(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジベレリンＡ３を含むジベレリンの調製のためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
（ａ）発酵ブロスにおいて、ジベレリン産生微生物株をインキュベートする工程；
（ｂ）該発酵ブロスのｐＨを、ｐＨ６．５〜７．０に調節し、そして濾過して、微生物菌糸体の濾過ケーキおよび濾液を得る工程；
（ｃ）該濾過ケーキを水で洗浄し、そして該洗浄液を該濾液と合わせて、水溶液を形成する工程；
（ｄ）該水溶液を濃縮する工程；
（ｅ）５〜１０℃の温度で、該水溶液を有機溶媒と混合し、そして該混合物のｐＨを、２．０未満に調節する工程；
（ｆ）該混合物を水相および第一の有機相に分離し、そして該第一の有機相を除去する工程；
（ｇ）工程（ｆ）の水相を、有機溶媒を用いて再抽出して、第二の有機相を得る工程；
（ｈ）該第一の有機相および第二の有機相を合わせ、そして濃縮して、濃縮有機溶液を形成する工程；
（ｉ）該濃縮有機溶液を、攪拌しながら３〜４時間にわたって、固形物の沈殿が止まるまで、６０〜７０℃にて加熱する工程；
（ｊ）該濃縮有機溶液を室温まで冷却し、そして濾過して沈殿物を得る工程；
（ｋ）該沈殿物を冷有機溶媒で洗浄し、そして乾燥して、約８０％のジベレリンＡ３、約４％のジベレリンＡ４および約４％のジベレリンＡ７を含むオフホワイトの固体を得る工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ｌ）３２．６％のメタノール、２．２％の水および６５．２％のアセトンの混合物中に、前記オフホワイトの固体を溶解して、ジベレリン溶液を得る工程；
（ｍ）該ジベレリン溶液を、有機溶媒と水との１０：１混合物で希釈する工程；
（ｎ）該希釈したジベレリン溶液を濾過し、そして該濾液を真空エバポレーションによって濃縮する工程；
（ｏ）該濃縮物を、攪拌しながら、２〜３時間にわたって、６０〜８０℃の温度で加熱し、室温まで冷却し、そして濾過して、固体結晶性沈殿物を得る工程；
（ｐ）該沈殿物を冷有機溶媒で洗浄し、そして乾燥してジベレリンＡ３結晶を得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
【請求項３】
前記ジベレリン産生微生物株が、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記工程（ｄ）および（ｈ）の溶液の濃縮が、真空エバポレーションを用いて達成される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記有機溶媒が酢酸エチルである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記有機溶媒が酢酸エチルである、請求項２に記載のプロセス。
【請求項７】
請求項２に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ｑ）前記ジベレリンＡ３をメタノール中に溶解する工程；
（ｒ）該ジベレリン溶液を、等モルのＮａＨＣＯ３水溶液に添加する工程；
（ｓ）該混合された溶液を乾燥するまでエバポレートして、固体残渣を得る工程；
（ｔ）該残渣を水中に溶解し、そして凍結乾燥して、ジベレリンＡ３ナトリウム塩を得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
【請求項８】
請求項７に記載のプロセスであって、
水中に前記ジベレリンＡ３ナトリウム塩を溶解する工程、
該溶液を、亜鉛イオン交換樹脂をロードしたカラムに通過させる工程、
該カラムを水で洗浄する工程、
該流出液および洗浄液を収集し、そして合わせる工程、ならびに
水を除去して、ジベレリンＡ３亜鉛塩を得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項２に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ｑ）アセトンの水に対する、５０：１の比率の混合物中に、ジベレリンＡ３を溶解する工程；
（ｒ）該ジベレリンＡ３溶液を、等モル量のトリエチルアミンおよびクロロ蟻酸エチル、ならびに１／１０モル量のＮ−メチルモルホリンと混合し、そして−１５℃で２０分間攪拌する工程；
（ｓ）該得られた混合物を無水エタノールで希釈し、そして室温で攪拌する工程；
（ｔ）該希釈した混合物を乾燥するまでエバポレートし、そして６：１の比で、酢酸エチルと水との間で残渣を分配する工程；
（ｕ）該酢酸エチル層を分離し、次いで２％ＨＣｌで洗浄し、次いで水で洗浄し、次いで５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次いで水で洗浄し、そして減圧下で乾燥するまでエバポレートして、ジベレリンＡ３エチルエステルを得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病、その合併症および関連する状態（肥満、微小血管疾患および大血管疾患（ｍｉｃｒｏ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、ネフロパシー、ニューロパシー、眼疾患、糖尿病性潰瘍などが挙げられる）の処置のための式（１）の化合物（ジベレリン）およびそれらの誘導体の使用、ならびにこれらの状態の処置に関する薬学的組成物または医薬の調製のためにこれらの使用に関する。本発明は、血清グルコースレベルおよび他の生理学的状態の正常化を生じる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、糖尿病および関連する疾患の処置のための薬学的組成物の調製のための、ジベレリンとして公知の化合物およびこれらの誘導体の群の適用、ならびにジベレリンおよび／またはこれらの薬学的に受容可能な塩もしくはエステル（グリコシドエステル、活性エステルまたはラクトンが挙げられる）を投与することによる、これらおよび他の状態の処置法、の適用に関する。さらに、本発明は、糖尿病および関連する状態を処置するための医薬の製造およびその使用に関する。さらに、特に、経口的に、注入によって、経皮パッチによって、または吸入によって投与される場合、ジベレリンおよびこれらの誘導体の適用は、インスリン処置および／またはそのフラグメント誘導体処置および／またはＩＧＦ（インスリン様成長因子）処置の代用として、あるいはインスリン、そのフラグメント誘導体、ＩＧＦ、成長因子または糖尿病および関連する状態の処置のための他の薬学的に適合性の抗糖尿病剤との組み合わせ処置の１つの選択肢として使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、獣医薬およびヒト医薬中のジベレリンの新規の適用に関する。特に、本発明は、ジベレリンを含む薬学的処方物、ならびにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病ならびにこれらの合併症ならびに関連する状態（肥満、微小血管疾患および大血管疾患、ネフロパシー、ニューロパシー、眼疾患、糖尿病性潰瘍などが挙げられる）の処置のためのこれらの使用に関する。
【０００４】
ジベレリンは、一連の天然に存在する化合物であり、この化合物は、植物界において広い適用を有する植物成長制御因子として公知である［１］。これらはまた、いくつかの微生物（例えば、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）の代謝物から単離される［２］。ジベレリン（特に、ジベレリン酸（ジベレリンＡ３）、およびそのジベレリンＡ４および／またはジベレリンＡ７との混合物（これらは市販される））は、いくつかの果物（苺および葡萄）および野菜（トマト、キャベツおよびカリフラワー）の成長を促進するために農学に広範に適用され、オオムギの麦芽処理における食品添加物としてもまた適用される［３］。
［１］．
Ｊ．ＭａｃＭｉｌｌｉａｎら、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  Ｆｒｏｍ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ」．Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ  ２８，１８−２４，（１９６１）．
［２］．
（ａ）Ｐ．Ｊ．Ｃｕｒｔｉｓら、Ｃｈｅｍ．＆  Ｉｎｄ．（Ｌｏｎｄｏｎ）１０６６，（１９５４）．
（ｂ）Ｂ．Ｅ．Ｃｒｏｓｓ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４６７０，（１９５４）．
（ｃ）Ｐ．Ｗ．Ｂｒｉａｎら、米国特許第２，８４２，０５１号．
（ｄ）Ｃ．Ｔ．Ｃａｌａｍら、米国特許第２，９５０，２８８号．
（ｅ）Ａ．Ｊ．Ｂｉｒｃｈら、米国特許第２，９７７，２８５．
［３］．
（ａ）Ｍ．Ｄｅｖｌｉｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，（１９６６）．
