(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一分子内に第１の蛍光物質と第２の蛍光物質とを有し測定対象の生体成分が作用することで前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間での蛍光共鳴エネルギー移動が影響される分子プローブと、検体と、を含む試料混合物を複数の試料保持部に保持させ、
前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物から発された蛍光を、透過光の波長域が可変である波長可変液晶分光フィルタを通過させた後に検出器により撮像することで同時に検出することを、前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変更して繰り返して、少なくとも前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値を前記試料保持部毎に取得することを、一定間隔をあけて複数回行い、
前記蛍光強度の検出値に基づいて、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量を、前記試料保持部毎に求め、
予め求められた、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量と、測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡と、の関係に基づいて、前記蛍光強度の検出値に基づいて求められた前記変化量から、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する、
ことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
前記検出器による蛍光の検出の際には、前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を、少なくとも前記第１の蛍光物質の蛍光ピーク波長と前記第２の蛍光物質の蛍光ピーク波長とを含む透過ピーク波長範囲にわたり所定の透過ピーク波長毎に変更して、前記検出器により撮像することを繰り返すことを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記複数の試料保持部のうち１個以上に保持された前記試料混合物には、複数種類の前記分子プローブが含まれており、該１個以上の試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体については、前記複数種類の前記分子プローブのそれぞれの前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値に基づいて、前記複数種類の前記分子プローブのそれぞれの測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記複数の試料保持部のうち２個以上に保持された前記試料混合物に含まれる前記分子プローブ間の種類が異なっており、該２個以上の試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体については、前記異なる種類の前記分子プローブのそれぞれの前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値に基づいて、前記異なる種類の前記分子プローブのそれぞれの測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項５】
前記生体成分は、タンパク質、酵素、ペプチド、アミノ酸、補酵素、糖、糖鎖、脂質、核酸、それらの誘導体並びにそれらの複合体、水素イオン、及び金属イオンからなるグループより選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの項に記載の測定方法。
【請求項６】
前記検体は、生体成分、細胞、細胞抽出液又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの項に記載の測定方法。
【請求項７】
前記検出器による蛍光の検出の際には、前記複数の試料保持部に、透過光、落射光、エバネッセント光又はそれらを組み合わせて励起光を照射することを特徴とする請求項１〜６のいずれかの項に記載の測定方法。
【請求項８】
前記検出器として、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、又はイメージインテンシファイアを用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの項に記載の測定方法。
【請求項９】
複数の試料保持部に保持された試料混合物から発された蛍光が通過する、透過光の波長域が可変である波長可変液晶分光フィルタと、
前記波長可変液晶分光フィルタを通過した後の前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物から発された蛍光を、撮像することで同時に検出する検出器と、
前記検出器により各前記試料保持部に対応して検出された蛍光の強度に基づいて、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する処理装置と、
を有し、
前記処理装置は；前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物が、同一分子内に第１の蛍光物質と第２の蛍光物質とを有し測定対象の生体成分が作用することで前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間での蛍光共鳴エネルギー移動が影響される分子プローブと、検体と、を含む場合に；前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変更させて前記検出器による蛍光の検出を繰り返させて、少なくとも前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値を前記試料保持部毎に取得することを、一定間隔をあけて複数回行い；前記蛍光強度の検出値に基づいて、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量を、前記試料保持部毎に求め；予め求められた、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量と、測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡と、の関係に基づいて、前記蛍光強度の検出値に基づいて求められた前記変化量から、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する、
ことを特徴とする測定装置。
【請求項１０】
前記処理装置は、前記検出器による蛍光の検出の際に、前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を、少なくとも前記第１の蛍光物質の蛍光ピーク波長と前記第２の蛍光物質の蛍光ピーク波長とを含む透過ピーク波長範囲にわたり所定の透過ピーク波長毎に変更して、前記検出器により撮像することを繰り返させることを特徴とする請求項９に記載の測定装置。
【請求項１１】
前記複数の試料保持部のうち１個以上に保持された前記試料混合物には、複数種類の前記分子プローブが含まれており、前記処理装置は、該１個以上の試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体については、前記複数種類の前記分子プローブのそれぞれの前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値に基づいて、前記複数種類の前記分子プローブのそれぞれの測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定することを特徴とする請求項９又は１０に記載の測定装置。
【請求項１２】
前記複数の試料保持部のうち２個以上に保持された前記試料混合物に含まれる前記分子プローブ間の種類が異なっており、前記処理装置は、該２個以上の試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体については、前記異なる種類の前記分子プローブのそれぞれの前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値に基づいて、前記異なる種類の前記分子プローブのそれぞれの測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定することを特徴とする請求項９又は１０に記載の測定装置。
【請求項１３】
前記生体成分は、タンパク質、酵素、ペプチド、アミノ酸、補酵素、糖、糖鎖、脂質、核酸、それらの誘導体並びにそれらの複合体、水素イオン、及び金属イオンからなるグループより選択されることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかの項に記載の測定装置。
【請求項１４】
前記検体は、生体成分、細胞、細胞抽出液又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項９〜１３のいずれかの項に記載の測定装置。
【請求項１５】
