(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固IX因子の精製方法であって、血液凝固IX因子に対する抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィー処理により得られる、血漿由来の高純度血液凝固IX因子含有画分を出発材料とし、さらに疎水クロマトグラフィー処理することを含み、該疎水クロマトグラフィー処理は、１Mよりも高く１.５M以下のNaCl濃度およびpH６以上でpH７よりも低いpHで血液凝固IX因子をクロマトグラフィー担体に吸着させ、１Mよりも高く１.１M以下のNaCl濃度およびpH６以上でpH７よりも低いpHで担体を洗浄してマンノース結合レクチン結合性セリンプロテアーゼ−１（以下、MASP-1）を素通りさせ、除去するものであり、血液凝固IX因子１国際単位当たりのMASP-1の含有量が０.１ｎｇ以下であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
血液凝固IX因子に対する活性化血液凝固IX因子の含有率が０.１％以下であり、血液凝固IX因子１国際単位当たりのMASP-1の含有量が０.１ｎｇ以下であることを特徴とする、血漿由来の血液凝固IX因子製剤。
【請求項３】
血液凝固IX因子製剤の製造工程において、血液凝固IX因子に対する抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィー処理および疎水クロマトグラフィー処理を行うことによって得られる血漿由来の血液凝固IX因子製剤であって、該疎水クロマトグラフィー処理は、１Mよりも高く１.５M以下のNaCl濃度およびpH６以上でpH７よりも低いpHで血液凝固IX因子を疎水クロマトグラフィー担体に吸着させ、１Mよりも高く１.１M以下のNaCl濃度およびpH６以上でpH７よりも低いpHで担体を洗浄するものであり、血液凝固IX因子１国際単位当たりのMASP-1の含有量を０.１ｎｇ以下まで低減することで、最終産物での血液凝固IX因子に対する活性化血液凝固IX因子の含有率を０.１％以下としたことを特徴とする、血液凝固IX因子製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、血液凝固ＩＸ因子（以下、ＦＩＸ）の精製方法および当該精製方法によって得られたより高純度のＦＩＸ調製物に関する。詳細には、ＦＩＸ含有画分からＦＩＸ活性化因子、特にマンノース結合レクチン結合性セリンプロテアーゼ−１（ＭＡＳＰ−１）を除去することによるＦＩＸの精製方法、および当該精製方法を経て得られるより高純度のＦＩＸ精製画分およびＦＩＸ製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  ＦＩＸはセリンプロテアーゼの前駆体であり、アミノ末端領域にγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基を有するビタミンＫ依存性血液凝固因子である。ＦＩＸは肝臓で合成され、血中には３〜５μｇ／ｍｌ存在する。ＦＩＸは、生理的には活性化血液凝固ＶＩＩ因子（以下、ＦＶＩＩａ）−組織因子（ＴＦ）複合体、あるいは活性化血液凝固ＸＩ因子（以下、ＦＸＩａ）により活性化されることが知られている。活性化により生成した活性化血液凝固ＩＸ因子（以下、ＦＩＸａ）は、さらに血液凝固Ｘ因子（以下、ＦＸ）を活性化し血液凝固を進行させる。ヒトＦＩＸは分子量５７，０００の一本鎖糖タンパク質で、アミノ末端からＧｌａドメイン、ヒンジ領域、２つのＥＧＦ様ドメイン、さらに活性化ペプチド領域を経てセリンプロテアーゼドメインというドメイン配列により構成されている。Ｇｌａドメインには１２個のＧｌａ残基が存在している。【０００３】  ＦＩＸの欠乏／欠損に基づく異常症は、出血性疾患である血友病Ｂとして知られている。血友病Ｂに対する根治的療法は現在のところなく、ＦＩＸの補充療法による患者の止血管理が治療の主体である。【０００４】  １９８０年代には、クリオ上清やコーンのエタノール分画のフラクションＩ上清などを出発原料として、陰イオン交換体を用いたクロマトグラフィーで分画して精製される血液凝固ＩＸ因子複合体製剤（ＰＣＣ製剤）がＦＩＸの補充療法に使用されていた（例えば、非特許文献１、非特許文献２、および非特許文献３参照）。