(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スピンプローブを用いるアルブミン含有試料のESR分光検出方法であって、以下の工程；
（ａ）前記試料のアリコートに、少なくとも３種類の濃度のアルブミン結合性スピンプローブと、それに加えて、少なくとも３種類の濃度の極性試薬を添加して、検査すべき試料中に特定のアルブミン分子の配座変化を誘発することにより、アルブミン含有試料中のアルブミンの輸送特性の変化を検出する工程；
（ｂ）スピンプローブ及び極性試薬と混合されたアリコートのESRスペクトルに基づきアルブミンの特異な結合位置におけるスピンプローブの結合パラメータの変化度を、スピンプローブの濃度及び極性試薬の濃度との関連においてESRスペクトルのコンピュータシミュレーションにより検出する工程；
（ｃ）スピンプローブ及び極性試薬の濃度の違いにより誘発されたアルブミンの配座状態についてスピンプローブの結合パラメータ値の変化からアルブミンの輸送特性の変化を算出する工程、
を含み、ここで、
(i)前記スピンプローブの前記濃度が、スピンプローブの濃度とアルブミンの濃度との比の平均値が２．０〜３．０になるように選択され、少なくとも２つの前記スピンプローブの濃度が、この平均値に基づきこの平均値との差が１．０以上となるようにさらに選択され、
(ii)前記極性試薬の前記濃度が、極性試薬の最終濃度の平均値が（０．３５×Cp）〜（０．８５×Cp）となるように選択され、ここで、Cpは極性試薬の臨界濃度であり、この臨界濃度は、アルブミンの変性が起こる極性試薬の最小濃度であり、少なくとも２つの前記極性試薬の濃度が、この平均値に基づきこの平均値との差が少なくとも１５％となるようにさらに選択され、及び
(iii)前記試料の各アリコートに添加される前記スピンプローブ及び前記極性試薬の濃度が、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが低濃度、極性試薬が低濃度になり、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが中濃度、極性試薬が中濃度になり、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが高濃度、極性試薬が高濃度になるように選択されること
を特徴とする方法。
【請求項２】
少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが高濃度、極性試薬が低濃度となるように、さらにスピンプローブ及び極性試薬の濃度の組合せを選択することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが低濃度、極性試薬が高濃度となるように、さらにスピンプローブ及び極性試薬の濃度の組合せを選択することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
アルブミン含有試料として血液試料又は薬剤試料を使用することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
スピンプローブとして、スピン標識付き脂肪酸を使用することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
極性試薬としてアルコール又はDMSOを使用することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
血液試料のアリコートのスピンプローブ結合のパラメータを異なる温度１５〜４５℃及び／又は異なるｐH値７．５〜３．５で検出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
アルブミンの結合パラメータをアリコート中でのスピンプローブの結合パラメータの比の数学的回帰法によりスピンプローブの濃度及び極性試薬の濃度の変化との関連において検出し、これらの結合パラメータからアルブミンの輸送特性の変化を算出することを特徴する請求項１記載の方法。
【請求項９】
診断すべき生理学的又は病理学的変化に応じて、特異なパラメータを、前記アルブミン含有試料から求められたアルブミンの結合パラメータから検出し、前記特異なパラメータを判別関数により求められた基準試料のカットオフ値と比較することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
請求項１により検出されたアルブミンの輸送特性の変化を原料及び／又は健康な被検査者の生の血清アルブミンの輸送特性と比較することにより、アルブミン含有製剤の品質の検出及び管理に利用されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を実施するための、少なくとも３つの試料容器を含むテストキットであって、前記各試料容器が、それぞれ相互に異なる濃度のスピンプローブ及びそれぞれ相互に異なる濃度の極性試薬を含有するアルブミン含有試料のアリコートをそれぞれ含み、ここで
(i)前記スピンプローブの濃度が、スピンプローブの濃度とアルブミンの濃度との比の平均値が２．０〜３．０になるように選択されたものであり、このうち少なくとも２つのスピンプローブの濃度が、この平均値に基づきこの平均値との差が１．０以上となるように選択されたものであり、
(ii)前記極性試薬の濃度が、極性試薬の最終濃度の平均値が（０．３５×Cp）〜（０．８５×Cp）となるように選択されたものであり、ここで、Cpは極性試薬の臨界濃度であり、この臨界濃度は、アルブミンの変性が起こる極性試薬の最小濃度であり、このうち少なくとも２つの極性試薬の濃度が、この平均値に基づきこの平均値との差が少なくとも１５％となるように選択されたものであり、及び
(iii)前記試料の各アリコートに添加する前記スピンプローブ及び前記極性試薬の前記濃度が、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが低濃度、極性試薬が低濃度になり、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが中濃度、極性試薬が中濃度になり、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが高濃度、極性試薬が高濃度になるように選択されたものである
