧＨ−Ｒ４細胞の増殖を刺激し、ＥＣ50は０．７５−０．８５ｎｇ／ｍｌ（０．０３−０．０４ｎＭ）であり、これは文献（Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら、１９９５年）で報告されているものと同様であった。
【００７１】
試験したＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質はすべてＧＨ−Ｒ４細胞の増殖を刺激した（表４）。ＧＨ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質は最も活性が高く、７−８ｎｇ／ｍｌ（〜０．１６ｎＭ）のＥＣ50を示した。ＧＨ−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質はＩｇＧ１融合タンパク質よりも活性が約２倍低く、平均ＥＣ50は１７ｎｇ／ｍｌ（０．３５ｎＭ）であった。ＧＨ−ＩｇＧ１−ＣH融合タンパク質の活性が最も低く、ＥＣ50は３５ｎｇ／ｍｌ（０．６ｎＭ）であった。モルを基準とすると、融合タンパク質の生物活性は下垂体ｈＧＨに対し、４倍（ＧＨ−ＩｇＧ１−Ｆｃ）、１０倍（ＧＨ−ＩｇＧ４−Ｆｃ）、１７倍（ＧＨ−ＩｇＧ１−ＣH）減少した。
【００７２】
【表４】
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（実施例４）
ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質におけるリンカーの排除または最小化
ＧＦをＩｇＧドメインに融合させる７アミノ酸リンカー［ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ］を排除するか（直接融合）または減少させて２から４のアミノ酸としたＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質を、以下のように作成することができる。同様の方法を使用して、７アミノ酸より短いリンカーを作成したり、７アミノ酸より長いリンカーを作成したり、他のアミノ酸配列を含むリンカーを作成したりことができる。以下で説明する実験では、例としてＩｇＧ−Ｆｃ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦを使用するが、他のＧＦまたはＩｇＧドメイン、他のＩｇＧサブタイプに対するドメイン、およびＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体からのドメインに対し同様の手順を用いることができる。実施例において説明されるように、修飾された融合タンパク質を発現、精製し、インビトロバイオアッセイにおいてその比活性を決定することができる。
【００７３】
１．直接融合
実施例１で説明されているＰＣＲに基づく「オーバーラップ延長による遺伝子スプライシング」によりリンカーの無いＧＦ−ＩｇＧ融合物を作成することができる（Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３年）。短い５′延長部を有するＩｇＧ１−Ｆｃコード配列からなり、ヒンジコード配列に直接融合されるＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのコード配列の３′末端〜１５ｂｐからなる、ＰＣＲ生成物を作成することができる。同時に、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦコード配列に直接融合されるヒンジコード配列の最初の１５ｂｐからなる短い３′延長部を有するＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦコード配列からなるＰＣＲ生成物を作成することができる。増殖因子断片およびＩｇＧ１−Ｆｃ断片はＰＣＲ「ソーイング」（Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３年）により共にスプライスすることができ、直接融合物が作成される。これらのＰＣＲ生成物は適当な制限酵素で消化することができ、融合点にわたる比較的小さなＤＮＡ断片が得られる。この断片は、配列確認およびＣＯＳ細胞発現のために、クローニングし、同様に切断されたベクターｐＣＤＮ３．１（＋）：：ＥＰＯ−ＩｇＧ１−ＦｃおよびｐＣＤＮ３．１（＋）：：Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃとすることが容易である。これらのより小さなＤＮＡ断片のクローニングにより、直接融合物の配列を確認するのに必要とされる配列決定が最小に抑えられる。
【００７４】
１．Ａ．ＥＰＯ−ＩｇＧ直接融合物
ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＢＢＴ１８０を使用してＰＣＲによりＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合物を作成した。第１のＰＣＲはオリゴＢＢ１９８（５′−ＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３′）（配列番号２２）およびＢＢ８２を使用した。第２のＰＣＲ反応はオリゴＢＢ１９９（５′−ＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣ−３′）（配列番号２３）およびＢＢ８９を使用した。これらのＰＣＲ反応の生成物をゲル精製し、混合し、オリゴＢＢ８２とＢＢ８９を使用して第３のＰＣＲ反応を行った。約１３００ｂｐのＰＣＲ生成物をゲル精製し、Ｂｓｒ  ＧＩおよびＳａｃ  ＩＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理されている同様に切断されたｐＢＢＴ１８０に入れてクローニングした。正しい挿入物を有するクローンをＤＮＡ配列決定により同定し、ｐＢＢＴ３５６と称した。
【００７５】
ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＢＢＴ１８１を使用してＰＣＲによりＥＰＯ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合物を作成した。１つのＰＣＲはオリゴＢＢ２００（５′−ＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３′）（配列番号２４）およびＢＢ８２を使用した。第２のＰＣＲ反応はオリゴＢＢ２０１（５′−ＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣ−３′）（配列番号２５）およびＢＢ８９を使用した。これらのＰＣＲ反応の生成物をゲル精製し、混合し、オリゴＢＢ８２とＢＢ８９を使用して第３のＰＣＲ反応をさせた。約１３００ｂｐのＰＣＲ生成物をゲル精製し、Ｂｓｒ  ＧＩおよびＳａｃ  ＩＩにより消化させ、子ウシ腸ホスファターゼで処理されている同様に切断されたｐＢＢＴ１８１に入れてクローニングした。正しい挿入物を有するクローンをＤＮＡ配列決定により同定し、ｐＢＢＴ３５７と称した。正しいＥＰＯ配列を有するが、ＩｇＧ−Ｆｃ領域に突然変位（Ｐｈｅ−２５がＳｅｒに変化）を有するクローンはｐＢＢＴ２７３と称した。
【００７６】
ＣＯＳ細胞をｐＢＢＴ２７３で形質移入し、実施例２で説明したようにＥＰＯ−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質を精製した。精製タンパク質は主にジスルフィド−架橋二量体（＞９０％）からなり、ＵＴ７０／ＥＰＯ細胞の増殖を刺激し、ＥＣ50は２ｎｇ／ｍｌであった。バイオアッセイを実施例３で説明したように実行した。
【００７７】
ＥＰＯ（ｄｅｓ−Ａｒｇ−１６６）−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合物を、ＢＢ１９８の代わりにオリゴヌクレオチドＥＰＯＤＦＣ（５′−ＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３′）（配列番号２６）を使用し、ＢＢ１９９の代わりにＥＰＯＤＦＦ（５′−ＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣ−３′）（配列番号２７）を使用することを除き、ＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合物について上述したように作成することができる。同様に、ＥＰＯ（ｄｅｓ−Ａｒｇ−１６６）−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合物を、ＢＢ２００の代わりにＥＰＯＤＦＧ（５′−ＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３′）（配列番号２８）を使用し、ＢＢ２０１の代わりにＥＰＯＤＦＨ（５′−ＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣ−３′）（配列番号２９）を使用することを除き、ＥＰＯ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合物について上述したように作成することができる。
【００７８】
１．Ｂ．  Ｇ−ＣＳＦ直接融合物
ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＢＢＴ１７４を使用してＰＣＲによりＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合物を作成した。第１のＰＣＲ反応はオリゴＢＢ２０２（５′−ＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３′）（配列番号３０）およびＢＢ８２を使用した。第２のＰＣＲ反応はオリゴＢＢ２０３（５′−ＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ−３′）（配列番号３１）およびＢＢ９１を使用した。これらのＰＣＲ反応の生成物をゲル精製し、混合し、オリゴＢＢ８２とＢＢ９１を使用して第３のＰＣＲ反応を行った。約１３００ｂｐのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＰｆｌＭ１およびＳａｃ  ＩＩにより消化し、〜４００ｂｐのＰｆｌＭ１／Ｓａｃ  ＩＩ断片をゲル精製した。この断片を、子ウシ腸ホスファターゼで処理されている同様に切断されたｐＢＢＴ１７４に入れてクローニングした。正しい挿入物を有するクローンをＤＮＡ配列決定により同定し、ｐＢＢＴ２９９と称した。
【００７９】
ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＢＢＴ１７５を使用してＰＣＲによりＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合物を作成した。１つのＰＣＲはオリゴＢＢ２０４（５′−ＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３′）（配列番号３２）およびＢＢ８２を使用した。第２のＰＣＲ反応はオリゴＢＢ２０５（５′−ＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ−３′）（配列番号３３）およびＢＢ９１を使用した。これらのＰＣＲ反応の生成物をゲル精製し、混合し、オリゴＢＢ８２とＢＢ９１を使用して第３のＰＣＲ反応をさせた。約１３００ｂｐのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＰｆｌＭ１およびＳａｃ  ＩＩにより消化させ、〜４００ｂｐのＰｆｌＭ１／Ｓａｃ  ＩＩ断片をゲル精製した。この断片を子ウシ腸ホスファターゼで処理されている同様に切断されたｐＢＢＴ１７５に入れてクローニングした。正しい挿入物を有するクローンを有するクローンを同定し、ｐＢＢＴ３００と称した。
【００８０】
ＣＯＳ細胞をｐＢＢＴ２９９およびｐＢＢＴ３００で形質移入し、実施例２で説明したようにＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−ＦｃおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合タンパク質を精製した。精製タンパク質は主にジスルフィド−架橋二量体（＞９０％）からなり、ＮＦＳ６０細胞の増殖を刺激し、ＥＣ50は５０−６０ｐｇ／ｍｌ（Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合物）および４３−５０ｐｇ／ｍｌ（Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合物）であった。バイオアッセイを実施例３で説明したように実行した。
【００８１】
２．  ２または４アミノ酸リンカーを含むＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質
ジペプチド［ｓｅｒ−ｇｌｙ］リンカーを作成するために、ヒンジコード配列に５′延長部ＣＧＣＴＣＣＧＧＡを付加した５′オリゴヌクレオチドによりＩｇＧ１−Ｆｃ配列をＰＣＲすることができる。ＴＣＣＧＧＡヘキサヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼＢｓｐ  ＥＩに対する開裂部位であり、アミノ酸ｓｅｒ−ｇｌｙをコードする。このＰＣＲ断片をＢｓｐ  ＥＩおよびＳａｃ  ＩＩで消化し、〜２４０ｂｐ断片を同様に切断されたｐＣＤＮ３．１（＋）：：ＥＰＯ−ＩｇＧ１−ＦｃおよびｐＣＤＮ３．１（＋）：：Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃに入れてクローニングすることができる。これらのプラスミドのそれぞれにおける固有のＢｓｐ  ＥＩ部位は、リンカー［ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ］の最初のｓｅｒ−ｇｌｙで現れる。そのため、得られた組換え体はこの２アミノ酸、すなわちｓｅｒ−ｇｌｙ、から成るリンカーを含む。新しく挿入された〜２５０ｂｐ  Ｂｓｐ  Ｉ−Ｓａｃ  ＩＩの配列を確認することができる。
【００８２】
同様の手順を使用して、４アミノ酸［ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ］リンカーを作成することができる。ヒンジコード配列に５′延長部ＣＧＣＧＧＡＴＣＣを付加した５′オリゴヌクレオチドによりＩｇＧ１−Ｆｃ配列をＰＣＲすることができる。ＧＧＡＴＣＣヘキサヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼＢａｍ  ＨＩに対する開裂部位であり、アミノ酸ｇｌｙ−ｓｅｒをコードする。このＰＣＲ断片をＢａｍ  ＨＩおよびＳａｃ  ＩＩで消化し、〜２４０ｂｐ断片を同様に切断されたｐＣＤＮ３．１（＋）：：ＥＰＯ−ＩｇＧ１−ＦｃおよびｐＣＤＮ３．１（＋）：：Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃに入れてクローニングすることができる。これらのプラスミドのそれぞれにおける固有のＢａｍ  ＨＩ部位は、リンカー［ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ］の最初のｇｌｙ−ｓｅｒで現れる。そのため、組換え体は４アミノ酸（ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ）から成るリンカーを含む。新しく挿入された〜２５０ｂｐ  Ｂａｍ  ＨＩ−Ｓａｃ  ＩＩ片の配列を確認することができる。
【００８３】
増殖因子／部位カインドメインとＩｇＧ１−Ｆｃドメインとの間に２アミノ酸ＳｅｒＧｌｙリンカーを含む融合タンパク質を作成するために使用することができるＩｇＧ１−ＦｃドメインをＰＣＲにより作成した。ＰＣＲ反応ではＢＢ１９４（５′−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ３′）（配列番号３４）とＢＢ８２を使用した。ＤＮＡ鋳型はｐＢＢＴ１９５とした。ＰＣＲ生成物をＰＣＲクリーンアップキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））にかけ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩＩにより消化した。制限消化物をＰＣＲクリーンアップキットにかけ、子ウシ腸ホスファターゼにより処理した、同様に切断されたｐＢＣＳＫ（＋）（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．））ＤＮＡに入れてクローニングした。ライゲーションを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の形質転換を行った。５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板上で形質転換体の選択を行った。正しい配列を有するクローンをＤＮＡ配列決定により同定し、ｐＢＢＴ２４２と称した。
【００８４】
増殖因子／部位カインドメインとＩｇＧ１−Ｆｃドメインとの間に４アミノ酸Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１）リンカーを含む融合タンパク質を作成するために使用することができるＩｇＧ１−ＦｃドメインをＰＣＲにより作成した。ＰＣＲ反応ではプライマーＢＢ１９５（５′−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３′）（配列番号３５）とＢＢ８２を使用した。ＤＮＡ鋳型はｐＢＢＴ１９５とした。ＰＣＲ生成物をＰＣＲクリーンアップキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））にかけ、Ｂａｍ  ＨＩおよびＳａｃＩＩにより消化した。制限消化物をＰＣＲクリーンアップキットにかけ、子ウシ腸ホスファターゼにより処理した、同様に切断されたｐＢＣＳＫ（＋）ＤＮＡに入れてクローニングした。ライゲーションを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の形質転換を行った。５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板上で形質転換体の選択を行った。正しい配列を有するクローンをＤＮＡ配列決定により同定し、ｐＢＢＴ２４３と称した。
【００８５】
増殖因子／部位カインドメインとＩｇＧ４−Ｆｃドメインとの間に２アミノ酸リンカーＳｅｒＧｌｙを含む融合タンパク質を作成するために使用することができるＩｇＧ４−ＦｃドメインをＰＣＲにより作成した。ＰＣＲ反応ではプライマーＢＢ１９６（５′−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３′）（配列番号３６）とＢＢ８２を使用した。ＤＮＡ鋳型はｐＢＢＴ１９６とした。ＰＣＲ生成物をＰＣＲクリーンアップキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））にかけ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩＩにより消化させた。制限消化物をＰＣＲクリーンアップキットにかけ、子ウシ腸ホスファターゼにより処理した、同様に切断されたｐＢＣ（ＳＫ＋）ＤＮＡに入れてクローニングした。ライゲーションを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の形質転換を行った。５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板上で形質転換体の選択を行った。正しい配列を有するクローンをＤＮＡ配列決定により同定し、ｐＢＢＴ２４４と称した。
【００８６】
増殖因子／部位カインドメインとＩｇＧ４−Ｆｃドメインとの間に４アミノ酸リンカーｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒを含む融合タンパク質を作成するために使用することができるＩｇＧ４−ＦｃドメインをＰＣＲにより作成した。ＰＣＲ反応ではプライマーＢＢ１９７（５′−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３′）（配列番号３７）とＢＢ８２を使用した。ＤＮＡ鋳型はｐＢＢＴ１９６とした。ＰＣＲ生成物をＰＣＲクリーンアップキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））にかけ、Ｂａｍ  ＨＩおよびＳａｃＩＩにより消化した。制限消化物をＰＣＲクリーンアップキットにかけ、子ウシ腸ホスファターゼにより処理した、同様に切断されたｐＢＣ（ＳＫ＋）ＤＮＡに入れてクローニングした。ライゲーションを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の形質転換を行った。５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板上で形質転換体の選択を行った。正しい配列を有するクローンをＤＮＡ配列決定により同定し、ｐＢＢＴ２４５と称した。
【００８７】
