(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の存在下および非存在下に、β−アミロイド１−４０を血管内皮前駆細胞と接触させ、両条件下における該細胞の分化の程度を比較することを含む、β−アミロイド１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
被験物質の存在下および非存在下に、β−アミロイド１−４０を幹細胞と接触させ、両条件下における該細胞の内皮前駆体への分化の程度を比較することを含む、β−アミロイド１−４０の幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
被験物質の存在下および非存在下に、β−アミロイド１−４０をプロテインキナーゼＢ活性を発現し得る細胞と接触させ、両条件下におけるプロテインキナーゼＢの活性を比較することを含む、β−アミロイド１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
下記工程を含む、β−アミロイド１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質の存在下、β−アミロイド１−４０を血管内皮前駆細胞と接触させる工程
（２）上記（１）で接触させた細胞における分化の程度を測定し、被験物質の非存在下でβ−アミロイド１−４０と接触させた対照細胞における分化の程度と比較する工程
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、β−アミロイド１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害した被験物質を選択する工程。
【請求項５】
下記工程を含む、β−アミロイド１−４０の幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質の存在下、β−アミロイド１−４０を幹細胞と接触させる工程
（ｂ）上記（ａ）で接触させた細胞における内皮前駆体への分化の程度を測定し、被験物質の非存在下でβ−アミロイド１−４０と接触させた対照細胞における分化の程度と比較する工程
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、β−アミロイド１−４０の幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害した被験物質を選択する工程。
【請求項６】
下記工程を含む、β−アミロイド１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質の存在下、β−アミロイド１−４０をプロテインキナーゼＢの活性を発現し得る細胞と接触させる工程
（ｉｉ）上記（ｉ）で接触させた細胞におけるプロテインキナーゼＢの活性を測定し、被験物質の非存在下でβ−アミロイド１−４０と接触させた対照細胞におけるプロテインキナーゼＢの活性と比較する工程
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の比較結果に基づいて、β−アミロイド１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する被験物質を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、β−アミロイド１−４０（以下、Ａβ１−４０とも称す）の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質ならびに／または血管新生を促進する物質を有効成分とする、アルツハイマー病の予防・治療剤に関する。また、本発明は、Ａβ１−４０のプロテインキナーゼＢ（以下、Ａｋｔ／ＰＫＢとも称す）活性抑制作用を阻害する物質を有効成分とする、アルツハイマー病の予防・治療剤に関する。さらに本発明は、アルツハイマー病の予防・治療剤となり得る、Ａβ１−４０の、血管内皮前駆細胞の分化抑制作用を阻害する物質、Ａβ１−４０の幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質、およびＡβ１−４０のＡｋｔ／ＰＫＢ活性抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  アルツハイマー病は老年性痴呆症の代表とされる脳の変性疾患であり、その患者の数は増加の一途をたどっている。アルツハイマー病患者の脳神経機能低下に伴う生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）の低下は、患者本人に加え家族など周囲に多大な影響を与え、高齢化社会の抱える深刻な問題となっている。アルツハイマー病の研究は精力的に進められているが、まだ発症機構の全貌も明らかではなく、その根治薬はいまだ開発されていないのが現状である。
アルツハイマー病は多様な症候群とされているが、多数の病理学的な所見により、脳における神経変性およびβ−アミロイド（以下、Ａβとも称す）産生／蓄積が重要な要因であることがわかっている。Ａβは、アルツハイマー病の主要な神経病理学的変化の１つである老人斑を構成する主要成分であり、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が２種の（β−及びγ−）セクレターゼで切断されることにより産生される。その主要な分子種として、４０アミノ酸残基からなるＡβ１−４０とＣ末端側がさらに２残基長いＡβ１−４２がある。Ａβは神経細胞に対して細胞毒性を示すが、この作用は単一分子よりもＡβが凝集した状態、さらに線維化した状態でより顕著となる。Ａβの凝集速度はＣ末端部分の長さによって異なり、Ａβ１−４０よりもＡβ１−４２でより凝集・線維化しやすい。従って、細胞外に分泌されるＡβの約９０％がＡβ１−４０であるにもかかわらず、脳実質に蓄積するＡβの主要な分子種はＡβ１−４２である。また、γ−セクレターゼ活性を担うプレセニリン（ＰＳ）に見出されるすべての病原性突然変異はＡβ１−４０に対するＡβ１−４２の相対的産生量を増大させることが知られている。従って、アルツハイマー病の発症・進展においてＡβ１−４２が極めて重要であることは間違いない。
Ａβ１−４２が老人斑に主に局在し、脳血管にほとんど存在しないのに対し、Ａβ１−４０は老人斑よりもむしろ脳血管に主に局在する（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１３）：７０１３−１６，１９９５年参照）。また、Ａβ１−４０の産生がＡβ１−４２に対して相対的に優勢になると、Ａβ１−４０の血管壁細胞への沈着が促進され、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を引き起こすとの知見に基づき、Ａβ１−４０阻害剤を用いてＣＡＡを治療する方法が記載されている（特表２００３−５３２６５６号公報参照）。しかしながら、Ａβ１−４０がアルツハイマー病発症の引き金を引くことを示す明確な証拠はこれまでに見出されていない。
最近の研究より、神経発生と血管発生とは密接に関連し合っていることが示されている。しかしながら、従来のアルツハイマー病の研究においては、Ａβの産生／蓄積や神経原線維化（異常リン酸化タウ蛋白質の蓄積による）等の神経変性に焦点が当てられてきた。例えば、アルツハイマー病の予防および処置として、Ａβに対する免疫応答を利用したワクチン療法（特表２００２−５０２８０２号公報参照）や、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼを阻害してＡβの産生を阻止する方法などが報告されている。
近年、脳アテローム硬化による進行性の血流低下および代謝低下がアルツハイマー病の最初期段階を引き起こす（Ｒａｆａｅｌ  Ｈ．ら、Ｓｔｒｏｋｅ  ３４（８）：ｅ１０６．Ｅｐｕｂ、２００３年参照）、脳虚血は血液脳関門を損傷し、脳内ＡＰＰおよびＡｐｏＥをアップレギュレーティングすることにより、Ａβの沈着を加速させる（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．６、２００４年、参照）などの報告にみられるように、アルツハイマー病における血管障害の側面が注目を浴び始めている。しかしながら、血管障害がアルツハイマー病の発症や進展にどのように関連するのかについては、未だほとんど解明されていないのが現状である。
