(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝固因子ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＶＩＩの欠損もしくは欠陥凝固因子ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＶＩＩ又は凝固因子ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＶＩＩに対する阻害因子によって引き起こされる出血の治療の為の皮下投与用薬剤の製造を目的とする因子ＶＩＩａの使用。
【請求項２】
因子ＶＩＩａは組換えヒト因子ＶＩＩａである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
因子ＶＩＩａは因子ＶＩＩａのアミノ酸配列の変異体であり、ここで、該変異体は、ｒＦＶＩＩａである、請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤が安定な水性溶液として使用され得る、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
前記薬剤は、投与前に、医薬的に許容できる注射ビヒクルにより再構築される凍結乾燥組成物である請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
因子ＶＩＩａにより発症可能な症状の治療の為の皮下投与用薬剤の製造を目的とする因子ＶＩＩａの使用であって、ここにおいて前記薬剤は、皮下に投与された時、生物学的半減期の延長を示し、因子ＶＩＩａにより発症可能な症状は、凝固因子ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＶＩＩの欠損もしくは欠陥、又は凝固因子ＶＩＩＩ、ＩＸもしくはＶＩＩに対する阻害因子によって生じる出血；欠陥血小板作用により生じる出血；あるいは過度の組織の損傷又は外傷に関連する出血である、因子ＶＩＩａの使用。
【請求項７】
因子ＶＩＩａは組換えヒト因子ＶＩＩａである、請求項６記載の使用。
【請求項８】
因子ＶＩＩａは因子ＶＩＩａのアミノ酸配列の変異体であり、ここで、該変異体は、ｒＦＶＩＩａである、請求項６記載の使用。
【請求項９】
前記薬剤が安定な水性溶液として使用され得る、請求項６〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤は、投与前に、医薬的に許容できる注射ビヒクルにより再構築される凍結乾燥組成物である請求項６〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
前記症状が欠陥血小板作用により引き起こされる出血である、請求項１又は６記載の使用。
【請求項１２】
前記症状が組織の損傷又は外傷に関連する出血である、請求項１又は６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、因子VIIａ により発症可能な症状の予防もしくは治療の為の薬剤の製造を目的とする凝固因子VIIａ の利用に関連する。当該薬剤は皮下、筋内、皮内投与を目的とする。本発明は更に、因子VIIａ により発症可能な症状の治療の為の薬剤の製造を目的とする凝固因子VIIａ の利用に関連する。前記薬剤は皮下、皮内又は筋内に投与された時、生物学的な半減期が延長したことを示す。
【０００２】
発明の背景
血液の凝固は、様々な血液成分又は因子の複合相互反応から成る作用であり、最終的にフィブリンの凝塊を生じる。一般的に、凝固「カスケード」と言われていることに加わる血液成分は、プロ酵素又はチモーゲンといった、それ自身活性化凝固因子であり、賦活物質の作用によりタンパク質分解酵素へと転化される酵素学的に不活性なタンパク質である。そのような転化を受ける凝固因子を一般的に「活性因子」といい、それらは小文字の接尾字「ａ」の付加（例えば、因子VIIａ ）により示される。
【０００３】
活性化因子Ｘ（「Ｘａ」）は、プロトロンビンをトロンビンに転化するのに必要である。尚、フィブリンの凝塊を形成する最終段階においてトロンビンはフィブリノゲンをフィブリンに転化する。因子Ｘの活性化を促進する２つの系、又は経路がある。「内因性の経路」は、血しょう中にのみに存在する因子の利用によるトロンビン形成につながる反応を言う。一連のプロテアーゼ−仲介活性は、因子VIIIａと共に、因子ＸをＸａへと解裂させる因子IXａを最終的に生成する。同一のタンパク質分解は、血液凝固の「外因性経路」において因子VIIａ 及びその補因子、組織因子によって影響を受ける。組織因子は膜結合タンパク質であり通常血しょう中を循環しない。しかしながら、血管の破裂により、Ｃａ2+及びリン脂質の存在下で因子Ｘの活性化又は因子IXの活性化を触媒する為に因子VIIａ と複合できる。止血における２つの凝固経路の相対的な重要性は不明確であるが、近年因子VII 及び組織因子は、血液凝固の調節において主軸たる役割を果たすことが分かっている。
【０００４】
