(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）：
【化１】
0004855626.tif 000016
[式中、
− Ｒ1は以下の基を表し：
【化２】
0004855626.tif 000017
− Ｒ2及びＲ3は独立に、飽和または不飽和の、環状、直鎖状、または分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基を形成し、
− Ｒ4は飽和または不飽和の、環状、直鎖状、または分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基を表し、
− Ｒ5及びＲ6は独立に、飽和または不飽和の、環状、直鎖状、または分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基を表し、あるいは一緒に窒素原子と共に、酸素原子、硫黄原子、または飽和または不飽和の、環状、直鎖状、または分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基、または１から７の炭素原子を含むアリール基、または１から１２の炭素原子を含むアラルキル基で置換されたまたは置換されていない、窒素原子で複素環の炭素原子が置換されたまたは置換されていない、２から６の炭素原子を含む飽和または不飽和の窒素を含む複素環を形成し、
− Ｒ7は水素原子、飽和または不飽和の、環状、直鎖状、または分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基を表し、
− Ｘはハライドイオン、または硝酸、硫酸、スルホン酸、カルボン酸、チオシアン酸、またはリン酸アニオンを表す]
に対応することを特徴とする化合物。
【請求項２】
以下のもの：
− S-メチル4-ジメチルアミノ-4-メチル-2-ペンチンチオアート；
− S-メチル4-メチル-4-トリメチルアンモニウム-2-ペンチンチオアートヨージド；
− S-メチル4-ジ-n-プロピルアミノ-4-メチル-2-ペンチンチオアート；
− S-メチル4-メチル-4-ピロジン-1-イル-2-ペンチンチオアート；
− S-メチル4-メチル-4-モルホリン-4-イル-2-ペンチンチオアート；
から選択されることを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
以下の特徴：
− Ｒ2及びＲ3はメチル基を表し；
− Ｒ4はメチル基を表し：
− Ｒ5及びＲ6は独立に、１から３の炭素原子を含むアルキル基を表し、または一緒に窒素原子と共に、ピロリジン、ピペリジン、及びモルホリンから選択される窒素を含む複素環を形成し；
− Ｒ7はメチル基または水素原子を表し；並びに
− Ｘはヨウ化物イオン、ギ酸イオン、またはカルボン酸イオンを表す；
の少なくとも一つを有することを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
医薬製品としての、請求項１から３のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５】
以下の疾患：
１）ガン性または前ガン性病状；
２）分化及び増殖に関する角質化疾患と関連する皮膚科学的病気、特に一般的挫創、コメド、多形、しゅさ、病巣挫創、凝塊性挫創、老人性挫創、及び日光、医薬、または職業性挫創のような二次的挫創；及び／または
３）魚鱗癬、魚鱗癬様疾患、掌蹠角皮症、白斑症、及び白斑症用疾患；及び／または
４）細胞増殖疾患を含むまたは含まない炎症性免疫アレルギー性成分を有する皮膚科学的病気、特に乾癬、関節症性乾癬、湿疹、呼吸性アトピー、及び歯肉肥厚；及び／または
５）良性または悪性の、ウイルス起源であってもなくても良い、真皮または表皮の増殖、例えば一般的ないぼ、扁平いぼ、及びいぼ状表皮異形成、口腔または葉状乳頭腫症、Ｔリンパ腫、及び特に基底細胞及び有棘細胞上皮腫の場合の、紫外光によって誘導される増殖、及び角化棘細胞腫のような前ガン性皮膚病変；及び／または
６）エリテマトーデスのような免疫性皮膚炎、水疱性免疫疾患、及び強皮症のようなコラーゲン疾患；及び／または
７）免疫学的成分を有する皮膚科学的または全身性疾患；及び／または
８）挫創の過剰脂漏症または単純脂漏症のような皮脂機能疾患；及び／または
９）ＵＶ光に対する暴露による皮膚疾患、皮膚の光誘導性または高齢性の加齢、または光線性角化症及び着色、または高齢性または化学線性加齢と関連する病理；及び／または
１０）瘢痕化疾患、または皮膚萎縮線条；及び／または
１１）関節炎のような炎症性疾患；及び／または
１２）カポシ肉腫または肝炎のようなウイルス起源の皮膚または全身性疾患；及び／または
１３）眼科的疾患、特に角膜炎；
の治療を企図する医薬製品の製造のための、請求項１から３のいずれか一項記載の化合物の使用。
【請求項６】
ガン性または前ガン性疾患の治療を企図する医薬製品の製造のための、請求項１から３のいずれか一項記載の化合物の使用。
【請求項７】
生理学的に許容可能な支持体中に、請求項１から３のいずれか一項記載の化合物の少なくとも一つを含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
ヒトまたは動物患者におけるトランスフォーム化細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量で請求項１から３のいずれか一項記載の化合物を含むことを特徴とする、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
トランスフォーム化細胞に存在するｂｃｌ2遺伝子、またはＭＤＲ遺伝子、またはＢＣＬ−ＸL遺伝子による、あるいは酵素ＡＬＤＨによる、トランスフォーム化細胞におけるアポトーシスの誘導に対する耐性についての性質の阻害を除去するのに有効な量で請求項１から３のいずれか一項記載の化合物を含むことを特徴とする、請求項７記載の製薬組成物。
【請求項１０】
前記化合物の濃度が、組成物の全重量に対して０．０００１から１０重量％の間であることを特徴とする、請求項７から９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
チオクト酸の３−メチルチオプロパノイルチオエステルから選択される少なくとも一つの化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項７から１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
２’−（トリメチルアンモニウム）エチル６Ｓ，８Ｓ−ビス（３−メチルチオプロパノイル）オクタノアートヨージドを含むことを特徴とする、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
少なくともＳ−メチル４−ジメチルアミノ−４−メチル−２−ペンチンチオアート、及びＳ−メチル４−メチル−４−モルホリン−４−イル−２−ペンチンチオアートを含むことを特徴とする、請求項７から１２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
トランスフォーム化細胞におけるアポトーシスの誘導を企図する組成物の調製のための、請求項１から３のいずれか一項記載の少なくとも一つの化合物の使用。
【請求項１５】
トランスフォーム化細胞に存在するｂｃｌ2遺伝子、またはＭＤＲ遺伝子、またはＢＣＬ−ＸL遺伝子による、あるいは酵素ＡＬＤＨによる、トランスフォーム化細胞におけるアポトーシスの誘導に対する耐性についての性質の阻害の除去を企図する組成物の調製のための、請求項１から３のいずれか一項記載の少なくとも一つの化合物の使用。
【請求項１６】
トランスフォーム化細胞の化学療法耐性、放射線療法耐性、または抗アンドロゲン耐性の性質の阻害の除去を企図する製薬組成物の調製のための、請求項１から３のいずれか一項記載の少なくとも一つの化合物の使用。
【請求項１７】
トランスフォーム化細胞の化学療法耐性、放射線療法耐性、または抗アンドロゲン耐性の性質が、トランスフォーム化細胞に存在するｂｃｌ2遺伝子によるものであることを特徴とする、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
トランスフォーム化細胞の化学療法耐性、または抗アンドロゲン耐性の性質が、トランスフォーム化細胞に存在するＭＤＲ遺伝子によるものであることを特徴とする、請求項１６記載の使用。
【請求項１９】
トランスフォーム化細胞の化学療法耐性、または抗アンドロゲン耐性の性質が、トランスフォーム化細胞に存在するＢＣＬ−ＸL遺伝子によるものであることを特徴とする、請求項１６記載の使用。
【請求項２０】
トランスフォーム化細胞の化学療法耐性、または抗アンドロゲン耐性の性質が、酵素ＡＬＤＨの活性によるものであることを特徴とする、請求項１６記載の使用。
【請求項２１】
ガン性腫瘍の治療、抑制、及び／または予防を企図する製薬組成物の調製のための、単独での、またはチオクト酸の３−メチルチオプロパノイルチオエステルから選択される化合物との混合物としての、請求項１から３のいずれか一項記載の化合物の使用。
【請求項２２】
チオクト酸の３−メチルチオプロパノイルチオエステルが、２’−（トリメチルアンモニウム）エチル６Ｓ，８Ｓ−ビス（３−メチルチオプロパノイル）オクタノアートヨージドであることを特徴とする、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