前記検出器による蛍光の検出の際に前記複数の試料保持部に透過光、落射光、エバネッセント光又はそれらを組み合わせて励起光を照射する光源を有することを特徴とする請求項９〜１４のいずれかの項に記載の測定装置。
【請求項１６】
前記検出器は、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、又はイメージインテンシファイアであることを特徴とする請求項９〜１５のいずれかの項に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体成分又はその機能の測定方法及び装置に関するものであり、より詳細には、複数の試料保持部内に保持された分子プローブと検体とを含む試料混合物からの光を撮像により同時に検出することで該試料混合物における生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定するための測定方法及び装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な分子プローブが開発され、分子プローブを利用して生体成分又はその機能を解析する技術が発展してきた。その一例として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Fluorescent Resonance Energy Transfer）を利用した分子プローブがある。ＦＲＥＴは、同一分子又は別の分子に存在する２種類の蛍光物質のうちエネルギーを与える側の蛍光物質であるドナーとエネルギーを与えられる側の蛍光物質であるアクセプターとの間で起こるエネルギー移動である。
【０００３】
図２２は、ＦＲＥＴを利用してプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）の活性を測定する方法を模式的に示す。この場合、分子プローブは、アクセプターである蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ）とドナーである蛍光色素とを、プロテアーゼと反応する基質のペプチドで結合した構造を有している。この分子プローブでは、プロテアーゼが作用していない状態ではドナーからアクセプターにエネルギーが移動してＦＲＥＴが起きるが、プロテアーゼの作用により基質が分解（切断）されることでアクセプターが外れると、ドナーとアクセプターとの間の距離が広がり、ＦＲＥＴが解消する。この原理を応用して、プロテアーゼ活性を測定することが可能になる。
【０００４】
図２３は、波長５３０ｎｍ付近に蛍光ピークを持つ蛍光タンパク質ＹＦＰと波長６２５ｎｍ付近に蛍光ピークを持つ蛍光色素とを有するプロテアーゼ活性測定用の分子プローブを用いた場合の蛍光スペクトルの一例を示す。図２３の例では、ドナーである蛍光タンパク質ＹＦＰの蛍光ピーク（波長５３０ｎｍ付近）とアクセプターである蛍光色素の蛍光ピーク（波長６２５ｎｍ付近）との２個の蛍光ピークを持つ蛍光スペクトルが観測されている。この分子プローブを用いた場合、プロテアーゼが作用する前は、ＦＲＥＴが起きることによって波長５３０ｎｍ付近の蛍光強度が相対的に弱く、波長６２５ｎｍ付近の蛍光強度が相対的に強いが、プロテアーゼが作用した後には、ＦＲＥＴが消滅することによって波長５３０ｎｍ付近の蛍光強度が相対的に強くなり、波長６２５ｎｍ付近の蛍光強度が相対的に弱くなる。
【０００５】
このような分子プローブを用いた測定では、典型的には、ドナーとアクセプターとの蛍光強度の比率を測定することで、生体成分又はその機能を測定することができる。例えば、上記のプロテアーゼ活性測定用の分子プローブの場合には、ドナーとアクセプターとの蛍光強度の比率は、プロテアーゼ活性と相関するため、この蛍光強度の比率を測定することで、測定対象となる生体成分のプロテアーゼの機能（活性）を測定することができる。
【０００６】
又、２種類以上の分子プローブ用いて、複数の生体成分又はその機能を同時に測定する技術も開発されている（特許文献１）。例えば、ＦＲＥＴを利用した２種類の分子プローブを用いる場合には、通常、４個の蛍光ピークの蛍光強度を測定する必要があり、ＦＲＥＴを利用した３種類分子プローブを用いる場合には、通常、６個の蛍光ピークの蛍光強度を測定する必要がある。
【特許文献１】ＷＯ２００６／１２６５７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、上述のような蛍光スペクトルの測定は、１個の試料を測定する場合は、回折格子やプリズムを利用した蛍光分光光度計を用いて支障なく行うことが可能である。しかしながら、複数の試料を測定する場合には、試料保持部を切り換えて測定する必要がある。プレートリーダ等では、試料保持部をスキャンしながら測定できるものもあるが、測定時間の短縮には限界があり、短時間のうちに同時に複数の試料を測定することは困難である。
【０００８】
又、蛍光イメージング手法を用いて複数の試料からの蛍光を同時に測定する方法もある。従来の蛍光イメージング手法では、複数の分光フィルタを切り換えて、蛍光ピーク波長付近のみの蛍光強度を測定する方法が一般的である。しかしながら、斯かる従来の蛍光イメージング手法では、測定する分子プローブの種類に応じて多種類の分光フィルタを用意し、それらを切り換えて測定する必要があり、煩雑な操作を要した。又、このような複数の分光フィルタを切り替えて使用する方法では、蛍光スペクトルを測定することは困難である。そのため、分子プローブの蛍光が正常に発生しているかの確認や、蛍光ピークの変化を測定できないなどの問題点があった。このような問題は、複数種類の分子プローブを一の又は複数の試料保持部において同時に用いるような場合にはより顕著となる。
【０００９】
従って、本発明の目的は、多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことを可能とする生体成分又はその機能の測定方法及び装置を提供することである。
【００１０】
又、本発明の他の目的は、複数種類の分子プローブを一の又は複数の試料保持部において同時に用いる場合でも、多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことを可能とする生体成分又はその機能の測定方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的は本発明に係る生体成分又はその機能の測定方法及び装置にて達成される。要約すれば、本発明の第１の態様は、同一分子内に第１の蛍光物質と第２の蛍光物質とを有し測定対象の生体成分が作用することで前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間での蛍光共鳴エネルギー移動が影響される分子プローブと、検体と、を含む試料混合物を複数の試料保持部に保持させ；前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物から発された蛍光を、透過光の波長域が可変である波長可変液晶分光フィルタを通過させた後に検出器により撮像することで同時に検出することを、前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変更して繰り返して、少なくとも前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値を前記試料保持部毎に取得することを、一定間隔をあけて複数回行い；前記蛍光強度の検出値に基づいて、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量を、前記試料保持部毎に求め；予め求められた、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量と、測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡と、の関係に基づいて、前記蛍光強度の検出値に基づいて求められた前記変化量から、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する；ことを特徴とする測定方法である。
【００１２】
本発明の一実施態様によると、前記検出器による蛍光の検出の際には、前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を、少なくとも前記第１の蛍光物質の蛍光ピーク波長と前記第２の蛍光物質の蛍光ピーク波長とを含む透過ピーク波長範囲にわたり所定の透過ピーク波長毎に変更して、前記検出器により撮像することを繰り返す。
【００１３】
本発明の一実施態様によると、前記複数の試料保持部のうち１個以上に保持された前記試料混合物には、複数種類の前記分子プローブが含まれており、該１個以上の試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体については、前記複数種類の前記分子プローブのそれぞれの前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値に基づいて、前記複数種類の前記分子プローブのそれぞれの測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する。
【００１４】
