(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬上許容され得る賦形剤と組み合わせて、ＨＩＶ−１  Ｏｙｉ変異体のＴａｔであることを特徴とし、ＴＡＲと結合できるが、トランス活性化ができない、９９乃至１０６個のアミノ酸を含むＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質を含有する抗ＨＩＶ−１ワクチン。
【請求項２】
Ｔａｔタンパク質が化学合成Ｔａｔであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
Ｔａｔが固相で合成されることを特徴とする請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
Ｔａｔタンパク質が組換えＴａｔであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
請求項１乃至４に記載のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、その発現のために必要な要素とを含む発現ベクターを含む、抗ＨＩＶワクチン。
【請求項６】
Ｔａｔ配列の少なくともＮ末端領域及び／又は塩基性領域を含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項７】
ＴａｔのＣ末端に位置するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ領域が改変されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項８】
幾つかのＴａｔ変異体を認識できる抗Ｔａｔポリクローナル抗体のin vitro製造方法であって、
−免疫応答アジュバントと組み合わせて、請求項１に記載のＴａｔタンパク質を注射することによって、動物を免疫化すること、
−該免疫化した動物の血清に含まれる特異的抗体を精製すること、
を含む方法。
【請求項９】
生体試料中の、Ｔａｔタンパク質又はＴａｔタンパク質の一部の存在のin vitro検出方法であって、
−該試料を、請求項８の方法により得られる抗Ｔａｔ抗体と接触させること、
−該抗原−抗体複合体の存在を測定すること、
を含む方法。
【請求項１０】
生体試料中のＴａｔタンパク質又はＴａｔタンパク質の一部の存在を測定することによる、ＨＩＶ感染の診断用キットであって、
−免疫学的反応に適した媒質の調製のための試薬であって、請求項８の方法を行なうことにより得られる抗体を含む試薬、
−免疫学的反応によって産生される抗原−抗体複合体の検出を可能とする試薬、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の主題は、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の全体又は一部を含有する抗ＨＩＶ−１ワクチン、幾つかのＴａｔ変異体を認識できるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造、及び生体試料中のＴａｔの検出方法である。
【０００２】
本発明の主題は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対するワクチンとしての、このウイルスの調節タンパク質、即ちＴａｔタンパク質の使用、及びＨＩＶに感染した個体におけるこのタンパク質の検出に関する。
【０００３】
Ｔａｔは、ＨＩＶ−１ウイルス遺伝子の発現とこのウイルスの複製に必須のウイルスタンパク質である。Ｔａｔ遺伝子は、単離株によって異なるが、９９乃至１０６残基からなるタンパク質をコードする２個のエキソンからなる。しかし、Ｃ末端の一部が欠失した８６残基を含む型のＴａｔ活性が、既に報告されている。８６残基を含むこれらのＴａｔ誘導体は、実験室のアーティファクトか、もはや天然状態では存在しない先祖型であると考えられている。このタンパク質は、ＨＩＶ−１のｍＲＮＡの５´末端に位置するＴＡＲと命名されたヌクレオチド標的と結合することによって、ＨＩＶ−１遺伝子を活性化させる。このタンパク質は、ＨＩＶに感染した細胞から分泌され、ＨＩＶ−１の有効な逆転写に必須である。細胞外に出ると、このタンパク質は、離れた感染細胞を活性化でき、非感染Ｔ細胞の免疫不全を引き起こすことができる。更に、このタンパク質は、カポシ肉腫などのＡＩＤＳ関連の病理学的疾患に直接関与する。
【０００４】
ＡＩＤＳに対するワクチンの開発が、地球上至る所で非常に期待されているが、ＡＩＤＳに対するワクチンの製造には、２点の主要な困難性がある。第１点は、エンベロープタンパク質であるＧＰ１２０の非常な変異性に関連する。第２の困難性は、抗ＧＰ１２０抗体は、明白なＡＩＤＳ患者に対しては病気を悪化させるらしいという事実による。しかし、予備的な結果によると、それ以前に汚染されていなかった人々においては、抗ＧＰ１２０抗体によって防御効果が可能でありうることが示されている。抗ＧＰ１２０ワクチンによるフェーズＩＩが、米国においてＲｏｃｈｅ社によって開始されている。このフェーズＩＩのために選別された集団は、医学的観点から十分に監視されている。しかし、ワクチンが上市されると、同等な医学的指示を得ることは困難であろう。
【０００５】
ＧＰ１２０とともに、Ｔａｔは、ＨＩＶ−１感染患者の血液中に検出される。ウイルスに感染した細胞全部を除去する役割を担うマクロファージと細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性は、徐々にＴａｔによってブロックされる。それ故、Ｔａｔは、免疫抑制物質として働く。抗Ｔａｔ抗体（又はＴａｔを標的とする活性な成分）は、ＣＴＬやマクロファージの活性を回復させるはずである。
【０００６】
それ故、Ｔａｔは、抗Ｔａｔ抗ウイルス剤の開発と、ワクチンアプローチの両方のために、好ましい標的である。
【０００７】
それ故、Ｔａｔタンパク質は、実験の題目となってきた。生物学的に不活性な組換えＴａｔタンパク質（Ｔａｔトキソイド）を用いて行われた前臨床試験によると、血清反応陰性の患者において、Ｔａｔトキソイドは、高いかつ持続的な抗Ｔａｔ抗体の産生を引き起こすことが特に示された（Le Buanec et al., 1998）。血清反応陽性及び免疫不全の患者においては、抗Ｔａｔ抗体レベルの顕著な増大が、通常の抗Ｔａｔ抗体レベルと比較して観察される（Westendorp et al., 1995）。
【０００８】
