(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚鱗および／もしくは魚骨を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンをバチルス（Bacillus）属由来の細菌アルカリ性分解酵素を用いて加水分解して得られるペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤。
【請求項２】
ペプチドが、魚鱗および／もしくは魚骨（以下、これらを総称して魚鱗類という）を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンとして、魚肉、その他の夾雑物の含有量が魚鱗類乾燥物重量当たり１重量％以下の魚鱗類から得られたコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである請求項１記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項３】
ペプチドが、鰯の魚鱗および／もしくは魚骨を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである請求項１もしくは２のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項４】
ペプチドが、真鰯もしくは片口鰯の魚鱗および／もしくは魚骨を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである請求項１〜３のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項５】
脱カルシウム処理が酸を用いた脱カルシウム処理である請求項１〜４のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項６】
酸が塩酸もしくは酢酸である請求項５記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項７】
糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する請求項１〜６のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項８】
ペプチドの分子量が、２００〜２００００である、請求項１〜６のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤に関する。さらに詳しくは、魚鱗および／もしくは魚骨（以下、これらを総称して魚鱗類ということがある）から得られたコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤特に糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、コラーゲン、ケラチン等の蛋白質やホエー蛋白質等を加水分解して得たペプチドは、血圧降下作用が発現されることが知られている。また、抗酸化作用といった生理活性作用も期待されている。血糖値上昇抑制作用を有する成分として、難消化性デキストリンや小麦アルブミンが良く知られている。その他、多くの植物、海藻およびその成分が、血糖値上昇抑制作用等抗糖尿病作用を有することが知られている。
【０００３】
特開平１−９８４４５号公報には、魚肉を蛋白分解酵素により分解して得られる、分子量５００〜５，０００の塩基性ペプチドを含有する経口摂食組成物が開示され、該組成物は糖尿病、高脂血症、肥満等の予防のための健康食品等として用いられることが記載されている。さらに、特開平２−１５４６９３号公報には、魚介類を、自己消化処理と蛋白分解酵素処理を同時に行って得られる分子量が５００〜６，０００の機能性ペプチドおよび該ペプチドを有効成分とする高脂血症の治療および予防の組成物、糖尿病の治療および予防の組成物、血圧降下及び血管拡張の組成物、肥満症、動脈硬化症の治療及び予防の組成物が開示されている。
しかしながら、これらの公報に記載されたものはその血糖値上昇抑制作用の効果が小さいものであり、魚骨や魚鱗由来のペプチドについてはなんら記載されていない。
【０００４】
また、特開平５−１２５１００号公報には魚鱗をそのままもしくは脱カルシウム処理したものを酸性水溶液中でペプシン処理してコラーゲンを抽出する方法が開示されている。また、特公昭５８−４９１５０号公報には魚鱗を水蒸気雰囲気下に加熱加圧して蒸製した後に粉末化した魚鱗がペプシン消化率の高い事が示されている。
【０００５】
