(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
日本薬局方外医薬品規格に記載のヘパリン類似物質を有効成分として含む血管拡張剤。
【請求項２】
日本薬局方外医薬品規格に記載のヘパリン類似物質を有効成分として含む降圧剤。
【請求項３】
日本薬局方外医薬品規格に記載のヘパリン類似物質を有効成分として含むＮＯ遊離促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多硫酸化多糖類（以下、ＰＰＳとする）を有効成分として含む血管拡張剤、降圧剤及びＮＯ（一酸化窒素）遊離促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在使用されている血管拡張剤は数多くの種類があり、血圧を下げる作用やその強弱も様々である。また、同一薬でも何種類もの働きをするものもあり、心臓機能や腎臓機能への作用も異なっている。血圧を下げる目的は、脳卒中や心筋梗塞などの合併症防止にあるので、血圧は低下させるものの、同時に心臓機能や腎機能を低下させたのでは、臨床上の使用は困難である。このような状況では、血圧を調整するメカニズムが複雑であるため、１種類の薬だけでは使用量が増加し副作用が起こりやすくなる。このため、現在では１種類の血管拡張剤だけではなく、作用の異なる血管拡張剤を併用して臨床上使用されている。したがって、作用メカニズムや作用強度が異なる血管拡張剤が提供されることは臨床使用上好ましい。
【０００３】
ＰＰＳの一種であるヘパリン類似物質は、保湿剤、血行促進剤として臨床適用されている。この血行促進剤としての働きは、血液凝固抑制作用、すなわち血液線溶系に作用して血液の粘度を下げ、血液凝固抑制や末梢血液循環促進の結果、血液量が増加することにより生じると考えられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、多硫酸化多糖類（以下、ＰＰＳとする）を有効成分として含む血管内皮細胞に作用する血管拡張剤、降圧剤及びＮＯ（一酸化窒素）遊離促進剤の提供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記従来技術の問題点に鑑み鋭意検討を重ねた結果、ＰＰＳの一種であるヘパリン類似物質が血管内皮細胞に作用し、血管を弛緩させる作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の血管拡張剤、降圧剤及びＮＯ遊離促進剤を提供するものである。
項１．多硫酸化多糖類を有効成分として含む血管拡張剤。
項２．多硫酸化多糖類が多硫酸化ムコ多糖類である項１に記載の血管拡張剤。
項３．多硫酸化多糖類を有効成分として含む降圧剤。
項４．多硫酸化多糖類が多硫酸化ムコ多糖類である項３に記載の降圧剤。
項５．多硫酸化多糖類を有効成分として含むＮＯ遊離促進剤。
項６．多硫酸化多糖類が多硫酸化ムコ多糖類である項５に記載のＮＯ遊離促進剤。
【０００７】
【発明の実施の形態】
多硫酸化多糖類（ＰＰＳ）を構成する単糖としては、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸等が例示され、ＰＰＳは、これら単糖の１種又は２種以上を繰り返し単位とする多糖に硫酸基が導入されたものを意味する。
【０００８】
ＰＰＳの硫酸基は、１単糖当たり通常平均０．５５〜５個、好ましくは平均０．６〜２．９個、より好ましくは平均０．７〜２個である。
【０００９】
天然由来の多糖には、硫酸基を持つものも存在するので、それらをさらに化学的に多硫酸化したものもＰＰＳに包含される。例えば、多硫酸化ムコ多糖である。また、デンプン、セルロース、グアガム、アラビアゴム、コンニャクマンナン、寒天アガロース、アミロペクチンなどの多糖を硫酸化した化合物などもＰＰＳに包含される。これらＰＰＳは単独でも２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００１０】
