(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２表面を有する基体を、内部に当該基体により分離された第１および第２の室が形成され且つ当該第１および第２表面がそれぞれ当該第１および第２の室に面するように支持する装置の内部で、そこに支持された当該基体と、コロニー形成が意図され、当該第１の室へ供給された細胞とをコロニー形成段階に供し、当該コロニー形成段階では、当該基体を当該装置内でまたは当該装置と共に少なくとも一つの軸の周りに回転させ、そして当該細胞を当該回転運動中に繰り返し当該基体の当該第１表面と接触させ、
当該コロニー形成段階の後に、当該基体を当該装置内で灌流段階に供し、当該灌流段階では、液体を当該第１の室に供給して、当該基体の当該第１表面を灌流することを特徴とする、基体に複数層の細胞のコロニーを形成させる方法。
【請求項２】
コロニー形成段階の間、細胞が、培地に供給されるか、または当該基体に塗布されるか、基体内に導入されるか、もしくは細胞を含む塊により基体を被覆することによって提供されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
因子または補因子を当該細胞に加えることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
成長因子または走化性因子を当該細胞に加えることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
灌流段階の間、当該基体が液体培地で灌流されることを特徴とする、請求項１ないし４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
灌流段階の間、当該基体が細胞培養栄養培養液または血液で灌流されることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
当該回転が、重なった回転運動の形で、少なくとも二つの空間軸の周りで同時に行われることを特徴とする、請求項１ないし６の何れか1項に記載の方法。
【請求項８】
当該回転が、順次にまたは交互に、少なくとも二つの空間軸の周りで行われることを特徴とする、請求項１ないし６の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
当該コロニー形成段階と灌流段階とが交互に行われることを特徴とする、請求項１ないし８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
コロニー形成段階の後で、当該基体を更なる休止段階に供し、その間は回転も灌流も行わないことを特徴とする、請求項１ないし９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
当該方法が、コロニーを形成させた基体、部分的にコロニーを形成させた基体、またはコロニーを形成させていない基体をコロニー形成に供するための更なる工程を含む、さらなる段階を包含することを特徴とする、請求項１ないし１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
当該灌流をパルス的に行うことを特徴とする、請求項１ないし１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
当該基体に、異なる細胞によって、異なる領域にコロニー形成させることを特徴とする、請求項１ないし１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
当該基体に、異なる細胞によって、順次または異なる位置にコロニー形成させることを特徴とする、請求項１ないし１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
コロニー形成に使用される装置において、当該基体を追加的に無細胞化し、そして／または無菌化し、そして／または運搬し、そして／または保存することを特徴とする、請求項１ないし１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
冷却用の液体または気体を導入することにより、コロニーを形成させた基体、コロニーを形成させていない基体、または部分的にコロニーを形成させた基体を一時的に低温保存することを特徴とする、請求項１ないし１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
当該気体が窒素であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）第１容器部材と、当該第１容器部材と取り外し可能に連結された第２容器部材とを含む容器と；
（ｉｉ）コロニーを形成させるべき第１表面および第２表面を有する基体のために当該容器の中に配置される装着装置であって、当該基体によって分離された第１および第２の室が当該容器内に形成され、当該第１表面および第２表面がそれぞれ当該第１および第２の室に面し、当該第１および第２の室が各々少なくとも１つの液体供給路および液体排出路を有するように当該基体を支持する装着装置と；
を具備し、
当該装着装置は当該第２容器部材に一体化されており、当該基体は、当該第１および第２容器部材を互いに連結するときに当該装着装置とともに当該第１容器部材に挿入され、当該第２容器部材を当該第１容器部材から取り外すときに当該装着装置とともに当該第１容器部材から再び取り出され得る、コロニー形成装置。
【請求項１９】
当該容器が回転可能に設計されていることを特徴とする、請求項１８に記載のコロニー形成装置。
【請求項２０】
１つまたは複数の装着装置が、容器の回転運動によって規定される、その中に存在する液体培地の優先的な運動方向に対して本質的に斜めに配置されることを特徴とする、請求項１８または１９に記載のコロニー形成装置。
【請求項２１】
当該供給路および排出路によって規定される室を通過する液体培地の流れ方向が、当該装着された基体に沿って走るように、当該装着装置を当該供給路および排出路に対して配置することを特徴とする、請求項１８ないし２０の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項２２】
