(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるモリブデントランスポーターをコードするＤＮＡの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用。
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列からなるモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるモリブデントランスポーターの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーターとしての使用。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質の、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーターとしての使用。
【請求項７】
モリブデントランスポーターを発現することができる組換えベクターを作製することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか記載の、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用。
【請求項８】
請求項７記載の非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしての使用により作製された組換えベクターが導入され、かつモリブデントランスポーターを発現する形質転換体に、被検物質の存在下、ＭｏＯ４２−を接触させ、細胞内へのモリブデンの取り込みの程度を測定・評価することを特徴とするモリブデントランスポーター活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
形質転換体が酵母であることを特徴とする請求項８記載のモリブデントランスポーター活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
形質転換体が植物であることを特徴とする請求項８記載のモリブデントランスポーター活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シロイヌナズナ、イネ、ナタネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、タルウマゴヤシに由来するモリブデントランスポーター及びそれらの遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
モリブデン（Ｍｏ）は植物の必須元素であり(例えば、非特許文献１参照)、その不足は節間伸長の抑制や葉の形態異常などの症状を引き起こす(例えば、非特許文献２及び３参照)。Ｍｏは遷移元素であり、電子供与体また受容体として植物の複数の酸化・還元反応を触媒する酵素に含まれている。窒素代謝経路の重要な反応を担う硝酸還元酵素はＭｏを含む酵素のひとつである(例えば、非特許文献４参照)。【０００３】
Ｍｏはプテリン化合物と結合したＭｏコファクター(Ｍｏｃｏ)の形態でこれらの酵素と結合する（例えば、非特許文献５参照）。硝酸還元酵素にはＭｏｃｏが必須であり、Ｍｏｃｏの含有量が低下した変異株は硝酸還元酵素の活性が低い(例えば、非特許文献６参照)。硝酸還元酵素の活性が低い変異株は、過塩素酸耐性とタングステン酸感受性の表現型を示す(例えば、非特許文献７参照)。これらの表現型を指標としてＭｏｃｏの生合成に必要な酵素が欠損した変異株が単離され、Ｍｏｃｏの合成系路が明らかにされた(例えば、非特許文献８参照)。一方で、植物体内のＭｏ濃度が低下したことが原因でＭｏｃｏ含有量が低下した変異株とその原因遺伝子については報告がない。【０００４】
植物は土壌からＭｏを主に二価の陰イオンであるＭｏＯ４２−の形態で吸収すると考えられており(例えば、非特許文献９参照)、一般のイオンと同様に膜の透過には輸送体が介在すると考えられる。細菌と古細菌においてはＡＢＣ−ｔｙｐｅ(ATP-binding cassette-type)のＭｏ輸送体が同定されている(例えば、非特許文献１０参照)。しかしながら、植物におけるＭｏ輸送体は同定されていなかった。【０００５】
一方、Ｍｏを多量に含む牧草地にＮａ２ＳＯ４を施用すると牧草へのＭｏの蓄積が抑制されることが知られていた（例えば、非特許文献１１参照）。これは土壌にＭｏＯ４２−と同じ二価の陰イオンであるＳＯ４２−が共存すると植物のＭｏ吸収が競合阻害されることが原因と考えられており（例えば、非特許文献１２参照）、ＭｏＯ４２−はＳＯ４２−と類似した機構で土壌から植物体内へ輸送されることを示唆している。【０００６】
硫黄はアミノ酸の構成元素であり、植物の必須元素である。植物は硫酸イオントランスポーターを介して二価の陰イオンであるＳＯ４２−を土壌から吸収することで硫黄を体内に取り込む(例えば、非特許文献１３参照)。ゲノムＤＮＡの配列分析(例えば、非特許文献１４参照)により、シロイヌナズナには少なくとも１４個の硫酸イオントランスポーターが存在することが予測された。この硫酸イオントランスポーターファミリーはその相同性からさらに５つのグループに分類でき、グループ１からグループ４に分類される遺伝子は組織特異的発現や細胞内局在にそれぞれのグループに共通する特徴を示す(例えば、非特許文献１５参照)。一方で、グループ５に分類される遺伝子についてはその特徴が明らかになっていない(例えば、非特許文献１６参照)。このグループに属する遺伝子の配列には硫酸イオントランスポーターファミリーに共通するドメインが存在するが、配列全体としては他のグループに属する遺伝子の配列との相同性が低い(例えば、非特許文献１７参照)。また、グループ５に属する遺伝子の翻訳産物が硫酸イオン輸送活性をもつことは報告されておらず、その機能は未知である。【０００７】
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のアクセッションＣｏｌ−０とＬｅｒの元素組成を比較すると、Ｃｏｌ−０のＭｏ含有量はＬｅｒよりも有意に高い(例えば、非特許文献１８参照)。【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２６２８７２号公報
【非特許文献１】Arnon, D. I. and Stout, P. R. (1939) The essentiality of certain elements in minute quantity for plants with special reference to copper. Plant Physiol.14: 37１／３75
【非特許文献２】fido, R. J., Gundry, C. S., Hewitt, E. J. and Notton, B. A. (1977) Ultrastructural features of Ｍolybdenum deficiency and whiptail of cauliflower leaves - effects of nitrogen-source and tungsten substitution for Ｍolybdenum. Australian J. Plant Physiol. 4: 675-689
【非特許文献３】Agarwala, S. C., Sharma, C. P., farooq, S. and Chatterjee, C. (1978) Effect of Ｍolybdenum deficiency on the growth and metabolisＭof corn plants raised in sand culture. Can. J. Bot. 56: 1905-1908
【非特許文献４】Mendel, R. R. and Hansch, R. (2002) Ｍolybdoenzymes and Ｍolybdenum cofactor in plants. J. Exp. Bot. 53: 1689-1698
【非特許文献５】Johnson, J. L., Hainline, B. E. and Rajagopalan, K. V. (1980) Characterization of the Ｍolybdenum cofactor of sulfite oxidase, xanthine, oxidase, and nitrate reductase. Identification of a pteridine as a structural component. J. Biol. Chem. ２55: 1783-1786
【非特許文献６】Gabard, J., Pelsy, f., Marionpoll, A., Caboche, M., Saalbach, I., Grafe, R. and Muller, A. J. (1988) Genetic-analysis of nitrate reductase deficient mutants of Nicotiana-plumbaginifolia - evidence for 6 complementation groups aＭong 70 classified Ｍolybdenum cofactor deficient mutants. Ｍol. Gen. Genet. 21/3: 206-21/3
【非特許文献７】LaBrie, S. T., Wilkinson, J. Q., Tsay, Y. f., feldmann, K. A. and Crawford, N. M. (1992) Identification of two tungstate-sensitive Ｍolybdenum cofactor mutants, chl２ and chl7, of Arabidopsis thaliana. Ｍol. Gen. Genet. 233: 169-176
【非特許文献８】Mendel, R. R. (1997) Ｍolybdenum cofactor of higher plants: biosynthesis and Ｍolecular biology. Planta 203: 399-405
【非特許文献９】Gupta, U. C. and Lipsett, J. (1981) Ｍolybdenum in soils, plants, and animals. Adv. Agron. 34: 73-115
【非特許文献１０】Self, W. T., Grunden, A. M., Hasona, A. and Shanmugam, K. T. (2001) Molybdate transport. Res. Microbiol. 152: 311/321
【非特許文献１１】Chatterjee, C., Nautiyal, N. and Agarwala, S. C. (1992) Excess sulphur partially alleviates copper deficiency effects in mustard. Soil Sci. Plant Nutr. 38: 57-64
【非特許文献１２】Pasricha, N. S., Nayyar, V. K., Randhawa, N. S. and Sinha,M. K. (1977) Influence of sulphur fertilization on suppressionof Molybdenum uptake by berseem (Trifolium alexandrinum L.) and oats (Avena sativa L.) grown in aMolybdenum-toxic soil. Plant Soil 46: 245-250
【非特許文献１３】Smith, f. W., Ealing, P. M., Hawkesford, M. J. and Clarkson, D. T. (1995) Plant members of a family of sulfate transporters reveal functional subtypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9373-9377
【非特許文献１４】The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature408: 796-815
【非特許文献１５】Hawkesford, M. J. (2000) Plant responses to sulphur deficiency and the genetic manipulation of sulphate transporters to improve S-utilization efficiency. J. Exp. Bot. 51: 1/31-1/38
【非特許文献１６】Hawkesford, M. J. (2003) Transporter gene families in plants: the sulphate transporter gene family. Redundancy or specialization Physiologia Plantarum 117: 155-163
