(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質を主膜材として含む脂質二重膜で形成され、外表面のみが親水性高分子を含む表面修飾剤で修飾されてなるリポソームに、リポソームの内水相と外水相との間にイオン勾配を用いて、イリノテカンおよび／またはその塩を、少なくとも０.１mol／mol（薬剤mol／膜総脂質mol）の濃度で内封したイリノテカン製剤。
【請求項２】
前記イオン勾配がプロトン濃度勾配であり、前記内水相側ｐＨが外水相側ｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ請求項１に記載のイリノテカン製剤。
【請求項３】
前記ｐＨ勾配が、アンモニウムイオン濃度勾配および／またはプロトン化しうるアミノ基を有する有機化合物の濃度勾配により形成される請求項２に記載のイリノテカン製剤。
【請求項４】
前記リポソームが、前記リン脂質以外の脂質および／または表面修飾剤をさらに含む請求項１〜３のいずれかに記載のイリノテカン製剤。
【請求項５】
前記表面修飾剤として、塩基性官能基を有する化合物を含む請求項４に記載のイリノテカン製剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のイリノテカン製剤を含有する医薬組成物。
【請求項７】
リン脂質を主膜材として含む脂質二重膜でリポソームを形成し、次にリポソームの外表面のみを親水性高分子を含む表面修飾剤で修飾した後、リポソームの内水相と外水相との間にイオン勾配を用いて、イリノテカンおよび／またはその塩を、少なくとも０.１mol／mol（薬剤mol／膜総脂質mol）の濃度で内封するイリノテカン製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、閉鎖小胞担体にイリノテカンおよび／またはその塩を高担持したイリノテカン製剤およびこれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療に用いられる医薬品のカテゴリーの一つに、トポイソメラーゼ阻害剤があり、その例にカンプトテシン（camptothecin）がある。カンプトテシンは、１９６６年に米国のWallらによって中国原産の植物：喜樹（Camptotheca acuminata）から抽出・単離された５環状アルカロイドであり、高い抗腫瘍活性と広い抗腫瘍スペクトルを有することが見出された（非特許文献１参照）。従来の癌化学療法剤がII型トポイソメラーゼ阻害により抗腫瘍活性を発現するのに対し、カンプトテシンは、Ｉ型トポイソメラーゼを阻害することにより、ＤＮＡの複製、修復、遺伝子組換えおよび転写で役割を演じるトポイソメラーゼ酵素の作用を阻害する。【０００３】
カンプトテシンは、薬剤として使用するに際していくつかの問題を有しており、そのうち水不溶性については、これを改良した水溶性カンプトテシン類縁化合物がいくつか提案されている（たとえば特許文献１参照）。中でも１９９４年、日本国内で市販に至ったカンプトテシンの水溶性誘導体である塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）は、プロドラッグであるが、高い抗腫瘍活性を示すため医療分野において大きな期待がもたれた。プロドラッグである塩酸イリノテカンは投与後に活性本体であるＳＮ−３８に代謝され、抗腫瘍活性を示す。【０００４】
一方、イリノテカンおよびその塩は、その投与により、骨髄機能抑制、胃腸障害などの重大な副作用を発現するため、その使用には厳重な制限が加えられている。さらにカンプトテシンおよびその類縁化合物に特有の水性環境における感受性により、そのα-ヒドロキシラクトン環が加水分解されてしまい、抗腫瘍活性が減弱してしまうという問題がある。【０００５】
これらの問題を解決し、カンプトテシン類縁化合物を細胞周期特異的代謝拮抗物質を用いて最適の抗癌治療を行うには、長期間にわたって薬剤の局所濃度を維持することが必要である。しかし、このような薬剤は静脈内又は皮下投与後の半減期が数時間と短いという事実がある。これらの薬剤は、治療的濃度の医薬を送達するのに使用できる制御放出製剤が有用である。安定的にかつ効率よく目的病巣部位に送達し、目的病巣部位おいて抗腫瘍活性を示すための一つのアプローチとして、閉鎖小胞形態の担体への担持が考えられる。カンプトテシン類のリポソーム製剤化は、すでにいくつか提案されており、たとえばカンプトテシンをリポソーム膜中に含有させることで、α-ヒドロキシラクトン環の加水分解を抑えることが報告されている（たとえば特許文献２、非特許文献２など参照）。また塩酸イリノテカンの活性本体であるＳＮ−３８そのものをリポソームの膜中に含有させる方法が開示されている（非特許文献３、非特許文献４など参照）。しかしながら、ＳＮ−３８のリポソーム膜中での安定化は困難であり、血液中で速やかに消失してしまうことから、ＳＮ−３８の血漿中濃度を長時間維持することは困難である。
水溶性誘導体である塩酸イリノテカンを受動的封入方法によりリポソーム中に閉じ込め、その脂質二重膜に静電的に固定化して安定化する常習的方法（Passive loading法）で製造した例も報告されている（非特許文献５参照）。【０００６】
【特許文献１】特公平３−４０７７号公報
【特許文献２】特表平９−５０４５１７号公報
【非特許文献１】Am.Chem.Soc.,94（1966）,388
【非特許文献２】Tomas G. Burkeら、Biochemistry,32（1993）,5352-5364
【非特許文献３】W. Gaoら、J. of Chromatography B,791（2003）,85-92
【非特許文献４】Joshua Williamsら、J. of Controlled Release,91（2003）,167-172
【非特許文献５】Yasuyuki Sazukaら、Cancer Letter 127（1998）,99-106
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような従来報告されている塩酸イリノテカンの封入方法（Passive loading法）によりリポソーム中に取り込める塩酸イリノテカン量は、約０.０５（薬剤（mol）／総脂質（mol）であり、このような担持量では、塩酸イリノテカンの血漿中濃度ひいてはその活性代謝物である７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）の血漿中濃度を長時間維持することは困難であり、臨床効果にとって充分な濃度とはいえない。また、リポソーム化することで塩酸イリノテカンの血中滞留性の改善が見られたが、血中からの消失速度は依然速いという点からも活性代謝物であるＳＮ−３８の血漿中濃度を長時間維持することは困難である。
塩酸イリノテカンの活性代謝物であるＳＮ−３８の血漿中濃度を長時間維持することを目的に、プロドラッグであるイリノテカンおよび／またはその塩を、閉鎖小胞に、臨床的に適切・充分な封入量で内封し、かつα-ヒドロキシラクトン環の加水分解を抑えた状態で血液中に長期間存在し、活性代謝物であるＳＮ−３８の血漿中濃度を長時間維持しうる製剤は未だ存在しない。
このような状況に鑑みて、本発明は、臨床効果にとって充分な薬剤の封入量を達成した製剤として、閉鎖小胞に、イリノテカンおよび／またはその塩を、少なくとも０.０７（薬剤（mol）／総脂質（mol））の高担持量で内封し、塩酸イリノテカンの活性代謝物であるＳＮ−３８の血漿中濃度を長時間維持することが可能であるイリノテカン製剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成すべく検討したところ、イリノテカンおよび／またはその塩の閉鎖小胞への薬剤封入方法として特に、閉鎖小胞の内側／外側にイオン勾配を形成させて、閉鎖小胞の膜を透過させて薬剤を導入するイオン勾配によるRemote loading（遠隔装填）法を選択すれば、従来のPassive loading法では困難であった高濃度の封入が達成可能であるだけでなく、従来法で調製したリポソームに比べて血中滞留性が飛躍的に向上し、その結果として塩酸イリノテカンの活性代謝物であるＳＮ−３８の血漿中濃度を長時間維持することができるという知見を得た。さらに、Remote loading法を選択することで３７℃での製剤安定性、４℃での長期製剤安定性が飛躍的に向上するという知見を得た。これにより、臨床効果にとって充分な薬剤封入量である０.０７（薬剤（mol）／総脂質（mol））の高担持量で閉鎖小胞に内封したイリノテカン製剤を獲得できることが確認できた。このような濃度で閉鎖小胞内にイリノテカンおよび／またはその塩を内封し、塩酸イリノテカンの活性代謝物であるＳＮ−３８の血漿中濃度を長時間維持することができる製剤は報告されていない。したがって上記課題を解決するものとして、以下の本発明を提供する。【０００９】
（１）脂質膜で形成される閉鎖小胞に、イリノテカンおよび／またはその塩を、少なくとも０.０７mol／mol（薬剤mol／膜総脂質mol）の濃度で内封したイリノテカン製剤。
好ましい態様例において、イリノテカン製剤は、薬剤を少なくとも０.１mol薬剤／mol脂質より高い濃度で担持する。
本発明のイリノテカン製剤の平均粒子径は、好ましくは０.０２〜２５０μｍである。
本発明において、閉鎖小胞へのイリノテカンおよび／またはその塩の高濃度封入は、たとえば下記イオン勾配を利用する遠隔装填（Remote loading）により達成することができる。【００１０】
（２）前記イリノテカン製剤が、前記閉鎖小胞の内水相と外水相との間にイオン勾配を有する（１）に記載のイリノテカン製剤。上記イオン勾配により、イリノテカンおよび／またはその塩をイオン化した状態で前記濃度で閉鎖小胞内に保持することができる。
（３）前記イオン勾配がプロトン濃度勾配であり、前記内水相側ｐＨが外水相側ｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ（２）に記載のイリノテカン製剤。
（４）前記ｐＨ勾配が、アンモニウムイオン濃度勾配および／またはプロトン化しうるアミノ基を有する有機化合物の濃度勾配により形成される（３）に記載のイリノテカン製剤。たとえば、内水相側の上記アンモニウムイオン濃度が外水相側よりも高いことにより、内水相側ｐＨが外水相側ｐＨよりも低いｐＨ勾配を形成することができる。【００１１】
（５）前記閉鎖小胞が、リン脂質を主膜材として含む脂質二重膜で形成されるリポソームである（１）〜（４）のいずれかに記載のイリノテカン製剤。
上記（５）において、主膜材が相転移点５０℃以上のリン脂質である態様は好ましい。
リン脂質として、具体的に、水素添加されたリン脂質および／またはスフィンゴリン脂質が好ましく例示される。【００１２】
（６）前記リポソームは、前記リン脂質以外の脂質および／または表面修飾剤をさらに含むことができる。
他の脂質としては、コレステロールが好ましい。
表面修飾剤としては、親水性高分子誘導体が好ましく例示される。親水性高分子は、具体的に分子量５００〜１０,０００ダルトンのポリエチレングリコールが挙げられ、そのリン脂質またはコレステロール誘導体として導入されうる。
（７）表面修飾剤として親水性高分子誘導体を含む態様において、好ましくは、前記リポソームの外表面のみが親水性高分子で修飾されてなる（６）に記載のイリノテカン製剤。【００１３】
（８）上記（６）または（７）のイリノテカン製剤において、前記表面修飾剤として、塩基性官能基を有する化合物を含む態様も好ましい。
塩基性官能基を有する化合物としては、特に3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩が好ましく挙げられる。【００１４】
（９）上記（１）〜（８）のいずれかに記載のイリノテカン製剤を含有する医薬組成物。
（１０）予防および／または治療有効量の上記（１）〜（８）のいずれかのイリノテカン製剤を宿主に投与することからなる、疾患の予防および／または治療方法。
（１１）（１）〜（８）のいずれかのイリノテカン製剤を宿主に投与することからなる、有効量のイリノテカンおよび／またはその塩を宿主内で放出する方法。
（１２）（１）〜（８）のいずれかのイリノテカン製剤を宿主に投与することからなる、有効量のイリノテカンおよび／またはその塩を標的部位に暴露する方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明で提供するイリノテカン製剤は、イリノテカンおよび／またはその塩を少なくとも０.０７（薬剤（mol）／総脂質（mol））の担持量で内封し、薬剤を臨床効果にとって充分な高濃度で含む。また後述の実施例に示すように、本発明のイリノテカン製剤は、従来公知のイリノテカンリポソーム製剤に比べて血中滞留性が飛躍的に向上し、長期間血中に存在することができる。さらに３７℃での製剤安定性、４℃での長期製剤安定性が飛躍的に向上している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１で調製したＣＰＴ-１１製剤の３７℃での製剤加速安定性試験の結果（放出率）を示す図である。
【図２】実施例３で調製したＣＰＴ-１１製剤の３７℃での製剤加速安定性試験の結果（放出率）を示す図である。
【図３】実施例３で調製したＣＰＴ-１１製剤の３７℃での製剤加速安定性試験の結果（粒子径）を示す図である。
【図４】血中滞留性試験における注射後の採血時間における血漿（Plasma）中の塩酸イリノテカン濃度を示す図である。
【図５】ＣＰＴ−１１の封入効率（％）と開環体存在率（％）における外水相ｐＨの関係を示す図である。
【図６】本発明の実施例８で調製したＣＰＴ-１１製剤の抗腫瘍効果を推定腫瘍体積の経時変化で示す図である。
