(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子、パンジー(Viola x wittrockiana)由来のフラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子、及びアントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子を含むバラであって、
前記フラボン合成酵素遺伝子は、以下の：
（１）キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子であって、以下の：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は１個〜数個の他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、又は
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列を有する核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、
のいずれかをコードする遺伝子、並びに
（２）トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子であって、以下の：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は１個〜数個の他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素あって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、又は
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列を有する核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、
のいずれかをコードする遺伝子、
からなる群から選ばれ、
前記フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するフラボノイド3',5'−水酸化酵素、
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は１個〜数個の他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボノイド3',5'−水酸化酵素であって（ａ）に記載したフラボノイド3',5'−水酸化酵素と同じ機能を有するもの、
（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボノイド3',5'−水酸化酵素であって（ａ）に記載したフラボノイド3',5'−水酸化酵素と同じ機能を有するもの、又は
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列を有する核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボノイド3',5'−水酸化酵素であって（ａ）に記載したフラボノイド3',5'−水酸化酵素と同じ機能を有するもの、
のいずれかをコードし、
前記アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
（ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は１個〜数個の他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素であって（ａ）に記載したメチル基転移酵素と同じ機能を有するもの、
（ｃ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素であって（ａ）に記載したメチル基転移酵素と同じ機能を有するもの、又は
（ｄ）配列番号９に示す塩基配列を有する核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたメチル基転移酵素であって（ａ）に記載したメチル基転移酵素と同じ機能を有するもの、
のいずれかをコードし、そして
前記バラは、以下の：
（ａ）前記フラボン合成酵素遺伝子の発現により生産されたフラボン、
（ｂ）前記フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子の発現により生産されたデルフィニジン、及び
（ｃ）前記アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子の発現により生産されたマルビジン、
を含む、前記バラ。
【請求項２】
請求項１に記載のフラボン合成酵素遺伝子、フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子、及びアントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子を含む、請求項１に記載のバラの部分、子孫、組織、栄養増殖体又は細胞。
【請求項３】
バラの花色を改変する方法であって、以下のステップ：
ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子、パンジー(Viola x wittrockiana)由来のフラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子、及びアントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子を、バラに導入し、そして
該フラボン合成酵素遺伝子、該フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子、及び該アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子を発現させて、該バラの花色を改変する、
を含み、ここで、
前記フラボン合成酵素遺伝子は、以下の：
（１）キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子であって、以下の：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は１個〜数個の他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、又は
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列を有する核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、
のいずれかをコードする遺伝子、並びに
（２）トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子であって、以下の：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は１個〜数個の他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素あって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、又は
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列を有する核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素であって（ａ）に記載したフラボン合成酵素と同じ機能を有するもの、
のいずれかをコードする遺伝子、
からなる群から選ばれ、