このＴａｔトキソイドは、Ｔａｔシステインのカルボキシメチル化後に生物学的に不活性になっている組換えタンパク質である。本発明者らはまた、カルボキシメチル化Ｔａｔ（Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ）を製造でき、トランス活性化活性の喪失も観察した（遊離のシステインを有する同じＴａｔ変異体（Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｆＣ）が、トランス活性化ができるにもかかわらず）。Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣは、Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｆＣに匹敵するアフィニティでＴＡＲと結合できる。
【０００９】
ワクチンとしてのカルボキシメチル化Ｔａｔの使用が不利である主要な点は、システインの化学修飾によって、本発明者らが円二色性とＮＭＲで観察したコンフォメーション変化が引き起こされるということである。コンフォメーション変化は種々のＴａｔ変異体間に存在するが、システインのカルボキシメチル化は、Ｔａｔのペプチド鎖のフォールディングにおいて大きな変化をもたらし、結果として、それは、抗Ｔａｔワクチンの製造のための良い候補とはならない。
【００１０】
それ故、抗ＨＩＶ−１ワクチンにおいて、欠損はあるが、機能的なＴａｔに類似した構造的特徴を有するＴａｔタンパク質を使用することが賢明である。このＴａｔは、自然のＴａｔによって引き起こされる免疫応答と同様の免疫応答を引き起こすことができるように、できるだけ自然のＴａｔタンパク質に近いが、トランス活性化できない、即ち、上記のように、離れた感染細胞を活性化できず、非感染Ｔ細胞の免疫不全を引き起こすことができない、三次元構造を実際は有すべきである。この免疫不全性を阻害することは実に決定的である。
【００１１】
それ故、本発明の主題は、医薬上許容され得る賦形剤及び、適宜、１種以上の適切な免疫アジュバントと組み合わせて、ＴＡＲと結合でき、かつトランス活性化できない、少なくとも１種のＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の全体又は一部を含有する抗ＨＩＶ−１ワクチンである。このＴａｔタンパク質は、それを投与される動物において、このタンパク質の他の変異体を認識できる抗体の産生を、該変異体のトランス活性化を阻害するのに十分なレベルで引き起こすことができるべきである。
【００１２】
従って、本発明のワクチンの製造のために、Ｔａｔタンパク質ばかりでなく、本発明においてＴａｔタンパク質に所望される機能を果たすことができるこのタンパク質の１種以上の部分も使用することができる。上記ワクチンはまた、種々のＴａｔタンパク質、又は種々のＴａｔタンパク質の部分の組み合わせも含みうる。
【００１３】
本発明の好適な実施態様によれば、Ｔａｔタンパク質が全体として使用される場合、Ｔａｔタンパク質は、好ましくは９９乃至１０６個のアミノ酸からなり、更により好ましくは１０１個のアミノ酸からなる。
【００１４】
“Ｔａｔタンパク質の一部”という表現は、同じ変異体に属するか、又は属さない１種以上のＴａｔタンパク質の任意のフラグメント、又はフラグメントの組み合わせ（抗体の産生を引き起こすために十分に免疫原性である）を意味するものと理解されたい。好ましくは、該フラグメントは、１５乃至３０アミノ酸からなり、好ましくは１８乃至２５アミノ酸からなる。この定義は、この表現が、本出願で使用されるときにはいつでも有効である。
【００１５】
それ故、本発明のワクチンに使用できるＴａｔタンパク質は、トランス活性化はできないがＴＡＲとは結合できるように、“天然”と呼ばれる、即ち、天然状態で存在する種々のＨＩＶ−１株から抽出される、機能的なＴａｔタンパク質とは異なるべきである。そういうわけで、本発明のワクチンに使用されるＴａｔは、機能的なＴａｔのヌクレオチド配列と比較して少なくとも１個の変異を有するヌクレオチド配列を有する。この変異は、一般的に点変異であり、例えば、１個以上のアミノ酸のサプレッション、付加、又は置換を引き起こしうる。
【００１６】
本研究において、本発明者らはまず第１に、Ｂｒｕ単離株に対応するＴａｔ変異体（８６残基）を研究し、次いで、このタンパク質で観察される構造的多様性を各々が代表する５種の他の変異体を合成した（Gregoire et Loret, 1996）。即ち、Ｔａｔ  Ｚ２（８６残基）、Ｔａｔ  Ｍａｌ（８７残基）、Ｔａｔ  Ｅｌｉ（９９残基）、Ｔａｔ  Ｏｙｉ（１０１残基）、及びＴａｔ  Ｊｒ（１０１残基）。全てのＨＩＶ−１単離株のうち、６つの構造的な群が、タンパク質の大きさと変異の性質に基づき決定された。これらの全ての変異体は、カルボキシメチル化システイン（Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ）を有するものと、次いで遊離システイン（Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｆＣ）を有するものと、２度合成されたＴａｔ  Ｂｒｕと類似の薬理活性を恐らく有していた。使用した化学は、ＨＢＴＵアクティベータを用いるｆａｓｔＦｍｏｃタイプのものである。タンパク質の精製は、高速液体クロマトグラフィーで行った。これらの全ての合成タンパク質はＴＡＲに結合できることが見出されたが、大きな相違がＨｅＬａ細胞のトランス活性化試験で観察された。最も驚くべき結果は、Ｔａｔ  Ｏｙｉ変異体で観察された、トランス活性化の無いことであった。また、カルボキシメチル化システインを有するＴａｔ  Ｂｒｕ誘導体でもトランス活性化は観察されなかった。これらの合成タンパク質における水相円二色性（ＣＤ）研究は実際に、Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣの化学修飾は、Ｔａｔ  Ｂｒｕの構造を顕著に改変したことを示す。一方、Ｔａｔ  Ｏｙｉは、そのＣＤスペクトルによって実証されたように、他のものと類似の構造を有する。
【００１７】
ＨＩＶ−１  Ｏｙｉ株は、１９８８年にガボン人患者（より正確には、妊婦）で同定された（Huet et al., 1989）。この患者は、数年間血清反応陽性であったが、完全に健康であった。明らかに、欠陥のあるＴａｔタンパク質が、このＨＩＶ−１株に存在するという事実によって、この患者におけるＡＩＤＳへの進行が妨げられ、彼女にＡＩＤＳウイルスに対する免疫が与えられていた。実際、フィールドで行われた疫学的研究は、ＨＩＶ−１  Ｏｙｉに感染した患者が、長期間非進行者であったことを示している。
【００１８】
ＨＩＶ  Ｏｙｉ株は、欧州と北米で最も一般的なＨＩＶ−１株に対応するサブタイプＢに属する。ＨＩＶ  Ｏｙｉ株が同定されたガボン人女性は、ガボンの南東のＨａｕｔ  Ｏｇｏｏｕｅという田舎の州に住む３１人のグループに属していた。このグループは、１９８６年、ガボン全体で感染した約２０００人に対し行われた血清疫学的解析の間に見出された。このＨａｕｔ  Ｏｇｏｏｕｅグループは注目をあびた。というのは、感染した人々は、健康良好で、また、全く例外的なウエスタンブロットプロフィールをも示したからである。実際に、これらの人々において、抗ｇｐ１２０抗体、抗ｇｐ１６０抗体、抗ｇｐ４１抗体の存在を検出できなかったが、抗ｇａｇ抗体、抗ｐｏｌ抗体は同定された（Huet et al., 1989）。
