(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列SEQ ID No.2を含むULIP 6と命名された精製ポリペプチド、又は該ポリペプチドのうち配列SEQ ID No.4を含むエピトープ断片。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチド又はエピトープ断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項３】
ヌクレオチド配列SEQ ID No.1を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
ヌクレオチド配列SEQ ID No.3からなる、又はSEQ ID No.1のヌクレオチド1からヌクレオチド162までの配列からなる単離核酸。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸を収めたクローニングベクター及び／又は発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体、あるいは該モノクローナル又はポリクローナル抗体の断片、キメラ抗体又はイムノコンジュゲートであって、請求項１に記載のポリペプチドに対し特異的であるもの。
【請求項８】
傍腫瘍性神経症候群の診断及び／又は腫瘍形成の早期診断に有用な、請求項１に記載のポリペプチド又はエピトープ断片を含有する組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドの、生体試料中の抗CV2抗体の検出への使用。
【請求項１０】
請求項７に記載のモノクローナル又はポリクローナル抗体、あるいはその断片、キメラ抗体又はイムノコンジュゲートの、生体試料中の請求項１に記載のULIP 6ポリペプチドの精製又は検出への使用。
【請求項１１】
アミノ酸配列SEQ ID No.2を含むポリペプチドに対する自己抗体が個人から予め採取された生体試料中に存在することが明らかにされる、傍腫瘍性神経症候群の診断及び／又は腫瘍形成の早期診断のためのインビトロアッセイ方法であって:
−  個人から予め採取された生体試料を、随意に支持体へと付着させたアミノ酸配列SEQ ID No.2を含むポリペプチドへと、該ポリペプチドと該生体試料中に存在する可能性のある自己抗体の間での特異的免疫複合体の形成を可能にするようなインビトロ条件下で、接触させるステップ、及び
−  形成される可能性のある該特異的免疫複合体を検出するステップ、
を含む前記インビトロアッセイ法。
【請求項１２】
次の構成要素:
−  随意に支持体に付着させた請求項１に記載の１以上のULIP 6ポリペプチド、及び
−  抗ULIP 6自己抗体と該ULIP 6ポリペプチドの間の特異的抗原／抗体複合体の形成を明らかにする手段、及び／又は該複合体を定量する手段。
を含む、生体試料を使用して傍腫瘍性神経症候群を診断するための、また腫瘍形成を早期診断するためのキット。
【請求項１３】
生体試料中の抗CV2抗体の存在又は不在を検出する方法であって、以下のステップ：
−  該試料を、アミノ酸配列SEQ ID No.4を含む精製ポリペプチドへと、該ポリペプチドと該自己抗体の間での特異的抗原／抗体複合体の形成を可能にするようなインビトロ条件下で、接触させるステップ、及び
−  該複合体を検出するステップ、
を含み、ここで、複合体が検出される場合、抗CV2抗体が該生体試料中に存在し、一方、複合体が検出されない場合、抗CV2抗体が該生体試料中に存在しない、前記方法。
【請求項１４】
前記生体試料は、血液、脳脊髄液又は血清を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは支持体に付着されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
生体試料中の抗CV2抗体の存在又は不在を検出する方法であって、以下のステップ：
−  該試料を、アミノ酸配列SEQ ID No.2を含む精製ポリペプチドへと、該ポリペプチドと該自己抗体の間での特異的抗原／抗体複合体の形成を可能にするようなインビトロ条件下で、接触させるステップ、及び
−  該複合体を検出するステップ、
を含み、ここで、複合体が検出される場合、抗CV2抗体が該生体試料中に存在し、一方、複合体が検出されない場合、抗CV2抗体が該生体試料中に存在しない、前記方法。
【請求項１７】
前記生体試料は、血液、脳脊髄液又は血清を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは支持体に付着されている、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規ヒトULIP/CRMPタンパク質とそのがん及び傍腫瘍性神経症候群の診断治療への使用に関する。
【０００２】
