(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
診断上又は治療上の対象分子を密着結合した上皮を介して輸送するためのベクターを製造するための、ホメオドメインの第三ヘリックス由来の導入ドメイン及びホメオドメインタンパク質の核輸出配列からなるペプチドの使用。
【請求項２】
密着結合した上皮が、血液-脳関門又は脈絡膜叢であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
核輸出配列が、少なくともペプチド配列AQELGLNESQIからなることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
核輸出配列が、少なくともペプチド配列SLAQELGLNERQIKIからなることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
輸送される診断上又は治療上の対象分子が、核酸、ポリペプチド、ペプチド/核酸及びヌクレオチド類似体から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、血液-脳関門、より一般的には、2つの区画間に緊密な障壁を形成する上皮を介して活性分子を輸送できる新規なベクターに関する。
【０００２】
血液-脳関門(BBB)の機能は、血液組成中の経験的な変動から脳を維持すること、及び潜在的に毒性の物質に対して神経細胞を保護することである。それは、中枢神経系を洗浄する毛細管の内皮レベルにある。この内皮は、身体の他の毛細管とは区別される特定の性質を有する。それは、他の多数の毛細管に見られる性質を欠いている。さらに、その構成細胞は、互いに緊密に結合している。これらの「密着結合」は、(1000オーム/cm2オーダーの)高い耐電性も有しており、そのためにイオンの受動拡散にさえ有効な障害となっている。
【０００３】
したがって、血液-脳関門は、天然には少数の物質を通過させるに過ぎない極めて選択的なフィルターを構成している。これらは主に:
-  低分子量の脂肪親和性分子で、受動拡散によって血液-脳関門を通過することができる;
-  神経細胞の機能に必須の栄養素(特に糖、アミノ酸、神経ペプチド、ビタミンなど)を構成する低分子量の親水性分子である。これらの分子は、特定の輸送体を介して血液-脳関門を通過する;
-  高分子量分子(例えばポリペプチドホルモン)で、これは、内皮細胞表面に存在する特定のレセプターに結合後、血液-脳関門を通過する。
【０００４】
血液-脳関門の不浸透性は、脳への多くの医薬品の透過の主たる障壁となっている。
これを改善するために、幾つかの方策が提案されている:
1)  髄腔内注射又は注入による、中枢神経系における所望の分子の直接投与。この方法には、極めて侵襲性で、実施が難しいという欠点がある。関連する手法は、被投与物質を生じ、この結果、「ミニポンプ」のように作用して、物質をその場で分配するように遺伝学的に改質された細胞の中枢神経系への移植からなる。その潜在的な利点にもかかわらず、この手法は、合成でき、細胞によって分泌される薬剤に依然として限定されるであろう。
【０００５】
2)  浸透ショック又はある物質(例えばブラディキニン又はアンギオテンシン)の作用によって一般に生じ、幾つかの成分の細胞外ドメインとの相互作用によって密着結合を過渡的に解放する、BBBの瞬間的な開口。この手法は、非選択的であり、かつ血中に存在する多くの他の分子が被輸送分子として同時に通過することを可能にする欠点を有する。
3)  血液-脳関門を通過するための天然のメカニズムの使用。しかし、受動拡散は、脂肪親和性であるか、又は薬理特性を変えずに脂肪親和性になることのできる低分子量物質にのみ用いることができる。特異的な輸送体は、輸送体によって天然に輸送される物質に十分近い構造を有する分子にのみ用いることができる。特定のレセプターの場合、被輸送分子とこれらのレセプターに対する天然のリガンドを結合することが提案される。この手法の主たる欠点は、多少望ましくない副作用を生じることのできる、これらのリガンドに特異的な生物活性にある。
