(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トルライクレセプター１遺伝子上に存在する配列番号１の２０１番目の塩基に相当する塩基または配列番号２の１９７番目の塩基に相当する塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて、配列番号１の２０１番目の塩基に相当する塩基がＧの場合または配列番号２の１９７番目の塩基に相当する塩基がＣの場合、心筋梗塞の発症リスクが高いまたは心筋梗塞に罹患している可能性が高いと判定される、心筋梗塞を検査する方法。
【請求項２】
トルライクレセプター１遺伝子上に存在する配列番号１の２０１番目の塩基に相当する塩基および配列番号２の１９７番目の塩基に相当する塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて、配列番号１の２０１番目の塩基に相当する塩基がＧの場合および／または配列番号２の１９７番目の塩基に相当する塩基がＣの場合、心筋梗塞の発症リスクが高いまたは心筋梗塞に罹患している可能性が高いと判定される、心筋梗塞を検査する方法。
【請求項３】
トルライクレセプター４遺伝子上に存在する配列番号３の２０２番目の塩基に相当する塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて、配列番号３の２０２番目の塩基に相当する塩基がＣの場合、心筋梗塞の発症リスクが高いまたは心筋梗塞に罹患している可能性が高いと判定される、心筋梗塞を検査する方法。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列において２０１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する心筋梗塞検査用プローブ。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列において２０１番目の塩基を含む領域を増幅することのできるプ
ライマーであって、該塩基の３０〜１００塩基上流の１５塩基以上の配列、又は該塩基の３０〜１００塩基下流の領域に相補的な１５塩基以上の配列を有する心筋梗塞検査用プライマー。
【請求項６】
配列番号２の塩基配列において１９７番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する心筋梗塞検査用プローブ。
【請求項７】
配列番号２の塩基配列において１９７番目の塩基を含む領域を増幅することのできるプライマーであって、該塩基の３０〜１００塩基上流の１５塩基以上の配列、又は該塩基の３０〜１００塩基下流の領域に相補的な１５塩基以上の配列を有する心筋梗塞検査用プライマー。
【請求項８】
配列番号３の塩基配列において２０２番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する心筋梗塞検査用プローブ。
【請求項９】
配列番号３の塩基配列において２０２番目の塩基を含む領域を増幅することのできるプライマーであって、該塩基の３０〜１００塩基上流の１５塩基以上の配列、又は該塩基の３０〜１００塩基下流の領域に相補的な１５塩基以上の配列を有する心筋梗塞検査用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は心筋梗塞などの炎症性疾患の検査方法及び炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ライフスタイルの変化に伴って、炎症性疾患、特に心筋梗塞などの冠動脈疾患の死亡リスクが増加している（非特許文献１又は２参照）。したがって、これらの疾患について早期に発症リスクを判定する方法の開発が望まれている。【０００３】
心筋梗塞などの冠動脈疾患は遺伝的素因によって発症する可能性が提唱され、遺伝子変異の有無によって、心筋梗塞を判定する方法がいくつか知られている。例えば、プロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の発症リスクを判定する方法が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、より正確に判定するためには、さらなる判定法の開発が求められていた。【０００４】
トルライクレセプター（Toll-like receptor）は、昆虫の受容体であるTollのホモログとして単離された、免疫応答などに関与する一回膜貫通型受容体である（非特許文献３参照）。トルライクレセプターをコードする遺伝子のいくつかの部位における多型が喘息に関連することが知られていた（非特許文献４参照）。しかしながら、トルライクレセプター遺伝子の多型と心筋梗塞等の炎症性疾患との関連については知られていなかった。【０００５】
ガレクチン（galectin）はガラクトースに結合性を示すタンパク質であるが、哺乳類では現在、１０種類のガレクチンが知られている。その中で、ガレクチン−２は１４ｋＤａのサブユニットからなる非共有結合性のホモダイマーを形成し、還元剤非存在下では自己凝集し活性を失うことが知られている。また、ガレクチン−２の発現は正常成人組織中では下部小腸を主とした上皮細胞に多く認められることが知られているが、その詳細な生理機能については知られていなかった（非特許文献５参照）。
【特許文献１】特開２００２−１３６２９１号公報
【非特許文献１】Nature Medicine, 1997, vol.3, p600-601
【非特許文献２】New England Journal of Medicine, 1997, vol.337, p1360-1369