好ましいＰＰＳは、１単糖当たり通常平均０．５５〜５個、好ましくは平均０．６〜２．９個、より好ましくは平均０．７〜２個の硫酸基を有する多硫酸化ムコ多糖類（ＭＰＳ）である。ＭＰＳの具体例としては、ヘパリン、コンドロイチンポリ硫酸と呼ばれるコンドロイチン硫酸Ｄやコンドロイチン硫酸Ｅ、ケラタンポリ硫酸、コンドロイチン硫酸等である。また、キチン、ヒアルロン酸を硫酸化したものも挙げられる。より好ましいＭＰＳとしては日本薬局方外医薬品規格に記載のヘパリン類似物質、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸の多硫酸化物が挙げられる。
【００１１】
また、ＰＰＳは、必要に応じナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の水酸化物若しくは炭酸塩、又はアミン類等を用いる増塩反応により得られる生理学的に許容される塩形態、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩等も包含する。
【００１２】
ＰＰＳの平均分子量は、１０００〜１０００００００程度であり、好ましくは５０００〜１００００００程度、より好ましくは１００００〜１０００００程度である。
【００１３】
多糖に硫酸基を導入する方法は既知の方法により行われる。例えば、先ず、原料の多糖１ｇに対し、氷冷した溶媒を１０〜３０ｍｌ用意し、これに硫酸化剤を原料多糖１ｇに対して２〜６倍加える。この溶媒に、原料の多糖１ｇを加え、０℃〜１００℃で、１〜１０時間反応させて、硫酸化を行う。使用する溶媒としては、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアルデヒド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド等が使用でき、硫酸化剤としては、クロロスルホン酸、トリエチルアミン−サルファトリオキサイド錯塩等が使用できる。
【００１４】
また、例えば、多糖と硫酸化剤を適当な溶媒中で加温し、反応させる方法が挙げられる。硫酸化剤としては、多硫酸化の目的を達成することができるものであれば特に限定されるものではないが、無水硫酸とピリジン若しくはトリエチルアミン等の錯体を使用するのが好ましい。多糖と硫酸化剤の使用割合は、所望の多硫酸化多糖の硫酸化率（又は硫黄含有率）及び反応条件に従って任意に選択することができるが、一般に、多糖類１重量部に対して２〜１０重量部となるような割合で使用する。溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド等の親プロトン性溶媒を挙げることができる。反応温度、反応時間としては、所望の硫酸化率が達成できる限り特に限定されないが、例えば、４０〜９０℃で３０分〜２０日間程度反応させる。
【００１５】
上述のようにして生成したＰＰＳは、各種修飾多糖類の製造で常用されている精製操作により精製することができる。例えば、中和、透析による脱塩、有機溶媒添加による沈殿を回収する操作、凍結乾燥による回収操作などが挙げられる。
【００１６】
本発明の血管内皮細胞に作用する血管拡張剤及び降圧剤は、経口投与、局所投与、または非経口投与などの使用に適した製剤の形態で投与され、治療目的、方法等に応じて適切な形態が選択される。非経口投与の形態としては、局所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内投与や、点滴法、注腸、経直腸、点眼、点鼻、粘膜への塗布投与等が挙げられるが、患部への直接投与も可能である。好ましい投与方法は、ヒトを含む哺乳動物に、局所的、静脈内内、筋肉内、動脈内、皮下に投与する方法であり、より好ましくは、経皮、粘膜に投与する方法である。
【００１７】
本発明の血管内皮細胞に作用する血管拡張剤、降圧剤及びＮＯ（一酸化窒素）遊離促進剤の製剤形態としては、溶液製剤、分散製剤、半固形製剤、粉粒製剤、成型製剤、浸出製剤などがあげられる。例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョン剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤、テープ剤、クリーム剤、油剤、坐剤、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、塗布剤、輸液剤、凍結乾燥製剤、ゲル調製品や、注射剤などのための粉粒剤などが挙げられる。好ましい製剤の形態としては軟膏剤、ローション剤、注射剤が挙げられる。
