(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーにより検体中の測定対象成分の分析を行うための液体クロマトグラフ装置であって、
測定対象成分を含む検体を供給する検体供給手段と、
前記検体供給手段から検体が供給される第１の流路と、
前記第１の流路に希釈液を供給するために前記第１の流路に接続された希釈液供給手段と、
前記第１の流路において、前記検体供給手段及び前記希釈液供給手段よりも下流側に接続されている分離用カラムと、
前記検体供給手段及び前記希釈液供給手段と、前記分離用カラムとの間において、前記第１の流路から分岐された第２の流路の流路と、
前記第１の流路と前記第２の流路とを切換える流路切換手段と、
前記第２の流路に接続されており、前記検体の濃度を測定するための濃度測定手段と、
前記濃度測定手段により測定された検体濃度が所定の濃度範囲外の場合には、前記流路切換手段を検体が前記第２の流路に流れるように切換え、前記検体供給手段及び／または前記希釈液供給手段を駆動して検体濃度を所定の濃度範囲内とし、前記濃度測定手段により測定された検体濃度が予め定められた所定の濃度範囲にある場合に、前記流路切換手段を前記第１の流路に切換え、検体を前記分離用カラムに流して測定対象成分を分離させる制御手段とを備えることを特徴とする、液体クロマトグラフ装置。
【請求項２】
前記濃度測定手段が、光学的濃度測定装置である、請求項１に記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項３】
前記濃度測定手段が、電気抵抗もしくはインピーダンス測定により検体の濃度を測定する装置である、請求項１に記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項４】
前記検体濃度が所定の濃度範囲外の場合に、前記希釈液供給手段が駆動され、希釈液量を変化させることにより検体濃度が調整される請求項１〜３にいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項５】
前記検体濃度が所定の濃度範囲外の場合に、前記検体供給手段が駆動され、検体供給量を変化させることにより検体濃度が調整される、請求項１〜３いずれか１項に記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項６】
前記測定対象成分がヘモグロビン類である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ装置を用いた液体クロマトグラフィーであって、
前記検体供給手段から第１の流路に検体を供給する工程と、
前記第１の流路に前記希釈液供給手段から希釈液を供給する工程と、
前記第２の流路に流れてきた検体の濃度を前記濃度測定手段により測定する工程と、
前記制御手段によって、前記濃度測定手段により測定された検体濃度が所定の濃度範囲外の場合には、流路切換手段を検体が第２の流路に流れるように切換え、検体供給手段及び／または希釈液供給手段を駆動して検体濃度を所定の濃度範囲とし、前記濃度測定手段により測定された検体濃度が予め定められた所定の濃度範囲にある場合には、前記流路切換手段を第１の流路に切換え、検体を分離用カラムに流して測定対象成分を分離する工程とを備える、液体クロマトグラフィー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばヘモグロビンなどの測定対象成分の分離を行うための液体クロマトグラフ装置及び液体クロマトグラフィーに関し、より詳細には、分離用カラムの上流側に検体濃度を調整する手段が設けられた液体クロマトグラフ装置及び液体クロマトグラフ装置を用いた液体クロマトグラフィーに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、液体クロマトグラフ装置を用いた液体クロマトグラフィーにより、様々な測定対象成分の分離及び測定が行われている。例えば、血液中のヘモグロビン類を測定する場合には、以下のような手順でヘモグロビン類の分離及び測定が行われている。先ず、全血を用意する。用意された全血に希釈液を加えて検体を得る。希釈液を加えることにより、検体濃度が調整され、かつ溶血される。このようにして、適当な濃度に調整され、かつ溶血された検体を得ることができる。この検体を液体クロマトグラフ装置の分離用カラムに送液することでヘモグロビン類の分離が行われる。その後、分離したヘモグロビン類の測定を行う。
