(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小麦タンパク質又は小麦糖タンパク質であるキシラナーゼ阻害剤であって、前記阻害剤が、約７．０より大きいｐＩ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約４０〜４３ｋＤａの分子量を有し、前記阻害剤が、β−メルカプトエタノールでの還元後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に二つの別個のバンドとして表われ、前記二つの別個のバンドが、約３０ｋＤａ及び約１０ｋＤａの分子量を有し、前記タンパク質又は糖タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記二つの別個のバンドがそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする阻害剤。
【請求項２】
植物又は植物材料から請求の範囲１の阻害剤を得る方法であって、前記植物又は植物材料が１以上の抽出及び／又は分別操作に供されることを特徴とする方法。
【請求項３】
大麦、モロコシ及び小麦の如き穀物のモルト製造及び／又はビール製造を改善するための、請求の範囲１の阻害剤又は請求の範囲２の方法によって得られた阻害剤の使用方法。
【請求項４】
ストレートドウ、スポンジドウ、Ｃｈｏｒｌｅｙｗｏｏｄパン、朝食用シリアル、ビスケット、パスタ及び麺からなる群から選択される焼かれた又は押し出された穀物製品の製造及び／又は質を改善するための、請求の範囲１の阻害剤又は請求の範囲２の方法によって得られた阻害剤の使用方法。
【請求項５】
動物飼料効率を改善するための、請求の範囲１の阻害剤又は請求の範囲２の方法によって得られた阻害剤の使用方法。
【請求項６】
澱粉由来のシロップ、ソルビトール、キシロース及び／又はキシリトール製造を改善するための、請求の範囲１の阻害剤又は請求の範囲２の方法によって得られた阻害剤の使用方法。
【請求項７】
小麦粉のグルテン−澱粉分離及び製造のための、請求の範囲１の阻害剤又は請求の範囲２の方法によって得られた阻害剤の使用方法。
【請求項８】
トウモロコシ加工の改善のための、請求の範囲１の阻害剤又は請求の範囲２の方法によって得られた阻害剤の使用方法。
【請求項９】
紙及びパルプ工業の改善のための、請求の範囲１の阻害剤又は請求の範囲２の方法によって得られた阻害剤の使用方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明はセルロース分解、キシラン分解及び／又はβ−グルカン分解酵素（これらはセルラーゼ、ペントサナーゼ及び／又はヘミセルラーゼとも呼ばれることもある）の阻害剤、特にエンドキシラナーゼ（例えばＥＣ：３．２．１．８）、β−キシロシダーゼ（例えばＥＣ：３．２．１．３７）及びα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（例えばＥＣ：３．２．１．５５）の如きペントサン分解酵素の阻害剤、セルラーゼ（例えばＥＣ：３．２．１．４）、β−グルカナーゼ（例えばＥＣ：３．２．３．７３又はＥＣ：３．２．１．６）の阻害剤、及び他のキシラン、アラビノキシラン及びβ−グルカン分解酵素の阻害剤に関する。これらの酵素は微生物、植物、植物材料又はその画分（例えば穀物、穀粒、穀粉又はその画分）中に存在する。
本発明は前記阻害剤を得るための方法及び食品、飼料及び／又は飲料工業の様々な分野における前記阻害剤の使用方法にも関する。前記使用方法の例としては、モルト製造及び醸造、変換率を増大させるための動物飼料の製造、ストレートドウ（straight dough）、スポンジドウ（sponge dough）、及びChorleywoodパン、朝食用シリアル、様々なタイプのビスケット、パスタ及び麺の如き焼かれた及び／又は押し出された穀物製品の製造、澱粉由来のシロップ、ソルビトール、キシロース及び／又はキシリトールの製造、小麦グルテン−澱粉分離工業、トウモロコシ加工、植物の病気抵抗性の改善、食物繊維材料の構造を保持するといった栄養学的又は製薬的適用、及び紙及びパルプ工業の分野における使用方法が挙げられる。
発明の背景
大麦モルト以外にも小麦の如きモルトにされていない穀物もビール製造には一般的に用いられる（Pierce, J.S., Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Madrid, 1987, 445）。モルトにされていない小麦（４０−５０％）は例えばベルギー白（小麦）ビールの製造に用いられる。
大麦及び小麦の内胚乳の細胞壁はそれぞれ２０及び７０％（ｗ／ｗ）のアラビノキシランを含むものの（Ballance, G.M., & Manners, D.J., Carbohydrate Research, 1978, 61,107; Fincher, G.B., & Stone, B.A. In: Advances in Cereal Science and Technology, Vol. VIII. Y. Pomeranz,（Ed）, Am. Assoc. Cereal Chem., St. Paul（MN）, 1986, 207）、それらの総アラビノキシラン含有量はほぼ同じである。つまり大麦については２．８−７．１％（ｗ／ｗ）であり、小麦については３．６−７．１％（ｗ／ｗ）である（Henry, J., Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36, 1243; Hashimoto, S., Shogren, M.D. &  Pomeranz, Y., Cereal Chemistry, 1987, 64, 30）。