【０００６】
近年、血液-脳関門を介する輸送用ベクターとして導入ペプチド(transducing peptides)を使用することが提案されている。導入ペプチドは、特異的な輸送体又はレセプターの存在から独立して、生細胞に透過能力を付与する「導入ドメイン」として言及される配列からなるペプチドである。
導入ペプチドに関する論説は、最近LIDGRENら[TiPS, 21, 99-102, (2000)];SCHWARZE及びDOWDY [TiPS, 21, 45-48, (2000)]; SCHWARZEら[Trends Cell. Biol., 10, 290-295, (2000)];PROCHIANTZ [Current Opinion in Cell Biology, 12, 400-406, (2000)]によって公表されている。
【０００７】
導入ペプチドの一例として、特に以下が挙げられる:
-  ホメオドメインの第三ヘリックス由来ペプチドであるペネトラチン; ペネトラチンファミリーのペプチドは、例えば JOLIOTら [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1864-1868, (1991)];DEROSSIら [J. Biol. Chem., 269, 14, 10444-10450, (1994)];BRUGIDOUら [Biophys. Biochem. Res. Com., 214, 685-693, (1995)]の文献及び米国特許5,888,762号、米国特許6,080,724号又はPCT 出願 WO/00/ 01417号にも記載されている;
-  HIV1 Tatタンパク質、特に該タンパク質の48〜60フラグメント由来のペプチド;かかるペプチドは、例えばFAWELLら[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 664-668, (1994)] 又はVIVESら [J. Biol. Chem., 272, 16010-16017, (1997)]によって記載されている;
【０００８】
-  HSV VP22タンパク質由来のペプチド; かかるペプチドは、例えば ELLIOTT 及びO'HARE [Cell, 88, 223-233, (1997)]によって記載される;
-  核の局在配列に任意に結合する、シグナル配列由来のペプチド;かかるペプチドは、例えばLINら[J. Biol. Chem., 270, 14255-14258, (1995); J. Biol. Chem., 271, 5305-5308, (1996)]、LIUら[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11819-11824, (1996)]、MORRISら[Nucleic Acids Res., 25, 2730-2736, (1997)]、CHALOINら [Biochemistry, 36, 11179-11187, (1997); Biochem. Biophys. Res. Commun., 243, 601-608, (1998)]、ZHANGら[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9184-9189, (1998)]によって記載される;
-  神経ペプチドの一部、ガラニン及び蜂毒(wasp venom)ペプチドの融合由来の輸送体[POOGAら、FASEB J., 12, 67-77, (1998); Ann. New York Acad. Sci., 863, 450-453, (1998)]。
【０００９】
SCHWARZEら[Science, 285, 1569-1572, (1999)]は、Tatタンパク質の導入ドメインに結合したβ-ガラクトシダーゼを、脳を含む身体の全組織中で、腹膜投与後に検出できることを観察した。
ROUSSELLEら[Mol. Pharmacol, 57, 679-686, (2000)]も、D-ペネトラチン又はSynB1ペプチドとのドキソルビシンの結合は、血液-脳関門を介するその通過を増大させることを報告している。