【非特許文献１７】Buchner, P., Takahashi, H. and Hawkesford, M. J. (2004) Plant sulphate transporters: co-ordination of uptake, intracellular and long-distance transport. J. Exp. Bot. 55: 1765-1773
【非特許文献１８】Lahner, B., Gong, J., MahMoudian, M., Smith, E. L., Abid, K. B., Rogers, E. E., Guerinot, M. L., Harper, J. f., Ward, J. M., McIntyre, L.,Schroeder, J. I. and Salt, D. E. (2003) Genomic scale profiling of nutrient andtrace elements in Arabidopsis thaliana. Nat. Biotechnol. 21: 1215-1221
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｍｏは植物の必須元素であり、その不足は節間伸長の抑制や葉の形態異常などの症状を引き起こす。Ｍｏは遷移元素であり、電子供与体また受容体として植物の複数の酸化・還元反応を触媒する酵素に含まれている。窒素代謝経路の重要な反応を担う硝酸還元酵素はＭｏを含む酵素のひとつである。植物は土壌からＭｏを主に二価の陰イオンであるＭｏＯ４２−の形態で吸収すると考えられており、一般のイオンと同様に膜の透過には輸送体が介在すると考えられる。細菌と古細菌においてはＡＢＣ−ｔｙｐｅのＭｏ輸送体が同定されている。しかしながら、植物におけるＭｏ輸送体は同定されていなかった。植物体におけるモリブデン輸送機構を分子レベルで解明し、モリブデン輸送における主要な経路や制限要因を明らかにすることは効率的な施肥方法や育種戦略への知見を与えるものであると考えられる。また、植物体でモリブデン輸送に関与する遺伝子を同定することはモリブデン欠乏・過剰耐性品種の作出に直接つながると考えられる。本発明の課題は、環境中からのモリブデンの取込みや生体内でのモリブデンの輸送をより効率良く制御することが可能となる、植物における初めてのモリブデン輸送を司る新たな遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究し、シロイヌナズナのＭｏ輸送体をコードするＭｏＴＲ１遺伝子を同定した。この遺伝子は半優性であり、葉におけるＭｏ濃度を決定する。ＭｏＴＲ１は細胞膜タンパク質であり、細胞内へＭｏを濃縮する能力をもつ輸送体であった。また、このＭｏ輸送体は硝酸還元が行われる組織で発現することが示唆された。以下、詳細に説明する【００１１】
（遺伝子の同定）
本発明者らによるシロイヌナズナのアクセッションＣｏｌ−０とＬｅｒの間におけるＱＴＬ解析により、葉のＭｏ濃度を支配するＱＴＬが染色体２番上に存在することを見い出した。本発明では遺伝解析により原因遺伝子の存在する領域を１７２ｋｂの範囲に限定した。この領域には、硫酸イオントランスポーターと共通のドメインをもつがその機能は解析されていない遺伝子Ａｔ２ｇ２５６８０が存在していた。硫黄とＭｏはＳＯ４２−およびＭｏＯ４２−として植物に吸収されるので、硫酸イオントランスポーターに相同なＡｔ２ｇ２５６８０がＭｏ吸収に関与している可能性が考えられた。そこで、Ａｔ２ｇ２５６８０に外来遺伝子断片(Ｔ−ＤＮＡ)が挿入された独立な２系統の遺伝子破壊株を入手して葉のＭｏ濃度を測定したところ、いずれの変異株においても濃度が野生型株の約１／３に低下していた。この結果は、Ａｔ２ｇ２５６８０がシロイヌナズナの葉のＭｏ濃度を決定する遺伝子であることを示唆する。また、独立な２系統の遺伝子破壊株を掛け合わせて得たＦ１世代の葉のＭｏ濃度は野生型株の約１／３であり、Ｍｏ濃度が低いという表現型は相補されなかった。さらに、変異株と野生型株を掛け合わせたＦ１世代の自家受粉により得たＦ２世代において、挿入遺伝子をヘテロにもつ株の葉のＭｏ濃度は、挿入遺伝子をホモにもつ株と野生型株との中間の値を示した。これらの結果は、Ｍｏ濃度の低下がＡｔ２ｇ２５６８０の変異によって起こっていることを支持するとともに、この変異は半優性であることを示唆する。これらの結果から、変異株の葉のＭｏ濃度が低下した原因はＡｔ２ｇ２５６８０の変異であることが確定したので、この遺伝子をＭｏＴＲ１と命名した。【００１２】
（細胞内局在）
ＭｏＴＲ１は膜貫通領域を７−１１個もつと予測された。翻訳産物が細胞のどの膜に局在しているかを調べるために、カリフラワーモザイクウィルス３５ＳＲＮＡプロモーター制御下でＭｏＴＲ１とＧＦＰ(green Fluorescent protein)との融合タンパク質を発現するためのコンストラクトを作製し、タマネギ表皮細胞に導入した。レーザー共焦点顕微鏡による観察では、融合タンパク質の蛍光は細胞の外縁部に局在した。この結果は、ＭｏＴＲ１が細胞膜タンパク質であることを示唆する。【００１３】
（Ｍｏ輸送活性）
ＭｏＴＲ１のＭｏ輸送能を調べるために、酵母においてＭｏＴＲ１を発現するためのコンストラクトを作製して、酵母に導入した。この遺伝子導入株と野生型株を、Ｍｏを加えない培地で継代培養した後に、１．７×１０２ｎＭのＭｏＯ４２−を含む培地へ移して３０分間振盪培養した。菌体内のＭｏ濃度を測定したところ、遺伝子導入株の濃度は野生型株の８０倍以上に上昇していた。また、菌体の乾燥重量から菌体内の液体量を推定して算出した菌体内Ｍｏ濃度は、培地のＭｏ濃度よりも高かった。したがって、ＭｏＴＲ１はＭｏを濃度勾配に逆らって濃縮する能力をもつ輸送体と考えられる。【００１４】
（発現組織）
ＭｏＴＲ１が発現する組織を調べるために、Ａｔ２ｇ２５６８０の開始コドンから上流約２．９ｋｂのプロモーター領域にβ-glucuronidase(ＧＵＳ)遺伝子を連結して、シロイヌナズナに形質転換した。独立な遺伝子導入株１６系統において、地上部では葉柄と葉の外縁部でＧＵＳ活性が認められた。根では、根端にＧＵＳ活性が認められ、根端から１−６ｍｍの領域では活性が認められなかった。その上部では内鞘にＧＵＳ活性が観察され、さらに側根が認められる領域よりも上部では皮層に活性が観察された。同じ解析でＧＦＰをレポーターとして用いた場合も結果は同様であった。根での発現パターンはこれまでに報告されている硝酸イオントランスポーターＡｔＮＲＴ１．１のものと類似しており、ＭｏＴＲ１は硝酸イオン濃度が高い組織で発現して硝酸還元酵素にＭｏを供給している可能性がある。【００１５】
次いで、ＭｏＴＲ１のアミノ酸配列（４５６アミノ酸）をクエリーにしてＤＤＢＪのＷｅｂサイト上でtblastnのプログラムによるＢＬＡＳＴ検索を行い、シロイヌナズナ、イネ、ナタネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、タルウマゴヤシに由来するモリブデントランスポーター遺伝子を見い出し、シロイヌナズナとイネについてモリブデントランスポーター活性を確認した。
本発明は上記知見に基づいて完成するに至ったものである。【００１６】
すなわち本発明は、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるモリブデントランスポーターをコードするＤＮＡの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用や、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用や、（３）配列番号１に示される塩基配列からなるモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用や、（４）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用や、（５）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるモリブデントランスポーターの、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーターとしての使用や、（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質の、非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーターとしての使用や、（７）モリブデントランスポーターを発現することができる組換えベクターを作製することを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれか記載の非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する形質転換酵母作製又は形質転換植物作製のための使用や、（８）上記（７）記載の非ＡＢＣタイプの高親和性モリブデントランスポーターＤＮＡとしての使用により作製された組換えベクターが導入され、かつモリブデントランスポーターを発現する形質転換体に、被検物質の存在下、ＭｏＯ４２−を接触させ、細胞内へのモリブデンの取り込みの程度を測定・評価することを特徴とするモリブデントランスポーター活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（９）形質転換体が酵母であることを特徴とする上記（８）記載のモリブデントランスポーター活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（１０）形質転換体が植物であることを特徴とする上記（８）記載のモリブデントランスポーター活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のの測定結果を示す図である。
【図２】Ｔ−ＤＮＡ挿入位置の決定の結果を示す図である。  Ａｔ２ｇ２５６８０またはその近傍に外来遺伝子断片(Ｔ−ＤＮＡ)が挿入された遺伝子破壊株ＳＡＬＫ_１１８３１１とＳＡＬＫ_０６９６８３について、Ｔ−ＤＮＡ挿入予測位置の上流と下流のそれぞれの塩基配列に相同なプライマーとＴ−ＤＮＡの内部配列に相同なプライマー(表１参照)を用いてＰＣＲを行い、挿入遺伝子をホモにもつ系統をそれぞれ選抜した。  さらに、選抜された系統について、挿入されたＴ−ＤＮＡとゲノムＤＮＡとの境界付近の塩基配列解析を行った。ここでの５’-３’はＡｔ２ｇ２５６８０のＯＲＦの方向に従って記してある。ＬＢｂ１-ＬＰ１またはＬＢｂ１-ＲＰ２として記した配列は、それぞれのプライマーで増幅された産物の塩基配列解析をした結果の一部である。また、genomeとして記した配列は、それらの産物と相同性が高いシロイヌナズナのゲノムＤＮＡ配列を示す。ここでは、増幅産物とシロイヌナズナのゲノムＤＮＡの配列を比較したときに、配列の相同性にギャップが生じる境界付近の配列を示した。５塩基以上配列が一致する領域を大文字で、それ以外を小文字で記す。図の数字はＡｔ２ｇ２５６８０の開始コドンのアデニンを１番目の塩基として５’から３’へ塩基に番号を付けたとき、Ｔ−ＤＮＡが挿入された位置が何番目の塩基にあたるかを示す。
【図３】Ａｔ２ｇ２５６８０破壊株の葉のＭｏ濃度を示す図である。  ＳＡＬＫ_１１８３１１、ＳＡＬＫ_０６９６８３、 Ｃｏｌ−０およびＬｅｒをロックウールに播種し、１．７×１０２ｎＭのＭｏＯ４２−を含むＭＧＲＬ水耕液を用いて３０日間栽培した。それぞれの系統において５個体の葉のＭｏ濃度を測定し、その平均値を示した。エラーバーは標準偏差を表す。なお、それぞれの系統のＭｏ濃度はStudentのt検定(P < 0.05)において他のいずれの系統のＭｏ濃度とも有意に異なる。
【図４】戻し交雑したＦ２世代(ＳＡＬＫ_１１８３１１×Ｃｏｌ−０;Ｆ２)の葉のＭｏ濃度を示す図である。ＳＡＬＫ_１１８３１１とＣｏｌ−０を掛け合わせたＦ１世代の株を自家受粉させてＦ２種子を得た。このＦ２種子、Ｃｏｌ−０およびＬｅｒをロックウールに播種し、１．７×１０２ｎＭのＭｏＯ４２−を含むＭＧＲＬ水耕液を用いて３０日間栽培した。Ｆ２世代の個体についてはＰＣＲを用いてＡｔ２ｇ２５６８０へのＴ−ＤＮＡ挿入の有無を確認し、Ｔ−ＤＮＡが挿入されていない系統（Wild Type）、挿入遺伝子をヘテロにもつ系統（Hetero）および挿入遺伝子をホモに持つ系統（Homo）の３系統に分類した。それぞれの系統において４個体の葉のＭｏ濃度を測定し、その平均値を示した。エラーバーは標準偏差を表す。なお、それぞれの測定値に付記した英字は、付記された英字が同一の系統間のＭｏ濃度はStudentのt検定(P < 0.05)において有意差がなく、付記された英字が異なる系統間のＭｏ濃度はそれぞれ有意に異なることを表す。
