(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドとの少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシクロヘキサデプシペプチド合成酵素；
（ｂ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する、（ａ）の対立遺伝子変異体であって、そのアミノ酸配列が、１又は数個のアミノ酸残基の挿入若しくは欠失によって、及び／又は異なるアミノ酸残基による１又は数個のアミノ酸残基の置換によって配列番号２のアミノ酸配列と異なる、対立遺伝子変異体；及び
（ｃ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する（ａ）又は（ｂ）のフラグメントであって、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は数個のアミノ酸が欠失したフラグメント、
から成る群から選択される、単離したシクロヘキサデプシペプチド合成酵素。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドとの少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列、あるいは、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有するそのフラグメントであって、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は数個のアミノ酸が欠失したフラグメントから成る、請求項１に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列から成る、請求項３に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドから成る、請求項４に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素。
【請求項６】
フサリウムの菌株から獲得される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素。
【請求項７】
フサリウム・ベネナツムの菌株から獲得される、請求項６に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素。
【請求項８】
エスケリッチャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６８に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＡ、エスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６９に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＢ、及びエスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００７０に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＣに含まれる核酸配列によってコードされる、請求項１に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする、単離した核酸。
【請求項１０】
配列番号１の成熟シクロヘキサデプシペプチド合成酵素のコード配列において少なくとも１つの変異を有する核酸配列であって、配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドからなるシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする、単離した核酸。
【請求項１１】
適当な発現宿主においてシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の産生を増強する１又は複数の調節配列に作用可能に連結した、請求項９又は１０に記載の核酸を含んで成る核酸コンストラクト。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸コンストラクトを含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸コンストラクトを含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項１４】
分泌型の異種のポリペプチドを産生する方法であって：
（Ｉ）親の糸状菌細胞の変異株を、分泌型の異種のポリペプチドの産生を導く条件下で培養し：ここで（ｉ）前記変異株が分泌型の異種のポリペプチドをコードする第１核酸配列、及び、シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する遺伝子の修飾を含んで成る第２核酸配列を含んで成り、当該修飾が：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチド、との少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシクロヘキサデプシペプチド合成酵素；
（ｂ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する、（ａ）の対立遺伝子変異体であって、そのアミノ酸配列が、１又は数個のアミノ酸残基の挿入若しくは欠失によって、及び／又は異なるアミノ酸残基による１又は数個のアミノ酸残基の置換によって配列番号２のアミノ酸配列と異なる、対立遺伝子変異体；及び
（ｃ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する（ａ）又は（ｂ）のフラグメントであって、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は数個のアミノ酸が欠失したフラグメント、
から成る群から選択される、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素の挿入、破壊、置換又は欠失であり、そして（ii）前記変異株が、同一の条件下で培養する場合、親の糸状菌細胞ほどシクロヘキサデプシペプチドを産生しない；そして
（ＩＩ）前記の分泌型の異種のポリペプチドを培養培地から回収すること、
を含んで成る方法。
【請求項１５】
前記シクロヘキサデプシペプチド合成酵素が、配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記糸状菌細胞がアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ネオカリマスチックス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チェラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記糸状菌細胞がフサリウム細胞である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記フサリウム細胞がフサリウム・ベネナツム（ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フサリウム・ベネナツム細胞がフサリウム・ベネナツムＡＴＣＣ２０３３４である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する遺伝子がシクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子である、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する遺伝子がエニアチン合成酵素遺伝子である、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記糸状菌細胞が前記の第１核酸配列のコピーを少なくとも２つ含んで成る、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記の分泌型の異種のポリペプチドがホルモン、ホルモン変異体、酵素、受容体又はその一部、抗体又はその一部、あるいはレポーターである、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素が酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、又は連結酵素である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素がアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファーグルコシダーゼ、ベーターグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記変異細胞が更に１又は複数の第３核酸配列の１又は複数の修飾を含んで成り、前記修飾が１又は複数の第３核酸配列の発現を低下させるか又は排除する挿入、破壊、置換又は欠失であり、前記の第３核酸配列が、前記異種ポリペプチドの産生、回収、及び／又は利用に有害な酵素であって、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファーグルコシダーゼ、ベーターグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及びキシラナーゼから成る群から選択される酵素をコードする、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記の第３核酸配列がプロテアーゼをコードする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
同一の条件下で培養した場合に変異細胞の親の糸状菌細胞ほどシクロヘキサデプシペプチドを産生しない変異細胞であって、当該変異細胞が、分泌型の異種のポリペプチドをコードする第１核酸配列、及び、シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する遺伝子の修飾を含んで成る第２核酸配列を含んで成り、当該修飾が：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチド、との少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシクロヘキサデプシペプチド合成酵素；
（ｂ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する、（ａ）の対立遺伝子変異体であって、そのアミノ酸配列が、１又は数個のアミノ酸残基の挿入若しくは欠失によって、及び／又は異なるアミノ酸残基による１又は数個のアミノ酸残基の置換によって配列番号２のアミノ酸配列と異なる、対立遺伝子変異体；及び
（ｃ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する（ａ）又は（ｂ）のフラグメントであって、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は数個のアミノ酸が欠失したフラグメント、
から成る群から選択される、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素の挿入、破壊、置換又は欠失である、変異細胞の親の糸状菌細胞ほどシクロヘキサデプシペプチドを産生しない細胞。
【請求項２９】
前記シクロヘキサデプシペプチド合成酵素が、配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の変異細胞。
【請求項３０】
前記遺伝子がシクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子である、請求項２８又は２９に記載の変異細胞。
【請求項３１】
前記遺伝子がエニアチン合成酵素遺伝子である、請求項２８又は２９に記載の変異細胞。
【請求項３２】
前記細胞が前記の第１核酸配列のコピーを少なくとも２つ含んで成る、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の変異細胞。
【請求項３３】
（ａ）親の糸状菌細胞に、分泌型の異種のポリペプチドをコードする第１核酸配列及びシクロヘキサデプシペプチドの産生に必要な遺伝子の修飾を含んで成る第２核酸配列を導入し、ここで、当該修飾が挿入、破壊、置換又は欠失である；そして
（ｂ）段階（ａ）から変異株を同定する；ここで前記変異株は、同一の培養条件下で培養する場合、前記変異細胞の親の糸状菌細胞ほどシクロヘキサデプシペプチドを産生しない、
ことを含んで成る、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の変異細胞を獲得するための方法。
【請求項３４】
（ａ）配列番号１の成熟シクロヘキサデプシペプチド合成酵素のコード配列に少なくとも１つの変異を導入し、ここで変異核酸配列が配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドから成るシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードし；そして（ｂ）前記変異核酸配列を回収することを含んで成る、変異核酸配列を産生するための方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法によって産生する変異核酸。
【請求項３６】
（ａ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする核酸配列を含んで成る核酸コンストラクトを含んで成る宿主細胞を、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素の産生に適した条件下で培養し；そして（ｂ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素を回収することを含んで成る、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素を産生するための方法。
【請求項３７】
（ａ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素の産生を誘導する条件下で宿主細胞を培養し、ここで前記宿主細胞は配列番号１の成熟シクロヘキサデプシペプチド合成酵素において少なくとも１つの変異を有する変異核酸配列を含んで成り、ここで変異核酸配列は配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドから成るシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする；そして（ｂ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素を回収することを含んで成る、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素を産生するための方法。
【請求項３８】
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素を、Ｄ−２−ヒドロキシイソ吉草酸、分枝鎖Ｌ−アミノ酸、Ｓ−アデノシルメチオニン及びＡＴＰと反応させ；そして
（ｂ）反応物からシクロヘキサデプシペプチドを単離すること、
を含んで成る、シクロヘキサデプシペプチドを産生するための方法。
【請求項３９】
前記シクロヘキサデプシペプチド合成酵素が、配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）シクロヘキサデプシペプチドの産生に適した条件下で細胞を培養し、ここで前記細胞は（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列から成る成熟ポリペプチドとの少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシクロヘキサデプシペプチド合成酵素；（ii） シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する、（ｉ）の対立遺伝子変異体であって、そのアミノ酸配列が、１又は数個のアミノ酸残基の挿入若しくは欠失によって、及び／又は異なるアミノ酸残基による１又は数個のアミノ酸残基の置換によって配列番号２のアミノ酸配列と異なる、対立遺伝子変異体；あるいは（iii）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する（ｉ）又は（ii）のフラグメントであって、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は数個のアミノ酸が欠失したフラグメントをコードする核酸配列を含んで成る；そして
（ｂ）反応物からシクロヘキサデプシペプチドを単離すること、
を含んで成る、シクロヘキサデプシペプチドを産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の背景
本発明の分野
本発明はシクロヘキサデプシペプチド欠損糸状菌変異細胞において異種のポリペプチドを産生するための方法に関する。本発明は更に、糸状菌細胞の変異株及び変異細胞を獲得する方法に関する。本発明は更に、単離したシクロヘキサデプシペプチド合成酵素及び、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする単離した核酸配列に関する。本発明は更に、前記核酸配列を含んで成る核酸コンストラクト、ベクター、及び宿主細胞並びにシクロヘキサデプシペプチド合成酵素を産生する方法に関する。本発明は更に、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素によって産生するシクロヘキサデプシペプチドに関する。
【０００２】
関連技術の説明
デプシペプチドはアミド及びエステル結合によって結合したヒドロキシ及びアミノ酸から誘導したペプチド関連化合物の巨大なクラスを構成する。この化合物のクラスの多くのメンバーは生物学的に活性であり、そして抗生物質、アルカロイド、及びタンパク質を含む（Shemyakin et al., 1969, Journal of Membrane Biology 1 : 402-430）。例えば、エニアチン（ｅｎｎｉａｔｉｎ）、ビューベルシン（ｂｅａｕｖｅｒｃｉｎ）、及びバシアノライド（ｂａｓｓｉａｎｏｌｉｄｅ）を含む。
【０００３】
エニアチンは放射菌及び糸状菌の様々な種、特にフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の菌株によって産生する、イオン泳動特性を有するシクロヘキサデプシペプチドの植物毒素である。それらは１８員環構造を形成する交互のＤ−２−ヒドロキシイソ吉草酸残基及びＬ−アミノ酸又はＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸から成る。
【０００４】