導入ペプチドの使用は血液-脳関門を介する通過を増大させると思われるが、にもかかわらず、これは依然として極めて低い。
【００１０】
さらに、先の研究で、発明者のチームは、ホメオドメインタンパク質Engrailedで、このタンパク質の核からの退出及び分泌区画へのその通過に寄与する核輸出配列の存在を立証している[JOLIOTら、Curr Biol, 8, 856-863, (1998); MAIZELら、Development, 126, 3183-3190, (1999)]。この配列は、その構造及び分子での位置に関して、シグナルペプチド型の従来の分泌配列と異なる。
【００１１】
したがって、発明者らは、この核輸出配列が、全Engrailedタンパク質の状況外で機能的であるかどうかを調べた。この目的をもって、導入ドメイン(ペネトラチン、この場合pAntpペプチドの第三ヘリックスからなる)のみからなるペプチドと、この導入ドメインの他にEngrailedタンパク質の核輸出配列を含むペプチド(NES-Penet)の透過ならびに細胞内分布の性質を比較した。37℃で細胞に透過後、導入ドメインのみからなるペプチドは、核に、また拡散して細胞質に位置しているが、核輸出配列も含むペプチドは主に細胞質の小胞区画に位置していることが認められた。4℃で細胞に透過後、導入ドメインのみからなるペプチド、またそれに加えて核輸出配列も含むペプチドは、依然として核に位置していた。細胞を37℃に導くと、導入ドメインと核輸出配列からなるペプチドが、小胞区画に入り、エネルギー依存性の核輸出メカニズムを反映することが認められる。
【００１２】
また、発明者らは、核輸出配列の添加が、ペネトラチンの小胞区画との相互作用能を変えるかどうかも研究した。この目的で、2つのペプチドのそれぞれを精製膜画分とインキュベートし、トリプシンで処理した。次いで、導入ドメインのみを含むペプチド(ペネトラチン)はトリプシンによってほぼ完全に分解されるが、導入ドメインと核輸出配列からなるペプチド(NES-Penet)はトリプシンの作用に対して保護されることが観察された。同一の分画及び保護実験を、生細胞による内面化後に行った; ペネトラチンの分解とNES-Penetペプチドの保護も観察された。膜とインキュベートしたペネトラチンのみが保護されないという事実は、核輸出配列の役割が核からの退出に限定されないが、槽内区画へのペプチドの接近と該区画でのその蓄積を可能にすることを示唆している。
【００１３】
小胞区画への通過がペプチドの有効な外面化を生じるかどうか、またこの外面化が密着結合した上皮を介した通過を促進できるかどうかを決定するため、発明者らは、密着結合した上皮を再生する、細胞層で被覆された微小孔膜によって分離される2つの区画からなる実験モデルを用いた。区画の1つは、細胞の先端極と接触しており、他方は側底極と接触している。この結果、導入ドメインのみからなるペネトラチンペプチドが側底区画に加えられると、細胞へのこのペプチドの進入が、先端区画への通過には少量であるが、認められることが分かった。同一ペプチドを先端区画に加えると、それも細胞に進入する; 他方、側底区画への通過は認められない。
【００１４】
同一の実験を、NES-Penetペプチドの場合に行った; 側底区画から先端区画への通過は極めて増大されるが、先端区画から側底区画への通過はわずかに残っているか、又は存在しない。
さらに、発明者らは、4℃と37℃で2つの区画の一方又は他方にあるペネトラチンとNES-Penetペプチドの進入と退出を比較した。これらのペプチドの一方又は他方の進入は4℃と37℃で起こるが、NES-Penetの退出は4℃で阻害されることが認められ、進入と退出のメカニズムは異なることが確認された。
【００１５】
したがって、導入ドメインと核輸出配列との組み合わせは、側底/先端方向に密着結合した上皮を介する輸送効率を増大させると思われる。
本発明の対象は、密着結合した上皮、特に血液-脳関門ならびに脈絡膜叢を介する対象分子の輸送用ベクターとしての、導入ドメインを構成する少なくとも1つのアミノ酸配列及び核輸出配列を構成するアミノ酸配列からなるペプチドの使用である。
