(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液接触材料にデキストラン硫酸およびトリプトファンを固定化し、デキストラン硫酸の固定化量を表面積１ｍ2当たり６．４ｎｍｏｌ以上９６．２ｎｍｏｌ以下とし、かつ、トリプトファンの固定化量とデキストラン硫酸の固定化量とのモル比を１以上７０以下とすることにより、顆粒球活性化を抑制することを特徴とする血液接触材料の改質方法。
【請求項２】
デキストラン硫酸の固定化量が表面積１ｍ2当たり７．７ｎｍｏｌ以上６６．１ｎｍｏｌ以下で、かつトリプトファンの固定化量とデキストラン硫酸の固定化量とのモル比が５以上６０以下である請求項１に記載の血液接触材料の改質方法。
【請求項３】
デキストラン硫酸の固定化量が表面積１ｍ2当たり８．１ｎｍｏｌで、かつトリプトファンの固定化量とデキストラン硫酸の固定化量とのモル比が５６．６である請求項１に記載の血液接触材料の改質方法。
【請求項４】
血液接触材料がヒドロキシル基を有する高分子化合物よりなる請求項１から３のいずれかに記載の血液接触材料の改質方法。
【請求項５】
血液接触材料がセルロースよりなる請求項１から３のいずれかに記載の血液接触材料の改質方法。
【請求項６】
デキストラン硫酸およびトリプトファンを固定化してなる顆粒球活性化が抑制された血液接触材料であって、デキストラン硫酸の固定化量が表面積１ｍ2当たり６．４ｎｍｏｌ以上９６．２ｎｍｏｌ以下、かつトリプトファンの固定化量とデキストラン硫酸の固定化量とのモル比が１以上７０以下である血液接触材料。
【請求項７】
デキストラン硫酸およびトリプトファンを固定化してなる顆粒球活性化が抑制された血液接触材料であって、デキストラン硫酸の固定化量が表面積１ｍ2当たり７．７ｎｍｏｌ以上６６．１ｎｍｏｌ以下、かつトリプトファンの固定化量とデキストラン硫酸の固定化量とのモル比が５以上６０以下である請求項６記載の血液接触材料。
【請求項８】
デキストラン硫酸およびトリプトファンを固定化してなる顆粒球活性化が抑制された血液接触材料であって、デキストラン硫酸の固定化量が表面積１ｍ2当たり８．１ｎｍｏｌ、かつトリプトファンの固定化量とデキストラン硫酸の固定化量とのモル比が５６．６である請求項６に記載の血液接触材料。
【請求項９】
血液接触材料がヒドロキシル基を有する高分子化合物よりなる請求項６から８のいずれかに記載の血液接触材料。
【請求項１０】
血液接触材料がセルロースよりなる請求項６から８のいずれかに記載の血液接触材料。
【請求項１１】
請求項６から１０のいずれかに記載の血液接触材料を用いた血液接触回路。
【請求項１２】
請求項６から１０のいずれかに記載の血液接触材料を用いた体内留置器具。
【請求項１３】
請求項６から１０のいずれかに記載の血液接触材料を用いた血液浄化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において血液と接触する部位に使用される材料について、その材料の有する顆粒球活性化作用を抑制する表面改質方法及び顆粒球活性化が抑制された血液接触材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
顆粒球は異物認識に伴い付着性が増加し、活性酸素を放出すると共に、アズール顆粒中に含まれる各種酵素を放出する。顆粒球エラスターゼおよびミエロパーオキシダーゼは、アズール顆粒に貯蔵されている中性プロテアーゼであり、一般に顆粒球活性化の指標としてこれらの濃度が測定されている。これまでの研究から、顆粒球エラスターゼおよびミエロパーオキシダーゼの濃度上昇は、補体活性化とは別の機序によるものであると推測されている（非特許文献１）。【０００３】
顆粒球活性化の臨床的影響としては、産生された活性酸素により、ＬＤＬなどの脂質の酸化（酸化ＬＤＬ）を介して動脈硬化などの血管障害の原因となる可能性（非特許文献２）や、赤血球膜脂質の過酸化による赤血球膜の脆弱化が貧血の一因となっている可能性（非特許文献３）が指摘されている。【０００４】
近年、血液浄化の分野における血液透析、循環器外科分野での血管へのステント留置に代表される人工物と血液の接触が発生する医療において、白血球の大部分を占める顆粒球による接触材料に対する異物認識が問題となっている。【０００５】
従って、血液接触材料が有する顆粒球活性化作用を低減しうる血液接触材料の改質方法の開発が望まれていた。
【非特許文献１】ジェイ・ベーラー（Ｊ．Ｂｏｅｈｌｅｒ）ら、ネフロロジー・ダイアリシス・トランスプランテーション（Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）第８巻、１３５９〜１３６５頁、１９９３年
