(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的架橋剤又は化学的修飾剤を用いないヒアルロン酸単独からなる生体適合性のヒアルロン酸ゲル、及びリン脂質を含有しており、
且つ前記生体適合性のヒアルロン酸ゲルの濃度が５〜６０％であり、前記生体適合性のヒアルロン酸ゲルが破砕状で含有されている、膝関節症治療用注入剤。
【請求項２】
前記生体適合性のヒアルロン酸ゲルが、ヒアルロン酸無機塩の水溶液を酸性に調整し、凍結、解凍して形成された生体適合性のヒアルロン酸ゲルである、請求項１に記載の膝関節症治療用注入剤。
【請求項３】
リン脂質の濃度が、１〜２００ｍｇ／ｍｌである請求項１または２に記載の膝関節症治療用注入剤。
【請求項４】
該リン脂質がフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン及びそれらの誘導体からなる群から選択されてなる請求項１〜３いずれかに記載の膝関節症治療用注入剤。
【請求項５】
該リン脂質が、α−ジパルミトイルフォスファチジルコリンである請求項１〜４いずれかに記載の膝関節症治療用注入剤。
【請求項６】
ヒアルロン酸溶液をさらに含有している、請求項１〜５いずれかに記載の膝関節症治療用注入剤。
【請求項７】
ヒアルロン酸の濃度が、１〜１０ｍｇ／ｍｌである請求項６記載の膝関節症治療用注入剤。
【請求項８】
リン脂質を含む溶液に対して超音波処理を行い、リン脂質溶液を調製する工程と、
前記リン脂質溶液、及び化学的架橋剤又は化学的修飾剤を用いないヒアルロン酸単独からなる生体適合性のヒアルロン酸ゲルを含む混合溶液を調製する工程と、
前記ヒアルロン酸ゲルの破砕処理、及び前記リン脂質溶液の分散処理を行う工程と、
を含み、前記混合溶液中の前記ヒアルロン酸ゲルの濃度が５〜６０％である、
膝関節症治療用注入剤の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体適合性のヒアルロン酸ゲルを用いた関節症治療用注入剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
関節液は、生体関節において関節軟骨へ栄養を供給するとともに、他に類を見ない優れた潤滑機能とショックアブソーバー機能を有し、その優れた粘弾性機能は関節液中の主成分の一つであるヒアルロン酸（以下、ＨＡと略す）に大きく支配されている。ＨＡは、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖であり、その分子量は数百万〜１千万もの高分子量であることが知られている。
【０００３】
一般に、変形性関節症，慢性関節リウマチ等の各種関節症の患者関節液中のＨＡ濃度及び分子量の分析結果から、関節症患者の関節液は正常関節液に比較し、濃度、分子量において低下傾向が認められており、このことが関節液の潤滑作用、関節軟骨表面保護作用の低下に起因する運動機能障害や疼痛症状の発生に密接な関係があるものと考えられている。
【０００４】
これら関節疾患のうち変形性膝関節症に有効な手段として、ＨＡ溶液を疾患関節部位へ注入する方法が採用されてきており、その膝関節治療剤の例としてはアルツ（生化学工業製、平均分子量９０万）、Hyalgan（Fidia 製、平均分子量＜５０万）や、高分子量の方が一層の効果が期待できるとの考えのもと本発明者らが開発した、慢性関節リウマチにも適応するスベニール（アベンティスファーマ社／中外製薬社／電気化学工業社製、平均分子量１９０万）が挙げられる。
【０００５】
また、ＨＡを化学的に架橋することで高分子化し粘弾性を改良した、架橋ＨＡゲルを含有するSynvisc（ジェンザイム製）が開発されている。この架橋ＨＡゲルは架橋剤ジビニルスルホンでＨＡを化学的に架橋したＨＡゲルでハイランと呼ばれる。ハイラン及びハイランを架橋したゲルの生成法は、米国特許第４，７１３，４４８号に詳細に記載されている。ＨＡをベースとする単一及び混合ゲルは、米国特許第４，５８２，８６５号及び同第４，６０５，６９１号に記載されている。
【０００６】
これら関節製剤を用いた治療は、患者の関節に直接１週間毎に３〜５回の注射を行う必要があり、患者及び医者の負担の面からその低減が望まれている。
【０００７】