【００１９】
次いで、この同じＨａｕｔ  Ｏｇｏｏｕｅ州の７５０人の妊婦の一群が研究され、彼女らのうち２５人（即ち、３．３％）がＥＬＩＳＡ試験でＨＩＶ陽性であることが示された。これらの２５人の女性のうち、２３人がこの地区に特徴的な例外的ウエスタンブロットプロフィール（上記参照）を有していた。ＨＩＶ−１  Ｏｙｉ株を有するその一人を含む約１０人の女性が、２年間追跡調査された。
【００２０】
この期間中、例外的な血清学的プロフィールは一定のままであった。これは、最近感染したこと（最近感染したのならば、抗ｇｐ１２０抗体の形成のための時間が無かったであろう）の可能性を除外している。ＨＩＶ−２感染の存在は除外された。というのは、ＨＩＶ−２  ｇａｇに対する反応が無く、ＨＩＶ−２感染は、ガボンでは２ケースが報告されるのみであり、それらは沿岸地域に位置していたからである。モニタリングされた全ての患者は、２年間の研究の間、健康良好で、体重の減少は無く、日和見疾患も無かった（Huet et al., 1989）。
【００２１】
Ｏｙｉが同定された女性は、田舎出身で、健康は良好で、ＨＴＬＶ−１とＨＩＶ−２に対し血清反応陰性であった。彼女のリンパ球とＰＰＭＣの共培養は、１５日間後のみＲＴ活性を示した。これは、非常に異常である。該ウイルスはまた、殆ど検出できない細胞変性活性しか有しなかった。培養上清は、ＰＢＭＣを感染させることができたが、Ｈ−９やＣＥＭ又はＵ−９３７単球などの正常なリンパ球株では、実質的に複製は不可能であった。この解析の正当性を実証すべく、全てのケースで抗ｇｐ１２０抗体の非存在を確認している、同じ地区の１７人の他の患者でも、同様の結果が観察された。通常のＨＩＶ−１ドナーの血清は、ＨＩＶ−１  Ｏｙｉ  ｇｐ１２０を認識できることに注目することは、興味深い（Huet et al., 1989）。それ故、ＨＩＶ−１  Ｏｙｉ  ウイルスはクローニングされた。Ｔａｔ遺伝子を除いて配列決定は成功した（Huet et al., 1989）。
【００２２】
Ｃｙｓ２２のＳｅｒへの変異が、トランス活性化の喪失の理由であると考えられ、この変異の復帰が、Ｔａｔ活性の回復を可能とする。
【００２３】
更に、Ｔａｔの非存在下、該ウイルスの増殖は可能であるが、非常に低レベルであることが観察された。それ故、ＨＩＶの毒性とＴａｔトランス活性化効率の間に密接な関連がある。この疫学的研究は、今一度、この疾患の死亡率とＨＩＶ複製速度の間に存在する密接な関連を示す。それ故、Ｔａｔは、このウイルス感染を命にかかわる疾患に変化させる複製速度にＨＩＶが到達するのを可能にすると考えられる。
【００２４】
更に、Ｈａｕｔ  Ｏｇｏｏｕｅ地区のこれらの例外的な患者に関するこの研究から、正常なＨＩＶ株と比較して、欠陥のあるＨＩＶ株が提供するように考えられる防御が示された。実際に、数人の例外的な患者からの新しく集められたリンパ球のＰＣＲ解析は、正常なＨＩＶ株の存在を示したらしい。該防御機構は抗ｇｐ１２０抗体を含まない。抗ｇｐ１２０抗体はこれらの患者には存在しないからである。細胞障害性Ｔリンパ球の作用は、該ウイルスの除去を可能にする機構でありうる。
【００２５】
ガボンで行われた比較的最近の疫学研究（Delaporte et al., 1996）によると、他のアフリカ諸国と比較してＨＩＶ感染者の割合が低い（２乃至３％）ことがわかる。Ｏｙｉサブタイプは、集団から完全に消失したようであり、ＨＩＶ−１  Ｏｙｉ株が採取されたガボン人女性は、１９９５年において完全に健康であり、３人の子供を産んだ。３人とも全て血清反応陰性であった。ＨＩＶ−１  Ｏｙｉウイルスは、もはや彼女において検出できなかった。
【００２６】
それ故、ＨＩＶ−１  Ｏｙｉ変異株のＴａｔタンパク質は、抗ＨＩＶ−１ワクチンの組成物に入れる最良の候補であると考えられる。しかし、不活性化されたＴａｔは、必ずしも免疫原性ではない。目下、ワクチンの全ての利点は、抗体の産生を引き起こすことであり、本ケースでは、更に、他のＴａｔ変異体に対して活性な抗体の産生を引き起こすことである。驚くべきことに、本発明者らは、この証明をすることができた。それ故、本発明のワクチンは、特に好適な実施態様によれば、ＨＩＶ−１  Ｏｙｉ変異株のＴａｔの全体又は一部を含有する。
【００２７】
抗Ｔａｔワクチンの利点は、幾つかのレベルで予見さえされうる。無症候の患者において、免疫不全性を制限することによって、ＡＩＤＳへの進行を遅らせることは可能であろう。このようなワクチンは、感染の開始においてそうであると考えられるように、患者が該ウイルスに対し有効な免疫を保持するのを可能にするだろう。特に、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とマクロファージ（それらはＨＩＶに感染しないが、それらの活性はＴａｔによって阻害される）の活性の回復は、結果的に患者が非進行者になることを可能にするだろう。
【００２８】
明白なＡＩＤＳ患者において、抗Ｔａｔワクチンは、ＨＩＶ感染細胞によるＴａｔタンパク質の分泌後のＴａｔタンパク質の直接的な作用に関連していると考えられる、カポシ肉腫又は神経学的症候群などのある種の病理学的疾患の発生を制限できよう。
【００２９】
本発明において、ＨＩＶ−１  Ｏｙｉ変異株の利点は、異なるＴａｔ変異体の間の交差認識があるかどうかを決定するために本発明者らが行った、ウエスタンブロット実験（ゲルの写真は、本出願で示さず）とＥＬＩＳＡ試験によって、更に確認される。
【００３０】
実際に、これら２つのタイプの実験において、３種の異なる抗Ｔａｔ血清が、７種のＴａｔ変異体に対して試験された。
【００３１】
本発明者らは、フロイントアジュバントの存在下、従来の免疫化プロトコルに従い、ウサギをＴａｔ  Ｏｙｉ、Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ、Ｔａｔ  Ｅｌｉで免疫化した。５３日後に得られたポリクローナル血清をウエスタンブロッティングとＥＬＩＳＡ試験で解析した。観測された力価は、抗Ｏｙｉ抗体、抗Ｂｒｕ  ｃｍＣ抗体、抗Ｅｌｉ抗体に関して、それぞれ７００、１１、６６０ｐＭである。
【００３２】
変性条件下でのウエスタンブロット実験より、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ血清と抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清は、全ての変異体と交差免疫原性を示すことができないことがわかる（抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ血清の場合は交差免疫原性を示すのだが）。
【００３３】
Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣは、そのシステインがカルボキシメチル化されている変異体である。システインのこの化学修飾は、トランス活性化活性の喪失（Peloponese et al., 1999）を引き起こすだけではなく、この変異体の３Ｄ構造の喪失も引き起こす（ランダムコイルに変換する）（結果は発表されていない）。それ故、全ての変異体が変性している場合、抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ血清がそれら全てを認識できることが観察されるのは、驚くべきことではない。
【００３４】
非変性条件下でのＥＬＩＳＡ試験（図７）より、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ血清は、抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ血清と同様、全ての変異体を認識できることがわかる。一方、抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清は、やはり全ての変異体を認識できない。それ故、保存された３Ｄエピトープが多数のＴａｔ変異体に存在すると考えられる。しかし、Ｔａｔ  Ｏｙｉの特別な免疫原性の特徴のみが、これらの抗体を大量に産生させることを可能とする。それ故、今まで、患者におけるＴａｔの存在が過少評価されてきた可能性が高い。３種の血清の希釈は１／１０００である。希釈しない以外は同一の実験においては、抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清もまた全ての他のＴａｔ変異体を認識できる。Ｔａｔ  Ｂｒｕのリシン５０（Ｔａｔ  Ｂｒｕ  Ｋ５０）のアセチル化は、低濃度で抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清による認識を可能とすることに注目するのは、好都合である。
【００３５】
それ故、これら３種のウサギポリクローナル血清を用いて行われたこれらの実験によって、ワクチンとしてのＴａｔ  Ｏｙｉの利点が確認される。更に、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ血清は、Ｔａｔ  Ｂｒｕ又はＴａｔ  ＥｌｉによるＨｅＬａ細胞におけるトランス活性化を阻害できる。対照として使用された抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清は、活性な変異体からの抗体の産生でさえ、Ｔａｔ  Ｏｙｉで観察されているようには全てのＴａｔ変異体の交差認識を保証しないことを示す。長い変異体である（１０１残基）Ｔａｔ  Ｏｙｉは、短い変異体である（８６残基）Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣと比較して、Ｔａｔ変異体のより良好な認識を可能とする。短いＴａｔ変異体を有するＨＩＶ−１株は実際的に消失して、それは、実験室のアーティファクトであったと考えられる（Jeang et al., 1999）。更に、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ血清は、もはや、変性型（即ち、線状エピトープ）を認識しないので、それは、高特異性を示す。逆に、抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ血清は、Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣの大きな構造的多様性の故に、ヒトにおいて自己免疫抗体を産生する顕著なリスクがある。本発明者らは実際に、ヒトアルブミンを認識できる抗体が抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ血清中に存在することを観察した（データは示さず）。
【００３６】
それ故、少なくとも１種のＴａｔエピトープの三次元構造の保存は、抗Ｔａｔ  ３Ｄ抗体による他のＴａｔ変異体の認識に必須である。
【００３７】
更に、本発明者らは、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ抗体は、Ｔａｔ  Ｅｌｉタンパク質のトランス活性化を阻害できることも示した。
【００３８】
それ故、本発明の主題はまた、幾つかのＴａｔ変異体を認識できる抗Ｔａｔ  モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造方法である。それ故、これらの抗体が、ＨＩＶに感染したかもしれない個体において、変異体にかかわらず、血液中にＴａｔタンパク質の存在を検出するのに使用し得ることは、実際に強調されるべきである。
【００３９】
それ故、本発明は、幾つかのＴａｔ変異体を認識できる抗Ｔａｔポリクローナル抗体の製造方法であって、
−免疫応答アジュバントと組み合わせて、Ｔａｔタンパク質又はこのＴａｔタンパク質の一部によって動物を免疫化すること、
−該免疫化した動物の血清中に含まれる特異的抗体を精製すること、
を含む方法に関する。
【００４０】
動物の免疫化は、注射、吸入、経口投与、皮下、皮内、腹腔内、静脈内、又は筋肉内などの、Ｔａｔタンパク質又はこのＴａｔタンパク質の一部をこの動物内に導入する任意のやり方で行うことができる。
【００４１】
動物の免疫化はまた、当業者に周知の技術に従って、Ｔａｔタンパク質の全体又は一部の配列ばかりではなく、Ｔａｔタンパク質の発現に必要な全てのシステムを担持するベクターをｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｓｉｔｕで発現させることによって行うこともできる。
【００４２】
免疫化した動物の血清に含まれる特異的抗体の精製は、例えば、抗原として役立ったタンパク質又はタンパク質の一部が前もって結合されているアフィニティーカラムで行うことができる。
【００４３】
本発明の好適な実施態様によれば、上記方法の免疫化工程で使用されるＴａｔタンパク質又はＴａｔタンパク質の一部は、Ｏｙｉ変異体又はＢｒｕ  ｃｍＣ変異体に対応する。
【００４４】
本発明の別の実施態様によれば、上記タンパク質は化学合成タンパク質である。
【００４５】
７個のシステイン残基の位置（領域２２−３７）は、全てのＴａｔ変異体で高度に保存されている。トランス活性化のために、これらのシステイン残基のうち６個が重要であることが、文献（Jeang, 1996）に広範に記載されている。
【００４６】
それ故、Ｔａｔ変異体をトランス活性化できなくするが、本発明において所望される性質を有するようにするために、これらのシステインの少なくとも一つにおいて、Ｔａｔ変異体を変異させることを想起することは大いに可能である。この変異は、例えば、システインのセリン又はアラニンなどの別のアミノ酸への置換でありうる。
【００４７】