因子VII は、単鎖チモーゲンとして血中を循環する微量な血しょう糖タンパク質である。チモーゲンは触媒的に不活性である。単鎖因子VII は二鎖因子VIIａ へと、因子Ｘａ、因子VIIａ 、因子IXａ又はトロンビンによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで転化されうる。因子Ｘａは因子VII の重要な生理学的賦活物質であると考えられる。止血に関連する他のいくつかの血しょうタンパク質と同様、因子VII はその活性をビタミンＫに依存し、その活性は、タンパク質のアミノ末端において一団になる多重グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化を要求するのに必要である。これら、γ−カルボキシル化グルタミン酸は、因子VII のリン脂質との金属会合相互作用（ｍｅｔａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）に必要とされる。
【０００５】
チモーゲン因子VII の活性化二鎖分子への転化は、おおよそ分子の中央に位置する内部のペプチド結合の解裂によって起こる。ヒト因子VII において活性解裂部位はＡｒｇ152−Ｉｌｅ153である。組織因子、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下で、二鎖因子VIIａ は、制限タンパク質分解により、因子Ｘ又は因子IXを素早く活性化する。
【０００６】
凝固因子は巨大タンパク質であり、通常、血流中で直接薬剤を有効にする為に静脈に投与される。しかしながら、もし薬剤が皮下、筋内又は皮内に投与可能なら有利である。なぜなら、これらの投与形態は、患者に対するとり扱い、特にもし当該薬剤が全生涯の間規則的に取り込まれなければならず、又治療を早く開始する時、例えば患者が子供の時、大変簡単であるからだ。しかし、通常とても大きく不安定な分子を有する薬剤は、もし皮下、筋内又は皮内に投与されるなら、摂取率が低く、分解が激しいので、低い生物学的利用能を有する。更に、そのような巨大分子は、皮下に投与された時免疫原性でありうる。
【０００７】
組換えヒト因子VIIａ（ｒＦVIIａ）は因子VIII又は因子IXに対する中性抗体を生成する血友病の治療において有用な活性化凝固因子である。因子VIII及び因子ＸＩは、血友病患者の約１０％において、激しい抗体形成を引き起こす。ｒＦVIIａ の作用（因子Ｘによる凝固系の活性化）は体の血管の区画において発揮される。現在迄ｒＦVIIａ の投与の経路は静脈内である。比較的短い半減期の結果、通常、投与は２．５〜３時間ごとに繰り返される。妥当な生物学的利用能及び長く続く吸収期をもたらすであろう投与の代替形態は、投与間隔の増加を可能にし、そして同時に自己投与を可能にするであろうし、従って患者に対する利便性を増すであろう。
【０００８】
因子VIIａ は分子量約５０kDa を有する糖タンパク質である。それ故、それは、血流中への直接導入に関するニーズに差し向けるにはあまりにも大きな分子である。その理由は、たとえあるにしても、極めて低い生物学的利用能が予測されるからである。更に、かなりに大用量が成人に対して、例えば、手術の間要求されうる。従って、一般的に因子VIIａ は血友病ＡもしくはＢの患者に対して、予防的もしくは出血症状に応答して静脈に投与されている。そのような静脈注射の繰り返しの使用は、疾患を制御する為に必要である一方、副作用を持ちうる。繰り返しの注射は注射の部位で、静脈が繊維芽細胞形成又は閉塞することにつながり、問題は特に、年配者を治療する時に深刻である。又、乳児のように静脈が小さい時、医者にとって要求された治療上の用量を注射する為に当該静脈へと針を挿入することは困難である。
【０００９】
皮下注射により投与されて来た凝固因子タンパク質は因子VIII（１７０〜３００kDa ）及びIX（６０kDa ）のみである。これら凝固因子は、未だ活性化されていない単鎖チモーゲンの形態において投与される。これら非活性化形態はより素速く分解される活性化（解裂した）形態より一層安定である。これら２つのタンパク質の皮下注射は、それらの薬物動態学的特性（例えば、半減期）を有為に変えない。
【００１０】
凝固因子VIIａ の活性化、解裂、そしてそれ故一層不安定な形態は、生物学的活性を有する形態及び十分な濃度において、十分に血流中への移送を伴い皮下、筋内又は皮内注射により導入されうることが分かっている。皮下、筋肉又は皮内に注射された時、ＦVIIａ は望ましい薬物動態学的特性（特に半減期）を示すことが又分かっている。
【００１１】
因子VIIａ は哺乳動物、特にヒトに対して、出血性疾患、特に凝固因子欠損（血友病Ａ及びＢ）、もしくは凝固因子の阻害因子により引き起こされる出血性疾患又は血友病ＡもしくはＢを患わない患者、例えばヴォン・ヴィレブランド病を患う患者の出血性疾患の抑制に有用である。ヴォン・ヴィレブランド病を伴う患者は、ヴォン・ヴィレブランド因子タンパク質を欠く又は異常なヴォン・ヴィレブランド因子タンパク質を持つので不完全な一次止血を有する。出血性疾患は、正常に作用する血液凝固カスケードを有する患者においても見られ、欠陥血小板の機能、血小板減少症、又は未知の理由によってさえ引き起こされうる。更に、ＦVIIａ は凝固カスケード及び血小板等を含む止血系が正常に機能する患者における過度の出血を予防又は治療する為に用いられて良い。例えば、そのような過度の出血は、組織の損傷、例えば手術又は外傷に関連し、特に組織因子（ＴＦ）に富む組織における出血である。ＦVIIａ はそのような状況並びに出血が分散し現在の止血技術又は治療に十分に対応しない（例えば出血性の胃炎及び重篤な子宮の出血）時用いられて良い。ＦVIIａ は又脳、耳の内側の領域、目のような、機械的止血に関して限定された可能性を伴う器官における出血並びに様々な器官から生体材料を抽出する方法と関連する及び腹腔鏡手術における出血の治療に対して適切であって良い。
【００１２】
