(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８に示されるカッパ軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号９に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０に示されるＣＤＲ−Ｌ３を含むヒトシアロアドヘジンファクター−２（ＳＡＦ−２）と結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
抗体が、２．０ｘ１０−１０Ｍのアフィニティー平衡定数でヒトＳＡＦ−２と結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
請求項１記載の抗体のイムノグロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項３記載のポリペプチドをコード化する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、配列番号２に示される重鎖可変領域ポリペプチドおよび配列番号４に示されるカッパ軽鎖可変領域ポリペプチドを含む、請求項１記載の抗体。
【請求項６】
配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるメンバーを含むポリペプチドをコード化する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
【請求項８】
サンプルにおいてＳＡＦ−２蛋白を含む細胞の存在を検出する方法であって、
ａ）該サンプルを請求項１記載の抗体に曝すこと；および
ｂ）請求項１記載のＳＡＦ−２と結合する抗体を検出すること
を含む方法。
【請求項９】
ＳＡＦ−２蛋白が抗体によって結合しやすいように、サンプルを抗体に曝す前に処理する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
細胞が好酸球である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、２．０ｘ１０−１０Ｍのアフィニティー平衡定数でヒトＳＡＦ−２と結合する、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、配列番号２に示される重鎖可変領域ポリペプチドおよび配列番号４に示されるカッパ軽鎖可変領域ポリペプチドからなるモノクローナル抗体２Ｃ４である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
単離されたポリペプチドが、モノクローナル抗体、改変抗体、ヒト化抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２である、請求項３記載の単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、シアロアドへジンファクター−２（ＳＡＦ−２）と結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ならびに診断および治療目的のためのかかる抗体の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
好酸球、好塩基球および肥満細胞は、寄生虫感染症、ならびにいくつかの疾患、特に、喘息、鼻炎、およびアトピー性皮膚炎に反応して炎症メディエーターを産生する主たる細胞型として関連付けられてきた（Weller, P.F.(1991) N. Engl. J. Med: 324: 1110; Sur, S., C. et al. (1993) In Allergy Principles and Practice. E. Middleton et al. Eds. Mosby, St. Louis, MO, p. 169; Costa, J. J. et al. (1997) JAMA 278: 1815）。これらの状況において、これら細胞の優先的蓄積および活性化が注目されてきた。好酸球が炎症部位に補充されるという我々の理解はかなり進歩したが、移動プロセス中のこれらの部位への局在化に用いられるメディエーターをはじめとする多くの重要な点が依然として不明である。例えば、微小血管内皮細胞の活性化および接着分子、特にＶＣＡＭ−１の発現はアレルギー性炎症中のこのプロセスの重要な事象であると思われる（Bochner, B.S.(1998) In Allergy Principles and Practice. J. Middleton et al. eds. Mosby, St. Louis）。加えて、多くのケモカインおよび他の走化性因子、例えば、 ＣＣＲ３により作用するものなどは、それらが好酸球、好塩基球および肥満細胞走化性に関与するため関連付けられてきた（Dahinden, C.A. et al.(1999) J. Exp. Med. 179:751; Daffern, P. J. et al. (1995) J. Exp. Med. 181:2119; Nickel, R., L. et al. (1999) J. Allergy Clin. Immunol. 104: 723; Romagnani, P. et al. (1999) Am. J. Pathol 155:1195; Rot, A. et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1489）。しかしながら、もう一つの可能性は、独自の細胞表面表現型のために、特異的な方法でこれらの細胞が選択的に補充され、活性化されることである。好酸球、好塩基球および肥満細胞はこれらの着色特性により容易に同定可能であるが、それでもこれらの細胞サブセット独自の細胞表面マーカーは同定されてない（Saito, H. et al. (1986) Blood 67:50; Bodger, M. P. et al. (1987) Blood 69:1414）。
【０００３】
シアロアドへジンファクター−２、またはＳＡＦ−２（欧州特許公開番号ＥＰ０９２４２９７Ａ１）は、Ｉ−型レクチンとしても知られる蛋白のシアロアドへジンファミリーのメンバーであり、最近、ｓｉｇｌｅｃファミリー（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン）と改名されている（Kelm, S. et al. (1996) Glycoconjugate Journal 13:913）。ファミリーのメンバーは、シアロアドへジン（ｓｉｇｌｅｃ−１）、ＣＤ２２（ｓｉｇｌｅｃ−２）、ＣＤ３３（ｓｉｇｌｅｃ−３）、ミエリン結合糖蛋白（ＭＡＧまたはｓｉｇｌｅｃ−４）、ｓｉｇｌｅｃ−５（Cornish, A. L. et al. (1998) Blood 92:2123）、ＯＢ−ＢＰ−１／ｓｉｇｌｅｃ−６（Patel, N. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:22729）およびＡＩＲＭ１またはｓｉｇｌｅｃ−７（Falco, M. et al. (1999) J. Exp. Med. 190:793; Nicoll, G. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:34089）を包含する。ｓｉｇｌｅｃ−４を除いて、すべては造血細胞の様々なサブセット上で発現される。ｓｉｇｌｅｃはイムノグロブリン（Ｉｇ）超遺伝子科に属し、Ｎ−末端Ｖ−セットＩｇドメインとそれに続いて１−１６Ｃ２セットＩｇドメインを有する。ｓｉｇｌｅｃは他の細胞とのシアル酸依存性接着を媒介し、一般に、α２，３結合（ｓｉｇｌｅｃ−１、−３、および−４）またはα２，６結合（ｓｉｇｌｅｃ−２）のいずれかを選択する（Kelm et al.前掲）。ほとんどのファミリーのメンバーは、ＩＴＩＭまたはＩＴＡＭのホスホチロシンと結合するＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインによるシグナル化に関与する免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）または活性化モチーフ（ＩＴＡＳＭ）のいずれかを有する。このことは、ＣＤ２２、ＣＤ３３およびＡＩＲＭ１について証明されている（Falco et al.前掲；Freeman, S. D. et al. (1995) Blood 85:2005; Blasioli, J. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:2302）。
【０００４】
（発明の開示）
本発明の一の態様は、ヒトＳＡＦ−２と結合するモノクローナル抗体を含む。より詳細には、本発明はモノクローナル抗体２Ｃ４の同定特性を有するモノクローナル抗体を含む。本発明のこの態様の具体例は、配列番号２に示されるような重鎖可変領域ポリペプチドおよび配列番号４に示されるようなカッパ軽鎖可変領域ポリペプチドを含む抗体である。
本発明はさらに、配列番号５、６または７に示されるいずれかのポリペプチドまたはそのいずれかの組み合わせを含むイムノグロブリン重鎖相補性決定領域、および配列番号８、９または１０に示されるいずれかのポリペプチドまたはそのいずれかの組み合わせを含むイムノグロブリンカッパ軽鎖相補性決定領域も包含する。本発明の好ましい具体例は、配列番号５、６、７、８、９および１０に示されるようなポリペプチドを含むイムノグロブリン相補性決定領域を含むポリペプチドである。本発明はさらに、前記ポリペプチドのいずれかをコード化する単離されたポリヌクレオチドも包含する。
【０００５】
本発明のさらにもう一つの具体例は、サンプルにおけるＳＡＦ−２蛋白を含む細胞の存在を検出する方法であって、該方法は、ａ）サンプルをＳＡＦ−２と結合する抗体に暴露し、ｂ）ＳＡＦ−２と結合した抗体を検出することを含む。細胞を含むと推測されるサンプルは、所望により、ＳＡＦ−２を抗体により結合されやすくするために抗体に暴露する前に処理することができる。この例の好ましい用途は、好酸球の検出である。