（ｂ）Ｐ．Ｗ．Ｂｒｉａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，５，６６９（１９５５）．
（ｃ）Ａ．Ｋ  Ｍｅｈｔａら、Ｊ．Ｈｏｓｔｉｃ  Ｓｃｉ  ４，１６７（１９７５）．
（ｄ）Ｒ．Ｊ．Ｗｅａｖｏｒ，Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ  ２８，８９（１９６１）．
（ｅ）Ｆ．Ｇ．Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ３５，５２１（１９６０）．
（ｆ）Ｆｅｄ．Ｒｅｇ．２５，２１６２（１９６０）。
【０００５】
ジベレリンＡ３およびそのジベレリンＡ４および／またはジベレリンＡ７との混合物は、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉのような微生物の発酵によって得られ得る。粗化合物が、単離および精製され、高純度の結晶性生成物が得られ得る。ジベレリンの他の誘導体は、ジベレリンＡ３からの半合成経路または十分に記載される全合成のいずれかによって得られ得る［４］。
［４］．
（ａ）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１２，４４２６，明細書中に引用される文献。
（ｂ）Ｆｕｒｂｅｒ  Ｍ．ら、「Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｆｒｏｍ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ  ｔｏ  Ａｕｔｈｅｒｉｄｉｏｇｅｎｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｅｒｎ  Ｇｅｎｕｓ  Ａｎｅｍｉａ」，Ｊ．ｏｆ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第５５巻，第１５号，４８６０−４８７０（１９９０）．
（ｃ）Ｍａｎｄｅｒ  Ｌ．Ｎ．ら、「Ｃ−１８  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ」，Ｊ．Ｃ．Ｓ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１（１７），２８９３−２８９４（２０００）．
（ｄ）Ｐｏｕｒ  Ｍ．ら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ３，１２−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−９，１５−Ｃｙｃｌｏ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４（４５），１３８３３−１３８５０（１９９８）．
（ｅ）Ｌｉｕ  Ｊ．Ｐ．ら、「Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ−１４  ｉｎ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １４−Ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  Ａｉ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４（３８），１１６３７−１１６５０（１９９８）．
（ｆ）Ｐｏｕｒ  Ｍ，ら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｎｏｖｅｌ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ」，Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０（２），３５１−３５４（１９９８）；「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−９，１５−Ｃｙｃｌｏ−Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３９（１４），１９９１−１９９４（１９９８）；Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０（４），２８９−２９９（１９９７）．
（ｇ）Ｋｉｎｇ  Ｇ．Ｒ．ら、「Ａ  Ｎｅｗ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  Ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ−Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ（＋／−）−ＧＡ１０３  ａｎｄ（＋／）−ＧＡ７３」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９（１６），３８２８−３８２９（１９９７）．
（ｈ）Ｍａｎｄｅｒ  Ｌ．Ｎ．，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｃ−２０−Ｇｉｅｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  Ａ３」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３（６），２１３７〜２１６２（１９９７）および本明細書中に引用される文献。
【０００６】
さらに、異なる植物、苗条、果実および種子由来の異なるジベレリンの抽出および単離はまた、広範に公開されている［５］。
［５］．
（ａ）Ｐｅａｒｃｅ  Ｄ．Ｗ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５９（６），６７９〜６８７（２００２）．
（ｂ）Ｃｈａｎｇ  Ｓ．Ｔ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１１２（３），４２９−４３２（２００１）．
（ｃ）Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７（５），７４９−７５８（２００１）；４８（４），５８７−５９３（１９９８）．
（ｄ）Ｂｌａｋｅ  Ｐ．Ｓ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５（８），８８７−８９０（２０００）；５３（４），５１９−５２８（２０００）．
（ｅ）Ｋｏｓｈｉｏｋａ  Ｍ．ら、Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６８（６），１１５８−１１６０（１９９９）；６７（６），８６６−８７１（１９９８）．
（ｆ）Ｍａｎｄｅｒ  Ｌ．Ｎ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（８），２１９５−２２０６（１９９８）；４９（６），１５０９〜１５１５（１９９８）．
（ｇ）Ｗｙｎｎｅ  Ｇ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（７），１８３７−１８４０（１９９８）．
ジベレリンは、抗炎症、前立腺炎および乾癬の処置、腫瘍の処置、ならびに潰瘍および創傷の回復のために以前に使用された［６］。
［６］．
（ａ）米国特許第４４２４２３２号  １／１９８４  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ
（ｂ）仏国特許第２５９７３３９号  １０／１９８７
（ｃ）米国特許第５４８７８９９号  １／１９９６  Ｄａｖｉｓ
（ｄ）米国特許第５５８０８５７号  １２／１９９６  Ｏｄｅｎ
（ｅ）豪州特許第６９５０５４号  １１／１９９８  Ｗｕ
（ｆ）米国特許第６１２１３１７号  ９／２０００  Ｗｕ
本発明者らは、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病ならびにこれらの関連する状態を含む糖尿病の処置のための、ジベレリンまたはその誘導体の適用をここで見出した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
ジベレリンが、哺乳動物の成長因子（例えば、ＩＧＦ、ＥＧＦ）様の特徴を保有することは、本出願人らの実験室においてここで見出された。
【０００８】
実験結果（実施例３および４）は、植物および微生物によって生成されたジベレリンが、ある範囲の成長因子レセプターに結合する広いスペクトルの結合因子として作用することを示唆する。これらは、動物において見出される成長因子とは異なり、これらの各々は、特定のレセプターに対して高い親和性を有する。これは、進化の結果である。植物および微生物の生物学的系は、より複雑な生命形態（例えば、動物）の物質よりもより広い（特異性がより低い）基体に作用する生物学的物質を産生する。
【０００９】
