(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌性ペプチドであり、グリコシル化されておらず、リン酸化されておらず、１００アミノ酸より少なく、且つ：
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：１）
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：２） 
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：３）及び
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：４）
（ここで、配列番号：１及び２の部位１２のアミノ酸は、ホスホリル化セリンである）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗菌ペプチド。
【請求項２】
ペプチドが７０アミノ酸より少ないものである請求項１記載の抗菌ペプチド。
【請求項３】
ペプチドが：
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：７）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１１）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１４）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１５）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１６）及び
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１７）
（ここで、配列番号：７の部位４４のアミノ酸、配列番号：７の部位２２のアミノ酸、配列番号：１１の部位３３のアミノ酸、並びに、配列番号：１１の部位１１のアミノ酸は、ホスホリル化セリン残基である）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１又は２記載の抗菌ペプチド。
【請求項４】
ペプチドが：
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：１）
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：２）
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：３）
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：４）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：７）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１０）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１１）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１２）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１３）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１４）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１５）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１６）及び
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１７）
（ここで、配列番号：１及び２の部位１２のアミノ酸、配列番号：７の部位４４のアミノ酸、配列番号：７の部位２２のアミノ酸、配列番号：１０、１１、１２及び１３の部位３３のアミノ酸、並びに、配列番号：１１及び１３の部位１１のアミノ酸は、ホスホリル化セリン残基である）
からなる群から選択される請求項１乃至３のいずれか１項記載の抗菌ペプチド。
【請求項５】
非ペプチド分子に接合した請求項１乃至４のいずれか１項記載のペプチドを含むキメラ化合物。
【請求項６】
その分子の非ペプチド部分がアシル基を含む請求項５記載のキメラ化合物。
【請求項７】
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：７）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１０）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１１）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１２）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１３）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１４）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１５）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１６）及び
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１７）
（ここで、配列番号：７の部位４４のアミノ酸、配列番号：７の部位２２のアミノ酸、配列番号：１０、１１、１２及び１３の部位３３のアミノ酸、並びに、配列番号：１１及び１３の部位１１のアミノ酸は、ホスホリル化セリン残基である）
からなる群から選択されるペプチドと、製薬上許容される担体とを含む抗菌組成物。
【請求項８】
(a)  (i) アミノ酸配列AVESTVATLEASPEVIESPPE（配列番号：１）（ここで、配列番号：１のアミノ酸残基１２のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(ii) アミノ酸配列AVESTVATLEDSPEVIESPPE（配列番号：２）（ここで、配列番号：２のアミノ酸残基１２のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(iii) アミノ酸配列TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：１０）（ここで、配列番号：１０のアミノ酸残基３３のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(iv) アミノ酸配列TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：１１）（ここで、配列番号：１１のアミノ酸残基１１のセリン及びアミノ酸残基３３のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(v) アミノ酸配列TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：１２）（ここで、配列番号：１２のアミノ酸残基３３のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；並びに
(vi) アミノ酸配列TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：１３）（ここで、配列番号：１３のアミノ酸残基１１のセリン及びアミノ酸残基３３のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
から選択されるペプチド；並びに
(b)製薬上許容される担体
を含む組成物。
【請求項９】
アシル基に接合した、グリコシル化されていない抗菌性ペプチドであり、
(a) アミノ酸配列AVESTVATLEASPEVIESPPE（配列番号：１）（ここで、配列番号：１のアミノ酸残基１２のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(b) アミノ酸配列AVESTVATLEDSPEVIESPPE（配列番号：２）（ここで、配列番号：２のアミノ酸残基１２のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(c) アミノ酸配列MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：６）（ここで、配列番号：６のアミノ酸残基４４のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(d) アミノ酸配列MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：７）（ここで、配列番号：７のアミノ酸残基２２及びアミノ酸残基４４のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(e) アミノ酸配列MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：８）（ここで、配列番号：８のアミノ酸残基４４のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(f) アミノ酸配列MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：９）（ここで、配列番号：９のアミノ酸残基２２及び４４のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(g) アミノ酸配列TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：１０）（ここで、配列番号：１０のアミノ酸残基３３のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(h) アミノ酸配列TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：１１）（ここで、配列番号：１１のアミノ酸残基１１のセリン及びアミノ酸残基３３のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
(i) アミノ酸配列TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：１２）（ここで、配列番号：１２のアミノ酸残基３３のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；並びに
(j) アミノ酸配列TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV（配列番号：１３）（ここで、配列番号：１３のアミノ酸残基１１のセリン及びアミノ酸残基３３のセリンは、ホスホリル化セリン残基である）からなるペプチド；
から選択される、ペプチド。
【請求項１０】
グリコシル化されておらず、１００アミノ酸より少なく、且つ：