したがって、本発明が解決しようとする課題は、アルツハイマー病の発症・進展と血管障害との関連を明らかにし、当該関連性を利用した新規のアルツハイマー病の予防・治療剤を提供することである。また本発明の別の課題は、上記の新規作用機序に基づくアルツハイマー病の予防・治療物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【発明の開示】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、血管中に局在していることが知られているＡβ１−４０が、血管内皮細胞の分化、増殖、遊走、および管形成を阻害すること、および幹細胞からの内皮前駆体分化抑制を阻害すること、並びに血管の発生・成熟を阻害することを見出した。さらに本発明者らは、Ａβ１−４０の上記作用が、ＶＥＧＦ刺激により活性化されるＡｋｔ／ＰＫＢ経路の阻害に基づくことを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
（１）β−アミロイド１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質ならびに／または血管新生を促進する物質を有効成分とする、アルツハイマー病の予防・治療剤、
（２）β−アミロイド１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質ならびに／または血管新生を促進する物質がサイトカインである、（１）に記載の剤、
（３）β−アミロイド１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害するサイトカインが、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）からなる群より選ばれる１種以上である、（２）に記載の剤、
（４）血管新生を促進するサイトカインが、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴｄＲＰａｓｅ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）からなる群より選ばれる１種以上である、（２）に記載の剤、
（５）β−アミロイド１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する蛋白質ならびに／または血管新生を促進する蛋白質をコードする核酸を含んでなる、アルツハイマー病の予防・治療剤、
（６）被験物質の存在下および非存在下に、β−アミロイド１−４０を血管内皮前駆細胞と接触させ、両条件下における該細胞の分化の程度を比較することを含む、β−アミロイド１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法、
（７）被験物質の存在下および非存在下に、β−アミロイド１−４０を幹細胞と接触させ、両条件下における該細胞の内皮前駆体への分化の程度を比較することを含む、β−アミロイド１−４０の幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法、
（８）アルツハイマー病の予防・治療物質のスクリーニング方法である、（６）または（７）に記載の方法、
（９）被験物質の存在下および非存在下に血管新生が誘導され得る細胞を培養し、両条件下における該細胞における血管新生の程度を比較することを含む、アルツハイマー病の予防・治療物質のスクリーニング方法、
（１０）β−アミロイド１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する物質および／またはプロテインキナーゼＢの活性を促進する物質を有効成分とする、アルツハイマー病の予防・治療剤、
（１１）β−アミロイド１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する物質および／またはプロテインキナーゼＢの活性を促進する物質がサイトカインである、（１０）に記載の剤、
（１２）サイトカインが、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴｄＲＰａｓｅ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）からなる群より選ばれる１種以上である、（１１）に記載の剤、
（１３）β−アミロイド１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する蛋白質および／またはプロテインキナーゼＢの活性を促進する物質をコードする核酸を含んでなる、アルツハイマー病の予防・治療剤、
（１４）被験物質の存在下および非存在下に、β−アミロイド１−４０をプロテインキナーゼＢ活性を発現し得る細胞と接触させ、両条件下におけるプロテインキナーゼＢの活性を比較することを含む、β−アミロイド１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法、
（１５）アルツハイマー病の予防・治療物質のスクリーニング方法である、（１４）に記載の方法、
（１６）被験物質の存在下および非存在下にプロテインキナーゼＢ活性を発現し得る細胞を培養し、両条件下における該細胞におけるプロテインキナーゼＢ活性を比較することを含む、アルツハイマー病の予防・治療物質のスクリーニング方法、
（１７）β−アミロイド１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質ならびに／または血管新生を促進する物質を投与することを含む、アルツハイマー病の予防・治療方法、
（１８）β−アミロイド１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する物質および／またはプロテインキナーゼＢの活性を促進する物質を投与することを含む、アルツハイマー病の予防・治療方法、
（１９）アルツハイマー病の予防・治療剤を製造するための、β−アミロイド１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質ならびに／または血管新生を促進する物質の使用、および
（２０）アルツハイマー病の予防・治療剤を製造するための、β−アミロイド１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する物質および／またはプロテインキナーゼＢの活性を促進する物質の使用、を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１の結果を示すグラフである。
図２は、実施例１の結果を示す顕微鏡写真である。
図３は、実施例２の結果を示すグラフである。
図４は、実施例２の結果を示す顕微鏡写真である。
図５は、実施例３の結果を示すグラフである。
図６は、実施例４の結果（血管密度）を示すグラフである。
図７は、実施例４の結果（ヘモグロビン含有量）を示すグラフである。
図８は、実施例５の結果を示すグラフである。
図９は、実施例６の結果（Ａｋｔ）を示す電気泳動像である。
図１０は、実施例６の結果を示すグラフである。
図１１は、実施例６の結果（Ｐｈｏｓｈｏ−ＥＲＫ，＋ＶＥＧＦ）を示す電気泳動像である。
図１２は、実施例６の結果（Ｐｈｏｓｈｏ−ＥＲＫ，＋ＶＥＧＦ＋Ａβ１−４０）を示す電気泳動像である。
図１３は、実施例７の結果を示す顕微鏡写真である。
図１４は、試験例１（水飲み場探し試験）においてヒトＨＧＦ遺伝子を導入した際の効果を示したグラフである。
図１５は、試験例２（Ｙ−Ｍａｚｅ試験）においてヒトＨＧＦ遺伝子を導入した際の効果を示したグラフである。
発明の詳細な説明
以下に本発明の実施の形態について説明する。
本発明における「予防・治療剤」とは、疾患患者の病状を予防および治療するために用いられるものであり、ここでいう治療とは、症状の改善、病状ないし症状の進展（悪化）防止をも含む概念である。
本発明の予防・治療剤は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト等）に対して効果を有し、アルツハイマー病に対して有用である。