【０００３】
このような液体クロマトグラフィーによる分析方法は、例えば下記の特許文献１等に開示されている。
【特許文献１】特開２０００−１７１４５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
液体クロマトグラフィーにより例えばヘモグロビン類を測定する場合、検体の濃度によっては測定精度が低下しがちであった。すなわち、液体クロマトグラフ装置に備えられている分離用カラムの性能には限界があり、あまり高い濃度の検体を送液すると、測定精度が低下するという問題があった。そのため、例えば、絶対検量線法や内部標準法を用いて測定対象成分の定量を行おうとした場合、測定対象成分を正確に定量することができないことがあった。
【０００５】
本発明の目的は、上述した従来技術の欠点を解消し、様々な濃度の検体が用意された場合であっても、使用される分離用カラムの性能に応じた濃度範囲の検体を分離用カラムに供給して、液体クロマトグラフィーにより高精度に測定対象成分を分析することを可能とする液体クロマトグラフ装置及び該液体クロマトグラフ装置を用いた液体クロマトグラフィーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る液体クロマトグラフ装置は、液体クロマトグラフィーにより検体中の測定対象成分の分析を行うための液体クロマトグラフ装置であって、測定対象成分を含む検体を供給する検体供給手段と、前記検体供給手段から検体が供給される第１の流路と、前記第１の流路に希釈液を供給するために前記第１の流路に接続された希釈液供給手段と、前記第１の流路において、前記検体供給手段及び希釈液供給手段よりも下流側に接続されている分離用カラムと、前記検体供給手段及び希釈液供給手段と、前記分離用カラムとの間において、前記第１の流路から分岐された第２の流路の流路と、前記第１の流路と前記第２の流路とを切換える流路切換手段と、前記第２の流路に接続されており、前記検体の濃度を測定するための濃度測定手段と、前記濃度測定手段により測定された検体濃度が所定の濃度範囲外の場合には、前記流路切換手段を検体が前記第２の流路に流れるように切換え、前記検体供給手段及び／または前記希釈液供給手段を駆動して検体濃度を所定の濃度範囲内とし、前記濃度測定手段により測定された検体濃度が予め定められた所定の濃度範囲にある場合に、前記流路切換手段を前記第１の流路に切換え、検体を前記分離用カラムに流して測定対象成分を分離させる制御手段とを備えることを特徴とする。
【０００７】
上記濃度測定手段としては、好ましくは、光学的濃度測定装置が用いられる。光学的濃度測定装置としては、吸光度を測定する装置あるいは蛍光を測定する装置などを用いることができるが、いずれの場合においても、非接触で検体濃度を測定することができる。従って、濃度測定手段の構造を簡略化することができる。
【０００８】
また、上記濃度測定手段としては、好ましくは、電気抵抗もしくは電気インピーダンスを測定することにより検体の濃度を測定する手段も用いられる。この場合には、第２の流路に電極を挿入するだけでよいだけでよいため、簡単な構造で検体濃度を測定することができる。
【０００９】
本発明において、上記検体濃度を所定の濃度範囲内に調整するに際しては、希釈液供給手段を駆動して希釈液量を変化させて、検体濃度を調整してもよく、あるいは検体供給手段を駆動して検体供給量を変化させて、検体濃度を調整してもよい。また、これらの２種の手段を併用してもよい。
【００１０】
本発明の液体クロマトグラフ装置では、様々な測定対象成分が分析されるが、測定対象成分がヘモグロビン類の場合、血液中のヘモグロビン類を高精度に分離し、測定することが可能となるので好ましい。
【００１１】
