(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分、酸性液、及び／又は極性有機液体を含有する液状製剤であって、以下の製剤から選ばれる液状製剤；
（１）ヒトグレリン（２９６．７ｎｍｏｌ／ｍＬ）を有効成分として含有し、酢酸緩衝液（０．０３Ｍ、ｐＨ４．０）を酸性液として含有し、ベンジルアルコール（１％（ｗ／ｖ））を極性有機液体として含有し、更に白糖（１０％（ｗ／ｖ））を含有することを特徴とする液状製剤；
（２）ヒトグレリン（１４．８ｎｍｏｌ／ｍＬ）を有効成分として含有し、酢酸緩衝液（０．０３Ｍ、ｐＨ４．０）を酸性液として含有し、ベンジルアルコール（１％（ｗ／ｖ））及びＮ−メチル−２−ピロリドン（１０％（ｗ／ｖ））を極性有機液体として含有し、更に白糖（１０％（ｗ／ｖ））を含有することを特徴とする液状製剤；
（３）ヒトグレリン（１４．８ｎｍｏｌ／ｍＬ）を有効成分として含有し、酢酸緩衝液（０．０３Ｍ、ｐＨ４．０）を酸性液として含有し、ベンジルアルコール（１％（ｗ／ｖ））を極性有機液体として含有し、更にスルホブチルエーテル  β−シクロデキストリンナトリウム塩（１０％（ｗ／ｖ））を含有することを特徴とする液状製剤；
（４）ヒトグレリン（１４．８ｎｍｏｌ／ｍＬ）を有効成分として含有し、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（１０％（ｗ／ｖ））を極性有機液体として含有し、更に白糖（１０％（ｗ／ｖ））を含有することを特徴とする液状製剤；
（５）ヒトグレリン（１４．８ｎｍｏｌ／ｍＬ）を有効成分として含有し、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（２０％（ｗ／ｖ））を極性有機液体として含有し、更に白糖（１０％（ｗ／ｖ））を含有することを特徴とする液状製剤；
（６）ヒトグレリン（１４．８ｎｍｏｌ／ｍＬ）を有効成分として含有し、ジメチルホルムアミド（１０％（ｗ／ｖ））を極性有機液体として含有し、更に白糖（１０％（ｗ／ｖ））を含有することを特徴とする液状製剤；
【請求項２】
液状製剤が、注射用液状製剤である請求項１に記載の液状製剤。
【請求項３】
注射用液状製剤が、皮下注射用製剤あるいは筋肉内注射用製剤である請求項２に記載の液状製剤。
【請求項４】
グレリンを溶解した水溶液に、酸性液及び／又は極性有機液体を添加したことを特徴とするグレリンの生物学的利用率を改善する方法であって、グレリン、酸性液及び／又は極性有機液体の組み合わせが、請求項１に記載の組み合わせである当該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性ペプチドあるいは生理活性タンパク質を投与した際の生物学的利用率を改善した液状製剤、およびその改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、インスリン、成長ホルモン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、ＬＨ−ＲＨ誘導体、副甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン誘導体などの種々の生理活性ペプチドあるいは生理活性タンパク質製剤が、医薬品として販売されている。しかしながら、これらの化合物は、消化管内のプロテアーゼによる分解で不活性化されることから、経口投与製剤としての開発は困難であり、そのほとんどが非経口投与として、主に注射剤としての製剤形態で臨床的に供されている。【０００３】
注射剤の場合、疾病の治療として連続投与、長期投与を行う場合には、そのたび毎に患者は通院して投与を受けることとなり、患者には負担が大きい。したがって、注射剤でも、患者が自分で投与できる皮下注射の形態が望まれている。しかし、皮下注射にて投与した場合は、皮下からの吸収過程でプロテアーゼ等による分解をうけるため、静脈内注射にて投与した場合に比べると生物学的利用率（バイオアベイラビリティ；以下ＢＡという）が低くなるという問題点がある。【０００４】
そのため、皮下注射による投与では、静脈内投与時よりも多量の薬剤量及び／又は投与回数を増やすことが必要とされているのが現状であり、患者への負担が大きなものとなっている。本発明における生物学利用率ＢＡとは、投与された製剤中の薬物が体循環血液中に到達する割合（生物学的利用率、ＥＢＡ：extent of bioavailability）をいう。【０００５】
グレリンは、成長ホルモン分泌促進因子レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）に対する内因性成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）であり、１９９９年にラットの胃から単離精製された生理活性ペプチドである（非特許文献１）。その後、ラット以外の脊椎動物、例えばヒト、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマス、イヌからも、類似した一次構造を有するグレリンが単離され、あるいはｃＤＮＡから推定されている。これらの構造式を表１に示す。また、ここに列記する以外に、ネコ、ヤギなどのグレリンが単離されている。【０００６】
【表１】
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（上記表１中において、アミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣまたはＩＵＣの一文字標記により表している。）【０００７】
これら各動物に内在する天然型グレリンは、３位のセリン残基（Ｓ）あるいはスレオニン残基（Ｔ）の側鎖水酸基がオクタン酸、デカン酸などの脂肪酸によりアシル化された特異的な構造を有するペプチドであり、疎水性修飾構造を有する。また、成長ホルモン分泌促進因子レセプターに結合することによって、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する。これらグレリンは、強力な成長ホルモン分泌促進活性を有し、成長ホルモン分泌の調節に機能することが解明されており、グレリンの生理活性的役割と、医薬品への適用に関して興味がもたれている（特許文献１）。なお、本発明では天然型グレリンを総称してグレリンという。【０００８】
また、これら各動物に内在する天然型グレリンと該グレリンの一部構造を置換あるいは欠失させたグレリン誘導体、或いはグレリン類似体（特許文献３）なども、各疾病等の治療剤として期待されている。
グレリン誘導体とは、グレリンの疎水性修飾構造において、オクタノイル基（Ｃ８）ではなく、ヘキサノイル基（Ｃ６）、デカノイル基（Ｃ１０）、ドデカノイル基（Ｃ１２）等の炭素原子数２〜２０、好ましくは炭素原子数４〜１２程度の脂肪酸による修飾構造のものや、さらに分枝構造を有する脂肪酸や不飽和脂肪酸による修飾構造、また、フェニルプロピオニル基などの芳香環を含む修飾構造や、アダマンタン骨格を持つ修飾構造等に置換されているものをいう。また、これら各動物に内在する天然型のグレリンは、疎水性修飾構造とペプチド主鎖はエステル結合により結合しているが、エステル、エーテル、チオエーテル、アミドまたはジスルフィド結合を介して結合しているものもグレリン誘導体となる（特許文献１）。【０００９】
グレリン、グレリン誘導体或いはグレリン類似体からなるグレリン類の医薬品への適用は非常に期待されているが、いまだ具体的に医薬組成物として製剤設計されておらず、体内での動態については未知の部分が多い。
グレリン類は医薬組成物としては、特許文献２において、グレリン類の水溶液の安定性に及ぼすｐＨの影響、グレリン類の疎水性修飾構造の分解を抑制する方法等に関して報告されている。これによると、グレリン類を含有する水溶液の安定なｐＨは２〜７の範囲であり、このｐＨの調節には、ｐＨ調節剤や緩衝液を用いて行うことができることが記載されている。また、保存中における水溶液のｐＨの変動が小さい方が好ましいため、緩衝能を有する緩衝液であることが好ましく、そのような緩衝液として、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、リン酸−酢酸−ホウ酸緩衝液、フタル酸緩衝液が挙げられている（特許文献２：ｐ１１、５〜１４行）。【００１０】
また、実施例においても、McIlvaine緩衝液（クエン酸水溶液とリン酸水素二ナトリウム水溶液を混合したもの）、Britton-Robinson緩衝液（リン酸・酢酸・ホウ酸水溶液と水酸化ナトリウム水溶液を混合したもの）、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液におけるグレリンの水溶液中での安定性についての試験が記載されている。いずれの種類の緩衝液を用いても、グレリン類水溶液のｐＨの範囲を２〜７の範囲とすることにより、グレリン類の水溶液での安定性を確保できることが記載されているが、体内に投与した場合の動態については、全く検討されていない。
医薬組成物を考えた場合、ペプチド蛋白は一般に水溶液中では不安定であるため、投与するまでの安定性をいかに確保するかも重要な課題であるが、投与に際して最も有効な製剤を設計することは、更に重要な課題である。【００１１】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／０７４７５号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ０３／０９７０８３号公報
【特許文献３】特表２００４−５１４６５１号公報
【特許文献４】特公昭６３−４０１６６号公報
【特許文献５】特許第２６４３４２６号
【特許文献６】特表２００４−５２２８０３号公報
【特許文献７】特公平２−１９０９２号公報
【特許文献８】特公平５−２４１２９号公報
【特許文献９】特許第３１２０９８７号
【非特許文献１】Kojimaら：Nature，402巻、656-660頁、1999年
【非特許文献２】Tokihiroら：J. Pharm. Pharmacol., 52巻、911-917頁、2000年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
グレリン類は生理活性ペプチドであるので、医薬品として投与する場合、プロテアーゼ等の影響を受けない非経口投与剤が、そしてその中でも注射剤が考えられる。注射剤にあっても、皮下注射の場合には、注射部位からの薬物の吸収、そして血中への移行を保証できることが必要となる。しかしながら、一般にペプチド製剤は、皮下注射による投与の場合、ＢＡが低いとされており、注射剤としての製剤設計は困難である。
現在は、グレリン類の各薬理効果に対する有効量は、薬物の投与量に対する薬理効果を指標として、模索されている状況である。薬物治療を合理的かつ安全に遂行するためには、薬物の血中濃度を調節できることが必要であり、薬物の吸収に大きく係る製剤技術を確保する必要がある。【００１３】
そこで、まずグレリン類のうち、グレリンを皮下注射剤として投与した場合のＢＡについて、ラットおよびサルを用いて確認したところ、他のペプチド製剤のＢＡは他の薬剤に比して低く、一般に２０％から４０％程度であると言われているのに対して、グレリンのＢＡはラットで５％程度であり、サルにおいては３％程度と著しく低いことがわかった。この事実についても初めて確認した。