また、ＦＩＸは、その他のビタミンＫ依存性の凝固因子（プロトロンビン、ＦＶＩＩ、ＦＸなど）と物理化学的に性状が類似しているために、それらとの分離が困難であったが、アフィニティークロマトグラフィー精製技術の発達により、高純度ＦＩＸの精製が可能になった。例えば、１９８０年代後半には、ヘパリンをリガンドにした担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＦＩＸを高度に精製したＦＩＸ製剤が臨床使用されるようになった（例えば、非特許文献４、非特許文献５、および非特許文献６参照）。さらに１９９０年代になると、ＦＩＸに対するモノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーでＦＩＸ以外のビタミンＫ依存性の凝固因子を除去し、ＦＩＸを特異的に高度に精製したＦＩＸ製剤が使用されるようになってきた（例えば、非特許文献７、非特許文献８、および非特許文献９参照）。【０００５】
【非特許文献１】Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ  Ｃ．ら，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，５５巻，４号，１９８８年，ｐ．２０２−２１０
【非特許文献２】神谷忠，日本輸血学会誌，３３巻，５号，１９８７年，ｐ．６３８−６４４
【非特許文献３】安田純一，血液製剤，近代出版，１９８６年，ｐ．１８４−１９１
【非特許文献４】Ｂｕｒｎｏｕｆ  Ｔ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，４９巻，１−３号，２００１年，ｐ．５７５−５８６
【非特許文献５】Ｊｏｓｉｃ  Ｄ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，６３２巻，１−２号，１９９３年，ｐ．１−１０
【非特許文献６】Ｂｕｒｎｏｕｆ  Ｔ．ら，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，５７巻，４号，１９８９年，ｐ．２２５−２３２
【非特許文献７】森河亘ら，基礎と臨床，２４巻，１０号，１９９０年，７１３−７１７頁
【非特許文献８】Ｉｇａ  Ｙ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，１９９０年，ｐ．１０７−１１６
【非特許文献９】Ａｋｉｍｏｔｏ  Ｙ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，１９９０年，ｐ．１１７−１３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  しかし、アフィニティークロマトグラフィーあるいはイムノアフィニティークロマトグラフィーで高純度に精製されたＦＩＸ製剤であっても、精製工程中に生成した微量のＦＩＸａ（ＦＩＸ量に対して０．１〜１．０％）が含まれる。ＦＩＸａとウサギ鬱血試験（血栓傾向を検査する生体内試験）のスコアーとの間に正相関があるとの報告もある（例えば、Ｇｒａｙ  Ｅ．ら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７３巻，４号，１９９５年，ｐ．６７５−６７９およびＰｈｉｌｉｐｐｏｕ  Ｈ．ら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７６巻，１号，１９９６年，ｐ．２３−２８参照）。したがって、高純度に精製されたＦＩＸ調製物中になお微量に混在するＦＩＸａを可能な限り低減させることは、血栓誘発の危険性をさらに低減させ、ＦＩＸ製剤の安全性をより高めるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  ここで、ＦＩＸ製剤中のＦＩＸａを低減させる方策としては、一旦生成したＦＩＸａをＦＩＸ製剤の最終組成物となる以前の精製工程で除去することの他に、ＦＩＸａ生成の原因となるＦＩＸ活性化因子をＦＩＸ製造工程中で予め除き、精製されたＦＩＸ調製物中にＦＩＸａが混入されないようにするという対応策も考えられた。