【００１６】
特に、本発明の対象は、密着結合した上皮、特に血液-脳関門ならびに脈絡膜叢を介する診断上又は治療上の対象分子の輸送用ベクターを製造するための、導入ドメインを構成する少なくとも1つのアミノ酸配列及び核輸出配列を構成する少なくとも1つのアミノ酸配列の使用である。
本発明の実施に使用できる導入ドメインは、それ自体公知であり、特に上記の先行技術の文献に記載されている。
導入ドメインは、核局在配列(NLS)からなってもよく、又はそれからなっていなくてもよい。
【００１７】
「核局在配列」は、導入ドメインでの存在時、細胞への進入後に核へのその接近を可能にする配列として定義される。
核局在配列からなる導入ドメインを構成するペプチドの非限定的な一例として、特に以下が挙げられる:
(i)  HIV1 Tatタンパク質のフラグメント48〜60からなるペプチド;
(ii)  NFkBのNLSとK-FGFのシグナルペプチド間の融合物;
(iii)  SV40 T抗原のNLSとK-FGFのシグナルペプチド間の融合物;
(iv)  ペネトラチン。
【００１８】
核局在配列を含まない導入ドメインを構成するペプチドの非限定的な一例として、特に以下が挙げられる:
(i)  両親媒性ペプチドKLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 1);
(ii)  ペネトラチンのある変異体[DEROSSIら、J. Biol. Chem., 271, 18188-18193, (1996)]。
導入ドメインが核局在配列を含まない時、望ましくは、異種核局在配列と任意に組み合わさっていてもよい。
「核輸出配列」(NES)の表現は、細胞核を残し、分泌区画に進入させる能力を該配列からなるペプチドに付与し得るいずれかのペプチド配列を意味することを意図する。
【００１９】
それ自体公知の核輸出配列は、この発明の実施に使用できる。3タイプの核輸出配列が現在記載されている(論評には、例えばNAKIELNY及びDREYFUSS, Current Opinion in Cell Biology 9, 420-429, 1997参照):ホメオドメインタンパク質であるものに含まれる、多数のタンパク質に存在する、大きな割合の脂肪族疎水性アミノ酸(ロイシン又はイソロイシン、ならびにバリン又はアラニン)からなる約10アミノ酸の配列である、「ロイシン-リッチ」な核輸出配列; hnRNP A1のM9配列 [MICHAELら、Cell, 83, 415-422, (1995)]; hnRNP K のKNS (「hnRNP K 核シャトル(nuclear shuttling)ドメイン」)配列[MICHAELら、EMBO J., 16, 3587-3598, (1997)]。
【００２０】
この発明の好ましい具体例によれば、ロイシン-リッチな核輸出配列、特にホメオドメインタンパク質の核輸出配列が利用される。本発明の実施に特に使用できるホメオドメインタンパク質の核輸出配列は、これらのタンパク質において第三ヘリックスのN末端に位置するか、又は部分的にそれを覆う約10〜15アミノ酸の配列である。一例として、少なくともAQELGLNESQI (SEQ ID NO: 2)の配列(1-文字コード)、有利には少なくともSLAQELGLNERQIKI (SEQ ID NO: 3)の配列(1-文字コード)からなる「Engrailed」タンパク質の核輸出配列を利用してもよい。
【００２１】
核輸出配列と導入ドメインは、直接隣合って、別のアミノ酸配列で分離されて、又は少なくとも部分的に重複していてもよい。
この発明は、密着結合した上皮、特に血液-脳関門を介して、輸送可能な診断上又は治療上の対象分子を、ホメオドメインタンパク質を含む導入ペプチドによって生細胞に輸送するのに使用できる。つまり、それは、特に抗腫瘍剤として使用される核酸、ポリペプチド、ペプチド/核酸又はヌクレオチド類似体の輸送に使用することができる。
【００２２】
この発明の実施のため、被輸送分子は、結合が導入ドメイン又は核輸出配列の機能性を変えない条件で、ベクターペプチド上のいずれかに結合できる。分子は、例えば導入ドメインと核輸出配列間のペプチドのN-末端、C-末端又は内部に結合できる。