化粧剤としての、請求項７、８及び１０〜１３のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項２４】
皮膚、とりわけ挫創の傾向を有する皮膚、または頭皮のためのクレンジング剤として、皮膚萎縮線条を低減するための化粧剤として、日光の有害な影響に対する保護のための化粧剤として、光誘導性または高齢性の加齢を保護及び/または低減するための化粧剤として、あるいは皮膚または毛髪のべたつき感の出現を低減するための化粧剤としての、請求項２３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、式（Ｉ）のアミノチオールエステル化合物、及び細胞アトポーシスインデューサーとしてのそれらの使用に関する。本発明に係る化合物は、アポトーシスインデューサーとしての顕著な活性を有し、とりわけガン及び前ガン、並びに皮膚科学的、リューマチ様及び眼科的症状の局所的及び全身的治療において応用が見出される。
【０００２】
本発明はまた、生理学的に許容可能な賦形剤中に、活性剤として少なくとも一つの式（Ｉ）のアミノチオールエステル化合物を含む、製薬または化粧品組成物に関する。
【０００３】
【従来の技術】
用語、「アポトーシス」は、特にKerr J.F.R.等, J. Cancer, 265, 239 (1972)に記載された細胞死の現象を意味する。アポトーシスは、細胞自殺の非常に選択的な形態であり、容易に観察可能な形態学的及び生化学的現象によって特徴付けされる。かくして、エンドヌクレアーゼ活性と関連するであろうクロマチンの凝集、アポトーシスボディーの形成、及びアガロースゲル電気泳動によって容易に認識可能であるプロフィールを与える、エンドヌクレアーゼの活性化による、１８０−２００塩基対のＤＮＡ断片へのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の断片化が観察される。
【０００４】
アポトーシスは、組織の発達、分化、及び再生に関与する。かくして、アポトーシスの誘導は、治療上の観点、及び美容上の観点から大きな興味が持たれている。
【０００５】
現在利用可能な非常に他種類の天然または合成の抗ガン医薬製品は、アポトーシス誘導性化合物である
【０００６】
これらの抗新生物医薬製品の中では、シクロホスファミドのようなアルキル化剤、1,.3-ビス-(2-クロロエチル)-1-ニトロソウレア(BCNU)のようなニトロソウレア、アクチノマイシンＤまたはアドリアマイシンのような挿入剤、6-チオグアニン及び5-フルオロウラシルのようなプリンまたはピリミジン塩基類似体、メトトレキセートのようなプリン塩基のde novo合成の阻害剤、並びに最後にタキソール（登録商標）のようなチューブリン重合阻害剤が挙げられる。
【０００７】
さらに、特に特許出願WO 96/20701において、メチオナール、マロンアルデヒド、及びこれらの化合物の細胞内濃度を増大するためにいずれかの因子、即ち図１においてメモとして示されている(Quash等, Biochem. J. 305, 1017 (1995))、メチオナールの代謝に対する作用を有するいずれかの化合物から選択されるアポトーシス誘導性化合物を使用することが、本出願人によってすでに提案されている。
【０００８】
L-メチオニンとピリドキサールとのエステルの化合物である、4-メチルチオ-2-オキソブタン酸(MTOB)トランスアミナーゼインヒビターは、メチオナールの細胞内濃度を増大するための因子として、前述の特許出願に開示されている。MTOBトランスアミナーゼは、4-メチルチオ-2-オキソブタン酸のメチオニンにへの変換に関与する酵素であるため、これらの化合物の使用は、メチオナールの直接的な前駆体であるMTOBの蓄積を促進する（図１）(Roch等, Biochem. J. 313, 973 (1996))。
【０００９】
これらの物質の使用の主な欠点の一つは、腫瘍細胞に対する選択的なアポトーシス活性の存在しないことである。かくして、身体の健康な組織に対しては、最も少ない傷害を可逆的な態様で生ずる一方で、腫瘍組織において最大のアポトーシスを誘導する利用可能な分子を有する必要性が未だに存在する。
【００１０】
この選択性の存在しないことを解消するために、本出願人は、特許出願WO 98/44919において、メチオナールのメチルプロピオン酸への変換に関与する酵素である、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ＡＬＤＨ)の酵素のインヒビターとして、チオアンパールを含むアミノチオールエステル誘導体を使用し、かくしてメチオナールの地区性基を促進することを開示している。これらの化合物は、ｂｃｌ2遺伝子の過剰発現のためアポトーシス耐性であるトランスフォーム化細胞の増殖の選択的インヒビターである。
【００１１】
かくしてそのような化合物は、乳ガン、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、神経芽腫、前立腺の腺ガン、プロラクチノーマ、及び他の下垂体腺腫のような、ｂｃｌ2遺伝子の過剰発現によって特徴付けられる病理の治療についてとりわけ企図される。
【００１２】
しかしながらこれらのアミノチオールエステル誘導体は、調製が困難である。特にそれらのを調製するための工程は、２０％未満の収率しか与えない。さらにこれらの化合物は安定性の問題を有し、それらの分解を防止するため約−２０℃の温度で貯蔵しなければならない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
かくして、安定で、良好な収率で調製が容易であり、ｂｃｌ２遺伝子の過剰発現によりアポトーシス耐性であるトランスフォーム化細胞の増殖を選択的に阻害する、新規な化合物を開発することが所望されている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、以下の一般式（Ｉ）によって表される新規なアミノチオールエステル化合物に関する：
【化３】
0004855626.tif 000002
[式中、
−  Ｒ1は以下の基を表し：
【化４】
0004855626.tif 000003
−  Ｒ2及びＲ3は独立に、飽和または不飽和の、環状、直鎖状、または分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基、または１から７の炭素原子を含むアリール基、または１から１２の炭素原子を含むアラルキル基を表し、あるいは一緒に３から７の炭素原子を含む飽和アルキル環を形成し、
−  Ｒ4は飽和または不飽和の、環状、直鎖状、またはまたは分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基、または１から７の炭素原子を含むアリール基、または１から１２の炭素原子を含むアラルキル基を表し、
−  Ｒ5及びＲ6は独立に、飽和または不飽和の、環状、直鎖状、または分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基、または１から７の炭素原子を含むアリール基、または１から１２の炭素原子を含むアラルキル基を表し、あるいは一緒に窒素原子と共に、酸素原子、硫黄原子、または飽和または不飽和の、環状、直鎖状、または分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基、または１から７の炭素原子を含むアリール基、または１から１２の炭素原子を含むアラルキル基で任意に置換された窒素原子で任意に置換された、２から６の炭素原子を含む飽和または不飽和の窒素複素環を形成し、
−  Ｒ7は水素原子、飽和または不飽和の、環状、直鎖状、または分枝状の、１から７の炭素原子を含むアルキル基、または１から７の炭素原子を含むアリール基、または１から１２の炭素原子を含むアラルキル基を表し、
−  Ｘはハライドイオン、または硝酸、硫酸、スルホン酸、カルボン酸、チオシアン酸、またはリン酸アニオンを表す]。
【００１５】
【発明の実施の形態】
３から７の炭素原子を含む環状アルキル基の中では、特にシクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロヘプチル基が挙げられる。
【００１６】
１から７の炭素原子を含む飽和直鎖状アルキル基の中では、特にメチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、またはn-ヘプチル基が挙げられる。
【００１７】
１から７の炭素原子を含む飽和分枝状アルキル基の中では、特にi-プロピル、t-ブチル、2-ブチル、2-ペンチル、i-ペンチル、2-ヘキシル、3-ヘキシル、2-ヘプチル、3-ヘプチル、またはi-ヘプチル基が挙げられる。
【００１８】
１から７の炭素原子を含む不飽和アルキル基の中では、特にアリルまたはビニル基が挙げられる。
【００１９】
用語、「１から１２の炭素原子を含むアラルキル基」は、１から５の炭素原子を含む飽和直鎖状アルキル鎖に結合した、１から５の炭素原子を含む直鎖状または分枝状アルキル基で任意に置換されたフェニル基、例えば１から５の炭素原子を含むアルキル基で任意に置換されたベンジル基、または1-フェニルエチル、1-フェニルプロピル、1-フェニルブチル、若しくは1-フェニルペンチル基を意味する。
【００２０】
１から７の炭素原子を含むアリール基の中では、特にフェニル、トリル、クロロフェニル、ニトロフェニル、メトキシフェニル、チオフェン、及びフラン基が挙げられる。窒素複素環の中では、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、チアモルホリン、ピペラジン、ホモピペラジン、またはN-メチルピペラジンが挙げられる。ハライドの中では、フルオリド、クロリド、ブロミド、及び特にヨージドが挙げられる。
