(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列
【数１】
0004939715.tif 000008
（ここで、Ｘ１は、アミノ酸Ｅ又はＤを表し；
Ｘ２は、アミノ酸Ｔ又はＩを表し；
Ｘ３は、アミノ酸Ｎ又はＳを表し；
Ｚ1は、−ＮＨ2、置換されたアミン、又はアミノ酸を１０個まで有する任意のペプチドを表し；
Ｚ2は、−ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、置換されたアミド、又はアミノ酸を１０個まで有する任意のペプチドを表す）
を有するＴＩＭＰ−２、並びに／又はアミド化、アシル化、硫酸化、リン酸化、グリコシル化、及び／若しくはポリエチレングリコール化誘導体を含有する、骨折又は外科的介入後に骨芽細胞の刺激に用いるための薬剤。
【請求項２】
前記ＴＩＭＰ−２誘導体が、請求項１に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
他の成長因子及び／又は薬剤と組み合わせた、請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
医学的な補助と組合せて用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
医学的な補助が移植である、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
注射、軟膏、又は徐放性カプセルのために調製された請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤を調製するためのＴＩＭＰ−２の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、骨合成代謝活性な(osteoanabolically active)ペプチド調製物としての、金属プロテイナーゼ(metalloproteinases)−２（ＴＩＭＰ−２）の組織阻害剤を含む薬剤及び診断薬、並びにその使用に関する。
【０００２】
ＴＩＭＰ−２は、異なる生物学的機能を有する４つの異なるペプチド（ＴＩＭＰ−２〜ＴＩＭＰ−４）が今まで知られていた、“金属プロテイナーゼの組織阻害剤”の群に属する。
【０００３】
ヒト（リオッタ(Liotta)ら、１９９１）、ラット(ロスウィット(Roswit)ら、１９９２)、及びマウス（キシ(Kishi)ら、１９９１）のような様々な生物において、ＴＩＭＰ−２の一次構造を解明することができた。ペプチドは、６個のシステインブリッジによってお互いに結合している、合計１２個のシステインを含んでいる。
【０００４】
ＴＩＭＰ−２の生物学的機能は、特に、活性マトリックス金属プロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）の阻害を含む。ＭＭＰｓという語は、細胞外マトリックスを分解し得る亜鉛依存性エンドプロテイナーゼの群を意味する。細胞外マトリックスは、複雑な構造からなり、特に、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、及びグリコサミノグリカンから構成される。細胞外マトリックスの分解は、胚形成、形態形成、並びに組織吸収及び再形成のような、多くの生物学的工程にとって、極めて重要である。しかし、ＭＭＰｓの活性が制御できないため、リューマチ性関節炎のような、多くの組織の破壊をもたらし得る（オカダ（Okada）ら、１９８６）。
【０００５】
ＴＩＭＰ−２の更なる生物学的機能は、特に、腫瘍細胞の成長の減少（ゴメス(Gomez)ら、１９９７）、及び血管形成の阻害（バレンテ(Valente)ら、１９９８）を含む、マトリックス金属プロテイナーゼの阻害に関する。
【０００６】
これら機能のほかに、ＴＩＭＰ−２の固有の生物学的活性も記載されている。これらは、赤血球の形成の増加（ステトラー−ステベンソン(Stetler-Stevenson)ら、１９９２）、及び異なる細胞系における分裂促進(motogenic)効果（ハヤカワ(Hayakawa)ら、１９９４）を含む。更に、骨培養液全体における骨吸収の阻害（ヒル（Hill）ら、１９９３）、及び破骨細胞による骨吸収の刺激（シブタニ(Shibutani)ら、１９９３）を、いずれもインビトロで示すことができた。