エニアチンの生合成は、それらの一次前駆体、すなわちＤ−２−ヒドロキシイソ吉草酸、分枝鎖Ｌ−アミノ酸（例えばバリン、ロイシン、イソロイシン）、Ｓ−アデノシルメチオニン、及びＡＴＰからエニアチンを構築するのに必要な全ての機能を有する巨大な多機能性酵素であるエニアチン合成酵素によって触媒される（Reper et al., 1995, European Journal of Biochemistry 230 : 119-126）。前記前駆体（Ｄ−２−ヒドロキシイソ吉草酸及び分枝鎖Ｌ−アミノ酸）はチオエステルとして活性化される。共有結合した基質のアミノ酸残基はＳ−アデノシルメチオニンの消費のもとでメチル化される。続いて、ペプチド結合の形成及び還化反応が起こる。
【０００５】
エニアチンはエニアチン産生フサリア（ｆｕｓａｒｉａ）による感染の間のしおれる毒性の事象における役割を果たしていると仮定されており（Walton, 1990, Biochemistry of Peptide Antibiotics, H. Kleinkauf and H. von Dohren, editors, W. de Gruytre, Berlin, pp. 179-203）、そして昆虫病原特性を示す（Grove and Pople, 1980, Mycopathologia 70 : 103-105）。
【０００６】
エニアチン合成酵素遺伝子（ｅｓｙｎ１）はフサリウム・スチルピ（ｓｃｉｒｐｉ）からクローニングされた（Haese et al., 1993, Molecular Microbiology 7 : 905-914）。
【０００７】
エニアチンを産生しないフサリウム・アベナシューム（ａｖｅｎａｃｅｕｍ）のエニアチン合成酵素変異株が生成した（Herrmann et al., 1996, Molecular Plant-Microbe Interactions 9 : 226-232）。
【０００８】
シクロヘキサデプシペプチド欠損糸状菌変異細胞において異種のポリペプチドを産生する方法を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
本発明の要約
本発明は、（ａ）親の糸状菌細胞の変異株を、異種のポリペプチドの産生を誘導する条件下で培養すること、ここで（ｉ）変異細胞は前記異種ポリペプチドをコードする第１核酸を含んで成り、そして（ii）前記変異株は同一の条件で培養する場合に親の糸状菌細胞ほどシクロヘキサデプシペプチドを産生しない；及び（ｂ）前記の異種のポリペプチドを培養培地から単離することを含んで成る、異種のポリペプチドを産生する方法に関する。
【００１０】
本発明は更に、糸状菌細胞の変異株及び変異細胞を獲得するための方法に関する。
【００１１】
本発明は更に、フサリウム・ベネナツム（ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）から単離したシクロヘキサデプシペプチド合成酵素及びシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする単離した核酸配列に関する。本発明は更に、前記核酸配列を含んで成る核酸コンストラクト、ベクター、及び宿主細胞並びにシクロヘキサデプシペプチド合成酵素を産生する方法に関する。
【００１２】
本発明は更に、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素によって産生するシクロヘキサデプシペプチドに関する。
【００１３】
本発明の詳細な説明
本発明は、（ａ）親の糸状菌細胞の変異株を、異種のポリペプチドの産生を誘導する条件下で培養すること、ここで（ｉ）変異糸状菌細胞は前記の異種のポリペプチドをコードする第１核酸を含んで成り、そして（ii）前記変異株は、同一の条件下で培養する場合に、親の糸状菌細胞ほどシクロヘキサデプシペプチドを産生しない；及び（ｂ）前記の異種のポリペプチドを前記変異細胞の培養培地から単離することを含んで成る、異種のポリペプチドを産生する方法に関する。
【００１４】
用語「シクロヘキサデプシペプチド」は、アミド及びエステル結合によって結合したヒドロキシ及びアミノ酸から成るペプチド関連化合物のファミリーとして本明細書で定義される。
【００１５】
用語「シクロヘキサデプシペプチドの産生」は、限定しないが生合成、生合成の制御、輸送、及び分泌を含む、シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与するいずれかの段階を含むとして本明細書で定義される。
【００１６】
好ましい態様において、シクロヘキサデプシペプチドはエニアチンである。
【００１７】
用語「エニアチン」は、１８員環構造を生成するためにＬ−アミノ酸又はＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸と交互に連結した３つのＤ−２−ヒドロキシイソ吉草酸残基を構成するシクロヘキサデプシペプチドのファミリーとして本明細書で定義される。エニアチンは、限定しないがエニアチン、Ａ，Ａ1 ，Ｂ，Ｂ1 ，Ｂ2 ，Ｂ3 ，Ｂ4 ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、及びＦ；並びにそれらの誘導体（Visconte et al., 1992, Journal of Agricultural and Food Chemistry 40 : 1076-1082 ; Tomodo et al., 1992, Journal of Antibiotics 45 : 1207-1215）、並びに１種類以上のアミノ酸を含む混合型エニアチン（Zocher et al., 1982, Biochemistry 21 : 43-48）を含む。
【００１８】
本発明の方法において、前記糸状菌細胞は野生型細胞又はその変異株であってもよい。更に、前記糸状菌細胞は検出可能なシクロヘキサデプシペプチドを全く産生しないが、シクロヘキサデプシペプチドをコードする遺伝子を含む細胞であってもよい。好ましくは、前記糸状菌細胞はアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ネオカリマスチックス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チェラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞である。
【００１９】
好ましい態様において、前記糸状菌細胞は、アスペルギルス・アクレアタス（ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエチダス（ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス・オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）の細胞である。
【００２０】
別の好ましい態様において、糸状菌細胞は、フサリウム・アクミナタム（ａｃｕｍｉｎａｔｕｍ）、フサリウム・アベナシューム（ａｖｅｎａｃｅｕｍ）、フサリウム・バクテリジオイデス（ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・コンパクタム（ｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、フサリウム・クルックベレンス（ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）（フサリウム・セレアリス（ｃｅｒｅａｌｉｓ）の異名）、フサリウム・クルモラム（ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・エクイセチ（ｅｑｕｉｓｅｔｉ）、フサリウム・ギボサム（ｇｉｂｂｏｓｕｍ）、フサリウム・グラミニアラム（ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ラテリチウム（ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、フサリウム・モニリホルム（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、フサリウム・ネガンジ（ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・ニバレ（ｎｉｖａｌｅ）、フサリウム・オキシスポラム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチクラタム（ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロジューム（ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サンバシナム（ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スチルピ（ｓｃｉｒｐｉ）、フサリウム・セミテクタム（ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ）、フサリウム・ソラニ（ｓｏｌａｎｉ）、フサリウム・スポロトリチオイデス（ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルファリューム（ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコテシオイデス（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・トリシンクタム（ｔｒｉｃｉｎｃｔｕｍ）、又はフサリウム・ベネナツム（ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の細胞である。
【００２１】
別の好ましい態様において、糸状菌細胞は、ジベレラ・プリカリス（ｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、ジベレラ・ジアエ（ｚｅａｅ）、フミコラ・インソレンス（ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエーイ（ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフソラ・サーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、マイロセシウム・ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）、ニューロスポラ・クラッサ（ｃｒａｓｓａ）、パエシロミセス・フモソ−ロゼウス（ｆｕｍｏｓｏ−ｒｏｓｅｕｓ）、ペニシラム・パーピュロジェナム（ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、又はポリポラス・スルファレウス（ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ）の細胞である。
【００２２】
別の好ましい態様において、糸状菌細胞は、トリコデルマ・ハルジアナム（ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラチアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（ｖｉｒｉｄｅ）の細胞である。
【００２３】
更に好ましい態様において、フサリウム・ベネナツムの細胞は、最初にフサリウム・グラミニアラム  ＡＴＣＣ  ２０３３４として寄託され、そして最近、Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23 : 62-80及びO'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23 : 57-67によってフサリウム・ベネナツムとして再分類されたフサリウム・ベネナツム  Ａ  ３／５及び、現在知られているそれらの種名にかかわらず分類学的にフサリウム・ベネナツムと等しいものである。別の更に好ましい態様において、フサリウム・ベネナツムの細胞は、ＷＯ９７／２６３３０に開示されている様なフサリウム・ベネナツム  Ａ  ３／５又はフサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４の形態学的変異株である。
【００２４】
前記糸状菌細胞は、（一部）の菌糸を含む生成物の産生であって、例えばフサリウムの菌株から産生する生成物ＱＵＯＲＮ（商標）（Marlow Foods, Ltd., Great Britain）の産生に関与する細胞であってもよい。
【００２５】
本発明の方法において、前記変異細胞はシクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する遺伝子のうち少なくとも１つの修飾を含んで成る第２核酸配列を含んで成る。シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する糸状菌細胞のいずれかの遺伝子が修飾されうる。好ましい態様において、前記遺伝子はシクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子である。更に好ましい態様において、前記遺伝子はエニアチン合成酵素遺伝子である。別の更に好ましい態様において、前記遺伝子はＤ−ヒドロキシイソ吉草酸脱水素酵素遺伝子である。Ｄ−ヒドロキシイソ吉草酸脱水素酵素は、２−ケトイソ吉草酸のＤ−ヒドロキシイソ吉草酸への変換を触媒する（Lee and Zocher, 1996, Journal of Biochemistry and Molecular Biology 29 : 493-499）。より更に好ましい態様において、前記遺伝子は（ａ）配列番号２に含まれる成熟ポリペプチドとの少なくとも６８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；（ｂ）配列番号１の成熟ポリペプチドのコード領域との少なくとも６５％の相同性を有する核酸配列；（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で、（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ii）配列番号１のｃＤＮＡ配列、 （iii）少なくとも１００個のヌクレオチドの（ｉ）又は（ii）の亜配列、あるいは（iv）（ｉ），（ii）又は（iii） の相補鎖とハイブリダイズする核酸配列、（ｄ）（ａ），（ｂ）、又は（ｃ）の対立遺伝子変異体、あるいは（ｅ）（ａ），（ｂ），（ｃ）、又は（ｄ）の亜配列であって、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする亜配列、を有するフサリウム・ベネナツムのシクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子である。最も好ましい態様において、前記遺伝子は、配列番号１の核酸配列を有するフサリウム・ベネナツムのシクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子である。
【００２６】
シクロヘキサデプシペプチド欠損糸状菌変異細胞は、１又は複数の上述した遺伝子の発現を、当業界で公知の方法、例えば挿入、分裂、置換、又は欠失を用いて低下又は排除することによって構築されうる。修飾又は不活性化されうる遺伝子は、例えばコード領域又は活性に必須なその部分、あるいは前記コード領域の発現に必要な遺伝子の制御因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）であってもよい。その様な制御（ｒｅｇｕｒａｔｏｒｙ）又は調節（ｃｏｎｔｒｏｌｌ）配列の例は、プロモーター配列又はその機能的な部分、すなわち前記核酸配列の発現に影響を及ぼすのに十分な部分であってもよい。可能な修飾についての他の配列は、限定しないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、転写終結因子、及び転写活性化因子を含む。
【００２７】
前記遺伝子の修飾又は不活性化は、親の細胞を突然変異誘発にかけ、そして前記遺伝子の発現が低下又は排除された変異細胞を選択することによって行われうる。特異的又は無作為でありうる前記突然変異誘発は、例えば適当な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用によって、適当なオリゴヌクレオチドの使用によって、あるいは前記ＤＮＡ配列をＰＣＲによって生じる突然変異誘発にかけることによって行われうる。更に、前記突然変異誘発はこれらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用によっても行われうる。
【００２８】
本目的に適した物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチド類似体を含む。
【００２９】
前記突然変異誘発剤を使用する場合、前記突然変異誘発は典型的に、突然変異誘発されうる親細胞を選択した突然変異誘発剤の存在下で適当な条件のもとインキュベートし、そして前記遺伝子の低下した又は排除された発現を示す変異細胞をスクリーニングし、そして／あるいは選択することによって行われる。
【００３０】
前記遺伝子の修飾又は不活性化は、前記遺伝子の１又は複数のヌクレオチド、あるいはその転写又は翻訳に必要な制御因子の導入、置換、又は除去によって達成されうる。例えば、ヌクレオチドは終止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームの変化をもたらす様に挿入又は除去されうる。前記の修飾又は不活性化は、部位指定突然変異誘発又はＰＣＲによって生じる突然変異誘発によって、当業界で知られている方法に従い達成されうる。原理において、前記修飾はｉｎ  ｖｉｖｏ、すなわち修飾されうる遺伝子を発現する細胞に対して直接的に行われうるが、前記修飾は以下に例示する様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われるのが好ましい。
【００３１】
選択した糸状菌細胞によってシクロヘキサデプシペプチドの産生を排除又は低下するための簡便的な方法の例は、遺伝子の置換、遺伝子の欠失、又は遺伝子の破壊の技術に基づいている。例えば、遺伝子の破壊方法において、注目の内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントに相当する核酸配列は、欠損遺伝子を産生するための親細胞に続いて形質転換される、欠損核酸配列を産生するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異誘発される。相同組換えによって、前記欠損核酸は前記内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントと置き換わる。前記欠損遺伝子又は遺伝子フラグメントはまた、前記核酸配列が修飾又は破壊された形質転換体の選択に使用されうるマーカーをコードするのが望ましいであろう。特に好ましい態様において、前記遺伝子は選択可能なマーカー、例えば本明細書に記載したもので破壊される。
【００３２】