【非特許文献３】J. Biol. Chem., Vol. 278, Issue 40, 38105-38108, 2003
【非特許文献４】Genes Immun. 2004 Aug;5(5):343-6
【非特許文献５】Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, vol.9, No.45, p87-93
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法を提供することを課題とする。本発明はまた、心筋梗塞等の炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、トルライクレセプター遺伝子の一塩基多型が心筋梗塞に関連することを見出した。さらに、トルライクレセプターがガレクチン−２と特異的な相互作用を示すことから、両者の相互作用を変化させる物質をスクリーニングすることで心筋梗塞等の炎症性疾患の治療薬が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）トルライクレセプター遺伝子の多型を分析し、該分析結果に基づいて炎症性疾患を検査する方法。
（２）前記多型が一塩基多型である、（１）の方法。
（３）トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター１遺伝子であり、該トルライクレセプター１遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号１の２０１番目の塩基に相当する塩基または配列番号２の１９７番目の塩基に相当する塩基の多型である、（２）の方法。
（４）トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター４遺伝子であり、該トルライクレセプター４遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号３の２０２番目の塩基に相当する塩基の多型である、（２）の方法。
（５）トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター１遺伝子であり、該トルライクレセプター１遺伝子の多型が、配列番号１の２０１番目の塩基または配列番号２の１９７番目の塩基の一塩基多型と連鎖不平衡にある多型である、（１）の方法。
（６）トルライクレセプター遺伝子がトルライクレセプター４遺伝子であり、該トルライクレセプター４遺伝子の多型が、配列番号３の２０２番目の塩基の一塩基多型と連鎖不平衡にある多型である、（１）の方法。
（７）炎症性疾患が心筋梗塞である（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８）配列番号１の塩基配列において２０１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
（９）配列番号１の塩基配列において２０１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる炎症性疾患検査用プライマー。
（１０）配列番号２の塩基配列において１９７番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
（１１）配列番号２の塩基配列において１９７番目の塩基を含む領域を増幅することのできる炎症性疾患検査用プライマー。
（１２）配列番号３の塩基配列において２０２番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
（１３）配列番号３の塩基配列において２０２番目の塩基を含む領域を増幅することのできる炎症性疾患検査用プライマー。
（１４）トルライクレセプターおよびガレクチン−２を含むスクリーニング系に医薬候補物質を添加する工程、トルライクレセプターとガレクチン−２との相互作用を測定する工程、及び前記相互作用を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法。
（１５）トルライクレセプターがトルライクレセプター１またはトルライクレセプター２である（１４）のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】免疫沈降によるTLRとガレクチン２の相互作用解析の結果を示す図。IPは免疫沈降を、WBはウエスタンブロットを意味する。
【図２】免疫沈降によるTLR2の細胞内領域とガレクチン２の相互作用解析の結果を示す図。IPは免疫沈降を、WBはウエスタンブロットを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、トルライクレセプター（TLR）遺伝子の炎症性疾患に関連する遺伝子多型を分析し、該分析に基づいて炎症性疾患を検査する方法である。炎症性疾患としては、炎症との相関が知られている細胞接着因子やサイトカインの誘導が認められる疾患であれば特に限定されないが、例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリマトーデス、炎症性腸炎、種々のアレルギー疾患、細菌性ショック、または心筋梗塞や脳卒中などの冠動脈疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。なお、本発明において、「検査」とは炎症性疾患の発症リスクの検査や発症の有無の検査を含む。【００１１】
