(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培地中、ＤＡＮＣＥの存在下で弾性線維再生能を有する細胞を培養することを含む、弾性線維の製造方法。
【請求項２】
ＤＡＮＣＥ及び／又はＴＧＦβが添加された培地、あるいはＤＡＮＣＥ発現ベクター及び／又はＴＧＦβ発現ベクターが導入された弾性線維再生能を有する細胞を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＤＡＮＣＥ及び弾性線維再生能を有する細胞がヒトに由来するものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
弾性線維再生能を有する細胞が線維芽細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＤＡＮＣＥ、又はＤＡＮＣＥ発現ベクター、ＴＧＦβ及びＴＧＦβ発現ベクターからなる群から選択されるいずれかのＤＡＮＣＥの発現を促進する物質を含有する、弾性線維再生剤。
【請求項６】
無血清培地中、ｆｉｂｕｌｉｎ−４の存在下で弾性線維再生能を有する細胞を培養することを含む、弾性線維の製造方法。
【請求項７】
ｆｉｂｕｌｉｎ−４が添加された培地、あるいはｆｉｂｕｌｉｎ−４発現ベクターが導入された弾性線維再生能を有する細胞を用いる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ｆｉｂｕｌｉｎ−４及び弾性線維再生能を有する細胞がヒトに由来するものである、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
弾性線維再生能を有する細胞が線維芽細胞である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弾性線維の新規製造方法、並びに当該方法により得られうる弾性線維などに関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢に伴って弾性線維の劣化・分解がおこり、体中の組織の弾性は失われていく。このことは単に体が硬くなるとか皮膚がたるむといった問題だけではない。高齢者の主要疾患である肺気腫や動脈中膜の硬化・大動脈瘤、さらに最近では加齢黄斑変性症なども弾性線維の劣化・分解が直接原因であると考えられてきている［Ｈａｕｔａｍａｋｉ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３３４）：２００２−４；Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６３（６）：２３２９−３５；Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｈｅ  ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５１（４）：３４６−５３；Ｃｈｏｎｇ，Ｎ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６６（１）：２４１−５１］。しかし弾性線維のターンオーバーは非常に遅く、弾性線維が劣化・分解しても弾性線維が再生されることはない。弾性線維の再生の研究には弾性線維の形成機構の解明が不可欠であるが、弾性線維形成の分子メカニズムについて知られていることは少ない。
弾性線維形成の研究が進まない大きな原因は、よいｉｎ  ｖｉｔｒｏ弾性線維形成系がなかったことである。従来、培養細胞を用いて弾性線維を形成させるためには１０％以上の牛胎仔血清を必要としていた。このため、血清中に含まれる何が弾性線維形成に必要なのか全くわからなかった。例えば、エラスチンを発現しない毛様体色素細胞細胞株の２次元培養において、エラスチンを遺伝子導入すれば弾性線維が形成されることが報告されている［Ｒｏｂｂ，Ｂ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  １０（１１）：３５９５−６０５］。しかしやはり培養には１０％の牛胎仔血清を用いており、エラスチン以外の因子の弾性線維形成における役割は不明である。
また、培養人工皮膚・培養人工血管など人への移植を前提とした医薬品には牛胎仔血清を用いることは厳しく制限されており、正常量の弾性線維を含む人工皮膚や人工血管の作製は極めて困難である。コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルに平滑筋細胞や線維芽細胞を蒔いた３次元培養において弾性線維が形成されたこと、およびＴＧＦβ１とインスリンの併用によって弾性線維形成が増強されたことが報告されている［Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍａｔｒｉｘ  ｂｉｏｌｏｇｙ２２（４）：３３９−５０］。しかしこの培養にはすべて１０％の牛胎仔血清という異種動物由来成分を用いているため、ヒトへの移植には問題が多いだけでなく、何が弾性線維形成に必要なのかも不明である。また、できた弾性線維もまだらで、正常構造とは云えない。
従って、無血清でも弾性線維形成を誘導できる細胞培養技術を確立することは、弾性線維形成の分子機構を解明する上で極めて重要であるだけでなく、弾性線維形成を制御する医薬の開発、並びに正常構造を保持する弾性線維を含む培養人工皮膚や培養人工血管の開発のためなどに切望されている。
【発明の開示】
【０００３】
従って、本発明は、正常構造を保持する弾性線維の簡便且つ効率的な形成又は再生、並びに無血清培地における弾性線維の形成又は再生を可能とする細胞培養技術を確立し、以って弾性線維再生を制御する医薬、並びに正常構造を保持する弾性線維を含む培養人工皮膚や培養人工血管の開発などを可能とする手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、弾性線維の形成能を有する細胞の無血清培養において、ＤＡＮＣＥ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｒｔｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）−ｌｉｋｅ；ｆｉｂｕｌｉｎ−５ともいう）及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４という分泌蛋白質を加えることにより効率よく弾性線維を再生できることを見出した。また、線維芽細胞にＤＡＮＣＥの発現を誘導できることが知られているＴＧＦβ［Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３０）：２７３６７−７７（２００２）］にも同じ活性があることを見出した。ＤＡＮＣＥは、本発明者らが発生期の心血管よりクローニングした分泌蛋白質であり［Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（３２）：２２４７６−８３（１９９９）］、同じく本発明者らが作製・解析したＤＡＮＣＥ遺伝子欠損マウスが弾性線維形成異常を来したことから、ＤＡＮＣＥが弾性線維形成に必須であることが判明している［Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：１７１−５（２００２）］。本発明者らによる今回の発見は、ＤＡＮＣＥが弾性線維形成に必須であるだけでなく、弾性線維の再生に用いることができることを示している。
このＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４あるいはＤＡＮＣＥ発現誘導因子による弾性線維再生技術は、正常量・正常構造を保持する弾性線維を含む人工皮膚、皮膚モデルもしくは人工血管の作製に直ちに応用できる他、生体内での弾性線維再生にも必須の技術であると考えられる。
本発明者らは、以上の知見に基づき本発明を完成した。即ち、本発明は下記の通りである：
〔１〕ＤＡＮＣＥの存在下で弾性線維再生能を有する細胞を培養することを含む、弾性線維の製造方法；
〔２〕培養が無血清培地中で行われる、上記〔１〕の方法；
〔３〕ＤＡＮＣＥ及び／又はＤＡＮＣＥ誘導因子が添加された培地、あるいはＤＡＮＣＥ発現ベクター及び／又はＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクターが導入された弾性線維再生能を有する細胞を用いる、上記〔１〕の方法；
〔４〕ＤＡＮＣＥ誘導因子がＴＧＦβである、上記〔１〕の方法；
〔５〕ＤＡＮＣＥ及び弾性線維再生能を有する細胞がヒトに由来するものである、上記〔１〕の方法；
〔６〕弾性線維再生能を有する細胞が線維芽細胞である、上記〔１〕の方法；
〔７〕ＤＡＮＣＥを含み、且つＤＡＮＣＥが由来する動物に対して異種動物由来の成分を含まない人工弾性線維；
〔８〕ＤＡＮＣＥ又はＤＡＮＣＥの発現を促進する物質を含有する、弾性線維再生剤；
〔９〕ＤＡＮＣＥを含む無血清培地；
〔１０〕ＤＡＮＣＥ発現ベクター又はＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクターの少なくとも一方が導入された、弾性線維再生能を有する細胞；
〔１１〕ｆｉｂｕｌｉｎ−４の存在下で弾性線維再生能を有する細胞を培養することを含む、弾性線維の製造方法；
〔１２〕培養が無血清培地中で行われる、上記〔１１〕の方法；
〔１３〕ｆｉｂｕｌｉｎ−４を含み、且つｆｉｂｕｌｉｎ−４が由来する動物に対して異種動物由来の成分を含まない人工弾性線維；
〔１４〕ｆｉｂｕｌｉｎ−４又はｆｉｂｕｌｉｎ−４の発現を促進する物質を含有する、弾性線維再生剤；
〔１５〕ｆｉｂｕｌｉｎ−４を含む無血清培地；
〔１６〕ｆｉｂｕｌｉｎ−４発現ベクターが導入された、弾性線維再生能を有する細胞。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明は、ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４の存在下で弾性線維再生能を有する細胞を培養することを含む、弾性線維の製造方法を提供する。
「ＤＡＮＣＥ」（ｆｉｂｕｌｉｎ−５とも呼ばれる）とは、ヒトＤＡＮＣＥ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１１２１５２参照）又はそのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）をいう。ＤＡＮＣＥのオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウスなどが挙げられる。ＤＡＮＣＥは分泌蛋白質であり、プロセシングによりシグナル配列（例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１〜２３番目のアミノ酸残基に相当）が除去され得る。本発明の方法では、ＤＡＮＣＥとしては、シグナル配列が除去されたもの、シグナル配列が除去されていないもののいずれでも使用できるが、シグナル配列が除去されたものが好ましい。ＤＡＮＣＥはまた、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼにより切断されることが確認されている。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を例に挙げると、Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号１で表されるアミノ酸配列において７７番目〜７８番目のアミノ酸に相当）が切断され得る。切断型ＤＡＮＣＥは弾性線維再生能が弱いことが確認されているので、本発明で使用されるＤＡＮＣＥは全長型ＤＡＮＣＥ（即ち、上記の通り切断されていないもの）が好ましい。
ＤＡＮＣＥ変異体は、弾性線維の再生を可能とするものである限り特に限定されず、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは２以上（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列である。また、ＤＡＮＣＥ変異体として、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに抵抗性を示すようにプロテアーゼ切断部位に変異が導入されたものを使用できる。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列においてＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに抵抗性を示すようにプロテアーゼ切断部位（Ａｒｇ−Ｇｌｙ：配列番号１で表されるアミノ酸配列において７７番目〜７８番目のアミノ酸に相当）又はその近傍のアミノ酸（例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において７０番目〜８５番目、好ましくは７２番目〜８３番目、より好ましくは７４番目〜８１番目、さらにより好ましくは７６番目〜７９番目のアミノ酸）が変異（例えば、欠失、付加、置換）しているものを使用できる。「ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに抵抗性を示す」とは、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断能が、変異後においてより低下（例えば１．５倍以上、好ましくは２倍以上の低下）することを意味し、切断能の低下の程度は特に限定されない。ＤＡＮＣＥ変異体がＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに対して抵抗性を示すか否かは、正常ＤＡＮＣＥ、ＤＡＮＣＥ変異体の切断処理（例えば、後述の参考例を参照）の後に、正常ＤＡＮＣＥ、ＤＡＮＣＥ変異体の切断量を測定・比較することで確認できる。かかるＤＡＮＣＥ変異体は、半減期が天然型ＤＡＮＣＥよりも長いと考えられるため、本発明の方法での使用に有用である。