【００１８】
医薬組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。例えば、適宜必要に応じて、生理的に認められた担体、医薬として許容される担体、アジュバント剤、賦形剤、補形剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩和剤などを単独もしくは組み合わせて用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で製造する。
【００１９】
軟膏剤に配合される添加剤としては、基剤、乳化剤、保存剤等が挙げられる。基剤としては白色ワセリン、流動パラフィン等の炭化水素、大豆等の油脂類、ミツロウ、ラノリン等のロウ類、ステアリン酸、オレイン酸等の脂肪酸、ラノリンアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール及びそのエステル類、マクロゴール等が挙げられる。乳化剤としては、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。保存剤としては、チモール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００２０】
本発明の血管内皮細胞に作用する血管拡張剤及び降圧剤の投与量は、患者の年齢、性別、疾病の種類及び程度、並びに剤型及び投与様式により、適宜決定される。また、製剤中のＰＰＳの含有量は、使用条件に応じて適宜決定されるが、軟膏製剤の場合、好ましくは、０．０１〜２０重量％程度、さらに好ましくは０．０５〜１０重量％程度、より一層好ましくは０．１〜５重量％程度である。
【００２１】
本発明のＮＯ遊離促進剤は、ＮＯが関与もしくはＮＯにより影響を受ける分野で使用される。例えば、神経系、免疫系、消化器系、生殖器系等において、生体投与に適した形態で使用される。
【００２２】
【実施例】
実施例１
Slc:SD系雄性ラット（９〜10週齢）をエーテル麻酔下で放血致死させた後、片側大腿動脈を摘出した。実体顕微鏡下で大腿動脈に付着している脂肪組織や結合組織を丁寧に取り除いた後、長さ２mmのリング状標本（内皮細胞温存標本）を作成した。該標本の管腔内にステンレス棒（直径0.4mm）を挿入することによって内皮細胞を剥離し、内皮細胞除去標本を作成した。作成した各標本の管腔内にトライアングル型ステンレス製フック（直径0.1mm）を２個挿入し、フックの一方をステンレス棒を用いてアイソメトリックトランスデューサに固定し、もう一方のフックをＬ字型支持棒を用いて栄養液（クレブス-ヘンゼルライト緩衝液（Krebs-Henseleit buffer）、10mL、pH 7.3-7.4、37℃）の入ったオーガンバス内の底部側に固定した。その後、標本には１gの静止張力を負荷し、60〜90分間平衡化させた。平衡化の間、オーガンバス内の栄養液は10〜15分ごとに交換した。また、栄養液には実験終了時まで絶えず95％O2-５％CO2混合ガスを通気した。平衡化終了後、標本に60mM KClを２〜３回適用し、その収縮反応が再現性良く認められた標本を実施例２及び３の試験に供した。標本の張力はアイソメトリックトランスデューサを介して張力アンプで増幅した後、ペンレコーダ上に等尺性に記録した。
【００２３】
実施例２
非収縮条件下の内皮細胞温存標本におけるＰＰＳ（ヘパリン類似物質）及びヘパリンの作用
内皮細胞温存標本に対して、まず９mlの栄養液を添加し、次に、先に添加された栄養液に0.001％（w/v）の濃度となるようヘパリン類似物質を添加して、標本の張力を測定した。次に、0.003、0.01、0.03、0.1％（w/v）の濃度となるよう累積的にヘパリン類似物質を添加して標本の収縮を測定した。さらに、ヘパリン類似物質をヘパリンに代えて同様の実験を行った。結果を図１に示す。