【図５】ＭｏＴＲ１::ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を示す図である。  カリフラワーモザイクウィルス３５ＳＲＮＡプロモーター制御下でＭｏＴＲ１とＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのコンストラクトを作製し、タマネギ表皮細胞に導入した。ＧＦＰの蛍光はレーザー共焦点顕微鏡により観察した。スケールバーは１００μｍを表す。
【図６】ＭｏＴＲ１のＭｏ輸送能を示す図である。  酵母においてＭｏＴＲ１を発現するためのコンストラクトを作製して、酵母(Saccharomyces cerevisiae, BY4741)に導入した。この遺伝子導入株と野生型株を、Ｍｏを加えていない培地に植菌して継代培養を行った。対数増殖期中期にある菌体を遠心により回収し、Ｍｏを加えない培地(-Ｍｏ)または最終濃度が１．７×１０２ｎＭとなるようにＭｏＯ４２−を加えた培地(+Ｍｏ)に再懸濁して３０分間振盪培養した。振盪後の菌体をそのまま乾燥して、Ｍｏ濃度を測定した。それぞれの系統において異なるコロニーから継代培養を始めた４株のＭｏ濃度を測定し、それぞれの系統の平均値を示した。エラーバーは標準偏差を表す。なお、下段のグラフは上段のグラフの縦軸の縮尺を変えたものであり、同一のデータを示す。また、それぞれの系統のＭｏ濃度はStudentのt検定(P < 0.05)において他のいずれの系統のＭｏ濃度とも有意に異なる。
【図７】ＭｏＴＲ１の発現組織を示す図である。  Ａｔ２ｇ２５６８０の開始コドンから上流２９０３ｂｐのプロモーター領域とＧＵＳ遺伝子を連結して、シロイヌナズナに形質転換した。発芽後７日目の形質転換体のＧＵＳ活性を光学顕微鏡（（Ｂ），（Ｃ），（Ｄ），（Ｆ）および（Ｊ））または実体顕微鏡（（Ｈ）および（Ｉ））で観察した。（Ａ）：発芽後７日目の形質転換体のＧＵＳ染色像。（Ｂ）：子葉の外縁部。（Ｃ）：子葉の葉柄。（Ｄ）：成熟根（根端から２ｃｍの部位）。（Ｆ）：根端。（Ｈ）：成熟根（根基部から１ｃｍの部位）。（Ｉ）：成熟根（根端から２ｃｍの部位）。（Ｊ）：成熟根（根端から２ｃｍの部位）の水平切片。  さらに、Ａｔ２ｇ２５６８０の開始コドンから上流２９０３ｂｐのプロモーター領域とＧＦＰ遺伝子を連結して、シロイヌナズナに形質転換した。発芽後７日目の形質転換体のＧＦＰ蛍光をレーザー共焦点顕微鏡で観察した。（Ｅ）：発芽後７日目の形質転換体の成熟根（根端から２ｃｍの部位，propidium iodideで染色）。（Ｇ）：根端。  スケールバーは（Ａ）では１ｃｍを表し、それ以外では１００μｍを表す。
【図８】モリブデントランスポーターのＫｍを示す図である。縦軸はモリブデン輸送速度の逆数（1 / [モリブデン輸送速度]）、横軸は培地のモリブデン濃度の逆数（1 / [培地のモリブデン濃度]）。
【図９】シロイヌナズナ（野生型株、変異株）を各条件で３週間栽培した結果を示す図である。（Ａ）はモリブデン存在下で栽培したもの、（Ｂ）はモリブデン非存在下で栽培したものである。
【図１０】イネのＭｏＴＲ１、ＭｏＴＲ２のＭｏ輸送活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のＤＮＡとしては、配列番号２（シロイヌナズナＭｏＴＲ１），配列番号３１（シロイヌナズナＭｏＴＲ２），配列番号３３（イネＭｏＴＲ１），配列番号３５（イネＭｏＴＲ２）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；配列番号２，３１，３３又は３５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつモリブデン（Ｍｏ）トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；配列番号１（シロイヌナズナＭｏＴＲ１遺伝子），配列番号３０（シロイヌナズナＭｏＴＲ２遺伝子），配列番号３２（イネＭｏＴＲ１遺伝子），配列番号３４（イネＭｏＴＲ２遺伝子）に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるモリブデントランスポーター遺伝子ＤＮＡ；配列番号１，３０，３２又は３４に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は配列番号１，３０，３２又は３４に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；からなるモリブデントランスポーター遺伝子の他、配列番号３７（ナタネＭｏＴＲ１），配列番号３９（オオムギＭｏＴＲ１），配列番号４１（オオムギＭｏＴＲ２），配列番号４３（コムギＭｏＴＲ１），配列番号４５（トウモロコシＭｏＴＲ１），配列番号４７（タルウマゴヤシＭｏＴＲ１），配列番号４９（タルウマゴヤシＭｏＴＲ２）に示されるアミノ酸配列を含み、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；配列番号３７，３９，４１，４３，４５，４７又は４９に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；配列番号３６（ナタネＭｏＴＲ１遺伝子），配列番号３８（オオムギＭｏＴＲ１遺伝子），配列番号４０（オオムギＭｏＴＲ２遺伝子），配列番号４２（コムギＭｏＴＲ１遺伝子），配列番号４４（トウモロコシＭｏＴＲ１遺伝子），配列番号４６（タルウマゴヤシＭｏＴＲ１遺伝子）又は配列番号４８（タルウマゴヤシＭｏＴＲ２遺伝子）に示される塩基配列若しくはその相補的配列を含み、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６又は４８に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６又は４８に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明のタンパク質としては、配列番号２，３１，３３又は３５に示されるアミノ酸配列からなるモリブデントランスポーター；又は配列番号２，３１，３３又は３５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質；の他、配列番号３７，３９，４１，４３，４５，４７又は４９に示されるアミノ酸配列を含み、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質；配列番号３７，３９，４１，４３，４５，４７又は４９に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつモリブデントランスポーター活性を有するタンパク質からなるモリブデントランスポータータンパク質であれば特に制限されず、ここで、「モリブデントランスポーター遺伝子」とはモリブデンの輸送に関与する遺伝子をいい、「モリブデントランスポータータンパク質」とはモリブデンの輸送に関与するタンパク質をいう。【００１９】
上記「モリブデントランスポーター活性を有するタンパク質」とは、酵母、植物などの細胞内に生体内にモリブデンを輸送する作用を有するタンパク質を意味する。【００２０】
モリブデントランスポーター遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列からなるシロイヌナズナＭｏＴＲ１遺伝子；配列番号３０に示される塩基配列からなるシロイヌナズナＭｏＴＲ２遺伝子；配列番号３２に示される塩基配列からなるイネＭｏＴＲ１遺伝子；配列番号３４に示される塩基配列からなるイネＭｏＴＲ２遺伝子；配列番号３６に示される塩基配列を含むナタネＭｏＴＲ１遺伝子；配列番号３８に示される塩基配列を含むオオムギＭｏＴＲ１遺伝子；配列番号４０に示される塩基配列を含むオオムギＭｏＴＲ２遺伝子；配列番号４２に示される塩基配列を含むコムギＭｏＴＲ１遺伝子；配列番号４４に示される塩基配列を含むトウモロコシＭｏＴＲ１遺伝子；配列番号４６に示される塩基配列を含むタルウマゴヤシＭｏＴＲ１遺伝子；配列番号４８に示される塩基配列を含むタルウマゴヤシＭｏＴＲ２遺伝子；をそれぞれ挙げることができ、また、モリブデントランスポータータンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるシロイヌナズナＭｏＴＲ１；配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるシロイヌナズナＭｏＴＲ２；配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるイネＭｏＴＲ１；配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなるイネＭｏＴＲ２；配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むナタネＭｏＴＲ１；配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含むオオムギＭｏＴＲ１；配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含むオオムギＭｏＴＲ２；配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含むコムギＭｏＴＲ１；配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むトウモロコシＭｏＴＲ１；配列番号４７に示されるアミノ酸配列を含むタルウマゴヤシＭｏＴＲ１；配列番号４９に示されるアミノ酸配列を含むタルウマゴヤシＭｏＴＲ２；を、それぞれ挙げることができる。【００２１】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。【００２２】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１，３０，３２又は３４に示される塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６又は４８に示される塩基配列を含むＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。【００２３】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後"モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。【００２４】
すなわち、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。【００２５】
本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１，３０，３２又は３４、あるいは、配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６又は４８に示される塩基配列情報又は配列番号２に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。【００２６】
具体的には、本発明の遺伝子が単離されたシロイヌナズナより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。【００２７】
また、上記の本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。  
相同遺伝子の探索方法としては、例えば、シロイヌナズナＭｏＲＴ１、シロイヌナズナＭｏＲＴ２、イネＭｏＲＴ１、イネＭｏＲＴ２等のアミノ酸配列をクエリーとしてＤＤＢＪに登録された塩基配列を対象にtblastnによるＢＬＡＳＴ検索を行い、得られた配列のうちscoreが１００以上のものを相同遺伝子とみなす方法等があげられる。その場合、相同遺伝子のアミノ酸配列とＭｏＲＴ１のアミノ酸配列をclustalWにより整列した後、相同遺伝子のアミノ酸における完全一致したアミノ酸の割合をホモロジーとすることができる。
このようにして、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むナタネＭｏＴＲ１；配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含むオオムギＭｏＴＲ１；配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含むオオムギＭｏＴＲ２；配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含むコムギＭｏＴＲ１；配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むトウモロコシＭｏＴＲ１；配列番号４７に示されるアミノ酸配列を含むタルウマゴヤシＭｏＴＲ１；配列番号４９に示されるアミノ酸配列を含むタルウマゴヤシＭｏＴＲ２；等を得ることができる。【００２８】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。【００２９】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。【００３０】