本発明のもう一つの態様は、哺乳動物における様々なアレルギー、喘息または癌性症状を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者にモノクローナル抗体２Ｃ４の同定特性を有するヒトＳＡＦ−２に対する有効量のモノクローナル抗体を投与することを含む方法を包含する。
本発明のさらにもう一つの態様は、モノクローナル抗体２Ｃ４の同定特性を有するヒトＳＡＦ−２に対するモノクローナル抗体を含む医薬組成物を包含する。
【０００６】
（図面の簡単な記載）
図１は、ＳＡＦ−２と結合するモノクローナル抗体、ｍＡｂ２Ｃ４のＶＨｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す。太字の残基は３つのＣＤＲを示す（配列番号５、６、および７）。
図２は、ＳＡＦ−２と結合するモノクローナル抗体、２Ｃ４のＶＫｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を示す。太字の残基は３つのＣＤＲを示す（配列番号８、９、および１０）。
図３は、ヒト末梢血好酸球、好塩基球および１６週齢の臍帯血由来の培養された肥満細胞上のＳＡＦ−２の発現についてのデータを表す。柱状グラフに示したのは、各細胞型について事実上同一の結果を有する３〜４の実験の代表例である。正および負の対照として用いたモノクローナル試薬も示す。
【０００７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、改変抗体およびそのフラグメントを含み、ＳＡＦ−２に対する様々な抗体であって、ヒトＳＡＦ−２ポリペプチドまたはこれから得られるポリペプチドと結合する能力により特徴づけられる抗体を提供する。このクラスの抗体の例は、モノクローナル抗体２Ｃ４である。これらの抗体産物は、好酸球の特異的検出を包含する、ＳＡＦ−２ポリペプチドを含む細胞の検出において有用である。これらの抗体産物は、アレルギー性鼻炎、アレルギー、喘息、湿疹、あるいはリンパ腫、白血病、または全身性肥満細胞症などの疾患を治療するための治療用および医薬組成物においても有用である。別法として、本発明の抗体は、過度のＳＡＦ−２発現の領域における細胞を殺すために毒素、増殖抑制剤または放射線核種と結合させ、これにより、アレルギー性鼻炎、アレルギー、喘息、湿疹、あるいはリンパ腫、白血病、または全身性肥満細胞症などの疾患を治療することができる。
【０００８】
「抗体」とは、通常のハイブリドーマ技術、ファージディスプレーコンビナトリアルライブラリー、イムノグロブリンチェーンシャッフリング（immunoglobulin chain shuffling）およびヒト化技術により調製することができるイムノグロブリンを意味する。完全なヒトモノクローナル抗体も含まれる。本発明において用いられる場合、「抗体」とは、選択された宿主細胞における発現により得ることができる、改変されたイムノグロブリンコーディング領域によりコード化される蛋白を意味する「改変抗体（ａｌｔｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」も包含する。かかる改変抗体は、操作された抗体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（例えば、キメラまたはヒト化抗体）あるいはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２などのイムノグロブリン定常領域の全部または一部が欠失した抗体フラグメントである。Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２なる用語は、その標準的意味で用いられる。例えば、Harlow et al. in "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)参照。
【０００９】
「ＣＤＲ」とは、イムノグロブリン重および軽鎖の非常に変異しやすい領域である、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)参照。イムノグロブリンの可変部分において３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲまたはＣＤＲ領域がある。したがって、本発明において用いられる「ＣＤＲ」は、すべての３つの重鎖ＣＤＲ、またはすべての３つの軽鎖ＣＤＲ、または適当ならばすべての重および軽鎖ＣＤＲの両方を意味する。
ＣＤＲは抗体の抗原またはエピトープに対する結合の接触残基の大部分を提供する。本発明において重要なＣＤＲは、ドナー抗体可変重および軽鎖配列から得られ、天然に存在するＣＤＲの類似体を包含し、該類似体は、これらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または拮抗物質能力を共有または保持し、さらに抗原に対する親和性が増大する場合もある。該類似体を得るための一例となるプロセスは、Hoogenboom (1997) Trends in Biotechnology 15:62; Barbas et al. (1996) Trends in Biotechnology 14:230 ;およびWinter et al. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12:433およびIrving et al. (1996) Immunotechnology 2:127に記載されているようなファージ提示技法による親和性成熟法である。
【００１０】
「改変されたイムノグロブリンコーディング領域」とは、本発明の改変抗体をコード化する核酸配列を意味する。改変抗体が相補性決定領域−接合（ＣＤＲ−接合）またはヒト化抗体である場合、非ヒトイムノグロブリンからＣＤＲをコード化する配列は、ヒト可変フレームワーク配列を含む第一のイムノグロブリンパートナー中に挿入される。所望により、第一のイムノグロブリンパートナーは第二のイムノグロブリンパートナーに操作可能に結合される。
「第一のイムノグロブリンパートナー」とは、ネイティブ（または天然に存在する）ＣＤＲ−コード化領域がドナー抗体のＣＤＲ−コード化領域と置換されているヒトフレームワークまたはヒトイムノグロブリン可変領域をコード化する核酸配列を意味する。ヒト可変領域はイムノグロブリン重鎖、軽鎖（または両鎖）、その類似体または機能的フラグメントであってもよい。かかるＣＤＲ領域は、抗体（イムノグロブリン）の可変領域内に位置し、当該分野において公知の方法により決定することができる。例えば、Kabat et al, in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)は、ＣＤＲの位置決めについての法則を開示している。加えて、ＣＤＲ領域／構造の同定に有用なコンピュータープログラムが公知である。
【００１１】
「第二のイムノグロブリンパートナー」とは、第一のイムノグロブリンパートナーがフレーム内で、あるいは任意の通常のリンカー配列により融合した（すなわち、操作可能に連結された）蛋白またはペプチドをコード化するもう一つのヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、これはイムノグロブリン遺伝子である。第二のイムノグロブリンパートナーは、対象となる抗体と同じ（すなわち、ホモローガスな、ここに、第一と第二の改変抗体は同じ供給源由来である）または別の（すなわち、ヘテロローガスな）抗体の定常領域全体をコード化する核酸配列を含んでもよい。これは、イムノグロブリン重鎖または軽鎖（または単一のポリペプチドの一部としての両鎖）であってもよい。第二のイムノグロブリンパートナーは特定のイムノグロブリンクラスまたはイソタイプに限定されない。加えて、第二のイムノグロブリンパートナーはイムノグロブリン定常領域の一部、例えばＦａｂ、またはＦ（ａｂ’）２において見いだされるもの（すなわち、適当なヒト定常領域またはフレームワーク領域の独立した一部）を含んでもよい。かかる第二のイムノグロブリンパートナーは、例えばファージ提示ライブラリーの一部として宿主細胞の外表面上に露出したインテグラルメンブランプロテインをコード化する配列、あるいは例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの分析または診断的検出のための蛋白をコード化する配列を含んでもよい。
【００１２】
本明細書において用いられる場合、「操作された抗体」とは、改変抗体の種類、すなわち、選択されたアクセプター抗体の軽および／または重鎖可変ドメインが、選択されたエピトープについての特異性を有する１またはそれ以上のドナー抗体から得られる類似した部分により置換された完全長合成抗体（例えば、抗体フラグメントに対してキメラまたはヒト化抗体）を意味する。例えば、かかる分子は、非修飾軽鎖（またはキメラ軽鎖）と結合しているヒト化重鎖により特徴づけられる抗体を含んでもよく、逆も同様である。操作された抗体は、ドナー抗体結合特異性を保持するためにアクセプター抗体軽および／重可変ドメインフレームワーク領域をコード化する核酸配列の改変によっても特徴づけられる。これらの抗体は、本明細書において記載するドナー抗体からのＣＤＲでアクセプター抗体から得られる１またはそれ以上のＣＤＲ（好ましくは全部）が置換されている。
【００１３】
「ドナー抗体」なる語は、その可変領域、ＣＤＲまたは他の機能的フラグメントの核酸配列、またはその類似体に寄与し、したがって、改変されたイムノグロブリンコーディング領域および結果として発現された、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する改変抗体を提供するモノクローナルまたは組換え抗体を意味する。本発明における使用に適したドナー抗体は２Ｃ４として表されるネズミモノクローナル抗体である。