本発明の他の実施態様によると、前記複数の試料保持部のうち２個以上に保持された前記試料混合物に含まれる前記分子プローブ間の種類が異なっており、該２個以上の試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体については、前記異なる種類の前記分子プローブのそれぞれの前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値に基づいて、前記異なる種類の前記分子プローブのそれぞれの測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する。
【００１７】
本発明の一実施態様によれば、前記生体成分は、タンパク質、酵素、ペプチド、アミノ酸、補酵素、糖、糖鎖、脂質、核酸、それらの誘導体並びにそれらの複合体、水素イオン、及び金属イオンからなるグループより選択される。又、本発明の一実施態様によれば、前記検体は、生体成分、細胞、細胞抽出液又はそれらの混合物である。又、本発明の一実施態様によれば、前記検出器による蛍光の検出の際には、前記複数の試料保持部に透過光、落射光、エバネッセント光又はそれらを組み合わせて励起光を照射する。更に、本発明の一実施態様によれば、前記検出器として、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、又はイメージインテンシファイアを用いる。
【００１８】
そして、本発明の第２の態様によれば、複数の試料保持部に保持された試料混合物から発された蛍光が通過する、透過光の波長域が可変である波長可変液晶分光フィルタと、前記波長可変液晶分光フィルタを通過した後の前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物から発された蛍光を、撮像することで同時に検出する検出器と、前記検出器により各前記試料保持部に対応して検出された蛍光の強度に基づいて、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する処理装置と、を有し、前記処理装置は；前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物が、同一分子内に第１の蛍光物質と第２の蛍光物質とを有し測定対象の生体成分が作用することで前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間での蛍光共鳴エネルギー移動が影響される分子プローブと、検体と、を含む場合に；前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変更させて前記検出器による蛍光の検出を繰り返させて、少なくとも前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値を前記試料保持部毎に取得することを、一定間隔をあけて複数回行い；前記蛍光強度の検出値に基づいて、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量を、前記試料保持部毎に求め；予め求められた、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量と、測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡と、の関係に基づいて、前記蛍光強度の検出値に基づいて求められた前記変化量から、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する、ことを特徴とする測定装置が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことが可能となる。又、本発明によれば、複数種類の分子プローブを一の又は複数の試料保持部において同時に用いる場合でも、多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明に係る生体成分又はその機能の測定方法及び装置を図面に則して更に詳しく説明する。
【００２１】
本発明によれば、上述の問題を解決するための手段として、蛍光分光フィルタに、透過ピーク波長が固定された従来の分光フィルタではなく、波長可変液晶分光フィルタを使用する。
【００２２】
即ち、本発明の一実施態様によれば、複数の試料保持部に保持された、蛍光物質又は発光物質を利用した分子プローブと検体とを含む試料混合物から発された光を、透過光の波長域が可変である波長可変液晶分光フィルタを通過させた後に、検出器により撮像することで同時に検出する。そして、検出器により各試料保持部に対応して検出された光の強度に基づいて、各試料保持部に保持された試料混合物中の検体における分子プローブが対象とする生体成分又はその機能を測定する。
【００２３】
波長可変液晶分光フィルタは、１９３３年にリオ（Ｂ．Ｌｙｏｔ）により考案された、結晶板による干渉を利用して比較的狭い波長域の光だけを透過するリオ・フィルタの原理を応用したものである。リオ・フィルタは、透過する直線偏光の振動方向を平行にした複数個の偏光子の列の間に、光学軸が端面に平行で厚さが２ｎｄ（ｎ＝０、１、２‐‐‐）の複屈折板である結晶板（一軸結晶：例えば水晶板）を、光学軸が偏光子の振動方向に４５゜をなすように配置した構成を有する。リオ・フィルタは、透過光の波長域が固定されている。これに対して、波長可変液晶分光フィルタは、複屈折板としてリオ・フィルタにおける一軸結晶の代わりに液晶セル（液晶板）を使用することで、液晶セルに対する印加電圧を変化させることにより、透過光の波長域を可変にすることができるように設計したものである。
【００２４】
図３は、波長可変液晶分光フィルタの概略構成を示す。この波長可変液晶分光フィルタは、偏光子１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄと、該偏光子間に挟まれる液晶セル１４ａ、１４ｂ、１４ｃと、該液晶セルに電圧を印加する電圧源１５ａ、１５ｂ、１５ｃと、を有する。液晶セルに印加する電圧を変化させることで、リオ・フィルタにおけるｎを変化させることができる。これにより、波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変化させることができる。
【００２５】
図３の例では３枚の液晶セルが４枚の直線偏光子で挟まれた構造となっている。透過波長の半値幅は、液晶セルと直線偏光子の枚数を増やすことにより狭くすることができるが、枚数が増えると透過率も低下する。又、透過波長の可変範囲も液晶セルと直線偏光子の枚数により変化するため、透過波長の可変範囲により適切な枚数を選択することが望まれる。
【００２６】
現在では、各透過波長域において非常に狭い波長域の光を透過する波長可変液晶分光フィルタが得られるようになっている（特開平３−２８２４１７号公報、特開２００５−１１５２０８号公報参照）。
【００２７】
図４は、６枚の液晶セルを使用した波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を４４０ｎｍから７００ｎｍまで２０ｎｍステップで変化させたときの、透過ピーク波長と透過率との関係を示す。
【００２８】
波長可変液晶分光フィルタは所望の設定透過波長をピークとして、左右対称の波長透過特性を有しており、その半値幅は短波長ほど小さくなっている。又、短波長では透過率が小さくなる傾向がある。又、波長毎に透過特性が異なるため、透過率の補正を行うことが望ましい。
【００２９】
この補正方法は、一実施態様では、次のようにすることができる。即ち、例えば波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を４４０ｎｍから７００ｎｍに１ｎｍ毎に変更し、透過ピーク波長毎の透過波長スペクトルを予め測定する。そして、それらのスペクトルの面積比を計算し、ピーク波長毎に面積比を乗算することで、透過波長特性を補正することができる。
【００３０】
図１は、本発明の一実施態様に係る測定装置１００である波長可変液晶分光フィルタを用いた蛍光イメージング装置の一例の概略構成を示す。図１の測定装置１００は、概略、光源１と、波長可変液晶分光フィルタ２と、本例では高感度冷却ＣＣＤカメラとされる検出器（撮像装置）３と、波長可変液晶分光フィルタ２の駆動装置８と、駆動装置８を制御し且つ検出器３から入力された信号を処理する処理装置（コンピュータ）１１と、を有する。又、光源１から検出器３に至る光学経路において、励起光を平行光とするための光源レンズ４、所定の波長域の励起光を透過する励起フィルタ５、励起光が検出器３に入射しないように所定の波長域以外の光をカットするカットフィルタ（広帯域フィルタ）６、試料混合物から発された蛍光を検出器３の受光面に結像するためのレンズ（本例ではテレセントリックレンズ）７などが光学的に整列されて配置される。本例では、光源１から検出器３に至る光学経路は、下から上へと略垂直方向に向いている。
【００３１】
そして、光源１と波長可変液晶分光フィルタ２との間、図示の例では、励起フィルタ５と波長可変液晶分光フィルタ２との間に、複数の試料保持部としてのウェル１２ａを有する試料容器としての測定プレート１２が光学的に整列されて配置される。測定プレート１２は、測定装置１００の本体内に設けられたガイド、位置決め手段などの所定の装着手段を介して測定装置１００の本体に対して着脱可能に装着される。測定プレート１２は、光源１から検出器３に至る光学経路の光軸に略直交する平面に沿って複数のウェル１２ａが配列されるように配置される。
【００３２】