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：１）
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：２）
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：３）及び
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：４）
（ここで、配列番号：１及び２の部位１２のアミノ酸は、ホスホリル化セリンである）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドからなる、抗菌剤。
【請求項１１】
ペプチドが７０アミノ酸より少ないものである請求項１０記載の抗菌剤。
【請求項１２】
ペプチドが：
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：６）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：７）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：８）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：９）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１０）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１１）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１２）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１３）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１４）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１５）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１６）及び
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１７）
（ここで、配列番号：６、７、８及び９の部位４４のアミノ酸、配列番号：７及び９の部位２２のアミノ酸、配列番号：１０、１１、１２及び１３の部位３３のアミノ酸、並びに、配列番号：１１及び１３の部位１１のアミノ酸は、ホスホリル化セリン残基である）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１０又は１１記載の抗菌剤。
【請求項１３】
ペプチドが：
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：１）
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：２）
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：３）
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：４）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：６）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：７）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：８）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：９）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１０）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１１）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１２）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１３）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１４）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１５）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１６）及び
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１７）
（ここで、配列番号：１及び２の部位１２のアミノ酸、配列番号：６、７、８及び９の部位４４のアミノ酸、配列番号：７及び９の部位２２のアミノ酸、配列番号：１０、１１、１２及び１３の部位３３のアミノ酸、並びに、配列番号：１１及び１３の部位１１のアミノ酸は、ホスホリル化セリン残基である）
からなる群から選択される請求項１０乃至１２のいずれか１項記載の抗菌剤。
【請求項１４】
ペプチドが非ペプチド分子に接合し、キメラ化合物を形成する、請求項１０乃至１３のいずれか１項記載の抗菌剤。
【請求項１５】
非ペプチド分子がアシル基を含む請求項１４記載の抗菌剤。
【請求項１６】
請求項１乃至４若しくは９のいずれか１項記載のペプチド、請求項５若しくは６記載の化合物、請求項７若しくは８記載の組成物又は請求項１０乃至１５のいずれか１項記載の抗菌剤を、活性成分として含む、虫歯又は歯周疾患の治療用または防止用組成物。
【請求項１７】
(a)牛乳またはその画分を提供する工程；及び
(b)そこからカゼインの断片を得る工程であって、
カゼイン断片が、
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：１）
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：２）
AVESTVATLEASPEVIESPPE, （配列番号：３）
AVESTVATLEDSPEVIESPPE, （配列番号：４）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：７）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１０）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１１）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１２）
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１３）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１４）
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１５）
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１６）及び
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;（配列番号：１７）
（ここで、配列番号：１及び２の部位１２のアミノ酸、配列番号：７の部位４４のアミノ酸、配列番号：７の部位２２のアミノ酸、配列番号：１０、１１、１２及び１３の部位３３のアミノ酸、並びに、配列番号：１１及び１３の部位１１のアミノ酸は、ホスホリル化セリン残基である）
からなる群から選択されるペプチドである、工程を含む、
抗菌性ペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳タンパク質カゼインから得ることができ或いは化学的に合成され又は組換えＤＮＡ技術によって製造することができる新規抗菌ペプチドに関する。これらのペプチドは、歯苔(dental plaque)の制御及び虫歯又は歯周疾患に関連付けられる病因の抑制のために口内ケア製品（例えば練り歯磨き、口内洗浄液、デンタルフロス）において、抗菌保存料として食品において使用することができる。該抗菌ペプチドはまた、局所又は非経口適用のための又は口-指趾節骨の(oro-pharangeal)及び胃-腸の病因の、同じく全身の又は局在化した感染の制御のための薬学調製物において使用することもできる。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
歯周疾患は、歯の支持組織の細菌-関連炎症性疾患であり、且つ主要な公衆衛生上の問題である。ヒトの集団のほとんど全てがそのような度合で歯周疾患に罹っている。最近のメルボルン調査(Spencerra,1985)において、成人の歯状試料の２０％のみが歯周治療を必要としない一方で、６２％が中間の治療が必要とされ且つ１８％が複合的な治療が必要であった。広範囲にわたる米国歯科健康調査より、Brownら(1989)は、研究した集団の１５％のみが歯周疾患が無かったことを報告した。歯周疾患の主な形成は、歯肉縁での歯苔の特異的でない蓄積と関連付けられる歯肉炎である。これに対して、より少ない有病率で、歯周疾患の破壊的な形態は、特有のグラム陰性細菌の歯肉下の感染に関連付けられる。歯周炎は、オーストラリアの成人における歯の損失の主要な原因である。
【０００３】
たとえ歯肉炎が歯周炎の進行のために必要な前状態ではないとしても(Christerssonら、1989)、歯周炎において優勢であるが、健康な歯周においては検出不可能な、特有のグラム陰性細菌が、歯肉炎において低い割合で見出されていることから(Moorera,1987)、歯肉炎は、歯周疾患のより重篤な形態に感染しやすい部位にさせると思われる。さらに、歯周炎の間に進展する環境条件は、歯周炎において連続した集落形成又は関連した種の増殖に有利に作用すると思われる。より優る歯苔の制御は、従って、歯周疾患の制御における予防策の重要な部分であると見なされ、さらに実際に各種の歯苔制御プログラムは、歯周疾患の予防において成功していることが証明されている(Loesche,1976)。大部分の個人において、歯磨きの習慣的な口内衛生方法は、口内健康に和合できる歯苔制御のレベルを提供するため長期間にわたりそれ自身通常不十分である。結果として歯苔と歯肉炎を制御することを企図して歯科用製品への抗菌剤の混入が主張されており(Addy,1988;Marsh,1991)、且つ練り歯磨きと口内洗浄液の会社に相当な興味を与えている。多くの薬剤が抗プラーク(antiplaque)添加剤として示唆されている（例えばビスグアニド、フェノール、金属イオン、第四級アンモニウム塩）がしかし、取るに足らない口内活性、望ましくない副作用（例えば粘膜の刺激、歯の変色）及び／又は練り歯磨き処方との不和合性のいずれかを有する。防臭剤、石鹸及び他の皮膚科学用調製物において広く用いられる抗菌剤、トリクロサン(2,4,4'-トリクロロ-2'-ヒドロキシジフェニルエーテル)は、現在いくつかの国で抗-プラーク練り歯磨き添加剤として使用されているが、しかしながら、臨床的に有効な、安全で天然の抗プラーク剤を見出すことに相当な興味がある。
【０００４】
