(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロール調節エレメント結合タンパク質ＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型に基づき、牛体脂肪における不飽和脂肪酸含有量の多寡を判定し、その結果に基づき、風味及び食感の良い牛肉が得られる牛かどうかを評価判定する方法であって、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の第５イントロンの多型を検査することによってＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型を決定し、配列番号4の塩基配列において、173〜256番目に位置する配列が欠損した配列を含むアレルを有する牛は、配列番号4の塩基配列を含むアレルを有する牛に比べて、風味及び食感の良い肉質を持つと評価する方法。
【請求項２】
請求項１記載の判定方法であって、被検体の牛から調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号4の塩基配列において、173〜256番目に位置する部分を挟む遺伝子領域を増幅する工程と、得られた増幅断片の長さによりＳＲＥＢＰ―１の遺伝子型を決定する工程とを含む判定方法。
【請求項３】
請求項２記載の判定方法であって、上記増幅工程において配列番号１の塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅を行うことを特徴とする判定方法。
【請求項４】
請求項２記載の判定方法であって、被検体の牛毛から調製したゲノムＤＮＡを鋳型に使用することを特徴とする判定方法。
【請求項５】
請求項１記載の判定方法であって、ＤＮＡチップを用いて第５イントロンの多型を検査することを特徴とする判定方法。
【請求項６】
ステロール調節エレメント結合タンパク質ＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型と、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ（ＳＣＤ）の遺伝子型との組み合わせに基づき、牛体脂肪における不飽和脂肪酸含有量の多寡を判定し、その結果に基づき、風味及び食感の良い牛肉が得られる牛かどうかを評価判定する方法であって、被検牛の配列番号4の塩基配列において、173〜256番目に位置する配列が欠損した配列を含むアレル数と、ＳＣＤ遺伝子型の「Ａ型」のアレル数とを合わせた数が３個以上の場合、より風味及び食感の良い肉質を持つと評価する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、牛肉の風味や食感の良さ等に関する遺伝子判定法に関し、より詳細には、ステロール調節エレメント結合タンパク質ＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型に基づき、風味や食感の良い牛肉が得られる牛かどうか等を評価判定する方法に関するものである。本発明は、特に、畜産（牛の育種・改良・繁殖・肥育等）、牛肉の生産加工、流通等の諸分野に有用な技術を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
牛の体脂肪の不飽和度は、牛肉の肉質における食感や風味に関係することが知られている。一般に、体脂肪の不飽和度が高いと融点が低く、牛肉を口に入れたときに口溶けの良い食感や風味を与える肉質ということができる。【０００３】
しかし、牛がこのような肉質を持つかどうかを判定するためには、実際にその牛肉を食して調べる感応試験などによるほかなく、より客観的で簡易かつ効率的な判定方法、例えば、牛の特定の遺伝子型に基づいて簡易にその牛肉の肉質を判定するといった検査方法は従来存在しなかった。【０００４】
ところで、牛の体脂肪を不飽和化する酵素として、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ（stearoyl-CoA desaturase（ＳＣＤ））が知られている。この酵素は、生体内において脂質の生合成や分解に重要な役割を果たすステアロイル-CoAを不飽和化する酵素であり、ウシ（Bos taurus）ＳＣＤの遺伝子配列およびアミノ酸配列については、下記の非特許文献１に記載されている。【０００５】
本発明者らは、このＳＣＤの遺伝子型に基づき、牛体脂肪中の不飽和脂肪酸含有量が多いか少ないかを判定し、さらに風味や食感の良い肉質を持つ牛かどうかを評価判定する方法について、下記の特許文献１において提案している。
【特許文献１】特開２００４−２６１０１４号公報
【非特許文献１】DDBJ/EMBL/GenBank databases：アクセッション番号ＡＢ０７５０２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、牛の体脂肪の不飽和度（換言すれば、不飽和脂肪酸含有量の多寡）は、牛肉の風味や食感等に関係しており、牛の特定の遺伝子型に基づいて不飽和脂肪酸含有量の多寡を判定することができれば、その牛肉の風味や食感等を簡易に検査できることにもなる。そして、このような遺伝子型に基づく判定方法は、単に風味や食感の良い肉質を持つ肉用種（肉牛）の選別に役立つばかりでなく、例えば種付けの際、遺伝子型に基づき分類された、より風味や食感の良い肉質を持つ牛同士を交配させる等して、牛の育種や品種改良などにも有用である。【０００７】
