(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センダイウイルスエンベロープからなる抗腫瘍免疫誘導剤。
【請求項２】
シスプラチンとともに使用されることを特徴とする、請求項１記載の抗腫瘍免疫誘導剤。
【請求項３】
シスプラチンに加え、更に化学療法剤とともに使用されることを特徴とする、請求項２記載の抗腫瘍免疫誘導剤。
【請求項４】
化学療法剤がブレオマイシンである、請求項３記載の抗腫瘍免疫誘導剤。
【請求項５】
センダイウイルスエンベロープからなる抗腫瘍剤。
【請求項６】
シスプラチンとともに使用されることを特徴とする、請求項５記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
シスプラチンに加え、更に化学療法剤とともに使用されることを特徴とする、請求項６記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
化学療法剤がブレオマイシンである、請求項７記載の抗腫瘍剤。
【請求項９】
化学療法剤又は免疫促進剤が封入されたセンダイウイルスエンベロープを有効成分として含有することを特徴とする、癌の治療用医薬組成物。
【請求項１０】
化学療法剤が抗癌剤である、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
抗癌剤がブレオマイシン類、アントラキノン系制癌剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、5-フルオロウラシル(5-FU)およびその誘導体、ビラルビシンおよびそれらの薬理学的に許容される塩から選ばれた１種以上である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ブレオマイシン類が、ブレオマイシンまたはその薬理学的に許容される塩、あるいはペプロマイシンまたはその薬理学的に許容される塩である、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
免疫促進剤が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含むタンパク質である、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１４】
更なる抗癌剤を含有する、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１５】
更なる抗癌剤が、シスプラチンである、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
注射剤である請求項９−１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
癌が、肺癌、乳癌、消化器癌、頭頚部癌、婦人科領域の癌、泌尿器科領域の癌、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、原発不明癌、皮膚癌、皮膚悪性腫瘍、神経膠腫、甲状腺癌から選ばれた１種である、請求項９−１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
化学療法剤又は免疫促進剤が封入されたセンダイウイルスエンベロープを有効成分として含有することを特徴とする、抗腫瘍免疫誘導用医薬組成物。
【請求項１９】
化学療法剤が抗癌剤である、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
抗癌剤がブレオマイシン類、アントラキノン系制癌剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、5-フルオロウラシル(5-FU)およびその誘導体、ビラルビシンおよびそれらの薬理学的に許容される塩から選ばれた１種以上である、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ブレオマイシン類が、ブレオマイシンまたはその薬理学的に許容される塩、あるいはペプロマイシンまたはその薬理学的に許容される塩である、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
免疫促進剤が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含むタンパク質である、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２３】
更なる抗癌剤を含有する、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２４】
更なる抗癌剤が、シスプラチンである、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
注射剤である請求項１８−２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
腫瘍が、肺癌、乳癌、消化器癌、頭頚部癌、婦人科領域の癌、泌尿器科領域の癌、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、原発不明癌、皮膚癌、皮膚悪性腫瘍、神経膠腫、甲状腺癌から選ばれた１種である、請求項１８−２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生体内で抗腫瘍免疫を惹起するためのビヒクルに関する。より詳しくは、ウイルス、不活性化ウイルス、特に不活性化センダイウイルス（以下、ＨＶＪともいう）に、化学療法剤、好ましくは抗癌剤を併用ないし封入して固形腫瘍内に導入し、さらに抗癌剤全身投与と併用することにより、より高い抗腫瘍免疫を惹起させることに関する。また、本発明は、ウイルスエンベロープと抗癌剤を含む抗腫瘍作用を有する医薬組成物に関する。
【背景技術】  現在の癌治療における治癒率は約５０％程度といわれ、その治癒は一般的には外科療法や放射線療法など局所療法によりもたらされる場合が多い。特に固形癌の治療においては、全身療法である化学療法が単独で治癒に貢献する割合は極めて少なく、各種療法と併用されるのが通常である。
一方外科療法では、全ての臓器癌の手術が可能となり、治療法として既に完成域に達していると考えられ、これ以上の治癒率向上は望めない。また放射線療法も感受性のある臓器癌の治療成績がほぼ一定率に達しており、同様にこれ以上の治癒率向上は望めない。
従ってこれらの治療法により、今後の癌治癒率の大幅な向上は期待しがたいため、癌の治癒率を現状の５０％からさらに改善し癌制圧に達するには、より優れた化学療法の開発が欠かせない。
化学療法に使用される抗癌剤は、癌細胞のような増殖能の高い細胞の殺細胞効果を目的としており、正常細胞、特に細胞増殖能の高い骨髄細胞等に与えるダメージが大きく、その結果患者に与える苦痛も大である。これは抗癌剤の送達法が注射剤による全身への投与であり、癌細胞以外の正常細胞にも抗癌剤が到達し、正常細胞が殺傷されホメオスタシスが機能しなくなるためである。
しかし現状では、抗癌剤を単独投与した際の効果は概ね３０％程度であるとされており、ゲノムの遺伝子情報解析研究が進められ適切な抗癌剤の選定が今後可能になることも期待されているが、現時点での抗癌剤療法は効果と比較して副作用が高いといわれている。
これは抗癌剤全身投与により正常細胞がダメージを受けたためである。よって、癌組織特異的な抗癌剤の導入、加えて癌細胞への取り込み方法が確立できれば、理想的な抗癌剤の送達システムとなる。さらに、抗癌剤のベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）への封入が可能になれば、標的臓器・細胞選択的に、しかも正常細胞への影響（副作用）が少ない治療法を確立できる。また、これにより副作用が強く開発を断念した抗癌剤の再評価に結びつくものと考えられる。
また、近年、悪性腫瘍に対する治療成績は化学療法を中心とする集学的治療の進歩によって著しく向上している。特に白血病や悪性リンパ腫などの造血器腫瘍においては、造血幹細胞移植などとの併用により治癒も十分に期待できるものとなっている。しかし、抗癌剤や放射線治療などによる毒性効果のみしか認められない場合があり、腫瘍細胞撲滅には限界がある。免疫機構による選択的腫瘍細胞排除が重要であることが基礎的研究ならびに臨床的観察より明らかになってきている。免疫機構は粘膜、非粘膜器官を問わずタンパク質（ペプチド）および糖質、脂質等の非ペプチド抗原を認識して作用する。病原体進入の際，主に単球が進入局所に遊走し、貪食作用などを介して抗原に非特異的な防御応答を行う。糖質や脂質などの非ペプチド等に対する自然免疫がまず惹起され、病原体排除に関する種々の因子の産生を幇助する。その後病原体ペプチドを認識するリンパ球が増殖、分化し、Ｂリンパ球は抗体産生細胞に分化し、Ｔリンパ球が免疫系をコントロールするヘルパーＴ細胞や細胞性障害Ｔ細胞などに分化し抗原特異的免疫応答、いわゆる獲得免疫を誘導する。獲得免疫には抗体が主体をなす体液性免疫とＴリンパ球が主体となる細胞性免疫がある。免疫が細胞性免疫あるいは体液性免疫のどちらが主導になるかは、ヘルパーＴ細胞の２つの亜集団である、Ｔｈ１あるいはＴｈ２のどちらが優位になるかによって決定される。免疫状態がＴｈ１に傾けば細胞性免疫が優位になり、一方Ｔｈ２に傾けば体液性免疫が優位になる。両者はお互いの免疫バランスの上に成り立っており、これら免疫状態は種々の細胞が分泌する液性分子であるサイトカインに依存している。Ｔｈ１型サイトカインとしてＩＬ−１２、ＩＦＮγなどが、一方Ｔｈ２型サイトカインとして、ＩＬ−４、ＩＬ−５などが挙げられる。
免疫、特に腫瘍免疫を考える場合には、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞が非常に重要な役割を果たしていることが報告（Ｎｏｒｔｈ  ＲＪ．１９８４，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＰＤ．１９９１，Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ．１９９８）されている。特に免疫された動物のＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接標的細胞を障害し（Ｗａｎｇｅｒ  Ｈ．１９８０）、養子免疫による非免疫動物に腫瘍抵抗性を持たせることができた（Ｎｏｒｔｈ  ＲＪ．１９８４，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＰＤ．１９９１）との報告がなされている。したがって、腫瘍特異的ＣＴＬをいかに効率よく誘導できるかが抗腫瘍療法の開発において重要である。ＣＴＬによる抗腫瘍免疫はＴ細胞レセプターを介して、腫瘍細胞表面に発現された主要組織抗原（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）クラスＩ分子と腫瘍抗原由来ペプチドの複合体をＣＴＬが認識し、パフォーリン等を腫瘍細胞に導入することによって細胞障害性を発揮する。腫瘍特異的ＣＴＬ誘導には、まず腫瘍細胞特異的に発現され、細胞内でプロセスされてペプチド断片としてＭＨＣに提示されうる標的抗原ペプチドを同定することに主眼が置かれ、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＳＥＲＥＸ）法により高力値のＩｇＧ抗体を産生する多くのペプチド分子が見出されている。
