(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清濃度が２％以下である培養液を用いた培養条件下で以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含むプロセスを行い、工程（Ｂ）〜（Ｄ）においてｒＬＩＦを含有する培養液を用いることを特徴とする、ラット胚性幹細胞の製造方法：
（Ａ）ラット胚盤胞をｒＬＩＦを含有しない培養液を用いて培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、
（Ｂ）解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、
（Ｃ）継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代・培養する工程、
（Ｄ）さらに継代・培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程。
【請求項２】
培養液が血清代替試薬を含有する、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
工程（Ａ）が物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
工程（Ｃ）が物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、請求項１〜３いずれか記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ラット胚性幹細胞（以下ＥＳ細胞）に関する。より詳細には、本発明は、ラットＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞の製造方法、ラットＥＳ細胞の継代培養方法、ラットＥＳ細胞を用いた分化誘導関連物質のスクリーニング方法、および遺伝子改変ラットの作製における前記ラットＥＳ細胞の使用などに関する。
【背景技術】  ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊より樹立された細胞株で、白血病阻害因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ；ＬＩＦ）の存在下で自己複製することができる細胞である。培養条件を変えることにより、ＥＳ細胞をあらゆる種類の細胞（神経細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、赤血球、白血球、血小板、骨、軟骨、腎臓、腸、肝臓、膵臓、肺など）に分化させることができる。ゲノムプロジェクトにより多くの動物種のゲノムが解読され、ヒトとの相同性に関する情報が蓄積されてきた。これらの情報に基づきＥＳ細胞の段階で特定の遺伝子を破壊し、その遺伝子が細胞の分化あるいは個体の成育、恒常性の維持などに果たす役割（機能）を知ることができる。具体的には特定の遺伝子を破壊したＥＳ細胞を正常な宿主の胚盤胞に注入して宿主胚の細胞と混ぜ子宮に戻すとキメラ動物を作ることができ、得られたキメラ動物を交配させることにより特定の遺伝子が破壊された動物（ノックアウト動物）を作製することができる。また、ＥＳ細胞に化合物を作用させることで、様々な細胞（臓器）中の遺伝子に与える影響を評価することができる。一方、ＥＳ細胞を分化させて得られた正常な細胞を用いることで、細胞療法、再生医療が可能となる。以上のようにＥＳ細胞は生理学、薬理学や再生医療等の研究において幅広く応用することができる。しかしながら、実験動物においてはこれまでマウス（Ｅｖａｎｓ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８１，２９２：１５４−１５６）、アカゲザル（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２：７８４４−７８４８）、マーモセット（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９８，３８：１３３−１６５）およびカニクイザル（Ｓｕｅｍｏｒｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００３，３６５：４１９−４２９）のＥＳ細胞が樹立されたのみであり、ラットＥＳ細胞は未だ樹立されていない。
ラットはマウスに比べて約１０倍という実験上適当な大きさを有する哺乳動物であり、▲１▼細部の血管に容易に薬物投与可能である、▲２▼外科・移植実験が可能である、そして▲３▼組織を大量に採取可能である、といった利点を有する。これまで多くのヒト疾患モデルラットが開発・発見されており、ラットは医学をはじめとする各分野で広範に利用される最も有用な実験動物の一つである。ラットは過去１００年以来、現在も、がん、脳神経系、移植およびヒト多因子疾患などのモデルとして機能研究等に利用され、機能に関する膨大な研究資産の蓄積がある。特に脳地図の解析が進んでおり、かつ心理生理学における行動の研究においても情報が豊富である。マウスに比べて最大の弱点であった遺伝子解析についても、ラットゲノムの解析が進んでいることから、ヒトとの遺伝子レベルでの比較が可能となり、ポストゲノムを担う格好の実験動物として着目されている。実際、平成１４年３月に開催された科学技術・学術審議会研究計画・評価分科会ライフサイエンス委員会バイオリソース領域小委員会も、ラットが今後我が国で充実すべきバイオリソースの一つであり、ノックアウトラットの産生を目的としたＥＳ細胞の樹立が必要であると報告されている。
このようなラットの有用性とその周辺の遺伝子情報などの充実にもかかわらず、遺伝子改変ラット作製に欠くことの出来ないラットＥＳ細胞の樹立は困難を極めていた。例えばＩａｎｎａｃｃｏｎｅ  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９４，１６３：２８８−２９２およびその対応の特許出願であるＷＯ  ９５／０６７１６号公報には、ラットＰＶＧ株よりＥＳ細胞を樹立し、キメララットを作製したことが記載されている。しかしながらその後、Ｂｒｅｎｉｎ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７，１８５：１２４−１２５において、前記Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９４，１６３：２８８−２９２で作製したキメララットはマウスＥＳ細胞の混入により作製されたとの記載がなされている。すなわちラットＥＳ細胞の樹立およびキメララットの作製には成功しなかったことが示されている。また、他にもラットＥＳ細胞の樹立を試みた例はあるが（ＷＯ  ９９／２７０７６号公報及び特開２００２−１７６９７３号公報を参照）、いずれもその樹立には到っていない。
このように、これまでに複数の研究グループがラットＥＳ細胞株の樹立を試みているが、樹立には到っておらず、２００４年１月に米国キーストンにて開催されたＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ国際会議においてもラットＥＳ細胞の樹立は世界中で報告は無いとの認識であった。ラットＥＳ細胞の樹立の成功の鍵を握るのはＥＳ細胞作製の培養条件の設定である。これまでマウスＥＳ細胞の樹立および培養条件を基本にして樹立が試みられてきたが、ラットＥＳ細胞の樹立には到っていない。このような背景から、ラットＥＳ細胞の作出には培養条件の工夫が必要不可欠であると考えられている。
【発明の開示】
本発明の目的は、従来得ることのできなかったラットＥＳ細胞を提供することにある。またラットＥＳ細胞の樹立方法、製造方法、ラットＥＳ細胞の継代培養方法、ラットＥＳ細胞を用いた分化誘導関連物質のスクリーニング方法、および遺伝子改変ラットの作製における前記ラットＥＳ細胞の使用などを提供することにある。
本発明者らは、種々の系統のラットに由来する胚盤胞からラットＥＳ細胞の樹立を試みた結果、マウスＥＳ細胞とは全く異なる培養条件・継代条件を確立することにより、ラットＥＳ細胞株を樹立することに成功した。具体的には、実質的に血清を含有しない培養液を用い、内部細胞塊の単離及びＥＳ細胞の継代において物理的手法により樹立を試みるなど種々の工夫をこらすことにより、安定的かつＥＳ細胞の条件を全て満たしたラットＥＳ細胞を樹立・供給することに初めて成功した。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、下記に掲げるものである：
（１）  以下の（ａ）〜（ｊ）の性質を有することを特徴とするラット胚性幹細胞：
（ａ）Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子を発現する、
（ｂ）アルカリホスファターゼ活性陽性である、
（ｃ）胚様体形成能を有する、
（ｄ）ＳＳＥＡ（胎児ステージ特異的抗原）−１およびＳＳＥＡ−４を発現する、
（ｅ）正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、
（ｆ）未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、
（ｇ）インビトロで多分化能を有する、
（ｈ）三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、
（ｉ）奇形腫形成能を有する、
（ｊ）キメララット作製能を有する、
（２）  さらに（ｋ）２０％血清存在下での培養により分化する、という性質を有する、前記（１）記載のラット胚性幹細胞、
（３）  実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含むプロセスを行うことにより得られる、ラット胚性幹細胞：
（Ａ）ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、
（Ｂ）解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、
（Ｃ）継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代・培養する工程、
（Ｄ）さらに継代・培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程、
（４）  培養液が血清代替試薬を含有する、前記（３）記載の胚性幹細胞、
（５）  工程（Ａ）が物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、前記（３）または（４）記載の胚性幹細胞、
（６）  工程（Ｃ）が物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、前記（３）〜（５）いずれか記載の胚性幹細胞、
（７）  工程（Ａ）においてラット由来白血病阻害因子（ｒＬＩＦ）を含有しない培養液を用いる、前記（３）〜（６）いずれか記載の胚性幹細胞、
（８）  工程（Ｂ）〜（Ｄ）においてｒＬＩＦを含有する培養液を用いる、前記（３）〜（７）いずれか記載の胚性幹細胞、
（９）  培養においてフィーダー細胞を用いる、前記（３）〜（８）いずれか記載の胚性幹細胞、
（１０）  フィーダー細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、前記（９）記載の胚性幹細胞、
（１１）  ウイスターキョウト株（ＷＫＹ）、ウイスターハノーバーギャラス株（ＷＨＧ）及びブラウンノルウエー株（ＢＮ）のいずれかの系統に由来する、前記（１）〜（１０）いずれか記載の胚性幹細胞、
（１２）  実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含むプロセスを行うことを特徴とする、マウス以外の胚性幹細胞の製造方法：
（Ａ）ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、
（Ｂ）解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、
（Ｃ）継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代・培養する工程、
（Ｄ）さらに継代・培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程、
（１３）  マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記（１２）記載の製造方法、
（１４）  培養液が血清代替試薬を含有する、前記（１２）または（１３）記載の製造方法、
（１５）  工程（Ａ）が物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、前記（１２）〜（１４）いずれか記載の製造方法、
（１６）  工程（Ｃ）が物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、前記（１２）〜（１５）いずれか記載の製造方法、
（１７）  工程（Ａ）においてｒＬＩＦを含有しない培養液を用いる、前記（１２）〜（１６）いずれか記載の製造方法、
（１８）  工程（Ｂ）〜（Ｄ）においてｒＬＩＦを含有する培養液を用いる、前記（１２）〜（１７）いずれか記載の製造方法、
（１９）  培養においてフィーダー細胞を用いる、前記（１２）〜（１８）いずれか記載の製造方法、
（２０）  フィーダー細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、前記（１９）記載の製造方法、
（２１）  ラット胚性幹細胞がウイスターキョウト株（ＷＫＹ）、ウイスターハノーバーギャラス株（ＷＨＧ）及びブラウンノルウエー株（ＢＮ）のいずれかの系統に由来する、前記（１３）〜（２０）いずれか記載の製造方法、
（２２）  細胞集塊を保持した状態で解離し継代することを特徴とする、マウス以外の胚性幹細胞の継代培養方法、
（２３）  マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記（２２）記載の継代培養方法、
（２４）  物理的に細胞を解離する工程を含む、前記（２２）または（２３）記載の継代培養方法、
（２５）  実質的に血清を含有しない培養液を用いて培養することを特徴とする、前記（２２）〜（２４）いずれか記載の継代培養方法、
（２６）  培養液が血清代替試薬を含有するものである、前記（２５）記載の継代培養方法、
（２７）  培養液がｒＬＩＦを含有するものである、前記（２５）または（２６）記載の継代培養方法、
（２８）  血清代替試薬およびｒＬＩＦを含有する、マウス以外の胚性幹細胞用培養液、
（２９）  マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記（２８）記載の培養液、
（３０）  血清代替試薬およびｒＬＩＦを成分として含有する、マウス以外の胚性幹細胞培養キット、
（３１）  マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記（３０）記載の培養キット、