酸を用いない脱カルシウム処理としては、特開平５−９３０００号公報に、魚鱗の脱カルシウム処理をエチレンジアミン四酢酸塩を用いて行い、酸可溶性コラーゲンを抽出する方法が示されている、しかしながら、この方法では、多大の時間と高価な薬品を用いる事から経済上大きな問題がある。
また、これら公報には、魚鱗からコラ−ゲンが得られる事は開示されているが、このコラ−ゲンを加水分解してペプチドを得ることも、得られたペプチドが、高脂血症改善作用や優れた血糖値上昇抑制効果を有することについてもなんら記載されていない。
【０００６】
魚鱗類中のコラーゲンはカルシウムアパタイトで取り囲まれているために、該魚鱗類に直接プロテア−ゼ等の蛋白分解酵素を作用させても抽出や加水分解は起こらないか、起こるとしてもその分解率が非常に低く経済性の点で問題である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、血糖値上昇抑制効果に優れた血糖値上昇抑制剤を得るべく鋭意研究した。その結果、魚鱗類を用いて得られるコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解することによって得られるペプチドを有効成分とすると血糖値上昇抑制効果に優れ、かつ、糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤が得られることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成した。以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、魚鱗類を用いて得られるコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解することによって得られるペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制作用に優れ、かつ、糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖上昇抑制剤を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下から構成される。
（１）魚鱗類を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤。
【０００９】
（２）ペプチドが、魚鱗類を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンとして、魚肉、その他の夾雑物の含有量が魚鱗類乾燥物重量当たり１重量％以下の魚鱗類から得られたコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである前記第１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【００１０】
（３）ペプチドが、鰯の魚鱗類を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである前記第１項もしくは第２項のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【００１１】
（４）ペプチドが、真鰯もしくは片口鰯の魚鱗類を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである前記第１項〜第３項のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【００１２】
（５）脱カルシウム処理が酸を用いた脱カルシウム処理である前記第１項〜第４項のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【００１３】
（６）酸が塩酸もしくは酢酸である前記第５項記載の血糖値上昇抑制剤。
【００１４】
（７）加水分解が蛋白分解酵素を用いた加水分解である前記第１項〜第４項のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【００１５】
（８）蛋白分解酵素がバチルス（Bacillus）属由来の細菌アルカリ性分解酵素である前記第７項記載の血糖値上昇抑制剤。
【００１６】
（９）ペプチドが水溶性ペプチドである前記第１項〜第８項のいずれか１項記載の血糖値上昇抑制剤。
【００１７】
（１０）魚鱗類を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られ、ペプチドを有効成分とする糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００１８】
