(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘起するための組成物であって、該組成物は、有効量の、インフルエンザウイルスから抽出された赤血球凝集素抗原および熱不安定性変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシンを含み、経口投与されることを特徴とし、該熱不安定性変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシンは、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２からなる群より選択される、組成物。
【請求項２】
哺乳動物の鼻分泌物または唾液においてインフルエンザウイルスに対する抗原特異的ＩｇＡを誘起するための組成物であって、該組成物は、有効量の、インフルエンザウイルスから抽出された赤血球凝集素抗原および少なくとも一種の熱不安定性変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシンを含み、経口投与されることを特徴とし、該熱不安定性変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシンは、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２からなる群より選択される、組成物。
【請求項３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
哺乳動物のための経口インフルエンザ免疫原性組成物であって、該組成物は、有効量の、インフルエンザ赤血球凝集素および少なくとも一種の熱不安定性変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシンを含み、該赤血球凝集素は、インフルエンザウイルスから抽出されたものであり、そして、該熱不安定性変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシンは、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２からなる群より選択される、組成物。
【請求項５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、米国出願番号６０／１６０，０２８（１９９９年１０月１８日出願）（本明細書中でその全体が参考として援用される）に対する優先権の恩恵を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、感染性因子に対する免疫応答を刺激するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、感染性因子由来の少なくとも１種の粘膜付着抗原および少なくとも１種の熱不安定性変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシンを含有する経口組成物に関する。本発明の組成物および方法は、インフルエンザに対して特に有用である。
【０００３】
（発明の背景）
感染性疾患は、有意な罹患率および死亡率を全世界にわたって担う。感染性疾患の処置は、しばしば、患者が感染し、そして既に感染の影響に苦しんだ後に開始される。感染の有害な影響が生じる前に感染を予防するためのストラテジーを開発する必要性が、長い間存在している。
【０００４】
感染性疾患の大部分は、粘膜表面を介してもたらされる。分泌免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、このような感染に対する防御の第１線として機能し、付着および粘膜を通る移動を防ぎ、そして感染した上皮細胞内でのウイルス複製を阻害し得る。
【０００５】
１つの特定の重要な感染性疾患は、インフルエンザである。インフルエンザは、無防備な（例えば、非常に若年、非常に老年、および免疫易感染性個体）集団における高い罹患率、および一般的な集団における有意な死亡率を示す、重篤なヒト疾患である（Ｇｌｅｚｅｎ  Ｐ．Ｗ．（１９８２）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．４：２５−４４）。毎年のインフルエンザの激増に関連する社会的経費および経済的費用は高い（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  Ｍ．Ｌ．およびＩ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ．「Ｎｅｗ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．」ＮＥＷ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ，第２版（Ｌｅｖｉｎｅ  Ｍ．Ｍ．ら編）．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９９７．５４５−５７０頁）。ホルマリン−不活性化全ウイルスおよび分離−ウイルスの筋内（ｉ．ｍ．）ワクチンは、インフルエンザの蔓延および重症度を制御するために市販されている（Ｇｈｅｎｄｏｎ  Ｙ．（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５７：３７−４５：Ｒｉｄｄｉｏｕｇｈ  Ｍ．Ａ．ら（１９８３）ＪＡＭＡ  ２４９：３１８９−９５）。これらの予防ワクチンは、インフルエンザを制御する際に重要であるが、予防ワクチンの効率および受容可能性を制限する多く欠点を有する。現在の市販のインフルエンザワクチンは、ウイルスチャレンジに対して保護性である、健康な成人ヒトにおける血清抗体応答を誘導することが示されるが、この保護性免疫性は、効力が可変である傾向にあり、そして比較的有効期間が短い（特に、高齢者および胎児集団において）（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  Ｍ．Ｌ．およびＩ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ（１９９７）５４５−７０頁；Ｇｈｅｎｄｏｎ  Ｙ．（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５７：３７−４５；Ｒｉｄｄｉｏｕｇｈ  Ｍ．Ａ．ら（１９８３）ＪＡＭＡ  ２４９：３１８９−３１９５；Ｈｏｓｋｉｎｓ  Ｔ．Ｗ．（１９７９）Ｌａｎｃｅｔ  ｉ：３３−３５：Ｐａｔｒｉａｒｃａ  Ｐ．Ａ．ら（１９８５）ＪＡＭＡ  ２５３：１１３６−１１３９）。さらに、不活性化全ウイルスおよび分割−ウイルスワクチンは、時々のみ、ＣＤ−８細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を活性化することが公知であり、これは、抗原性改変体に対して乏しい交差反応性しか有さず、そして乏しい分泌ＩｇＡ応答しか生じない（Ｇｌｅｚｅｎ  Ｐ．Ｗ．（１９８２）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．４：２５−４４；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  Ｍ．Ｌ．およびＩ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ（１９９７）５４５−５７０頁；Ｂｅｎｄｅｒ  Ｂ．Ｓ．ら（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．７２：５１４−５１９；Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｔ．Ｗ．（１９７９）Ｌａｎｃｅｔ  ｉ：３３−５；Ｐａｔｒｉａｒｃａ  Ｐ．Ａ．ら（１９８５）ＪＡＭＡ  ２５３：１１３６−３９；Ｐｏｗｅｒｓ  Ｄ．Ｃ．（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．４１：１−５）。さらに、注射部位反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）および微弱な免疫応答は、非常に若年のこどもにおいて問題であり得る（Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ  Ｊ．Ｒ．ら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１３９−４１；Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ  Ｊ．Ｒ．ら（１９９１）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ８７：８２３���８２８）。主に、粘膜で活性なインフルエンザワクチンの開発により、ワクチン効率および許容性を改善するための著しい努力が、現在求められている（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  Ｍ．