【０００７】
図１：  Ａ）〜Ｄ）  骨増殖性(osteoproliferative)ＴＩＭＰ−２の精製のための異なるクロマトグラフィー段階。
図２：  Ａ）  ラットの胎児の第一骨芽細胞における組み換え型ヒトＴＩＭＰ−２の増殖効果。
Ｂ）  マウスの骨芽細胞系ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１における平均細胞直径に対する組み換え型ヒトＴＩＭＰ−２の影響。
【０００８】
驚くべきことに、アミノ酸配列
【数５】
0004939715.tif 000002
（ここで、Ｘ１は、アミノ酸Ｅ又はＤを表し；
Ｘ２は、アミノ酸Ｔ又はＩを表し；
Ｘ３は、アミノ酸Ｎ又はＳを表し；
Ｚ1は、−ＮＨ2、置換されたアミン、又はアミノ酸を１０個まで有する任意のペプチドを表し；
Ｚ2は、−ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、置換されたアミド、又はアミノ酸を１０個まで有する任意のペプチドを表す）
を有するＴＩＭＰ−２、並びに／又はアミド化、アシル化、硫酸化、リン酸化、グリコシル化、及び／若しくはポリエチレングリコール化誘導体は、骨形成をもたらす骨芽細胞の刺激を引き起こし得る。ＴＩＭＰ−２は、胎児の骨芽細胞に対する、増殖及び保護効果を有する。
【０００９】
従って、本発明によれば、アミノ酸配列
【数６】
0004939715.tif 000003
（ここで、Ｘ１は、アミノ酸Ｅ又はＤを表し；
Ｘ２は、アミノ酸Ｔ又はＩを表し；
Ｘ３は、アミノ酸Ｎ又はＳを表し；
Ｚ1は、−ＮＨ2、置換されたアミン、又はアミノ酸を１０個まで有する任意のペプチドを表し；
Ｚ2は、−ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、置換されたアミド、又はアミノ酸を１０個まで有する任意のペプチドを表す）
を有するＴＩＭＰ−２、並びに／又はアミド化、アシル化、硫酸化、リン酸化、グリコシル化、及び／若しくはポリエチレングリコール化誘導体を含む薬剤がクレームされる。
【００１０】
本発明によれば、ヒトＴＩＭＰ−２（配列番号１）及びラットＴＩＭＰ−２（配列番号２）を用いることが好ましい：
【数７】
0004939715.tif 000004
【００１１】
本発明は、アミノ酸配列
【数８】
0004939715.tif 000005
（ここで、Ｘ１は、アミノ酸Ｅ又はＤを表し；
Ｘ２は、アミノ酸Ｔ又はＩを表し；
Ｘ３は、アミノ酸Ｎ又はＳを表し；
Ｚ1は、−ＮＨ2、置換されたアミン、又はアミノ酸を１０個まで有する任意のペプチドを表し；
Ｚ2は、−ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、置換されたアミド、又はアミノ酸を１０個まで有する任意のペプチドを表す）
を有するＴＩＭＰ−２、並びに／又はアミド化、アシル化、硫酸化、リン酸化、グリコシル化、及び／若しくはポリエチレングリコール化誘導体の、骨合成代謝(osteoanabolic)薬剤を調製するための使用にも関する。
【００１２】
本発明によって使用され得るＴＩＭＰ−２誘導体は、ＴＩＭＰ−２の固有の配列又は記載の変形と、少なくとも９０％の配列同一性を有することが好ましい。
【００１３】
本発明によって使用されるべきＴＩＭＰ−２を、他の成長因子、及び／又は薬剤と組み合わせて、かつ、医学的な補助、例えば、移植と(in grafts)組み合わせて使用することが、有用であり得る。
【００１４】
ＴＩＭＰ−２の投与は、特に、注射、軟膏、徐放性カプセルの状態の製剤として、及び類似の本草医学的製剤として行われる。
【００１５】
本発明は、骨折、骨欠乏(osteopenia)、及び骨粗鬆症のような骨系の疾患を治療するための薬剤を調製するための、骨細胞に対してＴＩＭＰ−２に匹敵する効果を有する低分子量物質及び活性化合物の使用にも関する。
【００１６】