（１１）ペプチドが、魚鱗類を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンとして、魚肉、その他の夾雑物の含有量が魚鱗類乾燥物重量当たり１重量％以下の魚鱗類から得られたコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである前記第１０項記載の糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００１９】
（１２）ペプチドが、鰯の魚鱗類を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである前記第１０項もしくは第１１項のいずれか１項記載の糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００２０】
（１３）ペプチドが、真鰯もしくは片口鰯の魚鱗類を脱カルシウム処理して得たコラ−ゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである前記第１０項〜第１２項のいずれか１項記載の糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００２１】
（１４）ペプチドが、片口鰯の魚鱗を脱カルシウム処理して得たコラーゲンもしくはゼラチンを加水分解して得られるペプチドである前記第１０項〜第１３項のいれか１項記載の糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００２２】
（１５）脱カルシウム処理が酸を用いた脱カルシウム処理である前記第１０項〜第１４項のいずれか１項記載の糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００２３】
（１６）酸が塩酸もしくは酢酸である前記第１５項記載の糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００２４】
（１７）加水分解が蛋白分解酵素を用いた加水分解である前記第１０項〜第１４項記載の糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００２５】
（１８）蛋白分解酵素がバチルス（Bacillus）属由来の細菌アルカリ性分解酵素である前記第１７項記載の糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００２６】
（１９）ペプチドが水溶性ペプチドである前記第１０項〜第１４項のいずれか１項記載の糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有する血糖値上昇抑制剤。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の魚鱗類を得る魚種としては、特に限定されず、水産加工場の選別ラインよりロータリースクリーン等で現在も回収されている鰯類、秋刀魚や水産加工場にて切り身加工の際にジェット水流にて鱗を剥ぐ真鯛等を例示することができ、この他にも鮭類、ニシン、鯉等の鱗や骨およびその他の魚種の鱗もしくは骨も使用することが可能である。本発明のペプチドを得るための原料である魚鱗類はその鮮度及び純度ができるだけ高いものが好ましい。青魚である秋刀魚や鰯類の水産加工場より回収された鱗中には鮮度が落ちた魚体や魚肉、巻き網漁で混在したシラスや稚魚、鰭、海藻、その他の夾雑物が多く、回収後直ちに、これらの夾雑物を水洗等により除かないと、魚肉の自己消化や鱗表面のヌルにより発生した有臭物質付着や着色が鱗に生じて、かかる原料を用いて製造したペプチドはその品質を損なうことになる。かかる魚肉やシラス、稚魚、鰭、海藻等の夾雑物の含有量としては、できるだけ少ないことが好ましく、魚鱗類乾燥物重量当たり１重量％以下、より好ましくは、０．１重量％以下であることが好ましい。
【００２８】
本発明で用いるコラーゲンもしくはゼラチンは、魚鱗類を脱カルシウム処理して得られるコラ−ゲンもしくはゼラチンである。
【００２９】