本発明においてアルツハイマー病とは、脳の神経細胞が変性・脱落する病気であり、そのことにより引き起こされる病態の総称である。その程度、症状は様々であるが、いずれも本願の発明の予防および治療剤の対象となる。
本発明の予防・治療剤は、有効成分としてＡβ１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質ならびに／または血管新生を促進する物質を含有する。
Ａβ１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質、血管新生を促進する物質は当該作用を示すものであれば特に限定されないが、例えばサイトカイン等が挙げられる。ここで、サイトカインの語は、当該技術分野で普通に用いられている意味、内容を表すものとして使用している。
Ａβ１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害するサイトカインとしては、例えば、種々の間葉系細胞によって産生される肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージ・平滑筋細胞・腫瘍細胞などの細胞で産生される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、内皮を含む様々な細胞から分泌される線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、唾液中や尿中に比較的多く存在することが知られている上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、様々な種類の細胞の増殖を促進するインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経栄養因子の１種である神経成長因子（ＮＧＦ）などが挙げられるが、好ましくはＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＥＧＦであり、さらに好ましくはＨＧＦ、ＶＥＧＦおよびＦＧＦである。
また、血管新生を促進するサイトカインとしては、例えば肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血清中に存在する血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）の他に、ピリミジンヌクレオシド代謝に関与する酵素であるチミジンホスホリラーゼ（ＴｄＲＰａｓｅ）および血小板から精製される血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）などが挙げられるが、好ましくはＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＥＧＦである。
本発明におけるサイトカインは、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋］などに由来する蛋白質であってよく、また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成された蛋白質であってもよい。あるいは当該蛋白質をコードする塩基配列を含有する核酸を導入された形質転換体から産生された組換え蛋白質であってもよい。
該サイトカインは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
サイトカインがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のサイトカインに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、サイトカインには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
また、該サイトカインは、酸または塩基との生理学的に許容される塩であってもよく、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられるが、これらに限定されない。
サイトカインを上記のような細胞・組織等から単離・精製する場合、該細胞・組織を常法に従ってホモジナイズした後、自体公知の蛋白質分離法、例えば、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などを適宜組み合わせて行うことができる。かくして得られるサイトカインが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該蛋白質が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるサイトカインは、Ａβ１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害ならびに／または血管新生を促進する限り、全長蛋白質だけでなくそのフラグメント（部分ペプチド）であってもよい。
本発明で用いられるサイトカインまたはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。サイトカインを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）〜（５）に記載された方法に従って行われる。
（１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（３）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（４）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（５）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
このようにして得られたサイトカインまたはその部分ペプチドは、公知の精製法により単離・精製することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるサイトカインまたはその部分ペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にサイトカインまたはその部分ペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
サイトカインの部分ペプチドまたはその塩は、全長蛋白質またはその塩を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
さらに、本発明のサイトカインまたはその部分ペプチドは、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からサイトカインまたはその部分ペプチドを分離精製することによって製造することもできる。
サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
サイトカインまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）のあらゆる細胞［例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞などや血球系の細胞］、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。サイトカインまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＰＣＲ法」と略称するおよびＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、サイトカインまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
サイトカインまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
上記のサイトカインまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛋白質またはペプチドを製造することができる。
サイトカインまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、サイトカインをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス；ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、サイトカインまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン（Ｇｅｎｅ），２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンペ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞、Ｅｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２〜６．４である。培養は、通常約２７℃で、約３〜５日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にサイトカインまたはその部分ペプチドを生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、サイトカインまたはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、サイトカインまたはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれるサイトカインまたはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られるサイトカインまたはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するサイトカインまたはその部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるサイトカインまたはその部分ペプチドの存在は、それに特異的親和性を有する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、サイトカインまたはその部分ペプチドは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、サイトカインまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質（転写／）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１７９−２０９，Ｈａｍｅｓ  Ｂ．Ｄ．＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に記載の方法等に凖じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ  ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ  Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１（１９５７）あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ  Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０（１９９６）等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）前述）や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ  Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３）等を用いることができる。
また、Ａβ１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質、血管新生を促進する物質が、上記サイトカインまたはその部分ペプチドなどの蛋白質またはペプチドである場合には、該物質はそれをコードする核酸、特に該核酸を含む発現ベクターの形態で本発明の予防・治療剤に配合させることができる。サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする核酸としては、該サイトカインまたはその部分ペプチドを製造するのに用いられる上記核酸が例示される。発現ベクターは、上記の核酸が、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、マウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
発現ベクターは、好ましくは上記の核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターの投与は、治療対象動物自身の細胞を体外に取り出し、培養してから導入を行って体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法と、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行うｉｎ  ｖｉｖｏ法のいずれかで行われる。ｅｘ  ｖｉｖｏ法の場合、標的細胞へのベクターの導入は、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等により行うことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法の場合、ウイルスベクターは、注射剤等の形態で静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内等に投与される。あるいは、静脈内注射などによりベクターを投与すると、ウイルスベクターに対する中和抗体の産生が問題となるが、標的細胞の存在する部位に局所的にベクターを注入すれば（ｉｎ  ｓｉｔｕ法）、抗体の存在による悪影響を軽減することができる。
また、サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターとして非ウイルスベクターを使用する場合、該発現ベクターの導入は、ポリＬ−リジン−核酸複合体などの高分子キャリアーを用いるか、リポソームに被包して行うことができる。あるいは、パーティクルガン法を用いてベクターを標的細胞に直接導入することもできる。
本発明の予防・治療剤は、Ａβ１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質ならびに／または血管新生を促進する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白蝋等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の予防・治療剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約１μｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜約５００ｍｇ、さらに好ましく約１００μｇ〜約１００ｍｇである。これを１回または数回に分けて投与する。
本発明の予防・治療剤は、Ａβ１−４０の、血管内皮前駆細胞分化抑制作用および／もしくは幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質、または血管新生を促進する物質のいずれか１種が有効成分として含有されていればよく、或いは両方が含有されていてもよい。また、両方の作用を有する物質を単独で使用することもできる。さらに、Ａβ１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害する物質および血管新生を促進する物質のいずれか一方、あるいは両方がそれぞれ２種以上含有されていてもよい。本発明薬剤の投与方法は、経口投与、または点滴投与、注射投与（経静脈投与）等の非経口投与（摂取）でも良く、特に限定しないが、有効成分がタンパク質あるいはそれをコードする核酸の場合、筋肉注射、皮下投与などの局所投与が好ましい。