【非特許文献２】樋口ら、人工臓器  ２６巻４号：８３５〜８３９頁、１９９７年
【非特許文献３】エス・エス・シュミットマン（Ｓ．Ｓ．Ｓｃｈｍｉｄｔｍａｎｎ）ら、ネフロロジー・ダイアリシス・トランスプランテーション（Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）第５巻、６００〜６０３頁、１９９０年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、血液接触材料が有する顆粒球活性化作用を低減しうる血液接触材料の改質方法、該方法により改質された血液接触材料、および該改質血液接触材料が使用された血液接触回路、体内留置器具、血液浄化装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、血液接触材料が有する顆粒球活性化作用を抑制しうる血液接触材料の改質方法につき鋭意検討した。その結果、血液接触材料にポリアニオン性化合物を材料表面積１ｍ2当たり６．４ｎｍｏｌ以上９６．２ｎｍｏｌ以下で、かつトリプトファン誘導体をポリアニオン性化合物固定化量とのモル比が１以上７０以下で固定化することにより、血液を接触させたときの顆粒球活性化作用が元の血液接触材料よりも大幅に低減することを発見し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明は、血液接触材料にポリアニオン性化合物を表面積１ｍ2当たり６．４ｎｍｏｌ以上９６．２ｎｍｏｌ以下で、かつトリプトファン誘導体をポリアニオン性化合物固定化量とのモル比が１以上７０以下で固定化する血液接触材料の改質方法であって、該改質により血液を接触させたときの顆粒球活性化作用が元の血液接触材料よりも大幅に低減することを特徴とする血液接触材料の改質方法に関する。【０００９】
また本発明は、該方法により改質された改質血液接触材料に関する。【００１０】
また本発明は、該改質血液接触材料が血液接触部に使用された血液接触回路、体内留置器具、血液浄化装置に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の血液接触材料の改質方法により、血液接触材料が有する顆粒球活性化作用を劇的に低減することが可能であり、より安全性の高い医療器具の作製が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の血液接触材料の改質方法は、ポリアニオン性化合物を表面積１ｍ2当たり６．４ｎｍｏｌ以上９６．２ｎｍｏｌ以下で、かつトリプトファン誘導体をポリアニオン性化合物固定化量とのモル比が１以上７０以下で固定化してなる。【００１３】
本発明におけるポリアニオン性化合物とは、分子内に複数のアニオン性官能基を有する化合物をいう。本発明におけるアニオン性官能基とは、カルボキシル基、スルホン酸基、硫酸エステル基、リン酸エステル基など、ｐＨが中性で負に帯電する官能基をいう。【００１４】
このようなポリアニオン性化合物の代表例としては、ポリアクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、スチレン−マレイン酸共重合体などの合成ポリアニオン性化合物、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロースなどの合成酸性多糖類、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケタラン硫酸などの硫酸エステル基を有する生体由来の酸性ムコ多糖類、ヘパリン、ヘパラン硫酸などのＮ−スルホン酸基および硫酸エステル基を有する酸性ムコ多糖類、コンドロイチン、ホスホマンナンなどの生体由来のアニオン性官能基を有する多糖類、ならびにデオキシリボ核酸、リボ核酸などの生体由来の核酸などがあげられるが、これらの代表例に限定されるわけではない。【００１５】
これらに代表される化合物のなかでも、安価に純度の高い物質が得られる、さらにはアニオン性官能基の導入量をコントロール出来る等の理由から、生体由来の化合物をそのまま用いるよりも、合成化合物を用いる方がより実用的である。これらの点より、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、スチレン−マレイン酸共重合体などの合成ポリアニオン性化合物や、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロースなどの合成酸性多糖類が好ましく用いられる。中でも安価であるという点から、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、デキストラン硫酸が好ましく、安全性の点からデキストラン硫酸が特に好ましい。また、ポリアニオン性化合物の分子量の上限はとくに制限はないが、実用上の面から１００万以下が好ましい。【００１６】