更に、本発明は、骨折、骨欠乏、及び骨粗鬆症のような骨系の疾患のための薬剤を調製するための、骨細胞において、その関連するアゴニスト及びアンタゴニストと結合したＴＩＭＰ−２に対するレセプターの使用にも関する。
【００１７】
本発明によって使用されるべきＴＩＭＰ−２は、特に、骨欠陥(bone defects)を治療するための、かつ、特に骨折又は外科的介入(surgical intervention)後の骨の再生を向上するための、かつ骨粗鬆症、骨欠乏、及び骨軟化症のような変性的かつ代謝的な骨疾患(degenerative and metabolic bone diseases)、並びに骨炎及び骨髄炎のような炎症性骨疾患の治療のための骨合成代謝薬剤を調製するために使用される。
【００１９】
骨合成代謝ペプチドとしてのＴＩＭＰ−２の同定の基礎は、生物の年齢に依存して、骨欠陥の再生能力が異なるという観察結果である。成長した生物が、一般に、新たな骨組織の形成によって主な骨欠陥を再生することができないのに対して、より若い生物では、同様の(comparable)骨欠陥の完全な再生が行われる。
【００２０】
同様の観察結果は、インビトロの骨芽細胞の試験でも得られた：胎児段階の生物から単離された骨芽細胞は、培養液中で、何ら問題なく成長し、数日後に鉱物化(mineralize)し始める。それに対して、未成熟の動物及び成長した動物からの骨芽細胞は、標準的な培養条件下では増殖することができず、結局死亡する。単独では生存し得ないこれらの細胞に、胎児の骨芽細胞の上清が補充されると、それらは胎児の細胞と同様に増殖して鉱物化する。
【００２１】
胎児の骨芽細胞の細胞培養液の上清の明らかな再生能力が、インビボでも示され得た。よって、外部刺激なしで骨組織の形成によって治すことができない頭蓋骨欠陥が、ラットにおいて外科的に引き起こされた。しかし、胎児の第一骨芽細胞の細胞培養液の上清からのペプチド抽出物が、これら欠陥に投与されると、新たな骨組織の形成によって、欠陥の完全な再生が起こる。
【００２２】
上記の効果を引き起こす(responsible)物質を単離するために、胎児の骨芽細胞の上清からのペプチド抽出が行われ、次いで、得られたペプチドの骨増殖能力(osteoproliferative capabilities)がインビトロで試験された（実施例３参照）。そのため、本発明によるペプチドは、その生物学的活性により、分離用(preparative)、半分離用(semipreparative)、及び分析用ＲＰクロマトグラフィーを用いて精製され得た。
【００２３】
本発明による精製されたペプチドの生化学的特徴付けは、質量分析法及びＮ−末端配列決定によって行われた。エレクトロスプレー質量分析法による分子量決定により、２１７１５Ｄａの分子量が得られた。エドマン(Edman)分解によるＮ−末端配列分析により、以下の配列：
【数１０】
0004939715.tif 000006
が得られた。
【００２４】
本発明による物質は、骨組織の成長の増強及び再生の向上を引き起こすために用いられ得る。これは、特に、骨折又は外科的介入の後であると考えられ得るが、全身的な(systemic)骨疾患におけるものとも考えられ得る。
【００２５】
【実施例】
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明する：
実施例１：  細胞培養液の上清からのＴＩＭＰ−２の単離
細胞培養液の上清が、胎児の第一骨芽細胞の１つにまとめた(confluent)培養液から得られた。よって、コラゲナーゼ及びトリプシンによって逐次消化し、次いでペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清(FCS)を含むイーグル最小主要培地（Eagle's minimal essential medium）（MEM）において培養することにより、
骨芽細胞は、最初に、ラット胎児の頭蓋冠から単離された。１つにまとめられた後(After confluency was reached)、細胞は、１０％ＦＣＳとともに２４時間維持されるか、又は血清なしの状態で２４時間維持された。血清を含まない上清が回収され、更なるペプチド単離のために使用された。