Ｌ．およびＩ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ（１９９７）５４５−５７０頁；Ｂａｒａｃｋｍａｎ  Ｊ．Ｄ．ら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：４２７６−４２７９；Ｄｅ  Ｈａａｎ  Ａ．ら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１５５−１６２；Ｏｈ  Ｙ．ら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：５０６−５１１；Ｓａｎｔｉａｇｏ  Ｎ．ら「Ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」ｉｎ  ＶＡＣＣＩＮＥ  ＤＥＳＩＧＮ：ＴＨＥ  ＳＵＢＵＮＩＴ  ＡＮＤ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ．Ｐｏｗｅｌｌ  Ｆ．Ｍ．およびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ（編）．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９９５．４１３−３８頁）。
【０００６】
粘膜免疫ストラテジーは、筋肉内免疫によって生じるよりも広い免疫応答を提供することによってインフルエンザワクチン接種の効率および期間を改善する手段として広く試験されてきた（Ｏｈ  Ｙら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：５０６〜５１１；Ｇａｌｌｉｃｈａｎ  Ｗ．Ｓ．およびＫ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１８７９〜１８９０；Ｏｇｒａ  Ｐ．Ｌ．「Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」ＭＵＣＯＳＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥ、Ｋｉｙｏｎｏ  Ｈら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６、第３〜１４頁；Ｎｏｖａｋ  Ｍら（１９９５）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７１Ｂ：１５８７〜１５９０：Ｓｔａａｔｓ  Ｈ．Ｆ．およびＪ．Ｒ．ＭｃＧｈｅｅ「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」ＭＵＣＯＳＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥ、Ｋｉｙｏｎｏ  Ｈ．ら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６第１７〜３９頁）。最も通常に使用され、従って相当首尾良い、インフルエンザワクチン接種のための粘膜免疫ストラテジーは、経鼻経路を介するものである（Ｂａｒａｃｋｍａｎ  Ｊ．Ｄ．ら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：４２７６〜４２７９；Ｎｉｃｈｏｌ  Ｋ．Ｌ．ら（１９９９）ＪＡＭＡ  ２８２：１３７〜１４４；Ｒｕｄｉｎ  Ａら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：３３９０〜３３９６；Ｔａｋａｓｅ  Ｈら（１９９６）Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１６５１〜１６５６）。
【０００７】
生の、風邪対応（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）インフルエンザウイルスワクチンでの経鼻免疫、およびＬＴ（熱不安定性エンテロトキシン）およびＣＴＢ（コレラ毒素の非毒性サブユニットＢ）とともにインフルエンザ抗原を同時投与することは、改善されたインフルエンザワクチン開発への実行可能なアプローチのようである（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂ．Ｌ．およびＪ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｏｒａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ」ＭＵＣＯＳＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ，Ｋｉｙｏｎｏ  Ｈら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６、第７３〜８７頁；Ｎｉｃｈｏｌ  Ｋ．Ｌ．ら（１９９９）ＪＡＭＡ  ２８２：１３７〜１４４）。これらのアプローチは、ヒトにおいて、局所的（唾液および気管上部）な抗原特異的ＩｇＡレベルを増大することが示されており、そして市販のインフルエンザワクチンでの伝統的な筋肉内免疫に比べて細胞性免疫応答を増大した。しかし、この生の、風邪対応インフルエンザウイルスワクチンは、高齢の患者では有効性に限界があることが示されており、そして乳児においてはＣＴＬ刺激因子に欠しいことが示されている（Ｍｂａｗｕｉｋｅ  Ｉ．Ｎ．ら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５０：１０５〜１１１；Ｔｒｅａｎｏｒ  Ｊ．ら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６９：４０２〜４０７）。毒性が、ヒトにおける、粘膜アジュバントとしてのエンテロトキシンの使用に関する主な制限要因であった。
【０００８】
経口免疫は、長らく、ワクチン接種のための所望の標的であった。経鼻免疫と同様、経口免疫は、強力な分泌型ＩｇＡ応答を誘導し、防御的細胞免疫応答を改善し、そして有意な血清抗体応答も生じることが示されている（Ｔａｋａｓｅ  Ｈら（１９９６）Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１６５１〜１６５６；Ｂｅｂｅｄｅｔｔｉ  Ｒ，ら（１９９８）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１０７〜１１８；Ｇａｌｌｉｃｈａｎ  Ｗ．Ｓ．およびＫ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１８７９〜１８９０；Ｎｏｖａｋ  Ｍら（１９９５）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７１Ｂ：１５８７〜１５９０；Ｋａｔｚ  Ｊ．Ｍ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：３５２〜３６３）。経口免疫についての分泌型ＩｇＡ応答は、泌尿器管および直腸管で最強であり、そして経鼻免疫と比べた場合、上部気道、鼻咽頭および唾液の応答はいくらか弱められたことがいくつかの動物モデルで示された（Ｒｕｄｉｎ  Ａら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：３３９０〜３３９６）。これらの比較的弱い上部気道ＩｇＡ応答は、ヒトの系での場合であることが見出される場合、進入の最初の様式が上部気道管を介するウイルス（例えばインフルエンザ）に対して、ウイルスチャレンジに対して有効な防御を達成することに関して、問題であるようである。しかし、他の研究では、十分な局所分泌型ＩｇＡ応答が存在すること、そしてより重要なことには、初回抗原刺激を受けたＢ細胞およびＴ細胞の気道上部への遊走が強力な防御免疫を誘導する証拠が存在することが示されている（Ｔａｋａｓｅ  Ｈら（１９９６）Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１６５１〜１６５６；Ｋａｔｚ  Ｊ．Ｍ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：３５２〜３６３）。さらに、経口免疫は、骨髄において記憶Ｂ細胞維持を促進することが示されており、これは、ウイルスチャレンジに対する免疫の持続の開発において重要であり得る要因である（Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ  Ｒ．ら（１９９８）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９；１０７〜１１８）。しかし、多くの抗原から強力な免疫応答を獲得するため、強力な粘膜アジュバントである、エンテロトキシンを、通常、同時投与しなければならない（Ｄｅ  Ａｉｚｐｕｒｎａ  Ｈ．Ｊ．ら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：４４０〜４５１）。
