(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（αサブユニット）、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニット（βサブユニット）、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼからなる４量体である芳香環ジオキシゲナーゼを複素環化合物または芳香族カルボン酸と反応させることにより、複素環化合物または芳香族カルボン酸を水酸化することを含んでなり、
前記αサブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、βサブユニットが、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、フェレドキシンが、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、フェレドキシンレダクターゼが、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつαサブユニット、βサブユニット、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼからなる４量体が芳香環ジオキシゲナーゼ活性を有するものである、水酸化された複素環化合物または水酸化された芳香族カルボン酸の製造法。
【請求項２】
芳香環ジオキシゲナーゼがPseudomonas pseudoalcaligenes由来である、請求項１に記載製造法。
【請求項３】
αサブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、βサブユニットが、配列番号４のアミノ酸配列からなり、フェレドキシンが、配列番号６のアミノ酸配列からなり、フェレドキシンレダクターゼが、配列番号８のアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の製造法。
【請求項４】
αサブユニットが、配列番号２と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつBurkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされているタンパク質である、請求項１に記載の製造法。
【請求項５】
Burkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸配列が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列である、請求項４に記載の製造法。
【請求項６】
配列番号２と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつBurkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされているタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項４に記載の製造法。
【請求項７】
請求項１に記載の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（αサブユニット）、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニット（βサブユニット）、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼからなる４量体である芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を発現するように形質転換された微生物を培養することにより得られた培養物を複素環化合物または芳香族カルボン酸と反応させることにより、複素環化合物または芳香族カルボン酸を水酸化することを特徴とする、請求項１に記載の製造法。
【請求項８】
芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子がPseudomonas pseudoalcaligenes由来である、請求項７に記載の製造法。
【請求項９】
αサブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、βサブユニットが、配列番号４のアミノ酸配列からなり、フェレドキシンが、配列番号６のアミノ酸配列からなり、フェレドキシンレダクターゼが、配列番号８のアミノ酸配列からなる、請求項７または８に記載の製造法。
【請求項１０】
αサブユニットをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１のＤＮＡ配列であり、βサブユニットをコードするＤＮＡ配列が、配列番号３のＤＮＡ配列であり、フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列が、配列番号５のＤＮＡ配列であり、フェレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡ配列が、配列番号７のＤＮＡ配列である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項１１】
αサブユニットが、配列番号２と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつBurkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされているタンパク質である、請求項７に記載の製造法。
【請求項１２】
Burkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸配列が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列である、請求項１１に記載の製造法。
【請求項１３】
配列番号２と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつBurkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされているタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１１に記載の製造法。
【請求項１４】
αサブユニットをコードするＤＮＡ配列が、配列番号９のＤＮＡ配列であり、βサブユニットをコードするＤＮＡ配列が、配列番号３のＤＮＡ配列であり、フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列が、配列番号５のＤＮＡ配列であり、フェレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡ配列が、配列番号７のＤＮＡ配列である、請求項７または１３に記載の製造法。
【請求項１５】
複素環化合物が、式（Ｉ）
Ｈｅｔ−Ａｌｋｙｌ−Ｒ１ （Ｉ）
（式中、Ｈｅｔは複素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは結合または炭素数１〜４の分岐していてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ１は非置換フェニル基を表す）、で表される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項１６】
水酸化された複素環化合物が、式（Ｉ’）
Ｈｅｔ−Ａｌｋｙｌ−Ｒ１’ （Ｉ’）
（式中、ＨｅｔおよびＡｌｋｙｌは請求項１５で定義した内容と同義であり、Ｒ１’は下記基：
【化１】
0004972255.tif 000037
のいずれかを表す）で表される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項１７】
Ｈｅｔが、キノリン、インドール、インダノン、ベンゾチアゾール、ベンゾキサゾール、ピリジン、３−メチルピリジン、ピリミジン、ピロール、ピラゾール、３−メチルピラゾール、イミダゾール、イソチアゾール、ベンゾフラン、チオフェン、クロモン（４Ｈ−クロメン−４−オン）、クロマン−４−オン、６−ヒドロキシ−クロマン−４−オン、またはフタルイミドを表す、請求項１５または１６に記載の製造法。
【請求項１８】
複素環化合物が、式（ＩＩ）
Ｈｅｔ−Ａｌｋｙｌ−Ｒ２ （ＩＩ）
（式中、Ｈｅｔは複素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは結合または炭素数１〜４の分岐していてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基または水酸基により置換されたフェニル基を表す）で表される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項１９】
Ｈｅｔがベンゾキサゾールまたはピリジンを表し、Ｒ２が２−ヒドロキシフェニルまたは４−メチルフェニルを表す、請求項１８に記載の製造法。
【請求項２０】
水酸化された複素環化合物が、式（ＩＩ’）
Ｈｅｔ’−Ａｌｋｙｌ−Ｒ２ （ＩＩ’）
（式中、Ｒ２およびＡｌｋｙｌは請求項１８で定義した内容と同義であり、Ｈｅｔ’は１または２の水酸基により置換された複素環式基を表す）で表される、請求項１〜１４、１８、および１９のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項２１】
Ｈｅｔ’が４，５−ジヒドロキシ−４，５−ジヒドロベンゾキサゾールまたは３−ヒドロキシピリジンである、請求項２０に記載の製造法。
【請求項２２】
複素環化合物が、式（ＩＩＩ）
Ｈｅｔ−Ａｌｋｙｌ−Ｈ （ＩＩＩ）
（式中、Ｈｅｔは複素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは炭素数１〜８の分岐していてもよいアルキレン鎖を表す）で表される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項２３】
Ｈｅｔがベンゾフランまたはチオフェンを表す、請求項２２に記載の製造法。
【請求項２４】
水酸化された複素環化合物が、式（ＩＩＩ’）
Ｈｅｔ’−Ａｌｋｙｌ−Ｈ （ＩＩＩ’）
（式中、Ｈｅｔ’は１または２の水酸基により置換された複素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは請求項２２で定義した内容と同義である）で表される、請求項１〜１４、２２、及び２３のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項２５】
Ｈｅｔ’が３−ヒドロキシベンゾフラン、４−ヒドロキシベンゾフラン、または２，３−ジヒドロキシ−２，３−ジヒドロチオフェンを表す、請求項２４に記載の製造法。
【請求項２６】
複素環化合物および水酸化された複素環化合物が、下記組み合わせから選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造法。
複素環化合物                  水酸化された複素環化合物
２−フェニルキノリン                ３−（２−キノリル）−３，５−
シクロヘキサジエン−１，２−
ジオール
２−フェニルインドール              ３−(１H−２−インドリル)−３，５
−シクロヘキサジエン−１,２−
ジオール
２−フェニルインドール              ２−(１H−２−インドリル)フェノール
２−フェニルインドール              ２−フェニル−１H−５−インドロール
３−フェニル−１−インダノン        ３−（５，６−ジヒドロキシ−１,３−
シクロヘキサジエニル）−１−
インダノン
２−フェニルベンゾチアゾール        ３−（１，３−ベンゾチアゾール−２−
イル）−３，５−シクロヘキサジエン−
１,２−ジオール
２−フェニルベンゾキサゾール        ３−（１，３−ベンゾオキサゾール−２
−イル）−３，５−シクロヘキサジエン
−１，２−ジオール
２−フェニルピリジン                ３−（２−ピリジル）−３，５−
シクロヘキサジエン−１,２−ジオール
３−メチル−２−フェニルピリジン    ３−（３−メチルピリド−2−イル）
−３，５−シクロヘキサジエン
−１，２−ジオール
４−フェニルピリミジン              ３−（４−ピリミジニル）−３，５−
シクロヘキサジエン−１，２−ジオール
１−フェニルピロール                ３−（１H−１−ピロリル）−３，５−
シクロヘキサジエン−１，２−ジオール
１−フェニルピラゾール              ４−ヒドロキシ−１−フェニルピラ
ゾール
３−メチル−１−フェニルピラゾール  ３−（３−メチルピラゾール−１−
イル）−３，５−シクロヘキサジエン
−１，２−ジオール
３−メチル−１−フェニルピラゾール  ２−（３−メチルピラゾール−１−
イル）フェノール
２−ベンジルピリジン                ３−（２−ピリジルメチル）−３，５−
シクロヘキサジエン−１，２−ジオール
１−ベンジルイミダゾール            ３−（１H−１−イミダゾリルメチル）
−３，５−シクロヘキサジエン−１，２
−ジオール
４−ベンジルイソチアゾール          ３−（４−イソチアゾリルメチル）
−３，５−シクロヘキサジエン−１，２
−ジオール
４−ベンジルイソチアゾール          ２−（４−イソチアゾリルメチル）
フェノール
２−（２−ヒドロキシフェニル）      ２−（２−ヒドロキシフェニル）
ベンゾキサゾール                    −４，５−ジヒドロ−１，３−
ベンゾオキサゾール−４，５−ジオール
２−（ｐ−トリル）ピリジン          ２−（４−メチルフェニル）−３−
ピリジオール
２−ｎ−ブチルベンゾフラン          ２−ブチルベンゾ［ｂ］フラン−６−
オール
２−ｎ−ブチルベンゾフラン          ２−ブチルベンゾ［ｂ］フラン−５−
オール
３−ｎ−ヘキシルチオフェン          ４−ヘキシル−２，３−ジヒドロ−
２，３−チオフェンジオール
フラボン                            ２’，３’−ジヒドロキシフラボン
フラボン                            ３’−ヒドロキシフラボン
フラバノン                          ２’，３’−ジヒドロキシフラバノン
フラバノン                          ２’−ヒドロキシフラバノン
フラバノン                          ３’−ヒドロキシフラバノン
６−ヒドロキシフラバノン            ２’，６−ジヒドロキシフラバノン
６−ヒドロキシフラバノン            ３’，６−ジヒドロキシフラバノン
２−（１−フェニルエチル）−１，３  ２−［１−(４−ヒドロキシフェニル)
−イソインドールイネジオン          エチル］−１，３−イソインドール
イネジオン
２−（１，２，３，４−テトラハイド  ２−（４−ヒドロキシ−１，２，３，
ロ−１−ナフタレニル）−１，３−イ  ４−テトラハイドロ−１−ナフタレ
）ソインドールイネジオン            ニル−１，３−イソインドールイ
ネジオン
【請求項２７】
複素環化合物がフラボノイドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項２８】
フラボノイドが、フラボン、フラバノン、または６−ヒドロキシフラバノンである、請求項２７に記載の製造法。
【請求項２９】
水酸化されたフラボノイドが、２’，３’−ジヒドロキシ体、２’−ヒドロキシ体または３’−ヒドロキシ体である請求項２７または２８に記載の製造法。
【請求項３０】
水酸化されたフラボノイドが、２’，３’−ジヒドロキシフラボン、３’−ヒドロキシフラボン、２’，３’−ジヒドロキシフラバノン、２’，−ヒドロキシフラバノン、３’−ヒドロキシフラバノン、２’，６−ジヒドロキシフラバノン、または３’，６−ジヒドロキシフラバノンである、請求項２９に記載の製造法。
【請求項３１】
フラボノイドおよび水酸化されたフラボノイドが、下記組み合わせから選択される、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の製造法。
フラボノイド              水酸化されたフラボノイド
フラボン                    ２’，３’−ジヒドロキシフラボン
フラボン                    ３’−ヒドロキシフラボン
フラバノン                  ２’，３’−ジヒドロキシフラバノン
フラバノン                  ２’−ヒドロキシフラバノン
フラバノン                  ３’−ヒドロキシフラバノン
６−ヒドロキシフラバノン    ２’，６−ジヒドロキシフラバノン
６−ヒドロキシフラバノン    ３’，６−ジヒドロキシフラバノン
【請求項３２】
複素環化合物が芳香環を有するフタルイミド誘導体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項３３】
芳香環を有するフタルイミド誘導体が、２−（１−フェニルエチル）−１，３−イソインドールイネジオンまたは２−（１，２，３，４−テトラハイドロ−１−ナフタレニル）−１，３−イソインドールイネジオンである、請求項３２に記載の製造法。
【請求項３４】
水酸化された芳香環を有するフタルイミド誘導体が、芳香環内またはベンジル位におけるヒドロキシ体である、請求項３２または３３に記載の製造法。
【請求項３５】
水酸化された芳香環を有するフタルイミド誘導体が、２−［１−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−１，３−イソインドールイネジオンまたは２−（４−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラハイドロ−１−ナフタレニル）−１，３−イソインドールイネジオンである、請求項３４に記載の製造法。
【請求項３６】
芳香環を有するフタルイミド誘導体および水酸化された芳香環を有するフタルイミド誘導体が、下記組み合わせから選択される、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の製造法。
芳香環を有するフタルイミド              水酸化された芳香環を有する
誘導体                                  フタルイミド誘導体
２−（１−フェニルエチル）−１，３  ２−［１−（４−ヒドロキシフェニル）
−イソインドールイネジオン          エチル］−１，３−イソインドールイネ
ジオン
２−（１，２，３，４−テトラハイド  ２−（４−ヒドロキシ−１，２，３，４
ロ−１−ナフタレニル）−１，３−イ  −テトラハイドロ−１−ナフタレニル）
ソインドールイネジオン              −１，３−イソインドールイネジオン
【請求項３７】
芳香族カルボン酸が、式（ＩＶ）
Ｒ３−Ａｌｋｙｌ−ＣＯＯＲ４ （ＩＶ）