当該装着装置が、少なくとも一つの枠型支持体から成ることを特徴とする、請求項１８ないし２１の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項２３】
当該装着装置が、Ｙ字形に分岐した管状補綴を作製するための少なくとも一つの分岐した支持体を有することを特徴とする、請求項１８ないし２１の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項２４】
当該基体は複数の壁を有し、当該装着装置は、培地、細胞および／または材料を当該基体の少なくとも一つの内室に導入するための少なくとも一つの更なる供給路および／または排出路を有することを特徴とする、請求項１８ないし２３の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項２５】
当該基体は複数の壁を有し、当該装着装置は、当該基体を支持する支持体を含み、当該支持体は、少なくとも一つの内室に培地、細胞および／または材料を導入するための少なくとも一つの更なる供給路および／または排出路を有することを特徴とする、請求項１８ないし２３の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項２６】
当該容器が円筒形であることを特徴とする、請求項１８ないし２５の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項２７】
当該容器が球形または球形に近い形であることを特徴とする、請求項１８ないし２５の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項２８】
少なくとも一つの室が、さらに一以上のガス供給路およびガス排出路を含むことを特徴とする、請求項１８ないし２７の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項２９】
当該液体供給路および液体排出路、並びに、存在する場合は、当該ガス供給路およびガス排出路が、回転可能な継ぎ手で連結されることを特徴とする、請求項１８ないし２８の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項３０】
当該コロニー形成装置の容器が、ガス透過性の壁から成ることを特徴とする、請求項１８ないし２９の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項３１】
当該液体培地を、それが当該室を流れる間に所望の様式で導く内部構造が、当該容器の内部に配置されることを特徴とする、請求項１８ないし３０の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項３２】
当該液体培地を、それが当該室を流れる間に所望の様式で導く内部構造が、当該容器の内部であって、当該容器の内壁上に配置されることを特徴とする、請求項１８ないし３０の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項３３】
当該容器は、当該第１容器部材の内壁と、当該装着装置により支持され、当該第１容器部材内に位置した当該基体との間に配置されて、当該基体と当該第１容器部材の内壁との間の空間を第２の室と更なる室とに分ける微細孔隔壁をさらに含み、当該更なる室が少なくとも１つの供給路と排出路とを有することを特徴とする、請求項１８ないし３２の何れか１項に記載のコロニー形成装置。
【請求項３４】
請求項１８ないし３３のいずれか１項に記載のコロニー形成装置を、コロニーが形成された基体の運搬容器および保存容器として使用する使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、基体に生きた細胞のコロニーを形成させる方法およびそれに使用可能なコロニー形成装置に関する。
【０００２】
基体またはマトリクスに細胞のコロニーを形成させ、その基体上でコロニーを培養することが各方面から望まれている。基体としては天然由来のものばかりでなく人工合成された基体も対象となる。天然由来の基体の例としては、特にコラーゲンを挙げることができる。合成基体としては、生物に不活性なプラスチックが考えられる。生きた細胞を移植してコロニーを形成させる基体は、細胞の増殖を促進させるために、しばしば網目構造にしたり、スポンジ構造にしたりすることが行われる。
【０００３】
コロニーを形成させるためには、細胞を壊したり損傷を与えないで基体に供給し、そこで増殖を開始するように移植する必要がある。ほとんどの場合、閉鎖系の細胞芝が目標とされる。
【０００４】
培地には、一般に、コロニーの形成を想定して培養される細胞か、または別の場所から移植された細胞が存在する。主として実験室で行われている既存のコロニー形成法では、基体と、培地に存在する細胞とを、たとえばいわゆる回転びんの中で接触させている。すなわち、基体、培地および細胞の運動が激し過ぎないように回転びんを常に制御しながら 回転培養装置(Rollschrank)の中で回転させている。
【０００５】
コロニーを形成させるには、常に細胞を基体に供給してそこで培養するために、一方では、細胞を含む培地を基体から洗い出さなければならず、他方では、フラスコ内部の流れや、回転運動または旋回運動が大きくなり過ぎて、新しく接種した細胞がうまく増殖するより前に刈り取られることがないようにしなければならない。その上、細胞のための基体はすべての場所に行き渡らなければならず、それゆえ、基体が回転運動によって折り重なったり、回転びん本体に付着したりしてはならないなどの問題が残されている。
【０００６】
これまでのコロニー形成実験では、増殖しつつある細胞を正常に分化させることはほとんど、または全く成功していない。人工的にコロニーを形成させた基体は、その細胞層の構造が天然の基体の場合と異なっている。
【０００７】
従来のコロニー形成法のさらに別の欠点は、生物的に人工的な脈管で内皮細胞芝の完全な集合体を十分形成させることができなかったことである。
【０００８】
従って、コロニーに使用される細胞が、培養条件によって、組織に特徴的な細胞集合体および生理学的な細胞分化を発達させることのできる方法が開発されることが望まれる。
【０００９】