しかし、腫瘍ペプチドの同定のみで腫瘍免疫を語ることは困難である。同定されたペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで細胞表面上に如何に効率よく提示させるかという点、ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅであるＣＤ８０／ＣＤ８６の発現など、残されている課題は多い。詳述すれば、効率的に当該ペプチドを発現させてもｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅであるＣＤ８０／ＣＤ８６などの発現が低く、抗原シグナルのみが伝わった場合は抗原特異的Ｔ細胞の増殖をきたさないばかりか、その抗原を発現する細胞に対するＴ細胞ａｎｅｒｇｙに陥るとされている（Ｇｒｉｂｂｅｎ  ＪＧ．１９９６）。白血病細胞においては、その増殖優位性を獲得する機序として多くの遺伝子異常が明らかになっており、このような遺伝子異常により形成された特異的異常タンパク質が発現し、プロセス断片化されたペプチドは細胞表面上ＭＨＣの溝に提示されると考えられている。しかし、多くの白血病細胞はこのような白血病特異的抗原を発現しているにも拘らず、その表面におけるＣＤ８０／ＣＤ８６などのｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅの発現が不全なことから、白血病に対する有効な免疫反応を惹起することが難しいことが報告されている（Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ．１９９６）。
また、最近の知見としてＣＴＬの上昇は認められるが腫瘍拒絶が起こらない理由として、腫瘍近傍に存在しているｓｔｒｏｍａ細胞（乳癌、すい臓癌、胃癌の腫瘍組織の９０％以上が間質線維芽細胞よりなる）により、免疫細胞、炎症細胞の浸潤の妨げになっており、これらの障害を取り除くことにより腫瘍細胞の退縮効果が飛躍的な上昇したことが報告されており（Ｙｕ  Ｐ．２００４）、腫瘍細胞への炎症細胞、免疫細胞の浸潤が腫瘍退縮に関しては重要な要因として考えられるようになってきている。
以上より腫瘍免疫を上手く利用するためには、腫瘍特異的なＣＴＬを如何に効率よく惹起させることができるかにかかっており、その問題点として、以下の点が挙げられる。
・腫瘍特異的抗原が同定されているか
・腫瘍特異的抗原が同定されてない場合はどうするか
・免疫惹起細胞（樹状細胞など）に如何に効率よく抗原提示をさせるか
・免疫惹起細胞（樹状細胞など）の成熟を如何に効率よく図るか
・以上踏まえた上で如何に腫瘍免疫（ＣＴＬを中心とした）を惹起させるか
・免疫細胞の腫瘍組織効率的な浸潤
上記問題点のなかで、腫瘍免疫（ＣＴＬを中心とした）を惹起させるかが最も重要な要件でありＣＴＬの誘導には免疫惹起を誘発させるアジュバントが必要である。免疫状態をＴｈ１にシフトできうるアンジュバンドとして「ＨＶＪ−電荷型リポソームからなるアジュバント」としての特許出願公開がされている（特開２００１−３０２５４１号公報）。その腫瘍ワクチンとしての効果についても報告がなされている（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（１９）：５３６７−５３７４．１９９９，Ｉｈｓｈｄａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，（１０）：２７１９−２７２４．１９９９，Ｚｈｏｕ  ＷＺ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，（６）：１７６８−１７７３．１９９９．Ｚｈｏｕ  ＷＺ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５（３），２９１−２９９，２００２．Ｔａｎａｋａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）。しかしながら、リポソームの形態ではないセンダイウイルスエンベロープ（以下、ＨＶＪ−Ｅともいう）に関してはこういった効果はいまだ報告されていない。
ＨＶＪ−ＥはＨＶＪをもとに構築されたベクターであり（特開２００２−６５２７８号公報）、ベクタービヒクルの中にプラスミド、オリゴＤＮＡ・ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、低分子化合物を封入でき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて当該封入試料をベクタービヒクル近傍の細胞へ導入でき、またエンベロープタンパク質であるＦタンパク質の働きにより細胞同士を融合させることが可能である。本発明者らは、上記利点を利用してＨＶＪ−Ｅを用いた腫瘍免疫について検討を行った。
癌の転移の抑制や再発の防止に最も適した遺伝子治療法は免疫遺伝子治療であるが、その効果は世界的にまだ十分に上がっていない。その原因のひとつとしては腫瘍免疫を治療に十分な程度に増強できないことが推察される。我々はこの課題を実現するために遺伝子導入ベクターや遺伝子発現方法の開発を行ってきた。その結果、アジュバントとしての不活性化ＨＶＪエンベロープと抗癌剤を当該ベクターに封入ないし併用して固形腫瘍内に直接投与し、他の抗癌剤の併用投与により腫瘍特異的な抗腫瘍免疫を惹起させることが可能になった。その際腫瘍特異的抗原ペプチドを必要としない、換言すれば腫瘍ペプチドが同定されていない広範な腫瘍に応用可能である。さらにＣＴＬが惹起されているにもかかわらず、固形腫瘍組織を取り巻くｓｔｒｏｍａ細胞等により腫瘍部位にＣＴＬ細胞が到達することができず、固形腫瘍の腫瘍細胞を殺傷できないことによって、腫瘍退縮が認められないという局面をＨＶＪ−Ｅと抗癌剤との併用により打破することができるという画期的な発明である。
【発明の開示】
本発明者らは上記問題を解決すべく鋭意検討した結果、化学療法剤を併用ないし封入したウイルスエンベロープベクターを有効成分として含有する医薬組成物を完成させることができた。
さらに臨床応用により近い方法として、抗癌剤をウイルスエンベロープベクターに封入ないし併用して直接腫瘍内に導入し、他の抗癌剤との併用により、ＨＶＪ−Ｅのアジュバント作用にも起因する腫瘍細胞特異的な抗腫瘍免疫を惹起でき、腫瘍を退縮させることができた。
従って本発明は具体的には、例えば外来遺伝子の封入能を有する不活性化ＨＶＪ−Ｅベクター等の中に抗癌剤等を封入ないし併用した医薬組成物を提供するものである。
さらに、腫瘍内に抗癌剤を含有したＨＶＪ−Ｅベクター等を導入し、抗癌剤投与との併用によりベクター自身のアジュバント効果にも起因する高い抗腫瘍免疫を惹起し、腫瘍を退縮させる方法を提供するものである。
また、本発明は、固形癌、特に泌尿器科領域の癌を治療するための、センダイウイルスエンベロープおよびエンベロープに封入しない抗癌剤を含有してなる医薬組成物を提供する。
本発明の要点は４つある。
１つはＨＶＪの使用である。ＨＶＪのアジュバント効果によって腫瘍免疫の惹起を誘導させることである。
２点目としてＨＶＪ−Ｅを用いて腫瘍免疫を惹起させるために、全身投与していたシスプラチン（ＣＤＤＰ、ランダ注：日本化薬）とＨＶＪ−Ｅにブレオマイシン（塩酸ブレオマイシン、ブレオ注射用：日本化薬）をＨＶＪ−Ｅベクターに封入し移植した腫瘍組織中に導入し、効率的な腫瘍免疫を惹起させることができた点にある。
さらに３点目として、惹起されたＣＴＬ細胞を非常に効率よく固形腫瘍中に集積できることが挙げられる。
また、誘導された腫瘍免疫は同種腫瘍細胞を排除する等、免疫本来の働きも保持しており、当該作用により転移した腫瘍の排除、さらには固形腫瘍を外科的に排除するために前もって当該処置をすることにより外科手術後の転移を防ぐ、そして腫瘍近傍転移リンパ節への転移腫瘍を殺傷し、外科的処理による除去部分を極力小さくするというような、いわゆるネオアジュバントとしての利用可能性を示した点にある。
４点目は、ＨＶＪ−ＥとＨＶＪ−Ｅに封入しない抗癌剤を併用することにより、有意な抗腫瘍効果が得られたことである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ウイルスエンベロープからなる免疫アジュバント。
（２）前記アジュバントが免疫応答を増強させるためのアジュバントである、（１）記載のアジュバント。
（３）前記アジュバントが抗腫瘍免疫を増強させるためのアジュバントである、（１）または（２）記載のアジュバント。
（４）前記ウイルスが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスである、（１）ないし（３）記載のアジュバント。
（５）前記ウイルスがセンダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたはインフルエンザウイルスから選ばれた１種である、（１）ないし（４）のアジュバント。
（６）前記ウイルスがセンダイウイルスである、（１）ないし（５）記載のアジュバント。
（７）免疫アジュバントとして使用するためのウイルスエンベロープ。
（８）免疫アジュバントとして使用するためのセンダイウイルスエンベロープ。
（９）抗腫瘍免疫アジュバントとして使用するためのセンダイウイルスエンベロープ。
（１０）抗原提示細胞の腫瘍抗原提示能を高め、その結果として細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）細胞の腫瘍組織へ集積させるための、ウイルスエンベロープとシスプラチンの使用。
（１１）抗原提示細胞の腫瘍抗原提示能を高め、その結果として細胞傷害性Ｔリンパ球細胞の腫瘍組織へ集積させるための、ウイルスエンベロープ、シスプラチンおよび化学療法剤の使用。
（１２）前記ウイルスエンベロープがセンダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）である、（１０）または（１１）記載の使用。
（１３）前記化学療法剤がブレオマイシンである、（１０）ないし（１２）記載の使用。
（１４）ウイルスエンベロープとシスプラチンを用いた、抗原提示細胞の腫瘍抗原提示能を高め、その結果として細胞傷害性Ｔリンパ球細胞の腫瘍組織へ集積させる方法。
（１５）ウイルスエンベロープおよびシスプラチンを含有してなる、抗原提示細胞の腫瘍抗原提示能を高め、その結果として細胞傷害性Ｔリンパ球細胞の腫瘍組織へ集積させるための医薬組成物。
（１６）抗原提示細胞の腫瘍抗原提示能を高め、その結果として細胞傷害性Ｔリンパ球細胞の腫瘍組織へ集積させるための医薬を製造するための、ウイルスエンベロープおよびシスプラチンの使用。
（１７）免疫惹起能を有するウイルスエンベロープベクターに封入した化学療法剤を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
（１８）化学療法剤が抗癌剤である、（１７）記載の医薬組成物。
（１９）化学療法剤がブレオマイシン類、アントラキノン系制癌剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびその誘導体、ビラルビシンおよびそれらの薬理学的に許容される塩から選ばれた１種以上である、（１７）または（１８）記載の医薬組成物。
（２０）ブレオマイシン類が、ブレオマイシンまたはその薬理学的に許容される塩、あるいはペプロマイシンまたはその薬理学的に許容される塩である、（１７）ないし（１９）記載の医薬組成物。
（２１）ブレオマイシン類が、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシンまたは硫酸ペプロマイシンである、（１７）ないし（２０）記載の医薬組成物。
（２２）免疫惹起能を有するウイルスが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来である、（１７）ないし（２１）記載の医薬組成物。
（２３）前記ウイルスがセンダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたはインフルエンザウイルスから選ばれた１種である、（１７）ないし（２２）記載の医薬組成物。
（２４）化学療法剤が塩酸プレオマイシン、硫酸ブレオマイシンまたは硫酸ペプロマイシンから選ばれた１種以上であり、ウイルスがセンダイウイルスである、（１７）ないし（２３）記載の医薬組成物。
（２５）注射剤である（１７）ないし（２４）記載の医薬組成物。
