(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)純粋でないクラブラン酸と、スクシニルチロシンに特異的である不純物選択的吸着物質とを接触させ；
(ii)クラブラン酸から、吸着された不純物を伴う該選択的吸着物質を分離する、ことを含む、より純粋な形態でクラブラン酸又はその薬学的に許容される塩を製造する方法。
【請求項２】
不純物選択的吸着物質が、前記不純物であるプリント分子に特異性を有する分子インプリントポリマーであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該分子インプリントポリマーがメタクリル酸を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
該分子インプリントポリマーが、スクシニルチロシンの官能基と相互作用し得る正に荷電した部分を含む１つ以上の機能的に置換されたモノマーを含むことを特徴とする請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
該正に荷電した部分が、式[NR1R2R3R4]+（式中、R1、R2、R3又はR4の少なくとも１つは、独立して、水素又はC1-8 アルキルから選択され、且つR1、R2、R3又はR4の少なくとも１つは、独立して、重合可能な官能基から選択される。）の第四級アンモニウム基である請求項４記載の方法。
【請求項６】
該分子インプリントポリマーがビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライドを含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
該分子インプリントポリマーがビニルピリジンを含むことを特徴とする請求項２又は３記載の方法。
【請求項８】
該分子インプリントポリマーが、スクシニルチロシンの存在下で、メチルアクリル酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド又はビニルピリジン、及び架橋モノマーの混合物を重合することにより形成されるポリマーを含むことを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
(a)クラブラン酸を含有する水溶性ブロスを産生する微生物による発酵と；
(b)該クラブラン酸の有機溶媒への抽出と；
(c)該クラブラン酸の、クラブラン酸の薬学的に許容される塩への変換と；
及び、該クラブラン酸と既知の不純物のための該選択的吸着物質とを上記全工程中の任意の時点で接触させる、
ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程(b)の後に、該クラブラン酸と選択的吸着物質とを接触させることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
(a)スクシニルチロシンであるプリント分子と少なくとも１つの機能的に置換されたモノマーとを溶媒系中で接触させ；
(b)前記モノマーを架橋剤の存在下で重合させ；
(c)該プリント分子を、そのように形成された該ポリマーから抽出により除去する、
ことを含む選択的吸着物質の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法により得られる選択的吸着物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、より純粋な形態でクラブラン酸又はその薬学的に許容される塩を製造する新規な方法、それに使用される選択的吸着物質及びそのような選択的吸着物質の製造方法に関する。
【０００２】
クラブラン酸 (Z)-(2R,5R)-3-(2-ヒドロキシエチリデン)-7-オキソ-4-オキサ-1-アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン-2-カルボン酸)、即ち、式(I)の化合物：
【化１】
0004944350.tif 000002
は、β-ラクタマーゼ阻害剤として当技術分野で公知であり、通常はクラブラン酸カリウム等のその薬学的に許容される塩の形態で医薬製剤の成分として商業的に使用されている。クラブラン酸は、例えばGB-A-1 508 977に記載のような方法により、微生物ストレプトミセス・クラブリゲラス(Streptomyces clavuligerus)の培養により商業的に生産されている。
【０００３】