【００２４】
ヘパリン類似物質、ヘパリンともに弛緩作用を示さなかった。これは、ヘパリン類似物質、ヘパリンともに、収縮状態にない血管に対して、弛緩作用を引き起こさないことを示している。
【００２５】
実施例３
Ｕ46619による収縮条件下の内皮細胞温存標本及び内皮細胞除去標本におけるＰＰＳ（ヘパリン類似物質）及びヘパリンの作用
両標本に対して、10-8〜3×10-5ＭトロンボキサンＡ2受容体作用薬であるＵ46619（シグマ社製）を累積的に適用し、ＥＣ60-80を決定した。また、Ｕ46619の最大収縮反応が得られた時点で10-6Ｍアセチルコリンを添加し、内皮細胞温存標本の場合は、アセチルコリンの弛緩作用が著明に認められること、内皮細胞除去標本の場合はその弛緩作用が認められないことを確認した。
【００２６】
両標本にＥＣ60-80のＵ46619を再度添加し、収縮反応が安定した時点でヘパリン類似物質又はヘパリンを実施例２の場合と同様の濃度となるよう累積的に添加して、標本の張力を測定した。なお、内皮細胞除去標本の場合は、各試験物質の累積添加開始前に10-6Ｍアセチルコリンを再度適用し、その弛緩反応が認められないことを再確認した。各試験物質の累積添加後、10-4Ｍパパベリンを添加し、標本を完全に弛緩させた。なお、コントロールには栄養液を同様に適用した。内皮細胞温存標本に対するヘパリン類似物質及びヘパリンの作用を図２に示す。ヘパリン類似物質は0.003〜0.1％(w/v)濃度においてコントロールと比較して有意な弛緩作用を示したのに対し、ヘパリンは弛緩作用を示さなかった。
【００２７】
内皮細胞除去標本に対するヘパリン類似物質及びヘパリンの作用をそれぞれ図３及び４に示す。内皮細胞除去標本ではヘパリン類似物質は弛緩作用を示さず、0.003〜0.1％（w/v）濃度においては内皮温存標本と内皮除去標本の間に有意な差が認められた（図３）。一方、ヘパリンは内皮細胞除去標本においても弛緩作用を示さなかった（図４）。
【００２８】
これは、ヘパリン類似物質はヘパリンと異なり、収縮状態にある血管に対して弛緩作用を引き起こし、その作用は内皮細胞に由来することを示している。このため、ヘパリン類似物質は血管を拡張させ、血圧を低下させると考えられる。
【００２９】
実施例４
ウレタン／α−クロラロース麻酔下で、Slc:SD系雄性ラット（9〜10週齢）の気管にカニューレを挿入した。試験物質をラットの後肢に局所投与するために、実体顕微鏡下で片側後肢鼠径部を切開し、浅後腹壁動脈に薬物投与用カニューレを挿入した。そのカテーテルの先端は大腿動脈との分岐点に留置した。片側頚動脈及び頚静脈にはそれぞれ、血圧測定用及び補液用カニューレを挿入した。
【００３０】
手術後、レーザードップラー血流計のプローブを両側後肢足底に固定し、皮膚血流量を測定した。皮膚血流量は生体電気用アンプで増幅した後、熱書記録器上に記録した。血圧は血圧トランスデューサを介してひずみ圧力用アンプで増幅させた後、熱書記録器上に記録した。心拍数は血圧波形から瞬時心拍計ユニットを用いて計測し、熱書記録器上に記録した。実験中は動物をホットプレート上に乗せ、直腸温を36〜38℃に維持させた。また、両側後肢甲部の皮膚表面温度もモニタリングした。
【００３１】
血流量、血圧、心拍数、皮膚表面温度及び直腸温が安定した時点で、10％（w/v）ヘパリン類似物質生理食塩液溶液30μlを薬物投与用カニューレから動脈内投与した。コントロールには生理食塩液を同様に投与した。ヘパリン類似物質の後肢足底皮膚血流量に対する作用を図５に示す。ヘパリン類似物質は10％（w/v）濃度において、コントロール群と比較して有意に皮膚血流量を増加させた。ヘパリン類似物質の全身血圧に対する作用を図６に示す。ヘパリン類似物質は10％（w/v）濃度において血圧低下作用を示した。
【００３２】
実施例５
ウレタン／α−クロラロース麻酔下で、Slc:SD系雄性ラット（9〜10週齢）の気管にカニューレを挿入した。試験物質をラットの後肢に局所投与するために、実体顕微鏡下で片側後肢鼠径部を切開し、浅後腹壁動脈に薬物投与用カニューレを挿入した。そのカニューレの先端は大腿動脈との分岐点に留置した。片側頚動脈及び頚静脈にはそれぞれ、血圧測定用及び補液用カニューレを挿入した。