一方、リン脂質は関節軟骨表面に存在し表面を疎水性に保ち、関節軟骨間に関節液による流体潤滑膜を形成するのに寄与している。従って、このリン脂質を用いＨＡ水溶液に混合することで、関節面の潤滑を改善する関節炎治療のための潤滑組成物を提供することができる。（特願昭６３−５０７０２１号）
通常、人の膝関節に生じる定常負荷約３ｋｇ／ｃｍ2ではヒアルロン酸の運動摩擦係数は上昇し潤滑能力が低下すると言われているが、リン脂質を添加することにより膝関節への負荷が２０ｋｇ／ｃｍ2の厳しい条件でも運動摩擦係数を０．００３〜０．０５に低く保ち、潤滑能力を改善できる。（「生体関節に於ける多モード適応潤滑機構と摩擦特性」（日本機械学会第７３期通常総会講演会講演要旨集、５０２−５０３（１９９６））。「靱帯切離による変形性関節症モデル家兎に対するリン脂質リポソームの関節腔内注入効果」（日本臨床バイオメカニクス学会誌、Ｖｏｌ．１９，１３１−１３５（１９９８）等）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従来のＨＡ及びＨＡゲルの構成の潤滑組成物は、ＨＡ注入だけでは困難であった関節液の粘弾性のさらなる向上を可能とし、潤滑作用や関節軟骨表面保護作用の改善が期待できる。
しかし、その投与回数は患者の関節に直接１週間毎に３〜５回の注射を行う必要があった。また、関節に負荷のかかる条件下では軟骨間の摩擦係数を低下させることは難しく、さらに関節軟骨が摩耗した重度の病態では、関節液による境界潤滑膜が形成されにくいため潤滑作用の改善を十分に発揮できなかった。
【０００９】
一方、ＨＡ及びリン脂質の構成の潤滑組成物は、関節に負荷のかかる条件下でも軟骨間の摩擦を低下させ、また、関節軟骨が摩耗した病態でも、リン脂質が軟骨面を疎水性に保つことができるため関節の摩擦を低減することが期待できる。
しかし、関節液の粘弾性は改善できないため、潤滑作用や関節軟骨表面保護作用を十分に得ることは難しい。
【００１０】
本発明者らは、物性試験及び動物試験を鋭意検討した結果、ＨＡゲル及びリン脂質、及び／又はＨＡを含有してなる構成が、動物を用いた薬理試験に於いて驚くべき相乗効果を奏し、著名な製剤の投与回数の低減効果と高い治療効果を発揮することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、（１）生体適合性のＨＡゲル及びリン脂質、及び／又はＨＡを含有してなる関節症治療用注入剤、（２）生体適合性のＨＡゲルの濃度が、５〜６０％であることを特徴とする（１）記載の関節症治療用注入剤、（３）生体適合性のＨＡゲルが、粉砕状で含有されていることを特徴とする（１）記載の関節症治療用注入剤、（４）リン脂質の濃度が、１〜２００ｍｇ／ｍｌである（１）記載の関節症治療用注入剤、（５）該リン脂質がフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン及びそれらの誘導体からなる群から選択されてなる（１）記載の関節症治療用注入剤、（６）該リン脂質が、α−ジパルミトイルフォスファチジルコリンである（１）記載の関節症治療用注入剤、（７）ＨＡの濃度が、１〜１０ｍｇ／ｍｌである（１）記載の関節症治療用注入剤である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるＨＡは、動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のＨＡ生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第２３１９号）のような高収率で安定にＨＡを生産する変異株が望ましい。上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
本発明に用いられるＨＡの分子量は、約１×１０5〜約１×１０7ダルトンの範囲内のものが好ましい。また、上記範囲内の分子量をもつものであれば、より高分子量のものから加水分解処理をして得た低分子量のものでも同様に好ましく使用できる。
尚、本発明でいうＨＡは、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
【００１３】