技術背景
国際特許出願ＷＯ９３／０７８９０は、皮下注射によりＦIXを伴う、血友病の治療に関連する。
【００１３】
国際特許出願ＷＯ９５／２６７５０は血友病ＡもしくはＢの治療の為の皮下注射の為の適切なＦVIIIもしくはＦIXの製剤に関連する。
【００１４】
国際特許出願ＷＯ９５／２８９５４は保存及び皮下注射の為の適切なＦIXの濃縮製剤に関連する。
【００１５】
表の一覧
表１は１１．４〜１３．４kgの体重のミニブタに対して０．２mg／kg（０．３３ml／kg）ｒＦVII を静脈及び皮下に投与することに引き続くＥＬＩＳＡ−アッセイによるＰＫ結果を示す。
【００１６】
表２は１１．４〜１３．４kgの体重のミニブタに対して０．２mg／kg（０．３３ml／kg）ｒＦVII を静脈及び皮下に投与することに引き続く凝固アッセイによるＰＫ結果を示す。
【００１７】
発明の概要
活性化凝固因子VIIａ（因子VIIａ又はＦVIIａ ）は、とても感度の良いタンパク質であり、皮下、筋内又は皮内に投与でき、血液中で許容可能な吸収及び高レベルの活性因子VIIａ タンパク質を示すことが分かっている。更に、ＦVII 抗原及びＦVII 活量の血しょうの半減期は上記投与により有為に増加され、ｔ（最大）は数時間遅延される。
【００１８】
従って、ある側面において、本発明は、薬剤の皮下、筋内又は皮内投与を目的とするＦVIIａ により発症可能な症状の治療の為の薬剤の製造を目的とする因子VIIａ の利用を供する。
【００１９】
他の側面において、本発明は、薬剤が、皮下、皮内又は筋内に投与された時、生物学的半減期の延長を示す、ＦVIIａ により発症可能な症状の治療の為の薬剤の製造を目的とする因子VIIａ の利用を供する。
【００２０】
ある実施態様において、本発明は、ＦVIIａ により発症可能な症状の治療の為の薬剤の製造を目的とする単一の活性凝固因子として因子VIIａ の利用を供する。前記薬剤は皮下、筋内又は皮内に投与される。
【００２１】
他の実施態様において、本発明は、ＦVIIａ により発症可能な症状の治療の為の薬剤の製造を目的とする単一の活性凝固因子として因子VIIａ の利用を供する。ここにおいて、前記薬剤は皮下、皮内又は筋内に投与される時、生物学的な半減期の延長を示す。
【００２２】
本発明の他の実施態様において、因子VIIａ は組換えヒト因子VIIａ である。
【００２３】
ある実施態様において、因子VIIａ は、因子VIIａ のアミノ酸配列の変異体である。
【００２４】
他の実施態様において、野性型因子VIIａ と比較して実質的に同じ又は向上した生物学的活性を持つ因子VIIａ の変異体は、本明細書に記載の１又は複数の凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイにおいて試験された時、同じ型の細胞で生産されている因子VIIａ の比活性の約２５％以上、好適には約５０％以上、更に好適には約７５％以上そして、最も好適には約９０％以上を示す。ある実施態様に於いて、因子VIIａ 変体は、〔Ｌ３０５Ｖ〕−ＦVIIａ ，〔Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ〕−ＦVIIａ ，〔Ｌ３０５Ｉ〕−ＦVIIａ ，〔Ｌ３０５Ｔ〕−ＦVIIａ ，〔Ｆ３７４Ｐ〕−ＦVIIａ ，〔Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ〕−ＦVIIａ ，〔Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ〕−ＦVIIａ 及び〔Ｋ３３７Ａ〕−ＦVIIａ の群から選択される。
【００２５】
ある実施態様において、薬剤は皮下投与にふさわしい。他の実施態様において、当該薬剤は筋内投与にふさわしい。他の実施態様において、当該薬剤は皮内投与にふさわしい。
【００２６】
ある実施態様において、薬剤はすぐに使用できる水溶液の形態である。他の実施態様において、当該薬剤は、投与前に、注射に適切な医薬的に許容できるビヒクル中で再構築される凍結乾燥組成物の形態にある。
【００２７】
本発明の他の実施態様において、因子VIIａ により発症可能な症状は、凝固因子VIII、IXもしくはVII の欠損もしくは欠陥、又は凝固因子VIII、IXもしくはVII に対する阻害因子によって生じる出血である。他の実施態様において、症状は欠陥血小板作用により生じる出血である。更に他の実施態様において、症状は過度の組織の損傷又は外傷に関連する出血である。
【００２８】
因子VIIａ により発症可能な症状を患う患者は任意の動物、特にホニュウ動物、好適な実施態様においては、当該ホニュウ動物はヒトであって良い。
【００２９】
発明の詳細な説明
定義
因子VIIａ 、又はＦVIIａ は血液から精製又は組換えの方法により生産されて良い。本明細書に記載の方法の実施はどのようにして精製因子VIIａ が生じるかとは独立している。それ故、本発明は、本明細書中の用途に適切な任意の因子VIIａ の製剤の用途を網羅するように熟慮されている。
【００３０】
本明細書中で使用する時、「因子VIIａ 」は野生型因子VII （即ち、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されているアミノ酸配列を持つポリペプチド）、並びに野生型因子VII と比較して実質的に同じ又は向上した生物学的活性を示す因子VII の変異体を包含する。用語「因子VIIａ 」は、それらの各生物活性形態を生じる為にタンパク質分解の処理を受けている因子VII ポリペプチドを包含することを意図される。典型的に、因子VII は因子VIIａ を生じる為に残基１５２と１５３との間で解裂される。