あるいは、前記遺伝子の修飾又は不活性化は、確立されたアンチセンス技術によって、前記遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を用いて行われうる。更に具体的には、糸状菌細胞による前記遺伝子の発現は、前記細胞において転写されることができ、そして前記細胞において産生するｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる前記遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することによって低下又は排除されうる。前記の相補的アンチセンスヌクレオチド配列が前記ｍＲＮＡにハイブリダイズしうる条件下で、翻訳されるタンパク質量は結果として低下するか又は排除されうる。
【００３３】
シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する遺伝子の核酸配列に相補的又は相同の核酸配列は、シクロヘキサデプシペプチドを産生する他の微生物源から得られうる。
【００３４】
フサリウム・ベネナツムの配列番号１の核酸配列に相補的又は相同な核酸配列を有するエニアチン合成酵素遺伝子にとって好ましい供給源は、他のフサリウムの菌株を含む。更に好ましい供給源は、フサリウム・スチルピである（Haese et al., 1993, supra）。
【００３５】
糸状菌細胞の相当する遺伝子の核酸配列に相補的又は相同でありうるＤ−ヒドロキシイソ吉草酸脱水素酵素遺伝子にとって好ましい供給源は、他のフサリウムの菌株を含む。Ｄ−ヒドロキシイソ吉草酸脱水素酵素遺伝子にとって更に好ましい供給源はフサリウム・サンバシナムである（Lee and Zocher, 1996, supra）。更に、前記核酸配列は糸状菌細胞に対して天然であってもよい。
【００３６】
本発明の変異糸状菌細胞によって産生するシクロヘキサデプシペプチドのレベルは、Visconti et al., 1992, Journal of Agriculture and Food Chemistry 40 : 1076-1082 の方法を用いて決定されうる。具体的には、１mlのフサリウム・ベネナツム細胞を含まない培養液が２．０mlの酢酸エチルで２回抽出される。一緒の有機的抽出物が窒素ガスの気流のもとで乾燥するまで蒸発され、そして０．５mlのヘキサン中で再溶解される。１μｌの試料を、電子緩衝（ＥＩ）型において実行するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣ／シリーズＭＳＤシステムを用いて解析する。試料をカラム上に注入し、そして１５℃／分の速度で１２０〜３００℃に加熱する温度プログラムを適用するＤＢ−５キャピラリーカラムを利用して分離する。例えば、エニアチンＡ，Ａ１，Ｂ，Ｂ１，Ｂ２及びＢ３は、それぞれ６８２，６６８，６４０，６５４，６２６及び６１２の（Ｍ+ ＋Ｈ）についてのｍ／ｚ比によって同定される。
【００３７】
前記変異糸状菌細胞は、好ましくは相当する親の糸状菌細胞と比べて、同一の条件下で培養する場合に少なくとも約２５％以下、更に好ましくは少なくとも５０％以下、より更に好ましくは少なくとも７５％以下、最も好ましくは少なくとも約９５％以下のシクロヘキサデプシペプチドを産生し、そして更に最も好ましくは全く産生しない。前記の親と変異細胞とは、注目のポリペプチドの産生を誘導する条件下又はシクロヘキサデプシペプチドの産生を誘導する条件下で、シクロヘキサデプシペプチドの産生に関して比較されうる。
【００３８】
本発明の別の観点において、前記の変異糸状菌細胞は、注目の異種ポリペプチドの産生、回収、及び／又は利用に有害であろうタンパク質をコードする、１又は複数の第３核酸配列の修飾を更に含みうる。前記修飾は、第３核酸配列の修飾無しの変異細胞より、同一の条件下で培養する場合に前記異種ポリペプチドを更に産生しうる変異細胞を生じる、１又は複数の第３核酸配列の発現を低下又は排除する。前記の第３核酸配列は、いずれかのタンパク質又は酵素をコードすることがある。例えば、前記酵素はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファーグルコシダーゼ、ベーターグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼであってもよい。前記の第３核酸配列は、好ましくはタンパク質分解酵素、例えばアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチド、又はエンドプロテアーゼをコードする。
【００３９】
前記の変異糸状菌細胞は、当業界で知られている方法を用いて注目の異種ポリペプチドの産生に適した栄養培地において培養される。例えば、前記細胞は適当な培地において及び異種ポリペプチドを発現させ、そして／あるいは単離する条件下で行われる、研究又は工業用の発酵槽における振盪フラスコ培養、小規模又は大規模な発酵（連続、バッチ、フェドバッチ、又は固体発酵を含む）によって培養されうる。前記培養は炭素及び窒素源並びに無機塩を含んで成る適当な栄養培地において、当業界で知られている方法を用いて起こる。適当な培地は商業的な業者から入手可能であるが、又は公開されている組成（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ）に従い調製されうる。分泌された異種ポリペプチドは培地から直接的に回収されうる。
【００４０】
前記異種ポリペプチドは、前記ポリペプチドに特異的な当業界で知られている方法を用いて検出されうる。これらの検出法は特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、酵素基質の消失、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥを含みうる。例えば、酵素アッセイは前記の異種ポリペプチドの活性を決定するために使用されうる。酵素活性を決定するための方法は、多くの酵素について当業界で知られている。
【００４１】
生じた異種ポリペプチドは、当業界で知られている方法によって単離されうる。例えば、前記ポリペプチドは、限定しないが遠心、濾過、抽出、スプレー乾燥、蒸発又は沈澱を含む常用の方法によって栄養培地から単離されうる。単離したポリペプチドは、続いて限定しないがクロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、等電点及びサイズ排除）、電気泳動的方法（例えば、調製用等電点電気泳動）、溶解度の差（例えば、硫酸アンモニウム沈澱）、又は抽出（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）を含む当業界で知られている様々な方法によって更に精製されうる。
【００４２】
前記ポリペプチドは、前記の変異糸状菌細胞に対して異種のポリペプチドのいずれかであってもよい。用語「ポリペプチド」は、コードされた生成物の具体的な長さを言及することを本明細書で意味しておらず、そしてそれ故にペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含する。用語「異種ポリペプチド」は、前記糸状菌細胞にとって天然でないポリペプチド、修飾が天然配列を変化させるために行われた天然タンパク質、又は発現が組換えＤＮＡ技術による糸状菌細胞の操作の結果として定量的に変化した天然タンパク質として本明細書で定義する。前記の変異菌細胞は前記ポリペプチドをコードする核酸の１又は複数のコピーを含みうる。好ましい態様において、前記の異種ポリペプチドは細胞外に分泌されたポリペプチドである。
【００４３】
好ましくは、前記の異種ポリペプチドはホルモン、ホルモン変異体、酵素、受容体若しくはその一部、抗体若しくはその一部、又はレポーターである。更に好ましい態様において、前記の異種ポリペプチドは酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、又は連結酵素である。より更に好ましい態様において、前記の異種ポリペプチドはアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファーグルコシダーゼ、ベーターグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである。
【００４４】
糸状菌細胞で発現することができる異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、いずれかの原核細胞、真核細胞又は他の供給源から獲得されうる。本発明の目的のために、用語「獲得」は与えられた供給源と関連して本明細書で使用する場合、前記ポリペプチドが前記供給源によって又は前記供給源由来の遺伝子が挿入された細胞によって産生することを意味するはずである。
【００４５】
本発明の方法において、前記の変異糸状菌細胞は前記細胞にとって天然であるポリペプチドの組換え産生にも使用されうる。前記の天然ポリペプチドは、例えば前記ポリペプチドの発現を増強し、シグナル配列の使用によって注目の天然ポリペプチドの細胞の外側への輸出を促進し、そして前記細胞によって通常産生するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増大させるために、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を、異なるプロモーターの調節のもとに据えることによって組換え的に産生しうる。本発明は更に、用語「異種ポリペプチド」の範囲において、前記の発現が前記細胞にとって非天然の遺伝因子の使用、又は宿主細胞において通常起こらない方法で機能する様に操作された天然の因子の使用に関与する程度まで、相同ポリペプチドの前記組換え方法を包含する。
【００４６】
異種ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化するために使用する技術は当業界で知られており、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組み合わせを含む。その様なゲノムＤＮＡからの核酸配列のクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによってもたらされることがある。例えば、Innis et al., 1990, PCR Protocols : A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照のこと。前記のクローニング方法は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及び単離、前記フラグメントのベクター分子への挿入、前記核酸配列の複数のコピー又はクローンが置換されるであろう変異真菌細胞への組換えベクターの組み込みを含みうる。前記核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
【００４７】
本発明の方法において、異種ポリペプチドは更に、別のポリペプチドが前記ポリペプチド又はそのフラグメントのＮ末端又はＣ末端で融合されている融合又は混成ポリペプチドを含むことがある。融合ポリペプチドは、あるポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を、別のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）に融合することによって産生する。融合ポリペプチドを産生するための技術は当業界で知られており、そして前記ポリペプチドをコードするコード配列がインフレームにあり、そして融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーター及びターミネーターの調節のもとにある様にそれらを連結することを含む。前記混成ポリペプチドは、１又は複数のものが変異糸状菌細胞にとって異種であってもよい、少なくとも２つの異なるポリペプチドから獲得される部分的又は完全なポリペプチドの組み合わせを含んで成ってもよい。
【００４８】
注目の異種ポリペプチドをコードする単離した核酸配列は、前記ポリペプチドの発現を提供する様々な方法で操作されうる。発現は、限定しないが転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む前記ポリペプチドの産生に関与するいずれかの段階を含むと理解されるだろう。前記核酸配列の、ベクターへのその挿入の前の操作は、発現ベクターに依存して所望であるか又は必要であるだろう。クローニング方法を利用する核酸配列を修飾するための技術は当業界で公知である。
【００４９】
「核酸コンストラクト」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの、天然の遺伝子から単離した又は他の方法で天然に存在しないであろう方法で組み合わされ、そして並列した核酸のセグメントを含む様に修飾した核酸分子として定義される。核酸コンストラクトの用語は、前記核酸コンストラクトがコード配列の発現に必要な全ての調節配列を含む場合に、発現カセットの用語と同義である。本明細書で定義する場合の用語「コード配列」は、ｍＲＮＡに転写され、そしてポリペプチドに翻訳される配列である。前記コード配列の境界は、前記ｍＲＮＡの５′末端側のオープンリーディングフレームのちょうど上流に位置するＡＴＧ開始コドンと、前記ｍＲＮＡの３′末端側のオープンリーディングフレームのちょうど下流に位置する転写終結因子配列とによって通常決定される。コード配列は、限定しないがゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成、組換え、又はそれらのいずれかの組み合わせを含むことがある。
【００５０】
用語「調節配列」は、異種ポリペプチドの発現に必要又は有利な全ての要素を含むと本明細書で定義する。各調節配列は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然又は外来であってもよい。前記調節配列は、限定しないがリーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写終結因子を含む。最低限、前記調節配列はプロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。前記調節配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と、前記調節配列との連結を容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーと一緒に提供されうる。用語「作用可能に連結」は、調節配列が異種ポリペプチドの産生を管理する様な、前記ＤＮＡ配列のコード配列に関連する位置で調節配列が適当に位置している配置として本明細書で定義される。
【００５１】
前記調節配列は適当なプロモーター配列、前記核酸配列の発現のために糸状菌細胞によって認識される核酸配列であってもよい。前記プロモーター配列は、前記異種ポリペプチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。前記プロモーターは、変異の、短かくなった、及び混成のプロモーターを含む糸状菌細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であってもよく、そして前記細胞にとって同種又は異種のいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から獲得されうる。
【００５２】
本発明の方法における、前記核酸コンストラクトの転写を管理するのに適当なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエのタカアミラーゼ、リゾムコール・ミエーイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アルファーアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定アルファーアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー若しくはアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエーイのリパーゼ、アスペルギルス・オリザエのアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアセトアミダーゼ、アスペルギルス・オリザエのアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、フサリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼ（米国特許第４，２８８，６２７号）から獲得されるプロモーター、並びにそれらの変異の、短かくなった、及び混成のプロモーターである。特に好ましいプロモーターは、ＮＡ２−ｔｐｉ（アスペルキルス・ニガーの中性アルファアミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の混成プロモーター）、グルコアミラーゼ、及びタカアミラーゼのプロモーターである。
【００５３】
前記調節配列は更に、適当な転写終結配列、転写を終結するために糸状菌細胞によって認識される配列であってもよい。前記終結配列は前記異種ポリペプチドをコードする核酸配列の３′末端に作用可能に連結する。前記糸状菌細胞において機能的であるいずれかの終結因子が本発明で使用されうる。
【００５４】
好ましい終結因子は、アスペルギルス・オリザエのタカアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニル酸塩合成酵素、アスペルギルス・ニガーのアルファーグルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から獲得される。
【００５５】
前記調節配列は更に、適当なリーダー配列、翻訳にとって重要なｍＲＮＡの前記糸状菌細胞によって翻訳されない領域であってもよい。前記リーダー配列は、前記異種ポリペプチドをコードする核酸配列の５′末端に作用可能に連結する。前記糸状菌細胞において機能的ないずれかのリーダー配列が、本発明において使用されうる。
【００５６】
好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエのタカアミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から獲得される。
【００５７】
前記調節配列は更に、ポリアデニル化配列、前記核酸配列の３′末端に作用可能に連結し、そして転写されるときに、転写されるｍＲＮＡにポリアデノシン残基を加えるためのシグナルとして糸状菌細胞によって認識される配列であってもよい。糸状菌細胞において機能的ないずれかのポリアデニル化配列が、本発明において使用されうる。
【００５８】
好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエのタカアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニル酸塩合成酵素、及びアスペルギルス・ニガーのアルファーグルコシダーゼから獲得される。
【００５９】