傍腫瘍（新形成）性神経症候群(PNSs)はがんの発現に際してしばしばその発見に先立って発症し、また腫瘍の増殖自体(初発、転移)にも治療にも関連しない。その発症頻度はがん全体の約1%である。いくつかの臨床像 (脳脊髄炎、Denny-Brown感覚性ニューロパシー、小脳萎縮、縁辺脳炎、眼球クローヌスなど) が長期にわたり個別化されてきたが、それらは実際には特定神経細胞群の選択的又は差別的発作に対応している。病変近傍における炎症細胞の出現頻度から長年、自己免疫過程又はウィルス疾患過程の可能性が考えられた。もっと最近になって、腫瘍のタイプ及び変性神経細胞のタイプに特異的である自己抗体がPNS患者の血清中及び脳脊髄液(CSF)中に存在することが証明されたため、この病理状態を引き起こす要因は自己免疫であるとの仮説が息を吹き返した(Graus et al., 1985; Greenlee et al., 1983)。
【０００３】
患者血液及びCSF中の高力価の自己抗体の存在とは別に、PNSsは自己免疫機序に由来するという議論がある (Anderson et al., 1987)。中枢神経系に認められる抗原が患者腫瘍中にも存在するのはそのためだとする。腫瘍組織内にはこれらの抗原に対して、またB及びT細胞に対しても特異的な抗体が見られる(Hetzel et al., 1990)。
【０００４】
これらのデータは、自己免疫過程が腫瘍抗原の発現を引き金として起こる可能性のあることを示唆する。中枢神経系の病変は交差免疫過程に起因する可能性がある。他の議論もまた、脳の病変が自己免疫反応に起因することを示唆している。そのため、患者の脳では血清やCSFに比べて特異的抗体価が高いとする(Dalmau et al., 1991)。さらに、抗Hu抗体に関連する脳脊髄炎の場合には、破壊途上にある神経細胞近傍にB及びT細胞からなる激しいリンパ球反応が存在する(Dalmau et al., 1991; Graus et al., 1990)。
【０００５】
これまでに、免疫学的、神経学的及びがん関連基準に応じた症候群の厳密なグループ分けを可能にする数タイプの自己抗体が記述されてきた。
【０００６】
たとえば、抗Yo抗体は傍腫瘍性小脳萎縮や産婦人科(卵巣、乳又は子宮)がんを患う女性の血清及びCSF中に見られる(Greenlee et al., 1983; Jaeckle et al., 1985)。
【０００７】
これらの抗体は、小脳のプルキニェ細胞に特異的な34kDaと62kDaの2種類の細胞質タンパク質を認識する。
【０００８】
抗Ri抗体は、眼球ミオクローヌス、小脳症候群及び乳がんの(主に女性)患者の血清及びCSF中に見られる。これらの抗体は中枢神経系の神経細胞に特異的な50kDaと80kDaの2種類のタンパク質を認識する(Luque et al., 1991)。
【０００９】
抗Hu抗体はPNSsの進行過程で最も一般に見られる。抗Hu抗体が見られるのは、Denny-Brown症候群又は脳脊髄炎及び小細胞肺がんの患者の血清中及びCSF中である(Graus et al., 1985; Dalmau et al., 1992)。これらの抗体は神経系のすべての神経細胞で特異的に発現する37〜45 kDaの数種のタンパク質を認識する。
【００１０】
PNS患者ではもう1つのタイプの自己抗体、すなわち抗CV2抗体がすでに同定されている(Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996)。これらの抗体は非定型抗体である。というのは、4患者の脳の死後検査により神経細胞の欠損、グリオーシス及びPNSsに特徴的な炎症過程の観察が可能になるとはいえ、成人において認識される抗原の標的は本質的に非神経細胞だからである。
【００１１】
抗CV2抗体発見のオリジナリティーは第1に、その存在の立証にある。このタイプの自己抗体はそれまで、死後脳を対象とする通常の検査、すなわち認識された抗原を免疫組織化学法で明らかにする検査をすべてすり抜けていた。認識された抗原は実際には可溶性であり、大多数の固定条件下では死後脳から消滅してしまう。パラホルムアルデヒドへの浸漬によるヒト死後脳組織の固定又は動物へのパラホルムアルデヒドの潅流によるin situ固定により初めて、PNS患者のCSF又は血清中の抗CV2抗体の存在を明らかにすることが可能になった(Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996)。
【００１２】
傍腫瘍性神経症候群(PNS)患者の血清中に存在する抗CV2自己抗体は、間接免疫組織化学法により、成熟ラット脳内で脳幹、髄質及び小脳の希突起膠細胞の部分母集団が特異的に発現する細胞質抗原を認識するその能力によって特徴付けられるに至った。
【００１３】
抗CV2抗体発見のオリジナリティーは第2に、その診断面の有用性にある。患者血清又はCSF中のその存在は、神経症候群の傍腫瘍性の特定を可能にするため、診断面で有用である。抗CV2抗体の発見は、それががんの発見に先行する場合には、がん検査に道を開き、がんの早期発見を可能にする。抗CV2抗体をもつ19患者中6患者はそのような例であった。臨床像は患者次第で異なり、縁辺脳炎を示す患者もいれば、脳脊髄炎を示す患者もいれば、またLambert-Eaton症候群を示す患者もいた。それにもかかわらず、症例の60%余りでは小脳症候群が支配的であった。最も一般的な随伴腫瘍は小細胞肺がんであった(症例の60%)。
【００１４】
新生ラットの脳を対象にした実験では、抗CV2抗体は66kDaのタンパク質と反応することが判明した(Honnorat et al., 1996)。
【００１５】