（３２）  さらに前記（１）〜（１１）いずれか記載のラット胚性幹細胞を成分として含有する、前記（３１）記載の培養キット、
（３３）  さらにフィーダー細胞を含有する、前記（３０）〜（３２）いずれか記載の培養キット、
（３４）  フィーダー細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、前記（３３）記載の培養キット、
（３５）  前記（１）〜（１１）いずれか記載のラット胚性幹細胞を分化誘導剤で刺激することを特徴とする、ラット胚性幹細胞の分化誘導方法、
（３６）  分化誘導剤がレチノイン酸、増殖因子、グルココルチコイドまたは細胞外基質である、前記（３５）記載の分化誘導方法、
（３７）  前記（１）〜（１１）いずれか記載のラット胚性幹細胞を分化誘導して得られた細胞、
（３８）  前記（１）〜（１１）いずれか記載のラット胚性幹細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリーまたは細胞抽出物、
（３９）  以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、組織または細胞の分化誘導剤のスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質を前記（１）〜（１１）いずれか記載のラット胚性幹細胞に接触させる工程、
（ｉｉ）ラット胚性幹細胞の分化の有無や程度を評価する工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する工程、
（４０）  以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程を含む、組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーニング方法：
（Ｉ）被験物質を前記（１）〜（１１）いずれか記載のラット胚性幹細胞に接触させる工程、
（ＩＩ）胚性幹細胞の分化誘導条件下で前記（Ｉ）のラット胚性幹細胞を培養し、分化の有無や程度を評価する工程、
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に作用する物質であるか否かを判断する工程、
（４１）  前記（１）〜（１１）いずれか記載のラット胚性幹細胞の、遺伝子改変ラットの作製における使用、
（４２）  遺伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットのいずれかである、前記（４１）記載の使用、
（４３）  以下の（Ｘ）〜（Ｚ）の工程を含むプロセスを行うことによる遺伝子改変ラットの製造方法：
（Ｘ）前記（１）〜（１１）いずれか記載のラット胚性幹細胞に所望の遺伝子を導入する工程、
（Ｙ）遺伝子導入されたラット胚性幹細胞を含有する移植用卵を調製する工程、
（Ｚ）移植用卵を偽妊娠させたメスのラットに導入し、仔ラットを産出する工程、
（４４）  前記（４３）記載の製造方法により製造された遺伝子改変ラット、
（４５）  遺伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットのいずれかである、前記（４４）記載のラット、
（４６）  実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下の（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、
（Ｂ）解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、
（Ｃ）継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代・培養する工程、
（Ｄ）さらに継代・培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程、
の工程を含むプロセスを行うことにより得られ、かつ以下の（ａ）〜（ｊ）：
（ａ）Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子を発現する、
（ｂ）アルカリホスファターゼ活性陽性である、
（ｃ）胚様体形成能を有する、
（ｄ）ＳＳＥＡ（胎児ステージ特異的抗原）−１およびＳＳＥＡ−４を発現する、
（ｅ）正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、
（ｆ）未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、
（ｇ）インビトロで多分化能を有する、
（ｈ）三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、
（ｉ）奇形腫形成能を有する、
（ｊ）キメララット作製能を有する、
の性質を有することを特徴とするラット胚性幹細胞、
（４７）  さらに（ｋ）２０％血清存在下での培養により分化する、という性質を有する、前記（４６）記載のラット胚性幹細胞、ならびに
（４８）  ウイスターキョウト株（ＷＫＹ）、ウィスターハノーバーギャラス株（ＷＨＧ）及びブラウンノルウエー株（ＢＮ）のいずれかの系統に由来する、前記（４６）または（４７）記載の胚性幹細胞。
【図面の簡単な説明】  図１は、ラットＥＳ細胞樹立に用いたラット胚盤胞（後期）の写真である。
図２は、ラットＥＳ細胞樹立に用いたマイトマイシンＣ処理を施した正常マウス胎児繊維芽細胞（フィーダー細胞）の写真である。
図３は、ラットＥＳ細胞樹立後におけるラットＬＩＦの添加の必要性について検討した結果を示す図である。開始時は継代５代目で、同一培養皿から各濃度のｒＬＩＦを添加した培養液にて３回継代した時のアルカリホスファターゼ活性陽性率を調べた結果を示している。
図４は、培養液における血清の有無の検討結果を示す写真である。それぞれ、（Ａ）２０％血清代替試薬（ＫＳＲ）を用いたラット由来内部細胞塊の形成写真、（Ｂ）２０％ウシ胎仔血清を用いたラット由来内部細胞塊の形成写真、（Ｃ）２０％血清代替試薬（ＫＳＲ）を用いて作製したラット由来内部細胞塊を、２０％血清代替試薬（ＫＳＲ）を添加したラットＥＳ細胞用培養液とフィーダー細胞とを用いて培養した場合の形態写真、（Ｄ）２０％ウシ胎仔血清を用いて作製したラット由来内部細胞塊を、２０％ウシ胎仔血清を添加したラットＥＳ細胞用培養液とフィーダー細胞とを用いて培養した場合の形態写真である。
図５は、５〜２０個の細胞集塊状態でラットＥＳ細胞を継代した場合（ａ））と、トリプシン・ＥＤＴＡ溶液で完全に単一細胞化して継代した場合（ｂ））とを比較した結果を示す写真である。単一細胞化することにより自発的分化が発生する。
図６は、ラットＥＳ細胞樹立法の概略を示す図である。
図７は、フィーダー細胞とラットＥＳ細胞樹立用培養液とを用いて、透明帯を除去したラット胚盤胞を培養し、内部細胞塊を形成させた写真である。矢印は形成させた内部細胞塊を示している。
図８は、ラット由来内部細胞塊をラットＥＳ細胞用培養液とフィーダー細胞を用いて培養し、出現した初代ラットＥＳ細胞の写真である。
図９は、ＥＳ細胞コロニー出現から７日目の、継代可能となった状態のラットＥＳ細胞の写真である。
図１０は、ラットＥＳ細胞用培養液とフィーダー細胞を用いて、安定的に増殖および継代可能となったラットＥＳ細胞（樹立ラットＥＳ細胞）の細胞群を示す写真である。図中矢印はラットＥＳ細胞塊を示す。
図１１は、樹立したラットＥＳ細胞の形態を示した写真である。ａ）は１００倍、ｂ）は２００倍、ｃ）は４００倍の写真である。
図１２は、樹立したラットＥＳ細胞が未分化マーカー遺伝子を発現していることを示すＲＴ−ＰＣＲの写真である。ＥＳ細胞の代表的な未分化マーカー遺伝子であるＯｃｔ  ３／４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子の発現の有無を調べた。コントロールとしてβアクチンの遺伝子発現も分析した。
図１３は、樹立したラットＥＳ細胞が未分化能を有していることを証明する代表的な指標の一つであるアルカリホスファターゼ活性を示す写真である。
図１４は、樹立したラットＥＳ細胞の胚様体形成能を分析した結果を示す写真である。約２０日目に心筋様に鼓動（矢印）する胚様体が多数確認された。
図１５は、樹立した細胞がＥＳ細胞であることを示す指標マーカー抗体４種類（（Ａ）：ＳＳＥＡ−１、（Ｂ）：ＳＳＥＡ−４、（Ｃ）：ＴＲＡ−１−６０、（Ｄ）：ＴＲＡ−１−８１）を用いて免疫染色を行った結果を示す写真である。
図１６は、樹立したラットＥＳ細胞をＧバンド法にて染色体数を解析した写真である。正常ラット細胞の染色体数（２ｎ＝４２）を示している。
図１７は、樹立したラットＥＳ細胞の継代回数と未分化維持能力（アルカリホスファターゼ活性）の関係を示すグラフである。開始は継代回数５代目からで、以後、５代目毎にアルカリホスファターゼ活性染色を行った。縦軸は陽性ＥＳ細胞コロニー数を全ＥＳ細胞コロニー数で割った値を百分率にして示しており、横軸は継代回数を示している。
図１８は、樹立したラットＥＳ細胞がインビトロ系において多分化能を有していることを示す写真である。胚様体形成開始７日後に、ゼラチンコート培養皿に胚様体を移し、自発的分化誘導を行った。（ａ）ラットＥＳ細胞由来神経様細胞の写真、（ｂ）図（ａ）の四角で囲った領域を拡大した写真、（ｃ）ラットＥＳ細胞由来脂肪様細胞の写真、（ｄ）ラットＥＳ細胞由来上皮様細胞の写真。
図１９は、樹立したラットＥＳ細胞に対する血清・ＬＩＦ添加の影響を調べた結果を示す写真である。図中「ラットＬＩＦ＋２０％ＦＢＳ」はラットＬＩＦ（ｒＬＩＦ）含有、２０％血清含有条件下で培養した結果を、「無血清」はＬＩＦ無添加、無血清（２０％ＫＳＲ含有）条件下で培養した結果を、「マウスＬＩＦ＋無血清」はマウスＬＩＦ（ｍＬＩＦ）含有、無血清（２０％ＫＳＲ含有）条件下で培養した結果を、また「ラットＬＩＦ＋無血清」はラットＬＩＦ（ｒＬＩＦ）含有、無血清（２０％ＫＳＲ含有）条件下で培養した結果を、それぞれ示す。
図２０は、各ラット（ＷＫＹ、ＷＨＧ及びＢＮ）からＥＳ細胞を樹立した結果を示す写真である。上図：各ラットの胚盤胞から形成させた内部細胞塊の写真。図中、矢印は形成させた内部細胞塊を示している。下図：継代５代目の樹立ＥＳ細胞の写真。図中、ＷＫＹｒＥＳはＷＫＹラットから樹立したＥＳ細胞を、ＷＨＧｒＥＳはＷＨＧラットから樹立したＥＳ細胞を、またＢＮｒＥＳはＢＮラットから樹立したＥＳ細胞を、それぞれ示す。
図２１は、樹立したラットＥＳ細胞（ＷＫＹラットＥＳ細胞）がＥＳ細胞マーカー遺伝子を発現していることを示すＲＴ−ＰＣＲの写真である。ＥＳ細胞の代表的なマーカー遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｒｅｘ−１、ＮａｎｏｇおよびＥＲａｓの各因子の遺伝子発現を解析した。コントロールとしてβアクチン遺伝子の発現も解析した。レーン１：未分化ラットＥＳ細胞、レーン２：マウス繊維芽細胞、レーン３：鋳型ＤＮＡ無添加（コントロール）。各々からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
図２２は、樹立したラットＥＳ細胞（ＷＨＧラットＥＳ細胞）から形成させた胚様体が三胚葉系列の細胞へ分化していることを示すＲＴ−ＰＣＲの写真である。図中、左側は各マーカー遺伝子の名称を示しており、ＴＵＪ１はｂｅｔａ３−ｔｕｂｌｉｎを、ＭＳＩ−１はｍｕｓａｓｈｉ−１を、ＧＦＡＰはｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｌｐｈａを、ＣＣＣはｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎを、ＡＮＦはａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒを、ＡＬＢはａｌｂｕｍｉｎを、ＴＤＯはｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅを、ＴＡＴはｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを、Ｇ６Ｐはｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐａｔａｓｅを、そしてＡＣＴはβアクチンを、それぞれ示す。レーン１：未分化ラットＥＳ細胞、レーン２：ラットＥＳ細胞由来胚様体、レーン３：コントロール（鋳型ＤＮＡ無添加）、レーン４：ＷＨＧ個体由来の各臓器（脳、心臓、肝臓）。各々からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
図２３は、樹立したラットＥＳ細胞（ＷＨＧラットＥＳ細胞）のマウス皮下への移植によりテラトーマが形成されたこと、及びこのテラトーマが三胚葉構造を有することを示した写真である。ａ）：ＷＨＧラットＥＳ細胞を免疫不全マウス皮下に移稙し、テラトーマが形成されたマウスの写真。首元のコブがテラトーマである。ｂ）：摘出したテラトーマの写真。図中サイズバーは１ｃｍである。ｃ）：テラトーマを切片化し、ヘマトキシリン・エオジン染色した組織像。左上は腺構造、右上は血管内皮様構造、左下は腸管様構造、右下は骨細胞様構造を、それぞれ示す。
図２４は、樹立した遺伝子導入ラットＥＳ細胞（ｐＣＡＧ−ＥＧＦＰ／ＷＨＧｒＥＳ細胞）を用いて作製したキメララットにおいて、殆どの組織でＥＧＦＰが発現していることを示したゲノムＰＣＲの写真である。上図はｐＣＡＧ−ＥＧＦＰ／ＷＨＧｒＥＳ細胞を用いて作製したキメララットの結果を示し、下図は野生型ラットの結果を示す。レーン１：脳、レーン２：胸腺、レーン３：心臓、レーン４：食道、レーン５：肺、レーン６：胃、レーン７：膵臓、レーン８：小腸、レーン９：大腸、レーン１０：肝臓、レーン１１：脾臓、レーン１２：腎臓、レーン１３：精巣、レーン１４：血管、レーン１５：筋肉。各々の組織から染色体ＤＮＡを抽出し、ゲノムＰＣＲを行った。
図２５は、ＧＦＰキメララットの各組織（腎臓、骨格筋および胃）を切片化し、ＧＦＰ抗体を用いて免疫染色を行った写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、従来の手法では得ることのできなかったラットＥＳ細胞を初めて提供するものである。
本発明のラットＥＳ細胞は、実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下において、以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程：
（Ａ）ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、
（Ｂ）解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代ＥＳ細胞を、継代可能となるまで培養する工程、
（Ｃ）継代可能となった初代ＥＳ細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代・培養する工程、
（Ｄ）さらに継代・培養を行うことによりＥＳ細胞を樹立する工程、