本発明のＨＡの濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍｌが好ましい。１ｍｇ／ｍｌより低濃度では粘弾性が低く関節用医薬品としては効果が低く、１０ｍｇ／ｍｌより高濃度では粘性が高すぎて関節に注入する際、圧力が高くなり取り扱いが困難となる。
【００１４】
ＨＡの分子量は、一般的に用いられるＨＰＬＣ（液体クロマトグラフィー）を用いたＧＰＣ法や極限粘度測定から導き出すなどの方法で測定できる。
【００１５】
本発明でいうＨＡゲルとは、三次元網目構造をもつ高分子及びその膨潤体である。三次元網目構造はＨＡの架橋構造によって形成されている。
なお、ＨＡ自体は直鎖状の高分子であり、分岐構造を有さないことが知られている（多糖生化学１  化学編  共立出版  昭和４４年）。またゲルとは、新版高分子辞典（朝倉書店  昭和６３年）によれば、「あらゆる溶媒に不溶の三次元網目構造をもつ高分子及びその膨潤体」と定義されている。理化学辞典（岩波書店第４版  昭和６２年）によれば、「ゾル（コロイド溶液）がジェリー状に固化したもの」と定義されている。
【００１６】
本発明でいうＨＡゲルとしては、生体に移植または注入した場合に優れた生体適合性を有するものであればどのようなものでも使用できる。
本発明でいう生体適合性とは、本発明のＨＡゲルと接触する生体組織に好ましくない作用もしくは副作用が全くないか、または最小限であることを意味する。
起こり得る副作用としては、毒性、炎症、免疫反応、異物反応、及び被包反応等が挙げられる。
【００１７】
ＨＡゲルの例としては、化学的架橋剤や化学的修飾剤を用いないＨＡ単独からなるＨＡゲル（ＰＣＴ／ＪＰ９８／０３５３６）や、ＨＡのカルボキシル基と水酸基間のエステル結合形成を導く方法により得られる自己架橋ＨＡを挙げることができる（ＥＰ ０３４１７４５ Ｂ１参照）。また、ジビニルスルホン、ビスエポキシド類、ホルムアルデヒド等の二官能性試薬を架橋剤に用いて架橋したＨＡゲルを挙げることができる（米国特許第４，５８２，８６５号明細書、特公平６−３７５７５号公報、特開平７−９７４０１号公報、特開昭６０−１３０６０１号公報参照）。また、ＨＡ水溶液を、ｐＨ２．０〜３．８、２０〜８０質量％水溶性有機溶剤存在下におくことを特徴とするＨＡゲルが挙げられる（特開平５−５８８８１公報参照）。
【００１８】
この中でも化学的架橋剤や化学的修飾剤を用いないＨＡ単独からなるＨＡゲル（ＰＣＴ／ＪＰ９８／０３５３６）が、生体適合性の面から特に好ましい。
【００１９】
本発明に用いられるＨＡゲルの濃度は、５〜６０％が好ましい。５％未満では、関節用医薬品としては効果が低く好ましくない。また、６０％を越えるとＨＡゲルの凝集が大きくなり注入の際の取り扱いが難しくなるため好ましくない。
【００２０】
本発明に用いられるＨＡゲルは、粉砕状で含有されていることが好ましい。
【００２１】
本発明に用いられるリン脂質は、動物組織から抽出したものでも、また人工的に合成して製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。
リン脂質は、好ましくはフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン及びそれらの誘導体を含む。
特に好ましくは、α−ジパルミトイルフォスファチジルコリン（α−ＤＰＰＣ）である。このα−ＤＰＰＣはＬ体、Ｄ体、あるいはラセミ（ＤＬ）体混合物でもよい。
【００２２】
本発明に用いられるリン脂質の濃度は、１〜２００ｍｇ／ｍｌが好ましい。
リン脂質の濃度が１ｍｇ／ｍｌ未満では、関節用医薬品としては効果が低く、２００ｍｇ／ｍｌを越えるとリン脂質の凝集が大きくなり保存の面で難があり、取り扱いが難しくなるため好ましくない。
【００２３】
リン脂質は、両親媒性物質なのでＨＡ溶液中での安定性などの目的のためリポソーム化しても良いが、特にリポソーム化せず懸濁させるだけでもよい。
【００２４】
リン脂質の懸濁液を得るには、リン脂質に生理的食塩水を加え、超音波処理すれば容易にリン脂質の生理的食塩水懸濁液が得られる。
【００２５】
リン脂質のリポソーム化は、定法に従い、次のようにして作成できる。
例えば、α−ＤＰＰＣをクロルフォルムに１質量％になるように溶解し、これをナス型フラスコにとり、ロータリーエバポレーターでクロロフォルムを蒸発除去させ、ナス型フラスコ表面にα−ＤＰＰＣ薄膜を形成させる。次に、ここに生理的食塩水を加え、超音波処理を行うことにより、α−ＤＰＰＣのリポソーム膜の生理的食塩水の懸濁液を得ることができる。