ことを特徴とするテストキット。
【請求項１２】
少なくとも３つのキャビティ内に指定された濃度のスピンプローブ及び極性試薬を入れた微小滴定濃度プレートを含むことを特徴とする請求項１１記載のテストキット。
【請求項１３】
請求項１記載のESR分光検出方法において、前記方法の実施のために、ホール安定化システム付き遮蔽小型電磁石(２)、固有周波数ｆ0が９．４５±０．５ＧＨｚであり、９．４５±０．５ＧＨｚの周波数の２００〜４００ＭＨｚの領域における周波数同調用の制御主発振器付きUHFユニット(５)に結合された測定共鳴器(３)、装置制御・信号記録ユニット(９)、及び検査試料のサーモスタット制御用システム(７)からなるESR分光計を使用することと、しかも、検査試料のアリコートのスペクトル記録時の周波数差の補償に関する測定共鳴器(３)の制御のために、測定共鳴器(３)が共鳴器空隙体積変動による領域１０〜５０ＭＨｚにおける共鳴周波数同調用の別の制御装置に結合されていることとを特徴とする方法。
【請求項１４】
使用されるESR分光計のサーモスタット制御システム(７)が、電磁自己加熱による共鳴器内部の勾配の最小化による試料温度安定化の精度向上用の追加制御ループを含み、前記制御ループが電磁石への電流供給の制御によりスペクトル記録中断中の電磁石の自己加熱を制御し、電磁石の放熱により共鳴器が加熱されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
使用されるESR分光計内の共鳴器本体(３)が、アルブミンの場合３７±０．２℃である具体的な試料温度まで共鳴器を加熱する電磁石の電磁自己加熱の制御用の温度センサ(４)に接続されていることを特徴とする請求項１３又は１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医学、生物学、生物工学及び獣医学の分野において利用可能で、人間又は動物の身体内の生理学的又は病理学的変化の診断及び／又は監視、又はアルブミン含有製剤、特に血液製剤の品質管理に使用することができるアルブミン含有試料中のアルブミン輸送特性の変化の電子スピン共鳴（ESR）分光検出方法に関する。本発明による方法を実施するためのESR分光計も本発明の対象である。
【０００２】
【従来の技術】
疾病の診断に血液学的パラメータ又は抗原、ホルモン、酵素及びその他の生物学的活性物質に関するパラメータを利用することは公知であり、これは臨床化学的定型診断において幅広く利用されている。
NMR及びESR分光分析も疾病診断において血漿中のタンパク質及び脂質成分の把握に用いることができる。たしかに高分子中での運動プロセスの検査にスピンラベルを使用するESR分光分析を利用することは公知の技術水準ではあるが、これまでのところ臨床的定型診断へのこのテスト方法の幅広い導入に失敗しているのは、装置費用の高さ及び信号分析の複雑さ又は信頼性の低さにその原因がある。
SU 第１３１９７０５ A１号には、入れられたスピンプローブを結合する血清又は血漿の能力をESRにより測定することにより、悪性の疾病を診断する方法が記載されている。ピークAとピークBの振幅との比を表す結合係数αが検出される。α＞１の場合は、癌性疾患が存在する。α＜１の場合は、被検査者は健康である。
【０００３】
上記方法には、感度が十分ではなく、従って、信頼性の高い診断を行うことができないという欠点がある。この方法に関する研究の結果、早期疾病段階において診断結果が擬陽性及び擬陰性になる場合が≧３０％に達することが明らかになっている。
ＥＰ 第０９７３０４３ A１号には、血清中の悪性新生物のESR分光診断方法が記載されており、この方法では、スピン標識付き脂肪酸であるスピンプローブのスピンプローブ運動性の物理化学的パラメータをアルブミンの３つの結合位置で検出する。
アルブミンは血液輸送系における主成分であり、標的赤血球への脂肪酸、トリプトファン、ビリルビン、カルシウム、ステロイドホルモン及びその他の機能的に重要な作用物質の輸送を可能にし、その際、多数の毒素（内因性起源のものを含む）の結合及び配分に関与する。アルブミンは外因性（医薬品）及び内因性物質に対する結合能力が大きなポリペプチド（分子量６８０００）である。アルブミンは、ジスルフィド橋かけによりループ構造に配置された５８５のアミノ酸から構成されている。文献によれば、血清アルブミンとの結合位置は様々である。脂肪酸の場合は、アルブミン分子中にいわゆる結合位置１、２及び３が存在する。
【０００４】
ＥＰ 第０９７３０４３ A１号による診断方法の場合は、スピンプローブ結合のパラメータと健康な被検査者が示す数値との差により癌疾患を検出する。
ＥＰ 第０９７３０４３ A１号による方法では、癌性所見が存在する場合は健康な被検査者のものとは異なるアルブミンの具体的な生の配座状態が血液中で検出される。例えば、血液脂肪値の上昇、薬物摂取、スピンプローブ溶剤の影響又は空気中での血液試料保存のような、血液からの追加的な影響がアルブミンに及ぶ場合は、この方法により得られる結果が擬陽性又は擬陰性になることが明らかになっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、低コストで、迅速に実施可能で、上記影響を考慮に入れた上でアルブミンの配座に関する正確で再現可能な情報の提供を可能にし、臨床化学検査室業務に利用可能であるアルブミン含有試料、特に血液試料のESR分光検出方法を提供することにある。この方法は人間又は動物の身体内の生理学的又は病理学的変化の診断及び／又は監視、アルブミン含有材料、特に保存血液の品質管理、及びアルブミン分子の解毒能力の判定に適するものとする。この方法の効果的な実施のための装置を提供することも本発明の課題であった。