抗菌ペプチドは、自然界に広く分布し、且つ植物及び動物の宿主保護において役割を演じる(BomanとHultmark,1987；BevinsとZasloff,1996)。それは、両親媒性のチャンネル形成ペプチド、例えばセクロピア蛾(cecropia moth)から単離したセクロピン(cecropins)(BomanとHultmark,1987)、アフリカツメガエルXenopus laevisの皮膚分泌物から単離したマガイニン(magainins)(BebinsとZasloff,1990)、樹上カエル(arboreal frog)の皮膚から単離したデルマセプチン(dermaseptins)(MorとNicolas,1994)及びボンビナ・バリエガータ(Bombina variegata)の皮膚からのボンビニン(bombinins)(Simmacoら、1991)を含む。他の抗菌ペプチドは、分子内ジスルフィドを含む環式カチオン性ペプチド、例えば、ウシガエルからのラナレキシン(ranalexin)(Clarkら、1994)とウシ好中球からのバクテネシン(bactenecin)(Romeoら、1988)を含む。プロリン-含有抗菌ペプチドもまた同定されており、これらはミツバチのリンパ液からのアピダエシン(apidaecins)(Casteelsら、1989)及びブタ脊髄抗菌ペプチドＰＭＡＰ-２３(Zanettiら、1994)を含む。
【０００５】
乳タンパク質カゼインが、栄養剤としてだけでなく、トリプシンによって放出された特異的なペプチドが新生児粘膜の細菌感染に対する保護剤として見なすべきであることが現在十分に確立され、或いは原位置消化が顕著な生物学的活性を所有することが示されている。これらの生物活性ペプチドは、更なる蛋白分解的な分解作用に対して相対的に抵抗性であり、牛乳の摂取後にヒトの小腸と血液の末梢部において検出されている(Svedbergら、1985)。Migliore-Samourら(1989)は、0.1μMと以下の濃度でペプチドβ-カゼイン(63-68)PGPIPNとαs1-カゼイン(194-199)TTMPLWが、致死性の感染チャレンジの前に0.3mg/kgで静脈内に注射した場合に、クレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumoniae)感染に対してマウスにおける顕著な保護的効果を発揮することが示されている。氷酢酸による乳の処理によって放出したウシαs2-カゼインからの抗菌ペプチド[αs2-カゼイン(f172-203)]は現在特徴付けされており、且つ大腸菌(Escherichia coli)とスタヒロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)の増殖を阻害することが示されている(Zuchtら、1995)。
【０００６】
グラム陽性及びグラム陰性細菌の範囲に対し活性を有する抗菌ペプチドは、口内ケア、機能性食品、食品保存料及び製薬の分野において潜在能力を有する。口内ケア製品は、練り歯磨き、口内洗浄液、デンタルフロス及び専門家に使用される材料を含む。機能性食品は、チューインガム、糖菓、朝食用シリアル、幼児用処方、飲料、ドロップなどを含む。食品保存料を適用できるものは、日常の製品、スープ、サラダドレッシング、加工肉類、調理食品、ソース類などを含む。製薬的使用は、全身及び局所に適用される抗生物質と抗感染剤及び潰瘍と他の胃腸管疾患の治療用医薬品を含む。
【０００７】
食品への適用について、天然の抗菌剤は、ソース、湿り気のあるサラダ、調理済食品と練り粉製食品、加工肉類、冷凍した日常の製品、サラダドレッシングとスープにおける維持と商品寿命の延長のために典型的に使用される。ナイシン(Nisin)は、抗菌活性の相対的に狭いスペクトルと高コストのために食品保存料として制限された適用を有する。保存料としてカゼイン抗菌ペプチドを用いた食品製造は、人工の又は化学保存料を用いる場合には許されない「全てが天然物」の表示請求を使用できる。食品業界における主要な流れは、一般に増加した水分レベルを有することを意図する低脂肪製品の増大した要求である。これは天然の抗菌剤の混入のようなより良好な食品保存系統の要求を創作する。
【０００８】
創傷治癒、上部消化管潰瘍及び疾患に基づく炎症用の医薬のためのグローバルな市場は、主要な製薬市場を表す。十二指腸及び胃の潰瘍の分野で働く医師は、上部消化管潰瘍における鎮静剤としてピロリ菌(Helicobacter pylori)について現在注目している。細菌細胞へのＨ+を許容するチャンネル形成抗菌ペプチドは、胃の酸分泌に対する細菌の感受性を増すことによってピロリ菌感染の治療のための潜在能力を有する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抗菌活性を有する新規ペプチドを開発している。これらのペプチドは、化学合成的に製造できるが、カゼインから最も利便的に得ることができる。
【００１０】
従って、本発明の最初の態様は、グリコシル化されておらず、約１００アミノ酸より少なく、好ましくは約７０アミノ酸より少なく、且つ：
AVESTVATLEAΣPEVIESPPE,
AVESTVATLEDΣPEVIESPPE,
AVESTVATLEASPEVIESPPE,
AVESTVATLEDSPEVIESPPE,
DMPIQAFLLYQQPVLGPVR,
及びその中に保存的置換のあるもの、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗菌ペプチドである。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様において、該ペプチドは：
AVESTVATLEAΣPEVIESPPE,AVESTVATLEDΣPEVIESPPE,AVESTVATLEASPEVIESPPE,AVESTVATLEDSPEVIESPPE,及びDMPIQAFLLYQQPVLGPVRからなる群から選択される、好ましくは、AVESTVATLEAΣPEVIESPPE,AVESTVATLEDΣPEVIESPPE、又はDMPIQAFLLYQQPVLGPVRのアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明の更に好ましい実施態様において、該ペプチドは：
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIAΣGEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEDΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIAΣGEPTSTPTIEAVESTVATLEDΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
TEIPTINTIAΣGEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
TEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
TEIPTINTIAΣGEPTSTPTTEAVESTVATLEDΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
及びその中に保存的置換のあるもの、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
該ペプチドは、
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIAΣGEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEDΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIAΣGEPTSTPTIEAVESTVATLEDΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
TEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
TEIPTINTIAΣGEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV;
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からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことが更に好ましい。
【００１４】
本発明の更に好ましい実施態様において、該ペプチドは：
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からなる群から選択されるアミノ酸配列である。
【００１５】
当業者によって理解されるであろうように、本発明のペプチドは、該ペプチドの送達プロフィール又は薬物動態学を変更するための、アシル誘導体のような他の分子に接合することができる。そのような接合体は、その開示が参考によりここに組み込まれるＰＣＴ／ＡＵ９０／００５９９中に開示される。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、キメラ化合物であり、該化合物は、非ペプチド分子に接合した本発明の第１の態様のペプチドを含む。そのような非ペプチド分子は、アシル基を含む。
【００１７】
第３の態様において、本発明は、製薬上許容される担体とともに、本発明の第１の態様のヌクレオチドを含む抗菌組成物を提供する。そのような組成物は、歯科、口内用組成物、局所及び全身適用のための治療用抗感染組成物として良い。歯科用組成物又は治療用組成物は、ゲル、液体、固体、粉末、クリーム又はロゼンジの形態として良い。治療用組成物は、錠剤又はカプセルの形態としても良い。
【００１８】
第４の態様において、患者における虫歯又は歯周疾患を治療又は防止する方法が提供されており、該方法は、そのような治療の必要な患者の歯又は歯肉に本発明のペプチド又は組成物を投与する工程を含む。該ペプチドの局所投与が好適である。
【００１９】
科学的な理論への結合を望むことなしに、本発明のペプチドは、その両親媒性の特質によってその抗菌活性を発揮すると確信される。該ペプチドは、それが凝集物を形成する場合に細菌の膜の中に取り込まれると確信される。これらの凝集体は、イオンが通過し得る膜通路に通じる孔又はチャンネルを提供又は形成する。細菌の膜を横切るイオンの非制御的な通路は、細菌細胞の死滅をもたらす。
【００２０】
その抗菌活性をもたらす該ペプチドの特有の配列と言うよりはむしろ該ペプチドの生理学的特質であるとして、保存的置換と呼ばれるものを活性の実質上の損失無しに該ペプチド配列中に作製し得る。活性の実質的な損失をもたらさないそのような保存的置換が本発明に包含されることが意図される。
【００２１】
保存的置換の概念が当業者によって十分に理解されると同時に、明確化の目的で、保存的置換は次に記載するそれらである。
Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｍ；
Ｄ，Ｅ，Ｓ；
Ｎ，Ｑ；
Ｓ，Ｔ；
Ｋ，Ｒ，Ｈ；
Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｈ；及び
Ｐ，Ｎα-アルカルアミノ酸(Alkalamino acids)。
Σはホスホセリル残基である。
【００２２】