本発明において、血液接触材料にポリアニオン性化合物を固定化する方法は種々あり、いかなる方法でもよいが、代表的な方法としては、（１）ポリアニオン性化合物を、放射線や電子線を用いたグラフト法によって表面に共有結合する方法、（２）官能基を介して化学的方法によりポリアニオン性化合物を共有結合する方法などがある。なおこれらの固定化方法は材料の形状によらず、用いることが出来る。【００１７】
このなかでも、本発明の血液接触材料がポリアニオン性化合物とトリプトファン誘導体とを固定化してなる材料であることを考慮し、官能基を介して化学的にポリアニオン性化合物を共有結合させる方法が、トリプトファン誘導体の固定化と同じ方法で行えるため、本発明においてはより簡便で好ましい方法といえる。【００１８】
本発明におけるトリプトファン誘導体とは、トリプトファン、トリプトファンエチルエステル、トリプトファンメチルエステルなどのトリプトファンエステル類、トリプタミン、トリプトファノールなどのインドール環を有するトリプトファンと類似した構造を有する化合物をいう。またこれらのトリプトファン誘導体はＬ体、Ｄ体、ＤＬ体、またこれらの混合物のいずれであってもよい。さらに２種類以上のトリプトファン誘導体の混合物であってもよい。これらのトリプトファン誘導体のなかでも、トリプトファンが安全上好ましく、その中でもＬ−トリプトファンが天然型のアミノ酸であること、その安全性に関するデータが豊富であること、安価で入手しやすいことから、実用上好ましく用いられる。【００１９】
本発明におけるトリプトファン誘導体の固定化方法としては、血液接触材料の官能基を介して化学的方法によりトリプトファン誘導体を共有結合する方法が好ましく用いられる。【００２０】
本発明におけるポリアニオン性化合物の固定化量は表面積１ｍ2当たり６．４ｎｍｏｌ以上９６．２ｎｍｏｌ以下であり、かつトリプトファン誘導体固定化量とポリアニオン性化合物固定化量とのモル比が１以上７０以下であることが必要である。【００２１】
本発明におけるトリプトファン誘導体固定化量とポリアニオン性化合物固定化量モル比（ＴＲ／ＰＡ比）とは、下式により算出される値をいう。【００２２】
ＴＲ／ＰＡ比＝材料表面積１ｍ2当たりのトリプトファン誘導体固定化モル数／材料表面積１ｍ2当たりのポリアニオン固定化モル数
本発明者らは、ポリアニオン性化合物の固定化量、並びにトリプトファン誘導体の固定化量と、血液接触時の顆粒球活性化の程度につき鋭意検討した結果、驚くべきことに、ポリアニオン性化合物の固定化量を表面積１ｍ2当たり６．４ｎｍｏｌ以上９６．２ｎｍｏｌ以下とし、かつＴＲ／ＰＡ比を１以上７０以下に制御することにより、血中の顆粒球活性化の低減効果があることを見いだした。【００２３】
本発明において、ポリアニオン性化合物の固定化量は、表面積１ｍ2当たり６．４ｎｍｏｌ以上９６．２ｎｍｏｌ以下である。この固定化量を６．４ｎｍｏｌより少なくした場合、白血球および血小板の付着性が材料との接触により上昇し、血液中の白血球および血小板数が減少する。また、９６．２ｎｍｏｌ以下より多くすると、ポリアニオンの陰性荷電による血中物質の吸着が顕著になる。これらの２点から好ましくは７．７ｎｍｏｌ以上６６．１ｎｍｏｌ以下であり、最も好ましくは９．６ｎｍｏｌ以上３２．１ｎｍｏｌ以下である。【００２４】
また、本発明において、トリプトファン誘導体固定化量とポリアニオン性化合物固定化量とのモル比（ＴＲ／ＰＡ比）は１以上７０以下であり、ＴＲ／ＰＡ比この範囲から逸脱すると、血小板の付着性が増加する。この点から好ましくは５以上６０以下であり、最も好ましくは１０以上５０以下である。【００２５】
本発明における血液接触材料の表面積測定法としては、積分により数学的に算出する方法、ＢＥＴ法に代表される材料表面への気体吸着量測定を利用した方法などがあるが、多孔質の表面積を図る際には後者の手法がより簡便である。気体吸着量測定を利用して表面積を測定する場合、サンプルに乾燥処理を施す必要があるが、この際、材料の構造を破壊しない凍結乾燥の様な処理方法をとることが望ましい。【００２６】