前記フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するフラボノイド3',5'−水酸化酵素、
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は１個〜数個の他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボノイド3',5'−水酸化酵素であって（ａ）に記載したフラボノイド3',5'−水酸化酵素と同じ機能を有するもの、
（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボノイド3',5'−水酸化酵素であって（ａ）に記載したフラボノイド3',5'−水酸化酵素と同じ機能を有するもの、又は
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列を有する核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボノイド3',5'−水酸化酵素であって（ａ）に記載したフラボノイド3',5'−水酸化酵素と同じ機能を有するもの、
のいずれかをコードし、
前記アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
（ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は１個〜数個の他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素であって（ａ）に記載したメチル基転移酵素と同じ機能を有するもの、
（ｃ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素であって（ａ）に記載したメチル基転移酵素と同じ機能を有するもの、又は
（ｄ）配列番号９に示す塩基配列を有する核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたメチル基転移酵素であって（ａ）に記載したメチル基転移酵素と同じ機能を有するもの、
のいずれかをコードし、そして
前記バラは、以下の：
（ａ）前記フラボン合成酵素遺伝子の発現により生産されたフラボン、
（ｂ）前記フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子の発現により生産されたデルフィニジン、及び
（ｃ）前記アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子の発現により生産されたマルビジン、
を含む、前記方法。
【請求項４】
前記バラは、前記フラボン合成酵素遺伝子、前記フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子、及び前記アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子を含まないバラよりも、L*a*b表色系色度図における色相角度（θ）が２７０°により近づく変化を示す、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラボン(flavone)及びマルビジン(malvidin)を人為的に含有させたバラ(a rose)に関する。本発明は、遺伝子操作によりフラボン及びマルビジンを含めることにより生ずるコピグメンテーション効果(co-pigmentation effect)によりバラの花色を改変する方法、特に花色を青色方向に変化させる方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
花は植物の生殖器官であり次の世代となる種子を生産するために必要である。種子を形成するためには花粉がめしべに付着し、受精することが必要である。通常花粉の運搬は、蜂や蝶などの昆虫や、ハチドリ、まれにはコウモリにより行われる。花弁の役割は花粉を運ぶこれらの生物を魅了することにあり、植物はそのために、花の色や形、模様に工夫を凝らしている。
【０００３】
花の色は鑑賞の際にも花卉の最も重要な形質であることから、古くから様々な色の花が交配によって育種されてきた。しかしながら、ひとつの植物種の花があらゆる色をもつ場合は少なく、たとえば、交配により作製されたバラ(rose(Rosa hybrida))、カーネーション(carnation(Dianthus caryophyllus))、キク(chrysanthemum(Chryanthemum morifolium))、ユリ(lily(Lilium spp.))などには紫から青の品種がなく、ハナショウブ(Japanese garden iris(Iris ensata thumb.))やリンドウ(gentian(Gentiana triflora))には鮮やかな赤い品種はない。
【０００４】
花色のうち、淡い黄色から赤色、青色はフラボノイド(flavonoid)及びアントシアニン(anthocyanin)（フラボノイドに属する有色配糖体）に由来することが多い。フラボノイドは植物の代表的な二次代謝物で、以下に示すように、C6C3C6の基本骨格をもち、フェニルアラニンとマロニルCoAから合成される。Ｃ環の酸化状態により、フラボン、フラボノール(flavonol)などに分類される。
【０００５】
【化１】
0005057349.tif 000002
【０００６】
【化２】
0005057349.tif 000003
【０００７】
フラボノイドは、紫外線を吸収したり、ラジカルを除去したりするので、もともとは植物体を様々なストレスから保護する機能を担っていたと考えられる。また健康によい成分としても近年注目されている(Harborne and Williams 2000 Phytochemistry 55, 481-504参照)。
【０００８】
有色のアントシアニンには、数百分子種が知られているが、以下に示すように、その発色団であるアントシアニジン(anthocyanidin)には、（１）オレンジ色から赤色の花に多いペラルゴニジン(pelargonidin)、（２）赤色から紅色の花に多いシアニジン(cyanidin)及びペオニジン(peonidin)、並びに（３）紫から青色の花に多いデルフィニジン(delphinidin)、ペチュニジン(petunidin)及びマルビジン(malvidin)の６種が一般的である。
【０００９】
【化３】
0005057349.tif 000004
【００１０】
アントシアニンの構造はその色に大きな影響を与える。アントシアニンのＢ環の水酸基数が増えると青みが増す。従って、デルフィニジン型アントシアニンは、ペラルゴニジン型アントシアニン、シアニジン型アントシアニンに比べ青い。アントシアニンを含むフラボノイドの生合成は、植物種を超えてよく保存されている。フラボノイドは細胞質で生合成され、糖やアシル基が付加した後に、液胞へと輸送され蓄積される(Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, 1-24、及びTanaka and Brugliera 2006 Ainsworth 編、Flowering and its manipulation、pp.201-239, Blackwell Publishing Ltd.参照)。
【００１１】
生合成に関わる酵素の構造遺伝子はすべてクローニングされている。組換え植物を作製できれば、これらの遺伝子の発現を人為的に調整することにより花で蓄積するフラボノイドの構造と量を改変し、花色を変えることができる(Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, 1-24、及びTanaka and Brugliera 2006 Ainsworth 編、Flowering and its manipulation、pp.201-239, Blackwell Publishing Ltd.参照)。たとえば、花弁でデルフィニジンを生産できないカーネーションやバラにおいて、デルフィニジンを合成するために必要なフラボノイド3',5'−水酸化酵素（以下、「F3'5'H」と略す。）遺伝子を発現させることにより、デルフィニジンを生産させ、自然にはない青い花を作製した例がある(Tanaka 2006 Phytochemistry Reviews 5, 283-291参照)。