を含むプロセスを行うことにより、樹立、製造することができる。
本発明のラットＥＳ細胞の樹立方法の特徴は、（１）胚盤胞、内部細胞塊およびＥＳ細胞の培養全般において実質的に血清を含有しない培養液を用いる点と、（２）内部細胞塊やＥＳ細胞の解離（剥離）を行うステップにおいて、細胞を単一化することなく、ある程度の細胞集塊を保持した状態で解離（剥離）を行う点である。
以下、本発明のラットＥＳ細胞の樹立方法、樹立ラットＥＳ細胞の性質分析法、ならびにラットＥＳ細胞の継代培養方法等につき説明する。
１．ラット
本発明のラットＥＳ細胞の由来となるラットは、前記本発明の樹立方法の特徴に基づきＥＳ細胞を樹立できるものであれば、如何なる系統のラットであっても良い。例えばＷｉｓｔａｒ  Ｋｙｏｔｏ株（ＷＫＹ）、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ株（ＢＮ）、Ｇｏｔｏ−Ｋａｋｉｚａｋｉ株（ＧＫ）、ＳＤ株、Ｆ３４４／Ｄｕ株（Ｆｉｓｃｈｅｒ）、Ｗｉｓｔｅｒ株，Ｗｉｓｔｅｒ  Ｈａｎｎｏｖｅｒ株、ＡＣＩ株などの系統のラットから選択される。
２．フィーダー細胞
本発明のラットＥＳ細胞の樹立および樹立後の培養においてはフィーダー細胞を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては当業者に入手可能な如何なる種由来のフィーダー細胞であっても良いが、ライン化されたフィーダー細胞よりも正常繊維芽細胞を用いることが好ましい。具体的にはマウス胎児の正常繊維芽細胞が挙げられる。より具体的には、妊娠１２日〜１６日目のマウス胎児繊維芽細胞の初代培養細胞（正常繊維芽細胞）が挙げられ、当該正常繊維芽細胞としては、例えばマウスＩＣＲの胎児１２．５日目の正常繊維芽細胞が例示される。当該フィーダー細胞は常法により調製することもできれば、市販品（マウス繊維芽細胞、旭テクノグラス株式会社等）を利用することもできる。当該フィーダー細胞は、マイトマイシンＣ等で処理して不活性化して用いることが好ましい。
３．培養液
本発明のラットＥＳ細胞の製造（樹立・培養）においては、実質的に血清を含有しない培養液を用いる。ここで「実質的に血清を含有しない」とは、血清の影響によりラットＥＳ細胞がＥＳ細胞としての性質を示さなくなる（例えばアルカリホスファターゼ活性が陰性となる）程の血清を含有しないことを意味し、具体的には血清濃度が１０％以下であること、好ましくは５％以下であること、より好ましくは２％以下であることを意味する。さらに好ましくは血清を含有しない無血清培地を用いる。この場合、血清の代わりとなる試薬を添加する必要があり、具体的には、血清代替試薬（ＫＳＲ：ギブコＢＲＬ）などが用いられる。当該血清代替試薬は２０％程度の濃度で用いることが好ましい。
またラット由来白血病阻害因子（ｒＬＩＦ）に関しては、胚盤胞から内部細胞塊を形成・分離するまでの段階では、ラットＬＩＦ（ｒＬＩＦ）を含有しない培養液を用いることが好ましい。一方、内部細胞塊形成以降の段階（樹立したラットＥＳ細胞の培養、継代も含む）においては、ｒＬＩＦを含有する培養液を用いることが好ましい。濃度としては培養液１ｍｌあたりｒＬＩＦを１００単位以上添加することが好ましく、１０００単位程度、若しくはそれ以上添加することがより好ましい。当該ｒＬＩＦは市販品（ケミコン社）を利用することができる。
培養液中のその他の成分に関しては、ＥＳ細胞の培養に通常用いられる成分を、当業者の常識の範囲で組み合わせ培養液中に適宜含有させる。
以下に、培養液の具体的組成を例示する。
１）ラットＥＳ細胞樹立用培養液
胚盤胞から内部細胞塊を形成するまでの段階で使用する培養液を、「ラットＥＳ細胞樹立用培養液」と称する。
（組成の具体例）
ダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（旭テクノグラス、東京、日本）３８０ｍｌ
０．２Ｍ  Ｌ−グルタミン  ５ｍｌ
血清代替試薬（ＫＳＲ：ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）１００ｍｌ
非必須アミノ酸（ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）５ｍｌ
抗生物質−抗菌物質溶液（ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）５ｍｌ
１００ｍＭ  Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ５ｍｌ
０．１Ｍ  βメルカプトエタノール  ０．５ｍｌ
２）ラットＥＳ細胞用培養液
内部細胞塊形成以降の培養（樹立ラットＥＳ細胞の培養も含む）において使用する培養液を、「ラットＥＳ細胞用培養液」と称する。
（組成の具体例）
ダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（旭テクノグラス、東京、日本）３７５ｍｌ
０．２Ｍ  Ｌ−グルタミン  ５ｍｌ
血清代替試薬（ＫＳＲ：ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）１００ｍｌ
非必須アミノ酸（ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）５ｍｌ
１００倍ヌクレオシド保存液  ５ｍｌ
（アデノシン  ４ｍｇ、グアノシン  ４．２５ｍｇ、シチジン  ３．６５ｍｇ、ウリジン  ３．６５ｍｇ、チミジン  １．２ｍｇ）
抗生物質−抗菌物質溶液（ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）５ｍｌ
１００ｍＭ  Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ５ｍｌ
０．１Ｍ  βメルカプトエタノール  ０．５ｍｌ
１０００Ｕ  ラット由来白血病阻害因子（ｒＬＩＦ）
このうちラット由来白血病阻害因子（ｒＬＩＦ）は、要時に添加して混合するのが好ましい。
４．培養条件
本発明のラットＥＳ細胞の製造（樹立・培養）における細胞の培養温度は、３５℃〜３７．５℃の範囲内であれば良く、好ましくは３７℃である。培養は、通常の培養に用いられる５％ＣＯ２培養装置中で行われる。
５．ラットＥＳ細胞の樹立方法
以下本発明のラットＥＳ細胞の樹立方法につき具体例を示す。
１）卵（胚盤胞期胚）の採取
卵採取用のラットとしては、前記したＷｉｓｔａｒ  Ｋｙｏｔｏ株（ＷＫＹ）、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ株（ＢＮ）、Ｇｏｔｏ−Ｋａｋｉｚａｋｉ株（ＧＫ）、ＳＤ株、Ｆ３４４／Ｄｕ株（Ｆｉｓｃｈｅｒ）、Ｗｉｓｔｅｒ株、Ｗｉｓｔｅｒ  Ｈａｎｎｏｖｅｒ株、ＡＣＩ株といった系統のラットから選択される。週齢は８週齢〜４０週齢の範囲内であれば使用可能であるが、好ましくは１０週齢〜２０週齢のラットが用いられ、より好ましくは１０週齢〜１２週齢のラットが用いられる。
卵の採取は当業者に知られた常法により行えば良い。具体的にはラットを自然交配させ、膣栓確認３日目頃に採卵用メスラットをと殺し子宮を摘出する。この子宮を適当な培地で灌流することにより、受精卵（胚）を回収する。ここで灌流に用いる培養液としては、例えばｍｗ培地（ＮａＣｌ  ６４０．０ｍｇ／１００ｍｌ，ＫＣｌ  ３５．６ｍｇ／１００ｍｌ，ＫＨ２ＰＯ４  １６．２ｍｇ／１００ｍｌ，ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ２９．４ｍｇ／１００ｍｌ，ＮａＨＣＯ３  １９０．０ｍｇ／１００ｍｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ  １００．０ｍｇ／１００ｍｌ，Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ２．５ｍｇ／１００ｍｌ，Ｃａ−ｌａｃｔａｔｅ  ４６．０ｍｇ／１００ｍｌ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ５．０ｍｇ／１００ｍｌ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ７．５ｍｇ／１００ｍｌ，０．５％  ｐｈｅｎｒｏｌ  ｒｅｄ  ０．２ｍｌ，２０ｍＭ  ｂｅｔａ−ＭＥ  １０μｌ，１００ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ  １０μｌ，ＢＳＡ  ３００．０ｍｇ／１００ｍｌ）やＭ２培地（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ−２Ｈ２０  ０．２５１ｇ／Ｌ，Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．１４３ｇ／Ｌ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ０．３５６ｇ／Ｌ，Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ０．１６２ｇ／Ｌ，Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ５．５３２ｇ／Ｌ，Ａｌｂｕｍｉｎ  ４．０ｇ／Ｌ，Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  １．０ｇ／Ｌ，ＨＥＰＥＳ  ４．９６９ｇ／Ｌ，Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ−Ｎａ  ０．０１ｇ／Ｌ，Ｐｙｒｕｖｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｎａ  ０．０３６ｇ／Ｌ，Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ０．３５ｇ／Ｌ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ  ０．０６ｇ／Ｌ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．０５ｇ／Ｌ，ＤＬ−Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ４．３４９ｇ／Ｌ）などが挙げられる。
回収された胚は、ｍｗ培地、Ｍ２、Ｍ１６等の培養液中で培養を行う。
培養により受精卵（胚）から桑実胚を経て胚盤胞（胚盤胞期胚）まで発生を進める。この段階まで発生を進めるためには通常、３７℃、５％ＣＯ２培養装置内にて一晩培養を行う。胚盤胞まで発生が進んだことは、顕微鏡で観察することにより確認することができる。好ましくは、胚盤胞後期段階まで発生を進める。
２）内部細胞塊の形成・分離
前記１）で得られた胚盤胞を顕微鏡下にて確認した後、透明帯を除去する。透明帯の除去は、酸性タイロイド（ｐＨ２．５）、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ等を用いて行う。その後、マイトマイシンＣ処理を施したフィーダー細胞をゼラチンコート培養皿に播種し、透明帯を除去したラット胚盤胞を５〜１０個ずつ移し、ラットＥＳ細胞樹立用培養液にて培養を開始する。
培養から１〜４日目にフィーダー細胞上に透明帯を除去したラット胚盤胞（後期段階）が接着する。接着後５〜１０日目に胚盤胞から出現した内部細胞塊を２００μｌのピペットなどを用いて物理的に分離する。この分離した内部細胞塊をラットＥＳ細胞樹立用培養液を含有する滅菌チューブ等に移し、５個〜２０個程度の細胞からなる細胞集塊になるまで解離する。その際、トリプシン・ＥＤＴＡなどの蛋自分解酵素を用いた解離は行わず、ピペット等を用いて物理的に内部細胞塊を解離する。また細胞が単一化されるまで解離を行うことは避け、前記のように５個〜２０個程度の細胞からなる細胞集塊を保持する程度に解離を行う。ここで細胞集塊を保持した状態であることは顕微鏡下で確認することができる。
３）ＥＳ細胞の樹立
フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿において、前記２）で解離した内部細胞塊をラットＥＳ細胞用培養液で培養する。通常、培養から２〜４日目に初代ＥＳ細胞コロニーが出現する。初代ＥＳ細胞コロニーの出現は顕微鏡下で観察することにより確認することができる（出現したＥＳ細胞を「初代ＥＳ細胞」と称する）。その後５〜１０日程度培養を続行することにより、初代ＥＳ細胞コロニーが継代可能な状態となる。ここで「継代可能な状態」とは、形成された初代ＥＳ細胞コロニーを構成している細胞数が２００〜６００個前後に達し、かつ各細胞間が緊密になった状態を指す。このような形態となったことを顕微鏡下にて確認しながら、２００μｌのピペット等を用いて当該ＥＳ細胞コロニーを分離する。この分離したＥＳ細胞コロニーをラットＥＳ細胞用培養液を含有する滅菌チューブ等に移し、５個〜２０個程度の細胞からなる細胞集塊になるまで解離する。この段階においても細胞が単一化されるまで解離を行うことは避け、前記のように細胞集塊を保持する程度に解離を行う。またこの段階においても、トリプシン・ＥＤＴＡ等の蛋白分解酵素を用いた細胞解離は行わず、物理的に解離することが望ましい。解離したＥＳ細胞コロニーは、フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿においてラットＥＳ細胞用培養液で初代培養を行う（継代１代目の細胞）。培養から２〜４日程度でＥＳ細胞コロニーが出現し、５〜１０日程度で継代可能な状態となる。
以降の細胞継代は、細胞が単一化されない状態、すなわち５個〜２０個程度の細胞からなる細胞集塊を維持した状態を保てば、当業者の常識の範囲内で継代を行うことができるが、トリプシン・ＥＤＴＡ等の蛋白分解酵素による処理は最低限にとどめ、物理的手段により細胞解離を行うことが望ましい。以下に具体例を示す。
前記において継代可能となったＥＳ細胞コロニーから培養液を除去し、室温に戻したＰＢＳ（−）にて洗浄し、予め３７℃に保温した２．５％トリプシンを全面に塗り広げる。トリプシンの量としては６０ｍｍディッシュあたり５００μｌ程度、若しくはそれ以下であることが好ましい。トリプシンを全面に塗り広げた後は、ただちに溶液を除去する。顕微鏡下にて全体の７割以上のＥＳ細胞コロニーがフィーダー細胞から剥離してくる状態を確認し、ただちにトリプシン処理を停止させる。ここでトリプシン処理を停止させるためには、例えば１０％ウシ胎仔血清を含む培養液を添加することが容易であるが、大量の無血清培養液等を加えてトリプシンの濃度を希釈することにより停止させても良い。その後、５ｍｌピペット等を用いて更に物理的にＥＳ細胞コロニーを剥離させ、細胞懸濁溶液を遠心（室温で１０００ｒｐｍ、３分程度）にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収する。ラットＥＳ細胞用培養液で細胞を懸濁し、完全に単一化するのでは無く、顕微鏡下にて５〜２０個の細胞塊を形成している状態を確認し、フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿に移し培養を行う（継代２代目の細胞）。