本発明のペプチドは、多くの適用を有し、例えば、歯苔の制御及び虫歯と歯周疾患に関連した病因の抑制のための口内ケア製品（練り歯磨きと口内洗浄液）において、それは抗菌保存料として食品中に使用することができる。本発明の抗菌ペプチドはまた、薬学調製物（例えば、局所及び全身用抗感染医薬）においても使用し得る。
【００２３】
この出願を通して、用語「含む」、又は「含む」又は「含んでいる」のような変形は、記載した要素又は成分又は要素又は成分の群の包含を必ず含むが、いずれかの他の要素又は成分又は要素又は成分の群を除外するものでないと解されるであろう。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明は新規抗菌ペプチドに関する。これらのペプチドは、カゼイン、κ-カゼイン(106-169)及びβ-カゼイン(184-202)[表１]から初めに得られた。これらのペプチドは、とりわけ次の微生物のために使用されるべき潜在能力を有する。
ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)
ストレプトコッカス・サングイニス(Streptococcus sanguinis)
大腸菌(Escherichia coli)
ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)
ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)
キャンピロバクター・ジェズニ(Campylobacter jejuni)
リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)
ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)
ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)
ストレプトコッカス・ニューモニア(Streptcoccus pneumoniae)
カンディダ・アルビカンス(Candida albicans)
【００２５】
抗菌ペプチドSer(P)149κ-カゼインＢ(106-169)とSer(P)149κ-カゼインＢ(117-169)の両方は、口内病原菌ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスに対して２．４μＭの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を有するとともに、１０倍低濃度（０．２４μＭ）でそれら細菌の増殖を４１％阻害した。
【００２６】
抗菌ペプチドSer(P)149κ-カゼイン(117-169)とSer(P)127，Ser(P)149κ-カゼイン(117-169)とβ-カゼイン(184-202)は、アニオン交換及び逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の標準的なクロマトグラフィー手法を用いてウシカゼインのトリプシン消化物から精製することができる。Ser(P)149κ-カゼイン(106-169)とSer(P)127，Ser(P)149κ-カゼイン(106-169)もまた、限外濾過によって、又は酸沈澱に続いて該ホスホペプチドの逆相ＨＰＬＣ精製によってホエータンパク質の除去によってチーズホエーとレンネットホエーから調製することができる。該ペプチドは、他の種、例えば、ヤギ、ヒツジなどのカゼインから調製することができる。
【表１】
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【００２７】
該ペプチドκ-カゼイン(106-169)は、幾つかの異なる形態でチーズホエー又はレンネットホエー中に存在する。該ペプチドは、２つの主要な遺伝的変異体（ＡとＢ）を有するとともに、グリコシル化及びリン酸化によって翻訳後に改変される。カッパ-カゼイノ-グリコペプチド又はグリコマクロペプチドとして知られるそのグリコシル化形態は、該ペプチドのトレオニン残基に結合した各種のオリゴサッカリド鎖によって抗-プラーク及び抗-う食剤として、Neeser[米国特許第４９９２４２０と４９９４４４１号]によって記載されている。Neeserは、プラーク形成口内細菌に特異的に結合することによって、該糖ペプチドのオリゴサッカリド鎖が、唾液-被覆された歯のエナメル質上のこれら細菌の粘着を阻止することを主張する。κ-カゼイン(106-169)のグリコシル化形態は、クロマトグラフィー（例えばアニオン交換と逆相ＨＰＬＣ）によって或いは選択沈澱又は限外濾過によって非グリコシル化形態から分離できる。κ-カゼイン(117-169)又はκ-カゼイン(106-169)の非グリコシル化形態のみが、抗菌活性を示した。グリコシル化が抗菌活性を破壊するように、クロマトグラフィー、選択沈澱又は限外濾過を用いて達成することができるκ-カゼイン(117-169)又はκ-カゼイン(106-169)のグリコ-及びアグリコ-形態を分離することが望まれる。Ser149の及びより劣る大きさのSer127へのリン酸化は、抗菌活性のために重要であり、且つ２の主要な遺伝的変異体（ＡとＢ）のリン酸化形態は、等しい活性を所有することが明らかである[表１]。Neeser特許は、κ-カゼイン(106-169)の抗菌活性も、細菌の病因を抑制するために該ペプチドの非-グリコシル化形態の使用も開示していない。
【００２８】
本発明の特に好ましい実施態様において、抗菌ペプチドは、虫歯と歯周疾患の予防及び／又は治療の目的で、練り歯磨き、口内洗浄液又は口用の処方のような歯磨き剤の中に混入される。該ペプチドは、該組成物の０．０１−５０重量％、好ましくは０．１−１０重量％で含有せしめて良い。口用組成物のためには、投与されるペプチドの量が該組成物の０．０１−５０重量％、好ましくは０．１−１０重量％であることが好ましい。上述したペプチドを含む本発明の口用組成物は、練り歯磨き、粉歯磨き及び液体歯みがき剤、口内洗浄液、トローチ、チューインガム、デンタルペースト、歯肉マッサージ用クリーム、含そう薬錠剤、ロゼンジ、日常製品及び他の食料品を含む製品のような歯に適用される各種形態において調製され且つ使用し得る。本発明に従う口用組成物は、特有の口用組成物のタイプと形態に基づいて付加の周知の成分を更に含み得る。
【００２９】
本発明のある種のより高度に好ましい形態において、該口用組成物は、口内洗浄又は濯ぎのような、特質において実質上液状とし得る。そのような調製物において、賦形剤は、典型的に、以下に記載する保湿剤を望ましくは含んでいる水-アルコール混合物である。一般に、アルコールに対する水の重量比は、約１：１から約２０：１までの範囲においてである。このタイプの調製物中の水-アルコール混合物の全重量は、典型的に該調製物の約７０から約９９．９重量％までの範囲とする。アルコールは典型的に、エタノール又はイソプロパノールである。エタノールが好適である。
【００３０】
本発明のそのような液体及び他の調製物のｐＨは、一般に、約４．５から約９まで、典型的には約５．５から約８までの範囲内とする。該ｐＨは、好ましくは約６から約８．０，好ましくは７．４までの範囲内とする。該ｐＨは、酸（例えばクエン酸又は安息香酸）又は塩基（例えば水酸化ナトリウム）によって制御することができ、或いは緩衝化（クエン酸ナトリウム、安息香酸塩、炭酸塩、又は重炭酸塩、リン鎖水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどにより）することができる。
【００３１】
本発明の他の望ましい形態、該口用組成物は、粉歯磨き、歯科錠剤又は歯磨き剤、即ち練り歯磨き（デンタルクリーム）又はゲル状歯磨き剤のような、特質において実質上固体又はペースト状とし得る。そのような固体又はペースト状調製物の賦形剤は、歯科用に許容される研磨剤を普通は含む。研磨剤の実例は、不溶性メタリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム、リン酸三カルシウム、二水化したリン酸カルシウム、無水リン酸二カルシウム、ピロリン酸カルシウム、オルトリン酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム、炭酸カルシウム、水和したアルミナ、か焼アルミナ、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸ジルコニウム、ベントナイト、及びそれの混合物である。他の適当な研磨材料は、メラミン-、フェノール、及び尿素-ホルムアルデヒドのような熱硬化性樹脂、及び架橋したポリエポキシドとポリエステルを含む。好ましい研磨剤は、約５ミクロンまでの粒径、約１．１ミクロンまでの平均粒径、及び約50000cm2/gmまでの表面積を有する結晶性シリカ、シリカゲル又はコロイダルシリカ、及び無定型アルカリ金属アルミノシリケート複合体を含む。
【００３２】
視覚的に透明なゲルを用いる場合、Syloid 72とSyloid 74として商標SYLOIDの下に又はSanrocel 100,アルカリ金属-ケイ酸塩複合体として商標SANTOCELの下に販売されるそれらのようなコロイダルシリカの研磨剤が、それが歯磨き剤中で普通に使用されるゲル化剤-液体(水及び／又は保湿剤を含む)系の屈折率に近い屈折率を有することから、特に有用である。
【００３３】
「不溶性」と言われる多くの研磨剤は、特質においてアニオン性であり、また極く少量の可溶性材料を含む。かくして、不溶性メタリン酸ナトリウムは、Thorpe's Dictionary of Applied Chemistry,Volume 9,4版,510-511頁によって説明されるような何れかの適当な手法で形成し得る。Madrell's塩とKurrol's塩として知られる不溶性メタリン酸カルシウムの形態は、適当な材料の更なる実例である。これらのメタリン酸塩は、水中に僅かな可溶性のみを示し、従って不溶性メタリン酸塩（ＩＭＰ）として普通は参照される。これらは、不純物として少量の可溶性リン酸材料、通例は４重量％までのような数パーセントがその中に存在する。不溶性メタリン酸塩のケースにおいて可溶性トリメタリン酸ナトリウムを含むと思われる、可溶性リン酸材料の量は、もし望むのであれば、水で洗浄することによって減じる又は無くすことができる。不溶性メタリン酸アルカリ金属塩は、典型的に、３７ミクロンより大きい材料が１％以下となるような粒径の粉末形状で利用される。
【００３４】
該研磨剤は一般に、約１０％から約９９％の重量濃度で固体又はペースト状組成物中に供される。好ましくは、練り歯磨き中に約１０％から約７５％までの量で、及び粉歯磨き中に約７０％から約９９％までの量で存在させる。練り歯磨きにおいて、研磨剤が天然のシリカである場合、それは一般に、約１０−３０重量％の量で存在させる。他の研磨材料は、典型的に、約３０−７５重量％の量で存在させる。
【００３５】
練り歯磨きにおいて、液体賦形剤は、水と保湿剤とを、典型的にその調製物の約１０重量％から約８０重量％までの範囲の量で含み得る。グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールとポリプロピレングリコールは、特に好適な保湿剤／担体である。また有利には、水、グリセリン及びソルビトールの液状混合物である。その屈折率が重要な考慮すべき事項である場合、透明なゲルにおいては、約２．５−３０％の水、０乃至７０％w/wのグリセリン及び２０−８０％w/wのソルビトールが好適に利用される。
【００３６】