本発明者らは、異核２Ｄ  ＮＭＲによるＴａｔ  Ｂｒｕの３Ｄ構造の決定により、Ｔａｔ変異体において保存されるべき標的領域を更に同定した。この標的は部分的には、Ｔａｔ配列のＮ末端領域と塩基性領域からなる。
【００４８】
Ｔａｔ  Ｂｒｕ変異体の３Ｄ構造は、システインリッチな領域は、Ｎ末端領域と塩基性領域の３次元空間に近いことを示す。このことは、システインのカルボキシメチル化は恐らく、この標的の構造を改変することを示す。また、このことから、このように改変されたＴａｔは、抗ＨＩＶワクチンの製造のために可能性ある候補として考えることができないという事実が確認される。
【００４９】
更に、本発明者らは、種々のＴａｔタンパク質の固相化学合成を行った。
【００５０】
当分野の知識の現在のレベルで、この形態の合成により与えられる利点は、分子生物学によって製造されるＴａｔと比較して、製造費の安いこと、より良好な収率、及びコンタミネーションの無いことにある。
【００５１】
好ましくは、本発明のワクチンで使用されるＴａｔは、化学合成、より詳細には、固相化学合成、例えば、ＦＭＯＣタイプ、好ましくはｆａｓｔＦＭＯＣタイプの合成によって製造される。このタイプの保護基を用いる合成方法もまた、本発明の主題である。
【００５２】
しかし、本発明のワクチンで使用されるＴａｔはまた、他の任意の方法、例えば、当業者に周知の組換え技術によっても合成することができる。これらの技術において使用されるこれらのクローニング及び発現システムは、大腸菌、バチルス、ストレプトマイセス、サッカロマイセスなどの微生物ばかりでなく、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞に由来し得る。バキュロウイルス発現システムも想起することができる。Ｔａｔタンパク質の全体又は一部の配列を担持するベクターは、当業者に周知の技術に従い、上記のことをするために必要な発現システムを全て含むことは、きわめて明白である。
【００５３】
更に、Ｔａｔタンパク質、特にＴａｔ  Ｏｙｉの膜内への移行の故の毒性のリスクの可能性を避けるために、全てのＴａｔ変異体の配列のＣ末端に存在するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を改変することが賢明であろう。この配列は細胞表面の膜レセプターを認識するので（Jeang, 1996）、膜移行に実に必須である。より詳細には、この改変は、構造には何の影響も与えないであろうＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ配列、又は、ことによるとＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ配列で、この配列を置換することでありうる。
【００５４】
上記のように、ＨＩＶ感染者数は、今まで、感染者における、例えば、感染者の血液中におけるＴａｔタンパク質の存在を検出するのに失敗したために、過少評価されてきた可能性が高い。本発明の利点は、限られた数の抗体によって、最大可能数のＴａｔ変異体を検出する手段を提供することである。
【００５５】
それ故、本発明の主題はまた、生体試料中のＴａｔタンパク質又はＴａｔタンパク質の一部の存在の検出方法であって、
−該試料を、幾つかのＴａｔ変異体と抗原−抗体複合体を生じさせることができる抗Ｔａｔ抗体と接触させること、
−該抗原−抗体複合体の存在を測定すること、
を含む方法である。
【００５６】
“抗Ｔａｔ抗体”という表現は、抗体全体ばかりでなく、本発明において所望される役割を果たすことができる、即ち、Ｔａｔタンパク質の全体又は一部を認識できる抗体のフラグメント又はキメラ抗体をも意味するものと理解されたい。
【００５７】
抗原−抗体複合体の存在の測定は、当業者に周知の方法で行う。詳細には、これらの複合体の検出を可能とする試薬はマーカーを含んでもよく、あるいは、より詳細には使用される抗体が非標識である場合、今度は標識試薬によって認識されるものであってもよい。
【００５８】
本発明の方法において、生体試料を、抗Ｔａｔ抗体と接触させることは、抗Ｔａｔ血清によって行いうる。
【００５９】
“生体試料”という表現は、患者から収集された任意の液体試料、細胞試料、又は組織試料を意味し、適当な抗体の存在下、抗原−抗体複合体を産生できる抗原を含んでいそうであるものと理解されたい。好ましくは、この生体試料は血液である。
【００６０】
最後に、本発明の主題はまた、生体試料中のＴａｔタンパク質又はＴａｔタンパク質の一部の存在を測定することによる、ＨＩＶ感染の診断用キットであって、
−免疫学的反応に適した媒質の調製のための試薬、
−免疫学的反応によって産生される抗原−抗体複合体の検出を可能とする試薬、−任意で、抗原を含まない参照生体試料（陰性対照）、
−任意で、所定量の抗原を含む参照生体試料（陽性対照）、
を含むキットである。
【００６１】
本発明の好適な実施態様によれば、免疫学的反応に適した媒質を調製するための試薬は、幾つかのＴａｔ変異体と抗原−抗体複合体を生じさせることができる抗Ｔａｔ抗体を含む。好ましくは、該試薬は、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ抗体もしくは抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＭ抗体又はこれら２つの組み合わせを含む。
【００６２】
図面
図１：種々のＴａｔタンパク質の比較。
Ｔａｔタンパク質は、６つの構造群に分離される。６つの構造群は、図１Ａでは太字で言及され、図１Ｂでは下線が引いてある。
【００６３】
図１Ａ：Ｔａｔタンパク質のアミノ酸配列。
ＴａｔＺ２は、ＨＩＶ−１ウイルスの先祖株に近いＨＩＶ−１単離株から得られる（Zhu et al., 1998）。Ｔａｔ  ＭａｌとＴａｔ  Ｅｌｉは、異性愛ＨＩＶ感染において中央アフリカで８０年代に単離されたＨＩＶ−１株から得られる（Alizon et al., 1986）。Ｔａｔ  Ｂｒは、実験室で最も広範に使用される配列を含み、フランスで単離されたＨＩＶ−１株から得られる（Barre-Sinoussi et al., 1983）。一方、Ｔａｔ  Ｊｒは、アメリカのＨＩＶ−１単離株から得られる（O'Brien et al., 1990）。Ｔａｔ  Ｏｙｉは、Ｔａｔ  ＪｒとＴａｔ  Ｂｒｕに密接に関連するが、ガボンの健康な患者で同定されたＨＩＶ株から得られる（Huet et al., 1989）。
【００６４】
図１Ｂ：ＭＵＬＴＡＬＩＮプログラムを用いた、Ｔａｔタンパク質のサイズと、それらが含む変異の関数としてのＴａｔタンパク質の分類（Corpet，1989）。
【００６５】
図２：ＨＩＶ−Ｏｙｉ変異体のＴａｔタンパク質の配列（Huet et al., 1989に記載）。
【００６６】
図３：２８０ｎｍにおける、Ｃ８グラフテッドカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーによる６つのＴａｔ変異体の精製（実験方法の材料及び方法を参照）。