（式中、Ｒ３は非置換炭素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは結合または炭素数１〜４の分岐していてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ４は水素原子またはカルボキシル基の保護基を表す）、で表される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項３８】
Ｒ３がナフタレンである、請求項３７に記載の製造法。
【請求項３９】
式（ＩＶ）の化合物が、１−ナフトイック酸または１−ナフチル酢酸である、請求項３７に記載の製造法。
【請求項４０】
水酸化された芳香族カルボン酸が、式（ＩＶ’）
Ｒ３’−Ａｌｋｙｌ−ＣＯＯＲ４ （ＩＶ’）
（式中、ＡｌｋｙｌおよびＲ４は前記で定義した内容と同義であり、Ｒ３’は１または２の水酸基により置換された炭素環式基を表す）で表される、請求項１〜１４および３７〜３９のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項４１】
Ｒ３’が１または２の水酸基により置換されたナフタレンである、請求項４０に記載の製造法。
【請求項４２】
式（ＩＶ’）の化合物が、４−ヒドロキシ−１−ナフトイック酸、４−ヒドロキシ−１−ナフチル酢酸、または５−ヒドロキシ−１−ナフチル酢酸である、請求項４０に記載の製造法。
【請求項４３】
芳香族カルボン酸および水酸化された芳香族カルボン酸が、下記組み合わせから選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造法。
芳香族カルボン酸        水酸化された芳香族カルボン酸
１−ナフトイック酸      ４−ヒドロキシ−１−ナフトイック酸
１−ナフチル酢酸        ４−ヒドロキシ−１−ナフチル酢酸
１−ナフチル酢酸        ５−ヒドロキシ−１−ナフチル酢酸
【請求項４４】
微生物が、大腸菌、放線菌または酵母である、請求項７〜４３のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項４５】
芳香環ジオキシゲナーゼを複素環化合物または芳香族カルボン酸と反応させることを含み、
前記芳香環ジオキシゲナーゼが、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（αサブユニット）、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニット（βサブユニット）、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼからなる４量体であり、
前記αサブユニットが、配列番号２と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつBurkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされているタンパク質であり、βサブユニットが、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、フェレドキシンが、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、フェレドキシンレダクターゼが、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつαサブユニット、βサブユニット、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼからなる４量体が芳香環ジオキシゲナーゼ活性を有する、複素環化合物または芳香族カルボン酸に水酸基を導入する方法。
【請求項４６】
配列番号２と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつBurkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされているタンパク質が配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（αサブユニット）、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニット（βサブユニット）、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼからなる４量体である芳香環ジオキシゲナーゼを含んでなり、
前記αサブユニットが、配列番号２と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつBurkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされているタンパク質であり、βサブユニットが、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、フェレドキシンが、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、フェレドキシンレダクターゼが、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつαサブユニット、βサブユニット、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼからなる４量体が芳香環ジオキシゲナーゼ活性を有する、複素環化合物または芳香族カルボン酸を水酸化するための組成物。
【請求項４８】
配列番号２と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつBurkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされているタンパク質が配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項４７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、水酸基が導入された複素環化合物および水酸基が導入された芳香族カルボン酸の製造法、および複素環化合物および芳香族カルボン酸を水酸化する新規改変酵素に関し、更に詳細には、組換え大腸菌や組換え放線菌等の組換え微生物を用いて複素環化合物等に水酸基を導入する生物工学的変換技術に関する。
【０００２】
関連技術
今日の医薬品研究開発においては、まず創薬のターゲットとするべき疾患関連分子(創薬標的分子)を明らかにした後、その創薬標的分子を用いて何らかの生物活性を指標に高速化スクリーニング(ハイスループット・スクリーニング)を行い、ヒットする化合物を探すという方法がよく取られる。この際に、経口用医薬品に繋げるためのリード化合物（通常、分子量が100-700位の脂質性化合物）のスクリーニングソースのライブラリーが必要となる。このライブラリーの質と量が医薬品研究開発に重要であると考えられている。
【０００３】
現在、スクリーニングソースのライブラリーはコンビナトリアルケミストリー等の有機化学技術によって化学合成されたものが主流を占めている(田中昭弘, 創薬とコンビナトリアルケミストリー, 蛋白質 核酸 酵素, 45, 887-894, 2000)。微生物代謝産物等の天然物由来のライブラリーも 経口用医薬品の研究開発に用いられているが、偽ヒット体 (false positive) が多い、活性物質の特定に時間がかかる、新規化合物が見つかりにくい等の理由で、天然物由来のものが占める割合は少なくなりつつある。
【０００４】
一方、化学合成されたスクリーニングソースのライブラリーはそれ特有の偏りを有している場合が多い。化学合成法では、−ＮＨＣＯ−結合を介して２つの前駆体を結合させる反応のような結合反応は容易であるが、水酸基などの官能基をある化合物の特定の位置に導入したり立体特異的に導入したりするのは困難である。また、医薬品研究開発において、HTSにより 創薬標的分子に作用するリード化合物が発見された後には、そのリード化合物の類縁体を作り 最適な開発候補化合物を見い出す必要がある(リード最適化)。このリード化合物の類縁体作製に際しても、現在は化学合成法が主流であり、有機化学反応特有の偏りを有していると見ることができる。
【０００５】
ところで、複素環式基はほとんどの経口用医薬品や合成染料、半数以上の天然有機化合物に含まれている。したがって、経口用医薬品またはドラックライク化合物の合成を行う上だけでなく、これらや他の化成品に繋げるための化学合成法の初発構成単位であるビルディングブロックの合成を行う上で、複素環化合物に水酸基などの官能基を特異的に導入する生物工学的変換技術はきわめて重要で、必要性の高い技術であると言える。
【０００６】
また、ビルディングブロックとしてアミンとカルボン酸の組み合わせがもっともよく用いられており、その中でも特に、芳香環を分子内に有するアミン体(以後、芳香族アミンという)や芳香環を分子内に有するカルボン酸(以下、芳香族カルボン酸という)が頻繁に使われている。したがって、芳香環アミンや芳香環カルボン酸に水酸基などの官能基を特異的に導入する生物工学的変換技術もきわめて重要で、必要性の高い技術であると言える。
【０００７】
Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 株は、九州大学農学部 古川謙介らにより北九州で単離されたポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）分解菌である。ＰＣＢの最初の酸化を担う酵素である芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子がP. pseudoalcaligenes KF707 から単離され、ビフェニル ジオキシゲナーゼ (biphenyl dioxygenase) 遺伝子 (bphA1A2A3A4 遺伝子) と命名された (A. Suyama, R. Iwakiri, N. Kimura, A. Nishi, K. Nakamura, K. Furukawa, J. Bacteriol., 178, 4039-4046, 1996)。P. pseudoalcaligenes KF707 株は、ビフェニル、4-メチルビフェニル、または ジフェニルメタン (diphenylmethane) を炭素源とする培地で生育することができたが、ベンゼンやトルエンを炭素源とする培地では生育できなかった (A. Suyama, R. Iwakiri, N. Kimura, A. Nishi, K. Nakamura, K. Furukawa, J. Bacteriol., 178, 4039-4046, 1996)。この差は、最初の酸化反応を行うビフェニルジオキシゲナーゼの基質特異性に起因していると観ることができる。
【０００８】
Burkholderia cepacia LB400 株 (以前はPseudomonas sp. LB400株と呼ばれていた) は、 Johnsonらによりニューヨーク州で単離されたポリ塩化ビフェニル分解菌である(Bedard, D.L., Unterman, R., Bopp, L.H., Brennan, M.J., Haberl, M.L., Johnson, C., Appl. Environ. Microbiol., 51, 761-768, 1986)。B. cepacia LB400 株は 強力なＰＣＢ分解菌として、P. pseudoalcaligenes KF707 株とともに、関連遺伝子や関連酵素の解析も含めて研究されてきた。B. cepacia LB400 においても、最初の酸化を担う酵素である芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子が単離され、ビフェニル ジオキシゲナーゼ (biphenyl dioxygenase) 遺伝子 (bphAEFG 遺伝子) と命名された (B. D. Erickson, E. J. Mondello, J. Bacteriol., 174, 2903-2912, 1992)。
【０００９】
P. pseudoalcaligenes KF707とB. cepacia LB400 のビフェニルジオキシゲナーゼ (BDO) は、アミノ酸配列レベルで きわめて高いホモロジーを有していた。すなわち、大サブユニット 94%、小サブユニット99%、フェレドキシン 100%、フェレドキシンレダクターゼ 100%であった。それにもかかわらず、両者の基質特異性や反応特異性は異なっていた。例えば、2,5,4'-トリクロロビフェニル (2,5,4'-trichlorobiphenyl) を基質とした場合、P. pseudoalcaligenes KF707 のビフェニルジオキシゲナーゼ (BDO) は、本基質の2',3'位に酸素を添加しcis-ジオールを生成した（図１参照）が、B. cepacia LB400 のBDOは 本基質の3,4位に酸素を添加しcis-ジオールを生成した（図２参照）(N. Kimura, A. Nishi, M. Goto, K. Furukawa, J. Bacteriol., 179, 3936-3943, 1997)。また、KF707株のBDOはジフェニルメタンを基質として認識し変換できたのに対して、LB400株のBDOはこれを基質として認識し変換することはできなかった。一方、2,5,2',5'-テトラクロロビフェニルの場合は、LB400株のBDOはこれを基質として認識し変換できた（図２）のに対して、KF707株のBDOは基質として認識し変換することはできなかった。
【００１０】
九州大学の古川 謙介らは、LB400株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ 大サブユニットをコードするDNA、および、 KF707株由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットをコードするDNAを、共通のフランキング配列からなるbphA1 プライマーを用いたPCRにより単離した。次に、これらをDnaseIで分解し、10−50 bp DNA断片を回収、混合し、セルフプライミングPCR, bphA1 プライマーを加えたPCRを行い、ランダムにアミノ酸配列が入れ替わった種々のキメラbphA1 を得た [DNA シャフリング (DNA shuffling)]。これらのキメラbphA1 を  P. pseudoalcaligenes KF707由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニット以外の３つの構成要素 (bphA2A3A4) の上流に繋ぎ、種々の改変ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子 (modified bphA1::bphA2A3A4 遺伝子) を得ることが可能であることが報告されている (T. Kumamaru, H. Suenaga, M. Mitsuoka, T. Watanabe, K. Furukawa, Nature Biotechnology, 16, 663-666, 1998)。
【００１１】
しかしながら、芳香環ジオキシゲナーゼが複素環化合物および芳香族カルボン酸に水酸基を導入できることは現在まで知られていない。また、これらの複素環化合物や芳香族カルボン酸に水酸基を特異的に導入できる酵素も現在まで知られていない。
【００１２】
【発明の概要】
本発明者らは今般、P. pseudoalcaligenes KF707 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼを用いると、分子内に複素環基を有する化合物や芳香族カルボン酸に反応特異的に水酸基を導入することができることを見い出した。
【００１３】
本発明者らはまた、P. pseudoalcaligenes KF707 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼにおける大サブユニットをコードするＤＮＡを、Burkholderia cepacia LB400株由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットをコードするDNAとの間でＤＮＡシャフリング（DNA shuffling）を行い、得られたＤＮＡとP. pseudoalcaligenes KF707由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニット以外の３つの構成要素をコードするＤＮＡとからなる改変ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子を発現させ、このようにして得られた改変芳香環ジオキシゲナーゼを用いると分子内に複素環基を有する化合物や芳香族カルボン酸に反応特異的に水酸基を導入することができることを見い出した。
【００１４】
本発明は、水酸化された複素環化合物や水酸化された芳香族カルボン酸を生物工学的に生産する方法の提供をその目的とする。
【００１５】
本発明による水酸化された複素環化合物または水酸化された芳香族カルボン酸の製造法は、芳香環ジオキシゲナーゼを複素環化合物または芳香族カルボン酸と反応させることにより、これらの化合物を水酸化することを含んでなるもの、である。
【００１６】
本発明による製造法によれば、水酸化された複素環化合物および水酸化された芳香族カルボン酸を安価にかつ容易に製造することができる。
【００１７】
本発明はまた、複素環化合物および芳香族カルボン酸を効率的に水酸化することができる改変酵素を提供する事をその目的とする。
【００１８】
本発明による改変酵素は、
置換、欠失、挿入、および付加からなる群から選択される１以上の改変を有する配列番号２のアミノ酸配列であって、Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされたアミノ酸配列からなるαサブユニット、
配列番号４のアミノ酸配列または置換、欠失、挿入、および付加からなる群から選択される１以上の改変を有する配列番号４のアミノ酸配列からなるβサブユニット、
配列番号６のアミノ酸配列または置換、欠失、挿入、および付加からなる群から選択される１以上の改変を有する配列番号６のアミノ酸配列からなるフェレドキシン、および
配列番号８のアミノ酸配列または置換、欠失、挿入、および付加からなる群から選択される１以上の改変を有する配列番号８のアミノ酸配列からなるフェレドキシンレダクターゼ
からなる４量体からなる、改変された芳香環ジオキシゲナーゼである。
【００１９】
本発明は更に、複素環化合物および芳香族カルボン酸を効率的に水酸化するように改変された芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットを提供する事をその目的とする。
【００２０】
本発明による芳香環ジオキシゲナーゼの改変αサブユニットは、
置換、欠失、挿入、および付加からなる群から選択される１以上の改変を有する配列番号２のアミノ酸配列であって、Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされたアミノ酸配列からなるもの、である。
【００２１】
【発明の具体的説明】
微生物の寄託
Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を組み込んだ大腸菌JM109（pKF6622）は、２０００年９月１３日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３００である。
【００２２】
改変された芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を組み込んだ大腸菌JM109（pKF2072）は、２０００年９月１３日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９９である。
【００２３】
芳香環ジオキシゲナーゼおよびその遺伝子
芳香環ジオキシゲナーゼは、ベンゼン環のような芳香環に作用し、２原子の分子状酸素を芳香環上に導入できる酵素を意味する。２原子からなる分子状酸素が芳香環上に導入された結果、芳香環上に２つの水酸基が導入されることとなる。
【００２４】
芳香環ジオキシゲナーゼは、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット（αサブユニット）(BphA1)、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニット（βサブユニット）(BphA2)、フェレドキシン（ferredoxin）(BphA3)、およびフェレドキシンレダクターゼ（ferredoxin reductase, 別名: NAD(P)H-ferredoxin reductase）(BphA4)からなる４つのサブユニット（テトラマー）からなることができる。
【００２５】
本発明においては、芳香環ジオキシゲナーゼは（１）Pseudomonas pseudoalcaligenes由来の芳香環ジオキシゲナーゼおよび芳香環ジオキシゲナーゼ活性を依然として有するその改変体、および（２）Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼに従ってαサブユニットが改変されたPseudomonas pseudoalcaligenes由来の芳香環ジオキシゲナーゼ(modified BphA1-BphA2-BphA3-BphA4 )であることができる。
【００２６】
（１）Pseudomonas pseudoalcaligenes由来の芳香環ジオキシゲナーゼおよびその改変体
芳香環ジオキシゲナーゼは、Pseudomonas pseudoalcaligenes由来のビフェニルジオキシゲナーゼ、特にPseudomonas pseudoalcaligenesＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ（BphA1-BphA2-BphA3-BphA4）(A. Suyama, R. Iwakiri, N. Kimura, A. Nishi, K. Nakamura, K. Furukawa, J. Bacteriol., 178, 4039-4046, 1996)であることができる。
【００２７】
Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニット、βサブユニット、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４、６、および８に記載のアミノ酸配列であることができる。
【００２８】
本発明において、配列番号２、４、６、および８に記載のアミノ酸配列は、それぞれ置換、欠失、挿入、および付加からなる群から選択される１以上の改変（例えば、１〜数個の改変）を有していてもよい。この場合、改変されていてもよい配列番号２のアミノ酸配列からなるαサブユニット、改変されていてもよい配列番号４のアミノ酸配列からなるβサブユニット、改変されていてもよい配列番号６のアミノ酸配列からなるフェレドキシン、および改変されていてもよい配列番号８のアミノ酸配列からなるフェレドキシンレダクターゼからなる４量体は芳香環ジオキシゲナーゼ活性を有する。
【００２９】
本発明においては、
αサブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の相同性を有するアミノ酸配列からなり、
βサブユニットが、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の相同性を有するアミノ酸配列からなり、
フェレドキシンが、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の相同性を有するアミノ酸配列からなり、
フェレドキシンレダクターゼが、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ
αサブユニット、βサブユニット、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼからなる４量体が芳香環ジオキシゲナーゼ活性を有する
ことを特徴とする芳香環ジオキシゲナーゼを、複素環化合物および芳香族カルボン酸の水酸化に用いることができる。
【００３０】
本明細書において「芳香環ジオキシゲナーゼ活性を有する」とは、被験タンパク質と基質とを反応させて、基質変換反応の有無を検出することにより評価することができる。例えば実施例４および５に記載の方法に従って「芳香環ジオキシゲナーゼ活性を有する」か否かを評価することができる。
【００３１】
（２）改変芳香環ジオキシゲナーゼ (modified BphA1-BphA2-BphA3-BphA4)
本発明による芳香環ジオキシゲナーゼは、Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットに従ってαサブユニットが最適化されたPseudomonas pseudoalcaligenes由来のビフェニル ジオキシゲナーゼ、特にPseudomonas pseudoalcaligenesＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ(modified BphA1-BphA2-BphA3-BphA4 )であることができる。
【００３２】
従ってPseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットは、置換、欠失、挿入、および付加からなる群から選択される１以上の改変を有する配列番号２のアミノ酸配列からなり、かつBurkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされた配列であることができる。Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来のビフェニルジオキシゲナーゼのβサブユニット、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列は、それぞれ、改変されていてもよい配列番号４、６、および８に記載のアミノ酸配列であることができる。この場合、Burkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変された配列番号２のアミノ酸配列からなるαサブユニット、改変されていてもよい配列番号４のアミノ酸配列からなるβサブユニット、改変されていてもよい配列番号６のアミノ酸配列からなるフェレドキシン、および改変されていてもよい配列番号８のアミノ酸配列からなるフェレドキシンレダクターゼからなる４つのサブユニットは芳香環ジオキシゲナーゼ活性を有する。
【００３３】
Burkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸配列は配列番号１１に記載のアミノ酸配列であることができる。Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子、すなわちbphAEFG 遺伝子のヌクレオチド配列は GenBank accession M86348に登録されている。
【００３４】
本発明において「Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変がなされた」とは、Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来のαサブユニットのアミノ酸配列とBurkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸配列とを比較し、Burkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸残基と相違しているPseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来のαサブユニットの１または複数個のアミノ酸残基を、対応するBurkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸残基に置き換えることを意味する。対応するBurkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸残基が存在しない場合には、Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来のαサブユニットのアミノ酸残基を欠失させることができる。対応するBurkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸残基が存在するが、Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来のαサブユニットのアミノ酸残基が存在しないときには、対応するBurkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸残基を挿入することができる。
【００３５】
Burkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変された配列番号２のアミノ酸配列としては、配列番号１０のアミノ酸配列が挙げられる。
【００３６】
芳香環ジオキシゲナーゼの最適化は例えば下記のようにして行うことができる。
【００３７】
Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ 大サブユニットをコードするDNAと Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707株由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットをコードするDNAを、共通のフランキング配列からなるbphA1 プライマーを用いたPCRにより単離する。次に、これらをDnaseIで分解し、10−50 bp DNA断片を回収、混合し、セルフプライミングPCR, bphA1 プライマーを加えたPCRを行い、ランダムにアミノ酸配列が入れ替わった(DNA シャフリング)種々のキメラbphA1 を得る(実施例1参照)。
【００３８】
得られたキメラbphA1をbphA2A3A4とともに発現ベクターに連結し、基質変換反応を測定する。芳香環ジオキシゲナーゼは基質に作用するとメタ開裂産物を生じ、一般に、メタ開裂産物は黄色を呈するので、４３４nmでモニターすることが可能である。次に、形質転換体を用いて、種々の芳香族炭化水素の変換能（水酸基導入活性）を調べる。芳香族炭化水素の変換能を指標にして形質転換体を選択し、組み込まれている遺伝子を常法に従って解析することにより、最適化されたアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を得ることができる。
【００３９】
最適化された遺伝子を持つ形質転換体のうち、組換え大腸菌pKF2072は非常に広い基質特異性を示すことがわかった。このプラスミドpKF2072に含まれる改変ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子における大サブユニット遺伝子 (modified bphA1) の塩基配列およびコードされるアミノ酸配列は配列番号９および１０に記載される通りである。この改変されたαサブユニットを BphA1 (2072)、遺伝子をbphA1 (2072) と呼ぶ場合がある。BphA1 (2072) は、親株P. pseudoalcaligenes KF707由来のビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニット（BphA1 (KF707) と呼ぶ場合がある）と４アミノ酸異なっており、もう一方の親株B. cepacia. LB400由来のビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニット（BphA (LB400) と呼ぶ場合がある）と１５アミノ酸異なっていた。この３つの大サブユニットのアミノ酸配列の比較を図３に示す。
【００４０】
本発明による製造法の具体的な態様において、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を発現するように形質転換された微生物を培養することにより得られた培養物を複素環化合物または芳香族カルボン酸と反応させることにより、複素環化合物または芳香族カルボン酸を水酸化することを含んでなる、水酸化された複素環化合物または芳香族カルボン酸の製造法が提供される。この場合、形質転換体を培養して培地を得、次いで複素環化合物または芳香族カルボン酸を得られた培地と接触させてこれらの化合物を水酸化する態様のみならず、複素環化合物や芳香族カルボン酸を含む培地中で形質転換体を培養する態様をも含む。本発明による製造法ではまた、形質転換体から生産された酵素が機能している限りにおいて、反応時に形質転換体は生存していても、していなくてもよい。
【００４１】
芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子は、芳香環ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡであることができる。
【００４２】
芳香環ジオキシゲナーゼには、上述のように、（１）Pseudomonas pseudoalcaligenes由来の芳香環ジオキシゲナーゼおよび芳香環ジオキシゲナーゼ活性を依然として有するその改変体、および（２）Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼに従ってαサブユニットが改変されたPseudomonas pseudoalcaligenes由来の芳香環ジオキシゲナーゼ(modified BphA1-BphA2-BphA3-BphA4 )が含まれる。芳香環ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、例えば、配列番号２、４、６、８、および１０のアミノ酸配列およびこれらの改変配列をコードするヌクレオチド配列を選択することができる。従って、４つのサブユニットからなる芳香環ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列とは、配列番号１、３、５、７、および９のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００４３】
本発明においては、
αサブユニットをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１のＤＮＡ配列または配列番号１のＤＮＡ配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の相同性を有するＤＮＡ配列であり、
βサブユニットをコードするＤＮＡ配列が、配列番号３のＤＮＡ配列または配列番号３のＤＮＡ配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の相同性を有するＤＮＡ配列であり、
フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列が、配列番号５のＤＮＡ配列または配列番号５のＤＮＡ配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の相同性を有するＤＮＡ配列であり、
フェレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡ配列が、配列番号７のＤＮＡ配列または配列番号７のＤＮＡ配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の相同性を有するＤＮＡ配列であり、
これらのＤＮＡ配列によりコードされたαサブユニット、βサブユニット、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼからなる４量体が芳香環ジオキシゲナーゼ活性を有する
ことを特徴とする芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を、複素環化合物および芳香族カルボン酸の水酸化に用いることができる。
【００４４】
Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来の芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニット、βサブユニット、フェレドキシン、およびフェレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１、３、５、および７であることができる。Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子、すなわち、bphA1A2A3A4 遺伝子の塩基配列は GenBank accession M83673に登録されている。
【００４５】
Burkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニットのアミノ酸配列に従って改変された配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列としては、配列番号９のヌクレオチド配列が挙げられる。
【００４６】
遺伝子の導入および遺伝子の発現
芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を発現するよう形質転換された微生物は、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子が連結された発現ベクターにより形質転換された微生物であることができる。
【００４７】
本発明による発現ベクターの構築の手順および方法並びに発現ベクターの宿主への導入および発現は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。プラスミドの作製並びにプラスミドの導入および発現は、例えば、"Vectors for cloning genes", Methods in Enzymology, 216, p. 469-631, 1992, Academic Press、および、"Other bacterial systems", Methods in Enzymology, 204, p.305-636, 1991, Academic Press 、および、石田功, 安東民衛 編, 遺伝子発現実験マニュアル, 1994, 講談社を参照できる。形質転換体の選択および培養条件は、例えば、Sambrook, J., Fritsch,  E. F., Maniatis, T., "Molecular cloning -A laboratory manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、または、財団法人 発酵研究所, LIST OF CULTURES 10th Edition, 1996を参照できる。