本発明の有効成分である物質は、それぞれが単独で、若しくは任意の組み合わせで製剤化されてもよく、又は全てを含有する製剤としてもよい。別々に製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても異なっていてもよく、また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。併用する薬剤の種類や効果によって適宜決定する。
本発明はまた、被験物質の存在下および非存在下に、Ａβ１−４０を血管内皮前駆細胞と接触させ、両条件下における該細胞の分化の程度を比較することを含む、Ａβ１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られる物質、および当該物質を含有してなるアルツハイマー病の予防・治療剤を提供する。
本スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を含む：（Ｉ）被験物質の存在下、Ａβ１−４０を血管内皮前駆細胞と接触させる工程、
（ＩＩ）上記（Ｉ）で接触させた細胞における分化の程度を測定し、被験物質の非存在下でＡβ１−４０と接触させた対照細胞における分化の程度と比較する工程、
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、Ａβ１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害した被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（Ｉ）では、被験物質の存在下、Ａβ１−４０を血管内皮前駆細胞と接触させる。該接触は、培養培地中で行われ得る。細胞は、動物由来の血管内皮前駆細胞、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳動物由来の血管内皮前駆細胞であり得る。血管内皮細胞は、例えば、ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト臍動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などが市販されており、これらを購入して利用することができる。
Ａβ１−４０を血管内皮前駆細胞と接触させる培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。該培地には、内皮細胞への分化を誘導し得る成分、培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９７３  Ｎｏｖ；５２（１１）：２７４５−５６．参照）
上記方法の工程（ＩＩ）では、先ず、Ａβ１−４０を接触させた細胞における細胞の分化抑制の程度が測定される。該測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。
例えば、日本ベクトン・ディキンソン社製、ＢＤバイオコートＴＭアンジオジェネシスシステム等のキットを用いて評価することができる。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｊ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／３５−２８４−２８８．ｐｄｆ）
次いで、被験物質の存在下で接触させた細胞における細胞の分化抑制の程度が、被験物質の非存在下で接触させた細胞における細胞の分化抑制の程度と比較される。分化の程度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。被験物質の非存在下で接触させた対照細胞における分化の程度は、被験物質の存在下で接触させた細胞における分化の程度の測定に対し、事前に測定した分化の程度であっても、同時に測定した分化の程度であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した分化の程度であることが好ましい。
上記方法の工程（ＩＩＩ）では、Ａβ１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害した被験物質、即ち、対照細胞よりも細胞の分化を促進した被験物質が選択される。
本発明はまた、被験物質の存在下および非存在下に、Ａβ１−４０を幹細胞と接触させ、両条件下における該細胞の内皮前駆体への分化の程度を比較することを含む、Ａβ１−４０の幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られる物質、および当該物質を含有してなるアルツハイマー病の予防・治療剤を提供する。
本スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程（Ｉ’）、（ＩＩ’）及び（ＩＩＩ’）を含む：（Ｉ’）被験物質の存在下、Ａβ１−４０を幹細胞と接触させる工程、
（ＩＩ’）上記（Ｉ’）で接触させた細胞における内皮前駆体への分化の程度を測定し、被験物質の非存在下でＡβ１−４０と接触させた対照細胞における分化の程度と比較する工程、
（ＩＩＩ’）上記（ＩＩ’）の比較結果に基づいて、Ａβ１−４０の幹細胞からの内皮前駆体分化抑制作用を阻害した被験物質を選択する工程。  培養条件、測定方法などは、上記のスクリーニング方法の工程（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）と同様にして行う。
本発明はさらに、被験物質の存在下および非存在下に血管新生が誘導され得る細胞を培養し、両条件下における該細胞における血管新生の程度を比較することを含む、アルツハイマー病の予防・治療物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られる物質、および当該物質を含有してなるアルツハイマー病の予防・治療剤を提供する。
本スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
一実施形態では、本スクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：（ａ）被験物質と血管新生が誘導され得る細胞を接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）で接触させた細胞における血管新生の程度を測定し、被験物質と接触させない対照細胞における血管新生の程度と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、血管新生を促進する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ａ）では、被験物質を血管新生が誘導され得る細胞と接触させる。該接触は、培養培地中で行われ得る。細胞は、動物由来の血管内皮細胞、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳動物由来の血管内皮細胞、あるいは血管組織等であり得る。
被験物質を血管新生が誘導され得る細胞と接触させる培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させた細胞における血管新生の促進の程度が測定される。該測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。
例えば、日本ベクトン・ディキンソン社製、ＢＤバイオコートＴＭアンジオジェネシスシステム等のキットを用いて評価することができる。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｊ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／３５−２８４−２８８．ｐｄｆ）
次いで、被験物質を接触させた細胞における血管新生の促進の程度が、被験物質を接触させない対照細胞における血管新生の促進の程度と比較される。血管新生の促進の程度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞における血管新生の促進の程度は、被験物質を接触させた細胞における血管新生の促進の程度の測定に対し、事前に測定しても、同時に測定してもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した血管新生の促進の程度であることが好ましい。