ＢＡ率の変動要因としては、一般には、まず投与部位からその近傍の末梢血への移行効率や移行速度の影響が考えられる。これらは、薬物の分子量、ｐＫａや脂溶性などの体液中、組織中での拡散や生体膜の透過を決定する物理化学的特性や、投与された部位の組織学的形態や生理的特性といった薬物と投与部位の固有の性質によるものである。【００１４】
ＢＡが低い場合、治療のために必要な血漿中有効濃度を確保するためには、投与量及び／又は投与回数を多くしなければならず、それは患者にとっては大きな負担となるため、ＢＡを上げる製剤技術が必要とされる。【００１５】
したがって本発明は、グレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質の薬剤としてのＢＡを確保し、より有効な液状製剤を提供すること、およびグレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を溶解した水溶液を皮下注射した際のＢＡを改善する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
かかる課題を解決するために、本発明者らはグレリン類の注射による投与後の血中濃度について詳細に検討を行った。
まず、グレリンと、注射剤に用いることができる各種補助剤とを共に投与し、ＢＡについて確認した。等張化剤としてマンニトール、あるいは溶解補助剤として尿素、あるいは緩衝液として酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）などをグレリンに添加してラットに皮下注射したところ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）はＢＡが３５．３％と非常に上がったが、それ以外はほとんど変化せず、最も高くて尿素で３．４％であった。
次に、酸性液の種類を変え、同様にＢＡを測定したところ、一様にＢＡが上がることを確認した。
その結果、グレリンは、これを皮下注射する際に酸性液と共に投与することによって、ＢＡが顕著に上昇することを見出した。【００１７】
また酸性液の種類や濃度、ｐＨ等を調整することによってＢＡを制御することができることを見出した。酸性液の種類によりＢＡの改善の効果が異なることも見出し、これは、グレリン製剤或いはグレリン溶液におけるｐＨの値を制御することによる効果だけではないことを意味している。【００１８】
更に、グレリンを皮下注射する際に極性有機液体と共に投与することによって、ＢＡが顕著に上昇することを見出した。【００１９】
また、グレリンと酸性液と極性有機液体を共に投与した場合、酸性液を単独でグレリンに単独で投与した場合及び極性有機液体を単独でグレリンと共に投与した場合に比べ、ＢＡは上昇することを見出した。【００２０】
また、グレリンを皮下注射する際に酸性液と糖類、或いは極性有機液体ほかと糖類と共に投与することによって、ＢＡが顕著に上昇することを見出した。【００２１】
更に、これらのＢＡを上昇させる効果は、グレリンにとどまらず、生理活性ペプチドあるいは生理活性タンパク質の製剤に酸性液及び／又は極性有機液体及び／又は糖類を共に投与することによって、ＢＡが顕著に上昇することを見出した。【００２２】
したがって、本発明の具体的態様を示せば、以下のようになる。
（１）生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を有効成分とし、酸性液を含有する液状製剤；
（２）酸性液が、酢酸、乳酸、リン酸、グリシン、クエン酸、塩酸、プロピオン酸、酪酸、安息香酸またはこれらの塩からなる群の１種または２種以上の組み合わせを成分とする上記（１）に記載の液状製剤；
（３）酸性液が、酢酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸及び／又はリン酸またはこれらの塩からなる群の１種または２種以上の組み合わせを成分とする上記（１）に記載の液状製剤；
（４）液状製剤のｐＨが３．０から７．０の範囲であることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の液状製剤；
（５）酸性液の濃度が１〜１０００ｍＭである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の液状製剤；
（６）酸性液の濃度が１０〜５００ｍＭである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の液状製剤；
（７）酸性液が、ｐＨ３．０〜７．０の範囲である酸緩衝液であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の液状製剤；
である。【００２３】
また、本発明は別の態様として、
（８）生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を有効成分とし、極性有機液体を含有することを特徴とする液状製剤；
（９）生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を有効成分とし、極性有機液体を含有することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の液状製剤；
（１０）極性有機液体が、アルコール類及び／又はＮ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、メチルパラベンからなる群の１種または２種以上の組み合わせを成分とする上記（８）または（９）に記載の液状製剤；
（１１）極性有機液体が、ベンジルアルコール、エタノール、フェノール、tert−ブタノール、クロロブタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドからなる群の１種または２種以上の組み合わせである上記（８）または（９）に記載の液状製剤；
（１２）極性有機液体の濃度が０．００１〜８０％（ｗ／ｖ）である上記（８）〜（１１）のいずれかに記載の液状製剤；
（１３）極性有機液体の濃度が０．１〜１０％（ｗ／ｖ）である上記（８）〜（１１）のいずれかに記載の液状製剤；
（１４）更に糖類を含有することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の液状製剤；
（１５）更に糖類を含有することを特徴とする上記（８）〜（１２）のいずれかに記載の液状製剤；
（１６）更に極性有機液体及び糖類を含有することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の液状製剤；
（１７）糖類がマンニトール、白糖、ブドウ糖、シクロデキストリン類からなる群の１種または２種以上の組み合わせである上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の液状製剤；
（１８）糖類がシクロデキストリン類であることを特徴とする上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の液状製剤；
（１９）糖類の濃度が０．１〜２０％（ｗ／ｖ）である上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の液状製剤；
である。【００２４】
また、より具体的な本発明は、
（２０）生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質が、グレリン類、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ｈＧＬＰ−１）、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰ）、ヒトアドレノメデュリン、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ（1-34））、ヒトインスリンから選択される一種である上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の液状製剤；
（２１）生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質が、グレリン類である上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の液状製剤；
（２２）グレリン類が、グレリンである上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の液状製剤；
（２３）グレリンが、ヒトグレリンである上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の液状製剤；
（２４）グレリン類の濃度が、０．０３ｎｍｏｌ／ｍＬ〜１５μｍｏｌ／ｍＬであることを特徴とする上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の液状製剤；
（２５）液状製剤が、注射用液状製剤であることを特徴とする上記（１）〜（２４）のいずれかに記載の液状製剤；
（２６）注射用液状製剤が、皮下注射用製剤あるいは筋肉内注射用製剤であることを特徴とする上記（２５）に記載の液状製剤；
である。【００２５】
さらに本発明は、より具体的な態様として、
（２７）グレリン類を有効成分とし、酢酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸及び／又はリン酸からなる群の１種または２種以上の組み合わせを成分とする酸性液を含有し、且つ、ベンジルアルコール、エタノール、フェノール、tert−ブタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドからなる群の１種または２種以上の組み合わせである極性有機液体を含有し、ｐＨが３．０〜７．０である液状製剤；
（２８）グレリン類を溶解した水溶液に酸性液および極性有機液体を添加したことを特徴とするグレリン類の生物学的利用率を改善する方法；
である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、グレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を有効成分とする薬剤としての生物学的利用率（バイオアベイラビリティ：ＢＡ）を確保し、より有効な液状製剤が提供される。
さらに、グレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を溶解した水溶液を皮下注射した際のＢＡを改善する方法が提供される。
したがって、例えば皮下投与では医療上有効な血漿濃度が得られないとされていた、グレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質の血中濃度を維持しうることができるものであり、その医療上の価値は多大なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に、本発明が提供するグレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を有効成分として含有する液状製剤、およびＢＡの改善方法について、その詳細を説明する。【００２８】