本発明に係る液体クロマトグラフィーは、本発明に係る液体クロマトグラフ装置を用いた液体クロマトグラフィーであって、前記検体供給手段から第１の流路に検体を供給する工程と、前記第１の流路に前記希釈液供給手段から希釈液を供給する工程と、前記第２の流路に流れてきた検体の濃度を前記濃度測定手段により測定する工程と、前記制御手段によって、前記濃度測定手段により測定された検体濃度が所定の濃度範囲外の場合には、流路切換手段を検体が第２の流路に流れるように切換え、検体供給手段及び／または希釈液供給手段を駆動して検体濃度を所定の濃度範囲とし、前記濃度測定手段により測定された検体濃度が予め定められた所定の濃度範囲にある場合には、前記流路切換手段を第１の流路に切換え、検体を分離用カラムに流して測定対象成分を分離する工程とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る液体クロマトグラフ装置を用いることにより、検体供給手段から検体の濃度が分離用カラムにおいて測定するのに適した所定の濃度範囲外の場合には、本発明の液体クロマトグラフィーに従って検体供給手段及び／または希釈液供給手段からの検体及び／または希釈液の供給量が変化され、検体濃度が所定の濃度範囲内とされた状態で分離用カラムに供給される。従って、最初に用意される検体の濃度の如何に関わらず、検体中の測定対象成分を分離用カラムにおいて高精度に分離し、測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面を参照しつつ、本発明の具体的な実施形態を説明することにより、本発明を明らかにする。
【００１４】
図１は本発明の一実施形態に係る液体クロマトグラフ装置の概略ブロック図である。
【００１５】
液体クロマトグラフ装置１は、検体供給手段２として、検体吸引ノズル３及びポンプ４を有する。検体吸引ノズル３が、検体５が収納された検体容器１３に挿入されている。ポンプ４を駆動することにより、検体吸引ノズル３から検体５が吸引され、第１の流路６に供給される。第１の流路６には、バルブ７を介して、ポンプ８及びノズル９が接続されている。ポンプ８及びノズル９が希釈液供給手段１０を構成している。上記ノズル９の先端が希釈液１１に挿入されている。希釈液１１は、容器１２に貯留されている。
【００１６】
バルブ７は三方弁からなり、検体５及び希釈液１１を第１の流路６の下流側に通過させるように構成されている。また、上記ポンプ４及びポンプ８の送液速度を変化させることにより、第１の流路６に供給される検体５と希釈液１１との割合が変化される。すなわち、第１の流路６に供給される検体５の濃度を変化させることが可能とされている。
【００１７】
本実施形態では、検体供給手段２が希釈液供給手段１０よりも上流側に位置しているが、逆に、希釈液供給手段１０を検体供給手段２よりも上流側に配置してもよい。
【００１８】
第１の流路６では、上記検体供給手段２及び希釈液供給手段１０よりも下流側において、流路切換えバルブ１４が接続されている。流路切換えバルブ１４において、第１の流路６から第２の流路１５が分岐されている。すなわち、流路切換えバルブ１４を切換えることにより、上流側から送液されてきた液体を、第１の流路６の下流側部分または第２の流路１５に流すことができる。
【００１９】
第１の流路６においては、流路切換えバルブ１４よりも下流側に、分離用カラム１６が接続されている。分離用カラム１６では、検体が送液されてきた際に、液体クロマトグラフィーにより測定対象成分が分離される。分離用カラム１６を通過した液体は、測定が行われた後に廃棄される。
【００２０】
他方、第２の流路１５には、濃度測定手段としての濃度測定装置１７が接続されている。濃度測定装置１７は、送液されてきた検体濃度を測定する適宜の分析装置からなる。本実施形態では、上記濃度測定装置１７は、図２に示すように、光源１７ａと受光セル１７ｂとを有する吸光度測定装置からなる。上記光源１７ａから照射される光が通過する測定する測定セル１５ａが、第２の流路１５の一部に構成されている。
【００２１】
吸光度測定装置に代えて、検体からの蛍光を測定する装置を用いてもよい。吸光度測定装置や蛍光を利用した測定装置のように光学的濃度測定装置を用いる場合、検体に対して非接触で測定を行うことができるため、流路の構造を簡略化することができる。
【００２２】
もっとも、濃度測定装置としては、検体の電気抵抗やインピーダンスを測定することにより検体濃度を測定する装置を用いてもよい。その場合には、検体中に複数の電極を配置する必要がある。もっとも、電気抵抗やインピーダンスは簡単に測定することができるので、測定装置を小型化することができる。