【０００９】
研究によって、経口的に免疫した抗原に対する免疫応答は、この抗原それ自体が粘膜結合特性を有するかまたは、粘膜付着性のレクチンとの因子の化学的な結合による粘膜結合特性、もしくはレセプター結合特性を有するように作製され得る場合に有意に、より強力であることが示された（Ｈａｒｏｋｏｐａｋｉｓ  Ｅ．ら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：４２９９〜４３０４；Ｎｅｕｔｒａ  Ｍ．Ｒ．およびＪ．Ｋｒａｅｋｅｎｂｕｈｌ「Ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  Ｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」ＭＵＣＯＳＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  Ｋｉｙｏｎｏ  Ｈら編、Ｏｇｒａ  ＰＬ，ＭｃＧｈｅｅ  ＪＲ編、Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６：４１〜５５．，Ｄｅ  Ａｉｚｐｕｒｕａ  Ｈ．Ｊ．およびＧ．Ｊ．Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：４４０〜４５１；Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ  Ｃら（１９８９）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．５７：１０７２〜１０７７）。ＣＴＢは、これらの目的で用いられてある程度成功している（Ｄｅ  Ａｉｚｐｕｒｕａ  Ｈ．Ｊ．およびＧ．Ｊ．Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ（１９８８）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：４４０−４５１；Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ  Ｃ．ら（１９８９）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．５７：１０７２〜１０７７）。インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）は、インフルエンザウイルス由来の膜糖タンパク質であり、赤血球を凝集させ、ウイルス付着およびエンベロープ融合を媒介する。インフルエンザＨＡは、ノイラミン酸富化糖タンパク質に結合するが、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｋ６３は、ＧＭ１−ガングリオシド、ならびにガラクトース含有糖タンパク質およびリポ多糖（リポポリサッカライド）に結合する（これらのリガンドの全てが腸において遍在的に見出される）（Ｋｕｚｉｅｍｋｏ  Ｇ．Ｍ．ら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：６３７５−６３８４；Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ  Ｔ．Ｊ．ら（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：５０２−５０６：Ｓａｎｇｌｅｒ  Ｂ．Ｄ．（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６：６２２−６４７）。
【００１０】
複数の障害により、サブユニット抗原を使用する経口免疫が有意にチャレンジを起こすが、これは、多くによって、ワクチンの高度に所望の形態だと考えられている。（Ｂａｒａｃｋｍａｎ  Ｊ．Ｄ．ら（１９９８）ＳＴＰ  Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．８：４１−４６；Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ  Ｓ．Ｊ．ら（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．７６：１６４−１６８；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂ．Ｌ．およびＪ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｏｒａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ」ｉｎ  ＭＵＣＯＳＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ，Ｋｉｙｏｎｏ  Ｈ．ら（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６．第７３−８７頁）。強力な細胞免疫、より良好な交差保護、記憶、および分泌ＩｇＡ応答を引き起こすための経口ワクチン接種の能力が、要求されてきた（Ｔａｋａｓｅ  Ｈ．ら（１９９６）Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１６５１−１６５６；Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ  Ｒ．ら（１９９８）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１０７−１１８；Ｇａｌｌｉｃｈａｎ  Ｗ．Ｓ．およびＫ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ（１９９６）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１８７９−１８９０：Ｍｅｉｔｉｎ  Ｃ．Ａ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１８７−１１１９１；Ｏａｒａ  Ｐ．Ｌ．「Ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｖ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」ｉｎ  ＭＵＣＯＳＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  Ｋｉｙｏｎｏ  Ｈ．ら（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９９６．第３−１４頁）が、患者の快適さのさらなる利点は、過度に強調され得ない（Ｒａｈｍａｎ  Ｓ．ら（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．４８：８２３−８２６）。
【００１１】
噛むことができる丸剤の形態または口当たりが良い甘い液体処方物でのインフルエンザワクチンの投与は、多くによって、子供における好ましい投与形態と考えられており、そして臨床医の注射によりも安全である。生存可能な経口活性インフルエンザワクチンを開発する多くのアプローチが研究されており、これらのアプローチには、インフルエンザ抗原を微粒子に処方すること、標的細胞がＰａｙｅｒ’ｓ  Ｐａｔｃｈに取りこむキャリアタンパク質に抗原を連結すること、および粘膜活性アジュバンドで同時投与することを含む（Ｂａｒａｃｋｍａｎ  Ｊ．Ｄ．ら（１９９８）ＳＴＰ  Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．８：４１−４６：Ｍｅｉｔｉｎ  Ｃ．Ａ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１８７−１１１９１；Ｈａｒｏｋｏｐａｋｉｓ  Ｅ．ら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｍｔ．６６：４２９９−４３０４：Ｎｅｕｔｒａ  Ｍ．Ｒ．およびＪ．  Ｋｒａｅｋｅｎｂｕｈｌ  「Ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  Ｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」ｉｎ  ＭＵＣＯＳＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  Ｋｉｙｏｎｏ  Ｈ．ら，編）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６．第４１−５５頁）。これらのアプローチの中で、この粘膜アジュバンド（主に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ加熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ）およびコレラ毒素（ＣＴ））は、最も一般的に使用される（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂ．Ｌ．およびＪ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｏｒａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ」ｉｎ  ＭＵＣＯＳＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＴＥＳ  Ｋｉｙｏｎｏ  Ｈ．ら（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６．第７３−８７頁：Ｅｌｓｏｎ  Ｃ．Ｏ．「Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  ａｓ  ａ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ」ｉｎ  ＭＵＣＯＳＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  Ｋｉｙｏｎｏ  Ｈ．ら（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９９６．第５９−７２頁）。強力な免疫アジュバンドＬＴおよびＣＴは、アジュバンド活性に有用である容量でヒトにおいて毒性であるが、それ故、経口インフルエンザワクチンを開発するために有用ではない。
【００１２】
非毒性ＣＴのＢサブユニット（ＣＴＢ）は、全ＣＴに対する代替物として調査されているが、研究によると、全ＣＴの少量が、ヒトのＣＴＢの能力を阻害する、十分なアジュバンド能力に必要とされることが示された（Ｔａｍｕｒａ  Ｓ．ら（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３３７−１３４４；Ｔａｍｕｒａ  Ｓ．ら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：９８１−９８８；Ｔａｍｕｒａ  Ｓ．ら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０８３−１０８９）。これらの研究のために、ＬＴおよびＣＴのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性は、アジュバンド活性に必要な成分として与えられた（Ｌｙｃｈｅ  Ｎ．ら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：２２７７−８１）。
【００１３】
経口投与される場合、免疫反応を安全に惹起する組成物を開発する必要性が、当該分野において存在する。
【００１４】
本明細書中で引用される各文献は、その全体が参考として援用される。
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物における免疫応答を惹起する組成物を提供し、ここで、この組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に少なくとも１つの粘膜付着抗原を含む。
【００１６】
本発明の組成物は、粘膜付着性または腸関連結合特性を有する抗原に使用する使用のために適切である。このように、これらの抗原は、粘膜または消化管の感染剤から誘導され得る。
【００１７】
本発明の組成物は、広範の病原に対して免疫応答を惹起するのに使用するために適切であり、これには、ウイルス、細菌、原生動物亜界、真菌および蠕虫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明は、特に、インフルエンザに対する免疫応答を刺激する場合の利用（特に、インフルエンザウイルスの血球凝集素抗原を使用）を見出す。
【００１９】
本発明はまた、少なくとも１種の有効量の粘膜付着抗原を哺乳動物に経口投与することによる、哺乳動物の免疫応答を惹起する方法を包含する。
【００２０】
本発明はまた、粘膜または消化管の病原体に対する、哺乳動物の免疫応答を惹起する方法を包含し、ここで、この粘膜付着抗原は、加熱不安定な変異Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシン（例えば、ＬＴ−Ｋ６３および／またはＬＴ−Ｒ７２）と共に投与される。
【００２１】
本発明の方法は、血球凝集素抗原の経口投与を介した、インフルエンザに対する免疫応答性の刺激を含む。
【００２２】
本発明はまた、少なくとも１種の有効量の粘膜付着抗原を哺乳動物に投与することによる、鼻分泌物および唾液中の抗原特異的ＩｇＡ応答の刺激を含む。いくつかの実施形態において、この粘膜付着抗原は、加熱不安定な変異Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシン（例えば、ＬＴ−Ｋ６３および／またはＬＴ−Ｒ７２）と共に投与される。
【００２３】
特定の実施形態において、哺乳動物のための経口インフルエンザ免疫原性組成物が提供され、ここで、この免疫原性組成物は、有効量のインフルエンザ血球凝集素および加熱不安定、変異Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシンを含む。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
粘膜付着特性または消化管関連（ｇｕｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）結合特性を全く有さない抗原は、非常に高い用量レベル以外で、ＬＴの非存在下でかまたは可溶性抗原と可溶性ＬＴとの混合物としてのいずれかで、マウスにおいて経口送達される場合、最小の免疫原性を有することが、発見された。穏やかな免疫応答が、インフルエンザ抗原が妥当な用量レベルで経口送達される場合に示され得るが、これらの抗原は、野生型のＬＴもしくはＣＴとアジュバント化された場合に、実質的かつ広範な免疫応答を生じる（Ｋａｔｚ  Ｊ．Ｍ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：３５２〜３６３）。
【００２５】
本発明者らは、変異体ＬＴ毒素ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２（Ｂａｒａｃｋｍａｎ  Ｊ．Ｄ．ら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：４２７６〜４２７９）を研究した。これらの毒素は、インフルエンザ抗原と組み合わせて経鼻送達された場合、ｗｔＬＴと同様のアジュバント性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）を示すが、実質的に０まで減少したインビトロおよびインビボでの毒性を示し、このことは、広範に適用可能な有効な経鼻インフルエンザワクチンを開発する可能性を改善する（Ｂａｒａｃｋｍａｎ  Ｊ．Ｄ．ら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：４２７６〜４２７９；Ｇｉｕｌｉａｎｉ  Ｍ．Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１１２３〜１１３２）。さらに、ＬＴ−Ｒ７２は、非常に低レベルのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示すが、なお強力な粘膜アジュバント活性を維持し、一方ＬＴ−Ｋ６３において、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、強力なアジュバント性にも関わらず検出不能である（Ｇｉｕｌｉａｎｉ  Ｍ．Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１１２３〜１１３２）。このデータは、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性がアジュバント活性に関連しないかもしれずことを示し、このことは、これらのアジュバントをヒトにおける経口投与に適切な非毒性粘膜アジュバントにする（Ｆｒｅｙｔａｇ  Ｌ．Ｃ．およびＪ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３６：２１５〜２３６）。
【００２６】
本発明の実施は、他のように示されない限り、当業者の範囲内にあるウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；ＤＮＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、第１巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．）；ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；ならびにＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２版、第ＩおよびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。