【図７】本発明の実施例８で調製したＣＰＴ-１１製剤の抗腫瘍効果を体重変化で示す図である。
【図８】実施例８におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中総ＣＰＴ-１１濃度推移を示す図である。
【図９】実施例８におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中遊離ＣＰＴ-１１濃度推移を示す図である。
【図１０】実施例８におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中ＳＮ-３８濃度推移を示す図である。
【図１１】実施例８におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中ＳＮ-３８Ｇ濃度推移を示す図である。
【図１２】実施例８で調製したＣＰＴ-１１製剤の血液毒性（リンパ球）を示す図である。
【図１３】実施例８で調製したＣＰＴ-１１製剤の血液毒性（好中球）を示す図である。
【図１４】実施例９で調製したＣＰＴ-１１製剤の抗腫瘍効果を推定腫瘍体積の経時変化で示す図である。
【図１５】実施例９で調製したＣＰＴ-１１製剤の抗腫瘍効果を体重変化で示す図である。
【図１６】実施例９におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中総ＣＰＴ-１１濃度推移を示す図である。
【図１７】実施例９におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中遊離ＣＰＴ-１１濃度推移を示す図である。
【図１８】実施例９におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中ＳＮ-３８濃度推移を示す図である。
【図１９】実施例９におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中ＳＮ-３８Ｇ濃度推移を示す図である。
【図２０】実施例１０におけるＣＰＴ-１１製剤の抗腫瘍効果を推定腫瘍体積の経時変化で示す図である。
【図２１】実施例１０におけるＣＰＴ-１１製剤の抗腫瘍効果を体重変化で示す図である。
【図２２】実施例１０におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中ＣＰＴ-１１濃度推移を示す図である。
【図２３】実施例１０におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中ＳＮ-３８濃度推移を示す図である。
【図２４】実施例１０におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における血漿中ＳＮ-３８Ｇ濃度推移を示す図である。
【図２５】実施例１０におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における腫瘍中ＣＰＴ-１１濃度推移を示す図である。
【図２６】実施例１０におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における腫瘍中ＳＮ-３８濃度推移を示す図である。
【図２７】実施例１０におけるＣＰＴ-１１製剤の薬物動態試験における腫瘍中ＳＮ-３８Ｇ濃度推移を示す図である。
【図２８】実施例１２におけるＣＰＴ-１１製剤の抗腫瘍効果を推定腫瘍体積の経時変化で示す図である。
【図２９】実施例１２におけるＣＰＴ-１１製剤の抗腫瘍効果を体重変化で示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
イリノテカン（irinotecan）は、化学名（＋）-（4S）-4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-9-［(4-ピペリジノ-ピペリジノ)カルボニルオキシ］-1Ｈ-ピラノ［3',4'：6,7］インドリジノ［1,2-ｂ］キノリン-3,14（4Ｈ,12Ｈ）-ジオンで表記されるカンプトテシン骨格を有する化合物である。イリノテカンおよび／またはその塩は、抗悪性腫瘍剤であり、下記のような塩酸塩（irinotecan・ＨＣｌ（hydrochloride））として用いられる水溶性物質である。本明細書において「イリノテカンおよび／またはその塩」を単に「イリノテカン」または「薬剤」と称することがある。また、イリノテカン塩酸塩を「塩酸イリノテカン」または「ＣＰＴ−１１」と称することがある。【００１８】
【化１】
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【００１９】
本発明では、上記イリノテカンおよび／またはその塩を、脂質膜で形成される閉鎖小胞（担体）に、０.０７mol／mol（薬剤mol／膜総脂質mol）以上の高担持量で内封したイリノテカン製剤を提供する。
閉鎖小胞は、薬剤を内封することのできる構造を有していれば特に限定されず、様々な形態をとることができるが、その内部に薬剤を高濃度封入することのできる潜在的機能を有する、リポソーム、リピッドマイクロスフェアおよびナノパーテイクルなどを利用することができる。これらのうちでも特に好ましい形態例は、リポソームである。
以下、本発明のイリノテカン製剤の担体が、特に好ましいリポソームである態様を例にとって主に説明する。【００２０】
リポソームは、リン脂質二重膜からなり、脂質の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生ずる膜により外界から隔てられた空間を形成する構造を有する閉鎖小胞であり、その小胞空間内に水相（内水相）を含む。リポソーム製剤は、このリポソームを担体とし、これに薬剤を担持させたものである。
「リン脂質」とは、生体膜の主要構成成分であり、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基とリン酸基より構成される親水性基のグループを持つ両親媒性物質である。リン脂質としては、フォスファチジルコリン（＝レシチン）、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジン酸、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、さらにスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質や、カルジオリピン等の天然あるいは合成のリン脂質もしくはこれらの誘導体、およびこれらを常法にしたがって水素添加したもの等を挙げることができる。以下、これらを含む意味で「リン脂質」をリン脂質類と称することもある。
これらのうちでも、水素添加大豆フォスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）などの水素添加されたリン脂質、スフィンゴミエリン（Sphingomyelin,ＳＭ）等が好ましい。
主膜材として、単一種のリン脂質を含んでいてもよく、複数種のリン脂質を含んでいてもよい。【００２１】
リポソームは、封入された薬剤が、保存時にあるいは血液などの生体中で容易に漏出しないようにするため、主膜材として相転移点が生体内温度（３５〜３７℃）より高いリン脂質を用いることが好適である。さらに、このようなリポソームを製造する場合には、生体温度より高い温度に晒される場合がある。すなわち、５０℃〜７０℃程度、例えば６０℃前後の温度条件下で製造されることがあり、熱によるリポソーム形成に対する影響が大きくなるので、これらの温度より高い相転移点を持つ主膜材を用いることが特に好ましい。具体的には、主膜材の相転移点は５０℃以上のリン脂質であることが好ましい。【００２２】
リポソームは、上記主膜材とともに他の膜成分を含んでいてもよい。たとえば、リン脂質以外の脂質もしくはその誘導体（以下、他の脂質類と称することもある）を含み、上記リン脂質とともに混合脂質による膜を形成することが好ましい。
「リン脂質以外の脂質」とは、分子内に長鎖アルキル基等より構成される疎水性基を有し、リン酸基を分子内に含まない脂質であり、特に限定されないがグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質および安定化剤として後述するコレステロールなどのステロール類等およびこれらの水素添加物などの誘導体を挙げることができる。コレステロール誘導体とは、シクロペンタノヒドロフェナントレン環を有するステロール類であり、具体例としては特に限定されないがコレステロールが挙げられる。
混合脂質は、他の脂質類のそれぞれ単一種含んでいてもよく、複数種含んでいてもよい。
イリノテカン製剤の血漿中での放出率はコレステロールの量で調節することが可能であり、放出率を低く抑えたい場合は０〜２０mol％の量で含むことが好ましく、逆に放出率を高くしたい場合は３０〜５０mol％で、好ましくは４０〜５０mol％の量で含む。【００２３】
本発明におけるリポソームは、上記膜構成脂質とともに、上記膜構造を保持しうるものであって、リポソームに含むことができる他の膜成分を、本発明の目的を損なわない範囲で含むことができる。他の膜成分としては、脂質の物性を変化させ担体の膜成分に所望の特性を付与するための表面修飾剤が挙げられる。表面修飾剤としては、特に限定されないが荷電物質、親水性高分子の誘導体、水溶性多糖類の誘導体などが挙げられる。【００２４】
荷電物質は、特に限定されないが、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基などの塩基性官能基を有する化合物、酸性官能基を有する化合物などが挙げられる。
塩基性化合物としては、特開昭６１−１６１２４６号に開示されたＤＯＴＭＡ、特表平５−５０８６２６号に開示されたＤＯＴＡＰ、特開平２−２９２２４６号に開示されたトランスフェクタム（Transfectam）、特開平４−１０８３９１号に開示されたＴＭＡＧ、国際公開第９７／４２１６６号に開示された3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩、ＤＯＳＰＡ、ＴｆｘＴＭ-５０、ＤＤＡＢ、ＤＣ-ＣＨＯＬ、ＤＭＲＩＥなどが挙げられる。
酸性官能基を有する化合物としては、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＭ３等のシアル酸を有するガングリオシド類、Ｎ-アシル-Ｌ-グルタミン等の酸性アミノ酸系界面活性剤などが挙げられる。【００２５】
上記荷電物質が、脂質に、塩基性官能基を有する化合物が結合した物質である場合には、カチオン化脂質と称される。カチオン化脂質の脂質部分はリポソームの脂質二重膜中に安定化され、塩基性官能基部分は担体の脂質二重層の膜表面上（外膜表面上および／または内膜表面上）に存在することができる。カチオン化脂質で膜を修飾することにより、リポソーム膜と細胞との接着性等を高めることができる。【００２６】
水溶性多糖類としては、特に限定されないが、たとえばグルクロン酸、シアル酸、デキストラン、プルラン、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどの水溶性多糖類などが挙げられる。水溶性多糖類の誘導体は、糖脂質などが挙げられる。【００２７】
親水性高分子としては、特に限定されないがポリエチレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸などが挙げられる。【００２８】
親水性高分子は、リポソームを修飾するための構造を有していることが好ましい。特に、親水性高分子鎖の一端に該構造を有していることが好ましい。すなわち、修飾に使用される親水性高分子は、親水性高分子の本体部分とリポソームを修飾するための構造部分とからなっていることが好ましい。該構造が脂質等の疎水性部分である場合は、該疎水性部分がリポソーム膜に挿入されるかたちで親水性高分子の本体部分がリポソーム外表面上から突出するように固定化され、該構造がリポソーム膜構成成分と共有結合しうる反応性官能基である場合は、リポソームの外表面に露出しているリン脂質等のリポソーム膜構成成分と共有結合することにより親水性高分子の本体部分がリポソーム外表面上から突出するように固定化される。
次に、親水性高分子本体と結合して親水性高分子−疎水性高分子化合物を形成せしめるために使用される疎水性化合物について以下に説明する。
当該疎水性化合物は、特に限定されない。例えば、疎水性の領域を有する化合物（疎水性化合物）を挙げることができる。疎水性化合物としては、例えば、後述する混合脂質を構成するリン脂質や、ステロール等の他の脂質類、あるいは、長鎖脂肪族アルコール、グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。中でも、リン脂質が好ましい態様の一つである。また、これらの疎水性化合物は反応性官能基を有してもよい。反応性官能基によって形成される結合としては共有結合が望ましく、具体的にはアミド結合、エステル結合、エーテル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合、などが挙げられるが特に限定されない。
上記リン脂質に含まれるアシル鎖は、飽和脂肪酸であることが望ましい。アシル鎖の鎖長は、Ｃ１４−Ｃ２０が望ましく、さらにはＣ１６−Ｃ１８であることが望ましい。アシル鎖としては、例えば、ジパルミトイル、ジステアロイル、パルミトイルステアロイルが挙げられる。
リン脂質は、特に制限されない。リン脂質としては、例えば、上記の親水性高分子と反応可能な官能基を有するものを使用することができる。このような親水性高分子と反応可能な官能基を有するリン脂質の具体例としては、アミノ基を有するフォスファチジルエタノールアミン、ヒドロキシ基を有するフォスファチジルグリセロール、カルボキシ基を有するフォスファチジルセリンが挙げられる。上記のフォスファチジルエタノールアミンを使用するのが好適な態様の1つである。