これらの穀粒はほぼ同レベルの水抽出可能なアラビノキシランをも含む。つまり大麦については０．２４−０．８０％（ｗ／ｗ）であり、小麦については０．２５−１．１８％である（Henry, J., Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36, 1243; Hashimoto, S., Shogren, M.D. &  Pomeranz, Y., Cereal Chemistry, 1987, 64, 30 Åman, P., & Hesselman, K., Swedish Journal of Agricultural Research, 1984, 14, 135; Girhammer, U., & Nair, B.M., Food Hydrocolloids, 1992, 6, 285）。更に、大麦と小麦の内胚乳の細胞壁はそれぞれ７０及び２０％のβ−グルカンを含む（Ballance, G.M., & Manners, D.J., Carbohydrate Research, 1978, 61,107; Fincher, G.B., & Stone, B.A. In: Advances in Cereal Sciences and Technology, Vol. VIII. Y. Pomeranz,（Ed）, Am. Assoc. Cereal Chem., St. Paul（MN）, 1986, 207）。
大麦は１．７−４．１％（ｗ／ｗ）の水抽出可能なβ−グルカン及び３．６−６．４％（ｗ／ｗ）の総β−グルカンを含む（Anderson, M.A., Cook, J.A., & Stone, B.A. Journal of the Institute of Brewing, 1978, 84, 233-239; Henry, J., Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36, 1243）。小麦は０．１−０．８％（ｗ／ｗ）の水抽出可能なβ−グルカン及び０．６−１．４％（ｗ／ｗ）の総β−グルカンを含む（Anderson, M.A., Cook, J.A., & Stone, B.A. Journal of the Institute of Brewing, 1978, 84, 233-239; Henry, J., Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36, 1243）。小麦中には低レベルのアラビノキシラン（Cleemput, G., Bleukx, W., van Oort, M., Hessing, M. & Delcour, J.A., Journal of Cereal Science, 1995, 22, 139）及びβ−グルカン分解酵素活性しか測定されないので、醸造中の小麦とモルトのアラビノキシラン及びβ−グルカンの加水分解に最も深くかかわっているのは大麦モルトであるにちがいない。
アラビノキシラン及びβ−グルカンを効率良く加水分解することは重要である。というのも、かかる化合物はウワート（wort）の粘度（Ducroo, P. &  Frelon, P.G., Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Zurich, 1989, 445;
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R.J. & Voragen, A.G.J., Journal of the Institute of Brewing, 1993, 99, 243）や濾過しやすさやにごり（haze）の形成（Coote, N. & Kirsop, B.H. 1976., Journal of the Institute of Brewing, 1976, 82, 34; Izawa, M., Kano, Y. & Kanimura, M. 1991. Proceedings Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distillling, 1990, 427）の如き製造過程における問題に関与することがあり得るからである。
他の分野においてもキシラン及び／又はアラビノキシランの効率の良い加水分解は同様に極めて望ましい。これらの分野の例としてはライ麦及び小麦を用いた製パン過程、紙及びバルブ工業が含まれる。上述したような適用のため、キシラン及び／又はアラビノキシラン加水分解酵素の（潜在的）適用に対して多くの研究努力がなされてきている。
発明の概要
本発明はセルロース分解、キシラン分解、及び／又はβ−グルカン分解酵素の阻害剤に関する。前記阻害剤は好ましくはエンドキシラナーゼ、β−グルカナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、及び他のキシラン、アラビノキシラン及びβ−グルカン分解酵素の阻害剤である。好ましくは前記阻害剤は微生物、植物、植物材料又はそれらの画分（例えば穀物、穀粒、穀物の胚芽又はその画分、穀粉又はその画分）から得られる。
「酵素の阻害剤」とは、前記酵素の活性を部分的又は全体的に阻害することができる分子を意味する。不可逆阻害においては阻害剤は酵素に共有結合的に結合しているか又は極めて堅固に結合しているので、酵素からの阻害剤の解離は極めて遅い。この場合、阻害剤は架橋反応で前記酵素の正常な基質を通常模倣する。対照的に、可逆阻害は酵素と阻害剤の間の迅速な平衡によって特徴付けられるであろう。競合的阻害剤は基質が活性部位に結合することを妨げ、基質に結合する酵素分子の割合を減少させることによって反応速度を減少させるかもしれない。非競合阻害においては阻害剤は代謝回転数を減少させるかもしれない。基質濃度を上昇させることによって阻害が解消されうるかどうかを測定することによって競合阻害と非競合阻害とを区別することができる。特定の生物種から単離された阻害剤であってタンパク質性又は糖タンパク質性の性質を持つものは同一種の酵素（つまり内因性酵素）に対して及び／又は異なる種の酵素（つまり外因性酵素）に対して活性であるかもしれない。