適当なスピンプローブを添加し、極性試薬を用いて検査すべき試料中に目標に合致したアルブミン分子の配座変化を誘発することにより、検査すべき試料中のアルブミンの輸送特性の変化をESR分光分析により検出することで、本発明の課題は解決される。ESRにより検出可能なアルブミンの特異な公知の結合位置へのスピンプローブのパラメータがアルブミン配座の生物物理学的パラメータと相関関係があることと、アルブミン配座の生物物理学的パラメータが人間又は動物の身体内又は輸液又は移植用製剤中の生理学的又は病理学的変化に関して信頼性の高い情報を提供することを可能にすることとが明らかになっている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、試料のアリコートに、少なくとも３種類の、好ましくは最大８種類の濃度のアルブミン結合性スピンプローブと、それに加えて、少なくとも３種類、好ましくは最大８種類の濃度の極性試薬を添加し、スピンプローブ及び極性試薬と混合されたアリコートのESRスペクトルに基づきアルブミンの特異な結合位置におけるスピンプローブの結合パラメータの変化度をESRスペクトルのコンピュータシミュレーションによりスピンプローブの濃度及び極性試薬の濃度との関連において検出し、スピンプローブ及び極性試薬の濃度の違いにより誘発されたアルブミンの配座状態についてスピンプローブの結合パラメータ値の変化からアルブミンの輸送特性の変化を算出し、しかも、スピンプローブの濃度とアルブミンの濃度の比の平均値が２．５±０．５になるように、添加すべきスピンプローブの濃度を選択し、この平均値に基づきこの平均値との差が１．０以上の少なくとも２つの濃度をさらに選択し、極性試薬の最終濃度の平均値が（０．６±０．２５）・Cpとなるように、添加すべき極性試薬の濃度を選択し、ここで、Cpは極性試薬の臨界濃度であり、この臨界濃度を超えた場合は、アルブミンの変性が起こることになり、この平均値に基づきこの平均値との差が少なくとも１５％となる少なくとも２つの極性試薬の濃度をさらに選択する。
【０００７】
その際、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが低濃度、極性試薬が低濃度になり、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが中濃度、極性試薬が中濃度になり、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが高濃度、極性試薬が高濃度になるように、試料の各アリコートに添加するスピンプローブ及び極性試薬の濃度を選択しなければならない（３スペクトル・スクリーニング分析）。好ましくは、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが高濃度、極性試薬が低濃度となるように、特に好ましくは、少なくとも１つのアリコートではスピンプローブが低濃度、極性試薬が高濃度となるように、さらにいくつかの濃度を選択することができる（８スペクトル分析）。この濃度の組合せにより、様々な段階における、すなわち、例えば脂肪酸のような疎水性化合物の結合時（スピンプローブは低濃度、極性試薬は低濃度）の生理学的状態、脈管系による疎水性化合物の輸送中（スピンプローブは高濃度、極性試薬は低濃度）の生理学的状態、及び標的赤血球への疎水性化合物の引渡し（放出）時（スピンプローブは高濃度、極性試薬は高濃度）の生理学的状態におけるアルブミンの輸送特性が確実に把握されることになる。
【０００８】
SU 第１３１９７０５号によれば、生の状態における血漿又は血清の結合係数の検出だけしか可能ではなく、ＥＰ 第０９７３０４３ A１号によれば、検査すべき試料中のアルブミンの具体的な生の状態が検出されるのに対して、本発明による方法は極性試薬の影響の下でアルブミン配座（配座運動性）の変化をその時間的推移において把握し、それとともにアルブミンの機能性及びアルブミンへの基質の結合パラメータの変化を把握する。かかる変化は、例えば、発癌のような病理学的経過、医学的処置、薬物乱用により、又は血漿成分の分画段階中及び血漿誘導体の不良保存時にも極めて早期に発生するので、本発明によれば、アルブミン機能性の変化の初期段階から明確な診断を下すことが可能である。ERS用媒質の物理化学的特性との関連で、血液試料中では、アルブミン配座が変化し、それにより、アルブミンへの一連の基質の結合特性が変化する。
【０００９】
従って、本発明による方法は、様々な濃度のスピンプローブを用いて様々な濃度の極性試薬により目標に合致したアルブミン分子の配座変化を誘発することにより、例えば血液中のアルブミンの輸送特性の変化（アルブミン機能性）をESR分光分析により検出することを特徴とする。アリコートにより記録されたESRスペクトルを、好ましくは軸方向異方性を有するハミルトン関数に基づく数学モデルにより電子的にシミューレーションし、に実験に基づくスペクトルとシミュレーションされたスペクトルとを比較し、好ましくは、アルブミンの特異なスピンプローブ結合位置に対応するモデル化されたESRスペクトルと実験により測定されたESRスペクトルのスペクトル値の差の２乗を最小化することにより、これらの結合位置におけるスピンプローブ結合のパラメータを検出するが、ここで、得られたスピンプローブ結合のパラメータはアルブミン配座の生物物理学的パラメータと相関関係があり、診断すべき生理学的又は病理学的変化に応じて、特異なパラメータを得られたパラメータから選択し、これらの特異なパラメータから、特別な病理学的又は生理学的変化の発生時に起こるようなアルブミン配座の特異な変位に関する判別関数により、判別基準としてカットオフ値を電子的に算出する。
【００１０】
本発明によれば、スピンプローブとして、アルブミンと特異な結合を行なうことができる化合物を、好ましくはスピン標識が付けられていなければならない脂肪酸、ステロイドホルモン又は複素環式炭化水素を使用する。公知のスピン標識であるニトロキシル基が標識として付けられている疎水性化合物も本発明による方法においては使用することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、スピン標識付き脂肪酸を、好ましくはドキシルステアリシン酸をスピンプローブとして使用する。特に好ましくは、１６−、５−、７−又は１２−ドキシル−ステアリン酸を使用する。スピン標識付き脂肪酸をスピンプローブとして使用する場合は、アルブミンの結合位置１、２及び３におけるスピンプローブ結合のパラメータを検出することができる。
極性試薬としてはアルコール又はDMSOを使用し、好ましくはＣ1−Ｃ6−アルコールを、特に好ましくはエチルアルコールを使用する。
アルブミン含有試料とは、本発明の意味では、例えば、血液試料又はアルブミン含有医薬品又は製品試料であると理解するものとする。
【００１１】