本発明におけるグレリン類は、内因性の成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）であり、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性、および成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有するペプチドである。本発明においては、これら各動物に内在する天然型グレリンおよび該グレリンのペプチド主鎖におけるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸が挿入、除去、置換及び／又は付加等している該グレリンと同等の生理活性を示すグレリン誘導体のペプチドをいう。【００２９】
また、本発明では、ヒト、ラット、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマス、またはイヌ由来のグレリンなど、これら各動物に内在する天然型グレリンが好ましく用いられる。グレリン誘導体では、好ましくは、これら各動物に内在する天然型グレリンと同様の活性を有するペプチドで、例えば３位のセリンの位置にオクタノイル基ではなく、炭素原子数４〜１２の脂肪酸によりアシル化修飾されている誘導体或いは３位のセリン側鎖のオクタノイル基を除去したデス−オクタノイル体が用いられる。
さらに、本発明の液状製剤の投与対象者がヒトであるときは、ヒトグレリンが最も好ましく用いられる。【００３０】
また、グレリン類は、遊離のペプチドのほか、塩の形態のものを含むことができる。遊離のペプチドとその塩は、慣用の方法により相互に変換可能である。遊離のペプチドを、薬理的に許容できる塩とする場合には、例えば、遊離ペプチドを無機酸あるいは有機酸と反応させることにより行うことができる。このような塩としては、例えば、炭酸塩、重炭酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ホウ酸塩等の無機酸との塩；例えば、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等の有機酸との塩が挙げられる。【００３１】
さらに、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、または有機塩基、例えば、トリエチルアミン等の有機アミン類、アルギニン等の塩基性アミノ酸類等などとの塩を挙げることができる。また、該ペプチドは、金属錯体化合物（例えば、銅錯体、亜鉛錯体等）を形成してもよい。【００３２】
また、グレリン類について、その起源は特に限定されるものではなく、その製法についても天然の原料から単離する以外に、常法による化学合成法、半化学合成法、遺伝子組換え法、もしくはそれらを適宜組合せた製造法、または生体から抽出などにより得られたもののいずれであってもよい。例えば特許文献１に記載される方法により得ることができる。【００３３】
本発明が提供する液状製剤におけるグレリン類の濃度は、医薬品として提供できる範囲であれば特に限定されない。すなわち、下限としては、医薬品として薬効を示す濃度であればよく、上限としては、水溶液中で溶解できる濃度であればよい。好ましくは、一般的に利用されている製剤含有量である０．０３ｎｍｏｌ／ｍＬ〜１５μｍｏｌ／ｍＬ程度、より好ましくは０．０３ｎｍｏｌ／ｍＬ〜６μｍｏｌ／ｍＬ程度の範囲とすればよい。【００３４】
本発明が提供する液状製剤において、酸性液はカルボキシル基を有する化合物であり、酢酸、乳酸、クエン酸、塩酸、プロピオン酸、酪酸、安息香酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、炭酸、重炭酸、グルコン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、リンゴ酸、トリフルオロ酢酸、またはこれらの塩などを挙げることができる。またはこれらの塩からなる群の１種または２種以上の組み合わせである成分を含む酸性液を含有させる。好ましくは、酢酸、乳酸、リン酸、グリシン、クエン酸、塩酸、プロピオン酸、酪酸、安息香酸またはこれらの塩からなる群の１種または２種以上の組み合わせを成分とする酸性液が好ましい。更に好ましくは、酢酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸及び／又はリン酸またはこれらの塩からなる群の１種または２種以上の組み合わせを成分とする酸性液を用いる。【００３５】
酸性液の濃度は特に限定されず、ＢＡを上げる効果を有する濃度であればよく、１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。【００３６】
グレリン類の安定性を考慮した場合、保存中における水溶液のｐＨの変動が小さいほうが好ましく、酸性液として、緩衝能を有する水溶液、すなわち緩衝液を用いることができる。その場合、緩衝液のｐＨは、３．０〜７．０の範囲がよい。緩衝液を添加した後の液状製剤のｐＨは、緩衝液によりｐＨは維持されるが、緩衝液の濃度や特異的な状況下においては、ｐＨは０．１乃至０．２程度前後する場合もありうるが、それも本発明の範囲内である。【００３７】
好ましい具体的な緩衝液としては、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液を含む）、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液を含む）、グリシン塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム緩衝液を含む）、クエン酸−リン酸緩衝液（マクイルバイン（McIlvaine）緩衝液を含む）、リン酸−酢酸−ホウ酸緩衝液（ブリットン−ロビンソン（Britton-Robinson）緩衝液を含む）、フタル酸緩衝液、プロピオン酸緩衝液が挙げられる。これらの緩衝液を１種あるいは複数を組合せて使用することができる。本発明においては、特に、酢酸緩衝液、酪酸緩衝液、プロピオン酸緩衝液、乳酸緩衝液及び／又はリン酸緩衝液が好ましく用いられる。【００３８】
液状製剤のｐＨは、３．０〜７．０の範囲がよい。より好ましくは、ｐＨ４．０〜７．０の範囲である。ｐＨが３．０より小さい場合も、ＢＡを上げる効果はあるが、液状製剤、特に注射剤の場合、痛みなどの問題があり、好ましくない。
この液状製剤のｐＨの調節には、前述の緩衝液のほか、例えばｐＨ調節剤を用いることができる。このようなｐＨ調節剤としては、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、炭酸、重炭酸、グルコン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、クエン酸、モノエタノールアミン、乳酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、メタンスルホン酸、リンゴ酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、またはこれらの塩などを挙げることができる。【００３９】
さらに本発明においては、ｐＨ緩衝液のほかに、極性有機液体を添加することが出来る。本発明においては酸性液のほかに極性有機液体を添加することにより、皮下注射時のＢＡが、酸性液単独を用いた時以上のＢＡになり、アルコール類を含む極性有機液体の添加によりＢＡを上昇させる効果、あるいは吸収パターンを調節する効果があることを見出した。【００４０】
注射剤は常に無菌であることが必要であり、特に分割使用を目的とする場合に、保存剤または防腐剤が添加されることがある。このような目的で使用される添加剤として、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、パラオキシ安息香酸エステル類などが挙げられる。【００４１】
また、注射剤はその投与時に疼痛を伴う場合があり、無痛化剤が添加されることがある。このような目的で使用される添加剤として、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、あるいはプロカイン、キシロカインなどの局所麻酔剤が挙げられる。
例えば、特許文献４には、薬効成分のほか、疼痛緩和剤としてのベンジルアルコール又はその類縁化合物と、シクロデキストリンを含有する注射剤が開示されている。ベンジルアルコールは、注射時の疼痛を緩和し、ベンジルアルコール又はその類縁化合物は、ベンジルアルコールによる赤血球に対する溶血作用を防止するために用いられている。【００４２】
一般的に、アルコール類は、保存剤、防腐剤、無痛化剤などとして添加されるものであるが、本発明においては、アルコール類を含む極性有機液体を酸性液と共に投与すると、グレリンの液状製剤のＢＡをさらに上昇させる効果があることが判明した。かかる知見は本発明者らによって初めて見出されたものであり、極めて特異的なものである。【００４３】
本発明で用いられるこのようなアルコール類としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、２−ブタノール、イソブタノール、クレゾール、ｍ−クレゾール、クロロクレゾール、パラオキシ安息香酸エステル類（メチルパラベン、エチルパラベン等）、イノシトール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、セタノール、ステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、ヘキサントリオール、ベヘニルアルコール、ラウリルアルコール、ラノリンアルコール、グリセロール（グリセリン）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、メントール、ボルネオール、マルトール、エチルマルトール、オイゲノール、ゲラニオール、チモール、ジイソプロパノールアミン、ジエタノールアミン、トロメタモールなどが挙げられる。本発明において、好ましく用いられるのは、ベンジルアルコール、エタノール、フェノール、tert−ブタノールまたはクロロブタノールである。【００４４】
また、アルコール類と同様にＢＡを上昇させる極性有機液体として、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、メチルパラベンを同様に用いることができる。【００４５】
これらの極性有機液体は、１種あるいは複数種を組合せて使用することもできる。本発明における極性有機液体の量は、上述した効果を有する濃度であって、かつ、本発明の薬剤の製造時や長期保存時に問題を生じない範囲で適宜設定できる。例えば、投与時に溶液とした際の濃度が０．００１〜８０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲が望ましい。【００４６】
その他、本発明の液状製剤においては、目的に応じて各種の添加剤を添加することができる。そのような添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、マンニトールなどの等張化剤；安息香酸ナトリウムなどの防腐剤；亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸などの抗酸化剤；塩酸リドカイン、塩酸メプリルカインなどの無痛化剤などを、適宜選択し使用することができる。
また、本発明によれば、ＢＡが改善された、グレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を有効成分として含有する液状製剤が提供されるが、さらに、製剤ごとに必要な要件である、例えば注射剤であれば、浸透圧、溶解性、低刺激性、防腐効果および吸着抑制効果などを考慮して、各種添加剤を選択して使用することができる。【００４７】