図２（ａ）〜２（ｃ）に示すように、本例では測定プレート１２は２層の構造になっており、第１層１２ｂとしての透明のアクリル板上に、第２層１２ｃとして直径２ｍｍの穴が３行３列で９個開けられた黒色のプラスチック板を、防水接着剤で張り合わせた構造となっている。又、本例では、各ウェル１２ａの深さは３ｍｍで、容量は約１０μＬである。励起光が照射される側の図中下方に配置される第１層１２ｂを透明としたのは、励起光を良く透過して、ウェル１２ａ内の試料混合物に入射するようにするためである。より好ましくは、第２層１２ｂの表面１２ｂ１には、励起光を拡散してウェル１２ａ内の試料混合液に均一に入射させるための手段として、フロスト処理などが施される。一方、ウェル１２ａが形成される第２層１２ｃを黒色としたのは、複数のウェル１２ａ間を遮光して、各ウェル１２ａ内の試料混合物間の干渉を抑制し、又各ウェル１２からの光を良好に区別して検出できるようにするためである。測定プレート１２は、本例では樹脂製であるが、これに限定されるものではなく、ガラスなどその他の材料で作製されてもよい。
【００３３】
光源１から検出器３に至る光学経路の全体は、遮光手段としての遮光箱１０内に配置されており、測定プレート１２の装着又は取り外しのための開口部（図示せず）が閉じられた状態で、遮光箱１０内は周辺光から実質的に完全に遮断される。
【００３４】
斯かる構成の測定装置１００において、光源１からの励起光は、光源レンズ４と励起フィルタ５とを通して複数のウェル１２ａに透過光として照射される。測定プレート１２の複数のウェル１２ａのそれぞれには、分子プローブと検体とを含む試料混合物（サンプル溶液）が収容される。励起光が照射されることによって、各ウェル１２ａ内の試料混合物から発生された蛍光は、波長可変液晶分光フィルタ２とカットフィルタ６とで分光され、レンズ７を通して検出器３で蛍光イメージング画像として検出される。即ち、波長可変液晶分光フィルタ２を通して検出器３によって測定プレート１２の複数のウェル１２ａを同時に撮像する。
【００３５】
この時、波長可変液晶分光フィルタ２を、処理装置１１からの指示によって駆動装置８で制御することで、透過ピーク波長を必要な範囲で変化させる。これにより、検出器３は、測定プレート１２からの蛍光を、波長可変液晶分光フィルタ２を透過した波長毎の画像として検出する。検出器３は、検出結果に係る画像情報信号を、ケーブル９を介して処理装置１１に入力する。
【００３６】
処理装置１１は、波長毎に検出された画像から、ウェル１２ａ毎に波長毎の蛍光強度を計算する。これにより、波長毎の蛍光強度の集合から、ウェル１２ａ毎の蛍光スペクトルデータ得ることが可能になる。
【００３７】
この方法によれば、従来困難であった複数の試料保持部からの蛍光の蛍光スペクトルを短時間のうちに一度に取得することが可能である。又、一の又は複数の試料保持部内で複数の分子プローブを用いることにより検体における複数の生体成分又はその機能を同時に短時間に測定することが可能となり、従来の方法と比較し格段にハイスループットな測定を実現することができる。
【００３８】
ここで、量子ドット蛍光試薬を測定した場合を例にして、測定装置１００による蛍光イメージング手法について更に説明する。量子ドット蛍光試薬は、染色用の蛍光物質として使用することができるものであり、一種類の励起波長で複数の蛍光波長の量子ドット蛍光試薬を励起できる点や、蛍光が安定して持続するなどの利点を有する。ここでは、量子ドット蛍光試薬として、インビトロジェン製のＱｄｏｔ（登録商標）ストレプトアビジン標識シリーズを用いた。又、励起フィルタ５としては、４１０ｎｍ〜４２０ｎｍの光を透過する特性を有する光学フィルタを用いた。又、カットフィルタ６としては、励起光をカットするために、４９０ｎｍより短波長の光を透過しない特性を有する光学フィルタを用いた。又、波長可変液晶分光フィルタ２は、処理装置１１から駆動装置８を通して制御し、１ｎｍステップで透過ピーク波長を４４０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲で任意にコントロールできるようにした。
【００３９】
図５は、測定装置１００で撮像された測定プレート１２の画像の一例を示しているが、図示の通りに９個のウェルのそれぞれをウェル（１）〜ウェル（９）としたとき、ウェル（１）〜ウェル（６）には、５２５ｎｍ〜７０３ｎｍの６種類の量子ドット蛍光試薬を単独で入れた。又、ウェル（７）、ウェル（８）、ウェル（９）にはそれぞれ、２種類、３種類、４種類の量子ドット蛍光試薬を入れた。各ウェル（１）〜（９）に入れた量子ドット蛍光試薬の種類（蛍光ピーク波長）は次の通りである。ウェル（１）：５２５ｎｍ、ウェル（２）：５６５ｎｍ、ウェル（３）：５８５ｎｍ、ウェル（４）：６０５ｎｍ、ウェル（５）：６５５ｎｍ、ウェル（６）：７０３ｎｍ、ウェル（７）：５６５ｎｍ，６５５ｎｍ、ウェル（８）：５２５ｎｍ，５８５ｎｍ，６５５ｎｍ、ウェル（９）：５２５ｎｍ，５６５ｎｍ，６０５ｎｍ，６５５ｎｍ。
【００４０】
一例として、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を５００ｎｍ〜７００ｎｍに１０ｎｍステップで変化させて、各ウェル（１）〜（９）からの蛍光を撮像する。又、撮像は、２秒の露光時間で行い、５ｎｍステップで画像データを処理装置１１に記憶し、各ウェル（１）〜（９）に対応する平均輝度（平均蛍光強度）を求めた。
【００４１】
即ち、処理装置１１は、各ウェル１２ａに対応した蛍光画像の平均輝度を計算するために、各ウェル１２ａの領域を同じ面積の円で領域指定し、円内の平均輝度を計算する。更に説明すると、図６は、処理装置１１の制御態様を説明するための概略制御ブロック図である。又、図７は、処理装置１１による各ウェルからの蛍光の平均輝度の計算方法の概略を示すフローチャートである。先ず、処理装置１１の制御部１１ａは、駆動装置８に制御信号を送り、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を設定し、検出器３から複数のウェル１２ａを同時に撮像した画像データを受信して、処理装置１１に設けられた記憶手段としてのＲＡＭ１１ｂに記憶する（Ｓ１０１）。次いで、制御部１１ａは、各ウェル１２ａの領域と同じ面積の円である平均輝度を計算する領域を、本例では９ヶ所指定する（Ｓ１０２）。次いで、制御部１１ａは、例えば先ずウェル（１）について、指定領域内の検出器３により撮像された画像データの各ドット（画素）の輝度値を積算し（Ｓ１０３）、ドット数で除算することで平均輝度を求める（Ｓ１０４）。Ｓ１０３及びＳ１０４の処理を全ての指定領域について行い、全ての指定領域について平均輝度を求める（Ｓ１０５）。そして、制御部１１ａは、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を所定のステップ幅で変更して、Ｓ１０１〜Ｓ１０５の操作を所定の透過波長範囲にわたり繰り返す（Ｓ１０６）。
【００４２】
処理装置１１の制御部１１ａは、処理装置１１に設けられた記憶手段としてのＲＯＭ１１ｃ内に予め格納されているプログラム、データに従って各種の処理を行う。
【００４３】
尚、図７のフローチャートでは、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を変更して蛍光画像を撮像するたびにウェル１２ａ毎の平均輝度を計算するものとして示しているが、全ての画像を取得後、まとめて計算することも可能である。
【００４４】
上述のようにして、ウェル１２ａ毎に波長毎の平均輝度（平均蛍光強度）のデータを取得することが可能である。尚、本明細書では、測定装置１００において、上述のようにして求められた波長毎の平均輝度（平均蛍光強度）を「蛍光強度」とも呼ぶ。そして、このようにして取得された各ウェル１２ａの位置の波長毎の蛍光強度のデータから、各ウェル１２ａの位置の蛍光スペクトルを求めることができる。
【００４５】
図８は、ウェル（１）〜ウェル（６）の蛍光スペクトルを示す。蛍光強度は、各ウェルの蛍光ピーク波長における蛍光強度を１００とした相対強度で示した。ウェル（１）〜ウェル（６）にはそれぞれ、５２５ｎｍ、５６５ｎｍ、５８５ｎｍ、６０５ｎｍ、６５５ｎｍ、７０３ｎｍの蛍光ピーク波長を有する量子ドット蛍光試薬が入っており、各ウェルの波長毎の蛍光強度は、各量子ドット蛍光試薬の蛍光ピーク波長とほぼ一致した結果が得られた。
【００４６】
図９は、ウェル（７）の蛍光スペクトルを示す。ウェル（７）には、５６５ｎｍと６５５ｎｍの蛍光ピーク波長を有する量子ドット蛍光試薬が入っており、５６５ｎｍと６５５ｎｍ付近に２個の蛍光ピークを有するスペクトルが得られた。この結果は、測定した量子ドット蛍光試薬の蛍光パターンと一致した結果であった。
【００４７】
同様に、図１０は、ウェル（８）の蛍光スペクトルを示す。ウェル（８）には５２５ｎｍ、５８５ｎｍ及び６５５ｎｍの蛍光ピークを有する３種類の量子ドット蛍光試薬が入っており、それぞれに対応した波長に蛍光ピークが観測された。又、図１１は、ウェル（９）の蛍光スペクトルを示す。ウェル（９）には５２５ｎｍ、５６５ｎｍ、６０５ｎｍ及び６５５ｎｍの蛍光ピークを有する４種類の量子ドット蛍光試薬が入っており、それぞれに対応した蛍光ピークが観測された。
【００４８】
このように波長可変液晶分光フィルタ２を用いた測定装置１００により、複数の試料保持部からの蛍光の蛍光スペクトルを、波長毎に取得される２次元の画像として測定することが可能である。そして、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を変更して、該透過ピーク波長毎の検出器３により検出された光の強度を試料保持部毎に求め、試料保持部毎に、分子プローブに対応する特定の透過ピーク波長における光の強度に基づいて、その試料保持部に保持された試料混合物中の検体における分子プローブが対象とする生体成分又はその機能を測定することができる。