【００４８】
本発明による発現ベクターは、例えば、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子の上流にプロモーターを、また下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結し、場合によっては遺伝子マーカーおよび／または他の制御配列を作動可能に連結することにより作製できる。本発明による遺伝子へのプロモーターおよびターミネーターの連結、および発現ユニットのベクターへの挿入は、慣用方法に従って行うことができる。
【００４９】
芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を発現するよう形質転換された微生物は、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子をそのまま直接導入した微生物であってもよい。遺伝子の宿主への直接導入は慣用方法に従って行うことができる。
【００５０】
本発明において用いることができる代表的な微生物への外来遺伝子の導入およびその発現を概要すると下記の通りである。
【００５１】
（１）大腸菌
大腸菌への外来遺伝子の導入法は、ハナハンの方法、ルビジウム法などすでに確立されたいくつかの効率的方法があり、それを用いて行えばよい（例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch,  T.  Maniatis,  "Molecular cloning -A laboratory manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 参照）。大腸菌での外来遺伝子の発現は常法に従って行えばよいが（例えば、"Molecular cloning -A laboratory manual."、および、遺伝子発現実験マニュアル, 講談社 参照）、pUC系やpBluescript 系等のlacのプロモーター、または pT7-7等のT7のプロモーターを有する大腸菌用ベクターを用いて発現させてもよい。
【００５２】
（２）放線菌
Streptomyces lividans 等 いくつかの放線菌は、すでに宿主・ベクター系が確立されている。例えば、発現ベクター pIJ6021 は、薬剤耐性マーカー遺伝子として カナマイシン (Km) 耐性遺伝子を有しており、チオストレプトン (thiostrepton) で誘導をかけることができる (E. Takano, J. White, C. J. Thompson, M. J. Bibb, Gene, 166, 133-137, 1995 参照)。
【００５３】
（３）酵母
酵母Saccharomyces cerevisiae への外来遺伝子の導入法は、リチウム法などすでに確立された方法があり、それを用いて行えばよい（例えば、秋山裕一監修バイオインダストリー協会編集、「酵母のニューバイオテクノロジー」医学出版センター 刊参照）。酵母での外来遺伝子の発現は、PGK や GPD 等のプロモーターおよびターミネーターを用いて、外来遺伝子をこのプロモーターとターミネーターの間に転写のリードスルーを受けるように挿入した発現カセットを構築し、この発現カセットを、 S. cerevisiae のベクター、例えば、YRp系（酵母染色体のARS配列を複製起点とする酵母用マルチコピーベクター）、YEp系（酵母の２ μm DNAの複製起点を持つ酵母用マルチコピーベクター）、YIp系（酵母の複製起点を持たない酵母染色体組込み用ベクター）等のベクターに挿入することにより行うことができる（「酵母のニューバイオテクノロジー」医学出版センター刊、日本農芸化学会ABCシリーズ「物質生産のための遺伝子工学」朝倉書店刊、および、Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa, M., Ikenaga, H., Misawa, N., "Metabolic engineering for production of β-carotene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae".  Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1112-1114, 1994 参照）。
【００５４】
酵母Candida utilisへの外来遺伝子の導入法は、特開平8-173170号公報に従って実施できる。具体的にはシクロヘキシミド耐性遺伝子、G418耐性遺伝子、あるいはハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカー遺伝子を含んだプラスミドを直鎖状にした後、電気パルス法もしくはリチウム法によって、染色体上に組み込むことができる。外来遺伝子の発現には特開平8-173170号公報に記載されたGAP、PGKなどのプロモーターを使用することができる。
【００５５】
形質転換体の培養と基質の変換反応
形質転換された微生物の培養には通常の培養方法を用いることができる。この際、外来遺伝子である芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を運ぶベクターが脱落しないように、抗生物質添加などの適切な選択圧をかけることができる。培地としてはペプトン類、酵母エキス、糖類および無機物が使用できる。培養法としては、液体培養法が最も適している。培養温度は16〜40℃、特に20〜30℃が適当であり、培養中の培地のpHは4〜10、特にpH6〜8に維持することが望ましい。さらに、芳香環ジオキシゲナーゼを菌体内で多量につくらせるために遺伝子を誘導することが好ましい。例えば、組換え大腸菌の場合は、菌体をOD600 nmが１位まで増殖させた後にIPTGで誘導することができる。さらに、基質を添加した後、通常半日〜4日間、共存培養を行うと、変換産物が培地中または菌体中に生成蓄積される。変換の程度は、HPLC分析により明らかにすることができる。
【００５６】
生成産物のHPLC分析には種々の方法が適用可能だと思われるが、種々の複素環化合物とその産物を１つのカラムで効率的に分離させるには、C18カラムを用いてグラジエントをかけて行うのが好ましい。また、ピークの紫外吸収スペクトルの解析を効率的に行うために、フォトダイオードアレイ検出器を用いるのが好ましい。
宿主として大腸菌を使用した場合の培養と変換反応は、例えば、下記のようにして実施できる。
【００５７】
一般に、大腸菌を始めとする多くの微生物は、15〜50％のグリセロールに懸濁し、−70〜−80℃のディープフリーザーに入れることで半永久的に保存できる (グリセロール保存)。従って形質転換体の保存に際しては、形質転換体をグリセロール保存株とすることができる。
【００５８】
生成物の精製と同定
生成物の精製は、一般的な有機低分子化合物の精製に用いられる合目的的な任意の方法を用いることができる。
【００５９】
生成物は抽出の原理に基づいて精製することができる。培養濾液中の生成物についてはこれを水不混和性の有機溶媒、例えば酢酸エチルなどで抽出する方法、あるいは菌体内の生成物についてはろ過、遠心分離などで得た菌体をメタノール、エタノール、アセトンなどで回収する方法などが挙げられる。菌体を分離せずに培養物そのままを上記の抽出操作に付すこともできる。適当な溶媒を用いた向流分配法も抽出の範疇にいれることができる。
【００６０】
生成物はまた吸着の原理に基づいて精製することができる。既に液状となっている生成物含有物、例えば培養濾液あるいは上記のようにして抽出操作を行うことにより得られる抽出液を、適当な吸着剤、例えばシリカゲル、活性炭、「ダイヤイオンHP-20」（三菱化成社製）で処理して目的の生成物を吸着させ、その後適当な溶媒にて溶離させることによって生成物を得ることができる。このようにして得られた生成物溶液を減圧濃縮乾固すれば、生成物粗標品を得ることができる。
【００６１】
このようにして得られた生成物粗標品を更に精製するためには、上記の抽出法および吸着法にゲル濾過法、高速液体クロマトグラフィーなどを必要に応じて組み合わせて必要回数行えばよい。例えばシリカゲルなどの吸着剤、「セファデックスLH-20」（ファルマシア社製）などのゲル濾過剤を用いたカラムクロマトグラフィー、「YMCパック」（山村科学社製）などを用いた高速液体クロマトグラフィーおよび向流分配法を適宜組み合わせて実施することができる。
【００６２】
生成物の同定は、1H-NMRおよび13C-NMRスペクトル分析、およびMSスペクトル分析等により行うことができる。
【００６３】
複素環化合物および水酸化された複素環化合物
本明細書において「複素環化合物」とは分子内に複素環式基を有する化合物を意味する。
【００６４】
本明細書において「複素環式基」とは窒素原子、酸素原子、および硫黄原子からなる群から選択される１以上の異種原子を含んでなる単環式または二環式の環状基であって、置換基により置換されていてもよいもの、を意味する。
【００６５】
「複素環式基」の例としては、Ｃ１−４アルキル基により置換されていてもよい５〜７員の飽和または不飽和の単環性複素環式基、およびＣ１−４アルキル基により置換されていてもよい９〜１１員の飽和または不飽和の二環性複素環式基が挙げられる。
【００６６】
「複素環式基」を構成する複素環の具体的な例としては、キノリン、インドール、インダノン、ベンゾチアゾール、ベンゾキサゾール、ピリジン、３−メチルピリジン、ピリミジン、ピロール、ピラゾール、３−メチルピラゾール、イミダゾール、イソチアゾール、ベンゾフラン、チオフェン、クロモン（４Ｈ−クロメン−４−オン）、クロマン−４−オン、６−ヒドロキシ−クロマン−４−オン、およびフタルイミドが挙げられる。
【００６７】
複素環化合物中の複素環式基がベンゾキサゾールであるとき、水酸化された複素環化合物は中の複素環式基はｃｉｓ−４，５−ジヒドロベンゾキサゾールジオールであることができる。
【００６８】
複素環化合物中の複素環式基がインドールであるとき、水酸化された複素環化合物中の複素環式基は５−ヒドロキシインドールであることができる。
【００６９】
複素環化合物中の複素環式基がピラゾールであるとき、水酸化された複素環化合物中の複素環式基は４−ヒドロキシピラゾールであることができる。
【００７０】
複素環化合物中の複素環式基がピリジンであるとき、水酸化された複素環化合物中の複素環式基は３−ヒドロキシピリジンであることができる。
【００７１】
複素環化合物中の複素環式基がベンゾフランであるとき、水酸化された複素環化合物中の複素環式基は５−ヒドロキシベンゾフランまたは６−ヒドロキシベンゾフランであることができる。
【００７２】
複素環化合物中の複素環式基がチオフェンであるとき、水酸化された複素環化合物は中の複素環式基は２，３−ジヒドロキシ−２，３−ジヒドロチオフェンであることができる。
【００７３】
複素環化合物は、複素環式基の他に非置換のフェニル基を有していてもよく、具体的には、式（Ｉ）
Ｈｅｔ−Ａｌｋｙｌ−Ｒ１    （Ｉ）
（式中、Ｈｅｔは複素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは結合または炭素数１〜４の分岐していてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ１は非置換フェニル基を表す）
を表すことができる。
【００７４】
複素環化合物が式(Ｉ)である場合、水酸化された複素環化合物は、式(Ｉ’)
Ｈｅｔ−Ａｌｋｙｌ−Ｒ１’    （Ｉ’）
（式中、ＨｅｔおよびＡｌｋｙｌは式（Ｉ）で定義した内容と同義であり、Ｒ１’は下記基：
【化２】
0004972255.tif 000002
のいずれかを表す）
を表すことができる。
【００７５】
式（Ｉ）および式（Ｉ’）においてＡｌｋｙｌは好ましくは−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは０〜４の整数を表す）を表す。
【００７６】
Ａｌｋｙｌが結合を表すとき、すなわちｎが０であるとき、複素環化合物は、複素環フェニル、すなわち複素環基とフェニル基とが単結合してなる化合物である。基質が「複素環フェニル」である場合、反応産物として複素環基−ｃｉｓ−２，３−ジヒドロベンゼンジオール（複素環基−ｃｉｓ−２，３−ジヒドキシシクロヘキサ−４，６−ジエン、フェニル基の２位と３位がｃｉｓ−ジオールになったもの）を立体特異的反応により得ることができる。基質が「複素環フェニル」である場合、フェニル基の２位に１つの水酸基を導入することもできる。この場合の基質としては２−フェニルインドール、３−メチル−１−フェニルピラゾールが挙げられる。
【００７７】
Ａｌｋｙｌがメチレンであるとき、すなわちｎが１であるとき、複素環化合物は、複素環ベンジル、すなわち複素環基とフェニル基がメチレンを介して結合してなる化合物である。基質が「複素環ベンジル」である場合、反応産物として複素環基−メチレン−ｃｉｓ−２，３−ジヒドロベンゼンジオール（複素環基−メチレン−ｃｉｓ−２，３−ジヒドキシシクロヘキサ−４，６−ジエン、フェニル基の２位と３位がｃｉｓ−ジオールになったもの）を立体特異的反応により得ることができる。基質が「複素環ベンジル」である場合、フェニル基の２位に１つの水酸基を導入することもできる。この場合の基質としては４−ベンジルイソチアゾールが挙げられる。
【００７８】
式（Ｉ）においてＨｅｔがインドールであるとき、水酸化された複素環化合物は式（Ｉ）の化合物であってＨｅｔが５−ヒドロキシインドールであるものを表すことができる。
【００７９】
式（Ｉ）においてＨｅｔがピラゾールであるとき、水酸化された複素環化合物は式（Ｉ）の化合物であって、Ｈｅｔが４−ヒドロキシピラゾールであるものを表すことができる。
【００８０】
医薬品や化成品の製造においてｃｉｓ−ジオール体をビルディングブロックとする有機合成反応が知られている（例えば、T. Hudlicky, A. J. Thorpe, Chem. Commun., 1993-2000, 1996、D. R. Boyd, G. N. Sheldrake, Natural Product Report, 309-324, 1998, または T. Hudlicky, D. Gonzalez, D. T. Gibson, Aldrichimia Acta, Vol. 32, Number 2, 35-62, 1999 参照)。従って、得られたｃｉｓ−ジオール体は、医薬品や他の化成品に繋げるための化学合成法のビルディングブロックの製造法として有用である。
【００８１】
複素環化合物はまた、複素環式基の他に置換されたフェニル基を有していてもよく、具体的には、式（ＩＩ）
Ｈｅｔ−Ａｌｋｙｌ−Ｒ２    （ＩＩ）
（式中、Ｈｅｔは複素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは結合または炭素数１〜４の分岐していてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基または水酸基により置換されたフェニル基を表す）
を表すことができる。
【００８２】
式（ＩＩ）においてＨｅｔはベンゾキサゾールまたはピリジンを表し、Ｒ２は２−ヒドロキシフェニルまたは４−メチルフェニルを表すことができる。
【００８３】
複素環化合物が式（ＩＩ）である場合、水酸化された複素環化合物は、式（ＩＩ’）
Ｈｅｔ’−Ａｌｋｙｌ−Ｒ２    （ＩＩ’）
（式中、Ｒ２およびＡｌｋｙｌは式（ＩＩ）で定義した内容と同義であり、Ｈｅｔ’は１または２の水酸基により置換された複素環式基を表す）
を表すことができる。式（ＩＩ’）の化合物は、水酸基が複素環式基に導入されていることを特徴とする。
【００８４】
式（ＩＩ）および式（ＩＩ’）においてＡｌｋｙｌは好ましくは−（ＣＨ２）ｐ−（ｐは０〜４の整数を表す）を表す。
【００８５】
式（ＩＩ）においてＨｅｔがベンゾキサゾールを表し、Ｒ２が２−ヒドロキシフェニルを表す場合、式（ＩＩ’）においてＨｅｔ’は４，５−ジヒドロキシ−４，５−ジヒドロベンゾキサゾールであることができる。
【００８６】
式（ＩＩ）においてＨｅｔがピリジンを表し、Ｒ２が４−メチルフェニルを表す場合、式（ＩＩ’）においてＨｅｔ’は３−ヒドロキシピリジンであることができる。
【００８７】
複素環化合物は更にまた、複素環式基の他に炭化水素鎖を有していてもよく、具体的には、複素環化合物は、式（ＩＩＩ）
Ｈｅｔ−Ａｌｋｙｌ−Ｈ    （ＩＩＩ）
（式中、Ｈｅｔは複素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは炭素数１〜８の分岐していてもよいアルキレン鎖を表す）
を表すことができる。
Ｈｅｔはベンゾフランまたはチオフェンを表すことができる。
【００８８】
複素環化合物が式（ＩＩＩ）である場合、水酸化された複素環化合物は、式（ＩＩＩ’）
Ｈｅｔ’−Ａｌｋｙｌ−Ｈ    （ＩＩＩ’）
（式中、Ｈｅｔ’は１または２の水酸基により置換された複素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは式（ＩＩＩ）で定義された内容と同義である）
を表すことができる。式（ＩＩＩ’）の化合物は、水酸基が複素環式基に導入されていることを特徴とする。
【００８９】
式（ＩＩＩ）および式（ＩＩＩ’）においてＡｌｋｙｌは好ましくは−（ＣＨ２）ｒ−（ｒは１〜８の整数を表す）を表す。
【００９０】
式（ＩＩＩ）においてＨｅｔがベンゾフランを表す場合、式（ＩＩＩ’）においてＨｅｔ’は３−ヒドロキシベンゾフランまたは４−ヒドロキシベンゾフランであることができる。
【００９１】
式（ＩＩＩ）においてＨｅｔがチオフェンを表す場合、式（ＩＩＩ’）においてＨｅｔ’は２，３−ジヒドロキシ−２，３−ジヒドロチオフェンであることができる。
【００９２】
本発明による製造法において、複素環化合物（基質）および水酸化された複素環化合物（反応産物）は、好ましくは、下記組み合わせから選択できる。
【００９３】
0004972255.tif 000003
0004972255.tif 000004
上記複素環化合物の化学構造は図４および図５に示される通りである。上記水酸化された複素環化合物の絶対立体配置は図６および図７に示される通りである。
【００９４】
本発明において用いることができる複素環化合物としては更に、フラボノイド、例えば、フラボン、フラバノン、または６−ヒドロキシフラバノンが挙げられる。フラボノイドおよび水酸化されたフラボノイドは、それぞれ式（Ｉ）および式（Ｉ’）で表すことができる。この場合式（Ｉ）および式（Ｉ’）において、Ｈｅｔは、クロモン（４Ｈ−クロメン−４−オン）またはクロマン−４−オン、６−ヒドロキシ−クロマン−４−オンであることができる。
【００９５】
水酸化されたフラボノイドとしては、フラボノイドの２’，３’−ジヒドロキシ体、２’−ヒドロキシ体、および３’−ヒドロキシ体、例えば、２’，３’−ジヒドロキシフラボン、３’−ヒドロキシフラボン、２’，３’−ジヒドロキシフラバノン、２’，−ヒドロキシフラバノン、３’−ヒドロキシフラバノン、２’，６−ジヒドロキシフラバノン、および３’，６−ジヒドロキシフラバノンが挙げられる。