本発明における液状製剤とは、非経口投与方法に用いられる製剤である。更に詳しくは、注射剤、輸液、経鼻剤などが挙げられる。注射剤としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、点滴静脈注射などが挙げられるが、中でも、皮下注射、筋肉内注射などは、本発明の目的とするところのＢＡの改善効果が最も得られる。【００４８】
本発明により提供される液状製剤の製造は、製剤学上慣用される製造法によって行うことができる。例えば、凍結乾燥品として提供される原薬としてのグレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を精製水により溶解し、一方で、緩衝液およびその他の添加剤を精製水で溶解する。その後、これらの原薬溶解液および添加剤溶解液を混合し、適宜、滅菌濾過などの工程を施した後、アンプルやバイアル等に分注してグレリン類を有効成分とする製剤を得ることができる。【００４９】
また、注射剤のとり得る形態に用時溶解型の製剤がある。これは溶液中で長期間にわたる安定性の確保が困難な場合に適した剤型である。用時に本発明のグレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を有効成分とする液状製剤となる、用時溶解型の薬剤も本発明の１つの形態である。用時溶解型の薬剤は、例えば、粉末品等の固体組成物として供給されるグレリン類に、目的に応じて前述の各種添加剤を適宜選択し、必要量添加して得られた固形組成物、あるいは、グレリン類を含有する水溶液に、目的に応じて前述の各種添加剤を適宜選択し、必要量添加した液体組成物を乾燥することにより固体組成物として得る。これら固体組成物を、用時、水などの溶媒に溶解して使用することができる。水以外の溶媒は医薬品として許容される範囲であれば、含まれていても良い。例えば、エタノール、２−プロパノール等を用いることができる。【００５０】
本発明では、グレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を固形組成物として提供される場合に、糖類を用いることもできる。そして、酸性液及び／又は極性有機液体と共に添加することにより、グレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質のＢＡが更に上昇することを見出した。【００５１】
用いられる糖類としては、単糖類としては、マンニトール、ブドウ糖、果糖、イノシトール、ソルビトール、キシリトールなどが挙げられ、二糖類として、白糖（スクロース）、乳糖、マルトース、トレハロースなどが挙げられ、多糖類として、デンプン、デキストラン、プルラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、フィチン酸、フィチン、キチン、キトサンなどが挙げられる。また、デキストリン類として、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシエチルスターチなどが挙げられ、セルロース類として、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが挙げられる。これらの糖類は、１種或いは複数種を組合せて使用することもできる。
本発明においては、特にマンニトール、白糖、ブドウ糖、シクロデキストリン類が好ましく用いられる。特にシクロデキストリン類が好ましく用いられる。【００５２】
シクロデキストリン類については、インスリンの皮下注射時のラットにおけるＢＡが、スルホブチルエーテルβシクロデキストリン誘導体（β−ＣｙＤｓ）を添加することにより、上昇することが報告されている（非特許文献２）。
シクロデキストリン類については、医薬品と共に添加されることによって軟水溶性物質の溶解性の改善、医薬品の保存安定性の改善が図られることはよく知られている。【００５３】
特許文献６には、インターフェロンポリペプチドとスルホアルキルエーテルシクロデキストリンを含有する製剤が開示されているが、この製剤において、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体は製剤組成物の保存安定化剤として用いられており、インターフェロンポリペプチドの生物活性が保持されることを特徴としている。【００５４】
特許文献７には、生理活性ポリペプチドとシクロデキストリンとを含有する経鼻投与製剤が、特許文献８には、生理活性を有するポリペプチドとシクロデキストリンとを含有する膣投与製剤が開示されている。いずれも、生理活性を有するポリペプチドが消化管内あるいは消化管壁の酵素により加水分解を受けるため、消化管吸収性を高めた、非注射製剤として経鼻投与製剤或いは膣投与製剤を開発したものである。シクロデキストリンは、生理活性ポリペプチドの吸収促進剤として用いられている。【００５５】
特許文献９には、β−及びγ−シクロデキストリン類によるインターフェロンなどのタンパク質の可溶化及び安定化方法が開示されている。これらのいずれの文献も、本発明の生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質の皮下注射による投与の際のＢＡを上昇させることを示唆或いは開示するものではない。【００５６】
これらの糖類は、１種あるいは複数種を組合せて使用することができる。本発明における糖類の量は、上述した効果を有する濃度であって、かつ、本発明の薬剤の製造時や長期保存時に問題を生じない範囲内、或いは液剤の粘度が製造或いは投与時に問題を生じない範囲内で適宜設定できる。例えば、投与時に溶液とした際の濃度が０．１〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲が望ましい。【００５７】
本発明では、更に、生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質がグレリン、グレリン誘導体或いはグレリン類似体などのグレリン類、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ｈＧＬＰ−１）、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰ）、ヒトアドレノメデュリン、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ(1-34)）、ヒトインスリンである液状製剤に酸性液、極性有機液体、糖類などを添加することによって、皮下注射投与においても、そのＢＡが顕著に上昇することを確認した。特にグレリン類のように、皮下注射による投与では、医学的な効果が得られないであろう血漿濃度しか得られない生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質においては、本発明は新たな投与形態を確保するものである。
【実施例】
【００５８】
以下に本発明について実施例を説明することにより、さらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの例により限定されるものでない。【００５９】
本実施例において使用する主な略号は、それぞれ以下の意味を有する。また、用いた試験法と機器は、特に記載しない限り以下に記載のものを使用した。
［使用機器］
（Ａ）ｐＨ測定
機器：株式会社堀場製作所製  カスタニーLAB pHメーター F-22
（Ｂ）ラジオイムノアッセイ（RIA）
機器：Packard Instruments製  γ−カウンター COBRA-II
（Ｃ）エンザイムイムノアッセイ（ELISA）
機器：Molecular Devices Corporation製  マイクロプレートリーダー【００６０】
比較例１：ヒトグレリンを含有する製剤の調製（１）
５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液、生理食塩水または１０％（ｗ／ｖ）白糖水溶液に、下記表２示す濃度になるようにヒトグレリンを溶解して、製剤１〜５及び３４〜３５を調製した。【００６１】
【表２】
0004951344.tif 000003
【００６２】
実施例１：ヒトグレリンを含有する製剤の調製（２）
以下に示す方法で、０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、０．５Ｍ酢酸緩衝液、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．５Ｍクエン酸緩衝液、０．５Ｍグリシン塩酸緩衝液、１Ｍ乳酸緩衝液、０．０６Ｍプロピオン酸緩衝液及び０．０６Ｍ  ｎ−酪酸緩衝液について、括弧内のｐＨ値を有する緩衝液をそれぞれ調製した。
（１）０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）：
酢酸ナトリウム（分子量８２．０３）８．２０ｇに精製水を加えて１００ｍＬとし、これに１Ｍ塩酸を加えてｐＨ７．０とした。この溶液に精製水を加えて２００ｍＬとした。
（２）０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）：
酢酸ナトリウム（分子量８２．０３）８．２０ｇに精製水を加えて１００ｍＬとし、これに１Ｍ塩酸を加えてｐＨ４．０とした。この溶液に精製水を加えて２００ｍＬとした。
（３）０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）：
酢酸ナトリウム（分子量８２．０３）８．２０ｇに精製水を加えて１００ｍＬとし、これに１Ｍ塩酸を加えてｐＨ５．０とした。この溶液に精製水を加えて２００ｍＬとした。
（４）０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）：
酢酸ナトリウム（分子量８２．０３）８．２０ｇに精製水を加えて１００ｍＬとし、これに１Ｍ塩酸を加えてｐＨ６．０とした。この溶液に精製水を加えて２００ｍＬとした。
（５）０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）：
酢酸アンモニウム（分子量７７．０８）７．７１ｇに精製水を加えて１００ｍＬとし、これに１Ｍ塩酸を加えてｐＨ４．０とした。この溶液に精製水を加えて２００ｍＬとした。
（６）０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）：
酢酸（分子量６０．０５）６．０１ｇに精製水を加えて１００ｍＬとし、これに１Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ４．０とした。この溶液に精製水を加えて２００ｍＬとした。
（７）０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）：
リン酸二水素ナトリウム二水和物（分子量１５６．０１）１５．６０ｇに精製水を加えて１００ｍＬとし、これに１Ｍ塩酸を加えてｐＨ４．０とした。この溶液に精製水を加えて２００ｍＬとした。
（８）０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）：
リン酸二水素ナトリウム二水和物（分子量１５６．０１）１５．６０ｇに精製水を加えて１００ｍＬとし、これに１Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ５．０とした。この溶液に精製水を加えて２００ｍＬとした。
（９）０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）：