【０００８】  本発明者らは、ヒト血漿から陰イオン交換体を用いる既報告の方法（例えば、森河亘ら，基礎と臨床，２４巻，１０号，１９９０年，７１３−７１７頁参照）で精製分離したビタミンＫ依存性凝固因子画分を出発原料として、ＦＩＸに対するモノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーで精製したＦＩＸサンプル（Ｍ画分）の溶液をインキュベーションするとＦＩＸが活性化し、ＦＩＸａに変換されることを見出していた。このＦＩＸａの生成速度は、陰イオン交換体ゲルと混合すると増加した。【０００９】  この原因は、ＦＩＸの生理的な活性化因子であるといわれているＦＸＩａやＦＶＩＩａが微量に混在しているためであろうと当初は推測された。しかし、Ｍ画分サンプル中のＦＸＩａとＦＶＩＩａ含量をＥＬＩＳＡにて調べ、あらかじめ高純度に精製したＦＩＸにＭ画分と同等量のＦＸＩａあるいはＦＶＩＩａを添加し反応させ、それらによるＦＩＸ活性化能を調べた結果、ＦＸＩａあるいはＦＶＩＩａを添加したサンプルよりも、Ｍ画分サンプルのＦＩＸ活性化能が著しく高いことが示された。この事実より、ＦＸＩａおよびＦＶＩＩａ以外の新規なＦＩＸ活性化プロテアーゼの存在が示唆された。【００１０】  一方、レクチン経路と呼ばれる第３の補体活性化経路で働くセリンプロテアーゼの一種にマンノース結合レクチン結合性セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）がある（例えば、Ｓａｔｏ  Ｔ．ら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６巻，４号，１９９４年，ｐ．６６５−６６９；Ｅｎｄｏ  Ｙ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６１巻，９号，１９９８年，ｐ．４９２４−４９３０；および遠藤雄一ら，蛋白質  核酸  酵素，４５巻，５号，２０００年，ｐ．６７１−６７８参照）。このＭＡＳＰには、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３、およびｓＭＡＰの４タイプがあることが知られている。しかしながら、ＭＡＳＰが、血液凝固因子の活性化に関与することは従来知られていなかった。【００１１】  本発明者らは、上記の諸問題に鑑み鋭意検討した結果、精製ＭＡＳＰ−１が時間依存的にＦＩＸを活性化すること、およびヒトＭＡＳＰ−１に対するモノクローナル抗体を固定化したゲルを用いてＭ画分からＭＡＳＰ−１を除去すると、ＦＩＸ活性化の程度が激減（約９５％の活性化能が消失）することを見出し、これら事実からＦＩＸ活性化プロテアーゼの主体がＭＡＳＰの一種であるＭＡＳＰ−１であることを確認した。このようにして、アフィニティークロマトグラフィーあるいはイムノアフィニティークロマトグラフィーで高純度に精製された従来のＦＩＸ製剤中になお微量のＦＩＸａ（ＦＩＸ量に対して０．１〜１．０％）が含まれる原因は、ＭＡＳＰ−１の混入による精製工程中でのＦＩＸの活性化にあることが判明した。【００１２】  すなわち、本発明は、���純度に精製された従来のＦＩＸ製剤中になお微量に混在しているＦＩＸａの原因が、これまでＦＩＸの生理的な活性化因子であることが知られているＦＸＩａやＦＶＩＩａとは異なる新規なＦＩＸ活性化因子であるＭＡＳＰ、特にＭＡＳＰ−１によるものであるとの上記知見に基づき、ＦＩＸ含有画分から当該ＦＩＸ活性化因子（ＭＡＳＰ、特にＭＡＳＰ−１）を除去することを特徴とするＦＩＸの精製方法に関するものである。本発明により、高純度に精製されたＦＩＸ調製物中になお微量に混在するＦＩＸａが可能な限り低減された、さらに安全性の高いＦＩＸ製剤を提供することが可能となる。【００１３】  また、本発明は、本発明による精製方法によって得られた、ＦＩＸ１国際単位当たりのＭＡＳＰ−１含有量が０．１ｎｇ以下のＦＩＸ精製画分に関する。【００１４】  また、本発明は、ＦＩＸに対するＦＩＸａの含有率が０．１％以下のＦＩＸ製剤に関する。当該ＦＩＸ製剤は、さらにＦＩＸ１国際単位当たりのＭＡＳＰ−１含有量が０．１ｎｇ以下である。