トルライクレセプター遺伝子としては、トルライクレセプター１（TLR1）遺伝子又はトルライクレセプター４（TLR4）遺伝子が好ましい。TLR1遺伝子としては、ヒトTLR1遺伝子が好ましく、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のデータベースにアクセス番号U88540で登録された配列を有する遺伝子を挙げることができる。TLR4遺伝子としては、ヒトTLR4遺伝子が好ましく、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のデータベースにアクセス番号AF172169で登録された配列を有する遺伝子を挙げることができる。なお、これらの遺伝子は人種の違いなどによって炎症性疾患に関連する塩基以外の塩基において置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
なお、トルライクレセプター遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。【００１２】
遺伝子多型の種類は炎症性疾患に関連するものである限り特に制限されず、一塩基多型（SNPｓ）、及びＶＮＴＲ（Variable Number of Tandem Repeat）などを含む。
炎症性疾患に関連するTLR1遺伝子の一塩基多型は特に制限されないが、好ましくは１８０５番目（配列番号１の２０１番目）の塩基または１３０番目（配列番号２の塩基配列の１９７番目）の多型が挙げられる。なお、１８０５番目、１３０番目とは翻訳開始点から数えた番号である。
１８０５番目の塩基を含む配列としては、例えば、配列番号１の配列が挙げられる。該１８０５番目の塩基は、この配列の２０１番目の塩基に相当する。ヒト染色体上のTLR1遺伝子においては、この塩基がT（チミン）又はG（グアニン）となる多型が存在する。
１３０番目の塩基を含む配列としては、例えば、配列番号２の配列が挙げられる。該１３０番目の塩基は、この配列の１９７番目に相当する。ヒト染色体上のTLR1遺伝子においては、この塩基がT（チミン）又はC（シトシン）となる多型が存在する。
なお、「相当する」とは、ヒトTLR1遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がSNP以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。【００１３】
炎症性疾患に関連するTLR4遺伝子の一塩基多型は特に制限されないが、好ましくは−１４４０番目（配列番号３の２０２番目）の塩基の多型が挙げられる。なお、−１４４０番目とはDunnen J. T. and Antonarakis S. E. Hum. Mutation 15, 7-12, 2000に基づく番号である。−１４４０番目の塩基を含む配列としては、例えば、配列番号３の配列が挙げられる。該−１４４０番目の塩基は、この配列の２０２番目の塩基に相当する。ヒト染色体上のTLR4遺伝子においては、この塩基がT（チミン）又はC（シトシン）となる多型が存在する。
なお、「相当する」とは、ヒトTLR4遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がSNP以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。
上記の塩基の多型を単独または組み合わせて解析することにより、炎症性疾患を検査することができる。また、これらの一塩基多型と連鎖不平衡にある多型に基づいて検査を行ってもよい。連鎖不平衡にある多型としては、他の塩基の一塩基多型やＶＮＴＲなどが挙げられる。【００１４】
TLR遺伝子の遺伝子多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、粘膜細胞などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。遺伝子多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。【００１５】
TLR遺伝子の遺伝子多型の解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。【００１６】
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。【００１７】
また、PCRによる増幅の有無を調べることによって解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
また、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許2843586号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。【００１８】
また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、TLR遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。【００１９】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。TLR1遺伝子の１８０５番目の塩基の多型については、この多型がGの場合PstI切断部位が生じるため、PstIによる切断の有無によって検出することができる。【００２０】
次に、上記のような方法によって解析した多型に基いて、炎症性疾患について検査を行う。