「アクセプター抗体」なる語は、第一のイムノグロブリンパートナーに対して、その重および／または軽鎖フレームワーク領域および／またはその重および／または軽鎖定常領域をコード化する核酸配列またはＶ領域サブファミリーコンセンサス配列の全部、または一部に寄与するドナー抗体についてヘテロローガスなモノクローナル抗体または組換え抗体を意味する。好ましくは、ヒト抗体はアクセプター抗体である。
【００１４】
「キメラ抗体」とは、アクセプター抗体から得られる軽および重鎖定常領域と組み合わされたドナー抗体から得られる天然に存在する可変領域（軽鎖および重鎖）を含む操作された抗体を意味する。
「ヒト化抗体」とは、ヒト以外のドナーイムノグロブリンから得られるＣＤＲを有する操作された抗体の種類を意味し、分子の残りのイムノグロブリン由来の部分は１またはそれ以上のヒトイムノグロブリン由来である。加えて、フレームワークサポート残基は、結合親和性を保持するために改変することができる。例えば、Queen et al. (1089) Proc. Natl Acad Sci USA 86:10029;Hodgson et al. (1991) Bio/Technology 9:421)。さらに、本明細書において記載するように、ドナー抗体の活性を保持するために追加の残基を改変することができる。
【００１５】
「抗原結合特異性を共有する」とは、例えば、ｍＡｂ  ２Ｃ４はあるレベルの結合活性により特徴づけられるが、適当な構造環境においてｍＡｂ  ２Ｃ４由来のＣＤＲをコード化するポリペプチドはさらに低いかまたはさらに高い活性を有し得ることを意味する。かかる環境におけるｍＡｂ  ２Ｃ４のＣＤＲは、それでもｍＡｂ  ２Ｃ４と同じエピトープを認識すると予想される。
本明細書において用いられる「〜の同定特性を有する」とは、かかる抗体またはポリペプチドが本明細書において例示される抗体と同じ抗原結合特異性を共有し、当業者に周知の方法により測定すると本明細書において例示する抗体と実質的に類似した親和力で特異的抗原と結合することを意味する。
「機能的フラグメント」は、フラグメントが由来する抗体と同じ抗原結合特異性を共有する、部分的な重鎖または軽鎖可変配列（例えば、イムノグロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端でわずかに欠失した配列）である。
【００１６】
「類似体」とは、少なくとも１個のアミノ酸により修飾されたアミノ酸配列であって、前記修飾は化学的であってもよいし、また数個のアミノ酸（すなわち、１０以下）および対応する核酸配列の置換または再配列であってもよく、該修飾によりアミノ酸配列が生物学的特徴、例えば、未修飾配列の抗原特異性および高親和性を保持することが許容される。核酸類似体の例としては、ＣＤＲ−コード化領域内またはその周囲にあるエンドヌクレアーゼ制限部位を形成するために置換により構築できるサイレント変異が挙げられる。
類似体は対立遺伝子変異体としても生じ得る。「対立遺伝子変異または修飾」は本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコード化する核酸配列における改変である。かかる変化または修飾は遺伝コードにおける縮重によるか、または所望の特性を得るために故意に操作することもできる。これらの変化または修飾は、任意のコードされたアミノ酸配列における改変の結果であってもよいし、そうでなくてもよい。
【００１７】
「エフェクター因子」なる語は、改変抗体および／またはドナー抗体の天然または合成軽または重鎖あるいはドナー抗体の他のフラグメントを通常の手段により結合させることができる非タンパクキャリア分子を意味する。かかる非タンパクキャリアは、診断分野において用いられる通常のキャリア、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）システムにおいて用いられるような多糖類、あるいは医学分野において有用で、ヒトおよび動物に投与するのに安全な他の非タンパク物質を包含する。他のエフェクター因子は、重金属原子または放射性元素をキレート化するためのマクロサイクル（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ）を包含する。かかるエフェクター因子は、改変抗体、例えば、ポリエチレングリコールの半減期を増大させるためにも有用である。
本明細書において用いる場合、「治療」およびそれに類似した語は、予防的療法、緩和療法または治療的療法を意味する。
【００１８】
本発明の抗体、改変抗体およびフラグメントを構築する際の使用について、ヒト以外の種、例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯類（例えば、ネズミおよびラット）を利用し、ヒトＳＡＦ−２またはそれから由来のペプチドエピトープとの結合を示す、所望のイムノグロブリンを生成することができる。ＳＡＦ−２に対して非ヒトｍＡｂＳＡＦを分泌するハイブリドーマ細胞系を提供するために通常のハイブリドーマ技術を用いることができる。かかるハイブリドーマを次に実施例の項に記載するように結合活性についてスクリーンする。別法として、当業者に知られた方法により完全なヒトｍＡｂを生成させることができる。
本発明の典型的なｍＡｂは、ｍＡｂ  ２Ｃ４、キメラまたはヒト化分子の開発に用いることができるネズミ抗体である。２Ｃ４  ｍＡｂは、ヒトＳＡＦ−２に対する比結合活性により特徴づけられる。このｍＡｂはハイブリドーマ細胞系２Ｃ４により産生される。
【００１９】
本発明はさらに、二価フラグメントとしてＳＡＦ−２に対して方向付けられるｍＡｂ由来のＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの使用も包含する。これらのフラグメントはＳＡＦ−２に対する結合活性を有する試薬として有用である。Ｆａｂフラグメントは完全な軽鎖および重鎖のアミノ末端部分を含む。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはジスルフィド結合により結合した２個のＦａｂフラグメントにより形成されるフラグメントである。ｍＡｂ  ２Ｃ４および他の類似した高親和性抗体は、通常の手段、例えば、ｍＡｂを適当な蛋白分解酵素、パパインおよび／またはペプシンで開裂させることにより、または組換え法により得ることができるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの供給源を提供する。これらのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントはそれ自体、治療薬、予防薬または診断薬として有用であり、本明細書に記載される組換えまたはヒト化抗体の形成において有用な可変領域およびＣＤＲ配列を包含するドナー配列として有用である。
【００２０】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントはコンビナトリアルファージライブラリー（例えば、Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12:433）またはイムノグロブリンチェーンシャッフリング（例えば、Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779）により構築することができ、ここに、選択された抗体（例えば、２Ｃ４）から得られるＦｄまたはＶＨイムノグロブリンは、新規Ｆａｂを形成するために軽鎖イムノグロブリンのレパートリー、ＶＬ（またはＶＫ）と結合できる。逆に、新規Ｆａｂを形成するために、選択された抗体から得られる軽鎖イムノグロブリンを重鎖イムノグロブリンのレパートリー、ＶＨ（またはＦｄ）と結合させることができる。抗ＳＡＦ−２ｍＡｂは、ｍＡｂ  ２Ｃ４のＦｄを軽鎖イムノグロブリンのレパートリーと結合させることにより得ることができる。ここで、チェーンシャッフリング技術から独自の配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸）を有するＦａｂを回収することができる。
ｍＡｂ  ２Ｃ４は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴づけられる様々な改変抗体を設計し、得るために有用な、例えば、可変重および／または軽鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、ＣＤＲ配列、機能的フラグメント、およびその類似体、ならびにこれらをコードする核酸配列などの配列に寄与することができる。
【００２１】
可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードする本発明の核酸配列、またはそのフラグメントもＣＤＲをコード化する核酸配列またはフレームワーク領域内の特異的変化の変異誘発性導入、および結果として得られる修飾または融合核酸配列を発現のためにプラスミド中に組み入れるために有用である。例えば、変異誘発ＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域の挿入を促進する制限酵素部位を生成するためにフレームワークおよびＣＤＲ−コード化領域のヌクレオチド配列におけるサイレント置換を用いることができる。これらのＣＤＲ−コード化領域は、本発明のヒト化抗体の構築において用いることができる。
ｍＡｂ  ２Ｃ４の重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号１に示す。この領域から得られるＣＤＲアミノ酸配列を、配列番号５、６および７に示す。