上記方法の工程（ｃ）では、血管新生を促進する被験物質が選択される。
本発明のスクリーニング方法における被験物質と血管新生が誘導され得る細胞との接触はまた、被験物質の動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の非ヒト哺乳動物等が挙げられる。この場合、「細胞を培養し」とは、該動物を適当な飼育条件下で飼育することを意味する。
本発明のスクリーニング方法は、血管新生を促進する物質のスクリーニングを可能とする。従って、本発明のスクリーニング方法は、アルツハイマーの予防・治療剤、並びに該疾患の研究用試薬の開発などに有用である。
また、本発明の予防・治療剤の別の有効成分は、Ａβ１−４０のＡｋｔ／ＰＫＢ活性抑制作用を阻害する物質および／またはＡｋｔ／ＰＫＢ活性を促進する物質でありうる。
Ａｋｔ／ＰＫＢを活性抑制するのを阻害する物質および／またはＡｋｔ／ＰＫＢ活性を促進する物質としては、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴｄＲＰａｓｅ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）などのサイトカインが挙げられるが、好ましくはＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＥＧＦであり、さらに好ましくはＨＧＦ、ＶＥＧＦおよびＦＧＦである。これらのサイトカインは、上記Ａβ１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害するサイトカインおよび／または血管新生を促進し得るサイトカインと同様の方法により製造することが出来る。
また、Ａβ１−４０のＡｋｔ／ＰＫＢ活性抑制作用を阻害する物質および／またはＡｋｔ／ＰＫＢ活性を促進する物質が、上記サイトカインまたはその部分ペプチドなどの蛋白質またはペプチドである場合には、該物質はそれをコードする核酸、特に該核酸を含む発現ベクターの形態で本発明の予防・治療剤に配合させることができる。この場合も、上記Ａβ１−４０の血管内皮前駆細胞分化抑制作用を阻害するサイトカインおよび／または血管新生を促進し得るサイトカインをコードする核酸と同様にして調製することができ、同様に医薬上許容される担体とともに製剤化して、ヒトなどの哺乳動物に投与することができる。
本発明の予防・治療剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約１μｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜約５００ｍｇ、さらに好ましく約１００μｇ〜約１００ｍｇである。これを１回または数回に分けて投与する。
本発明はまた、被験物質の存在下および非存在下に、Ａβ１−４０をプロテインキナーゼＢ活性を発現し得る細胞と接触させ、両条件下におけるプロテインキナーゼＢの活性を比較することを含む、Ａβ１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られる物質、および当該物質を含有してなるアルツハイマー病の予防・治療剤を提供する。
本スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
一実施形態では、上記のスクリーニング方法は、下記の工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む：（ｉ）被験物質の存在下、Ａβ１−４０をＡｋｔ／ＰＫＢの活性を発現し得る細胞と接触させる工程、
（ｉｉ）上記（ｉ）で接触させた細胞におけるＡｋｔ／ＰＫＢの活性を測定し、被験物質の非存在下でＡβ１−４０と接触させた対照細胞におけるＡｋｔ／ＰＫＢの活性と比較する工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の比較結果に基づいて、Ａβ１−４０のＡｋｔ／ＰＫＢ活性抑制作用を阻害する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程（ｉ）では、被験物質の存在下、Ａβ１−４０をＡｋｔ／ＰＫＢの活性が測定可能な細胞と接触させる。該接触は、培養培地中で行われ得る。細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳動物由来の細胞（例えば、血管内皮細胞）等であり得る。
Ａβ１−４０をＡｋｔ／ＰＫＢの活性を発現し得る細胞と接触させる培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
上記方法の工程（ｉｉ）では、先ず、Ａβ１−４０を接触させた細胞における細胞のＡｋｔ／ＰＫＢの活性が測定される。該測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知のリン酸化を検出する方法により行われ得る。
例えば、リン酸Ａｋｔに対する抗体を用いたＡｋｔ／ＰＫＢの自己リン酸化の検出、質量分析などを用いて行うことができる。あるいは、日本ベクトン・ディキンソン社製、ＢＤバイオコートＴＭアンジオジェネシスシステム等のキットを用いて間接的に評価することができる。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｊ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／３５−２８４−２８８．ｐｄｆ）
次いで、被験物質の存在下で接触させた細胞における細胞の活性が、被験物質の非存在下で接触させた細胞における細胞の活性と比較される。活性の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質の非存在下で接触させた対照細胞における活性は、被験物質の存在下で接触させた細胞における活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した活性であることが好ましい。
上記方法の工程（ｉｉｉ）では、Ａβ１−４０のＡｋｔ／ＰＫＢ活性抑制作用を阻害する被験物質が選択される。
本発明のスクリーニング方法はまた、被験物質の動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の非ヒト哺乳動物が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法は、Ａβ１−４０のＡｋｔ／ＰＫＢ活性抑制作用を阻害する物質のスクリーニングを可能とする。従って、本発明のスクリーニング方法は、アルツハイマーの予防・治療剤、並びに該疾患の研究用試薬の開発などに有用である。
本発明はまた、被験物質の存在下および非存在下にプロテインキナーゼＢ活性を発現し得る細胞を培養し、両条件下における該細胞におけるプロテインキナーゼＢ活性を比較することを含む、アルツハイマー病の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、上記Ａβ１−４０のプロテインキナーゼＢ活性抑制作用を阻害する物質のスクリーニング方法において、Ａβ１−４０を添加しないこと以外は全く同様にして行うことができ、被験物質の存在下で、非存在下に比べてプロテインキナーゼＢ活性が増大した被験物質が、アルツハイマー病の予防・治療物質の候補として選択される。
【実施例】  以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（細胞培養）
ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト臍動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。細胞を、２％または１０％ＦＢＳを補充した改変ＭＣＤＢ１３１培地で培養し、継代数３から６のものを以下の実験で用いた。
（実施例１）
上述の方法で、１２ウェルにおいて培養したヒト脳微小血管内皮細胞（動脈および静脈）を、Ａβ１−４０（０．０５μＭ、０．５μＭおよび５μＭ）、Ａβ１−４２（０．５μＭ）、Ａβ４０−１（０．５μＭ）、およびコントロール（Ａβ誘導体無添加）で７２時間刺激した。Ａβ４０−１は、Ａβ１−４０に対する逆順のシークエンスを有する。これをコントロールペプチドとして用いた。ついで細胞数を、血球計数器を用いて手動で数えた。