例えば、TLR１遺伝子の１８０５位の塩基の多型に基いて判定する場合は、該塩基がGの場合、炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。また、対立遺伝子の多型を含めて考慮してもよく、例えば、遺伝子型がGGまたはTGアレルの場合に、TTアレルと比べて炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。
TLR１遺伝子の１３０位の塩基の多型に基いて判定する場合は、該塩基がCの場合、炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。また、対立遺伝子の多型を含めて考慮してもよく、例えば、遺伝子型がCCまたはTCアレルの場合に、TTアレルと比べて炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。
TLR４遺伝子の−１４４０位の塩基の多型に基いて判定する場合は、該塩基がCの場合、炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。また、対立遺伝子の多型を含めて考慮してもよく、例えば、遺伝子型がCCアレルの場合に、TCまたはTTアレルと比べて炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。【００２１】
本発明の判定法においては、TLR遺伝子の多型に加え、他の遺伝子の多型を解析し、それらの遺伝子の多型の組合わせに基いて炎症性疾患の判定を行ってもよい。他の遺伝子としては、ガレクチン−２遺伝子が挙げられる。ガレクチン−２遺伝子の配列としては、NCBIにNT_011520に登録されている配列を挙げることができ、ガレクチン−２遺伝子の多型としては、イントロン１の３２７９番目の塩基の多型を挙げることができる。この塩基は、配列番号２０の３７７番目の塩基に相当する。ヒトガレクチン−２遺伝子では該塩基がA／Ｔとなる多型が存在する。そして、この位置の遺伝子型がAAの場合に比べて、TTの場合に炎症性疾患のリスクが高い（Nature. 2004 May 6;429(6987):72-5.）。
さらに、本発明の検査方法においては心筋梗塞との関連が知られているリンホトキシンα遺伝子の多型（Nat Genet. 2002 Dec;32 (4):650-4. 2002；ＷＯ２００４／０１５１００）を組合わせて検査することもできる。【００２２】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、炎症性疾患を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、配列番号１の塩基配列において２０１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有するプローブ、配列番号２の塩基配列において１９７番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有するプローブ、配列番号３の塩基配列において２０２番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有するプローブが挙げられる。
また、プライマーとしては、配列番号１の塩基配列の２０１番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号１の塩基配列の２０１番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマー；配列番号２の塩基配列の１９７番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号２の塩基配列の１９７番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマー；配列番号３の塩基配列の２０２番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号３の塩基配列の２０２番目の塩基を含む配列を有する領域を増幅することのできるプライマーが挙げられる。これらのプライマーは多型を含む領域（好ましくは５０〜１０００塩基の長さの領域）の両端に設定されたフォワードプライマーとリバースプライマーのプライマーセットであってもよい。また、シークエンス解析や単鎖増幅に用いる場合、上記塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
このようなプライマーやプローブの長さは特に制限されないが、例えば、１０〜１００塩基のオリゴヌクレオチドが好ましく、１５〜５０塩基のオリゴヌクレオチドがより好ましい。なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファーを含むものであってもよい。【００２３】
また、本発明の検査用試薬は、さらにガレクチン−２遺伝子の多型を解析するためのプライマーやプローブをさらに含むものであってもよい。このようなプローブとしては、配列番号２０の塩基配列の３７７番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有するプローブが挙げられ、プライマーとしては、配列番号２０の塩基配列の３７７番目の塩基を含む配列を有するDNAを増幅することのできるプライマーが挙げられる。【００２４】