【００２３】
液体クロマトグラフ装置１では、上記ポンプ４、ポンプ８、流路切換えバルブ１４、分離用カラム１６及び濃度測定装置１７を制御するために、これらに接続された制御装置１８が備えられている。
【００２４】
制御装置１８によりこれらの各装置が駆動され、本発明に従って液体クロマトグラフィーにより様々な濃度の検体から測定対象成分を高精度に測定することができる。これを図３のフローチャートを参照しつつより具体的に説明することとする。
【００２５】
なお、本実施形態では、検体として、血液検体を用い、該血液検体中のヘモグロビンの割合ＨｂＡ１ｃ（％）が測定される。本実施形態では、最初の検体として、全血にグッド（ｇｏｏｄ）の緩衝液を添加し、２００倍に全血を希釈し、溶血してなる検体を用意した。
【００２６】
また、上記希釈液１１として、同じくグッド（ｇｏｏｄ）の緩衝液を用意した。
【００２７】
先ず、図３のステップＳ１において、制御装置１８により検体供給手段のポンプ４を駆動し、検体吸引ノズル３から検体を吸引し、第１の流路６に送液する。初期状態では、流路切換えバルブ１４は、送液されてきた液体を第２の流路１５に流すように設定されている。従って、送液されてきた検体５は、流路切換えバルブ１４を経て第２の流路１５に導かれる。そして、ステップＳ２において、制御装置１８の指令により濃度測定装置１７が駆動され、検体の濃度が測定される。得られた検体濃度が制御装置１８に与えられる。
【００２８】
制御装置１８には、用いられる分離用カラム１６に適した検体濃度範囲が所定の濃度範囲として予め記憶されている。この所定の濃度範囲は、用いる分離用カラム１６に応じてユーザが予め制御装置１８に入力し、記憶させておく。
【００２９】
ステップＳ３において、制御装置１８は、濃度測定装置１７から与えられた検体の濃度が上記所定濃度範囲外か否かを判断する。
【００３０】
測定された検体濃度が所定濃度範囲外である場合には、ステップＳ４において、制御装置１８により測定された検体濃度を所定濃度範囲になるように希釈する希釈倍率が算出される。次に、ステップＳ５において、制御装置１８は、上記希釈倍率を実現するようにポンプ４及び／またはポンプ８の送液速度を変化させ、希釈液１１の注入量及び／または検体５の採取量を変化させる。このようにして、第１の流路６に、上記所定濃度範囲内の検体が供給されることになる。そして、ステップＳ２に戻り、検体濃度が再度濃度測定装置１７で測定される。そして、測定された検体濃度が上記所定濃度範囲外である場合には、再度ステップＳ４、ステップＳ５を経てステップＳ２に戻ることとなる。
【００３１】
他方、測定された検体濃度が上記所定濃度範囲内であった場合には、ステップＳ６において、制御装置１８の指令に基づいて流路切換えバルブ１４が切換えられる。その結果、流路切換えバルブ１４の上流側から送液されてきた検体が第２の流路１５ではなく、第１の流路６の下流側に、すなわち分離用カラム１６に導かれる。そして、ステップＳ７において、分離用カラム１６による分離・測定が行われる。
【００３２】
従って、本実施形態の測定方法では、分離用カラム１６に適した検体の濃度範囲、すなわち上記所定の濃度範囲内となるように、検体が自動的に希釈される。従って、分離用カラム１６において、分離用カラムに適した濃度の検体が確実に供給されて液体クロマトグラフィーによる測定が行われる。よって、様々な検体を用意した場合であっても、分離用カラム１６において測定対象成分を高精度に分離し、定量することが可能となる。
【００３３】
次に、具体的な実験例につき説明する。
【００３４】
図４は、上記液体クロマトグラフ装置１を用いた場合に検体から分離されたヘモグロビン類を示すクロマトグラムの一例を示す図である。
【００３５】
周知のように、液体クロマトグラフィーでは、分離用カラムにおいて各成分が吸着されるが、成分毎に吸着力が異なり、溶出力の異なる分離液を分離用カラムに流すことにより、溶出力に応じて分離用カラムに吸着されていた各成分が溶出される。この溶出順序が成分によって異なるため、図４に示すクロマトグラムが得られる。そして、図４のクロマトグラムのピーク面積に応じて各成分を定量することができる。
【００３６】