成人の脳では、この抗原は希突起膠細胞の部分母集団中に、又は成人の脳にあって分化能を保持している細胞(嗅球、歯状回)中に、局在する。認識された該抗原は、PNS患者の死後脳で観察される神経細胞の欠損が示唆するように、神経細胞／希突起膠細胞の相互作用を通じて神経細胞の生存に寄与すると考えられる。
【００１６】
成人に見られるその非常に限定的な発現は発達途上の中枢及び末梢神経系での非常に強い一時的な発現とは対照的であり、それは神経系の発達で果たすと推定されるこの抗原の役割を示唆する。
【００１７】
出願WO 98/37192及びHonnorat et al.(1999)論文では、抗CV2自己抗体の標的抗原、すなわち傍腫瘍性希突起膠細胞タンパク質66kDa (paraneoplastic oligodendrocyte protein 66 kDa)を略してPOP-66と命名されたタンパク質に対応する抗原がヒト型ULIP-4タンパク質として同定された。ULIP [Unc-33様リンタンパク質(Unc-33 like phosphoprotein)の略]は神経の発達と軸索輸送の調節に関与するタンパク質である(Byk et al., 1996)。ULIPファミリーのタンパク質はすでに4種類が3チーム(Byk et al., 1998; Wang and Strittmatter, 1996; Hamajima et al., 1996)により同定されていた。このファミリーに属する可能性のあるタンパク質をさらに探し求める徹底的な研究が行われたが徒労であった。
【００１８】
本発明者はその後、出願WO 98/37192による同定とは首尾一貫しない新たな結果に直面した。すなわち、Hela細胞を対象に試験したすべての抗CV2血清は免疫組織化学法では確かに組換えULIP 4タンパク質を認識したものの、同じ細胞抽出物を対象にしたウェスタンブロット法ではULIP 4タンパク質を認識したのはこれらの血清のうち20%にすぎなかった。そのうえ、脳抽出物を対象にしたウェスタンブロット法でも、免疫沈降後には試験したすべての抗CV2血清が同じ66kDaタンパク質を認識した。さらに、in situハイブリダイゼーションでは希突起膠細胞内でのULIP4 mRNAの発現は非常に弱いものにすぎなかった。これらのデータから、本発明者は希突起膠細胞中で強く発現し、かつウェスタンブロット法ですべての抗CV2血清によって認識される未同定の新規ULIPファミリーメンバーが存在するものと想定した。
【００１９】
本発明者は今日、出願WO 98/37192による提唱に反し、抗CV2自己抗体の主要な標的抗原であるPOP-66がULIP 4タンパク質ではなく別のタンパク質であることを立証済みである。本発明者はこのタンパク質の特性解明にもすでに成功している。それはULIPファミリーの新規ヒトタンパク質であり、ULIP 6と命名した。
【００２０】
ULIP 6はそのC末端部分に、ウェスタンブロット法で抗CV2自己抗体により認識される大きなエピトープを含む。
【００２１】
したがって、本発明の主題はアミノ酸配列SEQ ID No.2を含む精製ULIP 6ポリペプチドである。
【００２２】
前述のポリペプチドのエピトープ断片もまた本発明に包含され。より具体的に言えば、本発明の主題は配列SEQ ID No.4の精製ペプチドである。
【００２３】
本発明の主題はまた、前述のULIP 6ポリペプチドをコードする、好ましくはヌクレオチド配列SEQ ID No.1を含む単離核酸である。配列SEQ ID No.1は5’非コード領域(ヌクレオチド1〜162)、オープンリーディングフレーム(ヌクレオチド163〜1854)、及び3’非コード領域(ヌクレオチド1855〜3074)を有する。
【００２４】
本発明の主題はまた、ヒトコード配列SEQ ID No.1の3’非コード領域に対応するヌクレオチド配列SEQ ID No.3を含む単離核酸である。この非コード配列は5’非コード部分(SEQ ID No.1のヌクレオチド1〜162)と共に特に特異的プローブの調製に使用されよう。
【００２５】
本発明のポリペプチドは技術上周知の諸々の方法で合成することができる。本発明のポリペプチドはたとえば、純度、抗原特異性、無用の副産物の排除、生産し易さの点で有利であるMerrifieldタイプの合成などのような化学合成法で合成してもよい。
【００２６】
配列SEQ ID No.1を含む核酸を収めたベクターを宿主細胞中に導入し、対応するポリペプチドの発現を許容するような条件下で該宿主細胞を培養するという方法で組換えULIP 6タンパク質を産生させてもよい。
【００２７】
産生されたタンパク質は次に回収、精製することができる。
【００２８】
使用する精製法は技術上周知である。得られた組換えポリペプチドの細胞溶解物からの、また培地上清からの精製には、分画法、クロマトグラフィー法、特異的単クローン又は多クローン抗体などの使用によるイムノアフィニティー法を用いることができる。
【００２９】
ULIP 6ポリペプチドをコードする核酸配列は、その発現を調節するエレメント、たとえば特に転写プロモーター、アクチベーター及び／又はターミネーターと機能的に連結して発現ベクター中に挿入してもよい。
【００３０】