（２６）固形癌の治療剤である、（１７）ないし（２５）記載の医薬組成物。
（２７）固形癌が、肺癌、乳癌、消化器癌、頭頚部癌、婦人科領域の癌、泌尿器科領域の癌、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫または原発不明癌から選ばれた１種である、（２６）記載の医薬組成物。
（２８）消化器癌が胃癌、大腸癌または食道癌から選ばれた１種である、（２７）記載の医薬組成物。
（２９）頭頚部癌が上顎癌、舌癌、口唇癌、咽頭癌、喉頭癌または口腔癌から選ばれた１種である、（２７）記載の医薬組成物。
（３０）婦人科領域の癌が子宮癌、卵巣癌または子宮頸癌から選ばれた１種である、（２７）記載の医薬組成物。
（３１）泌尿器科領域の癌が前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、腎盂・尿管癌、精巣腫瘍、副腎腫瘍または陰茎癌から選ばれた１種である、（２７）記載の医薬組成物。
（３２）免疫惹起能を有するウイルスエンベロープベクターを有効成分とし、化学療法剤との併用に供することを特徴とする医薬組成物。
（３３）免疫惹起能を有するウイルスエンベロープベクターおよび化学療法剤を１製剤中に含有することを特徴とする、（３２）記載の医薬組成物。
（３４）生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置するための、センダイウイルスエンベロープに封入した抗癌剤または免疫促進剤を含有する医薬組成物。
（３５）生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置するための、センダイウイルスエンベロープに封入した抗癌剤または免疫促進剤と、さらなる抗癌剤を含有する医薬組成物。
（３６）センダイウイルスエンベロープがリポソームの形態でないことを特徴とする（３４）または（３５）記載の医薬組成物。
（３７）抗癌剤がブレオマイシンまたはその薬理学的に許容される塩、あるいはペプロマイシンまたはその薬理学的に許容される塩である、（３４）ないし（３６）記載の医薬組成物。
（３８）免疫促進剤が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むタンパク質である、（３４）または（３５）記載の医薬組成物。
（３９）生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置するための、センダイウイルスエンベロープを有効成分とし、抗癌剤または免疫促進剤との併用に供することを特徴とする医薬組成物。
（４０）生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置するための、センダイウイルスエンベロープを有効成分とし、抗癌剤または免疫促進剤並びにさらなる抗癌剤との併用に供することを特徴とする医薬組成物。
（４１）センダイウイルスエンベロープに封入した抗癌剤または免疫促進剤とを含有する医薬組成物を投与することを含む、生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置する方法。
（４２）センダイウイルスエンベロープに封入した抗癌剤または免疫促進剤に加えてさらなる抗癌剤を含有する医薬組成物を投与することを含む、生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置する方法。
（４３）センダイウイルスエンベロープがリポソームの形態でないことを特徴とする（４１）または（４２）記載の方法。
（４４）抗癌剤がブレオマイシンまたはその薬理学的に許容される塩、あるいはペプロマイシンまたはその薬理学的に許容される塩である、（４１）ないし（４３）記載の方法。
（４５）免疫促進剤が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むタンパク質である、（４１）ないし（４４）記載の方法。
（４６）生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置する医薬を製造するための、センダイウイルスエンベロープに封入した抗癌剤または免疫促進剤の使用。
（４７）生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置する医薬を製造するための、センダイウイルスエンベロープに封入した抗癌剤または免疫促進剤とさらなる抗癌剤の使用。
（４８）生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置する薬剤組成物を製造するための、アジュバントとしてのセンダイウイルスエンベロープの使用。
（４９）生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置する医薬を製造するための、アジュバントおよび抗癌剤または免疫促進剤封入ベクターとしての、センダイウイルスエンベロープの使用。
（５０）生体内において抗腫瘍免疫を誘導し固形腫瘍を処置する医薬を製造するための、アジュバントおよび抗癌剤または免疫促進剤送達ベクターとしての、センダイウイルスエンベロープの使用。
（５１）生体内において腫瘍免疫を惹起させるための、センダイウイルスエンベロープと抗癌剤の併用。
（５２）固形腫瘍組織内に細胞傷害性Ｔリンパ球を導入し抗腫瘍効果を惹起するための、センダイウイルスエンベロープの使用。
（５３）生体内において抗腫瘍免疫を誘導する術前補助療法（ネオアジュバント療法）に用いるための、センダイウイルスエンベロープの使用。
（５４）センダイウイルスエンベロープがリポソームでないことを特徴とする（４６）ないし（５３）記載の使用。
（５５）抗癌剤がブレオマイシンまたはその薬理学的に許容される塩、あるいはペプロマイシンまたはその薬理学的に許容される塩である、（４６）ないし（５４）記載の使用。
（５６）免疫促進剤が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むタンパク質である、（４６）ないし（５４）記載のその使用。
（５７）泌尿器科領域の癌を治療するための、センダイウイルスエンベロープおよび抗癌剤を含有してなる医薬組成物。
（５８）泌尿器科領域の癌が前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、腎盂・尿管癌、精巣腫瘍、副腎腫瘍または陰茎癌から選ばれた１種である、（５７）記載の医薬組成物。
（５９）抗癌剤がアドリアマイシン、ダウノマイシン、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ダカルバジンまたはミトキサントロンから選ばれる少なくとも１種である、（５７）または（５８）記載の医薬組成物。
（６０）膀胱癌を治療するための、センダイウイルスエンベロープとアドリアマイシンを含有してなる医薬組成物。
（６１）膀胱癌を治療するための、センダイウイルスエンベロープとアドリアマイシンを含有してなる膀胱内注入用医薬組成物。
（６２）膀胱癌を治療するための、センダイウイルスエンベロープとアドリアマイシンの併用。
（６３）センダイウイルスエンベロープおよび抗癌剤を投与することを含む、泌尿器科領域の癌を治療する方法。
（６４）泌尿器科領域の癌が前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、腎盂・尿管癌、精巣腫瘍、副腎腫瘍または陰茎癌から選ばれた１種である、（６３）記載の方法。
（６５）抗癌剤がアドリアマイシン、ダウノマイシン、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ダカルバジンまたはミトキサントロンから選ばれる少なくとも１種である、（６３）または（６４）記載の方法。
（６６）膀胱癌を治療するため医薬を製造するための、センダイウイルスエンベロープおよび抗癌剤の使用。
（６７）抗癌剤がアドリアマイシン、ダウノマイシン、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ダカルバジンまたはミトキサントロンから選ばれる少なくとも１種である、（６６）記載の使用。
（６８）泌尿器科領域の癌を治療するための、センダイウイルスエンベロープを有効成分とし、抗癌剤との併用に供することを特徴とする医薬組成物。
【図面の簡単な説明】図１．各群の腫瘍容量を比較したグラフである。
図２．ＣＤＤＰとＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭの単回および複数回投与の抗腫瘍効果を比較したグラフである。
図３．同系腫瘍細胞再投与試験で、腫瘍免疫惹起効果を比較したグラフである。再投与は１５日に行ったものである。
図４．同系異腫瘍細胞再投与試験で、腫瘍免疫惹起効果を比較したグラフである。再投与は０日に行ったものである。
図５．ＣＤＤＰとＢＬＭをＨＶＪ−Ｅへの封入の有無で投与した場合の抗腫瘍効果を比較したグラフである。
図６．ＣＴＬ  ａｓｓａｙによるＣＴＬの誘導をみたグラフである。
図７．各腫瘍組織切片のＨＥ染色図である。（１）対照群［右上］、（２）ＨＶＪ−Ｅ群［右下］、（３）ＢＬＭのみ群［左上］、（４）ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群［左下］における、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色図である。
図８．（５）ＣＤＤＰのみの群［右上］、（６）ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群［右下］、（７）ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ連続投与群［左上］における、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色図である。
図９．各群におけるＣＤ−４陽性像を比較したグラフである。
図１０．各群におけるＣＤ−８陽性像を比較したグラフである。
図１１．膀胱癌細胞接種マウスモデルにおける腫瘍容量の変化を、群間比較したグラフである。
図１２．ＭＢ４９細胞のアドリアマイシン感受性を示したグラフである。
図１３．膀胱へのＭＢ４９細胞の浸潤像を示した顕微鏡写真である（第１群および第２群、倍率×４００）。
図１４．膀胱へのＭＢ４９細胞の浸潤像を示した顕微鏡写真である（第３群および第４群、倍率×４００）。
図１５．ＭＢ４９の膀胱への生着率（癌の発生率）を群間比較したグラフである。
図１６．ＣＤＤＰおよびＨＶＪ−Ｅ（卵由来）の併用による抗腫瘍効果を示したグラフである。
図１７．ＣＤＤＰおよびＨＶＪ−Ｅ（細胞由来）の併用による抗腫瘍効果を示したグラフである。
図１８ａ．ＩＬ−１２に対する免疫惹起作用を示したグラフである。
図１８ｂ．ＩＬ−６に対する免疫惹起作用を示したグラフである。
図１８ｃ．ＩＬ−６とＩＬ−１２に対する免疫惹起作用の比較を示したグラフである。
図１９．ＣＤ４＋細胞の増減を示したグラフである。
図２０．制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）の増減を示したグラフである。
発明の詳細な説明
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明におけるウイルスエンベロープとは、ウイルスからＲＮＡまたはＤＮＡを取り除いた膜であり、通常は遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プラスミド等を封入して細胞移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）に利用されるものである。本発明において好ましく用いられるウイルスエンベロープは、リポソームの形態であったも、リポソーム以外の形態であってもよいが、好ましくはリポソーム以外の形態である。