ジベレリンが成長因子よりも小さな分子であるので、ジベレリンの成長因子レセプターに対する結合は、おそらくより弱い。より低いレベルの成長因子の存在下で、ジベレリンは、細胞成長および他の機能を刺激する空の成長因子レセプターに結合する。この条件下で、ジベレリンは、成長因子の機能を果たす。成長因子の正常なレベルの存在下で、成長因子は、これらのレセプター部位に対する高い親和性に起因して、より迅速にこれらのレセプターに結合する。これらの成長因子の物理的なかさ高さは、ジベレリンが結合するレセプター部位に空間を残さないか、または非常に小さな空間しか残さない。このことは、十分な結合親和性を有する成長因子が十分量存在する場合、非効率的なジベレリンを生じる。この機構は、ＩＧＦを含む成長因子に対する基質または感作物質として作用するジベレリンについての、非常に良好なプロフィールを提供する。なぜなら、過剰のジベレリンの存在は、これらの成長因子の正常な機能に干渉しないからである。
【００１０】
真性糖尿病は、高血糖症ならびに変更された脂質代謝およびタンパク質代謝によって示される慢性障害である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに従うと、米国の１３００万人を超える人口が、糖尿病を罹患し、毎年６５０，０００の新規患者が同定される。インスリンおよびスルホニルウレアの導入は、真性糖尿病の処置における重要な目標を示す。インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、インスリンに対する構造相同性を有する分子は、その独自の特異的なレセプター（Ｉ型ＩＧＦレセプター）を有し、このレセプターを介して、インスリンと類似する種々の代謝効果を生じる。分子のインスリン用作用を担うヒト成長因子の活性領域の発見は、新規の抗糖尿病ペプチド剤の開発を導いた。さらに、成長因子は、細胞の複製、分化および代謝恒常を調節するポリペプチドである。これらは、ニューロンの成長および／または生存を増大する。糖尿病ニューロパシーを含む種々の神経学的障害の処置のための臨床前試験において、ＩＧＦ−２は、神経再生速度を増加する。さらに、ｃ−ＡＭＰの細胞内濃度の増加は、膵臓β細胞由来のグルコース依存性インスリン分泌を増強する。ジベレリンは、アデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸（ｇｒｙａｎｙｌａｔｅ）シクラーゼの活性を増加することが見出され、それによって、ｃ−ＡＭＰおよびｃ−ＧＭＰの細胞内濃度が、ジベレリンの投与によって増加し、次いで、膵臓β細胞からのグルコース依存性インスリン分泌を増強する。従って、ジベレリンは、糖尿病の処置における適用を有すると考えられ得る。
【００１１】
動物実験の結果（実施例５および６）は、５ｍｇ／ｋｇのジベレリンＡ３、またはＡ３とＡ４もしくはＡ７の混合物、で処置された糖尿病ラットは、これらのグルコースレベルおよびこれらの体重を正常に復帰したことを示した。ジベレリンは、糖尿病の処置において効果的でありえることを示した。
【００１２】
ジベレリンＡ３の哺乳動物に対する毒性は、極端に低い。ラットおよびマウスに対する急性経口ＬＤ５０は、それぞれ６．３ｇ／ｋｇ［７ａ］および＞１５ｇ／ｋｇ［７ｂ］であることが報告された。９０日の給餌試験において、ラットおよびイヌに対する無効化レベルは、１ｇ／ｋｇ／日より小さかった［７ｂ］。皮膚および眼に対して刺激性ではない［７ｂ］。発癌性の指示はなかった［７ｃ］。分類：ＷＨＯ毒性レベル表５（最小有害性クラス生成物、正常な使用において急性の有害性を示さないかもしれない）；ＥＰＡ毒性クラスＩＩＩ（２番目に最小の有害性分類）。
［７］．
（ａ）ＮＴＰ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，ｈｔｔｐ：／／ｎｔｐｓｅｒｖｅｒ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｄｏｃｓ／ＣＨＥＭ＿Ｈ  ＆  Ｓ／ＮＴＰ＿ＣＨＥＭ７／Ｒａｄｉａｎ７７−０６−５．ｈｔｍｌ
（ｂ）Ｔｈｅ  Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｕｇｕｓｔ  １９９１．
（ｃ）Ｇｏｌｄ  Ｌ．Ｓ．，Ｓｌｏｎｅ  Ｔ．Ｈ．，Ａｍｅｓ  Ｂ．Ｎ．（２００１），Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｉｓｋ：Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，第２版（Ｒ．Ｋｒｉｅｇｅｒ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．
従って、本発明の局面は、糖尿病およびその合併症ならびに関連する状態（肥満、微小血管疾患および大血管疾患、ネフロパシー、ニューロパシー、眼疾患、糖尿病性潰瘍などが挙げられる）の処置のための式（１）の化合物（ジベレリン）またはこれらの誘導体の使用に関する。本発明の別の局面において、糖尿病および関連する状態（肥満、微小血管疾患および大血管疾患、ネフロパシー、ニューロパシー、眼疾患、糖尿病性潰瘍などが挙げられる）の処置のための薬学的調製物、ジベレリンを含有する前記薬学的調製物、および／またはこれらの薬学的に受容可能な塩もしくはエステルが提供される。
【００１３】
ジベレリンは以下の式を有し：
【００１４】
【化２】
0004885989.tif 000002
式（１）
ここで、Ｒ１は、Ｈまたは−Ｏ−Ｒ２０基であり、ここで、Ｒ２０は、Ｈ、グリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であり、Ｃ１−６アルキル基であるか、またはＲ１は、Ｒ２またはＲ１０と一緒になって、結合（それぞれ、Ｃ１−Ｃ２二重結合またはＣ１−Ｃ１０二重結合）を形成し；
Ｒ２は、Ｈまたは−Ｏ−Ｒ２１であり、ここでＲ２１は、Ｈ、グリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）、またはＲ４と一緒になって結合（ラクトン）を形成するか、あるいは、
Ｒ２は、Ｒ１またはＲ３と一緒になって結合（それぞれ、Ｃ１−Ｃ２二重結合またはＣ２−Ｃ３二重結合）を形成し；
Ｒ３は、Ｈ、＝Ｏ、または−Ｏ−Ｒ２２であり、ここでＲ２２は、Ｈまたはグリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であるか、あるいはＲ３は、Ｒ２と一緒になって結合（Ｃ２−Ｃ３二重結合）を形成し；
Ｒ４は、ＯＨ、または−ＯＲ２３であり、ここでＲ２３は、非置換または置換された、Ｃ１−２０アルキル、アリル、アリール、アリールアルキル、アミジン、−Ｎ２４Ｒ２５あるいは窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む不飽和環または飽和環であり；Ｒ２４およびＲ２５は、同じであってもなくてもよく、水素またはＣ１−２０アルキル、アリル、アリール、アリールアルキルあるいは窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む不飽和環または飽和環であり；あるいは
Ｒ４は、Ｒ２１またはＲ２８と一緒になって結合（ラクトン）を形成し；
Ｒ５は、Ｈまたはグリコシルエステル（グリコシドエステル）基であるか、あるいは非置換または置換された（例えば、ハロゲン化された）Ｃ１−２０アルキルエステル、アリルエステル、アリールエステル、アリールアルキルエステル、活性エステル（例えば、フェナシルエステル、ピバロイルエステル）であり；
Ｒ６は、ＨまたはＯＨであるか、あるいはＲ７と一緒になって結合（Ｃ１１−Ｃ１２二重結合）を形成し；
Ｒ７は、Ｈ、＝Ｏ、または−ＯＲ２６であり、ここで、Ｒ２６は、Ｈまたはグリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であるか、あるいはＲ７は、Ｒ６と一緒になって結合（Ｃ１１−Ｃ１２二重結合）を形成し；
Ｒ８は、Ｈ、ヒドロキシル、メルカプタン、またはハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ）、アミノ、アジド、ＮＲ２４Ｒ２５であるか、不飽和または飽和（例えば、ハロゲン化）Ｃ１−２０アルキル、アリル、アリール、アリールアルキル、アミジン、または−ＯＲ２７であり、ここでＲ２７は、グリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であり；
Ｒ９は、ＨまたはＯＨであるか、あるいはＲ１５と一緒になって結合（Ｃ９−Ｃ１５結合）を形成し；
Ｒ１０は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、または前記ＣＯＯＨ、ＣＨ２Ｏ−Ｒ２８もしくは−ＯＲ２８のグリコシルエステル（グリコシドエステル）であり、ここでＲ２８は、Ｈであるか、またはＲ４と一緒になって結合（ラクトン）を形成するか、あるいはＲ１０は、Ｒ１と一緒になって結合（Ｃ１−Ｃ１０二重結合）を形成し；
Ｒ１１は、ＨまたはＯＨであるか、あるいは存在せず；