【００１２】
このように植物の代謝を人為的に改変する方法は代謝工学と呼ばれることがある。代謝を改変し、目的の物質を蓄積させるためには、目的の物質を生産する酵素遺伝子を組換え植物において発現させればよいが、しばしば植物自身が持つ内在の酵素との競合により、目的の物質の蓄積がまったく、あるいはほとんど起こらず、産業上有用な形質を持つに至らないことも多い。
【００１３】
たとえば、ペチュニア(Petunia hybrida)はそのジヒドロフラボノール還元酵素（以下、「DFR」と略す。）の特異性のためにペラルゴニジンを蓄積できず、したがってオレンジ色の花色の品種は天然には存在しない。
【００１４】
バラなどのDFR遺伝子を導入することによりペラルゴニジンを蓄積させたオレンジ色のペチュニアが報告されているが、ペラルゴニジンを蓄積させるためには、DFRと競合するフラボノイド3'-水酸化酵素（以下、「F3'H」と略す。）、F3'5'H、フラボノール合成酵素（以下、「FLS」と略す。）の遺伝子が欠損しているペチュニア品種を用いる必要があり、これらが欠損していないペチュニアにバラのDFR遺伝子を導入しても表現型の変化は認められない（Tanaka and Brugliera 2006 Ainsworth 編、Flowering and its manipulation、pp.201-239, Blackwell Publishing Ltd.参照)。したがって目的の遺伝子を単に導入するだけで目的の化合物が蓄積し表現型があらわれるかどうかは予想できない。
【００１５】
さらに、代謝工学においては予想外の結果が出ることも多い。たとえば、トレニア(Torenia hybrida)においてフラボン合成酵素遺伝子の発現を抑制したところ、フラボン量が減少し、フラバノン(flavanone)の蓄積が見られた。フラバノンが蓄積すればアントシアニン量は増加するはずであるが、実際にはアントシアニン量も減少した（Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263, 2002）。このように代謝物の増減を予想することは困難で目的の表現型を得るためには鋭意工夫が必要である。
【００１６】
また、アントシアニンは結合する芳香族アシル基の数が増えると分子内コピグメント作用により青くなる。２つ以上の芳香族アシル基をもつアントシアンはポリアシル化アントシアニンと呼ばれ、安定な青い色を呈する（Harborne and Williams 2000 phytochemistry 55, 481-504参照）。
【００１７】
必須色素であるアントシアニン色素自体の構造によるほか、共存するフラボノイド（コピグメントともいう）や金属イオン、液胞のｐＨなどによっても花の色は変化する。たとえば、フラボンやフラボノールは、代表的なコピグメントで、アントシアニンとサンドイッチ状に積み重なることにより、アントシアニンを青くし、濃く見えるようにする効果がある（Goto (1987) Prog. Chem. Org. Natl. Prod. 52参照）。この点で、フラボンは無色の補助色素成分であるといえる。たとえばフラボンの一種であるイソビテキシン（isovitexin）はハナショウブ(Japanese gardeniris(Iris ensata Thunb.))においてアントシアニンに対しコピグメント効果を発揮し、色を青くする。また、イソビテキシンはアントシアニンを安定化することによりハナショウブの花の色を安定化することも示されている（Yabuya et al. Euphytica 2000 115, 1-5参照）。
【００１８】
また、フラボンはフラボノールよりも強いコピグメント効果を示すことが多い。たとえば遺伝子組換えカーネーションの解析ではフラボンがフラボノールよりもコピグメント効果が強いことが示されている（Fukui et al. Phytochemistry, 63, 15-23, 2003参照）。したがって、フラボンの蓄積は花の色を青くするために重要である。しかしながら、すべての植物がフラボンを生産できるわけではなく、バラやペチュニアなどはフラボンを蓄積しないことが知られている。また、フラボンは、花色以外に、紫外線の吸収、さまざまなストレス、他の微生物との相互作用などにも関与しており、フラボンを合成させることにより新しい形質を持った植物を得ることができることも知られている(フラボン合成酵素をコードする遺伝子に関する特許文献として、特開2000-279182を参照のこと)。しかしながら、バラにおいてフラボンを発現させた例は未だ知られていない。
【００１９】
フラボンはフラボン合成酵素が触媒する反応によりフラバノンから合成される。すなわち、アピゲニン(apigenin)はナリンゲニン(naringenin)から、ルテオリン(luteolin)はエリオジクチオール(eriodictyol)から、トリセチン(tricetin)はペンタヒドロキシフラバノンから合成される。フラボン合成酵素には、フラボン合成酵素Iとフラボン合成酵素IIの２種類がある。両者は同じ反応を触媒するが、異なるタイプの酵素である。フラボン合成酵素Iは2-オキソグルタル酸依存的なジオキシゲナーゼ（Britsch  et al. (1981) Z.Naturforsch 36c pp. 742-750、及びBritsch (1990) Arch. Biochem. Biophys.282 pp.152-160参照）の1種であり、フラボン合成酵素IIはチトクロームP450型のモノオキシゲナーゼである。フラボン合成酵素IIの構造遺伝子は、トレニア、キンギョソウ、シソ(Perilla frutescens)、ガーベラ(gerbera(Gerbera hybrida))、リンドウなどから得られている(Tanaka and Brugliera 2006 Ainsworth 編、Flowering and its manipulation、pp.201-239, Blackwell Publishing Ltd.参照)。
【００２０】
フラボン合成酵素遺伝子を、フラボンを生産しない遺伝子組換え植物において発現させると、フラボンが合成されることが予想される。しかしながら、ペチュニアにおいてトレニアのフラボン合成酵素遺伝子を発現させたところ、濃い青紫色の花の色が薄くなったとの報告もある(Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004)。また、リンドウ由来のフラボン合成酵素遺伝子をタバコで発現させたところ、フラボンが合成されたが、やはり花の色は薄くなったとの報告もある（Nakatsuka et al. 2006, Molecular Breeding 17:91-99）。このように、フラボンが合成されても必ずしも花色は青くならない。言い換えれば、コピグメント効果を示さない原因として、アントシアニンとフラボンの量や比が適切でないことや、アントシアニンとフラボンの糖やアシル基による修飾が適切ではないことなどが挙げられる。これらの結果から、単にフラボン合成酵素遺伝子を発現させフラボンを蓄積させるだけでは花の色をより青くすることはできないということが示唆される。
【００２１】
バラは最も人気のある花卉植物であり、紀元前から栽培されていた記録がある。また、数百年にわたり人為的な品種改良がされてきた。その結果、ペラルゴニジン、シアニジン、フラボノールといったフラボノイドを含むバラが得られている。また、近年では遺伝子組換えの手法を用いて、自然のバラにはないデルフィニジンを生産するバラも作られている。しかしながら、フラボンを蓄積するバラは、交配によっても遺伝子組換えによっても未だ得られていない。また、フラボンとマルビジンの両者を蓄積するバラも未だ得られていない。