ヌクレオチド配列の発現を調節するシグナル配列(プロモーター、アクチベーター、ターミネーター)は、使用宿主細胞に応じて選択する。本発明のヌクレオチド配列はこれを目的に、選択された宿主中で自己複製するベクターに、又は選択された宿主と一体化するベクターに、挿入してもよい。その種のベクターは技術上周知慣用の方法で作製されようが、そこから得られるクローンは標準方法、たとえばエレクトロポレーション法又はリン酸カルシウム法を用いて好適な宿主に導入することができる。
【００３１】
本発明のヌクレオチド配列を収めた前述のクローニング及び／又は発現ベクターもまた本発明に包含される。
【００３２】
本発明はまた、これらの発現ベクターが一時的又は安定的に導入された宿主細胞に関する。これらの細胞は、前述のベクターに挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、次いで導入されたヌクレオチド配列の複製及び／又は発現を許容するような条件下で該細胞を培養することによって得ることができる。
【００３３】
宿主細胞は細菌などのような原核生物系、又はたとえば酵母、昆虫細胞、CHO(チャニーズハムスター卵巣)細胞などのような真核生物系、又は他の有利に利用可能な生物系から選択してよい。本発明のタンパク質の発現にとって好ましい宿主細胞は細菌E. coliからなる。
【００３４】
本発明のヌクレオチド配列は人工起源でもそれ以外でもよい。また、配列SEQ ID No.1又はNo.3を土台にして作製されたプローブを用いて配列ライブラリーをスクリーニングすることによって得られるDNA又はRNAでもよい。そうしたライブラリーは技術上周知の通常の分子生物学的手法で作製されよう。
【００３５】
本発明のヌクレオチド配列はまた、化学合成で作製しても、又はライブラリーのスクリーニングによって得られる配列の化学的又は酵素的修飾を含む混合的方法で作製してもよい。
【００３６】
この核酸は、本発明のポリヌクレオチド又はその生物活性断片をコードする核酸配列、ゲノムDNA配列又はメッセンジャーRNA配列と強力かつ特異的にハイブリダイズすることができるヌクレオチドプローブの作製を可能にする。好適なハイブリダイゼーション条件は、技術上慣用の温度及びイオン強度条件(Sambrook et al., 1989)に対応し、好ましくは[Tm−5℃]と[Tm−30℃]の間の温度条件に、より好ましくは[Tm−5℃]と[Tm−10℃]の間の温度(高ストリンジェンシー)条件に対応する。ただし、Tmは理論融解温度であり、50%の相補対が離れる温度と定義される。本発明にはそうしたプローブもまた包含される。それらは、本発明のポリペプチドに対応する生体試料中の転写産物をハイブリダイゼーション実験によって検出するための、又は多型、突然変異又は不正確なスプライシングに由来する異常合成又は遺伝子異常を明らかにするための、in vitro診断手段として使用されよう。
【００３７】
本発明のプローブは最小限で10個のヌクレオチドを含み、また最大限でヌクレオチド配列SEQ ID No.1かNo.3又はその相補鎖の全部を含む。
【００３８】
本発明の核酸はまた、高ストリンジェンシー条件下で配列SEQ ID No.1かNo.3とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの作製に使用してもよい。
【００３９】
これらのセンス及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定反応に、又はPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法かその変法による特異的増幅反応に有用であろう。
【００４０】
好ましくは、本発明のプローブ又はプライマーは使用前に標識する。これには技術上周知の手法がいくつかある。たとえば蛍光、放射性、化学発光又は酵素標識法などである。
【００４１】
本発明には、本発明のULIP 6ポリペプチドをコードする核酸配列からヘテロ接合性の消失や遺伝子再編成などのような異常合成又は遺伝子異常を検出するためにこれらのプローブが使用されるin vitro診断法もまた包含される。その種の方法は次のステップを含む:
−  本発明のヌクレオチドプローブを、該プローブと前述のヌクレオチド配列との間で、随意に該ヌクレオチド配列の増幅という先行ステップの後に、ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするような条件下で、生体試料と接触させる
−  形成される可能性のあるハイブリダイゼーション複合体を検出する、及び
−  随意に、本発明のプローブとハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド配列の配列を決定する。
【００４２】
本発明のプローブはまた、染色体異常の検出に有利に使用することができる。
【００４３】
さらに、本発明のヌクレオチド配列は治療分野で、メッセンジャーRNAを含む核酸配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンス配列を作製するうえでも有用であり、得られるアンチセンス配列は遺伝子治療に使用することができる。よって、本発明の主題は前述のような本発明のポリペプチドの産生を、少なくとも部分的に、阻害することができるアンチセンス配列である。
【００４４】
それらのアンチセンス配列は、中枢及び末梢神経系障害や視覚障害の治療に、特に傍腫瘍性神経症候群の治療に、また抗がん治療、特に傍腫瘍性神経症候群に随伴する腫瘍の治療に、とりわけ有用である。