Ｒ１２は、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨまたは前記ＣＯＯＨのグリコシルエステル（グリコシドエステル）であり；
Ｒ１３は、メチレン、または二価へテロ原子、またはＮＲ２９であり、ここでＲ２９は、ＮＨＲ３０またはＯＲ３０であり、ここでＲ３０は、ＨまたはＣ１−２０アルキル、アリール、アルキルアリールであり；そして二重結合が、Ｒ１１が存在しない場合に、Ｃ１６とＲ１３との間に存在するか；あるいは
Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３ＣＨＯ、ＣＨ２Ｘであり、ここでＸは、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ）であり；ＣＨＮＲ２９、ここでＲ２９
は、ＮＨＲ３０またはＯＲ３０であり、ここでＲ３０は、Ｈであるか、またはＲ１１がＨまたはＯＨである場合、Ｃ１−２０アルキル、アリール、アルキルアリールであり；但し、Ｒ１１がＯＨである場合、Ｒ１３はＯＨではなく；
Ｒ１４は、ＨまたはＯＨであり；
Ｒ１５は、ＨであるかまたはＲ９と一緒になって結合（Ｃ９−Ｃ１５結合）を形成し；
薬学的に受容可能な誘導体（式（１）の化合物のラクトン、エステルおよび塩を含む）としては、アルカリ金属塩（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋）、アルカリ土類金属塩（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）、金属塩（例えば、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋）、およびアンモニウム塩、これらの有機塩基（例えば、リドカイン、またはＮＲ１６Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９、ここでＲ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は、同じであっても同じでなくてもよく、水素、Ｃ１−２０アルキル、アルカノール、アリール）が挙げられる。
【００１５】
実線と並んだ点線は、二重結合が点線と実線とで連結された３つの炭素原子の２つの間に位置し得ることを示し；但し、二重結合は、Ｒ１１がＯＨ基である場合には存在しない。
【００１６】
式（１）は、通常の原子価則を満たすので、これは、以下のようなさらなる条件を導く：
Ｒ１とＲ２は、Ｒ１０とＲ１および／またはＲ２とＲ３が結合を形成する場合、結合を形成し得ず；Ｒ１０とＲ２３が結合を形成する場合、Ｒ１０とＲ１は、結合を形成し得ず；
Ｒ２とＲ１またはＲ２とＲ３は、Ｒ４とＲ２１が結合を形成する場合、結合を形成し得ない。
【００１７】
ジベレリンＡ３の場合において、Ｒ１は、Ｒ２と一緒になって結合（Ｃ１−Ｃ２二重結合）を形成し；Ｒ３はβ−ＯＨであり、Ｒ４は、Ｒ２８と一緒になって、結合（ラクトン）を形成し；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ９は、水素であり、Ｒ８は、ＯＨであり、Ｒ１１は、存在せず；Ｒ１２は、メチルであり；Ｒ１３は、メチレンであり、二重結合がＣ１６とＲ１３との間に存在し；Ｒ１４およびＲ１５は水素である。
【００１８】
最も容易に入手可能なジベレリンは、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの発酵由来の、ジベレリンＡ３およびそのジベレリンＡ４および／またはジベレリンＡ７との混合物である。溶媒抽出およびクロマトグラフィーを含む、ジベレリンの単離および精製方法が、本発明の背景において記載されるように公開されているにも関わらず、単離および精製のための単純かつ効率的なプロセスは、なお必要とされる。本発明において、ジベレリンＡ３の大スケール産生のための実用的なプロセスが提供され、このプロセスは、ジベレリンの濃度が約３０００μｇ／ブロス１ｍｌに到達するまで、発酵ブロス中で微生物のジベレリン産生株をインキュベートする工程、続いて以下の工程を包含する：
（ａ）発酵ブロスのｐＨをｐＨ６．５〜７．０に調整し、濾過し、微生物菌体の濾過ケーキを得、濾液を得る工程；
（ｂ）濾過ケーキを水で洗浄し、洗浄液を濾液と合わせ、水溶液を形成する工程；
（ｃ）この水溶液を濃縮する工程；
（ｄ）この水溶液を５〜１０℃の温度で有機溶媒と混合し、この混合物のｐＨを２．０未満に調整する工程；
（ｅ）この混合物を水層と第１有機層とに分配させ、第１有機層を除去する工程；
（ｆ）水層を工程（ｆ）からの水層を有機溶媒を用いて再抽出し、第２の有機層を得る工程；
（ｇ）第１および第２の有機層をあわせ、濃縮し、濃縮有機溶液を形成する工程；
（ｈ）固体物質の沈殿がなくなるまで、攪拌しながら、６０〜７０℃で３〜４時間、濃縮有機溶液を加熱する工程；
（ｉ）濃縮有機溶液を室温まで冷却し、濾過し、沈殿物を得る工程；
（ｊ）沈潜物を冷有機溶媒中で洗浄し、乾燥し、約８０％ジベレリンＡ３、約４％ジベレリンＡ４および約４％ジベレリンＡ７を含有する、オフホワイト固体を得る工程。
【００１９】
必要に応じて、本発明は、以下の工程をさらに包含する：
（ｋ）３２．６％メタノール、２．２％水および６５．２％アセトンの混合物中にオフホワイト固体を溶解し、ジベレリン溶液を得る工程；
（ｌ）このジベレリン溶液を有機溶媒と水の１０：１混合物で希釈する工程；
（ｍ）この希釈されたジベレリン溶液を濾過し、真空エバポレーションによって濾液を濃縮する工程；
（ｎ）この濃縮物を、攪拌しながら、６０〜８０℃の温度で２〜３時間加熱し、室温まで冷却し、濾過し、固体の結晶性沈殿物を得る工程；
この沈殿を冷酢酸エチルで洗浄し、乾燥し、９５％を超える純度でジベレリン結晶を得る工程。
【００２０】
さらに、ジベレリン塩およびエステルの調製のためのプロセスが、開示される。特に、本発明は、ジベレリンのナトリウム塩を得るためのプロセスを含み、このプロセスは、以下の工程を包含する：
（ａ）ジベレリンＡ３をメタノール中に溶解する工程；
（ｂ）ジベレリン溶液を、等モルのＮａＨＣＯ３の水溶液に添加する工程；
（ｃ）混合溶液を、乾燥状態にエバポレートし、固体残渣を得る工程；
（ｄ）この残渣を水中に溶解し、凍結乾燥し、ジベレリンＡ３のナトリウム塩を得る工程。
【００２１】
本発明は、ジベレリンの亜鉛塩を得るためのプロセスをさらに包含し、このプロセスは、以下のさらなる工程を包含する：ジベレリンＡ３のナトリウム塩を水中に溶解する工程、この溶液を亜鉛イオン交換樹脂を充填したカラムを通す工程、このカラムを水で洗浄する工程、溶出液および洗浄液を回収し合わせる工程、ならびに水を除去し、ジベレリンＡ３の亜鉛塩を得る工程。
【００２２】
本発明は、ジベレリンのエチルエステルを得るためのプロセスをさらに包含し、このプロセスは、以下の工程を包含する：
（ａ）ジベレリンＡ３を、アセトンと水の５０：１比の混合物中に溶解する工程；
（ｂ）ジベレリンＡ３溶液を、当量のトリエチルアミンおよびエチルクロロホルメート、ならびに１０分の１量のＮ−メチルモルホリンと混合し、−１５℃で２０分間攪拌する工程；
（ｃ）得られた混合物を、無水エタノールで希釈し、室温で攪拌する工程；
（ｄ）この希釈混合物を乾燥状態までエバポレートし、この残渣を６：１比の酢酸エチルと水との間で分配する工程；
（ｅ）酢酸エチル層を分け、２％ＨＣｌ、次いで、水、次いで、５％ＮａＨＣＯ３、次いで、水で洗浄し、そして減圧下で乾燥状態までエバポレートし、ジベレリンＡ３エチルエステルを得る工程。
【００２３】
本明細書以下での式（１）の化合物の参照は、式（１）の化合物および薬学的に受容可能な誘導体（その塩、エステルおよびラクトン）を含む。
【００２４】
式（１）の化合物の薬学的に受容可能な組成物はまた、式（１）の化合物と１種類以上の他の活性成分（例えば、インスリン、インスリン様ポリペプチド、インスリンフラグメント、ＩＧＦ、ＩＧＦフラグメント、増殖因子、または糖尿病および関連する状態を処置するための他の薬学的に適合性の抗糖尿病剤）とを合わせることによって形成され得る。
【００２５】
式（１）の化合物は、インスリンおよびインスリン様アゴニストおよび／または糖尿病、その合併症および関連する状態（肥満、微小血管疾患および大血管疾患、ネフロパシー、ニューロパシー、眼疾患、糖尿病性潰瘍などを含む）の処置のための増感物質としての活性を有する。従って、本発明のさらなる局面において、糖尿病および関連する状態の処置において活性治療薬として用いるための式（１）の化合物が提供される。
【００２６】
本発明のさらなる局面において、薬学的組成物を製造する方法が提供され、この方法は、式（１）の化合物および／またはその誘導体を薬学的に受容可能なキャリアを合わせる工程を包含する。
【００２７】
本発明のさらなる局面において、動物（ヒトを含む）における糖尿病および関連する状態を処置するための方法が提供され、この方法は、有効量の式（１）の化合物を投与する工程を包含する。
【００２８】
本発明のさらなる局面において、糖尿病および関連する状態の処置のため薬学的組成物を製造するための式（１）の化合物の使用がまた、提供される。