ｍＡｂ  ２Ｃ４の軽鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号３に示す。この領域から得られるＣＤＲアミノ酸配列を、配列番号８、９および１０に示す。
【００２２】
遺伝コードの縮重を考慮に入れて、本発明の様々な重および軽鎖アミノ酸配列およびＣＤＲ配列ならびにドナー抗体の抗原特異性を共有する機能的フラグメントおよびその類似体をコードする様々なコーディング配列を構築することができる。第二のイムノグロブリンパートナーと操作可能に組み合わされた場合に、本発明の改変抗体、例えばキメラまたはヒト化抗体、あるいは他の操作された抗体を産生するために、可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコード化する本発明の単離された核酸配列、またはそのフラグメントを用いることができる。
【００２３】
本明細書に記載される改変抗体の部分をコード化する単離された核酸配列に加えて、ネイティブＣＤＲ−コード化配列に対して相補性のもの、またはＣＤＲ−コーディング配列のまわりの修飾されたヒトフレームワーク領域に対して相補性のものなどの核酸配列も本発明により含まれることに注意する。有用なＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成する配列を包含する。T. Maniatis et al., Molecular Clonig: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pp.387-389参照。かかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃で４×ＳＳＣでハイブリッド形成し、続いて６５℃で０．１×ＳＳＣ中で１時間洗浄することである。別法として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアルデヒド、４２℃で４×ＳＳＣである。好ましくは、これらのハイブリッド形成ＤＮＡ配列は、少なくとも約１８ヌクレオチドの長さ、すなわち、ほぼＣＤＲの寸法である。
【００２４】
改変されたイムノグロブリン分子は、操作された抗体、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体を包含する改変抗体をコード化できる。所望の改変されたイムノグロブリンコーディング領域は、抗ＳＡＦ−２抗体、好ましくは、高親和性抗体、例えば本発明により提供されるものの抗原特異性を有するペプチドをコード化する第一のイムノグロブリンパートナー、例えばヒトフレームワークまたはヒトイムノグロブリン可変領域中に挿入されたＣＤＲ−コード化領域を含む。
好ましくは、第一のイムノグロブリンパートナーは、操作可能に第二のイムノグロブリンパートナーと結合している。第二のイムノグロブリンパートナーは前記定義の通りであり、対象となる第二の抗体領域、例えばＦｃ領域をコード化する配列を含む。第二のイムノグロブリンパートナーも、軽または重鎖定常領域がフレーム内で、またはリンカー配列により融合されるもう一つのイムノグロブリンをコード化する配列を含む。ヒトＳＡＦ−２の機能的フラグメントまたは類似体に対する操作された抗体は、同じ抗体との結合の強化を惹起するように設計することができる。
【００２５】
第二のイムノグロブリンパートナーも、第二のイムノグロブリンパートナーを通常の手段により操作可能に結合させることができる非タンパクキャリア分子を包含する前記定義のエフェクター因子と結合させることができる。
第二のイムノグロブリンパートナー、例えば、抗体配列とエフェクター因子間の融合または結合は、任意の適当な手段により、例えば、通常の共有結合またはイオン結合、蛋白融合、またはヘテロ二官能性架橋剤、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによる。かかる技術は当該分野においては一般的であり、一般的な化学および生化学テキストに記載されている。
加えて、第二のイムノグロブリンパートナーとエフェクター因子間に所望の空間をもたらすだけの通常のイムノグロブリンパートナーも、改変されたイムノグロブリンコーディング領域中に構築することができる。かかるリンカーのデザインは、当業者には周知である。
加えて、本発明の分子のシグナル配列は、発現ならびに細胞内および細胞間輸送を向上させることが当業者に知られている技術により修飾することができる。
【００２６】
好ましい改変抗体は、例えば、ＶＨおよびＶＬ鎖などのｍＡｂ  ２Ｃ４の抗原特異性を有する可変重および／または軽鎖ペプチドまたはタンパク配列を含む。もうひとつの本発明の望ましい改変抗体は、ネズミ抗体分子２Ｃ４の重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは全部を含むアミノ酸配列により特徴づけられ、残りの配列はヒト起源であるか、あるいはその機能的フラグメントまたは類似体である。
もうひとつの例において、本発明の改変抗体はそのさらなる試薬に付着することができる。例えば、完全抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ２ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子、すなわち、ペプチドエフェクターまたはレポーター分子により置換されている本発明の改変抗体分子を産生するために、組換えＤＮＡテクノロジーを用いることができる。他の試薬は、毒素、増殖抑制剤および放射性核種を包含する。
【００２７】
第二のイムノグロブリンパートナーも、ヒトＳＡＦ−２に対する抗原特異性を有するＣＤＲ−含有配列に対してヘテロローガスな非イムノグロブリンペプチド、蛋白またはそのフラグメントと操作可能に結合させることができる。結果として得られる蛋白は、発現に際して抗原特異性および非イムノグロブリンの特徴を示す。この融合パートナー特性は、例えば、もう一つの結合またはレセプタードメインなどの機能的特徴であってもよいし、あるいは融合パートナーがそれ自体治療用蛋白である場合は治療的特徴、あるいは別の抗原特性であってもよい。
本発明のもう一つの望ましい蛋白は、完全長重および軽鎖またはその任意の独立したフラグメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント、重鎖ダイマーまたはその任意の最小の組換えフラグメント、例えば、Ｆｖまたは一本鎖抗体（ＳＣＡ）あるいは例えばｍＡｂ  ２Ｃ４などの選択されたドナーモノクローナル抗体と同じ特異性を有する他の分子を有する完全抗体分子を含む。かかる蛋白は改変抗体の形態において用いてもよいし、あるいは未融合形態において用いてもよい。
【００２８】
第二のイムノグロブリンパートナーがドナー抗体と異なる抗体、例えば、イムノグロブリンフレームワークまたは定常領域のイソタイプまたはクラス由来である場合はいつでも、操作された抗体が得られる。操作された抗体は、例えばアクセプター抗体などの一つの起源から得られるイムノグロブリン定常領域および可変フレームワーク領域、および例えばｍＡｂ  ２Ｃ４から得られるドナー抗体からの１またはそれ以上（好ましくは全部）のＣＤＲを含み得る。加えて、核酸またはアミノ酸レベルでのアクセプターｍＡｂ軽および／または重可変ドメインフレームワーク領域またはドナーＣＤＲ領域の変更、例えば、欠失、置換、または付加を、ドナー抗体抗原結合特異性を保持するために行うことができる。
【００２９】
かかる操作された抗体は、抗ＳＡＦ−２ｍＡｂの可変重および／または軽鎖の一方（または両方）あるいは１またはそれ以上の重または軽鎖ＣＤＲを用いるように設計される。本発明の操作された抗体は結合活性を示す。
かかる操作された抗体は、選択されたヒトイムノグロブリンのフレームワーク領域を含むヒト化抗体またはサブタイプまたは抗ＳＡＦ−２ｍＡｂ機能的フラグメントと融合したヒト重および軽鎖定常領域を含むキメラ抗体を含んでもよい。適当なヒト（または他の動物）のアクセプター抗体は、一般的なデータベース、例えばＫＡＢＡＴデータベース、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース、およびＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対する相同性により選択されるものである。ドナー抗体のＶ領域フレームワークまたはＶ領域サブファミリーコンセンサス配列（アミノ酸に基づく）に対する相同性により特徴づけられるヒト抗体はドナーＣＤＲの挿入のための重鎖可変フレームワーク領域を提供するために適している。軽鎖可変フレームワーク領域を付与できる適当なアクセプター抗体は同様の方法で選択できる。アクセプター抗体の重および軽鎖が同じアクセプター抗体起源である必要はないことは重要である。
【００３０】
好ましくは、ヘテロローガスなフレームワークおよび定常領域は、ヒトイムノグロブリンクラスおよびイソタイプ、例えばＩｇＧ（サブタイプ１〜４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥから選択される。ＩｇＧ１,ｋおよびＩｇＧ４,ｋが好ましい。特に好ましいのはＩｇＧ４,ｋである。もっとも好ましいのは、重鎖定常領域において変異Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ（ＰＥ変異）を含み、その結果エフェクター機能が低下したＩｇＧ４サブタイプ変異体である。このＩｇＧ４サブタイプ変異体は本発明においてはＩｇＧ４ＰＥとも呼ぶ。米国特許第５６２４８２１号および第５６４８２６０号参照。
アクセプター抗体はヒトイムノグロブリンタンパク配列のみからなる必要はない。例えば、ヒトイムノグロブリン鎖のＤＮＡ配列コード化部分が非イムノグロブリンアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、例えば、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子と融合している遺伝子を構築することができる。