親水性高分子の脂質誘導体は、上記の親水性高分子と上記の脂質とからなる。上記の親水性高分子と上記の脂質との組み合わせは、特に限定されない。目的に応じて適宜組み合わせたものを使用することができる。例えば、リン脂質、ステロール等の他の脂質類、長鎖脂肪族アルコール、グリセリン脂肪酸エステルの中から選ばれる少なくとも１つと、ＰＥＧ、ＰＧ、ＰＰＧの中から選ばれる少なくとも１つとが結合した親水性高分子の誘導体が挙げられる。具体的には、ポリオキシプロピレンアルキルなどが挙げられ、特に、親水性高分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である場合において脂質としてリン脂質、コレステロールを選択するのが好適な態様のひとつである。このような組み合わせによるＰＥＧの脂質誘導体としては、例えば、ＰＥＧのリン脂質誘導体またはＰＥＧのコレステロール誘導体が挙げられる。
親水性高分子の脂質誘導体は、脂質の選択により、正電荷、負電荷、中性の選択が可能である。例えば、脂質としてＤＳＰＥを選択した場合、リン酸基の影響で負電荷を示す脂質誘導体となり、また脂質としてコレステロールを選択した場合、中性の脂質誘導体となる。脂質は、その目的に応じ、選択することが可能である。
ＰＥＧの分子量は、特に限定されない。ＰＥＧの分子量は、通常、５００〜１０,０００ダルトンであり、好ましくは１,０００〜７,０００ダルトン、より好ましくは２,０００〜５,０００ダルトンである。
ＰＧの分子量は、特に限定されない。ＰＧの分子量は、通常１００〜１００００ダルトンであり、好ましくは２００〜７０００ダルトン、より好ましくは４００〜５０００ダルトンである。
ＰＰＧの分子量は、特に限定されない。ＰＰＧの分子量は、通常１００〜１０,０００ダルトンであり、好ましくは２００〜７,０００ダルトン、より好ましくは１,０００〜５,０００ダルトンである。
これらの中でも、ＰＥＧのリン脂質誘導体が好ましい態様の一つとして挙げられる。ＰＥＧのリン脂質誘導体としては、例えば、ポリエチレングリコール−ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＤＳＰＥ）が挙げられる。ＰＥＧ-ＤＳＰＥは、汎用の化合物であり入手容易であることから好ましい。
上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
このような親水性高分子の脂質誘導体は、従来公知の方法によって製造することができる。親水性高分子の脂質誘導体の一例であるＰＥＧのリン脂質誘導体を合成する方法としては、例えば、ＰＥＧに対し反応可能な官能基を有するリン脂質と、ＰＥＧとを、触媒を用いて反応させる方法が挙げられる。当該触媒としては、例えば、塩化シアヌル、カルボジイミド、酸無水物、グルタルアルデヒドが挙げられる。このような反応により、前記官能基とＰＥＧとを共有結合させてＰＥＧのリン脂質誘導体を得ることができる。
このような親水性高分子の脂質誘導体を用いて表面修飾されたリポソームは、血漿中のオプソニンタンパク質等が当該リポソームの表面へ吸着するのを防止して当該リポソームの血中安定性を高め、ＲＥＳでの捕捉を回避することが可能となり、薬物の送達目的とする組織や細胞への送達性を高めることができる。【００２９】
上記親水性高分子脂質誘導体による膜脂質（総脂質）の修飾率は、膜脂質に対する比率で、通常０.１〜２０mol％、好ましくは０.１〜５mol％、より好ましくは０.５〜５mol％とすることができる。
なお本発明において、「総脂質」とは、膜を構成する脂質のうちから親水性高分子脂質誘導体を除いた総脂質をいい、具体的に、リン脂質類および他の脂質類（コレステロールを含む）、さらに親水性高分子脂質誘導体以外の表面修飾剤を含む場合にはこの表面修飾剤も含むが、親水性高分子脂質誘導体中に含まれるフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）などのリン脂質、コレステロールなどは含まない。【００３０】
本発明において、上記のようなリポソームの親水性高分子脂質誘導体（ＰＥＧ-ＰＥ）による膜修飾は、脂質二重膜の内／外双方に親水性高分子（ＰＥＧ）を分布させてもよく、外膜側に選択的に分布させてもよい。具体的には、後述するリポソーム製剤の調製時に、リポソーム形成脂質とＰＥＧ-ＰＥとを予め均一に混合してリポソームを形成させてもよく（先導入）、ＰＥＧ-ＰＥを含まないリポソーム形成脂質を混合して得られた混合脂質を用いて常法によりリポソームを形成させた後にＰＥＧ-ＰＥを導入してもよい（後導入）が、特に脂質二重膜の未修飾リポソームを形成した後に、外部より親水性高分子で膜表面を修飾（後導入）して、脂質二重膜の外膜のみを選択的に表面修飾したリポソームが好ましい。この際、親水性高分子の導入ための修飾剤として、親水性高分子脂質誘導体を用いると、親水性高分子部分が外方に向かって突出した状態で、疎水性部分である脂質部分がリポソームの脂質二重膜中に入り込み安定して保持されるので、リポソームの脂質二重膜の外膜表面上に、脂質に結合した親水性高分子を存在させ、分布させることができる。【００３１】
リポソーム形成工程後のリポソームは、温度、時間に依存して凝集などの不安定化が起こる。この不安定化はリポソームの脂質組成に応じて異なることから、脂質組成ごとに温度、時間が異なることが知られている。脂質組成によって異なるこの不安定化を回避するために、リポソーム形成工程後に親水性高分子修飾工程を設定することが望ましい。【００３２】
親水性高分子添加工程における親水性高分子の添加の時期は、リポソーム形成工程直後から近いほど望ましい。具体的には１８０分以内であれば、膜成分や内封物への熱の影響が少ないので好ましく、より好ましくは１２０分以内であり、さらに好ましくは４５分以内であり、リポソーム形成工程直後であることが最も望ましい。より具体的には、リポソーム形成工程後のリポソーム分散液を親水性高分子溶液に直接投入してもよく、また、その逆で親水性高分子溶液をリポソーム形成工程後のリポソーム分散液に加える方法でも良い。またリポソーム分散液と親水性高分子溶液を同時に別の容器に移し、混合する方法でもよい。その際、濃度均一性及び温度均一化の観点から、スターラーなどで撹拌する工程をとることが望ましい。
親水性高分子修飾工程における親水性高分子添加後は、相転移温度以上で所定の時間、加温撹拌することが望ましい。加温撹拌する時間は０〜１２０分、好ましくは０〜６０分より好ましくは０〜４５分である。【００３３】
また上記とは別に、反応活性な官能基を持つリン脂質等の膜構成脂質を含有するリポソームを常法にて製造した後、リポソーム外液に片末端活性化ＰＥＧを添加して官能基を持つリン脂質等の膜構成脂質と結合させることにより、リポソームを製造することもできる。
またリポソームは、上記方法以外にも、上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる。この方法は、「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田、吉村ら；シュプリンガー・フェアラーク東京（1992））に具体的に記載されており、この記載を引用して本明細書の記載されているものとする。【００３４】
上記において、リポソームを所望のサイズにサイジングするために、いくつかの技術が利用可能である（G.Gregoriadis編「Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques」2nd edition, Vol.Ｉ-III、CRC Press）。この記載を引用して本明細書の記載されているものとする。【００３５】
リポソームの脂質二重膜構造は、ユニラメラ小胞（Small Unilamellar Vesicle，ＳＵＶ，Large Unilamellar Vesicle，ＬＵＶ）および複数枚からなる多重ラメラ小胞（Multilamellar Vesicle，ＭＬＶ）などの膜構造が知られている。
本発明に係るリポソームは、どの膜構造でもよいが、ユニラメラ小胞のリポソームが好ましく、具体的にＬＵＶリポソームが好ましい。
リポソーム分散液は、エクストルーダーを用いて、フィルターを複数回強制通過させることによりユニラメラ化することができる。通常、フィルターは、所望径より大径の孔径をもつもの、最後に所望径の得られるものの孔径の異なるものを２種以上使用する。このようにエクストルーダーを用いて孔径の異なるフィルターの通過回数を多くするほどユニラメラ化率が高くなり、実質的にユニラメラ小胞のリポソームとみなせるようになる。実質的にユニラメラ小胞のリポソームとは、具体的には、リポソーム製剤を構成する全担体（小胞）中、ユニラメラ小胞が占める割合が、存在比で全体の５０％以上であればよく、８０％以上であることが好ましい。【００３６】
上記のようなリポソームでは、その外膜表面の親水性高分子鎖はリポソーム外方に向かって分布しており、一方、脂質二重膜の内水相側内膜は表面修飾されていないため、内水相内には実質的に親水性高分子鎖が分布しない。このような分布構造であれば、内水相のｐＨが低くても、二重膜の内外膜の両側上に親水性高分子が分布するものに比して、膜の安定性を確保することができる。また二重膜の内外膜の両側上に分布するものに比して、全体量として少ない親水性高分子で血中安定性の効果を得ることができる。【００３７】
なお本発明において、「血中滞留性」とは担体を投与した宿主において、担体に内封された状態の薬剤が血液中に存在する性質を意味する。薬剤が担体から放出されると速やかに血中から消失し、薬剤が暴露した部位へ作用する。血中滞留性が良いとより少ない量の薬剤を投与することが可能である。【００３８】
本発明の担体は、球状またはそれに近い形態をとることができ、その粒子径（粒子外径の直径）は特に限定されないが、０.０２〜２５０μｍ、好ましくは０.０３〜０.４μｍ、より好ましくは０.０５〜０.２μｍが好ましい。粒子外径の直径とは、動的光散乱法により測定されるリポソーム製剤全粒子の直径の平均値であり、具体的にはZetasizer (Malvern Instruments 3000HS またはS ZEM 5002）を用いて測定することができる。【００３９】
本発明のイリノテカン製剤は、投与経路次第で医薬的に許容される安定化剤および／または酸化防止剤をさらに含むものであってもよい。安定化剤としては、特に限定されないがグリセロールまたはスクロースなどの糖類が挙げられる。酸化防止剤としては、特に限定されないがアスコルビン酸、尿酸あるいはトコフェロール同族体例えばビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。【００４０】
投与経路次第で医薬的に許容される添加物をさらに含むものであってもよい。このような添加物の例として、水、生理食塩水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される界面活性剤あるいは生体内で許容し得る生理的ｐＨの緩衝液などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。【００４１】
本発明では、これら添加物を含む態様のイリノテカン製剤を、医薬組成物として供することができる。本発明の医薬組成物は、通常の方法、たとえば０〜８℃での冷蔵あるいは１〜３０℃の室温で保存することができる。【００４２】
本発明におけるリポソームは、ＣＰＴ−１１を内封する形態をとる。ＣＰＴ−１１は、中性条件より高いｐＨ領域ではα-ヒドロキシラクトン環の加水分解が起こることが知られている。このため、本発明のリポソームは、ＣＰＴ−１１が脂質二重膜中に取り込まれているにせよ、内水相に取り込まれているにせよ、α-ヒドロキシラクトン環の加水分解を抑えるためにリポソームの内水相を酸性に保つ必要がある。
一般的に脂質は温度、ｐＨによって加水分解が起こることが知られている。特にＳｎ-１とＳｎ-２位における脂肪酸のカルボン酸エステルは、加水分解を受けやすく、リゾ脂質及び脂肪酸に分解することが知られており（Gritら，Chem.Phys.Lipids，64,3-18,1993）、このような分解物は従来の脂質膜組成を乱し、脂質膜の透過性が向上することによりリポソームの安定性が損なわれる。これらのことより、内水相を酸性に保つ場合、脂質の安定性の観点より、外水相のｐＨは中性付近が望ましい。
これらの相反する二つの条件が最も、厳しく制限される状況は薬物導入工程である。薬物導入工程は、脂質膜の相転移温度以上に加温する必要があり、脂質の加水分解を著しく促進する。脂質の加水分解を抑えるために、外水相のｐＨを中性付近に設定することが望ましいが、外水相のｐＨを中性付近に設定すると、ＣＰＴ−１１のα-ヒドロキシラクトン環の加水分解が促進されてしまう。これらの相反する二つの条件を鑑みると、薬物導入工程における外水相のｐＨは４.０〜８.０がよく、より好ましくは４.０〜７.０、さらに好ましくは５.０〜７.０である。【００４３】
本発明の高担持量イリノテカン製剤は、担体リポソームを形成した後、その膜内外のイオン勾配を利用して薬剤を導入する遠隔装填（Remote loading）と称される方法により達成することができる。Remote loading法は、適切な水性媒体に溶解された場合に、荷電状態で存在し得る慣用的薬剤に関して用い得る。リポソームの内側／外側にイオン勾配を形成することで、薬剤は形成された勾配に従いリポソーム膜を透過し薬剤を封入し得る。【００４４】