有利には本発明の阻害剤は微生物によって生産されるか又は微生物又は植物材料からの様々な抽出媒体中に存在することができる。これらの植物材料の例としては、小麦、マカロニ小麦、ライ麦、ライ小麦、大麦、モロコシ、カラス麦、トウモロコシ及び／又は米からの穀物又はその画分、穀粒又はその画分、穀物の胚芽又はその画分、穀粉又はその画分を挙げることができる。本発明の阻害剤はこれらから当業者には良く知られている方法によって得ることができる。本発明の好ましい具体例によれば、阻害剤はキシラナーゼ阻害剤であり、それは通常水溶性のアルカリ性タンパク質性種であり、約７．０より大きいｐＩ（つまり等電点の−log）を持つ。SDS−PAGEによって測定されたキシラナーゼ阻害剤の分子量は通常４０−４３kDaである。β−メルカプトエタノールを用いて還元した後、三つのSDS−PAGEタンパク質バンドが出現し、それらのSDS−PAGE分子量は約４０−４３kDa、約３０kDa及び約１０kDaである。４０−４３kDaのタンパク質又は糖タンパク質のＮ末端配列は今まで記述されていなかったものであり、通常以下の通りである：配列番号１：
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（ただし、Xaaは好ましくはAspである）。３０kDaのバンドは上述の通常のＮ末端アミノ酸配列番号１を持つが、１０kDaのバンドのＮ末端アミノ酸配列は通常以下の通りである：配列番号２：
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（ただし、第一のXaaは好ましくはSer, Phe又はGlyであり、第二のXaaは未同定である）。この配列は以前には記述されていない。
従って、本発明はアミノ酸配列が配列番号１に対して７０％より大きい、好ましくは８５％より大きい相同性を持つマーカー（標識）か、更に好ましくは配列番号１と同一であるマーカーを持つタンパク質又は糖タンパク質であって、通常４０−４３kDaのSDS−PAGE分子量を持つ阻害剤にも関する。
本発明はアミノ酸配列が配列番号１に対して７０％より大きい、好ましくは８５％より大きい相同性を持つマーカーか、更に好ましくは配列番号１と同一であるマーカーを持つタンパク質又は糖タンパク質であって、通常３０kDaのSDS−PAGE分子量を持つ阻害剤にも更に関する。
本発明はアミノ酸配列が配列番号２に対して７０％より大きい、好ましくは８５％より大きい相同性を持つマーカーか、更に好ましくは配列番号２と同一であるマーカーを持つタンパク質又は糖タンパク質であって、通常１０kDaのSDS−PAGE分子量を持つ阻害剤にも更に関する。
有利には前記マーカーはタンパク質又は糖タンパク質の末端アミノ酸配列である。
本発明によれば、タンパク質又は糖タンパク質のマーカーはあるタンパク質族を他のタンパク質族から区別することができる特異的なアミノ酸配列（又はその対応する核酸配列）を意味する。
キシラン及び／又はアラビノキシラン加水分解酵素に対する阻害効果は例えばAZCLアラビノキシランを用いたエンドキシラナーゼ法によって示すことができる（下記参照）。β−グルカン加水分解酵素に対する阻害効果もAZCL−β−グルカンを用いたβ−グルカナーゼ法によって同様に示すことができる（下記参照）。
本発明は前記阻害剤を発現する遺伝的に改変された微生物の如き微生物から、植物から、又は穀物、穀粒、穀粉又はその画分の如き植物材料から前記阻害剤を得る方法にも関し、前記方法は前記植物、前記植物材料及び／又は前記微生物を１以上の抽出及び／又は分別操作に供することによる。
本発明の別の側面は本発明による阻害剤を発現させるために微生物、植物又は植物材料を遺伝的に形質転換する方法に関し、そこでは微生物、植物又は植物材料は当該分野の当業者には周知の遺伝子工学手法によって前記阻害剤をコードする遺伝物質を微生物、植物又は植物材料に導入してそれを翻訳させて発現させることによって、遺伝的に改変される。
本発明は当該分野の当業者には周知の方法によって前記阻害剤の発現を減少又は増大させることによって及び／又は前記阻害剤の阻害活性を阻止することができる分子か又は前記阻害剤を活性化することができる分子を用いることによって微生物、植物又は植物材料における前記阻害剤のレベルを変化させること、好ましくは前記レベルを減少又は増大させることを目的とする方法に更に関する。
本発明は得られた阻害剤、微生物、植物、植物材料及び／又はその画分、及び食品、飼料及び／又は飲料工業の様々な分野におけるそれらの使用方法にも更に関する。前記使用方法の例としては、モルト製造及び醸造の改善、動物飼料の変換率の改善、（ストレートドウ、スポンジドウ、及びChorleywoodパン、朝食用シリアル、様々なタイプのビスケット、パスタ及び麺の如き）焼かれた及び／又は押し出された穀物製品、澱粉由来のシロップ、ソルビトール、キシロース及び／又はキシリトールの製造の改善、小麦グルテン−澱粉分離及び製造の改善、トウモロコシ加工、植物の病気抵抗性の改善、（食物繊維材料の構造を保持するといった）栄養学的又は医薬的適用の改善、及び紙及びパルプ工業の改善が挙げられる。
本発明は以下の好ましい具体例の記述において詳細に説明されるが、これらの具体例は本発明の範囲を限定するものではない。
発明の詳細な説明