【００４９】
この方法によれば、同じ試料保持部に複数種類の蛍光試薬が混在する場合でも、蛍光スペクトルを測定することで、蛍光試薬の分布を調べることができる。従って、複数の試料保持部のうち１個以上に保持された試料混合物に複数種類の分子プローブが含まれている場合に、該１個以上の試料保持部に保持された試料混合物中の検体について、複数種類の分子プローブのそれぞれが対象とする複数種類の生体成分又はその機能を測定することができる。又、複数の試料保持部においてそれぞれ異なる種類の蛍光試薬が用いられる場合でも、一度にそれぞれの試料保持部における蛍光試薬の分布を調べることができる。従って、複数の試料保持部のうち２個以上に保持された試料混合物に含まれる分子プローブ間の種類が異なっている場合に、該２個以上の試料保持部に保持された試料混合物中の検体間で、複数種類の分子プローブのそれぞれが対象とする異なる種類の生体成分又はその機能を測定することができる。
【００５０】
尚、測定装置１００において、光源１としてはＬＥＤ、ハロゲン、クリプトン、メタルハライド、水銀、キセノン、レーザーなどを使用できる。
【００５１】
又、本例では、検出器３としてＣＣＤカメラを使用しているが、検出器３としては、ＣＭＯＳカメラ、イメージインテンシファイアなどの、その他の光検出器（光電変換素子）を使用することも可能である。
【００５２】
又、光源１から検出器３に至る光学経路において、例えば、カットフィルタ６は、図１に示すように波長可変液晶分光フィルタ２よりも検出器３側（本例では波長可変液晶分光フィルタ２とレンズ７との間）に配置してもよいし、図２０に示すように波長可変液晶分光フィルタ２よりも測定プレート１２側に配置してもよい。即ち、光源１から検出器３に至る光学経路における各光学部品は、本例と実質的に同じ機能を達成できるのであれば、その配列順序等は適宜に変更可能である。
【００５３】
又、励起光は、上述のように透過光として照射する方法、落射光として上部又は斜めから照射する方法、エバネッセント光として照射（エバネッセント照明）する方法、又はこれらを組み合わせた方法によって照射することができる。
【００５４】
例えば、図２１は、測定プレート１２に、光源１からの励起光を斜めからの落射光として照射し、生じた蛍光をテレセントリックレンズ７を通し、波長可変液晶分光フィルタ２で分光して、高感度冷却ＣＣＤカメラとされる検出器３で撮像する装置の例を示す。この場合には、ウェル１２ａ内の試料混合物に励起光を透過光として照射する必要がないため、測定プレート１２の底面（例えば、図２に示すような層構成の場合は第１層１２ｂの表面１２ｂ１）は透明である必要はない。又、光源１は斜めから光を照射しているので、分子プローブに均一に励起光を照射するため、測定プレート１２から検出器３に至る直線に対して左右の両側に光源を設けた構造になっている。又、図２１の例では、試料混合物から発された蛍光を平行光として波長可変液晶分光フィルタ２を透過させるために、測定プレート１２から検出器３に至る光学経路において、波長可変液晶分光フィルタ２よりも前（即ち、測定プレート１２側）に、テレセントリックレンズ７を設置している。
【００５５】
又、エバネッセント照明を利用する場合は、例えば、次のような構成とする。即ち、図２に示すような層構成の測定プレート１２の第１層１２ｂをＢＫ−７のようなガラス材料で作製する。そして、その測定プレート１２の底面１２ｂ１側から斜めに、全ウェル１２ａに光が当たるように、又第１層１２ｂの上面（第２層１２ｃ側の面）で光が全反射するような角度で、励起光を照射する。
【００５６】
又、測定プレート１２は本例の構成に限定されるものではなく、任意にウェル１２ａの径などの大きさを変更したり、ウェル１２ａの数を変更したりすることで、より多くの検体又はより少ない検体を測定できるようにしてもよい。
【００５７】
更に、本例では、複数の試料保持部を有する試料容器は、測定装置の本体に対して着脱可能に装着されるものであるが、試料容器は測定装置に固定されていてもよい。
【００５８】
次に、本発明に従って測定し得る生体成分又はその機能について説明する。
【００５９】
「生体成分」とは、生体内に存在する全ての成分のことであり、より詳細には、生体内おいて機能的又は構造的な役割を担って存在する全ての成分である、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、補酵素、糖、糖鎖、又はそれらの誘導体及び複合体（例えば、糖タンパク質、糖脂質など）、各種酵素（例えば、核酸分解酵素、核酸修飾酵素、核酸合成酵素、タンパク質分解酵素、タンパク質修飾酵素、糖鎖分解酵素、糖ヌクレオチド合成酵素又は糖転移酵素）、酵素反応の基質（例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖など）、水素イオン、金属イオン、その他の生体内物質が含まれる。
【００６０】
「生体成分の機能」とは、生体成分に関わる全ての機能のことであり、より詳細には、生体成分同士の化学反応、その他の生体成分同士の相互作用を含む全ての生体反応が含まれる。生体成分の機能には、生体反応以外にも、ある生体成分の作用により関連する他のある生体成分の量が変わる（例えば、カルシウムイオン濃度変化、プロトンの濃度変化であるｐＨ変化など）などの生体内状態変化を引き起こす全ての機能が含まれる。生体成分の機能の典型例としては、タンパク質、核酸、脂質、糖質などに対する分解、転移、付加、合成を行う酵素反応や、生体内物質の濃度変化、細胞内局在変化などが挙げられる。
【００６１】
「分子プローブ」は、測定対象となる生体成分又はその機能の存否若しくは多寡（より詳細には、生体成分の有無若しくは濃度又は生体成分の機能（活性）の有無若しくは大小：これを以下単に「生体成分の活性又は濃度」ともいう）の状態の相違に応じて、蛍光・発光の有無又は強度の状態が相違し、斯かる蛍光・発光の有無又は強度の相違から上記測定対象の状態の相違を測定することを可能とする分子である。分子プローブは、１種類の分子で当該分子プローブとしての機能を発揮するものであってもよいし、複数種類の分子が協働して当該分子プローブとしての機能を発揮するものであってもよい。
【００６２】
分子プローブとしては、代表的には、蛍光分子間（蛍光タンパク質間、有機蛍光分子間、蛍光タンパク質と有機蛍光分子間など）、又は蛍光分子（蛍光タンパク質、有機蛍光分子など）と量子ドット間のＦＲＥＴを利用した分子プローブが挙げられる。この場合、上記蛍光分子（蛍光タンパク質、有機蛍光分子など）や量子ドットなどの蛍光物質は、測定対象となる生体成分又はその相互作用パートナー（測定対象となる生体成分の機能により存否若しくは多寡の状態が変化する関連生体成分と相互作用をするものを含む）に結合される。又、この場合、ＦＲＥＴを生起する一対の蛍光物質（蛍光分子、量子ドットなど）は、当初、１種類の分子上に全てが結合されていても、複数種類の分子上に分けて結合されていてもよい。
【００６３】
又、分子プローブは、液体中などの流動状態においても、又は基盤などの支持体に固定した状態においても、使用することができる。例えば、分子プローブを測定プレートのウェルに固定する方法は、利用可能な任意の方法を用いることができる。
【００６４】
「蛍光物質」としては、適宜に任意のもの利用可能であるが、例えば、ＦＲＥＴを利用した分子プローブに使用する第１の蛍光物質としては、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰを代表とする蛍光タンパク質とその変異体、量子ドット蛍光試薬などが好適に利用可能である。又、特に、ＦＲＥＴを利用する場合に、上記の如き第１の蛍光物質と対をなす第２の蛍光物質としては、ＦＲＥＴが起こるような蛍光物質であれば如何なるものでも利用可能であるが、Ａｌｅｘａ  ｄｙｅ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ、ｄｙｅ、ｑｕｅｎｃｈｅｒなどが好適に利用可能である。
【００６５】
ＦＲＥＴを利用した分子プローブによって、典型的には、生体成分の機能としての生体反応、例えば、タンパク質同士、タンパク質と核酸、核酸同士、タンパク質と糖鎖などの結合や解離反応、或いは、酵素反応を測定することができる。
【００６６】
例えば、第１、第２の蛍光物質（ドナー及びアクセプター）を有する分子プローブにタンパク質、核酸、糖鎖などの生体成分が含まれる場合に、タンパク質分解酵素、核酸分解酵素、糖鎖分解酵素で処理することでその生体成分が切断され、ＦＲＥＴが解消されることを検出することによって、酵素活性を測定することができる。
【００６７】
又、酵素が転移酵素である場合には、分子プローブとして、第１の蛍光物質に第２の蛍光物質で標識されていない基質が結合された第１の分子プローブと、第２の蛍光物質で標識された基質である第２の分子プローブとから成るものを用い、第２の分子プローブの基質が転移酵素によって転移された結果生じるＦＲＥＴを検出することによって、酵素活性を測定することができる。
【００６８】
このような分子プローブに含まれる生体成分としてのペプチドは、生体内においてそれ自体機能しているものでも、タンパク質の機能領域等に相当するペプチド部分でもよい。又、このペプチドは、特定のタンパク質の機能ドメイン又は機能領域に相当する配列など、タンパク質の一部であってもよい。このようなペプチドとしては、例えば、タンパク質分解酵素の認識配列、タンパク質リン酸化酵素の認識配列、糖転移酵素の認識配列、核酸結合配列など、ある生体成分によって認識され、該生体成分との相互作用が期待されるものであって、その結果としてＦＲＥＴに影響を及ぼすものであれば任意のものが利用可能である。