【００４５】
ULIPタンパク質特にULIP 6の利用、またこれらのタンパク質に対する抗体の利用は様々な分野で有望である。
【００４６】
たとえば、固定動物脳を対象にした抗CV2自己抗体の免疫蛍光法による検出は目下、診断検査として利用されている。
【００４７】
本発明による組換えULIP 6タンパク質の産生は、抗CV2抗体を検出するための迅速確実な(Elisa法又はウェスタンブロット法タイプの)検査法の実現を可能にする。
【００４８】
そうした検査法は抗Hu、抗Yo及び抗Ri抗体に関してはすでに存在している。傍腫瘍性神経症候群が疑われる場合には患者血清中の抗CV2抗体を検出するための検査法を指示することができるであろうし、したがって抗CV2抗体だけでなく前述のようなPNSsで同定される他抗体も検査対象に含まれよう。
【００４９】
したがって、本発明はまた傍腫瘍性神経症候群の診断及び／又はがん性腫瘍の形成の早期診断のための方法に関するが、該方法では個人から採取した生体試料(血液、血清、CSFなど)中のULIP 6タンパク質に対する抗体の存在が、次のステップにより明らかにされる:
−  個人から採取した生体試料を、随意に支持体へと付着させた精製ULIP 6ポリペプチドへと、該ポリペプチドと該生体試料中に存在する可能性のある自己抗体の間での特異的免疫複合体の形成を可能にするような条件下で、接触させる、及び
−  形成される可能性のある該特異的免疫複合体を検出する。
【００５０】
したがって本発明の主題は、傍腫瘍性神経症候群の診断及び／又は腫瘍形成の早期診断に有用な、ULIP 6ポリペプチド又は該ポリペプチドのエピトープ断片を含む組成物である。
【００５１】
完全長ポリペプチドの代りに、支配的エピトープを含むC末端部分(たとえばアミノ酸No.475からアミノ酸No.564にわたる断片)を使用するのが有利であろう。特に、配列SEQ ID No.4を含むULIP 6ポリペプチドのエピトープ断片が使用されよう。たとえば、配列SEQ ID No.4の該ペプチドはULIP 6に対してきわめて特異的な抗体の産生を可能にしてきた。
【００５２】
本発明の主題はまた、生体試料を使用して傍腫瘍性神経症候群を診断するための、また腫瘍形成を早期診断するための、次の構成要素を含むキットである:
−  随意に支持体に付着させた1以上の精製ULIP 6ポリペプチド、及び
−  抗ULIP 6自己抗体と該精製ULIP 6ポリペプチド(又はポリペプチド誘導体又は断片)の間の特異的抗原／抗体複合体の形成を明らかにする手段、及び／又は該複合体を定量する手段。
【００５３】
本発明の主題はまた、アミノ酸配列SEQ ID No.2又はNo.4を含む精製ULIPポリペプチド又はペプチドを使用して得られる単クローン又は多クローン抗体又は断片、キメラ抗体又はそのイムノコンジュゲート、及び生体試料中のULIPタンパク質の精製又は検出を目的としたそれらの使用である。
【００５４】
多クローン（ポリクローナル）抗体は、該タンパク質をたとえば前述の方法による遺伝子組換えにより通常の手順に従って生成し、該タンパク質に対して免疫にした動物の血清から得られよう。
【００５５】
単クローン（モノクローナル）抗体はKoehler and Milsteinが記述している在来ハイブリドーマ培養法に従って得られよう。
【００５６】
抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、それにFab及びF(ab’)2フラグメントであろう。それらもまたイムノコンジュゲート又は標識抗体の形をとってよい。
【００５７】
本発明はまた、診断を目的に腫瘍及び傍腫瘍性神経症候群におけるULIP 6タンパク質の存在を明らかにするための、ULIP 6タンパク質に対する抗体の使用に関する。
【００５８】
好ましくは、本発明は周知慣用の技術による白血球の不滅化によって患者の多クローン抗CV2血清から得られる単クローン抗体の使用に関する。
【００５９】
たとえば、ULIPファミリーのタンパク質に対する抗体は、在来法による診断でまだがんが発見されていない神経症候群患者におけるULIPタンパク質の異常発現を検出するうえで有用である。このULIP 6タンパク質の異常発現は未発見のがんの存在と関連する可能性がある。したがって、ULIP 6タンパク質に対する抗体はがんの早期診断に有用である。
【００６０】
患者から得られる、又は前述のようなULIP 6タンパク質の全部又は一部で免疫した後に得られるヒト又は非ヒト抗体は、たとえば放射性元素を結合させることにより検出可能に標識してから、個人に注射してもよい。技術上周知の画像化法を使用すれば、これらの抗体の腫瘍細胞との抗原反応後にがん性腫瘍の検出又は診断を行うことが可能になろう。
【００６１】
したがって、本発明の主題はまた、がん性腫瘍を検出又は診断するための方法であって、検出可能に標識した前述のような抗体の患者への投与及び該抗体の付着部位の画像化法による視覚化を含む方法である。
【００６２】