【００２９】
糖尿病および関連する状態の処置において使用するために必要とされる式（１）の化合物の量は、投与速度、処置する状態の性質ならびに動物（ヒト患者を含む）の年齢および状態に伴って変化し、最終的には、付き添いの獣医または医者の裁量である。
【００３０】
一般に、適切な用量は、１日あたり、０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは５０μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【００３１】
処置は、好ましくは、糖尿病の発症後または発症時に開始し、必要であれば継続する。予防処置として式（１）の化合物を使用することもまた、可能である。
【００３２】
適切な処置を、毎日１〜４回与え、必要であれば継続する。あるいは、時間放出処方を用いる場合、この処置は、２日〜１週間に１回与えられ得る。
【００３３】
所望の用量は、単回用量で提示され得るか、または適切な間隔で投与され得る、分割された用量（例えば、１日当り２サブ用量、３サブ用量、４サブ用量またはさらに多くのサブ用量）として提示され得る。
【００３４】
式（１）の化合物は、単位用量形態（例えば、単位用量形態あたり０．１ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分を含む）で、都合よく投与される。治療において用いるために、式（１）の化合物を未加工の化学物質として投与することが可能であるが、活性成分を、薬学的処方物として提供することが好ましい。
【００３５】
従って、本発明は、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア、ならびに必要に応じて他の治療的成分および／または予防的成分とともに、式（１）の化合物またはそれらの薬学的に受容可能な誘導体を含む薬学的処方物さらに提供する。これらのキャリアは、処方物の他の成分と適合性であり、そしてその時レシピエントに対して有害でないという意味で、「受容可能」でなければならない。
【００３６】
薬学的処方物としては、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所的投与（頬投与および舌下投与を含む）、膣内投与または非経口投与（筋肉内投与、頬皮内投与、皮下投与および静脈内投与を含む）に適切な処方物あるいは胃腸管への投与に適した形態の処方物、または気道（鼻孔を含む）への投与に適した形態（例えば、吸入またはガス注入または皮内移植または皮下移植のためかあるいは経皮的パッチのため）の症物が挙げられる。この処方物は、適切な場合、分割した用量単位で、都合よく存在し得、そして薬学の分野で公知のいずれかの方法で調製され得る。全ての方法は、活性化合物を液体キャリアまたは微細に砕かれた固体キャリアまたはその両方との会合させ、次いで、必要であれば、生成物を所望の処方物の形状にする工程を包含する。
【００３７】
経口投与に適した薬学的処方物は、個別の単位（例えば、各々所定の量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤または錠剤）として；粉末または顆粒として；溶液、懸濁液またはエマルジョンとして提供され得る。活性成分はまた、ボーラス舐剤またはペーストとして提供され得る。経口投与のためのカプセルおよび錠剤は、従来の賦形剤（例えば、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤、または加湿剤）を含み得る。錠剤は、当該分野で周知の方法に従って、コーティングされ得る。経口液体調製物は、例えば、水性懸濁液または油性懸濁液、水溶液または油溶液、水性エマルジョンまたは油性エマルジョン、水性シロップまたは油性シロップならびに水性エリキシルまたは油性エリキシルの形態であっても、使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提供されても良い。このような液体調製物は、従来の添加剤（例えば、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、または保存剤）を含み得る。
【００３８】
式（１）の化合物はまた、非経口投与（例えば、注射（例えば、ボーラス注射または継続的注入）による）のために処方され得、そしてアンプル中、予め充填したシリンジ中、少量注入中または複数回用量容器中に、添加された保存剤と共に、単位投薬形態で提示され得る。この組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態を取り得、そして処方剤（例えば、懸濁剤、安定剤および／または分散剤）を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌した発熱物質を含まない水）を用いて構成するための粉末形態であり得、これは、滅菌固形物の無菌的単離または溶液からの凍結乾燥によって得られる。
【００３９】
表皮への局所的な投与のために、式（１）の化合物を、軟膏、クリームまたはローションとして、あるいは経皮的パッチとして処方し得る。軟膏およびクリームは、例えば、適切な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して、水性基剤または油性基剤を用いて処方され得る。ローションは、水性ベースまたは油性ベースで処方され得、一般に１つ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、または着色剤もまた含む。
【００４０】
口内への局所的な投与のために、式（１）の化合物は、風味基剤（通常は、スクロースおよびアカシアまたはトラガント）中に活性成分を含むロゼンジ；不活性基剤中に基剤成分（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア）を含む香錠；および適切な液体キャリア中に活性成分を含むうがい薬として処方され得る。
【００４１】
膣内投与のために、これらの処方物は、活性成分に加えて、適切であることが当該分野で公知のキャリアを含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体またはスプレーとして提供され得る。
【００４２】
直腸投与のために、キャリアが固形物である単位用量坐薬が好ましい。適切なキャリアとしては、ココアバターまたは当該分野で一般的に使われる他の物質が挙げられ、この坐薬は、軟化キャリアまたは融解キャリアとの活性化合物の混合、その後の冷却および成型により成形によって都合よく形成され得る。
【００４３】
気道に投与（鼻孔内投与を含む）のために、式（１）の化合物は、気道への投与のために当該分野で用いられる任意の方法および任意の処方によって投与され得る。
【００４４】
したがって、一般に、式（１）の化合物は、溶液形態または懸濁液形態で、あるいは乾燥粉末として投与され得る。
【００４５】
溶液および懸濁液は、好ましくは、水性（例えば、水（例えば、滅菌水または発熱物質なしの水）のみで調製されるか、または水および生理学的に受容可能な共溶媒（例えば、エタノール、プロピレン、グリコール、およびポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ  ４００））で調製される。
【００４６】
さらに、このような溶液または懸濁液は、他の賦形剤（例えば、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム）、可溶化剤／界面活性剤（例えば、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ  ８０、塩化ベンザルコニウム））、緩衝剤、等張性調節剤（例えば、塩化ナトリウム）、吸収促進剤および増粘剤）を含み得る。懸濁液は、さらに、懸濁剤（例えば、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）を含みうる。
【００４７】
溶液または懸濁液は、従来の手段（例えば、点滴、ピペットまたはスプレー）で、鼻孔に直接適用される。これらの処方物は、単回用量形態または複数回用量形態で提供され得る。後者の場合、望ましくは、用量計の手段が提供される。点滴またはピペットの場合、これは適切な所定容量の溶液または懸濁液を患者に投与することよって達成され得る。スプレーの場合、これは例えば、計測噴霧スプレーポンプによって達成され得る。
【００４８】
エアロゾル処方物はまた、気道投与のために用いられ得、ここで、式（１）の化合物は、適切な噴霧剤（例えば、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、またはジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体））を用いた加圧パックで提供される。このエアロゾルはまた、界面活性剤（例えば、レシチン）を都合よく含み得る。薬物の用量は、計測バルブの設置により制御され得る。
【００４９】