また、牛の体脂肪の不飽和度は、牛肉の摂食によるコレステロール蓄積とも関係しており、牛肉を主食とする欧米先進国において特に重要視されている牛の重要な形質である。このような健康面、病気予防の点からも、遺伝子型に基づき不飽和脂肪酸含有量の多寡を判定する方法は、その有用性が高いものと考えられる。【０００８】
本発明者らによって提案された上記ＳＣＤの遺伝子型に基づく判定法は有用であるが、ＳＣＤ遺伝子型の相違からは評価困難なケースも存在し、この方法とは異なる新たな遺伝子判定法の開発が望まれていた。新規遺伝子判定法は、ＳＣＤ遺伝子型に基づく判定法等と組み合わせることによって、より優れた評価判定法の提供が期待できる。【０００９】
本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、その目的は、牛の遺伝子型に基づいて脂肪中の不飽和脂肪酸含有量の多寡を簡易かつ精度良く判定するための新規な遺伝子判定法を提供すること、さらに、その判定結果に基づいて牛肉の風味や食感等を評価判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
不飽和脂肪酸含有比は種間で異なり、黒毛和種は、ホルスタイン種に比べて不飽和脂肪酸含有比が高く、脂肪の融点が低い。それゆえ、黒毛和種は口溶けの良いやわらかな肉質を持つのであるが、解析の結果、このような不飽和脂肪酸含有比の相違はＳＣＤ遺伝子の発現量に関係するのではないかと考えられた。本発明者らは更なる検討の結果、ＳＣＤ遺伝子の上流制御領域にはＳＲＥ（sterol regulatory element）配列が存在し、この配列に結合する転写因子ＳＲＥＢＰ−１（sterol regulatory element binding protein：ステロール調節エレメント結合タンパク質）の遺伝子発現量がＳＣＤ遺伝子の発現量と相関すること、および、このＳＲＥＢＰ−１遺伝子には第５イントロンが長いタイプ（Ｌ型）とそれより８４塩基短いタイプ（Ｓ型）の多型が存在し、黒毛和種にみられるＳ型のほうが牛体脂肪の不飽和脂肪酸含有比が高く、脂肪の融点が低いことを見出した。また、これらの解析に伴い、ウシＳＲＥＢＰ−１の遺伝子配列およびアミノ酸配列を明らかにし、本発明を完成させるに至った。【００１１】
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｌ）の発明を包含するものである。
Ａ）  ステロール調節エレメント結合タンパク質ＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型に基づき、牛体脂肪における不飽和脂肪酸含有量の多寡を判定し、その結果に基づき、風味や食感の良い牛肉が得られる牛かどうかを評価判定する方法。
Ｂ）  上記Ａ）記載の判定方法であって、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の第５イントロンの多型を検査することによってＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型を決定し、当該イントロンが短い「Ｓ型」のアレルを有する牛は、当該イントロンが長い「Ｌ型」のアレルを有する牛に比べて、風味や食感の良い肉質を持つと評価する方法。
Ｃ）  上記Ｂ）記載の判定方法であって、被検体の牛から調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして、第５イントロンの多型に関係する８４塩基の欠損部分を挟む遺伝子領域を増幅する工程と、得られた増幅断片の長さによりＳＲＥＢＰ―１の遺伝子型を決定する工程とを含む判定方法。
Ｄ）  上記Ｃ）記載の判定方法であって、上記増幅工程において配列番号１の塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅を行うことを特徴とする判定方法。
Ｅ）  上記Ｃ）記載の判定方法であって、被検体の牛毛から調製したゲノムＤＮＡを鋳型に使用することを特徴とする判定方法。
Ｆ）  上記Ｂ）記載の判定方法であって、ＤＮＡチップ等の遺伝子多型検出器具を用いて第５イントロンの多型を検査することを特徴とする判定方法。
Ｇ）  ステロール調節エレメント結合タンパク質ＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型と、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ（ＳＣＤ）の遺伝子型との組み合わせに基づき、牛体脂肪における不飽和脂肪酸含有量の多寡を判定し、その結果に基づき、風味や食感の良い牛肉が得られる牛かどうかを評価判定する方法。
Ｈ）  上記Ｇ）記載の判定方法であって、被検牛のＳＲＥＢＰ−１遺伝子型の「Ｓ型」のアレル数と、ＳＣＤ遺伝子型の「Ａ型」のアレル数とを合わせた数が３個以上の場合、より風味や食感の良い肉質を持つと評価する方法。