【発明の開示】
【００２２】
植物の品種改良に遺伝子組換えの手法を用いることの最大の利点は、交配による品種改良と異なり、交配することができない植物や他の生物の遺伝子を利用して植物を改良できることである。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いると他種の生物の任意の遺伝子を任意の植物、たとえばバラに導入し、その植物に新しい能力を付与することができるとされている。しかしながら、バラはアラビドプシス(Arabidopsis thaliana)やタバコ(tobacco(Nicotiana tabacum L.))などのモデル植物とは異なり、導入した遺伝子が機能するかどうかはその遺伝子の起源や使用するプロモーターなどに大きく依存することが知られている。
【００２３】
WO2005/017147によれば、フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子(F3'5'H)をバラに導入した場合、遺伝子組換えバラにおいて、ペチュニアやリンドウに由来する同遺伝子は発現せず、デルフィニジンも検出されなかったが、興味深いことにパンジー由来の同遺伝子は発現し、デルフィニジンを生産するという新しい能力をバラに付与することができた。この結果はバラにおいては、どの植物種由来の遺伝子を導入すれば機能するかは容易に類推できないことを示している。
【００２４】
また、キクにおいてはある遺伝子を導入することができてもその遺伝子がキクで機能するかどうかは予想することは困難であり、また組換えキクの加齢にしたがって導入した遺伝子が機能しなくなることが知られている。組換え植物において異種の遺伝子の転写によく使用されるカリフラワーモザイクウィルスの３５Sプロモーターは、リンドウにおいては機能しないことも報告されている(Mishiba et al. Plant Journal 2005, 44: 541-556参照)。
【００２５】
フラボンをバラで合成させるためには、フラボン合成酵素遺伝子を発現させればよいことは容易に類推できるが、ジオキシゲナーゼ型又はチトクロームP450型のいずれのフラボン合成酵素を発現させればよいのか、どの植物起源のフラボン合成酵素遺伝子を発現させればよいのかなどについては、容易に類推することはできないので、試行錯誤が要求される。また、コピグメント効果は液胞中にアントシアニンとフラボンやフラボノールが一定の濃度で共存すれば生じる現象であるが、発色源であるアントシアニンの配糖化等の修飾状態に対し、コピグメントとなるフラボンやフラボノールがより適合した配糖化等の修飾を受けていることが必要であることも明らかにされている（Nature. 2005 Aug 11;436(7052):791、及びNature, 358, 515-518 (1992)参照）。
【００２６】
つまり、必要な色調発現のためには、アントシアニンとフラボン・フラボノールが、最適な構造上の組み合わせをとることが必要であり、また、どのように修飾されたアントシアニンとフラボン・フラボノールを共存させればよいのかという点についても試行錯誤を要するであろう。さらに、フラボン合成酵素がバラで機能したとしても、天然のバラではナリンゲニンなどのフラバノンはフラバノン3-水酸化酵素(以下、「F3H」と略す。)により速やかに水酸化されるため、フラバノンからフラボンが合成されるとは限らない。
【００２７】
従って、本発明は、バラにおける目的とする色調発現のために適切な色素を含むバラを提供しようとするものである。
上記の課題を解決するため、本発明者は、種々検討の結果、バラに人為的にフラボン及びマルビジンを含有せしめることにより目的とする色調発現が達成されることを見出し、本発明を完成した。
【００２８】
具体的には、本発明は以下の通りのものである：
１．遺伝子組換え手法によりフラボン及びマルビジンを含むことを特徴とするバラ(a rose)。
２．フラボンを含み、且つパンジー(Viola x wittrockiana)由来のフラボノイド3',5'−水酸化酵素及びアントシアニンのメチル基転移酵素の発現によりマルビジンを含む、前記１に記載のバラ。
３．アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子、フラボン合成酵素遺伝子及びパンジー由来の3',5'−水酸化酵素遺伝子の発現により、マルビジン、フラボン及びデルフィニジンを有する、前記１又は２に記載のバラ。
４．前記フラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子である、前記１〜３のいずれかに記載のバラ。
５．前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科キンギョソウ(Scrophulariaceae, Antirrhinum majus)由来のフラボン合成酵素遺伝子である、前記４に記載のバラ。
６．前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科トレニア(Scrophulariaceae, Torenia hybrida)由来のフラボン合成酵素遺伝子である、前記４に記載のバラ。
【００２９】
７．前記ゴマノハグサ科キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子が、
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号１に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、前記５に記載のバラ。
【００３０】
８．前記ゴマノハグサ科トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子が、
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号３に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、前記６に記載のバラ。
【００３１】
９．前記パンジー由来のフラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子が、
（１）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するフラボノイド3',5'−水酸化酵素、
（２）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボノイド3',5'−水酸化酵素、
（３）配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボノイド3',5'−水酸化酵素、又は
（４）配列番号７に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボノイド3',5'−水酸化酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、前記２〜８のいずれかに記載のバラ。
【００３２】
１０．前記アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子が、
（１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
（２）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
（３）配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、又は