＜３＞スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、トルライクレセプター（TLR）およびガレクチン−２を含むスクリーニング系に医薬候補物質を添加する工程、TLRとガレクチン−２との相互作用を測定する工程、及び前記相互作用を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法である。【００２５】
TLR及びガレクチン−２（Nature. 2004 May 6;429(6987):72-5.）は、いずれもその遺伝子上の多型が心筋梗塞などの炎症性疾患に関連を示し、かつ、これらのタンパク質は生体内で特異的に相互作用しているため、これらの相互作用を変化させる物質は炎症性疾患に対する医薬の候補物質になりうる。TLRタンパク質としては、TLR1またはTLR2が好ましい。【００２６】
医薬候補物質としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドであってもよい。スクリーニングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。候補物質の中からTLRとガレクチン−２の相互作用を変化させるものを選択することにより、炎症性疾患の治療薬を得ることができる。ここで、「変化」とは相互作用を阻害すること、および相互作用を強化することを含む。【００２７】
TLRおよびガレクチン−２を含むスクリーニング系とは、これらの両タンパク質を含むスクリーニング系を意味し、インビトロの系であってもよいし、細胞系であってもよい。上記スクリーニング系はこれらのタンパク質が直接添加される系であってもよいし、遺伝子から転写されたｍＲＮＡが翻訳されることによりこれらのタンパク質が含まれるようになった系であってもよい。【００２８】
インビトロのスクリーニング系として具体的には、以下に示すような、TLRタンパク質およびガレクチン−２タンパク質を用いたプルダウンアッセイや表面プラズモン共鳴現象を利用した検出法などが挙げられる。【００２９】
インビトロのスクリーニング系に用いられるTLRタンパク質およびガレクチン−２タンパク質は組換えタンパク質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。さらに、化学合成したものであってもよい。タンパク質の由来に制限はなく、ヒトおよび他の動物を含む真核生物由来の蛋白質を用いることができるが、好ましくは、ヒト由来のタンパク質が用いられる。ヒト由来のTLR１タンパク質としては、配列番号１３のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ヒト由来のTLR２タンパク質としては、配列番号１５のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、ガレクチン−２との結合性を保持する限りにおいて、配列番号１３または１５のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸が置換・欠失・付加された配列を有するものであってもよい。
一方、ヒト由来のガレクチン−２タンパク質としては、配列番号１７のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、TLR２との結合性を保持する限りにおいて、配列番号１７のアミノ酸配列において位置または数個のアミノ酸が置換・欠失・付加された配列を有するものであってもよい。なお、上記数個とは、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜２０個、特に好ましくは２〜１０個である。【００３０】
また、タンパク質は結合部位を含む部分ペプチドを使用してもよい。TLRは分子量が大きく発現が必ずしも容易でないため、ガレクチン−２との結合に関与する細胞内ドメインを用いてもよい。または他のペプチドとの融合タンパク質を用いてもよい。融合させるペプチドとしては、例えば、プルダウンアッセイや精製に使用できるGST、Hisタグ、Sタグなどのペプチドタグが挙げられる。【００３１】
組換えによりタンパク質を得るためには、例えば、配列番号１２（TLR１）、配列番号１４（TLR２）や配列番号１６（ガレクチン−２）の塩基配列を有するDNAを大腸菌や動物細胞などに導入して組換えタンパク質を発現させ、該タンパク質を精製することによって得ることができる。なお、必ずしも精製されたタンパク質を用いる必要はなく、粗精製物や細胞抽出物を相互作用の検出に使用してもよい。上記ＤＮＡを大腸菌に導入するためのベクターとしてはpETベクター（Novagen社）やpGEXベクター（Amersham Pharmacia社）などが挙げられ、動物細胞に導入するためのベクターとしては、pcDNAベクター（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ（Invitrogen）などが挙げられる。【００３２】
インビトロの系として、プルダウンアッセイを行う場合は、TLRとガレクチン−２タンパク質とをインビトロでインキュベートし、一方のタンパク質に対する抗体、またはこのタンパク質が融合タンパク質の場合、融合するペプチドタグに対する抗体やアフィニティカラム等で複合体を回収したのち、該タンパク質に結合する他方のタンパク質を検出することにより、両タンパク質の相互作用を評価することができる。この系に被検物質を添加し、相互作用に影響を与える物質を選択することによってスクリーニングを行うことができる。プルダウンアッセイにおいては、一方のタンパク質を放射性同位体やビオチン等の標識物質で標識し、それを利用して検出してもよい。【００３３】