修飾した上記ＩｇＧドメインを使用して、４アミノ酸リンカーを含むＥＰＯ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質を作成した。プラスミドｐＢＢＴ１７４およびｐＢＢＴ１８０をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理した。〜６ｋｂのベクターバンドをゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩＩによるｐＢＢＴ２４３  ＤＮＡの消化後にゲル精製したｐＢＢＴ２４３からの〜８００ｂｐＩｇＧ挿入物とライゲートした。同様に、プラスミドｐＢＢＴ１７５およびｐＢＢＴ１８１をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理した。〜６ｋｂのベクターバンドをゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩＩによるｐＢＢＴ２４５  ＤＮＡの消化後にゲル精製したｐＢＢＴ２４５からの〜８００ｂｐＩｇＧ挿入物とライゲートした。ライゲーションを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの形質転換を行い、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天平板上で形質転換体の選択を行った。正しい配列を有するクローンを制限マッピングおよびＤＮＡ配列決定により同定した。４アミノ酸リンカーを含むＥＰＯ−ＩｇＧ１−ＦｃおよびＥＰＯ−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合物をそれぞれ、ｐＢＢＴ２７９およびｐＢＢＴ２８０と称した。４アミノ酸リンカーを含むＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−ＦｃおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合物をそれぞれ、ｐＢＢＴ２７７およびｐＢＢＴ２７８と称した。
【００８８】
修飾した上記ＩｇＧドメインを使用して、２アミノ酸リンカーを含むＥＰＯ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質を作成することができる。プラスミドｐＢＢＴ１７４およびｐＢＢＴ１８０をＢｓｐＥＩおよびＳａｃＩＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理することができる。〜６ｋｂのベクターバンドをゲル精製し、ＢｓｐＥＩおよびＳａｃＩＩによるｐＢＢＴ２４２  ＤＮＡの消化後にゲル精製したｐＢＢＴ２４２からの〜８００ｂｐＩｇＧ挿入物とライゲートすることができる。同様に、プラスミドｐＢＢＴ１７５およびｐＢＢＴ１８１をＢｓｐＥＩおよびＳａｃＩＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理することができる。〜６ｋｂのベクターバンドをゲル精製し、ＢｓｐＥＩおよびＳａｃＩＩによるｐＢＢＴ２４４  ＤＮＡの消化後にゲル精製したｐＢＢＴ２４４からの〜８００ｂｐＩｇＧ挿入物とライゲートすることができる。ライゲーションを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの形質転換を行い、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天平板上で形質転換体の選択を行った。
【００８９】
組換え融合タンパク質は、ＣＯＳ細胞を形質移入するのに使用することができ、実施例２で説明したように精製することができる。これらの融合タンパク質のインビトロおよび生体内生物活性を、実施例３および８において説明したように決定することができる。
【００９０】
（実施例５）
ＩｇＧ−ＣH融合タンパク質の生物活性を改善するための方法
ＩｇＧ−ＣH融合タンパク質はすべて精製中に凝集したようであり、融合増殖因子の比活性は類似ＩｇＧ−Ｆｃ融合物に比べて〜２−３倍減少した。凝集は普通は軽鎖と結合するＣＨＩドメインが関係する疎水性相互作用によるものである可能性がある。Ｉｇ軽鎖のＧＦ−ＩｇＧ−ＣH融合物との同時発現により凝集を防止することができる。以下、Ｉｇ軽鎖とＩｇ重鎖を同時発現させる３つの方法を説明する。以下で説明する実験では例としてＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣH、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦを使用するが、他のＧＦまたはＩｇＧドメイン、他のＩｇＧサブタイプに対するドメイン、およびＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体からのドメインに対し同様の手順を使用することができる。ヒトκおよびλ軽鎖のＤＮＡ配列は周知である（Ｈｅｉｔｅｒら、１９８０年）。ヒトκおよび／またはλ軽鎖定常（ＣＬ）領域のｃＤＮＡ配列は、ヒト白血球一本鎖ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））またはヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック）からＰＣＲ増幅により得ることができる。クローニングしたＣＬドメインのＤＮＡ配列は、下記の実験において使用する前に確認することができる。修飾した融合タンパク質を発現させ、精製させることができ、その比活性を実施例２および３において説明したようにインビトロバイオアッセイにおいて決定することができる。
【００９１】
１．  軽鎖定常領域の同時発現
コザック（Ｋｏｚａｋ）配列（Ｋｏｚａｋ、１９９１年）と分泌シグナルを軽鎖定常領域の５′端に付加し、軽鎖定常領域の翻訳開始を促進し、その分泌を誘導することができる。翻訳停止コドンをその配列の３′端に付加することができる。適当なクローニング部位を５′および３′端に付加すると、ＲＳＶプロモータの制御下でクローニングして哺乳類細胞発現ベクターｐＲＥＰ４（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））とすることができ、ＳＶ４０誘導ポリＡ付加部位に先行させることができる。この構成を使用して、例えばＥＰＯ−ＩｇＧ−ＣHおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ−ＣHを発現するｐＣＤＮＡ３．１（＋）誘導体と共にＣＯＳ細胞を同時形質移入することができる。その代わりに、軽鎖および重鎖の両方を単一プラスミド構成から発現させることができる。この場合、軽鎖配列および側面のプロモータおよびｐＲＥＰ４からのポリＡ部位は適当な制限酵素により削除することができ、クローニングしてｐＣＤＮＡ３．１（＋）とすることができる。ＥＰＯ−ＩｇＧ−ＣHおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ−ＣHコード配列をその後クローニングして、ＣＭＶプロモータの制御下でｐＣＤＮＡ３．１（＋）ポリリンカーとすることができるであろう。
【００９２】
ヒトκ軽鎖の定常領域（ＩｇＫＣ）をコードするＤＮＡを、この実施例の２節で説明されているようにヒトゲノムＤＮＡから増幅した。この配列をＰＣＲにより修飾して軽鎖定常領域の発現に適した構成を作成した。コザック配列（Ｋｏｚａｋ、１９９１年）およびヒト成長ホルモン分泌シグナルを軽鎖定常領域の５′端に付加した。これらの修飾は２回の連続ＰＣＲ反応により行った。第１に、クローニングされ配列決定されたｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｆｕｓｉｇＫＣ  ＤＮＡを鋳型として使用した。プライマーはＢＢ１６９（５＞ＧＣＴＴＴＴＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴ＞３）（配列番号３８）およびＢＢ１５０（５＞ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ＞３）（配列番号３９）とした。順方向プライマーＢＢ１６９は軽鎖定常領域の５′端にアニールし、ｈＧＨリーダー配列の１５アミノ酸をコードする配列を付加する。逆方向プライマーＢＢ１５０はヒトκ軽鎖の定常領域に対するコード配列の３′端にアニールし、Ｘｂａ  Ｉ部位へと続く翻訳停止コドンを含む。このＰＣＲ反応生成物をゲル精製し、プライマーＢＢ１６８（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＴＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣ＞３）（配列番号４０）およびＢＢ１５０を用いる第２のＰＣＲ反応における鋳型として使用した。順方向プライマーＢＢ１６８はｈＧＨリーダー配列の残りをコザック配列と共に付加し、クローニング目的のＨｉｎ  ｄＩＩＩ部位を含む。逆方向プライマーＢＢ１５０は上述した通りである。このＰＣＲ反応生成物をＨｉｎ  ｄＩＩＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩおよびＸｂａ  Ｉで消化されアルカリホスファターゼで処理したベクターｐＣＤＮ３．１（＋）に入れてクローニングした。ＤＮＡ配列を１つのそのようなクローンに対し確認した。
【００９３】
２．  ＧＦ−軽鎖定常領域融合タンパク質の同時発現
軽鎖発現の他のモードは５′端を修飾し、ＣＬコード配列のアミノ酸末端に融合された柔軟なペプチドリンカー配列の一部を追加すると共にその配列の３′端に翻訳停止コドンを追加するものである。適当なクローニング部位を５′および３′端に付加すると、プラスミドｐＣＤＮ３．１（＋）：：ＥＰＯｆｕｓおよびｐＣＤＮ３．１（＋）：：Ｇ−ＣＳＦｆｕｓに入れてクローニングされるＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ遺伝子に対するインフレーム融合としてのクローニングが可能となる。このプラスミドを、例えばＥＰＯ−ＩｇＧ１−ＣHおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−ＣHを発現するプラスミドと共にＣＯＳ細胞に同時形質移入することができる。この場合、重鎖および軽鎖はどちらも増殖因子融合物を含む。軽鎖および重鎖は、やはり上述したように単一ｐＣＤＮＡ３．１（＋）構成から発現させることができるであろう。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦも、やはり実施例で説明した手順と類似の手順を使用してＩｇ−ＣLとの直接融合物として発現させることもできる。
【００９４】
ヒトκ軽鎖の定常領域（ＩｇＫＣ）をコードするＤＮＡを、プライマーＢＢ１４９（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴ＞３）（配列番号４１）およびＢＢ１５０（５＞ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ＞３）（配列番号４２）を用いてヒトゲノムＤＮＡから増幅した。順方向プライマーＢＢ１４９はヒトκ軽鎖の定常領域に対するコード配列の５′端にアニールし、５′端にＢａｍ  ＨＩ部位を含むペプチドリンカーの一部（ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ）（配列番号２）を含む。逆方向プライマーＢＢ１５０はヒトκ軽鎖の定常領域に対するコード配列の３′端にアニールし、Ｘｂａ  Ｉ部位へと続く翻訳停止コドンを含む。得られた〜３３０ｂｐＰＣＲ生成物をＢａｍ  ＨＩおよびＸｂａ  Ｉにより消化し、ゲル精製し、Ｂａｍ  ＨＩおよびＸｂａ  Ｉで消化されアルカリホスファターゼで処理され、ゲル精製されているベクターｐＣＤＮ３．１（＋）に入れてクローニングした。１つのクローンの配列決定を行うと、公表されているヒトＩｇＫＣゲノムＤＮＡ配列（Ｈｉｅｔｅｒら、１９８０年）に匹敵することがわかった。その後〜３３０Ｂａｍ  ＨＩ−Ｘｂａ  Ｉ断片をこのプラスミドから削除し、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｆｕｓＩｇＫＣと称し、クローニングしｐＢＢＴ１９０、ｐＢＢＴ１９１、ｐＢＢＴ１９２とした（以下の実施例１０において説明）。これらはそれぞれ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＦＮ‐γへのＩｇＫＣドメインの融合物となる。同様の手順を使用して、他の増殖因子／部位カイン−ＩｇＫＣ融合タンパク質を作成することができる。
【００９５】
３．  軽鎖−重鎖融合物
「同時発現」の第３のモードはＣＬコード配列の５′および３′端を修飾して、両端に柔軟なペプチドリンカーの一部を組み込むものである。適当なクローニング部位（例えば、Ｂｓｐ  ＥＩおよびＢａｍ  ＨＩ）をも組み込むことにより、そのような構成をｐＣＤＮＡ３．１（＋）におけるＥＰＯ−ＩｇＧ−ＣHおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ−ＣH融合物の柔軟なペプチドリンカー内のＢｓｐ  ＥＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位に挿入することができる。得られた構成は、例えば単一ポリペプチド［ＥＰＯ］−［ＣＬ］−［ＩｇＧ−ＣH］および［Ｇ−ＣＳＦ］−［ＣＬ］−［ＩｇＧ−ＣH］融合物をコードする。重鎖ＣＨ１ドメインのアミノ末端への軽鎖定常領域のカルボキシ末端の融合は一本鎖Ｆｖポリペプチドに類似する。長さ１４から２０残基のオーダーの（ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）モチーフから成るフレキシブルペプチドリンカーを使用して、軽鎖可変領域のカルボキシ末端を重鎖可変ドメインのアミノ末端に融合させ（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９５年）、ＣＬドメインをＩｇＧ−ＣHドメインに結合させることができる。
【００９６】
（実施例６）
補体結合およびＦｃ受容体結合特性が減少したＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質
一定のＧＦ−ＩｇＧ１融合タンパク質は、補体の活性化あるいはＦｃ受容体結合に関連する免疫プロセスにより、毒性があるか、あるいは動物モデルにおける効力に欠けていることがある。この理由のため、ＧＦ−ＩｇＧ４融合タンパク質が好ましいことがある。というのは、ＩｇＧ４は補体活性化およびＦｃ受容体結合における効果がＩｇＧ１よりも低いからである（Ｒｏｉｔら、１９８９年）。ＥＰＯ−およびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロバイオアッセイではＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質と同じか、あるいはほとんど同じ効力を有する。その代わりに、以下に詳細を示すように、インビトロ突然変異誘発実験を実行し、補体活性化およびＦｃ受容体結合の原因となることがわかっているＩｇＧドメイン中の特定アミノ酸を変更することができる。修飾した融合タンパク質を実施例２および３で説明したように、発現、精製させ、その比活性をインビトロバイオアッセイで決定することができる。
【００９７】
Ａ．補体結合
補体活性化において役割を果たすＩｇＧ中のアミノ酸はＩｇＧ  ＣＨ２ドメインに限局化されている。とりわけ、ヒトＩｇＧ１中のアミノ酸Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、Ｌｙｓ３２２、Ａｌａ３３０およびＰｒｏ３３１は、補体活性化に寄与するものとして考えられている（Ｉｓａａｃｓら、１９９８年）。ＩｇＧ１中のＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、Ｌｙｓ３２２をアラニン残基と置換すると、補体を活性化する能力が減少したＩｇＧタンパク質となる（Ｉｓａａｃｓら、１９９８年）。ＩｇＧ４のアミノ酸配列はこの領域ではＩｇＧ１と同一であるが、ＩｇＧ４は補体を活性化しない。ＩｇＧ４を使用する代わりに、実施例１で説明したＰＣＲを用いる突然変異誘発戦略を用いて、ＩｇＧのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、Ｌｙｓ３２２残基を有するＩｇＧのこれらの残基を（単独で、あるいは組み合わせて）アラニン残基または補体活性化を減少させる他のアミノ酸に変えることができる。
【００９８】
Ｂ．Ｆｃ受容体結合
ヒトＩｇＧサブクラスはＦｃ受容体に結合する能力および抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）を刺激する能力が異なる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４は最もＡＤＣＣを刺激し、ＩｇＧ２ではＡＤＣＣを刺激する能力がかなり減少する（Ｒｏｉｔら、１９８９年）。ＡＤＣＣは免疫細胞上のＦｃ受容体への抗体の結合が関係するメカニズムにより起こる。Ｆｃ受容体の原因となるアミノ酸はＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインに限局化されている。とりわけ、アミノ酸２３３−２３５はＦｃ受容体結合に関係している。ヒトＩｇＧ１はこの領域にアミン酸配列ＧｌｕＬｅｕＬｅｕを有し、Ｆｃ受容体に結合しないＩｇＧ２はＰｒｏＡｌａＶａｌ配列を有する。ＩｇＧ４はこの領域にＧｌｕＰｈｅＬｅｕ配列を有し、ＩｇＧ１に比べ、Ｆｃ受容体結合に対し１０倍効力が低い。ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の２３３−２３５位置でＧｌｕＬｅｕＬｅｕをＩｇＧ２のＰｒｏＡｌａＶａｌ配列に変えると、Ｆｃ受容体結合およびＡＤＣＣに対する能力がかなり減少したＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体となる（Ｉｓａａｃｓら、１９９８年）。実施例１で説明したＰＣＲを用いる突然変位誘発戦略を用いると、ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質構成にこれらのアミノ酸変化のいくつかまたは全てを導入することができる。その代わりに、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン内のアスパラギン２９７（あるいは他のＩｇＧサブクラスの同等のアスパラギン残基）のグリコシル化が防止される修飾ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質を作成することができる。グリコシル化されたＩｇＧ１抗体では、グリコシル化されたＩｇＧ１抗体に比べ、Ｆｃ受容体に結合する能力および標的細胞を溶解する能力がかなり減少する（Ｉｓａａｃｓら、１９９８年）。アスパラギン−２９７をグルタミンまたは他のアミノ酸に変えることにより、あるいはグリコシル化認識配列（アスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニン）の一部であるトレオニン２９９をアラニンまたはセリン以外のアミノ酸に変えることによりＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の無グリコシル化バージョンを作成することができる。グリコシル化認識配列のＸ位置のアミノ酸、すなわちアミノ酸２９８もプロリンに変えて、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７のグリコシル化を防止することができる。
【００９９】
（実施例７）
ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質を用いた薬物動態学実験
薬物動態学実験を行い、ＧＦ−ＩｇＧ融合タンパク質が対応する非融合タンパク質より長い循環半減期を有することを証明することができる。静脈薬物動態学データおよび皮下薬物動態学データの両方を得ることができる。静脈送達データから末端薬物動態パラメータを計算することができる。
【０１００】
静脈送達試験では、ラット（〜３５０ｇ）にＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質（ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦ）または対応する非融合タンパク質（ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦ）の静脈ボーラス注射（０．１ｍｇ／ｋｇ）を受けさせ、タンパク質の循環レベルを１４４時間にわたって測定することができる。各タンパク質サンプルに対し３匹のラットを使用することができる。静脈注射後、０、０．０８、０．５、１．５、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４時間目に血液サンプルを採取することができる。試験タンパク質の血清レベルを市販のＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いて定量することができる。各血液サンプルの連続希釈物を最初にインビトロバイオアッセイで分析し、ＥＬＩＳＡの直線領域（ＥＰＯでは０．０２５から１．６ｎｇ／ｍｌ、Ｇ−ＣＳＦでは０．０４から２．５ｎｇ／ｍｌ）内にある希釈物を同定することができる。滴定実験を行い、ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質および対応する非融合タンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡの相対感度を決定することができる。皮下送達試験は送達経路を除き静脈試験と同じプロトコルに従うことができる。試験タンパク質の血清レベルを上述したようにＥＬＩＳＡにより定量することができる。