【００６９】
又、タンパク質同士、タンパク質と核酸、核酸同士、タンパク質と糖鎖などの結合反応に関しては、一方の生体成分を第２の蛍光物質で標識せずに第１の蛍光物質に結合させた分子プローブを調製し、この分子プローブと結合パートナーとなる第２の蛍光物質で標識した生体成分を接触させ、ＦＲＥＴの低い状態から高い状態への変化を測定することにより、両生体分子の結合又は相互作用の存在を判断することができる。
【００７０】
又、例えば、生体成分との結合（金属イオンをキレートするなども含め）によりその蛍光特性が変化する環境依存型蛍光色素を適切なスペーサー分子等を用いて量子ドットなどの蛍光物質に結合させた分子プローブを用いて、該生体成分の濃度変化をＦＲＥＴ変化検出法に適応することも可能である。更に、例えば、量子ドットなどの第１の蛍光物質と、第２の蛍光物質としてのｐＨ感受性の蛍光色素とを結合した分子プローブを用いて、ｐＨに応じた蛍光スペクトルの変化により、生体成分又はその機能としてｐＨを測定することができる。
【００７１】
尚、分子プローブは、ＦＲＥＴを利用せずに、単独の蛍光物質（蛍光分子、量子ドットなど）を利用したものであってもよく、この場合も、該蛍光物質は、測定対象となる生体成分又はその相互作用パートナーに結合される。例えば、抗体に蛍光物質を標識したものなどが利用可能である。
【００７２】
一方、分子プローブは、蛍光物質を利用せずに、発光物質を利用したものであってもよい。一例として、蛍ルシフェラーゼ標識プローブを分子プローブとした、ＤＮＡの測定が挙げられる。この場合、測定装置１００において、励起光を照射するための光源１は設けなくてよい。
【００７３】
ここで、測定装置１００を用いて試料混合物から発された光を検出した結果に基づいて生体成分又はその機能を測定する方法は、大別して２種類のパターンに分類できる。
【００７４】
第１のパターンは、検出された複数（典型的には２個）の特定波長における光強度の比率が、生体成分の活性又は濃度に相関するパターンである。図１２は、第１のパターンの一例として、ＦＲＥＴを利用する分子プローブを用いた場合の蛍光スペクトルの一例を示す。この例では、ドナー（第１の蛍光物質）のピーク１と、アクセプター（第２の蛍光物質）のピーク２との２個の蛍光ピークが観測される。そして、測定対象となる生体成分の活性又は濃度に応じて、観測されるピーク１とピーク２の平均輝度（蛍光強度）が変化する。図１２中に実線、破線、２点鎖線で示す３個の蛍光スペクトルは、生体成分の活性又は濃度を３段階に変化させた場合のものである。
【００７５】
この場合、次のようにして、生体成分又はその機能を測定することができる。
【００７６】
先ず、図１３のフローチャートに示すように、特定の分子プローブに関し、複数の特定波長の光強度比と、生体成分の活性又は濃度との関係を予め求める。より具体的には、先ず、特定の分子プローブを含む所望の測定系において、測定対象となる生体成分の活性又は濃度を所望の範囲内の適切な値に設定し、所望の波長範囲における波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を、図７を参照して説明したのと同様にして求める（Ｓ２０１）。次いで、得られた波長と平均輝度との関係から、ピーク１とピーク２の平均輝度をそれぞれ求める（Ｓ２０２）。次いで、ピーク２の平均輝度をピーク１の平均輝度で除算してピーク比率を求める（Ｓ２０３）。生体成分の活性又は濃度を所望の範囲で変化させて、Ｓ２０１〜Ｓ２０３の処理を繰り返し、所望の数のピーク比率データを得る（Ｓ２０４）。そして、得られた所望の数のピーク比率データから、相関式やテーブルデータとして、生体成分の活性又は濃度とピーク比率との関係を求める（Ｓ２０５）。この関係は、測定装置１００において、処理装置１１の制御部１１ａが演算制御することによって求めることができ、ＲＯＭ１１ｃに記憶させておくことができる。
【００７７】
次に、検体の測定においては、図１４のフローチャートに示すように、予め求められた関係と、検体に関して測定された複数の特定波長の光強度比との比較結果に基づいて、検体における生体成分又はその機能を測定する。より具体的には、先ず、特定の分子プローブと検体とを含む試料混合物について、所望の波長範囲における波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を、図７を参照して説明したようにして求める（Ｓ３０１）。次いで、処理装置１１の制御部１１ａは、得られた波長と平均輝度との関係から、ピーク１とピーク２の平均輝度をそれぞれ求める（Ｓ３０２）。次いで、制御部１１ａは、ピーク２の平均輝度をピーク１の平均輝度で除算してピーク比率を求める（Ｓ３０３）。そして、制御部１１ａは、予め求められてＲＯＭ１１ｂに記憶されている関係と、検体について測定されたピーク比率とを比較することによって、当該検体における測定対象となる生体成分の活性又は濃度を求める（Ｓ３０４）。
【００７８】
尚、図１３及び図１４の例では、ピーク比率自体と、生体成分の活性又は濃度との関係から、生体成分の活性又は濃度を求めているが、ピーク比率の変化量と、生体成分の活性又は濃度との関係から、生体成分の活性又は濃度を求めてもよい。この場合、所定の期間でのピーク比率の変化量と、生体成分の活性又は濃度との関係を予め求めておき、検体についても同じ所定期間でのピーク比率の変化量を測定し、予め求められた関係と比較することによって、検体における生体成分の活性又は濃度を求めることができる。このように変化量から生体成分の活性又は濃度を測定する場合は、一定間隔をあけて複数回（例えば２回）の測定を行い、その複数回の測定値間における変化量と、予め求められた関係とを比較すればよい。該一定間隔の間は、測定プレート１２は、測定装置１００の内部又は外部のいずれにあってもよい。又、複数回の測定における各回の測定値は、処理装置１１のＲＡＭ１１ｂに記憶しておき、所望の数の測定値が得られたときに、制御部１１ａによって生体成分の活性又は濃度を計算するようにすることができる。
【００７９】
又、図１３及び図１４の例では、ピーク１とピーク２とのピーク比率から生体成分の活性又は濃度を計算しているが、得られる蛍光スペクトルが複数の蛍光ピークを有する場合であっても、後述する第２のパターンの場合と同様にして、複数の蛍光ピークのそれぞれ又はいずれか（本例ではピーク１及び／又はピーク２）のピーク高さ又はその変化から、生体成分の活性又は濃度を計算してもよい。
【００８０】
次に、第２のパターンは、検出されたある特定波長における光強度が、生体成分の活性又は濃度に相関するパターンである。図１５は、第２のパターンの一例として、蛍光ピークが１個の分子プローブを用いた場合の蛍光スペクトルの一例を示す。この例では、蛍光ピークは１個だけ観測される。そして、測定対象となる生体成分の活性又は濃度に応じて、観測されるピークの平均輝度（蛍光強度）が変化する。図１５中に実線、破線、２点鎖線で示す３個の蛍光スペクトルは、生体成分の活性又は濃度を３段階に変化させた場合のものである。
【００８１】
この場合、次のようにして、生体成分又はその機能を測定することができる。
【００８２】
先ず、図１６のフローチャートに示すように、特定の分子プローブに関し、特定波長の光強度比と、生体成分の活性又は濃度との関係を予め求める。より具体的には、先ず、特定の分子プローブを含む所望の測定系において、測定対象となる生体成分の活性又は濃度を所望の範囲内の適切な値に設定し、所望の波長範囲における波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を、図７を参照して説明したのと同様にして求める（Ｓ４０１）。次いで、得られた波長と平均輝度との関係から、ピークの平均輝度を求める（Ｓ４０２）。生体成分の活性又は濃度を所望の範囲で変化させて、Ｓ４０１〜Ｓ４０２の処理を繰り返し、所望の数のピークの平均輝度（即ち、ピーク高さ）のデータを得る（Ｓ４０３）。そして、得られた所望の数のピークの平均輝度データから、相関式やテーブルデータとして、生体成分の活性又は濃度とピークの平均輝度との関係を求める（Ｓ４０４）。この関係は、測定装置１００において、処理装置１１の制御部１１ａが演算制御することによって求めることができ、ＲＯＭ１１ｃに記憶させておくことができる。
【００８３】
次に、検体の測定においては、図１７のフローチャートに示すように、予め求められた関係と、検体に関して測定された特定波長の光強度比との比較結果に基づいて、検体における生体成分又はその機能を測定する。より具体的には、先ず、特定の分子プローブと検体とを含む試料混合物について、所望の波長範囲における波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を、図７を参照して説明したようにして求める（Ｓ５０１）。次いで、処理装置１１の制御部１１ａは、得られた波長と平均輝度との関係から、ピークの平均輝度を求める（Ｓ５０２）。そして、制御部１１ａは、予め求められてＲＯＭ１１ｂに記憶されている関係と、検体について測定されたピークの平均輝度（即ち、ピーク高さ）とを比較することによって、当該検体における測定対象となる生体成分の活性又は濃度を求める（Ｓ５０３）。
【００８４】
尚、図１６及び図１７の例では、ピーク高さ自体と、生体成分の活性又は濃度との関係から、生体成分の活性又は濃度を求めているが、ピーク高さの変化量と、生体成分の活性又は濃度との関係から、生体成分の活性又は濃度を求めてもよい。この場合、所定の期間でのピーク高さの変化量と、生体成分の活性又は濃度との関係を予め求めておき、検体についても同じ所定期間でのピーク高さの変化量を測定し、予め求められた関係と比較することによって、検体における生体成分の活性又は濃度を求めることができる。