さらに、インビトロのスクリーニング系として、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用する系を挙げることもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、タンパク質間の相互作用 を微量の蛋白質試料を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることによりTLRおよびガレクチン−２の結合を評価することが可能である。さらに、コンビナトリアルケミストリーを利用したハイスループットスクリーニング（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８４  ｐ１１−１３）などにより本発明のスクリーニング を行うことも可能である。
さらに、その他のスクリーニング系として、蛍光によって検出する系を用いることもできる（Fluorescence Resonance Energy Transfer（FRET））。【００３４】
また、細胞系でスクリーニングを行うこともできる。例えば、免疫沈降を用いる方法を挙げることができる。すなわち、TLRとガレクチン−２とを発現する細胞を培養し、細胞を回収後、一方のタンパク質に対する抗体等で複合体を回収したのち、他方のタンパク質を、そのタンパク質に対する抗体等を用いて検出することにより、両者のタンパク質の相互作用を検出でき、また、該相互作用に与える被検物質の影響を評価することができる。この場合において、両タンパク質は細胞が内因的に発現するタンパク質であってもよいが、どちらかまたは両方のタンパク質を外来的に細胞で発現させることもできる。用いる細胞としては、CHO細胞やCOS細胞などを挙げることができるが、これらに限定されない。
動物細胞内で蛋白質を外来的に発現させる場合、例えば、上述したようなTLRおよび／またはガレクチン−２をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ  Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで当該遺伝子を発現させることができる。なお、これらのタンパク質はＭｙｃタグやＦｌａｇタグなどのペプチドタグとの融合タンパク質として発現させてもよい。【００３５】
細胞を用いたスクリーニング系としては、さらに、酵母または動物細胞などを用いた２ハイブリッド法が挙げられる。
酵母２−ハイブリッド法においては、TLRまたはガレクチン−２のどちらか一方のタンパク質またはその部分ペプチドを、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域等と融合させた融合タンパク質を発現するベクター、そして他方のタンパク質またはその部分ペプチドをＶＰ１６またはＧＡＬ４等の転写活性化領域と融合させた融合タンパク質を発現するベクターを構築し、これらを、レポーター遺伝子をコードするベクターと共に酵母細胞に導入して、被検物質を含む試料の存在下でレポーター活性を指標に化合物のアッセイを行う。TLRタンパク質とガレクチン−２タンパク質との相互作用によりレポーター遺伝子の発現が誘導されるが、被検化合物により両者のタンパク質の相互作用が阻害されると、レポーター遺伝子の発現が抑制される。レポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
２ハイブリッド法によるスクリーニングは例えば、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））などを使用して行うことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
（１）一塩基多型の解析
インフォームドコンセントの得られた日本人の心筋梗塞患者及び非心筋梗塞者（コントロール）それぞれについて、TLR１遺伝子、TLR4遺伝子の一塩基多型を解析した。具体的には、TLR1遺伝子の１８０５番目の塩基の多型については、被検者の血液から単離した染色体DNAを鋳型にし、配列番号４，５のプライマーを用いてPCRを行ってDNAフラグメントを増幅し、得られたフラグメントを制限酵素PstI（Takara）で消化し、４％Nusieve GTGアガロースゲル（Takara）で泳動パターンを解析することにより調べた。
TLR1遺伝子の１３０番目の塩基の多型については、被検者の血液から単離した染色体DNAを鋳型に、配列番号６および７のプライマーを使用してPCRを行い、得られた増幅産物について配列番号１０のプライマーを用いて多型部位のシークエンス解析を行った。
TLR４遺伝子の−１４４０番目の塩基の多型については、被検者の血液から単離した染色体DNAを鋳型に、配列番号８および９のプライマーを使用してPCRを行い、得られた増幅産物について配列番号１１のプライマーを用いて多型部位のシークエンス解析を行った。
なお、解析された心筋梗塞患者は、（i）３０分以上の胸部圧迫感、痛み、胸苦しさなどの病歴を持つ、（ii）少なくとも１の標準誘導又は２の胸部誘導において0.1mVより大きいSTセグメントの上昇を示す、（iii）血清クレアチンキナーゼ濃度が標準値の2倍以上に上昇する、の3つの条件（Nat Genet. 2002 Dec;32 (4):650-4. 2002）のうち2つ以上を満たすことによって心筋梗塞であると診断された患者である。解析結果を表１に示す。【００３７】
【表１】
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【００３８】
【表２】
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【００３９】