リポソーム膜を隔てて形成されるイオン勾配としてＮａ＋／Ｋ＋濃度勾配がある。Ｎａ＋／Ｋ＋濃度勾配に対するRemote loading法により予め形成されているリポソーム中に薬剤を添加する技術は、米国特許５０７７０５６号に記載されており、これを参照して行うことができる。なおこの記載を引用して本明細書に記載されているものとすることができる。【００４５】
本発明では、イオン勾配としてプロトン濃度勾配が好ましく挙げられ、リポソーム膜の内側（内水相）ｐＨが外側（外水相）ｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ態様が挙げられる。ｐＨ勾配は、具体的に、アンモニウムイオン濃度勾配および／またはプロトン化しうるアミノ基を有する有機化合物の濃度勾配などにより形成することができる。
アンモニウムイオン濃度勾配により、薬剤（イリノテカンまたはその塩）をリポソーム内に封入する方法の具体例としては、まず０.１〜０.３Ｍのアンモニウム塩を含有する水性緩衝液中で予めリポソームを形成し、外部媒体をアンモニウムイオンを含有していない媒質、例えばスクロース溶液と交換することでリポソーム膜の内／外にアンモニウムイオン勾配を形成する。内部アンモニウムイオンはアンモニアおよびプロトンにより平衡化し、アンモニアは脂質膜を透過して拡散することでリポソーム内部から消失する。アンモニアの消失に伴ってリポソーム内の平衡がプロトン生成の方向に連続的に移動する。その結果、リポソーム内にプロトンが蓄積され、リポソームの内側／外側にｐＨ勾配が形成される。このｐＨ勾配を有するリポソーム分散液に薬剤を添加することによって薬剤がリポソーム中に内封される。【００４６】
上記アンモニウムイオン濃度勾配を形成しうるアンモニウム塩は、特には限定されないが、硫酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、アンモニウムラクトビオネート、炭酸アンモニウム、酒石酸アンモニウムおよびシュウ酸アンモニウムなどが挙げられる。
なお、アンモニウムイオン濃度勾配に対するRemote loading法により予め形成されているリポソーム中に薬剤を導入する技術そのものは、米国特許５１９２５４９号に記載されており、これを参照して行うことができ、またこの記載を引用して本明細書に記載されているものとすることができる。【００４７】
プロトン化しうるアミノ基を有する有機化合物は、低分子量のものが望ましく、具体的にはメチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明において、アンモニウムイオン濃度勾配を用いたRemote loading法により、イリノテカンまたはその塩を内封する態様は好適である。【００４８】
本発明のイリノテカン製剤は、上記のような担体に、イリノテカンまたはその塩を０.０７mol／mol（薬剤mol／膜総脂質mol）、好ましくは０.１mol／molより高い濃度で内封してなる。
本発明において、「内封」とは、担体の内部に薬剤が封入された状態を意味する。また、担体の構成成分である脂質層内に一部または全ての部分が含まれている状態であってもよい。本発明の担体は、ゲルろ過、透析、膜分離および遠心分離等の通常用いられる方法で精製することにより、担体に内封されなかった薬剤を除去することができる。【００４９】
担体は内封されなかった薬剤を除去するための段階を経て供される。したがって、担体の内部と担体の外部とでは、脂質二重層を介して薬剤の濃度勾配が生じ得る。好ましくは、本発明の担体は調製後に脂質二重層の外部に内封されなかった薬剤を有さない。そして、担体に内封された薬剤を内部から外部環境へ放出する。本発明の担体は、薬剤を内封した状態で標的部位まで到達し、その結果内封する薬剤を標的部位まで送達する。薬剤の標的部位への送達は、担体に担持された薬剤を標的部位へ取りこませることであってもよいし、標的部位に取りこまれずとも薬剤の影響を標的部位またはその近傍へ及ぼすことであってもよい。【００５０】
また本発明において、「放出」とは、担体に内封された薬剤が担体を構成する脂質膜を通過することにより、または脂質膜の一部の構造が変わることにより閉鎖小胞の外部へ出てくることを意味する。血漿中において塩酸イリノテカンは活性代謝物であるＳＮ−３８へと代謝され、長時間高濃度で標的部位に暴露されることで強い抗腫瘍活性を示すことから放出を制御することが重要となる。イリノテカン製剤の血漿中での放出率はコレステロールの量で調節することが可能であり、コレステロール量を調節することで好ましい効果が期待される。「放出率」とは担体の構成成分と塩酸イリノテカンを担持した担体から閉鎖小胞の外部へ出てくる薬剤と、担体に担持された薬剤との比率（重量比またはmol比）をいう。「放出率が低い」とは単位時間あたりに閉鎖小胞の外部へ出てくる薬剤量が少ないことを意味する。【００５１】
本発明において、「標的部位」とは担体が内封する薬剤が放出されて作用する特定の部位であり、部位ごとに特定された細胞、組織、器官または臓器およびそれらの内部を意味する。細胞、組織、器官または臓器およびそれらの内部などの標的部位は薬剤による治療の対象となる部位であることができ、放出された薬剤が暴露することにより、その効果を発揮する。標的部位としては、特に限定されないが腫瘍が挙げられる。【００５２】
治療の対象となる腫瘍としては、特に限定されないが固形腫瘍であり、具体的には食道癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、喉頭癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌または卵巣癌が挙げられる。標的部位は、腫瘍の細胞、組織、器官または臓器およびそれらの内部などである。したがって、本発明において、疾患とは前記の腫瘍を意味し、薬剤はそれらに対し抗腫瘍効果を示すことが期待される。【００５３】
本発明において、「暴露」とは、担体の外部へ放出された薬剤が外部環境へ作用を及ぼすことを意味する。具体的には、放出された薬剤は標的部位に近接し、接触することによりその作用である抗腫瘍効果を発揮する。薬剤が標的部位に作用することにより、標的部位のＤＮＡ合成が行われている細胞周期にある細胞に局所的に作用し、期待された効果を示す。このような効果を示すために、担体からの薬剤の放出率と担体の血中滞留性との均衡を保つ必要がある。【００５４】
本発明の担体はイリノテカンおよび／またはその塩を好ましい放出速度にて放出し、さらに放出されたイリノテカンおよび／またはその塩は活性代謝物であるＳＮ−３８へと代謝される。本発明はＳＮ−３８が所望の標的部位に長時間暴露するために使用される。したがって、本発明において、宿主の疾患の予防および／または治療のため、有効量のイリノテカンおよび／またはその塩を内封する担体を宿主に投与することにより、宿主内で有効量のイリノテカンおよび／またはその塩を放出するため、または有効量のＳＮ−３８を標的部位に長時間高濃度で暴露するために、宿主（患者）に非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。投与対象の宿主としては、哺乳動物、好ましくはヒト、サル、ネズミ、家畜等が挙げられる。【００５５】
非経口的投与の経路としては、例えば点滴などの静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本発明の担体は、病気に既に悩まされる患者に、疾患の症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。例えば、担体に封入される薬剤の有効投与量は、一日につき体重１ｋｇあたり０.０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。しかしながら、本発明の担体はこれらの投与量に制限されるものではない。投与時期は、疾患が生じてから投与してもよいし、あるいは疾患の発症が予測される時に発症時の症状緩和のために予防的に投与してもよい。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。【００５６】
具体的な投与方法としては、医薬組成物をシリンジや点滴によって投与することができる。また、カテーテルを患者または宿主の体内、例えば管腔内、例えば血管内に挿入して、その先端を標的部位付近に導き、当該カテーテルを通して、所望の標的部位またはその近傍あるいは標的部位への血流が期待される部位から投与することも可能である。
実施例に示すように、本発明の担体について内封された薬剤の放出率を測定したところ、低い放出率が認められた。放出率は、本発明の担体を遠心にて沈降させ、上清に存在する薬剤の量と担体を測定することにより計算することができる。
【実施例】
【００５７】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例、試験例に限定されるものではない。
各例で調製された薬剤封入リポソームの各濃度および粒子径は、以下のように求めた。
・リン脂質濃度（ｍｇ／ｍＬ）：リン脂質定量キット（リン脂質Ｃテストワコー、和光純薬工業株式会社）を用いて定量されるリポソーム分散液中でのリン脂質（ＨＳＰＣ）濃度。
・総脂質濃度（mol／Ｌ）：上記リン脂質濃度から算出される膜構成成分である混合脂質の合計モル濃度（ｍＭ）。この総脂質中には、混合脂質として調製される表面修飾剤中の脂質成分は含むが、ＰＥＧを導入するためのＰＥＧ誘導体中の脂質（実施例では、ＰＥＧ-ＰＥ中のＰＥ（フォスファチジルエタノールアミン）またはＣｈｏｌ-ＰＥＧ中のＣｈｏｌ（コレステロール））は含まない。
・薬剤濃度（ｍｇ／ｍＬ）：上記で得られた製剤を生理食塩水４０倍に希釈した後、５０μＬとり、メタノール２ｍＬを加えた溶液について、励起波長：３６０ｎｍ、蛍光波長：４３５ｎｍでの蛍光強度を分光蛍光光度計で測定して求めた。内封された塩酸イリノテカン濃度を薬剤量（ｍｇ）／製剤全量（ｍＬ）で示す。
・薬剤担持量（薬剤／総脂質のモル比）：担体に内封された塩酸イリノテカン濃度を、上記総脂質濃度に対する上記薬剤濃度の比から、薬剤／総脂質のモル比で示す。
・粒子径（ｎｍ）：リポソーム分散液２０μＬを生理食塩水で３ｍＬに希釈し、Zetasizer3000ＨＳ (Malvern Instruments)で測定した平均粒子径である。【００５８】
以下に、使用した各成分の略称および分子量を示す。
ＨＳＰＣ：水素添加大豆フォスファチジルコリン（分子量７９０、リポイド（Lipoid）社製ＳＰＣ３）
Ｃｈｏｌ：コレステロール（分子量３８６.６５、ソルベイ（Solvay）社）
ＰＥＧ5000-ＰＥ：ポリエチレングリコール（分子量５０００）−フォスファチジルエタノールアミン（分子量５９３８、Genzyme社）
ＰＥＧ2000-ＰＥ：ポリエチレングリコール（分子量２０００)−フォスファチジルエタノールアミン（分子量：２７２５、日本油脂社）
ＰＥＧ1600-Ｃｈｏｌ：ポリエチレングリコール（分子量１６００)−コレステロール（分子量：１９８２、日本油脂社）
ＣＰＴ-１１：塩酸イリノテカン（分子量６７７.１９）
Ｒ-ＤＨＰＥ：ローダミンジヘキサデカノイルフォスファチジルエタノールアミン（分子量：１３３３.８１、Molecular Probes社）
ＴＲＸ-２０：3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（分子量６０９.４１、常興薬品）【００５９】
［実施例１］
塩酸イリノテカン高担持リポソーム製剤を達成しうる方法を確認するため、Remote Loading法（調製例１）またはPassive loading法（比較調製例１）により、高濃度薬剤の導入を試みた。導入方法が異なる以外は、いずれの塩酸イリノテカン担持リポソーム製剤（以下、ＣＰＴ-１１製剤）も、ＰＥＧ-ＰＥ（後導入）リポソームを担体とした。【００６０】
（調製例１）＜Remote Loading法＞
（１）混合脂質の調製：水素添加大豆フォスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）０.４２２ｇおよびコレステロール（Ｃｈｏｌ）０.１７６ｇを、６０℃で加温したｔ-ブタノール（関東化学株式会社）２５ｍＬに溶解した後氷冷し、凍結乾燥することでＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５４：４６（モル比）の混合脂質を調製した。【００６１】
（２）リポソームの作製：上記で調製した混合脂質０.５９８ｇに、２５０ｍＭ硫酸アンモニウム溶液１０ｍＬを加えて充分膨潤させ、ボルテックスミキサーにて撹拌し、６８℃でエクストルーダー（The Extruder Ｔ.10,Lipex biomembranes Inc.）に取り付けたフィルター（孔径０.２μｍ×５回、０.１μｍ×１０回、Whatman社）を順次通し、リポソーム分散液を調製した。【００６２】
（３）ＰＥＧ-ＰＥの導入：上記リポソーム分散液に、ポリエチレングリコール5000−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ5000-ＰＥ）の蒸留水溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）を１.２１ｍＬ（混合脂質の総脂質量の０.７５mol％に相当）加え、６０℃で３０分加温することによりＰＥＧ5000-ＰＥを導入した。
１０ｍＭ  ヒスチジン（Histidine）／１０％スクロース（Sucrose）溶液（ｐＨ６.０）で溶媒置換したゲルカラムにて外水相置換を行った。
リン脂質定量キットを用いて、ＨＳＰＣ濃度を定量した。ＨＳＰＣ濃度から総脂質量ｍＭを求めた。【００６３】
（４）薬剤の封入：１０ｍｇ／ｍＬ濃度の塩酸イリノテカン（ＣＰＴ-１１）／ＲＯ水（逆浸透膜浄水）溶液を調製した。