クラブラン酸は種々の方法により該培養液から抽出することができる。通常は、そのような抽出操作を開始する前に、最初にストレプトミセス・クラブリゲラスの細胞をろ過又は遠心分離等の方法により培養液から除去する。該クラブラン酸は、酸性pHに調整した冷清澄培養液からの溶媒抽出により、当該清澄培養液から抽出される。該溶媒抽出工程では、クラブラン酸は有機溶媒に抽出される。その層を分離後、クラブラン酸はその有機層の溶液中に見出される。
【０００４】
該クラブラン酸は、有機アミンとクラブラン酸との塩のより高い水溶解性を利用することにより、有機層から新たな水層に逆抽出することができ、そのようなアミン塩を該水層から単離する。そのような工程では、該アミン塩は、粗クラブラン酸を薬学的に許容される塩に変換する工程において中間体として形成される。そのような工程は、例えばEP-A-0 026 044に記載されており、有機溶媒中の純粋でないクラブラン酸(impure clavulanic acid)溶液をt-ブチルアミンと接触させてクラブラン酸のt-ブチルアミン塩を形成させ、次いでそれを単離する。他の類似の方法が公知であり、それらは第三級オクチルアミン(EP-A-0 594 099 (ファルマ・デベロップメント：Pharma Development)参照)、ジエチルアミン、トリ-(低級アルキル)アミン、ジメチルアニリン及びN,N'-ジイソプロピルエチレンジアミン等の他の有機アミンを利用する。WO-A-93/25557 (スミスクライン・ビーチャム：SmithKline Beecham)は、この方法に使用できる非常に広範囲のアミンの一覧を開示している。WO-A-94/22873 (ギスト・ブロカーデス：Gist Brocades)は、N,N,N',N'-テトラメチル-1,2-ジアミノエタン、N,N,N',N'-テトラメチル-1,6-ジアミノヘキサン、1,2-ジピペリジノエタン及びジピペリジノメタン等の種々の第三級、第三級ジアミン類の使用を開示している。WO-A-96/20199 (Spurcourt)は、ビス(2-ジメチルアミノエチル) エーテル等のジアミノエーテル類の使用を開示している。GB-A-2 298 201 (Spurcourt)は、種々のベンズヒドリルアミン類の使用を開示している。WO-A-96/33197 (LEK)は、N,N'-ジイソプロピルエチレンジアミン、N,N'-ジエチレンジアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン及びN,N,N',N'-テトラメチレンジアミン等の対称N,N'-アルキルエチレンジアミン類を含むさらなるアミン類の使用を開示している。WO-A-98/21212 (Gist-Brocades)は、例えば、アミン類であるN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン、1,3-ビス(ジメチルアミノ)-2-プロパノール、ベンズヒドリルアミン及びビス(2-(ジメチルアミノ)エチル)エーテルを使用する方法を開示している。WO-A-98/23622 (Biochemie)は、ジイソプロピルエチレンジアミンの使用を開示している。
【０００５】
単離後、該中間体アミン塩は、一般的には該中間体アミン塩と2-エチルヘキサン酸カリウム等の塩前駆体化合物との反応により、クラブラン酸の薬学的に許容される有用な塩、特にはアルカリ金属塩、とりわけクラブラン酸カリウムに変換することができる。
【０００６】
クラブラン酸及びその薬学的に許容される塩を製造する上で述べた方法は、ある副生成物、代謝産物及び分解物(degradant)（以後、不純物として認識される）を伴う。そのような不純物の多くは、粗クラブラン酸、中間体アミン塩及びクラブラン酸の薬学的に許容される塩のHPLCトレースでピークとして確認されている。これらの不純物のいくつかはその後に化学的に同定されている。明らかに、最終生成物中のそのような不純物の濃度は最小限に維持することが望ましい。それゆえに、公知の精製技術と結合して作用し、且つ商業的規模で利用することが可能な、公知のクラブラン酸不純物を選択的に除去するための新規な方法が求められている。
【０００７】