本発明の魚鱗類の脱カルシウム処理は、特に限定されず、公知の処理方法をそのまま使用することができるが、酸を用いた処理にあっては、カルシウムと反応して塩を生成する酸や蛋白質を変成させる酸は好ましくなく、これら好ましくない酸の例としては、具体的には硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸等を挙げることができる。本発明で好ましい酸の種類は塩酸と酢酸であり、該酸の濃度は処理温度によっても変動するが、一般的に０．１規定〜１０規定程度の濃度が好ましい。また、処理温度は脱カルシウム反応が起こる温度であれば特に限定されないが、通常は０〜８０℃、好ましくは４〜４０℃程度の温度である。処理時間も処理温度により若干変動するがおおよそ１５分〜３日程度である。該処理は撹拌下に行うことが好ましい。
【００３０】
本発明でコラ−ゲンもしくはゼラチンの加水分解に好ましく用いられる蛋白分解酵素の種類は、食品に使用できるものであり、高分解率で多量製造され比較的安く入手可能で、アミノ酸生成が殆どないものが好ましい。これらの諸条件を満足させる為の分解条件としては、コラーゲンがゼラチン化する４０℃以上の温度と分解が容易なｐＨ６．５〜１２で使用できる酵素が加水分解率を高くすることができるので好ましい。しかしながら、その他の条件にて使用する蛋白分解酵素や２種以上の分解酵素を混合して使用することもできる。特に、該蛋白分解酵素として、バチルス（Bacillus）属由来の細菌アルカリ性プロテアーゼが好ましい。かかる蛋白分解酵素としては市販品を使用することができ、該市販品としては、例えばノボノルディスクバイオインダストリー（株）製「アルカラーゼ（商標）」、長瀬産業（株）製「ビオプラーゼ（商標）ＳＰ−１５ＦＧ」及び天野製薬（株）製「プロレザー（商標）ＦＧ−Ｆ」等を挙げることができる。
【００３１】
加水分解溶液中のペプチドは混合物であり、分子量は２００〜数万に分布している。未加水分解物がある場合には、減圧ろ過等の手段を用いて該未加水分解物を除去する。透明なろ過液を分画分子量２万程度の限外ろ過膜に通して、高分子量のペプチドを除去する。ここで用いることができる限外ろ過膜の材質は、フッ素系ポリマ−、ポリスルフォン、ポリエ−テルスルフォン、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデンフロライド等である。ついで、該限外ろ過膜透過液を逆浸透膜に通してアミノ酸モノマ−等の極低分子量物を透過液とともに除く。濃縮の必要性がある場合には、逆浸透膜に通して濃縮する。ここで用いることのできる逆浸透膜の材質は、酢酸セルロ−ス、ポリアクリロニトリルや複合膜である架橋芳香族ポリアミド系樹脂、架橋ポリピペラジンアミド系樹脂、ポリビニルアルコ−ル系樹脂、ポリエ−テルスルフォン系樹脂、ポリエ−テル系樹脂等である。逆浸透膜濃縮液をさらに必要に応じて活性炭や活性白土を用いて脱色や脱臭を行うこともできる。逆浸透膜濃縮液より粉末を得るには真空凍結乾燥が好ましいが、他の低温乾燥法を用いてもよい。
【００３２】
本発明のペプチドは易水溶性であることが血糖値上昇抑制剤として使用する際に好ましい。本発明の血糖値上昇抑制剤は、粉末の形で単離、取得したペプチドを、そのまま、もしくはより好適には適当な無毒性の経口摂取用担体等に添加して適宜の形状、形態からなる組成物として使用される。すなわち、水に溶解して飲料への添加剤の形態での使用や固形食品等の担体に添加する形態で使用してもよく、この他、健康食品への添加剤として他の有用成分と混合したタブレットや粉末としても利用でき、さらには、液状の食品や嗜好品、例えば菓子類、粉末茶、アイスクリ−ム、ヨ−グルト、アルコ−ル飲料、スポ−ツ飲料等への添加剤の形態としてもよい。本発明の血糖値上昇抑制剤中におけるペプチドの含有量は、適宜選択可能であるが、一般には１〜１００重量％の範囲である。
【００３３】
上述したように、本発明の血糖値上昇抑制剤は、少なくとも新鮮な魚類の持つ芳香が弱いながら感じられる程度か、好ましくは無味、無臭、無色であることが望ましく、糖尿病に随伴する高脂血症の改善作用を有し、血糖値上昇抑制作用を効果的に示すものでなければならない。そして、主として飲料や食品、健康食品等の経口摂取組成物への添加剤として用いられるので、無毒性のものでなければならない。本発明の血糖値上昇抑制剤は生活習慣病と言われるインスリン非依存型糖尿病の予防と改善、肥満症に伴う高脂血症の改善を目的とした食品や健康食品への添加剤としても、飲料やタブレットその他の形態で好適に使用できる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３５】
実施例１
（１）．ペプチドの製造