練り歯磨き、クリーム及びゲルは、典型的に、約０．１乃至１０、好ましくは約０．５乃至５％w/wの比率で天然の又は合成の増粘剤又はゲル化剤を含む。適当な増粘剤は、合成ヘクトライト、例えばLaporte Industries社によって販売されるLaponite（例えばCP,SP 2002,D)として利用可能な合成コロイダルマグネシウムアルカリ金属シリケートである。Laponite Dは、ほぼ５８．００重量％ＳｉＯ2、２５．４０重量％ＭｇＯ、３．０５重量％Ｎａ2Ｏ、０．９８重量％Ｌｉ2Ｏ、及びいくらかの水分と微量金属元素である。その真比重は２．５３であり、且つそれは８（水分で１．０ｇ／ｍｌの見かけ上のかさ密度を有する。
【００３７】
他の適当な増粘剤は、アイリッシュモス、イオタカラゲナン、トラガカントガム、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、Natrosolとして利用可能である）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微細なSyloid（例えば244）のようなコロイダルシリカを含む。可溶化剤はまた、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びヘキシレングリコールのような保湿剤ポリオール、メチルセロソルブとエチルセロソルブのようなセロソルブ、、オリーブ油、ヒマシ油のような直鎖で少なくとも約１２炭素を含む植物油及びワックス、及び酢酸アミル、酢酸エチルと安息香酸ベンジルのような石油製品とエステルも含まれる。
【００３８】
通常であるとして理解されるように、口用調製物は、適当にラベルした包装において販売され、又はその他頒布される。かくして、口内リンスの容器には、物品において、口内リンス又は口内洗浄液としてその使用のための指示を有するそれを記載しているラベルを有するであろう；さらに練り歯磨き、クリーム又はゲルは、物品において練り歯磨き、ゲル又は歯科クリームとしてそれを記載しているラベルを有する、折り畳めるチューブ、典型的には鉛又はプラスチックで内張りしたアルミニウムの、又は他の絞り出し、ポンプ又はその内容物を計量するための加圧された分注器の中に通例は存在するであろう。
【００３９】
有機界面活性剤は、増加した予防効果を達成するために、口腔を通して該活性剤の徹底した及び完全な分散を達成することを補助するために、及び該組成物をより商業上許容させるために、本発明の組成物において使用される。該有機界面活性剤は、本発明の抗菌ペプチドを分解しない本質において、好ましくはアニオン性、非イオン性又は両性であり、且つ該ペプチドを変性しない一方で組成物に洗浄及び起泡特性を与える界面活性剤洗浄材料として利用することが好ましい。アニオン性界面活性剤の好適な例は、水素添加ココナッツ油脂肪酸のモノ硫酸化モノグリセリドのナトリウム塩のような高級脂肪酸モノグリセリドモノスルファート、ラウリル硫酸ナトリウムのような高級アルキルスルファート、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムのようなアルキルアリールスルホン酸塩、高級アルキルスルホ-アセタート、1,2-ジヒドロキシプロパンスルホナートの高級脂肪酸エステル、及び脂肪酸、アルキル又はＮ-アシル基などにおいて１２乃至１６炭素を有するそれらのような、低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質上飽和した高級脂肪族アシルアミドである。最後に記したアミドの例は、Ｎ-ラウロイルサルコシン、及び石鹸が実質上無い又は類似の高級脂肪酸材料とされるであろうＮ-ラウロイル、Ｎ-ミリストイル、Ｎ−パルミトイルサルコシンのナトリウム、カリウム、及びエタノールアミン塩である。本発明の口用組成物におけるこれらサルコナイト化合物の使用は、酸性溶液でのエナメル質の溶解におけるいくらかの減少を発揮することに加え、これらの材料が炭水化物の分解のために口腔における酸形成の阻害において延長された顕著な効果を呈することから、特に有効である。ペプチドとともに使用するために好適な水溶性非イオン性界面活性剤の例は、ポリ（エチレンオキシド）と、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、多価アルコール（例えば、ソルビタンモノステアラート）及びポリプロピレンオキシド（例えばプルロニック(Pluronic)材料）との縮合生成物のような親水性ポリオキシエチレン部分を含む縮合生成物（"エトキサマー"）である、長い疎水性鎖（例えば、約１２乃至２０炭素原子の脂肪鎖）を有するそれとともに反応する各種の反応性水素含有化合物を持ったエチレンオキシドの縮合生成物である。
【００４０】
界面活性剤は、典型的に約０．１−５重量％の量で存在する。界面活性剤が本発明のペプチドの溶解を助け、それによって必要とされる可溶化保湿剤の量を減じることは注目に値する。
【００４１】
美白剤、保存料、シリコーン、クロロフィル化合物及び／又は尿素、リン酸二アンモニウムのようなアンモニア化合物、及びそれらの混合物のような各種の他の材料を、本発明の口用調製物に混入させて良い。存在する場合、これらのアジュバントは、望まれる特性と特徴に実質上好ましくない影響を及ぼさない量で混入される。
【００４２】
何れかの適当な香料又は甘味料もまた用いて良い。適当な香料成分の例は、香油、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、クローブ、セージ、ユーカリ、マジョラム、シナモン、レモン及びオレンジの油、及びサリチル酸メチルである。適当な甘味料は、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ソルビトール、キシリトール、サイクラミン酸ナトリウム、ペリルアルチン(perillartine)、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニン、メチルエステル）、サッカリン、などを含む。好ましくは、香料と甘味料は、それぞれ又は一緒に該調製物の約０．１％乃至５％以上まで含んで良い。
【００４３】
本発明の好適な実践において、本発明の組成物を含む口内洗浄液又は歯磨き剤のような本発明に従う口用組成物は、少なくとも２週間から８週間まで又はより長い存続期間までの間、約４．５乃至約９，一般には約５．５乃至約８のｐＨで、毎日、又は二日おきに又は三日おきに又は好ましくは１から３回、歯肉と歯に好ましくは規則的に適用される。
【００４４】
本発明の組成物は、ロゼンジ中に、又はチューインガム又はその他の製品中に、例えば、望ましい通常の可塑剤又は軟化剤、又はグルコース、ソルビトールなどのような糖又は他の甘味料とともに、挙げられ得るジェルトング(jelutong)、ラバーラテックス、ビニライト樹脂などの実例となる暖めたガムベースの中に撹拌することによって又はガムベースの外表面を被覆することによって、混入することができる。
【００４５】
別な実施態様において、本発明のペプチドは、保存料として作用させるために、好ましくは０．０１−１０％w/w、より好ましくは０．１−５％w/w、最も好ましくは１−５％及び特に２％w/wを食品中に処方する。
【００４６】
本発明は、製薬上許容される担体と一緒に、記載した通りの抗菌ペプチドを含む薬学組成物を含む組成物を提供する。そのような組成物は、歯科用、口内用組成物、局所及び全身適用のための治療用抗感染組成物からなる群から選択し得る歯科用組成物又は治療用組成物は、ゲル、液状、固体、粉末、クリーム又はロゼンジの形態として良い。治療用組成物は、錠剤又はカプセルの形態としても良い。
【００４７】
本発明はまた、治療の必要な患者の歯又は歯肉に、本発明のペプチド又は組成物を投与する工程を含む、虫歯又は歯周疾患を治療する又は予防する方法もまた提供する。該ペプチドの局所適用が好適である。
【００４８】
本発明はまた、カゼイン又はホエーから抗菌ペプチドを生産する方法もまた提供する。κ-カゼイン(106-169)は、限外濾過又は酸沈澱によってチーズ又はレンネットホエーから得ることができる。中性で又は好ましくは酸性ｐＨ（３−５）での10000-30000ノミナル分子量カットオフ（ＮＭＣＯ）膜フィルターを通してのホエーの限外濾過は、カゼインペプチド、乳糖及びミネラル分に富む透過物を生じ、主要なホエータンパク質は残存する。1000ＮＭＣＯ膜フィルターを用いた透過物の限外濾過と濃縮で、κ-カゼイン(106-169)に富む分画を生産する。この分画は、次いでトリプシンとともにインキュベーションし、得られる加水分解物を逆相ＨＰＬＣにかけ、相対的に純粋なκ-カゼイン(117-169)ペプチドを生産する。或いは、該ペプチドκカゼイン(117-169)とβ(184-202)は、逆相ＨＰＬＣを用いてカゼインのトリプシン消化から得ることができる。ペプチドκ-カゼイン(138-158)は、κ-カゼイン(106-169)の部分的エンド-Glu-C消化、続いて逆相ＨＰＬＣを用いた精製によって得ることができる。
【００４９】
たとえこの明細書がヒトでの適用に特に関するとしても、本発明は獣医学的な目的のためにも有用である。かくして、全ての態様において、本発明は、ウシ、ヒツジ、ウマ及び家禽のような家畜動物のために；ネコとイヌのような愛玩動物のため；及び動物園の動物のために有用である。
【００５０】
本発明の本質がより明確に理解されるであろうように、それの好ましい形態は以下の非制限的な実施例を参照とともにここに記載されるであろう。
【００５１】
本発明の抗菌ペプチドを含む処方の特有な実施例が以下に提供される。
【００５２】
【実施例】
実施例１
ホエータンパク濃縮物のトリプシン消化からの抗菌ペプチドの調製
ホエータンパク濃縮物（５０ｍｇ／ｍｌ）水溶液（pH8.0)を、ノボ（Novo）トリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）を用い、５０℃で２時間、１ＮのＮａＯＨを加えることによりｐＨを８．００±０．０１に保持しながら、加水分解した。加水分解は、ｐＨ４．６になるまで１Ｍ塩酸を加えることにより、終結させた。加水分解物を、遠心分離（１１，６００ｇ,１０分間）し、次いで、７μｍＣ8（Beownlee）逆相カラム（４．６ｘ２２０mm）にかける前に、０．２μｍＰＶＤＦフィルターで濾過した。Applied Biosystems 140A Solvent Delivery System を用い、２分間０−２０％Ｂ、次いで４０分間２０−４５％Ｂの漸次直線濃度勾配を作り、流速１ml/分で試料を溶出した。溶出液Ａは、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液であり、溶出液Ｂは、８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液であった。溶出液は、Applied Biosystems 1000S Diode Array検出器を用い、初期波長２１５nmで測定した。得られたクロマトグラムを、図１に示す。ピークを回収し、抗菌活性をアッセイした。抗菌アッセイは、滅菌９６ウェルプレート（各ウェルは、３００μｌ容量を有する）を用い、液体増殖培地中で行った。増殖培地は、１００mmol/Lリン酸カリウム緩衝液中、Todd Hewit培地（３６．４ｇ／Ｌ）、酵母エキス（５．０ｇ／Ｌ）からなる。通常、増殖培地のｐＨを、６．３に調整する。指数関数的増殖期中に回収された約１．５ｘ１０2細胞（ストレプトコッカス・サングイス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス）の接種物を各ウェルに加えた。イオノフォアグラミシジン（最終濃度４０μｍｏｌ／Ｌ）を、陰性対照として一連のウェルに添加した。陽性対照は、接種物と増殖培地のみを含むものとした。増殖は、接種後３０時間を超えた時に、マイクロプレートリーダー（Biorad、４５０型）を用い、波長６５０nm（ＯＤ650）での細胞懸濁液の光学密度を測定することによって、測定した。増殖は、最終の読み取り値（最大培養OD）から接種直後に取られた最初の読み取り値を差し引くことによって決定した。