【００９６】
本発明による製造法において、フラボノイド（基質）および水酸化されたフラボノイド（反応産物）は、好ましくは、下記組み合わせから選択できる。
【００９７】
フラボノイド              水酸化されたフラボノイド
フラボン                    ２’，３’−ジヒドロキシフラボン
フラボン                    ３’−ヒドロキシフラボン
フラバノン                  ２’，３’−ジヒドロキシフラバノン
フラバノン                  ２’−ヒドロキシフラバノン
フラバノン                  ３’−ヒドロキシフラバノン
６−ヒドロキシフラバノン    ２’，６−ジヒドロキシフラバノン
６−ヒドロキシフラバノン    ３’，６−ジヒドロキシフラバノン
上記フラボノイドの化学構造は図８に示される通りである。上記水酸化されたフラボノイドの化学構造は図９に示される通りである。
【００９８】
本発明において用いることができる複素環化合物としては更に、芳香環を有するフタルイミド誘導体、例えば、２−（１−フェニルエチル）−１，３−イソインドールイネジオンおよび２−（１，２，３，４−テトラハイドロ−１−ナフタレニル）−１，３−イソインドールイネジオンが挙げられる。芳香環を有するフタルイミド誘導体および水酸化された芳香環を有するフタルイミド誘導体は、それぞれ式（Ｉ）および式（Ｉ’）で表すことができる。この場合式（Ｉ）および式（Ｉ’）において、Ｈｅｔはフタルイミドであることができる。
【００９９】
水酸化された芳香環を有するフタルイミド誘導体としては、その芳香環内またはベンジル位がヒドロキシ化されたヒドロキシ体、例えば、２−［１−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−１，３−イソインドールイネジオンおよび２−（４−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラハイドロ−１−ナフタレニル）−１，３−イソインドールイネジオンが挙げられる。
【０１００】
本発明による製造法において、芳香環を有するフタルイミド誘導体（基質）および水酸化された芳香環を有するフタルイミド誘導体（反応産物）は、好ましくは、下記組み合わせから選択できる。
【０１０１】
0004972255.tif 000005
上記芳香環フタルイミド誘導体の化学構造は図８に示される通りである。上記水酸化された芳香環フタルイミド誘導体の化学構造は図９に示される通りである。
【０１０２】
芳香族カルボン酸および水酸化された芳香族カルボン酸
本明細書において「芳香族カルボン酸」とは分子内にカルボキシル基を有する芳香族化合物を意味する。
【０１０３】
本明細書において「芳香族化合物」の具体的な例としては、ベンゼン、ナフタレンが挙げられる。
【０１０４】
芳香族カルボン酸はより具体的には、式（ＩＶ）
Ｒ３−Ａｌｋｙｌ−ＣＯＯＲ４    （ＩＶ）
（式中、Ｒ３は非置換炭素環式基を表し、Ａｌｋｙｌは結合または炭素数１〜４の分岐していてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ４は水素原子またはカルボキシル基の保護基を表す）、
で表すことができる。
【０１０５】
Ｒ３は好ましくは不飽和の５〜７員単環性炭素環式基または不飽和の９〜１１員二環性炭素環式基、より好ましくはフェニルおよびナフチルを表す。
【０１０６】
水酸化された芳香族カルボン酸は、式（ＩＶ’）
Ｒ３’−Ａｌｋｙｌ−ＣＯＯＲ４    （ＩＶ’）
（式中、ＡｌｋｙｌおよびＲ４は前記で定義した内容と同義であり、Ｒ３’は１または２の水酸基により置換された炭素環式基を表す）
で表すことができる。
【０１０７】
Ｒ３’は好ましくは１または２の水酸基により置換された不飽和の５〜７員単環性炭素環式基または不飽和の９〜１１員二環性炭素環式基、より好ましくは１または２の水酸基により置換されたフェニルおよびナフチルを表す。
【０１０８】
式（ＩＶ）および式（ＩＶ’）においてＡｌｋｙｌは、好ましくは、結合、メチレン、または−（ＣＨ）（−ＣＨ３）−を表す。
【０１０９】
本発明による製造法において、芳香族カルボン酸（基質）および水酸化された芳香族カルボン酸（反応産物）は、好ましくは、下記組み合わせから選択できる。
【０１１０】
芳香族カルボン酸              水酸化された芳香族カルボン酸
１−ナフトイック酸            ４−ヒドロキシ−１−ナフトイック酸
１−ナフチル酢酸              ４−ヒドロキシ−１−ナフチル酢酸
１−ナフチル酢酸              ５−ヒドロキシ−１−ナフチル酢酸
上記芳香族カルボン酸の化学構造は図８に示される通りである。上記水酸化された芳香族カルボン酸の化学構造は図９に示される通りである。
【０１１１】
Burkholderia cepacia LB400 株由来の芳香環ジオキシゲナーゼに従ってαサブユニットが改変されたPseudomonas pseudoalcaligenes由来のビフェニル ジオキシゲナーゼ(modified BphA1-BphA2-BphA3-BphA4 )は上記の複素環化合物をすべて水酸化できる。
【０１１２】
P. pseudoalcaligenes KF707 由来の芳香環ジオキシゲナーゼ (BphA1A2A3A4)を発現させて得られた培地も、種々の複素環化合物を変換できる。P. pseudoalcaligenes KF707 由来の芳香環ジオキシゲナーゼを用いる場合、基質としては、上記複素環化合物のうち２−フェニルピリジン、３−メチル−２−フェニルピリジン、４−フェニルピリミジン、および１−フェニルピラゾール以外の複素環化合物が好ましい。
【０１１３】
本発明によれば複素環化合物に水酸基を導入する方法が提供される。この方法は芳香環ジオキシゲナーゼを複素環化合物と反応させることを含んでなるもの、である。芳香環ジオキシゲナーゼには、上述のように、（１）Pseudomonas pseudoalcaligenes由来の芳香環ジオキシゲナーゼおよび芳香環ジオキシゲナーゼ活性を依然として有するその改変体、および（２）Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼに従ってαサブユニットが改変されたPseudomonas pseudoalcaligenes由来の芳香環ジオキシゲナーゼ(modified BphA1-BphA2-BphA3-BphA4 )が含まれる。
【０１１４】
本発明によればまた、複素環化合物を水酸化するための組成物が提供される。この組成物は、芳香環ジオキシゲナーゼを含んでなるもの、である。芳香環ジオキシゲナーゼには、上述のように、（１）Pseudomonas pseudoalcaligenes由来の芳香環ジオキシゲナーゼおよび芳香環ジオキシゲナーゼ活性を依然として有するその改変体、および（２）Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼに従ってαサブユニットが改変されたPseudomonas pseudoalcaligenes由来の芳香環ジオキシゲナーゼ(modified BphA1-BphA2-BphA3-BphA4 )が含まれる。本発明による組成物には、単離・精製された芳香環ジオキシゲナーゼを含むもののみならず、芳香環ジオキシゲナーゼを発現する微生物を培養することにより得られた液体培地も含まれる。
【０１１５】
【実施例】
以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【０１１６】
ここで用いられた通常の遺伝子組換え実験は、特に言及されていない場合は、標準的な方法（Sambrook, J., Fritsch,  E. F., Maniatis, T., "Molecular cloning -A laboratory manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に基づいている。
【０１１７】
実施例１：大腸菌発現用プラスミドの作製
1-1．Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来の biphenyl dioxygenase 遺伝子を含むプラスミド
Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 由来の biphenyl dioxygenase 遺伝子群 (bphA1A2A3A4) を 大腸菌ベクターpUC118のlacプロモーターの転写のリードスルーを受ける方向に挿入することにより、大腸菌における biphenyl dioxygenase 遺伝子発現用プラスミドであるpKF6622 を作製した。より具体的には、bphA1A2A3A4-bphB-bphC 遺伝子群を含む6.78 kb XhoI 断片 (A. Suyama, R. Iwakiri, N. Kimura, A. Nishi, K. Nakamura, K. Furukawa, J. Bacteriol., 178, 4039-4046, 1996、または、GenBank accession M83673 参照) をpUC118のXhoI部位に挿入した。次に、bphBとbphC内にまたがって存在していた1.43 kb PpuMI断片を、PpuMI消化, re-ligationにより欠失させた。これにより、bphA1A2A3A4 遺伝子のみを含む5.35 kb断片がpUC118のlacプロモーターの転写のリードスルーを受ける方向に挿入されたプラスミドpKF6622を得た。このpKF6622を大腸菌JM109株に導入することにより得られた形質転換体（大腸菌（pKF6622）：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３００）を以後の実験に用いた。
【０１１８】
1-2．改変biphenyl dioxygenase 遺伝子を含むプラスミド
Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ 大サブユニットをコードするDNA (bphA1) (この塩基配列は GenBank accession M86348に登録されている) と Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707株由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットをコードするDNA (bphA1) (この塩基配列は GenBank accession M83673に登録されている) を、共通のフランキング配列からなるbphA1 プライマーを用いたPCRにより単離した。bphA1 プライマーの塩基配列を示す下記の通りである。
【０１１９】
【表１】
0004972255.tif 000006
フォワード側にはSacI部位が、リバース側にはBglII部位があり (イタリックで示されている)、両側にさらにEcoRI部位が付与されている (アンダーラインで示されている)。PCRの条件は、94℃ 1 分、52℃ 1.5 分、72℃ 1 分で、25サイクルであった。
【０１２０】
単離された上記の2種類のbphA1 を混ぜ合わせ、0.15 ユニットのDnaseI (宝酒造) で15℃ 6 分間、分解処理した。10−50 bp DNA断片をアガロースゲルから回収後、混合し、セルフプライミングPCR, bphA1 プライマーを加えたPCRを行い、ランダムにアミノ酸配列が入れ替わった(DNA シャフリング)種々のキメラbphA1 を含むPCR産物を得た。なお、PCRは上記と同じ条件で行い、種々のキメラbphA1 を含むPCR産物は、SacI/BglIIで二重消化後、アガロースゲルから精製した。
【０１２１】
P. pseudoalcaligenes KF707株のbphA1A2A3A4-bphB-bphC 遺伝子群を含む発現プラスミドpJHF18 (Hirose, J., Suyama, A., Hayashida, S., Furukawa, K., Gene, 128, 27-33, 1994 参照) を有する大腸菌は、メタ開裂まで反応が進むので、ビフェニルを基質とした場合は メタ開裂産物として、2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acidを生成する。一般に、メタ開裂産物は黄色を呈するので、 434 nm でモニターすることが可能である。プラスミドpJHF18において、1ヵ所のMluI部位がbphA1内にあるので、MluIで消化, filled-in後、re-ligationを行うことにより、bphA1 のみを破壊したプラスミドpJHF18Δ MluIを作製した (T. Kumamaru, H. Suenaga, M. Mitsuoka, T. Watanabe, K. Furukawa, Nature Biotechnology, 16, 663-666, 1998 参照)。次に、pJHF18Δ MluIをSacI/BglIIで二重消化により、ΔbphA1 遺伝子をのみを含む1.39 kb断片を除き、代わりに、上記で作製した種々のキメラbphA1 を含むPCR産物 (SacI/BglIIで二重消化後のもの) を挿入し、種々の改変ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子 (modified bphA1::bphA2A3A4 遺伝子) と bphBbphC 遺伝子を含む種々のプラスミド (pSHF1000シリーズ) を得た。これら種々のプラスミドを有する大腸菌 XL1-Blue にビフェニール蒸気を充て、メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーを選抜し、以後の実験に用いた。メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーにおいては、DNA shufflingにより得られたmodified bphA1 遺伝子が正常に機能できることを意味している。
【０１２２】
ビフェニール蒸気により黄色を呈することができた、いくつかの大腸菌形質転換体のうちの１つ (この大腸菌に含まれるプラスミドをpSHF1072と命名) は、ビフェニルに対するメタ開裂の分解効率が、それぞれの親 (KF707およびLB400) のbphA1遺伝子を持つものより、２倍近く高かっただけでなく、それぞれの親 (KF707およびLB400) のbphA1遺伝子を持つものが分解できないベンゼンやトルエンをもメタ開裂により分解することができた。ただし、この分解効率は、P. putida F1 の相当遺伝子todC1 遺伝子を持つものの1/3位であった。
【０１２３】
次に、プラスミドpSHF1072に含まれるshuffled bphA1::bphA2A3A4 遺伝子群 が 大腸菌ベクターpUC118のlacプロモーターの転写のリードスルーを受ける方向に挿入された、改変biphenyl dioxygenase遺伝子発現用プラスミドpKF2072 を作製した。より具体的には、プラスミドpSHF1072からshuffled bphA1-bphA2A3A4-bphB-bphC 遺伝子群を含む6.78 kb XhoI 断片を切りだし、pUC118のXhoI部位に挿入した。次に、bphBとbphC内にまたがって存在していた1.43 kb PpuMI断片を、PpuMI消化, re-ligationにより欠失させた。これにより、shuffled bphA1 (pSHF1072由来)::bphA2A3A4 遺伝子のみを含む5.35 kb断片がpUC118のlacプロモーターの転写のリードスルーを受ける方向に挿入されたプラスミドpKF2072を得た。このpKF2072を大腸菌JM109株に導入することにより得られた形質転換体（大腸菌（pKF2072）：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９９）を以後の実験に用いた。
【０１２４】
実施例２：大腸菌形質転換体と基質の共存培養
実施例１で作製した2種類のフェレドキシン性の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を有する組換え大腸菌、すなわち、大腸菌 (pKF6622) および 大腸菌 (pKF2072) を、150 μg/mlのアンピシリン (Ap) を含むLB培地 (1％ トリプトン、0.5％酵母エキス、1％ NaCl) で対数期前半まで液体培養し、最終濃度が約30%になるようにグリセロールに懸濁し、−70〜−80℃のディープフリーザーに入れることにより、グリセロール保存株とした。また、コントロールとして、pUC118等のAp耐性のベクターのみを有する大腸菌 (JM109株) も同様に培養してグリセロール保存株を作製した。
【０１２５】
変換反応を開始するにあたって、まず、上記のグリセロール保存株から、必要な大腸菌形質転換体を白金耳で掻き取り、150 μg/mlのアンピシリン (Ap) を含むLB培地 4 mlに懸濁し、175 rpm、28℃で7〜8時間培養した (前培養)。次に、この前培養液を、150 μg/mlのAp、0.4％ (w/v) のグルコース、および 10 μg/mlのチアミン (thiamine) を含むM9培地 （Sambrook, J., Fritsch,  E. F., Maniatis, T., "Molecular cloning -A laboratory manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Appendex A・3 参照） 70 mlに入れ、175 rpm、28℃で16〜17時間 (一晩) 培養した (本培養)。これで、OD 600 nmが約1になる。これを8,000 rpm, 5分間、遠心分離して菌体のみを集めた後、最終濃度 1 mMのイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド (IPTG) と 5 mgの基質を含む70 mlのM9培地 (150 μg/mlのAp、0.4％ (w/v) のグルコース、および 10 μg/mlのチアミンを含む) に懸濁し、175 rpm、28℃で2〜3日間さらに培養を行った。なお、基質は、通常10 mg/mlの濃度になるようにエタノール等の溶媒に溶かしたものを 0.5 ml 加えた。培養2〜3日目に70 mlのメタノールを加え 30分間攪拌することにより脂質を抽出し、8,000 rpm, 5分間、遠心分離して上清を集め、脂質粗抽出液とした。たいていの場合、この状態で4℃で数週間 保存可能であったが、脂質抽出液は すぐにHPLC分析に供した。
【０１２６】
実施例３：変換産物のHPLC分析
実施例３で調製された脂質粗抽出液 80 μlを1回のinjectionに供した。Puresil C18カラム (4.6 mm x 250 mm, Waters) を用い、1 ml/minの速度でHPLCを行った。HPLCの本体装置として Waters社のアライアンスシステムを用い、フォトダイオードアレイ検出器として Waters 996型を用いた。展開溶媒の条件は、以下の通りである。
A液：水 / メタノール (50/50)
B液：メタノール / 2-プロパノール (60/40)