【００２１】
本発明の文脈の範囲に入る式（Ｉ）の化合物の中では、特に以下のものが挙げられる：
化合物番号
１−  S-メチル4-ジメチルアミノ-4-メチル-2-ペンチンチオアート
２−  S-メチル4-メチル-4-トリメチルアンモニウム-2-ペンチンチオアートヨージド
３−  S-メチル4-ジ-n-プロピルアミノ-4-メチル-2-ペンチンチオアート
４−  S-メチル4-メチル-4-ピロジン-1-イル-2-ペンチンチオアート
５−  S-メチル4-メチル-4-モルホリン-4-イル-2-ペンチンチオアート。
【００２２】
本発明によれば、特に好ましい式（Ｉ）の化合物は、以下の条件の少なくとも一つを守るものである：
−  Ｒ2及びＲ3はメチル基を表し；
−  Ｒ4はメチル基を表し：
−  Ｒ5及びＲ6は独立に、１から３の炭素原子を含むアルキル基を表し、または一緒に窒素原子と共に、ピロリジン、ピペリジン、及びモルホリンから選択される窒素複素環を形成し；
−  Ｒ7はメチル基または水素原子を表し；並びに
−  Ｘはヨウ化物イオン、ギ酸イオン、またはカルボン酸イオンを表す。
【００２３】
本発明の主題はまた、式（Ｉ）の化合物の調製方法である。
【００２４】
本発明に係る式（Ｉ）（Ｒ1＝Ｎ（Ｒ5Ｒ6））の化合物は、図２に示された反応スキームに従って得られて良い。この合成方法は、ブチルリチウムを式（ＩＩＩ）のプロパルギルアミンとＴＨＦ中で反応することからなる。形成された中間体リチウムアセチレンをオキシ硫化炭素と反応させ、次いでヨウ化物Ｒ4Ｉ登坂の反応させる。かくして式（Ｉ）（Ｒ1＝Ｎ（Ｒ5Ｒ6））のチオエーテルが、約７０％の収率で得られる。
【００２５】
図３に示されるように、リチウムアセチレンを式（ＩＶ）の時アルキルまたはジアリールジチオカルボナートと直接反応させることが考慮されても良い。これらの化合物は、例えばＲ4がメチル基を表す場合、広く記載されている[Douglass, I.B., Warner, G.H., 78, 6070-6071, (1956)]。
【００２６】
式（ＩＩＩ）のプロパルギルアミンは、Hennion, G.F., Boiselle, A.P., J. Am. Chem. Soc., 26, 725-727, (1961)の方法に従って調製されて良い。図４に示されるように、この方法は、約７０％の収率で、銅及び塩化銅の存在下で、塩酸媒体中に式（Ｖ）の第四級アルコールを塩素化することからなる。
【００２７】
前記アルコールは例えば、式Ｒ2ＣＯＲ3のケトンとアセチリドから調製されて良い。
【００２８】
次いで式（ＶＩ）のプロパルギルクロリドは、Hennion, G.F., Nelson, K.W., J. Am. Chem. Soc., 79, 2142-2144, (1957)及びHennion, G.F., Hanzel, R.F., J. Am. Chem. Soc., 82, 4908-4912, (1960)に従って、式Ｒ5ＮＨＲ6のアミンの作用を受ける。一般的に得られる収率は、２０％から６０％の間である。
【００２９】
本発明に係る式（Ｉ）の化合物（Ｒ1＝Ｎ+（Ｒ5Ｒ6Ｒ7），Ｘ-）は、図５の反応スキームに従って合成されて良い。この合成方法は、ハライドＲ7Ｘ（好ましくはヨウ化物）または鉱物または有機酸（Ｒ7＝Ｈ）を、式（Ｉ）の化合物（Ｒ1＝Ｎ（Ｒ5Ｒ6））と反応させることにある。収率は約７０％である。
【００３０】
かくして、特許出願WO 98/44919における化合物の合成が、プロパギルアミンのラージスケールでの調製を妨げる、これらの化合物の脱保護の困難な工程を必要とした一方で、本発明の化合物の合成は、より優れた収率で、より単純で、ラージスケールに発展できるという利点を有する。
【００３１】
これらの新規化合物はまた、より安定であるという利点を有し、特にチオアンパールのような特許出願WO 98/44919に開示されたものより、ｂｃｌ2遺伝子の過剰発現によりアポトーシス耐性であるトランスフォーム化細胞の増殖の阻害においてずっと活性であるという利点を有する。
【００３２】
本発明に係る化合物はまた、ｂｃｌ2の過剰発現によるものだけでなく、ＡＬＤＨ酵素（ＡＬＤＨ１、ＡＬＤＨ２及び／またはＡＬＤＨ３）の発現、ＭＤＲ（"Multi-Drug Resistant"）遺伝子またはＢＣＬ−ＸL遺伝子の過剰発現による、アポトーシス耐性であるトランスフォーム化細胞の増殖の阻害において活性であるという利点を有し、それは使用の分野を拡大するものである。
【００３３】
かくして本発明はまた、トランスフォーム化細胞におけるアポトーシスの誘導に対する耐性についての性質の阻害を除去するための製薬組成物を調製するための、式（Ｉ）の少なくとも一つのアミノチオールエステル誘導体の使用に関し、この性質は、これらの細胞に存在するｂｃｌ2遺伝子、ＭＤＲ遺伝子、またはＢＣＬ−ＸL遺伝子による、あるいはＡＬＤＨの活性によるものである。
【００３４】
本発明はまた、トランスフォーム化細胞の、化学療法耐性または放射線療法耐性または抗アンドロゲン耐性の性質の阻害を除去するための製薬組成物を調製するための、少なくとも一つのアミノチオールエステル誘導体の使用に関する。
【００３５】
とりわけ、トランスフォーム化細胞の化学療法耐性または抗アンドロゲン耐性の性質は、これらの細胞に存在するｂｃｌ2遺伝子、ＢＣＬ−ＸＬ遺伝子、またはＭＤＲ遺伝子による、あるいは酵素ＡＬＤＨの活性によるものである。とりわけ、トランスフォーム化細胞の放射線療法耐性の性質は、これらの細胞におけるｂｃｌ2遺伝子の存在または高濃度のグルタチオンによるものである。
【００３６】
特に、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）酵素は、各種の脂肪族及び芳香族アルデヒドの対応するカルボン酸への酸化を、補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下で触媒する。これらの酵素の各種のサブファミリー、特にＡＬＤＨ１、ＡＬＤＨ２またはＡＬＤＨ３は各種の器官に存在し、生体異物の脱毒素化において役割を果たしている。これらの酵素の活性の増大は、シクロホスファミドのような抗ガン剤に対する耐性を引き起こす[Magni等, Blood, 87, 1097-1103, (1996)]。
【００３７】
特許出願WO 98/44919に示されるように、ＡＬＤＨ１酵素の活性のインヒビターの使用は、ＡＬＤＨ１によって誘導される化学療法耐性または抗アンドロゲン耐性の性質を除去することが可能である。
【００３８】
ガン性腫瘍内には、化学療法剤に対して耐性の性質を有するマルチドラッグ耐性（ＭＤＲ）細胞として知られている特定のガン細胞が存在する。これらの中では、ＭＤＲ遺伝子を過剰発現しているＲ７細胞が、ダウノルビシンに耐性であることが開示されている[Jeannesson, P.等, Cancer Res., 50, 1231-1236, (1990)]。
【００３９】
マウスリンパ腫細胞のＬＹ−ａｒ細胞系は、放射線療法に感受性であるＬＹ−ａｓ細胞とは異なり、放射線に対して耐性であることが開示されている[Mirkovic, N.等, Oncogene, 15, 1461-1470, (1997)]。この耐性は、ｂｃｌ2遺伝子の過剰発現によるものである。
【００４０】
これらの化合物はまた、広範囲のトランスフォーム化細胞においてアポトーシスを誘導する利点を有し、かくしてそれらを、数多くのガン性病理、及び他の疾患、とりわけ自己免疫疾患またはアレルギーのような細胞過剰増殖と関連する疾患を治療するための製薬組成物の調製において使用することが可能である。
【００４１】
これらの化合物はまた、トランスフォーム化細胞においてアポトーシスを選択的に誘導することを示すが、特定の広範囲の濃度では、ＭＲＣ５細胞のような正常細胞においてアポトーシス誘導特性をも示す。これはそれらを、特に高齢性または光誘導性の加齢の防止または治療を企図する化粧品組成物の調製において使用することを可能にする。
【００４２】
本発明の主題はまた、医薬製品としての前述の式（Ｉ）の化合物に関する。本発明に係る化合物は、特に以下の治療分野において適している：
１）ガン性または前ガン性病状の治療または予防；
２）分化及び増殖に関する角質化疾患と関連する皮膚科学的病気の治療、特に一般的挫創、コメド、多形、しゅさ、病巣挫創、凝塊性挫創、老人性挫創、及び日光、医薬、または職業性挫創のような二次的挫創の治療；
３）魚鱗癬、魚鱗癬様疾患、掌蹠角皮症、白斑症、及び白斑症用疾患の治療；
４）細胞増殖疾患を含むまたは含まない炎症性免疫アレルギー性成分を有する皮膚科学的病気、特に全ての形態の乾癬、気候性皮膚病、粘膜または爪の乾癬、さらに関節症性乾癬、または別のものとして湿疹のような皮膚性アトピー、または呼吸性アトピー、または歯肉肥厚の治療；
５）良性または悪性の、ウイルス起源であってもなくても良い、真皮または表皮の増殖、例えば一般的ないぼ、扁平いぼ、及びいぼ状表皮異形成、口腔または葉状乳頭腫症、Ｔリンパ腫、及び特に基底細胞及び有棘細胞上皮腫の場合の、紫外光によって誘導される増殖、及び角化棘細胞腫のような前ガン性皮膚病変の治療；
６）エリテマトーデスのような免疫性皮膚炎、水疱性免疫疾患、及び強皮症のようなコラーゲン疾患の治療；
７）免疫学的成分を有する皮膚科学的または全身性疾患の治療；
８）挫創の過剰脂漏症または単純脂漏症のような皮脂機能疾患の治療；