ここで、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子型の「Ｓ型」とは、上記Ｂ）と同じく、第５イントロンが短い「Ｓ型」アレルのことである。また、ＳＣＤ遺伝子型の「Ａ型」とは、特開２００４−２６１０１４号公報の記載と同じく、同遺伝子のｃＤＮＡ配列中、第８７８番目に相当する塩基がシトシン（Ｃ）の場合で、コードするアミノ酸がアラニン（Ala）となる「Ａ型」のことである。同公報に記載されるように、「Ａ型」のハプロタイプを有するかどうかを調べる場合、第８７８番目に相当する塩基を直接調べる方法以外に、他の一塩基多型（ＳＮＰ）の塩基、具体的には、ＳＣＤ遺伝子のｃＤＮＡ配列中、第７０２番目、第７６２番目、第１９０５番目、第３１４３番目、第３３５１番目、第３５３７番目および第４７３６番目のいずれかに相当する塩基を調べることによって、遺伝子型が「Ａ型」か「Ｖ型」かを間接的に調べることが可能である。
Ｉ）  以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるウシＳＲＥＢＰ―１タンパク質。
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＲＥ配列に結合し、転写制御活性を有するタンパク質。
Ｊ）  上記Ｉ）記載のタンパク質をコードするウシＳＲＥＢＰ―１遺伝子。
Ｋ）  以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである上記Ｊ）記載の遺伝子。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列中、第２２〜３３２４番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列中の少なくとも１００塩基以上の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＳＲＥ配列に結合し、転写制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
Ｌ）  上記Ｋ）記載の遺伝子が導入されたトランスジェニックウシ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子がＬ型Ｓ型いずれであるかを検査することで、牛体脂肪の不飽和度、さらに牛肉の風味や食感の良さ（やわらかさ）を評価判定することができる。検査は、ＰＣＲ法などにより、例えば牛毛から簡易にＬ型かＳ型かを判別可能である。本判定法とＳＣＤ遺伝子型による判定法とを組み合わせることで、更に優れた遺伝子判定法を提供することができる。
牛体脂肪の不飽和度は、牛肉の風味に影響すると同時に、牛肉を主食とする欧米先進国において、コレステロールの蓄積を少なくする要因として重要視される牛の重要な形質である。本判定法は、牛の個体識別や種牛の選定をはじめ、畜産（牛の育種・改良・繁殖・肥育等）、牛肉の生産加工、流通などに利用できる有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】筋間脂肪組織中のＳＣＤ遺伝子の発現量と、一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）含有量との関係を示すグラフである。
【図２】各品種についてＳＣＤ遺伝子発現量の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。
【図３】経時的に取得した各品種の複数のサンプルについて、ＭＵＦＡ含有量とＳＣＤ遺伝子発現量との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図４】ＳＣＤ遺伝子上流の制御領域にある転写制御配列を示す図である。
【図５】ＳＣＤ遺伝子発現量とＳＲＥＢＰ−１遺伝子発現量との相関を示すグラフである。
【図６】ＳＲＥＢＰ−１遺伝子のゲノム構造と第５イントロンの欠損部分を説明する図である。
【図７】黒毛和種およびホルスタイン種の各品種について、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型を判定した結果を示す図である。
【図８】ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型を判定した結果、および、各遺伝子型について不飽和脂肪酸含有量および融点を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
［１］本発明の判定方法
本発明の判定方法は、前述のように、ＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型に基づき、牛体脂肪における不飽和脂肪酸含有量の多寡を判定し、その結果に基づき、風味や食感の良い牛肉が得られる牛かどうかを評価判定する方法である。【００１５】
本明細書において、「牛」とは、ウシ属（Bos）に属する動物を意味するが、特に家畜牛（Bos primigenius）を意味するものとする。この「家畜牛」には、ヨーロッパ牛（Bos taurus）とインド牛（Bos indicus）とが含まれ、ヨーロッパ牛（Bos taurus）には、黒毛和種（Japanese Black）、褐毛和種、無角和種、日本短角種などの和牛、及び、ホルスタイン種、ジャージー種、肉用ショートホーン種、ヘレフォード種、アバデイーンアンガス種などのヨーロッパ家畜牛が包含されるものとする。判定対象（被検体）となる「牛」は、上記いずれの肉用種（肉牛）であってもよい。【００１６】