被輸送分子とベクターペプチドとの結合は、導入ペプチドへの結合に使用されるのと同一の方法を用いて、直接あるいはリンカーを介して行うことができる。種々の適当な方法がそれ自体知られており、特に上記の先行技術の文献に記載されている。
この発明は、密着結合した上皮を介する導入ドメインと核輸出ドメインからなるペプチドの通過を例示する非限定的な例に言及する、以下のさらなる記載から、さらに明らかに理解されるであろう。
【００２３】
実施例1: pANTPペプチドの導入ドメインと ENGRAILED タンパク質の核輸出配列からなるペプチドの細胞内位置
以下のビオチニル化ペプチドを合成する:
Biot-QSLAQELGLNERQIKIWFQNRRMKWKK-COOH (SEQ ID NO: 4)
このペプチド(以降、NES-Penetとして言及)は、部分的に重複した、ENGRAILED タンパク質の核輸出配列を含む配列:
QSLAQELGLNERQIKI (SEQ ID NO: 5)
とpAntpペプチド(ドロソフィリア・アンテナペディアのタンパク質のホメオドメイン)の第三ヘリックスからなるペネトラチン配列:
RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 6)
を含む。
【００２４】
アミノペンタノンのアーム(arm)腕を介して結合するビオチンで、そのN-末端をラベルする。
対照として、ペネトラチン配列のみからなるビオチニル化ペプチド:
Biot-RQIKIWFQNRRMKWKK-COOH (以降、Penet-1とする)
も合成した。
2ペプチドそれぞれを、37℃で1時間懸濁液中のラットの胚脳細胞(E17、107細胞/ml)と10μMの濃度でインキュベートした。
細胞を溶解し、以下のプロトコルにしたがって分画した:
【００２５】
細胞を、プロテアーゼインヒビターのカクテルを含む200μlの10 mM Hepes緩衝液、3 mM MgCl2、pH 7に溶解する。溶解は、1mlシリンジに取付けたG26ニードルをとおして10回細胞を前後に押して行う。
0.25 Mと1.7 Mの不連続のシュクロースクッションをとおして抽出物を遠心分離(1時間、150000g、4℃)した後、核をペレットに回収し、膜画分を0.25 M/1.7 M 界面に回収する。
これらの各画分の一部を以下のプロトコルにしたがってトリプシンで処理した: 100μg/ml トリプシンの存在下で4℃で1時間リン酸緩衝液(PBS)中でインキュベーション; 10% (vol/vol)のトリクロロ酢酸(TCA)を5分100℃で加えて、反応を止める。
【００２６】
トリプシンで処理していないか又は処理した画分を、SDSの存在下、22％ポリアクリルアミドゲルで変性条件下に電気泳動して分析した。
Penet-1 及びNES-Penetのペプチドを、DEROSSIら[J. Biol. Chem., 271, 18188-18193, (1996)]により記載されるプロトコルにしたがってストレプトアビジン-ペルオキシダーゼで顕在化した。
結果を図１に示す。
トリプシン未処理(-)では、Penet-1 及びNES-Penetペプチドが、核画分(核)及び膜画分(Mb)と結合することが認められる。
トリプシン処理(+)は、核画分と膜画分でPenet-1ペプチドの分解を誘導する。他方、NES-Penetペプチドの場合、膜画分に分解は認められず、分解に対する部分的な保護が核画分に認められる。この保護は、核周囲膜でのこの画分のわずかな汚染をおそらく反映している。
【００２７】
実験の第二系列では、培養中の細胞を溶解し、上記プロトコルにしたがって、ペプチドと事前にインキュベーションすることなく、膜画分を精製した。
2つのペプチドPenet-1及びNES-Penetそれぞれは、37℃で1時間107個のニューロン由来の膜画分の調製物(上記)と10μMの濃度でインキュベートし、次いで上記のプロトコルにしたがってトリプシンで処理した。
インキュベート後、ペプチド/膜調製混合物を、上記プロトコルにしたがってトリプシンで処理した。