ウイルスの種類も限定されないが具体的には、例えばレトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスを挙げることができる。
本発明にかかるウイルスとしてさらに具体的には、例えばセンダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス等を挙げることができる。
これらの中でも、好ましくはマウス肺炎ウイルスの一つであるセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ、以下ＨＶＪともいう）を挙げることができる。
なおＨＶＪとして具体的には、例えばＶＲ−１０５，ＶＲ−９０７等をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ。住所：Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８  ＵＳＡ，ＴＥＬ［１］−７０３−３６５−２７００）から購入することができる。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ｌｏｎｇｖｉｅｗ．ｃｆｍ？ｖｉｅｗ＝ａｖ，１５２３７６，ＶＲ−１０５＆ｔｅｘｔ＝Ｓｅｎｄａｉ＆ｍａｘ＝２０
ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ｌｏｎｇｖｉｅｗ．ｃｆｍ？ｖｉｅｗ＝ａｖ，１３７５４７８，ＶＲ−９０７＆ｔｅｘｔ＝Ｓｅｎｄａｉ＆ｍａｘ＝２０
ウイルスエンベロープベクターについてより詳しくは、例えば特開２００１−２８６２８２号公報（ＷＯ０１／５７２０４号公報）、特開２００２−０６５２７８号公報、ＷＯ０３／０１４３３８号公報等に記載されており、具体的には例えば特開２００１−２８６２８２号公報の実施例８などに従って調製することができる。
これらのウイルスエンベロープは免疫アジュバントとして使用することができ、免疫応答を増強させたり、抗腫瘍効果を増強させる効果を有する。またシスプラチンとともに使用することによって、抗原提示細胞の腫瘍抗原提示能を高め、その結果として細胞傷害性Ｔリンパ球細胞を腫瘍組織へ集積させることができる。
ウイルスエンベロープを用いる主な利点を以下に詳述する。
上記した通り、ウイルスエンベロープの中でもセンダイウイルスエンベロープ（以下、ＨＶＪ−Ｅともいう）が好ましく用いられるが、生ウイルスであるＨＶＪに比べ、ＨＶＪ−Ｅでは抗原提示細胞である樹上細胞に対するサイトカインの誘導が低減される。特に、Ｔｈ１サイトカインであるＩＬ−１２が低減されること、およびＩＬ−６の誘導量はＨＶＪに比べて約１／２に抑えられることが後述の実施例によりわかった。この場合でも、Ｔｈ２サイトカインの上昇は見られない。以上のことより、ＨＶＪ−Ｅを用いる場合、サイトカインの誘導量は下がるが、樹上細胞のｍａｔｕｒａｔｉｏｎ能は依然保持していることがわかった。
また、抗腫瘍免疫においては、制御性Ｔ細胞の割合が上昇すると、続いて起こる抗腫瘍免疫作用が抑制されることが報告されているが（Ｃａｓａｒｅｓ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｄｅｃ  １；１７１（１１）：５９３１−９．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  Ｄｅｃ；１０（１２）：１９６９−８０．）、ＨＶＪ−Ｅは、後述の実施例で示すとおり、Ｔ細胞全体の割合に影響を及ぼすことなく、制御性Ｔ細胞ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の割合を下げる作用を有している。この作用は抗癌剤によって影響を受けないため、ＨＶＪ−Ｅの使用は抗腫瘍免疫において非常に有用である。
また、かかるウイルスエンベロープは、生体内において抗腫瘍免疫を誘導する術前補助療法（ネオアジュバント療法）に用いることもできる。
さらにシスプラチンに加えて化学療法剤をともに用いてもよい。ここで用いる好ましい化学療法剤としてはブレオマイシンなどが挙げられる。
また、本発明のウイルスエンベロープにより副作用が大きな抗癌剤を、簡便に、しかも安全に癌部に送達できる方法が提供される。すなわち、本発明は、免疫惹起能を有するウイルスエンベロープに封入ないし併用した化学療法剤を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物を提供する。
本発明において使用される化学療法剤とは、細胞に直接作用する低分子化合物であれば限定されないが、例えば東京化学同人刊・生化学事典第３版には、「現在、選択毒性の高い化学物質を用いる治療法すなわち化学療法の対象は微生物による感染症のみならず悪性腫瘍にまで広げられている。」と記載されており、抗菌剤、抗癌剤等が含まれることは論を待たない。
なお本発明においては、化学療法剤として好ましくは抗癌剤および抗菌剤を挙げることができる。ここで、抗癌剤は、制癌剤、抗腫瘍剤と呼ばれているものを含む概念であり、本明細書において、抗癌、制癌、抗腫瘍は同義語として用いている。
抗癌剤として具体的には例えば、ブレオマイシン類、アドリアマイシン（ドキソルビシン）・ダウノマイシン（ダウノルビシン）・アクラルビシン・アムルビシン・イダルビシン・エピルビシン・ピラルビシン・ミトキサントロン等のアントラキノン（アントラサイクリン）系制癌剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、イリノテカン等のカンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびその誘導体、ビラルビシン、ダカルバジンおよびそれらの薬理学的に許容される塩を挙げることができる。
これら化学療法剤の中でも、より好ましくは抗癌剤、さらに好ましくはブレオマイシン類、シスプラチン類またはアドリアマイシンを挙げることができ、具体的にはブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）またはその薬理学的に許容される塩、あるいはペプロマイシン（Ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）またはその薬理学的に許容される塩を挙げることができ、さらに詳しくは塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシンを挙げることができる。
なお本発明におけるシスプラチン類とは、具体的には例えばシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ：ＣＤＤＰ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ［ｐａｒａｐｌａｔｉｎ］：ＣＢＤＣＡ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）等の制癌性白金錯体を意味する。
抗菌剤として具体的には、例えばオキソリン酸、オルメトプリム（ｏｒｍｅｔｏｐｒｉｍ：ＯＭＰ）、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）、サルファ剤、ホスホマイシン、ペニシリン系抗菌剤、セファロスポリン系抗菌剤、バンコマイシン、テトラサイクリン系抗菌剤、リファンピシン、フルオロキノン系抗菌剤などが挙げられる。
本発明にかかる医薬組成物を抗癌剤として使用する場合、適応となる癌の種類は限定されず、具体的には固形癌、血液細胞癌等を挙げることができる。これらの中でも固形癌が好適対象である。
固形癌としてより具体的には、例えば肺癌、乳癌、消化器癌、頭頚部癌、婦人科領域の癌、泌尿器科領域の癌、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、原発不明癌、皮膚癌、皮膚悪性腫瘍、神経膠腫、甲状腺癌等を挙げることができ、さらに具体的には、例えば消化器癌として胃癌、大腸癌、食道癌等を、頭頚部癌として上顎癌、舌癌、口唇癌、咽頭癌、喉頭癌、口腔癌等を、婦人科領域の癌として子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌等を、泌尿器科領域の癌として前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、腎盂・尿管癌、精巣腫瘍、副腎腫瘍、陰茎癌等を挙げることができる。
これらの固形癌の中でも、より好適な対象としては、皮膚癌、皮膚悪性腫瘍、頭頸部癌（上顎癌、舌癌、口唇癌、咽頭癌、口腔癌など）、肺癌（特に原発性および転移性扁平上皮癌）、食道癌、悪性リンパ腫（細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病など）、子宮頸癌、神経膠腫、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌を挙げることができる。
上記の医薬組成物が含有するウイルスエンベロープには、さらに免疫促進剤を封入ないし併用してもよい。ここで、好ましい免疫促進剤としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むタンパク質などが挙げられる。
本発明の抗癌剤または免疫促進剤を含有する医薬組成物は生体内において抗腫瘍免疫を誘導し、固形腫瘍を処置することもできる。ここで、「処置する」とは、固形腫瘍を治療・抑制するための行為を指し、具体的には、該医薬組成物を患部に直接注入したり、全身に投与したりすることなどによって、固形腫瘍を退縮・消滅させることなどを意味する。
なお化学療法剤または免疫促進剤をウイルスエンベロープに封入する工程においては界面活性剤を使用することが好ましく、界面活性剤として具体的には、例えばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００、デオキシコール酸またはその塩、コール酸またはその塩、ドデシールマルトシド等を挙げることができる。またデオキシコール酸の塩として好ましくはデオキシコール酸ナトリウム、コール酸の塩として好ましくはコール酸ナトリウムを挙げることができる。
具体的には、不活性化センダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）の場合を例にとると、ＨＶＪ−Ｅに抗癌剤または免疫促進剤を封入する場合には、抗癌剤または免疫促進剤を緩衝液に溶解する。ここで使用する緩衝液は限定されず、具体的には例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）等を適宜選択し使用できるが、ｐＨが６−９の緩衝液が好ましい。
上記の医薬組成物にはウイルスエンベロープに封入した抗癌剤または免疫促進剤に加え、さらなる抗癌剤を含有させてもよい。さらに含有させる抗癌剤としては、具体的には、例えば前述の抗癌剤の例示と同様のものなどを挙げることができる。
上記の医薬組成物の投与形態・剤型は、経口投与、非経口投与のいずれでもよく、経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤が、また、非経口投与剤としては、注射剤、軟膏、スプレー剤などが挙げられる。好ましくは非経口投与、さらに好ましくは注射剤である。
ヒト以外の動物としては、家畜、家禽類のほか、実験動物が含まれる。ヒト以外の動物への投与形態としては、飼料中への添加であってもよい。
上記医薬組成物の投与量は、対象患者の年齢・体重・病態、投与方法などによっても異なるが、成人当たりの１日量として、抗癌剤を封入したウイルスエンベロープの組成物において、抗癌剤が例えばブレオマイシンの場合、通常１５〜３０ｍｇ力価を、シスプラチンの場合、通常１０〜１００ｍｇ／ｍ２程度投与するのが好ましい。また、免疫促進剤を封入したウイルスエンベロープの組成物においては、例えばＧＭ−ＣＳＦの場合、通常１００万から２，０００万単位程度投与するのが好ましい。