本発明におけるポリアニオン性化合物の固定化量の測定方法としては、ポリアニオン性化合物に含まれる元素の血液接触材料中の含有量を定量する方法（例えばデキストラン硫酸の場合、血液接触材料の硫黄含有量を定量する）、ポリアニオン性化合物と結合する性質を有する色素溶液と血液接触材料を接触させ、溶液中の色素の減少量から測定する方法などがあるが、その中でも色素溶液を用いる方法は簡便でしかも正確にポリアニオン性化合物の固定化量を測定することができる。具体的には実施例１においてその方法を示す通り、ポリアニオン性化合物がデキストラン硫酸やポリアクリル酸などのばあいには、該化合物がトルイジンブルーと結合する性質を有していることを利用し、トルイジンブルー溶液と血液接触材料を接触させた時のトルイジンブルーの吸着量からその固定化量を非常に簡便に測定することができる。【００２７】
本発明におけるトリプトファン誘導体の固定化量は、強酸性条件下でｐ−ジメチルベンズアルデヒドなどのアルデヒドをトリプトファン誘導体の分子内に存在するインドール環に縮合させるときに発色する性質を利用して定量することができる（山田浩一編、アミノ酸発酵（下）各論、４３〜４５頁、共立出版、１９７２年）。また、トリプトファン誘導体の分子内に存在するインドール環が２８０ｎｍ付近の光で励起させたときに３５０ｎｍ付近に極大を有する蛍光を発する性質を利用して定量する方法や、材料自身が窒素を含有しない化合物である場合は、実施例１において具体的方法を示す通り、血液接触材料中の窒素含有量の定量により測定することもできる。【００２８】
本発明における血液接触材料の改質方法は、血液の接触する医療器具であれば、特に制限無く適用可能である。このような医療器具の例としては、血液接触回路、体内留置器具、血液保存容器、血管内治療器具、血液浄化装置等が挙げられる。【００２９】
本発明の血液接触材料は、常温常圧で固体であり水不溶性である。血液接触材料の形状としては、板状、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等いずれも有効に用いられ、特に制限はない。【００３０】
本発明における血液接触材料は、その形状によらず、ポリアニオン性化合物、およびトリプトファン誘導体を固定化するために、結合に利用し得る官能基を有することが好ましい。このような官能基の代表例としては、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、酸無水物基、スクシンイミド基、ヒドロキシル基、チオール基、アルデヒド基、ハロゲン基、エポキシ基、シラノール基、トレシル基などがあげられるが、これらに限定されるわけではない。また、これらの官能基は、たとえばハロゲン化シアン化法、エピクロロヒドリン法、ビスエポキシド法、ブロモアセチルブロミド法などの方法で活性化されていてもよく、このなかで実用上、安全上の観点から、エピクロロヒドリン法が特に好ましく用いられる。【００３１】
本発明における血液接触材料の材質は特に限定されないが、セルロース、酢酸セルロース、デキストリン等の多糖類からなる有機材料、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコール等の合成高分子などが代表例として挙げられる。これらは、ヒドロキシエチルメタクリレート等のヒドロキシル基を有する高分子材料や、ポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と他の重合性単量体との共重合のようなグラフト共重合体等のコーティング層を有していてもよい。これらの中でセルロースや、ポリビニルアルコール等からなる合成高分子が、材料表面に活性基を導入しやすいため、実用上好ましく用いられる。【００３２】
本発明における顆粒球エラスターゼは、好中球エラスターゼと呼ばれることもあり、両者は同一の物質を指すものである。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例にもとづいて本発明の血液接触材料の改質方法をさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。【００３４】
（実施例１）
平均粒径約４５０μｍのセルロースビーズ１００ｍL（湿潤時の沈降体積）に水２２ｍｌ、４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液３４ｍｌおよびエピクロロヒドリン３３ｍｌを加え、４０℃で２時間攪拌して反応させた。反応後ビーズを水で十分洗浄してエポキシ化セルロースビーズを得た。【００３５】