同時に、2つのペプチドPenet-1及びNES-Penetのそれぞれを、膜調製物と事前にインキュベーションすることなく、同一条件下、トリプシンで処理した。
【００２８】
トリプシン溶解物を、上記のように電気泳動により分析した。
結果を図2に示す。
膜調製物(A)とのインキュベーションがなければ、Penet-1及びNES-Penetペプチドの全体的な分解が、トリプシン処理(+)後に認められる。
膜調製物(B)とのインキュベーション後、Penet-1ペプチドの部分的な保護(保護されるペプチド量については、30％未満と評価できる)及びNES-Penetペプチドの視覚上、全体的な保護が、トリプシン処理(+)後に認められる。
これらの結果は、核の存在とは独立して、核輸出配列が膜内区画へのペプチドの接近、及び/又はこの区画でのその維持を促進することを示している。
【００２９】
実施例2:密着結合した上皮を介する、pANTP ペプチドの導入ドメインとENGRAILEDタンパク質の核輸出配列からなるペプチドの通過
密着結合した上皮を介するPenet及びNES-Penetペプチドの通過は、図3に示す装置(TRANSWELL システム、CORNING-COSTAR)を用いて評価した。
この装置は、微小孔ポリエステル膜(3)によって分離される2つの区画(1、2)からなり、そこでMDCK (Madin-Darby Canine Kidney)細胞からなる上皮(4)がつくられる。細胞を播種し、集密するまで成長させる。
【００３０】
微小孔膜及び細胞の側底極と接触した区画(1)を、側底区画とする。 細胞の先端極と接触した区画(2)を、先端区画とする。
各区画を、プロテアーゼインヒビター混合物を補充した、以下からなる培地で満たす: Earle塩を有する最少必須培地(MEM)、2 mMグルタミン、2 mM Hepes、pH 7、5 U/mlペニシリン、 5μg/ml ストレプトマイシン。
各実験について、密着結合の完全性を、2つの区画間の抵抗を測定して制御する(R＞2000Ω/cm2)。
さらに、上皮の堅牢性を、先端区画又は側底区画のいずれかにトリチュレート化イヌリン(6.5×105 cpm/区画)を加え、180分後に他の区画中の放射活性を測定することによっても確認した。これらの条件下、トリチュレート化イヌリンの通過は、先端/側底方向あるいは側底/先端方向のいずれでも認められなかった。
【００３１】
ビオチニル化Penet-1 ペプチド又はビオチニル化NES-Penetペプチド(それぞれ10μM濃度で用いられる)を、先端区画又は側底区画に置く。他の区画は、ビオチニル化ペプチドの捕捉を可能にするストレプトアビジンを、10μMの濃度で含む。37℃又は4℃で30分インキュベーション後、出発区画中の培地と最終区画中の培地を標本にする。
ペプチドを、10％トリクロロ酢酸(TCA)を加えて沈降させ、沸騰ラエムリ培地に溶解する。細胞を0.5 M NaCl溶液ですすぎ、次いで沸騰ラエムリ培地に溶解する。開始区画、最終区画又は細胞内のPenet-1又は NES-Penetペプチドの有無を、上記実施例１に示すようにストレプトアビジン-ペルオキシダーゼで顕在化して検出する。
【００３２】
結果を図4Aと4Bに示す。
図4Aは、開始区画が側底区画である時、30分インキュベートした後のNES-Penet及びPenet-1ペプチドの電気泳動分析を示す。37℃ (左パネル)で、細胞への2つのペプチドの透過と極めて少量のPenet-1ペプチドの先端区画への通過が認められる;他方、先端区画へのNES-Penetペプチドの通過は、極めて大きい。通過が、ペプチドの分解を全く伴わないことも観察される。4℃(右パネル)で、細胞への2つのペプチドの透過も観察される;他方、2つのペプチドは、いずれも先端区画には通過しない。
図4Bは、開始区画が先端区画である時、30分インキュベートした後のNES-Penet及びPenet-1ペプチドの電気泳動分析を示す。37℃で、4℃でのように、2つのペプチドの細胞への透過が認められるが、側底区画への通過は認められない。
【００３３】