本発明の主題はまた、精製ULIP 6タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸、ヌクレオチド配列SEQ ID No.1又はNo.3と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンス配列、又は該タンパク質に対する抗体から選択される治療剤及び該治療剤と混合した製薬上許容しうる担体とを含有する製剤組成物である。本発明は好ましくは、有効成分として好ましくは可溶性の形にした精製ULIP 6ポリペプチド、及びそれと混合した製薬上許容しうる担体とを含有する製剤組成物を含む。
【００６３】
そうした組成物は中枢・末梢神経系の障害及び視覚障害特に傍腫瘍性神経症候群を治療するための新しい方針を提供する。さらに、そうした組成物は神経系における神経細胞欠損及び／又はULIP 6タンパク質の過剰発現の治療に有用である。
【００６４】
たとえば、ULIP 6は神経変性病理状態にも有用である。それはたとえば、希突起膠細胞小集団の異常がすでに判明しているPNSs類似の障害であり(Rapp et al., 1992)。
【００６５】
本発明の組成物はさらに、抗がん治療にも有効である。
【００６６】
ULIP 6タンパク質に対する抗体は抗腫瘍薬と併用して、該薬剤を腫瘍細胞に集中させるようにしてもよい。
【００６７】
ULIP 6タンパク質と前述のヌクレオチド配列、それにアンチセンス配列又はオリゴヌクレオチドは、ULIP 6タンパク質をコードする遺伝子が関与する任意タイプのがんの治療に有用であろう。そうしたがんの例としては、末梢性腫瘍たとえば小細胞肺がん、胸腺種、乳がん及び卵巣がん、それに脳腫瘍、好ましくはグリア起源の原発性脳腫瘍があげられよう。これとの関連では、ULIP 6は正常脳の非増殖細胞内で発現すること、それはたとえば肺又は胸腺などのような正常組織には見られないこと、それはこれらの組織内で腫瘍形成時に差別的に再発現すること、及び腫瘍系において分化時のその発現が調節されることは、ULIP 6が腫瘍抑制遺伝子に由来するという可能性を示唆する。
【００６８】
ULIP 6の作用を阻害する合成又は天然起源の化合物又は化合物ミックスを使用してもよい。
【００６９】
あるいは、ULIP 6の刺激が望ましいかもしれない。その場合にはULIP 6タンパク質の発現又は作用を活性化する合成又は天然起源の化合物又は化合物ミックスを使用することができる。
【００７０】
これらの活性化又は阻害化合物は製剤組成物中に含めてもよい。
【００７１】
何よりも、本発明の製剤組成物は好ましくは静脈内、筋内、皮内又は経口法により全身投与するのがよい。
【００７２】
その最適投与法、用量及び剤型は、患者に適した治療処置を決め際に一般に考慮される基準、たとえば患者の年齢又は体重、症状全般の重篤度、該処置に対する耐性、及び観察される副作用などに応じて決定されよう。
【００７３】
本発明はまた、精製ULIPタンパク質、該タンパク質をコードする又はULIP 6遺伝子の非コード領域に属する核酸、ヌクレオチド配列SEQ ID No.1又はNo.3と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンス配列、又は該タンパク質に対する抗体の、製薬上許容しうる担体と組み合せた、神経変性疾患及び腫瘍の治療を目的とした製剤への使用を含む。
【００７４】
最後に本発明の主題は、神経変性疾患及び腫瘍を治療するための方法であって、前述の製剤組成物の治療有効量をそうした治療を必要とする患者に投与することを含む方法である。
【００７５】
以下、説明を目的に実施例と凡例を添えた図を示す。
【００７６】
実施例1:  抗CV2抗体の標的の同定
本発明者は、ULIP 4ファミリーの組換えタンパク質をHela細胞中で発現させた後、当時本発明者が保有していた抗CV2血清がいずれもULIP 4を認識することを免疫組織化学法で証明することができた。この結果は、ULIP 4が抗CV2血清によって認識される主要抗原であるという可能性を示唆するものであった(Honnorat et al., 1999)。他方、E. coli中で発現させたULIP 4タンパク質を対象にウェスタンブロット法でもっと大きな血清群を検査すると、いくつかの抗CV2血清は確かに組換えULIP 4タンパク質を認識するものの、それを認識しない血清もあること、ただし脳由来のタンパク質を免疫沈降させた後ではすべてのCV2血清がウェスタンブロット法で同じ66kDaタンパク質を認識することが判明した(Honnorat et al., 1996)。さらに、in situハイブリダイゼーション法では希突起膠細胞はULIP 4メッセンジャーRNAを発現しなかった。そこで本発明者は、ULIPタンパク質と同族ではあるが、まだ記述されてない、また希突起膠細胞では発現されない別のタンパク質が存在するとの仮説を提出した。
【００７７】