先ず、比較のために、通常の液体クロマトグラフ装置を用いて、検体Ａ及び検体Ｂ中のヘモグロビンＡ１ｃの割合を測定した。検体Ａ及び検体Ｂは、それぞれ異なる健常人から採取した全血である。使用した分離用カラムは、Ｍｅｒｃｋ社製、フラクトゲルＳＯ３−（Ｍ）強カチオン交換体（４０−９０μｍ）、充填ステンレスカラム（φ３０×１００ｍｍ）である。検体Ａ及び検体Ｂをそれぞれ下記の表１に示すように１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍及び２００倍に希釈した複数種の検体溶液を作製した。この様々な希釈倍率の検体溶液を用い、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の割合（％）を測定した。結果を表１及び図５に示す。
【００３７】
表１及び図５から明らかなようように、検体Ａでは、希釈倍率が３０倍以上であれば、４．６〜４．６２％の範囲であるのに対し、希釈倍率が２０倍では、４．８５％、希釈倍率が１０倍では、５．２１％と高くなっていることがわかる。検体Ｂでは、希釈倍率が７５倍以上では、５．２１％または５．２２％とほぼ一定であるが、希釈倍率が５０倍以下では、ＨｂＡ１ｃの割合が５．５２％、５．６７％、５．９４％、６．４％とかなり高くなっていることがわかる。
【００３８】
従って、検体Ａ及び検体Ｂのいずれの場合においても、比較的高倍率に希釈した場合には、ヘモグロビンＡ１ｃの割合が高精度に求められているが、希釈倍率が低い場合すなわち検体濃度が高い場合には、ヘモグロビンＡ１ｃの割合（％）が正しく求められておらず、高い値側にシフトしていることがわかる。
【００３９】
よって、Ｍｅｒｃｋ社製ゲルを用いた上記分離用カラムを用いる場合、検体の希釈倍率は、７５倍以上に設定することが望ましいことがわかる。その場合であれば、検体Ａ及び検体Ｂのいずれにおいても、ヘモグロビンＡ１ｃの割合を高精度に測定し得ることがわかる。
【００４０】
【表１】
0005044454.tif 000002
【００４１】
従って、上記実施形態の液体クロマトグラフ装置１において、分離用カラム１６としてＭｅｒｃｋ社製ゲルを用いた上記分離用カラムを用いる場合、検体の所定の濃度範囲として、希釈倍率が７５倍以上となる濃度範囲を設定しておけば、ヘモグロビンＡ１ｃの割合（％）を高精度にを求め得ることがわかる。
【００４２】
なお、上記所定の濃度範囲は、分離用カラムの性能に応じて適宜設定すればよい。また、測定しようとする検体の種類を考慮して、分離用カラムにおいて高精度に測定される希釈倍率、すなわち所定の濃度範囲を設定することが好ましい。
【００４３】
上記実施形態では、血液試料中のヘモグロビンＡ１ｃの割合を求めたが、本発明は、液体クロマトグラフィーを用いた様々な測定対象成分の測定に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の一実施形態に係る液体クロマトグラフ装置の概略ブロック図である。
【図２】図１の実施形態の液体クロマトグラフ装置における濃度測定装置の一例を示す平面図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る液体クロマトグラフィーによる測定方法を説明するためのフローチャートである。
【図４】本発明の一実施形態において、血液試料から分離・測定される各ヘモグロビン類を説明するためのクロマトグラムを示す図である。
【図５】比較のために用意した従来の液体クロマトグラフ装置において、検体Ａ及び検体Ｂを様々な希釈倍率で希釈してヘモグロビンＡ１ｃ（％）を求めた結果を示す図である。
【符号の説明】
【００４５】
１…液体クロマトグラフ装置
２…検体供給手段
３…検体吸引ノズル
４…ポンプ
５…検体
６…第１の流路
７…バルブ
８…ポンプ
９…ノズル
１０…希釈液供給手段
１１…希釈液
１２…容器
１３…検体容器
１４…流路切換えバルブ
１５…第２の流路
１５ａ…測定セル
１６…分離用カラム
１７…濃度測定装置
１７ａ…光源
１７ｂ…受光セル
１８…制御装置
１９…供給装置
２１…溶離液供給装置
【図１】
0005044454.tif 000003
【図２】
0005044454.tif 000004
【図３】
0005044454.tif 000005
【図４】
0005044454.tif 000006
【図５】
0005044454.tif 000007