【００３１】
血液凝固において因子VIIａ の生物学的な活性はその（ｉ）組織因子（ＴＦ）に対する結合、及び（ii）活性化因子IXもしくはＸ（それぞれ因子IXａもしくはＸａ）を生成する為に因子IXもしくは因子Ｘのタンパク質分解解裂を触媒する能力から生じる。本発明の目的について、因子VIIａ の生物学的活性は、例えば米国特許第５，９９７，８６４号に記載の、因子VII 欠損血しょう及びトロンボプラスチンを用いて、血液の凝固を促進する製剤の能力を測定することにより定量されて良い。このアッセイにおいて、生物学的活性は、コントロールの試料に相対する凝固時間における減少として表わされ、そして１単位／ml因子VII 活性を持つヒトプール血清標準との比較により「因子VII 単位」に変換される。もう一つの方法として因子VIIａ の生物学的活性は（ｉ）脂質膜中に組み込まれたＴＦ及び因子Ｘを含んで成る系において因子VIIａ の因子Ｘａの生産する能力を測定すること（Perssonら、J. Biol. Chem. 272 : 19919-19924, 1977 ）；（ii）水性系において因子Ｘの加水分解を測定すること；(iii）表層プラズモン共鳴に基づく装置を用いてそのＴＦに対する物理的な結合を測定すること（Persson, FEBS Letts. 413 : 359-363, 1997）、そして（iv）合成基質の加水分解を測定することにより定量化されて良い。
【００３２】
野生型因子VIIａ に対して実質的に同じ又は向上された生物学的活性を有する因子VII 変異体は、上記の１又は複数の凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイもしくはＴＦ結合アッセイにおいて試験された時、同じ細胞型において生産されている因子VIIａ の約２５％以上、好適には約５０％以上、更に好適には約７５％以上、そして最も好適には約９０％以上の比活性を示すものを包含する。野生型因子VII と相対して実質的に改変された生物学的活性を有する因子VII 変異体は、例えば限定せず、ＴＦ非依存性因子Ｘタンパク質分解活性を示す因子VII の変異体である。
【００３３】
野生型因子VII と同じ又は事実上より良い生物学的活性を示そうが、因子VII の変異体には、例えば、限定をしないが、１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、置換により野生型因子VII の配列とは異なるアミノ酸配列を持つペプチドが挙げられる。実質的に野生型因子VII と同じ生物学的活性を有する因子VII 変異体の限定しない例には、〔Ｓ５２Ａ〕−ＦVIIａ ，〔Ｓ６０Ａ〕−ＦVIIａ（Iinoら、Arch. Biochem Biophys. 352 : 182-192, 1998）；米国特許第５，５８０，５６０号に開示されている増大したタンパク質分解活性安定性を示すＦVIIａ 変体；残基２９０と２９１の間又は残基３１５と３１６の間でタンパク質分解解裂をされている因子VIIａ（Mollerupら、Biofech. Bioeng. 48 : 501-505, 1995）；及び因子VIIａ の酸化形態（Kornfelt ら、Arch. Biochem. Biophys. 363 43-54, 1999）が挙げられる。野生型因子VIIａ と比較して事実上同じ又はより良い生物学的な活性を有する因子VII 変体の例は限定しないが、デンマーク国特許出願ＰＡ２０００  ００７３４、ＰＡ２０００  ０１３６０、ＰＡ２０００  ０１３６１、及びＰＡ２００１  ００４７７記載のものである。限定ではない例は〔Ｌ３０５Ｖ〕−ＦVIIａ ，〔Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ〕−ＦVIIａ ，〔Ｌ３０５Ｉ〕−ＦVIIａ ，〔Ｌ３０５Ｔ〕−ＦVIIａ ，〔Ｆ３７４Ｐ〕−ＦVIIａ ，〔Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ〕−ＦVIIａ ，〔Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ〕−ＦVIIａ 及び〔Ｋ３３７Ａ〕−ＦVIIａ である。
【００３４】
本文中で、３文字又は１文字表記のアミノ酸は、表１に示したようにそれらの汎用の意味において用いられている。明示的に示されなければ、本明細書中で述べるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。例えば、Ｋ３３７の第一番目の表記は、図３に示してある位置に天然に存在するアミノ酸を示し、例えば〔Ｋ３３７Ａ〕−ＦVIIａ はＦVIIａ 変異体を表し、ここにおいて変異体は、図３において示された位置に天然に存在している１文字コードＫによって示されたアミノ酸は、１文字コードＡによって示されたアミノ酸によって置換されている。
【表１】
0005090605.tif 000002
【表２】
0005090605.tif 000003
【００３５】
本文中で、用語「ＦVIIａ 単位」は、１９９３年に確立された第一国際標準８９／６８８の第二標準に対する較正として規定される。５０国際標準単位（ＩＵ）ヒト野生型ＦVIIａ は約１ngのタンパク質に対応する。
【００３６】
本文中、用語「治療」はＦVIIａ が発症可能な症状の予防的な治療を含むことを意図する。
【００３７】