また、本明細書において、「ＳＲＥＢＰ−１（sterol regulatory element binding protein：ステロール調節エレメント結合タンパク質）」とは、ＳＣＤ遺伝子の上流に存在するＳＲＥ配列（図４参照）に結合し、転写制御活性を有する牛由来の転写因子である。配列番号５には、本発明者らが黒毛和種から単離しその配列を決定したＳＲＥＢＰ−１遺伝子のｃＤＮＡ配列が、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域によってコードされるアミノ酸配列と共に示される。また、配列番号６には、ＳＲＥＢＰ−１タンパク質のアミノ酸配列が単独で示される。【００１７】
図６は、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子のゲノム構造を模式的に示すものであり、同図に示すように、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子は、１９個のエクソンと１８個のイントロンからなる。そして、第５イントロン（イントロン５）の塩基配列において、下線部の８４塩基については、当該部分を有する遺伝子型とこれを欠失する遺伝子型の多型が存在することが判明した。この８４塩基の部分を便宜上「欠損部分」と称する。また、この欠損部分を有し、第５イントロンが長い遺伝子型を便宜上「Ｌ型」と称する一方、この欠損部分を欠き、第５イントロンが短い遺伝子型を便宜上「Ｓ型」と称することとする。欠損部分は、「Ｌ型」において、第５イントロンの第８５〜１６８番目の配列に相当する。【００１８】
このように、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型には「Ｌ型」と「Ｓ型」の２つのタイプが存在することが分かったが、さらなる調査検討の結果、上記ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型と牛体脂肪の不飽和度（換言すれば、不飽和脂肪酸含有量の多寡）とが関連することを見出した。即ち、上記「Ｌ型」と「Ｓ型」との間で、牛の体脂肪の不飽和度が有意に異なることが判明した。結果の詳細は後述の実施例において説明するが、被検体の牛の体脂肪における一価不飽和脂肪酸（MUFA）含有量の割合は、Ｓ型のＳＲＥＢＰ−１遺伝子をホモで有する場合（Ｓ／Ｓ）が最も高く、次いでＬ型とＳ型のＳＲＥＢＰ−１遺伝子をヘテロで有する場合（Ｌ／Ｓ）、Ｌ型のＳＲＥＢＰ−１遺伝子をホモで有する場合（Ｌ／Ｌ）の順に高い値を示した（図８）。【００１９】
前述のように、牛の体脂肪の不飽和度は、牛肉の肉質における食感や風味に関係しており、一般に、体脂肪の不飽和度が高いと融点が低く（図８）、牛肉を口に入れたときに口溶けの良い食感や風味を与える肉質ということができる。したがって、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型が（Ｓ／Ｓ）の牛は、（Ｌ／Ｌ）の牛に比べて風味や食感の良い肉質を持つと評価することができる。このように、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型を調べることにより、体脂肪の不飽和度、脂肪酸組成のみならず、より風味や食感の良い牛肉が得られる牛かどうかを判定することが可能になる。【００２０】
本発明の判定方法において、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型を調べる方法は特に限定されるものではなく、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子上の前記欠損部分の有無を直接的または間接的に調べることが可能な従来公知の方法を適用することができる。ＰＣＲ法を用いて前記欠損部分の有無を検査することによりＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型を調べる方法は簡易な方法であり、精度も良好であるので、以下ではこの方法について簡単に説明する。【００２１】
［２］ＰＣＲ法によるＳＲＥＢＰ−１遺伝子型の判定方法
判定に供する遺伝子試料は、ゲノムＤＮＡであるが、被検体の牛（屠殺前後を問わない）の任意の器官・組織・細胞（血液、羊水中の細胞、採取した組織等を培養した細胞を含む）から常法に従ってＤＮＡを精製・抽出すればよい。後述の実施例では血液組織からゲノムＤＮＡを調製している。なお、ＰＣＲ法による遺伝子増幅が可能な限りにおいて、ＤＮＡの精製・抽出工程は省略又は簡略化してもよい。【００２２】
次に、欠損部分の有無による遺伝子型の同定（遺伝子タイピング）のため、上記の方法で調製したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法を行い、欠損部分を挟む遺伝子領域を増幅する。その後、得られた増幅断片の長さによりＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型を判定する。【００２３】
上記ＰＣＲ法における各条件、使用する試薬・プライマーなどは特に限定されるものではないが、以下では、後述の実施例において使用した条件等について説明する。【００２４】
ＰＣＲ反応液の組成は、ゲノムDNA20ngに、TaKaRa Ex TaqTM polymerase HS 0.5 Unit、10×Taq polymerase buffer 2.0μl、25mM dNTP mix 1.6μl、フォワードプライマー（10pmol）及びリバースプライマー（10pmol）各1.0μlを加えたものを超純水で20μlにメスアップした。使用したプライマー等は、以下のとおりである。【００２５】