本発明によれば、ESRスペクトルは少なくとも３種類の、好ましくは最大８種類のスピンプローブ濃度により記録する。例えば、体積が各５０μｌの血清試料の３つのアリコートを３種類の濃度の１６−ドキシル−ステアリン酸及び3種類の体積の極性試薬と混合し、その結果、検査すべきアリコート中のスピンプローブの最終濃度は８．３３×１０-4 mol／ｌ、１．５５×１０-3 mol／ｌ及び２．４１×１０-3 mol／ｌとなり、極性試薬の濃度は２．９０ mol／ｌ、３．３７ mol／ｌ及び３．８０ mol／ｌとなる（表1を参照）。
培養時間は７〜１５分、好ましくは１０分である。培養時には振とうを行なうものとする。ESRは通常は３７℃及び血液の生理学的ｐH値において記録する。精度を高めるために、スペクトルは１５〜４５℃の間の２種類以上の試料温度値及び／又は７．５〜３．５の間の２種類以上の血清試料ｐH値において記録することができる。
【００１２】
測定されたESRスペクトルの分析は特別に開発された分子運動性構造解析（MMS）用コンピュータソフトウエアを用いて電子的に行なう。アルブミン含有試料の、好ましくは血清又は血漿試料の少なくとも３つの、好ましくは８つのアリコートに基づき記録されたESRスペクトルはコンピュータソフトウエアに転送し、様々なタイプの結合位置におけるスピンプローブ結合のパラメータを算出する。スピンプローブ結合のパラメータはESRスペクトルパラメータに基づき分析する。好ましくは軸方向異方性を有するハミルトン関数に基づくESRスペクトルモデルを、実験により得られたESRスペクトルのシミュレーションに使用する。アルブミン中のスピンプローブ結合のパラメータは、ＥＰ 第０９７３０４３ A１号に示されているように、シミュレーションされたESRスペクトルと実験により得られたESRスペクトルの差の２乗によるシミュレーションを記述したものである。
パラメータの算出は結合位置のタイプ毎に別々に行なう。アルブミン分子の結合位置におけるスピンプローブの結合の特徴を示すパラメータはESRスペクトルシミュレーションにより算出する。好ましくは軸方向異方性を有するハミルトン関数に基づくESRスペクトルモデルをスペクトルの各成分の算出に利用する。算出は、上記ＥＰ 第０９７３０４３ A１号の４頁〜７頁に示されているようにして行なう。
【００１３】
スピンプローブのESRスペクトルの数学的処理には、記載された計算アルゴリズムを実行する上記コンピュータプログラムを使用する。
ESRスペクトルの処理時間は１５秒以下である。
各ESRスペクトルのシミュレーション計算の結果として、３つのアルブミン結合位置についての４８のスピンプローブの数値範囲が得られる。これらのパラメータの各々が、アルブミン分子の配座状況を反映しているアルブミン分子に結合したスピンプローブの状態に対応して、比分散を有する。例えば１６−ドキシル−ステアリン酸をスピンプローブとして用いる場合は、アルブミン配座状況の特異な特徴を示す表２のパラメータを合計で１７選択する。
表２による１７のパラメータのセットは、アルブミンの結合位置において結合しており、結合位置の結合特性の影響の下でアルブミン分子の配座状態を生物物理学的パラメータの形で反映しているスピンプローブ分子の状態を記述している。
【００１４】
得られた１７のパラメータのセットから、各アリコートについてのスピンプローブ分布及び運動性パラメータを表３により算出し、その際、スピンプローブプールＣ1〜Ｃ3の相対スピンプローブ濃度のパラメータから、結合位置において結合したスピンプローブ分子の相対個数Ｎ1〜Ｎ3の分布特徴を、Ｃ１〜Ｃ３に脂肪酸（ＦＳ）と血清アルブミン（ＳＡ）との比を乗ずることにより算出する。
アルブミン結合位置において不動化されたスピンプローブ分子の運動性特徴を表３の式により算出し、その際、結合位置１及び２のミクロ環境の極性係数をＨＦ組織Ａ1ないしはＡ2の等方性定数から算出する。配向係数Ｓ1〜Ｓ3をＨＦ組織Ａ1ないしはＡ2の等方性定数及びＨＦ組織δＡ1ないしはδＡ2の各異方性から算出する。相関時間Ｔ’２及びＴ”２をスペクトル線ＷL、ＷM及びＷHの幅から算出する。
その際、アルブミンの結合パラメータを、好ましくはアリコート中のスピンプローブの結合パラメータの比の数学的回帰により、スピンプローブの濃度及び極性試薬の濃度の変化との関連において検出する。アルブミンの結合特徴として、
【００１５】
・  ＫB＝結合定数、
・  Ｎ10＝脂肪酸結合位置１の能力、及び
・  ＣP＝極性試薬の臨界濃度
からなるアリコートの結合パラメータのセットを、脂肪酸結合位置において結合したスピンプローブ分子の相対個数Ｎ1〜Ｎ3と極性試薬の濃度（Ｃ）との比の回帰により、次の式Ｉを用いて算出する。
【００１６】
【数２】
0004885396.tif 000002
【００１７】
アルブミンのその他のパラメータとして、各アリコートについて、パラメータ
・  Ｒ2＝アルブミンの生の状態における脂肪酸結合位置２と１との能力の比、
・  Ｋ2＝脂肪酸結合位置２の柔軟性係数、
・  Ｌ2＝アルブミンの配座の限界
を、脂肪酸結合位置において結合したスピンプローブ分子の相対個数Ｎ1〜Ｎ3と極性試薬の濃度（Ｃ）との比の回帰により、次の式IIを用いて求める。
【００１８】
Ｎ2＝Ｒ2×Ｎ1×（１＋Ｋ2×Ｃ×（Ｌ2−Ｎ1））    （II）
式Ｉ及びIIは、本発明により広範な実験的研究に基づき作成されたアルブミン分子の脂肪酸結合位置の系統のモデルを記述している。
アルブミンの輸送特性の変化を、アリコートについて算出されたアルブミンの結合パラメータのセットから、アリコートの製造に利用される表４のテスト条件との関連において算出する。好ましくは利用すべきテスト条件により、アルブミンへの脂肪酸の供給（ＫL、ＮL0−テスト条件：Ｃ＝０、商  脂肪酸／アルブミン＝０．５）、脂肪酸の輸送（ＮT0、ＫT−テスト条件：Ｃ＝０、商  脂肪酸／アルブミン＝１．５）、及び脂肪酸の放出（ＤU、ＮU0、−テスト条件：Ｃ＝３．３７Ｍ、商  脂肪酸／アルブミン＝１．５）を決定する特徴の計算が可能になる。これらの特徴の計算は次の式により行なう。
【００１９】
積分結合定数＝ＫL＝ＫB×（Ｎ10＋Ｎ20）、
有効供給能力＝ＮL0＝（Ｎ10＋Ｎ20）、
有効輸送能力＝ＮT0＝（Ｎ10＋Ｎ20）、
積分輸送結合定数＝ＫT＝ＫB×（Ｎ10＋Ｎ20）、
解離定数＝ＤU＝１／ＫB、
有効放出能力＝ＮU0＝（Ｎ10＋Ｎ20）。
【００２０】