同一実験を開始区画中10％濃度のウシ血清の存在下で行うと、同一の結果が認められ、これは、通過が血清成分によって阻害されないことを示している。
これらの結果は、2つのペプチドは上皮の2つの面で内在化されるが、核輸出配列の存在は上皮を介するNES-Penet ペプチドの通過を実質的に増すこと、及びこの通過は分極化され、側底/先端方向にのみ生じることを立証している。
さらに、温度は、進入には影響しない(4℃と37℃で生じる)が、退出は温度依存性であり(4℃で阻害される)、これは、これらの2つの現象が異なる過程に対応していることを示している。
【００３４】
実験の別系列で、ゴルジ体の関与するタンパク質分泌を阻害するブレフェルジン A (BFA)のNES-Penet ペプチドの通過に対する作用を研究した。
ビオチニル化NES-Penetペプチド(10μM)を、ブレフェルジンA (10 μM)の存在下又は不在下、4℃又は37℃で1時間上記の条件下、側底区画でインキュベートした。
インキュベーションの最後に、側底区画と先端区画の内容物ならびに細胞の内容物を上記のように分析し、NES-Penet ペプチドの存在を検出した。
【００３５】
結果を図5に示す。
これらの結果から、NES-Penetペプチドは4℃(左パネル)で進入するが、ブレフェルジンAの存在下(+)又は不在下(-)であろうと、この温度では再退出しないことが確認される。他方、37℃(右パネル)では、NES-Penetペプチドの退出が、ブレフェルジンAの存在下(+)又は不在下(-)で認められる。
これらの結果は、NES-Penetペプチドによる上皮の横断は、ゴルジ体を介した通過を伴わないことを示している。
【００３６】
実施例3: 血液-脳関門を介するNES-PENETのインビボ通過
ビオチニル化NES-Penetペプチド(50μg/PBS 50μl)又はPBS (50μl)を、マウスの尾部静脈に注入する; このマウスを、注射から1時間後に殺す。脳を除き、4％パラホルムアルデヒドで固定し、20％シュクロースを含むPBS溶液中4℃で一晩浸漬して凍結防止した。脳の前面切片(10μM厚)を次いでクリオスタットで切断する。次いで、ストレプトアビジン-フルオレセイン複合体を用いてこれらの切片にペプチドを顕在化し、共焦顕微鏡で次いで蛍光発光を分析する。
結果を図６に示す(A: PBS; B: NES-Penetペプチド)。これらの結果は、ビオチニル化NES-Penetペプチドは、極めて有意に血液-脳関門を横切り、皮質及び皮質下の領域に達することを示している。
【００３７】
実施例4: 種々のタイプの導入ドメインを含むペプチドの細胞下局在と経上皮通過に対する核輸出配列の影響
上記のNES-Penetペプチドの細胞内局在化と密着結合した上皮を介する横断を、実施例1に記載されるEngrailedタンパク質の核輸出配列からなるペプチド(以降、NES-Pen3Pとする)、及びAntp ホメオドメインの45、50及び55位置にそれぞれ位置するIle、Gln及びLys残基を3個のプロリン残基で置換することによる、pAntpペプチドの第三ヘリックス由来のペネトラチン配列(以降、Pen3Pとする)のそれらと比較した。Pen3Pペプチドは細胞に透過するが、核には透過しない。当初DEROSSIら [J. Biol. Chem., 271, 30, 18188-18193, (1996)]に記載されたPen3P配列は、RQPKIWFPNRRKPWKK (SEQ ID NO: 7)である。
【００３８】
ビオチニル化NES-Pen3Pペプチドの配列は、以下のとおりである:
Biot-QSLAQELGLNERQPKIWFPNRRKPWKK-COOH (SEQ ID NO: 8)。
ビオチニル化したPenet、NES-Penet、Pen3P 及びNES-Pen3Pのペプチドを、100μMの濃度でMDCK細胞の培養物に加える。4℃で2時間インキュベーション後、0.5M濃度でNaClを含む4℃に予備冷却した培地で細胞をすすぐ; 次いで、それらを4％ パラホルムアルデヒド溶液で固定する(環境温度で5分)か、あるいはパラホルムアルデヒドで固定する前に、30分無ペプチドの培養培地で37℃でチェイス(chase)に付す。次いで、メタノールを用いてそれらを-20℃で5分浸透させ、5％ウシ胎児血清を含むPBS中で1時間予備インキュベートする。ペプチドを、ストレプトアビジン-フルオレセイン複合体を用いて顕在化する。次に、蛍光発光を、共焦顕微鏡により分析する。