９）ＵＶ光に対する暴露による皮膚疾患の治療、及び光誘導性または高齢性の加齢のいずれかの皮膚の加齢の修復または治療、または光線性角化症及び着色、または高齢性または化学線性加齢と関連するいずれかの病理の減少；
１０）瘢痕化疾患の予防または治療、あるいは皮膚萎縮線条の予防または修復；１１）関節炎のような炎症性疾患の治療；
１２）カポシ肉腫または肝炎のようなウイルス起源のいずれかの皮膚または全身性疾患の治療；並びに
１３）特定の眼科的疾患、特に角膜炎の治療。
【００４３】
前述の治療分野では、本発明に係る化合物は、チオクト酸の３−メチルチオプロパノイルチオエステル化合物、メチオナール、数多くの抗新生物性剤、レチノイドと組み合わせて、コルチコステロイドまたはエストロゲンと組み合わせて、抗酸化剤と組み合わせて、α−ヒドロキシ酸またはα−ケト酸またはそれらの誘導体と組み合わせて、カリウムチャンネルブロッカーと組み合わせて、免疫系を妨げることが既知の他の医薬製品と組み合わせて（例えばシクロスポリン、ＦＫ５０６、グルココルチコイド、モノクローナル抗体、サイトカイン、または増殖因子）、ビタミンＤ誘導体と組み合わせて、またはビタミンＤ類似体化合物と組み合わせて、有利に使用されて良い。
【００４４】
抗新生物性剤の中では、特にデキサメタゾン、シクロホスファミド、シスプラチン、エトポシド、及びＢＣＮＵ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−シクロエチル）−Ｎ−ニトロソウレア）が挙げられ、それらはまたアポトーシスを誘導可能である。
【００４５】
チオクトサンの３−メチルチオプロパノイルチオエステルの中では、特に特許出願EP 947 503に開示された化合物、とりわけ化合物２１、即ち２’−（トリメチルアンモニウム）エチル６Ｓ，８Ｓ−ビス（３−メチルチオプロパノイル）オクタノアートヨージド（以下でメトメトリコと称される）が挙げられる。
【００４６】
特に、本発明の化合物の相乗効果は、特許出願EP 947 503に開示された抗腫瘍治療剤と組み合わせて使用された場合、抗腫瘍活性において明らかにされている。
【００４７】
用語、「レチノイド」は、天然または合成の、アゴニストまたはアンタゴニストタイプの、ＲＡＲまたはＲＸＲレセプターリガンドを意味する。
【００４８】
ビタミンＤまたはそれらの誘導体の中では、特にビタミンＤ2及びＤ3誘導体、特に１，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３、及び特許出願FR 98/13747
、FR 99/14783またはFR 99/14781に開示された化合物から選択されるビタミンＤ類似体である化合物が挙げられる。
【００４９】
抗酸化剤の中では、特にα−トコフェロール、スーパーオキシドジスムターゼ、ユビキノール、及び特定の金属キレート化剤が挙げられる。
【００５０】
α−ヒドロキシ酸またはα−ケト酸またはそれらの誘導体の中では、特にケトロイシン、ケトイソロイシン、ケトバリン、２−オキソブチラート、４−メチルチオ−２−オキソブタン酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、グリコール酸、マンデル酸、酒石酸、及びグリセリン酸、あるいはこれらの塩、アミドまたはエステルが挙げられる。
【００５１】
カリウムチャンネルブロッカーの中では、特にミノキシジル（２，４−ジアミノ−６−ピペリジノピリミジン３−オキシド）及びその誘導体が挙げられる。
【００５２】
本出願人はまた、驚くべきことに且つ予期せぬことに、本発明に係る二つの化合物の組み合わせによる相乗的活性を見出した。
【００５３】
本発明の主題はまた、生理学的に許容可能な賦形剤中に、活性成分として、本発明の主題である少なくとも一つの新規な化合物の有効量を含む、新規な製薬または化粧品組成物である。
【００５４】
かくして本発明の主題はまた、特に前述の疾患を治療することを企図するそのような製薬組成物である。
【００５５】
本発明はまた、抗腫瘍治療剤として、単独で、または特許出願EP 947 503に開示されたものから選択される抗腫瘍治療剤と組み合わせて、本発明の主題である少なくとも一つの新規な化合物の有効量を含む、ガンの治療、抑制、及び予防のための新規な製薬組成物に関する。
【００５６】
本発明に係る化合物は、腸溶的、非経口的、局所的、または接眼的に投与されても良い。
【００５７】
腸溶的な経路を介して、前記製薬組成物は、錠剤、ゲルカプセル、糖被覆錠剤、シロップ、懸濁液、溶液、パウダー、顆粒、エマルション、または制御された放出を可能にする脂質若しくはポリマーベシクル若しくはナノスフェア若しくはミクロスフェアの形態で存在しても良い。
【００５８】
非経口的経路を介して、前記組成物は、点滴または注射のための溶液または懸濁液の形態で存在しても良い。
【００５９】
本発明に係る式（Ｉ）の化合物は、１から３の投与量取り込みで、約０．００１から１００ｍｇ／体重のｋｇの毎日の投与量で投与される。
【００６０】
局所的経路を介して、本発明に係る化合物に基づく化粧品または製薬組成物は、とりわけ頭皮の皮膚及び粘膜を処理することを企図しており、軟膏、クリーム、乳液、ポマード、パウダー、浸液パッド、溶液、ゲル、スプレー、ローション、または懸濁液の形態で存在しても良い。それはまた、制御された放出を可能にする脂質またはポリマーベシクルまたはナノスフェアまたはミクロスフェアまたはポリマーパッチまたはヒドロゲルの形態で存在しても良い。変形例として、それはまた、シャンプー、コンディショナー、または石鹸の形態で存在しても良い。
【００６１】
これらの局所的経路の組成物は、治療上の支持に依存して、無水形態、水性形態、またはエマルションの形態で存在しても良い。
【００６２】
接眼的経路を介して、それらは特に点眼である。
【００６３】
製薬的応用について、式（Ｉ）の化合物は、組成物の全重量に対して、一般的に０．０００１から１０重量％の間、好ましくは０．００１から１重量％の間の濃度で、局所的または接眼的に使用される。
【００６４】
本発明に係る式（Ｉ）の化合物はまた、化粧品分野、特に毛髪及び身体の衛生、特に挫創の傾向を有する皮膚の処理、皮膚萎縮線条の処理または予防、日光の有害な影響に対する保護、光誘導性または高齢性の加齢の予防または対処、あるいは皮膚または毛髪のべたつき感の出現の対処のための応用が見出される。
【００６５】
化粧品組成物中の式（Ｉ）の化合物の濃度は、組成物の全重量に対して０．００１から３重量％の間であって良い。
【００６６】
本発明に係る製薬または化粧品組成物はまた、不活性または製薬学的若しくは化粧品的に活性な添加剤、あるいはこれらの添加剤の組み合わせを含んでも良く、特に以下のものを含んでも良い：湿潤剤；ヒドロキノン、アゼライン酸、カフェー酸、またはコウジ酸のような脱色素剤；皮膚軟化剤；グリセロール、ＰＥＧ−４００、チアモルホリノン及びその誘導体、またはウレアのような保湿剤；Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステアミン、それらの塩及びそれらの誘導体、または過酸化ベンゾイルのような抗脂漏剤または抗挫創剤；エリスロマイシン及びそのエステル、ネオマイシン、クリンダマイシン及びそのエステル、並びにテトラシクリンのような抗生物質；ケトコナゾールまたはポリ（４，５−メチレン−３−イソチアゾリノン）のような抗真菌剤；ミノキシジル（２，４−ジアミノ−６−ピペラジノ−ピリミジン３−オキシド）及びその誘導体、ジアゾキシド（７−クロロ−３−メチル−１，２，４−ベンゾ−チアジアジン１，１−ジオキシド）、及びフェニトイン（５，４−ジフェニル−イミダゾリン−２，４−ジオン）；のような毛髪の成長の促進剤；非ステロイド系抗炎症剤；カロチノイド、特にβ−カロチン；アントラリン及びその誘導体のような抗乾癬剤；並びに最後にエイコサ−５，８，１１，１４−テトライン酸及びエイコサ−５，８，１１−トリイン酸、及びそれらのエステル及びアミド。
【００６７】
本発明に係る組成物はまた、香料、パラ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような防腐剤、安定剤、湿度調節剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤、乳化剤、またはＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂスクリーニング剤を含んでも良い。
【００６８】
言うまでもなく、当業者は、本発明に本質的に関連する有利な特性が、考慮される添加によって負に影響されない、または実質的に負に影響されないように、これらの組成物に添加された任意の化合物の選択に注意を払うであろう。
【００６９】
本発明の係る式（Ｉ）の活性化合物の生産のいくつかの実施例、及び本発明に係る式（Ｉ）の化合物の生物学的活性を評価するための試験例が、制限的な性質を有することなく、説明の目的で与えられるであろう。
【００７０】
【実施例】
Ａ．化合物の実施例
実施例１
S-メチル4-ジメチル-アミノ-4-メチル-2-ペンチンチオアートの調製方法