ベルギー白ビールの製造プロセスにおけるベルギー白ビール及び中間生産物中のアラビノキシランの構造に関する研究の過程で発明者等は水によって抽出可能な小麦中の物質によってキシラン分解性大麦モルト系が阻害されるという徴候に思いがけなく気付いた。内因性及び外因性α−アミラーゼ（Deponte, R., Parlamenti, T., Petrucci, V., Silano, V., & Tomasi, M., Cereal Chemistry, 1976, 53, 805; Buonocore, V., Petrucci, T., & Silano, V., Phytochemistry, 1977, 16, 811; Mundy, J., Hejgaard, J., & Svendsen, I., Federation of Societies, 1984, 167, 210; Silano, V. α-Amylase inhibitors. In: Enzymes and their Role in Cereal Technology, J.E. Kruger, D. Lineback and C.E. Stauffer,（Eds）. Am. Assoc. Cereal Chem., St. Paul（MN）, 1987, 141）及びプロテアーゼ（Birk, Y., Methods Enzymology, 1976, 45, 723; Lawszkowski, M., & Kato, I., Annual Review of Biochemistry, 1980, 49, 593）阻害剤が穀粒中に存在するということは明らかに立証されていたが、前記のことは以前には報告されていなかったことである。
実際、（１）ウワートのアラビノキシラン含有量とスタート材料の酵素活性を関連付けること、及び（２）醸造中どのようにして小麦がアラビノキシランの可溶化を阻害するのかを調査することという目的のために大麦モルト及びモルトにされていない小麦を用いた醸造中のアラビノキシランの可溶化を測定することにより、小麦中にキシラナーゼ阻害剤が存在することが明らかになった。これは６０％のモルトと４０％の小麦で製造されたウワート中のアラビノキシランの可溶化と遊離キシロース（Xyl）の放出を１００％のモルトウワート中のそれと比較することにより実際観察された。
特定の実験条件下では微生物起原のキシラナーゼをウワートに添加することによりウワート製造中のアラビノキシランの可溶化は明らかに改善された。
実施例
材料
β−Ｄ−アロース、β−メルカプトエタノール、ｐ−ニトロ−フェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド及びTrizma塩基（試薬等級、トリス［ヒドロキシメチル］アミノ−メタン）はSigma, St-Louis, MO, USAから購入した。アズリン架橋（AZCL）小麦アラビノキシラン（Xylazymeアラビノキシラン錠剤）、AZCL及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からのXylanase M4はMegazyme, Bray, Irelandから購入した。微生物バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、トリコデルマ・ヴィリデ（Trichoderma viride）及びアスペルギルス・ニガーからのキシラナーゼはNV Puratos, Groot-Bijgaarden, Belgiumから購入した。緩衝液Ａは：０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７であり；緩衝液Ｂは：０．０２５Ｍマレイン酸ナトリウム、ｐＨ６．０であり；緩衝液Ｃは：０．０２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０であり；緩衝液Ｄは：０．２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０であり；緩衝液Ｅは：０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０であった。
大麦モルトサンプルはCargill Malt Division, Herent（Belgium）から供給された。発明者等は低エンドキシラナーゼ活性及び低水抽出可能Xyl含有量の二条冬大麦品種（Clarine）、及び高水抽出可能Xyl含有量の六条冬大麦品種（Plaisant）からの２種類のモルトを使用した。Plaisantモルトサンプル１及び２は高及び低エンドキシラナーゼ活性をそれぞれ持っていた。小麦サンプルはAmylum, Aalst（Belgium）及びSAPSA SES SA, Jodoigne（Belgium）から購入した。発明者等は高及び低水抽出可能Xyl含有量をそれぞれ持つSkirlou及びSoissonsを使用した。小麦胚芽はCeres, Vilvoorde（Belgium）によって供給された。ライ麦粉はMeneba, Rotterdam（The Netherlands）によって供給されるオランダのライ麦品種の混合物からのものであった。品種Clarineからの大麦はCargill, Malt Division, Herent（Belgium）によって供給された。Clarine大麦、Plaisant 1及びPlaisant 2大麦モルト、Skirlou及びSoissons未精白小麦粉はTecatorサンプル製粉機
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を用いて、又は醸造実験用にはEBC−応用研究用製粉機（Analytica−EBC, 第４版, Brauerei- und
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Rundschau, Zurich, 1987）を用いて調製された。Soissons小麦粉は