略記
ＴＦ        組織因子
ＦVII       単鎖、未活性形態にある因子VII
ＦVIIａ     活性化形態にある因子VII
ｒＦVIIａ   活性化形態にある組換え因子VII
ＦVIII      未活性化形態にある因子VIII
ＦIX        未活性化形態にある因子IX
ＩＵ        国際単位
【００３８】
化合物の調製
本発明においての使用の為の適切なヒトの精製した因子VIIａ は、例えばHagenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412-2416, 1986により記載された、又はヨーロッパ特許第２００，４２１号（Ｚｙｍｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に記載のあるＤＮＡ組換え技術により、好適に行われる。
【００３９】
本明細書中に記載の因子VII の変異体は組換え核酸技術により生産されて良い。概して、クローン化された野生型因子VII の核酸配列は所望のタンパク質をコードする為に修飾されている。次いでこの修飾された配列は発現ベクター中に挿入され、宿主細胞中へと順に形質転換又はトランスフェクションされる。高等真核細胞、特に哺乳類細胞は好適な宿主細胞として好ましい。ヒト因子VII についての完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列が公知である（組換えヒト因子VIIのクローニング及び発現が記載されてある米国第４，７８４，９５０号を参照のこと）。ウシ因子VII の配列はTakeyaら、J. Biol. Chem. 263 : 14868-14872 (1998) に記載がある。
【００４０】
アミノ酸配列の改変は様々な技術により達成されて良い。核酸配列の修飾は部位特異的な突然変異生成によって行われて良い。部位特異的突然変異生成の為の技術は、当業界で周知であり、それらは例えばZoller及びSmith (DNA 3 : 479-488, 1984) 又は“Splicing by extension overlap”, Horton ら、Gene 77, 1989, pp. 61-68に記載がある。従って、因子VII のヌクレオチド及びアミノ酸配列を使用することは、選り抜きの改変を導きうる。特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いることによるＤＮＡ構築体を調製する為の方法も、更に当業者に周知である（参照、PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA ）。
【００４１】
因子VII は又Broze 及びMajerus, J. Biol. Chem. 255 (4) : 1242-1247, 1980及びHedner及びKisiel, J. Clin. Invest. 71 : 1836-1841, 1983によって記載された方法により生産されて良い。これらの方法は、検出可能な量の他の血液凝固因子を有さない因子VII を生じる。更に精製された因子VII 製剤でさえ、最終精製段階の時、更なるゲルろ過等により得られうる。次いで因子VII は周知の方法、例えば因子ＸIIａ，IXａ又はＸａのようないくつかの異なる血しょうタンパク質等により活性化ＦVIIａ に転化される。もう一つの方法として、Bjoernら（Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565）による記載のように、因子VII はＭｏｎｏＱ（登録商標）（Pharmacia fine Chemicals）等イオン交換クロマトグラフィーカラムを通すことにより活性化されて良い。
【００４２】
医薬投与
本明細書中で説明したＦVIIａ により治療される任意の患者に対する処方計画は、当業者により決定されるべきである。治療において投与される投与量は医師によって決定され投与経路（皮下、筋内又は皮内）並びに患者の体重及び状態に依存する。
【００４３】
通常ＦIIａが静脈に注射される場合は２．５〜３時間ごとに投与されなければならず、ＦIIａが皮下、皮内又は筋内に投与される時１２〜４８時間、好適には２４時間の間隔で投与されるべきである。ＦVIIａ は約１００〜１００，０００単位／kg体量、そして好適には約５〜５００μｇ／kgに対応する２５０〜２５，０００単位／kg体重の量において皮下注射により投与されるのが好ましい。
【００４４】
薬剤の処方
静脈注射は通常５〜２０mlである。皮下に与える注射は０．０５〜１mlが通常好まれる。それ故ＦVIIａ の濃度はそのような薬剤中で高くなくてはならない。
【００４５】
与えられる容量は０．０１ml超、適切には０．１〜２ml、好適には０．２５〜１．５ml、及び一層好ましくは０．５〜１mlでありうる。
【００４６】