4.07ml(9.24mmol)のヘキサン中のn-ブチルリチウムの2.27M溶液を、-70℃で５分間かけて0.855gの3-ジメチルアミノ-3-メチル-1-部チンの溶液に加える[Hennion, G.F., Nelson, K.W. (1957) J. Am. Chem. Soc., 79, 2142-2144]。５分後、反応媒体を０℃に温め、この温度でさらに30分間攪拌する。-70℃に冷却後、2mlの事前濃縮オキシ硫化炭素をカニューレで加え、混合物を-70℃で30分間攪拌する。次いで反応媒体を０℃で30分維持し、0.575ml(9.24mmol)のヨウ化メチルを加え、攪拌を０℃で２時間継続する。生成した混合物を250mlのエーテルで希釈し、飽和塩化ナトリウム溶液（３×30ml）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥する。真空下での蒸発と、シリカゲルでのクロマトグラフィーによる精製(70/30のワセリンエチル／酢酸エチル混合物で溶出)の後、1.16gの実施例１の化合物を、無色のオイルの形態で単離する（収率：81％）。
【数１】
0004855626.tif 000004
【００７１】
実施例２
S-メチル4-メチル-4-トリメチルアンモニウム-2-ペンチンチオアートヨージドの調製方法
0.25ml(4.02mmol)のヨウ化メチルを、室温で10mlの酢酸エチル中に実施例１で得られた化合物の0.184g(0.99mmol)に加える。混合物を暗所で４日間攪拌する。生成した混合物を真空下で蒸発し、残余物をシリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製する(90/10のジクロロメタン／メタノール混合物で溶出)。0.229gの実施例２の化合物（70％の収率）が、固体の形態で単離される。
【数２】
0004855626.tif 000005
【００７２】
実施例３
S-メチル4-ジ-n-プロピルアミノ-4-メチル-2-ペンチンチオアートの調製方法
3-ジメチルアミノ-3-メチル-1-ブチンの代わりに、3-ジ-n-プロピルアミノ-3-メチル-1-ブチンを使用して、実施例１に記載された方法と同一の調製方法を実施する[Hennion, G.F., Hanzel, R.F., J. Am. Chem. Soc., 82, 4908-4912, (1960)]。スケール：2.8mmol、シリカゲルでのクロマトグラフィーによる精製（溶出液：95/5のワセリンエーテル／酢酸エチル）、収率：75％。無色のオイル。
【数３】
0004855626.tif 000006
【００７３】
実施例４
S-メチル4-メチル-4-ピロジン-1-イル-2-ペンチンチオアートの調製方法
3-ジメチルアミノ-3-メチル-1-ブチンの代わりに、3-メチル-3-ピロジン-1-イル-1-ブチンを使用して、実施例１に記載された方法と同一の調製方法を実施する[Hennion, G.F., Nelson, K.W. J. Am. Chem. Soc., 79, 2142-2144, (1957)]。スケール：2.8mmol、シリカゲルでのクロマトグラフィーによる精製（溶出液：70/30のワセリンエーテル／酢酸エチル）、収率：85％。無色のオイル。
【数４】
0004855626.tif 000007
【００７４】
実施例５
S-メチル-4-メチル-4-モルホリン-4-イル-2-ペンチンチオアートの調製方法
3-ジメチルアミノ-3-メチル-1-ブチンの代わりに、3-メチル-3-モルホリン-4-イル-1-ブチンを使用して、実施例１に記載された方法と同一の調製方法を実施する。スケール：1.5mmol、シリカゲルでのクロマトグラフィーによる精製（溶出液：60/40のワセリンエーテル／酢酸エチル）、収率：77％。白色の固体。
【数５】
0004855626.tif 000008
【００７５】
Ｂ．本発明の化合物の生物学的活性を評価する試験例
実施例１−トランスフォーム化細胞または非トランスフォーム化細胞の増殖に対する化合物の効果
ａ）DU145及びBAF3 bcl2細胞の増殖に対する化合物の効果
使用される細胞は二つの細胞系に対応する：ヒト前立腺ガンの転移細胞（DU145）、及びヒトbcl2遺伝子でトランスフェクトされたネズミリンパ細胞（BAF3 bcl2）。
【００７６】
DU145についての試験のため使用される方法は、以下の通りである：
105細胞を、1mlの培養培地中のミクロプレートの各種のウェルでインキュベートする。
【００７７】
細胞をウェルに配置した４時間後で、化合物を添加する。
【００７８】
72時間後、細胞を各種の時間で取り出す。DU145細胞を、PBSで二度洗浄し、0.1M塩化ナトリウムで直接回収する。
【００７９】
DU145細胞の増殖に対する効果を、Lowry法(Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L.及びRandall, J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951))に従ってタンパク質アッセイにより、及びHoechst法(West, D.C., Sattar, A.及びKumar, S., Anal. Biochem. 147, 289-295, (1985))によるDNAアッセイにより測定する。
【００８０】
BAF3 bcl2細胞についての試験のため使用される方法は、以下の通りである：105細胞を、1mlの培養培地中のミクロプレートの各種のウェルでインキュベートする。４時間のインキュベーション後、試験化合物をBAF3 bcl2細胞を含むウェルに加える。
【００８１】
BAF3 bcl2細胞については、0.1%トリパンブルーの存在下で生存細胞をカウントすることによって、増殖を測定する。コントロールは、特許出願WO 98/44919に開示されたチオアンパールからなる。
【００８２】
その結果が、以下の表１に表される：
【表１】
0004855626.tif 000009
【００８３】
IC50の濃度は、細胞増殖の50％阻害に対応する濃度である。
【００８４】
これらの結果は、本発明の化合物のIC50値が、チオアンパールで得られるものよりずっと低いことを示す。かくして、本発明に係る化合物で得られるDU145細胞及びBAF3 bcl2細胞の増殖の阻害は、チオアンパールで得られる阻害より大きい。
【００８５】
DU145細胞及びBAF3 bcl2細胞の増殖の阻害は、これらの細胞のアポトーシスの減少の増大に少なくとも部分的に依存する。
【００８６】
かくしてこれらの結果は、本発明の化合物が、チオアンパールより、DU145細胞及びBAF3 bcl2細胞においてアポトーシスを誘導することを示唆する。
【００８７】
ｂ）L1210、L1210T、B16及びMRC5細胞の増殖に対する化合物の効果
使用される細胞は、各種の細胞系に対応する：ヒト肺正常胚性線維芽細胞（MRC5）、マウスメラノーマ細胞（B16）、マウスリンパ球白血病細胞（L1210）、及びヒトALDH1 cDNAを有するレトロウイルスベクターでL1210細胞を感染することによって得られたL1210T細胞。
【００８８】
L1210細胞に対する試験のため使用される方法は以下の通りである。
105細胞を、1mlの培養培地中のミクロプレートの各種のウェルでインキュベートする。４時間のインキュベーション後、試験化合物をL1210細胞を含むウェルに加える。
【００８９】
L1210細胞については、0.1%トリパンブルーの存在下で生存細胞をカウントすることによって、増殖を測定する。
【００９０】
B16及びMRC5細胞に対する試験のため使用される方法は以下の通りである：
細胞をウェルに配置した４時間後で、化合物を添加する。72時間後、細胞を各種の時間で取り出す。B16及びMRC5細胞を、PBSで二度洗浄し、0.1M塩化ナトリウムで直接回収する。
【００９１】
B16及びMRC5細胞の増殖に対する効果を、Lowry法(Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L.及びRandall, J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951))に従ってタンパク質アッセイにより、及びHoechst法(West, D.C., Sattar, A.及びKumar, S., Anal. Biochem. 147, 289-295, (1985))によるDNAアッセイにより測定する。
【００９２】
その結果は、以下の表２に表される：
【表２】
0004855626.tif 000010
NTは試験されないことを意味する
【００９３】
IC50の濃度は、細胞増殖の50％阻害に対応する濃度である。
【００９４】
これらの結果は、本発明の化合物のIC50値が、チオアンパールで得られるものよりずっと低いことを示す。かくして、本発明に係る化合物で得られるL1210、L1210T、B16及びMRC5細胞の増殖の阻害は、チオアンパールで得られる阻害より強力である。
【００９５】
L1210、L1210T、B16及びMRC5細胞の増殖の阻害は、これらの細胞のアポトーシスの減少の増大に少なくとも部分的に依存する。かくしてこれらの結果は、本発明の化合物が、チオアンパールより、L1210、L1210T、B16及びMRC5細胞においてアポトーシスを誘導することを示唆する。
【００９６】
２−本発明の化合物でのBAF3-b0及びBAF3 bcl2細胞におけるアポトーシスの誘導の測定
BAF3 bcl2細胞は、bcl2遺伝子でトランスフェクトされたBAF3細胞（マウスリンパ細胞）に対応する。これらの細胞の中では、H16、G18、B14及びG21として既知の４の系が、bcl2遺伝子を過剰発現している。
【００９７】
以下は、BAF3-b0として既知の細胞は、bcl2遺伝子でトランスフェクトされていないBAF3細胞に対応する。
【００９８】