水産加工場の選別ラインの末端に取り付けられたロータリースクリーンから排出された片口鰯の鱗を直ちに数回水洗した後、鱗乾物に対して約５０倍程度の水に分散させ、目視にて夾雑物を徹底して除去した。網目３ｍｍのプラスチック製ざるに鱗を入れ、該ざるをプラスチック製容器に入れ、５０倍量の水を該容器に加える。水中にて鱗をもみ洗いした後、ざるを左右上下にゆすり、ざる目からヌルその他の微小夾雑物を水中へ洗い出した。濁り水を捨て、再度水を張り、この操作を水が濁らなくなるまで約１０回程度繰り返し、洗浄した。洗浄した魚鱗を、乾燥物１００ｇ当たり、０．６規定塩酸１，５００ｍｌの割合の塩酸に投入し、室温下に１昼夜緩攪拌しながら脱カルシウム処理を行った。不溶解分であるコラーゲン成分をろ過して集め、０．３規定塩酸にて２回、水にて１回洗浄した。
【００３６】
水１リットル当たり、上記の脱カルシウムしたコラーゲンを６３ｇ、プロテアーゼ（天野製薬（株）製プロレザー（商標）ＦＧ−Ｆ）を０．９ｇの割合で加え、溶液を苛性ソ−ダにてｐＨを８．０に調整した。ついで６０℃に加温し、溶液のｐＨを８．０に維持しつつ６０分間攪拌混合して加水分解した。
加水分解液をＮｏ．５Ａろ紙にて吸引ろ過して、ろ紙に残る物の重量を測定してコラーゲン分解率を計算した。その結果、コラーゲン分解率は９９．８重量％以上であった。ついで、得られたコラーゲン分解ろ過液を限外ろ過膜（日東電工（株）製ＮＴＵ−２１２０）と逆浸透膜（日東電工（株）製ＮＴＲ−７２５０）を通して濃縮した。限外ろ過膜を透過し、逆浸透膜を不透過の区分を集めて、凍結乾燥機で凍結乾燥して片口鰯由来のペプチド粉末を得た。なお、使用したポンプユニット及び膜セルは、日東電工（株）製メンブレンマスターＲＵＭ−２小型ポンプユニットとメンブレンマスターＣ１０−Ｔ薄層流式平膜テストセルである。なお、逆浸透膜透過液中の窒素量の測定より、アミノ酸を含む成分は全窒素量に対して１重量％前後と極少量であった。また目的成分であるペプチドの収率は７０〜９０重量％であった。得られたペプチドをゲルパ−ミエ−ションクロマトグラフィ−（ＧＰＣ）分析して、分子量分布を求めた。その結果、片口鰯鱗由来ペプチドの数平均分子量は８８０であった。また、比較試料として市販ゼラチン（宮城化学製豚皮ゼラチン）を上記の片口鰯鱗由来コラ−ゲンと同様に酵素分解し、ろ紙ろ過液について限外ろ過膜および逆浸透膜を用いて分離、濃縮し、凍結乾燥して豚皮ゼラチン由来ペプチドを得た。この豚皮ゼラチン由来ペプチドの数平均分子量は１０７０であった。それぞれの分子量分布曲線を図１および図２に示した。
【００３７】
（２）．インスリン様作用試験（脂肪動員試験）
使用試薬：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ，Ｆｒ．Ｖ）、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ＴｙｐｅII）、ＮＥＦＡテストワコー（和光純薬）、ボスミン注（ａｄｒｅｎａｌｉｎｅ、第一製薬）、インスリン(bovine pancreas)ラット副睾丸脂肪組織からの脂肪細胞の調製：Ｒｏｄｂｅｌｌの方法に準じて行った。すなわち、Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（６週齢、１８０〜２００ｇ）の精巣上体（副睾丸）脂肪細胞を摘出し、重量を測定後、細切し、４重量％ＢＳＡ、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（3mg/ml）を含むＨａｎｋｓ'  ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ，ｐＨ７．４）２．５ｍｌ／ｇ ｔｉｓｓｕｅを加え、３７℃で１．５時間インキュベートし、組織を消化した後、２５０μｍのナイロンメッシュにてろ過し、遠心分離（２５℃，５００ｒｐｍ，３０ｓｅｃ）し、脂肪細胞を得た。その脂肪細胞を３７℃に保温したｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ不含ＨＢＳＳ（４重量％ＢＳＡを含む）にて３回遠心洗浄（２５℃，５００ｒｐｍ，３０ｓｅｃ）し、２．５重量％ＢＳＡ含有ＨＢＳＳに４００ｍｇ ｔｉｓｓｕｅ／ｍｌとなるように懸濁し、脂肪細胞懸濁液とした。
（２−１）．脂肪動員試験：脂肪細胞懸濁液（脂肪組織１００ｍｇの相当量）に４重量％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ０．２５ｍｌ、被検体（ＨＢＳＳに溶解）０．２５ｍｌおよびａｄｒｅｎａｌｉｎｅ（最終濃度：１μｇ／ｍｌ）０．２５ｍｌ添加し、３７℃、２時間インキュベートし、脂肪分解反応液中の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）量をＮＥＦＡテストワコーにて測定した。
【００３８】