【００６７】
各フレームにおいて、下のトレーシングは、精製前のペプチド合成の結果を示し、一方、上のトレーシングは、最後の精製工程後の合成の結果を示す。Ｔａｔ  Ｂｒｕ（Ａ）、Ｔａｔ  Ｊｒ（Ｂ）、ＴａｔＺ２（Ｃ）、Ｔａｔ  Ｏｙｉ（Ｄ）、Ｔａｔ  Ｍａｌ（Ｅ）、及びＴａｔ  Ｅｌｉ（Ｆ）を、ＴＦＡによって樹脂から切断した。ブチルメチルエーテルによる沈殿後、タンパク質を、０．１％となるようにＴＦＡ緩衝液に溶解した（各フレームにおける下のトレーシング）。各タンパク質について、Hybar Merk C8カラム（4.5×125mm、流速0.8mL/分）上で２回の連続的半分取ＨＰＬＣランにより精製を行い、次いで、純粋なフラクションを解析し（各フレームの上のトレーシング）、質量分析とアミノ酸分析によって同定した（データは示さず）。各場合において、主要ＨＰＬＣピークは完全な配列を示すことが観察される。１０分乃至１５分の間のピークは、５０残基の誘導体を表し、一方、主要フラクションに近いピークは、Ｎ末端から１０乃至１５欠失を有する誘導体である。高度に疎水性のフラクションは、恐らく不完全に未保護の側鎖による高分子量の誘導体である。
【００６８】
図４：電気泳動による、ヌクレオチド標的ＴＡＲに対する合成Ｔａｔのアフィニティ定数の測定（材料及び方法の電気泳動移動度シフトの試験を参照）。
【００６９】
タンパク質濃度（ｎｇ／μＬ）は、各ゲルバンドの上部に示している。遊離ＲＮＡ又は複合体を形成したＲＮＡは、それぞれｆ（遊離の場合）及びｃによって示している。同じＲＮＡ調製物を、６つのタンパク質による滴定のために使用する。カルボキシメチル化システインを有するＴａｔ  Ｂｒｕ誘導体（Ｂｒｕ  ｃｍＣ）も試験した。平衡における解離定数（Ｋｄ）は、電気泳動移動度シフト試験から直接測定された。Ｋｄ値は、Ｔａｔ  ＥｌｉとＴａｔ  Ｍａｌの場合の約５０ｎＭからＴａｔ  ＯｙｉとＴａｔ  Ｊｒの場合の約１４０ｎＭまで変動する。更に、本発明者らは、Ｋｄ値のバリエーションに加えて、種々のタンパク質による結合プロフィールがやや異なることに注目した。例えば、Ｔａｔ  Ｂｒｕは、低濃度では単一の良く分離された複合体を生じ、凝集物が形成されてアクリルアミドゲルを通り抜けられないのは、かなり高濃度（４．５ｎｇ／μＬ超）の場合だけである。対照的に、Ｔａｔ  Ｅｌｉでは、多量体の複合体が低濃度でさえ容易に同定される。Ｔａｔ  Ｅｌｉでは３つまでの遅延バンドを観察することが可能であり、Ｔａｔ  Ｊｒではより少ない程度で観察することが可能である。このような効果は、例えば、Ｔａｔ  ＢｒｕやＴａｔ  Ｍａｌなどのより短いタンパク質、及びより長いタンパク質であるＴａｔ  Ｏｙｉでは観察されない。
【００７０】
図５：ＨｅＬａ細胞に対する合成Ｔａｔタンパク質のトランス活性化の試験。これらの細胞を、ＬａｃＺレポーター遺伝子が結合しているＨＩＶ−１  ＬＴＲでトランスフェクトした。産生されたβ−ｇａｌタンパク質のレベルは、種々の合成Ｔａｔのトランス活性化能力に比例する。ＬＴＲは、ＨＩＶの転写のために必要な上流と下流のＤＮＡ配列を含み、ＴＡＲは、ｍＲＮＡの始まりに存在する（Claven and Charneau, 1994）。ＨＩＶのトランス活性化に必要な細胞の補因子は、ＨｅＬａ細胞に存在する。Ｔａｔが無ければ、対照（Ｃ）として示されるβ−ｇａｌの基礎量の発現がある。次の柱状グラフは、２つの濃度、即ち、１μＭ（明灰色ボックス）と５μＭ（暗灰色ボックス）を用いて、種々のＴａｔ変異体で観察されるトランス活性化を示す。各々の場合に、Ｔａｔは細胞緩衝液に加えられるので、対照より高いβ−ｇａｌの発現は、合成Ｔａｔが核膜と細胞質膜を通過することができ、ＴＡＲと結合でき、細胞補因子と相互作用できることを意味する。Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ（データは示さず）とＴａｔ  Ｏｙｉのみが、この実験で欠陥があるが、それらはＴＡＲと結合する（図１）。Ｔａｔ  ＭａｌとＴａｔ  Ｅｌｉは、Ｔａｔ  Ｂｒｕより３乃至４倍高いトランス活性化のレベルを示す。Ｔａｔ  Ｚ２は、先祖Ｔａｔタンパク質に最も近いが、それは、低レベルのトランス活性化を示す。進化はより有効なＴａｔを有するＨＩＶ−１単離株を選択するのだろう。同様の結果が、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いた、他のトランスフェクション試験で得られた。Ｔａｔ  ＭａｌとＴａｔ  Ｅｌｉは、１μＭで、トランス活性化Ｔａｔ−ｐＣＭＶによって得られたものに匹敵するレベルでＬＴＲを実際にトランス活性化した（データは示さず）。種々の実験で使用される濃度範囲は、０．１μＭ乃至１０μＭである（データは示さず）。０．１μＭで、Ｔａｔ  Ｅｌｉのみが、基礎レベルより有意に高いトランス活性化レベルを示す。１０μＭで、６つのＴａｔは、非常に高いトランス活性化レベルを示すので、飽和の故に、それらの間で差異を観察することは不可能である。
【００７１】
図６：Ｔａｔ  Ｚ２（白三角）、Ｔａｔ  Ｏｙｉ（黒三角）、Ｔａｔ  Ｂｒｕ（白円）、Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ（記号無し）、Ｔａｔ  Ｊｒ（黒円）、Ｔａｔ  Ｍａｌ（白四角）、Ｔａｔ  Ｅｌｉ（黒四角）変異体の二色性スペクトル。
【００７２】
スペクトルは、リン酸緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ４．５で測定する。スペクトルは、光路長５０μｍで、２６０から１７８ｎｍまで記録する。ＣＤスペクトルで観察された差異は、サイズにかかわらず、Ｔａｔ変異体間で構造的な不均一性を示す。短いＴａｔ（白記号）と長いＴａｔ（黒記号）からなる２つのカテゴリーにＣＤスペクトルを整理することは不可能である。ＣＤスペクトルは、無秩序な構造に典型的な２００ｎｍに近い負バンドによって特徴づけられる。Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣで観察された２００ｎｍのバンドの強い大きさは、システインの修飾が、他のＴａｔと比較して、大きなコンフォメーション変化を引き起こしたことを示す。
【００７３】
図７：変性条件下、Ｔａｔタンパク質の７つの変異体に関し、３つのウサギポリクローナル血清（抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ、抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ）の希釈液を用いて行われたＥＬＩＳＡ試験。
【００７４】
図８：抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ血清、抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ血清による、Ｔａｔ  Ｅｌｉによるトランス活性化の阻害。