0〜5分 (A液)、5〜20分 (A液)→(B液) 凸型グラジエント(No 3, Waters)、20分~
(B液)
この条件では通常、33分以内に全化合物が分離された。230〜350nmの範囲で吸収極大値を示した波長（max plot）でモニターしたピークの面積比を変換率とした。
【０１２７】
この分析で変換が確認されたものについて次の精製・同定のステップに進めた。なお、精製・同定のステップに進める場合は、培養のスケールを 実施例２のスケールの10倍で行った。
【０１２８】
実施例４：各種基質を用いた変換実験
以下で用いた基質は、Sigma-Aldrich 社や東京化成などから購入した。
4-1．２−フェニルキノリンの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、２−フェニルキノリン（図４）の変換実験を行った。２−フェニルキノリンは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は ２−フェニルキノリンを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、89% および 53%であった。
【０１２９】
4-2．２−フェニルインドールの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、２−フェニルインドール（図４）の変換実験を行った。２−フェニルインドールは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は２−フェニルインドールを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、71% および 23%であった。なお、前者において、変換産物のピークは 3本観察された。
【０１３０】
4-3．３−フェニル−１−インダノンの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、３−フェニル−１−インダノン（図４）の変換実験を行った。３−フェニル−１−インダノンは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622)は３−フェニル−１−インダノンを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、97% および 93%であった。
【０１３１】
4-4．２−フェニルベンゾチアゾールの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、２−フェニルベンゾチアゾール（図４）の変換実験を行った。２−フェニルベンゾチアゾールは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF6622) および 大腸菌 (pKF2072) は２−フェニルベンゾチアゾールを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、81% および 36%であった。
【０１３２】
4-5．２−フェニルベンゾキサゾールの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、２−フェニルベンゾキサゾール（図４）の変換実験を行った。２−フェニルベンゾキサゾールは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は２−フェニルベンゾキサゾールを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、100% および 45%であった。
【０１３３】
4-6．２−フェニルピリジンの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、２−フェニルピリジン（図４）の変換実験を行った。２−フェニルピリジンは、10 mg/mlの濃度で 70% エタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) のみが明確に２−フェニルピリジンを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は 14%であった。大腸菌 (pKF6622) の場合は、変換産物は ほとんど観察されなかった。
【０１３４】
4-7．３−メチル−２−フェニルピリジンの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、３−メチル−２−フェニルピリジン（図４）の変換実験を行った。３−メチル−２−フェニルピリジンは、10 mg/mlの濃度で 70% エタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) のみが明確に３−メチル−２−フェニルピリジンを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は 16%であった。大腸菌 (pKF6622) の場合は、変換産物は ほとんど観察されなかった。
【０１３５】
4-8．４−フェニルピリミジンの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、４−フェニルピリミジン（図４）の変換実験を行った。４−フェニルピリミジンは、10 mg/mlの濃度で70% エタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) のみが明確に４−フェニルピリミジンを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は 100%であった。大腸菌 (pKF6622) の場合は、変換産物は ほとんど観察されなかった。
【０１３６】
4-9．１−フェニルピロールの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、１−フェニルピロール（図４）の変換実験を行った。１−フェニルピロールは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は１−フェニルピロールを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、両者とも 100%であった。
【０１３７】
4-10．１−フェニルピラゾールの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、１−フェニルピラゾール（図４）の変換実験を行った。１−フェニルピラゾールは、10 mg/mlの濃度で 70% エタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) の１株のみが明確に１−フェニルピラゾールを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は 47%であった。大腸菌 (pKF6622) の場合は、変換産物は ほとんど観察されなかった。
【０１３８】
4-11．３−メチル−１−フェニルピラゾールの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、３−メチル−１−フェニルピラゾール（図４）の変換実験を行った。３−メチル−１−フェニルピラゾールは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は３−メチル−１−フェニルピラゾールを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、100% および 63%であった。なお、前者において、変換産物のピークは 2本観察された。
【０１３９】
4-12．２−ベンジルピリジンの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、２−ベンジルピリジン（図５）の変換実験を行った。２−ベンジルピリジンは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は２−ベンジルピリジンを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、57% および 11%であった。
【０１４０】
4-13．１−ベンジルイミダゾールの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、１−ベンジルイミダゾール（図５）の変換実験を行った。１−ベンジルイミダゾールは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は１−ベンジルイミダゾールを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、97% および 43%であった。
【０１４１】
4-14．４−ベンジルイソチアゾールの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、４−ベンジルイソチアゾール（図５）の変換実験を行った。４−ベンジルイソチアゾールは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622)は４−ベンジルイソチアゾールを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、65% および 27%であった。なお、大腸菌 (pKF2072) において、変換産物のピークは 2本観察された。
【０１４２】
4-15．２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾキサゾールの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾキサゾール（図５）の変換実験を行った。２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾキサゾールは、5 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 1 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾキサゾールを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、39% および 25%であった。
【０１４３】
4-16．２−（ｐ−トリル）ピリジンの変換
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、２−（ｐ−トリル）ピリジン（図５）の変換実験を行った。２−（ｐ−トリル）ピリジンは、10 mg/mlの濃度で 70% エタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は２−（ｐ−トリル）ピリジンを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、96% および 61%であった。
【０１４４】
4-17．２−ｎ−ブチルベンゾフランの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、２−ｎ−ブチルベンゾフラン（図５）の変換実験を行った。２−ｎ−ブチルベンゾフランは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF6622) および 大腸菌 (pKF2072) は２−ｎ−ブチルベンゾフランを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、100% および 90%であった。なお、大腸菌 (pKF2072) において、変換産物のピークは 2本観察された。
【０１４５】
4-18．３−ｎ−ヘキシルチオフェンの変換実験
実施例２に示した方法により、2種類の組換え大腸菌 (コントロールも含む) を用いて、３−ｎ−ヘキシルチオフェン（図５）の変換実験を行った。３−ｎ−ヘキシルチオフェンは、10 mg/mlの濃度でエタノールに溶かしたもの 0.5 mlを 70 mlの本培養培地に添加し共存培養した。HPLC分析の結果、大腸菌 (pKF2072) および 大腸菌 (pKF6622) は３−ｎ−ヘキシルチオフェンを基質として利用し変換できることがわかった。変換率は、それぞれ、100% および 99%であった。
【０１４６】
実施例５：変換産物の精製・同定
5-1．２−フェニルキノリンの変換産物（図６）
大腸菌 (pKF2072) と２−フェニルキノリンの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス55 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１の溶媒で展開することにより、化合物1 （３−（２−キノリル）−３，５−シクロヘキサジエン−１，２−ジオール）(12mg) を純粋な物質として単離した。
化合物1 (3-(2-quinolyl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol) の物性
EI-MS(m/z): 239(M+)
1H-NMR: (500MHz, CDCl3):
4.50(dd,J=3.0,6.7,1H), 5.08(d,J=6.7,1H), 6.23(m,2H), 6.78(m,1H), 7.46(dd,J=6.7,6.7,1H), 7.49(dd,J=6.7,6.7,1H), 7.69(d,J=6.7,1H), 7.73(d,J=6.7,1H), 7.96(d,J=8.5,1H), 8.07(d,J=9.2,1H)
【０１４７】
5-2．２−フェニルインドールの変換産物（図６）
大腸菌 (pKF2072) と２−フェニルインドールの混合培養液 700mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス86mgを得た。エキスをシリカゲルカラム(Merck60，φ2cm x 30cm)に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１の溶媒で展開することにより、化合物2（３−（１H−２−インドリル）−３，５−シクロヘキサジエン−１,２−ジオール） (5mg), 化合物3（２−（１H−２−インドリル）フェノール） (10mg), 化合物4（２−フェニル−１H−５−インドロール） (7mg),をそれぞれ純粋な物質として単離した。
化合物2 (3-(1H-2-indolyl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol) の物性
EI-MS(m/z):225(M+)
1H-NMR(500MHz, DMSO-d6)
4.34(2H), 4.70(d,J=5.5,1H), 4.97(d,J=6.0,1H), 5.78(d,J=9.2,1H), 6.01(ddd,J=2.4,5.5,9.2), 6.50(d,J=5.5,1H), 6.61(s,1H), 6.94(dd,J=7.9,7.9,1H),  7.06(dd,J=7.9,7.9,1H), 7.30(d,J=7.3,1H), 7.47(d,J=7.3,1H), 11.11(s,1H)
化合物3 (2-(1H-2-indolyl) phenol)の物性
EI-MS(m/z): 209(M+)
1H-NMR: (500MHz, CDCl3):
5.63(brs,1H), 6.84(d,J=2.0,1H), 6.90(d,J=8.5,1H), 7.02(dd,J=7.3,7.3,1H), 7.12(dd,J=7.3,7.3,1H), 7.16-7.22(3H), 7.40(d,J=8.5,1H), 7.63(d,J=7.9,1H), 7.67(dd,J=2.0,7.9,1H)
化合物4 (2-phenyl-1H-5-indolol)の物性
EI-MS(m/z):209(M+)
1H-NMR:(500MHz, CDCl3):
6.60(dd,J=2.4,8.5,1H), 6.70(d,J=2.0,1H), 6.82(d,J=2.4,1H), 7.17(d,J=8.5,1H), 7.27(dd,J=7.3,7.3,1H), 7.42(dd,J=7.3,7.3,2H), 7.79(d,J=7.3,2H), 8.66(brs,1H), 11.19(s,1H)
【０１４８】
5-3．３−フェニル−１−インダノンの変換産物（図６）
大腸菌 (pKF2072) と３−フェニル−１−インダノンの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス57 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、ジクロロメタン：酢酸エチル＝２：１の溶媒で展開することにより、化合物5（３−（５，６−ジヒドロキシ−１,３−シクロヘキサジエニル）−１−インダノン） (10mg)を純粋な物質として単離した。
化合物5 (3-(5,6-dihydroxy-1,3-cyclohexadienyl)-1-indanone)の物性
EI-MS(m/z): 242(M+)
1H-NMR: (500MHz, CDCl3):
2.68(dd,J=3.1,18.9,1H), 3.01(dd,J=7.9,18.9,1H), 4.174.28(3H), 5.70(d,J=4.9,1H), 5.91(m,1H), 5.95(m,1H), 7.38(dd,J=7.3,7.3,1H), 7.45(d,J=7.3,1H), 7.58(dd,J=7.3,7.3,1H), 7.74(d,J=7.3,1H)
【０１４９】
5-4．２−フェニルベンゾチアゾールの変換産物（図６）
大腸菌 (pKF6622) と２−フェニルベンゾチアゾールの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス68 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、ジクロロメタン：酢酸エチル＝５：１の溶媒で展開することにより、化合物6（３−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−３，５−シクロヘキサジエン−１,２−ジオール） (32.5mg)を純粋な物質として単離した。
化合物6 (3-(1,3-benzothiazol-2-yl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol)の物性
EI-MS(m/z): 245(M+)
1H-NMR: (500MHz, CDCl3):
4.51(m,1H), 5.00(d,J=6.1,1H), 6.21(dd,J=4.9,9.2,1H), 6.26(dd,J=4.3,9.2,1H), 6.78(d,J=4.9,1H), 7.34(dd,J=7.3,7.3,1H), 7.44(dd,J=7.3,7.3), 7.81(d,J=7.3,1H), 7.94(d,J=7.3,1H)
【０１５０】
5-5．２−フェニルベンゾキサゾールの変換産物 (図6)