この塩酸イリノテカン溶液を、上記ＨＳＰＣ濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対し、ＣＰＴ-１１／ＨＳＰＣ＝０.２（ｗ／ｗ）となる量でリポソーム分散液に加え、６０℃で６０分撹拌を行い、塩酸イリノテカンを導入した。導入後のサンプルは氷冷した。塩酸イリノテカン封入後のリポソーム分散液を、１０ｍＭヒスチジン／１０％スクロース溶液（ｐＨ６.５）にて置換したゲルカラムにて未封入薬剤の除去を行った。
上記で得られたＣＰＴ-１１製剤の組成および粒子径を表１に示す。
本発明の高担持ＣＰＴ-１１製剤が得られた。【００６４】
（比較調製例１）＜Passive loading法＞
調製例１と同様の方法で調製した混合脂質（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５４：４６（モル比））０.２９９２ｇに、塩酸イリノテカン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ濃度のＣＰＴ-１１／１０％スクロース溶液）５ｍＬを加え、充分膨潤させた。ボルテックスミキサーにて撹拌し、調製例１と同様に６８℃でエクストルーダーに取り付けたフィルター（０.２μｍ×５回、０.１μｍ×１０回）を順次通し、塩酸イリノテカンを封入したリポソームを調製した。
このリポソームに、調製例１の（３）と同様にして、混合脂質の総脂質量の０.７５mol％に相当するＰＥＧ5000-ＰＥを０.６１ｍＬ加え、６０℃で３０分加温することによりＰＥＧ5000-ＰＥを導入し、次いで、１０ｍＭヒスチジン／１０％スクロース溶液（ｐＨ６.５）にて置換したゲルカラムにて未封入薬剤を除去した。
上記で得られたＣＰＴ-１１製剤の組成および粒子径を表１に示す。
調製例１と同じ薬剤量を用いて薬剤導入したが、Passive loading法では、高担持ＣＰＴ-１１製剤の獲得を達成できなかった。【００６５】
［実施例２］
Remote Loading法において、本発明の高担持ＣＰＴ-１１製剤を得るために必要な仕込み量を調べた。
（調製例２）
調製例１の（４）薬剤の封入において、（１）〜（３）と同様にして調製したＰＥＧ-ＰＥ後導入リポソーム分散液に加える１０ｍｇ／ｍＬのＣＰＴ-１１／ＲＯ水溶液の量を、ＣＰＴ-１１／ＨＳＰＣ（w/w）比で０.１、０.２、０.４、０.８となる量に変えた以外は、調製例１と同様にしてＣＰＴ-１１製剤を得た。得られたＣＰＴ-１１製剤の組成および粒子径を表１に示す。
表１に示すように、Remote Loading法では、薬剤仕込み量（薬剤／ＨＳＰＣの比）を上げることにより、臨床効果上充分な濃度の高担持ＣＰＴ-１１製剤の獲得が達成できた。【００６６】
【表１】
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【００６７】
（試験例１）３７℃での製剤加速安定性
実施例１で調製した各ＣＰＴ-１１製剤を３７℃で所定期間加温した。加温終了後のＣＰＴ-１１製剤に、生理食塩水を加えて２０倍希釈した後、超遠心（１×１０５ｇ、２時間、１０℃）し、ＣＰＴ-１１製剤（塩酸イリノテカンを封入しているリポソーム）を沈降させた。上清に存在する塩酸イリノテカン量の蛍光強度を測定することによって、ＣＰＴ-１１製剤からの塩酸イリノテカンの放出率（％）を算出した。結果を図１に示す。
比較調製例１で調製したＣＰＴ-１１製剤は、３７℃で７日間の加温において、塩酸イリノテカン放出率が約６０％を示すのに対し、調製例１のRemote loading法で調製したＣＰＴ-１１製剤は、３７℃で７日間の加温後もほとんど塩酸イリノテカンを放出していない。このことから、塩酸イリノテカンは、Remote loading法によりリポソームに封入することで、高担持でかつ製剤安定性に優れたＣＰＴ-１１製剤を調製することができることが明らかになった。【００６８】
（試験例２）３７℃での製剤安定性
実施例２で調製した各ＣＰＴ-１１製剤を３７℃で所定期間加温した。加温終了後のＣＰＴ-１１製剤について、試験例１と同様に塩酸イリノテカンの放出率を測定した。各ＣＰＴ-１１製剤は、３７℃で１４日間の加温後も放出率は１％以下であった。
このことから、Remote loading法により調製されたＣＰＴ-１１製剤の放出率は、薬剤担持量（薬剤／総脂質比）に大きく影響されず、きわめて高担持のＣＰＴ-１１製剤でも製剤安定性に優れていることが明らかになった。【００６９】
［実施例３］
調製例１と膜構成の異なるリポソームを担体として、ＣＰＴ-１１製剤を調製した。すなわち膜成分が以下に示す混合脂質からなるＰＥＧ-ＰＥ後導入リポソーム（調製例３）またはＰＥＧ-ＰＥ先導入リポソーム（参考調製例１）を用いて、調製例１と同様のRemote loading法により塩酸イリノテカン封入操作を行った。
（調製例３）
（１）混合脂質の調製：水素添加大豆フォスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を１.５３１７ｇ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）０.６４１９ｇ、およびローダミンジヘキサデカノイルフォスファチジルエタノールアミン（Ｒ-ＤＨＰＥ）０.００５ｇを、６０℃で加温したt-ブタノール５０ｍＬに溶解した後、氷冷し、凍結乾燥することでＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｒ-ＤＨＰＥ＝５４：４６：０.１（モル比）の混合脂質を調製した。【００７０】
（２）リポソームの作製：上記で調製した混合脂質を０.３７ｇ使用した以外は、調製例１と同様にして、２５０ｍＭ硫酸アンモニウム溶液１０ｍＬの添加、ボルテックスミキサーによる撹拌、エクストルーダーに取り付けたフィルター（０.２μｍ×５回、０.１μｍ×１０回）の通過を行うことによりリポソーム分散液を得た。
次いで、１０ｍＭヒスチジン／１０％スクロース溶液（ｐＨ６.０）で外水相置換を行った。【００７１】
（３）ＰＥＧ-ＰＥの導入：上記リポソーム分散液に、総脂質量の２.８mol％に相当するポリエチレングリコール2000−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ2000-ＰＥ）の蒸留水溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）を加え、６０℃で３０分加温することによりＰＥＧ2000-ＰＥを導入した。【００７２】
（４）調製例１の薬剤封入と同様にして、ＣＰＴ-１１／ＨＳＰＣ＝０.２（w/w）に必要な量の１０ｍｇ／ｍＬのＣＰＴ-１１／ＲＯ水溶液を、リポソーム分散液に加え、塩酸イリノテカンを導入した後、氷冷、次いで１０ｍＭヒスチジン／１０％スクロース溶液（ｐＨ６.５）にて未封入薬剤を除去した。得られたＣＰＴ-１１製剤を表２に示す。【００７３】
（参考調製例１）
調製例３の（３）で添加するＰＥＧ2000-ＰＥを、予め（２）において膜材料の混合脂質に添加し、ＰＥＧ-ＰＥが内外膜の両側に分布するリポソームを作製した以外は、調製例３と同様にしてＣＰＴ-１１製剤を調製した。以下のとおりである。
調製例３の（１）と同様に調製した混合脂質（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｒ-ＤＨＰＥ＝５４：４６：０.１（モル比））０.３７ｇおよび調製例３の倍量（５.６mol％）に相当するＰＥＧ2000-ＰＥ０.０９４ｇに、エタノール１ｍＬを加えて６５℃で３０分撹拌し、完全に溶解させた。
撹拌による完全溶解を確認後のエタノール溶液に、２５０ｍＭに調製した硫酸アンモニウム溶液１０ｍＬを加え、以降、調製例３の（２）と同様のボルテックスミキサーおよびエクストルーダー操作を行い、１０％スクロース溶液を用いて得られたリポソーム分散液の外水相置換を行った。【００７４】
調製例３の（４）と同様にして、ＣＰＴ-１１／ＨＳＰＣ量＝０.２（w/w）となるに必要な量の１０ｍｇ／ｍＬのＣＰＴ-１１／ＲＯ水溶液をリポソーム分散液に加え、塩酸イリノテカンを導入した。導入後、調製例３の（４）と同様にして、氷冷、未封入薬剤の除去を行った。得られたＣＰＴ-１１製剤を表２に示す。【００７５】
【表２】
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【００７６】
（試験例３）３７℃での製剤加速安定性
実施例３で調製した各ＣＰＴ-１１製剤を、３７℃で１ヶ月間加温する加速試験を行った。１週間ごとに加温したＣＰＴ-１１製剤を一部採取し、生理食塩水を加えて２０倍希釈した後、超遠心（１×１０５ｇ、２時間、１０℃）し、ＣＰＴ-１１製剤を沈降させた。上清に存在する塩酸イリノテカン量の蛍光強度を定量することによって、リポソームからの放出率（％）を算出した。結果を図２に示す。また加温したリポソーム分散液の粒子径を１週間ごとに測定した。結果を図３に示す。【００７７】
上記図２および図３から、調製例３で調製したリポソームは、３７℃で１ケ月後も薬剤を放出せず（図２）、粒子径はほぼ一定（図３）で製剤安定性に優れたリポソームであることが明らかになった。なお参考調製例１で調製したＰＥＧ-ＰＥ先導入リポソームは、３７℃で３週目に放出が始まり、４週目に非常に高い放出率を示し（図２）、また粒子径は３週目以降増大した（図３）ことから、３週目以降、膜の破壊が起きていることが示唆された。
これら結果から、本発明の高担持ＣＰＴ-１１製剤において、リポソーム形成後のＰＥＧ-ＰＥ添加によるＰＥＧ-ＰＥ後導入リポソームは、好適な形態であることが分かった。【００７８】
［実施例４］
本発明の高担持ＣＰＴ-１１製剤の長期保存安定性および血中安定性を試験するため、以下の調製例４〜５によりＣＰＴ-１１製剤を調製した。
（調製例４）
調製例１の（３）において、ＰＥＧ-ＰＥ後導入リポソームの分散液の外水相置換を１０ｍＭ  ＭＥＳ／１０％スクロース溶液（ｐＨ６.０）で置換したゲルカラムで行った以外は、調製例１と同様にして、Remote loading法薬剤導入により、高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。組成を表３に示す。【００７９】
（調製例５）
下記（１）で調製した混合脂質を膜成分とした以外は、調製例４と同様にして、荷電物質の3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩を含む高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。以下に示す。
（１）混合脂質の調製：水素添加大豆フォスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）０.４５６１ｇ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）０.１８７６ｇ、および3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（ＴＲＸ-２０）０.０５６３ｇを、６０℃で加温したt-ブタノール２５ｍＬに溶解した後、氷冷し、凍結乾燥することでＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＴＲＸ-２０＝５０：４２：８（モル比）の混合脂質を調製した。【００８０】
上記で調製した混合脂質０.７００ｇを使用して、調製例１の（２）と同様にして、リポソーム分散液を調製した。
上記リポソーム分散液に、混合脂質の総脂質量の０.７５mol％に相当するＰＥＧ5000-ＰＥの蒸留水溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）１.４２ｍＬを添加し、ＰＥＧ5000-ＰＥを導入した後、リポソーム分散液の外水相置換を、１０ｍＭ  ＭＥＳ／１０％スクロース溶液（ｐＨ６.０）で行った以外は、調製例１の（３）と同様にして、Remote loading法薬剤導入により、高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。組成を表３に示す。【００８１】
（試験例４）４℃での長期保存安定性試験
上記で得られた各ＣＰＴ-１１製剤を、４℃で所定の期間保存した。所定期間終了後のＣＰＴ-１１製剤の粒子径測定、およびＣＰＴ-１１製剤からの塩酸イリノテカン放出率（％）を試験例１と同様にして測定した。結果を表３に示す。【００８２】
【表３】
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【００８３】
上記実施例４で調製した各ＣＰＴ-１１製剤は、４℃、６ヶ月保存において粒子径および放出率に変化は認められなかった。このことからRemote loading法により調製したＣＰＴ-１１製剤は、長期間の保存安定性に優れていることが明らかになった。【００８４】
（試験例５）血中滞留性
実施例４（調製例４および５）で調製した各ＣＰＴ-１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水溶液（塩酸イリノテカンとして１ｍｇ／ｍＬ）を、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、♀、５週齢、日本クレア）に、塩酸イリノテカン量として１０ｍｇ／ｋｇ（イリノテカン量として８.７７ｇ／ｋｇ）を尾静脈注射した。
注射後、１,６,２４時間後に採血し、遠心分離し（３,０００rpm,１０分，４℃）血漿を採取した。各血漿中の塩酸イリノテカン濃度を蛍光強度測定によって測定した。血漿は測定時まで冷凍庫で保管した。結果を表４および図４に示す。