ｆｉｂｕｌｉｎ−４とは、ヒトｆｉｂｕｌｉｎ−４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１４７４参照）又はそのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）をいう。ｆｉｂｕｌｉｎ−４のオルソログは特に限定されず、例えば上記の動物に由来するものであり得る。ｆｉｂｕｌｉｎ−４は分泌蛋白質であり、プロセシングによりシグナル配列が除去され得る。本発明の方法では、ｆｉｂｕｌｉｎ−４としては、シグナル配列が除去されたもの、シグナル配列が除去されていないもののいずれでも使用できるが、シグナル配列が除去されたものが好ましい。ｆｉｂｕｌｉｎ−４変異体は、弾性線維の再生を可能とするものである限り特に限定されず、例えば、ｆｉｂｕｌｉｎ−４をコードするアミノ酸配列において１もしくは２以上（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列である。
「弾性線維再生能を有する細胞」とは、弾性線維構成成分を分泌し、且つＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４の存在下で培養されることにより弾性線維の新生を可能とする細胞をいう。弾性線維再生能を有する細胞は、任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４のオルソログが由来するものと同様のものが挙げられる。弾性線維再生能を有する細胞はまた、遺伝子非導入細胞又は遺伝子導入細胞であり得る。
弾性線維再生能を有する細胞が遺伝子非導入細胞である場合、かかる細胞は、弾性線維が存在する組織、例えば皮膚、血管（例、動脈）、肺又は子宮に由来する細胞であり得る。かかる細胞はまた、線維芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、内皮細胞等の細胞であり得る。好ましくは、かかる細胞としては、皮膚線維芽細胞又は血管平滑筋細胞が用いられ得る。弾性線維再生能を有する細胞はさらに、初代培養細胞、初代培養細胞から誘導された細胞株、幹細胞等の未分化細胞の培養により得られる細胞であり得る。このような細胞は、自体公知の方法により調製できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）；機能細胞の分離と培養，丸善書店（１９８７）参照）。
弾性線維再生能を有する細胞が遺伝子導入細胞である場合、かかる細胞は、１又は２以上の遺伝子がその発現が可能なように導入されたものであり得る。導入対象である細胞が弾性線維再生能を有していない、あるいは十分に有していない細胞である場合、弾性線維構成成分及び／又は弾性線維の形成を促進する他の因子を発現可能なベクターをかかる細胞に導入することにより、弾性線維再生能を獲得した細胞、あるいは弾性線維再生能が改善された細胞が作製できる。勿論、先に言及した皮膚線維芽細胞、血管平滑筋細胞等の細胞に対して弾性線維構成成分及び／又は弾性線維の形成を促進する他の因子を発現可能なベクターを導入し、その弾性線維再生能をより向上させてもよい。ＤＡＮＣＥは、弾性線維構成成分を組織化（ｏｒｇａｎｉｚｅ）する（詳細には、ＤＡＮＣＥがミクロフィブリルを足場としてリシルオキシダーゼファミリーの酵素（エラスチンをクロスリンクする酵素）をミクロフィブリル上に局在させ、以ってエラスチンの沈着・クロスリンクがミクロフィブリル上で起こるようにさせている）と考えられるため、また、ｆｉｂｕｌｉｎ−４も弾性線維形成に重要な役割を果たし得ると考えられるため、弾性線維再生能を有していない、あるいは十分に有していない細胞に対して、かかるベクターを導入すれば、導入細胞は、必要な弾性線維構成成分が分泌可能となり、且つＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４の存在下で培養されることにより弾性線維を新生できるようになると考えられる。弾性線維再生能を有していない、あるいは十分に有していない細胞で発現されるべき弾性線維構成成分及び／又は弾性線維の形成を促進する他の因子は特に限定されず、細胞の種類に応じて当業者により適宜決定され得るが、例えば、弾性線維構成成分としては、エラスチン、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、リシルオキシダーゼ様１−４（ＬＯＸＬ１−４）、ＬＴＢＰ２及び４、フィブリリン１−３、ＥＭＩＬＩＮ１及び２、ＭＡＧＰ１及び２などが挙げられ、弾性線維の形成を促進する他の因子としては、バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）Ｖ３、ヒアルロニダーゼなどが挙げられる。なお、弾性線維構成成分及び／又は弾性線維の形成を促進する他の因子を発現可能なベクター及び該ベクターの細胞への導入方法としては、後述するＤＡＮＣＥ発現ベクター及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４発現ベクター並びにＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクターと同様のものを用いることができる。
ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４の存在下での弾性線維再生能を有する細胞の培養は、結果的に、ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４を含む培養培地中で弾性線維再生能を有する細胞を培養することとなる限り特に限定されない。従って、培養開始時に、ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４蛋白質が培地中に存在していなくとも構わない。ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４の存在下での弾性線維再生能を有する細胞の培養としては、例えば、（１）ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４を添加した培養培地における弾性線維再生能を有する細胞の培養、（２）ＤＡＮＣＥ誘導因子を添加した培養培地における弾性線維再生能を有する細胞の培養、（３）ＤＡＮＣＥ発現ベクター及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４発現ベクター並びに／あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクターを導入した弾性線維再生能を有する細胞の培養、（４）ＤＡＮＣＥ発現細胞及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４発現細胞並びに／あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子発現細胞との弾性線維再生能を有する細胞の共培養などが挙げられる。本発明の方法において、培養培地中に播種する際の弾性線維再生能を有する細胞の密度は特に限定されないが、例えばサブコンフルエント又はコンフルエントになるよう播種され得る。
上記（１）の場合、培養培地に添加されるＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４は、天然蛋白質又は組換え蛋白質であり得る。ＤＡＮＣＥ及びｆｉｂｕｌｉｎ−４は、自体公知の方法により調製でき、例えば、ａ）ＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４を含有する生体試料（例えば、血液）からＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４を回収してもよく、ｂ）宿主細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）にＤＡＮＣＥ発現ベクター又はｆｉｂｕｌｉｎ−４発現ベクター（後述）を導入することにより形質転換体を作製し、該形質転換体により産生されるＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４を回収してもよく、ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系によりＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４を合成してもよい。ＤＡＮＣＥ及びｆｉｂｕｌｉｎ−４は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、ＤＡＮＣＥ抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。培養培地に添加されるＤＡＮＣＥ及びｆｉｂｕｌｉｎ−４の量は、弾性線維の再生を可能とする限り特に限定されないが、例えば培養培地中での最終濃度が、０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜２０μｇ／ｍｌとなるような量が添加され得る。
上記（２）の場合、培養培地に添加されるＤＡＮＣＥ誘導因子は、ＤＡＮＣＥの発現を誘導できるものである限り限定されないが、例えばＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）などが挙げられる。ＤＡＮＣＥ誘導因子が蛋白質である場合、天然蛋白質又は組換え蛋白質（ＤＡＮＣＥと同様に調製可能）を使用できる。培養培地に添加されるＤＡＮＣＥ誘導因子の量は、弾性線維の再生を可能とする程度の量のＤＡＮＣＥを誘導するものである限り特に限定されないが、例えばＤＡＮＣＥ誘導因子としてＴＧＦβを用いた場合、培養培地中での最終濃度が、０．５〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５〜４０ｎｇ／ｍｌとなるような量が添加され得る。
上記（３）の場合、弾性線維再生能を有する細胞に導入される発現ベクターは、上記ＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子を発現可能なベクターであり得る。これらの発現ベクターは、目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドが、目的とする細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、目的の細胞で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。プロモーターはまた、線維芽細胞特異的プロモーター（例えば、コラーゲンプロモーター）、平滑筋細胞特異的プロモーター（例えば、ＳＭ２２プロモーター、α−平滑筋アクチンプロモーター）等の弾性線維再生能を有する細胞に特異的なプロモーターであってもよい。
発現ベクターは、好ましくは目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。また、発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、並びにレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
発現ベクターの弾性線維の形成能を有する細胞への導入は、自体公知の方法、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、リポソーム、陽イオン性脂質等の脂質を使用する方法などにより行われ得る。また、該発現ベクターの一部又は全てが、弾性線維の形成能を有する細胞のゲノムに組み込まれていても、組み込まれていなくてもよい。発現ベクターの細胞内ゲノムへの組込みには、自体公知の方法、例えばレトロウイルスを使用する方法、相同組換えを可能とするターゲティングベクターを使用する方法などが用いられ得る。