かくして、本発明が解決すべき課題は、基体のコロニー形成を最適培養条件で行うことができるコロニー形成法およびそのためのコロニー形成装置を開発することである。開発すべきコロニー形成装置は、機構が簡単であり、かつコロニー形成が効果的に行えるものでなければならない。さらにまた、コロニー形成の工程全体にわたって基体の取扱いが安全かつ簡単でなければならない。
【００１０】
コロニー形成装置は、同時に滅菌、無細胞化(Azellularisierung)、保存、運搬、低温保存するための容器として使用できるものであることが望ましい。これは、最終ユーザーに至るまで、滅菌の連鎖が途絶えないために望ましことである。
【００１１】
この課題の、一つは、基体に細胞のコロニーを形成させることで解決される。その場合、−装置内ではそこに支持されている基体と、コロニーの形成が想定される細胞と、を少なくともコロニー形成段階にかけ、その間に、基体を、装置の中でまたは装置と一緒に、少なくとも一つの軸の周りに回転させ、そしてその回転運動中に、細胞を繰り返し基体と接触させ−そして、基体は一つまたは複数のコロニー形成段階の後に、または形成段階中に少なくとも一つの灌流段階にかけ、その間に、基体の少なくともその外部表面領域、または内部表面領域を灌流する。
【００１２】
本発明において、コロニー形成段階とは、その過程中に適切な方法で細胞を基体に供給して基体に細胞のコロニーを形成させる段階を意味する。
【００１３】
コロニー形成段階の間、細胞は培地に含まれた形で基体に供給するか、または基体に塗布するか、または基体に導入するか、または細胞を含む塊（たとえばコラーゲン）の層で基体に被覆される形で供給することが好ましい。
【００１４】
その際、細胞に因子または補因子、特に成長因子または走化性因子を加えることができる。
【００１５】
本発明において、灌流段階とは、その間に通常の専門用語の用法における「潅流(Perfusion)」の概念に従って、基体に灌流液を流す段階を意味する。様々な物質を濃縮させることができる細胞培養−栄養培養液、血液または血漿を灌流させることが好ましい。
【００１６】
方法の内部では複数のコロニー形成段階と灌流段階が相互に交代し、できれば交互に行われることが好ましい。コロニー形成段階の似たような実施は既に知られているにもかかわらず、工程の進行過程に一回または複数回の灌流段階を取り入れると、コロニー形成段階は顕著に改善されることが明らかとなった。灌流段階を加えることによって正常な細胞分化の発達に不可欠な準生理条件が模擬的に実現される。灌流によって剪断応力が目標範囲に入ると、内皮細胞が分化する。平滑筋も、灌流中にパルス圧が発生するとこれに反応する。灌流中に酸素および栄養物を導入すると、圧力負荷が作用する可能性がある。生体内で収縮期と、拡張期との間で発生するような生理学的な圧変動は、新しく形成される細胞（細胞外マトリクスの）の方向づけと、正常な安定性の形成および圧力負荷容量の十分な形成と、にとって特に重要である。
【００１７】
チューブ状の合成脈管の内側にコロニーを形成させることについては、既にBr. J. Surg. Vol.78, 878〜882 (1991)に記載されている。それによれば、脈管を回転させながら一定量の内皮細胞懸濁液を使ってコロニーが形成された。その際、短い（２０分間）コロニー形成サイクルに代わって、回転培養装置中に一晩入れておく長いサイクルが採用され、フィブロネクチンの被膜で覆ったＰＴＦＥの脈管にコロニーを形成させると、パルス状に流れる血液に対する抵抗性を格段に向上させることができることが確認された。しかしこの研究では、コロニー形成させる脈管に意図的に灌流液を流すとコロニー形成の結果そのものが向上するということは認識されなかった。一般に、当該装置はそれ自身の軸の周りにのみ回転が可能であって、多くの空間方向に回転させることはできない。さらに、脈管を受入れ、そして取り出すには、両端のキャップをはずす必要があり、極めて煩雑である。すなわち、リアクターから脈管を取り出すには煩雑な取扱いが必要となる。その結果、コロニーを形成させた脈管を取り出す際、構造が菌に汚染される危険性がある。
【００１８】
コロニー形成段階における基体の回転は、少なくとも２つの空間軸の周りの重なった回転運動の形で同時に行いうることが好ましい。その際、すべての空間方向の中で偶然に支配された回転運動も関わってくる可能性がある。この点については、本法にふさわしいコロニー形成装置との関連においてさらに論じることにする。
【００１９】
別の方法として、コロニー形成段階における基体の回転は、少なくとも２つの空間軸の周りに、順次にまたは交互に、行うことができる。
【００２０】
本発明の方法は、少なくとも一つのコロニー形成段階の後に、基体に休止段階を追加して、その間は回転も灌流も行わないように設計することもできる。このような休止段階を中間に挿入して、完全にまたは部分的にコロニーを形成させた基体に無負荷の癒合段階与えることができ、その間に細胞芝は強化され、または内部で再編成されることも可能性がある。
【００２１】
さらに、灌流を間欠的に行うことによって複数の構造を形成させることもできる。それには、たとえば、複数のコロニー形成段階で、たとえば最初に結合組織細胞、つづいて平滑筋細胞、そして最後に内皮細胞といったように順次に添加し、各コロニー形成段階の間に灌流段階を挿入する。このようにして、既に構造が形成されてその組織に固有な分化が行われている細胞集合体の上に、各事例に応じて、後続する細胞タイプを加えることができる。
【００２２】
最終的に数時間ないし数日以内に内皮細胞が増殖するまで、繊維芽細胞／平滑筋のコロニー形成を数日間および数週間にわたって行うことができる。内皮細胞は、不必要な培養時間を受けないように途中で低温保存することができ、そうすることが有利である。
【００２３】
さらに、マトリクスを形成する細胞を何回も新たに追加することができる。細胞を灌流段階と交互に繰り返して添加することも可能である。このことはコロニー形成装置の回転運動から運転を休止に切り替えて灌流を行うことを意味する。それを行うには、コロニー形成装置は、立てた位置で靜置することができる。しかし、水平に置くこともできるし、その他の任意の位置で靜置することも可能である。これは心臓弁を調製する時に重要である。後で詳しく説明するパルス操作は、心臓弁を垂直位置にして行われる。この場合、パルス段階が終了した後、重力によって房室弁の自発的な閉鎖が可能である。
【００２４】