BAF3-b0細胞は、１６時間インターロイキン３（IL3)）の不存在下でアポトーシスを経験する（80％より多い細胞）[Collins, M.K.L., Marvel, J., Malde, P. & Lopez-Rivas, A., J. Exp. Med. 176, 1043-1051, (1992)]が、BAF3 bcl2細胞は、IL3の不存在下でアポトーシスの兆候を示さない。かくしてそれらはアポトーシス耐性である。
【００９９】
使用された方法は以下の通りである：IL3の存在下で培養されたBAF3-b0またはBAF3 bcl2細胞を、Wright, S.等, J. of Cell. Biochem. 48, 344-355, (1992)に開示されたものから適応された方法によってラベルした。
【０１００】
105細胞/mlを、37℃で40時間4.62KBq.ml-1の[3H]-チミジンでインキュベートした。培養培地での２℃の洗浄の後、2.5×106細胞を、試験化合物の存在下で培養した。
【０１０１】
24時間のインキュベーションの後、これらの細胞を、５分間400×ｇでの遠心分離により回収し、ＰＢＳバッファーで３回洗浄した。ペレットで回収された細胞を、2mlの0.1％ Triton X-100、20mM EDTA、5mM Tris pH8で溶解し、30分間４℃で30000×ｇで遠心分離した。
【０１０２】
上清を回収し、ペレットを0.3mlの0.5N NaOHに溶解した。
【０１０３】
培養培地(1ml)、上清(0.3ml)、及び溶解ペレット(0.1ml)の等量物を、シンチレーションカウンターでアッセイした。
【０１０４】
DNA断片のパーセンテージは、以下の態様で計算される：
【数６】
0004855626.tif 000011
【０１０５】
DNAの断片化のパーセンテージは、細胞が受けたアポトーシスの直接的な測定値である。
【０１０６】
得られた結果は、表３で表される：
【表３】
0004855626.tif 000012
【０１０７】
BAF3-b0細胞は、コントロールとして機能する。これらの細胞のアポトーシスは、実施例１の化合物の添加によって誘導され、この減少は投与量依存的な態様で増大する。
【０１０８】
これらの結果は、本発明に係る化合物の存在が、bcl2遺伝子を過剰発現するH16、G18、B14及びG21細胞において、bcl2遺伝子によるアポトーシスの阻害を除去することが可能であることを示す。
【０１０９】
以下の表４に表される試験方法は、インキュベーション時間が24時間の代わりに６時間であることを除き、前述の方法と同一である：
【表４】
0004855626.tif 000013
【０１１０】
これらの細胞のアポトーシスは、チオアンパールよりも実施例１の化合物でずっと強力に誘導され、投与量依存的な態様である。
【０１１１】
これらの結果は、本発明に係る化合物の存在が、bcl2遺伝子によるアポトーシスの阻害を除去することが可能であり、従来技術の化合物よりずっと強力であることを示す。
【０１１２】
実施例２：ALDH1の活性に対する化合物の効果
使用された方法は以下に表される：
パン酵母から得た260mUのALDHを、60mMのリン酸ナトリウムバッファーpH6中の1mM EDTA、100mM KClの最終容量200μlの混合物で、37℃または０℃で事前インキュベートする。
【０１１３】
200μlの混合物を含む各チューブに、試験化合物を含まないコントロールシリーズを除いて、400μMの濃度で試験化合物を添加する。
【０１１４】
０℃または37℃で実施されたインキュベーションを、100μgのBSA（ウシ血清アルブミン）を加えることによって停止し、タンパク質（ALDH及びBSA）を沈降するために-20℃で最終濃度80％でアセトンを加える。チューブを-20℃で１時間放置し、10分間10000rpmで遠心分離し、80％アセトンで洗浄する。
【０１１５】
沈降したタンパク質を358μlの水に溶解し、60mMのリン酸ナトリウムバッファーpH8.5中に1mM EDTA、100mM KCl、及び2.35mM NADからなる反応複合体に迅速に加える。
【０１１６】
2mMのプロパナールを加えることによって反応を開始し、光学密度（OD）をT=0及びT=5、10、20及び30分で340nmで測定する。
【０１１７】
酵素の活性を、分当たりの光学密度ΔODの変化によって測定する(Quash G.等, Enzymology and molecular biology of carbonyl metabolism, Weiner等編, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 97-106)。
【０１１８】
得られた結果が図６に表される。
【０１１９】
０℃（■によって表される）または37℃（▲によって表される）での実施例１の化合物での各種の事前インキュベーション時間で、あるいは別法として０℃（□によって表される）または37℃（△によって表される）での実施例１の化合物での事前インキュベーションなしで、得られたALDH1酵素のパーセンテージ活性（A%）が、時間ｔ（分で表される）の関数として測定される。
【０１２０】
実施例１の化合物での事前インキュベーションが０℃の温度で実施される場合、酵素の活性に対する実施例１の化合物の阻害の効果は存在しない。特に、実施例１の化合物での事前インキュベーション有りまたは無しで得られた二つの曲線は重ね合わせることが可能である。これは、この温度では、実施例１の化合物はＡＬＤＨ１によって代謝されることができないという事実によって説明される。結局、切断後に形成される活性成分と酵素の間での共有結合の形成は、確立されることができない。
【０１２１】
他方で、実施例１の化合物での事前インキュベーションが、３７℃の温度で実施される場合、酵素ALDH1は実施例１の化合物を代謝し、共有結合を介してそれに結合し、酵素の活性の阻害の効果が観察される。この効果は、実施例１の化合物での事前インキュベーション時間の関数として増大する。
【０１２２】
これらの結果は、本発明に係る化合物が、ALDHの活性を減少可能であり、「自殺」タイプ（酵素ALDHとの不可逆的共有結合）である利点を有し、かくして抗ガン剤に対する耐性を除去可能であることを示す。
【０１２３】
実施例３：MDR遺伝子を過剰発現するR7細胞に対する化合物の効果
この試験で使用されるK562細胞は、MDR遺伝子を過剰発現しているガン細胞であるR7細胞とは対照的に、MDR遺伝子を過剰発現しておらず、コントロールとして機能し、ヒト脊髄白血病細胞である。
【０１２４】
この試験の目的は、これらのR7細胞に対する本発明の化合物の効果を示すことである。
【０１２５】
使用される方法は以下に示される：
【０１２６】
105細胞を、1mlの培養培地でミクロプレートの各種のウェルでインキュベートした。これらは、一方でR7細胞であり、他方でK562細胞である。
【０１２７】
４時間のインキュベーションの後、試験化合物（一方で本発明に係る実施例１の化合物、他方でダウノルビシン）を、細胞を含むウェルに加えた。
【０１２８】
72時間後、細胞を各種の時間で回収した。
【０１２９】
細胞の増殖を、0.1％トリパンブルーの存在下で生存細胞をカウントすることによって測定した。
【０１３０】
その結果が図７及び８に表される。
【０１３１】
図７及び８はぞれぞれ、増大する濃度Ｃで得られた、R7及びK562細胞の増殖に対するダウノルビシン及び実施例１の化合物によるパーセンテージ阻害（I%）を表す。K562細胞で得られた結果は◆によって記号化され、R7細胞で得られた結果は▲によって記号化される。
【０１３２】
これらの結果は、ダウノルビシンが、K562細胞の増殖を阻害する濃度で、MDR遺伝子を過剰発現しているR7細胞の増殖に対して阻害効果を有さないことを示す。
【０１３３】
他方で、実施例１の化合物は、R7細胞の増殖を非常に強力に阻害する。R7細胞の増殖に対する阻害効果は、K562細胞の増殖に対して同じ濃度で得られた阻害効果より大きい。
【０１３４】
これらの結果は、本発明に係る化合物が、MDR遺伝子による化学療法耐性を除去可能であることを示す。
【０１３５】
実施例４：DU145細胞の増殖に対する、本発明に係る化合物と特許出願EP 947 503に開示されたものから選択される化合物の組み合わせの効果
特許出願EP 947 503は、チオクトサンに対して結合されたチオエステルを介して結合したメチオナールを含むメチオナール誘導体が、トランスフォーム化細胞及び腫瘍細胞に対して強力な選択的アポトーシス活性を示すことを開示する。これらの化合物の中では、メトメトリコと称される、2'-(トリメチルアンモニウム)エチル6S,8S-ビス(3-メチルチオプロパノイル)オクタノアートヨージド（この文献の化合物２１）が挙げられる。
【０１３６】
使用される方法は以下に示される：
【０１３７】
使用される細胞は、ヒト前立腺ガンDU145の転移細胞に対応する。
【０１３８】
105のDU145細胞を、1mlの培養培地でミクロプレートの各種のウェルでインキュベートする。
【０１３９】
細胞をウェルに配置した４時間後に、試験化合物を添加する。72時間後、細胞を各種の時間で取り出す。細胞を、PBSで二度洗浄し、0.1M塩化ナトリウムで直接回収する。
【０１４０】
DU145細胞の増殖に対する効果を、Lowry法(Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L.及びRandall, J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951))に従ってタンパク質アッセイにより、及びHoechst法(West, D.C., Sattar, A.及びKumar, S., Anal. Biochem. 147, 289-295, (1985))によるDNAアッセイにより測定する。