本発明によれば、人間又は動物の身体内の生理学的又は病理学的変化の診断及び／又は監視のための上記方法は、例えば、癌疾患の早期診断に利用することができる。濃度の異なるスピンプローブ及び極性試薬による少なくとも３つのアリコートの評価に基づくESRスクリーニング分析により疾病ないしは生理学的変化を診断するために、それぞれ検出された表２の結合パラメータを判別関数の一部とし、診断すべきそれぞれの疾病ないしは病理学的変化についてのカットオフ値を検出し、基準試料のカットオフ値と比較する。
例えば、癌疾患の診断のためには、表５のパラメータＤiを求める。その際、信頼性の高い診断を行なうためには、パラメータＤ1〜Ｄ6のいずれか１つで十分である。診断結果の信頼性をさらに高めるために、その他のパラメータ、特にＤ2、Ｄ3、Ｄ5又はＤ6、又は６つのパラメータＤiの全てを検出するのが効果的であるかもしれない。パラメータＤiの１つが＞１である場合は、アルブミン配座が妨害されており、例えば腫瘍性疾患が存在する。Ｄiが＜１の場合は、被検査者は腫瘍性疾患に罹患していない。
【００２１】
本発明による方法の診断精度について、２１２名の癌疾患のある患者及び８７名の癌疾患のない患者を対象として調査を行なった（表６）。
表６は本発明によるESR法が９０％を超える高い診断精度を有することを立証している。癌疾患を疾患の極めて早期段階で診断することもできる。例えば、Ｄ2、Ｄ3、Ｄ5又はＤ6をそれぞれ算出することにより、それぞれ約９５％への診断精度の向上が達成される。
従って、血液試料のESR分析により、疾病の極めて早期段階での癌及びその他の疾患又は生理学的変化の診断が可能になる。アルブミンの輸送機能の変化は、すでに罹患時に起こっているアルブミンの特異な脂肪酸結合位置の遮断に基づくものである。この結合遮断の結果として、正常な輸送機能にとってのアルブミン機能及び結合特性の全般的な障害が発生するが、新生物の供給にとっての障害となることはなく、従って、その成長の前提条件の１つが発生することになる。脂肪酸結合位置における遮断により、正常な細胞の大量の供給不足及び免疫系の障害が起こる。現在の臨床化学的定型診断方法により検出可能なパラメータはこれらの変化を把握していない。腫瘍発生に対する有機体の最初の反応は本発明によるESR法によってしか検出できないのである。
【００２２】
本発明により検出されたアルブミンの輸送特性の変化を原料及び／又は健康な被検査者の生の結成アルブミンの輸送特性と比較することにより、本発明による方法を、アルブミン含有医薬品の製造時の工程内管理パラメータとして利用することもできるし、アルブミン含有製剤の、好ましくは血液又は血漿製剤の品質の検出及び管理に利用することもできる。本発明による方法の利用は、原料と清浄されたアルブミン含有材料との比較により、分子に結合した配位子をアルブミンから清浄化除去する様々な方法の有効性を検出するための利用、及び、例えば血液収着及び血液透析のような、それぞれアルブミンの結合特徴及び輸送特性に影響を与える内毒素の除去方法も含んでいる。
本発明による方法は費用対効果及び時間対効果が大きい。この方法により、様々なESRスペクトルの自動化検出が可能になる。３つのアリコートについての各スクリーニングテストの結果は１０分以内で得られ、８つのアリコートの複雑なESR分析には約２４分が必要である。
【００２３】
固定化され、安定化され、正確に調整された不可欠な異なる濃度のスピンプローブ及び極性試薬を入れた微小滴定濃度プレートを含む本発明による方法を実施するためのテストキットも本発明の対象である。テストキットは、例えば密封された試料管のような外部容器の中に、正確に配量されたスピンプローブ及び極性試薬だけを入れておくこともでき、その結果、実験室にでは、事前配量されたスピンプローブ及び極性試薬を検査すべき試料のアリコートに添加するだけでよいことになる。
これとともに、本発明による方法を実施するためのESR分光計、及びESRスペクトル記録の高精度、高安定性及び高感度を実現するための方法も、本発明の対象である。測定データの診断分析のためにコンピュータプログラムと共働して装置制御、信号記録及び信号評価を統合することにより、本発明によるESR分光計は自動化ESR分析器として現在の臨床実験室業務における簡素かつ信頼性の高い取扱いという要件を満たすことになる。
【００２４】
本発明による方法を実現するためのESR分光計１は、図１に示したように、ホール(Hall)安定化システム付き遮蔽小型電磁石２、ホモダインUHFユニット５に結合された測定共鳴器３、装置制御・信号記録ユニット９、及び検査試料のサーモスタット制御システム７からなる。
装置制御・信号記録ユニット９は２つのシングルチップコンピュータ（図示せず）からなり、一方のコンピュータは自動化同調及び安定化用のシステム制御器１０の役割を果たし、もう一方のコンピュータはESR信号プロセッサ１１としてスペクトルの走査アルゴリズムを生成し、信号データを蓄積し、デジタル濾過し、記録する。
ESRスペクトルの記録のために、UHFユニット５の主発振器がUHF波を内部で発する共鳴器３の測定シャフトの中に検査試料を挿入する。ESR信号を、測定共鳴器３により反射されるUHF放射の放射源としてのホモダインウェーブガイドユニットにより測定する。
【００２５】
ESR信号の励起に必要となる磁界を作るのは電磁石２である。電磁石２の電圧源６はESR信号プロセッサ１１により制御する。
UHFユニット５を制御するのは、測定共鳴器３とUHFユニット５の主発振器との微周波数同調を保証し、検査試料のサーモスタット制御システム７を制御し、分光計制御及びデータ分析のために利用されるオペレータとパーソナルコンピュータ８とESR分光計１とを結合する装置制御ユニット１０である。
発振器周波数同調用又は共鳴周波数同調用として同調エレメントを１つしか含んでおらず、大きな周波数範囲における同調が発振器の同調によってしか行うことができず、一方、共鳴器の同調によっては小さな周波数範囲の制御しか行うことができないが、しかしその代わりに様々な試料の測定時には安定した周波数を保証する公知のESR分光計とは対照的に、本発明による分光計は結合された２つの制御装置を備え、その一方は発振器周波数の制御用、もう一方は共鳴周波数用である。これが必要になるのは、一方では、多種多様な試料の検査のために大きな帯域幅の利用を可能にするためであり、それと同時にもう一方では、アリコート試料の検査時に絶対に不可欠なESRスペクトルの特徴の一致及び再現性を本発明により可能にするためである。
【００２６】