【０１０１】
（実施例８）
ＥＰＯ−ＩｇＧ１−ＦｃおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ効力は、正常なラットおよびマウスで示されうる。これらの研究では、適切な用量および投与スケジュールを確認するために種々の用量および投与スケジュールを使用できる。ＥＰＯ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力も、適切な疾病モデル−ＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃに関しては貧血、およびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃに関しては好中球減少症で示されることができる。薬物動態学実験は、動物研究のために使用されるＩｇＧ１融合タンパク質についての投与スケジュールを決定する指針を提供するであろう。他のＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質を用いた公表結果（Ｒｉｃｈｔｅｒら、１９９９；Ｚｅｎｇら、１９９５）から、ＥＰＯ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質は、１日おきまたは３日毎、およびおそらくより少なく、例えば単回注射で投与されるときに効果がありうる。投与スケジュールは、薬物動態学的研究の結果、当初の動物効力の結果によって修飾されなければならないかもしれない。げっ歯類に対する注射当たりの投与されるタンパク質の用量は、薬物動態学的実験の結果、当初の動物効力結果に基づいて修飾されなければならないかもしれない。
【０１０２】
Ａ．ＥＰＯ動物効力モデル−正常ラット
１．単回注射：
各〜３２０ｇの体重のスプレーグ・ダウレイ（Ｓｐｒａｇｅ  Ｄａｗｌｅｙ）のラットの群は、それぞれ１００μｇ／ｋｇの用量で、そのカルボキシ末端にアミノ酸配列ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ａｓｐ−ｔｙｒ−ｌｙｓ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌｙｓ（配列番号４３）（ｒＥＰＯ−ＦＬＡＧ）を含む野生型組換えＥＰＯ、またはＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃの単回静脈内注射（側方尾部静脈）を受けた。ｒＥＰＯ−ＦＬＡＧは、ＣＯＳ−１細胞の形質移入によって発現され、そして抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。ｒＥＰＯ−ＦＬＡＧおよびＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃのタンパク質濃度は、ブラッドフォードの染料結合アッセイ、および標準としてウシ血清アルブミンを用いて測定された。選択された時点で、血液試料（０．３〜０．４ｍｌ）を、ラットから、ＥＤＴＡ抗−凝固剤試験管に抜いた。アリコート量の血液試料を、全血細胞（ＣＢＣ）計数について分析した。血液試料の残りを、遠心分離し、そして血漿を−８０℃で凍結した。血液試料を、注射後０．２５、２、４、１０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８および１９２時間に抜いた。０時間目のベースラインは、試験化合物の注射の〜２４時間前に得た。表４は、０時間で、および注射の１９２時間後での異なる試験群についての平均血液ヘマトクリット（±ＳＥ）を示す。ＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃを受ける群は、０時間と比べた１９２時間でのヘマトクリットレベルで有意な増加を示した（ｐ＜０．０５）。ｒＥＰＯ−ＦＬＡＧは、０時間と１９２時間の時点との間のヘマトクリットレベルに有意な増加を示さなかった。
【０１０３】
【表５】
0004944324.tif 000006
同様の研究は、より低い、またはより高い用量（０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ）のタンパク質を用いて行うことができる。同様の研究は、タンパク質の投与の皮下経路を用いても行うことができる。
【０１０４】
２．毎日、１日おきまたは３日毎の投与スケジュール
スプレーグ・ダウレイのラット（〜２００ｇ）は、チャールズリバー社、マサチューセッツ州ウィルミントン所在（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のような商業供給者から購入されうる。先の研究は、皮下注射による１日当たり１回の１００〜１０００ＩＵ／ｋｇ（およそ８００ｎｇ〜８μｇ／ｋｇ）のｒＥＰＯの投与（１６０ｎｇ〜１．６μｇＳＩＤ／２００ｇラット）が、げっ歯類でのヘマトクリットおよび赤血球生成における有意な増加を与えることを示した（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、１９９０；Ｖａｚｉｒｉら、１９９４；Ｂａｌｄｗｉｎら、１９９８；Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉら、１９９８）。５匹のラットの群は、５〜９日の間、特定の間隔（毎日、１日おきまたは３日毎）で、ｒＥＰＯ、ｒＥＰＯ−ＦＬＡＧ、ＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃまたはプラセボ（ベヒクル溶液）の皮下注射を受ける可能性がある。ＥＰＯのモル比に等価な用量（ＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質の４００ｎｇ〜４μｇ／２００ｇラット）が試験されうる。より高い、またはより低い用量も、試験されうる。広範なＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ用量（５００倍を超える変動）は、これらの当初の実験で試験して、用量の内の１つが効果がある見込みを増大できる。多すぎるＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃの投与が、毒性のために赤血球生成を妨害する可能性がある。対照ラットは、ベヒクル溶液のみを受けることができる。さらなる対照群は、ｒＥＰＯの毎日の注入（５〜９日間、１６０ｎｇ〜１．６μｇ／２００ｇラット）、およびＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃと同じ投与計画を用いて１６０ｎｇ〜１．６μｇのｒＥＰＯを受けることができる。最終の注射の１日から２日後に、その動物を屠殺し、そして血液試料を、ヘマトクリットおよび全血細胞数（ＣＢＣ）分析のために収集できる。造血組織（肝臓および脾臓）が収集され、秤量され、そして増加した赤血球生成の証拠を求める組織病理学的分析のためにホルマリンで固定することができる。骨髄は、赤血球生成が増加した証拠を求めるために、種々の長骨、そして単位粒子調製および組織病理学的分析については胸骨から取り出されることができる。群の間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定を、そして多重比較についての差異の一方向分析を利用できる。Ｐ＜０．０５は、有意であると考えられうる。
【０１０５】
ｒＥＰＯの毎日の注射は、ラットでヘマトクリットおよび赤血球生成における増加を刺激できるのに対して、同じ用量のｒＥＰＯの頻繁でない投与は、刺激できないか、またはより少ない範囲まで刺激する。これらのパラメーターでの用量依存性の増加は、ＥＰＯ−ＩｇＧ−Ｆｃ処置動物で観察することができる。これらのパラメーターにおけるより大きな増加は、頻度の少ない投与スケジュールを用いたＥＰＯで処置された動物においてよりもＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ処置動物で観察することができる。明らかに少ないＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃは、ＥＰＯの毎日の注射で得られるこれらのパラメーターにおける同じ増加を達成するために要求されうる。
【０１０６】
頻度のより低い投与、例えば単回注入を用いたさらなる実験を行うことができる。
Ｂ．ＥＰＯ効力実験−貧血ラットモデル
シスプラチン誘導貧血は、化学療法誘導貧血の十分特徴付けられたげっ歯類モデルであり、そしてヒトの臨床設定に直接的関連性を示す。ｒＥＰＯは、１００〜１，０００単位／ｋｇの毎日用量で投与されるときに、このモデルにおける貧血を逆行させる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、１９９０；Ｖａｚｉｒｉら、１９９４；Ｂａｌｄｗｉｎら、１９９８）。ＥＰＯ−ＩｇＧ−Ｆｃも、１日当たり１回、１日おき、または３日毎の投与スケジュールを用いて、このモデルでの貧血を逆行させるときに効果がある。この実験で使用されるＥＰＯ−ＩｇＧ−Ｆｃについての投与スケジュールは、正常なラットの実験で最高に作用したものでありうる。スプレーグ・ダウレイラット（〜２００ｇ）に、貧血を誘発するために、０日目に、シスプラチン（３．５ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射で処理し、そして種々の処置群に無作為化できる。ラットは、９日間まで、２μｇ〜２０μｇ／ｋｇの用量で、毎日、１日おきに、または３日毎に、ＥＰＯ−ＩｇＧ−Ｆｃ、ｒＥＰＯまたは生理食塩水の注射を受けることができる。ラットの１つの対照群は、毎日、ｒＥＰＯの皮下注射（１００〜１，０００単位／ｋｇ）を受けることができる。別の対照群は、当初のシスプラチンを受けることができないが、しかし他の試験タンパク質と同様の投与スケジュールを用いて生理食塩水の注射を受け得る。９日目に、ラットは、屠殺され、そして血液および組織試料は、包括的なＣＢＣおよび組織病理学的分析のために得ることができる。１０〜１００倍高いか、または低い用量のＥＰＯ−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質も試験することができる。
【０１０７】
Ｃ．Ｇ−ＣＳＦ動物効力モデル
Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質（Ｃ１７またはＣ１７Ｓのバージョン）のインビボ効力は、タンパク質が、ベヒクル処理動物に比較した循環中の好中球レベルおよび顆粒球形成における増大を刺激することを示すことによって、正常または好中球減少症のマウスまたはラットのようなげっ歯類で測定されうる。Ｇ−ＣＳＦは、１００μｇ／ｋｇの用量で、正常および好中球減少症のげっ歯類での好中球レベルを刺激する（Ｋｕｂｏｔａら、１９９０；Ｋａｎｇら、１９９５）。マウスまたはラットは、これらの実験のために使用されうる。タンパク質クリアランスが、体重に比例するので、ラットからマウスまでの薬物動態学的データを推定できる（Ｍａｈｍｏｏｄ、１９９８）。毎日、１日おき、または３日毎の投与スケジュールを用いた、正常な動物におけるＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃの効力を示すことができる。効力は、単回注射に引き続いて示されうる。マウス好中球減少症モデルにおけるＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃの有効性も、毎日、１日おき、または３日毎の投与スケジュールを用いて示されることができる。
【０１０８】
Ｃ．１．単回注射に続く正常なラットにおける効力
それぞれが〜３２０ｇの体重の３匹の雄スプレーグ・ダウレイのラットの群は、野生型組換えＧ−ＣＳＦ（ボルダー・バイオテクノロジー社（Ｂｏｌｄｅｒ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）（登録商標）（アムジェン社（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）によって販売されている組換えＧ−ＣＳＦ）またはＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃの単回の静脈内注射（外側尾部静脈）を、各々１００μｇ／ｋｇの用量で受けた。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いたブラッドフォード染色結合アッセイを用いて測定された。選択された時点で、血液試料（０．３〜０．４ｍｌ）を、ラットからＥＤＴＡ抗−凝固試験管に抜取った。アリコート量の血液試料は、全血細胞（ＣＢＣ）数について分析された。残りの血液試料を遠心分離し、そして血漿を、−８０℃で凍結させた。血液試料を、注射後０．２５、１．５、４、８、１２、１６、２４、４８、７２、９６、１２０および１４４時間に抜いた。０時間のベースラインの試料は、試験化合物の注射の〜２４時間前に得られた。表５、６および７は、様々の試験群についての平均血中好中球、総白血球細胞数および血中単核細胞数を経時的に示す。３つの試験化合物全ては、ベースラインの値より末梢の白血球細胞および好中球における増加を刺激した。野生型組換えＧ−ＣＳＦおよびＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）を受けている試験群についての白血球細胞および好中球数は、注射の〜２４時間後にピークに達し、そして〜４８時間までにベースラインの値に戻った。対照的に、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃを受けているラットについての白血球細胞および好中球数は、注射の〜４８時間後にピークに達したが、注射の〜９６時間後までベースラインの値に達しなかった。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１を受けているラットで観察された白血球細胞および好中球レベルのピークは、野生型組換えＧ−ＣＳＦまたはＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）を受けている群についてよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。データは、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１が、循環の好中球および白血球細胞における増大を刺激する能力があること、および末梢の白血球細胞数および好中球における絶対増加が、低モル用量の融合タンパク質を使用した場合でさえ、組換え野生型Ｇ−ＣＳＦまたはＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）で見られるものより大きく、そして長く続くことを示す。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃは、経時的に血中単核細胞レベルにおける有意な増加をも刺激した（表７）。同様の実験は、他のＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）−ＩｇＧ融合タンパク質（ＦｃまたはＣHバージョン）の効力を示すために行うことができる。同様の研究は、タンパク質の投与のための皮下経路を用いても行うことができる。
【０１０９】
【表６】
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【表７】
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【表８】
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血漿Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧタンパク質の濃度は、商業的に入手可能なＧ−ＣＳＦＣＬＩＳＡキット（アール・アンド・ディー・システムズ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））を用いて定量することができる。滴定実験は、野生型Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡの相対的感度を測定するために行うことができる。類似の研究は、タンパク質の投与の皮下経路を用いて行われうる。
【０１１０】
Ｃ．２．正常なマウスにおけるＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力
正常なマウスにおける効力を示すために、５匹の群（それぞれ〜２０ｇの体重）は、５日間まで、特定の間隔で、Ｇ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質またはプラセボ（ベヒクル溶液）の皮下注射を受けることができる。ＩＣＲマウスのような正常なマウスは、ジャクソン・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、チャールズリバー社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）またはハーランド・スプレーグ・ダウレイ社（Ｈａｒｌａｎｄ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）のような商業的販売者から購入することができる。６日目に、動物を屠殺し、そして血液試料を、全血細胞数（ＣＢＣ）分析のために収集した。造血組織（肝臓および脾臓）が収集され、秤量され、そして増加した顆粒球形成の証拠を求める組織病理学的分析のためにホルマリンで固定される。骨髄は、顆粒球生成が増加した証拠を求めるために、種々の長骨、そして単位粒子調製および組織病理学的分析については胸骨から取り出すことができる。群の間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定を、そして多重比較については差異の一方向分析を利用できる。Ｐ＜０．０５は、有意であると考えられることができる。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質は、ベヒクル処理マウスに比較して、マウスにおいて循環している好中球レベルおよび顆粒球形成におけるより高い増大を刺激できる。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力は、１日目に１回、１〜５日目当たり１回、１、３および５日目に１日おきに、または１および４日目に３日毎に投与されるときに試験されうる。当初の実験では、異なる群のマウス（それぞれ〜２０ｇの体重）は、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の注射当たり０．００８〜２０μｇの皮下注射を受けることができる。対照マウスは、ベヒクル溶液のみを受けうる。さらなる対照群は、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質と同じ投与計画を用いて、野生型Ｇ−ＣＳＦまたはＮｅｕｐｏｇｅｎ（２μｇ／５日間毎日）および２μｇの野生型Ｇ−ＣＳＦを受けることができる。
【０１１１】
ｒＧ−ＣＳＦの毎日の注射は、マウスにおいて循環している好中球および顆粒球形成における増大を刺激しうるのに対して、ｒＧ−ＣＳＦの同じ用量の頻度の低い投与では、刺激できないか、または少ない範囲まで刺激する。これらのパラメーターでの用量依存性の増加は、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ−Ｆｃ処置動物で観察することができる。これらのパラメーターにおける大きな増加は、頻度の少ない投与スケジュールを用いたｒＧ−ＣＳＦで処置された動物でよりＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ処置動物で観察することができる。明らかに少ないＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃは、ｒＧ−ＣＳＦの毎日の注射で得られるこれらのパラメーターにおける同じ増加を示しうる。
【０１１２】
３．好中球減少症のマウスにおけるＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力：Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃの効力も、好中球減少症の動物で示されることができる。好中球減少症は、シクロホスファミド（ＣＰＡ；１００ｍｇ／ｋｇ）での処置によって誘導され得て、それは、骨髄抑制性であり、そしてヒト臨床設定に等しい一般に使用される化学療法剤である。Ｇ−ＣＳＦは、シクロホスファミド処置動物における正常な好中球レベルの回復を促進する（Ｋｕｂｏｔａら、１９９０；Ｋａｎｇら、１９９５）。マウス（〜２０ｇ）は、０日目にシクロホスファミドの腹膜内注射を受けて、好中球減少症を誘導することができる。動物は、各々、様々な群の５匹の動物に分割でき、そしてＣＰＡ処置後の５日間までの間、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃまたはプラセボの皮下注射を受ける。１つの対照群は、シクロホスファミドを受けることができないが、プラセボ注射を受けることができる。使用されるべき正確な投与スケジュールは、上に記載される薬物動態学的実験および正常なマウス効力研究の結果によって測定することができる。実験は、５日間にわたって、毎日、１日おき、または３日毎の投与スケジュールを用いて行われうる。試験されるべきＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃの用量は、０．００８〜２０μｇ／注射でありうる。６日目に、動物を屠殺し、そして血液および組織試料を、上に記載されるとおり分析できる。あるいは、群当たり５匹のマウスを、０〜１０日目に屠殺し、そして血液および組織試料を、上記の正常なマウスの実験について記載されるとおりに分析しうる。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質は、ベヒクルを注射したＣＰＡ注射対照群に比べて、マウスでの循環中の好中球レベルおよび顆粒形成における促進された増加を刺激できる。