（４）配列番号９に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたメチル基転移酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、前記２〜９のいずれかに記載のバラ。
【００３３】
１１．アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子、フラボン合成酵素遺伝子、及びパンジー由来の3',5'−水酸化酵素遺伝子の導入前の宿主と比べて花色が変化している、前記２〜１０のいずれかに記載のバラ。
１２．前記花色の変化が、青に向けての変化である、前記１１に記載のバラ。
１３．前記花色の変化が、L*a*b表色系色度図における色相角度（θ）が青方向軸である２７０°に近づく変化である、前記１１又は１２に記載のバラ。
１４．前記花色の変化が、花弁の反射スペクトルの極小値が長波長側にシフトする変化である、前記１１に記載のバラ。
１５．前記１〜１４のいずれか１項に記載のバラと同じ性質を有する、その部分、子孫、組織、栄養増殖体又は細胞。
１６．遺伝子組換え手法によりフラボン及びマルビジンを含めることにより生ずるコピグメンテーション効果によりバラの花色を改変する方法。
１７．前記コピグメンテーション効果が、花色を青色方向に変化させる効果である、前記１６に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
用語の定義
用語「バラ(a rose)」とは、本明細書中で使用するとき、バラ目バラ科バラ属(Order, Rosales, Family, Rosaceae, Genus Rosa)の落葉低木である鑑賞用植物の総称をいい、特定の品種に限定されることを意図されず、また、植物の全体又は通常花を含む部分を意味する。
【００３５】
用語「バラ」の「部分、子孫、組織、栄養増殖体又は細胞」とは、本明細書中に使用するとき、本願発明に係る「バラ」の所望の遺伝的形質が保持されている限り、当該「バラ」に由来するすべての物を意味し、特定のものに限定されることを意図されない。
【００３６】
用語「高ストリンジェント条件」とは、本明細書中で使用するとき、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、アンチセンス鎖と、対象の核酸とを５５℃で一晩保温し、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又は６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件をいい、特に、バックグラウンドの非特異的なシグナルが実質的に存在しなくなる条件をいう。
【００３７】
用語「L*a*b表色系色度図における色相角度（θ）」とは、本明細書中で使用するとき、１９７６年国際照明委員会（ＣＩＥ）で規格化され、日本国においてもＪＩＳ８７２９として採用された色相角度（θ）をいい、０°は赤方向、９０°は黄方向、１８０°は緑方向、そして２７０°は青方向である。尚、花の色は、かかる色相角度と、ＲＨＳ（英国王立園芸協会）のカラーチャートのデータを併用して、表すことができる。
フラボン合成遺伝子、フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子、及びアントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子の導入
【００３８】
バラに公知の方法で、シソ由来のフラボン合成酵素IIの遺伝子を、パンジー由来のF3'5'H遺伝子などとともに導入した。その結果、シソ由来のフラボン合成酵素IIの遺伝子を導入したバラではフラボンは検出されず、この遺伝子はバラの中では機能しないことが示された。一方、トレニア又はキンギョソウ由来のフラボン合成酵素IIの遺伝子を導入したバラではフラボンが検出され、フラボン合成遺伝子はバラの中で機能することがわかった。
【００３９】
このようにして、従来は存在しなかったフラボンを蓄積するバラを作出することができた。フラボンの総フラボノイド中の含量（％）は、1％以上、好ましくは5％以上、より好ましくは10％以上、そして最も好ましくは30％以上であればよい。アントシアニンとフラボンの両方を蓄積するバラは、同じアントシアニンのみを含むバラよりも、相対的に青い色をしており、フラボンの蓄積が青色化という新しい形質の付与に貢献していることがわかった。
【００４０】
さらには、B環がメチル化されたアントシアニン（マルビジンを含むアントシアニン）とフラボンが共存するときに、デルフィニジンを含むアントシアニンとフラボンが共存する場合より高いコピグメント効果が発揮されることを見出し、上述のフラボン合成酵素IIの遺伝子とパンジーのF3’5’H遺伝子に加え、B環のメチル基転移酵素遺伝子を導入する事により、メチル化されたデルフィニジン型アントシアニンとフラボンをバラ花弁で蓄積させ、バラ花弁をより青くすることが可能となった。
【００４１】
また、交雑試験により、デルフィニジン型アントシアニンとフラボンの両方を蓄積する形質は子孫にも伝達されることがわかった。
これらのことから、本来花弁でフラボンを蓄積していない、又はマルビジンなどメチル化されたアントシアニンを蓄積していない植物において、これらの化合物を同時に蓄積させることにより、花弁の色彩をより青くすることが可能となる。この際、バラなどのように、元々フラボンとマルビジンのいずれも蓄積していない植物を宿主として用いることが望ましい。
【００４２】
本発明に関連する酵素類は、典型的には、配列表に記載されている特定のアミノ酸配列を有する酵素である。しかしながら、酵素においては、特定の、例えば生来の、アミノ酸配列のみならず、酵素活性に関与する領域以外の領域においてアミノ酸配列が修飾されていても、所望の酵素活性が維持されることはよく知られている。従って、本発明の酵素類は、配列番号に示す特定のアミノ酸配列に対して、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、本来の酵素活性を維持しているタンパク質、及び配列番号に示す特定のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、本来の酵素活性を維持しているタンパク質も、本発明の酵素に含まれる。
【００４３】
また、ある酵素をコードする遺伝子を手にすれば、当該遺伝子に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸は、当該酵素と同様の活性を有する酵素をコードしている蓋然性が高いことが知られている。従って、特定の配列番号で示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、且つ目的の酵素活性を有する酵素も、本発明の酵素に含まれる。
【００４４】
従って、本発明に関与する酵素遺伝子として下記のものが挙げられる。
（Ａ）キンギョソウ(Antirrhinum majus)由来のフラボン合成酵素遺伝子
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号１に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
【００４５】
（Ｂ）トレニア(Torenia hybrida)由来のフラボン合成酵素遺伝子
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号３に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
【００４６】
（Ｃ）シソ(Perilla frutescens)由来のフラボン合成酵素遺伝子