一方の制御装置は、中心周波数９．４５±０．５GHｚの領域２００〜４００、好ましくは３００MHｚにおける周波数同調のために、UHFユニット５の主発振器５上に配設してある。もう一方の制御装置は、モータ駆動連結棒を利用する共鳴器空隙体積変動による領域１０〜５０、好ましくは３０MHｚにおける共鳴周波数同調のために、測定共鳴器３上に配設してある。
検査試料の交換後のUHFユニット５の主発振器の調整を行うのは、共鳴周波数同調の範囲が不十分である場合に限られる。これを行うのは、検査試料のタイプが変わる場合又は試料調整手順を根本的に変更した場合である。
従って、同じタイプの試料のセットを検査する場合は、そのスペクトルは事実上１つのUHF周波数において記録されることになる。この場合、基本（バックグラウンド）スペクトル線は記録された全てのスペクトルについて同一であり、このことは、後続の検査対象品の特徴の算出の精度にとって極めて重要である。
サーモスタット制御システム７は試料温度を範囲３０℃〜４５℃において高い精度で安定化させる役割を果たす。
【００２７】
公知のESR分光計とは対照的に、このシステム７は図示していない追加制御ループの形で追加サブシステムを含んでいる。サーモスタット制御システム７の一般的な制御ループは、試料アンプルの温度制御のために予熱又は予冷された空気を必要に応じて共鳴器シャフト内に吹込む熱制御空気流からなる。サーモスタット制御システム７の一般的な制御ループは、試料アンプルの温度制御の追加制御ループは共鳴器内部の勾配の最小化により試料温度安定化の精度を高める役割を果たす。この目的のために、共鳴器本体３を磁石の自己加熱による熱放射により具体的な試料温度まで加熱する。それに加えて、温度センサ４により共鳴器本体３の温度を測定する。スペクトル記録の中断中は、電磁石２の電圧源６の電圧を上昇又は下降させる。
さらに、遮蔽電磁石２の構造及び質量の大きさにより、周囲の影響からの共鳴器３の断熱が確保される。
【００２８】
本発明の方法によるESRスペクトルの分析のためには、公知の分光計とは対照的に、シミュレーションによるスペクトルパラメータの算出のために正確な形でのスペクトルの記録を保証する特殊なデジタル濾過方法を開発することが必要であったが、これは、ESRスペクトル記録に必要な高精度、分光計の安定性及び感度の保証により本発明による方法への本発明による分光計の利用を保証するためには、公知の方法とは対照的に、測定された信号中に信号雑音及びパルス障害の濾過時に又は雑音抑圧により生じる相関を最小にしなければならなかったからである。
そのために、ESR信号プロセッサは電圧源の制御によりスペクトル走査のアルゴリズムを生成する。
UHFユニット５によるESR信号の読取り値は周波数１０KHzのアナログ・デジタル変換器により変換し、信号プロセッサ１１のメモリに蓄積する。
典型的なスペクトル走査時間は１分以上となり、スペクトル点の数は１０，０００以下となるので、各スペクトル点は６０以上の信号読取り値から展開される。
【００２９】
それにもかかわらず、蓄積されたスペクトル読取り値の特定の部分が不正確であるのは、ESR分光計が、電磁障害または機械的振動に対して反応することがある超高感度計器だからである。
本発明によるESR分光計の高感度及び高安定性は、公知のESR分光計とは対照的に、ESR信号SiのN個の記録を各スペクトル点ごとに蓄積し、特別な加重係数ｋiにより合計する各スペクトル点の特別な算出アルゴリズムを利用することにより実現される。これらの係数は対応する記録の測定誤差の２乗に反比例する。
ｉ番目の信号読取り値の誤差△iはこの読取り値Siとその他（Ｎ−１）の読取り値の差算術平均との差として算出される。
【００３０】
【数３】
0004885396.tif 000003
得られる信号点の算出式は次のようになる。
【００３１】
【数４】
0004885396.tif 000004
【００３２】
読取り値Siがパルス雑音を含んでいる場合は、誤差値△iは（例えば１０倍に）上昇し、対応する加重係数は大きく（例えば１００分の１に）低下する。これにより、本発明によるESR分光計においては、公知のESR分光計とは対照的に、パルス雑音を含む読取り値はスペクトル情報の記録から排除される。このアルゴリズムはスペクトルの測定点の各々の蓄積に利用する。
結果には記録されたESRスペクトルの高感度及び高安定性が保証される。同時に、これにより、公知のESR信号濾過方法の場合はスペクトルシミュレーションによるスペクトルパラメータの検出の精度を低下させる主原因となる隣接のスペクトル点間における追加的相関の発生を防止する。
得られたESRスペクトルを特別なソフトウエア（MMS）によって分析するが、その際、ESRスクリーニング用のプログラムは３つのアリコートの測定用の測定アルゴリズムを生成し、表５の判別関数に基づく評価のための基準に従って結果を実現する。
複雑なESR分析の実施のために、プログラムは５から好ましくは８のアリコート用の測定アルゴリズムを生成し、アルブミンの輸送特性の検出のための基準に基づき数学的回帰法を用いてその結果を実現する。
このプログラムにより、簡単な自動化された試料測定及び評価の実施が保証され、しかも、測定要員の特別な教育又は資格は不要である。
以下では、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３３】
【実施例】
例１：
ESRスクリーニング分析（３スペクトル分析）による腫瘍性疾患患者及び健康人の検査
血清を全血遠心分離により入手し、血清試料を３つのアリコートに分割する。各５０μLのこれらの血清試料を１０、１２及び１４μLのスピンプローブのアルコール溶液と混合する（スピンプローブ最終濃度  ８．３３×１０-4 mol／L、１．５５×１０-3 mol／L及び２．４１×１０-3 mol／L）。調製された混合物を連続的に振とうしながら３７℃で１０分間培養する。
調製された試料の培養の後に、これらの試料を３本の毛管に移す。各毛管ごとにESRスペクトルをESR分光計の共鳴器内で一定温度３７±０．２℃において撮影する。
撮影された各ESRスペクトルは、長鎖脂肪酸に特異な現象であるが、様々な結合位置において不動化されるスピンプローブ分子の特異なスペクトルの重ね合せである。これらの結合位置は検査された血清の血清アルブミン中に局限されている。
撮影された３つのESRスペクトルをコンピュータにロードし、スピンプローブ結合のパラメータを算出する。この分析は上記ESRスペクトルシミュレーション法により各結合位置ごとに別々に行う。