上記（４）の場合、培養培地中で弾性線維の形成能を有する細胞と共存させる細胞は、ＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子を発現可能である限り特に限定されない。該発現細胞は、例えば、ＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子の発現ベクターの宿主細胞への導入により得られる細胞、ＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子を発現する天然細胞であり得る。ＤＡＮＣＥを発現する天然細胞としては、ＤＡＮＣＥ発現組織（例えば、心臓、腎臓、膵臓、精巣、卵巣、小腸、結腸、軟骨、動脈、肺、子宮、皮膚）由来の細胞を使用できる。ｆｉｂｕｌｉｎ−４を発現する天然細胞としては、ｆｉｂｕｌｉｎ−４発現組織（例えば、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、皮膚、動脈）由来の細胞を使用できる。ＤＡＮＣＥ誘導因子を発現する天然細胞としては、例えば、ＤＡＮＣＥ誘導因子としてＴＧＦβを意図する場合には、白血球、骨、胎盤、脾臓、小腸、結腸、肝臓、腎臓、心臓、脳、骨髄、軟骨等の組織由来の細胞を使用できる。ＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子の発現細胞はまた、初代培養細胞、初代培養細胞から誘導された細胞株、幹細胞等の未分化細胞の培養により得られる細胞（例えば、分化細胞）、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などであり得る。ＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子の発現細胞はまた、弾性線維再生能を有する細胞と同種動物由来の細胞であり得る。
共培養としては、弾性線維の形成能を有する細胞とＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子の発現細胞とが物理的に接触している場合や、これら細胞が同じ培養系に存在するが物質の行き来が可能な隔壁により隔てられ細胞自体の物理的接触ができない場合も含まれる。弾性線維の形成能を有する細胞とＤＡＮＣＥ又はｆｉｂｕｌｉｎ−４あるいはＤＡＮＣＥ誘導因子の発現細胞が同じ培養系に存在するが物質の行き来が可能な隔壁により隔てられ細胞自体の物理的接触ができない場合とは、例えば、通常の細胞培養に用いられるフィルター（例えば、カルチャーインサート）を用いて両細胞を隔てて培養する場合が挙げられる。
上述した通りのＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４存在下での弾性線維再生能を有する細胞の培養は、通常の細胞培養方法に準じて行うことができる。例えば、基礎培地としては、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等を使用できる。基礎培地には、アミノ酸、ビタミン、脂質、抗生物質、緩衝剤等の成分を補充してもよい。培地のｐＨは、例えば約６〜８、好ましくは約６．５〜７．５である。培養温度は、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養期間は、十分な量の弾性線維が得られるように適宜調製され得る。
なお、上記培養は、無血清培地、血清培地（例えば５％以下、３％以下又は１％以下の血清を含有）中のいずれで行われてもよいが、未同定成分の混入の防止、感染リスクの軽減などの観点から、無血清培地で行うことが好ましい。さらに、異種動物由来成分の除去の観点から（例えば、アレルギー反応抑制のため）、培養で用いられるＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４、及び弾性線維再生能を有する細胞、並びにその他の成分は、同種動物に由来するもので統一することが好ましい。
上記培養で用いられる培地はまた、弾性線維再生能を有する細胞により効率的に弾性線維を形成させるため、ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４以外の弾性線維構成成分（例えば、エラスチン、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、リシルオキシダーゼ様１−４（ＬＯＸＬ１−４）、ＬＴＢＰ２及び４、フィブリリン１−３、ＥＭＩＬＩＮ１及び２、ＭＡＧＰ１及び２）、及び／又は弾性線維の形成を促進する他の因子（例えば、バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）Ｖ３、ヒアルロニダーゼ）、並びに／あるいはその他の成分（例えば、ｂｅｔａｉｇ−ｈ３、６７ｋＤエラスチン結合蛋白質）を含むことができる。
培養はまた、二次元培養又は三次元培養であり得る。二次元培養又は三次元培養は、自体公知の方法により行うことができる。例えば、三次元培養に関する技術については、Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍａｔｒｉｘ  ｂｉｏｌｏｇｙ２２（４）：３３９−５０、Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９３（３）：５３７−４４を参照のこと。
弾性線維が製造（即ち、再生）されたか否かは、自体公知の方法により確認できる。例えば、培養物の一部を採取し、抗ＤＡＮＣＥ抗体、抗ｆｉｂｕｌｉｎ−４抗体、抗エラスチン抗体等の弾性線維構成成分に対する抗体を用いて免疫染色することにより確認が行われる。
本発明はまた、ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４を含む人工弾性線維を提供する。本明細書中で使用される場合、「人工弾性線維」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再生された弾性線維を意味するものとする。
本発明の人工弾性線維は、培養に使用されたＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４、並びに／あるいは培養に使用された弾性線維再生能を有する細胞が由来する動物に対して異種動物由来の成分を含まないものであり得る。即ち、本発明の人工弾性線維は、動物由来の生体成分について、単一の動物種に由来する成分のみからなるものであり得る。上述した本発明の方法により、このような人工弾性線維を提供することが初めて可能となった。従って、本発明の人工弾性線維は、同種異系移植等の同種移植で好適に用いられ得る。また、弾性線維再生能を有する細胞として、移植が所望される個体由来の細胞を用い、且つ異種動物由来成分が一切混入していない培地を用いることで、同種同系移植に好適に用いられる弾性線維が得られる。