血漿（Plasma）中の塩酸イリノテカン濃度は、実施例４の各ＣＰＴ-１１製剤の場合には、尾静脈注射後２４時間まで検出されたが、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液の場合には、尾静脈注射後１時間で検出されたのみであった。
このことからRemote loading法により調製されたＣＰＴ-１１製剤により、塩酸イリノテカンの血漿中濃度を長期間高濃度で維持することが可能となった。【００８５】
【表４】
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【００８６】
［実施例５］
本発明の高担持ＣＰＴ−１１製剤の薬効について試験するため、以下の調製例６〜９によりＣＰＴ−１１製剤を調製した。
（調製例６）
下記（１）で調製した混合脂質を膜成分とした以外は、調製例４と同様にして、荷電物質の3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩を含む高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。以下に示す。
（１）混合脂質の調製：水素添加大豆フォスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を４.５６２ｇ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）１.８７６ｇ、3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（ＴＲＸ-２０）０.５６４ｇを、６０℃で加温したt-ブタノール５０ｍＬに溶解した後、氷冷し、凍結乾燥することでＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＴＲＸ−２０＝５０：４２：８（モル比）の混合脂質を調製した。【００８７】
上記で調製した混合脂質を７.００２ｇ使用した以外は、調製例１と同様にしてリポソーム分散液を調製した。
上記リポソーム分散液に、総脂質量の０.７５mol％に相当するポリエチレングリコール5000−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ5000-ＰＥ）の蒸留水溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）を加え、６０℃で３０分加温することによりＰＥＧ5000-ＰＥを導入した後、調製例１の（４）と同様にして、Remote loading法薬剤導入により、高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。組成を表５に示す。【００８８】
【表５】
0004885715.tif 000007
【００８９】
(調製例７)
下記（１）で調製した混合脂質を膜成分とした以外は、調製例４と同様にして、荷電物質の3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩を含む高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。以下に示す。
（１） 混合脂質の調製：水素添加大豆フォスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を４.５６２ｇ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）１.５１８ｇ、3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（ＴＲＸ-２０）１.１２６ｇを、６０℃で加温したt-ブタノール５０ｍＬに溶解した後、氷冷し、凍結乾燥することでＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＴＲＸ−２０＝５０：３４：１６（モル比）の混合脂質を調製した。【００９０】
上記で調製した混合脂質を７.２０７ｇ使用した以外は、調製例１と同様にしてリポソーム分散液を調製した。
上記リポソーム分散液に、総脂質量の２.０mol％に相当するポリエチレングリコール1600−コレステロール（ＰＥＧ1600-Ｃｈｏｌ）の蒸留水溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）を加え、６０℃で３０分加温することによりＰＥＧ1600-Ｃｈｏｌを導入した後、リポソーム分散液の外水相置換を、１０ｍＭ  ＭＥＳ／１０％スクロース（Sucrose）溶液（ｐＨ６.０）で行った以外は、調製例１の（４）と同様にして、Remote loading法薬剤導入により、高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。組成を表６に示す。【００９１】
【表６】
0004885715.tif 000008
【００９２】
（調製例８）
下記（１）で調製した混合脂質を膜成分とした以外は、調製例４と同様にして、荷電物質の3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩を含む高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。以下に示す。
（１）混合脂質の調製：水素添加大豆フォスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を４.５６２ｇ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）１.８７６ｇ、3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（ＴＲＸ-２０）０.５６４ｇを、６０℃で加温したt-ブタノール５０ｍＬに溶解した後、氷冷し、凍結乾燥することでＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＴＲＸ−２０＝５０：４２：８（モル比）の混合脂質を調製した。【００９３】
上記で調製した混合脂質を７.００２ｇ使用した以外は、調製例１と同様にしてリポソーム分散液を調製した。
上記リポソーム分散液に、総脂質量の０.７５mol％に相当するポリエチレングリコール5000−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ5000-ＰＥ）の蒸留水溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）を加え、６０℃で３０分加温することによりＰＥＧ5000-ＰＥを導入した後、調製例１の（４）と同様にして、Remote loading法薬剤導入により、高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。組成を表７に示す。
【００９４】
（調製例９)
下記（１）で調製した混合脂質を膜成分とした以外は、調製例４と同様にして、高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。以下に示す。
（１）混合脂質の調製：水素添加大豆フォスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を４.９４０ｇ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）２.０６０ｇを、６０℃で加温したt-ブタノール５０ｍＬに溶解した後、氷冷し、凍結乾燥することでＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５４：４６（モル比）の混合脂質を調製した。【００９５】
上記で調製した混合脂質を７.００２ｇ使用した以外は、調製例１と同様にしてリポソーム分散液を調製した。
上記リポソーム分散液に、総脂質量の０.７５mol％に相当するポリエチレングリコール5000−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ5000-ＰＥ）の蒸留水溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）を加え、６０℃で３０分加温することによりＰＥＧ5000-ＰＥを導入した後、調製例１の（４）と同様にして、Remote loading法薬剤導入により、高担持ＣＰＴ-１１製剤を調製した。組成を表７に示す。【００９６】
【表７】
0004885715.tif 000009
【００９７】
［実施例６］
外水相ｐＨの薬剤封入率への影響を検証した。
（調製例１０）
（１）混合脂質の調製：ＨＳＰＣを７.０１ｇ及びＣｈｏｌを２.９３ｇ秤量し、これらに無水エタノール１０ｍＬを加えて６８℃にて加温溶解させた。完全溶解確認後、硫酸アンモニウム溶液（２５０ｍＭ）を９０ｍＬ加え、６８℃にて加温撹拌を行った。
（２）リポソームの作製：加温撹拌終了後６８℃に加温したエクストルーダーを用いて、孔径０.２μｍのフィルターを５回通し、その後孔径０.１μｍのフィルターに交換し５回通した。その後、再度孔径０.１μｍのフィルターに交換し、５回通した。ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥの導入：エクストルージョン後のサンプルを、所定のＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ含有率（mol％）になるようにＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）を２０.４ｍＬ加え６０℃、３０分加温撹拌を行い、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥを導入した。導入後のサンプルは氷冷した。
（３）外水相置換：氷冷したサンプルを８ｍＬずつとり、ｐＨの異なる（ｐＨ４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０）外水相溶液、具体的にはｐＨ４.０、５.０（１０ｍＭ酢酸／１０％スクロース溶液）、ｐＨ６.０（１０ｍＭヒスチジン／１０％スクロース溶液）、ｐＨ７.０、８.０、９.０（１０ｍＭＴｒｉｓ／１０％スクロース溶液）にて充分置換したゲルカラムを用い、外水相置換を行った。外水相置換後のリポソーム分散液リン脂質定量キットを用いて、ＨＳＰＣ濃度を定量した。ＨＳＰＣ濃度から総脂質量ｍＭを求めた。【００９８】
（４）薬剤の封入：１０ｍｇ／ｍＬ濃度の塩酸イリノテカン（ＣＰＴ-１１）／ＲＯ水（逆浸透膜浄水）溶液を調製した。この塩酸イリノテカン溶液を、上記総脂質量（ｍＭ）に対し、ＣＰＴ-１１／総脂質量＝０.１６（mol／mol）となる量でリポソーム分散液に加え、６０℃で６０分撹拌を行い、塩酸イリノテカンを導入した。導入後のサンプルは氷冷した。塩酸イリノテカン封入後のリポソーム分散液を、１０ｍＭ  ヒスチジン（Histidine）／１０％スクロース（Sucrose）溶液（ｐＨ６.５）にて置換したゲルカラムにて未封入薬剤の除去を行った。
上記で得られた各ＣＰＴ-１１製剤の脂質（ＨＳＰＣ）濃度、薬剤（ＣＰＴ−１１）濃度および粒子径を表８に示す。【００９９】
（薬剤封入率）
上記各ＣＰＴ-１１製剤について、以下の式に従い、薬剤仕込み濃度０.１６（mol／mol）に対する最終薬剤濃度ＣＰＴ−１１の比から薬剤封入効率（％）を算出した。
【数１】
0004885715.tif 000010
【０１００】
結果を表８及び図５に示す。表および図に示されるように、外水相のｐＨが８.０以下の場合、ＣＰＴ−１１の封入効率（％）は９０％以上と非常に高いが、８.０より高くなるとＣＰＴ−１１の封入効率（％）が低下することが明らかになった。【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
［実施例７］
外水相ｐＨの薬剤安定性への影響を検証した。
調製例１０の（３）で使用した各ｐＨの外水相溶液（ｐＨ４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０）、具体的にはｐＨ４.０、５.０（１０ｍＭ酢酸／１０％スクロース溶液）、ｐＨ６.０（１０ｍＭヒスチジン／１０％スクロース溶液）、ｐＨ７.０、８.０、９.０（１０ｍＭＴｒｉｓ／１０％スクロース溶液）の各１ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬ濃度の塩酸イリノテカン（ＣＰＴ-１１）／ＲＯ水（逆浸透膜浄水）溶液を０.７ｍＬ加え、６０℃で６０分撹拌を行った。【０１０３】
上記で得られたＣＰＴ−１１溶液を、各外水相溶液にて２０倍希釈した後、試料溶液５μＬにつき、高速液体クロマトグラフを測定し、下式からＣＰＴ−１１のα-ヒドロキシラクトン環の加水分解率（開環体存在率）（％）を算出した。
CPT-11開環体存在率（％）＝｛Ａopen／（Ａopen＋1.102×Ａclose）｝×100
Ａopen：CPT-11開環体のピーク面積
Ａclose：CPT-11閉環体のピーク面積【０１０４】
結果を図５に示す。
外水相のｐＨが８.０以上の場合、ＣＰＴ−１１開環体存在率（％）が増大し９５％以上と非常に高くなることが明らかになった。ＣＰＴ−１１の活性を維持するためには、α-ヒドロキシラクトン環の加水分解を抑えるため、ｐＨを４.０以下に保つ必要があるが、脂質の安定性（脂質の加水分解）の観点より、ｐＨは６.０〜７.０付近が望ましい。実施例６の結果を踏まえて考えると、薬物導入時における外水相のｐＨは４.０〜７.０が好ましいことが明らかになった。【０１０５】
［実施例８］
（調製例１１）
（１）リポソーム形成