【０１１３】
Ｃ．ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力
ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質のインビボ効力は、下垂体切除（ＨＹＰＯＸ）ラットで試験することができる。これは、ＧＨ欠乏の十分に特徴付けられたモデルである（Ｃｏｘら、１９９４；Ｃｌａｒｋら、１９９６）。ＧＨは、ＨＹＰＯＸラットにおける体重増加および骨および軟骨成長を刺激する（Ｃｏｘら、１９９４；Ｃｌａｒｋら、１９９６）。下垂体切除したスプレーグ・ダウレイのラットは、チャールズリバー社、マサチューセッツ州ウィルミントン所在（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のような商業供給者から購入されうる。一般に、ラットは、４０および５０日齢およびおよそ１００〜１２０ｇの体重で下垂体切除される。５〜８匹ラットの群は、１０日間の期間をかけて毎日測定された特定の間隔および体重増加で、ｒｈＧＨ、ＧＨ−ＩｇＧまたはプラセボ（ベヒクル溶液）の皮下注射を受けることができる。ラットは、給餌に関連した可能性のある変数を最小にするために１日の同じ時間に毎日秤量することができる。全体の体重増加に加えて、骨成長（脛骨の骨端幅）を測定することができる。屠殺するときに、右および左の近傍の脛骨の骨端を取り出し、そしてホルマリンで固定することができる。固定した脛骨は、矢状面にある近傍末端で分断され、硝酸銀で染色され、そして強力な光に暴露することができる（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら、１９４９）。軟骨の骨端板の幅は、マイクロメーターアイピースを具備した立体顕微鏡を用いて測定されうる。各骨端について１０回の測定が行われ、そして左および右脛骨についての合わせた値についての平均±ＳＥＭを計算することができる。群の間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定を、そして多重比較についての差異の一方向分析を利用できる。Ｐ＜０．０５は、有意であると考えられうる。
【０１１４】
ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力は、毎日、１日おき、３日毎、４日毎にラットにタンパク質を投与するか、または単回注射によって試験することができる。皮下注射により毎日２回（１０μｇ／日）投与される５μｇのｈＧＨは、ＨＹＰＯＸラットモデルにおける強力な成長応答を示す（Ｃｏｘら、１９９４；Ｃｌａｒｋら、１９９６）。当初の実験で、様々の群のラットが、０．２〜２００μｇ／注射／ラットまでの範囲にあるＧＨ−ＩｇＧの種々の用量の皮下注射を受けることができる。対照ラットは、ベヒクル溶液のみを受け得る。さらなる対照群は、ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質と同じ投与計画を使用して、ｒｈＧＨ（５μｇのＢＩＤ）および１０μｇのｈＧＨを受けることができる。ＨＹＰＯＸラットに対するＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質の投与は、ベヒクル処置群に比べて、体重増加および脛骨の骨端幅成長における増大を生じうる。
【０１１５】
ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力も、悪液質のげっ歯類モデルで試験することができる。デキサメタゾン（ＤＥＸ）は、体重損失を誘導するためにラットに投与することができる。正常なスプレーグ・ダウレイのラット（２００〜２２５ｇ）は、毎日、デキサメタゾン（２００μｇ／ラット；およそ１ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を受けることができる。この量のデキサメタゾンは、８日の期間にわたり、およそ５〜６ｇの損失を誘導しうる。ベヒクルまたは可変の用量のＧＨ−ＩｇＧは、様々な異なる実験で、１回、毎日、１日おき、３日毎、４日毎にラットに投与されうる。異なる群のラットが、ラット１匹あたり０．２〜４００μｇのＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質の皮下注射を受けることができる。さらなる対照は、ＤＥＸまたは注射を受けない群のラット、ＤＥＸおよびｒｈＧＨ（５μｇＢＩＤまたは１０μｇＳＩＤ）を受けるラットの群、およびＤＥＸおよびｒｈＧＨ（実験によって、毎日、１日おき、３日毎、４日毎に１０μｇ、すなわち、ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質が投与される頻度）を受けるラットの群を誘導することができる。動物は、毎日秤量されうる。食糧および水の消費は、毎日、監視されうる。屠殺する時に、内臓が秤量されうる。統計学上の分析は、ＨＹＰＯＸラット研究について記載されるとおりに行われうる。ＧＨ−ＩｇＧ融合タンパク質で処置した動物は、ベヒクル処置した動物より体重損失が少ない可能性がある。
【０１１６】
（実施例９）
ＩｇＧ融合タンパク質二量体のさらなる精製
増殖因子／サイトカイン−ＩｇＧ融合タンパク質についての最終精製模式図は、タンパク質混入物および凝集物を除去するアフィニティークロマトグラフィー、および融合タンパク質四量体、二量体および単量体の純粋製造を行うことに加えて別のカラムクロマトグラフィー工程を誘導することができた。Ｉｇ融合タンパク質の純粋製造は、インビトロバイオアッセイにおけるそれらの特異的活性を改善することができる。ヒト治療剤として使用するために、実質的に融合タンパク質二量体を含まない増殖因子／サイトカイン−ＩｇＧ単量体の調製品、および実質的に融合タンパク質単量体を含まないＩｇＧ融合タンパク質二量体の調製品を得ることが好ましいであろう。増殖因子／サイトカイン−ＩｇＧ二量体は、当業者に公知の多様なカラムクロマトグラフィー操作を使用して、ＩｇＧ融合タンパク質単量体から分離することができる。クロマトグラフィー操作は、凝集物および他の混入タンパク質からＩｇ融合タンパク質を精製するために使用することもできる。このようなクロマトグラフィー操作の例は、イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用、逆相、金属キレート化、アフィニティーカラム、レクチンアフィニティー、ヒドロキシアパタイトおよび固定化染料アフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。当業者に公知の他の有用な分離操作としては、塩沈殿、溶媒沈殿／抽出およびポリエチレングリコール沈殿が挙げられる。精製タンパク質中の内毒素濃度は、それらが発熱物質でないことを保証する、商業的に利用可能なキットを用いて試験することができる。
【０１１７】
実施例４に記載されたＥＰＯ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合体（ｐＢＢＴ２７３によってコードされた）を、実施例２に記載されるとおりプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製タンパク質を、スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。緩衝液は、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌであった。カラム容積は、２４ｍｌであった。カラムを、０．５ｍｌ／分の流速で、１．５カラム容積の緩衝液で抽出させた。０．５ｍｌの画分を収集した。単独の主要タンパク質ピークが観察され、そしてそれは、２０４ｋＤａの見かけの分子量で溶出した。カラムは、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（カタログ番号ＭＷ−ＧＦ−２００）から購入されたタンパク質標準を使用して対応させた。還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、主要なタンパク質ピークは、主に、ジスルフィド結合ＥＰＯ−ＩｇＧ４−Ｆｃ二量体（少なくとも９０％、およびおそらく、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより＞９５％）から構成されることを示した。大きな分子量の混入物（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、見かけの分子量＞２００ｋＤａ）および低分子量の混入物（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、見かけの分子量＜５０ｋＤａ）は、このカラム工程によって主に取出された。
【０１１８】
同様の実験が、ｐＢＢＴ１８０によってコードされたＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質、ｐＢＢＴ１７４によってコードされたＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質、およびｐＢＢＴ１７５によってコードされたＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質を用いて行われた。これらのタンパク質は、実施例２に記載されるようにプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製され、そしてその後、上記のようにサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。ＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質は、２１９ｋＤａの見かけの分子量を示すサイズカラムから溶出され、そして主に、ＥＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ二量体（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより＞９５％）から構成された。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質は、１４８ｋＤａの見かけの分子量で溶出され、そして主に、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ二量体（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより＞９５％）から構成された。Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質は、１３５ｋＤａの見かけの分子量で溶出され、そして主に、Ｇ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ二量体（少なくとも９０％、そして非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより＞９５％）から構成された。大きな分子量混入物（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、見かけの分子量＞２００ｋＤａ）および低い分子量混入物（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、見かけの分子量＜５０ｋＤａ）が、このカラム工程によって取出された。
【０１１９】
（実施例１０）
前述の実施例に記載される操作は、わずかな修飾を伴って、他のタンパク質と共にＩｇＧ融合体を作成するために使用することができる。ヒトでの治療用途を見出す他のＩｇＧ融合体タンパク質の例としては、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ−１１、ＴＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子およびｆｌｔ３リガンドを含めたＧＨスーパー遺伝子ファミリーの他の構成員のＩｇＧ融合体が挙げられる。これらのタンパク質をコードするＤＮＡは、下に記載されとおりクローン化され、そして実施例１に記載される種々のＩｇＧドメインに融合されうる。組換え融合タンパク質は、実施例２および９に記載されるとおり発現および精製されることができる。精製融合タンパク質は、それらの特異的活性を測定する適切なインビトロバイオアッセイで試験されうる。これらのタンパク質についてのＤＮＡ配列、アミノ酸配列および適切なインビトロおよびインビボバイオアッセイは公知であり、ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ（１９９２；１９９６）、Ａｇｇａｒｗａｌ（１９９８）、およびＳｉｌｖｅｎｎｏｉｍｅｍおよびＩｈｌｅ（１９９６）に記載される。これらのタンパク質についてのバイオアッセイも、アール・アンド・ディー・システムズ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、エンドジェン社（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびギブコ・ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）のようなこれらのタンパク質の商業的供給者のカタログで供給される。
【０１２０】
１．ヒトαインターフェロンのクローニング。αインターフェロンは、白血球によって生成され、そして抗ウイルス、抗腫瘍および免疫調節効果を示す。７０％またはそれより大きなアミノ酸同一性を共有するタンパク質をコードする少なくとも２０の固有のαインターフェロン遺伝子がある。既知のαインターフェロン種のアミノ酸配列は、Ｂｌａｔｔら、１９９６に示される。最も一般的なアミノ酸を、ポリペプチド一本鎖に組込む「コンセンサス」インターフェロンが、記載された（Ｂｌａｔｔら、１９９６）。ハイブリッドαインターフェロンタンパク質は、αインターフェロンタンパク質の様々の部分を、単独タンパク質に分割することによって生成されうる（ＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒおよびＤｉ  Ｍａｒｃｏ、１９９５）。以下の実施例は、α２インターフェロンＩｇＧ融合タンパク質の構築を記載する。同様の操作が、他のαインターフェロンタンパク質のＩｇＧ融合体を作成するために使用することができる。
【０１２１】
ＤＮＡコードヒトαインターフェロン（ＩＦＮ−α２）を、ヒトのゲノムのＤＮＡ（クロンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応を、ＢＢ９３（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＧ＞３  配列番号４４）およびＢＢ９４（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴ＞３  配列番号４５）で行った。ＢＢ９３は、ＩＦＮ−α２コード配列の〜３００ｂｐ上流（すなわち、５’）のゲノム配列にアニールし、そしてクローニング目的のＥｃｏＲＩ部位を含有する。ＢＢ９４は、ＩＦＮ−α２コード配列の〜１００ｂｐ下流（すなわち、３’）のゲノム配列にアニールし、そしてクローニング目的のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する。ＰＣＲ反応は、３３μｌ反応中の１×ＰＣＲ反応緩衝液（プロメガコープ社、ウイスコンシン州マディソン所在（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．２μＭの各オリゴヌクレオチドプライマー、０．３３μｇのゲノムＤＮＡおよび０．４単位のＴａｑポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用した。反応は、３分間、９６℃、続いて［９５℃で６０秒間、５８℃で７５秒間、７２℃で９０秒間］の３５回サイクル、続いて試料を６℃に冷却することから構成された。反応は、「ロボサイクラー」熱循環装置（ストラタジーン社、カリフォルニア州サンディエゴ所在（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で行われた。得られた〜１ｋｂＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、そして同様に消化し、そしてアルカリホスファターゼ処理したｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社、カリフォルニア州サンディエゴ所在（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）にクローニングした。ＩＦＮ−α２についての修正ＤＮＡ配列を有するクローン（Ｈｅｎｃｏら、１９８５）が同定され、そしてｐＢＢＴ１６０と称された。
【０１２２】
ＩｇＧコード配列とのＩＦＮ−α２の遺伝子融合体を構築および発現するために、ＩＦＮ−α２遺伝子を、ＰＣＲに基く突然変異誘発を用いて、５’および３’末端で修飾した。ｐＢＢＴ１６０プラスミドＤＮＡは、順方向プライマーＢＢ１０８（５’ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡ−３’）および逆方向プライマーＢＢ１０９（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣ−３’）を有するＰＣＲのための鋳型として使用された。プライマーＢＢ１０８は、ＩＦＮ−α２分泌シグナルについてのコード配列の５’にアニールし、そして逆方向プライマーＢＢ１０９は、ＩＦＮ−α２の３’末端にアニールする。得られたＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化させ、ゲル精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化され、アルカリホスファターゼ処理し、そしてゲル精製されたｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングした。修正ＤＮＡ配列を有するクローン（Ｈｅｎｃｏら、１９８５）は、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ＩＦＮＡｆｕｓまたはｐＢＢＴ１９０と称した。
【０１２３】
２．ヒトβインターフェロンのクローニング。
βインターフェロンは、線維芽細胞によって生成され、そして抗ウイルス、抗腫瘍および免疫調節効果を示す。βインターフェロンは、単独遺伝子の産物である。ＤＮＡコードヒトのβインターフェロン（ＩＦＮ−β）を、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から得られるＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ１１０（５’ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣ−３’）（配列番号４８）および逆方向プライマーＢＢ１１１（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＡＧ−３’）（配列番号４９）を用いて行われた。プライマーＢＢ１１０は、ＩＮＦ−β分泌シグナルについてのコード配列の５’末端にアニールし、そして逆方向プライマーＢＢ１１１は、ＩＮＦ−βコード配列の３’末端にアニールする。得られたＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化され、ゲル精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、そしてゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングした。修正ＤＮＡ配列を有するクローン（Ｄｅｒｙｎｃｋら、１９８０）は、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ＩＦＮＢｆｕｓまたはｐＢＢＴ１９１と称した。
【０１２４】
３．ヒトγインターフェロンクローニング。