【０１４１】
試験化合物は、実施例１の化合物、メトメトリコ、及びそれらの混合物である。
【０１４２】
その結果が表５にさらわされる：
【表５】
0004855626.tif 000014
【０１４３】
この結果は、実施例１の化合物単独で、DU145細胞の増殖を阻害することを示す。他方で、メトメトリコ単独では、この実施例で使用された濃度でこれらのDU145細胞の増殖に対する阻害効果を有さない。
【０１４４】
本発明に係る化合物と、特許出願EP 947 503に開示された化合物の組み合わせは、DU145細胞の増殖を相乗的に阻害する。これらの結果は、それらを単独で使用する場合に使用される投与量よりずっと低い投与量での組み合わせて、これらの化合物を使用する可能性を示す。
【０１４５】
実施例５：DU145細胞または正常細胞の増殖に対する、本発明に係る二つの化合物の組み合わせの効果
105の正常ヒト前立腺細胞または105のガン性ヒト前立腺細胞（DU145）を、1mlの培養媒体でミクロプレートの各種のウェルでインキュベートする。
【０１４６】
細胞をウェルに配置した４時間後に、化合物を添加する。
【０１４７】
72時間後、細胞を各種の時間で取り出す。DU145細胞または正常細胞を、PBSで二度洗浄し、0.1M塩化ナトリウムで直接回収する。
【０１４８】
DU145細胞または正常細胞の増殖に対する効果を、Lowry法(Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L.及びRandall, J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951))に従ってタンパク質アッセイにより、及びHoechst法(West, D.C., Sattar, A.及びKumar, S., Anal. Biochem. 147, 289-295, (1985))によるDNAアッセイにより測定する。
【表６】
0004855626.tif 000015
【０１４９】
本発明に係る二つの化合物は、正常細胞の増殖に対するいずれかの適切な効果なく、ガン細胞の増殖を相乗的に阻害し、かくしてトランスフォーム化細胞に関する本発明に係る化合物の活性及び選択性をさらに増大可能である。これらの結果は、化合物単独で使用される場合に使用される投与量よりも低い投与量で組み合わせて、これらの化合物を使用する可能性を示す。
【０１５０】
Ｃ．処方例
１）経口経路
（ａ）以下の組成物を、０．２ｇの錠剤の形態で調製する：
実施例１の化合物                                    ０．００５ｇ
事前ゼラチン化澱粉                                  ０．０６５ｇ
マイクロクリスタリンセルロース                      ０．０７５ｇ
ラクトース                                          ０．０５０ｇ
ステアリン酸マグネシウム                            ０．００５ｇ
（ｂ）５ｍｌのアンプルに実装することを企図した飲料懸濁液を調製する：
実施例２の化合物                                    ０．００１ｇ
グリセロール                                        ０．５００ｇ
７０％ソルビトール                                  ０．５００ｇ
糖酸ナトリウム                                      ０．０１０ｇ
メチルパラ−ヒドロキシベンゾアート                  ０．０４０ｇ
香味料  ｑｓ                                        適量
精製水  ｑｓ                                        ５ｍｌまでの残部
（ｃ）ゲルカプセルに実装することを企図した以下の製剤を調製する：
実施例１の化合物                                    ０．０１ｍｇ
実施例５の化合物                                    ０．０１ｍｇ
シクロスポリン                                      ０．０５０ｇ
トウモロコシ澱粉                                    ０．０６０ｇ
ラクトース  ｑｓ                                    ０．３００ｇ
使用されるゲルカプセルは、ゼラチン、酸化チタン、及び保存剤からなる。
【０１５１】
２）局所経路
（ａ）以下の非イオン性油中水型クリームを調製する：
実施例１の化合物                                    ０．１００ｇ
BDF社により"anhydrous eucerin"の名称で
販売されている乳化したラノリンアルコール、
ワックス、及び精製オイルの混合物                  ３９．９００ｇ
メチルパラ−ヒドロキシベンゾアート                  ０．０７５ｇ
プロピルパラ−ヒドロキシベンゾアート                ０．０７５ｇ
滅菌脱鉱水  ｑｓ                                １００．０００ｇ
（ｂ）以下の製剤を生産することにより、ゲルを調製する：
実施例１の化合物                                    ０．００１ｇ
塩基性エリスロマイシン                              ４．０００ｇ
ブチルヒドロキシトルエン                            ０．０５０ｇ
Hercules社により"Klucel HF"の名称で販売
されているヒドロキシプロピルセルロース              ２．０００ｇ
エタノール（９５°）  ｑｓ                      １００．０００ｇ
（ｃ）以下の成分を併せて混合することにより、ローションを調製する：
実施例２の化合物                                    ０．０３０ｇ
プロピレングリコール                                ５．０００ｇ
ブチルヒドロキシトルエン                            ０．１００ｇ
エタノール（９５°）  ｑｓ                      １００．０００ｇ
（ｄ）以下の成分を併せて混合することにより、日光の有害な影響を緩和する化粧品組成物を調製する：
実施例１の化合物                                    １．００ｇ
ベンジリデンカンファー                              ４．００ｇ
脂肪酸トリグリセリド                              ３１．００ｇ
グリセリルモノステアラート                          ６．００ｇ
ステアリン酸                                        ２．００ｇ
セチルアルコール                                    １．２０ｇ
ラノリン                                            ４．００ｇ
防腐剤                                              ０．３０ｇ
プロピレングリコール                                ２．００ｇ
トリエタノールアミン                                ０．５０ｇ
香料                                                ０．４０ｇ
脱鉱物水  ｑｓ                                  １００．００ｇ
（ｅ）以下の非イオン性水中油型クリームを調製する：
実施例３の化合物                                    ０．５００ｇ
レチノール酸                                        ０．０２０ｇ
セチルアルコール                                    ４．０００ｇ
グリセリルモノステアラート                          ２．５００ｇ
ＰＥＧ−５０ステアラート                            ２．５００ｇ
カリテバター                                        ９．２００ｇ
プロピレングリコール                                ２．０００ｇ
メチルパラ−ヒドロキシベンゾアート                  ０．０７５ｇ
プロピルパラ−ヒドロキシベンゾアート                ０．０７５ｇ
滅菌脱鉱物水  ｑｓ                              １００．０００ｇ
（ｆ）以下の成分を併せて混合することにより、局所的ゲルを調製する：
実施例４の化合物                                    ０．０５０ｇ