ＨＳＰＣを７０.８７ｇ及びＣｈｏｌを２９.１３ｇ秤量し、無水エタノール１００ｍＬを加えて６８℃にて加温溶解させた。完全溶解確認後、２５０ｍＭ硫酸アンモニウム溶液（２５０ｍＭ）を９００ｍＬ加え、６８℃にて加温撹拌を行った。
（２）リポソームの作製
リポソームの粒子径制御：加温撹拌終了後６８℃に加温したエクストルーダーを用いて、孔径１００ｎｍのフィルターを５回通した。
ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥの導入：エクストルージョン後のサンプルを、所定のＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ含有率（ｍｏｌ％）になるようにＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）を２００ｍＬ加え６０℃、３０分加温撹拌を行い、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥを導入し氷冷した。
（３）外液置換
氷冷したサンプルをクロスフローろ過システムを用いて外水相溶液（１０ｍＭヒスチジン（Histidine）／１０％スクロース（Sucrose）溶液（ｐＨ６.５））に外液置換を行った。外液置換後のリポソーム分散液を高速液体クロマトグラフィーを用いて、ＨＳＰＣ濃度及びCholesterol濃度を定量した。ＨＰＳＣ濃度及びCholesterol濃度の総和を総脂質濃度とし、封入する塩酸イリノテカン量を求めた。
（４）薬剤の封入
１０ｍｇ／ｍＬ濃度の塩酸イリノテカン（ＣＰＴ-１１）／ＲＯ水（逆浸透膜浄水）溶液を調製した。この塩酸イリノテカン溶液を、上記総脂質量（ｍＭ）に対し、ＣＰＴ-１１／総脂質量＝０.１６（mol／mol）となる量でリポソーム分散液に加え、５０℃で２０分撹拌を行い、塩酸イリノテカンを導入した。導入後のサンプルは直ちに氷冷した。
（５）未封入薬物除去
塩酸イリノテカン封入後のリポソーム分散液に、外水相を加え、クロスフローろ過システムを用いて未封入薬物の除去を行った。
（６）濃度調整
未封入薬物除去後のリポソーム分散液を高速液体クロマトグラフィーを用いて、塩酸イリノテカン量を定量し、５.０ｍｇ/ｍＬの塩酸イリノテカン濃度に調整した。
（７）ろ過滅菌
濃度調整を行ったリポソーム分散液を０.２μｍの滅菌フィルターを用いてろ過滅菌を行い、バイアル瓶に充填した。
上記で得られたＣＰＴ-１１製剤の組成および粒子径を表９に示す。【０１０６】
【表９】
0004885715.tif 000012
【０１０７】
（試験例６）抗腫瘍効果
ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ-３）、２.５×１０６cells／mouseをマウス（ＢＡＬＢ/c nude、♂、６週齢、日本チャールズリバー）の左鼠蹊部皮下に移植した。腫瘍移植後、1/2・ａｂ２(ａは腫瘍の長径、ｂは短径)より求めた推定腫瘍体積が４０ｍｍ３前後に達した(day０) 翌日から、４日毎に計３回（day１，５，９）、調製例１１で調製したＣＰＴ−１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水溶液を尾静脈注射した。薬剤を注射していないマウスを対照群とした。
Day１，５，９，１２，１６，２２に推定腫瘍体積およびマウスの体重を求めた。
また、Day２２に腫瘍を摘出し重量を測定した後、次式により腫瘍増殖阻止率Ｉ.Ｒ.（％）を算出した。
Ｉ.Ｒ.％＝（１− 投与群の平均腫瘍重量／対照群の平均腫瘍重量）×100【０１０８】
結果を、表１０並びに図６および図７に示す。
ヒト前立腺癌に対して、ＣＰＴ−１１製剤および塩酸イリノテカン生理食塩水溶液は、いずれも対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果を示した（表１０，図６）。また、ＣＰＴ−１１製剤は塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比べ高い抗腫瘍効果を示した。また、両薬剤ともマウスの体重には影響を与えなかった（図７）。【０１０９】
【表１０】
0004885715.tif 000013
【０１１０】
（試験例７）薬物動態
調製例１１で調製したＣＰＴ−１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水溶液を、塩酸イリノテカン量として１０ｍｇ／ｋｇとなるように、カニクイザル（♂、４〜５齢、Guangxi Research Center of Primate Laboratory Animal）の橈側皮静脈に４分間の持続投与をした。
投与終了直後および投与開始後１０、３０分、および１、６、２４、４８、７２、１６８、３３６、５０４時間後に採血し、遠心分離して血漿を得た。血漿５０ｍＬに内標準溶液Ｂ（内標準物質のメタノール溶液）５５０μＬを加えて遠心し、上清をメタノールで１００倍希釈したものを総ＣＰＴ−１１濃度測定用試料とした。一方、各血漿５０ ｍＬに内標準溶液Ａ（内標準物質の０.１４７mol／Ｌ Ｈ３ＰＯ４溶液）２００ｍＬを添加し、その２００ｍＬを超遠心分離し（１００,０００×ｇ、３０分間、１０℃）、上層部より１００ｍＬを分取して固相抽出し、抽出液を遊離ＣＰＴ−１１濃度、ＳＮ-３８濃度およびＳＮ-３８Ｇ（ＳＮ-３８  １０−Ｏ−グルクロナイド）濃度測定用試料とした。得られた試料を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて各々の濃度を測定した。結果を、図８〜１１に示す。【０１１１】
総ＣＰＴ−１１濃度は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液では投与後急激に減少し、１時間までに定量下限値未満（＜１ｍｇ/ｍＬ）に減少した。一方、ＣＰＴ−１１製剤では、投与後１時間から４８時間までほぼ指数関数的に減少し、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比べ顕著な滞留時間の延長が認められた（図８）。【０１１２】
遊離ＣＰＴ−１１濃度は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液では、投与終了直後の最高濃度となり、その後６時間までは比較的速やかに、それ以後は緩やかに減少した。一方、ＣＰＴ−１１製剤では、投与開始後１時間に最高濃度に達し、その後緩やかに減少した（図９）。【０１１３】
ＳＮ-３８濃度は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液では、投与終了直後に最高濃度となり、その後急激に減少し、２４時間までに定量下限値未満（＜０.０００５ｍｇ/ｍＬ）となった。一方、ＣＰＴ−１１製剤では、投与終了直後に最高濃度に達し、その後１時間まで維持された後減少し６時間から４８時間までほぼ一定に維持された（図１０）。【０１１４】
ＳＮ-３８Ｇ濃度は、ＣＰＴ−１１製剤、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液いずれも投与1時間後まで急激に増加し、その後は濃度を維持しながら僅かずつ減少した（図１１）。【０１１５】
（試験例８）血液毒性
調製例１１で調製したＣＰＴ−１１製剤を、塩酸イリノテカン量として３，１０および３０ｍｇ／ｋｇ、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液を３０ｍｇ／ｋｇとなるように、ラット（ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳラット、♂、７週齢、日本チャールズリバー）に、尾静脈投与した。
薬物投与前および投与後２，４，６，１３，２０，２７日目（４週間）に頸静脈から０.４ｍＬ採血し、血液自動分析装置（Sysmex XT-2000i、シスメックス）にて好中球数およびリンパ球数を測定した。結果を、図１２および図１３に示す。【０１１６】
好中球数は、いずれの薬剤投与においても投与直後に一過性の減少が見られ、その後速やかに回復した。減少の程度は３ｍｇ／ｋｇに比べて１０および３０ｍｇ／ｋｇでは大きく、回復期では３０ｍｇ／ｋｇが急激な増加を示した。両投与薬剤の３０ｍｇ／ｋｇにおいて好中球推移に有意な差は認められなかった（図１２)。リンパ球数は投与直後に減少する傾向が見られたが、その程度は僅かであり、投与量間での差は認められなかった（図１３)。
以上の結果から、ＣＰＴ−１１製剤において好中球に対する一過性の弱い血液毒性が認められたが、同用量の塩酸イリノテカン生理食塩水溶液の血液毒性と同程度であった。【０１１７】
［実施例９］
（調製例１２）
（１）リポソーム形成
ＨＳＰＣを６５.２５０ｇ、Ｃｈｏｌを２６.８００ｇ及びＴＲＸ−２０を８.０００ｇ秤量し、無水エタノール１００ｍＬを加えて６８℃にて加温溶解させた。完全溶解確認後、硫酸アンモニウム溶液（２５０ｍＭ）を９００ｍＬ加え、６８℃にて加温撹拌を行った。
（２）リポソームの作製
リポソームの粒子径制御：加温撹拌終了後６８℃に加温したエクストルーダーを用いて、孔径１００ｎｍのフィルターを５回通した。
ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥの導入：エクストルージョン後のサンプルを、所定のＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ含有率（ｍｏｌ％）になるようにＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ溶液（３６.７４ｍｇ／ｍＬ）を２００ｍＬ加え６０℃、３０分加温撹拌を行い、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥを導入し氷冷した。
（３）外液置換
氷冷したサンプルをクロスフローろ過システムを用いて外水相溶液（１０ｍＭヒスチジン（Histidine）／１０％スクロース（Sucrose）溶液（ｐＨ６.５））に外液置換を行った。外液置換後のリポソーム分散液を高速液体クロマトグラフィーを用いて、ＨＳＰＣ濃度及びCholesterol濃度を定量した。ＨＰＳＣ濃度、Cholesterol濃度及びＴＲＸ−２０濃度の総和を総脂質濃度とし、封入する塩酸イリノテカン量を求めた。【０１１８】
（４）薬剤の封入
１０ｍｇ／ｍＬ濃度の塩酸イリノテカン（ＣＰＴ-１１）／ＲＯ水（逆浸透膜浄水）溶液を調製した。この塩酸イリノテカン溶液を、上記総脂質量（ｍＭ）に対し、ＣＰＴ-１１／総脂質量＝０.１６（mol／mol）となる量でリポソーム分散液に加え、５０℃で２０分撹拌を行い、塩酸イリノテカンを導入した。導入後のサンプルは直ちに氷冷した。
（５）未封入薬物除去
塩酸イリノテカン封入後のリポソーム分散液に、外水相を加え、クロスフローろ過システムを用いて未封入薬物の除去を行った。
（６）濃度調整
未封入薬物除去後のリポソーム分散液を高速液体クロマトグラフィーを用いて、塩酸イリノテカン量を定量し、５.０ｍｇ/ｍＬの塩酸イリノテカン濃度に調整した。
（７）ろ過滅菌
濃度調整を行ったリポソーム分散液を０.２μｍの滅菌フィルターを用いてろ過滅菌を行い、バイアル瓶に充填した。
上記で得られたＣＰＴ-１１製剤の組成および粒子径を表１１に示す。【０１１９】
【表１１】
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【０１２０】
（試験例９）抗腫瘍効果
ヒト大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）、２×１０６cells/mouseをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ nude、♂、６週齢、日本チャールズリバー）の左鼠蹊部皮下に移植した。腫瘍移植後、1/2・ａｂ２（ａは腫瘍の長径、ｂは短径)より求めた推定腫瘍体積が９０ｍｍ３前後に達した(day０) 翌日から、４日毎に計３回（day１，５，９）、調製例１２で調製したＣＰＴ−１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水溶液を尾静脈注射した。薬剤を注射していないマウスを対照群とした。
注射後、５，８，１２，１６，２１日後に推定腫瘍体積およびマウスの体重を求めた。また、注射後、２１日目に腫瘍を摘出し重量を測定した後、試験例６に示す式により腫瘍増殖阻止率Ｉ.Ｒ.（％）を算出した。【０１２１】
結果を、表１２並びに図１４および図１５に示す。
ヒト大腸癌に対して、ＣＰＴ−１１製剤および塩酸イリノテカン生理食塩水溶液は、いずれも対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。また、ＣＰＴ−１１製剤は塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比べ高い抗腫瘍効果を示した（表１２，図１４)。また、両薬剤ともマウスの体重には影響を与えなかった（図１５)。【０１２２】
【表１２】
0004885715.tif 000015
【０１２３】
（試験例１０）単回投与による薬物動態
調製例１２で調製したＣＰＴ−１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水希釈溶液を、塩酸イリノテカン量として３，１０および３０ｍｇ／ｋｇとなるように、麻酔下で大腿静脈および大腿静脈にカニューレを施した後ボールマンケージにセットしたラット（ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳラット、♂、７週齢、日本チャールズリバー）に、大腿静脈カニューレから静脈内投与した。