その後は、約５〜１０日毎に継代可能な状態となるため、前記継代１代目の細胞の継代（継代２代目の細胞への継代）と同様の継代方法により継代・培養を続行することができる。
細胞集塊の数や細胞集塊を構成する細胞数が安定化した段階をもって、ＥＳ細胞が樹立されたと判断する。具体的には、継代３代目以降、望ましくは継代５代目以降の細胞を、樹立したラットＥＳ細胞と判断することができる。樹立ラットＥＳ細胞を商品として供給する場合は、１系統における安定した供給量を保持するために、継代３代目以降、好ましくは継代５代目以降、より好ましくは継代１０代目以降の細胞を商品化の対象とする。
６．本発明のラットＥＳ細胞
本発明のラットＥＳ細胞は、以下の（ａ）〜（ｊ）の性質：
（ａ）Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子を発現する、
（ｂ）アルカリホスファターゼ活性陽性である、
（ｃ）胚様体形成能を有する、
（ｄ）ＳＳＥＡ（胎児ステージ特異的抗原）−１およびＳＳＥＡ−４を発現する、
（ｅ）正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、
（ｆ）未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、
（ｇ）インビトロで多分化能を有する、
（ｈ）三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、
（ｉ）奇形腫形成能を有する、
（ｊ）キメララット作製能を有する、
を含有することを特徴とする。
本発明は、前記（ａ）〜（ｊ）に示したＥＳ細胞としての性質を全て保持したラットＥＳ細胞をはじめて提供するものである。樹立したラットＥＳ細胞がＥＳ細胞としての性質を保持していること、すなわち未分化状態（全能性）を維持したＥＳ細胞としての性質を保持していることは、以下の手法により解析することができる。
１）未分化マーカーの発現
ＥＳ細胞であることを特徴づける決定的な因子として、Ｏｃｔ３／４（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６０：４６１−４７２（１９９０）、Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２１８５−２１９５（１９９０））およびＮａｎｏｇ（Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３：６３１−６４２（２００３）、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３：６４３−６５５（２００３））が知られている。これらの遺伝子の発現は、ラット  Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行うことにより確認することができる。ここで用いられるラットＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ特異的なプライマーとしては、実施例に記載のプライマー（Ｏｃｔ  ３／４：５’−ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：３）、５’−ＴＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＣ−３’（配列番号：４）、Ｎａｎｏｇ：５’−ＴＡＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＧＣＡ−３’（配列番号：５）、５’−ＴＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴＡＡ−３’（配列番号：６））を例示することができる。
２）アルカリホスファターゼ活性
未分化ＥＳ細胞ではアルカリホスファターゼが大量に発現している。当該アルカリホスファターゼの発現は、市販の種々のアルカリホスファターゼ検出キットを用いることにより容易に測定することができる。当該検出キットとしては、例えばＡＬＰ組織染色キット（Ｓｉｇｍａ社）やベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットＩ（フナコシ）などが挙げられる。
３）胚様体形成能
ＥＳ細胞をフィーダー細胞やＬＩＦの存在しない条件下で非コート培養皿を用いて培養することにより、胚様体が形成されることが知られている（Ｒｏｙ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：３９４７−３９５５（１９９８））。胚様体の形成は、ラットＥＳ細胞を非コート培養皿にてＬＩＦを除いたラットＥＳ細胞用培養液を用いて７日間〜１４日間程度培養し、顕微鏡下で細胞が凝集して形成される球状体の出現を観察することにより確認することができる。
４）細胞表面抗原の発現
ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞の分化を同定する指標の一つとして、分化段階特異的に発現量が変化する細胞表面抗原の検出が挙げられる。本発明のラットＥＳ細胞はＳＳＥＡ（胎児ステージ特異的抗原）−１およびＳＳＥＡ−４を発現している。当該細胞表面マーカーの発現は、ＥＳ細胞キャラクタライゼイションキット（フナコシ）を用いた免疫染色により、評価することができる。
５）染色体数
樹立されたラットＥＳ細胞が起源となるラットの染色体数（２ｎ＝４２）を保持した正常ＥＳ細胞であることは、Ｇ−バンド法（Ｓｕｍｎｅｒ  Ａ．Ｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．６：５９−８７（１９８２））によって染色体数を分析することにより確認することができる。
６）未分化状態の維持
樹立されたＥＳ細胞は、未分化状態を維持したまま継代培養を行うことができる。本発明で樹立したラットＥＳ細胞は、少なくとも３５継代目まで継代培養を行うことができるという優れた特徴を有する。未分化状態の維持は、本発明のラットＥＳ細胞の継代培養方法（後述の７．）により継代培養を行い、前記アルカリホスファターゼ活性等を測定することにより確認することができる。
７）多分化能
ＥＳ細胞をフィーダー細胞やＬＩＦの存在しない条件下で培養することにより、胚様体を経て種々の細胞へと自発的に分化する。このＥＳ細胞の性質は、まず前記３）に記載の方法により胚様体を形成させ、その後ゼラチンコート培養皿に胚様体を移し、７日間〜１４日間程度培養を行うことにより観察することができる。各細胞の特徴的な形態から、神経様細胞、脂肪様細胞、または上皮系細胞などの出現を確認することができる。
８）三胚葉系列の細胞への分化能
ＥＳ細胞は三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）系列の細胞へ分化する能力を有する。このＥＳ細胞の性質は、前記３）に記載の方法で形成させた胚様体（心筋様細胞の出現した胚様体）からＲＮＡを抽出し、外胚葉系列の細胞（例えば神経細胞）、中胚葉系列の細胞（例えば心筋細胞）、内胚葉系列の細胞（例えば肝細胞）の各マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで解析することにより確認することができる。
ここで神経細胞マーカーとしてはＮｅｓｔｉｎ、ＴＵＪ１（ｂｅｔａ３−ｔｕｂｌｉｎ）、ＭＳＩ−１（ｍｕｓａｓｈｉ−１）、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｌｐｈａ）などが挙げられる。また心筋細胞マーカーとしてはＣＣＣ（ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＡＮＦ（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ＫｖＬＱＴ１などが挙げられる。また肝細胞マーカーとしてはＡＬＢ（ａｌｂｕｍｉｎ）、ＴＤＯ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、ＴＡＴ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、Ｇ６Ｐ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ）などが挙げられる。
９）奇形腫（テラトーマ）形成能
ＥＳ細胞を同種若しくは先天的に免疫不全である異種動物に移植することにより、奇形腫（テラトーマ）を形成させることができる。ここでテラトーマとは、内胚葉、中胚葉、外胚葉の三胚葉から出来る諸組織を雑然と一腫瘍中に存する混合腫瘍の称である。当該テラトーマの形成は、同種または先天的に免疫不全である異種動物の皮下等にラットＥＳ細胞を移植し、数ヶ月後にコブ状の物体の存在を肉眼で観察することにより確認することができる。形成されたテラトーマが三胚葉構造を有していることは、摘出したテラトーマを切片化し、ヘマトキシリン・エオジンで染色し、顕微鏡下で組織や細胞の形態を観察することにより、確認することができる。
１０）キメララット作製能
ＥＳ細胞を同種または異種ラットに導入することによりキメララットを産生することができる。キメララットの作製は、例えば以下の手法により行うことができる。
キメララットが作製されたことを容易に確認するために、あらかじめマーカー遺伝子（例えばＧＦＰ、βｇａｌ、ルシフェラーゼ等）を本発明のラットＥＳ細胞に導入しておくと良い。具体的にはこのようなマーカー遺伝子を含むベクターをエレクトロポレーション法等によってラットＥＳ細胞の染色体上に組込み、培養液中に薬剤を添加してセレクションすることにより、ＥＳ細胞染色体に前記ベクターが組み込まれた組換えラットＥＳ細胞を樹立する。この組換えラットＥＳ細胞を、例えば、顕微操作でラット胚盤胞の胚盤腔内や桑実胚期または１６細胞期に移植して内部細胞塊と一緒にまた内部細胞塊の一部として発生させるか（マイクロインジェクション法：Ｇｏｒｄｏｎ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ．，７７：７３８０−７３８４（１９８０））、若しくは２個の８細胞期胚の透明帯を取り除き前記組換えラットＥＳ細胞と共培養して凝集塊を作らせる。この凝集塊を培養すると１個の胚盤胞となる（細胞凝集法：Ｄｖｏｒａｋ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３９：６４５−６５２（１９９５））。以上のようにして得られた胚（移植用卵）を、精管結紮処置を施した雄ラットと自然交配を行い準備した偽妊娠させた雌ラットの子宮内に移植し発生させることにより、キメララットを産出させることができる。
得られたキメララットがＥＳ細胞に由来する細胞・組織を有していること、すなわち樹立したラットＥＳ細胞がキメララット作製能を有していることは、当業者に知られた一般的な手法により確認することができる。例えばキメララットの種々の組織から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用い、マーカー遺伝子（ＥＳ細胞に導入したマーカー遺伝子）特異的プライマーを用いたゲノムＰＣＲを行うことにより、確認することができる。さらに、ＥＳ細胞が各組織系列の細胞へ分化していることは、例えばキメララットの各組織を切片化し、マーカー遺伝子発現産物（マーカータンパク）の存在を、用いたマーカータンパクの性質に基づき検出することにより、確認することができる。
１１）血清存在下での培養による分化
さらに本発明のラットＥＳ細胞は、２０％血清存在下での培養により分化するという性質を有する。好ましくは、本発明のラットＥＳ細胞は、１０％血清存在下での培養により分化するものであり、さらに好ましくは５％血清存在下での培養により分化するものである。ラットＥＳ細胞の分化は、アルカリホスファターゼ活性の消失や、Ｏｃｔ３／４やＮａｎｏｇ等のＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現消失により、確認することができる。
７．ラットＥＳ細胞の継代培養方法
本発明のラットＥＳ細胞は、未分化状態を維持した状態で継代培養を行うことができる。本発明のラットＥＳ細胞の継代は、細胞が単一化されない状態、すなわち５個〜２０個程度の細胞からなる細胞集塊を維持した状態を保てば、当業者の常識の範囲内で継代を行うことができるが、トリプシン・ＥＤＴＡ等の蛋自分解酵素による処理は最低限にとどめ、物理的手段により細胞解離を行うことが望ましい。以下に具体例を示す。
樹立されたラットＥＳ細胞が継代可能な状態となった段階で、培養液を除去し、室温に戻したＰＢＳ（−）にて洗浄し、予め３７℃に保温した２．５％トリプシンを全面に塗り広げる。トリプシンの量としては６０ｍｍディッシュあたり５００μｌ程度、若しくはそれ以下であることが好ましい。トリプシンを全面に塗り広げた後は、ただちに溶液を除去する。顕微鏡下にて全体の７割以上のＥＳ細胞コロニーがフィーダー細胞から剥離してくる状態を確認し、ただちにトリプシン処理を停止させる。ここでトリプシン処理を停止させるためには、例えば１０％ウシ胎仔血清を含む培養液を添加することが容易であるが、大量の無血清培地等を添加してトリプシン濃度を希釈することにより停止させても良い。その後、５ｍｌピペット等を用いて更に物理的にＥＳ細胞コロニーを剥離させ、細胞懸濁溶液を遠心（室温で１０００ｒｐｍ、３分程度）にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収する。培養液で細胞を懸濁し、完全に単一化するのでは無く、顕微鏡下にて５〜２０個の細胞塊を形成している状態を確認し、フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿に移し培養を行う。その後も同様に、約５〜１０日毎に継代可能な状態となるため、同様の継代培養を行う。
継代細胞の培養には、実質的に血清を含有しない培養液を用いる。ここで「実質的に血清を含有しない」とは、血清の影響によりラットＥＳ細胞がＥＳ細胞としての性質を示さなくなる（例えばアルカリホスファターゼ活性が陰性となる）程の血清を含有しないことを意味し、具体的には血清濃度が１０％以下であること、好ましくは５％以下であること、より好ましくは２％以下であることを意味する。さらに血清を含有しない無血清培地を用いることがより好ましい。この場合、血清の代わりとなる試薬を添加する必要があり、具体的には、血清代替試薬（ＫＳＲ：ギブコＢＲＬ）などを含有する培養液を用いる。当該血清代替試薬は２０％程度の濃度で使用することが好ましい。
また前記継代細胞の培養に用いる培養液は、ｒＬＩＦを含有していることが望ましい。ｒＬＩＦの濃度としては培養液１ｍｌあたりｒＬＩＦを１００単位以上添加することが好ましく、１０００単位程度、若しくはそれ以上添加することがより好ましい。
以上のように、本発明のラットＥＳ細胞の継代培養用の培養液は、血清代替試薬およびｒＬＩＦを含有することが好ましく、前記３．−２）に記載のラットＥＳ細胞用培養液が有効に用いられる。
８．ラットＥＳ細胞培養キット