前記調節配列は更に、前記異種ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、そしてコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせるシグナルペプチドのコード領域であってもよい。前記核酸配列のコード配列の５′末端は、本質的に翻訳の読み枠において分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結する、シグナルペプチドのコード領域を含みうる。あるいは、前記コード配列の５′末端は、前記コード配列に対して外来であるシグナルペプチドのコード領域を含みうる。前記の外来のシグナルペプチドのコード領域は、前記コード配列がシグナルペプチドのコード領域を天然に含まない場合に必要だろう。あるいは、前記の外来のシグナルペプチドのコード領域は、前記ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドのコード領域を置換する。前記のシグナルペプチドのコード領域は、アスペルギルス種由来のグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、あるいはリゾムコール種由来のリパーゼ又はプロテイナーゼ遺伝子から獲得されうる。しかし、発現する異種ポリペプチドを糸状菌細胞の分泌経路に向かわせる、いずれかのシグナルペプチドのコード領域が、本発明において使用されうる。
【００６０】
有効なシグナルペプチドのコード領域は、アスペルギルス・オリザエのタカアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、リゾムコール・ミエーイのアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、及びフミコラ・ラヌギノサのセルラーゼをコードする遺伝子から獲得されるシグナルペプチドのコード領域である。
【００６１】
前記調節配列は更に、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドのコード領域であってもよい。生じたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（あるいはいくつかの場合において酵素原）として知られている。プロペプチドは通常不活性であり、そして前記プロポリペプチド由来のプロペプチドの触媒的又は自己触媒的な開裂によって、成熟な活性ポリペプチドに変換されうる。前記プロペプチドのコード領域は、リゾムコール・ミエーイのアスパラギン酸プロテイナーゼ及びマイセリオフソラ・サーモフィラのラッカーゼをコードする遺伝子から獲得されうる（ＷＯ９５／３３８３６）。
【００６２】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域、その両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、前記プロペプチド領域は前記ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そして前記シグナルペプチド領域は前記プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【００６３】
前記核酸コンストラクトは更に、前記異種ポリペプチドの発現を管理するのに有利な１又は複数の因子、例えば転写活性化因子（例えば、トランス活性化因子）、シャペロン、及びプロセシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸を含んで成ってもよい。糸状菌細胞において機能的ないずれかの因子が、本発明において使用されうる。１又は複数のこれらの因子をコードする核酸は、前記異種ポリペプチドをコードする核酸配列と連携して必要である。
【００６４】
糸状菌細胞の増殖に関係する異種ポリペプチドの発現の制御を行う制御配列を付加することが望ましいであろう。制御系の例は、制御化合物の存在を含む、化学的又は物理的刺激に応じて切り替わりうる遺伝子の発現をもたらすものである。タカアルファーアミラーゼのプロモーター、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼのプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエのグルコアミラーゼのプロモーターは制御配列として使用されうる。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を許容するもの、例えば重金属で増幅されるメタロチオネインである。これらの場合において、異種ポリペプチドをコードする核酸配列は制御配列と作用可能に連結するだろう。
【００６５】
上述した様々な核酸及び調節配列は、１又は複数の簡便な制限部位を、その様な部位で前記異種ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を許容する様に含みうる組換え発現ベクターを産生するために一緒に連結しうる。あるいは、前記異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、前記配列又は前記配列を含んで成る核酸コンストラクトを発現に適したベクターに挿入することによって発現しうる。前記発現ベクターの作製において、コード配列は、コード配列が発現、及び可能な限り分泌に適した調節配列と作用可能に連結する様に前記ベクター内に位置する。
【００６６】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ方法に簡便にかけることができ、そして異種ポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらすことができるいずれかの発現ベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってもよい。前記ベクターの選択は、典型的に前記ベクターが導入されるべき糸状菌細胞と前記ベクターとの適合性に依存するだろう。前記ベクターは直鎖状又は閉環状プラスミドであってもよい。前記ベクターは自己複製ベクター、すなわち染色体外の実在物として存在し、染色体の複製に非依存的なベクター、例えばプラスミド、染色体外因子、ミニ染色体、又は人工染色体であってもよい。前記ベクターは自己複製を保証するいずれかの手段を含んでもよい。あるいは、前記ベクターは、糸状菌細胞に導入される場合に、ゲノムに組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。前記ベクター系は、前記糸状菌細胞のゲノムに導入されるべき全ＤＮＡを含む単一のベクター若しくはプラスミド又は２又はそれ以上のベクター若しくはプラスミド、あるいはトランスポゾンであってもよい。
【００６７】
前記ベクターは、好ましくは形質転換した糸状菌細胞の容易な分泌を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは生物致死又はウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子生成物である。糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーは、限定しないがａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）、並びにそれらと等しいものを含む群から選択されうる。糸状菌細胞における使用にとって好ましいのは、アスペルギルス・ニジュランス又はアスペルギルス・オリザエのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子並びにストレプトマイセス・ハイグロスコピカスのｂａｒ遺伝子である。
【００６８】
前記ベクターは、好ましくは前記ベクターの糸状菌細胞への安定な組み込み又は前記細胞のゲノムに非依存性の細胞におけるベクターの自律複製を可能にする因子を含む。
【００６９】
「導入」は、前記ベクターが染色体組み込み物として、又は自己複製する染色体外ベクターとして維持される様に、前記核酸配列を含んで成るベクターを糸状菌細胞に導入することを意味する。組み込みは、前記核酸配列が前記細胞において安定に維持されやすい場合に有利であると通常みなされる。前記ベクターの染色体への組み込みは、相同組換え、非相同組み換え、又は遺伝子転移によって生じる。
【００７０】
発現ベクターの糸状菌細胞への導入は、本質的に知られている方法のプロトプラスト形成、前記プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生から成る過程に関与しうる。アスペルギルスの宿主細胞の形質転換に適した方法は、ＥＰ  ２３８  ０２３及びYelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 : 1470-1474に記載されている。フサリウム種を形質転換するのに適した方法は、Malardier et al., 1989, Gene 78 : 147-156 又はＷＯ９６／００７８７に記載されている。
【００７１】
糸状菌細胞のゲノムへの組み込みのために、前記ベクターは前記異種ポリペプチドをコードする核酸配列又は相同若しくは非相同組換えによる前記ゲノムへの前記ベクターの安定な組み込みのための、前記ベクターのいずれかの他の因子に依存することがある。あるいは、前記ベクターは前記糸状菌細胞のゲノムへの相同組換えによる組み込みを管理するための追加の核酸配列を含みうる。前記の追加の核酸配列は染色体において正確な位置で前記ベクターを前記ゲノムに組み込むことを可能にする。正確な位置での組み込みの見込みを増大させるために、組み込み因子は、好ましくは相同組換えの可能性を増強するために相当する標的配列と高度に相同性の、十分な数の核酸、例えば１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜１，５００塩基対、及び最も好ましくは８００〜１，５００塩基対を含むべきである。前記組み込み因子は前記糸状菌細胞のゲノムの標的配列と相同性があるいずれかの配列であってもよい。更に、前記組み込み因子は核酸配列をコードしていなくても、又はコードしていてもよい。一方、前記ベクターは非相同組換えによって前記細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【００７２】
自律複製のために、前記ベクターは更に、問題の糸状菌細胞において自律的に複製することを前記ベクターに可能にさせる複製起点を含んで成る。
【００７３】
本発明の方法は、変異糸状菌細胞を獲得するための特定の注文に限定されない。シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する遺伝子の修飾は、異種ポリペプチドの産生のための前記細胞の構築におけるいずれかの段階で、親細胞に組み込まれうる。前記糸状菌変異体が、異種ポリペプチドをコードする遺伝子の導入前に、本発明の方法を用いて、既にシクロヘキサデプシペプチド欠損にされていることが好ましい。
【００７４】
組換え発現ベクターを構築するために本明細書に記載の因子を連結するのに使用する方法は当業者に公知である（例えば、J. Sambrook, E.F. Fritsh, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。
【００７５】
本発明は更に、（ａ）親の糸状菌細胞に、シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する遺伝子のうち少なくとも１つの修飾を含んで成る第１核酸配列及び異種ポリペプチドをコードする第２核酸配列を導入し；そして（ｂ）修飾した核酸配列を含んで成る段階（ａ）から変異株を同定することを含んで成る、シクロヘキサデプシペプチド欠損糸状菌変異細胞を獲得するための方法に関し、ここで、変異細胞は、同一の条件下で培養する場合に、変異細胞の親の糸状菌細胞よりシクロヘキサデプシペプチドを産生しない。
【００７６】
本発明は更に、シクロヘキサデプシペプチドの産生に関与する遺伝子のうち少なくとも１つの修飾を含んで成る第１核酸配列及び前記異種ポリペプチドをコードする第２核酸配列を含んで成る異種ポリペプチドを産生するための糸状菌細胞のシクロヘキサデプシペプチド欠損変異株に関し、ここで、前記変異株は、同一の条件で培養した場合に、変異細胞の親の糸状菌細胞よりシクロヘキサデプシペプチドを産生しない。
【００７７】
本発明は更に、単離したシクロヘキサデプシペプチド合成酵素に関する、用語「シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性」は、Ｄ−２−ヒドロキシイソ吉草酸、分枝鎖Ｌ−アミノ酸（例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン）、Ｓ−アデノシルメチオニン、及びＡＴＰからのシクロヘキサデプシペプチドの産生を触媒する合成酵素活性として本明細書で定義される。本発明の目的のために、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性は、Zocher et al., 1982, Biochemistry 21 : 43-48の方法に従いシクロヘキサデプシペプチドの産生を測定することによって決定される。具体的には、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、１００μｌの合計量中の１mMバリン、０．２mM  Ｓ−アデノシルメチオニン、０．２mM  Ｄ−２−ヒドロキシイソ吉草酸、４mM  ＡＴＰ、及び４mM  Ｍｇ（ＯＡｃ）2 と、１０分間３７℃で５０mM  ＭＯＰＳ  pH７．０中でインキュベートされる。シクロヘキサデプシペプチドの量は、Visconti et al, 1992（上述）に基づき、本明細書に記載した様に決定される。１ユニットのシクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性は、３７℃、pH７．０で１分当たりに産生する１μmoleのシクロヘキサデプシペプチドとして定義される。
【００７８】
第１の態様において、本発明は配列番号２に含まれる成熟ポリペプチドに対して、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、より更に好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、及び更に最も好ましくは少なくとも９７％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する、単離したシクロヘキサデプシペプチド合成酵素に関する（以降、「相同シクロヘキサデプシペプチド合成酵素」）。好ましい態様において、相同シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、配列番号２に含まれる成熟ポリペプチドと５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、更に好ましくは３つのアミノ酸、より更に好ましくは２個のアミノ酸、及び最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）のソフトウェア（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を、同一性表及び次の複数のアラインメントパラメーター：ギャップペナルティー（１０）及びギャップレングスペナルティー（１０）で用いるＣｌｕｓｔａｌ法（Higgins, 1989, CABIOS 5 : 151-153）によって決定される。対のアラインメントパラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティー＝３、ウィンドウ＝５、及びダイアゴナル＝５であった。
【００７９】
好ましくは、本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、配列番号２アミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；あるいはシクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有するそのフラグメントを含んで成る。更に好ましい態様において、本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る。別の好ましい態様において、本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、配列番号２に含まれる成熟ポリペプチド、又はその対立遺伝子変異体；あるいはシクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有するそのフラグメントを含んで成る。別の好ましい態様において、本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は配列番号２に含まれる成熟ポリペプチドを含んで成る。別の好ましい態様において、本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、配列番号２のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；あるいはシクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有するそのフラグメントから成る。別の好ましい態様において、本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は配列番号２のアミノ酸配列から成る。別の好ましい態様において、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、配列番号２に含まれる成熟ポリペプチド又はその対立遺伝子変異体；あるいはシクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有するそのフラグメントから成る。別の好ましい態様において、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、配列番号２に含まれる成熟ポリペプチドから成る。
【００８０】
配列番号２のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ及び／又はアルボキシル末端から欠失した１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドである。好ましくは、フラグメントは少なくとも２８５４アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも２９５４アミノ酸残基、及び最も好ましくは少なくとも３０５４アミノ酸残基を含む。
【００８１】
対立遺伝子変異体は、同一の染色体の遺伝子座位を占有する遺伝子の２又はそれ以上の選択型のいずれかを表す。対立遺伝子変異は突然変異を介して自然に起こり、そして個体群において多型性をもたらしうる。遺伝子の突然変異は無変化（コードされたポリペプチドにおける変化が無い）であってもよく、又は変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもある。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドである。