【００３１】
特に好ましいヒト化抗体は、選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域中に挿入されたｍＡｂ  ２Ｃ４のＣＤＲを含む。ヒト化抗体について、重鎖および／または軽鎖可変領域からの１、２または好ましくは３個のＣＤＲを選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域中に挿入して、ヒト抗体のネイティブＣＤＲと置換する。
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト重および軽鎖の両方における可変領域は１またはそれ以上のＣＤＲ置換により操作されている。６個のＣＤＲすべて、または６より少ないＣＤＲの様々な組み合わせを用いることが可能である。好ましくは、６個のＣＤＲすべてを置換する。軽鎖としてヒトアクセプター抗体から得られる未修飾軽鎖を用いて、ヒト重鎖においてのみＣＤＲを置換することが可能である。さらに別法として、適合性軽鎖をもう一つのヒト抗体から通常の抗体データベースにより選択することができる。操作された抗体の残りは、任意の適当なアクセプターヒトイムノグロブリン由来であってもよい。
【００３２】
操作されたヒト化抗体は、従って好ましくは天然のヒト抗体またはそのフラグメントの構造を有し、アレルギー性鼻炎、アレルギー、喘息、湿疹、またはリンパ腫、白血病、あるいは全身性肥満細胞症などの疾患の治療などの有効な治療に必要とされる性質の組みあわせを有する。
当業者らは、操作された抗体はさらに、必ずしもドナー抗体（すなわち類自体）の特異性および高親和性に影響を与えることなく可変ドメインアミノ酸における変化により修飾することができることを理解するであろう。重および軽鎖アミノ酸は、可変ドメインフレームワークまたはＣＤＲのいずれか、あるいはその両者において他のアミノ酸により置換することができると理解される。これらの置換は、ドナー抗体または特定のサブグループから得られるコンセンサス配列により供給される。
【００３３】
加えて、定常領域を改変し、本発明の分子の選択的特性を向上または低下させることができる。例えば、二量化、Ｆｃレセプターとの結合、または補体と結合し、活性化する能力（Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105; Xu et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:3469; 欧州特許公開番号ＥＰ０３０７４３４Ｂ１参照）である。
キメラ抗体である改変抗体は、両鎖のヒトイムノグロブリン定常領域と組み合わせて、フレームワーク領域を含む全体的非ヒトドナー抗体重鎖および軽鎖可変領域を提供する点で、上記したヒト化抗体と異なる。本発明のヒト化抗体と比べて追加の非ヒト配列を保持するキメラ抗体はアレルギー性鼻炎、アレルギー、喘息、湿疹あるいはリンパ腫、白血病、または全身性肥満細胞腫などの疾患の治療に有用であることが期待される。
【００３４】
好ましくは、ｍＡｂ  ２Ｃ４または他の適当なドナーｍＡｂの可変軽および／または重鎖配列およびＣＤＲおよびそのコード化核酸配列は、本発明の改変抗体、好ましくはヒト化抗体の下記のプロセスによる構築において用いられる。本発明の他の具体例を生じさせるために、同じかまたは類似の技術も用いることができる。
ネズミ抗体２Ｃ４などの選択されたドナーｍＡｂを産生するハイブリドーマは通常どおりクローンされ、その重および軽鎖可変領域のＤＮＡは当業者に公知の技術、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に記載されている技術により得られる。少なくともＣＤＲ−コード化領域を含む可変重および軽領域およびドナーｍＡｂ結合特異性を保持するために必要なアクセプターｍＡｂ軽および／または重鎖可変ドメインフレームワーク領域の一部、ならびにヒトイムノグロブリン由来の抗体鎖の残りのイムノグロブリン由来の部分生成物は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得られる。ＣＤＲ−コード化領域は、公知データベースを用いて他の抗体との比較により同定される。
【００３５】
マウス／ヒトキメラ抗体を次に調製し、結合能力について分析することができる。かかるキメラ抗体は全体的な非ヒトドナー抗体ＶＨおよびＶＬ領域を、両鎖のヒトＩｇ定常領域とともに含む。
ヒト抗体から得られる重鎖可変領域のホモローガスなフレームワーク領域は、コンピューター化されたデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴを用いて同定され、ドナー抗体のＶ領域フレームワークまたはｍＡｂ  ２Ｃ４に対するＶ領域サブファミリーコンセンサス配列（アミノ酸に基づく）に対する相同性により特徴づけられるヒト抗体は、アクセプター抗体として選択される。ヒト抗体フレームワーク内にＣＤＲ−コード化領域を含む合成重鎖可変領域の配列は、制限部位を組み入れるためにフレームワーク領域において任意のヌクレオチド置換を有するように設計される。この設計された配列を次に長い合成オリゴマーを用いて合成する。別法として、設計された配列は、オリゴヌクレオチドを重複させることにより合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、および誤差を修正することができる。好適な軽鎖可変フレームワーク領域を同様に設計することができる。
【００３６】
ヒト化抗体は、キメラ抗体由来であってもよいし、あるいは好ましくは重および軽鎖からのドナーｍＡｂ  ＣＤＲ−コード化領域を選択された重および軽鎖フレームワーク内に適当に挿入することにより合成することができる。別法として、本発明のヒト化抗体は標準的変異誘発技術を用いて調製することができる。従って、得られるヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域およびドナーｍＡｂ  ＣＤＲ−コード化領域を含む。その後、フレームワーク残基を操作してもよい。得られるヒト化抗体は組換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞において発現させることができる。
【００３７】
通常の発現ベクターまたは組換えプラスミドは、これらの改変抗体のコーディング配列を、宿主細胞における複製および発現、および／または宿主細胞からの分泌を調節できる通常の調節配列と有効に組み合わせることにより産生される。調節配列は、プロモーター配列、例えば、ＣＭＶまたはラウス肉腫ウイルスプロモーター、および他の公知抗体由来のシグナル配列を含む。同様に、相補抗体軽または重鎖をコード化するＤＮＡ配列を有する第二の発現ベクターを産生できる。可能な限り、各ペプチド鎖が機能的に発現されることを確実にするためには、この第二の発現ベクターは、コーディング配列および選択可能なマーカーに関する以外は第一のものと同一であるのが好ましい。別法として、改変抗体の重および軽鎖コーディング配列は単一のベクター上にある。
【００３８】
選択された宿主細胞を、第一および第二のベクターの両方を用いて通常の技術により同時トランスフェクションに付し（または単一のベクターにより単独でトランスフェクトして）、組換えまたは合成軽および重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を形成する。トランスフェクトされた細胞を次に通常の技術により培養して、本発明の操作された抗体は産生する。組換え重鎖および／または軽鎖の両方の組み合わせを含むヒト化抗体を適当な検定法、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより培地からスクリーンされる。本発明の他の改変抗体および分子を構築するために、同様の通常の技術を用いることができる。
本発明の方法および組成物の構築において用いられるクローニングおよびサブクローニング段階に好適なベクターは、当業者により選択することができる。例えば、ＡｍｅｒｓｈａｍまたはＰｈａｒｍａｃｈｉａなどの販売業者から商業的に入手可能なクローニングベクターのｐＵＣシリーズ、例えばｐＵＣ１９を用いることができる。加えて、容易に複製可能で、多くのクローニング部位および選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、容易に操作される任意のベクターをクローニングに用いることができる。従って、クローニングベクターの選択は、本発明において限定的因子ではない。
【００３９】
同様に、本発明に従って操作された抗体の発現に用いられるベクターは、任意の通常のベクターから当業者により選択される。ベクターは、選択された宿主細胞においてヘテロローガスなＤＮＡ配列の複製および発現を行う、選択された調節配列（例えば、ＣＭＶまたはラウス肉腫ウイルスプロモーター）も含む。これらのベクターは、操作された抗体または改変されたイムノグロブリンコーディング領域をコードする前記ＤＮＡ配列を含む。加えて、ベクターは、容易に操作するために所望の制限部位の挿入により修飾された、選択されたイムノグロブリンコーディング領域を組み込むことができる。
発現ベクターも、例えば哺乳動物ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）などのヘテロローガスなＤＮＡ配列の発現の増幅に好適な遺伝子により特徴づけられる。他の好ましいベクター配列は、ポリＡシグナル配列、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）から得られるもの、およびベータグロビンプロモーター配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）を含む。本発明において有用な発現ベクターは、当業者に周知の技術により合成することができる。