“分子インプリント法（molecular imprinting）”と呼ばれる方法も知られており、それは特定の化合物（“プリント分子（the print molecule）”）のための選択的吸着物質であるポリマーを製造する技術である。その技術は、該プリント分子の存在下で、過剰の架橋モノマー(cross-linking monomer)を用いて、典型的には重合を開始するための開始剤もともに用いて、該プリント分子を結合することができる１つ以上のモノマーを共重合させることに関する。そのように形成された(so-formed)該ポリマーから、例えば抽出又は化学的開裂による該プリント分子の除去により、空間内に正しく固定化され、且つ該プリント分子の鋳型と同一の形を有し、該プリント分子の形及び機能性を“記憶”した空洞に存在する結合基が残される。重合により該プリント分子との相補性がこのように維持され、そのように形成された該ポリマー（本明細書において“分子インプリントポリマー(molecularly imprinted polymer)”と呼ぶ。）はその後で該プリント分子を選択的に吸着し、そして該プリント分子は構造的類縁体よりもその抽出されたポリマーに対し都合よく結合する。不純物を該プリント分子として使用すれば、そのように形成された該ポリマーは、したがって、不純物選択的吸着物質(impurity selective absorption material)を構成し、不純物を含む混合物から不純物を選択的に吸着するのに使用できる。
【０００８】
通常、２つの異なるアプローチのうちの１つが採用される：(A)該プリント分子は共有結合的にであるが可逆的に結合されている；か、又は(B)モノマーと該プリント分子と間の最初の相互作用は非共有結合的である。この方法論の要約は、Ekberg等(Trends Biotech., 7, 1989, 92)、Mosbach等(Biotechnology, Vol. 14, February 1996, 163 - 170)、Ekberg及びMosbach(「分子インプリント法:特異的分離物質を製造するための技術(Molecular imprinting: a technique for producing specific separation materials)」TIBTECH-April 1989(7) 92-96)、Ramstrom及びMosbach(「副生成物除去のための分子インプリントポリマー吸着剤:Molecularly Imprinted Polymeric Adsorbents for By-product Removal」Anal. Chem. 1998(70) 2789-2795)、Ramstrom、Krook及びMosbach(「分子インプリントポリマーを用いるコンビナトリアルステロイドライブラリーのスクリーニング:Screening of a combinatorial steroid library using molecularly imprinted polymers」Anal. Comm. January 1998(35) 9-11)、WO-A-93/05068、WO-A-9807671、WO-A-99/33768、EP-A-0 602 154にある。これらの文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００９】
したがって、本発明は、第一の態様では、
(i)純粋でないクラブラン酸と不純物選択的吸着物質とを接触させ；
(ii)クラブラン酸から、吸着された不純物を伴う該選択的吸着物質を分離する、ことを含む、より純粋な形態でクラブラン酸又はその薬学的に許容される塩を製造する方法を提供する。
【００１０】
該不純物選択的吸着物質は、好ましくは、粗クラブラン酸に存在することが知られているか、又はその疑いがある不純物、特にはスクシニルチロシンに特異的である。該不純物選択的吸着物質は、好ましくは、そのような不純物であるプリント分子に特異性を有する分子インプリントポリマーである。
【００１１】
好適には、分子インプリントポリマーは、架橋モノマー(cross-linking monomer)及び該プリント分子の存在下での、該不純物に結合する１つ以上の機能的に置換されたモノマーの重合により形成されるポリマーであってもよい。
【００１２】
好適なポリマーはポリアクリレート又はポリアクリルアミドを基本とする系に基づくものであるが、ポリスチレンを基本とする系も用いることができる。使用される典型的な機能的に置換されたモノマー(functionally substituted monomers)は、カルボン酸類、スルホン酸類及び複素芳香環を基本とするものが挙げられ、特にはビニル化合物、即ち、ビニル基(CR1R2=CR3-)（式中、例えば、各R1、 R2及びR3は、独立して、水素又はC1-8アルキルから選択され、好ましくは水素である。）含む化合物である。