【００２６】
ＴＩＭＰ−２の単離は、全ペプチド抽出物を分画するために役立つ、様々なその後のＲＰ−ＨＰＬＣ段階によって行われた。フラクションのアリコートが、バイオアッセイにおいて試験された。フラクションは、−２０℃に保存された。
【００２７】
骨増殖性ＴＩＭＰ−２の精製のための異なるクロマトグラフィー段階を、図１Ａ−Ｄに示す。
【００２８】
１．分離用クロマトグラフィー
血清を含まない細胞培養液の上清を、ＨＣｌによってｐＨ２．５に調整し、かつアセトニトリルを添加することにより、５％アセトニトリルに調整した。次いで、それらを最初にグラスファイバーフィルター（ＧＦ６、シュライヒャー・アンド・シュウェル(Schleicher & Schuell)）上で、次いでメンブレンフィルター（ＯＥ  Ｇ７、４．４３μｍ、シュライヒャー・アンド・シュウェル(Schleicher & Schuell)）上で濾過した。こうして得られた材料を、４０〜５０ｍｌ／ｍｉｎの流速で、１〜２リットルの量でＲＰカラムに充填した。
【００２９】
クロマトグラフィー条件：
カラム：ＹＭＣゲルベーシック(Gel Basic)（１５−３０μｍ、４７×３００ｍｍ）
流速：４０ｍｌ／ｍｉｎ
フラクション：５０ｍｌ
バッファーＡ：１０ｍＭ  ＨＣｌ
バッファーＢ：８０％（ｗ／ｖ）アセトニトリル、１０ｍＭ  ＨＣｌ
勾配：４７．５分間５〜７５％
５分間７５〜１００％
次いで、得られたフラクションのアリコートをバイオアッセイにおいて試験した。
【００３０】
２．半分離用分離
アッセイ中で生物活性であったフラクション３７−４０を、更なるＲＰ段階によって分離した。
クロマトグラフィー条件：
カラム：バイオテク(Biotek)ＲＰシリカＣ４（１００Ａ、５μｍ、２０×１２５ｍｍ）
流速：５ｍｌ／ｍｉｎ
フラクション：５ｍｌ
バッファーＡ：０．１％  ＴＦＡ
バッファーＢ：８０％（ｗ／ｖ）アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ
勾配：１０分間５〜４０％
６０分間４０〜１００％
得られたフラクションのアリコートを、バイオアッセイにおいて再度試験した。
【００３１】
３．分析用クロマトグラフィー
生物活性フラクション２２及び２３のその後の分画を、別のＲＰクロマトグラフィーによって行った。
クロマトグラフィー条件：
カラム：ＹＭＣ  Ｃ１８（１２０Ａ、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
フラクション：０．６ｍｌ
バッファーＡ：０．１％  ＴＦＡ
バッファーＢ：８０％（ｗ／ｖ）アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ
勾配：４分間５〜３０％
５０分間３０〜５５％
５分間５５〜１００％
得られたフラクションのアリコートを、バイオアッセイにおいて再度試験した。
【００３２】
４．分析用クロマトグラフィー
生物活性フラクション２７−２９を、ＲＰクロマトグラフィーによって再度分離した。
クロマトグラフィー条件：
カラム：フェノメネクス(Phenomenex)Ｃ５（４．６×２５０ｍｍ）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
フラクション：０．６ｍｌ
バッファーＡ：０．１％  ＴＦＡ
バッファーＢ：８０％（ｗ／ｖ）アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ
勾配：４分間５〜３８％
６０分間３８〜５８％
５分間５８〜１００％
次のバイオテストにおいて、本発明によるペプチドを、フラクション２４中で純粋な状態で得ることができた。
【００３３】
実施例２：ＴＩＭＰ−２の生物化学的分析
１．質量決定
精製された固有のペプチドの質量決定を、ＥＳＩ質量分析法によって行った。２７７１５Ｄａの分子量が得られた。これは、全てのシステインがシステインブリッジによって架橋しているＴＩＭＰ−２の酸化型の理論質量と非常に良好に一致する。
【００３４】
２．配列決定
精製された固有のペプチドを、標準プログラムを用いてＡＢＩ４９４シーケンサーにおいて、エドマン分解によって分析した。最初の２４分解段階により、以下のＮ−末端配列：