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MLU-202研究用製粉機
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を用いて製造された。
抽出物
BMWM1, WWM,及びWG
粉末化された大麦モルト及び小麦又は小麦胚芽（１．００ｇ）のサンプル（３．００ｇ）は緩衝液Ａ（１０．０ｍｌ）に懸濁された。室温で１５分間強く攪拌した後、懸濁液は遠心分離された（３０００ｇ、１５分、２０℃）。生じた抽出物はBMWM1（大麦モルト未精白粉抽出物１）、WWM（未精白小麦粉抽出物）、及びWG（小麦胚芽抽出物）と称される。
WF, RF及びBWM
好適な穀粉又は未精白粉（２．５０ｇ）のサンプルは緩衝液Ｂ（１０．０ｍｌ）に懸濁された。室温で１５分間強く攪拌した後、懸濁液は遠心分離され（１００００ｇ、１５分、２０℃）、上澄みは濾過された（０．４５μ）。生じた未精白小麦粉抽出物はWF（小麦粉抽出物）、RF（ライ麦粉抽出物）、およびBWM（大麦未精白粉抽出物）と称される。
BMWM2
粉末化された大麦モルトのサンプル（５．００ｇ）は緩衝液Ｂ（１０．０ｍｌ）に懸濁された。室温で１５分間強く攪拌した後、懸濁液は遠心分離され（１００００ｇ、１５分、２０℃）。懸濁物は濾過された（０．４５μ）。生じた未精白粉抽出物はBMWM2（大麦モルト未精白粉抽出物２）と称される。
方法
Xyl含有量の測定
抽出及び加水分解の手順はCleemput等（Cleemput, G., Roels, S.P., van Oort, M., Grobet P.J. & Delcour, J.A., Cereal Chemistry, 1993, 70, 324）によって記述されているのと同じであり、未精白粉（小麦及び大麦モルト）のサンプルの加熱（１３０℃）は抽出に先立って酵素活性を除去するために５時間行われた。ウワートは未精白粉の水抽出物と同様の方法で分析された。遊離Xylはアルジトールアセテート調製に先立つ加水分解ステップを省略することによって測定された。アルジトールアセテートサンプル（１μｌ）（Englyst, H.N. & Cummings J.H., Analyst, 1984, 109, 937）は２２５℃でSupelco SP−2380カラム（３０ｍ、０．３２ｍｍ  ID，０．２μｍ薄層厚さ）で分離され、Chrompack 9011 Chromatograph（Middelburg, The Netherlands）で水素炎イオン化検出器を用いて検出された。投入及び検出温度は２７５℃であった。β−Ｄ−アロースは内部標準として使用された。測定されたアラビノース（Ara）はアラビノキシラン及びアラビノガラクタンの両方から由来しており、アラビノキシランレベルを０．８８×（Ara＋Xyl）として計算することを不可能にする（Cleemput, G., van Oort, M., Hessing, M., Bergmans, M.E.F., Gruppen, H., Grobet, P.J., Delcour, J.A., Journal of Cereal Science, 1995, 22, 73-84）。更に、小麦未精白粉の水抽出物においてはガラクトース（Gal）のかなりの部分はアラビノガラクタンから由来しないので、小麦粉について知られているようなアラビノガラクタン中のGal／Ara比率が１．５であると仮定することによるアラビノガラクタンについてのAra数の補正は同様に不可能であった（Izydorczyk, M., Biliaderis, C.G. & Bushuk, W., Cereal Chemistry, 1991, 68, 139-144）。従って、Xyl数がアラビノキシランレベルについての相対的測定値として用いられる。同様に、醸造中のXylレベルの増大は醸造中のアラビノキシランの可溶化の指標である。
エンドキシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）活性及びその阻害の測定
抽出物（１．０ｍｌ）BMWM1及びWWM（上記参照）は５０℃で５分間インキュベートされ、それからAZCL−キシラン錠剤（Megazyme）が添加された。その後インキュベーションは５０℃で６０分間続けられた。反応は１％（ｗ／ｖ）Trizma塩基（１０．０ｍｌ）を添加して強く攪拌することによって停止された。室温に５分間置いた後、管は強く振盪され、内容物はWhatman N°1フィルターを通して濾過された。吸光度は基質錠剤なしで抽出物を５０℃で６０分間インキュベートすることによって調製されたコントロールに対して５９０ｎｍで測定された。基質錠剤は１％（ｗ／ｖ）Trizma塩基を抽出物に添加した後で添加された。活性は５９０ｎｍでのサンプルとコントロールの間の吸光度の差として表され、乾燥モルト１ｇ当たりで表された（ΔＡ590／ｇ）。
０．６ｍｌのBMWM1（上記参照）及び０．４ｍｌの緩衝液Ａのエンドキシラナーゼ活性が、０．４ｍｌのWWMが添加された０．６ｍｌのBMWM1の活性と比較された。いくつかの場合にはWWMは添加に先立って３０分間煮沸され、遠心分離された（３０００ｇ、１５分、２０℃）。
様々な穀物からの抽出物による微生物からの酵素の阻害の評価においては以下の手順が用いられた。抽出物（WF, WG, RF及びBWM）、又は煮沸され（３０分、１００℃）、遠心分離された（１００００ｇ、１５分、２０℃）抽出物（２５０μｌ）は適当に希釈された微生物のキシラナーゼ溶液２５０μｌと共に室温で３０分間予備インキュベートされ、キシラザイム錠剤が添加され、混合物は５０℃で６０分間インキュベートされた。手順の残りは反応を停止させるのに１０．０ｍｌの１％（ｗ／ｖ）Trizma塩基の代わりに５．０ｍｌの２％（ｗ／ｖ）Trizma塩基が添加されたことを除いては上述したのと同様であった。