（１）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号５に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
【００４７】
（Ｄ）パンジー(pansy(Viola x wittrockiana))由来の3',5'−水酸化酵素遺伝子
（１）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する3',5'−水酸化酵素、
（２）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する3',5'−水酸化酵素、
（３）配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する3',5'−水酸化酵素、又は
（４）配列番号７に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされた3',5'−水酸化酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
【００４８】
（Ｅ）トレニア(Torenia hybrida)由来のメチル基転移酵素遺伝子
（１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
（２）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
（３）配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、又は
（４）配列番号９示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたメチル基転移酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明する。本実施例は、本発明を例示することのみを目的とし、本発明の範囲を限定するものと解されることを意図されない。
実施例１：アントシアニンに対するフラボンのコピグメント効果のシミュレーション
アントシアニンに対するフラボンのコピグメント効果のシミユレーションを行うため、まずアントシアニン類を調製した。Cyaninはバラ品種“Rote Rose”(rose cv.“Rote Rose”)の花弁より抽出、精製した。Delphinはバーベナ品種“タピアンバイオレット”(vberbena cv.“Tapien Violet”or vberbena variety Sunmaref TP-V(“Tapien Violet”)(“Tapien is a Trade Mark registered in Japan”))の花弁より抽出した色素を、アルカリ加水分解した後精製した。Malvin、及びLuteolin 7- O-glucosideはフナコシ株式会社より購入した。
【００５０】
このようにして調製した種々のアントシアニンに対してフラボン（Luteolin 7- O-glucoside）を、pH5.0の緩衝液中、0、1、2、4当量のモル濃度比で添加し、吸収スペクトルを測定した。アントシアニンとしては、Cyanin（Cyanidin 3,5-diglucoside）、Delphin（Delphinidin 3,5- diglucoside）、Malvin（Malvidin 3,5-diglucoside）を用いた。アントシアニンの濃度はCyanin、DelphinおよびMalvinは1mMとした。
【００５１】
以下の表１と２に示すように、フラボンの添加により、アントシアニン水溶液の吸光度は増大し、その変化の割合（吸光度比）は、Malvinで最大であった。また、吸収極大（λmax）もフラボンの添加とともに長波長側へシフトした。その変化の割合はMalvinで最大、次いでDelphinであった。さらに、L*a*b*表色系により色彩値の評価を行ったところ、フラボンの添加により、色彩の青色化が観察され、彩度も上昇した。その効果は、Malvinで最も顕著であった。すなわち、Luteolin 7- O-glucosideのコピグメント効果を最も受けるのはMalvinであることが判明した。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
【表２】
0005057349.tif 000006
【００５４】
実施例２（参考例）：バラ品種 “Lavande”へのパンジー由来F3’5’H ＃40遺伝子とシソ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
特開2000-279182に記載のシソ由来フラボン合成酵素遺伝子を含むプラスミド、pYFS3をXbaIで消化した後、平滑末端化し、さらにBamHIで消化して、約1.8kbのシソ  フラボン合成酵素遺伝子断片を得た。一方、WO2005/017147に記載のpSPB906をXhoIで消化後、平滑末端化し、さらにBamHIで消化した。この平滑末端とBamHI切断部位の間に、前述のシソのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し906-pYFS3を得た。906-pYES3はEl235SプロモーターとD8ターミネーター（いずれもWO2005/017147に記載）の間にシソ由来のフラボン合成酵素遺伝子を有するものである。
【００５５】
Ueyama らの報告（Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263, 2002)に記載されたpSPB176のBamHIとSalI部位に、WO2005/017147に記載のpCGP1961からBamHIとXhoIの部分消化で切り出したパンジーF3'5'H #40遺伝子 の断片を挿入したプラスミドをpSPB575とした。このAscI部位に、上述の906-pYFS3をAscIで消化して得られる約3.4kbのシソのフラボン合成酵素遺伝子発現カセットを挿入した。得られたプラスミドのうち、F3’5’H #40遺伝子の発現カセットとシソのフラボン合成酵素の発現カセットが同じ方向に連結されたベクターをpSPB1310 とした。本プラスミドは植物においてはパンジーのF3'5'H #40遺伝子とシソのフラボン合成酵素遺伝子を構成的に発現する。
【００５６】
このようにして作製したpSPB1310を藤色系バラ品種“Lavande”(maure rose variety “Lavande”)へ導入し、55個体の形質転換体を得た。色素分析を行った50個体のうち49個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高70％（平均26％）であった。しかしながら、フラボンは全く検出されず、シソ由来のフラボン合成酵素遺伝子がバラの細胞では機能していないことが推察された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表３に示す。
【００５７】
【表３】
0005057349.tif 000007
【００５８】
実施例３：バラ品種 “Lavande”へのパンジー由来F3’5’H ＃40遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
Akashiらの報告（Plant Cell Physiol 40, 1182-1186, 1999）に記載のトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子が、プラスミドpBluescript II SK（-）のEcoRIとXhoI部位に挿入されたプラスミドをpSPB426とした。これをKpnIで消化した後、平滑末端化し、さらにBamHIで消化し、約1.7kbのトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子断片を得た。一方、WO2005/017147に記載のpSPB906をXhoIで消化後、平滑末端化し、さらにBamHIで消化した。この平滑末端とBamHI切断部位の間に、前述のトレニアのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し906-426を得た。