【００２６】
更に、本発明では、ＨＡゲル及びリン脂質、及び／又はＨＡに、医薬的に許容し得る生理的食塩水やリン酸緩衝液等を用いることができる。
【００２７】
【実施例】
以下、詳細な内容について実施例を用いて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
調製例１
ＨＡ溶液の調製
分子量２×１０6 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業製）６ｇをクリーンベンチ内で計りとり、ナルゲンフィルターにより無菌濾過した５ｍＭのｐＨ７．２リン酸緩衝化生理的食塩水４５０ｍｌを加えて、ローラーボトルで溶解した（高分子量ＨＡナトリウム  １．３質量％）。
【００２９】
調製例２
ＨＡゲルの調製
分子量２×１０6 ダルトンのＨＡナトリウム（電気化学工業製）を注射用水に溶解し、１質量％のＨＡ水溶液を調整した。この水溶液のｐＨを、１Ｎ塩酸でｐＨ１．５に調整し、ＨＡ酸性水溶液を得た。このＨＡ酸性水溶液１００ｍｌを、３００ｍｌサンプル瓶に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１２０時間の凍結でＨＡゲルが得られた。次にこれを注射用水１０ｍｌを加え１０分間放置後デカンテーションする洗浄を３回繰り返した後、生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加えて調整したｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水２００ｍｌを加えデカンテーションする中和を２回繰り返した後、５ｍＭのｐＨ７．２リン酸緩衝化生理的食塩水で十分に洗浄しＨＡゲルを得た。
【００３０】
調製例３
リン脂質溶液の調製
１．０ｇのＬ−α−ＤＰＰＣ（和光純薬製）に５ｍＭのｐＨ７．２リン酸緩衝化生理的食塩水１００ｍｌを加え、これを３分間激しく攪拌し、更に３分間超音波処理を行って懸濁させた。これを１２１℃、１５分間のオートクレーブ処理で滅菌した（乳白色の懸濁液となった）。
【００３１】
実施例１
ＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤の調製
ナルゲンフィルターにより無菌濾過した５ｍＭのｐＨ７．２リン酸緩衝化生理的食塩水２００ｍｌに、調製例２のＨＡゲル３００ｍｌと調製例３のリン脂質溶液１００ｍｌを加えた。この混合溶液をマイクロホモジナイザー（NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER）を用いＨＡゲルの破砕処理及びリン脂質の完全な分散を行い、平均粒径が３００〜１，０００μｍのヒアルロン酸ゲルを含むＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤を得た。
なお、これら一連の操作は無菌・無埃環境下で行い、使用する薬液等も予め滅菌処理を行ったものを用いた。
【００３２】
実施例２
ＨＡとＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤の調製
それぞれ別個に調製した調製例１のＨＡ溶液４５０ｍｌに、調製例２のＨＡゲル１００ｍｌと調製例３のリン脂質溶液５０ｍｌを加えた。この混合溶液をマイクロホモジナイザー（NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER）を用い、ＨＡゲルの破砕処理及びリン脂質の完全な分散を行い、平均粒径が３００〜１，０００μｍのヒアルロン酸ゲルを含むＨＡとＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤を得た。
なお、これら一連の操作は無菌・無埃環境下で行い、使用する薬液等も予め滅菌処理を行ったものを用いた。
【００３３】
比較例１
ＨＡ及びＨＡゲルの混合製剤の調製