【００３３】
手術後、レーザー血流画像化装置を用いて、薬物投与用カニューレを挿入した後肢の足底部における皮膚血流量を面積法により測定した。スキャナーヘッドを足底表面より約１５ｃｍ上方に固定し、スキャナーヘッドより発せられるレーザー光が足底全体（サイズ：縦４．５ｃｍ、横１．５ｃｍ、測定ポイント：縦３０ポイント、横１５ポイント）をスキャニングするように、後足の位置を調節した。
【００３４】
スキャナーの解像度、スキャニング速度、バックグラウンド閾値及び増幅度を、各々、中程度、標準、６．２ボルト及び１．０に設定した。この条件下で足底部全体の皮膚血流量を測定するのに要する時間は約１８秒であった。スキャニング操作開始後、足底部の皮膚血流量を順次画像化し、足底部全体の血流画像並びに最高、最低及び平均血流量（単位：volts,V）を記録した。
【００３５】
レーザー血流量画像化装置にて、皮膚血流量が安定していることを確認した後、ＮＯ合成阻害剤であるＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（以下、Ｌ−ＮＡＭＥと称する）１０ｍｇ／ｋｇを、補液用カニューレを介して、静脈内投与した。その３０分後に、１０％ヘパリン類似物質生理食塩溶液又は１０％ヘパリン生理食塩溶液の３０μｌを、薬物投与カニューレを介して、動脈内投与し、レーザー血流画像化装置により１５分間、皮膚血流量を測定した。
【００３６】
測定結果を図７に示す。Ｌ−ＮＡＭＥ非処置１０％ヘパリン生理食塩溶液投与群及びＬ−ＮＡＭＥ処置１０％ヘパリン生理食塩溶液投与群では、平均血流量の増加はわずかであり、両者の間の平均血流量の差は有意なものではなかった。一方、Ｌ−ＮＡＭＥ処置１０％ヘパリン類似物質食塩溶液投与群の平均血流量の増加は、Ｌ−ＮＡＭＥ非処置１０％ヘパリン類似物質食塩溶液投与群に対して、有意に抑制された。
【００３７】
ヘパリン類似物質の血流量増加作用がＮＯ合成阻害剤の存在によりほぼ完全に抑制されることから、ヘパリン類似物質の血流量増加作用には主にＮＯが関与しており、ヘパリン類似物質がＮＯを遊離促進していると考えられる。実施例３において、ヘパリン類似物質が血管内皮細胞依存性の弛緩作用を有することが明らかであり、さらに、前述のとおり、ヘパリン類似物質の血流量増加作用にはＮＯが関与している。従って、ヘパリン類似物質による血流量増加作用は血管内皮細胞由来の血管弛緩因子であるＮＯ遊離による血管拡張作用のためと考えられる。
【００３８】
【発明の効果】
ＰＰＳは、血管内皮細胞に直接作用し、ＮＯを遊離促進し、血管を拡張させる。このため、ＰＰＳは、血流量増加作用、血管拡張作用、血圧低下作用を有する。このため、高血圧、狭心症、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病などの循環器疾患、クモ膜下攣縮、脳梗塞などの脳循環障害に対して有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】非収縮状態の内皮細胞温存標本に対するヘパリン類似物質及びヘパリンの作用を示すグラフである。
【図２】収縮状態の内皮細胞温存標本に対するヘパリン類似物質及びヘパリンの作用を示すグラフである。
【図３】収縮状態の内皮細胞除去標本におけるヘパリン類似物質の作用を示すグラフである。
【図４】収縮状態の内皮細胞除去標本におけるヘパリンの作用を示すグラフである。
【図５】ラットの後肢足底皮膚血流量に対するヘパリン類似物質の作用を示すグラフである。
【図６】ラットの血圧に対するヘパリン類似物質の作用を示すグラフである。横軸の１目盛は、53.084秒を示す。
【図７】ＮＯ合成阻害剤の存在化又は非存在化における、ヘパリン類似物質及びヘパリンの血流量に対する影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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