【００８２】
相同シクロヘキサデプシペプチド合成酵素のアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入若しくは欠失によって、及び／又は異なるアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸残基の置換によって、配列番号２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドと異なりうる。好ましくは、アミノ酸の変化は前記タンパク質の折りたたみ及び／又は活性に有意に影響を与えない保存的なアミノ酸置換；わずかな欠失、典型的に１〜約３０アミノ酸；わずかなアミノ又はカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基；最大約２０〜２５残基の小さいリンカーペプチド；あるいは正電価の変化又は別の態様による精製を容易にするわずかな伸長、例えばポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープ又は結合ドメインという、軽微な性質である。
【００８３】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の群においてある。一般的に特異的活性を変化させないアミノ酸置換は当業界で知られており、そして例えばH. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New Yorkに記載されている。最も普通に起こる交換はＡｌａ／Ｓｅｒ，Ｖａｌ／Ｉｌｅ，Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ａｌａ／Ｇｌｙ，Ａｌａ／Ｔｈｒ，Ｓｅｒ／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ，Ｓｅｒ／Ｇｌｙ，Ｔｙｒ／Ｐｈｅ，Ａｌａ／Ｐｒｏ，Ｌｙｓ／Ａｒｇ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｌｅｕ／Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙ並びにこれらの反対のものである。
【００８４】
第２の態様において、本発明は、低いストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度にストリンジェントな条件、より更に好ましくは高度にストリンジェントな条件、及び最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件のもと、同一の条件下で（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ii）配列番号１のｃＤＮＡ配列、（iii） （ｉ）若しくは（ii）の亜配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、若しくは（iii） の相補鎖とハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、単離したシクロヘキサデプシペプチド合成酵素に関する（J. Sambrook, E.F. Fritsh, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。配列番号１の亜配列は少なくとも１００個のヌクレオチド又は好ましくは少なくとも２００個のヌクレオチドであってもよい。更に前記亜配列は、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有するポリペプチドフラグメントをコードすることがある。シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は更に、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する対立遺伝子変異体又はフラグメントであってもよい。
【００８５】
配列番号１の核酸配列又はその亜配列、及び配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当業界で公知の方法に従い、異なる属又は種の菌株からシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードするＤＮＡを同定し、そしてクローン化するための核酸プローブを設計するために使用されうる。特に、前記プローブは、標準的なサザンブロッティング方法に従い、その中で相当する遺伝子を同定し、そして単離するために、注目の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用されうる。前記プローブは全配列よりもかなり短いことがあるが、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、及び更に好ましくは少なくとも３５ヌクレオチドの長さであるべきである。更に長いプローブも使用することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブ、その両方を使用することができる。前記プローブは、典型的に相当する遺伝子を検出するために標識される（例えば、32Ｐ、 3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンによる）。前記プローブは本発明に包含される。
【００８６】
従って、その様な他の生物から調製したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述したプローブとハイブリダイズし、そしてシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードするＤＮＡのためにスクリーニングされうる。その様な他の生物由来のゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいは他の分離技術によって分離されうる。前記ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離したＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の適当な担体材料上に移され、そして固定化されうる。配列番号１又はその亜配列と相同なクローン又はＤＮＡを同定するために、前記担体材料はサザンブロットに使用される。本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションは、前記核酸配列が（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ii）配列番号１のｃＤＮＡ配列、（iii） （ｉ）又は（ii）の亜配列、あるいは（iv）（ｉ），（ii）、又は（iii） の相補鎖に、低いないし非常に高度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを示唆する。前記核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを用いて検出される。
【００８７】
好ましい態様において、前記核酸プローブは、配列番号２のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする核酸配列、又はその亜配列である。別の好ましい態様において、前記核酸プローブは配列番号１である。別の好ましい態様において、前記核酸プローブは、配列番号１に含まれる成熟ポリペプチドのコード領域である。別の好ましい態様において、前記核酸プローブは、エスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６８に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＡ、エスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６９に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＢ、及びエスケリッチャ・コリ  Ｂ−３００７０に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＣに含まれる核酸配列であり、この中で、前記核酸配列は配列番号２のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする。別の好ましい態様において、前記核酸プローブは、エスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６８に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＡ、エスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６９に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＢ、及びエスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００７０に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＣに含まれる配列番号２の成熟シクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする核酸配列である。
【００８８】
少なくとも１００ヌクレオチドの長さの長いプローブのための、低いないし非常に高度なストリンジェントな条件は、５×  ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／mlの剪断し、そして変性したサケ精子ＤＮＡ、並びに非常に低い及び低いストリンジェント性のための２５％ホルムアミド、中程度及び中程度−高度にストリンジェント性のための３５％ホルムアミド、又は高度及び非常に高度なストリンジェント性のための５０％ホルムアミドのいずれかにおける、標準的なサザンブロッティング方法に従う４５℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。
【００８９】
少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブのために、前記担体材料は、最終的に２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（非常に低いストリンジェント性）、更に好ましくは少なくとも５０℃（低いストリンジェント性）、更に好ましくは少なくとも５５℃（中程度のストリンジェント性）、更に好ましくは少なくとも６０℃（中程度−高度なストリンジェント性）、より更に好ましくは６５℃（高度なストリンジェント性）、及び最も好ましくは少なくとも７０℃（非常に高度なストリンジェント性）で、各１５分間、３回洗浄される。
【００９０】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さの短いプローブのためのストリンジェントな条件は、Bolton及びMcCarthy（1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48 : 1390） に従う計算を用いて算出したＴm から５℃〜１０℃低い温度で、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  pH７．６、６mM  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０，１×デンハルト溶液、１mMピロリン酸ナトリウム、１mM  一塩基リン酸ナトリウム、０．１mM  ＡＴＰ、及び０．２mg／mlの酵母ＲＮＡ中で、標準的なサザンブロッティング方法に従うプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーション後の洗浄として定義される。
【００９１】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さの短いプローブのための前記担体材料は、１回、６×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳ中で１５分間、及び２回、６×ＳＳＣを用いて算出したＴm より５℃〜１０℃低い温度で各１５分間洗浄される。
【００９２】
第３の態様において、本発明は配列番号２のアミノ酸配列を有するシクロヘキサデプシペプチド合成酵素又はその成熟ポリペプチドに対して免疫化学的同一性又は部分的な免疫化学的同一性を有する、単離したポリペプチドに関する。免疫化学的特性は、公知のオクタロニー二重免疫拡散法による免疫学的交差反応同定試験によって決定される。具体的には、免疫反応性の、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはその成熟ポリペプチドのエピトープに結合するポリクローナル抗体を含む抗血清は、Harboe and Ingild, In N.H. Axelsen, J. Kroll and B. Weeks, editors, A Manual of Quantative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23、又はJohnstone and Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982（更に具体的には２７〜３１ページ）に記載されている方法に従いウサギ（又は他のげっ歯類）を免疫化することで調製される。免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、同一の様式、例えば沈澱の全体的な融合、同一な沈澱の形態、及び／又は同一な電気泳動の移動度で、特異的な免疫化学的技術を用いて抗血清と反応するポリペプチドである。免疫化学的同一性の更なる説明は、Axelsen, Bock, and Kroll, In N.H. Axelsen, J. Kroll, and B. Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 10に記載されている。部分的な免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、部分的に同一な様式、例えば沈澱の部分的融合、部分的に同一な沈澱の形態、及び／又は部分的に同一な電気泳動の移動度で、特異的な免疫化学的技術を用いて抗血清と反応するポリペプチドである。部分的な免疫化学的同一性の更なる説明は、Bock and Axelsen, In N.H. Axelsen, J. Kroll, and B. Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immunoelec trophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 11に記載されている。
【００９３】
前記抗体は更に、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、例えばE. Harlow and D. Lane, editors, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York の方法に従い調製され、そして使用されうる。
【００９４】
本発明の単離したシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、配列番号２の成熟ポリペプチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、更に好ましくは少なくとも６０％、より更に好ましくは少なくとも８０％、より更に好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも１００％のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する。
【００９５】
好ましい態様において、本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、フサリウム・ベネナツムの菌株、及び更に好ましくはフサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４又はその変異菌株から獲得され、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００９６】
本明細書で定義した様に、「単離した」シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定する場合、本質的に他のポリペプチドが無い、例えば少なくとも約２０％純粋、好ましくは少なくとも約４０％純粋、更に好ましくは約６０％純粋、より更に好ましくは約８０％純粋、最も好ましくは約９０％純粋、及び更に最も好ましくは約９５％純粋のポリペプチドである。
【００９７】
本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、いずれかの属の微生物から獲得されうる。
【００９８】
本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、細菌のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素であってもよい。例えば、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、グラム陽性細菌のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素、例えばバチルスのシクロヘキサデプシペプチド合成酵素、例えばバチルス・アルカロフィラス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｒｓ）、バチルス・ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアギュランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はバチルス・サーリンジェンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素；あるいはストレプトマイセスのシクロヘキサデプシペプチド合成酵素、例えばストレプトマイセス・リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトマイセス・ムリナス（ｍｕｒｉｎｕｓ）のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素；あるいはグラム陰性細菌のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素、例えばＥ．コリ又はシュードモナス種のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素であってもよい。