【００５９】
Ueyama らの報告（Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263, 2002)に記載されたpSPB176のBamHIとSalI部位に、WO2005/017147に記載のpCGP1961からBamHIとXhoIの部分消化で切り出したパンジーF3’5’H #40遺伝子 の断片を挿入したプラスミドをpSPB575とした。このAscI部位に、上述の906-426をAscIで消化して得られる約3.3 kbのトレニアのフラボン合成酵素遺伝子発現カセットを挿入した。得られたプラスミドのうち、F3'5’H#40遺伝子の発現カセットとトレニアのフラボン合成酵素の発現カセットが同じ方向に連結されたベクターをpSPB1309 とした。本プラスミドは植物においてはパンジーF3'5'H #40遺伝子とトレニアのフラボン合成酵素遺伝子構成的に発現する。
【００６０】
このようにして作製したpSPB1309を藤色系バラ品種“Lavande”へ導入し、50個体の形質転換体を得た。色素分析を行った38個体のうち36個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高45％（平均12％）であった。一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、35個体で新たにフラボン（ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり1.68mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表４に示す。
【００６１】
【表４】
0005057349.tif 000008
【００６２】
実施例４：バラ品種 “WKS124”へのパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
サーモンピンク系バラ品種“WKS124”(salman-pink rose variety “WKS124”)へ実施例３に記載のpSPB1309を導入し、40個体の形質転換体を得た。色素分析を行った27個体のうち26個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高96％（平均81％）であった。一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、26個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり4.41mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表５に示す。
【００６３】
【表５】
0005057349.tif 000009
【００６４】
実施例５：バラ品種“WKS124”へのパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例３に記載のpSPB1309をPacI処理し、トレニア由来のフラボン合成酵素発現カセットとパンジー由来F3'5'H #40遺伝子発現カセットの連結部位付近に存在する（より厳密には、フラボン合成酵素発現カセットのD8ターミネーター3'末端付近に存在する）PacI部位とベクターのマルチクローニングサイト内のPacI部位を切断することにより、パンジーF3'5'H #40遺伝子発現カセットを切り出した。
【００６５】
一方、WO2003-062428に記載されたトレニアのメチル基転移酵素遺伝子発現カセットを有するバイナリーベクターpSPB1530をPacIで切断し、そこに上記のパンジーF3'5'H #40発現カセットを、メチル基転移酵素遺伝子発現カセットと同じ方向に挿入した。本プラスミドをTMT-BP40とする。
一方、pSPB1309をAscIで切断し、トレニアのフラボン合成酵素発現カセットを切り出した。これをTMT-BP40のAscI部位に、これらの発現カセットと同じ方向に挿入し、得られたプラスミドをpSFL535とした。本プラスミドは植物において、パンジーF3'5'H #40遺伝子とトレニアのメチル基転移酵素遺伝子、及びトレニアのフラボン合成酵素遺伝子を構成的に発現する。
【００６６】
このようにして得られたpSFL535をサーモンピンク系のバラ「WKS124」へ導入し、173個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った98個体の形質転換体のうち88個体でマルビジン（デルフィニジンの3'位と5'位がメチル化されたアントシアニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高84％（平均50％）であった。
【００６７】
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、77個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり4.58mgという高い含有量であった。また、51個体でメチル化されたトリセチンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表６に示す。
【００６８】
【表６】
0005057349.tif 000010
【００６９】
実施例６：バラ品種“Lavande”へのパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例５に記載のpSFL535を藤色系バラ品種“Lavande”へ導入し、130個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った118個体の形質転換体のうち37個体でマルビジン（デルフィニジンの3'位と5'位がメチル化されたアントシアニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高55.6％（平均20.5％）であった。
【００７０】
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、78個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり5.11mgという高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体のうち20個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表７に示す。
【００７１】
【表７】
0005057349.tif 000011
【００７２】
実施例７：バラ品種“WKS82”へのパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例５に記載のpSFL535を藤色系バラ品種“WKS82”(mauve rose variety “WKS82”)へ導入し、250個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った232個体の形質転換体のうち110個体でマルビジン（デルフィニジンの3'位と5'位がメチル化されたアントシアニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高65.2％（平均19.7％）であった。
【００７３】