【００７５】
本発明は上記記載に限定されない。本発明は、例示としてだけ記載されている実施例によってより明確に理解されよう。
【００７６】
実施例
１）図３乃至６に対応する材料及び方法
タンパク質合成、精製及びキャラクタリゼーション
ペプチドは、BaranyとMerrifieldの方法（1980）に従って、自動合成機（ABI 433A, Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA）で、１％の４−ヒドキシメチル−フェノキシメチル−コポリスチレン  ジビニルベンゼン（ＨＭＰ）（０．５−０．６５ｍｍｏｌ）で予めチャージした樹脂（Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA）上で合成した。欠失を示す誘導体が得られるのを避けるために、無水酢酸（Merck）４．７５％、２．０ＭのＤＩＥＡ６．２５％、１Ｍの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Warrington, GB）１．５％、及びＮ−メチルピロリドン（Perkin Elmer, Forster City, CA）８７．５％を含む混合物による処理後、ＦｍｏｃのないＮ末端をアセチル基で保護した。各脱保護工程は導電率デバイスで制御した。ペプチドを脱保護し、１０％メチルフェニルスルフィド（Merck）と５％エタンジチオール（Merck）を補充したトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって樹脂から切り離した。精製は、Beckman高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置とMerck C8逆相カラム（１０×２５０ｍｍ）によって行った。緩衝液Ａは水と０．１％ＴＦＡからなり、緩衝液Ｂはアセトニトリルと０．１％ＴＦＡからなっていた。グラジエントは、緩衝液Ｂが２０から４０％で、４０分かけ、流速は２ｍＬ／分であった。エレクトロスプレー質量分析は、Perkin Elmer PE-SCIEX API 150ex simple quadを用いて行った。アミノ酸分析は、Beckman, model 6300 analyzerで行った。
【００７７】
電気泳動移動度シフト試験
必須のピリミジンＵＵＵバルジを含むＴＡＲ  ＲＮＡの５９ヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＲＮＡポリメラーゼＴ３による転写によって調製した。結合反応混合液（２０μＬ）は、ＴＫ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４，２０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中に０．２ｎｍｏｌの放射性標識ＴＡＲ  ＲＮＡ、０−１００ｎｇのＴａｔを含んでいた。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む８％変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動によって、複合体を非結合ＲＮＡから分離した。試料（２５μＬ）を負荷する前に、ゲルを３０分間予め作動した。電気泳動は、約２００Ｖで９０分間続ける。遊離及び／又は結合ＲＮＡの相対量は、リンイメージングによって測定した。
【００７８】
円二色性（ＣＤ）
円二色性スペクトルは、Jobin-Yvon CD UV スペクトロフォトメータ（Long-Jumeau, FRANCE）（Ｍａｒｋ  ＶＩ）上で、光路長５０μｍで、２６０ｎｍから１７８ｎｍで測定した。装置は、（＋）−１０−カンファースルホン酸で較正した。２９０．５ｎｍでの正のＣＤバンドと１９２．５ｎｍでの負のバンドの間で、比２．１が見出された。データを、スキャニング速度１ｎｍ／分で、０．５ｎｍの間隔で集めた。ＣＤスペクトルはアミド当たりΔεの形式でプロットした。試料を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に調製した。タンパク質濃度は、０．５乃至１ｍｇ／ｍＬの範囲であった。
【００７９】
ＨＩＶ  ＬＴＲでトランスフェクトされた細胞でのトランス活性化
合成Ｔａｔによる機能的トランス活性化をＰ４細胞を用いて測定した。これらのＣＤ４−ＨｅＬａ細胞は、ＨＩＶ  ＬＴＲの制御下に細菌のｌａｃＺ遺伝子を担持し、β−ガラクトシダーゼの細胞質蓄積は、厳密にＴａｔの存在に依存した。１２ウエルプレート上にまかれた８０％コンフルエントな細胞を、５％ＣＯ2存在下、３７℃で２４時間、０．１％ＢＳＡを補充したＤＭＥＭ培地に含まれるＴａｔタンパク質と共にインキュベートした。このインキュベーションの期間の後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、タンパク質を抽出して、β−ガラクトシダーゼの場合に抗原に結合した酵素を用いる市販の免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）（Boehringer Mannheim, FRANCE）により、製造業者の指示に従ってβ−ガラクトシダーゼを分析した。Bradford法によって測定した、異なる細胞溶解液の全タンパク質の濃度を用いて、値を基準に合わせた。
【００８０】
トランス活性化の阻害
今回、抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清、又は抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ血清、又は抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ血清を培養培地に添加する以外は、ＨＩＶ  ＬＴＲでトランスフェクトされた細胞によるトランス活性化の上記実験を再現した。Ｔａｔタンパク質は、その役目のためにＥｌｉ変異体から得た。
【００８１】
本発明者らは、特に抗体を含まない対照培地と比較して、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ抗体により、Ｔａｔ  Ｅｌｉタンパク質のトランス活性化が不活化されることを観察した。
【００８２】
２）図７に対応する材料及び方法
免疫化条件は、０．５ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ４．５＋０．５ｍＬの完全フロイントアジュバント中の精製Ｔａｔタンパク質１００μｇの皮内注射である（０日）。２１日目に、不完全フロイントアジュバント（０．５ｍＬ）を用いる以外は同一条件下で、最初のブースターを行う。４２日目に、４１日目と同一で、２回目のブースターを行う。５３日目に血液をＦＳＴチューブに集め、２０００回転／分の遠心後に血清を得る。血清の希釈は１／１０００である。