ＦVIIａ の生物学的利用能を増加する添加剤は、それ自体適切な有機化合物、その塩、それ自体有機化合物を含む浮濁液もしくは分散液又はそれらの塩、例えば極性脂質の分散液、もしくはその添加剤の任意の組み合わせもしくは序列である。本発明において有用な有機化合物は、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質及び多糖類である。ペプチドは、ジペプチド、トリペプチド、コラーゲン及びゼラチンのようなオリゴペプチド等である。コラーゲン及びゼラチンは好適に加水分解される。多糖類は例えば、キトサン、シクロデキストリン、でんぷん、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース及び任意の誘導体、これら添加剤の組み合わせ及び／又は序列等である。でんぷんは好適に加水分解される。乳濁液は分散相としての油による水中油乳濁液、及び連続相としての油による油中水分散液等である。油は植物もしくは動物由来又は合成的に生産されるものでありうる。適切に、乳濁液の植物油は大豆油もしくはヒマワリ油、又はそれらの任意の組み合わせである。適切に、極性脂質は１又は複数のリン脂質もしくは糖脂質又はそれらの任意の組み合わせである。ＦVIIａ の生物学的利用能を増加する添加剤は乾燥もしくは再構築に至る前に製剤に添加できうり、又それはＦVIIａ を含む適切な溶液もしくは分散液に対して添加できうる。
【００４７】
投与前、適切な水溶液、分散液又は乾燥形態にある本発明の薬剤に対して任意の混合物又は序列において、１又は複数の水性溶液もしくは分散液が添加されうる。
【００４８】
薬剤は乾燥形態、好適には凍結乾燥形態でありうる。投与前、乾燥生成物もしくは組成物は水性溶液又は分散液、例えば、懸濁液、リポソーム製剤もしくは乳濁液により再構築できうる。
【００４９】
薬剤は又投与に備えた適切な水性溶液でありうる。それは又、分散液、例えば、懸濁液、リポソーム製剤又は乳濁液でありうる。
【００５０】
薬剤は好適に皮下に供される。製剤中のＦVIIａ 活量は好適に約０．１mg／mlから約５０mg／ml、更に好適に約０．３mg／mlから約２５mg／ml一層好適には約０．６mg／mlから約２５mg／ml、より好適には約０．６mg／mlから約１５mg／ml、もっと好適には約１mg／mlから約１５mg／ml、そして更に一層好ましくは、約３mg／mlから１５mg／mlである。
【００５１】
薬剤は又等張液を与える為に塩、例えばＮａＣｌ，ＫＣｌを含んで成り、そして／又はそれらは好適に１．０mg／mlより多くの量において、１又は複数の他の等張化合物を含んで成りうる。
【００５２】
カルシウム、又は他の二価の金属イオン、例えば亜鉛は、ＦVIIａ 活性の維持に必要である。例えば、塩化カルシウムとして添加され、しかし他の塩、例えばグルコン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム又はグルセプト酸カルシウムも又用いられて良い。薬剤は好適に０．１５mg／ml超の量において塩化カルシウムを含んで成る。
【００５３】
アミノ酸は、好適に系を緩衝する為、そしてもしも製剤が凍結乾燥されるならば、タンパク質を保護する為に用いられる。適切な緩衝剤は、グリシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン又はグリシルグリシンであり、好適にはグリシルグリシンである。
【００５４】
非イオン性の界面活性剤も又薬剤中に存在して良い。界面活性剤はポロキサマー、例えば、ポロキサマー１８８、もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノラウレートもしくはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノオリエートのようなブロック−共重合体から好適に選択される。好ましいのは、ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノオリエート（トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）である。トゥイーン２０は好適に０．０１mg／ml以上の濃度において用いられる。もし用いるなら、非イオン性の界面活性剤は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える量において存在する。Wan及びLee, Journal of Pharm Sci, 63, p.136, 1974 を参照のこと。
【００５５】
単又は二糖類（例えばスクロース）、低分子量デキストリンのような多糖類、又は糖アルコール（例えばソルビトール、グリセロールもしくはマンニトール）が添加されて良い。薬剤は又抗酸化物質、例えば亜硫酸水素塩、アスコルビン酸グルタチオン、アセチルシステイン、トコフェノール、メチオニン、ＥＤＴＡ、クエン酸、ブチルヒドロキシトルエン及び／又はブチルヒドロキシアニソールを含んで成りうる。もしカルシウム又は他の二価イオン、例えばＺｎ2+よりも非安定化金属イオンに対してより強い親和性を示すならば、ＥＤＴＡ及びクエン酸のような錯体形成試薬は又ＦVIIａ 分子を安定化する目的で少濃度において存在できうる。更にベンジルアルコール、フェノール、ソルビン酸、パラベン及びクロロクレゾールのような防腐剤が添加されて良い。
【００５６】
アジュバントは一般的に０．００１〜４％ｗ／ｖの濃度において存在する。医薬製剤は又プロテアーゼ阻害剤、例えばアプロチニン又はトラネキサム酸を含んで良い。
【００５７】
製剤のpHは、好適に２〜９の間の値に調整される。pH約５．０〜約７．５を有する製剤が好ましく、一層好適にはpH約５．０〜約６．０のpHを持つ製剤、pH約５．５を持つ製剤が最も好適である。
【００５８】
好適には、用いられるＦVIIａ は高度に精製された、即ち４０IU／μｇ超の特異的な活性を持つものである。
【００５９】
ある実施態様において、薬剤は
ｒＦVIIａ                   ０．６mg／ml（３０，０００IU／ml）
塩化ナトリウム              ２．９２mg／ml