さらに、配列番号２，３１，３３又は３５、あるいは、配列番号３７，３９，４１，４３，４５，４７又は４９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例をそれぞれ示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてシロイヌナズナ以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。【００３１】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子ＤＮＡを含み、かつモリブデントランスポーターを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。例えば、本発明の遺伝子の５’と３’側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、トリオースフォスフェートイソメラーゼプロモーター、ＭｏＴＲ１（Ａｔ２ｇ２５６８０）プロモーター等の下流につないだコンストラクトを好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、酵母用発現ベクター、植物細胞用発現ベクター、細菌用発現ベクター、動物細胞用発現ベクター等を用いることができるが、酵母用発現ベクターや植物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。【００３２】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ(Promega)、ｐＹＥＳ２（Invitrogen）、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを具体的に挙げることができる。【００３３】
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ-Ｔベクター、ｐＩＧ１２１-Ｈｍ〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、ｐＢＩ１２１〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕などのプラスミド、あるいはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクター等を例示することができる。植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモーター等を挙げることができ、ターミネーターとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。【００３４】
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつモリブデントランスポーターを発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）を挙げることができるが、形質転換酵母や形質転換植物（細胞、組織、個体）が好ましい。【００３５】
形質転換酵母の作製に用いられる宿主酵母としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。【００３６】
形質転換植物（細胞、組織、個体）の作製に用いられる宿主植物（細胞、組織、個体）としては、その種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、根菜、穀類、観葉植物、果樹を含む樹木などの植物、例えばナス科、イネ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科又はアカネ科に属する植物や、それら植物の培養細胞、組織（種子、カルスなど）のうちから適宜選択することができる。この形質転換植物を作製するには、本発明の遺伝子を含有した上記本発明の組換えベクターを用い、この組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内のゲノムＤＮＡ中に本発明の遺伝子ＤＮＡを導入する方法を採用することができる。植物の形質転換は、植物の種類等に応じて、リーフディスク共存培養法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の公知の方法を適宜用いて行うことができる。その他、物理的または化学的に植物細胞の透過性を高めて本発明の組換えベクターを受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する方法を採用することもできる。【００３７】
本発明のモリブデン強化食品又は食品素材としては、モリブデンを取り込んだ本発明の形質転換酵母や形質転換植物（細胞、組織、個体）等の形質転換体又はその処理物が添加された食品又は食品素材であれば特に制限されず、酵母等のモリブデントランスポーターを発現し、モリブデンを取り込んだ形質転換体は、食品や食品素材に添加し、Ｍｏ欠乏症の予防・治療機能を有する食品や食品素材として使用することもできる。Ｍｏ欠乏症の予防・治療に用いられるモリブデン強化食品又は食品素材における食品や食品素材の種類としては特に制限されず、例えば、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。これら食品や食品素材には、酵母をはじめとする上記のモリブデントランスポーターを発現し、モリブデンを取り込んだ形質転換体そのものだけでなく、それらの粉砕物、乾燥物、乾燥粉砕物、抽出物、酵素処理物等の処理物を添加することもできる。【００３８】
また、本発明のモリブデン強化飼料としては、モリブデンを取り込んだ本発明の形質転換酵母や形質転換植物（細胞、組織、個体）等の形質転換体又はその処理物が添加された飼料であれば特に制限されず、酵母等のモリブデントランスポーターを発現し、モリブデンを取り込んだ形質転換体は、基礎飼料へ配合することにより、ブタ、ウシ、ニワトリ等の家畜・家禽や、イヌ、ネコ等のペット、養殖魚介類の飼育等に有利に用いることができる飼料用素材として使用することもできる。前記基礎飼料原料として、米糠、小麦フスマ、大豆粕、大豆胚芽、醤油粕、ポテトパルプ、こんにゃくトビ粉、パーム油残渣、カルシウム含有物、澱粉類を用いることができる。前記カルシウム含有物としては、卵殻、牡蠣貝殻、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、リン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム等を１種又は２種以上の混合物を挙げることができる。また、澱粉類としては、トウモロコシ、ソルガム、その他飼料用穀物、甘藷澱粉、馬鈴薯澱粉、コーンスターチ、小麦澱粉、タピオカやサゴ澱粉、各種化工澱粉、ブドウ糖、異性化糖、水飴等を挙げることができる。これら飼料には、酵母をはじめとする上記のモリブデントランスポーターを発現し、モリブデンを取り込んだ形質転換体そのものだけでなく、それらの粉砕物、乾燥物、乾燥粉砕物、抽出物、酵素処理物等の処理物を添加することもできる。【００３９】
本発明のモリブデントランスポーター活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法としては、組換えベクターが導入され、かつモリブデントランスポーターを発現する形質転換体に、被検物質の存在下、ＭｏＯ４２−を接触させ、細胞内へのリブデンの取り込みの程度を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、上記形質転換体としては、酵母、植物細胞、植物を挙げることができ、また、酵母菌体のＭｏ濃度の測定は文献（Takano, J., Noguchi, K., YasuMori, M., Kobayashi, M., Gajdos, Z., Miwa, K., Hayashi, H., Yoneyama, T. and fujiwara, T. (2002) Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature 420: 337-340）記載の方法等に準じて行うことができる。測定・評価に際しては、モリブデントランスポーターを発現していない同種の細胞と比較することが好ましい。【００４０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
（材料と方法）
［植物の生育］
本実験ではシロイヌナズナのアクセッションＣｏｌ−０とＬｅｒおよびそれらを掛け合わせたrecombinant inbred (RI)系統(Lister and Dean, 1993)を用いた。Ｃｏｌ−０とＬｅｒは研究室のストックを用いた。ＲＩ系統はNottingham Arabidopsis Stock Centreより分与を受けた。また、変異株としてSALK institute より外来遺伝子断片(Ｔ−ＤＮＡ)挿入遺伝子破壊株ＳＡＬＫ_０６９６８３とＳＡＬＫ_１１８３１１の分与を受けた。これらの変異株のバックグラウンドはＣｏｌ−０である。【００４２】
シロイヌナズナの栽培は文献（Hirai, M. Y., fujiwara, T., Chino, M. and Naito, S. (1995) Effects of sulfate concentrations on the expression of a soybean seed storage protein gene and its reversibility in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 36: 1/331-1/339）記載の方法を一部変更して行った。プラスチックトレイに並べたロックウール(Nittobo Co., Tokyo, Japan)に播種し、４℃で４８時間以上春化処理した。人工気象器を用いて、明期１０時間／暗期１４時間の蛍光灯照明により２２℃で栽培した。水耕液にはＭＧＲＬ(fujiwara, T., Hirai, M. Y., Chino, M., Komeda, Y. and Naito, S. (1992) Effects of sulfur nutrition on expression of the soybean seed storage protein genes in transgenic petunia. Plant Physiol. 99: 263-268)水耕液を用いた。３日毎にプラスチックトレイを脱イオン水ですすぎ、水耕液を交換した。このＭＧＲＬ水耕液には１．７×１０２ｎＭのＭｏＯ４２−が含まれる。【００４３】
［シロイヌナズナの葉のＭｏ濃度の測定］
シロイヌナズナの葉のＭｏ濃度の測定のための試料の調整は、文献（Noguchi, K., YasuＭori, M., Imai, T., Naito, S., Matsunaga, T., oda, H., Hayashi, H., Chino, M. and fujiwara, T. (1997) bor1-1, an Arabidopsis thaliana mutant that requires a high level of boron. Plant Physiol. 115: 901-906）記載の方法に従った。本葉が１１−１／３枚展開した個体の５−９枚目の葉のうち３枚を測定に用いた。試料は８０℃で４８時間以上乾燥させ、乾燥重量を測定した。テフロン（登録商標）チューブに試料を移し、試料あたり２ｍｌの硝酸を用いて１／３０℃で分解した。硝酸分解後の試料は、内部標準物質として５ｐｐｂのインジウムを含む０．０８Ｎ硝酸１．５ｍｌで溶解した。inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS; SEIKo, Chiba, Japan)を用いて、ＩＣＰ−ＭＳに添付の説明書に記載された方法に従ってＭｏ濃度を測定した。【００４４】
［遺伝解析］
遺伝解析に用いるシロイヌナズナからのＤＮＡ抽出は文献（Kasajima, I., Ide, Y., ohkama-ohtsu, N., Hayashi, H., Yoneyama, T. and fujiwara, T. (2004) A protocol for rapid ＤＮＡ extraction from Arabidopsis thaliana for PCR analysis. Plant Mol.Biol. Rep. 22: 49-52）記載の方法に従った。文献（Jander, G., Norris, S. R., Rounsley, S. D., Bush, D. f., Levin, I. M. and Last, R. L. (2002) Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129: 440-450）により報告されたＣｏｌ−０とＬｅｒの間における遺伝子多型データに基づき、ＳＳＬＰを含む領域をＰＣＲ(polymerase chain reaction)により増幅するプライマーを作製した。ＰＣＲに用いたプライマーを表１に示す。【００４５】