【００８５】
いずれの場合も、図６に示すように、制御部１１ａは、測定結果に係る情報を処理装置のＲＡＭ１１ｂなどの記憶手段に記憶させたり、処理装置１１の表示部１１ｄにおいて表示させたり、通信制御部１１ｅを介して通信可能に処理装置１１に接続された表示装置、プリンタ、ホスト機器に送信してそれぞれ表示、プリント、記憶などさせたりすることができる。各種設定の入力、測定の開始又は停止などの処理装置１１の制御部１１ａに対する指示は、処理装置１１の入力部１１ｆによって行うことができる。
【００８６】
又、分子プローブが蛍光物質を利用する場合において、分子プローブと検体とを含む試料混合物に励起波長を照射するタイミングは、該試料混合物をインキュベートしている間、又はインキュベートの後のいずれであってもよい。リアルタイムで何らかの活性、反応を見たい場合は、インキュベート中に励起波長を照射するのが好ましく、最終的な活性の確認を行うのであれば、インキュベート後に励起波長を照射すればよい。
【００８７】
又、いずれの場合も、複数の分子プローブを使用する場合には、それぞれの分子プローブ毎に上述のような計算を実施する必要がある。
【００８８】
この点、本発明によれば、試料保持部毎に種類の異なる分子プローブを用いるような場合でも、測定装置１００を用いて試料保持部毎の蛍光スペクトルを別々に同時に測定することができるため、分子プローブから発される光のパターンがどのように変化しても対応できるという利点がある。
【００８９】
尚、分子プローブからの光のピークがどの波長に出現するかが予め分かっている場合には、必ずしも上述した各パターンの例のようにスペクトルを測定する必要はなく、ピークが発現する波長のみの平均輝度を測定するだけで、検体における測定対象の生体成分の活性又は濃度を計算することが可能である。このような場合でも波長可変液晶分光フィルタを使用することで、分子プローブの種類が変わっても分光フィルタを交換する必要がないという利点がある。
【００９０】
上述のように、典型的には、それ自体又はその機能が測定対象となる生体成分は、タンパク質、酵素、ペプチド、アミノ酸、補酵素、糖、糖鎖、脂質、核酸、それらの誘導体並びにそれらの複合体、水素イオン、及び金属イオンからなるグループより選択される。より詳しくは、それ自体又はその機能が測定対象となる生体成分としては、カスパーゼ３、カスパーゼ９、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、トリプシン、セパラーゼ、ＤＮａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素が挙げられる。
【００９１】
又、検体としては、単離された又は混合された状態の生体成分、細胞、細胞抽出物又はそれらの混合物が挙げられる。
【００９２】
以下、本発明に従う更に具体的な実施例を参照して、本発明の効果について更に説明する。
【００９３】
実施例１
本実施例では、図１に示す全体構成を有する波長可変液晶分光フィルタ２を用いた測定装置１００において、光源１として中心波長４８０ｎｍの光を発する超高輝度ＬＥＤ光源を用いた。光源１からの光は、測定プレート１２のウェル１２ａ内の試料混合物に平行光を照射するための光源レンズ４を通した後、励起フィルタ５で４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの波長の光を透過させるようにした。励起フィルタ５を通過した光は、９個のウェル１２ａを有する測定プレート１２に入射する。
【００９４】
測定プレート１２のウェル１２ａ内に分子プローブと検体とを含む試料混合物を収容し反応させて、該試料混合物から発される蛍光を測定する。測定プレート１２のウェル１２ａから発生した蛍光は、波長可変液晶分光フィルタ２を通過し、５００ｎｍ以下の波長の光をカットする広帯域フィルタ７を通過し、更に平行光を検出器（本実施例では高感度冷却ＣＣＤカメラ）３の受光面に投影するためのテレセントリックレンズ７を通過して、検出器３により蛍光イメージングとして検出される。検出器３によって撮像した画像の情報は、接続手段としてのＵＳＢケーブル９により処理装置（コンピュータ）１１に送られ、画像データとして保存及び処理される。波長可変液晶分光フィルタ２は、処理装置１１に接続された駆動装置８により、その透過ピーク波長がコントロールされる。
【００９５】
そして、本実施例では、この測定装置１００を用いて、複数の生体成分又はその機能を同時に測定する。本実施例では、分子プローブとしては、ＦＲＥＴを応用したプロテアーゼ活性分析用の分子プローブを用いた。又、本実施例では、そのプロテアーゼ活性分析用の分子プローブとしては、図１８に示すように、次の２種類の分子プローブ１及び２の混合物を使用した。即ち、分子プローブ１は、ドナーとしての蛍光タンパク質ＧＦＰと、アクセプターとしての波長５７０ｎｍに蛍光ピークを持つ蛍光物質１とを有して構成された分子プローブである。又、分子プローブ２は、ドナーとしての蛍光タンパク質であるＲＦＰと、アクセプターとしての波長６７０ｎｍ付近に蛍光ピークを持つ蛍光物質２とを有して構成された分子プローブである。分子プローブ１は、カスパーゼ３が作用すると蛍光物質１が蛍光タンパク質ＧＦＰから外れ、ＦＲＥＴが解消する特性を有する。又、分子プローブ２は、トリプシンが作用すると蛍光物質２が蛍光タンパク質ＲＦＰから外れ、ＦＲＥＴが解消する特性を有する。
【００９６】
従って、本実施例では、各分子プローブのドナー側の蛍光ピーク波長における蛍光強度と、アクセプター側の蛍光ピーク波長における蛍光強度との比率を測定することで、各分子プローブに対応した酵素活性を測定することが可能になる。
【００９７】
本実施例における分子プローブ１と分子プローブ２を用いたカスパーゼ３とトリプシンの活性測定方法は次の通りである。本実施例の測定装置１００でイメージングにより蛍光スペクトルを測定する場合、先ず、２種類の分子プローブ１及び２（溶液）を測定プレート１２の９個のウェル１２ａのそれぞれに入れ、次いでカスパーゼ３とトリプシンの活性を測定する検体（溶液）をそれぞれのウェル１２ａに添加して試料混合物（混合液）を調製した後、この測定プレート１２を３７℃で１時間程度インキュベートする。次いで、測定プレート１２を測定装置１００にセットし、励起光として波長が４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの光を照射する。これにより、測定プレート１２のウェル１２ａ内の試料混合物に励起光が照射されて、分子プローブ１及び２から蛍光が発される。続いて、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を５００ｎｍから５ｎｍステップで７００ｎｍまで変化させ、複数のウェル１２ａから発される蛍光を、波長毎の２次元の画像として測定する。
【００９８】
図５に示すような波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長毎に得られる画像から、図７を参照して説明したようにして、各ウェル１２ａに対応した蛍光画像の平均輝度を計算する。本実施例では、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を最初は５００ｎｍに設定し、蛍光画像を測定して保存する。続いて、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を５０５ｎｍに設定し、蛍光画像を測定して保存する。この操作を波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を５００ｎｍから７００ｎｍまで５ｎｍステップで変更するたびに繰り返して行い、取得された波長毎の画像から各ウェル１２ａの位置に対応する波長毎の平均輝度（蛍光スペクトル）を得る。
【００９９】
図１９は、本実施例に従って得られた蛍光スペクトルの一例を示す。図１９の例では、分子プローブ１については、蛍光タンパク質ＧＦＰの蛍光ピーク（１）と蛍光物質１の５７０ｎｍ付近の蛍光ピーク（２）が測定され、又分子プローブ２については、蛍光タンパク質ＲＦＰの蛍光ピーク（３）と蛍光物質２の６７０ｎｍ付近の蛍光ピーク（４）が測定される。
【０１００】
分子プローブ１はカスパーゼ３の活性が高いとＦＲＥＴが解消するため、アクセプターである蛍光物質１の５７０ｎｍ付近の蛍光ピーク（２）が小さくなり、ドナーであるＧＦＰの蛍光ピーク（１）が相対的に大きくなる。従って、カスパーゼ３の活性を求める場合、（２）のピーク高さを（１）のピーク高さで除算した値が、カスパーゼ３の活性に比例することになる。
【０１０１】
同様に、分子プローブ２はトリプシンの活性が高いとＦＲＥＴが解消するため、アクセプターである蛍光物質２の６７０ｎｍ付近の蛍光ピーク（４）が小さくなり、ドナーであるＲＦＰの蛍光ピーク（３）が相対的に大きくなる。従って、トリプシンの活性を求める場合、（４）のピーク高さを（３）のピーク高さで除算した値が、トリプシンの活性に比例することになる。この計算を９個のウェル１２ａについて得られた各蛍光スペクトルに基づいて同時に行うことで、９個の検体における２種類のプロテアーゼの酵素活性の測定を同時に行うことが可能となる。
【０１０２】