ビニル酸(vinylic acids)の例としては、マレイン酸、アクリル酸類（例えば、アルキルアクリル酸及びフルオロアルキルアクリル酸、典型的にはC1-5アルキル又はフルオロアルキル、特にはアクリル酸それ自身）、メチルアクリル酸又はトリフルオロメチルアクリル酸；イタコン酸、4-ビニル安息香酸等の置換されていてもよいビニル安息香酸、4-ビニルベンジルイミノジ酢酸、又はアクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸等のビニルモノ-若しくはジ-カルボン酸又はスルホン酸が挙げられる。複素芳香環を基礎とするものの例としては、ビニル-置換アミノ-、アンモニウム又はアミジン化合物、ビニルイミダゾール類（例えば、1-ビニルイミダゾール、4(5)-ビニルイミダゾール）、ビニルピリジン類（例えば、2-ビニルピリジン及び4-ビニルピリジン）等のビニル-置換 5-又は6-員窒素複素環が挙げられる。そのような化合物のさらなる例としては、アリルアミン類、2-(ジエチルアミノ)エチル メタクリレート、1-(2-アミノエチル)メタクリルアミド、2-(トリメチルアミノ)エチル メタクリレート、N,N'-ジエチル-4-スチリルアミジン、及びウロカニン酸C1-5アルキルエステル(エチルエステル等)が挙げられる(これらの化合物の式は図３に示されている。)。典型的には、２つ以上のそのような機能的に置換されたモノマーが使用される。
【００１３】
該プリント分子は、例えば、粗クラブラン酸中の不純物であると知られているか、又は信じられている分子であってもよい。そのような不純物の例としては、Pharmeuropa (Vol. 12, No. 3, July 2000)に列挙されたものが挙げられ、それには、とりわけ、以下の分解生成物：ピラジン-2,5-ジイル(ジエタノール)、3-[3,6-ジ(2-ヒドロキシエチル)ピラジン-2-イル]プロパン酸、3-エチルピラジン-2,5-ジイル(ジエタノール)及び4-(2-ヒドロキシエチル)ピロール-3-カルボン酸、が示されている。
【００１４】
微生物の培養中に形成され得るさらなる不純物はスクシニルチロシン、即ち式(II)の化合物：
【化２】
0004944350.tif 000003
である。
【００１５】
本明細書で用いられる用語“スクシニルチロシン(succinyl tyrosine)”はそれらの全ての異性体を含む。
【００１６】
良好な分子インプリントポリマーを当該不純物のために得ることができ、ここで、少なくとも１つの機能的に置換された利用されるモノマーはスクシニルチロシンの官能基と相互作用し得る適切に正に荷電した部分(positively charged moiety)を含む。好適な正に荷電した部分としては、式[N.R1.R2.R3.R4]+（式中、R1、R2、R3又はR4の少なくとも１つ、好ましくは３つは、独立して、水素又はC1-8アルキル（好ましくはC1-5アルキル、特にはメチル）から選択され、R1、R2、R3又はR4の少なくとも１つ、好ましくは１つのみは、独立して、重合可能な官能基、好ましくはビニル基(vinylic group)、特にはビニルベンジル基から選択される）の第四級アンモニウム基が挙げられる。そのような部分中の重合可能な基は、例えば上述のような別の重合可能なモノマーと一緒に、重合させてポリマーを形成させる。好適には、そのような部分は、その正に荷電した基とハロゲンイオン等の適切な対アニオンとの塩である機能的に置換されたモノマーの形態で与えられてもよい。そのような機能的に置換されたモノマーの好ましい例は、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライドである。
【００１７】
形成される分子インプリントポリマーの必要とされる特異性を達成するために、高程度の架橋が望ましい。好適な架橋剤は、１つ以上の重合可能な二重結合を有する。分子インプリント技術で用いられる典型的な架橋剤としては、ジビニルベンゼン（例えば、4-ジビニルベンゼン）（特に、ポリスチレンに基づく系の架橋のための）の異性体、エチレングリコールジメタクリレート(EDMA)（これが好ましい）、及びトリメチロールプロパントリメチルアクリレート(TRIM)、並びにN,N'-メチレンビスアクリルアミド、N,N'-フェニレンビスアクリルアミド及び2,6-ビスアクリルアミドピリジン等のアクリルアミド類が挙げられる。他の架橋剤としては、ペンタエリスリトール トリアクリレート、及びペンタエリスリトール テトラアクリレート(特に、ペプチド選択的分子インプリントモノマーのための)等のトリ-及びテトラ-官能性架橋剤が挙げられる。架橋剤の選択に影響する重要な要因は、プレ-ポリマー溶液(pre-polymeric solution)におけるその剤の溶解性である。１つを超える架橋剤を使用してもよい。
【００１８】