設計したフォワードプライマー及びリバースプライマーの配列はそれぞれ下記(a),(b) に示すとおりである。
(a) 5’- CCACAACGCCATCGAGAAACGCTAC -3’（配列番号１）
(b) 5’- GGCCTTCCCTGACCACCCAACTTAG -3’ （配列番号２）【００２６】
上記フォワードプライマーの配列は、欠損部分の上流、第５エクソン内の塩基配列（配列番号４の１〜２５番目）をもとに設計したものであり、上記リバースプライマーの配列は、欠損部分の下流、第５イントロン内の塩基配列（配列番号４の４０８〜４３２番目）をもとに設計したものである。なお欠損部分は、配列番号４の配列において、これら塩基配列の間の１７３〜２５６番目に位置する。【００２７】
ＰＣＲの反応条件は、まず、（１）９４℃２分、次に、（２）９４℃３０秒、６５℃  ３０秒、７２℃１分を１サイクルとして、これを３０サイクル行い、最後に、（３）７２℃７分、に設定した。【００２８】
上記ＰＣＲ法によって、前記欠損部分の有無に応じて長さの異なるＰＣＲ増幅産物が得られる。得られたＰＣＲ増幅産物をマーカー等と一緒に電気泳動することによってＬ型かＳ型かを容易に検出できる。【００２９】
図７・図８には、実際に行った電気泳動の結果が示される。試料の遺伝子型がＬ型をホモで有する「ＬＬ」の場合は４３２ｂｐの１本のバンドのみとなり、Ｓ型をホモで有する「ＳＳ」の場合は３４８ｂｐの１本のバンドのみとなり、Ｌ型とＳ型をヘテロで有する「ＬＳ」の場合は両方のバンドが現れる。このように、ＰＣＲ法によれば簡便かつ精度良くＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型を調べることができる。【００３０】
［３］本発明の判定方法の変更態様
前述したように、本発明の判定方法は、上記［２］のＰＣＲ法に限定されるものではない。例えば、ＰＣＲ法により判定するにしても、各反応条件、使用する試薬・プライマーなどは様々に変更可能である。【００３１】
勿論、本発明の判定方法は、ＰＣＲ法以外の方法を使用してもよい。一例としてＤＮＡチップ等の遺伝子多型検出器具を用いた判定方法を挙げることができる。この方法では、例えば前記欠損部分中の塩基配列と特異的にハイブリダイズするプローブを基板上に配置したＤＮＡチップ（または同種の器具）を作製し、このＤＮＡチップ等を用いて被検体からの遺伝子試料とプローブとのハイブリダイゼーションシグナルの有無により、遺伝子のタイピングを行う。プローブには、欠損部分中の塩基配列またはその相補配列を用いることができる。なお、ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。【００３２】
その他にも、本発明の判定方法として、欠損部分中の配列を認識切断する制限酵素を用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などを用いて欠損部分の有無を検出してもよいし、本発明の判定方法において、ＰＣＲ法以外の他の増幅方法（例えば、ＲＣＡ法など）を用いてもよい。また、電気泳動の代わりに、ＤＮＡ増幅後に塩基配列決定装置（シークエンサー）などで直接増幅断片の塩基配列を決定し、遺伝子のタイピングを行ってもよい。【００３３】
牛からの試料（サンプル）の取得方法は特に限定されるものではないが、牛毛から遺伝子試料を取得することは、牛に傷害を与えず好ましい方法である。【００３４】
尚、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の塩基配列は、ウシ属（Bos）に属する動物間、さらにヨーロッパ牛（Bos taurus）に属する動物間でも、前記第５イントロンの多型以外に変異（多型）が生じている可能性がある。ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の発現量はＳＣＤ遺伝子の発現量と相関する（図５）ことから、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子上のこのような変異（多型）が牛の体脂肪の不飽和度と関係し、当該変異（多型）を調べることで、体脂肪の不飽和度ひいては牛肉の風味等を評価できる可能性がある。当該変異（多型）が例えばＳＲＥＢＰ−１遺伝子のＯＲＦ上の変異であれば、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、当該変異（多型）を検出することも可能である。また、遺伝子上流の制御領域の変異であれば、当該箇所のゲノムの塩基配列を比較することで、有効な遺伝子型を知ることができる。【００３５】
［４］本発明の利用分野（有用性）
前述のように、本発明は、牛の個体識別や種牛の選定をはじめ、畜産（牛の育種・改良・繁殖・肥育等）、牛肉の生産加工、流通等の分野に利用可能である。例えば、黒毛和種などの肉用種（肉牛）について、より風味や食感の良い肉質を持つ牛かどうかを評価することができる。さらに、この評価結果をもとに、例えば種付けの際、遺伝子型に基づき分類された、より風味や食感の良い肉質を持つ牛同士を交配させる等して、牛の育種や品種改良などにも利用できる。【００３６】
尚、牛の体脂肪の不飽和度は、牛肉の摂食によるコレステロール蓄積とも関係しており、このような健康面、病気予防の点からも、本発明の判定方法により体脂肪の不飽和度を判定する方法は、その有用性が高い。例えば、低い融点の脂肪を持つ牛肉は、牛肉を主食とする欧米諸国において、健康に良いヘルシー牛肉の生産や販売に繋がるものとして重要である。【００３７】