本発明は、本発明のラットＥＳ細胞を培養するための培養キットを提供する。具体的には、血清代替試薬（ＫＳＲ）およびｒＬＩＦを成分として含有する、ラットＥＳ細胞培養キットを提供する。血清代替試薬およびｒＬＩＦは、混合して１つの容器中に封入されていても良いが、それぞれ別々の容器に封入されていることが好ましい。ここでＫＳＲとしてはギブコＢＲＬ社製のものを用いることができ、またｒＬＩＦとしてはケミコン社製のものを用いることができる。
前記キットは、さらに、本発明のラットＥＳ細胞を成分として含有することができる。本発明のラットＥＳ細胞を商品として供給する場合は、継代３代目以降、好ましくは継代５代目以降、より好ましくは継代１０代目以降の細胞を商品化の対象とする。当該ラットＥＳ細胞は、それ単独で商品化されても良いが、前記のように本発明の培養キットの１成分として商品化されても良い。
前記キットは、さらにフィーダー細胞を成分として含有することができる。フィーダー細胞としては当業者に入手可能な如何なる種由来のフィーダー細胞であっても良いが、ライン化されたフィーダー細胞よりも正常繊維芽細胞を用いることが好ましい。具体的には、妊娠１２日〜１６日目のマウス胎児の繊維芽細胞の初代培養細胞（正常繊維芽細胞）が挙げられ、当該正常繊維芽細胞としては、例えばマウスＩＣＲの胎児１２．５日目の正常繊維芽細胞が例示される。当該フィーダー細胞は常法により調製することもできれば、マウス胎児繊維芽細胞（旭テクノグラス株式会社）等を利用することもできる。
以上に述べたＥＳ細胞の製造方法（樹立方法、継代培養方法）、およびＥＳ細胞の培養液や培養キットは、ラットＥＳ細胞のみならず、他の動物種にも適用可能である（ただしマウスは除く）。
マウスＥＳ細胞はコロニーがドーム状に盛り上がり、全体的に隣接する細胞同士の境界が不明瞭である。また光沢を有している。一方、霊長類ＥＳ細胞のコロニーは扁平状に広がり、マウスＥＳ細胞のような光沢は観察されない。さらに細胞同士の境界がマウスＥＳ細胞と比べて明瞭である。本発明において樹立されたラットＥＳ細胞は扁平状のコロニーを形成し、マウスＥＳ細胞のような強い光沢が観察されず、マウスよりも霊長類ＥＳ細胞に近い形態を示すことが明らかとなった。よって、本発明のＥＳ細胞の製造方法（樹立方法、継代培養方法）およびＥＳ細胞の培養液や培養キットは、霊長類のＥＳ細胞にも適用可能である。
９．ラットＥＳ細胞を分化誘導して得られた細胞
本発明は、本発明のラットＥＳ細胞の分化誘導方法、および分化誘導して得られた細胞を提供する。
マウスやヒトＥＳ細胞で知られているように、ＥＳ細胞をフィーダー細胞やＬＩＦの存在しない条件下で培養することにより種々の細胞に分化誘導させることができる（Ｒｏｙ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：３９４７−３９５５（１９９８））。またレチノイン酸、細胞増殖因子、グルココルチコイド等の作用により種々の細胞に分化誘導させることができる（Ｋａｗａｍｏｒｉｔａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ．，１５：１７８−１８２（２００２））。さらに細胞外基質により分化誘導させることもできる。従って本発明のラットＥＳ細胞を前記のような条件下で培養することにより、同様に分化誘導することができる。ここでＥＳ細胞から分化誘導して得られる細胞としては、例えば神経細胞、血球系細胞、肝細胞、血管内皮細胞、または心筋細胞などが挙げられる。
これらＥＳ細胞から分化誘導して得られた細胞は、例えば移植治療の実験モデルにおける移植用細胞として有用である。また当該分化細胞は、核酸、タンパク質または発がん物質、環境変異原物質などに細胞を暴露した際の影響を調べるためにも有効に用いられる。具体的には前記物質の添加による細胞のｇｅｎｅｔｉｃあるいはｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃな変化、細胞のトランスフォーメーション、軟寒天培地中でのコロニー形成能、浸潤能を含むがん化の指標の変化、代謝機能の変化、生理機能の変化、生化学的変化などの生物学的指標に基づき細胞への影響を調べることができる。
１０．ラットＥＳ細胞由来の物質
本発明においてラットＥＳ細胞を樹立したことにより、ラットＥＳ細胞のみならず、それに由来する種々の物質（例えば樹立ラットＥＳ細胞由来のｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリー、あるいはラットＥＳ細胞の細胞抽出物など）を提供することが可能となった。本発明のＥＳ細胞由来の種々の物質は、再生医療における研究や発生学における分子レベルでの発現解析の研究、動物個体に代わる創薬研究や安全性評価試験などにおいて有効に用いることができる。
ここでｃＤＮＡライブラリーは、本発明のラットＥＳ細胞より抽出したＲＮＡを鋳型として用い、市販のｃＤＮＡライブラリー作製キット（例えばクローンマイナーｃＤＮＡライブラリー作製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）やＣｒｅａｔｏｒ  ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡライブラリー作製キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等）などを用いて作製することができる。またゲノムライブラリーはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ等の基本書を参考にして常法により作製することができる。またＥＳ細胞由来の細胞抽出物は、常法により細胞を破砕し、プロテアーゼ阻害剤の存在下にて遠心分離することなどにより調製することができる。
１１．組織または細胞の分化誘導剤のスクリーニング方法
本発明は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）被験物質を本発明のラットＥＳ細胞に接触させる工程、
（ｉｉ）ラットＥＳ細胞の分化の有無や程度を評価する工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する工程、
を含む、組織または細胞の分化誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
前記工程（ｉ）においてスクリーングに供される被験物質は、制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、前記スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料（被験試料）をラットＥＳ細胞に接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、細胞抽出液、遺伝子（ゲノム、ｃＤＮＡ）ライブラリー、ＲＮＡｉライブラリー、アンチセンス核酸、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。これら被験試料又は被験物質は、ラットＥＳ細胞への取り込み可能な形態で接触させる。例えば被験試料が核酸の場合は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランや遺伝子導入用リピッドを用いてＥＳ細胞に導入する。
ラットＥＳ細胞と被験物質とを接触させる条件は、該細胞が死滅せず且つ被験物質が取り込まれるのに適した培養条件（温度、ｐＨ、培養液の組成など）であれば特に制限はない。好ましくは分化誘導に適した条件、すなわちフィーダー細胞やＬＩＦの存在しない条件下で培養されたラットＥＳ細胞に対して前記被験物質を添加する。
続く工程（ｉｉ）においてはラットＥＳ細胞の分化の有無や程度を評価し、（ｉｉｉ）においては当該評価結果に基づき被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する。ラットＥＳ細胞から所望の組織または細胞への分化は、例えば、所望の組織または細胞で発現するマーカーを指標として評価することができる。所望の組織又は細胞のマーカーとては、組織または細胞特異的抗原が挙げられる。当該マーカーとして具体的には、例えば神経系細胞のマーカーとしてニューロン特異的エノラーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、ネスチン等が挙げられ、軟骨のマーカーとしてＳ−１００タンパク質、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ等が挙げられる。また筋肉のマーカーとしてデスミン、筋特異的アクチン等が挙げられる。このような組織・細胞特異的マーカーは、該マーカーに対する抗体を用い、ＥＬＩＳＡや免疫染色などにより検出することができる。またこれらのマーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ等の手法により検出することもできる。
１２．組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーニング方法
本発明は、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程：
（Ｉ）被験物質を本発明のラットＥＳ細胞に接触させる工程、
（ＩＩ）ＥＳ細胞の分化誘導条件下で前記（Ｉ）のラットＥＳ細胞を培養し、分化の有無や程度を評価する工程、
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に作用する物質であるか否かを判断する工程、
を含む、組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーニング方法を提供する。
ＥＳ細胞は、前記のようにフィーダー細胞やＬＩＦの存在しない条件下で培養することにより種々の細胞に分化誘導させることができる（Ｒｏｙ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：３９４７−３９５５（１９９８））。またレチノイン酸、増殖因子、グルココルチコイド等の作用により種々の細胞に分化誘導させることもできる（Ｋａｗａｍｏｒｉｔａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ．，１５：１７８−１８２（２００２））。さらに細胞外基質により分化誘導させることもできる。この培養系に被験化合物（例えば抗癌剤等の医薬品や環境変異物質など）を加えて培養することにより、被験物質が正常な分化にどのような影響を及ぼすかを評価することができる。当該スクリーニングは、例えば開発中の医薬品の副作用研究などに応用することができる。
工程（Ｉ）においてスクリーニングに供される被験物質としては、前記１１．と同様の物質が挙げられる。被験物質とラットＥＳ細胞との接触については、被験物質を本発明のラットＥＳ細胞に接触させた後にＥＳ細胞の分化誘導条件下で培養しても良く、またラットＥＳ細胞を分化誘導条件下で培養開始し、その後被験物質を接触させても良い。
分化誘導条件下での培養とは、前記したようなフィーダー細胞やＬＩＦの存在しない培養条件下や、レチノイン酸、増殖因子、グルココルチコイドまたは細胞外基質等を培養液中に添加した培養条件などが挙げられる。分化誘導条件下での培養過程若しくは培養後に、被験物質がラットＥＳ細胞の分化に及ぼす影響を評価する。当該評価は、被験物質を作用させない対象細胞における分化の程度との比較に基づき行われることが望ましい。具体的には、例えば肝細胞分化誘導因子（特願２００４−５９７０５）を培養液に添加することにより機能を有した成熟肝細胞へと分化誘導を行い、肝細胞特異的発現遺伝子（アルブミンやトリプトファン２，３ジオキシゲナーゼ等）などを指標として評価することができる。
１３．遺伝子改変ラット
本発明のラットＥＳ細胞は、遺伝子改変ラットの作製において使用することができる。
ラットはマウスに比べて約１０倍という実験上適当な大きさの哺乳動物であり、▲１▼細胞の血管に容易に薬物投与可能である、▲２▼外科・移植実験が可能である、▲３▼組織を大量に採取可能である、といった利点を有する。従来から多くのヒト疾患モデルラットが開発・発見されてきたが、ラットＥＳ細胞が樹立されていなかったがために、遺伝子改変ラット、特にノックアウトラットやノックインラットといったジーンターゲッティングを要する遺伝子改変ラットの作製は事実上不可能であった。本発明のラットＥＳ細胞は、そのような遺伝子改変ラットの作製を初めて可能とするものである。本発明のラットＥＳ細胞の提供により、当業者に周知の技術にて当該遺伝子改変ラットを作製することができる。
ここで「遺伝子改変ラット」とは、キメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットといった当業者に知られた全ての遺伝子改変ラットを意味する。
前記遺伝子改変ラットは、以下の（Ｘ）〜（Ｚ）の工程：
（Ｘ）本発明のラットＥＳ細胞に所望の遺伝子を導入する工程、
（Ｙ）遺伝子導入されたラットＥＳ細胞を含有する移植用卵を調製する工程、
（Ｚ）移植用卵を偽妊娠させたメスのラットに導入し、仔ラットを産出する工程、
を含むプロセスを行うことにより製造することができる。
ノックアウトラットとは人為的に標的とする遺伝子を破壊した変異ラットを意味し、遺伝子ターゲッティングラットとも呼ぶことができる。ノックアウトラットの作製は、例えばＤｏｎｅｈｏｗｅｒ  Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３５６：２１５−２２１（１９９２）等に記載のノックアウトマウスの作製法に準じて行うことができる。簡単に述べると、まず標的とする遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をもとに、相同組換えのためのベクター（ターゲッティングベクター）を構築する。この時組換えクローンの選別のために、マーカー遺伝子としてＧ４１８耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を組み込む。この構築したターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法等によってラットＥＳ細胞に導入する。得られた導入細胞の中から相同組換えを起こしたコロニーを選別する。このようにして得られた相同組換えラットＥＳ細胞を、例えば、顕微操作でラット胚盤胞の胚盤腔内や桑実胚期または１６細胞期に移植して内部細胞塊と一緒にまた内部細胞塊の一部として発生させるか（マイクロインジェクション法：Ｇｏｒｄｏｎ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７７：７３８０−７３８４（１９８０））、若しくは２個の８細胞期胚の透明帯を取り除き前記相同組換えラットＥＳ細胞と共培養して凝集塊を作らせる。この凝集塊を培養すると１個の胚盤胞となる（細胞凝集法：Ｄｖｏｒａｋ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３９：６４５−６５２（１９９５））。以上のようにして得られた胚（移植用卵）を、精管結紮処置を施した雄ラットと自然交配を行い準備した偽妊娠させた雌ラットの子宮内に移植し発生させることにより、キメララットを産出させる。当該キメララットを野生型ラットと交配させることにより、ヘテロノックアウトラットを産出させることができ、このヘテロノックアウトラット同士を交配させることによりホモノックアウトラットを産出させることができる。