したがって、本発明の方法での使用に適切な好ましい分子インプリントポリマーは、スクシニルチロシンの存在下で、メチルアクリル酸と、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド又は好ましさがそれ程ではないビニルピリジンと、及び架橋モノマー、特にエチレングリコール ジメタクリレート、との混合物を重合することにより形成されるポリマーである。
【００１９】
典型的には、該分子インプリントポリマーは、架橋剤:モノマーが1:0.1〜2.0、例えば1:0.1〜0.5、好適にはおよそ1:0.3の範囲の組成(出発物質に基づいて)モル比で、１つ以上の機能的に置換されたモノマーと架橋剤との混合物のポリマーを含んでいてもよい。例えば、これらのモル比は、いくつかの架橋剤（例えば、TRIM）が2以上の重合可能な結合を有することを考慮している。しかしながら、官能性(functional)モノマー:TRIMのモル比がおよそ1:1も好適である。
【００２０】
上述の好適な分子インプリントポリマーは、エチレングリコール ジメタクリレート:ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド:メタクリル酸が1:0.2:0.1+/-10％の範囲の組成比(出発物質に基づいて)で、メタクリル酸、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド及びエチレングリコール ジメタクリレートの重合混合物を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明で使用するための該分子インプリントポリマーは分子インプリントの当業者に公知の手順（例えば、WO-A-94/11403若しくはWO-A-97/38015又はRanstrom等（「分子インプリント法により製造されたコルチコステロイドに対する人工抗体(Artificial antibodies to corticosteroids prepared by molecular imprinting)」Chem. Biol. (1996)3:471-477）を参照）にしたがって製造することができる。
【００２２】
分子インプリントの全手順は、通常、溶媒中（細孔形成剤（porogen）とも記載される）で行なわれ、それは、特に、プリント分子とモノマーとの間の相互作用の強度を左右する。加えて、溶媒の選択は、形成されるポリマーのモルホロジーにも影響する。例えば、利用する溶媒が極性であるほど、該プリント分子と官能性モノマーとの間の相互作用は弱くなるであろう。一方で、製造されたものの構造に対する該溶媒の影響により、より極性の溶媒を使用することについての明らかに不利な点を補うことができる。多くの慣用の溶媒が分子プリント技術に幅広く使用される。好適な例としては、水、アセトニトリル、トルエン、ジクロロメタン及びメタノールが挙げられる。本明細書において使用される場合、用語“溶媒”又は“細孔形成剤（porogen）”は共溶媒及び単一溶媒系の両方を含む。そのような製造に好ましい溶媒はメタノールである。
【００２３】
該モノマーの重合は、典型的には、イニシエーター又は開始剤の存在下で行なわれる。そのような剤の好ましい例は、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)である。１つ以上のイニシエーターを使用してもよい。
【００２４】
特異的吸着物質の製造に使用される官能性モノマー、溶媒系及び架橋剤は相互に関連していることが上記から理解されるであろう。したがって、最適条件は、標準的な方法を用いて且つ過度な実験を必要とすることなく、分子インプリントの当業者が決定してもよい。
【００２５】
典型的には、重合により該分子インプリントポリマーの固体の塊が得られ、それは、適当な機械的処理（例えば、粉砕、ふるい分け）及び繰り返し沈降（例えば、アセトン中で）により好適な大きさの粒子に砕くことができる。好適な粒子サイズは該ポリマーのその後の使用される方法によるが、10〜25μが好適であることが分かっている。該プリント分子は、例えば、カラムにポリマー粒子スラリーを充填し、適切な溶媒で洗浄し、プリント分子を適当にモニターしながら（典型的にはHPLCにより）抽出することによりポリマーから除去できる。その後、該ポリマー粒子をカラムから取り除き、洗浄（例えばアセトンで）し、乾燥（例えば減圧下で）する。
【００２６】
本発明はさらに、
(a)クラブラン酸の既知の不純物であるプリント分子と少なくとも１つの機能的に置換されたモノマー、好ましくは多数の機能的に置換されたモノマーとを溶媒系中で接触させ；