【００４０】
レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などのかかるベクターの成分は、商業的または天然の供給源から得ることができるか、または選択された宿主において組換えＤＮＡの産物の発現および／または分泌を行うのに用いられる公知手順により合成することができる。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌の発現において多くの種類が公知である他の適当な発現ベクターをこの目的のために選択してもよい。
本発明はさらに、操作された抗体またはその改変されたイムノグロブリン分子のコーディング配列を含む組換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞系も含む。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞も通常通りである。しかしながら、もっとも望ましくは、クローニングベクターの複製および本発明の改変抗体の構築における他の段階に、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の様々な菌株から得られる細胞が用いられる。
【００４１】
本発明の操作された抗体または改変抗体の発現に好適な宿主細胞または細胞系は、好ましくは哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３）および骨髄細胞であり、より好ましくはＣＨＯまたは骨髄細胞である。ヒト細胞を用いることができ、したがって、分子をヒト糖鎖形成パターンで修飾することができる。別法として、他の真核細胞系を用いることができる。好適な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物産生および精製法は当該分野において公知である。例えば、Sambrookら（前掲）参照。
細菌細胞は本発明の組換えＦａｂの発現に適当な宿主細胞として有用であることが判明している（例えば、Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130、151-188 (1992)参照）。しかしながら、細菌細胞において発現される蛋白は折りたたまれていないかまたは不適当に折りたたまれた形態であるか、または非糖鎖形成形態である傾向があるので、細菌細胞において産生される任意の組換えＦａｂは抗原結合能力の保持についてスクリーンされなければならない。細菌細胞により発現される分子が適当に折りたたまれた形態において産生されたならば、該細菌細胞は望ましい宿主である。例えば、発現に用いられるイー・コリの様々な株はバイオテクノロジーの分野において宿主としてよく知られている。ビー・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、他のバシラスの様々な株も用いることができる。
【００４２】
所望により、当該分野において公知の酵母細胞の菌株も宿主細胞として利用可能であり、同様に、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ）および鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、およびウイルス発現系も利用可能である。例えば、Miller et al., Genetic Engineering, 8, 277-298, Plenum Press (1986)およびその中の引用文献参照。
かかる宿主細胞から本発明のベクターを構築できる一般法、本発明の宿主細胞を産生するために必要なトランスフェクション法、および本発明の改変抗体を産生するために必要な培養法は、すべて通常の技術である。同様に、いったん産生されると、本発明の改変抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを包含する当該分野の常法に従って細胞培養物から精製される。かかる技術は当業者の技術範囲内であり、本発明を限定するものではない。
【００４３】
ヒト化抗体を発現させるもう一つ別の方法は、トランスジェニック動物、例えば、米国特許第４８７３３１６号に記載されている動物を利用してもよい。これは、トランスジェニック的に哺乳動物中に組み入れられた場合に、メスがその母乳中に所望の組換え蛋白を産生させることができるカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
所望の方法によりいったん発現されると、適当な検定法を用いて、操作された抗体をインビボ活性について試験する。
【００４４】
ｍＡｂ  ２Ｃ４から調製されるヒト化抗体に関して記載された手順に従って、当業者らは本明細書に記載されている他のドナー抗体、可変領域配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築することができる。潜在的に「自己」を操作された抗体のレシピエントにより認識する可変領域フレームワークを有する操作された抗体を産生できる。可変領域フレームワークについての修飾は、レシピエントについての免疫原生を相当増大させることなく、抗原結合および拮抗物質活性を増大させることができる。かかる操作された抗体は、心筋梗塞または脳卒中などの虚血性疾患または糖尿病などの血管欠乏性疾患についてヒトを有効に治療することができる。かかる抗体は、これらの症状の診断においても有用である。
【００４５】
本発明はさらに、哺乳動物、特にヒトにおけるアレルギー性鼻炎、アレルギー、喘息、湿疹、あるいはリンパ腫、白血病、または全身性肥満細胞症などの疾患を治療する方法であって、有効量の抗ＳＡＦ−２モノクローナル抗体を投与することを含んでなる方法に関する。ｍＡｂは、１またはそれ以上の抗体または本明細書に記載された改変抗体またはそのフラグメントを含むことができる。従って、本発明の分子は、治療的用途に適当な製剤および処方において、アレルギー性鼻炎、アレルギー、喘息、湿疹、あるいはリンパ腫、白血病、または全身性肥満細胞症などの疾患にかかりやすいかまたはかかっている人に非常に望ましい。
本発明の方法において用いられるモノクローナル抗体は、１またはそれ以上の本明細書に記載された抗体または改変抗体またはそのフラグメントを含むことができる。好ましくは、本発明の方法において用いられる抗ＳＡＦ−２抗体は、ｍＡｂ  ２Ｃ４の同定特性を有する。
【００４６】
本発明の改変抗体、抗体およびそのフラグメントは、さらに他の抗体、特に、本発明の操作された抗体が関与する症状の原因である他のマーカー（エピトープ）と反応性に富むヒトｍＡｂと組み合わせて用いることができる。
本発明の抗体は、医薬組成物に処方し、成熟蛋白について記載されているのと同じ方法で投与することができる。例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９０／０２７６２参照。一般に、これらの組成物は治療的に有効量の本発明の抗体および許容される医薬担体を含む。適当な担体は当業者に周知であり、例えば塩溶液が挙げられる。別法として、かかる組成物は通常のデリバリーシステムを含んでもよく、その中に本発明の蛋白が組み入れられる。所望により、これらの組成物は他の活性成分を含んでもよい。
【００４７】
本発明の治療薬は、任意の適当な内部経路により投与することができ、必要に応じて、例えば１日から約３週間のあいだ１日に１〜３回から１週間に１回または２週間に１回の頻度で繰り返し投与することができる。好ましくは、抗体は治療的に用いられる場合、リガンドよりも少ない回数で投与される。用量および治療期間は、ヒトの循環系における本発明の分子の相対的持続期間に関連し、治療される症状および患者の全般的な健康状態に応じて当業者により調節することができる。
本発明において用いられる場合、「医薬的」なる用語は、本発明の獣医学適用とも包含する。「治療的に有効量」なる用語は、選択された状態を軽減するために有用な抗体の量を意味する。これらの本発明の治療組成物は、正常なレセプターリガンドの効果を模倣するために投与することができる。
【００４８】
本発明の治療薬の投与様式は、宿主に薬剤を送達する任意の適当な経路であってもよい。本発明の改変抗体、抗体、操作された抗体、およびそのフラグメント、ならびに医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内または鼻内投与に特に有用である。
本発明の治療薬は、医薬的に許容される担体中、活性成分としては本発明の有効量の操作された（例えば、ヒト化）抗体を含む医薬組成物として調製することができる。本発明の組成物において、操作された抗体を含む、好ましくは、生理学的ｐＨで緩衝された、注射できる形態における水性懸濁液または溶液が好ましい。非経口投与用組成物は通常、医薬的に許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された、本発明の操作された抗体またはそのカクテルの溶液を含む。様々な水性担体、例えば、０．４％塩溶液、０．３％グリシンなどを用いることができる。これらの溶液は無菌で、一般に粒子状物質を含まない。これらの溶液は、通常の、よく知られた滅菌技術（例えば、濾過）により滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調節および緩衝剤などの生理学的状態に近づけるのに必要な医薬上許容される補助物質を含んでもよい。かかる医薬処方中の本発明の抗体の濃度は広範囲に及び、すなわち、約０．５％未満から、通常約１％または少なくとも約１％〜１５または２０重量％までであり、主に、液体の体積、粘度などに基づいて、選択される個々の投与方法に応じて選択される。
【００４９】