【００５３】
また、抗菌アッセイは、試験菌種と共に接種される好適な増殖培地を含む寒天プレート上で行った。５０μｌペプチド溶液が添加された濾紙ディスク（直径６mm）を、寒天プレート上に設置した。各ディスク周囲の増殖阻害区域の直径を、接種３日後に測定し、緩衝液を添加しただけの対照と比較した。増殖条件は、試験される菌種依存的であるが、通常、有酸素装置内、３７℃で培養を行った。図１のピーク９のみが、抗菌活性を示した。このピークの、アミノ酸配列決定（Hewlett Packard自動プロテインシークエンサー）と、質量分析（Perseptive Voyager MALDI-TOF質量分析機）を用いた解析により、該ピークが異種起源であることが明らかとなったため、試料を、SMARTTM(Pharmacia)システムに接続されたMono Q PC 1.6/5（１０μｍ）カラム上でアニオン交換クロマトグラフィーにかけた。試料を、４０分間０−７５％Ｂの直線的濃度勾配を用い、流速１００μｌ／ｍｉｎで溶出した。溶出液Ａは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＫＣｌであった。溶出液Ｂは、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＫＣｌであった。溶出液を、μピークモニターを用いて、２１５と２８０nmで測定した。ＲＰ−ＨＰＬＣからピーク９のアニオン交換クロマトグラムを図２に示す。ピークを回収し、抗菌活性をアッセイしたところ、ピーク９、１０および１１が活性を示した。Ｎ末端配列決定と質量分析により、画分９がＳｅｒ（Ｐ）149κ−カゼインＡ（１１３−１６９）、画分１０がＳｅｒ（Ｐ）149κ−カゼインＡ（１２４−１６９）および画分１１がＳｅｒ（Ｐ）149κ−カゼインＡ（１１７−１６９）を含むことが明らかになった。質量分析により、どのペプチドもグリコシル化されていないことが明らかになった。次いで、純粋Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼインＡ（１１７−１６９）の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、細菌ストレプトコッカス・ミュータンスで測定し、図３に示す。得られたＭＩＣは、２．４μＭであった。
【００５４】
実施例２
Ａ．チーズホエーからの抗菌ペプチドの調製
チーズホエーを、分子量２００００カットオフ膜で限外濾過（ＵＦ）した。濾過物を回収し、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を最終濃度１１％ｗ／ｖになるまで添加して、沈殿させた。沈殿したタンパクを、遠心（１００００ｇ、５分）によって除去し、中和された上清を凍結乾燥させた。乾燥させたＴＣＡ-可溶ＵＦホエーを、０．１％ＴＦＡ水溶液中に溶解し、ＲＰ-ＨＰＬＣにかけた。試料を、Brownlee aquapore analytical（Ｃ１８）逆相カラム（２２０ｘ４．６ｍｍ）もしくはBrownlee（Ｃ１８）調製用カラム（２５ｃｍｘ１０ｍｍ）にかけた。溶媒Ｂは、０．１％ｖ／ｖＴＦＡを含む９０％アセトニトリルからなり、溶媒Ａは、０．１％ＴＦＡ水溶液からなるものであった。溶出物を、Applied Biosystens社（ABI; Melbourne, Vic., Australia）1000Sダイオードアレイ検出器を用い、波長２１５nmで測定した。
【００５５】
試料を、Brownlee分析カラムにかけ、２分間０−３５％溶媒Ｂ、２分間３５％溶媒Ｂ、次いで４０分間３５−８０％溶媒Ｂの濃度勾配を用い、流速１．０ｍｌ／分で溶出した。回収した画分を、抗菌活性についてアッセイした。画分を、グラム陽性菌のストレプトコッカス・ミュータンス・イングブリット(Sterptococcus mutans Ingbritt)、ストレプトコッカス・サングイス(Streptococcus sanguinis)（略してＳ．サングイス）、ストレプトコッカス・ソブリヌス(Sterptococcus sobrinus)6715 WT15、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923およびグラム陰性菌の大腸菌(Escherichia coli)NCTC 10418、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)ATCC 13311および緑濃菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 25619と共に試験した。上記菌は、３０％グリセリン溶液中、−２０℃で保存した。
【００５６】
抗菌アッセイを、滅菌９６ウェルプレート（Becton Dickinson, Melbourne, Australia)で行った。グラム陽性菌用の増殖培地は、Todd Hewitt培地（ＴＨ；３６．４ｇ／ｌ）、酵母エキス（ＹＥ；５ｇ／ｌ）および１００mMリン酸カルシウム、ｐＨ６．２８（ＴＹＰＢ）からなるものとした。グラム陰性菌用の培地は、栄養培地、ｐＨ６．２８、およびＰ．ジンジバリス用にはBrain Heart Infusion培地（１μｇ／ｍｌヘムと０．５ｇ／ｌシステインを含む）、ｐＨ７．０からなるものであった。接種物は、増殖培地中、指数関数的に増殖している細胞を希釈して、接種物が約２．７ｘ１０4生存細胞／ｍｌとなるように調整した。各ウェルに、様々な濃度のペプチドと、５０μｌ菌接種物を含む２５０μｌ培地を添加した。対照アッセイは、ペプチドを除く全ての成分を含むものとした。陰性対照ウェルは、２５０μｌの培地、５０μｌの接種物、および５μｌのグラミシジンＤ（２．５mM）を含むものとした。菌の増殖を、マイクロプレートリーダ（BIORAD、４５０型、NSW、Australia）を用いて読み取らせた最終と最初の光学密度（OD）６５０の差によって決定した。最終のODは、最大培養ODを表し、通常、接種後、２０−３０ｈ（その間、P.gongivalisを除く細胞を、３７℃、有酸素条件でインキュベートし、Ｐ．ジンジバリスを同じ温度、無酸素条件でインキュベートした）で、記録された。最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、ペプチドが細菌の増殖を阻害するのに要する最小濃度として決定した。ペプチド濃度は、０．０５μＭ−５００μＭの間で変化させた。
【００５７】
中和された出発材料（ＴＣＡ-可溶ＵＦホエー）の抗菌活性を、表２に示す。
【表２】
0004940439.tif 000003
【００５８】
図４は、ＴＣＡ-可溶ＵＦホエーのＲＰ-ＨＰＬＣを示す。５つのピークを回収し、抗菌活性を解析した。表３に示すように、ピーク４が、最も高い特異的抗菌活性を示した。ピーク４（ＲＰ４）を、さらに、ゲル濾過カラム（Supelco３０ｘ７．８ｃｍ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、流速１ml/minで、３０％アセトニトリルｖ／ｖ０．１％ＴＦＡ水溶液を用いて溶出した。
【表３】
0004940439.tif 000004
【００５９】
図５に、ＴＣＡ-可溶ＵＦホエーのＲＰ-ＨＰＬＣからピーク４（ＲＰ４）のゲル濾過クロマトグラフィーを示す。クロマトグラフィーから４つのピークが回収され、表４に示されるように、Ｓ．ミュータンスに対する抗菌活性をアッセイした。
【表４】
0004940439.tif 000005
【００６０】
また、４つのピークが、アミノ酸配列決定と質量分析によって解析された。
【００６１】
ペプチドの質量スペクトル分析（ＭＳ）は、遅延抽出装置を備えたPerspective Biosystems(Framingham,MA,USA)Voyager linear matrix assisted laser desorption/ionisation Time of Flight(MALDI-TOF)質量分析計を用いて行った。試料は、試料分析プレート上で、０．２５％ｖ／ｖＴＦＡ水溶液を含む５０％アセトニトリル水溶液中の２−５，ジヒドロキシ安息香酸溶液５ｍｇ／ｍｌと、（１：１ｖ／ｖ）で混合した。全てのスペクトルは、上昇電圧２０ｋＶ、グリッド電圧９２％、パルス遅延時間１２５nsで、直線的、陽性形態で得られた。補正を、ウシのインシュリン（ＭＷ５７３３．５４Da）を用いて行った。配列決定用に、ペプチドを、１ｍｌ試料ローディング溶液中、予備処理されたHewlett-Packard(HP;Blackburn,Vic,Aust)シークエンスカラムにかけ、次いで、HP G1005Aプロテインシークエンサーを用いて解析した。
【表５】
0004940439.tif 000006
【００６２】
同程度の特異的抗菌活性を有する２つのゲル濾過ピークＲＰ４ＧＦ１とＲＰ４ＧＦ４(表４）は、同じペプチドを含み、分子量の大きい方の画分ＲＰ４ＧＦ１は、リン酸ペプチドの凝集状態を表しているものと推定された。活性ペプチドは、以下のように同定された：
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン−Ｂ−（１０６−１６９）
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン−Ａ−（１０６−１６９）
Ｓｅｒ（Ｐ）127、Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン−Ｂ−（１０６−１６９）
Ｓｅｒ（Ｐ）127、Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン−Ａ−（１０６−１６９）
【００６３】
κ−カゼイン（１０６−１６９）のリン酸化、非グリコシル化型での抗菌活性の同定は、実施例１において抗菌ペプチドとしてトリプシン処理したカゼインペプチドＳｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）の同定と一致する。
【００６４】
Ｂ．エンドペプチダーゼＧｌｕ-Ｃで処理したＴＣＡ-可溶ＵＦホエーからの抗菌ペプチドの調製
エンドペプチダーゼＧｌｕ-Ｃ(Sigma Chemical Co,St.Lousi,Mo,USA)を、酢酸アンモニウム中(0.05M,pH4.0)、ＴＣＡ-可溶ＵＦホエーの溶液(1.0mg/ml)に加え(5.0μg/ml)、２４時間３７℃でインキュベーションした。この反応は氷酢酸の添加によって３．０までｐＨを低下させることによって停止させた。酵素消化生成物はＲＰ-ＨＰＬＣによって分離した。
【００６５】
図６は、ＴＣＡ-可溶ＵＦホエーのエンドＧｌｕ-Ｃ消化のＲＰ-ＨＰＬＣを示す。１２のピークが採取され、ピーク１２のみが、表６中に示した通りＳ．ミュータンスに対して抗菌活性を示した。ピーク１２は、配列及び質量分析（表７）によって示した通り３つのペプチドを含んでいた。これらのピークは、分析用ＲＰ-ＨＰＬＣによって更に精製し、そしてペプチドSer(P)149κ-カゼインＡ(138-158)のみが、Ｓ．ミュータンスの１００％増殖阻害に近接して与えられる１００μＭ濃度での抗菌活性を示した。