【表１】
0005011101.tif 000002
【００４６】
遺伝解析に用いる株は必ず複数のＣｏｌ−０およびＬｅｒと同時に栽培した。それぞれのＭｏ濃度測定につき、試料とともにＣｏｌ−０およびＬｅｒのＭｏ濃度を測定した。同時に栽培したＣｏｌ−０とＬｅｒのＭｏ濃度の中間値を基準として、それよりＭｏ濃度が高いもの(High)と低いもの(Low)とを区別した。【００４７】
［コンストラクトの作製］
本実験に用いたコンストラクトは以下の手順で作製した。作製したコンストラクトの一覧を図１に示す。また、コンストラクト作製に使用したプライマーは表１参照のこと。以下にプラスミド名とその作製法を以下に示す。【００４８】
（１）ｐＨＴ０１０(ＣａＭＶ３５ＳＯ::Ａｔ２ｇ２５６８０(genomic ＯＲＦ)::ｓＧＦＰ (synthetic ＧＦＰ))
１）Ｃｏｌ−０のゲノムＤＮＡを鋳型として、genomic ＯＲＦ ５’(ＳａｌI-ＥｃｏＲＩ)とgenomic ＯＲＦ ３’(ＢａｍＨＩ)のプライマー(表１参照)の組み合わせでＡｔ２ｇ２５６８０のＯＲＦを増幅した。
２）増幅した産物をＴＡクローニング法によってｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ(Promega)に挿入した（ｐＨＴ００２と命名）。
３）塩基配列解析により、挿入された配列がＡｔ２ｇ２５６８０のＯＲＦと一致することを確認した。
４）ｐＨＴ００２をＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断して、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断したｐＴＦ４８６に挿入した（ｐＨＴ０１０と命名）。【００４９】
（２）ｐＨＴ００７(Triose Phosphate Isomerase promoter:: Ａｔ２ｇ２５６８０ (genomic ＯＲＦ))
１）Ｃｏｌ−０のゲノムＤＮＡを鋳型として、genomic ＯＲＦ ５’(ＳａｌＩ-ＥｃｏＲＩ)とgenomic ＯＲＦ ３’(XhoI)のプライマー(表１参照)の組み合わせでＡｔ２ｇ２５６８０のＯＲＦを増幅した。
２）増幅した産物をＴＡクローニング法によってｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ(Promega)に挿入した（ｐＨＴ００１と命名）。
３）塩基配列解析により、挿入された配列がＡｔ２ｇ２５６８０のＯＲＦと一致することを確認した。
４）ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩでｐＨＴ００１を切断して、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断したｐＹＸ２２２ｘ（Iowa State UniversityのDr. Beom-Seok Seoより分与）に挿入した（ｐＨＴ００７と命名）。【００５０】
（３）ｐＨＴ００５(Ａｔ２ｇ２５６８０ プロモーター(２９０３ｂｐ)::ＧＵＳ)
１）Ｃｏｌ−０のゲノムＤＮＡを鋳型として、プロモーター５’(ＢａｍＨＩ)とプロモーター３’(ＮｃｏＩ)のプライマー（表１参照）の組み合わせでＡｔ２ｇ２５６８０の開始コドンから上流へ向けて２９０３ｂｐの領域を増幅した。
２）増幅した産物をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで切断して、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩで切断したｐＴＦ５３７（植物機能工学研究室の藤原博士が作製）に挿入した（ｐＨＴ００３と命名）。
３）ｐＨＴ００３をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断して、ＢａｍＨＩとＡｐａＩで切断したｐＴｋａｎ＋に挿入した（ｐＨＴ００５と命名）。【００５１】
（４）ｐＨＴ００６(Ａｔ２ｇ２５６８０ プロモーター(２９０３ｂｐ)::ｓＧＦＰ)
１）Ｃｏｌ−０のゲノムＤＮＡを鋳型として、プロモーター５’(ＢａｍＨＩ)とプロモーター３’(ＮｃｏＩ)のプライマー(表１参照)の組み合わせでＡｔ２ｇ２５６８０の開始コドンから上流へ向けて２９０３ｂｐの領域を増幅した。
２）増幅した産物をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで切断して、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩで切断したｐＴＦ５３８（ｐＨＴ００４と命名）。
３）ｐＨＴ００３をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断して、ＢａｍＨＩとＡｐａＩで切断したｐＴｋａｎ＋に挿入した（ｐＨＴ００６と命名）。【００５２】
［ＡＴ２Ｇ２５６８０の細胞内局在の解析］
Ａｔ２ｇ２５６８０の翻訳産物の細胞内局在を調べるために、ＡＴ２Ｇ２５６８０とＧＦＰとの融合タンパク質の細胞内局在を観察した。まず、植物細胞においてカリフラワーモザイクウィルス３５ＳＲＮＡプロモーター制御下でＡｔ２ｇ２５６８０の翻訳産物とＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのコンストラクト（ｐＨＴ０１０；図１参照）を作製した。次に、このプラスミドを付着させた金粒子を、チャンバー内の真空度を２８ inches Hgとしてヘリウム圧７．６ＭＰａでhelium-gas-driven particle accelerator (PDS-1000/He; BioRad)を用いてタマネギ表皮細胞へ導入した。導入後のタマネギ表皮細胞はＭＧＲＬ水耕液を染み込ませた濾紙の上に並べ、２２℃の暗所に１２時間静置した。このタマネギ表皮のＧＦＰ蛍光を、文献（Takano, J., Noguchi, K., YasuMori, M., Kobayashi, M., Gajdos, Z., Miwa, K., Hayashi, H., Yoneyama, T. and fujiwara, T. (2002) Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature 420: 337-340）記載の方法に従って観察した。【００５３】
［酵母の生育］
本実験に用いた酵母(Saccharomyces cerevisiae)はＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ  ｈｉｓ２ＤＯ  ｍｅｔ１５ＤＯ  ｕｒａ３ＤＯ）である。酵母の培養は常法に従った。培地は、Sherman(2002)の最少培地からＮａ２Ｍｏ４を除いて、２％グルコース、２０ｍｇ／ｌ  Ａｄｅ、３０ｍｇ／ｌ  Ｌ−Ｌｅｕ、２０ｍｇ／ｌ  Ｍｅｔ、２０ｍｇ／ｌ  Ｕｒａおよび２０ｍｇ／ｌ  Ｌ−Ｔｒｐを加えたもの(以下、「−ＭｏＳＤ培地」ということがある)を用いた。【００５４】
［酵母の形質転換］
酵母の形質転換には酢酸リチウム法(Rose, M. D., Winston, f. and Heiter, P. (1990) Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press)の変法を用いた。以下にその手順を示す。
（１）ＯＤ６００の値が０．４前後の酵母培養液１．５ｍｌを１／３０００ｒｐｍ、  ４℃、５ｓｅｃ．で遠心して上清を除いた。
（２）滅菌水で２回洗浄した。１回目は７５０μｌ、２回目は１００μｌの滅菌水を用いた。
（３）ＴＥ／ＬｉＡｃ buffer［１０×ＴＥ（ｐＨ７．５）５ｍｌ、１ＭのＬｉＡｃ（ｐＨ７．５）５ｍｌ、滅菌水４０ｍｌ］５０μｌを加えてよく懸濁し、１／３０００ｒｐｍ，４℃、５ｓｅｃ．で遠心して上清を除いた。
（４）ＴＥ／ＬｉＡｃ buffer５０μｌを加えてよく懸濁し、ＰＥＧ／ＬｉＡｃ buffer［１０×ＴＥ（ｐＨ７．５）５ｍｌ、１ＭのＬｉＡｃ（ｐＨ７．５）５ｍｌ、５０％（w/v）ＰＥＧ４００ ４０ｍｌ］２１０μｌを添加した。さらに、Salmon Sperm DNA［６ｍｇＤＮＡにＴＥ（ｐＨ７．５）１ｍｌを加え、３７℃で一昼夜攪拌］５μｌとプラスミド５μｌ（１μｇ）を添加してよく懸濁した。
（５）３０℃の恒温室に３０分間静置した。
（６）４２℃のヒートブロックに１５分間静置し、１／３０００ｒｐｍ，４℃，  １０ｓｅｃ．で遠心して上清を除いた。
（７）滅菌水１００μｌを加えて固形培地に菌体を播いた。【００５５】
［酵母を用いた輸送活性の測定］
酵母においてtriose phosphate isomeraseプロモーター制御下でＡｔ２ｇ２５６８０を過剰発現するためのコンストラクト(ｐＨＴ００７；図１参照)を作製した。次に、酢酸リチウム法の変法を用いた形質転換によりこのコンストラクトを酵母（Saccharomyces cerevisiae, ＢＹ４７４１）へ導入して、遺伝子導入株を得た。同様に、Ａｔ２ｇ２５６８０を含まないベクターのみを酵母へ導入して、対照株を得た。遺伝子導入株と対照株のシングルコロニーをそれぞれ別の−ＭｏＳＤ液体培地へ植菌して、３０℃，３００ｒｐｍで振盪培養した。【００５６】
酵母菌体のＭｏ濃度の測定は文献（Takano, J., Noguchi, K., YasuMori, M., Kobayashi, M., Gajdos, Z., Miwa, K., Hayashi, H., Yoneyama, T. and fujiwara, T. (2002) Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature 420: 337-340）記載の方法を一部変更して行った。６００ｎｍにおける吸光度の値を指標として遺伝子導入株と対照株のおおよその細胞密度をＯＤ６００の値が０．５となるように揃え、この培養液３０ｍｌの菌体を遠心によって回収した。回収した菌体を−ＭｏＳＤ液体培地または１．７×１０２ｎＭのＭｏＯ４２−を含む−ＭｏＳＤ液体培地２０ｍｌに再懸濁して、３０℃、３００ｒｐｍで３０分間振盪培養した。再び遠心により菌体を回収し、氷冷したｍｉｌｌｉＱを用いて洗浄を２回行い、そのまま菌体を乾燥させた。菌体は８０℃で４８時間以上乾燥させ、乾燥重量を測定した。酵母菌体のＭｏ濃度の測定は、シロイヌナズナの葉のＭｏ濃度測定と同様に行った。【００５７】
［Ａｔ２ｇ２５６８０の発現組織の解析］
Ａｔ２ｇ２５６８０が発現する組織を調べるために、Ａｔ２ｇ２５６８０の開始コドンから上流にむけて２９０３ｂｐのプロモーター領域にβ-glucuronidase (ＧＵＳ)遺伝子を連結したコンストラクト(pHT006; 図１参照)を作製した。アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens, GV3101; Koncz, C. and Schell, J. (1986) The proMoter of TL-ＤＮＡ gene 5 controls the tissue specific expression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol. Gen. Genet. 204: 383-396)を用いて減圧浸潤法(Clough, S. J. and Bent, A. f. (1998) floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-743)によりシロイヌナズナ野生型株（Ｃｏｌ−０）に形質転換した。この形質転換株から得た種子を、ClaForan ２５０ｍｇ／ｌ、Kanamycin ５０ｍｇ／ｌ、Agar ８ｇ／ｌおよび通常濃度の半分のムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類(Wako, Ｏsaka, Japan)を含む固形培地に播種して、Kanamycinへの耐性を示した株から種子を得て形質転換系統とした。形質転換系統のＧＵＳによる染色と切片の作製および観察は文献（Shibagaki, N., Rose, A., McDerMott, J. P., fujiwara, T., Hayashi, H., Yoneyama, T. and Davies, J. P. (2002) Selenate-resistant mutants of Arabidopsis thaliana identify Sultr1;2, a sulfate transporter required for efficient transport of sulfate into roots. Plant J. 29: 475-486）記載の方法に従った。【００５８】