さらに、遺伝子組換え法などを用いて牛の品種改良を行ったり、畜産等の分野に有用な遺伝子実験を行う場合にも、対象となる牛や精子、受精卵などの選別に本発明の判定方法を利用できる。その他、出産前の判定も可能であり、例えば子宮の羊水から牛胎児由来の細胞を採取し、その細胞から遺伝子試料を調製し、より風味や食感の良い肉質を持つ牛かどうか等を判定すればよい。【００３８】
また、本発明の判定方法を、ＳＣＤ遺伝子型による判定法と組み合わせることで、更に良好な判定が可能である（例えば、後述の表３参照）。この場合、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子型の「Ｓ型」と、ＳＣＤ遺伝子型の「Ａ型」（特開２００４−２６１０１４号公報参照）との組み合わせが、不飽和度が高く、融点が低く、口溶けのよい牛肉を持つ牛と評価できる。特に、Ｓの数とＡの数の合計が、３個以上であると、融点が顕著に下がり、不飽和脂肪酸が多くなる傾向がある。【００３９】
［５］ウシＳＲＥＢＰ−１遺伝子とそのタンパク質
ウシＳＲＥＢＰ−１の遺伝子・タンパク質は、本発明者らによってはじめてクローニングされ、その配列が決定された新規遺伝子・新規タンパク質であり、これらも本発明に含まれる。【００４０】
本発明のタンパク質には、（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＲＥ配列に結合し、転写制御活性を有するタンパク質、が含まれる。【００４１】
本発明の「ウシＳＲＥＢＰ−１タンパク質」は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、たとえばHis やMyc 、flag等によってエピトープ標識されるような場合が挙げられる。【００４２】
また、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の変異タンパク質作製法により欠失、置換及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。【００４３】
本発明の遺伝子は、本発明のウシＳＲＥＢＰ―１タンパク質をコードする遺伝子であり、（ａ）配列番号５に示される塩基配列中、第２２〜３３２４番目の塩基配列を有するＤＮＡ、および（ｂ）配列番号５に示される塩基配列中の少なくとも１００塩基以上（好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＳＲＥ配列に結合し、転写制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、が含まれる。【００４４】
本発明の「遺伝子」としてはｃＤＮＡが好ましいが、特に限定されるものではなく、ＲＮＡであってもゲノムＤＮＡであってもよい。また、本発明の「遺伝子」は、ウシＳＲＥＢＰ―１タンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。【００４５】
上記「ストリンジェントな条件下」でのハイブリダイゼーションは、たとえばMolecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocols in Molecular Biology; Wiley Interscienceに記載の方法によって行うことができ、具体的には以下の方法が例示される。【００４６】
ｃＤＮＡライブラリー等のＤＮＡ分子を膜に転写し、これと標識したプローブ（即ち、上記「相補的な塩基配列からなるＤＮＡ」）とをハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、たとえば０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０容のブロッキング試薬、および２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては、たとえば１００×Denhardt's solution 、２％（重量／容量）Bovine serum albumin、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５培濃度で調製したものを１／２０に希釈して使用する。【００４７】
ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、またはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は、好ましくは０．１〜６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液であり、ＳＳＣの濃度を変えながら洗浄バッファーで数回膜を洗浄する。その後、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子を、プローブに付された標識を利用して検出する。【００４８】
本発明の遺伝子・タンパク質は牛の研究用に広く利用することができるが、トランスジェニックウシの作出などにも利用できる。トランスジェニックウシは、公知のトランスジェニック技術（例えば、Science1998 Oct23;282(5389):751-4）により作出可能であり、本発明のウシＳＲＥＢＰ―１遺伝子を導入した細胞の核をウシの卵と融合させ、得られた胚を代理母ウシに移植する方法等を挙げることができる。