【数１１】
0004939715.tif 000007
が得られた。Ｘは、配列決定によって検出できないシステイン残基である。検出不可能な(non-detectable)システインを考慮すると、得られた配列は、ＴＩＭＰ−２の既知の配列と正確に一致する。小さい(Minor)配列は得られなかった。
【００３５】
３．データベース調査
データベース スイスプロット(SwissProt)における次の列において、配列は、ＴＩＭＰ−２の開始部分(beginning)と明らかに同定された。２７７１３Ｄａの蛋白質の理論質量も、測定された質量である２７７１５Ｄａと一致する。よって、精製されたペプチドを、ＴＩＭＰ−２と明らかに同定することができた。
【００３６】
実施例３：ＴＩＭＰ−２の生物学的ペプチドの決定
ＴＩＭＰ−２の単離が、その生物学的活性によって行われ、ラットの胎児の骨芽細胞の増殖が測定された。
よって、得られたペプチドフラクションのアリコートが凍結乾燥され、血清を含まない培地中に再懸濁された。次いで、胎児の骨芽細胞に対するそれらの増殖効果が試験された。次いで、増殖効果を示すフラクションが別のクロマトグラフィー分離に付された。骨増殖性ＴＩＭＰ−２の精製のための異なるクロマトグラフィー段階を、図１Ａ−Ｄに示す。
【００３７】
増殖測定のために、第一骨芽細胞をトリプシン化し、血清を含まない培地中で、９６ウェルプレートにおいてウェル当たり５０００細胞の細胞密度で平板培養した(plated)。次いで、試験されるべきフラクションを添加した。４８時間〜７２時間のインキュベーション時間後、２つの異なる方法によって増殖を試験した。プラスの(positive)対照として、異なる濃度のウシ胎児血清及びＴＧＦβ１を使用した。刺激なく得られた細胞(Cells having obtained no stimulation)を、マイナスの(negative)対照として用いた。
【００３８】
一方、Ｗｓｔ−１基質によって、増殖測定を行った。この基質は、代謝活性細胞中のミトコンドリア酵素によって、着色生成物に転化され、形成された色の濃さは、細胞数に比例していた。色の濃さは、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて、４０５ｎｍの波長及び６００ｎｍ以上の対照波長で測定される。
【００３９】
一方、増殖は、コールター(Coulter)カウンター（ＣＡＳＹ）における細胞数の直接測定によって測定される。
【００４０】
いずれの方法も、骨芽細胞において、組み換え型ヒトＴＩＭＰ−２の投与量に依存する成長促進効果を示した（図２Ａ）。１００ｎｇ／ｍｌの濃度から、これらのインビトロ試験において、ＴＩＭＰ−２の顕著な骨増殖効果が検出され得る。また、マウスの骨芽細胞系ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１において、平均細胞直径の減少が、ヒトＴＩＭＰ−２によって引き起こされる（図２Ｂ）。
【００４１】
１００ｎｇ／ｍｌの濃度から、このインビトロ試験において、ＴＩＭＰ−２の顕著な効果が検出され得る。更に、顕微鏡法により、マウスの骨芽細胞系ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１における保護及び増殖効果が示され得た。
【００４２】
これら細胞全ては、典型的な骨細胞であるので、ＴＩＭＰ−２は、骨合成代謝因子であると考えられ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  骨増殖性ＴＩＭＰ−２の精製のための異なるクロマトグラフィー段階である。
【図２】  ラットの胎児の第一骨芽細胞における組み換え型ヒトＴＩＭＰ−２の増殖効果（図２Ａ）、及びマウスの骨芽細胞系ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１における平均細胞直径に対する組み換え型ヒトＴＩＭＰ−２の影響（図２Ｂ）を示す。
【図１】
0004939715.tif 000009
【図２】
0004939715.tif 000010