さらに、本発明の方法は、既にコロニーを形成させた基体、または部分的にコロニーを形成させた基体、またはまだコロニーを形成させていない基体を処理するための工程を追加したさらなる段階を包含することもできる。たとえば、バイオリアクターを開いて基体を置き換える必要がなく、コロニーを形成させるべき基体をあらかじめ無細胞化する工程、一つまたは複数の洗浄段階、滅菌および／または各種のガス処理工程を全工程中に含めることができる。
【００２５】
本発明のさらに別の構成において、たとえば、ヒドロゲルのような補助物質の中に埋め込んだ成長因子または細胞を適用することができる。たとえば、特にチューブにコロニーを形成させる場合に、コラーゲンマトリクス（タイプＩまたは別のマトリクス成分との混合物）、またはフィブリノーゲンもしくはフィブロネクチンと細胞との混合物をチューブの外側および／または内側に添加することができる。添加は塗布によって行うこともできるし、滴下によって行うこともできる。細胞のタイプに特異的な成長因子および走化性因子としては、たとえば、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦを使用することができる。これによって結合組織細胞が動き回るための勾配が形成される。タイプが異なる細胞を複数の部屋で培養すれば、培地を対応する細胞のタイプに合わせることができる。
【００２６】
滅菌段階または保存段階に対しては、それに先行して、もしくはその後に低温保存段階を入れても、または入れなくても中断することができる。
【００２７】
灌流はパルス的に行うのが好ましい。この方法は、自然にまかせた生理学的条件のシミュレーションに利用される。既に述べたように、特に平滑筋はパルス状の圧力に反応するため、そのようにしてさらに構成された方法は、たとえば筋細胞のコロニーを形成させるのに考慮に値する。後で詳しく述べるコロニー形成装置は、その位置を変えることで内部の基体の姿勢をいろいろ変えることができるため、この目的に特に適している。さらに、体積を柔軟に（体積を大きくしたり小さくしたり）変えられるに十分な空間が基体に与えられる。
【００２８】
最後に、本発明の方法によれば、各事例に応じて必要であれば、基体の各領域に異なる細胞のコロニーを形成させることができる。これは−後でさらに詳しく説明するが−特に、この方法のために特別に開発されたコロニー形成装置を使うことで可能である。その装置は、互いに分離した複数の部屋、または分割された複数の部屋が基体に隣接して設けられ、それらの部屋は、それぞれ異なる培地またはコロニー形成培養液と接触し、さらに個別に灌流液を流すことができる。しかしこれに代えて、基体を領域的に保護し、たとえば覆いを取るか結びをほどいて、各領域を順次段階的に処理することも可能である。
【００２９】
もし望めば、基体に順次異なる細胞のコロニーを形成させることによって、異なる細胞で複数の層を形成させることもできよう。
【００３０】
使用される基体は、既に上で述べたように平面または管状であることが好ましく、それ自身が、内部に室を有するか、または２つ以上の壁を有することができる。また、基体は多孔質か、または海綿状であっても良い。細胞はその細孔または通路に沈着することができる。
【００３１】
基体は天然由来の生物材料（異種、同種材料、オートローグ）で形成することができ、たとえばコラーゲンのような再生生物材料、合成タンパク質、生体ポリマー、ポリマー、プラスチック織布または固体で構成することができる。また、多孔質の固体または海綿状の固体、たとえば軽石構造の無機固体を基体にすることもできる。このような固体は、とりわけ、人工骨の作製に適している。その場合の固体の基体は、棒状または管状に形成させることができるかもしれない。一般に、基体は、コロニー形成時にその周囲に流れるのに適していさえすれば良く（場合に応じて内側または外側を流れる）、その形状を問わない。
【００３２】
基体は、希望めば低温の液体またはガス、とりわけ窒素を導入しながら低温保存することができる。
【００３３】
一般に、本発明に従う課題は、容器と、その中に配置され、そしてコロニーを形成させるべき基体を装着する装置と、から成るコロニー形成装置によって解決される。その際、基体装着装置は、装着される基体と協働して、容器内に、少なくとも二つの本質的に液体を分離する室か、または制御しながら液体を運搬することのできる一つの室が、装着される基体と向き合う側に形成されるように、そしてさらに、形成される室のそれぞれが液体供給系と液体排出系とを少なくとも一つずつ有するように設計される。
【００３４】
コロニー形成装置の容器は、基体を装着装置に取り付け時、その基体全体を洗うことによって培養液を洗い流すことができるように成形すべきである。その場合、基体は、あらゆる適切な方法で支持体に結びつけ、または留め金具で留め、または縫いつけ、またはその他の方法によって、固定することができる。容器および装着装置の形状は相互にぴったり適合しなければならない。たとえば、容器は蓋の付いた脈管から成り、その蓋が装着装置と結合されて、両者が一体と成って取り出しが可能なインサート（入れ子）を形成することができる。
【００３５】
この取り出し可能なインサートによってコロニー形成の前後における基体の取扱いは簡単に成る。リアクターからインサートを取り出す時、基体（すなわち、たとえば出来上がったインプラント）に触れてはならず、リアクター内部の手の届きにくい位置にある、固定されたリアクター部材から基体を取り出さなければならない。従って、固定されて取り出しが出来ないようなハウジング部材に、コロニーを形成させる基体を取り付けたり取り外したりすることは不利であり、避けなければならない。かくして、取扱いは著しく容易になり、さらに、最終使用者まで運搬した後で、たとえば、医師が手術室で移植する時に無菌状態で使用することさえ著しく容易になる。装着装置と一緒にリアクターから取り出される基体は、自由に手が届き、差し当たり安定化されたまま維持されているので−固定機構に応じて−極めて簡単に（結びをほどいて、または留め金を外して、または切り取って）取り外すことができる。かくして、出来上がったコロニー形成基体、たとえばインプラント、の無菌的な取扱いは著しく簡単に成る。
【００３６】