以上のように、本実施例によれば、複数のウェル１２ａに複数の分子プローブと検体を入れ、波長可変液晶分光フィルタ２を用いて、蛍光イメージングにより波長毎の画像を全てのウェル１２ａについて取得する。又、取得された画像から各ウェル１２ａについての波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を求め、各分子プローブに特異的なドナーとアクセプターとのそれぞれに対応する蛍光ピーク波長における平均輝度（即ち、ピーク高さ）を求める。そして、各分子プローブに特異的なアクセプターに対応する蛍光ピーク波長におけるピーク高さを、ドナーに対応する蛍光ピーク波長におけるピーク高さで除算することで、複数種類の酵素活性の同時測定が可能となる。
【０１０３】
この方法の利点は、波長毎の蛍光強度を測定することで、分子プローブの種類が変わっても、その都度その分子プローブの種類に対応した蛍光分光フィルタを用意する必要がなく、例えば試料保持部毎に蛍光特性の異なる分子プローブを使用するような場合であっても極めて簡便、短時間に測定を行うことが可能になる。又、分子プローブによっては、測定条件により蛍光特性が変化する場合もあり、そのような場合でも異なる蛍光分光フィルタを別途容易する必要がなく、最適な波長の蛍光強度を使用して生体成分の活性又は濃度を計算することが可能になる。
【０１０４】
本実施例では、２種類の分子プローブを使用し、２種類のプロテアーゼ活性を測定しているが、分子プローブの種類の数は、測定対象となる生体成分又はその機能に対応して任意に設定することができ、測定精度等に鑑みれば、好ましくは、分子プローブは１種類から３種類程度である。
【０１０５】
１種類の分子プローブを使用する場合には、励起波長は分子プローブに最適な領域を選択して使用すれば良いし、蛍光を測定する範囲も使用する分子プローブに最適な波長を使用すれば良い。
【０１０６】
複数の分子プローブを使用する場合の励起波長と蛍光波長の選択は重要である。ＦＲＥＴを利用した分子プローブは、通常ドナーとアクセプターの２個の蛍光波長のピークが生じる。そのため、ＦＲＥＴを利用した２種類の分子プローブを使用する場合には、４個の蛍光ピークが生じることになる。本実施例では、ＧＦＰの蛍光ピークが約５１５ｎｍに、蛍光物質１の蛍光ピークが約５６５ｎｍに、ＲＦＰの蛍光ピークが約６００ｎｍに、蛍光物質２の蛍光ピークが約６７５ｎｍにあり、各蛍光ピークは重ならない。従って、全ての蛍光ピークを的確に測定することが可能である。このように、使用するドナーとアクセプターの蛍光ピーク波長はできるだけ重ならないように分子プローブを設計することが重要である。又、本実施例では、４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの狭帯域フィルタを使用して１帯域の励起光を照射しているが、これはＧＦＰとＲＦＰの両方の蛍光タンパク質が、４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの光で励起可能であるためである。
【０１０７】
３種類の生体成分又はその機能を測定するＦＲＥＴを利用した３種類の分子プローブのドナー及びアクセプターとしては、例えば、次のような組み合わせが使用可能である。ＧＦＰ（ドナー：蛍光ピーク波長５１０ｎｍ）−蛍光物質（アクセプター：蛍光ピーク波長６１７ｎｍ）、ＹＦＰ（ドナー：蛍光ピーク波長５３０ｎｍ）−蛍光物質（アクセプター：蛍光ピーク波長６４７ｎｍ）、ＲＦＰ（ドナー：蛍光ピーク波長５６０ｎｍ）−蛍光物質（アクセプター：蛍光ピーク波長６８０ｎｍ）などの組み合わせである。この場合にも、４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの狭帯域フィルタを使用して１帯域の励起光で照射することで測定を行うことが可能である。
【０１０８】
又、使用する蛍光物質によっては１個の帯域の励起波長だけでは適正な励起ができない場合もある。その場合には、励起光を切り換えて測定することもできる。例えば、ドナーとして蛍光タンパクのＢＦＰを使用する場合には、励起波長は３８４ｎｍなどを使用することができる。励起光の切り替えは、当業者には明らかな利用可能な任意の方法を用いて光学フィルタを切り替えて光源から試料容器への光学経路中に配置することで行うことができる。
【０１０９】
又、前述したように、分子プローブは本実施例のようなＦＲＥＴを利用して測定するもの以外に、単独の蛍光物質を使用した分子プローブ、発光物質を利用した分子プローブなども利用できる。発光物質を利用した分子プローブの場合には、励起光を照射する必要はない。
【０１１０】
以上説明したように、本発明によれば、従来困難であった多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことが可能となる。更に言えば、本発明によれば、複数の分子プローブを一の又は複数の検体に対して同時に用いて、一の又は複数の検体における複数の生体成分又はその機能を同時に測定する場合でも、多検体を同時に短時間に測定することが可能となり、よりハイスループットな成分と機能の測定を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明に係る測定装置の一実施例の概略構成図である。
【図２】本発明に係る測定装置の一実施例において用いられる測定プレートを示す（ａ）平面図、（ｂ）側面図、及び（ｃ）斜視図である。
【図３】本発明に係る測定装置において用いられる波長可変液晶分光フィルタの一例の模式図である。
【図４】波長可変液晶分光フィルタの透過波長と透過率との関係の一例を示すグラフ図である。
【図５】本発明に従って撮像された測定プレートのウェルの画像の一例を示す図である。
【図６】本発明に係る測定装置の一実施例における制御態様を示すブロック図である。
【図７】平均輝度の計算方法を説明するためのフローチャート図である。
【図８】本発明に係る測定装置の一実施例において得られた複数のウェルについての蛍光スペクトルの一例を示すグラフ図である。
【図９】本発明に係る測定装置の一実施例において得られた複数種類の蛍光物質を収容したウェルについての蛍光スペクトルの一例を示すグラフ図である。
【図１０】本発明に係る測定装置の一実施例において得られた複数種類の蛍光物質を収容したウェルについての蛍光スペクトルの一例を示すグラフ図である。
【図１１】本発明に係る測定装置の一実施例において得られた複数種類の蛍光物質を収容したウェルについての蛍光スペクトルの一例を示すグラフ図である。
【図１２】本発明に係る測定装置を用いた生体成分又はその機能の測定方法の第１のパターンを説明するためのグラフ図である。
【図１３】本発明に係る測定装置を用いた生体成分又はその機能の測定方法の第１のパターンを説明するためのフローチャート図である。
【図１４】本発明に係る測定装置を用いた生体成分又はその機能の測定方法の第１のパターンを説明するためのフローチャート図である。
【図１５】本発明に係る測定装置を用いた生体成分又はその機能の測定方法の第２のパターンを説明するためのグラフ図である。
【図１６】本発明に係る測定装置を用いた生体成分又はその機能の測定方法の第２のパターンを説明するためのフローチャート図である。
【図１７】本発明に係る測定装置を用いた生体成分又はその機能の測定方法の第２のパターンを説明するためのフローチャート図である。
【図１８】分子プローブの一例の機能を説明するための模式図である。
【図１９】本発明に係る測定装置の一実施例において得られたＦＲＥＴを利用した複数の分子プローブを用いた場合の蛍光スペクトルの一例を示すグラフ図である。
【図２０】本発明に係る測定装置の他の実施例の概略構成図である。
【図２１】本発明に係る測定装置の他の実施例の概略構成図である。
【図２２】分子プローブの一例の機能を説明するための模式図である。
【図２３】ＦＲＥＴを利用した分子プローブを用いた場合の蛍光スペクトルの一例を示すグラフ図である。
【符号の説明】
【０１１２】
１          光源
２          波長可変液晶分光フィルタ
３          検出器
４          光源レンズ
５          励起フィルタ
６          カットフィルタ
７          レンズ
８          駆動装置
９          ケーブル
１０        遮光箱
１１        処理装置
１００      測定装置
【図１】
0005057377.tif 000002
【図２】
0005057377.tif 000003
【図３】
0005057377.tif 000004
【図４】
0005057377.tif 000005
【図６】
0005057377.tif 000006
【図７】
0005057377.tif 000007
【図８】
0005057377.tif 000008
【図９】
0005057377.tif 000009
【図１０】
0005057377.tif 000010
【図１１】
0005057377.tif 000011
【図１２】
0005057377.tif 000012
【図１３】
0005057377.tif 000013
【図１４】
0005057377.tif 000014
【図１５】
0005057377.tif 000015
【図１６】
0005057377.tif 000016
【図１７】
0005057377.tif 000017
【図１８】
0005057377.tif 000018
【図１９】
0005057377.tif 000019
【図２０】
0005057377.tif 000020
【図２１】
0005057377.tif 000021
【図２２】
0005057377.tif 000022
【図２３】
0005057377.tif 000023
【図５】
0005057377.tif 000024