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、125個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり4.71mgという高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体のうち80個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表８に示す。
【００７４】
【表８】
0005057349.tif 000012
【００７５】
実施例８：バラ品種“WKS140”へのパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例５に記載のpSFL535を藤色系バラ品種“WKS140”(mauve rose variety “WKS140”)へ導入し、74個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った74個体の形質転換体のうち20個体でマルビジン（デルフィニジンの3'位と5'位がメチル化されたアントシアニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高51.3％（平均33.5％）であった。
【００７６】
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、29個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり3.04mgという高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体のうち20個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表９に示す。
【００７７】
【表９】
0005057349.tif 000013
【００７８】
実施例９：フラボン及びマルビジン合成能の後代への伝播−パンジー由来F3’5’H ＃40遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子を導入した遺伝子組換えバラと栽培バラとの交雑
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するため、実施例５で作出したマルビジン及びフラボンを生産するバラ（表６中、植物No.6）を花粉親として用いた交配を行った。種子親には、中輪系栽培バラ“Medeo（メデオ）”(floribunda rose variety “Medeo”)を用いた。
【００７９】
取得した形質転換体F1雑種後代のうち10個体の色素分析を行ったところ、7個体でマルビジンの蓄積が確認され、バラの花弁においてパンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高68.2％（平均46.6％）であった。
【００８０】
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、8個体の形質転換体後代でフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり7.35mgという極めて高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体後代のうち6個体でメチル化されたトリセチンが検出された。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表１０に示す。
【００８１】
【表１０】
0005057349.tif 000014
【００８２】
実施例１０：フラボン合成能の後代への伝播
パンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子を導入したバラ品種“WKS124”と、パンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子を導入したバラ品種“Lavande”の交配
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するため、実施例３で作出したフラボン生産株（表４中、植物No.4）を花粉親として用いた交配を行った。種子親には、バラ品種WKS124へpSPB1532を導入し、パンジー由来F3'5'H ＃40遺伝子およびトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の働きにより花弁でマルビジンを高蓄積した形質転換体WKS124/1532-12-1（WO2003/062428に記載）を用いた。
【００８３】
取得した形質転換体後代のうち149個体の色素分析を行ったところ、88個体でフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積が確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり4.09mgという高い含有量であった。また、42個体でメチル化されたトリセチンが検出され、11個体でメチル化されたルテオリン（Chrysoeriol（3'Met-Lut））が検出された。なお、色素分析を行った149個体のうち、129個体でマルビジンの蓄積が確認できた。マルビジン含有率は最高79％（平均36％）であった。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表１１に示す。
【００８４】
【表１１】
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【００８５】
実施例１１：フラボンを含むバラの花色の評価
実施例４及び５において作出された形質転換体（バラ品種“WKS124”を宿主とする）について、（１）主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、フラボンを含まないもの、（２）主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、フラボンを含むもの、（３）主な色素としてマルビジンを高蓄積し、フラボンを含まないもの、及び（４）主な色素としてマルビジンを高蓄積し、フラボンを含むもの、及び（５）宿主（主な色素としてペラルゴニジンを蓄積）というグループに分類し、それぞれの花弁の色彩について分光測色計を用いて評価を行った（ｎ＝10）。
【００８６】
主色素がデルフィニジンタイプのバラ、マルビジンタイプのバラいずれにおいても、フラボンが共存する場合に花弁の色相角度は青色方向へシフトしていた。また、主色素がマルビジンタイプのバラにおいては、その傾向がより顕著であり、反射スペクトルの極小（λMin）も長波長側へ大きくシフトしていた。以上の結果から、フラボンの共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。結果を以下の表１２に示す。
【００８７】
【表１２】
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【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明により、鑑賞用植物として人気のある花卉植物であるバラにおいて、遺伝子組換え手法によりフラボン及びマルビジンを含ませることで、コピグメンテーション効果によりバラの花色を青色方向に変化させることができる。青色の花色をもつバラは観賞用植物としての商品需要が見込まれる。
【００８９】
ここで、本明細書中に引用した特許文献、非特許技術文献の全てを、個別に又はそれらを全体として、本明細書中に援用する。
これまで、本発明を説明してきたが、本発明は、その本質から逸脱せずに、修正又は変更されうると解されるべきであり、本発明の範囲は、実施例の記載に基づくのではなく、添付の請求の範囲により画されるべきことはいうまでもない。