次に、インサートは、装着装置が容器の内側に隣接するように設計され、それに応じて、装着される基板と向き合う側に、液体を分離する二つの室が形成された。各室では分離された培地または細胞による工程を行うことができる。基体の両側、すなわち内側と外側とで、同じ細胞および／または培地を使った工程を行うことができることは当然である。この装置の本質的な利点は、リアクターを開けなくても、細胞を（異なった細胞でも）繰り返しくまなく洗浄することができること、およびコロニー形成段階と灌流段階とを交代させることができることである。さらに、特に有機質の基体では、基体を貫通して意図した液体を移動させることが望ましい。コロニーを形成させる基体は、インサートを補完して室を隔てる一つまたは複数の壁を形成する。装着装置は、複数個の基体を装着できるように設計することもでき、その際は、複数個の室が形成される。形成された各室には、それぞれに液体供給路と、液体排出路とを設けることが望ましい。同ように、既に基体自体を多室構造にして、特に、壁の間に空腔を備えた二つ以上の壁を持つ構造にすることもできる。この場合、本発明のさらに別の構成において、装着装置は−好ましくは基体支持体の一つに−培地、細胞および／または材料を導入するための、少なくともさらに一つの供給路および／または排出路を、二つ以上の壁を持つこの基体内部の室に、有することを想定することができる。
【００３７】
分岐した基体の作製を希望する場合、それに応じて、装着装置を、たとえばＹ字形補綴を作製するために分岐させた支持体の一つに適合させることができる。
【００３８】
別の方法として、容器にキャップの取り付けを可能にするか、または適当な方法によって、容器の取り出しを可能にし、そうすることによって、または装着装置に取り付けられた基体は、極力問題がなくコロニー形成装置に導入し、それから再び同装置から取り出すことができる。
【００３９】
コロニー形成装置の容器自体を回転または旋回可能な設計にして、コロニー形成の全時間中、またはある決められたコロニー形成段階に対して、熱的に静止した回転培養装置に入れることができるようにすることが好ましい。それにはコロニー形成装置を円筒形に設計することができる。これは、たとえば心臓弁または他の脈管のようなチューブ状の基体にコロニーを形成させなければならない時に、特に有利である。この実施形態は図によってさらに詳しく説明される。
【００４０】
一般に、装着装置は、容器の回転運動または旋回運動によってあらかじめ規定される容器中に存在する液体培地の優先的な運動方向に対して斜めに配置される。その場合、装着装置は、供給路および排出路によって規定されるリアクターを貫通する流れの方向が、基板に沿って進むか、または基板の内部を進むように配置することが好ましい。
【００４１】
平板な基体の場合、たとえば皮膚の断片のような場合は、装着装置は、少なくとも一つの枠型の支持体で構成される。枠型の支持体はインサートを側面で固定することが好ましく、インサートは同時に箱型容器の蓋の役割も果たす。インサートを枠型支持体と一緒に入れる場合は、枠の三方を箱型の容器と内部で接するようにし、四方はインサートに固定された蓋と結合させる。こうすることによって容器内に三つの室が形成される。場合によって、これらの部屋に液体培地の供給路および排出路を設けなければならない。これらの供給管および排出管はインサートの蓋を介して通すことができる。箱型の容器そのものは回転することができないため、回転培養装置内で使用するには支持体に装着する必要がある。このような配置については後で述べる。
【００４２】
さらに、装着装置は、基体を支持するための二つの支持体で構成することもできる。これらの支持体は、機械的に動かないように、たとえば棒で上下に固定される。
【００４３】
回転または旋回する容器は、回転培養装置の中でもっと自由に運動できるようにするため、球形または球に近い形にすることもできる。その場合、球形の容器（または球形の支持体、下記参照）に転動用突起(Auslenknoppen)を取り付けることができる。それによって、回転培養装置、またはそのような装置の中で処理する場合、もっと無作為な運動をするように変えることができ、その結果、あらゆる空間方向に回転および旋回ができるようになる。容器は剛直な材料で構成することもできるし、柔軟な材料で構成することもできる。後者の場合は、とりわけ、容器の体積をある範囲内で可変にすることができ、その結果、たとえば圧力負荷がかかった時に、基体がさらに大きく膨張することが可能であるという利点がもたらされる。
【００４４】
コロニー形成時に培地と細胞を流す液体供給路および排出路に加えて、室に一つまたは数本のガス導入管およびガス排出管を設けることができる。ガス導入管およびガス排出管は、ホース状にすることができ、壁に沿って取り付けられ、その材料にはシリコーンのようなガスを透過しうる材料で構成される。これによってコロニーを形成させている間に培地にガスを導入し、そして培地から排出させることができる。しかし、コロニー形成装置の容器の外壁をガス透過性に替えるか、外壁にガス透過性の壁を追加することによって、ガスの交換を可能にすることができる。
【００４５】
そのためには、容器の壁をＰＴＦＥフィルムまたはシリコーンフィルムで構成するか、該壁は、これらの構造、またはガス透過性の材料から成るインサートを含むことができる。壁の構造は融着させた金属と、微細孔セラミクス質または多孔質ガラスで構成することもできる。これらの多孔性支持体構造は、ガス透過層、たとえばプラスチックフィルム層（たとえば、ＰＴＦＥ、シリコーン）、で被覆することができる。
【００４６】
コロニー形成装置のハウジングの壁構造に組み込まれたガス透過性膜またはフィルムの利点は、インキュベーター（在来の回転培養装置またはそれ用に作られた装置）周辺の大気が、酸素の交換ばかりでなく、二酸化炭素相を介して培地のｐＨを調節するのにも使用できることにある。従って、ここでは、導入される三次元構造（たとえば脈管または心臓弁）のコロニーが形成される分割された室（コロニーが形成される室）を、同時に培地容器と酸素供給機能として使用されることが重要である。
【００４７】
培地の供給路と排出路、およびガス供給管とガス排出管は、回転可能な継ぎ手によって、コロニー形成装置に接続することができる。もしそうすれば、このために特別に設計された回転培養装置の中で、コロニー形成装置を回転させながら、コロニーを形成させることが可能となろう。そのために、継ぎ手で連結される導管を同心的に製作することもできよう。
【００４８】