大腸菌 (pKF2072) と２−フェニルベンゾキサゾールとの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス65.4 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、CH2Cl2：酢酸エチル＝１：１の溶媒で展開することにより、化合物7（３−（１，３−ベンゾオキサゾール−２−イル）−３，５−シクロヘキサジエン−１，２−ジオール） (26.1mg)を純粋な物質として単離した。
化合物7（3-(1,3-benzoxazol-2-yl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol）の物性
EI-MS(m/z):229(M+)
1H-NMR: (500MHz, DMSO-d6)
4.41(m,1H), 4.62(dd,J=5.5, 5.5,1H), 4.97(d,J=5.5,1H), 5.18(d,J=7.1,1H), 6.08-6.15(2H), 7.10(d,J=4.9,1H), 7.33-7.40(2H), 7.68(dd,J=2.0, 6.7,1H), 7.72(dd,J=2.0, 6.7,1H)
【０１５１】
5-6．２−フェニルピリジンの変換産物（図６）
大腸菌 (pKF2072) と２−フェニルピリジンの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス50mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、CH2Cl2：MeOH＝40：1の溶媒で展開することにより、化合物8（３−（２−ピリジル）−３，５−シクロヘキサジエン−１,２−ジオール） (10mg)を純粋な物質として単離した。
化合物8（3-(2-pyridyl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol）の物性
EI-MS(m/z) 189(M+)
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6)
4.34(dd,J=2.5,5.5,1H), 4.56(d,J=5.5,1H), 5.89(d,J=10.2,1H), 6.04(ddd,J=3.0,5.5,9.8), 6.92(d,J=5.5,1H), 7.21(dd,J=4.9,8.0,1H), 7.63(d,J=8.0,1H), 7.75(dd,J=8.0,8.0,1H), 8.54(d,J=4.9,1H)
【０１５２】
5-7．３−メチル−２−フェニルピリジンの変換産物 (図6)
大腸菌 (pKF2072) と３−メチル−２−フェニルピリジンとの混合培養液 70 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。この70 μlを用いて HPLC分析を行った。産物のピークは、保持時間 5.88 分に見い出され、290 nmに吸収極大値 (λmax) を示した。化合物8の吸収スペクトル (λmax = 295 nm) との比較、及び保持時間より、化合物9の構造は、３−（３−メチルピリド−2−イル）−３，５−シクロヘキサジエン−１，２−ジオール[3-(3-methylpyrid-2-yl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol] であると結論された。
【０１５３】
5-8．４−フェニルピリジンの変換産物（図６）
大腸菌 (pKF2072) と４−フェニルピリジンの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを 7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス23.5 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム(Merck60，φ2cm x 30cm)に供し、CH2Cl2：MeOH＝30：1の溶媒で展開することにより、化合物10（３−（４−ピリミジニル）−３，５−シクロヘキサジエン−１，２−ジオール） (6.6mg)を純粋な物質として単離した。
化合物10（3-(4-pyrimidinyl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol）の物性
EI-MS:190(M+)
1H-NMR:(500MHz, CDCl3)
4.54(d,J=6.0,1H), 4.84(d,J=6.0,1H), 6.16-6.24(2H), 6.91(d,J=4.9,1H), 7.52(dd,J=1.8,5.5,1H), 8.66(d,J=5.5,1H), 9.11(d,J=1.8,1H)
【０１５４】
5-9．１−フェニルピロールの変換産物（図６）
大腸菌 (pKF2072) と１−フェニルピロールの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス 25 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１の溶媒で展開することにより、化合物11（３−（１H−１−ピロリル）−３，５−シクロヘキサジエン−１，２−ジオール） (5 mg) を純粋な物質として単離した。
化合物11 (3-(1H-1-pyrrolyl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol)の物性
EI-MS(m/z): 163(M+)
1H-NMR: (500MHz, CDCl3):
4.44(d,J=6.1,1H), 4.62(ddd,J=3.0,3.0,6.1,1H), 5.71(dd,J=2.4,9.8,1H), 5.91(d,J=6.1,1H), 5.97(ddd,J=2.4,6.1,9.8,1H), 6.26(dd,J=2.4,2.4,2H), 6.99(dd J=2.4,2.4,2H)
【０１５５】
5-10．１−フェニルピラゾールの変換産物 (図7)
大腸菌 (pKF2072) と１−フェニルピラゾールの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。培養液700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7000 rpm, 10min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス55mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝２：１の溶媒で展開することにより、化合物12（４−ヒドロキシ−１−フェニルピラゾール） (7.0 mg)を純粋な物質として単離した。
化合物12 (4-hydroxy-1-phenyl pyrazole) の物性
EI-MS(m/z): 160
1H-NMR: (500MHz, CDCl3)
7.16-7.22(1H), 7.34-7.38(3H), 7.50-7.55(3H)
【０１５６】
5-11．３−メチル−１−フェニルピラゾールの変換産物（図７）
大腸菌 (pKF2072) と３−メチル−１−フェニルピラゾールの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス68mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、CH2Cl2：MeOH＝20：1(stepwise)の溶媒で展開することにより、化合物13（３−（３−メチルピラゾール−１−イル）−３，５−シクロヘキサジエン−１，２−ジオール） (18mg), 化合物14（２−（3−メチルピラゾール−１−イル）フェノール） (19mg)を純粋な物質として単離した。
化合物13（3-(3-methylpyrazol-1-yl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol）の物性
EI-MS(m/z):192(M+)
1H-NMR:(500MHz, CDCl3)
2.28(s,3H), 4.54(m,1H), 4.81(d,J=6.0,1H), 5.86(dd,J=3.0,5.0,1H), 6.00-6.08(2H), 6.15(d,J=2.5,1H), 7.65(d,J=2.5,1H)化合物14（2-(3-methylpyrazol-1-yl)-phenol）の物性
EI-MS(m/z):174(M+)
1H-NMR:(500MHz, CDCl3)
2.31(s,3H), 6.20(d,J=2.5,1H), 6.82(dd,J=7.4,7.4,1H), 7.03(d,J=7.4,1H), 7.09(dd,J=7.4,7.4,1H), 7.25(d,J=7.4,1H), 7.81(d,J=2.5,1H), 11.53(s,1H)
【０１５７】
5-12．２−ベンジルピリジンの変換産物 (図7)
大腸菌 (pKF2072) と２−ベンジルピリジンの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス55 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、CH2Cl2：MeOH＝5０：１の溶媒で展開することにより、化合物15（３−（２−ピリジルメチル）−３，５−シクロヘキサジエン−１，２−ジオール） (5.6mg)を純粋な物質として単離した。
化合物15（3-(2-pyridylmethyl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol）の物性
EI-MS(m/z): 203(M+)
1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)
3.55-3.62(2H), 3.82(m,1H), 4.03(m,1H), 5.57(d,J=4.9,1H), 5.66(dd,J=3.0, 9.7,1H), 5.80(m,1H), 7.21(dd,J=5.5, 6.0,1H), 7.27(d,J=7.6,1H), 7.70(ddd,J=4.9, 6.0, 7.6,1H), 8.46(d,J=5.5,1H)
【０１５８】
5-13．１−ベンジルイミダゾールの変換産物（図７）
大腸菌 (pKF2072) と１−ベンジルイミダゾールの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを 7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス65mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、CH2Cl2：MeOH＝7：1の溶媒で展開することにより、化合物16（３−（１H−１−イミダゾリルメチル）−３，５−シクロヘキサジエン−１，２−ジオール） (2mg)を純粋な物質として単離した。
化合物16（3-(1H-1-imidazolylmethyl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol）の物性EI-MS(m/z):192(M+)
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)
3.72(m,1H), 4.00(m,1H), 4.62(d,J=15.9,1H), 4.77(d,J=15.9,1H), 5.58(d,J=5.5,1H), 5.75(dd,J=3.0, 9.1,1H), 5.82(m,1H), 6.89(s,1H), 7.10(s,1H), 7.61(s,1H)
【０１５９】
5-14．４−ベンジルイソチアゾールの変換産物（図７）
大腸菌 (pKF2072) と４−ベンジルイソチアゾールの混合培養液700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを 7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス34mgを得た。エキスをシリカゲルカラム(Merck60，φ2cm x 30cm)に供し、CH2Cl2：MeOH＝40：1の溶媒で展開することにより、化合物17（３−（４−イソチアゾリルメチル）−３，５−シクロヘキサジエン−１，２−ジオール） (8.0mg), 化合物18（２−（４−イソチアゾリルメチル）フェノール） (6.5mg)を純粋な物質として単離した。
化合物17（3-(4-isothiazolylmethyl)-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol）の物性
EI-MS(m/z):209(M+)
1H-NMR:(500MHz, DMSO-d6)
3.52(d,J=16.5,1H), 3.62(d,J=16.5,1H), 3.78(dd,J=6.0,6.0,1H), 4.03(m,1H), 4.61(d,J=6.7,1H), 4.66(d,J=6.0,1H), 5.55(d,J=5.5,1H), 5.68(dd,J=3.0,9.8,1H), 5.80(dd,J=5.5,9.8,1H), 8.42(s,1H), 8.70(s,1H)化合物18（2-(4-isothiazolylmethyl)phenol）の物性
EI-MS(m/z):191(M+)
1H-NMR:(500MHz, DMSO-d6)
3.93(s,2H), 6.71(dd,J=7.4,7.4,1H), 6.80(d,J=7.4,1H), 7.02(dd,J=7.4,1H), 7.06(d,J=7.4,1H), 8.43(s,1H), 8.59(s,1H), 8.72(s,1H)
【０１６０】
5-15．２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾキサゾールの変換産物（図７）
大腸菌 (pKF2072) と２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾキサゾールの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス40 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム(Merck60，φ2cm x 30cm)に供し、ジクロロメタン：酢酸エチル＝１０：１の溶媒で展開することにより、化合物19（２−（２−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−１，３−ベンゾオキサゾール−４，５−ジオール） (7.8mg)を純粋な物質として単離した。
化合物19 (2-(2-hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-1,3-benzoxazole-4,5-diol)の物性
EI-MS(m/z): 243(M+)
1H-NMR: (500MHz, DMSO-d6):
4.50(2H), 5.22(d,J=5.5,1H), 5.33(d,J=6.7,1H), 5.95(d,J=10.0,1H), 6.57(dd,J=2.4,10.0,1H), 7.00(dd,J=7.3,7.3,1H), 7.04(d,J=8.6,1H), 7.39(dd,J=7.3,8.6,1H), 7.79(d,J=7.3,1H), 10.92(s,1H)
【０１６１】
5-16．２−（ｐ−トリル）ピリジンの変換産物（図７）
大腸菌 (pKF2072) と２−（ｐ−トリル）ピリジンの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス65mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm) に供し、ジクロロメタンで展開することにより、化合物20（２−（４−メチルフェニル）−３−ピリジオール） (9mg)を純粋な物質として単離した。
化合物20 (2-(4-methylphenyl)-3-pyridiol)の物性
EI-MS(m/z): 185(M+)
1H-NMR: (500MHz, DMSO-d6):
2.33(s,3H), 7.15(dd,J=4.3,7.9,1H), 7.21(d,J=7.9,2H), 7.29(d,J=7.9,1H), 7.91(d,J=7.9,2H), 8.11(d,J=4.3,1H), 10.06(s,1H)
【０１６２】
5-17．２−ｎ−ブチルベンゾフランの変換産物（図７）
大腸菌 (pKF2072) と２−ｎ−ブチルベンゾフランの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス45 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム(Merck60，φ2cm x 30cm)に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１の溶媒で展開することにより、化合物21（２−ブチルベンゾ［ｂ］フラン−６−オール） (17mg), 化合物22（２−ブチルベンゾ［ｂ］フラン−５−オール） (5mg)をそれぞれ純粋な物質として単離した。
化合物21 (2-butylbenzo[b]furan-6-ol)の物性
EI-MS(m/z): 190(M+)
1H-NMR: (500MHz, CDCl3):
0.91(t,J=7.3,3H), 1.37(m,2H), 1.67(m,2H), 2.68(m,2H), 4.81(s,1H), 6.24(s,1H), 6.67(dd,J=2.4,7.9,1H), 6.88(s,1H), 7.24(d,J=7.9,1H)
22 (2-butylbenzo[b]furan-5-ol)の物性
EI-MS(m/z):190(M+)
1H-NMR:(500MHz, CDCl3):
0.91(t,J=7.3,3H), 1.37(m,2H), 1.67(m,2H), 2.67(m,2H), 4.58(s,1H), 6.23(s,1H), 6.76(dd,J=2.0,8.0,1H), 6.84(d,J=2.0,1H), 7.21(d,J=8.0,1H)
【０１６３】
5-18．３−ｎ−ヘキシルチオフェンの変換産物（図７）
大腸菌 (pKF2072) と３−ｎ−ヘキシルチオフェンの混合培養液 700 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7,000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス37.5 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム (Merck60，φ2cm x 30cm)に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝5：１の溶媒で展開することにより、化合物23（４−ヘキシル−２，３−ジヒドロ−２，３−チオフェンジオール） (10mg)を純粋な物質として単離した。
【０１６４】
化合物23（4-hexyl-2,3-dihydro-2,3-thiophenediol）の物性
EI-MS(m/z):202(M+)
1H-NMR:(500MHz, CDCl3)
0.88(t,J=7.3,3H), 1.22-1.55(8H), 2.16(t,J=7.3,2H), 4.53(s,1H), 5.54(s,1H), 5.82(s,1H)
【０１６５】
実施例６：各種変換産物の立体構造の決定