グリシルグリシン            １．３２mg／ml
ポリソルベート８０          ０．０７mg／ml
塩化カルシウム、２Ｈ２Ｏ    １．４７mg／ml
マンニトール                ３０．００mg／ml
pH５．５
（滅菌水により１mlに再構築された）
からなる。
【００６０】
本発明に従い用いることができうる、医薬組成物を調製する為の汎用の技術は、例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy 19th ed., 1995に記載がある。
【００６１】
薬剤は、例えば細菌保持フィルターによるろ過、当該薬剤中へ滅菌剤を組み込むこと、当該薬剤に照射をすること、又は当該薬剤を加熱することによって滅菌されて良い。それらは又使用する前、予めもしくは即座に、滅菌水又は他の滅菌注射媒体中に溶解できうる滅菌固体薬剤の形態において製造できうる。
【００６２】
本発明は更に以下の実施例により例示される。本実施例は限定としてではなく、本発明の例示としての手段である。
【００６３】
実施例
材料と方法
組換え因子VIIａ （ｒＦVIIａ ）の生産は本質的にヨーロッパ特許第２００，４２１号に記載されたように実行した。
【００６４】
ＦVIIａ 活性及び濃度を注射の目的で水による希釈により調整し、そして賦形剤を適切な濃度で添加した。次いで溶液を滅菌ろ過し、凍結乾燥した。
ｒＦVIIａ の凍結乾燥粉末
ｒＦVIIａ                   ０．６mg／ml
塩化ナトリウム              ２．９２mg／ml
グリシルグリシン            １．３２mg／ml
ポリソルベート８０          ０．０７mg／ml
塩化カルシウム、２Ｈ２Ｏ    １．４７mg／ml
マンニトール                ３０．００mg／ml
pH５．５
使用前、凍結乾燥組成物を総体積１mlに水中で再構築した。
【００６５】
実施例１
動物
研究を、Ellegaard Goettingen Minipigs ApS, Soro Landevej 302, DK-4261, Dalmose, Denmark産の４匹のメスのミニブタにおいて行った。順化期間の開始にて、動物は７〜８月齢であり体重は１１．２〜１３kgの範囲であった。（５日の順化期間を含む）予備投与期間の一週目は投与前放置した。
【００６６】
週２度動物に水と餌（最初の２日に渡りアルトミン（Ａｌｔｏｍｉｎ）９２０３を１７５ｇ、以後は２００ｇ）を与えた。
【００６７】
研究を２１±３℃に温度を調節した室内で行った。
【００６８】
薬物と薬品
投与する目的でｒＦVIIａ を用いた。物質を０．６mg／mlを与えるように滅菌Ｈ2 Ｏ中に溶解させた。他の薬品は全て商業資源から得られ、それらは分析用の等級である。
【００６９】
実験の計画
動物に下記のとおり、一週間のウォシュアウト期間をあけて静脈（ｉ．ｖ．）を１回そして、皮下に１回投与した。
【表３】
0005090605.tif 000004
投与は０．３３ml／kg体重に対応する０．２mg／kg体重であった。
静脈投与は耳の静脈において（注射）針又は短いカテーテルを介して与えた。投与直後（注射）針／カテーテルを２〜５ml滅菌、等張水により洗い流した。
皮下投与を耳翼の後側に行った。投与する領域はカラーマーカーで印をつけた。
【００７０】
血液及び組織の採取
血液試料を頸部静脈／双頸静脈幹の鍼穴により収集した。静脈投与に関連して、試料を予め及び投与の後６，１５，３０，６０及び９０分並びに２，３，４，６及び８時間後に採取した。皮下投与の後、試料を３０，６０分及び２，３，４，５，６，８，１０，１２，１４及び２４時間並びに投与前に採取した。
【００７１】
全ての血液試料を、計画した時間の後２分後に採取した２つの試料（動物番号４、皮下投与後１４及び２４時間後）を除いて、規定時間から１分以内に抽出した。
【００７２】
血液試料（３ml）を安定化の為にクエン酸を含むバキュテイナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）中で採取し遠心（１０分、＋４℃、約×１２６８Ｇ）迄氷水中で維持した。２つのアリコート各１５０Ｔ１を各試料から採出した。一方のアリコートに対しＥＬＩＳＡアッセイの為に用いた１３５０Ｔ１の緩衝剤を添加し、そして、混合物を同定とは別に「ＥＬＩＳＡ」と表示した２つのナンククリオチューブ（Ｎｕｎｃ  Ｃｒｙｏｔｕｂｅ）に分け、アッセイの為の免疫化学的な部門への移行を持つ間、約−２０℃で保存した。他のアリコートに対しては凝固アッセイの為に用いた１３５０μｌの緩衝剤を添加し、そして、混合物を２つのナンククリオチューブに分けた。同定とは別にチューブを「クロット」で表示し、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋの、アッセイの為の免疫化学的な部門への移項を待つ間−８０℃で保存した。緩衝剤を試料採収後０．５時間以内に添加し、当該試料を採収後１時間以内に凍らせた。
【００７３】
第二投与翌日、全ての動物をメブマル（ｍｅｂｕｍａｌ）の腹腔内注射より麻酔し放血にさせ殺した。皮下注射部位を確認し、顕微鏡によって検査し、代表試料を採取し、リン酸緩衝化した中性の４％ホルムアルデヒド中で固定化した。次いでＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋの組織病理学試験の為の病理学部門へ移した。
【００７４】
解析方法