最後に、本発明のさらに別の構成において、液体培地がリアクター内を通過する間、それを希望通りに導く組み込み構造が、容器内に配置されていることが可能である。この場合、容器の内壁に渡り板またはホースを配置することが考えられる。より広い意味での好適な組み込み構造は、他の目的に使用されるリアクターの設計で知られている。
【００４９】
リアクター容器には、加熱または冷却のために、そのようなものとして知られている装置を装備しまたは接続することができる。そこで、たとえばリアクターの外側に培地を調整するための加熱線が入れてある。さらに、リアクターのジャケットに通入する加熱媒体または冷却媒体には、たとえば水を使用することができる。
【００５０】
ある実施形態では、培地は、コロニーを形成させるべき細胞を含み、供給路を通してリアクターに導入され、そして排出路から排出される。別の方法として、所定量の細胞をあらかじめリアクターに入れておくこともできる。その場合は純粋な培地だけが循環する。望ましくない細胞の破片を阻止するには、供給路および排出路にフィルターを装着しておくことが好ましい。さらに、供給路および排出路には閉鎖装置（遮断弁）を取り付け、各室を閉鎖することができるようにすべきである。本発明に従う方法では細胞を再循環させることは避けることが好ましい。従来の流通式コロニー形成法と異なり、細胞は基体の上に維持される。
【００５１】
既に上で説明したように、容器内には、コロニーを形成させる基体のための装着装置が存在する。基体は、培地および細胞にとって望ましい側から自由に手が届き、それ自身が重なったり相互にくっついたりしないよう、コロニーを形成させている間、終始装着装置内に置かれる。同時に、支持体は、取り出しができることが望ましいインサート内の基体をリアクターに導入し、そして再び取り出すことに使用される。このようにすれば、取り出しが可能なインサートは、基体の取扱い性が向上し、コロニーを形成させた後で直ちに液体に入れて常法に従って処理し保存することができる。
【００５２】
コロニーを形成させるべき基体は、装着装置内の、供給路と排出路の間の面を連続的に結合しなければならないため、長さおよび大きさを合わせる調節部材の他に、たとえば繊維で強化したシリコーン、またはその他の、好ましくは弾性プラスチックから成るチューブまたは漏斗で作られた中間部材を導入することができる。これは橋渡しに関しては短縮にもなりうる。
【００５３】
本発明に従えば、装着装置は、容器、または後でさらに説明する支持体に支持された容器、の回転または旋回運動によってあらかじめ規定された、液体培地の好ましい運動方向に対して本質的に斜めに配置される。ここで言う、「本質的に斜めに」とは、装着装置によって、運動する液体培地、すなわち培地中の細胞懸濁液が、回転または旋回によって、回転または旋回運動の回転軸に対して常に約３０゜ないし１５０゜の間の角度で基体に目がけて「投げつけられる」こと、すなわち、基体と繰り返し接触させられることを意味する。その場合、別の流れがあったとしてもそれを無視すれば、液体培地の好ましい運動方向は、装着された基体に沿うものと考えられる。
【００５４】
コロニー形成時に、すなわち少なくともある所定のコロニー形成期間に、回転または旋回可能な容器、すなわちコロニー形成装置全体を、回転培養装置または旋回させるための装置または相当する機能を有する同等の装置に導入して回転または旋回させ、装着した基体に対して、培地およびその中に懸濁させた細胞を運動させる。
【００５５】
コロニー形成装置は、回転培養器中で回転びんと同ように処理し、すなわち回転させ、もし必要なら調整する。回転培養器の代わりにコロニー装置を希望通りに運動させるのに好適な別の装置を使用することもできる。それはこの目的のために特別に設計された別個の装置であってもよい。回転培養器または装置は、特定の雰囲気（酸素、二酸化炭素）で使用することもできる。
【００５６】
コロニー形成期間中は、培地または細胞懸濁液を一つまたは複数の液体供給路と、一つまたは複数の液体排出路とを通してリアクター内に流してはならない。また、この流れを一時的に−たとえば、回転培養器中で回転させている間、または同様の目的に適った装置中で処理する間−止めておくことも特に目的に適っている。これは、供給路および排出路を留め金具かまたはコックで一時的に遮断することによって達成することができる。
【００５７】
培地は−細胞を含んでいてもいなくても−少なくとも一時的に供給路および排出路を通して循環させることができる。そうすることによって、一回通過させた時に増殖しなかった細胞が、基体に再度供給される。
【００５８】
培地中で運動しているが、まだ増殖はしていない細胞は、供給路を通じて流れの方向に沿って基体に供給され、そして基体に沿って分配される。それに対して、実質的に回転と旋回から成る運動の場合は、分配は、この流れの方向に対して「斜めに」行われる。この場合、両運動は重なってもよく、協働的に作用してもよい。細胞を基体と繰り返し接触させ、そして細胞を基体上に分布させるために、さらに別の運動様式、たとえば振とう運動を、回転および旋回運動と重ね合わせることもできる。
【００５９】
流れを基体に沿って調節することによって、基体のすべての位置に細胞を一ように分配させることが可能になる。細胞の運搬と細胞の成長が阻害されないように流速を調節することができる。培地を一時的に停止させ、その結果、基体のすぐ上にある細胞がそこに一時的に滞留し、付着増殖する機会を持つことでその培養を有利にすることもできる。
【００６０】
本発明は、既に述べたようにコロニー形成装置および回転できるように設計された支持体から成る配置を包含する。支持体は、その自体では回転出来ない容器、たとえば箱型容器を回転培養器内で処理することができるようにするために、またはさらに別の運動方向を導入するために、使用される。回転可能な支持体の回転軸、およびコロニー形成装置の装着装置に装着された基体の縦軸は、ある角度を成して互いに延びていることが好ましい。
【００６１】
前に挙げた配置に対する支持体として、前述のように、コロニー形成装置のための一つまたは複数の切り欠き部または受け部、を有する回転対称体を使用することができる。この回転対称体は、たとえばガラス、プラスチック、金属など、好適な材料で構成することができる。支持体は、たとえば、管状の通路を有する球形で構成することができる。この球形の通路には円筒形のリアクター容器を入れることができ（複数の容器に対して複数の管が存在することも可能である）、そしてその球は、コロニー形成装置の供給路および排出路を留め金で封鎖した後、回転培養器に入れられ、基体はあらゆる方向に向きを変える。また支持体は、管状の通路が円筒の軸に対して斜めに配置された円筒体またはフレームで構成することもできる。この支持体においてコロニー形成装置を回転させると、容器、およびそれと一緒に基体には、長さ軸の方向に対してさらに旋回運動が加わる。