またＨＶＪ−Ｅとして通常は、４０〜４００，０００ＨＡＵを、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵを、さらに好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵを投与する。
抗癌剤を封入ないし併用したウイルスエンベロープに加えてさらなる抗癌剤を含有する医薬組成物の場合、抗癌剤を封入ないし併用したＨＶＪ−Ｅとさらに添加する抗癌剤は、それぞれが単独で、若しくは組み合わせで製剤化されてもよく、又は全てを含有する製剤としてもよい。別々に製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても異なっていてもよく、また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。併用する抗癌剤の種類や効果によって適宜決定する。
なお本発明における「併用」とは、その投与のタイミングが同時であっても、別々であってもよく、限定されないものとする。
上記の医薬組成物は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤、または、注射剤、スプレー剤、軟膏などに製剤化することができる。
製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などを配合して製剤化される。
賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、でんぷん類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが、結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが、溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが、崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが、溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが、懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが、安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが、無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどが、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが、抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが、矯味矯臭剤としては、医薬分野において通常に使用される甘味料、香料などが、着色剤としては、医薬分野において通常に使用される着色料が挙げられる。
本発明の特長として、副作用あるいは毒性の強い抗癌剤をウイルスエンベロープベクターに封入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では培養液中に抗癌剤がもれることなく直接細胞に抗癌剤を送達することもできる。
またｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験においては、抗癌剤の全身投与ではなく、局所投与を行うことが可能であり、固形癌の癌細胞のみに効率よく抗癌剤を送達することができる。
さらにヒトの治療においては、抗癌剤封入／併用ウイルスエンベロープベクターの単独投与による化学療法だけではなく、進行癌患者で抗癌剤の投与不能な患者に対し局所投与を行うことにより癌の退縮を図り、さらに放射線治療、外科的処理との併用により、一層優れた抗癌効果が得られる。
例えば膀胱癌に対しては、膀胱内注入等の局所投与することもできる。
抗癌剤を併用ないし封入したウイルスエンベロープベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験ではホスト細胞にトランスフェクションする。その場合の手続きは、例えば抗癌剤を封入／併用したウイルスエンベロープベクターの溶液を培養細胞の培地に添加するなどの方法を採用することができる。
トランスフェクションは３７℃で反応させる場合、その反応時間は３０分以上、４８時間程度とする。効果判定は生細胞数のカウントあるいはＷＳＴ  ａｓｓａｙ（生細胞のカウント手法：ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８、同仁化学）により行うのが好ましい。
ｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験における対象には、例えばマウスの場合、癌細胞が同系移植では免疫不全マウスではない通常マウスを、異種移植の場合はヌードマウスあるいはＳＣＩＤマウスを使用するのが好ましい。
ペトリディッシュで培養した培養癌細胞をマウスの皮内に移植し、移植細胞が増殖後、抗癌剤を封入／併用したウイルスエンベロープベクターを増殖固形癌部内に投与し、癌部の長径および短径を測定し、その抗癌効果測定をするなどの方法を採用することができる。
さらに本発明は、ＨＶＪ−Ｅと抗癌剤を含有してなる医薬組成物を提供する。この場合、上述したようなウイルスエンベロープへの抗癌剤の封入処理を行わなくてもよい。
かかる医薬組成物に含有させる抗癌剤としては、ブレオマイシン類、アドリアマイシン（ドキソルビシン）・ダウノマイシン（ダウノルビシン）・アクラルビシン・アムルビシン・イダルビシン・エピルビシン・ピラルビシン・ミトキサントロン等のアントラキノン（アントラサイクリン）系制癌剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、イリノテカン等のカンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびその誘導体、ビラルビシン、ダカルバジンなどが挙げられ、特に好ましくはブレオマイシン類、シスプラチン類またはアドリアマイシンを用いる。
本発明にかかる医薬組成物を抗癌剤として使用する場合、適応となる癌の種類は限定されず、具体的には固形癌、血液細胞癌等を挙げることができる。これらの中でも固形癌が好適対象である。
固形癌としてより具体的には、例えばメラノーマ、大腸癌等の消化器癌、乳癌、肺癌、泌尿器科領域の癌を治療するのに適している。泌尿器科領域の癌としてさらに具体的には前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、腎盂・尿管癌、精巣腫瘍、副腎腫瘍または陰茎癌などを挙げることができる。
上記医薬組成物はＨＶＪ−Ｅおよび抗癌剤を含むものであるが、それぞれが単独で、若しくは組み合わせで製剤化されてもよく、又は全てを含有する製剤としてもよい。別々に製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても異なっていてもよく、また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。併用する抗癌剤の種類や効果によって適宜決定する。
上記の医薬組成物の投与形態・剤型としては、先述の医薬組成物と同様の形態・剤形などが挙げられ、好ましくは注射剤である。
ヒト以外の動物としては、家畜、家禽類のほか、実験動物が含まれる。ヒト以外の動物への投与形態としては、飼料中への添加であってもよい。
上記医薬組成物の投与量は、対象患者の年齢・体重・病態、投与方法などによっても異なるが、例えばアドリアマイシンとＨＶＪ−Ｅを含有する医薬組成物の場合、成人当たりの１日量として、通常ＨＶＪ−Ｅを４０〜４００，０００ＨＡＵ、アドリアマイシンを１〜５００ｍｇを、好ましくはＨＶＪ−Ｅを４，０００〜４０，０００ＨＡＵ、アドリアマイシンを３０〜６０ｍｇ程度投与する。
上記の医薬組成物は、先述したような通常の方法によって、製剤化することができる。
【実施例】  続いて、本発明による免疫惹起能を有するウイルスエンベロープベクターに封入／併用した化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物が有する優れた効果、特にウイルスエンベロープベクターのウイルスエンベロープ糖タンパク質等によるアジュバントによる優れた効果を示すため、具体的実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
（実施例１）
（１）試験デザイン
８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ系雄マウスの背部皮内に、マウス大腸癌由来のＣＴ−２６細胞（５×１０６細胞）を移植し、担癌マウスを作製した。移植５日後に腫瘍径（長径）が５ｍｍ程度に達した動物の腹腔内に０．２ｍｇ／ｂｏｄｙのプラトシン注（シスプラチン，ＣＤＤＰ）を投与した。投与日後に、単回（投与翌日）あるいは複数回（３回：投与１，５，８日後）、抗癌剤（塩酸ブレオマイシン［ＢＬＭ］：日本化薬）含／不含ＨＶＪ−Ｅ等を腫瘍内に投与した。腫瘍径、生存曲線、腫瘍組織における免疫反応について検討した。
さらに担癌マウスに当該処置を施したマウスに、ＣＴ−２６細胞あるいは同系マウス由来Ｍｅｔｈ−Ａ細胞を移植し移植細胞の動態を観察した。
（試験１）以下記載の群設定を行い、移植腫瘍における当該処置の抗腫瘍効果について検討した。
モデル設定として、（１）対照群、（２）ＨＶＪ−Ｅ群、（３）ＢＬＭのみ群、（４）ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群、（５）ＣＤＤＰのみ群、（６）ＣＤＤＰ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与の各群を設定し、それぞれについてした場合の２１日後の腫瘍容量の測定を行い抗腫瘍効果に及ぼす影響を調べた。
当該群構成および投与用量等について以下に詳細した。
0004855250.tif 000002
0004855250.tif 000003
（試験２）  試験１においてした場合の当該ＣＤＤＰ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与（単回）処置における抗腫瘍効果の更なる増強を鑑み、ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭの複数回（３回）投与を行った（試験．２−１）。さらに当該試験において抗腫瘍免疫により腫瘍の退縮が起こった場合、当該惹起免疫の種類の推定を行うため、腫瘍細胞（ＣＴ２６細胞（試験．２−２）およびＢＡＬＢ／ｃマウス肉腫細胞であるＭｅｔｈ−Ａ細胞（試験．２−３））の再投与を行い、当該移植細胞の生着、腫瘍用量の増減について調べた。
（試験２−１）
（１）対照群、（２）ＣＤＤＰ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群（単回）、（３）ＣＤＤＰ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ３回投与群の２１日後の腫瘍容量について検討を行った。
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（試験２−２）
細胞の再移植を行なう前までは上記試験と同様の処置を実施し、ＣＤＤＰの投与１５日後に初回腫瘍細胞移植隣接部にＣＴ−２６細胞およびＭｅｔｈ−Ａ細胞（５×１０６個細胞）をそれぞれ皮内に移植し、再移植細胞の拒絶について調べた。
0004855250.tif 000006
（試験３）試験２の結果を補足する試験として、直接腫瘍内に封入量と同等量換算のＢＬＭを投与しその効果についての検討を行った。
0004855250.tif 000007
（試験４）ＣＴＬ  ａｓｓａｙ