γインターフェロンは、活性化Ｔ細胞によって生成され、そして抗ウイルス、抗腫瘍および免疫調節効果を示す。ヒトγインターフェロンをコードするｃＤＮＡ（ＩＦＮ−γ）は、ヒトジャルカット（Ｊａｒｋａｔ）Ｔ細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクション、メリーランド州ロックビル所在（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））から入手できる）から単離された総ＲＮＡからＰＣＲによって増幅された。その細胞を、１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭ１培地で成長させた。ＲＮＡ単離（Ｗｅｉｓｓら、１９８４；Ｗｉｓｋｏｃｉｌら、１９８５）の前にＩＦＮ−γ発現を誘導するために、６時間、１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ−Ｌ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号Ｌ−４１４４）および５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ（ホルボル１２−ミリステート１３−アセテート、シグマケミカル社、カタログ番号Ｐ−１５８５）を用いて、細胞を、インビトロで活性化させた。ＲＮＡは、製造業者の指示に従って、キアゲン社、カリフォルニア州サンタクラリタ所在（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）から購入したＲＮイージーミニＲＮＡ単離キットを用いて細胞から単離された。およそ１０４μｇの総ＲＮＡを、２．４×１０7細胞から単離した。一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成を、ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス所在（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）用の第一鎖ｃＤＮＡ合成キットを使用して達成し、プライマーとしてランダムヘキサマーを使用した。鋳型として第一鎖合成の産物を用いたその後のＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ１１２（５’−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＡＴＡＣＡＡＧＴＴＡＴＡＴＣ−３’）（配列番号５０）および逆方向プライマーＢＢ１１３（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＧＡＣＣＴＴＧ−３’）（配列番号５１）を用いて行われた。プライマーＢＢ１１２は、ＩＮＦ−γ分泌シグナルについてのコード配列の５’末端にアニールし、そして逆方向プライマーＢＢ１１３は、ＩＮＦ−γコード配列の３’末端にアニールする。得られたＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化され、ゲル精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、そしてゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングした。修正ＤＮＡ配列を有するクローン（Ｇｒａｙら、１９８２）は、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ＩＦＮＧｆｕｓまたはｐＢＢＴ１９２と称した。
【０１２５】
４．インターフェロン−ＩｇＧ融合体の構築。
ＩｇＧ１−Ｆｃコード配列は、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γのカルボキシ末端に融合された。〜７９０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を、プラスミドｐＢＢＴ１６７［上記実施例１に記載された］から切除し、そしてＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ１９０、ｐＢＢＴ１９１およびｐＢＢＴ１９２に入れてクローニングした。同様に、ＩｇＧ４−Ｆｃコード配列も、ＩＦＮ−α２、ＩＮＦ−β、およびＩＦＮ−γに融合された。プラスミドｐＢＢＴ１５８の〜７９０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片［上記実施例１に記載］を、切断し、ゲル精製し、そしてＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ１９０、ｐＢＢＴ１９１およびｐＢＢＴ１９２に入れてクローニングした。ＩｇＧ１−ＣHコード配列は、ＩＦＮ−α２、ＩＮＦ−β、およびＩＦＮ−γのカルボキシ末端に融合させた。プラスミドｐＢＢＴ１６６［上記実施例１に記載］の〜１０８０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を切断し、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ１９０、ｐＢＢＴ１９１およびｐＢＢＴ１９２にクローニングした。得られた組換えプラスミドの構造は、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって確認された。それらがコードするこれらのプラスミドおよびＩＦＮ−ＩｇＧ融合タンパク質は、表８に列記される。
【０１２６】
【表９】
0004944324.tif 000010
５．インターフェロン−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性
５．Ａ．インビトロ生物活性
インターフェロンについてのインビトロ生物学的アッセイとしては、抗ウイルスアッセイおよび細胞増殖阻害アッセイが挙げられる。ヒトダウジ細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクション、メリーランド州ロックビル所在（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））の増殖は、α、β、およびγインターフェロンによって阻害され、そしてこれらのタンパク質をアッセイするために使用されうる（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら、１９７９；ＥｖｉｎｇｅｒおよびＰｅｓｔｋａ、１９８１）。ダウジ細胞は、１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地で維持される。バイオアッセイは、９６穴プレートの各ウエルに添加された細胞の数が、５〜２０×１０3個でありうること、およびプレートが、３〜４日間、３７℃でインキュベートされる以外は上に記載される操作を用いて、この培地で行われる。ダウジ細胞は、インターフェロンの最適な効率についてのアッセイで使用する前に、早期飽和密度（１〜２×１０6個／ｍｌ）にある可能性がある。組換えα、βおよびγインターフェロンの連続希釈（エンドジェン（Ｅｎｄｏｇｅｎ）；アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ギブコ・ビーアールエル（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ユーエスバイオロジカル（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ））は、平行に分析することができる。組換えαインターフェロンは、およそ５〜３０ｐｇ／ｍｌのＩＣ50（５０％まで増殖を阻害するために必要とするタンパク質の濃度）を示す。
【０１２７】
α、βおよびγインターフェロンの生物活性も、細菌プラーク阻害アッセイを用いて測定することができる。これらのアッセイは、細胞をウイルス感染から保護するインターフェロンタンパク質の能力を測定する。これらのアッセイを行う方法は、Ｏｚｅｓら（１９９２）およびＬｅｗｉｓ（１９８７；１９９５）に記載される。ヒトＨｅＬａまたはＷＩＳＨ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能である）は、９６穴プレート（３×１０4細胞／ウエル）中で培養し、そして３７℃でほぼコンフレンシ−に成長することができる。細胞を、洗浄し、そして２４時間、一連の２〜３倍希釈の各ＩＦＮ−ＩｇＧ融合タンパク質調製物で処理した。その後、小疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）または脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）は、０．１の多数の感染で添加でき、そしてそのプレートを、３７℃で、さらに２４〜４８時間、インキュベートした。さらなる対照としては、ウイルスなしの試料を挙げることができる。９０％またはそれ以上の細胞が、ウイルス処理された、ＩＦＮなしの対照ウエル中で死滅させた（ウエルの目視観察によって測定された）場合、細胞単層を、クリスタルバイオレット（２０％メタノール中の０．５％）で染色することができ、そしてウエルの吸光度は、マイクロプレート読取り装置を用いて読取ることができる。あるいは、２０μｌのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（セルタイター９６アクエアスワン溶液、プロメガ社、ウイスコンシン州マディソン所在（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ））は、細胞単層に添加され、そして実施例３に記載されるとおり１〜４時間後、ウエルの吸光度を４９０ｎｍで読取ることができる。ＥＣ50値（ウイルスの細胞変性効果を５０％阻害するために必要とされるタンパク質の量）は、融合タンパク質および非融合野生型タンパク質の相対的効力を比較するために使用することができる。野生型ＩＦＮタンパク質は、細胞を、ＶＳＶおよびＥＭＣＶの細胞変性効果から保護し、そしてＩＦＮ種に依存して、このアッセイでおよそ１×１０7〜２×１０8単位／ｍｇの特異的活性を示す（Ｏｚｅｓら、１９９２）。
【０１２８】
表８に列記されるＩＦＮ−α−ＩｇＧおよびＩＦＮ−β−ＩｇＧ融合タンパク質は、ＣＯＳ細胞で発現され、そして実施例１および２に記載されるとおり精製された。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＩＦＮ−α−ＩｇＧ１−ＦｃおよびＩＦＮ−α−ＩｇＧ１−ＣH融合タンパク質が、優先的に、ジスルフィド結合二量体から構成されることを示した；しかし、少量（＜１０％）の単量体の融合タンパク質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる試料の全てで観察された。ＩＦＮ−α−ＩｇＧ１−ＣH融合タンパク質は、有意な量のジスルフィド結合凝集物をも含有し、そしてそれはゲルに入ることができなかった。ＩＦＮ−α−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質は、優先的に二量体性でもあった；単量体は、ＩＦＮ−α−ＩｇＧ１−Ｆｃ試料中よりも、この試料中に存在した。ＩＦＮ−β−ＩｇＧ１−ＦｃおよびＩＦＮ−β−ＩｇＧ１−ＣH融合タンパク質は、主に二量体性でもあって、少量の単量体性融合タンパク質が、各試料中に存在した。対照的に、精製ＩＦＮ−β−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質の大多数は、単量体性であった；残りは、二量体であった。有意な量のジスルフィド結合凝集物は、精製ＩＦＮ−β−ＩｇＧ融合タンパク質の全てに存在した。
【０１２９】
精製ＩＦＮ−α−ＩｇＧおよびＩＦＮ−β−ＩｇＧ融合タンパク質は、上記のダウジ細胞成長阻害アッセイを用いて検定された。ＩＦＮ−α−ＩｇＧおよびＩＦＮ−β−ＩｇＧ融合タンパク質の全ては、生物学的に活性であった。各タンパク質についてのＩＣ50値が計算され、そして表９に示される。対照組換えＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、それぞれ、エンドジェン社、マサチューセッツ州ウォーバン所在（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）およびユーエスバイオロジカル社、マサチューセッツ州スワンプスコット所在（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）から購入された。
【０１３０】
【表１０】
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ＩＦＮ−γ−ＩｇＧ融合タンパク質は、実施例２に記載されるとおり、ＣＯＳ細胞で発現され、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。ＩＦＮ−γは、低ｐＨに感受性があるので、融合タンパク質は、低ｐＨを含まない溶出条件を用いたアフィニティーカラムから溶出することができる。このような方法の１つは、ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（カタログ番号２１０１３および２１０１４）から入手できるジェントル（Ｇｅｎｔｌｅ）  Ａｇ／Ａｂ溶出緩衝液でγインターフェロン−ＩｇＧ融合タンパク質を溶出させ、続いて脱塩カラムでのタンパク質の脱塩をすることである。
【０１３１】
５．Ｂ．ＩＦＮ−α−ＩｇＫＣのインビトロ活性
実施例５に記載されるＩＦＮ−α−ＩｇＫＣ融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを、ＣＯＳ細胞に形質移入させ、そして調節培地を、３日後に収集した。調節培地の一連の希釈は、ダウジ細胞成長阻害アッセイで試験された。融合タンパク質の濃度を、エンドジェン社から購入したＩＦＮ−α２ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。調節培地は、ダウジ細胞の増殖を阻害した。ＩＦＮ−α−ＩｇＫＣ融合体についてのＩＣ50値は、およそ２０ｐｇ／ｍｌ（〜０．６９ｐＭ）であると推測された。対照非融合ＩＦＮ−αタンパク質は、これらの実験で、６．５ｐｇ／ｍｌ（〜０．３３ｐＭ）のＩＣ50値を示すダウジ細胞増殖を阻害した。
【０１３２】
５．Ｃ．ＩＦＮ−ＩｇＧ融合タンパク質のインビボ活性
ＩＦＮ−α生物活性は、相対的に種特異的であり、そしてそれは、研究されうる臨床前動物モデルの範囲を制限する。インビボでのＩＦＮ−α−ＩｇＧ融合タンパク質の効力を測定するために使用することができる１つのモデルは、無胸腺のヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移殖片成長の阻害である。ヒトＩＦＮ−α２は、マウス細胞で活性でなく、そしてヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片成長の阻害は、ヒト腫瘍細胞における直接抗増殖効果を通して起る。ＩＦＮ−α２は、無胸腺のマウスにおける多様な一次ヒト腫瘍異種移植片およびヒト腫瘍細胞株の成長を阻害する（Ｂａｌｋｗｉｌｌら、１９８５；Ｂａｌｋｗｉｌｌ、１９８６；Ｊｏｈｎｓら、１９９２；ＬｉｎｄｎｅｒおよびＢｏｒｄｅｎ、１９９７）。その研究についての一次終点は、処置マウスにおける腫瘍容積でありうる。ＩＦＮ−α−ＩｇＧ融合タンパク質の投与は、ベヒクル処置動物に対して、マウスにおける腫瘍成長（腫瘍容積によって測定される）を阻害する。無胸腺のヌードマウスは、チャールズリバー社のような商業的販売者から購入されうる。各マウスに、０日目に、２×１０6ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３またはＭＣＦ−７腫瘍細胞（これらの細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できる）を注射でき、そして試験群に無作為に付与され、各々１０匹のマウスから構成されうる。別のＩＦＮ−α応答性腫瘍型から得られる適切な数の細胞は、ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３またはＭＣＦ−７細胞に置換されうる。腫瘍容積は、ＬｉｎｄｅｒおよびＢｏｒｄｅｎ（１９９７）によって記載されるとおり、カリパスを用いて腫瘍の長さおよび幅を測定することによって、４日の間隔で測定することができる。屠殺のときに、腫瘍を切断し、そして秤量できる。各試験群についての平均腫瘍容積±ＳＥＭは、各試料の採取点について計算することができる。群の間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定を、そして多重比較については差異の一方向分析を利用することができる。皮下注射により１日当たり１回投与される５μｇのＩＦＮ−α２は、６週後に無胸腺のマウスにおけるＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３細胞およびＭＣＦ−７細胞の成長を８０％阻害する（ＬｉｎｄｅｒおよびＢｏｒｄｅｎ、１９９７）。いずれかの細胞株は、これらの研究のために使用することができる。ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３株（ＡＴＣＣから入手可能である）は、ＭＣＦ−７細胞がそうであるように、成長のためにエストロゲンを必要としない。ＭＣＦ−７細胞を用いた異種移殖片実験は、マウスが、卵巣切除され、そしてエストロゲンペレットを移殖されることが必要である（ＬｉｎｄｅｒおよびＢｏｒｄｅｎ、１９９７）。当初の実験で、異なる群のマウスは、毎日、１日おき、または３日毎の投与スケジュールを用いて、注射当たり１または５μｇのｒＩＦＮ−α２、または注射当たり０．１〜１００μｇのＩＦＮ−α−ＩｇＧ融合タンパク質の皮下注射を受けることができる。投与は、マウスへの腫瘍細胞の注射に続いて２日目に始まることができる。対照マウスは、ベヒクル溶液のみを受けることができる。１日おきおよび３日毎の投与実験で、さらなる正の対照群は、毎日、５μｇのｒＩＦＮ−α２の皮下注射を受けることができる。
【０１３３】
ＩＦＮ−β−ＩｇＧ融合タンパク質のインビボ効力は、類似の用量および投与スケジュールを用いて、同じ腫瘍異種移殖片モデルで示されることができる。
６．ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質
６．Ａ．ＩＬ−１１のクローニング。ＩＬ−１１は、血小板の巨核球前駆体の発達を刺激する。ヒトＩＬ−１１をコードするｃＤＮＡは、ヒト膀胱癌細胞株５６３７並びにＨＬ６０およびＵ９３７白血病細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能）のようなＩＬ−１１を発現するヒト細胞株から単離されたＲＮＡからＰＣＲによって増幅されることができる。ＰＣＲ反応は、順方向プライマーＩＬ−１１Ｆ（５’−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＴＧ−３’）（配列番号５２）および逆方向プライマーＩＬ−１１Ｒ（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号５３）を用いて行われうる。プライマーＩＬ−１１Ｆは、ＩＬ−１１分泌シグナルについてのコード配列の５’末端にアニールし、そして逆方向プライマーＩＬ−１１Ｒは、ＩＬ−１１コード配列の３’末端にアニールする。得られたＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングすることができる。数種のクローンは、修正ＤＮＡ配列であるものを同定するために配列決定することができる。
【０１３４】
あるいは、ＩＬ−１１コード配列は、上記実施例１、セクションＣ４に記載されるように、およびＨｏｒｔｏｎら（１９９３）による「重複延長」の技術によって、その後、連続して一緒に分断して、全長クローンを生じる２つのセグメントのように、ＰＣＲによって増幅された。アミノ酸１〜１４７をコードする１つのセグメントは、上記セクション２Ｂで詳述されるとおり、ヒト膀胱癌細胞株５６３７から抽出された総ＲＮＡから由来する一本鎖ｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅された。鋳型として第一鎖合成の産物を用いたＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ２６５（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＴＧ＞３）（配列番号５４）および逆方向プライマーＢＢ２７３（５＞ＧＣＧＧＧＡＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣＡＧ＞３）（配列番号５５）を用いて行うことができる。プライマーＢＢ２６５は、ＩＬ−１１分泌シグナル配列についてのコード配列の５’末端にアニールし、そして逆方向プライマーＢＢ２７３は、アミノ酸１３８〜１４７をコードする配列にアニールし、そしてエキソン４および５のアニールを埋める（ＭｃＫｉｎｌｅｙら、１９９２）。この反応の〜４５０ｐｂ産物を、ゲル精製し、そして連続分断反応で使用した。アミノ酸１４２〜１９７をコードするＤＮＡ配列を含む第二セグメントは、ヒトゲノムＤＮＡ（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ））からＰＣＲにより増幅された。鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ２７２（５＞ＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧ＞３）（配列番号５６）および逆方向プライマーＢＢ２７４（５＞ＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＣ＞３）（配列番号５７）を用いて行われた。ＢＢ２７２は、アミノ酸１４２〜１５０をコードする配列にアニールし、そしてエキソン４および５の連結を埋める。ＢＢ２７４は、アミノ酸１８９〜１９７をコードする配列にアニールする。この反応の〜１７０ｐｂ産物を、ゲル精製し、そして連続分断反応に使用した。