【００２７】
本明細書中にて使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、単数および複数をいう。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「粘膜付着（物）」とは、感染性因子に関連することが見出される免疫原性化合物であって、その抗原が消化管関連結合特性もしくは粘膜結合特性を有する粘膜および／または消化管の免疫原性化合物をいう。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「粘膜」は、口、鼻の通路、膣および尿道の滑らかな内層（ｌｕｂｒｉｃａｔｅｄ  ｉｎｎｅｒ  ｌｉｎｉｎｇ）をいい、そして「消化管」は、口から肛門に伸びる消化管をいう。
【００３０】
有効量の本発明の組成物が、感染性因子による感染を予防もしくは改善するために哺乳動物に投与される。本明細書中で使用される場合、疾患もしくは状態を有する個体を処置することに関する句「有効量」は、不都合な効果（例えば、毒性、刺激またはアレルギー応答）を伴うことなく、その疾患もしくは状態の処置を達成しそして改善および／または除去するに十分な量か、あるいは感染性因子による感染を予防するために十分な量を意味する。個々の需要は変化し得、そして投薬要求量のいくらかの変動が、有効量の処方物の最適な範囲を達成するために種々の型の哺乳動物にとって必要であるが、このような慣用的実験は、当業者の範囲内である。ヒトの用量は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐ．Ａ．、１９９０の第２７章、Ｋａｔｏｃｓらにより教示されるような動物研究から容易に推定され得る。一般的に、当業者により調整され得る有効量の処方物を提供するために必要な投薬量は、レシピエントの年齢、健康、身体的状態、体重、疾患もしくは障害の型および程度、処置の頻度、必要な場合は併用治療の性質、ならびに所望の効果の性質および範囲を含む、いくつかの要因に依存して変化する（Ｎｉｅｓら、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３、ＧＯＯＤＭＡＮ  ＆  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９６）。約５〜約１００μｇの範囲の投薬量が、意図される。
【００３１】
その組成物の１回を超える投与が必要とされ得ることもまた、意図される。投与間の時間は、与えられる投与の数に依存する。例えば、２回の投与が与えられる場合、第１回は０月目に行われ得、そして第２回は１月目、２月目もしくは６月目に行われ得；４回の投与が与えられる場合、それらはそれぞれ、０月目、１月目、２月目および６月目に与えられ得る。あるいは、それらの投与は、１月間隔で行われ得る。複数の投与間の時間は、当業者により容易に決定され得る。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「投与する」には、経皮、非経口、皮下、筋肉内、経口および局所送達が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法において、少なくとも１つの投与が経口であり、そして投与の好ましい経路は経口である。本発明の組成物は、好ましくは、経口投与のために処方される。
【００３３】
開示される本発明の方法の意図される目的は、インフルエンザウイルスの感染の回復である。回復は、例えば、インフルエンザに関連する感染の徴候および症状の軽減によって決定され得る。インフルエンザに対する有効な免疫化は、血清試験によりモニタリングされ得、ここで抗原特異的抗体が誘発される。このような試験において、抗体は、慣用的な試験を使用して、被験体の血液、唾液および鼻分泌物において検出され得る。好ましくは、本発明に従う処置は、インフルエンザウイルスの同時的な減少／消失を伴う、抗原特異的抗インフルエンザ抗体の出現を生じる。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物を用いる処置は、インフルエンザウイルスの感染を予防し得る。本発明のいくつかの実施形態において、アッセイは、抗原特異的ＩｇＡ抗体の存在を検出し得る。
【００３４】
被験体に有効な投薬量の決定を助けるために、本明細書中に記載される血清アッセイが使用され得る。免疫応答の十分な刺激は、免疫学的アッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、または血清、唾液および鼻分泌物のような体液中の抗原特異的抗体を検出するための任意の他のアッセイ）によって決定され得る。本発明の組成物中の抗原の濃度と抗体力価との相関は、有効な免疫応答を引き起こす組成物の能力における有効性の指数を提供する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、免疫原性組成物に関する成句「免疫学的有効量」とは、治療的または予防的免疫応答を引き起こすのに十分な量を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、感染因子による感染に対する個体の処置に関する「予防的免疫応答」とは、予防的であり、そしてチャレンジの際に感染因子を阻害する免疫応答を意味する。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、予防的免疫応答に関する「阻害する」とは、感染の影響が最小化されるかまたは排除されるように、感染因子での感染を軽減または排除することを意味する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、感染因子に感染した個体の処置に関する「治療的免疫応答」とは、感染因子を回復しそして／または排除する免疫応答を意味する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、個体に投与された免疫原性組成物の量に関する成句「治療的有効量」とは、個体における治療的免疫応答を引き起こすのに十分な量を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、個体に投与された免疫原性組成物の量に関する「予防的有効量」とは、個体における予防的免疫応答を引き起こすのに十分な量を意味する。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「個体」とは、本発明の免疫原性組成物で処置され得るヒトおよび非ヒト動物をいう。
【００４２】
「粘膜または消化管の感染因子」としては、ウイルス、細菌、原生動物、真菌および蠕虫が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスの非限定的な例としては、インフルエンザウイルスが挙げられる。
【００４３】
本発明の粘膜付着抗原は、当該分野で公知の任意の手段によって調製され得る。全病原体は、不活化され、殺され、超音波処理され、そして／または可溶化され、例えば、抗原が抽出される。本発明における使用のための抗原調製物は、従来の方法を使用してさらに精製され得る。あるいは、抗原は、組換えＤＮＡ技術によって産生され得、ここで、選択した抗原をコードする核酸配列は、続いて宿主細胞に導入される発現ベクターに挿入される。組換えタンパク質の発現が行われ、そして選択された抗原は、従来の方法によって宿主細胞から精製される。このような方法としては、例えば、アンフィニティー精製、クロマトグラフィー、および電気泳動が挙げられ得る。
【００４４】
経口組成物の形態は、カプセル、錠剤、液体、シロップ、懸濁液、エリキシル、または当該分野で公知の経口投与の任意の他の処方物であり得る。さらに、本発明の経口組成物は、当該分野で公知であり当該分野で使用される他の賦形剤と組み合わされ得る。この組成物は、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラートなどの形態であり得る。ＬＴ−Ｋ６３またはＬＴ−Ｒ７２は、約１０μｇ〜１０ｍｇの全用量で使用され得る。アジュバントは、全処方物の約０．０１〜１％の全経口処方物の一部を形成し得る。粘膜付着剤を含む賦形剤の用量は、アジュバントの用量より１００〜１０００倍多くてもよい。治療的に有用な組成物中の粘膜付着抗原の量は、治療的に有効な免疫応答または感染阻害免疫応答を引き起こすのに十分な量である。
【００４５】