当該試験においてした抗腫瘍免疫効果が、ＣＴ２６細胞特異的な抗腫瘍免疫の惹起においてされているかどうかの検討を行うため、動物より回収した脾臓細胞をＣＴ２６細胞で刺激し、放射ラベルしたクロムを用いたＣＴＬ  ａｓｓａｙを行い、ＣＴ２６特異的な抗腫瘍免疫が惹起されているかについて検討した。
係る試験において、（１）ＣＴ−２６細胞未接種群、（２）ＣＴ−２６細胞のみ接種群、（３）ＣＴ−２６細胞接種＋ＣＤＤＰ投与群、（４）ＣＴ−２６細胞接種＋ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ３回投与群をそれぞれ作製し試験に供した。
（試験５）当該抗腫瘍免疫による抗腫瘍効果についての試験においてした腫瘍組織におけるＣＤ−４、ＣＤ−８、好中球、マクロファージ等の浸潤を調べるため以下に示す試験群を設定し、ＣＤＤＰ投与９日後の腫瘍組織を摘出し、組織免疫染色を行った。
0004855250.tif 000008
（２）実験方法
２−１）腫瘍細胞の培養
ＢＡＬＢ／ｃマウス大腸癌由来ＣＴ−２６細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
７５ｃｍ２のフラスコを用いて細胞培養を行った。約８０％コンフルエントに達した後、継代培養を行った。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）液を除去後，１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、１ｍＬの０．２５％トリプシンおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有ＰＢＳを添加し、３７℃で細胞を剥離した。９ｍＬのＤＭＥＭ培地を添加後、細胞を集め、遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分間）にて細胞を回収した。上清除去後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて細胞を希釈し、培養した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスＭｅｔｈ−Ａ細胞は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
２−２）腫瘍細胞懸濁液の調製
約８０％コンフルエントに達した細胞の培養液を除去後、ＰＢＳを用いて、培養フラスコを洗浄した。０．２５％トリプシンおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有ＰＢＳを少量添加し、３７℃で細胞を剥離し始めるまで放置した。ＤＭＥＭ培地を用いて細胞を集め、遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分間）した。上清を除去後，ＰＢＳに懸濁した。再度遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分間）し、上清を除去後、ＰＢＳを用いて５×１０７個／ｍＬに調製した。
２−３）マウスの馴化
１６日間の検疫馴化期間中、固型飼料および飲水を自由に与えた。
２−４）腫瘍細胞の接種
検疫馴化が終了した動物にバリカンを用いて剃毛を実施した。マウスの背部に、ディスポーザブル注射筒および注射針（２６Ｇ）を用いて、１００μＬ／ｓｉｔｅ（５×１０６個／ｂｏｄｙ）を５９匹の動物に皮内投与した。投与した翌日に５７匹の動物（未投与動物）に同様に投与した。
２−５）動物の群分け
腫瘍の径（長径、短径）を、移植後５日目に測定（群分け後は測定しなかった）した。５日後に腫瘍径（長径）が５ｍｍ程度になった動物を、平均腫瘍径（長径）がほぼ均一になるよう、層別無作為化によって群分けした。
２−６）投与
ディスポーザブル注射筒および注射針を用いて、ＣＤＤＰ投与群については１回腹腔内投与（１０００μｌ）した。腫瘍内試料投与群においては、ＣＤＤＰ投与日後に所望試料を腫瘍内に投与（１００μｌ）した。
２−７）腫瘍径の測定
投与日を投与後０日とした。投与後３，６，９，１２，１５，１８および２１日に、全例について腫瘍径を計測し、腫瘍体積（長径×短径×短径÷２）を算出した。
ＣＴ−２６細胞およびＭｅｔｈ−Ａ細胞の再投与においても再投与後の腫瘍径を測定した。
２−８）ＣＴＬ  ａｓｓａｙ
麻酔下の動物より脾臓を取り出し、３ｍｌのＲＰＭＩ溶液の入った６ｃｍ径ペトリディシュに回収した。滅菌した２枚のスライドガラスのすり部分で脾臓組織をすりつぶし、極力皮膜より脾臓細胞を分離し、残渣はメッシュにより除去した。７ｍｌのＰＲＭＩ溶液を加えて１２００ｒｐｍ、１０分間遠心し上清を除去した。さらに１０ｍｌのＲＰＭＩ溶液を加えて洗浄した。再度洗浄操作を行い、当該操作により得られた細胞を５ｍｌのＧＩＴ（１０％ＦＣＳ及び抗生剤含有）溶液に懸濁した。該操作で得られた細胞の数を測定した。当該細胞を５×１０６細胞／ｍｌに調整し、１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２ｍｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を撒種した。当該ｗｅｌｌに刺激細胞としてＣＴ−２６細胞を添加した。当該刺激細胞の作製は、１×１０７細胞／ｍｌに調整した刺激細胞含有ＧＩＴ溶液に１００μｌのマイトマイシンＣを添加し１時間、３７℃にて処理した。該処理後９ｍｌのＧＩＴ溶液を加え、１０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を除去後、１０ｍｌのＧＩＴ溶液を加えて洗浄操作を行い、当該操作をさらにもう一度行い、最後に１ｍｌのＧＩＴ溶液に細胞を懸濁することにより調整した。当該細胞を細胞密度がＧＩＴ溶液を添加することにより、２．５×１０５細胞／ｍｌになるように調整し、前述の脾臓組織より回収した細胞懸濁液中に該溶液２ｍｌを添加した。
刺激細胞なし試料ではＧＩＴ溶液のみを２ｍｌを添加した。当該試料を６日間培養した。ＣＴＬ  ａｓｓａｙにおいては当該細胞をターゲットとして使用した。
該組織より回収した脾臓細胞の培養試料を用いてＣＴＬ  ａｓｓａｙを行った。まずターゲット細胞として使用するＣＴ−２６細胞の調整を以下のように行った。ＣＴ−２６細胞を１×１０７細胞／ｍｌ（ＧＩＴ培地中）となるよう調整し１５０μｌを取り、該溶液に１ｍＣｉ／ｍｌの放射ラベルしたＣｒ溶液１５０μｌを加え、１時間３７℃にで培養した。１０ｍｌのＧＩＴ溶液を加えて細胞を洗浄し、１０００ｒｐｍ、５分間遠心し細胞を回収した。上清を除去し１０ｍｌのＧＩＴ溶液を加えて洗浄した。都合３回同操作を行い洗浄を行った。当該操作により得られた細胞を１５０μｌのＧＩＴ溶液に懸濁し、最後に１００倍希釈し１×１０５細胞／ｍｌとなるよう調整し、ターゲット細胞（Ｔ）として以下の操作に用いた。
エフェクター細胞（Ｅ）は方法の部分で示した４群からの処理した細胞を回収し、調整し用いた。
実際のＣＴＬ  ａｓｓａｙは、エフェクター細胞（Ｅ）とターゲット細胞（Ｔ）との比、Ｅ／Ｔ比がそれぞれ８０、４０、２０、１０、５にし測定を行った。この際、ターゲット細胞は１００μｌ（１×１０５細胞／ｍｌ）を加え、全量を２００μｌとした。当該試料を４時間３７℃で処理した。
培養終了後、遠心により細胞および残渣を除去し、１００μｌを回収し、γ−カウンターに入れ計測した。以下の式により％ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｒ  ｒｅｌｅａｓｅを算出した。
％  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｒ  ｒｅｌｅａｓｅ＝ｂ−ｃ／（ａ−ｃ）＊１００（％）
ａ：ｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ（ｃｐｍ）
ｂ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ（ｃｐｍ）
ｃ：ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ（ｃｐｍ）
２−９）当該腫瘍組織は腫瘍組織染色を行うために液体窒素中で凍結した。腫瘍組織をクライオスタットで８μｍ厚切片を作製した。組織切片を−２０℃の冷アセトン中で１５分間固定した。水洗後内因性アビジン・ビオチンのブロッキングを行い水洗した。試料を正常ウサギ血清により反応を行い、５０倍希釈した一次抗体（抗マウスＣＤ８ａ・ラット抗体（Ｌｙ−Ｚ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗マウスＣＤ４ａ・ラット抗体（Ｌ３Ｔ４；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））と４℃、一晩反応させた。７．５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、３００倍希釈した抗ラット・ビオチン標識ウサギＩｇ（ＤＡＫＯ）と３０分間反応させた。９．５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、１００倍希釈のストレプトアビジンと３０分間反応させた。１１．５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、ファーストレッドにより発色させた。水洗後ヘマトキシリンで核染色を行った。
結果
試験１の結果
（１）対照群、（２）ＨＶＪ−Ｅ群、（３）ＢＬＭのみ群、（４）ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群、（５）ＣＤＤＰのみ群、（６）ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群の腫瘍容量を測定した。
試験は各群合計１０匹とし５匹づつ２回に分けて試験を行った。当該試験において特筆すべきことは（６）ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群において当該試験動物１０匹のうち２匹のマウスにおいて外見上移植した腫瘍細胞が消え、寛解したことである。２回試験した内１の試験において５匹の動物の腫瘍容量の平均値をグラフに示した。それぞれの平均腫瘍容量は、（１）対照群：１６４１ｍｍ３、（２）ＨＶＪ−Ｅ群：１３８６ｍｍ３、（３）ＢＬＭのみ群：１３０３ｍｍ３、（４）ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群：７１８ｍｍ３、（５）ＣＤＤＰのみ群：３８７ｍｍ３、（６）ＣＤＤＰ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群：５１ｍｍ３となった。対照群の平均腫瘍容量を１００％とし、各群の平均値を比較すると、（２）ＨＶＪ−Ｅ群、（３）ＢＬＭのみ群、（４）ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群、（５）ＣＤＤＰのみ群、（６）ＣＤＤＰ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群はそれぞれ、８２．９％、８０．０％、４３．０％、２３．２％、３．１％となった（図１）。
試験２−１の結果
（１）対照群、（２）ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群、（３）ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ３回投与群（ＣＤＤＰ投与後のＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ投与日、１，５，８日後）モデルを作製し、当該（２）ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群と（３）ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ３回投与群における腫瘍拒絶について効果を調べた。