本発明の人工弾性線維はまた、ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４以外の弾性線維構成成分（例えば、エラスチン、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、リシルオキシダーゼ様１−４（ＬＯＸＬ１−４）、ＬＴＢＰ２及び４、フィブリリン１−３、ＥＭＩＬＩＮ１及び２、ＭＡＧＰ１及び２）、並びにその他の成分（例えば、ｂｅｔａｉｇ−ｈ３、６７ｋＤエラスチン結合蛋白質）を含み得る。
本発明の人工弾性線維はさらに、弾性線維再生能を有する細胞を伴う形態（即ち、本発明の人工弾性線維及び弾性線維再生能を有する細胞を含む複合物）で提供され得る。例えば、本発明の方法により得られる培養物が、かかる形態に対応する。勿論、本発明の人工弾性線維は、弾性線維再生能を有する細胞を伴わない形態としても提供され得る。このような形態は、自体公知の方法により得られる。例えば、本発明の方法により得られる培養物を、細胞除去処理（例えば、ＥＤＴＡ処理）、放射線（例えば、γ線）照射、細胞変性処理（例えば、凍結・融解、凍結乾燥）などの処理に付すことにより、弾性線維再生能を有する細胞を伴わない人工弾性線維が得られる。
本発明はさらに、上記弾性線維を含む人工組織を提供する。弾性線維を含む人工組織としては、例えば人工皮膚、人工血管（例えば、人工動脈）、人工肺、人工子宮等が挙げられるが、人工皮膚及び人工血管が好ましい。本発明の人工組織は、自体公知の方法により作製できる（例えば、Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍａｔｒｉｘ  ｂｉｏｌｏｇｙ２２（４）：３３９−５０、Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９３（３）：５３７−４４を参照）。
本発明はまた、ＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４（蛋白質）又はＤＡＮＣＥ及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４の発現を促進する物質を含有する、弾性線維再生剤を提供する。
ＤＡＮＣＥの発現を促進する物質は、ＤＡＮＣＥの発現を可能とする限り特に限定されず、例えば、ＤＡＮＣＥ発現ベクター、ＤＡＮＣＥ誘導因子、ＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクターが挙げられる。
ｆｉｂｕｌｉｎ−４の発現を促進する物質は、ｆｉｂｕｌｉｎ−４の発現を可能とする限り特に限定されず、例えば、ｆｉｂｕｌｉｎ−４発現ベクターが挙げられる。
本発明の再生剤は、任意の担体、例えば、医薬上許容される担体を配合することにより、弾性線維の再生が所望される状態又は疾患、例えば、肺気腫、血管損傷、皮膚弛緩症、創傷、弾性線維劣化（例えば、加齢又は紫外線により引き起こされるもの）、肌荒れ、動脈硬化、大動脈瘤、加齢黄斑変性症、会陰ヘルニア、肛門ヘルニアの予防、治療又は改善のため、あるいは皮膚のたるみやしわをとるといった美容の目的のために有用である。本発明の調節剤はまた、弾性線維の再生能を有する細胞の培養用試薬として有用である。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のリガンドを懸濁させた懸濁液剤、有効量のリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の製剤の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
本発明はさらに、本発明の方法において用いられる任意の物、例えば無血清培地、ＤＡＮＣＥ発現ベクター及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４発現ベクター、ＤＡＮＣＥ発現ベクター及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４発現ベクターが導入された細胞等を提供する。
本明細書中で挙げられた全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０００５】
１．材料及び方法
１．１．材料
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、モノクローナル抗ＦＬＡＧ．Ｍ２抗体（Ｆ３１６５）はＳｉｇｍａから購入、牛胎仔血清（ＦＢＳ）はＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。抗マウスＤＡＮＣＥ抗体ＢＳＹＮ１９２３は、マウスＤＡＮＣＥ７６−９８アミノ酸に対応する合成ペプチドをウサギに免疫して作製し、抗原ペプチドを固定したカラムを用いてアフィニティー精製した。抗Ｍｙｃ（９Ｅ１０）抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚより購入した。ポリクローナル抗エラスチン抗体（ＰＲ５３３）はＥｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＩＮＣから購入した。抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６抗体はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入した。Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｃｏｖｅｒ  ＧｌａｓｓはＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄから、ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄはＶｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓから購入した。
１．２．組換えＤＡＮＣＥ
２９３Ｔ細胞とＤＡＮＣＥ発現ベクターを用いてヒトＤＡＮＣＥ安定発現細胞株を作製し、その培養上清からＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて組換えＤＡＮＣＥを精製した後、脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて脱塩した。