（２−２）．被検体の調製：実施例１の（１）で調製した片口鰯由来のコラーゲンペプチド凍結乾燥品と豚皮ゼラチン由来ペプチドの凍結乾燥品を被検体とした。
【００３９】
（２−３）結果の統計学的処理：平均値±標準誤差で表し、有意差検定にはＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎの多重比較検定（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）を用いた。
【００４０】
（２−４）結果：表１にラット副睾丸脂肪細胞からのアドレナリンによる脂肪動員の測定結果を示した。脂肪細胞にアドレナリンを添加すると、９．５４±０．４０μＥｑ／ｇ ｔｉｓｓｕｅのＦＦＡが遊離した。そこで各被検体をこの系に共存させると、いずれの被検体にもアドレナリンによる脂肪動員を抑制する作用が認められた。作用強度を２００μｇ／ｍｌ添加時で比較すると、各被検体間に大きな差は見られなかったが、５０μｇ／ｍｌ添加時の効果で比較すると、片口鰯鱗のペプチド添加群の効果が強いことが分かった。
【００４１】
【表１】
ラット副睾丸脂肪細胞からのアドレナリンによる脂肪動員
0004862235.tif 000002
有意差；  印*＝ｐ＜０．０５，印**＝ｐ＜０．０１ｖｓ.対照群
【００４２】
（３）．ＳＴＺ誘発糖尿病ラットによる抗糖尿病作用試験
（３−１）．使用試薬：ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ，Ｓｉｇｍａ）、グルコースＣIIテストワコー（和光純薬）
【００４３】
（３−２）．実験動物：Ｓｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（約２００ｇ）を用いた。飼育環境は恒温恒湿、１２時間明／１２時間暗のサイクルの実験動物飼育室で、市販の固形飼料（日本農産（株）製ラボＭＲストック）を用い、自由に水を摂取させ、購入後、実験に供するまで１週間予備飼育し、健常なラットを用いた。
【００４４】
（３−３）．被検体の調製：実施例１の（１）で調製した片口鰯由来のコラーゲンペプチド凍結乾燥品および豚皮ゼラチン由来ペプチドの凍結乾燥品を被検体とした。
【００４５】
（３−４）．ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病モデルラット試験：１８時間絶食したＳｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（７週齢、１７０〜１９０ｇ）にＳＴＺ（ｐＨ４．５クエン酸緩衝液に溶解）を５０ｍｇ／Ｋｇの用量で静脈内投与し、２日後に尾静脈採血し、各群の血糖値の平均値がほぼ同等になる様に再群構成し、被検体の経口投与を開始し、１日１回３０日間、連日経口投与した。体重は３日おきに測定した。また、前日より１８時間絶食したラットから、投与１０日ごとに尾静脈から採血し、血漿分離後、空腹時の血糖値をグルコースＣIIテストワコーを用いて測定し、血糖値の変動をを観測した。さらに、最終投与の１時間後に、ペントバルビタール（４４．２ｍｇ／Ｋｇ，ｉ．ｐ．）麻酔下で腹部大動脈から採血し、血漿分離後、血糖値を測定した。また肝臓、膵臓、脾臓、腎臓などの肉眼的所見及び主要臓器の体重比湿重量を測定した。
【００４６】
（３−５）結果の統計学的処理：平均値±標準誤差で表し、有意差検定にはＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎの多重比較検定（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）を用いた。
以  上
【００４７】
（３−６）結果：解剖所見においては、正常群に比べ、ＳＴＺ処置群は内臓が透けて見えるほど腹壁が薄く、皮下および内臓脂肪がほとんど認められない状態であった。盲腸はいずれの群においても肥大しており、小腸は内部が黒く見えるものが多数のラットに認められた。肝臓、腎臓および脾臓は正常群に比べ色が悪く、肝臓は肝硬変化したような白っぽいものが数例認められ、また、脾臓は正常群に比べると萎縮していると観察した。主要臓器の体重比湿重量を表２に示した。ＳＴＺ処置群は肝臓、腎臓の体重比湿重量が正常群のそれらに比較して増加した。脾臓は萎縮していた。肝臓と腎臓の重量増加は見掛け上であり、実際には体重減少に基づく相対比重量の増加と思われる。しかし、ＳＴＺ処置群の脾臓は正常群に比べ、体重が減少しているにもかかわらず萎縮していた。このことから肝、腎、代謝系機能異常のみならず、造血系の異常も惹起されているのではないかと推察された。豚皮ゼラチン由来ペプチドと片口鰯鱗由来ペプチドのいずれも肝臓、腎臓、脾臓の肉眼的所見および体重比湿重量には影響を及ぼさなかった。