前記ノックアウトラットの範疇には、コンディショナル・ノックアウトラットも含まれる。ここでコンディショナル・ノックアウトとは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムまたはＦＬＰ／ＦＲＴシステムを利用して、部位特異的・時期特異的に遺伝子をノックアウトするシステムである。具体的にはターゲッティングしたい遺伝子をｌｏｘＰ配列またはＦＲＴ配列で挟んだものに置き換えておき、ＣｒｅまたはＦＬＰタンパクの供給により前記ｌｏｘＰ配列またはＦＲＴ配列で挟んだ遺伝子を切り取るシステムである（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４８７−５０７（１９８１））。
ノックインラットとは、標的とする遺伝子の位置に、人為的に作製した相同性を有する外来性遺伝子を導入した変異ラットを意味する。標的遺伝子は破壊される場合もあれば破壊されない場合もある。例えば遺伝子の発現をモニターするためにｌａｃＺ遺伝子やＧＦＰ遺伝子などのマーカー遺伝子を導入したり、遺伝子に変異を導入して入れ替えることも可能である。
当該ノックインラットは、例えばＰｅｗｚｎｅｒ−Ｊｕｎｇ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：４６３４−４６４５（１９９８）等に記載のノックインマウスの作製法に準じて作製することができる。基本的には前記ノックアウトラットの作製と全く同じ原理を利用して作製することができる。
トランスジェニックラットとは、人為的に外来遺伝子を導入したラットを意味する。トランスジェニック動物の作製は従来より顕微操作によって受精卵の雄性前核に所望の遺伝子を注入する方法が一般化されている。そのため前記ノックアウトラットやノックインラットほど本発明のラットＥＳ細胞の必要性は高くない。しかしながら導入効率や個体の作製効率を上昇させるためには、本発明のラットＥＳ細胞が有効に用いられる。
当該トランスジェニックラットは、例えばＹａｍａｍｏｔｏ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：１６４１−１６４７（２００２）等に記載のトランスジェニックマウスの作製法に準じて作製することができる。すなわち、ＥＳ細胞をガラスピペットで吸い付けて固定し、他端から先端２μｍ以下の鋭く細いガラスピペットを使って核の中に直接外来性標的遺伝子溶液を注入する。溶液を注入したＥＳ細胞を培養系に移行し、遺伝子が組み込まれた株を樹立し、マウスの受精卵（モルラ胚またはブラスト胚）をガラスピペットで吸い付けて固定し、樹立したＥＳ細胞をガラスピペットを使って受精卵に注入し、試験管内で培養し、ある程度発生させた後に、偽妊娠雌マウスの卵管または子宮に戻して仔マウスを得る技法である。
前記トランスジェニックラットの範疇には、コンディショナル・トランスジェニックラットも含まれる。ここでコンディショナル・トランスジェニックとは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰまたはＦＬＰ／ＦＲＴを利用して、部位特異的・時期特異的に遺伝子を発現させるシステムである。具体的には薬剤耐性遺伝子などをｌｏｘＰ配列またはＦＲＴ配列で挟んでおき、ＣｒｅまたはＦＬＰタンパクの供給により前記ｌｏｘＰ配列またはＦＲＴ配列で挟んだ遺伝子を切り取ることにより、目的遺伝子を発現させるシステムである（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４８７−５０７（１９８１））。
ノックダウンラットとは、ＲＮＡｉの中間物質である短い２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）やアンチセンス核酸を人為的に導入・発現させ、当該ｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸の作用により標的遺伝子の発現を抑制させたラットを意味する。このようなノックダウン動物は、ベクター系によるｓｉＲＮＡの発現システムが確立したことに基づき、作製可能となった（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：５００−５０５（２００２）等）。
当該ノックダウンラットは、例えばＴｉｓｃｏｒｎｉａ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１００：１８４４−１８４８（２００３）等に記載の方法に準じて作製することができる。基本的には前記トランスジェニックラットの作製と全く同じ原理を利用して作製することができる。
本発明は、以上のような操作により製造された遺伝子改変ラットをも提供する。ここで「遺伝子改変ラット」とは、前記のようにキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラット若しくはノックダウンラットといった当業者に知られた全ての遺伝子改変ラットを意味する。
【実施例】  以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
ラットＥＳ細胞の樹立
１）卵の採取
Ｗｉｓｔａｒ  Ｋｙｏｔｏ株であるＷＫＹ／Ｎのメス（日本チャールズ・リバー、１０週齢以上）を自然交配し、膣栓確認３日目に採卵用雌ラットをと殺し子宮を摘出した。ｍｗ培地（ＮａＣｌ  ６４０．０ｍｇ／１００ｍｌ，ＫＣｌ  ３５．６ｍｇ／１００ｍｌ，ＫＨ２ＰＯ４  １６．２ｍｇ／１００ｍｌ，ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ２９．４ｍｇ／１００ｍｌ，ＮａＨＣＯ３  １９０．０ｍｇ／１００ｍｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ  １００．０ｍｇ／１００ｍｌ，Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ２．５ｍｇ／１００ｍｌ，Ｃａ−ｌａｃｔａｔｅ  ４６．０ｍｇ／１００ｍｌ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ５．０ｍｇ／１００ｍｌ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ７．５ｍｇ／１００ｍｌ，０．５％  ｐｈｅｎｒｏｌ  ｒｅｄ  ０．２ｍｌ，２０ｍＭ  ｂｅｔａ−ＭＥ  １０μｌ，１００ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ  １０μｌ，ＢＳＡ  ３００．０ｍｇ／１００ｍｌ）で潅流して胚を回収し、５％ＣＯ２培養装置にて胚盤胞（後期段階）まで発生を進めた（図１）。なおラットＥＳ細胞の樹立において、胚盤胞後期段階の卵が最も樹立（内部細胞塊形成）効率が高かったため、前記のように胚盤胞後期段階の卵を使用することとした。
２）フィーダー細胞の調製
ラットＥＳ細胞の樹立および培養の際に使用するフィーダー細胞として、マウスＩＣＲの胎児１２．５日目の正常繊維芽細胞をマイトマイシンＣで処理したものを使用した（図２）。使用に際し、凍結保存したフィーダー細胞を使用前日に解凍し、ＳＴＯ培地（ＤＭＥＭ  ４５０ｍｌ，ＦＢＳ  ５０ｍｌ，Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｔｉｃｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５ｍｌ）とゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）を用いて培養した。
３）ラットＥＳ細胞樹立用培養液およびラットＥＳ細胞用培養液の検討
（１）ＬＩＦ添加の検討
前記１）で調製されたラット胚盤胞から内部細胞塊を形成させ、この内部細胞塊からＥＳ細胞コロニーを形成させ、最終的に安定化したラットＥＳ細胞を樹立する。これら一連のステップにおいて用いる培養液の検討を行った。
まずラット胚盤胞から内部細胞塊を形成させる段階における、ラット由来白血病阻害因子（ｒＬＩＦ）の培養液中への添加の必要性につき検討を行った。ラット胚盤胞から内部細胞塊を形成させる段階で、種々の濃度（０〜５０００単位）のｒＬＩＦ（ケミコン社）を添加して培養し、その後形成された内部細胞塊の数および初代ＥＳ細胞の数を観察した。その結果、ｒＬＩＦを除いた方が効率良く内部細胞塊が形成され、ｒＬＩＦの添加濃度に依存して変化する事が示された。この結果から内部細胞塊形成までの段階ではＬＩＦ無添加の培養液を用いることとした。
次に内部細胞塊形成後〜ラットＥＳ細胞樹立までの段階におけるｒＬＩＦの添加の有無につき検討を行った。内部細胞塊形成・分離後にｒＬＩＦを添加（１０００単位）した培養液で培養を行った結果、内部細胞塊から約５０％以上の割合でＥＳ細胞を樹立することができた。さらに、ラットＥＳ細胞樹立後におけるｒＬＩＦの添加の必要性についても検討した。ラットＥＳ細胞を５継代目までｒＬＩＦを１０００単位添加した培養液で培養し、継代５代目のラットＥＳ細胞に種々の濃度のｒＬＩＦを添加し、さらに３代継代した。この細胞に対して未分可能を維持しているか否かを、アルカリホスファターゼ陽性率（％）を測定することにより行った（アルカリホスファターゼ活性測定法については実施例２に記載）。その結果、未分化能を維持するためには、培養液１ｍｌあたりｒＬＩＦを１００単位以上添加することが好ましく、１０００単位程度、若しくはそれ以上添加することがより好ましいことが明らかとなった（図３）。これらの結果から、内部細胞塊形成後はｒＬＩＦ添加培養液を用いることとした。
（２）血清添加の検討
従来、ＥＳ細胞の培養にはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が用いられている。ラットＥＳ細胞の樹立におけるＦＢＳの添加の有無につき検討を行った。
具体的には、ラット胚盤胞から内部細胞塊を形成する段階において、２０％ＦＢＳを添加した場合としない場合（血清代替試薬を用いた場合）における内部細胞塊形成能および形成率を調べた。また初代培養した継代１代目のＥＳ細胞における未分化能維持の有無についても調べた。未分化能維持の有無は、アルカリホスファターゼ活性および胚様体形成能の有無により判定した。その結果、ＦＢＳを添加した場合は大部分が内部細胞塊を形成せずに（形成されても栄養芽細胞と分離可能な大きさまで成長しない）、多核の細胞に分化した。また初代培養したＥＳ細胞では未分化指標であるアルカリホスファターゼ活性は陰性で、コロニーや胚様体も形成されなかった。一方、血清の代わりに血清代替試薬（ＫＳＲ）を用いた場合は、ラット胚盤胞からピックアップ可能な内部細胞塊が形成され、また初代培養したＥＳ細胞においてもアルカリホスファターゼ活性が陽性で、コロニーや胚様体が形成された（図４）。この結果から、ラットＥＳ細胞樹立においてＦＢＳよりもＫＳＲの方が優れている事が明らかとなった。なおＦＢＳ濃度が５％、１０％の場合も前記２０％ＦＢＳの場合と同様の結果であった。
（３）培養液の組成
以上の（１）および（２）の検討結果に基づき、ラットＥＳ細胞の樹立には以下の組成の培養液を用いることとした。
ラットＥＳ細胞樹立用培養液
胚盤胞から内部細胞塊を形成するまでの段階で使用する培養液である。
ダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（旭テクノグラス、東京、日本）３８０ｍｌ
０．２Ｍ  Ｌ−グルタミン  ５ｍｌ
血清代替試薬（ＫＳＲ：ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）１００ｍｌ
非必須アミノ酸（ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）５ｍｌ
抗生物質−抗菌物質溶液（ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）５ｍｌ
１００ｍＭ  Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ５ｍｌ
０．１Ｍ  βメルカプトエタノール  ０．５ｍｌ
ラットＥＳ細胞用培養液
内部細胞塊形成以降の培養において使用する培養液である。
ダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（旭テクノグラス、東京、日本）３７５ｍｌ
０．２Ｍ  Ｌ−グルタミン  ５ｍｌ
血清代替試薬（ＫＳＲ：ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）１００ｍｌ
非必須アミノ酸（ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）５ｍｌ
１００倍ヌクレオシド保存液  ５ｍｌ
（アデノシン  ４ｍｇ、グアノシン  ４．２５ｍｇ、シチジン  ３．６５ｍｇ，ウリジン  ３．６５ｍｇ、チミジン  １．２ｍｇ）
抗生物質−抗菌物質溶液（ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）５ｍｌ
１００ｍＭ  Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ５ｍｌ
０．１Ｍ  βメルカプトエタノール  ０．５ｍｌ
１０００Ｕ  ラット由来白血病阻害因子
４）ラットＥＳ細胞の単離方法の検討
細胞を単離する際のトリプシン処理の影響を調べた。まず、内部細胞塊を単離してフィーダー細胞上に撒く段階で通常のトリプシン・ＥＤＴＡ処理を行った結果、大部分のＥＳ細胞が分化してしまった。一方、ピペットを用いて物理的に細胞塊を解離した結果、未分化状態を維持できることが分かった。また、初代ラットＥＳ細胞コロニー（細胞塊）を継代する際にも、トリプシン・ＥＤＴＡ処理して継代した場合には細胞は単一化され分化してしまうが、前記と同様に物理的手法により細胞クランプを解離させて継代した場合は未分化状態を維持できることが明らかとなった。
次に、２回目以降の継代におけるトリプシンの影響について調べた。すなわち２回目の継代においてトリプシン・ＥＤＴＡを用いて完全に単一細胞化した場合と、トリプシン・ＥＤＴＡによる処理を最小限にとどめ、最終的には物理的操作により５〜２０個の細胞塊として継代した場合とで未分化状態維持に差があるかどうか検討を行った。その結果、単一細胞状態で継代すると自発的に分化してしまうのに対し、物理的にＥＳ細胞コロニーを剥離し、５〜２０個の細胞塊として継代した場合は、未分化状態を維持できることが明らかとなった（図５）。
以上の結果から、マウスＥＳ細胞の場合はトリプシン・ＥＤＴＡ溶液で完全に単一細胞化し、継代する事が望ましいが、ラットＥＳ細胞の場合、マウスＥＳ細胞の方法を適用すると自発的分化が発生するため、物理的にＥＳ細胞コロニーを剥離し、５〜２０個の細胞塊として継代するのが望ましいことが分かった。