表７及び図３は、数人の癌疾患のある患者及び癌疾患のない患者の血清アルブミン中の（１６−ＤＳ）スピンプローブパラメータの検出の例を含んでいる。
【００３４】
I．癌疾患のある患者
患者１、研究コード５０６
臨床診断：食道癌
患者２、研究コード５０７
臨床診断：胃癌
患者３、研究コード５２８
臨床診断：乳癌
患者４、研究コード５２９
臨床診断：肺癌
【００３５】
II．癌疾患のない患者
患者１、研究コード１１０、４２歳
臨床診断：広汎性乳腺障害、癌病歴なし
患者２、研究コード１１１、２３歳
臨床診断：全般的健康状態
患者３、研究コード１１２、２２歳
臨床診断：全般的健康状態
患者４、研究コード１１４、４０歳
臨床診断：リューマチ性心臓疾患
【００３６】
表７及び図２は、測定されたスピンプローブの結合パラメータについて癌患者と癌の兆候のない患者との間で差が出るのは、極性試薬のアルコール濃度が比較的高い場合だけであることを立証している（血清試料B及びC）。この差は、癌疾患のある患者の血液試料中の血清分子の配座運動性の特異な変化を示している。
例２：
健康な集団（男女）の生血清中のアルブミン輸送機能の複雑なESR分析（３及び８スペクトル分析
体積が各５０μLの血清試料を３又は８種類の濃度の１６ドキシルステアリン酸スピンプローブ（エチレンアルコール中に溶解）と混合し、その結果、スピンプローブ最終濃度  ０．８３×１０-3 mol／L〜２．３４×１０-3 mol／L及びエチレンアルコール最終濃度１．８６ mol／L〜３．８ mol／Lが得られた。血清試料のｐH値はスピンプローブとの混合後には７．４±０．０５に達した。調製された混合物を連続的に振とうしながら３７℃で１０分間培養し、培養の後に、ESRスペクトル撮影及び分析のために、ガラス毛管に移した。スペクトルの撮影は本発明によるESR分光計内で行った。各毛管ごとにESRスペクトルをESR分光計の共鳴器内で一定温度３７±０．２℃において撮影した。撮影された各試料の全てのESRスペクトル（３つ及び８つのスペクトル）について、一体化されたESR分析器内で、本発明によるコンピュータソフトウエアを用いてスピンプローブ結合のパラメータを算出する。実験により得られた様々なスピンプローブのESRシミュレーションのためには、ESRスペクトルモデル（軸方向異方性を有するハミルトン関数）を使用する。血清アルブミン中のスピンプローブ結合のパラメータは、シミュレーションされたESRスペクトルと実験により得られたESRスペクトルとの差の２乗の最小化によりシミュレーションを記述する。分析は各結合位置ごとに別々に行い、コンピュータプログラムによりアルブミン機能及び配座の特徴に関するESRパラメータを提供する。
健康な血液及び血漿提供者の生血清中のアルブミン提供機能のパラメータが表８に健全なアルブミン輸送機能の例として示してある。複雑なESRスペクトル分析によれば、これらの健康な提供者の血清試料中には異常を確認することはできなった。
【００３７】
例３：
血液系疾患（血芽球症、慢性リンパ性白血病（CML）、プラスマ細胞腫）のある患者の生血清中のアルブミン輸送機能の拡大ESRスペクトル分析（３スペクトル及び３D分析）
血清を全血遠心分離により入手し、血清試料を３つのアリコートに分割する。各５０μLのこれらの血清試料を１０、１２及び１４μLのスピンプローブのアルコール溶液と混合する（スピンプローブ最終濃度  ０．８３×１０-3 mol／L、１．６１×１０-3 mol／L及び２．３４×１０-3 mol／L）。調製された混合物を連続的に振とうしながら３７℃で１０分間培養する。
調製された試料の培養の後に、これらの試料を３本の毛管に移す。各毛管ごとにESRスペクトルをESR分光計の共鳴器内で一定温度３７±０．２℃において撮影する。撮影された３つのESRスペクトルをコンピュータにロードし、スピンプローブ結合のパラメータを算出する。この分析は上記ESRスペクトルシミュレーション法により本発明によるコンピュータソフトウエアを用いて各結合位置ごとに別々に行う。
悪性血液系疾患はESRスクリーニングにより把握することができる。表９には、CMLのある５人の患者及びプラスマ細胞腫のある３人の患者の血清試料の判別パラメータが示してある。判別関数Ｄ１〜Ｄ５は癌疾患の存在の典型的な姿を明らかにしており、この姿は脂肪酸結合位置の３Ｄ解析においても明らかになる。
【００３８】
例４：
品質管理のためのアルブミン含有医薬品試料のアルブミン輸送機能の拡大ESRスペクトル分析（３スペクトル及び３D分析）
体積が各５０μLのアルブミン含有医薬品の試料（アルブミン溶液、冷凍新鮮血漿）を３又は８種類の濃度の１６ドキシルステアリン酸スピンプローブ（エチレンアルコール中に溶解）と混合し、その結果、スピンプローブ最終濃度  ０．８３×１０-3 mol／L〜２．３４×１０-3 mol／L及びエチレンアルコール最終濃度１．８６ mol／L〜３．８ mol／Lが得られた。血清試料のｐH値はスピンプローブとの混合後には７．４±０．０５に達した。調製された混合物を連続的に振とうしながら３７℃で１０分間培養し、培養の後に、ESRスペクトル撮影及び分析のために、ガラス毛管に移した。スペクトルの撮影は本発明によるESR分光計内で行った。各毛管ごとにESRスペクトルをESR分光計の共鳴器内で一定温度３７±０．２℃において撮影した。撮影された各アリコートの全てのESRスペクトル（３つ及び８つのスペクトル）について、一体化されたESR分析器内で、本発明によるコンピュータソフトウエアを用いてスピンプローブ結合のパラメータを算出する。実験により得られた様々なスピンプローブのESRシミュレーションのためには、ESRスペクトルモデル（軸方向異方性を有するハミルトン関数）を使用する。血清アルブミン中のスピンプローブ結合のパラメータは、シミュレーションされたESRスペクトルと実験により得られたESRスペクトルとの差の２乗の最小化によりシミュレーションを記述する。分析は各結合位置ごとに別々に行い、コンピュータプログラムによりアルブミン機能及び配座の特徴に関するESRパラメータを提供する。
【００３９】
アルブミン含有医薬品の製造時には、拡大ESRスペクトル分析（３スペクトル及び３D分析）が品質及び工程内管理に適している。表１０及び１１は、異なる形で入手され（全血血漿対肢体切断血漿）、処理された（濾過された＝白血球除去）血漿製品（表１０）並びに健全なアルブミン及び変性したアルブミン（表１１）についての３及び８スペクトル分析におけるESR技術の工程随伴利用を示している。最終製品（例えば、アルブミン溶液、移植用冷凍新鮮血漿）のアルブミン輸送機能の容量を評価することができるだけではなく、質的アルブミン輸送特性に対する製造工程の個々の部分の影響をも分析することができることが明らかになる。