【００９９】
本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、菌類のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素であってもよく、そして更に好ましくは酵母のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素、例えばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素；あるいは更に好ましくは糸状菌のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素、例えばアクレモニウム、アスペルギルス、アウレオバシジウム、クリプトコッカス、フィリバシジウム、フサリウム、フミコラ、マグナポルセ、ムコール、マイセリオフソラ、ネオカリマスチックス、ニューロスポラ、パエシロミセス、ペニシラム、ピロミセス、シゾフィラム、タラロミセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポクラジウム、又はトリコデルマのシクロヘキサデプシペプチド合成酵素であってもよい。
【０１００】
好ましい態様において、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素はサッカロマイセス・カールスベルジュネシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタチカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロマイセス・オビホルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素である。
【０１０１】
別の好ましい態様において、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、アスペルギルス・アクレアツス（ａｃｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ホエチダス（ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、ムコール・ミエーイ、マイセリオフソラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシラム・パーピュロジェナム、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・ロンギブラチアタム、トリコデルマ・レエセイ、又はトリコデルマ・ビリデのシクロヘキサデプシペプチド合成酵素である。
【０１０２】
別の好ましい態様において、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、フサリウム・バクテリジオイデス、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クルックベレンス、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミニアラム、フサリウム・グラミナム、フサリウム・ヘテロスポラム、フサリウム・ネガンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチクラタム、フサリウム・ロジューム、フサリウム・サンバシナム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・スポロトリチオイデス、フサリウム・スルファリューム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコテシオイデス、又はフサリウム・ベネナツムのシクロヘキサデプシペプチド合成酵素である。
【０１０３】
本発明は更に、本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする、単離した核酸配列に関する。好ましい態様において、前記核酸配列は配列番号１に記載されている。別の更に好ましい態様において、前記核酸配列はエスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６８に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＡ、エスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６９に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＢ、及びエスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００７０に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＣに含まれる配列である。別の更に好ましい態様において、前記核酸配列はエスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６８に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＡ、エスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６９に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＢ、及びエスケリッチャ・コリ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３００７０に含まれるプラスミドｐＺＬ−ＥＳＣに含まれる、配列番号２に含まれる成熟ポリペプチドをコードする配列である。別の好ましい態様において、前記核酸配列は配列番号１に含まれる成熟ポリペプチドのコード領域である。本発明はまた遺伝暗号の縮重性によって配列番号１と異なる、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその成熟配列をコードする核酸配列を包含する。本発明はまた、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する、配列番号２のフラグメントをコードする配列番号１の亜配列に関する。
【０１０４】
配列番号１の亜配列は、５′及び／又は３′末端の１又は複数のヌクレオチドが欠失しているのを除いて、配列番号１に包含される核酸配列である。好ましくは、亜配列は少なくとも８５６２ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも８８６２ヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも９１６２ヌクレオチドを含む。
【０１０５】
本発明はまた、配列番号１の成熟ポリペプチドのコード配列において少なくとも１つの変異を含んで成る、変異核酸配列に関し、ここで、前記変異核酸配列は配列番号２に含まれる成熟ポリペプチドから成るポリペプチドをコードする。
【０１０６】
シクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする核酸配列を単離又はクローン化するために使用する技術は、本明細書に記載のゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。前記ゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えばＰＣＲによって達成されることがあり、又は他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、結合活性転写（ｌｉｇａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＬＡＴ）及び核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）が使用されうる。前記核酸配列はフサリウムの菌株、又は別の若しくは関連の生物からクローン化してもよく、そしてそれ故に、例えば前記核酸配列のポリペプチドコード領域の対立遺伝子又は種の変異体であってもよい。前記核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
【０１０７】
用語「単離した核酸配列」は、本明細書で使用する場合、本質的に他の核酸配列を含まない、例えばアガロース電気泳動によって決定される様に少なくとも約２０％純粋、好ましくは少なくとも約４０％純粋、更に好ましくは少なくとも約６０％純粋、より更に好ましくは少なくとも約８０％純粋、及び最も好ましくは少なくとも約９０％純粋である核酸配列を言及する。
【０１０８】
本発明はまた、配列番号１に含まれる成熟ポリペプチドのコード領域に対してある程度の相同性、少なくとも約６５％、好ましくは約７０％、好ましくは約８０％、更に好ましくは約９０％、より更に好ましくは約９５％、及び最も好ましくは約９７％の相同性を有する、活性ポリペプチドをコードする核酸配列に関する。本発明の目的のために、２つの核酸配列の間の相同性の程度はＷｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎ法（Wilbur and Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Sicerce USA 80 : 726-730）により、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）のソフトウェア（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を同一性表及び次の複数のアラインメントパラメーター：ギャップペナルティー（１０）、及びギャップレングスペナルティー（１０）を用いて決定した。対のアラインメントパラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝３、ギャップペナルティー＝３、及びウィンドウ＝３であった。
【０１０９】
本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする核酸配列の修飾は、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素に実質的に類似しているポリペプチドの合成に必要である様である。前記シクロヘキサデプシペプチド合成酵素に対しての、用語「実質的に類似」は、前記酵素の非天然型を言及している。これらのペプチドは、その天然の供給源から単離したシクロヘキサデプシペプチドと、いくつかの実行されている方法において異なることがあり、例えば、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素の変異体は、特異的活性、熱安定性、至適pH等において異なる。変異体配列は、配列番号１の一部をコードするポリペプチド、例えばその亜配列として、提示される核酸配列に基づいて、及び／又は前記核酸配列によってコードされるポリペプチドの別のアミノ酸配列をもたらさないが、前記酵素の酸性が意図される宿主生物のコドンの使用に相当するヌクレオチド置換の導入によって、又は異なるアミノ酸配列をもたらしうるヌクレオチド置換の導入によって構築されうる。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、例えばFord et al., 1991, Protein Expression and Purification 2 : 95-107 を参照のこと。
【０１１０】
前記の置換が、分子の機能に必須の領域の外側で行われ、そして更に活性ポリペプチドを生じうることは当業者に理解されるだろう。本発明の単離した核酸配列によってコードされるシクロヘキサデプシペプチドの活性に必須な、そしてそれ故に好ましくは置換にかけられないアミノ酸残基は、当業界で知られている方法、例えば部位指定突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（例えば、Cunningham and Wells, 1989, Science 244 : 1081-1085 を参照のこと）に従い同定されうる。後者の技術において、突然変異は分子内の正電荷残基ごとに導入され、そして生じた変異分子は前記分子の活性に必須なアミノ酸残基を同定するためにシクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性について試験される。基質−酵素の相互作用部位も、核磁気共鳴解析、結晶学又は光親和性標識の様な技術によって決定される三次元構造の解析によって決定されうる（例えば、de Vos et al., 1992, Science 255 : 306-312 ; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224 : 899-904 ; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309 : 59-64）。
【０１１１】
本発明はまた、本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素をコードする単離した核酸配列であって、本明細書で定義した様な低いストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度にストリンジェントな条件、より更に好ましくは高度にストリンジェントな条件、及び最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件のもとで、同一の条件下で（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ii）配列番号１のｃＤＮＡ配列、（iii） （ｉ）若しくは（ii）の亜配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、若しくは（iii） の相補鎖；あるいはそれらの対立遺伝子変異体（Sambrook et al., 1989, supra）と本明細書で定義した様にハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする核酸配列に関する。
【０１１２】
本発明はまた、（ａ）低い、中程度に、高度に、又は非常に高度にストリンジェントな条件下で、（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ii）配列番号１のｃＤＮＡ配列、（iii） （ｉ）若しくは（ii）の亜配列、又は（iv）（ｉ），（ii）、若しくは（iii） の相補鎖とハイブリダイズし、そして（ｂ）前記核酸配列を単離することによって産生する、単離した核酸配列に関する。前記亜配列は、好ましくはシクロヘキサデプシペプチド合成活性を有する、少なくとも１００ヌクレオチドの配列、例えばポリペプチドフラグメントをコードする配列である。
【０１１３】
本発明は更に、少なくとも１つの変異を配列番号１の成熟ポリペプチドのコード配列又はその亜配列に導入することを含んで成る、変異核酸配列を産生するための方法に関し、ここで、変異核酸配列は、配列番号２に含まれる成熟ポリペプチド又はシクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有するそのフラグメントから成るポリペプチドをコードする。
【０１１４】
あるヌクレオチドを別のヌクレオチドと交換するための、前記核酸配列への変異の導入は、当業界で知られている方法のいずれかを用いる部位指定突然変異誘発によって達成されうる。特に有用なものは、注目の挿入断片を有する超らせんの二本鎖ＤＮＡベクター及び所望の変異を含む２つの合成プライマーを利用する方法である。前記ベクターの反対の鎖にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによって、温度サイクリングの間伸長する。前記プライマーの組み込みにより、ねじれ型のニックを含む変異プラスミドが生じる。温度サイクリングの後、生成物は親のＤＮＡ鋳型を消化し、そして変異含有合成ＤＮＡを選択するために、メチル化及び半メチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩで処理される。当業界で知られている他の方法も使用されうる。
【０１１５】
本発明はまた、前記配列の発現のための、配列番号１の核酸配列、その亜配列又は相同体を含む、核酸コンストラクト、組換え発現ベクター、及び宿主細胞に関する。前記コンストラクト及びベクターは、本明細書に記載されている様に構築される。前記の宿主細胞は前記核酸配列の発現に適したいずれかの細胞であってよい。
【０１１６】
前記宿主細胞は真核生物、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞又は菌細胞であってもよい。有用な哺乳類細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、又は例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な、いずれかの番号の不死化細胞系を含む。
【０１１７】
好ましい態様において、前記宿主細胞は菌細胞である。更に好ましい態様において、菌類の宿主細胞は酵母細胞又は糸状菌細胞である。
【０１１８】
より更に好ましい態様において、酵母の宿主細胞はカンジダ、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス、ピキア、サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス、又はヤロビアの細胞である。
【０１１９】
最も好ましい態様において、酵母の宿主細胞はサッカロマイセス・カールスベルジェネシス、サッカロマイセス・セレビシアエ、サッカロマイセス・ジアスタチカス、サッカロマイセス・ドウグラシイ、サッカロマイセス・クルイベリ、サッカロマイセス・ノルベンシス又はサッカロマイセス・オビホルミスの細胞である。別の最も好ましい態様において、酵母の宿主細胞はクルイベロマイセス・ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）の細胞である。別の最も好ましい態様において、酵母の宿主細胞はヤロビア・リポリチカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞である。
【０１２０】
別のより更に好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアクレモニウム、アスペルギルス、フサリウム、フミコラ、ムコール、マイセリオフソラ、ニューロスポラ、ペニシラム、チエラビア、トリポクラジウム、又はトリコデルマの細胞である。
【０１２１】