５）ラットＥＳ細胞の樹立
以上の検討結果に基づきラットＥＳ細胞を樹立した。樹立法の概略を図６に示す。
ラット胚盤胞（後期段階）を顕微鏡下にて確認した後、タイロイド酸（ｐＨ２．５）を用いて透明帯を除去した。マイトマイシンＣ処理を施した正常マウス胎児繊維芽細胞（フィーダー細胞）を６０ｍｍゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）に播種し、透明帯を除去したラット胚盤胞（後期段階）を５〜１０個ずつ移し、ラットＥＳ細胞樹立用培養液にて培養を開始した。１〜４日目に正常マウス胎児繊維芽細胞上に透明帯を除去したラット胚盤胞（後期段階）が接着し、接着後５〜１０日目に内部細胞塊（図７）のみを２００μｌのピペットを用いて分離した。２００μｌのラットＥＳ細胞樹立用培養液を１．５ｍｌ滅菌チューブに分注し、分離した内部細胞塊を移し、ビペットを用いて物理的に細胞塊を解離した。使用前日にフィーダー細胞を播種した６穴ゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）において、解離した内部細胞塊をラットＥＳ細胞用培養液で培養した。培養から２〜４日目にＥＳ細胞コロニーが出現し（図８、また図６中「初代ＥＳ細胞」）、コロニーの出現から５〜１０日目のＥＳ細胞コロニー（図９）を顕微鏡下にて形態を確認しながら２００μｌのピペットを用いて分離した。使用前日にフィーダー細胞を播種した６穴ゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）において、物理的に解離したＥＳ細胞コロニーをラットＥＳ細胞用培養液で培養した（図６中「継代１代目」）。培養から２〜４日目にＥＳ細胞コロニーが出現し、５〜１０日目に継代可能となった。
次に培養液を除去し、室温に戻したＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、予め３７℃に保温した２．５％トリプシン（ギブコＢＲＬ、フナコシ、東京、日本）を６０ｍｍディッシュあたり５００μｌ加えて全面に塗り広げ、ただちに溶液を除去した。顕微鏡下にて全体の７割以上のＥＳ細胞コロニーがフィーダー細胞から剥離してくる状態を確認し、１０％ウシ胎仔血清を含む培養液を２ｍｌ加えてトリプシン処理を停止させた。５ｍｌピペットを用いて更に物理的にＥＳ細胞コロニーを剥離させ、細胞懸濁溶液を遠心（１０００ｒｐｍで３分、室温）にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収した。ラットＥＳ細胞用培養液で細胞を懸濁し、完全に単離化するのでは無く、顕微鏡下にて５〜２０個の細胞塊を形成している状態を確認し（図５のａ））、使用前日にフィーダー細胞を播種した６０ｍｍゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）に移し培養した（図６中「継代２代目」）。その後５〜１０日目に継代可能な状態へと安定化した細胞を、前記と同様の手法にて継代して得られた継代３代目の細胞以降の細胞を、樹立ラットＥＳ細胞とした（図１０）。この樹立したラットＥＳ細胞の形態は、これまでに報告されている各種ＥＳ細胞と非常に良く似たＥＳ細胞の典型的な形態であった（図１１）。なお、樹立以降も前記と同様の手法にて５〜１０日毎に継代を行い、細胞を維持した。
実施例２
樹立したラットＥＳ細胞の解析
継代５代目のラットＥＳ細胞を用いて、ＥＳ細胞としての特性を有することを確認した。具体的には以下の各性質について検討した。
１）ＲＴ−ＰＣＲ分析による未分化マーカー遺伝子の発現解析
樹立したラットＥＳ細胞における、代表的な未分化マーカーであるＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ遺伝子の発現の有無を検討した。まず樹立したラットＥＳ細胞から総ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン、東京、日本）を用いて抽出した。一本鎖ｃＤＮＡは、総ＲＮＡ２μｇ、オリゴ（ｄＴ）１８プライマー０．５μｌ、ｄＮＴＰｓ１０ｐｍｏｌ、ＲＡＶ−２ＲＴアーゼ５単位、および一本鎖合成緩衝液（タカラ、京都、日本）を含む全量２０μｌにおいて合成した。合成は、３７℃で１０分間、４２℃で１時間、５６℃で１０分間、および９９℃で５分間行った。また、以下のプライマーを合成した（オリゴヌクレオチド配列は、センス、アンチセンスプライマーの順に括弧内に記載し、その後にアニーリング温度、ＰＣＲに用いたサイクル、および増幅した断片の長さを示す）：β−アクチン（５’−ＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＡＴＣＣＴＧ−３’（配列番号：１）、５’−ＡＧＡＧＣＡＴＡＧＣＣＣＴＣＧＴＡＧＡＴ−３’（配列番号：２）；５５℃；２５サイクル；３３９ｂｐ）、Ｏｃｔ  ３／４（５’−ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：３）、５’−ＴＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＣ−３’（配列番号：４）；５６℃；３５サイクル；４４８ｂｐ）、Ｎａｎｏｇ（５’−ＴＡＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＧＣＡ−３’（配列番号：５）、（５’−ＴＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴＡＡ−３’（配列番号：６）；５４℃；３５サイクル；６１７ｂｐ）。なおラットＯｃｔ  ３／４のプライマーは、マウスＯｃｔ  ３／４遺伝子のＣＤＳ配列をＧｅｎＢａｎｋより入手し、さらに、その塩基配列をＢＬＡＳＴにて検索してラットＯｃｔ  ３／４遺伝子配列を得、マウスとラットの相同性を検索し、マウスＥＳ細胞は増幅しない領域を選んで、これをラット特異的Ｏｃｔ  ３／４プライマーとして設計した。ＮａｎｏｇについてもマウスおよびヒトＮａｎｏｇ遺伝子のＣＤＳ配列をもとにしてプライマーを設計した。
増幅は、鋳型ｃＤＮＡ４μｌ、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー１０ｐｍｏｌ、Ｅｘ−Ｔａｑ１．０単位およびＥｘ−Ｔａｑ緩衝液（タカラ、京都、日本）を含む全量５０μｌにおいて行った。ＰＣＲ後、少量を３．０％アガロースゲル上で泳動させて、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）によって染色した後、ＵＶ照射下で写真を撮影した。結果を図１２に示す。図１２より明らかなように、ラットＥＳ細胞のｃＤＮＡでのみ、ラット特異的Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ遺伝子断片の増幅を示すバンドが確認された。
２）アルカリホスファターゼ活性の分析
細胞が未分化能を有していることを証明する代表的な指標の一つであるアルカリホスファターゼ活性の有無を分析した。まずラットＥＳ細胞用培養液およびフィーダー細胞存在下にて培養を行った樹立ラットＥＳ細胞を直接、４％パラホルムアルデヒドを用いて１０分間固定して、その後１００％ＥｔＯＨで１０分間固定した。Ｈ２Ｏによって３０分間洗浄した。アルカリホスファターゼ活性は、説明書に従って、ベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットＩ（フナコシ、東京、日本）によって検出した。結果を図１３に示す。樹立したラットＥＳ細胞はアルカリホスファターゼ活性陽性であることが示された。
３）胚様体形成能の分析
ＥＳ細胞をフィーダー細胞やＬＩＦの存在しない条件下で非コート培養皿を用いて培養することにより、胚様体が形成されることが知られている（Ｒｏｙ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：３９４７−３９５５（１９９８））。そこで樹立ラットＥＳ細胞１．０×１０７個を非コート培養皿にてｒＬＩＦを除いたラットＥＳ細胞用培養液を用いて播種し、３７℃で３日間置きに培養液を交換し、２０日間インキュベートした。結果を図１４に示す。図１４より明らかなように胚様体が形成され、心筋様に鼓動する胚様体が多数確認できた。
４）ＥＳ細胞マーカー染色の分析
未分化マーカーの発現の有無につき検討した。ラットＥＳ細胞用培養液およびフィーダー細胞存在下にて培養を行った樹立ラットＥＳ細胞を直接、４％パラホルムアルデヒドを用いて１０分間固定して、その後０．０２％トライトンＸ−１００で１５分間静置し、３％過酸化水素水／メタノールにて１５分間静置した。５％血清／ＰＢＳにて１５分間ブロッキングした後、ＥＳ細胞の代表的な膜タンパク質であり、未分化マーカーの一種であるＳＳＥＡ（胎児ステージ特異的抗原；ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）−１、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を、説明書に従って、ＥＳ細胞キャラクタライゼイションキット（フナコシ、東京、日本）と二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体−ビオチン標識（フナコシ、東京、日本））、ＤＡＢ染色キット（コウワ、東京、日本）によって検出した。結果を図１５に示す。ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４は陽性であり、これら未分化マーカーが発現していることが示された。ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１については本抗体染色結果では発現は検出できなかった。
５）染色体数の分析
樹立したラットＥＳ細胞が正常な染色体数を保持しているかどうか確認した。樹立ラットＥＳ細胞をフィーダー細胞非存在下のゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）ラットＥＳ細胞用培養液を用いて培養を行い、Ｇ−バンド法（Ｓｕｍｎｅｒ  Ａ．Ｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．６：５９−８７（１９８２））によって染色体数を分析した。結果を図１６に示す。正常ラット細胞の染色体数（２ｎ＝４２）を保持していることが示された。
６）継代回数の分析
樹立したラットＥＳ細胞の継代回数と未分化能維持率について検討した。ラットＥＳ細胞をフィーダー細胞存在下のゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）においてラットＥＳ細胞用培養液を用いて培養し、継代回数と未分化能力の保持性についてアルカリホスファターゼ活性を指標に検討した。開始は継代回数５代目からで、以後、５代目毎にアルカリホスファターゼ活性染色を行った。アルカリホスファターゼ活性は、説明書に従って、ベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットＩ（フナコシ、東京、日本）によって検出した。結果を図１７に示す。ラットＥＳ細胞用培養液を用いることにより少なくとも継代２５代目まで安定的に未分化能を維持した状態で培養が可能であることが明らかとなった。なおその後、継代３５代目まで安定的に培養できることが明らかとなっている。
７）インビトロ系における多分化能の分析
樹立したラットＥＳ細胞の自発的分化能につき検討した。樹立ラットＥＳ細胞１．０×１０７個を非コート培養皿（イワキ、東京、日本）において、ラット由来白血病阻害因子（ｒＬＩＦ）を除いたラットＥＳ細胞用培養液で培養することにより胚様体形成を開始した。形成開始７日目にゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）に胚様体を移し、さらに７日間培養を行った。結果を図１８に示す。
図１８（ａ）に示されるように、胚様体から神経様細胞が出現した。この神経様細胞の拡大図（ｂ）においては２細胞間で神経突起を伸ばし、また連結しているような像が確認された。脂肪様細胞は細胞質内に多数の透明顆粒を含んでいるのが特徴であるが、図１８（ｃ）に示すように多数の透明顆粒を含む脂肪様細胞像が確認された。また図１８（ｄ）に示すように上皮系細胞も多数確認された。このように樹立したラットＥＳ細胞は自発的に様々な細胞へと分化する能力を有していることが確認された。
８）血清およびＬＩＦ添加のラットＥＳ細胞への影響
樹立したラットＥＳ細胞に対するＬＩＦと血清が及ぼす未分化能維持や増殖能への影響について検討した。継代５代目のラットＥＳ細胞を以下の４種類の培養条件にて１代継代した。（１）ラットＬＩＦ（ｒＬＩＦ）含有、無血清（２０％ＫＳＲ含有）、（２）ＬＩＦ無添加、無血清（２０％ＫＳＲ含有）、（３）マウスＬＩＦ（ｍＬＩＦ）含有、無血清（２０％ＫＳＲ含有）、及び（４）ラットＬＩＦ（ｒＬＩＦ）含有、２０％血清含有。
未分化能を維持しているか否かは、ＥＳ細胞の未分化マーカー遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１の各遺伝子の発現の有無を解析することにより調べた。またＥＳ細胞の特徴である奇形腫瘍形成に重要なＥＲａｓ遺伝子の発現の有無も解析した。用いたプライマーの配列、アニーリング温度およびＰＣＲに用いたサイクルは以下の通りである：
Ｏｃｔ  ３／４：５’−ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：３）、５’−ＴＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＣ−３’（配列番号：４）、５６℃、４０サイクル、
Ｎａｎｏｇ：５’−ＴＡＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＧＣＡ−３’（配列番号：５）、５’−ＴＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴＡＡ−３’（配列番号：６）、６０℃、４０サイクル、
Ｒｅｘ−１：５’−ＡＡＡＴＣＡＴＧＡＣＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣ−３’（配列番号：７）、５’−ＴＧＡＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＴＣＴ−３’（配列番号：８）、６０℃、４０サイクル、
ＥＲａｓ：５’−ＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号：９）、５’−ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号：１０）、６４℃、４０サイクル。
さらに形態学的な観察も行った。結果を図１９に示す。