クエン酸一水和物（分子量２１０．１４）１０．５１ｇに精製水を加えて１００ｍＬとしてクエン酸水溶液を調製した。また、クエン酸三ナトリウム（分子量２９４．１０）１４．７１ｇに精製水を加えて１００ｍＬとしてクエン酸三ナトリウム水溶液を調製した。クエン酸水溶液およびクエン酸三ナトリウム水溶液を混合してｐＨ４．０とした。
（１０）０．５Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）：
グリシン（分子量７５．０７）７．５１ｇに精製水を加えて１００ｍＬとし、これに１Ｍ塩酸を加えてｐＨ４．０とした。この溶液に精製水を加えて２００ｍＬとした。
（１１）１Ｍ乳酸緩衝液（ｐＨ４．０）：
乳酸（分子量９０．０８）４５．０４ｇに精製水を加えて２５０ｍＬとし、これに１Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ４．０とした。この溶液に精製水を加えて５００ｍＬとした。
（１２）０．０６Ｍプロピオン酸緩衝液（ｐＨ４．０）：
プロピオン酸（分子量７４．０８）２．２２ｇに精製水を加えて２５０ｍＬとし、これに１Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ４．０とした。この溶液に精製水を加えて５００ｍＬとした。
（１３）０．０６Ｍ  ｎ−酪酸緩衝液（ｐＨ４．０）：
酪酸（分子量８８．１１）２．６４ｇに精製水を加えて２５０ｍＬとし、これに１Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ４．０とした。この溶液に精製水を加えて５００ｍＬとした。【００６３】
上記の緩衝液、または上記の緩衝液を適宜希釈した溶液を酸性液として用いて、あるいは他の添加物を溶解して、下記表３に示す濃度になるようにヒトグレリンを含有する製剤６〜３３、５１〜５９、７３及び８１〜９７を調製した。【００６４】
【表３．１】
0004951344.tif 000004
【００６５】
【表３．２】
0004951344.tif 000005
【００６６】
【表３．３】
0004951344.tif 000006
【００６７】
上記の緩衝液、または上記の緩衝液を適宜希釈した溶液を酸性液として用いて、あるいは他の添加物を溶解して、下記表４に示す濃度になるようにペプチド類を含有する製剤３６〜５０及び９８〜１０７を調製した。【００６８】
【表４．１】
0004951344.tif 000007
【００６９】
【表４．２】
0004951344.tif 000008
【００７０】
酸性液を用いずに、他の添加物を溶解して、下記表５に示す濃度になるようにヒトグレリンを含有する製剤６０〜６８、７０〜７２、７４、７６及び７８〜８０を調製した。【００７１】
【表５】
0004951344.tif 000009
【００７２】
以上の製剤に用いた医薬品添加物は、日本薬局方に収載されているものについては、その規格のものを使用した。【００７３】
比較例２：ラットを用いた静脈内注射および皮下注射による薬物動態試験
比較例１で作製した製剤２および３をラットに静脈内投与または皮下投与し、血漿中濃度を測定した。
試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）各々１群に３匹を実験に供した。静脈内投与は、予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いて実施した。製剤２を０．５ｍＬ／ｋｇの投与容量で、尾静脈より注射筒および２６Ｇの注射針（ともにテルモ社製）を用いて投与し、投与前、および投与後１、３、５、１０、２０、３０、６０、９０分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。【００７４】
皮下投与もまた、予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用いて実施した。製剤３を１ｍＬ／ｋｇの投与容量で、背部皮下より注射筒および２６Ｇの注射針を用いて投与し、投与前、および投与後５、１０、２０、３０分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。
それぞれの採取した血液には直ちに１／１００容量のＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ溶液および１／５０容量のＡＥＢＳＦ溶液を添加後、遠心して血漿を分離した。血漿にはただちに１／１０容量の１Ｎ塩酸を添加、混合し、測定に供するまで−８０℃で保管した。【００７５】
グレリンの血漿中濃度測定は、抗グレリン抗体を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により実施した。すなわち、血漿試料に抗グレリン抗体を加えたのち、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ２９］グレリンを加えて競合反応させた。これに二次抗体を加えて抗グレリン抗体に結合したグレリンを沈殿させ、上清分離後に沈殿画分中の放射能をγ−カウンター（パッカード社製）で測定した。なお、ここで用いた抗グレリン抗体は、グレリン認識し、デスアシルグレリン（グレリンからオクタノイル基が解離した不活性体）を認識しない。すなわち本測定法は活性型グレリンを特異的に検出する測定法である。【００７６】
得られた血漿中グレリン濃度推移を図１に示した。図１に示した結果から薬物速度論的パラメータとして最高血漿中濃度（Ｃmax）、最高血漿中濃度到達時間（Ｔmax）を求めた。静脈内投与においては、時間０における外挿値（Ｃ０）を算出した。さらに血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法にて算出し、この値より生物学的利用率（バイオアベイラビリティ：ＢＡ）を求めた。その結果を表６に示す。なお、これらの値は各群３匹のラットから得られた値の平均値である。【００７７】
表６：グレリンの５％マンニトール水溶液を添加した製剤をラットに静脈内投与または皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ【００７８】
【表６】
0004951344.tif 000010
【００７９】
表中に示した結果から判明するように、製剤２を１０μｇ／ｋｇの用量で静脈内投与したときのＡＵＣは２０５．９８ｎｇ・分／ｍＬであり、また製剤３を５０μｇ／ｋｇの用量で皮下投与したときのＡＵＣは２５．７２ｎｇ・分／ｍＬであった。したがって、５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液に溶解時のヒトグレリンのＢＡは２．５％と算出された。【００８０】
実施例２：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（酢酸ナトリウム緩衝液の効果）
製剤３４、６および製剤７を、比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その結果を図２に示した。また、薬物速度論的パラメータを下記表７に示した。【００８１】
表７：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（酢酸ナトリウム緩衝液の効果）【００８２】
【表７】
0004951344.tif 000011
【００８３】
表中に示した結果から判明するように、製剤６および製剤７のＢＡはそれぞれ２２．９％および３５．３％であった。生理食塩水の溶液による製剤３４のＢＡが５．０％、５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液による製剤３のＢＡが２．５％に対して、驚くべきことに、０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を添加したときのＢＡは、緩衝液のｐＨに関わらず、５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液の場合に対して９〜１４倍と顕著に上昇した。【００８４】
実施例３：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（酸性液の成分の影響）
製剤７、８、９、１０および１１を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表８に示す。【００８５】
表８：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（酸性液成分の影響）【００８６】
【表８】
0004951344.tif 000012
【００８７】
製剤７、８、９、１０および１１のＢＡはそれぞれ３５．３％、２０．９％、７．０％、８．９％および１６．３％であった。すなわち、ｐＨを４．０としたいずれの成分の緩衝液を酸性液として用いても、ＢＡは５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液に対して顕著に上昇していた。【００８８】
実施例４：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（酸性液の濃度の影響）
製剤１２、１３、１４および１５を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その薬物速度論的パラメータを下記表９に示した。【００８９】
表９：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（酸性液の濃度の影響）【００９０】
【表９】
0004951344.tif 000013
【００９１】
製剤１２、１３、１４および１５のＢＡはそれぞれ３４．０％、２８．１％、１３．８％および４．８％であった。すなわち、酸性液（ｐＨ４．０）中の酢酸ナトリウム濃度が０．０１Ｍ〜０．５Ｍの場合、いずれの濃度でも、ＢＡは５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液よりも高かった。【００９２】
実施例５：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（液状製剤のｐＨの影響）
製剤１３、１６および１７を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表１０に示した。【００９３】
表１０：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（液状製剤のｐＨの影響）【００９４】
【表１０】
0004951344.tif 000014
【００９５】
製剤１３、１６および１７のＢＡはそれぞれ２８．１％、１６．６％および９．１％であった。すなわち、酸性液である酢酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ）のｐＨが４．０〜６．０の場合、いずれもＢＡが５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液よりも高いことが示された。
【００９６】
実施例６：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（リン酸緩衝液の濃度およびｐＨの影響）
製剤１８、１９、２０、２１、２２および２３を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表１１に示した。【００９７】