(b)前記モノマーを架橋剤の存在下で重合させ；
(c)該プリント分子を、そのように形成された該ポリマーから抽出により除去する、
ことを含む選択的吸着物質の製造方法を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、上記方法により得られる選択的吸着物質を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、クラブラン酸又はその薬学的に許容される塩の精製に使用するための選択的吸着物質、典型的には分子インプリントポリマーを提供する。
本発明により製造される選択的吸着物質は物理的（例えば、応力、高温及び高圧）及び化学的要因（例えば、酸、塩基及び広範な有機溶媒及び水性媒体による処理に対する耐性）に対して高耐性である。選択的吸着物質は有用性が顕著に低減することなく100回まで多数回再使用できる。該選択的吸着物質は、例えば、その最初の製造後に該ポリマーから該プリント分子を除去するために使用されるのと同様の手順により、利用後に再生することができる。
【００２９】
本発明により製造される不純物特異的な選択的吸着物質は、任意の他の系（例えば、多くの化学種を含む発酵ブロス）から特定の不純物を除去するために利用できる（即ち、クラブラン酸を含む系に限定されない）ことが理解されるであろう。したがって、本発明により製造されるスクシニルチロシン選択的吸着物質は、スクシニルチロシンが存在する他の系からこの種を選択的に除去するために使用できる。例えば、該不純物選択的吸着物質は、不純物を含有するクラブラン酸化合物又は塩（例えば、純粋でないクラブラン酸それ自身から製造された）から該不純物を除去するために使用することもできる。この理由から、本明細書で使用される用語“純粋でないクラブラン酸”とはクラブラン酸のそのような純粋でない化合物又は塩を含む。
【００３０】
本発明の方法において、該純粋でないクラブラン酸と該不純物選択的吸着物質（例えば、上記の分子インプリントポリマー）との接触は、適切な溶媒中で行なわれる。クラブラン酸は水に感応性であるので有機溶媒が好ましい。メタノールが有用な溶媒であることが分かっている。上述のように、クラブラン酸の単離のための慣用の方法は有機溶媒への抽出を含み、該純粋でないクラブラン酸と該不純物選択的吸着物質との接触は、この手順により得られたクラブラン酸溶液を用いて行なわれる。抽出に使用される典型的な溶媒は、メチルイソブチルケトン及び酢酸エチルである。これらの後者のような溶媒が使用された場合、クラブラン酸自身の該ポリマーへの結合の可能性を低減させるために、例えば、そのような溶媒をメタノール等のより極性の溶媒と混合することにより溶媒の極性を増大させることが望ましく、メチルイソブチルケトン：メタノール＝1：1を含む混合物が有用であることも分かっている。該方法は、そのような抽出手順により得られるような典型的な濃度のクラブラン酸溶液で行なってもよく、典型的には、該クラブラン酸及び不純物選択的吸着物質は5時間まで、より典型的には2時間までの時間にわたって接触させるが、好適な接触時間は実験的に決定してもよい。好適には、純粋でないクラブラン酸の溶液は、満足な精製レベルが達成されるまで、不純物濃度をモニターしながら、該不純物選択的吸着物質との接触に連続的に循環させてもよい。
【００３１】
その後、精製されたクラブラン酸の有機溶媒溶液を公知の方法、例えば、水層への逆抽出（back-extracted）（例えば、アミン若しくは金属塩の形態で）でさらに処理するか、又は、例えば逆抽出せずに金属塩に変換してもよい。
【００３２】
本発明の方法は、粗クラブラン酸（例えば、発酵ブロス中に形成されるような）から出発して、より純粋な形態でクラブラン酸の薬学的に許容される塩を製造するための全工程の部分を形成してもよい。そのような全工程は、例えば、
(a)クラブラン酸を含有する水溶性ブロスを産生する微生物による発酵と；
(b)該クラブラン酸の有機溶媒への抽出と；
(c)該クラブラン酸の、クラブラン酸の薬学的に許容される塩への変換と；
及び、該クラブラン酸と既知の不純物のための該選択的吸着物質とを上記全工程中の任意の時点で、好ましくは工程(b)に続いて、接触させる、ことを含んでいてもよい。
【００３３】
そのような工程の1つの形態としては、工程(b)の後に、クラブラン酸のクラブラン酸の中間体アミン塩（これは続いてその薬学的に許容される塩に変換される）への予備的な変換を伴う工程(d)を含む工程が挙げられる。
【００３４】