あるいは、式（１）の化合物は、乾燥粉末形態（例えば、適切な粉末基剤（例えば、ラクトース、デンプン、デンプン誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）およびポリビニルピロリジン（ｐｏｌｙｂｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｉｎｅ）（ＰＶＰ））中の化合物の粉末混合物）で提供され得る。従来、この粉末キャリアは、鼻孔中にゲルを形成する。この粉末組成物は、この粉末が、吸入によって投与され得る単位用量形態（例えば、（例えば、ゼラチンまたはブリスターパックの）カプセルまたはカートリッジ）で提供され得る。
【００５０】
気道への投与を意図する処方物（鼻腔内処方物を含む）において、一般に、この化合物は、小さな粒子サイズ（例えば、５ミクロン以下のオーダー）を有する。そのような粒子サイズは、当該分野に公知の手段（例えば、微粉化）によって得られ得る。
【００５１】
胃腸管に投与するために、式（１）の化合物または薬学的に受容可能な誘導体が、胃腸管への投与のために当該分野で用いられる任意の方法および処方により投与され得る。
【００５２】
所望される場合、活性成分の持続的な放出を与えるために適合された処方物が用いられ得る。
【００５３】
式（１）の化合物はまた、他の治療剤（例えば、抗糖尿病剤（例えば、インスリン、ＩＧＦ）、または鎮痛薬（ａｎａｌｇｅｓｉｃ）、抗高血圧薬、鎮静薬、催眠薬、脂質低下薬、抗感染剤など）との組合せで用いられ得る。したがって、本発明は、さらなる局面において、別の治療的に活性な薬剤とともに、式（１）の化合物またはその薬学的に受容可能な誘導体を含む組合せを提供する。
【００５４】
上記の組み合わせは、薬学的な処方物の形態で用いるために、都合よく提供され得、従って、薬学的に受容可能なキャリアとともに、上記のような組み合わせを含むそのような処方物は、従って、本発明のさらなる局面を構成する。
【００５５】
そのような組み合わせの個々の成分が、分けられたまたは合わされた薬学的処方物で、連続的または同時のいずれかで投与され得る。
【００５６】
式（１）の化合物を、糖尿病および関連する状態の処置において活性な、第２の治療的剤とともに使用する場合、使用される各化合物の用量は、各化合物を単独で用いる場合と同じであるか、または異なるかのいずれかであり得る。適切な用量が、当業者によって容易に理解される。
【００５７】
式（１）の化合物およびそれらの薬学的に受容可能な誘導体が、類似構造の化合物を調製するために当該分野で公知の任意の方法で調製され得る。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
糖尿病およびその合併症および関連する状態についての処置方法であって、式（１）の化合物（ジベレリン）：
【００５８】
【化１】
0004885989.tif 000003
ならびに／または、そのラクトン、グリコシド、エステル、活性エステルおよび塩を含む薬学的に受容可能な誘導体を、そのような処置を必要とする患者に施す工程を包含し、ここで、
Ｒ１は、Ｈまたは基−Ｏ−Ｒ２０であり、ここで、Ｒ２０は、Ｈ、グリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）、Ｃ１〜６アルキル基であるか、あるいはＲ１は、Ｒ２またはＲ１０と一緒になって、結合（それぞれ、Ｃ１−Ｃ２二重結合またはＣ１−Ｃ１０二重結合）を形成し、
Ｒ２は、Ｈまたは基−Ｏ−Ｒ２１であり、ここで、Ｒ２１は、Ｈ、グリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であるか、あるいはＲ４と一緒になって、結合を形成するか（ラクトン）、あるいはＲ２は、Ｒ１またはＲ３と一緒になって、結合（それぞれ、Ｃ１−Ｃ２二重結合またはＣ２−Ｃ３二重結合）を形成し、
Ｒ３は、Ｈ、＝Ｏまたは−Ｏ−Ｒ２２であり、ここで、Ｒ２２は、Ｈまたはグリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であるか、あるいはＲ３はＲ２と一緒になって結合（Ｃ２−Ｃ３二重結合）を形成し；
Ｒ４は、ＯＨまたは−ＯＲ２３であり、ここで、Ｒ２３は、非置換もしくは置換の、Ｃ１〜２０アルキル、アリル、アリール、アリールアルキル、アミジン、−ＮＲ２４Ｒ２５、または窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される１個以上のヘテロ原子を含む、不飽和もしくは飽和環であり；Ｒ２４およびＲ２５は、同じでも異なってもよく、水素、もしくはＣ１〜Ｃ２０アルキル、アリル、アリール、アリールアルキル、または窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される１個以上のヘテロ原子を含む、不飽和もしくは飽和環であるか；あるいはＲ４は、Ｒ２１またはＲ２８と一緒になって結合を形成し（ラクトン）；
Ｒ５は、Ｈまたはグリコシルエステル（グリコシドエステル）基、または非置換もしくは置換のＣ１〜２０アルキルエステル、アリルエステル、アリールエステル、アリールアルキルエステル、活性エステルであり；
Ｒ６は、ＨまたはＯＨであるか、あるいはＲ７と一緒になって結合（Ｃ１１−Ｃ１２二重結合）を形成し；
Ｒ７は、Ｈ、＝Ｏまたは−ＯＲ２６であり、ここで、Ｒ２６は、Ｈまたはグリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であるか、あるいはＲ７は、Ｒ６と一緒になって、結合（Ｃ１１−Ｃ１２二重結合）を形成し；
Ｒ８は、Ｈ、ヒドロキシル、メルカプタン、またはハロゲン、アミノ、アジド、−ＮＲ２４Ｒ２５、非置換もしくは置換のＣ１〜２０アルキル、アリル、アリールもしくはアリールアルキル、または−ＯＲ２７であり、ここで、Ｒ２７は、グリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であり；
Ｒ９は、ＨまたはＯＨであるか、あるいは、Ｒ１５と一緒になって結合（Ｃ９−Ｃ１５結合）を形成し；
Ｒ１０は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨＯ、ＣＯＯＨもしくは当該ＣＯＯＨのグリコシルエステル（グリコシドエステル）、ＣＨ２Ｏ−Ｒ２８または−ＯＲ２８であり、ここで、Ｒ２８は、Ｈであるか、またはＲ４と一緒になって結合を形成するか（ラクトン）、あるいはＲ１０は、Ｒ１と一緒になって、結合（Ｃ１−Ｃ１０二重結合）を形成し；
Ｒ１１は、ＨもしくはＯＨであるか、または存在せず；
Ｒ１２は、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨもしくは当該ＣＯＯＨのグリコシルエステル（グリコシドエステル）であり；
Ｒ１３は、メチレンまたは二価ヘテロ原子またはＮＲ２９であり、ここで、Ｒ２９は、ＮＨＲ３０またはＯＲ３０であり、ここで、Ｒ３０は、Ｈ、またはＣ１〜２０アルキル、アリール、アルキルアリールであり；そしてＲ１１が存在しない場合には、二重結合がＣ１６とＲ１３との間に存在するか；あるいは、Ｒ１１がＨまたはＯＨである場合、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３ＣＨＯ、ＣＨ２Ｘ（ここで、Ｘはハロゲンである）、ＣＨＮＲ２９（ここで、Ｒ２９は、ＮＨＲ３０である）またはＯＲ３０（ここで、Ｒ３０は、ＨもしくはＣ１〜２０アルキル、アリール、アルキルアリールである）；但し、Ｒ１１がＯＨである場合、Ｒ１３はＯＨではない；
Ｒ１４は、ＨまたはＯＨであり；
Ｒ１５は、Ｈであるか、またはＲ９と一緒になって結合（Ｃ９−Ｃ１５結合）を形成する、方法。
・（項目２）
項目１に記載の方法であって、上記糖尿病の合併症および関連する状態が、以下：肥満、微小血管疾患および大血管疾患、ネフロパシー、ニューロパシー、眼疾患、糖尿病性潰瘍、のうちの１つ以上である、方法。
・（項目３）
項目１に記載の方法であって、上記ジベレリンが、ジベレリンＡ３である、方法。
・（項目４）
項目１に記載の方法であって、上記ジベレリンが、ジベレリンＡ３およびジベレリンＡ４および／またはジベレリンＡ７の混合物である、方法。
・（項目５）
項目１に記載の方法であって、上記薬学的に受容可能な誘導体が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、金属およびアンモニウムまたは有機塩基の塩を含む塩である、方法。
・（項目６）
項目５に記載の方法であって、上記有機塩基が、リドカインまたはＮＲ１６Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９であり、ここで、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は同じであってもなくてもよく、水素または置換もしくは非置換のＣ１〜２０アルキル基、アルカノール基もしくはアリール基である、方法。
・（項目７）
項目１に記載の方法であって、上記薬学的に受容可能な誘導体が、ラクトン、グリコシド、またはエステルおよび活性エステルである、方法。