【００３９】
Penetペプチドは4℃で進入する;この温度では、細胞質標識が拡散し、37℃に移した後に弱化する強力な核標識が認められる。
NES-Penetペプチドは4℃で進入する この温度では、顕著な細胞質又は核の局在化のない標識の拡散が認められる。37℃に移した後、細胞質内小胞との標識の強い結合(実施例2参照)が認められる。これは、おそらく先立っていないゴルジ-分泌区画(non-post-golgian secretion compartment)に対応する、
Pen3Pペプチドは4℃で進入する; NES-Penetペプチドの場合のように、細胞質及び核の標識の拡散がこの温度で認められる。他方、 NES-Penetペプチドとは異なって、この標識は37℃で修飾されない。
【００４０】
NES-Pen3Pペプチドは、4℃で進入する; NES-Penetペプチドの場合のように、細胞質及び核の標識の拡散がこの温度で認められる。37℃では、NES-Penetで観察されたものと同様に、細胞質内小胞との標識の強い結合が認められる。
さらに、密着結合した上皮を介するペプチドの通過を、上記実施例2に記載の装置を用いて評価した。
ビオチニル化ペプチド(10μM)を、37℃で30分上記の条件下、側底区画でインキュベートする。インキュベーションの最後に、側底区画と先端区画の内容物ならびに細胞の内容物を、実施例2に記載のように分析する。
【００４１】
細胞へのPen3P及びNES-Pen3Pペプチドの透過、ならびに先端区画へのごくわずかなPenet3Pペプチドの通過が認められる; 他方、先端区画へのNES-Penet3Pペプチドの通過は、かなり大きい。
これらの結果は、分泌区画への方向付けと、密着結合した上皮を介する通過が、ペプチドの核への方向付けを事前に要求しないことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  トリプシン未処理(-)では、Penet-1 及びNES-Penetペプチドが、核画分(核)及び膜画分(Mb)と結合することが認められる。
トリプシン処理(+)は、核画分と膜画分でPenet-1ペプチドの分解を誘導する。
【図２】  膜調製物(A)とのインキュベーションがなければ、Penet-1及びNES-Penetペプチドの全体的な分解が、トリプシン処理(+)後に認められる。
膜調製物(B)とのインキュベーション後、Penet-1ペプチドの部分的な保護(保護されるペプチド量については、30％未満と評価できる)及びNES-Penetペプチドの視覚上、全体的な保護が、トリプシン処理(+)後に認められる。
【図３】  この装置は、微小孔ポリエステル膜(3)によって分離される2つの区画(1、2)からなり、そこでMDCK 細胞からなる上皮(4)がつくられる。
【図４】  図4Aは、開始区画が側底区画である時、30分インキュベートした後のNES-Penet及びPenet-1ペプチドの電気泳動分析を示す。図4Bは、開始区画が先端区画である時、30分インキュベートした後のNES-Penet及びPenet-1ペプチドの電気泳動分析を示す。
【図５】  これらの結果から、NES-Penetペプチドは4℃(左パネル)で進入するが、ブレフェルジンAの存在下(+)又は不在下(-)であろうと、この温度では再退出しないことが確認される。他方、37℃(右パネル)では、NES-Penetペプチドの退出が、ブレフェルジンAの存在下(+)又は不在下(-)で認められる。
【図６】  これらの結果は、ビオチニル化NES-Penetペプチドは、極めて有意に血液-脳関門を横切り、皮質及び皮質下の領域に達することを示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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