表１１：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（リン酸緩衝液の濃度およびｐＨの影響）【００９８】
【表１１】
0004951344.tif 000015
【００９９】
製剤１８、１９、２０、２１、２２および２３のＢＡはそれぞれ１７．７％、８．０％、５．３％、１５．０％、１０．６％および５．４％であった。すなわち、酸性液であるリン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）を用いたときも、そのＢＡは５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液よりも高値であった。【０１００】
実施例７：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（アルコール類の種類と濃度の影響）
製剤１４、３０、８１、８２及び８６を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表１２に示した。【０１０１】
表１２：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（アルコール類の種類と濃度の影響）【０１０２】
【表１２】
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【０１０３】
製剤１４、３０、８１、８２および８６のＢＡはそれぞれ１３．８％、２５．２％、２５．８％、１３．８％よび２２．５％であった。製剤１４は、酸性液と糖類を含むが、アルコール類を含まない製剤である。製剤３０は、製剤１４と同じ酸性液と糖類を含み、かつアルコール類としてベンジルアルコールを含む製剤であるが、製剤１４のＢＡの２倍のＢＡを示し、アルコール類を含まない製剤よりもＢＡは高くなることが判った。また、アルコール類の種類及び濃度に関わらず、そのＢＡは高くなることが判った。【０１０４】
実施例８：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（白糖の濃度の影響）
製剤２４、１３および２５を、比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その結果を図３に示し、薬物速度論的パラメータを下記表１３に示した。【０１０５】
表１３：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（白糖の濃度による影響）【０１０６】
【表１３】
0004951344.tif 000017
【０１０７】
製剤２４、１３および２５のＢＡは、それぞれ３８．２％、２８．１％および１９．４％であった。すなわち、酸性液である酢酸ナトリウム緩衝液に０、１０および２０％（ｗ／ｖ）の白糖を添加したときのＢＡは、いずれも５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液よりも高いことが示された。酸性液のみを含有する製剤２４に対して、糖類として白糖を更に添加した製剤１３及び２５はＴ１／２が延長されることが判った。
【０１０８】
実施例９：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（糖類の種類の影響）
製剤３５、５３、８４および８５を、比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表１４に示した。【０１０９】
表１４：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（糖類の種類よる影響）【０１１０】
【表１４】
0004951344.tif 000018
【０１１１】
製剤３５、５３、８４および８５のＢＡは、それぞれ３．０％、２２．４％、２１．３％および８．７％であった。白糖のみを含む製剤３５はＢＡは上がるものの３．０％と低かった。すなわち、酸性液及びアルコール類の添加条件を一致させ、糖類の種類を変更した場合でも、ＢＡは、いずれも５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液よりも高いことが示された。また、糖類のうち、白糖とブドウ糖が、デキストラン７０よりも効果が高いことが判った。【０１１２】
実施例１０：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（糖類のうち、シクロデキストリン類を用いた場合の影響）
製剤８７〜９７を、比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表１５に示した。【０１１３】
表１５：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（糖類のうち、シクロデキストリン類を用いた場合の影響）【０１１４】
【表１５】
0004951344.tif 000019
【０１１５】
製剤８７ないし９７はいずれも高いＢＡを示した。糖類として白糖を用いた製剤５３のＢＡが２２．４％で、ブドウ糖を用いた製剤８４のＢＡが２１．３％あったが、糖類としてシクロデキストリン類を用いた場合も同様に高いＢＡを示した。【０１１６】
実施例１１：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（グレリンの投与量の影響）
製剤２６、１３、２７および２８を、比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与した。すなわち、グレリンの投与量は１０、５０、２５０および２，０００μｇ／ｋｇである。採血は実施例２と同様に実施し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定し、その結果を図４および５に示した。また、薬物速度論的パラメータを下記表１６に示した。【０１１７】
表１６：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（グレリンの投与量の影響）【０１１８】
【表１６】
0004951344.tif 000020
【０１１９】
製剤２６、１３、２７および２８のＡＵＣはそれぞれ４９．２８ｎｇ・分／ｍＬ、２８９．９０ｎｇ・分／ｍＬ、１５８０．２８ｎｇ・分／ｍＬ、および１５０５０．５９ｎｇ・分／ｍＬであり、ＢＡはそれぞれ２３．９％、２８．１％、３０．７％および３６．５％であった。すなわち、グレリンの投与量を１０μｇ／ｋｇから２，０００μｇ／ｋｇまで上げても、吸収に飽和は見られず、吸収改善効果が維持されることが確認された。【０１２０】
実施例１２：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（ベンジルアルコールの添加の影響）
製剤１３、１４、２９および３０を、比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その薬物速度論的パラメータ下記表１７に示した。【０１２１】
表１７：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（ベンジルアルコールの効果）【０１２２】
【表１７】
0004951344.tif 000021
【０１２３】
製剤１３、１４、２９および３０のＢＡは、それぞれ２８．１％、１３．８％、３９．３％および２５．２％であった。すなわち、酸性液である酢酸ナトリウム緩衝液に、アルコール類として１％（ｗ／ｖ）のベンジルアルコールを添加したときのＢＡは、酢酸ナトリウム濃度が０．１Ｍおよび０．０３Ｍのいずれの場合でも、ベンジルアルコール非添加の場合と比べて高値であり、アルコール類であるベンジルアルコールにグレリンのＢＡを改善する効果があることが確認された。【０１２４】
実施例１３：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（グレリンの濃度の影響）
製剤３０および３１を比較例２と同様に皮下投与した。投与容量は製剤３０では１ｍＬ／ｋｇ、製剤３１では５０μＬ／ｋｇとした（５０μＬ／ｋｇの容量で投与するときにはマイクロシリンジ（ＳＧＥ社製）を使用した）。すなわち、グレリンの投与量は両者とも５０μｇ／ｋｇで同じである。採血は比較例２と同様に実施し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その薬物速度論的パラメータを下記表１８に示した。【０１２５】
表１８：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（グレリンの濃度の影響）【０１２６】
【表１８】
0004951344.tif 000022
【０１２７】
製剤３０および３１のＢＡは、それぞれ２５．２％および２３．２％であり、ほぼ同等であった。すなわち、酢酸ナトリウム緩衝液およびベンジルアルコールの吸収改善効果はグレリンの濃度や投与容量に関係なく維持されることが確認された。【０１２８】
実施例１４：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（酢酸緩衝液調製方法の影響）
製剤３１および３２を５０μＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与した。すなわちグレリンの投与量は５０μｇ／ｋｇである。採血は比較例２と同様に実施し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その薬物速度論的パラメータを下記表１９に示した。【０１２９】
表１９：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（酢酸緩衝液調製方法の影響）【０１３０】
【表１９】
0004951344.tif 000023
【０１３１】
製剤３１および３２のＢＡは、それぞれ２３．２％および４３．２％であった。すなわち、酸性液として、酢酸ナトリウム水溶液を塩酸でｐＨ４．０に合わせた緩衝液、または酢酸を水酸化ナトリウム溶液でｐＨ４．０に合わせた緩衝液のいずれにおいても、５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液と比べて高いＢＡを示し、酸性液の成分に関わらずＢＡが上昇することが判った。【０１３２】
実施例１５：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（酢酸緩衝液の影響）
製剤３２、５１、５２および５３を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表２０に示した。【０１３３】
表２０：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（酢酸緩衝液の濃度とｐＨの影響）【０１３４】
【表２０】
0004951344.tif 000024
【０１３５】
製剤３２、５１、５２および５３のＢＡは、それぞれ２３．２％、２２．８％、１８．０％および２２．４％であった。製剤３２及び５１ないし５３は、ＢＡを上昇させるアルコール類であるベンジルアルコールと、糖類である白糖とを添加した製剤において、酸性液として酢酸緩衝液を用いた製剤であるが、いずれも製剤７９のベンジルアルコールと白糖を含む製剤のＢＡ１４．２％より高く、酸性液とアルコール類と糖類を含有する製剤は高いＢＡを示すことが判った。【０１３６】