これらの錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはまた、以下の成分を含み得る：結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシア、スクロース、トウモロコシデンプン、ゼラチンなど）；賦形剤（リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムなど）；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、特定の複合シリケート、アルギン酸など）；潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウムなど）；甘味剤（例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンなど）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、チェリー香料、または当該分野で公知かつ使用されている他の任意の香料）。類似の型の固形組成物もまた、軟らかく充填したゼラチンカプセルおよび硬く充填したゼラチンカプセルにおける、充填剤として使用される。投薬単位形態が、カプセルに含まれる場合、組成物は、液体キャリアに存在し得る。
【００４６】
種々の他の材料が、コーティングとして存在し得るか、さもなければ、その投薬単位の物理的形態を改変し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖または両方でコーティングされ得る。
【００４７】
本発明の組成物を含むシロップまたはエリキシルはまた、甘味剤、保存剤（例えば、メチルパラベンおよびプロピルパラベン）、色素、香料、乳化剤および／または懸濁剤、ならびに希釈剤（例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよび当該分野で公知かつ使用されるこれらの種々の組み合わせ）を含み得る。
【００４８】
投薬単位は、好ましくは、純粋であり、そして優良製造規範（ＧＭＰ）条件下で生成される。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、免疫原性量の少なくとも１つのインフルエンザ赤血球凝集素抗原を、有効量の少なくとも１つの易熱性変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉエンテロトキシンと組み合わせて、インフルエンザウイルスに対する免疫原性組成物を形成する。この組成物は、インフルエンザに対する免疫応答を誘発するために、哺乳動物（特に、ヒト）への投与に適切である。より詳細には、ＩｇＡ特異的免疫応答が、インフルエンザに対して誘発され、そして抗インフルエンザＩｇＡ抗体が、この免疫原性組成物を受ける哺乳動物の唾液および鼻内分泌物に見い出される。好ましくは、この組成物において使用されるエンテロトキシンは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２またはその混合物である。免疫原性組成物の投与は、好ましくは、経口投与を介する。
【００５０】
（実施例）
（実施例１：）
（１．１．１  使用されるインフルエンザ抗原）
精製された多価Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７（Ｈ１Ｎ１）ウイルス成分インフルエンザ抗原は、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｓｉｅｎａ．Ｉｔａｌｙによって提供された。投薬は、以前に記載のように（Ｊｏｈａｎｎｓｅｎ  Ｒ．ら（１９８５）Ｖａｃｃｉｎｅ  ３：２３５−２４０）、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）によってアッセイした場合のＨＡ含量に基づいた。ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２は、以前に記載のように（Ｐｉｚｚａ  Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：５１−６０）調製した。野生型ＬＴ（ｗｔＬＴ）は、Ｓｉｇｍａから得た（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシン、凍結乾燥粉末、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ．ＵＳＡ）。全ての免疫原性調製物を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に処方した。ｉ．ｇ．投与のために調製した免疫原は、１．５％ｗ／ｗの重炭酸ナトリウムを含んだ。
【００５１】
（１．２．１  免疫およびサンプル収集）
１０匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のグループ（６〜１０週齢）を、表１、２および３に従って免疫した。マウスを、各免疫の前に１２時間絶食させた。免疫は、１ｍｇシリンジに繋いだ２０ゲージのステンレス鋼供給針を使用して、後大腿筋へのｉ．ｍ．（５０μｌ）注射または胃への直接的ｉ．ｇ．（２００μｌ）のいずれかによって行った。動物を、免疫の間に麻酔しなかった。血液サンプルの収集を、イソフロリン（ｉｓｏｆｌｕｏｒｉｎｅ）ガスを使用する軽度の麻酔後に、マイクロヘマトクリットチューブを使用して、眼窩洞穿刺によって行った。血清を、標準的な方法を使用して血液から分離した。唾液洗浄液（ＳＷ）サンプルを、０．２×３．２ｃｍのセルロース吸着剤ウィック（ｗｉｃｋ）（Ａｍｅｒｉｃａ  Ｆｉｌｔｒｏｎａ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ．ＶＡ）の一端を、各々の免疫していないマウスの口に１〜２分間配置し、唾液を吸着させることによって収集した。次いで、抗体を、アッセイ前に、ＰＢＳ（４００μｌ）中に溶出した。鼻内洗浄液サンプル（ＮＷ）を、塩酸ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）の混合物で最初に動物を麻酔することによって収集した。動物を、頭をわずかに下方に傾けて、背側横臥位に保持しながら、ＰＢＳ（６００μｌ）を、小さいシリンジに連結したカテーテルを使用して鼻腔に挿入した。洗浄液を、小さいチューブへの自然の（重力による）流れによって収集した。血清および分泌サンプルを、アッセイまでに凍結（−７０℃）保存した。
【００５２】
（１．２．２  ｉ．ｇ．免疫後の抗体応答に対するエンテロトキシン型および用量の効果）
用量範囲研究を、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡでのｉ．ｇ．免疫についてのＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２に対する用量応答関係を決定するために実施した。１０匹のマウスの群を、表１に記載されるように、ｗｔＬＴ、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の３つの用量レベルと組合せた２０μｇのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを用いるｉ．ｇ．経路によって免疫した。ｗｔＬＴで補助されたＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３を受けた群、および補助されていないＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡ（ＨＡのみ）を受けた群を、比較の目的のために含んだ。
【００５３】
【表１】
0004889175.tif 000002
これらの結果を、図１および図２に示す。
【００５４】
（１．２．３  ＬＴ−Ｒ７２の２つの用量レベルでの抗体応答に対するＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡ用量の効果）
第二の用量範囲研究を、ＬＴ−Ｒ７２で補助された場合のｉ．ｇ．免疫についてのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡの最適用量を決定するために実施した。１０匹のマウスの群を、表２に記載されるように、１０μｇまたは１００μＧのいずれかのＬＴ−Ｒ７２と組合せた３つの用量レベルのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを用いるｉ．ｇ．経路によって免疫した。補助されていないＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡコントロール群（ＨＡのみ）を受けた群を、比較の目的のために含んだ。
【００５５】
【表２】
0004889175.tif 000003
これらの結果を、図３および４に示す。
【００５６】
（１．２．４  ｉ．ｇ．およびｉ．ｍ．免疫の比較）
Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡ単独で、またはＬＴと組合せたＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡのいずれかでｉ．ｇ．免疫されたマウスの血清抗体応答を、ｉ．ｍ．経路によって、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡで免疫されたマウスと比較した。１０匹のマウスの群を、表３に記載されるように、２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡ単独で、または２つの用量レベルのｗｔＬＴ、ＬＴ−Ｋ６３またはＬＴ−Ｒ７２と組合せた２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡのいずれかを用いて、ｉ．ｇ．経路によって免疫した。ｉ．ｍ．経路によって１μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡを受けた群を、比較の目的のために含んだ。
【００５７】
【表３】
0004889175.tif 000004
これらの結果を、図５、６および７に示す。
【００５８】
（１．３．１  抗体ＥＬＩＳＡ）
個々の動物からの血清サンプルを、コーティング抗原として適切なＡ／Ｂｅｊｉｎｇ８−９／９３またはＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７を用いて以前記載されたように、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンベースの比色定量酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、総抗ＨＡ  Ｉｇ（ＩｇＧおよびＩｇＡおよびＩｇＭ）力価に関してアッセイした（Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９８８．５５３−６１２頁）。Ａ４９０を、標準的なＥＬＩＳＡ読取装置を用いて測定した。この力価は、０．５のＡ４９０を与える相互血清希釈を表し、そして並行でアッセイした血清標準物質に対して正規化した。個々の動物からのＳＷおよびＮＷサンプルを、コーティング抗原として適切なＡ／Ｂｅｊｉｎｇ８−９／９３またはＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７を用いて以前に記載されたように、生物発光イムノソルベントアッセイを用いて、ＨＡ特異的ＩｇＡ力価に関してアッセイした（Ｕｇｏｚｚｏｌｉ  Ｍ．ら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：５６３−５７１）。ヤギ抗マウスＩｇＡビオチン結合体（ＥＹ  Ｌａｂｓ、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）を使用して、交差反応性を減少するために精製マウスＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて前飽和させた。定量は、３ｓに対して積分された総発光を表す相対的な光単位数（任意の単位）に基づいた。力価は、平均のバックグラウンドを越えた、少なくとも２つの標準的な偏差におけるカットオフ値に対する相対的な光単位のログから直線的に外挿したログの希釈値を表す。
【００５９】
（１．３．２  胃内投与後の血清抗体応答）
血清抗体応答（図１）は、試験するエンテロトキシンのいずれかと組合わせてＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを受けた動物の大部分の場合で、未アジュバントのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを受けた動物に比較して、有意に高かった。図１は、表１に示すように、単独（ＨＡのみ）またはエンテロトキシンと組合わせてかのいずれかで、２０μｇ用量のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡ抗原を用いて免疫したマウスの血清中での、平均抗Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡ抗体力価を示す。星印は、その値が、ＨＡのみの群の値よりも有意に高かった群（Ｐ≦０．０５）を示す。用量応答は、明確に示されなかったが、１０μｇおよび１００μｇのＬＴ−Ｒ７２と組合わせてＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを受けた群は、ｗｔＬＴと組合わせてＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを受けた群の血清抗体応答に対して比較可能であることを、見出した。１つの群（１００μｇ  ＬＴ−Ｋ６３の用量レベルにおける群７）のみが、強いアジュバント効果を示さなかった。
【００６０】
より明確なアジュバント用量応答を、抗原特異的な唾液ＩｇＡ応答に見出した（図２）。図２は、表１に示すように、単独（ＨＡのみ）またはエンテロトキシンと組合わせてかのいずれかで、２０μｇ用量のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡ抗原を用いて免疫したマウス群の、平均抗Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡ  ＳＷ  ＩｇＡ抗体力価を示す。星印は、その値が、ＨＡのみの群の値よりも有意に高かった群（Ｐ≦０．０５）を示す。有意により強い唾液ＩｇＡ応答を、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡ単独を受けた動物に比較して、１つのＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２アジュバント群以外の全てに対して示した。さらに、１００μｇのＬＴ−Ｒ７２と組合わせて２０μｇ  Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを胃内投与した動物は、１０μｇまたは２５μｇのｗｔＬＴのいずれかを用いて胃内投与した動物よりも、有意に高い（Ｐ≦０．０５）抗原特異的唾液ＩｇＡ応答を有することを見出した。
【００６１】
（１．３．３  胃内投与後の抗原特異的ＳＷ  ＩｇＡ応答に対するエンテロトキシン用量の比較）
抗原特異的血清抗体応答（図３）は、この動物を免疫したＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３の用量レベルおよびＬＴ−Ｒ７２の用量レベルに関する、用量応答傾向を示す。図３は、表２に示すように単独で投与した（ＨＡのみ）２０μｇ  ＨＡに対して比較した場合、１０μｇまたは１００μｇのいずれかのＬＴ−Ｒ７２と組合わせた１、５、または２０μｇ用量のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡで免疫したマウス血清中の、平均抗Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡ抗体力価を示す。星印は、その値が、ＨＡのみの群の値よりも有意に異なる群（Ｐ≦０．０５）を示す。血清抗体は、未アジュバントのコントロール群と比較した場合、１０μｇまたは１００μｇのいずれかのＬＴ−Ｒ７２と組合わせて２０μｇ用量のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを用いて胃内で免疫した動物において有意により高かった（Ｐ≦０．０５）。試験した最も高い用量レベルを受けた群（１００μｇ  ＬＴ−Ｒ７２と組合わせた２０μｇのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３）は、試験した全ての他の群よりも、有意により高い（Ｐ≦０．０５）抗原特異的血清抗体応答を有した。
【００６２】
抗原特異的唾液ＩｇＡ応答（図４）は、１０μｇ  ＬＴ−Ｒ７２と組合わせて１μｇのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３を受けた群（群１２）を例外として、血清抗体応答で見出した傾向と一致した。図４は、表２に示すように単独で投与される（ＨＡのみ）２０μｇ  ＨＡと比較した場合、１０μｇまたは１００μｇのいずれかのＬＴ−Ｒ７２と組合わせて、１、５、または２０μｇ用量のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを用いて免疫したマウス群の、平均抗Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡ  ＳＷ  ＩｇＡ抗体力価を示す。星印は、その値が、ＨＡのみの群の値よりも有意に高かった群（Ｐ≦０．０５）を示す。１００μｇのＬＴ−Ｒ７２と組合わせて５μｇまたは２０μｇいずれかのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを受けた動物は、未アジュバントのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３  ＨＡを受けた動物と比較して、有意ににより高い（Ｐ≦０．０５）抗原特異的唾液ＩｇＡ応答を示した。
【００６３】
（１．３．４  抗原特異的血清の抗体応答におけるｉ．ｍ．およびｉ．ｇ．投与の効果の比較）