【実施例】
【００４９】
以下図面を参照しつつ、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。【００５０】
〔実施例１：不飽和脂肪酸含有量とＳＣＤ遺伝子発現量との関係〕
不飽和脂肪酸含有量は種間で異なり、黒毛和種は、ホルスタイン種に比べて不飽和脂肪酸含有量が高く、脂肪の融点が低い。このように不飽和脂肪酸含有量が相違する理由として、ＳＣＤ遺伝子の発現量が関係しているかどうかを検討するため、両者の関係について以下の実験を行った。【００５１】
牛の脂肪組織または筋肉組織から常法に従ってｍＲＮＡを精製・抽出した後、逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として、TaqManTMプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法を行うことで、ＳＣＤ遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）を定量した。使用したフォワードプライマー、リバースプライマー及びTaqManTMプローブの配列はそれぞれ下記(1), (2), (3) に示すとおりである。
(1) 5’- GTGATGTTCCAGAGGAGGTACTACAA -3’（配列番号７）
(2) 5’- AACGTTTCATCCCACAAGCATAGGA -3’（配列番号８）
(3) 5’- CCTGGTGTCCTGTTGTTGTGCTTCATCC -3’（配列番号９）【００５２】
上記実験の結果得られた筋間脂肪組織中のＳＣＤ遺伝子の発現量（相対値）と、一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）含有量（％）との関係が、図１のグラフに示される。また、頚部の筋肉をと殺時に採取し、そのＳＣＤ ｍＲＮＡ量とＭＵＦＡ含有量の牛品種間の差異を調べた結果を下記表１に示す。（表中の異なる肩文字は（危険率５％以下で）有意差を示す。以下同様。）
【表１】
0004893893.tif 000002
【００５３】
これらの実験の結果、品種間での不飽和脂肪酸含有量の相違に、ＳＣＤ遺伝子の発現量が関係している可能性が考えられたが、各品種の月齢をそろえて飼育し、更に以下の実験を行った。【００５４】
「黒毛和種」「ホルスタイン種」「Ｆ１雑種」の各品種とも、２６カ月の肥育牛からバイオプシー法で採取したサンプルを用いて、筋肉および皮下脂肪組織のＭＵＦＡ含有量とＳＣＤ遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）を調べた。結果を下記表２に示す。
【表２】
0004893893.tif 000003
【００５５】
各品種ともＳＣＤ遺伝子の発現量は筋肉組織より脂肪組織での方が多く、ＭＵＦＡ含有量との関連性も認められた。【００５６】
図２は、各品種についてＳＣＤ遺伝子発現量の経時的変化を調べた結果であり、サンプル取得時期が１０月と２６月の月齢のときに特に黒毛和種のＳＣＤ発現量が高く、有意な差異が認められた。【００５７】
また、サンプル取得時期が１０月、１６月、２１月、２６月、３１月の月齢のものをそれぞれＴ１〜Ｔ５として、黒毛和種（ＪＢ）、ホルスタイン種（Ｈｏｌｓ）、Ｆ１雑種（Ｆ１）の各品種について、ＭＵＦＡ含有量とＳＣＤ遺伝子発現量との関係を調べた結果を図３に示す。【００５８】
これらの実験結果から、不飽和脂肪酸含有量の相違にはＳＣＤ遺伝子の発現量が関係している可能性が考えられた。【００５９】
〔実施例２：ＳＣＤ遺伝子発現量とＳＲＥＢＰ−１遺伝子発現量との関係〕
ＳＣＤ遺伝子の発現量に影響する要因として、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子に注目した。その理由として、（１）図４に示すように、ＳＣＤ遺伝子の上流にはＳＲＥ配列が存在し、ＳＲＥＢＰ−１はこのＳＲＥ配列に結合し、ＳＣＤ遺伝子の転写制御活性を有すると考えられること、（２）第１９染色体および第２６染色体に体脂肪に関与するＱＴＬ（Quantitative Trait Loci）が存在し、また、第２６染色体上にはＳＣＤ遺伝子、第１９染色体上にはＳＲＥＢＰ−１遺伝子が存在することから、主としてＳＲＥＢＰ−１がＳＣＤ遺伝子の発現制御に関与している可能性が高いこと、が挙げられる。【００６０】
そこで、ＳＣＤ遺伝子発現量とＳＲＥＢＰ−１遺伝子発現量との相関を調べるため、上記と同様にリアルタイムＰＣＲ法を行い、ＳＣＤ遺伝子およびＳＲＥＢＰ−１遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）を定量した。ＳＲＥＢＰ−１ ｍＲＮＡの定量に使用したフォワードプライマー、リバースプライマー及びTaqManTMプローブの配列はそれぞれ下記(4), (5), (6) に示すとおりである。
(4) 5’- TCAACTGTTCCGCGAACATC -3’（配列番号１０）
(5) 5’- CATCTGAGAACTCCTTGTCCCCC -3’（配列番号１１）
(6) 5’- TCTTGGAGCGAGCACTGAATTGCGT -3’（配列番号１２）【００６１】