最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ホエチダス、アスペルギルス・ジャポニカス、アスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、フサリウム・バクテリオイデス、フサリウム・クルックベレンス（フサリウム・セレアリスの同義語）、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミニアラム、フサリウム・ヘテロスポラム、フサリウム・ネガンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチクラタム、フサリウム・ロジューム、フサリウム・サンバシナム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・ソラニ、フサリウム・スポロトリチオイデス、フサリウム・スルファリューム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコテシオイデス、フサリウム・ベネナツム（例えば、フサリウム・ベネナツム（ニレンベルグ（Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ）ｓｐ．ｎｏｖ．）、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、ムコール・ミエーイ、マイセリオフソラ・サーモフィラム、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシラム・パーピュロジュナム、チエラビア・テレストリス（ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・ロンギブラチアタム、トリコデルマ・レエセイ、又はトリコデルマ・ビリデの細胞である。
【０１２２】
菌細胞は、本質的に知られている方法の、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生に関与する方法によって形質転換しうる。アスペルギルス及びフサリウムの宿主細胞の形質転換に適した方法は、本明細書に記載されている。酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York ; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153 : 163 ; 及びHinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 : 1920 に記載の方法を用いて形質転換されうる。
【０１２３】
本発明はまた、（ａ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素を産生することができる野生型の菌株を培養し、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素を含んで成る上清を産生せしめ；そして（ｂ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素を回収すること、を含んで成る本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素を産生するための方法に関する。好ましくは、前記菌株はフサリウム属のものであり、そして更に好ましくはフサリウム・ベネナツムである。
【０１２４】
本発明はまた、（ａ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素の産生を誘導する条件下で宿主細胞を培養し；そして（ｂ）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素を回収すること、を含んで成る本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素を産生するための方法に関する。
【０１２５】
本発明の産生方法において、前記細胞はシクロヘキサデプシペプチドの産生に適した栄養培地において、本明細書に記載の当業界で知られている方法を用いて培養される。シクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、前記酵素に特異的な当業界で知られている方法を用いて検出されうる（例えば、Visconti et al., 1992, supraを参照のこと）。生じたシクロヘキサデプシペプチド合成酵素は、本明細書に記載の当業界で知られている方法によって回収され、そして精製されうる。
【０１２６】
本発明はまた、シクロヘキサデプシペプチドを産生するための方法及び本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素によって産生するシクロヘキサデプシペプチドに関する。シクロヘキサデプシペプチドの産生は、前記の単離した合成酵素を用いて又は前記合成酵素をコードする遺伝子を含む細胞の発酵によって達成されうる（例えば、Madry et al., 1983, European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 17 : 75-79 を参照のこと）。前記細胞は、野生型細胞又は組換え細胞であってもよい。シクロヘキサデプシペプチドは、当業界で知られている方法のいずれかによって単離し、そして精製されうる。例えば、米国特許第５，６５６，４６４号；Visconti et al., 1992, supraを参照のこと。
【０１２７】
好ましい態様において、シクロヘキサデプシペプチドを産生するための方法は：（ａ）本発明のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素を、Ｄ−２−ヒドロキシイソ吉草酸、分枝鎖Ｌ−アミノ酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、及びＡＴＰと反応させ；そして（ｂ）反応物からシクロヘキサデプシペプチドを単離すること、を含んで成る。
【０１２８】
別の好ましい態様において、シクロヘキサデプシペプチドを産生するための方法は：（ａ）シクロヘキサデプシペプチドの産生に適した条件下で細胞を培養し、ここで、前記細胞は（ｉ）配列番号２に含まれる成熟ポリペプチドとの少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシクロヘキサデプシペプチド合成酵素；（ii）中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号１の核酸配列又はその相補鎖、又は少なくとも１００ヌクレオチドの配列番号１の亜配列とハイブリダイズする核酸配列によってコードされるシクロヘキサデプシペプチド合成酵素；（iii) （ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；あるいは（iv）シクロヘキサデプシペプチド合成酵素活性を有する（ａ），（ｂ）又は（ｃ）のフラグメントをコードする核酸配列を含んで成る；そして（ｂ）反応物からシクロヘキサデプシペプチドを単離すること、を含んで成る。
【０１２９】
本発明は更に、本発明の範囲を限定するとして解釈されるべきでない次の例によって説明される。
【０１３０】
例
菌株
フサリウム・ベネナツムの菌株  ＡＴＣＣ  ２０３３４は、これらの実験のためのゲノムＤＮＡの供給源として使用した。ゲノムＤＮＡライブラリーは、組換えバクテリオファージのプレーティング及び精製のための宿主としてのＥ．コリ  Ｙ１０９０ＺＬ及び組換えｐＺＬ１誘導体の切り出しのためのＥ．コリ  ＤＨ１０Ｂｚｉｐを有するλＺｉｐＬｏｘクローニング系（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を用いて構築した。フサリウム・トルロサム  Ｒ−５６９０（Fusarium Research Center, Penn State University, State Collage, PA）及びアスペルギルス・ニガー  Ｂｏ−１（Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark） が、ハイブリダイゼーション実験のためのコントロールＤＮＡの供給源として使用された。ｔｒｉ５欠失フサリウム・ベネナツムの菌株ＬｙＭＣ１Ａ（ＷＯ９９／６０１３７）は、形質転換実験の宿主として使用した。エスケリッチャ・コリ  ＴＯＰ１０（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）及びＥ．コリ  ＤＨ５−アルファ菌株（Gibco-BRL Life Technologies, Bethesda, MD）は、ベクターの構築及び慣習的なプラスミドの増殖に使用した。
【０１３１】
培地
ＲＡ胞子形成培地は、１Ｌ当たり５０ｇのコハク酸（二ナトリウム塩）、２０mlの５０×Ｖｏｇｅｌ塩、１２．１ｇのＮａＮＯ3 及び１ｇのグルコースから構成した。
【０１３２】
５０×Ｖｏｇｅｌ塩は、１Ｌ当たり１２５ｇのクエン酸ナトリウム、２５０ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１０ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、５ｇのＣａｌｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（あらかじめ２０mlの水に溶解）、及び５mlの２００×Ｖｏｇｅｌ微量元素から構成した（各成分は次のものの添加の前に完全に溶解した）。濾過滅菌した。
【０１３３】
２００×Ｖｏｇｅｌ微量元素は、１００ml当たり５ｇのクエン酸・１Ｈ2 Ｏ、５ｇのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１ｇのＦｅ（ＮＨ4 ）2 （ＳＯ4 ）2 ・６Ｈ2 Ｏ、０．２５ｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．０５ｇのＭｎＳＯ4 ・１Ｈ2 Ｏ、０．０５ｇのＨ3 ＢＯ3 、及び０．０５ｇのＮａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏから構成した。
【０１３４】
フルオロアセトアミドアガー（ＦＡ）は、１Ｌ当たり１２ｇの酢酸ナトリウム、２ｇの塩化ナトリウム、０．５ｇのＭｇＳＯ4 、３ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、０．３ｇの尿素、２ｇのフルオロアセトアミド、１mlのＶｏｇｅｌ塩、及び１５ｇの不活性アガー（pH６．１）から構成した。
【０１３５】
Ｃｏｖｅ培地は、１Ｌ当たり３４２．３ｇのスクロース、２０mlの５０×Ｃｏｖｅ塩溶液、１０mlの１Ｍアセトアミド、１０mlの１．５Ｍ  ＣｓＣｌ、及び２５ｇの不活性アガーから構成した。
【０１３６】
５０×Ｃｏｖｅ塩は、１Ｌ当たり２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、７６ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、及び５０mlの２０×Ｃｏｖｅ微量元素から構成した。
【０１３７】
２０×Ｃｏｖｅ微量元素は１Ｌ当たり０．０４ｇのＮａ2 Ｂ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、０．８ｇのＮａ2 ＭｏＯ2 ・２Ｈ2 Ｏ、及び１０ｇのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏから構成した。
【０１３８】
例１：フサリウム・ベネナツム、フサリウム・トルロサム、及びアスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡ抽出
フサリウム・ベネナツム、フサリウム・トルロサム、及びアスペルギルス・ニガーは、１Ｌ当たり５ｇの酵母抽出物及び２０ｇのグルコースから構成した２５mlのＹＥＧ培地中で、２８℃及び１５０rpm で２４〜３６時間生育した。続いて、菌糸がＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Calbiochem, La Jolla, CA）を介した濾過によって回収され、そして２５mlの１０mM  Ｔｒｉｓ−１mM  ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液で１回洗浄された。過剰な緩衝液は、液体窒素中で引き続いて凍結される菌糸から排出した。凍結した菌糸は、電機コーヒーひき器中で微粉末に粉砕し、各粉末は、使い捨てのプラスチック遠心管中の２０mlのＴＥ緩衝液及び５mlの２０％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に加えられた。混合物は、混合を確かなものにするために数回おだやかに反転され、そして等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖ）で２回抽出した。酢酸ナトリウム（３Ｍ溶液）は、０．３Ｍの最終濃度を与えるために加えられ、そして核酸は２．５倍量の氷冷エタノールで沈澱した。遠心管は、１５，０００ｇで３０分間遠心され、そして沈澱は、０．５mlのＴＥ緩衝液中での再懸濁前に、３０分間風乾された。ＤＮアーゼ無しのリボヌクレアーゼＡは１００μｇ／mlの濃度で加え、そして混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、プロテイナーゼＫ（２００μｇ／ml）を加え、そして混合物を３７℃で追加時間インキュベートした。最後に、前記混合物は、標準的な方法に従う酢酸ナトリウム及びエタノールを用いるＤＮＡ沈澱の前に、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖ）で２回抽出された。ＤＮＡの沈澱は真空のもとで乾燥され、ＴＥ緩衝液中で再懸濁され、そして４℃で保存された。
【０１３９】
例２：ハイブリダイゼーション実験
例１に記載のゲノムＤＮＡ調製物は、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素の遺伝子配列の存在についてサザンハイブリダイゼーションを用いて試験された。前記ＤＮＡの分割量はＢａｍＨＩ又はＢａｍＨＩ＋ＸｂａＩで消化され、そしてアガロースゲル電気泳動によって分離された。前記ゲルのＤＮＡは、Davis et al. (1980, Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY） の方法に従いＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（商標）の濾過膜（Amersham Corporation, Arlington Heights, IL） にブロットし、そして本明細書に記載の４５℃での低い、中程度に、及び高度にストリンジェントな条件下でフサリウム・トルロサムのｅｓｙｎ１遺伝子（Thomas Hohn 博士（USPDA, Peoria, IL）から入手） の５′部位をコードする放射性標識したフラグメントでプローブした。フサリウム・トルロサム由来のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素特異的プローブは、α〔32Ｐ〕ｄＣＴＰ（Amersham, Arlington Heights, IL）を用いるニックトランスレーション（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY）によって放射性標識し、そして最終濃度０．１ＭまでＮａＯＨを加えることによって変性させ、そして１ml当たり約１×１０6 cpm の活性でハイブリダイゼーション緩衝液に加えた。ハイブリダイゼーション後、フィルターは０．１％ＳＤＳを有する０．２×ＳＳＰＥ中で４５℃で１回洗浄され、続いて０．２×ＳＳＰＥ（ＳＤＳ無し）中で同一の温度での２回の洗浄が行われた。前記フィルターは紙タオル上で１５分間風乾され、続いてサランラップ（商標）に包まれ、そして増感スクリーン（Kodak, Rochester, NY）を用いて−７０℃で一晩Ｘ線フィルムに暴露された。
【０１４０】
サザンハイブリダイゼーション解析は、シクロヘキサデプシペプチド合成酵素特異的ＤＮＡ配列が、低い及び中程度にストリンジェント条件下でのみ、フサリウム・トルロサムのｅｓｙｎ１プローブとフサリウム・ベネナツムのゲノムにおいて検出されうることを示した。フサリウム・トルロサム由来のポジティブコントロールＤＮＡは、全ての条件下で強いハイブリダイゼーションシグナルを与え、そしてアスペルギルス・ニガー由来のネガティブコントロールは、試験した全ての条件下でハイブリダイズしなかった。これらの結果は、フサリウム・ベネナツムがフサリウム・トルロサムのエニアチン合成酵素遺伝子に相同なゲノムＤＮＡ配列を含むことを示唆した。
【０１４１】
例３：ゲノムＤＮＡライブラリーの構築及びスクリーニング
フサリウム・ベネナツムのゲノムライブラリーは、取扱い説明書（Life Technologies, Gaitherburg, MD）に従い、λＺｉｐＬｏｘ内で構築した。フサリウム・ベネナツムのゲノムＤＮＡは、Ｔｓｐ５０９Ｉで部分的に消化し、そして１％アガロースゲル上でサイズごとに分画した。３〜７Kbのサイズ範囲を移動するＤＮＡフラグメントを切り出し、そしてＰｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅ試薬（BioRad, Hercules, CA）を用いてアガロースゲルの切片から溶出した。溶出したＤＮＡフラグメントは、ＥｃｏＲＩで開裂し、そして脱リン酸化したλＺｉｐＬｏｘベクターアーム（Life Technologies, Gaithersburg, MD） で連結し、そしてライゲーション混合物は市販のパッケージング抽出物（Stratagene, La Jolla, CA）を用いてパッケージングした。パッケージングしたＤＮＡライブラリーをプレーティングし、そしてＥ．コリ  Ｙ１０９０ＺＬ細胞において増幅させた。
【０１４２】
前記ライブラリー由来の約５０，０００のプラークが、例２に記載の低いストリンジェントな条件を用いて、フサリウム・トルロサム  ｅｓｙｎ１遺伝子の放射性標識したプローブフラグメントによるプラークハイブリダイゼーション（Davis et al., 1980, supra） によってスクリーニングされた。ハイブリダイゼーションシグナルを与えるプラークは、Ｅ．コリ  Ｙ１０９０ＺＬ細胞において２回精製され、そして次にｐＺＬ１誘導体としてλＺｉｐＬｏｘベクターから切り出された（D'Alessio et al., 1992, Focus（商標）14 : 7）。 隣接しているＤＮＡ配列を得るための染色体「歩行」は、相同なフサリウム・ベネナツムのプローブを用いて高度なストリンジェント性で行った。
【０１４３】
フサリウム・トルロサムのｅｓｙｎ１遺伝子プローブと強力にハイブリダイズする４つのプラークが同定され、そして引き続いてそれぞれの潜在的なプローブが、ｐＺＬ誘導体（D'Alessio et al., 1992, supra）としてλＺｉｐＬｏｘベクターから切り出された。プラスミドＤＮＡは、標準的な方法を用いてＥ．コリのＤＨ１０Ｂ細胞の継代によって前記クローンから単離された。クローン化したインサートのサイズは、アガロースゲル電気泳動によって決定した。最大のインサートは、約３KbのＤＮＡフラグメントを含んで成った。前記クローンはＥ．コリ  ＤＨ１０Ｂ  ｐＺＬ−ＥＳＡと表した。
【０１４４】