血清での抗原特異的な抗体応答（図５）は、ＬＴで補助した２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡでｉ．ｇ．免疫化したマウスについて、ｉ．ｍ．免疫化したマウスと比較して等価または高かった。図５は、表３に示されるように免疫化されたマウスの血清における、抗Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡ抗体の平均力価を示す。アスタリスクは、ｉ．ｍ．免疫化されたグループの値よりも有意に異なる（Ｐ≦０．０５）値のグループを示す。２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡ非補助（ＨＡのみ）または１０μｇのＬＴ−Ｋ６３との組み合わせのいずれかでｉ．ｇ．免疫したマウスは、血清での抗原特異的な抗体応答において、ｉ．ｍ．経路で免疫化したマウスと比較して有意に低かった（Ｐ≦０．０５）が、それにもかかわらず１０μｇのＬＴ−Ｋ６３の存在下でのｉ．ｇ．免疫化は、非補助のＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡを用いるｉ．ｇ．免疫化よりも１ログ（ｌｏｇ）高い抗体応答を生じた。１００μｇのＬＴ−Ｒ７２と組み合わせて２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡを用いてｉ．ｇ．免疫化したマウスは、ｉ．ｍ．免疫化で見出される応答よりも有意に（Ｐ≦０．０５）高い血清での免疫特異的抗体応答を生じた。
【００６４】
（１．３．５  抗原特異的ＮＷ  ＩｇＡ抗体応答に対する、ｉ．ｍ．およびｉ．ｇ．投与の効果の比較）
図７は、抗原特異的ＮＷ  ＩｇＡ抗体応答に対する、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡのｉ．ｍ．およびｉ．ｇ．投与の効果の比較を示す。表３に示されるように免疫されたマウスの、抗Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡ  ＮＷ  ＩｇＡ抗体の平均力価が示される。アスタリスクは、ｉ．ｍ．免疫化グループの値よりも有意に高い（Ｐ≦０．０５）値のグループを示す。抗原特異的ＮＷ  ＩｇＡ応答は、ｗｔＬＴ．ＬＴ−Ｋ６３．またはＬＴ−Ｒ７２のいずれかと組み合わせた２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡを用いてｉ．ｇ．免疫化したマウスにおいてのみ有意であることが見出された。ｉ．ｍ．免疫化、または２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡ単独でのｉ．ｇ．によって免疫化したマウスは、有意な抗原特異的ＮＷ  ＩｇＡ応答を生じなかった。エンテロトキシンの用量レベルまたは型の結果として、抗原特異的ＩｇＡ応答における有意な差異は見出されなかった。
【００６５】
（１．４．１  ＨＩアッセイ）
グループ毎にプールした血清サンプルを、Ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）によって標準的ＥＬＩＳＡを使用して、赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価についてアッセイした。このＨＩアッセイは、ＨＡ抗原の存在下でヤギの赤血球の凝集を阻害するサンプル血清の能力に基づく。得られた力価は、完全な阻害のために必要とされる相互希釈として表される（Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒ  Ｊ．Ｃ．およびＭ．Ｔ．Ｓｕｇｇｓ（１９６９）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：８１６−８２３；Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒ  Ｊ．Ｃ．ら（１９６９）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：８２４−３３）。
【００６６】
（１．４．２  血清のＨＩ力価に対するｉ．ｍ．およびｉ．ｇ．投与の効果の比較）
図６は、血清のＨＩ力価に対する、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡのｉ．ｍ．およびｉ．ｇ．投与の効果の比較を示す。このデータは、表３で示されるように免疫されたマウスのグループ由来のプールされた血清について示す。１０μｇのｗｔＬＴ．または１００μｇのＬＴ−Ｒ７２のいずれかと組み合わせて、２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡでｉ．ｇ．免疫したマウスについての血清のＨＩ力価は、効力について、ｉ．ｍ．免疫されたマウスに匹敵した。１μｇのｗｔＬＴ．１０μｇのＬＴ−Ｒ７９．または１００μｇのＬＴ−Ｋ６３のいずれかと組み合わせて、２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡを用いてｉ．ｇ．免疫化したマウスは、適度なＨＩ力価レベルを生じた。有意なＨＩ力価は、単独または１０μｇのＬＴ−Ｋ６３と組み合わせてかのいずれかで、２０μｇのＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡを用いてｉ．ｇ．免疫化したマウスについては示されなかった。
【００６７】
（１．５．１  統計値）
個々の動物由来の、ログ抗Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ８−９／９３および抗Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７  ＨＡ血清Ｉｇ、唾液ＩｇＡ、ならびに鼻ＩｇＡの力価を、Ｆｉｓｈｅｒ最小有意差手順（ｌｅａｓｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｈ．Ｐ．ら（１９８０）Ａｍ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎ  ３４：１９５−１９９）を使用して分析した。比較の間隔は、重複していない棒が平均間の５％よりも大きな統計学的有意性（Ｐ≦０．０５）を意味するように示された。
【００６８】
上記の実験は、ｉ．ｇ．免疫化を使用し、そして変異体ＬＴ（これは、有意に減少し（ＬＴ−Ｒ７２）、そして測定できないレベル（ＬＴ−Ｋ６３）のＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示す）で補助してインフルエンザＨＡ抗原をマウス中に誘導する場合に、強力な抗原特異的血清抗体およびウイルス中和力価（ＨＩ力価によって示される）が、ｉ．ｍ．ＩｇＡ応答に匹敵するか、またはこれよりも強いことを実証する（Ｇｉｕｌｉａｎｉ  Ｍ．Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１１２３−１１３２）。
【００６９】
上記の実施例は本発明の例示であるが、添付の特許請求の範囲において規定される本発明の範囲を限定するようには意図されない。当業者は、本明細書中に記載される組成物およびプロセスの利点を容易に理解し、そして本発明が適用され得る方法を理解する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、胃内（ｉ．ｇ．）投与後の免疫原特異的血清抗体応答に際する、エンテロトキシン用量の比較を示す。
【図２】  図２は、胃内投与後の抗原特異的唾液洗浄物（ＳＷ）ＩｇＡ応答に際する、エンテロトキシン用量の比較を示す。
【図３】  図３は、胃内投与後の抗原特異的血清抗体応答に際する、ＨＡ用量の比較を示す。
【図４】  図４は、胃内投与後の抗原特異的唾液洗浄物（ＳＷ）ＩｇＡ応答に際する、ＨＡ用量の比較を示す。
【図５】  図５は、抗原特異的血清抗体応答に対する、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７ＨＡの筋肉内投与および胃内投与の効果の比較を示す。
【図６】  図６は、血清ＨＩ力価に対する、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７ＨＡの筋肉内投与および胃内投与の効果の比較を示す。
【図７】  図７は、抗原特異的鼻洗浄物（ＮＷ）ＩｇＡ抗体応答に対する、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９７ＨＡの筋肉内投与および胃内投与の効果の比較を示す。
【図１】
0004889175.tif 000005
【図２】
0004889175.tif 000006
【図３】
0004889175.tif 000007
【図４】
0004889175.tif 000008
【図５】
0004889175.tif 000009
【図６】
0004889175.tif 000010
【図７】
0004889175.tif 000011