このタンパク質を探すために、ウェスタンブロット法では組換えULIP 4を認識しなかった抗CV2血清を発現ライブラリーのスクリーニングに用いた。λgt11ファージ中にクローニングされたヒト脊髄(成人でCV2抗原の発現が最大である部位) cDNAライブラリー(Clontech, Palo alto, USA)を選択した。該ファージのスクリーニングを2×104 pfu毎150 mm径ディッシュの密度で行った。42℃での3時間半にわたるインキュベーション後に、IPTG (10mM) 中でインキュベートしたニトロセルロースフィルターでディッシュを覆い、37℃で3時間再インキュベートした。次に、フィルターにPBS-Tween-スキムミルクを飽和させ、次いで1/100に希釈した血清で一晩インキュベートした。次にフィルターをPBS-Tweenで洗い、次いでペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗血清でインキュベートした。フィルターを洗浄後、ジアミノベンジジン法で発色させた。陽性クローンを、100%の陽性クローンが得られるまで順次継代培養した。同じタンパク質のC末端部分をコードする1400〜1700塩基対の4つのcDNAを同定した。最大のコード配列をもつクローン(クローン97)は1490塩基対(SEQ ID No.1のヌクレオチド1585〜3074)を含み、90アミノ酸のポリペプチド(SEQ ID No.2のアミノ酸475〜564)をコードする270ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有していた。データバンクでの相同性検索により、このポリペプチド(本書では以下ULIP6 C-Termと呼ぶ)はULIPファミリーの各既知タンパク質のC末端部分と35%の相同性を示し、また他タンパク質ファミリーとの相同性はないことが判明した。
【００７８】
実施例2:  組換えタンパク質GST-ULIP6 C-Termの産生
このポリペプチドが実際に抗CV2血清によって認識された抗原であることを確認するために、クローン97のコード領域を細菌発現ベクターpGex 2T (Pharmacia Amersham Biotech, Sweden)中にクローニングした。このベクターは、目的タンパク質がE. coli中でグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST, 26kDa)との融合体として発現することを可能にする。ウェスタンブロット法では、試験した18抗CV2血清のうち16血清が細菌タンパク質抽出物中のGST-ULIP6 C-Term融合タンパク質を認識した(陽性率89%) (図1)。ULIP6 C-Termポリペプチドの分子量が10kDaであり、66kDaタンパク質の約15%を占めることは注目に値する。これらの血清はいずれも単独のGSTを認識しなかった。100のコントロール血清も検査したが、GST-ULIP6 C-Term融合タンパク質に対して反応性を示すものはなかった。検査を可能な限り特異的にするために、本発明者は、アガロース−グルタチオンビーズで精製したGST-ULIP6 C-Term融合タンパク質で抗CV2血清を検査した。図2はウェスタンブロット法で得られた結果の一例である。
【００７９】
実施例3:  ヒト脊髄RNAに対するノーザンブロット法の実施
ULIP 6遺伝子の転写産物のサイズを求めるために、ヒト脊髄から抽出した精製ポリA+ RNAs (Clontech, Palo alto, USA)を対象にノーザンブロット法を実施した。プローブはα-32P dCTPで標識した全クローン97に対応した。RNAsを1.2%アガロースホルムアルデヒド電気泳動ゲル上で分離し、ナイロンフィルター上に移した。フィルターはハイブリダイゼーション液(Clontech, Palo alto, USA)でプレハイブリダイズした後、プローブと1時間インキュベートした。フィルターを洗浄後、−80℃で一晩フィルムに焼き付けた。5kb転写産物に対応する単一バンドが現れた。
【００８０】
実施例4:  脊髄でのin situハイブリダイゼーション
希突起膠細胞内にULIP 6メッセンジャーRNAが存在することを確認するために、脊髄前部切片でin situハイブリダイゼーション分析を実施した。使用プローブは、pBluescript SK (Stratagene)中にサブクローニングしたクローン97の転写によって得られた、ジゴキシゲニンで標識したコールドRNAプローブであった。ネガティブコントロールとしてセンスプローブを使用した。希突起膠細胞の特異的標識を観察することができた。
【００８１】
実施例5:  ウサギ抗ULIP 6抗体の産生
ULIP 6タンパク質に特異的なペプチド(SEQ ID No.2のアミノ酸断片505〜524に対応するSEQ ID No.4のペプチドRep ULIP 6 = “KEMGTPLADTPTRPVTRHGG”)に対してウサギを免疫して単クローン抗体を産生させた。該ペプチドはCOVALAB社(Lyon, France)がペプチド合成機で合成した。試料純度はHPLCと質量分析で調節した。ヘモシアニンに結合させたペプチド1mgをフロイント完全アジュバントと共にウサギ (COVALAB, Lyon, France) に注射した。3週間ごとに、さらに0.5mgの注射を行った。抗体の産生とその特異性はウェスタンブロット法と免疫組織化学法で、免疫前血清をコントロールとして分析した。
【００８２】
得られた抗体はウェスタンブロット法では脳抽出物上でGST-ULIP6 C-Termタンパク質すなわち66kDaタンパク質を、また免疫組織化学法ではラット脊髄切片上で特異的に標識した希突起膠細胞を認識した。
【００８３】
実施例6:  完全長ULIP 6配列の探索