１，２−ジヒドロキシ−３，５−シクロヘキサジエン構造を有する化合物の絶対立体配置を決定するために、まずこれらの化合物を(R)-2NMA(メトキシ−（２−ナフチル)酢酸）および(s)-2NMAとのジエステル体へ導き、その１H-NMRを計測した。それぞれのエステル化合物のシグナルの化学シフト値(δ)を正確に計測し、Δδ（δRester-δSester)を算出した。このΔδ値の分布を検討することによりその絶対立体配置を決定することができた（図６および図７参照）。図６および図７中の番号は実施例５の化合物番号に対応する。
【０１６６】
実施例７：組換え放線菌を用いた変換実験
プラスミドpKF2072をSacI/SmaIで二重消化後、modified bphA1::bphA2A3A4 を含む4.06 kb断片を切り出した。そして、放線菌用ベクターpIJ6021 (E. Takano, J. White, C. J. Thompson, M. J. Bibb, Gene, 166, 133-137, 1995 参照) をNdeI-HindIIIで二重消化後、上記の4.06 kb-SacI-HindIII断片と、合成DNA 5`-TATGAGCT-3` を加えて アニーリング後、Klenow断片酵素で処理した後、ligation反応を行った。大腸菌JM109株を形質転換後、目的とするプラスミドpIJ-2072を得た。pIJ-2072において、放線菌の強力なプロモーター PtipA と そのリボソーム結合部位のすぐ下流に、modified bphA1 遺伝子が置かれ、bphA2A3A4 遺伝子と続くようにデザインされている。すなわち、5'の結合部位は、GAGAAGGGAGCGGACATATGAGCTCATC となっている。下線は、リボソーム結合部位であり、１８〜２０番目のATGから modified bphA1 遺伝子が始まっている。このプラスミドpIJ-2072を用いて、放線菌Streptomyces lividans TK21 (D. A. Hopwood, M. J. Bibb, K. F. Chater et al, Genetic manipulation of Streptomyces: A laboratory manual, The John Innes Institute, Norwich, 1985 参照) を形質転換した。
【０１６７】
得られた形質転換体を 5μg/ml のカナマイシンを含むYEME培地 (前述のHopwoodらの単行本参照) で 30℃で 対数期後半まで培養後、PtipA プロモーターの誘導をかけるため5μg/ml のチオストレプトン (thiostrepton) を加え、さらに、30℃で 24時間培養した。そして、菌体を最小培地（前述のHopwoodらの単行本参照）で洗浄した後、再び、この最小培地に 菌体濃度が 10 mg(生重量)/mlになるように懸濁し、さらに、最終濃度が0.1 mg/mlになるように、基質の例として２−フェニルキノリンを加え、30℃で 2日間培養した。実施例２, 実施例３に示した方法により、培養物から脂溶性画分を抽出後 HPLC分析を行った。その結果、２−フェニルキノリンは、ほぼ 100%、ジオール体 (図６の 1) に変換されたことがわかった。
【０１６８】
実施例８：フラボノイドの変換反応
８−１．フラボノイドの変換実験
実施例７に示した方法と同様の方法により、組換え放線菌(pIJ-2072)を用いて、フラボン、フラバノン、6-ヒドロキシフラバノン(図８)の変換実験を行った。より詳細には、これらの基質を、それぞれ、1 mMの最終濃度で、菌体 [10 mg(生重量)/ml]入りの最小培地 1000 mlに加え、30℃、2日間、共存培養を行うことにより変換実験を行った。
【０１６９】
８−２．フラボンの変換産物(図９)
組換え放線菌とフラボンとの混合培養液1000 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス250 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム[Silica Gel 60 (Merck), φ 2 cm x 15 cm]に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→１：１の溶媒で展開することにより、24 (12 mg)、25 (2.4 mg)を純粋な物質として単離した。
24, 25は各種スペクトルデータ(EI-MS, NMR)の解析により、それぞれ
24： 2’,3’-ジヒドロキシフラボン (2’,3’-dihydroxyflavone)
25： 3’-ヒドロキシフラボン (3’-hydroxyflavone)   と同定した。
【０１７０】
８−３．フラバノンの変換産物(図９)
組換え放線菌とフラバノンとの混合培養液1000 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7000 rpm, 1 0min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス300 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム [Silica Gel 60 (Merck), φ 2 cm x 15 cm]に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝３：１の溶媒で展開することにより、26 (13.2 mg), 27 (4.4 mg), 28 (4.6 mg)を純粋な物質として単離した。
26, 27, 28は各種スペクトルデータ(EI-MS, NMR)の解析により、それぞれ
26： 2’, 3’- ジヒドロキシフラバノン(2’, 3’-dihydroxyflavanone)
27： 2’-ヒドロキシフラバノン (2’-hydroxyflavanone)
28： 3’-ヒドロキシフラバノン (3’-hydroxyflavanone)   と同定した。
【０１７１】
26 [2’, 3’-dihydroxyflavanone]の物性
EI-MS (m/z): 256 (M+)
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)
2.76 (dd, J=3.0, 16.5, 1H), 3.16 (dd, J=13.0, 16.5, 1H), 5.78 (dd, J=3.0, 13.0, 1H), 6.70 (dd, J=7.9, 7.9), 6.80 (dd, J=1.2, 7.9, 1H), 6.93 (dd, J=1.2, 7.9, 1H), 7.07 (d, J=7.9), 7.08 (dd, J=7.9, 7.9, 1H), 7.57 (ddd, J=1.8, 7.9, 7.9), 7.79 (dd, J=1.8, 7.9, 1H)
【０１７２】
８−４．6-ヒドロキシフラバノンの変換産物(図９)
組換え放線菌と6-ヒドロキシフラバノンとの混合培養液1000 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス250 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム [Silica Gel 60 (Merck), φ 2 cm x 15 cm]に供し、ジクロロメタン：メタノール＝50：１の溶媒で展開することにより、29 (8. 5mg), 30 (9.0 mg)を純粋な物質として単離した。
29, 30は各種スペクトルデータ(EI-MS, NMR)の解析により、
29： 2’, 6-ジヒドロキシフラバノン(2’, 6-dihydroxyflavanone)
30： 3’, 6-ジヒドロキシフラバノン(3’, 6-dihydroxyflavanone)  と同定した。
【０１７３】
実施例９：芳香族アミンの変換反応
９−１．芳香族アミンのフタル酸イミド体の作製
芳香族アミン(１級アミノ基を含有する芳香環化合物)と等モルの無水フタル酸をナスフラスコ中で、１５０℃、３時間加熱した。生成物はシリカゲルカラム [Silica Gel 60(Merck), q2cm x 20cm, ヘキサン：酢酸エチル＝５：１] にて精製した。試験したすべての化合物で反応はほぼ定量的であった。
なお、アミノ化合物のフタル酸イミド誘導体はアルコール溶媒中で抱水ヒドラジン処理することにより、容易にフリー体へと導くことができる。
【０１７４】
９−２．芳香族アミンの変換実験
実施例７に示した方法と同様の方法により、組換え放線菌(pIJ-2072)を用いて、９−１で作製した芳香族アミンフタル酸イミドである、フェニルエチルアミンのフタル酸イミド体 [2-(1-フェニルエチル)-1,3-イソインドリンジオン] およびテトラヒドロナフチルアミンのフタル酸イミド体 [2-(1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ナフタレニル)-1,3-イソインドリンジオン] (図８)の変換実験を行った。より詳細には、これらの基質を、それぞれ、0.1 mg/mlの最終濃度で、菌体 [10 mg(生重量)/ml]入りの最小培地 1000 mlに加え、30℃、2日間、共存培養を行うことにより変換実験を行った。
【０１７５】
９−３．フェニルエチルアミンのフタル酸イミド体の変換産物 (図９)
組換え放線菌とフェニルエチルアミンのフタル酸イミド体 [2-(1-フェニルエチル)-1,3-イソインドリンジオン]との混合培養液1000 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7000  rpm, 10  min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス350 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム[Silica Gel 60(Merck), φ 2cm x 10cm]に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝３：１の溶媒で展開することにより、31 (4.2 mg)を純粋な物質として単離した。
31は各種スペクトルデータ(EI-MS, NMR)の解析により、
2-[1-(4-ヒドロキシフェニル)エチル]-1,3-イソインドリンジオン [2-[1-(4-hydroxyphenyl)ethyl]-1,3-isoindolinedione] と同定した。
【０１７６】
31 [2-[1-(4-hydroxyphenyl)ethyl]-1,3-isoindolinedione]の物性
EI-MS (m/z): 267(M+)
1H-NMR(500 MHz, CDCl3)
1.88 (d, J=7.3, 1H), 5.49 (q, J=7.3, 1H), 6.76 (d, J=8.5, 2H), 7.38 (d, J=8.5, 2H), 7.66 (dd, J=3.1, 5.5, 2H), 7.77 (dd, J=3.1, 5.5, 2H)
【０１７７】
９−４．テトラヒドロナフチルアミンのフタル酸イミド体の変換産物 (図９)
組換え放線菌と テトラヒドロナフチルアミンのフタル酸イミド体 [2-(1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ナフタレニル)-1,3-イソインドリンジオン]との混合培養液1000 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス350 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム[Silica Gel 60(Merck), φ 2cm x 10cm]に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝３：１の溶媒で展開することにより、32 (5.2 mg)を純粋な物質として単離した。
32は各種スペクトルデータ(EI-MS, NMR)の解析により、
2-(4-ヒドロキシ-1,2,3,4-テトラハイドロ-1-ナフタレニル)-1,3-イソインドリンジオン [2-(4-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthalenyl)-1,3-isoindolinedione]  と同定した。
【０１７８】
32 [2-(4-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthalenyl)-1,3-isoindolinedione]の物性
EI-MS (m/z): 293(M+)
1H-NMR (500 MHz, CDCl3)
1.82 (m, 1H), 2.17 (m, 1H), 2.36-2.44 (2H), 5.01 (dd, J=4.9, 9.2, 1H), 5.56 (dd, J=6.7, 9.8), 6.93 (d, J=7.9, 1H), 7.14 (dd, J=7.9, 7.9, 1H), 7.26 (dd, J=7.9, 7.9, 1H), 7.60 (d, J=7.9, 1H), 7.71 (dd, J=3.0, 5.5, 2H), 7.82 (dd, J=3.0, 5.5, 2H)
【０１７９】
実施例１０：芳香族カルボン酸の変換反応
10−１．芳香族カルボン酸の変換実験
実施例７に示した方法と同様の方法により、組換え放線菌(pIJ-2072)を用いて、芳香族カルボン酸である、1-ナフトイック酸(1-naphthoic acid)または1-ナフチル酢酸(1-naphthylacetate) (図８)の変換実験を行った。より詳細には、これらの基質を、それぞれ、0.1 mg/mlの最終濃度で、菌体 [10 mg(生重量)/ml]入りの最小培地 1000 mlに加え、30℃、2日間、共存培養を行うことにより変換実験を行った。
【０１８０】
10−２．1-ナフトイック酸の変換産物
組換え放線菌と1-ナフトイック酸との混合培養液1000 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、1N HClでpH3.0に調整後等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス400 mgを得た。エキスをシリカゲルカラム[Silica Gel 60(Merck), φ 2cm x 15cm]に供し、ジクロロメタン：メタノール＝１５：１の溶媒で展開することにより、33 (5.2 mg)を純粋な物質として単離した。
33は各種スペクトルデータ(EI-MS, NMR)の解析により、
4-ヒドロキシ-1-ナフトイック酸 (4-hydroxy-1-naphthoicacid)と同定した。
【０１８１】
33 [4-hydroxy-1-naphthoicacid]の物性
EI-MS (m/z): 188 (M+)
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)
6.90 (d, J=7.9, 1H), 7.49 (dd, J=7.3, 7.3), 7.58 (dd, J=7.3, 9.1), 8.12 (d, J=7.9, 1H), 8.22 (d, J=7.3, 1H), 9.02 (d, J=9.1, 1H)
【０１８２】
１０−３．1-ナフチル酢酸の変換産物
組換え放線菌と1-ナフチル酢酸との混合培養液1000 mlに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを7000 rpm, 10 min遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300 mlまで濃縮し、1N HClでpH3.0に調整後等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキス380mgを得た。エキスをシリカゲルカラム[Silica Gel 60(Merck), φ 2cm x 15cm]に供し、ジクロロメタン：メタノール＝１５：１の溶媒で展開することにより、34 (3.6 mg), 35 (2.0 mg)を純粋な物質として単離した。
34, 35は各種スペクトルデータ(EI-MS, NMR)の解析により、
34： 4-ヒドロキシ-1-ナフチル酢酸 (4-hydroxy-1-naphthylacetate)
35： 5-ヒドロキシ-1-ナフチル酢酸 (5-hydroxy-1-naphthylacetate)  と同定した。
【０１８３】
34 [4-hydroxy-1-naphthylacetate]の物性
EI-MS (m/z): 202 (M+)
1H-NMR (500 MHz, CDCl3)
3.96 (s, 2H), 6.72 (d, J=7.9, 1H), 7.18 (d, J=7.9, 1H), 7.45 (dd, J=7.9, 7.9, 1H), 7.51 (dd, 7.9, 8.5), 7.88 (d, J=8.5, 1H), 8.22 (d, J=7.9, 1H)
【０１８４】
35 [5-hydroxy-1-naphtylacetate]の物性
EI-MS (m/z): 202 (M+)
1H-NMR (500 MHz, CDCl3)
4.03 (s, 2H), 6.80 (d, J=7.3, 1H), 7.30 (dd, J=7.3, 7.3, 1H), 7.39 (2H), 7.51 (d, J=7.3, 1H), 8.16 (dd, J=2.5, 7.9, 1H)
【０１８５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Pseudomonas pseudoalcaligenesＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼが認識できる基質およびその反応産物を示した図である。
【図２】Burkholderia cepacia LB400 株由来のビフェニルジオキシゲナーゼが認識できる基質およびその反応産物を示した図である。
【図３】Pseudomonas pseudoalcaligenesＫＦ７０７株由来のαサブユニット（ＫＦ７０７）、Burkholderia cepacia LB400 株由来のαサブユニット（ＬＢ４００）、および改変されたPseudomonas pseudoalcaligenesＫＦ７０７株由来のαサブユニット（２０７２）のアミノ酸配列を整列させた図である。
【図４】本発明において基質として用いることができる複素環化合物の化学構造式を示した図である。
【図５】本発明において基質として用いることができる複素環化合物の化学構造式を示した図である。
【図６】本発明において変換産物として得ることができる複素環化合物の化学構造式を示した図である。
【図７】本発明において変換産物として得ることができる複素環化合物の化学構造式を示した図である。
【図８】本発明において基質として用いることができるフラボノイド、芳香環を有するフタルイミド誘導体、芳香族カルボン酸の化学構造式を示した図である。
【図９】本発明において変換産物として得ることができるフラボノイド、芳香環を有するフタルイミド誘導体、芳香族カルボン酸の化学構造式を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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