１．３．線維芽細胞培養
ヒト線維芽細胞は京都大学附属病院形成外科より供与して頂いた。２４ウエルプレートの底にＣｏｖｅｒ  Ｇｌａｓｓを置き、その上にヒト線維芽細胞を１ウエルあたり７．５×１０４個播種し、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。３日目にＰＢＳで洗浄後、ＦＢＳを添加していないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に換え、精製したＤＡＮＣＥ蛋白質、切断型のＤＡＮＣＥ蛋白質４μｇ／ｍｌ、もしくはＦＢＳを添加した。引き続き３７℃、５％ＣＯ２で培養し、１４日目に固定、免疫染色を行った。
１．４．免疫染色
培養１４日目に、１ｍｌのＰＢＳにて３回洗浄後、１００％メタノールにて、−２０℃で３０分間固定した。ＰＢＳにて洗浄後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳにて、室温で３０分間ブロッキングした後、ポリクローナル抗エラスチン抗体（１／１００）、および、モノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（１／１００）と室温で１時間以上インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、さらに抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（１／１００）、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６抗体（１／１００）と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒドにて、室温で１０分間固定し、ふたたびＰＢＳで洗浄後、ＤＡＰＩ含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄにてスライドガラス上にサンプルをマウントした。観察は共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ５１０，Ｚｅｉｓｓを用いて行った。
参考例１：ＤＡＮＣＥの一部はｉｎ  ｖｉｔｒｏ，ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＮ末端が切断されている
１．１．ヒト及びマウスＤＡＮＣＥの２９３Ｔ細胞での強制発現
シグナルペプチド切断部位直下にＦＬＡＧタグをつけたヒト及びマウスＤＡＮＣＥ  ｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、無血清培地に交換後４８時間培養を続け、その培養上清１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ウエスタンブロットを行った。抗体はマウスＤＡＮＣＥの７６−９８番目のアミノ酸に対応するペプチドをウサギに免疫して得られたＢＳＹＮ、および抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いた。
その結果、ＢＳＹＮはヒトＤＡＮＣＥを認識せず、マウスＤＡＮＣＥは２本のバンドとして検出された。これに対して抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体は、ヒト・マウスＤＡＮＣＥを１本のバンドとして検出した。
１．２．マウス由来皮膚線維芽細胞でのＤＡＮＣＥの発現
新生仔期のＤＡＮＣＥノックアウトマウス（Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：１７１−１７５（２００２）参照）およびその同腹のコントロールマウス皮膚より線維芽細胞を培養し、３５Ｓ−Ｍｅｔ，Ｃｙｓで２４時間ラベルした後、培養上清をＢＳＹＮ抗体で免疫沈降した。免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、オートラジオグラフィーで検出した。
その結果、ＤＡＮＣＥ＋／＋マウス由来の皮膚線維芽細胞では２本のバンドが検出され、ＤＡＮＣＥ−／−マウス由来の皮膚線維芽細胞ではバンドが検出されなかった。
１．３．マウス肺組織のウエスタンブロット
１２週齢のＤＡＮＣＥノックアウトマウスおよびその同腹のコントロールマウスの肺組織抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、ＢＳＹＮ抗体でウエスタンブロットを行った。
その結果、ＤＡＮＣＥ＋／＋マウスの肺組織では、ＤＡＮＣＥが２本のバンドとして検出され、ＤＡＮＣＥ−／−マウスの肺組織ではバンドが検出されなかった。
参考例２：切断型ＤＡＮＣＥのＮ末端は、ＤＡＮＣＥの７８番目以降のアミノ酸と一致する
カルボキシル末端にＦＬＡＧタグと６ｘＨｉｓタグのついたヒトＤＡＮＣＥ  ｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、安定発現株を樹立した。その無血清培養上清８００ｍｌよりＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて組換えＤＡＮＣＥを精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開してＣｏｏｍａｓｉｅ−Ｂｌｕｅで染色した。主要なバンド２本のうち、切断型ＤＡＮＣＥに相当するバンドを切り出し、エドマン分解によりＮ末端アミノ酸配列を解析した。
その結果、切断型ＤＡＮＣＥのＮ末端アミノ酸配列は、ＤＡＮＣＥの７８番目以降のアミノ酸配列と一致していた。
以上より、この低分子量タンパク質は、ＤＡＮＣＥの７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間での切断により生じると考えられた。
参考例３：ＤＡＮＣＥの切断はセリンプロテアーゼインヒビターで阻害される
カルボキシル末端にＦＬＡＧタグと６ｘＨｉｓタグのついたヒトＤＡＮＣＥ  ｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、システインプロテアーゼインヒビター（Ｅ６４）またはセリンプロテアーゼインヒビター（アプロチニン）を含む無血清培地で４８時間培養し、培養上清からＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて沈降させた組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体でウエスタンブロットを行った。