この実験の結果を表１、図１および図２に示す。
【表１】
0004855268.tif 000002
Ａβ１−４０はヒト脳微小血管内皮細胞の増殖を抑制するが、Ａβ４０−１は抑制しないことがわかった。これは動脈においてより顕著であった。（図１）
また、Ａβ１−４２で刺激した細胞においては壊死細胞が観察されたので、Ａβ１−４２は内皮細胞に対して毒性効果を有していることがわかった。（図２）
（実施例２）
ヒト臍動脈内皮細胞およびヒト臍静脈内皮細胞をＡβ１−４０（０．５μＭおよび５μＭ）、Ａβ４０−１（０．５μＭ）、およびコントロール（Ａβ誘導体無添加）で７２時間刺激して、８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅに達した内皮細胞を次いでＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、マトリゲル基底膜マトリックス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）でコートした６ウェル培養プレート上で１８時間培養した。マトリゲル上の細胞を写真撮影し、ＮＩＨイメージ分析器によって全体の長さを測定した。
結果を表２および表３に示す。ただし、単位はピクセル（ｐｉｘｅｌ）とする。
【表２】
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【表３】
0004855268.tif 000004
表２および３ともに、基本統計：列２、効果：列４とする。この結果により、Ａβ１−４０がマトリゲル上のＥＣの管形成を抑制することがわかった。（図３および４）
（実施例３）
次いで内皮細胞遊走を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイを用いて調べた。簡略には、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａβ１−４０（０．５μＭおよび５μＭ）＋ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａβ４０−１（０．５μＭ）＋ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳまたはコントロール（Ａβ誘導体無添加）を有するＥＢＭ−２培地をチャンバーの下方の区画に置いた。５×１０４内皮細胞（０．５％ウシ血清アルブミンを補充した５０μＬのＥＢＭ−２中）をチャンバーの上方の区画に蒔いた。細胞遊走を、４つの高倍率視野（×４０）で細胞を数えることによって測定した。すべてのグループにつき３回実験をした。（平均±標準偏差：Ｐ＜０．０５）
結果を表４に示す。ただし、単位は細胞数／視野とする。
【表４】
0004855268.tif 000005
これにより内皮遊走はＶＥＧＦによる脈管形成によって引き起こされたが、その効果はＡβ１−４０によって阻害されたことがわかった。（図５）
（実施例４）
（マトリゲルプラグ移植アッセイ）
年齢をマッチングした８週齢のオスのｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスに、５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦおよびＡβ１−４０（５μＭ）を含む５００μＬのマトリゲルと３７ユニットのヘパリンを皮下注射した。７日後、マトリゲルプラグを慎重に個々のマウスから回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、−２０℃で冷凍保存した。冷凍プラグの切片（６ｍｍ）を氷冷したアセトンで固定し、ついでラット抗マウスＣＤ３１の１次抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ−コンジュゲートした抗α平滑筋アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）およびＡｌｅｘａコンジュゲートしたヤギ抗ラット２次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で染色した。
染色した切片における血管密度を、ＮＩＨイメージソフトウェアを用いて、蛍光強度によって評価した。また、それぞれのプラグのヘモグロビン含有量を、成人血管再生の指標として測定した。
結果を表５および６に示す。
【表５】
0004855268.tif 000006
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【表６】
0004855268.tif 000008
これらの結果により、Ａβ１−４０が成人血管再生にインビボで抑制効果を有することがわかった。（図６および７）
（実施例５）
（ＥＬＩＳＡアッセイ）
ヒトＳＭＣを、１０％ＦＢＳを含むＭＣＤＢ培地の１２ウェル培養プレートで培養した。Ａβ１−４０刺激から４８時間後、それぞれのウェルにおけるＶＥＧＦレベルを酵素免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）によって試験した。
結果を表７に示す。
【表７】
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これにより、Ａβ１−４０はＶＳＭＣからのＶＥＧＦ分泌に直接効果を有さないことがわかった（図８）。また、Ｄｉｌアセチル化されたＬＤＬおよびＢＳ−１によって、Ａβ１−４０は血管幹細胞の分化に対し阻害効果を有することがわかった。
（実施例６）
（ウェスタンブロットアッセイ）
ＥＣが８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅに達した後、培地を、ＦＢＳを含んでいない新しい培地に変えて、４時間おいた。ついで細胞をヒトＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＡβ１−４０（０．５μＭ）で最高４０分まで刺激を与えた。ヒト内皮細胞からの全細胞タンパク質抽出物を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に分離し、ニトロセルロース膜に移した。その膜を、ヒトＡｋｔ、リン酸化Ａｋｔおよびリン酸化ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する抗体を用いウエスタンブロッティングを行った。結果を図９〜１２に示す。
これにより、細胞内Ａｋｔリン酸化はＶＥＧＦによって刺激を受けるが、Ａβ１−４０によって阻害されることがわかった（図９）。図１０は、Ａβ１−４０によるＡｋｔリン酸化の量的阻害を表すグラフである。また、Ａβ１−４０はＶＥＧＦによって引き起こされたＥＲＫリン酸化には影響を与えなかった（図１１および１２）。
（実施例７）
（成体血管幹細胞の分化アッセイ）
簡潔には、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０８３（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた密度遠心法によって、低密度の単核細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓から単離した。細胞を、ラットビトロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした４ウェルガラススライド（Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上に蒔き、２％の熱不活性化した規定（ｄｅｆｉｎｅｄ）ＦＢＳを含む培地で培養した。培地を、内皮成長補充キット、ＥＧＭ−２ＭＶシングルアリコート（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で補充した。
培養４日後、細胞をアセチル化したＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）を加えてインキュベートし、ＦＩＴＣ−コンジュゲートしたグリフォニア・シンプリシフォリアレクチンＩ（ＢＳ１−レクチン）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した。１５視野において４０×倍率下、ａｃＬＤＬ−ＤｉｌおよびＢＳ１で２重染色された細胞の数を、それぞれの試料ごとに内皮前駆体として数えた。その結果を図１３に示す。