デキストラン硫酸（硫黄含量約１８％、分子量約４０００）９．３ｇを３６ｍｌの水に溶解したデキストラン硫酸水溶液を調製し、水に湿潤した状態のエポキシ化セルロースビーズを表面積にして７８０ｍ2（沈降体積５０ｍＬ）加え、ＮａＯＨ水溶液でアルカリ性とした後、４５℃で７時間反応させた。反応後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄した後、Ｌ−トリプトファン０．７８ｇを希ＮａＯＨ水４０ｍｌに溶解させた液を加え、５０℃で８時間反応させた。その後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄して、改質セルロースビーズを得た。得られた改質セルロースビーズを内径１０ｍｍ、長さ１５０ｍｍのポリプロピレンチューブに沈降体積として０．５ｍｌ軽量し、生理食塩液で湿潤させた後、これに健常人血液３ｍｌを添加し、３７℃で３０分バッチ接触させた。改質セルロースビーズへの接触前後の顆粒球エラスターゼ濃度を顆粒球エラスターゼ測定キット（メルク社）により測定した。また対照として、ビーズＡ、Ｂの代わりに生理食塩液のみを０．５ｍＬ添加し３０分後の顆粒球エラスターゼ濃度を測定した。その結果、セルロースビーズ接触前の顆粒球エラスターゼ濃度は５５μｇ／Ｌであり、接触後顆粒球エラスターゼ濃度は、９０（μｇ／Ｌ）であった。生理食塩液のみの場合の濃度は、８２（μｇ／Ｌ）であった（表１）。【００３６】
なお、改質セルロースビーズの表面積はＢＥＴ多点法により計測した。すなわち改質セルロースビーズをエタノールにより脱水し、ｔ−ブタノール中で凍結乾燥処理を施した後、単位重量あたりの面積（比表面積）をＡＳＡＰ−２４００（ＭＩＣＲＯＭＥＲＩＴＩＣＳ社製）により計測した。
また、トリプトファン固定化量は、改質セルロースビーズの窒素含有量から求めた。すなわち１ｍｌの改質セルロースビーズを水で充分洗浄した後、６０℃で６時間以上減圧乾燥した後、微量全窒素分析装置により定量した。その結果、改質セルロースビーズのトリプトファン固定化量は４３５．０ｎｍｏｌ／ｍ2であった。【００３７】
また、デキストラン硫酸固定化量は、デキストラン硫酸とトルイジンブルーが親和性を有することを利用して測定した。すなわち改質セルロースビーズ３ｍｌに対し、約９０ｍｇ／ｌに調整したトルイジンブルー（ベーシック・ブルー１７（東京化成））水溶液を１００ｍｌ程度加え、１０分間攪拌、静置後、上清のトルイジンブルーを６３０ｎｍにおける吸光度により定量し、その減少量から求めた。その結果、Ｂのデキストラン硫酸固定化量は８．１ｎｍｏｌ／ｍ2であり、ＴＲ／ＰＡ比は５６．６であった。【００３８】
なお、ここでの湿潤状態のセルロースビーズの体積は以下のように求める。すなわち、セルロースビーズは水に浸漬したスラリーとしてメスシリンダーなどの計量容器に移しとり、計量容器内のスラリー状のセルロースビーズを自然に沈降させる。この後、計量容器が割れないようゴム製のマットなどを敷き、その上に計量容器を５〜１０ｃｍ程度の高さから鉛直方向に５回ないし１０回程度軽く（一度沈降したセルロースビーズが極度に舞い上がらない程度に）叩きつけることにより振動を加える。１５分以上静置した後、セルロースビーズの沈降体積を読みとる。この振動、静置の操作を繰り返し、セルロースビーズの沈降体積が変化しなくなった段階の湿潤状態のセルロースビーズの沈降体積とする。【００３９】
（比較例１）
実施例１の改質前セルロースビーズを実施例１のポリプロピレンチューブに０．５ｍｌ計量し、生理食塩液で膨潤させた後、これに実施例１と同一の健常人血液３ｍｌを添加し、３７℃で３０ｍｉｎバッチ接触させ、バッチ接触前後の顆粒球エラスターゼ濃度を測定した。その結果、接触後の顆粒球エラスターゼ濃度は１３４（μｇ／Ｌ）となった。【００４０】
【表１】
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【００４１】
表１の結果から、血液接触前後において、比較例１のセルロースビーズでは顆粒球活性化の指標である顆粒球エラスターゼ濃度が接触前に比べ著しく上昇した。すなわち、セルロースビーズ接触前後で比較例１において、顆粒球エラスターゼ濃度は上昇しており、生理食塩液のみを加えた場合（対照）の顆粒球エラスターゼ濃度上昇を考慮に入れても、増加率は６３．４％であった。一方、実施例１のデキストラン硫酸およびトリプトファンを固定化した改質セルロースビーズの場合、増加率は９．８％であり、顆粒球エラスターゼの濃度上昇が著しく低減しており、顆粒球活性化が抑制されたことが判る。