β−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．３．７３）活性及びその阻害の測定
抽出物（WF, RF及びBWM）、又は煮沸され（３０分、１００℃）、遠心分離された（１００００ｇ、１５分、２０℃）抽出物（４５０μｌ）は５０μｌのBMWM2と共に室温で３０分間予備インキュベートされ、β−グルカザイム錠剤が添加され、混合物は４０℃で６０分間インキュベートされた。手順の残りは反応を停止させるために１０．０ｍｌの１％（ｗ／ｖ）Trizma塩基の代わりに５．０ｍｌの２％（ｗ／ｖ）Trizma塩基が添加されたことを除いては上述したのと同様であった。
醸造
ウワートはEBC法（Analytica-EBC, 第４版, Brauerei- und
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Rundschau, Zurich, 1987）に従って二組調製された。１００％大麦モルトウワートについては５０．０ｇの大麦モルトが用いられ、４０％の小麦を含むウワートについては３０．０ｇの大麦モルトと２０．０ｇの小麦が用いられた。ウワートは１５分間２０００×ｇ（室温）で遠心分離された。用いられた穀粒は洗浄され（１５０ｍｌ）、ウワートに添加された。
バチルス・スブチリスのエンドキシラナーゼは水（４６℃）に添加され、６０％のClarineモルトと４０％のSoissons又はSkirlou小麦と混合された。ウワートに添加されたエンドキシラナーゼのレベル（０．８６７ΔＡ590／ｇ）はClarineモルトのエンドキシラナーゼ活性（０．７５０ΔＡ590／ｇ）をPlaisant 1モルトのレベル（１．６１７ΔＡ590／ｇ）に増大させるのに必要なレベルと等しかった。
上述の分析は全て少なくとも２回行われ、平均値が求められた。実験誤差（E.E.）は個別値と平均値との間の差（％）から計算された。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動
精製された阻害剤の分子量はLaemmli, U.K.の方法（Nature, 1970, 227, 680-685）に従って還元（β−メルカプトエタノール１％）又はPhastSystemユニット（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を用いた非還元条件下で２０％ポリアクリルアミドゲルでSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって測定された。ゲルは製造者の指示（Pharmacia, Development TechniqueファイルN°210）に従って銀染色された。低分子量マーカーはα−ラクトアルブミン（１４４００Da）；トリプシン阻害剤（２０１００Da）；カルボニックアンヒドラーゼ（３００００Da）；オボアルブミン（４３０００Da）；アルブミン（６７０００Da）；ホスホリラーゼｂ（９４０００Da）であった。阻害剤の等電点は両性電解質（ｐＨ３−９）を含むポリアクリルアミドゲルを用いたPhastSystemユニットを用いてそして適切な標準（Pharmacia校正キット、ｐＩ３．５−９．３）を用いて測定された。タンパク質は銀染色された（上記参照）。
タンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定
Ｎ末端アミノ酸配列はオンラインで１２０Ａ  PTH分析器に連結されたApplied Biosystemsモデル４７７Ａ気相配列決定機（Perkin Elmer, Belgium）によって決定された。
小麦中にエンドキシラナーゼ阻害剤が存在するという証拠
大麦モルト及び小麦のXylレベル及びアラビノキシラン加水分解活性は表Ｉに挙げてある。１００％モルトウワート中のXylレベル（表II）は０．４１から０．６２％まで変異があった（全ての分析データは乾燥物の割合として表された）。４０％の小麦を含むウワート中のXylレベルは０．３５から０．６１％まで変異があった（表III）。
４０％の小麦を含むウワートにおいては発明者等は６０％の大麦モルトを使用した。６０％のモルトを使用した醸造中のXylの増大を１００％の大麦モルトを用いたXyl増大の６０％と比較すると１２から５８％の減少が明らかになった（表II及び表III）。このことは大麦モルトからのエンドキシラナーゼは小麦の存在によって阻害されたこと、及び小麦のアラビノキシランはモルトエンドキシラナーゼにとってはそれほど好適な基質ではないということを示唆する。モルト化は大麦の細胞壁を破壊し、酵素がアクセスしやすいようにする（Selvig, A., & Aarnes, H., Journal of the Institute of Brewing, 1986, 92, 185）。
ウワート中の遊離Xylレベル
１００％モルトウワート中の遊離Xylレベルは０．０４６から０．０７６％まで変異があり、４０％の小麦を含むウワートにおいては０．０２５から０．０４０％まで変異があった（表IV）。放出された遊離Xylのレベルの間の差は１００％モルトウワートについては０．０３２−０．０４４％であり、４０％の小麦を含むウワートについては０．０１５から０．０２０％であった。１００％の大麦モルトウワートでの遊離Xylの放出の６０％と比較した遊離Xyl放出の減少は１から３２％まで変異があった（表II及び表IV）。バチルス・スブチルスのエンドキシラナーゼの使用は遊離Xylを増大させなかった。遊離のAraレベルも増大しなかった。それ故、エンドキシラナーゼは副次的なβ−Ｄ−キシロシダーゼ及びα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を持たなかった。