・（項目８）
糖尿病および関連する状態の処置方法であって、当該方法は、有効量の式（１）の化合物（ジベレリン）およびその薬学的に受容可能な誘導体を、このような処置を必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
・（項目９）
項目８に記載の方法であって、上記ジベレリンが、ジベレリンＡ３である、方法。
・（項目１０）
項目８に記載の方法であって、上記ジベレリンが、ジベレリンＡ３およびジベレリンＡ４および／またはジベレリンＡ７の混合物である、方法。
・（項目１１）
糖尿病および関連する状態の処置方法であって、当該方法は、式（１）の化合物（ジベレリン）またはその薬学的に受容可能な誘導体を、インスリン、そのフラグメント誘導体、ＩＧＦ、増殖因子、および他の薬学的に適合性の抗糖尿病剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される物質と組み合わせて、投与する工程を包含する、方法。
・（項目１２）
糖尿病および関連する状態の処置方法であって、当該方法は、式（１）の化合物（ジベレリン）またはその薬学的に受容可能な誘導体を、鎮痛薬、抗高血圧剤、鎮静剤、催眠薬、脂質低下剤、および抗感染剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される他の適合性の治療剤と組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
・（項目１３）
１型糖尿病およびその関連する状態の処置のための、項目１に記載の方法。
・（項目１４）
２型糖尿病およびその関連する状態の処置のための、項目１に記載の方法。
・（項目１５）
インスリン抵抗性糖尿病の処置のための、項目１に記載の方法。
・（項目１６）
肥満、微小血管疾患および大血管疾患、ネフロパシー、ニューロパシー、眼疾患および糖尿病性潰瘍を含む、糖尿病関連合併症および関連する状態を処置するための、項目１に記載の方法。
・（項目１７）
糖尿病および関連する状態の処置のための薬学的組成物であって、当該組成物は、活性成分として式（１）の化合物および／またはその誘導体を、薬学的に受容可能なキャリアと共に含む、薬学的組成物。
・（項目１８）
処方物が、薬物適用器を用いた投与に適切な医薬である、項目１７に記載の薬学的組成物。
・（項目１９）
糖尿病および関連する状態の処置のための薬学的組成物であって、当該組成物は、活性成分として式（１）の化合物を、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と共に含み、ここで、当該組成物は、緩徐放出組成物である、薬学的組成物。
・（項目２０）
処方物が、経口投与のためのものである、項目１７に記載の組成物。
・（項目２１）
処方物が、吸入投与のためのものである、項目１７に記載の組成物。
・（項目２２）
処方物が、経皮投与のためのものである、項目１７に記載の組成物。
・（項目２３）
処方物が、非経口注射のためのものである、項目１７に記載の組成物。
・（項目２４）
処方物が、局所投与、直腸投与または膣投与のためのものである、項目１７に記載の組成物。
・（項目２５）
項目１７、１８または１９のいずれか１項に記載の薬学的組成物であって、上記式（１）の誘導体が、ラクトン、エステル、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、金属塩、アンモニウム塩および有機塩基からなる群より選択される、薬学的組成物。
・（項目２６）
上記誘導体が、式（１）のナトリウム塩である、項目２５に記載の薬学的組成物。
・（項目２７）
上記誘導体が、式（１）の亜鉛塩である、項目２５に記載の薬学的組成物。
・（項目２８）
上記誘導体が、式（１）のエチルエステルである、項目２５に記載の薬学的組成物。
・（項目２９）
糖尿病および関連する状態の処置において使用するための薬学的組成物の製造における、式（１）の化合物および／またはその誘導体の、使用。
・（項目３０）
項目１７に記載の薬学的組成物を製造する方法であって、当該方法は、式（１）の化合物および／またはその誘導体を、薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程を包含する、方法。
・（項目３１）
ジベレリンＡ３を含むジベレリンの調製のためのプロセスであって、当該プロセスは、以下の工程：
（ａ）発酵ブロスにおいて、ジベレリン産生微生物株をインキュベートする工程；
（ｂ）当該発酵ブロスのｐＨを、ｐＨ６．５〜７．０に調節し、そして濾過して、微生物菌糸体の濾過ケーキおよび濾液を得る工程；
（ｃ）当該濾過ケーキを水で洗浄し、そして洗浄液を当該濾液と合わせて、水溶液を形成する工程；
（ｄ）当該水溶液を濃縮する工程；
（ｅ）５〜１０℃の温度で、当該水溶液を有機溶媒と混合し、そして当該混合物のｐＨを、２．０未満に調節する工程；
（ｆ）当該混合物を水相および第一の有機相に分離し、そして当該第一の有機相を除去する工程；
（ｇ）工程（ｆ）の水相を、有機溶媒を用いて再抽出して、第二の有機相を得る工程；
（ｈ）当該第一の有機相および第二の有機相を合わせ、そして濃縮して、濃縮有機溶液を形成する工程；
（ｉ）当該濃縮有機溶液を、攪拌しながら３〜４時間にわたって、固形物の沈殿が止まるまで、６０〜７０℃にて加熱する工程；
（ｊ）当該濃縮有機溶液を室温まで冷却し、そして濾過して沈殿物を得る工程；
（ｋ）当該沈殿物を冷有機溶媒で洗浄し、そして乾燥して、約８０％のジベレリンＡ３、約４％のジベレリンＡ４および約４％のジベレリンＡ７を含むオフホワイトの固体を得る工程、
を包含する、プロセス。
・（項目３２）
項目３１に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ｌ）３２．６％のメタノール、２．２％の水および６５．２％のアセトンの混合物中に、上記オフホワイトの固体を溶解して、ジベレリン溶液を得る工程；
（ｍ）当該ジベレリン溶液を、有機溶媒と水との１０：１混合物で希釈する工程；
（ｎ）当該希釈したジベレリン溶液を濾過し、そして当該濾液を真空エバポレーションによって濃縮する工程；
（ｏ）当該濃縮物を、攪拌しながら、２〜３時間にわたって、６０〜８０℃の温度で加熱し、室温まで冷却し、そして濾過して、固体結晶性沈殿物を得る工程；
（ｐ）当該沈殿物を冷有機溶媒で洗浄し、そして乾燥してジベレリンＡ３結晶を得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
・（項目３３）
上記ジベレリン産生微生物株が、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉである、項目３１に記載のプロセス。
・（項目３４）
上記工程（ｄ）および（ｈ）の溶液の濃縮が、真空エバポレーションを用いて達成される、項目３１に記載のプロセス。
・（項目３５）
上記有機溶媒が酢酸エチルである、項目３１に記載のプロセス。
・（項目３６）
上記有機溶媒が酢酸エチルである、項目３２に記載のプロセス。
・（項目３７）
項目３２に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ｑ）上記ジベレリンＡ３をメタノール中に溶解する工程；
（ｒ）当該ジベレリン溶液を、等モルのＮａＨＣＯ３水溶液に添加する工程；
（ｓ）当該混合された溶液を乾燥するまでエバポレートして、固体残渣を得る工程；
（ｔ）当該残渣を水中に溶解し、そして凍結乾燥して、ジベレリンＡ３ナトリウム塩を得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
・（項目３８）
項目３７に記載のプロセスであって、
水中に上記ジベレリンＡ３ナトリウム塩を溶解する工程、
当該溶液を、亜鉛イオン交換樹脂をロードしたカラムを通過させる工程、
当該カラムを水で洗浄する工程、
当該流出液および洗浄液を収集し、そして合わせる工程、ならびに
水を除去して、ジベレリンＡ３亜鉛塩を得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
・（項目３９）
項目３２に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ｑ）水に対するアセトンの、５０：１の比率の混合物中に、ジベレリンＡ３を溶解する工程；
（ｒ）当該ジベレリンＡ３溶液を、等モルのトリエチルアミンおよびクロロ蟻酸エチル、ならびに１／１０モル量のＮ−メチルモルホリンを混合し、そして−１５℃で２０分間攪拌する工程；
（ｓ）当該得られた混合物を無水エタノールで希釈し、そして室温で攪拌する工程；
（ｔ）当該希釈した混合物を乾燥するまでエバポレートし、そして６：１の比で、酢酸エチルと水との間で残渣を分配する工程；
（ｕ）当該酢酸エチル層を分離し、次いで２％ＨＣｌで洗浄し、次いで水で洗浄し、次いで５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次いで水で洗浄し、そして減圧下で乾燥するまでエバポレートして、ジベレリンＡ３エチルエステルを得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