完全長ULIP6 cDNAを得るために、λgt11ファージ中にクローニングされたヒト脊髄cDNAライブラリー(Clontech, Palo alto, USA)を放射性プローブでスクリーニングした。PCRで得られたこのプローブはα-32P dCTPで標識したが、SEQ ID No.1のヌクレオチド1585〜1854に対応していた。該ファージのスクリーニングを2×104 pfu毎150 mm径ディッシュの密度で行った。37℃での6時間にわたるインキュベーション後に、ナイロンフィルター上にレプリカを得た。このフィルターを処理してファージを変性させるようにし、次いでDNAを42℃で一晩固定した。急速ハイブリダイゼーション液(Clontech, Palo Alto, USA)でプレハイブリダイズした後、フィルターを放射性プローブで1時間インキュベートした。フィルターを洗浄後、−80℃で一晩フィルムに焼き付けた。陽性シグナルを示すクローンを、100%の陽性クローンが得られるまで順次継代培養で精製した。得られた最大のcDNAは3074ヌクレオチド(SEQ ID No.1)を含み、また1692ヌクレオチドのオーブンリーディングフレーム(SEQ ID No.1のヌクレオチド163〜1854)を含んでいた。該cDNAは564アミノ酸のタンパク質(SEQ ID No.2)をコードしていたが、そのC末端部分はULIP6 C-Termポリペプチド(SEQ ID No.2のアミノ酸475〜564)と厳密に一致した。得られたタンパク質の既知ヒトULIP/CRMPタンパク質4種とのアラインメントにより50%の相同性が観察された。
参考文献
−  Anderson et al., CRC Crit. Rev. Neurobiol., 1987, vol. 3, pp 245-99
−  Antoine J.C. et al., Journal of the Neurological Sciences, 1993, vol. 117, pp 215-223
−  Byk et al., Journal of Neuroscience, 1996, vol. 16(2), pp 688-701
−  Byk T., Ozon S., Sobel A., (1998). Eur. J. Biochem, 254:14-24
−  Dalmau et al., Neurology, 1991, vol. 41, pp 1757-64
−  Graus et al., Neurology, 1985, vol. 35, pp 538-543
−  Greenlee et al., Ann. Neurol., 1983, vol. 14, pp 609-13
−  Hamajima N., Matsuda K., Sakata S., Tamaki M., Nonaka M., (1996). Gene, 180:157-163
−  Hetzel et al., Mayo Clin. Proc., 1990, vol. 65, pp 1558-63
−  Honnorat J. et al., Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, 1996, vol. 61, pp 270-278
−  Jaeckle et al., Ann. Neurol., 1985, vol. 18, pp 592-600
−  Koehler and Milstein, Nature, 1975, vol. 256, pp 495-497
−  Levy N., Mattei M.G., 1995, Geneprobs II, a practical approach, B.D. Hames and S.J. Higgins, Oxford University Press, pp 211-243
−  Luque et al., Ann. Neurol., 1991, vol. 29, pp 241-51
−  Sambrook et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, 1989, 9.47-9.62
−  Wang L.H. and Strittmatter S.M., (1996). J. Neurosci., 16:6197-6207.
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、GST-ULIP6 C末端融合タンパク質を発現するE. coliのタンパク質抽出物に関するウェスタンブロットである。これらの抽出物はSDS-12.5% PAGEで分離し、PVDFフィルター上に移し、ヒト血清とインキュベートした。レーン1〜14: 抗CV2血清、レーン15〜17: コントロール血清。
【図２】  図2は、アガロース−グルタチオンビーズで精製後のGST-ULIP6 C末端融合タンパク質のウェスタンブロットである。2種類の抗CV2血清(レーン1: 血清94-822、レーン2: 血清95-590)は該タンパク質を認識しているが、コントロール血清(レーン3)は認識していない。
【配列表】
0004990459.tif 000002
0004990459.tif 000003
0004990459.tif 000004
0004990459.tif 000005
0004990459.tif 000006
0004990459.tif 000007
0004990459.tif 000008
【図１】
0004990459.tif 000009
【図２】
0004990459.tif 000010