例４：フサリウム・ベネナツムのシクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子のクローニング及び解析
約３KbのＤＮＡセグメントのＤＮＡ配列決定は、色素終結化学を用いるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７７  ＸＬ自動ＤＮＡ配列決定機で行った。隣接遺伝子は、トランスポゾン挿入戦略を用いて生成させた（Primer Island Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）。全てのクローン化領域が平均６．９の重複製で配列決定された。
【０１４５】
ヌクレオチドの配列決定は、前記の３Kbのセグメントが少なくとも９００アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含むことを明らかにした。しかし、このフラグメント（フラグメントＡ、ｐＺＬ−ＥＳＡと表す）は、全遺伝子生成物をコードしていなかった。その結果、前記ライブラリーはフラグメントＡの３′部分を含んで成るプローブ（約１KbのＨｉｎｄIII フラグメント）を用いて再スクリーニングされた。続いて、複数のクローンが同定され、そして制限地図によって解析された。これらの第２の最大のクローンは、約４．６KbのゲノムＤＮＡインサートを含んだ（フラグメントＢ、ｐＺＬ−ＥＳＢと表す）。前記クローンはＥ．コリ  ＤＨ１０Ｂ  ｐＺＬ−ＥＳＢと表した。
【０１４６】
フラグメントＢのヌクレオチド配列試験は、アミノ酸７７７〜２３１１によって、フラグメントＡのオープンリーディングフレームに及んだ。しかし、この配列はオープンリーディングフレームの終止コドンに達していなかったので、第３のゲノムセグメントの単離を必要とした。第３のゲノムクローンは、フラグメントＢに由来するＰＣＲで増幅したプローブを用いて前記のゲノムライブラリーを再スクリーニングすることによって単離した。以下に示す２つのＰＣＲプライマーは、前記ライブラリーのスクリーニングに使用した５８６bpのプローブセグメントを増幅するのに使用した。
５′−ｄＡＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＴＴＧＡＡＡＧＴＣＧＡＴ−３（配列番号３）
５′−ｄＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＡＣＧＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＣ−３′（配列番号４）
【０１４７】
増幅反応液（１００ml）は、次の成分：０．２μｇのｐＺＬ−ＥＳＢ  ＤＮＡ、４８．４pmolの正プライマー、４８．４pmolの逆プライマー、１mMの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、並びに２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）を含んだ。前記反応液は、９５℃で５分間の１サイクル、続いてそれぞれ９５℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で２分間の３０サイクルを設定したＥｒｉｃｏｍｐ  Ｔｗｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｅａｓｙ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートした。
【０１４８】
前記反応液をアガロースゲル上で電気泳動にかけ、そして５８６bpの予想した生成物を獲得した。反応液を調製用ゲル上に流し、所望の生成物を含むゲル切片を切り出し、そしてＤＮＡを、Ｑｉａｇｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Qiagen, Chatsworth, CA）を用いて前記ゲルから単離した。
【０１４９】
このプローブを用いて同定した７個のクローン由来の最大のもの（フラグメントＣ、ｐＺＬ−ＥＳＣ）は、５．５Kbのインサートを含んだ。続くＤＮＡ配列決定の解析は、フラグメントＣがアミノ酸１６１７〜３１２９、潜在的な終止コドン、及び１５５３bpの３′フランキングＤＮＡをコードすることを明らかにした。前記クローンは、Ｅ．コリ  ＤＨ１０Ｂ  ｐＺＬ−ＥＳＣと表した。シクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子の全ＤＮＡ配列は、３つの重複クローン（フラグメントＡ，Ｂ、及びＣ）から組み立てた。トランスポゾン挿入戦略は、高い重複性まで素速い配列決定を許容した。
【０１５０】
完全なＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を図１に示す。シクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）は、平均６．９の重複性を決定した。シクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子は、３１２９アミノ酸のポリペプチド（ＭＷ＝３４６，８５２）をコードする、イントロンの無い９３８７bpの長いオープンリーディングフレームを含んだ。
【０１５１】
シクロヘキサデプシペプチド合成酵素遺伝子生成物の推定されるアミノ酸配列（配列番号２）は、フサリウム・スチルピのエニアチン合成酵素と約５９％の同一性を共有した（Haese et al., 1993, Mol. Microbiol. 7 : 905-914 ; EMBLのデータベースにおいて、受託番号Ｚ１８７５５のもと列挙されているＤＮＡ配列）。同一性のパーセントは、Ｃｌｕｓｔａｌ法（Higgins, 1989, CABIOS 5 : 151-153）によって、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を同一性表及び次の複数のアラインメントパラメーター：ギャップペナルティー（１０）及びギャップレングスペナルティー（１０）で用いて決定した。対のアラインメントパラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティー＝３、ウィンドウ＝５、及びダイアゴナル＝５とした。
【０１５２】
例５：ｐΔＥＳ−ａｍｄＳの構築
ｄｐｓ１欠失ベクターｐΔＥＳ−ａｍｄＳ１及びｐΔＥＳ−ａｍｄＳ２の構築を図２に示す。簡単に述べると、ｄｐｓ１のコード領域の一部を含んで成る０．２KbのＤＮＡセグメントは、Ｓｔｕ１及びＮｒｕＩの制限エンドヌクレアーゼによる消化によって、プラスミドｐＺＬ−ＥＳＡ（フラグメントＡと表す）から除去した。これら両方の酵素は平滑末端のＤＮＡフラグメントを生成する。消化したｐＥＳＡベクターは、ウシの腸アルカリホスファターゼ（Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN）を用いてセルフライゲーションしない様に処理した。最後に、アスペルギルス・ニジュランスａｍｄＳ遺伝子をコードする３．２Kbフラグメント（アスペルギルス・オリザエのｐｙｒＧ遺伝子由来のフランキング反復配列を有する）は、ＳｍａＩ及びＰｍｅＩによるｐＪＲｏｙ４７（ＷＯ９９／６０１３７）の消化によって得られた。このａｍｄＳフラグメントは、続いて欠失プラスミドｐΔＥＳ−ａｍｄＳ１及びｐΔＥＳ−ａｍｄＳ２（ａｍｄＳ遺伝子セグメントの配向のみが異なる）を生成せしめるために、上述したｐＺＬ−ＥＳＡベクターのフラグメントとライゲーションした。
【０１５３】
例６：フサリウム・ベネナツム  ＬｙＭＣ１Ａの形質転換及びｄｐｓ１遺伝子欠失についての予備的スクリーニング
プラスミドｐΔＥＳ−ａｍｄＳ１をＳｐｅ１で消化し、そして５．７Kbの欠失フラグメント（アスペルギルス・ニジュランスａｍｄＳ遺伝子と一緒のフサリウム・ベネナツムのｄｐｓ１遺伝子の一部及び０．２Kbのｄｐｓ１コード領域を変換する反復を含んで成る）が続いて切り出され、そして形質転換実験における使用のために精製された。フサリウム・ベネナツム  ＬｙＭＣ１Ａのプロトプラストの調製及び形質転換は、Royer, 1995, Bio/Technology 13 : 1479-1483の方法に従い行った。
【０１５４】
フサリウム・ベネナツム  ＬｙＭＣ１Ａのプロトプラストは、ＣＯＶＥプレート上での選別による５．７KbのＳｐｅＩ  ΔＥＳ−ａｍｄＳフラグメントで形質転換した。１５個の形質転換体が得られ、そして単一の胞子を精製した。ＤＮＡは、ＳｐｅＩ  ΔＥＳ−ａｍｄＳフラグメントで生成した単一の胞子の精製形質転換体から、及びフサリウム・ベネナツム  ＬｙＭＣ１Ａから、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Qiagen, Chatsworth, CA）を用いて（取扱い説明書で推奨されている１０分の代わりに２時間の分解的インキュベーションを用いる）抽出された。１〜２μｇの各ＤＮＡを、ＸｈｏＩ又はＳｐｅＩ（３０μｌの反応液中に１０Ｕ／μｇのＤＮＡ）で７時間消化した。消化物をＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてＤＮＡを０．４Ｎ  ＮａＯＨ中でＨｙｂｏｎｄ  Ｎ+ に移した。ブロットをＵＶ架橋し、そして以下に記載の様にプローブした。
【０１５５】
プローブは、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  キット（Stratagene, La Jolla, CA）及びα〔32Ｐ〕−ｄＣＴＰを用いて調製した。標識の後、前記プローブはＧ  ５０  ＴＥ  Ｍｉｄｉカラム（５′から３′、Boulder, CO） を用いて、取り込まれていない標識から分離した。
【０１５６】
ブロットは、Ｒａｐｉｄ  Ｈｙｂ緩衝液（Amersham, Arlington Heights, IL)中で６５℃で４５分間プレハイブリダイゼーションした。変性プローブをＲａｐｉｄ  Ｈｙｂ溶液に加え、そしてハイブリダイゼーションを６５℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後、前記プロットは２×ＳＳＣ中で室温で５分間、１回洗浄し、そして０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で５分間、２回洗浄した。洗浄したブロットは、２×ＳＳＣ中で室温で５分間洗浄した。
【０１５７】
ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットを２回プローブした。はじめに、それらをｐΔＥＳ−ａｍｄＳ１の８００bpのＮｓｉＩ／ＳｐｅＩフラグメントでプローブした。１５個の形質転換体のうち４個が、８００bpのＮｓｉＩ／ＳｐｅＩフラグメントでプローブする場合に遺伝子置換について予想される５．２Kbのバンド（ＸｈｏＩで消化したＤＮＡ）及び５．７Kbのバンド（ＳｐｅＩで消化したＤＮＡ）を有していた。他の形質転換体の多くは、２．２Kbのバンド（ＸｈｏＩで消化したＤＮＡ）又は２．７Kb（ＳｐｅＩで消化したＤＮＡ）の野生型バンド、及びおそらく形質転換しているＤＮＡの異所性の組み込みに相当する追加のバンドを有していた。
【０１５８】
第２番目に、同一のサザンブロットは、ｄｐｓ１のコード領域の０．２Kb  ＳｔｕＩ／ＮｒｕＩ部分を含むプラスミド、ＨｉｎｄIII で直鎖化したｐＤＳＹ１７６でプローブした。ｐＤＳＹ１７６は以下の様に構築した：ｐＺＬ−ＥＳＡをＳｔｕＩ／ＮｒｕＩで消化し、そして０．２Kbのフラグメントを調製用の電気泳動によって単離した。単離したフラグメントは、ｐＤＳＹ１７６を生成するための取扱い説明書に従いｐＺＥＲＯ−Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）内にクローン化された。この第２のプローブ（ｐＤＳＹ１７６）を用いるハイブリダイゼーション解析は、４つの推定される欠失菌株（フサリウム・ベネナツムΔＥＳ４，６，８及び１０）が欠失したｄｐｓ１遺伝子の０．２Kb領域を含まないことを確かめた。
【０１５９】
例７：ａｍｄＳ遺伝子の除去
欠失していることが確認された２つの形質転換体、ΔＥＳ４Ａ及びΔＥＳ８Ａは、２ＬのＦｅｒｎｂａｃｈフラスコ中の５００mlのＲＡ培地で胞子形成した。これらはＣｏｖｅプレートから切断した１２個の菌糸の栓を用いて播種され、そして２４℃、１５０rpm で５３時間インキュベートされた。この後、胞子はＳｏｒｖａｌ  ＧＳ３ローターにおいて７，０００rpm で３０分間遠心した滅菌Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Calbiochem, San Diego, CA） を介して採集し、そして滅菌水で３回洗浄した。新たに採集した胞子は、ＦＡのプレート当たり１０4 ，１０5 及び１０6 個（各濃度につき５枚のプレート）で蒔かれた。これらのプレート上で生育したコロニーは、ＦＡ及びＣｏｖｅプレートに突かれた。
【０１６０】
多くのコロニーがＦＡプレート上で得られ（主に１０5 及び１０6 胞子／プレートで播種したプレートに由来）、これは継代培養時にＦＡではよく生育するが、Ｃｏｖｅ上では非常に低密度にしか生育しない。３２個のΔＥＳ４Ａ由来コロニー（フサリウム・ベネナツム  ＷＴＹ７００−３−４と表す）及び１２８個のΔＥＳ８Ａ由来コロニー（フサリウム・ベネナツム  ＷＴＹ７００−３−８）の全てが、ａｍｄＳマイナスの表現型を有していた。
【０１６１】
ＤＮＡは、５個のフサリウム・ベネナツム  ＷＴＹ７００−３−４の分離株（ＷＴＹ７００−３−４ａ〜４ｅ）及び１０個のフサリウム・ベネナツム  ＷＴＹ７００−３−８の菌株（ＷＴＹ７００−３−８ａ〜８ｊ）並びにＬｙＭＣ１Ａ、ΔＥＳ４Ａ及びΔＥＳ８Ａから、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  キットを用いて抽出した（取扱い説明書で推奨されている１０分の代わりに２時間の分解的インキュベーションを用いた）。１μｇの各ＤＮＡを、ＸｈｏＩ又はＳｐｅＩ（５０μｌの反応液中に２０Ｕ／μｇ  ＤＮＡ）で一晩消化した。消化物を１０μｌに濃縮し、そしてＴＢＥ中の１％アガロースゲル上で流した。ＤＮＡは取扱い説明書を用いてＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜に移され、そして続いて例６に記載のプローブを用いてプローブされた。
【０１６２】
これらの菌株から抽出したゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション解析（ΔＥＳ−ａｍｄＳ１及びＨｉｎｄIII で消化したｐＤＳＹ１７６（これはｄｐｓ１のオープンリーディングフレームの２００bpのＳｔｕＩ−ＮｒｕＩ部分を含む）の８００bpのＮｓｉＩ−ＳｐｅＩフラグメントを用いる）は、ＷＴＹ７００−３−４の分離株のいずれもａｍｄＳ遺伝子を失っていないが、５０％（５／１０）のフサリウム・ベネナツム  ＷＴＹ７００−３−８分離株がａｍｄＳ遺伝子の除去と一致するバンド形成パターンを示すことを明らかにした。この様に、ハイブリダイゼーション解析はフサリウム・ベネナツム  ＷＴＹ７００−３−８ａ，ｂ，ｃ，ｄ、及びｅがｄｐｓＩのオープンリーディングフレームの２００bpのＳｔｕＩ／ＮｒｕＩ部分を欠失していることを確かめた。欠失について予想される様に、ハイブリダイゼーションシグナルは上述したｐＤＳＹ１７６プローブを用いて、親の菌株フサリウム・ベネナツム  ＬｙＭＣ１Ａで観察されたが、５個のフサリウム・ベネナツム  ＷＴＹ７００−３−８ａ−ｅの菌株のいずれにも観察されなかった。
【０１６３】
生物学的材料の寄託
次の生物学的材料は、ブダペスト条約の名のもと、イリノイ州ピオリアのAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) に寄託され、そして次の寄託番号が与えられた：
【表１】
0004860820.tif 000002
【０１６４】
前記菌株は、米国特許法施行規則第１．１４条及び米国特許法第１２２条のもとでそれらを名付けるために、特許商標庁長官によって決定されるものにとって、この特許出願の審査の間、前記培養物の入手が可能であることを保証する条件のもとで寄託された。前記寄託は、寄託した菌株の実質的に純粋な培養物を表す。前記寄託は、従属する出願の対応物、又はその孫が提出されている国の外国特許法によって必要とされる場合に入手可能である。しかし、寄託の入手可能性が、政府の指令によって付与される特許権の減損における従属発明を実施する許可を構成しないと理解すべきである。
【０１６５】
本明細書に記載され、そして請求された発明が、本明細書で開示した具体的な態様によって範囲を限定されないのは、これらの態様が本発明の複数の観点の例示として意図されているためである。いずれかの等しい態様が、本発明の範囲内であることが意図されている。実際、本明細書に示し、そして記載したものに加えて、本発明の様々な変更が前述の説明から当業者に明らかとなるだろう。その様な変更は更に、特許請求の範囲に含まれることも意図されている。抵触する場合、定義を含む本開示が調節するだろう。
【０１６６】
様々な引用を本明細書に列記しており、これらの開示は引用によってそれら全体が組み入れられる。
【表２】
0004860820.tif 000003
【表３】
0004860820.tif 000004
【表４】
0004860820.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、フサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、フサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１Ｃ】  図１Ｃは、フサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１Ｄ】  図１Ｄは、フサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１Ｅ】  図１Ｅは、フサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１Ｆ】  図１Ｆは、フサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１Ｇ】  図１Ｇは、フサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１Ｈ】  図１Ｈは、フサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１Ｉ】  図１Ｉは、フサリウム・ベネナツム  ＡＴＣＣ  ２０３３４のシクロヘキサデプシペプチド合成酵素の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図２】  図２はｐΔＥＳ−ａｍｄＳの構築を示す。
【配列表】
0004860820.tif 000006
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【図１Ａ】
0004860820.tif 000017
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２】
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