実施例１６：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（他の酸性液の影響）
製剤５４〜５９及び７３を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表２１に示した。
【０１３７】
表２１：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（他の酸性液の影響）【０１３８】
【表２１】
0004951344.tif 000025
【０１３９】
製剤５４〜５９及び７３のＢＡは、それぞれ１９．９％、１７．３％、２２．３％、１９．８％、２６．６％、２３．２％及び１４．３％であった。製剤５４ないし５９は、ＢＡを上昇させるアルコール類であるベンジルアルコールと、糖類である白糖戸を添加した製剤において、酸性液を用いた製剤であるが、いずれも製剤７９のベンジルアルコールと白糖を含む製剤のＢＡ１４．２％より高く、酸性衝液とアルコール類と糖類を含有する製剤は高いＢＡを示すことが判った。また、酸性液の成分に関わらずＢＡは上昇した。【０１４０】
実施例１７：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（酸性液を含まない場合のアルコール類と糖類による影響）
製剤７８〜８０を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表２２に示した。【０１４１】
表２２：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（酸性液を含まない場合のアルコール類と糖類の影響）【０１４２】
【表２２】
0004951344.tif 000026
【０１４３】
製剤７８〜８０のＢＡは、それぞれ８．３％、１４．２％、１６．９％であった。白糖のみを含む製剤３５のＢＡは３．０％であり、酸性液を含有せずとも、アルコール類を添加したことにより、ＢＡが上がっていることが判る。
【０１４４】
実施例１８：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（酸性液を含まない場合のアルコール類の影響）
製剤６０〜６３、７１及び７２を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表２３に示した。【０１４５】
表２３：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（酸性液を含まない場合のアルコール類の影響）【０１４６】
【表２３】
0004951344.tif 000027
【０１４７】
製剤６０〜６３、７１及び７２のＢＡは、生理食塩水の溶液による製剤３４のＢＡが５．０％、１０％（Ｗ／Ｖ）白糖水溶液による製剤３５のＢＡが３．０％であるのに対して、ほとんどが高くなっている。酸性液を添加せずとも、アルコール類の添加だけで、ＢＡは上がることが示されている。【０１４８】
実施例１９：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（酸性液を含まない場合のアルコール類以外の極性有機液体による影響）
製剤６４〜６８、７０、７４〜７６を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表２４に示した。【０１４９】
表２４：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（酸性液を含まない場合のアルコール類以外の極性有機液体による影響）【０１５０】
【表２４】
0004951344.tif 000028
【０１５１】
製剤６４〜６８、７０、７４、７６のＢＡは、生理食塩水の溶液による製剤３４のＢＡが５．０％、１０％（Ｗ／Ｖ）白糖水溶液による製剤３５のＢＡが３．０％であるのに対して、ほとんどが高くなっている。酸性液を添加せずとも、極性有機液体の添加だけで、ＢＡは上がることが示されている。特にＮ−メチル−２−ピロリドンは、非常にＢＡが上がることが判った。【０１５２】
実施例２０：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（Ｎ−メチル−２−ピロリドンによる影響）
製剤８３と６５を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表２５に示した。【０１５３】
表２５：グレリン製剤をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ（Ｎ−メチル−２−ピロリドンによる影響）【０１５４】
【表２５】
0004951344.tif 000029
【０１５５】
製剤製剤８３及び６５のＢＡは、それぞれ６５．７％と５７．４％と非常に高いものであった。酸性液を含まない製剤６５より、更に酸性液を含む製剤８３のＢＡの方が高く、Ｎ−メチル−２−ピロリドンによるＢＡの上昇効果は単独でも優れているが、酸性液を添加することで更にＢＡは上昇する。【０１５６】
実施例２１：ラットを用いた筋肉内注射による薬物動態試験
筋肉内投与については、皮下投与と同様に、予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用いて実施した。製剤３および１３を１ｍＬ／ｋｇの投与容量で、大腿部筋肉内に注射筒および２６Ｇの注射針を用いて投与した。採血は比較例２と同様に実施し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その結果を図６に示した。また、薬物速度論的パラメータを下記表２６に示した。【０１５７】
表２６：グレリン製剤をラットに筋肉内投与したときの薬物速度論的パラメータ（酢酸ナトリウム緩衝液の効果）【０１５８】
【表２６】
0004951344.tif 000030
【０１５９】
製剤３および１３を筋肉内投与したときの静脈内投与に対するＢＡは、それぞれ１０．９％および２８．５％であった。すなわち、酢酸ナトリウム緩衝液を添加したときのＢＡは、５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液に対して２．６倍に上昇し、筋肉内投与においても皮下投与と同様に吸収改善効果があることが示された。【０１６０】
実施例２２：カニクイザルを用いた薬物動態試験
製剤５および３３をカニクイザルに皮下投与し、血漿中濃度を測定した。また製剤１をカニクイザルに静脈内投与し、血漿中濃度を測定した。
試験系として、４〜６才の雄性カニクイザル（中国産）を各群３匹として、実験に供した。投与溶液を０．２ｍＬ／ｂｏｄｙの投与容量で、背部皮下より注射筒および２６Ｇの注射針（ともにテルモ社製）を用いて投与した。
静脈内投与については、投与溶液を２ｍＬ／ｋｇの投与容量で、前腕橈側皮静脈内に注射筒および２６Ｇの注射針（ともにテルモ社製）を用いて投与した。
皮下および静脈内投与のいずれも、投与前、および投与後５、１０、１５、３０、４０、６０、９０、１２０分に前腕橈側皮静脈より血液を採取した。血液には直ちに１／１００容量のＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ溶液および１／５０容量のＡＥＢＳＦ溶液を添加後、遠心して血漿を分離した。血漿にはただちに１／１０容量の１Ｎ塩酸を添加、混合し、測定に供するまで−８０℃で保管した。【０１６１】
血漿中のグレリン濃度は、Active Ghrelin ELISA Kit（株式会社三菱化学ヤトロン，Cat. No. MM-401）を用いたエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法で測定した。本測定法は、ＲＩＡ法と同様、活性型グレリンを特異的に検出する測定法である。
得られた血漿中グレリン濃度の推移を図７に示した。図の結果より、薬物速度論的パラメータとしてＣmax、Ｔmaxを求めた。さらにＡＵＣを台形法にて算出し、この値よりＢＡを求めた。その結果を下記表２７に示した。なお、これらの値は各群３匹のカニクイザルから得られた値の平均値である。【０１６２】
表２７：グレリン製剤をカニクイザルに静脈内投与または皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ【０１６３】
【表２７】
0004951344.tif 000031
【０１６４】
製剤５および３３を皮下投与したときの静脈内投与に対するＢＡは、それぞれ４．９％および１２．８％であった。すなわち、１％（ｗ／ｖ）のベンジルアルコールを含む酢酸ナトリウム緩衝液を添加したときのＢＡは、５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液の場合に対して２．６倍に上昇し、カニクイザルにおいてもラットと同様に、ベンジルアルコールにはグレリンの吸収を改善させる効果があることが示された。【０１６５】
実施例２３：グレリン製剤のラットにおける血漿中成長ホルモン上昇作用
ラットにおけるグレリン投与後の血漿中成長ホルモン（ＧＨ）上昇作用について、製剤４および３１を用いて、以下のように検討した。
試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）３匹を１群として用い、予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０、クレイ・アダムス社製）を挿入して実施した。
投与溶液を５０μＬ／ｋｇの投与容量で、背部皮下より注射筒および２６Ｇの注射針（ともにテルモ社製）を用いて投与し、投与前、および投与後５、１０、２０、３０、６０分に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。血液には直ちに１／１００容量のＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ溶液を添加後、遠心して血漿を分離し、測定に供するまで−８０℃で保管した。【０１６６】
血漿中のＧＨ濃度は、Rat growth hormone (rGH)[125Ｉ]assay system (アマシャムバイオサイエンス株式会社：Cat. No. RPA551)を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法で測定した。得られた血漿中ＧＨの濃度推移を図８に示した。なお、これらの値は各群３匹のラットから得られた値の平均値である。【０１６７】
図中に示した結果からも判明するように、製剤４を皮下投与したときの血漿中ＧＨ濃度は投与前値（１１３ｎｇ／ｍＬ）と比較してわずかに上昇し、投与５分後に頂値（２０８ｎｇ／ｍＬ）を示した。これに対し、製剤３１を皮下投与したときの血漿中GH濃度は投与後２０分に頂値（３１６ｎｇ／ｍＬ）を示し、投与前値（９６ｎｇ／ｍＬ）の３．３倍であった。このようにグレリン製剤投与後の血漿中ＧＨ上昇作用は、酢酸ナトリウムおよびベンジルアルコールを用いた製剤のほうが有効であることが判明した。【０１６８】
実施例２４：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（グレリン類に対する影響）
製剤３７、３９、４１及び９８〜１０２を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表２８に示した。製剤３６、３８、４０を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で静脈内投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。これらの値よりＢＡを求めた。【０１６９】