大麦モルトと小麦を併用した結果としてXyl又はアラビノキシランの可溶化の増大を誘導したエンドキシラナーゼの減少は遊離Xylの放出の減少よりもずっと明白であった。このため、小麦成分による大麦モルトエンドキシラナーゼの阻害に焦点が合わされた。
小麦抽出物によるモルトのキシラン分解系の阻害
図１には緩衝液Ａの代わりにWWMが添加された場合のBMWM1のエンドキシラナーゼ活性の減少が示されている。エンドキシラナーゼ活性の減少は２６から５８％まで変異があった。大麦モルト未精白粉抽出物（BMWM1）のエンドキシラナーゼ活性の減少は緩衝液の代わりに小麦未精白粉抽出物（WWM）を添加することによって得られた。図１は未煮沸（□）及び煮沸抽出物（■）を用いて得られた結果を表す。（ａ）Clarineモルト＋Soissons小麦、（ｂ）Clarineモルト＋Skirlou小麦、（ｃ）Plaisant 1モルト＋Soissons小麦、（ｄ）Plaisant 1モルト＋Skirlou小麦、（ｅ）Plaisant 2モルト＋Soissons小麦、（ｆ）Plaisant 2モルト＋Skirlou小麦。
品種Soissonsよりも品種Skirlouを用いた場合により高い減少が観察された。このことは品種Soissonsよりも品種Skirlouを用いた方が醸造中Xylの増大が高度に減少するということと一致する（表III参照）。品種Soissonsよりも品種Skirlouの方が水抽出可能なXylの含有量が高いということは醸造中、小麦基質の感受性が低いために可溶化が減少したのかもしれないということを示唆する。WWMを煮沸すると阻害はほとんど全て起こらない。阻害剤は熱に対して不安定であるようにみえるので、発明者等は阻害剤はタンパク質的な性質を持っているかもしれないと結論を出した。しかし、プロテアーゼが関与している可能性はありそうにないと考えられた。というのも、モルトからのプロテアーゼ活性は小麦のプロテアーゼ活性よりも何倍も高いからである。減少した活性の大部分は明らかに小麦のアラビノキシランによって引き起こされたものではなかった。というのも、熱処理は小麦抽出物のアラビノキシラン濃度を変化させなかったからである。小麦の阻害剤が内因性大麦モルトエンドキシラナーゼ又は外因性エンドキシラナーゼに対して活性があるのかどうかは明らかではなかった。
バチルス・スブチリスのキシラナーゼを用いた醸造：大麦モルトでの貧弱なアラビノキシラン可溶化についての結論−小麦未精白粉醸造
バチルス・スブチリスのエンドキシラナーゼ（これは図２の実験条件下で比較的ほとんど阻害されなかった微生物由来の酵素の一つである）はウワート中に存在するXylのレベルを増大させた。エンドキシラナーゼを添加せずに調製した同様のウワートと比較すると、小麦添加物として品種Soissonsを用いて９４％以上のXylの可溶化、及び小麦添加物として品種Skirlouを用いて１７９％以上のXylの可溶化が得られた。バチルス・スブチリスのエンドキシラナーゼは小麦品種Soissonsからよりも小麦品種Skirlouからのアラビノキシランを明らかに多く可溶化する（表IV）。
小麦粉からのキシラナーゼ阻害剤の精製
Soissons小麦粉（２．０ｋｇ）は１０．０ｌの０．１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸に懸濁された。懸濁液は７℃で一晩混合され、遠心分離された（７℃、１００００ｇ、３０分）。その懸濁液に２．０ｇ／ｌのCaCl2が添加され、ｐＨは２．０M NaOHの添加によって９．０に上昇された。抽出物は７℃で一晩置かれ、遠心分離された（７℃、１００００ｇ、３０分）。抽出物のｐＨは２．０M HClを用いて５．０に調整され、抽出物は陽イオン交換器（SP Sepharose Fast Flow, ５０×５０ｍｍ, Pharmacia）の上にポンプされた。カラムは緩衝液Ｃ（２００ｍｌ）を用いて平衡化され、タンパク質画分は２００ｍｌの０．５M NaClで溶離された。この溶離液は５倍に希釈され、ｐＨは上述のように５．０に調整され、陽イオンは交換された（SP Sepharose Fast Flow, ２６×１００ｍｍ, Pharmacia）。カラムは緩衝液Ｃ（２００ｍｌ）で平衡化され、０−０．５ＭのNaCl直線塩傾勾（８００ｍｌ）の後、１０ｍｌの画分は脱塩され（PD １０カラム，Pharmacia）、穀物抽出物の代わりに溶離物及び好適に希釈されたアスペルギルス・ニガーからのキシラナーゼＭ４を用いて上述のキシラザイム法を用いてエンドキシラナーゼ阻害についてアッセイされた。阻害活性のある画分は集められ、脱イオン水に対して透析され（７℃、一晩）、凍結乾燥された。凍結乾燥された材料は緩衝液Ｄ（６．０ｍｌ）に溶解され、Sephacryl S100カラム（２６×６７０ｍｍ、Pharmacia）で分離され、同じ緩衝液で溶離された。２．５ｍｌの画分が集められ、阻害剤活性についてアッセイされた。活性画分は集められ、上述のように透析されて凍結乾燥された。凍結乾燥された材料は緩衝液Ｅ（６ｍｌ）に溶解され、同じ緩衝液で陽イオン交換された（Mono S HR 5/5, Pharmacia）。塩傾勾（０−０．５M NaCl）で溶離された画分は集められ、上述のようにキシラーゼ阻害についてアッセイされた。このようにして我々はSDS−PAGE上で単一タンパク質バンドとして移動する阻害剤の画分（１ｍｌ）を得た。それは約４０−４３kDaの見かけの分子量を持っていた。β−メルカプトエタノールでの還元により、通常３０及び１０kDaの分子量の二つの付加的なSDS−PAGEバンドが検出される。
エンドキシラナーゼ阻害剤のＮ末端アミノ酸配列の決定
β−メルカプトエタノールで還元された阻害剤タンパク質及び／又は糖タンパク質画分はSDS−PAGEに供され、ブロッティングされ、Ｎ末端アミノ酸配列が決定された。