エタノール                                        ４３．０００ｇ
トコフェロール                                      ０．０５０ｇ
Goodrich社により"Carbopol 941"の名称で
販売されているカルボキシビニルポリマー              ０．０５０ｇ
２０重量％での水溶液としての
トリエタノールアミン                                ３．８００ｇ
水                                                  ９．３００ｇ
プロピレングリコール  ｑｓ                      １００．０００ｇ
（ｇ）以下の製剤を生産することにより、水中油型クリームを調製する：
実施例４の化合物                                    ０．０２０ｇ
ベタメタゾン１７−バレラート                        ０．０５０ｇ
Ｓ−カルボキシメチルシステイン                      ３．０００ｇ
Atlas社により"Myrj 52"の名称で販売されている
ポリオキシエチレンステアラート
（４０ｍｏｌのエチレンオキシド）                    ４．０００ｇ
Atlas社により"Tween 20"の名称で販売されている
２０ｍｏｌのエチレンオキシドでポリオキシエチ
レン化されたソルビタンモノラウラート                １．８００ｇ
Gattefosse社により"Geleol"の名称で販売
されているグリセリルモノステアラートと
ジステアラートとの混合物                            ４．２００ｇ
プロピレングリコール                              １０．０００ｇ
ブチルヒドロキシアニゾール                          ０．０１０ｇ
ブチルヒドロキシトルエン                            ０．０２０ｇ
ケトセテアリルアルコール                            ６．２００ｇ
防腐剤                                              適量
パーヒドロスクアレン                              １８．０００ｇ
Dynamit Nobel社により"Miglyol 812"
の名称で販売されているカプリル酸／
カプリン酸トリグリセリドの混合物                    ４．０００ｇ
トリエタノールアミン（９９重量％）                  ２．５００ｇ
水  ｑｓ                                        １００．０００ｇ
（ｈ）以下の水中油型クリームを調製する：
乳酸                                                ５．０００ｇ
実施例２の化合物                                    ０．０２０ｇ
Atlas社により"Myrj 52"の名称で販売されている
ポリオキシエチレンステアラート
（４０ｍｏｌのエチレンオキシド）                    ４．０００ｇ
Atlas社により"Tween 20"の名称で販売されている
２０ｍｏｌのエチレンオキシドでポリオキシエチ
レン化されたソルビタンモノラウラート                １．８００ｇ
Gattefosse社により"Geleol"の名称で販売
されているグリセリルモノステアラートと
ジステアラートとの混合物                            ４．２００ｇ
プロピレングリコール                              １０．０００ｇ
ブチルヒドロキシアニゾール                          ０．０１０ｇ
ブチルヒドロキシトルエン                            ０．０２０ｇ
ケトセテアリルアルコール                            ６．２００ｇ
防腐剤                                              適量
パーヒドロスクアレン                              １８．０００ｇ
Dynamit Nobel社により"Miglyol 812"
の名称で販売されているカプリル酸／
カプリン酸トリグリセリドの混合物                    ４．０００ｇ
水  ｑｓ                                        １００．０００ｇ
（ｉ）以下の無水軟膏を調製する：
実施例１の化合物                                    ５．００ｇ
流動ワセリン                                      ５０．００ｇ
ブチルヒドロキシトルエン                            ０．０５ｇ
白色ワセリン  ｑｓ                              １００．００ｇ
【０１５２】
３）病変内経路
（ａ）以下の組成物を調製する
実施例３の化合物                                    ０．００２ｇ
エチルオレアート  ｑｓ                            １０ｇ
（ｂ）以下の組成物を調製する
実施例１の化合物                                    ０．０５％
ポリエチレングリコール                              ２０％
０．９％ ＮａＣｌ溶液  ｑｓ                         １００までの残部
（ｃ）以下の組成物を調製する
実施例３の化合物                                    ２．５％
ポリエチレングリコール４００                        ２０％
０．９％ ＮａＣｌ溶液  ｑｓ                         １００までの残部
【０１５３】
４）静脈内経路
（ａ）以下の注射可能な組成物を調製する：
実施例１の化合物                                    ０．００１％
メトメトリコ                                        ０．０１％
ポリエチレングリコール４００                        ２０％
０．９％ ＮａＣｌ溶液  ｑｓ                         １００までの残部
（ｂ）以下の注射可能な組成物を調製する：
実施例２の化合物                                    ０．０１％
ポリエチレングリコール４００                        ２０％
０．９％ ＮａＣｌ溶液  ｑｓ                         １００までの残部
（ｃ）以下のシクロデキストリン組成物を調製する：
実施例３の化合物                                    ０．１ｍｇ
シクロデキストリン                                  ０．１０ｇ
注射水  ｑｓ                                      １０．００ｇ
（ｄ）以下のシクロデキストリン組成物を調製する：
実施例４の化合物                                    ０．０１ｇ
２−ヒドロキシプロピルシクロデキストリン            ０．１０ｇ
注射水  ｑｓ                                      １０．００ｇ
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、メチオナールを中心とする代謝経路を表す図である。
【図２】  図２は、式（ＩＩＩ）の化合物から式（Ｉ）の化合物の合成スキームを表す図である。
【図３】  図３は、式（ＩＩＩ）の化合物から式（Ｉ）の化合物の合成スキームを表す図である。
【図４】  図４は、式（Ｖ）の化合物から式（ＶＩ）の中間体を経て式（ＩＩＩ）の化合物の合成スキームを表す図である。
【図５】  図５は、式（Ｉ）の化合物から別の式（Ｉ）の合成スキームを表す図である。
【図６】  図６は、分当たりの光学密度の変化によって測定された、酵素の活性を表す図である。
【図７】  図７は、濃度の増大で得られるＲ７細胞の増殖に対する、ダウノルビシン及び実施例１の化合物による阻害パーセンテージ（Ｉ％）を表す図である。
【図８】  図８は、濃度の増大で得られるＫ５６２細胞の増殖に対する、ダウノルビシン及び実施例１の化合物による阻害パーセンテージ（Ｉ％）を表す図である。
【図１】
0004855626.tif 000018
【図２】
0004855626.tif 000019
【図３】
0004855626.tif 000020
【図４】
0004855626.tif 000021
【図５】
0004855626.tif 000022
【図６】
0004855626.tif 000023
【図７】
0004855626.tif 000024
【図８】
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