従って、１ｍＬ滅菌緩衝水、および約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇまたはより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の操作された抗体を含む筋肉内注射用の本発明の医薬組成物を調製することができる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍＬの滅菌リンゲル液、および約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の操作された抗体からなる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は周知であり、当業者には明らかで、より詳細には、例えば、“Remingon's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaに記載されている。
本発明の治療薬は、医薬製剤中においては、単位投与形態において存在するのが好ましい。適当な治療的に有効な量は、当業者により容易に決定できる。ヒトまたは他の動物において有効に治療するためには、体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜約２０ｍｇの本発明の蛋白または抗体の一回量を非経口的に、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）で投与しなければならない。かかる用量は、必要ならば、反応期間中、医師により適当に選択された適当な間隔で繰り返すことができる。
【００５０】
本発明は、その精神または基本的特質から逸脱することなく他の特定の形態において具体化することができ、本発明の範囲を示すものとして、上記した明細書または下記の実施例よりも請求の範囲を参照しなければならない。
本明細書において記載されているかまたは本出願が優先権を主張する特許および特許出願を包含するが、これらに限定されないすべての開示は、各開示が具体的に、個々に全文示されているかのように本発明の一部として参照される。
【００５１】
（実施例）
本発明を次の特異的かつ非制限的実施例に関連して記載する。
実施例１  モノクローナル抗体の生成
Ａ．組換えＳＡＦ−２の調製
ＳＡＦ−２の完全長コーディング領域（欧州特許公開番号ＥＰ０９２４２９７Ａ１参照、本発明の一部として参照）を、ＰＣＲを用いて哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮ（Aiyar et al. (1994) Mol. Cell Biochem. 131:75-86）中にサブクローンした。挿入物の配列を、Ｃａ＋＋ＰＯ４を用いてＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトする前に確認した。クローンを５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８中選択し、ノザンブロット分析を用い、次にＦＡＣＳ分析を用いて評価した。ＳＡＦ−２の細胞外ドメインをＰＣＲによりサブクローンし、ヒトＩｇＧ１のファクターＸａ開裂部位およびＦｃ部分とともにフレーム中に挿入した。ベクターをＣＨＯＥＡ１細胞中に電気泳動する前に配列を確認した。安定に発現されたクローンを選択し、拡大し、Ｆｃ発現について評価し、スケールアップした。ＳＡＦ−２／Ｆｃ融合タンパクをタンパクＡセファロースを用いて上清から精製し、アリコートをファクターＸａで開裂させて、抗体生成に用いられるＳＡＦ−２ポリペプチドを得た。
【００５２】
Ｂ．モノクローナル抗体生成
マウスをまずフロインド完全アジュバント中ＳＡＦ−２（２５μｇ）で免疫し、次に２回のブースター注射（２５μｇ）を２および４週間後に投与した。ＳＡＤ−２に対する良好な血清抗体価に基づいて、１匹のマウスにさらにＰＢＳ中２０μｇのＳＡＦ−２を静脈内投与した。脾臓を４日後に収穫し、Zola（Zola, H. (1987) Monoclonal antibodies: A manual of techniques. CRC Press, Boca Raton, FL.）に記載されている方法に従って、骨髄腫細胞と融合させた。
【００５３】
Ｃ．ハイブリドーマスクリーニング分析
陽性のハイブリドーマを０．５ｇ／ｍＬでＳＡＦ−２／Ｆｃでコートされた９６ウェルマイクロタイタープレート中、結合に関して試験し、ヨーロピウム接合抗マウスＩｇＧで検出した。特に、９６ウェルプレートを４℃で一夜インキュベートすることによりＳＡＦ−２／Ｆｃ（ＰＢＳ中１００μｌ／ウェル）でコートした。溶液を吸引し、２５０μＬ／ウェルのＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｋａｔｈｏｎ、ｐＨ７．４）中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で５〜６０分間室温で非特異的結合部位をブロックした。この後、および次の段階のそれぞれの後、プレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％Ｋａｔｈｏｎ、ｐＨ７．４）中４回洗浄した。各ウェルに、５０μＬハイブリドーマ培地および５０μｌの分析緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％ウシガンマグロブリン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ４０、２０μＭＰＢＳ中ジエチレントリアミンペンタ酢酸）を添加し、６０分間室温で、シェーカーインキューター中でインキュベートした。各ウェルに１００μＬの検定緩衝液中０．５μｇ／ｍＬ  Ｅｕ３＋標識された抗マウス抗体を添加した。最後に、２００μＬ／ウェルのエンハンサー（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を添加し、室温で５分間インキュベートし、経時的に分解した蛍光を測定した。陽性のものをイムノアッセイおよびＢＩＡｃｏｒｅにより再スクリーンし、次に制限希釈法によりクローンした。クローンされた細胞系により産生された抗体がＳＡＦ−２について特異的であることを、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅおよびトランスフェクトされた細胞系を用いたフローサイトメトリーにより確認した。
Ｄ．ｍＡｂの精製
モノクローナル抗体を製造業者の使用説明書を用いてそれぞれＰｒｏｓｅｐＡ（Bio Processing, Consett, UK）クロマトグラフィーにより精製した。モノクローナル抗体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによると＞９５％の純度であった。
【００５４】
実施例２  モノクローナル抗体の特徴化
Ａ．モノクローナル抗体のイソタイピング
この研究において用いたモノクローナル抗体２Ｃ４は、商業的に入手可能な試薬（Pharmingen, San Diego, California）を用いてＩｇＧ１カッパとしてイソタイプ化された。
Ｂ．モノクローナル抗体のアフィニティー測定
モノクローナル抗体２Ｃ４のアフィニティーを、ＢＩＡｃｏｒｅ光学バイオセンサー（Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden）を用い、流量３０μＬ／分を用いて測定した。動力学的データを、すでに記載された関係式（Karlsson, et al. (1991) J. Immunol. Meth. 145:229）を用いて評価した。ｍＡｂ（ＨＢＳ緩衝液中希釈、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）をウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ表面上に注射し、続いて緩衝液を流し、ＲＵを記録した。ＳＡＦ−２（ＨＢＳ緩衝液中希釈）を次に１８０秒間注入し、続いて緩衝液を３００分間流し、ＲＵを記録した。０．１Ｍリン酸の注入によりセンサーチップ表面を再生した。結合のオン速度（Ｋａ）およびオフ速度（Ｋｄ）をＢＩＡｃｏｒｅ（Uppswala, Sweden）ソフトウェアを用いて計算した。この分析から得られたデータは、モノクローナル抗体２Ｃ４は２．２×１０５Ｍ−１ｓ−１のオン速度（Ｋａ）および４．３×１０５Ｍ−１ｓ−１のオフ速度（Ｋｄ）を示すことを示し、平衡定数（ＫＤ）の計算値は２．０×１０−１０Ｍであった。
【００５５】
Ｃ．細胞の精製および培養