血糖値の変動は表３に示した。ＳＴＺ２日後の血糖値は正常群のそれに比して約４倍に上昇し、３０日後にはさらに上昇した。片口鰯鱗由来ペプチド５００ｍｇ／Ｋｇ投与群には血糖値の上昇を有意に抑制する作用が認められたが、豚皮ゼラチン由来ペプチドには血糖値上昇抑制作用は認められなかった。
【００４８】
【表２】
ＳＴＺ誘発糖尿ラット試験終了時の肝臓、腎臓および脾臓体重比湿重量
0004862235.tif 000003
有意差；  印##＝ｐ＜０．０１ｖｓ.正常群
【００４９】
【表３】
ＳＴＺ誘発糖尿ラットの血糖値
0004862235.tif 000004
有意差；  印##＝ｐ＜０．０１ｖｓ.正常群，  印*＝ｐ＜０．０５ｖｓ.対照群
【００５０】
実施例２
（１）ペプチドの製造
真鰯鱗および片口鰯鱗は実施例１の（１）と同様に処理してペプチドを得た。片口鰯肉と骨由来のペプチドの製造は、新鮮な片口鰯を手作業にて頭と内臓を取り除き、次いで三枚におろして背骨と肉を分離する。肉部はカッターナイフにて外皮を剥ぐと共に小骨のある腹部をカットしてから水で洗浄した。背骨部は付着している肉を歯ブラシにて奇麗にこそいで落とし、背骨に付随する神経等を縫針等で丁寧に除去してから水で洗浄後に風乾した。水洗した片口鰯肉は微塵切りにし、２．５倍量のアセトンにて３回繰り返し脱脂した。その後、この肉に水を加えて振とう・ろ過する操作を繰り返し洗浄した。洗浄した肉を風乾物当たり実施例１の倍の酵素量で倍の反応時間にて加水分解した。加水分解液を遠心分離して未分解物を分離した上澄液について、実施例１と同様、膜濃縮・凍結乾燥して片口鰯肉由来のペプチド粉末を得た。風乾した片口鰯骨部は８倍量のアセトンにて３回繰り返し脱脂後、水を加えて振とう・ろ過操作を繰り返し洗浄した。洗浄した骨は実施例１の鱗と同様に脱灰操作を行った。脱灰残分であるコラーゲンは実施例１と同様に操作して、酵素分解・膜濃縮・凍結乾燥して片口鰯骨由来のコラーゲンペプチドを得た。
【００５１】
（２）インスリン様作用試験（脂肪動員試験）
試験方法は実施例１と同様に行った。
（２−１）結果
表４に片口鰯の各部位由来ペプチドの効果比較結果を示した。脂肪細胞にアドレナリンを作用させると、９．１±０．８（μＥｑ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ)のＦＦＡが遊離した。そこで各被検体をこの系に共存させると、いずれの被検体にもアドレナリンによる脂肪動員を抑制する作用が認められた。濃度２００ (μｇ／ｍｌ)で比較すると活性の高い順に片口鰯骨部＞片口鰯肉部＞片口鰯鱗部であった。
【００５２】
【表４】
ラット副睾丸脂肪細胞からのアドレナリンによる脂肪動員に及ぼす片口鰯各部位由来ペプチド間の効果比較
0004862235.tif 000005
ｎ＝４〜５、有意差； 印**＝ｐ＜０．０１ｖｓ. 対照群
【００５３】
（３）ＫＫ-Ａyマウスによる抗糖尿病作用試験
ＳＴＺ（薬剤）誘発糖尿病モデルはＳＴＺにて膵臓のランゲルハンス島β細胞を特異的に破壊し、インスリン分泌を減少させることにより、高血糖を示すモデルであることからインスリン依存型糖尿病モデルに近いと思われる。現代社会はライフスタイルが欧米化したことや運動不足などから、内臓脂肪の蓄積（肥満）などが原因で誘発されるインスリン非依存型糖尿病患者が急増していると言われている。ＫＫマウスは遺伝研究の目的で維持していた尾曲がりを発現するマウスの中に、高血糖を呈する数個体が発見され、II型糖尿病（インスリン非依存型）モデルとして注目された。
ＫＫ-ＡyマウスはＫＫマウスに肥満遺伝子Ａyが導入され、ＫＫマウスより早期かつ重度に肥満・高血糖を発現するII型糖尿病モデルである。この肥満ＫＫ（ ＫＫ-Ａy ）での糖尿病変化はヒトの成人型糖尿病に類似している。かかる状況から、最近の抗糖尿病薬の研究開発においては、種々の遺伝的糖尿病モデル動物を用いた研究例が増加している。
【００５４】
（３−１）被検体
被検体は片口鰯の鱗、肉、骨由来のペプチドと真鰯の鱗由来のペプチドの４種である。片口鰯の各部位のペプチドは実施例２に記した製造法にて、、真鰯鱗のペプチドについては片口鰯鱗と同様な製造法にて調製した。なお、被検体はマウス体重１０ｇあたり０．１ｍｌの用量で蒸留水に溶解し経口投与した。対照には蒸留水を用いた。
【００５５】
（３−２）試薬
試薬にはグルコースＣII−テストワコー、グラザイムインスリン−ＥＩＡテスト、コレステロールＣII−テストワコー、トリグリセライドＧ−テストワコー、ＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー（和光純薬工業）を用いた。