さらに、クラブラン酸から多数の既知の不純物を除去するために多数の不純物特異的な選択的吸着物質が必要かもしれないことが理解されるであろう。そのような状況では、該不純物特異的な選択的吸着物質を該純粋でないクラブラン酸と全工程中の異なる時点で接触させてもよい。
【００３５】
好ましくは、本発明の方法は、クラブラン酸カリウム塩である好ましい薬学的に許容される塩を製造するための全工程の部分を形成してもよい。上記工程(d)で形成される好ましいアミン塩はクラブラン酸の第三級ブチルアミン塩である。これは、第三級ブチルアミン塩とクラブラン酸との反応により製造することができ、アセトン溶媒和物として容易に単離される。該第三級ブチルアミン塩及びそのアセトン溶媒和物の両方とも容易にクラブラン酸カリウム塩に変換することができる。そのような手順はEP-A-0 026 044に開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。他の好適なアミン塩は上で引用した参考文献に開示されている。
【００３６】
あるいは、該方法は、クラブラン酸の薬学的に許容される塩（例えば、クラブラン酸カリウム塩）が直接形成される、即ち、アミン塩への変換なしに固体として溶液から単離される全工程の部分を形成してもよい。そのような、方法はWO-A-95/21173に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれ、限定というよりもむしろ例示として取り入れられるべきである。
【００３７】
以下の実施例は、本発明の方法での有用性とともに、本発明による不純物特異的な選択的吸着物質の製造を例示する。
【００３８】
１．クラブラン酸からのスクシニルチロシンの選択的除去のための分子インプリントポリマー(MIP)の製造
スクシニルチロシン (0.4 mmol)、ビニルベンジル トリメチルアンモニウムクロライド(1.6 mmol)、メタクリル酸(MAA)(0.8 mmol)、エチレングリコール ジメタクリレート(EDMA)(8 mmol)及びAIBN 50.0 mgをメタノール 4.0 mlに溶解した。得られた溶液を窒素で5分間置換した。重合を60℃で熱的に引き起こして、反応を16時間続けた。得られたポリマーの塊を機械式すり鉢で粉砕し、繰り返し粉砕、ふるい分け及びアセトン中での沈降により直径10〜25μmの粒子を収集した。プリント分子を除去するために、ポリマー粒子をステンレス鋼カラムに充填し、HPLC溶媒分配システムを用いて流速1.0 ml/minで18時間メタノール-酢酸(9:1, v/v)で洗浄した。バッチ式実験のために、洗浄した粒子をカラムから除去し、アセトンに数回再懸濁し、減圧下で乾燥した。
【００３９】
同じ手順を用いて、ビニルベンジル トリメチルアンモニウムクロライドの代わりに4-ビニルピリジン (1.6 mmol)を用いて、分子インプリントポリマーを製造した。
【００４０】
非分子プリント対照“ブランク”ポリマー(“BP”)も、プリント分子を用いない以外は同一の手順により製造した。
【００４１】
２．分子インプリントポリマーのクロマトグラフ分析
ポリマー粒子をアセトンに懸濁し、標準HPLCカラム(100 x 4.6 mm)に充填した。クロマトグラフ分析は、LaChrom L-7100溶媒分配システム及びL-7455ダイオードアレイ検出器(Merck社, ドイツ)を用いて行なわれた。0.5又は1.0％の酢酸を含むアセトニトリル又はメタノールを流速0.5又は1.0 ml/minの移動相として使用した。分析物は280nmでモニターされた。アセトンをボイドマーカー(void marker)として使用した。容量因子(k')は(t-t0)/t0（式中、tは分析物の保持時間であり、t0はボイドマーカーの保持時間である。）として計算した。インプリント効果は、インプリント因子(I = k'i/k'B)（式中、k'i及びk'Bは、それぞれ、MIP及びBPの容量因子である。）により評価した。
【００４２】
ビニルベンジル トリメチルアンモニウムクロライドを基本とするMIPを用いた場合、スクシニルチロシンとの強いイオン性相互作用が認められ、メタノール：酢酸(99 : 1 V/V, 流速 1.0L/min)において良好なインプリント効果(I = 2.18)の結果が得られた。4-ビニルピリジンを基本とするMIPを用いた場合には、スクシニルチロシンとの弱い相互作用が認められ、弱い溶離液アセトニトリル:酢酸(99.5 : 0.5 V/V, 流速 0.5L/min)においてほどほどのインプリント効果(I = 1.75)の結果が得られた。したがって、ビニルベンジル トリメチルアンモニウムクロライドを基本とするMIPを以下に記載する後続の実験に使用した。
【００４３】
３．吸着等温式の測定