【００４０】
【表１】
スピンプローブ（１６ドキシルステアリン酸）及び極性試薬（エチルアルコール）の好ましい濃度
１．ESRスクリーニング分析
0004885396.tif 000005
２．複雑なESRスペクトル分析
0004885396.tif 000006
グラフ表示のために、最終濃度
0004885396.tif 000007
を有する点（P０）をプログラムにより設定する。
P０＝アルブミンン生の配座の実験限界値
*＝血清又は血漿の場合のCアルブミン  生理学的に３５〜４５ｇ／ｌ
**＝極性試薬エチルアルコールの場合の値
アリコートの濃度分布のマトリックス（例―BS−２中のスピンプローブ分子の相対個数）は図３に表示
【００４１】
【表２】
ESRスペクトルから得られた１６−DＳ−スピンプローブパラメータ、及びそのアルブミン配座及び機能性の特徴との相関
0004885396.tif 000008
注：スペクトルの第3成分は親和性の低い結合位置におけるスピンプローブと対応しているので、その他の特徴は重要ではない。
【００４２】
【表３】
0004885396.tif 000009
【００４３】
【表４】
0004885396.tif 000010
【００４４】
【表５】
判別関数の例
0004885396.tif 000011
* パラメータC1、C2及びC3は結合位置1、2及び3のそれぞれにおける相対スピンプローブ濃度の値である。極性係数P2はP2＝1.47333／A2(ｍT)により算出し、ここに、A2は脂肪酸結合位置2の等方性HFS定数である。記号A、B及びCは検査された血液試料の次の一連の測定血清試料のそれぞれの試料記号である。
A−スピンプローブ最終濃度8.3×10-4 mol/l の血清試料
B−スピンプローブ最終濃度1.61×10-3 mol/l の血清試料
C−スピンプローブ最終濃度2.34×10-3 mol/l の血清試料
係数K1〜 K6は、関連の活性成分の具体的な濃度と、可能な限り多数の癌患者及び健康人の血清アルブミンのパラメータに関するデータの拡大及び精密化の結果とに相関している。
係数K1〜 K6は、例えば次の値とすることができる。
K1＝7.834     K2＝−1.517    K3＝6.3     K4＝1.881    K5＝3.009
K6＝1.002
【００４５】
【表６】
２１２人の癌疾患（胃癌、食道癌、直腸癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌）のある患者及び87人の癌疾患のない患者の臨床的研究の結果における判別関数に基づくテストの診断精度
0004885396.tif 000012
【００４６】
【表７】
実施例及び表３に挙げた癌疾患のある患者及び癌疾患のない患者のアルブミンの特異な結合位置におけるスピンプローブの結合パラメータ
0004885396.tif 000013
* 検査された各患者について、ここに示したパラメータを、記号A、B及びCを付けた３つ血清試料のESR分析により算出した。試料A、B及びCをそれぞれ10μl、12μl及び14μlのスピンプローブのアルコール溶液と混合した（スピンプローブ最終濃度は8.3×10-4 mol/l、1.55×10-3mol/l 及び2.41×10-3mol/l）。
ここに示したパラメータは次のものである。
C1−結合位置１における相対スピンプローブ最終濃度
C2−結合位置２における相対スピンプローブ最終濃度
C3−結合位置３における相対スピンプローブ最終濃度
【００４７】
【表８】
健康人（男性１６人、女性１８人）のESRパラメータ
アルブミン機能性のスクリーニングパラメータ
0004885396.tif 000014
脂肪酸結合位置の物理化学的特徴
0004885396.tif 000015
アルブミン輸送、供給及び放出の係数
0004885396.tif 000016
【００４８】
【表９】
アルブミン機能性のスクリーニングパラメータ
0004885396.tif 000017
【００４９】
【表１０】
異なる形で入手され、処理された血漿製品（冷凍新鮮血漿）のＥＳＲパラメータ
0004885396.tif 000018
【００５０】
【表１１】
健全なアルブミン溶液及び変性したアルブミン溶液のESRパラメータ
アルブミン機能性のスクリーニングパラメータ
0004885396.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【図１】  図中の数字は次の意味を有する。
１      ESR分光計
２      電磁石
３      測定共鳴器
４      温度センサ
５      UHFユニット
６      電圧源
７      サーモスタット制御システム
８      パーソナルコンピュータ
９      装置制御・信号記録ユニット
１０    装置制御ユニット
１１    信号プロセッサ
【図２】  アルブミン分子配座に対するアルコールの影響の結果として誘発された癌疾患のある患者及び癌疾患のない患者の血清アルブミン中におけるスピンプローブの結合パラメータの変化。図示した曲線は血清試料中におけるスピンプローブパラメータとアルコール濃度との相関関係を示している。
Ａ）血清試料は５０μLの血清及び濃度０．５×１０-2 mol／Lの１０μLのスピンプローブのアルコール溶液を含み、スピンプローブ最終濃度は８．３３×１０-4 mol／L。
Ｂ）血清試料は５０μLの血清及び濃度０．８×１０-2 mol／Lの１０μLのスピンプローブのアルコール溶液を含み、スピンプローブ最終濃度は１．５５×１０-4 mol／L。
Ｃ）血清試料は５０μLの血清及び濃度１．１×１０-2 mol／Lの１０μLのスピンプローブアルコール溶液を含み、スピンプローブ最終濃度は２．４１×１０-4 mol／L。
［１１０］〜［５２９］：患者の研究コード
【図３】  スピンプローブ（１６ドキシルステアリン酸及び極性試薬（エチルアルコール）の好ましい濃度。
【図１】
0004885396.tif 000020
【図２】
0004885396.tif 000021
【図３】
0004885396.tif 000022