【００６２】
コロニー形成装置は、基体のコロニー形成が終了した後、出来上がったコロニー形成基体の運搬および貯蔵用の容器として使用するのにも適する。こうすることによって、コロニーを形成させた、損傷を受けやすい基体を、すぐ引き続いて処理しなければならないといったこと、たとえば、培地溶液から取り出さなければならないといったこと、は避けられる。それどころか、使用されるまでそのまま、コロニ形成装置内に置いておくことができる。供給路と排出路、およびガス供給管と排出管は、運搬のために留め金具で固定することができる。さらに、コロニーを形成させた基体を望む培地中で（常に更新することができる）、任意に選択可能な雰囲気下に保管しておくことこともできる。
【００６３】
基体は、コロニー形成装置中で冷却することもできる。低温の液体またはガス（たとえば窒素）を少なくとも一つの室、できればすべての室に、同時に流すことによって、コロニーを形成させた基体、またはコロニーがまだ形成されていない基体、の低温保存を実現することができる。貯蔵を目的とする場合は、基体にコロニーを形成させる前に低温保存を行うことができる。その後で、たとえば滅菌工程に続けることができる。
【００６４】
本発明のさらなる構成においては、微細孔を持つ隔壁を使う、少なくとも一つの供給路および排出路を持つ室をコロニー形成装置の容器の内壁に追加形成することができる。同ようにして、複数の室を形成することもできる。これらの室には特別な培地または培養液（いわゆるfeeder-culture）をあらかじめ入れておくことができ、該装置の、一つまたは複数のコロニー形成室に栄養物または因子を供給する。
【００６５】
以下、実施例によって本発明を詳しく説明する。
【００６６】
図１は、本発明の実施形態を組立分解表示による縦断面で示したものである。図の装置は、管状基体（図中にＢで表示）にコロニーを形成させるために構成された円筒形コロニー形成装置である。容器１０は、二つの容器部材１０ａ、１０ｂ（略図のため、図中では連結されていない）から成る。液体供給路１６ａは、装置内部に同時に第一の環状または管状の基体のための支持体１２ａをも形成する。第２の環状支持体１２ｂは、円筒３０を介して容器の蓋１０ｂと結合され、さらにそれで、最初の支持体１２ａと機械的に結合されている。支持体１２ａ、１２ｂは協働して心臓弁となる管状基体Ｂのための装着装置を形成する。容器部材１０ａおよび１０ｂを一体化させる時、支持体１２ｂは、リングシール４０を介して容器部材１０ａの内壁および排出路１６ｂに対する密封性を確保している。同時に容器部材１０ａおよび１０ｂから成る容器１０は閉鎖され、シール４２で密封性が確保されている。こうすることによって、装着された基体Ｂと協働して、二つの室、すなわち管状基体Ｂの内部の室と、基体を取り囲む室と、が形成される。基体内部に細胞を供給するには、供給路１６ａを通って細胞懸濁液および／または培地が供給され、さらに管状支持体１２ａおよび１２ｂ、並びに基体を通過し、排出路１６ｂを通って再び排出される。コロニーが形成されている間は、供給路１６ａおよび排出路１６ｂは閉鎖されたままで維持される。コロニー形成段階が終了すると培地は排出路１６ｂを通って再び排出される。基体の外部表面にコロニーを形成させるには、細胞懸濁液および／または培地が供給路１６ａ’を通って供給され、容器内部の基体Ｂの周囲に分配され、排出路１６ｂ’を通って排出される。コロニーの形成は既に説明したように行う。
【００６７】
灌流段階中は、分離された二つの室または分割された室に対して別々に灌流を行うことができる。灌流は異なる成長因子および濃度を使って行うことができるため、異なった培地を細胞のタイプに合わせて供給し、内部に勾配を形成させることができる。リアクターを開かなくてもコロニー形成段階と灌流段階を交代させることができる。
【００６８】
処理終了時に蓋を開ける時、基体を装着したインサートは、引き出しのように一体として取り出される。作製された基体、すなわちここでは心臓弁インプラントの取扱いは、これによっていちじるしく簡略化され、基体の無菌性および無傷に対する確実性が高められる。
【００６９】
図２は、微細孔隔壁２０を追加することによって、円筒形１０ａの内壁で、すなわち円筒形ジャケットの内部で、室が分割されている、図１と同様の装置である。希望する培地を、少なくとも一つの供給路１８ａを通って少なくとも一つの排出路１８ｂに流すことによってこの追加室を被覆することができる。微細孔隔壁によって追加室と容器内部との間で交換が行われる。従って、追加室内には、栄養物または所定のガスが発生する可能性があろう。そうなれば、容器内部と連絡を取ることによって、栄養物またはガスを基体に供給することが可能になる。微細孔隔壁は、たとえばシリコーンフィルム、ＰＴＦＥ、融着ガラス、ポリカーボネート、セルロース、ポリアミド等のプラスチックで構成することが出来る。
【００７０】
図３は、二つの壁を有する管状基体Ｂ’のための円筒形の二室コロニー形成装置１０である。コロニー形成リアクターは大筋で図１に示す実施例と同じである。両図の間で、同じ部材には同じ番号が使用されている。図１とのコロニー形成装置の違いは、このリアクターが少なくとも二つの壁を有する基体に適することと、新たに供給路１９ａと排出路１９ｂが追加され、それによって、二つの壁を持つ基体Ｂ’の壁の間の空腔に培地または材料を導入することができることにある。この供給路１９ａ／排出路１９ｂは、装着装置の支持体１２ａに取り付けられている。支持体１２ａおよび１２ｂは、管状で二つの壁を持つ基体を両端で支持し、基体の端は支持体ｂでまとめられるか、または一つ結合されており、他方、供給路１９ａおよび排出路１９ｂは、支持体１２ａで、基体の二つの壁の間に導入される。そこで、基体の内部に、望む培地または材料並びに細胞を供給することができる。
【００７１】
図４は、そのような複数の壁を持つ基体Ｂ’のさらに別の実施例である。この例では基体は三つの壁を持っている。ここでも、基体は人工の基体であることが望ましい。本実施例ではこの基体の内部壁は１Ｂで示されている。その上方に二つの外被２ｂが配置され、内部基体上に任意の材料または細胞の層を保持している。ここで、基体は両端で一つに集束して、支持体１２ａおよび１２ｂ（図中には描かれていない）で結束される。