Ａｔ２ｇ２５６８０の開始コドンから上流にむけて２０９３ｂｐのプロモーター領域にＧＦＰ遺伝子を連結したコンストラクト（ｐＨＴ００５；  図１参照）についても、同様にシロイヌナズナに形質転換した。ＧＦＰ蛍光の観察は文献（Takano, J., Noguchi, K.,YasuMori, M., Kobayashi, M., Gajdos, Z., Miwa, K., Hayashi, H., Yoneyama, T. and fujiwara, T. (2002) Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature420: 337-340）記載の方法に従った。【００５９】
［モリブデントランスポーターのミカエリス定数の決定］
Michaelis（ミカエリス）定数（Ｋｍ）は、あるトランスポーターの基質輸送速度が最大値の半分のときの基質濃度で、それぞれのトランスポーターに固有の値である。すなわち、本発明の場合、モリブデントランスポーターが培地から細胞内へモリブデンを輸送する速度が最大速度の半分になるときの培地のモリブデン濃度がＫｍとなり、この値はトランスポーターの重要な特徴を記述すると共に、どのような局面でそのトランスポーターが効果を発揮するかという応用/実用に際しての示唆を得ることができる。【００６０】
酵母菌体のＭｏ濃度の測定は文献（Takano, J., Noguchi, K., YasuMori, M.,Kobayashi, M., Gajdos, Z., Miwa, K., Hayashi, H., Yoneyama, T. and fujiwara, T. (2002)Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature 420: 337-340）記載の方法を一部変更して行った。６００ｎｍにおける吸光度の値を指標として遺伝子導入株（ｐＨＴ００７）と対照株のおおよその細胞密度をＯＤ６００の値が０．５となるように揃え、この培養液４０ｍｌの菌体を遠心によって回収した。回収した菌体を−ＭｏＳＤ液体培地または６．４×１０, ７．５×１０, ９．０×１０, １．１×１０２, １．５×１０２, ２．２×１０２, ７．４×１０２または１．６×１０３ｎＭのＭｏＯ４２−を含む−ＭｏＳＤ液体培地２０ｍｌに再懸濁して、３０℃、３００ｒｐｍで１５分間振盪培養した。再び遠心により菌体を回収し、氷冷したｍｉｌｌｉＱを用いて洗浄を２回行い、そのまま菌体を乾燥させた。菌体は８０℃で４８時間以上乾燥させ、乾燥重量を測定した。酵母菌体のＭｏ濃度の測定は、シロイヌナズナの葉のＭｏ濃度測定と同様に行った。【００６１】
結果は、縦軸にモリブデン輸送速度の逆数（1 / [モリブデン輸送速度]）、横軸に培地のモリブデン濃度の逆数（1 / [培地のモリブデン濃度]）をとったグラフに実測値をプロットした。反応速度論におけるMichaelis-Menten（ミカエリス-メンテン）式と呼ばれる数式より、このグラフ上に実験結果をプロットして結んだ直線と横軸との交点の値は−1／Ｋｍとなることを利用して、モリブデントランスポーターのミカエリス定数を決定した。【００６２】
［モリブデン欠乏環境下でのシロイヌナズナの生育］
モリブデンは植物体内において生育に必要な酵素の構成成分などとして利用されており、植物が生存するためにはその体内にある程度のモリブデンの存在が不可欠である。植物は土壌からモリブデンを体内に取り込み、モリブデンを必要とする器官・組織へ輸送するシステム有しており、仮にモリブデントランスポーターがその一翼を担うのであれば、このモリブデントランスポーターが正常に機能しない植物では、モリブデン輸送システムに不具合が生じ、結果として生育に異常が発生すると考えられる。【００６３】
そこで、モリブデントランスポーターの遺伝子に外来の遺伝子であるＴ−ＤＮＡが挿入されたことによって正しいモリブデントランスポーターを作ることができない前記シロイヌナズナ変異株（ＳＡＬＫ＿１１８３１１）と、シロイヌナズナ野性型株（Ｃｏｌ−０）を、モリブデン存在下／非存在下で栽培し、その生育を比較した。【００６４】
シロイヌナズナの栽培は文献（Hirai, M. Y., fujiwara, T., Chino, M. and Naito, S. (1995) Effects of sulfate concentrations on the expression of a soybean seedstorage protein gene and its reversibility in transgenic Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol. 36: 1/331-1/339）記載の方法を一部変更して行った。ＭＧＲＬ(fujiwara, T., Hirai, M. Y., Chino, M., Komeda, Y. and Naito, S. (1992)Effects of sulfur nutrition on expression of the soybean seed storage protein genes in transgenic petunia. Plant Physiol. 99: 263-268)水耕液またはそこから(ＮＨ４)６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏを除いた水耕液にSucrose １％, Gellan Gum １．２％を加えた固形培地に播種し、４℃で４８時間以上春化処理した。これらの固形培地には１．７×１０２ｎＭまたは２．０〜９．０ｎＭの範囲のＭｏＯ４２−が含まれる。人工気象器を用いて、明期１０時間／暗期１４時間の蛍光灯照明により２２℃で栽培した。【００６５】
［イネのＭｏＴＲ１相同遺伝子に関する酵母を用いた輸送活性の測定］
（１）ＯｓＭｏＴＲ１ expression vector
１）イネ（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）のゲノムＤＮＡを鋳型として、primer attB1 9636.m0012 (５’-aaaaagcaggcttaggcgagcagagaagagaaga−３’:配列番号５０) とprimer attB2 9636.m00012 (５’-agaaagctgggtgcggaacgagctgtattgagt−３’：配列番号５１) のプライマーの組み合わせでＯｓ０８ｇ０１１２０のＯＲＦを増幅した。
２）増幅した産物をＢＰ反応によってpDONR/Zeo vector (Invitrogen)に挿入した（ＯｓＭｏＴＲ１ entry vectorと命名）。
３）塩基配列解析により、挿入された配列がＯｓ０８ｇ０１１２０のＯＲＦと一致することを確認した。
４）ＯｓＭｏＴＲ１ entry vectorをＬＲ反応によりpYES-DEST52 vector (Invitrogen)と組み替えた（ＯｓＭｏＴＲ１ expression vectorと命名）。【００６６】
（２）ＯｓＭｏＴＲ２expression vector
１）イネ（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）のゲノムＤＮＡを鋳型として、primer attB1 m04384-ATG (５’-aaaaagcaggctatatggcatcctccgccggcga−３’：配列番号５２) とprimer attB2 m04384 (５’-agaaagctgggtatcaagcatctccagccccat−３’：配列番号５３) のプライマーの組み合わせでＯｓ０１ｇ４５８３０のＣＤＳを増幅した。
２）増幅した産物をＢＰ反応によってpDONR/Zeo vector (Invitrogen)に挿入した（ＯｓＭｏＴＲ２entry vectorと命名）。
３）塩基配列解析により、挿入された配列がＯｓ０１ｇ４５８３０のＣＤＳと一致することを確認した。
４）ＯｓＭｏＴＲ２entry vectorをＬＲ反応によりpYES-DEST52 vector (Invitrogen)と組み替えた（ＯｓＭｏＴＲ２ expression vectorと命名）。【００６７】
（３）酵母の生育
本実験に用いた酵母(Saccharomyces cerevisiae)はＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ  ｈｉｓ２ＤＯ  ｍｅｔ１５ＤＯ  ｕｒａ３ＤＯ）である。酵母の培養は常法に従った。培地は、Sherman(２００２)の最少培地からＮａ２Ｍｏ４を除いて、２％ガラクトース、３０ｍｇ／ｌ  Ｌ−Ｌｅｕ、２０ｍｇ／ｌ  Ｍｅｔ、２０ｍｇ／ｌ  Hisおよび２０ｍｇ／ｌ  Ｌ−Ｔｒｐを加えたもの(以下、「−ＭｏＳＤ培地」ということがある)を用いた。ただし、［酵母を用いた輸送活性の測定］以外では２％ガラクトースを２％グルコースに置き換えた培地を用いた。形質転換は前記記載の方法と同様に行った。【００６８】
（４）酵母を用いた輸送活性の測定
酵母においてＧＡＬ１プロモーター制御下でＯｓ０８ｇ０１１２０またはＯｓ０１ｇ４５８３０を過剰発現するためのコンストラクト(ＯｓＭｏＴＲ１ expression vectorならびにＯｓＭｏＴＲ２ expression vector)を作製した。次に、酢酸リチウム法の変法を用いた形質転換によりこのコンストラクトを酵母（Saccharomyces cerevisiae, ＢＹ４７４１）へ導入して、遺伝子導入株を得た。同様に、pYES2 vectorを酵母へ導入して、対照株を得た。遺伝子導入株と対照株のシングルコロニーをそれぞれ別の−ＭｏＳＤ液体培地へ植菌して、３０℃，３００ｒｐｍで振盪培養した。酵母菌体のＭｏ濃度の測定は、前記記載の方法と同様に行った。
【実施例２】
【００６９】
（結果）
［シロイヌナズナの葉におけるＭｏ濃度に関するＱＴＬ解析］
本発明者らは、シロイヌナズナのアクセッションＣｏｌ−０とＬｅｒの葉の元素組成を比較して、Ｃｏｌ−０の葉のＭｏ濃度はLerの約３倍であることを発見した。さらに、Ｃｏｌ−０とＬｅｒを掛け合わせたＲＩライン１８系統を用いたＱＴＬ解析により、葉のＭｏ濃度を支配するQTLが染色体２番上腕に存在する２つの遺伝マーカーｍｉ２３８とｅｒにはさまれた領域に存在することを見い出した。【００７０】
そこで、葉のＭｏ濃度を決定する遺伝子を同定するために、遺伝マーカーｍｉ２３８とｅｒの間に組換えがあるＲＩライン１６系統(CL 36, 59, 84, 90, 160, 177, 179, 191, 194, 237, 253, 295, 303, 358, 370, 395 ; Lister, C. and Dean, C. (1993) Recombinant inbred lines for mapping RfLP and phenotypic markers in Arabidopsis-thaliana. Plant J.4: 745-750)について、その遺伝子型と葉のＭｏ濃度を調べた。結果を表２に示す。それぞれのＲＩ系統はＣＬ番号で示した。また、ＲＩ系統と同時に栽培したＣｏｌ−０とＬｅｒのＭｏ濃度の中間値を基準として、それよりＭｏ濃度が高いもの(High)と低いもの(Low)とに区別した。遺伝子型はＳＳＬＰマーカーによって判別した(C:Col-0, L:Ler, ＃:not clearly determined)。SNP60とSGCSNP300の間に組換えがある系統をrecombinantと示した。遺伝マーカーは染色体上にｍｉ２３８、ＳＮＰ６０、ＳＧＣＳＮＰ３００、ｅｒの順に存在している。これ以降、ｍｉ２３８側を上流として、ｅｒ側を下流として表記する。【００７１】
【表２】
0005011101.tif 000003
【００７２】
葉のＭｏ濃度が高い(Ｃｏｌ−０型の表現型を示す)ＣＬ  ８４の遺伝子型はＳＮＰ６０とＳＧＣＳＮＰ３００に挟まれた領域でＣｏｌ−０型からＬｅｒ型に組換わっており、葉のＭｏ濃度が低い(Ｌｅｒ型の表現型を示す)ＣＬ  １９１の遺伝子型はＳＮＰ６０とＳＧＣＳＮＰ３００に挟まれた領域でＬｅｒ型からＣｏｌ−０型に組換わっていた。これらの結果は、目的の遺伝子がＳＮＰ６０よりも下流に存在することを意味する。また、葉のＭｏ濃度が高いＣＬ  １７７の遺伝子型はｍｉ２３８とＳＮＰ６０に挟まれた領域およびＳＮＰ６０とＳＧＣＳＮＰ３００に挟まれた領域でＣｏｌ−０型からＬｅｒ型に組換わっていた。この結果は、目的の遺伝子がｍｉ２３８よりも下流かつＳＧＣＳＮＰ３００よりも上流に存在することを意味する。したがって、目的の遺伝子はＳＮＰ６０とＳＧＣＳＮＰ３００に挟まれた領域に存在することが示唆された。【００７３】
さらに、目的遺伝子の存在する領域を限定するために、Ｃｏｌ−０とＬｅｒを掛け合わせたＦ１世代を自家受粉させて得たＦ２世代６２系統から、Ｆ１／３Ｂ１５_０１とＴ１９Ｌ１８に挟まれた領域に組換えがある２１系統を選抜した。これらの株についてその遺伝子型と葉のＭｏ濃度を調べた。結果を表３に示す。Ｆ２系統をＭｏ濃度によって分けて、その番号(Ａ０２−Ｅ７２)を示す。組換え体を選抜したので、番号は連続していない。選抜された系統と同時に栽培したＣｏｌ−０とＬｅｒのＭｏ濃度の中間値を基準として、それよりＭｏ濃度が高いもの(Ｈｉｇｈ)と低いもの(Ｌｏｗ)とに区別した。遺伝子型はＳＳＬＰマーカー(表１参照)によって判別した（C:Col-0, L:Ler, H:ヘテロ, ＃:not clearly determined, -:not tested）。Ｆ１／３Ｂ１５_０２とＦ１７Ｈ１５の間にＣｏｌ−０からＬｅｒまたはヘテロからＬｅｒの組換えがある系統をrecombinantと示した。なお、遺伝マーカーは上流からＳＮＰ６０、Ｆ１／３Ｂ１５_０１、Ｆ１／３Ｂ１５_０２、Ｆ３Ｎ１１_０１、Ｆ３Ｎ１１_０２、Ｆ１７Ｈ１５、 Ｔ１９Ｌ１８、ＳＧＣＳＮＰ３００の順に存在している。【００７４】