【００５６】
（３―３）実験動物
Ｊｃｌ：ＫＫ- Ａy雄性マウス（４週齢、１８〜２２ｇ）を日本クレアより購入した。飼育環境は恒温恒湿、１２時間明／１２時間暗のサイクルの実験動物飼育室で、市販の固形飼料（ＣＥ-２、日本クレア）を用い、自由に水を摂取させ、購入後、実験に供するまで約２週間、単独予備飼育し、体重増加を指標に健常な動物を用いた。
【００５７】
（３−４）抗糖尿病作用試験
約２週間単独予備飼育したＫＫ- Ａy雄性マウスの眼底静脈叢からヘパリン処置キャピラリーにて採血し、遠心分離後、血漿を得、血糖値を測定し、各群の平均血糖値がほぼ同等になるように群構成し、被検体の経口投与を開始した。その後、１日１回、１４日間連日経口投与した。血糖値の経時変化として、投与開始７日および１４日後に被検体投与１時間後に採血し、血糖値を測定した。また、投与最終日にはペントバルビタール麻酔下で開腹し、内臓の肉眼的解剖所見を行い、その後心臓から採血を行い、血清を分離した。また、採血後に主要臓器を摘出した。その後、体重比臓器湿重量、血清インスリン量、中性脂肪量、総コレステロール量および遊離脂肪酸量を測定した。なお、体重は３日おきに測定した。
【００５８】
（３−５）結果の統計学的処理
実験結果は実施例１の（２−３）と同様に処理した。
（３−６）結果
ＫＫ- Ａyマウスは週齢が増すごとに体重は増加した。体重増加に関して被検体群と対照群に有意な差はなかった。血糖値の変動に及ぼす影響は、表５に示した。対照群は被検体投与の7日および１４日後において血糖値は上昇した。経口投与7日後において、片口鰯鱗由来ペプチド５００mg/kg投与群に血糖値の上昇を有意に抑制する作用が認められた。片口鰯の肉および骨由来ペプチド投与群においても抑制傾向が認められた。片口鰯鱗と真鰯鱗を比較すると真鰯鱗より片口鰯鱗由来ペプチドにより強い効果が認められた。経口投与１４日後においては、いずれの被検体においても抑制傾向にとどまった。
【００５９】
【表５】
ＫＫ- Ａyマウスにおける血糖値の変動に及ぼす鰯類ペプチドの影響
0004862235.tif 000006
ｎ＝９〜１０、有意差； 印*＝ｐ＜０．０５ｖｓ. 対照群
主要臓器の体重比湿重量に及ぼす影響を検討した。その結果を表６に示した。いずれの被検体も体重比肝臓、脾臓、腎臓湿重量に影響を及ぼさなかった。
【００６０】
【表６】
ＫＫ- Ａyマウスにおける体重比湿重量に及ぼす鰯類ペプチドの影響
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ｎ＝９〜１０
【００６１】
各種血清パラメーターに及ぼす影響を検討した。糖尿病罹患時に変動すると言われているインスリン量、総コレステロール量、中性脂肪量につき測定した。その結果は表７に示した。片口鰯の鱗と骨由来のペプチドは中性脂肪量を有意に抑制した。真鰯の鱗にも抑制傾向が認められた。遊離脂肪酸量に対しては片口鰯の肉由来ペプチドに抑制傾向が認められた。血中インスリン量に対してはいずれの被検体も有意な影響を及ぼさなかった。これは、インスリン量は血中グルコース量によって膵臓から分泌されるので、インスリン量が有意に増加しなかったことが被検体のインスリン分泌促進作用を否定する結果とは言えない。
【００６２】
【表７】
ＫＫ- Ａyマウスにおける各種血清パラメターに及ぼす鰯類ペプチドの影響
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ｎ＝９〜１０、    有意差； 印*＝ｐ＜０．０５ｖｓ. 対照群
【００６３】
【発明の効果】
本発明のペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤は、コラーゲンペプチドでありながら、同じくコラーゲンペプチドである豚皮ゼラチン由来のペプチドに血糖値上昇抑制作用が認められないのに比べ、血糖値上昇を抑制する効果が極めて高い血糖値上昇抑制剤であり、かつ、糖尿病に随伴する高脂血症を改善する作用を有する。したがって高脂血症改善作用を有する血糖値上昇抑制用の飲料、食品もしくは健康食品等への添加剤として好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】片口鰯鱗由来ペプチドの分子量分布曲線
【図２】豚皮ゼラチン由来ペプチドの分子量分布曲線
【図１】
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【図２】
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