【０１３５】
ゲル精製した〜４５０ｂｐおよび〜１７０ｂｐ産物は、鋳型として〜４５０ｂｐおよび〜１７０ｂｐ産物、並びに順方向プライマーＢＢ２６５（上記）および逆方向プライマーＢＢ２７５（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣ  ＧＧＡＣＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧ＞３）（配列番号５８）を含むＰＣＲ反応で一緒に分断された。ＢＢ２７５は、アミノ酸１９１〜１９９をコードするＤＮＡ配列にアニールする。この反応の〜６２０ｂｐ産物を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングした。修正ＤＮＡ配列を有するクローンは、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ＩＬ−１１ｆｕｓまたはｐＢＢＴ２９８と称した。
【０１３６】
６．Ｂ．ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合体の構築。
ＩｇＧ１−Ｆｃコード配列を、ＩＬ−１１のカルボキシ末端に融合させた。〜７９０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を、プラスミドｐＢＢＴ１７４［上記実施例２に記載、表１参照］から切断し、そしてＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化しアルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ２９８に入れてクローニングした。そして同様に、ＩｇＧ４−Ｆｃコード配列も、ＩＬ−１１のカルボキシ末端に融合させた。プラスミドｐＢＢＴ１７５の〜７９０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片［上記実施例２に記載、表１参照］を切断し、ゲル精製し、そしてＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ２９８に入れてクローニングした。ＩｇＧ１−ＣHおよびＩｇＧ４−ＣHコード配列も、ＩＬ−１１のカルボキシ末端に融合させた。ＩｇＧ１−ＣHおよびＩｇＧ４−ＣHコード配列を、それぞれプラスミドｐＢＢＴ１７３およびｐＢＢＴ１８４［上記実施例２に記載、表１参照］から得られる〜１０８０ｐｂ  ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片として切断し、そしてＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化したｐＢＢＴ２９８にクローニングし、アルカリホスファターゼで処理した。得られた組換えプラスミド全ての構造は、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって確認された。それらがコードするこれらのプラスミドおよびＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質は、表１０に列記される。
【０１３７】
【表１１】
0004944324.tif 000012
ＩＬ−１１−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＢＢＴ３３６を用いたＰＣＲによって作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＩＬ１１ＤＦＡ（５’ＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＣＴＧＧＡ  ＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３’）（配列番号５９）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＩＬ１１ＤＦＢ（５’ＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３）（配列番号６０）およびＢＢ２７２を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得られる産物を、ゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ２７２を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。およそ８００ｂｐ  ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＳｇｒＡＩ  ＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したｐＢＢＴ３３６にクローニングした。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１３８】
ＩＬ１１−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＢＢＴ３３７を用いたＰＣＲによって作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＩＬ１１ＤＦＣ（５−ＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣ  ＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３’）（配列番号６１）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＩＬ１１ＤＦＤ（５’−ＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号６２）およびＢＢ２７２を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得られる産物を、ゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ２７２を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。およそ８００ｂｐ  ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＳｇｒＡＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したｐＢＢＴ３３７にクローニングした。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１３９】
Ｂ９−１１細胞株（Ｌｕら、１９９４）、Ｔ１１細胞株（アール・アンド・ディー・システムズ）または別のＩＬ−１１−依存性細胞株は、ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性を測定するために使用することができる。ＩＬ−１１−依存性細胞株は、数日から数ヶ月の間、１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１１を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中のＢ９細胞株（ジャーマンコレクション・オブ・マイクロオーガニスムズ・アンド・セルカルチャーズ、ドイツ国ブラウンシュビーグ所在（ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能）を培養し、続いて個々の株について選択する細胞の希釈クローニングを制限することによって作成することができる。
【０１４０】
６．Ｃ．ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質のインビボ効力
ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質は、ｈＩＬ−１１およびｈＴＰＯについて見られるもの（Ｌｏｋら、１９９４；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙら、１９９４；Ｎｅｂｅｎら、１９９３；Ｙｏｎｅｍｕｒａら、１９９３）と同様に、正常なマウスまたはラットでの循環中の血小板および巨核球における増加を刺激する。ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質の効力は、１日おき、３日毎、または単回注射の投与スケジュールを用いた正常な動物で試験することができる。ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質の有効性は、１日おき、３日毎または単回注射の投与スケジュールを用いて、げっ歯類化学療法で誘導された血小板減少症モデルでも示すことができる（Ｈａｎｇｏｃら、１９９３；Ｌｅｏｎａｒｄら、１９９４）。
【０１４１】
マウスまたはラットの群は、７日までの間、特定の間隔（毎日、１日おき、３日毎）で、ｒｈＩＬ−１１、ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質またはプラセボ（ベヒクル溶液）の皮下注射を受けることができる。広範囲のＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質の用量は、用量の内の１つが効果がある見込みを増大するこれらの当初の実験で試験することができる。試験されるべきＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質の用量範囲は、これらの動物モデルについて先に測定されたＩＬ−１１の最適用量の０．００２Ｘから２５Ｘまでの範囲に及ぶ。多すぎる融合タンパク質の投与が、毒性のために巨核球形成を妨げることが可能である。対照動物は、ベヒクル溶液のみを受けることができる。さらなる対照群は、ｒｈＩＬ−１の皮下注射を毎日受けることができる。７日目に、動物を屠殺し、そして血液試料を、全血細胞数分析のために収集した。造血組織（肝臓および脾臓）を収集し、秤量し、そして増加した巨核球形成の証拠を求める組織病理学的分析のために、ホルマリンに固定することができる。骨髄は、巨核球生成が増加した証拠を求めるために、種々の長骨、そして単位粒子調製および組織病理学的分析については胸骨から取り出されることができる。群の間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定を、そして多重比較についての差異の一方向分析を利用できる。Ｐ＜０．０５は、有意であると考えられうる。ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合タンパク質は、動物中の循環中の血小板および巨核球形成における増加を刺激する。
【０１４２】
７．ＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質
７．Ａ．ＴＰＯのクローニング。トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血小板の巨核球前駆体の発生を刺激する。ヒトＴＰＯをコードするｃＤＮＡは、ヒト成人および胎児肝臓（クロンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．））から製造される一本鎖ｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅された。胎児または成人腎臓（クローンテック社）から製造された一本鎖ｃＤＮＡも、ＴＰＯを増幅するために使用することができる。ＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ３４３（５’−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＡＴＴＧＣＴＣ−３’）（配列番号６３）および逆方向プライマーＢＢ３４４（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＣＣＴＴＣＣ  ＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧ−３’）（配列番号６４）を用いて行われた。プライマーＢＢ３４３は、ＴＰＯ分泌シグナルについてのコード配列の５’末端にアニールし、そして逆方向プライマーＢＢ３４４は、ＴＰＯコード配列の３’末端にアニールする。
【０１４３】
ＴＰＯをコードする配列は、内部のＢａｍＨＩ部位を含有し、そしてこの部位は、２つのセグメントとして〜１０００ｂｐＴＰＯコード配列をクローニングするために使用された；〜４００ｂｐのアミノ末端ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片および〜６００ｂｐのカルボキシ末端ＢａｍＨＩ断片。これらの断片の各々は、最初にクローニングされ、そして配列決定し、そして続いて、内部のＢａｍＨＩ部位を通して一緒に連結されて、完全ＴＰＯコード配列を生成した。〜１，０００ｂｐ  ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化して、〜４００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片および〜６００のＢａｍＨＩ断片を生じた。これらの断片を、ゲル精製し、そしてそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ、またはＢａｍＨＩのみで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングした。各断片について修正ＤＮＡ配列を有するクローン（Ｆｏｓｔｅｒら、１９９４；Ｓｏｈｍａら、１９９４）が同定された。その後、６００ｂｐ  ＢａｍＨＩ断片を、配列が立証されたクローンから切断し、そしてＢａｍＨＩ切断物にクローニングし、アルカリホスファターゼ処理し、そして配列認証された４００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を含有するｐＣＤＮＡ３．１（＋）誘導体をゲル精製した。得られたクローンを、制限エンドヌクレアーゼ消化およびＰＣＲによって分析して、適切な配向で、すなわち、ＴＰＯについてのコード配列が適切に再構築されるように６００ｂｐＢａｍＨＩ断片を担持するものを同定した。１つの適切に配向されたクローンは、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ＴＰＯｆｕｓ、またはｐＢＢＴ３５５と称し、そしてさらなる構築のために使用された。
【０１４４】
７．Ｂ．ＴＰＯ−ＩｇＧ融合体の構築。ＴＰＯのカルボキシ末端へのＩｇＧコード配列の融合は、ＴＰＯについてのコード配列がＢａｍＨＩ部位を含むので、制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＥＩが、ＢａｍＨＩの代わりに使用される以外は、ＩＬ−１１−ＩｇＧ融合を構築するために使用されるものと類似の操作で構築された。実施例１、２および１０に記載された構築物の全てでｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ（配列番号３）リンカーペプチドをコードするために使用される配列は、単独ＢｓｐＥＩ認識部位（ＴＣＣＧＧＡ）を含み、そしてこの部位は、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターまたはＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ、ＩｇＧ１−ＣHおよびＩｇＧ４−ＣHコード配列内に生じない。
【０１４５】
ＩｇＧ１−Ｆｃコード配列は、ＴＰＯのカルボキシ末端に融合された。〜７９０ｂｐ  ＢｓｐＥＩ−ＸｂａＩ断片を、プラスミドｐＢＢＴ１７４［上記実施例２に記載、表１参照］から切断し、そしてＢｓｐＥ１およびＸｂａＩで消化し、し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ３５５に入れてクローニングした。同様に、ＩｇＧ４−Ｆｃコード配列も、ＴＰＯのカルボキシ末端に融合された。プラスミドｐＢＢＴ１７５の〜７９０ｂｐ  ＢｓｐＥＩ−ＸｂａＩ断片［上記実施例２に記載、表１参照］を切断し、ゲル精製し、そしてＢｓｐＥＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理されたｐＢＢＴ３５５に入れてクローニングした。ＩｇＧ１−ＣHおよびＩｇＧ４−ＣHコード配列も、ＴＰＯのカルボキシ末端に融合された。ＩｇＧ１−ＣHおよびＩｇＧ４−ＣHコード配列を、それぞれ、プラスミドｐＢＢＴ１７３およびｐＢＢＴ１８４［上記実施例２に記載、表１参照］から〜１０８０ｂｐ  ＢｓｐＥＩ−ＸｂａＩ断片として切断し、そしてＢｓｐＥＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ３５５に入れてクローニングした。得られた組換えプラスミド全ての構造は、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって立証された。表１１は、これらのプラスミドおよびそれらがコードするＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質を列記する。
【０１４６】
【表１２】
0004944324.tif 000013
成熟ＴＰＯタンパク質のアミノ酸１〜１５３から構成される、ＴＰＯのアミノ末端ドメインは、巨核球形成のために十分であると示された（Ｂａｒｔｌｅｙら、１９９４、ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅら、１９９４）。このドメインは、ｐＢＢＴ３５５（上記）中のＴＰＯコード配列からＰＣＲによってサブクローニングされ、そして免疫グロブリン配列に融合された。ＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ３４３（上記）および逆方向プライマーＴＰＯ１５３ｒｅｖ（５＞ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＧＡＣ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＣＣＣ＞３）（配列番号６５）を用いて行われるであろう。プライマーＴＰＯ１５３ｒｅｖは、アミノ酸１４７〜１５３をコードするＴＰＯ配列にアニールし、そしてＢａｍＨＩ部位を含む柔軟性リンカーの一部を加える。この反応についての鋳型は、ｐＢＢＴ３５５ＤＮＡであろう。得られた〜６００ｂｐのＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩで消化され、そして得られた〜１０５ｂｐＢａｍＨＩ断片は、ゲル精製され、ｐＵＣ１８でクローニングし、そして配列決定した。その後、修正配列を有するクローンは、それから〜１０５ｂｐＢａｍＨＩ断片がゲル精製されるプラスミドＤＮＡの源として使用される。この断片は、ｐＢＢＴ３４０、ｐＢＢＴ３４１、ｐＢＢＴ３４２およびｐＢＢＴ３４３（全て上記に記載されている）中に存在する〜６００ｂｐＢａｍＨＩ断片を置換するために使用される。これは、ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーを介して、それぞれＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ、ＩｇＧ１−ＣHおよびＩｇＧ４−ＣHに融合されたＴＰＯのアミノ酸１〜１５３から構成される融合タンパク質の構築を生じるであろう。
【０１４７】
ＴＰＯ−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＢＢＴ３４０を用いてＰＣＲにより作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＴＰＯＤＦＡ（５’ＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧ  ＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３’）（配列番号６６）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＴＰＯＤＦＢ（５’ＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧ−３）（配列番号６７）およびＢＢ９１を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得た産物をゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ９１を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。およそ１７００ｂｐ  ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したｐＢＢＴ３４０にクローニングした。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１４８】