投与後、２，１０，３０分、１，３，６，９，２４および３０時間後に大腿動脈カニューレより採血し、遠心分離して血漿５０ｍＬを分取し、内部標準液２００ｍＬで希釈した。この内部標準液希釈血漿５０ｍＬにメタノール５００ｍＬを加えて撹拌した後、０.１４６Ｍ Ｈ３ＰＯ４で１０倍希釈したものを総ＣＰＴ−１１濃度測定用試料とした。一方、内部標準液希釈血漿２００ｍＬを超遠心分離し（１００,０００×ｇ、３０分間、１０℃）、上層部より５０ｍＬを分取し０.１４６Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で１０倍希釈したものを遊離ＣＰＴ−１１濃度、ＳＮ-３８濃度およびＳＮ-３８Ｇ濃度測定用試料とした。得られた試料を、Kurita等の方法（J. Chromatogr B 724, p335-344, 1999）に従ってPROSPEKT-ＨＰＬＣにて各々の濃度を測定した。結果を、図１６〜１９に示す。【０１２４】
総ＣＰＴ−１１濃度は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液では、いずれの投与量（３，１０および３０ｍｇ／ｋｇ）においても、投与後急激に減少し、０.５から９時間までは指数関数的に減少した。一方、ＣＰＴ−１１製剤では、投与後１０分後から３０時間までほぼ指数関数的に減少し、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比べ顕著な滞留時間の延長が認められた（図１６)。【０１２５】
ＣＰＴ−１１製剤投与後の遊離ＣＰＴ−１１濃度はいずれも投与後１０分後から３０時間までほぼ指数関数的に減少し、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比べ顕著な滞留時間の延長が認められた（図１７)。【０１２６】
ＳＮ-３８濃度は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液では、いずれの投与量においても投与直後急激に減少したが、１時間後以降の消失は緩やかになり、３０ｍｇ／ｋｇでは３時間後まで濃度がほぼ一定に維持された。一方、ＣＰＴ−１１製剤では、３および１０ｍｇ／ｋｇでは投与後３〜６時間で最高濃度となり、その後緩やかに減少した。３０ｍｇ／ｋｇでは投与直後に最高濃度となりその後１時間まで急激に減少したが、その後９時間までは濃度はほぼ一定に維持された（図１８)。【０１２７】
ＳＮ-３８Ｇ濃度は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液では、いずれの投与量においても投与１０分後に最高濃度となり、その後１時間後までは比較的速やかに、それ以後は緩やかに減少した。一方、ＣＰＴ−１１製剤では、投与後１時間まで濃度は増加し、その後は濃度を維持しながら僅かずつ減少した（図１９)。【０１２８】
［実施例１０］
本発明の高担持ＣＰＴ−１１製剤として調製例９で調製したＣＰＴ−１１製剤について試験した。
（試験例１１）抗腫瘍効果
マウス（ＢＡＬＢ／ｃnude、♂、６週齢、日本クレア）の鼠蹊部皮下に２〜３ｍｍ角のヒト大腸癌細胞（ＨＴ-２９）を移植針で移植した。腫瘍移植後、1/2・ａｂ２（ａは腫瘍の長径、ｂは短径)より求めた推定腫瘍体積が１００ｍｍ３前後に達した時点（day１）とその４日後（day５）および８日後（day９）の計３回、調製例９で調製したＣＰＴ−１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水溶液を尾静脈注射した。薬剤を注射していないマウスを対照群とした。
初回注射後、４，８，１２，１７，２１日後に推定腫瘍体積およびマウスの体重を求めた。また、初回注射後、２１日目に腫瘍を摘出し重量を測定した後、試験例６に示す式により腫瘍増殖阻止率Ｉ.Ｒ.（％）を算出した。
【０１２９】
結果を、表１３、図２０および図２１に示す。
ヒト大腸癌に対して、ＣＰＴ−１１製剤および塩酸イリノテカン生理食塩水溶液は、いずれも対照群と比較して強い腫瘍増殖抑制効果を示した。また、ＣＰＴ−１１製剤は塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比べ高い抗腫瘍効果を示した（表１３，図２０)。また、両薬剤ともマウスの体重には影響を与えなかった（図２１)。【０１３０】
【表１３】
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【０１３１】
（試験例１２）単回投与による薬物動態
マウス線維肉腫（Meth Ａ）、２.５×１０５cells／mouseをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、♀、７週齢、日本エス・エル・シー）の鼠蹊部皮下に移植した。腫瘍移植後２０日間放置して腫瘍を増殖させた後、調製例９で調製したＣＰＴ−１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水溶液を、塩酸イリノテカン濃度として１０ｍｇ／ｋｇとなるように尾静脈投与した。
投与後、１０，３０分後および１、３、６、１２、２４、４８、９６時間後に心臓採血し、遠心分離（１５,０００rpm、１分、０℃）して血漿を得た。ＣＰＴ−１１製剤投与動物の血漿中ＣＰＴ−１１濃度の測定は、得られた血漿を０.１４６Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で５０希釈した後、等量の内部標準液を加えたものを測定用試料とした。ＣＰＴ−１１製剤投与動物の血漿中ＳＮ−３８およびＳＮ−３８Ｇ濃度および、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液投与動物の血漿中薬物濃度の測定は得られた血漿を０.１４６Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で４倍に希釈した後、等量の内部標準液を加えたものを測定用試料とした。
心臓採血した後、鼠径部より腫瘍を摘出し、生理食塩水で洗浄した後、腫瘍重量を測定した。５倍量の氷冷した０.１４６Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加えたのち、テフロンホモジナイザーを用いてホモジネートした。ホモジネート２００ ｍＬに内部標準液５０ｍＬおよびメタノール０.７５ｍＬを加えて懸濁した後、−２０℃で一晩放置した。遠心分離（１５,０００rpm、３分、０℃）した後、上清０.１ｍＬに０.１４６Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を０.４ｍＬ加え、ＨＰＬＣ測定用試料とした。得られた測定用試料は、Kurita等の方法（J. Chromatogr B 724, p335-344, 1999.）に従ってPROSPEKT-ＨＰＬＣにて各々の濃度を測定した。結果を、図２２〜２７に示す。【０１３２】
ＣＰＴ−１１の血漿中濃度は、リポソーム製剤化により、ＣＰＴ−１１製剤は塩酸イリノテカン生理食塩水溶液と比較して血漿中濃度−時間曲線下面積が３０２倍、平均滞留時間が４.４倍に増加した（図２２)。一方、ＳＮ−３８の血漿中濃度はリポソーム製剤化により、血漿中濃度−時間曲線下面積が２.５倍に上昇し、平均滞留時間も延長した（図２３)。また、ＳＮ−３８Ｇの血漿中濃度はリポソーム製剤化により、血漿中濃度−時間曲線下面積が１.８倍に上昇し、平均滞留時間も延長した（図２４)。【０１３３】
塩酸イリノテカンの腫瘍組織内薬物濃度は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液では投与後０.５時間で最高腫瘍組織中濃度に達した後、半減期２.３時間で減少した。一方、ＣＰＴ−１１製剤では、濃度は投与後徐々に増加し、１２時間後に最高腫瘍組織中濃度に達し、その後塩酸イリノテカン生理食塩水溶液よりも緩やかに減少し、腫瘍組織中濃度−時間曲線下面積は９.０倍に増加した（図２５)。【０１３４】
ＳＮ−３８の腫瘍組織内薬物濃度は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液では投与後１０分で最高腫瘍組織中濃度となった後徐々に減少した。ＣＰＴ−１１製剤では投与後約６時間まで徐々に上昇し、その後４８時間までほぼ一定に維持された。その後は塩酸イリノテカン生理食塩水溶液とほぼ同様の消失半減期で減少し、腫瘍組織中濃度−時間曲線下面積は３.９倍に増加した（図２６)。【０１３５】
ＳＮ−３８Ｇの腫瘍組織内薬物濃度は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液では投与後１０分で最高腫瘍組織中濃度となった後徐々に減少した。ＣＰＴ−１１製剤では投与後徐々に上昇し、投与後１２時間で最高腫瘍組織中濃度となり、その後緩やかに減少した（図２７)。
このことから、ＣＰＴ−１１製剤は塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比較して高い血中滞留性および腫瘍移行性を示すことが確認できた。【０１３６】
［実施例１１］
本発明の高担持ＣＰＴ−１１製剤として、調製例７で調製したＣＰＴ−１１製剤を試験した。
（試験例１３）薬剤３回投与による抗腫瘍効果
マウス線維肉腫（Meth Ａ）、２.５×１０５cells／mouseをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、♀、７週齢、日本クレア）の鼠蹊部皮下に移植した。腫瘍移植後、７、９、１１日目、または７、１１、１５日目の計３回、調製例７で調製したＣＰＴ−１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水溶液を尾静脈注射した。薬剤を注射していないマウスを対照群とした。
注射後、２１日目に腫瘍を摘出し重量を測定した後、試験例６に示す式により腫瘍増殖阻止率Ｉ.Ｒ.（％）を算出した。結果を、表１４に示す。
マウス線維肉腫に対して、ＣＰＴ−１１製剤および塩酸イリノテカン生理食塩水溶液は、いずれも対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。また、ＣＰＴ−１１製剤は塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比べ高い抗腫瘍効果を示した。また、両薬剤ともマウスの体重には影響を与えなかった。【０１３７】
【表１４】
0004885715.tif 000017
【０１３８】
（試験例１４）薬剤１回または２回投与による抗腫瘍効果
マウス線維肉腫（Meth Ａ）、２.５×１０５cells／mouseをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、♀、７週齢、日本クレア）の鼠蹊部皮下に移植した。腫瘍移植後、７、１１日目に計１回または２回、調製例７で調製したＣＰＴ−１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水溶液を尾静脈注射した。薬剤を注射していないマウスを対照群とした。
注射後、２１日目に腫瘍を摘出し重量を測定した後、試験例６に示す式により腫瘍増殖阻止率Ｉ.Ｒ.（％）を算出した。結果を、表１５に示す。【０１３９】
マウス線維肉腫に対して、ＣＰＴ−１１製剤および塩酸イリノテカン生理食塩水溶液は、塩酸イリノテカン生理食塩水溶液の一部を除き、いずれも対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。また、ＣＰＴ−１１製剤は塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比べ有意に高い抗腫瘍効果を示したものもあった。また、両薬剤ともマウスの体重には影響を与えなかった。【０１４０】
【表１５】
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【０１４１】
［実施例１２］
本発明の高担持ＣＰＴ−１１製剤として、調製例８で調製したＣＰＴ−１１製剤を試験した。
（試験例１５）抗腫瘍効果
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ nude、♂、６週齢、日本クレア）の鼠蹊部皮下に２〜３ｍｍ角のヒト肺癌細胞（ＱＧ５６）を移植針で移植した。腫瘍移植後、1/2・ａｂ２（ａは腫瘍の長径、ｂは短径)より求めた推定腫瘍体積が１ｍｍ３前後に達した時点（day１）とその４日後（day５）および８日後（day９）の計３回、調製例８で調製したＣＰＴ−１１製剤あるいは塩酸イリノテカン生理食塩水溶液を尾静脈注射した。薬剤を注射していないマウスを対照群とした。
初回注射後、４、８、１２、１６、２１日目に推定腫瘍体積およびマウスの体重を求めた。また、初回注射後、２１日目に腫瘍を摘出し重量を測定した後、試験例６に示す式により腫瘍増殖阻止率Ｉ.Ｒ.（％）を算出した。結果を、表１６、図２８および図２９に示す。【０１４２】
ヒト肺癌に対して、ＣＰＴ−１１製剤および塩酸イリノテカン生理食塩水溶液は、いずれも対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。また、ＣＰＴ−１１製剤は塩酸イリノテカン生理食塩水溶液に比べ高い抗腫瘍効果を示した(表１６，図２８)。また、両薬剤ともマウスの体重には影響を与えなかった（図２９）。【０１４３】
【表１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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