ｒＬＩＦと２０％ＫＳＲでラットＥＳ細胞を培養（前記（１））すると、形態的に安定であり（図１９）、またＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現が観察されたことにより、未分化能を維持した状態で増殖出来ることが確認された。一方、残りの３条件（前記（２）〜（４））で培養すると、特徴的なＥＳ細胞マーカー類の発現は消失し、形態的にも分化状態に移行した（図１９）。以上の結果より、ラットＥＳ細胞の培養にはラットＬＩＦと血清代替試薬（ＫＳＲ）の両者が重要であることが明らかとなった。
９）奇形腫形成能の分析
樹立したラットＥＳ細胞をＰＢＳにて１．０×１０７個／２００μｌに懸濁調整し、同系雄ラット（１５週齢）の精巣内部および皮下内部に細胞移植を行う。ラットをと殺し、形成された奇形腫を摘出した後、４％パラホルムアルデヒドにて固定する。組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジンで染色し、顕微鏡下にて三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）への分化誘導を確認する。
１０）キメララット作製能の分析
ｐＥＧＦＰ−１ベクター（クローンテック社）のＥＧＦＰ遺伝子上流にニワトリのアルブミンプロモーターを組み込み、ＥＧＦＰ遺伝子が安定的に細胞内で発現するベクターとして構築した。本作製したベクターをエレクトロポレーション法を用いてラットＥＳ細胞内部に導入し、ラットＥＳ細胞内部の染色体遺伝子内に組み込まれた細胞株をＧ４１８を用いて薬剤選別を行い、樹立した（ＲＥＳＣ／ＥＧＦＰ株）。
一方、ＥＳ細胞と同系のラットを用いて自然交配し、膣栓確認３日目に採卵用雌ラットをと殺し子宮を摘出し、ｍｗ培地で潅流して卵を回収した。その後５％ＣＯ２培養装置にて４０個の採卵を８細胞期胚まで発生を進める。オイルドロップ内でタイロイド酸（ｐＨ２．５）を用いて透明帯を除去し、フィーダー細胞を除去し、前記で樹立したラットＥＳ細胞株（ＲＥＳＣ／ＥＧＦＰ細胞）の細胞塊１個（５から２０個）を、同系ラットの受精卵にマイクロインジェクション法を用いて導入する。５％ＣＯ２培養装置内で一晩培養を行う（移植用卵）。一方、予め輸精管結紮手術を施した雄ラットと採卵用雌ラットを交配させ、翌日に雌ラットの膣栓を確認し、偽妊娠雌ラットを作製する。麻酔を掛けた偽妊娠雌ラットを開腹し、子宮内に移植用卵をそれぞれ１０個注入する。自然分娩や、特に必要とされた場合には帝王切開にて仔を摘出し、仔ラットに蛍光を照射して体が蛍光色を呈する事によりキメララットの誕生を確認する。
実施例３
ＥＳ細胞の樹立及び樹立したラットＥＳ細胞の解析（２）
１）ＥＳ細胞の樹立
実施例１に示したＷｉｓｔｅｒ  Ｋｙｏｔｏラット（ＷＫＹ）の場合と同様の手法にて、Ｗｉｓｔｅｒ  Ｈａｎｎｏｖｅｒ  ＧＡＬＡＳラット（ＷＨＧ）およびＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット（ＢＮ）についてもＥＳ細胞の樹立を行った。その結果、いずれのラットについてもＥＳ細胞を樹立することができた。各ラット（ＷＫＹ、ＷＨＧ及びＢＮ）の胚盤胞から形成された内部細胞塊の写真を図２０に示す。また継代５代目の樹立ＥＳ細胞の写真も併せて図２０に示す。ＷＨＧラットＥＳ細胞、ＢＮラットＥＳ細胞いずれについてもＷＫＹラットＥＳ細胞と同様に未分化能を維持したまま継代できることが確認できた。
２）ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現解析
樹立したＷＫＹラットＥＳ細胞、ＷＨＧラットＥＳ細胞、ＢＮラットＥＳ細胞におけるＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現の有無を、ＲＴ−ＰＣＲ分析により行った。実験は実施例２の１）と同様にして行った。ＥＳ細胞の未分化マーカー遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｒｅｘ−１およびＮａｎｏｇ遺伝子の発現を解析した。またＥＳ細胞の特徴である奇形腫瘍形成に重要なＥＲａｓ遺伝子の発現も解析した。ＲＴ−ＰＣＲのプライマーは実施例２の１）及び８）に示したものを用いた。ＷＫＹラットＥＳ細胞の結果を図２１に示す。Ｏｃｔ３／４、Ｒｅｘ−１、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓのいずれの因子についても発現が示された。ＷＨＧラットＥＳ細胞、ＢＮラットＥＳ細胞についても同じ結果が得られた。
３）ＥＳ細胞から形成された胚様体の分析
樹立ラットＥＳ細胞を非コート培養皿にてｒＬＩＦを除いたラットＥＳ細胞用培養液を用いて播種し、３７℃で３日間置きに培養液を交換し、２０日間インキュベートした。その結果胚様体が形成され、心筋様に鼓動する胚様体が多数確認できた。
次に、この心筋様細胞の出現した胚様体からＲＮＡを抽出し、神経細胞（外胚葉）、心筋細胞（中胚葉）および肝細胞（内胚葉）の各マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した。各マーカー遺伝子の名称、プライマー配列、アニーリング温度およびＰＣＲに用いたサイクルを以下に示す。
Ａ）神経細胞マーカー
Ｎｅｓｔｉｎ：５’−ＧＣＴＣＴＧＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号：１１）、５’−ＡＧＡＴＧＣＡＣＡＧＧＡＧＡＴＧＣＴＡＣ−３’（配列番号：１２）、５８℃、４０サイクル、
ＴＵＪ１：５’−ＧＧＡＡＣＧＣＡＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＣＴ−３’（配列番号：１３）、５’−ＡＣＣＡＣＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴ−３’（配列番号：１４）、６０℃、４０サイクル、
ＭＳＩ−１：５’−ＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＴＡＴＧＧＴＣＣＧＡ−３’（配列番号：１５）、５’−ＴＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＡＴＴＧＧＴＧＡ−３’（配列番号：１６）、６０℃、４０サイクル、
ＧＦＡＰ：５’−ＧＧＣＴＣＴＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＧＣＡ−３’（配列番号：１７）、５’−ＡＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＣ−３’（配列番号：１８）、５８℃、４０サイクル、
Ｂ）心筋細胞マーカー
ＣＣＣ：５’−ＴＣＴＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＣ−３’（配列番号：１９）、５’−ＴＧＡＣＣＴＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧＧＧＡ−３’（配列番号：２０）、５８℃、４０サイクル、
ＡＮＦ：５’−ＡＴＡＣＡＧＴＧＣＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡ−３’（配列番号：２１）、５’−ＴＴＡＴＣＴＴＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号：２２）、５８℃、４０サイクル、
ＫｖＬＱＴ１：５’−ＴＧＣＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＧＴＴＧＡＴ−３’（配列番号：２３）、５’−ＣＡＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ−３’（配列番号：２４）、５８℃、４０サイクル、
Ｃ）肝細胞マーカー
ＡＬＢ：５’−ＧＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号：２５）、５’−ＴＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＴＡＧＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号：２６）、５８℃、４０サイクル、
ＴＤＯ：５’−ＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣＧＴＣＡＴＧＡＣＴ−３’（配列番号：２７）、５’−ＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＧＴ−３’（配列番号：２８）、５８℃、４０サイクル、
ＴＡＴ：５’−ＡＡＴＧＡＧＡＴＴＣＧＡＧＡＣＧＧＧＣＴ−３’（配列番号：２９）、５’−ＴＴＣＡＴＣＡＣＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＣＴ−３’（配列番号：３０）、５８℃、４０サイクル、
Ｇ６Ｐ：５’−ＧＴＣＡＡＣＧＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＧＧＴ−３’（配列番号：３１）、５’−ＧＴＴＣＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧ−３’（配列番号：３２）、５８℃、４０サイクル。
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２２に示す。未分化状態（レーン１）では発現していない遺伝子が、胚葉体（レーン２）では全て陽性に転じていることが明らかとなった。この結果より、樹立したラットＥＳ細胞は三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）系列の細胞へと分化する能力を有していること、すなわちＥＳ細胞としての性質を有していることが明らかとなった。
４）奇形腫（テラトーマ）形成能の分析
樹立したＷＫＹラットＥＳ細胞、ＷＨＧラットＥＳ細胞、およびＢＮラットＥＳ細胞を、それぞれ免疫不全マウスの皮下に２．５×１０７細胞個移植した。その後１−２ヶ月後にこれら全てのＥＳ細胞移植マウスにおいてテラトーマの形成を確認した。ＷＨＧラットＥＳ細胞の結果を図２３に示す。マウスをと殺し、形成されたテラトーマを摘出した後、４％パラホルムアルデヒドにて固定した。組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジンで染色した（図２３）。顕微鏡下での観察により、腺構造（中胚葉系列）、血管内皮様構造（外胚葉系列）、腸管様構造（内胚葉系列）、および骨細胞様構造（中胚葉系列）の各組織が観察された。以上の結果より、樹立したラットＥＳ細胞はテラトーマ形成能を有し、形成されたテラトーマは三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）構造を有することが明らかとなった。
５）キメララット作製能の分析
ｐＣＡＧ−ＥＧＦＰ遺伝子をエレクトロポレーション法を用いてラットＥＳ細胞（ＷＨＧラットＥＳ細胞）に導入し、ｐＣＡＧ−ＥＧＦＰ遺伝子を染色体上に組み込んだＷＨＧラットＥＳ細胞株（以下、ｐＣＡＧ−ＥＧＦＰ／ＷＨＧｒＥＳ細胞株と称する）を作製した。
ＷＨＧラットＥＳ細胞と同系統の雌ラットを用いて自然交配し、翌日の膣栓陽性確認後、４日目に採卵した。その後５％ＣＯ２培養装置にて胚盤胞期まで発生を進めた受精卵を採取し、１個の卵につき８〜１２個のｐＣＡＧ−ＥＧＦＰ／ＷＨＧｒＥＳ細胞をマイクロインジェクション法にて移植した卵を作製した（以下、ＥＳ（＋）と称する）。
一方、精管結紮を施した同系統ラット雄と同系統ラット雌との交配を行い、翌日の膣栓陽性を確認し、偽妊娠雌ラットを作製した。膣栓陽性確認後４日目に、偽妊娠ラット１匹あたり６個〜１０個のＥＳ（＋）卵を移植した。その後帝王切開にて仔ラット（ＧＦＰキメララット）を摘出した。
このＧＦＰキメララットから種々の組織を分離し、ゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＦＰ特異的プライマーを用いて常法にてゲノムＰＣＲを行った。結果を図２４に示す。結果として、胸腺・血管・脾臓の３つを除く調べた全ての臓器でｐＣＡＧ−ＥＧＦＰ／ＷＨＧｒＥＳ細胞由来であることを示すＧＦＰ遺伝子のバンドが確認された。一方、コントロール（野生型ラット）のゲノムにはＧＦＰ遺伝子のバンドが確認されなかった。以上のようにラットＥＳ細胞（ｐＣＡＧ−ＥＧＦＰ／ＷＨＧｒＥＳ細胞）由来の遺伝子が各組織や細胞中に含まれていたことから、樹立したラットＥＳ細胞はキメララット作製能を有していることが明らかとなった。
６）キメララットの組織解析
前記５）で得られたＧＦＰキメララット、及び同系統の野生型ラットを用いて、それぞれ各組織を切片化し、ＧＦＰ抗体（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて免疫染色を行った。結果を図２５に示す。ＧＦＰキメララットの組織でのみＤＡＢ発色が確認され、確かにＥＳ細胞由来のＧＦＰ細胞が各組織に存在し、且つＧＦＰを発現していることが明らかとなった。
またＧＦＰキメララットの肝臓切片をヘキスト（青色）とローダミン（赤色）を用いて蛍光染色したところ、中心静脈近傍にＧＦＰ発現細胞であることを示す赤色領域が確認された（データは示さず）。
以上の結果より、ラットＥＳ細胞由来の遺伝子が各組織中に含まれているだけでなく、形態的に観察した結果、各組織系列の細胞へと分化していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明によりラットＥＳ細胞が提供される。本発明の樹立ラットＥＳ細胞は、遺伝子改変ラット（ノックアウトラット、ノックインラット等）の作製を初めて可能とするものであり、癌や脳神経系を初めとする様々な領域における薬理研究や生理学における研究、さらには再生医療の研究などに幅広く用いることができる。
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配列番号：２５に記載の塩基配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：２６に記載の塩基配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：２７に記載の塩基配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：２８に記載の塩基配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：２９に記載の塩基配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：３０に記載の塩基配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：３１に記載の塩基配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：３２に記載の塩基配列はＰＣＲプライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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