上記実験の結果、図５に示すように、ＳＣＤのｍＲＮＡ量とＳＲＥＢＰ−１のｍＲＮＡ量との相関が認められ、この結果から、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の発現量がＳＣＤ遺伝子の発現量に影響していると考えられた。【００６２】
〔実施例３：ＳＲＥＢＰ−１遺伝子より見出された多型とＭＵＦＡ含有量との関係〕
上記ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の変異の有無について解析を進めた結果、図６に示すように、第５イントロン（イントロン５）において、下線部の８４塩基を有する遺伝子型（Ｌ型）とこれを欠失する遺伝子型（Ｓ型）の多型が存在することが判明した。【００６３】
図７は、黒毛和種およびホルスタイン種の各品種について、上記ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の遺伝子型を判定した結果を示す。判定は前述のＰＣＲ法により行った。ＰＣＲ法に使用した試薬、反応条件などは前述したとおりであり、ここではその説明を省略する。同図に示すように、今回調査した範囲では、ホルスタイン種の遺伝子型はＬ型のみであった。【００６４】
図８も、上記判定方法により被検体の各牛の遺伝子型を決定した結果であるが、下段には、あわせて各遺伝子型について牛の不飽和脂肪酸含有量および融点を測定した結果をまとめた表が示される。この表に示すように、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子型の１要因で分散分析した結果、脂肪中の不飽和脂肪酸含有量は、遺伝子型がＳＳ型、ＬＳ型、ＬＬ型の順番で高い値を示した。なお、この表からもわかるように、不飽和脂肪酸含有量が高いと融点が低くなり、それだけ口溶けの良い柔らかな肉質が得られるものと考えられる。【００６５】
〔実施例４：ＳＲＥＢＰ−１遺伝子型とＳＣＤ遺伝子型とを組み合わせた判定〕
上記判定方法によりＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型を決定すると共に、特開２００４−２６１０１４号公報記載の方法にしたがって被検体の各牛のＳＣＤ遺伝子型を決定した。さらに、これら両遺伝子の遺伝子型の組み合わせと不飽和脂肪酸含有量および融点との関係を調査した結果を下記表３に示す。
【表３】
0004893893.tif 000004
【００６６】
この結果から、例えば、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子型の「Ｓ型」と、ＳＣＤ遺伝子型の「Ａ型」との組み合わせ、特に、Ｓの数とＡの数を合わせた数が３個以上の場合、不飽和度が高く、融点が低く、口溶けのよい牛肉を持つ牛と評価できる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
以上のように、本発明は、ステロール調節エレメント結合タンパク質ＳＲＥＢＰ−１の遺伝子型に基づき、風味や食感の良い牛肉が得られる牛かどうかを評価判定する方法等に関するものであり、前述のとおり、牛の個体識別や種牛の選定をはじめ、畜産（牛の育種・改良・繁殖・肥育等）、牛肉の生産加工、流通等の諸分野に利用することができ、種々の有用性を有するものである。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１：ウシＳＲＥＢＰ−１遺伝子型のタイピング用フォワードプライマー配列
配列番号２：ウシＳＲＥＢＰ−１遺伝子型のタイピング用リバースプライマー配列
配列番号３：ウシＳＲＥＢＰ−１の第５イントロンの欠損部分の配列
配列番号４：ウシＳＲＥＢＰ−１の第５エクソン〜第５イントロン〜第６エクソンの配列
配列番号５：ウシＳＲＥＢＰ−１のｃＤＮＡ配列とそれによってコードされるアミノ酸配列
配列番号６：ウシＳＲＥＢＰ−１のアミノ酸配列
配列番号７：ウシＳＣＤ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ用フォワードプライマー配列
配列番号８：ウシＳＣＤ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ用リバースプライマー配列
配列番号９：ウシＳＣＤ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ用TaqManTMプローブ配列
配列番号１０：ウシＳＲＥＢＰ−１ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ用フォワードプライマー配列
配列番号１１：ウシＳＲＥＢＰ−１ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ用リバースプライマー配列
配列番号１２：ウシＳＲＥＢＰ−１ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ用TaqManTMプローブ配列
【図１】
0004893893.tif 000005
【図２】
0004893893.tif 000006
【図３】
0004893893.tif 000007
【図４】
0004893893.tif 000008
【図５】
0004893893.tif 000009
【図６】
0004893893.tif 000010
【図７】
0004893893.tif 000011
【図８】
0004893893.tif 000012
【配列表】
0004893893000001.app