それぞれ別個に調製した調製例１のＨＡ溶液４５０ｍｌに、調製例２のＨＡゲル１００ｍｌと５ｍＭのｐＨ７．２リン酸緩衝化生理的食塩水５０ｍｌを加えた。  この混合溶液をマイクロホモジナイザー（NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER）を用いＨＡゲルの破砕処理を行い、平均粒径が３００〜１，０００μｍのヒアルロン酸ゲルを含むＨＡ及びＨＡゲルの混合製剤を得た。
なお、これら一連の操作は無菌・無埃環境下で行い、使用する薬液等も予め滅菌処理を行ったものを用いた。
【００３４】
比較例２
ＨＡ及びリン脂質の混合製剤の調製
それぞれ別個に調製した調製例１のＨＡ溶液４５０ｍｌに、調製例３のリン脂質溶液５０ｍｌと５ｍＭのｐＨ７．２リン酸緩衝化生理的食塩水１００ｍｌを加えた。この混合溶液をマイクロホモジナイザー（NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER）を用いリン脂質の完全な分散を行い、ＨＡ及びリン脂質の混合製剤を得た。なお、これら一連の操作は無菌・無埃環境下で行い、使用する薬液等も予め滅菌処理を行ったものを用いた。
【００３５】
実施例３
ＨＡとＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤の薬理効果
実施例１のＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤、及び実施例２のＨＡとＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤の薬理効果は、以下の動物試験で評価した。
日本白色家兎６０羽（体重約３ｋｇ）を麻酔し右膝の前十字靱帯と内側副靱帯を切離した。これにより日本白色家兎の右膝は関節間に異常な応力が負荷されるため、１週間内で関節が炎症を起こし変形性膝関節炎のモデルとなる。
術後７週間後、十分に関節の炎症が惹起された日本白色家兎の右膝に対し、１０羽に実施例１のＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤、１０羽に実施例２のＨＡとＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤、１０羽に比較例１のＨＡ及びＨＡゲルの混合製剤、１０羽に比較例２のＨＡ及びリン脂質の混合製剤、を０．３ｍｌを１０日間隔で２回、投与した。
尚、残り１０羽はコントロールのため水溶液の注入を行わず同間隔で麻酔のみを実施した。
２回目の注入より１０日後に全例屠殺し、Ｘ線撮影を行った。膝関節部より靱帯と関節包及び半月以外の軟部組織を切除し、直ちに、振り子摩擦試験機により低振幅域（０．０３〜０．０１ｒａｄ）、加重３ｋｇでの摩擦係数を測定した。摩擦係数は、振り子の減衰に於ける位置エネルギーの損失が全て摩擦によるとする仮定により算出した。その結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
0004990446.tif 000002
【００３７】
表１より、振り子摩擦試験による摩擦係数は実施例１のＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤、及び実施例２のＨＡとＨＡゲル及びリン脂質の混合製剤が、比較例１、２より優位に低く、その値は正常な無処置群と同様な低い値を示した。
【００３８】
また、関節軟骨組織切片を切り出し、このＸ線像から骨の増殖性変化を評価した。
評価基準は、無処置の膝と比較して、軟骨下骨への効果と軟骨辺縁の骨棘の形成と軟骨面の滑らかさの３つの面から各々（２点：正常、１点：中程度の異常、０点：重度の異常）から評価し、０点から６点の７段階にグレーディングした。その結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
0004990446.tif 000003
【００４０】
表２より、驚くべきことに実施例１、２は正常な無処置群に近い大きな治癒効果が認められた。それに対し、比較例１、２では軟骨の増殖変形が認められた。また、コントロールは著しい増殖性変形が認められた。
【００４１】
【発明の効果】
以上、本発明の生体適合性のＨＡゲル及びリン脂質、及び／又はＨＡを含有してなる構成の関節症治療用注入剤は、従来のＨＡ及びＨＡゲル、又はＨＡ及びリン脂質の構成の混合製剤では得られない製剤の投与回数の低減と高い治療効果を有するものである。