ＰＢＭＣのＰｅｒｃｏｌｌ除去、ＲＢＣの溶解および好中球イムノマグネティックネガティブ選択の後、好酸球を末梢血から精製した（Hansel, T.T. et al. (1991) J.Immunol. Methods 145:105）。結果として得られる集団は＞９５％好酸球であった。いくつかの実験においては、精製された好酸球を２日まで、１０％ＦＣＳおよび１または１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−５、あるいは１０または５０ｎｇ／ｍＬ  ｅｏｔａｘｉｎ（Peprotech, Rocky Hill, NJ）、Ｃ３ａ、またはＣ５ａ（Advanced Research Technologies）(Matsumoto, K. et al. (1998) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 18:860)を含む完全ＲＰＭＩ中で培養した。２日後またはそれ以下での培養物の生存率は＞８０％であった。好塩基球についての末梢血の富化は、ダブルＰｅｒｃｏｌｌ濃度勾配分離を用いて、好塩基球の数を全白血球数の３〜１０％に増大させて（Bochner, B.S. et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:265）またはさらに免疫磁気陰性選択を少なくとも５０％まで行った。ヒト臍帯血液由来の肥満細胞をすでに報告されているようにして生成させた（Tachimoto, H. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:293; Saito, H. et al. (1996) J. Immunol. 157:343）。精製されたＣＤ３４＋細胞を、１０μｇ／ｍＬインシュリン、５．５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬセレン、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール、５％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍＬ幹細胞刺激因子（一般に、Amgen, Thousand Oaks, CAにより提供される）および５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−６（Biosource, Camarillo, CA）で補足されたＩＭＤＭ中で少なくとも１０週間、１ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−３（Biosource）で最初の７日間培養した。Ｍａｙ−ＧｒuｎｗａｌｄおよびＧｉｅｍｓａ試薬で染色することにより肥満細胞の純度を測定し、培養の１４〜１６週で周期的に９９〜１００％に達した。これらの実験について、使用した細胞を培養の１６〜１７週で収穫した。骨髄由来の好酸球を次のようにして培養した：フィコールヒト骨髄の低密度細胞を、ＩＭＤＭ／２０％ＦＣＳと２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−５（R&D Systems）中で１．５×１０６細胞／ｍＬ、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞系ＨＬ−６０およびＥＯＬ３を酪酸ナトリウムで処理して、これらをより好酸球様表現系に分化させた（Collins, S. (1987) Blood 70:1233）。
【００５６】
Ｄ．ヒト好酸球、好塩基球および肥満細胞上でのＳＡＦ−２の発現
インテグリンまたはＳＡＦ−２の発現を凝集防止全血中または富化細胞中で、すでに記載されたような単色間接免疫蛍光およびフローサイトメトリーを用いて評価した（Matsumoto, K. et al. (1998) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 18:860; Bochner, B.S. et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:265）。好塩基球の二色検出も行った（Bochner, B.S. et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:265）。使用したモノクローナル抗体は次のものを含んでいた：対照ＩｇＧ１、ＣＤ１８（７Ｅ４）、ＣＤ５１（ＡＭＦ７、すべてCoulter-Immunotech, Hialeah, FL）、ＣＤ９（Immunotech）およびｍＡｂ  ２Ｃ４。Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）−接合またはＦＩＴＣ−接合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ−抗−マウスＩｇＧ（Biosource）およびＦＩＴＣ−接合ポリクローナルヤギ抗−ヒトＩｇＥ（Kierkergaard and Perry, Gaithersburg, MD）も用いた。すべてのサンプルを０．１％パラホルムアルデヒド（Sigma）中に固定し、ＦＡＣＡＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Becton Dickinson, Mountainview, CA）を用いて分析した。少なくとも１０００の事象を集め、４−ログスケールで表示して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を得た。
【００５７】
ＳＡＦ−２は好酸球に局在化し（図３）、好中球、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞を包含する他の精製された細胞集団には存在しなかった（データは省略）。最適濃度のｅｏｔａｘｉｎ、Ｃ５ａ、Ｃ３ａまたはＩＬ−５を用いて精製された好酸球を分析の２４または４８時間前に１時間活性化することにより、細胞表面上のＳＡＦ−２発現のレベルは変わらなかった（データは省略）。２個の細胞系、ＨＬ−６０およびＥＯＬ３は、酪酸ナトリウムで５日間分化後、さらに好酸球様になると報告されているが、これらをＳＡＦ−２の発現について調査した（Mayumi, M, (1992) Leukemia & Lymphoma 7:243）。これらの培養条件下で、ＨＬ−６０およびＥＯＬ３はＳＡＦ−２を発現しなかった（データは省略）。興味深いことに、好酸球がＩＬ−５を用いて骨髄からインビトロで生じる場合に、ＳＡＦ−２の発現はみられなかった。好酸球はＣＤ９（細胞の３〜１２％）およびＷｒｉｇｈｔ染色で染色することにより１４日までに同定された（データは省略）。従って、ＳＡＦ−２発現は好酸球分化について後期マーカーであると思われる。
【００５８】
低いが、一定して  検出可能な量のＳＡＦ−２（データは省略）が好塩基球においてみられた（図３；ｍＡｂ  ２Ｃ４については２１．１±４．０％陽性；平均±ＳＥＭ、ｎ＝４）。成熟ヒト臍帯血由来肥満細胞も強力にＳＡＦ−２を発現するが、発現のパターンは血液白血球よりもピークが完全に単峰でない点で幾分異種である（図３）。
Ｅ．機能的分析
機能的分析（Ｃａ＋＋および走化性）をすでに記載されているようにして行った（Macphee, C.H. et al. (1998) J. Immunol. 161:6273）。好酸球生物学におけるＳＡＦ−２の役割を確かめるために、抗ＳＡＦ−２  ｍＡｂをその好酸球機能に影響を及ぼす能力について試験した。まず、抗体を、精製された好酸球において、それ自身または第二の抗体との架橋後のいずれかで、そのＣａ＋＋フラックスを起こす能力について試験した。強力なＣａ＋＋フラックス応答をもたらすｅｏｔａｘｉｎと比較して、ＳＡＦ−２に対してｍＡｂはいずれも好酸球において１５分にわたりＣａ＋＋フラックスを引き起こさなかった（データは省略）。ｍＡｂを次に、精製された好酸球においてｅｏｔａｘｉｎに対するＣａ＋＋応答を調節する能力について試験した。好酸球を、架橋抗体とともに、またはなしで、抗ＳＡＦ−２とともにあらかじめインキュベートし、その後ｅｏｔａｘｉｎをシミュレートした。ここでも、ｍＡｂはｅｏｔａｘｉｎに反応してＣａ＋＋フラックスに影響を及ぼさなかった。加えて、化学走性剤としてｅｏｔａｘｉｎを用いて好酸球走化性分析においてｍＡｂを評価した；ここでも、ｍＡｂは好酸球機能を調節しなかった。
【００５９】
実施例３  −  重および軽鎖抗原結合領域のクローニングおよび配列決定
モノクローナル抗体２Ｃ４について次のクローニング法を用いて完全長ＶＨおよびＶＫ領域配列を得た。ｍＡｂ  ２Ｃ４ＶＨおよびＶＫのＮ−末端アミノ酸配列を決定した。Ｎ−末端Ｖ領域残基がピログルタミン酸でブロックされている事象において、酵素脱ブロックはピログルタメートアミノペプチダーゼにより行った。
全ハイブリドーマＲＮＡを精製し、逆転写し、ＰＣＲ増幅した。重鎖について、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、マウスＩｇＧ  ＣＨ１−特異性プライマーおよびＮ−末端タンパク配列に基づいた縮重プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。同様に、軽鎖について、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、マウスＣカッパプライマーおよびＮ−末端タンパク配列に基づいた縮重プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。適当な大きさ、すなわち、〜３５０のＰＣＲ産物をプラスミドベクター中にクローンし、Ｓａｎｇｅｒ法の変法により配列決定した（Sanger et al. (1977) PNAS USA 74:5463）。それぞれの場合において、複数のＶＨクローンの配列および複数のＶＫクローンの配列を比較して、それぞれ、コンセンサス重鎖可変領域配列およびコンセンサス軽鎖可変領域配列を生成させた。モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＫ領域のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ図１および２に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＳＡＦ−２と結合するモノクローナル抗体、ｍＡｂ２Ｃ４のＶＨｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す。
【図２】  ＳＡＦ−２と結合するモノクローナル抗体、２Ｃ４のＶＫｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を示す。
【図３】  ヒト末梢血好酸球、好塩基球および１６週齢の臍帯血由来の培養された肥満細胞上のＳＡＦ−２の発現についてのデータを表す。柱状グラフに示したのは、各セルタイプについて事実上同一の結果を有する３〜４の実験の代表例である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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