【表３】
0005011101.tif 000004
【００７５】
葉のＭｏ濃度が高いＣ０８の遺伝子型はＦ１／３Ｂ１５_０２とＦ３Ｎ１１に挟まれた領域でＣｏｌ−０型からＬｅｒ型に組換わっていた。また、葉のＭｏ濃度が低いＣ１０の遺伝子型はＦ１／３Ｂ１５_０２とＦ１／３Ｎ１１に挟まれた領域でＬｅｒ型からヘテロ型に組換わっており、Ｆ３Ｎ１１_０２とＦ１７Ｈ１５に挟まれた領域でＬｅｒ型からＣｏｌ−０型に組換わっていた。これらの結果は、目的の遺伝子がＦ１／３Ｂ１５_０２よりも下流かつＦ１７Ｈ１５よりも上流に存在することを意味する。【００７６】
この遺伝解析により、目的の遺伝子の存在する領域は２つのＳＳＬＰマーカーＦ１／３Ｂ１５_０２とＦ１７Ｈ１５に挟まれた１７２ｋｂに限定された。【００７７】
［Ａｔ２ｇ２５６８０に外来遺伝子断片（Ｔ−ＤＮＡ）が挿入された遺伝子破壊株のＴ−ＤＮＡ挿入位置］
Ｆ１／３Ｂ１５_０２とＦ１７Ｈ１５_０１に挟まれた１７２ｋｂの領域には、硫酸イオントランスポーター相同遺伝子Ａｔ２ｇ２５６８０が存在していた。この遺伝子は硫酸トランスポーターと共通のドメインをもつが、その機能は解析されていなかった（非特許文献１７）。硫黄とＭｏはＳＯ４２−およびＭｏＯ４２−として植物に吸収されること（非特許文献９）およびＮａ２ＳＯ４の施用が植物のＭｏ蓄積を抑制すること(非特許文献１１)から、硫酸イオントランスポーターに相同なＡｔ２ｇ２５６８０がＭｏ吸収に関与している可能性が考えられた。また、データベースに登録されたＣｏｌ−０のＡｔ２ｇ２５６８０の配列(非特許文献１４)をLerの配列(Jander, G., Norris, S. R., Rounsley, S. D., Bush, D. f., Levin, I. M. and Last, R. L. (2002) Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129: 440-450)と比較すると、４３９番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がLerではバリンに置換されており、さらに開始コドンの上流２７番目から７９番目までの塩基がＬｅｒでは欠損していることが判明した。【００７８】
そこで、Salk InstituteよりＡｔ２ｇ２５６８０またはその近傍に外来遺伝子断片(Ｔ−ＤＮＡ)が挿入された独立な２系統の遺伝子破壊株ＳＡＬＫ_１１８３１１とＳＡＬＫ_０６９６８３の分与を受けた。これらの系統について、Ｔ−ＤＮＡ挿入予測位置の上流と下流のそれぞれの塩基配列に相同なプライマーとＴ−ＤＮＡの内部配列に相同なプライマーを用いてＰＣＲを行い、挿入遺伝子をホモにもつ系統をそれぞれ選抜した。さらに、これらの選抜された系統について、挿入されたＴ−ＤＮＡとゲノムＤＮＡとの境界付近の塩基配列解析を行った。野生型株(Ｃｏｌ−０)の塩基配列との比較により、ＳＡＬＫ_１１８３１１では転写開始点から６７４番目の塩基の位置にleft borderが、ＳＡＬＫ_０６９６８３では転写開始点から上流に向かって４１９番目の塩基の位置にleft borderがそれぞれ挿入されていることが判明した(図２)。【００７９】
［Ａｔ２ｇ２５６８０遺伝子破壊株の表現型］
Ａｔ２ｇ２５６８０の変異がシロイヌナズナの生長に及ぼす影響を調べるために、ＳＡＬＫ_１１８３１１とＳＡＬＫ_０６９６８３の表現型を確認した。変異株と野生型株Ｃｏｌ−０およびＬｅｒをロックウールに播種し、ＭＧＲＬ水耕液を用いて３０日間栽培した。このＭＧＲＬ水耕液に含まれるＭｏの濃度は、２．０−９．０ｎＭの範囲（以下「Ｍｏ欠乏条件」という）または１．７×１０２ｎＭ（以下「Ｍｏ充分条件」という）である。【００８０】
Ｍｏ欠乏条件下では、変異株の葉にはクロロシスが生じ、萎縮した細長い形になる形態異常が現れた。しかし、この表現型は野生型株のＣｏｌ−０およびＬｅｒにおいても観察された。葉に生育阻害が現れる時期およびその程度は、変異型と野生型の間に差はなかった。【００８１】
一方で、Ｍｏ充分条件下では変異株と野生型株のいずれにも葉の形態異常は観察されなかった。しかしながら、Ｍｏ充分条件下で栽培した変異株と野生型株の葉のＭｏ濃度を測定すると、変異株のＭｏ濃度は野生型株（Ｃｏｌ−０）の約１／３に低下していた。特に、ＳＡＬＫ_１１８３１１のＭｏ濃度はＬｅｒよりも低かった(図３)。また、ＳＡＬＫ_１１８３１１とＳＡＬＫ_０６９６８３とを掛け合わせて得たＦ１世代の葉のＭｏ濃度はＣｏｌ−０の約１／３であり、Ｍｏ濃度が低いという表現型は相補されなかった。この結果は、Ａｔ２ｇ２５６８０がシロイヌナズナの葉のＭｏ濃度を決定する遺伝子であることを示唆する。【００８２】
変異株の葉においてＭｏ濃度が低下する表現型の遺伝形式を調べるために、Ａｔ２ｇ２５６８０変異株と野生型株(Ｃｏｌ−０)を戻し交雑した後代の表現型を調べた。まず、ＳＡＬＫ_１１８３１１とＳＡＬＫ_０６９６８３をそれぞれ野生型株（Ｃｏｌ−０）とを掛け合わせてＦ１種子を得た。このＦ１世代の株をＭｏ充分条件下で３０日間栽培して葉のＭｏ濃度を測定したところ、Ｆ１世代のＭｏ濃度は親となった変異株と野生型株の濃度のおよそ中間の値を示した。【００８３】
次に、ＳＡＬＫ_１１８３１１とＣｏｌ−０を掛け合わせたＦ１世代の株を自家受粉させてＦ２種子を得た。このＦ２世代の株について、Ｆ１世代と同様に葉のＭｏ濃度を測定するとともに、ＰＣＲを用いてＡｔ２ｇ２５６８０へのＴ−ＤＮＡ挿入の有無を確認した。Ｔ−ＤＮＡが挿入されていない株のＭｏ濃度はＣｏｌ−０とほぼ同じであり、挿入遺伝子をホモにもつ株のＭｏ濃度はＬｅｒよりも低かった。さらに、挿入遺伝子をヘテロに持つ株のＭｏ濃度はこれらの株のおよそ中間の値を示した(図４)。この結果は、葉のＭｏ濃度の低下がＡｔ２ｇ２５６８０の変異によって起こっていることを支持するとともに、この変異は半優性であることを示唆する。これらの結果から、変異株の葉のＭｏ濃度が低下した原因はＡｔ２ｇ２５６８０の変異であることが確定したので、この遺伝子をＭｏＴＲ１と命名した(以下、ＳＡＬＫ_１１８３１１をＭｏＴＲ１-1、ＳＡＬＫ_０６９６８３をＭｏＴＲ１-２と呼ぶ)。【００８４】
なお、Ｍｏ充分条件下で栽培した実験に用いた全ての系統において、葉の形態異常は観察されなかった。【００８５】
［ＭｏＴＲ１の細胞内局在］
膜タンパク質のデータベース(ARAMEMNＯN, http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/)における検索により、ＭｏＴＲ１は膜貫通領域を７−1２個もつと予測された。そこで、翻訳産物が細胞のどの膜に局在するかを調べるために、カリフラワーモザイクウィルス３５ＳＲＮＡプロモーター制御下でＭｏＴＲ１とＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのコンストラクト（ｐＨＴ０１０；図１参照）を作製し、タマネギ表皮細胞に導入した。他のタンパク質と融合していないＧＦＰは核と細胞質に検出されることが報告されている(Chiu, W., Niwa, Y., Zeng, W., Hirano, T., Kobayashi, H. and Sheen, J. (1996) Engineered GfP as a vital reporter in plants. Curr. Biol. 6: 325−330)。レーザー共焦点顕微鏡による観察では、融合タンパク質の蛍光は細胞の外縁部に局在した(図５)。この結果は、ＭｏＴＲ１が細胞膜タンパク質であることを示唆する。  【００８６】
［ＭｏＴＲ１のＭｏ輸送能］
ＭｏＴＲ１は細胞膜タンパク質であることが示唆されたことにより、ＭｏＴＲ１はＭｏ輸送能をもつ可能性が考えられた。そこで、ＭｏＴＲ１のＭｏ輸送能を調べるために、酵母においてＭｏＴＲ１を発現するためのコンストラクト（ｐＨＴ００７；図１参照）を作製して、酵母に導入した。この遺伝子導入株と対照株(vector control)を、Ｍｏを加えていない培地に植菌して継代培養を行った。このとき、遺伝子導入株の増殖速度は対照株よりも遅かった。ＯＤ６００の値が同じになるように植え継いだとき、対照株の植え継ぎ１６時間後のＯＤ６００の値と遺伝子導入株の植え継ぎ１９時間後のＯＤ６００の値はほぼ等しかった。【００８７】
遺伝子導入株と対照株のおおよその細胞密度をＯＤ６００の値が０．５となるように揃え、遠心で回収した菌体を１．７×１０２ｎＭのＭｏＯ４２−を含む培地に再懸濁して３０分間振盪培養した。菌体のＭｏ濃度を測定したところ、遺伝子導入株の濃度は対照株の８０倍以上に上昇していた（図６）。この結果は、ＭｏＴＲ１がＭｏ輸送体であることを示唆する。【００８８】
［ＭｏＴＲ１の発現組織］
ＭｏＴＲ１が発現する組織を調べるために、ＭｏＴＲ１の開始コドンから上流２９０３ｂｐの領域とβ-glucuronidase (ＧＵＳ)遺伝子を連結して、シロイヌナズナに形質転換した。発芽後７日目の独立な遺伝子導入株１６系統において、地上部では葉柄と葉の外縁部でＧＵＳ活性が認められた（図７Ｂおよび７Ｃ）。根では、根端にＧＵＳ活性が認められ、根端から１−６ｍｍの領域では活性が認められなかった(図７Ａ及び７Ｆ)。その上部では内鞘にＧＵＳ活性が観察され、さらに側根が認められる領域よりも上部では皮層に活性が観察された（図７Ｄ，７Ｈ，７Ｉ及び７Ｊ）。レポーターとしてＧＦＰを用いた場合も、結果は同様であった（図７Ｅ及び７Ｇ）。【００８９】
[ミカエリス定数の決定]
それぞれのＭｏ濃度の培地で１５分間培養した酵母内のＭｏ濃度は６．４×１０ｎＭ のＭｏ培地から順に、５．８, ６．０, ６．２, ６．６, ７．０, ６．９, ７．８, ７．３ (Ｍｏ[μｇ]／Dry weight[ｇ])であった。縦軸にモリブデン輸送速度の逆数（1 / [モリブデン輸送速度]）、横軸に培地のモリブデン濃度の逆数（1 / [培地のモリブデン濃度]）をとったグラフを作成した（図８参照）。実測値をプロットして結んだ直線はｙ＝２．６８４６×０．１３０３（Ｒ２＝０．９３２７）であり、Ｋｍは数十ｎＭであることが明らかになった。【００９０】
［モリブデン欠乏環境下でのシロイヌナズナの生育］
図９にシロイヌナズナ（野生型株、変異株）を各条件で３週間栽培した結果を示す。（Ａ）はモリブデン存在下で栽培したもの、（Ｂ）はモリブデン非存在下で栽培したものである。それぞれのプレートには左から野性型株５個体，変異株５個体, 野性型株５個体, 変異株５個体の順に２０個体のシロイヌナズナが植えられている。モリブデンを与えた条件の（Ａ）のプレートでは野生型株と変異株がほぼ同程度に生育したのに対し、モリブデンを与えなかった（Ｂ）のプレートでは野性型株の生育も抑制されたが、変異株の生育は著しく抑制された。【００９１】
［イネのＭｏＴＲ１相同遺伝子に関する酵母を用いた輸送活性］
イネのＭｏＴＲ１、ＭｏＴＲ２のＭｏ輸送活性について検討した結果を図１０に示す。Ｍｏを含む培地で１５分間インキュベーションした場合、イネのＭＯＴＲ1相同遺伝子２種それぞれを発現させた酵母は、ベクターコントロールの酵母と比較して酵母内Ｍｏ濃度の増加量が多いことが明らかとなった。
【実施例３】
【００９２】
（考察）
［ＭｏＴＲ１の表現型］
Ａｔ２ｇ２５６８０にＴ−ＤＮＡが挿入された遺伝子破壊株(ＭｏＴＲ１-１および ＭｏＴＲ１-２)を１．７×１０２ ｎＭのＭｏＯ４２−を含むＭＧＲＬ水耕液で栽培すると、葉のＭｏ濃度は野生型株の約１／３に低下した(図３)。また、ＭｏＴＲ１−１およびＭｏＴＲ１−２の葉におけるＭｏ濃度は、挿入遺伝子をヘテロにもつ系統では野生型株(Ｃｏｌ−０)の約１／２、挿入遺伝子をホモにもつ系統では野生型株の約１／１０にそれぞれ低下した(図４)。これらの結果から、ＭｏＴＲ１において葉のＭｏ濃度が低下する変異は半優性であることが示唆された。【００９３】
一方で、ＭｏＴＲ１−１および ＭｏＴＲ１−２は葉のＭｏ濃度低下の他に特徴的な表現型を示さなかった。１．７×１０２ｎＭのＭｏＯ４２−を含む水耕液で栽培したとき、栄養生長期と生殖生長期を通してＭｏＴＲ１−１およびＭｏＴＲ１−２が生育阻害を受けることはなかった。ＭｏＴＲ１−１およびＭｏＴＲ１−２から得た種子は正常に発芽した。さらに、ＭｏＯ４２−を加えない水耕液で栽培したときのＭｏ欠乏感受性ならびにＮＯ３−濃度が１／５０の水耕液で栽培したときの窒素欠乏感受性を調べたが、ＭｏＴＲ１−１およびＭｏＴＲ１−２と野生型株の間でこれらの環境における生育阻害の程度に明らかな差はなかった。【００９４】
Ｍｏを含む補酵素であるＭｏコファクターの含有量が少ない変異株(ｃｈｌ２)は、硝酸還元酵素の活性が低下することにより、過塩素酸に対する耐性とタングステン酸に対する感受性という特徴的な表現型を示すことが報告されている(非特許文献７)。１．７×１０２ｎＭのＭｏＯ４２−を含む水耕液に２ｍＭ ＫＣｌＯ３または０．１ｍＭ Ｎａ２ＷＯ4を添加して栽培したｃｈｌ２はそれらの特徴的な表現型を示すが、これらの条件でＭｏＴＲ１−１およびＭｏＴＲ１−２と野生型株を栽培してもその表現型に明らかな差は現れなかった。【００９５】