【表３】
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【００４０】
表１より、TLR１遺伝子のエクソン１の１３０番目の塩基のT／Cの多型については、心筋梗塞患者ではCが有意に多い (χ２=5.23, P=0.0022; odds ratio=1.23)ことがわかった。また、TLR１遺伝子のエクソン４の１８０５番目の塩基のT／Gの多型については、心筋梗塞患者ではGが有意に多い (χ２=13.4, P=0.00021; odds ratio=2.52)ことがわかった。
さらに、１３０番目の塩基がCCアレルであり、かつ１８０５番目の塩基がTGアレルである被験者（combination）をその他のアレルの被験者（others）と比較したところ、combinationの被験者は心筋梗塞の割合が有意に高いことがわかった(表２；χ２=17.12, P=0.000035; odds ratio=3.01)。【００４１】
表3には、TLR４遺伝子のプロモーター領域の−１４４０番目の塩基のT／C多型と心筋梗塞との関連を示す。それによると心筋梗塞患者ではCが有意に多い （χ２=9.2, P=0.0024; odds ratio=1.15)ことがわかった。【００４２】
（２）TLRとガレクチン−２の相互作用の確認
ＦＬＡＧタグ融合ガレクチン−２（ｇａｌｅｃｔｉｎ−ＦＬＡＧ）の構築
EcoRI, XhoI siteがそれぞれ付加されたgalectin-2に特異的なprimer (配列番号１８及び１９)を用い、ヒト肝臓cDNA (Clontech)をテンプレートとし，PCRを行った。増幅されたフラグメントをEcoRI, XhoI処理し，同様にEcoRI, XhoI処理したpFLAG-CMV5a vector (SIGMA)に連結して、ＦＬＡＧタグ融合ガレクチン−２発現ベクターを得た（ｇａｌｅｃｔｉｎ−２−FLAG）。
ＨＡタグ融合ＴＬＲ１，２，３発現用ベクターはinvivogenより購入した（ＴＬＲ−ＨＡ１，２，３）。【００４３】
ｇａｌｅｃｔｉｎ−２−FLAG発現ベクター及びＴＬＲ−ＨＡ発現ベクターをＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＣＯＳ７細胞（Health Science Research Resources Bank; JCRB9127）に一過的にトランスフェクションした。２４時間後、細胞を、complete protease inhibitor tablet（Ｒｏｃｈｅ；２０ｍｌあたり1錠）及びMG-132（Calbiochm；５μｇ／ｍｌ）を含むｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（20mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl., 0.1% Triton X-100）を用いて不溶性のｄｅｂｒｉｓが沈殿しない程度に１時間以上溶解した。次に、抗ＦＬＡＧタグＭ２アガロース（Sigma）または坑ＨＡアガロース（Santacruz）を用いて４℃で１２−１８時間免疫沈降を行った。沈降物をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後、抗HA抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（Santa Cruz）又は抗FLAG抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma）を用いて可視化した。結果を図１に示す。FLAG抗体を用いて免疫沈降（IP）を行い、得られた沈降物についてHA抗体でウエスタンブロット（WB）を行った結果、ガレクチン−２−ＦＬＡＧによってTLR1、TLR2を共沈降することができた。これにより、TLR１、TLR2とガレクチン−２が特異的に相互作用していることが明らかになった。【００４４】
（３）TLR２の細胞内領域とガレクチン−２の相互作用の確認
TLR２の細胞内領域（配列番号１５の６１４〜７８４番目の領域）とSタグの融合タンパク質を発現させるためのベクターを構築した。まず、配列番号２１，２２のプライマーを用いてTLR２の細胞内領域をコードするDNAフラグメントを増幅し、これをpTriEx4ベクター（Novagen社）に挿入した（S-tag-TLR２ID）。
ｇａｌｅｃｔｉｎ−２−FLAG発現ベクター及びS-tag-TLR２ID発現ベクターをＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＣＯＳ７細胞（Health Science Research Resources Bank; JCRB9127）に一過的にトランスフェクションした。S-Proteinを用いて免疫沈降を行った後、S-Proteinまたは坑FLAG抗体を用いてウエスタンブロット（WB）を行った。その結果、TLR２の細胞内領域とガレクチン−２が相互作用していることがわかった。
【産業上の利用の可能性】
【００４５】
本発明の判定方法によれば心筋梗塞等の炎症性疾患を早期に発見することができ、診断分野等において有用である。また、本発明のスクリーニング方法によれば、心筋梗塞等の炎症性疾患に対する新規医薬を得ることができ、医薬分野等において有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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