約４０−４３kDaのバンドのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）は：
0005044067.tif 000010
（ただし、Xaaは好ましくはAspである）である。この配列は以前には報告されていない。上述の約３０kDaのバンドも上述の通常のＮ末端アミノ酸配列番号１を持つが、約１０kDaのバンドのＮ末端アミノ酸配列は通常以下の通りである：配列番号２：
0005044067.tif 000011
（ただし、第一のXaaは好ましくはSer, Phe又はGlyであり、第二のXaaは未同定である）。この配列は以前には報告されていない。
小麦及び他の穀物からのエンドキシラナーゼ阻害剤による様々な微生物からのエンドキシラナーゼの阻害
図２においてはWF, RF及びBWMの存在下での様々な微生物からのキシラナーゼの阻害が示されている。３０分間煮沸された穀物抽出物の代わりに（煮沸されていない）同じ穀物の抽出物が添加された場合のキシラナーゼ活性の減少（％）が示されている。実験条件下では最も高い減少はトリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）からの三つのキシラナーゼの混合物について見出され（８２−９４％）、最も低い減少はバチルス・スブチリスからのキシラナーゼについて見出された（２４−３９％）。
微生物からのエンドキシラナーゼ活性の減少は煮沸された穀物抽出物ではなく穀物抽出物（WF, RF及びBWM）の添加によって得られた。図２は左から順に小麦粉（■）、ライ麦粉（□）及び大麦未精白粉（■）を用いて得られた結果を示す。微生物からのキシラナーゼは：（ａ）トリコデルマ・レーセイからの三つのキシラナーゼの混合物、（ｂ）アスペルギルス・ニガーからのキシラナーゼＭ４、（ｃ）バチルス・スブチリスからのキシラナーゼ、（ｄ）バチルス・スブチリスからの三つのキシラナーゼの混合物、（ｅ）アスペルギルス・ニガーからのキシラナーゼ、（ｆ）アスペルギルス・ニガーからの五つのキシラナーゼの混合物、（ｇ）アスペルギルス・ニガーからの五つのキシラナーゼの混合物である。実験条件下ではWGはアスペルギルス・ニガーからのキシラナーゼＭ４の活性を約８０％減少させた。
小麦及び他の穀物からの阻害剤による大麦モルトβ−グルカナーゼの阻害
図３においてはWF, RF及びBWMの存在下でのモルトβ−グルカナーゼの阻害が示されている。３０分間煮沸された穀物抽出物の代わりに（煮沸されていない）同じ穀物の抽出物が添加された場合のβ−グルカナーゼ活性の減少（％）が示されている。減少は７から１２％まで変異があった。
大麦モルト抽出物（BMWM2）のβ−グルカナーゼ活性の減少は煮沸された穀物抽出物の代わりに（煮沸されていない）穀物抽出物（WF, RF, BWM）の添加によって得られた。図３は小麦粉（ａ）、ライ麦粉（ｂ）及び大麦未精白粉（ｃ）を用いて得られた結果を示す。
0005044067.tif 000012
0005044067.tif 000013
0005044067.tif 000014
0005044067.tif 000015
〔配    列    表〕
（1）一般情報:
（i）出願人:
（A）名称: ケー.ユー． ルヴァン  リサーチ  アンド  ディヴェロプメント
（B）住所: グルート  ベジンオフ  ５９
（C）都市名: ルヴァン
（E）国名: ベルギー
（F）郵便番号（ZIP）: ベ−３０００
（A）氏名: ドゥビセル，  ウィノク
（B）住所: ウィラン， コースマンスストラート  ２３
（C）都市名: ケセル−ロ
（E）国名: ベルギー
（F）郵便番号（ZIP）: ベ−３０１０
（A）氏名: デルクール，  ジャン
（B）住所: カスタニエラーン  １４
（C）都市名: ルヴァン
（E）国名: ベルギー
（F）郵便番号（ZIP）:ベ−３００１
（ii）発明の名称: セルロース分解、キシラン分解及びβ−グルカン分解酵素の阻害剤
（iii）配列の数: 2
（iv）コンピューターが読出し可能なフォーム:
（A）媒体の種類: フロッピーディスク
（B）コンピューター: IBM PCコンパチブル
（C）オペレーティングシステム: PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア: PatentIn Release #1.0, Version #1.30（EPO）
（2）配列番号: 1についての情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ: 14
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号: Modified-site
（B）存在位置:12
（D）他の情報:/生成物 =「好ましくはAsp」
（xi）配列:配列番号: 1:
0005044067.tif 000016
（2）配列番号: 2についての情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ: 17
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号: Modified-site
（B）存在位置:1
（D）他の情報:/生成物 =「Ser, Phe,又はGly」
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号: Modified-site
（B）存在位置:16
（D）他の情報:/生成物 =「未同定」
（xi）配列:配列番号: 2:
0005044067.tif 000017
【図１】
0005044067.tif 000018
【図２】
0005044067.tif 000019
【図３】
0005044067.tif 000020