吸着実験は、MIP又はBP (50.0 mg)を予め製造しておいた種々の濃度のスクシニルチロシンのメタノール溶液1.0mlに添加することにより行なった。その懸濁液を振盪テーブル上で室温で１時間インキュベートした。遠心分離後、上清中の遊離(非結合)スクシニルチロシンの量を、逆相クロマトグラフィ(C-18 カラム, 移動相 0.1％ TFA in 5％ MeCN、流速 0.25 ml/min、40℃)により測定した。
【００４４】
図１は、分子インプリントポリマー (MIP)及びブランクポリマー(BP)についてのスクシニルチロシンの吸着結合等温式(adsorption binding isotherm)を示す。
【００４５】
該吸着等温式により、該BPは非常に少量のスクシニルチロシンしか吸着していないことが示され、吸着曲線は典型的な非特異的結合を表している。飽和条件下では、ビニルベンジル トリメチルアンモニウムクロライドを基本とするMIPは、BPよりもおよそ10倍以上のスクシニルチロシンを結合していた。
【００４６】
４．クラブラン酸発酵生成物からのスクシニルチロシンの除去
バッチ式試験及び流動(“動的(dynamic)”)式試験を行なった。
【００４７】
バッチ式試験：ビニルベンジル トリメチルアンモニウムクロライドを基本とするMIP 50mgを、15 mg/mlのクラブラン酸の存在下(スパイクされた(spiked))及び非存在下(スパイクされていない(unspiked))で、1.0 mlのスクシニルチロシン溶液(0.3 mg/ml)と室温で１時間インキュベートした。試料を14,000 rpmで10分間遠心分離した。上清中の遊離スクシニルチロシンの濃度は逆相HPLCで定量され、そこから結合スクシニルチロシンの量を計算した。
【００４８】
流動式試験：クラブラン酸 (15 mg /ml)を含有する40 mlのスクシニルチロシン溶液(0.3 mg/ml)を、HPLCカラム(250 mm x 4.6 mm I.D.)を通して、流速 1.0 ml/minで室温で1時間循環させた。該カラムはスクシニルチロシンに特異的なビニルベンジル トリメチルアンモニウムクロライドを基本とするMIP又はブランクポリマーのいずれかで充填されている。循環後、溶液を逆相HPLCで分析した。
【００４９】
図２は、スパイクされていないスクシニルチロシン試料及び50倍(w/w)のクラブラン酸でスパイクされた試料の使用、バッチ及び流動式系の使用による結合特性の比較を示す。
【００５０】
図２により、バッチ式では、過剰のクラブラン酸の存在下でMIPに結合するスクシニルチロシンの量は40％低減したことが示されているが、これはそれでもBPに結合する量よりも少なくとも5倍以上高い。同じMIP負荷量(load)(およそ50 mg ポリマー/ml 試料溶液)による流動式ではバッチ式方法とほとんど同一の結果が得られたが、しかし、この構成によりメタノール等の適切な溶媒の循環によりポリマーの簡易再生を可能にするという有利な点を有する。
【００５１】
MIP及びBPに結合したクラブラン酸の量も測定した。MIPを用いると、精製クラブラン酸（回収率97.6％）は１％未満のスクシニルチロシンを含有し、これと対照的に、BP（回収率93.5％）では1.7％のスクシニルチロシンを含有していた。
【００５２】
５．溶媒効果
溶媒としてメチルイソブチルケトン：メタノール (1:1 v/v)を使用した場合、ビニルベンジル トリメチルアンモニウムクロライドを基本とするMIPは、64.2 mg/g容量及び解離定数0.16 mMでスクシニルチロシンと選択的に結合することが分かった。
【００５３】
これらのデータは、クラブラン酸の既知の不純物のための選択的吸着物質を容易に製造でき、大過剰のクラブラン酸からこの選択された不純物を選択的に除去するために利用することができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、分子インプリントポリマー(MIP)及びブランクポリマー(BP)についてのスクシニルチロシンの吸着結合等温式(adsorption binding isotherm)を示す。
【図２】  図２は、スパイクされていないスクシニルチロシン試料と50倍(w/w)のクラブラン酸でスパイクした試料の使用、バッチ式及び流動式系の使用による結合特性の比較を示す。
【図３】  図３は、いくつかのビニル-置換モノマーの式を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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