【００７２】
栄養培地またはコロニー形成培地との連絡は、流れの方向に対して斜めの拡散することによって行われ、供給路１９ａおよび排出路１９ｂを介して行われる図３の場合と異なっている。この例では基体内に導入され、基体上に付着される細胞３Ｂが示されている。基体の多層構造がいちじるしく厚い基体を可能とし、その結果、たとえば、局部的な圧力差の下に自然に近い毛管作用によて組織の形成が可能となる。
【００７３】
さらに別の実施例において、基体を、固体材料、とりわけ無機固体材料で構成することが考えられよう。例を挙げれば、無機材料として、カルシウムを含む固体材料、とりわけリン酸トリカルシウムを含む固体材料が、各事例に応じて、融着または接着させた圧縮顆粒体の形で使用することができる。本発明に従うバイオリアクターを使用すれば、ちょうどこのような多孔質の固体材料において、極めて優れた材料を固体材料の多孔質壁構造に導入することができる。
【００７４】
バイオリアクター技術の大きな利点は、いずれの場合も、インプラントとして製作された製品は、手術室で移植を行う直前に初めてバイオリアクターから取り出され、基体の最初の処理からコロニー形成基体を患者に移植するまでの間は、閉鎖された無菌状態での取扱いが保証される点にある。
【００７５】
本発明に従うバイオリアクターによれば、管内部のコロニー形成を、管の外部と切り離して行うことができるため、管状の骨インプラントを製作することができるという大きな利点がある。
【００７６】
図５は、分岐した基体のための装着装置の部分図である。図には基体自体も描かれている。この実施例では、装着装置の支持体１２ｂは、管状の支持体の断片１２ｃ、１２ｄ、１２ｅに分岐し、−この場合は端が三本の枝に分岐−それらは、Ｙ字形補綴Ｂ”の枝の一つを固定している。装置のその他の設計は、図１〜３と同様である。
【００７７】
図６は、コロニー形成装置のさらに別の実施例であり、長方形の蓋１０ｂを持つ箱型の容器１０ａから成る。容器１０には、枠型の装着装置１２が配置され、後者は蓋１０ｂに固定されている。装着装置と蓋とから成るインサートと容器との密封はシール４２によって確保される。シール４２ａは、容器内で枠型装着装置１２の周りを取り囲むＵ形のシールであり、適当な隆起を持つことができる。組み立てた状態では、コロニー形成装置内に、液体を分ける二つの閉鎖された室、すなわち、基体の上側の室と下側の室が形成される。
【００７８】
室の間で行われる液体の内部移動は、コロニーを形成させる基体の多孔性に依存する。これによって、コロニー形成装置の回転段階で酸素を供給された培地は、内部の構造に達することができる。
【００７９】
各室は、液体供給路１６ａ、１６ａ’と液体排出路１６ｂ、１６ｂ’とを備えている。図には描かれていないが、さらにガス供給管とガス排出管も取り付けることもできる。回転させながらコロニーを形成させている間は、供給管１６ａ、１６ａ’および排出管１６ｂおよび１６ｂ’は、留め金具で封鎖される。これを望まないときは、回転可能なジョイントが取り付けられる。しかし、通常は段階的に進められる。
【００８０】
図７は、回転が可能な好適な支持体１００である。この支持体の場合、コロニー形成装置１０は、コロニーが形成されている間、回転培養器の中でさらに旋回運動を追加することができる。支持体１００は、ガラスまたは有機ガラス(Plexiglas)で作られた円盤１１０から成り、その円盤には二つの穴１２０が中心からずらして開けられている。穴１２０は、円筒形コロニー形成装置１０を入れるために、卵形か円形が最も良い。円盤１１０は、この実施例では円形であるが、別の形、たとえば楕円のような形でもよい。本実施例において、円盤１１０は、複数の棒１３０によって連結されているが、閉鎖された円筒形の外被で連結してもよい。円盤１１０は、穴１２０が投影されて互いに向き合うように連結される。穴１２０の間には管１４０がはめ込まれ、管の中にコロニー形成装置１０を挿入することができる。コロニー形成装置は図に描かれていないが、その縦軸は、円筒形支持体１００全体の縦軸に対して斜めに延びている。支持体１００は、コロニー形成装置１０と一体の形で、回転培養器内に置くことができる。回転培養器内で処理する時、コロニー形成装置は、その縦軸の周りに回転運動をすると同時に、その縦軸に対して斜めの旋回運動も行う。こうすることで、培地は特に激しくそして均等に分散して基体と接触することに成る。
【００８１】
図示された装置の側壁（円筒形外被状、長方形、球形の外壁）は、灌流を行わないコロニー形成段階中の酸素の供給を良くするために、たとえば、ガス透過性ＰＴＦＥまたはシリコーンフィルムで構成することができる。回転段階の間中、酸素または酸素混合物で連続的にガス交換するか、または意図的にしばらく酸素を供給すると接着率は著しく高くなる（最高１００〜２００％）。このようにして、基体は常に（回転段階および灌流段階）最適条件で酸素の供給を受ける。消耗した培地は、回転させることによって酸素を供給するリアクターの壁に連続的に到達する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、管状基体のための円筒形二室コロニー形成装置の組立分解縦断図である。
【図２】  図２は、微細孔隔膜によって容器内部にさらに室を形成させた図１の装置である。
【図３】  図３は、図１に対応する形で表示した、二つの壁を有する管状基体のための円筒形二室コロニー形成装置である。
【図４】  図４は、二つの壁を有する基体の縦断面である（リアクターは図示されていない）。
【図５】  図５は、分岐した基体（部分図示）のための装着装置である
【図６】  図６は、枠型装着装置を備えた箱型コロニー形成装置の横断面図である。
【図７】  図７は、本発明による円筒形コロニー形成装置のための支持体である。
【図１】
0004855580.tif 000002
【図２】
0004855580.tif 000003
【図３】
0004855580.tif 000004
【図４】
0004855580.tif 000005
【図５】
0004855580.tif 000006
【図６】
0004855580.tif 000007
【図７】
0004855580.tif 000008