【発明の効果】
【００１５】  本発明により、血友病Ｂ患者に対する補充療法剤として汎用されているＦＩＸ製剤に関して、微量に存在するＦＩＸａが従来の製剤よりも有意に低減し、血栓誘発の危険性の少ないより安全性の高い製剤を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  当該ＦＩＸ活性化因子の除去方法としては、「ＭＡＳＰ−１に対するモノクローナル抗体を固定化したゲルを用いてＦＩＸ画分からＭＡＳＰ−１を除去する方法」、「セファロース担体のカラムを通すことでＦＩＸ画分からＭＡＳＰ−１を吸着除去する方法」、および「陰イオン交換ゲル、疎水ゲル、キレートゲル、ベンズアミジン固定化ゲルを用いたクロマトグラフィーによりＦＩＸ画分からＭＡＳＰ−１を除去する方法」などがあるが、疎水クロマトグラフィーを実施する方法は特に好ましい態様である。【００１７】  本発明によりＭＡＳＰ−１を除去するには疎水クロマトグラフィーを利用するのが好ましい。その場合、イムノアフィニティーあるいはヘパリン様物質をリガンドとした担体で精製した高純度ＦＩＸの高食塩濃度溶液を疎水担体に展開してＦＩＸを吸着させ、ＭＡＳＰ−１を素通りさせる。ＦＩＸは低食塩濃度の緩衝液で特異的に溶出される。吸着の際の食塩濃度は１Ｍ以上が好ましく、溶出時は１Ｍ以下が好ましい。【００１８】  本発明の疎水クロマトグラフィーに用いる担体のリガンドは、ブチル基、フェニル基あるいはオクチル基が好ましく、担体はトヨパール（製品名：東ソー（株））をはじめ種々のものを選択可能である。【００１９】  また、本発明の疎水クロマトグラフィーでの温度は１℃〜３０℃が好ましく、ｐＨは５〜８が好ましい。【００２０】  このようにしてＦＩＸ精製画分に混入したＭＡＳＰ−１を有効に除去することで、ＦＩＸ精製画分に微量に混在するＦＩＸａを可能な限り低減させ、血栓誘発の危険性をさらに低下した安全性の高いＦＩＸ製剤を提供することができる。【００２１】  以下、本発明の実施例を血液凝固ＩＸ因子（ＦＩＸ）の調製例とともに示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】《１．血液凝固ＩＸ因子（ＦＩＸ）の調製》
ヒト血漿３０００ｍｌからクリオ沈殿を除去したクリオ上清を、２０ｍＭクエン酸緩衝液で平衡化した陰イオン交換体（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）１００ｍｌに通液し、吸着画分を０．５Ｍの食塩を含むクエン酸緩衝液で溶出し、ＦＩＸ含有画分を得た。【００２３】  得られたＦＩＸ画分に、終濃度５０ｍＭになるようにカルシウムを添加し、カルシウム依存性の抗ＦＩＸモノクローナル抗体をリガンドとした担体（１００ｍｌ）に通液しＦＩＸを担体に吸着させた。担体を洗浄し、２０ｍＭのＥＤＴＡ含有緩衝液でＦＩＸを溶出し、高純度化したＦＩＸを得た。【００２４】《２．疎水クロマトグラフィーによるＭＡＳＰ−１の除去およびＦＩＸの調製》
上記により調製されたＦＩＸ溶液に終濃度１．５Ｍになるように食塩を添加し、クロマトグラフィーアプライサンプルを調製した。次に、２５℃にて、そのサンプルを、ヒスチジン緩衝液（ｐＨ６）で平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（製品名：東ソー（株））２０ｍｌに通液しＦＩＸを吸着させた。１．１Ｍ食塩含有緩衝液で洗浄後、０．５Ｍ食塩含有緩衝液でＦＩＸを溶出した。疎水クロマトグラフィー精製後のＦＩＸは、森河らの方法（森河亘ら，基礎と臨床，２４巻，１０号，１９９０年，７１３−７１７頁）に準じて、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによりさらに高純度に精製された。得られたＦＩＸ画分におけるＭＡＳＰ−１含量およびＦＩＸａ含量を、疎水クロマトグラフィーを実施しない従来法により得られるＦＩＸ画分の成績と比較したものを、表１に示した。疎水クロマトグラフィーを導入することにより、ＦＩＸ１国際単位当たりのＭＡＳＰ−１含量は０．１ｎｇ以下まで低下し、それに伴いＦＩＸに対するＦＩＸａの含有率も０．１％以下まで低下した。【００２５】
【表１】
0004855074.tif 000002