【表６】
0004940439.tif 000007
【表７】
0004940439.tif 000008
【００６６】
これらの結果は、Ser(P)149κ-カゼインＡ(106-169)、Ser(P)149κ-カゼインＡ(138-158)の２０残基フラグメントのみが、より長いペプチド（２．５μＭのＭＩＣ）と比較してより劣る効力（１００μＭのＭＩＣ）ではあるが抗菌活性を示した。２つの主要な遺伝的変異体ＡとＢの２０残基フラグメントを示した：
Ser(P)149κ-カゼインＡ(138-158)  AVESTVATLEDΣPEVIESPPE
Ser(P)149κ-カゼインＡ(138-158)  AVESTVATLEAΣPEVIESPPE
【００６７】
その２０残基フラグメントは、両親媒性ヘリックスであり、且つ両親媒性ヘリックスを及び従って細菌の膜中にチャンネルを形成する潜在能力を有する。細菌細胞膜を通してカチオン（Ｎａ+，Ｋ+，Ｈ+など）の通路を与えることができ、それによって膜透過電気化学的勾配を散らす、非極性外面をもつ極性チャンネルを形成するヘキサマーとしてκ-カゼイン(130-158)の分子モデルは構築された。抗菌活性を有していない、κ-カゼイン(130-158)のグリコシル化形態の分子モデルは、恐らくは糖残基によって阻止されたチャンネルを有し、それによってグリコシル化ペプチドによる活性の欠如を説明しているものと思われる。
【００６８】
Ｃ．Ser(P)149κ-カゼイン(138-160)の合成
Ser(P)149κ-カゼイン(138-160)の抗菌活性を証明するために、関連したペプチドをリン酸化を伴う又は無しで合成し、抗菌活性を測定した。
【００６９】
Ser149上にホスホリル基を含む、Ser(P)149κ-カゼインＡ(138-160)、及びκ-カゼインＡ(138-158)に相当するペプチドは、Ｆｍｏｃ化学用の標準固相ペプチド合成プロトコールによって手動で合成した。該ペプチドは、Ｐａｃ-Ｐｅｇ-ＰＳ樹脂(PerSeptive Biosysyems)を用いたカルボキシル形として組み立てた。Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OHを含む残余のＦｍｏｃアミノ酸の連続付加は、Fmoc-アミノ酸の４当量とDIPEAの６当量を用いてHBTU/HOBt活性化によって遂行した。Ｆｍｏｃ基は、５分間、2%v/vピペリジンを含むＤＭＦ中2%v/vＤＢＵの連続流で除去した。樹脂支持体からの該ペプチドの切り離しは、暗所でＮ2下、２．５時間、ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：水(95:2.5:2.5)切断混液を用いて行った。切断後、樹脂は濾過によって除去し、濾液を窒素気流下で濃縮した。該ペプチド生成物が冷エーテル中で沈殿した後、それを遠心分離し、そして３回洗浄した。そのペプチド沈殿物は、0.1%v/vＴＦＡを含む水に溶かし、不溶性の残分を遠心分離で除去した。
【００７０】
合成したペプチドの精製は、Brownlee C18調製用カラムを用いて行った。クロマトグラムは、４．０ｍｌ／分の流速で展開し、沈殿は４３分間０−１００％溶媒Ｂの濃度勾配を用いて溶出した。該カラムから採取したペプチド画分は、４０分間０−１００％溶媒Ｂの濃度勾配を用いて溶出した。
【００７１】
採取したペプチド分画の全てを凍結乾燥し、ＭＳによる分析にかけた。
【００７２】
表８は、２つの合成ペプチドの抗菌活性を示す。これらの結果は、Ser149のリン酸化が完全な抗菌活性のために必須であることを示す。ホスホセリル残基Ser(P)149は、細菌膜中のイオンチャンネルの形成のために必要とされ、又は恐らくは可溶化のために必要であろう。さらに、より長いペプチドSer(P)149κ-カゼインＡ(117-169)(2.5μM MIC)と比較してSer(P)149κ-カゼインＡ(138-160)についてのより高いＭＩＣ(100-150μM)は、Ser(P)149κ-カゼイン(138-158)のフランキング残基が溶解性及び／又は細菌細胞との反応とイオンチャンネルの形成のために必要とされるであろうことを示唆する。
【表８】
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【００７３】
実施例３
Ａ．トリプシン加水分解
カゼインナトリウムを１０％(w/v)で１５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ８．０に溶かし、５０℃で２時間、Novoトリプシン(2g/L)を用いて加水分解した。加水分解は、ｐＨ４．６まで１Ｎ塩酸の添加によって終結し、さらに未消化のタンパク質を遠心分離によって除去した。加水分解物の試料は、７μｍApplied Biosystems Ｃ8カラム(4.6x220mm)にかけ、実施例１中に記載した通り溶出した。ピークを採取し、ストレプトコッカス・サングイニス(Streptococcus sanguinis)に対する抗菌活性について測定した。２つのペプチドは活性を示した、Ser(P)149κ-カゼインＡ(117-169)とβ-カゼイン(184-702)。
【００７４】
Ｂ．レンネット加水分解
カゼイン塩酸（５ｇ）を100mMの重炭酸アンモニウムの１００ｍｌに溶かした。カゼインが溶けたなら、そのｐＨを１Ｍ塩酸によって６．３まで低下し、そして１ｍｇのレンネットを加え、その混合物を３７℃で１時間インキュベーションした。ＴＣＡ(11%w/v)をその溶液に加えるか又はそのｐＨを１Ｎ塩酸の添加によって４．５まで低下させ、沈殿したタンパク質を遠心分離によって除去した。その上清を採取し、中性化すると共に凍結乾燥した。乾燥した試料を溶媒Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）に溶かし、Brownlee C18調製用ＲＰ-ＨＰＬＣカラムにかけた。該カラムは、４．０ｍｌ／分の流速で、５分間１５％溶媒Ｂ、２２５分間１５−６０％溶媒Ｂ、続いて１分間６０−１００％溶媒Ｂの濃度勾配を用いて溶出した。その溶出は２１５ｎｍでモニターした。４つのピークは、抗菌活性を有し、非グリコシル化、ホスホグリコシル化κ-カゼイン(106-169)に相当する２つを得た。
【００７５】
その活性ペプチドは：
Ser(P)149κ-カゼインＡ(106-169)
Ser(P)127，Ser(P)149κ-カゼインＡ(106-169)
及び
Ser(P)149κ-カゼインＢ(138-160)
Ser(P)127，Ser(P)149κ-カゼインＢ(106-169)
と同定した。
【００７６】
実施例４−提案した練り歯磨きの処方
処方１
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
リン酸２カルシウム２水和物                    ５０．０
グリセリン                                    ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム            １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                          １．５
ラウロイルサルコニサートナトリウム              ０．５
香料                                            １．０
サッカリンナトリウム                            ０．１
グルクロン酸クロルヘキシジン                    ０．０１
デキストラナーゼ                                ０．０１
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   １．０
水                                              バランス
【００７７】
処方２
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
リン酸２カルシウム２水和物                    ５０．０
ソルビトール                                  １０．０
グリセリン                                    １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム            １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                          １．５
ラウロイルサルコニサートナトリウム              ０．５
香料                                            １．０
サッカリンナトリウム                            ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                    ０．３
グルクロン酸クロルヘキシジン                    ０．０１
デキストラナーゼ                                ０．０１
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   ２．０
水                                              バランス
【００７８】
処方３
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
リン酸２カルシウム２水和物                    ５０．０
ソルビトール                                  １０．０
グリセリン                                  １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム            １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                          １．０
ラウロイルジエタノールアミン                    １．０
ショ糖モノラウレート                           ２．０
香料                                             １．０
サッカリンナトリウム                            ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                    ０．３
グルクロン酸クロルヘキシジン                   ０．０１
デキストラナーゼ                                ０．０１