ｒＦVIIａ の濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、そして凝固アッセイによりｒＦVIIａ の活性を決定した。
【００７５】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡアッセイはキット折込番号、１９９４．０９／ｄｂバージョン１．０（デンマークバージョン）に記載通りにして実施するＦVII ：Ａｇ  ＥＬＩＳＡとした。アッセイは予めヒト及びラットの血しょうに関して有効性が確認されている。予備検証は、ブタの血しょうにおける解析の為のアッセイを用いることによる問題の兆候を何も示さなかった。
【００７６】
アッセイは、標識酵素としてペルオキシダーゼを用いる２サイトモノクローナル免疫酵素学的アッセイである。ミクロタイターウェルは予め特異的な抗因子VII モノクローナル抗体でコーティングされている。その後試料及び酵素で標識した抗体をどちらもウェルに加える。次の段階の間、「サンドイッチ」が、固相抗体、因子VII 分子と酵素で標識された特異的な因子VII モノクローナル抗体の間で形成される。未結合の酵素で標識した抗体が除去される洗浄段階に続いて、結合したペルオキシダーゼの活性を、酵素の、無色基質を有色生成物に転化する能力により測定する。着色の進行を硫酸の添加により停め、そして４９２nmで測定する。標準として、このアッセイに導入されたｒＦVIIａ を用いた。標準の較正は２８０nmでの吸光度測定に基づく。
【００７７】
凝固アッセイ
凝固アッセイはＦVIIａ キットの折込に従い実施するＦVIIａ ：Ｃｌｏｔ（スタゴ（ｓｔａｇｏ））とした。このアッセイは既にヒト及びラット血しょうに対して有効性が確認されている。予備検証では、ブタの血しょうにおける解析用のアッセイを用いることによる何の問題の兆候も示さなかった。
【００７８】
組換え溶解性組織因子（ｒｓＴＦ）はＦVIIａ に対して特異的な補因子機能を有する。従って、試験血しょう中に存在するＦVII は、アッセイにおいて干渉しない。ＦVIIａ 、リン脂質及びＣａ2+の存在においてｒｓＴＦは、血しょうの凝固を引き起こす。観察された凝固時間は、初期に血しょう中に存在するＦVIIａ レベルと反比例の関係をもつ。標準としてこのアッセイに導入されたｒＦVIIａ を用いた。標準の較正は国際ＦVIIａ 標準品との比較に基づく。
【００７９】
データの解析
ＥＬＩＳＡ及び凝固解析による結果をＰＣに基部を置くソフトウェアウィンノンリン（Ｗｉｎ  Ｎｏｎｌｉｎ）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎｃ．）を用いる非細分化薬物動態学的アッセイに掛けた。
【００８０】
結果と考察
ＥＬＩＳＡ及び凝固解析からの結果を別表Ａに与えている。個々の血しょう濃度の特性を図１及び図２に与えている。一方個々の薬物動態学的パラメーターを表１及び２に与えている。
【００８１】
前記投与試料はどれも測定可能な濃度又は活性を有さず、２つの投与期間の間での十分なウォシュアウトを示唆する。
【００８２】
血しょう濃度及び活性特性（図１〜２）は、濃度及び活性それぞれについてのｔmax 平均６．５（５〜８時間の幅）及び４．０（１．０〜１０．０の幅）をもたらす皮下投与の後の延長吸収段階を示す。
【表４】
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【表５】
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【００８３】
結果的に、Ｃmax 値は静脈内投与の後のものと比較して大幅に減少した（表１及び２）。皮下投与後のＡＵＣは静脈投与後のそれらと比較して減少した（表１及び２）。しかし、生物学的利用能の程度は、それぞれＥＬＩＳＡ及び凝固解析結果から見積られると同じように平均ｆが４１．７％（幅２８．８〜６０．０％）及び４０．０％（幅２６．６〜５４．２％）であり、程々良かった。
【００８４】
皮下投与後の半減期は、全ての動物に対して濃度並びに活性に関して、静脈投与後に比べて増加をもたらした（表１及び２）。その理由には、吸収速度が除去速度より一層緩やかであることを意味する、いわゆる「フリップフロップ（ｆｌｉｐ  ｆｌｏｐ）」が有望である。皮下投与後の半減期はそれ故、除去速度よりむしろ吸収速度の測定（によるもので）ある。
【００８５】
結論
ミニブタに対する皮下投与後のｒＦVIIａ の生物学的利用能率は、この投与経路をヒトにおいて注目させるに十分高かった。皮下投与後の吸収段階はある程度延長された。その程度とはヒトにおいて静脈投与に関して要される投与時間と比較して、有為に投与間隔（時間の）の増加を可能にしうる程度である。
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１ａ〜ｄ】  ミニブタ（番号ａ〜ｄ）に対する０．２mg／kgの静脈（ｉ．ｖ．）及び皮下（ｓ．ｃ．）投与後のｒＦVIIａ の各血しょう濃度の特性を示している。
【図２ａ〜ｄ】  ミニブタ（番号ａ〜ｄ）に対する０．２mg／kgの静脈（ｉ．ｖ．）及び皮下（ｓ．ｃ．）投与後のｒＦVIIａ の個体の血しょう活性の特性を示している。
【図３】  野生型因子VII のアミノ酸残基の配列を示している。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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