これらの生理実験の結果は、ＭｏＴＲ１の生育に必要な水耕液のＭｏＯ４２−濃度は１．７×１０２ｎＭより少ないことを示すとともに、野生型株では必要量以上のＭｏＯ４２−が体内に蓄積していることを示唆する。シロイヌナズナのＭｏ貯蔵機構については分かっていないが、本実験の条件では野生型株の葉のＭｏ濃度は生育期間に比例する。生育段階をおってＭｏＴＲ１の発現組織を調べることがＭｏ貯蔵機構の解明につながると期待される。【００９６】
［ＭｏＴＲ１のＭｏ輸送能］
ＭｏＴＲ１は細胞膜タンパク質をコードする遺伝子であった(図５)。ＭｏＴＲ１がシロイヌナズナの葉のＭｏ濃度を決定する仕組みとして、２つの機構の仮説を立てた。ひとつはＭｏＴＲ１が輸送体としてＭｏの輸送を直接的に制御する機構であり、もうひとつはＭｏＴＲ１がセンサーとしてＭｏ濃度の変化を感知して別のタンパク質のＭｏ輸送活性を調節することで、Ｍｏの輸送を間接的に制御する機構である。本研究では、ＭｏＴＲ１を酵母に発現させてＭｏ濃度を測定した。もしＭｏＴＲ１がセンサーであるならば、シロイヌナズナと同様のシグナル伝達機構およびそのシグナルに応答するＭｏ輸送体が酵母にも存在していないかぎり、菌体のＭｏ濃度は上昇しないと考えられる。一方で、ＭｏＴＲ１がＭｏ輸送体であるならば、翻訳産物が細胞膜に局在して活性をもちさえすれば、菌体のＭｏ濃度に何らかの影響を及ぼすことが推定される。ＭｏＴＲ１を発現させた酵母でＭｏ濃度が野生型株の８０倍以上に上昇したことは、ＭｏＴＲ１がＭｏ輸送体であることを示唆している(図６)。【００９７】
ＭｏＴＲ１のＭｏ輸送能の特性を推測するために、菌体内のＭｏ濃度を概算した。一般に、ＯＤ６６０の値が０．５前後の酵母培養液には新鮮重にして約１／３ｍｇ／ｍｌの菌体が存在し、このとき乾燥重は約０．４ｍｇ／ｍｌとなると考えられている(Sherman, 2002)。今回の推算では、本研究において１．７×１０２ｎＭのＭｏＯ４２−を含む培地へ移して３０分間振盪培養した酵母の新鮮重／乾燥重の比が先の例に従うと仮定し、新鮮重と乾燥重の差を菌体内の液体量とみなした。これらの仮定の下で算出した振盪培養後のＭｏ濃度は約２５０μＭであった。したがって、ＭｏＴＲ１はＭｏを濃度勾配に逆らって濃縮する能力をもつ輸送体と考えられる。【００９８】
［ＭｏＴＲ１の発現組織と発現誘導］
Ａｔ２ｇ２５６８０の開始コドンから上流約２．９ｋｂのプロモーター領域にＧＵＳ遺伝子を連結した形質転換株では、組織特異的なＧＵＳ活性が認められた(図７)。根での発現パターンはこれまでに報告されている硝酸イオントランスポーターＡｔＮＲＴ１．１のものと類似している(Guo, f. Q., Wang, R., Chen, M. and Crawford, N. M. (2001) TheArabidopsis dual-affinity nitrate transporter gene AtNRT1.1 (CHL1) is activatedand functions in nascent organ development during vegetative and reproductive growth. Plant Cell 1/3: 1761-1777)。ＡｔＮＲＴ１．１が発現している組織はＮＯ３−濃度が高まることから、それらの組織では硝酸還元酵素の活性が上昇していることが推測される。窒素代謝経路の重要な反応を担う硝酸還元酵素はＭｏを含む酵素のひとつである。したがって、ＭｏＴＲ１はＡｔＮＲＴ１．１と同じ組織で発現してＭｏを硝酸還元酵素に供給することで窒素代謝に寄与している可能性がある。【００９９】
成熟根でのＧＵＳ活性は、根端側では内鞘に活性が認められ、側根が認められる領域よりも上部では皮層に活性が観察された。側根原基は内鞘に形成されるが(Casimiro, I., Beeckman, T., Graham, N., Bhalerao, R., Zhang, H., Casero, P., Sandberg, G. and Bennett, M. J. (2003) Dissecting Arabidopsis lateral root development. Trends Plant Sci. 8: 165-171)、chicoryの側根原基形成部位にはその形成過程で硝酸還元酵素が発現することが報告されている(Vuylsteker, C., Prinsen, E., Boutin, J., onckelen, H.V. and Rambour, S. (1998) Evidence for nitrate reductase expression during initiation of lateral roots by NAA in chicory. J. Exp. Bot.49: 937-944)。また、シロイヌナズナにおいても根圏のＮＯ3-濃度が側根形成を支配することが示されている(Zhang, H. and forde, B. G. (2000) Regulation of Arabidopsis root development by nitrate availability. J. Exp. Bot. 51: 51-59)。側根が形成される部位の前後でＭｏＴＲ１の発現組織が変化することは、ＭｏＴＲ１がＭｏの供給による硝酸還元酵素の活性化を介して側根の形成に関与していることを示唆しているのかもしれない。様々な濃度のＮＯ３−とＭｏＯ４２−を含む水耕液でＭｏＴＲ１を栽培したとき側根の形成に変化が生じるかを確認することにより、変異株の新たな表現型が見つかる可能性がある。【０１００】
[ミカエリス定数]
求められたミカエリス定数は他の植物必須元素とそのトランスポーターより報告されているものと比較して非常に小さな値であり、このモリブデントランスポーターとモリブデンとが高い親和性を有することを示唆している。【０１０１】
［モリブデン欠乏環境下でのシロイヌナズナの生育］
モリブデン欠乏環境下でのシロイヌナズナの生育を検討した結果、モリブデン非存在下では野性型株の生育も抑制されたが、変異株の生育は顕著に抑制されたことから、モリブデントランスポーターが正常に機能しないシロイヌナズナはモリブデン欠乏に弱くなること、ひいては野性型株でのモリブデントランスポーターの重要性が示唆された。すなわち、本発明のモリブデントランスポーターは、モリブデンが少ない環境下でのシロイヌナズナの生育において重要な役割を担っていることが確認された。【０１０２】
［イネのＭｏＴＲ１相同遺伝子を発現させた酵母のＭｏ濃度］
２種のイネのＭｏＴＲ１相同遺伝子のＭｏ輸送活性について検討したところ、該遺伝子を発現させた酵母はベクターコントロールの酵母よりも酵母内Ｍｏ濃度の増加量が多かったことから、イネのＭｏＴＲ１相同遺伝子がコードするタンパク質はモリブデンを輸送する活性を持つと考えられる。【０１０３】
一方、ＭｏＴＲ１は硫酸イオントランスポーターと相同なドメインをもつことから(Takahashi, H., Noji, M., Hirai, M. Y. and Saito, K. (2003) Molecular regulation of assimilatory sulfur metabolism in plants. Tanpakushitsu Kakusan Koso 48: 2121-2129, in Japanese)、ＭｏＴＲ１の発現量は培地中の硫酸イオン濃度に依存して調節されている可能性がある。硫黄と窒素はアミノ酸の構成元素であり、植物体内における硫黄と窒素の比はそれぞれの同化経路の接点であるo-acetylserinをシグナル分子としたフィードバック調節機構によって制御されることが報告されている（Kim, H., Hirai, M. Y., Hayashi, H., Chino, M., Naito, S. and fujiwara, T. (1999) Role of o-acetyl-L-serine in the coordinated regulation of the expression of a soybean seed storage-protein gene by sulfur and nitrogen nutrition. Planta 209: 282-289）。Ｍｏは硝酸還元酵素に含まれる元素であり、植物体内におけるＭｏの存在量はアミノ酸の生合成に利用可能な窒素の量を決定する要素である。したがって、ＭｏＴＲ１の発現量が培地中の硫酸イオン濃度に依存して調節されるならば、これは既知のフィードバック調節機構とは異なる、土壌からのＭｏの吸収を介した硫黄と窒素の比の調節機構であると考えられる。【０１０４】
また、地上部で発現したＭｏＴＲ１は根から導管を通して輸送されてきたＭｏを葉へ分配する役割を担うことが推測される。植物のＭｏ欠乏に対してはＭｏの葉面散布が有効であり、Ｍｏは篩管を通じて転流されることが報告されている(非特許文献９)。栄養生長後期および生殖生長期におけるＭｏＴＲ１の発現パターンを調べることで、植物のＭｏの分配戦略を解析する手掛りが得られると期待される。【０１０５】
［ＭｏＴＲ１の相同遺伝子］
シロイヌナズナの全遺伝子配列(The Arabidopsis Genome Initiative, ２000)を対象としてＢＬＡＳＴ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２、ＦＡＳＴＡ (http://www.arabidopsis.org/)のそれぞれの手法でＭｏＴＲ１の翻訳領域と高い相同性をもつ遺伝子を検索したところ、これらに共通して相同性が高いと判断される遺伝子は存在しなかった。また、これまでに細菌や古細菌で同定されたＭｏ輸送体はいずれもABC-type transporterであり(非特許文献１０)、それらの配列とＭｏＴＲ１との相同性は低い。【０１０６】
一方で、ＭｏＴＲ１は硫酸イオントランスポーターと相同なドメインをもつ (Takahashi, H., Noji, M., Hirai, M. Y. and Saito, K. (2003) Molecular regulation of assimilatory sulfur metabolism in plants. Tanpakushitsu Kakusan Koso 48: 2121-2129, in Japanese)。ゲノムＤＮＡの配列解析からシロイヌナズナには少なくとも１４個の硫酸イオントランスポーターが存在することが推定されており、これらは硫酸イオントランスポーターファミリーを構成していると考えられている。高橋らはこのファミリーを配列の相同性によりさらに５つのグループに分類し、ＭｏＴＲ１はグループ５(Sultr5)に属するとされた。この分類では、グループ５は本論文でＭｏＴＲ１と名付けたＡｔ２ｇ２５６８０(Sultr5;２)とＡｔｉｇ８０３１０(Sultr5;1)の２つの遺伝子により構成されている。このグループの遺伝子とその他のグループの遺伝子との相同性はその他の４つのグループ間における相同性よりも低い(非特許文献１７)。また、グループ５の遺伝子の翻訳産物の硫酸イオン輸送活性を確認したとの報告はない。【０１０７】
したがって、ＭｏＴＲ１はＭｏ輸送能に加えて硫酸イオン輸送能を有する可能性がある。逆に、硫酸イオントランスポーターファミリーに属するその他の遺伝子、特にＡｔ１ｇ８０３１０の翻訳産物がＭｏ輸送能を有することも考えられる。また、硫酸イオントランスポーターファミリーは、土壌中の硫酸イオン濃度の変化に対して高親和型のトランスポーターと低親和型のトランスポーターが巧みに協調して対応することで、外部環境に関わらず植物体内の硫酸イオン濃度を一定に保つ機構を構築している(非特許文献１７)。したがって、もしＡｔ１ｇ８０３１０がＭｏ輸送体であるならば、Ｍｏの吸収と輸送についても類似した機構によってＭｏＴＲ１(Sultr5;２)とＡｔ１ｇ８０３１０(Sultr5;1)がそれぞれ高親和型または低親和型のＭｏ輸送体として協調した対応をしている可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明のモリブデントランスポーターや、それをコードするモリブデントランスポーター遺伝を用いると、植物のモリブデン吸収を制御して生産性を高めたり、動物細胞に導入して細胞の活性を制御したり、環境中からのモリブデンの除去に応用できる可能性がある。
【図１】
0005011101.tif 000005
【図２】
0005011101.tif 000006
【図３】
0005011101.tif 000007
【図４】
0005011101.tif 000008
【図５】
0005011101.tif 000009
【図６】
0005011101.tif 000010
【図７】
0005011101.tif 000011
【図８】
0005011101.tif 000012
【図９】
0005011101.tif 000013
【図１０】
0005011101.tif 000014
【配列表】
0005011101000001.app