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   ５．０
水                                              バランス
【００７９】
処方４
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
ソルビトール                                  １０．０
トチャカ（Irish moss）                            １．０
水酸化ナトリウム（５０％）                      １．０
ガントレツ（Gantrez）                           １９．０
水（脱イオン化）                                 ２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム                     ０．３
サッカリンナトリウム                            ０．１
ピロリン酸塩                                    ２．０
水酸化アルミニウム                            ４８．０
香油                                            ０．９５
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   １．０
水                                              バランス
【００８０】
処方５
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
ポリアクリレートナトリウム                    ５０．０
ソルビトール                                  １０．０
グリセリン                                   ２０．０
サッカリンナトリウム                            ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                    ０．３
グルクロン酸クロルへキシジン                    ０．０１
エタノール                                      ３．０
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   １．０
リノール酸                                      ０．０５
水                                              バランス
【００８１】
実施例５−提案した口内洗剤の処方
処方１
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
エタノール                                    ２０．０
香料                                           １．０
サッカリンナトリウム                            ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                    ０．３
グルクロン酸クロルヘキシジン                    ０．０１
ラウロイルジエタノールアミン                    ０．３
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   ２．０
水                                              バランス
【００８２】
処方２
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
ガントレツＳ−９７（Ganterz S-97）               ２．５
グリセリン                                     １０．０
香油                                            ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム                    ０．０５
グルクロン酸クロルヘキシジン                    ０．０１
ラウロイルジエタノールアミン                    ０．２
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   ２．０
水                                              バランス
【００８３】
実施例６−提案したハッカドロップの処方
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
砂糖                                          ７５−８０
コーンシロップ                                  １−２０
香油                                            １−２
ＮａＦ                                      ０．０１−０．０５
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   ２．０
ステアリン酸マグネシウム                         １−５
水                                              バランス
【００８４】
実施例７−提案した歯茎マッサージクリームの処方
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
白色ペトロラタム                               ８．０
プロピレングリコール                           ４．０
ステアリン酸アルコール                         ８．０
ポリエチレングリコール４０００                ２５．０
ポリエチレングリコール４００                  ３７．０
モノステアリン酸シュークロース                  ０．５
グルクロン酸クロルヘキシジン                    ０．１
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   ３．０
水                                              バランス
【００８５】
実施例８−提案したチューインガムの処方
成分                                          ％Ｗ／Ｗ
ガムベース                                    ３０．０
炭酸カルシウム                                  ２．０
結晶ソルビトール                              ５３．０
グリセリン                                      ０．５
香油                                            ０．１
Ｓｅｒ（Ｐ）149κ−カゼイン（１０６−１６９）   ２．０
水                                              バランス
【００８６】
数多くの変更および／もしくは修飾を、広く記載された本発明の精神もしくは範囲から逸脱することなく、特定の実施態様に示したように行うことができることは、当業者が予想するところであろう。それゆえ、本実施態様は、全ての点において、限定するものではなく、例示として見なされる。
【００８７】
【図面の簡単な説明】
【図１】  ホエータンパク質濃度（ＷＰＣ）のトリプシン消化の逆相ＨＰＬＣ。ＷＰＣトリプシン消化物（８ｍｇ）は、Brownlee RP-300 C8カラムにかけた。そのサンプルは、１ｍｌ／分の流速で、２分間０−２０％Ｂ、続いて４０分間２０−４５％Ｂの段階式洗浄濃度勾配を用いて溶出した。溶出液Ａは、水中に０．１％(v/v)ＴＦＡ及び溶出液Ｂは水中０．１％(v/v)ＴＦＡ中８０％(v/v)アセトニトリルとした。
【図２】  ＷＰＣトリプシン消化物のＲＰ-ＨＰＬＣからのピーク９のアニオン交換クロマトグラフィー。ピーク９は、SMARTTMシステムに取り付けられたMono Qカラムにかけ、１００μｌ／分の流速で、４０分間０−７５％溶出液Ｂを用いて溶出した。溶出液Ａは、２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０，１０ｍＭ塩化カリウムとし、溶出液Ｂは、２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０，５００ｍＭ塩化カリウムとした。
【図３】  Streptococcus mutans Ingbrittについてのκ-カゼインＡSer(P)149(f117-169)のＭＩＣの測定。ＭＩＣは２．４μＭであった。
【図４】  ＵＦ-ホエーの分析用逆相ＨＰＬＣ溶出プロフィール。ＵＦ-ホエーの試料は、溶媒Ａに溶かし、分析用カラム（Ｃ１８）にかけ、そして５分間０−３５％溶媒Ｂ、続いて４０分間３５−８０％溶媒Ｂの直線状濃度勾配を用いて溶出した。溶媒Ａは、水中に０．１％ＴＦＡからなり、溶媒Ｂは９０％アセトニトリル（水中にv/v/0.1%ＴＦＡ）を含む。ピークは、２１５ｎｍで検出し、２１５ｎｍで手動で採取し、凍結乾燥した。
【図５】  ゲル濾過を用いたピーク４（ＲＰ−ＨＰＬＣからの）の精製。ピーク４は、ＡＢＩシステムに接続したゲル濾過カラムにかけた。材料は、１ｍｌ／分の流速で、３０％アセトニトリル(v/v)／０．１％ＴＦＡを用いて溶出し、２１５ｎｍでモニターした。
【図６】  エンドペプチダーゼGlu-CによってＴＣＡ-可溶ＵＦ-ホエーの加水分解によって生じたペプチドの精製。試料は溶媒Ａ（水中にv/v/0.1%ＴＦＡ）に溶かし、分析用カラム（Ｃ１８）にかけた。ピークは、４分間０−２０％溶媒Ｂ（９０％アセトニトリルv/v/水中に０．１％ＴＦＡ）、続いて４０分間２０−４０％溶媒Ｂの濃度勾配を用いて溶出した。ピークは２１５ｎｍでモニターした。
【配列表】
0004940439.tif 000010
0004940439.tif 000011
0004940439.tif 000012
0004940439.tif 000013
0004940439.tif 000014
【図１】
0004940439.tif 000015
【図２】
0004940439.tif 000016
【図３】
0004940439.tif 000017
【図４】
0004940439.tif 000018
【図５】
0004940439.tif 000019
【図６】
0004940439.tif 000020