なお、ラットグレリンの血漿中濃度はヒトグレリンと同様の方法で測定したが、ヒトグレリンデス−オクタノイル体の血漿濃度は、抗グレリン抗体を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により実施した。すなわち、血漿試料に抗グレリン抗体を加えたのち、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ］グレリン（１３−２８）を加えて競合反応させた。これに二次抗体を加えて抗グレリン抗体に結合したグレリンを沈殿させ、上清分離後に沈殿画分中の放射能をγ−カウンター（パッカード社製）で測定した。なお、ここで用いた抗グレリン抗体は、グレリン及びデス−オクタノイル体を同等に認識する測定法である。
【０１７０】
また、アミノドデカン体ヒトグレリン（Adodグレリン）の血漿中濃度測定は、抗Adodグレリン抗体を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により実施した。すなわち、血漿試料に抗Adodグレリン抗体を加えたのち、１２５I標識抗体を加えて競合反応させた。これに二次抗体を加えて抗Adodグレリン抗体に結合したAdodグレリンを沈殿させ、上清分離後に沈殿画分中の放射能をγ−カウンター（パッカード社製）で測定した。【０１７１】
表２８：グレリン類をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ【０１７２】
【表２８】
0004951344.tif 000032
【０１７３】
グレリン類として、ラットグレリン、デス−オクタノイル体（ヒトグレリン３位のセリン側鎖のオクタノイル基を除去）、［L-2-アミノドデカン酸３］ヒトグレリンについても、ヒトグレリンと同様に、糖類、アルコール類を含む極性有機液体及び酸性液を添加した製剤の場合、皮下注射におけるＢＡが著しく増加することがわかった。【０１７４】
実施例２５：ラットを用いた皮下注射による薬物動態試験（他の生理活性ペプチド、タンパク質に対する影響）
製剤４３、４５、４７、４９、５０、１０３〜１０７を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で皮下投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。薬物速度論的パラメータを下記表２９に示した。製剤４２、４４、４６、４８を比較例２と同様に１ｍＬ／ｋｇの投与容量で静脈内投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。これらの値よりＢＡを求めた。【０１７５】
なお、ヒト副甲状腺ホルモン（１−３４）（ｈＰＴＨ）の血漿中濃度測定は、抗ＰＴＨ抗体を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により実施した。すなわち、血漿試料に抗ＰＴＨ抗体を加えたのち、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ３４］ＰＴＨ（１−３４）を加えて競合反応させた。これに二次抗体を加えて抗ＰＴＨ抗体に結合したＰＴＨ（１−３４）を沈殿させ、上清分離後に沈殿画分中の放射能をγ−カウンター（パッカード社製）で測定した。  【０１７６】
ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の血漿中濃度測定は、Glucagon-like Peptide-1（Active）ELISA Kit（LINCO Research Inc.）を用いたエンザイムイムノアッセイ（ELISA）法で測定した。【０１７７】
ヒトアドレノメデュリンの血漿中の濃度は、AM matureリア  シオノギ（塩野義製薬株式会社）を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法で測定した。【０１７８】
ヒトインスリン血漿中の濃度は、インスリン・リアビーズII（ヤマサ醤油株式会社）を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法で測定した。【０１７９】
ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（hANP）の血漿中の濃度は、シオノリアANP（塩野義製薬株式会社）を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法で測定した。【０１８０】
表２９：他の生理活性ペプチド、タンパク質をラットに皮下投与したときの薬物速度論的パラメータ【０１８１】
【表２９】
0004951344.tif 000033
【０１８２】
ペプチド類として、ラットグレリン、デスアシルヒトグレリン（ヒトグレリン３位のセリン側鎖のオクタノイル基を除去したデス−オクタノイル体）、［Ｌ−２−アミノドデカン酸3］ヒトグレリン、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（hGLP-1）、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（hANP）、ヒトアドレノメデュリン、ヒト副甲状腺ホルモン（hPTH(1-34)）、ヒトインスリンについても、グレリン類と同様に、糖類、アルコール類及び酸性液を添加した製剤の場合、皮下注射におけるＢＡが著しく増加することがわかった。【０１８３】
製造例１：ｐＨを調節したヒトグレリン含有の医薬組成物の調製
グレリンの一つである、ヒトグレリンを精製水に溶解してヒトグレリンの濃度が約０．１５μｍｏｌ／ｍＬ（＝０．５ｍｇ／ｍＬ）となる水溶液を調製した。この水溶液のｐＨを測定しながら０．１Ｍ塩酸水溶液を少量加え、最終ｐＨを４．０に調節し、ヒトグレリンを含有する水溶液として、医薬組成物を得た。【０１８４】
製造例２：ラットグレリンを酢酸緩衝液に溶解した医薬組成物の調製
グレリンの一つである、ラットグレリンを０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解して、ラットグレリンの濃度が約０．１５μｍｏｌ／ｍＬ（＝０．５ｍｇ／ｍＬ）となる水溶液としての医薬組成物を調製した。この水溶液のｐＨを測定したところ、ｐＨ４．０であった。【０１８５】
製造例３：ヒトグレリンの医薬組成物の調製
グレリンの一つであるヒトグレリン及びベンジルアルコールを、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解して、ヒトグレリンの濃度が約０．１５μｍｏｌ／ｍＬ（＝０．５ｍｇ／ｍＬ）、ベンジルアルコールの濃度が約１％（ｗ／ｖ）となる水溶液としての医薬組成物を調製した。この水溶液のｐＨを測定したところ、ｐＨ４．０であった。【０１８６】
製造例４：ヒトグレリンの医薬組成物の調製
グレリンの一つであるヒトグレリン、ベンジルアルコール及び白糖を、精製水に溶解して、ヒトグレリンの濃度が約０．１５μｍｏｌ／ｍＬ（＝０．５ｍｇ／ｍＬ）、ベンジルアルコールの濃度が約１％（ｗ／ｖ）、白糖の濃度が１０％（ｗ／ｖ）となる水溶液としての医薬組成物を調製した。この水溶液のｐＨを測定したところ、ｐＨ４．７であった。【０１８７】
製造例５：ヒトグレリンの医薬組成物の調製
グレリンの一つであるヒトグレリン、ベンジルアルコール及び白糖を、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解した後、メスアップして、ヒトグレリンの濃度が約０．１５μｍｏｌ／ｍＬ（＝０．５ｍｇ／ｍＬ）、ベンジルアルコールの濃度が約１％（ｗ／ｖ）、白糖の濃度が１０％（ｗ／ｖ）となる水溶液としての医薬組成物を調製した。この水溶液のｐＨを測定したところ、ｐＨ４．０であった。
【産業上の利用可能性】
【０１８８】
以上記載のように、本発明により、グレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質の薬剤としての生物学的利用率（バイオアベイラビリティ：ＢＡ）を確保し、より有効な液状製剤が提供され、さらに、グレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質を溶解した水溶液を皮下注射した際のＢＡを改善する方法が提供することができる。
一般に皮下投与による吸収過程では、生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質はプロテアーゼ等による分解をうけるため、静脈内注射にて投与した場合に比べるとＢＡが低くなることを考慮すると、本発明が提供するグレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質の液状製剤は、皮下注射による投与であっても有効なグレリン類を含む生理活性ペプチド或いは生理活性タンパク質の血中濃度を維持しうることができるものであり、その医療上の価値は多大なものである。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】ヒトグレリンを５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液に溶解し、ラットに静脈内投与および皮下投与したときの血漿中濃度推移を表すグラフである（比較例２）。
【図２】ヒトグレリンを酢酸ナトリウム緩衝液に溶解し、ラットに皮下投与したときの血漿中濃度推移を表すグラフである（実施例２）。
【図３】０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に０〜２０％（ｗ／ｖ）の白糖を添加した溶液にヒトグレリンを溶解し、ラットに皮下投与したときの血漿中濃度推移を表すグラフである（実施例８）。
【図４】グレリンを１０、５０、２５０あるいは２，０００μｇ／ｋｇの投与量でラットに皮下投与したときの血漿中濃度推移を表すグラフである（実施例１１）。なお、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）及び１０％（ｗ／ｖ）白糖を添加した場合である。
【図５】グレリンを１０、５０、２５０あるいは２，０００μｇ／ｋｇの投与量でラットに皮下投与したときの投与量とＡＵＣの関係を表すグラフである（実施例１１）。
【図６】ヒトグレリンを５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液あるいは酢酸ナトリウム緩衝液に溶解し、ラットに筋肉内投与したときの血漿中濃度推移を表すグラフである（実施例２１）。
【図７】ヒトグレリンを５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液あるいは酢酸ナトリウム緩衝液に溶解し、カニクイザルに静脈内投与あるいは皮下投与したときの血漿中濃度推移を表すグラフである（実施例２２）。
【図８】ヒトグレリンを５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液あるいは酢酸ナトリウム緩衝液に溶解し、ラットに皮下投与したときの血漿中成長ホルモン濃度推移を表すグラフである（実施例２３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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