その結果、ＤＡＮＣＥの切断はＥ６４で阻害されなかったが、アプロチニンにより阻害された。
以上より、ＤＡＮＣＥはセリンプロテアーゼにより切断されることが示唆された。
参考例４：ＤＡＮＣＥのＡｒｇ７７をＡｌａに置換すると切断されにくくなる
ＤＡＮＣＥの７７番目のアルギニンをアラニンに置換した変異型ＤＡＮＣＥ（Ｃ末端ＦＬＡＧ，６ｘＨｉｓタグつき）の発現ベクター、及び正常型ＤＡＮＣＥ（Ｃ末端ＦＬＡＧ，６ｘＨｉｓタグつき）の発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、無血清培地で４８時間培養した培養上清からＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて沈降させた組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体でウエスタンブロットを行った。
その結果、この変異型ＤＡＮＣＥは、プロテアーゼによる切断に対して抵抗性を示すことが明らかとなった。
実施例１：ＤＡＮＣＥ蛋白質は無血清培養において弾性線維形成を誘導できる
ヒト皮膚線維芽細胞をコンフルエントになるよう播種し、無血清培地もしくは１０％牛胎仔血清を含有する培地に替えて２週間培養して弾性線維の形成を抗エラスチン抗体による免疫染色で検討した。
その結果、１０％の牛胎仔血清を含有する培地では弾性線維の形成がみられた。無血清培地でも細胞は生存していたが、弾性線維はほとんど形成されなかった。しかし無血清培地に組換えＤＡＮＣＥ蛋白質を４μｇ／ｍｌになるように加えておくと、血清含有培地と同等以上の弾性線維が形成された。このとき加えた組換えＤＡＮＣＥの局在を抗ＦＬＡＧ抗体で見ると、形成された弾性線維と共局在していた。なお、組換えＤＡＮＣＥのかわりに、ＤＡＮＣＥの発現誘導が報告されているＴＧＦβ１  １０ｎｇ／ｍｌを加えても同様の弾性線維の形成が観察された。
実施例２：ＤＡＮＣＥによる弾性線維形成の誘導はインテグリンに依存しないがアミノ末端ドメインを必要とする
次に、ＤＡＮＣＥによる弾性線維形成の誘導に細胞表面インテグリンとの結合が必要かどうか、また、プロテアーゼによるアミノ末端ドメイン切断が活性に影響するかどうかを検証した。なお、組換え蛋白質はすべて４μｇ／ｍｌの濃度になるよう加えた。
その結果、無血清培地での培養では弾性線維形成はほとんど認められず、組換えＤＡＮＣＥ蛋白質を加えた培地では多くの弾性線維の形成が確認された。インテグリンとほとんど結合しないことが確認されている変異蛋白質（インテグリン結合部位ＲＧＤをＲＧＥに変異させたもの）を加えた培地においても同等の弾性線維形成がみられたため、弾性線維形成においてはＤＡＮＣＥとインテグリンとの結合は必要ではないと考えられた。これに対して、アミノ末端ドメイン切断型ＤＡＮＣＥ（ΔＮＤ−ＤＡＮＣＥ）を加えた培地では弾性線維形成が非常に少なく、切断型ＤＡＮＣＥには弾性線維形成活性がほとんどないか、あっても非常に弱いと考えられた。リシルオキシダーゼ阻害薬ＢＡＰＮ（ｂｅｔａ−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｔｒｉｌｅ）を全長ＤＡＮＣＥとともに加えておくと、エラスチンのクロスリンクが阻害されるため弾性線維は形成されなかった。しかし、この時でも加えたＤＡＮＣＥ蛋白質は線維状に分布していた。すなわち、ＤＡＮＣＥが線維状に分布するためにはエラスチンを必要としていないと考えられる。
実施例３：ｆｉｂｕｌｉｎ−４蛋白質は無血清培養において弾性線維形成を誘導できる
次いで、実施例１と同様の方法にて、ヒト皮膚線維芽細胞をコンフルエントになるよう播種し、無血清培地もしくは１０％牛胎仔血清を含有する培地に替えて２週間培養して弾性線維の形成を抗エラスチン抗体による免疫染色で検討した。
その結果、１０％の牛胎仔血清を含有する培地では弾性線維の形成がみられた。無血清培地でも細胞は生存していたが、弾性線維はほとんど形成されなかった。しかし無血清培地に組換えｆｉｂｕｌｉｎ−４蛋白質を４μｇ／ｍｌになるように加えておくと、血清含有培地と同等以上の弾性線維が形成された。このとき加えた組換えｆｉｂｕｌｉｎ−４の局在を抗ＦＬＡＧ抗体で見ると、形成された弾性線維と共局在していた。
考察
今までｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で弾性線維を形成させるには１０％の牛胎仔血清が必須とされてきたため、血清に含まれる弾性線維形成に必要な因子が何か不明であった。本発明者は、ＤＡＮＣＥもしくはｆｉｂｕｌｉｎ−４又はＤＡＮＣＥ遺伝子発現を増強する因子（ＴＧＦβ）を培地に加えるだけで、ヒト皮膚線維芽細胞に効率よく弾性線維を作らせることができることを示した。これらの結果は、ヒト皮膚線維芽細胞に弾性線維形成を誘導するにはＤＡＮＣＥもしくはｆｉｂｕｌｉｎ−４又はＤＡＮＣＥ遺伝子発現を増強する因子（ＴＧＦβ）があれば十分であることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明の方法は、正常構造を保持する弾性線維の簡便且つ効率的な再生に有用である。本発明の方法はまた、血清を必要としないため、ヒトへの移植を前提とする、弾性線維を含む人工組織（例えば、人工皮膚、人工血管）の作製に有用である。本発明の方法はさらに、血清を用いる必要がないため、弾性線維形成・再生に必要な因子を同定するための実験系として有用である。本発明の弾性線維再生剤は、細胞培養用試薬として、あるいは美容剤又は医薬として有用である。
本発明の方法によれば、正常構造を保持する弾性線維の簡便且つ効率的な再生が可能となる。本発明の方法はまた、血清を必要としないため、ヒトへの移植を前提とする、弾性線維を含む人工組織（例えば、人工皮膚、人工血管）の作製を可能とする。本発明の方法はさらに、血清を用いる必要がないため、弾性線維形成・再生に必要な因子を同定するための実験系として使用できる。本発明の弾性線維再生剤は、細胞培養用試薬として、あるいは美容剤又は医薬として使用できる。
本出願は、日本で出願された特願２００５−０３０８６４（出願日：２００５年２月７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
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