まず図に示すように、（２）群で４匹中１匹のマウスで寛解が認められた。（３）群では５匹中４匹で寛解が認められた。（図２）
試験２−２および２−３の結果
試験２−２でした同系腫瘍細胞（ＣＴ−２６細胞）再投与試験において、ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群で４匹中１匹のマウスで寛解し、当該マウスにおいてＣＴ−２６細胞の再接種動物は移植細胞を拒絶した。しかし、残りの３匹において初発腫瘍細胞は拒絶されておらず、当該動物にＣＴ−２６細胞を移植した動物ではＣＴ−２６細胞の再移植後に該細胞を拒絶することはできなかった。一方ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ３回投与群では５匹中４匹で拒絶が認められた。以上の結果より、腫瘍免疫が惹起されていることが確認された（図３）。当該腫瘍免疫がＣＴ−２６細胞特異的であるかについては次試験により判定した。
試験２−３でした試験においてはＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ３回投与により寛解したマウスに移植したＭｅｔｈ−Ａ細胞を拒絶することはできなかった（図４）。
試験３の結果
今までにした試験において当該ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭにおいて抗腫瘍効果が認められた。しかし、この際のＢＬＭの効果について、ＨＶＪ−Ｅの有無、すなわちＢＬＭのＨＶＪ−Ｅへ封入の効果（ＨＶＪのアジュバント効果も含めて）の検討をしておらず、今回ＣＤＤＰ併用時における当該効果について検討した。その結果を図５に示した。図から明らかなように、ＢＬＭをＨＶＪ−Ｅに未封入の場合においてした試験では当該処理において腫瘍の退縮効果はＢＬＭをＨＶＪ−Ｅに封入した場合に比べて全く上がらず、腫瘍を退縮させることはできなかった。ＣＤＤＰ併用時においてＢＬＭを腫瘍組織直接導入する際にも、ＢＬＭをＨＶＪ−Ｅに封入し腫瘍組織に導入しなければ腫瘍を退縮させる効果が認められないことが判明した。
試験４の結果
試験１および２においてした試験結果において、ＣＤＤＰの全身投与とＢＬＭをＨＶＪ−Ｅに封入し腫瘍組織に直接投与することにより、以下の点が明らかになった。
・腫瘍組織を退縮させることができること
・その効果はＢＬＭをＨＶＪ−Ｅに封入した試料を複数回投与して効果があがること
・当該処理において移植細胞を退縮した寛解したマウスに同細胞を再移植した動物では当該細胞を拒絶したこと
・しかし、当該寛解マウスに同系異種細胞を移植した場合には拒絶することができなかったこと
よって当該試験において移植細胞に特異的な免疫が誘導されることが推定されたが、さらに直接的な特異的免疫の誘導を調べるためＣＴ−２６細胞に特異的な免疫が誘導されているかどうかについて検討した。
（１）ＣＴ−２６細胞未接種群、（２）ＣＴ−２６細胞のみ接種群、（３）ＣＴ−２６細胞接種＋ＣＤＤＰ投与群、（４）ＣＴ−２６細胞接種＋ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ  ３回投与群を設定、ＣＴＬ  ａｓｓａｙを行いＣＴ−２６細胞に特異的なＣＴＬについて検討した。エフェクター細胞（Ｅ）とターゲット細胞（Ｔ）との比、Ｅ／Ｔ比を変化させ、％ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｒ  ｒｅｌｅａｓｅによりＣＴＬの誘導を調べた。結果図６よりＥＴ比を８０％としたとき、（１）ＣＴ−２６細胞未接種群：８．１％、
（２）ＣＴ−２６細胞のみ接種群：８．１％、（３）ＣＴ−２６細胞接種＋ＣＤＤＰ投与群：１２．９％、（４）ＣＴ−２６細胞接種＋ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ  ３回投与群：３３．５％となった。
以上の結果より（４）ＣＴ−２６細胞接種＋ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ  ３回投与においてＣＴ−２６細胞に特異的なＣＴＬの誘導が起こっていることが判明した。
試験５の結果
（１）対照群、（２）ＨＶＪ−Ｅ群、（３）ＢＬＭのみ群、（４）ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群、（５）ＣＤＤＰのみ群、（６）ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群、（７）ＣＤＤＰ、ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ３回投与群を設定し、ＣＤＤＰ投与９日後の当該動物より腫瘍組織を採取し、当該組織の切片をそれぞれ作製した。まず、ＨＥ染色（図７，８）および抗ＣＤ−４抗体および抗ＣＤ−８抗体特異的免疫組織染色（データは示さず）より当該組織において認められる特徴的な病理所見を記載する。
（１）対照群においては核分裂を呈している細胞が多く、また核密度が高いという腫瘍細胞に特異的な悪性細胞所見が認められた。腫瘍組織の中心部ではネクローティックな細胞死が認められた。大半がｓａｒｃｏｍａ細胞特有の形態、つまりＣＴ−２６細胞の旺盛な増殖像が認められた。ＣＤ−４およびＣＤ−８（図９，１０）陽性像はほとんど見られなかった。（２）ＨＶＪ−Ｅ群においても総体的に（１）対照群とほぼ同じであり、ＨＶＪ−Ｅを投与した針跡近傍で好中球の浸潤が認められた。（３）ＢＬＭのみ群、（４）ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群においても、ほぼ同様の所見であった。
前者に比べて（５）ＣＤＤＰのみ群では、腫瘍組織の広範にわたって腫瘍細胞の壊死像が認められた。これは腹腔内投与したＣＤＤＰが血管等を通じて腫瘍組織に広がり、ＣＤＤＰの抗癌剤としての効果により腫瘍細胞を排除していると考えられた。しかし、ＣＤＤＰのみの投与ではまだ腫瘍細胞を壊滅させることはできず、腫瘍細胞の残存が認められ、当該細胞によりＣＤＤＰ投与９日後の腫瘍増殖が認められたものと推察された。（６）ＣＤＤＰ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ単回投与群では、総体的に腫瘍細胞が少なくなり、かなりの腫瘍細胞は消滅している。本試料の回収日はＣＤＤＰ投与９日目であり、まだ寛解状態に至っておらず、本試料が寛解できうるかどうかかは不明である。ただ、ＣＤ−４およびＣＤ−８陽性細胞数（図９，１０）は増加しているが、後述のＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭの連続投与に比べると少ない。（３）ＣＤＤＰ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ３回投与群では、腫瘍細胞はほとんど／全く認められず、抗原線維が変性壊死を起こし液状状態の部位が認められた。総体的に細胞数が少なく、広範に好中球の浸潤が認められた。特徴的なことは、他組織ではそれほど認められることのなかった、抗ＣＤ−４抗体および抗ＣＤ−８抗体陽性細胞（図９，１０）が広範に認められたことが特徴として挙げられる。腫瘍組織に浸潤する抗ＣＤ−８抗体に対する陽性細胞のほとんどはＣＴＬ細胞であることが報告されており、（３）ＣＤＤＰ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ３回投与群で、腫瘍の寛解は試験４の結果と合わせてＣＴＬによるものであると予想された。
本実施例では（１）樹状細胞によるワクチン効果がＣｐＧ−ＯＤＮを添加することにより上昇した点、と（２）ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭの腫瘍内投与とＣＤＤＰの全身投与の相乗効果により抗腫瘍免疫が惹起されたことが示された。
また本発明の特徴として、以下を挙げることができる。
・腫瘍の寛解が認められた。
・寛解の理由の一つとして、ＣＤ−８陽性細胞の腫瘍組織への浸潤、つまり腫瘍細胞特異的なＣＴＬによる効果が考えられる。
・ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭあるいはＣＤＤＰ単独投与のみでは効率のよい腫瘍免疫が惹起できないことから併用が重要である。
・ＣＤＤＰ投与でＣＤＤＰの効果は弱いながらも腫瘍組織全体に行き渡り、その後のＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ投与により、ＣＤＤＰにより脆弱となった腫瘍組織にＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭが効率よく送達されその効果を発揮した。
・その際、ＨＶＪ−Ｅは腫瘍免疫を惹起するアジュバントとして作用する。
免疫染色図の説明
図７および８のＨＥ染色図に対する説明
ＣｏｎｔｒｏｌではＣＴ−２６癌細胞の、核密度が高い、ｈｙｐｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ、核の大きさの不揃い、核分裂が多い等の悪性所見像が認められる。この現象はＨＶＪ−Ｅ、ＢＬＭ、ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ投与時にも多少の差はあれ同様の所見が認められた。壊死部分での好中球、マクロファージの浸潤像が認められた。ＣＤＤＰ投与の試料では空胞変性が認められ好中球、マクロファージ等が癌細胞中に浸潤しており、係る細胞が癌細胞を取り囲んでいる様子が見受けられる。ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭの単回投与では、腫瘍細胞数が少なくなり、リンパ系細胞が多く認められる。ＨＥ染色の濃さが薄くなり、よりピンクな像となっている。これは細胞中の核酸濃度が低下している証拠であり、癌細胞の細胞密度が低下していることによるものであると考えられる。ＣＤＤＰ＋ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭの３回投与では、ほとんど癌細胞が認められず、あっても分裂像は少なく増殖性を失っている。変性壊死している部分が多く炎症性細胞の浸潤も広範囲に認められ、リンパ球系細胞も多く認められた。
（実施例２）
（１）試験デザイン
ＭＢ４９細胞接種マウスモデル
本実験モデルは、例えばＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００４，２４（４）：２２２５−３０．などに記載された方法に従って作成することができる。
具体的には、２×１０６個のＭＢ４９細胞をＢ６マウスの背部皮内に接種し、５日間放置し腫瘍径が７−８ｍｍになった動物の腫瘍内に、Ｇ１〜Ｇ６各群それぞれのサンプルを３回接種し効果を検討した。
Ｇ１；  生理食塩水（コントロール）
Ｇ２；  アドリアマイシン（ＡＤＭ）２０μｇ
Ｇ３；  ＡＤＭ  １００μｇ
Ｇ４；  ＡＤＭ  ２０μｇ＋ＨＶＪ−Ｅ  ５０００ＨＡＵ
Ｇ５；  ＡＤＭ  １００μｇ＋ＨＶＪ−Ｅ  ５０００ＨＡＵ
Ｇ６；  ＨＶＪ−Ｅ  ５０００ＨＡＵ
（２）結果
以下に、各群の腫瘍容量（ｍｍ３）の経時変化を示す。（図１１参照）
0004855250.tif 000009
本実施例では、細胞増殖度が非常に高いＭＢ４９細胞を皮内投与し、しかも腫瘍径が７−８ｍｍというかなり大きな腫瘍において消失（ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ）が起こるかどうかが注目点であった。
結果として、ＡＤＭ単独でも腫瘍抑制効果が認められたが、消失は認められなかった。
一方、ＡＤＭ  １００μｇ＋ＨＶＪ−Ｅ  ５０００ＨＡＵ投与群の３匹の動物のうち１匹については、腫瘍の消失が認められた。
これより、ＨＶＪ−ＥとＡＤＭによるＭＢ４９細胞に対する抗腫瘍効果を示す結果が得られた。
（実施例３）