ＴＰＯ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＢＢＴ３４１を用いてＰＣＲにより作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＴＰＯＤＦＣ（５’ＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３’）（配列番号６８）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＴＰＯＤＦＤ（５−ＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧ−３’、配列番号６９）およびＢＢ９１を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得た産物をゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ９１を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。およそ２０００ｂｐ  ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したｐＢＢＴ３４１にクローニングした。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１４９】
同様の方法は、ＩｇＧ−Ｆｃドメインに融合されたＴＰＯのアミノ酸１〜１５３のみをコードする類似の直接融合体を構築するために使用できるであろう。
細胞株Ｍ−Ｏ７ｅ（Ａｖａｎｚｉら、１９８８；ジャーマンコレクション・オブ・マイクロオーガニスムズ・アンド・セルカルチャーズ、ドイツ国ブラウンシュビーグ所在（ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能）を、ＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質生物活性を測定するために使用できる。
【０１５０】
７．Ｃ．ＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質のインビボ効力
ＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質は、ｈＩＬ−１１およびｈＴＰＯについて見られるものと類似して、正常なマウスまたはラットでの循環中の血小板および巨核球形成における増加を刺激する（Ｌｏｋら、１９９４；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙら、１９９４；Ｎｅｂｅｎら、１９９３；Ｙｏｎｅｍｕｒａら、１９９３；Ｋａｓｚｕｂｓｋａら、２０００）。ＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力は、１日おき、３日毎、または単回注射の投与スケジュールを用いて、正常な動物で試験することができる。ＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質の有効性は、１日おき、３日毎または単回注射の投与スケジュールを用いて、げっ歯類化学療法で誘導された血小板減少症モデルでも示されることができる（Ｈａｎｇｇｏｃら、１９９３；Ｌｅｏｎａｒｄら、１９９４）。
【０１５１】
マウスまたはラットの群は、７日までの間、特定の間隔（毎日、１日おき、３日毎）で、ｒｈＴＰＯ、ＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質またはプラセボ（ベヒクル溶液）の皮下注射を受けることができる。広範囲のＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質の用量は、用量の内の１つが効果がある見込みを増大するこれらの当初の実験で使用することができる。試験されるべきＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質の用量範囲は、これらの動物モデルについて先に測定されたＴＰＯの最適用量の０．００２Ｘから２５Ｘまでの範囲に及ぶことができる。多すぎる融合タンパク質の投与が、毒性のために巨核球形成を妨げることが可能である。対照動物は、ベヒクル溶液のみを受けうる。さらなる対照群は、ｒｈＴＰＯの皮下注射を毎日受けうる。７日目に、動物を屠殺し、そして血液試料を、全血細胞数分析のために収集した。造血組織（肝臓および脾臓）を収集し、秤量し、そして増加した巨核球形成の証拠を求める組織病理学的分析のために、ホルマリンに固定することができる。骨髄は、巨核球生成が増加した証拠を求めるために、種々の長骨、そして単位粒子調製および組織病理学的分析については胸骨から取り出されることができる。群の間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定を、そして多重比較についての差異の一方向分析を利用できる。Ｐ＜０．０５は、有意であると考えられるであろう。ＴＰＯ−ＩｇＧ融合タンパク質は、動物中の循環中の血小板および巨核球形成における増加を刺激する。
【０１５２】
８．ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質
８．Ａ．ＧＭ−ＣＳＦのクローニング。ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードするｃＤＮＡは、上記セクション２．Ｂに詳述されるとおり、ヒト膀胱癌細胞株５６３７から調製される総ＲＮＡからＰＣＲによって増幅された。鋳型として一次鎖合成の産物を用いたＰＣＲ産物は、順方向プライマーＢＢ２６３（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣ  ＣＴＧＣＴＧ＞３）（配列番号７０）および逆方向プライマーＢＢ２６４（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＣＴ  ＣＣＣＡＧＣＡ＞３）（配列番号７１）を用いて行われた。プライマーＢＢ２６３は、ＧＭ−ＣＳＦ分泌シグナルについてのコード配列の５’末端にアニールし、そして逆方向プライマーＢＢ２６４は、ＧＭ−ＣＳＦコード配列の３’末端にアニールする。生じた〜４５０ｂｐＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングした。修正ＤＮＡ配列を有するクローン（Ｃａｎｔｒｅｌｌら、１９８５）は、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ＧＭ−ＣＳＦｆｕｓまたはｐＢＢＴ２６７と称した。
【０１５３】
あるいは、ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡは、ヒトＴ細胞株ＨＵＴ１０２（アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能）のようなＧＭ−ＣＳＦを発現する細胞株から単離されたＲＮＡから、またはヒト末梢血リンパ球または２０μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ（シグマケミカル社）および４０ｎｇ／ｍｌホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ、シグマケミカル社）で活性化されたヒトジャルカットＴ細胞株からＰＣＲにより増幅することができる。ＰＣＲ反応は、順方向プライマーＢＢ２６３および逆方向プライマーＢＢ２６４を用いて行うことができる。得られた〜４５０ｐｂのＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化され、そしてゲル精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングした。数種のクローンは、修正ＤＮＡ配列を用いて、あるものを同定するために配列決定することができる。
【０１５４】
８．Ｂ．ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ（ＧＦ−ＩｇＧ）融合体の構築。ＩｇＧ１−Ｆｃコード配列を、ＧＭ−ＣＳＦのカルボキシ末端に融合することができる。プラスミドｐＢＢＴ１７４から切断された〜７９０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片［上記実施例２に記載、表１参照］は、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ２６７に入れてクローニングすることができる。同様に、ＩｇＧ４−Ｆｃコード配列は、ＧＭ−ＣＳＦのカルボキシ末端にも融合されることができる。プラスミドｐＢＢＴ１７５から切断された〜７９０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片［上記実施例２に記載、表１参照］は、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ２６７に入れてクローニングした。ＩｇＧ１−ＣHおよびＩｇＧ４−ＣHコード配列は、ＧＭ−ＣＳＦのカルボキシ末端にも融合させることができる。ＩｇＧ１−ＣHおよびＩｇＧ４−ＣHコード配列を、それぞれ、プラスミドｐＢＢＴ１７３およびｐＢＢＴ１８４［上記実施例２に記載、表１参照］から〜１０８０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片として切断し、そしてＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢＢＴ２６７に入れてクローニングできる。得られた組換えプラスミド全ての構造は、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって立証される。ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性は、ＴＦ−１細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能）を用いて測定されうる。
【０１５５】
ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１：：ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃを使用してＰＣＲによって作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＧＭＣＳＦＤＦＡ（５’ＧＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３’）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＧＭＣＳＦＤＦＢ（５’ＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡ−３）およびＢＢ９１を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得られる産物を、ゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ９１を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。およそ１１５０ｂｐ  ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、得られた〜６７５ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩＩ断片をゲル精製し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したｐｃＤＮＡ３．１：：ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃにクローニングした。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１５６】
ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１：：ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃを使用してＰＣＲによって作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＧＭＣＳＦＤＦＣ（５ＧＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３’）（配列番号７６）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＧＭＣＳＦＤＦＤ（５’−ＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴ  ＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡ−３’）（配列番号７７）およびＢＢ９１を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得られる産物を、ゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ９１を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。およそ１１５０ｂｐ  ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、〜６７５ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩＩ断片をゲル精製し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１：：ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃにクローニングした。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１５７】
ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性は、ＴＦ−１細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能）を用いて測定することができる。
【０１５８】
８．Ｃ．ＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質のインビボ効力
ＧＭ−ＣＳＦは、正常および好中球減少症のヒトおよび動物における顆粒球形成および循環中の好中球レベルにおける増加を刺激する。ヒトＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力は、タンパク質の注射が循環している好中球レベルの経時的な増加を刺激する非ヒト霊長類（Ｄｏｎａｈｕｅら、１９８６ａ、１９８６ｂ；Ｍａｙｅｒら、１９８７ａ、１９８７ｂ）およびイヌ（Ｓｃｈｕｅｎｉｎｇら、１９８９；Ｍａｙｅｒら、１９９０）で測定することができる。あるいは、ここに記載されるものと類似のＩｇＧ融合タンパク質は、マウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｏｕｇｈら、１９８４；１９８５；Ｋａｊｉｇａｙａら、１９８６；Ｃａｎｔｒｅｌｌら、１９８５）およびヒトＧＭ−ＣＳＦシステイン突然変異タンパク質について記載されるとおり、発現および精製されたタンパク質を利用することができる。タンパク質のインビトロ生物活性は、ネズミＮＦＳ６０またはＤＡ−３細胞株を用いて測定することができる。マウスＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の効力は、日当たり１回、１日おき、または３日毎のネズミＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質についての投与スケジュールを用いて、２００ｍｇ／ｋｇの用量でシクロホスファミドの注射（Ｍａｙｅｒら、１９９１；Ｇａｍｂａ−Ｖｉｔａｌｏら、１９９１）により好中球減少症になったマウスで測定することができる。０．５μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇの範囲に及ぶＧＭ−ＣＳＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の用量を試験することができる。
【０１５９】
９．幹細胞因子−ＩｇＧ融合タンパク質
９．Ａ．幹細胞因子（ＳＣＦ）のクローニング：ＳＣＦは、造血先祖細胞の発生を調節する。ヒトＳＣＦをコードするｃＤＮＡは、ＨｅｐＧ２、５６３７またはＨＴ−１０８０細胞株から単離されたＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅することができる（Ｍａｒｔｉｎら、１９９０；ＨｅｐＧ２および５６３７細胞株は、ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル所在（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能である）。ＰＣＲ反応は、順方向プライマーＳＣＦ−Ｆ（５’−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡＡＣＴ−３’）（配列番号７８）および逆方向プライマーＳＣＦ−Ｒ（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧ−３’）（配列番号７９）を用いて行うことができる。プライマー中のＳＣＦ  ＤＮＡ配列は、下線が付される。プライマーＳＣＦ−Ｆは、ＳＣＦ分泌シグナルについてのコード配列の５’末端にアニールし、そして逆方向プライマーＳＣＦ−Ｒは、ＳＣＦコード配列の３’末端にアニールし、細胞外および膜貫通ドメインの接合部で始まる。他の逆方向ＰＣＲプライマーは、適切なヌクレオチドを、ＳＣＦ−Ｒで列記されるＳＣＦ  ＤＮＡ配列に置換することによって、ＳＣＦ細胞外ドメインの切断形態、特に成熟タンパク質のＡｌａ−１７４に続いて終止する形態を作成するために使用することができる。得られたＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化され、ゲル精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングし、アルカリホスファターゼ処理し、そしてゲル精製することができる。いくつかのクローンは、修正ＤＮＡ配列を用いて、あるものを同定するために配列決定されることができる。ＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ、ＩｇＧ１−ＣH、ＩｇＧ４−ＣHおよびカッパ軽鎖定常部は、実施例１および５に記載されるとおりＳＣＦの細胞外ドメインのカルボキシ末端に融合されることができる。細胞株ＴＦ−１（Ｋｉｔａｍｕｒａ、１９８９；アメリカンタイプカルチャーコレクション、メリーランド州ロックビル所在（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能）は、ＳＣＦ−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性を測定するために使用することができる。
【０１６０】
種々のＩｇＧドメインに対するＳＣＦの細胞外ドメインの直接融合体は、ＥＰＯ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ直接融合体を構築するために実施例４に記載されるものと類似の操作を使用して構築することができる。ＳＣＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１：：ＳＣＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ７ＡＡを使用するＰＣＲによって作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＳＣＦＤＦＦ（５’−ＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３’）（配列番号８０）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＳＣＦＤＦＲ（５’−ＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＧＴＧＴ  ＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧ−３’）（配列番号８１）およびＢＢ９１を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得られる産物を、ゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ９１を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したｐｃＤＮＡ３．１：：ＳＣＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ７ＡＡにクローニングすることができる。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１６１】
ＳＣＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１：：ＳＣＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ７ＡＡを使用するＰＣＲによって作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＳＣＦＤＦＣ（５’−ＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＣＡＣＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３’）（配列番号８２）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＳＣＦＤＦＤ（５’−ＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＧＴＧＴＡ  ＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧ−３’）（配列番号８３）およびＢＢ９１を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得られる産物を、ゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ９１を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したｐｃＤＮＡ３．１：：ＳＣＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ７ＡＡにクローニングすることができる。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１６２】
１０．Ｆｌｔ−３Ｌ−ＩｇＧ融合タンパク質：Ｆｌｔ−３Ｌ（Ｌｙｍａｎら、１９９３；Ｈａｎｎｕｍら、１９９４）は、造血幹細胞の発生を調節する膜結合サイトカインである。ヒトＦｌｔ−３ＬをコードするｃＤＮＡは、クロンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）およびストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）のような商業源から入手可能な成人または胎児の肝臓、腎臓、心臓、肺または骨格筋から製造された一本鎖ｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅することができる。ＰＣＲ反応は、順方向プライマーｆｌｔＦ（５’−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡＧＣＣ−３’）（配列番号８４）および逆方向プライマーｆｌｔＲ（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＧＧ−３’）（配列番号８５）を用いて行うことができる。プライマー中のＦｉｔ−３Ｌ  ＤＮＡ配列は、下線が付される。プライマーｆｌｔＦは、Ｆｌｔ−３Ｌ分泌シグナルについてのコード配列の５’末端にアニールし、そして逆方向プライマーｆｌｔＲは、Ｆｌｔ３コード配列の３’末端にアニールし、細胞外および膜貫通ドメインの接合部で始まる。他の逆方向ＰＣＲプライマーは、適切なヌクレオチドを、プライマーｆｌｔＲで列記されるＦｌｔ−３Ｌ  ＤＮＡ配列に置換することによって、Ｆｌｔ−３Ｌ細胞外ドメインの切断形態を作成するために使用することができる。得られたＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化され、ゲル精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに入れてクローニングし、アルカリ性ホスファターセ処理し、そしてゲル精製しうる。いくつかのクローンは、修正ＤＮＡ配列を用いて、あるものを同定するために配列決定することができる。ＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ、ＩｇＧ１−ＣH、ＩｇＧ４−ＣHおよびカッパ軽鎖定常部は、実施例１および５に記載されるとおりＦｌｔ−３Ｌの細胞外ドメインのカルボキシ末端に融合することができる。ヒトＦｌｔ−３レセプターで形質移入されたＢａ／Ｆ３細胞（Ｌｙｍａｎら、１９９３；Ｈａｎｎｕｍら、１９９４）は、Ｆｌｔ−３Ｌ−ＩｇＧ融合タンパク質の生物活性を測定するために使用することができる。Ｂａ／Ｆ３細胞は、ジャーマンコレクション・オブ・マイクロオーガニスムズ・アンド・セルカルチャーズ、ドイツ国ブラウンシュビーグ所在（ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能である。
【０１６３】
種々のＩｇＧドメインに対するＦｌｔ−３Ｌの細胞外ドメインの直接融合体は、ＥＰＯ−ＩｇＧおよびＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ直接融合体を構築することについての実施例４に記載されるものと類似の操作を使用して構築することができる。Ｆｌｔ−３Ｌ−ＩｇＧ１−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型として上に記載されるプラスミドｐｃＤＮＡ３．１：：Ｆｌｔ−３Ｌ−ＩｇＧ１プラスミドを使用するＰＣＲによって作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＦｌｔＤＦＡ（５’−ＧＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡ  ＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３’）（配列番号８６）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＦｌｔ３ＤＦＢ（５’−ＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＧＧ−３’）（配列番号８７）およびＢＢ９１を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得られる産物を、ゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ９１を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したｐｃＤＮＡ３．１：：ＳＣＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ７ＡＡにクローニングしうる。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１６４】
Ｆｌｔ−３Ｌ−ＩｇＧ４−Ｆｃ直接融合体は、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１：：Ｆｌｔ３−ＩｇＧ４−Ｆｃ７ＡＡを使用するＰＣＲによって作成することができる。１つのＰＣＲ反応は、オリゴＦｌｔＤＦＣ（５’−ＧＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡ−３’）（配列番号８８）およびＢＢ８２を使用できる。二次ＰＣＲ反応は、オリゴＦｌｔＤＦＤ（５’−ＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＴＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＧＧ−３’）（配列番号８９）およびＢＢ９１を使用できる。これらのＰＣＲ反応から得られる産物を、ゲル精製し、混合し、そしてオリゴＢＢ８２およびＢＢ９１を用いた三次ＰＣＲ反応に付すことができる。ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして仔ウシ腸のホスファターゼで処理した、同様に切断したｐｃＤＮＡ３．１：：ＳＣＦ−ＩｇＧ４−Ｆｃ７ＡＡにクローニングすることができる。修正挿入物を有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。
【０１６５】
（実施例１１）
多量体サイトカインおよび増殖因子融合タンパク質
生物活性融合タンパク質は、この出願に記載される増殖因子およびサイトカインの多量体融合タンパク質を構築することによっても作成することができる。これらの多量体融合タンパク質は、第２増殖因子／サイトカインタンパク質が、ＩｇＧドメインに置換されることができる以外は、ＩｇＧ融合タンパク質について記載されるとおりに構築することができる。２つの増殖因子／サイトカインは、２つの増殖因子／サイトカインの間のリンカーのアミノ酸と一緒に、またはアミノ酸なしで連結されうる。適切なペプチドリンカーとしては、実施例１および４に記載されるものが挙げられる。融合タンパク質は、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体（同じ増殖因子／サイトカインの３つまたはそれ以上のコピーを含む）またはヘテロ多量体（２つまたはそれ以上の異なる増殖因子／サイトカインを含む）であることができる。大部分のカルボキシ末端サイトカイン／増殖因子ドメインは、タンパク質の自然のシグナル配列を欠失し、そして所望の場合、成熟タンパク質配列の第一アミノ酸に先行する短いペプチドリンカー配列を添加するＰＣＲのような操作を使用して修飾されることができる。リンカー配列としては、アミノ末端サイトカイン／増殖因子ドメインに結合することを容易にする制限酵素部位を挙げられるであろう。多量体融合タンパク質で、そのタンパク質のアミノ−またはカルボキシ末端にないサイトカイン／増殖因子ドメインは、自然のシグナル配列および終止コドンを欠失し、そして所望の場合、ペプチドリンカーを、そのタンパク質のアミノ−およびカルボキシ末端に添加するように修飾されることができる。融合タンパク質は、形質移入に続くＣＯＳ細胞中で発現され、精製され、そしてインビトロバイオアッセイで適切に試験されうる。融合タンパク質は、実施例１２に記載されるとおり、哺乳類細胞のような安定に形質転換した真核生物の細胞でも発現することができる。
【０１６６】
（実施例１２）
安定に形質転換された真核生物の細胞におけるＩｇＧ融合タンパク質および多量体増殖因子／サイトカインの発現
前述の実施例に記載されたＩｇＧ融合タンパク質および多量体サイトカイン／増殖因子は、十分に確立した操作を用いて昆虫細胞または哺乳類細胞のような安定に形質転換された真核生物の細胞でも発現することができる。その後、ＩｇＧ融合タンパク質および多量体サイトカイン／増殖因子は、調製培地から精製される。安定に形質転換されたＣＨＯ細胞株は、組換えタンパク質の高レベル発現のために広範に使用される（Ｇｅｉｓｓｅら、１９９６；Ｔｒｉｌｌら、１９９５）。ＣＨＯ細胞において、染色体が組み込まれた異種遺伝子の高レベル発現は、遺伝子増幅によって達成することができる。一般に、目的の遺伝子は、増幅が選択性であるマーカー遺伝子に連結される。増幅についての選択を提供する多様な遺伝子は、記載された（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０）が、ネズミのジヒドロホレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）は、頻繁に使用される。この遺伝子の増幅は、ホレート類似メソトレキセート（ＭＴＸ）に対する耐性を付与し、そして耐性のレベルは、ｄｈｆｒ遺伝子コピー数で増加する（Ａｌｔら、１９７８）。ＭＴＸ選択の利用性は、ｄｈｆｒに欠乏しているＣＨＯ細胞株の利用性によって増強される（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０）。
【０１６７】
当業者は、ネズミｄｈｆｒ遺伝子を、Ｇ４１８に耐性を供与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）遺伝子を含む、商業的に入手可能なｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に組み込むＩｇＧ融合タンパク質または多量体サイトカイン／増殖因子についての発現ベクターを構築することができる。ネズミｄｈｆｒ発現ベクターｐｄｈｆｒ２．９は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（カタログ番号３７１６５）から入手可能である。このｄｈｆｒ遺伝子は、ｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞株で選択でき、そしてＭＴＸ耐性につての標準選択によって増幅することができる（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３）。ｄｈｆｒコード配列は、〜９００ｂｐＢｇｌＩＩ断片としてｐｄｈｆｒ２．９から切断でき、そして発現ベクターｐＲＥＰ４（インビトロジェン）のポリリンカーの独特なＢａｍＨＩ部位にクローニングすることができる。この構築物は、ＣＨＯ細胞で機能することが知られている（Ｔｒｉｌｌら、１９９５）、強力なＲＳＶプロモーターの下流に、そしてＳＶ４０から由来するポリアデニル化部位の上流に遺伝子を位置決めするであろう。その後、このｄｈｆｒ発現カセットは、ＳａｌＩ部位が、プロモーターおよびポリＡ付加部位を密接に側面を接するので、ＳａｌＩ断片としてｐＲＥＰ４から切断されることができる。オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、このＳａｌＩ断片は、ｐＣＤＮＡ３．１の独特なＢｇｌＩＩ部位にクローニングされ、それによりｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｄｈｆｒ+を作成することができる。ＩｇＧ融合タンパク質または多量体サイトカイン／増殖因子をコードするＤＮＡは、その後、ＣＭＶプロモーターの制御下でこのｐＣＤＮＡ３．１（＋）誘導体のポリリンカー領域にクローニングすることができる。例えば、ＥＰＯ−ＩｇＧ１−ＦｃまたはＧ−ＣＳＦ−ＩｇＧ１−Ｆｃ遺伝子は、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片のようにそれぞれ、プラスミドｐＢＢＴ１８０およびｐＢＢＴ１７４から切断され、そしてＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ−切断ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｄｈｆｒ+にクローニングすることができる。他の独特な制限酵素部位は、これらの制限酵素部位が、目的の遺伝子に存在する場合に使用することができる。あるいは、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｄｈｆｒ+、およびＩｇＧ融合タンパク質または多量体サイトカイン／増殖因子を発現するｐＣＤＮＡ３．１誘導体の同時形質移入は、目的のタンパク質を発現するｄｈｆｒ+ＣＨＯ細胞株を得るために使用することができる（Ｋａｕｆｍａｎｎ、１９９０）。
【０１６８】
内毒素を含まないプラスミドＤＮＡは、ＣＯＳまたはｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞を形質移入するために好ましい。Ｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞株は、コロンビア大学のＬ．Ｃｈａｓｉｎ博士（ＣＨＯ  Ｋ１  ＤＵＫＸ  Ｂ１１）のような多くの源から、またはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＣＨＯｄｕｋ-、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６）から得られる。細胞は、１０％ＦＢＳ、グルタミン、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジンで補足したＦ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｌｕｃａｓら、１９９６）で培養することができる。電気穿孔法によるか、または販売者のプロトコールおよび／または文献に記載されるもの（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０）を用いて、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）（ギブコ・ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））のような当業者に周知の形質移入試薬を使用することによって、形質移入を行うことができる。７％透析ＦＣＳで補足され、そしてグルタミン、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジンを欠くＦ１２／ＤＭＥＭ（Ｌｕｃａｓら、１９９６）中でｄｈｆｒ+形質移入物を選択することができる。あるいは、Ｇ４１８耐性（ｐＣＤＮＡ３．１のＮＰＴ遺伝子によってコードされる）について選択し、続いて、ｄｈｆｒ+表現型についての形質移入体をスクリーニングすることができる。Ｄｈｆｒ+クローンは、選択培地中で拡張され、そして培養上清は、増殖因子またはサイトカイン（アール・アンド・ディー・システムズ社、エンドジェン社（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびダイアグノスチック・システムズ・ラボラトリーズ社（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって入手可能）に特異的な、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット、または適切な抗血清（アール・アンド・ディー・システムズ社、エンドジェン社およびダイアグノスチックシステムズラボラトリーズ社によって入手可能）を用いたウエスタンブロットを使用して、ＩｇＧ融合タンパク質または多量体サイトカイン／増殖因子の発現についてスクリーニングすることができる。その後、ＩｇＧ融合タンパク質または多量体サイトカイン／増殖因子を発現するクローンは、保存され、そしてＫａｕｆｍａｎ（１９９０）によって記載されるとおり薬剤濃度を増加するときに、ＭＴＸ耐性についての複数経路の選択に付すことができる。各経路のＭＴＸ選択の後、個々のクローンは、ＩｇＧ融合タンパク質または多量体サイトカイン／増殖因子の発現について試験することができる。これらの操作は、文献に十分に記載され、そしてＣＨＯ細胞での多様な異種タンパク質を発現するために使用されてきた（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０で検討された）。
【０１６９】
ＩｇＧ融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞の調節培地から精製されることができる。遠心分離によるＣＨＯ細胞の除去の後、ＩｇＧ融合タンパク質は、実施例２に記載されるものと類似のプロトコールを用いてプロテインＡアフニティーカラムクロマトグラフィーによって上清から精製され、続いて必要とされる場合、さらなるクロマトグラフィー工程に付すことができる。二量体ＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−ＣH融合体は、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製して、単量体および凝集物を除去することができる。さらなるカラムクロマトグラフィー工程としては、ブルーセファロース（Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ヒドロキシアパタイト、逆相、疎水性相互作用、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。これらの手法は、当業者に周知である。
【０１７０】
多量体サイトカイン／増殖因子およびサイトカイン／増殖因子軽鎖定常部融合体は、ＣＨＯ細胞の調節培地からも精製されることができる。遠心分離によるＣＨＯ細胞の除去後、多量体サイトカイン／増殖因子およびサイトカイン／増殖因子軽鎖定常部融合体は、当業者に周知の手法を用いて、カラムクロマトグラフィーにより上清から精製することができる。これらのカラムクロマトグラフィー工程としては、ブルーセファロース、ヒドロキシアパタイト、逆相、疎水性相互作用、サイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。タンパク質は、サイトカイン／増殖因子または軽鎖定常部に特異的なモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによっても精製することができる。
【０１７１】
【表１３】
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本発明の種々の実施形態を詳細に説明したが、上記の実施形態の改変および適応が当業者に思い浮かぶことは明白である。しかしながら、そのような改変および適応が本発明の範囲内にあることは明らかに理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】部分的重複（ヒンジ領域の部分）を共有する２つのＤＮＡ断片（ＣＨ１−ヒンジおよびヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のＰＣＲを用いた増幅と、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む大きなＤＮＡ断片を生成するためのオリゴヌクレオチドプライマーａおよびｂとを示す略図。
【図１】
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