これにより、Ａβ１−４０が培養した血管前駆体細胞の増殖および分化を抑制したことがわかった。
（試験例）
（Ａβ−注入モデル）
雄ｄｄＹマウス（６〜８週齢）を日本クレア（株）から得た。ＨａｌｅｙとＭｃＣｏｒｍｉｃｋ（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１２（１）：１２−５、１９５７年）によって確立された手順に、少し改良（ＭａｍｉｙａとＵｋａｉ、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３４（８）：１５９７−９、２００１年）を加えて、脳室内投与を行った。マウスにイソフルランガス、キシラジンおよびケタミンで麻酔をかけ、３ｍｍの２７ゲージ針を有する１００μＬハミルトンシリンジで、正中線から１ｍｍ〜１．５ｍｍ横かつ前頂部から０．５ｍｍ後方へ、Ａβ１−４０（２００μｍｏｌ／５μＬ）を５μＬ、マウスに脳室内注射した。
また、Ｓｈａｍ手術を行い、Ｓｈａｍ施行マウス（ｓｈａｍ群）を作製した。
（ＨＧＦ遺伝子の送達）
ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡ（２．２ｋｂ）を、サイトメガロウイルス・プロモーター／エンハンサーを用いるｐＶＡＸ１プラスミドへ挿入した。プラスミドはＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１０μｇ／μＬに調製した。ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含む２μＬのプラスミドを１．２５μＬオプティソン（超音波造影剤）および１μＬのＴＥに懸濁した。Ａβ１−４０を脳室内注射してから１週間後、ｐＶＡＸプラスミド混合物を脳室内に、Ａβ注射と同じ方法で正中線の反対側に注射した（ＨＧＦ群）。注射後、個々のマウスに超音波をかけた（２．０Ｗ／ｃｍ２、１０秒）。
なお、ＨＧＦ挿入していないｐＶＡＸプラスミド混合物を同様にして別のマウスに注射し、それらをコントロールマウスとした（コントロール群）。
（試験例１）
（水飲み場探し試験）
ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むプラスミドを投与した１週間後、Ｎａｂｅｓｈｉｍａら（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，８４８（１−２）：１６７−７３、１９９９年）の方法によって水飲み場探し試験（Ｗａｔｅｒ  Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｔａｓｋ）を行った。簡略には、装置は、５０×３０ｃｍの広さで１５ｃｍの壁つきのオープンフィールドからなり、長径（５０ｃｍ）側の壁の中央に１０ｃｍ×１０ｃｍ×１０ｃｍの小部屋がついているものである。オープンフィールドの床は、自発運動量を測定するために１０ｃｍごとにグリッドが入っている。水のボトルを、小部屋の天井に、チューブの先端が、トレーニング試行においては床から５ｃｍ、また想起試行においては床から７ｃｍのところになるように挿入した。試験は２つの試行よりなる：トレーニング試行（１日目）および想起試行（２日目）である。トレーニング試行では、マウスを別々に小部屋の反対側のコーナーに置き、３分間自由に探索させた。その間、マウスが越えたグリッド線の数を数えることにより歩行を測定した。小部屋内の水チューブを、触れたり、嗅いだり、舐めたりする頻度（アプローチの数）も数えた。３分以内に水チューブを見つけることのできなかったマウスを試験から除いた。トレーニング試行の後、マウスを直ちにホームケージに帰し、水を探すモチベーションを高めるため、４８時間水から遠ざけた。想起試行では、マウスを別々に装置の同じコーナーに置いた。メモリー習得を評価するため、飲むまでの時間（ｄｒｉｎｋｉｎｇ  ｌａｔｅｎｃｙ，ＤＬ）は、コーナーを出て最初に水チューブに触れるまでの時間で測定した。加えて、配置から開始コーナーに行くまでの時間（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｌａｔｅｎｃｙ，ＳＬ）および開始コーナーから最初に小部屋に入るまでの時間（ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ｌａｔｅｎｃｙ，ＥＬ）を測定した。
（試験例２）
（Ｙ−Ｍａｚｅ試験）
ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡを含むプラスミドを投与した１週間後、Ｙ−Ｍａｚｅ試験を上述したＭａｍｉｙａ  ａｎｄ  Ｕｋａｉ（上述、２００１年）に記載の方法で行った。簡略には、Ｙ−Ｍａｚｅは３つのアーム（ａ，ｂ，ｃ）からなる。それぞれのアームは長さ４０ｃｍで、その断面は上辺１０ｃｍ、底辺３ｃｍ、高さ１２ｃｍの台形である（Ｎａｂｅｓｈｉｍａら、上述、１９９９年）Ｙ−Ｍａｚｅ装置を実験室の床にたて、２００Ｌｕｘで照射した。マウスをそれぞれ１つのアームの端に置き、８分間、Ｙ−Ｍａｚｅを探索させた。自発的交代行動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）による短期／空間のワーキングメモリーを評価するため、いずれのアームに入ったかを記録した。胴体が完全にアームに入った場合、そのマウスが当該アームを選んだとみなした。自発的交代行動とは、より新しい場所を好むという動物の行動に基づくものである。マウスがＹ−Ｍａｚｅにおいて、３回連続して別のアーム（つまり、３つ目のアームとして前に選んだ２つとは異なるアーム）を選んだ場合、マウスは実際の交代行動（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）を行ったとみなした。交代行動（％）を、アームに入った全回数から２を引いたものとして定義される、最大交代に対する割合として計算した。例えば、マウスがアームａ−ｂ−ｃ−ｂ−ａ−ｂ−ｃ−ａ−ｂ−ｃの順で１０回入ったとき、実際の交代行動、および最大交代行動はそれぞれ６と８になり、交代行動は７５％になる。アームに入った数、排便の数、排尿の数を数えた。
（結果）
試験例１の結果を表８および図１４に、試験例２の結果を表９および図１５に示す。ＨＧＦ遺伝子を導入したＡβ注入モデルマウスは、水飲み場探し試験およびＹ−Ｍａｚｅ試験において改善がみられた。
【表８】
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【表９】
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水飲み場探し試験では（図１４参照）、ＨＧＦ処理したＡβ注入マウスは、コントロールマウスより有意に優れていた（ｐ＜０．０５）。Ｓｈａｍ手術したマウスとコントロールマウスの間に有意差はなかった。しかしながら、ｓｈａｍ手術したマウスの方がコントロールマウスよりも優れた行動をとる傾向があった（ｐ＝０．０７）。
Ｙ−Ｍａｚｅ試験においても（図１５参照）、ＨＧＦ処理したＡβ注入マウスは、コントロールマウスより有意に優れていた（ｐ＜０．０５）。Ｓｈａｍ手術したマウスとコントロールマウスの間に有意差はなかった。しかしながら、ｓｈａｍ手術したマウスの方がコントロールマウスよりも優れた行動をとる傾向があった（ｐ＝０．２４）。
【産業上の利用可能性】  本発明により提供される予防・治療剤はアルツハイマー病に有用である。あるいは、本発明の予防・治療剤はアルツハイマー病の研究用試薬として有用である。また、本発明により提供されるスクリーニング方法は、アルツハイマー病の予防・治療薬あるいは該疾患の研究用試薬の開発に有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００４−３４７８６１を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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