ＭＢ４９（移行上皮癌）細胞のアドリアマイシン（ＡＤＭ）感受性
（方法）
アドリアマイシン（ＡＤＭ）濃度依存的なＭＢ４９の細胞生存率を、以下の方法によりＷＳＴ−８  ａｓｓａｙ（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８；同仁化学研究所）を用いて調べた。
ＭＢ４９細胞１万個にアドリアマイシン（商品名；アドリアシン注、協和発酵工業株式会社）を加え、試料溶液量を２００μｌとし、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。
４８時間培養後にＷＳＴ−８  ａｓｓａｙにより上清を除去し、ＲＰＭＩ培地で１０倍に希釈したｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ溶液を１００μｌ添加し、１．５時間３７℃で静置した。マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＭＢ４９細胞のみで生育させた試料の吸光度を１００％の生存率とし、各濃度における生存率を算出した。生存率が５０％、９０％となる濃度を算定し、ＬＤ５０およびＬＤ９０とした。
（結果）
0004855250.tif 000010
ＭＢ４９細胞に対するＡＤＭのＬＤ５０濃度は０．００８μｇ／ｍｌおよびＬＤ９０濃度は１μｇ／ｍｌとなった（図１２参照）。
この結果より、膀胱内へのＭＢ４９細胞、ＨＶＪ−Ｅ、ＡＤＭの同時投与においては、ＭＢ４９細胞のＡＤＭに対する感受性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で反映できることが示された。
（実施例４）
膀胱内へのＭＢ４９細胞、ＨＶＪ−Ｅ、ＡＤＭの同時投与による抗腫瘍効果
（方法）
各群３匹のＣ５７ＢＬ／６Ｃｒ  Ｓｌｃ  ６週齢♀マウスに、ケタミン（５０ｍｇ）９０μｌ＋キシラジン（２％溶液）１０μｌを混合したものを左大腿筋に投与麻酔し、膀胱に２４Ｇカテーテルを挿入し、以下の試料溶液１００μｌを１ｍｌシリンジで投与して１時間カテーテルを留置した。
設定した群は次の通りである。
１  ＭＢ４９＋ＡＤＭ（０．００８μｇ／ｍｌ）
２  ＭＢ４９＋ＡＤＭ（０．００８μｇ／ｍｌ）＋ＨＶＪ−Ｅ（５０００ＨＡＵ）
３  ＭＢ４９＋ＡＤＭ（１μｇ／ｍｌ）
４  ＭＢ４９＋ＡＤＭ（１μｇ／ｍｌ）＋ＨＶＪ−Ｅ（５０００ＨＡＵ）
投与したＭＢ４９細胞数は５×１０６ｃｅｌｌとした。最終容量は１００μｌとなるように調整し、膀胱内へ投与した。２週間後に膀胱を摘出し、切片を作製、ＨＥ染色を行った。
（結果）
ＨＥ染色像より、腫瘍の浸潤を評価した。第１群および第２群では、全ての動物においてＭＢ４９細胞の浸潤像が認められた（図１３，１５参照）。図１３において、中央の紫色（黒色）の濃い部分が癌細胞である。ＡＤＭの濃度を上げ、ＬＤ９０に相当量を投与第３群においても、８０％の動物ではＭＢ４９細胞の浸潤を阻止することはできなかった。しかし、第４群に５０００ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅを添加した群においては、ＭＢ４９細胞の浸潤した動物は全く認められなかった（０／５、浸潤阻止率１００％）（図１４，１５参照）。
これより、ＡＤＭ単独ではＭＢ４９細胞の膀胱内浸潤を阻止できないが、ＡＤＭとＨＶＪ−Ｅを併用することにより浸潤を阻止できることが示された。
特にＡＤＭ（１μｇ／ｍｌ）にＨＶＪ−Ｅを加えた群は、ＡＤＭのみを加えた群に比べてＭＢ４９の膀胱への生着率（癌の発生率）が顕著に抑制された。
（実施例５）
シスプラチン（ＣＤＤＰ）とＨＶＪ−Ｅの併用による抗腫瘍効果
（方法）
ＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮内にＣＴ−２６マウス大腸癌細胞を５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄで接種した。接種から５日後に、ＨＶＪ−ＥおよびＣＤＤＰのよる処置を以下の動物群において開始した。それぞれの動物群の腫瘍容量は長径×短径×短径／２で算出した。
動物群：
＃１：  生食群
＃２：  ＨＶＪ−Ｅ単独
＃３：  ＣＤＤＰ  １ｍｇ／ｋｇ
＃４：  ＣＤＤＰ  ３ｍｇ／ｋｇ
＃５：  ＣＤＤＰ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＨＶＪ−Ｅ（５，０００ＨＡＵ）
＃６：  ＣＤＤＰ  ３ｍｇ／ｋｇ＋ＨＶＪ−Ｅ（５，０００ＨＡＵ）
（各群ｎ＝５ないし６）
（結果）
卵および細胞由来のＨＶＪ−Ｅを用いて試験を行った各群の腫瘍容積の平均値を図１６（卵由来）および図１７（細胞由来）に示した。腫瘍容積について、生食群、ＨＶＪ−Ｅ単独投与群、ＣＤＤＰの１ｍｇ／ｋｇ投与群の３群においては、容積において大きな差は認められなかった（図１６（卵由来））。細胞由来ＨＶＪ−Ｅ投与群では、生食群、ＨＶＪ−Ｅ単独投与群、ＣＤＤＰの１ｍｇ／ｋｇ投与群の順に退縮効果が認められた。
今回注目した腫瘍の退縮効果については、ＣＤＤＰ  １ｍｇ／ｋｇ＋ＨＶＪ−Ｅ  ５，０００ＨＡＵおよびＣＤＤＰ  ３ｍｇ／ｋｇ＋ＨＶＪ−Ｅ  ５，０００ＨＡＵ投与群の３３−４０％の動物に認められた（卵および細胞由来ＨＶＪ−Ｅの両者において）。よって、ＨＶＪ−Ｅに抗癌剤を封入することなく、ＨＶＪ−Ｅと混和するだけで抗腫瘍効果を呈することが確認できた。
（実施例５）
ＨＶＪ−ＥおよびＨＶＪのマウス樹状（ＤＣ）細胞に対する応答
（方法）
マウスからの樹状細胞（ＤＣ）の回収
マウスの両下肢の大腿骨および脛骨を採取した。骨に付随する筋肉および脂肪を極力取り除いた。骨の両端を切離した。２７Ｇ針付着シリンジを用いて、開口部より無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０、抗生物質含有）を流入させ、圧力により骨髄を流出させた。当該処置により回収した骨髄細胞を含む試料溶液を、４０μｍ径のセルストレイナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）に通し、残渣を除去した。１，５００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、細胞を回収した。ＤＣ培地（ＰＲＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ（ＭＢＬ，ＥＱＩＴＥＣＨ社）、１０ｎｇ／５００ｍｌのＧＭＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社）、２μｌ／５００ｍｌの２−メルカプトエタノール（以下ＤＣ培地）に、当該細胞を懸濁した。該細胞総数をカウントし、ＤＣ培地１ｍｌに細胞数が１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように、添加培地量を調整し、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに各ｗｅｌｌ、１ｍｌとなるように細胞を撒いた。２および４日後に上清を交換した。６日後に浮遊細胞を回収した。
ＤＣとＨＶＪまたはＨＶＪ−Ｅとの共培養
ＤＣと生ウイルスであるＨＶＪあるいは不活化したＨＶＪ−Ｅとの共培養により誘導されるサイトカイン量を測定した。当該ＤＣ（１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に対して、ｍ．ｏ．ｉ．が２０相当になるように、ＨＶＪあるいはＨＶＪ−Ｅを培養液中に添加した。ＮＦ−ｋＢの阻害剤であるＮ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ，１５μＭ，和光純薬）の有無についても検討した。さらに、典型的なＴｈ１免疫誘導物質である、大腸菌の細胞壁（ｌｉｐｏｐｏｌｕｓａｃｃａｒｉｄｅ，ＬＰＳ，１０μＭ）についても検討した。２日間培養を行い、上清を回収した。当該溶液中のＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−５およびＩＬ−４のサイトカイン濃度をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社のＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｋｉｔを用いて測定した。
さらに、ＤＣのｍａｔｕｒａｔｉｏｎについても検討した。
（結果）
結果を図１８に示した。ＨＶＪとＨＶＪ−Ｅとの比較において、ＩＬ−１２はＨＶＪ刺激においては４９２８ｐｇ／ｍｌであるのに対して、ＨＶＪ−Ｅでは７４８ｐｇ／ｍｌであり、誘導量がかなり低減されていた。一方ＩＬ−６はＨＶＪ刺激においては１０６６ｐｇ／ｍｌであるのに対して、ＨＶＪ−Ｅでは４９６ｐｇ／ｍｌであった。一方ＩＬ−４および−５の誘導はほとんど認められなかった。（図１８）
ＨＶＪ−ＥおよびＨＶＪで刺激することにより、ＬＰＳで刺激したのと遜色ない程度にＤＣのｍａｔｕｒａｔｉｏｎが認められた。
（実施例６）
ＨＶＥ−Ｊの制御性Ｔ細胞（ｒｅｇ  Ｔ）に対する影響
（方法）
ＣＴ−２６（１ｘ１０５細胞）を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２００μｌの容量（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ含有）で撒いた。翌日に樹状細胞（１ｘ１０５細胞）を加えた。培地はＤＣ培地２００μｌに交換した。その際にＨＶＪ−Ｅの有無（１０４−１０９／ｗｅｌｌ）、さらにＣＤＤＰ（１μｇ／ｍｌあるいは３μｇ／ｍｌ）もそれぞれ添加した。翌日にＢＡＬＢ／ｃマウスより回収した５ｘ１０５個の脾臓細胞を加えた。３日間培養を行った。細胞を回収し、Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞（ｒｅｇ  Ｔ）についてＢｒｄＵの取り込み率をＦＡＣＳにより解析した。
（結果）
ＨＶＪ−Ｅ、ＨＶＪ−Ｅ＋ＣＤＤＰ（１μｇ／ｍｌ）およびＨＶＪ−Ｅ＋ＣＤＤＰ（３μｇ／ｍｌ）を作用させることにより、Ｔ細胞全体の細胞増殖には影響を与えなかったが、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇ  Ｔ）については細胞の増殖をＨＶＪ−Ｅ濃度依存的に抑制した。（図１９および２０）
【産業上の利用可能性】  本発明の実施により、わが国で急速に増加しつつある肺癌、乳癌、胃癌・大腸癌・食道癌などの消化器癌、頭頚部癌（上顎癌，舌癌，口唇癌，咽頭癌，喉頭癌，口腔癌など）、婦人科領域の癌（子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌など）、泌尿器科領域の癌（前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、腎盂・尿管癌、精巣腫瘍、副腎腫瘍、陰茎癌など）、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、原発不明癌等すべての固形癌への新たな化学療法が、ＨＶＪ−Ｅベクターを用いることにより可能になる。すなわち、本発明により抗腫瘍免疫を惹起するウイルスベクターに化学療法剤を封入した医薬組成物が提供され、それにより生体内の抗腫瘍免疫を高め、かつ正常細胞への副作用を抑えながら、種々の癌を治療することができる。
また、本発明の別の態様であるＨＶＥ−Ｊおよび抗癌剤を含有する医薬組成物により、特に泌尿器科領域の癌を効率よく治療することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００４−１０８５９９、特願２００４−１３６７５６および特願２００５−０４４６３９を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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