【００８３】
ＥＬＩＳＡ：
試験は、Maxisorp U96 プレート（Polylabo）で行う。リン酸緩衝液ｐＨ４．５中のタンパク質を、４℃で一晩プレート上でインキュベートする。ＭＰＢＳ緩衝液（８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ，１．４４ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4，０．２４ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4，５％スキムミルク，ＨＣｌでｐＨ７．４に調整）中で飽和後、タンパク質を、ウサギ１次抗体と１時間インキュベートする。次いで、ペルオキシダーゼと結合した、ウサギＦｃフラグメントに特異的なヤギ抗体（Cappel）と１時間インキュベートする。発色は、Ｈ2Ｏ2，１００ｍＭクエン酸，５０ｍＭ  ＮａＯＨ，０．２ｍｇ／ｍＬ  ＡＢＴＳ（Boehringer）の存在下で行う。吸光度を４０５ｎｍで読む。
【００８４】
希釈しなければ、抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清は全てのＴａｔ変異体又は誘導体を認識できる。
【００８５】
３）ウエスタンブロティングのための材料及び方法
ウエスタンブロティング：  まず、３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８，５％β−メルカプトエタノール，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，ブロモフェノールブルーの存在下で、タンパク質を変性させる。それらを１５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で分離する。次いで、免疫検出によって示されるように、該タンパク質をニトロセルロース膜上にトランスファーする。５％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液（８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ．１．４４ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4，０．２４ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4，ＨＣｌでｐＨ７．４に調整）で、特定の部位をブロッキングする。ニトロセルロース膜を、ウサギ１次抗体と１時間インキュベートする。次いで、ペルオキシダーゼと結合した、ウサギＦｃフラグメントに特異的なヤギ抗体（Sigma）とインキュベートする。発色は、Ｈ2ＣＯ2，ＰＢＳ，ジアミノベンズアミジンの存在下で行う（ゲル写真は、本発明では示さず）。
【００８６】
４）図８に対応する材料及び方法
トランス活性化は、図５に関して記載したプロトコルに従い、ＨＩＶ−１  ＬＴＲとβ−ガラクトシダーゼタンパク質のレポーター遺伝子（ＬａｃＺ）でトランスフェクトされたヒトＨｅＬａ細胞を用いて測定する。
【００８７】
血清は、図７に関して記載したプロトコルに従い、ウサギから得る。
【００８８】
１００μＬの３つの抗Ｔａｔ血清、即ち、抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ、抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣを希釈倍率を上げながら、細胞培養培地に加え、次いで、１００μＬのＴａｔ  Ｅｌｉ変異体を１又は５μＭ加える。それ故、β−ガラクトシダーゼの細胞質蓄積は、Ｔａｔの存在に依存する。
【００８９】
第１に、同一希釈では、抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清が最も効果的であることが観察される。このことは論理にかなう。該血清は、トランス活性化活性を中和することが求められているものと同じ変異体に対して産生される抗体を含むからである。しかし、Ｔａｔ  ＯｙｉがＴａｔ  Ｅｌｉのトランス活性化活性を顕著に中和する抗体を産生できることは、強調されるべきである。事実、この阻害は、特に、抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ血清を用いて１／１０希釈の場合に観察される阻害よりも大きい。このことにより、他のＴａｔ変異体に対する抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ抗体の利点が確認される。
【００９０】
参考文献
0004860823.tif 000002
0004860823.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】  種々のＴａｔタンパク質の比較。図１Ａ：Ｔａｔタンパク質のアミノ酸配列。図１Ｂ：ＭＵＬＴＡＬＩＮプログラムを用いた、Ｔａｔタンパク質のサイズと、それらが含む変異の関数としてのＴａｔタンパク質の分類。
【図２】  ＨＩＶ−Ｏｙｉ変異体のＴａｔタンパク質の配列。
【図３】  ２８０ｎｍにおける、Ｃ８グラフテッドカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーによる６つのＴａｔ変異体の精製。
【図４】  電気泳動による、ヌクレオチド標的ＴＡＲに対する合成Ｔａｔのアフィニティ定数の測定。
【図５】  ＨｅＬａ細胞に対する合成Ｔａｔタンパク質のトランス活性化の試験。
【図６】  Ｔａｔ  Ｚ２（白三角）、Ｔａｔ  Ｏｙｉ（黒三角）、Ｔａｔ  Ｂｒｕ（白円）、Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ（記号無し）、Ｔａｔ  Ｊｒ（黒円）、Ｔａｔ  Ｍａｌ（白四角）、Ｔａｔ  Ｅｌｉ（黒四角）変異体の二色性スペクトル。
【図７】  変性条件下、Ｔａｔタンパク質の７つの変異体に関し、３つのウサギポリクローナル血清（抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ、抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ）の希釈液を用いて行われたＥＬＩＳＡ試験。
【図８】  抗Ｔａｔ  Ｅｌｉ血清、抗Ｔａｔ  Ｏｙｉ血清、抗Ｔａｔ  Ｂｒｕ  ｃｍＣ血清による、Ｔａｔ  Ｅｌｉによるトランス活性化の阻害。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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