【００５９】
本発明は、以下の実施例によって、さらに説明されるが、この実施例は、例証目的のみであり、本発明の限定として解釈すべきではない。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
（ジベレリンの発酵、単離および精製）
（ａ）発酵：ジベレリンＡ３、Ａ４およびＡ７生成株Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉを、１００ｇのグルコース、１００ｇのスクロース、２．５ｇのＮＨ４ＮＯ３、０．２５ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇのＭｇＳＯ４、０．０１ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＫＣｌ、１０ｇのペプトン、３ｇのＣａＣＯ３、１０００ｍｌのＨ２Ｏを含む培地中で接種し、そして２８℃で３〜４日間増殖させた。次いで、１０００ｇのグルコース、１００ｇのペプトン、２４ｇのＮＨ４ＮＯ３、１００ｇのＫＨ２ＰＯ４、２０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、８ｇのＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、２０リットルのＨ２Ｏを含む生成培地（ｐＨ４．５）に移した（２８℃で８〜１０日間）。ジベレリンの生成がピーク（約３０００μｇ／ｍｌブロス）に達した場合、発酵を停止させた。
【００６１】
（ｂ）単離：発酵ブロス（１８リットル）を１０％  ＮａＯＨを用いてｐＨ６．５〜７．０に調整し、次いで濾過した。濾過ケーキ（菌糸体）を４ＬのＨ２Ｏで洗浄した。濾液および洗浄液を合わせ、真空エバポレートして容量を２Ｌにした。この濃縮物を、酢酸エチル（５Ｌ）とともに５〜１０℃で撹拌し、６ＮＨＣｌを用いてｐＨ１．５に調整した。次いで２層に分離させた。下層の水層を、酢酸エチル（２Ｌ）を用いて再抽出した。有機抽出物を合わせ、水（２Ｌ）で洗浄し、次いでエバポレートして４００ｍｌにした。この濃縮物を、それ以上沈殿物が生じなくなるまで、３〜４時間にわたって、６０〜７０℃で撹拌および加熱した。室温まで冷却した後、懸濁物を濾過した。固形物を冷酢酸エチルで洗浄し、乾燥させて、ジベレリンＡ３およびジベレリンＡ４／Ａ７混合物をオフホワイトの固形物（４５ｇ）として得た。この混合物は、約８０％のＡ３、約４％のＡ４および約４％のＡ７を含む。
【００６２】
（ｃ）精製：上記のジベレリンＡ３およびジベレリンＡ４／Ａ７の混合物（１０ｇ）を、１５ｍｌのメタノール（１ｍｌのＨ２Ｏを含む）および３０ｍｌのアセトンの混合物中に溶解した。この溶液を１００ｍｌの酢酸エチル（１０ｍｌのＨ２Ｏを含む）で希釈した。この混合物を濾過した。その濾液を真空エバポレートして容量を約８０ｍｌにした。この混合物を２〜３時間にわたって６０〜８０℃で撹拌および加熱し、次いで室温まで冷却した。それを濾過した。その固体を冷酢酸エチルで洗浄し、乾燥させ、白色の結晶としてジベレリンＡ３（６．３ｇ）（純度＞９５％）を得た。ＭＳ：３９１（Ｍ−１＋２Ｎａ）＋  ３６９（Ｍ＋２３）＋  ３２９（Ｍ＋１−Ｈ２Ｏ）＋
（実施例２）
（ジベレリンＡ３塩およびエステルの調製）
（ａ）ジベレリンＡ３ナトリウム塩の調製：ジベレリンＡ３（３４６ｍｇ（１ｍｍｏｌ））の溶液を１．５ｍｌのメタノール中に溶解し、２ｍｌのＨ２Ｏ中のＮａＨＣＯ３（８４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）溶液を添加した。混合物全体を減圧下でエバポレートし、乾燥させた。次いで、その残渣を水中（２ｍｌ）に溶解し、凍結乾燥し、ジベレリンＡ３ナトリウム塩（白色固体、高収率）を得た。
【００６３】
（ｂ）ジベレリンＡ３亜鉛塩の調製：１００ｍｇのジベレリンＡ３ナトリウム塩を、１０ｍｌの水中に溶解し、次いで、カラム（２０ｍｌ）Ｄｏｗｅｘ  ５０  Ｚｉｎｃイオン形態樹脂に通した。次いで、このカラムを、３０ｍｌのＨ２Ｏで洗浄した。この溶出液および洗浄液を合わせ、真空エバポレートして容量を小さくし、次いで凍結乾燥し、白色の固体として、高収率で、ジベレリンＡ３亜鉛塩を得た。
【００６４】
（ｃ）ジベレリンＡ３エチルエステルの調製：３４６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のジベレリンＡ３を、アセトン（１０ｍｌ）および水（０．２ｍｌ）の混合物中に溶解した。この混合物に、−２０℃で、トリエチルアミン（１００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（１０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、クロロギ酸エチル（１０８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、−１５℃で２０分間撹拌し、次いで、無水エタノール（１０ｍｌ）で希釈した。この混合物を、室温で一晩撹拌し、次いでエバポレートして乾燥させた。次いで、その残渣を、酢酸エチル（３０ｍｌ）と水（５ｍｌ）との間で分配した。有機層を分離し、２％ＨＣｌ（５ｍｌ）、水（５ｍｌ）、５％ＮａＨＣＯ３（５ｍｌ×２）、水（５ｍｌ）で連続して洗浄し、次いで減圧下でエバポレトートして、乾燥させ、無色固体のジベレリンＡ３エチルエステル（３１９ｍｇ、８５％）（ＭＳ  ３７５（Ｍ＋１）＋）を得た。
【００６５】
（実施例３）
（ａ）細胞の増殖に関するジベレリンＡ３の効果を、インビトロで、ＥＧＦの効果と比較した。ケラチノサイト培地を用いて、ヒト皮膚細胞培養物実験を実施した。各ウェルに１，５００細胞を播種した。インキュベーションを、５日間にわたって、３７℃で実施した。以下のように実験を示す：
【００６６】
【表１】
0004885989.tif 000004
実験３．１および実験３．３は、ＥＧＦ（上皮増殖因子）が、細胞増殖にとって重要であることを示した。実験２は、ＥＧＦおよびジベレリンＡ３の両方の存在が、細胞増殖の速度に、相加的効果を有さないことを示した。実験４は、ジベレリンＡ３単独が、ＥＧＦと同様に効率的に細胞増殖を刺激し得ることを示した。
【００６７】
（ｂ）（ａ）に記載した細胞増殖実験について、ＥＧＦの代わりにＩＧＦ−１を用いて、細胞培養物の増殖に対するジベレリンＡ３の効果を、ＩＧＦの効果と比較した。その結果は、（ａ）における結果と同様であった。
【００６８】
（実施例４）
ジベレリンＡ４および／またはジベレリンＡ７とジベレリンＡ３との混合物の効果を、インビトロでの細胞増殖に対するＩＧＦ−の効果と比較した。この結果は、実施例３（ｂ）における結果と同様であった。
【００６９】
（実施例５）
（糖尿病のラットにおけるジベレリンＡ３の効果）
（方法）
オスＷｉｓｔａｒラット（２９０ｇ〜３３０ｇ）を計量し、軽く麻酔し（４％ハロタン、２：１  Ｏ２／Ｎ２Ｏ）、その結果、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｑ．Ｉ．Ｄグルコメーターを用いて、尾部静脈サンプルによって血中グルコースレベルを測定し得た。次いで、使用直前に、シトレート緩衝液（５０ｍＭ  クエン酸および５０ｍＭ  クエン酸トリナトリウム；ｐＨ４．５）中に溶解したステプトゾトシン（ＳＴＺ、６０ｍｇ／ｋｇ）の単回の尾部静脈注射によって、糖尿病を誘導した。等容量のシトレート緩衝液を、年齢の一致したコントロールラットに注射した。
【００７０】
実験の間、ラットを２つのグループで収容した。動物のケージ（ｈｏｕｓｅ）の温度を、１２時間の明／暗サイクルで、２０℃（±２℃）に維持し、そしてラットを自由に食餌および水にアクセスすることが出来るようにした。
【００７１】
全ての実験のための論理的承認を、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得た。
【００７２】
（薬物投与および毎日のモニタリングプロトコル）
ＳＴＺ（６０ｍｇ／ｋｇ）の刺激の４８時間後に、血中グルコースサンプルを採取し、そして血中グルコースレベルが１６ｍＭ以上の動物が糖尿病であると見なした。次いで、ラットをランダムにグループ分けした。
【００７３】
緩やかに作用するＬｅｎｔｅ  Ｍｏｎｏｔａｒｄインスリンを使用し、ジベレリンナトリウム塩を、必要に応じて、使用直前に蒸留水で作製した。
【００７４】
血中グルコース読取りを、３日毎の薬物投与の２時間後または５時間後に得た。この結果を、以下に示す：
【００７５】
【表２】
0004885989.tif 000005
0004885989.tif 000006
（実施例６）
（糖尿病ラットにおけるジベレリンＡ３およびＡ４／Ａ７混合物の効果）
この実験のプロトコルは、実施例５のプロトコルと同様であるが、ジベレリンＡ３およびＡ４／Ａ７混合物をジベレリンＡ３の代わりに用いた。その結果は、実施例５における結果と異ならなかった。